(57)【要約】      （修正有）【課題】最小限の遺伝子発現構築物、細胞へのこの導入及び分子医学的応用のための遺伝子発現のためのこの使用。【解決手段】プロモーター配列、コード配列及び終結シグナルを含む線状の開鎖されたＤＮＡ二本鎖であり、少なくとも１つのＬ−ＤＮＡヌクレオチドを含む、遺伝子発現のためのＤＮＡ構築物。更には、ヒト、動物又は真核生物細胞の安定な又は一過性のトランスフェクションのための、及び遺伝子治療又はＤＮＡワクチン接種のための上記ＤＮＡ構築物の使用。【選択図】図１
2018007669.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロモーター配列、コード配列および終結シグナルを含む線状の開鎖されたＤＮＡ二本鎖であり、少なくとも１つのＬ−ＤＮＡヌクレオチドを含む、遺伝子発現のためのＤＮＡ構築物。
【請求項２】
少なくとも１つのＬ−ＤＮＡヌクレオチドが、５’および／または３’末端の最後の５つのヌクレオチド内に含まれる、請求項１に記載の構築物。
【請求項３】
ＤＮＡ構築物の少なくとも１つの末端が一本鎖ループを含む、請求項１または２に記載の構築物。
【請求項４】
部分的にまたは完全に二本鎖である、請求項１から３のいずれかに記載の構築物。
【請求項５】
少なくとも１つのＬ−またはＤ−ＤＮＡヌクレオチドが、カルボキシル、アミン、アミド、アルジミン、ケタール、アセタール、エステル、エーテル、ジスルフィド、チオールおよびアルデヒド基からなる群から選択される官能基で修飾されている、請求項１から４のいずれかに記載の構築物。
【請求項６】
修飾されたヌクレオチドが、ペプチド、タンパク質、炭水化物、抗体、合成分子、ポリマー、マイクロプロジェクタイル、金属粒子、ナノ粒子、脂質、または固相からなる群から選択される化合物に連結されている、請求項５に記載の構築物。
【請求項７】
プロモーターが、人間、動物または真核生物細胞において作動可能であるプロモーター配列からなる群から選択される、請求項１から６のいずれかに記載の構築物。
【請求項８】
タンパク質、ペプチド、抗体、ホルモン、サイトカインまたは他の生物学的活性物質をコードする、請求項１から７の少なくとも一項に記載の構築物。
【請求項９】
生物学的活性物質が免疫調節物質である、請求項８に記載の構築物。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれかに記載のＤＮＡ構築物を含む医薬組成物。
【請求項１１】
化学療法薬をさらに含む、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
ヒト、動物または真核生物細胞の安定なまたは一過性のトランスフェクションのための、請求項１から９のいずれかに記載のＤＮＡ構築物、または請求項１０もしくは１１に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１３】
生体外遺伝子治療またはＤＮＡワクチン接種のための、請求項１から９のいずれかに記載のＤＮＡ構築物、または請求項１０もしくは１１に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１４】
癌または自己免疫疾患の治療のための、請求項１から９のいずれかに記載のＤＮＡ構築物、または請求項１０もしくは１１に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１５】
非コード免疫調節性ＤＮＡ構築物と併用される、請求項１から９のいずれかに記載のＤＮＡ構築物、または請求項１０もしくは１１に記載の医薬組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、最小限の遺伝子発現構築物（ｍｉｎｉｍａｌｉｓｔｉｃ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）、細胞へのこの導入および分子医学的応用のための遺伝子発現のためのこの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
目的とする細胞に導入することができる遺伝子発現構築物は、ＤＮＡワクチン接種、腫瘍の治療および予防にしばしば使用されている。これらの目的のためのベクター構築物は、トランスフェクションの成功および患者に対する最大の安全性を確保しなければならない。物理的または化学的に細胞にトランスフェクトされる、環状閉鎖ＤＮＡ二本鎖のいわゆるプラスミドベースの構築物は比較的安全である。しかし、目的とする細胞タイプによっては、トランスフェクション効率は通常、満足のいくものではない。したがって、プラスミドは臨床プロトコルには適用できない。さらに、プラスミドは、細胞に共導入される幾つかの原核生物タンパク質（例えば抗生物質耐性遺伝子）を通常含む。原核生物プロモーターは、真核生物細胞において絶対にサイレントであるとは限らず、これが望ましくない免疫効果をもたらす可能性がある。宿主の免疫系もトランスフェクトされた細胞を排除する可能性がある。さらに、プラスミドベクターにおける非メチル化ＣＧモチーフは免疫刺激性となり得、遺伝子治療プロトコルにおいて観察される免疫毒性の少なくとも幾つかの主要因となり得る。
【０００３】
複製欠損レトロウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターは、プラスミドと比べてはるかに高いトランスフェクション効率により臨床プロトコルでしばしば使用されている。しかし、これらは、野生型ウイルスとの組換えまたは発癌遺伝子の活性化の相当なリスクを有する。さらに、高ウイルス価を使用する必要性が炎症の原因になる可能性がある。
【０００４】
したがって、改善された遺伝子発現構築物の開発は、プラスミドおよびウイルスベクターの望ましくない副作用を克服するために不可欠である。ＥＰ  ０  ９４１  ３１８は、最小限の免疫学的に定義された遺伝子発現（ｍｉｎｉｍａｌｉｓｔｉｃ，ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）（ＭＩＤＧＥ）のための小さい線状の共有結合閉鎖ダンベル型新規ベクタータイプを開示している。ＭＩＤＧＥは、最小サイズの遺伝子導入ユニットであり、最小限の必要な配列、すなわち、プロモーター、遺伝子、および２つの短いヘアピンオリゴヌクレオチド配列が隣接するＲＮＡ安定化配列を含む発現カセットのみを含有する。さらに、ＭＩＤＧＥの設計は、目的とする細胞への効果的な輸送のための手段を提供する。
【０００５】
ＭＩＤＧＥ分子は、従来使用されるプラスミドまたはウイルスベクターよりはるかに小さく、したがって細胞への導入がより容易であり、高い発現率を可能にする。該分子は、ヌクレアーゼによる分解に対して発現カセットを保護するために両方の末端に短いヘアピンを含む。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
技術水準に関して、ヌクレアーゼによる分解に対して保護される、真核生物細胞における遺伝子発現のための効果的なＤＮＡ構築物を提供することが本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示によれば、プロモーター配列、コード配列および終結シグナルを含む線状の開鎖されたＤＮＡ二本鎖であり、少なくとも１つのＬ−ＤＮＡヌクレオチドを含む、遺伝子発現のためのＤＮＡ構築物が提供される。少なくとも１つのＬ−ＤＮＡヌクレオチドを含む、線状の部分的に二本鎖のダンベル型ＤＮＡ構築物も、本開示の範囲内である。
【０００８】
少なくとも１つのＬ−ＤＮＡヌクレオチドが５’および／または３’末端に位置するＤＮＡ構築物がさらに提供される。一本鎖ループも、５’および／または３’末端の最後の２〜５つのヌクレオチド内に位置する少なくとも１つのＬ−ＤＮＡヌクレオチドと組み合わせて、５’および／または３’末端に位置することができる。
【０００９】
本開示による構築物は、部分的にまたは完全に二本鎖のＤＮＡ鎖を含むことができる。少なくとも１つのＬ−またはＤ−ＤＮＡヌクレオチドが、カルボキシル、アミン、アミド、アルジミン、ケタール、アセタール、エステル、エーテル、ジスルフィド、チオールおよびアルデヒド基からなる群から選択される官能基で修飾されていることがさらに意図される。
【００１０】
該ヌクレオチドは、ペプチド、タンパク質、炭水化物、脂質、ベシクル、抗体、合成分子、ポリマー、マイクロプロジェクタイル（ｍｉｃｒｏ  ｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ）、金属粒子、ナノ粒子、または固相からなる群から選択される化合物に連結することができる。
【００１１】
本開示による構築物は、人間、動物または真核生物細胞において作動可能であるプロモーター配列からなる群から選択されるプロモーターを含むことが意図される。構築物は、タンパク質、ペプチド、抗体、ホルモン、サイトカイン、あるいは抑制性、制御性、もしくは刺激性ＲＮＡまたは免疫調節物質などの他の生物学的活性物質をコードすることができる。
【００１２】
本開示のさらなる目的は、ヒト、動物または真核生物細胞の安定なまたは一過性のトランスフェクションのための、および遺伝子治療またはＤＮＡワクチン接種のための上記ＤＮＡ構築物の使用である。用語「遺伝子治療」には、生体内または生体外、および自家または同種異系アプローチが含まれる。
本開示のさらなる目的は、感染症または寄生虫に対する予防的または治療的ワクチン接種のための上記ＤＮＡ構築物の使用である。
【００１３】
本開示によるＤＮＡ構築物は、場合により非コード免疫調節性ＤＮＡ構築物の使用と併用して、癌または自己免疫疾患の治療に使用することができる。
【００１４】
上に開示されたＤＮＡ構築物を含む医薬組成物を提供することが、本発明のさらなる目的である。このような医薬品は、化学療法薬をさらに含んでもよい。あるいは、該医薬品は、細菌、真菌、寄生虫、またはウイルス起源の追加の抗原を含有してもよい。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本開示の意味において、線状開鎖ＤＮＡ配列がＤＮＡ構築物として指定される。前記ＤＮＡ配列は、一本鎖または部分的にもしくは完全に二本鎖であってもよい。用語ＤＮＡ構築物、ＤＮＡ分子、および発現構築物は同義的に使用され、対応するＤＮＡ配列の長さの限定を示すものではない。ＤＮＡ構築物の単量体成分はヌクレオチドである。
【００１６】
ＤＮＡ構築物は、合成的に作製されてもよく、または部分的にもしくは完全に生物学的起源であってもよく、生物学的起源には、ＤＮＡ配列の作製の遺伝子ベースの方法が含まれる。
【００１７】
Ｌ−ＤＮＡまたはＬ−立体配座にあるヌクレオチドは、自然発生のＤ−デオキシリボースの代わりに、糖残基としてＬ−デオキシリボースを含むヌクレオチドを指す。Ｌ−デオキシリボースは、Ｄ−デオキシリボースの光学異性体（鏡像）である。Ｌ−立体配座にあるヌクレオチドから部分的にまたは完全に成るＤＮＡ構築物は、部分的にまたは完全に一本鎖または二本鎖であってもよいが、Ｌ−立体配座にあるヌクレオチドは、Ｄ−立体配座にあるヌクレオチドにハイブリダイズすることができない（Ｈａｕｓｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２００６  ３４：５１０１〜１１頁）。Ｌ−ＤＮＡは、Ｄ−ＤＮＡと同様に可溶性であり選択的である。しかし、Ｌ−ＤＮＡは、自然発生の酵素、特にエキソヌクレアーゼによる酵素分解に対して抵抗性であり、そのためＬ−ＤＮＡは生物分解に対して保護される（Ｕｒａｔａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９２  ２０：３３２５〜３２頁）。したがって、Ｌ−ＤＮＡは極めて広く適用可能である。
【００１８】
本開示による「ステム」は、同一ＤＮＡ分子（この後、部分的に自己相補的となる）または異なるＤＮＡ分子（部分的にまたは完全に相補的である）内のどちらかの塩基対合により形成されるＤＮＡ二本鎖と理解されるものとする。分子内（ｉｎｔｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ）塩基対合は、同一ＤＮＡ分子内の塩基対合を指定し、異なるＤＮＡ分子間の塩基対合は、分子間（ｉｎｔｅｒｍｏｌｅｃｕｌａｒ）塩基対合と呼ばれる。
【００１９】
本開示の意味において「ループ」は、ステム構造内またはステム構造の末端のどちらかの、不対合一本鎖領域と理解されるものとする。「ヘアピン」は、ステムおよびループの特徴的な組み合わせであり、同一オリゴヌクレオチドの２つの自己相補的領域がハイブリダイズして不対合ループを有するステムを末端に形成する場合に生じる。
【００２０】
ダンベル型は、ステム領域に隣接する両方の末端にヘアピンを有する線状ＤＮＡ構築物を示す。故に、本開示の関連において「線状ＤＮＡ構築物」は、一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡを含む線状開鎖ＤＮＡ構築物、または二本鎖ＤＮＡステムの両方の末端の一本鎖ループを含む線状ダンベル型ＤＮＡ構築物のどちらかを示す。
【００２１】
ＤＮＡ一本鎖の５’末端または３’末端を意味するかにかかわらず、用語「ＤＮＡ末端」は、末端ヌクレオチドを指すだけでなく、末端の３つのヌクレオチド、またはさらには、それぞれのＤＮＡ末端に関して最後の５つのヌクレオチドも含む。ＤＮＡ末端の修飾は、それぞれのヌクレオチドの少なくとも１つに関する。
【００２２】
ヌクレオチドが、共有結合または非共有結合される「固相」は、カラム、マトリックス、ビーズ、修飾ガラスまたは官能化ガラスを含むガラス、シリコンおよび修飾シリコンを含むシリカまたはシリカベースの材料、プラスチック（ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレンならびにスチレンおよび他の材料のコポリマー、アクリル、ポリブチレン、ポリウレタン等を含む）、ナイロンまたはニトロセルロース、樹脂、多糖類、炭素ならびに無機ガラス、およびプラスチックを指すが、これらに限定されない。故に、マイクロタイタープレートも、本開示による固相の範囲内である。
【００２３】
本開示による免疫調節は、免疫刺激および免疫抑制を指す。免疫刺激は、免疫系のエフェクター細胞が増殖、移動、分化するまたはいずれか他の形態で活性になるように刺激されることを優先的に意味する。例えば、通常はヘルパーＴ細胞からの共刺激シグナルを必要とするＢ細胞増殖は、免疫刺激性ＤＮＡ分子により共刺激シグナルなしで誘導され得る。
【００２４】
一方、免疫抑制は、免疫系の活性化または有効性の減少と理解されるものとする。免疫抑制は一般に、例えば移植された臓器の拒絶を予防するため、骨髄移植後の移植片対宿主病を治療するため、または例えば、関節リウマチもしくはクローン病などの自己免疫疾患の治療のために意図的に誘導される。
【００２５】
この関連において、免疫調節はまた、まだ発達中または成熟中の免疫反応に影響を与えること、または確立された免疫反応の特徴を調節することによる、免疫反応の性質または特徴の影響も指す。
【００２６】
本開示において使用される用語「ワクチン接種」は、疾患に対する免疫を生じさせるための抗原物質（ワクチン）の投与を指す。ワクチンは、ウイルス、真菌、寄生原虫、細菌などの多くの病原体による感染の影響を予防または改善することができるが、アレルギー性疾患および喘息、ならびに腫瘍の影響も予防または改善することができる。ワクチンは、典型的には、免疫応答をブーストするのに使用される１つまたは複数のアジュバント、例えば免疫刺激性核酸を含有する。ワクチン接種は、感染症および他の疾患を予防する最も有効なおよび最も費用効果の高い方法であると一般に考えられている。
【００２７】
投与される物質、例えば、病原体（例えば、真菌、細菌またはウイルス）の生きているが弱毒化された形態、これらの病原体の死滅または不活化形態、精製物質（抗原をコードするタンパク質、核酸など）、または腫瘍細胞もしくは樹状細胞などの細胞であってもよい。特に、ＤＮＡワクチン接種は最近開発された。ＤＮＡワクチン接種は、抗原をコードするＤＮＡの、ヒトまたは動物細胞への挿入（および発現、免疫系認識の誘発）により効き目がある。発現されたタンパク質を認識する免疫系の幾つかの細胞は、これらのタンパク質および該タンパク質を発現する細胞に対する攻撃を開始する。ＤＮＡワクチンの１つの利点は、これらが極めて製造および貯蔵しやすいことである。さらに、ＤＮＡワクチンは、より広範囲の免疫応答型を誘導する能力を含む、従来のワクチンに対する幾つかの利点を有する。
【００２８】
ワクチン接種は、抗原に曝露した際、ワクチン接種された健康な個体において抗原に対する免疫をもたらす、予防的アプローチとして使用することができる。あるいは、治療的ワクチン接種は、個体の免疫系を抗原に導くことにより、ワクチン接種された罹患個体の免疫系の応答の改善をもたらすことができる。予防的および治療的ワクチン接種は両方とも、ヒトおよび動物に適用することができる。
【００２９】
本開示において使用される用語「遺伝子治療」は、腫瘍または自己免疫疾患などの疾患を治療するための、個体の細胞および／または生物組織の一過的または永続的な遺伝的修飾（例えば遺伝子の挿入、変更、または除去）を指す。遺伝子治療の最も一般的な形態は、変異遺伝子を置換するための不特定な遺伝子位置への機能遺伝子の挿入を伴うが、他の形態は、変異の直接的修正、またはウイルス感染を可能にする正常遺伝子の修飾、またはさらには遺伝子もしくは遺伝子断片の、転写のための細胞への移入を伴う。
【００３０】
「自家遺伝子治療（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ）」は、同一個体の組織または細胞の使用を指す。単離された細胞または組織は、遺伝子治療により修飾され、ドナーに再導入される。対照的に、「同種異系遺伝子治療（ａｌｌｏｇｅｎｉｃ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ）」は、受け入れ側（ａｃｃｅｐｔｏｒ）個体以外の個体由来の遺伝子治療用細胞の使用を指す。遺伝的修飾後、同種異系細胞は受け入れ側に導入される。
【００３１】
用語「生体外遺伝子治療」は、個体由来の細胞、例えば造血幹細胞または造血前駆細胞が、生体外で遺伝子修飾され、この後、治療される個体に導入される治療アプローチを指す。用語「生体内遺伝子治療」は、個体由来の細胞、例えば造血幹細胞または造血前駆細胞が、例えばウイルスベクターまたは他の発現構築物を用いて、生体内で遺伝子修飾される治療アプローチを指す。
【００３２】
遺伝子治療はまた、「生殖細胞系遺伝子治療」および「体細胞系遺伝子治療」に分類することもできる。「生殖細胞系遺伝子治療」の場合、生殖細胞、すなわち、精子または卵子が遺伝子修飾される。遺伝子変化は通常、それらのゲノムに組み込まれる。したがって、治療による変化は遺伝性となり、後の世代に受け継がれることになる。このアプローチは、遺伝的障害および遺伝性疾患の治療に有用である。「体細胞系遺伝子治療」の場合、治療的遺伝子は個体の体細胞系細胞に移入される。いずれの修飾および影響も個体のみに限定され、個体の子孫または後の世代に受け継がれない。
【００３３】
用語「癌」は、癌性疾患、または乳癌、黒色腫、皮膚新生物、胃腸腫瘍（結腸癌（ｃｏｌｏｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、胃癌、膵臓癌、結腸癌（ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ）、小腸癌を含む）、卵巣癌、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌、腎細胞癌および／もしくは肝転移を含む群から選択される治療または予防される腫瘍を含む。
【００３４】
本開示による自己免疫疾患は、関節リウマチ、クローン病、全身性ループス（ＳＬＥ）、自己免疫性甲状腺炎、橋本甲状腺炎、多発性硬化、バセドウ病、重症筋無力症、セリアック病およびアジソン病を含む。
【００３５】
本発明による感染症は、ＨＩＶ、肝炎、インフルエンザ、リーシュマニア症、細菌性肺炎、結核、麻疹、百日咳、破傷風、髄膜炎、梅毒、マラリアおよびコレラなどの細菌、ウイルス、真菌、または真核生物寄生虫による感染、ならびにネコ免疫不全ウイルス感染（ＦＩＶ）、ネコ白血病ウイルス感染（ＦｅＬＶ）、ウシヘルペスウイルス感染（ＢＨＶ）、およびウシウイルス性下痢などの動物特異的疾患を含む。
【００３６】
最小遺伝子発現ユニットを含む、Ｌ−ＤＮＡを含むデオキシリボ核酸構築物は、ヌクレアーゼにより分解されない遺伝子発現構築物をもたらす。実験データは、このような保護された遺伝子発現構築物が、目的とする細胞における効果的な遺伝子導入および発現に適切であることを示している。
【００３７】
本開示による構築物のトランスフェクションにより達成され得る遺伝子発現率は、ＥＰ  ０９４１３１８に開示された共有結合閉鎖分子（ＭＩＤＧＥベクター）により達成され得る率より高い。ＭＩＤＧＥベクターは、同等のプラスミドベクター（Ｓｃｈａｋｏｗｓｋｉら、ｉｎ  ｖｉｖｏ、２１：１７〜２４頁、２００７）より高いトランスフェクション効率および良好な発現率を達成することが示されている。ＥＰ  ０９４１３１８の一本鎖ループを避けることにより、本発明の分子はサイズがさらに減少され、これが遺伝子導入を促進する。Ｌ−ＤＮＡ修飾により、安定性が与えられる。事実、生成プロセス中に非修飾ＤＮＡを除去するためのＤＮＡ分解酵素の使用は、この安定性を際立たせる。少なくとも１つのヘアピンが二本鎖の一方の末端に配置されている、Ｌ−ＤＮＡを含むＤＮＡ構築物を提供することも、本開示の範囲内であることは留意されなければならない。
【００３８】
本開示によるＤＮＡ構築物は、目的とする細胞におけるコードされた遺伝子の人工的遺伝子発現に使用されてもよい。これに関して、ＤＮＡワクチン接種、腫瘍の治療および予防は、臨床プロトコルでの使用を可能にするために安全および効率的である発現構築物を必要とする。標準的発現構築物は、例えば、プラスミドベースのベクターである。しかし、これらのベクターは２つの欠点を有する。第一に、効率がやや低く、第二に、プラスミドベースのベクターは、所望のポリペプチドの発現に不必要な幾つかの遺伝子および遺伝的エレメントを含み、これにより予測不可能な免疫学的副作用の危険性を保有する。より長いおよび反復される適用により、所望の免疫応答は、起こり得る重篤な合併症によるこれらの副作用により覆い隠される可能性がある。
【００３９】
技術水準の他の発現構築物には、複製欠損レトロウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターが含まれる。これらは、多種多様な細胞タイプの非分裂細胞でさえ形質導入に使用することができるという点で極めて効率的であるが、野生型ウイルスとの組換えおよびこれによる新たな病原性ウイルスの生成、ならびに発癌遺伝子の活性化のリスクを有する。さらに、ウイルスタンパク質は、特に高力価では免疫学的副作用の原因になる可能性が極めて高い。
【００４０】
本開示による発現構築物の最小発現ユニットは、ＭＨＣ−ＩもしくはＭＨＣ−ＩＩ提示可能ペプチド、サイトカイン、または細胞周期の制御の成分、または制御性ＲＮＡ分子およびアンチセンスＲＮＡ、リボザイムまたはｍＲＮＡ編集ＲＮＡ分子をコードし得るが、これらに限定されない。さらに、本開示によるＤＮＡ構築物は、例えばペプチド、タンパク質、炭水化物、脂質、または糖ペプチドリガンドのほか、マイクロプロジェクタイル（弾道導入により細胞、特に真皮、筋肉組織、膵臓、および肝臓への構築物の導入を可能にする）への構築物の吸着または共有結合もしくはイオン結合を可能にする。
本開示は、開示された実施形態に限定されることなく例および図により以下にさらに例証される。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】本開示によるＤＮＡ構築物の略図である。
【図２】酵素消化後のＤＮＡ構築物のアガロースゲル電気泳動を示す図である。
【図３】Ｌ−ＤＮＡ構築物２Ｌ−Ｍのエレクトロポレーションを用いたトランスフェクション効率を示す図である。
【図４】Ｌ−ＤＮＡ構築物２Ｌ−Ｍのリポフェクションを用いたトランスフェクション効率を示す図である。
【図５】Ｌ−およびＤ−ＤＮＡ発現構築物を比較する蛍光強度を示す図である。
【図６】Ｌ−ＤＮＡ構築物ＤＬ−ＭおよびＬＤ−ＭならびにＭＩＤＧＥベクターのエレクトロポレーションを用いたトランスフェクション効率の比較を示す図である。
【図７】Ｂ型肝炎表面抗原の小タンパク質をコードするＭＩＤＧＥまたはＬ−ＭＩＤＧＥによるマウスの免疫化を示す図である。
【００４２】
図面の詳細な説明
図１は、本開示によるＤＮＡ構築物（２Ｌ−Ｍ）の略図を示す。表１に示されているように、末端オリゴヌクレオチドはＬ−立体配座でのヌクレオチドを含み、これは、二本鎖構築物の末端の図１のグレーの四角により示されている。故に、ＤＮＡ構築物全体が、エキソヌクレアーゼによる分解に対して保護される。図１に描かれた構築物は、分解に対して保護されるための一方または両方の末端におけるヘアピンループを有さずまたは必要としない。
【００４３】
図２は、Ｔ７バクテリオファージ由来のＴ７ポリメラーゼによる消化に供されるＤＮＡ構築物のアガロースゲルを示す。６μｇの各ＤＮＡ構築物は、１０単位のＴ７ポリメラーゼと共に合計反応容量２０μｌでインキュベートされた。０、１、５、３０、６０、および１５００分後、インキュベーション混合物のアリコート３μｌが試料から除去され、ホルムアミド含有サンガー色素５μｌで希釈された。全てのアリコートは３％アガロースゲルに添加され、これが１００ボルトで１００分間流された。
【００４４】
レーン１は、ＥＰ  ０  ９４１  ３１８によるＭＩＤＧＥベクターを示す。レーン２は、ＥＰ  ０  ９４１  ３１８によるＭＩＤＧＥベクターの製造に使用された非保護発現カセットを示す。レーン３は、両方の末端がＬ−ＤＮＡにより保護されている、本発明によるＤＮＡ構築物（この後「２Ｌ−Ｍ」と称される）を示す。レーン４および５は、一方の末端がＬ−ＤＮＡにより保護され、および他方がヘアピンにより保護されている、本発明による代替のＤＮＡ構築物を示す。レーン４におけるＤＮＡ構築物は、プロモーターの５’末端にＬ−ＤＮＡ保護末端を、３’末端にヘアピンを含有する一方、レーン５の構築物は、プロモーターからの３’末端でＬ−ＤＮＡにより、５’末端でヘアピンによりそれぞれ保護される。これらの構築物は、「ＤＬ−Ｍ」および「ＬＤ−Ｍ」と称される（詳しくは実施例の項参照）。
【００４５】
図３は、ＥＰ  ０  ９４１  ３１８に開示されているＭＩＤＧＥ（Ｍ）と比較した、本開示による２Ｌ−Ｍ  Ｌ−ＤＮＡを含む発現構築物（２Ｌ−Ｍ）のエレクトロポレーションを用いたトランスフェクション有効性を示す（両方ともｅＧＦＰをコードする）。陰性対照としてサケ精子を用いた実験結果が右側に示されている。左の黒いバーは生細胞の数を表し、グレーの真ん中のバーはトランスフェクトされた細胞の数を示し、白い右のバーは死滅細胞の数を示す。黒いラインは、エレクトロポレーション後の細胞の合計数を示す。
【００４６】
新規２Ｌ−Ｍ  Ｌ−ＤＮＡを含む構築物のトランスフェクション効率は、ダンベル型ＭＩＤＧＥ構築物を用いるより約３分の１高い。上述の通り、ＭＩＤＧＥベクターは、同等のプラスミド構築物（Ｓｃｈａｋｏｗｓｋｉら、ｉｎ  ｖｉｖｏ、２１：１７〜２４頁、２００７）より高いトランスフェクション有効性を有することが示されている。
【００４７】
結果は、本開示による発現構築物が遺伝子発現に適していることを示すだけでなく、驚くべきことに、該構築物が他の発現構築物と比較して予想外に高い効率を有することも示している。開示された発現構築物は、相当量の遺伝子発現を引き起こすほど明らかに安定であり、一方、細胞への該構築物の取り込みまたは導入は、エレクトロポレーションおよびリポフェクションを用いた場合のいずれも、極めてうまくいくと考えられる。
【００４８】
図３に示された結果が、エレクトロポレーションに関連するかどうかを確認するために、ＥＰ  ０  ９４１  ３１８に開示されているＭＩＤＧＥおよびＬ−ＤＮＡを含むＤＮＡ構築物２Ｌ−Ｍの等モル量が、リポフェクションにより細胞に導入された（図４）。サケ精子が陰性対照として使用された。各白いバーは生細胞の数を示し、グレーのバーはトランスフェクトされた細胞の数を示し、および黒いバーは死滅細胞の数を示す。
【００４９】
リポフェクションのための１．５μｇ  ＤＮＡの使用は、本開示による２Ｌ−Ｍ  Ｌ−ＤＮＡ構築物に対しより高い数のトランスフェクトされた細胞をもたらす。０．５μｇ  ＤＮＡを用いたトランスフェクトされた細胞の数は、Ｌ−ＤＮＡ構築物を用いた場合、より低いが、蛍光の強度はＬ−ＤＮＡ構築物でより高い。
【００５０】
図５は、トランスフェクションに使用されたＤＮＡの量（質量）と個々の細胞において誘発された平均蛍光強度の間の関係を示す。実線は本発明による２Ｌ−Ｍ構築物を表し、点線はＥＰ  ０  ９４１  ３１８に開示されているＭＩＤＧＥを用いた結果を示す。
【００５１】
等しい光強度を受け取るには、開示された２Ｌ−Ｍ構築物と比べて、ダンベル型ＤＮＡ構築物の約３０％多いＤＮＡ（質量）が適用されなければならない。その結果として、本開示によるＤＮＡ構築物の効率は、ダンベル型構築物を用いるより驚くほど高い。
【００５２】
図６は、ＭＩＤＧＥベクターを用いた、エレクトロポレーションを介してｅＧＦＰで修飾されたＣＨＯ−Ｋ１細胞、構築物ＬＤ−Ｍ、およびＤＬ−Ｍ、ならびに対照としてのサケ精子から得られた蛍光を比較している。驚くべきことに、使用された全ての濃度で、ＤＬ−ＭおよびＬＤ−Ｍ構築物は両方とも、ＭＩＤＧＥベクターと比べて細胞からのより高い蛍光シグナルを引き起こした。故に、１つのＬ−ＤＮＡ修飾末端および１つのＤ−ＤＮＡヘアピンを含有するＬ−ＤＮＡ構築物は、驚くべきことに、ＭＩＤＧＥベクターと比べて増加したトランスフェクション効率を示した。明らかに、これらの構築物は、細胞により極めてよく取り込まれ、安定なおよび効率的な発現を可能にし、ベクターによる改善された性能をもたらす。
【００５３】
動物モデルにおける開示された発現構築物の有効性をテストするため、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）の小タンパク質をコードするＤＮＡ配列が使用された。ＭＩＤＧＥおよびＬ−ＭＩＤＧＥで免疫されたマウスの群間の有意差を示す線形表示（ＩｇＧ２ａの場合、ｐ＝０．０３３）が、図７に描かれている。発現構築物としてのＬ−ＭＩＤＧＥの使用は、ＭＩＤＧＥの使用より高いＩｇＧ抗体濃度をもたらした。
【００５４】
本開示は、ヌクレアーゼによる分解に対して保護され、および細胞へのトランスフェクション後の効率的な遺伝子発現に適した、遺伝子発現のための線状構築物を提供する。本開示による発現構築物のトランスフェクションから得られる遺伝子産物が、特異的抗体を誘導していることを示すことが可能であった。故に、開示された発現構築物は、真核生物細胞における効率的な遺伝子発現に適していることが証明された。
【実施例】
【００５５】
ＤＮＡ構築物の製造
本開示によるＤＮＡ構築物の製造は、ＥＰ  ０  ９４１  ３１８のものと似ている。しかし、ヘアピンオリゴヌクレオチドは、表１に要約されたいわゆる「Ｌ−アダプター」に置き換えられる。両方のアダプターは、それぞれ、個々のキメラＤＮＡ分子、配列番号１および配列番号２（Ｌ−アダプター１）または配列番号３および配列番号４（Ｌ−アダプター２）から成った（表１）。アダプターは、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣ１２、１０ｍＭ  ＤＴＴ、０．５ｍＭ  ＡＴＰ（２５℃でｐＨ７．８）において、９０℃から２５℃に徐々に低下する温度で、４０分間、０．２８ｍｇ／ｍｌで等モル濃度の表１による一本鎖ＤＮＡ分子をハイブリダイゼーションして生成した。ＥＰ  ０  ９４１  ３１８において合成された発現カセットに両方のアダプターをライゲーションした後、続いてＴ７ポリメラーゼによる線状Ｄ−ＤＮＡの除去、および生成物の最終ＨＰＬＣ精製を実施した。この構築物は「２Ｌ−Ｍ」と称される。
【００５６】
あるいは、Ｌ−アダプターの１つを、ＥＰ  ０  ９４１  ３１８に記載されているＭＩＤＧＥベクターにおいて使用された対応するヘアピンに置き換えた。これは、プロモーターの片側にＬ−ＤＮＡ保護、および反対側にヘアピンを有するＤＮＡ構築物をもたらした。これらの構築物は、それぞれ、「ＤＬ−Ｍ」（Ｌ−アダプター１およびヘアピン）および「ＬＤ−Ｍ」（Ｌ−アダプター２およびヘアピン）と称される。
【００５７】
【表１】
2018007669.tif 000003
【００５８】
トランスフェクション
ＤＮＡ構築物を細胞に導入するために、異なるトランスフェクション方法、例えばリポフェクションまたはエレクトロポレーションを使用することができる。リポフェクションは次のように行った：６×１０４ＣＨＯ−Ｋ１細胞を３．８ｃｍ２組織培養マトリックスに播種し、２４時間後にｅＧＦＰ発現ＤＮＡの指示量を、Ｆｕｇｅｎｅ  ＨＤ（Ｒｏｃｈｅ社）と１：４を混合してトランスフェクトし、製造者により勧められたように処理した。トランスフェクション１日後、細胞をトリプシン処理により回収し、フローサイトメトリーにより蛍光について分析した（１０．０００イベントをカウント）。
【００５９】
エレクトロポレーション
エレクトロポレーションは次のように行った：２×１０６ＣＨＯ−Ｋ１細胞を５００μｌ増殖培地に再懸濁し、ｅＧＦＰ発現ＤＮＡの指示量プラス１１μｇサケ精子と混合し、１６５０μＦ、２７０  Ｖでパルスした。この後、細胞を９．５ｃｍ２組織培養マトリックスに播種し、培養した。トランスフェクション１日後、細胞をトリプシン処理により回収し、フローサイトメトリーにより蛍光について分析した（１０，０００イベントをカウント）。
【００６０】
マウスの免疫化
ＨＢｓＡｇコード配列は、強力なウイルスＰＣＭＶプロモーターの制御下に置いた。ＨＢｓＡｇをコードするＬ−ＭＩＤＧＥベクターはＯＤＮ  ＣＫｍ３６２〜３６５を用いて生成し（表１と比較されたい）、ＨＢｓＡｇをコードするＭＩＤＧＥベクターはＥＰ  ０  ９４１  ３１８に従って生成した。Ｂａｌｂ／ｃマウス（１群あたり６匹）を、３週間間隔で２回、１０μｇ／２５μｌ  Ｌ−ＭＩＤＧＥ−ＨＢｓＡｇベクター（８．１４ｐｍｏｌ）または１０μｇ／２５μｌ  ＭＩＤＧＥ−ＨＢｓＡｇベクター（８．１７９ｐｍｏｌ）で皮内免疫した。２回目の免疫２週間後、血清を得、ならびにＨＢｓＡｇ被覆ＥＬＩＳＡプレート（Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ社；Ｅｎｚｙｇｎｏｓｔ  Ａｎｔｉ−ＨＢｓ  ＩＩ；カタログ番号ＯＱＮＥ１７またはＯＱＮＥ１１）、二次抗体としてのラット抗マウスＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ（ＢＤ社；カタログ番号５５９６２６および５５３３９１）、標準としてのマウス抗ＨＢｓＡｇ  ＩｇＧ２ａ（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔｓ社、カタログ番号ＭＡ１−１９２６４）および標準としてのマウス抗ＨＢｓＡｇ  ＩｇＧ１（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔｓ社、カタログ番号ＭＡ１−１９２６３）を用いて、ＨＢｓＡｇ特異的ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ抗体についてＥＬＩＳＡを介して分析した。
【図１】
2018007669.tif 000004
【図２】
2018007669.tif 000005
【図３】
2018007669.tif 000006
【図４】
2018007669.tif 000007
【図５】
2018007669.tif 000008
【図６】
2018007669.tif 000009
【図７】
2018007669.tif 000010
【手続補正書】
【提出日】平成29年8月8日(2017.8.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロモーター配列、コード配列および終結シグナルを含む線状の開鎖されたＤＮＡ二本鎖であり、５’および／または３’末端の最後の５つのヌクレオチド内のみにおいて少なくとも１つのＬ−ＤＮＡヌクレオチドを含む、遺伝子発現のためのＤＮＡ構築物。
【請求項２】
ＤＮＡ構築物の少なくとも１つの末端が一本鎖ループを含む、請求項１に記載の構築物。
【請求項３】
部分的にまたは完全に二本鎖である、請求項１または２に記載の構築物。
【請求項４】
少なくとも１つのＬ−またはＤ−ＤＮＡヌクレオチドが、カルボキシル、アミン、アミド、アルジミン、ケタール、アセタール、エステル、エーテル、ジスルフィド、チオールおよびアルデヒド基からなる群から選択される官能基で修飾されている、請求項１から３のいずれかに記載の構築物。
【請求項５】
修飾されたヌクレオチドが、ペプチド、タンパク質、炭水化物、抗体、合成分子、ポリマー、マイクロプロジェクタイル、金属粒子、ナノ粒子、脂質、または固相からなる群から選択される化合物に連結されている、請求項４に記載の構築物。
【請求項６】
プロモーターが、人間、動物または真核生物細胞において作動可能であるプロモーター配列からなる群から選択される、請求項１から５のいずれかに記載の構築物。
【請求項７】
タンパク質、ペプチド、抗体、ホルモン、サイトカインまたは他の生物学的活性物質をコードする、請求項１から６の少なくとも一項に記載の構築物。
【請求項８】
生物学的活性物質が免疫調節物質である、請求項７に記載の構築物。
【請求項９】
請求項１から８のいずれかに記載のＤＮＡ構築物を含む医薬組成物。
【請求項１０】
化学療法薬をさらに含む、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
ヒト、動物または真核生物細胞の安定なまたは一過性のトランスフェクションのための、請求項１から８のいずれかに記載のＤＮＡ構築物、または請求項９もしくは１０に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１２】
生体外遺伝子治療またはＤＮＡワクチン接種のための、請求項１から８のいずれかに記載のＤＮＡ構築物、または請求項９もしくは１０に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１３】
癌または自己免疫疾患の治療のための、請求項１から８のいずれかに記載のＤＮＡ構築物、または請求項９もしくは１０に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１４】
非コード免疫調節性ＤＮＡ構築物と併用される、請求項１から８のいずれかに記載のＤＮＡ構築物、または請求項９もしくは１０に記載の医薬組成物の使用。
【外国語明細書】
2018007669.tif 000011
2018007669.tif 000012
2018007669.tif 000013
2018007669.tif 000014
2018007669.tif 000015
2018007669.tif 000016
2018007669.tif 000017
2018007669.tif 000018
2018007669.tif 000019
2018007669.tif 000020
2018007669.tif 000021
2018007669.tif 000022
2018007669.tif 000023
2018007669.tif 000024
2018007669.tif 000025
2018007669.tif 000026
2018007669.tif 000027
2018007669.tif 000028
2018007669.tif 000029
2018007669.tif 000030
2018007669.tif 000031
2018007669.tif 000032
2018007669.tif 000033
2018007669.tif 000034
【配列表】
2018007669000001.app