(57)【要約】      （修正有）【課題】半減期延長ドメインを含まない結合分子と比較して延長された血清半減期を示す半減期延長ドメインを含む結合分子の提供。【解決手段】少なくとも1つのポリペプチド鎖中に含まれる少なくとも3つの結合ドメインを含む結合分子であって、（a）第1のドメインが、標的細胞上の細胞表面分子に結合することができる結合ドメインであり、（b）第2のドメインが、T細胞CD3受容体複合体に結合することができる結合ドメインであり、かつ、（c）第3のドメインが、血清アルブミンに結合することができる結合ドメインであり、該第3のドメインが、第2のドメインのC末端に位置する、結合分子。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも1つのポリペプチド鎖中に含まれる少なくとも3つの結合ドメインを含む結合分子であって、
（a）第1のドメインが、標的細胞上の細胞表面分子に結合することができる結合ドメインであり、
（b）第2のドメインが、T細胞CD3受容体複合体に結合することができる結合ドメインであり、かつ
（c）第3のドメインが、血清アルブミンに結合することができる結合ドメインであり、該第3のドメインが、第2のドメインのC末端に位置する、
結合分子。
【請求項２】
前記3つのドメインが、N末端からC末端に向かって、
・第1の結合ドメイン、
・第2の結合ドメイン、および
・第3の結合ドメイン、
の順で、1つのポリペプチド上に存在する、請求項1記載の結合分子。
【請求項３】
前記結合分子の第3の結合が、scFvまたは単一ドメイン抗体である、請求項1または2記載の結合分子。
【請求項４】
（a）第1の結合ドメインが、ヒトおよび非ヒト霊長類の細胞上の細胞表面分子に結合することができ、
（b）第2の結合ドメインが、ヒトおよび非ヒト霊長類の細胞上のT細胞CD3受容体複合体に結合することができ、かつ
（c）第3の結合ドメインが、ヒトおよび非ヒト霊長類の血清アルブミンに結合することができる、
請求項1〜3のいずれか一項記載の結合分子。
【請求項５】
血清アルブミンに結合することができる第3の結合ドメインが、コンビナトリアルライブラリまたは抗体結合ドメインに由来する、請求項1〜4のいずれか一項記載の結合分子。
【請求項６】
第3の結合ドメインが、10〜25アミノ酸残基を含む、請求項1〜5のいずれか一項記載の結合分子。
【請求項７】
血清アルブミンに結合することができる第3の結合ドメインが、アミノ酸配列Asp-Xaa-Cys-Leu-Pro-Xaa-Trp-Gly-Cys-Leu-Trpを含み、Xaaが任意のアミノ酸である、請求項1〜6のいずれか一項記載の結合分子。
【請求項８】
血清アルブミンに結合することができる第3の結合ドメインが、単一ドメイン抗体のCDRに由来する、請求項1〜6のいずれか一項記載の結合分子。
【請求項９】
第3の結合ドメインが、≦500nMの親和性（KD）で血清アルブミンに結合する、請求項1〜8のいずれか一項記載の結合分子。
【請求項１０】
10％ヒト血清アルブミン存在下でのエフェクター細胞による標的細胞の溶解を測定するインビトロアッセイにおいて細胞毒性活性を示す、請求項1〜9のいずれか一項記載の結合分子。
【請求項１１】
単一ポリペプチド鎖からなる、請求項1〜10のいずれか一項記載の結合分子。
【請求項１２】
（a）第1の結合ドメインが、抗体由来のVLおよびVH鎖を含み、かつ／または
（b）第2の結合ドメインが、抗体由来のVLおよびVH鎖を含む、
請求項1〜11のいずれか一項記載の結合分子。
【請求項１３】
1つまたは複数のさらなる異種ポリペプチドを含む、請求項1〜12のいずれか一項記載の結合分子。
【請求項１４】
細胞表面分子に結合することができる第1の結合ドメインが、腫瘍抗原に結合する、請求項1〜13のいずれか一項記載の結合分子。
【請求項１５】
T細胞CD3受容体複合体に結合することができる第2の結合ドメインが、ヒトおよびコモンマーモセット（Callithrix jacchus）、ワタボウシタマリン（Saguinus oedipus）またはコモンリスザル（Saimiri sciureus）のCD3ε鎖のエピトープに結合することができ、該エピトープが、SEQ ID NO:2、4、6または8からなる群に含まれるアミノ酸配列の一部でありかつ少なくともアミノ酸配列Gln-Asp-Gly-Asn-Gluを含む、請求項1〜14のいずれか一項記載の結合分子。
【請求項１６】
SEQ ID NO:51、52、54、55、57、58、60、61、75、76、81、82、85、86、90、91、85、96、100または101に示されるアミノ酸配列によって特徴づけられる、請求項1〜7のいずれか一項記載の結合分子。
【請求項１７】
請求項1〜16のいずれか一項において定義される結合分子をコードする、核酸配列。
【請求項１８】
請求項17において定義される核酸配列を含む、ベクター。
【請求項１９】
請求項17において定義される核酸配列または請求項18において定義されるベクターで形質転換またはトランスフェクトされた、宿主細胞。
【請求項２０】
請求項1〜16のいずれか一項記載の結合分子の産生方法であって、請求項1〜16のいずれか一項において定義された結合分子の発現を可能にする条件下で請求項19において定義された宿主細胞を培養する工程、および、産生された結合分子を培養物から回収する工程を含む、方法。
【請求項２１】
請求項1〜16のいずれか一項記載の結合分子または請求項20記載の方法にしたがい産生された結合分子を含む、薬学的組成物。
【請求項２２】
増殖性疾患、炎症性疾患、感染症、および自己免疫疾患からなる群より選択される疾患の予防、処置または改善に使用するための、請求項1〜16のいずれか一項記載の結合分子または請求項20記載の方法にしたがい産生された結合分子。
【請求項２３】
増殖性疾患、炎症性疾患、感染症、および自己免疫疾患からなる群より選択される疾患の処置または改善のための方法であって、それを必要とする対象に、請求項1〜16のいずれか一項記載の結合分子または請求項20記載の方法にしたがい産生された結合分子を投与する工程を含む、方法。
【請求項２４】
請求項1〜16のいずれか一項において定義された結合分子、請求項17において定義された核酸分子、請求項18において定義されたベクター、または請求項20において定義された宿主細胞を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連特許出願の相互参照
本願は、2012年3月1日に出願された「Long life polypeptide binding molecules」を表題とする米国仮出願61/605,681および2012年3月2日に出願された「Long life polypeptide binding molecules」を表題とする米国仮出願61/606,268に関連する。これらの関連出願は、その全体が参照により組み入れられる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、第1の結合ドメインが標的細胞上の細胞表面分子に結合することができる結合ドメインであり、第2の結合ドメインがT細胞CD3受容体複合体に結合することができる結合ドメインであり、第3のドメインが血清アルブミンに結合することができる結合ドメインであり、該第3のドメインが第2のドメインのC末端に位置する、少なくとも1つのポリペプチド鎖中に含まれる少なくとも3つのドメインを含む結合分子に関する。さらに、本発明は、該結合分子をコードする核酸配列、該核酸配列を含むベクターおよび該ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。さらに、本発明は、本発明の結合分子の産生のための方法、該結合分子の医学的使用、および該結合分子を含むキットを提供する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
半減期の延長は、一般に、免疫グロブリン、特に抗体、その中でも特に小サイズの抗体フラグメントのインビボ適用において有用である。そのようなフラグメント（Fv、ジスルフィド結合型Fv、Fab、scFv、dAb）は、体内からの迅速なクリアランスが問題となることが多く；それゆえ、それらは体内のほとんどの部分に迅速に到達することができ、かつ素早く産生され取り扱いが容易であるにもかかわらず、それらのインビボ適用はインビボでのそれらの持久力の弱さによって制限され得る。
【０００４】
二重特異性分子、例えばBiTE（Bispecific T-cell engager；二重特異性T細胞エンゲージャー）抗体は、2つの単鎖抗体（scFv）を可動性を持たせて連結することによって作製された組み換えタンパク質コンストラクトである。BiTE抗体の一方のscFvは、標的細胞上の選択された腫瘍関連表面抗原に特異的であり；第2のscFvは、T細胞上のT細胞受容体複合体のサブユニットであるCD3に特異的である。それらの独自の設計および2価性の結合により、BiTE抗体は、T細胞を標的細胞に一過的に結合させ、同時に、T細胞の生来の細胞溶解能を標的細胞に対して強く活性化させるのに特に適している。BiTE分子は、これはBiTEと多くの他の抗体形式が共有している特徴であるが、短い半減期をもたらすであろう腎臓カットオフ未満の分子量を有する小さなタンパク質である。実際、小さい結合分子を有することは、一方では、例えばそれが体内の指定された場所に迅速に到達することができかつまた体内のほとんどの部分に到達することができるために、望ましいことであるが、そのような結合分子の「サイズ」は、特に腎臓クリアランスに関して好ましいものではない。そのような結合分子は、例えばアミノ酸交換によって事前に安定化させていない限り、いわば十分な自然保護力がないため、迅速に分解される。したがって、それは、小さいサイズと安定性／腎臓クリアランスの間のバランスの問題である。
【０００５】
したがって、その安定性が改善されかつ／またはその腎臓クリアランスが遅く、それゆえ全体的な血清半減期が延長されているが、それでもなお有利に小さいままであって、良い収量で製造できかつ／または取り扱いの利便性が高い、結合分子、特に二重特異性結合分子を実現することが望ましい。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、半減期延長ドメインを含まない結合分子と比較して延長された血清半減期を示す半減期延長ドメインを含む結合分子の形態の手段および方法を提供することによって、この問題を解決する。
【０００７】
したがって、第1の局面において、本発明は、少なくとも1つの、好ましくは1つのポリペプチド鎖中に含まれる少なくとも3つの連続する結合ドメインを含む結合分子であって、
（a）第1の結合ドメインが、標的細胞上の細胞表面分子に結合することができるドメインであり、
（b）第2の結合ドメインが、T細胞CD3受容体複合体に結合することができるドメインであり、かつ
（c）第3の結合ドメインが、血清アルブミンに結合することができるドメインであり、第3のドメインが第2のドメインのC末端に位置する、
結合分子、を提供する。
【０００８】
本発明の結合分子の1つの態様において、3つのドメインは、N末端からC末端に向かって、
・第1の結合ドメイン、
・第2の結合ドメイン、および
・第3の結合ドメイン、
の順で、1つのポリペプチド上に存在する。
【０００９】
本発明の1つの態様において、結合分子の第3の結合は、scFvまたは単一ドメイン抗体である。
【００１０】
1つの態様において、本発明の結合分子は、
（a）第1の結合ドメインが、ヒトおよび非ヒト霊長類の細胞上の細胞表面分子に結合することができ、
（b）第2の結合ドメインが、ヒトおよび非ヒト霊長類の細胞上のT細胞CD3受容体複合体に結合することができ、かつ
（c）第3の結合ドメインが、ヒトおよび非ヒト霊長類の血清アルブミンに結合することができる、
結合分子である。
【００１１】
本発明の1つの態様において、結合分子は、血清アルブミンに結合することができる第3の結合ドメインがコンビナトリアルライブラリまたは抗体結合ドメインに由来する点で特徴づけられる。
【００１２】
本発明の1つの態様において、結合分子は、第3の結合ドメインが10〜25アミノ酸残基を含む点で特徴づけられる。
【００１３】
本発明の1つの態様において、結合分子は、血清アルブミンに結合することができる第3の結合ドメインがアミノ酸配列Asp-Xaa-Cys-Leu-Pro-Xaa-Trp-Gly-Cys-Leu-Trpを含み、Xaaが任意のアミノ酸である点で特徴づけられる。
【００１４】
本発明の1つの態様において、結合分子は、血清アルブミンに結合することができる第3の結合ドメインが単一ドメイン抗体のCDRに由来する点で特徴づけられる。
【００１５】
本発明の1つの態様において、結合分子は、第3の結合ドメインが≦500nMの親和性（KD）で血清アルブミンに結合する点で特徴づけられる。
【００１６】
本発明の1つの態様において、結合分子は、結合分子が10％ヒト血清アルブミン存在下でのエフェクター細胞による標的細胞の溶解を測定するインビトロアッセイにおいて細胞毒性活性を示す点で特徴づけられる。
【００１７】
本発明の1つの態様において、結合分子は、該分子が単一ポリペプチド鎖からなる点で特徴づけられる。
【００１８】
本発明の1つの態様において、結合分子は、
（a）第1の結合ドメインが、抗体由来のVLおよびVH鎖を含み、かつ／または
（b）第2の結合ドメインが、抗体由来のVLおよびVH鎖を含む、
点で特徴づけられる。
【００１９】
本発明の1つの態様において、結合分子は、該分子が1つまたは複数のさらなる異種ポリペプチドを含む点で特徴づけられる。
【００２０】
本発明の1つの態様において、結合分子は、細胞表面分子に結合することができる第1の結合ドメインが腫瘍抗原に結合する点で特徴づけられる。
【００２１】
本発明の1つの態様において、結合分子は、T細胞CD3受容体複合体に結合することができる第2の結合ドメインがヒトおよびコモンマーモセット（Callithrix jacchus）、ワタボウシタマリン（Saguinus oedipus）またはコモンリスザル（Saimiri sciureus）のCD3ε鎖のエピトープに結合することができ、該エピトープがSEQ ID NO:2、4、6または8からなる群に含まれるアミノ酸配列の一部でありかつ少なくともアミノ酸配列Gln-Asp-Gly-Asn-Gluを含む点で特徴づけられる。
【００２２】
本発明の1つの態様において、結合分子は、SEQ ID NO:51、52、54、55、57、58、60、61、75、76、81、82、85、86、90、91、85、96、100または101に示されるアミノ酸配列によって特徴づけられる。
【００２３】
本発明の結合分子をコードする核酸配列。
【００２４】
本発明の核酸配列を含むベクター。
【００２５】
本発明の核酸配列または本発明のベクターによって形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【００２６】
本発明の結合分子の産生のための方法であって、本発明の結合分子の発現を可能にする条件下で本発明の宿主細胞を培養する工程、および、産生された結合分子を培養物から回収する工程を含む、方法。
【００２７】
本発明の結合分子または本発明の方法にしたがい産生された結合分子を含む、薬学的組成物。
【００２８】
増殖性疾患、炎症性疾患、感染症、および自己免疫疾患からなる群より選択される疾患の予防、処置または改善に使用するための本発明の結合分子または本発明の方法にしたがい産生された結合分子。
【００２９】
増殖性疾患、炎症性疾患、感染症、および自己免疫疾患からなる群より選択される疾患の処置または改善のための方法であって、それを必要とする対象に本発明の結合分子または本発明の方法にしたがい産生された結合分子を投与する工程を含む、方法。
【００３０】
本発明の結合分子、本発明の核酸分子、本発明のベクター、または本発明の宿主細胞を含むキット。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
発明の詳細な説明
標的細胞上の細胞表面分子、例えば腫瘍抗原、およびT細胞CD3受容体複合体の両方に結合する結合分子の作用様式は、公知となっている。T細胞を標的細胞の近くに運ぶ、すなわちT細胞を誘引すると、その状況下で、標的細胞はT細胞によって殺傷される。このプロセスは、増殖性疾患、炎症性疾患、感染症、および自己免疫疾患に対する取り組みの中で利用することができる。したがって、CD3結合ドメイン、すなわち結合分子の「エフェクタードメイン」、または標的結合ドメインに、何か、例えば追加のアミノ酸配列を融合すると、結合分子の特性が影響を受け、もはや適切にT細胞を誘引するおよび／またはその標的に結合するその機能を発揮しなくなる可能性がある。事実、T細胞は、パーフォリンと呼ばれる孔形成タンパク質およびグランザイムと呼ばれる細胞死誘導プロテアーゼという死の組み合わせを含む顆粒を備えている。これらのタンパク質は、死滅させようとする標的細胞の近くにT細胞が存在する場合にのみ形成され得る細胞溶解シナプスを通じて標的細胞に送達される。通常、T細胞と標的細胞の最大の接近は、T細胞がそれに対応するT細胞受容体を用いてMHCクラスI／ペプチド複合体に結合することによって達成される。しかし、T細胞受容体／MHCの相互作用の非存在下でもT細胞をそのように標的細胞の近くに運ぶことが、本発明の結合分子の機能である。したがって、本発明の結合分子の第1および／または第2の結合ドメインのいずれかまたは両方に、何か、例えば追加のアミノ酸配列を融合することによって、その機能、すなわち標的細胞を殺傷するために標的細胞とT細胞を引き合わせることが負の影響を受ける可能性があると想像され得る。
【００３２】
そのことと、結合分子の血清半減期を延長することがそれを安定化させるまたはその迅速な腎臓クリアランスを防ぐ等のために非常に望ましいということを考慮して、当業者はジレンマに陥っているようである。事実、半減期の延長は結合分子を例えば血清アルブミンに結合することによって達成され得、それは血清アルブミンに結合することができるドメインを結合分子に備え付けることを必要とするものであるが、そのようなドメインの付加はおそらくその結合分子の特性に悪影響を及し得る、例えばそれがその機能を喪失させまたは少なくとも効果を低下させる可能性がある。
【００３３】
この潜在的なジレンマおよび血清アルブミンに結合することができるさらなる結合性の付加によって本発明の結合分子が少なくとも弱体化するまたは不活性化さえされる可能性があるという懸念にもかかわらず、本発明者らは、標的細胞上の細胞表面分子に結合することができる第1の結合ドメインに加えて、T細胞CD3受容体複合体に結合することができる第2の結合ドメイン、血清アルブミンに結合することができる第3の結合ドメインを有する結合分子を作製した。
【００３４】
血清アルブミン結合ドメインを提供するWO 01/45746は、血清アルブミン結合ドメインをタンパク質、特に抗体のどちらの末端に融合すべきかを完全に当業者任せにしている - それはN末端またはC末端のいずれかであり得、かつ状況に依存し得る。したがって、先行技術は、その道標を提供するものではない。
【００３５】
驚くべきことに、本発明者らは、第3の結合ドメインが第2のドメインのC末端に配置されるべきであることを見出した。これは実に驚くべきことである、というのも、当業者は、上記の理由（シナプスの形成および標的細胞の殺傷の実行）から、標的細胞上の細胞表面分子に結合することができる第1の結合ドメインはT細胞受容体複合体への結合を通じて「エフェクター機能」すなわちT細胞を誘引する第2のドメインほど過敏ではないと予想するであろうからである。しかし、その予想とは異なり、本発明者らは、（標的細胞に結合する）第1の結合ドメインへの血清アルブミン結合ドメインの付加が結合分子の結合性を失効させることを観察した。
【００３６】
さらに、先行技術の結合分子、例えば、一方がCD3に第2がCEA等の標的分子に対する2つの結合ドメインを有しかつ血清アルブミン結合ドメインを備えているダイアボディは、血清アルブミン結合ドメインを標的細胞に結合するドメインに融合する形で構築されている；Stork et al., Prot Eng Des Sel 20(11), 569-576 (2007)およびMueller et al., J Biol Chem 282(17), 12650-12660 (2007)を参照のこと。したがって、先行技術から、当業者はまた、血清アルブミン結合ドメインを標的細胞の細胞表面分子に結合するドメインに付加するべきとの結論に至るであろう。同様のアプローチが、DART抗体、例えばABD-DARTの構築において行われた（WO 2010/080538、例えば図45を参照のこと）。
【００３７】
これに対し、本発明者らは、先行技術の教示および先行技術の教示からもたらされる予想とは異なり、血清アルブミン結合ドメインを、T細胞受容体複合体への結合を介してT細胞を誘引する第2の結合ドメインのC末端に付加し、血清半減期が延長された、それでいて標的細胞上の細胞表面分子への結合およびT細胞CD3受容体複合体への結合が依然として可能であり、それによって標的細胞に対するその殺傷機能を発揮する形でT細胞を誘引する結合分子の作製に成功した。したがって、結合ドメインが本明細書（例えば、請求項１を参照のこと）に記載される順になっている本発明の結合分子は、該結合分子によって誘引されたT細胞によりもたらされる標的細胞に対する細胞毒性を媒介することができる。
【００３８】
本発明の結合分子の第3の結合ドメインにより、本発明の結合分子は、好ましくは、体内で延長された半減期および／またはより長い持続時間を示し、それによってより長い結合分子の機能活性も提供する。
【００３９】
加えて、本発明者らは、本発明の結合分子が10％（v/v）血清アルブミン、特にヒト血清アルブミン存在下のインビトロでも細胞毒性を媒介することができることを観察した。ヒト血中の血清アルブミンは約10〜20％（v/v）で存在するので、これは重要な特徴である。実際、本発明の結合分子は、哺乳動物、特にヒトにおいて天然に存在するものではなく、したがって、血清アルブミンの存在が本発明の結合分子の作用を妨害するまたはその作用と干渉することもあり得たのである。
【００４０】
例として、その細胞毒性媒介能力について本発明の結合分子を試験するために、血清アルブミン、特にヒト血清アルブミンの存在下でのインビトロ細胞毒性アッセイが使用され得る。
【００４１】
本明細書、例えば請求項１に記載されるドメインの秩序（設定／配置）を有する本発明の結合分子の別の驚くべき特性は、主として単量体として産生され得ることである。特に、本発明者らは、この結合分子を発現する宿主細胞から入手可能な結合分子の80、85さらには90％超が単量体の形態であることを見出した。2量体や多量体は、標的細胞（細胞表面分子を介して）および／またはT細胞（T細胞受容体複合体を介して）に対するそれらの結合能力の大部分を喪失していると考えられ望ましくないので、これは重要な特徴である。
【００４２】
本明細書で使用される場合、単数形（「１つの」、「ある」および「その」）は、文脈が明らかにそうでないことを示していない限り、複数の参照を含むことに留意されなければならない。したがって、例えば、「１つの試薬」は、1つまたは複数のそのような異なる試薬を含み、「その方法」に対する言及は、本明細書に記載される方法を修正または置換することができる当業者に公知の等価な工程および方法に対する言及を含む。
【００４３】
そうでないことが示されない限り、要素の系列の前に置かれる「少なくとも」という用語は、この系列のあらゆる要素に言及していると理解されるべきである。当業者は、慣用的以上の実験を用いずとも、本明細書に記載される本発明の具体的態様の多くの等価物を認識するまたは確認することができる。そのような等価物は、本発明に含まれることが意図されている。
【００４４】
「および／または」という用語は、本明細書のいずれの場所で使用される場合でも、「および」、「または」および「この用語によって接続される要素のすべてまたは任意の他の組み合わせ」の意味を含んでいる。
【００４５】
本明細書で使用される「約」または「およそ」という用語は、示された値または範囲の20％以内、好ましくは15％以内、より好ましくは10％以内、最も好ましくは5％以内を意味する。
【００４６】
本明細書および添付の特許請求の範囲を通して、文脈がそうでないことを必要としない限り、「含む」という単語および「含んでいる」等の派生語は、言及されている整数値もしくは工程または整数値もしくは工程のグループを含むが、任意のその他の整数値もしくは工程または整数値もしくは工程のグループを排除しないことを暗に示すものと理解されるべきである。本明細書で使用される場合、「含む（comprising）」という用語は、「含む（containing）」もしくは「含む（including）」で、または本明細書で使用される場合「有する（having）」で置き換えられることもある。
【００４７】
本願で使用される場合、「からなる」は、請求項発明の要素の中で指定されていない任意の要素、工程または成分を排除する。本明細書で使用される場合、「から本質的になる」は、その請求項発明の基本的かつ新規の特徴に実質的に影響しない物質または工程を排除しない。
【００４８】
本明細書の各例において、「含む」、「から本質的になる」および「からなる」という用語はいずれも、他の2つの用語のいずれかと置き換えられ得る。
【００４９】
本開示の意味において、「結合分子」という用語は、標的細胞上の表面分子およびT細胞上のCD3受容体複合体に（特異的に）結合できる、これらと相互作用できるまたはこれらを認識できる、任意の分子を示す。本発明にしたがい、結合分子は、好ましくはポリペプチドである。そのようなポリペプチドは、タンパク質部分および非タンパク質部分（例えば、化学リンカーまたは化学架橋剤、例えばグルタルアルデヒド）を含み得る。
【００５０】
結合分子は、1つまたは複数の結合ドメインが標的細胞上の表面分子およびT細胞上のCD3受容体複合体と結合／相互作用できるよう、言わば、それらの結合ドメインのスキャホールドを提供する。例えば、そのようなスキャホールドは、プロテインA、特にそのZドメイン（アフィボディ）、ImmE7（免疫タンパク質）、BPTI/APPI（Kunitzドメイン）、Ras結合タンパク質AF-6（PDZドメイン）、カリブドトキシン（サソリ毒）、CTLA-4、Min-23（ノッチン）、リポカリン（アンチカリン）、ネオカルジノスタチン、フィブロネクチンドメイン、アンキリンコンセンサス反復ドメイン（Stumpp et al., Curr Opin Drug Discov Devel. 10(2), 153-159 (2007)）またはチオレドキシンによって提供され得る（Skerra, Curr. Opin. Biotechnol. 18, 295-304 (2005); Hosse et al., Protein Sci. 15, 14-27 (2006); Nicaise et al., Protein Sci. 13, 1882-1891 (2004); Nygren and Uhlen, Curr. Opin. Struc. Biol. 7, 463-469 (1997)）。好ましい結合分子は、抗体、より好ましくは二重特異性抗体である。
【００５１】
本明細書で使用される「細胞表面抗原」という用語は、細胞の表面上に提示される分子を表す。大部分の例で、この分子は、細胞の細胞膜中または膜上に配置され、この分子の少なくとも一部分が細胞外から3次形態でアクセス可能な状態で維持されているであろう。細胞膜中に配置される細胞表面分子の非限定的な例は、その3次構造に親水性の領域と疎水性の領域を含む膜貫通タンパク質である。この場合、少なくとも1つの疎水性領域は、細胞の疎水性の細胞膜中に細胞表面分子を埋没または挿入させ、その親水性領域は、細胞膜のいずれかの側から細胞質および細胞外空間のそれぞれに延びている。細胞膜上に配置される細胞表面分子の非限定的な例は、パルミトイル基を有するようシステイン残基で修飾されたタンパク質、ファルネシル基を有するようC末端システイン残基で修飾されたタンパク質またはグリコシルホスファチジルイノシトール（「GPI」）アンカーを有するようC末端で修飾されたタンパク質である。これらの基は、細胞膜の外表面へのタンパク質の共有結合付加を可能にし、そこでそれらは細胞外分子、例えば抗体による認識に対してアクセス可能な状態で維持される。
【００５２】
T細胞CD3受容体複合体は、タンパク質複合体であり、4つの別個の鎖から構成される。哺乳動物において、この複合体は、CD3γ鎖、CD3δ鎖および2つのCD3ε（イプシロン）鎖を含む。これらの鎖は、T細胞受容体（TCR）およびζ鎖として公知の分子と会合し、Tリンパ球において活性化シグナルを生成する。本発明の結合分子は、好ましくは、その第2のドメインを介して、T細胞受容体のCD3ε（イプシロン）鎖に結合する。
【００５３】
二重特異性分子によるT細胞の動員を通じた標的細胞の再方向付けされた溶解では、細胞溶解シナプスの形成ならびにパーフォリンおよびグランザイムの送達が行われる。誘引されたT細胞は、連続的な標的細胞溶解を行うことができ、ペプチド抗原のプロセシングおよび提示またはクローン性T細胞の分化に干渉する免疫回避機構に影響されない；例えば、WO 2007/042261を参照のこと。
【００５４】
本明細書で使用される「二重特異性」という用語は、結合分子が少なくとも第1および第2の結合ドメインを含み、第1の結合ドメインが1つの抗原または標的に結合することができ、第2の結合ドメインが別の抗原または標的に結合することができることを表す。本発明の「結合分子」はまた、多重特異性結合分子、例えば、3つの結合ドメインを含む三重特異性結合分子などを含む。しかし、本発明の結合分子の文脈において本明細書において使用される「二重特異性」という用語は、標的細胞上の細胞表面分子およびCD3以外の分子に対する結合特異性を有するさらなる結合ドメインを本発明の結合分子から排除するものと解釈されるべきではない。さらなる結合ドメインは、血清アルブミンに結合することができる本発明の結合分子の第3の結合ドメインである。
【００５５】
本発明の結合分子は、標的細胞上の表面分子およびT細胞上のCD3受容体複合体ならびに血清アルブミンに結合するその機能に加えて、さらなる機能を有することが想定されている。この形式では、結合分子は、標的細胞上の表面分子に対する結合を通じて形質細胞を標的化し、CD3への結合を通じて細胞毒性T細胞の活性を媒介し、そしてさらなる機能、例えば標識（蛍光等）および／または治療剤、例えば毒素または放射性核種等を提供する4機能性または多機能性結合分子である。
【００５６】
「結合ドメイン」という用語は、本発明との関連において、標的細胞の表面分子上およびT細胞のCD3受容体複合体上の所定の標的エピトープまたは所定の標的部位に特異的に結合／相互作用することができるドメインを特徴づける。さらに、この用語はまた、血清アルブミンに結合するまたは血清アルブミンに結合されるドメインを特徴づけるものであり得る。
【００５７】
結合ドメインは、結合ドメインドナー、例えば、抗体、プロテインA、ImmE7（免疫タンパク質）、BPTI/APPI（Kunitzドメイン）、Ras結合タンパク質AF-6（PDZドメイン）、カリブドトキシン（サソリ毒）、CTLA-4、Min-23（ノッチン）、リポカリン（アンチカリン）、ネオカルジノスタチン、フィブロネクチンドメイン、アンキリンコンセンサス反復ドメイン（Stumpp et al., Curr Opin Drug Discov Devel. 10(2), 153-159 (2007)）またはチオレドキシン（Skerra, Curr. Opin. Biotechnol. 18, 295-304 (2005); Hosse et al., Protein Sci. 15, 14-27 (2006); Nicaise et al., Protein Sci. 13, 1882-1891 (2004); Nygren and Uhlen, Curr. Opin. Struc. Biol. 7, 463-469 (1997)）から得ることができる。標的細胞上の表面分子およびT細胞上のCD3受容体複合体に結合する結合ドメインの場合、好ましい結合ドメインは、抗体に由来する。本発明の結合ドメインは、標的細胞の表面分子上およびT細胞のCD3受容体複合体上の所定の標的エピトープまたは所定の標的部位への結合／相互作用に必要となる上記の結合ドメインのいずれかの少なくとも一部分を含むことが想定されている。
【００５８】
上記の結合ドメインドナーの結合ドメインは、それぞれの標的への結合を担うこれらのドナーの一部分によって、すなわち、その一部分が結合ドメインドナーから除去されたときにそのドナーがその結合能力を喪失することによって特徴づけられることが想定されている。「喪失」は、結合性のドナーと比較してその結合能力が少なくとも50％減少することを意味する。これらの結合部位をマッピングする方法は当技術分野で周知であり、したがって結合ドメインドナーの結合部位を位置決め／マッピングし、それによってそれぞれの結合ドメインドナーから結合ドメインを「得る」ことは当業者の標準的な知識の範囲内である。
【００５９】
「に結合する（ことができる）」、「を特異的に認識する」、「に方向付けられる」および「と反応する」という用語は、本発明にしたがい、結合ドメインが、エピトープの1つまたは複数、好ましくは少なくとも2つ、より好ましくは少なくとも3つ、最も好ましくは少なくとも4つのアミノ酸と特異的に相互作用することができることを意味する。
【００６０】
本明細書で使用される場合、「特異的に相互作用する」、「特異的に結合する（specifically binding）」または「特異的に結合する（specifically bind(s)）」という用語は、結合ドメインが特定のタンパク質または抗原に対して感知できる親和性を示すこと、そして通常、標的細胞上の表面分子およびT細胞上のCD3受容体複合体以外のタンパク質または抗原に対して有意な反応性を示さないこと、を意味する。「感知できる親和性」は、約10-6 M（KD）またはそれより強い親和性の結合を含む。好ましくは、結合は、結合親和性が約10-11〜10-8 M、好ましくは約10-11〜10-9 Mである場合に特異的とみなされる。結合ドメインが標的に特異的に反応または結合するかどうかは、特に、標的タンパク質または抗原に対するその結合ドメインの反応を、標的細胞上の表面分子およびT細胞上のCD3受容体以外のタンパク質または抗原に対するその結合ドメインの反応と比較することによって、容易に試験することができる。好ましくは、本発明の結合ドメインは、標的細胞上の表面分子およびT細胞上のCD3受容体複合体以外のタンパク質または抗原に本質的に結合しないまたは結合することができない（すなわち、第1の結合ドメインは、標的細胞上のこの表面分子以外のタンパク質に結合することができず、第2の結合ドメインは、T細胞上のCD3受容体複合体以外のタンパク質に結合することができない）。
【００６１】
「本質的に結合しない」、「結合することができない」という用語は、本発明の結合ドメインが、標的細胞上の表面分子またはT細胞上のCD3受容体複合体以外の別のタンパク質または抗原に結合しない、すなわち、標的細胞上の表面分子またはT細胞上のCD3受容体複合体以外のタンパク質または抗原に対して30％超、好ましくは20％超、より好ましくは10％超、特に好ましくは9％、8％、7％、6％または5％超の反応性を示さないことを意味する。
【００６２】
特異的な結合は、結合ドメインおよび抗原のアミノ酸配列内の特定のモチーフによってもたらされると考えられる。したがって、結合は、それらの1次、2次および／または3次構造の結果としてならびにこれらの構造の2次的修飾の結果として達成される。抗原相互作用部位とその特異的抗原との特異的相互作用は、抗原に対する該部位の単なる結合をもたらし得る。さらに、抗原相互作用部位とその特異的抗原との特異的相互作用は、代替的にまたは付加的に、例えば抗原の立体構造の変化の誘導、抗原のオリゴマー化等により、シグナルを開始させ得る。
【００６３】
タンパク質（通常30未満のアミノ酸を有する、そのフラグメント、好ましくは生物学的に活性なフラグメント、およびペプチドを含む）は、共有結合的ペプチド結合を通じて相互に連結された（それによってアミノ酸の鎖を形成する）1つまたは複数のアミノ酸を含む。本明細書で使用される「ポリペプチド」という用語は、30超のアミノ酸からなる分子のグループを表す。ポリペプチドはさらに、多量体、例えば2量体、3量体およびより高次のオリゴマーを形成し得る、すなわち、2つ以上のポリペプチド分子からなり得る。そのような2量体、3量体等を形成するポリペプチド分子は、同一または非同一であり得る。その結果、そのような多量体の対応する高次構造は、ホモまたはヘテロ2量体、ホモまたはヘテロ3量体等と称される。ヘテロ多量体の例は、その天然形態において、2つの同一の軽ポリペプチド鎖および2つの同一の重ポリペプチド鎖からなる抗体分子である。「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語はまた、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化等のような翻訳後修飾による修飾がなされた天然修飾ポリペプチド／タンパク質を表す。本明細書における「ポリペプチド」はまた、化学修飾、例えばペグ化されたものであり得る。そのような修飾は、当技術分野で周知である。
【００６４】
「エピトープ」という用語は、結合ドメイン、例えば抗体もしくは免疫グロブリンまたは抗体もしくは免疫グロブリンの誘導体もしくはフラグメント、が特異的に結合する抗原上の部位を表す。「エピトープ」は抗原性であり、したがってエピトープという用語は本明細書において「抗原性構造」または「抗原性決定基」を表すこともある。したがって、結合ドメインは、「抗原相互作用部位」である。この結合／相互作用はまた、「特異的認識」を定義することが理解されている。1つの例において、標的細胞上の表面分子およびT細胞上のCD3受容体複合体の上の所定の標的エピトープまたは所定の標的部位に（特異的に）結合／相互作用する結合ドメインは抗体または免疫グロブリンであり、そして結合ドメインは抗体または免疫グロブリンのVHおよび／またはVL領域である。
【００６５】
「エピトープ」は、連続アミノ酸またはタンパク質の3次元折り畳みによって近接することになる非連続アミノ酸の両方によって形成され得る。「直線状エピトープ」は、アミノ酸の1次配列が認識されるエピトープを含んでいるエピトープである。直線状エピトープは、典型的に、特有の配列内に、少なくとも3つまたは少なくとも4つ、およびより一般には少なくとも5つまたは少なくとも6つまたは少なくとも7つ、例えば約8〜約10のアミノ酸を含む。
【００６６】
「立体構造エピトープ」は、直線状エピトープに対して、エピトープを含むアミノ酸の1次配列が、認識されるエピトープの唯一の定義要素ではないエピトープ（例えば、アミノ酸の1次配列が必ずしも結合ドメインによって認識されないエピトープ）である。典型的に、立体構造エピトープは、直線状エピトープよりも多数のアミノ酸を含む。立体構造エピトープの認識に関して、結合ドメインは、抗原、好ましくはペプチドもしくはタンパク質またはそれらのフラグメント、の3次元構造を認識する（本発明においては、結合ドメインの1つに対する抗原が標的細胞上の表面分子内およびT細胞上のCD3受容体複合体内に含まれている）。例えば、タンパク質分子が折り畳まれ3次元構造が形成される場合、立体構造エピトープを形成する特定のアミノ酸および／またはポリペプチド骨格は近接した状態になり、それによって抗体がそのエピトープを認識できるようになる。エピトープの立体構造を決定する方法は、x線結晶解析、2次元核磁気共鳴（2D-NMR）分光分析および部位特異的スピンラベルおよび電子常磁性共鳴（EPR）分光分析を含むがこれらに限定されない。
【００６７】
「アルブミン結合ドメイン」（ABP）という用語は、様々な種由来の血清アルブミンに対する高親和性の特異的結合を媒介する本発明の結合分子内の配列モチーフを特徴づける。
【００６８】
ABPの非限定的な例が、表1に示されている。
【００６９】
（表１）ABPモチーフの非限定的な例
2018138558.tif 000002
【００７０】
本発明の結合分子の1つの局面において、3つのドメインは、N末端からC末端に向かって、
・第1の結合ドメイン、
・第2の結合ドメイン、および
・第3の結合ドメイン、
の順で、1つのポリペプチド上に存在する。
【００７１】
また、本発明の1つの態様において、本発明の結合分子の第3の結合ドメインは、scFvまたは単一ドメイン抗体である。
【００７２】
1つの局面において、本発明の結合分子は、
（a）第1の結合ドメインが、ヒトおよび非ヒト霊長類の細胞上の細胞表面分子に結合することができるドメインであり、
（b）第2の結合ドメインが、ヒトおよび非ヒト霊長類の細胞上のT細胞CD3受容体複合体に結合することができるドメインであり、かつ
（c）第3の結合ドメインが、ヒトおよび非ヒト霊長類の血清アルブミンに結合することができるドメインである、
3つの結合ドメインを含む。
【００７３】
「非ヒト霊長類」という用語は、ヒトを除く霊長目のすべての種のグループを特徴づける。したがって、このグループは、明示的に、マーモセット科（Callitrichidae）（マーモセットおよびタマリン）、オマキザル科（Cebidae）、オナガザル科（Cercopithecidae）（旧世界ザル）、テナガザル科（Hylobatidae）（小型類人猿、ギボン）およびヒト上科（Hominoidea）（大型類人猿）を含む。第3の結合ドメインが、ヒトおよび少なくとも1つの非ヒト霊長類の血清アルブミン、好ましくはオナガザル科（旧世界ザル）に結合することができるドメインであることも想定されている。第3の結合ドメインが、ヒトおよび少なくとも1つの非ヒト霊長類の血清アルブミン、好ましくはオナガザル科（旧世界ザル）に結合することができ、それに加えてげっ歯類血清アルブミン、例えばマウスまたはラットに結合することができるドメインであることもさらに想定されている（実施例3を参照のこと）。
【００７４】
本明細書で使用される「異種間特異性」または「種間特異性」という用語は、ヒトおよび非ヒト霊長類における同一の標的分子に対する本明細書に記載される結合ドメインの結合を意味する。したがって「異種間特異性」または「種間特異性」は、異なる種において発現される同一の分子Xに対する、しかしX以外の分子に対するものではない種間反応性、と理解することができる。例えばヒトCD3イプシロンを認識するモノクローナル抗体の、非ヒト霊長類CD3イプシロン、例えばマカクCD3イプシロンに対する異種間特異性は、例えば、FACS分析によって決定することができる。FACS分析は、それぞれのモノクローナル抗体が、例えばそれぞれヒトおよび非ヒト霊長類CD3イプシロン抗原を発現するヒトおよび非ヒト霊長類の細胞、例えばマカク細胞に対する結合に関して試験されるように、行われる。適当なアッセイは、以下の実施例に示されている。
【００７５】
本発明の結合分子、例えば本明細書で定義される二重特異性単鎖抗体の結合ドメインの作製のために、ヒトおよび／または非ヒト霊長類のそれぞれの細胞表面抗原の両方に結合するモノクローナル抗体が使用され得る。本明細書で定義される二重特異性ポリペプチドに適した結合ドメインは、例えば、当技術分野で報告されている組み換え法によって異種間特異的モノクローナル抗体から得ることができる。ヒト細胞表面抗原および非チンパンジー霊長類における該細胞表面抗原のホモログに結合するモノクローナル抗体は、上記のようにFACSアッセイによって試験され得る。異種間特異的抗体はまた、文献（Milstein and Kohler, Nature 256 (1975), 495-7）に記載されるハイブリドーマ技術によって作製され得ることが当業者に明らかである。例えば、マウスが、ヒトおよび非ヒト霊長類抗原で交互に免疫され得る。これらのマウスから、ハイブリドーマ技術を通じて異種間特異的抗体産生ハイブリドーマ細胞が単離され、そして上記のようにFACSによって分析される。二重特異性ポリペプチド、例えば本明細書に記載される異種間特異性を示す二重特異性単鎖抗体の作製および分析は、以下の実施例に示されている。異種間特異性を示す二重特異性単鎖抗体の利点は、以下に列挙される点を含む。
【００７６】
さらに、本発明の結合分子の1つの局面において、血清アルブミンに結合することができる第3の結合ドメインは、コンビナトリアルライブラリまたは抗体結合ドメインに由来する。
【００７７】
本明細書で使用される場合、「コンビナトリアルライブラリ」という用語は、例えばNNSトリプレットを用いる遺伝子合成または当業者に公知のその他の方法によって得られる、特定の機能性、例えば関心対象のタンパク質に対する結合性、を有する分子を選択またはスクリーンするために1つまたは複数のアミノ酸位置で相違する推定アミノ酸配列セットをコードする核酸分子のライブラリを定義する。
【００７８】
「抗体」という用語の定義は、モノクローナル、キメラ、単鎖、ヒト化およびヒト抗体等の態様を含む。全長抗体に加えて、この定義はまた、特にFabフラグメントのような、抗体誘導体および抗体フラグメントを含む。抗体フラグメントまたは誘導体はさらに、F(ab')2、Fv、scFvフラグメントまたは単一ドメイン抗体、例えばドメイン抗体またはナノボディ、他のV領域またはドメインから独立して抗原またはエピトープに特異的に結合するVHH、VHまたはVLであり得る唯一の可変ドメインを含む単一可変ドメイン抗体または免疫グロブリン単一可変ドメインを含む；例えば、Harlow and Lane (1988) and (1999), loc. cit.; Kontermann and Dubel, Antibody Engineering, Springer, 2nd ed. 2010およびLittle, Recombinant Antibodies for Immunotherapy, Cambridge University Press 2009を参照のこと。この用語はまた、ダイアボディ（diabodies）またはDual-Affinity Re-Targeting（DART）抗体を含む。免疫グロブリン単一可変ドメインは、単離された抗体単一可変ドメインポリペプチドだけでなく、抗体単一可変ドメインポリペプチド配列の1つまたは複数の単量体を含むより大きなポリペプチドも含む。
【００７９】
そのような抗体および／またはフラグメントの産生に関しては様々な手順が当技術分野で公知であり、かつ使用され得る。したがって、（抗体）誘導体は、ペプチド模倣体によって産生され得る。さらに、単鎖抗体の産生に関して記載された技術（特に、米国特許第4,946,778号、Kontermann and Dubel (2010), loc. cit. およびLittle (2009), loc. cit.を参照のこと）を、選択されたポリペプチドに特異的な単鎖抗体を産生するために適合させることができる。また、トランスジェニック動物が、本発明のポリペプチドおよび融合タンパク質に特異的なヒト化抗体を発現させるために使用され得る。モノクローナル抗体の調製については、継続的な細胞株の培養によって産生される抗体を提供する任意の技術が使用され得る。そのような技術の例は、ハイブリドーマ技術（Kohler and Milstein Nature 256 (1975), 495-497）、トリオーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術（Kozbor, Immunology Today 4 (1983), 72）およびヒトモノクローナル抗体を産生するEBVハイブリドーマ技術（Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985), 77-96）を含む。BIAcoreシステムで用いられる表面プラズモン共鳴は、標的ポリペプチド、例えばCD3イプシロンのエピトープに結合するファージ抗体の効率を高めるために使用され得る（Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13）。本発明の文脈において、「抗体」という用語は、本明細書の以下に記載される宿主において発現され得る抗体コンストラクト、例えば、特にウイルスまたはプラスミドベクターを通じてトランスフェクトおよび／または形質導入され得る抗体コンストラクトを含むことも想定されている。
【００８０】
さらに、本明細書で用いられる「抗体」という用語はまた、記載されている抗体と同じ特異性を示す本明細書に記載される抗体の誘導体または変種に関する。「抗体変種」の例は、非ヒト抗体のヒト化変種、「親和性成熟」抗体（例えば、Hawkins et al., J. Mol. Biol. 254, 889-896 (1992)およびLowman et al., Biochemistry 30, 10832-10837 (1991)を参照のこと）およびエフェクター機能が変更された抗体変異体（例えば、米国特許第5,648,260号、Kontermann and Dubel (2010), loc. cit.およびLittle (2009), loc. cit.を参照のこと）を含む。
【００８１】
「抗原結合ドメイン」、「抗原結合フラグメント」および「抗体結合領域」という用語は、本明細書で使用される場合、抗体と抗原の間の特異的結合を担うアミノ酸を含む抗体分子の一部分を表す。抗体によって特異的に認識および結合される抗原の一部分は、本明細書上記のように「エピトープ」と称される。上記のように、抗原結合ドメインは、典型的に、抗体軽鎖可変領域（VL）および抗体重鎖可変領域（VH）を含み得るが；両方を含んでいなければならないわけではない。例えば、Fdフラグメントは、2つのVH領域を有し、多くの場合、インタクトな抗原結合ドメインの抗原結合機能をある程度保持している。抗体の抗原結合フラグメントの例は、（1）VL、VH、CLおよびCH1ドメインを有する1価のフラグメントである、Fabフラグメント；（2）ヒンジ領域におけるジスルフィド架橋によって連結されている2つのFabフラグメントを有する2価のフラグメントである、F(ab')2フラグメント；（3）2つのVHおよびCH1ドメインを有する、Fdフラグメント；（4）抗体の1つのアームのVLおよびVHドメインを有する、Fvフラグメント、（5）VHドメインを有する、dAbフラグメント（Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546）；（6）単離された相補性決定領域（CDR）、ならびに（7）単鎖Fv（scFv）を含む。Fvフラグメントの2つのドメインであるVLおよびVHは別個の遺伝子によってコードされるが、それらは、組み換え法を用いて合成リンカーによって接続し、VLおよびVH領域が対になり1価分子を形成する単一のタンパク質鎖（単鎖Fv（scFv）として公知；例えば、Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA 85: 5879-5883を参照のこと）として生成することができる。これらの抗体フラグメントは、当業者に公知の従来技術を用いて取得され、そしてそのフラグメントはインタクトな抗体と同じ様式で機能について評価される。
【００８２】
（合成）リンカーが使用される場合、このリンカーは、好ましくは、第1および第2のドメインの各々が互いから独立してそれらの異なる結合特異性を保持できることを確実にする上で十分な長さおよび配列のものである。より好ましくはおよび付属の実施例に示されているように、本発明の抗体コンストラクトは、「二重特異性単鎖抗体コンストラクト」、より好ましくは二重特異性単鎖Fv（scFv）である。二重特異性単鎖分子は当技術分野で公知であり、WO 99/54440、Mack, J. Immunol. (1997), 158, 3965-3970、Mack, PNAS, (1995), 92, 7021-7025、Kufer, Cancer Immunol. Immunother., (1997), 45, 193-197、Loffler, Blood, (2000), 95, 6, 2098-2103、Bruhl, Immunol., (2001), 166, 2420-2426、Kipriyanov, J. Mol. Biol., (1999), 293, 41-56に記載されている。
【００８３】
本明細書に記載される抗体コンストラクトに含まれる可変ドメインは、追加のリンカー配列によって接続され得る。「ペプチドリンカー」という用語は、本発明にしたがい、本発明の抗体コンストラクトの第1のドメインおよび第2のドメインのアミノ酸配列を相互に連結させるアミノ酸配列を定義する。そのようなペプチドリンカーの本質的な技術的特徴は、そのペプチドリンカーがいかなる重合活性も含まないことである。ペプチドリンカーにとって好ましいアミノ酸残基は、Gly、SerおよびThrを含み、5〜25アミノ酸残基の長さによって特徴づけられる。中でも適当なペプチドリンカーは、米国特許第4,751,180号および同第4,935,233号またはWO 88/09344に記載されているものである。ペプチドリンカーの好ましい態様は、アミノ酸配列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser、すなわちGly4Ser、またはそのポリマー、すなわち(Gly4Ser)x、ここでxは1またはそれより大きい整数である、によって特徴づけられる。2次構造への発展性を欠くペプチドリンカーの特徴は、当技術分野で公知であり、例えばDall'Acqua et al.（Biochem. (1998) 37, 9266-9273）、Cheadle et al.（Mol Immunol (1992) 29, 21-30）およびRaag and Whitlow（FASEB (1995) 9(1), 73-80）に記載されている。いかなる2次構造にも発展しないペプチドリンカーが好ましい。これらのドメインの相互に対する連結は、例えば実施例に記載される遺伝子操作によって提供され得る。融合され機能的に連結された二重特異性単鎖コンストラクトを調製しそれらを哺乳動物細胞または細菌中で発現させる方法は、当技術分野で周知である（例えば、WO 99/54440またはSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2001）。
【００８４】
本発明の抗体コンストラクトにおいて少なくとも2つの結合ドメインを接続するペプチドリンカーに関しては、数個程度のアミノ酸残基、例えば12アミノ酸残基またはそれ未満を含むペプチドリンカーが好ましい。したがって、12、11、10、9、8、7、6または5アミノ酸残基のペプチドリンカーが好ましい。5アミノ酸未満の想定されるペプチドリンカーは、4、3、2または1アミノ酸を含み、Glyリッチリンカーが好ましい。「ペプチドリンカー」の文脈において特に好ましい「単一」アミノ酸は、Glyである。したがって、ペプチドリンカーは、単一アミノ酸Glyからなるものであり得る。
【００８５】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を表す、すなわち、その集団を構成している個々の抗体が、微量で存在し得る潜在的な自然変異および／または翻訳後修飾（例えば、異性化、アミド化）を除いて同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原部位に方向付けられている。さらに、典型的に異なる決定基（エピトープ）に方向付けられた異なる抗体を含む従前の（ポリクローナル）抗体調製物と対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に方向付けられている。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、それらが他の免疫グロブリンの混入していないハイブリドーマ培養物によって合成されるという利点がある。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均質な抗体集団から得られるという抗体の特徴を示しており、その抗体が任意の特定の方法によって産生されることを必要とするものと解釈されるべきではない。例えば、本発明にしたがい使用されるモノクローナル抗体は、Kohler et al., Nature 256: 495 (1975)によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製され得、または、組み換えDNA法（例えば、米国特許第4,816,567号を参照のこと）によって作製され得る。「モノクローナル抗体」はまた、例えば、Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)およびMarks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)に記載される技術を用いて、ファージ抗体ライブラリから単離され得る。
【００８６】
本発明のモノクローナル抗体は、具体的に、重鎖および／または軽鎖の一部がある特定の種に由来するまたはある特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同であり、その鎖の残りの部分が別の種に由来するまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同である、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、ならびに、所望の生物学的活性を示す限り、そのような抗体のフラグメント、を含む（米国特許第4,816,567号；Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81; 6851-6855 (1984)）。本明細書における関心対象のキメラ抗体は、非ヒト霊長類（例えば、旧世界ザル、類人猿等）由来の可変ドメイン抗原結合配列およびヒト定常領域配列を含む「霊長類化」抗体を含む。
【００８７】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小限の配列を含む、大部分がヒト配列の、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそれらのフラグメント（例えば、Fv、Fab、Fab'、F(ab')2または抗体のその他の抗原結合部分配列）である。多くの場合、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であるが、そのレシピエントの超可変領域（またはCDR）の残基が所望の特異性、親和性および能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）、例えばマウス、ラットまたはウサギ、の超可変領域の残基で置き換えられているものである。いくつかの例において、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域（FR）の残基が、対応する非ヒト残基で置き換えられる。さらに、本明細書で使用される「ヒト化抗体」はまた、レシピエント抗体またはドナー抗体のいずれにおいても見られない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体の性能をさらに洗練および最適化するためになされる。ヒト化抗体はまた、必要に応じて、免疫グロブリン定常領域（Fc）の少なくとも一部分、典型的にはヒト免疫グロブリンのそれ、を含み得る。さらなる詳細については、Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988);およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992)を参照のこと。
【００８８】
「ヒト抗体」という用語は、例えばKabatら（Kabat et al. (1991) loc. cit.を参照のこと）によって記載されたものを含む、当技術分野で公知のヒト生殖系列免疫グロブリン配列に実質的に対応する可変および定常領域を有する抗体を含む。本発明のヒト抗体は、例えばCDRに、特にCDR3に、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでの無作為もしくは部位特異的変異誘発によってまたはインビボでの体細胞変異によって導入される変異）を含み得る。ヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基で置き換えられた、少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つまたはそれ以上の位置を有し得る。
【００８９】
本明細書で使用される場合、「インビトロ生成された抗体」は、可変領域（例えば、少なくとも1つのCDR）のすべてまたは一部分が非免疫細胞選択（例えば、インビトロファージディスプレイ、タンパク質チップまたは候補配列をそれらの抗原結合能力について試験することができる任意のその他の方法）によって生成された抗体を表す。したがってこの用語は、好ましくは、免疫細胞内での遺伝子の再配置によって生成される配列を排除する。
【００９０】
本発明の1つの好ましい局面において、血清アルブミンに結合することができる第3のドメインは、単一ドメイン抗体のCDRに由来する。本発明の好ましい局面において、血清アルブミンに結合することができる第3のドメインは、細菌起源のもの、例えば連鎖球菌由来のプロテインG由来のアルブミン結合ドメイン、例えば連鎖球菌株G418のプロテインGのABD3ドメイン、ではない。
【００９１】
本発明の結合分子の1つの局面において、第3の結合ドメインは、10〜25アミノ酸残基を含む。
【００９２】
本発明の好ましい局面において、血清アルブミンに結合することができる第3の結合ドメインは、アミノ酸配列Asp-Xaa-Cys-Leu-Pro-Xaa-Trp-Gly-Cys-Leu-Trpを含み、Xaaは任意のアミノ酸である。
【００９３】
さらに、本発明の結合分子の1つの局面において、第3の結合ドメインは、≦500nMの親和性（KD）で血清アルブミンに結合する。
【００９４】
アルブミンに対する異なる親和性を媒介する様々なABPをC末端にタグ付加したFabフラグメント4D5のインビボ半減期が、マウス、ラットおよびウサギにおいて調査された（Nguyen et al., Prot Eng Des Sel 19(7), 291-297 (2006)）。マウス、ラットおよびウサギアルブミンに対するFab-ABPの親和性と共にこれらの異なる小型種において決定された半減期値に基づき、ヒトアルブミンに対して500nMの親和性を有するFab-ABPのベータ半減期は、70kgのヒトにおいて4日間であると計算された。本発明の結合分子、例えばBiTE（二重特異性T細胞エンゲージャー）は、Fabフラグメントと同じ分子量を有し、かつ - Fabフラグメントと同様 - 合計4つの免疫グロブリンドメインからなるものなので、500nMのヒトアルブミンに対する親和性を有する本発明のABPタグ付加結合分子についても同じことが言えると考えられる。
【００９５】
同じ調査で、アルブミンに対する親和性が高いほど（すなわち、KD値が小さいほど）インビボ半減期が長くなることが確認された。したがって、500nMのヒトアルブミンに対する親和性を有する本発明のABPタグ付加結合分子は、ヒトにおいて4日間の半減期を有すると考えられる。＜500nMのヒトアルブミン親和性を有する本発明のABPタグ付加結合分子は、ヒトにおいて＞4日間の半減期を有すると考えられる。同様に、＞500nMのヒトアルブミンに対する親和性を有する本発明のABPタグ付加結合分子は、ヒトにおいて＜4日間の半減期を有すると考えられる。
【００９６】
上記のように、本発明の結合分子は、好ましくは、延長された血清半減期を有する。
【００９７】
リガンドの半減期の薬物動態分析および決定の方法は、当業者によく知られているであろう。詳細は、Kennetl, A et al. Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for PharmacistsおよびPeters et al, Pharmacokinetc analysis: A Practical Approach (1996)において見出され得る。薬物動態パラメータ、例えばtアルファおよびtベータ半減期ならびに曲線下面積（AUC）について記載する"Pharmacokinetics", M Gibaldi & D Perron, Marcel Dekker発行, 2nd Rev. ex edition (1982)に対する参照もなされる。
【００９８】
半減期は、ポリペプチドの血清濃度がインビボで、例えば自然機構による結合分子の分解および／または結合分子のクリアランスもしくは隔離に起因して50％低下するのに要する時間と定義され得る。半減期の薬物動態分析および決定の方法は、当業者によく知られている。詳細は、Kenneth, A et al. Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for PharmacistsおよびPeters et al, Pharmacokinete analysis: A Practical Approach (1996)において見出され得る。"Pharmacokinetics", M Gibaldi & D Perron, Marcel Dekker発行, 第2改定版 (1982)に対する参照もなされる。
【００９９】
本明細書に記載される結合分子は、好ましくは、対応する治療部分（すなわち、本明細書に記載されるような第3のドメインを含まない結合分子）それ自体の半減期よりも少なくとも1.5倍、好ましくは少なくとも2倍、例えば少なくとも5倍、例えば少なくとも10倍または20倍超長い半減期を有することが好ましい。
【０１００】
また、好ましくは、任意のそのような結合分子は、対応する治療部分それ自体の半減期と比較して1時間超、好ましくは2時間超、より好ましくは6時間超、例えば12時間超長い半減期を有する。
【０１０１】
また、好ましくは、任意のそのような結合分子は、対応する治療部分それ自体の半減期と比較して、1時間超、好ましくは2時間超、より好ましくは6時間超、例えば12時間超、例えば約1日間、2日間、1週間、2週間または3週間、かつ好ましくは2ヶ月間以下である半減期を有するが、後者の重要性は低いかもしれない。
【０１０２】
上記の基準に加えてまたはその代わりに、本発明は、1 mg.分/mlまたはそれ以上の範囲のAUC値（曲線下面積）を有する本発明にしたがう結合分子を含むリガンドまたは組成物を提供する。1つの態様において、その範囲の下限は、5、10、15、20、30、100、200または300 mg.分/mlである。加えてまたは代わりに、本発明にしたがう結合分子は、最大600 mg.分/mlの範囲のAUCを有する。1つの態様において、その範囲の上限は、500、400、300、200、150、100、75または50 mg.分/mlである。本発明にしたがう有利な結合分子は、以下からなる群より選択される範囲のAUCを有するであろう：15〜150 mg.分/ml、15〜100 mg.分/ml、15〜75 mg.分/mlおよび15〜50 mg.分/ml。
【０１０３】
本発明の1つの追加の局面において、結合分子は、10％ヒト血清アルブミン存在下でのエフェクター細胞による標的細胞の溶解を測定するインビトロアッセイにおいて細胞毒性活性を示す。
【０１０４】
本発明の結合分子の細胞毒性活性は、（T細胞表面上のT細胞CD3受容体複合体に結合することができる結合ドメインを介した）細胞毒性T細胞および（標的細胞上の細胞表面分子への結合を介した）標的細胞の誘引によって提供される。付属の実施例2は、10％ヒト血清アルブミン存在下で本発明の結合分子の細胞毒性活性を試験するのに適したインビトロアッセイの説明を提供する。
【０１０５】
本発明の好ましい局面において、結合分子は、単一ポリペプチド鎖からなる。そのような単鎖二重特異性結合分子の非限定的な例は、本明細書中以下に記載される二重特異性または2機能性抗体または免疫グロブリンの形式である。
【０１０６】
また、本発明の好ましい局面は、
（a）第1の結合ドメインが、抗体由来のVLおよびVH鎖を含み、かつ／または
（b）第2の結合ドメインが、抗体由来のVLおよびVH鎖を含む、
結合分子に関連する。
【０１０７】
好ましくは、「二重特異性」または「2機能性」抗体または免疫グロブリンは、2つの異なる重鎖／軽鎖の対および2つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体または免疫グロブリンである。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはFab'フラグメントの連結を含む様々な方法によって産生することができる。例えば、Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990)を参照のこと。抗体またはその抗原結合フラグメントの取得に関しては当業者に公知の多くの方法が利用可能である。例えば、抗体は、組み換えDNA法（米国特許第4,816,567号）を用いて産生することができる。モノクローナル抗体はまた、公知の方法にしたがうハイブリドーマの生成（例えば、Kohler and Milstein (1975) Nature, 256: 495-499を参照のこと）によって産生され得る。この様式で形成されるハイブリドーマは、次に、対象抗原に特異的に結合する抗体を産生する1つまたは複数のハイブリドーマを同定するために、標準的な方法、例えば酵素連結免疫吸着アッセイ（ELISA）および表面プラズモン共鳴（BIACORE（商標））分析を用いてスクリーニングされる。任意の形態の対象抗原、例えば、組み換え抗原、天然に存在する形態、それらの任意の変種またはフラグメントおよびそれらの抗原性ペプチド、が免疫原として使用され得る。
【０１０８】
抗体を作製する1つの例示的な方法は、タンパク質発現ライブラリ、例えばファージまたはリボソームディプレイライブラリ、のスクリーニングを含む。ファージディスプレイは、例えば、Ladnerらの米国特許第5,223,409号；Smith (1985) Science 228: 1315-1317; Clackson et al. (1991) Nature, 352: 624-628に記載されている。
【０１０９】
ディスプレイライブラリの使用に加えて、対象抗原は、非ヒト動物、例えばげっ歯類、例えばマウス、ハムスターまたはラットを免疫するために使用され得る。1つの態様において、非ヒト動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子の少なくとも一部分を含む。例えば、マウス抗体産生能を欠失しているマウス系統をヒトIg遺伝子座の大フラグメントを用いて改変することが可能である。ハイブリドーマ技術を用いて、所望の特異性を有する遺伝子由来の抗原特異的モノクローナル抗体が産生および選択され得る。例えば、XENOMOUSE（商標）、Green et al. (1994) Nature Genetics 7: 13-21、US 2003-0070185、WO96/34096およびWO96/33735を参照のこと。
【０１１０】
モノクローナル抗体は非ヒト動物から得ることができ、その後に、修飾された、例えばヒト化された、非免疫化（deimmunized）された、キメラ化されたものが、当技術分野で公知の組み換えDNA技術を用いて産生され得る。キメラ抗体を作製するための様々なアプローチが記載されている。例えば、Morrison et al., Proc. Natl. Acad. ScL U.S.A. 81: 6851, 1985; Takeda et al., Nature 314: 452, 1985, Cabillyらの米国特許第4,816,567号; Bossらの米国特許第4,816,397号; TanaguchiらのEP0171496；EP0173494、GB2177096を参照のこと。ヒト化抗体はまた、例えば、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子を発現するが内因性のマウス免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子を発現できないトランスジェニックマウスを用いて、産生され得る。Winterは、本明細書に記載されるヒト化抗体の調製に使用され得る例示的なCDR移植法を記載している（米国特許第5,225,539号）。特定のヒト抗体のCDRのすべてが非ヒトCDRの少なくとも一部分で置き換えられ得、またはCDRのいくつかのみが非ヒトCDRで置き換えられ得る。既定の抗原に対するヒト化抗体の結合に必要となる数のCDRを置き換えることのみが必要とされる。
【０１１１】
ヒト化抗体またはそのフラグメントは、抗原結合に直接関与しないFv可変ドメインの配列をヒトFv可変ドメイン由来の等価な配列で置き換えることによって生成され得る。ヒト化抗体またはそのフラグメントを生成するための例示的な方法は、Morrison (1985) Science 229: 1202-1207によって；Oi et al. (1986) BioTechniques 4: 214によって；ならびにUS5,585,089; US5,693,761; US5,693,762; US5,859,205；およびUS6,407,213によって提供される。これらの方法は、重鎖または軽鎖の少なくとも1つ由来の免疫グロブリンFv可変ドメインのすべてまたは一部分をコードする核酸配列の単離、操作および発現を含む。そのような核酸は、上記のような、既定の標的に対する抗体を産生するハイブリドーマから、およびその他の供給源から、入手され得る。ヒト化抗体分子をコードする組み換えDNAは、次いで、適当な発現ベクターにクローニングされ得る。
【０１１２】
ヒト化抗体は、保存的置換、コンセンサス配列置換、生殖系列置換および／または復帰変異の導入によって最適化され得る。そのような変更された免疫グロブリン分子は、当技術分野で公知の様々な技術のいずれかによって作製することができ（例えば、Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80: 7308-7312, 1983; Kozbor et al., Immunology Today, 4: 7279, 1983; Olsson et al., Meth. Enzymol., 92: 3-16, 1982）、かつEP 239 400の教示にしたがい作製され得る。
【０１１３】
抗体またはそのフラグメントはまた、ヒトT細胞エピトープの特異的欠失またはWO 98/52976およびWO 00/34317に開示される方法による「非免疫化」によって修飾され得る。簡潔に説明すると、抗体の重鎖および軽鎖可変ドメインが、MHCクラスIIに結合するペプチドについて分析され得；これらのペプチドが、（WO 98/52976およびWO 00/34317で定義されるように）潜在的T細胞エピトープである。WO 98/52976およびWO 00/34317に記載されるように、潜在的T細胞エピトープの検出のために、「ペプチドスレッディング（peptide threading）」と呼ばれるコンピューターモデリングアプローチが適用され得、加えて、ヒトMHCクラスII結合ペプチドのデータベースが、VHおよびVL配列に存在するモチーフについて検索され得る。これらのモチーフは、18個の主要MHCクラスII DRアロタイプのいずれかに結合し、したがって、潜在的T細胞エピトープを構成する。検出された潜在的T細胞エピトープは、可変ドメイン内の少数のアミノ酸残基を置換することによってまたは好ましくは単一アミノ酸置換によって除去され得る。典型的に、保存的置換が行われる。すべてではないが多くの場合、ヒト生殖系列抗体配列における位置に一般的なアミノ酸が使用され得る。ヒト生殖系列配列は、例えば、Tomlinson, et al. (1992) J. Mol. Biol. 227: 776-798; Cook, G.P. et al. (1995) Immunol. Today Vol. 16(5): 237-242;およびTomlinson et al. (1995) EMBO J. 14: 14: 4628-4638に開示されている。V BASEディレクトリは、（Tomlinson, LA. et al. MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UKによってコンパイルされた）ヒト免疫グロブリン可変領域配列の総合的なディレクトリを提供する。これらの配列は、例えばフレームワーク領域およびCDRのための、ヒト配列の供給源として、使用することができる。例えば米国特許第6,300,064号に記載されるような、コンセンサスヒトフレームワーク領域もまた使用することができる。
【０１１４】
VHおよびVLの対は共同で1つの抗原結合部位を形成する。VHに最も近いCHドメインはCH1と呼ばれる。各L鎖は、1つの共有結合的ジスルフィド結合によってH鎖に連結され、2つのH鎖は、H鎖のアイソタイプに依存して、1つまたは複数のジスルフィド結合によって相互に連結される。VHおよびVLドメインは、フレームワーク領域と呼ばれる4つの比較的保存された配列の領域（FR1、FR2、FR3およびFR4）からなり、これらが3つの超可変配列の領域（相補性決定領域、CDR）のスキャホールドを形成する。CDRは、抗体と抗原の特異的相互作用を担う残基の大部分を含んでいる。CDRは、CDR1、CDR2およびCDR3と称される。したがって、重鎖のCDR要素はH1、H2およびH3と称され、軽鎖のCDR要素はL1、L2およびL3と称される。
【０１１５】
「可変」という用語は、それらの配列における可変性（variability）を示し、個々の抗体の特異性および結合親和性の決定に関与する、免疫グロブリンドメインの一部分（すなわち、「可変ドメイン」）を表す。可変性は、抗体の可変ドメイン全体に均一に分布しているのではなく；それは重鎖および軽鎖の各々の可変領域の部分ドメインに集中している。これらの部分ドメインは、「超可変」領域または「相補性決定領域」（CDR）と呼ばれる。可変ドメインのより保存された（すなわち、非超可変）部分は、「フレームワーク」領域（FRM）と呼ばれる。天然に存在する重鎖および軽鎖の可変ドメインは各々、大部分がβシート配置をとっている4つのFRM領域を含んでおり、これらが、ループ接続を形成し、いくつかの例ではβシート構造の一部を形成する3つの超可変領域によって接続されている。各鎖の超可変領域は、FRMによって近接状態になってまとめられて保持されており、他の鎖の超可変領域と共に、抗原結合部位の形成に寄与している（Kabat et al., loc. cit.を参照のこと）。定常ドメインは、抗原結合に直接関与しないが、様々なエフェクター機能、例えば抗体依存的細胞媒介細胞毒性および補体活性化、を示す。
【０１１６】
本発明の結合分子において、第1および第2のドメインが(scFv)2、(単一ドメインmAb)2、scFv-単一ドメインmAb、ダイアボディまたはこれらのオリゴマーからなる群より選択される分子を形成していることも好ましい。
【０１１７】
「CDR」という用語およびその複数形は、相補性決定領域（CDR)を表し、そのうちの3つが軽鎖可変領域の結合特性を構成し（CDRL1、CDRL2およびCDRL3）、3つが重鎖可変領域の結合特性を構成する（CDRH1、CDRH2およびCDRH3）。CDRは、抗体分子の機能的活性に寄与し、スキャホールドまたはフレームワーク領域を含むアミノ酸配列によって分断されている。厳密なCDRの境界および長さは、分類および番号付け体系によって異なる。したがってCDRは、本明細書に記載される番号付け体系を含む、Kabat、Chothia、接触（contact）または任意のその他の境界の定義によって表され得る。境界が異なるとしても、これらの体系の各々は、可変配列内のいわゆる「超可変領域」を構成する部分に関してある程度重複している。したがって、これらの体系にしたがうCDRの定義は、長さおよび隣接するフレームワーク領域との境界領域の点で異なり得る。例えば、Kabat、Chothiaおよび／またはMacCallum（Kabat et al., loc. cit.; Chothia et al., J. Mol. Biol, 1987, 196: 901; およびMacCallum et al., J. Mol. Biol, 1996, 262: 732）を参照のこと。しかし、いわゆるKabat体系にしたがう番号付けが好ましい。
【０１１８】
「アミノ酸」または「アミノ酸残基」という用語は、典型的に、その当技術分野で知られている定義を有するアミノ酸、例えば、アラニン（AlaまたはA）；アルギニン（ArgまたはR）；アスパラギン（AsnまたはN）；アスパラギン酸（AspまたはD）；システイン（CysまたはC）；グルタミン（GlnまたはQ）；グルタミン酸（GluまたはE）；グリシン（GlyまたはG）；ヒスチジン（HisまたはH）；イソロイシン（HeまたはI）；ロイシン（LeuまたはL）；リジン（LysまたはK）；メチオニン（MetまたはM）；フェニルアラニン（PheまたはF）；プロリン（ProまたはP）；セリン（SerまたはS）；スレオニン（ThrまたはT）；トリプトファン（TrpまたはW）；チロシン（TyrまたはY）；およびバリン（ValまたはV）からなる群より選択されるアミノ酸を表すが、望ましい場合は修飾、合成または希少アミノ酸も使用され得る。一般に、アミノ酸は、非極性側鎖（例えば、Ala、Cys、He、Leu、Met、Phe、Pro、Val）；負荷電側鎖（例えば、Asp、Glu）；正荷電側鎖（例えば、Arg、His、Lys）；または非荷電極性側鎖（例えば、Asn、Cys、Gln、Gly、His、Met、Phe、Ser、Thr、TrpおよびTyr）を有する点でグループ化され得る。
【０１１９】
「超可変領域」という用語（「相補性決定領域」またはCDRとしても公知）は、本明細書で使用される場合、抗原結合部位を形成しかつ抗原特異性の主要決定基である、免疫グロブリンのV領域ドメイン内の（通常、極めて高い配列可変性を示す3つまたは4つの短い領域である）抗体のアミノ酸残基を表す。CDR残基を同定する方法は少なくとも2つ存在する：（1）種間配列可変性に基づくアプローチ（すなわち、Kabat et al., loc. cit.）；および（2）抗原・抗体複合体の結晶学研究に基づくアプローチ（Chothia C. et al., J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)）。しかし、2つの残基同定技術が同一領域ではない重複する領域を定義する程度まで、それらを、ハイブリッドCDRを定義するために組み合わせることができる。しかし、一般に、CDR残基は、好ましくは、いわゆるKabat（番号付け）体系にしたがい同定される。
【０１２０】
「フレームワーク領域」という用語は、よりばらつきのある（すなわち、超可変性の）CDRの間に存在する、抗体可変領域の当技術分野で知られている部分を表す。そのようなフレームワーク領域は、典型的に、フレームワーク1〜4（FR1、FR2、FR3およびFR4）と称され、6つのCDR（重鎖の3つおよび軽鎖の3つ）を3次元空間に提示し抗原結合表面を形成するためのスキャホールドを提供する。
【０１２１】
典型的に、CDRは、カノニカル構造に分類され得るループ構造を形成する。「カノニカル構造」という用語は、抗原結合（CDR）ループによって採用される主鎖の立体構造を表す。多くの構造研究により、6つの抗原結合ループのうちの5つは、利用可能な立体構造に関して限られたレパートリーしか有さないことが見出された。各カノニカル構造は、ポリペプチド骨格のねじれ角によって特徴づけることができる。したがって抗体間で対応するループは、それらのループの大部分において高度のアミノ酸配列可変性がみられるにもかかわらず、非常によく似た3次元構造を有し得る（各々全体が参照により本明細書に組み入れられる、Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 1987, 196: 901; Chothia et al., Nature, 1989, 342: 877; Martin and Thornton, J. Mol. Biol, 1996, 263: 800）。さらに、採用されるループ構造とその周囲のアミノ酸配列の間に関連性がある。特定のカノニカルクラスの立体構造は、ループの長さならびにそのループ内および保存されたフレームワーク内（すなわち、ループ外）の鍵となる位置に存在するアミノ酸残基によって決定される。したがって、特定のカノニカルクラスへの割り当ては、これらの鍵となるアミノ酸残基の存在に基づいてなされ得る。「カノニカル構造」という用語はまた、例えばKabatによるカタログ（Kabat et al., loc. cit.）にあるように、抗体の直線配列に対する考慮を含み得る。Kabatの番号付けスキーム（体系）は、抗体可変ドメインのアミノ酸残基の番号付けを共通の様式で行うために広く採用されている標準であり、本明細書の他所でも述べられているように本発明に適用される好ましいスキームである。さらなる構造の考慮も、抗体のカノニカル構造を決定するために使用され得る。例えば、Kabatの番号付けによっては十分に反映されない違いは、Chothiaらの番号付け体系によって説明され得および／またはその他の技術、例えば結晶学および2次元もしくは3次元コンピューターモデリング、によって明らかにされ得る。したがって、所定の抗体配列は、（例えば、様々なカノニカル構造をライブラリに含めたいという要望に基づき）特に適当なシャーシ（chassis）配列を見出すことができるカノニカルクラスに分類され得る。抗体のアミノ酸配列のKabatの番号付けおよびChothia et al., loc. cit.により記載される構造の考慮ならびに抗体構造のカノニカルな局面を解釈するためのそれらの含意は、文献に記載されている。
【０１２２】
CDR3は、典型的に、抗体結合部位における分子的多様性の最大の供給源である。例えば、H3は、2つのアミノ酸残基という短いものまたは26アミノ酸より大きなものであり得る。様々なクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および3次元構造が、当技術分野で周知である。抗体構造の見直しをする際には、Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, eds. Harlow et al., 1988を参照されたい。当業者は、各サブユニット構造、例えばCH、VH、CL、VL、CDR、FR構造が、活性フラグメント、例えば抗原に結合するVH、VLもしくはCDRサブユニットの一部分、すなわち抗原結合フラグメント、または例えば、例えばFc受容体および／もしくは補体に結合するおよび／もしくはこれを活性化するCHサブユニットの一部分、を含むことを理解しているであろう。CDRは、典型的に、Sequences of Proteins of immunological Interest, US Department of Health and Human Services (1991), eds. Kabat et al.に記載されるようなKabat CDRを表す。抗原結合部位を特徴づける別の標準は、Chothiaによって記載される超可変ループを参照することである。例えば、Chothia, et al. (1987; J. Mol. Biol. 227; 799-817）；およびTomlinson et al. (1995) EMBO J. 14: 4628-4638を参照のこと。さらに別の標準は、Oxford MolecularのAbM抗体モデリングソフトウェアによって使用されるAbM定義である。例えば、概要については、Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. In: Antibody Engineering Lab Manual (Ed.: Duebel, S. and Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg)を参照のこと。Kabat CDRに基づいて説明される態様は、代替的に、Chothia超可変ループまたはAbM定義のループに基づいて同様に説明される関係を用いて実施され得る。
【０１２３】
アセンブリおよび体細胞変異後の抗体遺伝子の配列は高度に多様化しており、これらの多様化した遺伝子は1010個の異なる抗体分子をコードすると見積もられる（Immunoglobulin Genes, 2nd ed., eds. Jonio et al., Academic Press, San Diego, CA, 1995）。免疫系はそのようにして免疫グロブリンのレパートリーを提供する。「レパートリー」という用語は、少なくとも1つの免疫グロブリンをコードする少なくとも1つの配列から全体がまたは一部が派生した少なくとも1つのヌクレオチド配列を表す。これらの配列は、インビボでの重鎖のV、DおよびJセグメントならびに軽鎖のVおよびJセグメントの再配置によって生成され得る。あるいは、これらの配列は、再配置を起こさせるもの、例えばインビトロ刺激、に応じて細胞から生成され得る。あるいは、これらの配列の一部またはすべてが、DNAスプライシング、ヌクレオチド合成、変異誘発およびその他の方法によって取得され得る、例えば、米国特許第5,565,332号を参照のこと。レパートリーは、1つのみの配列を含み得、または多種遺伝子コレクションの配列を含む、複数の配列を含み得る。
【０１２４】
本発明のさらに好ましい局面において、第1および／または第2の結合ドメインのVLおよびVH鎖は、それらの免疫原性もしくは結合親和性に関してヒト化され、脱免疫化されおよび／またはその他の方法で最適化される。
【０１２５】
本発明の結合分子の1つの局面において、結合分子は、1つまたは複数のさらなる異種ポリペプチドを含む。この文脈で使用される場合の「異種」は、異種ポリペプチド配列のアミノ酸配列が、そのさらなる異種ポリペプチドを含む本発明の結合分子のアミノ酸配列と異なることを意味する。異種ポリペプチドは、好ましくは、HAタグ、myc6タグ、flagタグ、strepタグ、strepIIタグ、TAPタグ、HATタグ、キチン結合ドメイン（CBD）、マルトース結合タンパク質、免疫グロブリンA（IgA）、His-6タグ、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）タグ、インテイン、ストレプトアビジン結合タンパク質（SBP）タグ、StrepタグおよびStrepIIタグからなる群より選択される。好ましいものではないが、異種ポリペプチドが抗体のFc領域であり得ることも想定されている。
【０１２６】
上記の定義に沿って、異種ペプチドは、結合分子の単離の助けとなるドメインであり得、単離法、例えば単離カラムにおいて捕捉され得るペプチドモチーフまたは2次的導入部分から選択され得る。そのような追加のドメインの非限定的な態様は、Mycタグ、HATタグ、HAタグ、TAPタグ、GSTタグ、キチン結合ドメイン（CBDタグ）、マルトース結合タンパク質（MBPタグ）、Flagタグ、Strepタグおよびそれらの変種（例えば、StrepIIタグ）ならびにHisタグとして公知のペプチドモチーフを含む。本明細書に開示される結合分子はすべて、分子のアミノ酸配列内の連続するHis残基、好ましくは6個のHis残基の反復として一般に公知のHisタグドメインを含むことが好ましい。
【０１２７】
また、本発明の1つの局面において、細胞表面分子に結合することができる結合分子の第1の結合ドメインは、腫瘍抗原に結合するものである。
【０１２８】
本明細書で使用される「腫瘍抗原」という用語は、腫瘍細胞上に提示される抗原であると理解され得る。これらの抗原は、細胞外部分を細胞表面上に提示するものであり得、これは多くの場合、その分子の膜貫通および細胞質部分につながっている。これらの抗原は、ときどき、腫瘍細胞によってのみ提示され得、正常な細胞によっては提示されない。腫瘍抗原は、専ら腫瘍細胞において発現され得、または正常細胞と比較して腫瘍特異的な変異を示し得る。この場合、それらは、腫瘍特異的抗原と呼ばれる。より一般的なものは、腫瘍細胞および正常細胞によって提示される抗原であり、それらは腫瘍関連抗原と呼ばれる。これらの腫瘍関連抗原は、正常細胞と比較して過剰発現され得るか、または、正常組織と比較して腫瘍組織の構造がコンパクトでないために腫瘍細胞では抗体結合に利用可能となっているものである。
【０１２９】
また、本発明の結合分子の1つの局面において、T細胞CD3受容体複合体に結合することができる第2の結合ドメインは、ヒトおよびコモンマーモセット、ワタボウシタマリンまたはコモンリスザルのCD3ε鎖のエピトープに結合することができ、該エピトープは、SEQ ID NO:2、4、6または8からなる群に含まれるアミノ酸配列の一部でありかつ少なくともアミノ酸配列Gln-Asp-Gly-Asn-Gluを含む。
【０１３０】
本発明の別の局面において、第2の結合ドメインは、CD3イプシロンに結合できる。本発明のさらに別の局面において、第2の結合ドメインは、ヒトCD3およびマカクCD3、好ましくはヒトCD3イプシロンおよびマカクCD3イプシロンに結合できる。付加的にまたは代替的に、第2の結合ドメインは、コモンマーモセット、ワタボウシタマリンおよび／またはコモンリスザルのCD3イプシロンに結合できる。これらの態様にしたがい、本発明の結合分子の一方または両方の結合ドメインは、好ましくは、霊長類の哺乳動物目のメンバーに対して種間特異的（cross-species specific）である。種間特異的CD3結合ドメインは、例えば、WO 2008/119567に記載されている。
【０１３１】
T細胞CD3受容体複合体に結合できる第2の結合ドメインが、
（a）WO 2008/119567のSEQ ID NO: 27に示されるCDR-L1、WO 2008/119567のSEQ ID NO: 28に示されるCDR-L2およびWO 2008/119567のSEQ ID NO: 29に示されるCDR-L3；
（b）WO 2008/119567のSEQ ID NO: 117に示されるCDR-L1、WO 2008/119567のSEQ ID NO: 118に示されるCDR-L2およびWO 2008/119567のSEQ ID NO: 119に示されるCDR-L3；ならびに
（c）WO 2008/119567のSEQ ID NO: 153に示されるCDR-L1、WO 2008/119567のSEQ ID NO: 154に示されるCDR-L2およびWO 2008/119567のSEQ ID NO: 155に示されるCDR-L3
から選択されるCDR-L1、CDR-L2およびCDR-L3を含むVL領域を含む本発明の結合分子が、特に好ましい。
【０１３２】
本発明の結合分子の代替の好ましい態様において、T細胞CD3受容体複合体に結合できる第2の結合ドメインは：
（a）WO 2008/119567のSEQ ID NO: 12に示されるCDR-H1、WO 2008/119567のSEQ ID NO: 13に示されるCDR-H2およびWO 2008/119567のSEQ ID NO: 14に示されるCDR-H3；
（b）WO 2008/119567のSEQ ID NO: 30に示されるCDR-H1、WO 2008/119567のSEQ ID NO: 31に示されるCDR-H2およびWO 2008/119567のSEQ ID NO: 32に示されるCDR-H3；
（c）WO 2008/119567のSEQ ID NO: 48に示されるCDR-H1、WO 2008/119567のSEQ ID NO: 49に示されるCDR-H2およびWO 2008/119567のSEQ ID NO: 50に示されるCDR-H3；
（d）WO 2008/119567のSEQ ID NO: 66に示されるCDR-H1、WO 2008/119567のSEQ ID NO: 67に示されるCDR-H2およびWO 2008/119567のSEQ ID NO: 68に示されるCDR-H3；
（e）WO 2008/119567のSEQ ID NO: 84に示されるCDR-H1、WO 2008/119567のSEQ ID NO: 85に示されるCDR-H2およびWO 2008/119567のSEQ ID NO: 86に示されるCDR-H3；
（f）WO 2008/119567のSEQ ID NO: 102に示されるCDR-H1、WO 2008/119567のSEQ ID NO: 103に示されるCDR-H2およびWO 2008/119567のSEQ ID NO: 104に示されるCDR-H3；
（g）WO 2008/119567のSEQ ID NO: 120に示されるCDR-H1、WO 2008/119567のSEQ ID NO: 121に示されるCDR-H2およびWO 2008/119567のSEQ ID NO: 122に示されるCDR-H3；
（h）WO 2008/119567のSEQ ID NO: 138に示されるCDR-H1、WO 2008/119567のSEQ ID NO: 139に示されるCDR-H2およびWO 2008/119567のSEQ ID NO: 140に示されるCDR-H3；
（i）WO 2008/119567のSEQ ID NO: 156に示されるCDR-H1、WO 2008/119567のSEQ ID NO: 157に示されるCDR-H2およびWO 2008/119567のSEQ ID NO: 158に示されるCDR-H3；ならびに
（j）WO 2008/119567のSEQ ID NO: 174に示されるCDR-H1、WO 2008/119567のSEQ ID NO: 175に示されるCDR-H2およびWO 2008/119567のSEQ ID NO: 176に示されるCDR-H3
から選択されるCDR-H1、CDR-H2およびCDR-H3を含むVH領域を含む。
【０１３３】
T細胞CD3受容体複合体に結合できる第2の結合ドメインが、WO 2008/119567のSEQ ID NO: 35、39、125、129、161または165に示されるVL領域からなる群より選択されるVL領域を含む本発明の結合分子が、さらに好ましい。
【０１３４】
T細胞CD3受容体複合体に結合できる第2の結合ドメインが、WO 2008/119567のSEQ ID NO: 15、19、33、37、51、55、69、73、87、91、105、109、123、127、141、145、159、163、177または181に示されるVH領域からなる群より選択されるVH領域を含むことが、代替的に好ましい。
【０１３５】
より好ましくは、本発明の結合分子は：
（a）WO 2008/119567のSEQ ID NO: 17または21に示されるVL領域およびWO 2008/119567のSEQ ID NO: 15または19に示されるVH領域；
（b）WO 2008/119567のSEQ ID NO: 35または39に示されるVL領域およびWO 2008/119567のSEQ ID NO: 33または37に示されるVH領域；
（c）WO 2008/119567のSEQ ID NO: 53または57に示されるVL領域およびWO 2008/119567のSEQ ID NO: 51または55に示されるVH領域；
（d）WO 2008/119567のSEQ ID NO: 71または75に示されるVL領域およびWO 2008/119567のSEQ ID NO: 69または73に示されるVH領域；
（e）WO 2008/119567のSEQ ID NO: 89または93に示されるVL領域およびWO 2008/119567のSEQ ID NO: 87または91に示されるVH領域；
（f）WO 2008/119567のSEQ ID NO: 107または111に示されるVL領域およびWO 2008/119567のSEQ ID NO: 105または109に示されるVH領域；
（g）WO 2008/119567のSEQ ID NO: 125または129に示されるVL領域およびWO 2008/119567のSEQ ID NO: 123または127に示されるVH領域；
（h）WO 2008/119567のSEQ ID NO: 143または147に示されるVL領域およびWO 2008/119567のSEQ ID NO: 141または145に示されるVH領域；
（i）WO 2008/119567のSEQ ID NO: 161または165に示されるVL領域およびWO 2008/119567のSEQ ID NO: 159または163に示されるVH領域；ならびに
（j）WO 2008/119567のSEQ ID NO: 179または183に示されるVL領域およびWO 2008/119567のSEQ ID NO: 177または181に示されるVH領域；
からなる群より選択されるVL領域およびVH領域を含むT細胞CD3受容体複合体に結合できる第2の結合ドメインによって特徴づけられる。
【０１３６】
本発明の結合分子、特にT細胞CD3受容体複合体に結合できる第2の結合ドメインの好ましい態様にしたがい、VH領域およびVL領域の対は、単鎖抗体（scFv）の形式にされる。VHおよびVL領域は、VH-VLまたはVL-VHの順で配列される。VH領域がリンカー配列のN末端側に配置されることが好ましい。VL領域は、リンカー配列のC末端側に配置される。
【０１３７】
上記の本発明の結合分子の好ましい態様は、WO 2008/119567のSEQ ID NO: 23、25、41、43、59、61、77、79、95、97、113、115、131、133、149、151、167、169、185または187からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むT細胞CD3受容体複合体に結合できる第2の結合ドメインによって特徴づけられる。
【０１３８】
1つの態様において、本発明の結合分子は、SEQ ID NO: 51、52、54、55、57、58、60、61、75、76、81、82、85、86、90、91、85、96、100、または101に示されるアミノ酸配列によって特徴づけられる。
【０１３９】
本発明の結合分子は、好ましくは、「単離された」結合分子である。本明細書に開示される結合分子を説明するために使用される「単離された」は、その生産環境の成分から特定され、分離されおよび／または回収された結合分子を意味する。好ましくは、単離された結合分子は、その生産環境由来のすべての他の成分を伴わないものである。その生産環境の混入成分、例えば組み換えトランスフェクト細胞から生じたものは、典型的にそのポリペプチドの診断的または治療的利用を妨げるであろう物質であり、酵素、ホルモンおよびその他のタンパク質性または非タンパク質性の溶質を含み得る。好ましい態様において、結合分子は、（1）スピンカップ式配列決定装置の使用によって少なくとも15残基のN末端もしくは内部アミノ酸配列を得るのに十分な程度まで、または（2）クマシーブルーもしくは好ましくは銀染色を用いる非還元または還元条件下でのSDS-PAGEによって均質になるまで、精製される。しかし、通常、単離された抗体は、少なくとも1つの精製工程によって調製される。
【０１４０】
本明細書に記載される結合分子のアミノ酸配列修飾が考慮に入れられる。例えば、抗体の結合親和性および／またはその他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。結合分子のアミノ酸配列変種は、結合分子の核酸に適当なヌクレオチド変化を導入することによってまたはペプチド合成によって調製される。
【０１４１】
そのような修飾は、例えば、結合分子のアミノ酸配列内の残基の欠失および／または挿入および／または置換を含む。最終コンストラクトが所望の特性を保持する限り、欠失、挿入および置換の任意の組み合わせが、その最終コンストラクトに到達するためになされる。アミノ酸の変化はまた、結合分子の翻訳後プロセスを変更し得る、例えば、グリコシル化部位の数または位置を変化させ得る。好ましくは、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個のアミノ酸がCDRにおいて置換され得、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20または25個のアミノ酸がフレームワーク領域（FR）において置換され得る。置換は、好ましくは、本明細書に記載されるような保存的置換である。付加的にまたは代替的に、1、2、3、4、5または6個のアミノ酸がCDRの各々において挿入または欠失され得（当然、それらの長さに依存して）、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20または25個のアミノ酸がFRの各々において挿入または欠失され得る。
【０１４２】
変異誘発に好ましい位置である結合分子の特定の残基または領域の同定に有用な方法は、Science, 244: 1081-1085 (1989)においてCunningham and Wellsによって記載されるように「アラニンスキャン変異誘発」と呼ばれるものである。この方法では、結合分子内の残基または標的残基群が、同定され（例えば、荷電残基、例えばarg、asp、his、lysおよびglu）、そしてエピトープに対するそのアミノ酸の相互作用に影響を与えるよう、中性または負荷電アミノ酸（最も好ましくは、アラニンまたはポリアラニン）で置き換えられる。
【０１４３】
この置換に対して機能的感受性を示すアミノ酸位置は、次いで、その置換部位にまたは置換部位のためにさらなるまたはその他の変種を導入することによって厳選される。したがって、アミノ酸配列変種の導入部位は予め決定されるが、変異の性質自体は予め決定される必要はない。例えば、所定部位における変異の働きを分析するため、alaスキャンまたは無作為変異誘発が標的のコドンまたは領域において行われ、そして発現される結合分子の変種が所望の活性についてスクリーニングされる。
【０１４４】
好ましくは、アミノ酸配列挿入は、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10残基〜100残基またはそれ以上を含むポリペプチドの長さの範囲の、アミノおよび／またはカルボキシル末端融合ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。結合分子の挿入変種は、酵素への抗体のNまたはC末端の融合または抗体の血清半減期を増加させるポリペプチドへの融合を含む。
【０１４５】
別のタイプの変種は、アミノ酸置換変種である。これらの変種は、好ましくは、結合分子の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個のアミノ酸残基が異なる残基で置き換えられたものである。置換変異誘発に関する最大の関心対象の部位は、重鎖および／または軽鎖のCDR、特に超可変領域を含むが、重鎖および／または軽鎖におけるFRの変更もまた考慮に入れられる。
【０１４６】
例えば、CDR配列が6個のアミノ酸を含む場合、これらのアミノ酸のうちの1、2または3個が置換されることが想定される。同様に、CDR配列が15個のアミノ酸を含む場合、これらのアミノ酸の1、2、3、4、5または6個が置換されることが想定される。
【０１４７】
一般に、重鎖および／または軽鎖のCDRの1つもしくは複数またはすべてにおいてアミノ酸が置換される場合、それによって得られる「置換された」配列が「当初の」CDR配列と少なくとも60％同一であることが好ましく、より好ましくは65％、さらにより好ましくは70％、特別に好ましくは75％、より特別に好ましくは80％である。これは、それがどの程度「置換された」配列と同一であるのかがCDRの長さに依存することを意味する。例えば、5アミノ酸を有するCDRは、少なくとも1つのアミノ酸が置換される場合、好ましくはその置換されたアミノ酸配列と少なくとも80％同一である。したがって、結合分子のCDRは、それらの置換された配列に対して異なる程度の同一性を有し得る、例えば、CDRL1は80％を有し得、CDRL3は90％を有し得る。
【０１４８】
好ましい置換（または置き換え）は、保存的置換である。しかし、結合分子が第1の結合ドメインを通じて標的細胞上の表面分子に結合し第2の結合ドメインを通じてT細胞上のCD3受容体複合体に結合する能力を保持する限りおよび／またはそのCDRがそのように置換される配列に対して同一性を有する（「当初」のCDR配列に対して少なくとも60％、より好ましくは65％、さらにより好ましくは70％、特別に好ましくは75％、さらに特別に好ましくは80％同一である）限り、任意の置換（非保存的置換または以下の表2に列挙される「例示的な置換」の1つもしくは複数を含む）が想定されている。
【０１４９】
保存的置換は、表2の「好ましい置換」という見出しの下に示されている。そのような置換が生物学的活性を変化させる場合、表2で「例示的な置換」として挙げられたまたはアミノ酸クラスに関して以下にさらに記載されるようなより実質的な変更が導入され、そしてその生産物が所望の特性についてスクリーニングされ得る。
【０１５０】
（表２）アミノ酸置換
2018138558.tif 000003
【０１５１】
本発明の結合分子の生物学的特性の実質的修飾は、（a）置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシートもしくはらせん立体構造、（b）標的部位における分子の電荷もしくは疎水性、または（c）側鎖のかさ高さ、の維持に対するそれらの効果が有意に異なる置換を選択することによって達成される。天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づきグループ分けされる：（1）疎水性：ノルロイシン、met、ala、val、leu、ile；（2）中性親水性；cys、ser、thr；（3）酸性：asp、glu；（4）塩基性：asn、gin、his、lys、arg；（5）鎖の配向性に影響する残基：gly、pro；および（6）芳香族：trp、tyr、phe。
【０１５２】
非保存的置換は、これらのクラスのうちの1つのメンバーから別のクラスのメンバーへの交換を伴うものであろう。結合分子の適切な立体構造の維持に関与しない任意のシステイン残基は、その分子の酸化安定性を改善し異常な架橋を防ぐために、通常セリンで置換され得る。逆に、システイン結合は、抗体に対して、その安定性（特にその抗体が抗体フラグメント、例えばFvフラグメントである場合）を改善するために添加され得る。
【０１５３】
特に好ましいタイプの置換変種は、親抗体（例えば、ヒト化またはヒト抗体）の1つまたは複数の超可変領域残基の置換を含むものである。通常、さらなる開発のために選択される得られた変種は、それらの起源となった親抗体に比して改善された生物学的特性を有するものであろう。そのような置換変種を生成する簡便な方法は、ファージディスプレイを用いる親和性成熟を含む。簡潔に説明すると、いくつかの超可変領域部位（例えば、6〜7部位）が、各部位ですべての可能性のあるアミノ酸置換が生成されるよう変異される。そのようにして生成された抗体変種は、1価の形態で、繊維状ファージ粒子から、各粒子内にパッケージングされたM13の遺伝子III産物との融合物として提示される。ファージディプレイされた変種は、次に、修飾のための超可変領域部位候補を同定するために、本明細書に開示されるようにしてそれらの生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされ、抗原結合に有意に寄与する超可変領域残基を同定するために、アラニンスキャン変異誘発が行われ得る。あるいはまたは加えて、結合ドメインと例えば標的細胞上の表面分子およびT細胞上のCD3受容体複合体との間の接触点を同定するために、抗原・抗体複合体の結晶構造を分析することが有益であり得る。そのような接触残基および隣接残基は、本明細書で詳述される技術にしたがう置換の候補である。そのような変種が生成された後、変種のパネルが本明細書に記載されるスクリーニングに供され、そして1つまたは複数の関連するアッセイにおいて優れた特性を示す抗体が、さらなる開発のために選択され得る。
【０１５４】
結合分子のその他の修飾も本明細書で考慮に入れられる。例えば、結合分子は、様々な非タンパク質性ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリアルキレンまたはポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールのコポリマー、の1つに連結され得る。結合分子はまた、例えばコアセルベーション技術によってまたは界面重合によって調製されたマイクロカプセル（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）に、コロイド薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフィア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）に、またはマクロエマルジョンに捕捉され得る。そのような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A., Ed.,(1980)に開示されている。
【０１５５】
本明細書に開示される結合分子はまた、免疫リポソームとして処方され得る。「リポソーム」は、哺乳動物への薬物送達に有用な様々なタイプの脂質、リン脂質および／または界面活性剤から構成される小さな小胞である。リポソームの成分は通常、生体膜の脂質の配置と同様の2重層の形式で配置される。抗体を含むリポソームは、例えば、Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); 米国特許第4,485,045号および同第4,544,545号；ならびに1997年10月23日公開のWO 97/38731に記載されるような当技術分野で公知の方法によって調製される。循環時間が強化されたリポソームは、米国特許第5,013,556号に開示されている。特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびPEG誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（PEG-PE）を含む脂質組成物を用いる逆相蒸発法によって生成され得る。リポソームは、所望の直径のリポソームを得るために、規定の孔サイズのフィルターを通して押出しされる。本発明の抗体のFab'フラグメントは、ジスルフィド交換反応を通じてMartin et al. J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982)に記載されるようなリポソームにコンジュゲートされ得る。場合により、化学療法剤がリポソーム内に含められる。Gabizon et al. J. National Cancer Inst. 81 (19) 1484 (1989)を参照のこと。
【０１５６】
組み換え技術を用いる場合、結合分子は、ペリプラズム間隙で細胞内産生され得、または培地に直接分泌され得る。結合分子が細胞内産生される場合、最初の工程として、宿主細胞または溶解したフラグメントのいずれかの粒状の残骸が、例えば遠心分離または限外ろ過によって除去される。Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)は、大腸菌（E.coli）のペリプラズム間隙に分泌された抗体を単離する手順を記載している。
【０１５７】
細胞から調製される結合分子組成物は、例えばヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析および親和性クロマトグラフィーを用いて精製され得、親和性クロマトグラフィーが好ましい精製技術である。
【０１５８】
さらなる局面において、本発明は、本発明の結合分子をコードする核酸配列に関する。本発明の結合分子がヘテロ2量体またはヘテロ多量体である場合、当該結合分子が2つ以上の核酸配列/分子によって、例えば単一ポリペプチド鎖のそれぞれに対して1つの核酸配列/分子によってコードされ得ることも想定される。
【０１５９】
「核酸」という用語は、当業者に周知であり、DNA（例えば、cDNA）およびRNA（例えば、mRNA）を含む。核酸は、2本鎖および1本鎖であり得る。核酸分子は、好ましくは、好ましくは宿主細胞の中に含まれる、ベクターの中に含まれる。宿主細胞は、例えば、本発明の核酸配列を用いた形質転換またはトランスフェクションの後に、結合分子を発現することができる。その目的で、核酸分子は、制御配列に機能的に連結される。
【０１６０】
本発明の代替の局面は、本明細書において上記で定義された核酸配列を含む、ベクターである。ベクターは、（外来）遺伝子物質を細胞内に運搬するためのビヒクルとして使用される核酸分子である。「ベクター」という用語は、プラスミド、ウイルス、コスミドおよび人工染色体を含むがこれらに制限されない。一般に、工学ベクターは、複製起点、マルチクローニング部位および選択マーカーを含む。ベクター自体は、一般に、インサート（導入遺伝子）およびベクターの「骨格」の役割をするより大きな配列を含むヌクレオチド配列、通常DNA配列である。最近のベクターは、導入遺伝子インサートおよび骨格に加えて追加の特徴：プロモーター、遺伝子マーカー、抗生物質耐性、レポーター遺伝子、標的化配列、タンパク質精製タグを含み得る。発現ベクター（発現コンストラクト）と呼ばれるベクターは特に、標的細胞において導入遺伝子を発現させるためのものであり、一般に、制御配列、例えば導入遺伝子の発現を促すプロモーター配列を有する。標的細胞へのベクターの投入は、通常、細菌細胞の場合は「形質転換」、真核生物細胞の場合は「トランスフェクション」と呼ばれるが、ウイルスベクターの投入は「形質導入」とも呼ばれる。
【０１６１】
さらに、本発明の代替の局面は、本明細書において上記で定義された核酸配列により形質転換またはトランスフェクトされた、宿主細胞である。本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、本発明の結合分子をコードする核酸が形質転換、トランスフェクション等によって導入される細胞を表すことが意図されている。そのような用語は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫または潜在的子孫も表すことを理解されたい。後続の世代では変異または環境の影響のいずれかにより一定の修飾が起こり得るので、そのような子孫は、実際には、その親細胞と同一ではないかもしれないが、そうであっても本明細書で使用される場合はこの用語の範囲に含まれる。
【０１６２】
本明細書で使用される場合、「発現」という用語は、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾および分泌を含むがこれらに限定されない、本発明の結合分子の産生に関与する任意の工程を含む。
【０１６３】
「制御配列」という用語は、機能的に連結されたコード配列を特定の宿主生物において発現させるのに必要なDNA配列を表す。原核生物に適した制御配列は、例えば、プロモーター、場合によりオペレーター配列およびリボソーム結合部位を含む。真核生物細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーを利用することが公知である。
【０１６４】
核酸は、それが別の核酸配列との機能的関係の下に置かれている場合、「機能的に連結」されている。例えば、プレ配列もしくは分泌リーダーのためのDNAがポリペプチドのためのDNAに機能的に連結されているのは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合であり；プロモーターもしくはエンハンサーがコード配列に機能的に連結されているのは、それがその配列の転写に影響する場合であり；またはリボソーム結合部位がコード配列に機能的に連結されているのは、それが翻訳を促進するよう配置される場合である。一般に、「機能的に連結」は、連結されるDNA配列が連続していること、および、分泌リーダーの場合は、連続しかつリーディングフェーズ内にあることを意味する。しかし、エンハンサーは、連続している必要がない。連結は、都合の良い制限部位でのライゲーションによって達成される。そのような部位が存在しない場合、従来の実務にしたがい、合成性のオリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが使用される。
【０１６５】
「宿主細胞」、「標的細胞」または「レシピエント細胞」という用語は、ベクターまたは外因性の核酸分子、ポリヌクレオチドおよび／もしくはタンパク質の組み込みのためのレシピエントであり得るまたはすでにレシピエントとなっている任意の個々の細胞または細胞培養物を含むことが意図されている。それはまた1つの細胞の子孫を含むことも意図されており、その子孫は、自然、偶発的または計画的変異により、必ずしも元の親細胞と（形態またはゲノムもしくは総DNAの補完性の点で）完全に同一でないかもしれない。細胞は原核生物細胞または真核生物細胞であり得、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、動物細胞および哺乳動物細胞、例えばマウス、ラット、マカクまたはヒトを含むがこれらに限定されない。
【０１６６】
適当な宿主細胞は、原核生物ならびに酵母、真菌、昆虫細胞および哺乳動物細胞を含む真核生物宿主細胞を含む。
【０１６７】
本発明の結合分子は、細菌において産生され得る。発現後、本発明の結合分子、好ましくは結合分子は、溶液画分において大腸菌細胞ペーストから単離され、そして例えば親和性クロマトグラフィーおよび／またはサイズ排除を通じて精製され得る。最終精製は、例えばCHO細胞において発現させた抗体を精製するためのプロセスと同様に行われ得る。
【０１６８】
原核生物に加えて、真核微生物、例えば糸状菌または酵母が、本発明の結合分子に適したクローニングまたは発現宿主である。出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）または一般パン酵母は、下等真核宿主微生物の中で最も一般的に使用されている。しかし、多くの他の属、種および株が一般に利用可能であり、かつ本発明において有用である、例えば、分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）、クライベロマイセス（Kluyveromyces）宿主、例えばK.ラクチス（K. lactis）、K.フラジリス（K. fragilis）（ATCC 12424）、K.ブルガリクス（K. bulgaricus）（ATCC 16045）、K.ウィッカラミイ（K. wickeramii）（ATCC 24178）、K.ウォルチイ（K. waltii）（ATCC 56500）、K.ドロソフィラルム（K. drosophilarum）（ATCC 36906）、K.サーモトレランス（K. thermotolerans）およびK.マルキシアヌス（K. marxianus）；ヤロウイア（yarrowia）（EP 402 226）；ピキア・パストリス（Pichia pastoris）（EP 183 070）；カンジダ（Candida）；トリコダーマ・リーシア（Trichoderma reesia）（EP 244 234）；ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）；シュワンニオミセス（Schwanniomyces）、例えばシュワンニオミセス・オクシデンタリス（Schwanniomyces occidentalis）；ならびに糸状菌、例えばニューロスポラ、ペニシリウム（Penicillium）、トリポクラジウム（Tolypocladium）およびアスペルギルス（Aspergillus）宿主、例えばA.ニデュランス（A. nidulans）およびA.ニガー（A. niger）。
【０１６９】
本発明のグリコシル化結合分子の、好ましくは抗体由来結合分子の発現に適した宿主細胞は、多細胞生物に由来する。無脊椎動物細胞の例は、植物および昆虫細胞を含む。多くのバキュロウイルス株および変種ならびにヨトウガ（Spodoptera frugiperda）（毛虫）、ネッタイシマカ（Aedes aegypti）（蚊）、ヒトスジシマカ（Aedes albopictus）（蚊）、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）（ショウジョウバエ）およびカイコ（Bombyx mori）等の宿主由来の対応する許容される昆虫宿主細胞が同定されている。トランスフェクションのための様々なウイルス株、例えばオートグラファ・カリフォルニカ（Autographa californica）NPVのL-1変種およびカイコNPVのBm-5株、が公的に入手可能であり、そのようなウイルスが、本発明にしたがい本明細書においてウイルスとして、特にヨトウガ細胞のトランスフェクションのために、使用され得る。
【０１７０】
綿、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、ピーナツ、ペチュニア、トマト、シロイヌナズナおよびタバコの植物細胞培養物もまた、宿主として使用され得る。植物細胞培養物におけるタンパク質の産生に有用なクローニングおよび発現ベクターは当業者に公知である。例えば、Hiatt et al., Nature (1989) 342: 76-78、Owen et al. (1992) Bio/Technology 10: 790-794、Artsaenko et al. (1995) The Plant J 8: 745-750およびFecker et al. (1996) Plant Mol Biol 32: 979-986を参照のこと。
【０１７１】
しかし、脊椎動物細胞に対する関心が最も高く、培養（組織培養）下での脊椎動物細胞の繁殖は慣用手順となっている。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1株（COS-7、ATCC CRL 1651）；ヒト胎児腎臓株（293または懸濁培養下での成長に関してサブクローニングされた293細胞、Graham et al., J. Gen Virol. 36: 59 (1977)）；ベビーハムスター腎臓細胞（BHK、ATCC CCL 10）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／-DHFR（CHO、Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980)）；マウスセルトリ細胞（TM4、Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)）；サル腎臓細胞（CV1 ATCC CCL 70）；アフリカミドリザル腎臓細胞（VERO-76、ATCC CRL1587）；ヒト子宮頸癌細胞（HELA、ATCC CCL 2）；イヌ腎臓細胞（MDCK、ATCC CCL 34）；バッファローラット肝臓細胞（BRL 3A、ATCC CRL 1442）；ヒト肺細胞（W138、ATCC CCL 75）；ヒト肝臓細胞（Hep G2、1413 8065）；マウス乳癌（MMT 060562、ATCC CCL5 1）；TRI細胞（Mather et al., Annals N. Y Acad. Sci. 383: 44-68 (1982)）；MRC 5細胞；FS4細胞；およびヒトヘパトーマ株（Hep G2）である。
【０１７２】
組み換え技術を用いる場合、本発明の結合分子は、ペリプラズム間隙で細胞内産生され得、または培地に直接分泌され得る。結合分子が細胞内産生される場合、最初の工程として、宿主細胞または溶解したフラグメントのいずれかの粒状の残骸が、例えば遠心分離または限外ろ過によって除去される。Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)は、大腸菌のペリプラズム間隙に分泌された抗体を単離する手順を記載している。簡潔に説明すると、細胞ペーストを、酢酸ナトリウム（pH 3.5）、EDTAおよびフッ化フェニルメチルスルホニル（PMSF）の存在下で約30分間解凍する。細胞の残骸は、遠心分離によって除去され得る。抗体が培地中に分泌される場合、通常最初に、そのような発現システムの上清が、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばAmiconまたはMillipore Pellicon限外ろ過ユニットを用いて遠心分離される。プロテアーゼ阻害剤、例えばPMSFは、タンパク質分解を阻害するために、上記の工程のいずれかにおいて含められ得、そして抗生物質は、外来混入物の成長を防ぐために、含められ得る。
【０１７３】
宿主細胞から調製された本発明の結合分子は、例えばヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析および親和性クロマトグラフィーを用いて精製され得、親和性クロマトグラフィーが好ましい精製技術である。
【０１７４】
親和性リガンドを付加するマトリクスは、アガロースであることが最も多いが、他のマトリクスも利用可能である。機械的に安定なマトリクス、例えば規定の孔を有するガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンは、アガロースを用いて達成できるよりも速い流速および短い処理時間を実現する。本発明の結合分子がCH3ドメインを含む場合、Bakerbond ABXMresin（J. T. Baker, Phillipsburg, NJ）が精製に有用である。他のタンパク質精製技術、例えばイオン交換カラムによる分画、エタノール沈降、逆相HPLC、シリカによるクロマトグラフィー、ヘパリンSEPHAROSE（商標）によるクロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換樹脂（例えば、ポリアスパラギン酸カラム）によるクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、SDS-PAGEおよび硫酸アンモニウム沈降もまた、回収される抗体に依存して利用可能である。
【０１７５】
別の局面においては、本明細書で定義される宿主細胞を、本発明の結合分子の発現を可能にする条件下で培養する工程、および、産生された結合分子を培養物から回収する工程を含む、本発明の結合分子を産生する方法が提供される。
【０１７６】
「培養」という用語は、培地中での適切な条件下での細胞のインビトロ維持、分化、成長、増殖および／または繁殖を表す。
【０１７７】
代替の態様においては、本発明の結合分子を含むまたは本発明の方法にしたがって産生される組成物が提供される。好ましくは、組成物は薬学的組成物である。
【０１７８】
本明細書で使用される場合、「薬学的組成物」という用語は、患者、好ましくはヒト患者に投与する組成物を表す。特定の好ましい本発明の薬学的組成物は、本発明の結合分子を含む。好ましくは、薬学的組成物は、担体、安定剤および／または賦形剤の適当な処方物を含む。好ましい態様において、薬学的組成物は、非経口、経皮、腔内、動脈内、くも膜下腔内および／もしくは鼻腔内投与または組織への直接注射のための組成物を含む。組成物が注入または注射を通じて患者に投与されることが特に想定されている。適当な組成物の投与は、異なる方法によって、例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋内、局所または皮内投与によって、行われ得る。特に、本発明は、適当な組成物の中断のない投与を提供する。非限定的な例として、中断のない、すなわち連続的な投与は、患者体内への治療剤の流入を計量する患者に装着された小型ポンプシステムによって行われ得る。本発明の結合分子を含む薬学的組成物は、このポンプシステムを用いることによって投与され得る。そのようなポンプシステムは概ね当技術分野で公知であり、一般には注入される治療剤を含むカートリッジの定期的交換が必要である。そのようなポンプシステムにおいてカートリッジを交換する際、それ以外では中断されない患者体内への治療剤の流入の一時的中断が生じ得る。そのような場合であっても、カートリッジ交換前の投与フェーズとカートリッジ交換後の投与フェーズは、薬学的手段および本発明の方法のどちらの意味においても、依然としてそのような治療剤の「中断のない」投与を構成するとみなされるであろう。
【０１７９】
本発明のこれらの結合分子の連続的なまたは中断のない投与は、流体をリザーバから送り出すための流体送出機構および送出機構を作動させるための作動機構を含む、流体送達デバイスまたは小型ポンプシステムによる静脈内または皮下投与であり得る。皮下投与用のポンプシステムは、患者の皮膚に突き入り適当な組成物を患者体内に送達するための針またはカニューレを含み得る。このポンプシステムは、静脈、動脈または血管に関係なく、ポンプシステムと患者の皮膚が直接接触するよう患者の皮膚に直接固定または取り付けられ得る。ポンプシステムは、患者の皮膚に24時間〜数日間取り付けられ得る。ポンプシステムは、少量のリザーバを有する小サイズのものであり得る。非限定的な例として、投与される適当な薬学的組成物のためのリザーバの容量は、0.1〜50mlの間であり得る。
【０１８０】
連続的な投与は、皮膚に装着され一定間隔で交換されるパッチによる経皮投与であり得る。当業者は、この目的に適した薬物送達のためのパッチシステムに精通している。経皮投与は、第1の使いきったパッチの交換が、新しい第2のパッチを例えば第1の使いきったパッチのすぐ隣の皮膚表面におよび第1の使いきったパッチの除去直前に設置するのと同時に達成され得る利点があるために、中断のない投与に特に適しているに注目されたい。流れの中断または動力源喪失の問題は生じない。
【０１８１】
本発明の組成物はさらに、薬学的に許容される担体を含み得る。適当な薬学的担体の例は当技術分野で周知であり、溶液、例えばリン酸緩衝生理食塩水溶液、水、エマルジョン、例えば油／水エマルジョン、様々なタイプの湿潤剤、滅菌溶液、リポソーム等を含む。そのような担体を含む組成物は、周知の従来法によって処方され得る。処方物は、炭水化物、緩衝溶液、アミノ酸および／または界面活性剤を含み得る。炭水化物は、非還元糖、好ましくはトレハロース、スクロース、八硫化物、ソルビトールまたはキシリトールであり得る。概ね、本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、薬物投与に適合する任意かつすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤を意味する。薬学的に活性な物質のためにそのような媒体および薬剤を使用することは当技術分野で周知である。許容される担体、賦形剤または安定剤は、用いられる投薬量および濃度でレシピエントに対して非毒性であり、追加の緩衝剤；保存剤；共溶媒；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化物質；キレート化剤、例えばEDTA；金属錯体（例えば、Zn・タンパク質錯体）；生分解性ポリマー、例えばポリエステル；塩形成性の対イオン、例えばナトリウム、多価糖アルコール；アミノ酸、例えばアラニン、グリシン、アスパラギン、2-フェニルアラニンおよびスレオニン；糖または糖アルコール、例えばトレハロース、スクロース、八硫化物、ソルビトールまたはキシリトールスタキオース、マンノース、ソルボース、キシロース、リボース、ミオイニシトース（myoinisitose）、ガラクトース、ラクチトール、リビトール、ミオイニシトール、ガラクチトール、グリセロール、シクリトール（例えば、イノシトール）、ポリエチレングリコール；硫黄含有還元剤、例えばグルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、[アルファ]-モノチオグリセロールおよびチオ硫酸ナトリウム；低分子量タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチンまたはその他の免疫グロブリン；ならびに親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドンを含む。そのような処方物は、ポンプシステムを用いるおよび／または用いない静脈内または皮下投与であり得る連続的な投与のために使用され得る。アミノ酸は、荷電アミノ酸、好ましくはリジン、リジン酢酸塩、アルギニン、グルタミン酸塩および／またはヒスチジンであり得る。界面活性剤は、デタージェント（detergent）、好ましくは分子量が>1.2KDのそれ、および／またはポリエーテル、好ましくは分子量が>3KDのそれ、であり得る。好ましいデタージェントの非限定的な例は、Tween 20、Tween 40、Tween 60、Tween 80またはTween 85である。好ましいポリエーテルの非限定的な例は、PEG 3000、PEG 3350、PEG 4000またはPEG 5000である。本発明において使用される緩衝システムは、5〜9の好ましいpHを有し得、クエン酸塩、コハク酸塩、リン酸塩、ヒスチジンおよび酢酸塩を含み得る。
【０１８２】
本発明の組成物は、例えば漸増用量の本明細書に記載される種間特異性を示す本発明のポリペプチドを非チンパンジー霊長類、例えばマカク、に投与する用量増加研究によって決定され得る適当な用量で対象に投与され得る。上記のように、本明細書に記載される種間特異性を示す本発明の結合分子は、非チンパンジー霊長類における前臨床試験においておよびヒトにおける薬物として同一の形態で使用できる利点がある。これらの組成物はまた、他のタンパク質性および非タンパク質性薬物と組み合わせて投与され得る。これらの薬物は、本明細書で定義される本発明のポリペプチドを含む組成物を用いて同時に投与され得または該ポリペプチドの投与前もしくは投与後に定義された時間間隔および用量で別々に投与され得る。投薬レジメンは、担当医および臨床的要因によって決定されるであろう。医学分野で周知のように、ある1人の患者に対する投薬量はその患者のサイズ、体の表面積、年齢、投与される個々の化合物、性別、投与時間および経路、健康状態全般ならびに同時に投与される他の薬物を含む、多くの要因に依存する。
【０１８３】
非経口投与用の調製物は、滅菌された水性または非水性の溶液、懸濁物およびエマルジョンを含む。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブ油、および注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。水性担体は、生理食塩水および緩衝化媒体を含む、水、アルコール性／水性の溶液、エマルジョンまたは懸濁物を含む。非経口ビヒクルは、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンゲルまたは固定油を含む。静脈内用ビヒクルは、流体および栄養補給物、電解質補給物（例えば、リンゲルデキストロースに基づくもの）等を含む。保存剤および他の添加物、例えば抗菌物質、抗酸化物質、キレート化剤、不活性ガス等もまた存在し得る。加えて、本発明の組成物は、例えば、好ましくはヒト起源の、血清アルブミンまたは免疫グロブリンのようなタンパク質性の担体を含み得る。本発明の組成物は、その組成物の意図されている用途に依存して、本明細書で定義される本発明のポリペプチドに加えてさらなる生物学的に活性な薬剤を含み得ることが想定されている。そのような薬剤は、胃腸管系に作用する薬物、細胞静止剤として作用する薬物、高尿酸血症（hyperurikemia）を予防する薬物、免疫反応を阻害する薬物（例えば、コルチコステロイド）、炎症応答を調整する薬物、循環器系に作用する薬物および／または当技術分野で公知の薬剤、例えばサイトカイン、であり得る。本発明の結合分子は、共同療法で、すなわち、別の抗癌医薬と併用して適用されることも想定されている。
【０１８４】
本明細書で定義される薬学的組成物の生物学的活性は、例えば、以下の実施例に、WO 99/54440にまたはSchlerethら（Cancer Immunol. Immunother. 20 (2005), 1-12）によって記載されたような、細胞毒性アッセイによって決定され得る。本明細書で使用される「効能」または「インビボ効能」は、例えば標準化されたNCIの応答基準を用いる、本発明の薬学的組成物による治療に対する応答を表す。本発明の薬学的組成物を用いる治療の成功またはインビボ効能は、その意図されている目的に対する組成物の有効性、すなわち、その所望の効果、すなわち病理学的細胞、例えば腫瘍細胞の枯渇、をもたらす組成物の能力、を表す。インビボ効能は、白血球数、分化、蛍光活性化細胞選別、骨髄吸引を含むがこれらに限定されない、各々の疾患において確立されている標準的方法によってモニタリングされ得る。加えて、様々な疾患に特異的な臨床化学パラメータおよびその他の確立された標準的方法が使用され得る。さらに、コンピューター断層撮影、X線、核磁気共鳴断層撮影（例えば、National Cancer Institute基準に基づく応答評価のため［Cheson BD, Horning SJ, Coiffier B, Shipp MA, Fisher RI, Connors JM, Lister TA, Vose J, Grillo-Lopez A, Hagenbeek A, Cabanillas F, Klippensten D, Hiddemann W, Castellino R, Harris NL, Armitage JO, Carter W, Hoppe R, Canellos GP. Report of an international workshop to standardize response criteria for non-Hodgkin's lymphomas. NCI Sponsored International Working Group. J Clin Oncol. 1999 Apr; 17(4): 1244］）、ポジトロン放出断層走査、白血球数、分化、蛍光活性化細胞選別、骨髄吸引、リンパ節生検／組織学、および様々なリンパ腫に特異的な臨床化学パラメータ（例えば、乳酸デヒドロゲナーゼ）ならびにその他の確立されている標準的方法が使用され得る。
【０１８５】
薬物、例えば本発明の薬学的組成物、の開発における別の大きな課題は、薬物動態特性を予測できるよう調整することである。この目的で、候補薬物の薬物動態プロフィール、すなわち、所定の状態を処置する特定の薬物の能力に影響する薬物動態パラメータのプロフィール、が確立され得る。特定の疾患を処置する薬物の能力に影響する薬物の薬物動態パラメータは、半減期、分布容積、肝臓の初回通過時代謝および血液血清結合度を含むがこれらに限定されない。所定の薬物の効能は、上記のパラメータの各々によって影響され得る。
【０１８６】
薬物の文脈において本明細書で使用される場合、「半減期」は、投与された薬物の50％が生物学的プロセス、例えば代謝、排出等を通じて排除される時間を意味する。
【０１８７】
「肝臓の初回通過時代謝」は、薬物が肝臓に最初に接したとき、すなわち、肝臓の初回通過の間に、代謝される性質を意味する。
【０１８８】
「分布容積」は、例えば細胞内および細胞外空間、組織および臓器等のような、身体の様々な区画における薬物の保持ならびにこれらの区画内での薬物の分配の程度を表す。
【０１８９】
「血液血清結合度」は、薬物が血液血清タンパク質、例えばアルブミンに相互作用および結合してその薬物の生物学的活性を減少または喪失させる性質を意味する。
【０１９０】
薬物動態パラメータはまた、バイオアベイラビリティ、ラグタイム（Tlag）、Tmax、吸収速度、より多い作用発現（more onset）および／または投与される所定の薬物量についてのCmaxを含む。「バイオアベイラビリティ」は、血液区画の薬物の量を意味する。「ラグタイム」は、薬物の投与から血液または血漿中でのその検出および測定可能段階までの間の時間の遅れを意味する。
【０１９１】
「Tmax」は、それ以降に薬物の最大血中濃度が達成される時間であり、「Cmax」は、所定の薬物によって得られる最大の血中濃度である。その生物学的効果に必要とされる薬物の血中または組織濃度に達するまでの時間は、すべてのパラメータに影響される。上記のような非チンパンジー霊長類における前臨床動物試験において決定され得る、種間特異性を示す二重特異性単鎖抗体の薬物動態パラメータは、例えばSchlerethら（Cancer Immunol. Immunother. 20 (2005), 1-12）による刊行物にも示されている。
【０１９２】
本明細書で使用される「毒性」という用語は、有害事象または重篤な有害事象において見られる薬物の毒性の効果を表す。これらの副事象は、全体的な薬物の認容性の欠如および／または投与後の局所的な認容性の欠如を表し得る。毒性はまた、その薬物によって引き起こされる催奇形効果または発癌効果を含み得る。
【０１９３】
本明細書で使用される「安全性」、「インビボ安全性」または「認容性」という用語は、投与直後に（局所的認容性）およびより長期の薬物適用期間の間に重篤な有害事象を誘導しない薬物の投与と定義される。「安全性」、「インビボ安全性」または「認容性」は、例えば、処置中およびフォローアップ期間中に一定間隔で評価され得る。測定は、臨床評価、例えば臓器の兆候、および検査異常のスクリーニングを含む。臨床評価が実施され、NCI-CTCおよび／またはMedDRA標準にしたがう正常所見からの逸脱が記録／コード化され得る。臓器の兆候は、例えばCommon Terminology Criteria for adverse events v3.0（CTCAE）に示されるように、アレルギー／免疫学、血液／骨髄、心不整脈、凝固等の基準を含み得る。試験され得る検査パラメータは、例えば、血液学、臨床化学、凝固プロフィールおよび尿検査ならびにその他の体液、例えば血清、血漿、リンパまたは脊髄液、リカー等の試験が含まれる。したがって安全性は、例えば身体試験、画像化技術（すなわち、超音波、x線、CTスキャン、磁気共鳴画像化（MRI）、専門的装置を用いるその他の測定（すなわち、心電図）、バイタルサインによって、検査パラメータを測定し有害事象を記録することによって、評価され得る。例えば、本発明にしたがう使用および方法において、非チンパンジー霊長類における有害事象が組織病理学および／または組織化学法により試験され得る。
【０１９４】
「有効用量」または「有効投薬量」は、所望の効果を達成するまたは少なくとも部分的に達成するのに十分な量と定義される。「治療有効用量」という用語は、疾患にすでに罹患している患者において疾患およびその合併症を治癒するまたは少なくとも部分的に抑止するのに十分な量と定義される。この用途に効果的な量は、感染の重篤度および対象自身の免疫系の全体的状態に依存するであろう。「患者」という用語は、予防的または治療的処置のいずれかを受けるヒトおよびその他の哺乳動物対象を含む。
【０１９５】
本明細書で使用される「有効・非毒性用量」という用語は、大きな毒性作用を生じさせずにまたは本質的に生じさせずに病理学的細胞の枯渇、腫瘍の除去、腫瘍の縮退または疾患の安定化をもたらすのに十分高い、本発明の結合分子の認容可能な用量を表す。そのような有効・非毒性用量は、例えば当技術分野で記載されている用量増加研究によって決定され得、そしてそれは重篤な有害副事象を誘導する用量以下とされるべきである（用量制限毒性、DLT）。
【０１９６】
上記の用語はまた、例えば、Preclinical safety evaluation of biotechnology derived pharmaceuticals S6; ICH Harmonised Tripartite Guideline; ICH Steering Committee meeting on July 16, 1997も参照する。
【０１９７】
本発明の結合分子の適当な投薬量または治療有効量は、処置される状態、状態の重篤度、これまでの治療ならびに患者の病歴および治療剤に対する応答に依存する。適当な用量は、1度にまたは一連の投与により患者に投与され得るように、担当医の判断にしたがい調節され得る。薬学的組成物は、単独の治療としてまたは必要な場合は追加の治療、例えば抗癌治療と併用して投与され得る。
【０１９８】
本発明の薬学的組成物は、非経口投与、すなわち、皮下、筋内、静脈内、関節内および／または滑液嚢内投与に特に有用である。非経口投与は、ボーラス注射または連続注入によるものであり得る。
【０１９９】
薬学的組成物が凍結乾燥される場合、凍結乾燥された物質はまず、投与の前に適当な液体で再構成される。凍結乾燥された物質は、例えば注射用静菌水（BWFI）、生理学的食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）または凍結乾燥の前にタンパク質を添加したのと同じ処方物で再構成され得る。
【０２００】
好ましくは、本発明の結合分子または本発明の方法によって産生される結合分子は、増殖性疾患、腫瘍性疾患、炎症性疾患、感染症、および自己免疫疾患/免疫学的障害から選択される疾患の予防、処置または寛解に使用される。
【０２０１】
本発明の代替の局面は、増殖性疾患、腫瘍性疾患、炎症性疾患、感染症、および自己免疫疾患/免疫学的障害から選択される疾患の処置または寛解のための方法であって、それを必要とする患者に本発明の結合分子または本発明の方法によって産生される結合分子を投与する工程を含む方法、を提供する。
【０２０２】
本明細書に記載される処方物は、それを必要とする患者における本明細書に記載される病理学的医学状態を処置および／または予防する薬学的組成物として有用である。「処置」という用語は、治療的処置および予防または抑止手段の両方を表す。処置は、その疾患、疾患の症状または疾患に対する素因を治癒する、修復する、軽減する、解放する、是正する、救済する、寛解する改善するまたはそれに影響を与える目的での、疾患／障害、疾患／障害の症状または疾患／障害の素因を有する患者の身体、単離された組織または細胞に対する処方物の適用または投与を含む。
【０２０３】
「処置を必要とする」は、すでに障害を有している者およびその障害を予防したい者を含む。「疾患」という用語は、本明細書に記載されるタンパク質処方物を用いた処置から利益を得るであろう任意の状態である。これは、哺乳動物が問題の疾患にかかりやすくなる病理学的状態を含む、慢性および急性の障害または疾患を含む。本発明により処置される疾患／障害の非限定的な例は、増殖性疾患、腫瘍性疾患、炎症性疾患、感染症、および自己免疫疾患/免疫学的障害を含む。
【０２０４】
別の局面において、本発明の結合分子、本発明の核酸分子、本発明のベクターまたは本発明の宿主細胞を含むキットが提供される。キットは、結合分子を含む1つまたは複数のバイアルおよび使用説明書を含み得る。キットはまた、本発明の結合分子を投与するための手段、例えば注射器、ポンプ、注入器等、本発明の結合分子を再構成するための手段および／または本発明の結合分子を希釈するための手段を含み得る。
【図面の簡単な説明】
【０２０５】
【図１（１）】図1(1)〜1(3)：実施例1に記載されるヒトPSMAを発現するCHO細胞およびヒトCD3+ T細胞株HPB-ALLのそれぞれに対する示されている二重特異性抗体コンストラクトのFACS結合分析。FACS染色は、実施例1に記載されるようにして行った。濃い（黒色の）線は、二重特異性抗体コンストラクトを発現するトランスフェクト細胞の細胞培養上清と共にインキュベートされた細胞を表している。薄い（灰色の）ヒストグラムは、陰性対照を示している。未トランスフェクトCHO細胞の上清を陰性対照として使用した。
【図１（２）】図1(1)の続きを示す図である。
【図１（３）】図1(2)の続きを示す図である。
【図２（１）】図2(1)〜2(2)：同図は、ヒトPSMAでトランスフェクトされたCHO細胞株に再方向付けされた示されている二重特異性抗体コンストラクトによって誘導された細胞毒性活性を測定するクロム放出アッセイの結果を示している。エフェクター細胞として刺激されたヒトCD 8+ T細胞を使用した。アッセイを10％ HSAを補充したRPMI 1640中で行い、そのことが実施例2に記載されている。
【図２（２）】図2(1)の続きを示す図である。
【図３】未修飾形態またはSA21もしくはHSAとの融合体としてのEpCAM BiTE分子の細胞毒性分析。用量応答曲線を、FCSを添加して、FCSを添加せずに、10％ヒト血清を添加しておよび20％ヒト血清を添加して、作製した。
【図４】未修飾形態またはSA21もしくはHSAとの融合体としてのEpCAM BiTE分子の細胞毒性分析。用量応答曲線を、8g/lのHSAを添加して、20g/lのHSAを添加して、10％ヒト血清を添加しておよび20％ヒト血清を添加して、作製した。
【図５（１）】図5(1)〜5(6)のダイアグラムは、HIV gp140でトランスフェクトされたCHO細胞株に再方向付けされた示されている二重特異性抗体コンストラクトによって誘導された細胞毒性活性を測定するFACSベースの細胞毒性アッセイの結果を示している。エフェクター細胞として刺激されたヒトCD 8+ T細胞を使用した。アッセイを10％ FCS（5(1)、5(3)および5(5)）または50％ ヒト血清（5(2)、5(4)および5(6)）のそれぞれを補充したRPMI 1640中で行い、そのことが実施例9に記載されている。
【図５（２）】図5(1)の続きを示す図である。
【図５（３）】図5(2)の続きを示す図である。
【図５（４）】図5(3)の続きを示す図である。
【図５（５）】図5(4)の続きを示す図である。
【図５（６）】図5(5)の続きを示す図である。
【図６（１）】HSA/MSA Biacore実験（表面プラズモン共鳴）。ダイアグラムは、固定されたHSAまたはMSAのそれぞれに対する示されている二重特異性抗体コンストラクトの親和性分析を示している。Biacore実験は、実施例10に記載されるようにして行った。ダイアグラムは、異なる濃度の示されている二重特異性コンストラクトの会合および解離特性を示している。
【図６（２）】図6(1)の続きを示す図である。
【図６（３）】図6(2)の続きを示す図である。
【図７】ヒトCD3 Biacore実験（表面プラズモン共鳴）。固定されたヒトCD3に対する示されている二重特異性抗体コンストラクトの親和性分析。Biacore実験は、実施例11に記載されるようにして行った。ダイアグラムは、異なる濃度の示されている二重特異性コンストラクトの会合および解離特性を示している。
【図８】固定されたヒトCD3に対する示されている二重特異性抗体コンストラクトの親和性分析。Biacore実験は、実施例12に記載されるようにして行った。ダイアグラムは、異なる濃度の示されている二重特異性コンストラクトの会合および解離特性を示している。
【図９】CD4(1+2)xaCD3LxSA21のSECプロフィール。ダイアグラムは、CD4(1+2)xaCD3LxSA21のサイズ排除プロフィールを示している。凝集体、多量体および単量体形態のピークが示されている。青色の線は、280nmでの光吸収を示している。精製方法は、実施例13に記載されている。
【実施例】
【０２０６】
以下の実施例により本発明を解説する。これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものとみなされるべきではない。実施例は解説の目的で含まれるものであり、本発明は特許請求の範囲によってのみ制限される。
【０２０７】
実施例1：二重特異性結合および種間交差反応
【０２０８】
フローサイトメトリーのために、ヒトPSMAトランスフェクトCHO標的細胞（細胞表面分子を用いてCHO細胞をトランスフェクトし適当な標的細胞を作製する一般的手順は、WO 2008/119567から導かれる）を使用した。それぞれの細胞株200,000細胞を、5μg/mlの濃度の精製された二重特異性分子50μlと共に氷上で30分間インキュベートした。この細胞を、2% FCSを含むPBSで2回洗浄し、コンストラクトの結合をマウスPentaHis抗体（Qiagen；2% FCSを含むPBS 50μlで1:20希釈）で検出した。洗浄後、結合したPentaHis抗体を、2% FCSを含むPBSで1:100希釈された、フィコエリトリンにコンジュゲートされたFcガンマ特異的抗体（Dianova）で検出した。
【０２０９】
図1は、これらのFACS分析のヒストグラムを示している。標的PSMAおよびCD3に対する結合の検出に関する結果が、付属の表3および4にまとめられている。特定されているBiTE分子の親にあたる、ABPを含まない変種は、そのアミノ酸配列の具体例を含めて、WO 2010/037836に詳細に記載されている。
【０２１０】
（表３）N末端にABPを含むPSMA BiTE抗体分子の結合特性
2018138558.tif 000004
【０２１１】
（表４）C末端にABPを含むPSMA BiTE抗体分子の結合特性
2018138558.tif 000005
【０２１２】
実施例2：細胞毒性活性
刺激されたヒトT細胞を用いたクロム放出アッセイ
CD8+T細胞について濃縮された刺激されたT細胞を、以下のようにして得た。
【０２１３】
ペトリ皿（直径145mm、Greiner bio-one GmbH, Kremsmunster）を、最終濃度1μg/mlの市販の抗CD3特異的抗体（OKT3、Orthoclone）を用いて、37℃で1時間コーティングした。未結合のタンパク質を、PBSを用いた1回の洗浄工程により除去した。安定化型グルタミン/10% FCS/IL-2 20 U/ml（Proleukin（登録商標）、Chiron）を含む120mlのRPMI 1640中3〜5 x 107個のヒトPBMCを、プレコートしたペトリ皿に添加し、2日間刺激した。3日目に、細胞を回収し、RPMI 1640で1回洗浄した。IL-2を最終濃度20 U/mlとなるよう添加し、そして細胞を再度、上記と同じ細胞培養培地中で1日培養した。
【０２１４】
CD8+細胞毒性Tリンパ球（CTL）を、Dynal-Beadsを製造元のプロトコルにしたがい用いてCD4+ T細胞およびCD56+ NK細胞を枯渇させることにより、濃縮した。
【０２１５】
マカクまたはヒトPSMAトランスフェクトCHO標的細胞（細胞表面分子を用いてCHO細胞をトランスフェクトし適当な標的細胞を作製する一般的手順は、WO 2008/119567から導かれる）をPBSで2回洗浄し、そして50％ FCSを含む最終容積100μlのRPMI中11.1 MBqの51Crを用いて37℃で60分間標識した。その後、標識された標的細胞を5ml RPMIで3回洗浄し、その後にこれを細胞毒性アッセイに使用した。アッセイは、96ウェルプレートにおいて、総容積200μlの補充されたRPMI（上記）中、10:1のE:T比で行った。出発濃度0.01〜1μg/mlの精製された二重特異性抗体およびその3倍希釈物を使用した。アッセイにおけるインキュベート時間は、18時間であった。細胞毒性は、最大溶解（Triton-Xの添加）と自然溶解（エフェクター細胞なし）の差に対する上清中に放出されたクロムの相対値として決定した。すべての測定を4連で行った。上清中のクロム活性の測定は、Wizard 3''ガンマカウンター（Perkin Elmer Life Sciences GmbH, Koln, Germany）において行った。結果の分析は、Windows版Prism 5（バージョン5.0、GraphPad Software Inc., San Diego, California, USA）を用いて行った。分析プログラムによってシグモイド型用量応答曲線から計算されたEC50値を、細胞毒性活性の比較に使用した。
【０２１６】
PSMA発現標的細胞の殺傷の結果が、図2に示されている。
【０２１７】
実施例3：異なる種の血清アルブミンに対するBiTE抗体の親和性のBiacoreベースの決定
ヒト血清アルブミンおよびその他の種の血清アルブミンに対するタグ付加PSMA BiTE分子の結合を確認するため、以下の血清アルブミン調製物を提供した：ヒト血清アルブミン（HSA）、Sigma A9511；アカゲザル血清アルブミン（RSA）、bioWorld 22070099；マウス血清アルブミン（MSA）、Sigma A3139；ウシ血清アルブミン（BSA）、Sigma A7906。
【０２１８】
結合実験は、Biacore機器においてプラズモン共鳴測定を用いて行った。詳細を述べると、CM5センサーチップ（GE Healthcare）に、製造元のマニュアルにしたがい酢酸緩衝液pH4.5を用いてそれぞれの血清アルブミンタンパク質を固定化した。BiTE抗体サンプルを、HBS-EP泳動緩衝液（GE Healthcare）で希釈した5つの関連する濃度、例えば：50nM、25nM、12.5nM、6.25nMおよび3.13nMで充填した。親和性決定のための流速は、35μl/分で3分間であり、その後にHBS-EP泳動緩衝液を再度35μl/分の流速で10分間適用した。チップの再生は、100mMグリシン 0.5M NaCl pH3.0溶液からなる緩衝液を用いて行った。データセットを、BiaEvalソフトウェアを用いて分析した。場合によって、結合曲線が、評価ソフトウェアの基礎となっている理論上の曲線と完全に一致することまたは全く一致しないことがあり得る。後者の場合、その結合を「陽性」と決定し；その場合、より近い一致する数値が示されているが、これは近似値として見る必要がある。
【０２１９】
Biacoreによって決定された異なる種の血清アルブミンに対するそれぞれのBiTE抗体の結合親和性が、表5にまとめられている。
【０２２０】
（表５）Biacore実験（表面プラズモン共鳴）で測定された異なる種の血清アルブミンに対するタグ付加PSMA BiTE抗体の親和性（KD）
2018138558.tif 000006
HSA = ヒト血清アルブミン、RSA = アカゲザル血清アルブミン、MSA = マウス血清アルブミン、BSA = ウシ血清アルブミン、「陽性」は、BiaEvalソフトウェアによって正確に決定することができなかった検出可能な結合を意味する；「陰性」は、選択された実験条件下で有意な結合がなかったことを意味する。
【０２２１】
表5に示されているように、異なる血清結合ペプチドタグを含む試験したPSMA BiTE抗体は、ヒト血清アルブミンに対して陰性であったがアカゲザル血清アルブミンに対しては明確な結合を示したPSMA x SA04を除いてすべて、ヒト血清アルブミンに対して有意な結合を示した。さらに、試験したタグ付加BiTE抗体は、PSMA-DX236を除いてすべて、アカゲザル血清アルブミンに対して明確な結合を示した。さらに、試験したBiTE抗体の中で、PSMA x SA04、PSMA x SA08、PSMA x SA21およびPSMA x SA25は、マウス血清アルブミンに対して明確な結合を示し、一方、PSMA x DX236、PSMA x DX321、PSMA x AB1、PSMA x AB14およびPSMA x AB156は、マウス血清アルブミンに対して有意な結合を示さなかった。
【０２２２】
試験した分子の中で、PSMA x SA08、PSMA x SA21およびPSMA x SA25のみが、ウシ血清アルブミンに対して明確な結合を示した。
【０２２３】
実施例4：C末端ABPを有する／有さないBiTE抗体の精製スキーム
BiTE抗体配列をコードするpEF DHFRベクターで安定的にトランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣CHO細胞を、60％の残存生存度に達するまでローラーボトル中で培養した。細胞培養上清を0.2μm濾過により清浄化し、そして固定化金属親和性クロマトグラフィー（IMAC）捕捉のために亜鉛保持キレートゲルFractogel EMD Chelate（Merck, Darmstadt）を満たしたカラムに適用した。
【０２２４】
サンプルの充填後、残った細胞培養上清を洗い流し、そして溶出前工程の後に、500mMイミダゾールを含む緩衝液を適用することによってHIS6タグ付加BiTE抗体を溶出させた。
【０２２５】
BiTE抗体を含む溶出物を、Superdex S200（GE Healthcare, Munich）サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）カラムに通し、BiTE単量体タンパク質を2量体BiTEタンパク質およびその他のタンパク質から分離した。
【０２２６】
BiTE単量体タンパク質を含む画分を集め、そしてタンパク質濃度を、280nmの波長および1cmの光路長で光吸収を測定しそれにタンパク質配列特異的吸収係数を掛け算することによって決定した。
【０２２７】
BiTE単量体率は、SECクロマトグラムにおけるBiTE2量体およびBiTE単量体画分の曲線下面積によって計算した。単量体率 = (単量体の面積/(単量体の面積+2量体の面積))*100。
【０２２８】
以下の表（表6〜8）から明らかなように、試験したすべての抗PSMA BiTEおよび抗ヒトEpCAM BiTEのBiTE抗体変種において、良好なBiTE単量体タンパク質収量および単量体率が達成された。
【０２２９】
（表６）良好な収量および80％を超える単量体率を示す、C末端に付加されたアルブミン結合ペプチドABPを備える抗PSMA BiTE変種のBiTE抗体単量体収量および単量体率
2018138558.tif 000007
【０２３０】
（表７）精製前のPSMA抗原発現細胞に対する結合に関する、n末端に付加されたアルブミン結合ペプチドABPを備える抗PSMA BiTE変種の細胞培養上清のサンプルのフローサイトメトリースクリーニングの結果。このアッセイにおいて結合を示さなかったすべての細胞培養上清を精製手順から除外した。
2018138558.tif 000008
【０２３１】
（表８）良好な収量および80％を超える単量体率を示す、C末端に付加されたアルブミン結合ペプチドABPを備える抗ヒトEpCAM BiTE変種のBiTE抗体単量体収量および単量体率
2018138558.tif 000009
【０２３２】
実施例5：ヒトEpCAM BiTE分子
親のヒトEpCAM BiTE分子の例は、WO 2005/040220に記載されている。
【０２３３】
EpCAM BiTEの生物活性を、Toxilight BioAssay Kit（Cambrex/Lonza）を使用する細胞ベースのアッセイにおいて評価した。このキットは、以下の原理にしたがい死細胞を定量することにより、EpCAM BITE存在下でのEpCAM発現乳癌細胞株MDA-MB-453に対するヒトPBMC（エフェクター細胞）の細胞毒性効果を測定することができる：
【０２３４】
このアッセイは、酵素アデニル酸キナーゼ（AK）の生物発光測定に基づくものであった。AKはすべての細胞に存在した。死細胞による細胞膜の完全性の喪失は、AKを周囲の培地中に漏出させる。（ADPおよび酵素ルシフェーラゼを含む）ToxiLight反応試薬の添加により、光を放射する2段階反応が誘発され、これをルミノメーターを用いて測定することができる。放射された光はAK濃度と直線的に関連し、そして死細胞の数と相関する。
2018138558.tif 000010
【０２３５】
性能およびデータの分析：
エフェクター（ヒトPBMC、2 x 106/ウェル）および標的細胞（MDA-MB-453、1 x 105/ウェル）を、異なるEpCAM BITE濃度（250 ng/mL〜4.2 pg/mL）の存在下、20：1のエフェクター対標的比で共培養する。16〜20時間後、ToxiLight試薬を添加し、発光を測定する（詳細な説明についてはSOP-BIA-110-012を参照のこと）。
【０２３６】
各EpCAM BiTE濃度で％比溶解を計算し、細胞毒性の最大半量（EC50）の決定のためにデータをフィッティングする。EC50値はEpCAM BiTEの生物学的効力を表すものであるが、その絶対値は変化し得、これは異なるエフェクター細胞ドナーを用いた細胞ベースのアッセイで通常のことである。したがって各用量応答分析において以下の式に基づきEpCAM BiTE実験標準との比較で相対効力を計算する。
相対効力 = EC50サンプル/ EC50標準
【０２３７】
相対効力の決定の妥当性は、様々なパラメータ、例えば曲線当てはめ、曲線振幅比、傾斜比等によって支配される。
【０２３８】
初期細胞毒性アッセイ条件は、そのアッセイが臨床試験物質を放出および安定性について試験する目的で構築されているため、HSAを含まない。
【０２３９】
ヒト血清の添加を試験し、EpCAM BiTE-SA21コンストラクトの相対生物活性は10％血清条件で51〜66％であり、20％血清条件で59〜66％であった（表13）。したがって、HSA結合ペプチドの共有結合付加および記載される条件の使用による生物活性の低下は、50〜60％の範囲であった。
【０２４０】
相対生物活性のより大きな低下は、共有結合により連結されたHSAを含むEpCAM BiTEコンストラクトで観察された。しかし、ここでもまた、その生物活性は完全にはブロックされず；残存生物活性は10および20％ヒト血清条件で19〜31％および24〜29％であった（表14）。
【０２４１】
FCSまたはHSAの添加等の異なるアッセイ条件は、相対生物活性に対して観察された効果を変化させなかった（表9）。
【０２４２】
記載された実験の用量応答曲線が図3および4に示されている。
【０２４３】
（表９）EpCAM BiTE変種のEC50値
2018138558.tif 000011
【０２４４】
（表１０）未修飾EpCAM BiTEとの比較での相対生物活性
2018138558.tif 000012
【０２４５】
（表１１）未修飾EpCAM BiTEとの比較での相対生物活性
2018138558.tif 000013
【０２４６】
実施例7：安定的にトランスフェクトされたHIV gp140を発現するCHO細胞の作製
HIV-1 HXB2株（Uniprot KB, Acc. No. P04578）のHIV gp160（gp140）の細胞外ドメインを、EpCAMの膜貫通および細胞内ドメインに融合させた。この融合タンパク質のオープンリーディングフレームを、標準的な手順にしたがいpEF DHFRベクターにクローニングし（細胞表面分子を用いてCHO細胞をトランスフェクトし適当な標的細胞を作製する一般的手順は、WO 2008/119567から導かれる）、その後にこれを示された二重特異性コンストラクトの分析のために使用した。
【０２４７】
実施例8：HIV 二重特異性コンストラクトの作製
以下に記載される二重特異性コンストラクトのHIV標的結合ドメインは、ヒトCD4起源のものである。CD4(1+2)と命名されたコンストラクトは、ヒトCD4の最初の2つのドメインを含む。コンストラクトCD4 D1.1またはCD4 D1.2は、1つの点変異を含むヒトCD4ドメイン1起源のものであり、これはChen, W., et al. (2011, J Virol 85(18):9395-9405)に記載されている。本明細書に記載される2つのコンストラクトはBiTEに関連するそれらの適用性が証明されているが、それはこれらの2つのCD4ドメイン1コンストラクトに限定されるものではない、すなわち、記載されている二重特異性形式は、すべての記載されているそれらの変種に適用され得る、特に公開されている変種CD4 D1.3〜CD4 D1.19に関して適用され得るものである。概ね、細胞膜上でアクセス可能となっているHIVタンパク質に対する固有の結合部分を有する分子は、二重特異性の状況で適用可能であり、例えば、そのコアペプチド配列等のヒトCD4の一部のみを含むコンストラクト、ヒトCD4タンパク質のアプタマーまたは例えばJames H. M. Simon（1993, J. Exp. Med, Volume 177, April 1993, 949-954）によって解説されているgp120結合に関与するヒトCD4挿入物を含むラットCD4のキメラが、BiTEの状況で使用され得る。ヒトCD4起源の結合ドメインとは別に、抗HIVヒトモノクローナル抗体の抗体特異性、例えばVH-VLまたはVL-VHの並びのscFv形式のB12、VRC01または4E10もまた、BiTEの状況で適用可能であり、それらの二重特異性結合および細胞毒性活性に関連して特徴づけられている。記載されているHIV gp120結合ドメインを、異種間特異的（cross-specific）ヒトCD3結合体に融合させた。標準的な手順にしたがいこれらの親HIV特異的コンストラクトの長寿命版を設計およびクローニングし、それを以下で特徴づける。
【０２４８】
実施例9：HIV陽性標的細胞に対する細胞毒性二重特異性コンストラクト
刺激されたヒトT細胞を用いたFACSベースの細胞毒性アッセイ
CD8+T細胞について濃縮された刺激されたT細胞を、以下に記載されるようにして得た。
ペトリ皿（直径145mm、Greiner bio-one GmbH, Kremsmunster）を、最終濃度1μg/mlの市販の抗CD3特異的抗体（OKT3、Orthoclone）および抗CD28（Art.No. 340975、BD）を用いて、37℃で1時間コーティングした。未結合のタンパク質を、PBSを用いた1回の洗浄工程により除去した。安定化型グルタミン/10% FCS/IL-2 20 U/ml（Proleukin（登録商標）、Chiron）を含む100mlのRPMI 1640中3〜5 x 107個のヒトPBMCを、プレコートしたペトリ皿に添加し、3日間刺激した。3日目に、細胞を回収し、RPMI 1640で1回洗浄した。IL-2を最終濃度20 U/mlとなるよう添加し、そして細胞を再度、上記の細胞培養培地中で1日培養した。
【０２４９】
CD8+細胞毒性Tリンパ球（CTL）を、製造元（Miltenyi Biotec）のプロトコルにしたがいヒトCD8+T Cell Isolation Kitを用いて非CD8+細胞を枯渇させることにより、濃縮した。
【０２５０】
HIV gp140トランスフェクトCHO標的細胞（細胞表面分子を用いてCHO細胞をトランスフェクトし適当な標的細胞を作製する一般的手順は、WO 2008/119567から導かれる）を2％ FCSを含むPBSで洗浄し、そして2％ FCSを含むPBS中、37℃で3分間、Vybrant（登録商標）DiD細胞標識溶液（Invitrogen、125,000細胞/ml、106細胞あたり5μl色素）で標識した。その後、標識された標的細胞を、2％ FCSを含む50mlのPBSで3回洗浄し、その後これを細胞毒性アッセイで使用した。アッセイは、96ウェルプレートにおいて、総容積200μlの補充されたRPMI培地（上記）中、10:1のエフェクター：標的比で行った。出発濃度の2〜10μg/mlの精製された二重特異性抗体およびその3〜4倍希釈物を使用した。アッセイにおけるインキュベート時間は、18〜24時間であった。
【０２５１】
インキュベート後、細胞を再懸濁させ、そして96ウェルv底プレートに移した。付着している標的細胞を37℃で5分間トリプシン処理し、PBS/2％ FCSに再懸濁させ、そして各ウェルからの他の細胞と組み合わせた。このプレートを1200rpmで4分間遠心分離し、その上清を廃棄し、そして細胞を2％ FCSおよび1μg/mlヨウ化プロピジウム（PI）（Sigma Aldrich提供）を含むPBSに再懸濁させた。細胞毒性は、FACSCantoII（BD Biosciences, Heidelberg, Germany）を用いたフローサイトメトリーによって決定されたDiD陽性細胞の全体数に対するDiD/PI 2重陽性細胞の百分率として決定した。すべての測定を2連で行った。結果の分析は、Windows版Prism 5（バージョン5.0、GraphPad Software Inc., San Diego, California, USA）を用いて行った。EC50値を、シグモイド型用量応答曲線または傾斜の変化する応答曲線から分析プログラムによって計算し、その後にこれを細胞毒性活性の比較に使用した。
【０２５２】
HIV gp140発現標的細胞に対する10％ FCSまたは50％ヒト血清（PAA Laboratories GmbH, Art.No. C11-021）を補充したRPMI 1640を用いたそれぞれの細胞毒性活性の結果が、図5(1)〜5(4)に示されている。
【０２５３】
表12〜17には、それらの細胞毒性活性を説明するために、示されている二重特異性分子のEC50値（すなわち、標的細胞の最大半量溶解時のBiTE濃度）が示されている。
【０２５４】
（表１２）10％ FCSの影響下でのN末端ABPタグ付加BiTE抗体のEC50値
2018138558.tif 000014
係数*：係数は、その親のABPタグ非含有二重特異性分子に対する示された二重特異性分子のEC50値の差を表している。
【０２５５】
（表１３）50％ヒト血清の影響下でのN末端ABPタグ付加BiTE抗体のEC50値
2018138558.tif 000015
係数*：係数は、その親のABPタグ非含有二重特異性分子に対する示された二重特異性分子のEC50値の差を表している。
【０２５６】
（表１４）10％ FCSの影響下でのC末端ABPタグ付加BiTE抗体のEC50値
2018138558.tif 000016
係数*：係数は、その親のABPタグ非含有二重特異性分子に対する示された二重特異性分子のEC50値の差を表している。
【０２５７】
（表１５）50％ヒト血清の影響下でのC末端ABPタグ付加BiTE抗体のEC50値
2018138558.tif 000017
係数*：係数は、その親のABPタグ非含有二重特異性分子に対する示された二重特異性分子のEC50値の差を表している。
【０２５８】
C末端SA21タグ付加二重特異性分子（表15、図5(4)）とN末端SA21タグ付加二重特異性分子（表13、図5(2)）のEC50値の比較は、50％ヒト血清存在下での増加したEC50値により示される、N末端SA21タグ付加二重特異性分子の細胞毒性活性における有意な負の影響を示している。この現象は、その分子の末端におけるSA21タグの位置と無関係に観察することができる、すなわち、細胞毒性活性は、ABPタグと隣接する結合ドメインの間に5AAまたは15AAリンカーを付加しても回復しない。数値的に、N末端SA21タグ付加BiTE分子は、SA21タグを二重特異性分子のC末端に付加した場合の5〜7倍の減少に対して、細胞毒性活性の11〜23倍の減少を示した。この記載される観察はまた、10％ FCS存在下でも見ることができる、すなわち、分子数の少なさおよび種の違いに起因する血清アルブミンの小さな影響である。C末端SA21タグ付加BiTE抗体の2〜3倍の減少（表14）に対して、N末端SA21タグ付加二重特異性分子（表12）では6〜16倍の減少であった。
【０２５９】
（表１６）10％ FCSの影響下での、標的およびCD3結合ドメインの間にABPタグ付加されたBiTE抗体のEC50値
2018138558.tif 000018
係数*：係数は、その親のABPタグ非含有二重特異性分子に対する示された二重特異性分子のEC50値の差を表している。
【０２６０】
（表１７）50％ヒト血清の影響下での、標的およびCD3結合ドメインの間にABPタグ付加されたBiTE抗体のEC50値
2018138558.tif 000019
係数*：係数は、その親のABPタグ非含有二重特異性分子に対する示された二重特異性分子のEC50値の差を表している。
【０２６１】
SA21 ABPタグをHIV結合特異性とCD3結合特異性の間に配置すると、10％ FCS存在下での細胞毒性活性がABPタグ挿入物の長さに依存して減少する（表16および図5(5)）。この細胞毒性活性の減少は、部分的に、50％ヒト血清存在下で大きくなる（表17および図5(6)）。
【０２６２】
実施例10：異なる種の血清アルブミンに対するBiTE抗体の親和性のBiacoreベースの決定
ヒト血清アルブミンおよびその他の種の血清アルブミンに対するタグ付加HIV特異的BiTE分子の結合を確認するため、以下の血清アルブミン調製物を提供した：ヒト血清アルブミン（HSA）、Sigma A9511；マウス血清アルブミン（MSA）、Sigma A3139。
【０２６３】
結合実験は、Biacore機器においてプラズモン共鳴測定を用いて行った。詳細を述べると、CM5センサーチップ（GE Healthcare）に、製造元のマニュアルにしたがい酢酸緩衝液pH3を用いてそれぞれの血清アルブミンタンパク質を固定化した。BiTE抗体サンプルを、HBS-EP泳動緩衝液（GE Healthcare）で希釈した5つの関連する濃度、例えば：400nM、200nM、100nM、50nM、25nM（低濃度BiTEの濃度：200nM、100nM、50nM、25nM、12.5nM）で充填した。親和性決定のための流速は、35μl/分で3分間であり、その後にHBS-EP泳動緩衝液を再度35μl/分の流速で6分間適用した。チップの再生は、100mMグリシン 0.5M NaCl pH3.0溶液からなる緩衝液を用いて60秒間行った。データセットを、BiaEvalソフトウェアを用いて分析した。場合によって、結合曲線が、評価ソフトウェアの基礎となっている理論上の曲線と完全に一致することまたは全く一致しないことがあり得る。後者の場合、その結合を「陽性」と決定し；その場合、より近い一致する数値が示されているが、これは近似値として見る必要がある。
【０２６４】
Biacoreによって決定されたHSAに対するそれぞれのBiTE抗体の結合親和性が、表18および図6にまとめられている。
【０２６５】
（表１８）Biacore実験（表面プラズモン共鳴）で測定されたヒト血清アルブミンに対するタグ付加HIV BiTE抗体の親和性（KD）。HSA = ヒト血清アルブミン、MSA = マウス血清アルブミン、「陽性」は、BiaEvalソフトウェアによって正確に決定することができなかった検出可能な結合を意味する；「陰性」は、選択された実験条件下で有意な結合がなかったことを意味する。
2018138558.tif 000020
【０２６６】
ABPタグ付加二重特異性分子の親和性に関して、それらはすべて、固定化されたHSAおよびMSAタンパク質に結合した。それらの結合特異性の間にABPタグを保持する二重特異性分子は、それらの末端のいずれか一方にSA21またはSA25をタグ付加された二重特異性分子よりも悪いHSAおよびMSA親和性を示した。
【０２６７】
実施例11：ヒトCD3に対するBiTE抗体の親和性のBiacoreベースの決定
ヒトCD3に対するC末端ABPタグ付加HIV BiTE分子の結合を確認するため、標準的な手順にしたがいCD3エピトープを含むヒトCD3ペプチドをヒトFcに融合させ、これを親和性の測定に使用した。
【０２６８】
結合実験は、Biacore機器においてプラズモン共鳴測定を用いて行った。詳細を述べると、CM5センサーチップ（GE Healthcare）に、製造元のマニュアルにしたがい酢酸緩衝液pH4.5を用いてヒトCD3 x huFcタンパク質を固定化した。BiTE抗体サンプルを、HBS-EP泳動緩衝液（GE Healthcare）で希釈した5つの関連する濃度、例えば：50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.125nMで充填した。親和性決定のための流速は、35μl/分で3分間であり、その後にHBS-EP泳動緩衝液を再度35μl/mlの流速で8分間適用した。チップの再生は、100mMグリシン 0.5M NaCl pH1.5溶液からなる緩衝液を用いて60秒間行った。データセットを、BiaEvalソフトウェアを用いて分析した。
【０２６９】
（表１９）Biacore実験（表面プラズモン共鳴）で測定されたヒトCD3 FC融合タンパク質に対するタグ付加HIV BiTE抗体の親和性（KD）
2018138558.tif 000021
係数*：親のABPタグ非含有BiTE分子との比較で減少したCD3親和性
【０２７０】
ABPタグのC末端付加は、隣接する結合特異性（すなわち、CD3）を最大2倍減少させる、表19および図7を参照のこと。
【０２７１】
実施例12：HIV gp120に対するBiTE抗体の親和性のBiacoreベースの決定
HIV gp120に対するN末端ABPタグ付加HIV BiTE分子の結合を確認するため、以下のHIV gp120を提供した：組み換えHIV-1 IIIBエンベロープ糖タンパク質gp120（バキュロウイルス）、製品＃ 1001、Immunodiagnostics, Incorporation。
【０２７２】
結合実験は、Biacore機器においてプラズモン共鳴測定を用いて行った。詳細を述べると、CM5センサーチップ（GE Healthcare）に、製造元のマニュアルにしたがい酢酸緩衝液pH4.5を用いてそれぞれのHIV gp120タンパク質を固定化した。BiTE抗体サンプルを、HBS-EP泳動緩衝液（GE Healthcare）で希釈した5つの関連する濃度、例えば：100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.125nMで充填した。親和性決定のための流速は、35μl/分で3分間であり、その後にHBS-EP泳動緩衝液を再度35μl/mlの流速で7分間適用した。チップの再生は、4M MgCl2溶液からなる緩衝液を用いて60秒間行った。データセットを、BiaEvalソフトウェアを用いて分析した。
【０２７３】
（表２０）Biacore実験（表面プラズモン共鳴）で測定されたHIV gp120タンパク質に対するタグ付加HIV BiTE抗体の親和性（KD）
2018138558.tif 000022
係数*：親のABPタグ非含有BiTE分子との比較で減少したHIV gp120親和性
【０２７４】
ABPタグのN末端付加は、隣接する結合特異性（すなわち、抗HIV gp120）を6〜14倍減少させる、表20および図8を参照のこと。
【０２７５】
実施例13：c末端ABPを有するBiTE抗体の精製スキーム
ヒト胎児由来腎臓（HEK 293−F、Invitrogen）細胞を、293フェクチン（製造元のマニュアルにしたがう、Invitorogen）を用いてBiTE抗体配列をコードする200μgのpEF DHFRベクターで一過的にトランスフェクトした。トランスフェクト細胞を、エルレンマイヤー細胞培養フラスコ中、37℃、135rpm、5％ CO2の下で72時間培養した。あるいは、同BiTE抗体配列をコードするpEF DHFRベクターで安定的にトランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣CHO細胞を、60％の残存生存度に達するまでローラーボトル中で培養した。細胞培養上清を、4'000rpmで10分間遠心分離することによって清浄化し、その後にろ過（0.2μm）し、そして固定化金属親和性クロマトグラフィー（IMAC）捕捉のために亜鉛保持キレートゲルFractogel FMD Chelate（Merck, Darmstadt）を満たしたカラムに適用した。
【０２７６】
サンプルの充填後、残った細胞培養上清を洗い流し、そして溶出前工程の後に、500mMイミダゾールを含む緩衝液を適用することによってHIS6タグ付加BiTE抗体を溶出させた。
【０２７７】
BiTE抗体を含む溶出物を、Superdex S200（GE Healthcare, Munich）サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）カラムに通し、BiTE単量体タンパク質を2量体BiTEタンパク質およびその他のタンパク質から分離した。
【０２７８】
BiTE単量体タンパク質を含む画分を集め、そしてタンパク質濃度を、280nmの波長および1cmの光路長で光吸収を測定しそれにタンパク質配列特異的吸収係数を掛け算することによって決定した。
【０２７９】
未修飾CD4(1+2)xaCD3LxSA21 BiTEのSECクロマトグラムを示す例示的な精製が、図9に示されている。
【０２８０】
本明細書で言及または引用されている文献、特許および特許出願ならびにすべての他の書類および電子的に利用可能な情報の内容は、各々個々の刊行物が具体的かつ個別に参照により組み入れられることが示されているのと同じように、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。出願人は、任意のそのような文献、特許、特許出願またはその他の物理的および電子的書類から任意かつすべての資料および情報を本願に物理的に組み入れる権利を留保している。
【０２８１】
本明細書に実例として記載されている発明は、本明細書に具体的に開示されていない任意の要素または要素群、制限または制限群なしに適切に実施され得る。加えて、本明細書で用いられている用語および表現は、説明の目的で使用されており、限定の目的では使用されておらず、そのような用語および表現は、示され記載されている特徴またはその一部分の任意の等価物を除外するために使用されることは意図されておらず、特許請求の範囲に記載の発明の範囲内で様々な改変を行うことが可能であることが明らかである。したがって、本発明は好ましい態様および任意の特徴によって具体的に開示されているが、本明細書の開示の中で具現化される本発明の改変物および派生物も当業者によって採用され得ること、ならびにそのような改変物および派生物も本発明の範囲に含まれるものとみなされることが理解されるべきである。
【０２８２】
本発明は、本明細書において広義的および概略的に記載されている。この概略的開示に包含されるより狭い種および亜属グループの各々も本発明の一部を形成している。これは、切り取られるものが本明細書で具体的に言及されているかどうかによらず、任意の対象物をその属から除外する但し書きまたは否定的制限を伴う本発明の概略的記載を含む。
【０２８３】
他の態様も添付の特許請求の範囲に包含される。加えて、本発明の特徴または局面がマーカッシュ群の形式で記載されている場合、当業者は、本発明がそのマーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたはメンバーのサブグループの形式でも記載されることを理解しているであろう。
【０２８４】
配列
2018138558.tif 000023
2018138558.tif 000024
2018138558.tif 000025
2018138558.tif 000026
2018138558.tif 000027
2018138558.tif 000028
2018138558.tif 000029
2018138558.tif 000030
2018138558.tif 000031
2018138558.tif 000032
2018138558.tif 000033
2018138558.tif 000034
2018138558.tif 000035
2018138558.tif 000036
2018138558.tif 000037
2018138558.tif 000038
2018138558.tif 000039
2018138558.tif 000040
2018138558.tif 000041
2018138558.tif 000042
2018138558.tif 000043
2018138558.tif 000044
2018138558.tif 000045
【図１（１）】
2018138558.tif 000046
【図１（２）】
2018138558.tif 000047
【図１（３）】
2018138558.tif 000048
【図２（１）】
2018138558.tif 000049
【図２（２）】
2018138558.tif 000050
【図３】
2018138558.tif 000051
【図４】
2018138558.tif 000052
【図５（１）】
2018138558.tif 000053
【図５（２）】
2018138558.tif 000054
【図５（３）】
2018138558.tif 000055
【図５（４）】
2018138558.tif 000056
【図５（５）】
2018138558.tif 000057
【図５（６）】
2018138558.tif 000058
【図６（１）】
2018138558.tif 000059
【図６（２）】
2018138558.tif 000060
【図６（３）】
2018138558.tif 000061
【図７】
2018138558.tif 000062
【図８】
2018138558.tif 000063
【図９】
2018138558.tif 000064
【手続補正書】
【提出日】平成30年4月26日(2018.4.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2018138558000001.app
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
本発明の1つの態様において、結合分子は、血清アルブミンに結合することができる第3の結合ドメインがアミノ酸配列Asp-Xaa-Cys-Leu-Pro-Xaa-Trp-Gly-Cys-Leu-Trp（SEQ ID NO:102）を含み、Xaaが任意のアミノ酸である点で特徴づけられる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
本発明の1つの態様において、結合分子は、T細胞CD3受容体複合体に結合することができる第2の結合ドメインがヒトおよびコモンマーモセット（Callithrix jacchus）、ワタボウシタマリン（Saguinus oedipus）またはコモンリスザル（Saimiri sciureus）のCD3ε鎖のエピトープに結合することができ、該エピトープがSEQ ID NO:2、4、6または8からなる群に含まれるアミノ酸配列の一部でありかつ少なくともアミノ酸配列Gln-Asp-Gly-Asn-Glu（SEQ ID NO:103）を含む点で特徴づけられる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８３】
本明細書に記載される抗体コンストラクトに含まれる可変ドメインは、追加のリンカー配列によって接続され得る。「ペプチドリンカー」という用語は、本発明にしたがい、本発明の抗体コンストラクトの第1のドメインおよび第2のドメインのアミノ酸配列を相互に連結させるアミノ酸配列を定義する。そのようなペプチドリンカーの本質的な技術的特徴は、そのペプチドリンカーがいかなる重合活性も含まないことである。ペプチドリンカーにとって好ましいアミノ酸残基は、Gly、SerおよびThrを含み、5〜25アミノ酸残基の長さによって特徴づけられる。中でも適当なペプチドリンカーは、米国特許第4,751,180号および同第4,935,233号またはWO 88/09344に記載されているものである。ペプチドリンカーの好ましい態様は、アミノ酸配列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser（SEQ ID NO:104）、すなわちGly4Ser、またはそのポリマー、すなわち(Gly4Ser)x、ここでxは1またはそれより大きい整数である、によって特徴づけられる。2次構造への発展性を欠くペプチドリンカーの特徴は、当技術分野で公知であり、例えばDall'Acqua et al.（Biochem. (1998) 37, 9266-9273）、Cheadle et al.（Mol Immunol (1992) 29, 21-30）およびRaag and Whitlow（FASEB (1995) 9(1), 73-80）に記載されている。いかなる2次構造にも発展しないペプチドリンカーが好ましい。これらのドメインの相互に対する連結は、例えば実施例に記載される遺伝子操作によって提供され得る。融合され機能的に連結された二重特異性単鎖コンストラクトを調製しそれらを哺乳動物細胞または細菌中で発現させる方法は、当技術分野で周知である（例えば、WO 99/54440またはSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2001）。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９２】
本発明の好ましい局面において、血清アルブミンに結合することができる第3の結合ドメインは、アミノ酸配列Asp-Xaa-Cys-Leu-Pro-Xaa-Trp-Gly-Cys-Leu-Trp（SEQ ID NO:102）を含み、Xaaは任意のアミノ酸である。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２９】
また、本発明の結合分子の1つの局面において、T細胞CD3受容体複合体に結合することができる第2の結合ドメインは、ヒトおよびコモンマーモセット、ワタボウシタマリンまたはコモンリスザルのCD3ε鎖のエピトープに結合することができ、該エピトープは、SEQ ID NO:2、4、6または8からなる群に含まれるアミノ酸配列の一部でありかつ少なくともアミノ酸配列Gln-Asp-Gly-Asn-Glu（SEQ ID NO:103）を含む。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２８４】
配列
2018138558.tif 000065
2018138558.tif 000066
2018138558.tif 000067
2018138558.tif 000068
2018138558.tif 000069
2018138558.tif 000070
2018138558.tif 000071
2018138558.tif 000072
2018138558.tif 000073
2018138558.tif 000074
2018138558.tif 000075
2018138558.tif 000076
2018138558.tif 000077
2018138558.tif 000078
2018138558.tif 000079
2018138558.tif 000080
2018138558.tif 000081
2018138558.tif 000082
2018138558.tif 000083
2018138558.tif 000084
2018138558.tif 000085
2018138558.tif 000086
2018138558.tif 000087
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
本発明の結合分子、本発明の核酸分子、本発明のベクター、または本発明の宿主細胞を含むキット。
[本発明1001]
少なくとも1つのポリペプチド鎖中に含まれる少なくとも3つの結合ドメインを含む結合分子であって、
（a）第1のドメインが、標的細胞上の細胞表面分子に結合することができる結合ドメインであり、
（b）第2のドメインが、T細胞CD3受容体複合体に結合することができる結合ドメインであり、かつ
（c）第3のドメインが、血清アルブミンに結合することができる結合ドメインであり、該第3のドメインが、第2のドメインのC末端に位置する、
結合分子。
[本発明1002]
前記3つのドメインが、N末端からC末端に向かって、
・第1の結合ドメイン、
・第2の結合ドメイン、および
・第3の結合ドメイン、
の順で、1つのポリペプチド上に存在する、本発明1001の結合分子。
[本発明1003]
前記結合分子の第3の結合が、scFvまたは単一ドメイン抗体である、本発明1001または1002の結合分子。
[本発明1004]
（a）第1の結合ドメインが、ヒトおよび非ヒト霊長類の細胞上の細胞表面分子に結合することができ、
（b）第2の結合ドメインが、ヒトおよび非ヒト霊長類の細胞上のT細胞CD3受容体複合体に結合することができ、かつ
（c）第3の結合ドメインが、ヒトおよび非ヒト霊長類の血清アルブミンに結合することができる、
本発明1001〜1003のいずれかの結合分子。
[本発明1005]
血清アルブミンに結合することができる第3の結合ドメインが、コンビナトリアルライブラリまたは抗体結合ドメインに由来する、本発明1001〜1004のいずれかの結合分子。
[本発明1006]
第3の結合ドメインが、10〜25アミノ酸残基を含む、本発明1001〜1005のいずれかの結合分子。
[本発明1007]
血清アルブミンに結合することができる第3の結合ドメインが、アミノ酸配列Asp-Xaa-Cys-Leu-Pro-Xaa-Trp-Gly-Cys-Leu-Trpを含み、Xaaが任意のアミノ酸である、本発明1001〜1006のいずれかの結合分子。
[本発明1008]
血清アルブミンに結合することができる第3の結合ドメインが、単一ドメイン抗体のCDRに由来する、本発明1001〜1006のいずれかの結合分子。
[本発明1009]
第3の結合ドメインが、≦500nMの親和性（KD）で血清アルブミンに結合する、本発明1001〜1008のいずれかの結合分子。
[本発明1010]
10％ヒト血清アルブミン存在下でのエフェクター細胞による標的細胞の溶解を測定するインビトロアッセイにおいて細胞毒性活性を示す、本発明1001〜1009のいずれかの結合分子。
[本発明1011]
単一ポリペプチド鎖からなる、本発明1001〜1010のいずれかの結合分子。
[本発明1012]
（a）第1の結合ドメインが、抗体由来のVLおよびVH鎖を含み、かつ／または
（b）第2の結合ドメインが、抗体由来のVLおよびVH鎖を含む、
本発明1001〜1011のいずれかの結合分子。
[本発明1013]
1つまたは複数のさらなる異種ポリペプチドを含む、本発明1001〜1012のいずれかの結合分子。
[本発明1014]
細胞表面分子に結合することができる第1の結合ドメインが、腫瘍抗原に結合する、本発明1001〜1013のいずれかの結合分子。
[本発明1015]
T細胞CD3受容体複合体に結合することができる第2の結合ドメインが、ヒトおよびコモンマーモセット（Callithrix jacchus）、ワタボウシタマリン（Saguinus oedipus）またはコモンリスザル（Saimiri sciureus）のCD3ε鎖のエピトープに結合することができ、該エピトープが、SEQ ID NO:2、4、6または8からなる群に含まれるアミノ酸配列の一部でありかつ少なくともアミノ酸配列Gln-Asp-Gly-Asn-Gluを含む、本発明1001〜1014のいずれかの結合分子。
[本発明1016]
SEQ ID NO:51、52、54、55、57、58、60、61、75、76、81、82、85、86、90、91、85、96、100または101に示されるアミノ酸配列によって特徴づけられる、本発明1001〜1007のいずれかの結合分子。
[本発明1017]
本発明1001〜1016のいずれかにおいて定義される結合分子をコードする、核酸配列。
[本発明1018]
本発明1017において定義される核酸配列を含む、ベクター。
[本発明1019]
本発明1017において定義される核酸配列または本発明1018において定義されるベクターで形質転換またはトランスフェクトされた、宿主細胞。
[本発明1020]
本発明1001〜1016のいずれかの結合分子の産生方法であって、本発明1001〜1016のいずれかにおいて定義された結合分子の発現を可能にする条件下で本発明1019において定義された宿主細胞を培養する工程、および、産生された結合分子を培養物から回収する工程を含む、方法。
[本発明1021]
本発明1001〜1016のいずれかの結合分子または本発明1020の方法にしたがい産生された結合分子を含む、薬学的組成物。
[本発明1022]
増殖性疾患、炎症性疾患、感染症、および自己免疫疾患からなる群より選択される疾患の予防、処置または改善に使用するための、本発明1001〜1016のいずれかの結合分子または本発明1020の方法にしたがい産生された結合分子。
[本発明1023]
増殖性疾患、炎症性疾患、感染症、および自己免疫疾患からなる群より選択される疾患の処置または改善のための方法であって、それを必要とする対象に、本発明1001〜1016のいずれかの結合分子または本発明1020の方法にしたがい産生された結合分子を投与する工程を含む、方法。
[本発明1024]
本発明1001〜1016のいずれかにおいて定義された結合分子、本発明1017において定義された核酸分子、本発明1018において定義されたベクター、または本発明1020において定義された宿主細胞を含む、キット。
【手続補正９】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも1つのポリペプチド鎖中に含まれる少なくとも3つの結合ドメインを含む結合分子であって、
（a）第1のドメインが、標的細胞上の細胞表面分子に結合することができる結合ドメインであり、
（b）第2のドメインが、T細胞CD3受容体複合体に結合することができる結合ドメインであり、かつ
（c）第3のドメインが、血清アルブミンに結合することができる結合ドメインであり、該第3のドメインが、第2のドメインのC末端に位置する、
結合分子。
【請求項２】
前記3つのドメインが、N末端からC末端に向かって、
・第1の結合ドメイン、
・第2の結合ドメイン、および
・第3の結合ドメイン、
の順で、1つのポリペプチド上に存在する、請求項1記載の結合分子。
【請求項３】
前記結合分子の第3の結合が、scFvまたは単一ドメイン抗体である、請求項1または2記載の結合分子。
【請求項４】
（a）第1の結合ドメインが、ヒトおよび非ヒト霊長類の細胞上の細胞表面分子に結合することができ、
（b）第2の結合ドメインが、ヒトおよび非ヒト霊長類の細胞上のT細胞CD3受容体複合体に結合することができ、かつ
（c）第3の結合ドメインが、ヒトおよび非ヒト霊長類の血清アルブミンに結合することができる、
請求項1〜3のいずれか一項記載の結合分子。
【請求項５】
血清アルブミンに結合することができる第3の結合ドメインが、コンビナトリアルライブラリまたは抗体結合ドメインに由来する、請求項1〜4のいずれか一項記載の結合分子。
【請求項６】
第3の結合ドメインが、10〜25アミノ酸残基を含む、請求項1〜5のいずれか一項記載の結合分子。
【請求項７】
血清アルブミンに結合することができる第3の結合ドメインが、アミノ酸配列Asp-Xaa-Cys-Leu-Pro-Xaa-Trp-Gly-Cys-Leu-Trp（SEQ ID NO:102）を含み、Xaaが任意のアミノ酸である、請求項1〜6のいずれか一項記載の結合分子。
【請求項８】
血清アルブミンに結合することができる第3の結合ドメインが、単一ドメイン抗体のCDRに由来する、請求項1〜6のいずれか一項記載の結合分子。
【請求項９】
第3の結合ドメインが、≦500nMの親和性（KD）で血清アルブミンに結合する、請求項1〜8のいずれか一項記載の結合分子。
【請求項１０】
10％ヒト血清アルブミン存在下でのエフェクター細胞による標的細胞の溶解を測定するインビトロアッセイにおいて細胞毒性活性を示す、請求項1〜9のいずれか一項記載の結合分子。
【請求項１１】
単一ポリペプチド鎖からなる、請求項1〜10のいずれか一項記載の結合分子。
【請求項１２】
（a）第1の結合ドメインが、抗体由来のVLおよびVH鎖を含み、かつ／または
（b）第2の結合ドメインが、抗体由来のVLおよびVH鎖を含む、
請求項1〜11のいずれか一項記載の結合分子。
【請求項１３】
1つまたは複数のさらなる異種ポリペプチドを含む、請求項1〜12のいずれか一項記載の結合分子。
【請求項１４】
細胞表面分子に結合することができる第1の結合ドメインが、腫瘍抗原に結合する、請求項1〜13のいずれか一項記載の結合分子。
【請求項１５】
T細胞CD3受容体複合体に結合することができる第2の結合ドメインが、ヒトおよびコモンマーモセット（Callithrix jacchus）、ワタボウシタマリン（Saguinus oedipus）またはコモンリスザル（Saimiri sciureus）のCD3ε鎖のエピトープに結合することができ、該エピトープが、SEQ ID NO:2、4、6または8からなる群に含まれるアミノ酸配列の一部でありかつ少なくともアミノ酸配列Gln-Asp-Gly-Asn-Glu（SEQ ID NO:103）を含む、請求項1〜14のいずれか一項記載の結合分子。
【請求項１６】
SEQ ID NO:51、52、54、55、57、58、60、61、75、76、81、82、85、86、90、91、85、96、100または101に示されるアミノ酸配列によって特徴づけられる、請求項1〜7のいずれか一項記載の結合分子。
【請求項１７】
請求項1〜16のいずれか一項において定義される結合分子をコードする、核酸配列。
【請求項１８】
請求項17において定義される核酸配列を含む、ベクター。
【請求項１９】
請求項17において定義される核酸配列または請求項18において定義されるベクターで形質転換またはトランスフェクトされた、宿主細胞。
【請求項２０】
請求項1〜16のいずれか一項記載の結合分子の産生方法であって、請求項1〜16のいずれか一項において定義された結合分子の発現を可能にする条件下で請求項19において定義された宿主細胞を培養する工程、および、産生された結合分子を培養物から回収する工程を含む、方法。
【請求項２１】
請求項1〜16のいずれか一項記載の結合分子または請求項20記載の方法にしたがい産生された結合分子を含む、薬学的組成物。
【請求項２２】
増殖性疾患、炎症性疾患、感染症、および自己免疫疾患からなる群より選択される疾患の予防、処置または改善に使用するための、請求項1〜16のいずれか一項記載の結合分子または請求項20記載の方法にしたがい産生された結合分子。
【請求項２３】
増殖性疾患、炎症性疾患、感染症、および自己免疫疾患からなる群より選択される疾患の処置または改善のための方法であって、それを必要とする対象に、請求項1〜16のいずれか一項記載の結合分子または請求項20記載の方法にしたがい産生された結合分子を投与する工程を含む、方法。
【請求項２４】
請求項1〜16のいずれか一項において定義された結合分子、請求項17において定義された核酸分子、請求項18において定義されたベクター、または請求項20において定義された宿主細胞を含む、キット。
【外国語明細書】
2018138558000001.pdf
2018138558000002.pdf
2018138558000003.pdf
2018138558000004.pdf