(57)【要約】【課題】捕捉用糖鎖と非共有結合的に相互作用する検出対象を高感度に測定することができる、生体試料の分析方法および生体試料の分析キットを提供する。【解決手段】本発明の生体試料の分析方法は、ウェル２００が設けられた本体基板２０５と、ウェル２００に固定された捕捉用糖鎖２５０と、を含むウェル型糖鎖基板１００において、ウェル２００に生体試料を添加する添加工程と、ウェル型糖鎖基板１００を振とうする振とう工程と、ウェル型糖鎖基板１００に電磁波を照射して、ウェル内の近接場光により生体試料を測定する測定工程とを含む。振とう工程によって、捕捉用糖鎖２５０と検出対象５５０とを十分に相互作用させることができる。さらに、洗浄工程を行わないことにより、捕捉用糖鎖が検出対象と相互作用した状態のまま測定することができるため、生体試料を高感度に測定することができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウェルが設けられた本体基板および前記ウェルに固定された捕捉用糖鎖を含むウェル型糖鎖基板において、
前記ウェルに生体試料を添加する添加工程と、
前記ウェル型糖鎖基板に電磁波を照射して、前記ウェル内の近接場光により前記生体試料を測定する測定工程と、
を含む生体試料の分析方法。
【請求項２】
前記添加工程および前記測定工程の間に振とう工程をさらに含み、
前記振とう工程は、前記ウェル型糖鎖基板を振とうする、
請求項１に記載の生体試料の分析方法。
【請求項３】
前記振とう工程は、振幅０．５ｍｍ以上５０ｍｍ以下かつ速度５０回/分以上１，０００回/分以下の条件下において、１０秒以上２４時間以下振とうさせる、請求項２に記載の生体試料の分析方法。
【請求項４】
前記本体基板は、熱可塑性樹脂製の底板と、前記底板に接着又は融着された前記ウェルを画定する熱可塑性樹脂製の枠体とを含む、
請求項１から３のいずれか１項に記載の生体試料の分析方法。
【請求項５】
前記生体試料中の、前記捕捉用糖鎖に対する特異的結合能を有する検出対象の濃度が、１ｆｇ/ｍｌ以上１００μｇ/ｍｌ以下である、請求項１から４のいずれか１項に記載の生体試料の分析方法。
【請求項６】
前記ウェル内に、前記捕捉用糖鎖がスポット状に固定されており、
前記スポットの面積が５，０００μｍ２以上５００，０００μｍ２以下であり、前記スポットの間隙の最小値が１０μｍ以上１，０００μｍ以下である、請求項１から５のいずれか１項に記載の生体試料の分析方法。
【請求項７】
前記測定工程は、蛍光標識として、極大励起波長５４０ｎｍ以上５６０ｎｍ以下かつ極大蛍光波長５６０ｎｍ以上５８０ｎｍ以下の色素を使用する、請求項１から６のいずれか１項に記載の生体試料の生体試料の分析方法。
【請求項８】
前記測定工程は、蛍光標識として、メチン鎖の炭素数が３のシアニン色素を含む、請求項１から７のいずれか１項に記載の生体試料の生体試料の分析方法。
【請求項９】
ウェルが設けられた本体基板と、前記ウェルに固定された捕捉用糖鎖と、を含むウェル型糖鎖基板、および、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法を実施するためのプロトコル情報を含む、生体試料の分析キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体試料の分析方法および生体試料の分析キットに関する。より具体的には、高い感度で測定可能な生体試料の分析方法および生体試料の分析キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
生体分子を基板に固定化させたバイオチップが種々開発されている。たとえば、特開２００６-７８４１８号公報（特許文献１）には、検出対象物の非特異的な吸着、結合の少ない糖鎖アレイ及びその製造方法が記載されている。この検出キットを用いた実施例では、スライドグラス上に固定化された糖鎖に、標識したコンカナバリンＡを相互作用させた後、バッファー及び水でスライドグラスを洗浄して、検出対象コンカナバリンＡの蛍光測定を行っている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００６-７８４１８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
固定された捕捉用糖鎖は、検出対象と非共有結合的に相互作用する。このため、検出対象と相互作用させた後に行われる洗浄によって、検出対象が捕捉用糖鎖から外れてしまい、測定が困難になるという問題があった。
【０００５】
そこで本発明の目的は、捕捉用糖鎖と非共有結合的に相互作用する検出対象とを高感度に測定することができる、生体試料の分析方法および生体試料の分析キットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（１）
一局面に従う生体試料の分析方法は、ウェルが設けられた本体基板およびウェルに固定された捕捉用糖鎖を含むウェル型糖鎖基板において、ウェルに生体試料を添加する添加工程と、ウェル型糖鎖基板に電磁波を照射して、ウェル内の近接場光により生体試料を測定する測定工程と、を含む。
【０００７】
生体試料の測定に近接場光を用いることにより、固定化された糖鎖に捕捉された基板表面近傍の検出対象を測定することができる。したがって、洗浄工程を行わず、生体試料を直接測定することができるため、捕捉用糖鎖が検出対象と相互作用した状態のまま測定することができる。したがって、生体試料を高感度に測定することができる。
【０００８】
（２）
第２の発明に係る生体試料の分析方法は、一局面に従う生体試料の分析方法であって、添加工程および測定工程の間に振とう工程をさらに含み、振とう工程は、ウェル型糖鎖基板を振とうさせてもよい。
【０００９】
ウェル型糖鎖基板を振とうさせる振とう工程によって、捕捉用糖鎖と検出対象とを十分に相互作用させることができる。さらに、捕捉用糖鎖と非共有結合的に相互作用している検出対象に対して洗浄工程を行わないことにより、捕捉用糖鎖が検出対象と相互作用した状態のまま測定するため、生体試料をより高感度に測定することができる。
【００１０】
（３）
第３の発明に係る生体試料の分析方法は、第２の発明に従う生体試料の分析方法であって、振とう工程は、振幅０．５ｍｍ以上５０ｍｍ以下かつ速度５０回/分以上１，０００回/分以下の条件下において、１０秒以上２４時間以下振とうさせてもよい。
【００１１】
この場合、捕捉用糖鎖と検出対象とをより十分に相互作用させることができる。これによって、従来は測定困難であった生体試料でも、より高感度に測定することができる。
【００１２】
（４）
第４の発明に係る生体試料の分析方法は、一局面から第３のいずれかの発明に係る生体試料の分析方法であって、本体基板は、熱可塑性樹脂製の底板と、底板に接着又は融着されたウェルを画定する熱可塑性樹脂製の枠体と、を含んでもよい。
【００１３】
底板及び枠体が熱可塑性樹脂で構成されており、底板及び枠体を接着又は融着することにより、両者をより強固に接合することができる。これにより、試料がウェルからリークするのを防ぎ、ウェル間で試料が混ざり合うことを防ぐことができる。
【００１４】
（５）
第５の発明に係る生体試料の分析方法は、一局面から第４のいずれかの発明に係る生体試料の分析方法であって、生体試料中の、捕捉用糖鎖に対する特異的結合能を有する検出対象の濃度が、１ｆｇ／ｍｌ以上１００μｇ／ｍｌ以下であってよい。
【００１５】
検出対象の濃度を１ｆｇ／ｍｌ以上とすることによって、捕捉用糖鎖と検出対象とを十分に相互作用させることができるため、より高感度に測定することができる。検出対象の濃度を１００μｇ／ｍｌ以下とすることによって、非特異的な検出を抑え、検出対象を選択的に検出できるようになる。
【００１６】
（６）
第６の発明に係る生体試料の分析方法は、一局面から第５のいずれかの発明に係る生体試料の分析方法であって、ウェル内に、捕捉用糖鎖がスポット状に固定されており、各スポットの面積が５，０００μｍ２以上５００，０００μｍ２以下であり、スポットの間隙の最小値が１０μｍ以上１，０００μｍであってよい。
【００１７】
各スポットの面積を５，０００μｍ２以上とすることで、スポット形状の均一化を図ることができるため、蛍光測定を高い精度ですることができる。また、各スポットの面積を５００，０００μｍ２以下とすることで、多スポット化を行うことができる。
さらに、スポットの間隙の最小の隣接距離を１０μｍ以上とすることで、隣接したスポットの蛍光の干渉を受けにくくすることができるため、より高い感度で分析する事ができる。また、スポットの間隙の最小の隣接距離を１，０００μｍ以下とすることで、多スポット化を達成することができる。
【００１８】
（７）
第７の発明に係る生体試料の分析方法は、一局面から第６のいずれかの発明に係る生体試料の分析方法であって、測定工程は、蛍光標識として、極大励起波長５４０ｎｍ以上５６０ｎｍ以下かつ極大蛍光波長５６０ｎｍ以上５８０ｎｍ以下の色素を使用してもよい。
【００１９】
この蛍光標識は、測定工程において近接場光による励起および蛍光測定に適している。
【００２０】
（８）
第８の発明に係る生体試料の分析方法は、一局面から第７のいずれかの発明に係る生体試料の分析方法であって、測定工程は、蛍光標識として、メチン鎖の炭素数が３のシアニン色素を含んでもよい。
【００２１】
この蛍光標識は、安定性が高い点で好ましい。
【００２２】
（９）
他の局面に従う生体試料の分析キットは、ウェルが設けられた本体基板と、ウェルに固定された捕捉用糖鎖と、を含むウェル型糖鎖基板、および、上記一局面に従う発明から第８の発明のいずれかの生体試料の分析方法を実施するためのプロトコル情報を含む。
【００２３】
これにより、捕捉用糖鎖と非共有結合的に相互作用する検出対象においても高感度に測定することができ、従来は測定が困難であった生体試料であっても高感度に測定することができる。
【発明の効果】
【００２４】
本発明に係る生体試料の分析方法および生体試料の分析キットは、捕捉用糖鎖と非共有結合的に相互作用する検出対象を、高感度に測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】第１実施形態の生体試料の分析方法についての模式的説明図（図２のＡ−Ａ’線断面図）である。
【図２】図１の生体試料の分析方法を説明する模式的断面図である。
【図３】第１実施形態の添加工程についての模式的説明図である。
【図４】第１実施形態の添加工程についての第１変形例を模式的に示す。
【図５】第１実施形態の添加工程についての第２変形例を模式的に示す。
【図６】実施例１および比較例１で得られた蛍光強度の測定結果である。
【図７】実施例で得られたウェル型糖鎖基板の蛍光スキャン画像の結果である。
【図８】実施例２および比較例２で得られた蛍光強度の測定結果である。
【図９】実施例３および比較例３で得られた蛍光強度の測定結果である。
【図１０】実施例４および比較例４で得られた蛍光強度の測定結果である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
［１．ウェル型糖鎖基板］
ウェル型糖鎖基板１００には、ウェル２００が設けられた本体基板２０５と、ウェルに固定された捕捉用糖鎖２５０とが含まれる。
【００２７】
［１−１．本体基板］
本体基板２０５は、底板２１０と、底板２１０に接着又は融着されたウェル２００を画定する枠体２１５とを含む。枠体２１５が設けられていることにより、本体基板２０５には、１または複数のウェル２００が構成される。本実施形態の他にも、本体基板２０５の形態は、分析の目的に応じて当業者が適宜選択することができる。
【００２８】
底板２１０は、本発明における蛍光測定の妨げとならず、捕捉用糖鎖２５０を固定することができる樹脂製のものであれば良い。
底板２１０の樹脂としては、熱可塑性樹脂、熱硬化性樹脂、および光硬化性樹脂が挙げられる。
より具体的には、（メタ）アクリル系樹脂、オレフィン系樹脂（ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリシクロオレフィンなど）、エステル系樹脂（ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレートなど）、スチレン系樹脂（ポリスチレン、アクリロニトリル−スチレン共重合体、メタクリル酸メチル−スチレン共重合体、スチレン−ブタジエン−スチレンブロック共重合体、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体、メタクリル酸メチル−ブタジエン−スチレン共重合体など）、ポリサルフォン、ポリカーボネート、ポリイミド、エポキシ系樹脂、フェノール系樹脂、塩素含有樹脂（ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデンなど）フッ素含有樹脂、シリコーン系樹脂、金属錯体樹脂などがあげられる。
底板２１０は、上記の材料から選択される１種が単独で構成されてもよく、または複数種が組み合わされて構成されてもよい。また、底板２１０と枠体２１５とは接着されてもよい。
【００２９】
底板２１０は、常温で硬質の樹脂であることが好ましい。また、後述の枠体２１５と底板２１０とがそれぞれ熱可塑性樹脂であることにより、枠体２１５と底板２１０とを接着または融着させることができる。これにより、両者をより強固に接合することができるため、試料がウェル２００からリークするのを防ぎ、ウェル２００間で試料が混ざり合うことを防ぐことができる。
底板２１０は、ポリメチルペンテン樹脂またはポリシクロオレフィン樹脂であることがより好ましい。これにより、近接場光を用いた蛍光測定に必要な透過率と屈折率とを確保することができ、また、自家蛍光が少ないため高感度の測定ができるとともに、耐溶剤性に強い底板２１０にすることができる。
【００３０】
底板２１０は、厚みが１００μｍ以上５ｍｍ以下であることが好ましく、２００μｍ以上３ｍｍ以下であることがより好ましい。これにより、本体基板２０５の強度を維持しつつ、近接場光を用いて高感度に測定をすることができる。
底板２１０は、近接場光の検出を行う手段にあわせて１つの層または適宜複数の層から構成してもよい。
【００３１】
枠体２１５は、当業者が適宜選択することができるが、取り扱いの容易さから樹脂製であることが好ましい。樹脂としては、熱可塑性樹脂、熱硬化性樹脂、および光硬化性樹脂が挙げられる。より具体的には、（メタ）アクリル系樹脂、オレフィン系樹脂（ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリシクロオレフィンなど）、エステル系樹脂（ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレートなど）、スチレン系樹脂（ポリスチレン、アクリロニトリル−スチレン共重合体、メタクリル酸メチル−スチレン共重合体、スチレン−ブタジエン−スチレンブロック共重合体、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体、メタクリル酸メチル−ブタジエン−スチレン共重合体など）、ポリサルフォン、ポリカーボネート、ポリイミド、エポキシ系樹脂、フェノール系樹脂、塩素含有樹脂（ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデンなど）フッ素含有樹脂、シリコーン系樹脂、金属錯体樹脂などが挙げられる。
【００３２】
枠体２１５は、底板２１０に接着または融着することで、本体基板２０５を形成する。接着で用いる接着剤は、枠体２１５および底板２１０の種類に応じて当業者が適宜選択することができる。
枠体２１５を底板２１０に融着させる場合は、枠体２１５は熱可塑性樹脂であることが好ましい。これにより、底板２１０と枠体２１５とをより強固に接合することができる。
枠体２１５は、蛍光測定を行う手段にあわせて、遮光性を付与するために、必要に応じて着色してもよく、金属薄膜を有してもよい。枠体２１５の好ましい形態として、顔料、染料、カーボンブラックなどを混合して黒色に着色することが挙げられる。
【００３３】
［１−２．捕捉用糖鎖］
ウェル２００内の底板２１０には、捕捉用糖鎖２５０が固定されている。
捕捉用糖鎖２５０と底板２１０との結合態様は、捕捉用糖鎖２５０の結合安定性の点からは、共有結合による固定が好ましい。捕捉用糖鎖２５０は底板２１０に安定的に固定されているため、仮に洗浄工程を経たとしても、底板２１０から遊離するリスクを低減することができる。
【００３４】
捕捉用糖鎖２５０は、生体試料中の検出対象５５０を特異的に認識する分子認識系を構築することができるアフィニティ物質であってよい。この場合、捕捉用糖鎖２５０は、検出目的となる検出対象５５０に応じ、当業者によって適宜選択されるものである。１個のウェル２００には、１種類の捕捉用糖鎖２５０のみが固定されていてもよいし、複数種の捕捉用糖鎖２５０が固定されていてもよい。本体基板２０５にウェル２００が複数ある場合、１個の本体基板２０５の全てのウェル２００において、同じ捕捉用糖鎖２５０または同じ組み合わせの捕捉用糖鎖２５０が固定されていてもよいし、一のウェル２００と他のウェル２００とにおいて、それぞれ異なる捕捉用糖鎖２５０または異なる組み合わせの捕捉用糖鎖２５０が固定されていてもよい。
【００３５】
[１−３．コーティング層]
ウェル２００の底板２１０と捕捉用糖鎖２５０とは直接結合してもよいし、必要に応じて底板２１０と捕捉用糖鎖２５０との間にコーティング層２３０を介して間接的に結合してもよい。
ウェル２００の底板２１０にコーティング層２３０を形成する場合は、コーティング層２３０の表面に機能性基２３５が露出している。これにより、捕捉用糖鎖２５０がウェル２００内により安定的に固定されるため、振とう工程を経ても捕捉用糖鎖２５０が底板２１０から遊離することを抑制できる。コーティング層２３０の被覆方法は、塗布、転写等一般的な方法を適宜選択することができる。
【００３６】
コーティング層２３０の機能性基２３５は、糖鎖の多くが還元末端を有することから、還元末端との反応性の高いヒドラジド基あるいはオキシルアミノ基に代表される一級アミノ基であることが好ましい。また、このコーティング層２３０は、底板２１０に良好に吸着するという観点から、疎水性基を有することがより好ましい。したがって、コーティング層２３０としては、少なくともヒドラジド基あるいはオキシルアミノ基に代表される一級アミノ基および疎水性基を併せ持つ高分子化合物を含むものが好ましい。
この高分子化合物は、それぞれの官能基を有するモノマーを共重合して得ることができる。ただし、一級アミノ基はモノマーの重合を阻害する場合があるので、高分子化合物の合成においては、アミノ基を有するモノマーを直接使用する代わりに、アミノ基を保護基で保護したモノマーを用いて合成してもよい。保護基としてはアミノ基を保護できるものであれば当業者が任意に用いることができるが、ｔ―ブトキシカルボニル基、ベンジロキシカルボニル基、９−フルオレニルメトキシカルボニル基などが好適に用いられる。このようなモノマーの例としては、Ｎ−［２−［２−［２−（ｔ−ブトキシカルボニルアミノオキシアセチルアミン）エトキシ］エトキシ］エチル］−メタクリアミドなどが挙げられる。脱保護は、高分子化合物合成後であればいつ実施してもよいが、捕捉用糖鎖２５０との反応性から、捕捉用糖鎖２５０を底板２１０に固定化する直前に行うのが好ましい。
一方、疎水性基の由来となるモノマーとしては、ｎ−ブチル（メタ）アクリレート、iso−プロピル（メタ）アクリレート、iso−ブチル（メタ）アクリレート、sec−ブチル（メタ）アクリレート、t−ブチル（メタ）アクリレート、ｎ−ネオペンチル（メタ）アクリレート、iso−ネオペンチル（メタ）アクリレート、iso−ネオペンチル（メタ）アクリレート、ネオペンチル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、ｎ−ヘキシル（メタ）アクリレート、iso−ヘキシル（メタ）アクリレート、ヘプチル（メタ）アクリレート、ｎ−オクチル（メタ）アクリレート、iso−オクチル（メタ）アクリレート、２−エチルヘキシル（メタ）アクリレート、ｎ−ノニル（メタ）アクリレート、iso−ノニル（メタ）アクリレート、ｎ−デシル（メタ）アクリレート、iso−デシル（メタ）アクリレート、ｎ−ドデシル（メタ）アクリレート、iso−ドデシル（メタ）アクリレート、ｎ−トリデシル（メタ）アクリレート、iso−トリデシル（メタ）アクリレート、ｎ−テトラデシル（メタ）アクリレート、iso−テトラデシル（メタ）アクリレート、ｎ−ペンタデシル（メタ）アクリレート、iso−ペンタデシル（メタ）アクリレート、ｎ−ヘキサデシル（メタ）アクリレート、iso−ヘキサデシル（メタ）アクリレート、ｎ−オクタデシル（メタ）アクリレート、iso−オクタデシル（メタ）アクリレート、イソボニル（メタ）アクリレート、スチレンなどが挙げられる。これらの中で、底板２１０への密着性をより高める観点からは、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、ｎ−ブチルメタクリレート、ｎ−ドデシルメタクリレート、ｎ−オクチルメタクリレートが好ましい。
【００３７】
また、コーティング層２３０に用いられる高分子化合物は、底板２１０に対して共有結合などの化学的結合をするものとしてもよい。このような観点から、高分子化合物における疎水性基の由来となるモノマーの一部または全てを、底板２１０との化学的結合性を有する官能基を持つモノマーに変更してもよい。これにより、捕捉用糖鎖２５０が底板２１０により強固に固定されるため、高感度の測定をすることができる。
底板２１０と化学的結合性を有する官能基としては特に限定されるものではないが、例えばシランカップリングが可能な官能基が挙げられる。このような官能基を有するモノマーとしては、例えば、３−（メタ）アクリロキシプロペニルトリメトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルビス（トリメチルシロキシ）メチルシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルジメチルメトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルジメチルエトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルメチルジメトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルメチルジエトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルトリメトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルトリエトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルトリス（メトキシエトキシ）シラン、８−（メタ）アクリロキシオクタニルトリメトキシシラン、１１−（メタ）アクリロキシウンデニルトリメトキシシラン等の（メタ）アクリロキシアルキルシラン化合物等を挙げることができる。なかでも３−メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルトリエトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルジメチルメトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルジメチルエトキシシランが好ましい。シランカップリングが可能な官能基を有する高分子化合物で被覆した場合、加熱により底板２１０と高分子化合物を結合させることができる。
【００３８】
コーティング層２３０を構成する高分子化合物において、ヒドラジド基あるいはオキシルアミノ基に代表される一級アミノ基を機能性基２３５として有する単位の割合は、高分子化合物を構成する単位の総数に対して、１ｍｏｌ％以上９４ｍｏｌ％以下が好ましく、より好ましくは２ｍｏｌ％以上９０ｍｏｌ％以下、さらに好ましくは２０ｍｏｌ％以上４０ｍｏｌ％以下である。
一方、疎水性基または底板２１０との結合性を有する官能基を有する単位の割合は、高分子化合物を構成する単位の総数に対して、合計で１ｍｏｌ％以上９５ｍｏｌ％以下が好ましく、より好ましくは２ｍｏｌ％以上９０ｍｏｌ％以下、さらに好ましくは３ｍｏｌ％以上８０ｍｏｌ％以下である。
これにより、捕捉用糖鎖２５０が底板２１０により強固に固定されるため、生体試料をより高感度に測定することができる。
【００３９】
底板２１０に一級アミノ基を導入する方法としては、ヒドラジド基またはオキシルアミノ基含有捕捉物質で基板を被覆する方法、ヒドラジド基またはオキシルアミノ基を保護基で保護した物質を被覆し、その後保護基を脱保護する方法等が挙げられる。
保護基としてはアミノ基を保護できるものであれば当業者が任意に用いることができるが、ｔ―ブトキシカルボニル基、ベンジロキシカルボニル基、９−フルオレニルメトキシカルボニル基などが好適に用いられる。
【００４０】
また、ヒドラジド基またはオキシルアミノ基に代表される一級アミノ基含有固定化物質においては、分析に不要な生体試料の成分が非特異的に吸着するのを抑制する観点から、親水性基を有することが好ましい。
親水性基は、特に構造を限定されるものではないが、例えば２−（メタ）アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、２−（メタ）アクリロイルオキシエトキシエチルホスホリルコリン、６−（メタ）アクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン、１０−（メタ）アクリロイルオキシエトキシノニルホスホリルコリン、２−（メタ）アクリロイルオキシプロピルホスホリルコリン等が挙げられる。
底板２１０の表面における非特異的吸着をより確実に抑制することができるため、上記の中でも２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンが好ましい。
コーティング層２３０を構成する高分子化合物において、親水性基を有する単位の割合は特に限定されないが、高分子化合物を構成する単位の総数に対して、５ｍｏｌ％以上９８ｍｏｌ％以下が好ましく、より好ましくは１０ｍｏｌ％以上９０ｍｏｌ％以下、さらに好ましくは１０ｍｏｌ％以上８０ｍｏｌ％以下である。
【００４１】
［１−４．スポット］
ウェル２００内には、捕捉用糖鎖２５０がスポット状に固定されていてもよい。
１つのウェル２００内に１つ又は複数のスポット２９０が形成されており、複数の場合の各スポットには、同種又は複数種の捕捉用糖鎖２５０が固定されていてもよい。
【００４２】
ウェル２００内に複数のスポット２９０が形成されている場合、各スポット２９０の面積は５，０００μｍ２以上５００，０００μｍ２以下が好ましく、１０，０００μｍ２以上２００，０００μｍ２以下がより好ましい。
各スポット２９０の面積を上記下限値以上とすることで、スポット形状の均一化を図ることができるため、蛍光測定を高い精度ですることができる。一方で、各スポット２９０の面積を上記上限値以下とすることで、多スポット化をすることができる。
【００４３】
スポット２９０の間隙の最小値とは、図２に示すように、スポット２９０を複数配列した場合における各スポット２９０の外枠の隣接距離のうち、最も距離が小さくなる箇所の値ｄをいう。
スポット２９０の間隙の最小値ｄは、１０μｍ以上１，０００μｍ以下が好ましく、２０μｍ以上５００μｍ以下がより好ましい。スポット２９０の間隙の最小の隣接距離ｄを上記下限値以上とすることで、隣接したスポット２９０の発光の干渉を受けにくくすることができるため、より高い感度で分析する事ができる。また、スポット２９０の間隙の最小の隣接距離ｄを上記上限値以下とすることで、多スポット化を達成することができる。
スポット２９０の形状は、図２における実施例では円形としているが、多角形または線状に形成されていてもよい。
【００４４】
［２−１．添加工程］
本発明の添加工程では、蛍光標識３５０および検出対象５５０を含む溶液を、ウェル２００内に滴下する。これにより、蛍光標識された検出対象５５０が捕捉用糖鎖２５０と相互作用し、検出対象５５０がウェル２００の底板２１０付近に捕捉される。
本発明の添加工程では、あらかじめ蛍光標識３５０が結合された検出対象５５０を準備してウェル２００に添加してもよいし、標識されていない検出対象５５０と蛍光標識３５０とを添加工程で添加してもよい。
あらかじめ蛍光標識３５０が結合された検出対象５５０をウェル２００内に添加すると、蛍光標識された検出対象５５０と捕捉用糖鎖２５０とが相互作用する。
【００４５】
［２−１−１．検出対象］
生体試料における検出対象５５０の濃度は、１ｆｇ／ｍｌ以上１００μｇ／ｍｌ以下であることが好ましい。
検出対象５５０の濃度を上記下限値以上とすることで、捕捉用糖鎖２５０と検出対象５５０とを十分に相互作用させることができるため、より高感度に測定することができる。また、検出対象５５０の濃度を上記上限値以下とすることによって、非特異的な検出を抑え、検出対象５５０を選択的に検出できるようになる。
生体試料における検出対象５５０の濃度を１ｐｇ／ｍｌ以上１μｇ／ｍｌ以下に調製することがより好ましい。また、生体試料における検出対象５５０の濃度を１０ｐｇ／ｍｌ以上１μｇ／ｍｌ以下に調製することがさらに好ましい。
検出対象５５０の濃度を上記下限値以上とすることで、捕捉用糖鎖２５０と検出対象５５０とを十分に相互作用させることができるため、より高感度に測定することができる。また、検出対象５５０の濃度を上記上限値以下とすることによって、振とう工程の効果を効果的に得ることができるようになる。
【００４６】
［２−１−２．蛍光標識］
検出対象５５０は蛍光標識３５０により標識し、これにより検出対象５５０を蛍光測定により検出することができる。検出対象５５０に蛍光標識３５０を直接結合させた場合の模式図を図３に示す。検出対象５５０への標識にあたり、蛍光標識３５０は、検出対象５５０に直接結合させてもよいし、リンカー３１０を介して検出対象５５０に結合させてもよい。蛍光標識３５０およびリンカー３１０は、検出対象５５０に応じて当業者が適宜選択することができる。
【００４７】
検出対象５５０の標識には、安全性、およびウェル型糖鎖基板１００の使用方法が簡素である点で、蛍光物質による標識が好ましい。蛍光物質としては、蛍光化合物および蛍光タンパク質が挙げられる。蛍光物質の中でも、蛍光化合物は生体物質でないため、ウェル２００で生体試料の分析を行うにあたり安定である点でより好ましい。
【００４８】
蛍光標識３５０として用いる蛍光化合物としては、フルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（Integrated DNA Technologies社）、ポリハロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（アプライドバイオシステムズジャパン(株)）、ヘキサクロロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（アプライドバイオシステムズジャパン(株)）、クマリン・ファミリーの蛍光色素（インビトロジェン(株)）、ローダミン・ファミリーの蛍光色素（GEヘルスケア  バイオサイエンス(株)）、シアニン・ファミリーの蛍光色素、インドカルボシアニン・ファミリーの蛍光色素、オキサジン・ファミリーの蛍光色素、チアジン・ファミリーの蛍光色素、スクアライン・ファミリーの蛍光色素、キレート化ランタニド・ファミリーの蛍光色素、BODIPY（登録商標）・ファミリーの蛍光色素（インビトロジェン(株)）、ナフタレンスルホン酸・ファミリーの蛍光色素、ピレン・ファミリーの蛍光色素、トリフェニルメタン・ファミリーの蛍光色素、Alexa Fluor（登録商標）色素シリーズ（インビトロジェン(株)）等の蛍光色素が挙げられる。
【００４９】
本発明で用いる蛍光標識３５０としては、メチン鎖の炭素数が３または５のシアニン色素を用いることができる。これにより、蛍光標識３５０の安定性を高くすることができる。メチン鎖の炭素数が３または５のシアニン色素としては、下記一般式［１Ａ］の化合物が挙げられる。
【００５０】
【化１】
2018189461.tif 000003
（上記式中、ｎは１または２の整数である。）
【００５１】
上記式中、Ｒ１とＲ１’、Ｒ３とＲ３’は、それぞれ独立して有機基または、それらが互いに連結して環状構造を形成する基をあらわす。
Ｒ１とＲ１’、Ｒ３とＲ３’の両方がそれぞれ独立した有機基であってもよいし、Ｒ１とＲ１’、Ｒ３とＲ３’のいずれかが独立した有機基であってもよいし、または、Ｒ１とＲ１’、Ｒ３とＲ３’の両方がそれぞれ互いに連結して環状構造を形成してもよい。
【００５２】
Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ３、Ｒ３’は、少なくとも１個の炭素原子を含む基であれば特に限定されない。有機基は、直鎖状、分岐状、または環状（脂環または芳香環）であってよい。有機基としては、Ｒ１とＲ１’、Ｒ３とＲ３’がそれぞれ互いに連結して環状構造を形成する閉鎖シアニンが挙げられる。
また、Ｒ２、Ｒ４は、それぞれ独立して、水素原子または炭素原子を含む基であれば特に限定されない。有機基は、直鎖状、分岐状、または環状（脂環または芳香環）であってよい。有機基としては、Ｒ２またはＲ４をビオチン化試薬のスペーサーアームおよび反応性基としたものが挙げられる。
【００５３】
本発明で用いる蛍光標識３５０は、極大励起波長５４０ｎｍ以上５６０ｎｍ以下かつ極大蛍光波長５６０ｎｍ以上５８０ｎｍ以下の色素を用いてもよい。この波長帯域の色素は測定工程における近接場光の励起および蛍光測定に適している。
【００５４】
極大励起波長５４０ｎｍ以上５６０ｎｍ以下かつ極大蛍光波長５６０ｎｍ以上５８０ｎｍ以下の色素としては、HiLyte Fluor 555（登録商標、アナスペック社製）、Cy3、DyLight 547（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、登録商標）、Rhodamine、TRITC（Tetramethylrhodamine）、DY-548、DY-554、DY-555、DY-556、DY-505-X5、DY-547、DY-560、（ＤＹＯＭＩＣＳ社製）Alexa Fluor 546（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、登録商標）、Alexa Fluor 555（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、登録商標）、ATTO 550（登録商標、ＡＴＴＯ−ＴＥＣ社製）、NorthernLights 557、Oyster 550、5-TAMRA（5-Carboxytetramethylrhodamine）、TAMRA（Tetramethylrhodamine）、MFP555（登録商標、Ｍｏｂｉｔｅｃ社製）、IC3-Osu（同仁化学研究所製）などがあげられる。これら蛍光色素は単独で使用されてもよいし、複数種が混合され使用されてもよい。
【００５５】
本発明で用いる蛍光標識３５０としては、安定性と汎用性の観点から下記式［１Ｂ］が好ましい。水溶性基が閉鎖シアニンの芳香環上にあるため、蛍光の安定性および水溶性が向上する。また、シアニン色素は、メチン鎖長などにより種々の波長の色素を合成することが可能であり、下記式［１Ｂ］の代表的な吸収波長は５５０ｎｍであり蛍光波長は５７０ｎｍであるため、測定工程における近接場光の励起および蛍光測定に適している。
【００５６】
【化２】
2018189461.tif 000004
【００５７】
［２−１−２．リンカー］
蛍光標識３５０は、リンカー３１０を介して検出対象５５０に結合したものであってよい。この場合、リンカー３１０と蛍光標識３５０の結合は、添加工程の前に行ってもよいし、添加工程において行ってもよい。
リンカー３１０と蛍光標識３１０とを添加工程の前に結合させる場合は、添加工程の前に、リンカー３１０が結合した蛍光標識３５０を含む調製液を作製して、検出対象５５０を調製液で標識してもよいし、または、リンカー３１０と蛍光標識３５０と検出対象５５０とを一度に結合させて、標識された検出対象５５０を作製してもよい。その後、添加工程において、標識された検出対象５５０をウェル２００内に添加することができる。
【００５８】
一方、添加工程において、リンカー３１０が結合した蛍光標識３５０を含む調製液と、検出対象５５０とをウェル２００内に添加してもよい。これにより、検出対象５５０は、ウェル２００内で捕捉用糖鎖２５０と相互作用するとともに、同時にリンカー３１０とも結合する。したがって、検出対象５５０の標識と固定をワンステップですることができるため、生体試料の分析方法が簡略化できる点で好ましい。また、振とう工程によって、リンカー３１０と検出対象５５０とを十分に結合させることができるため、生体試料を高感度に測定することができる点で好ましい。
【００５９】
検出対象５５０に特異的に結合するリンカー３１０を用いる場合は、検出対象５５０に応じて当業者が適宜選択することができる。リンカー３１０の例としては、検出対象５５０との親和性が強い糖鎖または抗体を用いることが好ましい。また、検出対象５５０にビオチンが結合している場合は、アビジンをリンカー３１０として用いることができる。糖鎖３１０aおよび抗体３１０ｂをリンカー３１０として用いた場合の模式図を図４および図５に示す。
リンカー３１０として用いる糖鎖３１０aおよび抗体３１０ｂは当業者が適宜選択することができる。リンカー３１０として抗体３１０ｂを使用する場合、抗体３１０ｂは、検出目的の抗原上の部位のうち、捕捉用糖鎖２５０が認識する部位とは異なる部位をエピトープとする抗体物質である。
【００６０】
［２−２．振とう工程］
本発明では、添加工程の後にウェル型糖鎖基板１００を振とうする振とう工程を行う。本発明の振とうの方法は、振とう器を用いて振動を与える方法などがあげられる。また、ウェル型糖鎖基板１００に与える振動は、回転振動によるものと往復振動によるものがあげられる。
本発明の振とう工程では、振幅０．５ｍｍ以上５０ｍｍ以下かつ速度５０回/分以上１，０００回/分以下の回転振動または往復振動の条件下で、１０秒以上２４時間以下振とうさせてもよい。
【００６１】
これにより、捕捉用糖鎖２５０と検出対象５５０とをより十分に相互作用させることができるため、生体試料を高感度に測定することができる。また、上述のとおり、振とうによって検出対象５５０が、蛍光標識３５０またはリンカー３１０とより十分に結合させることができるため、生体試料を高感度に測定することができる。
生体試料における検出対象５５０の濃度が低い場合は、得られる蛍光強度が弱いため測定が困難となり、また、測定できたとしても検出対象５５０の相互作用に時間をかける必要があった。しかし、本発明の振とう工程によって、検出対象５５０の相互作用を効果的に促進することができるため、従来は検出対象５５０の濃度が低く測定が困難であった生体試料であっても高感度に測定をすることができる。
【００６２】
本発明の好適な振とうの方法の一つは、振とう器を用いてウェル型糖鎖基板１００に回転振動を与える方法である。振とうの条件としては、振幅０．５ｍｍ以上５０ｍｍ以下、回転速度５０回/分以上１，０００回/分以下の条件下で、１０秒以上２４時間以下振とうすることが好ましく、振幅１ｍｍ以上１０ｍｍ以下、回転速度１００回/分以上５００回/分以下の条件下で、３０分以上５時間以下振とうすることがより好ましい。
振幅を上記範囲とすることで、検出対象５５０および蛍光標識３５０などの物質をウェル２００内に行き渡らせることができる。また、回転速度と振とう時間とを上記範囲にすることで、検出対象５５０と捕捉用糖鎖２５０との相互作用を効果的に促進させることができる。
【００６３】
また、本発明の振とう工程では、ウェル型糖鎖基板１００の温度は４℃以上３７℃以下に保たれることが好ましい。これにより適切に反応を進行させることができる。
【００６４】
［２−３．測定工程］
本発明では、振とう工程によって得られたウェル型糖鎖基板１００に対して、電磁波を照射して、ウェル２００内の近接場光により生体試料を測定する測定工程を行う。
【００６５】
本発明において「高感度」とは、本発明の分析方法または分析キットを用いることにより、本発明の分析方法または分析キットを用いない場合に比べて、捕捉された検出対象５５０に起因する蛍光の強度が強く得られることをいう。
【００６６】
捕捉用糖鎖２５０は、検出対象５５０と特異的に非共有的に結合するため、検出対象５５０は、捕捉用糖鎖２５０によって底板２１０の近傍に捕捉される。そして、蛍光標識３５０が、リンカー３１０を介して間接的に検出対象５５０と結合する。したがって、ウェル２００内の底板２１０の近傍に近接場光を発生させることによって、底板２１０付近に存在する蛍光標識３５０のみを励起することができる。
【００６７】
これにより、捕捉用糖鎖２５０に捕捉された基板表面近傍の検出対象５５０のみを測定することができる。したがって、ウェル２００内に残存する不要な生体物質等を除去する洗浄工程を行うことなく、生体試料を直接測定することができるため、測定手順が簡略化される。
また、上述のウェル型糖鎖基板１００を振とうさせる振とう工程によって、捕捉用糖鎖２５０と検出対象５５０とを十分に相互作用させることができ、さらに捕捉用糖鎖２５０と非共有結合的に相互作用している検出対象５５０に対して洗浄工程を行わないことによって、捕捉用糖鎖２５０が検出対象５５０と相互作用した状態のまま直接測定することができる。したがって、生体試料を高感度に測定することができる。
また、近接場光により励起して蛍光を検出するため、蛍光検出の際には入射光からの影響を最小限に抑えることができ、高感度の測定をすることができる。
【００６８】
具体例としては、エバネッセント波励起型蛍光検出法により、底板２１０の表面に発生するエバネッセント波を用いて蛍光標識３５０を励起する方法が挙げられる。
測定工程で用いられる蛍光の検出方法は、バイオアッセイの分野において一般に用いられている公知の検出方法であれば特に限定されない。本発明で近接場光により得られた蛍光を検出するために用いられる光源については、従来公知のものをそれぞれ用いることができる。また、測定におけるＳＮ比を高めるために、必要に応じて自家蛍光に伴うノイズを補正してもよい。この場合、蛍光標識されていない領域における蛍光を測定し、これをバックグラウンドの蛍光として補正することで、ＳＮ比が向上する。
【００６９】
また、本発明で検出された測定結果をもとにして、生体試料に含まれる検出対象５５０を定量することもできる。具体的には、既知濃度の検出対象５５０での測定を実施することで検量線を作成し、作成された検量線に基づいて生体試料中の検出対象５５０の量を測定シグナルから算出することができる。
【００７０】
［２−４．ウイルスの測定］
本発明におけるウェル２００に固定された捕捉用糖鎖２５０は、α２，３結合型シアル酸含有糖鎖及び／又はα２，６結合型シアル酸含有糖鎖であってよい。検出対象５５０がウイルスである場合、ウイルスの種類によって、ウイルスが結合し得るシアル酸と糖との結合の様式が異なるため、ウイルスが結合するシアル酸含有糖鎖の種類を調べることによって、ウイルスを分類することができる。
【００７１】
また、ウイルスの測定に用いる捕捉用糖鎖２５０として、さらに、アシアロ糖鎖が固定されてもよい。アシアロ糖鎖にはウイルスが結合しないため、アシアロ糖鎖が固定された区分は、反応のネガティブコントロールとして利用することができる。
【００７２】
［３．分析キット］
本発明の分析キットは、ウェル型糖鎖基板１００と、本発明の分析方法が記載されたプロトコルとを含む。ウェル型糖鎖基板１００における、本体基板２０５、捕捉用糖鎖２５０およびウェル２００の構成は上述のとおりである。また、本発明の分析方法で必要な、添加工程および振とう工程、測定工程の条件は上述のとおりである。
【００７３】
キット使用のためのプロトコル情報は、生体試料の分析方法が示された印刷物または説明書であってもよいし、当該方法が示されたウェブ上の情報へのアクセスを可能とするアクセス情報であってもよい。
また、本発明のキットには、上述のリンカー３１０およびまたは蛍光標識３５０を含んでいてもよい。検出対象５５０と相互作用する物質および検出方法は使用者が適宜選択することができる。
【実施例】
【００７４】
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に制限されるものではない。
【００７５】
［実施例１］
（１）以下のように、ウェル型糖鎖基板１００を作製した。
（１−１）本体基板２０５の作製
底板２１０としてシクロオレフィンポリマーを用意し、枠体２１５としてポリスチレンを用意した。底板２１０と枠体２１５とをそれぞれ射出成形により作製し、底板２１０上に枠体２１５を接着させて、ウェルを有する本体基板２０５を作製した。
【００７６】
（１−２）コーティング層２３０の作製
ウェル２００内の底板２１０に、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）、シクロヘキシルメタクリレート（ＣＨＭＡ）、Ｎ−［２−［２−［２−（ｔ−ブトキシカルボニルアミノオキシアセチルアミン）エトキシ］エトキシ］エチル］−メタクリアミド（ＯＡ）の共重合体（共重合体において、各モノマーに由来する繰り返し構成単位のモル比は３５：３８：２７である）の１．０重量％エタノール混合溶液を浸漬した後、室温で０．５時間乾燥することにより、表面がアミノオキシ基を有する重合体で被覆されたコーティング層２３０を作製した。その後、濃度２mol/lの塩酸にウェル型糖鎖基板１００を約１２時間浸漬することで脱保護を行った。
【００７７】
（１−３）捕捉用糖鎖２５０の固定
捕捉用糖鎖２５０として、ＧＭ１を用意し、コーティング層２３０にピン方式にてスポッティングした。スポッティングにあたっては、１つのウェル内にスポット２９０を１２個作製し、各スポット２９０の面積を４９，０００μｍ２とし、スポット２９０の間隔の最小値が５００μｍとなるようにした。
その後、底板２１０上にコートしたポリマーのアミノオキシ基と、スポッティングした糖鎖の還元末端との固定化反応を行った。その後、不要なアミノオキシ基を無水コハク酸（和光純薬工業社製）により用いてブロッキングし、ウェル型糖鎖基板１００を作製した。
【００７８】
（２）添加工程
検出対象５５０として、コレラトキシンBサブユニット(Invitrogen社製C34776)を準備した。検出対象５５０には、極大励起波長５５５ｎｍ極大蛍光波長５６５ｎｍのCy3色素が蛍光標識３５０として結合されている。
生体試料中の検出対象５５０の濃度が１ｎｇ／ｍlとなるよう調製し、各ウェル２００に７０μl添加した。
【００７９】
（３）振とう工程
添加工程を経たウェル型糖鎖基板１００を振とう器（アズワン社製マイクロプレートミキサー  ＮＳ−Ｐ）を用いて振幅２ｍｍ速度２００回/分の条件として室温で振とうを行った。振とうの時間は、０分、３０分、６０分、１２０分で実施した。
【００８０】
（４）測定工程
振とう工程を経たウェル型糖鎖基板１００をエバネッセント蛍光スキャナ（株式会社レクザムBio-REX SCAN 200）を用いて蛍光測定した。励起波長は５３２ｎｍとして蛍光波長５７５ｎｍの蛍光強度を測定した。
蛍光測定の結果、強い蛍光シグナルを得た。振とうした時間に応じて、得られた蛍光測定の結果を図６に示す。なお、蛍光強度の算出にあたっては、蛍光測定で得られた蛍光スペクトルから自家蛍光のスペクトル成分を差し引くことで、自家蛍光の補正をした。
また、振とうの時間を０分と１２０分とで比較した場合の蛍光測定のスキャン画像を図７に示す。図７の画像では、コレラトキシンBサブユニットの濃度を、上から順に100ｎｇ／ｍl、1ｎｇ／ｍlとした。
【００８１】
［実施例２］
蛍光標識された検出対象５５０の濃度を１０ｐｇ/ｍｌとした。それ以外は、実施例１と同様に分析を行った。
蛍光測定の結果、強い蛍光シグナルを得た。振とうした時間に応じて、得られた蛍光測定の結果を図８に示す。なお、蛍光強度の算出にあたっては、自家蛍光の補正をしている。
【００８２】
［実施例３］
蛍光標識３５０として、メチン鎖の炭素数が５のシアニン色素であるＣｙ５色素（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス(株)）を用意し、励起波長６３５ｎｍとして蛍光波長６７０ｎｍの蛍光強度を測定した。それ以外は、実施例１と同様に分析を行った。
蛍光測定の結果、強い蛍光シグナルを得た。振とうした時間に応じて、得られた蛍光測定の結果を図９に示す。なお、蛍光強度の算出にあたっては、自家蛍光の補正をしていない。
【００８３】
［実施例４］
蛍光標識された検出対象５５０の濃度を１０ｐｇ/ｍｌとした。また、蛍光標識３５０として、メチン鎖の炭素数が５のシアニン色素であるＣｙ５色素（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス(株)）を用意し、励起波長６３５ｎｍとして蛍光波長６７０ｎｍの蛍光強度を測定した。それ以外は、実施例１と同様に分析を行った。
蛍光測定の結果、強い蛍光シグナルを得た。振とうした時間に応じて、得られた蛍光測定の結果を図１０に示す。なお、蛍光強度の算出にあたっては、自家蛍光の補正をしていない。
【００８４】
［比較例１］
実施例１において、振とう工程を行なわず、ウェル型糖鎖基板１００を０分、３０分、６０分、１２０分静置して反応させた。それ以外は、実施例１と同様に分析を行った。
静置時間に応じた蛍光測定の結果を図６に示す。なお、蛍光強度の算出にあたっては、自家蛍光の補正をしている。
【００８５】
［比較例２］
実施例２において、振とう工程を行なわず、ウェル型糖鎖基板１００を０分、３０分、６０分、１２０分静置して反応させた。それ以外は、実施例２と同様に分析を行った。
静置時間に応じた蛍光測定の結果を図８に示す。なお、蛍光強度の算出にあたっては、自家蛍光の補正をしている。
【００８６】
［比較例３］
実施例３において、振とう工程を行なわず、ウェル型糖鎖基板１００を０分、３０分、６０分、１２０分静置して反応させた。それ以外は、実施例３と同様に分析を行った。
静置時間に応じた蛍光測定の結果を図９に示す。なお、蛍光強度の算出にあたっては、自家蛍光の補正をしていない。
【００８７】
［比較例４］
実施例４において、振とう工程を行なわず、ウェル型糖鎖基板１００を０分、３０分、６０分、１２０分静置して反応させた。それ以外は、実施例４と同様に分析を行った。
静置時間に応じた蛍光測定の結果を図１０に示す。なお、蛍光強度の算出にあたっては、自家蛍光の補正をしていない。
【００８８】
［実施形態における各部と請求項の各構成要素との対応関係］
本明細書におけるウェル型糖鎖基板１００が「ウェル型糖鎖基板」に相当し、ウェル２００が「ウェル」に相当し、本体基板２０５が「本体基板」に相当し、底板２１０が「底板」に相当し、枠体２１５が「枠体」に相当し、捕捉用糖鎖２５０が「捕捉用糖鎖」に相当し、蛍光標識３５０が「蛍光標識」に相当する。
【符号の説明】
【００８９】
１００  ウェル型糖鎖基板
２００  ウェル
２０５  本体基板
２１０  底板
２１５  枠体
２３０  コーティング層
２５０  捕捉用糖鎖
３１０  リンカー
３５０  蛍光標識
５５０  検出対象
【図１】
2018189461.tif 000005
【図２】
2018189461.tif 000006
【図３】
2018189461.tif 000007
【図４】
2018189461.tif 000008
【図５】
2018189461.tif 000009
【図６】
2018189461.tif 000010
【図７】
2018189461.tif 000011
【図８】
2018189461.tif 000012
【図９】
2018189461.tif 000013
【図１０】
2018189461.tif 000014