(57)【要約】【課題】新規な非アルコール性脂肪性肝疾患治療又は予防剤及び非アルコール性脂肪性肝疾患予防用食品を提供する。【解決手段】本発明は、緑藻類由来物質を有効成分として含有する非アルコール性脂肪性肝疾患治療又は予防剤である。前記緑藻類由来物質は、クロレラである。非アルコール性脂肪肝炎治療又は予防剤として使用される。肝線維化抑制剤として使用される。また、本発明は、緑藻類由来物質を有効成分として含有する非アルコール性脂肪性肝疾患予防用食品である。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
緑藻類由来物質を有効成分として含有する非アルコール性脂肪性肝疾患治療又は予防剤。
【請求項２】
前記緑藻類由来物質は、クロレラであることを特徴とする請求項１記載の非アルコール性脂肪性肝疾患治療又は予防剤。
【請求項３】
非アルコール性脂肪肝炎治療又は予防剤として使用されることを特徴とする請求項１又は２記載の非アルコール性脂肪性肝疾患治療又は予防剤。
【請求項４】
肝線維化抑制剤として使用されることを特徴とする請求項１乃至３いずれか記載の非アルコール性脂肪性肝疾患治療又は予防剤。
【請求項５】
緑藻類由来物質を有効成分として含有する非アルコール性脂肪性肝疾患予防用食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な非アルコール性脂肪性肝疾患治療又は予防剤及び非アルコール性脂肪性肝疾患予防用食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂肪性肝疾患（脂肪肝）とは、肝細胞に中性脂肪（TG）が沈着して、肝障害をきたす疾患の総称である。明らかな飲酒歴がない脂肪性肝疾患は、非アルコール性脂肪性肝疾患（nonalcoholic fatty liver disease: NAFLD）と呼ばれている。NAFLDは、予後良好な単純性脂肪肝と、肝硬変、肝癌へと進行する可能性のある非アルコール性脂肪肝炎 （nonalcoholic steatohepatitis: NASH）に分かれる（非特許文献１）。
日本における肝癌は、C型肝炎などウイルス性肝疾患が大部分を占めていたが、最近では非ウイルス性の症例が増加しており、その多くはNASHなど脂肪性肝炎に起因すると考えられている。NASHは少なくとも成人の1％と推定され、線維化の進行などにより症状が深刻になると肝硬変，肝細胞癌や合併症を引き起こし、肝臓癌や肝移植のケースに発展する。そこで、最近になって、NASHの予防，治療法の検討が行われるようになってきた。
【０００３】
NASH及びNAFLDの治療薬として、例えば、多糖類、パパイヤおよび海藻を、乳酸菌と酵母とで共棲発酵してなる発酵エキスを有効成分とする、非アルコール性脂肪性肝疾患および／または非アルコール性脂肪肝炎の治療薬（特許文献１）や、マルチトールを有効成分として含有する肝機能改善剤（特許文献２）等が提案されている。
【０００４】
しかし、現在のところ、NASHの治療法として確立されたものはなく、食事・運動療法による体重減少等の生活習慣の改善が基本となっている。食事・運動療法が無効のときには、薬物療法や鉄を減らす除鉄療法も行われるが、確立された薬物療法がないのが実情である。
食事・運動療法では、2〜3kgの体重減少で組織学的にも改善するが、患者は体重の増減を繰り返しがちで、体重が減ると単純性脂肪肝に改善し、逆に増えるとNASHへ進展して、風船様腫大やMallory-Denk小体の出現などの進行と改善を繰り返す症例も少なくない。治療は、長期戦となり、なかなか改善や完治に至らない症例が多いのが現状である。
【０００５】
一方で、食糧、飼料等としての利用が有望視されている生物資源として、クロレラが注目されている。
クロレラは、クロレラ属(Chlorella)に属する単細胞緑藻類であって、淡水に自生する直径約3〜8μmの球体をした生物である。クロレラの種としては、プレノイドサ種（pyrenoidosa）、エルプソイデア種（ellipsoidea）、ブルガリス種（vulgaris）、レギラリス種（regularis）等が挙げられる。
クロレラには、多くのタンパク質が含有され、必須アミノ酸、核酸、ミネラルのほか、ビタミンＥやカロチノイド等も含有されている。そのため、多種類の栄養素をバランスよく摂取するためのサプリメントとしての利用や、経済的，地理的事情等からバランスのとれた栄養摂取が難しい地域での食糧資源としての利用が提案されている。また、多くの機能性があることが期待されている。
そのため、クロレラを含む緑藻類、及び緑藻類由来物質についての機能や、機能性発現のメカニズムの解明、ひいては、これら物質の利用法等の開発が望まれている。
【０００６】
例えば、特許文献３では、クロレラのプロテアーゼ処理物を有効成分として含有する生活習慣病予防材が提案されている。特許文献２の生活習慣病予防剤によれば、肥満、高脂血（中性脂肪・遊離脂肪酸）、又は高血糖のいずれかを改善させ、インスリン感受性改善作用、肝機能（GPT）改善作用、又は腎機能（尿酸）改善作用のいずれかを有する。
しかし、特許文献３の発明によれば、肥満症、糖尿病、高脂血症などの生活習慣病を予防するが、NASH及びNAFLDの治療又は予防剤についての記載はない。
つまり、正常肝であったところに、肥満，糖尿病，高脂血症などのインスリン抵抗性によって肝臓に脂肪が蓄積して脂肪肝になるfirst hitと、次に脂質過酸化、サイトカイン、鉄などの酸化ストレスがNASHを起こすsecond hitが起こることにより発症すると考えられ、特有の発症メカニズムを有するNASH及びNAFLDの発症を抑制する作用については、検討もなされていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】「NASH/NAFLDの診療ガイド2010」、［online］、平成26年10月15日、一般社団法人 日本肝臓学会、［平成28年10月25日検索］、インターネット〈URL：http://www.jsh.or.jp/medical/guidelines/jsh_guidlines/NASH・NAFLD2010〉
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許第５５７１６５０号公報
【特許文献２】特開２０１４−１２９３２４号公報
【特許文献３】特開２０１０−２３５５１７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、上記の課題に鑑みてなされたものであり、本発明の目的は、新規な非アルコール性脂肪性肝疾患治療又は予防剤及び非アルコール性脂肪性肝疾患予防用食品を提供することにある。
本発明の他の目的は、緑藻類由来物質の新規な利用方法となる非アルコール性脂肪性肝疾患治療又は予防剤及び非アルコール性脂肪性肝疾患予防用食品を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記課題は、本発明によれば、緑藻類由来物質を有効成分として含有する非アルコール性脂肪性肝疾患治療又は予防剤により解決される。
上記構成により、非アルコール性脂肪性肝疾患又は非アルコール性脂肪肝炎患者や、非アルコール性脂肪性肝疾患又は非アルコール性脂肪肝炎を発症する可能性のあるヒト、動物に緑藻類由来物質を投与すると、緑藻類由来物質が生体内において、非アルコール性脂肪肝炎の特徴の一つである肝線維化を阻害する作用を果たすため、非アルコール性脂肪肝炎の進行を抑制できる。更に、線維化が進行することによって非アルコール性脂肪肝炎が肝硬変及び肝臓癌に進展することを阻害できる。非アルコール性脂肪性肝疾患の約10％が進行性の非アルコール性脂肪肝炎であると言われており、本発明は、線維化の進行を抑制する作用を通じて、非アルコール性脂肪性肝疾患治療又は予防剤として用いることができる。
【００１１】
このとき、前記緑藻類由来物質は、クロレラであってもよい。
このように、本発明の非アルコール性脂肪性肝疾患治療又は予防剤として、食品としても認可されているクロレラを用いるため、長期間の投与又は摂取が可能であり、食事・運動療法が中心で、治療が長期化しがちな非アルコール性脂肪性肝疾患の治療又は予防に適した治療又は予防剤を提供できる。
また、非アルコール性脂肪性肝疾患治療又は予防剤は、非アルコール性脂肪肝炎治療又は予防剤又は肝線維化抑制剤として使用されてもよい。
このように、本発明の非アルコール性脂肪性肝疾患治療又は予防剤は、肝線維化抑制剤として作用するため、非アルコール性脂肪性肝疾患の約10％を占める非アルコール性脂肪肝炎の特徴の一つである線維化が進行することを抑制し、非アルコール性脂肪肝炎の進行を抑制できる。更に、線維化が進行することによって非アルコール性脂肪肝炎が肝硬変及び肝臓癌に進展することを阻害できる。
非アルコール性脂肪性肝疾患及び非アルコール性脂肪肝炎に罹患していないヒト、動物に対しても、本発明の非アルコール性脂肪性肝疾患予防剤を用いることができる。例えば、家族歴や、肥満，糖尿病，高血圧，脂質異常症などの生活習慣病に罹患している、睡眠時無呼吸症候群に罹患している、ある種の薬の服用履歴がある、あるいは十二指腸や膵臓の手術後に起こる栄養吸収障害が起こっている等の情報に基づいて、非アルコール性脂肪肝炎に罹患する可能性が高い状態にあると判断された場合に、投与されることにより、非アルコール性脂肪性肝疾患予防剤として用いることができる。
また、前記課題は、本発明によれば、緑藻類由来物質を有効成分として含有する非アルコール性脂肪性肝疾患予防用食品により解決される。
このように構成しているので、非アルコール性脂肪性肝疾患及び非アルコール性脂肪肝炎に罹患していないヒト、動物であっても摂取することができる。例えば、家族歴や、肥満，糖尿病，高血圧，脂質異常症などの生活習慣病に罹患している、睡眠時無呼吸症候群に罹患している、ある種の薬の服用履歴がある、あるいは十二指腸や膵臓の手術後に起こる栄養吸収障害が起こっている等の情報に基づいて、非アルコール性脂肪肝炎に罹患する可能性が高い状態にあると判断された場合に、摂取することにより、非アルコール性脂肪性肝疾患予防用食品として用いることができる。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、非アルコール性脂肪性肝疾患又は非アルコール性脂肪肝炎患者や、非アルコール性脂肪性肝疾患又は非アルコール性脂肪肝炎を発症する可能性のあるヒト、動物に緑藻類由来物質を投与すると、緑藻類由来物質が生体内において、非アルコール性脂肪肝炎の特徴の一つである肝線維化を阻害する作用を果たすため、非アルコール性脂肪肝炎の進行を抑制できる。更に、線維化が進行することによって非アルコール性脂肪肝炎が肝硬変及び肝臓癌に進展することを阻害できる。非アルコール性脂肪性肝疾患の約10％が進行性の非アルコール性脂肪肝炎であると言われており、本発明は、線維化の進行を抑制する作用を通じて、非アルコール性脂肪性肝疾患治療又は予防剤として用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】試験１で摘出した肝臓サンプルの各葉の配置を示す説明図である。
【図２】試験１において、摘出した肝臓サンプルの外側左葉の切断箇所を示す説明図である。
【図３】試験１において、本発明の実施例１のクロレラ及び対比例１，２の対照物質を投与したラットの肝臓のヘマトキシリン・エオシン染色像の写真である。
【図４】試験１における本発明の実施例１のクロレラ及び対比例１，２の対照物質を投与したラットの肝臓のNAFLD Activity scoreの算出結果を示すグラフである。
【図５】試験１において、本発明の実施例１のクロレラ及び対比例１，２の対照物質を投与したラットの肝臓のシリウスレッド染色像の写真である。
【図６】試験１における本発明の実施例１のクロレラ及び対比例１，２の対照物質を投与したラットの肝臓のシリウスレッド陽性面積率の算出結果を示すグラフである。
【図７】試験２において、本発明の実施例１のクロレラ及び対比例１，２の対照物質を投与したラットの肝臓のF4/80免疫染色像の写真である。
【図８】試験２における本発明の実施例１のクロレラ及び対比例１，２の対照物質を投与したラットの肝臓のF4/80陽性面積率の算出結果を示すグラフである。
【図９】試験２において、本発明の実施例１のクロレラ及び対比例１，２の対照物質を投与したラットの肝臓のα-SMA免疫染色像の写真である。
【図１０】試験２における本発明の実施例１のクロレラ及び対比例１，２の対照物質を投与したラットの肝臓のα-SMA陽性面積率の算出結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の一実施形態について説明する。
本発明は、緑藻類由来物質、特にクロレラを有効成分とする非アルコール性脂肪性肝疾患治療又は予防剤及び非アルコール性脂肪性肝疾患予防用食品である。
＜非アルコール性脂肪性疾患及び非アルコール性脂肪肝炎＞
脂肪性肝疾患とは、肝細胞に中性脂肪(TG)が沈着して、肝障害をきたす疾患の総称である。
非アルコール性脂肪性肝疾患（以下、「NAFLD」という。）は、組織学的に大滴性の脂肪変性を基盤に発症し、非アルコール性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver，（NAFL）），非アルコール性脂肪肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，以下、「NASH」という。）に分類される。
【００１５】
NAFLDは、組織診断あるいは画像診断で脂肪肝を認め、アルコール性肝障害など他の肝疾患を除外した病態である。純アルコールで男性30g/日，女性20g/日以上の飲酒量でアルコール性肝障害を発症しうるので、NAFLDの飲酒量はそれ未満となる。
一般に、肝臓に肝組織の10％以上の脂肪沈着があり血清トランスアミナーゼ（ALT/AST）値が上昇している病態がNAFLDと考えられている。
NASHは、肝組織で診断され、脂肪変性に壊死・炎症や線維化を伴う脂肪肝炎（steatohepatitis）を呈する。脂肪変性，炎症性細胞浸潤，肝細胞傷害（風船様変性）が特徴である。
また、肝細胞の風船様腫大や Mallory−Denk小体の出現，炎症性細胞浸潤，線維化という特徴的な肝組織像がある，NAFLDの進行性の病態が、NASHであると考えられている。
【００１６】
NAFLD及びNASH発症のメカニズムは解明されていないが、二つのヒット理論(two hits theory)が広く受け入れられている。
two hits theoryとは、正常肝であったところに、肥満，糖尿病，高脂血症などのインスリン抵抗性によって肝臓に脂肪が蓄積して脂肪肝になるfirst hitと、次に脂質過酸化、サイトカイン、鉄などの酸化ストレスがNASHを起こすsecond hitが起こるとする説である。
つまり、まず、first hitにおいて、過栄養や運動不足により内臓脂肪が蓄積する。そして、内臓脂肪からの遊離脂肪酸の分泌亢進と、アディポネクチンの分泌低下やTNF-αの分泌亢進などを来たす。遊離脂肪酸は門脈を介して肝臓の組織に到達しそこで中性脂肪として蓄積され、脂肪肝の形成に直接的に関与する。さらに、この遊離脂肪酸やあるいはアディポサイトカインの分泌異常によりインスリン抵抗性が惹起され、肝臓への脂肪蓄積がさらに促進される。ここまでの病態でとどまっているのが単純性脂肪肝である。
【００１７】
そして、second hitにおいて、さらにアディポサイトカインの分泌異常やインスリン抵抗性などにより、過剰な酸化ストレスが発生する。second hitを経て、肝臓における炎症や肝細胞障害、肝の線維化などが起こっている状態にまで進んだものがNASHである。
このように、肝細胞への脂肪の沈着がfirst hitであり、さらに酸化ストレスや炎症性サイトカインなどの肝細胞障害要因をsecond hitと呼んでいる。
【００１８】
ここで、「インスリン抵抗性」とは、肝臓や筋肉、脂肪細胞などでインスリンが正常に働かなくなった状態のことをいう。インスリン抵抗性があると、食事で高くなった血糖値を感知して、すい臓からインスリンが分泌されても、筋肉や肝臓が血液中のブドウ糖を取り込まないため、血糖値が下がらず、糖尿病の発病につながる。
NASHは、炎症や線維化を起こすが、線維化が進むと肝臓が硬くなり肝硬変になる。NASHを発症すると、10年でおよそ2割が肝硬変になるという報告があり、肝硬変になると、やがて肝癌を発症することもある。
肝線維化は、NASHに限らず、C型肝炎などウイルス性肝炎やアルコール性肝炎においても起こるものであり、C型肝炎などウイルス性肝炎やアルコール性肝炎において肝線維化が起こって、肝硬変や肝癌を発症することもある。
【００１９】
＜非アルコール性脂肪性肝疾患治療又は予防剤＞
本発明の非アルコール性脂肪性肝疾患治療又は予防剤は、緑藻類由来物質、特にクロレラ由来物質を有効成分とする非アルコール性脂肪性肝疾患治療又は予防剤である。
本発明の非アルコール性脂肪性肝疾患治療又は予防剤の有効成分となる「緑藻類由来物質」とは、緑藻類又は緑藻類の乾燥粉末や微細粉末、熱水抽出物のほか、緑藻類細胞から抽出されたクロロフィル、クロロフィル粉末や、クロロフィルの加工品等が含まれる。
【００２０】
「緑藻類」としては、緑藻植物門（Chlorophyta）に含まれる単細胞生物又は多細胞生物であって、クロロフィルによって光合成を行うものを挙げることができる。
具体的には、緑藻植物門の下位分類となる緑藻網（Class Trebouxiophyceae）、プラシノ藻網（Class Prasinophyceae）、トレボウクシア藻綱（Class Trebouxiophyceae）、アオサ藻綱（Class Ulvophyceae）、ペディノ藻綱（Class Pedinophyceae）、プレウラストルム藻綱（Class Pleurastrophyceae）等が挙げられる。
これらの中で、緑藻網やトレボウクシア藻網として多系統に分類されているクロレラが用いられることが望ましい。
【００２１】
「クロレラ（パラクロレラを含む）」とは、主に緑藻植物門、緑藻綱、クロレラ属の淡水性単細胞緑藻類であって、その細胞内にクロロフィルを有し緑色に見える微生物である。
クロレラには、クロレラ属に分類される植物、その変種、その変異種の全てが含まれる。
クロレラ属の植物とは、クロロコッカス目（Chlorococcales）、オオシスティス科（Oocystaceae）に分類される植物である。
クロレラ属の微生物の種としては、プレノイドサ種、エルプソイデア種、ブルガリス種、レギラリス種、ソロキニアナ種等が挙げられる。これらの中で、広く研究に利用されているブルガリス種が用いられることが望ましい。
【００２２】
クロレラは、公知のMBBM培地、MAM培地や、これらの一部組成を変更した改変培地を用いて培養することができる。培養容器には、坂口フラスコ、三角フラスコ、試薬ビン等を用いることができる。クロレラはCO2を資化するため、1〜5%CO2を含む空気を培地中に通過させることが好ましい。また、終濃度0.5〜1.0%（容量比）となるように培地中にエタノールを加えると良好な生育となるため好ましい。さらに、葉緑体を十分に発達させるために、培地1リットルあたり1〜5g程度のリン酸アンモニウムを加えるとよい。培養温度は、通常20〜34℃で、特に28〜30℃が好適である。
なお、培養条件にもよるが、クロレラは通常、培養開始後2〜4日で対数増殖期となり、4〜6日程度で定常期に到達する。
クロレラは、光照射下で培養（明培養）されても良く、無照射で培養（暗培養）されても良いが、好ましくは明培養が良い。この場合の照度としては光従属栄養培養では3000〜8000Lux程度が望ましい。
【００２３】
クロレラ由来物質として、遠心分離，濾過又は沈降等によって分離したクロレラ生細胞をそのまま用いることができる。クロレラ生細胞は、培養槽から収穫後そのままの状態で使用することもできるが、水若しくは生理食塩水で洗浄するのが好ましい。また、藻体スラリーの状態で用いてもよい。
また、クロレラ生細胞を凍結乾燥処理やスプレー乾燥処理して得た乾燥藻体を用いてもよい。
更に、クロレラ生細胞を超音波照射処理や、ホモゲナイズ等の機械処理を行うことにより得た藻体の機械的処理物を用いてもよい。機械的処理物に乾燥処理を施した機械的処理物乾燥物を用いてもよい。
クロレラ由来物質としては、クロレラ微細粉末を用いると好適である。
【００２４】
「クロレラ微細粉末」は、クロレラ粉末に破砕処理を加え、細胞間結合を分離し細胞壁を破砕したものであって、粒子径が小さくなったものである。例えば、全ての粒子径を10μm以下にしたものであって、400メッシュから600メッシュ以上の、粒子径が非常に小さくなったものである。
クロレラ粉末を微細粉末にすると、色は若草色になる。クロレラ微細粉末は、別の粉末を加えて混合した場合、混合に要する時間が短く、混合が均一であるため色にムラやバラツキがでないという特徴がある。
また、微細粉末になるとクロレラ特有の藻体臭は弱まり、抹茶様の香りがでてくる。クロレラ特有の藻体味も弱まる。また、粒子径が2ミクロン〜10ミクロンと微細なため、クロレラ微細粉末を直接口にすると溶けてしまいザラザラしない。
なお、クロレラ微細粉末は、平均粒子径が10μm以下であることが望ましいが、特に限定されることなく変更可能である。例えば、一般のクロレラ粉末が、粒子径2μm〜60μmまでの不均一な粒子が混在したものであるところ、全ての粒子径が20μm以下又は30μm以下にしたもの等であっても良い。
【００２５】
本発明の緑藻類由来物質は、肝線維化発症を抑制することを通じて、NAFLD及びNASHを抑制する作用を有する。
従って、緑藻類由来物質は、アディポサイトカインの分泌異常やインスリン抵抗性などにより、過剰な参加ストレスが発生するsecond hitを阻害又は抑制することを通じて、肝線維化発症を抑制し、その結果、NASHの発症を抑制していると考えられる。
さらに、緑藻類由来物質は、肝線維化発症抑制を通じてNASHの発症を抑制することにより、NASHから進展する肝硬変、肝癌の発症も抑制する。
【００２６】
本発明の緑藻類由来物質を有効成分として含む非アルコール性脂肪性肝疾患治療又は予防剤は、NAFLD又はNASH患者、NAFLD又はNASHに罹患したヒト以外の動物に投与されることで、NAFLD又はNASHの治療剤として用いることができる。
また、NAFLD又はNASHに罹患する前のヒト、NAFLD又はNASHに罹患する可能性が高いヒト、これらヒト以外の動物を対象としたNAFLD又はNASHの予防剤として用いることもできる。
NAFLD又はNASHに罹患する可能性が高いヒトとしては、NASHの発症の原因と考えられている疾患を罹患している患者、又は状態にある者が含まれる。例えば、BMI（Body mass index）が25以上の肥満者や、肥満，糖尿病，高血圧，脂質異常症などの生活習慣病の患者、睡眠時無呼吸症候群の患者やある種の薬を服用した者、あるいは十二指腸や膵臓の手術後に起こる栄養吸収障害が起こっている者等である。また、遺伝的な体質が、NASH発症に影響することが分かっており、家族や親族にNASH患者がいる者も含まれる。
また、本発明の緑藻類由来物質は、緑藻類由来物質を有効成分として含有する非アルコール性脂肪肝炎予防又は治療剤，肝線維化抑制又は予防剤，NASHから進展する肝硬変の抑制又は予防剤，NASHから進展する肝癌の抑制又は予防剤に用いることもできる。
【００２７】
本実施形態の非アルコール性脂肪性肝疾患治療又は予防剤は、医薬組成物として利用することができる。
（医薬組成物）
本実施形態の非アルコール性脂肪性肝疾患治療又は予防剤は、医薬の分野では、NAFLD，NASH，肝線維化の抑制作用を有効に発揮できる量の緑藻類由来物質と共に、薬学的に許容される担体や添加剤を配合することにより、当該作用を有する医薬組成物が提供される。当該医薬組成物は、医薬品であっても医薬部外品であってもよい。
当該医薬組成物は、内用的に適用されても、また外用的に適用されても良い。従って、当該医薬組成物は、内服剤、静脈注射、皮下注射、皮内注射、筋肉注射及び／又は腹腔内注射等の注射剤、経粘膜適用剤、経皮適用剤等の製剤形態で使用することができる。
当該医薬組成物の剤型としては、適用の形態により、適当に設定できるが、例えば、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、粉末剤、散剤などの固形製剤、液剤、懸濁剤などの液状製剤、軟膏剤、またはゲル剤等の半固形剤が挙げられる。
【００２８】
（食品組成物及び飼料）
また、本発明の緑藻類由来物質は、食品にも用いることが可能である。
本実施形態の非アルコール性脂肪性肝疾患予防用食品は、食品の分野では、NAFLD，NASH，肝線維化の抑制作用を有効に発揮できる有効な量の緑藻類由来物質を食品素材として、各種食品に配合することにより、当該作用を有する食品組成物を提供することができる。
すなわち、本発明は、食品の分野において、NAFLD予防用，NASH予防用，肝線維化予防用，等と表示された食品の食品組成物を提供することができる。当該食品組成物としては、一般の食品のほか、特定保健用食品、栄養機能食品、機能性表示食品、病院患者用食品、サプリメント等が挙げられる。また、食品添加物として用いることもできる。
当該食品組成物としては、例えば、調味料、畜肉加工品、農産加工品、飲料（清涼飲料、アルコール飲料、炭酸飲料、乳飲料、果汁飲料、茶、コーヒー、栄養ドリンク等）、粉末飲料（粉末ジュース、粉末スープ等）、濃縮飲料、菓子類（キャンディ（のど飴）、クッキー、ビスケット、ガム、グミ、チョコレート等）、パン、シリアル等が挙げられる。また、特定保健用食品、栄養機能食品、機能性表示食品等の場合、カプセル、トローチ、シロップ、顆粒、粉末等の形状であっても良い。
【００２９】
ここで特定保健用食品とは、生理学的機能等に影響を与える保健機能成分を含む食品であって、消費者庁長官の許可を得て特定の保健の用途に適する旨を表示可能なものである。本発明においては、特定の保健用途としてNAFLD，NASHを予防する、肝線維化を抑えて肝臓を正常に保つことを助けるなどと表示して販売される食品となる。
また栄養機能食品とは、栄養成分（ビタミン、ミネラル）の補給のために利用される食品であって、栄養成分の機能を表示するものである。栄養機能食品として販売するためには、一日当たりの摂取目安量に含まれる栄養成分量が定められた上限値、下限値の範囲内にある必要があり、栄養機能表示だけでなく注意喚起表示等もする必要がある。
また機能性表示食品とは、事業者の責任において、科学的根拠に基づいた機能性を表示した食品である。販売前に安全性及び機能性の根拠に関する情報などが消費者庁長官へ届け出られたものである。
上記において本発明は、緑藻類由来物質を有効成分として含み、NAFLD，NASH患者、NAFLD，NASHを罹患したヒト以外の動物や、NAFLD，NASHを罹患する可能性の高いヒトやヒト以外の動物を対象としたNAFLD予防用，NASH予防用，肝線維化予防用，NASHから進展する肝硬変の予防用，NASHから進展する肝癌の予防用特定保健用食品や、NAFLD予防用，NASH予防用，肝線維化予防用，NASHから進展する肝硬変の予防用，NASHから進展する肝癌の予防用栄養機能食品、NAFLD予防用，NASH予防用，肝線維化予防用機能性表示食品，NAFLD予防用，NASH予防用，肝線維化予防用，NASHから進展する肝硬変の予防用，NASHから進展する肝癌の予防用飼料として用いることができる。
なお、本発明は、C型肝炎などウイルス性肝炎やアルコール性肝炎においても肝線維化を抑制することは、作用機序からみて当然である。本発明は、これらの肝炎における肝線維化を抑制，予防し、これらの肝炎から肝線維化により進展して発症する肝硬変及び肝癌の予防，治療剤や、予防，治療用食品，飼料として用いることができる。
【実施例】
【００３０】
以下、本発明を具体的実施例により詳細に説明するが、本発明の技術的範囲が、以下の実施例に制限されないことは当然である。
【００３１】
＜実施例１＞
緑藻類由来物質として、クロレラ粉末（（株）ユーグレナ提供）の必要量を秤量し、生理食塩水を加えて、乳鉢で懸濁液を調製した。
【００３２】
＜対比例１＞
ポジティブコントロール物質として、テルミサルタン（Telmisartan）錠1錠を乳鉢で破砕後、RO 水を徐々に加えながら、1 mg/mLの均一な懸濁液になるように調整した。
テルミサルタンは、主に高血圧の治療に使用されるアンジオテンシンII受容体拮抗薬である。
＜対比例２＞
また、ネガティブコントロールとして、実施例１で用いた溶媒である生理食塩水を対比例２とした。
【００３３】
＜試験１＞
本試験では、実施例１の緑藻類由来物質であるクロレラ及び対比例１のポジティブコントロール物質（テルミサルタン），対比例２のネガティブコントロールを、５週齢のNASHモデルマウス（STAM(登録商標)マウス）に27日間強制経口投与し、9週齢時に屠殺して解析を行い、抗NASH効果および抗線維化効果について検討した。
NASHモデルマウスは、糖尿病を背景に6週齢時に脂肪肝、8週齢時に脂肪性肝炎、9週齢時に肝線維化、その後20週齢時に肝癌を発症するヒトのNASHの進行と予後に類似した病理所見を示すモデルマウスである。
つまり、本試験のNASHモデルマウスには、実施例１のクロレラ、対比例１のテルミサルタン、対比例２の生理食塩水を、脂肪肝発生前の5週齢から、脂肪肝発生，脂肪性肝炎発生を経て、肝が線維化する9週齢時まで、投与した。
【００３４】
●試験動物
まず、試験動物の調製を行った。
妊娠14日の雌SPFマウス（C57BL/6J、日本エスエルシー）18匹を、馴化飼育した。全動物を自然分娩させ、出生した雄をモデル動物作製に使用した。なお、離乳は生後4週齢とした。
8:00の分娩観察時に出産が観察されたマウスは観察日前日を、20:00の分娩観察時に出産が観察されたマウスは観察日当日を出生日とし、生後0日から起算した。離乳まで母動物に哺育させた。
2日齢時の雄にストレプトゾトシン（シグマアルドリッチジャパン（株））を生理食塩液（日本薬局方、（株）大塚製薬工場）にて10mg/mL濃度とし、20μL/head（200μg/head）で背部皮下に1回投与して、NASHモデルマウスを作製した。その後は離乳まで母動物に哺育させた。生後28±2日齢時に離乳し、それ以降は、高脂肪食〔High Fat Diet 32（放射線滅菌、日本クレア（株））〕で飼育した。
【００３５】
●飼育条件
マウスは、温度23 ± 3°C、相対湿度50 ± 20%、換気回数1時間40回以上、照明1日12時間（08:00-20:00、分娩観察およびストレプトゾトシン投与操作並びに出生児の調整のための点灯を除く）の動物飼育室で飼育した。
動物入荷日から離乳までは、母児ともに固形飼料CE-2（放射線滅菌、日本クレア（株））を自由に摂取させた。離乳以降は、ストレプトゾトシンを投与した動物については、高脂肪食High Fat Diet 32（放射線滅菌、日本クレア（株））を自由に摂取させた。飲料水は自由摂取とした。
【００３６】
●投与
試験開始日（投与開始日）の前日に、NASHモデルマウスを、平均体重が均等になるように体重層別化無作為抽出法によって、6匹／群、1ケージ当たり3匹になるよう群分けした。
マウスの各群に、実施例１のクロレラ、対比例１のポジティブコントロール物質と、対比例２のネガティブコントロール（溶媒のみ）を、強制経口投与した。投与期間は生後5週齢からの27日間、投与回数は、1日1回（7回／週）とした。
1回の投与量は、実施例１は3g/kg体重、対比例１は、10mg/kg体重とした。投与容量は10mL/kg体重とした。対比例２は、10mL/kg体重で同様に投与した。
【００３７】
●肝臓サンプル採取
９週齢時の計画剖検時に、腹部大動脈切断により放血死させ、図１の通り、肝臓を摘出し、外側左葉Ｂを図２のように６等分した。
図２の外側左葉の中心部の2片ｂをブアン固定液（シグマアルドリッチジャパン（株））に浸漬し、24時間室温にて固定後、パラフィン包埋を行った。作製したパラフィン切片は、ヘマトキシリン・エオシン染色およびシリウスレッド染色に使用した。
図２の外側左葉の中心部の2片aは、O.C.T. compound（サクラファインテックジャパン（株））を満たしたクリオディッシュ（（株）硝英製作所）に包埋し、速やかに液体窒素にて凍結後、試験２のサンプルとして用いるため、-80°Cにて保存した。
【００３８】
●ヘマトキシリン・エオシン染色（NAFLD Activity scoreの算出）
実施例１，対比例１及び２のパラフィン切片をキシレン、100%〜70%のアルコール系列およびRO水で脱パラフィン・親水化した後、リリー・マイヤーヘマトキシリン液（武藤化学（株））にて10分間浸漬した。RO水にて余分な染色液を洗い流し、流水にて10分間色出しした後、1%エオシンYエタノール水溶液（和光純薬（株））に5分間浸漬し、RO水に浸透した。染色した切片は、70%〜100%のアルコール系列およびキシレンにて脱水・透徹後、エンテランニュー（メルク（株））にて封入し観察に供した。標本は明視野顕微鏡（ライカ マイクロシステムズ、型番: DM1000）を用い観察した。
Kleiner等の報告（Kleiner DE et al.Hepatology 2005 41:1313）に従い、表１の通り、1個体あたり1切片の脂肪化（Steatosis、中心静脈を中心とした代表的な50倍の1視野について）、肝実質における炎症（Lobular inflammation、中心静脈を中心とした切片の代表的な200倍の1視野について）、肝細胞障害（Hepatocyte ballooning、中心静脈を中心とした切片の代表的な200倍の1視野について）についてそれぞれ写真を撮影し、撮影した画像を観察してスコア化した。
【００３９】
【表１】
2018070569.tif 000003
【００４０】
実施例１，対比例１及び２の、NAFLD Activity score の算出結果を表２及び図４に示す。このとき、ｎ=６とした。
また、各群の平均値の差の検定をPrism6（Version 6.07, GraphPad Software 社）を用い、Bonferroni Multiple Comparison Test により、対比例１ vs. 実施例１、対比例１ vs. 対比例２の組み合わせに対して統計解析を行った。各群の平均はmean ± SD で表し、検定はそれぞれ有意水準5％で行った。
【表２】
2018070569.tif 000004
【００４１】
対比例２のネガティブコントロール群では、肝細胞の風船様変性、大滴性および小滴性の脂肪滴の沈着、リンパ球および好中球を含む炎症性細胞浸潤像が認められた。
実施例１のクロレラ投与群及び対比例１のテルミサルタン投与群（ポジティブコントロール）において、対比例２のネガティブコントロール群と比較して、NAFLD Activity scoreは有意に低値を示した。
【００４２】
●シリウスレッド染色（Fibrosis areaの算出）
パラフィン切片をキシレン、100%〜70%のアルコール系列およびRO水で脱パラフィン・親水化した後、0.03%ピクロ・シリウスレッド液（シリウスレッド:ワルデック社、Cat No.:1A-280）に60分間浸透した。0.5%酢酸溶液およびRO水に通した後、染色した切片は、70%〜100%のアルコール系列およびキシレンにて脱水・透徹後、エンテランニュー（メルク（株））にて封入し観察に供した。標本は明視野顕微鏡（ライカマイクロシステムズ）を用いて観察した。中心静脈を中心とした200倍の視野にて、1切片あたり5視野の写真をCCDカメラ（ライカマイクロシステムズ、型番:DFC295）を用いて撮影した。撮影した画像をもとに、ImageJ software（National Institute of Health）を用いて、各視野における撮影面積、シリウスレッド陽性面積、中心静脈内腔面積を計測した。
【００４３】
実施例１，対比例１及び２の、シリウスレッド染色像を図５に、シリウスレッド陽性面積率の算出結果を表３及び図６に示す。このとき、ｎ=６とした。統計解析は、NAFLD Activity scoreを算出したときと同様の方法で行った。
【表３】
2018070569.tif 000005
【００４４】
図５において、対比例２のネガティブコントロール（溶媒のみ）投与群では小葉間門脈周囲、小葉中間部の類洞壁および中心静脈壁にコラーゲンの沈着が認められた。
実施例１のクロレラ投与群において、対比例２のネガティブコントロール群と比較して、シリウスレッド陽性面積率は有意に低値を示した。
【００４５】
本試験では、対比例１のテルミサルタン投与群では、NAFLD Activity scoreおよびシリウスレッド陽性面積率の有意な減少が確認され、NASH病態進行および線維化を抑制することが確認された。これらの結果は、本モデルに対しテルミサルタンを使用した過去のデータと一致し、同剤は本試験においてポジティブコントロール薬として機能したと判断された。
実施例１のクロレラ投与群では、NAFLD Activity score の有意な減少が認められた。NAFLD Activity score を項目別に検証すると、炎症巣を評価するLobular inflammation スコアおよびバルーニング細胞を評価するHepatocyte ballooning スコアが減少していた。以上の結果から、クロレラはNASH 病態に対してinflammation およびhepatocyte ballooningの改善を特徴とする病態進行抑制作用を有することが分かった。
Hepatocyte ballooning は、肝細胞壊死の一過程で、酸化ストレスによって誘導される
ことが報告されており（Fujii H et al. J. Atheroscler. Thromb. 2009;16:893）、NASH 病態の進行に関わることが報告されている（Rangwala F et al. J. Pathol. 2011; 224:401）。そのため、実施例１のクロレラは抗酸化ストレス効果を有し、この作用により、hepatocyte ballooning を改善されたことが推測される。さらに、Lobular
inflammationの一部は、Hepatocyte ballooningの改善によるものであると推測される。
【００４６】
対比例２のネガティブコントロール群と比較して、実施例１のクロレラ投与群においてシリウスレッド陽性面積率の有意な減少が認められ、抗線維化効果を有することが分かった。NAFLD Activity scoreで明らかになったように、炎症を抑制することでの肝線維化の抑制の可能性が考えられる一方で、肝線維化の中心的な役割を担っている細胞として、肝星細胞があり、この細胞は活性化されることにより、コラーゲンを産生する。クロレラは、肝星細胞の活性化抑制を介して、抗線維化効果を発揮している可能性も推測される。
以上のように、本試験において、クロレラの抗NASHおよび抗線維化効果が認められた。
【００４７】
＜試験２＞
本試験では、試験１で採材した肝臓サンプルを用いて、F4/80およびα-SMA免疫染色およびF4/80およびα-SMA陽性面積率の算出を行った。対比例２のネガティブコントロール群における陽性面積率と実施例１の緑藻類由来物質であるクロレラ投与群における陽性面積率との比較により、実施例１のクロレラのNASHモデルマウス（STAM(登録商標)マウス）における抗炎症、肝星細胞の活性化抑制効果を評価し、実施例１のクロレラの抗NASH および抗線維化効果のメカニズムについて検討した。
【００４８】
●F4/80 免疫染色（F4/80 陽性面積率の算出）
試験１で準備した図２の外側左葉の中心部の2辺aの凍結切片は、アセトンで常温、10 分間固定し、ドライヤーの冷風に当て、1分間乾燥させた。その後、ダコペンで切片周囲を囲み、ドライヤーの冷風に当て、10分間乾燥させた。ドーゼへ凍結切片を移し、PBS（リン酸緩衝生理食塩水）で常温で10分間洗浄した後、0.03%過酸化水素水にて常温で10分間処置し、内因性ペルオキシダーゼの阻害を行った。PBSで洗浄後、PBSTにて処置した後、ブロッキング液（ブロックエース、DS ファーマバイオメディカル（株））を常温で、10分間反応させた。その後、100倍希釈の抗F4/80抗体（BMA Biomedicals 社）を4°Cで、一晩反応させた。PBSにて洗浄し、PBSTにて処置した後、200倍希釈ビオチン標識抗ラットIgG抗体（VECTASTAIN ABC Rat IgG kit、VECTOR LABORATORIES 社）を常温30 分間反応させた。PBS にて洗浄し、PBST にて処置した後、ABC Reagent（VECTOR LABORATORIES 社）を常温30分間反応させた。PBSにて洗浄し、1%グルタールアルデヒド溶液にて常温、1 分間固定した。RO水にて洗浄し、PBSTにて処置した後、発色基質（シンプルステインDAB、ニチレイバイオサイエンス（株））にて発色させた。発色後、RO水にて洗浄し、1%グルタールアルデヒド溶液にて常温、10分間固定した。固定後、RO水にて洗浄し、8倍希釈ヘマトキシリンに1分間通し、直ちにRO水で洗浄した。その後、切片を流水中に15分間静置し、アクアテックス（メルク（株））にて封入し観察した。標本は明視野顕微鏡（ライカマイクロシステムズ）を用いて観察した。中心静脈を中心とした200倍の視野にて、1切片あたり5視野の写真をCCDカメラ（ライカマイクロシステムズ）を用いて撮影した。撮影した画像をもとに、ImageJ software（National Institute of Health）を用いて、各視野における撮影面積、F4/80陽性面積を計測した。
【００４９】
各測定面積の一次データは整数として算出した。単位はpixelsとした。各個体5視野について、撮影面積、F4/80陽性面積、中心静脈内腔面積を算出した。1視野当たりのF4/80陽性面積率は、F4/80陽性面積を測定肝実質面積（＝撮影面積から中心静脈内腔面積を引いた値）で割った値を100倍し、小数点以下第3位で四捨五入し、小数点以下第2位まで算出した。単位は%とした。各個体のF4/80陽性面積率は、5視野の平均値を小数点以下第3位で四捨五入し、小数点以下第2位まで算出した。各群の平均値および標準偏差は、小数点以下第3位で四捨五入し、小数点以下第2位まで算出した。
【００５０】
F4/80免疫染色像を図７に、F4/80陽性面積率の算出結果を図８および表４に示す。
また、試験１と同様の方法で統計解析を行った。
【表４】
2018070569.tif 000006
F4/80陽性面積率は、対比例２のネガティブコントロール群に比べ、実施例１のクロレラ投与群および対比例１のテルミサルタン投与群では有意に低値を示した。
【００５１】
●Alpha-SMA 免疫染色（Alpha-SMA 陽性面積率の算出）
試験１で準備した図２の外側左葉の中心部の2辺aの凍結切片は、アセトンで常温、10分間固定し、ドライヤーの冷風に当て、1分間乾燥させた。その後、ダコペンで切片周囲を囲み、ドライヤーの冷風に当て、10分間乾燥させた。ドーゼへ凍結切片を移し、PBSで常温で10分間洗浄した後、0.03%過酸化水素水にて常温で10分間処置し、内因性ペルオキシダーゼの阻害を行った。PBSで洗浄後、PBSTにて処置した後、ブロッキング液（ブロックエース、DSファーマバイオメディカル（株））を常温、10分間反応させた。その後、200倍希釈の抗α-SMA抗体（Abcam社）を4°C、一晩反応させた。PBSにて洗浄し、PBSTにて処置した後、25倍希釈ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ラビットIgG抗体（VECTOR LABORATORIES社）を常温、30分間反応させた。PBSにて洗浄し、1%グルタールアルデヒド溶液にて常温、1分間固定した。RO水にて洗浄し、PBSTにて処置した後、発色基質（シンプルステインDAB、ニチレイバイオサイエンス（株））にて発色させた。発色後、RO水にて洗浄し、1%グルタールアルデヒド溶液にて常温、10分間固定した。固定後、RO水にて洗浄し、8倍希釈ヘマトキシリンに1分間通し、直ちにRO水で洗浄した。その後、切片を流水中に15分間静置し、アクアテックス（メルク（株））にて封入し観察した。標本は明視野顕微鏡（ライカマイクロシステムズ）を用いて観察した。中心静脈を中心とした200倍の視野にて、1切片あたり5視野の写真をCCDカメラ（ライカマイクロシステムズ）を用いて撮影した。撮影した画像をもとに、ImageJ software（National Institute of Health）を用いて、各視野における撮影面積、α-SMA陽性面積を計測した。
【００５２】
α-SMA陽性面積率は、F4/80陽性面積率と同様の方法で算出した。
F4/80免疫染色像を図９に、F4/80陽性面積率の算出結果を図１０および表５に示す。
また、試験１と同様の方法で統計解析を行った。
【表５】
2018070569.tif 000007
Alpha-SMA 陽性面積率は、対比例２のネガティブコントロール群に比べ、実施例１のクロレラ投与群および対比例１のテルミサルタン投与群では有意に低値を示した。
【００５３】
以上の本試験では、実施例１のクロレラ投与群で、F4/80 陽性面積率の有意な減少が認められた。
免疫染色像の解析の結果、実施例１のクロレラによるF4/80陽性面積率の低下は、陽性細胞の膨化抑制および中心静脈周囲への浸潤抑制に因るものと推察され、実施例１のクロレラは肝臓のマクロファージ/Kupper細胞の活性化、遊走に対する抑制効果を有する可能性が考えられた。
また、対比例２のネガティブコントロール群と比較して、クロレラ投与群においてα-SMA陽性面積率の有意な減少が認められた。実施例１のクロレラによるα-SMA陽性面積率の低下は、肝星細胞の活性化抑制に因るものと推察され、実施例１のクロレラは肝星細胞の活性化に対する抑制効果を有する可能性が考えられた。
肝星細胞は、活性化されることによりコラーゲンを産生し、肝線維化の中心的な役割を担っている。本試験の結果より、クロレラが、肝星細胞の活性化抑制を介して抗線維化効果を発揮していることが示唆された。
【符号の説明】
【００５４】
Ａ  内側右葉／左葉
Ｂ  外側左葉
Ｃ  右葉
Ｄ  尾状葉
Ｅ  残葉
【図１】
2018070569.tif 000008
【図２】
2018070569.tif 000009
【図３】
2018070569.tif 000010
【図４】
2018070569.tif 000011
【図５】
2018070569.tif 000012
【図６】
2018070569.tif 000013
【図７】
2018070569.tif 000014
【図８】
2018070569.tif 000015
【図９】
2018070569.tif 000016
【図１０】
2018070569.tif 000017
【手続補正書】
【提出日】平成29年10月2日(2017.10.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロレラ粉末を有効成分として含有し、
肝星細胞の活性化を抑制するために用いられることを特徴とする肝星細胞の活性化抑制剤。
【請求項２】
クロレラ粉末を有効成分として含有し、
肝星細胞の活性化を抑制するために用いられることを特徴とする肝星細胞の活性化抑制用食品組成物。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
本発明は、上記の課題に鑑みてなされたものであり、本発明の目的は、新規な肝星細胞の活性化抑制剤及び肝星細胞の活性化抑制用食品組成物を提供することにある。
本発明の他の目的は、緑藻類由来物質の新規な利用方法となる肝星細胞の活性化抑制剤及び肝星細胞の活性化抑制用食品組成物を提供することにある。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
前記課題は、本発明によれば、クロレラ粉末を有効成分として含有し、肝星細胞の活性化を抑制するために用いられることを特徴とする肝星細胞の活性化抑制剤により解決される。
上記構成により、肝星細胞の活性化を抑制できる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
このように、本発明の肝星細胞の活性化抑制剤の有効成分として、食品としても認可されているクロレラを用いるため、長期間の投与又は摂取が可能である肝星細胞の活性化抑制剤を提供できる。
また、前記課題は、本発明によれば、クロレラ粉末を有効成分として含有し、肝星細胞の活性化を抑制するために用いられることを特徴とする肝星細胞の活性化抑制用食品組成物により解決される。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
本発明によれば、肝星細胞の活性化を抑制できる。更に、本発明は、肝星細胞の活性化抑制剤として用いることができる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
以下、本発明の一実施形態について説明する。
本発明は、緑藻類由来物質、特にクロレラを有効成分とする肝星細胞の活性化抑制剤及び肝星細胞の活性化抑制用食品組成物である。
＜非アルコール性脂肪性疾患及び非アルコール性脂肪肝炎＞
脂肪性肝疾患とは、肝細胞に中性脂肪(TG)が沈着して、肝障害をきたす疾患の総称である。
非アルコール性脂肪性肝疾患（以下、「NAFLD」という。）は、組織学的に大滴性の脂肪変性を基盤に発症し、非アルコール性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver，（NAFL）），非アルコール性脂肪肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，以下、「NASH」という。）に分類される。