(57)【要約】【課題】  様々な鎖長の核酸分子を、当該核酸分子の配列を知る必要なく、温和な条件下で、基体上に、安定に固定化することができる方法を提供する。【解決手段】  片方の末端に核酸塩基であるグアニンと特異的に結合するナイトロジェンマスタード構造を有する核酸塩基結合部位を有し、もう片方の末端に基体に結合する部位を有し、これらを親水性のリンカーで連結してなるリンカー分子。当該リンカー分子を用いることで、水性溶液中、温和な条件で、リンカー分子を介して核酸分子を基体上に固定化できる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
片方の末端にナイトロジェンマスタード構造を有する核酸塩基結合部位を有し、もう片方の末端に基体に結合する部位を有し、これらを親水性のリンカーで連結してなる、核酸分子を基体に固定化するための固定化剤。
【請求項２】
基体に結合する部位がチオール基あるいは環状ジスルフィド基を有することを特徴とする、請求項１に記載の固定化剤。
【請求項３】
以下の化学構造式で表される、請求項２に記載の固定化剤。
【化１】
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【請求項４】
水性溶液中で核酸分子と請求項１〜３のいずれかに記載の固定化剤を接触させ、得られた生成物を含む溶液を基体と接触させることにより、核酸分子を基体に固定化する方法。
【請求項５】
基体と請求項１〜３のいずれかに記載の固定化剤を接触させ、得られた生成物を水溶液中で核酸分子と接触させることにより、核酸分子を基体に固定化する方法。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれかに記載の固定化剤を介して核酸分子が表面に固定化された基体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、DNA等の核酸分子を溶液中で基板やビーズなどの基体上に固定化するための、液中固定化剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
基板材料への核酸の固定化は、バイオセンサーやDNAチップなどの分析技術を開発する上で必要不可欠である(非特許文献１〜４)。また分析技術以外にも、核酸を固定化したビーズ(粒子)を用いることで、核酸と相互作用する物質を選択的に取得する技術の開発も行われている。
これまでに開発されてきた核酸の固定化法は、(ｉ)核酸と基体との静電的相互作用により、核酸を基体に物理的に固定化させる方法と、(ｉｉ)末端に官能基を標識した核酸を用い、当該官能基を介して核酸を基体に化学的に固定化させる方法に大別できる。
【０００３】
前者の固定化法では、核酸分子が複数の負電荷をもつ性質を利用して、ポリリジンやポリエチレンイミンなどのポリカチオンで表面処理したガラス上に核酸を静電的に結合させる。しかし、この方法が適応できる核酸はcDNAやPCR産物などの比較的長鎖のものに限られており、合成オリゴDNAやsiRNAなどの短い核酸を固定化することができない。また、静電的な結合は強度が比較的弱いため、フロー系での溶液分析においては、連続的な送液に伴う核酸分子の基体からの解離(脱離)も問題となる。
【０００４】
一方、後者の固定化法では、アミノ基やアルデヒド基、チオール基、ビオチン基などの官能基を末端に修飾した核酸を調製し、当該官能基と基体上の官能基との間で化学結合を形成させ、あるいは、当該官能基と基体を構成する金属との間で配位結合を形成させることで、固定化を実現する。
この方法では、核酸の鎖長によって、官能基を導入する方法が異なる。すなわち、短鎖長の核酸では、当該核酸に合成化学的に官能基を直接導入することができるが、長鎖長の核酸の場合は、末端が官能基で修飾されたプライマーを用いて当該核酸をPCR増幅する、あるいは官能基で修飾されたヌクレオチドトリリン酸誘導体をPCR反応で取り込ませる、などの生化学的な手法を用いる。
この方法の一態様として、固定化すべき核酸の配列と相補的な配列を有し、かつ末端にビオチン基やチオール基などの基体と直接結合する官能基を有するプローブ核酸を合成し、固定化すべき核酸と当該プローブ核酸の相補鎖とを結合させることで、プローブ核酸を介して当該核酸の基体への固定化を実現する方法がある。しかしながら、人工的に合成できる核酸長には限界があり、固定化すべき核酸とプローブ核酸との結合の長さもこれによって限定されるため、この方法で、比較的長い核酸を十分な強度で固定化することは難しい。また、固定化すべき核酸の配列情報が未知の場合は、プローブ核酸を設計することができない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Wittmann, Christine, and Salvador Alegret. Immobilisation of DNA on Chips: DNA adsorption on carbonaceous materials. Vol. 1. Springer Science & Business Media, 2005.
【非特許文献２】Sassolas, Audrey, Beatrice D. Leca-Bouvier, and Loic J. Blum. "DNA biosensors and microarrays." Chemical reviews 108.1 (2008): 109-139.
【非特許文献３】Nimse, Satish Balasaheb, et al. "Immobilization techniques for microarray: challenges and applications." Sensors 14.12 (2014): 22208-22229.
【非特許文献４】Naramura, M., Jang, I. K., Kole, H., Huang, F., Haines, D., & Gu, H. "c-Cbl and Cbl-b regulate T cell responsiveness by promoting ligand-induced TCR down-modulation.” Nature immunology, 3.12 (2002), 1192-1199.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、上述の従来技術の状況に鑑み、様々な鎖長の核酸を、当該核酸の配列を知る必要なく、温和な条件下で、基体上に、安定に固定化することができる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記目的で鋭意研究を重ねた結果、片方の末端に核酸塩基であるグアニンと特異的に結合するナイトロジェンマスタード構造を有する核酸塩基結合部位を有し、もう片方の末端に基体に結合する部位を有し、これらを親水性のリンカーで連結してなる新規リンカー分子を開発し、当該リンカー分子を用いることで、水性溶液中、温和な条件で、リンカー分子を介して核酸分子を基体上に固定化できること、そしてこのようにして固定化された核酸分子を用いて、天然の核酸分子を用いた場合と同様の、生体に関する有益な情報を得ることができることを見出した。
【０００８】
本発明者らは、具体的には、以下の化学構造式で表されるリンカー分子Ｌ１を合成し(実施例１)、核酸分子が当該リンカー分子に安定して結合すること、及び、当該核酸分子が結合したリンカー分子が金基板に安定して結合することを確認し(実施例２)、そして、当該リンカー分子を介して金基板に固定化された核酸を用いて、生体に関する有益な情報、具体的には核酸分子におけるシトシンのメチル化量を定量的に検出することができることを見出した(実施例３)。
【化１】
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本発明は、本発明者らによって得られたこれらの知見に基づいて、なされたものである。
【０００９】
すなわち、本出願は、以下の発明を提供するものである。
〈１〉片方の末端にナイトロジェンマスタード構造を有する核酸塩基結合部位を有し、もう片方の末端に基体に結合する部位を有し、これらを親水性のリンカーで連結してなる、核酸分子を基体に固定化するための固定化剤。
〈２〉基体に結合する部位がチオール基あるいは環状ジスルフィド基を有することを特徴とする、〈１〉に記載の固定化剤。
〈３〉以下の化学構造式で表される、〈２〉に記載の固定化剤。
【化１】
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〈４〉水性溶液中で核酸分子と〈１〉〜〈３〉のいずれかに記載の固定化剤を接触させ、得られた生成物を含む溶液を基体と接触させることにより、核酸分子を基体に固定化する方法。
〈５〉基体と〈１〉〜〈３〉のいずれかに記載の固定化剤を接触させ、得られた生成物を水性溶液中で核酸分子と接触させることにより、核酸分子を基体に固定化する方法。
〈６〉〈１〉〜〈３〉のいずれかに記載の固定化剤を介して核酸分子が表面に固定化された基体。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の固定化剤の核酸塩基結合部位は、全ての核酸分子に含まれる核酸塩基であるグアニンに特異的に共有結合する性質を有する。そのため、本発明の固定化剤は、核酸分子の配列に依存することなく、あらゆる配列の核酸分子に対して結合させることができ、当該固定化剤を用いて核酸分子を基体に固定化するにあたって、固定化する核酸分子の配列情報を予め知ることは必要としない。また、本発明の固定化剤は、核酸塩基と共有結合により強固に結合するので、核酸分子の鎖長に依存せずに、核酸分子を基体上へ安定に固定化することができる。また、本発明の固定化剤は、水性溶液中、温和な条件で、核酸塩基と共有結合を形成することができるので、核酸分子の固定化に当たり加熱や酸・塩基処理を必要としない。
また、本発明の固定化剤は、核酸分子がその相補鎖の核酸分子と二重鎖を形成する際にグアニンと相補鎖のシトシンの間に形成される水素結合に関与しない、グアニンの７位のＮ原子に結合するため、二本鎖を形成している核酸分子をそのまま固定化することができる。
また、本発明の固定化剤により基体に固定化された核酸分子を用いて、天然の核酸分子を用いた場合と同様の、生体に関する有益な情報を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】（Ａ）本発明の核酸固定化剤L1の化学構造を示す図。（Ｂ）本発明の核酸固定化剤の効果確認に使用した合成オリゴDNA(ODN)の核酸配列。
【図２】ナイトロジェンマスタード構造とグアニンの７位のＮ原子との間に共有結合が生成する反応スキームを示す図。
【図３】本発明の核酸固定化剤L1の調製プロセスを示す図。
【図４】様々な濃度の固定化剤L1を結合させた時のODNの変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す図。Mは分子量マーカーを表す。
【図５】本発明の固定化剤を結合させたODNが金基板に結合する様子を表面プラズモン共鳴検出装置で評価した図。縦軸のレスポンスは基板上に物質が結合した時に増加する。
【図６】本発明の固定化剤を結合させたλDNA断片が金基板に結合する様子を表面プラズモン共鳴検出装置で評価した図。縦軸のレスポンスは基板上に物質が結合した時に増加する。
【図７】本発明の固定化剤で基板上に固定化したODNにおけるメチル化量を免疫測定法によって評価した図。（Ａ）メチル化率の異なる各種ODNに対して抗mC抗体を送液した時のセンサーグラム。（Ｂ）送液120秒でのレスポンスとメチル化率の関係性をプロットした図。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の核酸固定化剤は、片方の末端にナイトロジェンマスタード構造を有する核酸塩基結合部位を有し、もう片方の末端に基体に結合する部位を有し、これらを親水性のリンカーで連結してなる構造を有することを特徴とする。図１(Ａ)にその具体例を図示する。
【００１３】
本発明において、ナイトロジェンマスタード構造とは、以下の構造を意味する。
【化２】
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上記ナイトロジェンマスタード構造は、図２に示すように、グアニンとの反応に当たり、ＣＨ2ＣＨ2Ｃｌ基におけるＣｌが脱離し、生じたＣＨ2ＣＨ2を介してグアニンの７位のＮ原子に共有結合することにより、グアニンと特異的に結合する。
ナイトロジェンマスタード構造の有する２つのＣＨ2ＣＨ2Ｃｌ基に対し、核酸分子の有する２つのグアニンが反応することにより、当該２つのグアニンを介して架橋を形成することもできる。これにより二本鎖の核酸分子において、それぞれの相補鎖の適切な位置に２つのグアニン基が存在する場合は、当該２つのグアニン基がナイトロジェンマスタード構造を介して架橋され、二本鎖が強固に保たれることとなる。
【００１４】
本発明に用いられる核酸塩基結合部位は、末端に上記ナイトロジェンマスタード構造を有するものであればよく、これと親水性のリンカーとを繋ぐ適宜の構造を有することができる。
例えば、実施例に示す固定化剤Ｌ１は、核酸塩基結合部位として、以下の構造を有している。
【化３】
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【００１５】
本発明の核酸固定化剤の基体との結合部位としては、固定化する基体の種類に応じて、当該基体と結合を形成させることができる公知の各種官能基を有する部位を適宜用いることができる。
例えば、基体が金基体である場合は、チオール基や、１，２−ジチオラン基、１，２−ジチアン基などの環状ジスルフィド構造を有する基を含む部位などを用いることができる。
また、基体が特定の官能基で表面修飾された基体である場合は、結合部位として、これと結合を形成することができる特定の官能基を有する部位を用いることができる。
例えば、アミノ基、アミノオキシ基、ヒドラジド基は、エポキシ基、アルデヒド基、カルボキシル基、スクシンイミド基と結合可能であり、その組み合わせは自由である。このため、基体側の官能基がこれらの一方である場合は、他方の官能基を有する結合部位を用いることができる。
また、チオール基やマレイミド基は、チオール基と結合を形成することができるので、基体側の官能基がこれらの一方である場合は、他方の官能基を有する結合部位を用いることができる。
また、基体がアビジン基を有する場合は、ビオチン基を有する結合部位を用いることができる。
本発明の基体との結合部位は、上記官能基に加えて、これと親水性のリンカーとを繋ぐ適宜の構造を有することができる。
【００１６】
本発明の核酸固定化剤における親水性のリンカーとしては、例えば、重合度２〜７程度のオリゴエチレングリコール等の、公知の親水性のオリゴマーを適宜用いることができる。
当該オリゴマーは、その両端に、核酸塩基結合部位、および、基体との結合部位を結合させるための、官能基などを含む適宜の構造を有していてもよい。
当該官能基などの構造により、当該オリゴマーの片方の末端に核酸塩基結合部位が結合し、もう一方の末端に基体との結合部位が結合する。
【００１７】
本発明の核酸固定化剤により基体に固定化される核酸分子は、核酸塩基としてグアニンを含むものであればよい。従って、天然に存在するDNAやRNAのみならず、人工的に合成されたDNAやRNA、さらには、ペプチド核酸(PNA)などの人工的核酸分子のいずれも、核酸塩基としてグアニンを含むものである限り、本発明の固定化剤により固定化することができる。
【００１８】
また、本発明の核酸固定化剤が結合するグアニンの７位のＮ原子は、一本鎖の核酸がその相補鎖の核酸とハイブリダイズする際にグアニンと相補鎖のシトシンの間に形成される水素結合には関与せず、ハイブリダイズにより形成される二本鎖の核酸分子の露出する側面に位置するため、本発明の固定化剤により、ハイブリダイズにより形成された二本鎖の核酸分子をそのまま基体に固定化することができる。
このような二本鎖核酸としては、通常のDNA二本鎖核酸のみでなく、二本鎖を形成しているRNA分子(siRNA、miRNA、pri-miRNA、pre-miRNAなど)、一本鎖核酸が高次構造をとって鎖内の一部で二本鎖を形成しているもの(mRNA、rRNA、tRNA、DNAzyme、RNAzyme、RNA/DNAアプタマー分子など)、一本鎖核酸の一部分のみが鎖長の短い核酸と二本鎖を形成しているもの、DNA分子とRNA分子が相補的な二本鎖を形成している核酸(キメラ核酸)などを挙ることができる。
【００１９】
核酸分子の本発明の固定化剤への結合は、ｐＨ６〜８程度の中性域の水性溶液中で、核酸分子と固定化剤とを接触させることにより、行うことができる。
【００２０】
本発明の固定化剤の基体への固定化は、ｐＨ６〜８程度の中性域の水性溶液中で、固定化剤と基体とを接触させることにより、行うことができる。
【００２１】
本発明の固定化剤を用いた核酸の基体への固定化は、核酸を固定化剤に結合させた後、基体に固定化することで行ってもよく、また、固定化剤を基体に固定化した後、核酸を固定化剤に結合させることで行ってもよい。
【００２２】
本発明により基体上に固定化された核酸は、二本鎖の形態をとることができる。
これにより、本発明により得られた、基体上に固定化された核酸を用いて、天然の核酸分子を用いた場合と同様の、生体に関する有益な情報を得ることができる。
【実施例】
【００２３】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に制限されるものではない。
【００２４】
実施例１.  固定化剤の合成
以下の手順により、本発明の核酸固定化剤L1を合成した。L1は、核酸塩基結合部位であるナイトロジェンマスタード構造、親水部位であるオリゴエチレングリコール、および、基板固定部位である環状ジスルフィド基を有するものである(図１Ａ参照)。
ナイトロジェンマスタード構造は、核酸鎖中のグアニン塩基と共有結合を形成することが知られている。
これらのナイトロジェンマスタード構造を、親水性のポリエチレングリコールリンカーを介して環状ジスルフィド構造を有するα-リポ酸と連結する。環状ジスルフィド構造は、チオール構造よりも強固に金基板に結合することが知られており、また固定化反応時の脱保護処理、あるいは還元処理も不要である。
以下に、実際に用いた合成の具体的手順を詳細に示すが、固定化剤の合成手法はこれに限定されるものではない。
【００２５】
（１）固定化剤Ｌ１：１３−ビス(２−クロロエチル)アミノ−４，７，１０−トリオキサトリデカン−１−イル１，２−ジチオラン−３−バレロイルアミド(化合物５)の合成(図３参照)
【００２６】
（１−１）１３−ビス(２−ヒドロキシエチル)アミノ−４，７，１０−トリオキサトリデカン−１−イル  １，２−ジチオラン−３−バレロイルアミド(化合物４)の合成
アルゴン雰囲気下、α-リポ酸(化合物１)(620mg、3.0mmol)をアセトニトリル(30ml)に溶解し、トリエチルアミン(1.00ml、7.2mmol)及び1,1’-カルボニルジイミダゾール(585mg、3.6mmol)を加えて、室温で100分間撹拌した。この反応液をジエチレングリコールビス(3-アミノプロピル)エーテル(化合物２)(2.62ml、12.0mmol)のアセトニトリル溶液(30ml)に15分かけて滴下し、室温で1時間撹拌した。反応液を減圧下で濃縮後、残渣をクロロホルム(160ml)に溶解し、水(60ml)で6回、飽和食塩水(60ml)で1回洗浄し、硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下で濃縮することで、１３−アミノ−４，７，１０−トリオキサトリデカン−１−イル  １，２−ジチオラン−３−バレロイルアミド(化合物３)(1.21 g、収率98％)を淡黄色泡状物質として得た。
アルゴン雰囲気下、化合物３(1.21g、2.95mmol)をジメチルホルムアミド(35ml)に溶解し、2-ブロモエタノール(2.09ml、29.5mmol)及びジイソプロピルエチルアミン(5.14ml、29.5mmol)を加えて、室温で20時間撹拌した。反応液に2-ブロモエタノール(1.05ml、14.8mmol)及びジイソプロピルエチルアミン(2.58ml、14.8mmol)を追加して、60℃で24時間加熱撹拌した。反応液を減圧下で濃縮後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶出溶媒：メタノール−クロロホルム)により精製して、化合物４(930mg、収率63％)を黄色アメ状物質として得た。
FAB-MS 計算値：497.2714 (C22H45N2O6S2 [M+H]+), 実測値：497.2710.
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ: 7.80 (br t, 1 H, NH, J = 5.5 Hz), 5.24 (br s, 2 H, OH×2), 3.74 (t, 4 H, CH2×2, J = 5.3 Hz), 3.61 (m, 1 H, CH), 3.53-3.51 (m, 6 H, CH2×3), 3.49-3.46 (m, 4 H, CH2×2), 3.39 (t, 2 H, CH2, J = 6.4 Hz), 3.24 (t, 4 H, CH2×2, J = 5.3 Hz), 3.22-3.17 (m, 1 H, CH2a), 3.14-3.11 (m, 1 H, CH2b), 3.07 (q, 2 H, CH2, J = 6.8 Hz), 2.41 (m, 1 H, CH2a), 2.05 (t, 2 H, CH2, J = 7.4 Hz), 1.92 (m, 2 H, CH2), 1.87 (m, 1 H, CH2b), 1.69-1.63 (m, 1 H, CH2a), 1.61 (t, 2 H, CH2, J = 6.8 Hz), 1.58-1.47 (m, 5 H, CH2×2, CH), 1.34 (m, 2 H, CH2).
13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) δ: 172.24 (C), 70.13 (CH2), 70.07 (CH2), 70.06 (CH2), 69.92 (CH2), 68.48 (CH2), 67.50 (CH2), 61.32 (CH2), 58.33 (CH2), 56.53 (CH), 54.98 (CH2), 40.30 (CH2), 38.48 (CH2), 36.08 (CH2), 35.58 (CH2), 34.48 (CH2), 29.79 (CH2), 28.68 (CH2), 25.43 (CH2).
【００２７】
（１−２）化合物４から化合物５の合成
アルゴン雰囲気下、化合物４(920mg、1.85mmol)及びトリエチルアミン(1.55ml、11.1mmol)を塩化メチレン(30ml)に溶解して氷冷し、メタンスルホニルクロリド(0.43ml、5.55mmol)をゆっくりと滴下した。氷冷下で1時間撹拌した後、室温で14時間撹拌した。反応液にクロロホルム(80ml)を加え、水(50ml)で2回、飽和食塩水(50ml)で1回洗浄し、硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下で濃縮後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶出溶媒：エタノール−クロロホルム)により精製して、化合物５(270mg、収率27％)を淡黄色固体状物質として得た。
FAB-MS 計算値：533.2036 (C22H43Cl2N2O4S2 [M+H]+), 実測値：533.2017.
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ: 7.74 (br t, 1 H, NH, J = 5.5 Hz), 3.59 (m, 1 H, CH), 3.58 (t, 4 H, CH2×2, J = 6.9Hz), 3.52-3.50 (m, 4 H, CH2×2), 3.47-3.46 (m, 4 H, CH2×2), 3.42 (t, 2 H, CH2, J = 6.3 Hz), 3.39 (t, 2 H, CH2, J = 6.4 Hz), 3.21-3.16 (m, 1 H, CH2a), 3.14-3.09 (m, 1 H, CH2b), 3.07 (q, 2 H, CH2, J = 6.7 Hz), 2.80 (t, 4 H, CH2×2, J = 6.9 Hz), 2.57 (t, 2 H, CH2, J = 6.9 Hz), 2.41 (m, 1 H, CH2a), 2.04 (t, 2 H, CH2, J = 7.3 Hz), 1.86 (m, 1 H, CH2b), 1.67-1.63 (m, 1 H, CH2a), 1.62-1.54 (m, 6 H, CH2×3), 1.53-1.47 (m, 1 H, CH2b), 1.34 (q, 2 H, CH2, J = 7.7 Hz).
13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) δ: 172.15 (C), 70.19 (CH2), 70.16 (CH2), 69.93 (CH2), 69.89 (CH2), 68.50 (CH2), 68.33 (CH2), 56.52 (CH), 55.98 (CH2), 50.68 (CH2), 42.88 (CH2), 40.28 (CH2), 38.47 (CH2), 36.08 (CH2), 35.59 (CH2), 34.49 (CH2), 29.79 (CH2), 28.69 (CH2), 27.78 (CH2), 25.43 (CH2).
【００２８】
実施例２．固定化剤による核酸分子の固定化
実施例１で調製した固定化剤L1を用いて、核酸分子の基体への固定化を行った。核酸分子として、図１Ｂに示す配列を有する合成オリゴDNA(ODN)、および、バクテリオファージゲノムDNA(λDNA; 48502塩基)を断片化したものを用い、基体として、金基板を用いた。
固定化剤L1の核酸分子への結合は、電気泳動により確認し、核酸分子が結合した固定化剤の金基板への固定化は、表面プラズモン共鳴を測定することにより確認した。
以下に、その詳細を示す。
【００２９】
（２−１）オリゴDNA(ODN; 27塩基)の固定化
実施例１で得られた固定化剤L1にジメチルスルホキシド(DMSO)を加え、10mMとなるように調製した。その後、5.0μMのODN溶液(溶媒：トリス-EDTA緩衝液)に対して0〜500μMの固定化剤L1を加え、37℃で30分静置した。その後、未反応の固定化剤を脱塩カラム(NAP5; GE healthcare)で取り除いた。
【００３０】
固定化剤としてL1を用い、このようにして得られた、それぞれ加える固定化剤の濃度が異なる各溶液について、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。その結果を、図４に示す。
変性ポリアクリルアミド電気泳動では、二本鎖DNAが通常一本鎖に解離する条件で電気泳動が行われる。実際に、固定化剤を加えないODN単独の溶液では、ODNの一本鎖27塩基に相当する分子量の位置にのみ、シャープなバンドが観測された。一方、固定化剤の濃度増加に伴い、27塩基に相当する位置のバンドが次第に消失し、50塩基以上の分子量に相当する位置に広がったバンドが確認された。
このバンドの移動は、L1が二本鎖ODNと化学反応してODNの二本鎖間を共有結合により架橋化することにより、通常一本鎖に解離する変性ポリアクリルアミド電気泳動の条件下において、ODNの一本鎖への解離を抑制していることを示している。このことは、とりもなおさず、ODNが本発明の固定化剤に結合したことを示すものである。
【００３１】
次に、上述のとおりにして得られた、500μMの固定化剤を反応させることで得られたODN-L1溶液について、表面プラズモン共鳴測定装置を用いて、表面プラズモン共鳴のレスポンスを観測した。その結果を、図５に示す。
この実験では、表面プラズモン共鳴測定装置に配置した金基板上に上記溶液を10μL/minの速度で送液し、当該基板の表面プラズモン共鳴を経時的に測定した。表面プラズモン共鳴のレスポンスは金基板上に物質が結合した時に増加する。
固定化剤L1を結合させていないODNでは、レスポンスの増加が確認できなかったが、固定化剤を結合させたODNではレスポンスが経時的に増加することが確認できた。また、レスポンスが飽和した時点(図５の右の破線)からは、基板上に緩衝液を継続的に流したが、これによりレスポンスは減少することなく、一定に保たれた。
このことは、本発明の固定化剤を結合させたODNが金基板上に固定化されたことを意味しており、これにより、本発明の固定化剤を結合させたODNが、室温、かつ、中性溶液中で速やかに金基板上に固定化されることが確認された。
【００３２】
（２−２）バクテリオファージゲノムDNA(λDNA; 48502塩基)の断片の固定化
5.0μgのλDNAに50Uの制限酵素Alu Iを加え、37℃で15分静置することで、λDNAを断片化した。その後、フェノール/クロロホルム抽出で酵素を除去し、エタノール沈殿でλDNA断片を回収した。
その後、30ng/mLの断片化されたλDNA溶液(溶媒：トリス-EDTA緩衝液)に対して0 〜 500μMの本発明の固定化剤を加え、37℃で30分静置した。その後、未反応の固定化剤L1を脱塩カラム(NAP5; GE healthcare)で取り除いた。
得られた溶液をチップ式電気泳動装置(Bioanalyzer; Agilent Technology)で調べることで、本発明の固定化剤が、ODNの場合と同様にλDNA断片に結合していることを確認した。
また、表面プラズモン共鳴測定装置を用いることで、本発明の固定化剤を結合させたλDNA断片が金基板上に固定化されることを確認した(図６)。
【００３３】
実施例３．固定化DNAのメチル化量計測
本発明により金基板に固定化された核酸分子を用いて、以下の手順で、核酸分子のメチル化率の計測を行うモデル実験を行った。
本実験では、図１Ｂに示される配列を有し、配列に含まれるシトシン(C)がメチル化されていないODN(Unmethylated ODN)と、Cがメチルシトシン(mC)に置換されているODN(Methylated DNA)の２種類を使用した。これらを任意の比で混合し、シトシンのメチル化率の異なる複数のサンプルを調製した。
実施例２に記載の方法で、固定化剤L1を上記ODNに結合させ、次いで、表面プラズモン共鳴測定装置を用いてODNを金基板上に固定化した。この時、ODNの固定量を約2000 RU(≒2.0ng/mm2)となるように設定した。
その後、同一の装置を用いて、固定化剤L1で基板上に固定化したODNに対し、抗mC抗体を送液し、当該ODNおけるメチル化量を免疫測定法によって評価した。その結果を、図７に示す。
図７の(Ａ)は、メチル化率の異なる各種ODNに対して抗mC抗体を送液した時のセンサーグラムを示している。図７の(Ｂ)は、送液120秒でのレスポンスとメチル化率の関係性をプロットした図である。
抗mC抗体の送液に伴いレスポンスは増加し(図７(Ａ))、またレスポンスの増加量とDNAのメチル化率は線形性を示している(図７(Ｂ))。すなわち、抗mC抗体は基板上のDNAに含まれるmCに選択的、かつ定量的に結合したことを示唆している。
メチルシトシン(mC)はエピジェネティクス制御機構に関わっている塩基であり、癌や精神疾患などに関わっていることから、病理診断や予測のターゲットとして知られている。本発明により基体に固定化された核酸分子において、核酸分子のメチル化率が正確に検出できたことは、本発明により基体に固定化された核酸分子によって、天然の核酸分子を用いた場合と同様の、生体に関する有益な情報を得ることができることを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年9月26日(2017.9.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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