(57)【要約】      （修正有）【課題】親アルブミンの変種を提供する。【解決手段】親アルブミンの変種アルブミン、その断片、または前記変種アルブミンもしくはその断片を含んでなる融合ポリペプチドであるポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、親アルブミン、その断片、または前記親アルブミンもしくはその断片を含んでなる融合ポリペプチドのＦｃＲｎに対する結合親和性と比較して、ＦｃＲｎに対するより強力な結合親和性および／またはより長い血漿半減期を有し、前記ポリペプチドが、親アルブミンのアミノ酸配列に対して少なくとも９４％の配列同一性を有し、前記ポリペプチドが、親アルブミンの１１１位に対応する位置のアミノ酸残基における改変を少なくとも含む、ポリペプチド。また、変種をコードするポリヌクレオチド；ポリヌクレオチドを含んでなる核酸コンストラクト、ベクター、および宿主細胞；および変種を使用する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルブミン変種、その断片、または前記変種アルブミンまたはその断片を含んでなる融合ポリペプチドであるポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、前記アルブミン、断片、または融合ポリペプチドのドメインＩ内に１つまたは複数の（いくつかの）改変を有し、前記アルブミン、断片、または融合ポリペプチドのドメインＩＩＩ内に１つまたは複数の（いくつかの）改変を有して、親アルブミン、参照アルブミン、その断片、または前記親アルブミン、参照アルブミンまたは断片を含んでなる融合ポリペプチド、またはその融合物のＦｃＲｎに対する結合親和性と比較して、ＦｃＲｎに対する結合親和性の変化を有する、ポリペプチド。
【請求項２】
アルブミン変種、その断片、または前記変種アルブミンまたはその断片を含んでなる融合ポリペプチドであるポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、前記アルブミン、断片、または融合ポリペプチドのドメインＩ内に１つまたは複数の（いくつかの）改変を有し、および／または前記アルブミン、断片、または融合ポリペプチドのドメインＩＩＩ内に１つまたは複数の（いくつかの）改変を有して、親アルブミン、参照アルブミン、その断片、または前記親アルブミン、参照アルブミンまたは断片を含んでなる融合ポリペプチド、またはその融合物のＦｃＲｎに対する結合親和性と比較して、ＦｃＲｎに対する結合親和性の変化を有し、ドメインＩ内の前記改変が、配列番号２の７８〜１２０位のいずれかに相当する位置から選択され、ドメインＩＩＩ内の前記改変が、配列番号２の４２５、５０５、５１０、５１２、５２４、５２７、５３１、５３４、５６９、５７３、５７５位のいずれかに相当する位置から選択される、ポリペプチド。
【請求項３】
ドメインＩ内の１つまたは複数の（いくつかの）改変が、配列番号２の７８〜８８位のいずれかおよび／または１０５〜１２０位のいずれかに相当する位置から選択される、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
配列番号２の（ａ）１１１および５７３；（ｂ）８２および８３；（ｃ）８２および１１１；（ｄ）８２および１１２；（ｅ）８２および５７３；（ｆ）８３および１１１；（ｇ）８３および１１２；（ｈ）８３および５７３；（ｉ）１１１および１１２；（ｊ）８３、１１１、および５７３；（ｋ）１１２および５７３；（ｌ）８２、８３、および１１１；（ｍ）８２、８３、および１１２；（ｎ）８２、８３、および５７３；（ｏ）８２、１１１、および１１２；（ｐ）８２、１１１、および５７３；（ｑ）８２、１１２、および５７３；（ｒ）８３、１１１、および１１２；（ｓ）８３、１１２、および５７３；（ｔ）１１１、１１２、および５７３；（ｕ）８２、８３、１１１、および１１２；（ｖ）８２、８３、１１１、および５７３；（ｗ）８２、８３、１１２、および５７３；（ｘ）８２、１１１、１１２、および５７３；（ｙ）８３、１１１、１１２、および５７３；または（ｚ）８２、８３、１１１、１１２、および５７３の位置に相当する位置に、改変を含んでなる、請求項１、２または３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
ドメインＩ内の前記１つまたは複数の（いくつかの）改変が、配列番号２の８３および／または１１１位に相当する位置から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
ドメインＩＩＩ内の前記改変が、配列番号２の５７３位に相当する位置である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
ドメインＩ内の前記改変および／またはドメインＩＩＩ内の前記改変が、置換である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項８】
８３位に相当する位置における前記改変が、Ｎ、ＫまたはＳの置換である、請求項２〜７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
１１１位に相当する位置における前記改変が、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｒ、ＱまたはＥの置換である、請求項２〜８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
５７３位に相当する位置における前記改変が、Ｐ、Ｙ、Ｗ、Ｈ、Ｆ、Ｔ、ＩまたはＶの置換である、請求項５〜９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
５７３位に相当する位置における前記置換が、Ｐ、ＹまたはＷである、請求項５〜１０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
５７３位に相当する位置における前記置換が、Ｐである、請求項５〜１１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
前記参照アルブミンが、ＨＳＡ（配列番号２）またはその断片、またはＨＳＡまたはその断片を含んでなる融合ポリペプチドであり、最も好ましくは配列番号２である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
親アルブミン、参照アルブミン、その断片、または前記親アルブミン、参照アルブミンまたはその断片を含んでなる融合ポリペプチド、またはその融合物よりも、ＦｃＲｎに対するより強力な結合親和性および／またはより長い血漿半減期を有する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
配列番号２に対するポリペプチドの配列同一性が、８０％を超え、好ましくは９０％を超え、より好ましくは９５％を超え、より好ましくは９６％を超え、さらに好ましくは９７％を超え、より好ましくは９８％を超え、最も好ましくは９９％を超える、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載のポリペプチドと、治療的、予防的、診断用、造影用またはその他の有益な部分から選択される融合パートナーポリペプチドとを含んでなる、融合ポリペプチド。
【請求項１７】
アルブミン変種、その断片、または前記変種アルブミンまたはその断片を含んでなる融合ポリペプチドであって、参照アルブミン、断片またはその融合物のＦｃＲｎに対する結合親和性と比較して、ＦｃＲｎに対する結合親和性の変化を有するポリペプチドを調製する方法であって、前記方法が、
（ａ）配列番号２に対する少なくとも８０％の配列同一性を有する親アルブミンをコードする核酸を提供するステップと；
（ｂ）ステップ（ａ）の前記核酸配列を修飾して、
ｉ．前記親アルブミンのドメインＩの１つまたは複数の（いくつかの）位置、およびドメインＩＩＩの１つまたは複数の（いくつかの）位置に相当する位置における改変；または
ｉｉ．配列番号２のドメインＩの７８〜１２０位のいずれかの１つまたは複数に相当する位置、または配列番号２のドメインＩＩＩの４２５、５０５、５１０、５１２、５２４、５２７、５３１、５３４、５６９、５７３、５７５位のいずれかの１つまたは複数（いくつか）に相当する位置における改変
を含んでなる、変種アルブミン、その断片、または前記変種アルブミンまたはその断片を含んでなる融合ポリペプチドであるポリペプチドをコードするステップと；
（ｃ）任意選択的に、ステップ（ｂ）の前記配列修飾を適切な宿主細胞中に導入するステップと；
（ｄ）任意選択的に、前記ポリペプチドの発現をもたらす条件下で、前記細胞を適切な成長培地中で培養するステップと；
（ｅ）任意選択的に、前記ポリペプチドを前記成長培地から回収するステップと
を含んでなり、
（ｆ）前記ポリペプチドが、ＦｃＲｎに対する結合親和性の変化、および／または親アルブミン、参照アルブミン、その断片、または前記親アルブミン、参照アルブミンまたはその断片を含んでなる融合ポリペプチド、またはその融合物の半減期と比較して、血漿半減期の変化を有する、方法。
【請求項１８】
ドメインＩ内の１つまたは複数の（いくつかの）改変が、配列番号２の７８〜８８位のいずれかおよび／または１０５〜１２０位のいずれかに相当する位置から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ポリペプチドが、配列番号２の（ａ）１１１および５７３；（ｂ）８２および８３；（ｃ）８２および１１１；（ｄ）８２および１１２；（ｅ）８２および５７３；（ｆ）８３および１１１；（ｇ）８３および１１２；（ｈ）８３および５７３；（ｉ）１１１および１１２；（ｊ）８３、１１１、および５７３；（ｋ）１１２、および５７３；（ｌ）８２、８３、および１１１；（ｍ）８２、８３、および１１２；（ｎ）８２、８３、および５７３；（ｏ）８２、１１１、および１１２；（ｐ）８２、１１１、および５７３；（ｑ）８２、１１２、および５７３；（ｒ）８３、１１１、および１１２；（ｓ）８３、１１２、および５７３；（ｔ）１１１、１１２、および５７３；（ｕ）８２、８３、１１１、および１１２；（ｖ）８２、８３、１１１、および５７３；（ｗ）８２、８３、１１２、および５７３；（ｘ）８２、１１１、１１２、および５７３；（ｙ）８３、１１１、１１２、および５７３；または（ｚ）８２、８３、１１１、１１２、および５７３の位置に相当する改変を含んでなる、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
ドメインＩ内の前記１つまたは複数の（いくつかの）改変が、配列番号２の８３および／または１１１位に相当する位置から選択される、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
ドメインＩＩＩ内の前記改変が、配列番号２の５７３位に相当する位置である、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
ドメインＩ内の前記改変および／またはドメインＩＩＩ内の前記改変が、置換である、請求項１７〜２１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
８３位に相当する位置における前記改変が、Ｎ、ＫまたはＳの置換である、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２４】
１１１位に相当する位置における前記改変が、Ｅ、Ｑ、Ｄ、Ｇ、またはＨの置換である、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
５７３位に相当する位置における前記改変が、Ｐ、Ｙ、Ｗ、Ｈ、Ｆ、Ｔ、ＩまたはＶの置換である、請求項２０〜２４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２６】
５７３位に相当する位置における前記置換が、Ｐ、ＹまたはＷである、請求項２０〜２５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２７】
５７３位に相当する位置における前記置換が、Ｐである、請求項２０〜２６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２８】
前記参照アルブミンが、ＨＳＡ（配列番号２）またはその断片、またはＨＳＡまたはその断片を含んでなる融合ポリペプチドであり、最も好ましくは配列番号２である、請求項１７〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の、または請求項１７〜２８のいずれか一項に記載の方法によって得られるポリペプチドと、複合化パートナーとを含んでなる、複合体。
【請求項３０】
前記複合化パートナーが、治療的、予防的、診断用、造影用またはその他の有益な部分である、請求項２９に記載の複合体。
【請求項３１】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の、または請求項１７〜２８のいずれか一項に記載の方法によって得られるポリペプチドと、治療的、予防的、診断用、造影用またはその他の有益な部分とを含んでなる、会合。
【請求項３２】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の、または請求項１７〜２８のいずれか一項に記載の方法によって得られるポリペプチド、請求項２９または３０に記載の複合体、または請求項３１に記載の会合を含んでなる、ナノ粒子または微粒子。
【請求項３３】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の、または請求項１７〜２８のいずれか一項に記載の方法によって得られるポリペプチド、請求項２９または３０に記載の複合体、請求項３１に記載の会合、または請求項３２に記載のナノ粒子または微粒子を含んでなる組成物であって、前記ポリペプチド、融合ポリペプチド、複合体、会合またはナノ粒子または微粒子のＦｃＲｎに対する結合親和性が、前記対応する親アルブミン、参照アルブミン、その断片、または前記親アルブミン、参照アルブミンまたは断片を含んでなる融合ポリペプチド、複合体、会合またはナノ粒子または微粒子、またはその融合物を含んでなる組成物のＦｃＲｎに対する結合親和性よりも強力である、組成物。
【請求項３４】
前記ポリペプチド、融合ポリペプチド、複合体、会合またはナノ粒子または微粒子のＦｃＲｎに対する結合親和性が、ＨＳＡのＦｃＲｎに対する結合親和性よりも強力である、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
前記ポリペプチド変種、融合ポリペプチド、複合体、会合またはナノ粒子または微粒子のＦｃＲｎに対する結合係数が、ＨＳＡのＦｃＲｎに対するＫＤの０．９×未満であり、より好ましくはＨＳＡのＦｃＲｎに対するＫＤの０．５×未満であり、より好ましくはＨＳＡのＦｃＲｎに対するＫＤの０．１×未満であり、なおもより好ましくはＨＳＡのＦｃＲｎに対するＫＤの０．０５×未満であり、なおもより好ましくはＨＳＡのＦｃＲｎに対するＫＤの０．０２×未満であり、最もより好ましくはＨＳＡのＦｃＲｎに対するＫＤの０．０１×未満である、請求項３３または３４に記載の組成物。
【請求項３６】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の、または請求項１７〜２８のいずれか一項に記載の方法によって得られるポリペプチド、請求項２９または３０に記載の複合体、請求項３１に記載の会合、または請求項３２に記載のナノ粒子または微粒子を含んでなり、抗体結合領域（ＡＢＤ）と治療的、予防的、診断用、造影用またはその他の有益な部分とを含んでなる化合物をさらに含んでなる、請求項２９〜３５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３７】
薬学的に許容できる担体または賦形剤を含んでなる、請求項３３〜３６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３８】
治療的、予防的、診断用、造影用またはその他の有益な部分のＦｃＲｎに対する結合親和性、または半減期好ましくは血漿中半減期を変化させるための、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の、または請求項１７〜２８のいずれか一項に記載の方法によって得られるポリペプチド、請求項２９または３０に記載の複合体、請求項３１に記載の会合、または請求項３２に記載のナノ粒子または微粒子、または請求項３３〜３７のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項３９】
ＨＳＡ（配列番号２）を含んでなり、またはそれからなる参照、またはその断片、融合物、複合体、会合、ナノ粒子または微粒子のＦｃＲｎに対する結合親和性と比較して、ＦｃＲｎに対する結合親和性が増大する、請求項３８に記載の使用。
【請求項４０】
ＨＳＡ（配列番号２）を含んでなり、またはそれからなる参照、またはその断片、融合物、複合体、会合、ナノ粒子または微粒子のＦｃＲｎに対する結合親和性と比較して、ＦｃＲｎに対する結合親和性が低下する、請求項３９に記載の使用。
【請求項４１】
（ａ）分子がポリペプチドである場合、前記分子を請求項１〜１６のいずれか一項に記載の、または請求項１７〜２８に記載の方法によって得られるポリペプチドに、または請求項２９または３０に記載の複合体に、融合または複合化させるステップと；前記分子を請求項１〜１６のいずれか一項に記載の、または請求項１７〜２８に記載の方法によって得られるポリペプチドに、または請求項２９または３０に記載の複合体に、結合させるステップと；前記分子を請求項３２に記載のナノ粒子または微粒子中で、または請求項３３〜３７のいずれか一項に記載の組成物中で、請求項３１に記載の会合に組み込むステップと；
（ｂ）分子がポリペプチドでない場合、前記分子を請求項１〜１６のいずれか一項に記載の、または請求項１７〜２８に記載の方法によって得られるポリペプチドに、または請求項２９または３０に記載の複合体に、複合化させるステップと；前記分子を請求項１〜１６のいずれか一項に記載の、または請求項１７〜２８に記載の方法によって得られるポリペプチドに、または請求項２９または３０に記載の複合体に、結合させるステップと；前記分子を請求項３２に記載のナノ粒子または微粒子中で、または請求項３３〜３７のいずれか一項に記載の組成物中で、請求項３１に記載の会合に組み込むステップと
を含んでなる、分子のＦｃＲｎに対する結合親和性または半減期、好ましくは血漿中半減期を変化させる方法。
【請求項４２】
前記分子が、治療的、予防的、診断用、造影用またはその他の有益な部分である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
請求項１〜１６、２９〜４２のいずれか一項に記載される、または請求項１７〜２８のいずれか一項に記載の方法によって得られるポリペプチド、融合ポリペプチド、複合体、会合、ナノ粒子または微粒子またはその組成物であって、本明細書に記載されるものから選択される１つまたは複数の（いくつかの）部分を含んでなる、ポリペプチド、融合ポリペプチド、複合体、会合、ナノ粒子または微粒子またはその組成物。
【請求項４４】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは融合ポリペプチドをコードする、核酸。
【請求項４５】
請求項４４に記載の核酸を含んでなる、ベクター。
【請求項４６】
請求項４５に記載の核酸または請求項３４に記載のベクターを含んでなる、宿主細胞。
【請求項４７】
宿主細胞が、好ましくは酵母（サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）など）または哺乳類細胞（ＣＨＯまたはＨＥＫなど）または植物細胞（イネなど）である真核生物である、請求項４６に記載の宿主細胞。
【請求項４８】
請求項１〜１６、２９〜４７のいずれか一項に記載の、または請求項１７〜２８のいずれか一項に記載の方法によって得られるポリペプチド、融合ポリペプチド、複合体、組成物、会合、ナノ粒子または微粒子またはポリヌクレオチドを対象に投与するステップを含んでなる、予防、治療または診断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表への言及
本出願は、参照によって本明細書に援用する、コンピューター可読形式の配列表を含有する。
【０００２】
本発明は、アルブミン、その断片、またはアルブミンまたはその断片を含んでなる融合ポリペプチドと比較して、ＦｃＲｎに対する結合親和性の変化および／または半減期の変化を有する、アルブミン変種またはその断片、または変種アルブミンまたはその断片を含んでなる融合ポリペプチドに関する。本発明は、使用者または用途の要件および希望に応じて、アルブミンの結合親和性および／または半減期を調節できるようにする。
【背景技術】
【０００３】
アルブミンは、哺乳類の血漿に自然に見られるタンパク質であり、その中で最も豊富なタンパク質である。それは所望の血液浸透圧を維持する上で、また血流中の様々な物質輸送においても重要な役割を有する。アルブミンは、ヒト、ブタ、マウス、ラット、ウサギおよびヤギをはじめとする多数の種から特性解析されており、それらは配列および構造の高度な相同性を共有する。
【０００４】
アルブミンは、生体内でその受容体である新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）「Ｂｒａｍｂｅｌｌ」に結合し、この相互作用は、アルブミンの血漿半減期にとって重要であることが知られている。ＦｃＲｎは、膜結合タンパク質であり、多数の細胞および組織型中で発現する。ＦｃＲｎは、アルブミンを細胞内分解から守ることが分かっている（Ｒｏｏｐｅｎｉａｎ  Ｄ．Ｃ．ａｎｄ  Ａｋｉｌｅｓｈ，Ｓ．（２００７），Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ７，７１５−７２５）。ＦｃＲｎは、ヒトなどの哺乳類血清中において、ＩｇＧｓおよびアルブミンの高レベルを維持するのに寄与する二官能性分子である。
【０００５】
ＦｃＲｎと免疫グロブリン（ＩｇＧ）の相互作用が、先行技術で特性解析されている一方で、ＦｃＲｎとアルブミンの相互作用は、特徴がよく分かっていない。主なＦｃＲｎ結合部位は、ＤＩＩＩ（３８１〜５８５）中に局在化する（Ａｎｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ（２０１０），Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３，３６７−３７２）。特にヒスチジンＨ４６４、Ｈ５１０、およびＨ５３６、およびＬｙｓ５００などのいくつかの主要アミノ酸が、結合に重要であることが示されている（Ａｎｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ（２０１０），Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．３：６１０．ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１６０７）。データは、ＩｇＧとアルブミンが、ＦｃＲｎ上の異なる部位に非協調的に結合することを示す（Ａｎｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００６），Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３６，３０４４−３０５１；Ｃｈａｕｄｈｕｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００６），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４５，４９８３−４９９０）。
【０００６】
マウスＦｃＲｎは、マウスおよびヒトからのＩｇＧに結合する一方で、ヒトＦｃＲｎは、識別力がより高そうであることが知られている（Ｏｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３，１５５１−１５５９）。Ａｎｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８５（７）：４８２６−３６は、マウスおよびヒトアルブミン（全ての可能な組み合わせ）のそれぞれに対する、ヒトおよびマウスＦｃＲｎ親和性を記載する。生理学的ｐＨでは、どちらの受容体に対しても、どちらの種からのアルブミンの結合も観察されなかった。酸性ｐＨでは、結合親和性に１００倍の違いが観察された。いかなる場合でも、双方の受容体に対する、いずれの種からのアルブミンおよびＩｇＧの結合も相加的であった。
【０００７】
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は、５８５個のアミノ酸のポリペプチドとして良く特性解析されおり、その配列は、Ｐｅｔｅｒｓ，Ｔ．，Ｊｒ．（１９９６）Ａｌｌ  ａｂｏｕｔ  Ａｌｂｕｍｉｎ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｐｐ１０，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｏｒｌａｎｄｏ（ＩＳＢＮ  ０−１２−５５２１１０−３）にある。それは、その受容体ＦｃＲｎに対する特徴的な結合を有して、ｐＨ６．０で結合するが、ｐＨ７．４では結合しない。
【０００８】
ＨＳＡの血漿半減期は、およそ１９日間であることが分かっている。置換Ｄ４９４Ｎを有する、より短い血漿半減期を有する天然変種が同定されている（Ｐｅａｃｈ，Ｒ．Ｊ．ａｎｄ  Ｂｒｅｎｎａｎ，Ｓ．０．，（１９９１）Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１０９７：４９−５４）。この置換は、野生型アルブミンには存在しないＮ−グリコシル化部位をこの変種中に生じた。グリコシル化またはアミノ酸変化が、血漿半減期の変化の原因であるかどうかは分かっていない。
【０００９】
アルブミンは長い血漿半減期を有し、この特性のために、薬物送達で利用することが提案されている。アルブミンは、薬理的に有益な化合物に複合化結合されており（国際公開第２０００／６９９０２号パンフレット）、複合体はアルブミンの長い血漿半減期を維持することが分かった。結果として生じる複合体の血漿半減期は、有益な治療用化合物のみの血漿半減期よりも、一般に大幅に長い。
【００１０】
さらにアルブミンは、治療的に有益なペプチドに遺伝子的に融合されており（国際公開第２００１／７９２７１Ａ号パンフレットおよび国際公開第２００３／５９９３４号パンフレット）、典型的な結果では、融合物は、治療的に有益なペプチドの活性と、治療的に有益なペプチドのみの血漿半減期よりも大幅に長い血漿半減期とを有する。
【００１１】
Ｏｔａｇｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ（２００９），Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．３２（４），５２７−５３４は、７０個を上回るアルブミン変種を開示し、その内２５個は、ドメインＩＩＩ内で変異していることが分かった。カルボキシ末端の最後の１７５個のアミノ酸を欠く天然変種は、半減期の低下を有することが示されている（Ａｎｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ（２０１０），Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３，３６７−３７２）。Ｉｗａｏ  ｅｔ  ａｌ（２００７）は、マウスモデルを使用して天然のヒトアルブミン変種の半減期を研究し、Ｋ５４１ＥおよびＫ５６０Ｅは半減期を低下させ、Ｅ５０１ＫおよびＥ５７０Ｋは半減期を増大させ、Ｋ５７３Ｅの半減期に対する効果はほぼ皆無であることを見出した（Ｉｗａｏ，ｅｔ．ａｌ．（２００７）Ｂ．Ｂ．Ａ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  １７７４，１５８２−１５９０）。Ｇａｌｌｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ（１９９３）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １２２５，２７−３２は、天然変種Ｅ５０５Ｋを開示する。Ｍｉｎｃｈｉｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ（１９９０）は、天然変種Ｋ５３６Ｅを開示する。Ｍｉｎｃｈｉｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ（１９８７）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ９１６，４１１−４１８は、天然変種Ｋ５７４Ｎを開示する。Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４，４４１３−４４１７は、天然変種Ｄ５５０Ｇを開示する。Ｃａｒｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ（１９９２）．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９，８２２５−８２２９は、天然変種Ｄ５５０Ａを開示する。
【００１２】
国際公開第２０１１／０５１４８９号パンフレットおよび国際公開第２０１２／１５０３１９号パンフレット（ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０５８２０６）は、ＦｃＲｎに対するアルブミンの結合を調節するアルブミン中のいくつかの点変異を開示し、国際公開第２０１０／０９２１３５号パンフレットは、アルブミン中の複合化結合のために利用できるチオール数を増大させるアルブミン中のいくつかの点変異を開示し、開示はアルブミンとＦｃＲｎの結合に対する変異の効果については言及していない。国際公開第２０１１／１０３０７６号パンフレットは、ＨＳＡのドメインＩＩＩ内にそれぞれ置換を含有する、アルブミン変種を開示する。国際公開第２０１２／１１２１８８号パンフレットは、ＨＳＡのドメインＩＩＩ内に置換を含有する、アルブミン変種を開示する。
【００１３】
アルブミンは、いくつかのリガンドと結合する能力を有し、これらはアルブミンと結合（会合）するようになる。この特性は、アルブミンと非共有結合的に結合する能力を有する、薬剤の血漿半減期を延長するのに利用されている。これは、わずかなまたは皆無のアルブミン結合特性を有する薬学的に有益な化合物（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）を、アルブミン結合特性を有する部分に結合させることでも達成され得る、総説、Ｋｒａｔｚ（２００８）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １３２，１７１−１８３、およびその中の参考分文献を参照されたい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
アルブミンは、薬理的に有益な化合物の製剤中で使用され、このような製剤は、例えばアルブミンのナノ粒子または微粒子であってもよいが、これに限定されるものではない。これらの例では、薬理的に有益な化合物または化合物混合物の送達は、アルブミンの受容体に対する親和性の改変から恩恵を被ってもよく、その中では、有益な化合物が、送達手段としてアルブミンと結びつくことが示されている。形成される会合（例えばＬｅｖｅｍｉｒ（登録商標）、Ｋｕｒｔｚｈａｌｓ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１９９５；３１２：７２５−７３１であるが、これに限定されるものではない）、複合体または融合ポリペプチドの血漿半減期を、何が決定するのかは明らかでないが、アルブミンと、選択された薬理的に有益な化合物／ポリペプチドとの組み合わせの結果であると思われる。治療が意図される適応症の詳細に従って、特定の薬物をデザインできるように、結合、複合化または融合の構成要素が与えるよりも、長いまたはより短い血漿半減期を達成し得るように、所与のアルブミン複合体、会合またはアルブミン融合ポリペプチドの血漿半減期を制御できることが望ましいであろう。
【００１５】
アルブミンは、腫瘍中で蓄積して分解することが知られており；関節リウマチ患者の炎症性関節に蓄積することが示されている。総説、Ｋｒａｔｚ（２００８）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １３２，１７１−１８３、およびその中の参考分文献を参照されたい。ＦｃＲｎに対する親和性が増大しているＨＳＡ変種は、薬理的に有益な化合物の送達に有利であろうことが想定される。
【００１６】
Ｋｅｎａｎｏｖａ  ｅｔ  ａｌ（２００９）Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．；５０（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ２）：１５８２）によって記載されるような、より短い半減期または制御された血清薬物動態を提供するために、ＦｃＲｎに対する結合がわずかまたは皆無であるアルブミン変種を有することが望ましいかもしれない。
【００１７】
Ｋｅｎａｎｏｖａ  ｅｔ  ａｌ（２０１０，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ  ＆  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ２３（１０）：７８９−７９８；国際公開第２０１０／１１８１６９号パンフレット）は、（ｐＨ７〜８で溶解する）ＨＳＡのドメインＩＩＩの構造モデルと（ｐＨ６．４で溶解する）ＦｃＲｎの構造モデルとを含んでなる、ドッキングモデルを開示する。Ｋｅｎａｎｏｖａ  ｅｔ  ａｌは、ドメインＩＩＩ内の４６４、５０５、５１０、５３１および５３５位が、ＦｃＲｎと潜在的に相互作用することを開示する。４６４、５１０および５３５位のヒスチジンは特に興味深いことが、Ｃｈａｕｄｈｕｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００６、前掲書中）によって特定され、これらはマウス中で、顕著な親和性低下とより短い半減期を有することが、Ｋｅｎａｎｏｖａ（２０１０、前掲書中）によって示された。しかしＫｅｎａｎｏｖａ  ｅｔ  ａｌの研究は、ＨＳＡのドメインＩＩＩに限定され、したがってＨＳＡをその天然の無傷の形状で検討していない。さらに同定された位置は、ＦｃＲｎ受容体に対する親和性の低下をもたらす。
【００１８】
本発明は、ＦｃＲｎ受容体に対する調節された（すなわち変化した）結合親和性を有する、さらなる変種を提供する。したがってアルブミン部分または部分群を使用して、アルブミン部分を含んでなる、融合ポリペプチド、複合体、会合、ナノ粒子および組成物のＦｃＲｎに対する結合親和性および／または半減期を調節してもよい。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明は、配列番号２の成熟ポリペプチドのドメインＩ内に、およびドメインＩＩＩ内に、１つまたは複数の（いくつかの）改変を含んでなり、またはその他のアルブミンまたはその断片の同等の位置に、１つまたは複数の（いくつかの）改変を含んでなる、アルブミン変種に関する。
【００２０】
本発明はまた、配列番号２の成熟ポリペプチドのドメインＩ内に、またはその他のアルブミンまたはその断片の同等の位置に、１つまたは複数の（いくつかの）改変を含んでなる、アルブミン変種にも関する。
【００２１】
本発明はまた、配列番号２の成熟ポリペプチドのドメインＩＩＩ内に、またはその他のアルブミンまたはその断片の同等の位置に、１つまたは複数の（いくつかの）改変を含んでなるアルブミン変種にも関する。
【００２２】
本発明また、変種をコードする単離ポリヌクレオチド；ポリヌクレオチドを含んでなる核酸コンストラクト、ベクター、および宿主細胞に関し；変種を生成する方法にも関する。
【００２３】
本発明はまた、本発明による変種アルブミンまたはその断片と、有益な治療成分とを含んでなる複合体または会合に関し、または本発明の変種アルブミンまたはその断片と、融合パートナーポリペプチドとを含んでなる融合ポリペプチドにも関する。
【００２４】
本発明は、変種アルブミン、その断片、変種アルブミンまたはその断片を含んでなる融合ポリペプチド、または本発明による変種アルブミンまたはその断片を含んでなる複合体、または本発明による変種アルブミンまたはその断片を含んでなる会合を含んでなる、組成物にさらに関する。組成物は、好ましくは医薬組成物である。
【００２５】
本発明は、変種アルブミン、その断片、変種アルブミンまたはその断片を含んでなる融合ポリペプチド、または変種アルブミンまたはその断片を含んでなる複合体、または変種アルブミンまたはその断片を含んでなる会合を含んでなる、医薬組成物にさらに関する。
【００２６】
本発明はまた、変種、断片、融合ポリペプチド、複合体、会合、ナノ粒子、および微粒子の使用にも関する。
【００２７】
本発明はまた、変種アルブミン、その断片、変種アルブミンまたはその断片を含んでなる融合ポリペプチド、または変種アルブミンまたはその断片を含んでなる複合体、または変種アルブミンまたはその断片を含んでなる会合を調製する方法にも関する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１−１】（ｉ）完全長成熟ＨＳＡ（Ｈｕ＿１＿２＿３）、（ｉｉ）ＨＳＡ（Ｈｕ＿１＿３）のドメインＩおよびドメインＩＩＩを含んでなるアルブミン変種、（ｉｉｉ）ＨＳＡ（Ｈｕ＿２＿３）のドメインＩＩおよびドメインＩＩＩを含んでなるアルブミン変種、（ｉｖ）完全長アカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）アルブミン（Ｍａｃ＿ｍｕｌ）、（ｖ）完全長ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）アルブミン（ラット）、および（ｖｉ）完全長ハツカネズミ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）アルブミン（マウス）のアミノ酸配列の多重アラインメントである。（完全長ＨＳＡに対する）５００、５５０、および５７３位が、矢印で示される。図１−１では、ドメインＩ、ＩＩ、およびＩＩＩは、（それぞれ）１、２、および３と称される。
【図１−２】（ｉ）完全長成熟ＨＳＡ（Ｈｕ＿１＿２＿３）、（ｉｉ）ＨＳＡ（Ｈｕ＿１＿３）のドメインＩおよびドメインＩＩＩを含んでなるアルブミン変種、（ｉｉｉ）ＨＳＡ（Ｈｕ＿２＿３）のドメインＩＩおよびドメインＩＩＩを含んでなるアルブミン変種、（ｉｖ）完全長アカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）アルブミン（Ｍａｃ＿ｍｕｌ）、（ｖ）完全長ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）アルブミン（ラット）、および（ｖｉ）完全長ハツカネズミ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）アルブミン（マウス）のアミノ酸配列の多重アラインメントである。（完全長ＨＳＡに対する）５００、５５０、および５７３位が、矢印で示される。図１−２では、ドメインＩ、ＩＩ、およびＩＩＩは、（それぞれ）１、２、および３と称される。
【図２−１】ヒト、ヒツジ、マウス、ウサギおよびヤギからの成熟アルブミン、およびチンパンジー（「Ｃｈｉｍｐ」）、マカク、ハムスター、モルモット、ラット、ウシ、ウマ、ロバ、イヌ、ニワトリ、およびブタからの未熟アルブミンのアミノ酸配列の多重アラインメントである。ドメイン１、２、および３の開始および末端アミノ酸（Ｄｏｃｋａｌ  ｅｔ  ａｌ（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９９，Ｖｏｌ．２７４（４１）：２９３０３−２９３１０）によって定義される）は、成熟ヒトアルブミンに対して示される。
【図２−２】ヒト、ヒツジ、マウス、ウサギおよびヤギからの成熟アルブミン、およびチンパンジー（「Ｃｈｉｍｐ」）、マカク、ハムスター、モルモット、ラット、ウシ、ウマ、ロバ、イヌ、ニワトリ、およびブタからの未熟アルブミンのアミノ酸配列の多重アラインメントである。ドメイン１、２、および３の開始および末端アミノ酸（Ｄｏｃｋａｌ  ｅｔ  ａｌ（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９９，Ｖｏｌ．２７４（４１）：２９３０３−２９３１０）によって定義される）は、成熟ヒトアルブミンに対して示される。
【図２−３】ヒト、ヒツジ、マウス、ウサギおよびヤギからの成熟アルブミン、およびチンパンジー（「Ｃｈｉｍｐ」）、マカク、ハムスター、モルモット、ラット、ウシ、ウマ、ロバ、イヌ、ニワトリ、およびブタからの未熟アルブミンのアミノ酸配列の多重アラインメントである。ドメイン１、２、および３の開始および末端アミノ酸（Ｄｏｃｋａｌ  ｅｔ  ａｌ（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９９，Ｖｏｌ．２７４（４１）：２９３０３−２９３１０）によって定義される）は、成熟ヒトアルブミンに対して示される。
【図２−４】ヒト、ヒツジ、マウス、ウサギおよびヤギからの成熟アルブミン、およびチンパンジー（「Ｃｈｉｍｐ」）、マカク、ハムスター、モルモット、ラット、ウシ、ウマ、ロバ、イヌ、ニワトリ、およびブタからの未熟アルブミンのアミノ酸配列の多重アラインメントである。ドメイン１、２、および３の開始および末端アミノ酸（Ｄｏｃｋａｌ  ｅｔ  ａｌ（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９９，Ｖｏｌ．２７４（４１）：２９３０３−２９３１０）によって定義される）は、成熟ヒトアルブミンに対して示される。
【図３】それらの特性に基づく、保存アミノ酸群である。
【図４】ｓｈＦｃＲｎ−ＨＳＡドッキングモデルの描写である。（Ａ〜Ｂ）複合体の２つの配向が示される。アルブミンは空間充填略図によって示され、ＦｃＲｎはリボン略図として示される。ＨＳＡのコア結合境界面は、ピンクで強調表示される（グレースケールではこれは最も濃い（ほぼ黒色の）領域として見られる；ＤＩ（ＣＢＩ））一方で、境界面から遠位に局在化する領域は、ＤＩＩ（オレンジ）として示され、ＤＩＩＩはサブドメインＤＩＩＩａ（カラーではシアン）とＤＩＩＩｂ（カラーでは青色）に分けられる。
【図５】サンプルをｐＨ５．５で固定化ｓｈＦｃＲｎ−ＨＩＳ（約１５００〜２５００ＲＵ）上に注入した、ｐＨ５．５におけるＷＴ  ＨＳＡ、ＨＳＡ  Ｋ５７３Ｐ、およびＨＳＡ  Ｎ１１１Ｑ／Ｋ５７３ＰのｓｈＦｃＲｎ結合である。
【図６】ｓｈＦｃＲｎ（空間充填略図）と、７８〜８８位および１０８〜１１２位を含んでなるＨＳＡループを含むＨＳＡ（リボン略図）ＤＩ、ＤＩＩおよびＤＩＩＩとの間の空間的関係性を示す、提案されるｓｈＦｃＲｎ−ＨＳＡドッキングモデルである。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
定義
変種：「変種」という用語は、１つまたは複数の（いくつかの）改変、すなわち１つまたは複数の（いくつかの）位置における、置換、挿入、および／または欠失による、親アルブミンに由来するポリペプチドを意味する。置換は、異なるアミノ酸による、位置を占めるアミノ酸の置換を意味し；欠失は、位置を占めるアミノ酸の除去を意味し；挿入は、位置を占めるアミノ酸に直接隣接する、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個などの１個以上（いくつか）の、好ましくは１〜３個のアミノ酸を付加することを意味する。置換に関して、「直接隣接する」は、位置を占めるアミノ酸（「指名されたアミノ酸」）のＮ側（「上流」）またはＣ側（「下流」）であってもよい。したがって「Ｘ」と指名された／番号付けされたアミノ酸では、挿入は、「Ｘ＋１」（「下流」）の位置または「Ｘ−１」（「上流」）の位置であってもよい。
【００３０】
変異体：「変異体」という用語は、変種をコードするポリヌクレオチドを意味する。
【００３１】
野生型アルブミン：「野生型」（ＷＴ）アルブミンという用語は、動物またはヒトで自然に見られるのと同じアミノ酸配列を有するアルブミンを意味する。
【００３２】
親アルブミン：「親」または「親アルブミン」という用語は、それに対して人の手によって改変が加えられて、本発明のアルブミン変種が作成される、アルブミンを意味する。親は、天然の（野生型）ポリペプチド、またはそのアレルまたはその変種であってもよい。
【００３３】
アルブミン：アルブミンは、タンパク質であり、哺乳類の血漿中で最も大量のタンパク質を構成し、多数の哺乳類からのアルブミンが、生化学的方法によっておよび／または配列情報によって、特性解析されている。例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などのいくつかのアルブミンは、結晶学的に特性解析され、構造が決定されている（ＨＳＡ：Ｈｅ  ＸＭ，Ｃａｒｔｅｒ  ＤＣ（Ｊｕｌｙ  １９９２）．“Ａｔｏｍｉｃ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ”．Ｎａｔｕｒｅ  ３５８（６３８３）：２０９−１５；ウマアルブミン：Ｈｏ，Ｊ．Ｘ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）．Ｘ−ｒａｙ  ａｎｄ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｈｏｒｓｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ（Ｅｑｕｕｓ  ｃａｂａｌｌｕｓ）ａｔ  ０．２７−ｎｍ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１５（１）：２０５−１２）。
【００３４】
「アルブミン」という用語は、ＨＳＡまたはＨＳＡドメインと同一のおよび／または非常に良く似た、三次元の（三次）構造を有して、ＨＳＡまたは該当するドメインに類似した特性を有する、タンパク質を意味する。同様の三次元構造は、例えば本明細書で言及される種からのアルブミンの構造である。アルブミンのいくつかの主な特性は、ｉ）血漿容積を調節する能力（膨張活性）、ｉｉ）約１９日間±５日の長い血漿半減期、ｉｉｉ）ＦｃＲｎに対する結合、ｉｖ）リガンド結合、例えばビリルビン、脂肪酸、ヘミンおよびチロキシンをはじめとする、酸性親油性化合物などの内在性分子の結合（参照によって本明細書に援用する、Ｋｒａｇｈ−Ｈａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，２００２，Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２５，６９５の表１もまた参照されたい）、ｖ）例えばワルファリン、ジアゼパム、イブプロフェンおよびパクリタキセルのような薬剤などの酸性または電気陰性特性がある小型有機化合物の結合（参照によって本明細書に援用する、Ｋｒａｇｈ−Ｈａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，２００２，Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２５，６９５の表１もまた参照されたい）である。タンパク質または断片をアルブミンとして特徴付けるために、これらの全ての特性が満たされなくてもよい。例えば断片が、特定のリガンドまたは有機化合物の結合に関与するドメインを含まなければ、このような断片の変種もまた、これらの特性も有することが期待されない。
【００３５】
アルブミンは、一般におよそ２０日間以上の長い血漿半減期を有し、例えばＨＳＡは１９日間の血漿半減期を有する。ＨＳＡの長い血漿半減期は、その受容体ＦｃＲｎとの相互作用を通じて媒介されることが知られているが、ＨＳＡの長い半減期の背後にある正確な機序の理解または知識は、本発明に必須でない。
【００３６】
本発明によるアルブミンタンパク質の例としては、ヒト血清アルブミン（例えばＡＡＡ９８７９７またはＰ０２７６８−１、配列番号２（成熟）、配列番号４（未熟））、霊長類血清アルブミン、（チンパンジー血清アルブミンなど（例えば予測配列ＸＰ＿５１７２３３．２、配列番号５）、ゴリラ血清アルブミンまたはマカク血清アルブミン（例えばＮＰ＿００１１８２５７８、配列番号６）、齧歯類血清アルブミン（ハムスター血清アルブミン（例えばＡ６ＹＦ５６、配列番号７）、モルモット血清アルブミン（例えばＱ６ＷＤＮ９−１、配列番号８）、マウス血清アルブミン（例えばＡＡＨ４９９７１またはＰ０７７２４−１バージョン３、配列番号９）、およびラット血清アルブミン（例えばＡＡＨ８５３５９またはＰ０２７７０−１バージョン２、配列番号１０））など）、ウシ血清アルブミン（例えばウシ血清アルブミンＰ０２７６９−１、配列番号：１１）、ウマ血清アルブミン（例えばＰ３５７４７−１、配列番号１２）またはロバ血清アルブミン（例えばＱ５ＸＬＥ４−１、配列番号１３）などのウマ科血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン（例えばＰ４９０６５−１バージョン２、配列番号１４）、ヤギ血清アルブミン（例えばＡＣＦ１０３９１、配列番号１５）、ヒツジ血清アルブミン（例えばＰ１４６３９−１、配列番号１６）、イヌ血清アルブミン（例えばＰ４９８２２−１、配列番号１７）、ニワトリ血清アルブミン（例えばＰ１９１２１−１バージョン２、配列番号１８）、およびブタ血清アルブミン（例えばＰ０８８３５−１バージョン２、配列番号１９）またはこのようなアルブミンと、少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または少なくとも９９％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドが挙げられる。親または参照アルブミンは、ＨＳＡＫ５７３Ｐ（配列番号３）などの人為的変種、またはＨＳＡのＮ末端とマカクアルブミンのＣ末端（配列番号２０）、ＨＳＡのＮ末端とマウスアルブミンのＣ末端（配列番号２１）、ＨＳＡのＮ末端とウサギアルブミンのＣ末端（配列番号２２）、ＨＳＡのＮ末端とヒツジアルブミンのＣ末端（配列番号２３）などのキメラアルブミンであってもよい。
【００３７】
本出願の範囲に含まれるアルブミンのその他の例としては、卵白アルブミンが挙げられる（例えばＰ０１０１２．ｐｒｏ：ニワトリ卵白アルブミン；Ｏ７３８６０．ｐｒｏ：シチメンチョウ卵白アルブミン）。
【００３８】
配列番号２で開示されるＨＳＡまたはそのあらゆる天然アレルが、本発明による好ましいアルブミン（親アルブミン）である。ＨＳＡは、５８５個のアミノ酸残基からなり、６７ｋＤａの分子量を有するタンパク質である。その天然形態では、それはグリコシル化されていない。当業者は、ＨＳＡと本質的に同一特性を有するが、配列番号２と比較して１つまたは複数の（いくつかの）アミノ酸変化を有する、天然アレルが存在してもよいことを理解するであろう。本発明者らは、本発明による親アルブミンとしてのこのような天然アレルの使用もまた想定する。
【００３９】
親アルブミン、その断片、または本発明によるアルブミンまたはその断片を含んでなる融合ポリペプチドのアルブミン部分は、好ましくは、配列番号２で示されるＨＳＡの配列と、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも８６％、好ましくは少なくとも８７％、好ましくは少なくとも８８％、好ましくは少なくとも８９％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、好ましくは少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９４％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する。親アルブミンは、アルブミンの主な特性の少なくとも１つを、またはＨＳＡなどのアルブミンと類似した三次構造を保つことが好ましい。配列同一性は、配列番号２の完全長に対するものでも、またはドメインＩＩＩからなり、またはそれを含んでなる分子（例えば配列番号２７）、ドメインＩＩとドメインＩＩＩとからなり、またはそれを含んでなる分子（例えば配列番号２５）、ドメインＩとドメインＩＩＩとからなり、またはそれを含んでなる分子（例えば配列番号２４）、ドメインＩＩＩの２つのコピーからなり、またはそれを含んでなる分子（例えば配列番号２６）、ドメインＩＩＩの３つのコピーからなり、またはそれを含んでなる分子（例えば配列番号２８）、またはドメインＩとドメインＩＩＩの２つのコピーとからなり、またはそれを含んでなる分子（例えば配列番号２９）などの、配列番号２の１つまたは複数の（いくつかの）ドメインなどの断片からなり、またはそれを含んでなる分子に対するものであってもよい。
【００４０】
親は、好ましくは配列番号４（ＨＳＡの未熟配列）、または配列番号２（ＨＳＡの成熟配列）のアミノ酸配列を含んでなり、またはそれからなる。
【００４１】
別の実施形態では、親は、配列番号２の成熟ポリペプチドのアレル変種である。
【００４２】
親アルブミンは、非常に低いストリンジェンシー条件、低ストリンジェンシー条件、中程度のストリンジェンシー条件、中程度に高いストリンジェンシー条件、高ストリンジェンシー条件、または非常に高いストリンジェンシー条件下で、（ｉ）配列番号１の成熟ポリペプチドコーディング配列、または（ｉｉ）（ｉ）の完全長相補鎖とハイブリダイズする、ポリヌクレオチドによってコードされてもよい（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。
【００４３】
当該技術分野で周知の方法に従って、配列番号１のポリヌクレオチドまたはその部分配列、ならびに配列番号２のアミノ酸配列またはその断片を使用して、核酸プローブをデザインし、異なる属または種の株からの親をコードするＤＮＡを同定しクローンしてもよい。特に、その中の対応遺伝子を同定および単離するために、標準サザンブロット手順に続いて、このようなプローブを、関心のある属または種のゲノムまたはｃＤＮＡとのハイブリダイゼーションのために利用し得る。このようなプローブは、配列全体よりも大幅に短くあり得るが、例えば少なくとも２５、少なくとも３５、または少なくとも７０など、少なくとも１４ヌクレオチド長であるべきである。好ましくは、核酸プローブは、例えば少なくとも２００ヌクレオチド、少なくとも３００ヌクレオチド、少なくとも４００ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチド、少なくとも６００ヌクレオチド、少なくとも７００ヌクレオチド、少なくとも８００ヌクレオチド、または少なくとも９００ヌクレオチド長など、少なくとも１００ヌクレオチド長である。ＤＮＡおよびＲＮＡプローブの双方を利用し得る。プローブは、対応遺伝子を検出するために、（例えば32Ｐ、3Ｈ、35Ｓ、ビオチン、またはアビジンで）典型的に標識される。このようなプローブは、本発明に包含される。
【００４４】
このようなその他の生物から作成されたゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーを、上述のプローブとハイブリダイズして、親をコードするＤＮＡについてスクリーニングしてもよい。このようなその他の生物からのゲノムのまたはその他のＤＮＡは、アガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはその他の分離技術によって分離してもよい。ライブラリーからのＤＮＡまたは分離ＤＮＡは、ニトロセルロース、またはその他の適切な担体材料上に移して、固定化してもよい。配列番号１またはその部分配列と相同的なクローンまたはＤＮＡを同定化するために、担体材料がサザンブロット法で使用される。
【００４５】
本発明の目的では、ハイブリダイゼーションは、ポリヌクレオチドが、低い〜非常に高いストリンジェンシー条件下で、配列番号１で示されるポリヌクレオチド、その相補鎖、またはその部分配列に相当する標識ヌクレオチドプローブとハイブリダイズすることを意味する。プローブがハイブリダイズする分子は、例えばＸ線フィルムまたは当該技術分野で公知のあらゆるその他の検出手段を使用して、検出し得る。
【００４６】
核酸プローブは、配列番号１の成熟ポリペプチドコーディング配列、すなわち配列番号１のヌクレオチド１〜１７８５を含んでなり、またはそれからなってもよい。核酸プローブは、配列番号２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその断片を含んでなり、またはそれからなってもよい。
【００４７】
少なくとも１００ヌクレオチド長の長いプローブでは、非常に低い〜非常に高いストリンジェンシー条件は、標準サザンブロット法手順に従って、至適には１２〜２４時間にわたる、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌの剪断変性サケ精子ＤＮＡ、非常に低いおよび低いストリンジェンシーでは２５％ホルムアミド、中程度のおよび中程度に高いストリンジェンシーでは３５％ホルムアミド、または高いおよび非常に高いストリンジェンシーでは５０％ホルムアミド中における、４２℃での予備ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションと定義される。担体材料は、最後に、４５℃（非常に低いストリンジェンシー）、５０℃（低ストリンジェンシー）、５５℃（中程度のストリンジェンシー）、６０℃（中程度に高いストリンジェンシー）、６５℃（高ストリンジェンシー）、または７０℃（非常に高いストリンジェンシー）で、２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを使用して、それぞれ１５分間にわたり３回洗浄される。
【００４８】
約１５ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチド長の短いプローブでは、ストリンジェンシー条件は、Ｂｏｌｔｏｎ  ａｎｄ  ＭｃＣａｒｔｈｙ（１９６２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ４８：１３９０）に従った計算を使用して計算されたＴmを約５℃〜約１０℃下回る温度における、０．９ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．６の０．０９Ｍのトリス−ＨＣｌ、６ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％ＮＰ−４０、１×デンハルト液、１ｍＭのピロリン酸ナトリウム、１ｍＭのリン酸二水素ナトリウム、０．１ｍＭのＡＴＰ、および１ｍｌあたり０．２ｍｇの酵母ＲＮＡ中における、標準サザンブロット法手順に従った、至適には１２〜２４時間にわたる予備ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションと定義される。担体材料は、最後に、計算されたＴmを約５℃〜約１０℃下回る温度で、０．１％ＳＤＳ添加６×ＳＣＣ中で１５分間にわたり１回、および６×ＳＳＣを使用してそれぞれ１５分間にわたり２回洗浄される。
【００４９】
親は、配列番号１の成熟ポリペプチドのコーディング配列と、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％などの少なくとも６０％の配列同一性があり、アルブミンとして機能できるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドによって、コードされてもよい。一実施形態では、親は、配列番号１を含んでなり、またはそれからなる、ポリヌクレオチドによってコードされる。
【００５０】
アルブミン部分：本発明によるアルブミン変種またはその断片を含んでなる、融合ポリペプチド、複合体、会合、ナノ粒子、または組成物のアルブミン部分は、「アルブミン部分」または「アルブミン成分」と称されてもよい。本発明によるポリペプチドは、アルブミン部分を含んでなり、またはそれからなってもよい。
【００５１】
ＦｃＲｎおよびｓｈＦｃＲｎ：「ＦｃＲｎ」という用語は、ヒト新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）を意味する。ｓｈＦｃＲｎは、ＦｃＲｎの可溶性組換え形態である。ｈＦｃＲｎは、配列番号３０（主要組織適合性複合体クラスＩ様Ｆｃ受容体（ＦＣＧＲＴ）のトランケート型重鎖）および配列番号３１（β−２−ミクログロブリン）のヘテロ二量体である。配列番号３０および３１は、一緒になってｈＦｃＲｎを構成する。
【００５２】
単離された変種：「単離された変種」という用語は、人の手によって改変され、天然でそれと共に存在する少なくとも１つの成分から、完全にまたは部分的に分離された変種を意味する。「単離された変種」という用語は、天然では存在しない形態にあるまたは環境にある、変種を意味する。単離された物質の非限定的例としては、（１）あらゆる非天然変種；（２）自然界でそれが付随する１つまたは複数の（いくつかの）または全ての天然の構成物から、少なくとも部分的に取り出されたあらゆる変種；（３）それが由来するポリペプチド（例えば天然に見られるようなそれが由来するポリペプチドなど）と比較して、人の手によって改変されたあらゆる変種；または（４）それが天然に結合しているその他の成分と比較して変種ｅ（ｖａｒｉａｎｔ  ｅ）の量を増大させることで修飾された、あらゆる変種（例えば物質をコードする遺伝子の複数コピー；物質をコードする遺伝子と天然で結合するプロモーターよりも強力なプロモーターの使用）が挙げられる。単離された変種は、発酵ブロスサンプル中に存在してもよい。変種は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたはＧＰ−ＨＰＬＣによる測定で、例えば少なくとも５％の純度、少なくとも１０％の純度、少なくとも２０％の純度、少なくとも４０％の純度、少なくとも６０％の純度、少なくとも８０％の純度、および少なくとも９０％の純度など、少なくとも１％の純度であってもよい。
【００５３】
実質的に純粋な変種：「実質的に純粋な変種」という用語は、それが天然で付随し、または組換え的に付随する、その他のポリペプチド材料を、重量基準で、最大１０％、最大８％、最大６％、最大５％、最大４％、最大３％、最大２％、最大１％、および最大０．５％含有する調製品を意味する。好ましくは変種は、製剤中に存在する全ポリペプチド材料の重量基準で、例えば少なくとも９４％の純度、少なくとも９５％の純度、少なくとも９６％の純度、少なくとも９７％の純度、少なくとも９８％の純度、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％の純度、および１００％の純度など、少なくとも９２％の純度である。純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたはＧＰ−ＨＰＬＣによって測定されてもよい。本発明の変種は、好ましくは実質的に純粋な形態である。これは、例えば周知の組換え法によって、および精製法によって、変種を作成することで達成し得る。
【００５４】
成熟ポリペプチド：「成熟ポリペプチド」という用語は、翻訳およびＮ末端プロセッシング、Ｃ末端トランケーション、グリコシル化、リン酸化などのあらゆる翻訳後修飾に続いて、その最終形態にあるポリペプチドを意味する。成熟ポリペプチドは、例えば本発明による改変があるおよび／またはあらゆる翻訳後修飾を包含する、配列番号２のアミノ酸１〜５８５であってもよい。
【００５５】
成熟ポリペプチドコード配列：「成熟ポリペプチドコード配列」という用語は、成熟アルブミンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。成熟ポリペプチドコード配列は、例えば本発明による変種をコードするのに必要な包含がある、配列番号１のヌクレオチドの１〜１７５８であってもよい。
【００５６】
配列同一性：２つのアミノ酸配列または２つのヌクレオチド配列間の関連性は、「配列同一性」パラメータによって記述される。
【００５７】
本発明の目的では、ＥＭＢＯＳＳパッケージのＮｅｅｄｌｅプログラム（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６−２７７）の好ましくはバージョン３．０．０以降、より好ましくはバージョン５．０．０以降で実装されるように、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）を使用して、２つのアミノ酸配列間の配列同一性の程度を判定する。使用される任意選択のパラメータは、ｇａｐ  ｏｐｅｎ  ｐｅｎａｌｔｙ＝１０、ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ＝０．５、およびＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。「最長同一性」と標識されるＮｅｅｄｌｅの出力（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを使用して得られる）は、％同一性として使用され、次のようにして計算される。
（同一残基×１００）／（アラインメント長−アラインメント中のギャップ総数）
【００５８】
本発明の目的では、ＥＭＢＯＳＳパッケージのＮｅｅｄｌｅプログラム（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００、前出）好ましくはバージョン３．０．０以降、より好ましくはバージョン５．０．０以降で実装されるように、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０、前出）を使用して、２つのデオキシリボヌクレオチド配列間の配列同一性の程度を判定する。使用される任意選択のパラメータは、ｇａｐ  ｏｐｅｎ  ｐｅｎａｌｔｙ＝１０、ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ＝０．５、およびＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ  ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。「最長同一性」と標識されるＮｅｅｄｌｅの出力（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを使用して得られる）は、％同一性として使用され、以下のように計算される。
（同一デオキシリボヌクレオチド×１００）／（アラインメント長−アラインメント中のギャップ総数）
【００５９】
断片：「断片」という用語は、アルブミンのアミノおよび／またはカルボキシル末端、および／またはアルブミンの内部領域から、１つまたは複数の（いくつかの）アミノ酸が欠失した、ＦｃＲｎ結合能力を保つポリペプチドを意味する。断片は、ＨＳＡに由来する１つの中断されていない配列からなってもよく、またはそれはＨＳＡに由来する２つ以上の（いくつかの）配列を含んでなってもよい。本発明による断片は、およそ２０アミノ酸残基を超え、好ましくは３０アミノ酸残基を超え、より好ましくは４０アミノ酸残基を超え、より好ましくは５０アミノ酸残基を超え、より好ましくは７５アミノ酸残基を超え、より好ましくは１００アミノ酸残基を超え、より好ましくは２００アミノ酸残基を超え、より好ましくは３００アミノ酸残基を超え、なおもより好ましくは４００アミノ酸残基を超え、最も好ましくは５００アミノ酸残基を超えるサイズを有する。断片は、ＤＩ＋ＤＩＩ、ＤＩ＋ＤＩＩＩ、ＤＩＩ＋ＤＩＩＩ、ＤＩＩＩ＋ＤＩＩＩ、ＤＩ＋ＤＩＩＩ＋ＤＩＩＩ、ＤＩＩＩ＋ＤＩＩＩ＋ＤＩＩＩなどのもう１つのアルブミンのドメイン、またはこのようなドメインの断片、またはドメイン組み合わせを含んでなり、またはそれからなってもよい。
【００６０】
ドメインＩ、ＩＩおよびＩＩＩは、ＨＳＡ（配列番号２）を参照して定義されてもよい。例えば、ＨＳＡドメインＩは、配列番号２のアミノ酸１〜１９４（±１〜１５アミノ酸）からなってもまたはそれを含んでなってもよく、ＨＳＡドメインＩＩは、配列番号２のアミノ酸１９２（±１〜１５アミノ酸）〜３８７（±１〜１５アミノ酸）からなってもまたはそれを含んでなってもよく、ドメインＩＩＩは、配列番号２のアミノ酸残基３８１（±１〜１５アミノ酸）〜５８５（±１〜１５アミノ酸）からなってもまたはそれを含んでなってもよい。「±１〜１５アミノ酸」は、残基番号が、記述されるアミノ酸位置のＣ末端および／またはＮ末端から、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５アミノ酸外れてもよいことを意味する。ドメインＩ、ＩＩ、およびＩＩＩの例は、Ｄｏｃｋａｌ  ｅｔ  ａｌ（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９９，Ｖｏｌ．２７４（４１）：２９３０３−２９３１０）ａｎｄ  Ｋｊｅｌｄｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，１９９８，Ｖｏｌ  １３：１６３−１６９）によって記載され、下で一覧にされる。
【００６１】
【表１】
2018138023.tif 000002
【００６２】
当業者は、例えば、ＥＭＢＯＳＳパッケージのＮｅｅｄｌｅプログラム（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６−２７７）の好ましくはバージョン３．０．０以降、より好ましくはバージョン５．０．０以降で実装されるように、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）を使用して、ＨＳＡとのアミノ酸配列アラインメントによって、非ヒトアルブミン中でドメインＩ、ＩＩ、およびＩＩＩを同定し得る。使用される任意選択のパラメータは、ｇａｐ  ｏｐｅｎ  ｐｅｎａｌｔｙ＝１０、ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ＝０．５、およびＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。その他の適切なソフトウェアとしては、利用者用ガイド（バージョン３．６、２００５年９月）に記載されるようにして、デフォルト設定で使用してもよい、ＭＵＳＣＬＥ（（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｂｙ  ｌｏｇ−ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ，Ｒｏｂｅｒｔ  Ｃ．Ｅｄｇａｒ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．６，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｒｉｖｅ５．ｃｏｍ／ｍｕｓｃｌｅ；Ｅｄｇａｒ（２００４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３２（５），１７９２−９７、およびＥｄｇａｒ（２００４）ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，５（１）：１１３）が挙げられ、ＭＵＳＣＬＥの３．６以降のバージョンもまた、本発明のあらゆる態様で使用してもよい）。適切なアラインメントの例は、図１および２に提供される。
【００６３】
ドメインが、ＨＳＡ（配列番号２）のドメインＩ、ＩＩまたはＩＩＩと、少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５％の同一性または１００％の同一性を有することが好ましい。
【００６４】
アレル変種：「アレル変種」という用語は、同じ染色体の遺伝子座を占める２つ以上の（いくつかの）遺伝子の代案形態のいずれかを意味する。アレルの多様性は、変異を通じて自然に生じて、集団内に多形性をもたらすこともある。遺伝子変異は、サイレント（コードされたポリペプチドに変化がない）であり得て、またはアミノ酸配列変化を有するポリペプチドをコードしてもよい。ポリペプチドのアレル変種は、遺伝子のアレル変種によってコードされるポリペプチドである。
【００６５】
コード配列：「コード配列」という用語は、その翻訳されたポリペプチド生成物のアミノ酸配列を直接規定する、ポリヌクレオチドを意味する。コード配列の境界は、一般に、通常は、ＡＴＧ開始コドンまたはＧＴＧおよびＴＴＧなどの代案の開始コドンで始まり、ＴＡＡ、ＴＡＧ、およびＴＧＡなどの停止コドンで終了する、読み取り枠によって定まる。コード配列は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成、または組換えポリヌクレオチドであってもよい。
【００６６】
ｃＤＮＡ：「ｃＤＮＡ」という用語は、真核細胞から得られる、成熟スプライスｍＲＮＡ分子からの逆転写によって作成され得るＤＮＡ分子を意味する。ｃＤＮＡは、対応するゲノムＤＮＡ中に存在することもあるイントロン配列を欠く。最初の一次ＲＮＡ転写物は、成熟スプライスｍＲＮＡとして出現する前のスプライシングをはじめとする、一連の段階を通じてプロセシングされる、ｍＲＮＡの前駆体である。
【００６７】
核酸コンストラクト：「核酸コンストラクト」という用語は、自然に存在する遺伝子から単離されるか、さもなければ自然に存在しないはずの様式で核酸断片を含有するように改変された、または合成された、一本鎖または二本鎖のいずれかの核酸分子を意味する。核酸コンストラクトが本発明のコーディング配列の発現に必要な制御配列を含有する場合、核酸コンストラクトという用語は、「発現カセット」という用語と同義である。
【００６８】
制御配列：「制御配列」という用語は、本発明の変種をコードするポリヌクレオチドの発現に必要な全ての成分（例えば核酸配列）を意味する。各制御配列は、変種をコードするポリヌクレオチドにとって、天然（すなわち同一遺伝子由来）または異質（すなわち異なる遺伝子由来）であってもよく、または互いに天然または異質であってもよい。このような制御配列としては、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列、および転写ターミネーターが挙げられるが、これに限定されるものではない。少なくとも制御配列は、プロモーターと、転写および翻訳停止シグナルを含む。制御配列は、変種をコードするポリヌクレオチドのコード領域内において制御配列のライゲーションを容易にする、特定の制限酵素認識部位を導入する目的で、リンカーと共に提供されてもよい。
【００６９】
作動可能に連結する：「作動可能に連結する」という用語は、その中で、制御配列がコーディング配列の発現を誘導するように、対照配列が、ポリヌクレオチドのコーディング配列に対して適切な位置に配置される、立体配置を意味する。
【００７０】
発現：「発現」という用語は、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、および分泌をはじめとするが、これに限定されるものではない、変種の生成に関与するあらゆるステップを含む。
【００７１】
発現ベクター：「発現ベクター」という用語は、変種をコードするポリヌクレオチドを含んでなり、その発現を提供する追加的なヌクレオチド（例えば制御配列）と作動可能に連結する、直鎖または環状ＤＮＡ分子を意味する。
【００７２】
宿主細胞：「宿主細胞」という用語は、本発明のポリヌクレオチドを含んでなる核酸コンストラクトまたは発現ベクターによる、形質転換、形質移入、形質導入などを受けやすい、あらゆる細胞型を意味する。「宿主細胞」という用語は、複製中に起きる変異のために、親細胞と同一でない、親細胞のあらゆる子孫を包含する。
【００７３】
血漿半減期：血漿半減期は、理想的には適切な個体／個人において、生体内で判定される。しかしこれは時間がかかって高価であり、動物またはヒトにおける実験の実施と結びついた倫理的懸念が不可避であることから、血漿半減期が延長または短縮したかどうかを判定するために、生体外アッセイを利用することが望ましい。アルブミンの受容体ＦｃＲｎへの結合は、血漿半減期にとって重要であることが知られており、受容体結合と血漿半減期の間の相関は、アルブミンの受容体に対するより高い親和性が、より長い血漿半減期をもたらす関係である。したがって本発明では、アルブミンのＦｃＲｎに対するより高い親和性は、血漿半減期の増大を示唆し、アルブミンのその受容体に対するより低い親和性は、血漿半減期の低下を示唆すると見なされる。
【００７４】
本出願および特許請求の範囲では、アルブミンの受容体ＦｃＲｎへの結合は、親和性という用語と、「より強力な」または「より弱い」という表現を使用して記述される。したがってＦｃＲｎに対してＨＳＡよりも高い親和性を有する分子は、ＦｃＲｎにＨＳＡよりも強力に結合すると見なされ、ＦｃＲｎに対してＨＳＡよりも低い親和性を有する分子は、ＦｃＲｎにＨＳＡよりも弱く結合すると見なされると理解すべきである。
【００７５】
「より長い血漿半減期」または「より短い血漿半減期」という用語、および類似表現は、対応する親または参照または対応アルブミン分子との相関におけるものと理解される。したがって本発明の変種アルブミンに関するより長い血漿半減期は、変種が、例えば、（例えば配列番号２中の）ドメインＩ内の１つまたは複数の（いくつかの）位置、およびドメインＩＩＩ内の１つまたは複数の（いくつかの）位置における、本明細書に記載される改変以外は、同一配列を有する対応するアルブミンよりも、長い血漿半減期を有することを意味する。
【００７６】
参照：参照は、それに対してアルブミン変種、融合物、複合体、組成物、会合またはナノ粒子が比較される、アルブミン、融合物、複合体、組成物、会合またはナノ粒子である。参照は、完全長アルブミン（ＨＳまたはその天然アレルなど）またはその断片（ｏｆ  ａ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｔｈｅｒｅｏｆ）を含んでなり、またはそれからなってもよい。参照はまた、それに対して、アルブミン変種、融合物、複合体、組成物、会合またはナノ粒子が比較される、「対応する」アルブミン、融合物、複合体、組成物、会合またはナノ粒子と称されることもある。参照は、ＨＳＡ（配列番号２）またはその断片、融合物、複合体、会合、ナノ粒子または微粒子を含んでなり、またはそれからなってもよい。好ましくは参照は、アルブミン部分を除いて、本発明による（「試験対象の」）ポリペプチド、融合ポリペプチド、複合体、組成物、会合、ナノ粒子または微粒子と同一である。好ましくは、参照のアルブミン部分は、アルブミン（例えばＨＳＡ、配列番号２）またはその断片を含んでなり、またはそれからなる。参照のアルブミン部分のアミノ酸配列は、アルブミン部分のアミノ配列より長くても、より短くてもよく、または好ましくは本発明による（「試験対象の」）ポリペプチド、融合ポリペプチド、複合体、組成物、会合、ナノ粒子または微粒子と同じ長さ（±１〜１５アミノ酸）である。
【００７７】
同等のアミノ酸位置：本明細書全体を通じて、アミノ酸位置は、完全長成熟ヒト血清アルブミン（すなわちリーダー配列なし、配列番号２）との関連で定義される。しかし当業者は、本発明がまた、非ヒトアルブミンの変種、例えば本明細書で開示されるもの）、および／またはヒトまたは非ヒトアルブミンの断片にも関することを理解する。同等の位置は、ペアワイズ（例えばＣｌｕｓｔａｌＷ）または複数（例えばＭＵＳＣＬＥ）アラインメントを使用して、アミノ酸配列を比較することによって、ヒト血清アルブミン断片中、動物アルブミン中、およびその断片、融合物、およびその他の誘導体または変種中で同定され得る。例えば図１は、完全長ヒト血清アルブミン中の５００、５５０および５７３と同等の位置が、ヒト血清アルブミン断片中、およびその他の種のアルブミン中で容易に同定されることを示す。５００、５５０、および５７３位は、矢印によって示される。さらなる詳細が、下の表に提供される。
【００７８】
【表２】
2018138023.tif 000003
【００７９】
図１は、ＣｌｕｓｔａｌＷ  １．８１形式の出力をはじめとする、デフォルトパラメータを使用して、ＭＵＳＣＬＥによって作成された。未加工出力データは、出力形式：ＲＴＦ＿ｎｅｗ；フォントサイズ：１０；コンセンサスライン：コンセンサスラインなし；配列画分（これは網掛けのために一致しなくてはならない）：０．５；入力配列形式：ＡＬＮを使用する、ＢｏｘＳｈａｄｅ  ３．２１（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈ．ｅｍｂｎｅｔ．ｏｒｇ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ＢＯＸ＿ｆｏｒｍ．ｈｔｍｌ）を使用して、網掛けされた。したがって本明細書全体を通じて、ヒト血清アルブミン中で定義されるアミノ酸位置はまた、ヒト血清アルブミンの断片、誘導体または変種および融合物中の、その他の種からの動物の、およびその断片および融合物の、同等の位置に当てはまる。このような同等の位置は、（ｉ）その天然タンパク質中における異なる残基番号、および／または（ｉｉ）その天然タンパク質中における異なる天然アミノ酸を有してもよい。
【００８０】
同様に、図２は、配列番号２（ＨＳＡ）を参照して、アルブミンの断片（例えばドメイン）中で同定され得る同等の位置を示す。
【００８１】
変種の命名規則
本発明の目的で、配列番号２で開示される成熟ポリペプチドを使用して、別のアルブミン中の対応するアミノ酸残基を判定する。別のアルブミンのアミノ酸配列は、配列番号２で開示される成熟ポリペプチドと配列比較され、アラインメントに基づいて、配列番号２で開示される成熟ポリペプチド中のあらゆるアミノ酸残基に対応するアミノ酸位置番号が、ＥＭＢＯＳＳパッケージのＮｅｅｄｌｅプログラム（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６−２７７）の好ましくはバージョン３．０．０以降、より好ましくはバージョン５．０．０以降で実装されるように、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）を使用して判定される。
【００８２】
別のアルブミン中の対応するアミノ酸残基の同定は、それぞれのデフォルトパラメータを使用した、「ＣｌｕｓｔａｌＷ」（Ｌａｒｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２３：２９４７−２９４８），ＭＵＳＣＬＥ（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｂｙ  ｌｏｇ‐ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ；バージョン３．５以降；Ｅｄｇａｒ，２００４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３２：１７９２−１７９７），ＭＡＦＦＴ（バージョン６．８５７以降；Ｋａｔｏｈ  ａｎｄ  Ｋｕｍａ，２００２，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３０：３０５９−３０６６；Ｋａｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３３：５１１−５１８；Ｋａｔｏｈ  ａｎｄ  Ｔｏｈ，２００７，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２３：３７２−３７４；Ｋａｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５３７：３９−６４；Ｋａｔｏｈ  ａｎｄ  Ｔｏｈ，２０１０，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２６：１８９９−１９００）、およびＣｌｕｓｔａｌＷを用いたＥＭＢＯＳＳ  ＥＭＭＡ（１．８３以降；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２２：４６７３−４６８０）をはじめとするが、これに限定されるものではない、適切なコンピュータプログラムを使用して、複数ポリペプチド配列のアラインメントによって、判定または確認し得る。
【００８３】
別のポリペプチド（またはタンパク質）が、従来の配列ベースの比較ではそれらの関係性を検出できないように配列番号２の成熟ポリペプチドから分化している場合（Ｌｉｎｄａｈｌ  ａｎｄ  Ｅｌｏｆｓｓｏｎ，２０００，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９５：６１３−６１５）、その他のペアワイズ配列比較アルゴリズムを利用し得る。配列ベースの検索におけるより大きな感受性は、検索データベースに対するポリペプチドファミリーの確率的表現（プロファイル）を利用する、検索プログラムを使用して達成され得る。例えばＰＳＩ−ＢＬＡＳＴプログラムは、反復データベース検索プロセスを通じてプロファイルを生成し、遠縁のホモログを検出できる（Ａｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）。ポリペプチドのファミリーまたはスーパーファミリーが、タンパク質構造データベース中に、１つまたは複数の（いくつかの）代表を有する場合は、さらにより大きな感受性を達成し得る。ＧｅｎＴＨＲＥＡＤＥＲ（Ｊｏｎｅｓ，１９９９，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８７：７９７−８１５；ＭｃＧｕｆｆｉｎ  ａｎｄ  Ｊｏｎｅｓ，２００３，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １９：８７４−８８１）などのプログラムは、クエリー配列の構造的折り畳みを予測するニューラルネットワークへの入力として、多様な情報源（ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ、二次構造予測、構造アラインメントプロファイル、および溶媒和ポテンシャル）からの情報を利用する。同様に、Ｇｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１３：９０３−９１９の方法を利用して、ＳＣＯＰデータベース中に存在するスーパーファミリーモデルによって、未知の構造の配列をアラインさせ得る。次にこれらのアラインメントを使用して、ポリペプチドの相同性モデルを作成し得て、その目的のために開発された多様なツールを使用して、このようなモデルを正確度について評価し得る。
【００８４】
既知の構造のタンパク質では、構造アラインメントを検索して作成するために、いくつかのツールおよび資源が利用できる。例えばタンパク質のＳＣＯＰスーパーファミリーは、構造的に配列比較され、これらのアラインメントは、アクセスおよびダウンロードできる。距離アラインメントマトリックス（Ｈｏｌｍ  ａｎｄ  Ｓａｎｄｅｒ，１９９８，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ３３：８８−９６）またはコンビナトリアル伸長（Ｓｈｉｎｄｙａｌｏｖ  ａｎｄ  Ｂｏｕｒｎｅ，１９９８，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １１：７３９−７４７）などの多様なアルゴリズムを使用して、２つ以上のタンパク質構造を配列比較し得て、これらのアルゴリズムの実装は、可能な構造ホモログを発見するために、対象構造によって構造データベースをクエリーするのにさらに利用される（例えばＨｏｌｍ  ａｎｄ  Ｐａｒｋ，２０００，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １６：５６６−５６７）。
【００８５】
本発明のアルブミン変種について記述する上で、参照しやすいように下述の命名法を適応させる。一般に認められたＩＵＰＡＣ一文字、または三文字アミノ酸略語が用いられる。「点変異」および／または「改変」という用語は、欠失、挿入および置換を含む。
【００８６】
置換。アミノ酸置換では、以下の命名法が使用される：元のアミノ酸、位置、置換アミノ酸。したがって例えば２２６位におけるスレオニンのアラニンによる置換は、「Ｔｈｒ２２６Ａｌａ」または「Ｔ２２６Ａ」と命名される。複数変異（または改変）は、加算記号（「＋」）によって区切られ、例えば「Ｇｌｙ２０５Ａｒｇ＋Ｓｅｒ４１１Ｐｈｅ」または「Ｇ２０５Ｒ＋Ｓ４１１Ｆ」は、それぞれ２０５位および４１１位におけるグリシン（Ｇ）のアルギニン（Ｒ）による置換、およびセリン（Ｓ）のフェニルアラニン（Ｆ）による置換に相当する。図はまた、例えば「Ｅ４９２Ｔ／Ｎ５０３Ｄ」のように（「／」）も利用し、これは（「＋」）と同義と見なすべきである。
【００８７】
欠失。アミノ酸欠失では、以下の命名法が使用される：元のアミノ酸、位置＊。したがって１９５位におけるグリシンの欠失は、「Ｇｌｙ１９５＊」または「Ｇ１９５＊」と命名される。複数の欠失は、例えば「Ｇｌｙ１９５＊＋Ｓｅｒ４１１＊」または「Ｇ１９５＊＋Ｓ４１１＊」のように、加算記号（「＋」）によって区切られる。
【００８８】
挿入。上で開示されるように、挿入は、位置を占めるアミノ酸（指名される（または元の）アミノ酸、「Ｘ」）のＮ側（「上流」、「Ｘ−１」）またはＣ側（「下流」、「Ｘ＋１」）であってもよい。
【００８９】
元のアミノ酸（「Ｘ」）のＣ側（「下流」、「Ｘ＋１」）へのアミノ酸挿入では、下の命名法が使用される：元のアミノ酸、位置、元のアミノ酸、挿入アミノ酸。したがって１９５位におけるグリシンの後へのリジンの挿入は、「Ｇｌｙ１９５ＧｌｙＬｙｓ」または「Ｇ１９５ＧＫ」と命名される。複数のアミノ酸の挿入は、［元のアミノ酸、位置、元のアミノ酸、挿入アミノ酸＃１、挿入アミノ酸＃２など］と命名される。例えば位置１９５におけるグリシン後へのリジンおよびアラニンの挿入は、「Ｇｌｙ１９５ＧｌｙＬｙｓＡｌａ」または「Ｇ１９５ＧＫＡ」として示される。
【００９０】
このような場合、挿入されたアミノ酸残基は、挿入されたアミノ酸残基に先行する、アミノ酸残基の位置番号への小文字の追加によって番号付けされる。したがって上の例では、配列は次のようになる。
【００９１】
【表３】
2018138023.tif 000004
【００９２】
元のアミノ酸（「Ｘ」）のＮ側（「上流」、「Ｘー１」）へのアミノ酸挿入では、下の命名法が使用される：元のアミノ酸、位置、挿入アミノ酸、元のアミノ酸。したがって１９５位におけるグリシン（Ｇ）前へのリジン（Ｋ）の挿入は、「Ｇｌｙ１９５ＬｙｓＧｌｙ」または「Ｇ１９５ＫＧ」と命名される。複数アミノ酸の挿入は、［元のアミノ酸、位置、挿入アミノ酸＃１、挿入アミノ酸＃２など、元のアミノ酸］と命名される。例えば１９５位におけるグリシン前へのリジン（Ｋ）およびアラニン（Ａ）の挿入は、「Ｇｌｙ１９５ＬｙｓＡｌａＧｌｙ」または「Ｇ１９５ＫＡＧ」として示される。このような場合、挿入されたアミノ酸残基は、挿入されたアミノ酸残基に続く、アミノ酸残基の位置番号へのプライム記号付き小文字の追加によって番号付けされる。したがって上の例では、配列は次のようになる。
【００９３】
【表４】
2018138023.tif 000005
【００９４】
複数の改変。複数の改変を含んでなる変種は、加算記号（「＋」）によって区切られ、例えば「Ａｒｇ１７０Ｔｙｒ＋Ｇｌｙ１９５Ｇｌｕ」または「Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ」は、それぞれ、１７０位および１９５位における、アルギニンおよびグリシンのチロシンおよびグルタミン酸による置換に相当する。
【００９５】
異なる改変（例えば置換）。異なる改変（例えば置換）を位置に導入し得る場合、異なる改変（例えば置換）は、コンマによって区切られ、例えば「Ａｒｇ１７０Ｔｙｒ，Ｇｌｕ」は、１７０位におけるアルギニンのチロシンまたはグルタミン酸による置換に相当する。したがって「Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ，Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ，Ａｌａ」は、以下の変種を指す：
「Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ」、「Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ＋Ａｒｇ１７０Ａｌａ」、「Ｔｙｒ１６７Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ」、および「Ｔｙｒ１６７Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ａｌａ」。
【００９６】
本発明は、配列番号２の成熟ポリペプチドのドメインＩ内の位置に、およびドメインＩＩＩ内の位置に改変を含んでなり、またはその他のアルブミンまたはその断片中の同等の位置に改変を含んでなる、アルブミン変種に関する。
【００９７】
変種
本発明の第１の態様は、ＨＳＡ（配列番号２）などのアルブミンのドメインＩ内の１つまたは複数の（いくつかの）改変、およびＨＳＡ（配列番号２）などのアルブミンのドメインＩＩＩ内の１つまたは複数の（いくつかの）改変を含んでなる、親アルブミンの変種アルブミンまたはその断片、または変種アルブミンまたはその断片を含んでなる融合ポリペプチドである、ポリペプチドを提供する。
【００９８】
親アルブミンおよび／または変種アルブミンは、
（ａ）配列番号２の成熟ポリペプチドと少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｂ）低ストリンジェンシー条件下で、（ｉ）配列番号１の成熟ポリペプチドコード配列と、または（ｉｉ）（ｉ）の完全長補体とハイブリダイズする、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；
（ｃ）配列番号１の成熟ポリペプチドコード配列と少なくとも６０％の同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；および／または
（ｄ）配列番号２の成熟ポリペプチドの断片
を含んでなり、またはそれからなることが好ましい。
【００９９】
配列番号２の成熟ポリペプチドのドメインＩ内の位置に、およびドメインＩＩＩ内の位置に、置換、欠失または挿入などの１つまたは複数の（いくつかの）改変を含んでなり、またはその他のアルブミンまたはその変種または断片中の同等の位置に、置換、欠失または挿入などの１つまたは複数の（いくつかの）改変を含んでなる、アルブミン変種またはその断片、またはアルブミンまたはその断片を含んでなる融合ポリペプチド。本明細書に記載される改変に加えて、停止コドンが導入されてもよく、導入される場合、それは５７４位またはさらに下流である（例えば配列番号２中では５７４〜５８５位に導入される）。
【０１００】
本発明による、変種アルブミン、その断片、または変種アルブミンまたはその断片を含んでなる融合ポリペプチドのアルブミン部分は、配列番号２で示されるＨＳＡの配列と、一般に、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する。変種は、配列番号２に対して１００％未満の同一性を有する。
【０１０１】
本発明による、変種アルブミン、その断片、または変種アルブミンまたはその断片を含んでなる融合ポリペプチドのアルブミン部分は、親アルブミンの配列と、一般に、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する。変種は、親アルブミンの配列に対して１００％未満の同一性を有する。
【０１０２】
一態様では、本発明の変種中の改変の数は、配列番号２と比較して、または親アルブミンの配列と比較して、１〜２０個であり、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個など、１〜１０個および１〜５個の改変である。
【０１０３】
ドメインＩ内の１つまたは複数の（いくつかの）改変は、ＨＳＡ（配列番号２）の７８〜８８位（すなわち７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８位）および／または１０５〜１２０位（すなわち１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０位）に相当する位置から選択されてもよい。ＨＳＡ中では、７８〜８８位はループを構成し、１０５〜１２０位はループを構成する。したがってその他のアルブミンの同等のループ中の位置もまた、本発明に含まれる。好ましい残基は、残基８１〜８５、特に８２および８３、および残基１１０〜１１４、特に１１１および１１２である。
【０１０４】
配列番号２の８２位（またはその他のアルブミンまたはその断片の変種の相当する位置）では、改変は、天然アミノ酸からＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙなどへの置換であることが好ましく、より好ましいのはＱ、ＤまたはＡ、さらにより好ましいのはＤまたはＡ、最も好ましいのはＡへの置換である。配列番号２中では、８２位の天然アミノ酸はグルタミン酸であり、したがってグルタミン酸への置換は好ましくない。
【０１０５】
配列番号２の８３位（またはその他のアルブミンまたはその断片の変種の相当する位置）では、改変は、天然アミノ酸から、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙなどへの置換であることが好ましく、より好ましいのはＮ、ＫまたはＳ、さらにより好ましいのはＮまたはＫ、最も好ましいのはＮへの置換である。配列番号２中では、８２位の天然アミノ酸はスレオニンであり、したがってスレオニンへの置換は好ましくない。
【０１０６】
配列番号２の１１１位（またはその他のアルブミンまたはその断片の変種の相当する位置）では、改変は、天然アミノ酸からＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙなどへの置換であることが好ましく、よりも好ましいのはＮ、Ｅ、Ｑ、Ｄ、ＧまたはＨ、さらにより好ましいのはＥまたはＱ、最も好ましいのはＥへの置換である。配列番号２中では、１１１位の天然アミノ酸はアスパラギンであり、したがってアスパラギンへの置換は好ましくない。
【０１０７】
配列番号２中の１１２位（またはその他のアルブミンまたはその断片の変種の相当する位置）では、改変は天然アミノ酸からＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙなどの置換であることが好ましく、より好ましいのはＦ、ＹまたはＷ、さらにより好ましいのはＦまたはＹ、最も好ましいのはＦへの置換である。配列番号２中では、１１２位の天然アミノ酸はロイシンであり、したがってロイシンへの置換は好ましくない。
【０１０８】
配列番号２の５７３位（またはその他のアルブミンまたはその断片の変種の相当する位置）では、改変は、天然アミノ酸からＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙなどへの置換であることが好ましく、よりも好ましいのはＰ、Ｙ、Ｗ、Ｈ、Ｆ、Ｔ、ＩまたはＶ、さらによりよりも好ましいのはＰ、ＹまたはＷ、最好ましいのはＰへの置換である。配列番号２中では、５７３位の天然アミノ酸はリジンであり、したがってリジンへの置換は好ましくない。
【０１０９】
アルブミン変種は、例えば、配列番号２のアルブミン、特に配列番号２のその変種または断片の８２および８３位（またはその他のアルブミンまたはその断片の変種の相当する位置）における置換などの改変を含んでなってもよい。
【０１１０】
アルブミン変種は、例えば、配列番号２のアルブミン、特に配列番号２のその変種または断片の８２および１１１位（またはその他のアルブミンまたはその断片の変種の相当する位置）における置換などの改変を含んでなってもよい。
【０１１１】
アルブミン変種は、例えば、配列番号２のアルブミン、特に配列番号２のその変種または断片の８２および１１２位（またはその他のアルブミンまたはその断片の変種の相当する位置）における置換などの改変を含んでなってもよい。
【０１１２】
アルブミン変種は、例えば、配列番号２のアルブミン、特に配列番号２のその変種または断片の８２および５７３位（またはその他のアルブミンまたはその断片の変種の相当する位置）における置換などの改変を含んでなってもよい。
【０１１３】
アルブミン変種は、例えば、配列番号２のアルブミン、特に配列番号２のその変種または断片の８３および１１１位（またはその他のアルブミンまたはその断片の変種の相当する位置）における置換などの改変を含んでなってもよい。
【０１１４】
アルブミン変種は、例えば、配列番号２のアルブミン、特に配列番号２のその変種または断片の８３および１１２位（またはその他のアルブミンまたはその断片の変種の相当する位置）における置換などの改変を含んでなってもよい。
【０１１５】
アルブミン変種は、例えば、配列番号２のアルブミン、特に配列番号２のその変種または断片の８３および５７３位（またはその他のアルブミンまたはその断片の変種の相当する位置）における置換などの改変を含んでなってもよい。
【０１１６】
アルブミン変種は、例えば、配列番号２のアルブミン、特に配列番号２のその変種または断片の１１１および１１２位（またはその他のアルブミンまたはその断片の変種の相当する位置）における置換などの改変を含んでなってもよい。
【０１１７】
アルブミン変種は、例えば、配列番号２のアルブミン、特に配列番号２のその変種または断片の１１１および５７３位（またはその他のアルブミンまたはその断片の変種の相当する位置）における置換などの改変を含んでなってもよい。
【０１１８】
アルブミン変種は、例えば、配列番号２のアルブミン、特に配列番号２のその変種または断片の１１２および５７３位（またはその他のアルブミンまたはその断片の変種の相当する位置）における置換などの改変を含んでなってもよい。
【０１１９】
アルブミン変種は、例えば、配列番号２のアルブミン、特に配列番号２のその変種または断片の８２、８３、および１１１位（またはその他のアルブミンまたはその断片の変種の相当する位置）における置換などの改変を含んでなってもよい。
【０１２０】
アルブミン変種は、例えば、配列番号２のアルブミン、特に配列番号２のその変種または断片の８２、８３、および１１２位（またはその他のアルブミンまたはその断片の変種の相当する位置）における置換などの改変を含んでなってもよい。
【０１２１】
アルブミン変種は、例えば、配列番号２のアルブミン、特に配列番号２のその変種または断片の８２、８３、および５７３位（またはその他のアルブミンまたはその断片の変種の相当する位置）における置換などの改変を含んでなってもよい。
【０１２２】
アルブミン変種は、例えば、配列番号２のアルブミン、特に配列番号２のその変種または断片の８２、１１１、および１１２位（またはその他のアルブミンまたはその断片の変種の相当する位置）における置換などの改変を含んでなってもよい。
【０１２３】
アルブミン変種は、例えば、配列番号２のアルブミン、特に配列番号２のその変種または断片の８２、１１１、および５７３位（またはその他のアルブミンまたはその断片の変種の相当する位置）における置換などの改変を含んでなってもよい。
【０１２４】
アルブミン変種は、例えば、配列番号２のアルブミン、特に配列番号２のその変種または断片の８２、１１２、および５７３位（またはその他のアルブミンまたはその断片の変種の相当する位置）における置換などの改変を含んでなってもよい。
【０１２５】
アルブミン変種は、例えば、配列番号２のアルブミン、特に配列番号２のその変種または断片の８３、１１１、および１１２位（またはその他のアルブミンまたはその断片の変種の相当する位置）における置換などの改変を含んでなってもよい。
【０１２６】
アルブミン変種は、例えば、配列番号２のアルブミン、特に配列番号２のその変種または断片の８３、１１１、および５７３位（またはその他のアルブミンまたはその断片の変種の相当する位置）における置換などの改変を含んでなってもよい。
【０１２７】
アルブミン変種は、例えば、配列番号２のアルブミン、特に配列番号２のその変種または断片の８３、１１２、および５７３位（またはその他のアルブミンまたはその断片の変種の相当する位置）における置換などの改変を含んでなってもよい。
【０１２８】
アルブミン変種は、例えば、配列番号２のアルブミン、特に配列番号２のその変種または断片の１１１、１１２、および５７３位（またはその他のアルブミンまたはその断片の変種の相当する位置）における置換などの改変を含んでなってもよい。
【０１２９】
アルブミン変種は、例えば、配列番号２のアルブミン、特に配列番号２のその変種または断片の８２、８３、１１１、および１１２位（またはその他のアルブミンまたはその断片の変種の相当する位置）における置換などの改変を含んでなってもよい。
【０１３０】
アルブミン変種は、例えば、配列番号２のアルブミン、特に配列番号２のその変種または断片の８２、８３、１１１、および５７３位（またはその他のアルブミンまたはその断片の変種の相当する位置）における置換などの改変を含んでなってもよい。
【０１３１】
アルブミン変種は、例えば、配列番号２のアルブミン、特に配列番号２のその変種または断片の８２、８３、１１２、および５７３位（またはその他のアルブミンまたはその断片の変種の相当する位置）における置換などの改変を含んでなってもよい。
【０１３２】
アルブミン変種は、例えば、配列番号２のアルブミン、特に配列番号２のその変種または断片の８２、１１１、１１２、および５７３位（またはその他のアルブミンまたはその断片の変種の相当する位置）における置換などの改変を含んでなってもよい。
【０１３３】
アルブミン変種は、例えば、配列番号２のアルブミン、特に配列番号２のその変種または断片の８３、１１１、１１２、および５７３位（またはその他のアルブミンまたはその断片の変種の相当する位置）における置換などの改変を含んでなってもよい。
【０１３４】
アルブミン変種は、例えば、配列番号２のアルブミン、特に配列番号２のその変種または断片の８２、８３、１１１、１１２、および５７３位（またはその他のアルブミンまたはその断片の変種の相当する位置）における置換などの改変を含んでなってもよい。
【０１３５】
アルブミン変種は、例えば、配列番号２のアルブミン、特に配列番号２のその変種または断片の４２５および５７３位（またはその他のアルブミンまたはその断片の変種の相当する位置）における置換などの改変を含んでなってもよい。
【０１３６】
アルブミン変種は、例えば、配列番号２のアルブミン、特に配列番号２のその変種または断片の５０５および５７３位（またはその他のアルブミンまたはその断片の変種の相当する位置）における置換などの改変を含んでなってもよい。
【０１３７】
アルブミン変種は、例えば、配列番号２のアルブミン、特に配列番号２のその変種または断片の５２７および５７３位（またはその他のアルブミンまたはその断片の変種の相当する位置）における置換などの改変を含んでなってもよい。
【０１３８】
アルブミン変種は、例えば、配列番号２のアルブミン、特に配列番号２のその変種または断片の５３４および５７３位（またはその他のアルブミンまたはその断片の変種の相当する位置）における置換などの改変を含んでなってもよい。
【０１３９】
特に好ましいアルブミン変種は、Ｔ８３Ｎ／Ｎ１１１Ｅ（例えば配列番号３２）；Ｔ８３Ｎ／Ｎ１１１Ｅ／Ｋ５７３Ｐ（例えば配列番号３３）；Ｔ８３Ｎ／Ｋ５７３Ｐ（例えば配列番号３４）；Ｔ８３Ｋ／Ｋ５７３Ｐ（例えば配列番号３８）；Ｅ８２Ａ／Ｋ５７３Ｐ（例えば配列番号３９）；Ｌ１１２Ｆ／Ｋ５７３Ｐ（例えば配列番号４０）；Ｅ８２Ｄ／Ｋ５７３Ｐ（例えば配列番号４３）；Ｐ１１０Ｇ／Ｋ５７３Ｐ（例えば配列番号４４）；Ｎ１１１Ｄ／Ｋ５７３Ｐ（例えば配列番号６０）；Ｎ１１１Ｇ／Ｋ５７３Ｐ（例えば配列番号６１）；Ｎ１１１Ｈ／Ｋ５７３Ｐ（例えば配列番号６２）；Ｅ４２５Ａ／Ｋ５７３Ｐ（例えば配列番号６４）；Ｅ５０５Ｑ／Ｋ５７３Ｐ（例えば配列番号６５）；Ｔ５２７Ｍ／Ｋ５７３Ｐ（例えば配列番号６６）；Ｎ１１１Ｅ／Ｋ５７３Ｐ（例えば配列番号６８）；Ｋ５３４Ｖ／Ｋ５７３Ｐ（例えば配列番号７３）；Ｎ１１１Ｑ／Ｋ５７３Ｐ（例えば配列番号７４）の置換を含んでなり、それらはＨＳＡ（配列番号２）を参照して記述される。その他の好ましいアルブミン変種は、ＨＳＡ（配列番号２）以外のアルブミン中に同等の置換を含んでなる。
【０１４０】
また本発明によるアルブミン変種は、ＨＳＡ（配列番号２）の７８〜８８（７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１）および／または１０５〜１２０（１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０）および／または４２５、５０５、５１０、５１２、５２４、５２７、５３１、５３４、５６９、５７５、またはその他のアルブミンの同等の位置から選択される位置における、１つまたは複数の（いくつかの）改変を含んでなってもよい。好ましい改変は、本発明の第１の態様で、これらの位置について記載されるものなどの置換である。特に好ましい置換としては、Ｄ１０８Ａ（配列番号５９）；Ｄ１０８Ｅ（例えば配列番号７０）；Ｎ１０９Ｋ（例えば配列番号６９）；Ｐ１１０Ｇ（例えば配列番号４２）；Ｎ１１１Ｄ（例えば配列番号４６）；Ｎ１１１Ｅ（例えば配列番号６７）；Ｎ１１１Ｇ（例えば配列番号４８）；Ｎ１１１Ｈ（例えば配列番号４９）；Ｎ１１１Ｋ（例えば配列番号５４）；Ｌ１１２Ｆ（例えば配列番号３７）；Ｅ４２５Ａ（例えば配列番号６３）；Ｅ４２５Ｋ（例えば配列番号５５）；Ｅ５０５Ｑ（例えば配列番号４５）；Ｈ５１０Ｄ（例えば配列番号５７）；Ｄ５１２Ｅ（例えば配列番号５０）；Ｋ５２４Ａ（例えば配列番号５１）；Ｔ５２７Ａ（例えば配列番号５２）；Ｔ５２７Ｍ（例えば配列番号４７）；Ｅ５３１Ｈ（例えば配列番号５３）；Ｋ５３４Ｖ（例えば配列番号５６）；Ａ５６９Ｓ（例えば配列番号５８）；Ｌ５７５Ｆ（例えば配列番号７２）；Ｅ８２Ａ（例えば配列番号３６）；Ｅ８２Ｄ（例えば配列番号４１）；Ｔ８３Ｋ（例えば配列番号３５）；Ｔ８３Ｎ（例えば配列番号７１）が挙げられ、それらはＨＳＡ（配列番号２）を参照して記述される。１つまたは複数の（いくつかの）改変を含んでなるその他の好ましいアルブミン変種は、ＨＳＡ（配列番号２）以外のアルブミン中に同等の置換を含んでなってもよい。
【０１４１】
変種アルブミン、その断片、または変種アルブミンまたはその断片を含んでなる融合ポリペプチドは、対応する親または参照アルブミン、その断片、または変種アルブミンまたはその断片を含んでなる融合ポリペプチドと比較して、ＦｃＲｎに対する結合親和性の変化および／または血漿半減期の変化および／またはＦｃＲｎに対する結合親和性の変化を有することが好ましい。
【０１４２】
特に好ましい実施形態では親または参照アルブミンは、ＨＳＡ（配列番号２）および変種アルブミン、その断片、または変種アルブミンまたはその断片を含んでなる融合ポリペプチドであり、ＨＳＡ、対応する断片、またはＨＳＡまたはその断片を含んでなる融合ポリペプチドと比較して、ＦｃＲｎに対する結合親和の変化性および／または血漿半減期の変化および／またはＦｃＲｎに対する結合親和性の変化を有する。
【０１４３】
本発明者らは、ＨＳＡ  Ｄ４９４Ｎの天然アレルに基づいて、アルブミンおよびその受容体の結合と、血漿半減期との間の相関に気付いた。本発明者らは、このアレルを以前分析して、それが受容体ＦｃＲｎに対して、ＷＴ  ＨＳＡのＦｃＲｎに対する親和性よりも低い親和性を有することを見出した。
【０１４４】
さらに、ヒトＦｃＲｎで置換された天然マウスＦｃＲｎを有する遺伝子組換えマウスは、正常なマウスよりも高い血清アルブミンレベルを有することが、開示されている（Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．（２００３）１９７（３）：３１５−２２）。本発明者らは、ヒトＦｃＲｎがマウス血清アルブミンに対して、マウスＦｃＲｎがマウス血清アルブミンに対して有するよりも、より高い親和性を有することを以前発見しており、したがって遺伝子組換えマウスの血清アルブミン中で観察された増大は、血清アルブミンとその受容体間のより高い親和性に対応するものであり、ＦｃＲｎに対するアルブミンの結合と、血漿半減期との間の相関が確認された。さらにＦｃＲｎに対してわずかなまたは皆無の結合を有するアルブミン変種は、マウスモデル中で半減期の低下を有することが示されているＫｅｎａｎｏｖａ  ｅｔ  ａｌ（２００９）Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．；５０（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ２）：１５８２）。
【０１４５】
変種アルブミンのＦｃＲｎに対する親和性が、親または参照アルブミンより高いかまたはより低いかを判定する１つの方法は、下述するように、表面プラズモン共鳴アッセイ（ＳＰＲ）を利用することである。当業者は、例えば結合定数ＫＤの測定および比較などのその他の方法が、変種アルブミンのＦｃＲｎに対する親和性が、親または参照アルブミンのＦｃＲｎに対する親和性より高いかまたはより低いかを判定するのに有用かもしれないことを理解するであろう。第１の分子（例えばリガンド）と第２の分子（例えば受容体）との間の結合親和性（ＫＤ）は、ＫＤ＝ｋd／ｋaに従った、結合速度（オン速度、ｋa）および解離速度（オフ速度、ｋd）の動態定数の関数である。したがって本発明によって、天然ＨＳＡのＫＤよりも低いＫＤを有する変種アルブミンは、ＨＳＡよりも長い血漿半減期を有し、天然ＨＳＡのＫＤよりも高いＫＤを有する変種アルブミンは、ＨＳＡよりも短い血漿半減期を有すると見なされる。
【０１４６】
本発明の一実施形態では、本発明による、アルブミン変種またはその断片、または変種アルブミンまたはその断片を含んでなる融合ポリペプチドは、親または参照アルブミン、その断片、または親または参照アルブミンまたはその断片を含んでなる融合ポリペプチドの血漿半減期より長い血漿半減期を有し、および／またはＦｃＲｎに対するより強力な結合親和性を有する。
【０１４７】
さらなる実施形態では、本発明による、アルブミン変種またはその断片、または変種アルブミンまたはその断片を含んでなる融合ポリペプチドは、親または参照アルブミン、その断片、または親または参照アルブミンまたはその断片を含んでなる融合ポリペプチドの血漿半減期より短い血漿半減期を有し、および／またはＦｃＲｎに対するより弱い結合親和性を有する。
【０１４８】
ドメインＩ内（本明細書に記載されるループ７８〜８８内および／またはループ１０５〜１２０内などの）、およびＩＩＩ内の位置（またはその他のアルブミンまたはその断片の変種の相当する位置）の改変に加えて、本発明による、変種アルブミンまたはその断片、または変種アルブミンまたはその断片を含んでなる融合ポリペプチドは、分子のその他の位置に、追加的な置換、欠失または挿入を含有してもよい。このような追加的な置換、欠失または挿入は、グリコシル化改変；チオール基などの反応基の表面への導入、カルバモイル化部位の除去／生成などであるが、これに限定されるものではない、分子のその他の特性の改変に、有用であってもよい。
【０１４９】
表面の反応性残基を提供するために、改変され、有利には本発明で応用され得る残基は、（参照によって本明細書に援用する）国際公開第２０１０／０９２１３５号パンフレットで開示される。特定の好ましい残基としては、配列番号２中の位置に相当する位置が挙げられる。
【０１５０】
表面に反応性チオール基を提供するために、配列番号２に、またはその他のアルブミンの相当する位置に、加え得る改変の例としては、配列番号２中の以下の改変に相当する改変が挙げられる：Ｌ５８５Ｃ、Ｄ１Ｃ、Ａ２Ｃ、Ｄ５６２Ｃ、Ａ３６４Ｃ、Ａ５０４Ｃ、Ｅ５０５Ｃ、Ｔ７９Ｃ、Ｅ８６Ｃ、Ｄ１２９Ｃ、Ｄ５４９Ｃ、Ａ５８１Ｃ、Ｄ１２１Ｃ、Ｅ８２Ｃ、Ｓ２７０Ｃ、Ａ５７８Ｃ、Ｌ５９５ＬＣ、Ｄ１ＤＣ、Ａ２ＡＣ、Ｄ５６２ＤＣ、Ａ３６４ＡＣ、Ａ５０４ＡＣ、Ｅ５０５ＥＣ、Ｔ７９ＴＣ、Ｅ８６ＥＣ、Ｄ１２９ＤＣ、Ｄ５４９ＤＣ、Ａ５８１ＡＣ、Ａ５８１ＡＣ、Ｄ１２１ＤＣ、Ｅ８２ＥＣ、Ｓ２７０ＳＣ、Ｓ５７９ＡＣ、Ｃ３６０＊、Ｃ３１６＊、Ｃ７５＊、Ｃ１６８＊、Ｃ５５８＊、Ｃ３６１＊、Ｃ９１＊、Ｃ１２４＊、Ｃ１６９＊、およびＣ５６７＊。代案としては、アルブミンのＮまたはＣ末端に、システイン残基を付加してもよい。「反応性チオール」という用語は、システインに結合するジスルフィドでなく、および／または複合化パートナーなどのパートナーとの結合に立体的に利用できる、Ｃｙｓによって提供されるチオール基を意味しおよび／またはそれを含む。
【０１５１】
融合ポリペプチド
本発明の第２の態様は、融合ポリペプチドに関する。したがって本発明によるアルブミン変種またはその断片は、非アルブミンポリペプチド融合パートナーと融合していてもよい。融合パートナーは、原則的にあらゆるポリペプチドであってもよいが、一般に、融合パートナーは、治療的、（ワクチンをはじめとする）予防的、診断用、造影用またはその他の有益な特性を有するポリペプチドであることが好ましい。このような特性は、「薬理的に有益な特性」と称されてもよい。アルブミンまたはその断片を含んでなる融合ポリペプチドは、当該技術分野で公知である。アルブミンまたはその断片と、融合パートナーポリペプチドとを含んでなるこのような融合ポリペプチドは、融合していない融合パートナーポリペプチドのみと比較して、より長い血漿半減期を有することが分かった。本発明によれば、先行技術の相当する融合ポリペプチドと比較して、本発明による融合ポリペプチドの血漿半減期を変化させることが可能である。「変化させる」は、血漿半減期を増大させること、および血漿半減期を低下させることの双方を含む。血漿半減期を増大させることが、好ましい。本発明は、半減期を所望の期間に調節できるようにする。
【０１５２】
１つまたは複数の（いくつかの）治療的、（ワクチンをはじめとする）予防的、診断用、造影用またはその他の有益な部分をＮ末端、アルブミンのＣ末端に融合してもよく、アルブミン構造中のループまたはそれらのあらゆる組み合わせに挿入してもよい。それは融合ポリペプチドの様々な構成要素を隔てるリンカー配列を含んでなってもよく、または含まなくてもよい。
【０１５３】
アルブミン融合物またはその断片に関する教示は、当該技術分野で公知であり、当業者は、このような教示を本発明にもまた応用し得ることを理解するであろう。（それぞれその内容全体を参照によって本明細書に援用する）国際公開第２００１／７９２７１Ａ号パンフレット（特に９頁および／または表１）、国際公開第２００３／５９９３４号パンフレット（特に表１）、国際公開第０３／０６００７１号パンフレット（特に表１）、および国際公開第０１／０７９４８０号パンフレット（特に表１）もまた、アルブミンまたはその断片と融合していてもよい、治療的、（ワクチンをはじめとする）予防的、診断用、造影用、またはその他の有益なポリペプチドの例を含み、これらの実施例はまた、本発明にも当てはまる。
【０１５４】
本発明の第２の態様のためのさらなる選択性としては、本発明の第１の態様のものと、本発明の第１２の態様の下に提供されるものとが挙げられる。当業者は、本発明のあらゆる態様を、本発明の別の態様または態様群と、および／または本発明の態様および／またはその他の本明細書の開示の選択性の１つまたは複数（いくつか）と、組み合わせてもよいことを理解する。
【０１５５】
ポリヌクレオチド
本発明の第３の態様は、本発明の変種または融合ポリペプチドのいずれかをコードする、単離ポリヌクレオチドに関する。ポリヌクレオチドは、単離ポリヌクレオチドであってもよい。ポリヌクレオチドは、（プラスミドなどの）ベクターおよび／または宿主細胞に含まれてもよい。
【０１５６】
本発明の第３の態様のためのさらなる選択性としては、本発明の第１の態様のものと、本発明の第１２の態様の下に提供されるものとが挙げられる。当業者は、本発明のあらゆる態様を、本発明の別の態様または態様群と、および／または本発明の態様および／またはその他の本明細書の開示の選択性の１つまたは複数（いくつか）と、組み合わせてもよいことを理解する。
【０１５７】
核酸コンストラクト
本発明の第４の態様は、制御配列と適合性の条件下で、適切な宿主細胞中におけるコーディング配列の発現を誘導する、１つまたは複数の（いくつかの）制御配列と作動可能に連結する、本発明の変種または融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなる、核酸コンストラクトに関する。
【０１５８】
ポリヌクレオチドを多様な方法で操作して、変種の発現を提供してもよい。発現ベクター次第で、ベクターへの挿入に先だつポリヌクレオチドの操作が望ましい、または必要なことがある。組換えＤＮＡ法を利用する、ポリヌクレオチドを修飾する技術は、当該技術分野で周知である。
【０１５９】
制御配列は、ポリヌクレオチドの発現のために宿主細胞によって認識される、プロモーター配列であってもよい。プロモーター配列は、変種の発現を媒介する転写制御配列を含有する。プロモーターは、変異、トランケート型、および雑種プロモーターをはじめとする、宿主細胞中で転写活性を示すあらゆる核酸配列であってもよく、宿主細胞に対して同種または異種のいずれかの、細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られてもよい。
【０１６０】
酵母宿主中では、有用なプロモーターは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）エノラーゼ（ＥＮＯ−１）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）プロテアーゼＡ（ＰＲＡ１）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）プロテアーゼＢ（ＰＲＢ１）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）翻訳延長因子（ＴＥＦ１）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）翻訳延長因子（ＴＥＦ２）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ１、ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）メタロチオネイン（ＣＵＰ１）、およびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）３−ホスホグリセリン酸キナーゼの遺伝子から得られる。酵母宿主細胞に有用なその他のプロモーターは、Ｒｏｍａｎｏｓｅｔａｌ．，１９９２，Ｙｅａｓｔ  ８：４２３−４８８によって記載される。
【０１６１】
当業者は、ＣＨＯまたはＨＥＫなどの、イネおよび哺乳類細胞における利用に有用なプロモーターを理解している。イネ宿主では、有用なプロモーターは、カリフラワーモザイクウイルス３５ＳＲＮＡ遺伝子（ＣａＭＶ３５Ｓ）、トウモロコシアルコールデヒドロゲナーゼ（Ａｄｈ１）、およびα  Ａｍｙ３から得られる。
【０１６２】
ＣＨＯまたはＨＥＫなどの哺乳類宿主細胞では、有用なプロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）およびＣＡＧ雑種プロモーター（ＣＭＶ初期エンハンサー因子およびニワトリβアクチンプロモーターの雑種）、サル空胞化ウイルス４０（ＳＶ４０）から得られる。
【０１６３】
制御配列はまた、宿主細胞によって認識されて転写を終結する、適切な転写ターミネーター配列であってもよい。ターミネーター配列は、変種をコードするポリヌクレオチドの３’末端と作動可能に連結する。宿主細胞中で機能性のあらゆるターミネーターを使用してもよい。
【０１６４】
酵母宿主細胞の好ましいターミネーターは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）エノラーゼ、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）チトクロームＣ（ＣＹＣ１）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ１）、およびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）グリセルアルデヒド‐３‐リン酸デヒドロゲナーゼの遺伝子から得られる。酵母宿主細胞のその他の有用なターミネーターは、前出のＲｏｍａｎｏｓｅｔａｌ．，１９９２によって記載される。当業者は、ＣＨＯまたはＨＥＫなどの、イネおよび哺乳類細胞における利用に有用なターミネーターを理解している。例えばイネ宿主では、好ましいターミネーターは、アグロバクテリウム・ツメフアシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ノパリンシンターゼ（Ｎｏｓ）およびカリフラワーモザイクウイルス３５ＳＲＮＡ遺伝子（ＣａＭＶ３５Ｓ）から得られる。
【０１６５】
制御配列はまた、宿主細胞による翻訳に重要なｍＲＮＡの非翻訳領域である、適切なリーダー配列であってもよい。リーダー配列は、変種をコードするポリヌクレオチドの５’末端と作動可能に連結する。宿主細胞中で機能性のあらゆるリーダー配列を使用してもよい。
【０１６６】
酵母宿主細胞の適切なリーダーは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）エノラーゼ（ＥＮＯ−１）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）α因子、およびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）の遺伝子から得られる。
【０１６７】
制御配列はまた、変種をコードする配列の３’末端と作動可能に連結し、転写されると、転写されたｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加するシグナルとして宿主細胞によって認識される配列である、ポリアデニル化配列であってもよい。宿主細胞中で機能性のあらゆるポリアデニル化配列を使用してもよい。
【０１６８】
酵母宿主細胞に有用なポリアデニル化配列は、Ｇｕｏ  ａｎｄ  Ｓｈｅｒｍａｎ，１９９５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌ．１５：５９８３−５９９０によって記載される。
【０１６９】
制御配列はまた、変種のＮ末端と連結して、変種を細胞の分泌経路内に誘導するシグナルペプチドをコードする、シグナルペプチドコード領域であってもよい。ポリヌクレオチドのコーディング配列の５’末端は、翻訳読み枠内で、変種をコードするコード領域断片と天然に連結する、シグナルペプチドコード領域を生得的に含有してもよい。代案としては、コーディング配列の５’末端は、コーディング配列にとって異質である、シグナルペプチドコード領域を含有してもよい。コーディング配列がシグナルペプチドコード領域を天然に含まない場合、異質シグナルペプチドコード領域が必要なこともある。代案としては、変種の分泌を向上させるために、異質シグナルペプチドコード領域で、天然シグナルペプチドコード領域を単に置き換えてもよい。しかし発現した変種を宿主細胞の分泌経路内に誘導する、あらゆるシグナルペプチドコード領域が使用されてもよい。
【０１７０】
酵母宿主細胞に有用なシグナルペプチドは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）α因子、およびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）インベルターゼの遺伝子から得られる。その他の有用なシグナルペプチドコード配列は、前出のＲｏｍａｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２によって記載される。当業者は、ＣＨＯまたはＨＥＫなどの、イネおよび哺乳類細胞における利用に有用なシグナルペプチドを理解している。
【０１７１】
シグナルペプチドおよびプロペプチド領域の双方が、変種のＮ末端に存在する場合、プロペプチド領域が変種のＮ末端の隣に配置され、シグナルペプチド領域は、プロペプチド領域のＮ末端の隣に配置される。
【０１７２】
本発明の第４の態様のためのさらなる選択性としては、本発明の第１の態様のものと、本発明の第１２の態様の下に提供されるものとが挙げられる当業者は、本発明のあらゆる態様を、本発明の別の態様または態様群と、および／または本発明の態様および／またはその他の本明細書の開示の選択性の１つまたは複数（いくつか）と、組み合わせてもよいことを理解する。
【０１７３】
変種の調製
本発明の第５の態様は、
（ａ）親アルブミンまたはその断片、または親アルブミンまたはその断片を含んでなる融合ポリペプチドに、ドメインＩ内の１つまたは複数の（いくつかの）改変、およびドメインＩＩＩ内の１つまたは複数の（いくつかの）改変を導入するステップと；
（ｂ）変種アルブミンまたはその断片、または変種アルブミンまたはその断片を含んでなる融合ポリペプチドを回収するステップと
を含んでなる、変種アルブミンまたはその断片、または変種アルブミンまたはその断片を含んでなる融合ポリペプチド、または変種アルブミンまたはその断片の会合を調製しまたは得る方法に関する。
【０１７４】
好ましい改変は、本発明の第１の態様に関して記載されるとおりである。結果として得られる変種アルブミンまたはその断片は、改変を含まない親アルブミンまたは断片などの参照のＦｃＲｎ結合親和性と比較して、ＦｃＲｎ結合親和性の変化を有してもよい。より好ましくは、結果として得られる変種アルブミンまたはその断片は、より強力なＦｃＲｎ結合親和性を有する。
【０１７５】
本発明は、アルブミン変種、その断片、または前記変種アルブミンまたはその断片を含んでなる融合ポリペプチドであって、参照アルブミン、断片、またはその融合物のＦｃＲｎに対する結合親和性と比較して、ＦｃＲｎに対する結合親和性の変化を有する、ポリペプチドを調製する方法を含み、上記方法は、
（ａ）配列番号２に対する少なくとも６０％の配列同一性を有するアルブミンなどの、親アルブミンをコードする核酸を提供するステップと；
（ｂ）ステップ（ａ）の配列を修飾して、
（ｉ）親アルブミンのドメインＩ内の１つまたは複数の（いくつかの）位置、およびドメインＩＩＩ（ドメイン３）中の１つまたは複数の（いくつかの）位置に相当する位置における改変、または
（ｉｉ）配列番号２のドメインＩの７８〜１２０位のいずれか１つまたは複数（いくつか）に相当する位置、または配列番号２のドメインＩＩＩの４２５、５０５、５１０、５１２、５２４、５２７、５３１、５３４、５６９、５７３、５７５位のいずれか１つまたは複数（いくつか）に相当する位置における改変
を含んでなる、変種アルブミン、その断片、または前記変種アルブミンまたはその断片を含んでなる融合ポリペプチドである、ポリペプチドをコードするステップと；
（ｃ）任意選択的に、ステップ（ｂ）の改変配列を適切な宿主細胞に導入するステップと；
（ｄ）任意選択的に、ポリペプチドの発現をもたらす条件下で、細胞を適切な成長培地中で培養するステップと；
（ｅ）任意選択的に、ポリペプチドを成長培地から回収するステップと
を含んでなり、
上記ポリペプチドは、ＦｃＲｎに対する結合親和性の変化、および／または親アルブミン、参照アルブミン、その断片、または前記親アルブミン、参照アルブミンまたはその断片を含んでなる融合ポリペプチド、またはその融合物の半減期と比較して、血漿半減期の変化を有する。
【０１７６】
親アルブミンおよび／または変種アルブミンは、
（ａ）配列番号２の成熟ポリペプチドと少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｂ）低ストリンジェンシー条件下で、（ｉ）配列番号１の成熟ポリペプチドコード配列と、または（ｉｉ）（ｉ）の完全長補体とハイブリダイズする、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；
（ｃ）配列番号１の成熟ポリペプチドコード配列と少なくとも６０％の同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；および／または
（ｄ）配列番号２の成熟ポリペプチドの断片
を含んでなり、またはそれからなることが好ましい。
【０１７７】
変種は、部位特異的変異誘発、合成遺伝子構築、半合成遺伝子構築、ランダム変異誘発、シャフリングなどの当該技術分野で公知のあらゆる変異誘発手順を使用して、当業者によって作成され得る。
【０１７８】
部位特異的変異誘発は、親をコードするポリヌクレオチド中の１つまたは複数の（いくつかの）規定部位において、１つまたは複数の（いくつかの）変異（改変）を作り出す技術である。
【０１７９】
部位特異的変異誘発は、所望の変異を含有するオリゴヌクレオチドプライマーの使用を伴うＰＣＲによって、生体外で達成し得る。部位特異的変異誘発はまた、親をコードするポリヌクレオチドを含んでなるプラスミド中の部位における制限酵素による切断と、引き続くポリヌクレオチド中の変異を含有するオリゴヌクレオチドのライゲーションを伴う、カセット変異誘発によっても生体外で実施し得る。通常は、プラスミドおよびオリゴヌクレオチドを消化する制限酵素は同一であり、プラスミドのライゲーションおよび相互の挿入を可能にする。例えば、Ｓｃｈｅｒｅｒ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ，１９７９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６：４９４９−４９５５；およびＢａｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：７３４９−４９６６を参照されたい。
【０１８０】
部位特異的変異誘発はまた、当該技術分野で公知の方法によっても生体内で達成し得る。例えば、米国特許出願公開第２００４／０１７１１５４号明細書；Ｓｔｏｒｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：７７３−７７６；Ｋｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：２８５−２９０；およびＣａｌｉｓｓａｎｏ  ａｎｄ  Ｍａｃｉｎｏ，１９９６，Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔ．Ｎｅｗｓｌｅｔｔ．４３：１５−１６を参照されたい。
【０１８１】
あらゆる部位特異的変異誘発手順を本発明で使用し得る。変種を調製するために使用できる、利用可能な多くの市販のキットがある。
【０１８２】
合成遺伝子構築は、対象ポリペプチドをコードするようにデザインされた、ポリヌクレオチド分子の生体外合成を必然的に伴う。遺伝子合成は、Ｔｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４，Ｎａｔｕｒｅ  ４３２：１０５０−１０５４）によって記載される多重マイクロチップベースの技術、および光プログラム可能なマイクロ流体チップ上でオリゴヌクレオチドが合成され組み立てられる同様の技術などの、いくつかの技術を利用して実施し得る。
【０１８３】
単一または複数のアミノ酸置換、欠失、および／または挿入は、変異誘発、組換え、および／またはシャフリングなどの既知の方法と、それに続く、Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓａｕｅｒ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：５３−５７；Ｂｏｗｉｅ  ａｎｄ  Ｓａｕｅｒ，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：２１５２−２１５６；国際公開第９５／１７４１３号パンフレット；または国際公開第９５／２２６２５号パンフレットによって開示されるような、妥当なスクリーニング手順とを使用して、作成し試験し得る。利用し得るその他の方法としては、誤りがちなＰＣＲ、ファージディスプレイ（例えば、Ｌｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：１０８３２−１０８３７；米国特許第５，２２３，４０９号明細書；国際公開第９２／０６２０４号パンフレット）、および領域特異的突然変異誘発（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｇｅｎｅ  ４６：１４５；Ｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，ＤＮＡ  ７：１２７）が挙げられる。
【０１８４】
変異誘発／シャフリング方法をハイスループット自動スクリーニング法と組み合わせて、宿主細胞によって発現されるクローン化変異誘発ポリペプチドによる活性を検出し得る（Ｎｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：８９３−８９６）。活性ポリペプチドをコードする変異誘発ＤＮＡ分子は、当該技術分野の標準法を使用して、宿主細胞から回収し、迅速に配列決定し得る。これらの方法は、ポリペプチド中における個々のアミノ酸残基の重要性の迅速な判定を可能にする。
【０１８５】
半合成遺伝子構築は、合成遺伝子構築、および／または部位特異的変異誘発、および／またはランダム変異誘発、および／またはシャフリングの態様を組み合わせることで達成される。半合成構築は、ＰＣＲ技術と組み合わせて、合成されたポリヌクレオチド断片を利用する方法を特徴とする。したがって遺伝子の規定領域が新規に合成されてもよい一方で、その他の領域は、部位特異的変異原性プライマーを使用して増幅されてもよく、その一方で、なおもその他の領域は、誤りがちなＰＣＲまたは誤りがちでないＰＣＲ増幅の対象となってもよい。次にポリヌクレオチドサブ配列をシャッフルしてもよい。
【０１８６】
本発明の第５の態様のためのさらなる選択性としては、本発明の第１の態様のものと、本発明の第１２の態様の下に提供されるものとが挙げられる。当業者は、本発明のあらゆる態様を、本発明の別の態様または態様群と、および／または本発明の態様および／またはその他の本明細書の開示の選択性の１つまたは複数（いくつか）と、組み合わせてもよいことを理解する。
【０１８７】
生成方法
本発明の第６の態様は、本発明による変種の調製法に関する。本発明の変種は、当業者に周知の技術を使用して作成し得る。１つの便利な方法は、親アルブミンまたはその断片、またはアルブミンまたはその断片を含んでなる融合ポリペプチドをコードする核酸をクローニングし、前記核酸を修飾して、配列番号２の成熟ポリペプチドのドメインＩおよびドメインＩＩＩ内の位置（またはその他のアルブミンまたはその断片中の同等の位置）に所望の置換を導入して、その中で修飾核酸が、プロモーター、ターミネーター、活性化部位、リボソーム結合部位などの適切な調節遺伝要素と作動可能に結合される適切な遺伝子コンストラクトを調製し、遺伝子コンストラクトを適切な宿主生物に導入し、変種の発現をもたらす条件下で形質転換宿主生物を培養して、変種を回収することである。これらの技術は全て当該技術分野で公知であり、本発明による特定の変種の適切な調製法をデザインすることは、平均的実務家の技能の範囲内である。
【０１８８】
本発明の変種ポリペプチドはまた、形質転換宿主生物の培養中に、変種ポリペプチドを成長培地中に分泌させるために、シグナル配列と連結させてもよい。容易な回収と精製のために、変種ポリペプチドを成長培地中に分泌させることが、一般に有利である。
【０１８９】
変種ポリペプチドを作成する技術は、（参照によって包含される）国際公開第２００９０１９３１４号パンフレットで開示されており、これらの技術を本発明に応用してもよい。
【０１９０】
アルブミンは、真菌（アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）（国際公開第０６０６６５９５号パンフレット）、クリベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）（Ｆｌｅｅｒ  １９９１，Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９，９６８−９７５）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  １９９８  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ  ２，２５７−２６２）およびサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）（Ｓｌｅｅｐ  １９９０，Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８，４２−４６）をはじめとするが、これに限定されるものではない）、細菌（Ｐａｎｄｊａｉｔａｂ  ２０００，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０５，２７９−２８５））、動物（Ｂａｒａｓｈ  １９９３，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２，２６６−２７６）、および植物（ジャガイモおよびタバコ（Ｓｉｊｍｏｎｓ  １９９０，Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８，２１７  ａｎｄ  Ｆａｒｒａｎ  ２００２，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １１，３３７−３４６）および例えばイネ（Ｏｒｙｚａｓａｔｉｖａ）などのイネをはじめとするが、これに限定されるものではない）、およびＣＨＯおよびＨＥＫなどの哺乳類細胞をはじめとする様々な宿主中で、組換えタンパク質として成功裏に発現されている。本発明の変種ポリペプチドは、好ましくは適切な宿主細胞中で組換え的に生成される。原則的に、適切な量でポリペプチドを産生できるあらゆる宿主細胞を使用してもよく、本発明による適切な宿主細胞を選択することは、平均値実務家の技能の範囲内である。好ましい宿主生物は酵母であり、好ましくサッカロミセス科（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃａｃａｅ）から選択され、より好ましいのはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。
【０１９１】
本発明の変種ポリペプチドは、濾過、遠心分離、クロマトグラフィー、およびアフィニティ分離技術などの既知の分離技術の組み合わせを使用して、成長培地から回収および精製してもよい。このような既知の分離手順の特定の組み合わせを使用して、本発明の変種を精製することは、平均的実務家の技能の範囲内である。本発明の変種に応用してもよい精製技術の一例としては、国際公開第００／４４７７２号パンフレットの教示に言及し得る。
【０１９２】
それを必要とする動物個体またはヒト個人に、（ワクチンなどの予防的に有益な化合物をはじめとする）治療的に有益な化合物を送達するために、本発明の変種ポリペプチドを使用してもよい。このような治療的に有益な化合物としては、様々な造影技術などの診断法で利用される、標識および容易に検出可能な化合物；薬剤などの薬学的に活性の化合物、または抗体などの特異的結合部分が挙げられるが、これに限定されるものではない。本発明の変種は、組み合わされた分子に、所望の標的と特異的に結合する能力を与え、それによって特定の標的において高濃度の結合薬物を提供する、例えば抗体および薬物などの、２種以上（いくつかの）異なる治療的に有益な化合物と、さらに結合されてもよい。
【０１９３】
本発明の第６の態様のためのさらなる選択性としては、本発明の第１の態様のものと、本発明の第１２の態様の下に提供されるものとが挙げられる。当業者は、本発明のあらゆる態様を、本発明の別の態様または態様群と、および／または本発明の態様および／またはその他の本明細書の開示の選択性の１つまたは複数（いくつか）と、組み合わせてもよいことを理解する。
【０１９４】
複合体
本発明の第７の態様は、複合体（結合）に関する。したがって当該技術分野で知られている技術を使用して、本発明によるアルブミン変種またはその断片または融合ポリペプチドを第２の分子（「複合化パートナー」）と複合化させてもよい。複合化パートナーは、治療的、（ワクチンをはじめとする）予防的、診断用、造影用またはその他の有益な部分であってもよい。前記複合化パートナーは、ポリペプチドまたは非ポリペプチド化学物質であってもよい。複合化パートナーは、ポリペプチド、化学物質（例えば化学的に合成された薬物）または核酸（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ）であってもよい。
【０１９５】
前記第２の分子は、診断用または造影用部分を含んでなってもよく、この実施形態では、複合体は、造影などの診断ツールとして有用であってもよく；または第２の分子は、治療的または予防的（例えばワクチン）化合物であってもよく、この実施形態では、複合体を治療的または予防的（例えばワクチン接種）目的で使用してもよく、複合体は、治療的または予防的化合物の治療的または予防的特性、ならびに複合体のアルブミン部分によって提供される望ましい血漿半減期を有する。アルブミンと治療的分子の複合体は、当該技術分野で公知であり、このような複合体は、非複合化遊離治療的分子それ自体と比較して、長い血漿半減期を有することが確認されている。本発明によれば、対応する先行技術の複合体と比較して、本発明による複合体のＦｃＲｎに対する結合親和性および／または血漿半減期を変化させることが可能である。「変化させる」は、血漿半減期を増大させること、およびＦｃＲｎに対する血漿半減期結合親和性を低下させること、および／またはＦｃＲｎに対する結合親和性を増大させること、および結合親和性を低下させることの双方を含む。血漿半減期および／またはＦｃＲｎに対する結合親和性を増大させることが好ましい。複合体は、好都合には、周知の化学検査を使用して、ＨＳＡ表面に存在する遊離チオール基（成熟ＨＳＡのアミノ酸残基３４）を介して結合してもよい。
【０１９６】
特定の好ましい一態様では、変種アルブミンまたはその断片は、有益な治療的または（ワクチンをはじめとする）予防的化合物と複合化し、複合体は、それを必要とする患者における病状の治療に使用され、その病状は、特定の選択された治療的化合物に応答性である。このような治療的に有用な化合物を変種アルブミンまたはその断片と複合化させる技術は、当該技術分野で公知である。（その内容全体を参照によって本明細書に援用する）国際公開第２００９／０１９３１４号パンフレットは、治療的化合物をポリペプチドに複合化させるのに適した技術の例を開示しており、その技術は、本発明にもまた応用し得る。さらに国際公開第２００９／０１９３１４号パンフレットは、置換トランスフェリンと複合化していてもよい化合物および部分の例を開示しており、これらの実施例は、本発明にもまた応用してもよい。国際公開第２００９／０１９３１４号パンフレットの教示は、参照によって本明細書に包含される。
【０１９７】
ＨＳＡは、その天然形態中で、１つの遊離チオール基を（Ｃｙｓ３４に）含有し、それは好都合には複合化のために使用されてもよい。この態様内の特定の実施形態として、変種アルブミンまたはその断片は、表面に追加的な遊離チオール基を生じるように提供される、さらなる改変を含んでなってもよい。これは、変種アルブミンまたはその断片の装填量が増大する利点を有し、その結果、治療的（例えば予防的）化合物の２つ以上の分子が、変種アルブミンまたはその断片の各分子に複合化し得て、または２つ以上の（いくつかの）治療的化合物が、異なる変種アルブミンまたはその断片の各分子に複合化されてもよく、例えば変種アルブミンまたはその断片に複合化された、腫瘍特異的抗体などの標的化特性を有する化合物；および細胞毒性薬など、それによって腫瘍に対する高度に特異的な薬物が作り出される。改変されて、表面にさらなる遊離チオール基を提供してもよい特定の残基の教示は、参照によって援用する同時係属特許出願、国際公開第２０１０／０９２１３５号パンフレットにある。
【０１９８】
複合化パートナーは、代案としては（本明細書に記載される）融合ポリペプチド複合化して、アルブミンに融合した融合パートナー、ならびに同一アルブミンと複合化しまたは融合パートナーとさえ複合化する、複合化パートナーを含んでなる分子をもたらしてもよい。
【０１９９】
本発明の第７の態様のためのさらなる選択性としては、本発明の第１の態様のものと、本発明の第１２の態様の下に提供されるものとが挙げられる。当業者は、本発明のあらゆる態様を、本発明の別の態様または態様群と、および／または本発明の態様および／またはその他の本明細書の開示の選択性の１つまたは複数（いくつか）と、組み合わせてもよいことを理解する。
【０２００】
会合
本発明の第８の態様は、会合に関する。したがってアルブミン変種またはその断片または融合ポリペプチドを、「会合」の形態でさらに使用してもよい。これに関連して「会合」という用語は、アルブミン変種またはその断片と、変種アルブミンまたはその断片に非共有結合によって結合または会合する別の化合物とを含んでなる、化合物を意味することが意図される。このような会合の一例として、変種アルブミンと、疎水性相互作用によってアルブミンに会合する脂質とからなる会合に言及し得る。このような会合は、当該技術分野で公知であり、それは周知の技術を使用して調製されてもよい。本発明による好ましい会合の一例として、変種アルブミンと、タキサン、タキソールまたはタキソール誘導体（例えばパクリタキセル）とを含んでなる会合に言及し得る。会合のさらなる例は、治療的、（ワクチンをはじめとする）予防的、診断用、造影用またはその他の有益な部分を含んでなる。
【０２０１】
本発明によるアルブミン会合の半減期は、「その他の化合物」のみの半減期より長くてもまたは短くてもよい。本発明によるアルブミン会合の半減期は、（本発明によるアルブミン変種または誘導体の代わりに）天然ＨＳＡなどの参照アルブミンと、「その他の化合物」とを含んでなり、またはそれからなる、類似／同等のアルブミン会合の半減期より長くてもまたは短くてもよい。同様に、本発明によるアルブミン会合のＦｃＲｎに対する結合親和性は、（本発明によるアルブミン変種または誘導体の代わりに）天然ＨＳＡなどの参照アルブミンと、「その他の化合物」とを含んでなり、またはそれからなる、類似／同等のアルブミン会合のＦｃＲｎに対する結合親和性より強力でもまたは弱くてもよい。会合を調製する方法は当業者に周知であり、例えばＨＳＡとリポ化合物の（会合による）調合は、Ｈｕｓｓａｉｎ，Ｒ．ａｎｄ  Ｓｉｌｉｇａｒｄｉ，Ｇ．（２００６）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．１２，ＮＯ：３，ｐｐ．３１１−３１５に記載される。
【０２０２】
本発明の第８の態様のためのさらなる選択性としては、本発明の第１の態様のものと、本発明の第１２の態様の下に提供されるものとが挙げられる。当業者は、本発明のあらゆる態様を、本発明の別の態様または態様群と、および／または本発明の態様および／またはその他の本明細書の開示の選択性の１つまたは複数（いくつか）と、組み合わせてもよいことを理解する。
【０２０３】
組成物
本発明の第９の態様は、組成物に関する。したがって本発明はまた、医薬組成物を製造するための、アルブミン変種またはその断片、またはアルブミン変種またはその断片を含んでなる融合ポリペプチド、またはアルブミン変種またはその断片を含んでなる複合体、またはアルブミン変種またはその断片を含んでなる会合の使用を対象とし、アルブミン変種またはその断片、またはアルブミン変種またはその断片を含んでなる融合ポリペプチド、またはアルブミン変種またはその断片を含んでなる複合体、またはアルブミン変種またはその断片を含んでなる会合は、ＨＳＡまたは対応するその断片、またはＨＳＡまたはその断片を含んでなる融合ポリペプチド、またはＨＳＡを含んでなる複合体と比較して、ＦｃＲｎに対する結合親和性の変化および／または血漿半減期の変化を有する。
【０２０４】
これに関連して、ＨＳＡの対応する断片とは、それが比較される変種アルブミン断片と配列比較されて、同一アミノ酸番号を有するＨＳＡ断片を意味することが意図される。同様に、ＨＳＡを含んでなる対応する融合ポリペプチド、またはＨＳＡを含んでなる複合体とは、それが比較される変種アルブミンを含んでなる複合体の融合ポリペプチドと、同一サイズおよびアミノ酸配列を有する分子を意味することが意図される。
【０２０５】
組成物は、水、ポリソルベート８０、またはヒトアルブミンについてＵＳ薬局方で規定されるものなどの、薬学的に許容できる担体または賦形剤を含んでなってもよい。
【０２０６】
本発明の第９の態様のためのさらなる選択性としては、本発明の第１の態様のものと、本発明の第１２の態様の下に提供されるものとが挙げられる。当業者は、本発明のあらゆる態様を、本発明の別の態様または態様群と、および／または本発明の態様および／またはその他の本明細書の開示の選択性の１つまたは複数（いくつか）と、組み合わせてもよいことを理解する。
【０２０７】
ナノ粒子
本発明の第１０の態様は、本明細書で開示される変種、融合物、複合体、会合、ナノ粒子、組成物またはポリヌクレオチドを含んでなるナノ粒子に関する。
【０２０８】
ナノ粒子または微粒子への分子組み込み技術は、当該技術分野で公知である。本発明によるアルブミン、その変種、断片、融合物、複合体または会合に応用してもよいナノ粒子または微粒子を作成する好ましい方法は、参照によって本明細書に援用する、国際公開第２００４／０７１５３６号パンフレット、または国際公開第２００８／００７１４６号パンフレット、またはＯｎｅｒ  ＆  Ｇｒｏｖｅｓ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ  １０（９），１９９３，ｐａｇｅｓ  １３８７  ｔｏ  １３８８）で開示される。好ましくはナノ粒子の平均径は、５〜１０００ｎｍ、より好ましくは５、１０、２０、３０、４０、５０、８０、１００、１３０、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または９９９〜５、１０、２０、３０、４０、５０、８０、１００、１３０、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００ｎｍである。直径が２００ｎｍ未満、より特には１３０ｎｍ未満の微粒子の利点は、０．２μｍ（ミクロン）フィルターを通過させる濾過滅菌に適していることである。好ましくはマイクロ粒子の平均径は、１０００ｎｍ（１μｍ（ミクロン））〜１００μｍ（ミクロン）、より好ましくは１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００〜１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００μｍ（ミクロン）である。
【０２０９】
本発明の第１０の態様のためのさらなる選択性としては、本発明の第１の態様のものと、本発明の第１２の態様の下に提供されるものとが挙げられる。当業者は、本発明のあらゆる態様を、本発明の別の態様または態様群と、および／または本発明の態様および／またはその他の本明細書の開示の選択性の１つまたは複数（いくつか）と、組み合わせてもよいことを理解する。
【０２１０】
使用
本発明の第１１の態様は、変種アルブミン、その断片、融合物または複合体、またはそのナノ粒子または会合の使用に関する。使用は、例えば、治療法、予防法、診断または造影における使用であってもよい。本発明による変種アルブミンまたはその断片、またはアルブミン変種またはその断片を含んでなる融合ポリペプチドは、それらのＦｃＲｎに対する結合親和性および／または血漿半減期が、親または参照アルブミンまたはその断片、または親または参照アルブミンまたはその断片を含んでなる融合ポリペプチドと比較して、変化している利点を有する。これは本発明による変種アルブミンまたはその断片を含んでなる複合体、または変種アルブミンまたはその断片を含んでなる融合ポリペプチド、または変種アルブミンまたはその断片を含んでなる会合のＦｃＲｎに対する結合親和性および／または血漿半減期が、特定の治療目的に従って選択され得る利点を有する。
【０２１１】
状況によっては、参照分子または組成物よりも長い血漿半減期を有する、アルブミン、変種、断片、融合物、複合体または会合またはその組成物を利用することは、アルブミン、変種、断片、融合物、複合体または会合またはその組成物の投与が、参照分子または組成物が使用された状況と比較して、より低い頻度で、またはより低い用量で必要とされるであろう（および結果的により少ない副作用がある）ことから、有利であろう。変種、融合物、複合体、会合、ナノ粒子、組成物またはポリヌクレオチドの使用に関して、アルブミン部分は、本明細書で開示されるようなもう１つの改変を含んでなってもよい。
【０２１２】
その他の状況では、参照分子または組成物よりも短い血漿半減期を有する、アルブミン、変種、断片、融合物、複合体または会合またはその組成物を利用することは、アルブミン、変種、断片、融合物、複合体または会合またはその組成物の投与が、参照分子または組成物が使用された状況と比較して、より高い用量で実施され得る利点を有するであろうことから有利であり、投与された化合物が、参照分子または組成物を使用した場合よりも、受容者からより迅速に除去される利点がある。変種、融合物、複合体、会合、ナノ粒子、組成物またはポリヌクレオチドの使用に関して、アルブミン部分は、本明細書で開示されるようなもう１つの改変を含んでなってもよい。
【０２１３】
例えば、造影部分が非常に短い半減期を有し、ＨＳＡを含んでなる複合体または融合ポリペプチドが造影目的で必要なよりもはるかにより長い血漿半減期を有する、動物またはヒトにおける造影目的で使用される複合体、会合または融合ポリペプチドでは、親または参照アルブミンまたはその断片よりも短い血漿半減期を有する、本発明の変種アルブミンまたはその断片を利用して、造影目的のために十分に長いが、それが施用される特定の患者の身体から除去される（ｃｌｅａｒｅｄ  ｆｏｒｍ）のに十分に短い血漿半減期を有する、融合ポリペプチドの複合体を提供することが有利であろう。
【０２１４】
このような治療を必要とする患者において、特定の病状を治療しまたは緩和するのに効果的な治療的化合物を含んでなる、複合体、会合または融合ポリペプチドの別の例では、親または参照アルブミンまたはその断片よりも長い血漿半減期を有する変種アルブミンまたはその断片を利用して、より長い血漿半減期を有する会合または複合体または融合ポリペプチドを提供することが有利であり、それは本発明の会合または複合体または融合ポリペプチドの投与が、親または参照アルブミンまたはその会合またはその断片を使用した状況と比較して、副作用がより少ない、より低い頻度またはより低い用量で必要とされる利点を有するであろう。例えば、本発明は、個人にタキサン、タキソールまたはタキソール誘導体（例えばパクリタキセル）を含んでなる、本発明による会合の有効量を投与するステップを含んでなる、個人において増殖性疾患治療する方法を提供する。
【０２１５】
さらなる態様では、本発明は、本発明による変種アルブミン、その会合またはその断片、変種アルブミン断片またはその会合、または変種アルブミンまたはその断片を含んでなる融合ポリペプチドを含んでなる組成物に関する。組成物は、好ましくは医薬組成物である。組成物は、医薬分野の一般に認められている手引き書に開示されるような領域で公知の技術を使用して、調製されてもよい。アルブミン、その変種、断片、融合物、複合体または会合は、調節された、参照分子よりも（より強力なまたはより弱いおよび／またはより長いまたはより短い）ＦｃＲｎに対する結合親和性および／または血漿半減期を有するので、組成物もまた、本明細書に記載されるようなアルブミン、その変種、断片、融合物、複合体または会合の代わりに参照分子を含んでなる対応する組成物と比較して、ＦｃＲｎに対する結合親和性および／または調節された（すなわち変化した）血漿半減期を有する。組成物は、ワクチンであってもよい。本発明によるポリペプチドは、活性製剤または賦形剤であってもよい。任意選択的に、組成物は、単一剤形で提供される。
【０２１６】
好ましくは、アルブミン、その変種、断片、融合物、複合体または会合は、例えばアルブミン成分（例えばアルブミン、変種、断片、融合物、複合体または会合）が野生型アルブミン（例えばＨＳＡ）または変種、断片、融合物、複合体または会合である以外は、同一組成物である、参照分子の血漿半減期より長い血漿半減期を有する。
【０２１７】
特定の実施形態では、組成物は、本発明による変種アルブミンまたはその断片を含んでなり、化合物は、薬理的に有益な部分およびアルブミン結合領域（ＡＢＤ）を含んでなる。本発明によれば、ＡＢＤとは、生体内で循環アルブミンに結合し、それによって循環中にＡＢＤの輸送を与え得る部位、部分またはドメイン、および前記ＡＢＤに結合するあらゆる化合物または部分を意味する。ＡＢＤは当該技術分野で公知であり、アルブミンと非常に密接に結合することが示されており、したがってアルブミンに結合したＡＢＤを含んでなる化合物は、ある程度まで単一分子として挙動する。本発明者らは、本発明による変種アルブミンまたはその断片と、薬理的に有益な部分およびＡＢＤを含んでなる化合物とを一緒に使用することで、前記化合物が、それを必要とする患者に、そのまま注射され、または天然アルブミンまたはその断片を含んでなる調合物中で投与される状況と比較して、薬理的に有益な部分およびＡＢＤを含んでなる化合物のＦｃＲｎに対する結合親和性および／または血漿半減期を変化させられるようになることに気付いた。
【０２１８】
本発明による変種アルブミンまたはその断片、変種アルブミンまたはその断片を含んでなる複合体、または変種アルブミンまたはその断片を含んでなる融合ポリペプチド、または変種アルブミンまたはその断片を含んでなる会合はまた、当該技術分野内で周知の技術を使用して、ナノ粒子または微粒子中に組み込まれてもよい。本発明による変種アルブミンまたはその断片に応用されてもよい、好ましいナノ粒子または微粒子調製法は、参照によって本明細書に援用する、国際公開第２００４／０７１５３６号パンフレットまたは国際公開第２００８／００７１４６号パンフレットまたはＯｎｅｒ  ＆  Ｇｒｏｖｅｓ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ  １０（９），１９９３，ｐａｇｅｓ  １３８７  ｔｏ  １３８８）で開示される。
【０２１９】
本発明の第１１の態様のためのさらなる選択性としては、本発明の第１の態様のものと、本発明の第１２の態様の下に提供されるものとが挙げられる。当業者は、本発明のあらゆる態様を、本発明の別の態様または態様群と、および／または本発明の態様および／またはその他の本明細書の開示の選択性の１つまたは複数（いくつか）と、組み合わせてもよいことを理解する。
【０２２０】
分子のＦｃＲｎ結合親和性または半減期を変化させる方法
本発明の第１２の態様は、
（ａ）分子がポリペプチドである場合、分子を本明細書で開示されるポリペプチドまたは本明細書で開示される複合体に、融合または複合化させるステップと；分子を本明細書で開示されるポリペプチド、または本明細書で開示される複合体に結合させるステップと；分子を本明細書で開示されるナノ粒子、または本明細書で開示される組成物に組み込むステップと；
（ｂ）分子がポリペプチドでない場合、分子を本明細書で開示されるポリペプチド、または本明細書で開示される複合体に複合化させるステップと；分子を本明細書で開示されるポリペプチドまたは本明細書で開示される複合体に結合させるステップと；分子を本明細書で開示されるナノ粒子、または本明細書で開示される組成物に組み込むステップと
を含んでなる、分子のＦｃＲｎ結合親和性または半減期を変化させる方法を提供する。
【０２２１】
「分子」の例としては、本明細書で記載されるものなどの、治療法、（活性医薬品成分または賦形剤のいずれかとして、ワクチンで使用されるものをはじめとする）予防法、造影および診断で有用なものが挙げられる。
【０２２２】
本発明の第１２の態様のためのさらなる選択性としては、本発明の第１の態様のものと、本発明のこの第１２の態様の下に提供されるものとが挙げられる。当業者は、本発明のあらゆる態様を、本発明の別の態様または態様群と、および／または本発明の態様および／またはその他の本明細書の開示の選択性の１つまたは複数（いくつか）と、組み合わせてもよいことを理解する。
【０２２３】
本発明の全ての態様の選択性は、下に提供される。当業者は、本発明のあらゆる態様を、本発明の別の態様または態様群と、および／または本発明の態様および／またはその他の本明細書の開示の選択性の１つまたは複数（いくつか）と、組み合わせてもよいことを理解する。
【０２２４】
アルブミン変種またはその断片、またはアルブミン変種またはその断片を含んでなる融合ポリペプチド、その断片、複合体、ナノ粒子、会合または組成物は、対応するアルブミンまたはその断片、またはアルブミンまたはその断片を含んでなる融合ポリペプチド、その断片、複合体、ナノ粒子、会合または組成物の血漿半減期よりも長いかまたは短いかのいずれかで、好ましくはより長い血漿半減期を有してもよく、またはＦｃＲｎに対するより強力なまたはより弱い、好ましくはより弱い結合を有してもよい。好ましくはアルブミン変種またはその断片、またはアルブミン変種またはその断片を含んでなる融合ポリペプチド、その断片、複合体、ナノ粒子、会合または組成物は、ＨＳＡまたは相当するアルブミンまたはその断片、またはアルブミンまたはその断片を含んでなる融合ポリペプチド、その断片、複合体、ナノ粒子、会合または組成物の血漿半減期より長い血漿半減期を有する。
【０２２５】
代案としては、これは、ＦｃＲｎに対するＨＳＡの、または対応するその断片、またはＨＳＡまたはその断片を含んでなる融合ポリペプチドの対応するＫＤよりも低い、ＦｃＲｎ（例えばｓｈＦｃＲｎ）に対するＫＤを有する、アルブミン変種またはその断片、またはアルブミン変種またはその断片を含んでなる融合ポリペプチド、その断片、複合体、ナノ粒子、会合または組成物として表されてもよい。好ましくは、アルブミン変種またはその断片、またはアルブミン変種またはその断片を含んでなる融合ポリペプチド、その断片、複合体、ナノ粒子、会合または組成物のＫＤは、ＨＳＡのＦｃＲｎに対するＫＤの０．９×未満であり、より好ましくはＨＳＡのＦｃＲｎに対するＫＤの０．５×未満であり、より好ましくはＨＳＡのＦｃＲｎに対するＫＤの０．１×未満であり、なおもより好ましくはＨＳＡのＦｃＲｎに対するＫＤの０．０５×未満であり、なおもより好ましくはＨＳＡのＦｃＲｎに対するＫＤの０．０２×未満であり、最も好ましくはＨＳＡのＦｃＲｎに対するＫＤの０．０１×未満である（×は「乗数」を意味する）。アルブミン変種またはその断片、またはアルブミン変種またはその断片を含んでなる融合ポリペプチド、その断片、複合体、ナノ粒子、会合または組成物のＫＤは、ＦｃＲｎに対するＷＴアルブミン（例えば配列番号２）のＫＤと、ＦｃＲｎに対するＨＳＡＫ５７３Ｐ（配列番号３）のＫＤとの間であってもよい。このようなＫＤは、ＨＳＡとＦｃＲｎ間の結合親和性よりも高い結合親和性に相当する。より高い結合親和性は、より長い例えば血漿半減期などの半減期を示唆する。
【０２２６】
代案としては、アルブミン変種またはその断片、または変種またはその断片を含んでなる融合ポリペプチドアルブミン、その断片、複合体、ナノ粒子、会合または組成物は、ＨＳＡまたは対応するその断片、またはＨＳＡまたはその断片を含んでなる融合ポリペプチドの血漿半減期より短い血漿半減期を有する。
【０２２７】
これは、ＦｃＲｎに対するＨＳＡの、または対応するアルブミンまたはその断片、またはアルブミンまたはその断片を含んでなる融合ポリペプチド、その断片、複合体、ナノ粒子、会合または組成物の対応するＫＤよりも高い、ＦｃＲｎに対するＫＤを有する、アルブミン変種またはその断片、またはアルブミン変種またはその断片を含んでなる融合ポリペプチド、その断片、複合体、ナノ粒子、会合または組成物として表されてもよい。好ましくは、アルブミン変種またはその断片、またはアルブミン変種またはその断片を含んでなる融合ポリペプチド、その断片、またはアルブミン変種またはその断片を含んでなる複合体のＫＤは、ＨＳＡのＦｃＲｎに対するＫＤの２×を超えて、より好ましくはＨＳＡのＦｃＲｎに対するＫＤの５×を超えて、より好ましくはＨＳＡのＦｃＲｎに対するＫＤの１０×を超えて、なおもより好ましくはＨＳＡのＦｃＲｎに対するＫＤの２５×を超えて、さらに最も好ましくはＨＳＡのＦｃＲｎに対するＫＤの５０×を超える。アルブミン変種またはその断片、またはアルブミン変種またはその断片を含んでなる融合ポリペプチド、その断片、複合体、ナノ粒子、会合または組成物は、ＦｃＲｎに対してヌルバインダーであってもよい。
【０２２８】
アルブミン変種またはその断片、またはアルブミン変種またはその断片を含んでなる融合ポリペプチド、その断片、またはアルブミン変種またはその断片を含んでなる複合体またはナノ粒子または会合または組成物は、好ましくは、本発明によるアルブミン変種またはその断片を含んでなるアルブミン変種またはその断片、またはアルブミン変種またはその断片を含んでなる融合ポリペプチド、その断片、または複合体またはナノ粒子または会合または組成物である。より低い結合親和性は、例えばより短い血漿半減期などの半減期を示唆する。
【０２２９】
本発明の１つの利点は、使用者の要求を満たす結合親和性または半減期を達成するために、アルブミン、アルブミン変種またはその断片、またはアルブミン変種またはその断片を含んでなる融合ポリペプチド、その断片、複合体、ナノ粒子、会合または組成物の半減期を調整できるようにすることである。
【０２３０】
ＫＤを測定するおよび／または比較する際には、以下のパラメータの１つまたは複数の（および好ましくは全て）を使用してもよい。
装置：Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）
フローセル：ＣＭ５センサーチップ
ＦｃＲｎ：好ましくは可溶性ヒトＦｃＲｎであるヒトＦｃＲｎ、任意選択的に、ＧＳＴまたはＨｉｓなどのタグ、最も好ましくはβ−２−ミクログロブリン（配列番号３１）のＣ末端の６ヒスチジンなどのＨｉｓと連結される。
ＦｃＲｎの量：１２００〜２５００  ＲＵ
複合化化学反応：（例えば装置の製造会社によって提供されるプロトコルに記載される）アミン複合化化学反応。
複合化法：複合化は、ｐＨ５．０の１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）への２０μｇ／ｍｌのタンパク質の注入によって実施してもよい。リン酸緩衝液（６７ｍＭのリン酸緩衝液、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．００５％のツイーン２０）ｐＨ５．５）を泳動用緩衝液および希釈緩衝液として使用してもよい。表面再生は、ｐＨ７．４におけるＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％の界面活性剤Ｐ２０）（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ）の注入を使用して、実施してもよい。
試験分子（例えばＨＳＡまたは変種）の注入量  ２０〜０．０３２μＭ
注入の流速：例えば３０μｌ／ｍｌなどの一定速度
注入温度：２５℃
データ評価ソフトウェア：ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ４．１ソフトウェア（ＢＩＡｃｏｒｅ  ＡＢ）。
【０２３１】
ＫＤを求める好ましい方法は、実施例２に提供される。
【０２３２】
本発明は、アルブミン、断片、融合物、複合体、会合、ナノ粒子または組成物の結合親和性および／または例えば血漿半減期などの半減期を調節する（増大または低下させる）ために、配列番号２のドメインＩＩＩ内の１つまたは複数の（いくつかの）位置（したがってヒト血清およびアルブミンおよび非ヒト血清アルブミンからのアルブミンおよび断片中の同等の位置）と組み合わせて、ドメインＩ内の１つまたは複数の（いくつかの）位置を変化させてもよいことを開示する。改変は、置換、挿入または欠失であってもよい。置換が好ましい。
【０２３３】
置換または挿入は、保存アミノ酸、すなわち対象位置のアミノ酸との関連で保存されたアミノ酸の導入を含んでなってもまたは含まなくてもよい。保存アミノ酸の例は、図３の脂肪族、芳香族、疎水性、荷電、極性、陽性、極小、および小型の集団で示される。
【０２３４】
配列番号２の８２位（またはその他のアルブミンまたはその断片の変種の相当する位置）では、改変は、天然アミノ酸から、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙなどへの置換であることが好ましく、より好ましいのはＱ、Ｄ、Ａ、さらにより好ましいのはＤ、Ａ、最も好ましいのはＡへの置換である。配列番号２中では、８２位の天然アミノ酸はグルタミン酸であり、したがってグルタミン酸への置換は好ましくない。
【０２３５】
配列番号２の８３位（またはその他のアルブミンまたはその断片の変種の相当する位置）では、改変は、天然アミノ酸から、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙなどへの置換であることが好ましく、より好ましいのはＮ、Ｋ、Ｓ、さらにより好ましいのはＮ、Ｋ、最も好ましいのはＮへの置換である。配列番号２中では、８３位の天然アミノ酸はスレオニンであり、したがってスレオニンへの置換は好ましくない。
【０２３６】
配列番号２の１１１位（またはその他のアルブミンまたはその断片の変種の相当する位置）では、改変は、天然アミノ酸からＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙなどへの置換であることが好ましく、よりも好ましいのはＮ、Ｅ、Ｑ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、さらにより好ましいのはＥ、Ｑ、最も好ましいのはＥへの置換である。配列番号２中では、１１１位の天然アミノ酸はアスパラギンであり、したがってアスパラギンへの置換は好ましくない。
【０２３７】
配列番号２中の１１２位（またはその他のアルブミンまたはその断片の変種の相当する位置）では、改変は天然アミノ酸からＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙなどの置換であることが好ましく、より好ましいのはＦ、Ｙ、Ｗ、さらにより好ましいのはＦ、Ｙ、最も好ましいのはＦへの置換である。配列番号２中では、１１２位の天然アミノ酸はロイシンであり、したがってロイシンへの置換は好ましくない。
【０２３８】
配列番号２の５７３位（またはその他のアルブミンまたはその断片の変種の相当する位置）では、改変は、天然アミノ酸からＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙなどへの置換であることが好ましく、よりも好ましいのはＰ、Ｙ、Ｗ、Ｈ、Ｆ、Ｔ、ＩまたはＶ、さらによりよりも好ましいのはＰ、ＹまたはＷ、最好ましいのはＰへの置換である。配列番号２中では、５７３位の天然アミノ酸はリジンであり、したがってリジンへの置換は好ましくない。
【０２３９】
位置８２における改変は、Ａに対して保存的であることが好ましい。位置８３における改変は、Ｎに対して保存的であることが好ましい。位置１１１における改変は、Ｅに対して保存的であることが好ましい。位置１１２における改変は、Ｆに対して保存的であることが好ましい。位置５７３における改変は、Ｐに対して保存的であることが好ましい。
【０２４０】
特に好ましいアルブミン変種は、Ｔ８３Ｎ／Ｎ１１１Ｅ（例えば配列番号３２）；Ｔ８３Ｎ／Ｎ１１１Ｅ／Ｋ５７３Ｐ（例えば配列番号３３）；Ｔ８３Ｎ／Ｋ５７３Ｐ（例えば配列番号３４）；Ｔ８３Ｋ／Ｋ５７３Ｐ（例えば配列番号３８）；Ｅ８２Ａ／Ｋ５７３Ｐ（例えば配列番号３９）；Ｌ１１２Ｆ／Ｋ５７３Ｐ（例えば配列番号４０）；Ｅ８２Ｄ／Ｋ５７３Ｐ（例えば配列番号４３）；Ｐ１１０Ｇ／Ｋ５７３Ｐ（例えば配列番号４４）；Ｎ１１１Ｄ／Ｋ５７３Ｐ（例えば配列番号６０）；Ｎ１１１Ｇ／Ｋ５７３Ｐ（例えば配列番号６１）；Ｎ１１１Ｈ／Ｋ５７３Ｐ（例えば配列番号６２）；Ｅ４２５Ａ／Ｋ５７３Ｐ（例えば配列番号６４）；Ｅ５０５Ｑ／Ｋ５７３Ｐ（例えば配列番号６５）；Ｔ５２７Ｍ／Ｋ５７３Ｐ（例えば配列番号６６）；Ｎ１１１Ｅ／Ｋ５７３Ｐ（例えば配列番号６８）；Ｋ５３４Ｖ／Ｋ５７３Ｐ（例えば配列番号７３）；Ｎ１１１Ｑ／Ｋ５７３Ｐ（例えば配列番号７４）の置換を含んでなり、それらはＨＳＡ（配列番号２）を参照して記述される。その他の好ましいアルブミン変種は、ＨＳＡ（配列番号２）以外のアルブミン中に同等の置換を含んでなる。
【０２４１】
また本発明によるアルブミン変種は、ＨＳＡ（配列番号２）の７８〜８８および／または１０５〜１２０および／または４２５、５０５、５１０、５１２、５２４、５２７、５３１、５３４、５６９、５７５、またはその他のアルブミンの同等の位置から選択される位置における、１つまたは複数の（いくつかの）改変を含んでなってもよい。好ましい改変は、本発明の第１の態様で、これらの位置について記載されるものなどの置換である。特に好ましい置換としては、Ｄ１０８Ａ（配列番号５９）；Ｄ１０８Ｅ（例えば配列番号７０）；Ｎ１０９Ｋ（例えば配列番号６９）；Ｐ１１０Ｇ（例えば配列番号４２）；Ｎ１１１Ｄ（例えば配列番号４６）；Ｎ１１１Ｅ（例えば配列番号６７）；Ｎ１１１Ｇ（例えば配列番号４８）；Ｎ１１１Ｈ（例えば配列番号４９）；Ｎ１１１Ｋ（例えば配列番号５４）；Ｌ１１２Ｆ（例えば配列番号３７）；Ｅ４２５Ａ（例えば配列番号６３）；Ｅ４２５Ｋ（例えば配列番号５５）；Ｅ５０５Ｑ（例えば配列番号４５）；Ｈ５１０Ｄ（例えば配列番号５７）；Ｄ５１２Ｅ（例えば配列番号５０）；Ｋ５２４Ａ（例えば配列番号５１）；Ｔ５２７Ａ（例えば配列番号５２）；Ｔ５２７Ｍ（例えば配列番号４７）；Ｅ５３１Ｈ（例えば配列番号５３）；Ｋ５３４Ｖ（例えば配列番号５６）；Ａ５６９Ｓ（例えば配列番号５８）；Ｌ５７５Ｆ（例えば配列番号７２）；Ｅ８２Ａ（例えば配列番号３６）；Ｅ８２Ｄ（例えば配列番号４１）；Ｔ８３Ｋ（例えば配列番号３５）；Ｔ８３Ｎ（例えば配列番号７１）が挙げられ、それらはＨＳＡ（配列番号２）を参照して記述される。１つまたは複数の（いくつかの）改変を含んでなるその他の好ましいアルブミン変種は、ＨＳＡ（配列番号２）以外のアルブミン中に同等の置換を含んでなってもよい。
【０２４２】
有利なことに、ポリペプチドは、ＨＳＡなどの参照または親アルブミンと、実質的に同じ三次構造（または断片の場合は、構造の該当する部分）を維持する。全てのタンパク質は、ある程度の構造融通性を有するので、当業者は、三次構造中のある程度の変動が予期されることを念頭に置いて、「実質的に同じ三次構造」という用語を理解する。これは特に、親または参照アルブミン（例えばＨＳＡ）がＦｃＲｎに対して有するよりも、より高いＦｃＲｎに対する結合親和性を有するポリペプチドに当てはまる。
【０２４３】
Ｈｉｓ残基の１つまたは複数（いくつか）は、親アルブミンに対して維持されてもまたはされなくてもよい。例えば配列番号２に関して、以下のＨｉｓ残基の１つまたは複数（いくつか）が維持されてもよい：３、９、３９、６７、１０５、１２８、１４６、２４２、２４７、２８８、３３８、３６７、４４０、４６４、５１０、および／または５３５。ドメインＩ内のＨｉｓ残基の１つまたは複数（いくつか）が、好ましくは全て（すなわち３、９、３９、６７、１０５、１２８、１４６）が維持される。ドメインＩＩ内のＨｉｓ残基の１つまたは複数（いくつか）が、好ましくは全て（すなわち２４２、２４７、２８８、３３８、３６７）が維持される。ドメインＩＩＩ内のＨｉｓ残基の１つまたは複数（いくつか）が、好ましくは全て（すなわち４４０、４６４、５１０、５３５）が維持される。Ｈｉｓ４６４、５１０、５３５の１つまたは複数（いくつか）または全てが、維持されてもよい。
【０２４４】
アルブミンのジスルフィド結合の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７個が、ポリペプチド中に維持されることが好ましい。完全長アルブミンに由来するポリペプチドでは、通常はそのアルブミン中に存在する全てのジスルフィド結合が、維持されることが好ましい。アルブミン断片に由来するポリペプチドでは、通常はその断片中に存在する全てのジスルフィド結合が、維持されることが好ましい。Ｃｙｓ３４（または非ヒトアルブミン中の同等物）が維持されることが好ましい。
【０２４５】
本発明の全ての態様で、融合パートナーポリペプチドおよび／または複合体は、以下の１つまたは複数（いくつか）を含んでなってもよい。４−１ＢＢリガンド、５−らせん、ヒトＣ−Ｃケモカイン、ヒトＬ１０５ケモカイン、ｈｕＬ１０５＿３．と称されるＡヒトＬ１０５ケモカイン、γ−インターフェロン（ＭＩＧ）によって誘導されるモノカイン、部分的ＣＸＣＲ４Ｂタンパク質、血小板塩基性タンパク質（ＰＢＰ）、α１−アンチトリプシン、ＡＣＲＰ−３０ホモログ；補体成分Ｃ１ｑＣ、アデノイド発現ケモカイン（ＡＤＥＣ）、ａＦＧＦ；ＦＧＦ−１、ＡＧＦ、ＡＧＦタンパク質、アルブミン、エトポシド、アンギオスタチン、炭疽病ワクチン、コラプシンに対して特異的な抗体、アンチスタチン、抗ＴＧＦベータファミリー抗体、抗トロンビンＩＩＩ、ＡＰＭ−１；ＡＣＲＰ−３０；ファモキシン、アポ−リポタンパク質種、アリールスルファターゼＢ、ｂ５７タンパク質、ＢＣＭＡ、β−トロンボグロブリンタンパク質（β−ＴＧ）、ｂＦＧＦ；ＦＧＦ２、血液凝固因子、ＢＭＰプロセッシング酵素フューリン、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１７、ＢＭＰ−１８、ＢＭＰ−２Ｂ、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−９、骨形態形成タンパク質−２、カルシトニン、カルパイン−１０ａ、カルパイン−１０ｂ、カルパイン−１０ｃ、がんワクチン、カルボキシペプチダーゼ、Ｃ−Ｃケモカイン、ＭＣＰ２、ＣＣＲ５変種、ＣＣＲ７、ＣＣＲ７、ＣＤ１１ａ  Ｍａｂ、ＣＤ１３７；４−１ＢＢ受容体タンパク質、ＣＤ２０  Ｍａｂ、ＣＤ２７、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ３３免疫毒素、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ５２  Ｍａｂ、セレブスタンパク質、ケモカインエオタキシン、ケモカインｈＩＬ−８、ケモカインｈＭＣＰ１、ケモカインｈＭＣＰ１ａ、ケモカインｈＭＣＰ１ｂ、ケモカインｈＭＣＰ２、ケモカインｈＭＣＰ３、ケモカインｈＳＤＦ１ｂ、ケモカインＭＣＰ−４、ケモカインＴＥＣＫおよびＴＥＣＫ変種、完全長および成熟ケモカイン様タンパク質ＩＬ−８Ｍ１、完全長および成熟ケモカイン様タンパク質ＩＬ−８Ｍ１０、ケモカイン様タンパク質ＩＬ−８Ｍ３、完全長および成熟ケモカイン様タンパク質ＩＬ−８Ｍ８、完全長および成熟ケモカイン様タンパク質ＩＬ−８Ｍ９、完全長および成熟ケモカイン様タンパク質ＰＦ４−４１４、完全長および成熟ケモカイン様タンパク質ＰＦ４−４２６、完全長および成熟ケモカイン様タンパク質ＰＦ４−Ｍ２、コレラワクチン、コンドロモジュリン様タンパク質、ｃ−キットリガンド；ＳＣＦ；肥満細胞成長因子；ＭＧＦ；線維肉腫由来幹細胞因子、ＣＮＴＦおよびその断片（ＣＮＴＦＡｘ１５｀（アキソキン（商標））など）、プレおよび活性形態双方の凝固因子、コラーゲン、補体Ｃ５  Ｍａｂ、結合組織活性化タンパク質−ＩＩＩ、ＣＴＡＡ１６．８８  Ｍａｂ、ＣＴＡＰ−ＩＩＩ、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、ＣＴＬＡ−８、ＣＸＣ３、ＣＸＣ３、ＣＸＣＲ３；ＣＸＣケモカイン受容体３、シアノビリン−Ｎ、ダルベポエチン、名称ｅｘｏｄｕｓ、名称ｈｕＬ１０５＿７、ＤＩＬ−４０、デオキシリボヌクレアーゼ、ＥＤＡＲ、ＥＧＦ受容体Ｍａｂ、ＥＮＡ−７８、エンドスタチン、エオタキシン、上皮好中球活性化タンパク質−７８、ＥＰＯ受容体；ＥＰＯＲ、エリスロポエチン（ＥＰＯ）およびＥＰＯ模倣体、ユートロピン、Ｅｘｏｄｕｓタンパク質、第ＩＸ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第Ｘ因子、および第ＸＩＩＩ因子、ＦＡＳリガンド阻害タンパク質（ＤｃＲ３）、ＦａｓＬ、ＦａｓＬ、ＦａｓＬ、ＦＧＦ、ＦＧＦ−１２；線維芽細胞成長因子相同因子−１、ＦＧＦ−１５、ＦＧＦ−１６、ＦＧＦ−１８、ＦＧＦ−３；ＩＮＴ−２、ＦＧＦ−４；ゲロニン、ＨＳＴ−１；ＨＢＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６；ヘパリン結合分泌形質転換因子−２、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９；Ｇｌｉａ活性化因子、フィブリノーゲン、ｆｌｔ−１、ｆｌｔ−３リガンド、濾胞刺激ホルモンαサブユニット、濾胞刺激ホルモンβサブユニット、フォリトロピン、フラクタルカイン、断片．筋原線維タンパク質トロポニンＩ、ＦＳＨ、ガラクトシダーゼ、ガレクチン−４、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＤＦ−１、遺伝子療法、神経膠腫由来成長因子、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド、グルコセレブロシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコシダーゼ、グリコデリン−Ａ；プロゲステロン結合子宮内膜タンパク質、ＧＭ−ＣＳＦ、ゴナドトロピン、顆粒球走化性タンパク質−２（ＧＣＰ−２）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、成長ホルモン、増殖関連発がん遺伝子−α（ＧＲＯ−α）、増殖関連発がん遺伝子−β（ＧＲＯ−β）、増殖関連発がん遺伝子−γ（ＧＲＯ−γ）、ｈＡＰＯ−４；ＴＲＯＹ、ｈＣＧ、Ｂ型肝炎表面抗原、Ｂ型肝炎ワクチン、ＨＥＲ２受容体Ｍａｂ、ヒルジン、ＨＩＶ  ｇｐ１２０、ＨＩＶ  ｇｐ４１、ＨＩＶ阻害ペプチド、ＨＩＶ阻害ペプチド、ＨＩＶ阻害ペプチド、ＨＩＶプロテアーゼ阻害ペプチド、ＨＩＶ−１プロテアーゼ阻害剤、ＨＰＶワクチン、ヒト６ＣＫｉｎｅタンパク質、ヒトＡｃｔ−２タンパク質、ヒト脂肪生成阻害因子、ヒトＢ細胞刺激因子−２受容体、ヒトベータ−ケモカインＨ１３０５（ＭＣＰ−２）、ヒトＣ−ＣケモカインＤＧＷＣＣ、ヒトＣＣケモカインＥＬＣタンパク質、ヒトＣＣ型ケモカインインターロイキンＣ、ヒトＣＣＣ３タンパク質、ヒトＣＣＦ１８ケモカイン、ＳＬＣ（二次リンパ系ケモカイン）と称されるヒトＣＣ型ケモカインタンパク質、ヒトケモカインベータ−８短鎖形態、ヒトケモカインＣ１０，ヒトケモカインＣＣ−２、ヒトケモカインＣＣ−３、ヒトケモカインＣＣＲ−２、ヒトケモカインＣｋベータ−７、ヒトケモカインＥＮＡ−７８、ヒトケモカインエオタキシン、ヒトケモカインＧＲＯアルファ、ヒトケモカインＧＲＯアルファ、ヒトケモカインＧＲＯベータ、ヒトケモカインＨＣＣ−１、ヒトケモカインＨＣＣ−１、ヒトケモカインＩ−３０９、ヒトケモカインＩＰ−１０、ヒトケモカインＬ１０５＿３、ヒトケモカインＬ１０５＿７、ヒトケモカインＭＩＧ、ヒトケモカインＭＩＧ−βタンパク質、ヒトケモカインＭＩＰ−１アルファ、ヒトケモカインＭＩＰ１ベータ、ヒトケモカインＭＩＰ−３アルファ、ヒトケモカインＭＩＰ−３ベータ、ヒトケモカインＰＦ４、ヒトケモカインタンパク質３３１Ｄ５、ヒトケモカインタンパク質６１１６４、ヒトケモカイン受容体ＣＸＣＲ３、ヒトケモカインＳＤＦ１アルファ、ヒトケモカインＳＤＦ１ベ��タ、ヒトケモカインＺＳＩＧ−３５、ヒトＣｈｒ１９Ｋｉｎｅタンパク質、ヒトＣＫベータ−９、ヒトＣＫベータ−９、ヒトＣＸ３Ｃ１１１アミノ酸ケモカイン、ヒトＤＮＡＸインターロイキン−４０、ヒトＤＶｉｃ−１Ｃ−Ｃケモカイン、ヒトＥＤＩＲＦＩタンパク質配列、ヒトＥＤＩＲＦＩＩタンパク質配列、ヒト好酸球ＣＣ型ケモカインエオタキシン、ヒト好酸球発現ケモカイン（ＥＥＣ）、ヒト速収縮骨格筋トロポニンＣ、ヒト速収縮骨格筋トロポニンＩ、ヒト速収縮骨格筋トロポニンサブユニットＣ、ヒト速収縮骨格筋トロポニンサブユニットＩタンパク質、ヒト速収縮骨格筋トロポニンサブユニットＴ、ヒト速収縮骨格筋トロポニンＴ、ヒト胎児脾臓発現ケモカイン、ＦＳＥＣ、ヒトＧＭ−ＣＳＦ受容体、ヒトｇｒｏ−アルファケモカイン、ヒトｇｒｏ−ベータケモカイン、ヒトｇｒｏ−ガンマケモカイン、ヒトＩＬ−１６タンパク質、ヒトＩＬ−１ＲＤ１０タンパク質配列、ヒトＩＬ−１ＲＤ９、ヒトＩＬ−５受容体α鎖、ヒトＩＬ−６受容体、ヒトＩＬ−８受容体タンパク質ｈＩＬ８ＲＡ、ヒトＩＬ−８受容体タンパク質ｈＩＬ８ＲＢ、ヒトＩＬ−９受容体タンパク質、ヒトＩＬ−９受容体タンパク質変種＃３、ヒトＩＬ−９受容体タンパク質変種断片、ヒトＩＬ−９受容体タンパク質変種断片＃３、ヒトインターロイキン１デルタ、ヒトインターロイキン１０、ヒトインターロイキン１０、ヒトインターロイキン１８、ヒトインターロイキン１８誘導体、ヒトインターロイキン−１ベータ前駆体、ヒトインターロイキン−１ベータ前駆体、ヒトインターロイキン−１受容体アクセサリータンパク質、ヒトインターロイキン−１受容体拮抗薬β、ヒトインターロイキン−１受容体３型、ヒトインターロイキン−１０（前駆体）、ヒトインターロイキン−１０（前駆体）、ヒトインターロイキン−１１受容体、ヒトインターロイキン−１２の４０ｋＤサブユニット、ヒトインターロイキン−１２受容体β−１、ヒトインターロイキン−１２受容体β−２、ヒトインターロイキン−１２のｐ３５タンパク質、ヒトインターロイキン−１２のｐ４０タンパク質、ヒトインターロイキン−１２受容体、ヒトインターロイキン−１３受容体α、ヒトインターロイキン−１３受容体β、ヒトインターロイキン−１５、クローンＰ１からのヒトインターロイキン−１５受容体、ヒトインターロイキン−１７受容体、ヒトインターロイキン−１８タンパク質（ＩＬ−１８）、ヒトインターロイキン−３、ヒトインターロイキン−３受容体、ヒトインターロイキン−３変種、ヒトインターロイキン−４受容体、ヒトインターロイキン−５、ヒトインターロイキン−６、ヒトインターロイキン−７、ヒトインターロイキン−７、ヒトインターロイキン−８（ＩＬ−８）、ヒト細胞内ＩＬ−１受容体拮抗薬、ヒトＩＰ−１０およびＨＩＶ−１のｇｐ１２０超可変領域融合タンパク質、ヒトＩＰ−１０およびヒトＭｕｃ−１コアエピトープ（ＶＮＴ）融合タンパク質、ヒト肝臓および活性化調節ケモカイン（ＬＡＲＣ）、ヒトＬｋｎ−１完全長および成熟タンパク質、完全長および成熟ヒト乳腺関連ケモカイン（ＭＡＣＫ）タンパク質、ヒト成熟ケモカインＣｋｂｅｔａ−７、ヒト成熟ｇｒｏ−アルファ、敗血症を治療するのに使用されるヒト成��ｇｒｏ−ガンマポリペプチド、ヒトＭＣＰ−３およびヒトＭｕｃ−１コアエピトープ（ＶＮＴ）融合タンパク質、ヒトＭＩ１０タンパク質、ヒトＭＩ１Ａタンパク質、ヒト単球走化性因子ｈＭＣＰ−１、ヒト単球走化性因子ｈＭＣＰ−３、ヒト単球走化性プロタンパク質（ＭＣＰＰ）配列、ヒトニューロタクチンケモカイン様ドメイン、ヒト非ＥＬＲＣＸＣケモカインＨ１７４、ヒト非ＥＬＲＣＸＣケモカインＩＰ１０、ヒト非ＥＬＲＣＸＣケモカインＭｉｇ、ヒトＰＡＩ−１変異体、ＩＬ−１６活性があるヒトタンパク質、ＩＬ−１６活性があるヒトタンパク質、ヒト二次リンパ系ケモカイン（ＳＬＣ）、ヒトＳＩＳＤタンパク質、ヒトＳＴＣＰ−１、ヒト間質細胞由来ケモカイン、ＳＤＦ−１、ヒトＴ細胞混合リンパ球反応発現ケモカイン（ＴＭＥＣ）、ヒト胸線および活性化調節サイトカイン（ＴＡＲＣ）、ヒト胸線発現、ヒトＴＮＦ−α、ヒトＴＮＦ−α、ヒトＴＮＦ−β（ＬＴ−α）、ヒトＣＣ型ケモカインエオタキシン３タンパク質配列、ヒトＩＩ型インターロイキン−１受容体、ヒト野生型インターロイキン−４（ｈＩＬ−４）タンパク質、ヒトＺＣＨＥＭＯ−８タンパク質、ヒト化抗ＶＥＧＦ抗体、およびその断片、ヒト化抗ＶＥＧＦ抗体、およびその断片、ヒアルロニダーゼ、ＩＣＥ  １０ｋＤサブユニット、ＩＣＥ  ２０ｋＤサブユニット、ＩＣＥ  ２２ｋＤサブユニット、イズロン酸−２−スルファターゼ、イズロニダーゼ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１阻害剤（ＩＬ−１ｉ）、成熟ＩＬ−１、ＩＬ−１０受容体、ＩＬ−１１、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２ｐ４０サブユニット、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５受容体、ＩＬ−１７、ＩＬ−１７受容体、Ｉｌ−１７受容体、Ｉｌ−１７受容体、ＩＬ−１９、ＩＬ−１ｉ断片、ＩＬ１−受容体拮抗薬、ＩＬ−２１（ＴＩＦ）、ＩＬ−３含有融合タンパク質、ＩＬ−３変異タンパク質、ＩＬ−３変種、ＩＬ−３変種、ＩＬ−４、ＩＬ−４ムテイン、ＩＬ−４ムテインＹ１２４Ｇ、ＩＬ−４ムテインＹ１２４Ｘ、ＩＬ−４ムテイン、Ｉｌ−５受容体、ＩＬ−６、Ｉｌ−６受容体、ＩＬ−７受容体クローン、ＩＬ−８受容体、ＩＬ−９成熟タンパク質変種（Ｍｅｔ１１７バージョン）、免疫グロブリンまたは免疫グロブリンベースの分子またはいずれかの断片（例えばＳｍａｌｌ  Ｍｏｄｕｌａｒ  ＩｍｍｕｎｏＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ（商標）（「ＳＭＩＰ」）ま
たはｄＡｂ、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＡｂ、ｓｃＦｖまたはｓｃＦｖ断片）、限定するものではないが、例えばプラスミノーゲン、インフルエンザワクチン、インヒビンα、インヒビンβ、インスリン、インスリン様成長因子、インテグリンＭａｂ、インターαトリプシン阻害剤、インターαトリプシン阻害剤、インターフェロンγ誘導性タンパク質（ＩＰ−１０）、インターフェロン（インターフェロンα種およびサブ種、インターフェロンβ種およびサブ種、インターフェロンγ種およびサブ種など）、インターフェロン（インターフェロンα種およびサブ種、インターフェロンβ種およびサブ種、インターフェロンγ種およびサブ種など）、インターロイキン６、インターロイキン８（ＩＬ−８）受容体、インターロイキン８受容体Ｂ、インターロイキン−１α、インターロイキン−２受容体会合タンパク質ｐ４３、インターロイキン−３、インターロイキン−４ムテイン、インターロイキン−８（ＩＬ−８）タンパク質、インターロイキン−９、インターロイキン−９（ＩＬ−９）成熟タンパク質（Ｔｈｒ１１７バージョン）、インターロイキン（ＩＬ１０、ＩＬ１１およびＩＬ２など）、インターロイキン（ＩＬ１０、ＩＬ１１およびＩＬ２など）、日本脳炎ワクチン、カリクレイン（Ｋａｌｉｋｒｅｉｎ）阻害剤、ケラチノサイト増殖因子、クニッツドメインタンパク質（アルブミン融合ありまたはなしの、アプロチニン、アミロイド前駆体タンパク質および国際公開第０３／０６６８２４号パンフレットに記載されるものなど）、クニッツドメインタンパク質（アルブミン融合ありまたはなしのアプロチニン、アミロイド前駆体タンパク質および国際公開第０３／０６６８２４号パンフレットに記載されるものなど）、ＬＡＣＩ、ラクトフェリン、潜在型ＴＧＦ−β結合タンパク質ＩＩ、レプチン、肝臓発現ケモカイン−１（ＬＶＥＣ−１）、肝臓発現ケモカイン−２（ＬＶＥＣ−２）、ＬＴ−α、ＬＴ−β、黄体形成ホルモン、ライム病ワクチン、リンホタクチン、マクロファージ由来ケモカイン類似体ＭＤＣ（ｎ＋１）、マクロファージ由来ケモカイン類似体ＭＤＣ−ｅｙｆｙ、マクロファージ由来ケモカイン類似体ＭＤＣ−イル、マクロファージ由来ケモカイン、ＭＤＣ、マクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ）、マスピン；プロテアーゼ阻害剤５、ＭＣＰ−１受容体、ＭＣＰ−１ａ、ＭＣＰ−１ｂ、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４受容体、Ｍ−ＣＳＦ、黒色腫阻害タンパク質、膜結合タンパク質、Ｍｅｔ１１７ヒトインターロイキン９、ＭＩＰ−３α、ＭＩＰ−３β、ＭＩＰ−γ、ＭＩＲＡＰ、修飾ランテス、モノクローナル抗体、ＭＰ５２、変異インターロイキン６Ｓ１７６Ｒ、筋原線維収縮タンパク質トロポニンＩ、ナトリウム利尿ペプチド、神経成長因子−β、神経成長因子−β２、ニューロピリン−１、ニューロピリン−２、ニューロタクチン、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４、ニューロトロフィン−４ａ、ニューロトロフィン−４ｂ、ニューロトロフィン−４ｃ、ニューロトロフィン−４ｄ、好中球活性化ペプチド−２（ＮＡＰ−２）、ＮＯＧＯ−６６受容体、ＮＯＧＯ−Ａ、ＮＯＧＯ−Ｂ、ＮＯＧＯ−Ｃ、ＰＴＥＣと命名される新規β−ケモカイン、Ｎ末端修飾ケモカインＧｒｏＨＥＫ／ｈＳＤＦ−１α、Ｎ末端修飾ケモカインＧｒｏＨＥＫ／ｈＳＤＦ−１β、Ｎ末端修飾ケモカインｍｅｔ−ｈＳＤＦ−１α、Ｎ末端修飾ケモカインｍｅｔ−ｈＳＤＦ−１β、ＯＰＧＬ、骨形成タンパク質−１；ＯＰ−１；ＢＭＰ−７、骨形成タンパク質−２、ＯＸ４０；作用し−４、ＯＸ４０Ｌ、オキシトシン（ニューロフィシンＩ）、副甲状腺ホルモン、Ｐａｔｃｈｅｄ、Ｐａｔｃｈｅｄ−２、ＰＤＧＦ−Ｄ、百日咳類毒素、下垂体発現ケモカイン（ＰＧＥＣ）、胎盤成長因子、胎盤成長因子−２、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤−１；ＰＡＩ−１、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤−２；ＰＡＩ−２、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤−２；ＰＡＩ−２、血小板由来成長因子、血小板由来成長因子Ｂｖ−ｓｉｓ、血小板由来成長因子前駆体Ａ、血小板由来成長因子前駆体Ｂ、血小板Ｍａｂ、血小板由来内皮細胞成長因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）、血小板由来成長因子Ａ鎖、血小板由来成長因子Ｂ鎖、敗血症治療に使用されるポリペプチド、プレプロアポリポタンパク質「ｍｉｌａｎｏ」変種、プレプロアポリポタンパク質「ｐａｒｉｓ」変種、プレトロンビン、霊長類ＣＣケモカイン「ＩＬＩＮＣＫ」、霊長類ＣＸＣケモカイン「ＩＢＩＣＫ」、プロインスリン、プロラクチン、プロラクチン２、プロサプチド、プロテアーゼ阻害剤ペプチド、タンパク質Ｃ、タンパク質Ｓ、プロトロンビン、プロウロキナーゼ、ランテス、ランテス８−６８、ランテス９−６８、ランテスペプチド、ランテス受容体、組換えインターロイキン−１６、レジスチン、レストリクトシン、レトロウイルスプロテアーゼ阻害剤、リシン、ロタウイルスワクチン、ＲＳＶ  Ｍａｂ、サポリン、サルシン、分泌膜貫通ポリペプチド、分泌膜貫通ポリペプチド、血清コリンエステラーゼ、血清タンパク質（血液凝固因子など）、可溶性ＢＭＰ受容体キナーゼタンパク質−３、可溶性ＶＥＧＦ受容体、幹細胞阻害因子、スタフィロコッカス（Ｓｔｒａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）ワクチン、間質由来因子−１α、間質由来因子−１β、物質Ｐ（タキキニン）、Ｔ１２４９ペプチド、Ｔ２０ペプチド、Ｔ４エンドヌクレアーゼ、ＴＡＣＩ、Ｔａｒｃ、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、Ｔｈｒ１１７ヒトインターロイキン９、トロンビン、トロンボポエチン、トロンボポエチン誘導体１、トロンボポエチン誘導体２、トロンボポエチン誘導体３、トロンボポエチン誘導体４、トロンボポエチン誘導体５、トロンボポエチン誘導体６、トロンボポエチン誘導体７、胸線発現ケモカイン（ＴＥＣＫ）、甲状腺刺激ホルモン、ダニ抗凝固性ペプチド、Ｔｉｍ−１タンパク質、ＴＮＦ−α前駆体、ＴＮＦ−Ｒ、ＴＮＦ−ＲＩＩ；ＴＮＦｐ７５受容体；細胞死受容体、ｔＰＡ、トランスフェリン、形質転換成長因子β、トロポニンペプチド、トランケート型単球走化性タンパク質２（６−７６）、トランケート型単球走化性タンパク質２（６−７６）、トランケート型ランテスタンパク質（３−６８）、腫瘍壊死因子、尿酸オキシダーゼ、ウロキナーゼ、バソプレシン（ニューロフィシンＩＩ）、ＶＥＧＦＲ−３；ｆｌｔ−４、ＶＥＧＦ受容体；ＫＤＲ；ｆｌｋ−１、ＶＥＧＦ−１１０、ＶＥＧＦ−１２１、ＶＥＧＦ−１３８、ＶＥＧＦ−１４５、ＶＥＧＦ−１６２、ＶＥＧＦ−１��５、ＶＥＧＦ−１８２、ＶＥＧＦ−１８９、ＶＥＧＦ−２０６、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−Ｅ；ＶＥＧＦ−Ｘ、フォン・ウィルブラント因子、野性型単球走化性タンパク質２、野性型単球走化性タンパク質２、ＺＴＧＦ−β９、例えばアンチカリンやアドネクチンやフィブリノーゲン断片などの代案の抗体スキャフォールド、ラクダ科動物ナノボディなどのナノボディ、インフェスチン、および／または（それぞれその内容全体を参照によって本明細書に援用する）国際公開第０１／７９２７１号パンフレット（特に９頁および／または表１）、国際公開第２００３／５９９３４号パンフレット（特に表１）、国際公開第０３／０６００７１号パンフレット（特に表１）または国際公開第０１／０７９４８０号パンフレット（特に表１）のいずれかで言及される分子。
【０２４６】
さらに複合体は、１３−シス−レチノイン酸、２−ＣｄＡ、２−クロロデオキシアデノシン、５−アザシチジン、５−フルオロウラシル、５−ＦＵ、６−メルカプトプリン、６−ＭＰ、６−ＴＧ、６−チオグアニン、Ａ、アブラキサン、アキュテイン（登録商標）、アクチノマイシン−Ｄ、アドリアマイシン（登録商標）、アドルシル（登録商標）、アグリリン（登録商標）、アラコート（登録商標）、アルデスロイキン、アレムツズマブ、アリムタ、アリトレチノイン、アルカバン−ＡＱ（登録商標）、アルケラン（登録商標）、オールトランスレチノイン酸、αインターフェロン、アルトレタミン、アメトプテリン、アミホスチン、アミノグルテチミド、アナグレリド、アナンドロン（登録商標）、アナストロゾール、アラビノシルシトシン、Ａｒａ−Ｃ、アラネスプ（登録商標）、アレディア（登録商標）、アリミデックス（登録商標）、アロマシン（登録商標）、アラノン（登録商標）、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、ＡＴＲＡ、アバスチン（登録商標）、アザシチジン、ＢＣＧ、ＢＣＮＵ、ベバシズマブ、ベキサロテン、ベキサール（登録商標）、ビカルタミド、ＢｉＣＮＵ、ブレノキサン（登録商標）、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブスルファン、ブスルフェクス（登録商標）、Ｃ２２５、カルシウムロイコボリン、キャンパス（登録商標）、カンプトサール（登録商標）、カンプトテシン−１１、カペシタビン、カラック（商標）、カルボプラチン、カルムスチン、カルムスチンウエハ、カソデックス（登録商標）、ＣＣ−５０１３、ＣＣＮＵ、ＣＤＤＰ、ＣｅｅＮＵ、セルビジン（登録商標）、セツキシマブ、クロランブシル、シスプラチン、シトロボラム因子、クラドリビン、コルチゾン、コスメゲン（登録商標）、ＣＰＴ−１１、シクロホスファミド、シタドレン（登録商標）、シタラビン、リポソーム性シタラビン、シトサール−Ｕ（登録商標）、シトキサン（登録商標）、ダカルバジン、ダコゲン、ダクチノマイシン、ダルベポエチンアルファ、ダサチニブ、ダウノマイシン、ダウノルビシン、塩酸ダウノルビシン、リポソーム性ダウノルビシン、ダウノキソーム（登録商標）、デカドロン、デシタビン、デルタ−コルテフ（登録）、デルタソン（登録商標）、デニロイキンジフチトクス、デポサイト（商標）、デキサメタゾン、酢酸デキサメタゾン、リン酸ナトリウムデキサメタゾン、デキサソン、デクスラゾキサン、ＤＨＡＤ、ＤＩＣ、ジオデックス、ドセタキセル、ドキシル（登録商標）、ドキソルビシン、リポソーム性ドキソルビシン、ドロキシア（商標）、ＤＴＩＣ、ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ（登録商標）、デュラロン（登録商標）、エフデックス（登録商標）、エリガード（商標）、エレンス（商標）、エロキサチン（商標）、エルスパー（登録商標）、エムサイト（登録商標）、エピルビシン、エポエチンアルファ、アービタックス（商標）、エルロチニブ、エルウィニアＬ−アスパラギナーゼ、エストラムスチン、エチオール、エトポホス（登録商標）、エトポシド、エトポシドホスフェート、オイレキシン（登録商標）、エビスタ（登録商標）、エキセメスタン、フェアストン（登録商標）、フェソロデックス（登録商標）、フェマーラ（登録商標）、フィルグラスチム、フロクスウリ���ン、フルダラ（登録商標）、フルダラビン、フルオロプレックス（登録商標）、フルオロウラシル、フルオロウラシル（クリーム）、フルオキシメステロン、フルタミド、フォリン酸、ＦＵＤＲ（登録商標）、フルベストラント、Ｇ−ＣＳＦ、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ゲムツズマブオゾガマイシン、ジェムザール（登録商標）、グリベック（商標）、グリアデル（登録商標）ウエハ、ＧＭ−ＣＳＦ、ゴセレリン、顆粒球−コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、ハロテスチン（登録商標）、ハーセプチン（登録商標）、ヘキサドロール、ヘキサレン（登録商標）、ヘキサメチルメラミン、ＨＭＭ、ハイカムチン（登録商標）、ハイドレア（登録商標）、酢酸ヒドロコート（登録商標）、ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾンリン酸ナトリウム、ヒドロコルチゾンナトリウムコハク酸、ハイドロコートンホスフェート、ヒドロキシ尿素、イブリツモマブ、イブリツモマブチウキセタン、イダマイシン（登録商標）、イダルビシン、Ｉｆｅｘ（登録商標）、ＩＦＮ−α、イホスファミド、ＩＬ−１１、ＩＬ−２、イマチニブメシレート、イミダゾールカルボキサミド、インターフェロンα、インターフェロンα−２ｂ（ＰＥＧ複合体）、インターロイキン−２、インターロイキン−１１、イントロンＡ（登録商標）（インターフェロンα−２ｂ）、イレッサ（登録商標）、イリノテカン、イソトレチノイン、キドロラーゼ（登録商標）、ラナコート（登録商標）、ラパチニブ、Ｌ−アスパラギナーゼ、ＬＣＲ、レナリドミド、レトロゾール、ロイコボリン、ロイケラン、ロイキン（商標）、ロイプロリド、ロイロクリスチン、ロイスタチン（商標）、リポソーム性Ａｒａ−Ｃ、液体Ｐｒｅｄ（登録商標）、ロムスチン、Ｌ−ＰＡＭ、Ｌ−サルコリシン、リュープロン（登録商標）、ルプロンデポ（登録商標）、Ｍ、マツラン（登録商標）、マキシデックス、メクロレタミン、塩酸メクロレタミン、メドラロン（登録商標）、メドロール（登録商標）、メゲース（登録商標）、メゲストロール、酢酸メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メスネックス（商標）、メトトレキサート、メトトレキサートナトリウム、メチルプレドニゾロン、メチコルテン（登録商標）、マイトマイシン、マイトマイシン−Ｃ、ミトキサントロン、Ｍ−プレドニゾール（登録商標）、ＭＴＣ、ＭＴＸ、マスタージェン（登録商標）、ムスチン、ムタマイシン（登録商標）、ミレラン（登録商標）、ミロセル（商標）、マイロターグ（登録商標）、ナベルビン（登録商標）、ネララビン、ネオサール（登録商標）、ニューラスタ（商標）、ニューメガ（登録商標）、ニューポジェン（登録商標）、ネクサバール（登録商標）、ニランドロン（登録商標）、ニルタミド、ニペント（登録商標）、ナイトロジェンマスタード、ノルバデックス（Ｎｏｖａｌｄｅｘ）（登録商標）、ノバントロン（登録商標）、オクトレオチド、酢酸オクトレオチド、オンカスパー（Ｏｎｃｏｓｐａｒ）（登録商標）、オンコビン（登録商標）、オンタック（登録商標）、オンキサール（商標）、オプレルベキン（Ｏｐｒｅｖｅｌｋｉｎ）、オラプレッド（登録商標）、オラソン（登録商標）、オキサリプラチン、例えばパクリタキセル��たはタンパク質結合パクリタキセルなどのタキソールまたはタキソール誘導体、パミドロネート、パニツマブ、パンレチン（登録商標）、パラプラチン（登録商標）、ペジアプレッド（登録商標）、ＰＥＧインターフェロン、ペグアスパラガーゼ、ペグフィルグラスチム、ＰＥＧ−イントロン（商標）、ＰＥＧ−Ｌ−アスパラギナーゼ、ペメトレキセド、ペントスタチン、フェニルアラニンマスタード、プラチノール（登録商標）、プラチノール−ＡＱ（登録商標）、プレドニゾロン、プレドニゾン、プレロン（登録商標）、プロカルバジン、ＰＲＯＣＲＩＴ（登録商標）、プロロイキン（登録商標）、包埋カルムスチン含有プロリフェプロスパン２０、プリネトール（登録商標）、Ｒ、ラロキシフェン、レブラミド（登録商標）、リウマトレックス（登録商標）、リツキサン（登録商標）、リツキシマブ、ロフェロン−Ａ（登録商標）（インターフェロンα−２ａ）、ルベックス（登録商標）、塩酸ルビドマイシン、サンドスタチン（登録商標）、サンドスタチンＬＡＲ（登録商標）、サルグラモスチム、ソルーコルテフ（登録商標）、ソルーメドロール（登録商標）、ソラフェニブ、スプリセル（商標）、ＳＴＩ−５７１、ストレプトゾシン、ＳＵ１１２４８、スニチニブ、スーテント（登録商標）、タモキシフェン、タルセバ（登録商標）、タルグレチン（登録商標）、タキソール（登録商標）、タキソテール（登録商標）、テモダール（登録商標）、テモゾロマイド、テニポシド、ＴＥＳＰＡ、サリドマイド、サロミド（登録商標）、テラシス（登録商標）、チオグアニン、チオグアニンタブロイド（登録商標）、チオホスホアミド、チオプレックス（登録商標）、チオテパ、ＴＩＣＥ（登録商標）、トポサール（登録商標）、トポテカン、トレミフェン、トシツモマブ、トラスツズマブ、トレチノイン、トレキサル（商標）、トリセノックス（登録商標）、ＴＳＰＡ、タイケルブ（登録商標）、ＶＣＲ、ベクティビックス（商標）、ベルバン（登録商標）、ベルケイド（登録商標）、ＶｅＰｅｓｉｄ（登録商標）、ベサノイド（登録商標）、ビアドゥール（商標）、ビダーザ（登録商標）、ビンブラスチン、硫酸ビンブラスチン、ビンカサールＰｆｓ（登録商標）、ビンクリスチン、ビノレルビン、ビノレルビン酒石酸、ＶＬＢ、ＶＭ−２６、ボリノスタット、ＶＰ−１６、ブモン（登録商標）、ゼローダ（登録商標）、ザノサール（登録商標）、ゼバリン（商標）、ジネカード（登録商標）、ゾラデックス（登録商標）、ゾレドロン酸、ゾリンザ、ゾメタ（登録商標）；炭素−１１、炭素−１４、クロム−５１、コバルト−５７、コバルト−５８、エルビウム−１６９、フッ素−１８、ガリウム−６７、金−１９８、インジウム−１１１、インジウム−１１３ｍ、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１２５、ヨウ素−１３１、鉄−５９、クリプトン−８１ｍ、窒素−１３、酸素−１５、亜リン酸−３２、レニウム−１８６、ルビジウム−８２、サマリウム−１５３、セレン−７５、ストロンチウム−８９、テクネチウム−９９ｍ、タリウム−２０１、トリチウム、キセノン−１２７、キセノン−１３３、イットリウム−９０などの放射性医薬品；ガドリニウム、磁鉄鉱、マンガン、テクネチウム、Ｉ１２５、Ｉ１３１、Ｐ３２、ＴＩ２０１、イオパミドール、ＰＥＴ−ＦＤＧなどの造影剤などの化学療法薬の１つまたは複数（いくつか）を含んでなってもよい。
【０２４７】
本発明によるナノ粒子、会合または組成物に組み入れるためのさらなる融合パートナー、複合化パートナーおよび／または分子としては、以下が挙げられる。例えばソマチュリン、ランレオチド、オクトレオチド、サンドスタチンなどの先端巨大症治療薬；例えばビバリルジン、アンギオマックス、ダルテパリン、フラグミン、エノキサパリン、ラブノックス、ドロトレコギンアルファ（例えば活性化）、ザイグリス、ヘパリンなどの抗血栓薬；例えば絨毛性ゴナドトロピン、オビドレル、フォリトロピン・アルファ／ベータなどの生殖補助医療化合物；例えばなどの酵素ヒアルロニダーゼ、ハイレネックス；例えばエクセナチド、バイエッタ、グルカゴン、インスリン、リラグルチド、アルビグルチド、ＧＬＰ−１作動薬、エキセンジンまたはエキセンジン類似体などの糖尿病治療薬；例えばプロチレリン、サイレルＴＲＨチピノン、セクレチン（例えば合成ヒト）、シロスチム、甲状腺刺激ホルモン（例えばα）などの診断で有用な化合物；例えばダルベポエチンアルファ、アラネスプ、エポエチンアルファ、エポジェン、エプレックスなどのタイロゲンの赤血球生成治療薬；例えばペガデマーゼなどの遺伝的欠陥の治療薬；例えばアダジェン、メカセルミン、リンファバートなどの成長障害の治療薬；例えばドルナーゼアルファ、プルモザイムなどの嚢胞性線維症の治療薬；例えばアガルシダーゼベータ、ファブラザイム、アルグルコシダーゼアルファ、ミオザイム、ラロニダーゼ、アルドラザイムなどの代謝障害の治療薬；例えばインターフェロンα−ｎ３、アルフェロンＮなどの生殖器疣病巣内の治療薬；例えばインターフェロンγ−１ｂ、アクティミューンなどの肉芽腫性疾患の治療薬；例えばペグビソマント、ソマバート、ソマトロピン、ジェノトロピン、ニュートロピン、ヒューマトロープ、セロスティム、プロトロピンなどの成長障害の治療薬；例えばネシリチド、ナトレコールなどの心不全の治療薬；例えば第ＶＩＩＩ因子とヘリキセートＦＳとコージネイトＦＳと第ＩＸ因子とベネフィックスと第ＶＩＩａ因子とノボセブンなどの凝固因子、デスモプレッシン、スチメート、ＤＤＡＶＰなどの血友病の治療薬；例えばフィルグラスチム（Ｇ−ＣＳＦ）、ニューポジェン、オプレルベキン、ニューメガ、ペグフィルグラスチム、ニューラスタ、サルグラモスチム、ロイキンなどの造血治療薬；例えばインターフェロンα−２ａ、ロフェロンＡ、インターフェロンα−２ｂ、イントロンＡ、インターフェロンアルファコン−１、インフェルゲン、ペグインターフェロンα−２ａ、ペガシス、ペグインターフェロンα−２ｂ、ＰＥＧ−イントロンなどのＣ型肝炎の治療薬；例えばエンフビルチド、フゼオンなどのＨＩＶの治療薬；例えばＦａｂ（抗トロンビン）、アブシキシマブ、レオプロなどのＦａｂ；例えばダクリズマブ、ゼナパックスなどのモノクローナル抗体；例えばパリビズマブ、シナジスなどの抗ウイルスモノクローナル抗体；例えばオマリズマブ、ゾレアなどの喘息治療のためのモノクローナル抗体；例えばアルシツモマブ、ＣＥＡ−スキャン、カプロマブペンデチド、プロスタシント、サツモマブペンデチド、オンコシントＣＲ／ＯＶなどの画像診断で使用されるモノクローナル抗体；例えばノフェツモ���ブ、べルルマなどの画像診断で使用されるＦａｂ；例えばバシリキシマブ、シムレクト、ムロモナブＣＤ３、オルソクローンＯＫＴ３などの免疫抑制（ｉｍｍｕｎｏ−ｓｕｐｒｅｓｓａｎｔ）モノクローナル抗体；例えばアレムツズマブ、キャンパス、イブリツモマブチウキセタン、ゼバリン、リツキシマブ、リツキサン、トラスツズマブ、ハーセプチンなどの悪性病変治療のためのモノクローナル抗体；例えばアダリムマブ、ヒュミラ、インフリキシマブ、レミケードなどの関節リウマチ（ＲＡ）治療のためのモノクローナル抗体；例えばトシツモマブおよびヨウ素Ｉ131、トシツモマブ、ベキサールなどの放射免疫療法剤として使用されるモノクローナル抗体；例えばペガプタニブ、マクジェンなどの黄斑変性の治療薬；例えばアルデスロイキン、プロロイキン、インターロイキン−２、アスパラギナーゼ、エルスパー、ラスブリカーゼ、Ｅｌｉｔｅｋ、デニロイキンジフチトクス、オンタック、ペグアスパラガーゼ、オンカスパー、ゴセレリン、ロイプロリドなどの悪性病変の治療薬；例えば酢酸グラチラマー（例えば共重合体−１）、コパキソン、インターフェロンベータ−１ａ、アボネックス、インターフェロンベータ−１ａ、レビフ、インターフェロンベータ−１ｂ、ベタセロンなどの多発性硬化症（ＭＳ）の治療薬；例えばパリフェルミン、ケピバンスなどの粘膜炎の治療薬；例えば神経毒、ボツリヌス毒素タイプＡ、ボトックス、ボトックス化粧品、Ｂ型ボツリヌス毒素、ミオブロックなどの筋緊張異常の治療薬；例えばテリパラチド、フォルテオなどの骨粗鬆症の治療薬；例えばアレファセプト、アメビブなどの乾癬の治療薬；例えばアバタセプト、オレンシア、アナキンラ、キネレット、エタネルセプト、エンブレルなどのＲＡの治療薬；例えばアルテプラーゼ、アクチバーゼ、組換え組織プラスミノーゲン活性化因子（ｒｔＰＡ）、アニストレプラーゼ、エミナーゼ、レテプラーゼ、レタバーゼ、ストレプトキナーゼ、ストレプターゼ、テネクテプラーゼ、ＴＮＫアーゼ（テネクテプラーゼ）、ウロキナーゼ、アボキナーゼ、キンリティックなどの血栓溶解薬；例えばカルシトニン（例えばサケ）、ミアカルシン、フォルティカルなどの骨粗鬆症の治療薬、例えばベカプレルミン、レグラネクス、コラゲナーゼ、サンチルなどの皮膚潰瘍の治療薬。
【０２４８】
このようなポリペプチドおよび化合物は、診断部分、治療的部分、予防的部分または有益な部分と称されてもよい。
【０２４９】
好ましくは融合パートナーおよび／または複合化パートナーは、アルブミン、その変種または断片でない。
【０２５０】
１つまたは複数の（いくつかの）治療的または予防的なポリペプチドをアルブミンのＮ末端、Ｃ末端に融合して、アルブミン構造中のループまたはそれらのあらゆる組み合わせに挿入してもよい。それは融合ポリペプチドの様々な構成要素を隔てるリンカー配列を含んでなってもよく、または含まなくてもよい。
【０２５１】
アルブミン融合物またはその断片に関する教示は、当該技術分野で公知であり、当業者は、このような教示を本発明にもまた応用し得ることを理解するであろう。国際公開第２００１／７９２７１Ａ号パンフレットおよび国際公開第２００３／５９９３４号パンフレット（参照によって本明細書に援用される）はまた、アルブミンまたはその断片に融合されてもよい治療的および予防的ポリペプチドの例も含み、これらの実施例は、本発明にもまた応用される。
【０２５２】
本発明の範囲を制限するものと解釈すべきではない、以下の実施例によって、本発明をさらに説明する。
【実施例】
【０２５３】
実施例１：ＨＳＡムテイン発現プラスミドの調製。
ＨＳＡ変種は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ａｎｄ  Ｄ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ）に記載されるような標準分子生物学技術を使用して、発現させた。
【０２５４】
Ｋ５７３Ｐ発現プラスミドの構築は、（参照によって本明細書に援用する）国際公開第２０１１／０５１４８９号パンフレットに記載される。残りの発現プラスミドの構築は、国際公開第２０１２／１５０３１９号パンフレット（ＰＣＴ／ＥＰ１２／０５８２０６、参照によって本明細書に援用する）に記載されるようにして実施した。変種ＨＳＡＴ８３Ｋ、ＨＳＡＥ８２Ａ、ＨＳＡＥ８２Ｄ、ＨＳＡＰ１１０Ｇ、ＨＳＡＬ１１２Ｆ、およびＨＳＡＴ８３Ｎ／Ｎ１１１Ｅは、国際公開第２０１２／１５０３１９号パンフレット（ＰＣＴ／ＥＰ１２／０５８２０６、参照によって本明細書に援用する）の実施例６の方法２に記載されるようにして生成した。Ｋ５７３Ｐ置換を含有する組み合わせ変異体は、「Ｋ５７３Ｐによる組み合わせ変異体の生成」（国際公開第２０１２／１５０３１９号パンフレット（ＰＣＴ／ＥＰ１２／０５８２０６））に記載されるようにして生成し、適切に消化されたｐＤＢ４８５２中に、必要な断片を挿入した（国際公開第２０１２／１５０３１９号パンフレット（ＰＣＴ／ＥＰ１２／０５８２０６、参照によって本明細書に援用する）に記載される）。Ｔ８３Ｎ／Ｎ１１１Ｅ、Ｔ８３Ｋ、Ｅ８２Ａ、Ｅ８２Ｄ、Ｐ１１０Ｇ、およびＬ１１２Ｆを含有する断片は、示された制限酵素認識部位（表１）を介して、合成コンストラクトから除去した。Ｔ８３Ｎ置換を含有する断片をｐＤＢ４８７４（国際公開第２０１２／１５０３１９号パンフレット（ＰＣＴ／ＥＰ１２／０５８２０６、参照によって本明細書に援用する）に記載される）から除去した。ＨＳＡ変種をコードするポリヌクレオチドおよびプラスミドｐＤＢ３９６４／ｐＤＢ４８５２のライゲーションからはプラスミドが生じ、それを使用して所望の変異体を発現させた（表１）。全てのプラスミドは、配列決定して、ＨＳＡ配列が所望の位置のみで変異していることを確認した。
【０２５５】
ＨＳＡ  Ｔ８３Ｎ、ＨＳＡ  Ｎ１１１ＥおよびＨＳＡ  Ｎ１１１Ｅ／Ｋ５７３Ｐの構築は、国際公開第２０１２／１５０３１９号パンフレット（ＰＣＴ／ＥＰ１２／０５８２０６、参照によって本明細書に援用する）に記載されるとおりであった。
【０２５６】
Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の形質転換は、宿主株が、ＰＤＩのコピーがゲノムに組み込まれているＳ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＤＹＢ７（Ｐａｙｎｅ  ｅｔ  ａｌ（２００８）Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．７４（２４）：７７５９−７７６６）であったことを除いては、国際公開第２０１１／０５１４８９号パンフレットに記載される２４時間貯蔵法を用いて、国際公開第２０１２／１５０３１９号パンフレット（ＰＣＴ／ＥＰ１２／０５８２０６、参照によって本明細書に援用する）に記載されるようにして実施した。
【０２５７】
【表５】
2018138023.tif 000006
【０２５８】
実施例２：アルブミン変種のＦｃＲｎに対する結合親和性のＳＰＲ分析
ＳＰＲ分析は、国際公開第２０１２／１５０３１９号パンフレット（ＰＣＴ／ＥＰ１２／０５８２０６、参照によって本明細書に援用する）に記載されるようにして実施した。
【０２５９】
変種は、それぞれ、Ｄ１０８Ａ、Ｎ１１１Ｄ、Ｎ１１１Ｇ、Ｎ１１１Ｈ、Ｎ１１１Ｋ、Ｋ１９０Ａ、Ｒ１９７Ａ、Ｋ２７６Ｎ、Ｒ４１０Ａ、Ｙ４１１Ａ、Ｐ４１６Ａ、Ｅ４２５Ａ、Ｅ４２５Ｋ、Ｋ４６６Ａ、Ｄ４７１Ａ、Ｒ４７２Ａ、Ｎ５０３Ｄ、Ｎ５０３Ｋ、Ｅ５０５Ｋ、Ｅ５０５Ｑ、Ｈ５１０Ｄ、Ｈ５１０Ｅ、Ｄ５１２Ａ、Ｄ５１２Ｅ、Ｋ５２４Ａ、Ｋ５２５Ａ、Ｔ５２７Ａ、Ｔ５２７Ｄ、Ｔ５２７Ｍ、Ｅ５３１Ａ、Ｅ５３１Ｈ、Ｋ５３４Ｖ、Ｈ５３５Ｆ、Ｅ５６５Ｖ、Ａ５６９Ｌ、Ａ５６９Ｓ、Ａ５６９Ｖ、およびＶ５７６Ｆから選択される１つの点変異があるアルブミン（配列番号２）であった。
【０２６０】
最初に、ＳＰＲによって変種を分析し、ｓｈＦｃＲｎに対するそれらの結合反応（ＲＵ）を測定した。野生型アルブミン結合反応より２０％以上高いまたは低い結合反応を示す変種のみを分析して、ＫＤを同定した（表２、下）。変異Ｋ５７３Ｐがある野生型ＨＳＡおよびＨＳＡを対照として使用した。
【０２６１】
【表６】
2018138023.tif 000007
【０２６２】
野生型ＨＳＡよりも低いＫＤがある変種は、ｓｈＦｃＲｎに対してより高い結合親和性を有する。逆に、野生型ＨＳＡよりも高いＫＤがある変種は、ｓｈＦｃＲｎに対してより低い結合親和性を有する。
【０２６３】
１０８および１１１位のデータは、ＦｃＲｎとの相互作用における、１０５〜１２０位をはじめとするループの関与を支持し、したがってこのループ内のあらゆる位置における改変は、アルブミンのＦｃＲｎに対する結合親和性を調節する。
【０２６４】
実施例３：アルブミン変種のＦｃＲｎに対する結合親和性のＳＰＲ分析
変種は、それぞれ、上に記載されるようにして調製された、Ｎ１１１Ｄ、Ｎ１１１Ｇ、Ｎ１１１Ｈ、Ｎ１１１Ｄ／Ｋ５７３Ｐ、Ｎ１１１Ｇ／Ｋ５７３Ｐ、Ｎ１１１Ｈ／Ｋ５７３Ｐ、Ｅ５０５Ｑ、Ｅ４２５Ａ、Ｔ５２７Ｍ、Ｅ５０５Ｑ／Ｋ５７３Ｐ、Ｅ４２５Ａ／Ｋ５７３Ｐ、およびＴ５２７Ｍ／Ｋ５７３Ｐから選択される１つの点変異があるアルブミン（配列番号２）であった。
【０２６５】
【表７】
2018138023.tif 000008
【０２６６】
野生型ＨＳＡよりも低いＫＤがある変種は、ｓｈＦｃＲｎに対してより高い結合親和性を有する。逆に、野生型ＨＳＡよりも高いＫＤがある変種は、ｓｈＦｃＲｎに対してより低い結合親和性を有する。
【０２６７】
Ｋ５７３Ｐを含む変種のデータは、Ｋ５７３Ｐ置換のみと一致して、親和性の増加を生じる。
【０２６８】
実施例４：アルブミン変種のＦｃＲｎに対する結合親和性のＳＰＲ分析
変種は、それぞれ、上述したとおりに調製されたＮ１１１Ｒ、Ｎ１１１Ｑ、Ｎ１１１Ｅ、Ｎ１１１Ｒ／Ｋ５７３Ｐ、Ｎ１１１Ｑ／Ｋ５７３Ｐ、Ｎ１１１Ｅ／Ｋ５７３Ｐ、Ｎ１０９Ｄ、Ｎ１０９Ｅ、Ｎ１０９Ｑ、Ｎ１０９Ｒ、Ｎ１０９Ｋ、Ｎ１０９Ｈ、Ｎ１０９Ｇ、Ｄ１０８Ｅ、Ｔ８３Ｎ、Ｌ５７５Ｆ、およびＫ５３４Ｖ／Ｋ５７３Ｐから選択される１つの点変異があるアルブミン（配列番号２）であった。
【０２６９】
【表８】
2018138023.tif 000009
【０２７０】
【表９】
2018138023.tif 000010
【０２７１】
データは、ＨＳＡのＦｃＲｎへの結合における１０８〜１１１ループの役割を実証し、Ｄ１０８ＡおよびＮ１１１Ｋ変種中における結合親和性の低下が観察される（表２）。位置１１１における追加的な変異は、Ｎ１１１Ｋ変種について観察された親和性低下から、ＷＴ  ＨＳＡと比較してＦｃＲｎに対する親和性増大を示すＮ１１１Ｅ変種に至る、一連の結合親和性を実証した（表４）。変種Ｎ１１１Ｑ／Ｋ５７３Ｐ（図５、配列番号７４）は、ＷＴ  ＨＳＡと比較して増大した応答と、ＷＴ  ＨＳＡと比較してより緩慢な解離とがある結合曲線を示し、これはＫ５７３Ｐ置換に一致する。ＨＳＡおよびＦｃＲｎに対するループ領域１０８〜１１２の相対的位置（図６）は、実施例２で予測されたように、この領域がＦｃＲｎ結合に寄与する可能性を有することを示唆する。図５および６に関するさらなる詳細は、国際公開第２０１２／１５０３１９号パンフレット（ＰＣＴ／ＥＰ１２／０５８２０６、参照によって本明細書に援用する）に提供される。
【０２７２】
残基７８〜８８を含んでなるドメインＩ（ドメイン１）の隣接するループ領域の相対的位置（図６）は、この領域がＦｃＲｎ結合に寄与する可能性を有することを示唆する。これは、Ｔ８３Ｎ変種が、ＷＴ  ＨＳＡと比較して、ＦｃＲｎに対する親和性の増大を示すという観察によって支持される（表４）。
【０２７３】
隣接する残基、特にＥ８２、Ｐ１１０、およびＬ１１２（図６）の変異は、ＨＳＡのＦｃＲｎに対する結合親和性を変化させると予測される。
【０２７４】
実施例５：アルブミン変種のＦｃＲｎに対する結合親和性のＳＰＲ分析
ＳＰＲ分析は、Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で実施した。固定化は、製造会社の使用説明書に従ってＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅアミン複合化化学反応を使用して、ｓｈＦｃＲｎ（ＧｅｎｅＡｒｔ  １１７７５２５）とカップリングされたＣＭ５チップ上で実施した。ｓｈＦｃＲｎ−ＨＩＳ（β２ミクログロブリンＣ末端に６−ＨｉｓテールがあるｓｈＦｃＲｎ）の固定化レベルは約１２００ＲＵであり、ｐＨ４．５の酢酸ナトリウム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）への２０μｇ／ｍＬのｓｈＦｃＲｎ注入によって達成された。一定流量（５μＬ／分）の泳動用緩衝液、ｐＨ５．５の二塩基性／一塩基性リン酸緩衝液によって、チップ表面を２５℃で一晩安定化させた。リガンド安定化後、３０μＬ／分で３×４５μＬの二塩基性／一塩基性リン酸緩衝液の注入によって、チップ表面を調整し、各注入間のｐＨ７．４におけるＨＢＳ＿ＥＰ（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％の界面活性剤Ｐ２０）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））再生手順（１２ｓ）がそれに続いた。次に３０μＬ／分で３×４５μＬの陽性対照の注入によって、活性について表面をチェックし、１２ｓ再生パルス投与がそれに続いた。
【０２７５】
ｐＨ５．５結合解析：結合データのセンサーグラムは、二重反復試験中で、（ｐＨ５．５の緩衝液中で希釈された）４５μＬの２０μＭ分析物の注入によって、３０μＬ／分のｐＨ５．５の泳動用緩衝液中で得た。注入後に２×１２ｓの再生パルス投与を実施して、ベースラインを復元した（ｐＨ７．４のＨＢＳ−ＥＰ；５０μＬ／分で１０μＬ）。次に参照を差し引いて、ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア４．１を使用して、結合解析データを得た。
【０２７６】
ｐＨ５．５動態解析：注入によって、動態データのためのセンサーグラムは、９０ｓの遅延注入（動態モデル化のための滑らかな解離を可能にするために）で、ｐＨ５．５の３０μＬ／分の泳動用緩衝液中の２０μＭ、４μＭ、０．８μＭ０．１６μＭ、および０．０３２μＭの５つの濃度の４５μＬの分析物を注入することで得た。注入後に２×１２ｓの再生パルス投与を実施して、ベースラインを復元した（ｐＨ７．４のＨＢＳ−ＥＰ；５０μＬ／分で１０μＬ）。解析は、２つの別個の機会に実施した。次に対照セル値を差し引いて、Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア４．１を使用して、動態データを得てＫＤ値を確認した。
【０２７７】
ＳＰＲを使用して、ＦｃＲｎに対する変種の結合反応を同定し、結果を表５ａおよび５ｂに示す。
【０２７８】
【表１０】
2018138023.tif 000011
【０２７９】
【表１１】
2018138023.tif 000012
【０２８０】
変種に対してＫＤ分析を実施し、ＨＳＡ−Ｋ５７３とＦｃＲｎの結合親和性と比較して、変種とＦｃＲｎの結合親和性を評価した。結果は、表６に示される。さらなる分析を実施して、結合親和性を計算した（表７）。
【０２８１】
【表１２】
2018138023.tif 000013
【０２８２】
【表１３】
2018138023.tif 000014
【０２８３】
データは、ＨＳＡ  Ｔ８３Ｎ／Ｎ１１１Ｅ／Ｋ５７３ＰおよびＨＳＡ  Ｔ８３Ｎ／Ｋ５７３Ｐが、野生型ＨＳＡと比較して高いＦｃＲｎ結合親和性を有することを示す。ＨＳＡＥ８２ＡおよびＨＳＡＬ１１２Ｆは、野生型ＨＳＡのＦｃＲｎへの結合と比較して、どちらもＦｃＲｎに対する改善された結合を示し、これはＨＳＡ（配列番号２）のアミノ酸７８〜８８およびＨＳＡ（配列番号２）の１０５〜１２０を含んでなるループが、ＨＳＡのＦｃＲｎへの結合に関与することを示唆する。
【０２８４】
Ｌ１１２またはＴ８３の位置に単一変異があるＨＳＡは、互いに類似したＦｃＲｎ結合親和性を示す。しかしＬ１１２およびＫ５７３の二重変異は、Ｔ８３およびＫ５７３の二重変異よりも強力なＦｃＲｎに対する結合親和性を有する。
【０２８５】
【表１４】
2018138023.tif 000015
【０２８６】
表８のデータは、ＨＳＡ−Ｅ８２Ｄが、野生型アルブミンと比較して低いＦｃＲｎ結合親和性を有し、ＨＳＡ−Ｋ５７３Ｐが、野生型アルブミンと比較して高いＦｃＲｎ結合有することを示す。しかし二重変異体ＨＳＡ−Ｅ８２Ｄ／Ｋ５７３Ｐは、ＨＳＡ−Ｋ５７３Ｐと同じＦｃＲｎ結合親和性を示し、すなわちＥ８２Ｄ置換の包含はＦｃＲｎ結合に悪影響を及ぼさない。
【０２８７】
本明細書で開示される特定の態様は、本発明のいくつかの態様の例証であることが意図されるので、本明細書で記載され特許請求される本発明の範囲は、これらの態様によって限定されない。あらゆる同等の態様は、本発明の範囲内であることが意図される。確かに、前述の説明から、当業者には、本明細書に示され記載されるものに加えて、本発明の様々な修正が明白になるであろう。このような修正もまた、添付の特許請求の範囲内であることが意図される。矛盾がある場合、定義を含めて本開示が優先する。
【図１−１】
2018138023.tif 000016
【図１−２】
2018138023.tif 000017
【図２−１】
2018138023.tif 000018
【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年4月24日(2018.4.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列を有する親アルブミンの変種アルブミン、その断片、または前記変種アルブミンもしくはその断片を含んでなる融合ポリペプチドであるポリペプチドであって、
前記ポリペプチドが、親アルブミン、その断片、または前記親アルブミンもしくはその断片を含んでなる融合ポリペプチドのＦｃＲｎに対する結合親和性と比較して、ＦｃＲｎに対するより強力な結合親和性および／またはより長い血漿半減期を有し、
前記ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９４％の配列同一性を有し、
前記ポリペプチドが、配列番号２の１１１位に対応する位置のアミノ酸残基における改変を少なくとも含む、ポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、ドメインＩ及び／又はドメインIII内に１又は２以上の更なる改変を含み、ここでドメインＩは、配列番号２の１〜１９７位に対応するアミノ酸残基により規定され、ドメインIIIは、配列番号２の３８１〜５８５位に対応するアミノ酸残基により規定される、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
ドメインＩ内の前記更なる改変が、配列番号２の７８〜１１０位及び１１２〜１２０位の何れかに相当する位置から選択される位置の改変であり、ドメインIII内の前記更なる改変が、配列番号２の４２５、５０５、５１０、５１２、５２４、５２７、５３１、５３４、５６９、５７３、及び５７５位の何れかに相当する位置から選択される位置の改変である、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
配列番号２の８３位に相当する位置に改変を有する、請求項１〜３の何れか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
配列番号２の５７３位に相当する位置に改変を有する、請求項１〜４の何れか一項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
請求項１〜５の何れか一項に記載のポリペプチドと、治療的、予防的、診断用、造影用またはその他の有益な部分から選択される融合パートナーポリペプチドとを含んでなる、融合ポリペプチド。
【請求項７】
アルブミン変種、その断片、または前記変種アルブミンもしくはその断片を含んでなる融合ポリペプチドを調製する方法であって、
前記ポリペプチドが、親アルブミン、その断片、または前記親アルブミンもしくはその断片を含んでなる融合ポリペプチドのＦｃＲｎに対する結合親和性と比較して、ＦｃＲｎに対するより強力な結合親和性および／またはより長い血漿半減期を有し、
前記方法が、
（ａ）配列番号２に対する少なくとも９４％の配列同一性を有するアルブミンをコードする核酸を提供するステップと；
（ｂ）ステップ（ａ）の前記核酸配列を、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９４％の配列同一性を有し、且つ、配列番号２の１１１位に対応する位置のアミノ酸残基における改変を少なくとも含むポリペプチドをコードするように改変するステップと；
（ｃ）任意選択的に、ステップ（ｂ）の前記配列修飾を適切な宿主細胞中に導入するステップと；
（ｄ）任意選択的に、前記ポリペプチドの発現をもたらす条件下で、前記細胞を適切な成長培地中で培養するステップと；
（ｅ）任意選択的に、前記ポリペプチドを前記成長培地から回収するステップとを含んでなり、
前記ポリペプチドが、親アルブミン、その断片、または前記親アルブミンもしくはその断片を含んでなる融合ポリペプチドと比較して、ＦｃＲｎに対するより強力な結合親和性および／またはより長い血漿半減期を有する、方法。
【請求項８】
前記ポリペプチドが、ドメインＩ及び／又はドメインIII内に１又は２以上の更なる改変を含み、ここでドメインＩは、配列番号２の１〜１９７位に対応するアミノ酸残基により規定され、ドメインIIIは、配列番号２の３８１〜５８５位に対応するアミノ酸残基により規定される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ドメインＩ内の前記更なる改変が、配列番号２の７８〜１１０位及び１１２〜１２０位の何れかに相当する位置から選択される位置の改変であり、ドメインIII内の前記更なる改変が、配列番号２の４２５、５０５、５１０、５１２、５２４、５２７、５３１、５３４、５６９、５７３、及び５７５位の何れかに相当する位置から選択される位置の改変である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
配列番号２の８３位に相当する位置に改変を有する、請求項７〜９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１１】
配列番号２の５７３位に相当する位置に改変を有する、請求項７〜１０の何れか一項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜６の何れか一項に記載のポリペプチドと、複合化パートナーとを含んでなる、複合体。
【請求項１３】
請求項１〜６の何れか一項に記載のポリペプチドと、治療的、予防的、診断用、造影用またはその他の有益な部分とを含んでなる、会合体。
【請求項１４】
請求項１〜６の何れか一項に記載のポリペプチド、請求項１２に記載の複合体、または請求項１３に記載の会合体を含んでなる、ナノ粒子または微粒子。
【請求項１５】
請求項１〜６の何れか一項に記載のポリペプチド、請求項１２に記載の複合体、請求項１３に記載の会合体、または請求項１４に記載のナノ粒子もしくは微粒子を含んでなる組成物であって、前記組成物が、対応する親アルブミン、その断片、または前記親アルブミンもしくは断片を含んでなる融合ポリペプチド、複合体、会合体またはナノ粒子もしくは微粒子を含んでなる組成物と比較して、ＦｃＲｎに対するより強力な結合親和性および／またはより長い血漿半減期を有する、組成物。
【請求項１６】
治療的、予防的、診断用、造影用またはその他の有益な部分のＦｃＲｎに対する結合親和性および／または血漿中半減期を増加させるための、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
分子のＦｃＲｎに対する結合親和性および／または血漿中半減期を増加させる方法であって、
（ａ）分子がポリペプチドである場合、前記分子を請求項１〜６の何れか一項に記載のポリペプチドに、または請求項１２に記載の複合体に、融合または複合化させるステップと；前記分子を請求項１〜６の何れか一項に記載のポリペプチドに、または請求項１２に記載の複合体に、結合させるステップと；前記分子を、請求項１３に記載の会合体に、請求項１４に記載のナノ粒子または微粒子に、または請求項１５もしくは１６に記載の組成物に組み込むステップを；
（ｂ）分子がポリペプチドでない場合、前記分子を請求項１〜６の何れか一項に記載のポリペプチドに、または請求項１２に記載の複合体に、複合化させるステップと；前記分子を請求項１〜６の何れか一項に記載のポリペプチドに、または請求項１２に記載の複合体に、結合させるステップと；前記分子を、請求項１３に記載の会合体に、請求項１４に記載のナノ粒子または微粒子に、または請求項１５もしくは１６に記載の組成物に組み込むステップを
含んでなる、方法。
【請求項１８】
請求項１〜６の何れか一項に記載のポリペプチドまたは融合ポリペプチドをコードする、核酸。
【請求項１９】
請求項１８に記載の核酸を含んでなる、ベクター。
【請求項２０】
請求項１８に記載の核酸または請求項１９に記載のベクターを含んでなる、宿主細胞。
【外国語明細書】
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