(57)【要約】【課題】被験者から採取された血球細胞から大量の樹状細胞を得る方法を提供する。【解決手段】樹状細胞集団の調製方法であって、（ａ）：採取された血球細胞集団から単核球集団を分離するステップと、（ｂ）：前記ステップ（ａ）で分離された単核球集団から、ＣＤ３を細胞表面に発現する細胞集団を除去するステップと、（ｃ）：前記ステップ（ｂ）で得られた単核球集団を、新規なコーティング剤によってコーティングされた培養容器を用い、ＧＭ−ＣＳＦ及びＳＣＦを含む培地で培養するステップ、を含む、調製方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
樹状細胞集団の調製方法であって、
（ａ）：採取された血球細胞集団から単核球集団を分離するステップと、
（ｂ）：前記ステップ（ａ）で分離された単核球集団から、ＣＤ３を細胞表面に発現する細胞集団を除去するステップと、
（ｃ）：前記ステップ（ｂ）で得られた単核球集団を、生体親和性基を有する単量体に基づく重合単位を含む含フッ素重合体から形成された被覆層を有する細胞培養容器を用い、ＧＭ−ＣＳＦ及びＳＣＦを含む培地で培養するステップ、
を含む、調製方法。
【請求項２】
前記含フッ素重合体におけるフッ素原子含有率が５〜６０質量％であり、かつ下式で表される割合Ｐが０．１〜４．５質量％である、請求項１に記載の調製方法。
（割合Ｐ）＝［（含フッ素重合体の全単位に対する生体親和性基を有する単位の割合（質量％））／（含フッ素重合体のフッ素原子含有率（質量％））］×１００
【請求項３】
前記被覆層の厚さが１ｎｍ〜１００μｍである、請求項１又は２に記載の調製方法。
【請求項４】
前記ＣＤ３を細胞表面に発現する細胞集団が、Ｔ細胞集団である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の調製方法。
【請求項５】
前記ステップ（ｂ）が、前記ステップ（ａ）で分離された単核球集団から、さらにＣＤ１９を細胞表面に発現する細胞集団、及びＣＤ５６を細胞表面に発現する細胞集団を除去するステップである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の調製方法。
【請求項６】
前記ＣＤ１９を細胞表面に発現する細胞集団が、Ｂ細胞集団であり、
前記ＣＤ５６を細胞表面に発現する細胞集団が、ＮＫ細胞集団である、
請求項５に記載の調製方法。
【請求項７】
前記ステップ（ｃ）の後に、
（ｄ）：前記ステップ（ｃ）で培養された細胞集団を、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を含む培地でさらに培養するステップ、
を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の調製方法。
【請求項８】
前記ステップ（ｃ）における培養期間が２週間〜５週間であり、
前記ステップ（ｄ）における培養期間が２日間〜１４日間である、
請求項７に記載の調製方法。
【請求項９】
前記採取された血球細胞集団が、採取された末梢血、臍帯血、骨髄及び／又はリンパ節由来の血球細胞集団である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の調製方法。
【請求項１０】
前記採取された血球細胞集団が、採取された末梢血からアフェレーシス法により採取された血球細胞集団である、請求項９に記載の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、樹状細胞の培養方法に関する。具体的には、新規なコーティング剤を用いてコーティングされた培養容器を用いることを特徴とする、樹状細胞の培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
樹状細胞は、抗原提示細胞として、獲得免疫及び自然免疫の両方を含む免疫系を刺激又は抑制することができる。そこで、がん、感染症、自己免疫疾患、アレルギー疾患等に関連する特定の抗原を提示させるように予め体外で処理された樹状細胞を患者に移植することによって、患者の免疫系を制御する、樹状細胞移植療法が試みられている。しかし、かかる樹状細胞移植療法には大量の樹状細胞が必要である。例えば、皮膚の腫瘍及び肺転移の実験動物モデル系を用いた研究によると、いずれのモデル系でも、移植する樹状細胞の１回投与の最適数は、実験動物の体重３０ｇあたり少なくとも１０6個であるとの結果が得られた（非特許文献１及び２）。これはヒトに換算すると、患者１人あたり１回投与で少なくとも約１０9個の樹状細胞に相当する。しかし臨床的には、１人の人間から回収できる樹状細胞は、アフェレーシスを行った場合でもせいぜい１０6ないし１０8個にすぎない。
【０００３】
樹状細胞の移植による免疫療法の対象となる患者の中には、疾患そのものか、あるいは、他の治療法の副作用かが原因で、造血能力が弱っている場合が多い。特に、現状では免疫療法は他の治療法で効果がない場合に試みられることが多いため、他の治療法の副作用により、アフェレーシスを利用しても、有効な治療に必要な１０9個のオーダーの樹状細胞又はその前駆細胞を用意できないことが治験拡大の妨げとなっている。
【０００４】
樹状細胞の前駆細胞から、大量の樹状細胞を培養する方法としては、被験者から採取された血球細胞から単核球を分離し、分離した単核球の集団からＴ細胞を除去し、残りの細胞を所定の培地で培養することによる、樹状細胞の培養方法が提案されている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１１−２３９７０１
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｈａｒａｄａ，Ｙ．ら、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ、４：ｅ６６７４（２００９）
【非特許文献２】Ｔａｔｓｕｔａ、Ｋ．ら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１６：２４０−２５１（２００９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記の特許文献１に記載の樹状細胞の培養方法は、樹状細胞移植療法を行うために、被験者から採取された血球細胞から大量の樹状細胞を得る方法として、非常に優れた方法である。本発明者らは、特許文献１に記載の方法を基礎として、様々な角度から、さらに効率の良い樹状細胞の培養方法を検討した。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記のとおり、本発明者らは、特許文献１に記載の方法を基礎として、様々な角度から、さらに効率の良い樹状細胞の培養方法を検討した。そして、本発明者らは、様々な培養条件を検討する中で、驚くべきことに、新規なコーティング剤によってコーティングされた培養容器を用いることにより、特許文献１に記載の方法よりも、さらに効率的に樹状細胞を培養できることを見出し、本発明を完成させるに到った。
【０００９】
すなわち、本発明は、一実施態様において、樹状細胞集団の調製方法であって、
（ａ）：採取された血球細胞集団から単核球集団を分離するステップと、
（ｂ）：前記ステップ（ａ）で分離された単核球集団から、ＣＤ３を細胞表面に発現する細胞集団を除去するステップと、
（ｃ）：前記ステップ（ｂ）で得られた単核球集団を、培養容器として生体親和性基を有する単量体に基づく重合単位を含む含フッ素重合体から形成された被覆層を有する細胞培養容器を用い、ＧＭ−ＣＳＦ及びＳＣＦを含む培地で培養するステップ、を含む、調整方法に関する。
【００１０】
また、本発明の一実施態様においては、前記含フッ素重合体におけるフッ素原子含有率が５〜６０質量％であり、かつ下式で表される割合Ｐが０．１〜４．５質量％であることを特徴とする。
（割合Ｐ）＝［（含フッ素重合体の全単位に対する生体親和性基を有する単位の割合（質量％））／（含フッ素重合体のフッ素原子含有率（質量％））］×１００
【００１１】
また、本発明の一実施態様においては、前記被覆層の厚さが１ｎｍ〜１００μｍであることを特徴とする。
【００１２】
また、本発明の一実施態様においては、前記ＣＤ３を細胞表面に発現する細胞集団が、Ｔ細胞集団であることを特徴とする。
【００１３】
また、本発明の一実施態様においては、前記ステップ（ｂ）が、前記ステップ（ａ）で分離された単核球集団から、さらにＣＤ１９を細胞表面に発現する細胞集団、及びＣＤ５６を細胞表面に発現する細胞集団を除去するステップであることを特徴とする。
【００１４】
また、本発明の一実施態様においては、前記ＣＤ１９を細胞表面に発現する細胞集団が、Ｂ細胞集団であり、前記ＣＤ５６を細胞表面に発現する細胞集団が、ＮＫ細胞集団である
ことを特徴とする。
【００１５】
また、本発明の一実施態様においては、前記ステップ（ｃ）の後に、（ｄ）：前記ステップ（ｃ）で培養された細胞集団を、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を含む培地でさらに培養するステップ、を含むことを特徴とする。
【００１６】
また、本発明の一実施態様においては、前記ステップ（ｃ）における培養期間が２週間〜５週間であり、前記ステップ（ｄ）における培養期間が２日間〜１４日間であることを特徴とする。
【００１７】
また、本発明の一実施態様においては、前記ステップ（ｄ）の後に、（ｅ）：前記ステップ（ｄ）で培養された細胞集団を、ＯＫ−４３２によって刺激するステップ、を含むことを特徴とする。
【００１８】
また、本発明の一実施態様においては、前記採取された血球細胞集団は、採取された末梢血、臍帯血、骨髄及び／又はリンパ節由来の血球細胞集団であることを特徴とする。
【００１９】
また、本発明の一実施態様においては、前記採取された血球細胞集団が、採取された末梢血からアフェレーシス法により採取された血球細胞集団であることを特徴とする。
【００２０】
また、上記に挙げた本発明の一又は複数の特徴を任意に組み合わせた発明も、本発明の範囲に含まれることは言うまでもない。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、本願の実施例において行った細胞培養過程（Ｎｅｗ  Ｃｏａｔ，  ＭＰＣ，  Ａｄｈｅｓｉｏｎ）の概略図を示す。
【図２】図２は、Ｆｉｃｏｌｌによる分離後の単核球集団、及び、さらにＣＤ３発現細胞、ＣＤ１９発現細胞、及び、ＣＤ５６発現細胞を除去した後の単核球集団の組成をフロー・サイトメトリー法によって調べた結果を示す。
【図３】図３は、それぞれの培養条件における、細胞数の推移を示す（Ｄａｙ０〜２９）。
【図４】図４は、それぞれの培養条件における、ＣＤ１１ｃ陽性細胞数の推移を示す（Ｄａｙ０〜２９）。
【図５】図５は、それぞれの培養条件における、Ｄａｙ０〜２９でのＣＤ１１ｃ陽性細胞数の増幅倍率を示す
【図６】図６は、培養終了時の最終産物における、細胞表面マーカーの発現を示す（ＣＤ１１ｃ、ＨＬＡ−ＡＢＣ、ＣＤ８３）
【図７】図７は、培養終了時の最終産物における、細胞表面マーカーの発現を示す（ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＨＬＡ−ＤＲ）
【発明を実施するための形態】
【００２２】
＜ステップ（ａ）＞
本発明の方法のステップ（ａ）において用いられる血球細胞集団の由来は、例えば、採取された末梢血、採取された骨髄、採取されたリンパ節、又は、採取された臍帯血であってよいが、本発明の方法を実施し得る限りにおいて、これらに限定されず、様々な由来の血球細胞集団を用いることができる。例えば、胚性幹細胞、成体幹細胞、又は、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞から誘導される造血幹細胞（あるいは当該造血幹細胞から調製される血球細胞集団）等も、本発明の方法のステップ（ａ）における「採取された血球細胞集団」に含まれ得る。ただし、本発明の方法のステップ（ａ）において用いられる血球細胞集団の由来は、末梢血であることが好ましい。
【００２３】
本発明の方法のステップ（ａ）において、血球細胞集団から単核球集団を分離する方法は限定されず、当業者が様々な方法で実施することができる。例えば、密度勾配遠心分離法によって血球細胞集団から単核球集団を分離することができる。
【００２４】
＜ステップ（ｂ）＞
本発明の方法のステップ（ｂ）において、単核球集団から、ＣＤ３を細胞表面に発現する細胞集団を除去する方法は限定されず、当業者が様々な方法で実施することができる。例えば、ライフテクノロジーズ社から販売されるＤｙｎａｌ社製Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）や、ミルテニーバイオテック社のＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（商標）やＣＤ３マイクロビーズを含むがこれらに限定されない免疫磁気ビーズを用いて、ＣＤ３を細胞表面に発現する細胞集団を除去することができる。あるいは、フロー・サイトメトリー法その他の免疫学的分離手段を用いて、ＣＤ３を細胞表面に発現する細胞集団を除去してもよく、ＣＤ３を細胞表面に発現する細胞集団（例えば、Ｔ細胞）に対する特異的結合パートナーを利用して、ＣＤ３を細胞表面に発現する細胞集団だけを選択的に傷害又は死滅させることによって、除去してもよい。
【００２５】
また、本発明の方法のステップ（ｂ）においては、ＣＤ３を細胞表面に発現する細胞集団に加えて、ＣＤ１９を細胞表面に発現する細胞集団、及び、ＣＤ５６を細胞表面に発現する細胞集団を単核球集団から除去してもよい。ＣＤ１９を細胞表面に発現する細胞集団を除去する方法、及び、ＣＤ５６を細胞表面に発現する細胞集団を除去する方法は限定されず、当業者が様々な方法で実施することができる。例えば、ミルテニーバイオテック社のＣＤ１９マイクロビーズやＣＤ５６マイクロビーズを用いてＣＤ１９を細胞表面に発現する細胞集団、及び、ＣＤ５６を細胞表面に発現する細胞集団を除去することができる。あるいは、フロー・サイトメトリー法その他の免疫学的分離手段を用いてＣＤ１９を細胞表面に発現する細胞集団及びＣＤ５６を細胞表面に発現する細胞集団を除去してもよく、ＣＤ１９を細胞表面に発現する細胞集団（例えば、Ｂ細胞）及びＣＤ５６を細胞表面に発現する細胞集団（例えば、ＮＫ細胞）に対する特異的結合パートナーを利用して、ＣＤ１９を細胞表面に発現する細胞集団及びＣＤ５６を細胞表面に発現する細胞集団だけを選択的に傷害又は死滅させることによって、除去してもよい。
【００２６】
なお、本発明の方法において、単核球集団をＧＭ−ＣＳＦ及びＳＣＦを含む培地で培養するステップ（すなわち、ステップ（ｃ））の前に、単核球集団からＣＤ３を細胞表面に発現する細胞集団（特に、Ｔ細胞）を除去するのは、単にリンパ球を除去して単核球集団を濃縮するためではない。例えば特開２０１１−２３９７０１に示すとおり、ＧＭ−ＣＳＦ及びＳＣＦを含むサイトカインカクテルが添加された培地で単核球集団を培養すると、樹状細胞自体が増殖するよりもＴ細胞の増殖促進が著しく、樹状細胞の割合の低い細胞集団が形成される。これは、Ｔ細胞との相互作用によって、樹状細胞自体の増殖及び／又は分化が妨げられるためと考えられる。そこで、樹状細胞が不必要にＴ細胞と相互作用しないように、Ｔ細胞を除去するのである。この工程を含むことによって、本願の実施例に示すように、ほぼ１００％の割合で樹状細胞を含み、且つ、増殖効率の良い樹状細胞集団を調製することができる。
【００２７】
＜ステップ（ｃ）＞
本発明の方法においては、上記の方法によって調製された単核球集団を、生体親和性基を有する単量体に基づく重合単位を有する含フッ素重合体からなるコーティング剤によってコーティングされた培養容器を用いて培養する。本容器を用いて単核球集団を培養することにより、例えば、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）を含む非フッ素の適合性ポリマーコーティングが施された細胞低吸着培養容器や、コロナ放電処理により表面が親水性処理されたポリスチレン細胞接着性培養容器（例えば、ＮｕｎｃｌｏｎＴＭ  Ｄｅｌｔａ  Ｓｕｒｆａｃｅ、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を用いて培養する場合と比較して、極めて効率よく樹状細胞を調製することができる（本願の実施例を参照のこと）。このような培養容器の例は、ＥＺ−ＢｉｎｄＳｈｕｔ（登録商標）ＳＰ（ＡＧＣテクノグラス株式会社製）である。
【００２８】
好ましい生体親和性基
生体親和性基としては、タンパク質の吸着防止効果が高い被覆層を形成しやすい点から、下記の基（１）、基（２）及び基（３）からなる群から選ばれる少なくとも１種が好ましい。生体親和性基としては、タンパク質の吸着防止効果が得られやすい点から、基（１）のみ、又は、基（２）及び基（３）のいずれか一方もしくは両方が好ましく、基（１）、基（２）又は基（３）のいずれか１つが特に好ましい。含フッ素重合体（Ａ）は基（１）〜（３）を含むと生体適合性に優れる。
【００２９】
【化１】
2018007599.tif 000002
【００３０】
ただし、前記式中、ｎは１〜１０の整数であり、ｍは基（１）が含フッ素重合体（Ａ）において側鎖に含まれる場合は１〜１００の整数であり、主鎖に含まれる場合は５〜３００であり、Ｒ１〜Ｒ３は、それぞれ独立に、炭素数１〜５のアルキル基であり、ａは１〜５の整数であり、ｂは１〜５の整数であり、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立に、炭素数１〜５のアルキル基であり、Ｘ−は下記の基（３−１）又は下記の基（３−２）であり、ｃは１〜２０の整数であり、ｄは１〜５の整数である。
【００３１】
【化２】
2018007599.tif 000003
【００３２】
基（１）：
基（１）は、血液中等で運動性が高く、被覆層の表面に吸着しようとするタンパク質が吸着しにくい。
基（１）は、含フッ素重合体（Ａ）の主鎖に含まれていてもよく、側鎖に含まれていてもよい。
基（１）におけるｎは、タンパク質が吸着しにくい点から、１〜６の整数が好ましく、１〜４の整数が特に好ましい。
基（１）は、直鎖状であってもよく、分岐鎖状であってもよい。タンパク質の吸着抑制効果がより高い点から、基（１）は直鎖状であることが好ましい。
基（１）におけるｍは、基（１）が含フッ素重合体（Ａ）の側鎖に含まれる場合、耐水性に優れる点から、１〜４０が好ましく、１〜２０が特に好ましい。
基（１）におけるｍは、基（１）が含フッ素重合体（Ａ）の主鎖に含まれる場合、耐水性に優れる点から、５〜３００が好ましく、１０〜２００が特に好ましい。
ｍが２以上の場合、基（１）の（ＣｎＨ２ｎＯ）は１種であってもよく、２種以上であってもよい。また、２種以上の場合、その並び方はランダム、ブロック、交互のいずれであってもよい。ｎが３以上の場合、直鎖構造であってもよく、分岐構造であってもよい。
含フッ素重合体（Ａ）が基（１）を有する場合、含フッ素重合体（Ａ）が有する基（１）は、１種でもよく、２種以上でもよい。
【００３３】
基（２）：
基（２）は、血液中のリン脂質に対して強い親和性を持つ一方、血漿タンパク質に対する相互作用力は弱い。そのため、基（２）を有する含フッ素重合体（Ａ）を用いることで、例えば、血液中では被覆層上にリン脂質が優先して吸着し、該リン脂質が自己組織化して吸着層が形成されると考えられる。その結果、表面が血管内皮表面に類似した構造となるために、フィブリノーゲン等のタンパク質の吸着が抑制される。
基（２）は、含フッ素重合体（Ａ）の側鎖に含まれることが好ましい。
基（２）におけるＲ１〜Ｒ３は、それぞれ独立に、炭素数１〜５のアルキル基であり、原料の入手容易性の点から、炭素数１〜４のアルキル基が好ましく、メチル基が特に好ましい。
基（２）におけるａは、１〜５の整数であり、原料の入手容易性の点から、２〜５の整数が好ましく、２が特に好ましい。
基（２）におけるｂは１〜５の整数であり、タンパク質が吸着しにくい点から、１〜４の整数が好ましく、２が特に好ましい。
含フッ素重合体（Ａ）が基（２）を有する場合、含フッ素重合体（Ａ）が有する基（２）は、１種でもよく、２種以上でもよい。
【００３４】
基（３）：
基（３）を有する含フッ素重合体（Ａ）を用いることで、基（２）を有する含フッ素重合体（Ａ）を用いる場合と同様の理由からタンパク質の吸着が抑制される。
基（３）は、含フッ素重合体（Ａ）の側鎖に含まれることが好ましい。
基（３）におけるＲ４及びＲ５は、それぞれ独立に、炭素数１〜５のアルキル基であり、タンパク質が吸着しにくい点から、炭素数１〜４のアルキル基が好ましく、メチル基が特に好ましい。
基（３）におけるｃは、１〜２０の整数であり、含フッ素重合体（Ａ）が柔軟性に優れる点から、１〜１５の整数が好ましく、１〜１０の整数がより好ましく、２が特に好ましい。
基（３）におけるｄは、１〜５の整数であり、タンパク質が吸着しにくい点から、１〜４の整数が好ましく、１が特に好ましい。
【００３５】
好ましい含フッ素重合体
好ましい含フッ素重合体は、下記の１）〜３）のいずれかである。
１）下式（ｍ１）で表される単量体に由来する単位（ｍ１）と、下式（ｍ２）で表される単量体に由来する単位（ｍ２）及び下式（ｍ３）で表される単量体に由来する単位（ｍ３）からなる群から選ばれる少なくとも１種とを有する含フッ素重合体。
【００３６】
【化３】
2018007599.tif 000004
【００３７】
（ただし、前記式中、Ｒ6は水素原子、塩素原子又はメチル基であり、ｅは０〜３の整数であり、Ｒ7及びＲ8はそれぞれ独立に水素原子、フッ素原子又はトリフルオロメチル基であり、Ｒf1は炭素数１〜２０のペルフルオロアルキル基であり、Ｒ9は水素原子、塩素原子又はメチル基であり、Ｑ1は−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−又はＣ（＝Ｏ）−ＮＨ−であり、Ｒ1〜Ｒ3はそれぞれ独立に炭素数１〜５のアルキル基であり、ａは１〜５の整数であり、ｂは１〜５の整数であり、Ｒ10は水素原子、塩素原子又はメチル基であり、Ｑ2は−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−又はＣ（＝Ｏ）−ＮＨ−であり、Ｒ4及びＲ5はそれぞれ独立に炭素数１〜５のアルキル基であり、Ｘ-は下式（３−１）で表される基又は下式（３−２）で表される基であり、ｃは１〜２０の整数であり、ｄは１〜５の整数である。）
【００３８】
【化４】
2018007599.tif 000005
【００３９】
２）下式（ｍ１）で表される単量体に由来する単位（ｍ１）と、下式（ｍ４）で表される単量体に由来する単位（ｍ４）とを有する含フッ素重合体。
【００４０】
【化５】
2018007599.tif 000006
【００４１】
（ただし、前記式中、Ｒ6は水素原子、塩素原子又はメチル基であり、ｅは０〜３の整数であり、Ｒ7及びＲ8はそれぞれ独立に水素原子、フッ素原子又はトリフルオロメチル基であり、Ｒf1は炭素数１〜２０のペルフルオロアルキル基であり、Ｒ11は水素原子、塩素原子又はメチル基であり、Ｑ3は−ＣＯＯ−又はＣＯＯ（ＣＨ2）h−ＮＨＣＯＯ−（ただし、ｈは１〜４の整数である。）であり、Ｒ12は水素原子又は（ＣＨ2）i−Ｒ13（ただし、Ｒ13は炭素数１〜８のアルコキシ基、水素原子、フッ素原子、トリフルオロメチル基、ヒドロキシ基又はシアノ基であり、ｉは１〜２５の整数である。）であり、ｆは１〜１０の整数であり、ｇは１〜１００の整数である。）
【００４２】
３）下式（ｍ６）で表される単量体に由来する単位（ｍ６）を含むセグメント（Ｉ）と、下式（６）で表される構造を有する高分子アゾ開始剤に由来する分子鎖を含むセグメント（ＩＩ）とを有する含フッ素重合体。
【００４３】
【化６】
2018007599.tif 000007
【００４４】
（ただし、前記式中、Ｒ16は水素原子、塩素原子又はメチル基であり、Ｑ5は単結合又は２価の有機基であり、Ｒ17は炭素原子と炭素原子の間にエーテル性酸素原子を有していてもよい炭素数１〜６のポリフルオロアルキル基であり、αは５〜３００の整数であり、βは１〜２０の整数である。）
【００４５】
上記含フッ素重合体におけるフッ素原子含有率は、例えば５〜６０質量％とすることができ、１０〜５０質量％であることが好ましく、１５〜４０質量％であることがより好ましい。また、下式で表される割合Ｐが０．１〜４．５質量％であることがさらに好ましい。
（割合Ｐ）＝［（含フッ素重合体の全単位に対する生体親和性基を有する単位の割合（質量％））／（含フッ素重合体のフッ素原子含有率（質量％））］×１００
【００４６】
被覆層の厚さは、例えば１ｎｍ〜１００μｍとすることができ、５ｎｍ〜５０μｍとすることが好ましく、１０ｎｍ〜１０μｍとすることがより好ましい。
【００４７】
本発明の方法において、細胞を培養するための培地としては、ＩＭＤＭ培地の他、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０、Ｘ−ＶＩＶＯ１５培地を含むが、これらに限らない、血液系細胞の増殖に適する培地が用いられる。これらの培地には、ウシ胎仔血清が添加される場合がある。ウシ胎仔血清の濃度は５ないし２０％の場合があり、１０％がより好ましい。代替策として、ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社その他から入手可能なヒトＡＢ型血清や、日本赤十字社から入手可能な献血ヒト血清アルブミンが添加される場合がある。ヒトＡＢ型血清は０ないし１５％の濃度で添加されることが好ましく、献血ヒト血清アルブミンは０ないし１０％の濃度で添加されることが好ましい。
【００４８】
本発明の方法は、ＧＭ−ＣＳＦ及びＳＣＦを含む培地を用いて細胞を培養するステップを含む。このステップにおいて、前記ＧＭ−ＣＳＦ及びＳＣＦを含む培地は、ＧＭ−ＣＳＦ及びＳＣＦを含むが、これら以外のサイトカインが実質的に含まれない培地であってもよい。
【００４９】
＜ステップ（ｄ）＞
本発明の方法は、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を含む培地を用いて細胞を培養するステップを含むことがある。このステップにおいて、前記ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を含む培地は、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を含むが、ＳＣＦが含まれない培地であってよく、また、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を含むが、これら以外のサイトカインが実質的に含まれない培地であってもよい。
【００５０】
＜ステップ（ｅ）＞
本発明の方法は、樹状細胞を増幅させるための培養ステップの後、増幅された樹状細胞にＴ細胞刺激能を獲得させるため、ＯＫ−４３２、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＰＧＥ2等の向炎症性メディエーター（好ましくはＯＫ−４３２）で刺激するステップをさらに含んでよい。
【００５１】
＜各ステップの培養条件＞
本発明の方法において、培地に添加するサイトカインは、ヒトのアミノ酸配列を有することが好ましく、安全上、組換えＤＮＡ技術で生産されることが好ましい。培地中のＧＭ−ＣＳＦの濃度は、１ないし５００ｎｇ／ｍＬ、１ないし２００ｎｇ／ｍＬ又は１ないし１００ｍｇ／ｍＬの範囲であってよく、より好ましくは、２ないし３００ｎｇ／ｍＬ、５ないし２００ｎｇ／ｍＬ、１０ないし１５０ｎｇ／ｍＬ、２０ないし１２０ｎｇ／ｍＬ又は３０ないし１００ｎｇ／ｍＬの範囲であってよい。培地中のＳＣＦ又はＩＬ−４の濃度は、０．５ないし５００ｎｇ／ｍＬ、０．５ないし１００ｎｇ／ｍＬ又は０．５ないし５０ｎｇ／ｍＬの範囲であってよく、より好ましくは、１ないし３００ｎｇ／ｍＬ、２ないし２００ｎｇ／ｍＬ、５ないし１００ｎｇ／ｍＬ、１０ないし７０ｎｇ／ｍＬ、２０ないし６０ｎｇ／ｍＬ又は２５ないし５０ｎｇ／ｍＬの範囲であってよい。
【００５２】
本明細書において、あるサイトカインが実質的に含まれない培地とは、例えば、正常血清中の当該サイトカインの濃度を著しく超えない範囲で当該サイトカインを含む培地であってよい。より具体的には、正常血清中における当該サイトカインの濃度の３倍以下、２倍以下、１倍以下、１／２以下、１／３以下、又は、１／５以下で当該サイトカインを含む培地であってよい。あるいは、当該サイトカインの濃度が０の場合の樹状細胞又はその前駆細胞の挙動と実質的に同じ挙動をすることを条件として、当該サイトカインを５０ｎｇ／ｍＬ以下、４０ｎｇ／ｍＬ以下、３０ｎｇ／ｍＬ以下、２０ｎｇ／ｍＬ以下、１０ｎｇ／ｍＬ以下、５ｎｇ／ｍＬ以下、３ｎｇ／ｍＬ以下、又は、１ｎｇ／ｍＬ以下の濃度で含む培地であってよい。
【００５３】
本発明の方法では、ＧＭ−ＣＳＦ及びＳＣＦを含む培地で増殖した樹状細胞の前駆細胞は、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を含む培地に切り替えることによって樹状細胞のサブセットの変更が可能になる。ここで、ＧＭ−ＣＳＦ及びＳＣＦを含む培地で増殖する細胞は、いつでもＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４によって樹状細胞に分化するように決定された細胞である。したがって、ＧＭ−ＣＳＦ及びＳＣＦを含む培地からＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を含む培地への切り替えは、培養開始後どの時点で行ってもかまわない。しかし、本発明の目的は樹状細胞を大量に調製することであるから、ＧＭ−ＣＳＦ及びＳＣＦを含む培地で培養する期間が２週間〜５週間であるとより多くの樹状細胞が得られる点で有利である。一方、培養期間が２週間未満及び５週間を超えた場合は、得られる樹状細胞の細胞数が十分でない場合がある。
【００５４】
実際には、本願の実施例においても示されるとおり、ＧＭ−ＣＳＦ及びＳＣＦを含む培地での培養開始から３週間後まではＣＤ１１ｃ陽性細胞は増加するが、４週間後になると、増殖速度が低下する。そこで、より大量の樹状細胞を得ることと、より短期間に樹状細胞を得ることとの折り合いをつけるのは、ＧＭ−ＣＳＦ及びＳＣＦを含む培地での増殖が、治療効果に必要な樹状細胞の細胞数（約１０9個）を達成できるとき、又は、増殖速度が低下して、これ以上ＧＭ−ＣＳＦ及びＳＣＦを含む培地で培養しても樹状細胞の前駆細胞が増えない状態となるときである。
【００５５】
したがって、本発明の方法において、細胞をＧＭ−ＣＳＦ及びＳＣＦを含む培地で培養するステップにおける培養期間は、２週間〜５週間であってよく、より好ましくは２週間〜３週間であってよい。また、ＧＭ−ＣＳＦ及びＳＣＦを含む培地からＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を含む培地への切り替えた後の、細胞をＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を含む培地で培養するステップにおける培養期間の培養期間は、２日間〜１４日間であってよく、２日間〜７日間であることがより好ましい。
【００５６】
＜実施態様＞
本発明の一実施態様においては、採取された血球細胞集団から分離された単核球集団を一旦凍結保存し、その後、好ましいタイミングで融解させて次のステップに供してもよい。また、本発明の一実施態様においては、前記単核球集団から、ＣＤ３を表面に発現する細胞等が除去された後で、残った単核球細胞集団を凍結保存し、その後、好ましいタイミングで融解させて次のステップに供してもよい。細胞の凍結には、例えば、株式会社リンフォテック製のバンバンカー（商標）や、その他の市販の細胞凍結保存液又は自家調製した細胞凍結保存液を用いてよい。
【００５７】
＜樹状細胞の用途＞
本発明の方法で調製された樹状細胞は、ＯＫ−４３２、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＰＧＥ2等の向炎症性メディエーター等で刺激されて、Ｔ細胞刺激能を獲得した後に、患者に移植される場合がある。癌の治療のためには、それぞれのがんに特異的に発現する抗原で刺激される場合がある。例えば、前立腺癌、非小細胞肺がん及び高リスクメラノーマでは、それぞれ、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、腫瘍抗原ＭＡＧＥ−Ａ３及び癌精巣抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１で刺激される場合がある。単一の癌に対する治療のために、複数の癌特異的抗原でそれぞれ単独に刺激された樹状細胞を組み合わせたり、あるいは、複数の癌特異的抗原で同時に刺激された樹状細胞を用いたりする場合もある。
【００５８】
本発明の方法によって調製された樹状細胞は、疾患の治療のための医薬品組成物（細胞医薬品組成物等の再生医療等製品を含む）としてさらに調製されてもよい。例えば、本発明の方法で調製された樹状細胞とともに、他の療法のための薬剤、例えば、化学療法剤、放射線療法剤が配合される場合がある。かかる薬剤には、ＣＤＤＰ、ＴＳ−１、Ｇｅｍｚａｒ等の癌細胞の増殖を抑制する薬剤や、ＩＬ−１２ｐ７０、ＰＧＥ２等の癌細胞を攻撃する細胞傷害性Ｔ細胞の活性を増強する因子の組換えタンパク質や、ＩＬ−１０等の前記細胞傷害性Ｔ細胞の活性を抑制する因子に対する阻害剤、例えば、抗体、短鎖干渉ＲＮＡ等が含まれるが、これらに限定されない。
【００５９】
本発明の方法によって調製された樹状細胞を含む医薬品組成物（細胞医薬品組成物等の再生医療等製品を含む）は、医薬品として許容される担体を含む場合がある。担体としては、生細胞を懸濁することができるいずれかの溶液、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、培地、血清等を例示することができる。また、樹状細胞をワクチンとして使用する場合には、免疫原性を増強するために、免疫原性増強剤を併用してもよい。免疫原性増強剤としては、例えば、サイトカイン、細菌毒素、結核菌菌体成分等の免疫促進剤や、ミョウバン、フロイントアジュバントその他のアジュバント剤を例示することができる。
【００６０】
本明細書において用いられる用語は、特に定義されたものを除き、特定の実施態様を説明するために用いられるのであり、発明を限定する意図ではない。
【００６１】
また、本明細書において用いられる「含む」との用語は、文脈上明らかに異なる理解をすべき場合を除き、記述された事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを意図するものであり、それ以外の事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを排除しない。
【００６２】
異なる定義が無い限り、ここに用いられるすべての用語（技術用語及び科学用語を含む。）は、本発明が属する技術の当業者によって広く理解されるのと同じ意味を有する。ここに用いられる用語は、異なる定義が明示されていない限り、本明細書及び関連技術分野における意味と整合的な意味を有するものとして解釈されるべきであり、理想化され、又は、過度に形式的な意味において解釈されるべきではない。
【００６３】
以下において、本発明を、実施例を参照してより詳細に説明する。しかしながら、本発明はいろいろな態様により具現化することができ、ここに記載される実施例に限定されるものとして解釈されてはならない。
【実施例】
【００６４】
＜材料と方法＞
【００６５】
本実施例で行った細胞培養過程の概略を図１に示した。
【００６６】
末梢血の採取
健康なボランティア被検者から末梢血が採取された。本実験は、九州大学医系地区部局臨床研究倫理審査委員会の承認（承認日：平成２５年８月２１日）を得て実施され、前記ボランティア被検者からは書面による同意が得られている。採血は、２２〜２３Ｇ針を取り付けた真空採血管（ＴＥＲＵＭＯ  ベノジェクトＩＩ  ＥＤＴＡ−２Ｎａ）を用いて行うか、あるいはアフェレーシスにより行った。
【００６７】
末梢血からの単核球の分離
得られた血液は、常温に保たれた希釈液１（Ｄ-ＰＢＳ）で２倍希釈され、各遠心管に、希釈血２０ｍＬないし３０ｍＬが、２０ｍＬのＦｉｃｏｌｌ  Ｐａｑｕｅ  ＰＬＥＭＩＵＭ（比重１．０７７）に重層された。遠心は、５００×ｇ、室温で２０分間行われ、ブレーキをかけずに停止された。遠心上清（血漿部分）は数ｍＬを残して除去され、中間層が回収された。遠心管１本ないし２本から回収された前記中間層が１本の新たな遠心管に集められ、前記希釈液１により体積が５０ｍＬに調整され、さらに２回遠心が行われた。その後、上清は除去され、ペレットは、希釈液２（２ｍＭ  ＥＤＴＡ及び２％ウシ胎仔血清が添加されたＰＢＳ）に懸濁された（以下、「単核球懸濁液」という。）。
【００６８】
ＣＤ３発現細胞、ＣＤ１９発現細胞、及び、ＣＤ５６発現細胞の除去
抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ１９抗体、又は、抗ＣＤ５６抗体が固定化された各磁気ビーズ（ＣＤ３マイクロビーズ，ヒト、Ｃａｔ．ｎｏ．１３０−０５０−１０１；ＣＤ１９マイクロビーズ，ヒト、Ｃａｔ．ｎｏ．１３０−０５０−３０１；ＣＤ５６マイクロビーズ，ヒト、Ｃａｔ．ｎｏ．１３０−０５０−４０１（Ｍｉｌｔｅｎｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｋ．Ｋ．））が、前記単核球懸濁液に添加された。前記ビーズを含む単核球懸濁液は、４℃で１５分間静置された。その後、前記磁気ビーズはＬＤカラム及びマニュアル細胞分離装置によって前記懸濁液から分離され、ＣＤ３を表面に発現する細胞（ＣＤ３発現細胞）、ＣＤ１９を表面に発現する細胞（ＣＤ１９発現細胞）、及び、ＣＤ５６を表面に発現する細胞（ＣＤ５６発現細胞）が除去された。
【００６９】
Ｆｉｃｏｌｌによる分離後の単核球集団、及び、ＣＤ３発現細胞、ＣＤ１９発現細胞、及び、ＣＤ５６発現細胞を除去した後の単核球集団の組成をフロー・サイトメトリー法によって調べた結果を、図２に示した。
【００７０】
除去後の細胞集団の培養：培養容器の表面処理の細胞増殖への影響の検討
前記懸濁液に残った細胞（以下、「ＣＤ３-ＣＤ１９-ＣＤ５６-細胞」という）は、１０ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＧＭ−ＣＳＦと、５ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＳＣＦと、１０％ウシ胎仔血清と、抗生物質（ペニシリンＧ１００単位／ｍＬ、硫酸ストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬ）とが添加されたＩＭＤＭ（以下、「ＧＭ／ＳＣＦ培地」という。）で希釈され、生体親和性基を有する単量体に基づく重合単位を含む含フッ素重合体のコーティングが施された細胞低吸着培養容器（ＥＺ−ＢｉｎｄＳｈｕｔ（登録商標）ＳＰ、ＡＧＣテクノグラス株式会社製）（以下「Ｎｅｗ  Ｃｏａｔ」という）、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）を含む生体適合性ポリマーコーティングが施された細胞低吸着培養容器（ＥＺ−Ｂｉｎｄｓｈｕｔ（登録商標）  ＩＩ、ＡＧＣテクノグラス株式会社製、６ウェルプレート）（以下、ＭＰＣという）、及びコロナ放電処理により表面が親水性処理されたポリスチレン細胞接着性培養容器（ＮｕｎｃｌｏｎＴＭ  Ｄｅｌｔａ  Ｓｕｒｆａｃｅ、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製、６ウェルプレート）（以下、Ａｄｈｅｓｉｏｎ）で培養された。
【００７１】
培地交換
培地交換は３ないし４日ごとに行われた。細胞が回収され、５００×ｇ、５分間の遠心により培地が除去され、ペレットの細胞が、前記ＧＭ／ＳＣＦ培地に懸濁され、Ｎｅｗ  Ｃｏａｔ、ＭＰＣ、及び、Ａｄｈｅｓｉｏｎでそれぞれ継続して培養された。
【００７２】
培養中の細胞のモニタリング
培養開始から１週間ごとに、当業者に周知の試薬、装置及び手順に従って、細胞数の計測の他、細胞表面マーカーＣＤ１１ｃ及びＣＤ１４の発現がフロー・サイトメトリー法で解析された。
【００７３】
培地の切り替えによる樹状細胞の成熟
Ｎｅｗ  Ｃｏａｔ、ＭＰＣ、Ａｄｈｅｓｉｏｎにおいて、ＣＤ３-ＣＤ１９-ＣＤ５６-細胞が前記ＧＭ／ＳＣＦ培地で３週間培養された後、樹状細胞の前駆細胞を樹状細胞に分化させるために、培地が切り替えられた。新しい培地は、５０ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＧＭ−ＣＳＦと、５０ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＩＬ−４が添加されたＣｅｌｌＧｒｏ（商標登録）ＤＣ  Ｍｅｄｉｕｍ（（以下、「ＧＭ／ＩＬ−４培地」という。）で、培養開始から３週間後に、ＧＭ／ＳＣＦ培地からＧＭ／ＩＬ−４培地に切り替えられ、さらに１週間培養された。
【００７４】
樹状細胞分化マーカーの検討
培養開始から４週間後のＣＤ３-ＣＤ１９-ＣＤ５６-細胞は、ＯＫ−４３２による刺激への応答を検討するため、ＯＫ−４３２が添加されたＣｅｌｌＧｒｏ  ＤＣ（以下、「ＯＫ−４３２培地」という。）に懸濁され、さらに一晩培養された。上記細胞は、樹状細胞分化マーカー測定のために、常法に従うフロー・サイトメトリー法による解析に供された。用いられた細胞表面マーカーは、ＣＤ１１ｃ、ＨＬＡ−ＡＢＣ、ＣＤ８３、ＣＤ８０、ＣＤ８６、及びＨＬＡ−ＤＲであった。
【００７５】
＜結果＞
【００７６】
増幅培養期間の細胞数推移（ｄａｙ０〜２９）
図３は、ＣＤ３-ＣＤ１９-ＣＤ５６-細胞をＮｅｗ  Ｃｏａｔ、ＭＰＣ、及び、Ａｄｈｅｓｉｏｎそれぞれで培養した細胞の増殖曲線である。いずれの場合も前記ＧＭ／ＳＣＦ培地での３週間の培養において細胞の数が増加し、ＧＭ／ＩＬ−４培地に切り替えられるまで継続して増加した。
【００７７】
増幅培養期間のＣＤ１１ｃ陽性率推移（ｄａｙ０〜２９）
培養開始時の細胞（ｄａｙ０）では、培養０日のＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ５６発現細胞が除去された細胞集団のＣＤ１１ｃ陽性かつＣＤ１４陽性細胞の割合は５２．３％であった（各群共通）。ＣＤ１１ｃ陽性かつＣＤ１４陽性の細胞は、樹状細胞又はその前駆細胞である。これらはＧＭ／ＳＣＦ培地で培養を継続していくに従ってＣＤ１４が次第に陰性に遷移する。Ｎｅｗ  Ｃｏａｔ、ＭＰＣ、Ａｄｈｅｓｉｏｎそれぞれについて、増幅培養期間（ｄａｙ０〜２９）のＣＤ１１ｃ陽性率推移をモニタリングしたところ、いずれもＧＭ／ＳＣＦ培地での培養の第２週〜３週にかけてやや陽性率の低下がみられたものの、ＧＭ／ＩＬ−４培地に切り替えた後、１週間の培養によって（すなわち、ｄａｙ２９において）陽性率は９０％程度まで上昇した（データ図示せず）。
【００７８】
図４（増幅培養期間の細胞数推移（ｄａｙ０〜２９））は、増幅培養期間のＣＤ１１ｃ陽性細胞数の推移を示したものであり、図５はｄａｙ０〜２９でのＣＤ１１ｃ陽性細胞数の増幅倍率を示したものである。いずれの場合も、ＣＤ１１ｃ陽性細胞の数が、培養開始時と、７日目、１４日目、２１日目、２８日目及び２９日目の時点での全細胞数と、それぞれの時点でのＣＤ１１ｃ陽性細胞の割合との積として算出された。Ｎｅｗ  Ｃｏａｔ、Ａｄｈｅｓｉｏｎ、ＭＰＣの順に３週目までＣＤ１１ｃ陽性細胞の数は増加し続け、３週目の段階でそれぞれ培養開始時から１０．７倍、９．４倍、７．０倍になった。その後、ＧＭ／ＩＬ−４培地に切り替え、樹状細胞前駆細胞の樹状細胞への分化誘導段階に入ると、増加速度は低下あるいは停止し、最終的なＣＤ１１ｃ陽性細胞数は、Ｎｅｗ  Ｃｏａｔ、ＭＰＣ、Ａｄｈｅｓｉｏｎの順に１３．３倍、１１．９倍、４．６倍となった。Ａｄｈｅｓｉｏｎは、培養容器への細胞接着の影響により、樹状細胞自体の増殖及び／又は分化が妨げられた、あるいは樹状細胞以外の細胞の増殖が惹起された可能性がある。これにより、本発明の培養においては培養容器のコーティングが重要であり、細胞低吸着性コーティングがなされた培養容器、特に「Ｎｅｗ  Ｃｏａｔ」によるコーティングが最も適していると考えられた。
【００７９】
樹状細胞分化マーカーの解析
図６及び７は、Ｎｅｗ  Ｃｏａｔ、ＭＰＣ、及びＡｄｈｅｓｉｏｎで培養した細胞の、細胞表面マーカーのフロー・サイトメトリー解析結果を比較したグラフである。解析に用いた細胞は、培養開始から３週間後に、ＧＭ／ＳＣＦ培地からＧＭ／ＩＬ−４培地に切り替えられ、さらに１週間培養された後、ＯＫ−４３２培地で一晩培養することによって調製された。図６及び７に示すように、Ｎｅｗ  Ｃｏａｔにおいて、樹状細胞が分化すると発現が増大することが知られているＣＤ８３及びＣＤ８６ともに発現が確認された。また、樹状細胞が抗原提示細胞として機能する際に、抗原の断片と複合体を形成するＨＬＡ分子も、問題なく発現していた。このことから、Ｎｅｗ  Ｃｏａｔで調製された細胞は、樹状細胞としての分化マーカーを発現し、抗原提示細胞としての機能を備えていることが示された。
【００８０】
なお、樹状細胞の標準的な定義する文献（Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０１１；１７：３０６４−３０７６）においては、フロー・サイトメトリーによって、細胞の７０％以上がＭＨＣクラスII及びＣＤ８６を発現していることが樹状細胞の要件として記載されており、本発明の方法によって得られた細胞はこの条件を満たしていることも確認された。
【００８１】
以上の結果から、本発明の方法によれば、従来技術と比較して飛躍的に多くの樹状細胞を得ることができる。すなわち、本発明の方法を用いることにより、樹状細胞移植療法に用いるための樹状細胞数の確保がより容易になる。また、本発明の方法を用いることにより、より短期間で一定数の樹状細胞を得ることができ、樹状細胞移植療法が必要な患者に対して、より早期の治療が可能となる。樹状細胞移植療法においては、治療に用いる樹状細胞の調製がボトルネックとなるため、特に早期の治療が必要な患者に対しては、１日でも早く必要な量の樹状細胞が準備できることは、治療において大きなアドバンテージとなり得る。
【００８２】
また、本発明の方法に用いられる培養容器は、従来の培養容器と比較して、樹状細胞の培養容器への接着が少ないため、本発明の方法を用いれば、実際データとして示した数値以上に多くの樹状細胞を回収できる。さらに、本発明の方法を用いれば、培養容器からの剥離に伴う細胞へのダメージが少なくて済むため、より正常な（あるいは生物活性の高い）樹状細胞を回収し得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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