(57)【要約】【課題】撮像対象物からの反射光と参照光との干渉を利用して容器内の撮像対象物を撮像する技術において、容器の壁面からの反射光に起因する自己相関ノイズを低減する。【解決手段】撮像対象となる生化学試料Ｓｐを含む液体Ｍを貯留可能な貯留空間を有する試料容器１１であって、貯留空間の底面をなす底面部は、光透過性を有する基材１１１と、基材１１１の表面のうち貯留空間に臨む内側表面に設けられ、基材１１１の屈折率と液体の屈折率との中間的な屈折率を有する減反射層１１２とを有する。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
撮像対象となる生化学試料を含む液体を貯留可能な貯留空間を有する試料容器であって、前記貯留空間の底面をなす底面部は、
光透過性を有する基材と、
前記基材の表面のうち前記貯留空間に臨む内側表面に設けられ、前記基材の屈折率と前記液体の屈折率との中間的な屈折率を有する減反射層と
を有する試料容器。
【請求項２】
前記減反射層は、前記基材の屈折率と前記液体の屈折率との中間的な屈折率を有する透明材料により前記基材の前記内側表面を覆って形成された薄膜である請求項１に記載の試料容器。
【請求項３】
前記減反射層は、材料の異なる複数の前記薄膜が積層された構造を有する請求項２に記載の試料容器。
【請求項４】
前記減反射層は、多孔質の微細構造により実効的な屈折率を材料固有の屈折率よりも低下させた層である請求項１に記載の試料容器。
【請求項５】
前記減反射層は、表面の凹凸構造により実効的な屈折率を材料固有の屈折率よりも低下させた層である請求項１に記載の試料容器。
【請求項６】
前記減反射層が前記基材の前記内側表面の表面加工により形成された請求項４または５に記載の試料容器。
【請求項７】
前記減反射層の屈折率は、前記基材の屈折率と水の屈折率との中間的な値である請求項１ないし６のいずれかに記載の試料容器。
【請求項８】
複数の貫通孔が設けられたプレート状部材を備え、シート状の前記基材により前記貫通孔の一端が塞がれた請求項１ないし７のいずれかに記載の試料容器。
【請求項９】
請求項１ないし８のいずれかに記載された試料容器の前記貯留空間に液体とともに貯留された撮像対象となる生化学試料に対し、前記底面部を介して照明光を入射させ、前記生化学試料により反射され前記底面部を介して出射される反射光と参照光とが干渉して生じる干渉光を受光する工程と、
前記干渉光の受光光量に基づいて前記生化学試料の断層画像を作成する工程と
を備える撮像方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、撮像対象物からの反射光と参照光との干渉光成分を検出して撮像を行う技術に関し、特に当該撮像技術に好適な試料容器に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
医学や生化学の技術分野では、容器中で培養された細胞や微生物を観察することが行われる。観察対象となる細胞等に影響を与えることなく観察を行う方法として、顕微鏡等を用いて細胞等を撮像する技術が提案されている。このような技術の１つとして、光コヒーレンストモグラフィ（Optical Coherence Tomography；ＯＣＴ）技術を利用したものがある。この技術は、光源から出射される低コヒーレンス光を照明光として被撮像物に入射させ、被撮像物からの反射光（信号光）と光路長が既知である参照光との干渉光を検出することで、被撮像物からの反射光の深さ方向における強度分布を求めて断層画像化するものである。
【０００３】
細胞等の生化学試料を光学的に観察または撮像する場合、生化学試料は、一般的には液体とともに試料容器中に入った状態で撮像に供される。このような生化学試料の撮像は、例えば試料容器の壁面を介して行うことが可能である。しかしながら、このような壁面を介した撮像に好適な透明材料は、比較的高い屈折率を有するものが多い。このため、容器壁面での光の反射が撮像結果に影響を及ぼすことがある。
【０００４】
このような問題に対応するため、例えば特許文献１に記載の技術では、試料を保持する容器の透明な底面に反射防止コートが施されている。この技術における反射防止コートは、容器底面の下側表面、つまり容器底面と外気との界面に相当する箇所に設けられている。これは、容器材料と空気との屈折率の差が容器材料と液体との屈折率の差よりも大きいことから、容器と外部の空気との界面における反射がより顕著であることに着目したものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１１−２３２０５６号公報（例えば、図３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
一方、ＯＣＴ撮像においては、容器壁面からの反射光が擬似的な参照光として作用し信号光と干渉することで自己相関ノイズと呼ばれるゴースト状ノイズが発生し、画像劣化の原因となる。撮像対象物が細胞等の生化学試料である場合、撮像対象物が半透明体でありその反射率が低いことから容器壁面の反射光の影響が大きい。特に撮像対象物が容器壁面に近接した位置にあるとき、撮像対象物からの反射光が容器壁面からの強い反射光にマスクされてしまい検出不能となることがあり得る。
【０００７】
この場合に問題となるのは、撮像対象物と近接した位置にある容器壁面、つまり容器表面のうち液体と接する側の表面からの反射である。しかしながら、上記した従来技術ではこの点が看過されており、結果として上記従来技術は、ＯＣＴ撮像における自己相関ノイズの低減という目的を達成することができない。
【０００８】
この発明は上記課題に鑑みなされたものであり、撮像対象物からの反射光と参照光との干渉を利用して容器内の撮像対象物を撮像する技術において、容器の壁面からの反射光に起因する自己相関ノイズを低減することのできる技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
この発明の一の態様は、撮像対象となる生化学試料を含む液体を貯留可能な貯留空間を有する試料容器であって、上記目的を達成するため、前記貯留空間の底面をなす底面部は、光透過性を有する基材と、前記基材の表面のうち前記貯留空間に臨む内側表面に設けられ、前記基材の屈折率と前記液体の屈折率との中間的な屈折率を有する減反射層とを有している。
【００１０】
このように構成された発明では、試料容器の底面部の表面のうち、貯留空間内の生化学試料により近い側に位置する内側表面に減反射層が設けられる。そのため、試料容器の底面部と容器内の液体との界面における光反射が抑制され、当該界面における反射光に起因する自己相関ノイズや撮像対象物からの反射光に対するマスキングを低減して、良好な画像品質で撮像を行うことが可能となる。
【００１１】
また、この発明の他の態様は、本発明に係る試料容器の前記貯留空間に液体とともに貯留された撮像対象となる生化学試料に対し、前記底面部を介して照明光を入射させ、前記生化学試料により反射され前記底面部を介して出射される反射光と参照光とが干渉して生じる干渉光を受光する工程と、前記干渉光の受光光量に基づいて前記生化学試料の断層画像を作成する工程とを備える撮像方法である。
【００１２】
このように構成された発明では、試料容器内の液体と接する側の表面に減反射層が設けられた底面部を介して生化学試料を撮像することで、容器と液体との界面における反射光に起因する自己相関ノイズや撮像対象物からの反射光に対するマスキングを低減して、良好な画像品質で撮像を行うことができる。
【発明の効果】
【００１３】
上記のように、本発明によれば、試料容器の底面部のうち容器内の液体と接する面に減反射層が設けられる。そのため、容器と液体との界面における光反射を低減させることが可能であり、反射光に起因する自己相関ノイズや撮像対象物からの反射光に対するマスキングを抑えて良好な画像品質で撮像を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明に係る撮像方法の実施に好適な撮像装置の一構成例を示す図である。
【図２】この撮像装置における撮像原理を説明する図である。
【図３】ＯＣＴ装置の具体的構成例を示す図である。
【図４】ウェル底面部での反射の影響を模式的に示す図である。
【図５】減反射層の他の構成例を示す図である。
【図６】ウェルプレートの全体構造を示す図である。
【図７】細胞観察に好適な撮像処理の内容を示すフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
図１は本発明に係る撮像方法の実施に好適な撮像装置の一構成例を示す図である。この撮像装置１は、培地Ｍ中で培養された細胞や、多数の細胞からなるスフェロイド（細胞集塊）、組織様構造体など（以下、「細胞等」と総称する）を撮像対象物として断層撮像し、得られた断層画像を画像処理して、撮像対象物の立体像を作成する。なお、ここでは培地中のスフェロイドを撮像対象物とした例を説明するが、撮像対象物はこれに限定されない。以下の各図における方向を統一的に示すために、図１に示すようにＸＹＺ直交座標軸を設定する。ここでＸＹ平面が水平面を表す。また、Ｚ軸が鉛直軸を表し、より詳しくは（−Ｚ）方向が鉛直下向き方向を表している。
【００１６】
撮像装置１は保持部１０を備えている。保持部１０は、内部の貯留空間に液体を保持可能なウェルＷと呼ばれる凹部が複数設けられたウェルプレート１１を、その開口面を上向きにして略水平姿勢に保持する。ウェルプレート１１のウェルＷには適宜の培地Ｍが所定量貯留され、培地中ではウェルＷの底面Ｗａ付近にスフェロイドＳｐが培養されている。図１では一部のウェルＷにのみ培地ＭおよびスフェロイドＳｐが担持された状態が記載されているが、１つのウェルプレート１１に設けられた複数のウェルＷのそれぞれでスフェロイドＳｐが培養される。
【００１７】
保持部１０により保持されたウェルプレート１１の下方に、撮像ユニット２０が配置される。撮像ユニット２０には、撮像対象物の断層画像を非接触、非破壊（非侵襲）で撮像することが可能な光干渉断層撮像（Optical Coherence Tomography；ＯＣＴ）装置が用いられる。詳しくは後述するが、ＯＣＴ装置である撮像ユニット２０は、撮像対象物への照明光を発生する光源２１と、ビームスプリッタ２２と、物体光学系２３と、参照ミラー２４と、分光器２５と、光検出器２６とを備えている。
【００１８】
また、撮像装置１はさらに、装置の動作を制御する制御ユニット３０と、撮像ユニット２０の可動機構を制御する駆動制御部４０とを備えている。制御ユニット３０は、ＣＰＵ（Central Processing Unit）３１、Ａ／Ｄコンバータ３２、信号処理部３３、３Ｄ復元部３４、インターフェース（ＩＦ）部３５、画像メモリ３６およびメモリ３７を備えている。
【００１９】
ＣＰＵ３１は、所定の制御プログラムを実行することで装置全体の動作を司り、ＣＰＵ３１が実行する制御プログラムや処理中に生成したデータはメモリ３７に保存される。Ａ／Ｄコンバータ３２は、撮像ユニット２０の光検出器２６から受光光量に応じて出力される信号をデジタルデータに変換する。信号処理部３３は、Ａ／Ｄコンバータ３２から出力されるデジタルデータに基づき後述する信号処理を行って、撮像対象物の断層画像を作成する。３Ｄ復元部３４は、撮像された複数の断層画像の画像データに基づいて、撮像された撮像対象物の立体像（３Ｄ像）を作成する機能を有する。信号処理部３３により作成された断層画像の画像データおよび３Ｄ復元部３４により作成された立体像の画像データは、画像メモリ３６により適宜記憶保存される。
【００２０】
インターフェース部３５は撮像装置１と外部との通信を担う。具体的には、インターフェース部３５は、外部機器と通信を行うための通信機能と、ユーザからの操作入力を受け付け、また各種の情報をユーザに報知するためのユーザインターフェース機能とを有する。この目的のために、インターフェース部３５には、装置の機能選択や動作条件設定などに関する操作入力を受け付け可能な例えばキーボード、マウス、タッチパネルなどの入力デバイス３５１と、信号処理部３３により作成された断層画像や３Ｄ復元部３４により作成された立体像など各種の処理結果を表示する例えば液晶ディスプレイからなる表示部３５２とが接続されている。
【００２１】
また、ＣＰＵ３１は駆動制御部４０に制御指令を与え、これに応じて駆動制御部４０は撮像ユニット２０の可動機構に所定の動作を行わせる。次に説明するように、駆動制御部４０により実行される撮像ユニット２０の走査移動と、光検出器２６による受光光量の検出との組み合わせにより、撮像対象物であるスフェロイド（細胞集塊）Ｓｐの断層画像が取得される。
【００２２】
図２はこの撮像装置における撮像原理を説明する図である。より具体的には、図２（ａ）は撮像ユニット２０における光路を示す図であり、図２（ｂ）はスフェロイドの断層撮像の様子を模式的に示す図である。前記したように、撮像ユニット２０は光干渉断層撮像（ＯＣＴ）装置として機能するものである。
【００２３】
撮像ユニット２０では、例えば発光ダイオードまたはスーパールミネッセントダイオード（ＳＬＤ）などの発光素子を有する光源２１から、広帯域の波長成分を含む低コヒーレンス光ビームＬ１が出射される。光ビームＬ１はビームスプリッタ２２に入射して分岐し、破線矢印で示すように一部の光Ｌ２が１つのウェルＷに向かい、一点鎖線矢印で示すように一部の光Ｌ３が参照ミラー２４に向かう。
【００２４】
ウェルＷに向かった光Ｌ２は、物体光学系２３を経てウェルＷに入射する。より具体的には、ビームスプリッタ２２から出射される光Ｌ２は、物体光学系２３を介してウェル底面Ｗａに入射する。物体光学系２３は、ビームスプリッタ２２からウェルＷに向かう光Ｌ２をウェルＷ内の撮像対象物（この場合にはスフェロイドＳｐ）に収束させる機能と、撮像対象物から出射される反射光を集光してビームスプリッタ２２に向かわせる機能とを有する。図では物体光学系２３は単一の対物レンズにより代表的に表されているが、複数の光学素子が組み合わされたものであってもよい。
【００２５】
物体光学系２３は、駆動制御部４０に設けられた焦点調整機構４１により、Ｚ方向に移動可能に支持されている。これにより、撮像対象物に対する物体光学系２３の焦点位置がＺ方向に変更可能となっている。以下、深さ方向（Ｚ方向）における物体光学系２３の焦点位置を「焦点深さ」と称することがある。物体光学系２３の光軸は鉛直方向と平行であり、したがって平面状のウェル底面Ｗａに垂直である。また、物体光学系２３への照明光の入射方向は光軸と平行であり、その光中心が光軸と一致するように、物体光学系２３の配置が定められている。
【００２６】
ユーザが入力デバイス３５１を介して焦点深さの設定情報を与えることにより、焦点調整機構４１は設定情報に応じて物体光学系２３の焦点位置を変更する。焦点調整機構４１は、例えば物体光学系２３に含まれる対物レンズを光軸方向に移動させることにより、焦点位置を変更することができる。１ステップ当たりの焦点位置の変化量が予め定められたステップ単位で焦点位置を調整する構成であってもよい。
【００２７】
スフェロイドＳｐが光Ｌ２に対する透過性を有するものでなければ、ウェル底面Ｗａを介して入射した光Ｌ２はスフェロイドＳｐの表面で反射される。一方、スフェロイドＳｐが光Ｌ２に対してある程度の透過性を有するものである場合、光Ｌ２はスフェロイドＳｐ内まで進入してその内部の構造物により反射される。光Ｌ２として例えば近赤外線を用いることで、入射光をスフェロイドＳｐ内部まで到達させることが可能である。スフェロイドＳｐからの反射光は散乱光として種々の方向に放射される。そのうち物体光学系２３の集光範囲内に放射された光Ｌ４が、物体光学系２３で集光されてビームスプリッタ２２へ送られる。
【００２８】
参照ミラー２４は、駆動制御部４０に設けられたミラー駆動機構４２により、その反射面を光Ｌ３の入射方向に対し垂直姿勢に、しかも、該入射方向に沿った方向（図ではＹ方向）に移動可能に支持されている。参照ミラー２４に入射した光Ｌ３は反射面で反射されて、入射光路を逆向きに辿るように進む光Ｌ５としてビームスプリッタ２２に向かう。この光Ｌ５が参照光となる。ミラー駆動機構４２により参照ミラー２４の位置が変更されることにより、参照光の光路長が変化する。参照ミラー２４の位置は撮像の用途に応じて自動的に設定されるほか、入力デバイス３５１を介したユーザからの設定入力に応じて適宜変更される。
【００２９】
スフェロイドＳｐの表面もしくは内部の反射面で反射された反射光Ｌ４と、参照ミラー２４で反射された参照光Ｌ５とは、ビームスプリッタ２２を介して光検出器２６に入射する。このとき、反射光Ｌ４と参照光Ｌ５との間で位相差に起因する干渉が生じるが、干渉光の分光スペクトルは反射面の深さにより異なる。つまり、干渉光の分光スペクトルは撮像対象物の深さ方向の情報を有している。したがって、干渉光を波長ごとに分光して光量を検出し、検出された干渉信号をフーリエ変換することにより、撮像対象物の深さ方向における反射光強度分布を求めることができる。このような原理に基づくＯＣＴ撮像技術は、フーリエドメイン（Fourier Domain）ＯＣＴ（ＦＤ−ＯＣＴ）と称される。
【００３０】
この撮像ユニット２０では、ビームスプリッタ２２から光検出器２６に至る干渉光の光路上に分光器２５が設けられている。分光器２５としては、例えばプリズムを利用したもの、回折格子を利用したもの等を用いることができる。干渉光は分光器２５により波長成分ごとに分光されて光検出器２６に受光される。
【００３１】
光検出器２６が検出した干渉光に応じて光検出器２６から出力される干渉信号をフーリエ変換することで、スフェロイドＳｐのうち、光ビームＬ２の入射位置における深さ方向、つまりＺ方向の反射光強度分布が求められる。ウェルＷに入射する光ビームＬ２をＸ方向に走査することで、ＸＺ平面と平行な平面における反射光強度分布が求められ、その結果から当該平面を断面とするスフェロイドＳｐの断層画像を作成することができる。以下、本明細書では、Ｘ方向へのビーム走査によってＸＺ平面と平行な断面における１つの断層画像Ｉｔを取得する一連の動作を、１回の撮像と称することとする。
【００３２】
また、Ｙ方向におけるビーム入射位置を多段階に変更しながら、その都度断層画像の撮像を行うことで、図２（ｂ）に示すように、スフェロイドＳｐをＸＺ平面と平行な断面で断層撮像した多数の断層画像Ｉｔを得ることができる。Ｙ方向の走査ピッチを小さくすれば、スフェロイドＳｐの立体構造を把握するのに十分な分解能の画像データを得ることができる。Ｘ方向およびＹ方向へのビーム走査は、例えば図示しないガルバノミラー等の光路を変化させる光学部品を用いてビーム入射位置をＸＹ方向に変化させる方法、スフェロイドＳｐを担持するウェルＷが設けられたウェルプレート１１と撮像ユニット２０とのいずれかをＸＹ方向に移動させてこれらの相対位置を変化させる方法などにより実現可能である。
【００３３】
なお、上記の原理説明では、撮像ユニット２０において光源２１からの光を照明光と参照光とに分岐させる分波機能、および信号光と参照光とを合成して干渉光を生じさせる機能がビームスプリッタ２２により実現されている。一方、近年では、ＯＣＴ装置においてこのような分波・合波機能を担うものとして、以下に例示するような光ファイバカプラが用いられる場合がある。
【００３４】
図３はＯＣＴ装置の具体的構成例を示す図である。なお、理解を容易にするために、以下の説明では、上記した原理図の構成と同一のまたは相当する構成に同一符号を付すものとする。その構造および機能は、特に説明のない限り上記原理図のものと基本的に同じであり、詳しい説明は省略する。また、光ファイバカプラによる干渉光を検出するＯＣＴ撮像原理も基本的に上記と同じであるので、詳しい説明を省略する。
【００３５】
図３（ａ）に示す構成例では、撮像ユニット２０ａは、ビームスプリッタ２２に代わる分波・合波器として光ファイバカプラ２２０を備えている。光ファイバカプラ２２０を構成する光ファイバの１つ２２１は光源２１に接続されており、光源２１から出射される低コヒーレンス光は、光ファイバカプラ２２０により２つの光ファイバ２２２，２２３への光に分岐される。光ファイバ２２２は物体系光路を構成する。より具体的には、光ファイバ２２２の端部から出射される光はコリメータレンズ２２３を介して物体光学系２３に入射する。撮像対象物からの反射光（信号光）は物体光学系２３、コリメータレンズ２２３を介して光ファイバ２２２に入射する。
【００３６】
他の光ファイバ２２４は参照系光路を構成する。より具体的には、光ファイバ２２４の端部から出射される光はコリメータレンズ２２５を介して参照ミラー２４に入射する。参照ミラー２４からの反射光（参照光）はコリメータレンズ２２５を介して光ファイバ２２４に入射する。光ファイバ２２２を伝搬する信号光と光ファイバ２２４を伝搬する参照光とが光ファイバカプラ２２０において干渉し、干渉光が光ファイバ２２６および分光器２５を介して光検出器２６に入射する。光検出器２６により受光された干渉光から撮像対象物における反射光の強度分布が求められることは上記原理通りである。
【００３７】
図３（ｂ）に示す例でも、撮像ユニット２０ｂに光ファイバカプラ２２０が設けられる。ただし光ファイバ２２４は使用されず、光ファイバ２２２から出射される光の光路に対してコリメータレンズ２２３およびビームスプリッタ２２７が設けられる。そして、前述の原理通り、ビームスプリッタ２２７により分岐される２つの光路にそれぞれ物体光学系２３、参照ミラー２４が配置される。このような構成ではビームスプリッタ２２７により信号光と参照光とが合成され、それにより生じた干渉光が光ファイバ２２２，２２６を通って光検出器２６へ導かれる。
【００３８】
これらの例では、図１では空間中を進行する各光の光路の一部が光ファイバに置き換えられているが動作原理は同じである。これらの例においても、焦点調整機構４１が物体光学系２３をウェルプレート１１に対し接近・離間方向に移動させることにより、撮像対象物に対する物体光学系２３の焦点深さを調整することが可能である。また、ミラー駆動機構４２が参照ミラー２４を光の入射方向に沿って移動させることにより、参照光の光路長を変更可能である。
【００３９】
以下、撮像対象物であるスフェロイドＳｐがウェル底面付近に存在する場合のＯＣＴ撮像における問題点と、その解決方法とについて説明する。なお、これまでウェルＷの底面を単に「ウェル底面Ｗａ」と称してきたが、以下ではより厳密に以下のように定義する。すなわち、ウェルＷの平坦な底面部をなす主面のうち、ウェルＷ内の貯留空間に面する上側の主面を「上部底面Ｗａ」と称する。また、これとは反対側の主面、つまりウェルプレート１１の下面をなし撮像ユニット２０と対向する下側の主面を「下部底面Ｗｂ」と称する。
【００４０】
図４はウェル底面部での反射の影響を模式的に示す図である。より具体的には、図４（ａ）は下方から入射する照明光の反射の態様を例示する図である。また、図４（ｂ）および図４（ｃ）は撮像により得られる断層画像の例を模式的に示す図である。また、図４（ｄ）は反射を低減するためのウェル底面部の構造を示す図である。
【００４１】
図４（ａ）に示すように、ウェルＷに貯留された培地Ｍ中において、スフェロイドＳｐが上部底面Ｗａの近傍にある場合を考える。このとき、ウェルＷの下方から照明光が入射すると、同図に破線矢印で示すようにウェルＷの下部底面Ｗｂで反射する反射光Ｌｂと、実線矢印で示すようにウェルＷの上部底面Ｗａで反射する反射光Ｌａと、スフェロイドＳｐの表面または内部の反射面で反射する反射光Ｌｓとが生じ得る。
【００４２】
ここで、空気の屈折率は約１であり、ウェルＷの底面部を構成する透明材料として使用される樹脂やガラス等の屈折率は１．５程度である。また、培地Ｍは一般的に水を主成分とし、何らかの化学物質が添加されることで若干の屈折率の変化が生じるが、概ね水と同程度の屈折率を有する。ここでは代表的に、水の屈折率の値１．３３を培地Ｍの屈折率と見なすこととする。一方、撮像対象物であるスフェロイドＳｐは液体中の半透明体と見なすことができ、屈折率も水や培地に近く光の反射率は低い。このため、深さ方向の各位置からの反射光の強度を比較すると、図４（ａ）右図に示すように、空気とウェル底面部との界面である下部底面Ｗｂにおける反射が最も強く、培地Ｍとウェル底面部との界面である上部底面Ｗａにおける反射がこれに次ぐ。そして、スフェロイドＳｐからの反射光は、一般的にこれらより弱くなる。
【００４３】
下部底面Ｗｂからの反射光については、ウェルＷの底面部の厚さがスフェロイドＳｐのサイズに対して十分に大きければ、スフェロイドＳｐからの反射光とは分離して検出することが可能である。スフェロイドＳｐの直径が最大でも１００μｍ程度であるのに対し、ウェルＷの底面部の厚さは一般的に１００μｍより大きい。このため下部底面Ｗｂからの反射光が強くても、断層画像への影響については比較的軽微に抑えることが可能である。
【００４４】
一方、上部底面Ｗａからの反射光は、深さ方向において近い距離にあるスフェロイドＳｐからの反射光との分離が困難となる場合がある。また、上部底面Ｗａからの反射光が短い光路長差をもってスフェロイドＳｐからの反射光と混合されることで干渉が生じ得る。つまり、上部底面Ｗａからの反射光が、ＯＣＴ撮像において疑似的な参照光として振る舞うことになる。
【００４５】
これらに起因して、断層画像には次のような影響が現れる。すなわち、図４（ｂ）左に例示する断層画像Ｉｂ１のように、画像中の上部底面Ｗａに対応する深さの位置に上部底面Ｗａの像が強く現れる。また、上部底面Ｗａからの反射光が疑似的な参照光として作用することにより、本来のスフェロイドＳｐの像とは異なる深さにゴースト状の像Ｇが現れる。このようなゴーストは自己相関ノイズと呼ばれるものである。
【００４６】
また、撮像対象物が非常に小さなものである場合、図４（ｃ）左に例示する断層画像Ｉｃ１のように、撮像対象物の像が上部底面Ｗａの像によりマスキングされて明瞭に現れなくなってしまうことがあり得る。
【００４７】
そこで、ウェルプレート１１では、ウェルＷ底面部が図４（ｄ）左図に示す構造となっている。すなわち、ウェルＷの底面部１１０は、照明光に対する光透過性を有する透明な基材１１１と、基材１１１の主面のうち上側、つまり培地Ｍと接する側の表面に形成された減反射層１１２とを有する構造となっている。減反射層１１２は、基材１１１の屈折率と培地Ｍ（代表的には水）の屈折率との中間的な屈折率を有する層であり、例えば後述する材料を基材１１１の表面、より具体的には、ウェルＷ内部の貯留空間に臨む内側表面にコーティングすることにより形成される。このため、ウェルＷの下方からウェル底面部１１０を介して入射する照明光の上部底面Ｗａにおける反射率、および、ウェル底面部１１０を介して下方へ出射されるスフェロイドＳｐからの反射光の上部底面Ｗａにおける反射率がいずれも低減される。
【００４８】
このため、図４（ｄ）右図に示すように、ウェルＷの上部底面Ｗａからの反射光の強度が大きく低下する。その結果、図４（ｂ）右に例示する断層画像Ｉｂ２のように、断層画像に現れる上部底面Ｗａの像および自己相関ノイズによるゴーストの影響を大きく低減させることが可能になる。また、図４（ｃ）右に例示する断層画像Ｉｃ２のように、減反射層がない状態では上部底面Ｗａの像によってマスキングされるような小さな撮像対象物の像もよりはっきりと示すことが可能となる。
【００４９】
前記したように、培地Ｍの屈折率は概ね水と同等の１．３３程度である。一方、基材１１１として一般的に使用されるのは、例えばポリエチレン（屈折率１．５３）、ポリプロピレン（屈折率１．４８）、ポリスチレン（屈折率１．５９）、無アルカリガラス（屈折率１．５１）等であり、これらの屈折率は概ね１．５前後であり、これは培地Ｍの屈折率よりも大きい。減反射層１１２としては、培地Ｍと基材１１１との中間的な屈折率を有するものが好ましい。つまり、減反射層１１２の屈折率は、培地Ｍの屈折率（代表値としては水の屈折率）よりも大きく、基材１１１として用いられる材料の屈折率よりも小さいことが望ましい。
【００５０】
反射率の低下効果を最大化するためには、培地Ｍの屈折率Ｎｍ、基材１１１の屈折率Ｎｓおよび減反射層１１２の屈折率Ｎａの間に次式、
Ｎａ＝（Ｎｍ・Ｎｓ）1/2  …  （式１）
の関係が成立することがより好ましい。屈折率Ｎｍ、Ｎｓの値をそれぞれ１．３３、１．５０とすると減反射層１１２の屈折率Ｎａとして好ましい値は１．４１となる。
【００５１】
これに近い屈折率を有する固体材料で基材１１１へのコーティングにより減反射層１１２を形成することが可能なものとしては、フッ化マグネシウム（屈折率１．３８）、フッ化カルシウム（屈折率１．３９）などの金属フッ化物や、二酸化ケイ素（ホワイトカーボン、屈折率１．４４〜１．５０）などがある。培地Ｍおよび基材１１１の材料が特定されれば、好ましい屈折率を有する材料をより具体的に選出することが可能である。
【００５２】
図５は減反射層の他の構成例を示す図である。図５（ａ）に示す減反射層１１２ａは、互いに屈折率の異なる材料で形成された複数の薄膜の積層体である。ここでは２層として示されているが３層以上であっても構わない。原理図として説明した図４（ｄ）に示される単層の減反射層１１２では、反射防止効果が不十分であったり、反射防止効果が発揮される波長域が限定されたりするケースがあり得る。これを補うために、屈折率や厚さの異なる複数の層を組み合わせることで、広い帯域にわたり優れた反射率低下効果を得ることが可能となる。
【００５３】
また、図５（ｂ）に示す多孔質構造を有する減反射層１１２ｂや、図５（ｃ）に示す微細な凹凸構造を有する減反射層１１２ｃを用いることによっても、同様の効果を得ることができる。これらの構造では、構造のサイズを使用される照明光の波長範囲よりも小さなものとすることで、層内での光散乱を防止することができる。また、当該層の実効的な屈折率が、当該層を構成する物質の屈折率とその周囲の間隙を充填する物質（この場合には培地Ｍ）の屈折率との中間的な値となり、しかもそれらの空間占有率により屈折率が変化する。そのため、目的に応じて所望の屈折率を有する減反射層を実現することが可能である。例えば（式１）で示される屈折率Ｎａと異なる屈折率を有する材料を用いて、（式１）の条件に合致する理想的な減反射層を構成することも可能である。
【００５４】
なお、図５（ｂ）に示す減反射層１１２ｂおよび図５（ｃ）に示す減反射層１１２ｃについては、このような微細構造を有する材料の層が基材１１１に積層されたものであってもよい。また、基材１１１の一方表面に表面加工を施すことで、基材１１１の表面自体がこのような微細構造を持つに至ったものであってもよい。つまり、減反射層１１２が基材１１１と同一材料により構成されていてもよい。
【００５５】
以下において「減反射層１１２」と称するとき、それは図４（ｄ）に示される構成だけでなく、図５（ａ）ないし図５（ｃ）に示された構成も含めた総称として用いられるものとする。
【００５６】
図６はウェルプレートの全体構造を示す図である。より詳しくは、図６（ａ）はウェルプレート１１の分解斜視図であり、また図６（ｂ）はこのウェルプレート１１の部分断面図である。このウェルプレート１１は、略円筒状（より厳密には、底面に向けて断面積が漸減するテーパー付き）の側面形状を有する貫通孔１１３が一定のピッチで規則的に二次元マトリクス配置された上部プレート１１４と、上部プレート１１４の下面に各貫通孔１１３を塞ぐように貼付された下面シート１１５とを有している。
【００５７】
図６（ｂ）に示すように、下面シート１１５は上部プレート１１４の下面に例えば接着によりぴったりと密着されており、上部プレート１１４の貫通孔１１３の側面と、下面シート１１５とによって囲まれた空間が、液体を保持することが可能な貯留空間となっている。すなわち、この貯留空間が液体を保持するウェルＷとして機能し、貫通孔１１３の側面がウェルＷの側壁面をなす。また、下面シート１１５のうち貫通孔１１３の下端側開口に臨む部分が、ウェルＷの底面部１１０をなしている。
【００５８】
つまり、下面シート１１５は、透明な樹脂またはガラスにより形成されたシート状の基材１１１の上面、つまり上部プレート１１４の下面と密着する側の面に、減反射層１１２として機能する表面層が設けられたものである。予めこのような構造として形成された下面シート１１５を上部プレート１１４の下面に貼り付けることにより、貫通孔１１３と下面シート１１５とで形成されるウェルＷの各々を、上記した減反射層１１２を有する構造とすることができる。
【００５９】
なお、ウェルプレートの構造はこれに限定されるものではない。例えば、ウェルの側壁面と底面部とが予め一体的に形成されており、底面部のうちウェル内の貯留空間に臨む内側表面に、後加工により減反射層が形成されるものであってもよい。
【００６０】
次に、上記した撮像装置１およびウェルプレート１１を用いた生化学試料の撮像について説明する。撮像装置１は種々の撮像対象物についてＯＣＴ撮像を実行することが可能なものであるが、上記したウェルプレート１１に担持される細胞等を撮像対象物とする場合には、特にウェル底面付近に存在する撮像対象物を鮮明に撮像することが可能である。
【００６１】
ＯＣＴ撮像は細胞等を非侵襲で撮像することができるため、細胞等の経時変化を観察するのにも適している。以下では、細胞を所定の培養条件下で培養することで作製される生化学試料を定期的に撮像（タイムラプス撮像）することで経時的な観察に供する場合の処理の流れについて説明する。
【００６２】
図７は細胞観察に好適な撮像処理の内容を示すフローチャートである。ここでは生化学試料の準備および培養も含めた観察のための一連の処理について説明するが、撮像装置１が稼働することにより実現される「狭義の撮像処理」は、図７の各ステップのうちステップＳ１０３からＳ１０９までである。
【００６３】
まず、観察対象となる生化学試料が準備される。具体的には、上記した構造を有するウェルプレート１１の各ウェルＷに適宜の種類および量の培地Ｍが注入され、観察対象となる細胞が播種される（ステップＳ１０１）。そして、所定の培養条件で細胞が培養される（ステップＳ１０２）。例えば、温湿度および雰囲気が制御された図示しないインキュベータ内にウェルプレート１１が所定時間保持されることにより、細胞が培養される。これにより撮像対象となる生化学試料（例えば複数の細胞により形成されるスフェロイド）が準備される。
【００６４】
ウェルプレート１１が撮像装置１に搬入され、保持部１０にセットされると（ステップＳ１０３）、ＣＰＵ３１が予め記憶された制御プログラムを実行し装置各部に以下に示す動作を行わせることで、撮像処理が実現される。具体的には、撮像時の条件に関するユーザからの設定入力が受け付けられる（ステップＳ１０４）。設定されるべき撮像条件は主として物体光学系２３の焦点位置と、参照ミラー２４の位置つまり参照光路長とである。その他に、例えば画像の解像度に関する設定入力がなされてもよい。これらの設定に応じて焦点調整機構４１が物体光学系２３を駆動して焦点位置を設定するとともに、ミラー駆動機構４２が参照ミラー２４の位置を設定する（ステップＳ１０５）。
【００６５】
そして、撮像ユニット２０がＸ方向に光走査しながら干渉光のスペクトル情報を取得し（ステップＳ１０６）、それに基づき信号処理部３３が反射光強度分布を算出し（ステップＳ１０７）、被撮像物のうち光が走査された１つのＸＺ断面における断層画像を作成する。作成された断層画像は表示部３５２に表示され（ステップＳ１０８）、ユーザに提示される。
【００６６】
ユーザは、表示される画像を見て撮像範囲や焦点位置等を調整することが可能である。ユーザが焦点位置や撮像範囲を変更したい場合には、入力デバイス３５１を介してその旨の設定入力を行うことができる。ユーザがこれらの撮像条件の変更を希望するときにはステップＳ１０４に戻り（ステップＳ１０９においてＹＥＳ）、撮像条件が再設定される。
【００６７】
このような撮像条件の調整を繰り返し変更が不要となれば（ステップＳ１０９においてＮＯ）、引き続き最終的な撮像が行われる（ステップＳ１１０）。このときの撮像は、１つのＸＺ断面についての撮像であってもよく、また照明光の入射位置をＹ方向に異ならせた複数のＸＺ断面についての撮像であってもよい。撮像により得られた断層画像のデータは画像メモリ３６に保存される。複数のＸＺ断面について撮像が行われた場合、それらの断層画像データから、３Ｄ復元部３４は必要に応じて被撮像物の立体像を作成する。撮像により得られた各種データは適宜ユーザに提示され、ユーザによる観察作業に供される。
【００６８】
引き続き細胞の培養が必要である場合（ステップＳ１１１においてＹＥＳ）、ウェルプレート１１が培養環境に戻されて培養が継続される。その後の必要なタイミングで再びウェルプレート１１が取り出され、撮像に供される。培養継続の必要性がなくなれば（ステップＳ１１１においてＮＯ）、全ての処理が終了する。
【００６９】
以上のように、上記の撮像処理では、撮像対象物である細胞等の生化学試料を液体とともに担持するウェルプレート１１において、各ウェルＷの底面部が次のような構成を有している。すなわち、ウェルＷの底面部は、撮像に用いられる照明光に対して透明な基材１１１のうち液体と接する側の内側表面に減反射層１１２が設けられた構造となっている。
【００７０】
減反射層１１２は、基材１１１の屈折率と液体の屈折率との中間的な屈折率を有している。このため、ウェルＷの底面部（具体的には上部底面Ｗａ）とウェルＷ内の液体との界面における光の反射率が、基材１１１と液体とが直接接する場合よりも低く抑えられている。これにより、上部底面Ｗａでの反射光に起因する自己相関ノイズや小さな撮像対象物に対するマスキングを抑制して、画像品質の良好な断層画像を取得することができる。
【００７１】
以上説明したように、上記実施形態においては、ウェルプレート１１が本発明の「試料容器」として機能している。また、ウェルプレート１１を構成する上部プレート１１３が本発明の「プレート状部材」に相当している。
【００７２】
なお、本発明は上記した実施形態に限定されるものではなく、その趣旨を逸脱しない限りにおいて上述したもの以外に種々の変更を行うことが可能である。例えば、上記した各部材の材料はその一例を示したものであり、本発明の趣旨に適合する範囲において種々の材料を使用することが可能である。例えば、培地Ｍとして軟寒天のようなゲル状のものが用いられてもよく、このようなゲル状の物質も、本発明にいう「液体」に該当するものとする。
【００７３】
また、上記のウェルプレート１１は、それぞれが液体を貯留可能な複数のウェルＷを有するものであるが、本発明の「試料容器」はこのような形態のものに限定されない。例えば、液体を貯留する貯留空間を１つだけ有する「ディッシュ」や「シャーレ」等と称される試料容器においても、その内側表面に減反射層を設けることにより、上記と同様の効果を得ることが可能である。また貯留空間の開口形状も円形に限定されず任意である。
【００７４】
また、上記実施形態のウェルプレート１１においては、底面部の内側表面（上部底面Ｗａ）のみに減反射層１１２が設けられている。これに加えて、下部底面Ｗｂにも減反射層が設けられてもよい。この場合には、光学素子における減反射コーティングとして既に実施されているように、基材１１１の屈折率と空気の屈折率との中間的な屈折率を有する単一のまたは複数種の材料により減反射層が構成されればよい。
【００７５】
以上、具体的な実施形態を例示して説明してきたように、本発明に係る試料容器において、減反射層は、例えば基材の屈折率と液体の屈折率との中間的な屈折率を有する透明材料により基材の内側表面を覆って形成された薄膜であってもよい。このような薄膜で基材の内側表面を覆うことで、基材の内側表面と液体との界面における反射率を低下させることが可能である。
【００７６】
この場合、減反射層は、例えば材料の異なる複数の薄膜が積層された構造を有するものであってもよい。単一の薄膜による減反射層は、反射率の低下効果および有効な波長域において薄膜材料の特性により制約を受けるが、複数種の薄膜を積層することで、より広い波長域で高い反射率低下効果を得ることが可能となる。
【００７７】
また例えば、減反射層は、多孔質の微細構造により実効的な屈折率を材料固有の屈折率よりも低下させた層、あるいは、表面の凹凸構造により実効的な屈折率を材料固有の屈折率よりも低下させた層であってもよい。このような微細構造とすることにより、減反射層を構成する材料固有の屈折率と、微細構造の間隙を充填する液体の屈折率との間の中間的な屈折率を有する層を実現することができる。このような層も減反射層として有効に機能する。
【００７８】
これらの場合において、減反射層は、基材の内側表面の表面加工により形成されたものであってもよい。減反射層は基材とは異なる材料により形成されてもよく、また基材と同一材料により形成されてもよい。基材の表面構造により屈折率を調整する構成においては、基材の表面を加工することで、単一材料により試料容器の底面部を構成することが可能になる。
【００７９】
また、減反射層の屈折率は、基材の屈折率と水の屈折率との中間的な値であってもよい。液体の屈折率はその組成により様々であり、本来的には使用される液体に応じて減反射層の屈折率が最適化されることが望ましい。しかしながら、例えば細胞のような生化学試料を撮像対象とするものでは、液体の主成分は水であり、その屈折率は水と大きく変わらない。そこで、液体の屈折率として近似的に水の屈折率を適用することができる。
【００８０】
また、本発明に係る試料容器は、複数の貫通孔が設けられたプレート状部材を備え、シート状の基材により貫通孔の一端が塞がれた構造であってもよい。このような構成によれば、各貫通孔の内壁面と基材とで囲まれた空間を貯留空間として機能させることができる。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
この発明は、細胞等の生化学試料を担持するための試料容器全般に適用することができる。特に生化学試料をＯＣＴ撮像する目的において好適なものである。したがって、容器中で培養された細胞や細胞集塊を撮像する医学・生化学・創薬の分野において好適に適用することができる。
【符号の説明】
【００８２】
１  撮像装置
１１  ウェルプレート（試料容器）
２０  撮像ユニット
１１１  基材
１１２，１１２ａ，１１２ｂ、１１２ｃ  減反射層
１１３  貫通孔
１１４  上部プレート（プレート状部材）
１１５  下面シート（基材、減反射層）
Ｓｐ  スフェロイド（生化学試料）
Ｗ  ウェル
Ｗａ  上部底面
Ｗｂ  下部底面
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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