(57)【要約】【課題】変異が集中する領域における変異の存在の有無を簡便かつ高感度に検出できる遺伝子の変異検出キット及び遺伝子の変異検出方法を提供する。【解決手段】遺伝子の変異検出キットは、標的遺伝子のエクソン内に含まれる相互に重複しない独立した複数の領域Ｒ１及びＲ２それぞれに、Ｒ１及びＲ２の塩基配列が野生型の場合にハイブリダイズするプローブと、プローブそれぞれがＲ１及びＲ２にハイブリダイズしたことを示す標識物質と、Ｒ１及びＲ２のすべてを、ポリメラーゼ連鎖反応で得られる１つのアンプリコンに含むように設計されたプライマー対と、を備える。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的遺伝子のエクソン内に含まれる相互に重複しない独立した複数の領域それぞれに、該領域の塩基配列が野生型の場合にハイブリダイズするプローブと、
前記プローブそれぞれが前記領域にハイブリダイズしたことを示す標識物質と、
前記複数の領域のすべてを、ポリメラーゼ連鎖反応で得られる１つのアンプリコンに含むように設計されたプライマー対と、
を備える、遺伝子の変異検出キット。
【請求項２】
前記標識物質は、
前記プローブが有する蛍光色素であって、
前記プローブは、
前記蛍光色素の発光を抑制する消光剤をさらに有し、
前記プローブが前記領域にハイブリダイズすると、前記消光剤による前記蛍光色素の発光の抑制が解除される、
請求項１に記載の遺伝子の変異検出キット。
【請求項３】
前記蛍光色素の発光の抑制は、
エキソヌクレアーゼ活性によって前記領域にハイブリダイズした前記プローブが分解されると解除される、
請求項２に記載の遺伝子の変異検出キット。
【請求項４】
前記複数の領域各々には、
複数の部位に変異が含まれ得る、
請求項１から３のいずれか一項に記載の遺伝子の変異検出キット。
【請求項５】
前記標的遺伝子のエクソンの塩基配列は、
βカテニン遺伝子のエクソン３の塩基配列であって、
前記プローブは、
配列番号１に示される塩基配列を有する第１のプローブと、
配列番号２に示される塩基配列を有する第２のプローブと、
を含み、
前記プライマー対は、
配列番号３に示される塩基配列を有するフォワードプライマーと、
配列番号４に示される塩基配列を有するリバースプライマーと、
からなる、
請求項１から４のいずれか一項に記載の遺伝子の変異検出キット。
【請求項６】
次の（ａ）〜（ｄ）を含む反応液でポリメラーゼ連鎖反応を行う反応ステップと、
（ａ）標的遺伝子のエクソン内に含まれる相互に重複しない独立した複数の領域それぞれに、該領域の塩基配列が野生型の場合にハイブリダイズするプローブ、
（ｂ）前記プローブそれぞれが前記領域にハイブリダイズしたことを示す標識物質、
（ｃ）前記複数の領域のすべてを、ポリメラーゼ連鎖反応で得られる１つのアンプリコンに含むように設計されたプライマー対、
（ｄ）前記複数の領域を含む核酸、
前記標識物質に基づいて、前記プローブがそれぞれ前記領域にハイブリダイズしたか否かを判定する判定ステップと、
を含む、遺伝子の変異検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子の変異検出キット及び遺伝子の変異検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんに特徴的な遺伝子変異の検出は、病理標本を用いた形態学的ながんの診断に加えて、がんの診断の有効な方法となりつつある。がんの診断に有用な変異が報告されている遺伝子としては、例えば、成人では、膵がん又は大腸がんのＫＲＡＳ遺伝子、肺がんのＥＧＦＲ遺伝子が挙げられる。一方、小児では、神経芽腫のＡＬＫ遺伝子及び肝芽腫のβカテニン遺伝子が知られている。βカテニン遺伝子の変異は、成人の肝細胞がんの診断に有用なバイオマーカーとしても期待されている。
【０００３】
腫瘍から流出してくる遊離ＤＮＡを血液中等から回収して、遺伝子の変異を検出することでがんを診断するリキッドバイオプシーと言われる方法が開発されつつある。リキッドバイオプシーによれば、遺伝子の変異の検出によって手術による腫瘍の切除又は生検の必要がなくなり、患者の負担が軽減される。リキッドバイオプシーでは、血液中又は体液中にある極めて微量の腫瘍由来のＤＮＡと正常のＤＮＡとが混ざった試料が用いられるため、高感度かつ迅速に遺伝子の変異を検出することが肝要である。
【０００４】
遺伝子の変異の検出には、核酸の塩基配列を一塩基ずつ決定していくダイレクトシークエンス法が用いられる。変異部位が明らかであれば、変異部位を切断する制限酵素による解析法及びインベーダー法等も遺伝子の変異の検出に用いられる。また、変異部位を特異的に増幅するように設計したプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＰＣＲ）法でも変異が検出できる。
【０００５】
特許文献１には、変異を高感度に検出するために、ＰＣＲ法において変異部位に特異的に結合するプローブを用いるＴａｑＭａｎ（商標）  ＰＣＲ法によるＵＧＴ１Ａ１遺伝子の多型検出方法が開示されている。該多型検出方法では、プロモーター領域に存在する多型ＵＧＴ１Ａ１＊２８と、エクソン１に存在する多型ＵＧＴ１Ａ１＊６を含む４２４ｂｐのアンプリコンをＰＣＲ産物として増幅し、ＵＧＴ１Ａ１＊２８の野生型及び変異型をそれぞれ検出するためのプローブ２種と、ＵＧＴ１Ａ１＊６の野生型及び変異型をそれぞれ検出するためのプローブ２種と、を用いて遺伝子型が決定される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１０−２３３４９６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
タンパク質の機能に重要な部位を構成するアミノ酸の変異が、がん等の疾患に関連していることがある。タンパク質の機能に重要な部位は、例えば、βカテニンであればユビキチン化による分解に必要な部位、ＡＬＫであれば活性化部位である。タンパク質の機能に重要な部位をコードする遺伝子の領域において、疾患に関連する変異が集中する領域はホットスポットと言われる。タンパク質を構成するアミノ酸は、４種類の塩基３個からなるコドンで規定される。このため、タンパク質の機能に重要な部位を構成するアミノ酸に変異がある場合、ホットスポットの塩基配列のパターンは、複数あることが通常である。
【０００８】
ホットスポットにおける変異の検出において、ダイレクトシークエンス法は煩雑で時間を要することに加え、検体内のＤＮＡ量が少ない場合は変異の検出が難しい。また、上述の変異部位に特異的なプライマーを用いるＰＣＲ法では、変異部位の塩基の種類ごとにプライマーを設計し、ＰＣＲを繰り返し行う必要がある。
【０００９】
上記特許文献１に開示された多型検出方法では、ホットスポットのように多数の変異が集中する領域で、しかも変異部位の塩基の種類が不明の場合、想定される塩基の種類ごとに異なる蛍光標識を有するプローブが必要なため、プローブの調製作業及び多種類の蛍光の解析作業が煩雑で迅速な解析が困難である。さらに、特許文献１に記載されているように、４２４ｂｐもの大きさのアンプリコンでは、増幅効率及び特異性等が低下するのが通常であり、ＵＧＴ１Ａ１遺伝子以外の遺伝子を対象とした場合に、高い検出感度が得られるのかが不明である。
【００１０】
本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、変異が集中する領域における変異の存在の有無を簡便かつ高感度に検出できる遺伝子の変異検出キット及び遺伝子の変異検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の第１の観点に係る遺伝子の変異検出キットは、
標的遺伝子のエクソン内に含まれる相互に重複しない独立した複数の領域それぞれに、該領域の塩基配列が野生型の場合にハイブリダイズするプローブと、
前記プローブそれぞれが前記領域にハイブリダイズしたことを示す標識物質と、
前記複数の領域のすべてを、ポリメラーゼ連鎖反応で得られる１つのアンプリコンに含むように設計されたプライマー対と、
を備える。
【００１２】
この場合、前記標識物質は、
前記プローブが有する蛍光色素であって、
前記プローブは、
前記蛍光色素の発光を抑制する消光剤をさらに有し、
前記プローブが前記領域にハイブリダイズすると、前記消光剤による前記蛍光色素の発光の抑制が解除される、
こととしてもよい。
【００１３】
また、前記蛍光色素の発光の抑制は、
エキソヌクレアーゼ活性によって前記領域にハイブリダイズした前記プローブが分解されると解除される、
こととしてもよい。
【００１４】
また、前記複数の領域各々には、
複数の部位に変異が含まれ得る、
こととしてもよい。
【００１５】
また、前記標的遺伝子のエクソンの塩基配列は、
βカテニン遺伝子のエクソン３の塩基配列であって、
前記プローブは、
配列番号１に示される塩基配列を有する第１のプローブと、
配列番号２に示される塩基配列を有する第２のプローブと、
を含み、
前記プライマー対は、
配列番号３に示される塩基配列を有するフォワードプライマーと、
配列番号４に示される塩基配列を有するリバースプライマーと、
からなる、
こととしてもよい。
【００１６】
本発明の第２の観点に係る遺伝子の変異検出方法は、
次の（ａ）〜（ｄ）を含む反応液でポリメラーゼ連鎖反応を行う反応ステップと、
（ａ）標的遺伝子のエクソン内に含まれる相互に重複しない独立した複数の領域それぞれに、該領域の塩基配列が野生型の場合にハイブリダイズするプローブ、
（ｂ）前記プローブそれぞれが前記領域にハイブリダイズしたことを示す標識物質、
（ｃ）前記複数の領域のすべてを、ポリメラーゼ連鎖反応で得られる１つのアンプリコンに含むように設計されたプライマー対、
（ｄ）前記複数の領域を含む核酸、
前記標識物質に基づいて、前記プローブがそれぞれ前記領域にハイブリダイズしたか否かを判定する判定ステップと、
を含む。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、変異が集中する領域における変異の存在の有無を簡便かつ高感度に検出できる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】βカテニン遺伝子のエクソン３の塩基配列を示す図である。
【図２】ＫＲＡＳ遺伝子のエクソン２の塩基配列の一部を示す図である。
【図３】βカテニン遺伝子のエクソン３のＡｓｐ３２Ｔｙｒに対応する変異の検出を示す図である。
【図４】βカテニン遺伝子のエクソン３のＴｈｒ４１Ｉｌｅに対応する変異の検出を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明に係る実施の形態について添付の図面を参照して説明する。なお、本発明は下記の実施の形態及び図面によって限定されるものではない。
【００２０】
（実施の形態）
本実施の形態に係る遺伝子の変異検出キットは、プローブと、標識物質と、プライマー対と、を備える。プローブは、標的遺伝子のエクソン内に含まれる相互に重複しない独立した複数の領域それぞれに対応させるため、複数種である。「相互に重複しない独立した複数の領域」とは、同一部位の塩基を共有しない複数の領域を意味する。領域間の間隔は、特に限定されないが、１〜３０ｂｐ、１〜２０ｂｐ又は１〜１０ｂｐである。
【００２１】
各プローブは、当該複数の領域それぞれに、該領域の塩基配列が野生型の場合にハイブリダイズする。１つの領域の長さは、特に限定されず、１５〜３０塩基又は１５〜２５塩基、好ましくは１５〜２０塩基である。以下では、上記標的遺伝子をβカテニン遺伝子とした場合について説明する。
【００２２】
図１は、野生型のβカテニン遺伝子（「ＣＴＮＮＢ１遺伝子」ともいう）のエクソン３の一方の鎖の塩基配列を示す。エクソン３の５’末端側から８０〜９８番目の領域及び５’末端側から１０８〜１２４番目の領域は、上述のホットスポットに相当し、各領域には複数の部位に変異が含まれ得る。より詳細には、ユビキチン化によるβカテニンの分解に必要な部位に含まれるアミノ酸は、エクソン３の５’末端側から８２〜８４番目の塩基からなるコドン（ＧＡＣ）、８５〜８７番目の塩基からなるコドン（ＴＣＴ）、８８〜９０番目の塩基からなるコドン（ＧＧＡ）、９１〜９３番目の塩基からなるコドン（ＡＴＣ）及び９７〜９９番目の塩基からなるコドン（ＴＣＴ）、１０９〜１１１番目の塩基からなるコドン（ＡＣＣ）及び１２１〜１２３番目の塩基からなるコドン（ＴＣＴ）によってコードされる。
【００２３】
本実施の形態では、ホットスポットを考慮して、βカテニン遺伝子のエクソン３内に含まれる相互に重複しない独立した複数の領域を、図１に示す領域Ｒ１及び領域Ｒ２とする。この場合、上記プローブは、例えば、Ｒ１の塩基配列が野生型の場合にＲ１にハイブリダイズする第１のプローブと、Ｒ２の塩基配列が野生型の場合にＲ２にハイブリダイズする第２のプローブと、である。第１のプローブ及び第２のプローブは、それぞれＲ１及びＲ２の塩基配列に相補的な塩基配列を有するものであってもよいし、Ｒ１及びＲ２それぞれの相補鎖の塩基配列に相補的な塩基配列を有するものであってもよい。具体的には、第１のプローブは、配列番号１に示される塩基配列を有し、第２のプローブは、配列番号２に示される塩基配列を有する。
【００２４】
第１のプローブ及び第２のプローブとしてのオリゴヌクレオチドは、既知の方法で合成することができる。オリゴヌクレオチドは、例えば、塩基配列に従って、固相ホスホルアミダイト法及びトリエステル法等の任意の核酸合成法により合成される。オリゴヌクレオチドは、市販の自動オリゴヌクレオチド合成装置で合成することもできる第１のプローブ及び第２のプローブの長さは、特に限定されず、変異を検出したい領域の長さに応じて適宜設定される。第１のプローブ及び第２のプローブの長さは、例えば、それぞれ１０塩基以上、１５〜３０塩基又は１５〜２５塩基、好ましくは１５〜２０塩基である。
【００２５】
上記第１のプローブ及び第２のプローブは、ＰＣＲ法で増幅されたアンプリコンにハイブリダイズさせる。ＰＣＲ法におけるプライマーは、ＤＮＡポリメラーゼによって、鋳型となるＤＮＡに相補的なデオキシヌクレオチド三リン酸がその３’末端に付加されて、５’末端から３’末端の方向に伸長される。ＰＣＲ法では、反応温度の変化により、２本鎖の鋳型のＤＮＡが１本鎖にほどかれ、プライマーが鋳型のＤＮＡにアニーリングされ、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応が行われ、伸長されたプライマーと鋳型のＤＮＡとがほどかれる。これを繰り返すことにより、アンプリコンを増幅することができる。プライマー対とは、例えば、２本鎖の鋳型ＤＮＡのコーディング鎖側を５’末端から３’末端の方向に伸長するためのフォワードプライマーと、非コーディング鎖側を５’末端から３’末端の方向に伸長するためのリバースプライマーとの対をいう。
【００２６】
上記遺伝子の変異検出キットが備えるプライマー対は、Ｒ１及びＲ２のすべてを、ＰＣＲで得られる１つのアンプリコンに含むように設計される。アンプリコンの長さは、Ｒ１及びＲ２のすべてを含むのであれば特に限定されない。ＰＣＲの効率及び特異性を考慮すると、アンプリコンの長さは最長で１００〜２００塩基対程度が好ましい。アンプリコンの長さとしては、３０〜２００、５０〜１５０又は６０〜１００塩基対が好ましい。フォワードプライマーはＲ１よりも５’末端側に設計され、リバースプライマーは、Ｒ２よりも３’末端側に設計される。例えば、Ｒ１及びＲ２を１つのアンプリコンに含むように設計されるフォワードプライマー及びリバースプライマーは、図１において下線で示された塩基配列に基づいて設計される。好適には、プライマー対は、配列番号３に示す塩基配列を有するフォワードプライマーと、配列番号４に示す塩基配列を有するリバースプライマーと、からなる。
【００２７】
ハイブリダイズの条件は、本技術分野で通常用いられる条件でよい。例えば、Ｒ１の塩基配列が野生型の場合に第１のプローブがＲ１にハイブリダイズする一方で、Ｒ１の塩基配列が野生型と異なる場合には第１のプローブがＲ１にハイブリダイズしないストリンジェントな条件である。ストリンジェントな条件としては、公知の条件を用いてよく、例えば、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ及び６５℃で保温等である。
【００２８】
次に、標識物質について説明する。該標識物質は、相互に異なる複数種の標識物質である。標識物質は、上述の第１のプローブ及び第２のプローブが、それぞれＲ１及びＲ２にハイブリダイズしたことを示すものであれば特に限定されない。
【００２９】
好ましくは、標識物質は第１のプローブ及び第２のプローブがそれぞれ有する第１の蛍光色素及び第２の蛍光色素である。蛍光色素としては、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、Ｙａｋｉｍａ  Ｙｅｌｌｏｗ、ＴＹＥ５６３、ＴＥＸ６１５、ＴＹＥ６６５、Ｃｙ５及びＣｙ３等、本技術分野で用いられるものが適宜用いられる。なお、以下では、第１のプローブに関して主に説明するが、特に言及しない限り第１のプローブと第２のプローブとは同様である。
【００３０】
第１の蛍光色素は、好ましくは、第１のプローブとＲ１とのハイブリダイズを経て蛍光を発する、あるいは蛍光強度を増大させるものである。例えば、第１のプローブは、第１の蛍光色素の発光を抑制する第１の消光剤（クエンチャー）をさらに有し、第１のプローブがＲ１にハイブリダイズすると、第１の消光剤による第１の蛍光色素の発光の抑制が解除されるようにしてもよい。第１の蛍光色素の発光の抑制の態様は特に限定されない。例えば、第１の消光剤は、蛍光共鳴エネルギー移動の消光原理で、第１の蛍光色素の発光を抑制してもよい。消光剤としては、例えばＺＥＮ、ＩＢＦＱ、ＴＡＭＲＡ、ＢＨＱ１、ＢＨＱ２及びＩＢＱＲ等が挙げられる。
【００３１】
第１の蛍光色素の発光の抑制は、第１の蛍光色素が第１の消光剤から離れると解除されるようにしてもよい。この場合、第１の蛍光色素の発光の抑制は、ＰＣＲ法で用いるＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性によってＲ１にハイブリダイズした第１のプローブが分解されると解除されるのが好ましい。このような第１のプローブとしては、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブが挙げられる。
【００３２】
第１の蛍光色素及び第１の消光剤は、第１のプローブの末端に公知の方法で付加される。例えば、第１の蛍光色素が第１のプローブの５’末端に付加され、第１の消光剤が第１のプローブの３’末端に付加される。
【００３３】
第１の蛍光色素及び第１の消光剤を有する第１のプローブは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎ法のプローブであってもよい。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎ法では、第１のプローブは、Ｒ１の塩基配列に相補的な塩基配列を持つ１本鎖ＤＮＡのループと、ループの塩基配列を挟むように設計された互いに相補的な塩基配列（アーム）がアニールした２本鎖のステムと、からなるヘアピン型構造のプローブである。当該プローブの５’末端及び３’末端は、それぞれ蛍光色素及び消光剤で修飾されている。当該プローブは、遊離状態ではヘアピン型構造によって蛍光色素と消光剤とが近接しているため、蛍光色素から発光される蛍光がエネルギー転移により抑制される。Ｒ１にループがハイブリダイズすると、ヘアピン型構造がとれず、蛍光色素及び消光剤の間隔が広がるために抑制が解除されて蛍光色素の蛍光強度が増加する。
【００３４】
また、第１の蛍光色素及び第１の消光剤を有する第１のプローブとして、サイクリングプローブ法のプローブが採用できる。サイクリングプローブ法では、第１のプローブとして、Ｒ１の塩基配列に相補的な塩基配列を有するＲＮＡとＤＮＡとからなるキメラプローブを用いる。キメラプローブの、ＲＮＡの部分を挟んで一方には第１の蛍光色素が、他方には第１の消光剤が付加される。キメラプローブの第１の蛍光色素の発光は、第１の消光剤によって抑制されているが、キメラプローブがＲ１にハイブリダイズすると、ＲＮａｓｅ  ＨによりＲＮＡの部分が切断される。この結果、第１の蛍光色素の発光抑制が解除されて蛍光強度が増加する。
【００３５】
続いて、上記遺伝子の変異検出キットに好適な遺伝子の変異検出方法について説明する。当該遺伝子の変異検出方法は、反応ステップと、判定ステップと、を含む。反応ステップでは、上述のプローブ、標識物質、プライマー対及びＲ１及びＲ２を含む核酸を含む反応液でＰＣＲを行う。以下では、第１の蛍光色素及び第１の消光剤を有する第１のプローブと、第２の蛍光色素及び第２の消光剤を有する第２のプローブとを用いた場合を例に説明する。
【００３６】
Ｒ１及びＲ２を含む核酸は、例えば、被検者又は患者の血液、組織及び腫瘍等からプロテイナーゼＫ／フェノール抽出法、プロテイナーゼＫ／フェノール／クロロホルム抽出法、アルカリ溶解法及びボイリング法等の公知の方法で抽出できる。必要に応じて、抽出した核酸を精製してもよい。ＰＣＲの反応条件は、アンプリコンの増幅効率等を指標に設定すればよい。
【００３７】
判定ステップでは、第１の蛍光色素及び第２の蛍光色素に基づいて、第１のプローブ及び第２のプローブがそれぞれＲ１及びＲ２にハイブリダイズしたか否かを判定する。判定ステップでは、第１の蛍光色素及び第２の蛍光色素の蛍光強度を測定することでハイブリダイズしたか否かを判定できる。判定ステップでは、第１の蛍光色素及び第２の蛍光色素それぞれの励起波長及び検出波長を用いることで、第１の蛍光色素及び第２の蛍光色素の蛍光強度を個別に測定することができる。蛍光強度は、任意の測光装置、例えばリアルタイムＰＣＲ装置でも測定できる。
【００３８】
第１のプローブは、Ｒ１の塩基配列が野生型の場合にＲ１にハイブリダイズする。このため、判定ステップにおいて、第１のプローブがハイブリダイズしないと判定された場合、上記の核酸におけるＲ１に変異があることがわかる。第２のプローブは、Ｒ２の塩基配列が野生型の場合にＲ２にハイブリダイズする。このため、判定ステップにおいて、第２のプローブがハイブリダイズしないと判定された場合、上記の核酸におけるＲ２に変異があることがわかる。通常、変異が存在する場合はＲ１及びＲ２ともに変異が存在するのではなく、Ｒ１及びＲ２のいずれか１か所にのみ変異が存在する。このため、判定ステップにおいて、第１のプローブ及び第２のプローブの双方がハイブリダイズしないと判定された場合、上記の核酸におけるＲ１及びＲ２の双方が欠損しているか、あるいはβカテニン遺伝子が反応液内に存在しないことがわかる。なお、判定ステップにおいて、第１のプローブがハイブリダイズすると判定された場合に、上記の核酸におけるＲ１に変異がない、すなわちＲ１の塩基配列は野生型である、としてもよい。
【００３９】
以上詳細に説明したように、本実施の形態に係る遺伝子の変異検出キットによれば、標的遺伝子のエクソン内に含まれる複数の領域における変異の存在の有無を、変異した塩基の種類又は領域内の部位に制約されることなく検出できる。また、該遺伝子の変異検出キットは、変異を有する微量のＤＮＡの存在を高感度で検出できる。このため、ホットスポットのような変異が集中する領域における変異の存在の有無を簡便かつ高感度に検出できる。
【００４０】
また、上記遺伝子の変異検出キットによって、血液又は体液中の遊離ＤＮＡにおける遺伝子の変異も検出できる。したがって、上記遺伝子の変異検出キットは、診断のみならず、手術又は化学療法の効果判定、さらには再発及び再燃の判定にも利用できる。当該変異検出キットによって、第１の蛍光色素の蛍光強度に基づいて野生型に対する変異の存在比又は変異の頻度を解析することができる。これにより、治療又は処置後の患者における変異ＤＮＡの量的推移を検出できるため、当該変異検出キットは変異の診断又は治療のフォローアップに有用である。
【００４１】
なお、該遺伝子の変異検出キットは、Ｒ１及びＲ２における変異の存在の有無のみの検出を目的にしているため、上記遺伝子の変異検出キットは、変異があるＲ１にハイブリダイズするプローブ及び変異があるＲ２にハイブリダイズするプローブを含まない。
【００４２】
なお、第１の蛍光色素は、第１のプローブがＲ１にハイブリダイズしたことを示すものであれば足りるため、第１のプローブとＲ１とのハイブリダイズを経て蛍光を消光する、あるいは蛍光強度を減少させるものであってもよい。この場合、判定ステップにおいて、蛍光強度が低下したプローブをハイブリダイズしたと判定すればよい。このような第１のプローブとして、例えば蛍光消光プローブ（Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ  Ｐｒｏｂｅ）が挙げられる。蛍光消光プローブは、プローブの末端に蛍光標識されたシトシンを有し、相補的な塩基配列を有する核酸とハイブリダイズすると蛍光強度が低下する。蛍光消光プローブを用いれば、プローブに消光剤を付加しなくても、核酸にハイブリダイズしたことを示すことができる。
【００４３】
なお、標的遺伝子はβカテニン遺伝子に限定されない。標的遺伝子としては、ＫＲＡＳ遺伝子、ＥＧＦＲ遺伝子及びＡＬＫ遺伝子等が挙げられる。ＫＲＡＳ遺伝子に関しては、エクソン２のコドン１２、１３を構成する６個の塩基の変異と膵がん又は大腸がんとの関連が知られている。例えば、図２に示すように、コドン１２、１３を含む領域Ｒ３に対して第１のプローブを設計し、Ｒ３よりも３’末端側の領域Ｒ４に第２のプローブを設定すればよい。Ｒ３及びＲ４を１つのアンプリコンに含むように設計されるフォワードプライマー及びリバースプライマーは、好ましくは図２において下線で示された塩基配列に基づいてそれぞれ設計される。疾患と関連性の高い変異がＲ４になくても、第２のプローブの第２の蛍光色素の蛍光強度をコントロールとすることで、ＰＣＲ及びプローブのハイブリダイズを確認することができる。
【００４４】
また、上記の実施の形態では、標的遺伝子のエクソン内に含まれる相互に重複しない独立した複数の領域として、２個の領域の場合を説明したが、領域の個数は２個に限らない。例えば、標的遺伝子のエクソン内を３個、４個、５個、６個又は７個以上の相互に重複しない独立した領域それぞれに対してプローブを設計してもよい。
【００４５】
なお、上記の反応ステップでは、反応液をドロプレット（ウェル）に分けて、各ドロップレット内でＰＣＲを行うデジタルＰＣＲ法を用いてもよい。デジタルＰＣＲ法によれば、各ドロプレットの第１の蛍光及び第２の蛍光を高精度で定量できるため、変異の存在の有無及び割合をさらに高感度に検出できる。デジタルＰＣＲ法を用いることで、野生型の塩基配列を有する核酸に対して、わずかに存在する変異型の塩基配列を有する核酸を検出することができる。
【実施例】
【００４６】
以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【００４７】
（実施例）
βカテニン遺伝子のエクソン３を標的遺伝子として変異の有無を検出した。βカテニンのＡｓｐ３２をコードするコドンがＴｙｒをコードするコドンに変異したＤＮＡが野生型のＤＮＡに混在するサンプル、及びβカテニンのＴｈｒ４１をコードするコドンがＩｌｅをコードするコドンに変異したＤＮＡが野生型のＤＮＡに混在するサンプルを解析した。Ａｓｐ３２をコードするコドンは、上記Ｒ１に存在する。Ｔｈｒ４１をコードするコドンは、上記Ｒ２に存在する。
【００４８】
小児肝癌（肝芽腫）組織から抽出したＤＮＡを鋳型ＤＮＡとした。詳細には、組織を粉砕し、洗浄後、バッファー（１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）及び１０ｍＭ  ＮａＣｌ）５００μｌに溶解し、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ（１ｍｇ／ｍｌ  ｗｉｔｈ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ａ）５００μｌと、１０％ＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ  ＤｏｄｅｃｙｌＳｕｌｐｈａｔｅ）１０μｌと、を加えて、５０℃１時間又は３７℃一晩反応させた。反応後、フェノール、クロロホルム及びイソアミルアルコールを２５：２４：１で混合した混合液を１ｍｌ加えて除蛋白した後に遠心し、上清を分離した。クロロホルム及びイソアミルアルコールを２４：１で混合した混合液を上清に０．５ｍｌ加えて遠心分離した。得られた上清に、１／１０倍量の５Ｍ塩化ナトリウムと３倍量のエタノールとを加えて混合後、遠心して塩析したＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡを、適量の蒸留水又はＴＥ緩衝液に溶解し、５０〜１００ｎｇ／ｍｌの濃度としたものを鋳型ＤＮＡとした。
【００４９】
βカテニン遺伝子のエクソン３を挟むようにプライマー対を設計した。フォワードプライマーの塩基配列を配列番号３に示す。リバースプライマーの塩基配列を配列番号４に示す。上述のＲ１に対して配列番号１に示す塩基配列のプローブ１と、Ｒ２に対して配列番号２に示す塩基配列のプローブ２と、を設計した。プローブ１の５’末端はＦＡＭで、３’末端はＩＢＦＱでそれぞれ標識した。プローブ２の５’末端はＨＥＸで、３’末端はＩＢＦＱでそれぞれ標識した。
【００５０】
ＰＣＲの反応液２２μｌの組成は、以下の通りである。
鋳型ＤＮＡ    １μｌ
プローブ１（ＦＡＭ）（２０μＭ）    １μｌ
プローブ２（ＨＥＸ）（２０μＭ）    ０．５μｌ
フォワードプライマー（１０μＭ）    １μｌ
リバースプライマー（１０μＭ）    １μｌ
ＤＮＡポリメラーゼ（１ｕｎｉｔ／μｌ）    ２μｌ
バッファー（２ｘｄｄＰＣＲ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ）    １０μｌ
蒸留水    ５．５μｌ
【００５１】
ＰＣＲの反応条件は、以下の通りである。
９５℃で１０分を１サイクル
９５℃で３０秒、５７℃で４０秒を４０サイクル
９５℃で１０分を１サイクル
４℃で保存
【００５２】
ＰＣＲは、反応液をドロプレットに分けて、各ドロップレット内でＰＣＲを行い、それぞれのドロプレットの蛍光を測定するデジタルＰＣＲ法で行った。ドロップレット作成機としてはＱＸ１００（商標）  Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ（バイオラッド社製）を使用した。デジタルＰＣＲの装置として、ＰｒｏＦｌｅｘ（商標）ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６−ｗｅｌｌ（ライフテクノロジー社製）を用いた。ドロップレットの蛍光の検出には、ＱＸ１００（商標）Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｒｅａｄｅｒ（バイオラッド社製）を用いた。
【００５３】
鋳型ＤＮＡに変異がなく野生型の場合、プローブ１及びプローブ２の両方がアンプリコンに結合するため、ＦＡＭの青色及びＨＥＸの緑色の両方の蛍光によって橙色の蛍光が検出される。Ａｓｐ３２をコードするコドンがＴｙｒをコードするコドンに変異したアンプリコンが混在している場合は、プローブ１が結合できず、プローブ２のみが結合するために緑色の蛍光を発するドロプレットが検出される。一方、Ｔｈｒ４１をコードするコドンがＩｌｅをコードするコドンに変異したアンプリコンが混在している場合は、プローブ２が結合できず、プローブ１のみが結合するために青色の蛍光を発するドロプレットが検出される。
【００５４】
（結果）
図３はＡｓｐ３２Ｔｙｒに対応する変異を有するＤＮＡが混在したサンプルの結果を示す。縦軸にプローブ１を標識したＦＡＭの蛍光強度、横軸にプローブ２を標識したＨＥＸの蛍光強度をプロットすると、両方の蛍光強度が相対的に高いシグナルとＨＥＸの蛍光強度のみが相対的に高いシグナルとを検出できた。両方の蛍光強度が相対的に高いシグナルは、Ｒ１及びＲ２が野生型の塩基配列であることを示す。一方、ＨＥＸの蛍光強度のみが相対的に高いシグナルは、Ａｓｐ３２Ｔｙｒの変異があることを示す。図３に示される野生型のシグナルと変異型のシグナルとを比較することで、野生型に対する変異型の割合を明らかにできた。
【００５５】
図４はＴｈｒ４１Ｉｌｅに対応する変異を有するＤＮＡが混在したサンプルの結果を示す。ＦＡＭとＨＥＸの両方の蛍光強度が相対的に高い野生型のＤＮＡと、ＦＡＭの蛍光強度のみが相対的に高いＴｈｒ４１Ｉｌｅに対応する変異があるＤＮＡと、を検出できた。野生型のＤＮＡを示すシグナル及び変異型のＤＮＡを示すシグナルから野生型のＤＮＡに対する変異型のＤＮＡの割合を明らかにできた。
【００５６】
本発明は、本発明の広義の精神と範囲を逸脱することなく、様々な実施の形態及び変形が可能とされるものである。また、上述した実施の形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。すなわち、本発明の範囲は、実施の形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内及びそれと同等な発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明は、遺伝子変異の有無の検出、特に疾患に関連する変異が集中する領域における変異の検出に好適である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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