(57)【要約】      （修正有）【課題】皮膚外用剤、育毛剤及び経口用組成物に配合可能であって、ＳＣＦ合成抑制効果、女性ホルモン様作用効果、タンパク質変性抑制効果、アスコルビン酸又はその誘導体の安定化効果、メラニン分解効果を有する天然物由来の新規有効成分の提供。【解決手段】シソ科ムラサキシキブ属の植物又はその抽出物を有効成分として皮膚外用剤、育毛剤又は経口用組成物。前記組成物を含有する皮膚用外用剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
シソ科ムラサキシキブ属（Callicarpa）の植物又はその抽出物を有効成分とするＳＣＦ合成抑制組成物。
【請求項２】
シソ科ムラサキシキブ属（Callicarpa）の植物又はその抽出物を有効成分とする女性ホルモン様作用組成物。
【請求項３】
シソ科ムラサキシキブ属（Callicarpa）の植物又はその抽出物を有効成分とするタンパク質変性抑制用組成物。
【請求項４】
シソ科ムラサキシキブ属（Callicarpa）の植物又はその抽出物を有効成分とするアスコルビン酸又はその誘導体の安定化用組成物。
【請求項５】
シソ科ムラサキシキブ属（Callicarpa）の植物又はその抽出物を有効成分とするアスコルビン酸又はその誘導体のメラニン分解用組成物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか1項に記載の組成物を含む皮膚外用剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体安全性にすぐれた皮膚外用又は経口用の新規有効成分を提供することを目的とする。
【背景技術】
【０００２】
従来、紫外線、化学物質、アレルギー物質等は、生体細胞に刺激を与えて、その構成成分の変質や、サイトカインや活性酸素の合成を促すことが知られている。そして、変質した細胞成分、サイトカイン又は活性酸素が、炎症や細胞内のメラニン色素の異常沈着を誘発して、シミ、ソバカス、肝斑等を生じさせることも知られている。
【０００３】
例えば、紫外線の刺激により表皮角化細胞（ケラチノサイト）が合成するサイトカインの一種であるＳＣＦ（Steam Cell Factor）は、メラノサイト（色素細胞）におけるメラニン合成を活性化し、シミ等の原因となることも知られている。
【０００４】
また、紫外線は、角層のタンパク質に酸化ダメージ（例えば、タンパク質のカルボニル化）を与え、この酸化ダメージにより皮膚の透明感の低下やくすみが生じることとも知られている。
【０００５】
以上の点を鑑みて、皮膚の健全化や老化を予防及び改善する目的で、従来、種々の紫外線吸収剤、抗酸化剤、抗炎症剤が提案され、それらを配合した化粧品、飲食品及び医薬品が上市されている。例えば、ケイヒ酸誘導体、ベンゾフェノン誘導体等の紫外線吸収剤；ビタミンＣ、ビタミンＥ、カタラーゼ等の抗酸化剤；グリチルリチン酸又はその塩、アラントイン、トラネキサム酸等の抗炎症剤が提案されている。
【０００６】
しかし、それら従来の成分には、皮膚等の生体に対する安全性、また、実際に生体に適用した際の有効性の観点で問題が存在する。例えば、上記アスコルビン酸は、生体内の酵素で容易に酸化されてモノデヒドロアスコルビン酸を経て、デヒドロアスコルビン酸に変化し、モノデヒドロアスコルビン酸やデヒドロアスコルビン酸は、細胞や生体内の酵素にダメージを与えることも知られている。従って、かかる点が改善された新規有効成分が求められている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、かかる従来技術の問題点に鑑みて、天然物由来の新たな新規有効成分を見出すべく鋭意研究を行った。その結果、シソ科ムラサキシキブ属（Callicarpa）に属する植物の抽出物が、ＳＣＦ合成抑制効果、女性ホルモン様作用並びにタンパク質の変性抑制効果を有し、更に、生体内に存在するアスコルビン酸、及び皮膚外用剤や食品添加剤等に使用されるアスコルビン酸又はその誘導体を安定化する効果を有することを新たに見出した。
【０００８】
従来、ムラサキシキブ属に属する植物の抽出物を化粧料に配合することは、例えば、特許文献１〜３により公開されているが、当該抽出物が、ＳＣＦ合成抑制効果、女性ホルモン様作用及びタンパク質の変性抑制効果を有し、更に、生体内に存在するアスコルビン酸、及び皮膚外用剤や食品添加剤等に使用されるアスコルビン酸又はその誘導体を安定化する効果を有することについては、知られていなかった。
【特許文献１】特開平4-312513号
【特許文献２】特開2005-145938号
【特許文献３】特開2011-225503号
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、シソ科ムラサキシキブ属の植物又はその抽出物を有効成分とするＳＣＦ合成抑制用組成物、女性ホルモン様作用組成物、タンパク質変性抑制用組成物、アスコルビン酸の安定化用組成物及びメラニン分解用組成物である。
本発明は、上記組成物を含む皮膚外用剤である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、シソ科ムラサキシキブ属に属する植物の抽出物を有効成分とする皮膚外用剤及び育毛剤であって、本発明によれば、この有効成分である抽出物の効果により、皮膚（頭皮も含む）の健全化効果、美白効果、髪質改善効果及び育毛効果を発揮する皮膚外用剤及び育毛剤を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明に用いられるムラサキシキブ属に属する植物としては、たとえば、ムラサキシキブ（Callicarpa japonica）、オオムラサキシキブ（Callicarpa japonica var. luxurians）、コムラサキ（Callicarpa dichotoma）、ホウライムラサキ（Callicarpa formosana）、ヤブムラサキ（Callicarpa mollis）等が挙げられる。
【００１２】
本発明の抽出物の調製は、ムラサキシキブ属植物の全草或いは花、果実、茎、根又は葉等の部位を、必要ならば予め水洗して異物を除いた後、そのまま又は乾燥した上、必要に応じて細切又は粉砕し、浸漬法等の常法に従って抽出溶媒と接触させることで行うことが可能である。また、水蒸気蒸留法や超臨界抽出法を用いることでも調製は可能である。得られた抽出物は減圧下で濃縮して濃度を調整してもよいし、またこの抽出物を凍結乾燥法やスプレイドライ法により粉末化して用いてもよい。
【００１３】
ここで、上記抽出溶媒としては、水；メタノール、エタノール、プロパノールなどの低級アルコール類；エチレングリコール、１，２−プロピレングリコール、１，３−プロパンジオール、１，３−ブチレングリコール、グリセリンなどの多価アルコール類；酢酸エチル、酢酸ブチル、プロピオン酸メチルなどのエステル類；アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類；エチルエーテル、イソプロピルエーテルなどのエーテル類；ｎ−ヘキサン、トルエン、クロロホルムなどの炭化水素系溶媒などが挙げられ、それらは単独でもしくは二種以上混合して用いられる。
【００１４】
上記抽出溶媒のうちでも、皮膚外用剤、育毛剤や美容用経口組成物等への幅広い適用が可能であるという点からも、本発明に於いては水、低級アルコール類或いは多価アルコール類などの親水性溶媒が好適に用いられる。この親水性溶媒を用いる場合の好ましい例としては、例えば水もしくは低級アルコール類（特にエタノール）の単独使用、或いは水と低級アルコール類との混合溶媒又は水と多価アルコール類（特に１，３−ブチレングリコール、１，２−プロピレングリコール、又は１，３−プロパンジオール）との混合溶媒の使用等が挙げられるが、なかでも水の単独使用が最も好ましい。
【００１５】
混合溶媒を用いる場合、各溶媒の混合比は、例えば水とエタノールとの混合溶媒であれば、重量比（以下同じ）で１：５〜２５：１、水と１，３−ブチレングリコールとの混合溶媒であれば１：５〜１５：１、又水と１，３−プロパンジオールとの混合溶媒であれば、１：５〜１５：１の範囲とすることが好ましい。
【００１６】
抽出物の調製に際して、抽出物溶液のｐＨに特に限定はないが一般には４〜８の範囲とすることが好ましく、かかる意味で、必要ならば前記の抽出溶媒に、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カリウムなどのアルカリ性調整剤や、クエン酸、塩酸、リン酸、硫酸などの酸性調整剤等を配合し、所望のｐＨとなるように調整してもよい。
【００１７】
抽出温度、抽出時間、浴比等の抽出条件は、用いる溶媒の種類やｐＨによっても異なるが、例えば水を抽出溶媒とする浸漬法の場合であれば、抽出温度は一般に４〜１００℃、好ましくは４〜８０℃の範囲であり、又抽出時間は、４℃の冷温抽出の場合で８時間〜５０日間、特に２４時間〜２０日間、４０℃の中温抽出の場合で１時間〜２０日間、特に３時間〜５日間、８０℃の高温抽出の場合で１０分〜８時間、特に３０分〜３時間の範囲である。浸漬法の場合、浴比は重量比で、植物体に対して溶媒が一般に１〜２００倍量、好ましくは１〜１００倍量の範囲とするのがよい。
【００１８】
以上の操作により得られる抽出物溶液は、一般にはｐＨを３〜８に調整した上、これをそのまま使用してもよく、又必要ならば減圧濃縮等により適宜の濃度として用いてもよい。さらに場合によっては、スプレイドライ法、凍結乾燥法などの常法により粉末化することもできる。
【００１９】
本発明に係る抽出物を含む皮膚外用剤・育毛剤（化粧料や医薬部外品も含む）としては、例えば、乳液、クリーム、ローション、エッセンス、パック、口紅、ファンデーション、リクイドファンデーション、メイクアッププレスパウダー、ほほ紅、白粉、洗顔料、ボディシャンプー、毛髪用シャンプー、石けん等が挙げられ、また、育毛剤、さらには浴剤等も挙げられるが、勿論これらに限定されるものではない。
【００２０】
また、本発明に係る抽出物を含む経口組成物としては、美容飲料、栄養ドリンク、スポーツドリンク、ニアウォーター、ビタミン飲料、ミネラル飲料、アルコール飲料等の飲料；各種スープ類（粉末スープも含む）、乳製品、ゼリー、キャンディ、錠菓、ガム等の食品；錠剤、液状、顆粒状又はゼリー状の健康食品・飲料等に配合することができるが、本発明はこれに限るものではなく、経口摂取できる飲食品等に配合することができる。
【００２１】
本発明に係る抽出物の製剤への配合量は、抽出物の固形分として、基礎化粧料の場合は、一般に０．００２〜１．０重量％（固形分重量％、以下同じ）、好ましくは０．０２〜０．２重量％の範囲、メイクアップ化粧料の場合は、一般に０．００２〜１．０重量％、好ましくは０．０２〜０．２重量％の範囲、又清浄用化粧料の場合は、一般に０．００２〜１０．０重量％、好ましくは０．０２〜７．０重量％の範囲である。また、毛髪用化粧料の場合は、抽出物の固形分として、一般的には０．０００１〜５．０重量％であり、好ましくは、０．００１〜３．０重量％である。また、経口組成物における本発明の抽出物の配合量は、抽出物の固形分として、０．１〜１５重量％の範囲が好ましい。
【００２２】
本発明に係る抽出物を皮膚外用剤、育毛剤又は経口組成物に配合するにあたっては、当該抽出物のほかに、通常、それらの剤や組成物に用いられる成分、例えば油性成分、界面活性剤（合成系、天然物系）、保湿剤、増粘剤、防腐・殺菌剤、粉体成分、抗酸化剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、色素、香料等を必要に応じて適宜配合することができる。また、本発明に係る抽出物の有効性、特長を損なわない限り、他の生理活性成分と組み合わせて配合することも何ら差し支えない。
【００２３】
ここで、油性成分としては、例えばハス油、オリーブ油、ホホバ油、ヒマシ油、大豆油、米油、米糠油、米胚芽油、ヤシ油、カミツレ油、パーム油、カカオ油、メドウフォーム油、ローズヒップ油、ランベンダー油、シアーバター、ティーツリー油、アボガド油、マカデミアナッツ油、植物由来スクワラン等の植物由来の油脂類；ミンク油、タートル油等の動物由来の油脂類；ミツロウ、カルナウバロウ、ライスワックス、ラノリン等のロウ類；流動パラフィン、ワセリン、パラフィンワックス、スクワラン等の炭化水素類；ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、イソステアリン酸、エイコセン酸等の脂肪酸類；ラウリルアルコール、セタノール、ステアリルアルコール等の高級アルコール類；ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、オレイン酸ブチル、２−エチルヘキシルグリセライド、高級脂肪酸オクチルドデシル（ステアリン酸オクチルドデシル等）等の合成エステル類及び合成トリグリセライド類等が挙げられる。
【００２４】
界面活性剤としては、例えばポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル等の非イオン界面活性剤；脂肪酸塩、アルキル硫酸塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、ポリオキシエチレン脂肪アミン硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル燐酸塩、α−スルホン化脂肪酸アルキルエステル塩、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル燐酸塩等のアニオン界面活性剤；第四級アンモニウム塩、第一級〜第三級脂肪アミン塩、トリアルキルベンジルアンモニウム塩、アルキルピリジニウム塩、２−アルキル−１−アルキル−１−ヒドロキシエチルイミダゾリニウム塩、Ｎ，Ｎ−ジアルキルモルフォルニウム塩、ポリエチレンポリアミン脂肪酸アミド塩等のカチオン界面活性剤；Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−アルキル−Ｎ−カルボキシメチルアンモニオベタイン、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリアルキル−Ｎ−アルキレンアンモニオカルボキシベタイン、Ｎ−アシルアミドプロピル−Ｎ′，Ｎ′−ジメチル−Ｎ′−β−ヒドロキシプロピルアンモニオスルホベタイン等の両性界面活性剤等を使用することができる。
【００２５】
乳化剤又は乳化助剤としては、酵素処理ステビア等のステビア誘導体、サポニン又はその誘導体、カゼイン又はその塩（ナトリウム等）、糖とタンパク質の複合体、ショ糖又はそのエステル、ラクトース、大豆由来の水溶性多糖、大豆由来タンパク質と多糖の複合体、ラノリン又はその誘導体、コレステロール、ステビア誘導体（ステビア酵素処理物等）、ケイ酸塩（アルミニウム、マグネシウム等）、炭酸塩（カルシウム、ナトリウム等）、サポニン及びその誘導体、レシチン及びその誘導体（水素添加レシチン等）、乳酸菌醗酵米、乳酸菌醗酵発芽米、乳酸菌醗酵穀類（麦類、豆類、雑穀等）等を配合することもできる。
【００２６】
保湿剤としては、例えばグリセリン、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ポリエチレングリコール、ソルビトール、キシリトール、ピロリドンカルボン酸ナトリウム等があり、さらにトレハロース等の糖類、ムコ多糖類（例えば、ヒアルロン酸及びその誘導体、コンドロイチン及びその誘導体、ヘパリン及びその誘導体等）、エラスチン及びその誘導体、コラーゲン及びその誘導体、ＮＭＦ関連物質、乳酸、尿素、高級脂肪酸オクチルドデシル、海藻抽出物、シラン根（白及）抽出物、各種アミノ酸及びそれらの誘導体が挙げられる。
【００２７】
増粘剤としては、例えばアルギン酸、寒天、カラギーナン、フコイダン等の褐藻、緑藻又は紅藻由来成分；シラン根（白及）抽出物；ペクチン、ローカストビーンガム、アロエ多糖体、アルカリゲネス産生多糖体等の多糖類；キサンタンガム、トラガントガム、グアーガム等のガム類；カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース等のセルロース誘導体；ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アクリル酸・メタクリル酸共重合体等の合成高分子類；ヒアルロン酸及びその誘導体；ポリグルタミン酸及びその誘導体等が挙げられる。
【００２８】
防腐・殺菌剤としては、例えば尿素；パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチル等のパラオキシ安息香酸エステル類；フェノキシエタノール、ジクロロフェン、ヘキサクロロフェン、塩酸クロルヘキシジン、塩化ベンザルコニウム、サリチル酸、エタノール、ウンデシレン酸、フェノール類、ジャマール（イミダゾデイニールウレア）、ポリリン酸、プロパンジオール、１，２−ペンタンジオール、各種精油類、樹皮乾留物、大根発酵液、サトウキビ等の植物由来のエタノール又は１，３−ブチレングリコール等がある。
【００２９】
粉体成分としては、例えばセリサイト、酸化チタン、タルク、カオリン、ベントナイト、酸化亜鉛、炭酸マグネシウム、酸化マグネシウム、酸化ジルコニウム、硫酸バリウム、無水ケイ酸、雲母、ナイロンパウダー、ポリエチレンパウダー、シルクパウダー、セルロース系パウダー、穀類（米、麦、トウモロコシ、キビ等）のパウダー、豆類（大豆、小豆等）のパウダー等がある。
【００３０】
紫外線吸収剤としては、例えばパラアミノ安息香酸エチル、パラジメチルアミノ安息香酸エチルヘキシル、サリチル酸アミル及びその誘導体、パラメトキシ桂皮酸２−エチルヘキシル、桂皮酸オクチル、オキシベンゾン、２，４−ジヒドロキシベンゾフェノン、２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン−５−スルホン酸塩、４−ターシャリーブチル−４−メトキシベンゾイルメタン、２−（２−ヒドロキシ−５−メチルフェニル）ベンゾトリアゾール、ウロカニン酸、ウロカニン酸エチル、アロエ抽出物等がある。
【００３１】
抗酸化剤としては、例えばブチルヒドロキシアニソール、ブチルヒドロキシトルエン、没食子酸プロピル、ムラサキシキブの抽出物、シラン根の抽出物、シャクヤク抽出物、ビタミンＥ及びその誘導体（例えば、ビタミンＥニコチネート、ビタミンＥリノレート等）等がある。
【００３２】
キレート剤としては、例えばエチレンジアミンヒドロキシエチル三酢酸三ナトリウム、エデト酸又はその塩類、グルコン酸、フィチン酸、ポリリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム、ヒドロキシエタンジホスホン酸四ナトリウムなどがある。
【００３３】
ｐＨ調整剤としては、例えばクエン酸又はその塩類、乳酸又はその塩類、グリコール酸、コハク酸、塩酸、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどがある。
【００３４】
美白剤としては、ｔ−シクロアミノ酸誘導体、コウジ酸及びその誘導体、アスコルビン酸及びその誘導体、ハイドロキノン又はその誘導体、エラグ酸及びその誘導体、ニコチン酸及びその誘導体、レゾルシノール誘導体、トラネキサム酸及びその誘導体、４−メトキシサリチル酸カリウム塩、マグノリグナン（5,5'−ジプロピル−ビフェニル−2,2’−ジオール）、ヒドロキシ安息香酸及びその誘導体、ビタミンＥ及びその誘導体、α−ヒドロキシ酸、ＡＭＰ（アデノシンモノホスフェイト、アデノシン１リン酸）が挙げられ、これらを単独で配合しても、複数を組み合わせて配合しても良い。
【００３５】
上記のコウジ酸誘導体としては、例えばコウジ酸モノブチレート、コウジ酸モノカプレート、コウジ酸モノパルミテート、コウジ酸ジブチレート等のコウジ酸エステル類、コウジ酸エーテル類、コウジ酸グルコシド等のコウジ酸糖誘導体等が、アスコルビン酸誘導体としては、例えばＬ−アスコルビン酸−２−リン酸エステルナトリウム、Ｌ−アスコルビン酸−２−リン酸エステルマグネシウム、Ｌ−アスコルビン酸−２−硫酸エステルナトリウム、Ｌ−アスコルビン酸−２−硫酸エステルマグネシウム等のアスコルビン酸エステル塩類、Ｌ−アスコルビン酸−２−グルコシド、Ｌ−アスコルビン酸−５−グルコシド、アスコルビルトコフェリルマレイン酸、アスコルビルトコフェリルリン酸Ｋ、ミリスチル３−グリセリルアスコルビン酸、カプリリル２−グリセリルアスコルビン酸等のアスコルビン酸糖誘導体、それらアスコルビン酸糖誘導体の６位アシル化物（アシル基は、ヘキサノイル基、オクタノイル基、デカノイル基等）、Ｌ−アスコルビン酸テトライソパルミチン酸エステル、Ｌ−アスコルビン酸テトララウリン酸エステル等のＬ−アスコルビン酸テトラ脂肪酸エステル類、３−Ｏ−エチルアスコルビン酸、Ｌ−アスコルビン酸−２−リン酸−６−Ｏ−パルミテートナトリウム、グリセリルアスコルビン酸又はそのアシル化誘導体、ビスグリセリルアスコルビン酸等のアスコルビン酸グルセリン誘導体、Ｌ−アスコルビン酸リン酸アミノプロピル、Ｌ−アスコルビン酸のヒアルロン酸誘導体、３−Ｏ−Ｄラクトース−Ｌ−アスコルビン酸、イソステアリルアスコルビルリン酸塩等が、ハイドロキノン誘導体としては、アルブチン（ハイドロキノン−β−Ｄ−グルコピラノシド）、α−アルブチン（ハイドロキノン−α−Ｄ−グルコピラノシド）等が、トラネキサム酸誘導体としては、トラネキサム酸エステル（例えば、トラネキサム酸ラウリルエステル、トラネキサム酸ヘキサデシルエステル、トラネキサム酸セチルエステル又はその塩）、トラネキサム酸のアミド体（例えば、トラネキサム酸メチルアミド）等が挙げられ、レゾルシノール誘導体としては、例えば、４−ｎ−ブチルレゾルシノール、４−イソアミルレゾルシノール等が、２，５−ジヒドロキシ安息香酸誘導体としては、例えば２，５−ジアセトキシ安息香酸、２−アセトキシ−５−ヒドロキシ安息香酸、２−ヒドロキシ−５−プロピオニルオキシ安息香酸等が、ニコチン酸誘導体としては、例えばニコチン酸アミド、ニコチン酸ベンジル等が、α−ヒドロキシ酸としては、例えば乳酸、リンゴ酸、コハク酸、クエン酸、α−ヒドロキシオクタン酸等がある。
【００３６】
生理活性成分としては、例えば、胎盤抽出液、ソウハクヒ抽出物、ユキノシタ抽出物、シソ抽出物、米糠抽出物又はその加水分解物、白芥子抽出物又はその加水分解物、白芥子の発酵物、シャクヤク抽出物又はその加水分解物、乳酸菌醗酵米、ハス種子抽出物又はその加水分解物、ハス種子発酵物、ハトムギ加水分解物、ハトムギ種子発酵物、ローヤルゼリー発酵物、酒粕抽出物又はそれに含まれるセラミド、酒粕発酵物、パンダヌス・アマリリフォリウス(Pandanus amaryllifolius Roxb.)抽出物、アルカンジェリシア・フラバ（Arcangelicia flava Merrilli）抽出物、カミツレ抽出物等が挙げられる。また、サンゴ草抽出物、イネの葉の抽出物又はその加水分解物、ナス（ハス、長ナス、賀茂ナス、米ナス等）抽出物又はその加水分解物、アンズ果実の抽出物、カタメンキリンサイ等の海藻の抽出物、アマモ等の海産顕花植物の抽出物、豆乳発酵物、クラゲ水、米抽出物又はその加水分解物、米醗酵エキス、発芽米抽出物又はその加水分解物、発芽米発酵物、黒豆抽出物又はその加水分解物、ダマスクバラの花の抽出物、タケノコの皮の抽出物、リノール酸及びその誘導体もしくは加工物（例えばリポソーム化リノール酸等）、動物又は魚由来のコラーゲン及びその誘導体、エラスチン及びその誘導体、グリチルリチン酸及びその誘導体（ジカリウム塩等）、ｔ−シクロアミノ酸誘導体、ビタミンＡ及びその誘導体、アラントイン、ジイソプロピルアミンジクロロアセテート、γ−アミノ−β−ヒドロキシ酪酸、ゲンチアナ抽出物、甘草抽出物、ニンジン抽出物、オタネニンジン抽出物又はその発酵物、紅参抽出物、ミツイシコンブ抽出物、ヘチマ抽出物、アナアオサ抽出物、モモ抽出物、桃仁抽出物、キウイ抽出物、ヒマワリ抽出物、ジュアゼイロ（Zizyphus joazeiro)抽出物、パウダルコ樹皮抽出物、萱草（デイリリー）抽出物又は発酵物、ハイビスカスの花抽出物又は発酵物、ハゴロモグサ抽出物、チェリモヤ抽出物、マンゴー抽出物、マンゴスチン抽出物、フノリ抽出物、烏龍茶抽出物、紅富貴抽出物、シラン抽出物、山椒果皮又は種皮の抽出物または加水分解物、ベニバナ花抽出物、カサブランカ抽出物、甘藷抽出物又はその発酵物、グアバ葉抽出物、ドクダミ抽出物、晩白柚抽出物、アロエ抽出物、イチジク花抽出物、リンゴ抽出物、ホワイトアスパラガス抽出物等がある。
【００３７】
次に、製造例、処方例及び試験例によって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はそれらに限定されるものではない。なお、以下において、部はすべて重量部を、また％はすべて重量％を意味する。
【００３８】
製造例１（ムラサキシキブ抽出物の調製）
ムラサキシキブの果実２０ｇに精製水と１，３−ブチレングリコールの混合液（１：１）２００ｇを加え、４０℃で２時間抽出した。得られた溶液を濾過して、褐色透明の溶液（固形分濃度１．４８％）１５６ｇを得た。これを精製水で１０倍に希釈し、ムラサキシキブ抽出物溶液とした。
【００３９】
製造例２（ムラサキシキブ抽出物の調製）
ムラサキシキブの果実３０ｇに精製水と１，３−プロパンジオールの混合液（１：１）３００ｇを加え、４０℃で２時間抽出した。得られた溶液を濾過して、褐色透明の溶液（固形分濃度１．３９％）２３５ｇを得た。これを精製水で１０倍に希釈し、ムラサキシキブ抽出物溶液とした。
【００４０】
製造例３（ムラサキシキブ抽出物の調製）
製造例１の精製水と１，３−ブチレングリコールの混合液（１：１）に代えて、精製水と１，３−ブチレングリコールの混合液（７０：３０）を抽出溶媒として使用する以外は、製造例１と同様の方法にて、褐色透明の溶液（固形分濃度１．７２％）１５５ｇを得た。
【００４１】
製造例４（ムラサキシキブ抽出物の調製）
ムラサキシキブの果実２０ｇに精製水２００ｇ加え、４０℃で２時間抽出した。得られた溶液を濾過して、褐色透明の溶液（固形分濃度１．９８％）１７８ｇを得た。これを精製水で１０倍に希釈し、ムラサキシキブ抽出物溶液とした。
【００４２】
製造例５（オオムラサキシキブ抽出物の調製）
製造例１で用いたムラサキシキブの果実の代わりに、オオムラサキシキブの果実を用いる以外は、製造例１と同様の方法にて、褐色透明の溶液（固形分濃度１．５１％）１４７ｇを得た。これを精製水で１０倍に希釈し、オオムラサキシキブ抽出物溶液とした。
【００４３】
製造例６（コムラサキシキブ抽出物の調製）
製造例１で用いたムラサキシキブの果実の代わりに、コムラサキシキブの果実を用いる以外は、製造例１と同様の方法にて、褐色透明の溶液（固形分濃度１．３８％）１５２ｇを得た。これを精製水で１０倍に希釈し、コムラサキシキブ抽出物溶液とした。
【００４４】
処方例１．化粧水
［成分］                                                    部
ホホバ油                                                  １．０
ポリオキシエチレン（５．５）セチルアルコール              ５．０
ブチルパラベン                                            ０．１
製造例１の抽出物                                          ５．０
グリセリン                                                ５．０
１，３−ブチレングリコール                                ５．０
水酸化カリウム                                              適量
精製水                                    全量が１００部となる量
香料                                                        適量
【００４５】
処方例２．化粧水
処方例１に含まれる製造例１の抽出物に代えて、製造例２の抽出物５．０部を用いるほかは、処方例１と同様にして化粧水を得た。
【００４６】
処方例３．化粧水
処方例１に含まれる製造例１の抽出物に代えて、製造例３の抽出物５．０部を用いるほかは、処方例１と同様にして化粧水を得た。
【００４７】
処方例４．化粧水
処方例１に含まれる製造例１の抽出物に代えて、製造例４の抽出物５．０部を用いるほかは、処方例１と同様にして化粧水を得た。
【００４８】
処方例５．化粧水
処方例１に含まれる製造例１の抽出物に代えて、製造例５の抽出物５．０部を用いるほかは、処方例１と同様にして化粧水を得た。
【００４９】
処方例６．化粧水
処方例１に含まれる製造例１の抽出物に代えて、製造例６の抽出物５．０部を用いるほかは、処方例１と同様にして化粧水を得た。
【００５０】
処方例７．乳液
［成分］                                                    部
流動パラフィン                                            ６．０
ヘキサラン                                                ４．０
ホホバ油                                                  １．０
ハス精油                                                  ０．０２５
ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート      １．０
親油型ステアリン酸グリセリル                              １．０
水添大豆レシチン                                          １．５
製造例４の抽出物                                          ３．０
Ｌ−アスコルビン酸−２−グルコシド                        ２．０
水酸化カリウム                                            ０．５
グリセリン                                                ３．０
１，３−ブチレングリコール                                ２．０
カルボキシメチルセルロース                                ０．３
ヒアルロン酸ナトリウム                                    ０．０１
水溶性コラーゲン                                          ０．１
精製水                                      全量が１００部となる量
香料                                                      適量
【００５１】
処方例８．乳液
処方例７に含まれるＬ−アスコルビン酸−２−グルコシド２．０部及び水酸化カリウム０．５部に代えてトラネキサム酸２．０部を用いるほかは処方例７と同様にして乳液を得た。
【００５２】
処方例９．乳液
処方例７に含まれるＬ−アスコルビン酸−２−グルコシド２．０部及び水酸化カリウム０．５部に代えてアルブチン３．０部を用いるほかは処方例７と同様にして乳液を得た。
【００５３】
処方例１０．乳液
処方例７に含まれるＬ−アスコルビン酸−２−グルコシド２．０部及び水酸化カリウム０．５部に代えてニコチン酸アミド５．０部を用いるほかは処方例７と同様にして乳液を得た。
【００５４】
処方例１１．乳液
［成分］                                                  部
スクワラン                                              ３．０
ベヘニルアルコール                                      ３．０
ヘキサラン                                              ４．０
ホホバ油                                                １．０
ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート    １．０
グリセリン脂肪酸エステル                                １．０
大豆レシチン                                            １．５
製造例４の抽出物                                        ５．０
Ｌ−アスコルビン酸−２−グルコシド                      ２．０
水酸化カリウム                                          ０．５
グリチルリチン酸ジカリウム                              ０．１
グリセリン                                              ３．０
１，３−ブチレングリコール                              ２．０
水溶性コラーゲン                                        ０．１
ヒアルロン酸ナトリウム                                  ０．０１
精製水                                    全量が１００部となる量 
【００５５】
処方例１２．乳液
処方例１１に含まれるグリチルリチン酸ジカリウム１．０部に代えてトラネキサム酸１．０部を用いるほかは処方例１１と同様にして乳液を得た。
【００５６】
処方例１３．ローション
［成分］                                                    部
製造例２の抽出物                                      １０．０
エタノール                                            １０．０
グリセリン                                              ３．０
１、３−ブチレングリコール                              ２．０
メチルパラベン                                          ０．２
クエン酸                                                ０．１
クエン酸ナトリウム                                      ０．３
カルボキシビニルポリマー                                ０．１
キサンタンガム                                          ０．１
グアーガム                                              ０．１
香料                                                      適量
水酸化カリウム                                            適量
精製水                                  全量が１００部となる量
上記の成分を混合してローションを得た。
【００５７】
処方例１４．ローション
処方例１３に含まれる製造例２の抽出物に代えて製造例３の抽出物１０．０部を用いるほかは処方例１３と同様にしてローションを得た。
【００５８】
処方例１５．エッセンス
［成分］                                                  部
エタノール                                              ２．０
グリセリン                                              ５．０
１，３−ブチレングリコール                              ５．０
メチルパラベン                                          ０．１
ヒアルロン酸                                            ０．１
加水分解ヒアルロン酸液                                  ０．１
製造例５の抽出物                                        ５．０
クエン酸                                                ０．３
クエン酸ナトリウム                                      ０．６
精製水                                  全量が１００部となる量
【００５９】
実施例１６．リキッドファンデーション
［成分］                                                  部
ステアリン酸                                            ２．４
モノステアリン酸プロピレングリコール                    ２．０
セトステアリルアルコール                                ０．２
液状ラノリン                                            ２．０
流動パラフィン                                          ３．０
ミリスチン酸イソプロピル                                ８．５
プロピルパラベン                                        ０．０５
製造例６の抽出物                                        ５．０
カルボキシメチルセルロースナトリウム                    ０．２
ベントナイト                                            ０．５
プロピレングリコール                                    ４．０
トリエタノールアミン                                    １．１
メチルパラベン                                          ０．１
精製水                                  全量が１００部となる量
酸化チタン                                              ８．０
タルク                                                  ４．０
着色顔料                                                  適量
【００６０】
処方例１７．ボディシャンプー
［成分］                                                  部
Ｎ−ラウロイルメチルアラニンナトリウム                ２５．０
ヤシ油脂肪酸カリウム液（４０％）                      ２６．０
ヤシ油脂肪酸ジエタノールアミド                          ３．０
メチルパラベン                                          ０．１
製造例１の抽出物                                        ５．０
１，３−ブチレングリコール                              ２．０
精製水                                  全量が１００部となる量
【００６１】
処方例１８．ヘアシャンプー
［成分］                                                    部
Ｎ−ヤシ油脂肪酸メチルタウリンナトリウム                １０．０
ポリオキシエチレン（３）アルキルエーテル硫酸ナトリウム  ２０．０
ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン                      １０．０
ヤシ油脂肪酸ジエタノールアミド                            ４．０
メチルパラベン                                            ０．１
クエン酸                                                  ０．１
製造例４の抽出物                                          ２．０
１，３−ブチレングリコール                                ２．０
精製水                                    全量が１００部となる量
【００６２】
実施例１９．ヘアコンディショナー
［成分］                                                    部
ポリオキシエチレン（１０）硬化ヒマシ油                    １．０
塩化ジステアリルジメチルアンモニウム                      １．５
塩化ステアリルトリメチルアンモニウム                      ２．０
２−エチルヘキサン酸グリセリル                            １．０
セタノール                                                ３．２
ステアリルアルコール                                      １．０
メチルパラベン                                            ０．１
製造例２の抽出物                                          ２．０
１，３−ブチレングリコール                                ５．０
精製水                                    全量が１００部となる量
【００６３】
処方例２０．育毛剤
［成分］                                                    部
グリチルリチン酸ジカリウム                                ０．１
モノニトログアヤコールナトリウム                          ０．０２
塩酸ピリドキシン                                          ０．０３
ｌ−メントール                                            ０．８
タマサキツヅラフジ根エキス                                ０．３
褐藻エキス                                                ０．３
オタネニンジンエキス                                      ０．３
センブリエキス                                            ２．０
製造例１の抽出物                                          ３．５
トリメチルグリシン                                        ０．５
乳酸                                                      ０．２
１，３−ブチレングリコール                              １０．０
フェノキシエタノール                                      ０．２
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油                            ０．４
Ｌ−アルギニン                                              適量
エタノール                                              ２０．０
精製水                                    全量が１００部となる量
上記の成分を十分攪拌混合して育毛料を得た。
【００６４】
試験例１．SCF合成抑制評価試験
まず、正常ヒト皮膚由来表皮細胞（NHEK）をHuMedia KG2培地（クラボウ社製）を入れた96穴マイクロプレートに8×103/穴播種し、37℃，5.0％CO2の条件下に１日間プレ培養した後、製造例1〜6の抽出物を試料溶液として調整した同培地を添加した。ここで、試料溶液の濃度は培地全量における溶液としての終濃度が2.0％、5.0％となるように調整した。その後、培養器底面からUV-Bランプ（Philips社製TL20W/12RS）を用いて約10mJ/cm2の紫外線照射を行った。同条件でさらに２日間培養した。
次に、細胞膜上に発現したSCFの判定は以下の様にして行った。培養上清を除去・洗浄後、細胞を固定し、HRP（horseradish peroxidase）ラベルされた抗SCF抗体を用いて細胞膜表面上のSCFの検出を行った。結果は、基質とHRPの反応によって得られた反応溶液の450nmにおける吸光度を測定し、さらに各試験区の細胞から抽出したタンパク質量で補正した値を算出し、紫外線照射区の値を100％とした相対値で示した。
【００６５】
試験例1の結果を表1に示す。
［表１］
2018193334.tif 000002
【００６６】
表１に示す通り、本発明に係る抽出物は、濃度依存的にすぐれた表皮細胞SCF合成抑制効果を有することが確認された。
【００６７】
試験例２．女性ホルモン様作用効果評価試験
ヒト乳腺癌細胞MCF-7を10％FBS（チャコールデキストリン処理）含有ダルベッコ変法イーグル最少必須培地を入れた96穴マイクロプレートに4×103個／穴播種し、37℃，5.0％CO2の条件下に1日間プレ培養した後、製造例1〜6の各抽出物を試料溶液として調整して培地に添加した。ここで、試料溶液の濃度は、培地全量における溶液としての最終濃度が2.0％、5.0％となるように調整した。
次に、５日間培養後の培地上清を捨て、PBS(-)で1回洗浄後、PBS(-)で100倍希釈したhoechst33342試薬を100μL／穴添加し、37℃で1時間インキュベートし、DNAを蛍光染色した。その後、蛍光強度（励起：355nm、放射：460nm：蛍光マイクロプレートリーダー［フルオロスキャンアセント、Thermo Fisher Scientific社製］）を測定し、DNA量を求めた。試料溶液の代わりにPBS(-)を添加した区に対しても同様の操作を行った区をコントロールとし、ここに得られた蛍光強度（DNA量）に対する各試料添加区の蛍光強度の相対値を求め、細胞増殖率（％）とした。また、試験系が正常に機能しているかを確認するために、試料溶液の代わりに陽性対照として0.1nMのエストラジオールを添加した場合についても、同様の試験を行った。
【００６８】
試験例２の結果を表２に示す。
［表２］
2018193334.tif 000003
【００６９】
表２に示すように、本発明に係る抽出物は、濃度依存的にすぐれた女性ホルモン様作用を有することが確認された。
【００７０】
試験例３．タンパク質糖化抑制効果評価試験
本試験例３においては、グルコースを介したBSA（牛血清アルブミン）の蛍光の発生、発色により、終末糖化産物（Advanced Glycation End Products：AGE）の発生抑制効果、すなわち、タンパク質糖化抑制効果を評価した。
まず、製造例1〜6の各抽出物40μLと、50mg/mLのBSA水溶液40μLと、2.5Mのグルコース水溶液40μLと、PBS(-)溶液80μLを混合、攪拌して試料溶液を調製した。試料溶液は製造例１〜6の各抽出液の溶液として最終濃度がそれぞれ2.0％、5.0％となるよう調製した。
次に、試料溶液を50℃で7日間静置し、7日後、各試料溶液について、蛍光発生（励起：355nm、放射：460nm：蛍光マイクロプレートリーダー［フルオロスキャンアセント、Thermo Fisher Scientific社製］）、及び吸光度（波長405nm：マイクロプレートリーダー［Model 680、バイオラッド社製］）を測定した。また、試料溶液に代えて精製水を用いた試料無添加（コントロール）の場合について同様の操作を行い、ここで得られた蛍光測定値、及び吸光度に対する各試料溶液の蛍光測定値、及び吸光度の相対値（％）を求め、タンパク質糖化率（％）とした。さらに、試料溶液の代わりに陽性対照として1mMのアミノグアニジン（AG）を添加した場合についても同様の試験を行った。
【００７１】
試験例３の結果を表３に示す。
［表３］
2018193334.tif 000004
【００７２】
表３に示す通り、本発明に係る抽出物は、濃度依存的にすぐれたタンパク質糖化抑制効果を有することが確認された。
【００７３】
試験例４．タンパク質カルボニル化抑制効果評価試験
20mg/mLウシ血清アルブミン（BSA）溶液250μLと試料溶液（製造例1〜6の抽出物）100μLとの混液に、36.5mM過酸化水素液50μLと2.1mM硫酸第一鉄溶液100μLを加え、37℃で1時間インキュベートし、フェントン反応によるBSAのカルボニル化を誘導した。このとき、各試験区について過酸化水素液と硫酸第一鉄溶液のかわりに精製水を添加してフェントン反応を行わないリファレンス区を設定した。0.44mM BHTを50μL添加して反応終了後、それぞれ別チューブに100μLずつ分取し、そこに2mg/mL 2,4-ジニトロフェニルヒドラジン（DNPH）400μL添加して室温暗所にて60分間静置することによりカルボニル化タンパク質をラベル化した。その溶液に20％トリクロロ酢酸溶液500μL添加して撹拌後、5分間水冷した後4℃、15,000rpm、10分間遠心分離し、上清を捨てた。さらに10％トリクロロ酢酸溶液1mL添加して撹拌後、5分間水冷した後4℃、15,000rpm、10分間遠心分離し、上清を捨てた。次ぎにエタノール/酢酸エチル（1:1）混液1ｍL添加して撹拌後、5分間水冷した後4℃、15,000rpm、10分間遠心分離し、上清を捨てた。上清が黄色くなくなるまでエタノール/酢酸エチル（1:1）混液による洗浄を繰り返した。得られたタンパク質ペレットを6M グアニジン塩酸塩500μLに再溶解し、その溶液の405nmにおける吸光度及び溶液のタンパク質濃度を測定した。各試験区の吸光度よりリファレンス区の吸光度を差し引き、これをタンパク質濃度で除した値をカルボニル化度合いとした。なお、試料添加時をカルボニル化度合いは、試料無添加のコントロール区（control）を設定し、上記方法と同様の操作により得られた値を100としたときの割合で示した。
【００７４】
試験例4の結果を表4に示す。
［表４］
2018193334.tif 000005
【００７５】
表1に示すように、本発明に係る抽出物は、格段にすぐれたタンパク質カルボニル化抑制効果を有することが確認された。
【００７６】
試験例５．アスコルビン酸安定化効果
1.1mMアスコルビン酸-KOH(pH6.5) 5mLに終濃度が2％に精製水で調整した製造例1〜6の抽出物5mLを加え37℃で静置した。同時に試料溶液に代えて精製水を含む液を添加した区を設けcontrolとして設定した。反応開始0分、5分、10分および20分に反応液を1mL抜き取り、デヒドロアスコルビン酸（酸化型アスコルビン酸）量を測定した。すなわち、反応液1mLに10％メタリン酸チオ尿素水溶液1mLおよび2％ 2,4-ジヒドロキシフェニルヒドラジン25％硫酸水溶液0.5mLを加え、37℃で3時間反応させた。反応終了後、85％硫酸水溶液2.5mL加え波長530nmにおける吸光度を測定し、デヒドロアスコルビン酸（酸化型アスコルビン酸）量を算出した。
【００７７】
試験例５の結果を表５に示す。
［表５］
2018193334.tif 000006
【００７８】
試験例５に示すように、本発明に係る抽出物は、すぐれたアスコルビン酸の酸化抑制効果を有することが確認された。これにより、生体内のアスコルビン酸を維持する効果や、化粧料や経口用組成物（飲食品等）に汎用されるアスコルビン酸を安定化させて、それら化粧料や経口用組成物の有効性や安定性を向上させる効果を有することが示唆される。
【００７９】
試験例６．デヒドロアスコルビン酸還元酵素活性促進効果
（１）細胞の培養
ヒトメラノーマ（HMV&#8722;II）を10％FBS含有HAM&#8722;F12培地に懸濁して６ウェルプレートに2×105個ずつ播種し、37℃で24時間培養した。製造物1〜6の各抽出物を試料溶液として含む培地をそれぞれウェルに添加し、さらに37℃で5日間インキュベートした。ここで、培地中の試料溶液の濃度は、培地全量に対する溶液としての最終濃度が5.0％になるように調整した。また、比較のため、試料溶液に代えて、精製水を含む培地を添加したウェル（コントロール）と、0.5mM ブチオニンスルフォキシイミンを含む培地を添加したウェル（ポジティブコントロール）を設け、同じく37℃で5日間インキュベートした。
（２）細胞の回収
インキュベート終了後、それぞれのウェルから培地を除き、トリプシン処理によって細胞を回収し、遠心分離を行って細胞のペレットを得た。上清を捨て、細胞ペレットに対して細胞溶解溶液（1％Triton&#8722;X100溶液）を添加し、ピペッティングすることによって細胞を溶解した。この溶液を各試料添加区のデヒドロアスコルビン酸レダクターゼ粗酵素液とした。そして、各デヒドロアスコルビン酸レダクターゼ粗酵素液のタンパク質量を、DCプロテインアッセイキット（BIO RAD社製）を用いて測定した。
（３）デヒドロアスコルビン酸レダクターゼの活性測定
デヒドロアスコルビン酸レダクターゼの活性測定は次のように行った。
マイクロチューブに基質液（2mM デヒドロアスコルビン酸、0.8mM β&#8722;NADPHをトリス&#8722;塩酸緩衝液（ｐH7.5）に溶解したもの）と、各試料添加区のデヒドロアスコルビン酸レダクターゼ粗酵素液を体積比１：１で混和し、37℃で10分間反応させた後、氷冷しておいた反応停止液（1mM EDTA・2Na含有メタノール液）を混和し、激しく攪拌した。そのまま氷冷5分間静置後、遠心分離（約10,000xg、10分間）し、上清をとり、そこに含まれるアスコルビン酸の量を、HPLC分析により求めた。それぞれのデヒドロアスコルビン酸レダクターゼ粗酵素液を、反応停止液を加えてから基質液と混和し、その後の操作は同様に行ったものを、それぞれの対照とした。
それぞれ酵素反応を行った区から行わなかった対照区の値を差し引き、さらにデヒドロアスコルビン酸レダクターゼ粗酵素液のタンパク質量で割った値を、コントロールとの相対値で表したものを各試料添加区のデヒドロアスコルビン酸レダクターゼ活性率とした。
（４）HPLC分析条件
・ガードカラム：ODS-80Ts（東ソー）3.2×15
・カラム：ODS-80Ts（東ソー）4.6mm（ID）×15.0cm（L）
・カラム温度：40℃
・移動相：10mM テトラブチルアンモニウムヒドロキシド/10mM KH2PO4(pH 6.0)/0.5％ メタノール
・注入量：20μL
・検出：265nm
【００８０】
試験例６の結果を表６に示す。
［表６］
2018193334.tif 000007
【００８１】
表６に示すとおり、本発明に係る抽出物はすぐれたデヒドロアスコルビン酸レダクターゼの活性亢進効果を有することが確認された。デヒドロアスコルビン酸レダクターゼは、生体内でアスコルビン酸が酸化されて生じるデヒドロアスコルビン酸を還元してアスコルビン酸に再生する酵素であることから、本発明に係る抽出物は、生体内でアスコルビン酸を再生させ、その機能を維持させる効果や、化粧料や経口用組成物（飲食品等）に汎用されるアスコルビン酸を生体内で安定化させて、それら化粧料や経口用組成物の有効性や安定性を向上させる効果を有することが示唆される。
【００８２】
試験例７．メラニン分解評価方法
ヒト正常表皮細胞（NHEK）を1×105個/ウェルの細胞濃度で24ウェルプレートに播種し、そこに別で培養し、抽出しておいたメラノーマ由来のメラノソームリッチ区画の溶液を添加した。メラノソームリッチ区画は次の様にして調製した。すなわちトリプシン処理によって回収したメラノーマのペレットに対してLysis Buffer［1％ Triton X-100、0.01％ SDSを含有した0.1M Tris-HCL緩衝液 (pH7.5)］を１ｍL添加し、途中ピペッティングにより撹拌しながら20分間室温で反応させた。遠心分離（1200rpm、3分間）を行い、上清を別のマイクロチューブに分取した。その上清をさらに遠心分離（15000rpm、10分間）し、上清を捨て、PBS(-)で再懸濁した。この処理を2回行い、Lysis Bufferを洗浄除去後、最終的に表皮細胞培養用の培地に再懸濁を行い、メラノソームリッチ区画溶液とした。メラノソームリッチ区画を添加した表皮細胞は、24時間培養後、取り込まれなかったメラノソーム等をPBS(-)により洗浄除去し、その後、評価試料を含む培地を添加した。3日間培養後、上清を除去洗浄後、メラニン抽出液（10%DMSO＋1N NaOH）を200μL添加し、50℃で2時間インキュベートし、メラニンを溶解させた。その溶液150μLを96ウェルマイクロプレートに移し、490nmにおける吸光度を測定し、メラニン量とした。試料の代わりにPBS(-)を同量添加した区をコントロールとして同じ操作を行い、PBS(-)添加区の490nmにおける吸光度に対する各試料添加区の490nmにおける吸光度の比を算出し、メラニンの分解程度を評価した。
【００８３】
試験例７の結果を表７に示す。
［表７］
2018193334.tif 000008
【００８４】
試験例７に示す通り、本発明に係る抽出物は、格段にすぐれたメラニン分解促進作用を有することが確認された。