(57)【要約】【課題】  時計遺伝子の発現調整効果に優れた新規な時計遺伝子発現調整剤および概日リズム調整剤を提供する。【解決手段】  本発明の時計遺伝子発現調整剤は、スフィンゴイド塩基を有効成分とすることで、時計遺伝子、特にPeriod遺伝子及び／又はBMAL遺伝子を顕著に発現調整することができる。本発明の概日リズム調整剤は、この時計遺伝子発現調整剤を含有する。【選択図】  図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
スフィンゴイド塩基を有効成分として含有する、時計遺伝子発現調整剤。
【請求項２】
前記時計遺伝子が、Period及びBMALからなる群から選択される１種または複数である、請求項１に記載の時計遺伝子発現調整剤。
【請求項３】
前記スフィンゴイド塩基が、セラミド、セラミド類縁体、及びスフィンゴ脂質からなる群から選択される１種または複数である、請求項１又は２記載の時計遺伝子発現調整剤。
【請求項４】
前記スフィンゴイド塩基が、サリチロイルフィトスフィンゴシン、カプロオイルフィトスフィンゴシン、及びグルコシルセラミドからなる群から選択される１種または複数である、請求項１又は２記載の時計遺伝子発現調整剤。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の時計遺伝子発現調整剤を含有する、概日リズム調整剤。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の時計遺伝子発現調整剤を含有する、皮膚外用剤。
【請求項７】
前記スフィンゴイド塩基の濃度が０．０００１質量％以上である、請求項６に記載の皮膚外用剤。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の時計遺伝子発現調整剤を含有する、飲食品。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の時計遺伝子発現調整剤を含有する、医薬品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、時計遺伝子発現調整剤、及びこれを含有する概日リズム調整剤に関するものであり、より詳しくは、Period遺伝子やBMAL遺伝子等の時計遺伝子の発現調整効果による時計遺伝子発現調整剤、並びにこれを含有する概日リズム調整剤、皮膚外用剤、飲食品、および医薬品に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトは体内に約２４時間周期で自律的に振動する生物時計を持っている。このような約２４時間周期の生物時計は、概日リズムとも呼ばれ、睡眠・覚醒のサイクルの他、ホルモン分泌、細胞の再生、摂食などの様々な生命活動の日周変動が存在するといわれている。そして、この概日リズムの乱れが、睡眠障害、皮膚疾患、生活習慣病、鬱病等の精神神経疾患といった様々な心身の症状または疾患の原因の１つであると言われている。
【０００３】
生物時計は、時計遺伝子によって作り出されており、哺乳類の場合、CLOCK、BMAL、Period、CRYPTOCHROMEの４つのコアとなるタンパク質をコードする遺伝子の転写の促進、抑制により形成されるフィードバックループが、生物時計の分子機構の中核をなし、これらコアループに関わる時計遺伝子が上手く発現しないと、欝や生活習慣病をはじめとする疾病を引き起こすという研究がある（非特許文献１）。
【０００４】
概日リズムの制御中枢は、脳の視床下部の視交叉上核に存在しているが、末梢の組織においても時計遺伝子が発現しており、同様のシステムで概日リズムを形成することが明らかになっている。皮膚でも時計遺伝子は発現しており、他の臓器と同様に、脳内の概日リズムの中枢と同調して時計遺伝子がリズムを刻むことにより、生体恒常性が維持されている（非特許文献２）。
【０００５】
末梢の組織における生物時計のシステムにおいて、PeriodとBMALが時計遺伝子として特に重要であると言われている。Period遺伝子としては、Period1、Period2、Period3が知られており、BMAL遺伝子としては、BMAL1、BMAL2が知られている。時計遺伝子の中でもこのPeriodやBMALの発現を調整することができる新規薬剤の開発が望まれている。
【０００６】
例えば、ヒト線維芽細胞を用いた評価系で、アルニカエキス、コウホネエキス等の生薬及びジュニパーオイル、セダーオイル等の精油がPeriod遺伝子の発現を促進することが報告されている（特許文献１）。
【０００７】
例えば、ヒト線維芽細胞を用いた評価系で、霊芝抽出物がBMAL遺伝子の発現を促進することが報告されている（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２０１１／１２２０４１号パンフレット
【特許文献２】特開２０１６−５６１４０号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】AkhileshB.Reddy,JohnS.O’Neill,Healthyclocks,healthybod  y,healthymind.TrendsCellBiol.2010January;20(1):36-44
【非特許文献２】MikiTanioka,MolecularClocksinMouseSkin.JournalofInvesti  gativeDermatology(2009),129,1225-1231
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上述したように、時計遺伝子として例えばPeriodあるいはBMALのいずれか一方の発現量を調整する成分についてはいくつかの知見がある。しかしながら、いずれの文献においても正常条件におけるアプローチによってしか効果が示されておらず、乱れた時計遺伝子の発現を回復ないし改善する、十分な時計遺伝子発現の調整効果を有する成分はほとんど知られていない。そのため、特に生体が様々なストレスを受けることにより時計遺伝子の発現が乱れた場合であっても、十分に時計遺伝子発現を調整することが困難な状況にある。
【００１１】
本発明は、このような従来技術を背景になされたものである。すなわち本発明は、時計遺伝子の発現を調整でき、且つ安全性の高い新規物質を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、スフィンゴイド塩基が時計遺伝子の発現を調整し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち、本発明は、その一態様として、時計遺伝子発現調整剤であって、この時計遺伝子発現調整剤は、スフィンゴイド塩基を有効成分として含むことを特徴とする。スフィンゴイド塩基が時計遺伝子の発現を調整できることは今まで全く知られておらず、また化粧品・食品等様々な産業分野で利用されている安全性の高い成分である。よって、本発明によれば安全性の高い時計遺伝子発現調整剤を提供することができる。
【００１４】
前記時計遺伝子は、Period及びBMALからなる群から選択される１種または複数であることが好ましい。
【００１５】
前記スフィンゴイド塩基は、セラミド、セラミド類縁体、及びスフィンゴ脂質からなる群から選択される１種または複数であることが好ましい。
【００１６】
前記スフィンゴイド塩基は、サリチロイルフィトスフィンゴシン、カプロオイルフィトスフィンゴシン、及びグルコシルセラミドからなる群から選択されることがより好ましい。
特に、フィードバックループを形成する複数種の時計遺伝子においては、いずれか一種だけではなく複数種の発現量を調節することで、より高い概日リズム調整効果を得ることができる場合がある。
前記本発明の時計遺伝子発現調整剤は、サリチロイルフィトスフィンゴシン、カプロオイルフィトスフィンゴシン、及びグルコシルセラミドからなる群から選択されるスフィンゴイド塩基を含有する。これにより、そうしたフィードバックループを形成する時計遺伝子として、例えば略相反する発現量の変動を経時的に示すPeriod及びBMALの双方の遺伝子発現量を調整することができる。PeriodとBMALのように発現時間が異なる両遺伝子について、それぞれ適切な時間に発現量を調整することで、高い概日リズム調整効果を得ることができる。
【００１７】
また、本発明は、別の態様として、概日リズム調整剤であって、前記時計遺伝子発現調整剤を含有する。
【００１８】
本発明の更に別の態様として、皮膚外用剤であって、前記時計遺伝子発現調整剤を含有する。前記皮膚外用剤において、前記スフィンゴイド塩基の濃度は０．０００１質量％以上であることが好ましい。
【００１９】
本発明の更に別の態様として、飲食品であって、前記時計遺伝子発現調整剤を含有する。
【００２０】
本発明の更に別の態様として、医薬品であって、前記時計遺伝子発現調整剤を含有する。医薬品としては、睡眠障害、皮膚疾患、生活習慣病、または鬱病等の精神神経疾患の予防、改善または治療等の医薬品が特に好ましい。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、例えば様々なストレスを生体が受けることで概日リズムが乱れても、時計遺伝子の発現を調整することができる。よって、概日リズム不調や、ストレス応答、肥満などの様々な不調を改善し、生体恒常性を維持することができる。
【００２２】
特に、本発明に係る時計遺伝子発現調整剤は、スフィンゴイド塩基を有効成分として含むため、時計遺伝子の発現を調整することができる。
【００２３】
特に、本発明に係る時計遺伝子発現調整剤は、時計遺伝子の中でもPeriod及びBMALからなる群から選択される１種または複数の発現を調整することができるので、時計遺伝子発現調整剤として優れた効果を発揮することができる。
【００２４】
また、本発明に係る時計遺伝子発現調整剤は、スフィンゴイド塩基としては、セラミド、セラミド類縁体、及びスフィンゴ脂質からなる群から選択される１種または複数を含有することで、より優れた効果を発揮することができる。特に、サリチロイルフィトスフィンゴシン、カプロオイルフィトスフィンゴシン、グルコシルセラミドのそれぞれは、例えばPeriodとBMAL等の、フィードバックループを形成し発現時間の異なる複数の遺伝子の発現を調整することができる。よって、そうしたスフィンゴイド塩基を含有する本発明の時計遺伝子発現調整剤は、特に時計遺伝子の発現リズムが乱れている時に、その効果を顕著に発揮できる。
【００２５】
また、本発明に係る概日リズム調整剤は、上述する時計遺伝子発現調整剤を含有するものであることから、時計遺伝子の発現を調整することができる他、それに関連する生体の様々な行動リズムや生理機能の概日リズムを調整することができる。
【００２６】
更に、本発明に係る皮膚外用剤は、上述する時計遺伝子発現調整剤を含有し、皮膚外用剤においてスフィンゴイド塩基の濃度を０．０００１質量％以上にすることで、皮膚において時計遺伝子の発現調整の効果を顕著に発揮することができる。こうした皮膚外用剤においては、紫外線や老化により乱れた皮膚のリズム改善といった新しい保湿・美白・アンチエイジング剤のアプローチとなり得る。
【００２７】
本発明に係る飲食品は、上述する時計遺伝子発現調整剤を含有することから、飲食によって、時計遺伝子の発現調整の効果を発揮することができる。
【００２８】
本発明に係る医薬品は、上述する時計遺伝子発現調整剤を含有するので、時計遺伝子の発現を調整し、恒常性維持を促進して、概日リズムの不調に起因する様々な心身の症状または疾患、例えば、睡眠障害、皮膚疾患、生活習慣病、または鬱病等の精神神経疾患の予防、改善または治療を行うことが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】ヒト表皮角化細胞における、デキサメタゾンによる刺激後のPeriod1及びBMAL1遺伝子の発現リズムを示すグラフである。
【図２】過酸化水素処理条件ヒト表皮角化細胞における、デキサメタゾンによる刺激後のPeriod1遺伝子の発現リズムを示すグラフである。
【図３】過酸化水素処理条件ヒト表皮角化細胞における、デキサメタゾンによる刺激後のBMAL1遺伝子の発現リズムを示すグラフである。
【図４】過酸化水素処理条件ヒト表皮角化細胞における、デキサメタゾンによる刺激１８時間後の、スフィンゴイド塩基を添加した際のPeriod1遺伝子の発現に対する効果を示すグラフである。
【図５】過酸化水素処理条件ヒト表皮角化細胞における、デキサメタゾンによる刺激１４時間後の、スフィンゴイド塩基を添加した際のBMAL1遺伝子の発現に対する効果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
以下、本発明に係る時計遺伝子発現調整剤、並びにこれを含有する概日リズム調整剤、皮膚外用剤、飲食品、および医薬品の一実施の形態について説明する。
【００３１】
本実施の形態の時計遺伝子発現調整剤は、スフィンゴイド塩基を有効成分とするものである。本発明において好ましく使用されるスフィンゴイド塩基として、例えば、セラミド、セラミド類縁体、スフィンゴ脂質等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３２】
セラミドは、スフィンゴイド類と脂肪酸がアミド結合した化合物群の総称である。セラミドの例としては、セラミド１、セラミド１Ａ、セラミド２、セラミド３、セラミド３Ｂ、セラミド４、セラミド５、セラミド６、セラミド６II等が挙げられる。
【００３３】
セラミド類縁体は、セラミドと構造及び性質が類似した疑似セラミド、並びにセラミド及び疑似セラミドの誘導体を含むものをいう。セラミド類縁体の例としては、セチルＰＧヒドロキシエチルパルミタミド、セチルヒドロキシプロリンパルミタミド、トリヒドロキシパルミタミドヒドロキシプロピルミリスチル、トリヒドロキシパルミタミドヒドロキシプロピルミリスチルエーテル等が挙げられる。
【００３４】
スフィンゴ脂質は、セラミドに糖がグリコシド結合したスフィンゴ糖脂質と、セラミドにリン酸や塩基が結合したスフィンゴリン脂質とに分類される。スフィンゴ糖脂質の例としては、グルコシルセラミド、コーンスフィンゴ糖脂質、コメヌカスフィンゴ糖脂質、セレブロシド（ウマスフィンゴ脂質）等が挙げられる。スフィンゴリン脂質の例としては、Ｎ−アセチルジヒドロスフィンゴシン、アセチルフィトスフィンゴシン、カプロオイルスフィンゴシン、カプロオイルフィトスフィンゴシン、サリチロイルフィトスフィンゴシン、スフィンゴミエリン、テトラアセチルフィトスフィンゴシン、フィトスフィンゴシン、ブチルレゾルシノールビスサクシニルフィトスフィンゴシン、スフィンガニン等が挙げられる。
【００３５】
本発明で使用されるスフィンゴイド塩基は、市販されているものを使用してもよい。また、動物、植物、鉱物、微生物よりスフィンゴイド脂質を有機溶媒にて抽出後、精製を行うことで得られたものを使用してもよい。あるいは、例えば特開平７−２５８１７８号公報に記載されている化学合成によって得たものを使用してもよい。
【００３６】
本発明において、時計遺伝子発現調整とは、時計遺伝子の発現を促進させることに加え、時計遺伝子の発現リズム（位相または周期）を調整することを含む。また、故意にストレスを加えて時計遺伝子の発現及び発現リズムが乱れた状態を是正することも挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明において、時計遺伝子は、主にPeriodとBMALを対象にしている。
【００３７】
また、時計遺伝子Periodとして、Period1、Period2、Period3などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３８】
また、時計遺伝子BMALとして、BMAL1、BMAL2などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３９】
本発明の時計遺伝子発現調整剤は、スフィンゴイド塩基を１種用いても、あるいは２種以上の複数のスフィンゴイド塩基を混合して用いてもよい。例えば、主にPeriod遺伝子を発現調整する１種または複数のスフィンゴイド塩基と、主にBMAL遺伝子を発現調整する１種または複数のスフィンゴイド塩基とを混合して用いてもよいし、Period遺伝子とBMAL遺伝子の両方を発現調整する１種または複数のスフィンゴイド塩基を用いてもよい。
【００４０】
本発明の時計遺伝子発現調整剤は、本発明の効果を損なわない限り、上記の必須成分に加えて任意のほかの成分を含んでいてよい。また、単独で用いてもよいが、他のPeriod遺伝子及び／又はBMAL遺伝子の発現調整作用を有する薬剤等と組み合わせて使用してもよい。
【００４１】
本発明の時計遺伝子発現調整剤の有効成分であるスフィンゴイド塩基は、時計遺伝子であるPeriod及び／又はBMALの発現を調整することができるので、時計遺伝子発現調整剤の他、それに関連する生体の様々な行動リズムや生理機能の概日リズムを調整することができ、よって、概日リズム調整剤の有効成分として使用することができる。
【００４２】
また、本発明の時計遺伝子発現調整剤の有効成分であるスフィンゴイド塩基は、Period遺伝子及びBMAL遺伝子の発現調整に関連して、特に限定されないが、例えば、皮膚に適用した場合には、肌の保湿や柔軟性向上、しわの予防または改善、肌荒れなどの皮膚諸症状の予防、改善または治療等に適用でき、皮膚外用剤として用いることができる。
【００４３】
更に、本発明の時計遺伝子発現調整剤の有効成分であるスフィンゴイド塩基は、概日リズムの乱れが睡眠障害の一要因であることから、睡眠障害の予防、改善または治療等の医薬品として用いることができる他、Period遺伝子の発現やBMAL遺伝子の発現を調整し、恒常性維持を促進して、概日リズムの不調に起因する様々な心身の症状または疾患、例えば、皮膚疾患や、生活習慣病、または鬱病等の精神神経疾患の予防、改善または治療等の医薬品として用いることが可能である。
【００４４】
本発明の時計遺伝子発現調整剤は、Period遺伝子が脳内ばかりでなく様々な末梢臓器でも発現していることより、投与方法については特に限定しない。例えば、Period遺伝子及び／又はBMAL遺伝子の発現を促進するスフィンゴイド塩基を配合した組成物を皮膚に適用した場合には、皮膚のPeriod遺伝子及び／又はBMAL遺伝子発現を調整して恒常性維持を促進し、健やかな肌状態を維持することが可能である。
【００４５】
本発明の時計遺伝子発現調整剤は、様々な対象物に含めることができ、その対象物の種類に応じて、上記の必須成分の他に、任意の構成要素をさらに含めることができる。
【００４６】
例えば、皮膚外用剤に配合する場合、その剤形（例えば、液剤、粉末剤、顆粒剤、エアゾール剤、固形剤、ジェル剤、パッチ剤等）や、製品形態（例えば化粧料、医薬品、医薬部外品等）に応じて、通常そのような皮膚外用剤に含まれる任意の成分を、本発明の時計遺伝子発現調整剤と共に含んでいてよい。皮膚外用剤は、皮膚（頭皮、頭髪、爪も含む）に対して適用する組成物全般を包括する概念であり、例えば、基礎化粧料、メーキャップ化粧料、毛髪化粧料、皮膚もしくは毛髪洗浄料等の化粧料や、軟膏剤、パッチ剤、等の種々の医薬品ないし医薬部外品等を含む。その剤形も特に限定されず、例えば、水溶液系、可溶化系、乳化系、油液系、ゲル系、ペースト系、軟膏系、エアゾール系、水―油２層系、水―油―粉末３層系等、任意の剤形を含む。皮膚外用剤が化粧料である場合、例えば、香水、オードトワレ、オーデコロン、クリーム、乳液類、化粧水、ファンデーション類、粉白粉、口紅、石鹸、シャンプー・リンス類、ボディーシャンプー、ボディーリンス、ボディーパウダー類、浴剤類等が挙げられる。
【００４７】
飲食品としては、例えば、パン類、菓子類、麺類、乳製品、粉類、飲料類、各種加工品等の一般加工食品や、ビタミン剤等のサプリメント（栄養補助食品）、栄養補助飲料、動物用健康食品、特定保健用食品、栄養機能食品、保健機能食品などが挙げられる。飲食品は、少なくとも本発明の時計遺伝子発現調整剤を含有し、更に任意の、飲食品に配合され得る成分を含有し、常法に応じて任意の剤型に製造することができる。
【００４８】
医薬品としては、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、粉末剤、カプセル剤等の固形組成物からなる経口用医薬品、通常液剤、懸濁剤、乳剤等の液体組成物からなる経口用医薬品、注射剤、経皮吸収剤、外用剤等の非経口用医薬品などが挙げられる。医薬品は、少なくとも本発明の時計遺伝子発現調整を含有し、更に任意の、医薬品に配合され得る成分を含有し、常法に応じて任意の剤型に製造することができる。
【００４９】
剤型としては、例えば、散剤、顆粒、錠剤、カプセル剤等の様々な形態のサプリメント（栄養補助食品）、菓子、飲料等の任意の食品、医薬等に、本発明の時計遺伝子発現調整剤を含めてもよい。
【００５０】
時計遺伝子発現調整剤、概日リズム調整剤、皮膚外用剤、飲食品、医薬品などの対象物中における有効成分であるスフィンゴイド塩基の配合量は、対象物の種類等によって適宜選択することができ、本発明の効果を発揮できる限り、特に限定されるものではない。例えば、皮膚外用剤に配合する場合、有効成分であるスフィンゴイド塩基の配合量は、皮膚外用剤全質量に対して、０．０００１％以上が好ましく、０．００１％以上がより好ましく、０．０１％以上が更に好ましく、０．１％以上が最も好ましい。スフィンゴイド塩基の配合量の上限は、特に限定されないが、１０％以下が好ましく、５％以下がより好ましく、１．０％以下が更に好ましい。
【００５１】
尚、本発明の使用態様を例示したが、これらに限定されるものではなく、本発明の効果を達成できる限り、任意の態様で用いることができる。また、本発明の時計遺伝子発現調整剤は、具体的な態様に応じて、本発明の効果を損なわない限り、他の任意の薬剤等と組み合わせて使用することができる。
【実施例】
【００５２】
以下、実施例および比較例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。尚、培養細胞として、ヒト表皮角化細胞、ヒト線維芽細胞、ヒトメラノサイト、ヒト脂肪細胞、ヒト神経細胞等、各種細胞を用いることができるが、本実施例ではヒト表皮角化細胞を用いて評価を行った。また、ヒトではPeriod遺伝子としてPeriod1、Period2、Period3の３種類の遺伝子が存在することが知られているが、本実施例では代表としてPeriod1の発現を測定した。また、ヒトではBMAL遺伝子としてBMAL1、BMAL2の２種類の遺伝子が存在することが知られているが、本実施例では代表としてBMAL1の発現を測定した。
【００５３】
［ヒト表皮角化細胞における時計遺伝子発現リズムの検討］
ヒト表皮角化細胞の系で時計遺伝子の発現パターンを確認するため、デキサメタゾンを刺激薬剤として用いて、Period1及びBMAL1遺伝子の発現量を経時的に測定した。培養細胞では通常、個々のタイミングでリズムを刻んでいるが、デキサメタゾンのようなシグナル刺激因子で刺激することにより、時計遺伝子発現リズムを同調させて概日リズムを誘導することができる。
【００５４】
正常ヒト表皮由来角化細胞（NHEK、クラボウ株式会社）を正常ヒト表皮角化細胞増殖用無血清培地（Humedia-KG2、クラボウ株式会社）に播種して３７℃、５％ＣＯ２条件にて培養した。培養４日目に、終濃度１００ｎＭのデキサメタゾンを含む培地に交換し、交換直後を０時間とし、その後３７℃、５％ＣＯ２条件下で２時間培養を続けた。その後、デキサメタゾンを含まない培地に交換し、以降４時間毎に細胞をサンプリングした。採取した細胞から、市販のＲＮＡ抽出キット（FASTLaneCellcDNAKit(50)(Qiagen)）を用い、ｃＤＮＡを合成し、ＲＴ−ＰＣＲ法により、Period1及びBMAL1遺伝子発現量を測定した。同様に、内部標準としてGAPDH遺伝子発現量を定量し、GAPDH遺伝子発現量に対する目的遺伝子の相対的発現量を算出した。
【００５５】
結果を図１に示す。Period1とBMAL1は逆位相で概日リズムを刻んで発現しており、Period1は添加後１０時間後、１８時間後に高く、１４時間後に低い発現ピークを示した。逆に、BMAL1は１４時間後に高く、その他の時間で低い発現ピークを示した。
【００５６】
［過酸化水素添加条件ヒト表皮角化細胞における時計遺伝子発現リズムの検討］
ヒト表皮角化細胞において低容量のＵＶＢ照射により時計遺伝子発現量の減少、あるいは、時計遺伝子の発現リズム周期の消失が報告されている（Low-doseUltravioletBRaysAlterthemRNAExpressionoftheCircadianClockGenesinCulturedHumanKeratinocytes,December2002Volume119,Issue6,Pages1220-1223）。そこで、今回酸化ストレス刺激剤として過酸化水素を用いて時計遺伝子発現リズムの乱れを誘発する実験条件を構築し、ヒト表皮角化細胞において過酸化水素処理を行った際に時計遺伝子の発現量に変動が起こるかを時計遺伝子Period1及びBMAL1の発現量を指標に検討した。
【００５７】
ヒト表皮角化細胞を正常ヒト表皮角化細胞増殖用無血清培地に播種して３７℃、５％ＣＯ２条件にて培養した。培養３日目に、終濃度１５０μＭの過酸化水素を添加し、２４時間培養を行った。その後、終濃度１００ｎＭのデキサメタゾンを含む培地に交換し、交換直後を０時間とし、３７℃、５％ＣＯ２条件下で２時間培養を続けた。その後、デキサメタゾンを含まない培地に交換し、以降４時間毎に細胞をサンプリングした。採取した細胞から、市販のＲＮＡ抽出キットを用い、ｃＤＮＡを合成し、ＲＴ−ＰＣＲ法により、Period1及びBMAL1遺伝子発現量を測定した。同様に、ハウスキーピング遺伝子であるGAPDH遺伝子発現量を定量して、内部標準として用い、GAPDH遺伝子発現量に対する目的遺伝子の相対的発現量を算出した。
【００５８】
結果を図２、図３に示す。図１より、Period1とBMAL1は逆位相で概日リズムを刻んで発現していたが、過酸化水素処理によって、Period1及びBMAL1の発現リズム周期は減退あるいは消失することが明らかとなった。そこで以下の実験では、それぞれの遺伝子の発現ピークである、デキサメタゾン刺激の１８時間後のPeriod1遺伝子発現量及び、１４時間後のBMAL1遺伝子発現量を指標として、過酸化水素処理条件ヒト表皮角化細胞における各試験物質のPeriod1及びBMAL1遺伝子に対する効果を評価した。
【００５９】
［各スフィンゴイド塩基による時計遺伝子発現調整効果の評価］
上記と同様の方法により、正常ヒト表皮角化細胞を播種し、培養３日目に、終濃度１５０μＭの過酸化水素を添加し、２４時間培養を行った。その後、終濃度１００ｎＭのデキサメタゾンを含む培地に交換し、交換直後を０時間とし、３７℃、５％ＣＯ２条件下で２時間培養を続けた。その後、各スフィンゴイド塩基を終濃度１０μＭとなるように培地に加え、BMAL1遺伝子発現量の確認用には１４時間後の細胞をサンプリングした。また、Period1遺伝子発現量の確認用には１８時間後の細胞をサンプリングした。採取した細胞から、市販のＲＮＡ抽出キットを使用してＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成し、市販のＰＣＲプライマーを用いて、ＲＴ−ＰＣＲ法によりPeriod1及びBMAL1遺伝子の発現量を測定した。同様に、内部標準としてGAPDH遺伝子発現量を定量し、GAPDH遺伝子発現量に対する目的遺伝子の相対的発現量を算出した。また、過酸化水素処理サンプルの発現量を１００％とした。得られた値について、Dunnettの多重比較検定を行い、コントロール（試験物質の添加なし）と比較して片側５％の危険率で有意差があるものを効果ありと判定した。
【００６０】
結果を図４、図５に示す。未添加条件と比較して、過酸化水素処理によってPeriod1及びBMAL1の発現量は減少した。この過酸化水素処理条件において終濃度１０μＭ同一濃度のスフィンゴイド塩基を添加したところ、セラミド２、セラミド３、セラミド３Ｂ、セラミド６、サリチロイルフィトスフィンゴシン、フィトスフィンゴシン、カプロオイルフィトスフィンゴシン、スフィンガニン、グルコシルセラミドは過酸化水素処理によって減退したPeriod1遺伝子の発現を有意に高めた。また、サリチロイルフィトスフィンゴシン、カプロオイルフィトスフィンゴシンにおいては、Period1遺伝子だけでなく、BMAL1遺伝子の発現量も高めた。
【００６１】
上記の結果から、スフィンゴイド塩基には、Period1遺伝子やBMAL1遺伝子の発現を促進し得ることが示された。
【００６２】
［皮膚外用剤の調製］
ポリオール２０ｇに水添レシチン２ｇを８０℃で加熱溶解したものに、エステルオイル２０ｇにスフィンゴイド塩基（サリチロイルフィトスフィンゴシン）１ｇを予め溶解したものを加えて攪拌・混合する。さらに熱水を加え全量を１００とし、攪拌・乳化する。乳化後冷却したものを。スフィンゴイド塩基含有乳化物とした。スフィンゴイド含有乳化物を実施例１〜４、比較例１の通りに配合し、皮膚外用剤を製造した。被験者１０名の腕部を石鹸にて洗浄し、恒温・恒湿（気温２２℃・湿度５５％）下で２０分馴化後、角層水分量を測定した。前述で製した実施例１〜４、比較例１を腕部皮膚に５０μＬ／９ｃｍ２に塗布し、６０分後の角層水分量を測定した。塗布前の水分量を１００とし、塗布６０分後の角層水分量を相対値として表１に示した（なお、表中の各成分量の単位は質量％である）。
【００６３】
【表１】
2018138524.tif 000003
【００６４】
実施例１〜４の結果より、スフィンゴイド塩基の濃度依存的に角層水分量は増加した。この結果は、スフィンゴイド塩基に起因するPeriod1遺伝子とBMAL1遺伝子の発現促進が生じたからだと考えられる。一方、比較例１については角層水分量の顕著な増加は認められなかった。したがって、皮膚外用剤全質量に対してスフィンゴイド塩基の量は０．０００１％以上が適切であり、より好ましくは０．１％以上であるといえる。
【００６５】
［配合例］
以下、皮膚外用剤や飲食品などの対象物において、本発明の時計遺伝子発現調整剤の有効成分であるスフィンゴイド塩基の配合例を示すが、本発明は以下の配合例に限定されるものではない。配合量は全て製品全量に対する質量％で表す。
【００６６】
［配合例１：化粧水］
（１）ＰＣＡイソステアリン酸グリセレス-２５                               １．０
（２）１，３−ブチレングリコール                                        １．４０
（３）防腐剤                                                                適量
（４）ＰＣＡ-ＴＥＡ                                                       ５．０
（５）安息香酸ナトリウム                                                  ０．１
（６）スフィンゴイド塩基                                            ０．０００１
（７）精製水                                                                残余
【００６７】
［配合例２：乳液］
（１）オリーブ油脂肪酸セテアリル、オリーブ油脂肪酸ソルビタン              ２．５
（２）パルミチン酸セチル                                                  ０．５
（３）ホホバ種子油                                                        １．０
（４）炭酸ジカプリリル                                                    ２．０
（５）セテアリルアルコール                                                ０．５
（６）アーモンド油                                                        １．０
（７）グリセリン                                                          ２．０
（８）キサンタンガム                                                      ０．３
（９）安息香酸ナトリウム                                                  １．０
（１０）スフィンゴイド塩基                                              ０．０１
（１１）香料                                                                適量
（１２）精製水                                                              残余
【００６８】
［配合例３：О／Ｗクリーム］
（１）カルボマー                                                        ０．１５
（２）キサンタンガム                                                      ０．１
（３）カルボキシメチルデキストランナトリウム                              ０．１
（４）ジグリセリン                                                        ４．０
（５）グリセリン                                                        １４．０
（６）ポリソルベート６０                                                  ３．５
（７）ステアリン酸ソルビタン、ヤシ脂肪酸スクロース                        １．１
（８）ベヘニルアルコール                                                  ３．８
（９）スクワラン                                                        １１．０
（１０）サラコスPO(T)                                                     ５．７
（１１）ジメチコン                                                        １．５
（１２）水酸化カリウム                                                  ０．０５
（１３）フェノキシエタノール                                              ０．３
（１４）スフィンゴイド塩基                                                １．０
（１５）精製水                                                              残余
【００６９】
［配合例４：Ｗ／０クリーム］
（１）ポリリシノレイン酸ポリグリセリル-６                                 １．５
（２）イソステアリン酸ポリグリセリル-２                                   １．５
（３）水添レシチン                                                        ０．３
（４）エチルヘキサン酸セチル                                              ７．０
（５）メチルフェニルポリシロキサン                                        ５．０
（６）スフィンゴイド塩基                                                  １．０
（７）グリセリン                                                          ８．０
（８）防腐剤                                                                適量
（９）アルギン酸ナトリウム（1％水溶液）                                 ２０．０
（１０）１，３−ブチレングリコール                                        ７．０
（１１）リン酸アスコルビルMg                                              ３．０
（１２）精製水                                                              残余
【００７０】
［配合例５：マッサージ用ジェル］
（１）エリスリトール                                                      ２．０
（２）カフェイン                                                          ５．０
（３）グリセリン                                                        ５０．０
（４）カルボマー                                                          ０．４
（５）ポリエチレングリコール４００                                      ３０．０
（６）エデト３ナトリウム                                                  ０．１
（７）ポリオキシエチレン（１０）メチルポリシロキサン共重合体              ２．０
（８）スクワラン                                                          １．０
（９）水酸化カリウム                                                    ０．１５
（１０）スフィンゴイド塩基                                                ０．１
（１１）精製水                                                              残余
【００７１】
［配合例６：マッサージクリーム］
（１）固形パラフィン                                                      ５．０
（２）ミツロウ                                                          １０．０
（３）ワセリン                                                          １５．０
（４）流動パラフィン                                                    ４１．０
（５）１，３−ブチレングリコール                                          ４．０
（６）モノステアリン酸グリセリン                                          ２．０
（７）ＰОＥ（２０）ソルビタンモノラウリン酸エステル                      ２．０
（８）防腐剤                                                                適量
（９）酸化防止剤                                                            適量
（１０）スフィンゴイド塩基                                                １．０
（１１）精製水                                                              残余
【００７２】
［配合例７：顆粒］
（１）スクラロース                                                        ０．１
（２）スフィンゴイド塩基                                                ０．０１
（３）香味料                                                              ５．０
（４）賦形剤（セオラス）                                                １０．０
（５）マルチトール                                                          残余
【００７３】
［配合例８：錠剤（チュアブルタイプ）］
（１）イノシトール                                                      １１．０
（２）マルチトール                                                      ２１．０
（３）スクロース                                                          ０．５
（４）鮭白子抽出物（ＤＮＡ  Ｎａ）                                        ０．１
（５）酵母抽出物                                                          ０．１
（６）スフィンゴイド塩基                                              ０．００１
（７）香味料                                                              ５．０
（８）賦形剤                                                                残余
【００７４】
［配合例９：タブレット］
（１）潤沢剤（ショ糖脂肪酸エステル等）                                    １．０
（２）アラビアガム水溶液（５％）                                          ２．０
（３）酸味料                                                              １．０
（４）着色料                                                                適量
（５）スフィンゴイド塩基                                              ０．００１
（６）糖質（粉糖またはソルビトール等）                                      残余
【００７５】
［配合例１０：キャンディー］
（１）砂糖                                                              ４３．０
（２）水飴                                                            ４７．９５
（３）有機酸                                                              ２．０
（４）スフィンゴイド塩基                                            ０．０００５
【００７６】
［配合例１１：ガム］
（１）砂糖                                                              ４３．０
（２）ガムベース                                                      ３０．９５
（３）グルコース                                                        １０．０
（４）水飴                                                              １６．０
（５）スフィンゴイド塩基                                              ０．００５
【００７７】
これら配合例の製品は、それぞれの製品形態の典型的な使用態様における使用テストにより、Period遺伝子及び／又はBMAL遺伝子の発現を促進して、生体の概日リズムを調整することができる。
【図１】
2018138524.tif 000004
【図２】
2018138524.tif 000005
【図３】
2018138524.tif 000006
【図４】
2018138524.tif 000007
【図５】
2018138524.tif 000008