(57)【要約】【課題】  流体中に含まれるサブビジブル凝集体に相当する粒子（具体的には、直径が０．１から数μｍの粒子）を精度よく分離および検出できる装置を提供すること。【解決手段】  キャピラリー管に導入した、粒子を含む流体へ、往復する流動を発生させることで、当該流動による粒子の配列および当該キャピラリー管内の液体の流れ速度分布により分離する方法および前記方法を利用した装置により、前記課題を解決する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
粒子を含む流体をキャピラリー管に導入し、当該粒子をその径に基づき分離する方法であって、
前記キャピラリー管に導入した、粒子を含む流体へ、往復する流動を発生させることで、前記流動による粒子の配列および前記キャピラリー管内の流体の流れ速度分布により、粒子を分離する方法。
【請求項２】
往復する流動が、粒子を含む流体の変位量を示す波形が非線対称波形となるように往復する流動である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
往復する流動が、キャピラリー管の軸方向と平行に往復する流動である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか一項に記載の方法で粒子を分離した後、流体の流れ速度分布のみによって、さらに粒子を分離する方法。
【請求項５】
請求項１から３のいずれか一項に記載の方法で粒子を分離した後、流体の流れと垂直方向に粒子を配列させてから、流体の流れ速度分布のみによって、さらに粒子を分離する方法。
【請求項６】
粒子を含む流体をキャピラリー管に導入し、当該粒子をその径に基づき分離する装置であって、
前記キャピラリー管に導入した、粒子を含む流体へ、往復する流動を発生させる１または複数の流動発生手段をさらに備えた、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法を利用した前記装置。
【請求項７】
流動発生手段を備えたキャピラリー管の下流側に、流動発生手段を備えていないキャピラリー管をさらに備えた、請求項６に記載の装置。
【請求項８】
流体が液体であり、流動発生手段を備えたキャピラリー管と流動発生手段を備えていないキャピラリー管との間にシース液を導入する手段をさらに備えた、請求項７に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、流体中に含まれる粒子をその径に基づき分離する方法および装置に関する。特に本発明は、流体中に含まれる直径が０．１μｍから数μｍの粒子をその径に基づき分離可能な方法および装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
医薬品用途で用いる抗体は通常、当該抗体を発現可能な細胞を培養後、得られた培養液を遠心分離、濾過、カラムクロマトグラフィーなどの精製操作を行ない製造する。その際、得られた前記抗体を含む溶液中には、当該抗体の凝集体が含まれている可能性がある。抗体凝集体は免疫原性を有するおそれがあるため、特に医薬品用途で用いる場合、当該凝集体を精度よく検出し、抗体を含む溶液中に当該凝集体を極力含まないように製造する必要がある。一般に抗体凝集体の評価はサイズ排除クロマトグラフィーや光遮蔽粒子計数法で評価されているが、サブビジブル（ｓｕｂｖｉｓｉｂｌｅ）凝集体といわれる、直径が０．１μｍから２μｍ程度の凝集体は前記手法では原理的に検出不能である。
【０００３】
サブビジブル凝集体を検出する装置として、レーザ回折・散乱法を利用した装置であるＡｇｇｒｅｇａｔｅｓ  Ｓｉｚｅｒ（島津製作所製）や、共振式質量測定法を利用した装置であるＡｒｃｈｉｍｅｄｅｓ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ製）が市販されている。しかしながら、これらの装置も検出再現性が悪いという問題点があり、抗体凝集体の評価装置として確立されていない。
【０００４】
この他、直径数μｍ程度のポリマービーズや細胞などを分級可能な方法としては、キャピラリー管を用いた方法（特許文献１）や非対称な振動流と凸凹構造を用いた方法（特許文献２）が知られているが、凸凹構造のないキャピラリー管内で非対称振動を利用して分級可能な方法は知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表平５−５０２７１７号公報
【特許文献２】国際公開第２０１６／００６６４２号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、流体中に含まれるサブビジブル凝集体に相当する粒子（具体的には、直径が０．１μｍから数μｍの粒子）を精度よく分離および検出できる方法ならびに装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するために、本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、粒子を含む流体をキャピラリー管に導入し当該流体へ往復する流動を発生させることで、前記流動による粒子の配列および前記キャピラリー管内の流体の流れ速度分布により、前記流体に含まれるサブビジブル凝集体に相当する粒子をその径に基づき精度良く分離できることを見出し、本発明に到達した。
【０００８】
すなわち本発明の第一の態様は、
粒子を含む流体をキャピラリー管に導入し、当該粒子をその径に基づき分離する方法であって、
前記キャピラリー管に導入した、粒子を含む流体へ、往復する流動を発生させることで、前記流動による粒子の配列および前記キャピラリー管内の流体の流れ速度分布により、粒子を分離する方法である。
【０００９】
また本発明の第二の態様は、往復する流動が、粒子を含む流体の変位量を示す波形が非線対称波形となるように往復する流動である、前記第一の態様に記載の方法である。
【００１０】
また本発明の第三の態様は、往復する流動が、キャピラリー管の軸方向と平行に往復する流動である、前記第一または第二の態様に記載の方法である。
【００１１】
さらに本発明の第四の態様は、前記第一から第三の態様のいずれかの態様に記載の方法で粒子を分離した後、流体の流れ速度分布のみによって、さらに粒子を分離する方法である。
【００１２】
さらに本発明の第五の態様は、前記第一から第三の態様のいずれかの態様に記載の方法で粒子を分離した後、流体の流れと垂直方向に粒子を配列させてから、流体の流れ速度分布のみによって、さらに粒子を分離する方法である。
【００１３】
さらに本発明の第六の態様は、
粒子を含む流体をキャピラリー管に導入し、当該粒子をその径に基づき分離する装置であって、
前記キャピラリー管に導入した、粒子を含む流体へ、往復する流動を発生させる１または複数の流動発生手段をさらに備えた、前記第一から第三の態様のいずれかの態様に記載の方法を利用した前記装置である。
【００１４】
また本発明の第七の態様は、流動発生手段を備えたキャピラリー管の下流側に、流動発生手段を備えていないキャピラリー管をさらに備えた、前記第六の態様に記載の装置である。
【００１５】
また本発明の第八の態様は、流体が液体であり、流動発生手段を備えたキャピラリー管と流動発生手段を備えていないキャピラリー管との間にシース液を導入する手段をさらに備えた、前記第七の態様に記載の装置である。
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１７】
前述したように、本発明は、粒子を含む流体をキャピラリー管に導入し、当該粒子をその径に基づき分離する方法において、前記キャピラリー管に導入した、粒子を含む流体へ、往復する流動を発生させることを特徴としている。
【００１８】
キャピラリー管内の流れによる、径に基づく粒子分離は、ＤｉＭａｒｚｉｏおよびＧｕｔｔｍａｎ（Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，７，２６７（１９６９））により、以下の２つの要因に依ることが示されている。
（１）大きな粒子は、小さな粒子ほどにはキャピラリー内壁に接近することができないため、大きな粒子はキャピラリー半径方向の中心付近に小さな粒子は断面の外側に偏在すること。
（２）キャピラリー管を通過する流体により生じる半径方向の速度特性により、粒子がそれぞれ異なった速度で移動可能であること。
そのため、大きな粒子は概して分散媒の平均速度より速い速度で移動し、より速い速度の流体流線の見本となる。
【００１９】
ＤｉＭａｒｚｉｏらの知見に基づき、Ｄｏｓ  Ｒａｍｏｓらは、直径が０．１μｍから数μｍの粒子をキャピラリー管に導入し、当該キャピラリー管からの前記粒子の排出時間から、径に基づく粒子分離を評価している（特表平５−２０２７１７号公報）。しかしながら本発明者らが検討した結果、径の小さい粒子における前記キャピラリー管からの排出時間が非常にばらつき、径の大きい粒子における前記キャピラリー管からの排出時間と重なったため、径に基づく精度良い分離が困難なことが判明した。
【００２０】
前記結果は、径の小さい粒子がキャピラリー管断面の外側付近に十分に偏在せずキャピラリー管の半径方向の中心付近にも分散したことが原因と考えられる。そこで、導入した粒子をキャピラリー管に半径方向に整列させる方法を検討した。
【００２１】
Ｄｏｓ  Ｒａｍｏｓらが開発した装置は粒子を含む流体を導排出するポンプ、キャピラリー管、検出器という構成であるが、本発明の方法を利用した装置（以下、単に本発明の装置とも表記する）は、前記キャピラリー管に前記流体に対し往復する流動を発生させる１または複数の流動発生手段をさらに備え、前記キャピラリー管を当該流動発生手段による流動を付与する場とすることで、キャピラリー管の半径方向に前記粒子を配列させることが可能となり、結果、サブビジブル凝集体に相当する粒子の精度よい分離が可能となった。なお、流動発生手段を備えたキャピラリー管の下流側に、流動発生手段を備えていない追加のキャピラリー管をさらに備えると、サブビジブル凝集体に相当する粒子の分離をさらに精度よく行なえるため、好ましい。
【００２２】
本発明の装置に備える流動発生手段は、往復する流動を発生させることにより流路（キャピラリー管）に導入した流体中の粒子が、往復する流動のうちの１の方向に、粒子固有の移動度で移動することで、粒子径に基づく分離を可能にしている。粒子固有の移動度は、様々な条件によって変化することから、条件として例えば流体、流路長、粒子を含む流体の変位量を示す波形等を適宜選択することにより、流体に含まれる所望の径を有した粒子を分離、取得できる。流動発生手段の一例として、送液手段、気流発生手段、圧力発生手段など直接流路内の流体に往復する流動を発生させる手段や、アクチュエーターや圧電素子など流路を構成する部材（基板部材または側面部材）に対し往復振動を与える手段により間接的に流路内の流体に往復する流動を発生させる手段があげられる。前記往復する流動は、例えば液体の変位量に相当する波形を有する駆動信号が流動発生手段を構成するアクチュエーターや圧電素子に伝えることにより発生することができる。したがって、流体の変位量を示す波形は、そのまま流動発生手段の駆動信号の波形に相当してもよい。流動発生手段が直接流路内の流体に往復する流動を発生させる手段の場合、前述した手段と、流路の流体導入口および／または流体排出口とを、液密または気密に接続すればよい。流動発生手段が上面基板部材と下面基板部材と側面部材とから構成され、圧電素子などにより間接的に流路内の流体に往復する流動を発生させる手段の場合、側面部材の材質は伸縮性を有した材とすると好ましい。
【００２３】
流動発生手段による流動発生方向は、粒子を含む流体の流れる方向に対して垂直方向でない限り、その方向に限定はないが、粒子を含む流体の流れる方向（すなわち流動発生手段による流動を付与する場であるキャピラリー管の軸方向）と平行にすると高い精度の分離を迅速に行なえる点で好ましい。また流動発生手段により発生される往復する流動の周期性および流体の変位量を示す波形に特に限定はなく、周期的な流動であってもよく、非周期的な流動であってもよく、対称波形（例えば正弦波、矩形波、三角波）の流動であってもよく、非線対称波形（例えばノコギリ波、減衰振動波、ハーフサインエッジパルス波、パルスサージ波、指数立ちあがり波、指数立ちさがり波）もしくは非点対称波形の流動であってもよいが、波形については非線対称波形とすると高い精度の分離を迅速に行なえる点で好ましい。なお流動発生手段を複数備える場合、各手段で異なる周期／波形の流動（非同期の流動）を発生させてもよいし、同一の周期／波形の流動（同期した流動）を発生させてもよい。
【００２４】
本発明において、粒子を含む流体は、キャピラリー管内を一定の速度以上で流れる（移動させる）ことで当該粒子を当該移動速度分布により前記流路中央側に整列させることができる。具体的には流速を１ｍｍ／ｓ以上とすると好ましい。一般に、動粘性率が１０−６から１０−９ｍ２／ｓの流体が流れる流路内において、粒子を整列させるパラメーターは、流路の幾何学構造、流路断面積に対する粒子サイズ、流路を流れる流体の物性、流路内を流れる粒子に働く力などがあげられる（Ｊｉａｎ  Ｚｈｏｕ  ｅｔ．ａｌ．，Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  ｃｈｉｐ，１３，１１２１−１１３２（２０１３））。本発明では、粒子は、流動発生手段により生じる往復する流動にさらされることで絶えず加速度が変化する空間にさらされている。当該加速度変化時に発生する、粒子周りの不均一な速度分布由来のせん断力が、壁面から離れる方向に粒子を押しつけ、粒子を流路中央に整列していると考えられる。また、前記せん断力は流路壁面に近い方が大きくなると考えられる。従って本発明の一態様における粒子の整列のためのパラメーターとしては、流路断面積に対する粒子径、粒子の加速度変化の有無、前記加速度変化量があげられる。
【００２５】
本発明における分離対象粒子は、試料および流体に対し不溶性の物質からなる粒子であれば特に限定はなく、一例としてビーズ、粉砕用ボール、液晶用スペーサー、クロマトグラフィー用分離剤、吸着剤といった工業材料や、細胞、ＤＮＡ、抗体などのタンパク質、ウイルスといった研究用・医療用材料があげられる。抗体などタンパク質の大きさ（粒径）は一般に数ｎｍ程度であるが、製造工程で機械的または熱ストレスなどにさらされると凝集し、不溶化するおそれがある。不溶化したタンパク質の大きさ（粒径）は数十ｎｍから数十μｍ程度である。数十ｎｍ程度の不溶化タンパク質であれば、従来のカラムクロマトグラフィー法や超遠心分離法で分離・除去することができる。しかしながら粒径０．１μｍから２μｍ程度のサブビジブル（ｓｕｂｖｉｓｉｂｌｅ）凝集体に該当する不溶化タンパク質は、前述した方法では精度よく分離することができなかった。本発明の装置は、サブビジブル凝集体であっても精度よく分離できるため、抗体などタンパク質の凝集体の分離や除去を精度よく実施できる。
【００２６】
本発明でキャピラリー管に導入する流体は、液体または気体があげられるが、より高い分離能を達成する観点では液体が好ましい。流体として液体を用いる場合、分離する粒子に応じ、適宜当該粒子に対し不溶性の液体を選択すればよい。例えば分離する粒子が工業材料の場合、製造時用いた溶媒をそのまま用いてもよいし、水などの安価かつ無害な溶媒に置換してもよい。一方、分離する粒子が細胞、ウイルス、抗体といった生体試料の場合は、製造時または調製時に用いた溶媒を用いると好ましい。具体的には分離する粒子が細胞の場合、当該細胞の生存を担保する点で、培養に用いた培地、全血、血漿、生理食塩水、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）、ＴＢＳ（Ｔｒｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）などが好ましい。なお流体として液体を用いる場合、当該液体に界面活性剤、タンパク質、ｐＨ調製剤、安定剤、増粘剤、保存剤、抗生物質、ポリマー、モノマーなどの添加物を添加してもよい。これら添加物により、液体の粘性を変えたり、非ニュートン性流体にすることで、キャピラリー管内の速度分布を変化させ、本発明による粒子分離能を高めることができる。
【００２７】
本発明の装置に備える、流動発生手段による流動を付与する場として用いるキャピラリー管（以下、後述のキャピラリー管と区別するためキャピラリー管Ａとも表記する）の内径および長さは、流動発生手段や検出部の性能に依存する点があるものの、流体中に含まれる粒子の加速度変化または加速度変化量が得られるものであれば、分離する粒子径の大きさに応じ、適宜選択すればよい。一例として、内径２００μｍ×長さ１ｍのキャピラリー管を用いることが出来る。分離能を向上させる目的で流動発生手段の出力を強化した場合、より内径が細く長いキャピラリー管を使用できる。
【００２８】
本発明では、往復する流動による粒子の配列およびキャピラリー管内の流体の流れ速度分布による粒子分離を行なった後、流体の流れ速度分布のみによるさらなる粒子分離を行なってもよい。本態様を採用することで、流体中に含まれる粒子の径に基づく分離をより精度よく行なえる。流体の流れ速度分布のみによるさらなる粒子分離を行なう際は、例えば、キャピラリー管Ａの下流側に追加のキャピラリー管（以下、前述のキャピラリー管Ａと区別するためキャピラリー管Ｂとも表記する）を備えればよい。なおキャピラリー管Ｂは、専らキャピラリー管内の流れ速度分布による、径に基づく粒子分離のために備えており、流動発生手段は備えない。キャピラリー管Ｂの内径は、分離する粒子径の大きさに応じ、適宜選択すればよいが、通常は、流体中に含まれる粒子の最大径（直径）の５倍から５０倍までの間とするとよく、２０倍から３０倍までの間とすると好ましい。具体例として、流体中に含まれる粒子の径が０．１μｍから２μｍの場合、キャピラリー管Ｂの内径は１０μｍから１００μｍまでの間とすればよく、４０μｍから６０μｍまでの間とすると好ましい。
【００２９】
キャピラリー管ＡおよびＢの形状および断面に特に限定はなく、形状としては直線状、曲線状、管状、面状などが、断面としては円形、楕円形、矩形、多角形、台形などが、それぞれあげられるが、断面形状は円形とした方が、耐圧の点および入手しやすさの点で好ましい。なお内面に様々な修飾が施されたキャピラリー管が市販されているが、分離したい粒子によりこのような修飾を施したキャピラリー管を適宜選択してもよい。キャピラリー管の材質は、流体および分離対象粒子に対して不活性（すなわち、流体に対して不溶性であり、かつ分離対象粒子との反応や吸着を起こさない）であればよく、さらに数ＭＰａ以上の耐圧性を持つ材質が好ましい。好ましい材質のキャピラリー管として、ポリイミドで被覆したフューズドシリカ（ｆｕｓｅｄ  ｓｉｌｉｃａ）管、ＰＥＥＫ（ポリエーテルエーテルケトン）樹脂製のキャピラリー管、融解石英などのガラス製キャピラリー管、ステンレスなどの金属製キャピラリー管が例示できる。
【００３０】
なお特にキャピラリー管Ｂは長さが長くなるため、コイル状にまとめられる材質を用いると、キャピラリー管の占有スペースが抑えられる点で好ましい。キャピラリー管Ｂの長さは、要求する粒子の分離（分画）度合に応じて適宜決定すればよいが、一般には１０ｃｍから５０ｍまでの間、好ましくは１ｍから３０ｍまでの間である。ただし細い内径のキャピラリー管を用いる場合、送液ポンプの送液限界圧力の関係上、短くする必要がある。またキャピラリー管Ｂは、当該管を直列および／または並列に複数備える態様であってもよい。
【００３１】
本発明の粒子分離方法を、往復する流動による粒子の配列および前記キャピラリー管内の流体の流れ速度分布による粒子分離（以下、１回目の粒子分離とも表記する）後、流体の流れ速度分布のみによるさらなる粒子分離（以下、２回目の粒子分離とも表記する）により行なう場合、当該１回目の粒子分離と２回目の粒子分離との間に、流体の流れと垂直方向に粒子を配列させる操作を行なうと、流体中に含まれる粒子の径に基づく分離を高い精度で迅速に行なえる点で好ましい。流体が液体であり、かつ１回目の粒子分離を前述したキャピラリー管Ａで、２回目の粒子分離を前述したキャピラリー管Ｂでそれぞれ行なう場合の、流体の流れと垂直方向に粒子を配列させる操作の一例として、キャピラリー管Ａとキャピラリー管Ｂとの間にシース液を導入する態様があげられる。シース液を導入すると、キャピラリー管に導入した粒子が当該管内壁に押し付けられ、キャピラリー管の半径方向（すなわち液体の流れと垂直方向）に前記粒子が整列する。粒子を含む液体が流れる流路に、層流となるようシース液を連続的に導入すると、流路の径が細い部分では、前記液体は流路壁（キャピラリー管）へほぼ接しながら流れる。また流路の流れと垂直の方向（流路断面が円形の場合、半径方向に等しい）では、液体中に含まれる各粒子が、その粒径に基づき整列する（特開２００５−２０５３８７号公報）。なお粒子を含む液体同様、シース液にも界面活性剤、タンパク質、ｐＨ調製剤、安定剤、増粘剤、保存剤、抗生物質、ポリマー、モノマーなどの添加物を添加してもよい。これら添加物により、液体の粘性を変えたり、非ニュートン性流体にすることで、キャピラリー管内の速度分布を変化させ、本発明の装置による粒子分離能を高めることができる。
【００３２】
本発明の方法および装置で分離した粒子の検出は、分離する粒子の性状に応じ、適宜選択すればよい。一例として、分離する粒子が、タンパク質、細胞やポリマービーズの場合、特定波長（例えば、２５４ｎｍや２８０ｎｍ）の吸収を検出する、ＵＶ検出器を用いることができる。なお分離対象粒子が蛍光色素や発光色素などで染色されている場合は、当該蛍光や発光を検出可能な検出器を用いてもよい。また粒子の通過を検出可能な装置（フローサイトメーターやコールターカウンターなど）や粒子の径を計測可能な装置（パーティクルカウンターなど）を用いて検出してもよい。さらに本発明の装置による分析結果に基づき、所望の径を有した粒子の分離・採取・除去も行なえる。
【発明の効果】
【００３３】
本発明のキャピラリー管を備えた流体中に含まれる粒子を分離する方法は、前記キャピラリー管に導入した、粒子を含む流体へ、往復する流動を発生させることに特徴がある。
【００３４】
本発明の方法および当該方法を利用した本発明の装置は、前記流動による粒子の配列および前記キャピラリー管内の流体の流れ速度分布に基づき粒子が分離されるため、試料中に含まれる粒子（特に直径が０．１μｍから数μｍである、サブビジブル凝集体に相当する粒子）をその径に基づき、精度よく分離（分級）することができる。
【００３５】
また本発明の装置は、前記往復する流動を発生する流動発生手段により粒子をその径に基づき流路（キャピラリー管）中央部へ移動させることができるため、前記キャピラリー管の下流側に、粒子分離用の追加のキャピラリー管をさらに備える場合、当該追加のキャピラリー管の長さを短くできる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】本発明の装置の一態様を示した図である。
【図２】図１に示す装置に備える、流動発生手段５０の詳細を示した側面図である。
【図３】図２に示す流動発生手段５０における、流路内への往復振動の発生を示した図（キャピラリー管４１およびチャンバー５１ａの部分）である。
【図４】本発明の装置に備えたキャピラリー管４１内で生じる、粒径に基づく各粒子９１・９２の分離を示した図である。
【図５】本発明の装置に備えたキャピラリー管４１・４２内で生じる、粒径に基づく各粒子９１・９２の分離の拡大を示した図である。
【図６】実施例１および２で行なった、流動発生手段５０による非対称振動流の振動方向を示した図である。
【図７】図１に示す装置を用いて、直径０．１μｍと１μｍとの混合粒子を分離した際、得られたクロマトグラムである。
【図８】実施例２で用いた装置を示した図である。
【図９】図８に示す装置を用いて、直径０．１μｍと１μｍとの混合粒子を分離した際、得られたクロマトグラム（ａ）、および回収した各ピークの顕微鏡観察結果（（ｂ）：直径１μｍの粒子に相当するピーク、（ｃ）：直径０．１μｍの粒子に相当するピーク）である。
【図１０】比較例１で用いた装置を示した図である。
【図１１】図１０に示す装置を用いて、直径０．１μｍおよび／または１μｍの粒子を分離した際、得られたクロマトグラムである。図中（Ａ）が直径０．１μｍの粒子を用いたときの結果であり、（Ｂ）が直径１μｍの粒子を用いたときの結果であり、（Ｃ）が直径０．１μｍと１μｍとの混合粒子を用いたときの結果である。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
以下、図面を用いて本発明を詳細に説明する。
【００３８】
本発明の装置の一態様を図１に示す。図１に示す粒子分離装置１００は、
粒子を含む試料を導入するためのインジェクター（試料導入手段）３０と、
粒子を含む試料を希釈し、粒子を分散させるための液体１１、およびその送液ポンプ２１と、
分離場であるキャピラリー管４１と、
キャピラリー管４１に往復する振動を付与することで、キャピラリー管４１内の液体に対し往復する流動を発生させる、流動発生手段５０と、
分離した粒子を検出するための検出器６０と、
流路を開閉する（切替える）ための三方弁７１・７２と、
を備えている。なお図１に示す粒子分離装置１００には、この他に、補給液１２およびその送液ポンプ２２を、その流路がキャピラリー管４１と検出器６０との間に設けた流路合流部８０で連通するよう、備えているが、これは検出器６０内の流路配管内径がキャピラリー管４１の内径より大きく、検出器６０内の流路配管で粒子が再混合することを防ぐ目的で備えている。
【００３９】
図１に示す装置に備える、流動発生手段５０の詳細図を図２に示す。図２に示す流動発生手段５０は、
チャンバー５１ａ・５１ｂと、
各チャンバー５１ａ・５１ｂ上面を押下することで各チャンバー５１ａ・５１ｂ内に振動を発生させる圧電素子５２ａ・５２ｂと、
前記発生した振動を、流動としてキャピラリー管４１へ伝達させるための連通流路５３ａ・５３ｂと、
を設けている。圧電素子５２へ印加する信号の波形に特に限定はなく、点対称、非点対称、線対称、非線対称、いずれの波形であってもよい。また各圧電素子５２ａ・５２ｂへ印加する信号の波形は同期していてもよいし、同期していなくてもよい。また時間軸に対して線対称の波形を用いてもよい。圧電素子５２へ印加する信号の波形の具体例としては、正弦波、三角波、方形波、台形波、ノコギリ波、減衰振動波、ハーフサインエッジパルス波、パルスサージ波、指数立ちあがり波、指数立ちさがり波があげられる。中でも、ノコギリ波、減衰振動波、ハーフサインエッジパルス波、パルスサージ波、指数立ちあがり波、指数立ちさがり波などの非線対称波形が、高い精度の分離を迅速に行なえる点で好ましい。なお圧電素子５２の押下により発生する往復流動の形成を阻害しないよう、流れの方向を制限するチェックバルブや圧電素子５２の挙動に同期した電動バルブをチャンバー５１にさらに設けてもよい。
【００４０】
図２に示す流動発生手段５０における、キャピラリー管４１内への往復流動の発生を示した図を図３に示す。印加される電圧に対応した距離で圧電素子５２ａがチャンバー５１ａ上面を押下すると、チャンバー５１ａ内空間が圧縮され、チャンバー５１ａ−連通流路５３ａ−キャピラリー管４１、という流れが形成される（図３（Ａ））。一方、印加された電圧が解除され圧電素子５２ａのチャンバー５１ａ上面への押下が解除されると、チャンバー５１ａ内空間が元の状態に戻り、逆にキャピラリー管４１−連通流路５３ａ−チャンバー５１ａ、という流れが形成される（図３（Ｂ））。これらの動作を圧電素子５２ａへ印加する周波数信号に基づき交互に行なうことで、キャピラリー管４１内の往復流動を発生させる。なおチャンバー５１ｂ側についても、同様に圧電素子５２ｂによるチャンバー５１ｂ上面への印加により、キャピラリー管４１内の往復流動を発生させる。
【００４１】
図１に示す粒子分離装置１００および図２に示す流動発生手段５０を用いた粒子分離は、具体的には、以下に示す流れで実施される。
（ｉ）インジェクター３０を用いて、粒子を含む試料を、粒子を分散させるための液体１１が流れる流路に導入する。
（ｉｉ）流動発生手段５０を備えたキャピラリー管４１に前記粒子を滞留させた後、三方弁７１・７２の切替により粒子を分散させるための液体１１側の流路を閉じる。なお粒子を分散させるための液体１１側の流路を閉じる際、送液ポンプ２１を止め粒子を分散させるための液体１１の流れを止めても良いし、送液ポンプ２１は動かしたまま粒子を分散させるための液体１１を迂回流路に流しても良い。
（ｉｉｉ）圧電素子５２ａ・５２ｂによるチャンバー５１ａ・５１ｂへの押下により、キャピラリー管４１内の粒子を含む液体を振動させる。前記粒子は振動流の効果により、管壁から流路の中心に向かって小さい粒子から大きい粒子の順に配列する（図４）。
（ｉｖ）再び三方弁７１・７２を切替えることで、キャピラリー管４１内の粒子を含む流体を、径の大きさに基づき粒子が配列した状態で、送液ポンプ２１によって流す。このときキャピラリー管４１内は管壁から中心に向かって溶離液の速度勾配があるため、前記配列した粒子はその径の大きさに基づき排出時間に差が生じる（図５）。そのため当該排出時間の違いにより、径に基づく粒子の分離（分級）が可能となる。
（ｖ）キャピラリー管４１から排出された粒子は、流路合流部８０で流量調製用の補給液１２の供給を受けた後、検出器６０で検出する。検出器６０からの出力は、Ａ／Ｄコンバーターを介してコンピュータ（図示せず）に取り込むことで、コンピュータによる解析を行なった後、クロマトグラムとして出力する。
【００４２】
送液ポンプ２１・２２は微小流量（例えば０．００１ｍＬ／ｍｉｎから０．５ｍＬ／ｍｉｎ）を正確に送液可能なポンプであれば特に限定はなく、一例としてＤＰ−８０２０（東ソー製）やＳＰＤ−２０Ａ（島津製作所製）などの高速液体クロマトグラフ用ポンプがあげられる。このうちＤＰ−８０２０は３０ＭＰａまで使用可能であり、流速は０．００１ｍＬ／ｍｉｎから５ｍＬ／ｍｉｎまで調整可能である。
【００４３】
インジェクター（試料導入手段）３０は、微小試料（例えば、０．１μＬから１０μＬ）を導入可能かつ、高速液体クロマトグラフなど耐圧性を必要とするシステム内で使用可能なインジェクターであれば特に限定はなく、一例としてＲｈｅｏｄｙｎｅ社製のＭｏｄｅｌ  ７５２０があげられる。Ｍｏｄｅｌ  ７５２０は導入試料量として、０．２μＬ、０．５μＬ、１μＬおよび５μＬのサンプル・ループが選択可能なインジェクターである。
【００４４】
ここで前記（ｉｉｉ）に記載の、キャピラリー管４１内における粒子の配列について、図２から図４を用いて詳細に説明する。粒子を含む液体はキャピラリー管４１内で圧電素子５２ａ・５２ｂによるチャンバー５１ａ・５１ｂへの押下により発生する振動にさられる（図２および図３）。液体中の粒子のうち、径の大きな粒子９２と径の小さな粒子９１は、前記振動による加速度変化時に発生する、粒子周りの不均一な速度分布由来のせん断力により流路中央に押し付けられるが、径の大きな粒子９２は径の小さな粒子９１と比較し、流路の中央に寄るため、粒子は液体の流れに対し垂直な方向（管の半径方向）に粒子径の大きさごとに配列する（図４）。図４に示す態様は、粒子を含む液体の液量が多い場合でも、粒子分離能の低下を防ぐことができる。
【００４５】
次に前記（ｉｖ）に記載の、キャピラリー管４１中における粒子分離について、図５を用いて詳細に説明する。ＤｉＭａｒｚｉｏおよびＧｕｔｔｍａｎが論文（Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，７，２６７（１９６９））中で説明しているように、キャピラリー管４１内を通過する液体には当該管の中心を頂点とした流速分布が形成される。粒子を含む液体は前記（ｉｉｉ）の工程により、径の大きな粒子９２はキャピラリー管４１の中央部に、径の小さな粒子９１はキャピラリー管４１の壁面部に、それぞれ配列するため、径の大きな粒子９２は径の小さな粒子９１よりも速くキャピラリー管４１内を移動する。結果、前記移動時間（速度分布）の違いにより、径に基づく粒子の分離（分級）が可能となる（図５）。
【００４６】
前記（ｖ）では、前記（ｉｖ）で径に基づき分離された粒子を、検出器６０で検出するが、キャピラリー管４１と検出器６０とを直結すると、一般に検出器６０内のセルおよび当該セルまでの流路配管の内径はキャピラリー管４１よりも大きいため、セル内または当該セルまでの流路配管内で、分離された粒子が再混合する。そこで、検出器６０の前（図１では流路合流部８０の位置）に補給液を供給する系（図１では補給液１２およびポンプ２２）を備えることで、前記粒子の再混合を抑え、検出器６０で得られるピークの拡散を防止する。補給液を導入する系に特に限定はなく、図１に示す系でもよく、特表平５−５０２７１７号公報に開示の系でもよい。なお検出器６０内のセルおよび当該セルまでの流路配管の内径がキャピラリー管４１よりも小さい場合は、前記粒子の再混合はないため、補給液を供給する系を備える必要はない。また補給液１２は、粒子を分散させるための液体１１と同じ溶液を使用すればよい。
【００４７】
本発明の装置の好ましい態様を図８に示す。図８に示す粒子分離装置１００は、図１に示す粒子分離装置１００に、追加のキャピラリー管４２を、流動発生手段５０を設けたキャピラリー管４１の下流側（すなわち三方弁７２側）に、さらに備えた態様である。図８に示す粒子分離装置１００は、追加のキャピラリー管４２により前記（ｉｖ）の工程が強化されるため、径に基づく粒子の分離能がさらに向上する。
【実施例】
【００４８】
以下、実施例および比較例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
【００４９】
実施例１
本実施例で用いた粒子分離装置を図１に示す。図１に示す粒子分離装置１００は、
粒子を分散させるための液体１１および補給液１２としては純水を、
ポンプ２１としてはＳＰＤ−２０Ａ（島津製作所）を、
ポンプ２２としてはＤＰ−８０２０（東ソー製）を、
インジェクター３０としてはＲｈｅｏｄｙｎｅ社製Ｍｏｄｅｌ  ７５２０（０．２μＬのサンプル・ループを使用）を、
キャピラリー管４１としては内径２００μｍ×長さ１ｍの融解石英製キャピラリー管（ＳＧＥ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ製）を、
流動発生手段５０としては図２に示す手段を、
検出器６０としてはＵＶ検出器ＵＶ−８０２０（東ソー製）を、
それぞれ用いた。なおポンプ２１の流速は０．０２５ｍＬ／ｍｉｎ、ポンプ２２の流速は０．２ｍＬ／ｍｉｎである。試料導入後４０秒後にポンプ２１を停止し、粒子懸濁液がキャピラリー管４１にある状態で三方弁７１・７２により流路閉に切り替えた後、圧電素子５２によるチャンバー５１上面の押下により、キャピラリー管４１の軸方向（すなわち三方弁７１から三方弁７２への方向）と平行に往復する流動を発生させた。なお前記流動における、キャピラリー管４１内に存在する粒子を含む液体の変位量を示す波形は、ピエゾ素子の振動幅１００μｍ、１０ヘルツ（１０秒サイクル）のノコギリ波（図６）であり、圧電素子５２へ１０分間印加した。ノコギリ波を印加後、三方弁７１・７２を流路開に切り替えることで検出器６０への流路と連通させた後、ポンプ２１の流速０．０１ｍＬ／ｍｉｎで通液を再開した。
【００５０】
試料としては、直径０．１μｍの１ｗｔ％単分散ラテックス溶液（ＪＳＲライフサイエンス製）と直径１μｍの１ｗｔ％単分散ラテックス溶液（ＪＳＲライフサイエンス製）とを１：１で混合後、純水で５０倍希釈した溶液（０．１μｍ粒子０．０１ｗｔ％、１μｍ粒子０．０１ｗｔ％含有）を用い、インジェクター３０を用いて粒子分離装置１００へ０．２μＬ導入した。検出器６０による検出は２５４ｎｍにおける吸収を用い、検出器６０からの出力をコンピュータに取り込み、クロマトグラムを作成した。
【００５１】
得られたクロマトグラムを図７に示す。導入３０秒後および４５秒後に、ピークトップを確認し、かつ両ピークトップは明確に分離していた。以上の結果から、図１に示す本発明の装置１００を用いることで、直径０．１μｍの粒子と直径１μｍの粒子とを明確に分離できることがわかる。
【００５２】
実施例２  
本実施例で用いた粒子分離装置を図８に示す。図８に示す粒子分離装置１００は、図１に示す装置に、追加のキャピラリー管４２を、流動発生手段５０を設けたキャピラリー管４１の下流側（すなわち三方弁７２側）に、さらに備えた装置である。
キャピラリー管４２としては内径７５μｍ×長さ１０ｍの融解石英製キャピラリー管（４１、４２ともにＳＧＥ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ製）を使用した。
【００５３】
粒子を分散させるための液体１１、補給液１２、送液ポンプ２１・２２、インジェクター３０、キャピラリー管４１、検出器６０は実施例１と同じものを用いた。送液ポンプ２１・２２の流速も実施例１と同じ流速とし、ポンプの圧力が安定した後、試料を導入した。試料は、実施例１で使用した溶液と同じもの（直径０．１μｍの粒子と直径１μｍの粒子との１：１混合液）を用いた。試料導入後、検出までの操作は実施例１と同様な方法で行ない、クロマトグラムを作成した。
【００５４】
得られたクロマトグラムを図９に示す。導入後１５０秒後に直径１μｍの粒子に相当するピークトップを、導入後２１０秒後に直径０．１μｍの粒子に相当するピークトップを確認し、かつ両ピークトップは明確に分離していた（図９（ａ））。さらに直径１μｍの粒子に相当するピークトップ領域および直径０．１μｍの粒子に相当するピークトップ領域をそれぞれ回収し、顕微鏡で確認したところ、直径１μｍの粒子に相当するピークトップ領域は粒子を確認できた（図９（ｂ））が、それに反して直径０．１μｍの粒子（図９（ｃ））では粒子が確認できなかった。（直径０．１μｍの粒子は小さすぎて顕微鏡では確認できない）以上の結果から、図１に示す粒子分離装置１００の下流側に追加のキャピラリー管４２を備えることで、直径０．１μｍの粒子の分離時間と直径１μｍの粒子の分離時間とが拡大（分離能が向上）することがわかる。
【００５５】
比較例１
本比較例で用いた粒子分離装置を図１０に示す。図１０に示す粒子分離装置１００は、図８に示す粒子分離装置１００から、キャピラリー管４１に備える流動発生手段５０を省いた態様である。粒子を分散させるための液体１１、補給液１２、送液ポンプ２１・２２、インジェクター３０、キャピラリー管４１・４２、検出器６０は実施例１と同じものを用いた。送液ポンプ２１・２２の流速も実施例１と同じ流速を用い、ポンプの圧力が安定した後、試料を導入した。試料としては下記（Ａ）から（Ｃ）のいずれかを用い、インジェクター３０を用いて粒子分離装置１００へ０．２μＬ導入した。
（Ａ）直径０．１μｍの１ｗｔ％単分散ラテックス溶液（ＪＳＲライフサイエンス製）を純水で１００倍希釈した溶液（粒子０．０１ｗｔ％含有）
（Ｂ）直径１μｍの１ｗｔ％単分散ラテックス溶液（ＪＳＲライフサイエンス製）を純水で１００倍希釈した溶液（粒子０．０１ｗｔ％含有）
（Ｃ）直径０．１μｍの１ｗｔ％単分散ラテックス溶液（ＪＳＲライフサイエンス製）と直径１μｍの１ｗｔ％単分散ラテックス溶液（ＪＳＲライフサイエンス製）とを１：１で混合後、純水で５０倍希釈した溶液（０．１μｍ粒子０．０１ｗｔ％、１μｍ粒子０．０１ｗｔ％含有）
検出は実施例１と同様な方法で行ない、クロマトグラムを作成した。
【００５６】
得られたクロマトグラムを図１１に示す。試料（Ａ）（直径０．１μｍの粒子）を導入したときは、導入後１７０秒のピークトップを確認し、試料（Ｂ）（直径１μｍの粒子）を導入したときは、導入後１９０秒後付近に単一ピークトップを確認しており、単一の粒径からなる粒子を用いればピークは重なるもののピークトップは粒径ごとに異なる（試料（Ａ）：導入後２００秒付近、試料（Ｂ）：導入後１７０秒付近）結果となった。一方、試料（Ｃ）（直径０．１μｍの粒子と直径１μｍの粒子との混合物）を導入したときは、導入後２００秒後付近に単一のピークトップを確認し直径０．１μｍの粒子と直径１μｍの粒子の明確な分離が確認できなかった。以上の結果から、流動発生手段を備えない（すなわちキャピラリー管４１・４２に導入した、粒子を含む液体へ、往復する振動を与えない）と、追加のキャピラリー管４２を装備しても、直径０．１μｍの粒子と直径１μｍの粒子との明確な分離ができないことがわかる。
【符号の説明】
【００５７】
１００：粒子分離装置
１１：粒子を分散させるための液体
１２：補給液
２１、２２：送液ポンプ
３０：インジェクター（試料導入手段）
４１、４２：キャピラリー管
５０：流動発生手段
５１：チャンバー
５２：圧電素子
５３：連通流路
６０：検出器
７１、７２：三方弁
８０：流路合流部
９１：径の小さな粒子
９２：径の大きな粒子
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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