(57)【要約】【課題】  ＭＤＣＫ細胞を用いて効率的にインフルエンザウイルスを増殖させる方法を提供すること。【解決手段】ＭＤＣＫ細胞を用いてインフルエンザＡ型ウイルスを増殖させる方法であって、インフルエンザＡ型ウイルスが、インフルエンザＡ型ウイルスのＲＮＡポリメラーゼ（ウイルスポリメラーゼ）を構成するＰＢ１、ＰＢ２、及びＰＡから選択される少なくとも１つのサブユニットにアミノ酸変異を含み、前記アミノ酸変異が、ウイルスポリメラーゼとウイルスゲノムＲＮＡ（ｖＲＮＡ）との接合部位に位置するアミノ酸の変異である、インフルエンザウイルスの増殖方法による。【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＤＣＫ細胞を用いてインフルエンザＡ型ウイルスを増殖させる方法であって、インフルエンザＡ型ウイルスが、インフルエンザＡ型ウイルスのＲＮＡポリメラーゼ（ウイルスポリメラーゼ）を構成するＰＢ１、ＰＢ２、及びＰＡからなる群より選択される少なくとも１つのサブユニットにアミノ酸変異を含み、前記アミノ酸変異が、ウイルスポリメラーゼとウイルスゲノムＲＮＡ（ｖＲＮＡ）との接合部位に位置する、インフルエンザウイルスの増殖方法。
【請求項２】
ウイルスポリメラーゼにおけるアミノ酸変異が、ＰＢ１のβ−リボンドメイン、ＰＢ１のβ−ヘアピンドメイン、ＰＢ２のＮ１−サブドメイン、及びＰＢ２のヘリカル−リドドメインからなる群より選択される少なくとも１つのドメインにおけるアミノ酸変異を含む、請求項１に記載のインフルエンザウイルスの増殖方法。
【請求項３】
ウイルスポリメラーゼにおけるアミノ酸変異が、以下の（１）及び（２）からなる群より選択される少なくとも１つの位置のアミノ酸の変異を含む、請求項１又は２に記載のインフルエンザウイルスの増殖方法：
（１）ＰＢ１のアミノ酸配列における１９８位、１８２位、１７５位、２１４位、又は３８４位； 
（２）ＰＢ２のアミノ酸配列における１９５位、又は８０位。
【請求項４】
ウイルスポリメラーゼが、以下の（ｉ）及び（ii）からなる群より選択される少なくとも１つの位置のアミノ酸の変異をさらに含む、請求項１〜３のいずれかに記載のインフルエンザウイルスの増殖方法：
（ｉ）ＰＢ２のアミノ酸配列における４７３位、又は５７０位；
（ii）ＰＡのアミノ酸配列における６４９位、６６９位、又は３４１位。
【請求項５】
インフルエンザＡ型ウイルスが、さらに核蛋白質（ＮＰ）にアミノ酸変異を含むものである、請求項１〜４のいずれかに記載のインフルエンザウイルスの増殖方法。
【請求項６】
ＮＰにおけるアミノ酸変異が、ＮＰのアミノ酸配列における２８７位、又は３７１位からなる群より選択される少なくとも１つの位置のアミノ酸の変異を含む、請求項５に記載のインフルエンザウイルスの増殖方法。
【請求項７】
ＭＤＣＫ細胞を用いてインフルエンザＡ型ウイルスを増殖させる方法であって、インフルエンザＡ型ウイルスが、以下の（ａ）〜（ｉ）から選択されるいずれかのアミノ酸変異を含む、インフルエンザウイルスの増殖方法：
（ａ）ＰＢ２のアミノ酸配列における４７３位及び１９５位のアミノ酸の置換：
（ｂ）ＰＢ１のアミノ酸配列における１８２位のアミノ酸の置換； 
（ｃ）ＰＢ１のアミノ酸配列における１９８位のアミノ酸の置換； 
（ｄ）ＰＢ１のアミノ酸配列における１９８位、及び１７５位のアミノ酸の置換； 
（ｅ）ＰＢ１のアミノ酸配列における１８２位、２１４位、及び３８４位のアミノ酸の置換；
（ｆ）ＰＢ２のアミノ酸配列における５７０位、及び８０位のアミノ酸の置換、ＰＢ１のアミノ酸配列における１９８位、及び１７５位のアミノ酸の置換、並びに、ＮＰのアミノ酸配列における２８７位のアミノ酸の置換；
（ｇ）ＰＢ２のアミノ酸配列における４７３位、及び１９５位のアミノ酸の置換、ＰＢ１のアミノ酸配列における１８２位、及び２１４位のアミノ酸の置換、ＰＡのアミノ酸配列における６６９位、及び６４９位のアミノ酸の置換、並びに、ＮＰのアミノ酸配列における２８７位、及び３７１位のアミノ酸の置換；
（ｈ）ＰＢ２のアミノ酸配列における５７０位、及び８０位のアミノ酸の置換、ＰＢ１のアミノ酸配列における１９８位のアミノ酸の置換、ＰＡのアミノ酸配列における３４１位のアミノ酸の置換、並びに、ＮＰのアミノ酸配列における２８７位のアミノ酸の置換；
（ｉ）ＰＢ２のアミノ酸配列における７０１位のアミノ酸の置換、及び、ＰＢ１のアミノ酸配列における１９８位のアミノ酸の置換。
【請求項８】
ＰＢ１が以下の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかであり、ＰＢ２が以下の（Ｄ）〜（Ｆ）のいずれかであり、ＰＡが以下の（Ｇ）〜（Ｉ）のいずれかであり、ＮＰが以下の（Ｊ）〜（Ｌ）のいずれかである、請求項１〜７のいずれかに記載のインフルエンザウイルスの増殖方法；
（Ａ）配列番号１で特定されるアミノ酸配列で特定される蛋白質；
（Ｂ）配列番号１で特定されるアミノ酸配列のうち、１個または複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、導入されてなるアミノ酸配列で特定される蛋白質であって、ウイルスポリメラーゼのサブユニットであるＰＢ１として機能する蛋白質；
（Ｃ）配列番号１で特定されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列で特定される蛋白質であって、ウイルスポリメラーゼのサブユニットであるＰＢ１として機能する蛋白質；
（Ｄ）配列番号２で特定されるアミノ酸配列で特定される蛋白質；
（Ｅ）配列番号２で特定されるアミノ酸配列のうち、１個または複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、導入されてなるアミノ酸配列で特定される蛋白質であって、ウイルスポリメラーゼのサブユニットであるＰＢ２として機能する蛋白質；
（Ｆ）配列番号２で特定されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列で特定される蛋白質であって、ウイルスポリメラーゼのサブユニットであるＰＢ２として機能する蛋白質；
（Ｇ）配列番号３で特定されるアミノ酸配列で特定される蛋白質；
（Ｈ）配列番号３で特定されるアミノ酸配列のうち、１個または複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、導入されてなるアミノ酸配列で特定される蛋白質であって、ウイルスポリメラーゼのサブユニットであるＰＡとして機能する蛋白質；
（Ｉ）配列番号３で特定されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列で特定される蛋白質であって、ウイルスポリメラーゼのサブユニットであるＰＡとして機能する蛋白質；
（Ｊ）配列番号４で特定されるアミノ酸配列で特定される蛋白質；
（Ｋ）配列番号４で特定されるアミノ酸配列のうち、１個または複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、導入されてなるアミノ酸配列で特定される蛋白質であって、核蛋白質であるＮＰとして機能する蛋白質；
（Ｌ）配列番号４で特定されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列で特定される蛋白質であって、核蛋白質であるＮＰとして機能する蛋白質。
【請求項９】
インフルエンザＡ型ウイルスが、Ｈ５亜型、Ｈ１亜型、Ｈ３亜型、Ｈ７亜型、及びＨ９亜型から選択されるいずれかである、請求項１〜８のいずれかに記載のインフルエンザウイルスの増殖方法。
【請求項１０】
インフルエンザＡ型ウイルスが、Ｈ５亜型である、請求項１〜９のいずれかに記載のインフルエンザウイルスの増殖方法。
【請求項１１】
ＭＤＣＫ細胞を用いて増殖させるためのインフルエンザＡ型ウイルスであって、ウイルスポリメラーゼを構成するＰＢ１、ＰＢ２、及びＰＡからなる群より選択される少なくとも１つのサブユニットにアミノ酸変異が導入されてなり、前記アミノ酸変異が、ウイルスポリメラーゼとｖＲＮＡとの接合部位に位置する、インフルエンザＡ型ウイルス。
【請求項１２】
インフルエンザＡ型ウイルスが、さらにＮＰにアミノ酸変異を含むものである、請求項１１に記載のインフルエンザＡ型ウイルス。
【請求項１３】
請求項１〜１０のいずれかに記載のインフルエンザウイルスの増殖方法を含む、インフルエンザワクチンの製造方法。
【請求項１４】
請求項１〜１０のいずれかに記載のインフルエンザウイルスの増殖方法により得られた、インフルエンザウイルス。
【請求項１５】
請求項１３に記載のインフルエンザワクチンの製造方法により製造された、インフルエンザワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＭＤＣＫ細胞を用いてインフルエンザウイルスを増殖させる方法に関する。より具体的には、インフルエンザＡ型ウイルスのＲＮＡポリメラーゼにアミノ酸変異を含むインフルエンザＡ型ウイルスを、ＭＤＣＫ細胞を用いて増殖させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザは毎年世界中で流行する感染症であり、インフルエンザウイルスにより引き起こされる。インフルエンザウイルスは、オルトミクソウイルス科に属し、脂質二重膜構造をもつエンベロープを有する。Ａ型、Ｂ型及びＣ型の３属に分類される。Ａ型、Ｂ型及びＣ型の違いは、ウイルス粒子を構成する蛋白質のうち、Ｍ１蛋白質とＮＰ蛋白質の抗原性の違いに基づく。また同じインフルエンザＡ型ウイルスであっても、エンベロープの表面上の分子である赤血球凝集素（ヘマグルチニン、以下「ＨＡ」）やノイラミニダーゼ（以下「ＮＡ」）の抗原性の違いから、１６種のＨＡ（Ｈ１〜Ｈ１６）亜型及び９種のＮＡ（Ｎ１〜Ｎ９）亜型に分類される。
【０００３】
インフルエンザＡ型ウイルスのＨ１Ｎ１亜型及びＨ３Ｎ２亜型は季節的に広まり、ヒト感染を引き起こす。２００３年には、鳥由来のインフルエンザウイルスＨ５亜型がヒト病原体として発生し、２００９年４月には、新型のインフルエンザウイルスとしてＨ１Ｎ１亜型ウイルスが発生し、ヒト集団において急速に蔓延した。鳥や豚で流行するインフルエンザウイルスは、ヒトで増殖しやすく変異を獲得することで、歴史的にパンデミックウイルスに変化してきたが、そのメカニズムの詳細は不明なままである。メカニズムを解明するために、例えばＲＮＡポリメラーゼのヒトへの適応変異についての研究が進められている（非特許文献１〜７）。
【０００４】
Ｈ５Ｎ１型の高病原性鳥インフルエンザウイルスは、鳥からヒトに感染すると致死率が６０％と極めて高い重度の呼吸器疾患を引き起こすことから、パンデミックが危惧されている。中国、インドネシア、ベトナム、エジプト等の地域では、鳥類において継続的な伝播を繰り返す流行域が存在する。特にエジプトは、Ｈ５Ｎ１型の高病原性鳥インフルエンザの蔓延地域であり、近年ヒト感染事例が際立って多いことが、世界保健機関（ＷＨＯ）より報告されており、同地域からパンデミックウイルスが出現する潜在性が高いことが指摘されている。さらに、インフルエンザウイルスは高い確率で抗原変化し、新型のインフルエンザウイルス株を生み出す。インフルエンザのパンデミックを防ぐために、新たなインフルエンザワクチンの開発が急務であり、インフルエンザワクチンを量的に確保するための技術が必要とされている。
【０００５】
インフルエンザワクチンの製造には、発育鶏卵を利用してインフルエンザウイルスを増殖させる方法が用いられている。一方で、発育鶏卵を利用した製造方法は原料調達や品質管理のハードルが高いことから、培養細胞でインフルエンザウイルスを増殖させて製造する方法が実用化されつつある。インフルエンザワクチンの製造に用いられる伝統的な培養細胞として、マディン−ダービーイヌ腎臓由来細胞（以下「ＭＤＣＫ細胞」）やアフリカミドリザル腎臓由来細胞（以下「Ｖｅｒｏ細胞」）等が挙げられる。Ｖｅｒｏ細胞は、広範囲のウイルスに対する感受性を持つことが知られている。ＭＤＣＫ細胞は１９５８年に正常な雄のコッカースパニエルの腎臓から樹立された細胞である。ＭＤＣＫ細胞は、インフルエンザウイルスに対する感受性が、１９６８年にＧａｕｓｈらによって明らかにされ、各種インフルエンザウイルスの分離に利用されてきた。
【０００６】
ＭＤＣＫ細胞やＶｅｒｏ細胞等の培養細胞を用いたインフルエンザワクチンの製造では、培養細胞の種類、インフルエンザウイルスの亜型や株によってインフルエンザウイルスの増殖性が低下してしまうため、迅速かつ十分な量のワクチン供給に制約が生じることが問題視されている。
【０００７】
培養細胞において効率よく増殖するインフルエンザウイルスを取得するために、インフルエンザウイルスのワクチン抗原として重要なＨＡとＮＡ以外の６つのウイルスＲＮＡ分節であるバックボーンについての探索が行われている。例えば、Ａ／プエルトリコ／８／３４ウイルス株（以下「ＰＲ８株」）の変異体ライブラリーのスクリーニングが行われ、効率よく増殖するＰＲ８株のバックボーンを得たことが報告されている。かかるＰＲ８株のバックボーンを用いて、Ｖｅｒｏ細胞およびＭＤＣＫ細胞を用いてインフルエンザウイルスを培養したところ、Ｈ１Ｎ１亜型、Ｈ３Ｎ２亜型、Ｈ５Ｎ１亜型およびＨ７Ｎ９亜型のウイルス力価が改善されたことが報告されている（非特許文献８）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｓｏｎｇ  Ｗ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２０１４  Ｎｏｖ  ２０；５：５５０９．  ｄｏｉ：  １０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ６５０９．
【非特許文献２】Ｆａｎ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２０１４  Ｏｃｔ  ７；５：５０２１．  ｄｏｉ：  １０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ６０２１．
【非特許文献３】Ｇａｂｒｉｅｌ  Ｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ２００５  Ｄｅｃ  ２０；１０２（５１）：１８５９０−５．  Ｅｐｕｂ  ２００５  Ｄｅｃ  ８．  ｄｏｉ：  １０．１０７３／ｐｎａｓ．０５０７４１５１０２
【非特許文献４】Ｌｉ  Ｚ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  ２００５  Ｓｅｐ；７９（１８）：１２０５８−６４．  ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．７９．１８．１２０５８−１２０６４．２００５
【非特許文献５】Ｍｅｈｌｅ  Ａ，  ｅｔ  ａｌ，    Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ２００９  Ｄｅｃ  １５；１０６（５０）：２１３１２−６．  ｄｏｉ：  １０．１０７３／ｐｎａｓ．０９１１９１５１０６．  Ｅｐｕｂ  ２００９  Ｄｅｃ  ７．
【非特許文献６】Ｔａｆｔ  ＡＳ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２０１５  Ｊｕｎ  １７；６：７４９１．  ｄｏｉ：  １０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ８４９１．
【非特許文献７】Ｙａｍａｄａ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ．  ２０１０  Ａｕｇ  ５；６（８）：ｅ１００１０３４．  ｄｏｉ：  １０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｐａｔ．１００１０３４．
【非特許文献８】Ｐｉｎｇ  Ｊ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２０１５  Ｓｅｐ  ２；６：８１４８．  ｄｏｉ：  １０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ９１４８．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、ＭＤＣＫ細胞を用いて効率的にインフルエンザウイルスを増殖させる方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、インフルエンザＡ型ウイルスのＲＮＡポリメラーゼ（以下「ウイルスポリメラーゼ」）にアミノ酸変異を含み、アミノ酸変異がウイルスポリメラーゼとウイルスゲノムＲＮＡ（以下「ｖＲＮＡ」）との接合部位に位置するインフルエンザＡ型ウイルスを、ＭＤＣＫ細胞を用いたインフルエンザウイルスの増殖方法に用いることにより、インフルエンザウイルスの増殖性を増大させ得ることを見出し、本発明を完成した。
【００１１】
本発明は、すなわち以下よりなる。
１．ＭＤＣＫ細胞を用いてインフルエンザＡ型ウイルスを増殖させる方法であって、インフルエンザＡ型ウイルスが、インフルエンザＡ型ウイルスのＲＮＡポリメラーゼ（ウイルスポリメラーゼ）を構成するＰＢ１、ＰＢ２、及びＰＡからなる群より選択される少なくとも１つのサブユニットにアミノ酸変異を含み、前記アミノ酸変異が、ウイルスポリメラーゼとウイルスゲノムＲＮＡ（ｖＲＮＡ）との接合部位に位置する、インフルエンザウイルスの増殖方法。
２．ウイルスポリメラーゼにおけるアミノ酸変異が、ＰＢ１のβ−リボンドメイン、ＰＢ１のβ−ヘアピンドメイン、ＰＢ２のＮ１−サブドメイン、及びＰＢ２のヘリカル−リドドメインからなる群より選択される少なくとも１つのドメインにおけるアミノ酸変異を含む、前項１に記載のインフルエンザウイルスの増殖方法。
３．ウイルスポリメラーゼにおけるアミノ酸変異が、以下の（１）及び（２）からなる群より選択される少なくとも１つの位置のアミノ酸の変異を含む、前項１又は２に記載のインフルエンザウイルスの増殖方法：
（１）ＰＢ１のアミノ酸配列における１９８位、１８２位、１７５位、２１４位、又は３８４位； 
（２）ＰＢ２のアミノ酸配列における１９５位、又は８０位。
４．ウイルスポリメラーゼが、以下の（ｉ）及び（ii）からなる群より選択される少なくとも１つの位置のアミノ酸の変異をさらに含む、前項１〜３のいずれかに記載のインフルエンザウイルスの増殖方法：
（ｉ）ＰＢ２のアミノ酸配列における４７３位、又は５７０位；
（ii）ＰＡのアミノ酸配列における６４９位、６６９位、又は３４１位。
５．インフルエンザＡ型ウイルスが、さらに核蛋白質（ＮＰ）にアミノ酸変異を含むものである、前項１〜４のいずれかに記載のインフルエンザウイルスの増殖方法。
６．ＮＰにおけるアミノ酸変異が、ＮＰのアミノ酸配列における２８７位、又は３７１位からなる群より選択される少なくとも１つの位置のアミノ酸の変異を含む、前項５に記載のインフルエンザウイルスの増殖方法。
７．ＭＤＣＫ細胞を用いてインフルエンザＡ型ウイルスを増殖させる方法であって、インフルエンザＡ型ウイルスが、以下の（ａ）〜（ｉ）から選択されるいずれかのアミノ酸変異を含む、インフルエンザウイルスの増殖方法：
（ａ）ＰＢ２のアミノ酸配列における４７３位及び１９５位のアミノ酸の置換：
（ｂ）ＰＢ１のアミノ酸配列における１８２位のアミノ酸の置換； 
（ｃ）ＰＢ１のアミノ酸配列における１９８位のアミノ酸の置換； 
（ｄ）ＰＢ１のアミノ酸配列における１９８位、及び１７５位のアミノ酸の置換； 
（ｅ）ＰＢ１のアミノ酸配列における１８２位、２１４位、及び３８４位のアミノ酸の置換；
（ｆ）ＰＢ２のアミノ酸配列における５７０位、及び８０位のアミノ酸の置換、ＰＢ１のアミノ酸配列における１９８位、及び１７５位のアミノ酸の置換、並びに、ＮＰのアミノ酸配列における２８７位のアミノ酸の置換；
（ｇ）ＰＢ２のアミノ酸配列における４７３位、及び１９５位のアミノ酸の置換、ＰＢ１のアミノ酸配列における１８２位、及び２１４位のアミノ酸の置換、ＰＡのアミノ酸配列における６６９位、及び６４９位のアミノ酸の置換、並びに、ＮＰのアミノ酸配列における２８７位、及び３７１位のアミノ酸の置換；
（ｈ）ＰＢ２のアミノ酸配列における５７０位、及び８０位のアミノ酸の置換、ＰＢ１のアミノ酸配列における１９８位のアミノ酸の置換、ＰＡのアミノ酸配列における３４１位のアミノ酸の置換、並びに、ＮＰのアミノ酸配列における２８７位のアミノ酸の置換；
（ｉ）ＰＢ２のアミノ酸配列における７０１位のアミノ酸の置換、及び、ＰＢ１のアミノ酸配列における１９８位のアミノ酸の置換。
８．ＰＢ１が以下の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかであり、ＰＢ２が以下の（Ｄ）〜（Ｆ）のいずれかであり、ＰＡが以下の（Ｇ）〜（Ｉ）のいずれかであり、ＮＰが以下の（Ｊ）〜（Ｌ）のいずれかである、前項１〜７のいずれかに記載のインフルエンザウイルスの増殖方法；
（Ａ）配列番号１で特定されるアミノ酸配列で特定される蛋白質；
（Ｂ）配列番号１で特定されるアミノ酸配列のうち、１個または複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、導入されてなるアミノ酸配列で特定される蛋白質であって、ウイルスポリメラーゼのサブユニットであるＰＢ１として機能する蛋白質；
（Ｃ）配列番号１で特定されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列で特定される蛋白質であって、ウイルスポリメラーゼのサブユニットであるＰＢ１として機能する蛋白質；
（Ｄ）配列番号２で特定されるアミノ酸配列で特定される蛋白質；
（Ｅ）配列番号２で特定されるアミノ酸配列のうち、１個または複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、導入されてなるアミノ酸配列で特定される蛋白質であって、ウイルスポリメラーゼのサブユニットであるＰＢ２として機能する蛋白質；
（Ｆ）配列番号２で特定されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列で特定される蛋白質であって、ウイルスポリメラーゼのサブユニットであるＰＢ２として機能する蛋白質；
（Ｇ）配列番号３で特定されるアミノ酸配列で特定される蛋白質；
（Ｈ）配列番号３で特定されるアミノ酸配列のうち、１個または複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、導入されてなるアミノ酸配列で特定される蛋白質であって、ウイルスポリメラーゼのサブユニットであるＰＡとして機能する蛋白質；
（Ｉ）配列番号３で特定されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列で特定される蛋白質であって、ウイルスポリメラーゼのサブユニットであるＰＡとして機能する蛋白質；
（Ｊ）配列番号４で特定されるアミノ酸配列で特定される蛋白質；
（Ｋ）配列番号４で特定されるアミノ酸配列のうち、１個または複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、導入されてなるアミノ酸配列で特定される蛋白質であって、核蛋白質であるＮＰとして機能する蛋白質；
（Ｌ）配列番号４で特定されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列で特定される蛋白質であって、核蛋白質であるＮＰとして機能する蛋白質。
９．インフルエンザＡ型ウイルスが、Ｈ５亜型、Ｈ１亜型、Ｈ３亜型、Ｈ７亜型、及びＨ９亜型から選択されるいずれかである、前項１〜８のいずれかに記載のインフルエンザウイルスの増殖方法。
１０．インフルエンザＡ型ウイルスが、Ｈ５亜型である、前項１〜９のいずれかに記載のインフルエンザウイルスの増殖方法。
１１．ＭＤＣＫ細胞を用いて増殖させるためのインフルエンザＡ型ウイルスであって、ウイルスポリメラーゼを構成するＰＢ１、ＰＢ２、及びＰＡからなる群より選択される少なくとも１つのサブユニットにアミノ酸変異が導入されてなり、前記アミノ酸変異が、ウイルスポリメラーゼとｖＲＮＡとの接合部位に位置する、インフルエンザＡ型ウイルス。
１２．インフルエンザＡ型ウイルスが、さらにＮＰにアミノ酸変異を含むものである、前項１１に記載のインフルエンザＡ型ウイルス。
１３．前項１〜１０のいずれかに記載のインフルエンザウイルスの増殖方法を含む、インフルエンザワクチンの製造方法。
１４．前項１〜１０のいずれかに記載のインフルエンザウイルスの増殖方法により得られた、インフルエンザウイルス。
１５．前項１３に記載のインフルエンザワクチンの製造方法により製造された、インフルエンザワクチン。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のインフルエンザウイルスの増殖方法によれば、ＭＤＣＫ細胞を用いて効率良くインフルエンザウイルスを増殖させ、高いウイルス力価及び高いＨＡ力価を達成する。本発明のインフルエンザウイルスの増殖方法は、インフルエンザワクチンの製造に利用することができ、インフルエンザワクチンの供給に寄与する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】インフルエンザウイルスのウイルスポリメラーゼ上におけるアミノ酸変異の位置を示す図である。
【図２】異なる亜型に属するインフルエンザＡ型ウイルスのＰＢ１遺伝子がコードするアミノ酸配列のアライメントを示す図である。
【図３】異なる亜型に属するインフルエンザＡ型ウイルスのＰＢ２遺伝子がコードするアミノ酸配列のアライメントを示す図である。
【図４】異なる亜型に属するインフルエンザＡ型ウイルスのＰＡ遺伝子がコードするアミノ酸配列のアライメントを示す図である。
【図５】異なる亜型に属するインフルエンザＡ型ウイルスのＮＰ遺伝子がコードするアミノ酸配列のアライメントを示す図である。
【図６】ウイルスポリメラーゼにアミノ酸変異を導入したインフルエンザウイルスを、ＭＤＣＫ細胞を用いて増殖させた場合のウイルス力価を示す図である。（実施例２）
【図７】ウイルスポリメラーゼにアミノ酸変異を導入したインフルエンザウイルスを、ＭＤＣＫ細胞を用いて増殖させた場合のＨＡ力価を示す図である。（実施例２）
【図８】ウイルスポリメラーゼにアミノ酸変異を導入したインフルエンザウイルスを、Ｖｅｒｏ細胞を用いて増殖させた場合のウイルス力価を示す図である。（比較例１）
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、ＭＤＣＫ細胞を用いてインフルエンザＡ型ウイルス（以下単に「インフルエンザウイルス」と称することもある）を増殖させる方法に関する。本発明者らは、Ｈ５Ｎ１型の高病原性鳥インフルエンザウイルスに感染した患者から検出されたウイルス遺伝子変異を網羅的に探索した結果、感染患者体内において、ウイルスポリメラーゼに新たな適応変異を獲得していることを明らかにし、ヒト細胞においてウイルスゲノムの複製・転写を高める２９種類の遺伝子変異を同定した。かかる知見に基づき変異を導入したインフルエンザウイルスを作製したところ、ＭＤＣＫ細胞にてウイルスの増殖性を増強し、抗原産生量を増大させるアミノ酸変異を同定することができた。本明細書では、まず本発明の増殖方法に用いられる、アミノ酸変異を含むインフルエンザウイルス、及び当該インフルエンザウイルスの作出方法について説明し、次いで、当該インフルエンザウイルスをＭＤＣＫ細胞に感染させて培養することによる、インフルエンザウイルスの増殖方法について説明する。
【００１５】
（インフルエンザウイルス）
インフルエンザウイルスは、エンベロープに覆われた球形のウイルスであり、粒子内部には、ｖＲＮＡ、ウイルスポリメラーゼ、核蛋白質（ＮＰ）、膜蛋白質（Ｍ１）を有する。「ウイルスポリメラーゼ」とは、３つのサブユニット、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡからなるＲＮＡポリメラーゼである。また表面には、いわゆる表面蛋白質であるＮＡ及びＨＡが突起物として存在する。ｖＲＮＡは、８本に分節化された一本鎖ＲＮＡである。８つのゲノム分節は、ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、ＨＡ、ＮＰ、ＮＡ、Ｍ及びＮＳ分節からなる。ＨＡおよびＮＡのゲノム分節は、それぞれＨＡ及びＮＡの抗原蛋白質をコードしており、それ以外のＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ及びＮＳ分節の６本のゲノム分節は、いわゆるバックボーンと呼ばれる蛋白質をコードしている。
【００１６】
インフルエンザウイルスの増殖は、ゲノムの複製・転写を根幹とする。ゲノムの複製最小単位は、ウイルスポリメラーゼとＮＰとｖＲＮＡの結合したｖＲＮＡ−蛋白質複合体（ｖＲＮＰ）である。本発明におけるインフルエンザウイルスは、ｖＲＮＰにおいて、ウイルスポリメラーゼとｖＲＮＡとの接合部位及びその付近に位置するアミノ酸に変異を有するインフルエンザＡ型ウイルスである。かかるアミノ酸変異は、ウイルスポリメラーゼのサブユニットであるＰＢ１、ＰＢ２、及びＰＡから選択される少なくとも１つの蛋白質に含まれる。
【００１７】
ゲノムの複製・転写は、まず、ｖＲＮＡを鋳型にして、転写によりｍＲＮＡが合成され、複製の第一段階反応により中間体であるｃＲＮＡ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ＲＮＡ）が合成される。その後、ｃＲＮＡを鋳型とした複製の第二段階反応により、子孫ｖＲＮＡが増幅される。ｖＲＮＰにおいて、ウイルスポリメラーゼはｖＲＮＡの末端領域（プロモーター領域）と結合するが、ゲノムの複製・転写は、ｖＲＮＡ末端領域をウイルスポリメラーゼが認識することで開始される。ウイルスポリメラーゼのｖＲＮＡ末端領域の認識及びそれらの接合の強さはゲノムの複製・転写に極めて重要である。本発明におけるアミノ酸変異はウイルスポリメラーゼとｖＲＮＡとの接合部位及びその付近に導入され、ウイルスポリメラーゼとｖＲＮＡとの接合面の変化をもたらすと考えられる。本発明のインフルエンザウイルスは、アミノ酸変異を含むことにより、ポリメラーゼ活性が増強され、ＭＤＣＫ細胞における子孫ＲＮＡの生産を増大させるものと考えられる。本発明のアミノ酸変異を含むインフルエンザウイルスは、ＭＤＣＫ細胞に感染させて増殖させた場合に、同じインフルエンザウイルス株の野生型に比べて、ウイルスの増殖性を向上させることができる。ウイルスの増殖性は、後述する実施例に記載のウイルス力価測定方法や、ＨＡ力価測定方法により、確認することができる。
【００１８】
本発明における「ウイルスポリメラーゼとｖＲＮＡの接合部位」とは、ウイルスポリメラーゼがｖＲＮＡプロモーターと接合する部位及び／又は接合面に位置する部位である。接合する部位とは、当該部位とｖＲＮＡの静電エネルギー等により、ｖＲＮＡとの相互作用に対して直接的に影響する部位のことである。接合面に位置する部位とは、ｖＲＮＡを取り囲む位置に存在し、他の構造ドメインや蛋白質全体の構造を変化させることで、ｖＲＮＡとの相互作用に対して間接的に影響する部位のことである。
【００１９】
「ウイルスポリメラーゼとｖＲＮＡの接合部位」は、インフルエンザウイルスポリメラーゼ（ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡの三量体）とｖＲＮＡプロモーターの結晶構造に基づきモデル構造を作製することにより、特定することができる。例えば、Ｈ１７Ｎ１０亜型インフルエンザウイルスポリメラーゼおよびｖＲＮＡプロモーターの結晶構造（Ｐｆｌｕｇ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ５１６，  ２０１４、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ＩＤ  Ｃｏｄｅ：４ＷＳＢ）をテンプレートとして、結合計算化学システムソフトであるＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ  Ｉｎｃ．  Ｃａｎａｄａ）を用いてＨ５Ｎ１亜型Ａ／ｄｕｃｋ／Ｅｇｙｐｔ／Ｄ１Ｂｒ／２００７株のポリメラーゼおよびｖＲＮＡプロモーターの構造をホモロジーモデリングする。分子最適化システムによってモデル構造を最適化した後、ウイルスポリメラーゼとｖＲＮＡプロモーターが接合する部位を特定することができる（図１参照）。ウイルス内部の遺伝子は保存性が高いため、インフルエンザＡ型ウイルスの亜型は上記に限定されず、同様の手法により接合部位を特定することができる。
【００２０】
ウイルスポリメラーゼのＰＢ１のβ−リボンドメイン（β−ｒｉｂｂｏｎ  ｄｏｍａｉｎ）（ＰＢ１の１７５位〜２１４位のアミノ酸配列）、ＰＢ１のβ−ヘアピンドメイン（β−ｈａｉｒｐｉｎ  ｄｏｍａｉｎ）（ＰＢ１の３５２位〜３９７位のアミノ酸配列）が、ｖＲＮＡプロモーター領域（５’末端の１〜１７塩基および３’末端の１〜１８塩基）と接合する。また、ＰＢ２のＮ１−サブドメイン（Ｎ１−ｓｕｂ  ｄｏｍａｉｎ）（ＰＢ２の５５位〜１０３位のアミノ酸配列）、ＰＢ２のヘリカル−リドドメイン（ｈｅｌｉｃａｌ−ｌｉｄ  ｄｏｍａｉｎ）（ＰＢ２の１６０位〜２１３位）がｖＲＮＡプロモーターとの接合面に位置する。本発明のウイルスポリメラーゼにおけるアミノ酸変異は、好ましくは、ＰＢ１のβ−リボンドメイン、ＰＢ１のβ−ヘアピンドメイン、ＰＢ２のＮ１−サブドメイン、及びＰＢ２のヘリカル−リドドメインの少なくとも１つのドメインに含まれる。ＰＢ１及びＰＢ２の各ドメインの位置は、図１、図２及び図３に示されている。
【００２１】
ＰＢ１のβ−リボンドメイン、ＰＢ１のβ−ヘアピンドメイン、ＰＢ２のＮ１−サブドメイン、及びＰＢ２のヘリカル−リドドメインの各ドメインについて、変異を導入する前のアミノ酸配列を以下に示す。下記アミノ酸配列は、異なる亜型に属するインフルエンザＡ型ウイルスに含まれる各ドメイン配列を示したものであるが、以下に限定されるものではない。
〔ＰＢ１のβ−リボンドメイン〕
ＸＫＥＥＸＥＩＴＴＨＦＱＲＫＲＲＶＲＤＮＭＴＫＫＭＶＴＱＲＴＩＧＫＫＫＱＲＸＸＫ（配列番号５）
配列番号５中、１番目のＸはアスパラギン酸又はアスパラギンであり、５番目のＸはメチオニン又はイソロイシンであり、３８番目のＸはロイシン又はバリンであり、３９番目のＸはアスパラギン又はトレオニンである。
〔ＰＢ１のβ−ヘアピンドメイン〕
ＧＸＧＹＭＦＥＳＸＸＭＫＸＲＴＱＸＰＡＥＭＬＡＸＩＤＬＫＹＦＮＸＸＴＸＸＫＩＥＫＩＲＰＬＬＩ（配列番号６）
配列番号６中、２番目のＸはアルギニン又はリシンであり、９番目のＸはリシン又はアルギニンであり、１０番目のＸはセリン又はアルギニンであり、１３番目のＸはロイシン又はイソロイシンであり、１７番目のＸはイソロイシン又はバリンであり、２４番目のＸはアスパラギン又はセリンであり、３２番目のＸはグルタミン酸又はリシンであり、３３番目のＸはロイシン又はセリンであり、３５番目のＸはリシン又はアルギニンであり、３６番目のＸはリシン又はグルタミン酸である。
〔ＰＢ２のＮ１−サブドメイン〕
ＹＰＩＴＡＤＫＸＩＸＸＭＸＰＥＲＮＥＱＧＱＴＬＷＳＫＸＸＤＡＧＳＤＲＶＭＸＳＰＬＡＶＴＷＷＮＲＮＧ（配列番号７）
配列番号７中、８番目のＸはアルギニン又はリシンであり、１０番目のＸはイソロイシン、トレオニン又はメチオニンであり、１１番目のＸはグルタミン酸又はアスパラギン酸であり、１３番目のＸはイソロイシン又はバリンであり、２７番目のＸはトレオニン、バリン又はメチオニンであり、２８番目のＸはアスパラギン、セリン、又はトレオニンであり、３７番目のＸはバリン又はイソロイシンである。
〔ＰＢ２のヘリカル−リドドメイン〕
ＱＤＶＩＭＥＶＶＦＰＮＥＶＧＡＲＩＬＴＳＥＳＱＬＸＩＴＸＥＫＸＸＥＬＸＸＣＸＩＸＰＬＭＶＡＹＭＬＥＲＥＬＶＲ（配列番号８）
配列番号８中、２５番目のＸはトレオニン又はアラニンであり、２８番目のＸはリシン又はアスパラギンであり、３１番目のＸはリシン又はアルギニンであり、３２番目のＸはグルタミン酸又はリシンであり、３５番目のＸはグルタミン、アルギニン又はリシンであり、３６番目のＸはアスパラギン酸又はアスパラギンであり、３８番目のＸはリシン又はアスパラギンであり、４０番目のＸはアラニン又はセリンである。
【００２２】
ＰＢ１のβ−リボンドメインに含まれるアミノ酸変異は、配列番号５のアミノ酸配列における、２４番目、８番目、１番目、及び４０番目から選択される少なくとも１つの位置のアミノ酸変異が好ましい。
ＰＢ１のβ−ヘアピンドメインに含まれるアミノ酸変異は、配列番号６のアミノ酸配列における、３３番目の位置のアミノ酸変異が好ましい。
ＰＢ２のＮ１−サブドメインに含まれるアミノ酸変異は、配列番号７のアミノ酸配列における、２６番目の位置のアミノ酸変異が好ましい。
ＰＢ２のヘリカル−リドドメインに含まれるアミノ酸変異は、配列番号８のアミノ酸配列における、３６番目の位置のアミノ酸変異が好ましい。
【００２３】
ＰＢ１の１９８位、１８２位、１７５位、２１４位のアミノ酸は、β−リボンドメインに位置し、各々β−リボンドメインの２４番目、８番目、１番目、及び４０番目に相当する。ＰＢ１の３８４位は、β−ヘアピンドメインに位置し、β−ヘアピンドメインの３３番目に相当する。β−リボンドメインは、ｖＲＮＡの３’末端と相互作用する。一方、β−ヘアピンドメインはＰＡと共に、ｖＲＮＡの５’末端と結合部位を形成する。ｖＲＮＡの５’末端および３’末端から構成されるｖＲＮＡプロモーター領域は、２つのドメインによって形成されたポケット内に挟まれ、より安定な構造を取ることとなる。β−リボンドメインは、ウイルスポリメラーゼの外側でｖＲＮＡの３’末端と接触し、ＲＮＡ合成の開始時にポリメラーゼ活性中心部位にｖＲＮＡを移す役割を担うと考えられる。β−リボンドメインとβ−ヘアピンドメインにおける変異は、ドメインの構造的または電気的な変化を介して、ｖＲＮＡプロモーター領域とｖＲＮＡ接触アミノ酸残基との間の相互作用エネルギー、ｖＲＮＡプロモーター領域とウイルスポリメラーゼとの相互作用エネルギーを変化させる。ＰＢ２の１９５位、８０位のアミノ酸は、各々Ｎ１−サブドメインの２６番目、ヘリカル−リドドメインの３６番目に相当する。Ｎ１−サブメインおよびヘリカル−リドドメインは、ｖＲＮＡとウイルスポリメラーゼとの接合面に位置していることから、ｖＲＮＡとウイルスポリメラーゼとの結合に関与していると考えられる。これらのドメインにおける変異は、ドメインの構造的または電気的な変化を介して、ｖＲＮＡとウイルスポリメラーゼとの結合に影響すると考えられる。
【００２４】
より好ましくは、本発明のウイルスポリメラーゼにおけるアミノ酸変異は、以下から選択される少なくとも１つの位置のアミノ酸に置換が導入されたインフルエンザウイルスを用いる。
・ＰＢ１のアミノ酸配列における１９８位、１８２位、１７５位、２１４位、又は３８４位； 
・ＰＢ２のアミノ酸配列における１９５位、８０位、４７３位、又は５７０位；
・ＰＡのアミノ酸配列における６４９位、６６９位、又は３４１位。
【００２５】
ウイルスポリメラーゼにおけるアミノ酸変異はアミノ酸置換が好適である。アミノ酸置換が導入された各サブユニットは、以下のいずれかのアミノ酸又は当該アミノ酸と化学組成が等しい構造異性体である類似アミノ酸を含むものである：
ＰＢ１のアミノ酸配列における１９８位において、アルギニンを含む；
ＰＢ１のアミノ酸配列における１８２位において、イソロイシン又はロイシンを含む；
ＰＢ１のアミノ酸配列における１７５位において、アスパラギンを含む； 
ＰＢ１のアミノ酸配列における２１４位において、アルギニンを含む；
ＰＢ１のアミノ酸配列における３８４位において、セリンを含む；
ＰＢ２のアミノ酸配列における１９５位において、アスパラギンを含む； 
ＰＢ２のアミノ酸配列における８０位において、アルギニンを含む； 
ＰＢ２のアミノ酸配列における４７３位において、バリンを含む； 
ＰＢ２のアミノ酸配列における５７０位において、イソロイシン又はロイシンを含む； 
ＰＡのアミノ酸配列における６４９位において、イソロイシン又はロイシンを含む； 
ＰＡのアミノ酸配列における６６９位において、バリンを含む； 及び／又は、
ＰＡのアミノ酸配列における３４１位において、ロイシン又はイソロイシンを含む 。
【００２６】
本発明においてはさらに、さらにＮＰにアミノ酸変異を含むインフルエンザＡ型ウイルスを用いることが好ましい。ＮＰにおけるアミノ酸変異は、ＮＰのアミノ酸配列における２８７位、及び３７１位から選択される少なくとも１つの位置のアミノ酸の変異である。ＮＰはｖＲＮＡに結合していることから、ウイルスポリメラーゼとＮＰも相互作用していると考えられる。ウイルスポリメラーゼとＮＰの変異が同時に導入されることにより、ＭＤＣＫ細胞におけるインフルエンザウイルスの増殖性を相乗的に増大させるものと考えられる。
【００２７】
ＮＰにおけるアミノ酸変異はアミノ酸置換が好適である。アミノ酸置換が導入された後のＮＰは、以下のいずれかのアミノ酸を含むものである。
ＮＰのアミノ酸配列における２８７位において、セリンを含む；及び／又は、
ＮＰのアミノ酸配列における３７１位において、メチオニンを含む。
【００２８】
本発明におけるインフルエンザウイルスは、好ましくはＰＢ１、ＰＢ２及びＮＰのいずれにもアミノ酸変異を含むものであり、より好ましくはＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ及びＮＰのいずれにもアミノ酸変異を含むものである。
【００２９】
より具体的には、インフルエンザウイルスは、以下の（ａ）〜（ｉ）から選択されるいずれかのアミノ酸変異を含むものである。
（ａ）ＰＢ２のアミノ酸配列における４７３位及び１９５位のアミノ酸の置換：
（ｂ）ＰＢ１のアミノ酸配列における１８２位のアミノ酸の置換； 
（ｃ）ＰＢ１のアミノ酸配列における１９８位のアミノ酸の置換； 
（ｄ）ＰＢ１のアミノ酸配列における１９８位、及び１７５位のアミノ酸の置換； 
（ｅ）ＰＢ１のアミノ酸配列における１８２位、２１４位、及び３８４位のアミノ酸の置換；
（ｆ）ＰＢ２のアミノ酸配列における５７０位、及び８０位のアミノ酸の置換、ＰＢ１のアミノ酸配列における１９８位、及び１７５位のアミノ酸の置換、並びに、ＮＰのアミノ酸配列における２８７位のアミノ酸の置換；
（ｇ）ＰＢ２のアミノ酸配列における４７３位、及び１９５位のアミノ酸の置換、ＰＢ１のアミノ酸配列における１８２位、及び２１４位のアミノ酸の置換、ＰＡのアミノ酸配列における６６９位、及び６４９位のアミノ酸の置換、並びに、ＮＰのアミノ酸配列における２８７位、及び３７１位のアミノ酸の置換；
（ｈ）ＰＢ２のアミノ酸配列における５７０位、及び８０位のアミノ酸の置換、ＰＢ１のアミノ酸配列における１９８位のアミノ酸の置換、ＰＡのアミノ酸配列における３４１位のアミノ酸の置換、並びに、ＮＰのアミノ酸配列における２８７位のアミノ酸の置換；
（ｉ）ＰＢ２のアミノ酸配列における７０１位のアミノ酸の置換、及び、ＰＢ１のアミノ酸配列における１９８位のアミノ酸の置換。
【００３０】
上記（ｉ）において、ＰＢ２のアミノ酸配列における７０１位のアミノ酸は、アスパラギンに置換されることが好適である。
【００３１】
アミノ酸変異が導入される前のＰＢ１、ＰＢ２、及びＰＡは各々ウイルスポリメラーゼのサブユニットとして、一方アミノ酸変異が導入される前のＮＰは核蛋白質として、ゲノムの複製最小単位を形成し、ゲノムの複製・転写を司る機能を有する。
アミノ酸変異が導入される前のＰＢ１は、以下の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかである。
（Ａ）配列番号１で特定されるアミノ酸配列で特定される蛋白質；
（Ｂ）配列番号１で特定されるアミノ酸配列のうち、１個または複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、導入されてなるアミノ酸配列で特定される蛋白質であって、ウイルスポリメラーゼのサブユニットであるＰＢ１として機能する蛋白質；
（Ｃ）配列番号１で特定されるアミノ酸配列と６０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上）の相同性を有するアミノ酸配列で特定される蛋白質であって、ウイルスポリメラーゼのサブユニットであるＰＢ１として機能する蛋白質。
【００３２】
アミノ酸変異が導入される前のＰＢ２は、以下の（Ｄ）〜（Ｆ）のいずれかである。
（Ｄ）配列番号２で特定されるアミノ酸配列で特定される蛋白質；
（Ｅ）配列番号２で特定されるアミノ酸配列のうち、１個または複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、導入されてなるアミノ酸配列で特定される蛋白質であって、ウイルスポリメラーゼのサブユニットであるＰＢ２として機能する蛋白質；
（Ｆ）配列番号２で特定されるアミノ酸配列と６０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上）の相同性を有するアミノ酸配列で特定される蛋白質であって、ウイルスポリメラーゼのサブユニットであるＰＢ２として機能する蛋白質。
【００３３】
アミノ酸変異が導入される前のＰＡは、以下の（Ｇ）〜（Ｉ）のいずれかである。
（Ｇ）配列番号３で特定されるアミノ酸配列で特定される蛋白質；
（Ｈ）配列番号３で特定されるアミノ酸配列のうち、１個または複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、導入されてなるアミノ酸配列で特定される蛋白質であって、ウイルスポリメラーゼのサブユニットであるＰＡとして機能する蛋白質；
（Ｉ）配列番号３で特定されるアミノ酸配列と６０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上）の相同性を有するアミノ酸配列で特定される蛋白質であって、ウイルスポリメラーゼのサブユニットであるＰＡとして機能する蛋白質。
【００３４】
アミノ酸変異が導入される前のＮＰは、以下の（Ｊ）〜（Ｌ）のいずれかである。
（Ｊ）配列番号４で特定されるアミノ酸配列で特定される蛋白質；
（Ｋ）配列番号４で特定されるアミノ酸配列のうち、１個または複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、導入されてなるアミノ酸配列で特定される蛋白質であって、核蛋白質であるＮＰとして機能する蛋白質；
（Ｌ）配列番号４で特定されるアミノ酸配列と６０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上）の相同性を有するアミノ酸配列で特定される蛋白質であって、核蛋白質であるＮＰとして機能する蛋白質。
【００３５】
「相同性」は配列同一性であり、異なる２つのアミノ酸配列又は塩基配列間で、ギャップを導入するか又はギャップを導入しないで配列を整列比較したときの２つの配列の一致度を表わし、一般に全アミノ酸数（又は全塩基数）に対する同一アミノ酸数（又は同一塩基数）の割合（％）を意味する。通常、相同性、類似性又は同一性のある配列の検索は、ＢＬＡＳＴ（例えばＢＬＡＳＴＸ、ＢＬＡＳＴＮなど）、ＦＡＳＴＡなどの公知のプログラムを利用して行うことができる。公知のプログラムを用いて相同性を求める際のパラメータは、例えばデフォルトの値を用いる。異なる亜型に属するインフルエンザＡ型ウイルス由来の各蛋白質についてアミノ酸配列のアライメントを行った例を、図２〜５に示す。図２〜５は、ＧＥＮＥＴＹＸ  １１  ソフトウェア（Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｏ．  Ｌｔｄ．  Ｔｏｋｙｏ，  Ｊａｐａｎ）を用いて、ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔを実施し、アミノ酸配列の自動アライメントを実施したものである。なお、ＣｌｕｓｔａｌＷ（Ｎｕｃｅｌｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２２，４６７３，（１９９４））でもｍｕｌｔｉｐｌｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔにより自動アライメントを行うことができる。ＣｌｕｓｔａｌＷは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）より利用することができる。ＣｌｕｓｔａｌＷを用いてアライメントを作製する際のパラメータは、例えばデフォルトの値を用いることができる。ＰＢ１，ＰＢ２，ＰＡ，ＮＰのいずれも、異なる亜型間でのアミノ酸配列の保存性が非常に高いものである。
【００３６】
アミノ酸変異が導入される前の各蛋白質は、以下のいずれかのアミノ酸を含むものである。以下のいずれかのアミノ酸を置換することにより、アミノ酸変異が導入される。
ＰＢ１のアミノ酸配列における１９８位に、リシンを含む。 
ＰＢ１のアミノ酸配列における１８２位に、トレオニンを含む。
ＰＢ１のアミノ酸配列における１７５位に、アスパラギン酸、又はアスパラギンを含む。
ＰＢ１のアミノ酸配列における２１４位に、リシンを含む。
ＰＢ１のアミノ酸配列における３８４位に、ロイシン、又はセリンを含む。
ＰＢ２のアミノ酸配列における１９５位に、アスパラギン酸、又はアスパラギンを含む。
ＰＢ２のアミノ酸配列における８０位に、リシンを含む。
ＰＢ２のアミノ酸配列における４７３位に、メチオニンを含む。
ＰＢ２のアミノ酸配列における５７０位に、メチオニン、又はロイシンを含む。
ＰＢ２のアミノ酸配列における７０１位に、アスパラギン酸を含む。
ＰＡのアミノ酸配列における６４９位に、ロイシンを含む。
ＰＡのアミノ酸配列における６６９位に、アラニン、又はバリンを含む。
ＰＡのアミノ酸配列における３４１位に、バリン、又はロイシンを含む。
ＮＰのアミノ酸配列における２８７位に、グリシンを含む。
ＮＰのアミノ酸配列における３７１位に、トレオニン、メチオニン、又はバリンを含む。
【００３７】
より具体的には、アミノ酸変異が導入される前のＰＢ１のアミノ酸配列は、配列番号１及び９〜１６のいずれかであり、アミノ酸変異が導入される前のＰＢ２のアミノ酸配列は、配列番号２及び１７〜２６のいずれかであり、アミノ酸変異が導入される前のＰＡのアミノ酸配列は、配列番号３及び２７〜３４のいずれかであり、アミノ酸変異が導入される前のＮＰのアミノ酸配列は、配列番号４及び３５〜４２のいずれかである。
【００３８】
本発明に示すアミノ酸変異の各位置は、各蛋白質のアミノ酸配列として配列番号１〜４を基準とした位置であることから、各蛋白質のホモログ蛋白質においては数字がずれる場合がある。すなわち、本発明のアミノ酸変異の位置は、ＰＢ１については、配列番号１に示すアミノ酸配列における位置、又はＰＢ１のホモログ蛋白質のアミノ酸配列を配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における各位置に対応する位置を意味し、ＰＢ２については、配列番号２に示すアミノ酸配列における位置、又はＰＢ２のホモログ蛋白質のアミノ酸配列を配列番号２記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号２に示すアミノ酸配列における各位置に対応する位置を意味し、ＰＡについては、配列番号３に示すアミノ酸配列における位置、又はＰＡのホモログ蛋白質のアミノ酸配列を配列番号３記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号３に示すアミノ酸配列における各位置に対応する位置を意味し、ＮＰについては、配列番号４に示すアミノ酸配列における位置、又はＮＰのホモログ蛋白質のアミノ酸配列を配列番号４記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号４に示すアミノ酸配列における各位置に対応する位置を意味する。
【００３９】
各配列番号で表されるアミノ酸配列と、ホモログ蛋白質のアミノ酸配列とのアライメントは、公知のアライメントプログラムＧＥＮＥＴＹＸ  １１  ソフトウェア、ＣｌｕｓｔａｌＷ、ＢＬＡＳＴを利用することができる。アライメントを作製する際のパラメータは、各プログラムのデフォルトの値を用いることができる。
【００４０】
（インフルエンザウイルスの作出方法）
本発明において、アミノ酸変異を導入するインフルエンザＡ型ウイルスはいかなる亜型であってもよい。ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、及びＮＰは、インフルエンザウイルス内部に存在し、抗原蛋白質のＨＡやＮＡとは異なり遺伝子の保存性が高いため、本発明の変異を導入したインフルエンザウイルスは、いかなる亜型においてもポリメラーゼ活性が増強され、ＭＤＣＫ細胞において子孫ＲＮＡの生産を増強するものと考えられる。好ましくは、Ｈ１亜型、Ｈ３亜型、Ｈ５亜型、Ｈ７亜型、及びＨ９亜型から選択されるいずれかであり、より好ましくはＨ５亜型、Ｈ７亜型、及びＨ９亜型から選択されるいずれかであり、さらに好ましくはＨ５亜型である。現在知られているすべての亜型、及び将来単離、同定される亜型から選択してもよく、様々なＨＡの亜型とＮＡの亜型との組み合わせを含むインフルエンザウイルスが考えられる。
【００４１】
インフルエンザＡ型ウイルスの各亜型は、ＲＮＡゲノムの変異性が高いため、新しい株が頻繁に生じている。２００９年４月にメキシコでの流行が認知された後、世界的に流行したとされるインフルエンザは、新型インフルエンザ、ブタインフルエンザ、パンデミックインフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）、ｓｗｉｎｅ  ｆｌｕ、Ａ／Ｈ１Ｎ１  ｐｄｍなどと呼ばれている。ブタの間で流行していたウイルスが、農場などでブタからヒトに直接感染し、その後ヒトの間で広まったとされる新型インフルエンザは、従前より存在していた季節性のＡソ連型インフルエンザであるインフルエンザＡ型ウイルスＨ１Ｎ１亜型（以下「Ｈ１Ｎ１亜型」と称する）や、Ａ香港型インフルエンザであるインフルエンザＡ型ウイルスＨ３Ｎ２亜型（以下「Ｈ３Ｎ２亜型」）とは、区別される。またＲＮＡゲノムの変異性が高いことから、インフルエンザＡ型ウイルスの同じ亜型の中でも、単離された時期や場所によって、ウイルス株が区別されている。
【００４２】
本発明において、アミノ酸変異を導入するインフルエンザＡ型ウイルスは、上述のような生体から分離されたインフルエンザウイルスの他、インフルエンザワクチンに適用可能なように、弱毒化、鶏卵増殖適合化、細胞培養増殖適合化、温度感受性表現形質化、粘膜投与適合化等の改変を加えて作出した組換えウイルスであっても良い。また、改変を加えるための手段として、インフルエンザウイルスの抗原部位やポリメラーゼ部位等の８本のＲＮＡ分節に変異を導入する方法や低温継代によって弱毒ウイルスを作出する方法、ウイルス培養系への変異誘発剤を添加することによる方法等が挙げられる。
【００４３】
例えば、Ａ／プエルトリコ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／カリフォルニア／７／２００９（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９、Ａ／カリフォルニア／４／２００９（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９、Ａ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ソロモン諸島／３／２００６（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ブリスベン／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／茨城／Ｎ１２２３２／２０１２（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／広島／５２／２００５（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／パナマ／２００７／９９（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／パナマ／２００７／９９（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ワイオミング／３／２００３（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ニューヨーク／５５／２００４（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／広島／５２／２００５（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ウルグアイ／７１６／２００７（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ビクトリア／２１０／２００９（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ビクトリア／３６１／２０１１（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／テキサス／５０／２０１２（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ニューヨーク／３９／２０１２（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／スイス／９７１５２９３／２０１３（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ベトナム／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／インドネシア／５／２００５（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／安徽／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／上海／２／２０１３（Ｈ７Ｎ９）、Ａ／安徽／１／２０１３（Ｈ７Ｎ９）等が例示されるが、これらに限定されない。
【００４４】
本発明におけるアミノ酸変異を導入してインフルエンザウイルスを作出する手段としてはいかなるものであってもよいが、リバースジェネティクス法を用いることができる。リバースジェネティクス法は、プラスミドから人工的にインフルエンザウイルスを作り出す系であり、Ｎｅｕｍａｎｎ  Ｇ，  ｅｔ  ｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ２００５  Ｎｏｖ  １５；１０２（４６）：１６８２５−９．  Ｅｐｕｂ  ２００５  Ｎｏｖ  ２．の開示内容に基づき、行うことができる。リバースジェネティクス法では、インフルエンザウイルスを作出するために種々のプラスミド設計を検討することができるが、その一つとして、ｖＲＮＡを供給するための８種類のプラスミド（ＰｏｌＩプラスミド）と、ウイルス粒子を形成するのに必要な構造蛋白質をコードする４種類の発現プラスミド（ＰｏｌＩＩプラスミド）の合計１２種類のプラスミドを同時に細胞に導入することによって、インフルエンザウイルスを作出する方法がある。ｖＲＮＡ（ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、ＨＡ、ＮＰ、ＮＡ、Ｍ及びＮＳ分節の８本のＲＮＡ分節）を供給するための発現ベクター、構造蛋白質（ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、ＮＰ）を供給するための発現ベクターを用いて、ポリヌクレオチドを細胞に導入する方法が挙げられる。ＨＡおよびＮＡのＲＮＡ分節を供給するためのポリヌクレオチドを抗原遺伝子、それ以外のＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ及びＮＳ分節の６本のＲＮＡ分節を供給するためのポリヌクレオチドをバックボーン遺伝子と称する。
【００４５】
具体的には、以下の工程により行うことができる。
まず、野生型のインフルエンザウイルスのゲノムの塩基配列に基づき、インフルエンザウイルスのｖＲＮＡを発現し得るポリヌクレオチド及びインフルエンザウイルスの構造蛋白質を発現し得るポリヌクレオチドを準備する（Ｗａｔａｎａｂｅ  Ｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ．  ２０１１  Ｍａｙ；７（５）：ｅ１００２０６８．  ｄｏｉ：  １０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｐａｔ．１００２０６８．  Ｅｐｕｂ  ２０１１  Ｍａｙ  ２６．、Ｆｏｄｏｒ  Ｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  １９９９  Ｎｏｖ；７３（１１）：９６７９−８２）。
【００４６】
ポリヌクレオチドは、野生型のインフルエンザウイルスを用いてｃＤＮＡをクローニングしてもよいし、野生型のｃＤＮＡの配列は、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒをもとにデータベースを検索し、容易に取得することもできる。ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ及びＮＰへの変異の導入は、公知の変異導入法を用いればよい。例えば、モレキュラー・クローニング第４版（２０１２年６月１５日発売、出版社  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）およびカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（１９８８年６月発売、出版社  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ）等に記載された部位特異的変異導入法により変異を導入し、他のアミノ酸をコードする塩基配列に置換することにより取得することができる。変異を導入したポリヌクレオチドについては、望ましくない変異が導入されていないことを確認するために、塩基配列を決定することが好ましい。
【００４７】
ポリヌクレオチドは、プロモーター等と連結されていることが好ましい。ｖＲＮＡをコードするＤＮＡは、ポリメラーゼＩプロモーター及びＲＮＡポリメラーゼＩターミネーター（ＰｏｌＩプラスミド）の制御下にてプラスミド中にクローン化することが好ましい。構造蛋白質をコードするＤＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＰｏｌＩＩプラスミド）の制御下にてプラスミドにクローン化することが好ましい。また複数種のポリヌクレオチドは、各々別個の発現ベクターに含まれても一つの発現ベクターに含まれてもよい。発現ベクターは特に限定されないが、プラスミドであることが好ましい。インフルエンザウイルスのｖＲＮＡ及び構造蛋白質を発現し得るポリヌクレオチドは、インフルエンザウイルスの同じ亜型から由来するものであってもよいし、２種以上の異なる亜型から由来するものであってもよい。また各ポリヌクレオチドには、本発明のアミノ酸変異以外の任意の変異が導入されていてもよい。また、本発明のインフルエンザウイルスにおいて、抗原遺伝子は、バックボーン遺伝子とは異なる亜型のインフルエンザウイルス由来のものを用いることもできるし、同じ亜型でも異なるインフルエンザウイルス株から由来したものを用いることもできる。
【００４８】
インフルエンザ作出手段においては、インフルエンザウイルスのｖＲＮＡ又は構造蛋白質を発現し得るポリヌクレオチドを、宿主に導入する遺伝子導入工程を含む。宿主は培養細胞を用いることが好ましく、哺乳動物細胞がより好ましい。具体的には、ハムスター、ウシ、霊長類（ヒトおよびサルを含む）およびイヌの細胞が例示されるが、これらに限定されない。より具体的には、ＭＤＣＫ細胞、Ｖｅｒｏ細胞等が例示される。ｖＲＮＡ発現プラスミド及び蛋白質発現プラスミドを、遺伝子導入試薬の存在下で、宿主に接触させてインキュベートを行う。２種以上のポリヌクレオチドを導入する場合は、同時に宿主に導入することが好ましい。宿主として培養細胞を用いる場合は、遺伝子導入技術としては、エレクトロポレーション法やリン酸カリウム法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法等の様々な方法が挙げられる。
【００４９】
ポリヌクレオチドを導入した宿主をインキュベートすることにより、インフルエンザウイルスを作出する。インキュベートを行った後、作出されたインフルエンザウイルス含有の上清を回収し、限界希釈によって生物学的にクローン化し、インフルエンザウイルスを単離することができる。宿主が培養細胞の場合は、培地、温度、湿度、インキュベート時間等のインキュベート条件は、公知のインキュベート条件又は今後開発されるインキュベート条件であればよい。インキュベート中、細胞内で合成されたｖＲＮＡと構造蛋白質によりウイルス粒子が形成される。ウイルス粒子は培養液中に放出され、インフルエンザウイルスとして単離することができる。インフルエンザウイルスの単離は、公知の手法又は今後開発される手法を用いて行うことができる。
【００５０】
（ＭＤＣＫ細胞を用いたインフルエンザウイルスの増殖方法）
本発明のアミノ酸変異を含むインフルエンザウイルスを、ＭＤＣＫ細胞にて培養することにより、インフルエンザウイルスを効率的に増殖することができる。本発明のインフルエンザウイルスの増殖方法は、インフルエンザウイルスをＭＤＣＫ細胞に感染させる工程、及びインフルエンザウイルスの感染したＭＤＣＫ細胞をインキュベートする工程を含む。インフルエンザウイルスのＭＤＣＫ細胞への感染は、インフルエンザウイルスとＭＤＣＫ細胞とを接触させることにより行われる。
【００５１】
本発明の増殖方法において用いられるＭＤＣＫ細胞は特に限定されず、例えば、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−３４にて特定される細胞を用いてもよいし、無血清培地に馴化させたＭＤＣＫ細胞であってもよいし、シングルセルクローン化したＭＤＣＫ細胞であってもよい。
【００５２】
インフルエンザウイルスの感染したＭＤＣＫ細胞をインキュベートする方法は、特に限定されない。例えば表面に細胞を接着させて培養させることができる微粒子であるマイクロキャリアを用いた培養が挙げられる。マイクロキャリアの表面は、細胞が接着可能な材質であれば特に限定されるものではない。ＭＤＣＫ細胞の播種密度、マイクロキャリアの密度、撹拌数、溶存酸素濃度、培養温度等の培養条件は細胞が増殖可能なものであればよく、適宜調節可能である。インフルエンザウイルスをＭＤＣＫ細胞に感染させ、その後細胞を一定時間インキュベートすることにより、インフルエンザウイルスを増殖させることができる。インキュベートする時間は特に限定されない。増殖させたインフルエンザウイルスのウイルス粒子は培養液中に放出され、インフルエンザウイルスとして単離することができる。インフルエンザウイルスの単離は、公知の手法又は今後開発される手法を用いて行うことができる。
【００５３】
（インフルエンザワクチン）
また、本発明の培養方法により増殖されたインフルエンザウイルスは、インフルエンザワクチンの製造に用いてもよい。インフルエンザワクチンの製造は、公知の手法又は今後開発される手法を用いればよい。
【００５４】
本発明のインフルエンザワクチンの製造方法により製造されたインフルエンザワクチンは、本発明の増殖方法により増殖されたインフルエンザウイルス由来の免疫原を有効成分として含むものである。免疫原は不活化ウイルス、抗原蛋白質等、特に限定されない。インフルエンザワクチンは、有効成分に加えて、薬理学上許容される担体または媒体（生理食塩水、植物油、懸濁剤、界面活性剤、安定剤など）を含んでよい。また、保存剤やその他の添加剤を添加することができる。免疫原の免疫原性を高めるために、水酸化アルミニウム塩やリン酸アルミニウム塩などのアルミニウム塩、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド、非イオン性界面活性剤、二本鎖ＲＮＡ、水中油型エマルション、サイトカイン、コレラ毒素、サルモネラ毒素等の免疫促進剤を添加することもできる。
【００５５】
ワクチンの接種は、経皮的、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、静脈内、または経口的に行われうる。投与量は、ワクチンの形態や投与方法などにより変動し得るが、当業者であれば適宜適当な投与量を選択することができる。インフルエンザウイルスは上気道の細胞で増殖すると発熱などの症状を直ちに誘発するので、この周辺すなわち鼻腔内粘膜や上気道においてワクチン接種により作られた局所抗体が働くことが好ましい。例えば皮下注射によるワクチンの接種では血液中に多量の抗体ができるが、鼻腔内粘膜や上気道に滲出する抗体の量が少ないため、肺炎などの重症化防止には有効でも、初期症状に対する効果が低いと考えられる。そのため、インフルエンザワクチンを鼻内噴霧等により気道へ接種することが有効と考えられる。慣用の賦形剤、結合剤、滑沢剤、水性溶剤、油性溶剤、乳化剤、懸濁化剤、保存剤、安定剤等を任意に用いることができる。
【００５６】
また、ワクチンの接種回数、接種時期は限定されない。特に新型インフルエンザに対しては基礎免疫を持たないと考えられるため、ワクチンの２回接種により十分な免疫を得ることが有効であると考えられる。ヒトの場合、２回の接種の間隔は通常２〜４週間である。ワクチン接種が可能な動物としては、免疫系を有し、かつインフルエンザウイルスに感染するあらゆる宿主が挙げられ、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ、ウマ、サル、トリなどが含まれる。
【実施例】
【００５７】
本発明の理解を助けるために、以下に実施例を示して具体的に本発明を説明するが、本発明は本実施例に限定されない。
【００５８】
（実施例１）アミノ酸変異を含むインフルエンザＡ型ウイルスの作出
プラスミドを用いたリバースジェネティクス法により、アミノ酸変異を導入したインフルエンザウイルスを作製した。インフルエンザウイルスのｖＲＮＡの各相補的ＤＮＡを、ｐＵＣ１８プラスミドのヒトポリメラーゼＩプロモーターとＤ型肝炎ウイルスリボザイムの間にクローン化して、ｐＰＯＬＩを作製した。相補的ＤＮＡは、ＥＧ／Ｄ１（野生型）（Ｃｌａｄｅ  ２．２．１ウイルス（Ａ／ｄｕｃｋ／エジプト／Ｄ１Ｂｒ／２００７））に由来するものである。ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰの相補的ＤＮＡに部位特異的変異導入ＰＣＲにより、以下の表１に示すような変異を導入した（ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ；  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。望ましくない変異が導入されていないことを確認するために、配列決定を行った。各ｐＰＯＬＩプラスミドを、２９３Ｔ細胞及びＣＥＦ細胞の共培養下でトランスフェクションを行い、組み換えウイルスを作出した。作出した組み換えウイルスを、鶏卵に感染させて、１代継代を行うことにより、増殖させた。
【００５９】
【表１】
2018064493.tif 000003
【００６０】
なお、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰの相補的ＤＮＡに部位特異的変異導入ＰＣＲに用いたプライマーは以下の通りである。
（１）ＰＢ１の変異導入プライマー
ＥＧ−ＰＢ１  Ｄ１７５Ｎ  Ｆｗ：ＡＡＣＡＡＧＧＡＡＧＡＡＡＴＧＧＡＧＡＴＡＡＣＡＡＣＡＣＡＴＴＴＣ（配列番号４３）
ＥＧ−ＰＢ１  Ｄ１７５Ｎ  Ｒｖ：ＣＡＴＴＧＡＴＴＣＣＡＴＣＡＣＡＴＣＣＴＴＧＡＧＧＡＡＡＴＣ（配列番号４４）
ＥＧ−ＰＢ１  Ｔ１８２Ｉ  Ｆｗ：ＡＴＣＡＣＡＣＡＴＴＴＣＣＡＧＡＧＡＡＡＧＡＧＡＡＧＡＧＴＧＡＧＡＧ（配列番号４５）
ＥＧ−ＰＢ１  Ｔ１８２Ｉ  Ｒｖ：ＧＡＡＴＣＡＡＴＧＧＡＴＡＡＧＧＡＡＧＡＡＡＴＧＧＡＧＡＴＡ（配列番号４６）
ＥＧ−ＰＢ１  Ｋ１９８Ｒ  Ｆｗ：ＣＧＴＡＴＧＧＴＣＡＣＡＣＡＡＡＧＡＡＣＡＡＴＡＧＧＧＡＡＧ（配列番号４７）
ＥＧ−ＰＢ１  Ｋ１９８Ｒ  Ｒｖ：ＧＡＧＡＡＧＡＧＴＧＡＧＡＧＡＣＡＡＣＡＴＧＡＣＣＡＡＡ（配列番号４８）
ＥＧ−ＰＢ１  Ｋ２１４Ｒ  Ｆｗ：ＣＧＴＡＡＧＡＧＣＴＡＣＣＴＧＡＴＡＡＧＡＧＣＡＣＴＧＡＣＡＣＴＧ（配列番号４９）
ＥＧ−ＰＢ１  Ｋ２１４Ｒ  Ｒｖ：ＧＡＡＣＡＡＴＡＧＧＧＡＡＧＡＡＡＡＡＧＣＡＡＡＧＧＣＴＧＡＡＣ（配列番号５０）
ＥＧ−ＰＢ１  Ｌ３８４Ｓ  Ｆｗ：ＡＧＣＡＣＧＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＴＴＧＡＡＡＡＡＡＴＡＡＧＡＣＣＴＣ（配列番号５１）
ＥＧ−ＰＢ１  Ｌ３８４Ｓ  Ｒｖ：ＣＴＴＧＣＡＡＡＣＡＴＴＧＡＴＣＴＴＡＡＡＴＡＣＴＴＣＡＡＴＧＡＡ（配列番号５２）
【００６１】
（２）ＰＢ２の変異導入プライマー
ＥＧ−ＰＢ２  Ｋ８０Ｒ  Ｆｗ：ＣＧＡＡＣＡＡＡＴＧＡＴＧＣＴＧＧＡＴＣＧＧＡＣＡＧＧＧＴＧＡＴＧ（配列番号５３）
ＥＧ−ＰＢ２  Ｋ８０Ｒ  Ｒｖ：ＧＡＡＴＧＡＡＣＡＡＧＧＡＣＡＧＡＣＡＣＴＣＴＧＧＡＧＣ（配列番号５４）
ＥＧ−ＰＢ２  Ｄ１９５Ｎ  Ｆｗ：ＡＡＣＴＧＴＡＡＧＡＴＴＧＣＴＣＣＣＴＴＡＡＴＧＧＴＴＧＣＡＴＡＣＡＴＧ（配列番号５５）
ＥＧ−ＰＢ２  Ｄ１９５Ｎ  Ｒｖ：ＧＡＣＡＡＴＡＡＣＧＡＡＡＧＡＧＡＡＧＡＡＡＧＡＡＧＡＧＣＴＣＣＡＡ（配列番号５６）
ＥＧ−ＰＢ２  Ｍ４７３Ｖ  Ｆｗ：ＧＴＡＴＣＡＣＴＧＡＧＡＧＧＡＧＴＡＡＧＡＧＴＴＡＧＴＡＡＡＡＴＧ（配列番号５７）
ＥＧ−ＰＢ２  Ｍ４７３Ｖ  Ｒｖ：ＧＡＡＴＡＴＴＡＣＣＴＧＡＣＡＴＧＡＣＴＣＣＣＡＧＣＡＣＡＧＡＡ（配列番号５８）
ＥＧ−ＰＢ２  Ｍ５７０Ｉ  Ｆｗ：ＡＴＡＴＴＧＴＡＣＡＡＴＡＡＧＡＴＧＧＡＧＴＴＴＧＡＡＣＣＧＴＴＣ（配列番号５９）
ＥＧ−ＰＢ２  Ｍ５７０Ｉ  Ｒｖ：ＣＧＴＧＧＧＧＴＣＴＴＧＡＧＡＣＣＡＣＴＧＡＡＴＴＴＴＣＡＣ（配列番号６０）
【００６２】
（３）ＰＡの変異導入プライマー
ＥＧ−ＰＡ  Ｖ３４１Ｌ  Ｆｗ：ＴＴＡＣＴＧＧＣＡＧＡＡＣＴＣＣＡＡＧＡＴＡＴＴＧＡＡＡＡＴＧＡＧ（配列番号６１）
ＥＧ−ＰＡ  Ｖ３４１Ｌ  Ｒｖ：ＧＴＡＴＡＡＡＣＣＣＣＡＡＴＴＡＣＣＴＣＣＴＧＡＣＴＴＧＧＡＡＧＣＡＡ（配列番号６２）
ＥＧ−ＰＡ  Ｌ６４９Ｉ  Ｆｗ：ＡＴＣＴＡＴＧＣＡＴＣＴＴＣＡＣＡＡＣＴＣＧＡＧＧＧＧＴＴＴＴＣＡＧ（配列番号６３）
ＥＧ−ＰＡ  Ｌ６４９Ｉ  Ｒｖ：ＣＡＧＡＡＣＣＴＴＧＣＴＧＧＣＧＡＡＧＴＣＴＧＴＴＴＴＣＡＡＣＡＧＴ（配列番号６４）
ＥＧ−ＰＡ  Ａ６６９Ｖ  Ｆｗ：ＧＴＣＣＡＧＧＣＡＣＴＴＡＧＧＧＡＣＡＡＣＣＴＧＧＡＡＣＣＴＧ（配列番号６５）
ＥＧ−ＰＡ  Ａ６６９Ｖ  Ｒｖ：ＧＴＴＴＴＣＡＧＣＴＧＡＡＴＣＡＡＧＡＡＡＡＴＴＧＣＴＴＣＴＣＡＴＴ（配列番号６６）
【００６３】
（４）ＮＰの変異導入プライマー
ＥＧ−ＮＰ  Ｇ２８７Ｓ  Ｆｗ：ＴＣＧＧＧＡＴＡＴＧＡＴＴＴＴＧＡＧＡＧＡＧＡＡＧＧＧＴＡＣＴＣ（配列番号６７）
ＥＧ−ＮＰ  Ｇ２８７Ｓ  Ｒｖ：ＣＴＧＣＴＴＧＴＧＴＧＴＡＣＧＧＡＣＴＴＧＣＴＧＴＧＧＣＣ（配列番号６８）
ＥＧ−ＮＰ  Ｔ３７１Ｍ  Ｆｗ：ＡＴＧＧＡＡＧＣＡＡＴＧＧＡＣＴＣＣＡＡＣＡＣＴＣＴＴＧＡＡＣＴＧＡＧ（配列番号６９）
ＥＧ−ＮＰ  Ｔ３７１Ｍ  Ｒｖ：ＣＡＣＣＡＧＡＧＧＧＧＴＴＣＡＡＡＴＴＧＣＴＴＣＡＡＡＴＧＡＡＡＡＣ（配列番号７０）
【００６４】
（実施例２）ＭＤＣＫ細胞を用いたインフルエンザＡ型ウイルスの増殖
ＭＤＣＫ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−３４）に実施例１にて得られたインフルエンザウイルスを感染させ、培養上清についてウイルス力価とＨＡ力価を確認した。インフルエンザウイルスのウイルス力価とＨＡ力価の確認は、常法に従って、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ法およびｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙによって定量化した。ＱＩＡａｍｐ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて培養上清からｖＲＮＡを抽出し、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｐｒｏｂｅ  ＲＴ-ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、Ｍ遺伝子に対するプライマーによりＲｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ法を行った（Ｗａｔａｎａｂｅ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．  ２０１１  Ｓｅｐ；９２（Ｐｔ  ９）：２１０５−１０．  ｄｏｉ：  １０．１０９９／ｖｉｒ．０．０３２６２３−０．  Ｅｐｕｂ  ２０１１  Ｊｕｎ  １．）。
【００６５】
結果を、図６及び７に示す。ＭＤＣＫ細胞では、野生型のインフルエンザウイルスに比べて、本発明によると、ウイルス力価、及びＨＡ力価が、１０２〜１０３倍ほど増大することがわかった。
【００６６】
（比較例１）Ｖｅｒｏ細胞を用いたインフルエンザＡ型ウイルスの増殖
ＭＤＣＫ細胞の代わりに、Ｖｅｒｏ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−８１）を用いた以外は、実施例２と同様にして、インフルエンザウイルスを細胞に感染させて増殖させ、ウイルス力価を確認した。
【００６７】
結果を、図８に示す。Ｖｅｒｏ細胞では、ＰＢ１−Ｔ１８２Ｉのインフルエンザウイルスの増殖性は、野生型のインフルエンザウイルスとほぼ同程度であった。また、ＰＢ１−Ｔ１８２Ｉ以外のインフルエンザウイルスの増殖性は、野生型に比べてわずかな増大に留まった。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
以上詳述したように、本発明のアミノ酸変異の導入されたインフルエンザウイルスは、ＭＤＣＫ細胞における増殖性が高いものであり、ＭＤＣＫ細胞を用いたインフルエンザウイルスの増殖に適している。本発明のインフルエンザウイルスの増殖方法は、高いウイルス力価及高いＨＡ力価を達成することができる。本発明のインフルエンザウイルスの増殖方法は、インフルエンザワクチンの製造に利用することができ、インフルエンザワクチンの供給に寄与することから有用である。
【図１】
2018064493.tif 000004
【図２】
2018064493.tif 000005
【図３】
2018064493.tif 000006
【図４】
2018064493.tif 000007
【図５】
2018064493.tif 000008
【図６】
2018064493.tif 000009
【図７】
2018064493.tif 000010
【図８】
2018064493.tif 000011
【配列表】
2018064493000001.app