(57)【要約】【課題】ケラチノサイトにおけるメラニン分解を促進し、細胞内メラニンを低減するメラニン分解促進剤の提供。【解決手段】１６−メチルオクタデカン酸又はその塩を有効成分とするメラニン分解促進剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１６−メチルオクタデカン酸又はその塩を有効成分とするメラニン分解促進剤。
【請求項２】
１６−メチルオクタデカン酸又はその塩を有効成分とする美白剤。
【請求項３】
１６−メチルオクタデカン酸又はその塩を有効成分とするシミ若しくはソバカスの予防又は改善剤。
【請求項４】
１６−メチルオクタデカン酸又はその塩を有効成分とする皮膚色素沈着の予防又は改善剤。
【請求項５】
１６−メチルオクタデカン酸又はその塩を有効成分とする細胞内メラニン低減剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メラニンの分解を促進するメラニン分解促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚や毛髪の色を決定する因子として様々なものが報告されているが、その中でも、表皮に存在するメラニンの量や質が、皮膚や毛髪の色に大きく寄与すると考えられている。すなわち、皮膚や毛髪の色の形成は、メラニン産生細胞（メラノサイト）中のメラノソームと呼ばれる細胞小器官中でつくられたメラニンが、表皮や毛包のケラチノサイトへと転送されて表皮や毛髪全体へと広がることに大きく影響を受けるとされる。
したがって、メラニン産生の抑制やメラニン分解の促進等により、ケラチノサイトにおけるメラニン量が低下すれば、皮膚や毛髪の色は明るくなる。
【０００３】
また、最近、本出願人は、ケラチノサイト内におけるメラニン動態にオートファジーが関与し、ケラチノサイトにおけるメラニン量とオートファジーの活性が相関することを見出している（特許文献１）。これによれば、オートファジーの活性を亢進することにより、ケラチノサイトにおけるメラニンの分解が促進され、皮膚や毛髪の明色化が可能であると考えられる。
【０００４】
皮膚においては、シミ、ソバカスの原因の一つとして、皮膚の紫外線暴露による刺激、ホルモンの異常又は遺伝的要素等によって皮膚内に存在するメラノサイトが活性化されメラニン産生が盛んになることが知られていることから、従来、メラニン産生を抑制したり、産生したメラニンを減少させたりする美白剤が開発されてきた。例えば、メラニンの生合成に関与するチロシナーゼの活性を阻害してメラニン産生を抑制し得る物質として、アスコルビン酸、アルブチン、コウジ酸、グルタチオン等が報告されている（非特許文献１）。
【０００５】
一方、１６−メチルオクタデカン酸又はその塩は、毛髪の質の改善に用いられている分岐脂肪酸である（特許文献２）。しかしながら、１６−メチルオクタデカン酸又はその塩にメラニン分解促進作用があることは全く知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２０１３／１６２０１２号
【特許文献２】特開２０１２−３１１２８号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】美白戦略（南江堂）ＩＶ.，美白剤の薬理と臨床，p95-116
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、優れたメラニン分解促進作用及び細胞内メラニン量低減作用を有するメラニン分解促進剤、美白剤、シミ若しくはそばかすの予防又は改善剤、皮膚色素沈着の予防又は改善剤、細胞内メラニン低減剤を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、表皮角化細胞（ケラチノサイト）におけるメラニン分解活性を制御する物質について探索したところ、１６−メチルオクタデカン酸又はその塩が、ケラチノサイトにおける優れたメラニン分解促進作用並びにケラチノサイト及びメラノサイトにおける優れた細胞内メラニン低減作用を有し、メラニン過剰生成に伴う皮膚の褐色化やシミ・ソバカス等の予防又は改善に有用であることを見出した。
【００１０】
すなわち、本発明は以下の１）〜５）に係るものである。
１）１６−メチルオクタデカン酸又はその塩を有効成分とするメラニン分解促進剤。
２）１６−メチルオクタデカン酸又はその塩を有効成分とする美白剤。
３）１６−メチルオクタデカン酸又はその塩を有効成分とするシミ若しくはソバカスの予防又は改善剤。
４）１６−メチルオクタデカン酸又はその塩を有効成分とする皮膚色素沈着の予防又は改善剤。
５）１６−メチルオクタデカン酸又はその塩を有効成分とする細胞内メラニン低減剤。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、ケラチノサイトにおけるメラニンの分解を促進し、また、ケラチノサイト及びメラノサイトの細胞内メラニンを低減し、皮膚の美白のための肌ケア、皮膚のシミ若しくはソバカスの予防又は改善、皮膚色素沈着の予防又は改善が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】１６−メチルオクタデカン酸がケラチノサイト内のメラニン（メラノソーム）量に及ぼす影響。
【図２】１６−メチルオクタデカン酸がメラノサイトのドーパオキシダーゼ活性に及ぼす影響。
【図３】１６−メチルオクタデカン酸がメラノサイトの細胞内メラニン量に及ぼす影響。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明における１６−メチルオクタデカン酸は、下記式で示される分岐脂肪酸である。
【００１４】
【化１】
2018070566.tif 000002
【００１５】
１６−メチルオクタデカン酸の塩としては、ナトリウム塩、リチウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩；トリエタノールアミン塩、ジエタノールアミン塩、モノエタノールアミン塩等の有機アミン塩；リジン塩、アルギニン塩等の塩基性アミノ酸塩が挙げられる。
【００１６】
１６−メチルオクタデカン酸又はその塩は、公知の方法により得た合成品を用いることもできるし、市販品を用いることもできる。
【００１７】
後記実施例に示すように、１６−メチルオクタデカン酸又はその塩は、ケラチノサイトにおけるメラニン（メラノソーム）の分解促進作用並びにケラチノサイト及びメラノサイトの細胞内メラニン低減作用を有する。これらの作用により、肌の美白効果、シミ若しくはソバカスの予防又は改善効果、或いは皮膚色素沈着の予防又は改善効果を得ることができる。
したがって、１６−メチルオクタデカン酸又はその塩を、動物、好ましくはヒトに投与することでメラニン分解を促進し、メラニンを低減することにより、皮膚の美白、シミ若しくはソバカスの予防又は改善、或いは皮膚色素沈着の予防又は改善が可能となる。
【００１８】
すなわち、本発明の１６−メチルオクタデカン酸又はその塩は、メラニン分解促進剤、美白剤、シミ若しくはソバカスの予防又は改善剤、皮膚色素沈着の予防又は改善剤、及び細胞内メラニン低減剤となり、メラニン分解促進のため、皮膚の美白のため、シミ若しくはソバカスを予防又は改善するため、或いは皮膚色素沈着を予防又は改善するために使用することができる。
【００１９】
本明細書において、本発明の１６−メチルオクタデカン酸又はその塩のヒトへの使用は、治療的使用であってもよく、又は美容目的での使用を含む非治療的使用であってもよい。
「非治療的」とは、医療行為を含まない、すなわち人間を手術、治療又は診断する方法を含まない、より具体的には医師、又は医療従事者もしくは医師の指示を受けた者が人間に対して手術、治療又は診断を実施する方法を含まない概念である。非治療的使用としては、美容的又は審美的な目的での皮膚美白のための本発明の化合物の使用、例えばエステティシャン、美容師等による使用等が挙げられる。
また、本明細書において、「改善」とは、症状又は状態の好転、症状又は状態の悪化の防止又は遅延、あるいは症状又は状態の進行の逆転、防止又は遅延をいう。
また、本明細書において、「予防」とは、個体における症状の発症の防止又は遅延、あるいは個体の症状の発症の危険性を低下させることをいう。
【００２０】
また、本発明の１６−メチルオクタデカン酸又はその塩は、メラニン分解促進剤、美白剤、シミ若しくはソバカスの予防又は改善剤、皮膚色素沈着の予防又は改善剤、或いは細胞内メラニン低減剤を製造するために使用することができる。
【００２１】
本発明のメラニン分解促進剤、美白剤、シミ若しくはソバカスの予防又は改善剤、皮膚色素沈着の予防又は改善剤、及び細胞内メラニン低減剤は、メラニン分解促進、美白、シミ若しくはソバカスの予防又は改善、皮膚色素沈着の予防又は改善、又は細胞内メラニン低減を目的とした、医薬品、医薬部外品若しくは化粧品であり得、又は当該医薬品、医薬部外品若しくは化粧品を製造するための原料又は素材であり得る。
【００２２】
上記医薬品又は医薬部外品は、投与形態は任意であり、経口投与、非経口投与の何れでもよい。経口投与のための剤型としては、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤のような固形製剤、ならびにエリキシル、シロップおよび懸濁液のような液体製剤が挙げられ、非経口投与のための剤型としては、注射、外用、経皮、経粘膜、経鼻、経腸、吸入、坐剤、貼付等の各製剤が挙げられる。好ましくは、当該医薬品又は医薬部外品は、外用剤の形態であるのが好ましく、具体的には、軟膏、クリーム、乳液、ローション、ジェル、エアゾール、パッチ、テープ、スプレー等の形態が挙げられる。
【００２３】
上記化粧品の形態としては、クリーム、乳液、ローション、懸濁液、ジェル、パウダー、パック、シート、パッチ、スティック、ケーキ等、化粧品に使用され得る任意の形態が挙げられ、特に限定されない。好ましくは、上記化粧品は皮膚美白用化粧料である。
【００２４】
上記医薬品、医薬部外品若しくは化粧品に係る製剤組成物は、それぞれ一般的な製造法により、本発明の化合物を、製剤上許容し得る担体、例えば、各種油剤、界面活性剤、ゲル化剤、防腐剤、酸化防止剤、溶剤、アルコール、水、キレート剤、増粘剤、紫外線吸収剤、乳化安定剤、pH調整剤、色素、香料等と共に混合、分散した後、所望の形態に加工することによって得ることができる。また、これらの製剤組成物には、本発明の化合物の他、それぞれ医薬品、医薬部外品、化粧品等の製剤の種類に応じて、適宜、植物抽出物、殺菌剤、保湿剤、抗菌剤、清涼剤等の薬効成分を本発明の効果を妨害しない範囲で適宜配合することができる。また、美白効果を更に高めるべく、他の美白成分を適宜配合することもできる。
【００２５】
当該製剤組成物中の本発明の１６−メチルオクタデカン酸又はその塩の含有量は、１６−メチルオクタデカン酸換算で、一般的に好ましくは０．０１質量％以上、より好ましくは０．１質量％以上、且つ好ましくは１０質量％以下、より好ましく５質量％以下であり、また好ましくは０．０１〜１０質量％、より好ましくは０．１〜５質量％である。
【００２６】
上記医薬品、医薬部外品、化粧品による１６−メチルオクタデカン酸又はその塩の投与量は、本発明の効果を達成できる量であり得る。当該投与量は、対象者の状態、体重、性別、年齢又はその他の要因に従って変動し得るが、成人（６０ｋｇ）１人当たり１日、１６−メチルオクタデカン酸換算で、例えば好ましくは０．００１ｍｇ以上、より好ましくは０．０１ｍｇ以上であり、且つ好ましくは１０００ｍｇ以下、より好ましくは１００ｍｇ以下である。また、好ましくは０．００１〜１０００ｍｇ、より好ましくは０．０１〜１００ｍｇである。
【００２７】
また、当該製剤は、任意の摂取・投与計画に従って摂取・投与され得るが、１日１回〜数回に分け、数週間〜数カ月間継続して投与することが好ましい。
上記化粧品、医薬品又は医薬部外品の適用の対象としては、それを必要としていれば特に限定されないが、好ましくは、皮膚の美白を所望するヒト、シミ若しくはソバカスの予防又は改善を所望するヒト、皮膚色素沈着の予防又は改善を所望するヒトである。
【００２８】
上述した実施形態に関し、本発明においては更に以下の態様が開示される。
【００２９】
＜１＞１６−メチルオクタデカン酸又はその塩を有効成分とするメラニン分解促進剤。
＜２＞１６−メチルオクタデカン酸又はその塩を有効成分とする美白剤。
＜３＞１６−メチルオクタデカン酸又はその塩を有効成分とするシミ若しくはソバカスの予防又は改善剤。
＜４＞１６−メチルオクタデカン酸又はその塩を有効成分とする皮膚色素沈着の予防又は改善剤。
＜５＞１６−メチルオクタデカン酸又はその塩を有効成分とする細胞内メラニン低減剤。
【００３０】
＜６＞メラニン分解促進剤を製造するための、１６−メチルオクタデカン酸又はその塩の使用。
＜７＞美白剤を製造するための、１６−メチルオクタデカン酸又はその塩の使用。
＜８＞シミ若しくはソバカスの予防又は改善剤を製造するための、１６−メチルオクタデカン酸又はその塩の使用。
＜９＞皮膚色素沈着の予防又は改善剤を製造するための、１６−メチルオクタデカン酸又はその塩の使用。
＜１０＞細胞内メラニン低減剤を製造するための、１６−メチルオクタデカン酸又はその塩の使用。
【００３１】
＜１１＞メラニン分解促進に使用するための１６−メチルオクタデカン酸又はその塩。
＜１２＞美白に使用するための１６−メチルオクタデカン酸又はその塩。
＜１３＞シミ若しくはソバカスの予防又は改善に使用するため１６−メチルオクタデカン酸又はその塩。
＜１４＞皮膚色素沈着の予防又は改善に使用するための１６−メチルオクタデカン酸又はその塩。
＜１５＞細胞内メラニン低減に使用するための１６−メチルオクタデカン酸又はその塩。
【００３２】
＜１６＞メラニン分解促進方法であって、それを必要とする対象に１６−メチルオクタデカン酸又はその塩を有効量で投与又は摂取させることを含む、方法。
＜１７＞美白方法であって、それを必要とする対象に１６−メチルオクタデカン酸又はその塩を有効量で投与又は摂取させることを含む、方法。
＜１８＞シミ若しくはソバカスを予防、改善、又は治療する方法であって、それを必要とする対象に１６−メチルオクタデカン酸又はその塩を有効量で投与又は摂取させることを含む、方法。
＜１９＞皮膚色素沈着を予防、改善、又は治療する方法であって、それを必要とする対象に１６−メチルオクタデカン酸又はその塩を有効量で投与又は摂取させることを含む、方法。
＜２０＞細胞内メラニン低減方法であって、それを必要とする対象に１６−メチルオクタデカン酸又はその塩を有効量で投与又は摂取させることを含む、方法。
【００３３】
＜２１＞上記＜１１＞〜＜１５＞において、上記使用は、好ましくは、美容的又は審美的な目的での皮膚美白のための非治療的な使用である。
＜２２＞上記＜１６＞〜＜２０＞において、上記方法は、好ましくは、美容的又は審美的な目的での皮膚美白のための非治療的な方法である。
【実施例】
【００３４】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３５】
試験物質の調製
１６-メチルオクタデカン酸は、特開２００８−２５５０５０号公報の実施例１に記載された方法により合成し、１０ｍＭとなるようにエタノール（ＥｔＯＨ）に溶解した。
【００３６】
実施例１：１６−メチルオクタデカン酸が表皮角化細胞（ケラチノサイト）内におけるメラニン（メラノソーム）に及ぼす影響
（１）細胞培養
正常ヒト新生児包皮由来表皮角化細胞（Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ，ｎｅｏｎａｔａｌ（ＨＥＫｎ）  ｌｉｇｈｔｌｙ；ケラチノサイト）はＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社より購入した。メラノーマ細胞株ＭＮＴ−１細胞は、Ｄｒ．  Ｎａｔａｌｉ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｌａ  Ｓａｐｉｅｎｚａ，Ｒｏｍｅ，Ｉｔａｌｙ）より供与いただいた。ケラチノサイトは培地用増殖添加剤（Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ）（倉敷紡績）を添加した表皮角化細胞用増殖培地（Ｅｐｉｌｉｆｅ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で３７℃、５Ｖｏｌ％ＣＯ２の条件下で培養した。ＭＮＴ−１細胞の増殖用培地として、ＡＩＭ−Ｖ培地とＦｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）をそれぞれ１０％（ｖ／ｖ）含むＲＰＭＩ１６４０培地（いずれもＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用し、３７℃、５Ｖｏｌ％ＣＯ２の条件下で培養した。
【００３７】
（２）メラノソーム画分の調製
ＭＮＴ−１細胞からメラノソーム画分を所定の方法（Ｍｕｒａｓｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ，１３３：２４１６−２４２４．）により単離調製した。具体的には、１７５ｃｍ２フラスコに培養しコンフルエントに達したＭＮＴ−１細胞を０．０５％  Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で回収し、Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ（ＤＰＢＳ、ｎｏ  ｃａｌｃｉｕｍ、ｎｏ  ｍａｇｎｅｓｉｕｍ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（以下、ＰＢＳと略記）にて洗浄した。続いて、２ｍＬのＬｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１％  Ｉｇｅｐａｌ  ＣＡ−６３０、０．０１％  ＳＤＳ）を加えて穏やかに混合し、４℃にて１時間振盪攪拌した。この細胞溶解液を１．５ｍＬマイクロチューブに分注し、１，０００ｇにて１０分間（４℃）遠心して、上清を回収した。本遠心操作を計２回繰り返し、得られた上清を続いて２０，０００ｇにて１０分間（４℃）遠心した。最後にペレットをＰＢＳで洗浄し、同条件で遠心操作を計２回繰り返して得られたペレットをメラノソーム画分（ｍｅｌａｎｏｓｏｍｅ−ｒｉｃｈ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）とした。
【００３８】
（３）メラニン定量
ケラチノサイトを１２−ウェルプレートに７×１０４ｃｅｌｌｓ／ウェル（１ｍＬ／ウェル）の細胞密度で播種し、３日後に１７５ｃｍ２フラスコ１本分に培養したＭＮＴ−１細胞から得られたメラノソーム画分を１枚分のプレート（１２−ウェル分）に対して均等量添加した。その翌日に培地を交換し、１６−メチルオクタデカン酸を終濃度で１、３、５μＭになるように添加し、３７℃、５Ｖｏｌ％ＣＯ２の条件下で２日間培養した。コントロールとしては、同量のＥｔＯＨを添加した。なお、この時の試験用培地としては、Ｅｐｉｌｉｆｅ（増殖添加剤（Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ）のうち、ハイドロコーチゾン、インスリン、ゲンタマイシン及びアンフォテリシンＢ含有、ヒト上皮細胞成長因子（ｈＥＧＦ；Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）及びウシ脳下垂体抽出物（ＢＰＥ；Ｂｏｖｉｎｅ  Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ  Ｅｘｔｒａｃｔ）不含）を使用した。培養終了後、細胞の培養プレートをＰＢＳで洗浄し、セルスクレーパーを用いて１．５ｍＬマイクロチューブに細胞を回収した。各チューブに２Ｍ  ＮａＯＨを１５０μＬ加えた後１００℃、６０分間の処理により細胞を溶解し、室温下において、２１，６４０ｇで１０分間の遠心処理により得られた上清の４０５ｎｍの波長の吸光度を測定し、ウェル当たりのメラニン量を算出した。その結果、ＥｔＯＨのみを添加したコントロールと比較して、１６−メチルオクタデカン酸は細胞内のメラニン量を濃度依存的に減少させることがわかった（図１；棒グラフ）。また、Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いたＢＣＡ（ビシンコニン酸）法により、Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）を標準物質として上清のタンパク量を測定した結果、１６−メチルオクタデカン酸はウェル当たりのタンパク量には影響を与えないことを確認した（図１；折れ線グラフ）。
【００３９】
以上のことより、１６−メチルオクタデカン酸がケラチノサイト内に取り込まれたメラニン（メラノソーム）の分解又は低減を促進することが示唆された。
【００４０】
実施例２：１６−メチルオクタデカン酸がメラノサイトに及ぼす影響
（１）細胞培養
正常ヒト新生児包皮由来表皮メラニン細胞（Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｓ，ｎｅｏｎａｔａｌ，ｌｉｇｈｔｌｙ  ｐｉｇｍｅｎｔｅｄ  ｄｏｎｏｒ（ＨＥＭｎ−ＬＰ）；メラノサイト）、表皮メラニン細胞用増殖培地（Ｍｅｄｉｕｍ２５４）、その培地用増殖添加剤（ＨＭＧＳ）はＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社より購入した。メラノサイトは、３７℃、５Ｖｏｌ％ＣＯ２の条件下で培養した。
【００４１】
（２）１６−メチルオクタデカン酸がメラノサイトのドーパオキシダーゼ活性に及ぼす影響
メラノサイトを１．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ウェル（１００μＬ／ウェル）の細胞密度で９６−ウェルプレートに播種した。この時の試験用培地としては、Ｍｅｄｉｕｍ２５４（増殖添加剤（ＨＭＧＳ）のうち、ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｈＦＧＦ−Ｂ；Ｈｕｍａｎ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｂａｓｉｃ）、ハイドロコーチゾン、インスリン、トランスフェリン、ヘパリン及びウシ脳下垂体抽出物（ＢＰＥ；Ｂｏｖｉｎｅ  Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ  Ｅｘｔｒａｃｔ）含有、ホルボール１２−ミリスチン酸１３−アセテート（ＰＭＡ；ｐｈｏｒｂｏｌ  １２−ｍｙｒｉｓｔａｔｅ  １３−ａｃｅｔａｔｅ）不含）を用いた。２日後、１６−メチルオクタデカン酸を終濃度で０．５、１、３、５、１０μＭになるように添加し、３７℃、５Ｖｏｌ％ＣＯ２の条件下で４日間培養した。コントロールとしては、同量のＥｔＯＨを添加した。培養終了後、細胞の培養プレートをＰＢＳで３回洗浄して、抽出Ｂｕｆｆｅｒ（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ：７．２）、１％  ＮＰ−４０、０．０１％  ＳＤＳ）を２０μＬ／ウェル、Ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒ（４％ジメチルホルムアミド、１００ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ（ｐＨ：７．１））を２０μＬ／ウェル添加した。４℃にて２時間かけて細胞を可溶化し、ドーパオキシダーゼ活性の測定を行ったが、その活性測定は、ＭＢＴＨ法（Ｗｉｎｄｅｒ  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９８：３１７−３２６）を基本とした次に示す方法で行った。すなわち、可溶化した細胞溶液の各ウェルに、上記Ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒを８０μＬ、２０．７ｍＭ  ＭＢＴＨ（３−メチル−２−ベンゾチアゾリノン  ヒドラゾン）水溶液を６０μＬ、基質として５ｍＭ  Ｌ−ＤＯＰＡ（Ｌ−ジヒドロキシフェニルアラニン）水溶液を４０μＬ加え、３７℃にて３０分間反応させた後、５０５ｎｍの波長の吸光度を測定した。
その結果、ＥｔＯＨのみを添加したコントロールと比較して、１６−メチルオクタデカン酸がメラニン生成のメカニズムに深く関与しているドーパオキシダーゼ活性を抑制することはなかった（図２）。
【００４２】
（３）１６−メチルオクタデカン酸がメラノサイトの細胞内メラニン量に及ぼす影響
メラノサイトを２×１０５ｃｅｌｌｓ／ウェル（２ｍＬ／ウェル）の細胞密度で６−ウェルプレートに播種した。この時の試験用培地としては、Ｍｅｄｉｕｍ２５４（増殖添加剤（ＨＭＧＳ）のうち、ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｈＦＧＦ−Ｂ；Ｈｕｍａｎ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｂａｓｉｃ）、ハイドロコーチゾン、インスリン、トランスフェリン、ヘパリン及びウシ脳下垂体抽出物（ＢＰＥ；Ｂｏｖｉｎｅ  Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ  Ｅｘｔｒａｃｔ）含有、ホルボール１２−ミリスチン酸１３−アセテート（ＰＭＡ；ｐｈｏｒｂｏｌ  １２−ｍｙｒｉｓｔａｔｅ  １３−ａｃｅｔａｔｅ）不含）を用いた。２日後、１６−メチルオクタデカン酸を終濃度で０．５、１、３、５、１０μＭになるように添加し、３７℃、５Ｖｏｌ％ＣＯ２の条件下で５日間培養した。コントロールとしては、同量のＥｔＯＨを添加した。なお、培地交換は３日に１度行った。培養終了後、細胞の培養プレートをＰＢＳで洗浄し、セルスクレーパーを用いて１．５ｍＬマイクロチューブに細胞を回収した。各チューブに２Ｍ  ＮａＯＨを１５０μＬ加えた後１００℃、６０分間の処理により細胞を溶解し、室温下において、２１，６４０ｇで１０分間の遠心処理により得られた上清の４０５ｎｍの波長の吸光度を測定し、メラニン量を算出した。その結果、ＥｔＯＨのみを添加したコントロールと比較して、１６−メチルオクタデカン酸は細胞内のメラニン量を濃度依存的に減少させることがわかった（図３）。なお、細胞内のメラニン量はＢｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）を標準物質としたＢＣＡ（ビシンコニン酸）法により測定したタンパク質量に対する相対値で示した。
【００４３】
以上のことより、１６−メチルオクタデカン酸がメラニン合成能の抑制とは異なる作用により、メラノサイトの細胞内メラニン量を減少させることが示唆された。
【００４４】
これらの結果より、１６−メチルオクタデカン酸は、表皮において皮膚色形成に関与するケラチノサイト及びメラノサイトのどちらにおいても、細胞内メラニン量を低減させるように作用することが示された。
【図１】
2018070566.tif 000003
【図２】
2018070566.tif 000004
【図３】
2018070566.tif 000005