(57)【要約】      （修正有）【課題】生分解性プラスチックとして利用が拡大しつつあるポリ乳酸（ＰＬＡ）を、常温付近でを効率よく分解可能な技術の提供。【解決手段】下記（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択されるポリペプチドを、ポリ乳酸と接触させることを含む、ポリ乳酸の分解方法。（ａ）：特定のアミノ酸配列からなるポリ乳酸分解活性を有するポリペプチド、（ｂ）：（ａ）に記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つポリ乳酸分解活性を有するポリペプチド、（ｃ）：（ａ）に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つポリ乳酸分解活性を有するポリペプチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択されるポリペプチドを、ポリ乳酸と接触させることを含む、ポリ乳酸の分解方法。
（ａ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つポリ乳酸分解活性を有するポリペプチド
（ｃ）配列番号４に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つポリ乳酸分解活性を有するポリペプチド
【請求項２】
下記（Ａ）〜（Ｇ）からなる群より選択されるポリヌクレオチドを導入した細胞を、ポリ乳酸と接触させることを含む、ポリ乳酸の分解方法。
（Ａ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（Ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つポリ乳酸分解活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（Ｃ）配列番号４に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つポリ乳酸分解活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（Ｄ）配列番号３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｅ）配列番号３に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換、付加、又は挿入された塩基配列からなり、且つポリ乳酸分解活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（Ｆ）配列番号３に記載の塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、且つポリ乳酸分解活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（Ｇ）配列番号３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つポリ乳酸分解活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
【請求項３】
カルシウムイオンの存在下で、前記ポリペプチド又は前記細胞を、ポリ乳酸と接触させる、請求項１又は２に記載のポリ乳酸の分解方法。
【請求項４】
下記（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択されるポリペプチドを含む、ポリ乳酸分解剤。
（ａ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つポリ乳酸分解活性を有するポリペプチド
（ｃ）配列番号４に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つポリ乳酸分解活性を有するポリペプチド
【請求項５】
下記（Ａ）〜（Ｇ）からなる群より選択されるポリヌクレオチドを導入した細胞を含む、ポリ乳酸分解剤。
（Ａ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（Ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つポリ乳酸分解活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（Ｃ）配列番号４に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つポリ乳酸分解活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（Ｄ）配列番号３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｅ）配列番号３に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換、付加、又は挿入された塩基配列からなり、且つポリ乳酸分解活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（Ｆ）配列番号３に記載の塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、且つポリ乳酸分解活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（Ｇ）配列番号３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つポリ乳酸分解活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリ乳酸の分解方法、及びポリ乳酸分解剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリ乳酸（以下、「ＰＬＡ」という。）は、生分解性プラスチックとして利用が拡大しつつあるものの、環境中における分解性は決して高いとはいえない。さらに、分別回収やマテリアルリサイクルコストの面でも課題があり、ＰＬＡの約８割が焼却処分されている現状にある。
【０００３】
上記のような現状から、ＰＬＡを生物学的手法により分解する方法が提案されている。例えば、特許文献１〜３には、ＰＬＡ分解菌として、サーモアクチノマイセス属に属する微生物、バチルス・リケニフォルミスに属する微生物、アクチノマデュラ・アツラハバセアに属する微生物が報告されており、これらの微生物を用いてＰＬＡを分解する方法が提案されている。また、特許文献４には、ミクロモノスポラ属に属する微生物から単離されたＰＬＡ分解酵素が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００７−３１９０７７号公報
【特許文献２】特開２００７−３１９０７８号公報
【特許文献３】特開２００８−１６７７０１号公報
【特許文献４】特開２０１３−９９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献１〜４に記載のＰＬＡ分解菌及びＰＬＡ分解酵素は、ＰＬＡの分解に５０℃程度の比較的高い温度を必要とし、ＰＬＡ分解速度も速いとはいえない。エネルギー効率の観点からは、より低い温度で、より早くＰＬＡを分解できることが望ましい。
【０００６】
本発明は上記事情に鑑みて為されたものであり、常温付近でＰＬＡを効率よく分解可能な技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は以下の通りである。
［１］下記（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択されるポリペプチドを、ポリ乳酸と接触させることを含む、ポリ乳酸の分解方法。
（ａ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つポリ乳酸分解活性を有するポリペプチド
（ｃ）配列番号４に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つポリ乳酸分解活性を有するポリペプチド
［２］下記（Ａ）〜（Ｇ）からなる群より選択されるポリヌクレオチドを導入した細胞を、ポリ乳酸と接触させることを含む、ポリ乳酸の分解方法。
（Ａ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（Ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つポリ乳酸分解活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（Ｃ）配列番号４に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つポリ乳酸分解活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（Ｄ）配列番号３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｅ）配列番号３に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換、付加、又は挿入された塩基配列からなり、且つポリ乳酸分解活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（Ｆ）配列番号３に記載の塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、且つポリ乳酸分解活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（Ｇ）配列番号３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つポリ乳酸分解活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
［３］カルシウムイオンの存在下で、前記ポリペプチド又は細胞を、ポリ乳酸と接触させる、［１］又は［２］に記載のポリ乳酸の分解方法。
［４］下記（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択されるポリペプチドを含む、ポリ乳酸分解剤。
（ａ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つポリ乳酸分解活性を有するポリペプチド
（ｃ）配列番号４に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つポリ乳酸分解活性を有するポリペプチド
［５］下記（Ａ）〜（Ｇ）からなる群より選択されるポリヌクレオチドを導入した細胞を含む、ポリ乳酸分解剤。
（Ａ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（Ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つポリ乳酸分解活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（Ｃ）配列番号４に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つポリ乳酸分解活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（Ｄ）配列番号３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｅ）配列番号３に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換、付加、又は挿入された塩基配列からなり、且つポリ乳酸分解活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（Ｆ）配列番号３に記載の塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、且つポリ乳酸分解活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（Ｇ）配列番号３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つポリ乳酸分解活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、常温付近でＰＬＡを効率よく分解可能な技術を提供することを目的とする。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】精製酵素の反応最適ｐＨを評価した結果を示す。
【図２】精製酵素のｐＨ安定性を評価した結果を示す。
【図３】精製酵素の反応最適温度を評価した結果を示す。
【図４】精製酵素の温度安定性を評価した結果を示す。
【図５】精製酵素に対する阻害剤の影響を評価した結果を示す。
【図６】精製酵素に対する金属イオンの影響を評価した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
［ポリ乳酸の分解方法］
（第１実施形態）
１実施形態において、本発明は、下記（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択されるポリペプチドを、ポリ乳酸と接触させることを含む、ポリ乳酸の分解方法を提供する。
（ａ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなりポリペプチド
（ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つポリ乳酸分解活性を有するポリペプチド
（ｃ）配列番号４に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つポリ乳酸分解活性を有するポリペプチド
【００１１】
〔ポリペプチド〕
本実施形態の方法で用いるポリペプチド（以下、「本ポリペプチド」という。）は、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択されるポリペプチドである。
（ａ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つポリ乳酸分解活性を有するポリペプチド
（ｃ）配列番号４に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つポリ乳酸分解活性を有するポリペプチド
【００１２】
上記（ｂ）において、欠失、置換、付加、又は挿入されるアミノ酸の数は、結果として生じるポリペプチドがＰＬＡ分解活性を有する限り、特に限定されないが、例えば１〜６０個であることができ、１〜５０個であることが好ましく、１〜３０個であることがより好ましく、さらに１〜２０個、１〜１０個、１〜５個等を例示することができる。
【００１３】
上記（ｃ）において、配列同一性は、８０％以上である限り、特に限定されないが、８５％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがさらに好ましい。なお、アミノ酸配列同士の配列同一性（相同性）は、２つのアミノ酸配列を、対応するアミノ酸が最も多く一致するように、挿入及び欠失に当たる部分にギャップを入れながら並置し、得られたアラインメント中のギャップを除くアミノ酸配列全体に対する一致したアミノ酸の割合として求められる。アミノ酸配列同士の配列同一性は、当該技術分野で公知の各種相同性検索ソフトウェアを用いて求めることができる。例えば、アミノ酸配列の配列同一性の値は、公知の相同性検索ソフトウェアＢＬＡＳＴＰにより得られたアライメントを元にした計算によって得ることができる。
【００１４】
なお、本明細書において、「ポリ乳酸分解活性」（ＰＬＡ分解活性）とは、ポリ乳酸（ＰＬＡ）の加水分解を触媒する活性を意味する。ＰＬＡは、主要な構成単位として乳酸を有するポリマーであり、乳酸単位同士はエステル結合により重合している。ＰＬＡは加水分解によりエステル結合が切断されて、乳酸が生じる。ポリペプチドがＰＬＡ分解活性を有するか否かは、例えば、本明細書の実施例に記載のハロー試験等により確認することができる。
【００１５】
上記（ａ）〜（ｃ）のポリペプチドは、イグジオバクテリウム・アセティリカム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｙｌｉｃｕｍ）  Ｚ１５３−３株（以下、「Ｚ１５３−３株」という。）から、ＰＬＡ分解酵素として単離されたポリペプチド（配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド）、又はその改変体である。Ｚ１５３−３株は、本願明細書の実施例に示されるように、２５℃付近の常温でＰＬＡを分解することができるＰＬＡ分解菌であり、ＰＬＡ分解速度もこれまでに報告されているＰＬＡ分解菌よりも速い。Ｚ１５３−３株は、２０１７年２月１日付で、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２４１０として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に受託されている。
【００１６】
配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの成熟タンパク質である。配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、シグナルペプチド（配列番号２の１〜２１番目；２１アミノ酸残基）及びプロペプチド（配列番号２の２２〜１８８番目：１６７アミノ酸残基）を有している。Ｚ１５３−３株のＰＬＡ分解酵素は、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドとして翻訳され、シグナルペプチドにより細胞外に輸送されると、シグナルペプチドとプロペプチドが切断されて、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドとなる。
【００１７】
配列番号４に記載のアミノ酸配列は、ＢＬＡＳＴ検索により、イグジオバクテリウム・エンクレンス（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｎｃｌｅｎｓｅ）のバシロリシン（Ｂａｃｉｌｌｏｌｙｓｉｎ）のアミノ酸配列と１００％一致することが確認された。しかしながら、バシロリシンにＰＬＡ分解活性があることは、これまでに報告されていない。すなわち、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが、ＰＬＡ分解活性を有することは、本発明により初めて見出された知見である。
【００１８】
一般的に何らかの生理活性を有するタンパク質は、その生理活性を損なうことなく、そのアミノ酸配列を改変（欠失、置換、付加、又は挿入）することができる。そのため、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの改変体である上記（ｂ）〜（ｃ）のポリペプチドもまた、ＰＬＡを分解するために使用することができる。
【００１９】
本ポリペプチドは、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか又は両方に、他の機能を付与するために、各種タグや別種のタンパク質を連結したものであってもよい。例えば、タグとしては、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ、Ｍｙｃタグ、Ｆｌａｇタグ等の汎用されているタグを挙げることができる。また、別種のタンパク質は、付与したい機能に応じて適宜選択すればよく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ルシフェラーゼ、免疫グロブリン等を挙げることができるが、これらに限定されない。これらのタグやタンパク質は、直接又はリンカーを介して、本ポリペプチドに付加することができる。
【００２０】
本ポリペプチドはまた、公知の固定化技術を用いて固定化したものであってもよい。固定化法は、酵素の固定化技術として公知の技術を用いればよく、特に限定されない。固定化技術としては、例えば、担体結合法、架橋法、包括法等を挙げることができる。例えば、担体結合法を用いる場合、本ポリペプチドと担体との結合は、物理的吸着、イオン結合、共有結合のいずれの方法で行ってもよい。担体としては、多孔質ガラス、ガラスビーズ、酸性白土、カオリナイト、ベントナイト、セラミックス、ヒドロキシアパタイト、イオン交換樹脂、ＤＥＡＥセルロース、シリカ、酸化チタン、中空糸膜等を挙げることができるが、これらに限定されない。架橋法を用いる場合には、架橋剤としては、例えば、グルタルアルデヒド等を挙げることができる。包括法を用いる場合、包括担体としては、例えば、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ウレタンポリマー、ナイロン、エチルセルロース、ポリスチレンなどの合成高分子化合物；ゼラチン、アルギン酸、カラギーナンなどの天然高分子化合物等を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００２１】
本ポリペプチドは、Ｚ１５３−３株又は後述する本ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入された細胞を培養し、その培養上清又は培養菌体若しくは細胞から、単離・精製することにより取得することができる。
【００２２】
Ｚ１５３−３株の培養は、一般的な好気性従属栄養細菌の培養に使用される炭素源、窒素源、無機塩類等を含む各種培地を用いて行うことができる。例えば、炭素源として、グルコース、デキストラン、デンプン、酵母エキス、牛肉エキス等を挙げることができ、窒素源としては、アンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、ペプトン、カゼイン、尿素等を挙げることができる。また、無機塩類としては、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、モリブデンナトリウムなどのナトリウム塩；リン酸カリウム、塩化カリウムなどのカリウム塩；塩化カルシウム、リン酸カルシウムなどのカルシウム塩；塩化マグネシウム、硫酸マグネシウムなどのマグネシウム塩等を挙げることができる。また、活性汚泥やスキムミルクを培地に添加してもよい。
Ｚ１５３−３株の培養は、固体培地及び液体培地のいずれで行ってもよいが、本ポリペプチドの取得効率の観点から、液体培地で培養することが好ましい。培地のｐＨは、例えばｐＨ５．０〜９．０、好ましくはｐＨ６．０〜８．０とすることができる。また、培養温度は、１５〜４０℃、好ましくは２０〜４０℃とすることができる。
培養は、静置培養でも振とう培養でもよいが、増殖効率がよくなることから振とう培養とすることが好ましい。さらに、通気攪拌培養してもよい。
【００２３】
本ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入された細胞を用いる場合、細胞の培養方法は、当該細胞の種類に応じて、適宜選択すればよい。
【００２４】
Ｚ１５３−３株又は細胞を培養後は、遠心分離やろ過等により、培養上清と菌体若しくは細胞とを分離することができる。本ポリペプチドの単離・精製には、培養上清と菌体若しくは細胞とのいずれを用いてもよいが、本ポリペプチドは分泌タンパク質であるため、培養上清を用いることが好ましい。
【００２５】
培養上清又は培養菌体若しくは細胞からの本ポリペプチドの単離・精製は、酵素の単離・精製技術として一般的に用いられている方法を組み合わせて行うことができる。例えば、アセトン沈殿、塩析、透析、限外ろ過、各種クロマトグラフィー（イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等）、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ等）等の公知の方法を、適宜組み合わせて用いることができる。
【００２６】
本ポリペプチドの単離・精製は、上記のような単離・精製技術で得られた画分について、ＰＬＡ分解活性を有する画分を選択していくことにより、行うことができる。単離・精製工程で得られた画分のＰＬＡ活性の確認は、例えば、本明細書の実施例に記載のハロー試験等により行うことができる。または、ＰＬＡを含む反応液に、単離・精製工程で得られた画分を添加し、乳酸の生成を検出することによっても、ＰＬＡ活性を確認することができる。あるいは、本ポリペプチドのＰＬＡ活性はプロテアーゼ活性と相関していることから、プロテアーゼ活性を指標として、本ポリペプチドの単離・精製を行ってもよい。単離・精製工程で得られた画分のプロテアーゼ活性の確認は公知の方法で行うことができ、例えば、本明細書の実施例に記載の方法等を用いることができる。また、本ポリペプチドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、約３５ｋＤａのバンドとして検出されるため、単離・精製工程で得られた画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、約３５ｋＤａのバンドを取得することによっても、本ポリペプチドを得ることができる。
【００２７】
さらに、本ポリペプチドは、無細胞タンパク質合成系を用いて合成してもよい。無細胞タンパク質合成系による本ポリペプチドの合成は、本ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ又はＤＮＡを用いて、大腸菌、ＰＵＲＥシステム等の公知の系により行うことができる。
【００２８】
〔ＰＬＡの分解方法〕
本実施形態のＰＬＡ分解方法は、本ポリペプチドとＰＬＡとを接触させることを含む。本実施形態の方法で分解させるＰＬＡは、主要な構成単位として乳酸を有する重合体であれば、特に限定されない。ＰＬＡとしては、例えば、ポリＬ−乳酸及びポリＤ−乳酸のようなホモポリマー、ポリＬ／Ｄ−乳酸、これらのポリマーと他の成分とが共重合した共重合体、これらの混合物等を挙げることができる。
【００２９】
ＰＬＡが、乳酸ポリマーと他のポリマー成分との共重合体である場合には、乳酸成分は質量比率が１０％以上であることが好ましく、２０％以上であることがより好ましく、３０％以上であることがさらに好ましい。共重合体を構成する他のポリマー成分としては、ε−カプロラクトン、グリコリド、デプシペプチド等を挙げることができる。これらの他のポリマー成分は１種であっても、２種以上であってもよい。
【００３０】
本実施形態の方法により分解されるＰＬＡの分子量に特に制限はないが、分解速度の点から、数平均分子量５０００〜５０００００であることが好ましく、１００００〜２０００００であることがより好ましい。
【００３１】
ＰＬＡに含まれる乳酸単位は、Ｌ−乳酸及びＤ−乳酸のいずれであってもよく、これらの両方を含んでいてもよいが、Ｌ−乳酸であることが好ましい。
【００３２】
また、本実施形態の方法で分解されるＰＬＡは、他の成分との混合物であってもよい。例えば、他の成分としては、ＰＬＡ以外のポリマー、増粘剤、可塑剤、安定剤、粘度安定剤等の各種添加剤等を挙げることができる。ＰＬＡを含む材料であれば、本実施形態の方法により、当該材料中のＰＬＡを分解することができる。ＰＬＡは、例えば、フィルム、シート、トレー、ボトル等の形態であってもよく、これらの破砕物、粉末、懸濁液・物、乳化物、可溶化物等であってもよい。分解効率を高くするためには、本ポリペプチドと接触させるＰＬＡは、ＰＬＡを含む製品の破砕物、粉末、懸濁液・物、乳化物、可溶化物等とすることが好ましく、懸濁液・物、乳化物、可溶化物とすることがより好ましい。
【００３３】
本ポリペプチドは、溶液等としてＰＬＡと接触させてもよく、適切な固定化技術により固定化したものをＰＬＡと接触させてもよい。また、本ポリペプチドの生産菌（細胞）およびその培養物等と接触させても良い。つまり、本ポリペプチドと何らかの様式で接触すれば良い。接触方法は、特に限定されないが、例えば、ＰＬＡを含む反応液に本ポリペプチドの溶液や本ポリペプチドを固定化した担体を添加する方法、本ポリペプチドを含む反応液にＰＬＡを添加する方法、本ポリペプチドを固定化した担体にＰＬＡを含む反応液を接触させる方法等を挙げることができる。
【００３４】
ＰＬＡの分解を行う際のｐＨは、例えば、ｐＨ４．０〜１１．０程度とすることができ、ｐＨ６．０〜９．０とすることが好ましく、ｐＨ６．０〜８．０とすることがより好ましい。また、ＰＬＡの分解を行う際の温度は、１０〜９０℃とすることができ、１０〜６０℃とすることが好ましく、１５〜５５℃とすることがより好ましく、２０〜５０℃とすることがさらに好ましい。なお、本ポリペプチドは、常温付近（２０〜４０℃程度）でも高いＰＬＡ分解効率が得られるため、エネルギー効率の観点から、２０〜４５℃程度、又は常温付近（２０〜４０℃程度）で分解反応を行うようにしてもよい。
【００３５】
また、本ポリペプチドとＰＬＡとの接触は、カルシウムイオンの存在下で行うことが好ましい。カルシウムイオン存在下で接触させることにより、本ポリペプチドによるＰＬＡの分解を促進することができる。カルシウムイオンの濃度は、特に限定されないが、例えば、０．０５〜１００ｍＭとすることができ、０．１〜１０ｍＭであることが好ましい。
【００３６】
本ポリペプチドとＰＬＡとの接触時間は、ＰＬＡが分解されるのに十分な時間であればよく、本ポリペプチドと接触させるＰＬＡの量に応じて、適宜選択すればよい。接触時間としては、例えば、０．５〜１０日、１〜５日、１〜３日等とすることができる。なお、ＰＬＡとの接触に用いる本ポリペプチドの量は、特に限定されず、ＰＬＡの量に応じて適宜選択すればよい。本ポリペプチドの量としては、例えば、ＰＬＡ  １ｇに対して０．０１〜０．２ｍｇ等を例示することができる。
【００３７】
（第２実施形態）
１実施形態において、本発明は、下記（Ａ）〜（Ｇ）からなる群より選択されるポリヌクレオチドを導入した細胞を、ポリ乳酸と接触させることを含む、ポリ乳酸の分解方法を提供する。
（Ａ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（Ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つポリ乳酸分解活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（Ｃ）配列番号４に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つポリ乳酸分解活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（Ｄ）配列番号３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｅ）配列番号３に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換、付加、又は挿入された塩基配列からなり、且つポリ乳酸分解活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（Ｆ）配列番号３に記載の塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、且つポリ乳酸分解活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（Ｇ）配列番号３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドし、且つポリ乳酸分解活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
【００３８】
〔ポリヌクレオチド〕
本実施形態の方法で用いるポリヌクレオチド（以下、「本ポリヌクレオチド」という。）は、以下の（Ａ）〜（Ｇ）からなる群より選択されるポリヌクレオチドである。
（Ａ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（Ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つポリ乳酸分解活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（Ｃ）配列番号４に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つポリ乳酸分解活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（Ｄ）配列番号３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｅ）配列番号３に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換、付加、又は挿入された塩基配列からなり、且つポリ乳酸分解活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（Ｆ）配列番号３に記載の塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、且つポリ乳酸分解活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（Ｇ）配列番号３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つポリ乳酸分解活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
【００３９】
上記（Ｂ）において、欠失、置換、付加、又は挿入されるアミノ酸の数は、第１実施形態における（ｂ）と同様とすることができる。また、上記（Ｃ）における配列同一性は、第１実施形態における（ｃ）と同様とすることができる。
【００４０】
上記（Ｅ）において、欠失、置換、付加、又は挿入される塩基の数は、結果として生じるポリヌクレオチドがポリ乳酸分解活性を有するポリペプチドをコードする限り、特に限定されないが、例えば１〜１８０個であることができ、１〜１５０個であることが好ましく、１〜９０個であることがより好ましく、さらに１〜６０個、１〜３０個、１〜１５個等を例示することができる。
【００４１】
上記（Ｆ）において、配列同一性は、８０％以上である限り、特に限定されないが、８５％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがさらに好ましい。なお、塩基酸配列同士の配列同一性（相同性）は、第１実施形態で記載したアミノ酸配列同士の配列同一性と同様に考えることができる。
【００４２】
上記（Ｇ）において、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ  ＴＨＩＲＤ  ＥＤＩＴＩＯＮ（Sambrookら、Cold Spring Harbor Laboratory Press）に記載の方法が挙げられる。例えば、６×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣの組成：３Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍクエン酸溶液、ｐＨ７．０）、５×デンハルト溶液（１００×デンハルト溶液の組成：２質量％ウシ血清アルブミン、２質量％フィコール、２質量％ポリビニルピロリドン）、０．５質量％のＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡ、及び５０％フォルムアミドからなるハイブリダイゼーションバッファー中で、４２〜７０℃で数時間から一晩インキュベーションを行うことによりハイブリダイズさせる条件を挙げることができる。なお、インキュベーション後の洗浄の際に用いる洗浄バッファーとしては、好ましくは０．１質量％ＳＤＳ含有１×ＳＳＣ溶液、より好ましくは０．１質量％ＳＤＳ含有０．１×ＳＳＣ溶液を挙げることができる。
【００４３】
上記（Ａ）〜（Ｃ）において、縮重コドンは、宿主細胞のコドン使用頻度の高いものを選択することが好ましい場合もある。例えば、（Ａ）の塩基配列としては、配列番号３に記載の塩基配列であってもよく、配列番号３に記載の塩基配列を、コードするアミノ酸配列は変更せずに、宿主細胞において使用頻度の高いコドンへ改変した塩基配列であってもよい。コドンの改変は、公知の遺伝子配列変異技術又は人工遺伝子合成によって行うことができる。
【００４４】
上記（Ａ）〜（Ｇ）のポリヌクレオチドは、シグナルペプチドをコードする塩基配列、及びプロペプチドをコードする塩基配列をさらに含んでいてもよい。例えば、配列番号１に記載の塩基配列において、１〜６３番目の塩基配列はシグナルペプチドをコードする塩基配列であり、６４〜５６４番目の塩基配列はプロペプチドをコードする塩基配列である。これらの塩基配列は、シグナルペプチド及びプロペプチドをコードする塩基配列の好適な例である。また、上記（Ａ）〜（Ｇ）のポリヌクレオチドは、各種タグ、別種タンパク質、リンカー配列等をコードする塩基配列をさらに含んでいてもよい。
【００４５】
本ポリヌクレオチドは、配列番号３に記載の塩基配列に基づいて、公知の核酸合成法等を用いて合成することにより、取得することができる。あるいは、Ｚ１５３−３株から抽出したＤＮＡ又はＺ１５３−３株から抽出したｍＲＮＡを逆転写して得たｃＤＮＡをテンプレートとして、ＰＣＲ法や等温増幅法等を用いて、本ポリヌクレオチドを増幅することにより、取得することができる。ＰＣＲ法や等温増幅法等で用いるプライマーは、配列番号３に記載の塩基配列に基づいて、設計することができる。
【００４６】
〔細胞〕
本実施形態の方法では、本ポリヌクレオチドを導入した細胞を用いる。本ポリヌクレオチドを導入する細胞は、特に限定されず、原核細胞及び真核細胞のいずれであってもよい。原核細胞としては、例えば、大腸菌、イグジオバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｕｓ）属、ブレビバチラス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、エシェリシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属等の細菌細胞を挙げることができる。また、真核細胞としては、酵母、真菌細胞、昆虫細胞、動物細胞、植物細胞等を挙げることができる。
【００４７】
本ポリヌクレオチドは、導入された宿主細胞内で発現可能なように、適切な制御配列を備えた発現ベクターの形態で宿主細胞に導入することが好ましい。制御配列としては、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、ターミネーター、エンハンサー等を挙げることができる。
【００４８】
発現ベクターは、宿主細胞の種類により適宜選択することがきる。本ポリヌクレオチドの発現ベクターへの組込みは、周知の遺伝子組み換え技術を用いることにより行うことができ、市販の発現ベクター作製キットを用いてもよい。
【００４９】
本発明に係る発現ベクターは、本ポリヌクレオチドに加えて、薬剤耐性遺伝子等をさらに含んでいてもよい。薬剤耐性遺伝子として、例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ビアラホス耐性遺伝子等を挙げることができる。薬剤耐性遺伝子を含んでいることにより、発現ベクターが導入された細胞の選別が容易になる。
【００５０】
発現ベクターを宿主細胞に導入する方法は、特に限定されず、公知の遺伝子導入法を用いればよい。例えば、ケミカルコンピテントセル法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）法、リン酸カルシウムトランスフェクション法等を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００５１】
発現ベクターにより本ポリヌクレオチドが導入された細胞は、当該細胞の種類に応じて、適宜培地を選択し、培養して増殖させることができる。本ポリヌクレオチドが導入された細胞は、本ポリヌクレオチドの発現により、本ポリペプチドを産生し、ＰＬＡ分解能を有するようになる。そのため、本ポリヌクレオチドが導入された細胞を用いて、ＰＬＡの分解を行うことができる。
【００５２】
〔ＰＬＡの分解方法〕
本実施形態のＰＬＡ分解方法は、本ポリヌクレオチドが導入された細胞（以下、「本細胞」という。）とＰＬＡとを接触させることを含む。本実施形態の方法により分解されるＰＬＡは、第１実施形態の方法と同様のものを挙げることができる。
【００５３】
本細胞は、培養液等としてＰＬＡと接触させてもよく、適切な固定化技術により固定化したものをＰＬＡと接触させてもよい。本細胞を固定化する場合は、第１実施形態で例示した包括法により固定化を行うことが好ましい。本細胞とＰＬＡとの接触方法は、特に限定されないが、例えば、ＰＬＡを含む反応液に本細胞を添加する方法、本細胞の培養物中にＰＬＡを添加する方法、本細胞が固定化された担体にＰＬＡを含む反応液を接触させる方法等を挙げることができる。
【００５４】
ＰＬＡの分解を行う際のｐＨ、温度等の条件は、宿主細胞の種類にもよるが、実施形態１で例示したものと同様の条件を挙げることができる。また、実施形態１の方法と同様に、本細胞とＰＬＡとの接触は、カルシウムイオンの存在下で行うことが好ましい。カルシウムイオン存在下で接触させることにより、本細胞によるＰＬＡの分解を促進することができる。カルシウムイオンの濃度は、特に限定されないが、例えば、０．０５〜１００ｍＭとすることができ、０．１〜１０ｍＭであることが好ましい。
【００５５】
本細胞とＰＬＡとの接触時間は、ＰＬＡが分解されるのに十分な時間であればよく、本細胞と接触させるＰＬＡの量に応じて、適宜選択すればよい。接触時間としては、例えば、０．５〜１０日、１〜５日、１〜３日等とすることができる。なお、ＰＬＡとの接触に用いる本細胞の量は、特に限定されず、宿主細胞の種類やＰＬＡの量に応じて適宜選択すればよい。
【００５６】
上記の第１実施形態及び第２実施形態のＰＬＡ分解方法は、常温付近（２０〜４０℃程度）でもＰＬＡを効率よく分解できることから、ＰＬＡを含む廃棄物の処理に幅広く利用することができる。また、ＰＬＡの分解により生じた乳酸は、回収して再度ＰＬＡを合成することも可能であり、ＰＬＡリサイクルに寄与することができる。
【００５７】
［ポリ乳酸分解剤］
１実施形態において、本発明は、下記（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択されるポリペプチドを含む、ポリ乳酸分解剤を提供する。
（ａ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つポリ乳酸分解活性を有するポリペプチド
（ｃ）配列番号４に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つポリ乳酸分解活性を有するポリペプチド
【００５８】
また、１実施形態において、本発明は、下記（Ａ）〜（Ｇ）からなる群より選択されるポリヌクレオチドを導入した細胞を含む、ポリ乳酸分解剤を提供する。
（Ａ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（Ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つポリ乳酸分解活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（Ｃ）配列番号４に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つポリ乳酸分解活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（Ｄ）配列番号３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｅ）配列番号３に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換、付加、又は挿入された塩基配列からなり、且つポリ乳酸分解活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（Ｆ）配列番号３に記載の塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、且つポリ乳酸分解活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（Ｇ）配列番号３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つポリ乳酸分解活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
【００５９】
本実施形態のＰＬＡ分解剤は、本ポリペプチド及び本細胞の少なくとも一方を、活性成分として含む。本実施形態のＰＬＡ分解剤において、活性成分の含量は適宜調製すればよく、特に限定されない。
【００６０】
活性成分としての本ポリペプチド又は本細胞は、本ポリペプチド又は本細胞をそのまま用いてもよく、適切な固定化技術により固定化したものを用いてもよい。本ポリペプチド又は本細胞をそのまま用いる場合、本ポリペプチド又は本細胞は、溶液又は培養液の状態であってもよいが、凍結乾燥等の処理を施したものであることが好ましい。本ポリペプチド又は本細胞として、固定化ポリペプチド又は固定化細胞を用いる場合には、上記ＰＬＡ分解方法の実施形態１で例示した固定化技術等を用いて固定化することができる。なお、固定化細胞を用いる場合には、包括法を用いて固定化したものであることが好ましい。
【００６１】
本実施形態のＰＬＡ分解剤の調製に当たっては、本ポリペプチド及び本細胞の少なくとも一方を活性成分として、錠剤、粉剤、顆粒剤、液剤、水和剤等、種々の形態に調製することができる。公知の製剤化技術にしたがって製剤することができ、適当な賦形剤、安定化剤等を適宜含ませることができる。また、ＰＬＡの分解を促進させるために、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、塩化カルシウムなどのカルシウム塩やスキムミルク等を配合してもよい。
【００６２】
本実施形態のＰＬＡ分解剤は、ＰＬＡの分解に好適に用いることができる。本実施形態のＰＬＡ分解剤は、約１０〜６０℃の温度範囲で用いることができるが、常温付近（２０〜４０℃程度）でも効率よくＰＬＡを分解することができる。そのため、ＰＬＡを含む廃棄物の処理に幅広く利用することができる。
【実施例】
【００６３】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００６４】
［実施例１］Ｚ−１５３株の同定
Ｚ−１５３株の分類上の同定を行うために、普通（ＮＢ）寒天培地（ＢａｃｔｏＴＭ  ｐｅｐｔｏｎｅ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）  １％，牛肉エキス  １％，ＮａＣｌ（和光純薬）  ０．５％，寒天末  １．５％）で培養したＺ１５３−３株について、株式会社テクノスルガラボに委託して、生理・生化学的性状試験を行った。その結果を表１に示す。
【００６５】
【表１】
2018138013.tif 000002
【００６６】
また、１６ＳｒＤＮＡ塩基配列の相同性検索の結果、Ｚ１５３−３株は、イグジオバクテリウム・アセティリカム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｙｌｉｃｕｍ）に属すると同定された。
【００６７】
［実施例２］Ｚ−１５３株のＰＬＡ分解活性の評価
Ｚ１５３−３株のＰＬＡ分解活性をポリ乳酸乳化寒天培地によるハロー試験で調べた。
【００６８】
（培地）
人工下水培地（表２）に、さらに約２％の活性余剰汚泥を加え、超音波処理（１分）後、寒天末を１．５％添加し、オートクレーブ滅菌（１２０℃、１５分）した。クリーンベンチ内で滅菌済みシャーレ（アズワン）に約２０ｍＬ注いで、ＵＶを１時間照射しながら固化させた。これを人工下水汚泥寒天培地とした。
【００６９】
【表２】
2018138013.tif 000003
【００７０】
（ＰＬＡの乳化）
ポリ乳酸樹脂（バイロエコール  ＢＥ−４００，東洋紡）  ０．４ｇをクロロホルム（和光純薬）  ２０ｍＬに溶解した。これに１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を２００ｍＬ加え、超音波処理（ＵＤ−２０１トミー精工、３０分）により乳化した。これを７０℃で１時間湯せんし、クロロホルムを揮発させて、乳化ＰＬＡとした。
【００７１】
（乳化ＰＬＡ寒天培地）
乳化ＰＬＡ  ５５ｍＬを人工下水培地４５ｍＬに溶かし、スキムミルクを０．１％（ｗ／ｖ）と寒天末を１．５％添加し、電子レンジで寒天を溶かした。クリーンベンチ内で滅菌済みシャーレ（アズワン）に約２０ｍＬ注いで、ＵＶを１時間照射しながら固化させた。これをＰＬＡ乳化寒天培地とした。
【００７２】
（培養）
〔前培養〕
１８φ試験管に人工下水培地（表２）を４．９ｍＬずつ分注し、湯せんで溶かした凍結活性汚泥を約０．１５ｇ薬さじで加え、ボルテックスで激しくかく拌した。シリコ栓をしてアルミホイルで覆い、オートクレーブ（トミー精工，ＥＳ３１５、又はＳＡＮＹＯ、ＭＬＳ−３０２０）滅菌した。室温にて冷却し、植菌前に別滅菌した１％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ５０μＬ、同じく別滅菌した無機塩溶液Ｉ（ＮａＣｌ  １．５％，ＫＣｌ  ０．７％，ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  ０．９％）５０μＬを加えて、前培養液とした。
Ｚ１５３−３株のグリセロールストック（−８０℃）を一白金耳分取り、画線法によりＮＢ寒天培地へ植菌した。２５℃に設定した恒温槽でインキュベートし、菌の生育を確認後、培地から菌を白金耳で取り出し、前培養液５ｍＬが入った試験管に植菌した。これを２５℃、１６４回/分間（ｓｐｍ）で２４時間振とう培養した。
【００７３】
〔本培養〕
５００ｍＬバッフルフラスコに汚泥約０．７ｇを含む人工下水培地（表２）を８８ｍＬ分注し、消泡剤を終濃度０．００２５％となるように添加した後、シリコ栓をしてアルミホイルで覆い、オートクレーブ滅菌した。植菌前にクリーンベンチ内で１％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを１ｍＬ、無機塩溶液Ｉを１ｍＬ、別滅菌した１０％スキムミルクを１０ｍＬ添加し、前培養液１ｍＬを植菌した。これを、２８℃、１８０ｒｐｍで２４時間振とう培養して本培養を行った。
【００７４】
（ハロー試験）
ＰＬＡ乳化寒天培地に、ＮＢ培地で培養したＺ１５３−３株のコロニーを滅菌したつまようじで植菌した。また、人工下水汚泥培地で培養した前培養液、本培養液１μＬをＰＬＡ乳化寒天培地上においたろ紙(３ｍｍ×３ｍｍ)上に摘下した。これを２５℃に設定した恒温槽でインキュベートし、２４時間ごとに透明なハローの大きさを測定した。
【００７５】
（結果）
ＰＬＡ乳化寒天培地を用いたハロー試験の結果を表３に示す。Ｚ１５３−３株のコロニー、前培養液、本培養液のいずれにおいても、ＰＬＡ分解によるハローが確認された。
【００７６】
【表３】
2018138013.tif 000004
【００７７】
なお、表４は、既知のＰＬＡ分解菌で報告されているＰＬＡ分解ハローと、Ｚ１５３−３株のＰＬＡ分解ハローとを比較した結果である。既知のＰＬＡ分解菌のＰＬＡ分解ハローの形成温度が５０℃である一方、Ｚ１５３−３株では２５℃でＰＬＡ分解ハローを形成することができた。また、Ｚ１５３−３株のＰＬＡ分解ハローの形成速度は、既知のＰＬＡ分解菌よりも速かった。この結果より、Ｚ１５３−３株は、既知のＰＬＡ分解菌よりも低い温度条件で、短期間でＰＬＡを分解できることが確認された。
【００７８】
【表４】
2018138013.tif 000005
【００７９】
（各種ＰＬＡに対する分解活性）
上記と同様のハロー試験により、各種ＰＬＡに対するＺ１５３−３株の分解活性を評価した。ハロー試験は、２５℃で１日インキュベートすることにより行った。
結果を表５に示す。Ｚ１５３−３株は、各種ＰＬＡを分解できることが確認された。
【００８０】
【表５】
2018138013.tif 000006
【００８１】
［実施例３］ＰＬＡ分解酵素の精製
Ｚ１５３−３株の培養上清から、ＰＬＡ分解酵素の精製を行った。
【００８２】
（アセトン沈殿）
Ｚ１５３−３株の前培養、及び本培養を、実施例２で記載したように行った。本培養液を遠心分離（１８，８００×ｇ、４℃、１０分）し、培養上清を回収した。回収した培養上清の体積をメスシリンダーで測り、ビーカーに移した。１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０、４℃）＋１ｍＭ  ＣａＣｌ２を、培養上清の１／５０倍量添加し、氷上でかく拌しながら冷アセトン（−２０℃）２倍量を全量添加した。アセトン添加後、−２０℃で２時間静置した。その後、遠心分離（１８，８００×ｇ、４℃、１０分）し、得られた沈殿を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ＋１ｍＭ  ＣａＣｌ２（ｐＨ９．０、４℃）で培養上清の１／１０倍量で懸濁した（１０倍濃縮）。これを精製用サンプルとした。
【００８３】
（クロマトグラフィー）
上記で調製した精製用サンプルについて、以下のカラムクロマトグラフィーを行った。
〔ＤＥＡＥ−６５０Ｍ〕
アセトン濃縮サンプルを、１ｍＭ  ＣａＣｌ２／２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ９．０：Ａバッファー）で平衡化したＤＥＡＥ−６５０Ｍ（ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ）カラム（カラム容量（以下、「ＣＶ」と略記する。）２０ｍｌ（内径２．５ｃｍ、ベッド高３．０ｃｍ）に流速１０ｍＬ／分でアプライし、Ａバッファーを流速１０ｍＬ／分で３ＣＶ洗浄した。その後、流速５ｍＬ／分、０〜１．０Ｍ  ＮａＣｌ／Ａ  ｂｕｆｆｅｒのリニアグラジエントにより溶出した。１フラクションあたり５ｍＬ（１分）ずつ回収した。
【００８４】
〔Ｈｉｔｒａｐ  Ｑ−ＨＰ〕
ＤＥＡＥカラムで得られた活性画分を透析膜により脱塩し、１ｍＭ  ＣａＣｌ２／２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０：Ｂバッファー）でバッファー置換した。Ｂバッファーで平衡化したＨｉｔｒａｐ  Ｑ−ＨＰカラム（ＣＶ＝５ｍＬ）にバッファー置換したサンプルを流速５ｍＬ／分でアプライし、Ｂバッファー、流速５ｍＬ／分で３ＣＶ洗浄した。その後、流速３ｍＬ／分で０〜１．０Ｍ  ＮａＣｌ／Ｂバッファーのリニアグラジエント（１０ＣＶ）により溶出した。１フラクションあたり３．０ｍＬ（１分）ずつ回収した。
【００８５】
〔ＭｏｎｏＱ〕
Ｈｉｔｒａｐ  Ｑ−ＨＰカラムで得られた活性画分を、Ｖｉｖａ  ｓｐｉｎ  ２０を用いて脱塩、濃縮し、Ｂバッファーによりバッファー置換した。このサンプルをＢバッファーで平衡化したｍｏｎｏＱカラム（ＣＶ＝１ｍＬ）に流速１ｍＬ／分でアプライし、Ｂバッファー、流速１ｍＬ／分で３ＣＶ洗浄した。その後、流速０．５ｍＬ／分で０〜１．０Ｍ  ＮａＣｌ／Ｂバッファーのリニアグラジエント（２０ＣＶ）により溶出した。１フラクションあたり０．５ｍＬ（１分）ずつ回収した。
【００８６】
（プロテアーゼ活性測定）
上記カラムクロマトグラフィーにおいて、酵素画分の取得は、プロテアーゼ活性を指標として行った。プロテアーゼ活性測定法は、アゾカゼインを基質とし、プロテアーゼによる加水分解でアゾカゼインから遊離したアゾ色素を測定することで求めた。プロテアーゼ活性の測定手順は以下のとおりである。
（１）１．５ｍＬエッペンチューブに０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２，終濃度０．１Ｍ）１２５μＬ、０．１Ｍ  ＣａＣｌ２２Ｈ２Ｏ  ２．５μＬ（終濃度１ｍＭ）、蒸留水（ＤＷ）を６２．５μＬ分注した。コントロール用の反応液に２０％ＴＣＡ  ５０μＬをあらかじめ加えておいた。反応液を３７℃で５分、予備加温した。
（２）酵素液を１０μＬ加え、３７℃で５分間反応させた。
（３）３％アゾカゼインを５０μＬ加え、ボルテックスにより攪拌混合した後、直ちに３７℃で５分間反応させた。
（４）２０％ＴＣＡを５０μＬ加えボルテックスにより攪拌混合し、反応停止させた。
（５）遠心分離（２１，６００×ｇ、１５分）し、２５０μＬの上清を新しいエッペンチューブに回収し、再び遠心分離（２１，６００×ｇ、５分）した。
（６）上清２００μＬをマイクロプレートに入れ、３４０ｎｍにおける吸光度（Ａ３４０）を測定した。
【００８７】
なお、上記で用いた反応液の組成を以下に示す。
＜酵素反応液の組成＞
０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２，３７℃）  ５μＬ
０．１Ｍ  ＣａＣｌ２２Ｈ２Ｏ  ２．５μＬ
蒸留水  ６２．５μＬ
酵素液  １０μＬ
【００８８】
（タンパク質濃度の測定）
タンパク質濃度の決定にはＢｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎａｔｅ（以下、「ＢＣＡ」と略記する。）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を使用し、ＢＳＡを標準タンパク質として測定した。タンパク質濃度の測定手順は以下のとおりである。
ＢＣＡ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ＡとＢＣＡ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｂを５０：１で混合したものを、Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔとし、Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ２５０μＬにサンプル１２．５μＬを加え、３７℃で３０分（加温法の場合は６０℃で３０分）インキュベートした。マイクロプレートリーダーを用いて、５６２ｎｍにおける吸光度（Ａ５６２）を測定し、既知濃度のＢＳＡを用いて作成した検量線からタンパク質濃度を決定した。
【００８９】
（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析）
精製により得た活性画分をＴＣＡ沈殿し、濃縮したサンプルについてドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行い、サンプル中のタンパク質を分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、Ｌａｅｍｍｌｉ法に準じて行い、プロテアーゼの精製度評価と分子量推定を行った。
【００９０】
（ＰＬＡ分解活性測定）
精製酵素サンプルにＰＬＡ分解活性があるかを明らにするため、乳化ＰＬＡプレートを用いてＰＬＡ分解活性を評価した。乳化ＰＬＡプレートにサンプルを３μＬ添加して、２５℃に設定した恒温槽でインキュベートし、形成されたハローの直径を測定した。
（乳化ＰＬＡプレート）
０．１８％  乳化ＰＬＡ  ５５ｍＬと０．１ｇスキムミルクを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ,ｐＨ８．０）４５ｍＬを混合し、寒天末を１．５％添加して電子レンジで寒天を溶かした。シャーレに約２０ｍＬ注ぎ、静置冷却することで固化させた。これをＰＬＡ乳化プレートとした。
【００９１】
（結果）
プロテアーゼ活性を指標とした精製結果を表６に示す。
【００９２】
【表６】
2018138013.tif 000007
【００９３】
上記精製を行うことにより、比活性は、培養上清の２．１５Ｕ／ｍｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｕ／ｍｇ）から８１．８Ｕ／ｍｇまで、約３８倍に濃縮することができた。ＭｏｎｏＱによる精製後のサンプルを１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析したところ、プロテアーゼ活性が高いフラクションでは約３５ｋＤａ付近にバンドが確認された。
【００９４】
また、乳化ＰＬＡプレートを用いて、ＭｏｎｏＱカラムクロマトグラフィーにより得られた酵素サンプルのＰＬＡ分解活性を調べた。その結果、乳化ＰＬＡプレートを２５℃で１日インキュベートした結果、ハローが確認された。高いプロテアーゼ活性を示したフラクションでのＰＬＡ分解活性も高い値を示したことから、プロテアーゼ活性とＰＬＡ分解活性とが一致していることを確認した。
【００９５】
［実施例４］ＰＬＡ分解酵素のキャラクタリゼーション
実施例３で精製した酵素について、酵素活性のキャラクタリゼーションを行った。酵素活性はプロテアーゼ活性で評価した。
【００９６】
（反応最適ｐＨ）
精製酵素の反応最適ｐＨを、以下に示す組成の反応液を用いて評価した。酵素反応は、３７℃で５分行った。
＜反応最適ｐＨ測定用反応液組成（２００μＬ）＞
０．２Ｍ  各バッファー（各ｐＨ，３７℃）  １２５μＬ
０．１Ｍ  ＣａＣｌ２２Ｈ２Ｏ  ２．５μＬ
蒸留水  ６２．５μＬ
酵素液  １０μＬ
【００９７】
なお、各バッファーの組成は以下の通りである。実験に用いた緩衝液は、すべて３７℃条件下で調製した。
０．２Ｍ  酢酸−酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．０，ｐＨ５．０，ｐＨ６．０）
０．２Ｍ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ６．０，ｐＨ７．０）
０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．０，ｐＨ７．２，ｐＨ８．０，ｐＨ９．０）
０．２Ｍ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨバッファー（ｐＨ９．０，ｐＨ１０．０）
【００９８】
結果を図１に示す。図１の相対活性（％）は、０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．０）のプロテアーゼ活性値を基準値（１００）として、それ以外の組成の反応液のプロテアーゼ活性値を相対値で表している。精製酵素のプロテアーゼ活性は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファーのｐＨ７．０で最大活性を示した。また、酸性域、塩基性域では活性値が低下していることから、精製酵素は、中性域から弱塩基性域で高い活性を有することが確認された。
【００９９】
（ｐＨ安定性）
精製酵素のｐＨ安定性は次の手順で調べた。下記で示した組成の緩衝液に精製酵素を添加（適宜希釈）し、４℃で３時間静置した後、上記「（反応最適ｐＨ）」で示した組成の反応液を用いて酵素反応（３７℃、５分）を行うことで残存活性を評価した。
【０１００】
なお、ｐＨ安定性試験に使用した各緩衝液の組成は以下の通りである。ｐＨ安定性試験に用いた緩衝液は、すべて４℃条件下で調製した。
０．２Ｍ  酢酸−酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．０，ｐＨ６．０）
０．２Ｍ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ６．０，ｐＨ７．０）
０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．０，ｐＨ７．２，ｐＨ８．０，ｐＨ９．０）
０．２Ｍ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨバッファー（ｐＨ９．０，ｐＨ１０．０，ｐＨ１０．５）
【０１０１】
結果を図２に示す。なお、図２の相対活性（％）は以下の計算により算出した。（１）４℃、３時間静置後のプロテアーゼ活性値と、４℃、３時間静置前のプロテアーゼ活性値から、静置後のプロテアーゼ活性の残存値（％）を算出した。（２）残存値のもっとも高かった緩衝液の残存値を１００として、その他の緩衝液の残存値の相対値（＝図２における相対活性（％））を算出した。精製酵素のプロテアーゼ活性は、ｐＨ６．０〜１０．０付近で安定性を示した。
【０１０２】
（反応最適温度）
精製酵素の反応最適温度を、以下に示す組成の反応液を用いて評価した。０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファーバッファー（ｐＨ７．０）は、各温度（１０℃，２０℃，３０℃，３７℃，４０℃，５０℃，６０℃，７０℃，８０℃，１００℃）でｐＨ７．０になるように調製した。酵素反応は、各温度で５分行った。
＜反応最適温度測定用反応液組成（２００μＬ）＞
０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファーバッファー（ｐＨ７．０）  １２５μＬ
０．１Ｍ  ＣａＣｌ２２Ｈ２Ｏ  ２．５μＬ
蒸留水  ６２．５μＬ
酵素液  １０μＬ
【０１０３】
結果を図３に示す。図３の相対活性（％）は、４０℃でのプロテアーゼ活性値を基準値（１００）として、それ以外の温度のプロテアーゼ活性値を相対値で表している。精製酵素のプロテアーゼ活性は、ｐＨ７．０において、４０℃で最大活性を示した。
【０１０４】
（温度安定性）
精製酵素の温度安定性は次の手順で調べた。各温度で調製した０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．０）に精製酵素を添加（適宜希釈）し、各温度（０℃，１０℃，２０℃，３０℃，４０℃，５０℃，６０℃，７０℃，８０℃）で３０分間静置した後、上記「（反応最適ｐＨ７．０）」で示した組成の反応液を用いて酵素反応（４０℃、５分）を行うことで残存活性を評価した。
【０１０５】
結果を図４に示す。なお、図４の相対活性（％）は以下の計算により算出した。（１）各温度３０分静置後のプロテアーゼ活性値と、静置前のプロテアーゼ活性値から、静置後のプロテアーゼ活性の残存値（％）を算出した。（２）残存値のもっとも高かった温度の残存値を１００として、その他の温度の残存値の相対値（＝図４における相対活性（％））を算出した。精製酵素のプロテアーゼ活性は、０〜３０℃において、安定性を示した。
【０１０６】
（プロテアーゼ阻害剤の影響）
精製酵素のプロテアーゼ活性に対するグリコールエーテルジアミン四酢酸（ＥＧＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、Ｎ−トシル−Ｌ−フェニルアラニンクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）、フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、ヨードアセトアミド（ＩＡＡ）、フルオロリン酸ジイソプロピル（ＤＩＦＰ）の影響を評価した。反応液は、０．２Ｍ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨバッファー（ｐＨ８．２，３７℃）  １２５μＬと０．１Ｍ  ＣａＣｌ２２Ｈ２Ｏ  ２．５μＬとを混合し、各阻害剤溶液を終濃度が０．１〜５ｍＭとなるように添加し、酵素液を１０μＬ加えて、全量２００μＬとなるように蒸留水を加えた。阻害剤存在下で３７℃、５分間（阻害剤としてＩＡＡを添加したときは３０分間）予備加温した後、基質であるアゾカゼインを加え３７℃で５分酵素反応を行った。
【０１０７】
結果を図５に示す。ＥＧＴＡ又はＥＤＴＡ存在下での相対活性が０％と完全に阻害されていたことから、精製酵素はＣａ２＋要求性であると考えられた。また、ＴＰＣＫ又はＰＭＳＦ存在下での相対活性が０〜３５％と大きく阻害されていたことから、精製酵素は活性部位にセリンが関与しているセリンプロテアーゼであると推察された。
【０１０８】
（金属イオン要求性）
精製酵素のプロテアーゼ活性に対する金属イオンの影響を評価した。反応液は、上記「（反応最適温度）」で示した組成のものを用い、各金属イオンを１ｍＭとなるように添加した。酵素反応は、３７℃で５分行った。
【０１０９】
結果を図６に示す。Ｃａ２＋存在下において最も高い相対活性を示したことから、精製酵素は、Ｃａ２＋要求性であることが確認された。
【０１１０】
［実施例５］ＰＬＡ分解酵素によるＰＬＡ分解活性試験
（ハロー試験）
乳化ＰＬＡ５５ｍＬを２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８．０）  ４５ｍＬに溶かし、スキムミルクを０．１％（ｗ／ｖ）添加し、蒸留水で１００ｍＬにメスアップした。これに寒天末を１．５％添加して、ＰＬＡ分解酵素用の乳化ＰＬＡ寒天培地とした。前記のように調製した乳化ＰＬＡ寒天培地に、２４９Ｕ／ｍｇの精製酵素液を２μＬ添加し、２５℃で１日インキュベートした。その後、寒天培地上に形成されたハローの大きさを測定した。
【０１１１】
結果を表７に示す。いずれのＰＬＡでもハローが形成されたことから、精製酵素でもＰＬＡが分解されることが確認された。
【０１１２】
【表７】
2018138013.tif 000008
【０１１３】
（ＰＬＡからの乳酸放出の評価）
バイロエコール  ＢＥ−４００を乳化した乳化ＰＬＡに、Ｚ１５３−３株培養液又は精製酵素液を添加し、スキムミルクを０．１％となるように加えて、３７℃で１時間インキュベートした。その後、反応液中のＬ−乳酸の濃度を測定した。Ｚ１５３−３株及び精製酵素により生成されたＬ−乳酸濃度は、これらの反応液中のＬ−乳酸濃度から、コントロール（乳化ＰＬＡ＋蒸留水）の反応液中のＬ−乳酸濃度を差し引くことにより求めた。
その結果、Ｚ１５３−３株及び精製酵素により、それぞれ２．８ｍｇ／ｍＬ及び３．７ｍｇ／ｍＬのＬ−乳酸が生成した。
【０１１４】
［実施例６］ＰＬＡ分解酵素遺伝子のクローニング
（Ｚ１５３−３株のゲノムＤＮＡライブラリ作製）
Ｚ１５３−３株のゲノムＤＮＡを抽出し、Ｉｏｎ  ｓｈｅａｒ  ｐｌｕｓ  ｅｎｚｙｍｅ  ｍｉｘ（ThermoFisher SCIENTIFIC）を用いて、２００ｂｐ程度に断片化した。調製したＤＮＡフラグメントの両末端に、２種類のＤＮＡアダプタープライマーをライゲーションさせ、ポリメラーゼを用いたニックトランスレーションを行うことにより、ライブラリを調整した。さらに、ＤＮＡ長を均一にするために、Ｅ−Ｇｅｌ（登録商標）  ｉＢａｓｅＴＭ（ThermoFisher SCIENTIFIC）を用いて電気泳動を行い、約２００ｂｐの長さの断片を回収した。
【０１１５】
（Ｚ１５３−３株のゲノムＤＮＡのシーケンシング）
上記で調製したＤＮＡライブラリをＩｏｎ  ＯｎｅＴｏｕｃｈＴＭ  ２  Ｓｙｓｔｅｍ（ThermoFisher SCIENTIFIC）を用いて、エマルジョンＰＣＲを行った。次に、Ｉｏｎ  ＯｎｅＴｏｕｃｈＴＭＥＳを用いて、ライブラリのエンリッチメントを行った。その後、Ｉｏｎ  ＰＧＭ（登録商標）システム（ThermoFisher SCIENTIFIC）を使用して、次世代シーケンシングによりゲノムＤＮＡの配列解析を行った。シーケンシング結果をｇｅｔ  ｏｒｆで解析したところ、ＯＲＦ数は６２７と推定された。
【０１１６】
（ＰＬＡ分解酵素遺伝子の配列解析）
【０１１７】
実施例３で精製した精製酵素について、プロテインシーケンサー  Ｐｒｏｃｉｓｅ  ４９４  ＨＴ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Applied Biosystems）によりＮ末端アミノ酸配列解析を行ったところ、Ｎ末端アミノ酸配列として、以下のアミノ酸配列が得られた。
ATGTTVLGTS(配列番号５)
【０１１８】
また、精製酵素について、ＬＣ／ＭＳ解析により内部アミノ酸配列を解析したところ、以下の内部アミノ酸配列が得られた。なお、内部アミノ酸配列解析に使用した装置等は以下のとおりである。
＜内部アミノ酸配列解析に使用した装置＞
メーカー（Waters Corp., Milford, MA, USA）
ＵＰＬＣシステム：ｎａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ（登録商標）  ｓｙｓｔｅｍ
分析カラム：ｎａｎｏ  ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ（登録商標）  ＢＥＨ１３０
Ｃ１８  ｃｏｌｕｍｎ（７５μｍ×１５０ｍｍ，１．７μｍ）
質量分析装置：Ｘｅｖｏ  ＱＴＯＦ  ＭＳ
解析ソフト：ＰｒｏｔｅｉｎＬｙｎｘ  Ｇｌｏｂａｌ  ＳＥＲＶＥＲ，
ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．３
【０１１９】
＜内部アミノ酸配列＞
AAYLLGNGGTFYNVSVTGIGVPK（配列番号６）
AAVVQSAKDLYGSTSAEATAAAK（配列番号７）
ALNVYLTPNSNFSSLR（配列番号８）
DLYGSTSAEATAAAK（配列番号９）
SMSNPAAYGDPDHYSK（配列番号１０）
YTGTQDNGGVHINSGIINK（配列番号１１）
SFDAVGVY（配列番号１２）
LGAIYYR（配列番号１３）
SMSNPAAYGDPDHYSKR（配列番号１４）
YTGTQDNGGVHINSGIINK（配列番号１５）
ALNVYLTPNSNFSSLR（配列番号１６）
RYTGTQDNGGVHINSGIINK（配列番号１７）
SVNEVGANGTGFF（配列番号１８）
TSPVDFISGPSVGSTSLSFANEK（配列番号１９）
【０１２０】
上記のＮ末端アミノ酸配列及び内部アミノ酸配列について、Ｚ１５３−３株のゲノムＤＮＡ配列解析で推定されたＯＲＦ配列を検索したところ、１４９４ｂｐの塩基配列（配列番号１）を有するＯＲＦが同定された。当該塩基配列にコードされるアミノ酸配列（配列番号２）は、１〜２１番目のアミノ酸配列がシグナルぺペプチド、２２〜１８８番目のアミノ酸配列がプロ配列であると推定された。そのため、精製酵素の成熟タンパク質は、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなり、配列番号３に記載の塩基配列によりコードされる。また、ＢＬＡＳＴ検索を行ったところ、配列番号２に記載のアミノ酸配列は、イグジオバクテリウム・エンクレンス（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｎｃｌｅｎｓｅ）のバシロリシン（Ｂａｃｉｌｌｏｌｙｓｉｎ）と１００％一致した。
【産業上の利用可能性】
【０１２１】
本発明によれば、常温付近でＰＬＡを効率よく分解可能な技術が提供される。本発明にかかるＰＬＡ分解方法及びＰＬＡ分解剤は、ＰＬＡを含む廃棄物の処理ならびにＰＬＡのバイオリサイクルなどに幅広く利用することができる。
【図１】
2018138013.tif 000009
【図２】
2018138013.tif 000010
【図３】
2018138013.tif 000011
【図４】
2018138013.tif 000012
【図５】
2018138013.tif 000013
【図６】
2018138013.tif 000014
【配列表】
2018138013000001.app