(57)【要約】      （修正有）【課題】インビトロおよびインビボにおいて、薬剤と同様の安定性を有するペプチドを製造する方法、およびスクリーニングする方法を提供する。【解決手段】酵素耐性について選択することによって、広い範囲のプロテアーゼに対して安定であるのみならず、チトクローム４５０などの薬剤処理酵素に対しても安定であるペプチドを誘導することができる。この方法によって、治療薬あるいは診断薬のための高度に安定化したペプチドの迅速な開発が可能となる。ペプチドは、経口アベイラビリティのためにさらに修飾される。この方法はまた、治療用組成物を作成するための同様のペプチドにも応用できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のいずれかのアミノ酸配列を含む非天然型ペプチド：
ａ）ＭＡＸＹＸＨＹＨＫ（ここで、３位および５位のＸは、Ｎ−メチルノルバリンである）；または
ｄ）ＭＶＣＸＸＬＹＤＤＫ（ここで、４位および５位のＸは、Ｎ−メチルノルバリンである）。
【請求項２】
ペプチドがＮ末端またはＣ末端でビオチン化されている、請求項１に記載の非天然型ペプチド。
【請求項３】
ペプチドがポリエチレングリコールまたは脂質分子にコンジュゲートされている、請求項１または２に記載の非天然型ペプチドを含むペプチドコンジュゲート。
【請求項４】
請求項１または２に記載の非天然型ペプチドまたは請求項３に記載のペプチドコンジュゲートと担体とを含む組成物。
【請求項５】
担体が医薬上許容され得る担体である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
請求項４または５記載の組成物であって、ＨＥＲ２＋乳がん細胞の成長を阻害するための組成物。
【請求項７】
請求項４または５記載の組成物であって、ＨＥＲ２＋乳がんの処置を必要とする対象におけるＨＥＲ２＋乳がんを処置するための組成物。
【請求項８】
対象におけるＨＥＲ２＋乳がん細胞を検出するための請求項３記載のコンジュゲートまたは請求項４または５記載の組成物であって、対象に投与し、対象中のＨＥＲ２＋乳がん細胞に結合したペプチドの存在に関してスクリーニングするための、組成物。
【請求項９】
請求項１または２に記載の非天然型ペプチド、または請求項３に記載のコンジュゲートを検出可能に標識して含む、対象におけるＨＥＲ２＋乳がん細胞を検出するための組成物。
【請求項１０】
標識が蛍光色素またはＰＥＴ標識である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
上記請求項１に記載の非天然型ペプチドをコードする単離核酸であって、Ｎ−メチルノルバリンが、終止コドンによってコードされる、単離核酸。
【請求項１２】
請求項１記載の非天然型ペプチドを生産するための方法であって、
ウサギ網状赤血球溶解物中で、該ペプチドをコードする単離された核酸を翻訳する工程を含み、
該溶解物に、Ｎ−メチルノルバリンでチャージされたサプレッサーｔＲＮＡが補充されており、そして、
Ｎ−メチルノルバリンが、該サプレッサーｔＲＮＡに相補的な終止コドンによりコードされている、
生産するための方法。
【請求項１３】
前記溶解物から非天然型ペプチドを単離することをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
候補薬剤がＨＥＲ２＋乳がん細胞の成長を阻害するための潜在的治療薬であるかどうかを決定するための方法であって、候補薬剤を乳がん細胞と接触させること、および成長阻害活性に関してアッセイすること、および候補薬剤の阻害活性を、請求項１記載の非天然型ペプチドの阻害活性と比較することを含む、方法。
【請求項１５】
乳がん細胞の成長を阻害すること、または乳がんを処置すること、あるいは候補薬剤ががん細胞の成長を阻害するための潜在的治療薬であるかどうかを決定することの１つ以上のためのキットであって、請求項１記載の非天然型ペプチド、および使用説明書とを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下に、それぞれ２０１１年９月１日に出願された米国仮特許出願第６１／５３０，３２７号、同第６１／５３０，３５２号および同第６１／５３０，３７２号に基づく利益を主張し、前記各出願の内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
［連邦政府の後援による研究または開発に関する陳述］
本発明は米国国立衛生研究所助成金番号Ｒ０１ＧＭ６０４１６の下に政府の支援を受けてなされた。したがって米国政府は本発明に対して一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
細胞機能ならびに疾患病理学の理解が増進すると、新しい治療薬および診断試薬を開発するためのターゲットになりうるものが数多く得られる。この細胞に関する知識を処置に転換する際の一般的な課題は、多くの潜在的ターゲットが、機能上、新薬の開発にはつながりえないということである。Ｈｏｐｋｉｎｓら（２００２）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ
Ｄｉｓｃｏｖ．１：７２７（非特許文献１）。それゆえに、細胞機能を制御するタンパク質−タンパク質相互作用の多くについては、それを調整することができる低分子を開発することができない。
【０００４】
モノクローナル抗体はターゲットタンパク質表面への重要な経路を与え、承認された治療薬の大部分を占めると共にその割合はさらに増えつつある。Ｎｅｌｓｏｎら（２００９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２７：３３１（非特許文献２）。しかし抗体は生産と投薬に費用がかかり、投与と品質管理が困難であり、中和免疫応答を生じる場合があり、細胞内タンパク質をターゲットとするためには使用することができない。Ｃｈｏら（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：１５３（非特許文献３）。このような厄介な分子が治療用タンパク質結合試薬の多くを占めるという事実は、これらの試薬の重要性の証拠であると共に、実用的な代用物を見つけることに我々が絶望している証拠でもある。
【０００５】
ペプチドは、このタイプのリガンドを開発するための魅力的な代替経路になる。シクロスポリンなどの非リボソームタンパク質は、ＤＮＡがコードする２０種類の一般的残基以外のアミノ酸も組み込まれているペプチド化合物である。これらの分子は細胞内タンパク質−タンパク質相互作用（ＰＰＩ）を調整する能力を有し、経口バイオアベイラビリティを呈する。しかし、天然物を探索することによって導き出された治療用分子の数は限られている。Ｈｏ，Ｓ．ら（１９９６）Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．８０：Ｓ４０（非特許文献４）；Ｂａｕｍａｎｎら（１９９４）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．３：７５０（非特許文献５）、およびＤｅ  Ｌａ  Ｃｒｕｚら（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３５：１４０５４（非特許文献６）。
【０００６】
ｍＲＮＡディスプレイやファージディスプレイなどの選択方法は、極めて多様なタンパク質相互作用について、ＰＰＩに結合してそれを調整することができるペプチドリガンドを作製する能力を持つことが示されている。Ｊａら（２００４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３：９２６５（非特許文献７）；Ｊａら（２００６）ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１：５７０（非特許文献８）；およびＭｉｌｌｗａｒｄら（２００７）ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２：６２５（非特許文献９）。しかし、これらのペプチドには、主にタンパク質分解のせいで、バイオアベイラビリティが低いという難点がある。
【０００７】
ペプチド薬物療法およびペプチド薬物開発のための、より伝統的なアプローチには、リード分子の生成と、それに続く広範な医薬的実験とが必要である。現時点において最新の戦略には、ヘリックスステープリング、ペプトイド合成、β−ペプチド生成、およびＮ−メチル組み込みなどがある。Ｆｉａｃｃｏ，Ｓ．Ｖ．およびＲｏｂｅｒｔｓ，Ｒ．Ｗ．（２００８）ＣｈｅｍＢｉｏ  Ｃｈｅｍ  ９：２２００；Ｗａｌｅｎｓｋｙら（２００４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０５：１４６６；Ｍｉｌｌｅｒら（１９９４）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４：２６５７；およびＮｇｕｙｅｎ，Ｊ．Ｔ．ら（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：２０８８（非特許文献１０〜１３）。しかし、これらの技法は非常に労働集約的であり、数年を要することも多く、成功の保証はない。得られた生成物は、往々にして、機能、特異性、またはその両方の喪失を呈する。
【０００８】
ペプチドを安定化し、ペプチドのプロテアーゼ安定性を強化しようとするこれまでの試みには、Ｎ−メチルアナログによる９つの位置のそれぞれの化学的スキャニングがある。９つの位置のうちの４つがプロテアーゼ耐性を強化したことから、単一のＮ−メチルが開裂結合の周囲に、保護のウインドウを設けることが示された。結果として得られるプロテアーゼ耐性は劇的であり、切断部位において７０倍から１０００倍以上にわたった。残念なことに、親分子と同じ結合特異性を保っていたのは、９個の置換体のうちの一つだけであり、それらの配列のうちの４つは機能を失い、４つは特異性が変化していて、元のターゲットｇαｉ１ではなく、関連タンパク質Ｇα１２に結合するようになっていた。興味深いことに、最もよいＧα１２結合性の修飾を２つ組み合わせると、機能の完全な喪失が起こった（Ｆｉａｃｃｏら（２００８），前出）。
【０００９】
もう一つのアプローチでは、非天然アミノ酸Ｎ−メチルフェニルアラニン（ＮＭＦ）を有する共有結合環状ｍＲＮＡディスプレイライブラリーが作られた。この研究により、環状ペプチドは抗体様のアフィニティを有しうること、および環化が安定性を改良することが明らかになった。しかし、プロテアーゼ耐性の増加はそれほど大きくはなく（２．６倍）、結果として得られた分子は非天然アミノ酸を欠いていた（Ｍｉｌｌｗａｒｄら（２００７）前出；Ｆｒａｎｋｅｌら（２００３）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０：１０４３およびＧｉｌｍｏｒｅら「Ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ」（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、ベルリン／ハイデルベルク）（１９９９）２０２：７７）（非特許文献１４〜１５）。加えて、Ｐｈｅは大きな残基であり、適合する位置はわずかしかないだろう。
【００１０】
したがって、天然ペプチドの安定性をインビトロでもインビボでも劇的に改良しつつ、その結合機能を保つスキームであって、任意の目的のターゲットに応用することができるものを考案し、それによって、一部のらせん構造にしか応用することができない前出のＷａｌｅｎｓｋｙら（２００４）に記載されているヘリックスステープリング法の制約を克服することが必要とされている。
【００１１】
未充足医療ニーズをターゲットとするための新しいアプローチも必要とされている。糖尿病はその一例である。糖尿病は２つのカテゴリーに分けることができる。１型糖尿病は、インスリンを作り出すことができない個体を特徴とする。この形態の糖尿病は膵β細胞塊の著しい喪失を特徴とする進行性疾患であり、インスリン分泌が損なわれることになる。損なわれたインスリン分泌は高血糖をもたらし、それは、処置せずに放置しておくと、ケトアシドーシスなどの重大な健康問題につながりうる。Ｉｙｅｒ，Ｈ．ら（２０１０）Ｄｉａｂｅｔｅｓ，Ｏｂｅｓｉｔｙ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  １２：１７９（非特許文献１６）。２型はインスリンを適正に利用できないことを特徴とする。長期間にわたる血糖の誤制御は、心不全、腎臓疾患、脳卒中、および手足の切断のリスクの増加につながる。Ｆｏｒｄ，Ｅ．Ｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｆｏｒｄ，Ｅ．Ｓ．（２０１１年７月８日）（非特許文献１７）。米国では、糖尿病である患者の９０％超が２型糖尿病を持つ。ウェブアドレス：ｄｉａｂｅｔｅｓ．ｗｅｂｍｄ．ｃｏｍ／ｇｕｉｄｅ／ｔｙｐｅで閲覧可能なＷｅｂＭｄ  ２０１１。現在、糖尿病は米国では死因の第７位である。ウェブアドレス：ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｄｉａｂｅｔｅｓ／ｐｕｂｓ／ｅｓｔｉｍａｔｅｓ１１．ｈｔｍｌで閲覧可能なＣｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ２０１１。
【００１２】
世界保健機関によれば、２０１１年現在、約２億２０００万人、すなわち世界人口の３．２％が糖尿病である。この数字は、２０３０年までに全世界人口の４．４％まで増加すると予想されている。Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｍ．ら（２００３）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ
Ｄｉｓｃｏｖ．２：２８９（非特許文献１８）。糖尿病は加齢と共に数が増え、６０歳を越えたアメリカ人では１８．３％（８６０万人）に達する（ウェブアドレス：ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｄｉａｂｅｔｅｓ／ｐｕｂｓ／ｅｓｔｉｍａｔｅｓ１１．ｈｔｍｌで閲覧可能なＣｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ２０１１）。
【００１３】
タンパク質−タンパク質相互作用をインビトロで制御することを目的とする、タンパク質表面に高いアフィニティおよび特異性で結合する能力を有するペプチドの開発には、かなりの前例がある。Ｊａ，Ｗ．ら（２００６）ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１：５７０；Ｋａｒａｔａｎ，Ｅ．ら（２００４）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １１：８３５；Ｆｕｈ，Ｇ．ら（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：２１４８６；ならびにＳｔｏｏｐ，Ａ．Ａ．およびＣｒａｉｋ，Ｃ．Ｓ．（２００３）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２１：１０６３（非特許文献１９〜２２）。しかし、それらを経口バイオアベイラブルな治療薬または細胞内ターゲットに到達することができる治療薬へと発展させることは、依然として、大変な難題である。これは、一つには、これらのタイプのリガンドが脂質二重層を横切る際に直面する本質的な困難によるものである。Ｍｏｒｒｉｓ，Ｍ．Ｃ．ら（２３００１）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １９：１１７３；Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｍ．およびＧｏｍｅｚ−Ｏｒｅｌｌａｎａ，Ｉ．（２００３）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．２：２８９（非特許文献２３〜２４）。細胞膜を横切って受動的に拡散すると考えられる薬学的に重要なペプチドリガンドには、シクロスポリン、アマニチン、およびファロイジンなどの例がある。Ｈｏ，Ｓ．ら（１９９６）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ８０：Ｓ４０；Ｂａｕｍａｎｎ，Ｋ．ら（１９９４）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．３：７５０；ならびにＤｅ  Ｌａ  Ｃｒｕｚ，Ｅ．Ｍ．およびＰｏｌｌａｒｄ，Ｔ．Ｄ．（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：１４０５４（非特許文献２５〜２７）。
【００１４】
現在行われている糖尿病の生物学的処置は、典型的には、さまざまなインスリン製品の注射が軸になっている。インスリンおよびインスリンアナログの販売は、２０１０年に、１５０億ドルを超える収入をもたらした。今のところ、ＦＤＡに承認されたインスリンの経口製剤はない。インスリン投与のための経口経路の開発は、便利だからというだけでなく、この投与経路の潜在的な健康上の利益からも、糖尿病を患う人々にとって大きな利益になるであろう。インスリンは、膵臓からの分泌後に、肝臓に移行してから、身体の残りの部分に分散していく。経口的に吸収された薬物はこれと同じ経路を辿るが、注射によって投与された薬物は違う。経口処置は、体重増加や低血糖などといったインスリン投与の有害副作用を軽減するであろうと推論される。Ｆｕｎｎｅｌｌ，Ｍ．Ｍ．（２００６）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ２４：１５４（非特許文献２８）。
【００１５】
糖尿病の効果的な処置は、低い患者コンプライアンスによっても妨げられる。現在、インスリンは、自己注射によって投与されている。経口バイオアベイラブルな薬物は患者コンプライアンスを強化するであろう。しかし、ペプチドリガンドなどの経口投与薬は、診断的または治療的に有効であるためには、ペプチドリガンドがそのターゲットに到達しなければならないという事実によって妨げられる。加えて、細胞内タンパク質は形質膜を横切らなくてはならず、バイオアベイラブルなペプチドは、そのターゲットに到達するために、腸粘膜を横断しなければならない。本発明は、当技術分野の現状の制約に対処するものである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｈｏｐｋｉｎｓら（２００２）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．１：７２７
【非特許文献２】Ｎｅｌｓｏｎら（２００９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２７：３３１
【非特許文献３】Ｃｈｏら（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：１５３
【非特許文献４】Ｈｏ，Ｓ．ら（１９９６）Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．８０：Ｓ４０
【非特許文献５】Ｂａｕｍａｎｎら（１９９４）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．３：７５０
【非特許文献６】Ｄｅ  Ｌａ  Ｃｒｕｚら（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３５：１４０５４
【非特許文献７】Ｊａら（２００４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３：９２６５
【非特許文献８】Ｊａら（２００６）ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１：５７０
【非特許文献９】；およびＭｉｌｌｗａｒｄら（２００７）ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２：６２５
【非特許文献１０】Ｆｉａｃｃｏ，Ｓ．Ｖ．およびＲｏｂｅｒｔｓ，Ｒ．Ｗ．（２００８）ＣｈｅｍＢｉｏ  Ｃｈｅｍ  ９：２２００
【非特許文献１１】Ｗａｌｅｎｓｋｙら（２００４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０５：１４６６
【非特許文献１２】Ｍｉｌｌｅｒら（１９９４）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４：２６５７
【非特許文献１３】Ｎｇｕｙｅｎ，Ｊ．Ｔ．ら（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：２０８８
【非特許文献１４】Ｆｒａｎｋｅｌら（２００３）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０：１０４３
【非特許文献１５】Ｇｉｌｍｏｒｅら「Ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ」（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、ベルリン／ハイデルベルク）（１９９９）２０２：７７）
【非特許文献１６】Ｉｙｅｒ，Ｈ．ら（２０１０）Ｄｉａｂｅｔｅｓ，Ｏｂｅｓｉｔｙ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  １２：１７９
【非特許文献１７】Ｆｏｒｄ，Ｅ．Ｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｆｏｒｄ，Ｅ．Ｓ．（２０１１年７月８日）
【非特許文献１８】Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｍ．ら（２００３）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．２：２８９（非特許文献１８）
【非特許文献１９】Ｊａ，Ｗ．ら（２００６）ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１：５７０
【非特許文献２０】；Ｋａｒａｔａｎ，Ｅ．ら（２００４）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １１：８３５
【非特許文献２１】Ｆｕｈ，Ｇ．ら（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：２１４８６
【非特許文献２２】Ｓｔｏｏｐ，Ａ．Ａ．およびＣｒａｉｋ，Ｃ．Ｓ．（２００３）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２１：１０６３
【非特許文献２３】Ｍｏｒｒｉｓ，Ｍ．Ｃ．ら（２３００１）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １９：１１７３；Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｍ．
【非特許文献２４】Ｇｏｍｅｚ−Ｏｒｅｌｌａｎａ，Ｉ．（２００３）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．２：２８９
【非特許文献２５】Ｈｏ，Ｓ．ら（１９９６）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ８０：Ｓ４０；
【非特許文献２６】Ｂａｕｍａｎｎ，Ｋ．ら（１９９４）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．３：７５０
【非特許文献２７】Ｄｅ  Ｌａ  Ｃｒｕｚ，Ｅ．Ｍ．およびＰｏｌｌａｒｄ，Ｔ．Ｄ．（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：１４０５４
【非特許文献２８】Ｆｕｎｎｅｌｌ，Ｍ．Ｍ．（２００６）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ２４：１５４
【発明の概要】
【００１７】
一態様において、出願人は、核酸のライブラリーから１つ以上の安定かつバイオアベイラブルなペプチドをコードする１つ以上の核酸を選択するための方法であって、核酸ライブラリーから安定かつバイオアベイラブルなペプチド（複数も可）をコードする１つ以上の核酸を選択すること、を含むか、あるいは、から本質的になるか、さらにまたは、からなり、核酸ライブラリーの１つ以上のメンバーが、１つ以上の非天然アミノ酸および／または天然のコグネイトｔＲＮＡを欠くコドンを含有する、方法を提供する。
【００１８】
もう一つの態様において、本発明は、二次構造を有する１つ以上のペプチドを選択するための方法を提供する。この方法は、ペプチドのライブラリーを作成するステップと、そのライブラリーを１つ以上のプロテアーゼで処理することによってそのライブラリーから個々の配列を選択するステップと、を含むか、あるいは、から本質的になるか、さらにまたは、からなり、それによって二次構造を有する１つ以上のペプチドに関して選択する。一態様では、核酸がＲＮＡであり、かつ／またはライブラリーがＲＮＡライブラリーである。さらなる一態様において、本方法は、終止コドンを抑制するためにアミノ酸を含む１つ以上のｔＲＮＡをライブラリーに補足することを、さらに含む。ｍＲＮＡライブラリーのメンバーは直線状および／または環状である。
【００１９】
もう一つの態様では、ペプチド（複数も可）をコードする１つ以上の核酸を調製するための方法であって、予め決定された特異性に関して選択されたペプチドのライブラリーを、安定性を付加するアミノ酸が組み込まれるように変異させるステップ；１つ以上の終止コドンを組み込むステップ；終止コドンを抑制するために所望のアミノ酸がチャージされたｔＲＮＡを補足するステップ；核ライブラリーの個々の配列の１つ以上を環化するステップ；プロテアーゼ耐性に関してライブラリーの個々の配列を選択するステップを含み、それによって１つ以上のペプチドをコードする１つ以上の核酸に関して選択する方法が提供される。一態様では、核酸ライブラリーがＤＮＡライブラリーまたはＲＮＡライブラリーである。一態様において、本方法は、１つ以上の核酸をペプチドに翻訳することを、さらに含む。さらなる一態様において、本方法は、ペプチドをビオチン分子またはビオチンアナログに結合を介してコンジュゲートすることを、さらに含む。ビオチン分子またはビオチンアナログの非限定的な例は、還元可能なビオチン分子；ペプチドのリジンの側鎖上のビオチン；アミド結合またはエステル結合を介してペプチドに連結されたビオチン、チオエステル結合またはエステル結合を介してペプチドに連結されたビオチンの１つ以上である。本方法のさらなる一態様では、核酸が単離される。核酸は、場合によっては、コードされているペプチドまたはタンパク質に翻訳され、さらに単離される。単離された分子も、本発明によって提供される。
【００２０】
ペプチドは一般にインビボでは安定性およびバイオアベイラビリティが低い。ここに出願人は、ｍＲＮＡライブラリーから個々の配列を選択することによって、１つ以上の安定かつバイオアベイラブルなペプチドをコードする１つ以上のＲＮＡを調製するための方法であって、ライブラリーが、予め決定された特異性および安定性に関して選択されたペプチドを含有し、それによって、１つ以上の安定かつバイオアベイラブルなペプチドをコードする１つ以上のＲＮＡに関して選択する方法を提供する。一態様では、ＲＮＡライブラリーの１つ以上のメンバーが、１つ以上の終止コドンを有する。もう一つの態様において、本方法は、終止コドンを抑制するために、所望のアミノ酸（複数も可）がチャージされた１つ以上のｔＲＮＡをライブラリーに補足することを、さらに含む。もう一つの態様では、ｍＲＮＡライブラリーの１つ以上のメンバーが直鎖状または環状である。一態様では、ｍＲＮＡライブラリーの１つ以上のメンバーが、安定性を付与する単一のアミノ酸、例えばＮ−メチルアミノ酸、ＡＩＢ、Ｄ−アミノ酸もしくはベータ（β）アミノ酸、またはインビトロおよびインビボで薬物様の安定性を呈する機能的ペプチドが誘導されるような形で側鎖にユニークな官能性を付与するものを有する。例えばカスパーゼ、エンドペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ、トリプシン、トロンビン、ペプシン、キモトリプシンに対する耐性およびプロテイナーゼｋ耐性などといったプロテアーゼ耐性を選択することにより、出願人は、広範囲なプロテアーゼに対して安定であるばかりでなく、他の薬物処理酵素、例えばシトクロムＰ４５０などに対しても安定なペプチドを誘導することができる。加えて、簡単な修飾により、インビボ半減期のかなりの増加、ならびにかなりの経口バイオアベイラビリティが得られる。このアプローチは、治療法の開発および診断のための高度に安定なペプチドを迅速に開発するための一般的方法を提供する。
【００２１】
一態様では、ＤＮＡレベルで、ライブラリーが、野生型アミノ酸、またはペプチドに安定性を付与するアミノ酸、例えばＮ−メチルアミノ酸、ＡＩＢ、Ｄ−アミノ酸またはベータ（β）アミノ酸の１つ以上、または側鎖にユニークな官能性を付与するものをコードするように設計される。そうする際に、他のアミノ酸が副産物としてコードされる。これは、ライブラリーの多様性をもたらす。ＤＮＡライブラリーは、場合によっては、５’端にメチオニン（Ｍｅｔ）をコードするコドン、および３’端にリジン（Ｌｙｓ）をコードするコドンも有する。そこから先は典型的なｍＲＮＡディスプレイ設計を使用することができる。リジンは環化にも使用することができる。配列内の終止コドン、例えば終止コドンＵＡＧを抑制するために、Ｎ−メチルアミノ酸で化学的にアシル化された（チャージされた）ｔＲＮＡが設計される。これは、典型的な翻訳混合物（例えばウサギ網状赤血球溶解物）に、補足される。
【００２２】
安定化されたペプチド（融合物と呼ばれる、それらをコードするｍＲＮＡに化学的に連結されたペプチド）に関して、追加の選択圧を適用することができる。翻訳産物をプロテアーゼ分解、例えば固定化精製プロテアーゼ、プロテイナーゼＫ、キモトリプシン、アミノペプチダーゼ、およびトリプシンに付す。タンパク質分解後に、プロテアーゼは、濾過によって融合物から除去することができる。
【００２３】
さらなる選択圧を適用することができる。例えば選択は、Ｈｅｒ−２などのタンパク質を過剰発現するがん患者からのヒト細胞に対して行うことができる。この例では、ターゲットは、疾患状態に関連する翻訳後修飾を受けたヒトタンパク質である。これは著しい技術的進歩である。なぜなら、本方法およびその使用によって選択されたペプチドは、疾患状態における翻訳後修飾を含有するタンパク質、および過剰発現または精製が困難なタンパク質のターゲティングを可能にするからである。
【００２４】
選択を必要とする上記の方法のそれぞれについて、本発明は、いくつかの選択方法を提供する。非限定的な方法として、細胞表面タンパク質に対する選択；哺乳動物細胞培養または組織に対する選択；精製タンパク質ターゲットに対する選択；ＳＵＰＲターゲットである精製タンパク質ターゲットに対する選択；インビボ治療有用性、例えばがん細胞の成長を阻害するかがん細胞を殺す能力、前がん細胞を阻害するか殺す能力、または所望のターゲット受容体を発現する細胞に結合する能力の１つ以上に関する選択が挙げられる。
【００２５】
一態様において、本開示は、本明細書に記載する方法によって調製された単離ＲＮＡライブラリー、または上記の方法によって調製された単離ペプチドライブラリーも提供する。もう一つの態様において、本開示は、本明細書に記載の方法によって調製された単離ペプチドを提供する。
【００２６】
ライブラリー、ペプチドおよび核酸は、担体、例えば医薬上許容され得る担体と組み合わせることができる。
【００２７】
この開示は、以下の群のアミノ酸配列を含む非天然型ペプチドも提供する：１）ＭＡＶＹＶＨＹＨＫ、ここで、１番目はＭｅｔ、ノルバリン、アラニン、またはノルロイシンから選択される；２番目はＡｌａまたはＶ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｑ、Ｎ、Ｌ、Ｖ、またはＩから選択される；３番目はＮ−メチルノルバリン、Ｓ、Ｔ、Ｑ、Ｎ、Ｈ、Ｐ、Ｉ、Ｖ、Ｌ、Ｙ、Ｆ、またはＰから選択される；４番目はＴｙｒ、Ｖ、Ｙ、Ｆ、Ｑ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、またはＨから選択される；５番目はＮ−メチルノルバリン、Ｙ、Ｆ、Ｓ、Ｔ、Ｅ、Ｄ、Ｍ、Ａ、またはＰから選択される；６番目はＨｉｓ、Ｖ、Ｙ、Ｆ、Ｑ、またはＮから選択される；７番目はＨｉｓ、Ｖ、Ｆ、Ｙ、Ｖ、Ｉ、またはＬから選択される；８番目はＨｉｓまたは任意のアミノ酸から選択される；そして９番目はＬｙｓまたはリジン誘導体、例えばＯｒｎから選択される；２）ＭＦＶＱＶＹＹＨＫ、ここで、１番目はＭｅｔ、ノルバリン、ノルロイシン、またはアラニンから選択される；２番目はＰｈｅまたは任意のアミノ酸から選択される；３番目はＮ−メチルノルバリン、Ｑ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｈ、Ｙ、Ｆ、またはＰから選択される；４番目はＧｌｎ、Ｙ、Ｆ、Ｖ、Ｐ、Ｓ、またはＴから選択される；５番目はＮ−メチルノルバリン、Ｙ、Ｆ、Ｓ、Ｔ、Ｄ、Ｅ、Ａ、またはＭから選択される；６番目はＴｙｒ、Ｆ、またはＨから選択される；７番目はＴｙｒ、Ｆ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｓ、Ｔ、またはＶから選択される；８番目はＨｉｓ、Ｔ、またはＳから選択される；９番目はＬｙｓまたはリジン誘導体、例えばＯｒｎから選択される；３）ＭＬＨＹＶＹＶＲＫ、ここで、１番目はＭｅｔ、ノルバリン、ノルロイシン、またはラニン（ｌａｎｉｎｅ）から選択される；２番目はＬｅｕ、Ｉ、またはＶから選択される；３番目はＨｉｓ、Ｙ、またはＦから選択される；４番目はＴｙｒまたはＦから選択される；５番目はＮ−メチルノルバリン、Ｓ、Ｔ、Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｍ、またはＰから選択される；６番目はＴｙｒ、Ｈ、Ｑ、Ｎ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、またはＶから選択される；７番目はＮ−メチルノルバリン、Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｈ、またはＰから選択される；８番目はＡｒｇまたは任意のアミノ酸から選択される；９番目はＬｙｓまたはリジン誘導体、例えばＯｒｎから選択される；４）ＭＶＣＶＶＬＹＤＤＫ、ここで、１番目はＭｅｔ、ノルバリン、ノルロイシン、またはアラニンから選択される；２番目はＶａｌ、Ｉ、またはＬから選択される；３番目はＣｙｓから選択される；４番目はＮ−メチルノルバリン、Ｙ、Ｆ、Ｐ、Ｄ、Ｅ、またはＭから選択される；５番目はＮ−メチルノルバリン、Ｙ、Ｆ、Ｄ，Ｅ、Ｗ、Ｃ、Ｇ、またはＰから選択される；６番目はＬｅｕ、Ｙ、Ｆ、Ｖ、Ｖ、Ｉ、Ｐ、またはＣから選択される；７番目はＴｙｒ、Ｖ、Ｅ、またはＤから選択される；８番目はＡｓｐ、Ｓ、Ｔ、Ｅ、Ｙ、Ｆ、Ａ、Ｐ、またはＶから選択される；９番目はＡｓｐ、Ｅ、Ｇ、Ｌ、Ｉ、またはＶから選択される；１０番目はＬｙｓまたはリジン誘導体、例えばＯｒｎから選択される；５）ＭＥＶＹＥＹＶＳＬＫ、ここで、１番目はＭｅｔ、ノルバリン、ノルロイシン、またはアラニンから選択される；２番目はＧｌｕまたは任意のアミノ酸から選択される；３番目はＮ−メチルノルバリン、Ｐ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｑ、またはＮから選択される；４番目はＴｙｒ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｖ、またはＰから選択される；５番目はＧｌｕ、Ｄ、Ｙ、Ｆ、Ｐ、またはＶから選択される；６番目はＴｙｒ、Ｆ、Ｌ、Ｖ、Ｉ、Ｐ、またはＶから選択される；７番目はＮ−メチルノルバリン、Ｆ、Ｌ、Ｖ、Ｉ、Ｐ、またはＶから選択される；８番目はＳｅｒまたは他の任意のアミノ酸から選択される；９番目はＬｅｕまたは他の任意のアミノ酸から選択される；１０番目はＬｙｓまたはリジン誘導体、例えばＯｒｎから選択される；６）ＭＮＥＹＶＬＹＶＬＫ、ここで、１番目はＭｅｔ、ノルバリン、ノルロイシン、またはアラニンから選択される；２番目はＡｓｎまたは任意のアミノ酸から選択される；３番目はＧｌｕ、Ｄ、Ｉ、Ｖ、Ｌ、Ｆ、Ｙ、Ｐ、またはＶから選択される；４番目はＴｙｒ、Ｄ、Ｅ、Ｐ、またはＶから選択される；５番目はＮ−メチルノルバリン、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｙ、Ｇ、Ｃ、またはＰから選択される；６番目はＬｅｕ、Ｙ、Ｆ、Ｐ、またはＶから選択される；７番目はＴｙｒ、Ｆ、Ｖ、Ｉ、またはＬから選択される；８番目はＮ−メチルノルバリン、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｆ、Ｅ、Ｄ、Ａ、またはＰから選択される；９番目はＬｅｕ、Ｋ、Ｒ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｓ、またはＴから選択される；１０番目はＬｙｓまたはリジン誘導体、例えばＯｒｎから選択される；
上記のそれぞれにおいて、Ｖは、Ｎ−メチルアミノ酸またはペプチドに安定化を付与する任意の修飾アミノ酸である。
【００２８】
上記の非天然型ペプチドを含有するペプチドコンジュゲート、宿主細胞ならびにこれらのペプチド、ポリヌクレオチド、コンジュゲートおよび／または宿主細胞の１つ以上を含有する組成物も開示する。ペプチドをコードするポリヌクレオチド、それらを含有するベクターおよび宿主細胞、ならびにペプチド、ペプチドコンジュゲート、宿主細胞、ポリヌクレオチド、ベクターの任意の１つ以上を単独でまたは互いに組み合わせて含有する組成物も開示する。上記はいずれも、医薬上許容され得る担体などの担体を含む組成物に製剤化することができる。一態様において、ペプチドがＨｅｒ−２受容体をターゲティングする場合、そのペプチドを含有する組成物は、インビトロまたはインビボで乳がん細胞の成長を阻害するのに役立つ。一態様では、接触がインビボであり、組成物の治療有効量が投与される。さらなる一態様では、患者がＨｅｒ−２＋患者である。
【００２９】
この開示は、ペプチドおよびタンパク質（一態様では本明細書に記載するペプチド）に、細胞膜を通過するそれらの送達を容易にすると共に経口取り込みを容易にするために組み込むことができる、簡単で無毒性なペプチド修飾も提供する。一態様では、ペプチドが、バイオアベイラビリティの最大２桁の強化をもたらすことが見いだされたＮ末端またはＣ末端ビオチン化を含む。ペプチドは、場合によっては、ターゲットへの送達を強化するために、ビオチンとペプチドとの間にジスルフィドも含む。この修飾により、哺乳動物細胞におけるペプチドカーゴの効率的な送達、ならびに安定なペプチド、例えばインスリンの経口送達の著しい増加が可能になった。
【００３０】
したがって、一態様において本開示は、Ｎ末端および／またはＣ末端で、ビオチン分子またはビオチンアナログに、ジスルフィド結合、エステル結合またはアミド結合を含む（ただしこれらに限るわけではない）リンカーを介して連結されたペプチド、を含むか、あるいは、から本質的になるか、さらにまたは、からなるペプチドコンジュゲートを提供する。一態様では、ビオチンが還元可能なビオチン分子である。考えうるビオチンアナログのさらなる例を本明細書に掲載する。
【００３１】
さらなる一態様では、ペプチドが、ペプチドのリジンの側鎖上のビオチンに連結される。この結合により、経口送達に適していてペプチドまたはタンパク質の細胞内送達を容易にするペプチドおよびタンパク質が得られる。
【００３２】
この開示は、乳がん細胞の成長を阻害するための方法であって、細胞を有効量の本明細書に記載する非天然型ペプチドまたはコンジュゲート、または本明細書記載の組成物と接触させることを含む方法も提供する。これらの組成物は、乳がんの処置を必要とする対象において、乳がんを処置するために使用することもできる。対象における乳がん細胞を検出するための方法であって、本明細書に記載する非天然型ペプチド、本明細書に記載するコンジュゲート、または本明細書に記載する組成物の１つ以上を対象に投与し、次に、対象中の乳がん細胞に結合したペプチドの存在に関してスクリーニングすることを含む方法が、さらに提供される。一態様では、投与される組成物が、例えば蛍光色素またはＰＥＴラベルなどで、検出可能に標識される。一態様では、ヒト患者がＨＥＲ２＋患者である。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１Ａ】図１Ａは、Ｎ−メチル環状ｍＲＮＡディスプレイの概略図である。図１Ａは、環状ＧＩＢＰ（本明細書では「ＧｉＢＰ」ともいう）からのＮ−メチルライブラリーの設計を示す。選択されたペプチドには枠で囲んだアミノ酸が見いだされた。
【００３４】
【図１Ｂ】図１Ｂは、Ｎ−メチル環状ｍＲＮＡディスプレイの概略図である。図１Ｂは、タンパク質分解を含む選択戦略を示す。
【００３５】
【図２】図２Ａ〜２Ｃは、例示的なスキャニング非天然プロテアーゼ耐性「ＳＵＰＲ」ペプチドである。図２Ａは選択されたペプチド配列を示す。図２ＢはｃｙｃＧＩＢＰの化学構造である。図２Ｃは例示的ＳＵＰＲペプチドの化学構造である。Ｎ−メチル組み込みの場所は明るいグレースケールで図解され、側鎖構造の変化は暗いグレースケールで示されている。
【００３６】
【図３】図３Ａ〜３Ｄは、ＳＵＰＲペプチドがｃｙｃＧＩＢＰの選択性を保っていたことを示している。ニュートラアビジン−アガロースを、（図３Ａ）Ｃ末端ビオチン化ｃｙｃＳＵＰＲまたは（図３Ｂ）Ｃ末端ビオチン化ｃｙｃＧＩＢＰで前処理し、さまざまな放射性標識Ｇαサブユニットをプルダウンするために使用した。結合はＧαｉ１結合に標準化されている。百分率値は３回の実験の平均を表し、誤差はＳＥＭで与えられている。図３Ｃ参照。ニュートラアビジン−アガロースを、Ｃ）Ｃ末端ビオチン化ｃｙｃＳＵＰＲペプチドまたは図３Ｄ）Ｃ末端標識ｃｙｃＧＩＢＰで前処理し、ＧＤＰ状態または活性ＧＴＰ（ＧＴＰγＳ）状態のＧαｉ１と共にインキュベートした。
【００３７】
【図４】図４Ａ〜４Ｆは、選択されたＳＵＰＲペプチドがタンパク質分解に対して耐性であることを示している。図４Ａは、予想されるキモトリプシン消化部位を配列の上の矢印で示している。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦで決定された実際の消化部位は配列の下に図示されている。図４Ｂは、キモトリプシン消化に関するｌｉｎＧＩＢＰ（▲）、ｃｙｃＧＩＢＰ（■）、ｌｉｎＳＵＰＲ（●）、およびｃｙｃＳＵＰＲ（◆）の半減期を示している。図４Ｃは、予想されるプロテイナーゼｋ消化部位を赤色で示している。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦで決定された実際の消化部位は青色で図示されている。図４Ｄは、プロテイナーゼＫ消化に関するｌｉｎＧＩＢＰ（▲）、ｃｙｃＧＩＢＰ（■）、ｌｉｎＳＵＰＲ（●）、およびｃｙｃＳＵＰＲ（◆）の半減期を示している。図４Ｅは、ｌｉｎＧＩＢＰ（▲）、ｃｙｃＧＩＢＰ（■）、ｌｉｎＳＵＰＲ（●）、およびｃｙｃＳＵＰＲ（◆）のヒト血清半減期を示す。図４Ｆは、ｌｉｎＧＩＢＰ（▲）、ｃｙｃＧＩＢＰ（■）、ｌｉｎＳＵＰＲ（●）、およびｃｙｃＳＵＰＲ（◆）の半減期に関して、ヒト肝ミクロソームに対する半減期安定性を示している。
【００３８】
【図５】図５Ａおよび５Ｂは、ｃｙｃＳＵＰＲにより、ＫｍとＫｃａｔの両方が最適化されたことを示している。図５Ａは、ｃｙｃＧＩＢＰ（●）、ｌｉｎＳＵＰＲ（◆）、およびｃｙｃＳＵＰＲ（■）のキモトリプシン消化に関するＶｍａｘである。データをより詳細に示すために、ｌｉｎＳＵＰＲおよびｃｙｃＳＵＰＲの拡大図が図に埋め込まれている。図５Ｂは、データをＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５．０で処理することによって導き出されたＫｍおよびＶｍａｘの値を示す表である。ｃｙｃＧＩＢＰと比較すると、ｃｙｃＳＵＰＲペプチドでは、プロテアーゼ耐性に関して、ＫｍとＶｍａｘがどちらも高度に最適化されている。
【００３９】
【図６】図６Ａおよび６Ｂは、ＳＵＰＲペプチドのインビボ安定性を図示している。図６Ａは、リジンの側鎖上にフルオレセインを有するＳＵＰＲペプチドの配列を示している。ＦＡ−ＳＵＰＲペプチドは追加の修飾が施されてＣ末端リジンの側鎖上にパルミトレイン酸を含んでいる。図６Ｂは、ｃｙｃＧＩＢＰ（▲）、ｌｉｎＳＵＰＲ（■）、ｃｙｃＳＵＰＲ（◆）、およびＦＡ−ｃｙｃＳＵＰＲ（●）のインビボ安定性を示している。Ｙ軸は、無傷の（未消化の）ペプチドの百分率を示す。
【００４０】
【図７】図７Ａおよび７Ｂは、ビオチン化およびパルミトレイン酸コンジュゲーションが経口バイオアベイラビリティを強化することを示している。図７Ａは、経口バイオアベイラビリティ百分率を、経口胃管栄養法によってマウスにビオチン化ペプチドを送り込んだ後の時間に対して示している。図７Ｂは、環状ペプチドとビオチン化環状ペプチドとパルミトレイン酸環状ペプチドの経口バイオアベイラビリティ百分率を対比して示している。図７Ａおよび７Ｂにおいて、データは２点の平均を表し、誤差は標準偏差として示されている。
【００４１】
【図８】図８は、Ｈｅｒ−２  Ｎ−メチルスキャニングライブラリーの設計を図解している。以前の研究（Ｐａｒｋ，Ｂ．ら（２０００）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １８：１９４、Ｎａｋａｊｉｍａ，Ｈ．ら（２００８）Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  １５：６５）により、Ｈｅｒ−２結合に使用されるモノクローナル抗体の残基が同定され、最適化されている。そこから、グレースケールで強調した残基を使って、ライブラリーを構築した。隣接ランダムアミノ酸を配列の両側に置いた。Ｍｅｔ−Ｌｙｓ環化も組み込んだ。Ｍｉｌｌｗａｒｄ，Ｓ．ら（２００７）ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２：６２５。
【００４２】
【図９】図９は、Ｈｅｒ−２  Ｎ−メチルライブラリー設計（９Ａ）および環状ＧＩＢＰからのＮ−メチルライブラリーの設計（９Ｂ）を図解している。最も優良だったペプチドには枠で囲んだアミノ酸が見いだされた。ＶはＮ−メチルノルバリンを表す。
【００４３】
【図１０】図１０は、Ｎ−メチルノルバリンの強化された翻訳効率を示している。Ｎ−メチルノルバリン（Ｎ−ＭｅＮｖａ）は、ＭＦＦＸＦＦテンプレート（ここでＸはＮ−メチルアミノ酸を表す）の環境において、Ｎ−メチルアラニン（ＮＭＡ）より約２倍効率よく翻訳される。Ｎ−メチルノルバリンの側鎖は、タンパク質−タンパク質結合ドメイン中に見いだされる主要アミノ酸であるメチオニンのアイソスターでもある。
【００４４】
【図１１】図１１Ａおよび１１ＢはＳＫＢＲ−３細胞上に発現したＨｅｒ−２の定量を示している。図１１Ａは、蛍光標識ＨＲＡＰがＳＫＢＲ−３細胞に結合していることを示している。成長培地、トリプシン溶液、および非機能的ペプチドは全てバックグラウンドのシグナルを示す。図１１Ｂは、２００，０００個の細胞が約１．５ｐｍｏｌのペプチドに結合することを示している。
【００４５】
【図１２】図１２Ａおよび１２Ｂは、それぞれの親分子からのペプチドの進化を示している。図１３Ａは、ハーセプチン抗体ループから採用されたペプチドがＭＸ８Ｋ環状ペプチドの環境に置かれ、先に図１で図解したようにランダム化されたことを示している。アミノ酸配列がその化学構造の上に示されている。Ｎ−メチルアミノ酸の挿入が赤色で強調され、他の変化は化学構造中に青色で示されている。図１２Ｂは、ＭＸ７Ｋ環状ペプチドの環境に置かれ、前述のようにランダム化された、オムニターグ抗体ループから採用されたペプチドを示している。アミノ酸配列がその化学構造の上に示されている。Ｎ−メチルアミノ酸の挿入が赤色で強調され、他の変化は化学構造中に青色で示されている。
【００４６】
【図１３】図１３は、ここに開示する方法によって作られたペプチドによる細胞増殖の阻害を示している。Ｈｅｒ−２陽性がん細胞（ＳＫＢＲ−３細胞、青色）の増殖に対する最大効果が示されている。１００−（％増殖）によって計算される阻害百分率。ＨｅＬａ細胞は、Ｈｅｒ−２過剰発現株ではないので、これを対照として使用している。
【００４７】
【図１４】図１４は、インビボ効力を示す選択されたペプチドを示している。個々のマウス曲線にラベルをつけてある。マウスには７ｍｇ／Ｋｇを静脈内投与によって週に３回投薬した。
【００４８】
【図１５】図１５は、ビオチン伝達ペプチドシャトリングの機序を示す案の概略図である。
【００４９】
【図１６】図１６は、ＰＡＭＰＡ  ｌｏｇ  Ｐｅ測定による経口アベイラビリティを示している。Ｓｔｏｏｐ，Ａ．Ａ．ら（２００３）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２１：１０６３。５０％以上のアベイラビリティと関連付けられるｌｏｇ  Ｐｅ値が緑色、５〜７５％は黄色、５％未満は赤色である。注目すべき例外は、−６．６〜−６．３のｌｏｇ  Ｐｅを持つが、２５％バイオアベイラブルな、シクロスポリンである。還元可能なビオチンで標識されたペプチドは、それぞれの番号に続くＲＢで表されている。
【００５０】
【図１７】図１７Ａ〜１７Ｇは、形質膜を横切るペプチドのビオチン伝達輸送を示している。画像は蛍光チャネルとそれに続く光チャネルである。図１７Ａは、ビオチンコンジュゲートとペプチドとの間に架橋ジスルフィドが組み込まれている、使用したペプチド配列を示す。図１７Ｂは、ペプチド１と共に一晩インキュベートした３Ｔ３細胞を示す。図１７Ｃは、ペプチド１と共に一晩インキュベートしたＨｅＬａ細胞を示す。図１７Ｄは、ペプチド２と共に一晩インキュベートした３Ｔ３細胞を示す。図１７Ｅは、ペプチド２と共に一晩インキュベートしたＨｅＬａ細胞を示す。図１７Ｆは、ペプチド３と共に一晩インキュベートしたニューロンを示す。図１７Ｇは、ペプチド４と共に一晩インキュベートしたニューロンを示す。
【００５１】
【図１８】図１８Ａ〜１８Ｄは、ビオチンシャトリングがエンドサイトーシスに依存しないことを示している。３Ｔ３細胞をペプチド１と共にインキュベートし、フルオレセインチャネル（図１８Ａ）またはロータミン（ｒｈｏｔａｍｉｎｅ）チャネル（図１８Ｂ）を使って、共焦点顕微鏡法で調べた。ペプチド投与に先だって３Ｔ３細胞をエンドサイトーシス阻害剤ダイナソアで処理しておき、フルオレセインチャネル（図１８Ｃ）またはロータミンチャネル（図１８Ｄ）下で調べる。
【００５２】
【図１９】図１９は、フローサイトメトリーによるペプチド取り込みの定量を示している。ビオチンシャトリングによるペプチド１の取り込み効率を、ＴＡＴ送達およびポリアルギニン送達と比較したもの。対照として、投与前に還元し脱塩しておいたペプチド１を使用した。
【００５３】
【図２０】図２０Ａおよび２０Ｂは、ビオチン化およびパルミトレイン酸コンジュゲーションが経口バイオアベイラビリティを強化することを示している。図２０Ａは、経口バイオアベイラビリティ百分率を、経口胃管栄養法によってマウスにビオチン化ペプチドを送り込んだ後の時間に対して示している。図２０Ｂは、環状ペプチドとビオチン化環状ペプチドとパルミトレイン酸環状ペプチドの経口バイオアベイラビリティ百分率を対比して示している。図２０Ａおよび２０Ｂにおいて、データは２点の平均を表し、誤差は標準偏差として示されている。
【００５４】
【図２１】図２１Ａ〜２１Ｃは、ビオチン化インスリンがインビボで血糖レベルを調節することを示している。図２１Ａは、キモトリプシン消化と質量スペクトル解析とで決定したところ、ビオチン化の部位が、インスリンＢ鎖のＮ末端であることを示している。図２１Ｂは、３．５ｎｍｏｌ／Ｋｇのビオチン化インスリンを静脈内に投与した４匹のマウスからのインスリン応答を示している。図２１Ｃは、無修飾ヒトインスリンを３．５ｎｍｏｌ／Ｋｇの用量で静脈内に投与した４匹のマウスからのインスリン応答を示している。
【００５５】
【図２２】図２２は、ビオチン化インスリンの経口バイオアベイラビリティを示している。図２２は、マウスにリン酸緩衝液（■）、７ｎｇ／Ｋｇのインスリン（▲）、または７ｎｇ／Ｋｇのビオチン化インスリン（◆）を投与した時のインビボでの血中グルコースレベルを示している。点は４匹のマウスについての平均応答を表し、誤差はＳＥＭで表されている。
【００５６】
【図２３】図２３は、ヒト血清中で消化されたペプチドの半減期を示している。ペプチド（ｎ＝３）を、９５％ヒト血清中、３７℃で消化した。ＰＭＰ（▲）、ＨＭＰ（■）、およびＳＵＰＲ（◆）ペプチドが示されている。
【００５７】
【図２４】図２４は、ヒト肝ミクロソームで処理されたペプチドの半減期を示している。ペプチド（ｎ＝３）を、９５％ヒト血清中、３７℃で消化した。ＰＭＰ（■）、ＨＭＰ（▲）、およびＳＵＰＲ（●）ペプチドが示されている。
【００５８】
【図２５】図２５Ａ〜２５Ｄは、実験番号４で説明するように、構造化されたペプチドを生産するための方法を示している。図２５Ａは、ｌｉｎＧＩＢＰ（出発ペプチド）が、全く構造不定であることを示すＣＤプロファイルを持つことを示している。図２５Ｂは、環状ＳＵＰＲペプチドが高度に構造化されており、らせん状であると思われることを示している。図２５Ｃは、Ｎ−メチルアミノ酸の除去がらせん性の喪失をもたらすことを示している。図２５Ｄは、直線状ＳＵＰＲペプチドもらせん状であることを示している。
【００５９】
【図２６】図２６Ａ〜２６Ｅは、ＳＵＰＲペプチドが構造化されていることを示している。図２６Ａは、ＳＵＰＲペプチドがらせん状プロファイルを持つことを示している。図２６Ｂは、Ｈｅｒ−２結合ペプチドファミリーのペプチドＤが歪んだらせん構造を示すことを示している。図２６Ｃは、Ｈｅｒ−２結合ペプチドファミリーのペプチド７がβターン構造を示すことを示している。図２６Ｄは、Ｈｅｒ−２結合ペプチドファミリーのペプチド１が、シクロスポリン（図２６Ｅ）とよく似たβターンプロファイルを持つことを示している。−１０，０００は、およそ−２．７ｍｄｅｇ単位と相関するモル楕円率単位を意味する。それゆえに、ペプチド１とシクロスポリンとは同じ形状を持つだけでなく、それらの構造度もよく似ている。
【００６０】
【図２７】図２７は、ｍｔｔで解析したペプチドの毒性の解析結果を示している。ペプチド（ｎ＝３）を１００μＭで３６時間投与した。ＤＭＳＯ濃度は１容量％だった。Ａｂｎｏｖａ社のｍｔｔアッセイキットを使って細胞を解析した。平均値と標準偏差の形での誤差とをプロットしている。
【００６１】
【図２８】図２８は、フロイント不完全アジュバントを伴うｃｙｃＧＩＢＰおよびＳＵＰＲの免疫原性を示している（ｎ＝３）。陽性対照はビオチン化マウス抗体である。陰性対照はビオチンである。ｃｙｃＧＩＢＰは青色、ＳＵＰＲペプチドは赤色である。平均値と標準偏差とがプロットされている。
【発明を実施するための形態】
【００６２】
別段の定義がある場合を除き、本明細書において使用する技術用語および科学用語は全て、本発明が属する技術分野の通常の技能を有する者が一般に理解しているものと同じ意味を有する。本明細書に掲載するヌクレオチド配列は全て５’→３’方向に提示する。本発明の実施または試験においては、本明細書に記載するものと類似するまたは等価な任意の方法および材料を使用することができるが、ここでは、好ましい方法、デバイスおよび材料を説明する。本明細書において言及する技術刊行物および特許刊行物は参照によりそのまま本明細書に組み込まれる。先行発明を理由として本発明がそれらの開示に先行する資格がないことの自認であると解釈すべきものは、本明細書にはない。
【００６３】
本発明の実施には、別段の表示がある場合を除き、当技術分野の技能の範囲内である、組織培養、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学および組換えＤＮＡの従来の技法が使用されるであろう。例えばＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ編（２００１）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」第３版；Ａｕｓｕｂｅｌら編（２００７）「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」シリーズ；「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」シリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ニューヨーク）；ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎら（１９９１）「ＰＣＲ  １：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）；ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎら（１９９５）「ＰＣＲ  ２：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編（１９９９）「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（２００５）「Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」第５版；Ｇａｉｔ編（１９８４）「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」；米国特許第４，６８３，１９５号；ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ編（１９８４）「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」；Ａｎｄｅｒｓｏｎ（１９９９）「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」；ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ編（１９８４）「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９８６））；Ｐｅｒｂａｌ（１９８４）「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」；ＭｉｌｌｅｒおよびＣａｌｏｓ編（１９８７）「Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ」（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍａｋｒｉｄｅｓ編（２００３）「Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ」；ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編（１９８７）「Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ロンドン）；ならびにＨｅｒｚｅｎｂｅｒｇら編（１９９６）「Ｗｅｉｒ’ｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」を参照されたい。
【００６４】
ｐＨ、温度、時間、濃度、および分子量などの数値指定は、範囲を含めて全て、近似であり、適宜、１．０単位または０．１単位で変動（＋）または（−）するか、あるいは＋／−１５％、あるいは１０％、あるいは５％、あるいは２％の変化量で変動する。常に明示的に述べるわけではないが、全ての数値指定は用語「約」が前についていることを理解すべきである。常に明示的に述べるわけではないが、本明細書に記載する試薬類が単なる例示であることと、それらの等価物が当技術分野において知られていることも理解すべきである。
【００６５】
本明細書および特許請求の範囲において使用する場合、単数形「ある」「一つの」（「ａ」または「ａｎ」）および「その」（「ｔｈｅ」）には、文脈上そうでないことが明らかである場合を除き、複数の指示物が含まれる。例えば「あるポリペプチド」（ａ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」という用語には、複数のポリペプチド（その混合物を含む）が含まれる。
【００６６】
本明細書において使用する用語「を含む」は、組成物および方法が列挙した要素を含むこと、ただし他の要素が排除されるわけではないことを意味するものとする。組成物および方法を定義するために使用する場合、「から本質的になる」は、意図する用途にとって、その組み合わせには不可欠な意義を持つ要素が、他にはないことを意味するものとする。したがって、本明細書に定義した要素から本質的になる組成物が、単離方法および精製方法からくる微量の夾雑物や、医薬上許容され得る担体、例えばリン酸緩衝食塩水、保存剤などを排除することはないであろう。「からなる」は、微量要素とは言えない他の成分および本発明の組成物を投与するための実質的方法ステップが排除されることを意味するものとする。これら移行部分の用語によって定義される実施形態は、本発明の範囲内にある。
【００６７】
診断または処置の「対象」は、細胞、または動物、例えば哺乳動物、もしくはヒトである。診断または処置の対象となる非ヒト動物は、感染を起こすもの、または動物モデル、例えばサル、ネズミ科動物、例えばラット、マウス、チンチラ、イヌ科動物、例えばイヌ、ウサギ科動物、例えばウサギ、家畜、競技用動物、およびペットである。
【００６８】
用語「タンパク質」、「ペプチド」および「ポリペプチド」は可換的に使用され、その最も広い意味において、２つ以上のサブユニットアミノ酸、アミノ酸アナログまたはペプチドミメティックの化合物を指す。サブユニットはペプチド結合によって連結されていてもよい。もう一つの実施形態では、サブユニットは他の結合、例えばエステル、エーテルなどによって連結されていてもよい。タンパク質またはペプチドは少なくとも２つのアミノ酸を含有しなければならず、タンパク質の配列またはペプチドの配列を構成しうるアミノ酸の最大数に制約はない。本明細書において使用する用語「アミノ酸」は、天然および／または非天然もしくは合成アミノ酸を指し、グリシン、ならびにＤ光学異性体とＬ光学異性体との両方、ならびにアミノ酸アナログおよびペプチドミメティックを含む。
【００６９】
用語「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は可換的に使用され、任意の長さのポリマー型のヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドまたはそのアナログを指す。ポリヌクレオチドは何らかの三次元構造を有することができ、何らかの既知または未知機能を果たしうる。以下はポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子フラグメント（例えばプローブ、プライマー、ＥＳＴまたはＳＡＧＥタグ）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、ＲＮＡｉ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドやヌクレオチドアナログなどの修飾ヌクレオチドを含むことができる。ヌクレオチド構造への修飾が存在する場合、それは、ポリヌクレオチドのアセンブリの前または後に付加することができる。ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチドコンポーネントで中断することができる。ポリヌクレオチドは、重合後に、例えば標識コンポーネントとのコンジュゲーションなどによって、さらに修飾することができる。また、この用語は、二本鎖分子と一本鎖分子の両方を指す。別段の指定または必要がない限り、ポリヌクレオチドである本発明の任意の実施形態は、二本鎖型と、二本鎖型を構成することが知られているまたは二本鎖型を構成すると予想される２つの相補的一本鎖型のそれぞれとの両方を包含する。
【００７０】
ポリヌクレオチドは、４つのヌクレオチド塩基、すなわちアデニン（Ａ）；シトシン（Ｃ）；グアニン（Ｇ）；チミン（Ｔ）；およびポリヌクレオチドがＲＮＡである場合はチミンの代わりにウラシル（Ｕ）の特異的配列から構成される。したがって、用語「ポリヌクレオチド配列」は、ポリヌクレオチド分子のアルファベット表記である。このアルファベット表記は中央処理装置を有するコンピュータ中のデータベースに入力し、機能ゲノミクスや相同性検索などのバイオインフォマティクス的応用に使用することができる。
【００７１】
核酸、例えばＤＮＡまたはＲＮＡに関して本明細書において使用する用語「単離」または「組換え」は、その高分子の自然源中に存在する他の、それぞれのＤＮＡまたはＲＮＡならびにポリペプチドから分離された分子を指す。「単離または組換え核酸」という用語は、フラグメントとしては自然には存在せず、自然状態で見いだされることはないであろう核酸フラグメントを包含するものとする。「単離（された）」という用語は、本明細書では、他の細胞タンパク質から単離されたポリヌクレオチド、ポリペプチドおよびタンパク質を指すためにも使用され、精製ポリペプチドと組換えポリペプチドの両方を包含するものとする。別の実施形態では、「単離または組換え」という用語が、その細胞、組織、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体またはそのフラグメント（複数も可）に、自然界において通常付随している細胞その他の構成成分からの分離を意味する。例えば、単離された細胞は、表現型または遺伝子型が異なる組織または細胞から分離されている細胞である。単離されたポリヌクレオチドは、そのネイティブ環境または自然環境において、例えば染色体上で、通常それらに付随している３’および５’隣接ヌクレオチドから分離されている。当業者には明白であるとおり、非天然型ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体またはそのフラグメント（複数も可）は、それを、その天然対応物と区別するために「単離」を必要としない。
【００７２】
別の配列に対して、一定の百分率（例えば８０％、８５％、９０％、または９５％）の「配列同一性」を有するポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域（またはポリペプチドもしくはポリペプチド領域）とは、アライメントした場合に、その塩基（またはアミノ酸）の百分率が、２つの配列の比較において同じであることを意味する。アライメントおよび相同性百分率または配列同一性百分率は、当技術分野において知られているソフトウェアプログラムを使って、例えば「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９８７）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ３０、Ｓｅｃｔｉｏｎ  ７．７．１８、Ｔａｂｌｅ  ７．７．１に記載されているものを使って、決定することができる。アライメントには、好ましくは、デフォルトパラメータを使用する。好ましいアライメントプログラムはデフォルトパラメータを使用するＢＬＡＳＴである。特に、以下のデフォルトパラメータを使用するＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、好ましいプログラムである：遺伝コード（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ）＝標準；フィルター＝なし；鎖＝両方（ｂｏｔｈ）；カットオフ＝６０；期待数＝１０；行列（Ｍａｔｒｉｘ）＝ＢＬＯＳＵＭ６２；表示（Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ）＝５０配列；分類方法（ｓｏｒｔ  ｂｙ）＝高スコア（ＨＩＧＨ  ＳＣＯＲＥ）；データベース（Ｄａｔａｂａｓｅｓ）＝非重複（ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ）、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、次のインターネットアドレスに見いだすことができる：ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ。配列同一性および同一性百分率は、それらをｃｌｕｓｔａｌＷ
（ウェブアドレス：／／ａｌｉｇｎ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／で利用可能。最終アクセス日２０１１年３月７日）に組み込むことによって決定した。
【００７３】
「相同性」または「同一性」または「類似性」は、２つのペプチド間または２つの核酸分子間の配列類似性を指す。相同性は、比較のためにアライメントしうる各配列中の位置を比較することによって決定することができる。比較される配列中の位置が同じ塩基またはアミノ酸で占められている場合、その分子はその位置において相同である。配列間の相同性の程度は、それらの配列が共有する一致位置または相同位置の数の関数である。「無関係な」配列または「非相同」配列は、本発明の配列の一つと、４０％未満の同一性、あるいは２５％未満の同一性を持つ。
【００７４】
「相同性」または「同一性」または「類似性」は、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする２つの核酸分子を指すこともできる。
【００７５】
「ハイブリダイゼーション」は、１つ以上のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合によって安定化される複合体を形成する反応を指す。水素結合は、ワトソン−クリック塩基対合、フーグスティーン（Ｈｏｏｇｓｔｅｉｎ）型結合、または他の任意の配列特異的方法によって起こりうる。複合体は二重鎖構造を形成する２本の鎖、多鎖複合体を形成する３本以上の鎖、一本の自己ハイブリッド形成鎖、またはこれらの任意の組み合わせを含みうる。ハイブリダイゼーション反応は、ＰＣＲ反応の開始やリボザイムによるポリヌクレオチドの酵素切断などといった、より広範囲にわたるプロセス中の一ステップを構成しうる。
【００７６】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例として、約２５℃〜約３７℃のインキュベーション温度；約６×ＳＳＣ〜約１０×ＳＳＣのハイブリダイゼーション緩衝液濃度；約０％〜約２５％のホルムアミド濃度；および約４×ＳＳＣ〜約８×ＳＳＣの洗浄溶液が挙げられる。中等度のハイブリダイゼーション条件の例としては、約４０℃〜約５０℃のインキュベーション温度；約９×ＳＳＣ〜約２×ＳＳＣの緩衝液濃度；約３０％〜約５０％のホルムアミド濃度；および約５×ＳＳＣ〜約２×ＳＳＣの洗浄溶液が挙げられる。高ストリンジェンシー条件の例としては、約５５℃〜約６８℃のインキュベーション温度；約１×ＳＳＣ〜約０．１×ＳＳＣの緩衝液濃度；約５５％〜約７５％のホルムアミド濃度；および約１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣ、または脱イオン水である洗浄溶液が挙げられる。一般に、ハイブリダイゼーションのインキュベーション時間は５分〜２４時間であり、洗浄ステップは１回、２回、またはそれ以上で、洗浄のインキュベーション時間は約１分、２分、または１５分である。ＳＳＣは０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸緩衝液である。他の緩衝液系を使ったＳＳＣの等価物も使用できることは言うまでもない。
【００７７】
本明細書にいう「発現」とは、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写されるプロセスおよび／または転写されたｍＲＮＡが次に、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現には、真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングが含まれうる。
【００７８】
ポリヌクレオチドに適用される「コードする」という用語は、あるポリヌクレオチドが、そのネイティブ状態で、または当業者に周知の方法によって操作された時に、転写されかつ／または翻訳されて、ポリペプチドおよび／またはそのフラグメントのｍＲＮＡを生じさせることができる場合に、そのポリペプチドを「コードする」と言われる、ポリヌクレオチドを指す。アンチセンス鎖はそのような核酸の相補体であり、コード配列はそこから推定することができる。
【００７９】
「終止コドン」という用語は、翻訳の終結をシグナルするメッセンジャーＲＮＡ内の３ヌクレオチドの連続する配列を表している。非限定的な例として、ＲＮＡでは、ＵＡＧ、ＵＡＡ、ＵＧＡが、またＤＮＡでは、ＴＡＧ、ＴＡＡまたはＴＧＡが挙げられる。別段の注記がある場合を除き、この用語には、中途終止コドンを導入して、その結果生じるタンパク質をいずれも異常に短縮されたものにする、ＤＮＡ内またはＲＮＡ内のナンセンス変異が包含される。例えば、バリンをコードするヌクレオチドを全て除去し、次に、それらが野生型配列内では通例存在しない位置にすることができる。
【００８０】
「非リボソームペプチド」または「ＮＲＰ」は、リボソームによって合成されないペプチドである。
【００８１】
細胞内ＰＰＩは細胞内タンパク質−タンパク質相互作用（「ＰＰＩ」）である。
【００８２】
本明細書において使用する用語「予め決定された特異性」は、予め選択されたターゲット、例えばＨｅｒ−２受容体を特異的に認識し結合するという、選択された能力を有するペプチドを表す。予め選択されたターゲットの非限定的な例には、例えば任意のペプチド、抗原、ポリヌクレオチドまたは抗体などがある。
【００８３】
本明細書において使用する用語「バイオアベイラブルなペプチド」は、その投与後にさまざまな生物学的障壁を横切ってターゲット細胞に到達する能力、特に経口投与後に腸障壁を通過する能力を有するペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を意味する。バイオアベイラビリティは、想定される応用に応じて選択された細胞タイプについて決定される。バイオアベイラビリティを決定するための方法は当技術分野では知られており、本明細書でも説明する。
【００８４】
本明細書において使用する用語「安定なペプチド」は、インビボ投与された後に、ターゲット細胞に到達し、その生物学的作用を発揮するのに十分な寿命を有するペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を表す。これらのペプチドは、生物学的活性を保ちつつ、細胞プロテアーゼによる分解からそれらを保護するコンフォメーションを有する。ペプチドの安定性の指標は、インビトロで行われる試験を使って得ることができる。例えば、ペプチドのインビトロ分解は、市販されているさまざまな精製プロテアーゼと、インキュベーション時間を増やしながら（例えば１時間〜７２時間）、接触させることによって測定される。次に、逆相ＨＰＬＣにより、消化前と消化後に得られるプロファイルを比較することで、ペプチド分解が証明される。一態様では、安定なタンパク質が、ヒト血清中に存在するプロテアーゼに対して、例えば約２０％超、あるいは約４０％超、あるいは約５０％超、あるいは約６０％超、あるいは約７０％超、あるいは約７５％超、あるいは約８０％より高い耐性を有する。
【００８５】
本明細書において使用する用語「ｍＲＮＡライブラリー」は、プロモーター領域と、それに続くアミノ酸Ｍｅｔと、それに続くいくつかのランダム化アミノ酸（典型的には７〜１０個）と、それに続くリジンとを有する複数の、少なくとも２つのＲＮＡメンバーを表す。
【００８６】
本明細書にいう「ビオチンアナログ」とは、膜透過性、細胞浸透、および／または経口アベイラビリティを強化するために、Ｎ末端またはＣ末端で、またはその近傍で、コンジュゲートされたペプチド配列を表す。ビオチンアナログの非限定的な例として、デヒドロビオチン、イミノビオチン、ビオチンアミン、ジアミノビオチン、デスチオビオチン、ハロゲン化ビオチン、長鎖ビオチン、およびビオチン−ＰＥＧが挙げられる。ペプチドをＰＥＧ化するための方法は当技術分野では知られており、例えばＭｅｒｏら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１１，Ｖｏｌ．７５１，Ｐａｒｔ．１，９５−１２９；およびＧｏｎｅｎ−Ｗａｄｍａｎｙａら（２０１１）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ３２（２６）：６０２５−６０３３に記載されている。
【００８７】
本明細書において使用する用語「予め決定された特異性」は、予め決定されたターゲット、例えばＨｅｒ−２受容体を特異的に認識し結合するという、選択された能力を表す。
【００８８】
本明細書において使用する「処置する」、「処置」などの用語は、本明細書では、所望の薬学的および／または生理学的効果を得ることを意味するために用いられる。効果は、障害またはその徴候もしくは症状を完全にまたは部分的に防止するという点から、予防的であってもよいし、かつ／または障害および／またはその障害に原因があると考えられる有害作用の部分的または完全な治癒という点から、治療的であってもよい。
【００８９】
「組成物」は、活性剤と、もう一つの化合物または組成物、不活性なもの（例えば検出可能な薬剤またはラベル）または活性なもの、例えばアジュバントとの組み合わせを意味するものとする。
【００９０】
「医薬組成物」は、活性剤と、インビトロ、インビボまたはエクスビボでの診断的使用または治療的使用に適した組成物を作る不活性または活性担体との組み合わせを包含するものとする。
【００９１】
「医薬上許容され得る担体」とは、本発明の組成物において使用しうる任意の希釈剤、補形薬、または担体を指す。医薬上許容され得る担体には、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えばリン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩類または電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイダルシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ロウ、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂などがある。適切な医薬担体は、この分野における標準的参考書である「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ）に記載されている。それらは好ましくは意図する投与形態、すなわち経口錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、シロップ剤などに合わせて、通常の医薬実務に従って選択される。
【００９２】
「投与」は、１回の投薬で、または処置の全過程にわたって持続的もしくは間欠的に実施することができる。最も有効な投与の手段と投薬量を決定する方法は当業者には知られており、治療に使用する組成物、治療の目的、処置されているターゲット細胞、および処置されている対象によって変動するであろう。単回または複数回の投与は、処置医が選択した用量レベルおよび用量パターンで行うことができる。適切な投薬用製剤および薬剤を投与する方法は、当技術分野において知られている。投与経路も決定することができ、最も効果的な投与経路を決定する方法は、当業者には知られており、処置に使用する組成物、処置の目的、処置されている対象の健康状態または病期、およびターゲット細胞またはターゲット組織によって変動するであろう。投与経路の非限定的な例として、経口投与、経鼻投与、注射、および局所適用などがある。
【００９３】
「有効量」という用語は、所望の効果を達成するのに十分な量を指す。治療的または予防的応用の場合、有効量は、問題の状態のタイプおよび重症度、個々の対象の特徴、例えば全身の健康状態、年齢、性別、体重、および医薬組成物に対する耐性などに依存するであろう。免疫原組成物の場合、いくつかの実施形態において、有効量は、病原体に対する防護的応答をもたらすのに十分な量である。別の実施形態では、免疫原組成物の有効量が、抗原に対する抗体生成をもたらすのに十分な量である。いくつかの実施形態では、有効量が、受動免疫を必要とする対象に受動免疫を付与するのに必要な量である。免疫原組成物に関して、いくつかの実施形態では、有効量が、上述の因子に加えて、意図する用途、特定抗原化合物の免疫原性の程度、および対象の免疫系の健康状態／応答性にも依存するであろう。当業者は、これらの因子および他の因子に応じて、適当な量を決定することができるであろう。
【００９４】
インビトロ応用の場合、いくつかの実施例では、有効量が、問題の応用のサイズおよび性質に依存するであろう。また、インビトロターゲットの性質および感度ならびに使用する方法にも依存するであろう。当業者は、これらの考慮事項および他の考慮事項に基づいて有効量を決定することができるであろう。有効量は、実施形態に応じて、組成物の１回以上の投与を含みうる。
【００９５】
「ペプチドコンジュゲート」とは、１つ以上のポリペプチドともう一つの化学的または生物学的化合物との共有結合または非共有結合による会合を指す。非限定的な例では、ポリペプチドと化学的化合物との「コンジュゲーション」が、その意図する目的に関して、そのポリペプチドの安定性または効力の改良をもたらす。ある実施形態では、ペプチドが、リポソーム、ミセル、または医薬上許容され得るポリマーである担体にコンジュゲートされる。
【００９６】
「遺伝子送達媒体」は、挿入されたポリヌクレオチドを宿主細胞中に運び込むことができる任意の分子と定義される。遺伝子送達媒体の例は、リポソーム、ミセル、天然ポリマーおよび合成ポリマーを含む生体適合性ポリマー；リポタンパク質；ポリペプチド；多糖；リポ多糖；人工ウイルスエンベロープ；金属粒子；および細菌、またはウイルス、例えばバキュロウイルス、アデノウイルスおよびレトロウイルス、バクテリオファージ、コスミド、プラスミド、真菌ベクター、および当技術分野において典型的に使用されている他の組換え媒体であり、これらは、さまざまな真核宿主および原核宿主における発現について記述されていて、遺伝子治療にも、単純なタンパク質発現にも使用されうる。
【００９７】
本発明のポリヌクレオチドは、遺伝子送達媒体を使って細胞または組織に送達することができる。本明細書にいう「遺伝子送達」、「遺伝子導入」、「形質導入」などは、導入のために使用する方法にかかわりなく、宿主細胞中への外因性ポリヌクレオチド（「導入遺伝子」という場合もある）の導入を指す用語である。そのような方法には、ベクターによる遺伝子導入（例えばウイルス感染／トランスフェクションによる方法、またはさまざまな他のタンパク質ベースもしくは脂質ベースの遺伝子送達複合体による方法）ならびに「裸の」ポリヌクレオチドの送達を容易にする技法（例えばエレクトロポレーション、「遺伝子銃」送達、およびポリヌクレオチドの導入に使用される他のさまざまな技法）など、さまざまな周知の技法がある。導入されたポリヌクレオチドは、宿主細胞内で安定に維持される場合も、一時的に維持される場合もありうる。安定な維持は、典型的には、導入されたポリヌクレオチドが宿主細胞に適合する複製起点を含有するか、または宿主細胞のレプリコン中に、例えば染色体外レプリコン（例えばプラスミド）中、または核染色体もしくはミトコンドリア染色体中に組み込まれることを必要とする。当技術分野では知られており、本明細書でも説明するとおり、いくつかのベクターは、哺乳動物細胞への遺伝子の導入を媒介する能力を有することが知
られている。
【００９８】
「プラスミド」は、染色体ＤＮＡとは別個の染色体外ＤＮＡ分子であって、染色体ＤＮＡとは独立して複製する能力を有するものである。多くの場合、それは環状かつ二本鎖である。プラスミドは微生物集団内での水平遺伝子伝播の機序を与え、典型的には、所与の環境状況下で、選択有利性を与える。プラスミドは、競争的環境ニッチにおいて天然抗生物質に対する耐性を与える遺伝子を運搬しうる。あるいは、生産されたタンパク質が、類似する状況下で毒素として作用しうる。
【００９９】
遺伝子工学で使用される「プラスミド」は「プラスミドベクター」と呼ばれる。そのような用途のために多くのプラスミドが市販されている。細胞を特定抗生物質に対して耐性にする遺伝子と、よく使用される数種類の制限部位を含有する短い領域であってこの場所でのＤＮＡフラグメントの容易な挿入を可能にするマルチクローニング部位（ＭＣＳまたはポリリンカー）とを含有するプラスミドのコピーに、複製されるべき遺伝子を挿入する。プラスミドのもう一つの主要用途は、大量のタンパク質を作ることである。この場合、研究者は、目的の遺伝子を内包するプラスミドを含有する細菌を成長させる。細菌がタンパク質を生産してその抗生物質耐性を付与すると同時に、挿入された遺伝子から大量のタンパク質が生産されるように誘導することもできる。これは、遺伝子を大量生産する、または次にそれがコードするタンパク質を大量生産する、安価で簡単な方法である。
【０１００】
「酵母人工染色体」または「ＹＡＣ」は、大きなＤＮＡフラグメント（１００ｋｂより大きく最大３０００ｋｂ）をクローニングするために使用されるベクターを指す。これは人工的に構築された染色体であり、酵母細胞における複製と保全に必要なテロメア配列、セントロメア配列および複製起点配列を含有する。まず環状プラスミドを使って構築された後、制限酵素を使って線状化され、次にＤＮＡリガーゼにより、目的の配列または遺伝子をその直線状分子内に、付着末端を利用して付加することができる。ＹＡＣ、ＹＩｐ（酵母組み込みプラスミド）、およびＹＥｐ（酵母エピソームプラスミド）などの酵母発現ベクターは、極めて有用である。というのも、酵母はそれ自体が真核細胞であるため、翻訳後修飾を受けた真核タンパク質産物を得ることができるからであるが、ＹＡＣはＢＡＣより不安定で、キメラ効果を生じることが見いだされている。
【０１０１】
「ウイルスベクター」は、インビボ、エクスビボまたはインビトロのいずれかで宿主細胞中に送達されるべきポリヌクレオチドを含む、組換え生産されたウイルスまたはウイルス粒子と定義される。ウイルスベクターの例には、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アルファウイルスベクターなどがある。感染性タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）系ベクターはタンパク質を製造するために使用することができ、タバコ葉においてグリフィスシンを発現させたと報告されている（Ｏ’Ｋｅｅｆｅら（２００９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０６（１５）：６０９９−６１０４）。セムリキ森林ウイルス系ベクターやシンドビスウイルス系ベクターなどのアルファウイルスベクターは、遺伝子治療用および免疫療法用としても開発されている。ＳｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒおよびＤｕｂｅｎｓｋｙ（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５：４３４−４３９ならびにＹｉｎｇら（１９９９）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５（７）：８２３−８２７参照。遺伝子導入がレトロウイルスベクターによって媒介される態様では、ベクター構築物とは、レトロウイルスゲノムまたはその一部と治療用遺伝子とを含むポリヌクレオチドを指す。
【０１０２】
本明細書にいう「レトロウイルス媒介遺伝子導入」または「レトロウイルス形質導入」は同じ意味を有し、ウイルスが細胞に進入して、そのゲノムを宿主細胞ゲノムに組みこむことにより、遺伝子または核酸配列が宿主細胞中に安定に導入されるプロセスを指す。ウイルスは、その通常の感染機序によって宿主細胞に進入することができ、あるいは、異なる宿主細胞表面受容体またはリガンドに結合することで細胞に進入するように修飾されていてもよい。本明細書にいうレトロウイルスベクターとは、ウイルスまたはウイルス様進入機序によって細胞中に外因性核酸を導入する能力を有するウイルス粒子を指す。
【０１０３】
レトロウイルスはその遺伝情報をＲＮＡの形態で運搬するが、ウイルスがひとたび細胞に感染すると、ＲＮＡはＤＮＡ型に逆転写され、それが感染した細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれる。組み込まれたＤＮＡ型はプロウイルスと呼ばれる。
【０１０４】
遺伝子導入がアデノウイルス（Ａｄ）やアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）などのＤＮＡウイルスベクターによって媒介される態様において、ベクター構築物とは、ウイルスゲノムまたはその一部と導入遺伝子とを含むポリヌクレオチドを指す。アデノウイルス（Ａｄ）は、５０を越える血清型を含む比較的よく特徴確認された同種のウイルス群である。例えばＰＣＴ公開番号ＷＯ９５／２７０７１を参照されたい。Ａｄは宿主細胞ゲノムへの組み込みを必要としない。組換えＡｄ由来のベクター、特に組換えと野生型ウイルスの生成の可能性を低減するものも、構築されている。ＰＣＴ公開番号ＷＯ９５／００６５５およびＷＯ９５／１１９８４を参照されたい。野生型ＡＡＶは高い感染性と特異性を有し、宿主細胞のゲノムに組みこまれる。Ｈｅｒｍｏｎａｔ  ＆  Ｍｕｚｙｃｚｋａ（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６４６６−６４７０およびＬｅｂｋｏｗｓｋｉら（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３９８８−３９９６を参照されたい。
【０１０５】
プロモーターと、ポリヌクレオチドを作動的に連結することができるクローニング部位とをどちらも含有するベクターは、当技術分野ではよく知られている。そのようなベクターは、インビトロまたはインビボで、ＲＮＡを転写する能力を有し、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（カリフォルニア州ラホーヤ）およびＰｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（ウィスコンシン州マディソン）などの供給源から市販されている。発現および／またはインビトロ転写を最適化するために、クローンの５’および／または３’非翻訳部分を除去、付加または改変することで、転写または翻訳レベルで、潜在的に不適当な余分な代替的翻訳開始コドンまたは発現を妨害もしくは低減しうる他の配列を取り除く必要があるかもしれない。あるいは、発現を強化するために開始コドンのすぐ５’側に、共通リボソーム結合部位を挿入することができる。ＤＮＡウイルス、ＲＮＡウイルス、修飾体、リポソームは、ベクターの非限定的な例である。
【０１０６】
遺伝子送達媒体には、ＤＮＡ／リポソーム複合体、ミセルおよび標的ウイルスタンパク質−ＤＮＡ複合体も含まれる。ターゲティング抗体またはそのフラグメントも含むリポソームを、本発明の方法において使用することができる。細胞または細胞集団へのポリヌクレオチドの送達に加えて、細胞または細胞集団への、本明細書に記載するタンパク質の直接導入も、例えば限定するわけではないが、タンパク質トランスフェクションの技法によって行うことができ、あるいは限定するわけではないが、他の技法として、本発明のタンパク質の発現を強化しかつ／または本発明のタンパク質の活性を増進することができる培養条件も挙げられる。
【０１０７】
本明細書にいう「抗体」（ａｎｔｉｂｏｄｙ、ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）および「免疫グロブリン」には、抗体全体、およびその任意の抗原結合性フラグメントまたは単一鎖が含まれる。したがって「抗体」という用語には、免疫グロブリン分子の少なくとも一部分を含む分子を含有する任意のタンパク質またはペプチドが包含される。また、「抗体」（ａｎｔｉｂｏｄｙ、ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）および「免疫グロブリン」という用語には、任意のアイソタイプの免疫グロブリン、抗原への特異的結合性を保っている抗体のフラグメント、例えば限定するわけではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆｄフラグメント、ｄＡｂ、ＶＨ、ＶＬ、ＶｈＨ、およびＶ−ＮＡＲドメイン；ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディおよびカッパボディ；抗体フラグメントと１つ以上の単離物とから形成される多重特異性抗体フラグメントが包含される。それらの例には、重鎖もしくは軽鎖またはそのリガンド結合部分の相補性決定領域（ＣＤＲ）、重鎖または軽鎖可変領域、重鎖または軽鎖定常領域、フレームワーク（ＦＲ）領域、またはそれらの任意の部分、結合タンパク質の少なくとも一部分、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、および抗体の抗原結合部分と非抗体タンパク質とを含む融合タンパク質などがあるが、これらに限るわけではない。免疫グロブリン分子の重鎖および軽鎖の可変領域は抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体（Ａｂ）の定常領域は、宿主組織への免疫グロブリンの結合を媒介する。
【０１０８】
本明細書において使用する用語「ラベル」は、「標識」組成物が生成するように、検出されるべき組成物に直接または間接的にコンジュゲートされる、直接または間接的に検出可能な化合物または組成物、例えばＮ末端ヒスチジンタグ（Ｎ−Ｈｉｓ）、磁気的に活性な同位体、例えば１１５Ｓｎ、１１７Ｓｎおよび１１９Ｓｎ、１３Ｃおよび１５Ｎなどの非放射性同位体、ポリヌクレオチドまたは抗体などのタンパク質を表す。この用語には、挿入された配列の発現時にシグナルを与える、ポリヌクレオチドにコンジュゲートされた配列、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）なども包含される。ラベルは、単独で検出可能であってもよいし（例えば放射性同位体ラベルまたは蛍光ラベル）、酵素ラベルの場合であれば、検出可能な基質化合物または組成物の化学変化を触媒してもよい。ラベルは、小規模検出に適しているか、またはハイスループットスクリーニングに、より一層適していることができる。したがって適切なラベルには、磁気的に活性な同位体、非放射性同位体、放射性同位体、蛍光色素、化学ルミネセンス化合物、色素、およびタンパク質（酵素を含む）などがあるが、これらに限るわけではない。ラベルは単に検出することができるか、または定量することができる。検出されるだけの応答が、一般に、単にその存在が確認されるだけの応答を含むのに対し、定量される応答は、一般に、例えば強度、偏光、および／または他の性質など、定量化可能な（例えば数値で報告することができる）値を有する応答を含む。ルミネセンスアッセイまたは蛍光アッセイでは、検出可能な応答を、結合に実際に関与するアッセイコンポーネントに付随する発光団または発蛍光団を使って直接的に、または別の（例えばレポーターまたは指示薬）コンポーネントに付随する発光団または発蛍光団を使って間接的に生成させることができる。シグナルを生じるルミネセントラベルの例には、生物ルミネセンスおよび化学ルミネセンスがあるが、これらに限るわけではない。検出可能なルミネセンス応答は、一般に、ルミネセンスシグナルの変化またはルミネセンスシグナルの発生を含む。適切な方法およびルミネセンス標識アッセイコンポーネント用の発光団は当技術分野では知られており、Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｐ．（１９９６）「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ」（第６版）に記載されている。ルミネセントプローブの例には、エクオリンおよびルシフェラーゼがあるが、これらに限るわけではない。
【０１０９】
本明細書において使用する用語「イムノコンジュゲート」は、例えば細胞毒性剤、検出可能な薬剤、放射性薬剤、ターゲティング剤、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、合成抗体、半合成抗体、または多重特異性抗体などといった第２の薬剤と会合したまたは第２の薬剤と連結された抗体または抗体誘導体を含む。
【０１１０】
適切な蛍光ラベルの例には、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリスロシン、クマリン、メチル−クマリン、ピレン、マラカイトグリーン（Ｍａｌａｃｉｔｅ  ｇｒｅｅｎ）、スチルベン、ルシファーイエロー、カスケードブルー
（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ（商標））、およびテキサスレッドなどがあるが、これらに限るわけではない。他の適切な光学的色素は、Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｐ．（１９９６）「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ」（第６版）に記載されている。
【０１１１】
もう一つの態様では、細胞または組織の中または表面に存在する細胞コンポーネント、例えば細胞表面マーカーへの共有結合による結合が容易になるように、蛍光ラベルが官能化される。適切な官能基には、イソチオシアネート基、アミノ基、ハロアセチル基、マレイミド、スクシンイミジルエステル、およびハロゲン化スルホニルなどがあるが、これらに限るわけではなく、これらは全て、蛍光ラベルを第２の分子に結合させるために使用することができる。蛍光ラベルの官能基の選択は、リンカーへの結合部位、薬剤、マーカー、または第２標識化剤に依存するであろう。
【０１１２】
「真核細胞」は、モネラ界を除く全ての生物界を含む。これらは膜に結合した核によって容易に識別することができる。動物、植物、真菌、および原生動物は、真核生物、または細胞内膜および細胞骨格によって複雑な構造に組織化された細胞を持つ生物である。最も特徴的な膜結合構造は核である。特に言及する場合を除き、「宿主」という用語は、例えば酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞などの真核宿主を包含する。真核細胞または真核宿主の非限定的な例には、サル、ウシ、ブタ、マウス、ラット、トリ、爬虫類およびヒトが含まれる。
【０１１３】
通常は核または他のいかなる膜結合性細胞小器官も欠く「原核細胞」は、２つのドメイン、すなわち細菌と古細菌とに分割される。これらの細胞は、染色体ＤＮＡに加えて、エピソームと呼ばれる円形の輪にも遺伝情報を含有することができる。細菌細胞は非常に小さく、ほぼ動物ミトコンドリアのサイズである（直径約１〜２μｍ、長さ１０μｍ）。原核細胞は、桿状、球状、およびらせん状という３つの主要形状をとる。真核生物のように精巧な複製プロセスを経るのではなく、細菌細胞は二分裂によって分裂する。例として、バチルス細菌、大腸菌細菌、サルモネラ細菌などが挙げられるが、これらに限るわけではない。
【０１１４】
「ネイティブ」または「天然」抗原は、エピトープを含有するポリペプチド、タンパク質またはフラグメントであって、そのエピトープが天然の生物学的供給源から単離されたものであり、かつ抗原受容体、特に対象におけるＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）に特異的に結合することができるものである。
【０１１５】
用語「抗原」および「抗原性の」は、抗体によって認識されうる分子、または他の形で抗体−リガンド対のメンバーとして働きうる分子を指す。「特異的結合」とは、抗原と免疫グロブリン重鎖および軽鎖の可変領域との相互作用を指す。抗体−抗原結合はインビボまたはインビトロで起こりうる。タンパク質、核酸、脂肪酸、脂質、リポ多糖および多糖などの高分子が抗原として作用する潜在的可能性を有することは、当業者には理解されるであろう。さらに、抗体リガンドとして作用する潜在的可能性を有するタンパク質をコードする核酸が必然的に抗原をコードすることも、当業者には理解されるであろう。さらに、抗原が完全長分子に限定されず、部分的分子もこれに包含されうることは、当業者には理解されるであろう。用語「抗原性の」は、抗原の性質を有する分子への形容詞的言及である。この用語は、免疫原性である物質、すなわち免疫原、ならびに免疫学的不応性またはアネルギーを誘発する物質、すなわちアネルゲン（ａｎｅｒｇｅｎ）を包含する。
【０１１６】
「改変抗原」は、対応する野生型抗原とは異なる一次配列を有するものである。改変抗原は合成法または組換え法で作ることができ、翻訳中または翻訳後に例えばリン酸化、グリコシル化、架橋、アシル化、タンパク質分解による切断、抗体分子、膜分子または他のリガンドへの連結などによって異なる修飾を受けた抗原ペプチドが含まれるが、これらに限るわけではない（Ｆｅｒｇｕｓｏｎら（１９８８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７：２８５−３２０）。本発明の合成抗原または改変抗原は天然エピトープと同じＴＣＲに結合するものとする。
【０１１７】
「自己抗原」は、本明細書ではネイティブ抗原または野生型抗原とも呼ばれ、その抗原に対する自己寛容ゆえに、対象においてほとんどまたは全く免疫応答を誘発しない抗原ペプチドである。自己抗原の例は、黒色腫特異抗原ｇｐ１００である。
【０１１８】
「ＳＵＰＲ」は「Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｕｎｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ（スキャニング非天然プロテアーゼ耐性）」ペプチドの頭字語であり、その例を図２に示す。具体例は、ペプチドＭＦＹＡＹＥＹＡＱＷＳＫ（ここでＡはＮ−メチルアラニンである）である。
【０１１９】
用語「経口取り込み」は、経口消費後に血流にアクセスする化合物のパーセントである経口バイオアベイラビリティと同義である。
【０１２０】
［開示を実行するための形態］
方法、ｍＲＮＡ、ライブラリー、ポリペプチドおよびタンパク質
一態様において、本発明は、１つ以上の安定かつバイオアベイラブルなペプチドをコードする１つ以上のＲＮＡメンバーを、ｍＲＮＡライブラリーから選択するための方法を提供する。本方法は、ペプチドをコードする配列を含有するｍＲＮＡライブラリーから選択すること、を含むか、あるいは、から本質的になるか、さらにまたは、からなり、ここで、ｍＲＮＡライブラリーの１つ以上のメンバーは、１つ以上の非天然アミノ酸および／または終止コドンを含有し、１つ以上のメンバーによってコードされるペプチドが、予め決定された特異性および安定性に関して選択され、それによって、１つ以上の安定かつバイオアベイラブルなペプチドをコードする１つ以上のＲＮＡに関して選択する。１つ以上のメンバーを選択するための方法をここに説明する。非限定的な例には、インビトロまたはインビボ機能、例えばプロテアーゼ耐性および／またはＨｅｒ−２受容体などの予め選択されたターゲットに結合する能力、タンパク質−タンパク質相互作用を破壊する能力、および／または酵素修飾に耐える能力などに関してスクリーニングすることが含まれる。
【０１２１】
この開示は、予め決定された特異性に関して選択されたペプチドのライブラリーを、安定性を付加するアミノ酸が組み込まれるように変異させること、そして次に１つ以上の終止コドンを組み込むこと、を含むか、あるいは、から本質的になるか、さらにまたは、からなる、１つ以上の安定かつバイオアベイラブルなペプチドをコードする１つ以上のＲＮＡを調製するための方法も提供する。もう一つの態様では、本方法はさらに、ペプチドのライブラリーをＲＮＡライブラリーに逆翻訳すること；ＲＮＡライブラリーの個々の配列の１つ以上を環化させること；およびｍＲＮＡライブラリーの個々の配列を、プロテアーゼ耐性に関して選択すること、を含むか、あるいは、から本質的になるか、さらにまたは、からなり、それによって、１つ以上の安定かつバイオアベイラブルなペプチドをコードする１つ以上のＲＮＡに関して選択する。予め決定された特異性の一例はＨｅｒ−２抗原である。検討されるもう一つの例は、Ｇαｉ１へのＧＩＢＰ結合である。どのタンパク質と結合パートナーでも機能するであろう。例えばタンパク質と、抗体、内在性結合パートナー、例えばリボソームディスプレイ、ファージディスプレイ、またはｍＲＮＡディスプレイなどの選択プロセスによって見いだされるペプチドも、本発明の範囲に包含される。安定性を付加するアミノ酸は当技術分野では知られており、限定するわけではないが、これにはＮ−メチルアミノ酸が含まれる。Ｎ−メチルアミノ酸の例には、Ｎ−メチルノルバリンまたはＮ−メチルアラニン、あるいは安定性を付与するアミノ酸への任意の修飾、例えばプロリン、Ｄ−アミノ酸、ベータアミノ酸、ペプトイド、および２−アミノイソ酪酸
（Ａｉｂ）またはリボソーム的にはコードされていない任意のアミノ酸などがあるが、これらに限るわけではない。一態様では、１つ以上のｍＲＮＡが、ライブラリーから単離される。
【０１２２】
一態様において、本方法はさらに、１つ以上の選択されたＲＮＡをペプチドに翻訳すること、を含むか、あるいは、から本質的になるか、さらにまたは、からなる。
【０１２３】
ここに開示する方法を使用することで、安定なペプチドが生成した。したがって、一態様において、本開示は、次に挙げる群のアミノ酸配列、を含むか、あるいは、から本質的になるか、さらにまたは、からなる非天然型ペプチドを提供する：ａ）ＭＡＶＹＶＨＹＨＫ、ここで、１番目はＭｅｔまたは（ノルバリン、アラニン、ノルロイシン）であり；２番目はＡｌａまたは（Ｖ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｑ、Ｎ、Ｌ、Ｖ、Ｉ）であり、３番目はＮ−メチルノルバリンまたは（Ｓ、Ｔ、Ｑ、Ｎ、Ｈ、Ｐ、Ｉ、Ｖ、Ｌ、Ｙ、Ｆ、Ｐ）であり；４番目はＴｙｒまたは（Ｖ、Ｙ、Ｆ、Ｑ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｈ）であり；５番目はＮ−メチルノルバリンまたは（Ｙ、Ｆ、Ｓ、Ｔ、Ｅ、Ｄ、Ｍ、Ａ、Ｐ）であり；６番目はＨｉｓまたは（Ｖ、Ｙ、Ｆ、Ｑ、Ｎ）であり；７番目はＨｉｓまたは
（Ｖ、Ｆ、Ｙ、Ｖ、Ｉ、Ｌ）であり；８番目はＨｉｓまたは任意のアミノ酸であり、９番目はＬｙｓまたは（リジン誘導体、例えばＯｒｎ）である；ｂ）ＭＦＶＱＶＹＹＨＫ、ここで、１番目はＭｅｔまたは（ノルバリン、ノルロイシン、アラニン）であり；２番目はＰｈｅまたは任意のアミノ酸であり；３番目はＮ−メチルノルバリンまたは（Ｑ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｈ、Ｙ、Ｆ、Ｐ）であり；４番目はＧｌｎまたは（Ｙ、Ｆ、Ｖ、Ｐ、Ｓ、Ｔ）であり；５番目はＮ−メチルノルバリンまたは（Ｙ、Ｆ、Ｓ、Ｔ、Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｍ）であり；６番目はＴｙｒまたは（Ｆ、Ｈ）であり；７番目はＴｙｒまたは（Ｆ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｓ、Ｔ、Ｖ）であり；８番目はＨｉｓまたは（Ｔ、Ｓ）であり；９番目はＬｙｓまたは（リジン誘導体、例えばＯｒｎ）である；ｃ）ＭＬＨＹＶＹＶＲＫ、ここで、１番目はＭｅｔまたは（ノルバリン、ノルロイシン、アラニン）であり；２番目はＬｅｕまたは（Ｉ、Ｖ）であり；３番目はＨｉｓまたは（Ｙ、Ｆ）であり；４番目はＴｙｒまたは（Ｆ）であり；５番目はＮ−メチルノルバリンまたは（Ｓ、Ｔ、Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｍ、Ｐ）であり；６番目はＴｙｒまたは（Ｈ、Ｑ、Ｎ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｖ）であり；７番目はＮ−メチルノルバリンまたは（Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｈ、Ｐ）であり；８番目はＡｒｇまたは任意のアミノ酸であり；９番目はＬｙｓまたは（リジン誘導体、例えばＯｒｎ）である；ｄ）ＭＶＣＶＶＬＹＤＤＫ、ここで、１番目はＭｅｔまたは（ノルバリン、ノルロイシン、アラニン）であり；２番目はＶａｌまたは（Ｉ、Ｌ）であり；３番目はＣｙｓであり；４番目はＮ−メチルノルバリンまたは（Ｙ、Ｆ、Ｐ、Ｄ、Ｅ、Ｍ）であり；５番目はＮ−メチルノルバリンまたは（Ｙ、Ｆ、Ｄ、Ｅ、Ｗ、Ｃ、Ｇ、Ｐ）であり；６番目はＬｅｕまたは（Ｙ、Ｆ、Ｖ、Ｖ、Ｉ、Ｐ、Ｃ）であり；７番目はＴｙｒまたは（Ｖ、Ｅ、Ｄ）であり；８番目はＡｓｐまたは（Ｓ、Ｔ、Ｅ、Ｙ、Ｆ、Ａ、Ｐ、Ｖ）であり；９番目はＡｓｐまたは（Ｅ、Ｇ、Ｌ、Ｉ、Ｖ）であり；１０番目はＬｙｓまたは（リジン誘導体、例えばＯｒｎ）である；ｅ）ＭＥＶＹＥＹＶＳＬＫ、ここで、１番目はＭｅｔまたは（ノルバリン、ノルロイシン、アラニン）であり；２番目はＧｌｕまたは任意のアミノ酸であり；３番目はＮ−メチルノルバリンまたは（Ｐ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｑ、Ｎ）であり；４番目はＴｙｒまたは（Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｖ、Ｐ）であり；５番目はＧｌｕまたは（Ｄ、Ｙ、Ｆ、Ｐ、Ｖ）であり；６番目はＴｙｒまたは（Ｆ、Ｌ、Ｖ、Ｉ、Ｐ、Ｖ）であり；７番目はＮ−メチルノルバリンまたは（Ｆ、Ｌ、Ｖ、Ｉ、Ｐ、Ｖ）であり；８番目はＳｅｒまたは他の任意のアミノ酸であり；９番目はＬｅｕまたは他の任意のアミノ酸であり；１０番目はＬｙｓまたは（リジン誘導体、例えばＯｒｎ）である；ｆ）ＭＮＥＹＶＬＹＶＬＫ、ここで、１番目はＭｅｔまたは（ノルバリン、ノルロイシン、アラニン）であり；２番目はＡｓｎまたは任意のアミノ酸であり；３番目はＧｌｕまたは（Ｄ、Ｉ、Ｖ、Ｌ、Ｆ、Ｙ、Ｐ、Ｖ）であり；４番目はＴｙｒまたは（Ｄ、Ｅ、Ｐ、Ｖ）であり；５番目はＮ−メチルノルバリンまたは（Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｙ、Ｇ、Ｃ、Ｐ）であり；６番目はＬｅｕまたは（Ｙ、Ｆ、Ｐ、Ｖ）であり；７番目はＴｙｒまたは（Ｆ、Ｖ、Ｉ、Ｌ）であり；８番目はＮ−メチルノルバリンまたは（Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｆ、Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｐ）であり；９番目はＬｅｕまたは（Ｋ、Ｒ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｓ、Ｔ）であり；１０番目はＬｙｓまたは（リジン誘導体、例えばＯｒｎ）である；
また、上記のそれぞれについて、Ｖは上に開示したとおりであるか、あるいは、安定性を付与するアミノ酸、例えばＮ−メチルアミノ酸である。
【０１２４】
ペプチドを、ジスルフィド結合を介してビオチン分子またはビオチンアナログにコンジュゲートするか、パルミトレイン酸にコンジュゲートすることによって、ペプチドをさらに修飾することができる。それらの非限定的な例として、還元可能なビオチン分子；ペプチドのリジンの側鎖上のビオチン；アミド結合またはエステル結合を介してペプチドに連結されたビオチンが挙げられる。ペプチドをビオチン分子におよび／またはビオチンアナログをペプチドにコンジュゲートするための方法は、当技術分野では知られており、本明細書にも開示する。それらの例には、ＰＥＧ化、ビオチン化、または脂質化が含まれるが、これらに限るわけではない。
【０１２５】
ペプチドコンジュゲートのさらなる具体例は、インスリンまたはアミノ酸配列ＭＦＹＡＹＥＹＡＱＷＳＫＫ−ｍｏｄ（ここで、ＡはＮ−メチルアラニンであり、Ｋ（ｍｏｄ）は、ビオチン、ビオチンアナログまたはパルミトレイン酸を含む修飾側鎖を有するリジンである）を含む。
【０１２６】
この開示は、適切な結合、例えばジスルフィド結合を介して、Ｎ末端および／またはＣ末端でビオチン分子またはビオチンアナログに連結された、直鎖状または環状のペプチドを含むコンジュゲートも提供する。一態様では、ビオチンアナログが還元可能なビオチン分子である。もう一つの態様では、ペプチドコンジュゲートが、リジンの側鎖上でビオチンに連結されたペプチド、あるいはアミド結合を介してビオチンに連結されたペプチド、あるいはエステル結合を介してビオチンに連結されたペプチドを含む。これらのペプチドコンジュゲートは経口送達に適しているので、経口送達に適した製剤も、ここに提供される。
【０１２７】
コンジュゲートのペプチドのサイズに制限されるつもりはないが、いくつかの代替的実施形態には、ペプチドが、インスリンの４〜５０アミノ酸、あるいは４〜３０アミノ酸、あるいは４〜１００アミノ酸を含むコンジュゲートが含まれる。ペプチドの例として、表２に１〜１０として特定するアミノ酸配列が挙げられる。
【０１２８】
ビオチンアナログの非限定的な例には、デヒドロビオチン、イミノビオチン、ビオチンアミン、ジアミノビオチン、デスチオビオチン、ハロゲン化ビオチン、長鎖ビオチン、およびビオチン−ＰＥＧなどがある。ペプチドをＰＥＧ化する方法は当技術分野では知られており、例えばＭｅｒｏら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１１，Ｖｏｌ．７５１，Ｐａｒｔ．１，９５−１２９；およびＧｏｎｅｎ−Ｗａｄｍａｎｙａら（２０１１）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ３２（２６）：６０２５−６０３３などに記載されている。
【０１２９】
あるいは、ペプチドコンジュゲートは、ビオチンまたはビオチンアナログの代わりに不飽和脂肪酸を含有する。その一例はパルミトレイン酸である。
【０１３０】
本開示のペプチドコンジュゲートは、Ｎ−メチルアミノ酸（例えばＮ−メチルアラニンまたはＮ−メチルノルバリン）修飾ペプチドを有するペプチド、またはペプチドに安定性を付与する修飾を持つ修飾アミノ酸を有するペプチドを含有する。その例を本明細書に記載する。
【０１３１】
さらなる一態様では、本明細書に記載するペプチドコンジュゲートが、アミノ酸配列がリジンからＮ末端へと環化されているペプチドを含む。
【０１３２】
もう一つの態様では、診断的および／または治療的使用のために、ペプチドおよび／またはコンジュゲートを担体、例えば医薬上許容され得る担体と組み合わせることができる。
【０１３３】
もう一つの態様では、ｍＲＮＡまたはペプチドが単離される。それらはさらに、インビボ治療有用性、例えば、がん細胞または前がん細胞の成長を阻害するかがん細胞または前がん細胞を殺す能力に関して、スクリーニグすることができる。インビボ有用性に関してペプチドをさらにスクリーニングするための方法を本明細書に開示する。
【０１３４】
本明細書に開示する方法によってそれぞれ調製される、単離ＲＮＡライブラリー；単離ペプチドライブラリー；単離ペプチドも開示する。これらは、本明細書に開示するように、担体、例えば医薬上許容され得る担体と組み合わせることができる。
【０１３５】
ポリヌクレオチドの複写と発現については、精製、化学合成および組換え法を含む、当業者に知られているいくつかのプロセスによって、ペプチド、タンパク質およびポリペプチドを得ることができる。ポリペプチドは、抗体による免疫沈降などの方法、ならびにゲル濾過、イオン交換、逆相およびアフィニティークロマトグラフィーなどの標準的技法によって、宿主細胞系などの調製物から単離することができる。そのような方法論については、例えばＤｅｕｔｓｃｈｅｒら（１９９９）「Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」（Ｖｏｌ．１８２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）を参照されたい。したがって本開示は、これらのポリペプチドを得るためのプロセス、ならびにこれらのプロセスによって得ることができる製品およびこれらのプロセスによって得られた製品も提供する。
【０１３６】
市販の自動ペプチド合成装置、例えばＰｅｒｋｉｎ／Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．によって製造されているもの、モデル４３０Ａまたは４３１Ａ（米国カリフォルニア州フォスターシティ）を使った化学合成によってポリペプチドを得ることもできる。合成されたポリペプチドは沈殿させ、例えば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって、さらに精製することができる。したがって、本開示は、タンパク質の配列と試薬類、例えばアミノ酸および酵素とを用意し、アミノ酸を適正な配向および直線的配列で一つに連結することによって、本開示のタンパク質を化学的に合成するためのプロセスも提供する。
【０１３７】
あるいは、タンパク質およびポリペプチドは、例えば前出のＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）などに記載されている周知の組換え法により、本明細書に記載する宿主細胞およびベクター系を使って得ることもできる。ポリペプチドは、抗体による免疫沈降などの方法、ならびにゲル濾過、イオン交換、逆相およびアフィニティークロマトグラフィーなどの標準的技法によって、宿主細胞系などの調製物から単離することができる。そのような方法論については、例えばＤｅｕｔｓｃｈｅｒら（１９９９）「Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」
（Ｖｏｌ．１８２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）を参照されたい。したがって本開示は、これらのポリペプチドを得るためのプロセス、ならびにこれらのプロセスによって得ることができる製品およびこれらのプロセスによって得られた製品も提供する。
【０１３８】
また本願は、治療方法または診断方法において使用するための、検出可能な薬剤にコンジュゲートされた本明細書に記載するペプチドも提供する。例えば、検出可能に標識されたペプチドをカラムに結合して、抗体の検出と精製に使用することができる。それらは、抗体を生産するための免疫原としても役立つ。本開示のペプチドは、細胞プロセスを調整する薬剤または薬物に関してスクリーニングするためのインビトロアッセイ系において役立つ。例えば、検出可能に標識されたペプチドをカラムに結合して、抗体の検出と精製に使用することができる。
【０１３９】
本開示のペプチドに修飾を加えて、それらに改変された性質を与えうることは、当業者にはよく知られている。本明細書において使用する用語「アミノ酸」は、天然および／または非天然もしくは合成アミノ酸を指し、グリシン、ならびにＤ光学異性体またはＬ光学異性体の両方、ならびにアミノ酸アナログおよびペプチドミメティックを包含する。３アミノ酸以上のペプチドは、そのペプチド鎖が短ければ、一般にオリゴペプチドと呼ばれる。ペプチド鎖が長ければ、ペプチドは一般にポリペプチドまたはタンパク質と呼ばれる。
【０１４０】
本開示のペプチドは非天然アミノ酸を含むように修飾されうる。したがってペプチドは、ペプチドに特別な性質を伝達するために、Ｄ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸とＬ−アミノ酸の組み合わせ、およびさまざまな「デザイナー」アミノ酸（例えばβ−メチルアミノ酸、Ｃ−α−メチルアミノ酸、およびＮ−アルファ−メチルアミノ酸など）を含みうる。加えて、特異的カップリングステップに特異的アミノ酸を割り当てることによって、αヘリックス、βターン、βシート、γターンを持つペプチド、および環状ペプチドを生成させることができる。一般的には、αヘリックス二次構造またはランダム二次構造が好ましいと考えられる。
【０１４１】
本開示のペプチドは、さまざまな固相担体、例えばインプラント、ステント、ペースト、ゲル、歯科インプラント、もしくは医用インプラント、または液相担体、例えばビーズ、滅菌または水性溶液，医薬上許容され得る担体、医薬上許容され得るポリマー、リポソーム、ミセル、懸濁液およびエマルションと組み合わせることもできる。非水性溶媒の例には、プロピルエチレングリコール、ポリエチレングリコールおよび植物油などがある。
【０１４２】
本発明のペプチドは、担体、例えば医薬上許容され得る担体を、さらに含むことができる。一態様では、担体が経口投与に適したものである。
【０１４３】
一態様において、ペプチドは、がんの処置を必要とする対象におけるがんの処置に、あるいはそれとは別に、糖尿病、前糖尿病または関連する状態もしくは障害の処置を必要とする対象における血糖値の調節またはそれらの処置であって、対象に有効量の適切な本開示のペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、コンジュゲートまたは組成物を投与することを含むものに役立つ。一態様では、対象がヒト患者である。
【０１４４】
候補薬剤が経口投与に適した潜在的治療薬であるかどうかを決定するための方法であって、候補薬剤を対象に投与しバイオアベイラビリティに関してアッセイすること、および候補薬剤のバイオアベイラビリティを本開示のペプチドコンジュゲートのバイオアベイラビリティと比較することを含み、薬剤のバイオアベイラビリティが本開示のペプチドコンジュゲートのバイオアベイラビリティと少なくとも実質的に等価であれば、その候補薬剤が潜在的治療薬である方法も提供される。
【０１４５】
さらに、本明細書に記載のペプチドコンジュゲートと使用説明書と、を含むか、あるいは、から本質的になるか、さらにまたは、からなる、候補薬剤が経口投与に適した潜在的治療薬であるかどうかを決定するためのキットも提供される。
【０１４６】
本開示は、単独の、または互いに、もしくは他の薬剤と組み合わされた、本開示のペプチド、アナログ、ムテイン、またはフラグメントのいずれかと、許容され得る担体または固形支持体と、を含むか、あるいは、から本質的になるか、さらにまたは、からなる、医薬組成物も提供する。これらの組成物は、本明細書に記載するさまざまな診断方法および治療方法に役立つ。
【０１４７】
ポリヌクレオチド
本開示は、上述したペプチドの１つ以上をコードする単離ポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドおよびそれら各々の相補鎖も提供する。さらに、それら単離ポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドを含むベクターも提供され、その例は、当技術分野では知られており、本明細書でも簡単に説明する。２つ以上の単離ポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドを単一の単位として発現させようとする一態様では、ポリシストロニックベクター内に、単離ポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドを含めることができる。ポリヌクレオチドは、ＤＮ
Ａ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡまたは干渉ＲＮＡ、例えばｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはｄｓＲＮＡであることができる。
【０１４８】
本開示はさらに、ＲＮＡ転写のプロモーターならびにＤＮＡまたはＲＮＡの複製および／または一過性もしくは安定発現のための他の調節配列に作動的に連結された単離ポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドを提供する。本明細書において使用する用語「作動的に連結された」は、そのプロモーターがＤＮＡ分子からのＲＮＡの転写を指示するような位置にあることを意味する。そのようなプロモーターの例は、ＳＰ６、Ｔ４およびＴ７である。一定の実施形態では、細胞特異的プロモーターが、挿入されたポリヌクレオチドの細胞特異的発現に使用される。プロモーターまたはプロモーター／エンハンサーを、終結コドンおよび選択可能マーカー配列、ならびに挿入されるＤＮＡ片を前記プロモーターに作動的に連結することができるクローニング部位と共に含有するベクターは、当技術分野では知られており、市販されている。一般的な方法論およびクローニング戦略については、「Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」（Ｇｏｅｄｄｅｌ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９１））およびそこに言及されている参考文献、ならびに種々の適切なベクターについてマップ、機能的性質、供給業者およびＧｅｎＥＭＢＬアクセッション番号への言及が掲載されている「Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｄａｔａ  Ｓｅｒｉｅｓ」（ＧａｃｅｓａおよびＲａｍｊｉ編，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ニューヨーク（１９９４））を参照されたい。
【０１４９】
一実施形態では、本開示のポリヌクレオチドから誘導されるポリヌクレオチドが、本明細書に記載するような診断的および治療的有用性を有するポリペプチドまたはタンパク質、ならびに存在するかもしれないし存在しないかもしれないタンパク質の転写産物を同定するためのプローブをコードする。
【０１５０】
これらの核酸を含有する発現ベクターは、タンパク質およびポリペプチドを生産するための宿主ベクター系を得るのに有用である。これは、これらの発現ベクターが宿主生物内でエピソームとしてまたは染色体ＤＮＡの不可分な一部として複製可能でなければならないことを含意する。適切な発現ベクターの非限定的な例には、プラスミド、酵母ベクター、ウイルスベクターおよびリポソームなどがある。アデノウイルスベクターは、インビトロでもインビボでも発現レベルが高く、細胞の形質転換効率がよいので、遺伝子をインビボの組織中に導入するのにとりわけ有用である。核酸が原核細胞または真核細胞などの適切な宿主細胞中に挿入され、宿主細胞が複製すると、タンパク質が組換え生産されうる。適切な宿主細胞はベクターに依存し、これには、既知の方法によって構築された哺乳動物細胞、動物細胞、ヒト細胞、サル細胞、昆虫細胞、酵母細胞、および細菌細胞が含まれる。前出のＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）を参照されたい。ウイルスベクターを使った細胞への外因性核酸の挿入に加えて、当技術分野において知られている方法、例えば細菌細胞の形質転換；リン酸カルシウム沈殿を使った哺乳動物細胞のトランスフェクション；またはＤＥＡＥ−デキストラン；エレクトロポレーション；またはマイクロインジェクションなどによって、核酸を宿主細胞中に挿入することもできる。方法論については前出のＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）を参照されたい。したがって本開示は、タンパク質またはポリペプチドまたは抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞、例えば哺乳動物細胞、動物細胞（ラットまたはマウス）、ヒト細胞、または原核細胞、例えば細菌細胞も提供する。
【０１５１】
ベクターをインビボまたはエクスビボでの遺伝子療法に使用する場合は、複製不能なレトロウイルスまたはアデノウイルスベクターなどの医薬上許容され得るベクターが好ましい。本開示の核酸を含有する医薬上許容され得るベクターは、挿入されたポリヌクレオチドの一過性発現または安定発現のためにさらに修飾することができる。本明細書において使用する用語「医薬上許容され得るベクター」には、分裂細胞中に核酸を選択的にターゲティングし導入する能力を有するベクターまたは送達媒体などが含まれるが、これらに限るわけではない。そのようなベクターの一例は、ウイルスタンパク質を生産する能力を持たず、感染宿主細胞におけるベクターの蔓延が阻止されるという性質によって定義される「複製不能な」ベクターである。複製不能なレトロウイルスベクターの一例はＬＮＬ６（Ｍｉｌｌｅｒら（１９８９）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ７：９８０−９９０）である。遺伝子マーカーのレトロウイルス媒介遺伝子導入を行うために複製不能なレトロウイルスを使用する方法論は確立されている（Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎ（１９８９）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８６：８９１２−８９５２；Ｃｕｌｖｅｒ（１９９１）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８８：３１５５；およびＲｉｌｌ（１９９１）Ｂｌｏｏｄ  ７９（１０）：２６９４−２７００）。
【０１５２】
本開示は、本開示のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含有しかつ／または発現する遺伝子修飾細胞も提供する。プロモーターまたは遺伝子活性化因子などの上流調節配列の挿入によって（米国特許第５，７３３，７６１号参照）、または本開示のペプチドの挿入によって、遺伝子修飾細胞を作出することができる。
【０１５３】
ポリヌクレオチドは、細胞における核酸および／または遺伝子の発現を検出するために、例えば酵素ラベルまたは放射性同位体などの検出可能マーカーにコンジュゲートすることもできる。検出可能なリガンドを与える能力を有する、蛍光リガンド、放射性リガンド、酵素リガンドまたは他のリガンド、例えばアビジン／ビオチンなどといった、多種多様な適当な検出可能マーカーが、当技術分野では知られている。一態様では、放射性試薬または環境上望ましくない他の試薬の代わりに、蛍光ラベルまたは酵素タグ、例えばウレアーゼ、アルカリホスファターゼまたはペルオキシダーゼなどを使用することが望まれるだろう。酵素タグの場合、相補的核酸を含有する試料との特異的ハイブリダイゼーションを同定するために、ヒトの眼に見えるまたは分光光度法で見ることができる手段が得られるように、比色指示物質を使用することができる。したがって本開示はさらに、ターゲット一本鎖ポリヌクレオチドを、本開示のポリヌクレオチドの一部分である標識一本鎖ポリヌクレオチド（プローブ）と、相補的一本鎖ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを許す条件（好ましくは中等度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件）下で、より好ましくは高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、接触させることによって、一本鎖ポリヌクレオチドまたはその相補体を検出するための方法を提供する。ハイブリダイズしたポリヌクレオチド対を、ハイブリダイズしていない一本鎖ポリヌクレオチドから分離する。ハイブリダイズしたポリヌクレオチド対は、当業者に知られていて例えば前出のＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）にも記載されている方法を使って、検出される。
【０１５４】
本開示において体現されるポリヌクレオチドは、化学合成、組換えクローニング法、ＰＣＲ、またはそれらの任意の組み合わせを使って得ることができる。化学的ポリヌクレオチド合成の方法は当技術分野では知られており、ここで詳しく説明する必要はない。当業者は、ここに提供する配列を使用し、ＤＮＡ合成装置を用いることによって、または商業的サービスに注文することによって、所望のポリヌクレオチドを得ることができる。
【０１５５】
ポリヌクレオチドを増幅するための一方法はＰＣＲであり、ＰＣＲ増幅用のキットは市販されている。増幅後は、結果として生じたＤＮＡフラグメントを、当技術分野において知られている任意の適当な方法によって、例えばアガロースゲル電気泳動と、それに続く臭化エチジウム染色および紫外線照射による可視化とによって、検出することができる。
【０１５６】
本開示のポリヌクレオチドは、ＰＣＲを使って単離または複製することができる。ＰＣＲ技術は、米国特許第４，６８３，１９５号；同第４，８００，１５９号；同第４，７５４，０６５号；および同第４，６８３，２０２号の主題であり、「ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ」（Ｍｕｌｌｉｓら編，Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ  Ｐｒｅｓｓ，ボストン（１９９４））または前出のＭａｃＰｈｅｒｓｏｎら（１９９１）および（１９９５）、ならびにそこに言及されている参考文献に記載されている。あるいは、当業者は、ここに提供される配列と市販のＤＮＡ合成装置とを使って、ＤＮＡを複製することもできる。したがって本開示は、本開示のポリヌクレオチドを得るためのプロセスであって、ポリヌクレオチドの直線的配列、ヌクレオチド、適当なプライマー分子、酵素などの化学品、およびそれらの複製に関する説明書を用意し、適正な配向でヌクレオチドを化学的に複製または連結してポリヌクレオチドを得ることによるプロセスも提供する。別の実施形態では、これらのポリヌクレオチドがさらに単離される。さらにまた、当業者は、ポリヌクレオチドを適切な複製ベクターに挿入し、そのベクターを、複製および増幅のために、適切な宿主細胞（原核または真核）に挿入することができる。そうして増幅されたＤＮＡは、当業者に知られている方法によって細胞から単離することができる。さらに、この方法によってポリヌクレオチドを得るためのプロセスも、そうして得られるポリヌクレオチドと共に、ここに提供される。
【０１５７】
あるいは、まずＤＮＡポリヌクレオチドを適切な宿主細胞中に挿入することによって、ＲＮＡを得ることもできる。ＤＮＡは適当な方法によって、例えば適当な遺伝子送達媒体
（例えばリポソーム、プラスミドまたはベクター）の使用などによって、またはエレクトロポレーションによって、送達することができる。細胞が複製し、ＤＮＡがＲＮＡに転写されたら、次に、当業者に知られている方法を使って、例えば前出のＳａｍｂｒｏｏｋら
（１９８９）に記載されているように、ＲＮＡを単離することができる。例えばｍＲＮＡは、前出のＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）に記載の手順に従い、さまざまな溶解酵素または化学溶液を使って単離するか、または核酸結合レジンにより、製造者によって提供される添付の説明書に従って抽出することができる。
【０１５８】
本開示のポリヌクレオチドに対して配列相補性または配列相同性を示すポリヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションプローブとして、または本明細書に同定される特異的ポリヌクレオチドの等価物として役立つ。転写産物の全コード配列がわかっているので、この配列または相同配列の任意の部分を、本開示の方法で使用することができる。
【０１５９】
特異的ハイブリダイゼーションにとって「完全にマッチする」プローブが必要でないことは、当技術分野において知られている。小数の塩基の置換、欠失または挿入によって獲得されるプローブ配列の軽微な変化は、ハイブリダイゼーション特異性に影響を及ぼさない。一般に、２０％もの塩基対ミスマッチ（最適にアライメントした場合）を認容することができる。好ましくは、前述のｍＲＮＡを検出するのに有用なプローブは、相同領域に対して少なくとも約８０％同一である。より好ましくは、プローブは、相同領域のアライメント後に、対応する遺伝子配列に対して８５％同一であり；さらに好ましくは、９０％の同一性を呈する。
【０１６０】
これらのプローブは、さまざまな細胞またはそれらの細胞を含有する組織を検出し、予後を判定し、診断しまたは監視するためのラジオアッセイ（例えばサザンブロット解析およびノーザンブロット解析）に使用することができる。プローブは、固形支持体またはアレイ、例えば本開示のポリヌクレオチドに対応する遺伝子の発現を検出するためのハイスループットスクリーニングアッセイに使用するためのチップに結合させることもできる。したがって本開示は、本開示のポリヌクレオチドまたはその等価物またはその相補体またはそのフラグメントを含むか、またはそれらに対応するプローブであって、ハイスループットスクリーンにおいて使用するための固形支持体に結合されたものも提供する。
【０１６１】
フラグメントの総サイズならびに相補的ストレッチのサイズは、その特定核酸セグメントの意図する用途または応用に依存するであろう。小さなフラグメントは一般にハイブリダイゼーション実施形態に役立つであろう。この場合、相補的領域の長さはさまざまであり、検出しようとする相補的配列に応じて、少なくとも５ヌクレオチドから１０〜約１００ヌクレオチド、さらには全長であってもよい。
【０１６２】
ハイブリッドの安定性および選択性を増加させ、それによって、得られる特定ハイブリッド分子の特異性を改良するために、５〜１０ヌクレオチドを上回る長さのストレッチにわたって相補的配列を有するヌクレオチドプローブが一般に好ましい。より好ましくは、長さが１０ヌクレオチド以上または５０ヌクレオチドを上回る、または所望であればさらに長い、遺伝子相補的ストレッチを有するポリヌクレオチドを設計することができる。そのようなフラグメントは、例えば化学的手段によってフラグメントを直接合成すること、米国特許第４，６０３，１０２号に記載されているように２つのプライミングオリゴヌクレオチドを使ったＰＣＲ技術などの核酸複写技術を応用すること、または組換え生産用の組換えベクター中に選択した配列を導入することなどによって、容易に調製することができる。一態様では、プローブの長さが約５０〜７５ヌクレオチド以上、あるいは５０〜１００ヌクレオチドである。
【０１６３】
本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に記載する細胞中で発現する遺伝子または遺伝子転写産物を検出するためのプライマーとして役立ちうる。この文脈において、増幅とは、ターゲット配列を妥当な忠実度で複製する能力を有するプライマー依存的ポリメラーゼを使用する任意の方法を意味する。増幅は、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメント、および逆転写酵素などといった、天然または組換えＤＮＡポリメラーゼによって行うことができる。単なる例示に過ぎないが、プライマーは、プローブについて述べたものと同じ長さである。
【０１６４】
有効量の遺伝子送達ベクターまたは媒体を細胞に投与するための方法は開発されており、当業者には知られているし、本明細書でも説明する。細胞における遺伝子発現を検出するための方法は当技術分野において知られており、ＤＮＡマイクロアレイへのハイブリダイゼーション、インサイチューハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、ＲＮアーゼ保護アッセイおよびノーザンブロット解析などの技術が、これに含まれる。そのような方法は、細胞における遺伝子の発現を検出し定量するのに役立つ。あるいは、コードされているポリペプチドの発現を、さまざまな方法によって検出することもできる。特に、ターゲットポリペプチドと特異的に反応するポリクローナルまたはモノクローナル抗体を調製することは有用である。そのような抗体は、ポリペプチドを発現する細胞を、免疫組織学、ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロッティングなどの技法を使って可視化するのに役立つ。これらの技法を使って、発現したポリヌクレオチドの発現レベルを決定することができる。
【０１６５】
組成物
さらに組成物が提供される。本組成物は、担体と、本開示の単離ｍＲＮＡ、本開示の単離ポリペプチド、本開示の単離ポリヌクレオチド、本開示のベクター、本開示の単離宿主細胞、または本開示の抗体の１つ以上とを含む。担体は固形支持体または医薬上許容され得る担体の１つ以上であることができる。本組成物は、アジュバントまたはワクチンとして投与するのに適した他のコンポーネントをさらに含むことができる。一態様では、本組成物が、１つ以上の医薬上許容され得る補形薬、希釈剤、担体および／またはアジュバントと共に製剤化される。加えて、本開示の組成物の実施形態は、１つ以上の医薬上許容され得る補助物質と共に製剤化された本開示の単離ポリペプチド、本開示の単離ポリヌクレオチド、本開示のベクター、本開示の単離宿主細胞、または本開示の抗体の１つ以上を含む。
【０１６６】
経口調製物の場合、本明細書に記載する単離ポリペプチドまたは組換えポリペプチド、本明細書に記載の単離ポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチド、本明細書に記載のベクター、本明細書に記載の単離された宿主細胞の任意の１つ以上を、単独で使用するか、あるいは、錠剤、粉末剤、顆粒剤またはカプセル剤を作るための適当な添加剤と組み合わされた、例えば、ラクトース、マンニトール、トウモロコシデンプンまたはバレイショデンプンなどの従来の添加剤と組み合わされた；結晶セルロース、セルロース誘導体、アラビアゴム、トウモロコシデンプンまたはゼラチンなどの結合剤と組み合わされた；トウモロコシデンプン、バレイショデンプンまたはカルボキシメチルセルロースナトリウムなどの崩壊剤と組み合わされた；タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤と組み合わされた；そして所望であれば、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存剤および矯味矯臭剤と組み合わされた、本開示のペプチドもしくは他の薬剤を含む、もしくはそれらから本質的になる、本開示の医薬製剤に入れて、使用することができる。医薬的に適合し得る結合剤および／またはアジュバント材料を、組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、以下の成分、または類似の性質を持つ化合物をどれでも含有することができる：微晶性セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチンなどの結合剤；デンプンまたはラクトースなどの補形薬、アルギン酸、プリモジェル（Ｐｒｉｍｏｇｅｌ）、またはトウモロコシデンプンなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはステロート（Ｓｔｅｒｏｔｅｓ）などの潤滑剤；コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤；スクロースまたはサッカリンなどの甘味剤；またはペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジフレーバーなどの矯味矯臭剤。
【０１６７】
経口投与に適した医薬製剤および単位剤形は、慢性状態、感染症の処置や、患者が薬物を自己投与する治療法では、とりわけ有用である。一態様では、製剤が小児への投与に特化している。
【０１６８】
本開示は、医薬製剤を提供する。本開示の単離ペプチド、本開示の単離ポリヌクレオチド、本開示のベクター、本開示の単離宿主細胞の１つ以上を、本開示に従って、それらを水性溶媒または非水性溶媒、例えば植物油または他の類似の油、合成脂肪族酸グリセリド、高級脂肪酸のエステルまたはプロピレングリコールに溶解、懸濁、または乳化することによって、また所望であれば、可溶化剤、等張化剤、懸濁化剤、乳化剤、安定剤および保存剤などの従来の添加剤、または他の抗がん剤と共に、投与用の調製物に製剤化することができる。静脈内投与の場合、適切な担体には生理食塩水またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）がある。いずれの場合も、非経口投与用の組成物は滅菌状態でなければならず、容易に注射できる程度の流動性を示すべきである。
【０１６９】
本開示が提供するエアロゾル製剤は吸入によって投与することができ、噴射剤ベースまたは非噴射剤ベースであることができる。例えば、本開示の医薬製剤の実施形態は、加圧された許容され得る噴射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などに製剤化された本開示のペプチドを含む。吸入による投与の場合、化合物は、エアロゾルスプレーの形態で、適切な噴射剤、例えば二酸化炭素などのガスを含有する加圧容器もしくはディスペンサーから、またはネブライザーから、送達することができる。非噴射剤の非限定的な例は、機械的力（すなわち、指によるピストンの押し下げ、または容器の圧縮、例えば容器の壁に加えられる圧縮力、または壁そのものが発揮する（例えば弾性の袋による）弾性力によるもの）を使って密閉容器から駆出されるポンプスプレーである。
【０１７０】
本開示の坐剤は、本開示の化合物を、乳化基剤または水溶性基剤などのさまざまな基剤のいずれかと混合することによって調製することができる。本開示の化合物のこの医薬製剤の実施形態は、坐剤として直腸投与することができる。坐剤は、体温では融解するが、室温では固化しているカカオ脂、カーボワックス、およびポリエチレングリコールなどの賦形剤を含むことができる。
【０１７１】
各投与単位、例えば小さじ１杯、大さじ１杯、錠剤または坐剤が、予め決定された量の、１つ以上の本開示の化合物を含有する組成物を含有する、経口投与または直腸投与用の単位剤形、例えばシロップ剤、エリキシル剤、および懸濁剤を提供することができる。同様に、注射用または静脈内投与用の単位剤形は、滅菌水、生理食塩水または他の医薬上許容され得る担体中の溶液としての組成物中に本開示の化合物を含みうる。
【０１７２】
本開示の医薬製剤の実施形態には、本開示の単離ポリペプチド、本開示の単離ポリヌクレオチド、本開示のベクター、本開示の単離宿主細胞、または本開示の抗体の１つ以上が注射可能な組成物に製剤化されているものが含まれる。本開示の注射可能な医薬製剤は、液状溶液または懸濁液として調製されるか、または注射前に液状賦形剤中に溶解または懸濁するのに適した固形として調製される。本開示の医薬製剤の他の実施形態では、調製物が乳化されているか、リポソーム媒体に封入された活性成分であることもできる。
【０１７３】
ある実施形態では、本開示の単離ポリペプチド、本開示の単離ポリヌクレオチド、本開示のベクター、本開示の単離宿主細胞、または本開示の抗体の１つ以上が、持続的送達システムによる送達のために製剤化される。「持続的送達システム」という用語は本明細書では「制御送達システム」と可換的に使用され、カテーテル、注射デバイスなどと組み合わされた持続的（例えば制御）送達デバイス（例えばポンプ）を包含し、当技術分野では、幅広く多様なものが知られている。
【０１７４】
機械式または電気機械式注入ポンプも本開示との使用に適している。そのようなデバイスの例には、例えば米国特許第４，６９２，１４７号；同第４，３６０，０１９号；同第４，４８７，６０３号；同第４，３６０，０１９号；同第４，７２５，８５２号；同第５，８２０，５８９号；同第５，６４３，２０７号；同第６，１９８，９６６号などに記載されているものが含まれる。一般に、本開示の化合物の送達は、さまざまな詰替可能ポンプシステムのいずれかを使って達成することができる。ポンプは経時的に一定の制御された放出をもたらす。いくつかの実施形態では、本開示の化合物が、薬物不透過性のリザーバーに入った液状製剤の形態にあり、個体に持続的に送達される。
【０１７５】
一実施形態では、薬物送達システムが少なくとも部分的に埋め込み型のデバイスである。埋め込み型デバイスは、任意の適切な埋め込み部位に、当技術分野において周知の方法およびデバイスを使って、埋め込むことができる。埋め込み部位とは、対象の身体内にあって、薬物送達デバイスが導入され、配置される部位である。必ずしも限定するわけではないが、埋め込み部位には、真皮下、皮下、筋肉内、または対象の身体内の他の適切な部位などがある。一部の実施形態では、薬物送達デバイスの埋め込みと取り出しに都合がよいので、皮下埋め込み部位が使用される。
【０１７６】
本開示における使用に適した薬物放出デバイスは、さまざまな作用様式のどれに基づいてもよい。例えば薬物放出デバイスは拡散系、対流系、または侵食系（例えば侵食に基づく系）に基づくことができる。例えば薬物放出デバイスは、電気化学的ポンプ、浸透圧ポンプ、電気浸透圧ポンプ、蒸気圧ポンプ、または浸透圧破裂マトリックス、例えば薬物がポリマーに組み込まれ、そのポリマーが薬物含浸ポリマー材料（例えば生分解性薬物含浸ポリマー材料）の分解に付随する薬物製剤の放出をもたらすものであることができる。別の実施形態では、薬物放出デバイスが、電気拡散系、電気分解ポンプ、発泡ポンプ、圧電ポンプ、加水分解系などに基づく。
【０１７７】
機械的または電気機械的注入ポンプに基づく薬物放出デバイスも、本開示との使用に適しうる。そのようなデバイスの例には、例えば米国特許第４，６９２，１４７号；同第４，３６０，０１９号；同第４，４８７，６０３号；同第４，３６０，０１９号；同第４，７２５，８５２号などに記載されているものが含まれる。一般に、対象処置法はさまざまな詰替可能、非交換式ポンプ系のいずれかを使って達成することができる。ポンプおよび他の対流系は、一般的には、経時的に、より一貫した制御放出が得られるので、一般に好ましい。浸透圧ポンプは、より一貫した制御放出と比較的小さなサイズという複合的利点ゆえに、一部の実施形態において使用される（例えばＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／２７８４０および米国特許第５，９８５，３０５号および同第５，７２８，３９６号を参照されたい）。必ずしも限定するわけではないが、本開示における使用に適した例示的浸透圧駆動デバイスには、米国特許第３，７６０，９８４号；同第３，８４５，７７０号；同第３，９１６，８９９号；同第３，９２３，４２６号；同第３，９８７，７９０号；同第３，９９５，６３１号；同第３，９１６，８９９号；同第４，０１６，８８０号；同第４，０３６，２２８号；同第４，１１１，２０２号；同第４，１１１，２０３号；同第４，２０３，４４０号；同第４，２０３，４４２号；同第４，２１０，１３９号；同第４，３２７，７２５号；同第４，６２７，８５０号；同第４，８６５，８４５号；同第５，０５７，３１８号；同第５，０５９，４２３号；同第５，１１２，６１４号；同第５，１３７，７２７号；同第５，２３４，６９２号；同第５，２３４，６９３号；同第５，７２８，３９６号などに記載されているものなどがある。本開示に適合させることができるさらにもう一つの例示的デバイスは、シンクロメッド注入ポンプ（Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ）である。
【０１７８】
いくつかの実施形態では薬物送達デバイスが埋め込み型デバイスである。薬物送達デバイスは、当技術分野において周知の方法およびデバイスを使って、任意の適切な埋め込み部位に埋め込むことができる。本明細書で述べたとおり、埋め込み部位とは、対象の身体内にあって、薬物送達デバイスが導入され、配置される部位である。必ずしも限定するわけではないが、埋め込み部位には、真皮下、皮下、筋肉内、または対象の身体内の他の適切な部位などがある。
【０１７９】
本開示のペプチドにとって適切な補形薬賦形剤は、例えば水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどと、それらの組み合わせである。加えて、所望であれば、賦形剤は、微量の補助物質、例えば湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含有してもよい。そのような剤形を調製する方法は知られており、または本開示を考慮すれば、当業者には明白であるだろう。例えば「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，ペンシルベニア州イーストン、第１７版、１９８５）を参照されたい。投与すべき組成物または製剤は、いずれにせよ、処置されている対象において所望の状態を達成するのに十分な量の化合物を含有するであろう。
【０１８０】
本開示の組成物には、持続放出マトリックスまたは制御放出マトリックスを含むものが含まれる。加えて、本開示の実施形態は、持続放出製剤を使用する他の処置と一緒に使用することもできる。本明細書にいう持続放出マトリックスは、酵素的加水分解もしくは酸に基づく加水分解または溶解によって分解しうる材料（通常はポリマー）から作られたマトリックスである。投与後に、マトリックスは酵素および体液の作用を受ける。持続放出マトリックスは、望ましくは、リポソーム、ポリラクチド（ポリ乳酸）、ポリグリコリド
（グリコール酸のポリマー）、ポリラクチド−コ−グリコリド（乳酸とグリコール酸のコポリマー）、ポリ無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリペプチド、ヒアルロン酸、コラーゲン、コンドロイチン硫酸、カルボン酸（ｃａｒｂｏｘｃｙｌｉｃ  ａｃｉｄｓ）、脂肪酸、リン脂質、多糖、核酸、ポリアミノ酸、アミノ酸、例えばフェニルアラニン、チロシン、イソロイシン、ポリヌクレオチド、ポリビニルプロピレン、ポリビニルピロリドンおよびシリコーンなどの生体適合性材料から選ばれる。生分解性マトリックスの実例には、ポリラクチドマトリックス、ポリグリコリドマトリックス、およびポリラクチド−コ−グリコリド（乳酸とグリコール酸のコポリマー）マトリックスなどがある。
【０１８１】
もう一つの実施形態では、ペプチド（ならびに複合組成物）が、制御放出系で送達される。例えば、本開示のペプチドは、静脈内注入、埋め込み型浸透圧ポンプ、経皮パッチ、リポソーム、または他の投与様式を使って投与することができる。一実施形態では、ポンプを使用することができる（Ｓｅｆｔｏｎ（１９８７）ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１；Ｂｕｃｈｗａｌｄら（１９８０）Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８：５０７；Ｓａｕｄｅｋら（１９８９）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４）。もう一つの実施形態では、ポリマー材料が使用される。さらにもう一つの実施形態では、制御放出系が治療ターゲット、すなわち肝臓の近傍に置かれ、したがって全身用量の一部分で足りるようになる。
【０１８２】
もう一つの実施形態において、本開示の組成物（ならびに個別の、または一つにされた、複合組成物）には、組成物を送達するために、本明細書に記載するペプチドを吸収性材料、例えば縫合糸、包帯、およびガーゼに含浸させるか、外科用ステープル、ジッパーおよびカテーテルなどの固相材料の表面にコーティングすることによって形成されるものが含まれる。このタイプの他の送達システムは本開示を考慮すれば当業者には容易に明白になるであろう。
【０１８３】
治療方法
さらに、処置を必要とする対象を処置するための方法であって、有効量の、本開示の方法によって得ることができるペプチド、本開示のコンジュゲートもしくは組成物、またはそれらの任意の組み合わせを対象に投与すること、を含む、から本質的になる、さらにまたは、からなる方法が提供される。
【０１８４】
ターゲット細胞、例えばがん細胞を、有効量の、本開示の方法によって得ることができるペプチド、本開示のコンジュゲートもしくは組成物、またはそれらの任意の組み合わせと接触させること、を含むか、あるいは、から本質的になるか、さらにまたは、からなる治療方法も、本開示によって提供される。接触はインビトロまたはインビボであることができる。インビトロで行う場合、本方法は、有用な前臨床スクリーンである。本方法がマウスまたは他の動物モデルなどの動物においてインビボで行われる場合、それは候補薬剤を試験するための二次前臨床スクリーンである。
【０１８５】
本開示は、血糖を調節するための方法、あるいは糖尿病または関連する状態もしくは障害を、それらの処置を必要とする対象において処置するための方法であって、有効量の本開示の組成物を対象に投与すること、を含むか、あるいは、から本質的になるか、さらにまたは、からなる方法も提供する。一態様では、対象がヒト患者、例えば糖尿病または関連状態を患っている患者である。
【０１８６】
併用療法
本開示の組成物および関連する方法は、他の治療法の施行、例えば後述するＧＬＰ−１アナログの投与と組み合わせて使用することができる。糖尿病および／または関連状態を処置するために使用される方法または組成物に先だって、またはそれと同時に、またはそれに続いて、さらなる治療的処置を加えることができ、それは同じ製剤内に含まれていてもよいし、別個の製剤としてであってもよい。
【０１８７】
スクリーニングアッセイ
本開示は、本開示のペプチドまたは組成物と等価な薬剤、例えば等価なペプチド、ならびに本開示の活性剤および医薬組成物の活性または本開示のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドもしくはペプチド産物の機能を調整するさまざまな薬剤に関してスクリーニングするための方法を提供する。本開示において、「候補薬剤」は、限定するわけではないが、生物学的化合物または化学的化合物、例えば簡単なまたは複雑な有機または無機分子、ペプチド、タンパク質（例えば抗体）、ポリヌクレオチド（例えばアンチセンス）またはリボザイムを包含するものとする。莫大な数の化合物、例えばポリペプチドおよびポリヌクレオチドなどのポリマー、ならびにさまざまなコア構造に基づく合成有機化合物を、合成することができ、「薬剤」という用語にはこれらも含まれる。加えて、さまざまな天然源、例えば植物または動物抽出物などから、スクリーニング用の化合物を得ることができる。常に明示的に述べるわけではないが、薬剤は単独で使用されるか、本発明のスクリーンによって同定される薬剤と同じまたは異なる生物学的活性を有する他の薬剤と組み合わせて使用されることを理解すべきである。
【０１８８】
キット
本明細書に記載のインビトロ法およびインビボ法を実施するのに必要な薬剤および説明書が含まれているキットも特許請求の範囲に含める。したがって本開示は、これらの方法を実施するためのキットであって、本開示のペプチドおよび／または他の組成物と、本開示の方法、例えば、本明細書に記載するように、組織を収集すること、および／またはスクリーンを実施すること、および／または結果を解析すること、および／または有効量のペプチドまたは他の組成物を投与することなどを実行するための説明書とを含みうるキットを提供する。これらは、他の既知の薬剤または他の候補薬剤と組み合わせることができる。
【０１８９】
以下の実施例は例示を意図するものであって、本明細書における開示を限定しようとするものではない。
【０１９０】
実験番号１
この実験では、プロテアーゼ耐性ペプチドをコードするｍＲＮＡライブラリーの合成およびスクリーニング、ならびに経口投与用ペプチドの合成を説明する。
【０１９１】
Ｇαｉ１の発現と固定化。大腸菌のＸＬ−１０ｇｏｌｄ株中で、Ｃ末端ＢｉｒＡタグを持つ２Ｌ  Ｇαｉ１を、標準条件下で発現させた。成長物を５０ｍＬずつ４℃、６０００ｒｐｍで遠沈し、ペレットを氷冷ＰＢＳで洗浄し、−８０℃で保存した。各選択ラウンドに先だって、ペレットを１ｍＬのＢＰＥＲで溶解する。固定化には１２０μＬのニュートラアビジンアガロースビーズを使用する。固定化は、１ｍＭ  ＰＭＳＦを含む結合緩衝液中、４℃で１時間行われる。１ｍＭビオチンを３０分間添加することにより、残存するビオチン結合部位をクエンチする。次いで、このビーズは結合緩衝液中、４℃で、最大１週間保存される。
【０１９２】
ＴＨＧ７３  ｔＲＮＡの調製。配列５’−ＡＴＴ  ＡＴＧ  ＣＴＧ  ＡＧＴ  ＧＡＴ  ＡＴＣ  ＣＡＡ  ＧＡＴ  ＡＴＣ  ＡＴＡ  ＴＣＧ  ＣＣＡ  ＡＴＣ  ＡＴＧ  ＡＣＣ  ＣＣＴ  ＧＡＧ  ＡＴＴ  ＴＡＧ  ＧＧＡ  ＡＣＴ  ＧＧＡ  ＣＣＣ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＡＧＧ  ＧＴＣ  ＡＴＣ  ＣＴＧ  ＧＡＧ−３’のＰＡＧＥゲル精製物をＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓに注文した。標準的転写をＴ７ランオフ転写によって行い、尿素−ＰＡＧＥによって精製した。
【０１９３】
ＮＭＡ−ｔＲＮＡ。Ｎ−メチル，Ｎ−ニトロベラトリルカルボニルアラニンシアノメチルエステルの合成は、公表されたプロトコールに従って行った。例えば前出のＭｉｌｌｗａｒｄら（２００７）を参照されたい。最終生成物を３：１ＥｔＯＡｃ／ヘキサン類でのシリカゲルクロマトグラフィーによって精製した。収量１８７．５ｍｇ（２４％）。Ｎ−メチル，Ｎ−ニトロベラトリルカルボニルアラニン−ｄＣＡの合成は、前出のＭｉｌｌｗａｒｄら（２００７）に従って行った。収量％０．５ｍｇ（２．５％）。ＴＨＧ−７３  ｔＲＮＡへのライゲーション後に、３１５ｎｍカットオフフィルタを装備したキセノンランプによる光分解によって、ニトロベラトリルオキシカルボニル基の脱保護を果たし、そのＮＭＡｔＲＮＡを直ちに翻訳反応に加えた。
【０１９４】
Ｎ−メチルスキャニングライブラリーの合成。一本鎖ＤＮＡテンプレートをＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓに注文した。配列は５’−ＧＧＧ  ＡＣＡ  ＡＴＴ  ＡＣＴ  ＡＴＴ  ＴＡＣ  ＡＡＴ  ＴＡＣ  ＡＡＴ  ＧＷＷ  ＫＷＭ  ＳＴＲ  ＧＴＡ  ＫＫＡ  ＲＴＷ  ＫＫＷ  ＧＫＭ  ＧＫＲ  ＳＷＭ  ＳＡＡ  ＡＴＣ  ＴＧＧ  ＡＡＧ  ＴＧＧ  ＡＡＧ  ＴＧＧ  Ａ−３’であり、可変位置には機械混合を使用した（Ｗ＝ＡまたはＴ、Ｋ＝ＧまたはＴ、Ｍ＝ＡまたはＣ、Ｒ＝ＧまたはＡ、Ｓ＝ＧまたはＣ）。二本鎖ライブラリーを作成し、１ｐｍｏｌのＰＡＧＥゲル精製一本鎖ライブラリーに対し、６サイクルのＰＣＲを行うことによって増幅した。ＰＣＲは、プライマーＧｅｎ−ＦＰ（５’−ＴＡＡ  ＴＡＣ  ＧＡＣ  ＴＣＡ  ＣＴＡ  ＴＡＧ  ＧＧＡ  ＣＡＡ  ＴＴＡ  ＣＴＡ  ＴＴＴ  ＡＣＡ  ＡＴＴ  ＡＣＡ−３’）およびリバースプライマー（５’−ＣＣＡ  ＣＴＴ  ＣＣＡ  ＣＴＴ  ＣＣＡ  ＧＡＴ  ＴＴ−３’）を利用して、標準的条件下で行った。
【０１９５】
第０ラウンドｍＲＮＡプールをＴ７ラ
ンオフ転写によって生成させ、尿素−ＰＡＧＥによって精製した。精製されたｍＲＮＡを、Ｆ３０Ｐ（５＝−ｄＡ２１［Ｃ９］３ｄＡｄＣｄＣ−Ｐ；Ｃ９％トリ−（エチレングリコール）ホスフェート（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、Ｐ％ピューロマイシン（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ））に、オリゴヌクレオチドスプリント（５’−ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＣＣ  ＡＣＴ  ＴＣＣ  ＡＣＴ−３’）を介してライゲートした。ライゲーション産物を尿素−ＰＡＧＥで精製し、２６０での吸光度によって定量した。
【０１９６】
翻訳および環化。５０ｐｍｏｌのライゲーション産物を、ウサギ網状赤血球溶解物中、標準的条件下で翻訳した。翻訳反応に、１ｍＭ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ＝４．５）中の２０μｇのＮＭＡｔＲＮＡ−ＣＵＡと３５Ｓ−メチオニンとを補足した。３０℃で４５分間の翻訳後に、ＫＯＡｃおよびＭｇＯＡｃを最終濃度がそれぞれ６００ｍＭおよび５０ｍＭになるように加え、反応を室温で１５分間インキュベートした。翻訳混合物を、ｄＴ結合緩衝液（１０ｍｇ・ｍＬ＊１  ｄＴセルロース、１Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００、ｐＨ％８）に１：５希釈し、４℃で４５分間撹拌した。ｄＴセルロースを濾過し、ｄＴ洗浄緩衝液（３００ｍＭ  ＮａＣｌ，２０ｍＭトリス、ｐＨ％８）で洗浄した。ＤＮＡ−ペプチドコンジュゲートをウォーターＨ（ｗａｔｅｒ  Ｈ）で溶出させ、線状アクリルアミド（Ａｍｂｉｏｎ）の存在下でエタノール沈殿させた。５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ％８）中の１５０μＬのｄＴ精製融合物を、５０μＬのＤＳＧ（ＤＭＦ中、１ｍｇ・ｍＬ／１）に加えることによって、第０ラウンドプールを環化した。反応を１時間進行させ、融合物をエタノール沈殿によって再び精製した。
【０１９７】
選択。第０ラウンドＤＳＧ処理融合物のエタノール沈殿後に、ペレットを１００μＬのｄＨ２Ｏに溶解し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩを使って標準的条件下で逆転写した。逆転写後に、ライブラリーを５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ＝８．０）に２倍希釈した。第０ラウンド消化には、１ｍｇの固定化トリプシン、１ｍｇの固定化キモトリプシン、１ｍｇの固定化プロテイナーゼＫ、および１ｍｇの固定化アミノペプチダーゼを、室温で２０分間使用した。固定化プロテアーゼは全てＳｉｇｍａから購入した。以降のラウンドでは固定化されたキモトリプシンおよびプロテイナーゼＫだけをタンパク質分解に使用した。融合物は遠心濾過によってプロテアーゼから精製した。
【０１９８】
消化した融合物を、２０μＬのＧαｉ１−ニュートラアビジンアガロース（ビオチンで予めブロッキングしたもの）を含有する１．５ｍＬの結合緩衝液（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ％７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン−２０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０μＭ  ＧＤＰ、および０．０５％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン）に入れた。結合反応を４℃で１時間行った。反応を濾過し、レジンを１×選択緩衝液で４回洗浄した。ライブラリーを室温において０．１５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳで溶出させ、ＳＤＳ−Ｏｕｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使って試料からＳＤＳを除去した。エタノール沈殿後に、ライブラリーをＰＣＲによって増幅した。溶出したライブラリーメンバーのＰＣＲ増幅は、４％アガロースゲルでバンドが観察されるまで行った（１８〜２４サイクル）。
【０１９９】
第５ラウンドプールをＰＣＲで増幅し、ＴＯＰＯ−ＴＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングした後、ＴＯＰ１０コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に形質転換した。個々のクローンを配列決定した（Ｌａｒａｇｅｎ）。
【０２００】
ペプチド合成。溶媒は全てＳｉｇｍａから購入した。Ｃ末端ビオチン化ＳＵＰＲペプチドはＮｏｖａｔａｇレジン（２５０ｍｇ，０．１２ｍｍｏｌ，ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で合成した。パルミトレイン酸コンジュゲートＳＵＰＲは、Ｄ−ＬｙｓがプレロードされたＷａｎｇレジン（２５０ｍｇ，０．１ｍｍｏｌ，Ａｎａｓｐｅｃ）で合成した。他のペプチドは全て、ＲｉｎｋアミドＡｍレジン（２５０ｍｇ，０．１５ｍｍｏｌ）を使って合成した。ＤＩＥＡ（１．２ミリモル濃度）を含むＤＭＦ中のＨＡＴＵ（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）（２ｍＬ，０．６ミリモル濃度）において、５当量のモノマー（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）を使って、標準的なカップリングを、室温で２０分間行った。Ｎ−メチルアミノ酸へのカップリングは同じ手順に従って、ＨＯＡＴ（１．２ミリモル濃度）を添加し、カップリング時間を３０分に延長した。Ｆｍｏｃ脱保護は、２０％ピペリジン（Ａｎａｓｐｅｃ）を使って、室温で１５分間行った。脱保護、９５％ＴＦＡによる切り離し、濾過およびエーテル抽出後に、勾配溶出（０％Ｂで５分間、４０分で１０−５０％Ｂ．溶媒Ａ：０．１％ＴＦＡを含むＨ２Ｏ、溶媒Ｂ：０．０３５％ＴＦＡを含むＣＨ３ＣＮ）を使って、Ｖｙｄａｃ  Ｃ−１８逆相カラムで、粗生成物を精製した。凍結乾燥固体をＤＭＳＯ中に再構成し、２８０ｎｍにおける吸光度で定量した（ε２８０＝９９７０Ｌ・ｍｏｌ−１・ｃｍ−１）。収率＝１０〜２５％。２０当量のジスクシンイミジルグルタレート（ＤＳＧ，Ｐｉｅｒｃｅ）によるペプチド（１ｍｇ／ｍＬ）の環化を、７０％ＤＭＳＯを含むＰＢＳ中、４２℃で一晩行った。ペプチドを上述のように精製した。収率＝１５〜２５％。
【０２０１】
特異性解析。ＴＮＴプルダウン実験は、ＳｔｏｏｐおよびＣｒａｉｋ（２００３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２１：１０６３に既に記述されているように行った。等量の各放射性標識サブユニットを、１ｍＬの１×選択緩衝液中で、１５ｐｍｏｌの結合済みＳＵＰＲ−Ｂｉｏペプチドを含有する１０μＬのニュートラアビジン−アガロースに加えた。対照ニュートラアビジン−アガロースはＤＭＳＯだけで処理した。結合反応を４℃で１時間進行させた後、濾過し、１×選択緩衝液で洗浄した。マトリックスをシンチレーション計数によって解析し、ＴＣＡ沈殿によって決定される総カウント数でマトリックスのカウント数を割ることによって、結合百分率を決定した。
【０２０２】
Ｒ６Ａ競合／平衡結合。既に確立されているプロトコール、例えば前出のＦｉａｃｃｏら（２００８）に従って、Ｒ６ＡとＳＵＰＲの相対的結合アフィニティを、ビオチン化Ｒ６Ａ（Ｂｉｏ−Ｒ６Ａ）に対する平衡競合実験によって決定し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５．０を使ってフィットと中間点とを決定した。
【０２０３】
プロテアーゼ耐性実験。固定化されたキモトリプシンおよびプロテイナーゼＫはＳｉｇｍａから購入した。ＤＭＳＯ中の２５０ｎｍｏｌのペプチドを５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝８．０）に加えて、最終ＤＭＳＯ濃度を２％にした。固定化プロテアーゼ（６０単位のキモトリプシンアガロースまたは６単位のプロテイナーゼＫ）を、キモトリプシンの場合は室温で、またプロテイナーゼＫの場合は４℃で加えた。さまざまな時点でアリコートを採取し、濾過し、Ｃ−１８逆相カラムに注入し、勾配溶出（２５分で１５−９０％Ｂ、溶媒Ａ：水中の０．１％ＴＦＡ、溶媒Ｂ：ＣＨ３ＣＮ（０．０５％ＴＦＡ））によって分離した。３２  Ｋａｒａｔ  Ｇｏｌｄソフトウェアパッケージ（Ｂｅｃｋｍａｎ）を使って出発物質ピーク下面積を定量した。プロットした値は、２つの実験値の平均を表し、エラーバーは平均の標準誤差を表す。１フェーズ指数関数的減衰式（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５．０）にデータを当てはめることによってグラフを作成した。
【０２０４】
ヒト血清消化物。脱脂／凍結乾燥ヒト血清をＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入し、製造者の指示に従って再構成した。１０％ＤＭＳＯを含む５０μＬのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝８．０）中の２５０ｎｍｏｌのペプチドを、１ｍＬの再構成血清に加え、３７℃でインキュベートした。さまざまな時点で１００μＬのアリコートを採取し、３００μＬのアセトニトリルでクエンチした。試料を遠沈し、デカンテーションで沈殿物を除去してから、水で１．５ｍＬに希釈した。次に、プロテアーゼ耐性実験で説明したように、試料をＨＰＬＣで解析した。
【０２０５】
ヒトミクロソーム消化物。シトクロムＰ４５０を含有するプールした男女混合ヒトミクロソームをｘｅｎｏｔｅｃｈから入手した。２５０ｎｍｏｌのペプチドを１％ＤＭＳＯと共に含有する５００μＬのＰＢＳ緩衝液に、１００μＬのミクロソームを加えた。さまざまな時点で５０μＬのアリコートを取り出し、ヒト血清消化物と同じ方法で後処理した。
【０２０６】
インビボ半減期。Ｃ末端リジン（ＦＡＭ）が付加されているペプチドを、既述のように合成した。Ｃ５７ＢＬ６マウスの尾静脈に２００μＬのペプチドを１０ｍｇ／Ｋｇの用量でＩＶ注射によって投与した。さまざまな時点で、ヘパリン被覆毛細管および麻酔用のイソローラン（ｉｓｏｆｌｏｕｒａｎｅ）を使った眼窩採血により、５０μＬの血液試料を採取した。試料をＴＥ緩衝液（ｐＨ＝８．０）で６００μＬに希釈してから、３０００ＭＷＣＯフィルターを通した遠心分離によって濾過した。素通り画分を島津ＲＦ−５３０１
ＰＣ蛍光光度計で解析した。Ｐｒｉｓｍ  ５．０ソフトウェアを使って、タイムポイントを積分し、解析した。
【０２０７】
経口バイオアベイラビリティ。経口投与用に以下のペプチドを合成した：ＭＦＹＶＹＥＹＶＱＷＳＫＫ（ＦＡＭ）、ＭＦＹＶＹＥＹＶＱＷＳＫＫ（ＦＡＭ）ＤＫ（パルミトレイン酸）、およびＭＩＴＷＹＥＦＶＡＧＴＫＫ（ＦＡＭ）［ここでＦＡＭはフルオレセインを含有するリジン誘導体である］。全てのペプチドを既述のようにリジンの側鎖からＮ末端へと環化した。麻酔したＣ５７ＢＬ６マウスに、経口胃管栄養法により、１０ｍｇ／Ｋｇの用量で、ペプチドを投与した。投与後に、マウスをイソフローランから取り出した。さまざまな時点で、既述のように眼窩採血によって、血液試料を採取した。ピークを、ＩＶ注射によってペプチドを投与したマウスからの１５分時点に標準化した。
【０２０８】
Ｒ５プールにおけるＳＵＰＲの頻度の定量。ＦＹＶＹＥＹＶＱＷＳのアンチコーディング鎖である以下のＤＮＡ配列：５’−ビオチン−ＴＴＴ  ＧＧＡ  ＣＣＡ  ＣＴＧ  ＣＴＡ  ＡＴＡ  ＣＴＣ  ＡＴＡ  ＣＴＡ  ＧＴＡ  ＡＡＡ  ＣＡＴを、ビオチン化オリゴとして、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓに注文した。約３５ｎｍｏｌのＤＮＡを約２６５μＬのニュートラアビジンアガロースビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ）に固定化した。第５ラウンドからの転写物を、ＳＵＰＲ  ＤＮＡを含有するビーズ、またはＤＮＡを伴わないビーズと共にインキュベートした。陽性対照として、ＳＵＰＲペプチドの転写物を、相補的ＤＮＡを含有するビーズと共にインキュベートした。ライブラリーおよびビーズをＤＴ緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  ｐＨ＝７．５、１Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％ツイーン）中、４℃で１時間、回転させた。固定化ＤＮＡと共にインキュベートする前と後に、２６０における吸光度を測定した。
【０２０９】
考察
本開示は、容易に翻訳され、したがってｍＲＮＡディスプレイにおける使用に適するペプチドを、単離し生産するための方法を提供する。これらの方法によって提供されるペプチドは、高レベルの全般的プロテアーゼ耐性も示す。一態様では、キモトリプシンおよびトリプシンを組み入れた。なぜなら、これらは腸内に豊富に存在するプロテアーゼだからである。ヒト血清にはアミノペプチダーゼが行き渡っているので、もう一つの実施形態では、アミノペプチダーゼを選んだ。２つの理由から、すなわち（１）その広い特異性ゆえに全てのプロテアーゼの代用物として、また（２）前出のＦｒａｎｋｅｌら（２００３）によって報告されているとおり、Ｎ−メチル挿入は高レベルのプロテイナーゼＫ耐性を与えるので、さらにもう一つの実施形態では、プロテイナーゼＫを組み入れた。
【０２１０】
一態様において、本方法は、環状ＧＩＢＰ（ｃｙｃＧＩＢＰ）に基づくスキャニングライブラリーを含むが、本開示の方法では、各位置が野生型またはＵＡＧまたは他のナンセンスサプレッサーのいずれかと体系的に組み合わされた、より大きいペプチドおよびより小さいペプチドを使用することもできる（図１Ａ参照）。加えて、天然アミノ酸のコドン
（例えばバリン）を使用することもできるだろう。これにより、約４×１０６の一次配列多様性を持つライブラリーがもたらされた。ライブラリーは、メンバーが０〜１０個（２個が最も一般的）のＮ−メチルアミノ酸を含有しうるように設計された。Ｎ−メチル残基に加えて、この変異導入により、いくつかの天然配列の挿入も、もたらされた（図１Ａ）。直線状ペプチドと環状ペプチドの混合物が存在するようにライブラリーを環化し、プロテアーゼ消化に付し、ターゲットへの結合に関して選択した（図１Ｂ）。
【０２１１】
選択手順は、ペプチドとターゲットとの間に十分な結合度が示されるまで繰り返すことができる。一態様では、十分な結合が５ラウンドの選択後に示され、次にそのプールが配列決定された。この選択で見いだされた２３個の配列は全て、少なくとも１つのＮＭＡを含有していた。１ペプチド配列あたりのＮＭＡの平均的な量は、第４ラウンドプールでも第５ラウンドプールでも、第０ラウンドプールと比較して増加した。ある配列ＭＦＹＡＹＥＹＡＱＷＳＫがプールを支配していることがわかった。プルダウンにより、プール中の配列の約３５％がこのペプチドをコードすることが決定された。我々の知る限り、これは、薬物様の特徴を強化する目的で非天然アミノ酸を組み込むための選択によって得られた初めての機能的ペプチドである。このペプチドは他の理由でも魅力的であった。Ｇαｉタンパク質に対する他の複数の選択で見いだされたコアモチーフに似たＹＥＹというコアモチーフが組み込まれていた。ＮＭＡ残基は間隔を空けて配置されており、これまでの予測手段によって予想される十分なウインドウのプロテアーゼ耐性を与えると予想される。リジン残基が一つしかないことは、考えうる環化が一つだけであることを示している。この分子をｓｃａｎｎｉｎｇ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ
ｐｅｐｔｉｄｅ（スキャニング非天然プロテアーゼ耐性ペプチド）の略でＳＵＰＲと名付けた。
【０２１２】
親分子から選択された分子へは著しい変化がある。アミノ酸変化が可能な１０の位置のうちの８つが配列の変化を示した。これらの変化の一部、例えばｃｙｃＧＩＢＰ中のＰＨＥおよびＴＨＲからそれぞれＴＹＲおよびＳＥＲへの変化は保存的であった。しかし、その他の変化、例えばｃｙｃＧＩＢＰのＶＡＬおよびＧＬＹからそれぞれＧＬＮおよびＴＲＰへの変化は、Ｇαｉ１結合ペプチドの配列の解析では予想されなかったであろう側鎖官能性の著しい変化を示す。構造比較は、図２に概説した配列変化を観察することによって行うことができる。
【０２１３】
標準的なプルダウンアッセイを利用することによってペプチドを特徴づけた。Ｃ末端にビオチンを組み込んだｃｙｃＳＵＰＲペプチドを合成した。ペプチドをニュートラアビジン−アガロースに固定化し、放射性標識タンパク質のプルダウンに使用した。このプルダウンの効率を、複数の異なるＧαサブユニットに対して試験した。図３からわかるように、ｃｙｃＳＵＰＲペプチドはその親分子の特異性を保持していた。これは、Ｇαファミリー内での特異性についても、Ｇαｉ１の状態特異性についても当てはまる。実際には、８５％近い配列類似性を持つタンパク質Ｇαｉ２との比較で、ターゲットＧαｉ１に対する特異性は、少し強化されているほどだった。ターゲット特異性を一致させうることは、９個の位置のうちの８つで選択性の改変をもたらしたＮ−メチルの化学的組み込みによる結果とは正反対である。所望のターゲットに対する選択性を保持または強化できることは、治療薬および診断薬の開発には、とても重要である。このデータは、ｍＲＮＡディスプレイへのＮ−メチル組み込みが、それを可能にすることを示唆している。
【０２１４】
次に、プロテアーゼ耐性強化を試験した。プロテアーゼ耐性を強化するための最も単純な解決策は、プロテアーゼＫおよびキモトリプシンによって認識されるアミノ酸の除去であるだろう。しかしこのペプチドは親分子とほぼ同じくらい多くの理論的消化部位を有する。プロテイナーゼＫおよびキモトリプシンで消化した場合、ＳＵＰＲペプチドはそれぞれ７箇所および５箇所の理論的消化部位を有する。しかし、解析した試料は、消化部位を、プロテイナーゼＫでは１箇所だけ、キモトリプシンでは２箇所だけ示した。タンパク質分解消化により、ＳＵＰＲ環状ペプチドは、ＣｙｃＧＩＢＰと比較すると、プロテイナーゼＫに対しては約５２００倍耐性が高く、キモトリプシンに対しては２００倍耐性が高いことが明らかになった。図４Ａ〜４Ｄからわかるように、ＳＵＰＲの環化がこれらの酵素の両方に対するプロテアーゼ耐性を強化したことから、環化とＮ−メチル化との協同効果が示唆される。
【０２１５】
これらの強化はヒト血清にさらされた場合の安定性にもつながった。ヒト血清は１５００を超えるタンパク質と数百のプロテアーゼから構成される。これは、ペプチド治療薬が遭遇するであろうインビボ環境を、インビトロで緻密に模倣したものである。それゆえに、ペプチドが潜在的治療薬として成立しうるには、ヒト血清に対して安定でなければならない。最新の薬物は、ペプチド薬物やモノクローナル抗体を含めて、数日〜数週間の血清中半減期を示す。ｌｉｎＧＩＢＰおよびｃｙｃＧＩＢＰは、それぞれ約０．１４時間および０．３３時間の半減期を示し、迅速すぎて、潜在的薬物候補になると予想することは到底できない。ｌｉｎＳＵＰＲも低い安定性を示し、半減期は０．２７時間しかない。これはおそらく何らかのエキソペプチダーゼ活性によるのであろう。というのも、Ｎ末端アルキル化およびＣ末端アミド化が安定性に役立つことは、当分野では一般に知られているからである。ｃｙｃＳＵＰＲペプチドに見いだされる環化とＮ−メチル化との両方の組み込みは、極めて大きな安定性の増加をもたらし、ヒト血清中で図４Ｅに示す１６０時間という半減期を持つペプチドを生成した。このデータは、キモトリプシン分解およびプロテイナーゼｋ分解に耐えることが、一般的プロテアーゼ耐性の付与にとっては十分であることを示唆している。なぜなら、ヒト血清には活性なキモトリプシンもプロテイナーゼｋも見いだされないからである。
【０２１６】
薬物のインビボ処理にとって極めて重要なもう一つの領域は肝臓である。血液は全て最終的には肝臓によって濾過され、肝臓では、さまざまなタイプの酵素が排泄を目的として薬物を官能化している。このプロセスに関与する肝臓酵素のなかで最大かつ最も活性なクラスはシトクロムＰ４５０である。これらの酵素は、主として、薬物の酸化に関与し、肝臓の細胞外表面上に見いだすことができる。ヒト肝臓ミクロソームはシトクロムＰ４５０を含有する機能的肝臓抽出物である。そこで、ヒトミクロソームへの曝露で起こるシトクロムＰ４５０によるペプチドの修飾の半減期を調べた。結果は、修飾に対する耐性の著しい強化には環化とＮ−メチル化との両方が必要である点で、ヒト血清結果と類似していた。実際には、ｃｙｃＧＩＢＰまたはｌｉｎＳＵＰＲ（類似する半減期）からｃｙｃＳＵＰＲへは、図４Ｆに示すように、安定性の一桁近い増加が起こった。シトクロムＰ４５０修飾に対する耐性ではなく、プロテアーゼ耐性の形質が選択基準であったのだから、これは興味深いことである。これは、キモトリプシンおよびプロテイナーゼｋに対する耐性によって付与される強化が、プロテアーゼに対する一般的安定性につながるだけでなく、他の種類の酵素修飾に対する耐性にもつながることを示唆している。
【０２１７】
キモトリプシンおよびプロテイナーゼｋなどのセリンプロテアーゼの結晶構造は、４つのアミノ酸位置において、プロテアーゼからそれらの基質のバックボーンへの水素結合ネットワークを示す。出願人は、Ｎ−メチル化が基質とプロテアーゼとの間の立体的衝突をもたらし、それによって、ペプチドに結合するというプロテアーゼの能力を阻害するのであろうと推測した。酵素速度論的には、これはＫｍの増加をもたらすであろう。加えて、いくつかの実験により、キモトリプシンなどのプロテアーゼは、その予想消化部位の全てを等しく切断するわけではないことが示されている。二次構造がタンパク質のタンパク質分解に影響を及ぼすであろうことは、古くから観察されてきた。しかし、タンパク質分解を受けない予想プロテアーゼ部位を有しながら、二次構造が予想されないペプチドの例も、独立していくつかある。出願人は、タンパク質分解にとって阻害的な何らかの局所配列コンテキストが存在しうるのではないかと考えている。この配列コンテキストは、プロテアーゼがその基質に結合することをより困難にするか（Ｋｍ）、またはプロテアーゼが基質に触媒作用を行うことをより困難にしうる（Ｖｍａｘ）。これらの強化の起源を調べるために、出願人は、キモトリプシンを使って基本的な速度論研究を行った。プロテイナーゼｋはＧＩＢＰを極めて迅速に消化するので、このタイプの解析には向かないが、他の系および他のペプチドには利用することができるだろう。出願人が見いだしたことは、図５に見られるように、Ｋｍ（基質への酵素の結合）とＶｍａｘ（基質を処理する酵素の能力）の両方が最適化されたＳＵＰＲペプチドは、ｃｙｃＧＩＢＰと比較して、プロテアーゼ耐性に関して最適化されているということである。
【０２１８】
次に、Ｎ−メチルアラニンのそれぞれの役割を、独立して解析した。伝統的な医薬品化学的アプローチでは、各位置を段階的に最適化することが提案されるであろう。例えば、Ｎ−メチル化を含む配列修飾は、１回に１つのアミノ酸で行われ、ペプチドを、低いプロテアーゼ安定性から高い安定性に向かってウォーキングさせることになるだろう。これがＳＵＰＲのようなペプチドを作るためのアプローチとして実行可能かどうかを調べた。この目的のために、出願人は、ＳＵＰＲペプチドからｃｙｃＧＩＢＰに近いものへと、逆向きにウォーキングさせ、プロテアーゼ耐性の漸減が起こるかどうかを決定した。この目的のために、３つのペプチドを合成した。そのうちの２つは、ＮＭＡを１つだけ持ち（ＮＭＡをアラニンで置換した）、もう一つはＮＭＡを持たなかった。ｃｙｃＧＩＢＰに向かって逆向きにウォーキングさせることができるのであれば、単一のＮ−メチルの喪失は、プロテアーゼ耐性を多少低下させる効果を持つが、それでもまだ、ｃｙｃＧＩＢＰよりは良いと予測されるであろう。また、二重変異体、すなわちＮ−メチル化を含有しないＳＵＰＲペプチド配列は、ｃｙｃＧＩＢＰに似た性質を示すと予想することができるだろう。効果は劇的で驚くべきものであった。環状配列でも直線的配列でも、ＮＭＡを一つ喪失させると、プロテアーゼ耐性は、親分子ＧＩＢＰよりかなり悪くなった。これは、表１に詳述するように、キモトリプシン消化にもプロテイナーゼｋ消化にも当てはまった。実際には、キモトリプシンの場合は加水分解があまりに効率よく起こるので、出願人は、その半減期を測定することができないほどだった。これは、Ｎ−メチル化間に相乗効果が存在することを含意するだけでなく、伝統的な段階的最適化によってこのペプチドを誘導することが、極めて困難であるだろうことを含意している。
【表１】
2018064573.tif 000002
【０２１９】
実験番号２
この実験は、予め決定された機能性を有するペプチドを合成するための実験番号１の方法の応用を示す。加えて、ｎ−メチルノルバリンを利用し、出発ペプチドを抗体ループ領域から選択した。
【０２２０】
毎年５０，０００人の女性が致死率の高いＨｅｒ−２（＋）乳がんと診断される。ハーセプチン（トラスツズマブ）は、ＦＤＡに承認された唯一の生物学的治療法であるが、１年につき１００，０００ドルの費用がかかる。これは、健康管理に経済的障壁を作り、処置に出費することを選んだ人に莫大な負担を課す。さらにまた、処置は苦痛を伴い、不便であり、感染リスクもある。というのも、これは大量のＩＶ注射によって投与されなければならないからである。ハーセプチンの売上はＲｏｃｈｅに年間約５０億ドルをもたらしており、この市場の大きさと重要性を裏付けている。
【０２２１】
Ｈｅｒ−２（ヒト上皮成長因子２）は、乳がん患者の２０〜３０％に過剰発現していることが見いだされる受容体チロシンキナーゼである。Ｌｉｎ，Ｎ．ら（２００７）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３：１６４８。Ｈｅｒ−２は既知リガンドを持たないユニークな受容体であり、ホモ二量体化および他のＨｅｒ（１、３および４）ファミリーメンバーとのヘテロ二量体化によって機能する。二量体化は、細胞増殖、浸潤、および抗アポトーシスの刺激を促進する（前出のＬｉｎら（２００７））。
【０２２２】
臨床的には、乳がんにおけるＨｅｒ−２の過剰発現は、増加した腫瘍成長、化学療法耐性、および患者の著しく低い長期生存率を伴う、より侵襲的な疾患と相関する。Ｓａｕｓｖｉｌｌｅ，Ｅ．ＡおよびＢｕｒｇｅｒ，Ａ．Ｍ．（２００６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６６：３３５１。毎年、約５０，０００人の女性がこの形態の乳がんと診断される。Ｈｅｒ−２のエクトドメインに対するモノクローナル抗体は、インビボで腫瘍の成長を制限するのに臨床的に有効であることが示されている。ハーセプチンは、がんを処置するためのＦＤＡ承認モノクローナル抗体の最初の例の一つであった。しかし、抗体治療薬にはよくあることだが、処置は非常に高額になる。ハーセプチンは典型的には２〜８ｍｇ／Ｋｇの用量で投与され、患者に年間最大１００，０００ドルの出費を強いる（ウェブアドレス：ｗｗｗ．ｕｓａｔｏｄａｙ．ｃｏｍ／ｎｅｗｓ／ｈｅａｌｔｈ／２００６で閲覧可能なＳｚａｂｏ，Ｌ．（２００６）ＵＳＡ  Ｔｏｄａｙ）。
【０２２３】
全ての抗体治療薬と同様に、これらは開発、品質管理、生産、貯蔵、投薬に費用がかかり、経口利用することができず、そのサイズが固形腫瘍におけるその効力を制限する（Ｃｈｏ，Ｍ．Ｊ．およびＪｕｌｉａｎｏ，Ｒ．（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４：１５３）。安定化されたペプチド治療薬は、費用を劇的に低下させ、潜在的経口投与経路を提供することによって、処置を受けやすくすることにより、この疾患を持つ患者にとって大きな利益になるであろう。
【０２２４】
ＴＨＧ７３  ｔＲＮＡの調製。実施例１で説明した方法に従った。
【０２２５】
Ｎ−メチルノルバリン−ｔＲＮＡ。ノルバリンは直鎖状の３炭素側鎖を有するアミノ酸であり、メチオニンの合理的なアイソスターである。Ｎ−メチルノルバリンは、ｎ−メチルアラニンより効率よく翻訳される。配列ＭＦＸＦＦ（ここでＸはｎ−メチルアミノ酸である）を翻訳するとき、Ｎ−メチルノルバリンは、図１０からわかるように、２倍の抑制効率（ｔＲＮＡ−Ｎ−メチルアミノ酸なしでの翻訳に対するｔＲＮＡ−Ｎ−メチルアミノ酸ありでの翻訳効率の比）を示す。Ｎ−メチル，Ｎ−ニトロベラトリルカルボニルノルバリンシアノメチルエステルの合成は、当技術分野において知られている方法および公表されたプロトコールに従って行った。最終生成物は３：１ＥｔＯＡｃ／ヘキサン類でのシリカゲルクロマトグラフィーによって精製した。収量１８７．５ｍｇ（２４％）。Ｎ−メチル，Ｎ−ニトロベラトリルカルボニルアラニン−ｄＣＡの合成は、以前のプロトコールに従って行った。収量％０．５ｍｇ（２．５％）。ＴＨＧ−７３  ｔＲＮＡへのライゲーション後に、３１５ｎｍカットオフフィルタを装備したキセノンランプによる光分解によって、ニトロベラトリルオキシカルボニル基の脱保護を果たし、Ｎ−メチルノルバリンｔＲＮＡを直ちに翻訳反応に加えた。
【０２２６】
Ｎ−メチルスキャニングライブラリーの合成。２つの一本鎖ＤＮＡテンプレートをＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓに注文した。配列は５’−ＧＧＧ  ＡＣＡ  ＡＴＴ  ＡＣＴ  ＡＴＴ  ＴＡＣ  ＡＡＴ  ＴＡＣ  ＡＡＴ  ＧＮＮ  ＳＫＲ  ＳＫＡ  ＫＫＲ  ＫＴＷ  ＳＴＡ  ＫＫＭ  ＳＮＮ  ＳＡＡ  ＡＡＧ  ＴＡＧ  ＴＧＧ  ＴＡＧ  ＣＡＧ  ＣＧＡ  ＴＴＡ  ＣＡ−３’および５’−ＧＧＧ  ＡＣＡ  ＡＡＴ  ＡＣＴ  ＡＴＴ  ＴＡＣ  ＡＡＴ  ＴＡＣ  ＡＡＴ  ＧＮＮ  ＳＹＭ  ＫＹＡ  ＫＫＭ  ＫＹＡ  ＳＴＷ  ＫＮＮ  ＳＡＡ  ＡＡＧ  ＴＡＧ  ＴＧＧ  ＴＡＧ  ＣＡＧ  ＣＧＡ  ＴＴＡ  ＣＡ−３’であり、可変位置には機械混合を使用した（Ｗ＝ＡまたはＴ、Ｋ＝ＧまたはＴ、Ｍ＝ＡまたはＣ、Ｒ＝ＧまたはＡ、Ｓ＝ＧまたはＣ、Ｙ＝ＴまたはＣ）。１ｐｍｏｌのＰＡＧＥゲル精製一本鎖ライブラリーに対して６サイクルのＰＣＲを行うことにより、二本鎖ライブラリーを作成し、増幅した。ＰＣＲは、プライマーＧｅｎ−ＦＰ（５’−ＴＡＡ  ＴＡＣ  ＧＡＣ  ＴＣＡ  ＣＴＡ  ＴＡＧ  ＧＧＡ  ＣＡＡ  ＴＴＡ  ＣＴＡ  ＴＴＴ  ＡＣＡ  ＡＴＴ  ＡＣＡ−３’）およびリバースプライマー（５’−ＴＧＴ  ＡＡＴ  ＣＧＣ  ＴＧＣ  ＴＡＣ  ＣＡＣ  ＴＡＣ  ＴＴＴ  Ｔ−３’）を利用して、標準的条件下で行った。
【０２２７】
第０ラウンドｍＲＮＡプールをＴ７ランオフ転写によって生成させ、尿素−ＰＡＧＥによって精製した。精製されたｍＲＮＡを、Ｆ３０Ｐ（５＝−ｄＡ２１［Ｃ９］３ｄＡｄＣｄＣ−Ｐ；Ｃ９％トリ−（エチレングリコール）ホスフェート（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、Ｐ％ピューロマイシン（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ））に、オリゴヌクレオチドスプリント（５’−ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＧ  ＴＡＡ  ＴＣＧ  ＣＴＧ  Ｃ−３’）を介してライゲートした。ライゲーション産物を尿素−ＰＡＧＥで精製し、２６０での吸光度によって定量した。
【０２２８】
翻訳および環化。実施例１で説明した方法に従った。
【０２２９】
選択。この選択ステップのためのターゲットタンパク質を取得することは、技術的難題であった。Ｈｅｒ−２はマルチドメインタンパク質であり、ペプチドは細胞内キナーゼドメインではなくエクトドメインをターゲットにする必要があった。加えて、Ｈｅｒ−２は、著しい翻訳後修飾を受ける。正しい翻訳後修飾を受けた機能的Ｈｅｒ−２を発現させ精製することは困難であるだろう。しかし、いくつかの不死化細胞株は、Ｈｅｒ−２を多量に過剰発現している乳がん患者から誘導されたものであり、それらはヒト細胞株であるから、Ｈｅｒ−２陽性がん患者に存在する翻訳後修飾を全て有するはずである。第０ラウンドＤＳＧ処理融合物のエタノール沈殿後に、ペレットを１００μＬのｄＨ２Ｏに溶解し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩを使って標準的条件下で逆転写した。逆転写後に、ライブラリーを５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ＝８．０）に２倍希釈した。タンパク質分解は、選択を継続するにつれて、よりストリンジェントにした。全てのタンパク質分解で、Ｓｉｇｍａから購入した固定化プロテアーゼを使用した。第０ラウンド融合物は０．１ｍｇのプロテイナーゼＫに３０秒間さらした。第１ラウンド融合物は１ｍｇのプロテイナーゼＫで３０秒間タンパク質分解した。第２および第３ラウンド融合物は、１ｍｇのプロテイナーゼＫで５分間タンパク質分解した。最後に、第４ラウンド融合物は、１ｍｇのプロテイナーゼＫ、１ｍｇのキモトリプシン、および１ｍｇのトリプシンで５分間タンパク質分解した。タンパク質分解は全て室温で行った。プロテアーゼを遠心濾過によって除去した。
【０２３０】
選択の２日前に、１ウェルにつき１５０，０００個のＳＫＢＲ−３細胞を、９６ウェルプレートの２つのウェルに播種し、標準的細胞培養条件下（Ｄ−１０培地、５％  ＣＯ２、３７℃）で成長させた。ＳＫＢＲ−３細胞を、Ｄ−１０培地で４００μＬに希釈しておいたタンパク質分解融合物（各ウェルにつき２００μＬを使用）と共にインキュベートした。室温で１時間後に、融合物を除去し、細胞をＤ−１０培地で４回洗浄した。洗浄後に、プロテイナーゼＫ（０．５ｍｇ／ウェル）を使って、細胞を室温で２０分間タンパク質分解した。ｓｐｉｎ−ｘ濾過によって、融合物を細胞およびプロテアーゼから取り出した。「Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｂｌｏｏｄ  Ｄｉｒｅｃｔ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ」（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を製造者の指示に従って使用することにより、４００μＬ  ＰＣＲで、Ｈｅｒ−２ライブラリーを再生させた。溶出したライブラリーメンバーのＰＣＲ増幅は、４％アガロースゲルでバンドが観察されるまで行った（１５〜２０サイクル）。
【０２３１】
第５ラウンドプールを、ｔａｑポリメラーゼを用いるＰＣＲで増幅し、ＴＯＰＯ−ＴＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングした後、ＴＯＰ１０コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に形質転換した。個々のクローンを配列決定した（Ｌａｒａｇｅｎ）。
【０２３２】
細胞培養。ＳＫＢＲ−３細胞はＡＴＣＣから購入した。ＤＭＥＭおよびＦＢＳはＧＩＢＣＯから購入した。Ｄ−１０培地を使用し、標準的条件下で、細胞を培養した。
【０２３３】
細胞増殖。増殖は、標準的なＢｒｄＵ細胞増殖アッセイ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）によって測定した。細胞株を、表示した量のペプチドを２％ＤＭＳＯと共に含むＤ−１０培地で、９６ウェルプレートにプレーティングし（２０，０００細胞／ウェル）、一晩インキュベートした。ＢｒｄＵ化合物を細胞に２時間与えた。製造者のプロトコールに従い、４５０ｎｍにおけるＵＶ吸光度測定によって、試料を解析した。ペプチドなしで２％ＤＭＳＯと共にインキュベートした細胞にペプチドシグナルを標準化した。データを薬物応答式に当てはめることによって（Ｌｏｇ（薬物）対応答、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５．０）、ＩＣ５０データを生成させた。
【０２３４】
インビボ研究。ＮＣｒホモ接合無胸腺（ヌード）マウス（６〜８週齢）を米国国立癌研究所から購入した。２×１０６個のＳＫＢＲ−３細胞のアリコートを２００ｍｌのＰＢＳに懸濁し、各動物の右大腿の真皮下に注射した。処置は接種の７日後に開始した。ペプチド１（インサート配列）およびペプチドＤ（インサート配列）を７ｍｇ／Ｋｇの総ペプチド濃度でＩＶ注射により週に３回同時投与した。腫瘍成長を４週間にわたって毎週モニタリングした。腫瘍体積測定は、電子ノギスを使用し、標準的プロトコールに従って行った。
【０２３５】
ペプチド合成。溶媒は全てＳｉｇｍａから購入した。別段の指定がある場合を除き、他のペプチドは全て、ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｗａｎｇレジン（２５０ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を使って合成した。ＰＳ−３自動ペプチド合成装置（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で、５当量のモノマーを使って、標準的カップリングを行った。Ｆｍｏｃ脱保護は２０％メチルピペリジンを使って室温で１０分間行った。Ｎ末端アミノ酸の付加後に、グルタル酸無水物でペプチドをキャッピングした。Ｎ末端キャッピング後に、ＤＣＭ中の３％ＤＣＭ、１．５％ＴＩＳおよび１．５％ＥＤＴにより、リジン（ｍｍｔ）を室温で１時間、選択的に脱保護した。レジンをＮＭＰで洗浄した後、ＨＡＴＵ（５当量）およびＤＩＥＡ（１０当量）を添加し、室温で１時間回転させることにより、レジン上での環化を達成した。環化、脱保護、９５％ＴＦＡによる切り離し、濾過およびエーテル抽出後に、勾配溶出（０％Ｂで５分間、４０分で１０−５０％Ｂ、溶媒Ａ：０．１％ＴＦＡを含むＨ２Ｏ、溶媒Ｂ：０．０３５％ＴＦＡを含むＣＨ３ＣＮ）を使って、Ｖｙｄａｃ  Ｃ−１８逆相カラムで、粗生成物を精製した。凍結乾燥固体をＤＭＳＯ中に再構成し、２８０ｎｍにおける吸光度で定量した（ε２８０＝９９７０Ｌ・ｍｏｌ−１・ｃｍ−１）。収率＝１０〜２５％。
【０２３６】
ヒト血清消化物。脱脂／凍結乾燥ヒト血清をＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入し、製造者の指示に従って再構成した。１０％ＤＭＳＯを含む５０μＬのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝８．０）中の２５０ｎｍｏｌのペプチドを、１ｍＬの再構成血清に加え、３７℃でインキュベートした。さまざまな時点で１００μＬのアリコートを採取し、３００μＬのアセトニトリルでクエンチした。試料を遠沈し、デカンテーションで沈殿物を除去してから、水で１．５ｍＬに希釈した。試料をＣ−１８逆相カラムに注入し、勾配溶出（２５分で１５−９０％Ｂ、溶媒Ａ：水中の０．１％ＴＦＡ、溶媒Ｂ：ＣＨ３ＣＮ
（０．０５％ＴＦＡ））によって分離した。３２  Ｋａｒａｔ  Ｇｏｌｄソフトウェアパッケージ（Ｂｅｃｋｍａｎ）を使って出発物質ピーク下面積を定量した。プロットした値は、２つの実験値の平均を表し、エラーバーは平均の標準誤差を表す。１フェーズ指数関数的減衰式（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５．０）にデータを当てはめることによってグラフを作成した。
【０２３７】
考察
ターゲット結合に関与する抗体ループを調べることで２つのペプチドを導き出した。ＡＮＨＰはハーセプチンループ（Ｐａｒｋ，Ｂ．−Ｗ．ら（２０００）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，１８：１９４）から導き出したペプチドであり、ＨＲＡＰは、オムニターグ（Ｎａｋａｊｉｍａ，Ｈ．ら（２００８）Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  １５：６５）から導き出された・BR>Bどちらも高μＭ濃度でインビトロ機能を呈する。これらのペプチドから２つの別個の環状ペプチドライブラリーを開発した。図８に図解するように、隣接ランダム化残基をリードペプチド配列の両側に置いた。
【０２３８】
その結果得られた２つのペプチドライブラリーは長さが異なるので（図９に図示するように、ハーセプチンに基づくライブラリーの場合はＭＸ８Ｋ、オムニターグに基づくライブラリーの場合はＭＸ７Ｋ）、同時投与用に選択するために、どのペプチドが、どの元のリガンドファミリーに由来するかを決定することが、追跡によって可能になった。第０ラウンドＰＣＲ後に、２つのライブラリーを同じ比率で混合し、選択を一緒に受けさせることにより、２１００万ユニークＤＮＡ配列の総多様性を得た。
【０２３９】
出願人は、Ｈｅｒ−２発現を定量するために、フルオレセイン標識ＨＲＡＰペプチドを使用した。ペプチドを細胞と共にインキュベートし、細胞を洗浄した後、トリプシン処理し、蛍光光度計で解析した。Ｈｅｒ−２を大量に発現するヒト細胞は、その表面に２００万コピー以上を有するであろう。出願人は、１細胞につき約４５０万コピーのＨｅｒ−２が発現していることを見いだした。２００，０００細胞は、約１．５ｐｍｏｌのターゲットを含有することになり、これは、ｍＲＮＡディスプレイによるターゲティングに必要な範囲内にある。
【０２４０】
選択は、実施例１で述べたものと類似する条件下で行った。４ラウンドの選択後に、第５プールを配列決定し、結果として得られた配列を、その元のファミリーに分離した。オムニターグファミリーから５つのメンバー（１〜５と命名、１−ＭＡＶＹＶＨＹＨＫ、２−ＭＳＹＨＹＶＶＰＫ、３−ＭＬＳＹＳＨＶＱＫ、４−ＭＥＹＶＳＹＶＡＫ、５−ＭＲＨＱＥＶＬＬＫ、ここで、ＶはＮ−メチルノルバリンである）、そしてハーセプチンファミリーから５つのメンバー（Ａ〜Ｅと命名、Ａ−ＭＱＹＤＥＹＶＤＳＫ，Ｂ−ＭＬＷＤＥＹＶＡＣＫ，Ｃ−ＭＭＷＶＥＦＹＳＬＫ，Ｄ−ＭＶＣＶＶＬＹＤＤＫ，Ｅ−ＭＶＣＥＹＹＶＹＳＫ、ここで、ＶはＮ−メチルノルバリンである）を、初回スクリーニングのために選択した（必要としている１〜５およびＡ〜Ｅがスプレッドシートでは特定されていない）。環化された融合物を、タンパク質分解の前と後に、結合について試験した。各ファミリー中で一番結合性の高いペプチドは、プロテアーゼ耐性が最も高いペプチドでもあった。これらのペプチド、すなわちペプチド１およびＤを、さらなる特性確認のために選択した。Ｎ−メチル化分子を親分子と比較すると、著しい変化が明らかになった。ペプチドＤでは、元の残基６個のうち５個が変化していた。変異の一つは保存的であったが、その他は合理的設計では予測することが困難であった。ペプチド１では、５つの位置のうち４つが変化していたが、これらの変化は、元の官能性のある程度の保存を示した。例えばＰＨＥはＴＹＲに変化し、ＰＲＯはＮ−メチルノルバリンに変化した。構造を検討すると、これらのペプチドの間にはかなりの化学的類似性が存在することは明白である。ただし、ペプチド１の場合も、ペプチドＤの場合も、全体的ペプチド構造は、親配列とは著しく異なっている。このデータは、伝統的な医薬品化学でこれらを開発することは極めて困難であるだろうことを示唆している。構造変化を示す概略図は図１２に見ることができる。
【０２４１】
次に、これらのペプチドを、Ｈｅｒ−２ターゲティング分子の効力を試験するための標準的インビトロアッセイを使って、機能についてスクリーニングした。このアッセイでは、細胞培養における増殖を阻害する分子の能力を解析した。広く使用されているキットはＢｒｄＵ細胞増殖アッセイである。このアッセイでは、細胞を、関心対象の分子と共にインキュベートしてから、その培地にブロモデオキシウリジンを補足する。ブロモデオキシウリジンは増殖する細胞のＤＮＡ中に組み込まれる。この修飾塩基を持つＤＮＡは抗体によって認識され、ＥＬＩＳＡによって定量される。出願人はペプチドを試験し、それらをそれぞれの親分子と比較した。どちらのペプチドでも劇的な改良があった。ＨＲＡＰが２３０μＭのＥＣ５０を持つのに対して、ペプチド１のＥＣ５０は５２０ｎＭで、ほぼ４５０倍の改良があった。ＡＮＨＰが６７μＭ７のＥＣ５０を持つのに対して、ペプチドＤの値は６４０ｎＭで、ほぼ１１０倍の強化があった（表２参照）。
【０２４２】
次に出願人は、細胞培養に等濃度のペプチドを加えて、ＢｒｄＵ細胞増殖アッセイを行った。出願人は、１５ｎＭの総ペプチド濃度に対応するＥＣ５０をもたらす強化を見いだした。これは、個別に投与された場合のペプチド１に対して４０倍の強化、ペプチドＤに対して３５倍の強化に相当する（表１）。これは、ペプチド１とペプチドＤが協同的に機能していることを示唆している。
【表２】
2018064573.tif 000003
【０２４３】
表２：ＢｒｄＵ取り込みに基づくＨｅｒ−２陽性細胞の増殖の阻害における劇的な改良。ペプチド１およびペプチドＤは、それぞれの親分子と比較して、約４４０倍および１００倍の改良を示す。ペプチド１とペプチドＤの同時投与は、個別投与に対して、それぞれ３５倍および４３倍の改良を示す。
【０２４４】
これらのペプチドの有効性のもう一つの尺度は、細胞増殖に対するそれぞれの最大阻害である。すなわち、ＥＣ５０を著しく上回る濃度において、ＳＫＢＲ−３細胞の増殖がどれくらい遅くなるかである。ハーセプチンで処理したＳＫＢＲ−３細胞は、無処理細胞の７５％の速度で増殖する（２５％阻害）。ペプチド１およびペプチドＤは、それぞれ７５％および５６％の増殖という阻害（それぞれ２５％および４４％阻害）を示す（図１３参照）。ＨｅＬａ細胞は、Ｈｅｒ−２を過剰発現せず、Ｈｅｒ−２ターゲティング処置に応答しないので、これを対照として使用した。予想どおり、ＨｅＬａ細胞は、その増殖能に、阻害を示さなかった。ペプチド１とペプチドＤとが協同的に機能して、阻害に乗法的効果をもたらすとすれば、出願人は、同時投与が４２％の増殖という阻害（５８％阻害）を示すと予想することになるだろう。この値は、実際には、３９％の増殖（６１％阻害）であり、この予測の誤差内にあった（図１３参照）。
【０２４５】
最後に、出願人は、選択されたペプチドがインビボ機能を例証しうるかどうかを決定したいと考えた。文献は、ハーセプチンで処置された異種移植片が、処置されていないマウスと比較して遅い腫瘍成長によって特徴づけられたことを示している。ヌードマウスにＳＫＢＲ−３細胞を接種した。マウスを、７ｍｇ／Ｋｇの総ペプチド濃度で、４週間にわたって週に３回、ペプチド１およびペプチドＤの静脈内注射によって処置した。ペプチドで処置されたマウスは、腫瘍成長の進行の停止を示すか、または腫瘍体積の減少を示した。この結果は、このモデル系でハーセプチンに関して公表された結果を上回っている。図１４参照。
【０２４６】
バイオテクノロジーの進歩をもってしても、多くのタンパク質は、その機能的状態で精製することが困難である。ヒトがん細胞上に発現するタンパク質のターゲティングに成功することにより、出願人は、ｍＲＮＡディスプレイ用のターゲットを取得するための新しい経路を導き出した。これは、これまでターゲティングすることが技術的に困難で不可能だった多くのタンパク質に対するリガンドの創製でもある。個別化医療との関わりもある。この選択における標的細胞ＳＫＢＲ−３細胞は乳がん患者に由来したものである。この技術の自明な拡張は、真に個別化された処置を得るために、生検をがん患者から採取し、その細胞をこのタイプのｍＲＮＡディスプレイにおいてターゲットとして使用しうるところまで、これを発展させることであるだろう。
【０２４７】
Ｈｅｒ−２のターゲティングにより、出願人は、環化とＮ−メチルアミノ酸との組み合わせをｍＲＮＡディスプレイに組み込みことによって、バイオアベイラブルなペプチドリガンドを誘導できることを示した。これらのリガンドは、薬物様機能にとって十分なインビボ安定性を示す。これらの強化は、高レベルのインビボ効力を示しうるペプチドにつながった。加えて、リード開発のプロセスが速かった。リード特性確認のためのターゲット選択は３ヶ月だった。インビボ効力は合計５ヶ月で示された。このデータは、疾患処置におけるペプチドミメティック開発を目的として、高度に安定で効力のあるペプチドリガンドを効率よく開発することができる迅速なプラットフォーム技術としての、このｍＲＮＡディスプレイ法の妥当性を立証している。これらのＨｅｒ−２阻害ペプチドは、著しく効果的な疾患の処置として開発されうる新しいペプチドミメティッククラスの中の数多くのペプチドの最初の例に過ぎない。
【０２４８】
実験番号３
この実施例では、経口バイオアベイラビリティを得るためのペプチドの修飾を例証する。
【０２４９】
細胞取り込みアッセイ。５％ＦＢＳを含む２００μＬのＤＭＥＭ成長培地中の約１．５×１０５個のＨｅＬａ細胞に、最終ペプチド濃度が１０μＭになるように、フルオレセイン標識ペプチドを加えた。細胞を５％ＣＯ２と共に３７℃で一晩インキュベートした。細胞をＰＢＳで４回洗浄し、トリプシン処理し、ＰＢＳに緩衝液交換した。蛍光フローサイトメトリーを使って細胞を解析し、死細胞を解析から排除した。提示するデータは、収集した５，０００細胞についての平均蛍光シグナルである。
【０２５０】
共焦点顕微鏡法。約１．５×１０５個のＨｅＬａ細胞を９６ウェルプレートにプレーティングした。細胞を１０μＭフルオレセイン標識ペプチドと共に、５％ＦＢＳおよび２％ＤＭＳＯを含むＤＭＥＭ培地中で、一晩インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、６０倍対物レンズを使って、倒立顕微鏡で観察した。フルオレセインの励起には４９０ｎｍ光を使用し、緑色蛍光の観察には５２０発光フィルターを使用した。ペプチドの取り込みまたは活性を比較する際は、強度が取り込み／活性の真の相違を表すように、異なるコンジュゲートの観察でもイメージング条件（例えば光電子増倍管ゲイン／オフセット、レーザー強度および共焦点開口部サイズ）を一定に維持した。
【０２５１】
経口バイオアベイラビリティ。以下のペプチドを経口投与用に合成した：ＭＦＹＶＹＥＹＶＱＷＳＫＫ（ＦＡＭ）、ＭＩＴＷＹＥＦＶＡＧＴＫＫ（ＦＡＭ）、ＭＦＹＶＹＥＹＶＱＷＳＫＫ（ＦＡＭ）ＤＫ（ビオチン）、およびＭＦＹＶＹＥＹＶＱＷＳＫＫ（ＦＡＭ）ＤＫ（パルミトレイン酸）。全てのペプチドを、Ｍｉｌｌｗａｒｄ，Ｓ．Ｗ．ら（２００７）ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２：６２５に既に記述されているとおり、リジンの側鎖からＮ末端へと環化した。麻酔したＣ５７ＢＬ６マウスに、１０ｍｇ／Ｋｇの用量で、経口胃管栄養法によってペプチドを投与した。投与後に、マウスをイソフローランから取り出した。さまざまな時点で、既述のとおり、眼窩採血によって血液試料を採取した。ピークを、ＩＶ注射によってペプチドを投与したマウスからの２０分時点に標準化した。曲線下面積はＧｒａｐｈｐａｄ  ５．０で解析した。
【０２５２】
ペプチド合成。溶媒は全てＳｉｇｍａから購入した。ペプチドは、リンク（ｒｉｎｋ）アミドａｍレジンを使った手作業の固相ペプチド合成により、標準的プロトコールに従って、合成された。標準的カップリングは、室温で２０分間ＤＩＥＡ（１．８ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ中、ＨＡＴＵ（２ｍＬ、０．６ｍｍｏｌ；Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）、ＨＯＡｔ（１．２ｍｍｏｌ；Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔ）において、モノマー（５当量；Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）で行った。Ｎ−メチルアミノ酸へのカップリングは、カップリング時間を３０分にして同じ手順に従った。Ｆｍｏｃ脱保護は、２０％ピペリジン（Ａｎａｓｐｅｃ）を使って、室温で２０分間行った。脱保護、９５％ＴＦＡによる切り離し、濾過およびエーテル抽出後に、勾配溶出（０％Ｂで５分間、４０分で１０−５０％Ｂ．溶媒Ａ：０．１％ＴＦＡを含むＨ２Ｏ、溶媒Ｂ：０．０３５％ＴＦＡを含むＣＨ３ＣＮ）を使って、Ｖｙｄａｃ  Ｃ−１８逆相カラムで、粗生成物を精製した。凍結乾燥固体をＤＭＳＯ中に再構成し、２８０ｎｍにおける吸光度で定量した。収率＝１０〜２５％。
【０２５３】
還元可能なビオチンによるＮ末端特異的ビオチン化は、ペプチドをＮＨＳ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ）と製造者のプロトコールに従って反応させることによって達成した。シクロスポリンはＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。ＤＮＡはＩＤＴ  ＤＮＡから購入した。
【０２５４】
ＰＡＭＰＡ。ＰＡＭＰＡアッセイは製造者の指示書に従ってセットアップした。簡単に述べると、１％ホスファチジルコリン（Ｓｉｇｍａ）をドデカン（Ｓｉｇｍａ）に６５℃で３分間溶解した。膜を製造者の指示書に従って各ウェルに適用した。ペプチド１〜１０および１〜１０Ｂ（表３参照、ＤＭＳＯ中の４ｍＭペプチド１５μＬ）をＰＢＳ（ｐＨ７．４）で３００μＬに希釈した。１００μＬの試料を各ドナーウェルに入れた。アクセプターウェルは、ＰＢＳ中の５％ＤＭＳＯ溶液３００μＬを含有していた。室温で２４時間、受動拡散させた。この時点で、勾配溶出（０％Ｂで５分間、４０分で１０−５０％Ｂ．溶媒Ａ：０．１％ＴＦＡを含むＨ２Ｏ、溶媒Ｂ：０．０３５％ＴＦＡを含むＣＨ３ＣＮ）を使って、試料をＨＰＬＣ  Ｖｙｄａｃ  Ｃ−１８逆相カラムにかけた。２１５ｎｍにおける吸光度をモニタリングした。ペプチドピーク下面積を積分した。シクロスポリンＡは吸光度読み値が低いので、複数ウェルのアクセプター溶液を合わせる必要があった。下記の式を使ってＬｏｇ  Ｐｅを算出した。
【０２５５】
ペプチド１ＲＢ、８ＲＢ、および１０ＲＢ（配列は表３に記載する）については、変化を追跡した。アクセプターウェルは還元剤として１０ｍＭ  ＤＴＴを含有した。データを６時間、１２時間および２４時間後に収集した。２８０ｎｍにおける吸光度を解析した。次の式を使ってＬｏｇ  Ｐｅを算出した：
【数１】
2018064573.tif 000004
【数２】
2018064573.tif 000005
【０２５６】
膜局在。膜は上述のようにセットアップした。ドナーウェルとアクセプターウェルには０．２ｍＭのペプチドが入っていた。ドナーウェル中のペプチド濃度を時刻０分および１５分に２８０ｎＭにおける吸光度で定量した。試料を取り出すときに膜を破壊しないように注意した。
【０２５７】
インスリンのビオチン化および特性確認。０．２５ｍｍｏｌのヒトインスリンを、１ｍＬの５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝８．０）に再構成した。これに、０．５ｍｍｏｌのスルホ−ＮＨＳビオチン（ｐｉｅｒｃｅ）を加えた。反応を室温で１時間進行させてから、勾配溶出（０％Ｂで５分間、４０分で１０−５０％Ｂ．溶媒Ａ：０．１％ＴＦＡを含むＨ２Ｏ、溶媒Ｂ：０．０３５％ＴＦＡを含むＣＨ３ＣＮ）を使って、Ｖｙｄａｃ
Ｃ−１８逆相カラムでのＨＰＬＣ精製を行った。ピークをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦで解析した。２つのピークが単一ビオチン化物に対応し、それらをインビボでの効力について試験した。２つ目のピークの方が効力は高いと決定され、さらなる特性確認には、それを使用した。ビオチン化の部位を決定するために、精製単一ビオチン化インスリンを、０．１ｍｇの固定化キモトリプシンアガロース（ｓｉｇｍａ）により、室温で１分間消化した。濾過によって反応を停止した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ解析を使って、ビオチン化はＢ鎖のＮ末端で起こっていることが決定された。
【０２５８】
インビボでのペプチドのインビボ効果。実験手順は、既に公表されたプロトコールに従い、そこにわずかな変更を加えた。例えば（ＭｃＫｅｒｎ，Ｎ．Ｍ．ら（２００６）Ｎａｔｕｒｅ  ４４３：２１８；Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ，Ｌ．ら（２００３）ＰＮＡＳ  １００：４４３５）を参照されたい。簡単に述べると、Ｃ５７ＢＬ６マウス（各群４匹）を一晩絶食させ、イソフルオラン（ｉｓｏｆｌｕｏｒａｎｅ）を使って麻酔してから、血液試料を眼窩採血によって採取した。マウスには、インスリンまたはビオチン化インスリンを、３．５ｎｍｏｌ／Ｋｇの濃度で、尾静脈へのＩＶ注射によって投薬した。経口バイオアベイラビリティについては、１．７５および７ｎｍｏｌ／Ｋｇのインスリンを経口胃管栄養法で投与した。いずれの場合も、インスリンは、１５０μＬの５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝８．０）中であった。血液を標準的Ｃｌａｒｉｔｙ  Ｐｌｕｓ血中グルコース計（ＶＷＲ）で解析した。読み値をＴ＝０の血糖測定値に標準化し、Ｇｒａｐｈｐａｄ  ５．０で解析した。
【０２５９】
ペプチドリガンドの開発に、より密接に応用することができる限定的な予測モデルも、いくつか存在する。第１に、Ｖｅｂｅｒらによる解析（Ｖｅｂｅｒ，Ｄ．Ｆ．ら（２００２）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４５：２６１５）では、経口アベイラビリティは回転可能な結合が１０個以下であることと相関することが示され、大環状分子は高い細胞透過性を持ちうると主張されている。第２に、Ｌｏｋｅｙとその共同研究者らによる実験的研究は、ペプチドを環化することによって、その受動膜透過性を１０〜１００倍に、劇的に改良することができ、シクロスポリンと類似する膜横断能力を持つ分子を生成させうることを示している。Ｒｅｚａｉ，Ｔ．ら（２００６）Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２８：２５１０。しかしこれらの結果の普遍性はまだ決定されておらず、環化が透過性を助長しないと思われる例もいくつかある。Ｋｗｏｎ，Ｙ．−Ｕ．およびＫｏｄａｄｅｋ，Ｔ．（２００７）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ
１４：６７１。
【０２６０】
Ｋｕｌｉｏｐｕｌｏｓ研究室とＳｍｒｃｋａ研究室での研究はどちらも、長鎖脂肪酸（パルミチン酸Ｃ１６、またはミリスチン酸Ｃ１４）を結合させることで、細胞に添加されたペプチド−脂肪酸コンジュゲートは、サイトゾルにアクセスすることが可能になることを示している（Ｖｅｂｅｒ，Ｄ．Ｆ．ら（２００２）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４５：２６１５；Ｋｗｏｎ，Ｙ．−Ｕ．；Ｋｏｄａｄｅｋ，Ｔ．（２００７）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １４：６７１）。その機序はまだ詳しくは研究されていないが、脂肪酸が外側のリーフレットに組み込まれた後、内側のリーフレットに移動するようである。さらなる研究により、これらの化合物は、血液脳関門を横切ることが示された（Ｚｈｕａｎｇ，Ｚ．Ｐ．ら（２００１）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４４：１９０５）。最後に、Ｍｅａｄｅとその共同研究者らは、細胞内造影剤として機能させるために、スチルベン誘導体（ＡＤＭＳ）が細胞膜越しにガドリニウムキレート化合物を運搬できることを示している。Ｂａｕｍａｎｎ，Ｋ．ら（１９９４）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  ３：７５０）。いずれの場合も、輸送機序は受動的であると思われ、疎水性または両親媒性分子をペプチドに結合させることは、それらに細胞膜を横切るための容易な経路を与えることを含意している。また、より疎水性の強い部分（パルミチン酸およびミリスチン酸）は、この方法で修飾されたタンパク質と同様に（Ｗａｄｉａ，Ｊ．Ｓ．ら（２００４）Ｎａｔ  Ｍｅｄ．１０：３１０）、それらが結合されたペプチドを、膜に会合した状態に保ち、膜を横切る受動輸送の効率を下げることになるだろうと思われる。
【０２６１】
臨床治験中の他の経口インスリン製剤はわずかしかない。これらの製剤の大半は、胃を経由したその輸送と腸における放出とを可能にするためのインスリンのカプセル化に焦点が絞られている。これらの技術は完全に仕上げることが難しく、より高用量でのインスリンの投薬を必要とし、前臨床試験においても、より高用量での投薬を必要とすることから、出願人の製品よりコストがかなり高くなることが示唆される。Ｆｕｒｔａｄｏ，Ｓ．ら
（２００８）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ３４７：１４９；Ｓｏｎａｊｅ，Ｋ．ら（２００９）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ３０：２３２９；Ｙｉｎ，Ｌ．ら（２００９）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ３０：５６９１。加えて、いずれもまだＦＤＡの承認をうけていないので、出願人は依然として、この新しい技術が毒性の問題を持たないかどうかを見る必要がある。
【０２６２】
脂肪酸に付加されたＧＬＰ−１アナログも、経口送達用に、Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋによって開発されているところである。ＧＬＰ−１は血糖が上昇している人の膵臓におけるインスリンの放出をシミュレートする。したがってこの処置は、まだインスリンを分泌することができるＩ型糖尿病患者、またはインスリンに対する感受性があまり高くない人
（進行したＩＩ型患者）には、無効でしかないだろう。加えて、経口取り込みのための脂肪酸の使用は、腸の刺激に関連付けられている。Ｉｙｅｒ，Ｈ．ら（２０１０）Ｏｂｅｓｉｔｙ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  １２：１７９およびＲｕｎｇｅ，Ｓ．（２００８）２８３：１１３４０。
【０２６３】
本開示のビオチン化インスリンは、すべての既存技術に対して、かなりの利点を有している。Ｉ型糖尿病にもＩＩ型糖尿病にも有用であり、合成が簡単であり、安価に製造することができる。ビオチンはビタミン（ビタミンＢ７）であり、毒性は検出できないので、出願人の化合物には毒性の問題はないはずである。加えて、出願人のデータは、細胞内薬物ターゲットへのターゲティングに必要な脂質二重層越しのカーゴの送達には、ビオチンの方が、効率がよいことも示している。
【０２６４】
出願人は、リン脂質二重層を横切るペプチド受動拡散の迅速なスクリーニングを可能にするであろう並列人工膜透過性アッセイ（ＰＡＭＰＡ）を使用した（Ｓｃｈｍｉｄｔら（２００３）Ｊ．Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏｔｅ  ＡＮ１７２９ＥＮ００）。このアッセイでは、２つのチャンバを不活性膜上に担持されたリン脂質二重層で隔てる。出願人は、まず、ヘテロ三量体型Ｇタンパク質Ｇαｉ１＊ＧＤＰおよびＧα１２＊ＧＤＰに高いアフィニティで結合するように開発されたペプチドリガンドに、出願人の検討を集中させることにした。Ｊａ，Ｗ．Ｗ．ら（２００４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３：９２６５；Ｍｉｌｌｗａｒｄ，Ｓ．Ｗ．ら（２００７）ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２：６２５；Ｆｉａｃｃｏ，Ｓ．ら（２００８）ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  ９：２２００。これらのリガンドには、配列、サイズ、総電荷、および極性のバリエーション、ならびに直線状ペプチドと環状ペプチドの比較、末端およびビオチン化が含まれていた。無修飾ペプチドの多くはリン脂質二重層を横切りにくい（表２）。注目に値する２つの例外がペプチド１とペプチド３であり、これらはシクロスポリンと同等の透過性を示した。透過性を増加させる古典的方法に従って（Ｐｉｎｓｋｉ，Ｃ．Ａ．ら（２００１）Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ４６：３）、出願人は、Ｎ−メチル化による水素結合ドナーの除去が、このペプチドの透過性をさらに増加させるはずであると推測した。ペプチド２および９は、透過性の著しい増加を起こした。これは末端の陽電荷が除去されたことによるのであろう。このデータは、ペプチドの末端における修飾が一般に有益でありうることを示唆している。
【０２６５】
最近、膜透過性に対する環化の効果に関して多少の論争が起こっている。環状ペプチドは、分子内水素結合をより容易に形成することにより、そのアミドプロトンを二重層の疎水性領域から遮蔽する能力が強化されているので、有益であると考えられている。Ｒｅｚａｉ，Ｔ．ら（２００６）Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２８：２５１０。しかしペプチドの環化が、常に、膜透過性の強化につながっているわけでもない。Ｋｗｏｎ，Ｙ．−Ｕ．およびＫｏｄａｄｅｋ，Ｔ．（２００７）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １４：６７１。本実験では、化合物７をＮ末端からＬｙｓの側鎖へと環化させた。この環化経路は、２つの陽電荷も除去し、それは透過性にとってさらに有益であると予想されるであろう。これらの知見では、環化は受動拡散を強化せず、実際には、このプロセスにとってわずかに有害であるほどだった。
【０２６６】
以前の研究により、ペプチドを脂肪酸またはスチルベン誘導体に係留すれば、ペプチドは細胞膜のサイトゾル側にアクセスすることが可能になることは実証されている。Ｃｏｖｉｃ，Ｌ．ら（２００２）Ｎａｔ  Ｍｅｄ．８：１１６１；Ｅｎｄｒｅｓ，Ｐ．Ｊ．ら（２００６）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ４：４８５；およびＧｏｕｂａｅｖａ，Ｆ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：１９６３４。機序は詳細には研究されていないが、この修飾は、ペプチドを二重層の外側部分に局在させ、次に膜の内側表面への移動が起こることによって機能すると考えられる。出願人の目的は、出願人のペプチドのリン脂質二重層への局在を強化するのに十分な疎水性を有し、かつ膜から解離しないほど疎水性でもない、ペプチドにコンジュゲートすることができる無毒性分子を見いだすことであった。この目的のために、出願人はペプチドをビオチンにコンジュゲートし、それらの透過性について調べた。ビオチンでＮ末端またはＣ末端標識されたペプチドのＬｏｇ  Ｐｅには、最大２桁の劇的な増加が観察された。これにより、シクロスポリンに類似するＬｏｇ  Ｐｅ値を持つペプチドが５つ得られた。このコンジュゲーションがペプチド送達の一般的強化因子として作用すると思われたことも、特記することができる。強化は、ペプチド配列のバリエーション、総電荷、主鎖修飾、または長さとは無関係に起こった。ペプチド９のＬｙｓの側鎖のビオチン化が膜透過性を強化しなかったことから、透過性の強化は、単に、ペプチドの疎水性の増加またはペプチドからの電荷の除去の結果ではないことが示唆される。Ｎ−メチルデータと合わせて考えると、これは、Ｎ末端またはＣ末端位置が修飾にとって最適でありうることを示唆している。
【表３】
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【０２６７】
表３：膜透過性はビオチンコンジュゲーションによって強化される。Ｍｏｒｒｉｓ，Ｍ．Ｃ．ら（２００１）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ，１９：１１７３に概説されているＰＡＭＰＡを使って計算した値。ビオチン標識ペプチドはその番号の後ろのＢで指定される。ペプチド７、８、９、および１１はアミド化されている。＊Ｎ末端ビオチン標識。†Ｃ末端ビオチン標識。‡Ｌｙｓの側鎖上のビオチン標識。
【０２６８】
この強化された透過の機序をより詳しく研究するために、出願人はビオチン−ペプチドコンジュゲートの膜局在を定量した。ペプチド１Ｂ、６Ｂ、７Ｂ、８Ｂおよび１０Ｂは、それぞれ８．４〜１４％の膜局在を呈した。それらの非ビオチン化対応物、ペプチド１、６、７、８、および１０は、それぞれ０〜４．２％局在した。これは、膜局在の強化がペプチド送達を容易にしたことを示唆している。
【０２６９】
ペプチドの初期透過性とは無関係に、約−６．０という最大膜透過係数が存在すると思われた。出願人の仮説は、このプロセスにおける遅いステップは、もはや内側の膜からアクセプターウェルへの解離になったというものだった。加えて、出願人の透過プロセスは可逆的だった。ビオチン標識ペプチドは、アクセプターウェルから膜へと局在し、フリップし、ドナーウェル中に遊離することができた。出願人は、細胞内では不安定だが細胞外では不安定でないジスルフィドを持つビオチンコンジュゲートを創製することによって、これに対処した。これは、内側膜からの脱離を促進し、不可逆的送達機序を創製して、ペプチドをアクセプターウェル内にトラップすることになるだろう。
【０２７０】
この目標を遂行するにあたって、出願人は、ペプチド１、８および１０を、還元可能なジスルフィドを含有するビオチンにコンジュゲートした。ドナーウェル中の条件が酸化的であり、アクセプターが還元的であるように、ＰＡＭＰＡアッセイをセットアップした。Ｌｏｇ  Ｐｅは、これら３つの例の全てにおいて、著しく増加した。非不安定還元可能対応物と比較して、ペプチド１Ｂは、−６．４から−４．９へのＬｏｇ  Ｐｅの増加を呈し、ペプチド８は−６．５から−５．９へと増加し、ペプチド１０は−６．２から−４．８へと増加した。これは、ペプチド１０の場合、ペプチド送達の１６倍の増加である。出願人は、ビオチンをより疎水性の高い分子で置き換えると、送達がさらに強化されるかどうかを決定しようともした。最初の試みではコレステロールを使用したが、ペプチド−コレステロールコンジュゲートは、ＰＡＭＰＡに要求される条件では凝集するだろう。１２炭素の飽和脂肪酸であるラウリン酸も使用したところ、これは、ビオチンと比較して強化された膜会合を示した（２７％対１４％）。ただし、これらのコンジュゲートは、ビオチンほど効率よくペプチドカーゴを送達することができず、ビオチンのｌｏｇ  Ｐｅが−４．８であるのに対し、−６．８のＬｏｇ  Ｐｅをもたらした。
【０２７１】
次に出願人は、これが、細胞培養において実行可能なペプチドカーゴ送達方法であるかどうかを決定しようとした。もしこれが可能であれば、細胞内タンパク質をターゲティングするためのリガンドを開発することが可能になるであろう。図１７に図示するように、ペプチド１のＮ末端をフルオロセイン（ｆｌｕｏｒｏｓｃｅｉｎ）で標識し、Ｃ末端を還元可能なビオチンで標識した。ヒト子宮頸がん細胞（ＨｅＬａ）およびマウス線維芽細胞
（３Ｔ３）中でペプチドを一晩インキュベートすることによって、取り込み研究を行った。図１７からわかるように、共焦点顕微鏡解析は、ビオチン修飾を含有するペプチドに関して、どちらの細胞株へもペプチドが効率的に送達されることを示している。しかし、ビオチン化なしでタンパク質と共にインキュベートした細胞は、蛍光を示さなかった。ペプチドが核にアクセスしたこともわかり、これが細胞質性でありうることを示唆している。
【０２７２】
出願人は、能動輸送がビオチン伝達ペプチド取り込みにおいてある一定の役割を果たしているかどうかを決定したいと考えた。エンドサイトーシス小胞を標識するために、３Ｔ３細胞をデトラン−ロータミン（ｄｅｔｒａｎ−ｒｈｏｔａｍｉｎｅ）化合物と共にインキュベートした。図１８からわかるように、出願人のペプチドとデキストラン・ロータミンとの間には著しい共局在が認められた。この実験をダイナミン依存的エンドサイトーシス阻害剤ダイナソアの存在下で繰り返した。内部移行したデキストラン−ロータミンが存在しない場合でも、出願人のペプチドの取り込みは依然として起こった。能動輸送はビオチンシャトリングの内部移行には有益でありうるが、その必要はないようである。
【０２７３】
次に、フローサイトメトリー実験を使って、ビオチン伝達送達をカチオン性ペプチドの送達と比較した。ＨＩＶ  ＴＡＴタンパク質の切断型は、細胞にカーゴを送達する能力を持つことが示されている。Ｗａｄｉａ，Ｊ．Ｓ．（２００４）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１０：３１０。加えて、ポリアルギニン配列も、同様の機序でカーゴを送達すると考えられている。それらの効率をビオチンシャトリングと比較するために、ペプチド１の変異体をさらに２つ合成した。一方はＮ末端ＴＡＴ（４７−５７）配列を含有し、他方は９個のＮ末端Ａｒｇ残基を含有した。ペプチドは全てＮ末端にフルオロセインを持っていた。フローサイトメトリーを使って取り込み効率を定量した。図１９は、ビオチン伝達送達およびジスルフィド放出の方が、標準的条件下で、ＴＡＴより１．６倍効率的であることを示している。
【０２７４】
細胞培養において細胞内ターゲットにアクセすることに加えて、ペプチドリガンドの経口バイオアベイラビリティを助長するであろう簡単な修飾を導き出すことは、治療薬開発にとって極めて有益であるだろう。脂肪酸とビオチンの腸吸収はどちらもほぼ１００％の効率である。Ｚｅｍｐｌｅｎｉ，Ｊ．およびＭｏｃｋ，Ｄ．Ｍ．（１９９９）Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ６９：５０４。そこで出願人は、ビオチンまたは脂肪酸のどちらかをコンジュゲートした安定なペプチドは、ある程度の経口バイオアベイラビリティを呈するであろうと理論づけた。出願人は、ＭＦＹＡＹＥＹＡＱＷＳＫＫ−ｍｏｄという配列を持つプロテアーゼ耐性ペプチド（ＳＵＰＲペプチドと命名）を合成した。ここで、ＡはＮ−メチルアラニンであり、ペプチドはリジンからＮ末端へと環化され、Ｋ（ｍｏｄ）は、ビオチンまたはパルミトレイン酸のどちらかを含む修飾側鎖を持つリジンである。パルミトレイン酸は、ヒト血清アルブミンに結合する能力を持つことと、コンジュゲートされたペプチドの溶解度を不飽和脂肪酸コンジュゲートより有利にすることができる低い融点を持つことから選択された、モノ不飽和脂肪酸である。このペプチドを、１０ｍｇ／Ｋｇの用量で、経口胃管栄養法によって、マウスに投与した。さまざまな時点で、マウスから眼窩採血によって血液を採取した。処理後に、蛍光を定量し、同じ用量のペプチドをＩＶ投与することによって得られる最大シグナルと比較した。図２０からわかるように、投与の３時間後に、ビオチン化ペプチドについては９．４％のバイオアベイラビリティ、脂肪酸にコンジュゲートされたペプチドについては９．８％のバイオアベイラビリティに相当する最大ペプチドシグナルがあった。
【０２７５】
ヒトインスリンをビオチン−ＮＨＳと反応させると、ＨＰＬＣによって分離することができる３つの異なる生成物が生成した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦで決定したところ、２つのピークが単一修飾を示し、３つめは二重修飾を示した。両方の単一修飾物をインビボ機能について調べたが、ピーク２の方が効力は高いことがわかった。キモトリプシン消化とその後のＭＡＬＤＩ解析により、ビオチン化の部位はＢ鎖のＮ末端上であることが示された。これは、この位置における修飾が効力を変化させないという先行文献と合致している。Ｃａｌｃｅｔｉ，Ｐ．ら（２００４）Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２２：３１５；およびＴｕｅｓｃａ，Ａ．ら（２００９）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２６：７２７。３．５ｎｍｏｌ／Ｋｇの用量でのこの化合物の静脈内注射は、血糖に対して、応答の総強度の点でも、その応答の持続時間の点でも、無修飾インスリンと類似する効果を示した（図２１）。
【０２７６】
ビオチン化インスリンおよびインスリンを経口胃管栄養法によってマウスに送り込んだ。７ｎｍｏｌ／Ｋｇの用量では、インスリンは血糖に対して効果がなかった。しかし、経口投与されたビオチン化インスリンは、典型的なインスリン応答を生じた。応答の持続時間が長くなっているのは、おそらく、腸粘膜による吸収の動態によるものだろう。
【０２７７】
出願人のデータは、ビオチンだけでなく、高度にバイオアベイラブルな低分子はどれでも同様の結果をもたらしうることを示唆している。これらには他のビタミン、飽和または不飽和脂肪酸、疎水性低分子、ならびに飽和および不飽和炭化水素が含まれ、これらは、Ｂ鎖のＮ末端またはＬｙｓの側鎖に存在しうる。加えて、他のインスリン誘導体およびアナログ、例えばインスリンリスプロおよびＧＬＰ−１アナログなどのインスリン分泌性化合物も、血糖調節のために、ビオチンの包含によって修飾することができる。
【０２７８】
出願人は、ｃｙｃＳＵＰＲの著しい安定性が、試験した天然ペプチド配列よりも、より良くインビボ安定性につながるかどうかも調べていた。先の研究により、サルコシンポリマー（Ｎ−メチルグリシン）は、グリシンポリマーと比較して、著しいインビボ半減期の強化を示すことが示された。これは、サルコシンがペプチドに付与した腎クリアランスに対する耐性によるのではないかと思われた。この目的のために、フルオレセインにコンジュゲートされたペプチドを、尾静脈へのＩＶ注射によって、マウスに投与した。血液試料は眼窩採血によって採取した。蛍光を１５分時点と比較することによって血中ペプチド濃度を決定した。インビボでのＳＵＰＲの安定性に劇的な強化が見いだされた。ＣｙｃＧＩＢＰは３．１分の半減期を示すのに対して、ｃｙｃＳＵＰＲペプチドの半減期は１１０分であり、半減期が約３５倍増加した。血清データとインビボデータの間の半減期の食い違いは、おそらく腎クリアランスによるものであるだろう。先の研究では、血清アルブミンに対してアフィニティを有する低分子にペプチドをコンジュゲートすることで、ペプチドのクリアランス率を著しく低下させうることが示されている。血中濃度が５００〜８００μＭの範囲にあるアルブミンは、Ｃ−１４〜Ｃ−１８脂肪酸に対してナノモル濃度域のアフィニティを有する。しかし、脂肪酸コンジュゲートを持つペプチドを合成しようとする最初の試みは、インビボ研究に必要な条件では、低い溶解度を持つ分子をもたらした。Ｃ−１６脂肪酸パルミトレイン酸中の１つのシス不飽和は、融点を６３℃から０℃へと低下させる。１つの不飽和を持つ脂肪酸は、アルブミンに対するナノモル濃度域の結合アフィニティも保っている。出願人は、パルミトレイン酸へのペプチドのコン
ジュゲーションが、これらの実験において十分な溶解度を保っていることを見いだした。加えて、インビボ半減期の有意な増加もあった。Ｃ末端にこの修飾を含有するｃｙｃＳＵＰＲペプチドは、図２０からわかるように、ｃｙｓＧＩＢＰより３５４倍高い、半減期の一桁の増加、１１００分を示した。
【０２７９】
経口バイオアベイラブルなＮＲＰの例がある。シクロスポリンは、そのような例の一つで、２５％の経口バイオアベイラビリティを示す。しかし、設計されたペプチドが、多少なりとも有意な経口取り込みを示すことは稀である。最も効率のよい例の一つは、前出のＷａｌｅｎｓｋｙら（２００４）によって設計されたステープルドヘリックスである。この場合でさえ、経口アベイラビリティは限られていて、取り込みは０．２％未満である。出願人は、本発明者らのペプチドの経口取り込みの効率を、当分野で見いだされてきたものと比較して決定したいと考えた。出願人は、パルミトレイン酸残基が付加されたＳＵＰＲペプチドおよびパルミトレイン酸残基が付加されていないＳＵＰＲペプチドを調べた。出願人は、Ｃ末端ビオチン化を含有するＳＵＰＲペプチドも調べた。修飾を持たないＳＵＰＲペプチドは、出願人が予期したとおり、検出可能な経口取り込みを一切示さなかった。しかし、ビオチンとパルミトレイン酸はほぼ１００％の経口バイオアベイラビリティを有する。本開示の方法によって作ったペプチドは、実施例３で説明したように、ビオチンまたはビオチンアナログとのコンジュゲーションによってさらに修飾することができる。そこで出願人は、これらの分子にコンジュゲートされたペプチドが、ある程度の経口アベイラビリティを呈するであろうと推論した。実際、図２１に概説するように、これがまさに出願人の見いだしたことである。単回経口投与後に、３時間の時点で、ビオチン化ペプチドの最大取り込みが起こるようだった。Ｃ末端ビオチン化およびパルミトレイン酸コンジュゲーションは、それぞれ６．４％および９．４％の経口取り込み効率を示し、それは、治療薬として十分許容できる範囲内にある。シクロスポリン送達を強化するために使用されるマイクロカプセル化技法などの標準的製剤技法を使用することによって、さらなる最適化を達成することができるであろう。
【０２８０】
実験番号４
Ｇαｉ１結合ＳＵＰＲペプチド（ＭＦＹＡＹＥＹＡＱＷＳＫ）のヒト血清安定性およびヒトミクロソーム安定性を、Ｈｅｒ−２結合能を持つペプチドと比較した。ヒト血清解析から始めることにして、ペプチドを９５％ヒト血清により３７℃で消化した。解析はＨＰＬＣで行った。ペプチドへの修飾はいずれも保持時間の変化をもたらし、試料から差し引かれた。それゆえに、無傷のペプチドは、全く無修飾のペプチドだけである。ＳＵＰＲ、ＨＭＰ、およびＰＭＰの消化は、それらがＳＵＰＲと非常によく似た寿命を持つことを示している。ＰＭＰ２の消化は現在行っているところである。データを図２３に示す。理論に拘泥するわけではないが、出願人は、ＨＭＰのフィッティングが人為的に低い半減期をもたらしたかもしれないと理論づけている。しかし、ペプチドは全て、ストリンジェントな消化条件下で、１００時間を超える半減期を呈した。
【０２８１】
同様の実験を行って、シトクロムＰ４５０消化に対するプロテアーゼ耐性を解析した。ペプチドをヒト肝臓ミクロソームと共に３７℃でインキュベートした。全てのペプチドが高度にプロテアーゼ耐性であった。しかしＳＵＰＲは、Ｈｅｒ−２結合ペプチドよりプロテアーゼ耐性が高かった。ＳＵＰＲペプチドの選択は、よりストリンジェントなタンパク質分解圧で行われた。これは、プロテアーゼ選択圧ステップをダイアルアップすることにより、選択プロセス中に、シトクロムＰ４５０分解をさらに強化できることを示していると思われる。これらのペプチドに関するデータを図２４に図解する。
【０２８２】
円偏光二色性による構造解析
ＳＵＰＲペプチドの構造が安定性の一因になっていることを示すために、出願人は円偏光二色性（「ＣＤ」）実験を行った。ペプチドを５０μＭの濃度で５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液に溶解した。ＣＤ実験は標準的プロトコールに従い、２０℃で行った。Ｇαｉ１に２ｎＭのアフィニティで結合する環状ペプチドであるｃｙｃＧＩＢＰは、完全に構造不定であるようだった（図２５Ａ）。安定化されたペプチドはすべて構造化されていた。ＳＵＰＲペプチドの場合、化合物はらせん状であるようだった（図２５Ｂ）。Ｇαｉ１に結合するペプチドは配列類似性を有し、結晶構造データにおいて、らせん状であることが示されている。したがってこの構造モチーフが、ＳＵＰＲペプチドに予想されるだろう。もう一つの興味深い知見は、ＳＵＰＲペプチドが直線状ペプチドとしても環状ペプチドとしても構造化されていることである（図２５Ｂおよび２５Ｄ）。しかし、一方または両方のＮ−メチル化を取り除くと、ほぼ完全な構造の喪失が起こる（図２５Ｄ）。Ｈｅｒ−２結合ペプチドはβターンに特有のＣＤシグナルを有する。実際、ＰＭＰのスペクトルはシクロスポリンのスペクトルと極めてよく似ている。データを図２６に示す。
【０２８３】
安定化されたペプチドの毒性の解析
本発明者らのペプチドがＨｅｒ−２を過剰発現しない細胞に及ぼす効果を調べるために、ｍｔｔアッセイを行った。標準的プロトコールに従った。簡単に述べると、９６ウェルプレートの各ウェルに１００，０００個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を播種し、Ｄ１０培地で培養した。ペプチドをさまざまな濃度で３６時間投与した。ｍｔｔ解析は製造者の指示書に従った。実験は三重に行った。平均および標準偏差をプロットする。
【０２８４】
ペプチドを１００μＭまで投与しても、明白な毒性はなかった（図２７）。ＤＭＳＯ濃度は、どの試料も、１容量％であった。肝臓細胞に対する毒性の測定を計画している。
【０２８５】
安定化されたペプチドの免疫原性の解析
本発明者らのペプチド試料の反復投与に対する免疫応答を試験した。まず、２つのペプチド、すなわちＳＵＰＲおよびｃｙｃＧＩＢＰを試験した。これらのペプチドはどちらもＧαｉ１に高いアフィニティで結合する。ただし安定化されているのはＳＵＰＲペプチドだけであった。
【０２８６】
各群３匹のマウス（Ｃ５７ＢＬ）を試験した。１００μｇのペプチドを、免疫応答の誘発を助けるためにフロイントアジュバントと共に投与した。ペプチドは８週間にわたって１週間おきに投与した。１０週目に、解析用の血液試料を採取した。
【０２８７】
解析は公表されたプロトコールに従った。マウスからの血清は必要時まで−８０℃に保存する。ＥＬＩＳＡアッセイはストレプトアビジン被覆プレートを使って行った。プレートをビオチン化ペプチドと共にインキュベートした後、血清原液の段階希釈液（１倍〜１／２０００）と共にインキュベートした。インキュベーションと洗浄の後、ＨＲＰとコンジュゲートした抗マウス抗体を加えた。再び洗浄した後、基質溶液を１５、加えた後、発色（停止）溶液を加えた。吸光度を４５０ｎＭで測定した。
【０２８８】
陽性対照として、ビオチン化ペプチドの代わりにビオチン化マウス抗体を使って、上記のプロトコールに従った。陰性対照ではビオチン化生成物（ペプチドまたは抗体）を使用しなかった。免疫原性に関するシグナルは極めて低いようである（図２８）。
【０２８９】
アミノ酸は一文字記号または三文字記号によって特定する。わかりやすくするために述べると、略号および記号は次のアミノ酸を特定している。
【表４】
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【０２９０】
上記の実施形態に関連して本発明を説明したが、上記の記述と実施例は例示を意図したものであり、本発明の範囲を限定するものではないことを理解すべきである。本発明の範囲内にある他の態様、利点および変更は、本発明が関係する技術分野の当業者には明白であるだろう。
【０２９１】
別段の定義がある場合を除き、本明細書において使用する技術用語および科学用語は全て、本発明が属する技術分野の通常の技能を有する者が一般に理解している意味と同じ意味を有する。本明細書に掲載するヌクレオチド配列は全て５’→３’方向に提示されている。
【０２９２】
本明細書に例証的に説明する発明は、本明細書に具体的に開示されていない１または複数の要素、１または複数の限定が一切存在しなくても、適切に実施することができる。したがって、例えば「を含む」、「を包含する」、「を含有する」などの用語は、限定的に解釈するのではなく、拡張的に解釈すべきである。加えて、本明細書において使用する用語および表現は、限定のために使用されているのではなく、説明のために使用されているのであり、そのような用語および表現の使用に、ここに示し説明した特徴またはその一部の等価物を排除しようという意図はなく、本願に係る発明の範囲内で、さまざまな変更が可能であると認められる。
【０２９３】
したがって、本発明を、好ましい実施形態および随意の特徴によって具体的に開示したが、そこに体現されている本明細書に記載の発明の変更、改良および変形を、当業者は採用することができ、そのような変更、改良および変形は、本発明の範囲内にあるとみなされると、理解すべきである。本明細書に掲載した材料、方法および実施例は、好ましい実施形態を代表するものであり、典型例であって、本発明の範囲に対する限定を意図したものではない。
【０２９４】
加えて、本発明の特徴または態様がマーカッシュ群によって記載されている場合、本発明が、それをもって、そのマーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたはメンバーの部分群についても記載されていることは、当業者には認識されるであろう。
【０２９５】
本明細書において言及する刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は全て、それぞれが個別に参照によって組み込まれた場合と同程度に、参照によりそのまま明白に本明細書に組み込まれる。万一、矛盾が生じた場合は、定義を含めて本明細書が優先されることになる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【配列表】
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