(57)【要約】【課題】足場として使用し得る新たなハイドロゲルを提供すること。【解決手段】（ａ）ブロック共重合体および（ｂ）水を含むハイドロゲルであって、（ａ）ブロック共重合体が、ブロックＡ−ブロックＢ−ブロックＡ’との構成を有し、中和度が０〜７０％であるＡＢＡ’型ブロック共重合体を含み、（ａ）ブロック共重合体が、ブロックＣ−ブロックＢ−ブロックＣ’との構成を有するＣＢＣ’型ブロック共重合体を含まず、ブロックＡおよびＡ’が、それぞれ独立に、ポリ（酸性アミノ酸）ブロックであり、ブロックＢが、ポリ（オキシＣ２−４アルキレン）ブロックであり、およびブロックＣおよびＣ’が、それぞれ独立に、ポリ（塩基性アミノ酸）ブロックである、ハイドロゲル。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ブロック共重合体および（ｂ）水を含むハイドロゲルであって、
（ａ）ブロック共重合体が、ブロックＡ−ブロックＢ−ブロックＡ’との構成を有し、中和度が０〜７０％であるＡＢＡ’型ブロック共重合体を含み、
（ａ）ブロック共重合体が、ブロックＣ−ブロックＢ−ブロックＣ’との構成を有するＣＢＣ’型ブロック共重合体を含まず、
ブロックＡおよびＡ’が、それぞれ独立に、ポリ（酸性アミノ酸）ブロックであり、
ブロックＢが、ポリ（オキシＣ２−４アルキレン）ブロックであり、および
ブロックＣおよびＣ’が、それぞれ独立に、ポリ（塩基性アミノ酸）ブロックである、ハイドロゲル。
【請求項２】
ブロックＡおよびＡ’が、それぞれ独立に、グルタミン酸およびアスパラギン酸からなる群から選ばれる少なくとも一つから構成されるブロックである請求項１に記載のハイドロゲル。
【請求項３】
ブロックＡおよびＡ’が、共に、ポリグルタミン酸ブロックである請求項１に記載のハイドロゲル。
【請求項４】
ブロックＡおよびＡ’の重合度の合計が、５〜１２５である請求項１〜３のいずれか一項に記載のハイドロゲル。
【請求項５】
ブロックＡおよびＡ’の重合度の合計が、５〜１００である請求項１〜３のいずれか一項に記載のハイドロゲル。
【請求項６】
ＡＢＡ’型ブロック共重合体のブロックＢが、ポリオキシエチレンブロックである請求項１〜５のいずれか一項に記載のハイドロゲル。
【請求項７】
ＡＢＡ’型ブロック共重合体のブロックＢの重量平均分子量が、１，０００〜３０，０００である請求項１〜６のいずれか一項に記載のハイドロゲル。
【請求項８】
（ａ）ブロック共重合体が、ブロックＡおよびＡ’が共にポリグルタミン酸ブロックであり、ブロックＡおよびＡ’の重合度の合計が１５〜１２５であり、ブロックＢがポリオキシエチレンブロックであり、ブロックＢの重量平均分子量が９，０００〜１１，０００であり、および中和度が０〜５０％であるＡＢＡ’型ブロック共重合体を含む請求項１に記載のハイドロゲル。
【請求項９】
（ａ）ブロック共重合体が、ブロックＡおよびＡ’が共にポリアスパラギン酸ブロックであり、ブロックＡおよびＡ’の重合度の合計が２０〜８０であり、ブロックＢがポリオキシエチレンブロックであり、ブロックＢの重量平均分子量が９，０００〜１１，０００であり、および中和度が０〜２５％であるＡＢＡ’型ブロック共重合体を含む請求項１に記載のハイドロゲル。
【請求項１０】
ＡＢＡ’型ブロック共重合体の量が、ハイドロゲル全体あたり、１〜９５重量％である請求項１〜９のいずれか一項に記載のハイドロゲル。
【請求項１１】
（ａ）ブロック共重合体および（ｂ）水を含むハイドロゲルであって、
（ａ）ブロック共重合体が、ブロックＣ−ブロックＢ−ブロックＣ’との構成を有し、中和度が０〜７０％であるＣＢＣ’型ブロック共重合体を含み、
（ａ）ブロック共重合体が、ブロックＡ−ブロックＢ−ブロックＡ’との構成を有するＡＢＡ’型ブロック共重合体を含まず、
ブロックＡおよびＡ’が、それぞれ独立に、ポリ（酸性アミノ酸）ブロックであり、
ブロックＢが、ポリ（オキシＣ２−４アルキレン）ブロックであり、および
ブロックＣおよびＣ’が、それぞれ独立に、ポリ（塩基性アミノ酸）ブロックである、ハイドロゲル。
【請求項１２】
ＣＢＣ’型ブロック共重合体のブロックＢが、ポリオキシエチレンブロックである請求項１１に記載のハイドロゲル。
【請求項１３】
ＣＢＣ’型ブロック共重合体のブロックＢの重量平均分子量が、１，０００〜３０，０００である請求項１１または１２に記載のハイドロゲル。
【請求項１４】
ブロックＣおよびＣ’が、それぞれ独立に、リジンおよびアルギニンからなる群から選ばれる少なくとも一つから構成されるブロックである請求項１１〜１３のいずれか一項に記載のハイドロゲル。
【請求項１５】
ブロックＣおよびＣ’が、共に、ポリリジンブロックである請求項１１〜１３のいずれか一項に記載のハイドロゲル。
【請求項１６】
ブロックＣおよびＣ’の重合度の合計が、５〜１００である請求項１１〜１５のいずれか一項に記載のハイドロゲル。
【請求項１７】
（ａ）ブロック共重合体が、ブロックＣおよびＣ’が共にポリリジンブロックであり、ブロックＣおよびＣ’の重合度の合計が１５〜６５であり、ブロックＢがポリオキシエチレンブロックであり、ブロックＢの重量平均分子量が９，０００〜１１，０００であり、および中和度が０〜７０％であるＣＢＣ’型ブロック共重合体を含む、請求項１１に記載のハイドロゲル。
【請求項１８】
ＣＢＣ’型ブロック共重合体の量が、ハイドロゲル全体あたり、１〜９５重量％である請求項１１〜１７のいずれか一項に記載のハイドロゲル。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか一項に記載のハイドロゲルを含む足場。
【請求項２０】
損傷した組織の再生または修復のために用いられる請求項１９に記載の足場。
【請求項２１】
損傷した組織が、皮膚または中枢神経である請求項２０に記載の足場。
【請求項２２】
ハイドロゲルが、生体シグナル因子をさらに含む請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の足場。
【請求項２３】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のＡＢＡ’型ブロック共重合体と水とを混合することを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のハイドロゲルを製造する方法。
【請求項２４】
請求項１１〜１７のいずれか一項に記載のＣＢＣ’型ブロック共重合体と水とを混合することを含む、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載のハイドロゲルを製造する方法。
【請求項２５】
ブロックＡ−ブロックＢ−ブロックＡ’との構成を有するＡＢＡ’型ブロック共重合体（前記ＡＢＡ’型ブロック共重合体において、ブロックＡおよびＡ’は、それぞれ独立に、ポリ（酸性アミノ酸）ブロックであり、ブロックＢは、ポリ（オキシＣ２−４アルキレン）ブロックである）を含む水性分散液を、透析膜を含む透析容器に充填し、透析液としてｐＨが７〜８である水酸化ナトリウム水溶液を用いて透析を行う工程（１）、および
透析容器から水性分散液を回収し、水を除去して、精製されたＡＢＡ’型ブロック共重合体を得る工程（２）、
を含む、精製されたＡＢＡ’型ブロック共重合体の製造方法。
【請求項２６】
工程（１）の後および工程（２）の前に、透析液として水を用いて透析を行う工程をさらに含む請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
請求項２５または２６に記載の方法によって得られた精製されたＡＢＡ’型ブロック共重合体と水とを混合することを含む、ハイドロゲルの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ブロック共重合体のハイドロゲルに関する。
【背景技術】
【０００２】
ハイドロゲルとは、水を内部に含む物質の総称である（非特許文献１）。ハイドロゲルは、一般に柔らかいため、細胞のための足場（scaffold）、特に損傷した組織の再生または修復のために用いられる再生医療用足場として期待される。この様な再生医療用足場材の先行品として、MedGel（登録商標）（ゼラチン架橋体）（(株)メドジェル）、PuraMatrix（登録商標）（（株）スリー・ディー・マトリクス)が挙げられる。しかし、これらは、生体由来材料を使用している、精密有機合成が必要である等の問題があった。
【０００３】
また、非特許文献２には、ポリグルタミン酸−ポリオキシエチレン−ポリグルタミン酸ブロック共重合体（非特許文献２で「ＰＧＡ−ＰＥＧ−ＰＧＡ」と記載）の水溶液と、ポリリジン−ポリオキシエチレン−ポリリジンブロック共重合体（非特許文献２で「ＰＬＬ−ＰＥＧ−ＰＬＬ」と記載）の水溶液とを混合することによって、ハイドロゲルを形成することが開示されている（非特許文献２のスキーム１等）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】田畑泰彦、「用語解説  ハイドロゲル」、再生医療 Vol. 11 No. 3, 第57頁左欄第1-2行
【非特許文献２】H. Cui et al., Acta Biomaterialia 11 (2015) 183-190
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、足場として使用し得る新たなハイドロゲルを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
非特許文献２には、ポリグルタミン酸−ポリオキシエチレン−ポリグルタミン酸ブロック共重合体の水溶液、ポリリジン−ポリオキシエチレン−ポリリジンブロック共重合体の水溶液、およびこれら二つの共重合体の混合物を含むハイドロゲルが開示されている。しかし、非特許文献２には、これら共重合体単独でハイドロゲルを形成することは開示されていない。この点、本発明者らが鋭意検討を重ねた結果、ポリグルタミン酸−ポリオキシエチレン−ポリグルタミン酸ブロック共重合体等の単独であっても、ハイドロゲルを形成し得ることを見出した。このような知見に基づく本発明は以下の通りである。
【０００７】
［１］  （ａ）ブロック共重合体および（ｂ）水を含むハイドロゲルであって、
（ａ）ブロック共重合体が、ブロックＡ−ブロックＢ−ブロックＡ’との構成を有し、中和度が０〜７０％であるＡＢＡ’型ブロック共重合体を含み、
（ａ）ブロック共重合体が、ブロックＣ−ブロックＢ−ブロックＣ’との構成を有するＣＢＣ’型ブロック共重合体を含まず、
ブロックＡおよびＡ’が、それぞれ独立に、ポリ（酸性アミノ酸）ブロックであり、
ブロックＢが、ポリ（オキシＣ２−４アルキレン）ブロックであり、および
ブロックＣおよびＣ’が、それぞれ独立に、ポリ（塩基性アミノ酸）ブロックである、ハイドロゲル。
［２］  ブロックＡおよびＡ’が、それぞれ独立に、グルタミン酸およびアスパラギン酸からなる群から選ばれる少なくとも一つから構成されるブロックである前記［１］に記載のハイドロゲル。
［３］  ブロックＡおよびＡ’が、共に、ポリグルタミン酸ブロックである前記［１］に記載のハイドロゲル。
［４］  ブロックＡおよびＡ’の重合度の合計が、５〜１２５である前記［１］〜［３］のいずれか一つに記載のハイドロゲル。
［５］  ブロックＡおよびＡ’の重合度の合計が、５〜１００である前記［１］〜［３］のいずれか一つに記載のハイドロゲル。
［６］  ＡＢＡ’型ブロック共重合体のブロックＢが、ポリオキシエチレンブロックである前記［１］〜［５］のいずれか一つに記載のハイドロゲル。
［７］  ＡＢＡ’型ブロック共重合体のブロックＢの重量平均分子量が、１，０００〜３０，０００である前記［１］〜［６］のいずれか一つに記載のハイドロゲル。
［８］  （ａ）ブロック共重合体が、ブロックＡおよびＡ’が共にポリグルタミン酸ブロックであり、ブロックＡおよびＡ’の重合度の合計が１５〜１２５であり、ブロックＢがポリオキシエチレンブロックであり、ブロックＢの重量平均分子量が９，０００〜１１，０００であり、および中和度が０〜５０％であるＡＢＡ’型ブロック共重合を含む前記［１］に記載のハイドロゲル。
［９］  （ａ）ブロック共重合体が、ブロックＡおよびＡ’が共にポリアスパラギン酸ブロックであり、ブロックＡおよびＡ’の重合度の合計が２０〜８０であり、ブロックＢがポリオキシエチレンブロックであり、ブロックＢの重量平均分子量が９，０００〜１１，０００であり、および中和度が０〜２５％であるＡＢＡ’型ブロック共重合を含む前記［１］に記載のハイドロゲル。
［１０］  ＡＢＡ’型ブロック共重合体の量が、ハイドロゲル全体あたり、１〜９５重量％である前記［１］〜［９］のいずれか一つに記載のハイドロゲル。
【０００８】
［１１］  （ａ）ブロック共重合体および（ｂ）水を含むハイドロゲルであって、
（ａ）ブロック共重合体が、ブロックＣ−ブロックＡ−ブロックＢ−ブロックＡ’−ブロックＣ’との構成を有するＣＡＢＡ’Ｃ’型ブロック共重合体を含み、
ブロックＡおよびＡ’が、それぞれ独立に、ポリ（酸性アミノ酸）ブロックであり、
ブロックＢが、ポリ（オキシＣ２−４アルキレン）ブロックであり、および
ブロックＣおよびＣ’が、それぞれ独立に、ポリ（塩基性アミノ酸）ブロックである、ハイドロゲル。
［１２］  ブロックＡおよびＡ’が、それぞれ独立に、グルタミン酸およびアスパラギン酸からなる群から選ばれる少なくとも一つから構成されるブロックである前記［１１］に記載のハイドロゲル。
［１３］  ブロックＡおよびＡ’が、共に、ポリグルタミン酸ブロックである前記［１１］に記載のハイドロゲル。
［１４］  ブロックＡおよびＡ’の重合度の合計が、５〜１００である前記［１１］〜［１３］のいずれか一つに記載のハイドロゲル。
［１５］  ブロックＢが、ポリオキシエチレンブロックである前記［１１］〜［１４］のいずれか一つに記載のハイドロゲル。
［１６］  ブロックＢの重量平均分子量が、１，０００〜３０，０００である前記［１１］〜［１５］のいずれか一つに記載のハイドロゲル。
［１７］  ブロックＣおよびＣ’が、それぞれ独立に、リジンおよびアルギニンからなる群から選ばれる少なくとも一つから構成されるブロックである前記［１１］〜［１６］のいずれか一つに記載のハイドロゲル。
［１８］  ブロックＣおよびＣ’が、共に、ポリリジンブロックである前記［１１］〜［１６］のいずれか一つに記載のハイドロゲル。
［１９］  ブロックＣおよびＣ’の重合度の合計が、５〜１００である前記［１１］〜［１８］のいずれか一つに記載のハイドロゲル。
［２０］  ＣＡＢＡ’Ｃ’型ブロック共重合体の量が、ハイドロゲル全体あたり、１〜９５重量％である前記［１１］〜［１９］のいずれか一つに記載のハイドロゲル。
【０００９】
［２１］  （ａ）ブロック共重合体および（ｂ）水を含むハイドロゲルであって、
（ａ）ブロック共重合体が、ブロックＣ−ブロックＢ−ブロックＣ’との構成を有し、中和度が０〜７０％であるＣＢＣ’型ブロック共重合体を含み、
（ａ）ブロック共重合体が、ブロックＡ−ブロックＢ−ブロックＡ’との構成を有するＡＢＡ’型ブロック共重合体を含まず、
ブロックＡおよびＡ’が、それぞれ独立に、ポリ（酸性アミノ酸）ブロックであり、
ブロックＢが、ポリ（オキシＣ２−４アルキレン）ブロックであり、および
ブロックＣおよびＣ’が、それぞれ独立に、ポリ（塩基性アミノ酸）ブロックである、ハイドロゲル。
［２２］  ＣＢＣ’型ブロック共重合体のブロックＢが、ポリオキシエチレンブロックである前記［２１］に記載のハイドロゲル。
［２３］  ＣＢＣ’型ブロック共重合体のブロックＢの重量平均分子量が、１，０００〜３０，０００である前記［２１］または［２２］に記載のハイドロゲル。
［２４］  ブロックＣおよびＣ’が、それぞれ独立に、リジンおよびアルギニンからなる群から選ばれる少なくとも一つから構成されるブロックである前記［２１］〜［２３］のいずれか一つに記載のハイドロゲル。
［２５］  ブロックＣおよびＣ’が、共に、ポリリジンブロックである前記［２１］〜［２３］のいずれか一つに記載のハイドロゲル。
［２６］  ブロックＣおよびＣ’の重合度の合計が、５〜１００である前記［２１］〜［２５］のいずれか一つに記載のハイドロゲル。
［２７］  （ａ）ブロック共重合体が、ブロックＣおよびＣ’が共にポリリジンブロックであり、ブロックＣおよびＣ’の重合度の合計が１５〜６５であり、ブロックＢがポリオキシエチレンブロックであり、ブロックＢの重量平均分子量が９，０００〜１１，０００であり、および中和度が０〜７０％であるＣＢＣ’型ブロック共重合体を含む、前記［２１］に記載のハイドロゲル。
［２８］  ＣＢＣ’型ブロック共重合体の量が、ハイドロゲル全体あたり、１〜９５重量％である前記［２１］〜［２７］のいずれか一つに記載のハイドロゲル。
【００１０】
［２９］  前記［１］〜［２８］のいずれか一つに記載のハイドロゲルを含む足場。
［３０］  損傷した組織の再生または修復のために用いられる前記［２９］に記載の足場。
［３１］  損傷した組織が、皮膚または中枢神経である前記［３０］に記載の足場。
［３２］  ハイドロゲルが、生体シグナル因子をさらに含む前記［２９］〜［３１］のいずれか一つに記載の足場。
【００１１】
［３３］  前記［１］〜［９］のいずれか一つに記載のＡＢＡ’型ブロック共重合体と水とを混合することを含む、前記［１］〜［９］のいずれか一つに記載のハイドロゲルを製造する方法。
［３４］  前記［１１］〜［１９］のいずれか一つに記載のＣＡＢＡ’Ｃ’型ブロック共重合体と水とを混合することを含む、前記［１１］〜［１９］のいずれか一つに記載のハイドロゲルを製造する方法。
［３５］  前記［２１］〜［２７］のいずれか一つに記載のＣＢＣ’型ブロック共重合体と水とを混合することを含む、前記［２１］〜［２７］のいずれか一つに記載のハイドロゲルを製造する方法。
【００１２】
［３６］  ブロックＡ−ブロックＢ−ブロックＡ’との構成を有するＡＢＡ’型ブロック共重合体（前記ＡＢＡ’型ブロック共重合体において、ブロックＡおよびＡ’は、それぞれ独立に、ポリ（酸性アミノ酸）ブロックであり、ブロックＢは、ポリ（オキシＣ２−４アルキレン）ブロックである）を含む水性分散液を、透析膜を含む透析容器に充填し、透析液としてｐＨが７〜８である水酸化ナトリウム水溶液を用いて透析を行う工程（１）、および
透析容器から水性分散液を回収し、水を除去して、精製されたＡＢＡ’型ブロック共重合体を得る工程（２）、
を含む、精製されたＡＢＡ’型ブロック共重合体の製造方法。
［３７］  工程（１）の後および工程（２）の前に、透析液として水を用いて透析を行う工程をさらに含む前記［３６］に記載の方法。
［３８］  前記［３６］または［３７］に記載の方法によって得られた精製されたＡＢＡ’型ブロック共重合体と水とを混合することを含む、ハイドロゲルの製造方法。
【発明の効果】
【００１３】
上述の共重合体を用いれば、ハイドロゲルを形成することができる。このようにして得られたハイドロゲルは、足場として使用することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
＜ハイドロゲル＞
本発明は、（ａ）ブロック共重合体および（ｂ）水を含むハイドロゲルであって、（ａ）ブロック共重合体が、上述のＡＢＡ’型ブロック共重合体、ＣＡＢＡ’Ｃ’型ブロック共重合体またはＣＢＣ’型ブロック共重合体を含むハイドロゲルを提供する。本発明のハイドロゲルは、ゲル形成に悪影響を及ぼさない範囲で、前記ブロック共重合体および水とは異なる他の成分を含んでもよい。他の成分としては、例えば、生体シグナル因子、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸二カリウム等が挙げられる。他の成分の合計量は、ハイドロゲル全体あたり、好ましくは０〜１０重量％、より好ましくは０〜３重量％である。
【００１５】
本発明のハイドロゲル中の（ａ）ブロック共重合体は、ＡＢＡ’型ブロック共重合体、ＣＡＢＡ’Ｃ’型ブロック共重合体またはＣＢＣ’型ブロック共重合体からなることが好ましい。以下、これら共重合体について順に説明する。
【００１６】
＜ＡＢＡ’型ブロック共重合体＞
ＡＢＡ’型ブロック共重合体は、ブロックＡ−ブロックＢ−ブロックＡ’との構成を有する共重合体である。前記ブロックは、好ましくはアミド結合を介して結合されている。ＡＢＡ’型ブロック共重合体を含む本発明のハイドロゲルは、非特許文献２と異なり、上述のＣＢＣ’型ブロック共重合体を含まないことを特徴の一つとする。
【００１７】
ブロックＡおよびＡ’は、それぞれ独立に、ポリ（酸性アミノ酸）ブロックである。ブロックＡおよびＡ’は、互いに同じものでもよく、異なるものでもよい。ブロックＡおよびＡ’は、好ましくは同じものである。ここで、酸性アミノ酸とは、アミノ基の数よりもカルボキシ基の数が多いアミノ酸を意味し、例えば、グルタミン酸、アスパラギン酸等が挙げられる。酸性アミノ酸としては、グルタミン酸が好ましく、Ｌ−グルタミン酸がより好ましい。また、ポリ（酸性アミノ酸）ブロックとは、１種または２種以上の酸性アミノ酸からなる単独重合体または共重合体のブロックを意味する。ポリ（酸性アミノ酸）ブロックは、好ましくは１種の酸性アミノ酸からなる単独重合体のブロックである。
【００１８】
ＡＢＡ’型ブロック共重合体のブロックＡおよびＡ’は、それぞれ独立に、グルタミン酸およびアスパラギン酸からなる群から選ばれる少なくとも一つから構成されるブロックであることが好ましく、該ブロックＡおよびＡ’は、共にポリグルタミン酸ブロックまたはポリアスパラギン酸ブロックであることがより好ましく、該ブロックＡおよびＡ’は、共にポリグルタミン酸ブロックであることがさらに好ましい。これらの態様において、グルタミン酸は、好ましくはＬ−グルタミン酸であり、アスパラギン酸は、好ましくはＬ−アスパラギン酸である。
【００１９】
ＡＢＡ’型ブロック共重合体のブロックＡおよびＡ’の重合度の合計は、好ましくは５以上、より好ましくは１０以上、さらに好ましくは１５以上、特に好ましくは２０以上であり、好ましくは１２５以下、より好ましくは１００以下、より一層好ましくは８０以下、さらに好ましくは７０以下、さらに一層好ましくは５０以下、特に好ましくは３６以下である。なお、ブロックＡおよびＡ’の重合度とは、酸性アミノ酸単位の繰返し数を意味する。この重合度の合計は、後述の実施例に記載するように、１Ｈ−ＮＭＲ測定で算出することができる。
【００２０】
ブロックＢは、ポリ（オキシＣ２−４アルキレン）ブロックである。オキシＣ２−４アルキレンとしては、例えば、オキシエチレン、オキシプロピレン、オキシブチレンが挙げられ、オキシエチレンが好ましい。オキシＣ２−４アルキレンは、１種のみでもよく、２種以上でもよい。オキシＣ２−４アルキレンは１種であることが好ましい。ブロックＢは、好ましくはポリオキシエチレンブロックである。
【００２１】
ＡＢＡ’型ブロック共重合体のブロックＢの重量平均分子量は、好ましくは１，０００〜３０，０００、より一層好ましくは３，０００〜２０，０００、さらに好ましくは６，０００〜２０，０００、さらに一層好ましくは９，０００〜２０，０００、特に好ましくは９，０００〜１１，０００、最も好ましくは１０，０００である。この重量平均分子量は、標準にポリエチレングリコールを用いるＧＰＣ法により測定することができる。
【００２２】
ＡＢＡ’型ブロック共重合体の量は、ハイドロゲル全体あたり、好ましくは１〜９５重量％、より好ましくは１〜７０重量％、さらに好ましくは１〜５０重量％である。
【００２３】
ＡＢＡ’型ブロック共重合体の中和度は、０〜７０％、好ましくは０〜６０％、より好ましくは０〜５０％、さらに好ましくは０〜４０％、特に好ましくは０〜２５％である。ここでＡＢＡ’型ブロック共重合体の中和度とは、ブロックＡおよびＡ’の全カルボキシ基に対する、塩の形態であるカルボキシ基（例えば、−ＣＯＯＮａ等）の割合（＝１００×塩の形態であるカルボキシ基の数／全カルボキシ基の数）を意味する。この中和度は、例えば、イオンクロマトグラフィー等によるＡＢＡ’型ブロック共重合体のカチオン（例えば、Ｎａ＋）の実測値（重量％）と、中和度が１００％であるときのＡＢＡ’型ブロック共重合体の理論分子量から算出されるカチオン含量（重量％）とを用いて次式から算出される。
中和度（％）＝１００×（カチオンの実測値（重量％））／（中和度が１００％であるときのＡＢＡ’型ブロック共重合体の理論分子量から算出されるカチオン含量（重量％））
【００２４】
ＡＢＡ’型ブロック共重合体の好ましい一態様として、ブロックＡおよびＡ’が共にポリグルタミン酸ブロックであり、ブロックＡおよびＡ’の重合度の合計が１５〜１２５であり、ブロックＢがポリオキシエチレンブロックであり、ブロックＢの重量平均分子量が９，０００〜１１，０００であり、および中和度が０〜５０％であるＡＢＡ’型ブロック共重合体が挙げられる。
【００２５】
ＡＢＡ’型ブロック共重合体の好ましい別の一態様として、ブロックＡおよびＡ’が共にポリアスパラギン酸ブロックであり、ブロックＡおよびＡ’の重合度の合計が２０〜８０であり、ブロックＢがポリオキシエチレンブロックであり、ブロックＢの重量平均分子量が９，０００〜１１，０００であり、および中和度が０〜２５％であるＡＢＡ’型ブロック共重合体が挙げられる。
【００２６】
ＡＢＡ’型ブロック共重合体は、例えば、両末端に酸性アミノ酸またはその誘導体と反応し得る官能基を有するポリ（オキシＣ２−４アルキレン）誘導体を出発原料として用い、これに酸性アミノ酸またはその誘導体を縮合させて製造することができる。アミノ酸の縮合は周知であり、当業者であれば、その条件を適宜設定して行うことができる。この縮合には、公知の縮合剤を使用してもよい。
【００２７】
出発原料であるポリ（オキシＣ２−４アルキレン）誘導体としては、両末端にアミノ基を有するポリ（オキシＣ２−４アルキレン）ビスアミン（例えば、ポリオキシエチレンビスアミン）が好ましい。酸性アミノ酸またはその誘導体としては、カルボキシ基が保護された酸性アミノ酸  Ｎ−カルボキシ無水物（例えば、γ−ベンジル−Ｌ−グルタメート  Ｎ−カルボキシ無水物）が好ましい。酸性アミノ酸  Ｎ−カルボキシ無水物は、公知の方法（例えば、F. Fuchs, Chem. Ber. 1922, 55(9), 2943、A. C. Farthing, J. Chem. Soc. 1950, 3213-3217に記載の方法）によって製造することができる。また、カルボキシ基の保護は周知であり、当業者であれば、例えば、Greene's Protective Groups in Organic Synthesis 等に記載の保護基および条件を適宜選択して、カルボキシ基を保護することができる。
【００２８】
ポリ（オキシＣ２−４アルキレン）ビスアミンとカルボキシ基が保護された酸性アミノ酸  Ｎ−カルボキシ無水物との縮合反応は、通常、非プロトン性溶媒が主成分である溶媒中で行われる。非プロトン性溶媒としては、例えば、ジクロロメタン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホオキシド、ジクロロエタン、およびこれらの混合溶媒が挙げられる。この縮合反応の温度は、通常０〜１００℃、好ましくは２０〜４０℃であり、その時間は、通常０．１〜５日間、好ましくは１〜３日間である。
【００２９】
縮合反応後、公知の手段（例えば、貧溶媒の添加による沈殿、ろ過、乾燥）によって、カルボキシ基が保護されたＡＢＡ’型ブロック共重合体を回収することができる。例えばGreene's Protective Groups in Organic Synthesis 等に記載の公知の手段によって、この共重合体を脱保護し、ＡＢＡ’型ブロック共重合体を得ることができる。脱保護反応後、公知の手段（例えば、貧溶媒の添加による沈殿、ろ過、乾燥）によって、ＡＢＡ’型ブロック共重合体を回収することができる。このようにして得られたＡＢＡ’型ブロック共重合体を、以下のように透析して、精製することが好ましい。
【００３０】
まず、上記のようにして回収したＡＢＡ’型ブロック共重合体と水とを混合して、ＡＢＡ’型ブロック共重合体を含む水性分散液を調製する。ここで水性分散液とは、分散媒が水である分散液を意味する。なお、非特許文献２には、ＡＢＡ’型ブロック共重合体を水酸化ナトリウム水溶液に溶解させて、水溶液を調製し、得られた水溶液を透析する方法が記載されている。これに対して、本発明のＡＢＡ’型ブロック共重合体の透析方法（即ち、精製されたＡＢＡ’型ブロック共重合体の製造方法）は、ＡＢＡ’型ブロック共重合体の水溶液ではなく、水性分散液を透析することを特徴の一つとする。
【００３１】
次いで、透析膜を含む透析容器に、得られたＡＢＡ’型ブロック共重合体の水性分散液を充填する。透析膜の透過分子量は、好ましくは１００〜５，０００、より好ましくは１００〜１，０００である。透析容器に特に限定はなく、例えば、透析チューブ等が挙げられる。
【００３２】
次いで、透析液としてｐＨが７〜８である水酸化ナトリウム水溶液を用いて透析を行う。水酸化ナトリウム水溶液による透析の温度は、好ましくは１〜３０℃であり、その透析操作にかかる時間は、好ましくは０．１〜３時間、より好ましくは０．５〜１時間である。水酸化ナトリウム水溶液による透析の後、透析液として水を用いて透析をさらに行うことが好ましい。水による透析の温度は、好ましくは１〜３０℃であり、その時間は、好ましくは０．１〜３時間、より好ましくは０．５〜１時間である。
【００３３】
透析後、透析溶液から水性分散液を回収し、水を除去して、精製されたＡＢＡ’型ブロック共重合体が得られる。水の除去手段としては、例えば、加熱乾燥、減圧乾燥、凍結乾燥等が挙げられる。これらの中で、凍結乾燥が好ましい。凍結乾燥の温度は、好ましくは−７７〜２５℃、より好ましくは−７７〜０℃であり、その圧力は好ましくは３０Ｐａ以下、より好ましくは１５Ｐａ以下である。
【００３４】
上述のＡＢＡ’型ブロック共重合体（好ましくは上述の透析によって精製されたＡＢＡ’型ブロック共重合体）と水とを混合することによってハイドロゲルを製造することができる。ハイドロゲルの形成では、ＡＢＡ’型ブロック共重合体と水とを混合し、得られた混合物を静置することが好ましい。静置の温度は、好ましくは０〜３０℃、より好ましくは０〜７℃であり、静置の時間は、好ましくは０．１〜５日間、より好ましくは１〜３日間である。
【００３５】
＜ＣＡＢＡ’Ｃ’型ブロック共重合体＞
ＣＡＢＡ’Ｃ’型ブロック共重合体は、ブロックＣ−ブロックＡ−ブロックＢ−ブロックＡ’−ブロックＣ’との構成を有する共重合体である。前記ブロックは、好ましくはアミド結合を介して結合されている。
【００３６】
ＣＡＢＡ’Ｃ’型ブロック共重合体におけるブロックＡおよびＡ’（ポリ（酸性アミノ酸）ブロック）、並びにブロックＢ（ポリ（オキシＣ２−４アルキレン）ブロック）の説明は、ＡＢＡ’型ブロック共重合体をＣＡＢＡ’Ｃ’型ブロック共重合体に変更すること以外は、上述のＡＢＡ’型ブロック共重合体での説明と同じである。
【００３７】
ブロックＣおよびＣ’は、それぞれ独立に、ポリ（塩基性アミノ酸）ブロックである。ブロックＣおよびＣ’は、互いに同じものでもよく、異なるものでもよい。ブロックＣおよびＣ’は、好ましくは同じものである。ここで、塩基性アミノ酸とは、アミノ基の数がカルボキシ基の数より多いアミノ酸を意味し、例えば、リジン、アルギニン等が挙げられる。塩基性アミノ酸としては、リジンが好ましく、Ｌ−リジンがより好ましい。また、ポリ（塩基性アミノ酸）ブロックとは、１種または２種以上の塩基性アミノ酸からなる単独重合体または共重合体のブロックを意味する。ポリ（塩基性アミノ酸）ブロックは、好ましくは１種の塩基性アミノ酸からなる単独重合体のブロックである。
【００３８】
ＣＡＢＡ’Ｃ’型ブロック共重合体のブロックＣおよびＣ’は、それぞれ独立に、リジンおよびアルギニンからなる群から選ばれる少なくとも一つから構成されるブロックであることが好ましく、該ブロックＣおよびＣ’は、共にポリリジンブロックであることがより好ましい。これらの態様において、リジンは、好ましくはＬ−リジンであり、アルギニンは、好ましくはＬ−アルギニンである。
【００３９】
ＣＡＢＡ’Ｃ’型ブロック共重合体のブロックＣおよびＣ’の重合度の合計は、好ましくは５〜１００、より好ましくは１０〜７０、さらに好ましくは１０〜５０、特に好ましくは１０〜４０である。なお、ブロックＣおよびＣ’の重合度とは、塩基性アミノ酸単位の繰返し数を意味する。この重合度の合計は、後述の実施例に記載するように、１Ｈ−ＮＭＲ測定で算出することができる。
【００４０】
ＣＡＢＡ’Ｃ’型ブロック共重合体の量は、ハイドロゲル全体あたり、好ましくは１〜９５重量％、より好ましくは１〜７０重量％、さらに好ましくは１〜５０重量％である。
【００４１】
ＣＡＢＡ’Ｃ’型ブロック共重合体は、例えば、上述のようにして製造したＡＢＡ’型ブロック共重合体を出発原料として用い、これに塩基性アミノ酸またはその誘導体を縮合させて製造することができる。アミノ酸の縮合は周知であり、当業者であれば、その条件を適宜設定して行うことができる。この縮合には、公知の縮合剤を使用してもよい。
【００４２】
出発原料であるＡＢＡ’型ブロック共重合体としては、両末端にアミノ基を有するＡＢＡ’型ブロック共重合体が好ましい。このようなＡＢＡ’型ブロック共重合体は、例えば上述したように、ポリ（オキシＣ２−４アルキレン）ビスアミンに、カルボキシ基が保護された酸性アミノ酸  Ｎ−カルボキシ無水物（例えば、γ−ベンジル−Ｌ−グルタメート
Ｎ−カルボキシ無水物）を縮合させることによって製造することができる。
【００４３】
上記のようにして得られたＡＢＡ’型ブロック共重合体に縮合させる塩基性アミノ酸またはその誘導体としては、アミノ基が保護された塩基性アミノ酸  Ｎ−カルボキシ無水物（例えば、ε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リシン  Ｎ−カルボキシ無水物）が好ましい。アミノ基の保護は周知であり、当業者であれば、例えば、Greene's Protective Groups in Organic Synthesis 等に記載の保護基および条件を適宜選択して、アミノ基を保護することができる。
【００４４】
両末端にアミノ基を有するＡＢＡ’型ブロック共重合体とアミノ基が保護された塩基性アミノ酸  Ｎ−カルボキシ無水物との縮合反応は、通常、非プロトン性溶媒が主成分である溶媒中で行われる。非プロトン性溶媒としては、例えば、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホオキシド、ジクロロメタン、ジクロロエタン、およびこれらの混合溶媒が挙げられる。この縮合反応の温度は、通常０〜１００℃、好ましくは２０〜４０℃であり、その時間は、通常０．１〜５日間、好ましくは１〜３日間である。
【００４５】
縮合反応後、公知の手段（例えば、貧溶媒の添加による沈殿、ろ過、乾燥）によって、アミノ基が保護されたＣＡＢＡ’Ｃ’型ブロック共重合体を回収することができる。例えばGreene's Protective Groups in Organic Synthesis 等に記載の公知の手段によって、この共重合体を脱保護し、ＣＡＢＡ’Ｃ’型ブロック共重合体を得ることができる。脱保護反応後、公知の手段（例えば、貧溶媒の添加による沈殿、ろ過、乾燥）によって、ＣＡＢＡ’Ｃ’型ブロック共重合体を回収することができる。
【００４６】
上述のＣＡＢＡ’Ｃ’型ブロック共重合体と水とを混合することによってハイドロゲルを製造することができる。ハイドロゲルの形成では、ＣＡＢＡ’Ｃ’型ブロック共重合体と水とを混合し、得られた混合物を静置することが好ましい。静置の温度は、好ましくは０〜３０℃、より好ましくは０〜１０℃であり、静置の時間は、好ましくは０．１〜７日間、より好ましくは０．１〜３日間である。
【００４７】
＜ＣＢＣ’型ブロック共重合体＞
ＣＢＣ’型ブロック共重合体は、ブロックＣ−ブロックＢ−ブロックＣ’との構成を有する共重合体である。前記ブロックは、好ましくはアミド結合を介して結合されている。ＣＢＣ’型ブロック共重合体を含む本発明のハイドロゲルは、非特許文献２と異なり、上述のＡＢＡ’型ブロック共重合体を含まないことを特徴の一つとする。
【００４８】
ＣＢＣ’型ブロック共重合体におけるブロックＢ（ポリ（オキシＣ２−４アルキレン）ブロック）の説明は、ＡＢＡ’型ブロック共重合体をＣＢＣ’型ブロック共重合体に変更すること以外は、上述のＡＢＡ’型ブロック共重合体での説明と同じである。ＣＢＣ’型ブロック共重合体におけるブロックＣおよびＣ’の説明は、ＣＡＢＡ’Ｃ’型ブロック共重合体をＣＢＣ’型ブロック共重合体に変更すること以外は、上述のＣＡＢＡ’Ｃ’型ブロック共重合体での説明と基本的に同じである。ＣＢＣ’型ブロック共重合体において、ＣＡＢＡ’Ｃ’型ブロック共重合体と異なる点を以下で説明する。
【００４９】
ＣＢＣ’型ブロック共重合体のブロックＣおよびＣ’の重合度の合計は、好ましくは５以上、より好ましくは１０以上、さらに好ましくは１５以上であり、好ましくは１００以下、より好ましくは７０以下、さらに好ましくは６５以下、特に好ましくは５０以下、最も好ましくは４０以下である。
【００５０】
ＣＢＣ’型ブロック共重合体の中和度は、０〜７０％、好ましくは０〜６０％、より好ましくは０〜５０％、さらに好ましくは０〜４０％である。ここでＣＢＣ’型ブロック共重合体の中和度とは、ブロックＣおよびＣ’の全アミノ基に対する、塩の形態であるアミノ基（例えば、−ＮＨ３＋Ｂｒ−等）の割合（＝１００×塩の形態であるアミノ基の数／全アミノ基の数）を意味する。この中和度は、例えば、イオンクロマトグラフィー等によるＣＢＣ’型ブロック共重合体のアニオン（例えば、Ｂｒ−）の実測値（％）と、中和度が１００％であるときのＣＢＣ’型ブロック共重合体の理論分子量から算出されるアニオン含量（％）とを用いて次式から算出される。
中和度（％）＝１００×（アニオンの実測値（％））／（中和度が１００％であるときのＣＢＣ’型ブロック共重合体の理論分子量から算出されるアニオン含量（％））
【００５１】
ＣＢＣ’型ブロック共重合体の量は、ハイドロゲル全体あたり、好ましくは１〜９５重量％、より好ましくは１〜７０重量％、さらに好ましくは１〜５０重量％である。
【００５２】
ＣＢＣ’型ブロック共重合体の好ましい一態様として、ブロックＣおよびＣ’が共にポリリジンブロックであり、ブロックＣおよびＣ’の重合度の合計が１５〜６５であり、ブロックＢがポリオキシエチレンブロックであり、ブロックＢの重量平均分子量が９，０００〜１１，０００であり、および中和度が０〜７０％であるＣＢＣ’型ブロック共重合体が挙げられる。
【００５３】
ＣＢＣ’型ブロック共重合体は、例えば、両末端に塩基性アミノ酸またはその誘導体と反応し得る官能基を有するポリ（オキシＣ２−４アルキレン）誘導体を出発原料として用い、これに塩基性アミノ酸またはその誘導体を縮合させて製造することができる。アミノ酸の縮合は周知であり、当業者であれば、その条件を適宜設定して行うことができる。この縮合には、公知の縮合剤を使用してもよい。
【００５４】
出発原料であるポリ（オキシＣ２−４アルキレン）誘導体としては、両末端にアミノ基を有するポリ（オキシＣ２−４アルキレン）ビスアミン（例えば、ポリオキシエチレンビスアミン）が好ましい。塩基性アミノ酸またはその誘導体としては、アミノ基が保護された塩基性アミノ酸  Ｎ−カルボキシ無水物（例えば、ε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リシン−Ｎ−カルボキシ無水物）が好ましい。塩基性アミノ酸  Ｎ−カルボキシ無水物は、公知の方法（例えば、F. Fuchs, Chem. Ber. 1922, 55(9), 2943、A. C. Farthing, J. Chem. Soc. 1950, 3213-3217に記載の方法）によって製造することができる。また、アミノ基の保護は周知であり、当業者であれば、例えば、Greene's Protective Groups in Organic Synthesis 等に記載の保護基および条件を適宜選択して、アミノ基を保護することができる。
【００５５】
ポリ（オキシＣ２−４アルキレン）ビスアミンとアミノ基が保護された塩基性アミノ酸
Ｎ−カルボキシ無水物との縮合反応は、通常、非プロトン性溶媒が主成分である溶媒中で行われる。非プロトン性溶媒としては、例えば、ジクロロメタン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホオキシド、ジクロロエタン、およびこれらの混合溶媒が挙げられる。この縮合反応の温度は、通常０〜１００℃、好ましくは２０〜４０℃であり、その時間は、通常０．１〜５日間、好ましくは１〜３日間である。
【００５６】
縮合反応後、ＡＢＡ’型ブロック共重合体と同様に、公知の手段（例えば、貧溶媒の添加による沈殿、ろ過、乾燥）によって、アミノ基が保護されたＣＢＣ’型ブロック共重合体を回収することができる。例えばGreene's Protective Groups in Organic Synthesis 等に記載の公知の手段によって、この共重合体を脱保護し、ＣＢＣ’型ブロック共重合体を得ることができる。このようにして得られたＣＢＣ’型ブロック共重合体を、以下のように透析して、精製することが好ましい。
【００５７】
まず、上記のようにして回収したＣＢＣ’型ブロック共重合体と水とを混合して、ＣＢＣ’型ブロック共重合体の水溶液を調製する。次いで、透析膜を含む透析容器に、得られたＣＢＣ’型ブロック共重合体の水溶液を充填する。透析膜の透過分子量は、好ましくは１００〜５，０００、より好ましくは１００〜１，０００である。透析容器に特に限定はなく、例えば、透析チューブ等が挙げられる。
【００５８】
次いで、透析液として水を用いて透析を行う。透析の温度は、好ましくは１〜３０℃であり、その透析操作にかかる時間は、好ましくは０．１〜３時間、より好ましくは０．５〜１時間である。透析後、透析チューブ内の水溶液に、水酸化ナトリウムまたはその水溶液を添加し、ＣＢＣ’型ブロック共重合体の中和度をコントロールすることが好ましい。
【００５９】
透析後、透析溶液から水性分散液を回収し、水を除去して、精製されたＣＢＣ’型ブロック共重合体が得られる。水の除去手段としては、例えば、加熱乾燥、減圧乾燥、凍結乾燥等が挙げられる。これらの中で、凍結乾燥が好ましい。凍結乾燥の温度は、好ましくは−７７〜２５℃、より好ましくは−７７〜０℃であり、その圧力は好ましくは３０Ｐａ以下、より好ましくは１５Ｐａ以下である。
【００６０】
上述のＣＢＣ’型ブロック共重合体と水とを混合することによってハイドロゲルを製造することができる。ハイドロゲルの形成では、ＣＢＣ’型ブロック共重合体と水とを混合し、得られた混合物を静置することが好ましい。静置の温度は、好ましくは０〜３０℃、より好ましくは０〜７℃であり、静置の時間は、好ましくは０．１〜５日間、より好ましくは１〜３日間である。
【００６１】
＜足場＞
上述のハイドロゲルは、細胞のための足場として使用することができる。従って、本発明は、上述の１種またはそれ以上のハイドロゲルを含む足場も提供する。本発明の足場は、損傷した組織の再生または修復のために用いることができる。損傷した組織は、好ましくは皮膚または中枢神経、より好ましくは皮膚である。後述の試験例で示すように、本発明のハイドロゲルを含む足場は、損傷した皮膚の再生または修復を促進することができる。なお、Trends in Molecular Medicine, 19, 135 (2013) 等では、皮膚および中枢神経の損傷では、機能修復を準備するステージまではメカニズムが似ていると報告されている。そのため、損傷した皮膚の再生または修復を促進する本発明の足場は、損傷した中枢神経の再生または修復を促進することが期待される。
【００６２】
ＡＢＡ’型ブロック共重合体、ＣＡＢＡ’Ｃ’型ブロック共重合体またはＣＢＣ’型ブロック共重合体のペレットと滅菌された水とを混合することによって得られたハイドロゲルを、患部に埋め込むことができる。また、前記ブロック共重合体のペレットを直接患部に埋め込んで、前記ブロック共重合体と体液中の水によって、患部中でハイドロゲルを形成してもよい。
【００６３】
ハイドロゲルは、生体シグナル因子をさらに含んでいてもよい。生体シグナル因子としては、例えば、線維芽細胞増殖因子（Fibroblast Growth Factor、例えばＦＧＦ２等）、肝細胞増殖因子（Hepatocyte Growth Factor、ＨＧＦ）、神経栄養因子（Nerve Growth Factor、ＮＧＦ）、等が挙げられる。生体シグナル因子は、１種のみを使用してもよく、２種以上を併用してもよい。生体シグナル因子の量は、ハイドロゲル１重量部あたり、好ましくは０．０００００１〜０．１重量部、より好ましくは０．０００００１〜０．０１重量部である。生体シグナル因子を含むハイドロゲルは、上述のＡＢＡ’型ブロック共重合体、ＣＡＢＡ’Ｃ’型ブロック共重合体またはＣＢＣ’型ブロック共重合体と、水と、生体シグナル因子とを混合し、得られた混合物を静置することによって製造することができる。
【実施例】
【００６４】
以下、実施例等を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例等によって制限を受けるものではなく、上記・下記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
なお、以下の実施例等における量または濃度の「％」は、特段の記載が無い限り、「重量％」を意味する。
【００６５】
製造例１（ＡＢＡ’型ブロック共重合体（１）の製造）
１，４−ジオキサンに分散させ、凍結乾燥して得られたポリオキシエチレンビスアミン（Sigma-Aldrich製、ポリオキシエチレンブロックの重量平均分子量：１０，０００、１．０ｇ）を、室温で脱水ジクロロメタン（１５ｍＬ）に溶解させて、ポリオキシエチレンビスアミン溶液を得た。
【００６６】
脱水ジメチルホルムアミド（５ｍＬ）にγ−ベンジル−Ｌ−グルタメート  Ｎ−カルボキシ無水物（以下「Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−ＮＣＡ」と記載する。Shanghai Sunway Pharmaceutical Technology Co., Ltd.製、０．５ｇ）を、室温で溶解させて、Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−ＮＣＡ溶液を得た。
【００６７】
１００ｍＬナスフラスコ内でポリオキシエチレンビスアミン溶液およびＧｌｕ（ＯＢｚｌ）−ＮＣＡ溶液を混合し、アルゴン置換した後、４０℃で撹拌しながら、２日間重合反応を行った。反応液をｎ−ヘキサンおよび酢酸エチルの混合溶媒（ｎ−ヘキサン：酢酸エチルの体積比＝３：２、３００ｍＬ）に滴下し、カルボキシ基が保護されたブロック共重合体を沈殿させた。桐山ロート（ろ紙：５Ｃ）を用いて沈殿物を回収し、真空乾燥して、カルボキシ基が保護されたブロック共重合体を白色ないし帯黄白色の固形物として得た。
【００６８】
カルボキシ基が保護されたブロック共重合体におけるポリグルタミン酸ブロックの重合度は、重トリフルオロ酢酸中で１Ｈ−ＮＭＲ測定することにより、ポリオキシエチレン中におけるＣＨ２ＣＨ２Ｏのプロトン（化学シフト：４ｐｐｍ）および保護されたグルタミン酸単位中におけるベンジル基のベンゼン環部分のプロトン（化学シフト：７．３ｐｐｍ）の数から算出した。その結果、二つのポリグルタミン酸ブロックの重合度の合計は１５であった。
【００６９】
カルボキシ基が保護されたブロック共重合体（１．２ｇ）をトリフルオロ酢酸（１０ｍＬ）に溶解させた後、その溶液に３０％の臭化水素（ＨＢｒ）の酢酸溶液（１３ｍＬ）を添加し、一晩室温で撹拌して、脱保護反応を行った。反応後、反応液を、そのままジエチルエーテルへ滴下することによってブロック共重合体を沈殿させた。桐山ロート（ろ紙：５Ｃ）を用いて沈殿物を回収し、真空乾燥して、ＡＢＡ’型ブロック共重合体（１）（即ち、ポリグルタミン酸（（Ｇｌｕ）ｘ）−ポリオキシエチレン（ＰＥＧ、重量平均分子量：１０，０００）−ポリグルタミン酸（（Ｇｌｕ）ｘ）ブロック共重合体）を、白色ないし帯黄白色の固形物として得た。
【００７０】
得られたＡＢＡ’型ブロック共重合体（１）を純水（約２０ｍＬ）に分散させて分散液を調製し、その分散液を透析チューブ（Spectrum Laboratories, Inc.製透析膜（透過分子量：１００〜５００）、直径：３ｃｍ×長さ：２０ｃｍ）に充填した。ｐＨが７付近である水酸化ナトリウム水溶液を透析液として用い、透析中、濃水酸化ナトリウム水溶液を用いて、透析液のｐＨを７〜８に調整しながら、室温で透析を行った（透析液の量：１，０００ｍＬ）。１時間後、透析液を水に交換し、同様にｐＨ調整して透析操作を１時間行った。最後に、室温で純水（１，０００ｍＬ）を用いて透析を１時間行い、透析チューブ内の液体を回収し、一晩凍結乾燥して、精製されたＡＢＡ’型ブロック共重合体（１）を得た（ポリオキシエチレンブロックの重量平均分子量（ＰＥＧの重量平均分子量）＝１０，０００、および二つのポリグルタミン酸ブロックの重合度の合計（２ｘ）（Ｇｌｕ重合度の合計）＝１５）。
【００７１】
製造例２〜７（ＡＢＡ’型ブロック共重合体（２）〜（７）の製造）
製造例１と同様にして、ポリオキシエチレンブロックの重量平均分子量およびポリグルタミン酸ブロックの重合度が異なるＡＢＡ’型ブロック共重合体（２）〜（７）を製造した。
【００７２】
製造例１〜７で得られたＡＢＡ’型ブロック共重合体（１）〜（７）（即ち、ポリグルタミン酸（（Ｇｌｕ）ｘ）−ポリオキシエチレン（ＰＥＧ）−ポリグルタミン酸（（Ｇｌｕ）ｘ）ブロック共重合体）におけるポリオキシエチレンブロックの重量平均分子量（ＰＥＧの重量平均分子量）、および二つのポリグルタミン酸ブロックの重合度の合計（２ｘ）（Ｇｌｕ重合度の合計）を表１に示す。
【００７３】
【表１】
2018070869.tif 000002
【００７４】
製造例８（ＣＡＢＡ’Ｃ’型ブロック共重合体（１）の製造）
１，４−ジオキサンに分散させ、凍結乾燥して得られたポリオキシエチレンビスアミン（Sigma-Aldrich製、ポリオキシエチレンブロックの重量平均分子量：１０，０００、１ｇ）を、室温で脱水ジクロロメタン（３２ｍＬ）に溶解させて、ポリオキシエチレンビスアミン溶液を得た。
【００７５】
脱水ジメチルホルムアミド（４ｍＬ）にＧｌｕ（ＯＢｚｌ）−ＮＣＡ（２ｇ）を、室温で溶解させて、Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−ＮＣＡ溶液を得た。
【００７６】
１００ｍＬナスフラスコ内でポリオキシエチレンビスアミン溶液およびＧｌｕ（ＯＢｚｌ）−ＮＣＡ溶液を混合し、アルゴン置換した後、４０℃で撹拌しながら、２昼夜重合反応を行った。反応液をｎ−ヘキサンおよび酢酸エチルの混合溶媒（ｎ−ヘキサン：酢酸エチルの体積比＝３：２、４００ｍＬ）に滴下し、カルボキシ基が保護されたブロック共重合体を沈殿させた。桐山ロート（ろ紙：５Ｃ）を用いて沈殿物を回収し、真空乾燥して、カルボキシ基が保護されたブロック共重合体を白色ないし帯黄白色の固形物として得た。
【００７７】
カルボキシ基が保護されたブロック共重合体におけるポリグルタミン酸ブロックの重合度は、重トリフルオロ酢酸中で１Ｈ−ＮＭＲ測定することにより、ポリオキシエチレン中におけるＣＨ２ＣＨ２Ｏのプロトン（化学シフト：４ｐｐｍ）および保護されたリジン単位中におけるベンジル基のベンゼン環部分のプロトン（化学シフト：７．３ｐｐｍ）の数から算出した。その結果、二つのポリグルタミン酸ブロックの重合度の合計は８１であった。
【００７８】
カルボキシ基が保護されたブロック共重合体（１．０ｇ）を脱水ジクロロメタン（３２ｍＬ）に溶解させて、ブロック共重合体溶液を得た。
【００７９】
脱水ジメチルホルムアミド（４ｍＬ）にγ−ベンジル−Ｌ−グルタメ−ト  Ｎ−カルボキシ無水物（以下「Ｌｙｓ（Ｚ）−ＮＣＡ」と記載する、Shanghai Sunway Pharmaceutical Technology Co., Ltd.製、１．０ｇ）を溶解させて、Ｌｙｓ（Ｚ）−ＮＣＡ溶液を得た。
【００８０】
１００ｍＬナスフラスコ内でブロック共重合体溶液およびＬｙｓ（Ｚ）−ＮＣＡ溶液を混合し、アルゴン置換した後、４０℃で撹拌しながら、２昼夜重合反応を行った。反応液をｎ−ヘキサンおよび酢酸エチルの混合溶媒（ｎ−ヘキサン：酢酸エチルの体積比＝３：２、４００ｍＬ）に滴下し、カルボキシ基およびアミノ基が保護されたブロック共重合体を沈殿させた。桐山ロート（ろ紙：５Ｃ）を用いて沈殿物を回収し、真空乾燥して、カルボキシ基およびアミノ基が保護されたブロック共重合体を白色ないし帯黄白色の固形物として得た。
【００８１】
カルボキシ基およびアミノ基が保護されたブロック共重合体におけるポリリジンブロックの重合度は、重トリフルオロ酢酸中で１Ｈ−ＮＭＲ測定することにより、ポリオキシエチレン中におけるＣＨ２ＣＨ２Ｏのプロトン（化学シフト：４ｐｐｍ）並びに保護されたポリグルタミン酸単位および保護されたリジン単位中のベンジル基のベンゼン環部分（化学シフト：７．３ｐｐｍ）の数から、ポリグルタミン酸ブロックおよびポリリジンブロックの重合度の合計を１０２と算出した。このように算出した重合度の合計（１０２）と、上述の二つのポリグルタミン酸ブロックの重合度の合計（８１）から、二つのポリリジンブロックの重合度の合計を２１と算出した。
【００８２】
カルボキシ基およびアミノ基が保護されたブロック共重合体（１．０ｇ）をトリフルオロ酢酸（５ｍＬ）に溶解させて、溶液を得た。得られた溶液に、３０％の臭化水素（ＨＢｒ）の酢酸溶液（６．０ｍＬ）を添加し、一晩室温で撹拌して、脱保護反応を行った。反応後、反応液を、そのままジエチルエーテル（１００ｍＬ）に滴下することによってブロック共重合体を沈殿させた。桐山ロート（ろ紙：５Ｃ）を用いて沈殿物を回収し、真空乾燥して、ＣＡＢＡ’Ｃ’型ブロック共重合体（１）（即ち、ポリリジン（（Ｌｙｓ）ｙ）―ポリグルタミン酸（（Ｇｌｕ）ｘ）−ポリオキシエチレン（ＰＥＧ、重量平均分子量：１０，０００）−ポリグルタミン酸（（Ｇｌｕ）ｘ）―ポリリジン（（Ｌｙｓ）ｙ））ブロック共重合体）を、白色ないし帯黄白色の固形物として得た（ポリオキシエチレンブロックの重量平均分子量（ＰＥＧの重量平均分子量）＝１０，０００、二つのポリグルタミン酸ブロックの重合度の合計（２ｘ）（Ｇｌｕ重合度の合計）＝８１、および二つのポリリジンブロックの重合度の合計（２ｙ）（Ｌｙｓ重合度の合計）＝２１）。
【００８３】
製造例９〜１２（ＣＡＢＡ’Ｃ’型ブロック共重合体（２）〜（５）の製造）
製造例８と同様にして、ポリグルタミン酸ブロックの重合度およびポリリジンブロックの縮合度が異なるＣＡＢＡ’Ｃ’型ブロック共重合体（２）〜（５）を製造した。
【００８４】
製造例８〜１２で得られたＣＡＢＡ’Ｃ’型ブロック共重合体（１）〜（５）（即ち、ポリリジン（（Ｌｙｓ）ｙ）−ポリグルタミン酸（（Ｇｌｕ）ｘ）−ポリオキシエチレン（ＰＥＧ）−ポリグルタミン酸（（Ｇｌｕ）ｘ）−ポリリジン（（Ｌｙｓ）ｙ）ブロック共重合体）におけるポリオキシエチレンブロックの重量平均分子量（ＰＥＧの重量平均分子量）、二つのポリグルタミン酸ブロックの縮合度の合計（２ｘ）（Ｇｌｕ重合度の合計）、および二つのポリリジンブロックの縮合度の合計（２ｙ）（Ｌｙｓ重合度の合計）を表２に示す。
【００８５】
【表２】
2018070869.tif 000003
【００８６】
製造例１３（ＣＢＣ’型ブロック共重合体（１）の製造）
１００ｍＬナスフラスコ内でポリオキシエチレンビスアミン（Sigma-Aldrich製、ポリオキシエチレンブロックの重量平均分子量：１０，０００）のジクロロメタン溶液（３０ｍＬ、ポリオキシエチレンビスアミン濃度：１ｇ／３０ｍＬ）およびＬｙｓ（Ｚ）−ＮＣＡのジメチルホルムアミド溶液（１０ｍＬ、Ｌｙｓ（Ｚ）−ＮＣＡの濃度：１ｇ／１０ｍＬ）を混合し、アルゴン置換した後、４０℃で撹拌しながら、２日間重合反応を行った。反応液をｎ−ヘキサンおよび酢酸エチルの混合溶媒（３００ｍＬ、ｎ−ヘキサン：酢酸エチルの体積比＝３：２）に滴下し、アミノ基が保護されたブロック共重合体を沈殿させた。桐山ロート（ろ紙：５Ｃ）を用いて沈殿物を回収し、真空乾燥して、アミノ基が保護されたブロック共重合体を白色ないし帯黄白色の固形物として得た。
【００８７】
アミノ基が保護されたブロック共重合体におけるポリリジンブロックの重合度は、重トリフルオロ酢酸中で１Ｈ−ＮＭＲ測定することにより、ポリオキシエチレン中におけるＣＨ２ＣＨ２Ｏのプロトン（化学シフト：４ｐｐｍ）および保護されたリジン単位中におけるベンジル基のベンゼン環部分のプロトン（化学シフト：７．３ｐｐｍ）の数から算出した。その結果、二つのポリリジンブロックの重合度の合計は２９であった。
【００８８】
アミノ基が保護されたブロック共重合体（０．６ｇ）をトリフルオロ酢酸６ｍＬに溶解させて、溶液を得た。得られた溶液に、保護されたリジンのＺ基に対して２０当量である臭化水素（ＨＢｒ）の酢酸溶液を加え、一晩室温で撹拌して、脱保護反応を行った。反応後、反応液を、そのままジエチルエーテル（４０ｍＬ）に滴下することによって、ブロック共重合体を沈殿させた。桐山ロート（ろ紙：５Ｃ）を用いて沈殿物を回収し、真空乾燥して、ＣＢＣ’型ブロック共重合体（１）（即ち、ポリリジン（（Ｌｙｓ）ｙ）−ポリオキシエチレン（ＰＥＧ、重量平均分子量：１０，０００）−ポリリジン（（Ｌｙｓ）ｙ）ブロック共重合体）を、白色ないし帯黄白色の固形物として得た。
【００８９】
得られたＣＢＣ’型ブロック共重合体（１）（０．６３ｇ）を純水（３０ｍＬ）に溶解させて水溶液を調製し、その水溶液を、透析チューブ（Biotech RC Tubing 製透析膜（透過分子量：１，０００）、サイズ：３ｃｍ×２０ｃｍ）に充填した。透析液として水３Ｌを用いて、４時間透析を行った。次いで透析液を新たな水４Ｌに交換して、さらに４時間透析を行った。次いで透析チューブ内の水溶液を回収し、一晩凍結乾燥して、精製されたＣＢＣ’型ブロック共重合体（１）を得た（ポリオキシエチレンブロックの重量平均分子量（ＰＥＧの重量平均分子量）＝１０，０００、および二つのポリリジンブロックの重合度の合計（２ｙ）（Ｌｙｓ重合度の合計）＝２９）。
【００９０】
実施例１〜６（ハイドロゲル（１）〜（６）の製造）
製造例１〜６で得られたＡＢＡ’型ブロック共重合体（１）〜（６）を、７℃にて、水と混合し、７℃で静置することによって、ハイドロゲル（１）〜（６）を製造した。各実施例で使用した共重合体および得られたハイドロゲル全体あたりの共重合体の量を表３に示す。
【００９１】
【表３】
2018070869.tif 000004
【００９２】
実施例７および比較例１（ＡＢＡ’型ブロック共重合体の中和度とハイドロゲル形成との関係）
実施例７および比較例１では製造例７で得られたＡＢＡ’型ブロック共重合体（７）を、サンプル１として使用した。
【００９３】
ＡＢＡ’型ブロック共重合体（７）（サンプル１）を水酸化ナトリウム水溶液に溶解させて、共重合体の水溶液を調製した。この水溶液のｐＨが１１以上であることを確認した。次いで、この水溶液を、室温で一晩撹拌した。一晩撹拌した水溶液を、透析チューブ（Biotech RC Tubing 製透析膜（透過分子量：１，０００）、サイズ：３ｃｍ×２０ｃｍ）に充填した。透析液として水３Ｌを用いて約４時間透析した後、透析液を新たな水３Ｌに交換し、さらに約４時間透析した。透析液のｐＨが７程度であることを確認した。透析チューブ内の液体を回収し、一晩凍結乾燥して、中和度が異なるＡＢＡ’型ブロック共重合体（７）（サンプル２）を得た。
【００９４】
イオンクロマトグラフィーによるサンプル１および２のＮａ＋含量の実測値は、それぞれ、０．０７４％および７．２８％であった。
【００９５】
サンプル１および２の中和度を、以下のようにして算出した。
まず、ＡＢＡ’型ブロック共重合体（７）のポリオキシエチレンブロックの重量平均分子量（１０，０００）と、ポリグルタミン酸ブロックの重合度の合計（７５）から、中和度が０％であるＡＢＡ’型ブロック共重合体（７）の理論分子量を算出した（中和度が０％であるＡＢＡ’型ブロック共重合体（７）の理論分子量＝１０，０００＋１２９．１×７５＋２）。
同様にして、中和度が１００％（ナトリウム塩１００％）であるＡＢＡ’型ブロック共重合体（７）の理論分子量を算出した（中和度が１００％であるＡＢＡ’型ブロック共重合体（７）の理論分子量＝１０，０００＋１５１．１×７５＋２）。
【００９６】
次いで中和度が１００％（ナトリウム塩１００％）であるＡＢＡ’型ブロック共重合体（７）の理論分子量から、そのＮａ＋含量を算出した（中和度が１００％であるＡＢＡ’型ブロック共重合体（５）のＮａ＋含量＝２３×７５／（１０，０００＋１５１．１×７５＋２）×１００＝８．０９％）。
【００９７】
以上のようにして得られたＮａ＋の実測値および中和度が１００％であるときのＡＢＡ’型ブロック共重合体の理論分子量から算出されるＮａ＋含量から、下記式：
中和度（％）＝１００×（Ｎａ＋の実測値（％））／（中和度が１００％であるときのＡＢＡ’型ブロック共重合体の理論分子量から算出されるＮａ＋含量（％））
を用いて、中和度を算出した。この結果、サンプル１および２の中和度は、それぞれ、０．９％および９０．０％であった。
【００９８】
各サンプル１または２（５ｍｇ）に純水（２０μＬ）を添加したところ、サンプル１（中和度０．９％）を用いた場合には、水を含んだハイドロゲルが得られ（実施例１）、サンプル２（中和度９０．０％）を用いた場合には、澄明な水溶液が得られた（比較例２）。このサンプル２の水溶液は、非特許文献２に記載の水溶液に該当する。これらの結果から、本発明のハイドロゲルと非特許文献２に記載の水溶液との違いは、これらの共重合体の中和度の違いによるものと推測される。これらの結果を表４に示す。
また、ＡＢＡ’型ブロック共重合体（７）（サンプル１）とＡＢＡ’型ブロック共重合体（１）〜（６）との製造方法は同じであるため、ＡＢＡ’型ブロック共重合体（１）〜（６）は、ＡＢＡ’型ブロック共重合体（７）の中和度（０．９％）と同程度の中和度を有すると考えられる。
【００９９】
【表４】
2018070869.tif 000005
【０１００】
実施例８〜１０（ＡＢＡ’型ブロック共重合体の中和度とハイドロゲル形成との関係）
実施例８〜１０でも、実施例７および比較例１と同様に、製造例７で得られたＡＢＡ’型ブロック共重合体（７）をサンプル１として使用した。
【０１０１】
ＡＢＡ’型ブロック共重合体（７）（サンプル１）０．２ｇに、水１，５００μＬおよび下記表４に示す量の１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液を添加し、一晩撹拌した。得られた溶液を、水を用いて８時間透析し、凍結乾燥することで、中和度の異なるＡＢＡ’型ブロック共重合体（７）（サンプル３〜５）を得た。得られたサンプル３〜５の中和度を、実施例７および比較例１と同様にして算出した。結果を表５に示す。
【０１０２】
【表５】
2018070869.tif 000006
【０１０３】
各サンプル３〜５（２５ｍｇ）に水（２５μＬ）を添加すると、ハイドロゲルが形成した（実施例８〜１０）。これらの結果を表６に示す。
【０１０４】
【表６】
2018070869.tif 000007
【０１０５】
実施例１１および比較例２（ＣＢＣ’型ブロック共重合体の中和度とハイドロゲル形成との関係）
製造例１３で得られたＣＢＣ’型ブロック共重合体（１）の中和度を、以下のように算出した。
まず、ポリオキシエチレンブロックの重量平均分子量（１０，０００）と、製造例１３で算出したポリリジンブロックの重合度の合計（２９）から、中和度が０％であるＣＢＣ’型ブロック共重合体（１）の理論分子量を算出した（中和度が０％であるＣＢＣ’型ブロック共重合体（１）の理論分子量＝１０，０００＋１２８．２×２９＋２）。
同様にして、中和度が１００％（臭化水素酸塩１００％）であるＣＢＣ’型ブロック共重合体（１）の理論分子量を算出した（中和度が１００％であるＣＢＣ’型ブロック共重合体（１）の理論分子量＝１０，０００＋２０９．１×２９＋１６３．８）。
【０１０６】
次いで中和度が１００％（臭化水素酸塩１００％）であるＣＢＣ’型ブロック共重合体（１）の理論分子量から、そのＢｒ−含量を算出した（中和度が１００％であるＣＢＣ’型ブロック共重合体（１）のＢｒ−含量＝７９．９×（２９＋２）／（１０，０００＋２０９．１×２９＋１６３．８）×１００＝１５．３％）。
次いで、イオンクロマトグラフィーにより、製造例１３で得られたＣＢＣ’型ブロック共重合体（１）のＢｒ−の実測値を求めた。
【０１０７】
以上のようにして得られたＢｒ−の実測値および中和度が１００％であるときのＣＢＣ’型ブロック共重合体の理論分子量から算出されるＢｒ−含量から、下記式：
中和度（％）＝１００×（Ｂｒ−の実測値（％））／（中和度が１００％であるときのＣＢＣ’型ブロック共重合体の理論分子量から算出されるＢｒ−含量（％））
を用いて、中和度を算出した。この結果、製造例１３で得られたＣＢＣ’型ブロック共重合体（１）の中和度は８７％であった。
【０１０８】
製造例１３で得られた中和度が８７％であるＣＢＣ’型ブロック共重合体（１）（サンプル６）０．１５ｇに、水２０００μＬおよび１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム水溶液１３０μＬを添加し、一晩撹拌した。この溶液を製造例１３と同様に透析し、凍結乾燥して、精製されたＣＢＣ’型ブロック共重合体（サンプル７）を得た。
得られたＣＢＣ’型ブロック共重合体（サンプル７）の中和度を、上記と同様にして算出した。その結果、この中和度は２２％であった。
【０１０９】
サンプル６（中和度８７％）またはサンプル７（中和度２２％）２５ｍｇに、水２５μＬを添加すると、前者は溶液を形成し（比較例２）、後者はハイドロゲルを形成した（実施例１１）。以上の結果から、ＣＢＣ’型ブロック共重合体の中和度がハイドロゲル形成に影響を与えると考えられる。これらの結果を表７に示す。
【０１１０】
【表７】
2018070869.tif 000008
【０１１１】
実施例１２〜３３（ＡＢＡ’型ブロック共重合体の重合度および中和度と、ハイドロゲル形成との関係）
ＡＢＡ’型ブロック共重合体として、ポリグルタミン酸ブロックの重合度が異なるポリグルタミン酸（（Ｇｌｕ）ｘ）−ポリオキシエチレン（ＰＥＧ、重量平均分子量：１０，０００）−ポリグルタミン酸（（Ｇｌｕ）ｘ）ブロック共重合体）を、製造例１と同様にして製造した。得られたＡＢＡ’型ブロック共重合体の二つのポリグルタミン酸ブロックの重合度の合計（２ｘ）（Ｇｌｕ重合度の合計）を表８に示す。
【０１１２】
得られたＡＢＡ’型ブロック共重合体の中和度を水酸化ナトリウム水溶液で調整し、凍結乾燥によって回収し、回収した共重合体の中和度を、実施例７および比較例１と同様にして測定した。結果を表８に示す。
【０１１３】
以上のようにして得られた、重合度および中和度が異なるＡＢＡ’型ブロック共重合体に、それと同量の水を添加して、ハイドロゲルが形成されるか否かを調べたところ、得られた全ての共重合体でハイドロゲルが形成された。これらの結果を表８に示す。
【０１１４】
【表８】
2018070869.tif 000009
【０１１５】
実施例３４〜３９（ＡＢＡ’型ブロック共重合体の重合度および中和度と、ハイドロゲル形成との関係）
ＡＢＡ’型ブロック共重合体として、ポリアスパラギン酸ブロックの重合度が異なるポリアスパラギン酸（（Ａｓｐ）ｚ）−ポリオキシエチレン（ＰＥＧ、重量平均分子量：１０，０００）−ポリアスパラギン酸（（Ａｓｐ）ｚ）ブロック共重合体）を、製造例１と同様にして製造した。得られたＡＢＡ’型ブロック共重合体の二つのポリアスパラギン酸ブロックの重合度の合計（２ｚ）（Ａｓｐ重合度の合計）を表９に示す。
【０１１６】
得られたＡＢＡ’型ブロック共重合体の中和度を水酸化ナトリウム水溶液で調整し、凍結乾燥によって回収し、回収した共重合体の中和度を、実施例７および比較例１と同様にして測定した。結果を表９に示す。
【０１１７】
以上のようにして得られた、重合度および中和度が異なるＡＢＡ’型ブロック共重合体に、それと同量の水を添加して、ハイドロゲルが形成されるか否かを調べたところ、得られた全ての共重合体でハイドロゲルが形成された。これらの結果を表９に示す。
【０１１８】
【表９】
2018070869.tif 000010
【０１１９】
実施例４０〜４８（ＣＢＣ’型ブロック共重合体の重合度および中和度と、ハイドロゲル形成との関係）
ＣＢＣ’型ブロック共重合体として、ポリリジンブロックの重合度が異なるポリリジン（（Ｌｙｓ）ｙ）−ポリオキシエチレン（ＰＥＧ、重量平均分子量：１０，０００）−ポリリジン（（Ｌｙｓ）ｙ）ブロック共重合体を、製造例１３と同様にして製造した。得られたＣＢＣ’型ブロック共重合体の二つのポリリジンブロックの重合度の合計（２ｙ）（Ｌｙｓ重合度の合計）を表１０に示す。
【０１２０】
得られたＣＢＣ’型ブロック共重合体の中和度を水酸化ナトリウム水溶液で調整し、凍結乾燥によって回収し、回収した共重合体の中和度を、実施例１１および比較例２と同様にして測定した。結果を表１０に示す。
【０１２１】
以上のようにして得られた、重合度および中和度が異なるＣＢＣ’型ブロック共重合体に、それと同量の水を添加して、ハイドロゲルが形成されるか否かを調べたところ、得られた全ての共重合体でハイドロゲルが形成された。これらの結果を表１０に示す。
【０１２２】
【表１０】
2018070869.tif 000011
【０１２３】
試験例１（皮膚欠損モデル評価１）
手術器具は０．１％クロルヘキシジングルコン酸塩水溶液で滅菌して使用した。ラット（ＳＤ、雄、週齢：６〜８週）を４％イソフルランで麻酔を導入し、手術台に移行させた後、２．５％イソフルランで麻酔を維持させた。背中の毛をバリカンで刈り、０．１％クロルヘキシジングルコン酸塩水溶液で術野を滅菌した。はさみで背中部分の皮膚（表皮、真皮、皮下組織、筋層一括）を１ｃｍ×１ｃｍのサイズで除去し、皮膚欠損部に足場（後述するハイドロゲル）を埋め込んだ。また、ネガティブコントロール群（開放創群）のラットには、足場を埋め込まず、皮膚欠損部をそのままとした。ペニシリン液（２００００Ｕ／ｍＬ食塩水）を浸した脱脂綿で術部を拭き、エラスチコン（登録商標）テープ（ジョンソン＆ジョンソン製）、３ＭＴＭデュラポアＴＭサージカルテープを用いて、足場の埋め込み部を被覆した。メロキシカム溶液（０．０４ｍｇ／ｍＬ食塩水）０．１ｍＬをラットの腰部皮下に注射し、ペニシリン溶液（２０００００Ｕ／ｍＬ食塩水）０．０５ｍＬを腿筋に注射して、処置を完了した。Ｎ＝３で実施した。術後のラットは、自由給水、自由摂餌とした。
【０１２４】
術後７日間の間に、２〜３回ペニシリン（２０００００Ｕ／ｍＬ食塩水）０．０５ｍＬをラットの腿筋に注射した。術後１４日後に皮膚欠損部分の性状観察、計測、および皮膚切片組織の評価を行った。皮膚組織切片は中性１０％ホルマリン緩衝液（和光純薬工業（株））で浸漬して、固定した。組織形態観察にはＨＥ染色を施し、顕微鏡観察を行った。
【０１２５】
製造例１で得られたＡＢＡ’型ブロック共重合体（１）のペレット（２５ｍｇ）およびＦＧＦ２水溶液（２．５μｇ／２５μＬ）（２５ｍｇ）を混合し、得られた混合物を５℃で１〜３日間静置して、ハイドロゲルを得た。
【０１２６】
皮膚欠損部には、４個の足場（ハイドロゲル）を埋め込んだ（各ハイドロゲル中のＡＢＡ’型ブロック共重合体（１）の量：２５ｍｇ、ＦＧＦ２量：１０μｇ）。
【０１２７】
創傷面積の推移を評価したところ、足場を用いないネガティブコントロール群（開放創群）は、術直後の創傷部位面積に対する術後７日目の創傷部位面積の割合（平均±ＳＤ）が術直後の４７±７面積％に、１５日目の割合（平均±ＳＤ）が１４±２面積％になった。一方、足場を用いた群では、術直後の創傷部位面積に対する術後７日目の創傷部位面積の割合が２４±５％に、１４日目の割合が４±１％になった。ネガティブコントロール（開放創）群と足場を用いた群のこれらの結果には、有意な差が認められた（ｐ＜０．０５、Student t-test）。
【０１２８】
同じ評価モデルではないものの、創傷治癒実験における有効ＦＧＦ２量：５０μｇ／ｐｏｉｎｔの例が報告されている（K. Kawai et al., British Journal of Plastic Surgery, 58, 1115-1123 (2005)）。そのため、今回のＦＧＦ２投与量（１０μｇ／ｐｏｉｎｔ）では創傷面積推移に影響を与えないと推測された。この報告および上述の結果から、足場（即ち、ＦＧＦ２およびＡＢＡ’型ブロック共重合体（１）を含むハイドロゲル）の皮膚損傷面積の縮小効果は、ＦＧＦ２によるものではなく、ＡＢＡ’型ブロック共重合体（１）によるものと推測された。
【０１２９】
術後２週間にて皮膚組織切片の観察を行った（ＨＥ染色）。ネガティブコントロール群（開放創群）では、表皮欠損、顕著な凹凸が観察された。一方、足場を用いた群では、均一で平らに表皮が形成されており、再生は問題なく完了していることが観察された。足場を用いた群は、ネガティブコントロール群（開放創群）に比較して、表皮再生の進行が速く、きれいに修復されていたことから、足場を用いた群は、皮膚組織の再生を促進していると推測された。上述したK. Kawai et al., British Journal of Plastic Surgery, 58, 1115-1123 (2005)の報告を考慮すると、この効果は、ＦＧＦ２によるものではなく、ＡＢＡ’型ブロック共重合体（１）によるものと推測された。
【０１３０】
試験例２（皮膚欠損モデル評価２）
手術器具は０．１％クロルヘキシジングルコン酸塩水溶液で滅菌して使用した。ラット（ＳＤ、雄、週齢：６週）を４％イソフルランで麻酔を導入し、手術台に移行させた後、２．５％イソフルランで麻酔を維持させた。背中の毛をバリカンで刈り、０．１％クロルヘキシジングルコン酸塩水溶液で術野を滅菌した。はさみで背中部分の皮膚（表皮、真皮、皮下組織、筋層一括）を１ｃｍ×１ｃｍのサイズで除去し、皮膚欠損部に足場（後述するハイドロゲル等）を埋め込んだ。ペニシリン液（２００００Ｕ／ｍＬ食塩水）を浸した脱脂綿で術部を拭き、エラスチコン（登録商標）テープ（ジョンソン＆ジョンソン製）、３ＭＴＭデュラポアＴＭサージカルテープを用いて、足場の埋め込み部を被覆した。メロキシカム溶液（０．０４ｍｇ／ｍＬ食塩水）０．１ｍＬをラットの腰部皮下に注射し、ペニシリン溶液（２０００００Ｕ／ｍＬ食塩水）０．０５ｍＬを腿筋に注射して、処置を完了した。Ｎ＝５で実施した。術後のラットは、自由給水、自由摂餌とした。
【０１３１】
術後１日目および２日目に、ペニシリン（２０００００Ｕ／ｍＬ食塩水）０．０５ｍＬをラットの腿筋に注射した。術後７日後に皮膚欠損部分の性状観察および計測を行った。
【０１３２】
製造例２〜６で得られたＡＢＡ’型ブロック共重合体のいずれかのペレット（２５ｍｇ）および水（２５ｍｇ）を混合し、得られた混合物を７℃で１〜３日間静置して、ハイドロゲルを得た。
【０１３３】
皮膚欠損部には、４個の足場（ハイドロゲル）を埋め込んだ（ハイドロゲル１個中のＡＢＡ’型ブロック共重合体の量：２５ｍｇ）。ポジティブコントロールとしてＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（登録商標）（３Ｄマトリクス社製）を用い、皮膚欠損部にこれを０．２ｍＬ埋め込んだ。さらに、コントロールとして、綿（イワツキカットメン００１−１０５１０）を用い、皮膚欠損部にこれを１０ｍｇ埋め込んだ。術直後の創傷部位面積に対する術後７日目で創傷部位面積の割合（平均±ＳＤ）を測定した。結果を表１１に示す。
【０１３４】
【表１１】
2018070869.tif 000012
【０１３５】
表１１に示すように、PuraMatrix（登録商標）を使用したポジティブコントロール群、および綿を使用したコントロール群に比べて、足場としてＡＢＡ’型ブロック共重合体（２）〜（６）を含むハイドロゲルを使用した群は、皮膚創傷面積の縮小効果が認められた。
【産業上の利用可能性】
【０１３６】
本発明のハイドロゲルは、足場（特に、損傷した組織の再生または修復のために用いられる足場）として使用し得る。