(57)【要約】      （修正有）【課題】ボトリオコッセン合成経路において、共通の前駆体からスクアレンが合成されることによる、ボトリオコッセンの生産量低下を抑制する方法の提供。【解決手段】プレスクアレン二リン酸を合成する活性を有するタンパク質をコードする特定の塩基配列を有するＤＮＡと、ボトリオコッセンを合成する活性を有するタンパク質をコードするの特定の塩基配列を有するＤＮＡとが、リンカーペプチドをコードするＤＮＡによって連結された構造とされている遺伝子セット、遺伝子セットによってコードされるタンパク質セット、遺伝子セットを有する発現ベクター、遺伝子セットが導入された形質転換酵母、形質転換酵母を培養しボトリオコッセンを回収するボトリオコッセンの合成方法。【選択図】図１
2018113952.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ１）又は下記（ｂ１）のいずれか一方に示すタンパク質と、下記（ｃ１）に示すタンパク質とを含み、ファルネシル二リン酸を基質としてボトリオコッセンを合成する活性を有するタンパク質セット。
（ａ１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ１）配列番号２に記載のアミノ酸配列と配列同一性が８７％以上のアミノ酸配列からなり、ファルネシル二リン酸を基質としてプレスクアレン二リン酸を合成する活性を有するタンパク質。
（ｃ１）ドメイン１〜５のアミノ酸配列を有し、ボトリオコッセンを合成する活性を有するタンパク質であり、
前記ドメイン１のアミノ酸配列は、配列番号１９に記載の配列又は配列番号１９に記載の配列と９９％以上の配列同一性をもち、
前記ドメイン２のアミノ酸配列は、配列番号２０に記載の配列又は配列番号２０に記載の配列と９４％以上の配列同一性をもち、
前記ドメイン３のアミノ酸配列は、配列番号２１に記載の配列又は配列番号２１に記載の配列と９４％以上の配列同一性をもち、
前記ドメイン４のアミノ酸配列は、配列番号２２に記載の配列又は配列番号２２に記載の配列と９３％以上の配列同一性をもち、
前記ドメイン５のアミノ酸配列は、配列番号２３に記載の配列又は配列番号２３に記載の配列と９２％以上の配列同一性をもつ。
【請求項２】
請求項１に記載のタンパク質セットであって、
前記（ａ１）又は前記（ｂ１）のいずれか一方に示すタンパク質と、下記（ｄ１）〜（ｆ１）のいずれか１つに示すタンパク質とを含み、ファルネシル二リン酸を基質としてボトリオコッセンを合成する活性を有するタンパク質セット。
（ｄ１）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｅ１）配列番号４に記載のアミノ酸配列と配列同一性が８７％以上のアミノ酸配列からなり、プレスクアレン二リン酸を基質としてボトリオコッセンを合成する活性を有するタンパク質。
（ｆ１）配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項３】
請求項１に記載のタンパク質セットであって、
前記（ａ１）又は前記（ｂ１）のいずれか一方に示すタンパク質と、前記（ｃ１）に示すタンパク質とが、リンカーペプチドによって連結された構造とされているタンパク質セット。
【請求項４】
下記（ａ２）又は下記（ｂ２）のいずれか一方に示すタンパク質。
（ａ２）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ２）配列番号２に記載のアミノ酸配列と配列同一性が８７％以上のアミノ酸配列からなり、ファルネシル二リン酸を基質としてプレスクアレン二リン酸を合成する活性を有するタンパク質。
【請求項５】
下記（ｄ２）又は下記（ｅ２）のいずれか一方に示すタンパク質。
（ｄ２）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｅ２）配列番号４に記載のアミノ酸配列と配列同一性が８７％以上のアミノ酸配列からなり、プレスクアレン二リン酸を基質としてボトリオコッセンを合成する活性を有するタンパク質。
【請求項６】
下記（ｇ１）〜（ｊ１）のいずれか１つに示すＤＮＡからなる遺伝子と、下記（ｋ１）に示すＤＮＡからなる遺伝子と、を含む遺伝子セット。
（ｇ１）配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡ。
（ｈ１）配列番号１に記載の塩基配列と配列同一性が８１％以上の塩基配列を有し、ファルネシル二リン酸を基質としてプレスクアレン二リン酸を合成する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｉ１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｊ１）配列番号２に記載のアミノ酸配列と配列同一性が８７％以上のアミノ酸配列からなり、ファルネシル二リン酸を基質としてプレスクアレン二リン酸を合成する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｋ１）ドメイン１〜５のアミノ酸配列を有し、ボトリオコッセンを合成する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであり、
前記ドメイン１のアミノ酸配列は、配列番号１９に記載の配列又は配列番号１９に記載の配列と９９％以上の配列同一性をもち、
前記ドメイン２のアミノ酸配列は、配列番号２０に記載の配列又は配列番号２０に記載の配列と９４％以上の配列同一性をもち、
前記ドメイン３のアミノ酸配列は、配列番号２１に記載の配列又は配列番号２１に記載の配列と９４％以上の配列同一性をもち、
前記ドメイン４のアミノ酸配列は、配列番号２２に記載の配列又は配列番号２２に記載の配列と９３％以上の配列同一性をもち、
前記ドメイン５のアミノ酸配列は、配列番号２３に記載の配列又は配列番号２３に記載の配列と９２％以上の配列同一性をもつ。
【請求項７】
請求項６に記載の遺伝子セットであって、
前記（ｇ１）〜（ｊ１）のいずれか１つに示すＤＮＡからなる遺伝子と、下記（ｌ１）〜（ｑ１）のいずれか１つに示すＤＮＡからなる遺伝子と、を含む遺伝子セット。
（ｌ１）配列番号３に記載の塩基配列を有するＤＮＡ。
（ｍ１）配列番号３に記載の塩基配列と配列同一性が７９％以上の塩基配列を有し、プレスクアレン二リン酸を基質としてボトリオコッセンを合成する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｎ１）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｏ１）配列番号４に記載のアミノ酸配列と配列同一性が８７％以上のアミノ酸配列からなり、プレスクアレン二リン酸を基質としてボトリオコッセンを合成する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｐ１）配列番号９に記載の塩基配列を有するＤＮＡ。
（ｑ１）配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項８】
請求項６に記載の遺伝子セットであって、
前記（ｇ１）〜（ｊ１）のいずれか１つに示すＤＮＡと、前記（ｋ１）に示すＤＮＡとが、リンカーペプチドをコードするＤＮＡによって連結された構造とされている遺伝子セット。
【請求項９】
下記（ｇ２）〜（ｊ２）のいずれか１つに示すＤＮＡからなる遺伝子。
（ｇ２）配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡ。
（ｈ２）配列番号１に記載の塩基配列と配列同一性が８１％以上の塩基配列を有し、ファルネシル二リン酸を基質としてプレスクアレン二リン酸を合成する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｉ２）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｊ２）配列番号２に記載のアミノ酸配列と配列同一性が８７％以上のアミノ酸配列からなり、ファルネシル二リン酸を基質としてプレスクアレン二リン酸を合成する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項１０】
下記（ｌ２）〜（ｏ２）のいずれか１つに示すＤＮＡからなる遺伝子。
（ｌ２）配列番号３に記載の塩基配列を有するＤＮＡ。
（ｍ２）配列番号３に記載の塩基配列と配列同一性が７９％以上の塩基配列を有し、プレスクアレン二リン酸を基質としてボトリオコッセンを合成する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｎ２）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｏ２）配列番号４に記載のアミノ酸配列と配列同一性が８７％以上のアミノ酸配列からなり、プレスクアレン二リン酸を基質としてボトリオコッセンを合成する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項１１】
請求項８に記載の遺伝子セットを有する発現ベクター。
【請求項１２】
請求項９及び請求項１０に記載の遺伝子が導入された形質転換体。
【請求項１３】
請求項８に記載の遺伝子セットが導入された形質転換体。
【請求項１４】
請求項１２又は請求項１３に記載の形質転換体を培養する工程、及び
培養された前記形質転換体からボトリオコッセンを回収する工程を含む、ボトリオコッセンの合成方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載のボトリオコッセンの合成方法であって、
請求項１２に記載の形質転換体を培養する工程、及び
培養された前記形質転換体からボトリオコッセンを回収する工程を含み、
回収されたボトリオコッセンの純度が８２％以上である、ボトリオコッセンの合成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、タンパク質セット、タンパク質、遺伝子セット、遺伝子、発現ベクター、形質転換体、及びボトリオコッセンの合成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
スクアレンはサメの肝油の主成分として知られ、食品だけでなく化粧品の原料としても利用されている。一方、ボトリオコッセンはバイオ燃料として近年注目され、研究が行われている。
【０００３】
ボトリオコッセンは、化学合成が困難な天然化合物である。例えば、非特許文献１では、ボトリオコッセンの合成に関する遺伝子を酵母に導入することによって、ボトリオコッセンを合成する技術が開示されている。具体的には、ファルネシル二リン酸を基質としてプレスクアレン二リン酸を合成する酵素をコードするプレスクアレン二リン酸合成酵素遺伝子と、プレスクアレン二リン酸を基質としてボトリオコッセンを合成する酵素をコードするボトリオコッセン合成酵素遺伝子と、を酵母に導入している。
【０００４】
プレスクアレン二リン酸合成酵素遺伝子としては、ｓｑｕａｌｅｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ−ｌｉｋｅ  １遺伝子（以下、ＳＳＬ−１遺伝子ともいう）を用いている。ボトリオコッセン合成酵素遺伝子としては、ｓｑｕａｌｅｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ−ｌｉｋｅ  ３遺伝子（以下、ＳＳＬ−３遺伝子ともいう）を用いている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｔｏｍ  Ｄ．  Ｎｉｅｈａｕｓら、「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｉｑｕｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｆｏｒ  ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｅ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｒａｕｎｉｉ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、２０１１年、第１０８巻、ｐ．１２２６０−１２２６５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
炭素数３０のボトリオコッセンはその化学構造や分子量等スクアレンと似た点が多く、スクアレンと同様に様々な用途が期待されている。その用途を研究するためには、ボトリオコッセンの生産量が高いことが要求されている。
【０００７】
しかしながら、非特許文献１では、ＳＳＬ−１遺伝子及びＳＳＬ−３遺伝子を導入した酵母は、ボトリオコッセンだけでなく、スクアレンを副産物として合成する。ファルネシル二リン酸からプレスクアレン二リン酸を合成しプレスクアレン二リン酸からボトリオコッセンを合成する経路であるボトリオコッセン合成経路において、ボトリオコッセン及びスクアレンはどちらもファルネシル二リン酸を前駆物質として合成される。そのため、スクアレンの合成によって、ボトリオコッセンの生産量が低下する恐れがあった。
【０００８】
本開示は、こうした問題に鑑みてなされたものであり、ボトリオコッセン合成経路においてボトリオコッセンの生産量が低下するのを抑制することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本件発明者らは、上記課題の解決のために鋭意研究した結果、ボトリオコッセンの生産量を増加させる新規なプレスクアレン二リン酸合成酵素遺伝子を見出し、本開示を完成した。
【００１０】
すなわち、下記に本開示の一態様を提供する。
〔１〕（ａ１）又は（ｂ１）のいずれか一方に示すタンパク質と、（ｃ１）に示すタンパク質とを含み、ファルネシル二リン酸を基質としてボトリオコッセンを合成する活性を有するタンパク質セット。
【００１１】
（ａ１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ１）配列番号２に記載のアミノ酸配列と配列同一性が８７％以上のアミノ酸配列からなり、ファルネシル二リン酸を基質としてプレスクアレン二リン酸を合成する活性を有するタンパク質。
【００１２】
（ｃ１）ドメイン１〜５のアミノ酸配列を有し、ボトリオコッセンを合成する活性を有するタンパク質。ドメイン１のアミノ酸配列は、配列番号１９に記載の配列又は配列番号１９に記載の配列と９９％以上の配列同一性をもち、ドメイン２のアミノ酸配列は、配列番号２０に記載の配列又は配列番号２０に記載の配列と９４％以上の配列同一性をもち、ドメイン３のアミノ酸配列は、配列番号２１に記載の配列又は配列番号２１に記載の配列と９４％以上の配列同一性をもち、ドメイン４のアミノ酸配列は、配列番号２２に記載の配列又は配列番号２２に記載の配列と９３％以上の配列同一性をもち、ドメイン５のアミノ酸配列は、配列番号２３に記載の配列又は配列番号２３に記載の配列と９２％以上の配列同一性をもつ。
【００１３】
〔２〕（ａ２）又は（ｂ２）のいずれか一方に示すタンパク質。
（ａ２）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ２）配列番号２に記載のアミノ酸配列と配列同一性が８７％以上のアミノ酸配列からなり、ファルネシル二リン酸を基質としてプレスクアレン二リン酸を合成する活性を有するタンパク質。
【００１４】
〔３〕（ｄ２）又は（ｅ２）のいずれか一方に示すタンパク質。
（ｄ２）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｅ２）配列番号４に記載のアミノ酸配列と配列同一性が８７％以上のアミノ酸配列からなり、プレスクアレン二リン酸を基質としてボトリオコッセンを合成する活性を有するタンパク質。
【００１５】
〔４〕（ｇ１）〜（ｊ１）のいずれか１つに示すＤＮＡからなる遺伝子と、（ｋ１）に示すＤＮＡからなる遺伝子と、を含む遺伝子セット。
（ｇ１）配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡ。
【００１６】
（ｈ１）配列番号１に記載の塩基配列と配列同一性が８１％以上の塩基配列を有し、ファルネシル二リン酸を基質としてプレスクアレン二リン酸を合成する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００１７】
（ｉ１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｊ１）配列番号２に記載のアミノ酸配列と配列同一性が８７％以上のアミノ酸配列からなり、ファルネシル二リン酸を基質としてプレスクアレン二リン酸を合成する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００１８】
（ｋ１）ドメイン１〜５のアミノ酸配列を有し、ボトリオコッセンを合成する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。ドメイン１のアミノ酸配列は、配列番号１９に記載の配列又は配列番号１９に記載の配列と９９％以上の配列同一性をもち、ドメイン２のアミノ酸配列は、配列番号２０に記載の配列又は配列番号２０に記載の配列と９４％以上の配列同一性をもち、ドメイン３のアミノ酸配列は、配列番号２１に記載の配列又は配列番号２１に記載の配列と９４％以上の配列同一性をもち、ドメイン４のアミノ酸配列は、配列番号２２に記載の配列又は配列番号２２に記載の配列と９３％以上の配列同一性をもち、ドメイン５のアミノ酸配列は、配列番号２３に記載の配列又は配列番号２３に記載の配列と９２％以上の配列同一性をもつ。
【００１９】
〔５〕（ｇ２）〜（ｊ２）のいずれか１つに示すＤＮＡからなる遺伝子。
（ｇ２）配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡ。
（ｈ２）配列番号１に記載の塩基配列と配列同一性が８１％以上の塩基配列を有し、ファルネシル二リン酸を基質としてプレスクアレン二リン酸を合成する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００２０】
（ｉ２）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｊ２）配列番号２に記載のアミノ酸配列と配列同一性が８７％以上のアミノ酸配列からなり、ファルネシル二リン酸を基質としてプレスクアレン二リン酸を合成する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００２１】
〔６〕（ｌ２）〜（ｏ２）のいずれか１つに示すＤＮＡからなる遺伝子。
（ｌ２）配列番号３に記載の塩基配列を有するＤＮＡ。
（ｍ２）配列番号３に記載の塩基配列と配列同一性が７９％以上の塩基配列を有し、プレスクアレン二リン酸を基質としてボトリオコッセンを合成する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００２２】
（ｎ２）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｏ２）配列番号４に記載のアミノ酸配列と配列同一性が８７％以上のアミノ酸配列からなり、プレスクアレン二リン酸を基質としてボトリオコッセンを合成する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００２３】
〔７〕遺伝子セットを有する発現ベクター。当該遺伝子セットは、前記（ｇ１）〜（ｊ１）のいずれか１つに示すＤＮＡと、前記（ｋ１）に示すＤＮＡとが、リンカーペプチドをコードするＤＮＡによって連結された構造とされている。
【００２４】
〔８〕前記〔５〕及び前記〔６〕に記載の遺伝子が導入された形質転換体。
〔９〕遺伝子セットが導入された形質転換体。当該遺伝子セットは、前記（ｇ１）〜（ｊ１）のいずれか１つに示すＤＮＡと、前記（ｋ１）に示すＤＮＡとが、リンカーペプチドをコードするＤＮＡによって連結された構造とされている。
【００２５】
〔１０〕前記〔８〕又は前記〔９〕に記載の形質転換体を培養する工程、及び培養された前記形質転換体からボトリオコッセンを回収する工程を含む、ボトリオコッセンの合成方法。
【００２６】
本開示によれば、（ａ１）又は（ｂ１）に示す新規なプレスクアレン二リン酸合成酵素及び（ｃ１）に示すタンパク質のタンパク質セットが提供される。また、本開示によれば、（ｇ１）〜（ｊ１）に示すＤＮＡからなる新規なプレスクアレン二リン酸合成酵素遺伝子及び（ｋ１）に示すＤＮＡからなる遺伝子の遺伝子セットが提供される。
【００２７】
本開示のタンパク質セットは、例えば本開示の遺伝子セットを酵母に導入することで、発現される。このとき、例えば非特許文献１で用いられたＳＳＬ−１及びＳＳＬ−３の遺伝子を導入しこれらのタンパク質が発現された場合に比べて、ボトリオコッセンを多く生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は本開示によるボトリオコッセン合成経路を示す図である。
【図２】図２は藻体の生育過程を示す図である。
【図３】図３はＭＨ１ＳＳＬ−１，３のアミノ酸配列を示す図である。
【図４】図４はＭＨ１ＳＳＬ−１＋ＳＨＳＳＬ−３のアミノ酸配列を示す図である。
【図５】図５はＳＨＳＳＬ−１，３のアミノ酸配列を示す図である。
【図６】図６は発現ベクターを示す図である。
【図７】図７はオイル生産能力の比較実験結果を示す図である。
【図８】図８はＭＨ１ＳＳＬ−３タンパク質、ＳＨＳＳＬ−３タンパク質、及びスクアレン合成酵素におけるドメイン１〜５を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
ボトリオコッセン合成経路について、図１を用いて説明する。図中、ファルネシル二リン酸はｆａｒｎｅｓｙｌ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅの略語であるＦＰＰで示し、プレスクアレン二リン酸はｐｒｅｓｑｕａｌｅｎｅ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅの略語であるＰＳＰＰで示している。また、スクアレン合成酵素はｓｑｕａｌｅｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅの略語であるＳＱＳで示している。
【００３０】
図１に示すように、ファルネシル二リン酸からプレスクアレン二リン酸を合成され、プレスクアレン二リン酸から下記の式（Ｉ）に示すボトリオコッセンが合成される。また、ファルネシル二リン酸やプレスクアレン二リン酸から、スクアレン合成酵素によって、下記の式（ＩＩ）に示すスクアレンが合成される。本開示によれば、ボトリオコッセン合成経路において、従来よりもボトリオコッセンが多く生産されることを特徴とする。
【００３１】
【化１】
2018113952.tif 000003
【００３２】
【化２】
2018113952.tif 000004
ここで、本明細書でいう「プレスクアレン二リン酸合成酵素」とは、ファルネシル二リン酸を基質として、プレスクアレン二リン酸を合成する活性を有するタンパク質である。また、本明細書でいう「ボトリオコッセン合成酵素」とは、プレスクアレン二リン酸を基質として、ボトリオコッセンを合成する活性を有するタンパク質である。また、本明細書でいう「プレスクアレン二リン酸合成酵素遺伝子」とは、ファルネシル二リン酸を基質として、プレスクアレン二リン酸を合成する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子である。また、本明細書でいう「ボトリオコッセン合成酵素遺伝子」とは、プレスクアレン二リン酸を基質として、ボトリオコッセンを合成する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子である。
【００３３】
［タンパク質セット］
本開示のタンパク質セットは、下記（ａ１）又は下記（ｂ１）のいずれか一方に示すタンパク質と、下記（ｃ１）に示すタンパク質とを含み、ファルネシル二リン酸を基質としてボトリオコッセンを合成する活性を有する。なお、（ａ１）及び（ｂ１）に示すタンパク質は、本件発明者が見出した新規なプレスクアレン二リン酸合成酵素であり、発見した場所にちなんで、ＭＨ１ＳＳＬ−１タンパク質と表記されることもある。
【００３４】
（ａ１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ１）配列番号２に記載のアミノ酸配列と配列同一性が８７％以上のアミノ酸配列からなり、ファルネシル二リン酸を基質としてプレスクアレン二リン酸を合成する活性を有するタンパク質。
【００３５】
（ｃ１）ドメイン１〜５のアミノ酸配列を有し、ボトリオコッセンを合成する活性を有するタンパク質。ドメイン１のアミノ酸配列は、配列番号１９に記載の配列又は配列番号１９に記載の配列と９９％以上の配列同一性をもち、ドメイン２のアミノ酸配列は、配列番号２０に記載の配列又は配列番号２０に記載の配列と９４％以上の配列同一性をもち、ドメイン３のアミノ酸配列は、配列番号２１に記載の配列又は配列番号２１に記載の配列と９４％以上の配列同一性をもち、ドメイン４のアミノ酸配列は、配列番号２２に記載の配列又は配列番号２２に記載の配列と９３％以上の配列同一性をもち、ドメイン５のアミノ酸配列は、配列番号２３に記載の配列又は配列番号２３に記載の配列と９２％以上の配列同一性をもつ。
【００３６】
本開示のタンパク質セットは、上記ＭＨ１ＳＳＬ−１タンパク質及び上記（ｃ１）に示すタンパク質の組み合わせである。タンパク質セットは、例えば、上記ＭＨ１ＳＳＬ−１タンパク質及び上記（ｃ１）に示すタンパク質がそれぞれ別々のタンパク質として組み合わされた状態であってもよい。また、タンパク質セットは、例えば、上記ＭＨ１ＳＳＬ−１タンパク質及び上記（ｃ１）に示すタンパク質が融合した融合タンパク質として組み合わされた状態であってもよい。
【００３７】
また、上記ＭＨ１ＳＳＬ−１タンパク質は５つのドメインＩ〜Ｖを持つ。ここで、本明細書において、ドメインＩ〜Ｖはドメイン１〜５の用語と区別して用いる。上記（ａ１）に示すタンパク質において、ドメインＩは配列番号２に記載の６５位から７８位のアミノ酸配列からなり、ドメインＩＩは配列番号２に記載の８０位から９７位のアミノ酸配列からなり、ドメインＩＩＩは配列番号２に記載の１７５位から１９２位のアミノ酸配列からなる。
【００３８】
上記（ａ１）に示すタンパク質において、配列番号２に記載のドメインＩのアミノ酸配列に対して、９３％以上、好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、かつ、ファルネシル二リン酸を基質としてプレスクアレン二リン酸を合成する活性を有するタンパク質であってもよい。
【００３９】
上記（ａ１）に示すタンパク質において、配列番号２に記載のドメインＩＩのアミノ酸配列に対して、８４％以上、好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、かつ、ファルネシル二リン酸を基質としてプレスクアレン二リン酸を合成する活性を有するタンパク質であってもよい。
【００４０】
上記（ａ１）に示すタンパク質において、配列番号２に記載のドメインＩＩＩのアミノ酸配列に対して、９５％以上であり、好ましくは９７％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、かつ、ファルネシル二リン酸を基質としてプレスクアレン二リン酸を合成する活性を有するタンパク質であってもよい。
【００４１】
また、上記（ｂ１）に示すタンパク質において、配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して、８７％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、かつ、ファルネシル二リン酸を基質としてプレスクアレン二リン酸を合成する活性を有するタンパク質であってもよい。
【００４２】
また、上記（ｃ１）に示すタンパク質は、ボトリオコッセン合成酵素であってもよい。
また、上記（ｃ１）に示すタンパク質は、下記（ｄ１）〜（ｆ１）のいずれか１つに示すタンパク質であってもよい。つまり、本開示のタンパク質セットは、上記（ａ１）又は上記（ｂ１）のいずれか一方に示すタンパク質と、下記（ｄ１）〜（ｆ１）のいずれか１つに示すタンパク質とを含み、ファルネシル二リン酸を基質としてボトリオコッセンを合成する活性を有するものであってもよい。
【００４３】
（ｄ１）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｅ１）配列番号４に記載のアミノ酸配列と配列同一性が８７％以上のアミノ酸配列からなり、プレスクアレン二リン酸を基質としてボトリオコッセンを合成する活性を有するタンパク質。
【００４４】
（ｆ１）配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
なお、（ｄ１）及び（ｅ１）に示すタンパク質は、本件発明者が見出した新規なボトリオコッセン合成酵素であり、発見した場所にちなんで、ＭＨ１ＳＳＬ−３タンパク質と表記されることもある。また、（ｆ１）に示すタンパク質は、Ｂｏｔｒｙｏｃｕｃｃｕｓ  ｂｒａｕｎｉｉ  ｓｈｏｗａ株（以下ｓｈｏｗａ株ともいう）由来のボトリオコッセン合成酵素であり、ＳＨＳＳＬ−３タンパク質と表記することもある。
【００４５】
上記ＭＨ１ＳＳＬ−３タンパク質及び上記ＳＨＳＳＬ−３タンパク質は、図８に示すように、ドメイン１〜５のアミノ酸配列を有する。具体的には、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるＭＨ１ＳＳＬ−３タンパク質の場合、ドメイン１，２，３，４，５のそれぞれは、配列番号４に記載のアミノ酸配列の５６位から６９位、７１位から８８位、１６６位から１８３位、２０３位から２１８位、２８５位から２９８位の部分である。また、配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるＳＨＳＳＬ−３タンパク質の場合、ドメイン１，２，３，４，５のそれぞれは、配列番号１０に記載のアミノ酸配列の５６位から６９位、７１位から８８位、１６６位から１８３位、２０３位から２１８位、２８５位から２９８位の部分である。
【００４６】
なお、図８には、ｓｈｏｗａ株由来のスクアレン合成酵素のアミノ酸配列を比較例として加えている。スクアレン合成酵素は、ＭＨ１ＳＳＬ−３タンパク質及びＳＨＳＳＬ−３タンパク質とは異なり、ドメイン１〜５のアミノ酸配列を有していない。スクアレン合成酵素のアミノ酸配列は、配列番号２４に記載のアミノ酸配列であり、ＮＣＢＩデータベースにＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＦ２０２０１．１として登録されている。
【００４７】
また、上記（ｅ１）に示すタンパク質において、配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して、８７％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、かつ、プレスクアレン二リン酸を基質としてボトリオコッセンを合成する活性を有するタンパク質であってもよい。
【００４８】
なお、本開示のアミノ酸配列の配列同一性は、市販の解析ツール又はインターネット等の電気通信回路を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができ、例えば、ＦＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ等のソフトウェアを用いて計算される。
【００４９】
また、本開示のタンパク質セットは、ファルネシル二リン酸を基質として従来よりもボトリオコッセンを多く合成する活性を有する限り、タンパク質セットのアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が置換、付加、欠失、又は挿入されたアミノ酸配列からなるものであってもよい。複数個のアミノ酸としては、例えば、１〜１５個以下、好ましくは１〜１０個以下、さらに好ましくは１〜５個以下のアミノ酸を意味する。
【００５０】
また、本開示のタンパク質セットは、上記（ａ１）又は上記（ｂ１）のいずれか一方に示すタンパク質と、上記（ｃ１）に示すタンパク質とが、リンカーペプチドによって連結された構造とされていてもよい。また、本開示のタンパク質セットは、上記（ａ１）又は上記（ｂ１）のいずれか一方に示すタンパク質と、上記（ｄ１）〜（ｆ１）のいずれか１つに示すタンパク質とが、リンカーペプチドによって連結された構造とされていてもよい。例えば、タンパク質セットとしては、配列番号６や配列番号２６に記載のアミノ酸配列からなるもの等が挙げられる。配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質は、上記（ａ１）に示すタンパク質と、上記（ｄ１）に示すタンパク質とが、リンカーペプチドによって連結されて構成されている。具体的には、配列番号６に記載の１位から４０３位のアミノ酸配列は配列番号２に記載のアミノ酸配列であり、配列番号６に記載の４１６位から７９９位のアミノ酸配列は配列番号４に記載のアミノ酸配列である。配列番号６に記載の４０４位から４１５位のアミノ酸配列は、リンカーペプチドのアミノ酸配列であり、Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙが３回繰り返されたアミノ酸配列である。なお、配列番号６に記載のアミノ酸配列は、配列番号５に記載の塩基配列がコードするアミノ酸配列に相当する。また、配列番号２６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質は、上記（ａ１）に示すタンパク質と、上記（ｆ１）に示すタンパク質とが、リンカーペプチドによって連結されて構成されている。具体的には、配列番号２６に記載の１位から４０３位のアミノ酸配列は配列番号２に記載のアミノ酸配列であり、配列番号２６に記載の４１６位から７９８位のアミノ酸配列は配列番号１０に記載のアミノ酸配列である。配列番号２６に記載の４０４位から４１５位のアミノ酸配列は、リンカーペプチドのアミノ酸配列であり、Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙが３回繰り返されたアミノ酸配列である。なお、配列番号２６に記載のアミノ酸配列は、配列番号２５に記載の塩基配列がコードするアミノ酸配列に相当する。
【００５１】
リンカーペプチドは、１又は２以上のアミノ酸が鎖状に結合したものである。リンカーペプチドの配列は、特に制限はないが、例えば、１〜１５のアミノ酸、好ましくは１〜８のアミノ酸、さらに好ましくは１〜６のアミノ酸の配列であってもよい。具体的には、リンカーペプチドとして、Ｌｙｓ、Ｌｙｓ  Ｌｙｓ、Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ、Ｇｌｙ  Ｐｒｏ、Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ、Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ、Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ、Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ、Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ、これらの繰り返し、あるいはこれらの任意の組み合わせ等が挙げられる。
【００５２】
また、本開示のタンパク質セットは、当業者が通常用いる方法を用いて、例えば、後述する遺伝子セットを宿主に導入して発現させることにより、得ることができる。遺伝子セットを宿主に導入させる方法としては、例えば、後述するＭＨ１ＳＳＬ−１遺伝子と（ｋ１）に示すＤＮＡからなる遺伝子とをそれぞれ同一の宿主に導入させてもよく、ＭＨ１ＳＳＬ−１遺伝子及び（ｋ１）に示すＤＮＡからなる遺伝子がリンカーペプチドをコードするＤＮＡによって連結されて構成される遺伝子セットを宿主に導入させてもよい。
【００５３】
次に、本開示のタンパク質セットの特徴について説明する。本開示のタンパク質セットはファルネシル二リン酸を基質としてボトリオコッセンを合成する活性を有し、合成されるボトリオコッセンは従来よりも多く生産されることを特徴とする。
【００５４】
また、本開示のタンパク質セットは、純度の高いボトリオコッセンを生産することができる。具体的に、ボトリオコッセンの純度は、４３．７％よりも高く、好ましくは６９％以上、さらに好ましくは８２％以上である。特に、ＭＨ１ＳＳＬ−１タンパク質及びＭＨ１ＳＳＬ−３タンパク質を含むタンパク質セットの場合、ボトリオコッセンの純度は非常に高くなることを特徴とする。
【００５５】
［遺伝子セット］
本開示の遺伝子セットは、下記（ｇ１）〜（ｊ１）のいずれか１つに示すＤＮＡからなる遺伝子と、下記（ｋ１）に示すＤＮＡからなる遺伝子と、を含む。なお、（ｇ１）〜（ｊ１）のいずれか１つに示すＤＮＡからなる遺伝子は、本件発明者が見出した新規なプレスクアレン二リン酸合成酵素遺伝子であり、発見した場所にちなんで、ＭＨ１ＳＳＬ−１遺伝子と表記されることもある。
【００５６】
（ｇ１）配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡ。
（ｈ１）配列番号１に記載の塩基配列と配列同一性が８１％以上の塩基配列を有し、ファルネシル二リン酸を基質としてプレスクアレン二リン酸を合成する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００５７】
（ｉ１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｊ１）配列番号２に記載のアミノ酸配列と配列同一性が８７％以上のアミノ酸配列からなり、ファルネシル二リン酸を基質としてプレスクアレン二リン酸を合成する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００５８】
（ｋ１）ドメイン１〜５のアミノ酸配列を有し、ボトリオコッセンを合成する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。ドメイン１のアミノ酸配列は、配列番号１９に記載の配列又は配列番号１９に記載の配列と９９％以上の配列同一性をもち、ドメイン２のアミノ酸配列は、配列番号２０に記載の配列又は配列番号２０に記載の配列と９４％以上の配列同一性をもち、ドメイン３のアミノ酸配列は、配列番号２１に記載の配列又は配列番号２１に記載の配列と９４％以上の配列同一性をもち、ドメイン４のアミノ酸配列は、配列番号２２に記載の配列又は配列番号２２に記載の配列と９３％以上の配列同一性をもち、ドメイン５のアミノ酸配列は、配列番号２３に記載の配列又は配列番号２３に記載の配列と９２％以上の配列同一性をもつ。
【００５９】
配列番号２に記載のアミノ酸配列は、配列番号１に記載の塩基配列がコードするアミノ酸配列に相当する。
遺伝子セットは、上記ＭＨ１ＳＳＬ−１遺伝子及び上記（ｋ１）に示すＤＮＡからなる遺伝子の組み合わせである。遺伝子セットは、例えば、上記ＭＨ１ＳＳＬ−１遺伝子の塩基配列及び上記（ｋ１）に示すＤＮＡからなる遺伝子の塩基配列がそれぞれ異なるポリヌクレオチド鎖を形成して組み合わされていてもよい。また、遺伝子セットは、例えば、上記ＭＨ１ＳＳＬ−１遺伝子の塩基配列及び上記（ｋ１）に示すＤＮＡからなる遺伝子の塩基配列が連結して、一本鎖のポリヌクレオチドを形成して組み合わされていてもよい。
【００６０】
また、上記（ｈ１）に示すＤＮＡからなるＭＨ１ＳＳＬ−１遺伝子において、配列番号１に記載の塩基配列に対して、８１％以上、好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列同一性を有する塩基配列であって、かつ、ファルネシル二リン酸を基質としてプレスクアレン二リン酸を合成する活性を有するタンパク質をコードするものであってもよい。
【００６１】
また、上記（ｊ１）に示すＤＮＡからなるＭＨ１ＳＳＬ−１遺伝子において、配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して、８７％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、ファルネシル二リン酸を基質としてプレスクアレン二リン酸を合成する活性を有するタンパク質をコードするものであってもよい。
【００６２】
また、上記（ｋ１）に示すＤＮＡからなる遺伝子は、ボトリオコッセン合成酵素遺伝子であってもよい。
また、上記（ｋ１）に示すＤＮＡからなる遺伝子は、下記（ｌ１）〜（ｑ１）のいずれか１つに示すＤＮＡからなる遺伝子であってもよい。つまり、本開示の遺伝子セットは、上記（ｇ１）〜（ｊ１）のいずれか１つに示すＤＮＡからなる遺伝子と、下記（ｌ１）〜（ｑ１）のいずれか１つに示すＤＮＡからなる遺伝子と、を含んでいてもよい。
【００６３】
（ｌ１）配列番号３に記載の塩基配列を有するＤＮＡ。
（ｍ１）配列番号３に記載の塩基配列と配列同一性が７９％以上の塩基配列を有し、プレスクアレン二リン酸を基質としてボトリオコッセンを合成する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００６４】
（ｎ１）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｏ１）配列番号４に記載のアミノ酸配列と配列同一性が８７％以上のアミノ酸配列からなり、プレスクアレン二リン酸を基質としてボトリオコッセンを合成する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００６５】
（ｐ１）配列番号９に記載の塩基配列を有するＤＮＡ。
（ｑ１）配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００６６】
配列番号４に記載のアミノ酸配列は、配列番号３に記載の塩基配列がコードするアミノ酸配列に相当する。配列番号１０に記載のアミノ酸配列は、配列番号９に記載の塩基配列がコードするアミノ酸配列に相当する。
【００６７】
なお、上記（ｌ１）〜（ｏ１）に示すＤＮＡからなる遺伝子は、本件発明者が見出した新規なボトリオコッセン合成酵素遺伝子であり、発見した場所にちなんで、ＭＨ１ＳＳＬ−３遺伝子と表記されることもある。また、（ｐ１）及び（ｑ１）に示すＤＮＡからなる遺伝子は、ｓｈｏｗａ株由来のボトリオコッセン合成酵素遺伝子であり、ＳＨＳＳＬ−３遺伝子と表記することもある。
【００６８】
上記（ｍ１）に示すＤＮＡからなるＭＨ１ＳＳＬ−３遺伝子において、配列番号３に記載の塩基配列に対して、７９％以上、好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列同一性を有する塩基配列であって、かつ、プレスクアレン二リン酸を基質としてボトリオコッセンを合成する活性を有するタンパク質をコードするものであってもよい。
【００６９】
上記（ｏ１）に示すＤＮＡからなるＭＨ１ＳＳＬ−３遺伝子において、配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して、８７％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、プレスクアレン二リン酸を基質としてボトリオコッセンを合成する活性を有するタンパク質をコードするものであってもよい。
【００７０】
なお、塩基配列の配列同一性は、市販の解析ツール又はインターネット等の電気通信回路を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができ、例えば、ＦＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ等のソフトウェアを用いて計算される。
【００７１】
また、本開示の遺伝子セットは、ファルネシル二リン酸を基質として従来よりもボトリオコッセンを多く合成する活性を有するタンパク質をコードする限り、本開示のタンパク質セットのアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が置換、付加、欠失、又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするものであってもよい。複数個のアミノ酸としては、例えば１〜１５個以下、好ましくは１〜１０個以下、さらに好ましくは１〜５個以下のアミノ酸を意味する。
【００７２】
また、本開示の遺伝子セットは、上記（ｇ１）〜（ｊ１）のいずれか１つに示すＤＮＡと、上記（ｋ１）に示すＤＮＡとが、リンカーペプチドをコードするＤＮＡによって連結された構造とされていてもよい。また、本開示の遺伝子セットは、上記（ｇ１）〜（ｊ１）のいずれか１つに示すＤＮＡと、上記（ｌ１）〜（ｑ１）のいずれか１つに示すＤＮＡとが、リンカーペプチドをコードするＤＮＡによって連結された構造とされていてもよい。例えば、遺伝子セットとしては、配列番号５や配列番号２５に記載の塩基配列からなるもの等が挙げられる。配列番号５に記載の塩基配列からなる遺伝子セットは、上記（ｇ１）に示すＤＮＡと、上記（ｌ１）に示すＤＮＡとが、リンカーペプチドをコードするＤＮＡによって連結されて構成されている。具体的には、配列番号５に記載の１位から１２０９位の塩基配列は配列番号１に記載の塩基配列であり、配列番号５に記載の１２４６位から２３９７位の塩基配列は配列番号３に記載の塩基配列である。配列番号５に記載の１２１０位から１２４５位の塩基配列は、リンカーペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列である。また、配列番号２５に記載の塩基配列からなる遺伝子セットは、上記（ｇ１）に示すＤＮＡと、上記（ｐ１）に示すＤＮＡとが、リンカーペプチドをコードするＤＮＡによって連結されて構成されている。具体的には、配列番号２５に記載の１位から１２０９位の塩基配列は配列番号１に記載の塩基配列であり、配列番号２５に記載の１２４６位から２３９４位の塩基配列は配列番号９に記載の塩基配列である。配列番号２５に記載の１２１０位から１２４５位の塩基配列は、リンカーペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列である。
【００７３】
また、当業者が通常用いる方法を用いて、例えば本明細書に記載の配列情報に基づいて、本開示の遺伝子セットを人工的に合成することができる。
また、当業者が通常用いる方法を用いて、例えば、下記の実施例１に記載される方法により、ＭＨ１ＳＳＬ−１遺伝子及びＭＨ１ＳＳＬ−３遺伝子を合成することができる。さらに、例えば、当業者が通常用いる方法を用いて、本明細書に記載の配列情報に基づいてプライマー等を調製し、ＭＨ１ＳＳＬ−１遺伝子が存在する起源のｃＤＮＡを鋳型とするＰＣＲによってもＭＨ１ＳＳＬ−１遺伝子を得ることができる。例えば、当業者が通常用いる方法を用いて、本明細書に記載の配列情報に基づいてプライマー等を調製し、ＭＨ１ＳＳＬ−３遺伝子が存在する起源のｃＤＮＡを鋳型とするＰＣＲによってもＭＨ１ＳＳＬ−３遺伝子を得ることができる。
【００７４】
また、本開示の遺伝子セットは、本開示のタンパク質セットをコードする。そのため、遺伝子工学的手法、例えば本開示の遺伝子セットを酵母に導入して形質転換体を作成することで、本開示のタンパク質セットの発現が可能である。
【００７５】
［発現ベクター］
本開示は、遺伝子セットを有する発現ベクターを提供する。本開示の発現ベクターに含まれる遺伝子セットは、上記（ｇ１）〜（ｊ１）のいずれか１つに示すＤＮＡと、上記（ｋ１）に示すＤＮＡとが、リンカーペプチドをコードするＤＮＡによって連結された構造である。また、本開示の発現ベクターに含まれる遺伝子セットは、上記（ｇ１）〜（ｊ１）のいずれか１つに示すＤＮＡと、上記（ｌ１）〜（ｑ１）のいずれか１つに示すＤＮＡとが、リンカーペプチドをコードするＤＮＡによって連結された構造とされていてもよい。この場合の遺伝子セットとしては、例えば、配列番号５や配列番号２５に記載の塩基配列からなるもの等が挙げられる。
【００７６】
本開示の発現ベクターは、例えば、骨格となるベクターに遺伝子セットを導入することで構築できる。骨格となるベクターの種類は、特に制限されず、例えば、宿主の種類に応じて、適宜決定できる。
【００７７】
本開示の発現ベクターには、プロモータ、ターミネータ、形質転換体を選択するための選択マーカー等を有していてもよい。
［形質転換体］
本開示は、上記ＭＨ１ＳＳＬ−１遺伝子及び上記（ｋ１）に示すＤＮＡからなる遺伝子が導入された形質転換体を提供する。
【００７８】
具体的には、本開示の形質転換体は、上記（ｇ１）〜（ｊ１）のいずれか１つに示すＤＮＡと、上記（ｋ１）のいずれか１つに示すＤＮＡとが、リンカーペプチドをコードするＤＮＡによって連結されて構成されている遺伝子セットが導入されたものでもよい。また、本開示の形質転換体は、上記（ｇ１）〜（ｊ１）のいずれか１つに示すＤＮＡと、上記（ｌ１）〜（ｑ１）のいずれか１つに示すＤＮＡとが、リンカーペプチドをコードするＤＮＡによって連結されている遺伝子セットが導入されたものでもよい。これらの場合、本開示の形質転換体は、本開示の発現ベクターが宿主に導入されたものも含む。当該形質転換体は遺伝子セットが発現可能であることから、ボトリオコッセンの生産に利用することができる。
【００７９】
また、本開示の形質転換体は、上記（ｇ１）〜（ｊ１）のいずれか１つに示すＤＮＡからなる遺伝子及び上記（ｋ１）に示すＤＮＡからなる遺伝子のそれぞれが発現可能に導入されたものでもよい。この場合、本開示の形質転換体は、上記（ｇ１）〜（ｊ１）のいずれか１つに示すＤＮＡからなる遺伝子を有する発現ベクターと、上記（ｋ１）に示すＤＮＡからなる遺伝子を有する発現ベクターと、が同一の宿主に導入されたものも含む。同一の形質転換体に上記ＭＨ１ＳＳＬ−１遺伝子及び上記（ｋ１）に示すＤＮＡからなる遺伝子のそれぞれが発現可能であることから、当該形質転換体はボトリオコッセンの生産に利用することができる。
【００８０】
また、本開示の形質転換体は、上記（ｇ１）〜（ｊ１）のいずれか１つに示すＤＮＡからなる遺伝子及び上記（ｌ１）〜（ｑ１）のいずれか１つに示すＤＮＡからなる遺伝子のそれぞれが発現可能に導入されたものでもよい。この場合、本開示の形質転換体は、上記（ｇ１）〜（ｊ１）のいずれか１つに示すＤＮＡからなる遺伝子を有する発現ベクターと、上記（ｌ１）〜（ｑ１）のいずれか１つに示すＤＮＡからなる遺伝子を有する発現ベクターと、が同一の宿主に導入されたものも含む。同一の形質転換体に上記ＭＨ１ＳＳＬ−１遺伝子及び上記（ｌ１）〜（ｑ１）のいずれか１つに示すＤＮＡからなる遺伝子のそれぞれが発現可能であることから、当該形質転換体はボトリオコッセンの生産に利用することができる。
【００８１】
形質転換される宿主としては、大腸菌、酵母等が挙げられ、特に制限されない。形質転換方法としては、特に制限されず、一般的な各種方法を採用することができる。
［ボトリオコッセンの合成方法］
本開示は、上記の形質転換体を培養する工程、及び培養された形質転換体からボトリオコッセンを回収する工程を含む、ボトリオコッセンの合成方法を提供する。
【００８２】
培養に用いられる培地としては、宿主に応じて適した培地を利用することができ、培養も宿主の生育に適した条件下で実施できる。なお、ボトリオコッセンの回収は、当業者に公知の方法によって行うことができる。
【００８３】
以下に本開示をより詳細に説明するために実施例を挙げるが、本開示はこれらによってなんら限定されるものではない。
［実施例１：ＭＨ１ＳＳＬ−１遺伝子及びＭＨ１ＳＳＬ−３遺伝子の抽出］
［野生株の培養と選抜］
天然の池の愛知県みよし市保田ヶ池より採取したボトリオコッカス・ブラウニー株をＡＦ−６培地にて１か月培養した。容器内で水面上に浮いた細胞をピペットにて個別に採取し単離した。単離した藻体は１％ＣＯ２を通気し、蛍光灯照射下でＡＦ−６培地にて培養し増殖させた。増えた藻体にヘキサンを添加し、オイル成分を抽出した。ＧＣ−ＭＳにてオイルを定性分析し、ボトリオコッセンを産生する株をピックアップした。
【００８４】
ピックアップした株をＭＨ１株と名付け、１Ｌガラス培養ビンにて下記の培養条件下で通気培養した。培養開始後、藻体が生育していく過程を図２に示した。培養開始から１４日目の培養液を８０ｍＬ回収し、ＲＮＡ抽出に用いた。
【００８５】
《培養条件》
期間：３週間
培地：ＡＦ−６培地
エアー：１％ＣＯ２通気
温度：２５℃室温
光量：１５０μｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎｓ／ｍ２／ｓｅｃ
［ＲＮＡの抽出］
回収した８０ｍＬの培養液を遠沈管２本に等分し、９０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した後、上澄みを廃棄した。滅菌水１５ｍＬを各遠沈管に加え撹拌し、再度遠心分離した後、上澄みを廃棄した。細胞を含む沈殿物を凍結用チューブへ移し液体窒素で凍結させた後、−８０℃で保管した。
【００８６】
次に、ＱＩＡＧＥＮ社製のＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを用いて、付属のプロトコルに従いＲＮＡ抽出操作を行った。具体的には、−８０℃で保管したサンプル５０ｍｇ程を、液体窒素が蒸発しないように加えることでサンプルの凍結を維持しつつ乳鉢ですり潰した。すり潰したサンプルを液体窒素の入った２ｍＬチューブに移し、１００ｍｇのサンプルに対し４５０μＬ  ＲＬＴバッファーを加え勢いよく撹拌した。
【００８７】
溶解液を紫色のＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒカラムに移し、２ｍＬ回収チューブと共に２００００×ｇで２分間遠心分離を行った。沈殿を巻き込まないように上澄みを新しいチューブに移し替えた。澄んだ上澄みに１：１となるようにＲＮＡ専用の９６〜１００％エタノールを加え、ピペッティングで混合した。ピンク色のＲＮａｓｅスピンカラム２ｍＬ回収チューブに６５０μＬを移し、静かに蓋をして８０００×ｇで１５秒間遠心分離を行い、スルーした液を捨てた。
【００８８】
次にスピンカラムに７００μＬ  ＲＷ１バッファーを加え、静かに蓋をして８０００×ｇで１５秒間遠心分離を行い、スルーした液を捨てた。さらにスピンカラムに５００μＬ  ＲＰＥバッファーを加え、同様に遠心分離を行い、スルーした液を捨てた。最後にもう一度スピンカラムに５００μＬ  ＲＰＥバッファーを加え、同様に遠心分離を行い、スルーした液を捨てた。スピンカラムを新しい１．５ｍＬチューブにセットしＲＮａｓｅフリー水を５０μＬ加え静かに蓋をして遠心分離した。スルーした液をＭＨ１株のトータルＲＮＡとして得た。
【００８９】
［シーケンスライブラリーの作製］
シーケンスライブラリーの作製は、イルミナ社のマニュアルDirectional mRNA-Seq Sample Preparation Rev.Aを参考に、イルミナ社製のTruSeq Small RNA Sample Prep Kit及びTruSeq RNA Sample Preparation Kit v2を用いて行った。なお、以下に説明する実施形態においては、別に記載しない限り、以下の材料を用いた。アルカリホスファターゼ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼはタカラバイオ社製のものを用い、Ｔ４  ＲＮＡ  ｌｉｇａｓｅ  ２，ｔｒｕｎｃａｔｅｄはＮＥＢ社製のものを用いた。
【００９０】
ＭＨ１株培養２週間目の藻体より抽出したトータルＲＮＡ８μｇからＰｏｌｙＡ＋  ＲＮＡを単離した。次にＰｏｌｙＡ＋  ＲＮＡを断片化しアルカリホスファターゼで処理した後、ＡＴＰとＴ４ポリヌクレオチドキナーゼにより、５’末端をリン酸化した。リン酸化処理したＲＮＡ断片の３’末端にＴ４  ＲＮＡ  ｌｉｇａｓｅ  ２，ｔｒｕｎｃａｔｅｄを用いてＲＮＡ  ３’アダプターを連結した後、５’末端にＡＴＰとＴ４  ＲＮＡリガーゼを用いてＲＮＡ  ５’アダプターを連結した。
【００９１】
次に、ＲＮＡ  ３’アダプターを認識するプライマーを用いた転写反応により、一本鎖ｃＤＮＡを合成した。合成された一本鎖ｃＤＮＡを鋳型とし、インデックス付プライマーを用いて、１５サイクルのＰＣＲによる増幅を行った。得られたＰＣＲ産物を、６％ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動によりサイズ選別し、シーケンスライブラリーとした。
【００９２】
作製されたシーケンスライブラリーの品質をＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを用いて測定した。その結果、シーケンスライブラリーのピークサイズは３０８ｂｐのシングルピークであることを確認した。また、得られたシーケンスライブラリーの濃度は１６．８ｎｍｏｌ／Ｌであった。なお、シーケンスライブラリーはアダプターを付加しているため、ピークサイズから約１００ｂａｓｅのアダプターサイズを除いたサイズがクローニングサイズとなる。
【００９３】
［塩基配列の取得］
作製したシーケンスライブラリーを用いて、シーケンスの鋳型となるクラスターを形成し、鋳型ＤＮＡの塩基配列を取得した。シーケンスデータの解析は付属のソフトウェアを使用しベースコールを行い、ｆａｓｔｑ形式ファイルとして出力した。これらの作業は表１に示すイルミナ社のマニュアルを参考に、表２に示すイルミナ社製の機器、試薬、及びソフトウェアを用いて行った。シーケンスデータの解析により、リード数１０２，０１８，４６８個、解析鎖長１０，２０１，８４６，８００ｂｐの塩基配列情報を得た。
【００９４】
【表１】
2018113952.tif 000005
【００９５】
【表２】
2018113952.tif 000006
次に、株式会社ＣＬＣバイオジャパン社製のソフトウェアである「ＣＬＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ  ６．５．１」を用いて、フィルタリング及びＤｅ  ｎｏｖｏアセンブリを行った。まず、ｆａｓｔｑ形式のファイルを読み込み、ペア配列に変換した後、低クオリティー部分の配列、Ｎ表示される塩基の配列、７５塩基以下の配列を除去し、フィルタリングを行った。その後、ペアが壊れた配列、重複断片を除去し、Ｄｅ  ｎｏｖｏアセンブリにより、３０８ｂｐの３５，８０９種類のコンティグを作製した。Ｄｅ  ｎｏｖｏアセンブリの条件は以下である。
【００９６】
《Ｄｅ  ｎｏｖｏアセンブリの条件》
Ambiguous trim = Yes
Ambiguous limit = 0
Quality trim = Yes
Quality limit = 0.00035
Create report = Yes
Save discarded sequences = No
Remove 5’ terminal nucleotides = No
Maximum number of nucleotides in reads = 1,000
Minimum number of nucleotides in reads = 97
Discard short reads = Yes
Remove 3’ terminal nucleotides = No
Discard long reads = Yes
Save broken pairs = No
ここで、プレスクアレン二リン酸合成酵素遺伝子としてｓｈｏｗａ株由来のＳＳＬ−１遺伝子（ＳＨＳＳＬ−１遺伝子と称する）、ボトリオコッセン合成酵素遺伝子としてｓｈｏｗａ株由来のＳＨＳＳＬ−３遺伝子が知られている。ＳＨＳＳＬ−１遺伝子の配列は、ＮＣＢＩデータベースにＧｅｎＢａｎｋ：ＨＱ５８５０５８．１として登録され、ＳＨＳＳＬ−３遺伝子の配列は、ＮＣＢＩデータベースにＧｅｎＢａｎｋ：ＨＱ５８５０６０．１として登録されている。
【００９７】
得られたコンティグをもとにＢＬＡＳＴ  Ｄａｔａｂａｓｅを構築し、既知のＳＨＳＳＬ−１及びＳＨＳＳＬ−３をクエリー配列とし、ＴＢＬＡＳＴＸを用いた相同遺伝子検索を行った。それぞれの全長ＯＲＦと８９％、８７％の相同性を持つ配列を得ることができた。なお、ＯＲＦはＯｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅの略称である。
【００９８】
［実施例２：形質転換酵母の作製］
［発現ベクターの構築］
実施例１で得られたアミノ酸配列情報を基に、酵母での発現に最適化した塩基配列の合成を行い、ＭＨ１株由来のＭＨ１ＳＳＬ−１遺伝子及びＭＨ１ＳＳＬ−３遺伝子を合成した。以下、具体的に説明する。
【００９９】
ＭＨ１ＳＳＬ−１遺伝子及びＭＨ１ＳＳＬ−３遺伝子の各塩基配列に応じたプライマーを設計し、ＰＣＲにより増幅させた。ＰＣＲ増幅産物を制限酵素反応で切り出した後、ベクターにライゲーションで接続させ、ＭＨ１ＳＳＬ−１遺伝子及びＭＨ１ＳＳＬ−３遺伝子を含むプラスミドを作製した。このプラスミドによりバクテリアを形質転換した。形質転換が行われたバクテリアのコロニーを単離し、コロニーＰＣＲにより導入したＭＨ１ＳＳＬ−１遺伝子及びＭＨ１ＳＳＬ−３遺伝子の増幅を確認した。シーケンス解析により、目的通り正しく各遺伝子が挿入されていることを確認した。
【０１００】
また、後述するオイル生産能力の比較対象として、ＳＨＳＳＬ−１及びＳＨＳＳＬ−３の配列情報をＮＣＢＩより入手し上記と同様の方法で合成し、シーケンス解析により目的通り正しく各遺伝子が挿入されていることを確認した。なお、ＳＨＳＳＬ−１の塩基配列は配列番号７に記載の配列であり、ＳＨＳＳＬ−１のアミノ酸配列は配列番号８に記載の配列である。ＳＨＳＳＬ−３の塩基配列は配列番号９に記載の配列であり、ＳＨＳＳＬ−３のアミノ酸配列は配列番号１０に記載の配列である。
【０１０１】
次に、ＭＨ１ＳＳＬ−１遺伝子及びＭＨ１ＳＳＬ−３遺伝子がリンカーペプチドをコードするポリヌクレオチドによって連結されて構成されるように人工合成を行った。具体的には、図３に示すように、非特許文献１に倣い、Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙのアミノ酸配列を３回繰り返したリンカーペプチドによってＭＨ１ＳＳＬ−１及びＭＨ１ＳＳＬ−３が連結された配列、つまり配列番号６に記載のアミノ酸配列を設計した。この設計を基に人工合成を行い、配列番号５に記載の塩基配列からなる遺伝子セット（以下、ＭＨ１ＳＳＬ−１，３とも称する）を得た。
【０１０２】
また、ＭＨ１ＳＳＬ−１遺伝子及びＳＨＳＳＬ−３遺伝子がリンカーペプチドをコードするポリヌクレオチドによって連結されて構成されるように人工合成を行った。具体的には、図４に示すように、非特許文献１に倣い、Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙのアミノ酸配列を３回繰り返したリンカーペプチドによってＭＨ１ＳＳＬ−１及びＳＨＳＳＬ−３が連結された配列、つまり配列番号２６に記載のアミノ酸配列を設計した。この設計を基に人工合成を行い、配列番号２５に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド（以下、ＭＨ１ＳＳＬ−１＋ＳＨＳＳＬ−３と称する）を得た。
【０１０３】
また、ＳＨＳＳＬ−１遺伝子及びＳＨＳＳＬ−３遺伝子がリンカーペプチドをコードするポリヌクレオチドによって連結されて構成されるように人工合成を行った。具体的には、図５に示すように、非特許文献１に倣い、Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙのアミノ酸配列を３回繰り返したリンカーペプチドによってＳＨＳＳＬ−１及びＳＨＳＳＬ−３が連結された配列、つまり配列番号１２に記載のアミノ酸配列を設計した。この設計を基に人工合成を行い、配列番号１１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド（以下、ＳＨＳＳＬ−１，３と称する）を得た。
【０１０４】
図６に示すように、得られたＭＨ１ＳＳＬ−１，３、ＭＨ１ＳＳＬ−１＋ＳＨＳＳＬ−３、及びＳＨＳＳＬ−１，３のそれぞれを骨格となるベクターに導入した。骨格となるベクターはプロメガ社製の大腸菌用ベクターｐＳＰ７３を用い、ｐＳＰ７３の制限酵素ＣｌａＩ１９及びＡｐａＬＩ２３７４部位間に導入し、発現ベクターを作製した。制限酵素ＣｌａＩ１９及びＡｐａＬＩ２３７４部位間には、プロモータのｌｅｘＡｐｏｘ５−ＴＤＨ３＿ＴＡＴＡ、ターミネータのＤＩＴ１ｔ−ｄ２２、及び選択マーカーとなるＵＲＡ３も併せて導入された。ｌｅｘＡｐｏｘ５−ＴＤＨ３＿ＴＡＴＡの配列は配列番号１７に記載したものであり、ＤＩＴ１ｔ−ｄ２２の配列は配列番号１８に記載したものである。なお、各発現ベクターは、導入した遺伝子に倣い、それぞれ、pSP73-URA3-MH1SSL-1,3、pSP73-URA3-MH1SSL-1+SHSSL-3、及びpSP73-URA3-SHSSL-1,3と称する。
【０１０５】
［酵母導入用発現ベクターの調製］
発現ベクターpSP73-URA3-MH1SSL-1,3、pSP73-URA3-MH1SSL-1+SHSSL-3、及びpSP73-URA3-SHSSL-1, 3をそれぞれ大腸菌のコンピテントセルに導入することによって、大腸菌のコンピテントセルを形質転換した。コンピテントセルは、ニッポンジーン社製のＥＣＯＭ（商標）Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを用いた。具体的な手順は、以下の通りである。
【０１０６】
まず、コンピテントセルを氷上で融解した。融解したコンピテントセルに、４℃に冷却した発現ベクターの溶液及びライゲーション溶液を添加した後、１秒間ボルテックスを行った。氷上で５分間インキュベートした後、４２℃で４５秒間インキュベートし、１秒間ボルテックスを行った。全量を５０ｍｇ／Ｌアンピシリン入りのＬＢプレートに移して均一に塗布した後、３７℃で１２〜１６時間インキュベートした。生えてきたコロニーは、５０ｍｇ／Ｌアンピシリン入りＬＢ液体培地で培養した後、プラスミドを抽出し、酵母に導入するための酵母導入用発現ベクターを調製した。
【０１０７】
［酵母の形質転換］
調製した酵母導入用発現ベクターを用いて、ＭＨ１ＳＳＬ−１，３、ＭＨ１ＳＳＬ−１＋ＳＨＳＳＬ−３、及びＳＨＳＳＬ−１，３をそれぞれ導入した形質転換酵母を得た。以下、具体的に説明する。
【０１０８】
宿主となる酵母を３０℃のＹＰＤＡ培地で対数増殖期（ＯＤ660＝０．４〜０．６）まで培養し、ＺＹＭＯ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ社製のＦｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩキットで処理してコンピテントセルを調製した。なお、以下に説明する実施形態においては、別に記載しない限り、宿主となる酵母はストラタジーン社製のＹＰＨ４９９を用いた。
【０１０９】
各酵母導入用発現ベクターを制限酵素ＣｌａＩ及びＡｐａＬＩを用いて、３７℃で３時間以上反応させ、目的遺伝子を断片化した。
予め調製しておいたコンピテントセル５０μＬに、断片化した各コンストラクトを５０μｇ加え、ＰＥＧバッファーで希釈した。これを４５分間加温することで、各コンストラクトを遺伝子座ＨＸＴへ導入し、形質転換した。形質転換した後の各形質転換酵母を洗浄後、滅菌水に懸濁して、下記成分のウラシル選抜培地（ＳＤ−Ｕｒａ）に塗布した。
ウラシル選抜培地成分：2% agar、2% glucose、0.67% Yeast Nitrogen Base without amino acids(YNB)(Difco Laboratories社製、デトロイト、ミシガン州)、0.082% Complete Supplement Mixture(CSM)-URA(ForMedium社製、ノーフォーク、イギリス)、adenine(40mg/L)
３０℃で１昼夜静止培養して形質転換酵母のコロニーを得た。得られたコロニーをそれぞれの選択培地で培養し、生育能を安定に保持している株を選択して、コロニーＰＣＲを行い、目的遺伝子の導入を確認した。使用したプライマーの塩基配列は以下の通りである。なお、ＭＨ１ＳＳＬ−１，３のＰＣＲ確認バンドの長さは２６００ｂｐであり、ＭＨ１ＳＳＬ−１＋ＳＨＳＳＬ−３のＰＣＲ確認バンドの長さは２０９５ｂｐであり、ＳＨＳＳＬ−１，３のＰＣＲ確認バンドの長さは２０２０ｂｐである。
【０１１０】
ＭＨ１ＳＳＬ−１，３のプライマー
フォワードプライマー：ATGTCCATGCACCAAGACCACGGTGTAG（配列番号１３）
リバースプライマー：TCTTGGGGATGGTCTGGAAGGGA（配列番号１４）
ＭＨ１ＳＳＬ−１＋ＳＨＳＳＬ−３のプライマー
フォワードプライマー：ATGTCCATGCACCAAGACCACGGTGTAG（配列番号１３）
リバースプライマー：TGAAGACACCTTCGTCCCAA（配列番号１６）
ＳＨＳＳＬ−１，３のプライマー
フォワードプライマー：TTAGCCGCCACTACATACGG（配列番号１５）
リバースプライマー：TGAAGACACCTTCGTCCCAA（配列番号１６）
［実施例３：オイル生産能力の比較］
ＭＨ１ＳＳＬ−１，３、ＭＨ１ＳＳＬ−１＋ＳＨＳＳＬ−３、及びＳＨＳＳＬ−１，３をそれぞれ導入した形質転換酵母をそれぞれＤ３１７株、Ｄ３１８株、及びＤ３２０株と命名した。以下の方法により、Ｄ３１７株、Ｄ３１８株、及びＤ３２０株の酵母それぞれを培養し、酵母培養液から抽出したオイルをＧＣ−ＭＳにて定性分析を行った。試験数３にて実施した。以下、具体的に説明する。
【０１１１】
［前培養］
下記組成の固体培地のプレート上にて各株を生育させ、コロニーをひとかき取り、下記組成の液体培地の入った試験管に移した。試験管を振とう培養器にセットし、４８時間培養を行った。固体培地及び液体培地の作成方法、振とう培養器による培養条件は以下の通りである。
【０１１２】
《ＳＤ−ｔｒｐ培地の組成》
（１）Yeast Nitrogen Base w/o amino acids 6.7 g/L
（２）CSM-Trp                             0.74g/L
（３）Adenine                             20mg/L
（４）D-glucose                           20 g/L
《作成方法》
（１）、（２）及び（３）を混合し、ｐＨ６に調整し、試料Ａとした。（４）を調製し、試料Ｂとした。固体培地の作製時には、（４）にＡｇａｒが２０ｇ／Ｌとなるように添加して調製し、試料Ｂとした。試料Ａ及び試料Ｂをオートクレーブにて滅菌した後、混合し、液体培地を作製した。固体培地の作製時には、当該混合液をプレートに撒いて固め、固体培地を作製した。
【０１１３】
《培養条件》
培養時間    ４８時間
容量        ３ｍＬ
容器        シリコ栓付きガラス試験管
振とう条件  １５０ｒｐｍ
温度        ３０℃
［本培養］
分光光度計を用いて、前培養で増殖した菌体のＯＤ600を測定し、１０００ｍＬに希釈されたときにＯＤ600が０．１となるように前培養液からの採取量を決定した。予め下記組成の培地の入ったフラスコに前培養で得た菌体を計算した採取量を加え、振とう培養器にセットし培養を開始した。培養条件は以下の通りである。
【０１１４】
《培地組成》
YPDA Broth(Clontech社製)  1パウチ／０．５Ｌ蒸留水
アデニン                    ４０ｍｇ／Ｌ
《作成方法》
YPDA Brothを1パウチ開封し、０．５Ｌ蒸留水に溶かした。溶解したＹＰＤＡ  Ｂｒｏｔｈに終濃度４０ｍｇ／Ｌになるようにアデニンを加え、オートクレーブで加熱殺菌した。
【０１１５】
《培養条件》
培養時間    ４８時間
容量        １００ｍＬ
容器        シリコ栓付きフラスコ
振とう条件  １５０ｒｐｍ
温度        ３０℃
［菌体の回収］
本培養した培養液を５０ｍＬ遠沈管に分注し、トミー精工社製の遠心分離機を用いて４６００Ｇで５分間遠心分離し、菌体と培地を分離し、培地を除いた。菌体を１５ｍＬの滅菌水に懸濁し、再度同条件で遠心分離し、菌体のみの状態にした後、−８０℃の冷凍庫で凍結させた。凍結乾燥機を用い、チューブ内の菌体を１２時間乾燥させた。
【０１１６】
［菌体乾燥重量の測定］
乾燥した菌体をスパーテルで取り出し、菌体の重量を測定した。
［菌体からのオイル抽出］
乾燥菌体を一定量かきとり、５０ｍＬ遠沈管に移し、ヘキサン及びグラスビーズを加えた後、密栓した。その後、安井器機株式会社製のマルチビーズショッカーに遠沈管をセットし破砕した。破砕条件は以下の通りである。
【０１１７】
《破砕条件》
乾燥菌体      １ｇ
ヘキサン      １０ｍＬ／ｇ菌体
グラスビーズ：ＹＧＢ０５  ０．５ｍｍ（安井器機株式会社製）  菌体と等量（ｖｏｌ．）
２５００ｒｐｍ、６０ｓｅｃ／６０ｓｅｃ（ＯＮ／ＯＦＦ）、３０サイクル
粉砕後に遠沈管を取り出し、４６００Ｇで５分間遠心分離し、菌体と溶媒を分離し、溶媒画分をガラスピペットによりガラス瓶に取り分けた。遠沈管に新たにヘキサン１０ｍＬを加え、ボルテックスで混合した後、再度同条件で遠心分離した。溶媒画分を先ほど分注したガラス瓶に移した。同様にヘキサンを遠沈管に加え、遠心分離し分注する作業を更に１回繰り返した。ガラス瓶に分注された溶媒画分を新たな遠沈管に移し、４６００Ｇで１０分間遠心分離し、分注時に混入した不溶画分を除き、溶媒画分のみをエバポレータにて濃縮した。乾固したサンプルの重量を測定し、オイル回収量とした。乾固したオイルを終濃度１ｍｇ／１０ｍＬとなるようにヘキサンで希釈し、ＧＣーＭＳ分析用のサンプルとした。
【０１１８】
［オイルのＧＣ−ＭＳ測定方法］
サンプルをヘキサンに溶解させて、非特許文献１と同様の方法でＧＣーＭＳ分析を行った。
【０１１９】
［結果］
形質転換酵母におけるオイル生産能力を比較した結果を図７に示す。有意差検定にはまずＤ３１７株、Ｄ３１８株、及びＤ３２０株の三群間の有意差を測定するためにKruskal Wallis検定を用い、Ｐ＜０．０５（帰無仮説が５％未満）のものを有意差ありと判断した。次にＤ３１７株とＤ３２０株、又はＤ３１８株とＤ３２０株の二群間の有意差検定を行うためMann-WhitneyのＵ検定を用い、Ｐ＜０．０５（帰無仮説が５％未満）のものを有意差ありと判断した。有意差検定の結果、Kruskal Wallis検定ではＰ＝０．０３８９９で有意差ありと判断した。Mann-WhitneyのＵ検定ではどちらの二群間でもＰ＝０．０４９３５で有意差ありと判断し、図中に記載した。
【０１２０】
図７に示すように、Ｄ３１８株は、Ｄ３２０株と比較すると、ボトリオコッセンの生産量が有意に増加した。この結果から、ＭＨ１ＳＳＬ−１タンパク質によって、ボトリオコッセンの生産量が増加することが示唆された。さらに、Ｄ３１７株も、Ｄ３２０株と比較すると、ボトリオコッセンの生産量が有意に増加した。
【０１２１】
また、Ｄ３１７株及びＤ３１８株は、Ｄ３２０株と比較すると、ボトリオコッセンの生産量が増加しただけでなく、副産物のスクアレンの生産量が減少した。つまり、Ｄ３１７株及びＤ３１８株は、Ｄ３２０株と比較すると、高純度のボトリオコッセンが得られた。ボトリオコッセンの純度は、以下の計算式を用いて算出され、Ｄ３１７株で８２．７％、Ｄ３１８株で６９．４％、Ｄ３２０株で４３．７％であった。
【０１２２】
特に、Ｄ３１７株及びＤ３１８株のボトリオコッセンの純度を比較すると、Ｄ３１７株の方が高かったことから、ＭＨ１ＳＳＬ−３タンパク質によって、ボトリオコッセンの純度が向上することが示唆された。
【０１２３】
【数１】
2018113952.tif 000007
［発明の効果］
ＭＨ１ＳＳＬ−１及びＭＨ１ＳＳＬ−３のタンパク質を利用することにより、ボトリオコッセンの生産量を増加し、さらにボトリオコッセンの純度を高めることができた。
【０１２４】
また、スクアレンは酵母の膜流動性を保つために必須成分であり、スクアレンを合成できない細胞は生育不可となる。Ｄ３１７株及びＤ３１８株は、スクアレンの生産量がゼロではないため、形質転換を行っても生育可能であり、ボトリオコッセンを合成する有用な微生物となり得る。
【０１２５】
また、スクアレンの合成を抑制する方法として、スクアレンの合成に関わる遺伝子をノックアウトした酵母ＴＮ７（Ｃａｌｉ−７）が存在する。しかし、Ｄ３１７株及びＤ３１８株を用いることで、宿主がＴＮ７に限定されることなく、スクアレンの合成を抑制することができる。
【０１２６】
また、本開示のボトリオコッセンの合成方法を用いれば、スクアレンよりも高濃度でボトリオコッセンを回収することができる。そして、例えばＨＰＬＣを用いて、回収されたオイルからボトリオコッセンを精製することができる。さらに、ボトリオコッセンよりもスクアレンの方が低濃度で回収されるため、ＨＰＬＣを用いてボトリオコッセンを精製する際、ボトリオコッセンとスクアレンとのピークが近くなったとしても、ボトリオコッセンを容易に精製することができる。
【図１】
2018113952.tif 000008
【図２】
2018113952.tif 000009
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
2018113952000001.app