(57)【要約】【課題】  被検試料に混入したカタラーゼを産生する微生物を簡易かつ迅速に検出する方法を提供する。【解決手段】  被検試料中のカタラーゼを産生する微生物の検出方法であって、  前記被検試料を含む溶液と、蛍光指示薬と、過酸化水素とを容器に入れる操作からなる工程、  前記工程後の前記容器内の前記蛍光指示薬に励起光を照射して、該蛍光指示薬が発光する蛍光の強度の変化を測定する工程、並びに  前記測定された蛍光の強度の変化に基づき前記被検試料中のカタラーゼを産生する微生物の有無を決定する工程、を含む方法である。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検試料中のカタラーゼを産生する微生物の検出方法であって、
前記被検試料を含む溶液と、蛍光指示薬と、過酸化水素とを容器に入れる操作からなる工程、
前記工程後の前記容器内の前記蛍光指示薬に励起光を照射して、該蛍光指示薬が発光する蛍光の強度の変化を測定する工程、並びに
前記測定された蛍光の強度の変化に基づき前記被検試料中のカタラーゼを産生する微生物の有無を決定する工程、を含む方法。
【請求項２】
前記蛍光指示薬を容器に入れる操作が蛍光指示薬を容器の内面に塗布する操作である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記蛍光の強度の変化が蛍光の強度の単位時間当たりの消失量である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記蛍光の強度の単位時間当たりの消失量が前記被検試料中の溶存酸素濃度の単位時間当たりの増加量に換算されて表わされる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記蛍光指示薬が遷移金属錯体、金属含有ポルフィリン、および希土類金属錯体からなる群から選択されるいずれかである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記励起光が４３０〜５３０ｎｍの励起光である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はカタラーゼを産生する微生物の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的に食品の製造においては微生物汚染が発生しないよう、その製造工程、製造環境、原料などの衛生状態が管理されている。食品工場では、このように食品の安全性が保持される取組みが徹底されているが、一般に安全性は高ければ高いほど好ましいため、さらに安全性の高い食品の製造と流通とが求められている。
【０００３】
食品の安全性を高い精度で確認する方法として微生物検査がある。その検査方法として寒天培地を用いた混和法、塗抹法、液体培地を用いた方法等が一般的に行われている。しかし、これらの方法は所定の温度で数日間培養する必要があり、検査方法の迅速化が希求されている。
【０００４】
このような背景のもと、微生物検査の迅速化を目的として、自動生菌数測定装置（テンポ）、ＡＴＰ法等多くの微生物検出法が開発されている。例えば、特許文献１には微生物の産生するカタラーゼを利用した生乳中の微生物の迅速測定法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平５−１５３９６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
これらの従来の手法は装置や試薬が高価であるという問題点があった。また、操作が煩雑で熟練を要する場合もあるという問題点があった。そこで本発明者は、微生物の検出には操作が簡便で熟練を要しない、簡易な方法が必要であるという観点に着目し、一定菌数以上のものを簡易迅速に検出することを課題とし、鋭意検討を重ねた。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
その結果、発明者は、検出対象となる微生物の多くがカタラーゼを産生することに着目し、当該カタラーゼによる酵素反応を蛍光消失時間の変化に基づいて簡易に検出できることを見出し、本発明を完成させた。
【０００８】
すなわち、前記課題を解決する本発明は、
被検試料中のカタラーゼを産生する微生物の検出方法であって、
前記被検試料を含む溶液と、蛍光指示薬と、過酸化水素とを容器に入れる操作からなる工程、
前記工程後の前記容器内の前記蛍光指示薬に励起光を照射して、該蛍光指示薬が発光する蛍光の強度の変化を測定する工程、並びに
前記測定された蛍光の強度の変化に基づき前記被検試料中のカタラーゼを産生する微生物の有無を決定する工程、を含む方法である。
【０００９】
前記蛍光指示薬を容器に入れる操作が蛍光指示薬を容器の内面に塗布する操作であることが好ましい。
前記蛍光の強度の変化が、蛍光の強度の単位時間当たりの消失量であることが好ましい。
前記蛍光の強度の単位時間当たりの消失量が前記被検試料中の溶存酸素濃度の単位時間当たりの増加量に換算されて表わされることが好ましい。
前記蛍光指示薬が遷移金属錯体、金属含有ポルフィリン、および希土類金属錯体からなる群から選択されるいずれかであることが好ましい。前記励起光が４３０〜５３０ｎｍの励起光であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のカタラーゼを産生する微生物の検出方法によれば、被検試料中のカタラーゼを産生する微生物の有無を迅速に検出することができる。また、操作において熟練を必要とせず、定性的な検出結果を簡易に得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の微生物の検出方法の一実施形態の原理を示す模式図である。
【図２】本発明の微生物の検出方法の他の実施形態の原理を示す模式図である。
【図３】本発明の微生物の検出方法の他の実施形態の図である。
【図４】本発明の微生物の検出方法のさらに他の実施形態の原理を示す模式図である。
【図５】試験例１の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は被検試料中のカタラーゼを産生する微生物の検出方法であって、
前記被検試料を含む溶液と、蛍光指示薬と、過酸化水素とを容器に入れる操作からなる工程、
前記工程後の前記容器内の前記蛍光指示薬に励起光を照射して、該蛍光指示薬が発光する蛍光の強度の変化を測定する工程、並びに
前記測定された蛍光の強度の変化、とくに好ましくは蛍光の強度の単位時間当たりの消失量に基づき前記被検試料中のカタラーゼを産生する微生物の有無を決定する工程、を含む方法である。これら３つの工程以外の工程を含んでいてもよい。
【００１３】
１．検出原理
本発明に係る微生物の検出方法は蛍光消失時間の原理と微生物由来のカタラーゼ反応とを用いる方法である。励起光を照射された蛍光分子の近傍に酸素分子が存在すると、発光した蛍光のエネルギーが酸素分子に移り蛍光強度が消失する現象（クエンチング現象）がみられる。本発明ではこの蛍光の強度の変化、例えば蛍光の強度の消失量に基づき、被検試料中のカタラーゼを産生する微生物の有無を決定する。
カタラーゼとは過酸化水素を分解し、酸素と水とを発生する反応を触媒する酵素である。カタラーゼ反応とはカタラーゼが触媒することにより、過酸化水素が分解されて酸素と水とが生成する反応である。
【００１４】
被検試料がカタラーゼを産生する微生物を含む場合、例えば、被検試料を含む溶液と、蛍光指示薬と、過酸化水素とを容器に入れる操作を行う。
過酸化水素と微生物の産生するカタラーゼとが接触することでカタラーゼ反応が起こり、被検試料中に酸素が発生する。
過酸化水素添加後の容器内の蛍光指示薬に励起光を照射して、該蛍光指示薬が発光する蛍光の強度の変化を測定する。
カタラーゼ反応により発生した酸素の存在により、蛍光の強度が消失する。
測定された蛍光の強度の変化、例えば単位時間当たりの消失量に基づき前記被検試料中のカタラーゼを産生する微生物の有無を決定する。
【００１５】
２．被検試料
被検試料は液状又は流動状である。液状の被検試料は、食品、医薬品、水等であるがこれらに限定されるものではない。液状の食品は例えば牛乳、加工乳、乳飲料、果汁飲料、コーヒー飲料、豆乳、茶飲料、清涼飲料、及びスポーツ飲料等である。流動状の被検試料は、食品、医薬品等であるがこれらに限定されるものではない。流動状の食品は例えばクリーム、バターオイル等である。固形の食品、医薬品、水、包装材料等を粉砕、溶解、融解したものを滅菌水等で希釈し、液状又は流動状にした試料を被検試料として用いることができる。固形の食品は例えばバター、プロセスチーズ、チョコレート等である。
【００１６】
被検試料には検査の対象となる液状の被検試料及び流動状の被検試料以外のものを含んでいてもよい。例えば、被検試料に滅菌水を添加して希釈したものを被検試料として用いることができる。被検試料としては最終製品、及び製造途中の段階の製品のいずれも用いることができる。被検試料中に存在する微生物が低濃度であるものは、微生物が増殖するような温度条件で保存したものを被検試料として用いることができる。被検試料の温度は測定する場所の気温と同等にすることが好ましい。
【００１７】
被検試料の量は好ましくは１ｍｌ〜１００ｍｌの範囲であり、より好ましくは１ｍｌ〜１０ｍｌであり、さらに好ましくは１ｍｌ〜２ｍｌの範囲である。この被検試料の範囲であると被検試料と過酸化水素とが混ざりやすく、カタラーゼ反応により発生した酸素が良好に蛍光指示薬に接触するスケールであるため好ましい。
【００１８】
３．カタラーゼを産生する微生物
本発明で検出することができる微生物は、カタラーゼを産生する微生物である。
カタラーゼを産生する微生物には、ブドウ球菌科、バシラス科、モラクセラ科、エアロモナス科、アルカリゲネス科、腸内細菌科、ナイセリア科、ビブリオ科、シュードモナス科、シェワネラ科、ブレビバクテリウム科、コリネバクテリウム科、デイノコッカス科、リステリア科、マイクロコッカス科、プロピオニバクテリウム科等に属する微生物がある。
【００１９】
ブドウ球菌科に属する微生物としてＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属がある。バシラス科に属する微生物としてＢａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｒｏｃｈｏｔｈｒｉｘ属がある。モラクセラ科に属する微生物としてＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ属、Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ属がある。エアロモナスア科に属する微生物としてＡｅｒｏｍｏｎａｓ属がある。アルカリゲネス科に属する微生物としてＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属がある。腸内細菌科に属する微生物としてＣｅｄｅｃｅａ属、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｅｒｗｉｎｉａ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｈａｆｎｉａ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ属、Ｙｅｒｓｉｎｉａ属、Ｐａｎｔｏｅａ属、Ｐｒｏｔｅｕｓ属、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属がある。ナイセリア科に属する微生物としてＣｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属がある。ビブリオ科に属する微生物としてＰｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｖｉｂｒｉｏ属がある。シュードモナス科に属する微生物としてＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属がある。シェワネラ科に属する微生物としてＳｈｅｗａｎｅｌｌａ属がある。ブレビバクテリウム科に属する微生物としてＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属がある。コリネバクテリウム科に属する微生物としてＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属がある。デイノコッカス科に属する微生物としてＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属がある。リステリア科に属する微生物としてＬｉｓｔｅｒｉａ属がある。マイクロコッカス科に属する微生物としてＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ属がある。プロピオニバクテリウム科に属する微生物としてＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属がある。
【００２０】
ブドウ球菌科、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属に属する微生物として例えば黄色ブドウ球菌がある。バシラス科、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する微生物として例えばセレウス菌がある。腸内細菌科、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する微生物として例えば大腸菌がある。
また、グラム陰性菌であるＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、グラム陽性菌であるＫｕｒｔｈｉａ属の細菌類を検出することが可能である。
【００２１】
４．蛍光指示薬
蛍光指示薬は励起光を照射されることにより励起されて蛍光を発光し、蛍光指示薬の近傍に存在する酸素により消光現象（クエンチング現象）がみられるものであれば特に種類は限定なく用いることができる。蛍光指示薬として遷移金属錯体、金属含有ポルフィリン、希土類金属錯体等を用いることができる。
遷移金属錯体としては例えばルテニウム錯体、オスミウム錯体、イリジウム錯体等を用いることができる。
金属含有ポルフィリンとしては例えば白金オクタエチルポルフィリンを用いることができる。
希土類金属錯体としては例えばユーロビウム錯体を用いることができる。
【００２２】
本発明において蛍光指示薬を容器に入れるためには様々な態様をとることができる。
蛍光指示薬と被検試料とが接触し、励起光の照射と発光する蛍光の測定が良好に行える態様であれば蛍光指示薬を容器に入れる態様は特に限定されない。例えば、被検試料を容器に入れた後に蛍光指示薬を被検試料に添加することができる。
被検試料を容器に入れる前に蛍光指示薬を容器に入れ、さらに被検試料を添加することができる。
蛍光指示薬と被検試料とを同時に容器に入れることができる。
予め蛍光指示薬を被検試料に添加したものを容器に入れてもよい。
予め蛍光指示薬を過酸化水素に添加したものを、容器に入れられた被検試料に添加してもよい。
図１は容器に蛍光指示薬と被検試料とを添加する場合の一例である。
【００２３】
しかしながら本発明においては、蛍光指示薬を容器に入れる操作は蛍光指示薬を容器の内面に塗布する操作である場合が好ましい。蛍光指示薬の塗布される部位は、容器の内面（側面又は底面）であり、被検試料と接触し、励起光の照射と蛍光の測定を行うことができる部位であれば特に場所は限定されない。
蛍光指示薬が容器の内面に塗布（固着）される固着の形状、厚さは励起光の照射と蛍光の検出を行うことができる状態であれば特に限定されない。蛍光指示薬を一カ所に塗布してもよいし、複数カ所に塗布してもよい。容器内面の一面に塗布することも可能である。例えば蛍光指示薬を容器の底面の中心に、直径２ｍｍの円状に、０．５ｍｍの厚さで塗布することが可能である。
【００２４】
蛍光指示薬を容器の内面に塗布するためにバインダーを用いることができる。バインダーは励起光と蛍光を吸収・反射せず、製膜性がよく、酸素の透過性が良い性質のものを用いることができる。バインダーは例えばポリジメチルシロキサン、シリコンゴム、ポリスチレン等を用いることができる。
【００２５】
このように蛍光指示薬が容器の内面に予め塗布されている場合、被検試料とは別途蛍光指示薬を容器に入れる操作を省略することができるため手順が簡便になり、好ましい。いずれの態様であっても蛍光指示薬の量は測定するために必要な蛍光を発することができる量であれば特に限定されない。
【００２６】
蛍光指示薬を容器に入れる操作を行わない場合、さらに他の態様をとることができる。例えば、蛍光指示薬は蛍光測定器に塗布されてもよい。蛍光指示薬が蛍光測定器に塗布される場合は、蛍光指示薬の塗布される部位は被検試料と接触し、励起光の照射と蛍光の検出を行うことができる部位であれば特に場所は限定されない。図４は蛍光指示薬が蛍光測定器に塗布された場合の一例である。
【００２７】
また、蛍光指示薬を容器に入れる操作を行わない場合、蛍光指示薬が他の基材に塗布されたものを予め容器に入れておくかまたは後から被検試料に沈めてもよい。
蛍光指示薬が他の基材に塗布されたものを予め容器に入れておくかまたは後から被検試料に沈める場合は、他の基材として励起光と蛍光を吸収、反射せず、透明な材質のものを用いることができる。例えば他の基材はポリプロピレン製、石英製等である。
他の基材は容器に入れることができる大きさ、形状であり、被検試料と接触することが可能な態様であれば特に限定されない。例えば、石英製の５ｍｍ×５ｍｍ×１ｍｍのプレートを用いることが可能である。
【００２８】
５．容器
容器は励起光と蛍光を吸収・反射しない透明な材質のものを用いることができる。容器は、例えばポリプロピレン製、石英製の容器を用いることができる。容器の底面の形状は平面、円柱型、円錐型、四角錐型などのものを用いることができる。容器の容積は被検試料と蛍光指示薬とが入る容積であれば特に限定されない。容器は１個単独のものを用いてもよいし、複数の容器が連結されたものを用いることも可能である。
蛍光指示薬が塗布された容器である場合には、上述の「４．蛍光指示薬」のとおり、蛍光指示薬が容器の内面に予め塗布されている。具体的には、蛍光指示薬が塗布された容器としてセンサーディッシュ（ＰｒｅＳｅｎｓ社製、形名：ＯＤ２４−１０）を用いることができる。
【００２９】
６．過酸化水素
本発明において過酸化水素を容器に入れるためには様々な態様をとることができる。過酸化水素が被検試料に接触し、良好にカタラーゼ反応が起こるような態様であれば特に限定されない。例えば、容器に過酸化水素を入れ、次いで被検試料と蛍光指示薬とを過酸化水素に添加してもよいし、容器に過酸化水素と蛍光指示薬とを含む被検試料を同時に添加してもよい。予め過酸化水素を被検試料に添加したものを容器に入れて、さらに蛍光指示薬を添加してもよい。
【００３０】
しかしながら本発明では蛍光指示薬を容器に入れるとともに容器に被検試料を含む溶液を入れ、次いで過酸化水素を添加する態様が、カタラーゼ反応の開始直後に蛍光強度を測定することができるため好ましい。
【００３１】
いずれの態様であっても過酸化水素としては過酸化水素水を用いることができる。過酸化水素水の濃度は好ましくは０．３質量％〜３．０質量％の範囲であり、より好ましくは０．３質量％〜１．０質量％の範囲である。この濃度の範囲内であれば、カタラーゼを産生する微生物にカタラーゼ反応を十分に起こさせることができ、過酸化水素の自己分解が起こらないため好ましい。
【００３２】
過酸化水素水の添加量は好ましくは被検試料に対して５体積％〜５０体積％の範囲であり、より好ましくは１０体積％〜２０体積％の範囲である。この添加量の範囲内であると、カタラーゼを産生する微生物にカタラーゼ反応を十分に起こさせることができ、過酸化水素の自己分解が起こらないため好ましい。
【００３３】
７．励起光
被検試料を含む溶液と、蛍光指示薬と、過酸化水素とを容器に入れる操作からなる工程後の容器内の蛍光指示薬に励起光を照射する。
励起光は蛍光指示薬を励起するために必要なエネルギーを持つ波長領域のものであれば特に限定されない。
例えば蛍光指示薬として遷移金属錯体を用いる場合は４３０ｎｍ〜５３０ｎｍの波長領域の励起光を用いることができる。
蛍光指示薬として金属含有ポルフィリンを用いる場合は４６０ｎｍ〜６００ｎｍの波長領域の励起光を用いることができる。
蛍光指示薬として希土類金属錯体を用いる場合は２００ｎｍ〜４００ｎｍの波長領域の励起光を用いることができる。
【００３４】
８．蛍光の強度の変化の測定と微生物の有無の決定
本発明では、被検試料を含む溶液と、蛍光指示薬と、過酸化水素とを容器に入れる操作からなる工程後の容器内の蛍光指示薬に励起光を照射して、蛍光指示薬が発光する蛍光の強度の変化、蛍光が完全に消失するまでの時間、位相のずれを測定する。中でも蛍光の強度の変化の測定が解り易く好適である。
本発明では、被検試料を含む溶液と、蛍光指示薬と、過酸化水素とを容器に入れる操作からなる工程後の容器内の蛍光指示薬に励起光を照射して、蛍光指示薬が発光する蛍光の強度の変化を測定する。励起光は１回のみ、複数回、連続的、断続的に照射することができる。蛍光の強度は１回のみ、複数回、連続的、断続的に測定することができる。
【００３５】
さらに、測定された蛍光の強度の変化に基づき被検試料中のカタラーゼを産生する微生物の有無を決定する。蛍光の強度の変化は、例えば蛍光の強度の大小の比較であっても良いし、蛍光の強度が事前に設定した閾値を超えるか否かであってもよい。また蛍光の強度の時間変化の積分をとる、蛍光の強度のある時点での微分係数を求める等であってもよい。
しかしながら本発明においては、蛍光の強度の変化としては、蛍光の強度の単位時間当たりの消失量を採用することが好ましい。
蛍光の強度の単位時間当たりの消失量を採用する場合には、蛍光の強度の変化の測定は蛍光の強度の単位時間あたりの消失量が得られる測定方法であれば特に限定されない。
単位時間は１マイクロ秒、１秒、１分等適宜設定することができる。例えば測定開始時点を基準とした場合に、発光した蛍光強度が一定以下に減少したときにアラーム音が鳴るように設定し、被検試料中のカタラーゼを産生する微生物の存在を検出することができる。ここで「測定開始」の時点は、励起光を一回照射する場合又は励起光を一回継続して照射する場合は「励起光照射開始した時点」であると定義する。励起光を複数回照射する場合又は励起光を断続的に照射する場合は、「測定開始」の時点は「初回の励起光照射開始した時点」であると定義する。
蛍光の強度の変化として蛍光の強度の単位時間当たりの消失量を採用した場合測定が簡易で解り易いため好ましい。
【００３６】
また、蛍光の強度とカタラーゼを産生する微生物の菌数との関係を表す検量線を作成することもできる。この場合、本発明の手法を被検試料中のカタラーゼを産生する微生物の定量方法に転用することが可能である。
【００３７】
９．測定値の換算
測定された蛍光の強度の変化、蛍光が完全に消失するまでの時間、蛍光の位相のずれは他の物理量に換算されることが可能である。他の物理量とは被検試料中のｐＨ、ある波長における吸光度、濁度、溶存酸素濃度等であるがこれに限定されるものではない。
蛍光指示薬の発光する蛍光が完全に消失するまでの時間を測定した場合は、蛍光が完全に消失するまでの時間と溶存酸素濃度との関係の検量線を作成することが好ましい。この検量線を用いて、蛍光が完全に消失するまでの時間が一定以下である場合に、陽性であると決定することができる。
【００３８】
蛍光指示薬の発光する蛍光と基準となる蛍光との位相のずれを測定した場合は、蛍光の位相のずれと溶存酸素濃度との関係の検量線を作成することが好ましい。この検量線を用いて、蛍光の位相のずれが一定以上である場合に、陽性であると決定することができる。
【００３９】
なかでも測定された蛍光の強度を被検試料中の溶存酸素濃度に換算して表わすことが解り易く好適である。蛍光の強度と被検試料中の溶存酸素濃度との関係の検量線を作成することが好ましい。
この検量線を用いて蛍光の強度の単位時間当たりの消失量が被検試料中の溶存酸素濃度の単位時間当たりの増加量に換算されて表わされる。溶存酸素濃度の単位時間当たりの増加量に基づき被検試料中のカタラーゼを産生する微生物の有無を決定することが可能である。
【００４０】
具体的には蛍光の強度と溶存酸素濃度との関係のキャリブレーションデータが内蔵された溶存酸素計、すなわち、蛍光消失時間式の原理を用いた溶存酸素計を用いて検出を決定することができる。具体的には、センサーディッシュリーダー（ＰｒｅＳｅｎｓ社製、形名：ＳＤＲ）が、評価手段としてのパーソナルコンピュータに接続されている。この評価手段としてのパーソナルコンピュータのソフトウェアにキャリブレーションデータが入力されている。
該評価手段によって、蛍光の強度の単位時間当たりの消失量が、被検試料の溶存酸素濃度の単位時間当たりの増加量に換算されて表わされる。このような蛍光消失時間式の原理を用いた溶存酸素計を用いると解り易く好適である。
【００４１】
蛍光の強度を被検試料中の溶存酸素濃度に換算して表わした場合、後述の試験例１に示すように、励起光照射開始直後に溶存酸素濃度が増加し始める。そのため、励起光照射開始直後、すなわち測定開始直後の一定時間の溶存酸素濃度の増加量に基づいて被検試料中のカタラーゼを産生する微生物の有無を決定することができる。
例えば、後述の試験例１で示すように、測定時期は測定開始直後０分〜１５分間が好ましく、測定開始直後０分〜４分間がより好ましく、測定開始直後０分〜１分間がさらに好ましい。測定開始直後０分〜１分間の測定を行うと、わずか１分間で微生物の有無を決定することができるため好ましい。
【００４２】
蛍光の強度を被検試料中の溶存酸素濃度に換算して表わした場合、後述の試験例１に示すように、例えば、カタラーゼを産生する微生物の有無を決定するための溶存酸素濃度の閾値は、測定開始直後０分〜１分間の溶存酸素濃度増加量が０．０８ｐｐｍ／ｍｉｎ以上である場合において微生物の有無を決定することができる。
さらに測定開始直後０分〜１分間の溶存酸素濃度増加量が０．１ｐｐｍ／ｍｉｎ以上である場合において微生物の有無を決定することができる。
さらに測定開始直後０分〜１分間の溶存酸素濃度増加量が０．１２ｐｐｍ／ｍｉｎ以上である場合において微生物の有無を決定することができる。ここで「ｐｐｍ」とは被検試料の体積に対する被検試料中の溶存酸素の体積の百万分率を意味する。
【００４３】
この溶存酸素濃度の単位時間当たりの増加量がこの閾値を超える場合、カタラーゼを産生する微生物が陽性であると決定することができる。溶存酸素濃度の単位時間当たりの増加量がこの閾値未満である場合、カタラーゼを産生する微生物が陰性であると決定することができる。
これらの溶存酸素濃度の単位時間当たりの増加量はカタラーゼを産生する微生物の種類によって異なるため、対象となる微生物の種類によって閾値となる溶存酸素濃度増加量を設定することができる。
【００４４】
図１は本発明の微生物の検出方法の一実施形態の原理を示す模式図である。
透明の容器１の内面には蛍光指示薬２が塗布されていない。容器１には蛍光指示薬２と被検試料３とが添加されている。
この蛍光指示薬２を含む被検試料３に過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を添加し、被検試料３中のカタラーゼ産生微生物のカタラーゼ反応により発生した酸素を検出する。
光源４から蛍光指示薬２を含む被検試料３に励起光６が照射され、蛍光指示薬２が発する蛍光７を検出手段５によって検出する。
検出手段５からの出力信号が評価手段８に入力され、評価される。
評価手段８には蛍光７の強度と溶存酸素濃度との関係を表すキャリブレーションデータが予め入力されている。評価手段８にて蛍光７の強度の単位時間当たりの消失量が溶存酸素濃度の単位時間当たりの増加量に換算されて表わされる。
【００４５】
図２は本発明の微生物の検出方法の他の実施形態の原理を示す模式図である。
蛍光指示薬２が底面の内面に塗布された透明の容器１には被検試料３が添加されている。
この被検試料３に過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を添加し、被検試料３中のカタラーゼ産生微生物のカタラーゼ反応により発生した酸素を検出する。
光源４から蛍光指示薬２に励起光６が照射され、蛍光指示薬２が発する蛍光７を検出手段５によって検出する。
検出手段５からの出力信号が評価手段８に入力され、評価される。
評価手段８には蛍光７の強度と溶存酸素濃度との関係を表すキャリブレーションデータが予め入力されている。評価手段８にて蛍光７の強度の単位時間当たりの消失量が、溶存酸素濃度の単位時間当たりの増加量に換算されて表わされる。
【００４６】
図３は本発明の微生物の検出方法の他の実施形態の図である。
本実施形態では、蛍光指示薬２が内面に塗布された透明の容器１が複数個（計２４個）連結されたものを使用する。容器１の底面の内面にはそれぞれ蛍光指示薬２が塗布されている。
この容器１それぞれに被検試料３を入れ、この被検試料３にそれぞれ過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を添加する。
被検試料３中の微生物のカタラーゼ反応により発生した酸素を検出する。
光源４と検出手段５が一体型となった機器を使用する。
光源４から蛍光指示薬２に励起光が照射され、蛍光指示薬２から発光する蛍光を検出手段５によって検出する。
検出手段５からの出力信号が評価手段８に入力され、評価される。
評価手段８には蛍光の強度と溶存酸素濃度との関係を表すキャリブレーションデータが予め入力されている。評価手段８にて蛍光の強度の単位時間当たりの消失量が被検試料中の溶存酸素濃度の単位時間当たりの増加量に換算されて表わされる。
【００４７】
図４は本発明の微生物の検出方法のさらに他の実施形態の原理を示す模式図である。
透明の容器１の内面には蛍光指示薬２が塗布されていない。
蛍光測定器としてプローブ型酸素計９を用いる。
プローブ型酸素計９の先端には、蛍光指示薬２、光源４、検出手段５が配置されており、プローブ型酸素計９の先端部位で、カタラーゼ反応によって発生した酸素を検出することが可能である。
容器１には被検試料３が添加されている。被検試料３に過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を添加し、被検試料３中のカタラーゼ産生微生物のカタラーゼ反応により発生した酸素を、蛍光指示薬２が先端に配置されたプローブ型溶存酸素計９を用いて検出する。
検出手段５からの出力信号が評価手段８に入力され、評価される。
評価手段８には蛍光の強度と溶存酸素濃度との関係を表すキャリブレーションデータが予め入力されている。評価手段８にて蛍光の強度の単位時間当たりの消失量が、溶存酸素濃度の単位時間当たりの増加量に換算されて表わされる。
【実施例】
【００４８】
以下に実施例を用いて本発明をさらに詳しく説明する。本発明はこれら実施例に限定されるものではない。特に断わりのない限り、「％」は「質量％」を意味する。
本明細書の検出の決定時期、時間、閾値の例については後述の試験例１に示す。
また、以下の実施例、試験例において「陽性である」とは、被検試料中にカタラーゼを産生する微生物を１０４ＣＦＵ／ｍｌ以上含むことを意味する。「陰性である」とは、被検試料中のカタラーゼを産生する微生物が１０４ＣＦＵ／ｍｌ未満であることを意味する。
【００４９】
＜試験例１＞
（目的）
試験例１では、本発明に係る方法の好ましい蛍光の測定時期及び測定時間を検討した。また、「陽性である」と検出するための溶存酸素濃度の閾値を検討した。
【００５０】
（試料の調製）
プロセスチーズ（エムケーチーズ社製）１０ｇに滅菌水９０ｍｌを加えてよく粉砕混合したものを被検試料とした。この被検試料にＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｕｏｓａを菌数が１０５ＣＦＵ／ｍｌ以上となるように接種して半量を試料１とし、残りの半量を比較対照としての比較試料１とした。試料１は続く試験方法にて過酸化水素水が添加される試料であり、比較試料１は続く試験方法にて過酸化水素水が添加されない試料である。
【００５１】
（試験方法）
試料１及び比較試料１中に含まれる微生物の数は食品衛生検査指針（微生物編）の低温細菌の測定方法により決定した。ＣＶＴ寒天培地を用いて、混和法又は塗抹法を行い、２５℃で４８時間培養した。培養後、寒天培地に生じたコロニー数をもとに菌数を算定した。
蛍光指示薬が内面に塗布された容器としてセンサーディッシュ（ＰｒｅＳｅｎｓ社製、形名：ＯＤ２４−１０）に試料１を１ｍｌ添加し、室温（２５℃）に１５分間静置した。次いで試料１に０．３質量％の過酸化水素水を１００μｌ添加した。このセンサーディッシュは蛍光指示薬が内面に塗布された容器を２４個有していた。
【００５２】
次に光源と検出手段が一体型となったセンサーディッシュリーダー（ＰｒｅＳｅｎｓ社製、型名：ＳＤＲ）を用いて蛍光指示薬に励起光（波長４６５ｎｍ）を照射して発光する蛍光の強度を測定する操作を１５秒間隔で１５分間行った。
【００５３】
評価手段であるＰＣに蛍光の強度と被検試料中の溶存酸素濃度との関係を表すキャリブレーションデータを予めソフトウェアに入力した。このキャリブレーションデータを用いて発光した蛍光の強度を被検試料中の溶存酸素濃度に換算して表わした。
比較試料１について過酸化水素水を添加しない以外は、試料１と同じ実験操作を行った。
【００５４】
（結果）
試験結果を図５に示す。試料１および比較試料１の溶存酸素濃度の値を表１に示す。試料１および比較試料１の単位時間あたりの溶存酸素濃度の増加量を表２に示す。また、試料１および比較試料１ともに含まれる細菌数は１．１×１０６ＣＦＵ／ｍｌであった。
【００５５】
【表１】
2018064518.tif 000003
【００５６】
【表２】
2018064518.tif 000004
【００５７】
（評価）
・測定時期について  
図５は、試料１および比較試料１の溶存酸素濃度（ｐｐｍ）の変化を示している。図５及び表１の結果より、過酸化水素水を添加した試料１では、測定開始時点（０分）での溶存酸素濃度は１１．８７ｐｐｍであった。測定開始後、徐々に被検試料中の溶存酸素濃度は上昇し、４分経過時点で１２．５５ｐｐｍであった。その後も溶存酸素濃度は増加し続け、１５分経過後では溶存酸素濃度は１５．１８ｐｐｍであった。
【００５８】
これに対して、過酸化水素水を添加しない比較試料１では、測定開始時点（０分）での溶存酸素濃度は１２．０３ｐｐｍであった。測定開始後、ほとんど被検試料中の溶存酸素濃度は上昇せず、４分経過時点で１２．０６ｐｐｍであった。１５分経過後では被検試料中の溶存酸素濃度は１２．１３ｐｐｍであった。
【００５９】
これらの結果より、過酸化水素水を添加した試料１、すなわちカタラーゼ反応が生じた被検試料では、励起光を照射開始し、測定開始した直後に溶存酸素濃度が上昇することがわかる。
一方、過酸化水素水を添加しない比較試料１、すなわちカタラーゼ反応が生じない被検試料では、励起光を照射開始し、測定開始した後ほとんど溶存酸素濃度が上昇しないことがわかる。
よって、本発明の蛍光の測定時期は測定開始直後０分〜１５分間の範囲が好ましく、測定開始直後０分〜４分間がより好ましく、測定開始直後０分〜１分間がさらに好ましい。
【００６０】
・測定時間
表２は単位時間あたりの溶存酸素濃度増加量である。過酸化水素水を添加した試料１では、測定開始後０〜１分で溶存酸素濃度の増加量が０．１２ｐｐｍ／ｍｉｎであった。その後測定終了まで溶存酸素濃度の増加量は０．１２ｐｐｍ／ｍｉｎを下回ることはなかった。
これに対して過酸化水素水を添加しない比較試料１では、測定開始後０〜１分で溶存酸素濃度の増加量が０．０３ｐｐｍ／ｍｉｎであった。その後測定終了まで溶存酸素濃度の増加量は０．０３ｐｐｍ／ｍｉｎを下回った。
【００６１】
これらの結果より、過酸化水素水を添加した被検試料、すなわちカタラーゼ反応が生じた被検試料では、測定開始直後０分〜１５分間にて明らかに溶存酸素濃度が増加し続けていることがわかる。測定時間は測定開始直後０分〜４分間がより好ましく、測定開始直後０分〜１分間がさらに好ましい。測定開始直後０分〜１分間の測定を行うと、わずか１分間で微生物の有無を決定することができるため好ましい。
【００６２】
・溶存酸素濃度の閾値  
表２及び上記「測定時間」で記載したとおり、試料１では溶存酸素濃度の増加量が０．１２ｐｐｍ／ｍｉｎを下回ることはなかった。また比較試料１では、測定開始後０〜１分で溶存酸素濃度の増加量が０．０３ｐｐｍ／ｍｉｎであり、測定終了までこの溶存酸素濃度の増加量は０．０３ｐｐｍ／ｍｉｎを下回った。
そのため「測定開始直後０分〜１分間の溶存酸素濃度増加量が０．０８ｐｐｍ／ｍｉｎ以上である」ときにカタラーゼを産生する微生物の検出を「陽性である」と決定することができる。
「測定開始直後０分〜１分間の溶存酸素濃度増加量が０．１ｐｐｍ／ｍｉｎ以上である」ときにカタラーゼを産生する微生物の検出を「陽性である」と決定することができる。
「測定開始直後０分〜１分間の溶存酸素濃度増加量が０．１２ｐｐｍ／ｍｉｎ以上である」ときにカタラーゼを産生する微生物の検出を「陽性である」と決定することができる。
【００６３】
これらの溶存酸素濃度の増加量はカタラーゼを産生する微生物の種類によって異なるため、対象となる微生物の種類によって閾値となる溶存酸素濃度増加量を定めることができる。
また、「測定開始直後の０分〜１分間の溶存酸素濃度増加量が０．１２ｐｐｍ／ｍｉｎ未満である」ときにカタラーゼを産生する微生物の検出を「陰性である」と決定することができる。
「測定開始直後の０分〜１分間あたりの溶存酸素濃度増加量が０．１ｐｐｍ／ｍｉｎ未満である」ときにカタラーゼを産生する微生物の検出を「陰性である」と決定することができる。
「測定開始直後の０分〜１分間あたりの溶存酸素濃度増加量が０．０８ｐｐｍ／ｍｉｎ未満である」ときにカタラーゼを産生する微生物の検出を「陰性である」と決定することができる。
【００６４】
＜試験例２＞
（目的）
試験例２は、本発明で検出することができる菌の種類を確認するために行った。
【００６５】
（試料の調製）
（ａ）試料２
牛乳（森永乳業社製）２０ｍｌにカタラーゼを産生する微生物としてＦｌａｖｉｍｏｎａｓ  ｏｒｙｚｉｈａｂｉｔａｎｓを１０個程度接種し、菌数が１０５ＣＦＵ／ｍｌ程度となるように培養し、試料２とした。
（ｂ）試料３
カタラーゼを産生する微生物として、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａを用いた以外は試料２と同じ操作を行い、試料３とした。
（ｃ）試料４
カタラーゼを産生する微生物として、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａを用いた以外は、試料２と同じ操作を行い、試料４とした。
（ｄ）試料５
カタラーゼを産生する微生物として、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｌｗｏｆｆｉを用いた以外は、試料２と同じ操作を行い、試料５とした。
【００６６】
（ｅ）試料６
カタラーゼを産生する微生物として、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａを用いた以外は、試料２と同じ操作を行い、試料６とした。
（ｆ）試料７
カタラーゼを産生する微生物として、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓを用いた以外は、試料２と同じ実験操作を行い、試料７とした。
（ｇ）試料８
カタラーゼを産生する微生物として、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｉｎｄｉｇｏｆｅｒａを用いた以外は、試料２と同じ操作を行い、試料８とした。
（ｈ）試料９
カタラーゼを産生する微生物を接種しない以外は、試料２と同じ操作を行い、試料９とした。
（ｉ）試料１０
カタラーゼを産生する微生物を接種せず、カタラーゼを産生しない微生物として、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓを接種した以外は、試料２と同じ実験操作を行い、試料１０とした。
【００６７】
（試験方法）
試料２〜１０を用いて上記試験例１と同じ実験操作を行った。
【００６８】
（結果）
結果を表３に示す。
【００６９】
【表３】
2018064518.tif 000005
【００７０】
表３において溶存酸素の増加量とは、測定開始直後の４分間の溶存酸素濃度変化から算出した値である。
表３から明かなように、試料２〜８に示すカタラーゼを産生する微生物が被検試料中に１０４〜１０６ＣＦＵ／ｍｌ程度含まれている場合、溶存酸素濃度の増加量が０．１３ｐｐｍ／ｍｉｎ以上であり「陽性」であると検出が可能であった。
【００７１】
試料９に示すように、カタラーゼを産生する微生物を含まない被検試料では、測定開始後にほとんど溶存酸素濃度が増加せず、「陰性」であった。
試料１０に示すように、カタラーゼを産生する微生物を含まず、カタラーゼを産生しない微生物を１．５×１０５ＣＦＵ／ｍｌ程度含む被検試料では、測定開始後にほとんど溶存酸素濃度が増加せず、「陰性」であった。
このように、表３に示す７種類のカタラーゼを産生する微生物の検出が可能であることが示された。カタラーゼを産生する微生物であれば良好に検出できることが示唆された。
【００７２】
以上のように、本発明によればごく短時間でカタラーゼを産生する微生物の検出することが可能であることが示された。また操作が簡便で熟練を要さず、定性的な結果を簡易に得ることができた。
表３に記載された７種類の細菌は冷蔵域（１０℃以下程度）で増殖可能である低温細菌に該当するものである。
牛乳に混入した低温細菌を検出するには、従来の方法では培養法により検出するのが一般的であるが、この方法には通常２〜３日間必要であった。本発明では、従来の方法と比較してごく短時間で簡易に食品中のカタラーゼを産生する微生物を検出することが可能であった。
【００７３】
＜実施例１＞
実施例１では本発明の検出方法により被検試料中のカタラーゼを産生する微生物の検出を行った。
牛乳（森永乳業社製）２０ｍｌにカタラーゼを産生する微生物としてＦｌａｖｉｍｏｎaｓ  ｏｒｙｚｉｈａｂｉｔａｎｓを１０個程度接種し、菌数が１０５ＣＦＵ／ｍｌ程度となるように培養し、被検試料とした。
この被検試料を、蛍光指示薬が内面に塗布された容器としてセンサーディッシュ（ＰｒｅＳｅｎｓ社製、形名：ＯＤ２４−１０）に１ｍｌ添加し、室温（２５℃）に１５分間静置した。次いで被検試料に０．３質量％の過酸化水素水を１００μｌ添加した。このセンサーディッシュは蛍光指示薬が内面に塗布された容器を２４個有していた。
【００７４】
次に光源と検出手段が一体型となったセンサーディッシュリーダー（ＰｒｅＳｅｎｓ社製、型名：ＳＤＲ）を用いて蛍光指示薬に励起光（波長４６５ｎｍ）を照射して発光する蛍光の強度を測定する操作を１５秒間隔で１５分間行った。センサーディッシュリーダーは評価手段であるＰＣに接続されていた。
評価手段であるＰＣに蛍光の強度と被検試料中の溶存酸素濃度との関係を表すキャリブレーションデータを予めソフトウェアに入力した。このキャリブレーションデータを用いて発光した蛍光の強度を被検試料中の溶存酸素濃度に換算して表した。
測定開始直後の４分間の被検試料中の単位時間あたりの溶存酸素濃度増加量が０．２３ｐｐｍ／ｍｉｎであったため、カタラーゼを産生する微生物の検出を「陽性である」と決定した。
【００７５】
＜実施例２＞
チーズ１０ｇに滅菌水９０ｍｌを加えてよく粉砕混合したものを被検試料とした以外は実施例１と同じ実験操作を行い、実施例２とした。測定開始直後１分間の被検試料中の溶存酸素濃度増加量が０．１２ｐｐｍ／ｍｉｎであったためカタラーゼを産生する微生物の検出を「陽性である」と決定した。
【００７６】
＜比較例１＞
被検試料に過酸化水素を添加しない以外は、実施例１と同じ実験操作を行い、比較例１とした。測定開始直後１分間の溶存酸素濃度増加量が０．０１ｐｐｍ／ｍｉｎであり、その後１５分間ほとんど溶存酸素濃度が増加しなかったためカタラーゼを産生する微生物の検出はできなかった。
【００７７】
＜符号の説明＞
１…容器  ２…蛍光指示薬  ３…被検試料  ４…光源  ５…検出手段  ６…励起光
７…蛍光  ８…評価手段  ９…プローブ型酸素計
【図１】
2018064518.tif 000006
【図２】
2018064518.tif 000007
【図３】
2018064518.tif 000008
【図４】
2018064518.tif 000009
【図５】
2018064518.tif 000010