(57)【要約】      （修正有）【課題】リステリアの抗原配列の発現を容易にするシグナルペプチド融合パートナー、ならびにその調整方法及びその使用の提供。【解決手段】非リステリア抗原に対する免疫応答を刺激するための、リステリア細菌を含む組成物。リステリア細菌の有効量をヒトに投与することを含み、リステリア細菌は非リステリア抗原を融合タンパク質として発現し、融合タンパク質は、分泌リステリアタンパク質配列の組み換え修飾によって生じるポリペプチドと非リステリア抗原を含み、分泌リステリアタンパク質配列が、その非修飾形においてシグナル配列および１以上のＰＥＳＴモチーフを含み、修飾が、ポリペプチドがいずれのＰＥＳＴモチーフを欠如するような、１以上の残基による欠失もしくは置換による各ＰＥＳＴモチーフの除去を含み、分泌リステリアタンパク質配列はＡｃｔＡまたはＬＬＯであり、非リステリア抗原は前記ヒトの１以上の細胞内で発現する組成物。【選択図】図１
2018135355.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトにおいて、非リステリア抗原に対する免疫応答を刺激するための方法に使用するための、リステリア細菌を含む組成物であって、
前記方法は、前記リステリア細菌の有効量を前記ヒトに投与することを含み、前記リステリア細菌は前記非リステリア抗原を融合タンパク質として発現し、
前記融合タンパク質は、分泌リステリアタンパク質配列の組み換え修飾によって生じるポリペプチドと非リステリア抗原を含み、前記分泌リステリアタンパク質配列が、その非修飾形においてシグナル配列および１以上のＰＥＳＴモチーフを含み、前記修飾が、前記ポリペプチドがいずれのＰＥＳＴモチーフを欠如するような、１以上の残基による欠失もしくは置換による前記各ＰＥＳＴモチーフの除去を含み、前記分泌リステリアタンパク質配列はＡｃｔＡまたはＬＬＯであり、
前記非リステリア抗原は前記ヒトの１以上の細胞内で発現する、組成物。
【請求項２】
前記修飾が、前記分泌リステリアタンパク質配列の約１００残基における切り詰めをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ポリペプチドが前記分泌リステリアタンパク質配列のシグナル配列を非修飾形で保持する、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記修飾が、
前記分泌リステリアタンパク質配列の前記シグナル配列の一部ではない１以上の疎水性ドメインの除去、および／または
前記分泌リステリアタンパク質配列の前記シグナル配列の一部ではない１以上の疎水性ドメイン内の１以上の残基の、非疎水性アミノ酸との置換をさらに含む、
請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記分泌リステリアタンパク質配列がＡｃｔＡ配列であり、配列ＫＴＥＥＱＰＳＥＶＮＴＧＰの少なくとも７５％が除去されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
配列ＫＴＥＥＱＰＳＥＶＮＴＧＰまたはＫＴＥＥＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲが除去されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記分泌リステリアタンパク質配列がＡｃｔＡ配列であり、配列ＫＴＥＥＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲ中の１以上のＰ、Ｅ、ＳおよびＴ残基がＰ、Ｅ、ＳおよびＴ以外の残基と置換されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記配列ＫＴＥＥＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲ中の各Ｐ、Ｅ、ＳおよびＴ残基がＫまたはＲと置換されている、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記分泌リステリアタンパク質配列がＡｃｔＡ配列であり、配列ＬＩＡＭＬ内の１以上の疎水性残基が非疎水性アミノ酸と置換されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記配列ＬＩＡＭＬが配列ＱＤＮＫＲに置き換えられている、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ポリペプチドが図２のｄｌＰＥＳＴおよびｄｌＰＥＳＴ  ｑｄｎｋｒと呼ばれる配列の一つの少なくとも最初の９５残基を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記分泌リステリアタンパク質配列がＬＬＯ配列であり、配列ＳＩＳＳＭＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥの少なくとも７５％が除去されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
配列ＫＥＮＳＩＳＳＭＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫまたはＮＳＩＳＳＭＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤが除去されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記分泌リステリアタンパク質配列がＬＬＯ配列であり、配列ＳＩＳＳＭＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤ中の１以上のＰ、Ｅ、ＳおよびＴ残基がＰ、Ｅ、ＳおよびＴ以外の残基と置換されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記配列ＳＩＳＳＭＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤ中の各Ｐ、Ｅ、ＳおよびＴ残基がＫまたはＲと置換されている、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ポリペプチドが図２のＬＬＯ  ｄｌＰＥＳＴおよびＬＬＯ  ｄｌ２６と呼ばれる配列の一つの少なくとも最初の９５残基を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
前記非リステリア抗原ががん細胞、腫瘍または感染病原体抗原である、請求項１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２０１２年１２月２７日出願の米国特許仮出願第６１／７４６，２３７号および２０１３年３月１３日出願の米国特許仮出願第６１／７８０，７４４号の優先権を主張する。すべての表、図および請求項を含む、これらのそれぞれ内容の全体を参照により本明細書に援用する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景に関する以下の考察は、読者が本発明を理解するのを支援するために提供するに過ぎず、本発明の先行技術を説明または構成することを認めるものではない。
【０００３】
リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（Ｌｍ））は、ワクチンにコードされた抗原に特異的な、強力かつ高機能のＣＤ４およびＣＤ８のＴ細胞免疫をもたらす深在性の自然免疫応答を誘発するその能力によって特徴付けられる通性細胞内細菌である。Ｌｍは、がんまたは他のウイルス誘発性免疫不全の患者、妊婦、高齢者および乳児などの免疫力が低下した個人の間で病原性が高い食物媒介細菌である。
【０００４】
選択された標的病原体または悪性腫瘍に関連する指定された抗原をコードするために設計された組換え修飾Ｌｍワクチンプラットフォームは、いくつかのヒト臨床試験の基礎を形成してきた。リステリアは、病原体、特に免疫無防備状態では病原体になり得るので、投与工程は、目的とする抗原の発現可能な免疫学的に活性な部分をコードする弱毒化リステリアを投与することを含む。「弱毒化」とは、細菌がその病原性を和らげるか、または除去するように修飾されるが、目的とする疾患の予防薬または治療薬として作用するその能力を保持しているプロセスを指す。例として、マウスのリステリア症モデルにおいて２つの病原性遺伝子を除去し、＞９９．９％に弱毒化している遺伝学的に定義された弱毒化生ＬｍΔａｃｔＡΔｉｎｌＢは、その免疫効力を保持しており、ヒト疾患のマウスモデルならびにヒトの両方において強いＣＤ４およびＣＤ８のＴ細胞免疫性を誘発することを示し、種々の固形悪性腫瘍の患者の臨床現場では、安全で良好な耐容性を示してきた。
【０００５】
リステリア株は、最も一般的には、リステイオリジンＯ（ＬＬＯ）またはＡｃｔＡなどの分泌されたリステリアタンパク質のすべてまたは一部との融合体として腫瘍抗原を分泌するように遺伝子操作されている。そのようなワクチンコンスラクトの有効性の考えられる理由は「ＰＥＳＴ」モチーフと呼ばれるＬＬＯおよびＡｃｔＡ内のアミノ酸配列の存在であってよいことが示唆されてきた。ＰＥＳＴ領域（Ｐ．プロリン；Ｅ．グルタミン酸；Ｓ．セリン；Ｔ．スレオニン）は、特定のタンパク質のＮＨ２またはＣＯＯＨ末端近くに存在する親水性アミノ酸配列である。これらは、細胞プロテアソームによる急速な分解ためタンパク質を標的にすると考えられている。Ｔリンパ球によって認識されるためには、タンパク抗原は、抗原提示細胞の表面に提示されるＭＨＣ分子に結合した短鎖ペプチドに変わる必要がある。実際に、ＭＨＣクラスＩ分子による提示で利用できるペプチドの供給は、タンパク質の細胞半減期を短くすることによって増やすことができるので、ＬＬＯのＰＥＳＴ領域はリステリアワクチンの成功にとって重大であることが示唆されてきた。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、宿主細胞のサイトゾルに目的の抗原を効率よく発現および分泌させ、翻訳リーディングフレーム内のＮ末端融合パートナーとしてリステリアまたは他の細菌シグナルペプチド／分泌シャペロンを選択された、コードされた組換えタンパク質抗原に機能的に結合することによってＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞の効果的な応答を誘発する核酸、発現系およびワクチン株を提供する。これらの細菌Ｎ末端シグナルペプチド／分泌シャペロン融合パートナーは、感染した宿主哺乳動物細胞中の組換え細菌から合成融合タンパク質の分泌を指示する。後述するように、これらのＮ末端融合パートナーは、その配列本来のいずれのＰＥＳＴ配列が（実際の欠失によって、突然変異によって、またはこれらの方法の組み合わせのいずれかによって）除去されている。
【０００７】
細菌Ｎ末端シグナルペプチド／分泌シャペロン融合パートナーは、ＰＥＳＴ配列の修飾に関して、および任意選択でシグナル配列の外側の疎水性モチーフの長さおよび／または存在にも関して、天然ポリペプチド配列と比較して修飾される。例として、ＡｃｔＡは、Ｃ末端膜結合ドメインを除去するよう切り詰めることができ、特定の実施形態において、融合タンパク質中の非抗原残基の数をさらに減少させるように切断されることができる。加えて、シグナル配列の一部でなく、ポリペプチド配列中の疎水性モチーフを形成するこれらN末端融合パートナー中の１以上の疎水性残基も、（ここでも、実際の欠失によって、突然変異によって、またはこれらの方法の組み合わせのいずれかによって）除去される。結果として生じる融合タンパク質は、高レベルで発現し、融合タンパク質に含まれる目的の抗原に対して強力な免疫応答を起こす。
【０００８】
第１の態様において、本発明は、
（ａ）プロモーターと、
（ｂ）前述のプロモーターに作動可能に結合した核酸とを含むポリヌクレオチドに関し、
前述の核酸は分泌リステリアタンパク質配列の組換え修飾に由来するポリペプチドを含む融合タンパク質と、非リステリア抗原とをコードし、前述の分泌リステリアタンパク質配列はその非修飾形においてシグナル配列および１以上のＰＥＳＴモチーフを含み、前述の修飾はポリペプチドがいずれのＰＥＳＴモチーフを欠如するような欠失による、または１以上の残基による置換による各ＰＥＳＴモチーフの除去を含む。
【０００９】
特定の実施形態において、Ｎ末端シグナルペプチド／分泌シャペロン融合パートナーは、ＡｃｔＡまたはＬＬＯに由来する。ＡｃｔＡまたはＬＬＯポリペプチド配列のＰＥＳＴモチーフ中の１以上のＰ、Ｅ、ＳおよびＴ残基、および好ましくは各Ｐ、Ｅ、ＳおよびＴ残基は、Ｐ、Ｅ、ＳおよびＴ以外の残基と置換されることができる。後述するように、単一の残基を除去することでもこのモチ−フの「ＰＥＳＴ様」を少なくすることができる。あるいは、ＡｃｔＡまたはＬＬＯポリペプチド配列のＰＥＳＴモチーフ中の１以上のＰ、Ｅ、ＳおよびＴ残基、および好ましくは各Ｐ、Ｅ、ＳおよびＴ残基は、単純に除去されてもよい。例として、ＰＥＳＴモチーフ中の各Ｐ、Ｅ、ＳおよびＴは、ＫまたはＲと置換してもよい。生成されたポリペプチドは、最も好ましくは、非修飾形において分泌リステリアタンパク質配列（例えば、ＡｃｔＡまたはＬＬＯ）のシグナル配列を保持する。
【００１０】
分泌リステリアタンパク質配列がＡｃｔＡ配列である場合、ＰＥＳＴモチーフＫＴＥＥＱＰＳＥＶＮＴＧＰの少なくとも７５％が好ましくは除去されている。特定の好適な実施形態において、配列ＫＴＥＥＱＰＳＥＶＮＴＧＰまたはＫＴＥＥＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲが、除去されている。分泌リステリアタンパク質配列がＬＬＯ配列である場合、ＰＥＳＴモチーフＫＥＮＳＩＳＳＭＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫの少なくとも７５％が、好ましくは除去されている。特定の好適な実施形態において、配列ＫＥＮＳＩＳＳＭＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫまたはＮＳＩＳＳＭＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤは、好ましくは除去されている。
【００１１】
任意選択で、疎水性モチーフを形成する配列は、疎水性でない１以上のアミノ酸と置換することができる。このように、Ｎ末端シグナルペプチド／分泌シャペロン融合パートナーの修飾は、分泌リステリアタンパク質配列のシグナル配列の一部でない１以上の疎水性ドメインの除去および／または分泌リステリアタンパク質配列のシグナル配列の一部でない１以上の疎水性ドメイン内の１以上の残基の疎水性でないアミノ酸との置換をさらに含むことができる。後述する例として、ＡｃｔＡ中の配列ＬＩＡＭＬは、配列ＱＤＮＫＲと置き換えることができる。
【００１２】
本明細書に記載するように、Ｎ末端シグナルペプチド／分泌シャペロン融合パートナーは、任意選択で親タンパク質（例えば、ＡｃｔＡまたはＬＬＯ）の天然の長さと比較して切り詰める。例として、ＡｃｔＡは、Ｃ末端膜結合ドメインを除去するように切り詰めることができ、特定の実施形態において、該融合タンパク質中の非抗原の数を減らすようにさらに切り詰めることがきる。同様に、ＬＬＯは、コレステロール結合を抑制するために、約４８４残基前で切り詰めることができ、および特定の実施形態において、融合タンパク質中の非抗原の数を再び減らすようにさらに切り詰めることがきる。
【００１３】
好適な実施形態において、分泌リステリアタンパク質配列は、ＡｃｔＡ配列から運ばれ、ポリペプチドは、図２にｄｌＰＥＳＴおよびｄｌＰＥＳＴｑｄｎｋｒと呼ぶ配列の一つの少なくとも最初の９５残基を含む。
【００１４】
好適な実施形態において、分泌リステリアタンパク質配列は、ＬＬＯ配列から運ばれ、ポリペプチドは、図２のＬＬＯ  ｄｌＰＥＳＴおよびＬＬＯ  ｄｌ２６と呼ばれる配列の一つの少なくとも最初の９５残基を含む。
【００１５】
特定の実施形態において、プロモーターは、宿主生物に細菌を導入すると、宿主細胞中で融合タンパク質の発現を誘発する制御配列を提供する。例としてのみ示すが、プロモーターは、ＰｒｆＡ依存性であるリステリア・モノサイトゲネス・プロモーターである。ＰｒｆＡ依存性プロモーターは、ｉｎｌＡプロモーター、ｉｎｌＢプロモーター、ｉｎｌＣプロモーター、ｈｐｔプロモーター、ｈｌｙプロモーター、ｐｌｃＡプロモーター、ｍｐｌプロモーターおよびａｃｔＡプロモーターからなる群から選択されてよい。
【００１６】
本発明の融合タンパク質の非リステリア抗原部分は、コードされた異種抗原に特異的な所望の免疫応答を誘発するよう、すなわち、治療される状態の症状を減少、予防または寛解させるように選択される１以上の配列を含む。特定の実施形態において、非リステリア抗原は、がん細胞、腫瘍または感染病原体抗原をコードする１以上の配列を含む。
【００１７】
関連する一態様において、本発明のポリヌクレオチドは、プラスミド、ベクターまたはその他の成分として提供される。
【００１８】
別の関連する態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むように修飾された組換えリステリア細菌を提供する。種々の実施形態において、ポリヌクレオチドはエピソームで提供されても、または細菌ゲノムに組み込まれてもよい。組換えリステリア細菌は、弱毒化するように、例えば細菌のａｃｔＡおよび／またはｉｎｌＢゲノム遺伝子の機能的欠失によってさらに修飾されてもよい。特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、細菌のａｃｔＡまたはｉｎｌＢゲノム遺伝子に挿入される。本発明の細菌は、例えば、これらの遺伝子から発現される異種タンパク質に対して免疫応答を起こす目的で、細菌と異種の１以上の遺伝子を発現させる発現プラットフォームとして利用することができる。このように、本態様は、組換えリステリア細菌と、薬学的に許容される賦形剤とを含むワクチンを提供することができる。
【００１９】
さらに別の関連する態様において、本発明は、本明細書に記載の有効量のリステリア細菌を、哺乳動物の１以上の細胞で非リステリア抗原が発現する哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物において非リステリア抗原に対する免疫応答を刺激する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ＡｃｔＡのいくつかの機能的属性を模式的に示す。
【図２】ＡｃｔＡおよびＬＬＯの配列への種々の修飾を示す。
【図３】ｅｐｅｓｔｆｉｎｄアルゴリズムを使用してスコア化した、ＬＬＯ配列中のＰＥＳＴモチーフの位置を示す。
【図４】ｅｐｅｓｔｆｉｎｄアルゴリズムを使用してスコア化した、ＡｃｔＡ配列中の４つのＰＥＳＴモチーフを示す。
【図５】種々の修飾ＡｃｔＡおよびＬＬＯ融合パートナーを有する融合コンストラクトを発現するリステリア・モノサイトゲネスによる免疫に続くＢ３ＺＴ細胞活性化アッセイの結果を示す。
【図６】いくつかのＬＬＯ４４１（Ａ）およびＡｃｔＡＮ１００（Ｂ）ワクチン株からの応答を示す。
【図７】モデル系としてＡｃｔＡを使用して、ＰＥＳＴモチーフの除去で用いるいくつかの置換および欠失を示す。
【図８】ＡｃｔＡＮ１００のハイドロパシープロット上で疎水性モチーフＬＩＡＭＬを修飾する結果を示す。
【図９】ＣＴ−２６腫瘍細胞の抗原投与に続く、ヒトメソテリン残基３５−６２１に融合した修飾ＡｃｔＡＮ１００配列を有する融合コンストラクトを発現するリステリア・モノサイトゲネスで免疫した動物のパーセント生存率を示す。
【図１０】模式的に示した本発明のＥＧＦＲｖＩＩＩ２０−４０／ＮＹ−ＥＳＯ−１１−１６５融合コンストラクトおよびウエスタンブロットによる融合コンストラクトの発現を示す。
【図１１】ＥＧＦＲｖＩＩＩ２０−４０／ＮＹ−ＥＳＯ−１１−１６５に融合した修飾ＡｃｔＡＮ１００配列を有する融合コンストラクトを発現するリステリア・モノサイトゲネスでの免疫に続く、（Ａ）パーセントＩＦＮ−γ陽性ＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞、および（Ｂ）脾臓当たりのＩＦＮ−γ陽性ＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の絶対数として、細胞内サイトカイン染色法により決定したＥＧＦＲ特異的Ｔ細胞応答を示す。
【図１２】ＥＧＦＲｖＩＩＩ２０−４０／ＮＹ−ＥＳＯ−１１−１６５に融合した修飾ＡｃｔＡＮ１００配列を有する融合コンストラクトを発現するリステリア・モノサイトゲネスでの免疫に続く、ＮＹ−ＥＳＯ−１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、リステリア細菌中での発現用の抗原融合タンパク質を調製するための組成物および方法に関する。本発明は、弱毒化生ワクチンに適していないリスク便益プロファイルを有する疾患の治療または予防で用いる有利な安全性プロファイルと共に弱毒化細菌ワクチン株を提供することができる。リステリア・モノサイトゲネスに関して以下に詳細に述べるが、当業者は、本明細書に記載の方法および組成物が一般にリステリア種に適用できることを理解する。
【００２２】
リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｍ）は、ワクチンにコードされた抗原に特異的な、強力で高機能のＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞免疫をもたらす深在性の自然免疫応答を誘発するその能力によって特徴付けられる通性細胞内細菌である。Ｌｍは、がんまたは他のウイルス誘発性免疫不全の患者、妊婦、高齢者および乳児などの免疫力が低下した個人の間で病原性が増加する食物媒介細菌である。所望のＣＤ８Ｔ細胞応答を刺激するために、Ｌｍワクチンは、リステリオリジンＯ（ＬＬＯ）として知られているポア形成細胞溶解素の発現によって仲介される過程で感染した樹状細胞（ＤＣ）の液胞から逃れる能力を保持する必要があり、および所望の抗原は、続いて処理されて、ＭＨＣクラスＩ分子上に提示される細胞質で細菌から発現、分泌されるように操作されている。
【００２３】
Ｌｍワクチン株の開発において抗原発現レベルと抗原プロセシングの要件との間にはある一定の二分法が明らかにある。Ｌｍワクチンの免疫学的効力が宿主細胞での抗原発現および分泌のレベルに直接的に関連しているが、有効なＭＨＣクラスＩとクラスＩＩプライミングおよび抗原特異的免疫応答の誘発は、細胞のタンパク質分解装置による抗原の急速なターンオーバーに依存すると示唆されてきた。
【００２４】
本明細書では、抗原発現カセットを提供する。これは、宿主細胞のサイトゾルへのコードされた抗原の効果的な発現および分泌を引き起こし、翻訳リーディングフレーム内のＮ末端融合パートナーとしてリステリアまたは他の細菌シグナルペプチド／分泌シャペロンを選択された、コードされた組換えタンパク質抗原に機能的に結合させることによってＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞の効果的な応答を誘発する。これらの細菌Ｎ末端シグナルペプチド／分泌シャペロン融合パートナーは、感染した宿主哺乳動物細胞中で組換え細菌から合成融合タンパク質の分泌を指示する。後述するように、これらのＮ末端融合パートナーは、その配列本来のいずれのＰＥＳＴ配列を（実際の欠失によって、突然変異によって、またはこれらの方法の組み合わせのいずれかによって）除去される。任意選択で、シグナル配列の一部でないこれらのN末端融合パートナー中の疎水性残基も（ここでも、実際の欠失によって、突然変異によって、またはこれらの方法の組み合わせのいずれかによって）除去される。結果として生じる融合タンパク質は、高レベルで発現し、融合タンパク質に含まれる目的の抗原に対して強力な免疫応答を起こす。
【００２５】
好適な実施形態において、前述の融合タンパク質は、Ｌｍ  ＰｒｆＡ誘導性プロモーターに機能的に結合される。好適な非限定例としては、野生型リステリア・モノサイトゲネスにおいて、それぞれリステイオリジンＯ（ＬＬＯ）の発現を推進するｈｌｙプロモーター、およびＡｃｔＡタンパク質の発現を推進するａｃｔＡプロモーターがある。ＰｒｆＡ依存性プロモーターは、感染した哺乳動物の宿主細胞内で誘発され、機能的に結合したタンパク質は高レベルで発現する。宿主細胞中でＰｒｆＡ依存性プロモーターに機能的に結合した選択された抗原を含むコードされた融合タンパク質の高レベル発現を一時的に調節することで、抗原プロセシングおよび提示を容易にし、最適なＬｍワクチン誘発免疫応答を引き起こす。
【００２６】
後述するように、Ｎ末端シグナルペプチド／分泌シャペロン融合パートナーの好適な非限定例としては、リステリア・モノサイトゲネス由来の修飾ＬＬＯまたはＡｃｔＡタンパク質がある。ＬＬＯおよびＡｃｔＡ  Ｎ末端シグナルペプチド／分泌シャペロン融合パートナーは、リステリアＰｒｆＡ依存性プロモーター（例えば、ｈｌｙプロモーターまたはａｃｔＡプロモーター）に機能的に結合することができる。好適な実施形態において、いずれの選択された抗原配列と共にフレーム内に融合用のいずれのＰＥＳＴ様配列モチーフがないＡｃｔＡおよびＬＬＯ  Ｎ末端シグナルペプチド／分泌シャペロン融合パートナーが提供される。そのようなＰＥＳＴがないN末端融合パートナーは、本明細書ではＰＥＳＴマイナス（ＰＥＳＴ−）ＡｃｔＡおよびＰＥＳＴ−ＬＬＯと呼ぶ。
【００２７】
図１は、ＡｃｔＡの機能的属性のいくつかを模式的に示す。下線を引いた部分は、天然のＡｃｔＡ配列中のＰＥＳＴ配列の位置を示す。特定の実施形態において、膜貫通領域を含むＣ末端ドメインを除去するために、Ｎ末端シグナルペプチド／分泌シャペロンは、ＡｃｔＡのシグナル配列を含み、ＡｃｔＡの３８９アミノ酸残基あたりで切り詰められているＡｃｔＡに由来する。これと関連して、本明細書で用いる場合、「あたり」という用語は、±２５アミノ酸残基を指す。
【００２８】
Ｎ末端融合パートナーで用いるシグナルペプチド／分泌シャペロンをもたらすために分泌リステリアタンパク質の修飾に関して本明細書で用いる場合、「由来の」という用語は、リステリアタンパク質本来のＰＥＳＴ配列の除去と、任意選択で天然の長さと比較しての切り詰め、および／またはシグナル配列の外側の１以上の疎水性モチーフの修飾を指す。例として、ＡｃｔＡは、Ｃ末端膜結合ドメインを除去するように切り詰めてもよく、特定の実施形態において、さらに融合タンパク質中の非抗原残基の数を減らすように切り詰めてもよい。加えて、シグナル配列の一部でなく、ポリペプチド配列中で疎水性モチーフを形成するこれらのＮ末端融合パートナー中の１以上の疎水性残基も（ここでも、実際の欠失によって、突然変異によって、またはこれらの方法の組み合わせのいずれかによって）除去される。後述するように、結果として生じる融合タンパク質は高レベルで発現し、融合タンパク質に含まれる目的の抗原に対して強力な免疫応答を起こす。
【００２９】
同様に、天然のＬＬＯは５２９残基を含み、２５残基シグナル配列とそれに続く４つの構造ドメインを含む。ドメイン４は、およそ４１５〜５２９の残基からなり、コレステロール結合領域を含む。ドメイン１は、単一のＰＥＳＴ配列を含む。特定の実施形態において、Ｎ末端シグナルペプチド／分泌シャペロンは、ＬＬＯのシグナル配列を含み、およびコレステロール結合を抑制するために、約４８４残基前で切り詰められているＬＬＯに由来する。これに関連して本明細書で用いる場合、「由来の」という用語は、長さ、ＰＥＳＴ配列の存在およびシグナル配列の外側の疎水性モチーフの存在に関連して、天然ＬＬＯ配列と比較して修飾されることを指す。修飾ＡｃｔＡは約４４１残基で切り詰められることが好ましい。
【００３０】
以下に示すように、ＰＥＳＴ配列および疎水性ドメインは、それらの除去によって、または残基の非保存的置換によって、またはこれらの方法の組み合わせによるいずれかで、機能的に除去されることができる。例としてのみ示すが、以下の例は、ＡｃｔＡ中のＬＩＡＭＬ疎水性モチーフのＱＤＮＫＲ配列との置き換え、およびＡｃｔＡ  ＰＥＳＴ配列のすべてもしくは一部の実際の欠失を示す。
【００３１】
本発明は、その用途において、構造体の詳細および以下の説明に記載のまたは図面に示した成分の配置に限定されないことを理解すべきである。本発明は、これらの記載および種々の方法で実行されおよび実施されるものに加えて、諸実施形態が可能である。また、本明細書で使用した表現および用語、ならびに要約は、説明を目的としており、限定するものとみなすべきではない。
【００３２】
そのようなものとして、当業者は、本開示が基づく概念が本発明のいくつかの目的を実施するための他の構造、方法および系を設計するための基礎として容易に利用できることを理解するであろう。したがって、本発明の意図および範囲から逸脱しない限り、請求項はそのような均等構造体を含むとみなされることが重要である。
１．定義
【００３３】
遺伝子中の突然変異またはその遺伝子を含む細菌中の突然変異を示すように用いられる略語は以下の通りである。例として、略語「Ｌ．モノサイトゲネスΔａｃｔＡ」とは、ａｃｔＡ遺伝子の一部またはすべてが除去されたことを意味する。Δ記号（Δ）は、欠失を意味する。上付きのマイナス記号（リステリアＡｃｔＡ−）を含む略語は、ａｃｔＡ遺伝子が例えば、欠失、点変異またはフレームシフト変異の変異型に限定されないがこれらによって変異したことを意味する。
【００３４】
ヒト、哺乳動物、哺乳動物対象、動物、家畜対象、プラセボ対象、研究対象、実験対象、細胞、組織、器官または生体液に適用される場合、「投与」とは、限定するものではないが、外因性リガント、試薬、プラセボ、小分子、医薬品、治療薬、診断薬または組成物を対象、細胞、組織、器官または生体液などに接触させることを指す。「投与」とは、例えば、治療方法、薬物動態方法、診断方法、研究方法、プラセボ方法および実験方法を指すことができる。細胞の処理は、細胞との試薬の接触、ならびに体液が細胞と接している場合、その体液と試薬の接触を包含する。また、「投与」は、例えば、細胞の、試薬、診断薬、結合組成物による、または別の細胞によるイン・ビトロおよびエクスビボ処理を包含する。
【００３５】
リガンドおよび受容体に関連する場合、「アゴニスト」とは、受容体を刺激する分子、分子の組み合わせ、複合体または試薬の組み合わせを含む。例えば、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）のアゴニストは、ＧＭＣＳＦ、ＧＭＣＳＦのムテインもしくは誘導体、ＧＭＣＳＦのペプチド模倣薬、ＧＭＣＳＦの生体機能を模倣する小分子、またはＧＭＣＳＦ受容体を刺激する抗体を包含することができる。
【００３６】
リガンドおよび受容体に関連する場合、「アンタゴニスト」とは、受容体を阻害する、対抗する、減少させるおよび／または脱感作する分子、分子の組み合わせまたは複合体を含む。「アンタゴニスト」とは、受容体の恒常的活性を阻害するいずれの試薬を包含する。恒常的活性は、リガンド／受容体相互作用がない場合明らかな活性である。また、「アンタゴニスト」は、受容体の刺激（または調節）活性を阻害または予防するいずれの試薬を包含する。例として、ＧＭＣＳＦ受容体のアンタゴニストとしては、いかなる限定を意味することなく、リガンド（ＧＭＣＳＦ）に結合して、リガンドが受容体に結合することを防ぐ抗体、または受容体に結合して、リガンドが受容体に結合することを防ぐ抗体、または抗体が不活性立体構造に受容体をロックする場合が挙げられる。
【００３７】
本明細書で用いる場合、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に関して「類似体」または「誘導体」とは、元のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質と同様もしくは同一の機能を有するが、元のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質と同様もしくは同一のアミノ酸配列もしくは構造を必ずしも含まない別のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を指す。類似体は、（ａ）元のアミノ酸配列と少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質性薬剤；（ｂ）ストリンジェント条件下で、元のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされたタンパク質性薬剤；および（ｃ）元のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列によってコードされたタンパク質性薬剤、の少なくとも一つを満たすことが好ましい。
【００３８】
「抗原提示細胞」（ＡＰＣ）は、抗原をＴ細胞に提示するために使用される免疫系の細胞である。ＡＰＣとしては、樹状細胞、単核細胞、マクロファージ、辺縁帯クッパー細胞、小膠細胞、ランゲルハンス細胞、Ｔ細胞およびＢ細胞が挙げられる。樹状細胞は、少なくとも２つの系統で生じる。第１の系統は、プレＤＣ１、骨髄系ＤＣ１および成熟ＤＣ１を包含する。第２の系統は、ＣＤ３４＋ＣＤ４５ＲＡ−初期前駆多能性細胞、ＣＤ３４＋ＣＤ４５ＲＡ＋細胞、ＣＤ３４＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４＋ＩＬ−３Ｒα＋プロＣＤ２細胞、ＣＤ４＋ＣＤ１１ｃ−形質細胞様プレＤＣ２細胞、リンパ球ヒトＤＣ２形質細胞様由来ＤＣ２および成熟ＤＣ２を包含する。
【００３９】
「弱毒化」および「弱毒化した」とは、宿主への毒性を減少させるように修飾されている細菌、ウイルス、寄生体、感染性微生物、プリオン、腫瘍細胞、感染性微生物中の遺伝子等を包含する。宿主は、ヒトもしくは動物宿主、または器官、組織もしくは細胞であってよい。非限定的な例を挙げれば、細菌は、宿主細胞への結合を減少させるよう、１つの宿主細胞から別の宿主細胞への伝播を減らすよう、細胞外増殖を減少させるよう、または宿主細胞中で細胞内増殖を減少させるように弱毒化することができる。弱毒化は、例えば、毒性の１つの兆候もしくは複数の兆候、ＬＤ５０、器官からの除去速度、または競合指数を測定することで評価することができる（例えば、Ａｕｅｒｂｕｃｈら．（２００１）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６９：５９５３−５９５７参照）。一般に、弱毒化はＬＤ５０の増加および／または除去速度の少なくとも２５％、より一般に少なくとも５０％、最も一般に少なくとも１００％（２倍）、、通常は少なくとも５倍、より通常は少なくとも１０倍、より通常は少なくとも５０倍、多くの場合少なくとも１００倍、より多くの場合少なくとも５００倍、および最も多くの場合少なくとも１０００倍、通常は少なくとも５０００倍、より通常は少なくとも１０，０００倍、および最も通常は少なくとも５０，０００倍、および最も多くの場合少なくとも１００，０００倍の増加を引き起こす。
【００４０】
「弱毒化遺伝子」とは、宿主に毒性、病理または病原性を仲介し、宿主内の増殖、または宿主内の生存を仲介する遺伝子を包含する。この場合、遺伝子は毒性、病理または病原性を軽減する、減少させる、または除去する方法で変異している。減少または除去は、変異遺伝子が仲介する病原性または毒性を非変異（または親）遺伝子が仲介するものと比較することによって評価できる。「変異遺伝子」とは、遺伝子の調節領域、遺伝子のコード領域、遺伝子の非コード領域またはそれらのいずれの組み合わせにおける欠失、点変異およびフレームシフト変異を包含する。
【００４１】
「保存的修飾変異体」とは、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的修飾変異体は、同じアミノ酸配列をコードする核酸、または１以上の保存的置換を有するアミノ酸を指す。保存的置換の一例としては、以下の基の一つにあるアミノ酸と、同じ基の別のアミノ酸との交換である（Ｌｅｅらに交付された米国特許第５，７６７，０６３号およびＫｙｔｅ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２）。逆に、非保存的置換とは、
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ
（２）中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ
（４）塩基性：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ，Ｐｈｅ、および
（７）小アミノ酸：Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ
のうちの基の一つにあるアミノ酸と、異なる基の別のアミノ酸との交換である。
【００４２】
「有効量」とは、限定するものではないが、医学的状態または障害の症状もしくは徴候を寛解させる、逆転させる、軽減する、予防する、または診断することができる量を包含する。明示的にまたは文脈において特段の指示のない限り、「有効量」は、状態を寛解させるのに十分な必要最低限量に限定されない。
【００４３】
「細胞外液」とは、例えば、血清、血漿、血液、間質液、脳脊髄液、分泌液、リンパ液、胆汁、汗、排泄物および尿を包含する。「細胞外液」は、膠質または懸濁液、例えば、全血または凝固血を含むことができる。
【００４４】
ポリペプチドと関連して、「フラグメント」という用語は、より大きなポリペプチドのアミノ酸配列の少なくとも５の近接するアミノ酸残基、少なくとも１０の近接するアミノ酸残基、少なくとも１５の近接するアミノ酸残基、２０の近接するアミノ酸残基、少なくとも２５の近接するアミノ酸残基、少なくとも４０の近接するアミノ酸残基、５０の近接するアミノ酸残基、少なくとも６０の近接するアミノ酸残基、少なくとも７０の近接するアミノ酸残基、少なくとも８０の近接するアミノ酸残基、少なくとも９０の近接するアミノ酸残基、１００の近接するアミノ酸残基、少なくとも１２５の近接するアミノ酸残基、少なくとも１５０の近接するアミノ酸残基、１７５の近接するアミノ酸残基、少なくとも２００の近接するアミノ酸残基、または少なくとも２５０の近接するアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含むペプチドまたはポリペプチドが挙げられる。
【００４５】
「遺伝子」とは、オリゴペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸配列を指す。オリゴペプチドまたはポリペプチドは、生物学的に活性、抗原的に活性、生物学的に不活性、または抗原的に不活性などであってよい。遺伝子という用語は、例えば、特定のオリゴペプチドまたはポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の総計；ＯＲＦと、イントロンをコードする核酸との総計；ＯＲＦと、作動可能に結合したプロモーターとの総計；ＯＲＦと、作動可能に結合したプロモーターと、いずれのイントロンとの総計；ＯＲＦと、作動可能に結合したプロモーターと、イントロンと、エンハンサーなどの他の調節エレメントとの総計を包含する。特定の実施形態において、「遺伝子」は、その遺伝子の発現を調節するシスで必要とされるいずれの配列を包含する。遺伝子という用語は、抗原またはペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質の抗原的に活性のフラグメンントを包含するペプチドをコードする核酸を指すこともできる。遺伝子という用語は、コードされたペプチドもしくはタンパク質がいずれの生物活性を有し、またはペプチドもしくはタンパク質が抗原的に活性であることさえ、必ずしも意味するものではない。非発現可能な配列をコードする核酸配列は、一般に偽遺伝子と考えられている。また、遺伝子という用語は、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡまたはリボザイムなどのリボ核酸をコードする核酸配列を包含する。
【００４６】
リステリアなどの細菌の「増殖」とは、限定されることなく、コロニー形成、複製、タンパク質含有量の増加および／または脂質含量の増加に関連する細菌生理学および遺伝子の機能を包含する。明示的にまたは文脈で特に明記しない限り、リステリアの増殖とは、宿主細胞外部の細菌の増殖および宿主細胞内部の増殖も包含する。増殖関連の遺伝子としては、いかなる限定も意味することなく、エネルギー生産（例えば、解糖、クレブス回路、シトクロム）、アミノ酸、糖、脂質、ミネラル、プリンおよびピリミジンの同化および／または異化、栄養素輸送、転写、翻訳および／または複製を仲介するものが挙げられる。一部の実施形態において、リステリア細菌の「増殖」とは、リステリア細菌の細胞内増殖、すなわち、哺乳動物細胞などの宿主細胞内の増殖を指す。リステリア細菌の細胞内増殖は光学顕微鏡検査またはコロニー形成単位（ＣＦＵ）アッセイで測定されることができるが、増殖は測定のいかなる技術によって限定されない。リステリア抗原、リステリア核酸配列またはリステリア細菌に特異的な脂質の量などの生化学的パラメータを用いて増殖を評価することができる。一部の実施形態において、増殖を仲介する遺伝子は、特に細胞内増殖を仲介する遺伝子である。一部の実施形態において、具体的には細胞内増殖を仲介する遺伝子としては、限定するものではないが、遺伝子の不活性化により細胞内増殖の速度が低減するが、検出可能に、大幅にまたは感知できるほどに細胞外増殖（例えば、ブロス中の増殖）の速度を低減しない遺伝子、または遺伝子の不活性化により細胞内増殖の速度を細胞外増殖の速度を低減するよりも大きな程度まで低減する遺伝子を包含する。非限定例を示すために、一部の実施形態において、不活性化により細胞内増殖の速度を細胞外増殖よりも大きな程度まで低減する遺伝子は、不活性化により細胞内増殖が正常値もしくは最大値の５０％未満まで低減するが、細胞外増殖は最大値のわずか１〜５％、５〜１０％または１０〜１５％まで低減する状態を包含する。特定の態様において、本発明は、細胞内増殖を減弱させたが、細胞外増殖は減弱させてないリステリア、細胞内増殖を減弱させてなく、細胞外増殖も減弱させてないリステリア、ならびに細胞内増殖を減弱させてないが、細胞外増殖を減弱させたリステリアを包含する。
【００４７】
「標識した」組成物は、直接的または間接的のいずれかで、分光法、光化学的方法、生化学的方法、免疫化学的方法、アイソトープ法または化学的方法によって検出可能である。例えば、有用な標識としては、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃ、３Ｈ、１２５Ｉ、安定同位体、エピトープタグ、蛍光色素、高電子密度の試薬、基質、または酵素（例えば、酵素結合免疫アッセイで使用されるもの）またはフルオレット（Ｒｏｚｉｎｏｖ  ａｎｄ  Ｎｏｌａｎ（１９９８）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．５：７１３−７２８参照）が挙げられる。
【００４８】
本明細書で用いる場合、「疎水性モチーフ」とは、アミノ酸残基がその一部であるタンパク質全体と関連して、ハイドロパシー分析によって疎水性を示す一連の近接するアミノ酸残基を指す。「ハイドロパシー分析」とは、ＫｙｔｅとＤｏｏｌｉｔｔｌｅ（Ａ  Ｓｉｍｐｌｅ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒ  ｏｆ  ａ  Ｐｒｏｔｅｉｎ”．Ｊ．Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．１５７（１９８２）１０５−１３２）の方法によるポリペプチド配列の分析を指す。この方法では、各アミノ酸は、４．６と−４．６の間の疎水性スコアを与えられる。４．６のスコアは最も疎水性であり、−４．６のスコアは最も親水性である。次いで、ウインドウサイズを設定する。ウインドウサイズとは、その疎水性スコアが平均化され、ウインドウ内の第１のアミノ酸に割り当てられるアミノ酸の数である。アミノ酸の第１のウインドウから算出を開始し、そのウインドウ内のすべての疎水性スコアの平均を算出する。次いで、ウインドウを１つ下のアミノ酸に移動し、第２のウインドウ内のすべての疎水性スコアの平均を算出する。このパターンをタンパク質の最後まで続け、各ウインドウの平均スコアを計算して、それをウインドウ内の第１のアミノ酸に割り当てる。次いで、平均値をグラフにプロットする。ｙ軸は疎水性スコアを表し、ｘ軸はウインドウ番号を表す。以下の疎水性スコアは、２０の共通アミノ酸で用いる。
Ａｒｇ：−４．５      Ｓｅｒ：−０．８      Ｌｙｓ：−３．９
Ｔｈｒ：−０．７      Ａｓｎ：−３．５      Ｇｌｙ：−０．４
Ａｓｐ：−３．５      Ａｌａ：１．８        Ｇｌｎ：−３．５
Ｍｅｔ：１．９      Ｇｌｕ：−３．５        Ｃｙｓ：２．５
Ｈｉｓ：−３．２      Ｐｈｅ：２．８      Ｐｒｏ：−１．６  
Ｌｅｕ：３．８      Ｔｙｒ：−１．３      Ｖａｌ：４．２
Ｔｒｐ：−０．９      Ｉｌｅ：４．５
【００４９】
「リガンド」とは、受容体のアゴニストまたはアンタゴニストである、小分子、ペプチド、ポリペプチドまたは膜関連分子もしくは膜結合分子を指す。「リガント」は、アゴニストまたはアンタゴニストでない結合剤も包含し、アゴニストまたはアンタゴニスト特性を持たない。慣例により、リガンドが第１の細胞上で膜結合している場合、受容体は通常第２の細胞上に生じる。第２の細胞は、同じ同一性（同じ名称）を持つこともあり得、または第１の細胞と異なる同一性（異なる名称）を持つこともある。リガンドまたは受容体は、完全に細胞内にあり得る、すなわち、それはサイトゾル、核内、または一部の他の細胞内区画内に存在し得る。リガンドまたは受容体は、その位置を、例えば、細胞内区画から細胞膜の外面に変わることもある。リガンドと受容体の複合体は、「リガンド受容体複合体」と称される。リガンドおよび受容体がシグナル経路に関与する場合、リガンドはシグナル経路の上流位置で生じ、受容体はシグナル経路の下流位置で生じる。
【００５０】
「核酸」とは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびその一本鎖状、二本鎖状または多重鎖状のいずれかでのポリマーを指す。核酸の非限定的な例としては、例えば、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドがある。また、特定の核酸配列は、暗黙的に、「対立遺伝子バリアント」および「スプライスバリアント」を包含する。
【００５１】
ｍＲＮＡをコードするプロモーターおよび核酸と関連して「作動可能に結合した」という用語は、そのプロモーターを用いてその核酸の転写を開始できることを意味する。
【００５２】
「パーセント配列同一性」および「%配列同一性」という用語は、２つ以上のアミノ酸配列または核酸配列を比較することによってまたは一列に並べて見出される配列類似性のパーセンテージを指す。パーセント同一性は、２つの分子間の配列情報を直接比較することによって、配列を一列に並べて、並べた２つの配列間での一致の正確な数を数えて、短い配列の長さによって割り、その結果に１００を乗じることで決定できる。パーセント同一性を算出するためのアルゴリズムは、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムがある（例えば、Ｋａｎｎ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ（２００２）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ４８：３６７−３７６；Ａｒｓｌａｎら（２００１）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １７：３２７−３３７参照）。
【００５３】
ポリペプチドを参照する場合、「精製された」および「単離した」によって、本来はそれが関連している本質的に存在しない他の生体高分子に存在することを意味する。本明細書で用いる場合、「精製された」という用語は、同一のポリペプチドが多くの場合、存在するポリペプチドの少なくとも５０重量％を占める、より多くの場合少なくとも６０重量％を占める、一般的に少なくとも７０重量％を占める、より一般的に少なくとも７５重量％を占める、最も一般的に少なくとも８０重量％を占める、通常は少なくとも８５重量％を占める、より通常は少なくとも９０重量％を占める、最も通常は少なくとも９５重量％を占める、および慣例的に少なくとも９８重量％またはそれを超えて占めることを意味する。水、緩衝液、塩類、界面活性剤、還元剤、プロテアーゼ阻害剤、安定剤（アルブミンなどの添加タンパク質を含む）と賦形剤、および１０００未満の分子量を有する分子は、通常ポリペプチド精製の決定で用いられない。例えば、Ｃｏｖａｃｃｉらに交付された米国特許第６，０９０，６１１号においての精製の考察参照。
【００５４】
「ペプチド」とは、アミノ酸が互いにペプチド結合によって結合されているアミノ酸の短い配列を指す。ペプチドは、遊離して、または高分子、脂質。オリゴ糖もしくは多糖および／またはポリペプチドなどの別の部分と結合して生じることができる。ペプチドがポリペプチド鎖に組み込まれる場合、「ペプチド」という用語を依然として用いて、アミノ酸の短い配列を具体的にいうこともある。「ペプチド」は、ペプチド結合または別のタイプの結合として、別の部分に結合することもある。ペプチド、長さにおいて少なくとも２つのアミノ酸および一般に長さにおいて約２５未満のアミノ酸であり、最大長はカスタムまたは文脈の機能である。「ペプチド」および「オリゴペプチド」という用語は、互換的に用いることができる。
【００５５】
「ＰＥＳＴモチーフ」は、本明細書ではＰ、Ｅ、ＳおよびＴアミノ酸の局所濃度が高い少なくとも１２アミノ酸長の親水性の伸長として定義され、ｅｐｅｓｔｆｉｎｄアルゴリズムによって有効なＰＥＳＴモチーフとしてスコア化する。負電荷アミノ酸はこれらのモチーフ内でクラスター形成されるが、正電荷アミノ酸、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）およびリジン（Ｋ）は一般に禁じられている。正電荷アミノ酸が隣接するために必要とされるそのＰＥＳＴモチーフにおいて、ｅｐｅｓｔｆｉｎｄアルゴリズムは最後の判定基準をさらにいっそう厳しく定義する。正電荷側面の間のすべてのアミノ酸は数えられ、ウインドウサイズのパラメータと等しいまたは高い多くのアミノ酸を含むモチーフのみがさらに検討される。さらに、すべての「有効な」ＰＥＳＴ領域は、少なくとも１つのプロリン（Ｐ）、１つのアスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）および少なくとも１つのセリン（Ｓ）またはトレオニン（Ｔ）を含むことを必要とする。上記の基準を満たさない配列は、「無効な」ＰＥＳＴモチーフとして分類される。
【００５６】
「有効な」ＰＥＳＴモチーフは、重要なアミノ酸の局所濃縮ならびにモチーフの疎水性に基づくスコアリングパラメータを用いて精製される。Ｄ、Ｅ、Ｐ、ＳおよびＴの濃縮は、質量パーセント（ｗ／ｗ）で表示され、１当量のＤまたはＥ、１当量のＰおよび１当量のＳまたはＴを修正する。疎水性の算出は、原則としてＪ．ＫｙｔｅおよびＲ．Ｆ．Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの方法に従う。簡易算出の場合、本来はアルギニンの場合の−４．５からイソロイシンの場合の＋４．５の範囲であるＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅハイドロパシー指数は、正整数に変換された。これは以下の線形変換によって達成され、アルギニンの０から、イソロイシンの９０の値を得た。
ハイドロパシー指数＝１０*Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅハイドロパシー指数＋４５
【００５７】
モチーフの疎水性は、モルパーセントの生成物および各アミノ酸種の疎水性指数にわたる合計として算出する。所望のＰＥＳＴスコアは、以下の式によって表されるように、局所濃縮用語と疎水性用語の組み合わせてとして得られる。
ＰＥＳＴスコア＝０．５５*ＤＥＰＳＴ−０．５*疎水性指数。
【００５８】
加えて、ｅｐｅｓｔｆｉｎｄアルゴリズムは、南カリフォルニア大学のＲｏｂｅｒｔ  Ｈ．Ｓｔｅｌｌｗａｇｅｎによって導入されたチロシンのハイドロパシー指数の修正を含む。しかしＰＥＳＴスコアは、ポリイソロイシンの場合の−４５から、ポリアスパラギン酸に１つのプロリンと１つのセリンとを加えた場合の約＋５０の範囲であってよい。「有効な」ＰＥＳＴモチーフは、上記の５．０の閾値スコアのものであり、本当の生物学的目的と考えられる。
【００５９】
「タンパク質」とは、一般にポリペプチド鎖を含むアミノ酸の配列を指す。タンパク質は、ポリペプチドの三次元構造を指すこともある。「変性タンパク質」とは、いくつかの残存する三次元構造を有する部分的に変性したポリペプチドを指すか、またはあるいは本質的にランダムな三次元構造、すなわちすっかり変性したポリペプチドを指す。本発明は、例えばグリコシル化、リン酸化、硫酸化、ジスルフィド結合形成、アミド分解、異性化、シグナルまたはリーダー配列プロセシングにおける切断点、共有および非共有結合補助因子、酸化変異体などを含むポリペプチド変異体の試薬およびこれらを用いる方法を包含する。ジスルフィド結合タンパク質の形成は記載されている（例えば、ＷｏｙｃｅｃｈｏｗｓｋｙおよびＲａｉｎｅｓ（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．４：５３３−５３９；Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎら（１９９５）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：１８−２３参照）。
【００６０】
例えば、核酸、細胞、動物、ウイルス、プラスミド、ベクターなどに関連して用いられる場合、「組換え体」とは、外因性、非天然核酸の導入による、天然核酸の変質による、または組換え核酸、細胞、ウイルス、プラスミドまたはベクターから全体もしくは一部の誘導による修飾を示す。組換えタンパク質は、例えば、組換え核酸、ウイルス、プラスミド、ベクターなどに由来するタンパク質を指す。「組換え細菌」とは、ゲノムが組換え方法によって、例えば、変異、欠失、挿入および／または再編成によって操作されている細菌を包含する。「組換え細菌」も、組換えゲノム外核酸、例えば、プラスミドもしくは第二染色体、または既存のゲノム外核酸が変化している細菌を含むように修飾された細菌を包含する。
【００６１】
「試料」とは、ヒト、動物、プラセボまたは研究試料、例えば、細胞、組織、器官、体液、気体、エアゾール、スラリー、膠質または凝固材に由来する試料を指す。「試料」とは、ヒトまたは動物から除去せずに、イン・ビボで検査することもでき、またはイン・ビトロで検査されることもできる。試料は、プロセシングの後、例えば組織学的方法によって検査されることができる。「試料」は、例えば、体液もしくは組織試料を含む細胞、または体液もしくは組織試料から分離された細胞を指すこともある。「試料」は、ヒトまたは動物から新たに採取された細胞、組織、器官もしくは体液を指すことも、または処理もしくは貯蔵された細胞、組織、器官もしくは体液を指すこともある。
【００６２】
「選択可能なマーカー」とは、選択可能なマーカーを含む細胞のために、または該細胞に対して選択することができる核酸を包含する。選択可能なマーカーの例としては、限定するものではないが、（１）別の毒化合物（例えば、抗生物質）に耐性を与える生成物をコードする核酸または別の無害な化合物（例えばショ糖）への感受性をコードする核酸；（２）あるいは受容細胞（例えば、ｔＲＮＡ遺伝子、栄養要求性マーカー）が欠如している生成物をコードする核酸；（３）遺伝子産物の活性を抑制する生成物をコードする核酸；（４）容易に特定されることができる生成物（例えば、β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、細胞表面タンパク質、エピトープタグ、ＦＬＡＧタグなどの表現型マーカー）をコードする核酸；（５）ハイブリッド形成技術、例えば、ＰＣＲまたは分子ビーコンによって特定されることができる核酸、が挙げられる。
【００６３】
リガンド／受容体、核酸／相補的核酸、抗体／抗原、または他の結合対（例えば、サイトカイン受容体に対するサイトカイン）を参照する場合、「特異的に」または「選択的に」結合するとは、タンパク質および他の生物製剤の不均一な集団中のタンパク質の存在を決定するような結合反応を示す。このように、所定の条件下で、特定されたリガンドは特定の受容体と結合して、試料中に存在する他のタンパク質と相当量で結合しない。特異的結合とは、例えば、考えられる方法の結合化合物、核酸リガンド、抗体または抗体の抗原結合部位に由来する結合組成物が、いずれの他の結合化合物との親和性よりも多くの場合少なくとも２５％を超える、より多くの場合少なくとも５０％を超える、最も多くの場合少なくとも１００％（２倍）を超える、通常は少なくとも１０倍を超える、より通常は少なくとも２０倍を超える、最も通常は少なくとも１００倍を超える親和性でその標的に結合することも意味することができる。
【００６４】
一般的な実施形態において、抗体は、例えばＳｃａｔｃｈａｒｄ分析（Ｍｕｎｓｅｎら（１９８０）Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０７：２２０−２３９）によって決定されるように、約１０９リットル／モルを超える親和性を有する。一部の化合物は１以上の標的に特異的に結合することができ、例えば、抗体は抗体のオリゴ糖としてその抗原、レクチンに、および／または抗体のＦｃ領域としてＦｃ受容体に特異的に結合することを当業者は認識する。
【００６５】
細菌の「伝播」とは、「細胞間伝播」を包含する。これは、例えば小胞によって仲介されるように、第１の宿主細胞から第２の宿主細胞への細菌の伝播である。伝播に関する機能としては、限定するものではないが、例えば、アクチン尾部の形成、偽足様伸長の形成および二重膜液胞の形成が挙げられる。
【００６６】
本明細書で用いる場合、「対象」という用語は、ヒトまたは非ヒト生物を指す。このように、本明細書に記載の方法および組成物は、ヒト疾患および獣医学的疾患の両方に適用可能である。特定の実施形態において、対象は、「患者」、すなわち疾患または状態の医療を受けているヒト生体である。これは、症状の徴候を調べられている定義されてない疾患の患者も含む。
【００６７】
リコンビナーゼの「標的部位」とは、リコンビナーゼによって認識、結合、および／または作用される核酸配列または領域である（例えば、Ｇｒａｈａｍらに交付された米国特許第６，３７９，９４３号；Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｔｈｏｒｐｅ（２００２）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４４：２９９−３０７；Ｇｒｏｔｈ  ａｎｄ  Ｃａｌｏｓ（２００４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３５：６６７−６７８；Ｎｕｎｅｓ−Ｄｕｂｙら（１９９８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６：３９１−４０６参照）。
【００６８】
「治療有効量」とは、患者の利益、すなわち治療される状態の症状を減少、予防するまたは寛解させるために示す、コードされた異種抗原に特異的な所望の免疫応答を誘発するのに十分な試薬または医薬組成物の量として定義される。薬剤または医薬組成物が診断薬を含む場合、「診断有効量」とは、シグナル、イメージまたは他の診断パラメータを生成するのに十分な量として定義される。医薬製剤の有効量は、個人の感受性の程度、年齢、性別および個人の体重、ならびに個人の特異体質の応答などの因子によって変わる（例えば、Ｎｅｔｔｉらに交付された米国特許第５，８８８，５３０号参照）。
【００６９】
「治療」または「治療する」（状態または疾患に関して）とは、好ましくは臨床結果を含み、有益な結果または所望の結果を得るための方法である。本発明のために、疾患に関して有益な結果または所望の結果とは、限定するものではないが、疾患に関連する状態を改善すること、疾患を治療すること、疾患の重症度を和らげること、疾患の進行を遅延させること、疾患に関連する１以上の症状を軽減すること、疾患の患者のクオリティ・オブ・ライフを上げること、および／または生存を延ばすこと、の１以上が挙げられる。同様に、本発明のために、状態に関して有益な結果または所望の結果とは、限定するものではないが、状態を改善すること、状態を治療すること、状態の重症度を和らげること、状態の進行を遅延させること、状態に関連する１以上の症状を軽減すること、状態の患者のクオリティ・オブ・ライフを上げること、および／または生存を延ばすこと、の１以上が挙げられる。
【００７０】
「ワクチン」は、予防ワクチンを包含する。ワクチンは、治療ワクチン、例えば、ワクチンによってもたらされる抗原またはエピトープに関連した状態または障害を含む、哺乳動物に投与されるワクチンも包含する。多くの細菌種はワクチンとしての使用用に開発されており、本発明において、シゲラ・フレキシネリ、エシェリキア・コリ、リステリア・モノサイトゲネス、エンテロコリチカ菌、サルモネラチフィムリウム、サルモネラ・チフィまたはマイコバクテリア種を含むがこれらに限定されず用いることが可能である。このリストは、限定を意図するものではない。例えば、国際公開第０４／００６８３７号、同第０７／１０３２２５号および同第０７／１１７３７１号参照。これらの各々は、すべての表、図および請求項を含みその全体を参照によって本明細書に組み込まれている。ワクチン組成物で使用される細菌ベクターは、通性、細胞内細菌ベクターであってよい。細菌は、本明細書に記載のポリペプチドを宿主生物中の抗原提示細胞に送達するために用いられることができる。本明細書に記載するように、Ｌ．モノサイトゲネスは本発明の抗原の発現用の好ましいワクチンプラットフォームを提供する。
抗原コンストラクト
標的抗原
【００７１】
本明細書に記載の融合タンパク質の好ましい特徴は、宿主内でＬ．モノサイトゲネスワクチンプラットフォームによって組換えで発現する場合、抗原に対する自然免疫応答ならびに抗原特異的Ｔ細胞応答の両方を開始する能力である。例えば、本明細書に記載の抗原を発現するＬ．モノサイトゲネスは、ワクチン誘発免疫応答の性質を形づくる１型インターフェロン（ＩＦＮ−α／β）および同時制御されるケモカインとサイトカインタンパク質のカスケードを誘発することができる。この免疫刺激に反応応答して、ＮＫ細胞および抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、静脈ワクチン接種経路に沿って、またはあるいは、ワクチン接種の他の経路に沿ってワクチン接種部位、例えば、筋肉内、皮下または皮内の免疫経路によって肝臓に補充される。特定の実施形態において、本発明のワクチンプラットフォームは、１以上の血清濃度で対象にワクチンプラットフォームを送達してから２４時間で、および好ましくはＩＬ−１２ｐ７０、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、ＴＮＦαおよびＭＣＰ−１からなる群から選択されるすべてのサイトカインおよびケモカインは増加を誘発し、ワクチンプラットフォームによって発現される１以上の抗原に対してＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋抗原特異的Ｔ細胞応答を誘発する。他の実施形態において、本発明のワクチンプラットフォームは、マウスモデル系におけるＤＸ５、ＣＤ１１ｂおよびＣＤ４３などの活性化マーカーの発現上昇によって、または標的細胞として使用された５１Ｃｒ−標識ＹＡＣ−１細胞を用いて測定したＮＫ細胞仲介細胞溶解活性によって示されるように、常在する未熟な肝臓ＮＫ細胞の成熟も誘発する。
【００７２】
ワクチンベクターとして役立つＬ．モノサイトゲネスの能力は、Ｗｅｓｉｋｉｒｃｈら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１５８：１５９−１６９（１９９７）に明らかにされている。Ｌ．モノサイトゲネスの自然生物学の多くの望ましい特徴により、治療ワクチンへの適用のための魅力的なプラットフォームになっている。中心的な理論的根拠は、Ｌ．モノサイトゲネスの細胞内ライフサイクルがＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞免疫の効果的な刺激を可能にすることである。ＴＬＲ（ＴＬＲ２、ＴＬＲ５，ＴＬＲ９）ヌクレオチド結合オリゴマー化ドメイン（ＮＯＤ）およびインターフェロン遺伝子の刺激装置（ＳＴＩＮＧ）を含む複数の病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）受容体は、感染に応じてＬ．モノサイトゲネス高分子との相互作用を誘発し、自然免疫エフェクターのｐａｎ活性化およびＴｈ−１極性化サイトカインの放出を引き起こし、発現した抗原に対するＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答の発生に重大な影響を及ぼす。
【００７３】
Ｌ．モノサイトゲネス株は、がんおよびＨＩＶなどの病原体の注入ができない臨床状態に対して免疫応答を誘発するために、免疫系への抗原の送達をもたらす異種タンパク質の効果的な細胞内送達ビヒクルとして近年開発されてきた。例えば、米国特許第６，０５１，２３７号；Ｇｕｎｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６７：６４７１−６４７９（２００１）；Ｌｉａｕら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６２：２２８７−２２９３（２００２）；米国特許第６，０９９，８４８号；国際公開第９９／２５３７６号；国際公開第９６／１４０８７号；および米国特許第５，８３０，７０２号参照。これらの各々はすべての表、図および請求項を含みその全体を参照によって本明細書に組み込まれている。リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）抗原を発現する組換えＬ．モノサイトゲネスも、抗原への保護細胞仲介免疫を誘発することが示されている（Ｓｈｅｎら，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２：３９８７−３９９１（１９９５）。
【００７４】
特定の実施形態において、本発明のワクチン組成物で使用するＬ．モノサイトゲネスは、ａｃｔＡおよび／またはｉｎｌＢに弱毒化変異体を含み、ａｃｔＡおよびｉｎｌＢ（本明細書では「ＬｍΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢ」と呼ぶ）のすべてはまたは一部の欠失が好ましく、および目的の１以上の抗原の発現をコードする組換えＤＮＡを含む。抗原は、細菌発現配列の制御下が好ましくは、Ｌ．モノサイトゲネスゲノムに安定して組み込まれる。
【００７５】
本発明は、少なくとも１つの調節因子、例えば、プロモーターまたは転写調節因子で弱毒化されたリステリアも考えられる。以下は、プロモーターに関する。ＡｃｔＡ発現は、２つの異なるプロモーターによって調節される（Ｖａｚｗｕｅｚ−Ｂｏｌａｎｄら（１９９２）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６０：２１９−２３０）。ＩｎｌＡおよびＩｎｌＢの発現は共に、５つのプロモーターによって調節される（Ｌｉｎｇｎａｕら（１９９５）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６３：３８９６−３９０３）。転写因子ｐｒｆＡは、多くのＬ．モノサイトゲネス遺伝子、例えば、ｈｌｙ、ｐｌｃＡ、ＡｃｔＡ、ｍｐｌ、ｐｒｆＡおよびｉａｐの転写のために必要である。ＰｒｆＡの調節特性は、例えば、ＰｒｆＡ依存的プロモーター（ＰｉｎｌＣ）およびＰｒｆＡボックスによって仲介される。特定の実施形態において、本発明は、ＡｃｔＡプロモーター、ｉｎｌＢプロモーター、ＰｒｆＡ、ＰｉｎｌＣ、ＰｒｆＡボックスなどの少なくとも１つにおいて不活性、変異または欠失をコードする核酸を提供する（例えば、Ｌａｌｉｃ  Ｍｕｌｌｔｈａｌｅｒら（２００１）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２：１１１−１２０；Ｓｈｅｔｒｏｎ−Ｒａｍａら（２００３）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４８：１５３７−１５５１；Ｌｕｏら（２００４）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５２：３９−５２参照）。ＰｒｆＡは、Ｇｌｙ１４５Ｓｅｒ変異、Ｇｌｙ１５５Ｓｅｒ変異またはＧｌｕ７７Ｌｙｓ変異によって構造的に活性させることができる（例えば、Ｍｕｅｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｆｒｅｉｔａｇ（２００５）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７３：１９１７−１９２６；Ｗｏｎｇ  ａｎｄ  Ｆｒｅｉｔａｇ（２００４）Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８６：６２６５−６２７６；Ｒｉｐｉｏら（１９９７）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：１５３３−１５４０参照）。
【００７６】
本発明での使用を見出し得る標的抗原の例を以下の表に収載する。標的抗原は、表に収載した抗原の免疫学的に活性の部分を含むフラグメントまたは融合ポリペプチドであってもよい。本リストは、限定を意図するものではない。
【００７７】
【表１】
2018135355.tif 000003
2018135355.tif 000004
2018135355.tif 000005
2018135355.tif 000006
2018135355.tif 000007
2018135355.tif 000008
2018135355.tif 000009
2018135355.tif 000010
2018135355.tif 000011
2018135355.tif 000012
2018135355.tif 000013
2018135355.tif 000014
2018135355.tif 000015
2018135355.tif 000016
【００７８】
好適な抗原が当分野で知られている他の微生物としては、限定するものではないが、クラミジア・トラコーマチス、化膿連鎖球菌（Ａ群連鎖球菌）、連溶血性鎖球菌（Ｂ群連鎖球菌）、肺炎球菌、黄色ブドウ球菌、大腸菌、インフルエンザ菌、髄膜炎菌、淋菌、コレラ菌、サルモネラ種（チフス、ネズミチフス菌を含む）、エンテリカ菌（ヘリコバクター・ピロリ菌、フレキシネリ赤痢菌および他のＤ群赤痢菌種を含む）鼻疽菌、類鼻疽菌、クレブシェラ肺炎桿菌、クロストリジウム属種（ディフィシル菌を含む）、腸炎ビブリオおよびビブリオ・バルニフィカスが挙げられる。このリストは、限定を意図するものではない。
【００７９】
本明細書に記載するように、抗原配列は、ＡｃｔＡまたはＬＬＯ分泌シグナル配列と共にＬ．モノサイトゲネスＡｃｔＡまたはＬＬＯタンパク質インフレームの修飾アミノ末端部分に融合された単一のポリペプチドとして発現することが好ましい。ＡｃｔＡシグナル配列は、ＭＧＬＮＲＦＭＲＡＭＭＶＶＦＩＴＡＮＣＩＴＩＮＰＤＩＩＦＡであり、ＬＬＯシグナル配列は、ＭＫＫＩＭＬＶＦＩＴ  ＬＩＬＶＳＬＰＩＡＱ  ＱＴＥである。好ましくは、使用される天然シグナル配列は、そのコンストラクトが修飾されていない。
【００８０】
一部の実施形態において、修飾ＡｃｔＡは、ＡｃｔＡのおよそ最初の１００アミノ酸が修飾された型を含み、本明細書ではＡｃｔＡ−Ｎ１００と呼ぶ。ＡｃｔＡ−Ｎ１００は以下の配列を有する。
ＶＧＬＮＲＦＭＲＡＭ  ＭＶＶＦＩＴＡＮＣＩ  ＴＩＮＰＤＩＩＦＡＡ  ＴＤＳＥＤＳＳＬＮＴ  ＤＥＷＥＥＥＫＴＥＥ    ５０
ＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲ  ＹＥＴＡＲＥＶＳＳＲ  ＤＩＥＥＬＥＫＳＮＫ  ＶＫＮＴＮＫＡＤＬＩ  ＡＭＬＫＡＫＡＥＫＧ    １００
【００８１】
この配列において、第１の残基は、バリンとして示され、ポリペプチドは、この位置でメチオニンと共にリステリアによって合成される。このように、ＡｃｔＡ−Ｎ１００は、以下の配列も有してよい。
ＭＧＬＮＲＦＭＲＡＭ  ＭＶＶＦＩＴＡＮＣＩ  ＴＩＮＰＤＩＩＦＡＡ  ＴＤＳＥＤＳＳＬＮＴ  ＤＥＷＥＥＥＫＴＥＥ    ５０
ＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲ  ＹＥＴＡＲＥＶＳＳＲ  ＤＩＥＥＬＥＫＳＮＫ  ＶＫＮＴＮＫＡＤＬＩ  ＡＭＬＫＡＫＡＥＫＧ    １００
【００８２】
本発明のコンストラクトは、修飾ＡｃｔＡのＣ末端残基と、抗原配列との間に位置する１以上の付加的な非ＡｃｔＡ残基も含むことができる。以下の配列において、ＡｃｔＡ−Ｎ１００は、ＢａｍＨｌ部位の封入によって添加された、以下の２つの残基によって伸長される。
ＶＧＬＮＲＦＭＲＡＭ  ＭＶＶＦＩＴＡＮＣＩ  ＴＩＮＰＤＩＩＦＡＡ  ＴＤＳＥＤＳＳＬＮＴ  ＤＥＷＥＥＥＫＴＥＥ    ５０
ＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲ  ＹＥＴＡＲＥＶＳＳＲ  ＤＩＥＥＬＥＫＳＮＫ  ＶＫＮＴＮＫＡＤＬＩ  ＡＭＬＫＡＫＡＥＫＧ    １００
ＧＳ
第１の残基メチオニンで合成される場合、以下の配列を有する。
ＭＧＬＮＲＦＭＲＡＭ  ＭＶＶＦＩＴＡＮＣＩ  ＴＩＮＰＤＩＩＦＡＡ  ＴＤＳＥＤＳＳＬＮＴ  ＤＥＷＥＥＥＫＴＥＥ    ５０
ＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲ  ＹＥＴＡＲＥＶＳＳＲ  ＤＩＥＥＬＥＫＳＮＫ  ＶＫＮＴＮＫＡＤＬＩ  ＡＭＬＫＡＫＡＥＫＧ    １００
ＧＳ。
【００８３】
次いで、これらの配列は、ＰＥＳＴモチーフおよびいずれの既存の疎水性モチーフの欠失（実際のまたは機能的）による修飾の基礎として役立つことができる。
このように、本発明の修飾ＡｃｔＡは、以下の配列（ダッシュは欠失を示し、太字のテキストは置換を示す）を含むか、またはこれからなってもよい。
【表２】
2018135355.tif 000017
【００８４】
この配列において、第１の残基は、バリンとして示され；ポリペプチドは、この位置でメチオニンと共にリステリアによって合成される。このように、修飾型も、以下の配列（配列番号４）を含むか、またはこれからなってもよい。
【表３】
2018135355.tif 000018
【００８５】
これらの場合、ＱＤＮＫＲとの置換は、任意選択でＰＥＳＴモチーフの欠失と共に含まれ、上記のように本発明のこれらのコンストラクトは、修飾ＡｃｔＡのＣ末端残基と、抗原配列との間に位置する１以上の付加的な非ＡｃｔＡ残基も含むことができる。
【００８６】
あるいは、抗原配列は、ワクチン接種した宿主内で細菌から融合タンパク質の発現および分泌を可能にするＬ．モノサイトゲネスＬＬＯタンパク質の修飾アミノ末端部分に融合した単一のポリペプチドとして発現するのが好ましい。これらの実施形態において、抗原コンストラクトは、融合タンパク質をコードする核酸配列に作動可能に結合したプロモーターを含むポリヌクレオチドであり得、融合タンパク質は、（ａ）修飾ＬＬＯと、（ｂ）修飾ＬＬＯ配列に続く融合タンパク質として発現する１以上の抗原エピトープとを含む。ＬＬＯシグナル配列は、ＭＫＫＩＭＬＶＦＩＴ  ＬＩＬＶＳＬＰＩＡＱ  ＱＴＥＡＫである。一部の実施形態において、プロモーターはｈｌｙプロモーターである。
【００８７】
一部の実施形態において、修飾ＬＬＯは、ＬＬＯのおよそ最初の４４１アミノ酸の修飾型を含み、本明細書ではＬＬＯ−Ｎ４４１と呼ぶ。ＬＬＯ−Ｎ４４１は、以下の配列を有する。
10         20         30         40         50         60 
MKKIMLVFIT LILVSLPIAQ QTEAKDASAF NKENSISSMA PPASPPASPK TPIEKKHADE 
70         80         90        100        110        120 
IDKYIQGLDY NKNNVLVYHG DAVTNVPPRK GYKDGNEYIV VEKKKKSINQ NNADIQVVNA 
130        140        150        160        170        180 
ISSLTYPGAL VKANSELVEN QPDVLPVKRD SLTLSIDLPG MTNQDNKIVV KNATKSNVNN 
190        200        210        220        230        240 
AVNTLVERWN EKYAQAYPNV SAKIDYDDEM AYSESQLIAK FGTAFKAVNN SLNVNFGAIS 
250        260        270        280        290        300 
EGKMQEEVIS FKQIYYNVNV NEPTRPSRFF GKAVTKEQLQ ALGVNAENPP AYISSVAYGR 
310        320        330        340        350        360 
QVYLKLSTNS HSTKVKAAFD AAVSGKSVSG DVELTNIIKN SSFKAVIYGG SAKDEVQIID 
370        380        390        400        410        420 
GNLGDLRDIL KKGATFNRET PGVPIAYTTN FLKDNELAVI KNNSEYIETT SKAYTDGKIN 
430        440         
IDHSGGYVAQ FNISWDEVNY D
【００８８】
この配列において、ＰＥＳＴモチーフは、ＫＥＮＳＩＳＳＭＡ  ＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫによって表される。これは、以下の配列との置き換えによって機能的に除去されてよい（ダッシュは欠失を示し、太字のテキストは置換を示す）。
ＫＥ−−−−−−−  −−−−−−−−−−またはその完全な欠失。これは、例示のみを目的とする。
【００８９】
１つの微生物によってコードされる配列は、必ずしも選択されたワクチンプラットフォーム細菌株内での最適な発現用に最適化されたコドンではないので、本発明も、Ｌ．モノサイトゲネスなどの細菌によって発現するように最適化されたコドンによって変わる核酸を提供する。
【００９０】
種々の実施形態において、いずれの非最適コドンの少なくとも1パーセントは、最適コドンを提供するように変化する、より通常は少なくとも５パーセントが変化する、最も通常は少なくとも１０パーセントが変化する、多くの場合少なくとも２０％が変化する、より多くの場合少なくとも３０％が変化する、最も多くの場合少なくとも４０％が変化する、通常は少なくとも５０％が変化する、より通常は少なくとも６０％が変化する、最も通常は少なくとも７０％が変化する、最適には少なくとも８０％が変化する、より最適には少なくとも９０％が変化する、最も最適には少なくとも９５％が変化する、および慣例的にいずれの非最適コドンの１００％がリステリア発現のために最適化されたコドンである（表２）。
【００９１】
【表４】
2018135355.tif 000019
【００９２】
本発明は、本発明の細菌を作製するまたは操作するための多くのリステリア種および株を供給する。本発明のリステリアは、表３に開示する種および株によって限定されるものではない。
【００９３】
【表５】
2018135355.tif 000020
2018135355.tif 000021
治療用組成物
【００９４】
本明細書に記載の細菌組成物は、単独または薬学的に許容される賦形剤との組み合わせのいずれかで、適切な免疫応答を誘発する十分な量で宿主に投与することができる。免疫応答とは、限定するものではないが、特異的免疫応答、非特異的免疫応答、特異的および非特異的の両免疫応答、自然免疫応答、一次免疫応答、適応免疫、二次免疫応答、記憶免疫反応、免疫細胞活性化、免疫細胞増殖、免疫細胞分化およびサイトカイン発現を含み得る。本発明のワクチンは、例えば、凍結して、凍結乾燥して、懸濁液として、細胞ペーストとして、固体マトリックスまたはゲルマトリックスと複合体を形成して貯蔵することができる。
【００９５】
特定の実施形態において、免疫応答を刺激するために、対象に第１のワクチンの有効用量を投与した後に第２のワクシンを投与する。これは、当分野では「プライム−ブースト」レジメンと呼ぶ。そのようなレジメンでは、本発明の組成物および方法は、「プライム」送達として、「ブースト」送達として、または「プライム」と「ブースト」の両方として使用することができる。「ブースト」免疫は任意の回数で、ワクチン誘発免疫応答の大きさまたは効果を維持するために送達されることができる。
【００９６】
一例として、抗原ポリペプチドをコードし発現する、死滅しているが代謝的に活性のリステリアを含む第１のワクチンは、「プライム」として送達されることができ、抗原ポリペプチドをコードする弱毒化（生または死滅しているが代謝的に活性）リステリアを含む第２のワクチンは「ブースト」として送達されることができる。しかし、当然のことながら、各プライムとブーストは本発明の方法および組成物を利用する必要はない。むしろ、本発明は、本発明の細菌ワクチン方法および組成物と共に他のワクチン様式の使用を熟慮する。好適な混合プライム−ブーストレジメンの例としては、ＤＮＡ（例えば、プラスミド）ワクチンプライム／細胞ワクチンブースト；ウイルスワクチンプライム／細胞ワクチンブースト；タンパク質ワクチンプライム／細菌ワクチンブースト；ＤＮＡプライム／細菌ワクチンブースト＋タンパク質ワクチンブースト；細菌ワクチンプライム／ＤＮＡワクチンブースト；細菌ワクチンプライム／ウイルスワクチンブースト；細菌ワクチンプライム／タンパク質ワクチンブースト；細菌ワクチンプライム／細菌ワクチンブースト＋タンパク質ワクチンブーストなどが挙げられる。このリストは限定を意図するものではない。
【００９７】
プライムワクチンおよびブーストワクチンは、同じ経路で投与されても、または異なる経路で投与されてもよい。「異なる経路」という用語は、限定するものではないが、体の異なる部位、例えば、経口、非経口、経腸、腸管外、直腸、内部節（リンパ節）、静脈内、動脈、皮下、皮内、筋内、腫瘍内、腫瘍周囲、注入、粘膜、鼻、脳脊髄腔もしくは脳脊髄液中などを包含し、ならびに異なる方法によって、例えば経口、静脈内および筋内による方法を包含する。
【００９８】
プライムまたはブーストワクチンの有効量は、単回投与で与えられてもよいが、単回投与に限定されない。したがって、投与は２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上のワクチン投与回数であってよい。本発明の方法において、１回以上のワクチンの投与は、１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分またはそれを超える分の間隔で、およそ１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、２４時間などの時間間隔であけることができる。時間に関連して、「およそ」という用語は、±３０分以内のいずれの時間間隔を意味する。投与は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日およびその組み合わせの時間間隔をあけることもできる。本発明は、時間を等しくあける投与間隔に限定されることはないが、ただ非限定的な例を上げると、１日目、４日目、７日目および２５日目での投与からなるプライミングスケジールなどの非等間隔での投与を包含する。
【００９９】
特定の実施形態において、ブーストワクチン接種の投与は、プライムワクチン接種を開始してから約５日後；プライムワクチン接種を開始してから約１０日後；プライムワクチン接種の投与を開始してから約１５日後；約２０日後；約２５日後；約３０日後；約３５日後；約４０日後；約４５日後；約５０日後；約５５日後；約６０日後；約６５日後；約７０日後；約７５日後；約８０日後、約６ヵ月後、および約１年後に開始することができる。好ましくは、プライムおよびブーストの両ワクチン接種は、本発明の組成物の送達を含む。
【０１００】
「薬学的に許容される賦形剤」または「診断的に許容される賦形剤」とは、限定するものではないが、滅菌蒸留水、生理食塩水、リン酸緩衝液、アミノ酸系の緩衝液または重炭酸塩緩衝液が挙げられる。選択される賦形剤および使用する賦形剤の量は、投与の方法に依存する。投与は、経口、静脈内、皮下、皮膚、皮内、筋内、粘膜、腸管外、臓器内、病巣内、鼻腔内、吸入、眼内、筋内、脈管内、結節内、スタンプ式、直腸、腹腔内、または投与の種々の周知の経路の任意の１つまたは組み合わせであってよい。投与は、注射、注入またはその組み合わせを含み得る。
【０１０１】
非経口経路による本発明のワクチンの投与は、耐性を回避することができる。当該分野で公知の方法としては、静脈内、皮下、皮内、筋内、腹腔内、経口、粘膜、尿路を通って、生殖管を通って、消化管を通って、または吸入法による投与がある。
【０１０２】
特定の患者のための有効量は、治療される状態、患者の全体の健康、投与経路および用量、副作用の重症度などの諸因子によって変化し得る。治療法および診断法のための指針は利用可能である（例えば、Ｍａｙｎａｒｄら（１９９６）Ａ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ＳＯＰｓ  ｆｏｒ  Ｇｏｏｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｉｎｔｅｒｐｈａｒｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ；Ｄｅｎｔ（２００１）Ｇｏｏｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ａｎｄ  Ｇｏｏｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｕｒｃｈ  Ｐｕｂｌ．，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ参照）。
【０１０３】
本発明のワクチンは、投与量または投薬量で投与されることができ、各投与量は少なくとも１００細菌細胞／体重ｋｇ以上；特定の実施形態において１０００細菌細胞／体重ｋｇ以上；通常は少なくとも１０，０００細胞／体重ｋｇ；より通常は、少なくとも１００，０００細胞／体重ｋｇ；最も通常は、少なくとも１百万細胞／体重ｋｇ；多くの場合、少なくとも１千万細胞／体重ｋｇ；より多くの場合、少なくとも１億細胞／体重ｋｇ；一般的に少なくとも１０億細胞／体重ｋｇ；通常は、少なくとも１００億細胞／体重ｋｇ；慣例的に少なくとも１千億細胞／体重ｋｇ；および時として少なくとも１兆細胞／体重ｋｇを含む。本発明は、細菌投与の単位がコロニー形成単位（ＣＦＵ）であり、ソラレン処理前のＣＦＵに相当する、または単位は細菌細胞の数である上記の投与量を提供する。
【０１０４】
本発明のワクチンは、投与量または投薬量で投与されることができ、各投与量は体重７０ｋｇ当たり（または表面積１．７平方メートル当たりまたは肝臓重量１．５ｋｇ当たり）１０７〜１０８の細菌；体重７０ｋｇ当たり（または表面積１．７平方メートル当たりまたは肝臓重量１．５ｋｇ当たり）２×１０７〜２×１０８の細菌；体重７０ｋｇ当たり（または表面積１．７平方メートル当たりまたは肝臓重量１．５ｋｇ当たり）５×１０７〜５×１０８の細菌；体重７０ｋｇ当たり（または表面積１．７平方メートル当たりまたは肝臓重量１．５ｋｇ当たり）１０８〜１０９の細菌；体重７０ｋｇ当たり（または表面積１．７平方メートル当たりまたは肝臓重量１．５ｋｇ当たり）２．０×１０８〜２．０×１０９の細菌；体重７０ｋｇ当たり（または表面積１．７平方メートル当たりまたは肝臓重量１．５ｋｇ当たり）５．０×１０８〜５．０×１０９の細菌；体重７０ｋｇ当たり（または表面積１．７平方メートル当たりまたは肝臓重量１．５ｋｇ当たり）１０９〜１０１０の細菌；体重７０ｋｇ当たり（または表面積１．７平方メートル当たりまたは肝臓重量１．５ｋｇ当たり）２×１０９〜２×１０１０の細菌；体重７０ｋｇ当たり（または表面積１．７平方メートル当たりまたは肝臓重量１．５ｋｇ当たり）５×１０９〜５×１０１０の細菌；体重７０ｋｇ当たり（または表面積１．７平方メートル当たりまたは肝臓重量１．５ｋｇ当たり）１０１１〜１０１２の細菌；体重７０ｋｇ当たり（または表面積１．７平方メートル当たりまたは肝臓重量１．５ｋｇ当たり）２×１０１１〜２×１０１２の細菌；体重７０ｋｇ当たり（または表面積１．７平方メートル当たりまたは肝臓重量１．５ｋｇ当たり）５×１０１１〜５×１０１２の細菌；体重７０ｋｇ当たり（または表面積１．７平方メートル当たりまたは肝臓重量１．５ｋｇ当たり）１０１２〜１０１３の細菌；体重７０ｋｇ当たり（または表面積１．７平方メートル当たりまたは肝臓重量１．５ｋｇ当たり）２×１０１２〜２×１０１３の細菌；体重７０ｋｇ当たり（または表面積１．７平方メートル当たりまたは肝臓重量１．５ｋｇ当たり）５×１０１２〜５×１０１３の細菌；体重７０ｋｇ当たり（または表面積１．７平方メートル当たりまたは肝臓重量１．５ｋｇ当たり）１０１３〜１０１４の細菌；体重７０ｋｇ当たり（または表面積１．７平方メートル当たりまたは肝臓重量１．５ｋｇ当たり）２×１０１３〜２×１０１４の細菌；体重７０ｋｇ当たり（または表面積１．７平方メートル当たりまたは肝臓重量１．５ｋｇ当たり）５×１０１３〜５×１０１４の細菌；体重７０ｋｇ当たり（または表面積１．７平方メートル当たりまたは肝臓重量１．５ｋｇ当たり）１０１４〜１０１５の細菌；体重７０ｋｇ当たり（または表面積１．７平方メートル当たりまたは肝臓重量１．５ｋｇ当たり）２×１０１４〜２×１０１５の細菌などを、湿重量で含む。
【０１０５】
また、上記の投与量の１以上が提供され、該投与量は、毎日1回の注射、２日ごとに１回の注射、３日ごとに１回の注射、４日ごとに１回の注射、５日ごとに１回の注射、６日ごとに１回の注射、７日ごとに１回の注射の方法によって投与され、注射のスケジュールは例えば、１日のみ、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、２週間、３週間、４週間、５週間またはそれ以上長く維持される。また、本発明は上記の投与量とスケジュールの組み合わせ、例えば、比較的大きな初回細菌投与量に続いて比較的小さい継続投与量、または比較的小さい初回投与量に続いて大きな投与量の組み合わせを包含する。
【０１０６】
例えば、週１回、週２回、週３回、週４回、週５回、週６回、週７回、２週間ごとに１回、３週間ごとに１回、４週間ごとに１回、５週間ごとに１回などの投与スケジュールが本発明で利用可能である。投与スケジュールは、例えば、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、２ヵ月、３ヵ月、４ヵ月、５ヵ月、６ヵ月、７ヵ月、８ヵ月、９ヵ月、１０ヵ月、１１ヵ月、および１２ヵ月の全期間を包含する。
【０１０７】
上記の投与スケジュールのサイクルが提供される。サイクルは、およそ、例えば７日間ごと、１４日間ごと；２１日間ごと；２８日間ごと；３５日間ごと；４２日間ごと；４９日間ごと；５６日間ごと；６３日間ごと；７０日間ごとなどと繰り返すことができる。非投与の間隔は、１サイクルの間に生じてもよく、その間隔はおよそ、例えば７日間、１４日間；２１日間；２８日間；３５日間；４２日間；４９日間；５６日間；６３日間；７０日間などであってよい。これに関連して、「およそ」という用語は、±１日、±２日、±３日、±４日、±５日、±６日または±７日を意味する。
【０１０８】
本発明は、経口であるリステリアの投与方法を包含する。静脈内であるリステリアの投与方法も提供する。さらに、経口、筋内、静脈内、皮内および／または皮下であるリステリアの投与方法が提供される。本発明は、肉をベースにした培地、または肉もしくは動物生成物に由来するポリペプチドを含む培地で増殖させることによって調製したリステリア細菌、またはリステリア細菌の培養物もしくは懸濁液を供給する。また、本発明が供給するは、肉もしくは動物生成物を含まない培地で増殖させることによって調製した、植物ポリペプチドを含む培地で増殖させることによって調製した、酵母生成物に基づいていない培地で増殖させることによって調製した、または酵母ポリペプチドを含む培地で増殖させることによって調製した、リステリア細菌またはリステリア細菌の培養物もしくは懸濁液である。
【０１０９】
さらなる治療薬との同時投与の方法は、当該分野において公知である（Ｈａｒｄｍａｎら（編）（２００１）Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，第１０版，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｐｏｏｌｅ  ａｎｄ  Ｐｅｔｅｒｓｏｎ（編）（２００１）Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｆｏｒ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａ．，ＰＡ；Ｃｈａｂｎｅｒ  ａｎｄ  Ｌｏｎｇｏ（編）（２００１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａ．，ＰＡ）。
【０１１０】
細胞溶解性Ｔ細胞反応を起こすことに有益なさらなる薬剤も用いてもよい。そのような薬剤を、本明細書では担体と称する。担体としては、限定するものではないが、Ｂ７共刺激分子、インターロイキン−２、インターフェロン−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＴＬＡ−４アンタゴニスト、ＯＸ−４０／ＯＸ−４０リガンド、ＣＤ４０／ＣＤ４０リガンド、サルグラモスチム、レバミソール、ワクシニアウイルス、カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）、リポソーム、ミョウバン、フロイント完全もしくは不完全アジュバント、無毒化エンドトキシン、鉱物油、例えばリポレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ププチドの表面活性物質、および油エマルジョンもしくは炭化水素エマルジョンが挙げられる。細胞溶解性Ｔ細胞応答対抗体応答を優先的に刺激するＴ細胞免疫応答を誘発するための担体が好ましいが、とはいえ両種類の応答を刺激するものも用いることができる。薬剤がポリペプチドである場合、ポリペプチドそれ自体またはそのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを投与することができる。担体は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）または樹状細胞などの細胞であってよい。抗原提示細胞は、マクロファージ、樹状細胞およびＢ細胞などの細胞の種類を含む。他の専門的な抗原提示細胞としては、単核細胞、辺縁帯クッパー細胞、小膠細胞、ランゲルハンス細胞、指状嵌入樹状細胞、濾胞樹状細胞およびＴ細胞が挙げられる。通性抗原提示細胞も用いることができる。通性抗原提示細胞の例としては、アストロサイト、濾胞細胞、血管内皮および線維芽細胞が挙げられる。担体は、ポリペプチドを発現させるよう、またはワクチン接種した個人の細胞内でその後発現するポリヌクレオチドを送達するように形質転換されている細菌細胞であってよい。水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムなどのアジュバントを添加して、免疫応答を引き起こす、増強するまたは延ばすワクチンの能力を高めることができる。別々にまたは記載の組成物と組み合わせて用いられる、サイトカイン、ケモカイン、およびＣｐＧのような細菌核酸配列、トール様受容体（ＴＬＲ）９アゴニスト、ならびにリポタンパク質、ＬＰ５、モノホスホリルリピドＡ、リポテイコ酸、イミキモド、レシキモドを含むＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９用のさらなるアゴニスト、およびｃ−ｄｉ−ＧＭＰ、ｃ−ｄｉ−ＡＭＰ、ｃ−ｄｉ−ＩＭＰおよびｃ−ＡＭＰ−ＧＭＰを含む環状ジヌクレオチドＳＴＩＮＧアゴニストなどの免疫修飾因子のような他のアゴニストも有望なアジュバントである。アジュバントの他の代表的な例としては、キラヤの樹皮から精製した均質のサポニンおよびコリネバクテリウム・パルバムを含む合成アジュバントＱＳ−２１が挙げられる（ＭｃＣｕｎｅら，Ｃａｎｃｅｒ，１９７９；４３：１６１９）。アジュバントは最適化の対象となることを理解されたい。換言すれば、当業者は、使用に最適のアジュバントを決定するために、ルーチンの実験を行うことができる。
【０１１１】
治療薬の有効量は、通常は少なくとも１０％、より通常は少なくとも２０％、最も通常は少なくとも３０％、一般的に少なくとも４０％、より一般的に少なくとも５０％、最も一般的に少なくとも６０％、多くの場合少なくとも７０％、より多くの場合少なくとも８０％、および最も多くの場合少なくとも９０％、慣例的に少なくとも９５％、より慣例的に少なくとも９９％、および最も慣例的に少なくとも９９．９％、症状を低減するまたは寛解させる。
【０１１２】
本発明の試薬および方法は、１回のみのワクチン接種を含む；もしくは第１のワクチン接種を含む；もしくは少なくとも１回のブースターワクチン接種；少なくとも２回のブースターワクチン接種；もしくは少なくとも３回のブースターワクチン接種を含むワクチンを提供する。ブースターワクチン接種のためのパラメータの指針が利用可能である。例えば、Ｍａｒｔｈ（１９９７）Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  ２５：１９９−２０３；Ｒａｍｓａｙら（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７５：３８２−３８８；Ｇｈｅｒａｒｄｉら（２００１）Ｈｉｓｔｏｌ．Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．１６：６５５−６６７；Ｌｅｒｏｕｘ−Ｒｏｅｌｓら（２００１）ＡｃｔＡ  Ｃｌｉｎ．Ｂｅｌｇ．５６：２０９−２１９；Ｇｒｅｉｎｅｒら（２００２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６２：６９４４−６９５１；Ｓｍｉｔｈら（２００３）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．７０：Ｓｕｐｐｌ．１：Ｓ３８−Ｓ４１；Ｓｅｐｕｌｖｅｄａ−Ａｍｏｒら（２００２）Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０：２７９０−２７９５参照。
【０１１３】
治療薬の製剤は、貯蔵用に生理的に許容される担体、賦形剤、または、例えば凍結乾燥粉末、スラリー、水溶液もしくは懸濁液の形状での安定剤と混合することによって調製されることができる（例えば、Ｈａｒｄｍａｎら（２００１）Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ａｖｉｓら（編）（１９９３）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら（編）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら（編）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｗｅｉｎｅｒ  ａｎｄ  Ｋｏｔｋｏｓｋｉｅ（２０００）Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓａｆｅｔｙ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ参照）。
実施例
【０１１４】
以下の実施例は、本発明を例示するものである。これらの実施例は、いかなる場合も本発明の範囲を限定することを意図しない。
実施例１．
【０１１５】
図２は、以下の実施例で試験した、ＡｃｔＡおよびＬＬＯの配列の様々な修飾を示す。
【０１１６】
修飾ＡｃｔＡ配列に関して、親ＡｃｔＡ配列を残基１００において切り詰めて、ＢａｍＨＩ部位の封入によって添加した２つの残基（図では残基Ｇ１０１およびＳ１０２として示す）によって伸長させた。ＰＥＳＴ配列への修飾は、図に示す欠失を含み、疎水性モチーフＬＩＡＭＬのＱＤＮＫＲへの任意選択の置換も示す。修飾ＬＬＯ配列に関して、親ＬＬＯ配列を残基４４１で切り詰めた。ＰＥＳＴ配列への修飾は、図に示す欠失を含んだ。それぞれの場合、示したシグナルペプチド／分泌シャペロンエレメントは、選択した抗原配列にインフレームで機能的に結合させる。
実施例２．
【０１１７】
図３は、ｅｐｅｓｔｆｉｎｄアルゴリズムを使用してスコア化した、ＬＬＯ配列中のＰＥＳＴモチーフの位置を示す。＋４．７２のスコアを有する単一モチーフは、実施例１で上記したように修飾した。また、図の上部にハイドロパシープロットを示す。多くの疎水性モチーフは、本明細書に記載するように、修飾し得ることを示す（模式的配列の上に上昇するピーク）。
【０１１８】
同様に、図４は、ＡｃｔＡ配列中のｅｐｅｓｔｆｉｎｄアルゴリズムを使用してスコア化した４つのＰＥＳＴモチーフを示す。これらのモチーフの第1のものは、＋１０．２７のスコアを有し、実施例１で上述したように修飾した。残りのＰＥＳＴモチーフは、残基１００でＡｃｔＡ配列の切り詰めることによって除去した。また、図の上部にハイドロパシープロットを示す。疎水性モチーフＬＩＡＡＭＬは、ＡｃｔＡＮ１００の模式的配列の上に上昇するピークとして明白である。
実施例３．
【０１１９】
図５は、図に示すコンストラクトによる免疫に続くＢ３Ｚ  Ｔ細胞活性化アッセイの結果を示す。各抗原コンストラクトにおいて、ＨＩＶｇａｇをＳＩＩＮＦＥＫＬ (［ＳＬ８」)エピトープタグに融合して発現させ、宿主ＬｍΔａｃｔＡΔｉｎｌＢワクチン株のゲノムに挿入した。選択した株でＤＣ２．４細胞を感染させて、ＯＶＡ２５７−２６４−特異的Ｔ細胞ハイブリドーマ、Ｂ３Ｚと共にインキュベートした。発色基質を用いてβ−ガラクトシダーゼ発現を測定することによってＨ−２ＫｂクラスＩ分子上のＳＩＩＮＦＥＫＬエピトープの提示を評価した。図に示すように、ＰＥＳＴ配列の欠失はアッセイ結果にプラス効果または中立的効果を及ぼした。
実施例４．
【０１２０】
図６は、ＬＬＯ４４１（Ａ）およびＡｃｔＡＮ１００ワクチン株からの応答を示す。Ｎ末端ＬＬＯまたはＡｃｔＡ融合パートナーの組成のみが異なるこれらの同質遺伝子系統の免疫原性を直接的に比較するために、ＢＡＬＢ／ｃマウスに、ＰＥＳＴモチーフを含有した、またはＰＥＳＴモチーフを除去したＮ末端融合パートナーを含む、示したワクチン株を５×１０６コロニー形成単位（ｃｆｕ）で静脈内に１回ワクチン接種した。ワクチン接種後７日目でのＬｍワクチン応答のピーク時に、マウスの脾臓を収集し、ＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔアッセイによるＨ２Ｋｄ拘束性ＨＩＶＧａｇ１９７−２０５エピトープＡＭＱＭＬＫＥＴＩに特異的なＨＩＶ−Ｇａｇ  ＣＤ８Ｔ細胞応答をＬｙｍｐｈｏｌｙｔｅ−哺乳動物（Ｇｅｄａｒｌａｎｅ  Ｌａｂｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＮＣ）およびマウスＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔ対（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて、マウス全血から単離したリンパ球を用いて行った。この実験の終了時に、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを脾細胞で行った。抗マウスＩＦＮ−γ被覆ＥＬＩＳｐｏｔプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）で２×１０５細胞／ウェルを適切なペプチドと共に終夜インキュベートした。陰性対照として、細胞をペプチドなしでインキュベートした。マウスＥＬＩＳｐｏｔをアルカリホスファターゼ検出試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて開発し、免疫スポットプレートリーダーおよびソフトウェア（ＣＴＬ  Ｌｔｄ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）を用いて走査して定量化した。
【０１２１】
ＰＥＳＴ−ＬＬＯ４４１Ｎ末端分泌／シャペロンエレメントを含むＬｍワクチン株でワクチン接種したマウスは、ＰＥＳＴモチーフと共にＬＬＯ４４１Ｎ末端分泌／シャペロンエレメントを含む同質遺伝子的なＬｍワクチン株でワクチン接種したマウスよりも高いＨＩＶ  Ｇａｇ−特異的ＣＤ８Ｔ細胞応答を起こした。ＰＥＳＴ−ＡｃｔＡＮ１００Ｎ末端分泌／シャペロンエレメントを含むＬｍワクチン株でワクチン接種したマウスは、ＰＥＳＴモチーフと共にＡｃｔＡＮ１００Ｎ末端分泌／シャペロンエレメントを含む同質遺伝子的なＬｍワクチン株でワクチン接種したマウスと少なくとも同等のＨＩＶ  Ｇａｇ−特異的ＣＤ８Ｔ細胞応答を起こした。
実施例５．
【０１２２】
図７は、モデル系としてＡｃｔＡを用いて、ＰＥＳＴモチーフを除去する際に用いるいくつかの代替置換および欠失を示す。ＡｃｔＡＮ１００配列中のＰ、Ｅ、ＳおよびＴの５つのアミノ酸（Ｅ５０、Ｐ５２，Ｓ５３、Ｅ５４、Ｔ５７）のいずれかと、正電荷残基（Ｒ、ＫまたはＨ）との置換は、ｐｅｓｔｆｉｎｄｅｒアルゴリズムを用いる陽性スコアを抑制するのに十分であった。
【０１２３】
図８は、結果として生じるハイドロパシープロット上での疎水性モチーフＬＩＡＭＩを修飾する結果をより詳細に示す。ＱＤＮＫＲに対する非保存的置換は、この配列の疎水性性質を除去するのに十分であった。
実施例６．
【０１２４】
ＡｃｔＡ−Ｎ１００（ＭＧＬＮＲＦＭＲＡＭ  ＭＶＶＦＩＴＡＮＣＩ  ＴＩＮＰＤＩＩＦＡＡ  ＴＤＳＥＤＳＳＬＮＴ  ＤＥＷＥＥＥＫＴＥ  ＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲ  ＹＥＴＡＲＥＶＳＳＲ  ＤＩＥＥＬＥＫＳＮＫ  ＶＫＮＴＮＫＡＤＬＩ  ＡＭＬＫＡＫＡＥＫＧ  ｇｓ）およびＰＥＳＴモチーフを除去して、非保存的なＱＤＮＫＲ置換を含む（ＭＧＬＮＲＦＭＲＡＭ  ＭＶＶＦＩＴＡＮＣＩ  ＴＩＮＰＤＩＩＦＡＡ  ＴＤＳＥＤＳＳＬＮＴ  ＤＥＷＥＥＥＹＥＴＡ  ＲＥＶＳＳＲＤＩＥＥ  ＬＥＫＳＮＫＶＫＮＴ  ＮＫＡＤＱＤＮＫＲＫ  ＡＫＡＥＫｇｌ；本明細書ではＡｃｔＡ−Ｎ１００＊と呼ぶ）を用いて、ヒトメソテリン残基３５−６２１と共に融合コンストラクトを調製した（上記の小文字残基は、インフレーム融合を調製するために使用した制限部位の結果として、ＡｃｔＡ配列とメソテリン配列の間に含まれていた）。このコンストラクトをリステリア・モノサイトゲネスΔａｃｔＡΔｉｎｌＢの染色体ｔＲＮＡＡｒｇ遺伝子座で組み込んだ。検査当日、Ｂａｌｂ／ｃマウスにヒトメソテリンを発現させる２×１０５ＣＴ−２６腫瘍細胞を投与した。４日目と１７日目に、リステリアワクチン株を治療としてマウスにワクチン接種したこの実験の結果をワクチン接種動物のパーセント生存率として図９に示す。示すように、ＡｃｔＡ−Ｎ１００対ＡｃｔＡ−Ｎ１００＊ベースのワクチンの間に有効性の差はなかった。
実施例７．
【０１２５】
実施例６のものと同様のリステリア・モノサイトゲネスΔａｃｔＡΔｉｎｌＢを、メソテリン抗原配列をＥＧＦＲｖＩＩＩ２０−４０配列とＮＹ−ＥＳＯ−１１−１６５の５コピーと置き換えることで調製した。抗原コンストラクトで用いたＤＮＡおよびタンパク質配列は以下の通りである（小文字、下線なし：ａｃｔＡプロモーター；小文字、下線：制限部位；大文字、太文字：ＡｃｔＡＮ１００＊配列；大文字、下線：ＥＧＦＲｖＩＩＩ２０−４０×５；大文字、イタリック体：ＮＹ−ＥＳＯ−１（１−１６５）（ペプチド配列中の各ＥＧＦＲｖＩＩＩ２０−４０の繰り返しは、二重下線を引き、リーディングＶａｌコドンを用いてＭｅｔをコードする）。
【表６】
2018135355.tif 000022
2018135355.tif 000023
【０１２６】
融合コンストラクトを図１０の左側パネルに模式的に示す。マウスの樹状細胞株ＤＣ２．４にＬｍΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢ（図１０、右側パネル、レーン１）、ＢＨ３７６３（ＥＧＦＲｖＩＩＩ２０−４０／ＮＹ−ＥＳＯ−１１−１６５）またはＢＨ３８１６（選択マーカーが除去されているＥＧＦＲｖＩＩＩ２０−４０／ＮＹ−ＥＳＯ−１１−１６５を含む臨床株）を感染させた。７時間後に、細胞を洗浄して、溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に掛け、次いでニトロセルロースに移す。ＡｃｔＡタンパク質のアミノ末端に産生したウサギポリクローナル抗体でウエスタンブロットを行い、発現レベルをリステリアＰ６０タンパク質に規準化した。これは感染した細胞の細菌数と関連する。高レベルの融合コンストラクトは、試験株および臨床株の両方で発現した。
【０１２７】
雌Ｂ１０．Ｂｒマウス（１群当たりｎ＝５）にＢＨ３８１６（ＬｍΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ  ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＮＹ−ＥＳＯ−１）を種々の投与量で静脈内にワクチン接種した。ＥＧＦＲ特異的Ｔ細胞応答を細胞内サイトカイン染色法によって決定し、図１１に（Ａ）パーセントＩＦＮ−γ陽性ＥＧＦＲｖＩＩＩ−特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞；および（Ｂ）脾臓当たりのＩＦＮ−γ陽性ＥＧＦＲｖＩＩＩ−特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の絶対数として示した。強力なＥＧＦＲ  Ｔ細胞応答が見られた。定義したＨ−２ｄ拘束性エピトープＡＲＧＰＥＳＲＬＬを用いた、プライムワクチン接種から７日後、細胞内サイトカイン染色法によって決定すると、図１２に示すように、ＮＹ−ＥＳＯ−１−特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答も見られた。
【０１２８】
本発明が目的を成し遂げ、記載した目標および利点ならびにそれに内在するものを得るために十分に適合していることを当業者は容易に認識する。本明細書に提供する実施例は、好適な実施形態を代表しており、本発明の範囲を限定することを目的としていない。
【０１２９】
本発明の範囲および意図を逸脱することなく、本明細書に開示する本発明に対して様々の置換および修飾を行えることが当業者には容易に明らかになるであろう。
【０１３０】
本明細書に記載したすべての特許および刊行物は、本発明が関連する分野の当業者のレベルを表す。個々の刊行物が参照によって組み込まれることを具体的にかつ個別に示されているかのように、すべての特許および刊行物は同じ程度まで参照によって本明細書に組み込まれている。
【０１３１】
本明細書に説明的に記載した本発明は、本明細書に具体的に開示されていない、いかなる要素もしくは複数の要素、限定事項もしくは複数の限定事項がなくても、実施することができる。したがって、例えば、本明細書の各例の場合、「含む」、「本質的にからなる」および「からなる」という用語は、残りの２つの用語のいずれかと置き換えることができる。用いられた用語および表現は、説明の限定ではなく用語として用いられ、そのような用語および表現の使用において、図示および記載された特徴の任意の相当物またはその一部を排除することを意図するものではなく、特許請求される本発明の範囲内で様々な修飾が認められる。したがって、本発明は好ましい実施形態および任意の特徴によって具体的に開示されているが、本明細書で開示された概念の修飾および変形例が当業者によって用いられることもあり、そのような修飾と変形例は、添付の特許請求の範囲によって定義されるように本発明の範囲内に含まれることが理解されるべきである。
【０１３２】
他の実施形態が、以下の特許請求の範囲内に記載される。
【図１】
2018135355.tif 000024
【図２】
2018135355.tif 000025
【図３】
2018135355.tif 000026
【図４】
2018135355.tif 000027
【図５】
2018135355.tif 000028
【図６Ａ】
2018135355.tif 000029
【図６Ｂ】
2018135355.tif 000030
【図７】
2018135355.tif 000031
【図８】
2018135355.tif 000032
【図９】
2018135355.tif 000033
【図１０】
2018135355.tif 000034
【図１１】
2018135355.tif 000035
【図１２】
2018135355.tif 000036
【配列表】
2018135355000001.app