(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒトＣＲＴＨ２（７回膜貫通型Ｇタンパク質共役型受容体）の特徴的なエピトープを認識し、結合することで所望の活性を有する抗ヒトＣＲＴＨ２抗体、該抗体断片、該抗体のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該抗体を生産するハイブリドーマおよび抗体生産細胞、該抗体の製造方法の提供。【解決手段】特定のアミノ酸配列からなるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１９２番目のグリシンおよび１９４番目のアスパラギン酸の少なくとも一方を認識し、結合する抗体または該抗体断片を含む組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１９２番目のグリシンおよび１９４番目のアスパラギン酸の少なくとも一方を認識し、結合する抗体または該抗体断片を含む組成物であり、該抗体が、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選ばれるいずれか１つである組成物。
（ａ）抗体重鎖可変領域（以下、ＶＨと略記する）の相補性決定領域（以下、ＣＤＲと略記する）１〜３が、それぞれ配列番号２０〜２２で表されるアミノ酸配列を含み、かつ抗体軽鎖可変領域（以下、ＶＬと略記する）のＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号２３〜２５で表されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｂ）配列番号４９で表されるアミノ酸配列または配列番号４９で表されるアミノ酸配列中の１８番目のロイシンをメチオニンに、７７番目のアスパラギンをセリンに、９３番目のバリンをスレオニンに、および１１７番目のスレオニンをバリンに置換する改変から選ばれる少なくとも１つの改変が導入されたアミノ酸配列を含むＶＨ並びに配列番号３３で表されるアミノ酸配列または配列番号３３で表されるアミノ酸配列中の２番目のイソロイシンをバリンに、４番目のメチオニンをロイシンに、１５番目のプロリンをロイシンに、および８５番目のアラニンをプロリンに置換する改変から選ばれる少なくとも１つの改変が導入されたアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体、
（ｃ）配列番号４９、５１、５３、５５、５７および５９で表されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むＶＨ並びに配列番号３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５および４７で表されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むＶＬを含む抗体、並びに
（ｄ）配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１９で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体。
【請求項２】
抗体が、配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１２番目のプロリン、１３番目のイソロイシン、１４番目のロイシン、１５番目のグルタミン酸、１７７番目のアスパラギン酸、１７８番目のグリシン、１７９番目のアルギニン、１８０番目のイソロイシン、１８１番目のメチオニン、１８２番目のシステイン、１８３番目のチロシン、１８４番目のチロシン、１８５番目のアスパラギン、１８６番目のバリン、１８７番目のロイシン、１８８番目のロイシン、１８９番目のロイシン、１９５番目のアルギニン、１９６番目のアスパラギン酸、１９７番目のアラニン、および１９８番目のスレオニンからなる群から選ばれるアミノ酸残基の少なくとも１つを認識し、結合する抗体である請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
抗体が、以下の（ａ）〜（ｇ）からなる群から選ばれるアミノ酸残基の少なくとも１つを認識する抗体である、請求項１または２に記載の組成物。
（ａ）配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１２番目のプロリン、１４番目のロイシンおよび１５番目のグルタミン酸、
（ｂ）配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１７７番目のアスパラギン酸、１７８番目のグリシン、および１７９番目のアルギニン、
（ｃ）配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１８０番目のイソロイシンおよび１８１番目のメチオニン、
（ｄ）配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１８３番目のチロシン、１８４番目のチロシンおよび１８５番目のアスパラギン、
（ｅ）配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１８７番目のロイシン、１８８番目のロイシンおよび１８９番目のロイシン、
（ｆ）配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１９５番目のアルギニン、並びに
（ｇ）配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１９６番目のアスパラギン酸および１９８番目のスレオニン。
【請求項４】
抗体が、下記（ａ）〜（ｈ）からなる群から選ばれる少なくとも１つの特徴を有する抗体である請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
（ａ）ヒトＣＲＴＨ２のリガンド存在下でヒトＣＲＴＨ２に対する反応性が低下しない、
（ｂ）中和活性を有しない、
（ｃ）抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を有する、
（ｄ）マスト細胞およびＴｈ１細胞の少なくとも一方に反応しない、
（ｅ）好酸球、好塩基球、Ｔｈ２細胞および２型自然リンパ球（ＩＬＣ２）から選ばれる少なくとも一つの細胞に反応する。
（ｆ）アゴニスト活性を有しない、
（ｇ）ヒトＣＲＴＨ２のリガンドによるシグナルを増強しない、並びに
（ｈ）活性化状態または不活性化状態のヒトＣＲＴＨ２に対する反応性が変化しない。
【請求項５】
抗体が、ヒトＦｃ領域を含む抗体である、請求項１〜４のうちのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
抗体が、モノクローナル抗体である請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
抗体が、遺伝子組換え抗体である請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
遺伝子組換え抗体が、ヒト型キメラ抗体、ヒト型ＣＤＲ移植抗体およびヒト抗体から選ばれるいずれか１つの遺伝子組換え抗体である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
抗体が、サルＣＲＴＨ２に結合する抗体である請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
抗体断片がＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｓＦｖおよびＣＤＲを含むペプチドから選ばれるいずれか１つの抗体断片である請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＣＲＴＨ２を特異的に認識し、結合する抗ヒトＣＲＴＨ２抗体、該抗体断片、該抗体のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該抗体を生産するハイブリドーマおよび抗体生産細胞、該抗体の製造方法、該抗体または抗体断片を含む組成物、該抗体または抗体断片を用いるアレルギー性疾患、自己免疫疾患、好酸球増多や機能亢進を伴う疾患、Ｔｈ２細胞の増多や機能亢進を伴う疾患などの治療方法および診断方法、並びに該抗体または抗体断片を含む医薬および診断薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトＣＲＴＨ２（Ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｏｎ  Ｔｈ２  ｃｅｌｌｓ）は、ＧＰＲ４４、ＣＤ２９４、ＤＰ２などの別名でも知られる７回膜貫通型Ｇタンパク質共役型受容体（Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、以下、ＧＰＣＲと記す）であり、プロスタグランジンＤ２（以下、ＰＧＤ２と記す）に対する受容体の一つであることが知られている（非特許文献１）。ＣＲＴＨ２は、１９９６年にヒトＴｈ２特異的タンパク質としてクローニングされ、Ｂ１９と称して開示されている（特許文献１）。
【０００３】
ＣＲＴＨ２は、リガンドであるＰＧＤ２および１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ−１５−ｋｅｔｏ  ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｄ２（以下、ＤＫＰＧＤ２と記す）に代表されるＰＧＤ２代謝物と結合し、細胞内にＧαｉタンパク質を介したシグナルを伝達し、その結果、ＣＲＴＨ２発現細胞の遊走および活性化に関与することが知られている（非特許文献１）。
【０００４】
ヒトＣＲＴＨ２はＴｈ２細胞、好酸球、好塩基球および２型自然リンパ球（Ｔｙｐｅ  ２  ｉｎｎａｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｃｅｌｌｓ、以下、ＩＬＣ２と記す）などに発現が認められている（非特許文献１、２）。ＣＲＴＨ２は、Ｔｈ２サイトカイン産生細胞に特異的に発現する表面マーカーであることが報告されている（非特許文献３）。
【０００５】
また、ＩＬＣ２は２０１１年にヒトにおいて同定されたアレルギー応答に関与する新規細胞集団であり、本細胞を規定する特異的な表面マーカーとしてＣＲＴＨ２が挙げられている（非特許文献２）。また、ｎｏｎｃｌａｓｓｉｃａｌ  ｍｏｎｏｃｙｔｅやＴｈ２／Ｔｈ１７細胞にＣＲＴＨ２が発現していることが報告されている（非特許文献４、５）。
【０００６】
喘息をはじめとするアレルギー疾患において、ＣＲＴＨ２発現細胞は病態に寄与することが知られている。喘息患者における気管支肺胞洗浄液中の細胞においては、健常人と比較して高頻度でＣＲＴＨ２陽性Ｔ細胞が認められることが報告されており（非特許文献６）、アトピー性皮膚炎においては、重症度と相関してＣＲＴＨ２陽性Ｔ細胞が増加することが報告されている（非特許文献７）。
【０００７】
好酸球は細胞傷害性を有する顆粒蛋白質を含んでおり、該蛋白質の沈着が慢性気管支喘息患者の気道組織あるいはアトピー性皮膚炎患者の病変部位に認められることなどから、好酸球は慢性気管支喘息またはアトピー性皮膚炎などのアレルギー性疾患の病態形成において重要な働きをしているものと考えられている（非特許文献８、９）。
【０００８】
好塩基球は細胞内にヒスタミンやロイコトリエンといった炎症性分子を貯留し、細胞表面に発現するＦｃε受容体やＦｃγ受容体のクロスリンクにより、該分子を放出することにより、アレルギー反応の惹起に関わっている（非特許文献１０）。
【０００９】
ＩＬＣ２は気道粘膜や皮膚といった局所に存在する細胞であり、組織障害に伴い産生されるインターロイキン（以下、ＩＬと記す）−２５、ＩＬ−３３といったサイトカインに応答し、大量のＴｈ２サイトカインを産生するという特性を持ち、アレルギー疾患の病態形成に関与していると考えられている（非特許文献１１）。
【００１０】
ＣＲＴＨ２に対するモノクローナル抗体として、３０１１０８（Ｒ＆Ｄ社）が市販されている。またＢＭ１６が知られている（特許文献２）。これらはげっ歯類抗体であり医薬品としては開発されていない。
【００１１】
さらに、クローン１９Ａ２に関する遺伝子組換えキメラ抗体およびヒト化抗体が、エフェクター活性によりＣＲＴＨ２発現細胞の除去を行うこと、クローン８Ｂ１に関するヒト化抗体やクローン３Ｃ１２および３１Ａ５に関するマウス抗体が、ＣＲＴＨ２に対するアンタゴニスト活性を有することが示されている。
【００１２】
またクローン１９Ａ２に関する抗体はヒトマスト細胞に対しても反応性を有することが示されている（特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特許第３１４４８０５号公報
【特許文献２】国際公開第９７／４６６７７号
【特許文献３】国際公開第２０１４／１４４８６５号
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】The Journal of Experimental Medicine, 2001. 193(2):p.255-261.
【非特許文献２】Nature Immunology, 2011. 12(11):p.1055-1062.
【非特許文献３】European Journal of Immunology, 2000. 30(10):p.2972-2979.
【非特許文献４】Blood, 2011. 118(5):e16-31.
【非特許文献５】Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2014.134(5):p. 1175-1186. e7.
【非特許文献６】Clinical & Experimental Immunology, 2010. 161(1):p. 34-40.
【非特許文献７】Journal of Investigative Dermatology, 2002. 119(3):p. 609-616.
【非特許文献８】Advances in Immunology, 1986. 39:p. 177-253.
【非特許文献９】Immunology Today, 1992. 13(12):p. 501-507.
【非特許文献１０】Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2013. 132(4):p. 789-801.
【非特許文献１１】Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2014. 134(3):p. 671-678.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
これまでに複数のヒトＣＲＴＨ２抗体が確立されているが、種々のヒト免疫細胞への反応性や、ヒトＣＲＴＨ２への特異的結合活性、またはヒトＣＲＴＨ２リガンド依存的な活性への影響など、所望の活性を有する抗ヒトＣＲＴＨ２抗体の確立が望まれていた。
【００１６】
本発明の目的は、ヒトＣＲＴＨ２の特徴的なエピトープを認識し、結合することで所望の活性を有する抗ヒトＣＲＴＨ２抗体、該抗体断片、該抗体のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該抗体を生産するハイブリドーマおよび抗体生産細胞、該抗体の製造方法、該抗体または抗体断片を含む組成物、該抗体または抗体断片を用いるアレルギー性疾患、自己免疫疾患、好酸球増多や機能亢進を伴う疾患、Ｔｈ２細胞の増多や機能亢進を伴う疾患などの治療方法および診断方法、並びに該抗体または抗体断片を含む医薬および診断薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、以下の（１）〜（２６）に関する。
（１）配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１９２番目のグリシンおよび１９４番目のアスパラギン酸の少なくとも一方を認識し、結合する抗体または該抗体断片。
（２）抗体が、配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１２番目のプロリン、１３番目のイソロイシン、１４番目のロイシン、１５番目のグルタミン酸、１７７番目のアスパラギン酸、１７８番目のグリシン、１７９番目のアルギニン、１８０番目のイソロイシン、１８１番目のメチオニン、１８２番目のシステイン、１８３番目のチロシン、１８４番目のチロシン、１８５番目のアスパラギン、１８６番目のバリン、１８７番目のロイシン、１８８番目のロイシン、１８９番目のロイシン、１９５番目のアルギニン、１９６番目のアスパラギン酸、１９７番目のアラニン、および１９８番目のスレオニンからなる群から選ばれるアミノ酸残基の少なくとも１つを認識し、結合する抗体である（１）に記載の抗体または該抗体断片。
（３）抗体が、以下の（ａ）〜（ｇ）からなる群から選ばれるアミノ酸残基の少なくとも１つを認識する抗体である、（１）または（２）に記載の抗体または該抗体断片。
（ａ）配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１２番目のプロリン、１４番目のロイシンおよび１５番目のグルタミン酸、
（ｂ）配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１７７番目のアスパラギン酸、１７８番目のグリシン、および１７９番目のアルギニン、
（ｃ）配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１８０番目のイソロイシンおよび１８１番目のメチオニン、
（ｄ）配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１８３番目のチロシン、１８４番目のチロシンおよび１８５番目のアスパラギン、
（ｅ）配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１８７番目のロイシン、１８８番目のロイシンおよび１８９番目のロイシン、
（ｆ）配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１９５番目のアルギニン、並びに
（ｇ）配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１９６番目のアスパラギン酸および１９８番目のスレオニン。
（４）抗体が、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選ばれるいずれか１つの抗体である、（１）〜（３）のいずれか１に記載の抗体または該抗体断片。
（ａ）抗体重鎖可変領域（以下、ＶＨと略記する）の相補性決定領域（以下、ＣＤＲと略記する）１〜３が、それぞれ配列番号２０〜２２で表されるアミノ酸配列を含み、かつ抗体軽鎖可変領域（以下、ＶＬと略記する）のＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号２３〜２５で表されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｂ）配列番号４９で表されるアミノ酸配列または配列番号４９で表されるアミノ酸配列中の１８番目のロイシンをメチオニンに、７７番目のアスパラギンをセリンに、９３番目のバリンをスレオニンに、および１１７番目のスレオニンをバリンに置換する改変から選ばれる少なくとも１つの改変が導入されたアミノ酸配列を含むＶＨ並びに配列番号３３で表されるアミノ酸配列または配列番号３３で表されるアミノ酸配列中の２番目のイソロイシンをバリンに、４番目のメチオニンをロイシンに、１５番目のプロリンをロイシンに、および８５番目のアラニンをプロリンに置換する改変から選ばれる少なくとも１つの改変が導入されたアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体、
（ｃ）配列番号４９、５１、５３、５５、５７および５９で表されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むＶＨ並びに配列番号３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５および４７で表されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むＶＬを含む抗体、並びに
（ｄ）配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１９で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体。
（５）抗体が、下記（ａ）〜（ｈ）からなる群から選ばれる少なくとも１つの特徴を有する抗体である（１）〜（４）のいずれか１に記載の抗体または該抗体断片。
（ａ）ヒトＣＲＴＨ２のリガンド存在下でヒトＣＲＴＨ２に対する反応性が低下しない、
（ｂ）中和活性を有しない、
（ｃ）抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を有する、
（ｄ）マスト細胞およびＴｈ１細胞の少なくとも一方に反応しない、
（ｅ）好酸球、好塩基球、Ｔｈ２細胞および２型自然リンパ球（ＩＬＣ２）から選ばれる少なくとも一つの細胞に反応する。
（ｆ）アゴニスト活性を有しない、
（ｇ）ヒトＣＲＴＨ２のリガンドによるシグナルを増強しない、並びに
（ｈ）活性化状態または不活性化状態のヒトＣＲＴＨ２に対する反応性が変化しない。
（６）抗体が、ヒトＦｃ領域を含む抗体である、（１）〜（５）のうちのいずれか１に記載の抗体または該抗体断片。
（７）抗体が、モノクローナル抗体である（１）〜（６）のいずれか１に記載の抗体または該抗体断片。
（８）抗体が、遺伝子組換え抗体である（１）〜（７）のいずれか１に記載の抗体または該抗体断片。
（９）遺伝子組換え抗体が、ヒト型キメラ抗体、ヒト型ＣＤＲ移植抗体およびヒト抗体から選ばれるいずれか１つの遺伝子組換え抗体である、（８）に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
（１０）抗体が、サルＣＲＴＨ２に結合する抗体である（１）〜（９）のいずれか1つに記載の抗体または該断片。
（１１）Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｓＦｖおよびＣＤＲを含むペプチドから選ばれるいずれか１つの抗体断片である（１）〜（１０）のいずれか１に記載の該抗体断片。
（１２）（１）〜（１１）のいずれか１に記載の抗体または該抗体断片を産生するハイブリドーマ。
（１３）（１）〜（１１）のいずれか１に記載の抗体または該抗体断片をコードするＤＮＡ。
（１４）（１３）に記載のＤＮＡを含有する組換え体ベクター。
（１５）（１４）に記載の組換え体ベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株。
（１６）（１２）に記載のハイブリドーマまたは（１５）に記載の形質転換株を培地に培養し、培養物中に（１）〜（１１）のいずれか１に記載の抗体または該抗体断片を生産蓄積させ、該培養物から抗体または該抗体断片を採取することを特徴とする（１）〜（１１）のいずれか１に記載の抗体または該抗体断片の製造方法。
（１７）（１）〜（１１）のいずれか１に記載の抗体または該抗体断片を有効成分として含有する、ヒトＣＲＴＨ２が関係する疾患の治療剤。
（１８）（１）〜（１１）のいずれか１に記載の抗体または該抗体断片を有効成分として含有する、ヒトＣＲＴＨ２が関係する疾患の診断剤。
（１９）ＣＲＴＨ２が関係する疾患がアレルギー性疾患、自己免疫疾患、好酸球増多および機能亢進の少なくとも一方を伴う疾患、Ｔｈ２細胞の増多および機能亢進の少なくとも一方を伴う疾患、または２型自然リンパ球（ＩＬＣ２）の増多および機能亢進の少なくとも一方を伴う疾患である（１７）または（１８）に記載の剤。
（２０）（１）〜（１１）のいずれか１に記載の抗体または該抗体断片の有効量を投与することを含む、ヒトＣＲＴＨ２が関係する疾患の治療方法。
（２１）（１）〜（１１）のいずれか１に記載の抗体または該抗体断片の有効量を投与することを含む、ヒトＣＲＴＨ２が関係する疾患の診断方法。
（２２）ヒトＣＲＴＨ２が関係する疾患がアレルギー性疾患、自己免疫疾患、好酸球増および機能亢進の少なくとも一方を伴う疾患、Ｔｈ２細胞の増多および機能亢進の少なくとも一方を伴う疾患、またはＩＬＣ２の増多および機能亢進の少なくとも一方を伴う疾患である（２０）または（２１）に記載の方法。
（２３）ヒトＣＲＴＨ２が関係する疾患の治療および診断の少なくとも一方に使用するための、（１）〜（１１）のいずれか１に記載の抗体または該抗体断片。
（２４）ヒトＣＲＴＨ２が関係する疾患がアレルギー性疾患、自己免疫疾患、好酸球増多および機能亢進の少なくとも一方を伴う疾患、Ｔｈ２細胞の増多および機能亢進の少なくとも一方を伴う疾患、またはＩＬＣ２の増多および機能亢進の少なくとも一方を伴う疾患である（２３）に記載の抗体または該抗体断片。
（２５）ヒトＣＲＴＨ２が関係する疾患の治療および診断剤の少なくとも一方の製造のための、（１）〜（１１）のいずれか１に記載の抗体または該抗体断片の使用。
（２６）ヒトＣＲＴＨ２が関係する疾患がアレルギー性疾患、自己免疫疾患、好酸球増多および機能亢進の少なくとも一方を伴う疾患、Ｔｈ２細胞の増多および機能亢進の少なくとも一方を伴う疾患、またはＩＬＣ２の増多および機能亢進の少なくとも一方を伴う疾患である（２５）に記載の使用。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１９２番目のグリシンおよび１９４番目のアスパラギン酸の少なくとも一方を認識し、結合する抗体または該抗体断片などが提供される。
【００１９】
本発明の抗体は、好酸球、好塩基球Ｔｈ２細胞、ＩＬＣ２などのＣＲＴＨ２を発現する細胞に特異的に反応し、高濃度のリガンド存在下においてもＣＲＴＨ２発現細胞に高い反応性を示すとともに、アゴニスト活性、中和活性、およびヒトＣＲＴＨ２のリガンドによるシグナルの増強活性を有しない。したがって本発明の抗体または該抗体断片は、ＣＲＴＨ２が発現する好酸球、好塩基球、Ｔｈ２細胞、ＩＬＣ２などのＣＲＴＨ２を発現する細胞を標的とする治療効果を発揮し得る。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、シグナル配列を含まないＬｙｍ２抗体軽鎖可変領域及び各ヒト化Ｌｙｍ２抗体軽鎖可変領域（ＬＶ０、ＬＶ１、ＬＶ２ａ、ＬＶ２ｂ、ＬＶ２ｃ、ＬＶ３ａ、ＬＶ３ｂおよびＬＶ４）のアミノ酸配列を示す。各配列中の枠で囲まれた領域は、ＣＤＲ配列を示す。
【図２】図２は、シグナル配列を含まないＬｙｍ２抗体重鎖可変領域及び各ヒト化Ｌｙｍ２抗体重鎖可変領域（ＨＶ０、ＨＶ１、ＨＶ２ａ、ＨＶ２ｂ、ＨＶ３およびＨＶ４）のアミノ酸配列を示す。各配列中の枠で囲まれた領域は、ＣＤＲ配列を示す。
【図３】図３（Ａ）〜（Ｃ）は、ラット／ヒトキメラ型Ｌｙｍ２抗体（以下、ｃｈＬｙｍ２と記す場合もある）およびヒト化Ｌｙｍ２抗体のヒト好酸球およびヒト好塩基球に対する細胞傷害活性をフローサイトメトリーで解析した結果を示す。図３（Ａ）〜（Ｃ）において、それぞれ、左側の図はヒト好酸球に対する細胞傷害活性を、右側の図はヒト好塩基球に対する細胞傷害活性を示す。それぞれの図において縦軸はコントロールビーズ２０００個あたりの各細胞の個数を、横軸は抗体濃度を示す。図３（Ａ）○はｃｈＬｙｍ２、●はヒト化Ｌｙｍ２抗体ＬＶ０ＨＶ０、△はアイソタイプコントロール抗体を示す。図３（Ｂ）○はｃｈＬｙｍ２、■はヒト化Ｌｙｍ２抗体ＬＶ０ＨＶ１、△はアイソタイプコントロール抗体を示す。図３（Ｃ）○はｃｈＬｙｍ２、▲はヒト化Ｌｙｍ２抗体ＬＶ０ＨＶ２ａ、△はアイソタイプコントロール抗体を示す。
【図４】図４（Ａ）はヒト化Ｌｙｍ２抗体ＬＶ０ＨＶ１、図４（Ｂ）はｃｈＬｙｍ２の各ヒトＣＲＴＨ２アミノ酸置換体発現細胞に対する反応性をそれぞれ示したものである。それぞれの図において、縦軸はアザミグリーンタグの蛍光強度で、各抗ヒトＣＲＴＨ２モノクローナル抗体の蛍光強度を補正した相対的蛍光強度に関して、野生型ヒトＣＲＴＨ２発現細胞に対する反応性の値を１００％とした際の、各アミノ酸置換体発現細胞に対する反応性の値（％）を示す。横軸においてＷＴは野生型ヒトＣＲＴＨ２を示し、それ以外は、アミノ酸置換体の種類を示す。＊は野生型ＣＲＴＨ２の相対的蛍光強度から９０％以上の相対的蛍光強度の低下が認められたことを意味する。以下、図５〜図７も同様である。
【図５】図５（Ａ）はｈｕ１９Ａ２  ｖ５２、図５（Ｂ）はｈｕ８Ｂ１  ｖ１の各ＣＲＴＨ２アミノ酸置換体に対する反応性をそれぞれ示したものである。
【図６】図６（Ａ）はｃｈ３Ｃ１２、図６（Ｂ）はｃｈ３１Ａ５の各ＣＲＴＨ２アミノ酸置換体に対する反応性をそれぞれ示したものである。
【図７】図７は、ＢＭ１６の各ＣＲＴＨ２アミノ酸置換体に対する反応性を示したものである。
【図８】図８は、ヒト好酸球に対する抗ヒトＣＲＴＨ２モノクローナル抗体の反応性をフローサイトメトリーで解析した結果を示す。●はＬｙｍ２抗体、○はＢＭ１６、▲は３０１１０８を示し、縦軸は蛍光強度を、横軸は各抗ヒトＣＲＴＨ２モノクローナル抗体の抗体濃度を示す。
【図９】図９は、ヒト好塩基球に対するｃｈＬｙｍ２の反応性をフローサイトメトリーで解析した結果を示す。塗りつぶし部分がアイソタイプコントロール抗体の反応性、実線で囲まれた部分がｃｈＬｙｍ２の反応性を、それぞれ示し、縦軸は細胞数を、横軸は蛍光強度を示す。
【図１０】図１０は、ヒトＣＤ４陽性Ｔ細胞に対するヒト化Ｌｙｍ２抗体ＬＶ０ＨＶ１の反応性をフローサイトメトリーで解析した結果を示す。Ｆｏｒｗａｒｄ  ｓｃａｔｔｅｒ（以下、ＦＳＣと記す）−Ｓｉｄｅ  ｓｃａｔｔｅｒ（以下、ＳＳＣと記す）展開によりリンパ球を分画し、さらにＣＤ３陽性かつＣＤ４陽性細胞で分画した細胞群に対する、ヒト化Ｌｙｍ２抗体ＬＶ０ＨＶ１による蛍光染色の蛍光強度およびＣＤ４抗体による蛍光染色の蛍光強度をそれぞれ縦軸および横軸に示す。
【図１１】図１１（Ａ）および図１１（Ｂ）は、抗ヒトＣＲＴＨ２モノクローナル抗体のヒト好酸球およびヒト好塩基球に対する細胞傷害活性をフローサイトメトリーで解析した結果を示す。上段はヒト好酸球、下段はヒト好塩基球に対する細胞傷害活性を示す。それぞれの図において、縦軸にコントロールビーズ１０００個あたりの各細胞の個数を、横軸に抗体濃度を示す。○はヒト化Ｌｙｍ２抗体ＬＶ０ＨＶ１、□はｈｕ１９Ａ２  ｖ５２、▲はｈｕ８Ｂ１  ｖ１、△はｃｈ３Ｃ１２、◆はｃｈ３１Ａ５、×はアイソタイプコントロール抗体を示す。
【図１２】図１２（Ａ）および図１２（Ｂ）は、抗ヒトＣＲＴＨ２モノクローナル抗体のヒトＴｈ２およびＴｈ１サイトカイン減少活性を解析した結果を示す。図１２（Ａ）は各抗体を添加した時のＴｈ２サイトカインであるＩＬ−５またはＩＬ−１３の濃度を縦軸に示す。また図１２（Ｂ）は各抗体を添加した時の、Ｔｈ１サイトカインであるＩＦＮ−γの濃度を縦軸に示す。
【図１３】図１３（Ａ）〜図１３（Ｃ）は、ＣＲＴＨ２リガンドであるＤＫＰＧＤ２存在下における抗ヒトＣＲＴＨ２モノクローナル抗体の反応性変化を、ヒトＣＲＴＨ２発現２９３ＥＢＮＡ細胞を用いて、フローサイトメトリーで解析した結果を示す。凡例に示す抗ヒトＣＲＴＨ２モノクローナル抗体の濃度が０．３μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、および３μｇ／ｍＬにおける結果をそれぞれ図１３（Ａ）、図１３（Ｂ）および図１３（Ｃ）に示す。それぞれの図において、縦軸はＤＫＰＧＤ２非存在下での蛍光強度を１００％としたときの蛍光強度の割合を示す。
【図１４】図１４は、ＩｇＥおよびクロスリンク抗体処理により刺激したヒト分化誘導マスト細胞に対する抗ヒトＣＲＴＨ２モノクローナル抗体の反応性をフローサイトメトリーで解析した結果を示す。それぞれの図は、図の上に示す抗体の反応性を示しており、縦軸に細胞数を、横軸に蛍光強度を示す。塗りつぶし部分がアイソタイプコントロール抗体の反応性を、実線で囲まれた部分が抗ヒトＣＲＴＨ２モノクローナル抗体の反応性を、それぞれ示す。
【図１５】図１５は、ヒト分化誘導Ｔｈ１細胞に対する抗ヒトＣＲＴＨ２モノクローナル抗体の反応性をフローサイトメトリーで解析した結果を示す。それぞれの図は、図の上に示す抗体の反応性を示しており、縦軸に細胞数を、横軸に蛍光強度を示す。塗りつぶし部分がアイソタイプコントロール抗体の反応性を、実線で囲まれた部分が抗ヒトＣＲＴＨ２モノクローナル抗体の反応性を、それぞれ示す。
【図１６】図１６は、ヒト好酸球の形態変化を指標にしたＬｙｍ２抗体のアンタゴニスト活性評価の結果を示す。グラフの下に示す各抗体の存在下または非存在下で、凡例に示す濃度のＤＫＰＧＤ２を処理した際に、フローサイトメーター解析における高ＦＳＣ領域に検出される好酸球の割合（％）を縦軸に示す。
【図１７】図１７は、ヒト好酸球の形態変化を指標にしたＬｙｍ２抗体のアゴニスト活性評価の結果を示す。凡例に示す濃度のＬｙｍ２抗体を処理した際に、高ＦＳＣ領域に検出される好酸球の割合（％）を縦軸に示す。
【図１８】図１８（Ａ）〜図１８（Ｃ）はいずれも、ヒト好酸球の形態変化を指標にした抗ヒトＣＲＴＨ２モノクローナル抗体のアゴニスト活性、アンタゴニスト活性およびリガンドによる活性化の増強活性の評価の結果を示す。図１８（Ａ）はヒト化抗体またはキメラ抗体、図１８（Ｂ）はラット抗体、図１８（Ｃ）はマウス抗体についての結果をそれぞれ示す。各図において、縦軸は、ＤＫＰＧＤ２の存在、または非存在下で、凡例に示す各抗ヒトＣＲＴＨ２モノクローナル抗体またはアイソタイプ抗体を処理した際に、フローサイトメーター解析における高ＦＳＣ領域に検出される好酸球の割合（％）を示す。
【図１９】図１９はＣＲＴＨ２発現細胞の膜画分へのＧＴＰγＳまたはＧＤＰ処理による、ＣＲＴＨ２のコンフォメーションの変化がＣＲＴＨ２モノクローナル抗体の反応性に与える影響を、ＥＬＩＳＡ法により解析した結果を示す。縦軸はＧＴＰγＳおよびＧＤＰ未処理時の吸光度を１とした際のＦｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅを示す。横軸はＧＴＰγＳおよびＧＤＰ処理の有無、および、評価抗体（ｈｕ１９Ａ２  ｖ５２およびヒト化Ｌｙｍ２抗体ＬＶ０ＨＶ１）を示す。
【図２０】図２０は、アザミグリーン融合ヒトＣＲＴＨ２発現ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞およびカニクイザルＣＲＴＨ２発現ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞におけるアザミグリーンの発現を、フローサイトメトリーで解析した結果を示す。縦軸に細胞数を、横軸にアザミグリーンの蛍光強度を示す。塗りつぶし部分が親細胞であるＣＨＯ／ＤＧ４４細胞における蛍光強度を、実線で囲まれた部分がアザミグリーン融合ヒトＣＲＴＨ２発現ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞における蛍光強度を、点線で囲まれた部分がアザミグリーン融合カニクイザルＣＲＴＨ２発現ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞における蛍光強度をそれぞれ示す。
【図２１】アザミグリーン融合ヒトＣＲＴＨ２発現ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞およびカニクイザルＣＲＴＨ２発現ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞に対するヒト化Ｌｙｍ２抗体ＬＶ０ＨＶ１およびアイソタイプ抗体の反応性をフローサイトメトリーで解析した結果を示す。○はアザミグリーン融合ヒトＣＲＴＨ２発現ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞に対するＬＶ０ＨＶ１の反応性、●はアザミグリーン融合カニクイザルＣＲＴＨ２発現ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞に対するＬＶ０ＨＶ１の反応性、△はアザミグリーン融合ヒトＣＲＴＨ２発現ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞に対するアイソタイプ抗体の反応性、▲はアザミグリーン融合カニクイザルＣＲＴＨ２発現ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞に対するアイソタイプ抗体の反応性を示し、縦軸は蛍光強度を、横軸は各抗体の抗体濃度を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明におけるヒトＣＲＴＨ２としては、配列番号２またはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＡ７４５１８で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられる。配列番号２またはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＡ７４５１８で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつヒトＣＲＴＨ２の機能を有するポリペプチド並びに配列番号２またはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＡ７４５１８で表されるアミノ酸配列と６０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつヒトＣＲＴＨ２の機能を有するポリペプチドも、本発明におけるヒトＣＲＴＨ２に包含される。
【００２２】
配列番号２またはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＡ７４５１８で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドは、部位特異的変異導入法［Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons (1987-1997)、Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982)、Gene, 34, 315 (1985)、Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)］などを用いて、例えば配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより得ることができる。欠失、置換または付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、好ましくは１個〜数十個、例えば、１〜２０個、より好ましくは１個〜数個、例えば、１〜５個のアミノ酸である。
【００２３】
ヒトＣＲＴＨ２をコードする遺伝子としては、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＢ００８５３５または配列番号１で表される塩基配列が挙げられる。ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＢ００８５３５または配列番号１で表される塩基配列において、１以上の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、かつヒトＣＲＴＨ２の機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含む遺伝子、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＢ００８５３５または配列番号１で表される塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有する塩基配列、好ましくは８０％以上の相同性を有する塩基配列、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつヒトＣＲＴＨ２の機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む遺伝子、並びに配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡからなり、かつヒトＣＲＴＨ２の機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む遺伝子なども本発明のＣＲＴＨ２をコードする遺伝子に包含される。
【００２４】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡをプローブに用いた、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、サザンブロット・ハイブリダイゼーション法、またはＤＮＡマイクロアレイ法などにより得られるハイブリダイズ可能なＤＮＡを意味する。
【００２５】
具体的には、ハイブリダイズしたコロニー若しくはプラーク由来のＤＮＡ、または該配列を有するＰＣＲ産物もしくはオリゴＤＮＡを固定化したフィルターまたはスライドガラスを用いて、０．７〜１．０ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーション［Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons (1987-1997)、DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, OxfordUniversity, (1995)］を行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターまたはスライドグラスを洗浄することにより同定できるＤＮＡを挙げることができる。
【００２６】
ハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＢ００８５３５または配列番号１で表される塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡ、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡを挙げることができる。
【００２７】
真核生物の蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列には、しばしば遺伝子の多型が認められる。本発明において用いられる遺伝子に、このような多型によって塩基配列に小規模な変異を生じた遺伝子も、本発明のヒトＣＲＴＨ２をコードする遺伝子に包含される。
【００２８】
本発明における相同性の数値は、特に明示した場合を除き、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であってよいが、塩基配列については、ＢＬＡＳＴ［J. Mol. Biol., 215, 403 (1990)］においてデフォルトのパラメータを用いて算出される数値など、アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴ２［Nucleic Acids Res., 25, 3389 (1997)、Genome Res., 7, 649 (1997)、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/information3.html］においてデフォルトのパラメータを用いて算出される数値などが挙げられる。
【００２９】
デフォルトのパラメータとしては、Ｇ（Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｏｐｅｎ  ｇａｐ）が塩基配列の場合は５、アミノ酸配列の場合は１１、−Ｅ（Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｅｘｔｅｎｄ  ｇａｐ）が塩基配列の場合は２、アミノ酸配列の場合は１、−ｑ（Ｐｅｎａｌｔｙ  ｆｏｒ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍｉｓｍａｔｃｈ）が−３、−ｒ（ｒｅｗａｒｄ  ｆｏｒ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍａｔｃｈ）が１、−ｅ（ｅｘｐｅｃｔ  ｖａｌｕｅ）が１０、−Ｗ（ｗｏｒｄｓｉｚｅ）が塩基配列の場合は１１残基、アミノ酸配列の場合は３残基、−ｙ［Ｄｒｏｐｏｆｆ（Ｘ）ｆｏｒ  ｂｌａｓｔ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ｂｉｔｓ］がｂｌａｓｔｎ  の場合は２０、ｂｌａｓｔｎ以外のプログラムでは７、−Ｘ（Ｘ  ｄｒｏｐｏｆｆ  ｖａｌｕｅ  ｆｏｒ  ｇａｐｐｅｄ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｉｎ  ｂｉｔｓ）が１５および−Ｚ（ｆｉｎａｌ  Ｘ  ｄｒｏｐｏｆｆ  ｖａｌｕｅ  ｆｏｒ  ｇａｐｐｅｄ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｉｎ  ｂｉｔｓ）がｂｌａｓｔｎの場合は５０、ｂｌａｓｔｎ以外のプログラムでは２５である（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/html/blastcgihelp.html)。
【００３０】
配列番号２またはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＡ７４５１８で示されるアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチドは、当業者に公知の方法によって作製することができる。例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの一部を欠失させ、これを含む発現ベクターを導入した形質転換体を培養することにより作製することができる。また、上記の方法で作製されるポリペプチドまたはＤＮＡに基づいて、上記と同様の方法により、配列番号２またはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＡ７４５１８で示されるアミノ酸配列の部分配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを得ることができる。さらに、配列番号２またはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＡ７４５１８で示されるアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチド、または配列番号２またはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＡ７４５１８で示されるアミノ酸配列の部分配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドは、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）法、ｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔＢｏｃ）法などの化学合成法によって製造することもできる。
【００３１】
ヒトＣＲＴＨ２としての機能としては、そのリガンド、例えばＰＧＤ２との結合により、ヒトＣＲＴＨ２依存的な細胞内シグナルが伝達され、ヒトＣＲＴＨ２を発現する細胞の遊走、該細胞からのサイトカイン産生亢進、または細胞径、細胞表面積などの変化を伴う細胞形態変化が誘導されることなどが挙げられる。
【００３２】
ヒトＣＲＴＨ２の細胞外領域としては、配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１〜３３番目のアミノ酸残基を含むＮ末領域、９５〜１１１番目のアミノ酸残基を含むループ１領域、１６９〜２０６番目のアミノ酸残基を含むループ２領域および２６４〜２８５番目のアミノ酸残基を含むループ３領域が挙げられる［J Immunol, 1999. 162(3): p.1278-86.］。Ｎ末領域、ループ１領域、ループ２領域およびループ３領域として、具体的には、それぞれ、配列番号２で表されるアミノ酸配列における１〜３３番目、９５〜１１１番目、１６９〜２０６番目および２６４〜２８５番目のアミノ酸残基を含むポリペプチド部分が挙げられる。
【００３３】
本発明における抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体等いずれの抗体であってもよいが、好ましくはモノクローナル抗体が挙げられる。本発明の抗体として具体的には、ハイブリドーマにより産生される抗体、または遺伝子組換え技術によって産生される遺伝子組換え抗体を挙げることができる。また遺伝子組換え抗体としては、例えば、遺伝子組換え技術によって作製されるマウス抗体、ラット抗体、ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体などが挙げられる。
【００３４】
モノクローナル抗体とは、単一クローンの抗体産生細胞が分泌する抗体であり、ただ一つのエピトープ（抗原決定基ともいう）を認識し、モノクローナル抗体を構成するアミノ酸配列（１次構造）が均一である。
【００３５】
本発明においてモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマにより生産される抗体、または抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した形質転換体により生産される抗体など、遺伝子組換え技術によって作製される遺伝子組換え抗体を挙げることができる。
【００３６】
ポリクローナル抗体とは、２つ以上のモノクローナル抗体が含まれる抗体群であり、その抗体群を構成する複数の抗体によって複数のエピトープを認識することができる。
本発明においてエピトープとしては、モノクローナル抗体が認識し、結合する単一のアミノ酸配列およびアミノ酸配列からなる立体構造並びに翻訳後修飾により修飾されたアミノ酸配列および該アミノ酸配列からなる立体構造などが挙げられる。
【００３７】
翻訳後修飾により修飾されたアミノ酸配列としては、糖鎖がＯＨ置換基を有するスレオニンおよびセリンに結合したＯ結合型糖鎖、ＮＨ２置換基を有するグルタミンおよびアスパラギンに結合したＮ結合型糖鎖並びに硫酸分子がＯＨ置換基を有するスレオニンに結合した硫酸基などが結合したアミノ酸配列が挙げられる。
【００３８】
本発明の抗体が認識するヒトＣＲＴＨ２のエピトープは、ヒトＣＲＴＨ２の一部のドメインを欠失させた欠損体、ヒトＣＲＴＨ２の一部のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換させた変異体、他のタンパク質由来のドメインと置換させた変異体およびヒトＣＲＴＨ２の部分ペプチド断片等を用いた抗体の結合実験を行うことにより決定することができる。また、本発明の抗体が結合するヒトＣＲＴＨ２のエピトープは、タンパク質分解酵素にて消化したヒトＣＲＴＨ２に本発明の抗体を添加し、既知の質量分析法を用いたエピトープマッピングを行うことにより決定することができる。
【００３９】
本発明の抗体が認識するヒトＣＲＴＨ２のエピトープに含まれるアミノ酸残基としては、例えば該アミノ酸残基の置換により、本発明の抗体の反応性が消失するアミノ酸残基が挙げられる。
【００４０】
本発明における抗体の反応性は、例えば、野生型ヒトＣＲＴＨ２受容体またはアミノ酸置換体を発現する細胞に対する抗体の結合量（野生型及び置換体の発現量に応じて補正される）をフローサイトメトリー等を用いて測定することによって求めることができる。また、抗体の結合量は、固相サンドイッチ法などを用いたラジオイムノアッセイ、または酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）などを用いたヒトＣＲＴＨ２に対する公知の免疫学的検出法、またはＢｉａｃｏｒｅシステム（ジーイーヘルスケア社）などを用いた表面プラズモン共鳴などの方法で確認することができる。
【００４１】
また、公知の免疫学的検出法［Monoclonal Antibodies-Principles and Practice, Third edition, Academic Press(1996)、Antibodies−A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory(1988)、単クローン抗体実験マニュアル,講談社サイエンティフィック(1987)］などを組み合わせて確認することもできる。
【００４２】
本発明における抗体の反応性の消失とは、野生型ヒトＣＲＴＨ２を発現する細胞に対する抗体の反応性と比較して、アミノ酸置換体を発現する細胞に対する抗体の反応性が７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上低下することを示す。
【００４３】
本発明の抗体が結合するエピトープとしては、配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１９２番目のグリシンおよび１９４番目のアスパラギン酸の少なくとも１つのアミノ酸残基を含むエピトープが挙げられる。
【００４４】
また、本発明の抗体が結合するエピトープとして、具体的には、下記の（ａ）〜（ｃ）のエピトープが挙げられる。
（ａ）配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１９２番目のグリシンを含むエピトープ、
（ｂ）配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１９４番目のアスパラギン酸を含むエピトープ、
（ｃ）配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１９２番目のグリシンおよび１９４番目のアスパラギン酸を含むエピトープ。
【００４５】
また、本発明の抗体が結合するエピトープとしては、配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１９２番目のグリシンおよび１９４番目のアスパラギン酸の少なくとも１つのアミノ酸残基を含み、かつ配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１２番目のプロリン、１４番目のロイシン、１５番目のグルタミン酸、１７７番目のアスパラギン酸、１７８番目のグリシン、１７９番目のアルギニン、１８０番目のイソロイシン、１８１番目のメチオニン、１８３番目のチロシン、１８４番目のチロシン、１８５番目のアスパラギン、１８７番目のロイシン、１８８番目のロイシン、１８９番目のロイシン、１９５番目のアルギニン、１９６番目のアスパラギン酸、および１９８番目のスレオニンからなる群から選ばれるアミノ酸残基の少なくとも１つを含むエピトープが挙げられる。
【００４６】
また、本発明の抗体が結合するエピトープとしては配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１９２番目のグリシンおよび１９４番目のアスパラギン酸の少なくとも１つのアミノ酸残基を含み、かつ下記の（ａ）〜（ｇ）の少なくともいずれか１つを含むエピトープが挙げられる。
（ａ）配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１２番目のプロリン、１４番目のロイシンおよび１５番目のグルタミン酸、
（ｂ）配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１７７番目のアスパラギン酸、１７８番目のグリシン、および１７９番目のアルギニン、
（ｃ）配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１８０番目のイソロイシンおよび１８１番目のメチオニン、
（ｄ）配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１８３番目のチロシン、１８４番目のチロシンおよび１８５番目のアスパラギン、
（ｅ）配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１８７番目のロイシン、１８８番目のロイシンおよび１８９番目のロイシン、
（ｆ）配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１９５番目のアルギニン、並びに
（ｇ）配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１９６番目のアスパラギン酸および１９８番目のスレオニン。
【００４７】
また、本発明の抗体が結合するエピトープに含まれる他のアミノ酸残基としては、本発明の抗体がＣＲＴＨ２へ結合する際に、配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列に存在し、かつ実質的に認識し結合しているアミノ酸残基であればいずれのアミノ酸残基でもよく、具体的には配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１２番目のプロリン、１４番目のロイシン、１５番目のグルタミン酸、１７７番目のアスパラギン酸、１７８番目のグリシン、１７９番目のアルギニン、１８０番目のイソロイシン、１８１番目のメチオニン、１８３番目のチロシン、１８４番目のチロシン、１８５番目のアスパラギン、１８７番目のロイシン、１８８番目のロイシン、１８９番目のロイシン、１９２番目のグリシン、１９４番目のアスパラギン酸、１９５番目のアルギニン、１９６番目のアスパラギン酸、および１９８番目のスレオニンからなる群から選ばれるアミノ酸残基と立体構造上近接して存在しているアミノ酸残基、並びに配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１２番目のプロリン、１４番目のロイシン、１５番目のグルタミン酸、１７７番目のアスパラギン酸、１７８番目のグリシン、１７９番目のアルギニン、１８０番目のイソロイシン、１８１番目のメチオニン、１８３番目のチロシン、１８４番目のチロシン、１８５番目のアスパラギン、１８７番目のロイシン、１８８番目のロイシン、１８９番目のロイシン、１９２番目のグリシン、１９４番目のアスパラギン酸、１９５番目のアルギニン、１９６番目のアスパラギン酸、および１９８番目のスレオニンからなる群から選ばれるアミノ酸から選ばれるアミノ酸残基と１次配列上近接しているアミノ酸残基などが挙げられる。
【００４８】
抗体分子はイムノグロブリン（以下、Ｉｇと表記する）とも称され、ヒト抗体は、分子構造の違いに応じて、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４およびＩｇＭのアイソタイプに分類される。アミノ酸配列の相同性が比較的高いＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を総称してＩｇＧともいう。
【００４９】
抗体分子は重鎖（Ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ、以下Ｈ鎖と記す）および軽鎖（Ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ、以下Ｌ鎖と記す）と呼ばれるポリペプチドより構成される。また、Ｈ鎖はＮ末端側よりＨ鎖可変領域（ＶＨとも表記される）、Ｈ鎖定常領域（ＣＨとも表記される）、Ｌ鎖はＮ末端側よりＬ鎖可変領域（ＶＬとも表記される）、Ｌ鎖定常領域（ＣＬとも表記される）の各領域により、それぞれ構成される。
【００５０】
ＣＨは各サブクラスごとに、α、δ、ε、γおよびμ鎖がそれぞれ知られている。ＣＨはさらに、Ｎ末端側よりＣＨ１ドメイン、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインの各ドメインにより構成される。ドメインとは、抗体分子の各ポリペプチドを構成する機能的な構造単位をいう。また、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインを併せてＦｃ領域または単にＦｃという。ＣＬは、Ｃλ鎖およびＣκ鎖が知られている。
【００５１】
本発明の抗体におけるＣＨとしては、Ｉｇに属すればいかなるものでもよいが、ＩｇＧクラスのものが好適であり、さらにＩｇＧクラスに属するＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。
【００５２】
本発明の抗体におけるＣＬのアミノ酸配列としては、ヒト抗体のアミノ酸配列または非ヒト動物抗体のアミノ酸配列のいずれでもよいが、ヒト抗体のアミノ酸配列のＣκまたはＣλが好ましい。
【００５３】
本発明の抗体は配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１９２番目のグリシンおよび１９４番目のアスパラギン酸の少なくとも一方のアミノ酸残基を認識し、結合する抗体である。
【００５４】
本発明の抗体として具体的には、下記の（ａ）〜（ｃ）から選ばれる抗体が挙げられる。
（ａ）配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１９２番目のグリシンを認識し結合する抗体、
（ｂ）配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１９４番目のアスパラギン酸を認識し結合する抗体、
（ｃ）配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１９２番目のグリシンおよび１９４番目のアスパラギン酸の両方を認識し、結合する抗体。
【００５５】
また、本発明の抗体としては、配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１９２番目のグリシンおよび１９４番目のアスパラギン酸の少なくとも１つのアミノ酸残基を認識し、かつ配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１２番目のプロリン、１４番目のロイシン、１５番目のグルタミン酸、１７７番目のアスパラギン酸、１７８番目のグリシン、１７９番目のアルギニン、１８０番目のイソロイシン、１８１番目のメチオニン、１８３番目のチロシン、１８４番目のチロシン、１８５番目のアスパラギン、１８７番目のロイシン、１８８番目のロイシン、１８９番目のロイシン、１９５番目のアルギニン、１９６番目のアスパラギン酸および１９８番目のスレオニンからなる群から選ばれるアミノ酸残基の少なくとも１つを認識し、結合する抗体が挙げられる。
【００５６】
また、本発明の抗体としては配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１９２番目のグリシンおよび１９４番目のアスパラギン酸の少なくとも１つのアミノ酸残基を認識し、かつ下記の（ａ）〜（ｇ）の少なくともいずれか１つを認識して結合する抗体が挙げられる。
（ａ）配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１２番目のプロリン、１４番目のロイシンおよび１５番目のグルタミン酸、
（ｂ）配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１７７番目のアスパラギン酸、１７８番目のグリシン、および１７９番目のアルギニン、
（ｃ）配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１８０番目のイソロイシンおよび１８１番目のメチオニン、
（ｄ）配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１８３番目のチロシン、１８４番目のチロシンおよび１８５番目のアスパラギン、
（ｅ）配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１８７番目のロイシン、１８８番目のロイシンおよび１８９番目のロイシン、
（ｆ）配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１９５番目のアルギニン、および
（ｇ）配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１９６番目のアスパラギン酸および１９８番目のスレオニン。
【００５７】
また本発明の抗体として、具体的には、下記の（ａ）〜（ｄ）から選ばれる抗体が挙げられる。
（ａ）ＶＨの相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ；ＣＤＲ、以下ＣＤＲと略記する）１〜３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号２０、２１および２２で表されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号２３、２４および２５で表されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｂ）前記（ａ）に記載の抗体と競合してヒトＣＲＴＨ２に結合する抗体、
（ｃ）前記（ａ）に記載の抗体が結合するエピトープを含むエピトープに結合する抗体、および
（ｄ）前記（ａ）に記載の抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する抗体。
【００５８】
本発明の上記（ｂ）の抗体とは、上記（ａ）の抗体とヒトＣＲＴＨ２との結合を阻害する抗ヒトＣＲＴＨ２抗体のことを示す。また、本発明の上記（ｃ）の抗体とは、上記（ａ）に記載の抗体を第１抗体、および第１抗体が結合するエピトープを第１エピトープとした場合、当該第１エピトープを含むエピトープに結合する抗体のことを示す。
【００５９】
また本発明の抗体として、具体的には、下記の（ａ）〜（ｃ）から選ばれる抗体が挙げられる。
（ａ）配列番号４９で表されるアミノ酸配列または配列番号４９で表されるアミノ酸配列中の１８番目のロイシンをメチオニンに、７７番目のアスパラギンをセリンに、９３番目のバリンをスレオニンに、および１１７番目のスレオニンをバリンに置換する改変から選ばれる少なくとも１つの改変が導入されたアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号３３で表されるアミノ酸配列または配列番号３３で表されるアミノ酸配列中の２番目のイソロイシンをバリンに、４番目のメチオニンをロイシンに、１５番目のプロリンをロイシンに、および８５番目のアラニンをプロリンに置換する改変から選ばれる少なくとも１つの改変が導入されたアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体、
（ｂ）配列番号４９、５１、５３、５５、５７および５９で表されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むＶＨ並びに配列番号３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５および４７で表されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むＶＬを含む抗体、並びに
（ｃ）配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１９で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体。
【００６０】
上記（ｂ）の抗体として、好ましくは以下の（１）〜（３）から選ばれる抗体が挙げられる。
（１）配列番号４９で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ並びに配列番号３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５および４７で表されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むＶＬを含む抗体、
（２）配列番号５９で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ並びに配列番号３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５および４７で表されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むＶＬを含む抗体、並びに
（３）配列番号５１、５３、５５および５７で表されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むＶＨ並びに配列番号３３で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体。
上記（ｂ）の抗体として、特に好ましくは、配列番号５１で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号３３で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体が挙げられる。
【００６１】
本発明の抗体としては、ヒトＣＲＴＨ２の１９２番目のグリシンおよび１９４番目のアスパラギン酸の少なくとも一方をアラニンに置換したアミノ酸置換体に対し反応性が消失する抗体が挙げられる。
【００６２】
また、本発明の抗体には、ヒトＣＲＴＨ２のリガンド存在下で、ヒトＣＲＴＨ２への反応性が低下しない抗体が包含される。ヒトＣＲＴＨ２のリガンド存在下でヒトＣＲＴＨ２への反応性が低下しない抗体は、ヒトＣＲＴＨ２への反応性が低下する抗体に比べて、炎症局所のようにヒトＣＲＴＨ２のリガンドが高濃度で存在する条件下でも、高い反応性を示すことができる。従って、ヒトＣＲＴＨ２リガンド非依存的にヒトＣＲＴＨ２へ特異的に結合することができ、薬効を発揮することができる。
【００６３】
本発明において、ヒトＣＲＴＨ２のリガンド存在下で抗体の反応性が低下するとは、ヒトＣＲＴＨ２のリガンド非存在下でのヒトＣＲＴＨ２発現細胞に対する抗体の反応性と比較して、ヒトＣＲＴＨ２のリガンド存在下での該反応性が少なくとも５％以上低下することを示す。より厳密には１０％以上低下することを示す。
【００６４】
ヒトＣＲＴＨ２のリガンドとしては、ヒトＣＲＴＨ２に特異的に結合するものであればいずれも包含されるが、好ましくはＰＧＤ２またはＤＫＰＧＤ２が挙げられる。より好ましくはＤＫＰＧＤ２が挙げられる。
本発明において、活性化状態または不活性化状態のヒトＣＲＴＨ２に対する反応性が変化しないとは、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）もしくはＧＤＰアナログまたはグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）もしくはＧＴＰアナログ存在下と非存在下で、抗体の、ヒトＣＲＴＨ２に対する反応性が変化しないことをいう。
ＧＤＰアナログとしては例えばグアノシン  ５’−Ｏ−（β−チオ）二リン酸（ＧＤＰβＳ）が挙げられる。ＧＴＰアナログとしては、例えばグアノシン  ５’−Ｏ−（γ−チオ）三リン酸（ＧＴＰγＳ）が挙げられる。
【００６５】
本発明の抗体には、中和活性を有しない抗体、アゴニスト活性を有しない抗体、ヒトＣＲＴＨ２のリガンドによるシグナルを増強しない抗体、または活性化状態または不活性化状態のヒトＣＲＴＨ２に対する反応性が変化しない抗体が包含される。
【００６６】
本発明において、抗体の中和活性とは、抗体が持つヒトＣＲＴＨ２の生物活性を阻害する活性のことをいう。例えば、ヒトＣＲＴＨ２とそのリガンドとの結合を阻害する活性や、ヒトＣＲＴＨ２によるシグナル伝達を阻害する活性などのアンタゴニスト活性をいう。
【００６７】
本発明において、アゴニスト活性とは、ヒトＣＲＴＨ２のリガンドの生物学的活性を模倣する活性をいい、ＣＲＴＨ２の活性化及び、活性化に伴う種々の反応を誘導する活性をいう。本発明におけるアゴニスト活性として、具体的には細胞遊走活性、細胞の形態変化誘導活性などが挙げられる。
【００６８】
本発明において、ヒトＣＲＴＨ２のリガンドによるシグナルとは、ヒトＣＲＴＨ２のリガンドがヒトＣＲＴＨ２に結合し、ヒトＣＲＴＨ２を活性化させることに伴うシグナルのことをいう。
【００６９】
ヒトＣＲＴＨ２のリガンドによるシグナルおよびアゴニスト活性は、ヒトＣＲＴＨ２の活性化に伴う種々の反応を解析することにより評価できる。例えば、ヒトＣＲＴＨ２発現細胞の形態変化を解析することにより評価できる。
【００７０】
ヒトＣＲＴＨ２発現細胞としては、ヒトＣＲＴＨ２を発現していればいずれの細胞でもよいが、例えば、好酸球、好塩基球、Ｔｈ２細胞、２型自然リンパ球（ＩＬＣ２）、ｎｏｎｃｌａｓｓｉｃａｌ  ｍｏｎｏｃｙｔｅ、Ｔｈ２／Ｔｈ１７細胞などが挙げられる。
【００７１】
本発明において、抗体がヒトＣＲＴＨ２のリガンドによるシグナルを増強しないとは、ヒトＣＲＴＨ２に対し、ヒトＣＲＴＨ２のリガンドを単独で作用させたときと比べ、ヒトＣＲＴＨ２のリガンドと抗体を共に作用させたときに、ヒトＣＲＴＨ２の活性化及び、該活性化に伴う種々の反応を増強しないことを指す。
【００７２】
本発明の抗体には、ヒトＣＲＴＨ２発現細胞に対し細胞傷害活性を示す抗体が含まれる。本発明における細胞傷害活性としては、補体依存性細胞傷害活性（以下、ＣＤＣ活性と表記する）あるいは抗体依存性細胞傷害活性（以下、ＡＤＣＣ活性と表記する）などが挙げられる。
【００７３】
本発明におけるＣＤＣ活性としては、細胞表面上のヒトＣＲＴＨ２に結合した抗体分子が、Ｆｃ部分を介して補体系のＣ１ｑに結合し、その結果、Ｃ１からＣ９の各補体成分が活性化し、最終的にはＣ５からＣ９が膜侵襲複合体と呼ばれる孔形成重合体を細胞膜上で形成して細胞溶解を引き起こす反応が挙げられる［Immunol Today. 1999 Dec;20(12):576-82.］。
【００７４】
本発明におけるＡＤＣＣ活性としては、細胞表面上のヒトＣＲＴＨ２に結合した抗体分子が、Ｆｃ部分を介して、Ｆｃ受容体を発現した、例えば、ナチュラルキラー細胞（以下、ＮＫ細胞と表記する）などを活性化することによる、パーフォリンやグランザイムなどの細胞傷害性分子の放出や貪食作用の亢進などによって生じる細胞傷害反応が挙げられる［Chemical Immunology, 65, 88 (1997)；Immunol Today, 20, 576 (1999)］。
【００７５】
本発明の抗体にはマスト細胞に対する細胞傷害性を有しない抗体が含まれる。このような抗体は、マスト細胞の傷害に起因する炎症性メディエーターの遊離による副作用の懸念が無いという利点を有する。
【００７６】
本発明の抗体には抗体のＦｃ領域にＮ−グリコシド結合糖鎖が結合し、該Ｎ−グリコシド結合糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない抗体が包含される。抗体のＦｃ領域にＮ−グリコシド結合糖鎖が結合し、該Ｎ−グリコシド結合糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない抗体としては、例えばα１，６−フコース転移酵素遺伝子が欠損したＣＨＯ細胞（国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第０２／３１１４０号）を用いて作製される抗体が挙げられる。抗体のＦｃ領域にＮ−グリコシド結合糖鎖が結合し、該Ｎ−グリコシド結合糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない本発明の抗体は、高いＡＤＣＣ活性を有する。
【００７７】
本発明の抗体には抗体のＦｃ領域のアミノ酸残基を、Ｆｃ受容体との結合活性が高くなるように改変した抗体が包含される。抗体のＦｃ領域のアミノ酸残基を、Ｆｃ受容体との結合活性が高くなるように改変した抗体としては、例えば米国特許第７３１７０９１号明細書記載の方法で作製された抗体分子を挙げることができる。
【００７８】
本発明の抗体には、抗体の可変領域を含むポリペプチドの表面電荷や早期エンドソーム内でのｐＨにおける抗原結合活性を改変し血中半減期が伸びた抗体が包含される。
【００７９】
抗体分子の可変領域を含むポリペプチドの表面電荷や早期エンドソーム内でのｐＨにおける抗原結合活性を改変し血中半減期が延びた抗体としては、例えば特開２０１３−１６５７１６号公報、特開２０１２−０２１００４号公報記載の方法で作製された抗体を挙げることができる。
【００８０】
本発明の抗体には、ヒト型キメラ抗体（以下、単にキメラ抗体とも表記する）、ヒト型ＣＤＲ移植抗体（以下ヒト化抗体とも表記する）およびヒト抗体などの遺伝子組換え抗体が包含される。
【００８１】
キメラ抗体は、ヒト以外の動物（非ヒト動物）の抗体のＶＨおよびＶＬとヒト抗体のＣＨとおよびＣＬからなる抗体をいう。非ヒト動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビット等、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
【００８２】
本発明のキメラ抗体は、ヒトＣＲＴＨ２に特異的に反応するヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してキメラ抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
【００８３】
ヒト化抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲをヒト抗体のＶＨおよびＶＬの適切な位置に移植した抗体を意味する。
【００８４】
本発明のヒト化抗体は、ヒトＣＲＴＨ２に特異的に反応するヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲを任意のヒト抗体のＶＨおよびＶＬのフレームワーク（以下、ＦＲと表記する）に移植した可変領域（以下Ｖ領域とも表記する）をコードするｃＤＮＡを構築し、ＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡを有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト化抗体発現ベクターを構築し、該発現ベクターを動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
【００８５】
ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列としては、ヒト抗体由来のアミノ酸配列であれば、いかなるものでも用いることができる。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ
Ｂａｎｋなどのデータベースに登録されているヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列、またはヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲの各サブグループの共通アミノ酸配列（Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991）などが挙げられる。
【００８６】
これらのアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、付加、置換または挿入され、かつヒトＣＲＴＨ２と特異的に結合して、かつ、例えば、細胞傷害活性等の生物活性において同等の機能を有する抗体または該抗体断片も本発明の抗体に包含される。
【００８７】
本発明の抗体にはサルＣＲＴＨ２に結合する抗体が包含される。サルＣＲＴＨ２としては例えばマーモセットＣＲＴＨ２、カニクイザルＣＲＴＨ２およびアカゲザルＣＲＴＨ２が挙げられる。好ましくはカニクイザルＣＲＴＨ２が挙げられる。
【００８８】
本発明の抗体としては、Ｆｃと抗体断片とが結合したＦｃ融合タンパク質、Ｆｃと天然に存在するリガンドまたは受容体とが結合したＦｃ融合タンパク質（イムノアドヘシンともいう）、複数のＦｃ領域を融合させたＦｃ融合タンパク質等も本発明に包含される。また、抗体を安定化させるためまたは血中半減期を制御するためにアミノ酸残基置換を行ったアミノ酸残基改変を含む改変Ｆｃ領域なども本発明の抗体に用いることができる。
【００８９】
本発明において、抗体断片とは、配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１９２番目のグリシンおよび１９４番目のアスパラギン酸の少なくとも一方を認識し、結合する抗原結合ドメインを含み、且つ抗原結合活性を有する断片である。本発明の抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆｖ（以下、ｓｃＦｖと記す）、ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｓＦｖおよび複数のＣＤＲを含むペプチドなどが挙げられる。
【００９０】
Ｆａｂは、ＩｇＧを蛋白質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２２４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｈ鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体がジスルフィド結合で結合した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
【００９１】
本発明のＦａｂは、本発明のヒトＣＲＴＨ２に特異的に結合する抗体を蛋白質分解酵素パパインで処理して得ることができる。または、該抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
【００９２】
Ｆ（ａｂ’）２は、ＩｇＧを蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２３４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｆａｂがヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合されたものよりやや大きい、分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
【００９３】
本発明のＦ（ａｂ’）２は、本発明のヒトＣＲＴＨ２に特異的に結合する抗体を蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得ることができる。または、下記のＦａｂ’をチオエーテル結合あるいはジスルフィド結合させ、作製することができる。
【００９４】
Ｆａｂ’は、上記Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明のＦａｂ’は、本発明のヒトＣＲＴＨ２に特異的に結合するＦ（ａｂ’）２組成物を還元剤ジチオスレイトール処理して得ることができる。または、該抗体のＦａｂ’断片をコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
【００９５】
ｓｃＦｖは、１本のＶＨと１本のＶＬとを４個のＧｌｙおよび１個のＳｅｒ残基からなるリンカー（Ｇ４Ｓ）を任意の個数つなげたリンカーペプチドなどの適当なペプチドリンカー（Ｐ）を用いて連結した、ＶＨ−Ｐ−ＶＬないしはＶＬ−Ｐ−ＶＨポリペプチドで、抗原結合活性を有する抗体断片である。
【００９６】
本発明のｓｃＦｖは、本発明のヒトＣＲＴＨ２に特異的に結合する抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
【００９７】
ｄｉａｂｏｄｙは、ｓｃＦｖが二量体化した抗体断片で、二価の抗原結合活性を有する抗体断片である。二価の抗原結合活性は、同一であることもできるし、一方を異なる抗原結合活性とすることもできる。
【００９８】
本発明のｄｉａｂｏｄｙは、本発明のヒトＣＲＴＨ２に特異的に結合する抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡをＰのアミノ酸配列の長さが８残基以下となるように構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターまたは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
【００９９】
ｄｓＦｖは、ＶＨおよびＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを該システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基はＲｅｉｔｅｒらにより示された方法（Protein Engineering, 7,697-704, 1994）に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。
【０１００】
本発明のｄｓＦｖは、本発明のヒトＣＲＴＨ２に特異的に結合する抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｄｓＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターまたは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
【０１０１】
ＣＤＲを含むペプチドは、ＶＨまたはＶＬのＣＤＲの少なくとも１領域以上を含んで構成される。複数のＣＤＲを含むペプチドは、直接または適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。
【０１０２】
本発明のＣＤＲを含むペプチドは、本発明のヒトＣＲＴＨ２に特異的に結合する抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
【０１０３】
また、ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）などの化学合成法によって製造することもできる。
【０１０４】
上述の抗体または該抗体断片を構成するアミノ酸配列において、１つ以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加され、かつ上述の抗体または該抗体断片と同様な活性を有するモノクローナル抗体または該抗体断片も、本発明の抗体または該抗体断片に包含される。欠失、置換、挿入または付加されるアミノ酸の数は１個以上でありその数は特に限定されないが、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79, 6409 (1982)、Gene, 34, 315 (1985)、Nucleic Acids Research, 13,4431 (1985)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)等に記載の部位特異的変異導入法等の周知の技術により、欠失、置換もしくは付加できる程度の数であり、例えば、１〜数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
【０１０５】
本発明のヒトＣＲＴＨ２または抗体のアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入または付加されたとは、同一配列中の任意かつ１もしくは複数のアミノ酸配列中において、１または複数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入または付加があることを意味し、欠失、置換、挿入または付加が同時に生じてもよく、置換、挿入または付加されるアミノ酸残基は天然型と非天然型とを問わない。
【０１０６】
天然型アミノ酸残基としては、例えば、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−システインなどが挙げられる。
【０１０７】
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の好ましい例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸、２−アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
【０１０８】
本発明の形質転換体としては、ヒトＣＲＴＨ２に特異的に結合する抗体分子をコードするＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる形質転換体であって、本発明の抗体を生産する形質転換体であればいかなる形質転換体でも包含される。具体的な例としては、ヒトＣＲＴＨ２に特異的に結合する抗体分子をコードするＤＮＡを以下の（ａ）〜（ｉ）などの宿主細胞に導入して得られる形質転換体が好例として挙げられる。
（ａ）チャイニーズハムスター卵巣組織由来ＣＨＯ細胞；
（ｂ）ラットミエローマ細胞株ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞；
（ｃ）マウスミエローマ細胞株ＮＳ０細胞；
（ｄ）マウスミエローマ細胞株ＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞；
（ｅ）シリアンハムスター腎臓組織由来ＢＨＫ細胞；
（ｆ）抗体を産生するハイブリドーマ細胞；
（ｇ）ヒト白血病細胞株ナマルバ細胞；
（ｈ）胚性幹細胞；
（ｉ）受精卵細胞。
【０１０９】
また、抗体のＦｃ領域にＮ−グリコシド結合糖鎖が結合し、該Ｎ−グリコシド結合糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない抗体を生産する本発明の形質転換体としては、ヒトＣＲＴＨ２に特異的に結合する抗体分子をコードするＤＮＡを国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第０２／３１１４０号に記載の方法で作製された糖転移酵素の低下または欠損した宿主細胞に導入して得られる形質転換体が好例として挙げられる。
【０１１０】
本発明の抗体または該抗体断片の製造法としては、本発明の抗体または該抗体断片を生産する形質転換体を培養する製造方法であれば、いかなる抗体製造方法でも包含されるが、好例として、本発明の抗体または該抗体断片を生産する形質転換体を培養し、培養物中に抗体または該抗体断片を生成蓄積させ、該抗体または該抗体断片を採取し、精製する抗体または該抗体断片の製造方法が挙げられる。
【０１１１】
上記製造法により製造される抗体または該抗体断片も、本発明の抗体または該抗体断片として挙げられる。
【０１１２】
本発明の組成物としては、本発明の抗体または該抗体断片を含む組成物であればいずれの組成物であってもよく、抗体に結合する糖鎖が単一の抗体分子を含む組成物、または複数の糖鎖構造を有する抗体分子を含む組成物であってもよい。また、適当な添加剤、バッファー等を含む組成物であってもよい。本発明の組成物としては、好ましくは本発明の抗体または該抗体断片を有効成分として含有する医薬、診断薬等が挙げられる。
【０１１３】
本発明の医薬または診断薬としては、本発明の抗体または該抗体断片を有効成分として含有する医薬または診断薬であればいかなる医薬または診断薬も含有される。好例として、ヒトＣＲＴＨ２発現細胞に関連した疾患の医薬または診断薬が挙げられる。
【０１１４】
本発明の治療方法としては、本発明の抗体または該抗体断片を有効量投与する治療方法であればいかなる治療方法も含まれるが、好ましくは、ヒトＣＲＴＨ２発現細胞に関連した疾患の治療方法が挙げられる。
【０１１５】
本発明の抗体または該抗体断片の使用としては、ヒトＣＲＴＨ２発現細胞に関連した疾患の治療薬を製造するための本発明の抗体または該抗体断片の使用であれば、いかなる抗体または該抗体断片の使用も含まれる。また、本発明の抗体または該抗体断片はヒトＣＲＴＨ２発現細胞が関係する障害または疾患の治療および予防の少なくとも一方に用いることができる。
【０１１６】
ヒトＣＲＴＨ２発現細胞が関係する障害または疾患としては、限定するものではないが、例えば、アレルギー性疾患、自己免疫疾患、好酸球増多および機能亢進の少なくとも一方を伴う疾患、Ｔｈ２細胞の増多および機能亢進の少なくとも一方を伴う疾患並びにＩＬＣ２の増多および機能亢進の少なくとも一方を伴う疾患などが挙げられる。
【０１１７】
より具体的には、例えば、アレルギー性又は非アレルギー性鼻炎又は副鼻腔炎、慢性副鼻腔炎又は鼻炎、鼻ポリープ、鼻ポリープを伴う慢性副鼻腔炎、抗酸球性副鼻腔炎、急性副鼻腔炎、喘息、小児喘息、アレルギー性気管支炎、肺胞炎、農夫の疾患（Ｆａｒｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、過敏性気道、感染、例えば、細菌又はウイルス又は蠕虫又は真菌又は原生動物その他の病原に起因するアレルギー性結膜炎、気管支炎又は肺臓炎、気管支拡張症、成人呼吸促迫症候群、気管支及び肺浮腫、様々な起源、例えば毒ガス、蒸気の吸引、吸入に起因する気管支炎又は肺臓炎又は間質性肺臓炎、心不全、Ｘ線、放射線、化学療法に起因する気管支炎又は肺臓炎又は間質性肺臓炎、膠原病、例えばエリテマトーデス、全身性強皮症に関連する気管支炎又は肺臓炎又は間質性肺臓炎、肺線維症、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、様々な起源の間質性肺疾患又は間質性肺臓炎、例えば、石綿肺症、珪肺症、ｍ．Ｂｏｅｃｋ又はサルコイドーシス、肉芽腫症、嚢胞性線維症又はムコビシドーシス、又はα１−抗トリプシン欠乏症、好酸球性セルライト（例えば、Ｗｅｌｌ症候群）、好酸球性肺炎（例えば、Ｌｏｅｆｆｌｅｒ症候群、慢性好酸球性肺炎）、好酸球性筋膜炎（例えば、Ｓｈｕｌｍａｎ症候群）、抗酸球性食道炎、抗酸球増加症候群、遅延型過敏、非アレルギー性喘息、運動誘発性気管支収縮；慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、急性気管支炎、慢性気管支炎、肺気腫；全身性アナフィラキシー又は過敏性反応、薬物アレルギー（例えば、ペニシリン、セファロスポリンに対して）、汚染トリプトファンの摂取による好酸球増多筋痛症候群、昆虫刺傷アレルギー；自己免疫疾患、例えば関節リウマチ、乾癬性関節炎、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、免疫性血小板減少症（成人ＩＴＰ、新生児血小板減少症、小児ＩＴＰ）、免疫性溶血性貧血（自己免疫及び薬物誘発）、Ｅｖａｎｓ症候群（血小板及び赤血球免疫性血球減少症）、新生児のＲｈ疾患、Ｇｏｏｄｐａｓｔｕｒｅ症候群（抗ＧＢＭ疾患）、セリアック病（Ｃｅｌｉａｃ）、自己免疫性心筋症、若年発症糖尿病；糸球体腎炎、自己免疫性甲状腺炎、ベーチェット病；移植片拒絶（例えば、移植において）、例えば、同種移植片拒絶又は移植片対宿主病；炎症性腸疾患、例えばクローン病及び潰瘍性大腸炎；脊椎関節症；強皮症；乾癬（Ｔ細胞媒介乾癬を含めて）及び炎症性皮膚病、例えば、皮膚炎、湿疹、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、蕁麻疹（例えば、慢性突発性、慢性自発性、物理的蕁麻疹）、水疱性類天疱瘡；血管炎（例えば、壊死性、皮膚性、肉芽腫性及び過敏性血管炎、抗酸球性多発血管炎性肉芽腫症）；結節性紅斑；好酸球性筋炎、好酸球性筋膜炎、皮膚又は器官の白血球浸潤を伴う癌を含めた炎症性又はアレルギー性疾患及び状態が挙げられる。
【０１１８】
ヒトＣＲＴＨ２発現細胞が関係する障害または疾患として、好ましくは喘息、小児喘息、慢性閉塞性肺疾患、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎および急性または慢性副鼻腔炎が挙げられる。
本発明の抗体もしくは該抗体断片、又はこれらの誘導体を含有する医薬は、有効成分としての該抗体もしくは該抗体断片、又はこれらの誘導体のみを含むものであってもよいが、通常は薬理学的に許容される１以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野において公知の方法により製造した医薬製剤として提供される。
【０１１９】
投与経路としては、例えば、経口投与、又は口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内、静脈内、若しくは腹腔内などの非経口投与が挙げられる。投与形態としては、例えば、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、坐剤、注射剤、軟膏、又はテープ剤などが挙げられる。  
【０１２０】
経口投与に適当な製剤としては、例えば、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、又は顆粒剤などでが挙げられる。  
【０１２１】
本発明の抗体には、本発明の抗体またはその抗体断片に放射性同位元素、低分子の薬剤、高分子の薬剤、蛋白質、核酸などを化学的または遺伝子工学的に結合させた抗体の誘導体を包含する。
【０１２２】
抗体の誘導体を治療方法、予防方法、治療薬または治療薬として使用する場合には、本発明の抗体またはその抗体断片に結合する薬剤として、化学療法剤、抗体医薬、免疫賦活剤、高分子の薬剤などが挙げられる。タンパク質としては、サイトカイン、増殖因子、毒素タンパク質などが挙げられる。核酸としては、デコイ、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどが挙げられる。
抗体の誘導体を検出方法、定量方法、検出用試薬、または定量用試薬として使用する場合には、本発明の抗体またはその抗体断片に結合する薬剤として、通常の免疫学的検出または測定法で用いられる標識体が挙げられる。
【０１２３】
本発明における、抗体の誘導体は、本発明の抗体またはその抗体断片のＨ鎖またはＬ鎖のＮ末端側またはＣ末端側、抗体またはその抗体断片中の適当な置換基または側鎖、さらには抗体または該抗体断片中の糖鎖などに、放射性同位元素、低分子の薬剤、高分子の薬剤、蛋白質などを化学的手法［抗体工学入門、地人書館（１９９４）記載の方法など］により結合させることにより製造することができる。
【０１２４】
また、本発明における、抗体の誘導体は、本発明の抗体または抗体断片をコードするＤＮＡと、結合させたい蛋白質をコードするＤＮＡを連結させて発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを適当な宿主細胞へ導入し、発現させる遺伝子工学的手法より製造することができる。
【０１２５】
放射性同位元素としては、例えば、１３１Ｉ、１２５Ｉ、９０Ｙ、６４Ｃｕ、９９Ｔｃ、７７Ｌｕ、または２１１Ａｔなどが挙げられる。放射性同位元素は、クロラミンＴ法などによって抗体に直接結合させることができる。また、放射性同位元素をキレー卜する物質を抗体に結合させてもよい。キレート剤としては、例えば、１−イソチオシアネートベンジル−３−メチルジエチレン卜リアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）などが挙げられる。
【０１２６】
低分子の薬剤としては、例えば、アクリジニウムエステルもしくはロフィンなどの発光物質、またはフルオレセインイソチオシアネ一卜（ＦＩＴＣ）もしくはテトラメチルローダミンイソチオシアネ一卜（ＲＩＴＣ）などの蛍光物質などが挙げられる。
【０１２７】
低分子の薬剤と抗体とを結合させる方法としては、例えば、グルタールアルデヒドを介して薬剤と抗体のアミノ基聞を結合させる方法、または水溶性カルボジイミドを介して薬剤のアミノ基と抗体のカルボキシル基を結合させる方法などが挙げられる。
【０１２８】
高分子の薬剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧと表記する）、アルブミン、デキストラン、ポリオキシエチレン、スチレンマレイン酸コポリマ一、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマ一、またはヒドロキシプロピルメタクリルアミドなどが挙げられる。
【０１２９】
免疫学的検出または測定方法とは、標識を施した抗原または抗体を用いて、抗体量または抗原量を検出または測定する方法である。免疫学的検出または測定方法としては、放射性物質標識免疫抗体法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡまたはＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、発光免疫測定法（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、ウエスタンブロット法または物理化学的手法などが挙げられる。
【０１３０】
本発明の抗体または該抗体断片を用いて、上記の方法に従いヒトＣＲＴＨ２が発現した細胞を検出または測定することにより、ヒトＣＲＴＨ２が関連する疾患を診断することができる。
【０１３１】
本発明においてヒトＣＲＴＨ２を検出または測定する対象となる生体試料としては、組織細胞、血液、血漿、血清、膵液、尿、糞便、組織液、肺胞洗浄液または培養液など、細胞外に分泌されたヒトＣＲＴＨ２もしくはその一部を含むペプチド断片、又はヒトＣＲＴＨ２を発現している細胞を含む可能性のあるものであれば特に限定されない。
【０１３２】
本発明の抗体若しくはその抗体断片、またはこれらの誘導体を含有する診断薬は、目的の診断法に応じて、抗原抗体反応を行なうための試薬、該反応の検出用試薬を含んでもよい。抗原抗体反応を行なうための試薬としては、緩衝剤、塩などが挙げられる。検出用試薬としては、該抗体若しくはその抗体断片、またはこれらの誘導体を認識する標識された二次抗体、または標識に対応した基質などの通常の免疫学的検出または測定法に用いられる試薬が挙げられる。
【０１３３】
以下に、本発明の抗体の製造方法、疾患の治療方法、及び疾患の診断方法について、具体的に説明する。
【０１３４】
１．抗体の製造方法
（１）抗原の調製
抗原となるヒトＣＲＴＨ２又はヒトＣＲＴＨ２を発現させた細胞は、ヒトＣＲＴＨ２全長又はその部分長をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを、大腸菌、酵母、昆虫細胞、又は動物細胞などに導入することにより、得ることができる。
【０１３５】
また、ヒトＣＲＴＨ２を多量に発現している各種ヒト培養細胞、ヒト組織などからヒトＣＲＴＨ２を精製することによっても、得ることができる。また、該培養細胞、又は該組織などをそのまま抗原として用いることもできる。さらに、Ｆｍｏｃ法、又はｔＢｏｃ法などの化学合成法によりヒトＣＲＴＨ２の部分配列を有する合成ペプチドを調製し、抗原に用いることもできる。
【０１３６】
ヒトＣＲＴＨ２またはヒトＣＲＴＨ２の部分配列を有する合成ペプチドには、Ｃ末端もしくはＮ末端にＦＬＡＧもしくはＨｉｓなどの公知のタグが付加されていてもよい。
【０１３７】
本発明で用いられるヒトＣＲＴＨ２は、Molecular Cloning、A Laboratory Manual、Second Edition、Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)又はCurrent Protocols in molecular Biology、John Wiley ＆ Sons (1987-1997)などに記載された方法などを用い、例えば以下の方法により、該ヒトＣＲＴＨ２をコードするＤＮＡを宿主細胞中で発現させて、製造することができる。
【０１３８】
まず、ヒトＣＲＴＨ２をコードする部分を含む完全長ｃＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。上記完全長ｃＤＮＡの代わりに、完全長ｃＤＮＡをもとにして調製された、ポリペプチドをコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を用いてもよい。次に、得られる該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、ポリペプチドを生産する形質転換体を得ることができる。
【０１３９】
発現ベクターとしては、使用する宿主細胞における自律複製又は染色体中への組込みが可能で、ポリペプチドをコードするＤＮＡを転写できる位置に、適当なプロモーターを含有しているものであればいずれも用いることができる。
【０１４０】
宿主細胞としては、大腸菌などのエシェリヒア属などに属する微生物、酵母、昆虫細胞、又は動物細胞など、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。
【０１４１】
大腸菌などの原核生物を宿主細胞として用いる場合、組換えベクターは、原核生物中で自律複製が可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、ヒトＣＲＴＨ２をコードする部分を含むＤＮＡ、及び転写終結配列を含むベクターであることが好ましい。
【０１４２】
また、該組換えベクターには、転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。さらに、該組換えベクターには、プロモーターを制御する遺伝子を含んでいてもよい。
【０１４３】
該組換えベクターとしては、リボソーム結合配列であるシャイン・ダルガルノ配列（ＳＤ配列ともいう）と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
【０１４４】
また、該ヒトＣＲＴＨ２をコードするＤＮＡの塩基配列としては、宿主内での発現に最適なコドンとなるように塩基を置換することができ、これにより目的とするヒトＣＲＴＨ２の生産率を向上させることができる  
【０１４５】
発現ベクターとしては、使用する宿主細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができ、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（以上、ロシュ・ダイアグノスティックス社）、ｐＫＫ２３３−２（ファルマシア社）、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社）、ｐＧＥＭＥＸ−１（プロメガ社）、ｐＱＥ−８（キアゲン社）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００号公報）、ｐＫＹＰ２００［Agricultural Biological Chemistry、48、669(1984)］、ｐＬＳＡ１［Agric Biol. Chem.、53、277(1989)］、ｐＧＥＬ１［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）（ストラタジーン社）、ｐＴｒｓ３０［大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０７）より調製］、ｐＴｒｓ３２［大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０８）より調製］、ｐＧＨＡ２［大腸菌ＩＧＨＡ２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４００）より調製、特開昭６０−２２１０９１号公報］、ｐＧＫＡ２［大腸菌ＩＧＫＡ２（ＦＥＲＭ  ＢＰ６７９８）より調製、特開昭６０−２２１０９１号公報］、ｐＴｅｒｍ２（米国特許第４６８６１９１号明細書、米国特許第４９３９０９４号明細書、米国特許第５１６０７３５号明細書）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＥＧ４００［J.Bacteriol., 172, 2392 (1990)］、ｐＧＥＸ（ファルマシア社）、ｐＥＴシステム（ノバジェン社）、又はｐＭＥ１８ＳＦＬ３などが挙げられる。  
【０１４６】
プロモーターとしては、使用する宿主細胞中で機能を発揮できるものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、又はＴ７プロモーターなどの、大腸菌又はファージなどに由来するプロモーターを挙げることができる。また、Ｐｔｒｐを２つ直列させたタンデムプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、又はｌｅｔＩプロモーターなどの人為的に設計改変されたプロモーターなども用いることができる。
【０１４７】
宿主細胞としては、例えば、大腸菌ＸＬ−１Ｂｌｕｅ、大腸菌ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、大腸菌ＤＨ１、大腸菌ＭＣ１０００、大腸菌ＫＹ３２７６、大腸菌Ｗ１４８５、大腸菌ＪＭ１０９、大腸菌ＨＢ１０１、大腸菌Ｎｏ．４９、大腸菌Ｗ３１１０、大腸菌ＮＹ４９、又は大腸菌ＤＨ５αなどが挙げられる。  
【０１４８】
宿主細胞への組換えベクターの導入方法としては、使用する宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972); Gene, 17, 107 (1982); Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979)］が挙げられる。  
【０１４９】
動物細胞を宿主として用いる場合、発現ベクターとしては、動物細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができ、例えば、ｐｃＤＮＡ  Ｉ、ｐｃＤＭ８（フナコシ社）、ｐＡＧＥ１０７［特開平０３−２２９７９号公報； Cytotechnology, 3, 133 (1990)］、ｐＡＳ３−３（特開平０２−２２７０７５号公報）、ｐｃＤＭ８［Nature, 329, 840 (1987)］、ｐｃＤＮＡ  Ｉ／Ａｍｐ（インビトロジェン社）、ｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社）、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社）、ｐＡＧＥ１０３［J. Biochemistry, 101, 1307 (1987)］、ｐＡＧＥ２１０、ｐＭＥ１８ＳＦＬ３、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（国際公開第９７／１０３５４号）、Ｎ５ＫＧ１ｖａｌ（米国特許第６００１３５８号明細書）、ＩＮＰＥＰ４（Ｂｉｏｇｅｎ−ＩＤＥＣ社）およびトランスポゾンベクター（国際公開第２０１０／１４３６９８号）などが挙げられる。  
【０１５０】
プロモーターとしては、動物細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ（ＩＥ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター、又はモロニーマウス白血病ウイルスのプロモーター若しくはエンハンサーが挙げられる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。  
【０１５１】
宿主細胞としては、例えば、ヒト白血病細胞Ｎａｍａｌｗａ細胞、サル細胞ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ細胞［Journal of Experimental Medicine, 108, 945(1958); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60, 1275(1968); Genetics, 55, 513(1968); Chromosoma, 41, 129(1973); Methods in Cell Science, 18, 115(1996); Radiation Research, 148, 260(1997); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216(1980); Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 60, 1275(1968); Cell, 6, 121(1975); Molecular Cell Genetics, Appendix I、II(pp.883-900)］、ＣＨＯ／ＤＧ４４、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−６１）、ＤＵｋＸＢ１１（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−９０９６）、Ｐｒｏ−５（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−１７８１）、ＣＨＯ−Ｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ＃１１６１９）、Ｐｒｏ−３、ラットミエローマ細胞ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０（又はＹＢ２／０ともいう）、マウスミエローマ細胞ＮＳ０、マウスミエローマ細胞ＳＰ２／０−Ａｇ１４、シリアンハムスター細胞ＢＨＫ又はＨＢＴ５６３７（特開昭６３−０００２９９号公報）などが挙げられる。
【０１５２】
宿主細胞への組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができる。例えば、エレクトロポレーション法［Cytotechnology、3、133(1990)］、リン酸カルシウム法（特開平０２−２２７０７５号公報）、又はリポフェクション法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)］などが挙げられる。  
【０１５３】
以上のようにして得られるヒトＣＲＴＨ２をコードするＤＮＡを組み込んだ組換えベクターを保有する微生物、又は動物細胞などの由来の形質転換体を培地に培養し、培養物中に該ヒトＣＲＴＨ２を生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、ヒトＣＲＴＨ２を製造することができる。該形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
【０１５４】
真核生物由来の細胞で発現させた場合には、糖又は糖鎖が付加されたヒトＣＲＴＨ２を得ることができる。  
【０１５５】
誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養する場合にはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドなどを、ｔｒｐプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養する場合にはインドールアクリル酸などを培地に添加してもよい。  
【０１５６】
動物細胞を宿主として得られる形質転換体を培養する培地としては、例えば、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地［The Journal of the American Medical Association、199、519(1967)］、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地［Science, 122, 501(1952)］、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地［Virology, 8, 396(1959)］、１９９培地［Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 73, 1(1950)］、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ）培地、又はこれら培地に牛胎児血清（ＦＢＳ）などを添加した培地などが挙げられる。培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ２存在下などの条件下で１〜７日間行う。また、培養中必要に応じて、カナマイシン又はペニシリンなどの抗生物質を培地に添加してもよい。  
【０１５７】
ヒトＣＲＴＨ２をコードする遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、分泌生産又は融合蛋白質発現などの方法［Molecular Cloning, A Laboratory Manual、Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)］を用いることができる。  
【０１５８】
ヒトＣＲＴＨ２の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、又は宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞、又は生産させるヒトＣＲＴＨ２の構造を変えることにより、適切な方法を選択することができる。
【０１５９】
ヒトＣＲＴＨ２が宿主細胞内又は宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法［J. Biol. Chem., 264, 17619(1989)］、ロウらの方法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86,8227 (1989); Genes Develop., 4, 1288 (1990)］、特開平０５−３３６９６３号公報、又は国際公開第９４／２３０２１号などに記載の方法を用いることにより、ヒトＣＲＴＨ２を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。  
【０１６０】
また、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子などを用いた遺伝子増幅系（特開平０２−２２７０７５号公報）を利用してヒトＣＲＴＨ２の生産量を上昇させることもできる。
【０１６１】
得られるヒトＣＲＴＨ２は、例えば、以下のようにして単離、精製することができる。ヒトＣＲＴＨ２が細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後に細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、又はダイノミルなどを用いて細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。
【０１６２】
前記無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の蛋白質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安などによる塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰＡ−７５（三菱化学社）などのレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
ＦＦ（ファルマシア社）などのレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロースなどのレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、又は等電点電気泳動などの電気泳動法などの手法を単独又は組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。  
【０１６３】
ヒトＣＲＴＨ２が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、上記と同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として該ヒトＣＲＴＨ２の不溶体を回収する。回収した該ヒトＣＲＴＨ２の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈又は透析することにより、該ヒトＣＲＴＨ２を正常な立体構造に戻した後、上記と同様の単離精製法によりポリペプチドの精製標品を得ることができる。  
【０１６４】
ヒトＣＲＴＨ２又はその糖修飾体などの誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清において該ヒトＣＲＴＨ２又はその糖修飾体などの誘導体を回収することができる。該培養物を上記と同様に遠心分離などの手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。  
【０１６５】
また、本発明において用いられるヒトＣＲＴＨ２は、Ｆｍｏｃ法、又はｔＢｏｃ法などの化学合成法によっても製造することができる。また、アドバンストケムテック社、パーキン・エルマー社、ファルマシア社、プロテインテクノロジインストルメント社、シンセセル−ベガ社、パーセプチブ社、又は島津製作所社などのペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。  
【０１６６】
（２）動物の免疫と融合用抗体産生細胞の調製
３〜２０週令のマウス、ラット又はハムスターなどの動物に、（１）で得られる抗原を免疫して、その動物の脾臓、リンパ節、末梢血中の抗体産生細胞を採取する。また、免疫原性が低く上記の動物で充分な抗体価の上昇が認められない場合には、ヒトＣＲＴＨ２ノックアウトマウスを被免疫動物として用いることもできる。
【０１６７】
免疫は、動物の皮下、尾根部、静脈内又は腹腔内に、例えば、フロインドの完全アジュバント、又は水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなどの適当なアジュバントとともに抗原を投与することにより行う。抗原が部分ペプチドである場合には、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、又はＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）などのキャリア蛋白質とコンジュゲートを作製し、これを免疫原として用いる。  
【０１６８】
抗原の投与は、１回目の投与の後、１〜２週間おきに１〜１０回行う。各投与後３〜７日目に眼底静脈叢あるいは尾静脈より採血し、その血清の抗体価を酵素免疫測定法［Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)］などを用いて測定する。免疫に用いた抗原に対し、その血清が十分な抗体価を示した動物を融合用抗体産生細胞の供給源とする。
【０１６９】
抗原の最終投与後３〜７日目に、免疫した動物より脾臓などの抗体産生細胞を含む組織を摘出し、抗体産生細胞を採取する。脾臓細胞を用いる場合には、脾臓を細断、ほぐした後、遠心分離し、さらに赤血球を除去して融合用抗体産生細胞を取得する。  
【０１７０】
（３）骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスから得られる株化細胞を用い、例えば、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３−Ｕ１）［Current Topics in Microbiology and Immunology, 18, 1(1978)］、Ｐ３−ＮＳ１／１Ａｇ４１（ＮＳ−１）［European J. Immunology,6, 511(1976)］、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ−２）［Nature, 276, 269(1978)］、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３（６５３）［J. Immunology, 123, 1548(1979)］、又はＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）［Nature, 256, 495(1975)］などを用いる。 
【０１７１】
該骨髄腫細胞は、正常培地［グルタミン、２−メルカプトエタノール、ジェンタマイシン、ＦＢＳ、及び８−アザグアニンを加えたＲＰＭＩ１６４０培地］で継代し、細胞融合の３〜４日前に正常培地に継代し、融合当日２×１０７個以上の細胞数を確保する。
【０１７２】
（４）細胞融合とモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの調製
（２）で得られる融合用抗体産生細胞と（３）で得られる骨髄腫細胞をＭｉｎｉｍｕｍ
Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）培地又はＰＢＳ（リン酸二ナトリウム１．８３ｇ、リン酸一カリウム０．２１ｇ、食塩７．６５ｇ、蒸留水１リットル、ｐＨ７．２）でよく洗浄し、細胞数が、融合用抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜１０：１になるよう混合し、遠心分離した後、上清を除く。
【０１７３】
沈澱した細胞群をよくほぐした後、ポリエチレングリコール−１０００（ＰＥＧ−１０００）、ＭＥＭ培地及びジメチルスルホキシドの混液を３７℃で、攪拌しながら加える。さらに１〜２分間毎にＭＥＭ培地１〜２ｍＬを数回加えた後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍＬになるようにする。遠心分離後、上清を除く。
【０１７４】
沈澱した細胞群をゆるやかにほぐした後、融合用抗体産生細胞にＨＡＴ培地［ヒポキサンチン、チミジン、及びアミノプテリンを加えた正常培地］中にゆるやかに細胞を懸濁する。この懸濁液を３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中、７〜１４日間培養する。  
【０１７５】
培養後、培養上清の一部を抜き取り、後述のヒトＣＲＴＨ２発現細胞に対する反応性解析などのハイブリドーマの選択方法により、ヒトＣＲＴＨ２を含む抗原に反応し、ヒトＣＲＴＨ２を含まない抗原に反応しない細胞群を選択する。次に、限界希釈法によりクローニングを２回繰り返し［１回目はＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地）、２回目は正常培地を使用する］、安定して強い抗体価の認められるものをモノクローナル抗体産生ハイブリドーマとして選択する。  
【０１７６】
（５）精製モノクローナル抗体の調製
プリスタン処理［２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ）０．５ｍＬを腹腔内投与し、２週間飼育する］した８〜１０週令のマウス又はヌードマウスに、（４）で得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを腹腔内に注射する。１０〜２１日でハイブリドーマは腹水がん化する。このマウスから腹水を採取し、遠心分離して固形分を除去後、４０〜５０％硫酸アンモニウムで塩析し、カプリル酸沈殿法、ＤＥＡＥ−セファロースカラム、プロテインＡ−カラム又はゲル濾過カラムによる精製を行ない、ＩｇＧ又はＩｇＭ画分を集め、精製モノクローナル抗体とする。
【０１７７】
また、（４）で得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを、１０％ＦＢＳ添加を添加したＲＰＭＩ１６４０培地などで培養した後、遠心分離により上清を除き、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地に懸濁し、３〜７日間培養する。得られる細胞懸濁液を遠心分離し、得られる上清よりプロテインＡ−カラム又はプロテインＧ−カラムによる精製を行ない、ＩｇＧ画分を集め、精製モノクローナル抗体を得ることもできる。なお、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地には５％ダイゴＧＦ２１を添加することもできる。  
【０１７８】
抗体のサブクラスの決定は、サブクラスタイピングキットを用いて酵素免疫測定法により行う。蛋白量の定量は、ローリー法又は２８０ｎｍでの吸光度より算出する。  
【０１７９】
（６）モノクローナル抗体の選択
モノクローナル抗体の選択は、以下に示す通り、ヒトＣＲＴＨ２を発現する細胞に対する反応性をフローサイトメトリーで解析することにより行う。
【０１８０】
ヒトＣＲＴＨ２を発現する細胞としては、例えば（１）で得られるヒトＣＲＴＨ２をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを動物細胞などに導入して得られる遺伝子導入細胞や、ヒトの好酸球、好塩基球、Ｔｈ２、ＩＬＣ２、ｎｏｎ  ｃｌａｓｓｉｃａｌ  ｍｏｎｏｃｙｔｅおよびＴｈ２／Ｔｈ１７細胞などが挙げられる。
【０１８１】
細胞を９６ウェルプレートなどのプレートに分注した後、第１抗体として血清、ハイブリドーマの培養上清又は精製モノクローナル抗体などの被験物質を分注し、反応させる。反応後の細胞を１〜１０％ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ（以下、ＢＳＡ−ＰＢＳと記す）などで、よく洗浄した後、第２抗体として蛍光試薬などで標識した抗イムノグロブリン抗体を分注して反応させる。ＢＳＡ−ＰＢＳなどでよく洗浄した後、フローサイトメーターを用いて標識化抗体の蛍光量を測定することにより、発現細胞に対して特異的に反応するモノクローナル抗体を選択する。
【０１８２】
また、本発明のモノクローナル抗体と競合してヒトＣＲＴＨ２に結合するモノクローナル抗体は、上述のフローサイトメトリーを用いた結合反応検出系に、被検抗体を添加して反応させることで取得できる。
【０１８３】
すなわち、被検抗体を加えた時に本発明のモノクローナル抗体の結合が阻害される抗体をスクリーニングすることにより、ヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列、又はその立体構造への結合について、本発明で取得したモノクローナル抗体と競合するモノクローナル抗体を取得することができる。  
【０１８４】
さらに、本発明のヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列、又はその立体構造に結合するモノクローナル抗体が認識するエピトープと同じエピトープに結合する抗体は、上述のフローサイトメトリーを用いた結合反応検出系で取得された抗体のエピトープを同定し、同定したエピトープの、部分的な合成ペプチド、又はエピトープの立体構造に擬態させた合成ペプチド等を作製し、免疫することで、取得することができる。  
【０１８５】
２．遺伝子組換え抗体の作製
遺伝子組換え抗体の作製例として、以下にヒト型キメラ抗体及びヒト化抗体の作製方法を示す。
（１）遺伝子組換え抗体発現用ベクターの構築
遺伝子組換え抗体発現用ベクターは、ヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードするＤＮＡが組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードするＤＮＡをそれぞれクローニングすることにより構築することができる。  
【０１８６】
ヒト抗体のＣ領域は任意のヒト抗体のＣＨ及びＣＬを用いることができる。例えば、ヒト抗体のγ１サブクラスのＣＨ及びκクラスのＣＬなどを用いる。ヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードするＤＮＡには、ｃＤＮＡを用いるが、エキソンとイントロンからなる染色体ＤＮＡを用いることもできる。
【０１８７】
動物細胞用発現ベクターには、ヒト抗体のＣ領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ｐＡＧＥ１０７［Cytotechnol.,3, 133(1990)］、ｐＡＧＥ１０３［J. Biochem., 101, 1307(1987）］、ｐＨＳＧ２７４［Gene, 27, 223(1984)］、ｐＫＣＲ［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 1527(1981)］、ｐＳＧ１ｂｄ２−４［Cytotechnol., 4, 173(1990)］、又はｐＳＥ１ＵＫ１Ｓｅｄ１−３［Cytotechnol., 13, 79(1993)］などを用いる。
【０１８８】
動物細胞用発現ベクターのうちプロモーターとエンハンサーには、ＳＶ４０の初期プロモーター［J. Biochem., 101, 1307(1987)］、モロニーマウス白血病ウイルスＬＴＲ［Biochem. Biophys. Res. Commun., 149, 960(1987)］、又は免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター［Cell, 41, 479(1985)］とエンハンサー［Cell, 33, 717(1983)］などを用いる。
【０１８９】
遺伝子組換え抗体発現用ベクターには、遺伝子組換え抗体発現ベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さ、動物細胞内での抗体Ｈ鎖及びＬ鎖の発現量のバランスが均衡するなどの点から、抗体Ｈ鎖及びＬ鎖が同一のベクター上に存在するタイプ(タンデム型)の遺伝子組換え抗体発現用ベクター［J. Immunol. Methods, 167, 271 (1994)］を用いるが、抗体Ｈ鎖及びＬ鎖が別々のベクター上に存在するセパレートベクターを用いることもできる。タンデム型の遺伝子組換え抗体発現用ベクターには、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（国際公開第９７／１０３５４号）、ｐＥＥ１８［Hybridoma, 17, 559 (1998)］などを用いる。 
【０１９０】
（２）ヒト以外の動物由来の抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの取得及びアミノ酸配列の解析
非ヒト抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡの取得及びアミノ酸配列の解析は以下のようにして行うことができる。
【０１９１】
非ヒト抗体を産生するハイブリドーマ細胞よりｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成する。合成したｃＤＮＡをファージ又はプラスミドなどのベクターにクローニングしてｃＤＮＡライブラリーを作製する。
【０１９２】
前記ライブラリーより、マウス抗体のＣ領域部分又はＶ領域部分をコードするＤＮＡをプローブとして用い、ＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡを有する組換えファージ又は組換えプラスミドをそれぞれ単離する。組換えファージ又は組換えプラスミド上の目的とするマウス抗体のＶＨ又はＶＬの全塩基配列をそれぞれ決定し、塩基配列よりＶＨ又はＶＬの全アミノ酸配列をそれぞれ推定する。
【０１９３】
非ヒト抗体を産生するハイブリドーマ細胞を作製するヒト以外の動物には、マウス、ラット、ハムスター、又はラビットなどを用いるが、ハイブリドーマ細胞を作製することが可能であれば、いかなる動物も用いることができる。
【０１９４】
ハイブリドーマ細胞からの全ＲＮＡの調製には、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法［Methods in Enzymol., 154, 3 (1987)］、又はＲＮＡ  ｅａｓｙ  ｋｉｔ（キアゲン社）などのキットなどを用いる。  
【０１９５】
全ＲＮＡからのｍＲＮＡの調製には、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法［Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition、Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)］、又はＯｌｉｇｏ−ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社）などのキットなどを用いる。また、Ｆａｓｔ  Ｔｒａｃｋ  ｍＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（インビトロジェン社）、又はＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ファルマシア社）などのキットを用いてハイブリドーマ細胞からｍＲＮＡを調製することもできる。  
【０１９６】
ｃＤＮＡの合成及びｃＤＮＡライブラリーの作製には、公知の方法［Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989), Current Protocols in molecular Biology、Supplement 1, John Wiley＆Sons(1987-1997)］、SperScript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning(インビトロジェン社)、又はＺＡＰ−ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ストラタジーン社）などのキットなどを用いる。  
【０１９７】
ｃＤＮＡライブラリーの作製の際、ハイブリドーマ細胞から抽出したｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡを組み込むベクターには、該ｃＤＮＡを組み込めるベクターであればいかなるものでも用いることができる。
【０１９８】
例えば、ＺＡＰ  ＥｘＰｒｅｓｓ［Strategies, 5, 58(1992)］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）［Nucleic Acids Research, 17, 9494(1989)］、λＺＡＰＩＩ（ストラタジーン社）、λｇｔ１０、λｇｔ１１［DNA Cloning:A Practical Approach, I,
49(1985)］、Ｌａｍｂｄａ  ＢｌｕｅＭｉｄ（クローンテック社）、λＥｘ  Ｃｅｌｌ、ｐＴ７Ｔ３−１８Ｕ（ファルマシア社）、ｐｃＤ２［Mol. Cell. Biol., 3, 280 (1983)］、又はｐＵＣ１８［Gene, 33, 103 (1985)］などを用いる。 
【０１９９】
ファージ又はプラスミドベクターにより構築されるｃＤＮＡライブラリーを導入する大腸菌には、該ｃＤＮＡライブラリーを導入、発現及び維持できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＸＬ−１Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ［Strategies, 5, 81(1992)］、Ｃ６００［Genetics, 39, 440(1954)］、Ｙ１０８８、Ｙ１０９０［Science, 222, 778(1983)］、ＮＭ５２２［J. Mol. Biol., 166, 1(1983)］、Ｋ８０２［J. Mol. Biol., 16, 118(1966)］、又はＪＭ１０５［Gene, 38, 275(1985)］などを用いる。 
【０２００】
ｃＤＮＡライブラリーからの非ヒト抗体のＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡクローンの選択には、アイソトープ又は蛍光標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法、又はプラーク・ハイブリダイゼーション法［Molecular Cloning、A Laboratory Manual、Second Edition、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)］などを用いる。
【０２０１】
また、プライマーを調製し、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ法［以下、PCR法と記す、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989), Current Protocols in molecular Biology, Supplement 1,
John Wiley＆Sons(1987-1997)］を行うことよりＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡを調製することもできる。  
【０２０２】
選択されたｃＤＮＡを、適当な制限酵素などで切断後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）（ストラタジーン社）などのプラスミドにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法などにより該ｃＤＮＡの塩基配列を決定する。塩基配列解析方法には、例えば、ジデオキシ法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463(1977)］などの反応を行った後、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３７００（ＰＥバイオシステムズ社）又はＡ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡシークエンサー（ファルマシア社）などの塩基配列自動分析装置などを用いる。
【０２０３】
決定した塩基配列からＶＨ及びＶＬの全アミノ酸配列をそれぞれ推定し、既知の抗体のＶＨ及びＶＬの全アミノ酸配列［A.L.F.DNA, US Dept. Health and Human Services(1991)］と比較することにより、取得したｃＤＮＡが分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨ及びＶＬの完全なアミノ酸配列をコードしているかをそれぞれ確認する。 
【０２０４】
分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨ及びＶＬの完全なアミノ酸配列に関しては、既知の抗体のＶＨ及びＶＬの全アミノ酸配列［A.L.F.DNA, US Dept. Health and Human Services(1991)］と比較することにより、分泌シグナル配列の長さ及びＮ末端アミノ酸配列を推定でき、さらにはそれらが属するサブグループを知ることができる。また、ＶＨ及びＶＬの各ＣＤＲのアミノ酸配列についても、既知の抗体のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列［A.L.F.DNA, US Dept. Health and Human Services(1991)］と比較することによって見出すことができる。 
【０２０５】
また、得られるＶＨ及びＶＬの完全なアミノ酸配列を用いて、例えば、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ又はＰＩＲ−Ｐｒｏｔｅｉｎなどの任意のデータベースに対してＢＬＡＳＴ法［J.
Mol. Biol., 215, 403(1990)］などの相同性検索を行い、ＶＨ及びＶＬの完全なアミノ酸配列が新規なものかを確認できる。
【０２０６】
（３）ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
（１）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨ又はＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流に、それぞれ非ヒト抗体のＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡをそれぞれクローニングすることで、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。  
【０２０７】
非ヒト抗体のＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡの３’末端側と、ヒト抗体のＣＨ又はＣＬの５’末端側とを連結するために、連結部分の塩基配列が適切なアミノ酸をコードし、かつ適当な制限酵素認識配列になるように設計したＶＨ及びＶＬのｃＤＮＡを作製する。  
【０２０８】
作製されたＶＨ及びＶＬのｃＤＮＡを、（１）で得られるヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨ又はＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現する様にそれぞれクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築する。  
【０２０９】
また、非ヒト抗体ＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡを、適当な制限酵素の認識配列を両端に有する合成ＤＮＡを用いてＰＣＲ法によりそれぞれ増幅し、（１）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターにクローニングすることもできる。
【０２１０】
（４）ヒト化抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの構築
ヒト化抗体のＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡは、以下のようにして構築することができる。
【０２１１】
非ヒト抗体のＶＨ又はＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を移植するヒト抗体のＶＨ又はＶＬのＦＲのアミノ酸配列をそれぞれ選択する。選択するＦＲのアミノ酸配列には、ヒト抗体由来のものであれば、いずれのものでも用いることができる。
【０２１２】
例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋなどのデータベースに登録されているヒト抗体のＦＲのアミノ酸配列、又はヒト抗体のＦＲの各サブグループの共通アミノ酸配列［A.L.F.DNA, US Dept. Health and Human Services(1991)］などを用いる。抗体の結合活性の低下を抑えるため、元の抗体のＶＨ又はＶＬのＦＲのアミノ酸配列とできるだけ高い相同性（少なくとも６０％以上）のＦＲのアミノ酸配列を選択する。
【０２１３】
次に、選択したヒト抗体のＶＨ又はＶＬのＦＲのアミノ酸配列に、もとの抗体のＣＤＲのアミノ酸配列をそれぞれ移植し、ヒト化抗体のＶＨ又はＶＬのアミノ酸配列をそれぞれ設計する。設計したアミノ酸配列を抗体の遺伝子の塩基配列に見られるコドンの使用頻度［A.L.F.DNA,US Dept. Health and Human Services(1991)］を考慮してＤＮＡ配列に変換し、ヒト化抗体のＶＨ又はＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列をそれぞれ設計する。
【０２１４】
設計したＤＮＡ配列に基づき、１００塩基前後の長さからなる数本の合成ＤＮＡを合成し、それらを用いてＰＣＲ反応を行う。この場合、ＰＣＲ反応での反応効率及び合成可能なＤＮＡの長さから、好ましくはＨ鎖、Ｌ鎖それぞれについて各６本の合成ＤＮＡを設計する。また、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、容易に、ヒト化抗体のＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡを、（１）で得られるヒト化抗体発現用ベクターに、クローニングすることができる。  
【０２１５】
ＰＣＲ反応後、増幅産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）（ストラタジーン社）などのプラスミドにそれぞれクローニングし、（２）に記載の方法と同様の方法により、塩基配列を決定し、所望のヒト化抗体のＨ鎖全長又はＬ鎖全長のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有するプラスミドを取得する。
【０２１６】
または、設計したＤＮＡ配列に基づき、ＶＨ全長およびＶＬ全長を各々１本の長鎖ＤＮＡとして合成したものを、上記ＰＣＲ増幅産物に代えて用いることもできる。さらに、合成長鎖ＤＮＡの両端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、ヒト化抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡを、（１）で得られるヒト化抗体発現用ベクターへ容易にクローニングすることができる。
【０２１７】
（５）ヒト化抗体のＶ領域のアミノ酸配列の改変
ヒト化抗体は、非ヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲのみをヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲに移植しただけでは、その抗原結合活性は元の非ヒト抗体に比べて低下する［BIO/TECHNOLOGY, 9, 266 (1991)］。ヒト化抗体では、ヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲのアミノ酸配列の中で、直接抗原との結合に関与しているアミノ酸残基、ＣＤＲのアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸残基、及び抗体の立体構造を維持し、間接的に抗原との結合に関与しているアミノ酸残基を同定し、それらのアミノ酸残基を元の非ヒト抗体のアミノ酸残基に置換することにより、低下した抗原結合活性を上昇させることができる。
【０２１８】
抗原結合活性に関わるＦＲのアミノ酸残基を同定するために、Ｘ線結晶解析［J. Mol. Biol.、112、535 (1977)］又はコンピューターモデリング［Protein Engineering, 7, 1501 (1994)］などを用いることにより、抗体の立体構造の構築及び解析を行うことができる。また、それぞれの抗体について数種の改変体を作製し、それぞれの抗原結合活性との相関を検討することを繰り返し、試行錯誤することで必要な抗原結合活性を有するヒト化抗体を取得できる。 
【０２１９】
ヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲのアミノ酸残基は、改変用合成ＤＮＡを用いて（４）に記載のＰＣＲ反応を行うことにより、置換することができる。ＰＣＲ反応後の増幅産物について（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、目的の改変が施されたことを確認する。  
【０２２０】
（６）ヒト化抗体発現ベクターの構築
（１）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨ又はＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流に、構築した遺伝子組換え抗体のＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡをそれぞれクローニングし、ヒト化抗体発現ベクターを構築することができる。
【０２２１】
例えば、（４）及び（５）で得られるヒト化抗体のＶＨ又はＶＬを構築する際に用いる合成ＤＮＡのうち、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、（１）で得られるヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨ又はＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにそれぞれクローニングする。
【０２２２】
（７）遺伝子組換え抗体の一過性発現
（３）及び（６）で得られる遺伝子組換え抗体発現ベクター、又はそれらを改変した発現ベクターを用いて遺伝子組換え抗体の一過性発現を行い、作製した多種類の遺伝子組換え抗体の抗原結合活性を効率的に評価することができる。
【０２２３】
発現ベクターを導入する宿主細胞には、遺伝子組換え抗体を発現できる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができるが、例えばＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１６５１）を用いる［Methods in Nucleic Acids Res., CRC Press, 283(1991)］。
ＣＯＳ−７細胞への発現ベクターの導入には、ＤＥＡＥ−デキストラン法［Methods in
Nucleic Acids Res., CRC Press(1991)］、又はリポフェクション法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413(1987)］などを用いる。 
【０２２４】
発現ベクターの導入後、培養上清中の遺伝子組換え抗体の発現量及び抗原結合活性は酵素免疫抗体法［Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press(1996); Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1988)、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック(1987)］などを用いて測定する。 
【０２２５】
（８）遺伝子組換え抗体を安定に発現する形質転換株の取得と遺伝子組換え抗体の調製
（３）及び（６）で得られる遺伝子組換え抗体発現ベクターを適当な宿主細胞に導入することにより遺伝子組換え抗体を安定に発現する形質転換株を得ることができる。  
【０２２６】
宿主細胞への発現ベクターの導入には、エレクトロポレーション法［特開平０２−２５７８９１号公報；Cytotechnology, 3, 133(1990)］などを用いる。 
【０２２７】
遺伝子組換え抗体発現ベクターを導入する宿主細胞には、遺伝子組換え抗体を発現させることができる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。例えば、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−６１）、ＤＵｋＸＢ１１（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−９０９６）、Ｐｒｏ−５（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−１７８１）、ＣＨＯ−Ｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｔ＃１１６１９）、ラットミエローマ細胞ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０（又はＹＢ２／０ともいう）、マウスミエローマ細胞ＮＳ０、マウスミエローマ細胞ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１５８０）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（Ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｒａｔｅ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ、以下、ＤＨＦＲと表記する）が欠損したＣＨＯ細胞［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216(1980)］、レクチン耐性を獲得したＬｅｃ１３［Somatic Cell and Molecular Genetics, 12, 55(1986)］、α1,6−フコース転移酵素遺伝子が欠損したＣＨＯ細胞（国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第０２／３１１４０号）、ラットＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１６６２）などを用いる。  
【０２２８】
発現ベクターの導入後、遺伝子組換え抗体を安定に発現する形質転換株は、Ｇ４１８硫酸塩などの薬剤を含む動物細胞培養用培地で培養することにより選択する（特開平０２−２５７８９１号公報）。  
【０２２９】
動物細胞培養用培地には、ＲＰＭＩ１６４０培地（インビトロジェン社）、ＧＩＴ培地（日本製薬社）、ＥＸ−ＣＥＬＬ３０１培地（ジェイアールエイチ社）、ＩＭＤＭ培地（インビトロジェン社）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（インビトロジェン社）、又はこれら培地にＦＢＳなどの各種添加物を添加した培地などを用いる。  
【０２３０】
得られる形質転換株を培地中で培養することで培養上清中に遺伝子組換え抗体を発現蓄積させる。培養上清中の遺伝子組換え抗体の発現量及び抗原結合活性はＥＬＩＳＡ法などにより測定できる。また、ＤＨＦＲ増幅系（特開平０２−２５７８９１号公報）などを利用して、形質転換株が産生する遺伝子組換え抗体の発現量を上昇させることができる。
【０２３１】
遺伝子組換え抗体は、形質転換株の培養上清よりプロテインＡ−カラムを用いて精製する［Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press
(1996); Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)］。また、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー及び限外濾過などの蛋白質の精製で用いられる方法を組み合わすこともできる。 
【０２３２】
精製した遺伝子組換え抗体のＨ鎖、Ｌ鎖または抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法［Nature, 227, 680(1970)］、又はウエスタンブロッティング法［Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press(1996); Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1988)］など用いて測定することができる。 
【０２３３】
３.精製モノクローナル抗体又は該抗体断片の活性評価
精製した本発明のモノクローナル抗体又は該抗体断片の活性評価は、以下のように行うことができる。 
【０２３４】
ヒトＣＲＴＨ２発現細胞株に対する結合活性は、例えば前述の１．（６）記載のフローサイトメトリーを用いた結合反応検出系などの蛍光抗体法［Cancer Immunol.Immunother., 36, 373(1993)］を用いて測定できる。 
【０２３５】
ヒトＣＲＴＨ２陽性培養細胞株に対するＣＤＣ活性、又はＡＤＣＣ活性は公知の測定方法［Cancer Immunol. Immunother., 36, 373(1993); Current protocols in Immunology,
Chapter7. Immunologic studies in humans, Editor, John E, Coligan et al., John Wiley & Sons,Inc.,(1993)］により測定する。 
【０２３６】
４．抗体のエフェクター活性を制御する方法
本発明のモノクローナル抗体のエフェクター活性を制御する方法としては、抗体のＦｃ領域の２９７番目のアスパラギン（Ａｓｎ）に結合するＮ結合複合型糖鎖の還元末端に存在するＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）にα１，６結合するフコース（コアフコースともいう）の量を制御する方法（国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第２００２／３１１４０号、国際公開第００／６１７３９号）、又は抗体のＦｃ領域のアミノ酸残基を改変することで制御する方法などが知られている。本発明のモノクローナル抗体にはいずれの方法を用いても、エフェクター活性を制御することができる。
【０２３７】
エフェクター活性とは、抗体のＦｃ領域を介して引き起こされる抗体依存性の活性をいい、ＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性、又はマクロファージ若しくは樹状細胞などの食細胞による抗体依存性ファゴサイトーシス（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ、ＡＤＰ活性）などが知られている。  
【０２３８】
エフェクター活性の測定法として、例えば、標的として炎症性細胞、エフェクターとしてヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、そして炎症性細胞特異的な抗体を混合し、４時間程度インキュベーションした後、細胞障害の指標として遊離してきた乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）を測定することができる。もしくは、ヒトＰＢＭＣに、例えばＣＤ２０の様な血液細胞特異的な抗原を認識する抗体を混合し、インキュベーションした後、遊離ＬＤＨの測定やフローサイトメトリーによる該細胞数の減少をエフェクター活性として測定することができる。
【０２３９】
抗体のＦｃのＮ結合複合型糖鎖のコアフコースの含量を制御することで、抗体のエフェクター活性を増加又は低下させることができる。抗体のＦｃに結合しているＮ結合複合型糖鎖に結合するフコースの含量を低下させる方法としては、例えば、α１，６−フコース転移酵素遺伝子が欠損したＣＨＯ細胞を用いて抗体を発現させる方法が挙げられ、フコースが結合していない抗体を取得することができる。フコースが結合していない抗体は高いＡＤＣＣ活性を有する。  
【０２４０】
一方、抗体のＦｃに結合しているＮ結合複合型糖鎖に結合するフコースの含量を増加させる方法としては、例えば、α１，６−フコース転移酵素遺伝子を導入した宿主細胞を用いて抗体を発現させる方法が挙げられ、フコースが結合している抗体を取得することができる。フコースが結合している抗体は、フコースが結合していない抗体よりも低いＡＤＣＣ活性を有する。  
【０２４１】
また、抗体のＦｃ領域のアミノ酸残基を改変することでＡＤＣＣ活性又はＣＤＣ活性を増加又は低下させることができる。例えば、米国特許公開第２００７／０１４８１６５号明細書に記載のＦｃ領域のアミノ酸配列を用いることで、抗体のＣＤＣ活性を増加させることができる。  
【０２４２】
また、米国特許第６７３７０５６号明細書、米国特許第７２９７７７５号明細書又は米国特許第７３１７０９１号明細書に記載のアミノ酸改変を行うことで、ＡＤＣＣ活性又はＣＤＣ活性を、増加させることも低下させることもできる。
【０２４３】
また本発明の抗体には、上述の抗体定常領域におけるアミノ酸改変や糖鎖改変に合わせて例えば特開２０１３−１６５７１６号公報、特開２０１２−０２１００４号公報などに記載のアミノ酸改変を行うことにより、Ｆｃ受容体への反応性を制御することで血中半減期を制御した抗体も含まれる。
【０２４４】
さらに、上述の方法を組み合わせて、一つの抗体に使用することにより、抗体のエフェクター活性や血中半減期が制御された抗体を取得することができる。
【０２４５】
５．本発明のモノクローナル抗体又は該抗体断片を用いた疾患の治療方法
本発明の抗体は、ヒトＣＲＴＨ２が関係する疾患の治療に用いることができる。投与経路としては、例えば、経口投与、又は口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内、静脈内、若しくは腹腔内などの非経口投与が挙げられる。投与形態としては、例えば、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、坐剤、注射剤、軟膏、又はテープ剤などが挙げられる。
【０２４６】
経口投与に適当な製剤としては、例えば、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、又は顆粒剤などが挙げられる。
乳剤又はシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール若しくは果糖などの糖類、ポリエチレングリコール若しくはプロピレングリコールなどのグリコール類、ごま油、オリーブ油若しくは大豆油などの油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、又はストロベリーフレーバー若しくはペパーミントなどのフレーバー類などを添加剤として用いて製造する。
【０２４７】
カプセル剤、錠剤、散剤又は顆粒剤などは、乳糖、ブドウ糖、ショ糖若しくはマンニトールなどの賦形剤、デンプン若しくはアルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム若しくはタルクなどの滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース若しくはゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤又はグリセリンなどの可塑剤などを添加剤として用いて製造する。
【０２４８】
非経口投与に適当な製剤としては、例えば、注射剤、坐剤、又は噴霧剤などが挙げられる。
【０２４９】
注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、又はその両者の混合物からなる担体などを用いて製造する。
【０２５０】
坐剤はカカオ脂、水素化脂肪、又はカルボン酸などの担体を用いて製造する。
【０２５１】
噴霧剤は受容者の口腔及び気道粘膜を刺激せず、かつ本発明のモノクローナル抗体又は該抗体断片を微細な粒子として分散させ、吸収を容易にさせる担体などを用いて製造する。担体としては、例えば乳糖又はグリセリンなどを用いる。また、エアロゾル又はドライパウダーとして製造することもできる。
【０２５２】
さらに、上記非経口剤においても、経口投与に適当な製剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
【０２５３】
６．本発明の抗体又は該抗体断片を用いた疾患の診断方法
本発明の抗体又は該抗体断片を用いて、ヒトＣＲＴＨ２又はヒトＣＲＴＨ２が発現した細胞を検出又は測定することにより、ヒトＣＲＴＨ２が関連する疾患を診断することができる。
【０２５４】
ヒトＣＲＴＨ２が関連する疾患の一つであるアレルギー疾患の診断は、例えば、患者由来の末梢血、喀痰、鼻汁または肺胞洗浄液などに存在する炎症性細胞に発現しているヒトＣＲＴＨ２をフローサイトメーターなどの免疫学的手法を用いて検出することにより行うことができる。
【０２５５】
免疫学的手法とは、標識を施した抗原又は抗体を用いて、抗体量又は抗原量を検出又は測定する方法である。例えば、放射性物質標識免疫抗体法、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、発光免疫測定法、ウエスタンブロット法又は物理化学的手法などを用いる。
【０２５６】
放射性物質標識免疫抗体法は、例えば、抗原又は抗原を発現した細胞などに、本発明の抗体又は該抗体断片を反応させ、さらに放射線標識を施した抗イムノグロブリン抗体又は結合断片を反応させた後、シンチレーションカウンターなどで測定する。
【０２５７】
酵素免疫測定法は、例えば、抗原又は抗原を発現した細胞などに、本発明の抗体又は該抗体断片を反応させ、さらに標識を施した抗イムノグロブリン抗体又は結合断片を反応させた後、発色色素を吸光光度計で測定する。例えばサンドイッチＥＬＩＳＡ法などを用いる。  
【０２５８】
酵素免疫測定法で用いる標識体としては、公知［酵素免疫測定法、医学書院（１９８７）］の酵素標識を用いることができる。例えば、アルカリフォスファターゼ標識、ペルオキシダーゼ標識、ルシフェラーゼ標識、又はビオチン標識などを用いる。
【０２５９】
サンドイッチＥＬＩＳＡ法は、固相に抗体を結合させた後、検出又は測定対象である抗原をトラップさせ、トラップされた抗原に第２の抗体を反応させる方法である。該ＥＬＩＳＡ法では、検出又は測定したい抗原を認識する抗体又は抗体断片であって、抗原認識部位の異なる２種類の抗体を準備し、そのうち、第１の抗体又は抗体断片を予めプレート（例えば、９６ウェルプレート）に吸着させ、次に第２の抗体又は抗体断片をＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼなどの酵素、又はビオチンなどで標識しておく。
【０２６０】
上記の抗体が吸着したプレートに、生体内から分離された、細胞又はその破砕液、組織又はその破砕液、細胞培養上清、血清、胸水、腹水、又は眼液などを反応させた後、標識したモノクローナル抗体又は抗体断片を反応させ、標識物質に応じた検出反応を行う。濃度既知の抗原を段階的に希釈して作製した検量線より、被験サンプル中の抗原濃度を算出する。
【０２６１】
サンドイッチＥＬＩＳＡ法に用いる抗体としては、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれを用いてもよく、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦ（ａｂ’）２などの抗体フラグメントを用いてもよい。サンドイッチＥＬＩＳＡ法で用いる２種類の抗体の組み合わせとしては、異なるエピトープを認識するモノクローナル抗体又は抗体断片の組み合わせでもよいし、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体又は抗体断片との組み合わせでもよい。
【０２６２】
蛍光免疫測定法は、文献［Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996)、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック(1987)］などに記載された方法で測定する。蛍光免疫測定法で用いる標識体としては、例えば、公知［蛍光抗体法、ソフトサイエンス社（１９８３）］の蛍光標識が挙げられる。例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、又はテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）などが挙げられる。
【０２６３】
発光免疫測定法は文献［生物発光と化学発光  臨床検査４２、廣川書店（１９９８）］などに記載された方法で測定する。発光免疫測定法で用いる標識体としては、例えば、公知の発光体標識が挙げられ、アクリジニウムエステル、ロフィンなどが挙げられる。
【０２６４】
ウエスタンブロット法は、抗原又は抗原を発現した細胞などをＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）−ＰＡＧＥ［Antibodies-A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory (1988)］で分画した後、該ゲルをポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜又はニトロセルロース膜にブロッティングし、該膜に抗原を認識する抗体又は抗体断片を反応させ、さらにＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼなどの酵素標識、又はビオチン標識などを施した抗マウスＩｇＧ抗体又は結合断片を反応させた後、該標識を可視化することによって測定する。一例を以下に示す。
【０２６５】
配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現している細胞又は組織を溶解し、還元条件下でレーンあたりの蛋白量として０．１〜３０μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により泳動する。泳動された蛋白質をＰＶＤＦ膜にトランスファーし１〜１０％ＢＳＡ−ＰＢＳに室温で３０分間反応させブロッキング操作を行う。
【０２６６】
ここで本発明の抗体を反応させ、０．０５〜０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（以下、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳと記す）で洗浄し、ペルオキシダーゼ標識したヤギ抗マウスＩｇＧを室温で２時間反応させる。Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄し、ＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（アマシャム社製）などを用いてモノクローナル抗体が結合したバンドを検出することにより、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを検出する。ウエスタンブロッティングでの検出に用いられる抗体としては、天然型の立体構造を保持していないポリペプチドに結合できる抗体が用いられる。
【０２６７】
物理化学的手法は、例えば、抗原であるヒトＣＲＴＨ２と本発明のモノクローナル抗体又は該抗体断片とを結合させることにより凝集体を形成させて、この凝集体を検出することにより行う。この他に物理化学的手法として、例えば、毛細管法、一次元免疫拡散法、免疫比濁法又はラテックス免疫比濁法［臨床検査法提要、金原出版（１９９８）］などが挙げられる。
【０２６８】
ラテックス免疫比濁法は、抗体又は抗原を感作させた粒径０．１〜１μｍ程度のポリスチレンラテックスなどの担体を用い、対応する抗原又は抗体により抗原抗体反応を起こさせると、反応液中の散乱光は増加し、透過光は減少する。この変化を吸光度又は積分球濁度として検出することにより被験サンプル中の抗原濃度などを測定する。
【０２６９】
本発明の抗体又は該抗体断片を用いて、当該抗体による治療有効性を治療開始前に判断する方法としては、例えば以下が挙げられる。
【０２７０】
まず、治療開始前に、患者体内から例えば末梢血、喀痰、肺胞洗浄液、鼻汁などを採取し、その懸濁液に本発明の抗体又は該抗体断片を添加し、一定時間後、炎症性細胞の除去やＴｈ２タイプサイトカインなどの生体機能分子に対する阻害活性をはじめとした、抗炎症性細胞活性を測定する。測定の結果、抗炎症性細胞活性が検出された場合、その末梢血、喀痰、鼻汁などを有する患者の治療には、本発明の抗体又は該抗体断片が有効であると治療開始前に判断することができる。
【実施例】
【０２７１】
以下に、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【０２７２】
［実施例１］ヒトＣＲＴＨ２発現細胞の造成
（１）ヒトＣＲＴＨ２発現ベクターの作製
ヒトＣＲＴＨ２（以下ＣＲＴＨ２と記すこともある）のｃＤＮＡは全合成し、以降の試験に用いた。ヒトＣＲＴＨ２のｃＤＮＡ配列を配列番号１に、アミノ酸配列を配列番号２に記載する。
【０２７３】
（ｉ）ヒトＣＲＴＨ２遺伝子発現ｐＫＡＮＴＥＸ９３ベクターの構築
制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩを用いて、ヒトＣＲＴＨ２のｃＤＮＡをベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３（国際公開第９７／１０３５４号）と連結し、ヒトＣＲＴＨ２遺伝子発現ｐＫＡＮＴＥＸ９３ベクターを構築した。
【０２７４】
（ｉｉ）ヒトＣＲＴＨ２遺伝子発現ｐＡＭｏｈベクターの構築
ｐＡＭｏｈ（国際公開第０３／０８７３６６号）に対しても、制限酵素ＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いてヒトＣＲＴＨ２遺伝子を組み込み、ヒトＣＲＴＨ２遺伝子発現ｐＡＭｏｈベクターを構築した。
【０２７５】
（２）ヒトＣＲＴＨ２発現ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞の造成
ＤＨＦＲ遺伝子欠損ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞ＤＧ４４株（ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞）を、三菱化学株式会社・横浜総合研究所より入手し、ヒトＣＲＴＨ２発現細胞造成に使用した。培養には１０％透析ウシ胎児血清（ｄＦＢＳ）（ＧＩＢＣＯ社）、ＨＴ［ヒポキサンチン（Ｈ）、チミジン（Ｔ）］ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＧＩＢＣＯ社）、及び５０μｇ／ｍＬ  ゲンタマイシン（ナカライテスク社）を添加したＩＭＤＭ（ＧＩＢＣＯ社）（以下、ＩＭＤＭ培養培地と略記する）を用いた。
【０２７６】
まず、（１）−（ｉ）で作製されたヒトＣＲＴＨ２遺伝子発現ｐＫＡＮＴＥＸ９３ベクターを制限酵素ＡａｔＩＩ処理によって切断し、得られた直鎖状ＤＮＡを精製し、滅菌水に溶解した。このＤＮＡをエレクトロポレーション法により、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞に導入し、ＨＴ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔを抜いたＩＭＤＭ培養培地にて３日程度培養した。
【０２７７】
その後、１０％ｄＦＢＳ、０．５ｍｇ／ｍＬ  Ｇ４１８（ナカライテスク社）、及び５０μｇ／ｍＬ  ゲンタマイシン（ナカライテスク社）を加えたＩＭＤＭ（以下、ＩＭＤＭ選択培地と略記する）で薬剤耐性細胞を選択した。選択した薬剤耐性細胞を、９６ウェルプレートに７５ｃｅｌｌｓ／プレートとなる様に播種し、さらに２週間ほどＩＭＤＭ選択培地にて培養した。ウェル毎に顕微鏡下で観察し、シングルクローンとなっているものを順次拡大培養した。
【０２７８】
得られた薬剤耐性細胞を０．０２％ＥＤＴＡ溶液（ナカライテスク社）で剥離し、ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）で洗浄した後、２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、０．０５％ＮａＮ３及び１ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳ（Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ、以下ＳＭと略記する）で懸濁した。次に、２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように９６ウェルプレートに播種し、１７００ｒｐｍで２分間の遠心分離を行った。
【０２７９】
上清を除いた後、ＳＭで調製したＰＥ標識抗ヒトＣＲＴＨ２抗体（ベックマンコールター社）を添加し、４℃で１時間の反応を行った。細胞を洗浄した後、細胞をＳＭで懸濁し、蛍光強度をフローサイトメーター（ＢＤバイオサイエンス社、ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩ）で解析した。ヒトＣＲＴＨ２が高発現するクローンを選択し、この細胞をヒトＣＲＴＨ２発現ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞とした。
【０２８０】
（３）ＦＬＡＧ融合ヒトＣＲＴＨ２発現ベクターの作製（ｉ）ＦＬＡＧ融合ヒトＣＲＴＨ２遺伝子発現ｐＡＭｏｈベクターの構築
（１）−（ｉｉ）で作製されたヒトＣＲＴＨ２遺伝子発現ｐＡＭｏｈから、プライマーｈｕｍａｎＣＲＴＨ２ＦＬＡＧ−Ａ（配列番号３）及びｈｕｍａｎＣＲＴＨ２ＦＬＡＧ−Ｂ（配列番号４）を用いて、Ｃ末端にＦＬＡＧタグが付加されたヒトＣＲＴＨ２（配列番号５）をｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、ＰＣＲと記す）で増幅し、制限酵素ＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて、ベクターｐＡＭｏｈ（国際公開第０３／０８７３６６号）と連結し、ＦＬＡＧ融合ヒトＣＲＴＨ２遺伝子発現ｐＡＭｏｈベクターを構築した。
【０２８１】
（ｉｉ）ＦＬＡＧ融合ヒトＣＲＴＨ２遺伝子発現ｐＫＡＮＴＥＸ９３ベクターの構築
（３）−（ｉ）で構築されたＦＬＡＧ融合ヒトＣＲＴＨ２遺伝子発現ｐＡＭｏｈベクターから、プライマーｈｕｍａｎＣＲＴＨ２ＦＬＡＧ−Ｃ（配列番号６）及びｈｕｍａｎＣＲＴＨ２ＦＬＡＧ−Ｄ（配列番号７）を用いて、Ｃ末端にＦＬＡＧタグが付加されたヒトＣＲＴＨ２をＰＣＲで増幅し、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩを用いて、ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３（国際公開第９７／１０３５４号）と連結し、ＦＬＡＧ融合ヒトＣＲＴＨ２遺伝子発現ｐＫＡＮＴＥＸ９３ベクターを構築した。
【０２８２】
（４）ＦＬＡＧ融合ヒトＣＲＴＨ２発現３Ｙ１−Ｂ細胞の造成
ラット３Ｙ１−Ｂ細胞を、理研バイオリソースセンターより入手し、ＦＬＡＧ融合ヒトＣＲＴＨ２発現細胞造成に使用した。培養には１０％ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ社）、及び５０μｇ／ｍＬ  ゲンタマイシン（ナカライテスク社）を添加したＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ社）（以下、ＤＭＥＭ培養培地と略記する）を用いた。
【０２８３】
（３）−（ｉｉ）で作製されたＦＬＡＧ融合ヒトＣＲＴＨ２遺伝子発現ｐＫＡＮＴＥＸ９３ベクターを制限酵素ＡａｔＩＩ処理によって切断し、得られた直鎖状ＤＮＡを精製し、滅菌水に溶解した。このＤＮＡを、Ｆｕｇｅｎｅ６（プロメガ社）を用いたＬｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ法により３Ｙ１−Ｂ細胞に導入し、ＤＭＥＭ培養培地にて３日間程度培養した。その後、１０％ＦＢＳ、０．８ｍｇ／ｍＬ  Ｇ４１８（ナカライテスク社）、及び５０μｇ／ｍＬ  ゲンタマイシン（ナカライテスク社）を添加したＤＭＥＭ（以下、ＤＭＥＭ選択培地）で薬剤耐性細胞を選択した。
【０２８４】
得られた薬剤耐性細胞を０．０５％トリプシン溶液（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で剥離し、ＰＢＳで洗浄した後、ＳＭで懸濁した。次に、２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように９６ウェルプレートに播種し、１７００ｒｐｍで２分間の遠心分離を行った。上清を除いた後、ＳＭで調製したＰＥ標識抗ヒトＣＲＴＨ２抗体（ベックマンコールター社）を添加し、４℃で１時間の反応を行った。細胞を洗浄した後、細胞をＳＭで懸濁し、蛍光強度をフローサイトメーター（ＢＤバイオサイエンス社、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ）で解析した。ＦＬＡＧ融合ヒトＣＲＴＨ２を高発現する画分をシングルセルソーティングし、拡大培養を行い、ＦＬＡＧ融合ヒトＣＲＴＨ２発現３Ｙ１−Ｂ細胞とした。
【０２８５】
［実施例２］ヒトＣＲＴＨ２に対する抗体モノクローナル抗体の作製
（１）ラットへの免疫
ヒトＣＲＴＨ２に対するモノクローナル抗体を取得するために、初回投与時の週齢が９週齢の雌性ＷＫＹ／ＮＣｒｌＣｒｌｊラット（ＷＫＹラット）（チャールスリバー社）に免疫した。
【０２８６】
初回投与は、５×１０６ｃｅｌｌｓのＦＬＡＧ融合ヒトＣＲＴＨ２発現３Ｙ１−Ｂ細胞を１００μＬの生理食塩液（大塚製薬工場社）に懸濁し、Ｓｉｇｍａ  Ａｄｊｕｖａｎｔ
Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（シグマアルドリッチ社）１００μＬと合わせて２００μＬの細胞懸濁液を調製し、１ヶ所あたり１００μＬをＷＫＹラットの尾根部に左右２ヶ所筋肉内投与した。
【０２８７】
また初回投与２週間後に、５×１０６ｃｅｌｌｓのＦＬＡＧ融合ヒトＣＲＴＨ２発現３Ｙ１−Ｂ細胞を２００μＬの生理食塩液に懸濁し、同様の方法で投与を行った。
【０２８８】
（２）ハイブリドーマの作製
（１）で２回目の免疫を行った３日後に、外科的にＷＫＹラットから腸骨リンパ節を摘出し、細胞融合に供した。
【０２８９】
まず、摘出した腸骨リンパ節をスライドガラスですりつぶし、組織をほぐした。この腸骨リンパ節組織をＭｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉａ（ＭＥＭ）（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に懸濁し、セルストレーナーを通すことにより、余分な組織を除いた。１２００ｒｐｍで５分間遠心分離することにより上清を除いた後、再びＭＥＭで懸濁し、腸骨リンパ節細胞とした。
【０２９０】
得られた腸骨リンパ節細胞数に対し、１／５細胞数のマウスミエローマ細胞株Ｐ３−Ｕ１（ＡＴＣＣ）を混合した。遠心分離により上清を除いた後、３７℃の温浴の中で温めつつ、５００μＬのＰＥＧ溶液［Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  １０００（純正化学社）及びＭＥＭをそれぞれ１ｍＬずつ混合し、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）（シグマアルドリッチ社）を３５０μＬ加えたもの］を穏やかに添加し、そこに１分毎にＭＥＭ  １ｍＬを５回加えた後さらに４５ｍＬのＭＥＭを添加した。
【０２９１】
９００ｒｐｍで５分間遠心分離することにより上清を除いた後、細胞をＨＡＴ培地［５００ｍＬのＲＰＭＩ−１６４０（和光純薬社）に対し、１０ｍＬのＨＡＴ（ヒポキサンチン（Ｈ）、アミノプテリン（Ａ）、チミジン（Ｔ））溶液（ＧＩＢＣＯ社）、０．５ｍＬの５５ｍｍｏｌ／Ｌ  ２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、５０ｍＬのウシ胎児血清（Ｍｏｒｅｇａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）、および０．５ｍＬの１０ｍｇ／ｍＬゲンタマイシン溶液（ナカライテスク社）を添加したもの］で懸濁し、９６ウェルプレートに播種し、培養した。
【０２９２】
（３）ハイブリドーマスクリーニング
（２）で播種されたハイブリドーマを７日間培養した後、各ウェルの培養上清を採取し、ヒトＣＲＴＨ２に対する反応性を解析した。陽性対照細胞及び陰性対照細胞は、それぞれヒトＣＲＴＨ２発現ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞及びＣＨＯ／ＤＧ４４細胞とした。まず、陽性対照細胞及び陰性対照細胞を０．０２％ＥＤＴＡ溶液（ナカライテスク社製）で剥離し、１ウェルあたりそれぞれ１×１０５ｃｅｌｌｓ／５０μＬとなるように９６ウェルプレートに播種し、５０μＬの培養上清を添加し、４℃で３０分間の反応を行った。
【０２９３】
細胞を洗浄した後、ＳＭで３００倍に希釈したＡｎｔｉ−ｒａｔ  ＩｇＧ（Ｆｃ）−Ｄｙｌｉｇｈｔ４８８（ａｂｃａｍ社）１００μＬで懸濁し、４℃で３０分間の反応を行った。再び細胞を洗浄した後、細胞をＳＭで懸濁し、蛍光強度をフローサイトメトリー（ＢＤバイオサイエンス社、ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩ）で解析した。
【０２９４】
ヒトＣＲＴＨ２発現ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞に特異的な反応が見られたウェルのハイブリドーマについて、クローニング培地［エス・クロン  クローニングメデュームＣＭ−Ｂ（エーディア社）に、０．５ｍＬの１０ｍｇ／ｍＬゲンタマイシン溶液（ナカライテスク社）、５ｍＬのＨＴ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ社）を添加したもの］を用いて限界希釈法によるシングルセルクローニングを２回行った。最終的に、ヒトＣＲＴＨ２発現ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞に最も強いフローサイトメトリー反応性を示すハイブリドーマＬｙｍ２クローン（以下、ハイブリドーマＬｙｍ２と記す）を樹立した。
【０２９５】
（４）ハイブリドーマＬｙｍ２の培養上清に含まれる抗体のサブクラスの同定
ハイブリドーマＬｙｍ２を３日間培養した培養上清をＰＢＳ（ナカライテスク社製）で１０倍に希釈し、その希釈液を１５０μＬ用いてＲａｔ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ  Ｔｅｓｔ  Ｋｉｔ（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ社）で添付の説明書に従いサブクラスの解析を行った。
【０２９６】
その結果、ハイブリドーマＬｙｍ２の培養上清中に含まれるラット抗ヒトＣＲＴＨ２モノクローナル抗体（以下、単にＬｙｍ２抗体と略記する場合もある）はラットＩｇＧ２ｂ抗体であることが明らかになった。
【０２９７】
（５）Ｌｙｍ２抗体の精製
Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に５％のＦｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ｕｌｔｒａ  Ｌｏｗ  ＩｇＧ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を加えた培地で、ハイブリドーマＬｙｍ２を１週間培養した。培養上清を回収し精製に供した。
【０２９８】
培養上清から、Ｐｒｏｓｅｐ−Ｇ（ＧＥヘルスケア社）を用いて、Ｌｙｍ２抗体を精製した。まず、培養上清をカラムにロードし、ＰＢＳでカラムを洗浄した後、ｐＨ５．０、３．５および３．０の溶出バッファー（０．１Ｍクエン酸一水和物−ＮａＯＨ／ｐＨ５．０、３．５および３．０）で順に溶出した。溶出したフラクションは速やかに中和バッファー（２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／ｐＨ８．５）で中和した。
【０２９９】
それぞれのフラクションの吸光度（２８０ｎｍ）を測定し、測定値の高い連続フラクションを抗体画分として回収した。ＰＢＳで透析を行い、０．２２μｍのフィルターを通したものを精製タンパク質とした。２８０ｎｍの吸光係数を１．４として、濃度を算出した。
【０３００】
［実施例３］Ｌｙｍ２抗体のフローサイトメトリーによる抗原結合性評価
ＦＬＡＧ融合ヒトＣＲＴＨ２発現３Ｙ１−Ｂ細胞を０．０５％トリプシン溶液（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で剥離し、ＰＢＳで洗浄した後、ＳＭで懸濁した。次に、１ウェルあたり２×１０５ｃｅｌｌｓとなるように９６ウェルプレートに播種し、１７００ｒｐｍで２分間の遠心分離を行った。上清を除いた後、ＳＭで１０μｇ／ｍＬになるように調製したＬｙｍ２抗体を１００μＬ添加し、４℃で１時間の反応を行った。
【０３０１】
細胞を洗浄した後、ＳＭで１００倍に希釈したＡｎｔｉ−ｒａｔＩｇＧ−ＦＩＴＣ（ベックマンコールター社）を添加し、４℃で１時間の反応を行った。再び細胞を洗浄した後、細胞をＳＭで懸濁し、蛍光強度をフローサイトメトリー（ＢＤバイオサイエンス社製、ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩ）で解析した。その結果、Ｌｙｍ２抗体のＦＬＡＧ融合ヒトＣＲＴＨ２発現３Ｙ１−Ｂ細胞への結合が認められた。
【０３０２】
［実施例４］Ｌｙｍ２抗体重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子のクローニング
ＲＮＡｉｓｏ  ｐｌｕｓ（タカラバイオ社）を用いて、添付の説明書に従い、ＰＢＳで洗浄したハイブリドーマＬｙｍ２を溶解し、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを調製した。得られたｔｏｔａｌ  ＲＮＡは、ＤＥＰＣ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｗａｔｅｒ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に溶解した。次に、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＦｒｏｍＴｏｔａｌ  ＲＮＡ）（タカラバイオ社）を用いて、添付の説明書に従い、得られたｔｏｔａｌ  ＲＮＡからｍＲＮＡを精製した。さらに、ＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて、添付の説明書に従い、精製したｍＲＮＡからｃＤＮＡを調製した。
【０３０３】
得られたｃＤＮＡを鋳型に、プライマーＲａｔＩｇＧ２ｂＨ−Ａ（配列番号８）及びＲａｔＩｇＧ２ｂＨ−Ｂ（配列番号９）を用いて、ラットＩｇＧ２ｂ重鎖遺伝子を、プライマーＲａｔｋ−Ａ（配列番号１０）及びＲａｔｋ−Ｂ（配列番号１１）を用いて、ラット軽鎖（κ鎖）遺伝子を、それぞれＰＣＲにより増幅した。増幅した遺伝子をサブクローニングし、塩基配列を解析した。
【０３０４】
その結果、シグナル配列を含むＬｙｍ２抗体のＶＨおよびＶＬの塩基配列およびアミノ酸配列を同定した。ＶＨ、ＶＬそれぞれの塩基配列を配列番号１２、１４、アミノ酸配列を配列番号１３、１５に示した。また、Ｋａｂａｔら［Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services(1991)］の報告から、シグナル配列を含まないＬｙｍ２抗体のＶＨおよびＶＬの配列を同定した。
【０３０５】
シグナル配列を除いたＶＨ、ＶＬそれぞれの塩基配列を配列番号１６、１８に、アミノ酸配列を配列番号１７、１９に示した。また、Ｌｙｍ２抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号２０、２１、及び２２に、Ｌｙｍ２抗体のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号２３、２４、及び２５に示した。
【０３０６】
［実施例５］ラット／ヒトキメラ型Ｌｙｍ２抗体の作製
（１）ラット／ヒトキメラ型Ｌｙｍ２抗体発現ベクターの構築
ラット／ヒトキメラ型Ｌｙｍ２抗体発現ベクターは、以下の方法で、Ｌｙｍ２抗体重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子を、それぞれヒトＩｇＧ１重鎖及びκ鎖定常領域遺伝子に連結することにより作製した。
【０３０７】
まずＶＨとして、配列番号２６の配列を、ＶＬとして、配列番号２７の配列を全合成した。合成された配列から、プライマーｃｈＬｙｍ２ＶＨ−Ａ（配列番号２８）およびプライマーｃｈＬｙｍ２ＶＨ−Ｂ（配列番号２９）を用いてＶＨを、プライマーｃｈＬｙｍ２ＶＬ−Ａ（配列番号３０）およびプライマーｃｈＬｙｍ２ＶＬ−Ｂ（配列番号３１）を用いてＶＬをＰＣＲにより増幅した。
【０３０８】
遺伝子断片はアガロースゲル電気泳動を行い、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）によって精製した。この断片と、ヒトκ鎖定常領域発現ベクター（ＢｇｌＩＩ／ＢｓｉＷＩ処理）およびヒト重鎖（ＩｇＧ１）定常領域発現ベクター（Ｓａｌ１／Ｎｈｅ１処理）を用いて、Ｉｎ−Ｆｕｉｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（クロンテック社）によるベクターへのサブクローニングを添付の説明書に従い行った。
【０３０９】
大腸菌ＤＨ５αコンピテントセル（タカラバイオ社）に形質転換して、プラスミド抽出、シーケンス確認を実施することで、ラット／ヒトキメラ型Ｌｙｍ２抗体（以下、ｃｈＬｙｍ２と記す）発現ベクターを作製した。
【０３１０】
（２）ｃｈＬｙｍ２一過性発現細胞株の調製
ｃｈＬｙｍ２の一過性発現株を作製するため、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＭＡＸ  ＣＨＯ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を、添付の説明書に従って使用し、以下の方法で、宿主細胞に（１）で作製された発現ベクターを導入した。宿主細胞には、ＦＵＴ８ノックアウトＣＨＯ細胞（国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第０２／３１１４０号）をＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＣＨＯ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に馴化した株を使用した。
【０３１１】
（１）で作製した３１２．５μｇのｃｈＬｙｍ２抗体発現ベクター（軽鎖発現ベクターと重鎖発現ベクターを１：２で混合したもの）を２０ｍＬのＯｐｔｉ−Ｐｒｏ  ＳＦＭ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に、また、３１２．５μＬのＦｒｅｅｓｔｙｌｅ  ＭＡＸ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を２０ｍＬのＯｐｔｉ−Ｐｒｏ  ＳＦＭにそれぞれ溶解し、室温で５分間放置した。上記二液を混合し、室温で１５分間放置した。該混合溶液を２５０ｍＬの宿主細胞培養液（１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）に全量添加しｃｈＬｙｍ２一過性発現細胞株を得た。
【０３１２】
（３）ｃｈＬｙｍ２の精製
（２）で得られたｃｈＬｙｍ２一過性発現細胞株を、８ｍＭのＬ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を添加したＦｒｅｅ  ｓｔｙｌｅ  ＣＨＯ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に懸濁し、三角フラスコで５日間培養した後、培養上清を回収した。回収した培養上清を遠心分離し、０．２２μｍフィルターを用いてろ過することでｃｈＬｙｍ２を含む培養上清を調製した。
【０３１３】
調製した培養上清からＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（ＧＥヘルスケア社）を用いて、ｃｈＬｙｍ２を精製した。まず、培養上清をカラムにロードし、ＰＢＳでカラムを洗浄した後、ｐＨ５．０、３．５、３．０の溶出バッファー（０．１Ｍクエン酸一水和物−ＮａＯＨ／ｐＨ５．０、３．５、３．０）で順に溶出した。溶出したフラクションは速やかに中和バッファー（２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／ｐＨ８．５）で中和した。
【０３１４】
それぞれのフラクションの２８０ｎｍの吸光度（Ａ２８０）を測定し、測定値の高い連続フラクションを抗体画分として回収した。抗体画分をＰＢＳで透析し、０．２２μｍのフィルターを通したものを精製タンパク質とした。２８０ｎｍの吸光係数を１．３７として、濃度を算出した。
【０３１５】
［実施例６］ヒト化抗体の作製
（１）ヒト化Ｌｙｍ２抗体重鎖及び軽鎖可変領域の設計
（ｉ）ヒト化Ｌｙｍ２抗体のＶＬおよびＶＨのアミノ酸配列の設計
ヒト化Ｌｙｍ２抗体のＶＬのアミノ酸配列を以下のようにして設計した。
まずＬｙｍ２抗体のＶＬのＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列（配列番号２３、２４、２５）の移植に適したヒト抗体のＶＬのＦＲのアミノ酸配列を、以下のようにして選択した。
【０３１６】
既知のヒト抗体重鎖可変領域配列はＴｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎが提供するＢＬＡＳＴＰデータベースにより、Ｌｙｍ２抗体のＶＬのＦＲ配列と相同性の高いヒト抗体配列を検索した。その結果、ＧｅｎｅＢａｎｋ  ＩＤ：ＡＢＡ７１３７４．１が最も相同性の高いヒト抗体配列であったため、この抗体のＦＲを選択した。以上のようにして決定したヒト抗体ＦＲ配列の適切な位置に配列番号２３、２４、２５で表されるＬｙｍ２抗体のＶＬのＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を移植することで、ＬＶ０（配列番号３３）を設計した。
【０３１７】
次に、ヒト化Ｌｙｍ２抗体のＶＨのアミノ酸配列を以下のようにして設計した。Ｌｙｍ２抗体のＶＨのＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列（配列番号２０、２１、２２）の移植に適したヒト抗体ＶＨのＦＲのアミノ酸配列を以下のようにして選択した。ＶＬ同様にＢＬＡＳＴＰデータベースにより、Ｌｙｍ２のＶＨのＦＲ配列と相同性の高いヒト抗体配列を検索した。
【０３１８】
その結果、ＧｅｎｅＢａｎｋ  ＩＤ：ＡＡＹ３３３３１．１が最も相同性の高いヒト抗体配列であったため、この抗体のＦＲを選択した。以上のようにして決定したヒト抗体ＦＲ配列の適切な位置に配列番号２０、２１、２２で表されるＬｙｍ２抗体のＶＨのＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を移植することで、ＨＶ０（配列番号４９）を設計した。
【０３１９】
上記で設計したヒト化Ｌｙｍ２抗体のＶＬのアミノ酸配列ＬＶ０、およびＶＨのアミノ酸配列ＨＶ０は、選択したヒト抗体のＦＲのアミノ酸配列に、ラットモノクローナル抗体であるＬｙｍ２由来のＣＤＲのアミノ酸配列のみを移植した配列である。しかし、一般に、ヒト化抗体を作製する場合には、単にげっ歯類由来抗体のＣＤＲのアミノ酸配列をヒト抗体のＦＲへ移植するのみでは、結合活性が低下してしまうことが多い。
【０３２０】
このような結合活性の低下を回避するため、ＣＤＲのアミノ酸配列の移植とともに、ヒト抗体とげっ歯類抗体で異なっているＦＲのアミノ酸残基のうち、結合活性に影響を与えると考えられるアミノ酸残基を置換することが行われている。そこで、本実施例においても、結合活性に影響を与えると考えられるＦＲのアミノ酸残基を以下のようにして同定し、置換した。
【０３２１】
まず、上記で設計したヒト化Ｌｙｍ２抗体のＶＬのアミノ酸配列ＬＶ０、およびＶＨのアミノ酸配列ＨＶ０より構成される抗体可変領域（以下、ＬＶ０ＨＶ０と表記する）の三次元構造をコンピューターモデリングの手法を用いて構築した。
【０３２２】
三次元構造座標作製および三次元構造の表示には、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ（アクセルリス社）を用いた。また、Ｌｙｍ２抗体の可変領域の三次元構造のコンピューターモデルも同様にして構築した。更に、ＬＶ０ＨＶ０のＶＬおよびＶＨのＦＲのアミノ酸配列の中で、Ｌｙｍ２抗体と異なっているアミノ酸残基を選択し、Ｌｙｍ２抗体のアミノ酸残基へ改変したアミノ酸配列を作製し、同様に三次元構造モデルを構築した。これら作製したＬｙｍ２抗体、ＬＶ０ＨＶ０および改変体の各可変領域の三次元構造を比較し、抗体の結合活性に影響を与えると予測されるアミノ酸残基を同定した。
【０３２３】
その結果、ＬＶ０ＨＶ０のＦＲのアミノ酸残基の中で抗原結合部位の三次元構造を変化させ、抗体の結合活性に影響を与えると考えられるアミノ酸残基として、ＬＶ０では、配列番号３３のアミノ酸配列の２番目のＩｌｅ、４番目のＭｅｔ、１５番目のＰｒｏ、および８５番目のＡｌａを、ＨＶ０では、配列番号４９のアミノ酸配列の１８番目のＬｅｕ、７７番目のＡｓｎ、９３番目のＶａｌ、および１１７番目のＴｈｒを、それぞれ選択した。
【０３２４】
これらの選択したアミノ酸残基のうち、少なくとも１つ以上のアミノ酸配列をＬｙｍ２抗体の同じ部位に存在するアミノ酸残基へ置換するアミノ酸改変をし、様々な改変を有するヒト化抗体のＶＬおよびＶＨを設計した。具体的には、ＶＬについては、配列番号３３のアミノ酸配列の２番目のＩｌｅをＶａｌに、４番目のＭｅｔをＬｅｕに、１５番目のＰｒｏをＬｅｕに、または８５番目のＡｌａをＰｒｏに置換するアミノ酸改変のうち、少なくとも１つの改変を導入した。ＶＨについては、配列番号４９のアミノ酸配列の１８番目のＬｅｕをＭｅｔに、７７番目のＡｓｎをＳｅｒに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、または１１７番目のＴｈｒをＶａｌに置換するアミノ酸改変のうち、少なくとも１つの改変を導入した。
【０３２５】
ＬＶ０ＨＶ０、またはＬＶ０ＨＶ０のＦＲに存在する少なくとも１つのアミノ酸残基を改変したヒト化Ｌｙｍ２抗体の抗体可変領域として、ＬＶ０ＨＶ０、ＬＶ１ＨＶ０、ＬＶ２ａＨＶ０、ＬＶ２ｂＨＶ０、ＬＶ２ｃＨＶ０、ＬＶ３ａＨＶ０、ＬＶ３ｂＨＶ０、ＬＶ４ＨＶ０、ＬＶ０ＨＶ４、ＬＶ１ＨＶ４、ＬＶ２ａＨＶ４、ＬＶ２ｂＨＶ４、ＬＶ２ｃＨＶ４、ＬＶ３ａＨＶ４、ＬＶ３ｂＨＶ４、ＬＶ４ＨＶ４、ＬＶ０ＨＶ１、ＬＶ０ＨＶ２ａ、ＬＶ０ＨＶ２ｂ、および、ＬＶ０ＨＶ３をそれぞれ設計した。
【０３２６】
以降の記述においては、上述の可変領域を含むヒト化Ｌｙｍ２抗体をそれぞれＬＶ０ＨＶ０、ＬＶ１ＨＶ０、ＬＶ２ａＨＶ０、ＬＶ２ｂＨＶ０、ＬＶ２ｃＨＶ０、ＬＶ３ａＨＶ０、ＬＶ３ｂＨＶ０、ＬＶ４ＨＶ０、ＬＶ０ＨＶ４、ＬＶ１ＨＶ４、ＬＶ２ａＨＶ４、ＬＶ２ｂＨＶ４、ＬＶ２ｃＨＶ４、ＬＶ３ａＨＶ４、ＬＶ３ｂＨＶ４、ＬＶ４ＨＶ４、ＬＶ０ＨＶ１、ＬＶ０ＨＶ２ａ、ＬＶ０ＨＶ２ｂ、および、ＬＶ０ＨＶ３と略記する。
【０３２７】
軽鎖可変領域ＬＶ０（配列番号３３）、ＬＶ１（配列番号３５）、ＬＶ２ａ（配列番号３７）、ＬＶ２ｂ（配列番号３９）、ＬＶ２ｃ（配列番号４１）、ＬＶ３ａ（配列番号４３）、ＬＶ３ｂ（配列番号４５）、ＬＶ４（配列番号４７）、および重鎖可変領域ＨＶ０（配列番号４９）、ＨＶ１（配列番号５１）、ＨＶ２ａ（配列番号５３）、ＨＶ２ｂ（配列番号５５）、ＨＶ３（配列番号５７）、ＨＶ４（配列番号５９）のアミノ酸配列をそれぞれ図１および図２に示す。
【０３２８】
（ｉｉ）ヒト化Ｌｙｍ２抗体の可変領域遺伝子の設計
ヒト化抗体の可変領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列は、動物細胞で高頻度で使用されるコドンを用いて設計した。これら塩基配列を用いて、以下に示すヒト化Ｌｙｍ２抗体発現ベクターの構築および対応する抗体の発現を行った。
【０３２９】
（２）ヒト化Ｌｙｍ２抗体発現ベクターの構築
実施例５−（１）に記載の方法に準じて、ヒト化Ｌｙｍ２抗体発現ベクターを構築した。すなわち、配列番号３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７および５９で示されるアミノ酸配列をそれぞれコードする、配列番号３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６および５８で示される塩基配列のＤＮＡを全合成し、配列番号２８−３１で示すプライマーにより、対応するＶＬ、ＶＨ遺伝子断片をＰＣＲによって増幅した。遺伝子断片はアガロースゲル電気泳動を行い、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）によって精製した。
【０３３０】
このＶＬまたはＶＨ断片を、Ｉｎ−Ｆｕｉｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（クロンテック社）を用いて添付の説明書に従い、それぞれヒトκ鎖定常領域発現ベクター（ＢｇｌＩＩ／ＢｓｉＷＩ処理）およびヒト重鎖（ＩｇＧ１）定常領域発現ベクター（Ｓａｌ１／Ｎｈｅ１処理）へサブクローニングした。作製したベクターを用いて大腸菌  ＤＨ５αコンピテントセル（タカラバイオ社）を形質転換して、プラスミド抽出、シーケンス確認を実施し、正しい配列が挿入されたコロニーを選抜し、一過性発現のためにプラスミド大量調製を行った。
【０３３１】
（３）ヒト化Ｌｙｍ２抗体の一過性発現
作製したヒト化Ｌｙｍ２抗体の一過性発現は、実施例５−（２）に記載のＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＣＨＯ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に馴化したＣＨＯ細胞を宿主とし、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＭＡＸ  ＣＨＯ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を使用して行った。プラスミド導入の方法は添付の説明書に従った。軽鎖発現ベクターと重鎖発現ベクターは、１：２の比率で混合して使用した。
【０３３２】
培養液量は２００ｍＬで行い、３７℃、８％ＣＯ２、１２５ｒｐｍの設定条件下で、５日間培養した。培養後、細胞懸濁液の遠心分離を行い、０．２μｍフィルター（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を通してヒト化Ｌｙｍ２抗体を含む培養上清を回収した。
【０３３３】
（４）ヒト化Ｌｙｍ２抗体の精製
以下に示す、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いたアフィニティー精製により、ヒト化Ｌｙｍ２抗体を精製した。レジンをＰＢＳで平衡化した後、（３）で取得された培養上清をロードし、ＰＢＳで２回洗浄した。
【０３３４】
洗浄後、溶出バッファー（２０ｍＭ  クエン酸、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ３．４）を用いて抗体を溶出し、中和バッファー（１Ｍ  リン酸−ＮａＯＨ、ｐＨ  ７．０）を１／１０量加えて中和した。続いてＮＡＰ２５（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いてＰＢＳにバッファー置換を行った。Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔｓ（ミリポア社）を用いて限外濾過による濃縮を行い、Ｎａｎｏｄｒｏｐ８０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用して２８０ｎｍにおける吸光度（Ａ２８０）を測定し、抗体溶液の濃度測定および調製を行った。
【０３３５】
［実施例７］ｃｈＬｙｍ２およびヒト化Ｌｙｍ２抗体の抗原結合活性
ＦＬＡＧ融合ヒトＣＲＴＨ２発現３Ｙ１−Ｂ細胞を０．２５％Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（ナカライテスク社）で剥離し、ＰＢＳで洗浄した後、ＳＭで懸濁した。次に、細胞数を１ウェルあたり１×１０５個となるように９６ウェルプレートに播種し、５００００、１２５００、３１２５、７８１、１９５、４９、１２および３ｎｇ／ｍＬ各最終濃度のｃｈＬｙｍ２またはヒト化Ｌｙｍ２抗体を添加し、４℃で６０分間の反応を行った。
【０３３６】
細胞をＳＭで洗浄した後、ＳＭで５００倍に希釈したＧｏａｔ  Ｆ（ａｂ’）２  Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  ＰＥ（γｃｈａｉｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ）（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を添加し、４℃で６０分間の反応を行った。ＳＭで細胞を洗浄した後、細胞を５０μＬのＳＭで再懸濁し、蛍光強度をフローサイトメトリー（ＢＤバイオサイエンス社、ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩ）で測定した。
【０３３７】
データはＦｌｏｗＪｏ  ７．６５（トミーデジタルバイオロジー社）によって解析し、各濃度におけるＧｅｏｍｅａｎ値からＬｏｇｉｓｔｉｃ曲線によるカーブフィッティングを行い、統計解析言語Ｒ（Ｖｅｒ．３．０２）を用いてｃｈＬｙｍ２および各ヒト化Ｌｙｍ２抗体の結合の５０％ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（ＥＣ５０）値およびそのｓｔａｎｄａｒｄ  ｅｒｒｏｒ（ＳＥ）値を算出した。結果を表１に示す。
【０３３８】
【表１】
2018138546.tif 000002
【０３３９】
その結果、表１に示すように、各種ヒト化抗体がキメラ抗体と同等のヒトＣＲＴＨ２反応性を有することが示唆された。
【０３４０】
［実施例８］
ｃｈＬｙｍ２およびヒト化Ｌｙｍ２抗体の好酸球、好塩基球に対する除去（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）活性
へパリンナトリウム注射液を加えて採取したヒト末梢血を４℃、１５００ｒｐｍ、３０分間遠心分離し、血漿を回収した。
【０３４１】
血漿を回収した後の赤血球を含むペレットに、ＰＢＳ（ナカライテスク社）を加えて元の血液容量に戻し、懸濁したもの１ｍＬに対して、溶血用溶液［１０×ＲＢＣ  Ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（ｅ−ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を滅菌水で１０倍に希釈したもの］を１０ｍＬ添加して転倒混和した。室温で１０分間放置した後、常温、１５００ｒｐｍ、５分間の遠心分離を行い、上清を除き、ＰＢＳで２回洗浄した。
【０３４２】
その後、細胞ペレットを、回収していた血漿で懸濁し、３００μＬ／ｗｅｌｌで４８ｗｅｌｌプレートに播種し、１０００、１００、３３、１１、３．７、１．２、０．４および０．０１ｎｇ／ｍＬ各最終濃度のｃｈＬｙｍ２、各ヒト化Ｌｙｍ２抗体ＬＶ０ＨＶ０、ＬＶ０ＨＶ１、ＬＶ０ＨＶ２ａ、またはアイソタイプコントロール抗体［Clin Cancer Res 2005, 11(8), 3126-3135記載の抗２，４−ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ（ＤＮＰ）ＩｇＧ１抗体をコードするベクターを用い、実施例５に記載の方法に準じて作製したＩｇＧ１抗体（以下、抗ＤＮＰ  ＩｇＧ１抗体と記す）］を添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で、２０時間反応させた。
【０３４３】
反応後、各ｗｅｌｌの細胞液を回収し、ＳＭを１０ｍＬ添加し、コントロールビーズとしてＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ  Ａｂｓｏｌｕｔｅ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｂｅａｄｓ、ｆｏｒ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）を２００μＬ／サンプルで添加した後、４℃、２０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離を行い、上清を除いた。ＳＭで２回洗浄し、ＳＭで希釈した１００００μｇ／ｍＬ  ＩｇＧ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ（シグマアルドリッチ社）を３００μＬ／サンプルで添加して、懸濁した後、４℃、３０分間反応させた。
【０３４４】
その後、４０μＬ／ｗｅｌｌで９６ウェルプレートに播種し、好酸球の検出として、ＰＥ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  Ｓｉｇｌｅｃ−８  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）、好塩基球の検出としてＰＥ−Ｃｙ７  Ｍｏｕｓｅ  Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ＣＤ１２３（ＢＤバイオサイエンス社）およびＡｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  Ｆｃ  ｅｐｓｉｌｏｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｉ  ａｌｐｈａ（ＦｃεＲ１）ＡＰＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を、それぞれ５μＬ／ｗｅｌｌ添加し、４℃、４０分間反応させた。
【０３４５】
ＳＭで２回洗浄後、７−ＡＡＤ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢＤバイオサイエンス社）を１％含有したＳＭで細胞を懸濁し、４℃、１０分間放置した後、蛍光強度をフローサイトメトリー（ＢＤバイオサイエンス社製、ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩ）を用いて解析した。
【０３４６】
ヒト好酸球は、ＦＳＣ−ＳＳＣ展開の顆粒球画分における７−ＡＡＤ陰性ｓｉｇｌｅｃ８−ＰＥ陽性画分として検出した。ヒト好塩基球は、ＦＳＣ−ＳＳＣ展開のリンパ球画分における７−ＡＡＤ陰性、ＣＤ１２３−ＰＣ−Ｃｙ７陽性、ＦｃεＲＩ−ＡＰＣ陽性画分として検出した。細胞除去活性は、一定数のＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔのｃｏｕｎｔ数当たりのそれぞれの細胞のｃｏｕｎｔ数を解析することで評価した。
【０３４７】
その結果、図３（Ａ）〜図３（Ｃ）に示すように、評価したヒト化Ｌｙｍ２抗体ＬＶ０ＨＶ０、ＬＶ０ＨＶ１およびＬＶ０ＨＶ２ａはいずれも、キメラＬｙｍ２抗体ｃｈＬｙｍ２と同等の好酸球および好塩基球に対する細胞傷害活性を示すことが明らかとなった。
【０３４８】
［実施例９］比較対照用抗ヒトＣＲＴＨ２抗体の作製
（１）比較対照用抗ヒトＣＲＴＨ２抗体発現ベクターの作製
国際公開第２０１４／１４４８６５号記載の抗ヒトＣＲＴＨ２モノクローナル抗体ｈｕ１９Ａ２  ｖ５２、ｈｕ８Ｂ１  ｖ１、ｍｕ８Ｂ１、ｍｕ３Ｃ１２およびｍｕ３１Ａ５のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列（それぞれ、国際公開第２０１４／１４４８６５号中ではＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：５７および４０、６４および５２、６２および５０、６３および５１、並びに６５および５３で表される）をコードする塩基配列を、全合成した。
【０３４９】
実施例５−（１）に記載の方法に準じて、それぞれの抗体のＶＨおよびＶＬの組み合わせとなるよう、上記塩基配列を抗体発現ベクターに組み込み、５種の比較対照用ヒト化またはキメラ抗ヒトＣＲＴＨ２抗体（それぞれｈｕ１９Ａ２  ｖ５２、ｈｕ８Ｂ１  ｖ１、ｃｈ８Ｂ１、ｃｈ３Ｃ１２およびｃｈ３１Ａ５）発現ベクターをそれぞれ作製した。
【０３５０】
（２）比較対照用抗ヒトＣＲＴＨ２抗体の一過性発現細胞の作製および抗体の精製
実施例５−（２）および（３）に記載の方法に準じて、ｈｕ１９Ａ２  ｖ５２、ｈｕ８Ｂ１  ｖ１、ｃｈ８Ｂ１、ｃｈ３Ｃ１２またはｃｈ３１Ａ５の抗体発現ベクターを宿主細胞に一過性発現させ、培養上清からそれぞれの抗体の精製を行った。
【０３５１】
［実施例１０］ヒトＣＲＴＨ２アミノ酸置換体発現細胞を用いた、抗ヒトＣＲＴＨ２モノクローナル抗体のエピトープ解析
（１）ヒトＣＲＴＨ２アミノ酸置換体発現ベクターの作製
ヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列のうち、細胞外領域のアミノ酸残基を部分的に別のアミノ酸残基に置換したアミノ酸置換体の発現ベクターを作製した。具体的には、配列番号２で表されるアミノ酸配列にＳ２Ａ；Ｎ４Ａ；Ｔ６ＡおよびＬ７Ａ；Ｋ８Ａ、Ｐ９ＡおよびＬ１０Ａ；Ｐ１２Ａ、Ｌ１４ＡおよびＥ１５Ａ；Ｑ１６Ｅ、Ｒ１９ＨおよびＱ２１Ｒ；Ｈ２３Ａ、Ｓ２４ＡおよびＮ２５Ａ；Ｔ２６Ａ、Ｓ２７ＡおよびＩ２８Ａ；Ｄ１７１Ａ、Ｔ１７２ＡおよびＩ１７３Ａ；Ｓ１７４Ａ、Ｒ１７５ＡおよびＬ１７６Ａ；Ｄ１７７Ａ、Ｇ１７８ＡおよびＲ１７９Ａ；Ｉ１８０ＡおよびＭ１８１Ａ；Ｙ１８３Ａ、Ｙ１８４ＡおよびＮ１８５Ａ；Ｌ１８７Ａ、Ｌ１８８ＡおよびＬ１８９Ａ；Ｎ１９０Ａ；Ｐ１９１Ａ；Ｇ１９２Ａ；Ｐ１９３Ａ；Ｄ１９４Ａ；Ｒ１９５Ａ；Ｄ１９６ＡおよびＴ１９８Ａ；Ｎ２７５Ａ、Ｇ２７７ＡおよびＬ２７８Ａ；Ｐ２７６Ａ；Ｐ２７９ＡおよびＬ２８１Ａ；Ｐ２８０Ａ；またはＶ２８２Ａ、Ｒ２８３ＡおよびＲ２８４Ａの置換をしたアミノ酸置換体を発現するベクターをそれぞれ作製した。なお、前記アミノ酸置換の記号は［置換前のアミノ酸残基の１文字表記］［Ｎ末端から数えた置換の位置］［置換後のアミノ酸残基の１文字表記］を表す。
【０３５２】
発現ベクターとしては、ｐｈｍＡＧ１−ＭＮＬｉｎｋｅｒ（ＭＢＬ社）を用い、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素サイトに終始コドンを欠失させた各種アミノ酸置換体をコードする遺伝子を挿入することで、細胞内Ｃ末端領域にアザミグリーンのタグが付加されるようにした。
【０３５３】
上記のアミノ酸置換体を発現するベクターは、１）アミノ酸置換体をコードする遺伝子配列を全合成し、ベクターに挿入する方法または、２）配列番号１で示される野生型ヒトＣＲＴＨ２アミノ酸配列をコードするＤＮＡが挿入されたベクターから、部位特異的変異導入を行うことにより作製した。
【０３５４】
（２）ヒトＣＲＴＨ２アミノ酸置換体一過性発現細胞の造成
ヒトＣＲＴＨ２アミノ酸置換体の発現細胞株の調製には、ＣＨＯ−Ｓ細胞（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いた。細胞の継代には８ｍＭ  Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含むＦｒｅｅ  ｓｔｙｌｅ  ＣＨＯ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で振とう培養した。
【０３５５】
（１）で作製された２５μｇのヒトＣＲＴＨ２アミノ酸置換体発現ベクターを４００μＬのＯｐｔｉ−Ｐｒｏ  ＳＦＭ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に、また、２５μＬのＦｒｅｅｓｔｙｌｅ  ＭＡＸ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を４００μＬのＯｐｔｉ−Ｐｒｏ  ＳＦＭにそれぞれ溶解し、室温で５分間放置した。上記二液を混合し、室温で１５分間放置した。該混合溶液を上記ＣＨＯ−Ｓ培養液に添加し、２４時間培養することでヒトＣＲＴＨ２アミノ酸置換体発現細胞株を得た。
【０３５６】
（３）ヒトＣＲＴＨ２アミノ酸置換体発現細胞を用いた、取得抗体の反応性解析
（２）で樹立されたヒトＣＲＴＨ２アミノ酸置換体発現ＣＨＯ−Ｓ細胞を、ＳＭで洗浄した後、１ウェルあたり２×１０５ｃｅｌｌｓとなるように９６ウェルプレートに播種し、１７００ｒｐｍで２分間の遠心分離を行った。上清を除いた後、ＳＭで１０μｇ／ｍＬになるように調製したｃｈＬｙｍ２、ＬＶ０ＨＶ１、実施例９で作製された抗ヒトＣＲＴＨ２抗体ｈｕ１９Ａ２  ｖ５２、ｈｕ８Ｂ１  ｖ１、ｃｈ３Ｃ１２もしくはｃｈ３１Ａ５、または市販ラット抗ヒトＣＲＴＨ２抗体ＢＭ１６（ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ社）を添加し、４℃で１時間の反応を行った。
【０３５７】
細胞を洗浄した後、ｃｈＬｙｍ２、ＬＶ０ＨＶ１、ｈｕ１９Ａ２  ｖ５２、ｈｕ８Ｂ１
ｖ１、ｃｈ３Ｃ１２またはｃｈ３１Ａ５が添加されたウェルにはＳＭで希釈したｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ＨｕｍａｎＩｇＧ  ａｌｅｘａ６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）を、ＢＭ１６が添加されたウェルにはＳＭで希釈した  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ＲａｔＩｇＧ  ａｌｅｘａ６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）をそれぞれ最終濃度１０μｇ／ｍＬで添加し、４℃で１時間の反応を行った。
【０３５８】
反応後、細胞を洗浄し、細胞をＳＭで懸濁し、蛍光強度をフローサイトメトリー（ＢＤバイオサイエンス社、ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩ）で解析した。解析に関しては、全細胞からアザミグリーンの陽性細胞をｇａｔｉｎｇし、その集団における各抗体の反応性を解析した。
【０３５９】
また、各変異体間での発現レベルを補正するため、各抗体の結合によるＡｌｅｘａ６４７の蛍光強度を、Ｃ末端領域に付加したアザミグリーンの蛍光強度で除して相対的蛍光強度を算出し、各抗体の反応性とした。そして、野生型ヒトＣＲＴＨ２発現細胞に対する各抗体の蛍光強度を１００％とした際の、ヒトＣＲＴＨ２アミノ酸置換体発現細胞への相対的蛍光強度を、各抗体に関して解析した。
【０３６０】
その結果、図４〜図７に示すように、ヒト化Ｌｙｍ２抗体ＬＶ０ＨＶ１は、Ｐ１２Ａ、Ｌ１４ＡおよびＥ１５Ａ；Ｄ１７７Ａ、Ｇ１７８ＡおよびＲ１７９Ａ；Ｉ１８０ＡおよびＭ１８１Ａ；Ｙ１８３Ａ、Ｙ１８４ＡおよびＮ１８５Ａ；Ｌ１８７Ａ、Ｌ１８８ＡおよびＬ１８９Ａ；Ｇ１９２Ａ；Ｄ１９４Ａ；Ｒ１９５Ａ；またはＤ１９６ＡおよびＴ１９８ＡのヒトＣＲＴＨ２アミノ酸置換体発現細胞への反応性が消失することが明らかになった。
【０３６１】
また、キメラＬｙｍ２抗体ｃｈＬｙｍ２は、加えて、Ｄ１７１Ａ、Ｔ１７２ＡおよびＩ１７３ＡのヒトＣＲＴＨ２アミノ酸置換体発現細胞への反応性が消失することが明らかになった。ヒト化Ｌｙｍ２抗体ＬＶ０ＨＶ１のＤ１７１Ａ、Ｔ１７２ＡおよびＩ１７３Ａを含むヒトＣＲＴＨ２アミノ酸置換体発現細胞への反応性は、大幅に低下していることから、ＬＶ１ＨＶ０およびｃＬｙｍ２はいずれも同じエピトープに結合していることが示唆された。
【０３６２】
一方、今回比較した他の抗ヒトＣＲＴＨ２抗体は、本発明の抗ヒトＣＲＴＨ２抗体とは異なる部位のヒトＣＲＴＨ２アミノ酸置換体発現細胞への反応性が顕著に低下していたことから、既存の他の抗ヒトＣＲＴＨ２抗体は、本願発明の抗体とは異なるエピトープを認識していることが明らかになった。
【０３６３】
更に、各アミノ酸置換体発現細胞への反応性を詳細に確認した結果、既存の抗ヒトＣＲＴＨ２抗体はいずれもＧ１９２ＡまたはＤ１９４Ａを含むアミノ酸置換体発現細胞への反応性は低下せず、本願発明の抗体のみが、該細胞への反応性が低下したことから、本願発明の抗ヒトＣＲＴＨ２抗体は、ヒトＣＲＴＨ２のＧｌｙ１９２およびＡｓｐ１９４の少なくとも１つアミノ酸残基を含むエピトープに結合することが明らかになった。
【０３６４】
［実施例１１］ヒト好酸球に対する反応性評価
へパリンナトリウム注射液を加えて採取したヒト末梢血に対し、等量の注射用生理食塩水を添加し、混和した。５０ｍＬ容量の遠沈管にＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＲＥＭＩＵＭ１．０８４（ＧＥヘルスケア社）を１５ｍＬ添加し、生理食塩水で希釈した上記ヒト末梢血を３０ｍＬ重層し、室温、１５００ｒｐｍで３０分間遠心分離を行った。
【０３６５】
遠心分離後、血漿層、単核球層およびＦｉｃｏｌｌ層の半量をアスピレーターで除去し、並びに遠心間の壁面に付着している血小板を滅菌した綿棒を用いて除いた。その後、滅菌した氷冷水２７ｍＬを各チューブに分注し３０秒間溶血させた。
【０３６６】
その後、氷冷した１０×ＰＩＰＥＳ緩衝液［５００ｍＬの蒸留水に、３２．１５ｇの塩化ナトリウム（和光純薬社）、１．８５ｇの塩化カリウム（ナカライテスク社）、３８ｇのＰＩＰＥＳ（ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−１，４−ｂｉｓ（２−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ナカライテスク社）、８．４ｇの水酸化ナトリウム（ナカライテスク社）を溶解させたもの］を３ｍＬ添加して等張に戻し、４℃、１２００ｒｐｍ、５分間遠心分離した。遠心分離終了後、上清を吸引し、２ｍＬの１×ＰＩＰＥＳ緩衝液［蒸留水を用いて１０×ＰＩＰＥＳ緩衝液を１０倍に希釈した溶液］を加えて細胞ペレットをほぐした。
【０３６７】
再度上記溶血操作を繰り返し、得られた細胞ペレットを、ａｕｔｏＭＡＣＳ  Ｒｉｎｓｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ミルテニーバイオテク社）にＭＡＣＳ  ＢＳＡ  Ｓｔｏｃｋ
Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ミルテニーバイオテク社）を添加したもの（以下、ＭＡＣＳバッファーと略記する）を用いて２回洗浄した。
【０３６８】
細胞数をカウントした後、ＣＤ１６  ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ、ｈｕｍａｎ（ミルテニーバイオテク社）を用いて、添付の説明書に従い好酸球をネガティブセレクション法により単離した。
【０３６９】
単離された細胞をＳＭで洗浄した後、１ウェルあたり１×１０５ｃｅｌｌｓとなるように９６ウェルプレートに播種し、２０００ｒｐｍで２分間の遠心分離を行った。上清を除いた後、ＳＭで希釈した、１０、３．３、１．１、０．３７、および０．１２μｇ／ｍＬ各最終濃度のＬｙｍ２抗体、市販ＣＲＴＨ２抗体のＢＭ１６（ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ社）または３０１１０８（Ｒ＆Ｄ社）を添加し、４℃で１時間の反応を行った。
【０３７０】
細胞を洗浄した後、Ｌｙｍ２抗体またはＢＭ１６が添加されたウェルには、ＳＭで希釈したＣＥＬＬ  ＬＡＢ  Ｍｏｕｓｅ  Ａｎｔｉ−Ｒａｔ  Ｋａｐｐａ（ｋａｐｐａ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ）ＦＩＴＣ（ベックマンコールター社）を、３０１１０８が添加されたウェルには、ＳＭで希釈したＣＥＬＬ  ＬＡＢ  Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（γ  ｃｈａｉｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ）Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＦＩＴＣ）Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ベックマンコールター社）をそれぞれ最終濃度１０μｇ／ｍＬで添加し、４℃で１時間の反応を行った。再び細胞を洗浄した後、細胞をＳＭで懸濁し、蛍光強度をフローサイトメトリー（ＢＤバイオサイエンス社製、ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩ）で解析した。
【０３７１】
その結果、ラット抗ヒトＣＲＴＨ２抗体Ｌｙｍ２はヒト好酸球に対して、市販のラット抗ヒトＣＲＴＨ２抗体ＢＭ１６およびマウス抗ヒトＣＲＴＨ２抗体３０１１０８よりも強い反応性を示すことが明らかとなった（図８）。
【０３７２】
［実施例１２］ヒト好塩基球に対するｃｈＬｙｍ２の反応性
へパリンナトリウム注射液を加えて採取したヒト末梢血に対し、等量の注射用生理食塩水を添加し、混和した。５０ｍＬ容量の遠沈管にＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＲＥＭＩＵＭ  １．０８４（ＧＥヘルスケア社）を１５ｍＬ添加し、生理食塩水で希釈したヒト末梢血を３０ｍＬ重層し、室温、１５００ｒｐｍで３０分間遠心分離を行った。
【０３７３】
遠心分離後、単核球層をピペットで回収し、ＭＡＣＳバッファーを用いて２回洗浄した。細胞数をカウントした後、Ｂａｓｏｐｈｉｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＩＩ，ｈｕｍａｎ（ミルテニーバイオテク社製）を用いて、添付の説明書に従い好塩基球をネガティブセレクション法により単離した。
【０３７４】
単離された細胞をＳＭで洗浄した後、１ウェルあたり５×１０４ｃｅｌｌｓとなるように９６ウェルプレートに播種し、２０００ｒｐｍで２分間の遠心分離を行った。上清を除いた後、１００μＬのＳＭで細胞を懸濁し、Ｚｅｎｏｎ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７  Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製）を用いて添付の説明書に従い標識を行った、ｃｈＬｙｍ２または実施例８記載のアイソタイプコントロール抗体を、最終濃度１０μｇ／ｍＬになるように添加し、４℃で１時間の反応を行った。細胞を洗浄した後、細胞をＳＭで懸濁し、蛍光強度をフローサイトメトリー（ＢＤバイオサイエンス社、ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩ）で解析した。
【０３７５】
その結果、ヒト好塩基球に対して、ｃｈＬｙｍ２の反応性が確認された（図９）。従って、本願発明のキメラ抗ヒトＣＲＴＨ２抗体ｃＬｙｍ２は、好塩基球に結合することが明らかになった。
【０３７６】
［実施例１３］ヒトＣＤ４陽性Ｔ細胞に対するヒト化Ｌｙｍ２抗体の反応性
実施例１２に準じ、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＲＥＭＩＵＭ  １．０８４の代わりにＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＲＥＭＩＵＭ（ＧＥヘルスケア社）を用いて調製した単核球層の細胞懸濁液を１００μＬ／ｗｅｌｌで９６ウェルプレートに播種し、ＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ，Ｎｏ−Ｗｅｉｇｈ  Ｆｏｒｍａｔ（ＰＩＥＲＣＥ社）を用いて添付の説明書に従いビオチン標識したヒト化Ｌｙｍ２抗体ＬＶ０ＨＶ１を最終濃度１０μｇ／ｍＬになるように添加し、４℃で１時間の反応を行った。
【０３７７】
細胞を洗浄した後、ＳＭで希釈した最終濃度１０μｇ／ｍＬ  ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、および添付の説明書に記載された量のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）、ＦＩＴＣ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＣＤ３  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（バイオレジェンド社）およびＣＤ４  Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｃｌｏｎｅ  ＳＫ３、ＰＥ−Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ（ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を添加し、４℃で１時間の反応を行った。
【０３７８】
再び細胞を洗浄した後、細胞をＳＭで懸濁し、蛍光強度をフローサイトメトリー（ＢＤバイオサイエンス社、ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩ）で解析した。解析は、ＦＳＣ−ＳＳＣ展開によりリンパ球を分画し、さらにＣＤ３陽性かつＣＤ４陽性細胞で分画した細胞群に対して、ヒト化Ｌｙｍ２抗体ＬＶ０ＨＶ１による蛍光染色の蛍光強度を縦軸に、ＣＤ４抗体による蛍光染色の蛍光強度を横軸に示すことで、ＣＤ３陽性ＣＤ４陽性細胞におけるヒト化Ｌｙｍ２抗体ＬＶ０ＨＶ１の反応性画分の割合を算出した。その結果、ＣＤ３陽性ＣＤ４陽性のＴ細胞画分の約２〜３％にヒト化Ｌｙｍ２抗体ＬＶ０ＨＶ１が反応した（図１０）。
【０３７９】
［実施例１４］好酸球、好塩基球に対する細胞傷害活性
実施例８と同様にして調製した細胞懸濁液を、９５μＬ／ｗｅｌｌで９６ｗｅｌｌプレートに播種し、１０００、１０、３、１、０．３、０．１ｎｇ／ｍＬ各最終濃度の被験抗体を添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で２０時間反応させた。被験抗体としては、ヒト化Ｌｙｍ２抗体ＬＶ０ＨＶ１、実施例９で作製された抗ヒトＣＲＴＨ２抗体ｈｕ１９Ａ２  ｖ５２、ｈｕ８Ｂ１  ｖ１、ｃｈ３Ｃ１２およびｃｈ３１Ａ５を用いた。アイソタイプコントロール抗体としては抗ＤＮＰ  ＩｇＧ１抗体を用いた。
【０３８０】
反応後の各ｗｅｌｌにＳＭを１００μＬ／ｗｅｌｌで添加し、コントロールビーズとしてＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ  Ａｂｓｏｌｕｔｅ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｂｅａｄｓ，ｆｏｒ
ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）を２０μＬ／ｗｅｌｌで添加し、４℃、２０００ｒｐｍ、２分間の遠心分離を行い、上清を除いた。ＳＭで２回洗浄し、ＳＭで希釈した１００００μｇ／ｍＬ  ＩｇＧ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ
ｓｅｒｕｍ（シグマアルドリッチ社）を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加して、４℃、３０分間反応させた。以降は、実施例８と同様の方法で行った。
【０３８１】
その結果、ヒト化抗ヒトＣＲＴＨ２抗体ＬＶ０ＨＶ１は、抗体濃度依存的に好酸球および好塩基球のいずれの細胞も除去した。既存の抗ヒトＣＲＴＨ２抗体ｃｈ３Ｃ１２は、ヒト化抗ヒトＣＲＴＨ２抗体ＬＶ０ＨＶ１と比べて細胞を除去する活性が弱かった［図１１（Ａ）および図１１（Ｂ）］。従って、本願発明の抗ヒトＣＲＴＨ２抗体は、ＣＲＴＨ２が発現する好酸球または好塩基球を標的とした治療効果を発揮し得ることが示唆される。
【０３８２】
［実施例１５］Ｔｈ２細胞に対する細胞傷害活性
実施例１３と同様にして調製した単核球層を、１／１０ｖｏｌｕｍｅ  ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社）、２００ｍＭ−Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  Ｓｔｏｃｋ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ナカライテスク社）、１０ｍＭ  ＭＥＭ  Ｎｏｎ−Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｇｉｂｃｏ社）、１００ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｐｙｒｕｖａｔｅ（Ｇｉｂｃｏ社）、１Ｍ  ＨＥＰＥＳ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｇｉｂｃｏ社）および１／１００ｖｏｌｕｍｅ  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ，Ｌｉｑｕｉｄ（Ｇｉｂｃｏ社）を添加したＲＰＭＩ１６４０（和光純薬社）［以下、ＰＢＭＣ（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ）培養培地と記す］で２回洗浄し、１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ細胞懸濁液を調製した。
【０３８３】
調製した細胞懸濁液を１００μＬ／ｗｅｌｌで９６ウェルプレートに播種し、ｃｈＬｙｍ２抗体、ヒト化抗ヒトＣＲＴＨ２抗体ＬＶ０ＨＶ１または実施例８記載のアイソタイプコントロール抗体を最終濃度１０μｇ／ｍＬ添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で２０時間反応させた。
【０３８４】
反応後の細胞をＰＢＭＣ培養培地で７回洗浄し、被験抗体を十分に除去した後、１００μＬのＰＢＭＣ培養培地に懸濁し、抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３（Ａｂｃａｍ社）を１μｇ／ｍＬの濃度で固相化したプレートに播種した。その後、２μｇ／ｍＬに調製した抗ＣＤ２８抗体（ＢＤバイオサイエンス社）を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で３日間反応させた。
【０３８５】
反応後の上清を回収し、Ｈｕｍａｎ  ＩＦＮ−γ  Ｆｌｅｘ  Ｓｅｔ（ＢＤバイオサイエンス社）、Ｈｕｍａｎ  ＩＬ−５  Ｆｌｅｘ  Ｓｅｔ（ＢＤバイオサイエンス社）、Ｈｕｍａｎ  ＩＬ−１３  Ｆｌｅｘ  Ｓｅｔ（ＢＤバイオサイエンス社）を用いて、添付の説明書に従い上清中サイトカインの定量を行った。
【０３８６】
その結果、キメラ抗ヒトＣＲＴＨ２抗体ｃｈＬｙｍ２およびヒト化抗ヒトＣＲＴＨ２抗体ＬＶ０ＨＶ１は、Ｔｈ２サイトカインであるＩＬ−５およびＩＬ−１３の産生を減少させたが、その一方で、Ｔｈ１サイトカインであるＩＦＮ−γの産生は変化させなかった。即ち、本発明の抗体はＴｈ２細胞を選択的に除去していることが示唆された［図１２（Ａ）および図１２（Ｂ）］。従って、本発明の抗ヒトＣＲＴＨ２抗体は、Ｔｈ２細胞を標的とした治療効果を発揮できることが示唆された。
【０３８７】
［実施例１６］リガンド存在下における反応性評価（２９３ＥＢＮＡ）
実施例１−（１）−（ｉｉ）で作製したヒトＣＲＴＨ２遺伝子発現ｐＡＭｏｈベクターを、Ｆｕｇｅｎｅ６（プロメガ社）を用いて２９３ＥＢＮＡ細胞（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に導入し、１０％ＦＢＳ、０．２５ｍｇ／ｍＬ  Ｇ４１８（ナカライテスク社）、１００μｇ／ｍＬ  ペニシリン、１００Ｕ／ｍＬ  ストレプトマイシン（ナカライテスク社）および３００μｇ／ｍＬ  ハイグロマイシンＢ（和光純薬社）ＤＭＥＭからなる培地で薬剤耐性細胞を選択し、ヒトＣＲＴＨ２発現２９３ＥＢＮＡ細胞を樹立した。
【０３８８】
ヒトＣＲＴＨ２発現２９３ＥＢＮＡ細胞を０．０２％ＥＤＴＡ溶液（ナカライテスク社）で剥離し、ＰＢＳで洗浄した後、上記培地で懸濁した。次に、１×１０５ｃｅｌｌｓ／９０μＬ／ｗｅｌｌとなるように９６ウェルプレートに播種し、ＤＫＰＧＤ２（Ｃａｙｍａｎ  ｃｈｅｍｉｃａｌ社）を最終濃度１０μＭになるように添加した。
【０３８９】
３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で１５分間放置した後、０．３、１および３μｇ／ｍＬ各最終濃度のヒト化Ｌｙｍ２抗体ＬＶ０ＨＶ１、公知の抗ヒトＣＲＴＨ２抗体ｈｕ１９Ａ２  ｖ５２、ｈｕ８Ｂ１  ｖ１、ｃｈ３Ｃ１２、ｃｈ３１Ａ５、ＢＭ１６（ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ社）または３０１１０８（Ｒ＆Ｄ社）を添加し、常温で３０分間の反応を行った。
【０３９０】
細胞をＳＭで５回洗浄した後、ＬＶ０ＨＶ１、ｈｕ１９Ａ２  ｖ５２、ｈｕ８Ｂ１  ｖ１、ｃｈ３Ｃ１２またはｃｈ３１Ａ５が添加されたウェルにはＳＭで希釈した１０μｇ／ｍＬ  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ＨｕｍａｎＩｇＧ  Ａｌｅｘａ６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｐｒｏｂｅｓ社）を、ＢＭ１６が添加されたウェルにはＳＭで希釈した１０μｇ／ｍＬ
ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ＲａｔＩｇＧ  Ａｌｅｘａ６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）を、３０１１０８が添加されたウェルには、ＳＭで希釈した１０μｇ／ｍＬ  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  Ａｌｅｘａ６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）をそれぞれ最終濃度１０μｇ／ｍＬで添加し、４℃、４０分間の反応を行った。再び細胞を洗浄した後、細胞をＳＭで懸濁し、蛍光強度をフローサイトメトリー（ＢＤバイオサイエンス社、ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩ）で解析した。
【０３９１】
その結果、図１３（Ａ）〜（Ｃ）に示すように、既存の抗ヒトＣＲＴＨ２抗体は、いずれもヒトＣＲＴＨ２リガンドであるＤＫＰＧＤ２存在下で、ヒトＣＲＴＨ２発現細胞への結合が低下したのに対して、ヒト化Ｌｙｍ２抗体ＬＶ０ＨＶ１は、検討したいずれの抗体濃度においても、ヒトＣＲＴＨ２発現細胞への結合は殆ど低下しなかった。
【０３９２】
即ち、本発明の抗体は、高濃度のリガンド存在下でも高い反応性を有することが明らかになった。従って、本発明の抗ヒトＣＲＴＨ２抗体は、リガンド存在下でもヒトＣＲＴＨ２発現細胞に対して、リガンド非存在下での反応性と同等に結合することができ、該ヒトＣＲＴＨ２発現細胞に作用することができる有用な抗体であることが示唆された。
【０３９３】
［実施例１７］分化誘導ヒトマスト細胞に対する反応性解析
Nature Protocols 2006, 1(4), 2178-2183記載の方法に準じてマスト細胞を調製した。分化誘導開始から１１週時点のマスト細胞をＳＭで洗浄し、１ウェルあたり５×１０４ｃｅｌｌｓとなるように９６ウェルプレートに播種し、ＰＥ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＣＤ２０３ｃ（Ｅ−ＮＰＰ３）Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ  ４２１（商標）ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＣＤ１１７（ｃ−ｋｉｔ）Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）、Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  Ｆｃ  ｅｐｓｉｌｏｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｉ  ａｌｐｈａ（ＦｃεＲ１）ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を添加し、４℃で１時間の反応を行った。細胞を洗浄した後、ＳＭで懸濁し、蛍光強度をフローサイトメトリー（ＢＤバイオサイエンス社製、ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩ）で解析した。
【０３９４】
その結果、分化誘導を行ったマスト細胞は、マスト細胞表面マーカーであるＣＤ２０３ｃ、ＣＤ１１７、ＦｃεＲＩをいずれも発現していることが確認できた。
【０３９５】
分化誘導開始から１５週間時点のマスト細胞培養液に、抗ＤＮＰ  ＩｇＧ１抗体の定常領域をＩｇＥ型に組み換えたヒトＩｇＥを最終濃度１０μｇ／ｍＬで添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で３日間反応させた。
【０３９６】
反応後のマスト細胞を最終濃度１００μｇ／ｍＬ  ペニシリン、１００Ｕ／ｍＬ  ストレプトマイシン（ナカライテスク社）および５５μＭ  β−ＭＥ（Ｇｉｂｃｏ社）を添加したＩＭＤＭ（Ｇｉｂｃｏ社）（以下、ｂａｓｉｃ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｕｍと略記する）で２回洗浄し、４ｍＬのｂａｓｉｃ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｕｍで懸濁し、最終濃度１０μｇ／ｍＬ  ｒａｂｂｉｔ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉ  ｈｕｍａｎ
ＩｇＥａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｄａｋｏ社）を添加し、ＭＡＣＳ  ｍｉｘ  ｔｕｂｅ  ｒｏｔａｔｏｒ（ミルテニーバイオテク社）を用いて回転させながら３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で１時間反応させた。
【０３９７】
反応後の細胞をＳＭで二回洗浄し、１ウェルあたり５×１０４個となるように９６ウェルプレートに播種し、２０００ｒｐｍで２分間の遠心分離を行った。上清を除いた後、ＳＭで希釈した１００００μｇ／ｍＬ  ＩｇＧ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ（シグマアルドリッチ社）を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加して、４℃、３０分間反応させ、ＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ，Ｎｏ−Ｗｅｉｇｈ  Ｆｏｒｍａｔ（ＰＩＥＲＣＥ社）を用いて添付の説明書に従い、それぞれビオチン標識したヒト化抗ヒトＣＲＴＨ２抗体ＬＶ０ＨＶ１、抗ヒトＣＲＴＨ２抗体ｈｕ１９Ａ２  ｖ５２、ｃｈ８Ｂ１、ｃｈ３Ｃ１２もしくはｃｈ３１Ａ５、または未標識の市販の抗ヒトＣＲＴＨ２抗体ＢＭ１６（ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ社）もしくは３０１１０８（Ｒ＆Ｄ社）を最終濃度１０μｇ／ｍＬで添加し、４℃で１時間の反応を行った。
【０３９８】
なお、アイソタイプコントロール抗体として、ＢＭ１６に対してはＰｕｒｉｆｉｅｄ  Ｒａｔ  ＩｇＧ２ａ，κ  Ｉｓｏｔｙｐｅ  Ｃｔｒｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）を、３０１１０８に対してはＮｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｍｏｕｓｅ
ＩｇＧ２ａ（Ｄａｋｏ社）を、それ以外の抗体に対しては抗ＤＮＰ  ＩｇＧ１抗体を、それぞれ用いた。
【０３９９】
細胞を洗浄した後、ビオチン標識したＬＶ０ＨＶ１、ｈｕ１９Ａ２  ｖ５２、ｃｈ８Ｂ１、ｃｈ３Ｃ１２またはｃｈ３１Ａ５を添加したウェルにはＳＭで希釈したｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）を、ＢＭ１６を添加したウェルにはＳＭで希釈したｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ＲａｔＩｇＧ  Ａｌｅｘａ６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）を、３０１１０８を添加したウェルにはＳＭで希釈したｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ＭｏｕｓｅＩｇＧ  Ａｌｅｘａ６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）を最終濃度１０μｇ／ｍＬで添加し、４℃、４０分間の反応を行った。再び細胞を洗浄した後、細胞をＳＭで懸濁し、蛍光強度をフローサイトメトリー（ＢＤバイオサイエンス社、ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩ）で解析した。
【０４００】
その結果、図１４に示すように、ｈｕ１９Ａ２  ｖ５２がマスト細胞に対して反応性を示す一方で、ＬＶ０ＨＶ１を含むｈｕ１９Ａ２ｖ５２以外の抗体は反応性を示さなかった。
【０４０１】
［実施例１８］分化誘導Ｔｈ１に対する反応性解析
（１）ＰＢＭＣからのナイーブＴ細胞の分離
健常人由来凍結ＰＢＭＣ（Ａｌｌｃｅｌｌｓ社）を、ＤＮａｓｅ  Ｉ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ、ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を５０μＬ含有した２０ｍＬのＰＢＭＣ培養培地で１回洗浄し、再びＤＮａｓｅ  Ｉ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ、ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅを５０μＬ含有した２０ｍＬのＰＢＭＣ培養培地に懸濁し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で２時間放置した。
【０４０２】
その後、実施例１１に記載のＭＡＣＳ  ｂｕｆｆｅｒで二回洗浄し、Ｎａｉｖｅ  ＣＤ４＋  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＩＩ  ｈｕｍａｎ（ミルテニーバイオテク社）を用いて、添付の説明書に従いナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞をネガティブセレクション法により単離した。ナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞の純度を高めるため、上記ネガティブセレクションを２回実施した。
【０４０３】
（２）ナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞からのＴｈ１細胞の分化誘導
J Immunol, 2002. 169(5):p. 2498-2506記載の方法に準じて分離したナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞を、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社）および２ｍＭ  グルタミン酸（ナカライテスク社）を添加したＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ社）（以下、培養培地と略記する）で１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに懸濁し、刺激の工程として、抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３（Ａｂｃａｍ社）を１μｇ／ｍＬの濃度で固相化したプレートに播種し、最終濃度２μｇ／ｍＬ  抗ＣＤ２８抗体（ＢＤバイオサイエンス社）、１００ｎｇ／ｍＬ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ＩＬ−１２（ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）、１０ｎｇ／ｍＬ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ＩＬ−２（ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）、および５μｇ／ｍＬ  抗ＩＬ−４抗体（ＢＤバイオサイエンス社）を添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で４日間反応させた。
【０４０４】
その後、細胞を回収し、遠心分離により上清を除去した後、培養培地で１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに懸濁し、増殖の工程として、最終濃度１００ｎｇ／ｍＬ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ＩＬ−１２（ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）、１０ｎｇ／ｍＬ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ＩＬ−２（ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）および５μｇ／ｍＬ
抗ＩＬ−４抗体（ＢＤバイオサイエンス社）を添加し３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で３日間反応させた。
【０４０５】
上記の刺激、増殖の工程を合計３回繰り返すことで、分化誘導Ｔｈ１細胞を樹立した。
【０４０６】
（３）分化誘導Ｔｈ１細胞からのサイトカイン産生解析
（２）の分化誘導Ｔｈ１細胞培養液に、最終濃度２０ｎｇ／ｍＬのＰｈｏｒｂｏｌ  １２−ｍｙｒｉｓｔａｔｅ  １３−ａｃｅｔａｔｅ（シグマアルドリッチ社）、１μｇ／ｍＬのＩｏｎｏｍｙｃｉｎ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｓａｌｔ  ｆｒｏｍ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ（シグマアルドリッチ社）および１０μｇ／ｍＬの  Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ  Ａ  ｆｒｏｍ  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｂｒｅｆｅｌｄｉａｎｕｍ（シグマアルドリッチ社）を添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で６時間反応させた。その後、２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで９６ウェルプレートに播種し、ＰＢＳ（ナカライテスク社）で洗浄した。
【０４０７】
その後、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ａｑｕａ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎ  Ｋｉｔ，ｆｏｒ  ４０５ｎｍ  ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）を用いて添付の説明書に従い死細胞を染色し、ＰＢＳで二回洗浄した後、上清を除き、Ｆｉｘａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤバイオサイエンス社）を用いて４℃、４５分間反応させた。
【０４０８】
反応後、ＰＢＳで１回、１×Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤバイオサイエンス社）で２回洗浄した後、最終濃度２．５μＬのＰＥａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＩＦＮ−γ
Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）、５μＬのＡＰＣ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ
ＩＬ−４  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）、１０μＬのａｎｔｉ−ＩＬ−５  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ＡＰＣ（ミルテニーバイオテク社）および２０μＬのＡＰＣ
ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＩＬ−１３  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）を添加し、４℃で３０分間反応させた。
【０４０９】
その後、１×Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒで２回洗浄し、細胞をＳＭで懸濁し、蛍光強度をフローサイトメトリー（ＢＤバイオサイエンス社、ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩ）で解析した。
【０４１０】
その結果、分化誘導Ｔｈ１は、ＩＬ−４／５／１３が陰性であり、９０％がＩＦＮγ陽性のｐｏｐｕｌａｔｉｏｎであることが確認され、Ｔｈ１サイトカインを選択的に産生する細胞であることが確認できた。
【０４１１】
（４）分化誘導Ｔｈ１細胞に対する抗ヒトＣＲＴＨ２抗体の反応性解析
（２）において樹立された分化誘導Ｔｈ１細胞をＳＭで洗浄した後、１ウェルあたり５×１０４ｃｅｌｌｓとなるように９６ウェルプレートに播種し、２０００ｒｐｍで２分間の遠心分離を行った。上清を除いた後、ＳＭで希釈した１０μｇ／ｍＬラット抗ヒトＣＲＴＨ２抗体Ｌｙｍ２、公知の抗ヒトＣＲＴＨ２抗体  ＢＭ１６（ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ社）または３０１１０８（Ｒ＆Ｄ社）を添加し、４℃で１時間の反応を行った。
【０４１２】
アイソタイプコントロール抗体として、Ｌｙｍ２に対してはＲａｔ  ＩｇＧ２ｂ、ｋａｐｐａ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ［ＲＴＫ４５３０］−ＢＳＡ／Ａｚｉｄｅ  ｆｒｅｅ（ａｂｃａｍ社）を、ＢＭ１６に対してはＰｕｒｉｆｉｅｄ  Ｒａｔ  ＩｇＧ２ａ、κ  Ｉｓｏｔｙｐｅ  ＣｔｒｌＡｎｔｉｂｏｄｙ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）を、３０１１０８に対してはＮｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ２ａ（Ｄａｋｏ社）を、それぞれ用いた。
【０４１３】
細胞を洗浄した後、Ｌｙｍ２抗体またはＢＭ１６を添加したウェルにはＳＭで希釈した１０μｇ／ｍＬ  ＣＥＬＬ  ＬＡＢ  Ｍｏｕｓｅ  Ａｎｔｉ−Ｒａｔ  Ｋａｐｐａ（ｋａｐｐａ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ）ＦＩＴＣ（ベックマンコールター社）を、３０１１０８を添加したウェルには、ＳＭで希釈した１０μｇ／ｍＬ  ＣＥＬＬ
ＬＡＢ  Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（γ  ｃｈａｉｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ）Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＦＩＴＣ）Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ベックマンコールター社）を最終濃度１０μｇ／ｍＬでそれぞれ添加し、４℃で１時間の反応を行った。再び細胞を洗浄した後、細胞をＳＭで懸濁し、蛍光強度をフローサイトメトリー（ＢＤバイオサイエンス社、ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩ）で解析した。
【０４１４】
その結果、図１５に示すように、ラット抗ヒトＣＲＴＨ２抗体Ｌｙｍ２および市販のラット抗ヒトＣＲＴＨ２抗体ＢＭ１６は分化誘導Ｔｈ１には反応性を示さなかった。一方で、市販のマウス抗ヒトＣＲＴＨ２抗体３０１１０８は分化誘導Ｔｈ１に対して反応性を示した。
【０４１５】
したがって、本発明の抗ヒトＣＲＴＨ２抗体は、好酸球、好塩基球およびＴｈ２細胞には反応するものの、Ｔｈ１細胞には反応しないことが明らかになった。また、３０１１０８は、ＣＲＴＨ２を発現する細胞以外にも非特異的に反応性を示すことが明らかになった。
【０４１６】
［実施例１９］ヒト好酸球の形態変化を指標にした、Ｌｙｍ２抗体のアンタゴニスト活性評価
実施例１１と同様の方法により、ヒト末梢血から好酸球の分離を行った。単離されたヒト好酸球をダルベッコりん酸緩衝生理食塩水（以下、Ｄ−ＰＢＳ（−）と記す）（ナカライテスク社）で懸濁し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で１時間３０分反応させた。その後、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０を用いて２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで９６ウェルプレートに播種した。その後、最終濃度１０μｇ／ｍＬのアイソタイプコントロール抗体［ＣＥＬＬ  ＬＡＢ  Ｒａｔ  ＩｇＧ２ｂ  Ｉｓｏｔｙｐｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ（ベックマンコールター社）］、もしくはＬｙｍ２抗体、またはポジティブコントロールとして最終濃度１０μＭ  ＣＲＴＨ２低分子拮抗薬ＯＣ０００４５９（Ｃａｙｍａｎ
ｃｈｅｍｉｃａｌ社）を添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で３０分間反応させた。
【０４１７】
次に、０．１、１、１０、１００および１０００ｎＭ各最終濃度のＤＫＰＧＤ２（Ｃａｙｍａｎ  ｃｈｅｍｉｃａｌ社）を添加し、さらに３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で６０分間反応させた。反応後、氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、ＦｉｘａｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ（ＢＤバイオサイエンス社）を２００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、よく懸濁した後、４℃で３０分間放置した。その後、ＳＭで二回洗浄し、フローサイトメトリー（ＢＤバイオサイエンス社、ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩ）で好酸球の形態変化を解析した。
【０４１８】
好酸球の形態変化は、フローサイトメーターによる解析において細胞の大きさ、細胞の表面積または細胞径の指標であるＦｏｗａｒｄ  Ｓｃａｔｔｅｒ  Ｌｉｇｈｔ（ＦＳＣ）プロットの増加を指標に解析を行い、ＤＫＰＧＤ２未処理の好酸球のＦＳＣを基準として、高ＦＳＣのｇａｔｅに検出される好酸球の割合（％）を算出した。
【０４１９】
その結果、図１６に示すように、ヒトＣＲＴＨ２リガンドＤＫＰＧＤ２は、濃度依存的な好酸球の形態変化誘導をしたが、ＣＲＴＨ２低分子拮抗薬ＯＣ０００４５９は、ＤＫＰＧＤ２依存的な好酸球の形態変化を抑制した。これに対して、本発明の抗ヒトＣＲＴＨ２抗体Ｌｙｍ２およびアイソタイプコントロール抗体は、いずれもＤＫＰＧＤ２依存的な好酸球の形態変化を抑制しなかった。即ち、本発明の抗ヒトＣＲＴＨ２抗体はアンタゴニスト活性を有しないことが示唆された。
【０４２０】
［実施例２０］ヒト好酸球の形態変化を指標にした、Ｌｙｍ２抗体のアゴニスト活性評価
上述実施例１９と同様の実験系において、０、０．０１、０．１、１および１０μｇ／ｍＬ各最終濃度のラット抗ヒトＣＲＴＨ２抗体Ｌｙｍ２を加え、１時間反応させて、好酸球の形態変化を解析した。
【０４２１】
その結果、図１７に示すように、Ｌｙｍ２抗体は抗体濃度０−１０μｇ／ｍＬの範囲で処理を行っても好酸球の形態変化を起こさないことが示された。即ち、本発明の抗ヒトＣＲＴＨ２抗体はアゴニスト活性を有しないことが示唆された。
【０４２２】
［実施例２１］ヒト好酸球の形態変化を指標にした、抗ヒトＣＲＴＨ２抗体のアゴニスト活性、アンタゴニスト活性、リガンドによるシグナルの増強活性の評価
実施例１１と同様の方法により、ヒト末梢血から好酸球の分離を行った。但し、血液に等量の注射用生理食塩水を添加する操作は行わず、直接Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＲＥＭＩＵＭ  １．０８４（ＧＥヘルスケア社）に重層した。単離されたヒト好酸球をＤ−ＰＢＳ（−）（ナカライテスク社）で懸濁し、５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、１時間３０分反応させた。
【０４２３】
その後、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０を用いて０．７×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで９６ウェルプレートに播種した。その後、アイソタイプコントロール抗体、ヒト化Ｌｙｍ２抗体ＬＶ０ＨＶ１、実施例９で作成された抗ヒトＣＲＴＨ２抗体ｈｕ１９Ａ２  ｖ５２、ｃｈ８Ｂ１、ｃｈ３Ｃ１２もしくはｃｈ３１Ａ５、または市販の抗ヒトＣＲＴＨ２抗体ＢＭ１６（ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ社）もしくは３０１１０８（Ｒ＆Ｄ社）を最終濃度１０μｇ／ｍＬで添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で３０分間反応させた。
【０４２４】
なお、アイソタイプコントロール抗体として、ＢＭ１６に対してはＰｕｒｉｆｉｅｄ  Ｒａｔ  ＩｇＧ２ａ、κ  Ｉｓｏｔｙｐｅ  Ｃｔｒｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）、３０１１０８に対してはＮｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ２ａ（Ｄａｋｏ社）、その他の抗体に対しては抗ＤＮＰ  ＩｇＧ１抗体を用いた。
【０４２５】
次に、１００ｎＭ最終濃度のＤＫＰＧＤ２（Ｃａｙｍａｎ  ｃｈｅｍｉｃａｌ社）または１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０を添加し、さらに３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で６０分間反応させた。反応後、氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、Ｆｉｘａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤバイオサイエンス社）を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、よく懸濁した後、４℃で３０分間放置した。その後、ＳＭで二回洗浄し、実施例１９と同様の方法で好酸球の形態変化を解析した。
【０４２６】
その結果、図１８（Ａ）〜（Ｃ）に示すように、リガンド非存在下における抗ヒトＣＲＴＨ２抗体の処理による形態変化に関しては、ｈｕ１９Ａ２  ｖ５２において若干の形態変化の傾向が認められるものの、強い形態変化を起こす抗体は存在せず、いずれの抗体もアゴニスト活性を有しないことが示唆された。
【０４２７】
また、ＤＫＰＧＤ２処理条件下における抗ヒトＣＲＴＨ２抗体の処理による形態変化に関しては、ｃｈ８Ｂ１、ｃｈ３Ｃ１２、ｃｈ３１Ａ５の処理により、ＤＫＰＧＤ２により誘発される形態変化が抑制されたことから、これらの抗体はアンタゴニスト活性を有することが示唆された。本結果は、先行特許文献（国際公開２０１４／１４４８６５号）における知見と一致する。
【０４２８】
一方、ｈｕ１９Ａ２  ｖ５２およびＢＭ１６は、ＤＫＰＧＤ２により誘発される形態変化を増強した。特にｈｕ１９Ａ２  ｖ５２は、１００ｎＭのＤＫＰＧＤ２により誘発される形態変化を約２倍まで増強することが明らかになった。
【０４２９】
上述の通り、ｈｕ１９Ａ２  ｖ５２およびＢＭ１６抗体はリガンド非存在下では形態変化を誘発しないことから、これらの抗体はＣＲＴＨ２リガンドであるＤＫＰＧＤ２によるシグナルの増強活性を有することが示唆された。
【０４３０】
一方ＬＶ０ＨＶ１および３０１１０８は、アイソタイプコントロール抗体と同様に、ＤＫＰＧＤ２非存在下、存在下のいずれの条件下においても、形態変化に影響を示さなかったことから、ＤＫＰＧＤ２によるシグナルの増強活性を有していないことが示唆された。
【０４３１】
本発明の抗ヒトＣＲＴＨ２抗体は、生理的シグナルを遮断または増強することがない点で好ましい。
【０４３２】
［実施例２２］ＣＲＴＨ２活性化状態の変遷に伴うコンフォメーション変化に対するＣＲＴＨ２モノクローナル抗体の反応性評価
（１）ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗体の作製
Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ２（Ｄｏｊｉｎｄｏ社）を用いて、添付文書に従い、ヒト化Ｌｙｍ２抗体ＬＶ０ＨＶ１およびｈｕ１９Ａ２  ｖ５２にＨＲＰを直接標識した後、Ｄ−ＰＢＳ（−）（ナカライテスク社）で１ｍｇ／ｍＬに希釈した。
【０４３３】
（２）ヒトＣＲＴＨ２発現細胞の膜画分の調製
実施例１で樹立したヒトＣＲＴＨ２発現ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞を０．０２％ＥＤＴＡ溶液（ナカライテスク社）に剥離し、４℃に冷却したＤ−ＰＢＳ（−）を用いて細胞を洗浄した。Ｍｉｎｕｔｅ  Ｐｌａｓｍａ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｅｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、添付文書に従い膜画分を調製した。
【０４３４】
（３）ヒトＣＲＴＨ２発現細胞の膜画分に対する抗ヒトＣＲＴＨ２抗体の反応性の評価
５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ社）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２（ナカライテスク社）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ（ナカライテスク社）および１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ社）を添加した５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ  ｐＨ７．４（ナカライテスク社）（以下、ＥＬＩＳＡ反応液と記す）を、（２）にて調製した膜画分に加え、１ｍｇ／ｍＬになるように調製し、プロテオセーブ１．５ｍＬマイクロチューブ（住友ベークライト社）に、５０μＬ／ｔｕｂｅで添加した。
【０４３５】
次に、５００μＭ  ＧＴＰγＳ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）または５００μＭ  ＧＤＰ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を添加したＥＬＩＳＡ反応液を５０μＬ／ｔｕｂｅで添加し、３０℃にて、１時間インキュベートした。
【０４３６】
続いて、Ｄ−ＰＢＳ（−）で１０ｍｇ／ｍＬに希釈したＩｇＧ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ
ｓｅｒｕｍ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）および３０％ｗ／ｖ  ＢＳＡ−ＰＢＳ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｆｒｅｅ（Ｗａｋｏ社）をそれぞれ５０μＬ／ｔｕｂｅで添加し、３０℃で、３０分間インキュベートした。
【０４３７】
次に、（１）で作製した、ＨＲＰ標識されたＬＶ０ＨＶ１またはｈｕ１９Ａ２  ｖ５２をＥＬＩＳＡ反応液により５μｇ／ｍＬに希釈し、５０μＬ／ｔｕｂｅで添加した後３０℃で１時間インキュベートすることにより、膜画分に対する抗体反応を行った。１６０００ｇにて４℃で３０分間遠心した後、上清を除去した。
【０４３８】
その後、もともとＧＴＰγＳを添加していたチューブには１００μＭ  ＧＴＰγＳを添加したＥＬＩＳＡ反応液、ＧＤＰを添加していたチューブには１００μＭ  ＧＤＰを添加したＥＬＩＳＡ反応液をそれぞれ１ｍＬ／ｔｕｂｅで添加して、再度１６０００ｇにて４℃で３０分間遠心した後、上清を除去した。同様の操作を４回繰り返した後、Ｄ−ＰＢＳ（−）を１００μＬ／ｔｕｂｅで添加し、膜画分を十分に懸濁した。
【０４３９】
懸濁液を９６ウェルプレートに３０μＬ／ｗｅｌｌで添加し、１−Ｓｔｅｐ  Ｕｌｔｒａ  ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加した。室温で１０分間反応させた後、０．５ｍｏｌ／Ｌ  硫酸（Ｗａｋｏ社）を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加し、反応を停止させた。
【０４４０】
ＳＰＥＣＴＲＡ  ｍａｘ  ３４０ＰＣにより４８０ｎｍにおける吸光度を測定し、得られた結果をＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ｖｅｒ．６．０５）を用いて解析した。また、Ｔｕｋｅｙ’ｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ  ｔｅｓｔを適応し、有意差検定を併せて実施した。
【０４４１】
その結果、図１９に示すようにＧＤＰ処理時におけるｈｕ１９Ａ２  ｖ５２の膜画分に対する反応性は、ＧＴＰγＳ処理時に比べて有意に低下した（ｐ＜０．０００１）。一方、ＬＶ０ＨＶ１の反応性は、ＧＴＰγＳまたはＧＤＰ処理時においても、変化しなかった（ｐ＞０．１）。
【０４４２】
ＣＲＴＨ２はＧＰＣＲであり、ＧＰＣＲは一般的に、活性化型コンフォメーションではＧＴＰが結合し、不活性化型コンフォメーションではＧＤＰが結合していることが知られている。上記結果の通り、本発明の抗ヒトＣＲＴＨ２抗体は、ＧＴＰアナログのＧＴＰγＳまたはＧＤＰによる処理の有無に関わらずＣＲＴＨ２への反応性が変化しなかったことから、ＣＲＴＨ２の活性化に伴うコンフォメーション変化に影響されず、一定の反応性を示す可能性が示唆された。
【０４４３】
［実施例２３］アザミグリーン融合ヒトおよびカニクイザルＣＲＴＨ２発現ｐｈｍＡＧ１−ＭＮＬｉｎｋｅｒベクターの作製
（１）アザミグリーン融合ヒトＣＲＴＨ２発現ｐｈｍＡＧ１−ＭＮＬｉｎｋｅｒベクターの作製
実施例１の（１）−（ｉｉ）で作製されたヒトＣＲＴＨ２遺伝子発現ｐＡＭｏｈに対し、プライマーｈｕｍａｎＣＲＴＨ２ａｚａｍｉ−Ａ（配列番号６０）及びｈｕｍａｎＣＲＴＨ２ａｚａｍｉ−Ｂ（配列番号６１）を用いて目的断片をＰＣＲで増幅し、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて、ベクターｐｈｍＡＧ１−ＭＮＬｉｎｋｅｒ（ＭＢＬ社）と連結し、アザミグリーン融合ヒトＣＲＴＨ２発現ｐｈｍＡＧ１−ＭＮＬｉｎｋｅｒベクターを構築した。
【０４４４】
（２）アザミグリーン融合カニクイザルＣＲＴＨ２発現ｐｈｍＡＧ１−ＭＮＬｉｎｋｅｒベクターの作製
全合成されたカニクイザルＣＲＴＨ２のｃＤＮＡ（ｃＤＮＡ配列：配列番号６２、アミノ酸配列：配列番号６３）を用い、実施例１の（１）−（ｉｉ）と同様の方法で構築したカニクイザルＣＲＴＨ２発現ｐＭｏｈベクターに対し、プライマーｃｙｎｏＣＲＴＨ２ａｚａｍｉ−Ａ（配列番号６４）およびｃｙｎｏＣＲＴＨ２ａｚａｍｉ−Ｂ（配列番号６５）を用い、（１）と同様にしてアザミグリーン融合カニクイザルＣＲＴＨ２発現ｐｈｍＡＧ１−ＭＮＬｉｎｋｅｒベクターを構築した。
【０４４５】
［実施例２４］アザミグリーン融合ヒトＣＲＴＨ２発現ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞およびカニクイザルＣＲＴＨ２発現ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞の造成
実施例２３で作製されたヒトおよびカニクイザルＣＲＴＨ２遺伝子発現ｐｈｍＡＧ１−ＭＮＬｉｎｋｅｒベクターを制限酵素ＢｓａＩ処理によって切断し、得られた直鎖状ＤＮＡを精製し、滅菌水に溶解した。このＤＮＡをエレクトロポレーション法により、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞に導入し、ＩＭＤＭ培養培地にて３日程度培養した。
【０４４６】
その後、０．５ｍｇ／ｍＬ  Ｇ４１８（ナカライテスク社）を加えたＩＭＤＭ選択培地で薬剤耐性細胞を選択した。選択した薬剤耐性細胞を、０．２５％  Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（ナカライテスク社）で剥離し、ＰＢＳで洗浄した後、ＩＭＤＭ選択培地で懸濁した。その後、Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｅｒ  ＳＨ８００（Ｓｏｎｙ社）を用いて、ヒトＣＲＴＨ２発現細胞およびカニクイザルＣＲＴＨ２発現細胞で同程度のアザミグリーン蛍光強度を示す細胞集団をそれぞれゲートし、１ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌでソーティングを行い、拡大培養し、アザミグリーン融合ヒトＣＲＴＨ２発現ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞およびカニクイザルＣＲＴＨ２発現ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞をそれぞれ樹立した。
【０４４７】
アザミグリーン融合ヒトＣＲＴＨ２発現ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞およびカニクイザルＣＲＴＨ２発現ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞について、上記と同様の方法で細胞調製を行い、フローサイトメトリー（ＢＤバイオサイエンス社、ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩ）を用いてアザミグリーンの発現確認を行った。その結果、図２０に示すように、それぞれの細胞のアザミグリーンの発現が同等であることを確認した。
【０４４８】
［実施例２５］ヒトまたはカニクイザルＣＲＴＨ２に対するヒト化Ｌｙｍ２抗体ＬＶ０ＨＶ１の結合活性評価
実施例２４で樹立されたアザミグリーン融合ヒトまたはカニクイザルＣＲＴＨ２発現ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞を、０．０２％ＥＤＴＡ溶液（ナカライテスク社）で剥離し、ＰＢＳで洗浄した後、ＳＭで懸濁した。次に、細胞数を１ウェルあたり２×１０５個となるように９６ウェルプレートに播種し、３００００、７５００、１８７５、４６９、１１７、２９、７および２ｎｇ／ｍＬ各最終濃度のヒト化Ｌｙｍ２抗体ＬＶ０ＨＶ１または抗ＤＮＰ
ＩｇＧ１抗体を添加し、４℃で４０分間の反応を行った。
【０４４９】
細胞をＳＭで３回洗浄した後、ＳＭで１０μｇ／ｍＬの濃度に希釈したｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ＨｕｍａｎＩｇＧ  ａｌｅｘａ６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）を１ウェルあたり１００μＬ添加し、４℃で４０分間の反応を行った。ＳＭで細胞を洗浄した後、細胞を１００μＬのＳＭで再懸濁し、蛍光強度をフローサイトメトリー（ＢＤバイオサイエンス社、ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩ）で測定した。
【０４５０】
データはＦｌｏｗＪｏ  ７．６５（トミーデジタルバイオロジー社）によって解析した。その結果、図２１に示す通り、ＬＶ０ＨＶ１が、ヒトＣＲＴＨ２およびサルＣＲＴＨ２に対し、ほぼ同等の結合性を示すことが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０４５１】
本発明によりヒトＣＲＴＨ２の特徴的なエピトープを認識し、結合することで所望の活性を有する抗ヒトＣＲＴＨ２抗体、該抗体断片、該抗体のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該抗体を生産するハイブリドーマおよび抗体生産細胞、該抗体の製造方法、該抗体または抗体断片を含む組成物、該抗体または抗体断片を用いるアレルギー性疾患、自己免疫疾患、好酸球増多や機能亢進を伴う疾患、Ｔｈ２細胞の増多や機能亢進を伴う疾患などの治療方法および診断方法、並びに該抗体または抗体断片を含む医薬および診断薬を提供することができる。
【配列表フリーテキスト】
【０４５２】
配列番号３：人工配列の記載：ｈｕｍａｎＣＲＴＨ２ＦＬＡＧ−Ａの塩基配列
配列番号４：人工配列の記載：ｈｕｍａｎＣＲＴＨ２ＦＬＡＧ−Ｂの塩基配列
配列番号５：人工配列の記載：ＦＬＡＧタグ付ヒトＣＲＴＨ２  ｃＤＮＡの塩基配列
配列番号６：人工配列の記載：ｈｕｍａｎＣＲＴＨ２ＦＬＡＧ−Ｃの塩基配列
配列番号７：人工配列の記載：ｈｕｍａｎＣＲＴＨ２ＦＬＡＧ−Ｄの塩基配列
配列番号８：人工配列の記載：ＲａｔＩｇＧ２ｂＨ−Ａの塩基配列
配列番号９：人工配列の記載：ＲａｔＩｇＧ２ｂＨ−Ｂの塩基配列
配列番号１０：人工配列の記載：Ｒａｔｋ−Ａの塩基配列
配列番号１１：人工配列の記載：Ｒａｔｋ−Ｂの塩基配列
配列番号２０：人工配列の記載：Ｌｙｍ２抗体  ＶＨ  ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号２１：人工配列の記載：Ｌｙｍ２抗体  ＶＨ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号２２：人工配列の記載：Ｌｙｍ２抗体  ＶＨ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号２３：人工配列の記載：Ｌｙｍ２抗体  ＶＬ  ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号２４：人工配列の記載：Ｌｙｍ２抗体  ＶＬ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号２５：人工配列の記載：Ｌｙｍ２抗体  ＶＬ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号２６：人工配列の記載：ｃｈＬｙｍ２発現ベクター用ＶＨの合成ＤＮＡ
配列番号２７：人工配列の記載：ｃｈＬｙｍ２発現ベクター用ＶＬの合成ＤＮＡ
配列番号２８：人工配列の記載：ｃｈＬｙｍ２  ＶＨ−Ａの塩基配列
配列番号２９：人工配列の記載：ｃｈＬｙｍ２  ＶＨ−Ｂの塩基配列
配列番号３０：人工配列の記載：ｃｈＬｙｍ２  ＶＨ−Ｃの塩基配列
配列番号３１：人工配列の記載：ｃｈＬｙｍ２  ＶＨ−Ｄの塩基配列
配列番号３２：人工配列の記載：ＬＶ０の塩基配列
配列番号３３：人工配列の記載：合成コンストラクトのアミノ酸配列
配列番号３４：人工配列の記載：ＬＶ１の塩基配列
配列番号３５：人工配列の記載：合成コンストラクトのアミノ酸配列
配列番号３６：人工配列の記載：ＬＶ２ａの塩基配列
配列番号３７：人工配列の記載：合成コンストラクトのアミノ酸配列
配列番号３８：人工配列の記載：ＬＶ２ｂの塩基配列
配列番号３９：人工配列の記載：合成コンストラクトのアミノ酸配列
配列番号４０：人工配列の記載：ＬＶ２ｃの塩基配列
配列番号４１：人工配列の記載：合成コンストラクトのアミノ酸配列
配列番号４２：人工配列の記載：ＬＶ３ａの塩基配列
配列番号４３：人工配列の記載：合成コンストラクトのアミノ酸配列
配列番号４４：人工配列の記載：ＬＶ３ｂの塩基配列
配列番号４５：人工配列の記載：合成コンストラクトのアミノ酸配列
配列番号４６：人工配列の記載：ＬＶ４の塩基配列
配列番号４７：人工配列の記載：合成コンストラクトのアミノ酸配列
配列番号４８：人工配列の記載：ＨＶ０の塩基配列
配列番号４９：人工配列の記載：合成コンストラクトのアミノ酸配列
配列番号５０：人工配列の記載：ＨＶ１の塩基配列
配列番号５１：人工配列の記載：合成コンストラクトのアミノ酸配列
配列番号５２：人工配列の記載：ＨＶ２ａの塩基配列
配列番号５３：人工配列の記載：合成コンストラクトのアミノ酸配列
配列番号５４：人工配列の記載：ＨＶ２ｂの塩基配列
配列番号５５：人工配列の記載：合成コンストラクトのアミノ酸配列
配列番号５６：人工配列の記載：ＨＶ３の塩基配列
配列番号５７：人工配列の記載：合成コンストラクトのアミノ酸配列
配列番号５８：人工配列の記載：ＨＶ４の塩基配列
配列番号５９：人工配列の記載：合成コンストラクトのアミノ酸配列
配列番号６０：人工配列の記載：ｈｕｍａｎ  ＣＲＴＨ２  ａｚａｍｉ−Ａの塩基配列
配列番号６１：人工配列の記載：ｈｕｍａｎ  ＣＲＴＨ２  ａｚａｍｉ−Ｂの塩基配列
配列番号６４：人工配列の記載：ｃｙｎｏ  ＣＲＴＨ２  ａｚａｍｉ−Ａの塩基配列
配列番号６５：人工配列の記載：ｃｙｎｏ  ＣＲＴＨ２  ａｚａｍｉ−Ｂの塩基配列
【図１】
2018138546.tif 000003
【図２】
2018138546.tif 000004
【図３】
2018138546.tif 000005
【図４】
2018138546.tif 000006
【図５】
2018138546.tif 000007
【図６】
2018138546.tif 000008
【図７】
2018138546.tif 000009
【図８】
2018138546.tif 000010
【図９】
2018138546.tif 000011
【図１０】
2018138546.tif 000012
【図１１】
2018138546.tif 000013
【図１２】
2018138546.tif 000014
【図１３】
2018138546.tif 000015
【図１４】
2018138546.tif 000016
【図１５】
2018138546.tif 000017
【図１６】
2018138546.tif 000018
【図１７】
2018138546.tif 000019
【図１８】
2018138546.tif 000020
【図１９】
2018138546.tif 000021
【図２０】
2018138546.tif 000022
【図２１】
2018138546.tif 000023
【配列表】
2018138546000001.app