(57)【要約】      （修正有）【課題】生物学的製剤製品で治療される動物における抗原性のレベルが低減されたポリペプチドタンパク質産物および核酸産物を製造するための方法の提供。【解決手段】疾患を治療するための単離された組み換え生物学的製剤ポリペプチドまたはタンパク質を製造するための方法であって、（ａ）人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を、前記ポリペプチドまたはタンパク質が前記ｉＰＳＣによって発現される条件下で、前記組み換え生物学的製剤ポリペプチドまたはタンパク質をコードする核酸でトランスフェクトすることと；（ｂ）前記トランスフェクトされたｉＰＳＣの分化をインビトロで誘導することと；（ｃ）工程（ｂ）で得られた分化された細胞から、インビトロで、前記ポリペプチドまたはタンパク質を単離することとを含み、前記ｉＰＳＣは動物の細胞に由来するものである、方法。【選択図】図１
2018007660.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組み換えポリペプチドまたはタンパク質を製造するための方法であって、人工的に生成された多能性幹細胞（ｓｐＰＳＣ）または内因性多能性幹細胞（ｅＰＳＣ）を、前記ポリペプチドまたはタンパク質が前記幹細胞によって発現される条件下で、前記ポリペプチドまたはタンパク質をコードする核酸でトランスフェクトすることを含み、前記ｓｐＰＳＣまたはｅＰＳＣは動物の細胞から生成または単離されたものである、方法。
【請求項２】
前記ポリペプチドまたはタンパク質は、エリスロポエチン、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、トロンビン、抗体もしくは抗体断片、αインターフェロン、インターフェロンα−２Ａおよび２Ｂ、βインターフェロン、成長ホルモン、抗血友病因子、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、可溶性受容体、ＴＧＦ−β、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ＴＧＦα、インターロイキン２、β−グルコセレブロシダーゼもしくはその類似体、α１−プロテイナーゼ阻害剤、フィブリン、フィブリノーゲン、フォンビルブランド因子、イミグルセラーゼ、アガルシダーゼβ、ラロニダーゼ、グルコシダーゼα、サイロトロピンα、ならびにチモシンαからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗体または抗体断片は、ターゲットに結合するものであり、前記ターゲットは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）分子、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、成長因子受容体、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）分子、インターロイキン１、インターロイキン４、インターロイキン６、インターロイキン１１、インターロイキン１２、γインターフェロン、核因子カッパＢ活性化受容体リガンド（ＲＡＮＫＬ）、およびＢｌｙｓからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記可溶性受容体は、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、およびＢｌｙｓからなる群から選択されるターゲットに結合するものである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記トランスフェクトされたｓｐＰＳＣを不死化することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記トランスフェクトされ不死化されたｓｐＰＳＣの分化を誘導することをさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記トランスフェクトされたｓｐＰＳＣまたはｅＰＳＣの分化を誘導することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記トランスフェクトされ分化された細胞を不死化することをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記ｓｐＰＳＣは、人工多能性幹細胞、体細胞核移植により生成された多能性幹細胞（ＳＣＮＴ多能性幹細胞）、改変核移植卵母細胞補助再プログラム化により生成された多能性幹細胞（ＡＮＴ−ＯＡＲ多能性幹細胞）、および単為発生により生成された多能性幹細胞（ＰＧＡ多能性）からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本願は、２０１１年１月３日に出願された米国仮特許出願第６１／４２９，４０９号、２０１１年１月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／４３１，３７６号に対して優先権を主張する。前述の全出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
現在、多くの疾患を治療するために治療的に使用される多くの組み換えポリペプチドおよびタンパク質が存在する。
【背景技術】
【０００２】
これらの組み換えポリペプチドおよびタンパク質は全て、非ヒトまたはヒトの初代継続的２倍体細胞系を使用して商業的に製造されている。例えば、一部は大腸菌等の細菌を使用して製造され、一方、他は酵母または動物由来の様々な卵巣細胞系を使用して製造されている。細菌は、一部のポリペプチドおよびタンパク質の製造には使用することができず、特にグリコシル化パターンおよび他のタンパク質修飾が生物学的製剤の受容体結合親和性、生物学的活性、生体内分布、もしくは薬物動態、またはレシピエント免疫認識に関して重要である場合は使用できない。グリコシル化が重要な可変要素である場合は、チャイニーズハムスターの卵巣細胞が、生物学的製剤の製造のために現在最も一般的に使用されている細胞系の１つである。
【０００３】
残念ながら、長期間に渡る、または慢性的治療のための組み換えポリペプチドまたはタンパク質の使用の必要性は、患者がその製品に対して中和抗体を発達させることをもたらし得、その薬物に対する患者の応答を弱め得る、あるいはその薬物に対して患者を無応答にし得る。いくつかの場合では、患者は、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、潰瘍性大腸炎、およびクローン病等の疾患を日常的に治療するために使用されるエンブレル（Ｅｎｂｒｅｌ）（エタネルセプトとしても知られる）、レミケード（Ｒｅｍｉｃａｉｄｅ）（インフリキシマブとしても知られる）、セルトリズマブ（Ｃｅｒｔｏｌｉｚｕｍａｂ）、およびヒュミラ（Ｈｕｍｉｒａ）（Ｄ２Ｅ７としても知られる）のような様々な抗ＴＮＦ生物学的製剤の場合のように、同類の別の薬物に切り替えることができる。しかしながら、一般に、１つの特定の抗ＴＮＦ生物学的製剤に対する中和抗体の生成は、その患者が最終的に別の抗ＴＮＦ生物学的製剤製品に対する中和抗体を生成しやすくさせる。場合によっては、患者にとって代替治療がなく、そのため、この中和抗体の形成は、患者が治療選択肢を有さない状態にする。適切な治療選択肢があるときでも、同類の他の薬物に対する中和抗体を発達させる傾向が、最終的に、これらの患者が治療選択肢を有さない状態にさせ得ることを意味する。
【０００４】
ヒト抗体により中和され得る他の生物学的製剤製品は、多発性硬化症の新たな療法であるナタリズマブあるいはタイサブリ、および核因子カッパＢ活性化受容体リガンド（ＲＡＮＫＬ）に対する完全ヒト化モノクローナル抗体であるデノスマブ（骨粗鬆症および化学療法による骨折の治療に承認されており、ＨＲＴおよびホルモン避妊薬によって生じる乳癌を治療するために使用される可能性もある）を含む。アバタセプト（Ａｂａｔｅｃｅｐｔ）は、抗ＴＮＦ療法に抵抗性となった関節リウマチ患者における使用が承認されているＣＴＬＡ−４融合タンパク質である。その使用は歴史が浅いため、アバタセプトに誘発された中和抗体についての証拠はまだないが、これも抗体反応を中和させるヒト抗体を誘発する可能性を有する。
【０００５】
抗体および融合タンパク質に基づく薬物以外の他のポリペプチドおよびタンパク質も、長期治療に伴い免疫応答を引き起こすことが示されてきた。例えば、組み換えヒトエリスロポエチンは、その有効性を減少させ稀な無形成（ａｐｌａｓｉａ）症候群をもたらし得る中和抗体形成を引き起こす。また、血友病の凝固因子療法に対する抗体の生成は、患者の２５〜３０％という高率になる。これは凝固因子に伴う一般的な問題である。癌およびＢ型肝炎についての組み換えインターフェロンα２ａ療法も、治療に対する中和抗体の生成によって妨げられる。低身長の子供のための長期成長ホルモン療法に対する不応性も問題である。いくつかのインスリン製品に対する中和抗体形成の報告がある。
【０００６】
中和抗体を引き起こす可能性がある他の生物学的製剤薬物としては、全血、血清、血漿プール、または生物学的製剤を供給する他の一次供給源、例えばヒトアルブミン、ヒトα１−プロテイナーゼ阻害因子、ヒト抗血友病因子／フォンビルブランド因子複合体、ＢａｂｙＢｉｇ  ボツリヌス症の静脈注射用免疫グロブリン、Ｃ１エステラーゼ阻害剤、フィブリンシーラント、フィブリノーゲン、静脈注射用免疫グロブリン、皮下注射用免疫グロブリン、タンパク質Ｃ濃縮物、静脈注射用Ｒｈｏ（Ｄ）免疫グロブリン、トロンビン、フォンビルブランド因子／凝固ＶＩＩＩ因子複合体が挙げられる。
【０００７】
組み換えポリペプチドおよびタンパク質は、複数の特徴に基づいて免疫応答および中和抗体生成を引き起こし、そのような特徴としては、生物学的製剤治療の時間枠、反復療法の間隔、生物学的製剤のアミノ酸組成、ならびに、生物学的製剤に対する修飾、例えばグリコシル化、メチル化、ニトロシル化、シアル化、リン酸化、硫酸化、プレニル化、セレン化（ｓｅｌｅｎａｔｉｏｎ）、ユビキチン化、ビタミン依存性修飾、タンパク質結合会合、アシル化、糖化、３次元構成、および超らせん化等が挙げられる。
【発明の概要】
【０００８】
よって、生物学的製剤製品で治療される動物において減少した抗原性レベルを有する、ポリペプチドタンパク質製品を製造する方法の必要性が存在する。
本明細書に引用される全ての参照文献の教示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００９】
本発明は、人工的に（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃａｌｌｙ）生成された多能性幹細胞（ｓｐＰＳＣ）または内因性多能性幹細胞（ｅＰＳＣ）をトランスフェクトまたは形質転換することによりポリペプチドもしくはタンパク質、核酸、ウイルス、およびワクチン等の生物学的製剤を製造するための方法を提供することにより、この必要性を満たす。これらの細胞は、治療される種に由来する細胞であって、所望の生物学的製剤を発現しそのトランスフェクトまたは形質転換されたｓｐＰＳＣまたはｅＰＳＣによるその生物学的製剤産物の発現を誘導するベクターによって、トランスフェクトされる細胞である。
【００１０】
本発明は、組み換えポリペプチドまたはタンパク質を製造するための方法をさらに提供し、成体細胞からｓｐＰＳＣを生成することまたは動物のｅＰＳＣを単離することと、そのポリペプチドもしくはタンパク質が前述の幹細胞によって発現される条件下で、前述のｓｐＰＳＣまたはｅＰＳＣを、前述のポリペプチドまたはタンパク質をコードする核酸でトランスフェクトまたは形質転換することとを含む。
【００１１】
本発明の代替的な実施形態では、組み換えポリペプチドまたはタンパク質を投与される個人と同じ民族の細胞から、ｓｐＰＳＣが生成され、またはｅＰＳＣが単離される。異なる民族群は、異なるグリコシル化パターン、および群ごとに異なる多型を有し得る。民族は、同じ血液型または組織型を有する集団である。よって、本発明によると、組み換えポリペプチドおよびタンパク質がｓｐＰＳＣまたはｅＰＳＣから製造され、そのｅＰＳＣはそのポリペプチドもしくはタンパク質を投与される個人と同じ民族から単離された細胞であり、または、ｓｐＰＳＣはそのポリペプチドもしくはタンパク質を投与される個人と同じ民族から単離された細胞から生成されるものである。ｓｐＰＳＣまたはｅＰＳＣから生産される組み換えポリペプチドまたはタンパク質が個人に投与され、ここで、そのｓｐＰＳＣはその個人が属する民族に属する細胞から製造されるか、またはそのｅＰＳＣはその個人が属する民族に属する細胞から単離される。
【００１２】
本発明は、ポリペプチドもしくはタンパク質を動物個体に投与する方法をさらに提供し、前述の動物の前述の細胞由来の、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）等のｓｐＰＳＣを生成すること、またはｅＰＳＣを単離することと、そのポリペプチドもしくはタンパク質が前述の多能性幹細胞によって発現される条件下で、前述のｓｐＰＳＣもしくはｅＰＳＣを、前述のポリペプチドまたはタンパク質をコードする核酸でトランスフェクトまたは形質転換することと、前述のポリペプチドもしくはタンパク質を前述の人工多能性幹細胞から単離することと、前述の単離したポリペプチドもしくはタンパク質を前述の個体に投与することとを含む。
【００１３】
本発明は、ポリペプチドまたはタンパク質治療薬を個別生成（ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）するための方法を提供し、それによってｓｐＰＳＣまたはｅＰＳＣを商業的に実行可能かつ有用なものにする。本発明は、長期的もしくは慢性的使用のためのポリペプチドまたはタンパク質において一般的に生じる中和抗体形成の問題を克服するために、患者特異的ポリペプチドまたはタンパク質を製造するための患者特異的ｓｐＰＳＣまたはｅＰＳＣを作製する方法に関する。患者は、あらゆる動物であり得、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトであり得る。本発明は、所望の核酸またはウイルスが生成される条件下で、ｓｐＰＳＣまたはｅＰＳＣをベクターでトランスフェクトまたは形質転換することから構成される、核酸もしくはウイルスを製造するための方法も提供する。
【００１４】
さらに、本発明は、治療的使用のための、密接に一致した翻訳後修飾がされた生物学的製剤を製造するために、患者特異的、および器官または細胞型特異的細胞系を誘導する方法を提供する。患者特異的幹細胞は、ＳＣＮＴ、人工的再プログラム化、単為発生（ｐａｒｔｈｅｎｏｇｅｎｅｓｉｓ）、またはＡＮＴ−ＯＡＲ再プログラム化法を使用して誘導されるか、またはターゲット患者から単離され得る。そのように誘導または単離された多能性幹細胞は、目的の治療薬を発現させるために、標準的な分子バイオテクノロジー手順を使用して、例えば挿入性もしくはエピソーム性発現ベクターまたは相同組み換え法を使用して、遺伝学的に改変され得る。その遺伝学的に改変された細胞系は、培養物中で増殖され、製造される生物学的製剤の保存寿命に基づき計画されるであろう周期的な生物学的製剤の生成作業のために貯えられ得る（実施例２）。あるいは、誘導された患者特異的幹細胞株は、培養物中で、通常最高レベルの所望の治療用タンパク質を発現する細胞型に分化され、次いで生物学的製剤の製造のために使用され得る。分化は、製造される治療薬の保存寿命に基づいて、各々の生成作業ごとに実行されるか、または、大規模で行われて、分化された患者特異的細胞株が後続の生成作業のために貯えられ得る（実施例３）。
【００１５】
加えて、グリコシル化パターンおよび他の翻訳後修飾は組織および細胞型によって異なることが知られているため、患者特異的幹細胞系は、その器官から、またはその生物学的製剤を内因的に発現する細胞型の中から単離された成体細胞もしくは体細胞から調製され得る。例として、ＳＣＮＴ、ＰＧＡ、ＡＮＴ−ＯＡＲ、または再プログラム化技法が次に適用されて生物学的製剤の生産のための多能性細胞系が誘導され得る。そのように誘導または単離された多能性幹細胞は、目的の治療薬を発現させるために、標準的な分子バイオテクノロジー手順を使用して遺伝学的に改変され得る。その遺伝学的に改変された細胞系は、培養物中で増殖され、製造される生物学的製剤の保存寿命に基づき計画されるであろう周期的な生物学的製剤の生成作業のために貯えられ得る（実施例４を参照）。再プログラム化細胞（ｉＰＳ細胞）の「記憶」特性をさらにうまく利用して、患者および組織もしくは細胞型特異的ｉＰＳ細胞は、内因的翻訳後修飾を可能とする細胞系をより完全に創出するために、その起始の（元の）細胞型に分化し戻るように誘導され得る。ｉＰＳ細胞は、元の単離された細胞型に再分化される前に、または元の細胞型に再分化された後に、目的の治療薬を発現するように遺伝学的に改変され得る（実施例５を参照）。
【００１６】
例えば、成長ホルモンは、通常、下垂体前葉内の成長ホルモン産生細胞（ｓｏｍａｔｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｃｅｌｌｓ）によって最も高度に産生され、胎盤（栄養膜）内の細胞ならびに舌および外陰または肛門皮膚でも高度に発現される。Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｔｌａｓによると、第ＶＩＩＩ因子タンパク質の発現は、腎臓内の尿細管細胞で高く、複数の組織および細胞型によって中程度に発現される。抗体は、典型的に、脾臓および他のリンパ器官の胚中心で成熟するＢ細胞によって産生される。高レベルの抗体依存性細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）を有する抗体の治療的生成は、製造細胞系に存在する、ＩｇＧ１亜型抗体の２等分位置にＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮａｃ）を配置することができるＧＤＰ−Ｄ−マンノース−４，６−デヒドラターゼ（ＧＭＤ）のレベルにより決定される（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２７３，ｐｐ．１４５８２−１４５８７，１９９８、およびＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７：８４−９７（２００７））。高ＡＤＣＣ活性を有する抗体の産生は、ＣＨＯ製造細胞系を使用すると必ずしも最適ではない（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７８：３４６６−３４７３，２００３）。本発明は、製造される抗体、融合タンパク質、および細胞毒性生物学的製剤の最適なＡＤＣＣ活性のための新規哺乳類細胞系を提供する。
【００１７】
患者特異的細胞系からの発現レベルを最適化するために、高レベルの生物学的製剤産生と関連することが知られる転写因子を、目的の遺伝子と一緒に共トランスフェクションし得る。例えば、高レベルのＰｉｔ−１発現は、ある細胞型において高プロラクチン発現をもたらし、一方で、成長ホルモンの発現を遮断または防止することができる（Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ，３：９４６−９５８  １９８９）。
【００１８】
モノクローナル抗体の生成は、例えば中華人民共和国のＳｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃによって開発されたもの等のシステムを使用して遺伝子コドンを最適化すること、モルフォジェニクス（ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃｓ）（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，１０３：３５５７−３５６２，２００６）、または他の標準的なバイオテクノロジー法によって強化され得る。
以下において、下記の図面を参照しながら、本発明の好ましい例および代替的な例を詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、全血の勾配遠心分離でもたらされる複数の層を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
＜人工的に生成される多能性幹細胞の生成＞
本発明の個別生物学的製剤を生産するために、あらゆる種類の人工的に生成された多能性幹細胞を使用することができる。２つの主なカテゴリーは、誘導または再プログラム化された多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）と、核移植（ＳＣＮＴ）、ＡＮＴ−ＯＡＲ、および単為発生によって産生された幹細胞である。
【００２１】
体細胞核移植（ＳＣＮＴ）は、成体体細胞の核を除核卵に注入し、その卵を、準備されたレシピエントの子宮内に移植して、完全な核遺伝学的クローンを得る出生をもたらす技術である。加えて、多能性幹細胞は、ＳＣＮＴ法からの培養物中でも誘導された（Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｒｏｇｒａｍ．１２：１０５−１１３，２０１０、およびＧｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，１９：２１９３−２２０１，２００９）。
【００２２】
改変核移植卵母細胞補助再プログラム化（ＡＮＴ−ＯＡＲ）は、ＳＣＮＴに類似する技術であるが、ドナー核が、レシピエント卵内に注入される前に遺伝学的に改変されるため、ＡＮＴ卵母細胞の分化および完全な生物体形成が防止される（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１９：２１９３−２２０１，２００９）。
【００２３】
多能性幹細胞を生成するために、帯なし（ｚｏｎａ−ｆｒｅｅ）核移植、単為発生活性化等の技術を使用する単為発生（ＰＧＡ）も使用され、ＳＣＮＴおよび単為発生（ＰＧＡ）等のクローン技術も再プログラム化多能性幹細胞を生成するために使用されてきた（Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｒｏｇｒａｍ．，１２：１０５−１１３，２０１０、およびＮａｔｕｒｅ，４５０：４９７−５０２  ２００７）。
【００２４】
これらの多能性幹細胞は、多少の長期不定期間に渡って培養物中で維持することができ、組み換えタンパク質、ＤＮＡ、およびウイルス等の生物学的製剤製造の供給源となり得る。
【００２５】
＜誘導または再プログラム化したｓｐＰＳＣ＞
人工多能性幹細胞は、特定の幹細胞遺伝子およびタンパク質の発現、クロマチンメチル化パターン、倍加時間、胚様体形成、奇形腫形成、生存可能なキメラ形成、ならびに発生能および分化能等の多くの点で、胚性幹（ＥＳ）細胞等の天然の多能性幹細胞に類似する。
【００２６】
一般にｉＰＳ細胞またはｉＰＳＣと略記される人工多能性幹細胞は、特定の遺伝子の「強制的」発現を誘導することにより、非多能性細胞、典型的には成体の体細胞から人工的に誘導される、多能性幹細胞の一種である（Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．２００７）。
人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、特定の幹細胞関連遺伝子を非多能性細胞にトランスフェクトすることにより生成される。人工多能性幹細胞は、典型的に、特定の幹細胞関連遺伝子を、成体の線維芽細胞等の非多能性細胞にトランスフェクトすることによって誘導される。トランスフェクションは、典型的に、レトロウイルス等のウイルスベクターまたはレトロトランスポゾンを通して達成される。トランスフェクトされる遺伝子には、マスター転写調節因子Ｏｃｔ−３／４（Ｐｏｕ５ｆ１）およびＳｏｘ２が含まれるが、他の遺伝子が誘導の効率を強化することが示唆されている。３〜４週間後、少数のトランスフェクトされた細胞が、形態学的および生化学的に多能性幹細胞に類似し始め、典型的には、形態的選択、倍加時間、またはレポーター遺伝子および抗生物質選択を通して単離される。
【００２７】
胚性幹細胞由来の線維芽細胞および成体の線維芽細胞ならびに他の細胞は、胚性幹細胞との融合により（Ｃｅｌｌ．１２６：６５２−６５５，２００６およびＳｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｖ，２：３３１−３４０，２００６）、レトロウイルストランスフェクション法を使用した４遺伝子の追加により（Ｃｅｌｌ．１２６：６６３−６７６，２００６）、単一カセットまたは双シストロン性レンチウイルストランスフェクション法により［Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．，２７：５４３−５４９，２００９およびＳｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．，２７：１０４２−１０４９，２００９］、ならびに転写因子を要する多能性の内因的刺激により（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．，２７：３０５３−３０６２，２００９）、多能性状態に再プログラム化されてきた。多能性の誘発は、ゲノムのメチル化またはポリアデニル化状態を改変すること（ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．，４：ｅ８４１９，２００９）、マイクロＲＮＡ（Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．，３４４：１６−２５，２０１０）、要求される転写因子の小分子活性化因子、エピジェネティックな再プログラム化（Ｒｅｇｅｎ  Ｍｅｄ．，２：７９５−８１６，２００７）、タンパク質に基づく再プログラム化（Ｂｌｏｏｄ  １１６：３８６−３９５，２０１０）、培養物中の多能性細胞からの培養上清または細胞抽出物の添加、多能性遺伝子を再活性化するための化学的もしくは放射線または他の手段の遺伝子突然変異、および、内因的多能性状態を誘発または維持する成長因子もしくはサイトカインまたは細胞シグナル伝達部分の付加によっても、達成され得る。
【００２８】
細胞を多能性状態に再プログラム化するためのレトロウイルスの使用は、免疫不全の遺伝子療法治験を想起させる危険性を提示する。再プログラム化の成功後にレトロウイルスを除去するために、Ｃｒｅ−ｌｏｘ等の切除技術が使用されており、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン法は、レトロウイルスの必要性を完全に排除する（Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０：５１６−５２１，２００９）。
【００２９】
ヒトｉＰＳＣは、レトロウイルス系を用い、４つの中枢遺伝子であるＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ−Ｍｙｃを使用して、ヒト線維芽細胞を多能性幹細胞に形質転換することにより生成されてきた。ヒトｉＰＳＣはまた、レンチウイルス系を使用して、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、および異なる遺伝子ＬＩＮ２８を使用しても生成されてきた。アデノウイルスも、マウスの皮膚細胞および肝細胞のＤＮＡに４つの必須の遺伝子を移入するために使用され、胚性幹細胞と同一の細胞をもたらした（Ｓｃｉｅｎｃｅ３２２（５９０３）：９４５−９４９，２００８）。成体細胞のｉＰＳＣへの再プログラム化は、いずれのウイルストランスフェクション系も全く用いずにプラスミドを介して達成することもできる（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２２（５９０３）：９４９−９５３，２００８）。ｐｉｇｇｙ  ｂａｃトランスポゾン系、ミニサークル（ｍｉｎｉ  ｃｉｒｃｌｅ）技術、タンパク質で刺激または調整された培地刺激による再プログラム化を使用してｉＰＳＣが生成されてきた。
【００３０】
ｉＰＳ細胞の生成は、誘導に使用される遺伝子に決定的に依存する。Ｏｃｔ−３／４およびいくつかのＳｏｘ遺伝子ファミリー（Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、およびＳｏｘ１５）は、誘導プロセスに関与する重要な転写調節因子と同定されており、その不在は誘導を不可能にする。しかしながら、いくつかのＫｌｆファミリー（Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４、およびＫｌｆ５）、Ｍｙｃファミリー（Ｃ−ｍｙｃ、Ｌ−ｍｙｃ、およびＮ−ｍｙｃ）、Ｎａｎｏｇ、およびＬＩＮ２８を含む追加的遺伝子が誘導の効率を増加させることが同定されている。
○  Ｏｃｔ−３／４（Ｐｏｕ５ｆ１）（Ｂｉｏｃｌｏｎｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡからｃＤＮＡが入手可能）（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０（１７）：４６１３−２０，１９９２）：Ｏｃｔ−３／４は、八量体（「Ｏｃｔ」）転写因子のファミリーのうちの１つであり、多能性の維持に重要な役割を果たす。卵割球および胚性幹細胞等のＯｃｔ−３／４＋細胞におけるＯｃｔ−３／４の不在は、自発的な栄養膜分化をもたらし、よって、Ｏｃｔ−３／４の存在は、胚性幹細胞の多能性および分化可能性をもたらす。Ｏｃｔ−３／４の類縁物であるＯｃｔ１およびＯｃｔ６を含む「Ｏｃｔ」ファミリーの他の様々な遺伝子は、誘導を引き起こすことができず、よって、誘導プロセスに対するＯｃｔ−３／４の限定性が示されている。
○  Ｓｏｘファミリー：Ｓｏｘファミリーの遺伝子は、Ｏｃｔ−３／４と同様に多能性の維持と関連するが、多能性幹細胞でのみ発現されるＯｃｔ−３／４とは対照的に、多能性幹細胞および単能性幹細胞と関連する（Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．２２７（２）：２３９−５５，２０００）。Ｓｏｘ２（Ｂｉｏｃｌｏｎｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡからｃＤＮＡが入手可能）は、誘導に使用された最初の遺伝子であったが（Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ  ５（１０）：６４０−６４２，１９９５）、Ｓｏｘファミリーの他の遺伝子も誘導プロセスにおいて機能することが分かった。Ｓｏｘ１（Ｂｉｏｃｌｏｎｅ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡからｃＤＮＡが入手可能な）は、Ｓｏｘ２と同様の効率でｉＰＳ細胞を生じ、Ｓｏｘ３遺伝子（Ｂｉｏｃｌｏｎｅ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡからヒトｃＤＮＡが入手可能）、Ｓｏｘ１５、およびＳｏｘ１８も、効率は減少するが、ｉＰＳ細胞を生成する。
○  Ｋｌｆファミリー：Ｋｌｆファミリーの遺伝子のＫｌｆ４は、マウスｉＰＳ細胞の生成因子である。Ｋｌｆ２（Ｂｉｏｃｌｏｎｅ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡからｃＤＮＡが入手可能）およびＫｌｆ４（Ｂｉｏｃｌｏｎｅ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡからｃＤＮＡが入手可能）は、ｉＰＳ細胞を生成することができる因子であり、関連遺伝子のＫｌｆ１（Ｂｉｏｃｌｏｎｅ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡからｃＤＮＡが入手可能）およびＫｌｆ５（Ｂｉｏｃｌｏｎｅ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡからｃＤＮＡが入手可能）も、効率は減少するが、ｉＰＳ細胞を生成した。
○  Ｍｙｃファミリー：Ｍｙｃファミリーの遺伝子は、癌に関与する癌原遺伝子である。Ｃ−ｍｙｃ（Ｂｉｏｃｌｏｎｅ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡからｃＤＮＡが入手可能）は、マウスｉＰＳ細胞の生成に関与する因子である。しかしながら、ｃ−ｍｙｃは、ヒトｉＰＳ細胞の生成には不要となり得る。ｃ−ｍｙｃ誘導ｉＰＳ細胞を移植されたマウスの２５％が致死的な奇形腫を発生したため、ｉＰＳ細胞の誘導における「ｍｙｃ」ファミリーの遺伝子の使用は、臨床療法としてのｉＰＳ細胞の最終的状況に支障をきたす。Ｎ−ｍｙｃ（Ｂｉｏｃｌｏｎｅ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡからｃＤＮＡが入手可能）およびＬ−ｍｙｃは、ｃ−ｍｙｃの代わりに、類似する効率で誘導することが確認されている。
○  Ｎａｎｏｇ：（Ｂｉｏｃｌｏｎｅ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡからｃＤＮＡが入手可能）胚性幹細胞において、Ｏｃｔ−３／４およびＳｏｘ２と共にＮａｎｏｇは、多能性の促進に必要である（Ｃｅｌｌ１１３（５）：６４３−５５，２００３）。
○  ＬＩＮ２８：（Ｂｉｏｃｌｏｎｅ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡからｃＤＮＡが入手可能）ＬＩＮ２８は、胚性幹細胞および胚性癌細胞で発現され分化および増殖と関連するｍＲＮＡ結合タンパク質である（Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ２５８（２）：４３２−４２，２００３）。
【００３１】
＜人工的に生成された多能性幹細胞のアイデンティティ＞
生成したｓｐＰＳＣは、以下の点において、天然に単離される多能性幹細胞（例えば、それぞれｍＥＳＣおよびｈＥＳＣと呼ばれるマウスおよびヒトの胚性幹細胞（ＥＳＣ））と非常に類似しており、よって、天然に単離される多能性幹細胞に対するｓｐＰＳＣの同一性、信憑性、および多能性を裏付ける。
細胞生物学的特性：
○  形態学：ｉＰＳＣは、形態学的にＥＳＣに類似する。それぞれの細胞は、形状が丸く、大型の核小体、およびわずかな細胞質を有する。ｉＰＳＣのコロニーも、ＥＳＣのものに類似する。ヒトｉＰＳＣは、ｈＥＳＣと同様に、縁が鋭利で平坦で密集したコロニーを形成し、マウスｉＰＳＣは、ｍＥＳＣに類似した、ｈＥＳＣより平坦さが少なくより凝集したコロニーを形成する。
○  成長特性：幹細胞はその定義の一部として自己再生しなければならないため、倍加時間および有糸分裂活性はＥＳＣの基本である。ｉＰＳＣは、有糸分裂的に活性であり、活発に自己再生し、増殖し、ＥＳＣと等しい速度で分裂する。
○  幹細胞マーカー：ｉＰＳＣは、ＥＳＣ上で発現されるのと同じ細胞表面抗原マーカーを発現する。ヒトｉＰＳＣは、ｈＥＳＣに特異的なマーカーを発現し、これにはＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＴＲＡ−２−４９／６Ｅ、およびＮａｎｏｇが含まれる。マウスｉＰＳＣは、ＳＳＥＡ−１を発現していたが、ｍＥＳＣと同様に、ＳＳＥＡ−３もＳＳＥＡ−４も発現していなかった。
○  幹細胞遺伝子：ｉＰＳＣは、未分化ＥＳＣで発現される遺伝子を発現し、これにはＯｃｔ−３／４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、ＧＤＦ３、ＲＥＸ１、ＦＧＦ４、ＥＳＧ１、ＤＰＰＡ２、ＤＰＰＡ４、およびｈＴＥＲＴが含まれる。
○  テロメラーゼ活性：テロメラーゼは、約５０細胞分裂のヘイフリック限界により制限されない細胞分裂を維持するために必要である。ｈＥＳＣは、自己再生および増殖を維持するために高いテロメラーゼ活性を発現し、ｉＰＳＣもまた高いテロメラーゼ活性を示し、テロメラーゼタンパク質複合体において必要な構成要素であるｈＴＥＲＴ（ヒトテロメラーゼ逆転写酵素）を発現する。
【００３２】
多能性：ｉＰＳＣは、ＥＳＣに類似する様式で、完全に分化した組織へと分化することができる。
○  神経分化：ｉＰＳＣは、βＩＩＩチューブリン、チロシンヒドロキシラーゼ、ＡＡＤＣ、ＤＡＴ、ＣｈＡＴ、ＬＭＸ１Ｂ、およびＭＡＰ２を発現するニューロンに分化することができる。カテコールアミン関連酵素の存在は、ｉＰＳＣが、ｈＥＳＣと同様に、ドーパミン作動性ニューロンに分化可能であり得ることを示し得る。幹細胞関連遺伝子は、分化後下方制御される。
○  心臓分化：ｉＰＳＣは、自発的に拍動し始める心筋細胞に分化することができる。心筋細胞は、ＴｎＴｃ、ＭＥＦ２Ｃ、ＭＹＬ２Ａ、ＭＹＨＣβ、およびＮＫＸ２．５を発現していた。幹細胞関連遺伝子は、分化後下方制御された。
○  奇形腫形成：免疫不全マウスに注入されたｉＰＳＣは、９週間後に、自発的に奇形腫を形成する。奇形腫は、内胚葉、中胚葉、および外胚葉の３つの胚葉に由来する組織を含む多系列の腫瘍であり、これは、典型的に単一の細胞型のみのものである他の腫瘍と異なる。奇形腫形成は、多能性の指標的な試験である。
○  胚様体：培養物中のｈＥＳＣは、「胚様体」と呼ばれるボール様の胚様構造を自発的に形成し、これは、有糸分裂的に活性で分化しているｈＥＳＣのコアと、３つ全ての胚葉由来の完全に分化した細胞の周縁とからなる。ｉＰＳＣも胚様体を形成し、周縁分化細胞を有する。
○  ４倍体相補性：４倍体胚盤胞（それ自体は胚体外組織のみを形成することができる）に注入された、マウス胎児線維芽細胞由来ｉＰＳ細胞は、成功率は低いものの、完全な、非キメラ性の生殖可能マウスを形成することができる。４倍体相補性アッセイは、２つの哺乳類胚の細胞が組み合わされて新しい胚が形成される生物学の技法である。これは、遺伝子改変生物体を構築すること、胚発生における特定の突然変異の因果関係を研究すること、および多能性幹細胞の研究において使用されている。
【００３３】
人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）は、腸の腸間膜細胞（Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｒｏｇｒａｍ．，１２：２３７−２４７，２０１０）、網膜色素上皮細胞（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．，２８：１９８１−１９９１，２０１０）、羊膜細胞（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．，８０：１２３−１２９，２０１０）、線維芽細胞（Ｊ  Ｖｉｓ  Ｅｘｐ．，８：１５５３，２００９）、成体神経細胞（Ｎａｔｕｒｅ．，Ｖｏｌ．４５４，ｐｐ．６４６−６５０，２００８）、歯髄（Ｊ  Ｄｅｎｔ  Ｒｅｓ，Ｖｏｌ．８９，ｐｐ．７７３−７７８，２０１０）、脂肪細胞（Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．，１９：５２５−５３６，２０１０）、卵巣（Ｊ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｄｅｖ．，５６：４８１−４９４，２０１０）、ならびに胚、胎児、および成体供給源からの他の多くの細胞から生成されてきた。ｉＰＳ細胞は、理論的に、あらゆる細胞型から生成され得るが、身体の全２２０種の細胞型がすでに系統的に検証されたわけではない。最近のいくつかの研究は、ｉＰＳ細胞がその起始細胞型に関する「記憶」を維持することを実証した。これは、ｉＰＳ細胞が、培養物中で、時として自発的に、最も容易にその起始細胞型に再分化する傾向として表される。
【００３４】
＜内因性幹細胞の単離＞
内因性多能性幹細胞（ｅＰＳＣ）を含む幹細胞は、その表面上に発現される特定の抗原によって特徴付けられ、それによって単離され得る。多能性幹細胞は、段階特異的胚抗原（ＳＳＥＡ）、転写因子Ｏｃｔ４およびＮａｎｏｇならびに他のマーカーの発現等の方法により特徴付けられ得る。今まで単離されてきた内因性多能性幹細胞の主な型は、極小胚様（ＶＳＥＬ）幹細胞である。
【００３５】
ＶＳＥＬは小さく（マウスにおいては直径３〜５ミクロン、ヒトに関しては直径３〜７ミクロン）、核対細胞質比は高い。ＶＳＥＬは、ＳＳＥＡ１、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｒｅｘ１および他の多能性幹細胞マーカー、ならびにＣＤ１３３、ＣＤ３４、ＡＰ、ｃＭｅｔ、ＬＩＦ−Ｒ、およびＣＸＣＲ４に関して陽性である（Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ  ５３（１）：１０−２０，２００９、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｖ４：８９−９９，２００８）。これらはＣＤ４５に関して陰性である。ＶＳＥＬはＨＳＣより小さく（３〜６  ｖｓ．６〜８μｍ）、核／細胞質比がより高い。ＶＳＥＬ核は大きく、開放型クロマチンを含み、多数のミトコンドリアを有する細胞質の細い縁によって囲まれる。したがって、その形態は、原子的なＰＳＣと一致する。
【００３６】
ＰＢにおける循環ＶＳＥＬの絶対数は、例外的に低く（定常状態条件下の１ｍＬの血液中に１〜２細胞）、よって、その同定および単離のためには特別なフローサイトメトリープロトコルが適用されなければならない。ＶＳＥＬを同定するために使用される表現型マーカーは、ＣＤ４５（マウスおよびヒト）の陰性発現、Ｓｃａ−１（マウス）、ＣＸＣＲ４、ＣＤ１３３、およびＣＤ３４（マウスおよびヒト）の陽性発現、前駆体幹細胞マーカー（つまり、Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、およびＳＳＥＡ）に関する陽性を含み、胚盤葉上層／生殖系幹細胞に特徴的ないくつかのマーカー特徴を発現する。
【００３７】
ＶＳＥＬの蛍光活性化細胞選別単離のみを利用することにより、１００ｍＬのＵＣＢ中に存在する全ＶＳＥＬの選別は、４作業日内で完了し得る。より効率的で経済的な３工程単離プロトコルは、Ｌｉｎ−／ＣＤ４５−／ＣＤ１３３＋  ＵＣＢ−のＶＳＥＬの初期数の６０％の回収を可能にする。このプロトコルは、低張塩化アンモニウム溶液中での赤血球の溶解、免疫磁気ビーズによるＣＤ１３３＋細胞選択、およびサイズマーカービーズコントロールを伴うＦＡＣＳによるＬｉｎ−／ＣＤ４５−／ＣＤ１３３＋細胞の選別を含む。単離された細胞は、小さい高度に原始的なＬｉｎ−／ＣＤ４５−／ＣＤ１３３＋細胞のＯｃｔ−４＋およびＳＳＥＡ−４＋集団が高度に濃縮されている。
【００３８】
ＶＳＥＬを選別する別の方法は、いくつかの表面マーカーの存在および細胞の直径に基づく。簡潔に述べると、初期工程は、赤血球を溶解して有核細胞の画分を得ることである。赤血球溶解緩衝液がフィコール遠心分離の代わりに使用されるが、これは、後者の手法は非常に小さい細胞の集団を除去する可能性があるためである。続いて、細胞をＳｃａ−１（マウスＶＳＥＬ）またはＣＤ１３３（ヒトＶＳＥＬ）に対する抗体、全造血抗原（ＣＤ４５）、造血系列マーカー（ｌｉｎ）、およびＣＸＣＲ４で染色し、多重パラメータ生減菌細胞選別システム（ＭｏＦｌｏ，  Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ；ＦＡＣＳＡｒｉａ，Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して選別する。この方法は、約９５％のＶＳＥＬを含む直径２〜１０μｍの事象を含むように、「拡張リンパ球ゲート」を使用する。
【００３９】
内因性幹細胞は、骨髄、全血、さい帯血、脂肪組織、もしくは他の供給源からの単核球画分内に含まれるか、またはそれらは、ＣＤ３４、ＣＤ１３３、ＣＤ１０５、ＣＤ１１７、ＳＳＥＡ１−４、色素排除、もしくは他の特定の幹細胞抗原についての選択により精製され得る。幹細胞は、フィコールハイパックまたは他の商業的に利用可能な勾配を使用した密度勾配遠心分離により、全血、骨髄、さい帯血、脂肪組織、嗅粘膜からの組織剥離物、および、さい帯組織のような単一細胞懸濁液中に解離され得る他の幹細胞供給源から単離され得る。幹細胞は、そのような手順から得られる単核球の画分から回収され得る。あるいは、幹細胞は、密度勾配遠心分離後に他の画分内に見出され得る（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ．２０１１［印刷前の電子出版］）。例えば、さい帯血をＰＢＳ中に１：１に希釈し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ１０７７（Ｓｉｇｍａ）上に慎重に積層し、室温で３０分間、１５００ｒｐｍで遠心分離し得る。示されているような、得られた層は、幹細胞単離のためにさらに処理され得る。層１は血小板層であり、層２は単核球を含むバフィーコートであり、層３はフィコール層であり、層４はＶＳＥＬも含む赤血球ペレット層である。層１、２、および３が回収され、ＦＢＳを含むまたは含まないＤＭＥＭ  Ｆ１２等の適切な培地で希釈され、再度遠心分離されて細胞ペレットが取得され得る。層４は、ＤＭＥＭ  Ｆ１２等の適切な培地で希釈され、標準的な卓上遠心分離器で、室温で１５分間、８００ｒｐｍで遠心分離され得る。幹細胞は、上記に概説する何種類かのフローサイトメトリー法に従って、主に層２（バフィーコート）および層４（ＲＢＣペレット）から回収され得る。図１は、全血の勾配遠心分離によって得られる典型的な層の図を示す。１は血小板を示す。２はＭＮＣおよび幹細胞を有するバフィーコートを示す。３はフィコールを示す。４はＲＢＣペレットおよび幹細胞を示す。
【００４０】
加えて、グリコシル化パターンおよび他の翻訳後修飾は、組織および細胞型によって異なり得るため、患者特異的幹細胞系は、その器官から、または生物学的製剤を内因的に発現する細胞型の中から単離された成体細胞もしくは体細胞から調製され得る。Ｒａｊｐｅｒｔ−Ｄｅ  Ｍｅｙｔｓ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ．“Ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｆｉｌｅ  ｏｆ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｕｃｉｎ−ｔｙｐｅ  Ｏ−ｇｌｙｃａｎｓ  ａｎｄ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ＧａｌＮＡｃ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｔｅｓｔｉｓ  ａｎｄ  ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ  ｎｅｏｐｌａｓｍｓ  ａｒｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｕｒ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ”．，Ｖｉｒｃｈｏｗｓ  Ａｒｃｈ，Ｖｏｌ．４５１：８０５−８１４  （２００７）を参照。Ｐｅｖａｌｏｖａ  Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．“Ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔａｕ  ｐｒｏｔｅｉｎ”．Ｂｒａｔｉｓｌ  Ｌｅｋ  Ｌｉｓｔｙ，１０７：３４６−３５３（２００６）を参照。
【００４１】
［好ましい実施形態の詳細な説明］
＜不死化ｓｐＰＳＣおよびｅＰＳＣの生成＞
本発明の好ましい実施形態では、ｓｐＰＳＣおよびｅＰＳＣは、典型的にはポリオーマサルウイルス４０（ＳＶ４０）を使用して、好ましくは大型Ｔ抗原の非ウイルス誘導を通して不死化される。Ｒｏｓｅ，Ｍ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）．“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｌａｒｇｅ  Ｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｏｍａ  Ｖｉｒｕｓ  Ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｔｈｅ  Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ｉｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  “Ｎｏｒｍａｌ”  Ｒｏｄｅｎｔ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ”．ＰＮＡＳ  ８０：４３５４−４３５８（１９８３）およびＨｏｆｍａｎｎ，Ｍ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．“Ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ＳＶ４０  ｌａｒｇｅ  Ｔ  ａｎｔｉｇｅｎ”Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１：４１７−４３５（１９９２）を参照。
【００４２】
＜人工的に生成された、好ましくは人工多能性幹細胞、より好ましくは単離された内因性多能性幹細胞を使用した実施形態の概要＞
好ましい実施形態において、
１．内因性多能性幹細胞が単離される。
２．そのｅＰＳＣが不死化される。
３．不死化されたｅＰＳＣが、非ウイルス技術の使用により目的の遺伝子、ウイルス、または核酸でトランスフェクトされる。
４．トランスフェクトされた不死化ｅＰＳＣが、次いで、より効率的な様式で核酸産物を発現することができるように、生殖系細胞、好ましくは卵巣細胞に分化するように誘導される。
５．分化された細胞は、ここで、目的の核酸を含む、前にトランスフェクトしたベクターから目的の核酸産物を発現するように誘導され得る。
【００４３】
別の好ましい実施形態では、
１．体細胞が単離される。
２．その体細胞が、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）に形質転換される。
３．そのｉＰＳ細胞が不死化される。
４．不死化されたｉＰＳ細胞は、目的の遺伝子、ウイルス、または核酸を含むベクターによってトランスフェクトされる。
５．トランスフェクトされた不死化ｉＰＳ細胞は、次いで、より効率的な様式でタンパク質を発現することができるように、体細胞に再分化するように誘導される。
６．再分化された細胞は、ここで、目的の遺伝子を含む、前にトランスフェクトしたベクターから目的のタンパク質を発現するように誘導され得る。
【００４４】
さらにより好ましい実施形態では、
１．内因性多能性幹細胞が単離される。
２．その不死のｅＰＳＣは、非ウイルス技術の使用により、目的の遺伝子、ウイルス、または核酸でトランスフェクトされる。
３．トランスフェクトされた不死化ｅＰＳＣは、次いで、より効率的な様式で核酸産物を発現することができるように、生殖系細胞、好ましくは卵巣細胞に分化するように誘導される。
４．その分化された細胞は、ここで、目的の核酸を含む、前にトランスフェクトしたベクターから目的の核酸産物を発現するように誘導され得る。
【００４５】
本発明の好ましい実施形態を達成するための方法は、当業者によく知られている。
【００４６】
代替的な実施形態では、ｅＰＳＣまたはｓｐＰＳＣは、不死化される前に、目的の核酸を含むベクターでトランスフェクトされ得る。Ｄｕ  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．“Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  ａｎｄ  Ｆｉｘｅｄ  Ｌｅｎｇｔｈ  ｓｉＲＮＡ  ｆｒｏｍ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｓｉＲＮＡ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ”，Ｂｉｏｍｅｄ．＆Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．３４５：９９−１０５（２００６）、２００８年１１月２１日に出願されたＹｏｒｋ  Ｚｈｕの米国特許出願第１２／３１３，５５４号を参照。あるいは、ｅＰＳＣまたはｓｐＰＳＣ細胞は、再分化するように誘導され得、次いで、その細胞は不死化され得、そして、その不死化した再分化細胞が、目的の核酸を含むベクターでトランスフェクトされ得る。別の可能性は、ｅＰＳＣまたはｓｐＰＳＣ細胞が再分化するように誘導され得、その再分化した細胞が、目的の核酸でトランスフェクトされ得、その再分化しトランスフェクトされた細胞が不死化され得る。
【００４７】
ｅＰＳＣまたはｓｐＰＳＣ細胞は、再分化前に、培養物中で、好ましくは自己ヒト血清および幹細胞因子もしくは白血病阻害因子を含む細胞培養培地中で、増殖されることが好ましい。
【００４８】
生成されるポリペプチドまたはタンパク質は、あらゆるポリペプチドまたはタンパク質であり得る。特に関心を引くものは、エリスロポエチン、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、トロンビン、抗体もしくは抗体断片、αインターフェロン、インターフェロンα２Ａおよび２Ｂ（米国特許第４，８１０，６４５号および同第４，８７４，７０２号を参照）、βインターフェロン（米国特許第４，７３８，９３１号を参照）、コンセンサスインターフェロン（米国特許第５，６６１，００９号を参照）、成長ホルモン、抗血友病因子、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、可溶性受容体、可溶性受容体と免疫グロブリン（Ｉｇ）の定常領域との融合体等の融合タンパク質（米国特許第５，１５５，０２７号を参照）、ＴＧＦ−β、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ＴＧＦα、インターロイキン２、β−グルコセレブロシダーゼもしくはその類似体、α１−プロテイナーゼ阻害因子、フィブリン、フィブリノーゲン、フォンビルブランド因子、イミグルセラーゼ、アガルシダーゼβ、ラロニダーゼ、アルグルコシダーゼα、アルグルコシダーゼα、サイロトロピンα、およびチモシンαからなる群から選択されるポリペプチドまたはタンパク質である。
【００４９】
本発明のプロセスにより、あらゆる抗体または抗体断片が製造され得る。特に関心を引くものは、ターゲットに結合する抗体または抗体断片であり、そのターゲットは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）分子、成長因子受容体、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）分子、インターロイキン１、インターロイキン４、インターロイキン６、インターロイキン１１、インターロイキン１２、γインターフェロン、核因子カッパＢ活性化受容体リガンド（ＲＡＮＫＬ）、およびＢｌｙｓからなる群から選択される。
【００５０】
＜幹細胞の分化の誘導＞
目的のタンパク質の生産を最適化するためには、トランスフェクトされたｅＰＳＣまたはｓｐＰＳＣ細胞は、体細胞に分化するように誘導されるべきである。
【００５１】
代替的な実施形態では、ｅＰＳＣまたはｓｐＰＳＣ細胞の集団が増殖され得、分化が誘導され得、次いで、分化した細胞が、目的の核酸でトランスフェクトされ得る。幹細胞は、細胞生物学および細胞分化の分野の者に公知である他の方法の中でも、様々な成長因子を培養物に添加すること（Ｂｌｏｏｄ．，８５：２４１４−２４２１，１９９５）、培養培地中の栄養素を変更すること、酸素分圧（ＢＭＣ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１：９４，２０１０）もしくは温度等の培養条件を操作すること、または幹細胞を様々な細胞外マトリックス上で培養することにより、培養物中で体細胞型に分化するように誘導され得る。例えば、レチノイン酸、ＴＧＦ−β、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、アスコルビン酸、およびβ−グリセロホスフェートは、骨芽細胞の生成をもたらし、インドメタシン、ＩＢＭＸ（３−イソブチル−１−メチルキサンチン）、インスリン、およびトリヨードサイロニン（Ｔ３）は、脂肪細胞の生成をもたらし、αＦＧＦ、βＦＧＦ、ビタミンＤ３、ＴＮＦ−β、およびレチノイン酸は、筋細胞の生成をもたらす（ＣＡＲＤＩＡＣ−ＤＥＲＩＶＥＤ  ＳＴＥＭ  ＣＥＬＬＳ．（国際公開第１９９９／０４９０１５号）１９９８年３月）。生殖細胞は、単層培養、胚様体（ＥＢ）の形成、ＢＭＰ４生成細胞との共凝集、および精巣細胞もしくは卵巣細胞馴化培地の使用、または組み換えヒト骨形成タンパク質（ＢＭＰ）を用いたＥＢ形成を使用して、多能性幹細胞から生成されている（ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２００９；４（４）：ｅ５３３８）。生殖細胞マーカー遺伝子は、ＺＮＦドメインを伴うＰＲドメインコンテイニング１（ＰＲＤＭ１、ＢＬＩＭＰ１としても知られる）、ＰＲドメインコンテイニング１４（ＰＲＤＭ１４）、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ５（ＰＲＭＴ５）、ＤＰＰＡ３、ＩＦＩＴＭ３、ＧＤＦ３、ｃ−ＫＩＴ、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体４（ＣＸＣＲ４）、ＮＡＮＯＳ１−３、ＤＡＺＬ、ＶＡＳＡ、ＰＩＷＩファミリー遺伝子（ＰＩＷＩＬ１およびＰＩＷＩＬ２、それぞれ、ヒトにおいてＨＩＷＩおよびＨＩＬＩとしても知られる）、Ｍｕｔ−Ｌ  Ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ−１（ＭＬＨ１）、シナプトネマ複合体タンパク質１（ＳＣＰ１）、およびＳＣＰ３を含む。得られた生殖細胞系は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞および他の現在使用されている製造細胞系の使用と同様に、目的の遺伝子またはタンパク質生成物を発現するように遺伝学的に改変され得る。様々な段階の幹細胞から様々な体細胞系を得るための分化戦略は、幹細胞生物学の分野の者によく知られている。
【００５２】
患者特異的細胞系からの発現レベルを最適化するために、高レベルの生物学的製剤の生成と関連することが知られる転写因子が、目的の遺伝子と共トランスフェクトされ得る。例えば、高レベルのＰｉｔ−１発現は、細胞型において高プロラクチン発現をもたらし、一方で、成長ホルモンの発現を遮断または防止することができる（Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ，３：９４６−９５８  １９８９）。
【００５３】
モノクローナル抗体の生成は、Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃによって開発されたもの等の系を使用した遺伝子コドンの最適化、モルフォジェニクス（ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃｓ）、または他の標準的なバイオテクノロジー法によって強化され得る。
【００５４】
本発明によると、組み換えポリペプチドおよびタンパク質がｅＰＳＣおよびｓｐＰＳＣにおいて製造され、ここで、動物の特定の種のいくつかの血統または民族はその特定の血統または民族により生成されるポリペプチドまたはタンパク質において異なるグリコシル化パターンを有するという事実のために、そのｓｐＰＳＣおよびｅＰＳＣは特定の血統または民族の細胞から生成または単離される。本発明によると、民族とは、そのメンバーが共通の遺伝形質（ｈｅｒｉｔａｇｅ）により相互に同一視する人々の群であって、多くの場合、共通の祖先または同族結婚（特定の集団内での結婚の習慣、例えばアシュケナージ系ユダヤ人）からなる。一般にそれは高度に生物学的に自己永続的な集団である。ポリペプチドおよびタンパク質において異なるグリコシル化パターンを有し得る民族の例は、Ｌｅｖｉｎｓｏｎ，Ｄａｖｉｄ（１９９８），Ｅｔｈｎｉｃ  Ｇｒｏｕｐｓ  Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ：Ａ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐに示されている。
【００５５】
＜幹細胞療法のための方法およびシステム＞
本発明は、奇形腫を形成することなく幹細胞療法を促進するための方法も含む。本発明は、より大きな治療利益のために、上記に定義される人工的に生成された多能性幹細胞（ｓｐＰＳＣ）とここで呼ばれる再プログラム化体細胞の、観察される「記憶」をいかに有利に利用するかを教示する。再プログラム化の前の起始細胞型へと再分化する選好を付与するｓｐＰＳＣの記憶は、再生医療のためのｓｐＰＳＣの安全性および治療的有用性を強化するための手段を提供する。
【００５６】
一般的な工程
本発明は、
１．目的の体細胞、特に再生したい体細胞の単離、
２．その体細胞の、人工的に生成される多能性幹細胞（ｓｐＰＳＣ）、特に上述のような人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）への形質転換、
３．ｓｐＰＳＣが上記体細胞の固有のエピジェネティック的記憶を維持する、ｓｐＰＳＣの集団の増殖、
４．培養物中における上記ｓｐＰＳＣの、元の体細胞型を有する再分化体細胞への再分化、および
５．その細胞型が望まれる身体の領域への、上記再分化体細胞の投与または送達
を伴う。
【００５７】
最近のいくつかの研究は、ｓｐＰＳＣ細胞がその起始細胞型の「記憶」を維持することを実証した（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．２８：１９８１−１９９１，２０１０）、（Ｎａｔｕｒｅ，４６７（７３１３）：２８５−９０，２０１０）、（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２８，：８４８−８５５，２０１０）、および（Ｍｏｌ  Ｈｕｍ  Ｒｅｐｒｏｄ．，１６：８８０−８８５，２０１０）。これは、ｓｐＰＳＣが、培養物中で、時として自発的に、最も容易にその起始細胞型に再分化する傾向として表される。科学者および臨床科学者は、臨床療法、薬剤開発、疾患モデル化、または毒性スクリーニング（Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０：５１６−５２１，２００９）に有用となり得る多能性幹細胞の生成にやみくもに重点を置き、多能性幹細胞のこの記憶側面が安全なヒト療法のために提供する治療的利点を見逃してきた。実際、再プログラム化多能性幹細胞のこの「記憶」の側面に関するデータを発表した科学者らは、ｓｐＰＳＣ細胞のこの特性が治療に関して生じる制約に重点を置き、これらの細胞の治療的有用性を提供するためのこの特性の意義を見逃してきた。
【００５８】
ｓｐＰＳＣの記憶側面は、複数の起源の体細胞で観察されてきた。例えば、初代胎児網膜上皮細胞が、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＬＩＮ２８、およびＮａｎｏｇのレンチウイルス発現を使用してｉＰＳＣに再プログラム化され（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．２８：１９８１−１９９１，２０１０）、多能性に関する標準的な試験に合格し、それらは奇形腫を形成し多能性幹細胞マーカーを発現した。成長培地からの塩基性ＦＧＦの除去後、網膜ｓｐＰＳＣ系の一部が、自発的に網膜上皮細胞系列に再分化し戻った。ヒトの胎児網膜上皮ｓｐＰＳＣ細胞から自発的に分化する細胞の約６０％は網膜上皮細胞であり、これは、ヒト胎児肺線維芽細胞由来ｓｐＰＳＣ、ヒト包皮線維芽細胞由来ｓｐＰＳＣ、またはヒトＥＳＣ細胞から生じる網膜上皮細胞が５〜１６％であることと対比される。しかしながら、ヒト胎児網膜上皮細胞からのｓｐＰＳＣ細胞の３つのうちの１つは、網膜上皮細胞に全く分化しなかった。Ｋｉｍら（Ｎａｔｕｒｅ，４６７（７３１３）：２８５−９０，２０１０）は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびＭｙｃのレトロウイルス導入を使用して、加齢マウスからの骨髄前駆体細胞および真皮線維芽細胞を再プログラム化した。それらの得られた全ての幹細胞系は、ヒトサンプルに典型的に適用される基準に基づく多能性を示した。それらの再プログラム化多能性幹細胞のその後の分化は、造血系供給源は線維芽細胞供給源よりも容易に造血系列へと再分化し、同様に、線維芽細胞供給源は造血系供給源よりも容易に間葉系列へと再分化したことを示した。これらの著者はまた、その起始体細胞系列へと好んで分化するこの傾向が、造血系列への分化後の再度の多能性再プログラム化、そしてそれに続くさらなる分化により、部分的に克服され得ることも示した。例えば、神経前駆体細胞に由来する再プログラム化細胞を造血系列へと分化した後に、多能性に再プログラム化したところ、神経細胞に分化され再プログラム化された後に造血系細胞に分化した神経前駆体と比べて造血系コロニーの形成がより高かったことが示された。
【００５９】
ヒト胎児神経前駆体細胞の非ウイルス性再プログラム化を使用して再プログラム化した細胞が、その起始細胞型へと好んで再分化するという同様の観察がなされている（ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．，４：ｅ７０７６−ｅ７０８８，２００９）。得られた再プログラム化細胞は、いくつかの多能性マーカー、３つ全ての胚葉のマーカーを発現し、胚様体を培養物中で形成し奇形腫を形成することができたが、その著者らは、ＧｅｎｅＣｈｉｐ分析を用いて、再プログラム化した神経前駆体細胞が神経幹細胞遺伝子の発現を一部維持していたことを実証した。Ｐｏｌｏら（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２８，：８４８−８５５，２０１０）は、マウス尾端部由来線維芽細胞、脾臓Ｂ細胞、骨髄顆粒球、および骨格筋前駆体から多能性再プログラム化細胞を誘導した。自己分化研究により、脾臓Ｂ細胞および骨髄顆粒球の再プログラム化ｓｐＰＳＣ細胞は、線維芽細胞または骨格筋に由来するｓｐＰＳＣ細胞より効率的に造血系前駆体を生じることが示された。興味深いことに、これらの様々なｓｐＰＳＣ細胞の連続継代は、継代１６までに遺伝子およびメチル化の相違の抑止をもたらし、これらの細胞はまた、その時点で、継代４におけるより初期の結果とは対照的に、同等の分化効率を示した。興味深いことに、この差次的な分化能力の現象は、再プログラム化した体細胞に限定されず、胚性幹細胞系においても観察されており、これら胚性幹細胞系は、異なる遺伝子シグネチャーを有し、特定の細胞系列に自発的に好んで分化することが見出されている（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２６：３１３−３１５，２００８）（Ｈｕｍ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｕｐｄａｔｅ．，１３：１０３−１２０，２００７）（Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．，３０７：４４６−４５９，２００７）（ＢＭＣ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，１０：４４，２００９）。
【００６０】
幹細胞は、その表面上に発現する特定の抗原によって、特徴付けられ、単離され得る。多能性幹細胞は、他の方法の中でも、段階特異的胚抗原（ＳＳＥＡ）、転写因子Ｏｃｔ４およびＮａｎｏｇならびに他のマーカーの発現により特徴付けられ得る。胚性幹細胞由来線維芽細胞および成体の線維芽細胞ならびに他の細胞が、胚性幹細胞との融合（Ｃｅｌｌ  １２６：６５２−６５５，２００６およびＳｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｖ，２：３３１−３４０，２００６）、レトロウイルストランスフェクション法を使用した４つの遺伝子の付加（Ｃｅｌｌ１２６：６６３−６７６，２００６）、単一カセットまたは双シストロン性レンチウイルストランスフェクション法（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ２７：５４３−５４９，２００９およびＳｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ２７：１０４２−１０４９，２００９）、ならびに転写因子を要する多能性の内因的刺激（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ２７：３０５３−３０６２，２００９）によって多能性状態に再プログラム化されてきた。多能性の誘導は、ゲノムのメチル化またはポリアデニル化状態を改変すること（ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ４：ｅ８４１９，２００９）、マイクロＲＮＡ（Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．３４４：１６−２５，２０１０）、要求される転写因子の小分子活性化因子、エピジェネティックな再プログラム化（Ｒｅｇｅｎ  Ｍｅｄ．２：７９５−８１６，２００７）、タンパク質に基づく再プログラム化（Ｂｌｏｏｄ１１６：３８６−３９５，２０１０）、多能性細胞からの培養上清または細胞抽出物を培養において添加すること、多能性遺伝子を再活性化するための、化学的もしくは放射線または他の手段の遺伝子突然変異、あるいは、内因性多能性状態を誘導または維持する成長因子もしくはサイトカインまたは細胞シグナル伝達部分の付加によっても達成され得る。細胞を多能性状態に再プログラム化するためのレトロウイルスの使用は、免疫不全の遺伝子治療治験を想起させる危険性を提示する。再プログラム化の成功後にレトロウイルスを除去するために、Ｃｒｅ−ｌｏｘまたはｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン法等の切除技術が使用されてきた（Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：５１６−５２１，２００９）。ＳＣＮＴおよび単為発生（ＰＧＡ）等のクローニング技術法（Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｒｏｇｒａｍ．１２：１０５−１１３，２０１０）も、再プログラム化された多能性幹細胞を生成するために使用されてきた（Ｎａｔｕｒｅ４５０：４９７−５０２，２００７）。
【００６１】
主にこれらの幹細胞がヒトの再生医療の療法に適切であるという期待のもと、多能性幹細胞の様々な供給源を発見することに大量の資源（経済的、知的、および労力的）が注ぎ込まれてきた。残念なことに、成体ＶＳＥＬを除き（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｖ４：８９−９９，２００８）、今までに単離された全ての多能性幹細胞は、奇形腫形成、腫瘍形成、さらには新生物的特性の問題のために阻まれている。したがって、過去１５年ほどにわたってなされてきた経済的、知的、および労力的な投資を生かすために、これら多能性幹細胞の何らかの実用性が必要とされる。
幹細胞は、細胞生物学および細胞分化の分野の者に公知である他の方法の中でも、様々な成長因子を培養物に添加すること（Ｂｌｏｏｄ．，８５：２４１４−２４２１，１９９５）、培養培地中の栄養素を変更すること、酸素分圧（ＢＭＣ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１：９４，２０１０）もしくは温度等の培養条件を操作すること、または幹細胞を様々な細胞外マトリックス上で培養することにより、培養物中で体細胞型に分化するように誘導され得る。例えば、レチノイン酸、ＴＧＦ−β、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、アスコルビン酸、およびβ−グリセロホスフェートは骨芽細胞の生成をもたらし、インドメタシン、ＩＢＭＸ（３−イソブチル−１−メチルキサンチン）、インスリン、およびトリヨードサイロニン（Ｔ３）は脂肪細胞の生成をもたらし、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ビタミンＤ３、ＴＮＦ−β、およびレチノイン酸は筋細胞の生成をもたらす（国際公開第１９９９／０４９０１５号）１９９８年３月）。様々な段階の幹細胞から様々な体細胞系を得るための分化戦略は、幹細胞生物学の分野の者によく知られている。
【００６２】
幹細胞療法は、多くのヒト疾患の治療のために研究され、改良されている。ＮＩＨウェブサイトｗｗｗ．ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖに含まれる臨床試験の情報は、３０００を超える幹細胞の研究を列挙している。評価中の疾患としては、血液悪性腫瘍、白血病、リンパ腫、癌、大理石骨病、再生不良性貧血、および血球減少症、鎌状赤血球疾患およびサラセミア、角膜縁幹細胞欠損、乳癌、急性心筋梗塞、冠動脈疾患、末梢血管疾患、心不全、１型糖尿病、２型糖尿病、脳卒中、脊髄損傷、神経芽細胞腫、多発性硬化症、全身性硬化症、紅斑性狼瘡、慢性創傷治癒、火傷、骨折治癒、軟骨修復、ＣＮＳ腫瘍、変形性関節炎、腎不全、パーキンソン病、骨髄腫、糖尿病性足病変、肝臓および胆汁性肝硬変、拡張型心筋症、貧血、網膜色素変性症、クローン病、糖尿病性神経障害、肥満細胞症、卵巣癌、癲癇、重症筋無力症、自己免疫疾患、肉芽腫性疾患、骨壊死、肝不全、ＰＭＤ疾患、リポジストロフィー、脱髄性疾患、軟骨欠損、網膜症、ループス腎炎、アルツハイマー病、外傷性脳損傷、肉腫、筋炎、高血糖、黄斑変性症、潰瘍性大腸炎、筋変性等が挙げられる。
【００６３】
幹細胞は、当業者に公知の様々なマーカーを使用して単離され得る。例えば、一般的な幹細胞マーカーのリストは、ｈｔｔｐ：／／ｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｎｆｏ／ｓｃｉｒｅｐｏｒｔ／ａｐｐｅｎｄｉｘｅ．ａｓｐ＃ｅｉｉに見出され得る。神経幹細胞はＣＤ１３３を使用して、間葉幹細胞および前駆体細胞は骨形成タンパク質受容体（ＢＭＰＲ）を使用して、造血幹細胞はＣＤ３４により、間葉幹細胞はＣＤ３４＋Ｓｃａ１＋Ｌｉｎ−マーカーの組み合わせにより、造血幹細胞および間葉幹細胞はｃｋｉｔ、Ｓｔｒｏ１、またはＴｈｙ１により、神経前駆体および膵臓前駆体はネスチンにより、外胚葉、神経前駆体および膵臓前駆体はビメンチンその他のマーカーにより、単離され得る。
【００６４】
本発明は、再生医療に関して、体細胞を安全に再プログラム化し再分化させるための方法をさらに提供する。有用な体細胞としては、完全に分化した体細胞、前駆体細胞、またはより原始的な幹細胞が挙げられ得る。再生療法を必要とする器官に応じて、より原始的な幹細胞は、器官穿刺、生検、剥離、または外科的アクセスにより、多かれ少なかれ利用可能であり得る。より原始的な幹細胞へのアクセスが可能である場合には、それらの幹細胞を使用することが好ましい。それらほどは好ましくないが、しかし完全に分化した体細胞よりは好ましいのは、前駆体細胞の使用である。
【００６５】
治療のターゲットとされる特定の器官からの体細胞の単離、これらの体細胞の再プログラム化、ｓｐＰＳＣの固有の「記憶」が維持されることを保証する培養物中での短期増殖、続いて培養物中での起始細胞型への再分化、その後の治療への適用は、腫瘍または奇形腫の形成の危険性を減少させながら多能性幹細胞方法を患者の治療のために使用することを可能にする。
【００６６】
再プログラム化体細胞は、継代１から１２の間で、最も好ましくは継代４で使用され得る。再プログラム化体細胞は、標準的な細胞生物学および分化の技術により、所望の再生のための細胞型へと分化され得る。得られた治療用細胞は、静脈内、動脈内、筋肉内、または、ＮＯＧＡＳｔａｒもしくはＭｙｏＳｔａｒ注入カテーテルもしくは他の承認済みカテーテル注入装置等のカテーテルを含み得る標準的な注入法を使用する他の注入法により、投与され得る。あるいは、治療用細胞は、低侵襲性の、またはより侵襲性の高い外科的方法によりターゲット組織に投与されてもよい。治療用細胞は、０〜１５％、より好ましくは５％の自己ヒト血清アルブミンを含む緩衝組成物において投与され得る。中枢神経系の疾患の治療のためには、治療用細胞は、好ましくは自己脳脊髄液を使用して緩衝される。治療用細胞はまた、コラーゲン、フィブリノーゲン、または他の細胞外マトリックスもしくは複数の細胞外マトリックスの組み合わせ等のスキャフォールドの使用を通して、または、アルギネートを使用して作製されたもののような縫合糸または他の標準的な方法を使用して、細胞を適所に保ち、再生修復を必要とする器官との接触を保持することにより、投与されてもよい。
【００６７】
好ましくは、最低５００個の治療用細胞が投与され、一般的には、細胞療法は１５００万〜５憶個の細胞を利用する。より好ましくは、１５００万〜１憶個の細胞が最適効果のために投与される。
【００６８】
例として、アルツハイマー病、パーキンソン病、脳卒中、ハンチントン病、多発性硬化症、麻痺、および中枢神経系（ＣＮＳ）の他の疾患等の神経疾患の細胞療法においては、好ましくは、刊行されているように（Ｊ  Ｓｐｉｎａｌ  Ｃｏｒｄ  Ｍｅｄ．２９：１９１−２０３，２００６）、剛性内視鏡を使用して、嗅粘膜を単離する。神経幹細胞および前駆体細胞もしくは嗅神経鞘細胞は、再生医療の分野の当業者に周知の方法により嗅粘膜から単離される。あるいは、神経冠幹細胞が、ヒトの毛嚢から単離され得る（Ｆｏｌｉａ  Ｂｉｏｌ．５６：１４９−１５７，２０１０）。最も好ましくは、神経幹細胞は、特定の因子の付加により再プログラム化され、４継代に渡り増殖および継代され、特定の因子の付加により特定の中枢神経系細胞型に再分化され、次いで再生療法のために患者に投与される。
【００６９】
本発明は、再生医療に関して、体細胞を安全に再プログラム化し再分化させるための方法を提供する。有用な体細胞としては、完全に分化した体細胞、前駆体細胞、またはより原始的な幹細胞が挙げられ得る。再生療法を必要とする器官に応じて、より原始的な幹細胞が、器官穿刺、生検、剥離、または外科的アクセスにより、多かれ少なかれ利用可能であり得る。より原始的な幹細胞へのアクセスが可能である場合には、それらの幹細胞を使用することが好ましい。それらほどは好ましくないが、完全に分化した体細胞よりは好ましいのは、前駆体細胞の使用である。
【００７０】
脊髄損傷の修復のために、嗅粘膜が剛性内視鏡により除去され、１９９２年にＲｅｙｎｏｌｄｓとＷｅｉｓｓにより最初に記述された神経球アッセイを使用して神経幹細胞が単離され（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５５：１７０７−１７１０，１９９２）、上皮成長因子（ＥＧＦ）および塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）が、嗅粘膜の数日間の培養中で生存する細胞に添加されて神経球成長を刺激し、そして神経幹細胞が、７〜１０日間以内の培養で回収可能である。得られた神経幹細胞は、５〜７日間に渡り、ハイグロマイシン選択を伴うＯＣＴ４およびＮＡＮＯＧの送達のためのエピソーム性ベクターの添加により再プログラム化される。細胞は、継代４まで継代され増殖されて、遺伝子挿入のない（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ−ｆｒｅｅ）コロニーが取得され、それから、自己脳脊髄液または特定の因子を使用して、嗅神経鞘、幹様神経前駆体細胞に分化される。標準的な正中切開および後方正中脊髄切開術を使用した手術において、損傷脊髄を露出させ、許容できる限り瘢痕組織を除去し、治療用細胞を自己脳脊髄液中に緩衝させ、生理活性スキャフォールド上に播種し、そして損傷脊髄に直接適用する。
【実施例】
【００７１】
＜実施例１＞
組み換えタンパク質生産のための、人工的に生成された患者特異的多能性幹細胞の遺伝学的改変
患者からのＳＣＮＴもしくはＰＧＡもしくはＡＮＴ−ＯＡＲもしくはｉＰＳＣ等の人工的に生成された多能性幹細胞（ｓｐＰＳＣ）が、生物学的製剤の産生を誘導するための遺伝学的改変に使用される。ＳＣＮＴ由来幹細胞は、患者の細胞の核を、調製した除核卵母細胞内に移入することにより調製される。ＡＮＴ−ＯＡＲ由来幹細胞は、患者の核ＤＮＡを遺伝学的に改変した後に、その改変した核を、除核され調製された卵母細胞内に移入することにより調製される。ｉＰＳＣ由来幹細胞は、遺伝学的改変、多能性転写因子の活性化因子、エピジェネティックな修飾、または上述した当該技術分野において公知の他の方法を使用して、患者の細胞を再プログラム化することにより調製される。得られた人工的に生成された患者特異的幹細胞系は、生物学的製剤の産生のための後続の遺伝学的改変のために、マスターセルバンク（ｍａｓｔｅｒ  ｃｅｌｌ  ｂａｎｋ）およびワーキングバンク（ｗｏｒｋｉｎｇ  ｂａｎｋ）として「貯蔵」される。
【００７２】
生殖細胞は、単層培養、胚様体（ＥＢ）の形成、ＢＭＰ４生成細胞との共凝集、精巣細胞もしくは卵巣細胞馴化培地の使用、または組み換えヒト骨形成タンパク質（ＢＭＰ）を用いたＥＢ形成を使用して、多能性幹細胞から生成される。生殖細胞は、ＺＮＦドメインを伴うＰＲドメインコンテイニング１（ＰＲＤＭ１、ＢＬＩＭＰ１としても知られる）、ＰＲドメインコンテイニング１４（ＰＲＤＭ１４）、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ５（ＰＲＭＴ５）、ＤＰＰＡ３、ＩＦＩＴＭ３、ＧＤＦ３、ｃ−ＫＩＴ、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体４（ＣＸＣＲ４）、ＮＡＮＯＳ１−３、ＤＡＺＬ、ＶＡＳＡ、ＰＩＷＩファミリー遺伝子（ＰＩＷＩＬ１およびＰＩＷＩＬ２、それぞれ、ヒトにおいてＨＩＷＩおよびＨＩＬＩとしても知られる）、Ｍｕｔ−Ｌ  Ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ−１（ＭＬＨ１）、シナプトネマ複合体タンパク質１（ＳＣＰ１）、およびＳＣＰ３を含み得るマーカー遺伝子の発現により同定される。得られた生殖細胞は、組み換え第ＶＩＩＩ因子の製造に一般的に使用される方法に従う第ＶＩＩＩ因子等、目的の遺伝子でトランスフェクトされる。
【００７３】
＜実施例２＞
組み換えインスリン生産のための、人工的に生成された患者特異的多能性幹細胞の遺伝学的改変
患者からのＳＣＮＴもしくはＰＧＡもしくはＡＮＴ−ＯＡＲもしくはｉＰＳＣ由来幹細胞等の、人工的に生成された多能性幹細胞（ｓｐＰＳＣ）が、生物学的製剤の産生を誘導するための遺伝学的改変に使用される。ＳＣＮＴ由来幹細胞は、患者の細胞の核を、調製した除核卵母細胞内に移入することにより調製される。ＡＮＴ−ＯＡＲ由来幹細胞は、患者の核ＤＮＡを遺伝学的に改変した後に、その改変した核を、除核され調製された卵母細胞内に移入することにより調製される。ｉＰＳＣ由来幹細胞は、遺伝学的改変、多能性転写因子の活性化因子、エピジェネティックな修飾、または上述した当該技術分野において公知の他の方法を使用して、患者の細胞を再プログラム化することにより調製される。得られた人工的に生成された患者特異的幹細胞系は、生物学的製剤の産生のための後続の遺伝学的改変のために、マスターセルバンクおよびワーキングバンクとして「貯蔵」される。
【００７４】
患者特異的幹細胞におけるインスリン前駆体の発現は、出芽酵母におけるインスリンの製造に一般的に使用される方法［Ｋｊｅｌｄｓｅｎ  Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｙｅａｓｔ  ｗｉｔｈ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｉｎｓｕｌｉｎ”．２１，Ｍａｙ  ２００２，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，２７７：１８２４５−１８２４８（Ｍａｙ  ２００２）、Ｚｈａｎｇ  Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｗｌｙ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｉｎ  ｙｅａｓｔ  ｉｓ  ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  ｅｎｄｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｇｏｌｇｉ  ｃｏｍｐｌｅｘ”．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１５３：１１８７−１１９８（Ｊｕｎｅ  ２００１）、およびＫｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，“Ａｌａｎｉｎｅ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｉｎｓｕｌｉｎ”．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，２７２：１２９７８−１２９８３（Ｍａｙ  １９９７）］またはＥ．  Ｃｏｌｉ  ［Ｓｏｎ  ＹＪ．，ｅｔ  ａｌ．“Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｂｅｔａ−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ  ａｎｄ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｏｎ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｉｎｓｕｌｉｎ  ｔｏ  ｉｎｓｕｌｉｎ”．，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１８：９８３−９８９（Ｍａｙ  ２００８）］に従って行われ、それから標準的な方法により処理され、精製される。インスリン前駆体を発現する患者特異的細胞系は、後のインスリン産生のために、マスターセルバンクおよびワーキングセルバンクとして「貯蔵」される。
【００７５】
＜実施例３＞
人工的に生成された患者特異的多能性幹細胞の遺伝学的改変を使用した、インスリン生産のためのβ細胞の生成
インスリンを生産するために、患者からの体細胞を、ｓｐＰＳＣを生成するための遺伝学的改変に使用し、これらを使用して生物学的製剤の産生を誘導する。ｓｐＰＳＣ由来幹細胞は、遺伝学的改変、多能性転写因子の活性化因子、エピジェネティックな修飾、または当該技術分野において公知の他の方法を使用して、患者の細胞を再プログラム化することにより調製される。得られた患者特異的幹細胞系は、生物学的製剤の産生のための後続の遺伝学的改変のために、マスターセルバンクおよびワーキングバンクとして「貯蔵」される。あるいは、内因性多能性幹細胞（ｅＰＳＣ）が上述の技法により単離されて貯蔵され得る。
【００７６】
患者特異的幹細胞におけるインスリン前駆体の発現は、上述のように、出願酵母または大腸菌におけるインスリンの製造に一般的に使用される方法により行われる。適切なインスリン遺伝子構築物を用いた遺伝子トランスフェクションの後、［Ｓｈｉ，Ｙ．，ｅｔ．Ａｌ．“Ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ  ｉｎｔｏ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｂｅｔａ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｔｈｒｅｅ−ｓｔｅｐ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｗｉｔｈ  ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ  ａｎｄ  ａｌｌ−ｔｒａｎｓ  ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ”．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．，２３：６５６−６６２（２００５）またはＴａｔｅｉｓｈｉ，Ｋ．，ｅｔ．Ａｌ．“Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ｉｓｌｅｔ−ｌｉｋｅ  ｃｌｕｓｔｅｒｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｓｋｉｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ”．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，２８３：３１６０１−３１６０７（２００８）］  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｔｏｃｏｌｏｎｌｉｎｅ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔ／Ｃｅｌｌ＿Ｂｉｏｌｏｇｙ／Ｓｔｅｍ＿Ｃｅｌｌｓ／Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ＿ｏｆ＿Ｓｔｅｍ＿Ｃｅｌｌ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ．Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  Ｏｎｌｉｎｅ．［オンライン］［２０１０年１２月１９日に引用。］に見出される標準的なプロトコルに従って、当該細胞はβ細胞系列に分化される。
【００７７】
次いで、結果として発現された生物学的製剤産物を、標準的な方法により処理し、精製する。得られたインスリン前駆体発現性患者特異的幹細胞系は、生物学的製剤の産生のための後続の遺伝学的改変のために、マスターセルバンクおよびワーキングバンクとして「貯蔵」される。
【００７８】
あるいは、得られた患者特異的幹細胞が、上記Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＣｏｎｓｏｒｔｉｕｍのＳｈｉ  ｅｔ．Ａｌ．同上またはＴａｔｅｉｓｈｉ  ｅｔ．Ａｌ．同上に見出される標準的なプロトコルに従い、β細胞系列に分化される。一旦分化されると、患者特異的幹細胞におけるインスリン前駆体の発現が、上述の出芽酵母または大腸菌におけるインスリンの製造に一般的に使用される方法により行われる。次いで、標準的な方法に従って、結果として発現された生物学的製剤産物を処理し、精製する。
【００７９】
＜実施例４＞
生物学的製剤抗体治療薬を生産するための再プログラム化およびトランスフェクションのための、成体（体細胞）抗体生成細胞の単離
患者特異的製造細胞系を生成して治療用抗体生物学的製剤を製造する目的のために、抗体産生Ｂ細胞を、末梢血、骨髄、および他の容易に利用可能な造血細胞源から単離する。Ｂ細胞は、利用可能なキット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を利用して、ＣＤ１９発現に基づき単離される。限界希釈法または細胞選別法を利用して、もっとも高いレベルの免疫グロブリン（Ｉｇ）を生成する細胞を選択することができる。短期間増殖させた後、標準的な再プログラム化法を使用して、高Ｉｇ産生クローン細胞を、多能性または前駆体状態に再プログラム化する。得られた患者特異的幹細胞は、標準的な分子生物学的技法および方法を使用して、所望の抗体遺伝子構築物で形質導入される。得られた発現抗体治療薬は、公的に入手可能となるか、抗体治療薬用組成物の所有者によって内密に維持されるかに関わらず、現状技術のバイオテクノロジー法により処理され、精製される。所望の精製された抗体産物を得るための方法としては、イオン交換クロマトグラフィーが挙げられる。
【００８０】
＜実施例５＞
抗体生成体細胞への再分化を伴う、生物学的製剤抗体治療薬を生産するための再プログラム化およびトランスフェクションのための成体（体細胞）抗体生成細胞の単離
患者特異的製造細胞系を生成して治療用抗体生物学的製剤を製造する目的のために、抗体産生Ｂ細胞を、末梢血、骨髄、および他の容易に利用可能な造血細胞源から単離する。限界希釈法または細胞選別法を利用して、もっとも高いレベルの免疫グロブリン（Ｉｇ）を産生する細胞を選択することができる。短期間増殖させた後、標準的な再プログラム化法を使用して、高Ｉｇ産生クローン細胞を、多能性または前駆体状態に再プログラム化する。得られた患者特異的幹細胞は、標準的な技法および方法を使用して、所望の抗体遺伝子構築物で形質導入される。遺伝学的改変後、多能性患者特異的細胞系は、ＣＤ４０Ｌ、ＢＡＦＦ、ｔｏｌｌ様受容体活性化（ＴＬＲ）の存在下［Ｈａｙａｓｈｉ  Ｅ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．“ＴＬＲ４  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ：  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｂ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ”．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８４：４６６２−４６７２（２０１０）、またはＢ細胞受容体（ＢＣＲ）活性化およびノッチ受容体リガンドファミリー活性化等の当該技術分野に公知の他のＢ細胞成熟因子［Ｐａｌａｎｉｃｈａｍｙ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．“Ｎｏｖｅｌ  ｈｕｍａｎ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｒｅｖｅａｌｅｄ  ｂｙ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ”．１０，Ｍａｙ  ２００９，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．１８２，ｐｐ．５９８２−５９９３（２００９）、Ｔｈｏｍａｓ  Ｍ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ”．，Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２３９：９２−１０２（２００６）の存在下での培養により、成熟抗体産生Ｂ細胞に分化される。
【００８１】
治療用抗体の力価および親和性は、Ｌｉ  Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｖｉａ  ａ  ｈｕｍａｎ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，１０３：３５５７−３５６２（２００６）に記載されるように、形態形成法等の方法を使用することにより改善され得る。得られた発現抗体治療薬は、公的に入手可能となるか、抗体治療薬用組成物の所有者により内密に維持されるかに関わらず、現状技術のバイオテクノロジー法により処理され、精製される。
【００８２】
あるいは、多能性患者特異的幹細胞は、ＣＤ４０Ｌ、ＢＡＦＦ、ｔｏｌｌ様受容体活性化（Ｈａｙａｓｈｉ，ｅｔ  ａｌ．同上を参照）の存在下での培養、またはＢ細胞受容体（ＢＣＲ）活性化およびノッチ受容体リガンドファミリー活性化等の当該技術分野に公知の他のＢ細胞成熟因子の存在下での培養により、成熟抗体産生Ｂ細胞に分化される（Ｐａｌａｎｉｃｈａｍｙ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．同上，およびＴｈｏｍａｓ，Ｍ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．同上を参照）。治療用抗体の力価および親和性は、記載されたような形態形成法等の方法を使用することにより改善され得る（Ｌｉ，ｅｔ  ａｌ．同上を参照）。
【００８３】
得られた患者特異的抗体産生細胞は、標準的な技法および方法を使用して、所望の抗体遺伝子構築物で形質導入される。得られた発現抗体治療薬は、公的に入手可能となるか、抗体治療薬用組成物の所有者により内密に維持されるかに関わらず、現状技術のバイオテクノロジー法により処理され、精製される。
【００８４】
＜実施例６＞
高活性ＡＤＣＣ抗体製造のための患者特異的細胞系の生成
免疫グロブリンのＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮａｃ）翻訳後修飾は、抗体依存性細胞媒介毒性（ＡＤＣＣ）において重要であり、フコシル化されていないＧｌｃＮａｃ残基はＦｃγ受容体に対して最高の親和性を有する。Ｍｏｒｉ  Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ｎｏｎ−ｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｔｈｅ  ｎｅｘｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”．，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．，５５：１０９−１１４（２００７）。
【００８５】
したがって、高レベルのＡＤＣＣを有する抗体治療薬が所望される場合、適切なレベルでＧｌｃＮａｃを付与しながらＧｌｃＮａｃを非フコシル化状態で残すことができる患者特異的細胞系が望ましい。癌細胞は高レベルのＧＭＤを発現することが知られており、したがって、癌幹細胞および多能性細胞は類似する遺伝子シグネチャーを有することから、多能性細胞も、翻訳後ＧｌｃＮａｃ結合に関与する酵素であるＧＭＤを高レベルで発現することが推測され得る。正常組織のなかでは、結腸および膵臓が最高レベルのＧＭＤを発現する。リツキシマブまたはハーセプチン等の、有効性のためにＡＤＣＣ活性に依存する治療用抗体の製造のための患者特異的幹細胞系においては、抗体をフコシル化する酵素の要因であるＦＵＴ８が欠如していることが望ましいであろう。例えば、ラットハイブリドーマＹＢ２／０細胞において生成されたモノクローナル抗体は、ＣＨＯ細胞を使用して生成された同じモノクローナル抗体よりＡＤＣＣ活性が５０倍高い。脂肪由来幹細胞および生殖細胞系ならびにＢ細胞リンパ腫は、平均レベルより高いＦＵＴ８を発現し、一方、造血幹細胞（ＨＳＣ）、未成熟Ｂ細胞、正常な骨格筋は、平均より低いＦＵＴ８を発現する。
【００８６】
造血幹細胞は、幹細胞動員剤による前処置を伴ってまたは伴わずに、標準的な方法により、骨髄穿刺液から、または全血アフェレーシス法により単離される。単離したＨＳＣは、続いて前述のように多能性に再プログラム化される。得られた患者特異的幹細胞は、標準的な技法および方法を使用して、所望の抗体遺伝子構築物で形質導入される。遺伝子トランスフェクション後、多能性患者特異的細胞系は、ＣＤ４０Ｌ、ＢＡＦＦ、ｔｏｌｌ様受容体活性化（ＴＬＲ）の存在下での培養（Ｈａｙａｓｈｉ  Ｅ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，同上を参照）、またはＢ細胞受容体（ＢＣＲ）活性化，およびノッチ受容体リガンドファミリー活性化等の当該技術分野で公知の他のＢ細胞成熟因子の存在下での培養により、成熟抗体産生Ｂ細胞に分化される（Ｐａｌａｎｉｃｈａｍｙ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．同上，およびＴｈｏｍａｓ，Ｍ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．同上を参照）。治療用抗体の力価および親和性は、記載された形態形成法等の方法を使用することにより改善され得る（Ｌｉ，ｅｔ  ａｌ．同上を参照）。得られた発現抗体治療薬は、公的に入手可能となるか、抗体治療薬用組成物の所有者により内密に維持されるかに関わらず、現状技術のバイオテクノロジー法により処理され、精製される。
【００８７】
あるいは、患者特異的製造細胞系を生成して治療用抗体生物学的製剤を製造する目的のために、末梢血、骨髄、および他の容易に利用可能な造血系細胞源から抗体産生Ｂ細胞が単離される。限界希釈法または細胞選別法を利用してもっとも高いレベルの免疫グロブリン（Ｉｇ）を産生する細胞を選択することができる。短期間増殖させた後、標準的な再プログラム化法を使用して、高Ｉｇ産生クローン細胞を、多能性または前駆体状態に再プログラム化する。得られた患者特異的幹細胞は、標準的な技法および方法を使用して、所望の抗体遺伝子構築物で形質導入される。遺伝学的改変の後、この多能性患者特異的細胞系は、フコースが低い、またはフコースを欠く治療用抗体の産生のために、ＨＳＣ、未成熟Ｂ細胞、または骨格筋細胞に分化される。
【００８８】
本発明の好ましい実施形態が説明され、記述されてきたが、上述のように、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、多くの変更を行うことができる。したがって、本発明の範囲は、好ましい実施形態の開示によって限定されない。そうではなく、本発明は、続く特許請求の範囲を参照することにより決定されるべきである。
【図１】
2018007660.tif 000003
【手続補正書】
【提出日】平成29年7月28日(2017.7.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
疾患を治療するための単離された組み換え生物学的製剤ポリペプチドまたはタンパク質を製造するための方法であって、
（ａ）人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を、前記ポリペプチドまたはタンパク質が前記ｉＰＳＣによって発現される条件下で、前記組み換え生物学的製剤ポリペプチドまたはタンパク質をコードする核酸でトランスフェクトすることと；
（ｂ）前記トランスフェクトされたｉＰＳＣの分化をインビトロで誘導することと；
（ｃ）工程（ｂ）で得られた分化された細胞から、インビトロで、前記ポリペプチドまたはタンパク質を単離することと
を含み、前記ｉＰＳＣは動物の細胞に由来するものである、方法。
【請求項２】
前記生物学的製剤ポリペプチドまたはタンパク質は、翻訳後修飾されたポリペプチドまたはタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生物学的製剤ポリペプチドまたはタンパク質は、グリコシル化されたポリペプチドまたはタンパク質である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記生物学的製剤ポリペプチドまたはタンパク質は、抗体または抗体断片である、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記トランスフェクトされたｉＰＳＣは、工程（ｂ）において、成熟抗体産生Ｂ細胞に分化される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記トランスフェクトされたｉＰＳＣは、工程（ｂ）において、造血幹細胞（ＨＳＣ）、未成熟Ｂ細胞、または骨格筋細胞に分化される、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
工程（ａ）の前に、抗体産生Ｂ細胞を再プログラム化して前記ｉＰＳＣを取得することをさらに含む、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
前記再プログラム化の前に、高Ｉｇ産生Ｂ細胞のクローンを選択することをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記トランスフェクトされ分化された細胞を不死化することをさらに含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【外国語明細書】
2018007660000001.pdf