(57)【要約】【課題】  癌に対して用いた場合には高い治療効果を発揮すると共に副作用が少なく、また、感染予防・治療にも有効に用いることのできる、免疫治療システム、あるいは細胞製剤を提供する。【解決手段】  細胞に、外来「デンジャー・シグナル」として抗原性のあるタンパク、ペプチド、あるいはそのエピトープを含むタンパク、ペプチドの遺伝子を導入後、培養を行い、培養上澄みから回収、単離して得たエクソソームを用いて作成した、腫瘍の治療、あるいは微生物の感染予防・治療のためのシステムであり、あるいは細胞製剤である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原性の高いタンパクの遺伝子を導入した細胞由来のエクソソームを用いて作成した予防・治療システム
【請求項２】
抗原性の高いタンパクの遺伝子を導入した細胞由来のエクソソームを加えて培養した免疫系細胞
【請求項３】
免疫系細胞が樹状細胞である請求項２の細胞
【請求項４】
抗原性の高いタンパクが微生物抗原である請求項１のシステム
【請求項５】
抗原性の高いタンパクが微生物抗原である請求項２の細胞
【請求項６】
抗原性の高いタンパクが微生物抗原である請求項３の細胞
【請求項７】
抗原性の高いタンパクが結核菌抗原である請求項１のシステム
【請求項８】
抗原性の高いタンパクが結核菌抗原である請求項２の細胞
【請求項９】
抗原性の高いタンパクが結核菌抗原である請求項３の細胞
【請求項１０】
抗原性の高いタンパクが結核菌抗原ｅａｒｌｙ  ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ６  ｋＤａ（ＥＳＡＴ‐６）である請求項１のシステム
【請求項１１】
抗原性の高いタンパクが結核菌抗原ｅａｒｌｙ  ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ６  ｋＤａ（ＥＳＡＴ‐６）である請求項２の細胞
【請求項１２】
抗原性の高いタンパクが結核菌抗原ｅａｒｌｙ  ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ６  ｋＤａ（ＥＳＡＴ‐６）である請求項３の細胞
【請求項１３】
抗原性の高いタンパクが結核菌抗原Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｍａｊｏｒ  Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｎｔｉｇｅｎ  ８５Ｂ（Ａｇ８５Ｂ）である請求項１のシステム
【請求項１４】
抗原性の高いタンパクが結核菌抗原Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｍａｊｏｒ  Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｎｔｉｇｅｎ  ８５Ｂ（Ａｇ８５Ｂ）である請求項２の細胞
【請求項１５】
抗原性の高いタンパクが結核菌抗原Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｍａｊｏｒ  Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｎｔｉｇｅｎ  ８５Ｂ（Ａｇ８５Ｂ）である請求項３の細胞
【請求項１６】
抗原性の高いタンパクが卵白アルブミン（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）（ＯＶＡ）である請求項１のシステム
【請求項１７】
抗原性の高いタンパクが卵白アルブミン（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）（ＯＶＡ）である請求項２の細胞
【請求項１８】
抗原性の高いタンパクが卵白アルブミン（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）（ＯＶＡ）である請求項３の細胞
【請求項１９】
抗腫瘍効果を目的とする請求項１のシステム
【請求項２０】
抗腫瘍効果を目的とする請求項２の細胞
【請求項２１】
抗腫瘍効果を目的とする請求項３の細胞
【請求項２２】
抗腫瘍効果を目的とする請求項４のシステム
【請求項２３】
抗腫瘍効果を目的とする請求項５の細胞
【請求項２４】
抗腫瘍効果を目的とする請求項６の細胞
【請求項２５】
抗腫瘍効果を目的とする請求項７のシステム
【請求項２６】
抗腫瘍効果を目的とする請求項８の細胞
【請求項２７】
抗腫瘍効果を目的とする請求項９の細胞
【請求項２８】
抗腫瘍効果を目的とする請求項１０のシステム
【請求項２９】
抗腫瘍効果を目的とする請求項１１の細胞
【請求項３０】
抗腫瘍効果を目的とする請求項１２の細胞
【請求項３１】
抗腫瘍効果を目的とする請求項１３のシステム
【請求項３２】
抗腫瘍効果を目的とする請求項１４の細胞
【請求項３３】
抗腫瘍効果を目的とする請求項１５の細胞
【請求項３４】
抗腫瘍効果を目的とする請求項１６のシステム
【請求項３５】
抗腫瘍効果を目的とする請求項１７の細胞
【請求項３６】
抗腫瘍効果を目的とする請求項１８の細胞
【請求項３７】
感染予防・感染症治療効果を目的とする請求項１のシステム
【請求項３８】
感染予防・感染症治療効果を目的とする請求項２の細胞
【請求項３９】
感染予防・感染症治療効果を目的とする請求項３の細胞
【請求項４０】
感染予防・感染症治療効果を目的とする請求項４のシステム
【請求項４１】
感染予防・感染症治療効果を目的とする請求項５の細胞
【請求項４２】
感染予防・感染症治療効果を目的とする請求項６の細胞
【請求項４３】
結核感染予防・感染症治療効果を目的とする請求項７のシステム
【請求項４４】
結核感染予防・感染症治療効果を目的とする請求項８の細胞
【請求項４５】
結核感染予防・感染症治療効果を目的とする請求項９の細胞
【請求項４６】
結核感染予防・感染症治療効果を目的とする請求項１０のシステム
【請求項４７】
結核感染予防・感染症治療効果を目的とする請求項１１の細胞
【請求項４８】
結核感染予防・感染症治療効果を目的とする請求項１２の細胞
【請求項４９】
結核感染予防・感染症治療効果を目的とする請求項１３のシステム
【請求項５０】
結核感染予防・感染症治療効果を目的とする請求項１４の細胞
【請求項５１】
結核感染予防・感染症治療効果を目的とする請求項１５の細胞
【請求項５２】
当該微生物による感染予防・感染症治療効果を目的とする請求項４のシステム
【請求項５３】
当該微生物による感染予防・感染症治療効果を目的とする請求項５の細胞
【請求項５４】
当該微生物による感染予防・感染症治療効果を目的とする請求項６の細胞
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、遺伝子導入した細胞から得られるエクソソームを用いて得られる癌などの免疫治療システムおよび微生物感染予防・治療システムに関する。
【背景技術】
【０００２】  癌などの疾患を対象とした免疫治療としては、様々な腫瘍関連抗原（以下ＴＡＡｓ）をコードしたＤＮＡワクチンが試みられ、限定的ではあるがその効果が報告されている（非特許文献１）。しかしＴＡＡｓは、もともと同じ個体の正常細胞がガン化した細胞の抗原であり、正常細胞にも量の差はあれ多少は発現しているのが普通である。そのためＴＡＡｓは一般に免疫原性が低く、ＴＡＡｓタンパクそのもの、あるいはそれをコードしたＤＮＡを投与しても、十分な免疫応答が誘導できないことが常に問題となり、抗イディオタイプ・ワクチンによるＢ細胞腫の治療など一部の例を除いては、十分な効果は認められていない（非特許文献１）。【０００３】  一方近年、エクソソームを用いた新しいガンの診断、治療法が注目を集めている。特に、２００７年にエクソソームが分泌細胞由来のｍＲＮＡやｍｉｃｒｏＲＮＡを内包することが報告されて以来、エクソソームをガンの診断や核酸医薬のキャリアーとして癌治療に用いる研究が急速に発展した。腫瘍細胞から放出されたエクソソームは腫瘍関連抗原（ＴＡＡｓ）を持つことが知られており、エクソソームを用いた抗腫瘍免疫応答の導入が試行された。しかし、ＴＡＡｓは一般に免疫原性が低いため、サイトカインである顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ‐ＣＳＦ）などの併用がないと、エクソソームそのものを投与しても免疫応答を誘導する効果は認められなかった（非特許文献２）。そこで、サイトカインであるインターロイキン−１２（ＩＬ‐１２）で修飾した腫瘍細胞由来エクソソームが作られ、これらには免疫抑制を抑える効果があることがイン・ビトロの実験で示された（非特許文献３）が、生体中での治癒効果までは確認されていない。また、腫瘍細胞由来エクソソームに代わって、ＴＡＡｓでパルスした樹状細胞（ＤＣ）に由来するエクソソームを用いた免疫誘導が試みられた。しかし、これらのＤＣ由来エクソソームは、成熟ＤＣに対しては免疫導入効果を示すが、未成熟ＤＣには効果は認められなかった（非特許文献４）。【０００４】  原発性の腫瘍細胞の腫瘍関連抗原（ＴＡＡｓ）は、上述のように抗原性が弱く、また正常細胞にもしばしば発現しているため、腫瘍細胞から放出されたエクソソームや、ＴＡＡｓでパルスした樹状細胞（ＤＣ）に由来するエクソソームだけでは抗腫瘍免疫を惹起するのに不十分であり、十分な治癒効果は得られない。免疫システムを稼動させるための「外来デンジャー・シグナル」の存在が無いと、抗原性の弱いＴＡＡｓに対する免疫を惹起させるのは難しい。【０００５】  また、ガンばかりでなく、感染症も毎年多くの人の命を奪い続けている重要な疾患である。三大感染症と呼ばれるエイズ、結核、マラリアだけで毎年３００万人以上が亡くなっており、いまだに多くの中・低所得国で主要な死因の一つである。エクソソームを用いた感染予防の研究も近年盛んになった。結核菌に感染したマクロファージから分泌されたエクソソームを用いる研究（非特許文献５）や、トキソプラズマの抗原で刺激したＤＣからのエクソソームを用いた感染予防の研究（非特許文献６）が行われている。【０００６】  しかし、細菌感染や、単離したトキソプラズマ抗原による抗原提示細胞の刺激は、煩雑な��法や、特殊な設備、技術を必要とするため、広く一般的に応用できる、容易で汎用的な手法の開拓が望まれている。【０００７】  本発明者は、原発性の腫瘍細胞の腫瘍関連抗原（ＴＡＡｓ）は、上述のように抗原性が弱く、また正常細胞にもしばしば発現しているため、単独、あるいはサイトカインの併用では抗腫瘍免疫を惹起するのに不十分であると考えた。そこで、免疫系を活性化させるためには「外来デンジャー・シグナル」の存在が必要であると考え、「抗原遺伝子導入細胞由来のデンジャー・シグナル担持エクソソーム製剤」を考案した。すなわち、抗原性の高いタンパクの遺伝子を導入した培養細胞から得たエクソソームを用いて効果的に免疫を惹起、誘導する製剤である。【０００８】  この抗原性の高いタンパクの遺伝子を導入した培養細胞から得たエクソソームは生体に投与することで高い細胞性免疫を引き出すことが確認され、また、著しい腫瘍の増殖抑制効果が認められた。【０００９】  しかし、エクソソームは極微細な粒子であり、分泌された時点ですでに大小様々な粒子の混合物であり、不均一である。また用いる細胞、産生条件、精製手法などによってその形状、含まれる成分性質は一定ではない。そのため、これを生体に直接投与する製剤とするのは容易ではない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，２０１０（２０１０），Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ５９６４３２，１３  ｐａｇｅｓ
【非特許文献２】Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ（２００８）１６  ４，７８２‐７９０
【非特許文献３】Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．２０１０  Ｍａｙ；２５（５）：６９５‐７００
【非特許文献４】Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００４；１７２，２１２６‐２１３６
【非特許文献５】ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２００８  Ｊｕｎ  １８；３（６）：ｅ２４６１
【非特許文献６】ＩＮＦＥＣＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＩＭＭＵＮＩＴＹ，Ｊｕｌｙ  ２００４，４１２７‐４１３７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】  エクソソーム製剤はそのポテンシャルの高さから広く注目されているが、産生条件、精製手法などが確立しておらず、再現性良い生産が困難で不均一なバイオ製剤である。これらを一般的な治療手段として広く用いることは容易ではない。
【課題を解決するための手段】
【００１２】  上記欠点を解決すべく鋭意研究を行った結果、上述のように、親細胞に抗原タンパクの遺伝子を導入して得られたエクソソームを、直接そのまま生体内に投与するのではなく、免疫系の細胞に加えて、これを活性化し、その後免疫系細胞を生体内に投与する（戻す）ことによって、目的とする免疫予防。治療効果が得られることを見出した。すなわち、本発明は、抗原性の高いタンパク遺伝子を培養腫瘍細胞に導入し、そこから得られたエクソソームを加えた免疫系細胞を抗腫瘍免疫製剤、感染症予防・治療製剤として利用する方法に関する。
【発明の効果】
【００１３】  親細胞として腫瘍細胞を用いた場合には、分泌されるエクソソームは「デンジャー・シグナル」と、ＴＡＡｓの両者を兼ね備えた強力なガンワクチンとなる。実際に、デンジャーシグナルとして結核菌抗原タンパクの遺伝子をコードしたＤＮＡの複合体を用いて、腫瘍細胞に「デンジャー・シグナル」遺伝子を導入後、培養を続けてエクソソームを分泌させ、回収、単離したエクソソームを培養樹状細胞に加えた後に、その樹状細胞を坦癌モデルマウスの腫瘍内に投与してみた。すると驚くべきことに、遺伝子導入していない（デンジャーシグナルを持たない）腫瘍細胞由来のエクソソームを加えた樹状細胞と比べて著しく高い治療効果が見られ、「抗原遺伝子導入細胞由来のデンジャー・シグナル担持エクソソーム」による免疫細胞活性化の優れた効果が確認された。と、同時に、抗腫瘍免疫活性化における「デンジャー・シグナル」の重要性が確認された。【００１４】  本発明で投与する免疫細胞は、腫瘍組織内や所属リンパ節への蓄積性が高く、また、細胞自体の毒性が低く副作用が少ないため、局所投与、腹腔内投与、動脈内投与、静脈内投与、頭蓋内投与などの各種投与が可能である。デンジャー・シグナル担持エクソソームを加えた樹状細胞を静脈内投与してみたところ、やはり高い抗腫瘍効果が確認され、転移癌の治療にも有効であることが示された。【００１５】  さらに驚くべきことに、罹患している腫瘍とは異なる種類の腫瘍細胞にデンジャーシグナルを遺伝子導入して生成したエクソソームや、親細胞として正常細胞にデンジャーシグナルを遺伝子導入して生成したエクソソームを加えた樹状細胞も、同様に高い腫瘍増殖抑制効果を示した。腫瘍細胞は貪食作用が盛んであり、エクソソームを取り込みやすいこと、さらに取り込んだエクソソームの持つ抗原、あるいはエピトープは自己の主要組織適合遺伝子複合体への再結合が可能であるため、と思われる。すなわち、抗原遺伝子導入した細胞由来のエクソソームは、親細胞が他家であっても、正常細胞であっても、また、他種の腫瘍に対しても効果的に用いることができることが示された。【００１６】  また、治療の対象となる患者の生体内には、すでに腫瘍細胞から分泌されたＴＡＡｓを持ったエクソソーム、あるいはＴＡＡｓそのもの、またはそれを含んだ細胞断片など、いく種類ものＴＡＡｓやその断片が存在している。これらが投与した免疫系細胞に協奏効果を及ぼすことによって抗腫瘍効果が現れたとも思われる。或いは「デンジャー・シグナル」を持ったエクソソーム自体が強力なアジュバントとして免疫系細胞を活性化する効果を示したことも考えられる。【００１７】  また、病原体の抗原遺伝子を導入した細胞から分泌されたエクソソームは、「デンジャー・シグナル」としてこれらの病原体の抗原またはそのエピトープを含む。そのため、これらの抗原に対する強い細胞性免疫を誘導することが見出された。これは、本発明のエクソソームを加えた免疫系細胞が微生物の感染予防、治癒にも非常に有効であることを示すものである。【００１８】  本発明のエクソソームを加えた免疫系細胞は、腫瘍組織内や所属リンパ節への蓄積性が高く、毒性が低いため、局所投与、腹腔内投与、動脈内投与、静脈内投与、頭蓋内投与などの各種投与が可能である。また、前駆細胞からの調製・精製・保存方法がすでに確立しているものも多く、取り扱いが簡便である。さらに、本発明の一態様においては、他の抗腫瘍免疫治療製剤と併用することで治癒効果を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】  抗原性の高いタンパクの遺伝子を導入したＢ１６細胞から得られたエクソソームを加えた樹状細胞をＢ１６細胞を移植したマウスに投与することによる抗腫瘍効果を示す。
【図２】  抗原性の高いタンパクの遺伝子を導入したＣＨＯ細胞または線維芽細胞から得られたエクソソームを加えた樹状細胞をＢ１６細胞を移植したマウスに投与することによる抗腫瘍効果を示す。
【図３】  抗原性の高いタンパクの遺伝子を導入したＢ１６細胞または線維芽細胞から得られたエクソソームを加えた樹状細胞をマウスに投与することによる腫瘍細胞に対する細胞性免疫惹起の効果を示す。
【図４】  微生物遺伝子を導入したＢ１６細胞または線維芽細胞から得られたエクソソームを加えた樹状細胞をマウスに投与することによる当該微生物抗原に対する細胞性免疫惹起の効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】  本発明で行う細胞に導入するデンジャー・シグナル遺伝子としては、抗腫瘍効果を期待するのであれば、対象とする患者、罹患動物において抗原性を有するものであればあらゆる種類のタンパク、ペプチド、またはこれらのエピトープを含むタンパク、ペプチドの遺伝子を使用することができる。デンジャー・シグナルとしての効果は、その抗原性の高さに由来するため、高い効果を期待するのであれば、抗原性の高いタンパク、ペプチド、またはこれらのエピトープを含むタンパク、ペプチドの遺伝子を用いるのが望ましい。例えば、ウィルス、バクテリア、原虫、異種生物、異種動物の抗原性タンパク遺伝子などが使用できる。
【００２１】  感染予防効果を期待するのであれば、対象となる疾患の病原体の抗原タンパク、ペプチド、またはそのエピトープを含むタンパク、ペプチドの遺伝子、またはそれらの類似の構造のタンパク、ペプチドの遺伝子が使用できる。また、免疫系細胞の活性化のためのアジュバントとして用いるのであれば、抗原性の高いタンパク、ペプチド、またはこれらのエピトープを含むタンパク、ペプチドの遺伝子すべてが使用できる。
【００２２】  本発明でデンジャー・シグナル遺伝子を導入し、エクソソームを分泌させる細胞にとしては、培養可能な細胞であれば、自家、他家を問わず、腫瘍細胞、繊維芽細胞、血球系細胞、ＤＣ、マクロファージなど、あらゆる動物・植物・微生物の細胞を使用することができる。
【００２３】  本発明で行う細胞への遺伝子導入法には、ウィルスを用いる方法、リン酸カルシウム、ポリカチオン、カチオン性脂質またはその集合体を用いる方法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法などを使用することができる。実施例では、非特許文献８に記載と同じＤＮＡ複合体を用いた。その複合体の特徴を以下に述べる。ただし、この特徴の記載は、本発明を説明するためのものであって、本発明を何ら限定するものではない。
【００２４】  培養細胞に人工のベクター（ポリカチオン、カチオン性脂質など）を用いて遺伝子導入しても、その遺伝子発現期間は短く、通常３〜４日後には発現が消えてしまう。また、発現を高めようと、多くのＤＮＡ複合体を細胞に加えると、その毒性のために細胞は弱り、一両日中に死んでしまう。効率よくデンジャー・シグナルを担持したエクソソームを調製するためには、細胞が導入した遺伝子を発現しながら長期間エクソソームを分泌する条件が必要である。我々は、以前生体内で高発現する遺伝子導入システムを得るために、通常のＤＮＮ／ポリカチオン（またはカチオン性脂質）複合体ではなく、これにさらにポリアニオンを加えたＤＮＡ三元複合体システムを開発し、様々な効果を上げてきた（特許文献１）。このＤＮＡ三元複合体システムは遺伝子発現が比較的長期間持続すること（非特許文献７）、また、細胞毒性が低いこと（非特許文献８）から、エクソソームの効率良い調製に適している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２５】
【特許文献１】ＰＣＴ／ＪＰ２００７／０６０００２
【非特許文献】
【００２６】
【非特許文献７】Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１０３，１７９‐１８４，２０１４
【非特許文献８】Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ２０１５，７，１６５‐１７４
【００２７】  様々な手法で遺伝子導入した細胞を数日間培養し、その上澄みから超遠心分離法、エクソソーム単離試薬など、通常の方法によって、目的のデンジャー・シグナルを担持したエクソソームを容易に得ることができる
【００２８】  免疫系細胞は、血液から、あるいは腹水、供水から、またリンパ組織、脾臓などから通常の方法によって容易に採取、単離、培養することができる。また、樹状細胞などの免疫系細胞は、血液中の単球などの分化前の細胞から通常の方法により、容易に分化培養して得ることができる。
【００２９】  得られたデンジャー・シグナルを担持したエクソソームを加えた免疫系細胞は、注射用シリンジ、点滴用具などを用いて、生体に腫瘍内投与、傍腫瘍投与、皮下投与、静脈内投与、動脈内投与などにより容易に投与することができる。
【００３０】  本発明を、実施例により更に具体的に説明する。なお、これらの実施例は、本発明を説明するためのものであって、本発明を何ら限定するものではない。
【実施例１】
【００３１】結核菌の抗原タンパクであるＥａｒｌｙ  Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  Ｔａｒｇｅｔ‐６（ＥＳＡＴ‐６）の遺伝子を導入したＢ１６メラノーマ細胞からのエクソソーム（ＥＳ‐Ｂ１６‐Ｅｘ）および遺伝子導入していないＢ１６メラノーマ細胞からのコントロールの空エクソソーム（Ｅｍｐｔｙ‐Ｂ１６‐Ｅｘ）の単離
ＥＳＡＴ‐６をコードしたプラスミド（ＥＳＡＴ‐６プラスミド）、およびＰＥＩ”Ｍａｘ”は、非特許文献８に記載したものと同じものを用いた。ＨＡは、生化学工業株式会社の「トリトサカ由来」のヒアルロン酸を用いた。ＰＢＳはＲｏｍａｎ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製のＰｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｔｓ（Ｔａｂｌｅｔ）を蒸留したイオン交換水に溶解したものを用いた。以降の実施例でも同様である。【００３２】操作手順
▲１▼  遺伝子を導入する３日前に、２４穴マルチプレートに１ウェルあたり１．０×１０４個のＢ１６メラノーマ細胞をまき、１０％ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）、ペニシリン（１００ｕｎｉｔ／ｍＬ）、およびストレプトマイシン（０．１ｍｇ／ｍＬ）を含むＥａｇｌｅ’ｓ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）培地を用いて３晩インキュベートした。
▲２▼  培養した培地を取り除き、１０％エクソソーム・フリーＦＢＳ、ペニシリン（１００ｕｎｉｔ／ｍＬ）、およびストレプトマイシン（０．１ｍｇ／ｍＬ）を含むＥＭＥＭ培地５００μｌをウェルに入れた。
▲３▼  ＥＳＡＴ‐６プラスミド１．５μｇを含む水溶液４．８４μｌを１．７８μｌのＣＳ溶液（５ｍｇ／ｍｌ）とＤＮＡ／ＣＳ比（電荷モル比）が８となるように混合した後、０．８８μｌのＰＥＩ”Ｍａｘ”水溶液（５ｍｇ／ｍｌ）とＤＮＡ／ＰＥＩ”Ｍａｘ”比（電荷モル比）が１２となるように混合し、２０分後に２倍濃縮ＰＢＳを７．５μｌ加えた。。
▲４▼  ▲３▼で調製したＤＮＡ複合体懸濁液１５μＬをウェルに加えた（ＥＳＡＴ‐６プラスミド１．５μｇ／ウェル）。
▲５▼  ３７℃、５％ＣＯ２‐９５％ａｉｒ下で５時間インキュベートした。
▲６▼  培地を新しい１０％エクソソーム・フリーＦＢＳと２５Ｕのペニシリンと２５μｇのストレプトマイシンを含むＥＭＥＭ１ｍｌと取り換え、３７℃で７２時間インキュベートした。
▲７▼  ７２時間のインキュベート後、ウェル中の上澄みを回収した。
▲８▼  遠心分離（３０００ｘｇ、１５分）した後、上清を採取し、体積にして半分量のＴｏｔａｌ  Ｅｘｏｓｏｍｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ（ｆｒｏｍ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉａ）（Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．Ｃｏｒｐｏｒａｔｅ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）．）を加え、一晩４℃で静置した。
▲９▼  遠心分離（１００００ｘｇ、１時間）した後、沈殿したエクソソームを０．１６ｍｌのＰＢＳに懸濁した。エクソソーム懸濁液は、４℃で保管、一週間以内に使用した。
▲１０▼  同様の実験を遺伝子導入していないＢ１６細胞に対しても行い、コントロールの空エクソソーム（Ｅｍｐｔｙ‐Ｂ１６‐Ｅｘ）懸濁液を作成した。【００３３】結果
遺伝子導入したもの、していないものともに、Ｅｘｏｓｏｍｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ（ｆｒｏｍ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉａ）と混合し、一晩後遠心分離することによって、白色のエクソソームの沈殿が得られた。再懸濁した液中のエクソソームをＥｘｏ‐ｇｒｅｅｎまたはＥｘｏ‐ｒｅｄ（ともにＳｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｉｎｃ．，ＣＡ，ＵＳＡ））で染色し、ＥｘｏＱｕｉｃｋ‐ＴＣ（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｉｎｃ．，ＣＡ，ＵＳＡ））で単離し、蛍光顕微鏡で観察したところ、直径数十ｎｍ前後の輝点が浮遊しているのが同じ位置に観察され、確かにエクソソーム懸濁液が得られたことが確認された。
【実施例２】
【００３４】結核菌の抗原タンパクであるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｍａｊｏｒ  Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｎｔｉｇｅｎ  ８５Ｂ（Ａｇ８５Ｂ）の遺伝子を導入したＢ１６メラノーマ細胞からのエクソソーム（Ａｇ‐Ｂ１６‐Ｅｘ）の単離
実施例１と同様の手法で、Ｂ１６メラノーマ細胞にＡｇ８５Ｂの遺伝子を導入した後、その培養上澄からＡｇ８５Ｂ遺伝子を導入したＢ１６メラノーマ細胞由来のエクソソーム（Ａｇ‐Ｂ１６‐Ｅｘ）を単離した。
【実施例３】
【００３５】アデノウィルスの抗原タンパクであるＡｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｄｅａｔｈ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＤＰ）の遺伝子を導入したＢ１６メラノーマ細胞からのエクソソーム（ＡＤ‐Ｂ１６‐Ｅｘ）の単離
実施例１と同様の手法で、Ｂ１６メラノーマ細胞にＡＤＰの遺伝子を導入した後、その培養上澄みからＡＤＰ遺伝子を導入したＢ１６メラノーマ細胞由来のエクソソーム（ＡＤ‐Ｂ１６‐Ｅｘ）を単離した。
【実施例４】
【００３６】卵白アルブミン（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）（ＯＶＡ）の遺伝子を導入したＢ１６メラノーマ細胞からのエクソソーム（ＯＶＡ‐Ｂ１６‐Ｅｘ）の単離
実施例１と同様の手法で、Ｂ１６メラノーマ細胞にＯＶＡの遺伝子を導入した後、その培養上澄みからＯＶＡ遺伝子を導入したＢ１６メラノーマ細胞由来のエクソソーム（ＯＶＡ‐Ｂ１６‐Ｅｘ）を単離した。
【実施例５】
【００３７】結核菌の抗原タンパクであるｅａｒｌｙ  ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ６  ｋＤａ（ＥＳＡＴ‐６）の遺伝子を導入したチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）からのエクソソーム（ＥＳ‐ＣＨＯ‐Ｅｘ）の単離
実施例１と同様の手法で、ＣＨＯ細胞にＥＳＡＴ‐６の遺伝子を導入した後、その培養上澄みからＥＳＡＴ‐６遺伝子を導入したＣＨＯ細胞由来のエクソソーム（ＥＳ‐ＣＨＯ‐Ｅｘ）、および遺伝子導入していないＣＨＯ細胞からのエクソソーム（Ｅｍｐｔｙ‐ＣＨＯ‐Ｅｘ）を単離した。
【実施例６】
【００３８】結核菌の抗原タンパクであるｅａｒｌｙ  ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ６  ｋＤａ（ＥＳＡＴ‐６）の遺伝子を導入した繊維芽細胞からのエクソソーム（ＥＳ‐Ｆｂ‐Ｅｘ）の単離
麻酔下で採取し、エタノール滅菌後、剃毛したマウスの耳片を約３ｍｍｘ３ｍｍに刻み、コラゲナーゼＤとプロナーゼ処理して繊維芽細胞を得た。これを培養し、実施例１と同様の手法でＥＳＡＴ‐６の遺伝子を導入した後、その培養上澄みからＥＳＡＴ‐６遺伝子を導入した繊維芽細胞由来のエクソソーム（ＥＳ‐Ｆｂ‐Ｅｘ）を単離した。
【実施例７】
【００３９】樹状細胞の分化培養
マウスの末梢血から単球由来樹状細胞の分化誘導用キットを用いて、未成熟の樹状細胞を得た。
【実施例８】
【００４０】デンジャーシグナル遺伝子を導入した細胞から分泌したエクソソームを加えた樹状細胞の抗腫瘍効果（１）
▲１▼  Ｃ５７ＢＬ／６マウス（オス、５週齢）の皮下にＢ１６細胞を移植し、坦癌モデルマウスを作成した。
▲２▼  腫瘍の直径が４ｍｍを越えたところで、実施例１〜４で得られた各エクソソーム懸濁液（２００μＬ）を加えて一晩培養した樹状細胞を腫瘍内に中３日で３回投与し、その後の腫瘍のサイズの変化を調べた。【００４１】  結果
結果を図１に示す。図の縦軸は腫瘍サイズの平均値である。デンジャーシグナル遺伝子を導入していないＢ１６細胞から得られたエクソソーム、Ｅｍｐｔｙ‐Ｂ１６‐Ｅｘを加えて培養した樹状細胞は余り顕著な抗腫瘍効果を示さなかったのに対し、デンジャーシグナル遺伝子を導入したＢ１６細胞から得られたエクソソーム、ＡＤ‐Ｂ１６‐Ｅｘ、Ａｇ‐Ｂ１６‐Ｅｘ、ＥＳ‐Ｂ１６‐Ｅｘ、ＯＶＡ‐Ｂ１６‐Ｅｘを加えて一晩培養した樹状細胞は明らかな抗腫瘍効果を示した。
【実施例９】
【００４２】デンジャーシグナル遺伝子を導入した細胞から分泌したエクソソームを加えた樹状細胞の抗腫瘍効果（２）
▲１▼  Ｃ５７ＢＬ／６マウス（オス、５週齢）の皮下にＢ１６細胞を移植し、坦癌モデルマウスを作成した。
▲２▼  腫瘍の直径が４ｍｍを越えたところで、実施例５、６で得られた各エクソソーム懸濁液（２００μＬ）を加えて一晩培養した樹状細胞を腫瘍内に中３日で３回投与し、その後の腫瘍のサイズの変化を調べた。【００４３】［結果］
結果を図２に示す。図の縦軸は腫瘍サイズの平均値である。デンジャーシグナル遺伝子を導入していないＣＨＯ細胞から得られたエクソソーム、Ｅｍｐｔｙ‐ＣＨＯ‐Ｅｘを加えて一晩培養した樹状細胞は余り顕著な抗腫瘍効果を示さなかったのに対し、ＥＳＡＴ‐６遺伝子を導入したＣＨＯ細胞から得られたエクソソーム、ＥＳ‐ＣＨＯ‐Ｅｘを加えて一晩培養した樹状細胞はより高い抗腫瘍効果を示し、異種の腫瘍に対しても効果があること、また他家のエクソソームも抗腫瘍効果を導くことが示された。同様に、ＥＳ‐Ｆｂ‐Ｅｘを加えて一晩培養した樹状細胞も明らかな抗腫瘍効果を示し、デンジャーシグナル遺伝子を導入した正常細胞由来ののエクソソームも抗腫瘍効果を導くことが確認された。
【実施例１０】
【００４４】デンジャーシグナル遺伝子を導入した細胞から分泌したエクソソームを加えた樹状細胞の細胞性免疫導入効果（１）
▲１▼  実施例１または６で得られたエクソソーム懸濁液を加えて一晩培養した樹状細胞をＣ５７ＢＬ／６マウス（オス、５週齢）の両後足の足底に７５μＬずつ一回投与した。
▲２▼  ９日目に両後足の膝裏のリンパ節を採取し、つぶしてメッシュを通した後、ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁させた。
▲３▼  得られたリンパ球懸濁液をマイトマイシン処理したＢ１６メラノーマ細胞とともに９６穴培養プレートに加え、３７℃で２日間インキュベート後、分泌されたＩＦＮ‐γをＭｏｕｓｅ  ＩＦＮ‐ｇａｍｍａ  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ））で定量した。【００４５】  ［結果］
結果を図３に示す。図の値は３例以上の平均値と標準偏差を表している。ＥＳＡＴ‐６遺伝子を導入したＢ１６細胞から得られたエクソソームＥＳ‐Ｂ１６‐Ｅｘを加えて培養した樹状細胞、またはＥＳＡＴ‐６遺伝子を導入した繊維芽細胞から得られたエクソソーム、ＥＳ‐Ｆｂ‐Ｅｘを加えて培養した樹状細胞を投与したマウスのリンパ球はどちらも、ＥＳＡＴ‐６遺伝子を導入していないＢ１６細胞から得られたエクソソーム、Ｅｍｐｔｙ‐Ｂ１６‐Ｅｘを加えて培養した樹状細胞を投与したマウスのリンパ球に比べて、Ｂ１６細胞と２日間インキュベートすることで明らかに多くのＩＦＮ‐γを分泌した。このことから、デンジャーシグナル遺伝子を導入した腫瘍細胞、または正常細胞から得られたエクソソームを加えて培養した樹状細胞は腫瘍細胞に対する細胞性免疫を惹起する効果を持つことが確認された。
【実施例１１】
【００４６】デンジャーシグナル遺伝子を導入した細胞から分泌したエクソソームを加えた樹状細胞の細胞性免疫導入効果（２）
▲１▼  実施例１または６で得られたエクソソーム懸濁液を加えて一晩培養した樹状細胞をＣ５７ＢＬ／６マウス（オス、５週齢）の両後足の足底に７５μＬずつ一回投与した。
▲２▼  ９日目に両後足の膝裏のリンパ節を採取し、つぶしてメッシュを通した後、ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁させた。
▲３▼  得られたリンパ球懸濁液を１μｇのＥＳＡＴ‐６を含むＱｕａｎｔｉＦＥＲＯＮ‐ＴＢ  Ｇｏｌｄ  ｂｌｏｏｄの検査管に加え、３７℃で一晩インキュベート後、分泌されたＩＦＮ‐γをＭｏｕｓｅ  ＩＦＮ‐ｇａｍｍａ  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ，（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ））で定量した。【００４７】  ［結果］
結果を図４に示す。ここで、図の値は３例以上の平均値と標準偏差を表している。ＥＳＡＴ‐６遺伝子を導入したＢ１６細胞から得られたエクソソームＥＳ‐Ｂ１６‐Ｅｘを加えて培養した樹状細胞、またはＥＳＡＴ‐６遺伝子を導入した繊維芽細胞から得られたエクソソーム、ＥＳ‐Ｆｂ‐Ｅｘを加えて培養した樹状細胞を投与したマウスのリンパ球はどちらも、ＥＳＡＴ‐６遺伝子を導入していないＢ１６細胞から得られたエクソソーム、Ｅｍｐｔｙ‐Ｂ１６‐Ｅｘを加えて培養した樹状細胞を投与したマウスのリンパ球に比べて、ＥＳＡＴ‐６抗原タンパクと一晩インキュベートすることで明らかに多くのＩＦＮ‐γを分泌した。このことから、微生物遺伝子を導入した腫瘍細胞、または正常細胞から得られたエクソソームを加えて培養した樹状細胞は当該微生物抗原に対する細胞性免疫を惹起する効果を持つことが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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