(57)【要約】【課題】鳥インフルエンザウイルス感染を予防又は治療するために有用な薬剤を提供することを課題とする。【解決手段】樹状コアと、配列番号４のアミノ酸配列中の連続する７〜１２アミノ酸からなるペプチドとを含む多重抗原ペプチドであって、前記樹状コアの末端に直接またはスペーサーを介して結合された４〜８個の同種もしくは異種の前記ペプチドを含み、かつ、哺乳動物又は鳥類においてＩｇＧ抗体の産生を誘導することを特徴とする多重抗原ペプチド、並びに、該多重抗原ペプチドを含む免疫誘導剤。【選択図】図２
2018070571.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
樹状コアと、前記樹状コアの末端に直接またはスペーサーを介して結合された４〜８個の抗原ペプチドを含む多重抗原ペプチドであって、スペーサーを介して結合された抗原ペプチドが配列番号４のアミノ酸配列中の連続する７〜１２アミノ酸からなるペプチド又は前記ペプチドのアミノ酸のうち１〜３個が置換されたペプチドである、多重抗原ペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドが、配列番号５〜９のアミノ酸配列中の連続する７〜１２アミノ酸からなるペプチド又は前記ペプチドのアミノ酸のうち１〜３個が置換されたペプチドである、請求項１に記載の多重抗原ペプチド。
【請求項３】
前記ペプチドが、配列番号１５のアミノ酸配列中の連続する７〜１２アミノ酸からなるペプチド又は前記ペプチドのアミノ酸のうち１〜３個が置換されたペプチドである、請求項１に記載の多重抗原ペプチド。
【請求項４】
前記ペプチドが、配列番号１６〜２０のアミノ酸配列中の連続する７〜１２アミノ酸からなるペプチド又は前記ペプチドのアミノ酸のうち１〜３個が置換されたペプチドである、請求項３に記載の多重抗原ペプチド。
【請求項５】
前記ペプチドが、配列番号２１〜２５のアミノ酸配列中の連続する７〜１２アミノ酸からなるペプチド又は前記ペプチドのアミノ酸のうち１〜３個が置換されたペプチドである、請求項４に記載の多重抗原ペプチド。
【請求項６】
前記スペーサーを介して結合された抗原ペプチドがすべて同一のペプチドである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の多重抗原ペプチド。
【請求項７】
前記樹状コアが、複数のリジン残基を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の多重抗原ペプチド。
【請求項８】
前記樹状コアが、システイン残基をさらに含む、請求項７に記載の多重抗原ペプチド。
【請求項９】
前記スペーサーがポリオキシアルキレン鎖を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の多重抗原ペプチド。
【請求項１０】
前記多重抗原ペプチドが、下記の式Ｉ
【化１】
2018070571.tif 000015
［式中、Ｒは、
【化２】
2018070571.tif 000016
である。］
によって表されることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の多重抗原ペプチド。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の１種又は少なくとも２種の多重抗原ペプチドを有効成分として含有する、免疫誘導剤。
【請求項１２】
インターフェロンγ産生能を有するアジュバントをさらに含む、請求項１１に記載の免疫誘導剤。
【請求項１３】
前記アジュバントがα−ガラクトシルセラミド又はその類縁体である、請求項１２に記載の免疫誘導剤。
【請求項１４】
哺乳動物において鳥インフルエンザウイルス感染を治療又は予防するために使用される、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の免疫誘導剤。
【請求項１５】
製薬的に許容可能な担体を含む、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の免疫誘導剤。
【請求項１６】
請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の免疫誘導剤を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物において鳥インフルエンザウイルス感染を治療又は予防するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、鳥インフルエンザウイルス感染を予防又は治療するための、多重抗原ペプチド（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ；  ＭＡＰ）、並びに該ＭＡＰを含む免疫誘導剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
鳥インフルエンザは、Ａ型インフルエンザウイルスが鳥類に感染して起こる感染症であるが、当該ウイルスのなかには強毒性又は高病原性を獲得したものが存在する。さらにヒトからヒトへ感染する能力をもつウイルスは世界的流行を引き起こす可能性があることから、鳥インフルエンザウイルスは危険視されている。鳥インフルエンザウイルスは、２種類の粒子表面糖蛋白質、ヘマグルチニン（ＨＡ）とノイラミニダーゼ（ＮＡ）、の組み合わせによって亜型に分けられる。現在までに、ＨＡは１６種類（Ｈ１〜Ｈ１６）、ＮＡは９種類（Ｎ１〜Ｎ９）が見つかっている。鳥インフルエンザウイルス亜型の具体例は、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、Ｈ６Ｎ１、Ｈ７Ｎ７、Ｈ７Ｎ９、Ｈ９Ｎ２、Ｈ１０Ｎ８などであり、トリからヒトへの感染事例として認められた亜型は、Ｈ７Ｎ７、Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ３、Ｈ７Ｎ９、Ｈ１０Ｎ８などである。とりわけ、ＨＡは抗体による選択圧を受けやすいので頻繁に抗原変異を起こす。
【０００３】
鳥インフルエンザウイルスに感染したときの初期症状は、高熱、咳などの気道症状、全身倦怠、時に、下痢、嘔吐、腹痛などを含み、重症化すると肺炎、ＡＲＤＳ、多臓器不全などを発症すると言われている。この感染症の治療のために抗インフルエンザウイルス薬であるノイラミニダーゼ阻害薬が使用されているが、その治療効果を疑問視する指摘もある。感染予防用のワクチンは開発されているが、有効性については明らかでなく、引き続き、ヒト用のワクチンについて研究・開発が行われている。
【０００４】
鳥インフルエンザウイルスに対するワクチンは、例えば、特許文献１には、ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ（配列番号１）、ＩＩＬＫＡＮＦＳＶ（配列番号２）、ＧＭＦＮＭＬＳＴＶ（配列番号３）の各ペプチドを結合したリポソームを開示しており、当該ペプチド結合リポソームをマウス脾臓細胞にパルスしたところ、いずれも高いＣＴＬ誘導活性を認めたこと、また、当該ペプチド（ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ（配列番号１））結合リポソームによって免疫したマウスにＨ１Ｎ１亜型又はＨ３Ｎ２亜型のウイルスを鼻腔内投与により感染させたときにはウイルス増殖が有意に抑制されたことが記載されている。
【０００５】
さらにまた、特許文献２には、Ｈ５亜型のヘマグルチニン又はその抗原性ペプチドを含む汎用Ｈ５Ｎ１ワクチン組成物が開示されている。また、この文献には、不活化全粒子Ｈ５Ｎ１ウイルスワクチン、３種のＨ５ヘマグルチニンペプチドミックスなどについては、単独か、或いはアジュバントと組み合わせることによって高い中和抗体力価を誘導したことがさらに記載されている。さらにまた、中和エピトープの同定が行われ、重要な変異を含有する抗原性エピトープ領域として、成熟ＨＡ１領域のアミノ酸位置１３８から２１８までの配列内の領域が記載されている。
【０００６】
近年では合成ペプチドワクチンの開発が盛んに行われるようになった。そのなかで特に、多重抗原ペプチド（ＭＡＰ）が注目されている。ＭＡＰペプチドは、例えばアミノ酸の一つである複数のリジン（Ｌｙｓ）および、場合により、システイン（Ｃｙｓ）を含む結合体をコアとし、Ｌｙｓの場合そのαアミノ基とεアミノ基に、あるいは、Ｃｙｓの場合、スルフヒドリル基にペプチド（細胞が認識する抗原の一部分）を結合させることによって得ることができる。
【０００７】
例えば、特許文献３には、肺炎双球菌に対してＭＡＰを使用している。具体的には、肺炎双球菌の抗原のペプチドから２箇所を選定し、この２種類のペプチドを交互に、合計４つのペプチドを有するＭＡＰ−４構造を作ったことが記載されている。その他、ＭＡＰの作製に関しては、特許文献４、特許文献５、非特許文献１〜３にも記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開第2011-126853号公報
【特許文献２】特許第5815676号
【特許文献３】特開2011-57691号公報
【特許文献４】国際公開WO1993/022343A1
【特許文献５】国際公開WO2015/190555A1
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Myron Christodoulides and John E. Heckels, Microbiology 1994, 140:2951-2960
【非特許文献２】Manju B. Joshi et al., Infection and Immunity 2001 69:4884-4890
【非特許文献３】Jon Oscherwitz et al., Infection and Immunigy 2009, 77:3380-3388
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上記の背景技術の欄に記載したように、現在臨床的に使用できる鳥インフルエンザウイルス感染に対する有効なワクチンが見いだされてなく、とりわけ複数種に渡って効果を有する汎用的な鳥インフルエンザウイルスに対するワクチン開発が望まれている。
【００１１】
本発明の目的は、鳥インフルエンザウイルス由来のペプチドを用いて鳥インフルエンザウイルス感染を予防又は治療するための汎用的な免疫誘導剤（例えばワクチン）を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を行った。各種の鳥インフルエンザウイルスのＨＡのアミノ酸配列から特定の部分を汎用的な抗原ペプチドとして最適であることを見出し、これまで抗体産生を誘導できた報告がない部位であるものの、当該抗原ペプチドを複数有する多重抗原ペプチドを開発した。その結果、当該ペプチドに対するＩｇＧ抗体の産生が確認され、さらに驚くべきことにＩｇＭ抗体の長期産生する効果も誘導することを見出し、鳥インフルエンザウイルスに対するワクチンとして有用な免疫誘導剤に関する本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち、本発明は以下の特徴を有する。
(1)樹状コアと、前記樹状コアの末端に直接またはスペーサーを介して結合された４〜８個の抗原ペプチドを含む多重抗原ペプチドであって、スペーサーを介して結合された抗原ペプチドが配列番号４のアミノ酸配列中の連続する７〜１２アミノ酸からなるペプチド又は前記ペプチドのアミノ酸のうち１〜３個が置換されたペプチドである、多重抗原ペプチド。
(2)上記ペプチドが、配列番号５〜９のアミノ酸配列中の連続する７〜１２アミノ酸からなるペプチド又は前記ペプチドのアミノ酸のうち１〜３個が置換されたペプチドである、上記(1)に記載の多重抗原ペプチド。
(3)上記ペプチドが、配列番号１５のアミノ酸配列中の連続する７〜１２アミノ酸からなるペプチド又は前記ペプチドのアミノ酸のうち１〜３個が置換されたペプチドである、上記(1)に記載の多重抗原ペプチド。
(4)上記ペプチドが、配列番号１６〜２０のアミノ酸配列中の連続する７〜１２アミノ酸からなるペプチド又は前記ペプチドのアミノ酸のうち１〜３個が置換されたペプチドである、上記(3)に記載の多重抗原ペプチド。
(5)上記ペプチドが、配列番号２１〜２５のアミノ酸配列中の連続する７〜１２アミノ酸からなるペプチド又は前記ペプチドのアミノ酸のうち１〜３個が置換されたペプチドである、上記(4)に記載の多重抗原ペプチド。
(6)上記スペーサーを介して結合された抗原ペプチドがすべて同一のペプチドである、上記(1)〜(5)のいずれかに記載の多重抗原ペプチド。
(7)上記樹状コアが、複数のリジン残基を含む、上記(1)〜(6)のいずれかに記載の多重抗原ペプチド。
(8)前記樹状コアが、システイン残基をさらに含む、上記(7)に記載の多重抗原ペプチド。
(9)上記スペーサーがポリオキシアルキレン鎖を含む、上記(1)〜(8)のいずれかに記載の多重抗原ペプチド。
(10)上記多重抗原ペプチドが、下記の式Ｉ
【化１】
2018070571.tif 000003
［式中、Ｒは、
【化２】
2018070571.tif 000004
である。］
によって表されることを特徴とする、上記(1)〜(9)のいずれかに記載の多重抗原ペプチド。
(11)上記(1)〜(10)のいずれかに記載の１種又は少なくとも２種の多重抗原ペプチドを有効成分として含有する、免疫誘導剤。
(12)インターフェロンγ産生能を有するアジュバントをさらに含む、上記(11)に記載の免疫誘導剤。
(13)上記アジュバントがα−ガラクトシルセラミド又はその類縁体である、上記(12)に記載の免疫誘導剤。
(14)哺乳動物において鳥インフルエンザウイルス感染を治療又は予防するために使用される、上記(11)〜(13)のいずれかに記載の免疫誘導剤。
(15)製薬的に許容可能な担体を含む、上記(11)〜(14)のいずれかに記載の免疫誘導剤。
(16)上記(11)〜(15)のいずれかに記載の免疫誘導剤を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物において鳥インフルエンザウイルス感染を治療又は予防するための方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、鳥インフルエンザウイルスの ＨＡ由来の特定領域のペプチドを樹状コアに結合して製造されたＭＡＰが、哺乳動物又は鳥類においてＩｇＧ抗体価を上昇させ、ワクチンとして機能しうるという免疫誘導効果を提供する。従来、鳥インフルエンザウイルス感染に対する有効な予防法又は治療法が極めて少なく、複数種に渡って効果を有する汎用的な鳥インフルエンザウイルスに対するワクチンが実用化されていないことから、本発明の効果は有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】この図は、ＭＡＰ−４、ＭＡＰ−８などのＭＡＰ構造を示す。
【図２】この図は、マウスに鳥インフルエンザＭＡＰ４を腹腔内投与したときの鳥インフルエンザウイルスに対するＩｇＧ抗体価の測定結果を示す。
【図３】この図は、マウスに鳥インフルエンザＭＡＰ４を腹腔内投与したときの鳥インフルエンザウイルスに対するＩｇＧ抗体のサブクラスの測定結果を示す。
【図４】この図は、マウスに鳥インフルエンザＭＡＰ４を腹腔内投与したときの鳥インフルエンザウイルスに対するＩｇＭ抗体価の測定結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明をさらに詳細に説明する。
【００１７】
１．多重抗原ペプチド
本発明は、第１の態様により、樹状コアと、抗原ペプチドとして配列番号４のアミノ酸配列中の連続する７〜１２アミノ酸からなるペプチド又は前記ペプチドのアミノ酸のうち１〜３個が置換されたペプチドとを含む多重抗原ペプチドであって、上記樹状コアの末端に直接またはスペーサーを介して結合された４〜８個の同種もしくは異種の前記抗原ペプチドを含み、かつ、哺乳動物においてＩｇＧ抗体の産生を誘導することを特徴とする、多重抗原ペプチドを提供する。
【００１８】
本明細書中で使用する「多重抗原ペプチド」は、樹状高分子（すなわち、デンドリマー）構造を有する樹状コアと、当該コアの樹状末端に直接又はスペーサーを介して結合した複数個の同種又は異種の鳥インフルエンザのＨＡタンパク質由来のペプチドとを含む高分子物質である。
【００１９】
本明細書中で使用する「多重抗原ペプチド」は、樹状高分子（すなわち、デンドリマー）構造を有する樹状コアと、当該コアの樹状末端に直接又はスペーサーを介して結合した複数個の同種又は異種の鳥インフルエンザウイルスヘマグルチニン由来のペプチドとを含む高分子物質である。
【００２０】
本明細書で使用する「前記ペプチドのアミノ酸のうち１〜３個が置換されたペプチド」とは、上記抗原ペプチド内のアミノ酸と置換するアミノ酸が、システイン（Ｃｙｓ）以外の任意のアミノ酸であり、好ましくは被置換アミノ酸と類似の化学的性質（疎水性、極性、陽イオン性、陰イオン性、電気的中性など）もしくは構造的性質（分枝構造、芳香族性など）をもつアミノ酸であるペプチドをいう。
【００２１】
樹状コアは、上記の鳥インフルエンザウイルスヘマグルチニン由来のペプチド（以下、便宜的に「抗原ペプチド」とも呼ぶ）を複数個、好ましくは４〜８個を結合するための樹状の支持コアである。樹状コアは、通常知られる構造であってよく、樹状ポリマーは少なくとも２個の官能基をもつコア分子から発生する２またはそれ以上の同一の枝を基礎とするものを好適に選択すればよい。当該樹状コアは樹状ポリマーとも呼ばれ、例えば米国特許第４，２８９，８７２号、米国特許第４，５１５，９２０号等に記載された構造体が挙げられるがこれらに限定されず、製造上の簡便さなどから好ましくは複数のリジン残基（Ｋ）を含むペプチドである。当該リジン残基を含むペプチドは、さらにシステイン残基（Ｃ）を含んでもよい。例えば、３個のリジン残基（Ｋ)からなるＫ-Ｋ-Ｋ構造の場合、各末端のリジン残基（Ｋ）のα−アミノ基側とε−アミノ基側にそれぞれ１個の上記抗原ペプチドを結合することができる。この場合、最高４個の抗原ペプチドを結合することができる。また、リジン残基（Ｋ）には、そのα−カルボキシル基を介してスペーサーペプチドを結合してもよい。スペーサーペプチドは、好ましくは２個以上１０個以下のアミノ酸残基からなるペプチドであり、例えばＫ−Ｋ−Ｃ、Ｋ−βＡ−Ｃ(ここで、βＡはβ−アラニン残基を表し、Ｃはシステイン残基を表す。）などを挙げることができる。スペーサーペプチドのＮ末端のアミノ酸残基には、例えばリジン残基（K）であれば、そのα−アミノ基を介して上記と同様の最高４個の抗原ペプチドを結合したＫ−Ｋ−Ｋ−構造を連結することができる。この場合、作製されるＭＡＰは最高８個の抗原ペプチドを有する。
【００２２】
本発明によれば、上記抗原ペプチドは、鳥インフルエンザウイルスの ＨＡに由来する。
【００２３】
鳥インフルエンザウイルスは、上記のとおり（Ｈ１〜Ｈ１６）×（Ｎ１〜Ｎ９）の多数の組合せからなる亜型が存在し、亜型の具体例は、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、Ｈ６Ｎ１、Ｈ７Ｎ７、Ｈ７Ｎ９、Ｈ９Ｎ２、Ｈ１０Ｎ８などであり、トリからヒトへの感染事例として認められた亜型は、Ｈ７Ｎ７、Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ３、Ｈ７Ｎ９、Ｈ１０Ｎ８などである。
【００２４】
上記ウイルスの亜型は、ＨＡ及びＮＡの抗原性の違いによって区別されている。本発明は、とりわけＨＡに注目し、亜型間で高度にアミノ酸配列が保存されている領域の中から多重抗原ペプチドを構築するための抗原ペプチドを選択した。
【００２５】
そのように選択された抗原ペプチドのアミノ酸配列は、以下の配列番号４のアミノ酸配列中の連続する７〜１２アミノ酸からなる。
配列番号４
(Q又はE)G(S,T,E又はV)G(Y,Q,T又はM)AAD(Q,L,Y又はR)(K,E又はD)STQ(N,A,K又はS)AID(G,Q又はK)(I又はV)(T又はN)(N,G又はS)
【００２６】
上記配列番号４のアミノ酸配列の具体例は、配列番号５、６、７、８及び９のアミノ酸配列であり、それぞれ亜型Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ９及びＨ９Ｎ２のヘマグルチニンの対応するアミノ酸配列である。
配列番号５
QGSGYAADQKSTQNAIDGITN
配列番号６
EGTGQAADLKSTQAAIDQING
配列番号７
QGSGYAADQESTQKAIDGVTN
配列番号８
QGEGTAADYKSTQSAIDQITG
配列番号９
QGVGMAADRDSTQKAIDKITS
【００２７】
亜型Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ９及びＨ９Ｎ２のＨＡのアミノ酸配列の具体例は以下のとおりである。
【００２８】
配列番号１０（H1N1のHA）
GenBank登録番号AGG82811
mat peptide 345..566
Influenza A virus (A/American black duck/New Brunswick/00326/2010(H1N1))
1   MEAKLFVLFC TFTVLKADTI CVGYHANNST DTVDTVLEKN VTVTHSVNLL EDSHNGKLCS
61  LNGIAPLQLG KCNVAGWLLG NPECDLLLTA NSWSYIIETS NSENGTCYPG EFIDYEELRE
121 QLSSVSSFEK FEIFPKTNSW PNHETTKGVT AACSYSGASS FYRNLLWITK KGTSYPKLSK
181 SYTNNKGKEV LVLWGVHHPP TTSEQQSLYQ NTDAYVSVGS SKYNRRFTPE IAARPKVRGQ
241 AGRMNYYWTL LDQGDTITFE ATGNLIAPWY AFALNKGSDS GIITSDAPVH NCDTRCQTPH
301 GALNSSLPFQ NVHPITIGEC PKYVKSTKLR MATGLRNVPS IQSRGLFGAI AGFIEGGWTG
361 MIDGWYGYHH QNEQGSGYAA DQKSTQNAID GITNKVNSVI EKMNTQFTAM GKEFNNLERR
421 IENLNKKVDD GFLDVWTYNA ELLVLLENER TLDFHDSNVR NLYERVRSQL RNNAKELGNG
481 CFEFYHKCDD ECMESVKNGT YDYPKYSEES KLNREEIDGV KLESMGIYQI LAIYSTVASS
541 LVLLVSLGAI SFWMCSNGSL QCRICI
【００２９】
配列番号１１（H3N2のHA）
GenBank登録番号AFY06393
mat_peptide 346..566
Influenza A virus (A/American black duck/New Brunswick/02650/2007(H3N2))
1   MKTIIVLSCF FCLAFSQNPS ENNNNTATLC LGHHAVPNGT IVKTITDDQI EVTNATELVQ
61  SSSTGKICNN PHRILDGRDC TLMDALLGDP HCDVFQDETW DLYVERSSAF SNCYPYDVPD
121 YASLRSLVAS SGSLEFITEG FTWTGVTQNG GSGACKRGPA NGFFSRLNWL TKSGNAYPLL
181 NVTMPNNDDF DKLYVWGVHH PSTNQEQTSL YVQASGRVTV STRRSQQTII PNIGSRPWVR
241 GQSGRISIYW TIVKPGDILV INSNGNLIAP RGYFKMRTGK SSIMGSDAPV DTCISECITP
301 NGSIPNDKPF QNVNKITYGA CPKYVKQSTL KLATGMRNVP EKQTRGLFGA IAGFIENGWE
361 GMIDGWYGFR HQNSEGTGQA ADLKSTQAAI DQINGKLNRV IEKTNEKFHQ IEKEFSEVEG
421 RIQDLEKYVE DTKIDLWSYN AELLVALENQ HTIDLTDSEM NKLFEKTRRQ LRENAEDMGN
481 GCFKIYHKCD NACIESIRNG TYDHDIYRDE ALNNRFQIKG VELKSGYKDW ILWISFAISC
541 FLLCVVLLGF IMWACQRGNI RCNICI
【００３０】
配列番号１２（H5N1のHA）
GenBank登録番号AAC32101
mat peptide 347..568
Influenza A virus (A/Chicken/Hong Kong/728/97 (H5N1))
1   MEKIVLLLAT VSLVKSDQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE RTHNGKLCDL
61  NGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDEFINVP EWSYIVEKAS PANDLCYPGN FNDYEELKHL
121 LSRINHFEKI QIIPKSSWSN HDASSGVSSA CPYLGRSSFF RNVVWLIKKN SAYPTIKRSY
181 NNTNQEDLLV LWGIHHPNDA AEQTKLYQNP TTYISVGTST LNQRLVPEIA TRPEVNGQSG
241 RMEFFWTILK PNDAINFESN GNFIAPEYAY KIVKKGDSTI MKSELEYGNC NTKCQTPMGA
301 INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNTPQRE RRRKKRGLFG AIAGFIEGGW
361 QGMVDGWYGY HHSNEQGSGY AADQESTQKA IDGVTNKVNS IINKMNTPFE AVGREFNNLE
421 RRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VKNLYDRVRL QLRDNAKELG
481 NGCFEFYHKC DNECMESVKN GTYDYPQYSE EARLNREEIS GVKLESMGTY QILSIYSTVA
541 SSLALAIMVA GLSLWMCSNG SLQCRICI
【００３１】
配列番号１３（H7N9のHA）
GenBank登録番号AJJ95060
mat peptide 340..560
Influenza A virus (A/chicken/Dongguan/1022/2014(H7N9))
1   MNTQILVFAL IAIIPTNADK ICLGHHAVSN GTKVNTLTER GVEVVNATET VERTNIPRIC
61  SKGKKTVDLG QCGLLGTITG PPQCDQFLEF SADLIIERRE GSDVCYPGKF VNEEALRQIL
121 RKSGGIDKEA MGFTYSGIRT NGATSACRRS GSSFYAEMKW LLSNTDNAAF PQMTKSYKNT
181 RKSPAIIVWG IHHSVSTAEQ TKLYGSGNKL VTVGSSNYQQ SFVPSPGARP QVNGLSGRID
241 FHWLMLNPND TVTFSFNGAF IAPDRASFLR GKSMGIQSGV QVDADCEGDC YHSGGTIISN
301 LPFQNIDSRA VGKCPRYVKQ RSLLLATGMK NVPEIPKGRG LFGAIAGFIE NGWEGLIDGW
361 YGFRHQNAQG EGTAADYKST QSAIDQITGK LNRLIEKTNQ QFELIDNEFN EVEKQIGNVI
421 NWTRDSITEV WSYNAELLVA MENQHTIDLA DSEMDKLYER VKRQLRENAE EDGTGCFEIF
481 HKCDDDCMAS IRNNTYDHSK YREEAMQNRI QIDPVKLSSG YKDVILWFSF GASCFILLAI
541 VMGLVFICVK NGNMRCTICI
【００３２】
配列番号１４（H9N2のHA）
GenBank登録番号AMP44491
mat peptide 339..560
Influenza A virus (A/chicken/Anhui/36/2014(H9N2))
1   METVSLITIL LVATVSNADK ICIGYQSTNS TETVDTLTEN NVPVTHAKEL LHTEHNGMLC
61  ATSLGQPLVL DTCTIEGLIY GNPSCDLSLE GREWSYIVER PSAVNGLCYP GNVENLEELR
121 SLFSSARSYQ RIQIFPDTIW NVSYDGTSSA CSGSFYKSMR WLTRKNGDYP IQDAQYTNNQ
181 GKNILFMWGI NHPPTDTTQR DLYTRTDTTT SVATEEINRI FKPLIGPRPL VNGLMGRIDY
241 YWSVLKPGQT LRIKSDGNLI APWYGHILSG ESHGRILKTD LKRGSCTVQC QTEKGGLNTT
301 LPFQNVSKYA FGNCSKYIGI KSLKLAVGLR NVPSRSSRGL FGAIAGFIEG GWSGLVAGWY
361 GFQHSNDQGV GMAADRDSTQ KAIDKITSKV NNIVDKMNKQ YEIIDHEFSE VETRLNMINN
421 KIDDQIQDIW AYNAELLVLL ENQKTLDEHD ANVNNLYNKV KRALGSNAVE DGKGCFELYH
481 KCDDQCMETI RNGTYNRRKY QEESKLERQK IEGVKLESEG TYKILTIYST VASSLVIAMG
541 FAAFLFWAMS NGSCRCNICI
【００３３】
好ましい抗原ペプチドは、以下の配列番号１５、１６、１７、１８、１９又は２０のアミノ酸配列中の７〜１２アミノ酸からなる。
配列番号１５
AAD(Q,L,Y又はR)(K,E又はD)STQ(N,A,K又はS)AID
配列番号１６
AADQKSTQNAID
配列番号１７
AADLKSTQAAID
配列番号１８
AADQESTQKAID
配列番号１９
AADKSTQSAID
配列番号２０
AADRDSTQKAID
【００３４】
さらに好ましい抗原ペプチドは、以下の配列番号２１、２２、２３、２４又は２５のアミノ酸配列からなる。
配列番号２１
STQ(N,A,K又はS)AID
配列番号２２
STQNAID
配列番号２３
STQAAID
配列番号２４
STQKAID
配列番号２５
STQSAID
【００３５】
本発明の抗原ペプチドは、鳥インフルエンザウイルスＨＡのなかで配列番号４のアミノ酸配列に注目し、当該アミノ酸配列中の連続する７〜１２アミノ酸からなる同種又は異種、好ましくは同種、の複数のペプチドが、上記の樹状コアと結合されたとき、鳥インフルエンザウイルス感染に対するワクチンとしても使用しうる免疫誘導剤を提供することができる。
【００３６】
本発明はまた、配列番号５〜９のいずれかのアミノ酸配列中の連続する７〜１２アミノ酸からなるペプチド類からなる群から選択される抗原ペプチド、並びに、配列番号１５〜２５のいずれかのアミノ酸配列中の連続する７〜１２アミノ酸からなるペプチド類からなる群から選択される抗原ペプチド、さらに具体的には配列番号２２〜２５のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチド類からなる群から選択される抗原ペプチドも提供する。
【００３７】
本発明の多重抗原ペプチド(ＭＡＰ)を構成する抗原ペプチドは、上記樹状コアの末端に直接またはスペーサーを介して結合され、好ましくは樹状コアの各末端に１個ずつ共有結合される。例えば、官能化された固相レジンに官能化された樹状コアを結合し、この樹状末端の反応性官能基にペプチドの反応性官能基を結合反応することができる（Ｗ．  ｋｏｗａｌｃｚｙｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｐｅｐ．  Ｓｃｉ．  ２０１１，  １７：  ２４７−２５1）。この場合、抗原ペプチドは、所定のアミノ酸配列に基づいて自動ペプチド合成機等を用いて合成するなど、公知の技術によって合成することができる（例えばＪ.Ｍ. Ｓｔｅｗａｒｔ ａｎｄ Ｊ.Ｄ. Ｙｏｕｎｇ, Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ２ｎｄ  ｅｄ．，  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  １９８４，Ｇ.Ｂ. Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ., Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ, ｉｎ Ｇ.Ａ. Ｇｒａｎｔ （ｅｄ）： Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ： Ａ Ｕｓｅｒ‘ｓ Ｇｕｉｄｅ, Ｗ.Ｈ. Ｆｒｅｅｍａｎ, １９９２）。或いは、公知のDNA組換え技術を用いて作製してもよい（例えばＭ.Ｒ. Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｊ. Ｓａｍｂｒｏｏｋ, Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ, Ｖｏｌ. １ ａｎｄ Ｖｏｌ. ２, Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈｏｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ, ｆｏｕｒｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ, ２０１２）。
【００３８】
本発明のＭＡＰは、抗原ペプチドを複数個、好ましくは２〜１６個、より好ましくは４〜８個を含み、抗原ペプチドは同種又は異種であってよく、好ましくは同種である。本明細書では、「同種の抗原ペプチド」とは、エピトープとして同じ性質を持つペプチドであって、高い同一性を有するペプチドを含む意味である。「高い同一性を有するペプチド」とは、複数の抗原ペプチドのうち任意の一つの抗原ペプチドを基準として、１〜３アミノ酸、好ましくは１もしくは２アミノ酸、より好ましくは１アミノ酸の置換を有するペプチドである。抗原ペプチド内のアミノ酸と置換するアミノ酸は、システイン（Ｃｙｓ）以外の任意のアミノ酸であり、好ましくは被置換アミノ酸と類似の化学的性質（疎水性、極性、陽イオン性、陰イオン性、電気的中性など）もしくは構造的性質（分枝構造、芳香族性など）をもつアミノ酸である。またここで、「エピトープとして同じ性質」とは、目的の標的タンパク質もしくはポリペプチドと結合可能な、かつウイルスに対し免疫誘導可能なＩｇＧ抗体の産生をインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で誘導できるという性質をいう。抗原ペプチドが異種（すなわち、「同種」ではない。）である場合には、異なる抗原ペプチドの各々は少なくとも１つ上記樹状コアに結合されている。
【００３９】
本明細書中で使用する「多重抗原ペプチドを投与する対象」（以下、便宜的に被験体ともいう）には、ヒト、家畜（例えばウシ、ブタ、ラクダ等）、家禽（ニワトリ、アヒル、ウズラ等）、愛玩動物（例えばイヌ、ネコ、トリ等）、競争用動物（例えば、ウマ、ニワトリ等）、動物園で飼育される観賞用動物などの哺乳動物、鳥類が含まれ、好ましくは、ヒトである。
【００４０】
本発明のＭＡＰは被験体の体内でクラススイッチされた抗体産生を誘導する。本発明によって産生される抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥであり、好ましくはＩｇＧである。一般的に、体内に異物が侵入した場合には最初の約１週間以内にＢ２Ｂ細胞からＩｇＭ抗体が産生されて初期の生体内防御が機能するが、ＩｇＭは半減期が短く１週間から１０日間程度で血中のその抗体価は低下する。ＩｇＭ産生に遅れて次第にその異物に反応するＴ細胞が体内で活性化されることにより、ＩｇＧ抗体が産生されて液性免疫による防御が強化されるようになる。ＩｇＧはいったん産生されるとその半減期が長く、数週間から数カ月以上血中の抗体価は持続する。
【００４１】
また、別の態様において、本発明のＭＡＰは自然免疫系Ｂ細胞（Ｂ１Ｂ細胞）を刺激してIｇＭをＢ２Ｂ細胞産生の場合よりも長期に産生することができる。本発明のＭＡＰの投与によって上昇したIｇＭは、例えば１４日以上、好ましくは２１日間以上、血中でのＩｇＭ上昇が確認される。
【００４２】
本発明のＭＡＰは、例えば図１に示すような構造を有するが、とりわけＭＡＰ−４およびＭＡＰ−８に示されるような４〜８個の抗原ペプチド、好ましくは同一の抗原ペプチド、を含む樹状構造を有する。具体的には、次のような式ＩのＭＡＰ−４構造であるが、この構造に限定されない。
式ＩのＭＡＰ：
【化３】
2018070571.tif 000005
［式中、Ｒは、
【化４】
2018070571.tif 000006
である。］
【００４３】
２．多重抗原ペプチド（ＭＡＰ）の製造
本発明のＭＡＰは、例えば以下の工程（１）〜（４）：
（１）反応性官能基を有する樹状コアを用意する工程、
（２）反応性官能基を有する複数の同種又は異種の上記抗原ペプチドを用意する工程、
（３）樹状コアの反応性官能基と上記の各抗原ペプチドの反応性官能基を結合反応して多重抗原ペプチドを作製する工程、および
（４）多重抗原ペプチドを回収する工程
を含む方法によって作製されうる。
【００４４】
樹状コアは、上で説明したように、複数個の同種又は異種、好ましくは同種、の上記抗原ペプチド、好ましくは４〜８個の同種の（好ましくは同一の）抗原ペプチドを結合するための樹状の支持コアである。樹状コアは、通常知られる構造であってよく、複数のリジン残基（Ｋ）を含むのがよく、および、さらにシステイン残基（Ｃ）を含んでもよい。図１に、本発明のＭＡＰの構造（好ましくはＭＡＰ−４およびＭＡＰ−８のような構造）を例示するように、４〜８個の抗原ペプチド以外の部分を形成するのが樹状コアである。樹状コアは、ＭＡＰ−４の場合、例えばＫ−Ｋ−Ｋ配列を含むのがよいし、また、ＭＡＰ−８の場合、例えばＫ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ配列を含むのがよい。これらの配列の中央のＫには、通常、スペーサーペプチドが結合する。スペーサーペプチドは、好ましくは２個以上のアミノ酸残基からなるペプチドであり、例えばＫ−Ｋ−Ｃ、Ｋ−βＡ−Ｃ（ここで、βＡはβ−アラニン残基を表す。）などであるが、これらに限定されないものとする。中央のＫ以外の左右のＫまたはＫ−Ｋには、Ｋ１個あたり２個の抗原ペプチドが結合するように設計される。また、樹状コアとペプチドとの間にはスペーサーを配置してもよい。スペーサーは、ポリオキシアルキレン鎖（例えばポリオキシエチレン鎖又はポリオキシプロピレン鎖）を含む水親和性の高い基であるのが好ましい。ポリオキシアルキレン鎖のオキシアルキレン単位の繰り返し数は、２以上、好ましくは２〜５０、より好ましくは３〜３０である。
【００４５】
樹状コアの末端には、抗原ペプチドと結合するための適切な官能基を有することができる。官能基は、タンパク質の修飾に使用可能な官能基であればよく、例えば、アミノ基、スルフヒドリル基、アセチレン基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル基などである。
【００４６】
一方の抗原ペプチドの側の官能基は、樹状コアの末端官能基と結合反応しうる任意の官能基であり、例えばアミノ基に対するＮ−ヒドロキシスクシンイミジル基、スルフヒドリル基に対するスルフヒドリル基またはカルボキシル基、アセチレン基に対するアジド基、などである。抗原ペプチドは、上で説明したとおりである。
【００４７】
本発明の実施形態により、Ｋ−Ｋ−Ｋ配列を有する樹状コアは、末端官能基がアセチレン基を有する下記の構造：
【化５】
2018070571.tif 000007
を有する。
【００４８】
上記構造のアセチレン基と反応する抗原ペプチドの末端官能基はアジド基である。この場合の結合反応は、下記のヒュスゲン反応である。
【００４９】
【化６】
2018070571.tif 000008
【００５０】
この反応は、アルキンとアジドを一価の銅イオンを触媒とし結合させる反応であり、反応生成物は安定で副反応がほとんど無いとされ、クリックケミストリーとして注目されている。銅イオン触媒溶液は、硫酸銅・５水和物水溶液とアスコルビン酸を用いて調製しうる。
【００５１】
ＭＡＰを回収する工程では、該ペプチドを精製する。ペプチドの回収の手法は、一般的なタンパク質またはポリペプチドの精製法でよく、例えばゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などのクロマトグラフィーを単独でまたは組み合わせて行われうる。目的物の同定は、核磁気共鳴スペクトル分析法ＮＭＲ、マススペクトル分析法、アミノ酸分析法などによって行うことができる。
【００５２】
３．免疫誘導剤
本発明はさらに上記の１種又は少なくとも２種の多重抗原ペプチド（ＭＡＰ）を含む免疫誘導剤を提供する。本発明の免疫誘導剤は、ＩｇＧ抗体、或いはＩｇＧ抗体及びＩｇＭ抗体の産生を誘導する製剤である。
【００５３】
本発明の免疫誘導剤は、医薬組成物として、鳥インフルエンザウイルス感染に対するＩｇＧ抗体産生を誘導することにより、該感染の予防又は治療もしくは改善のために用いることができ、「ワクチン」としても使用することができる。
【００５４】
本発明の免疫誘導剤は、医薬組成物として、鳥インフルエンザウイルス感染に対するＩｇＭ抗体産生を長期にわたって持続させることにより、非感染者においては当該感染の予防することができる。また、長期に渡るＩｇＭ抗体の産生よって、感染者においては非感染者への感染伝播防止に用いることができる。
【００５５】
本発明のＭＡＰのヒトでの有効量は、非限定的に、１回投与量としてＭＡＰ−４では約０．０５〜２．５μｇ／ｋｇ体重から１ｍｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、ＭＡＰ−８では、０．５〜２５．０μｇ／ｋｇ体重から１ｍｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ体重である。ここで、投与量は、ヒトを含む被験体の体重、年齢、性別、症状、重症度、投与方法などによって適宜変更しうるものとする。
【００５６】
本発明の免疫誘導剤の形態は、例えば溶液剤、懸濁剤、錠剤、注射剤、顆粒剤、乳化剤などであり、賦形剤、希釈剤、結合剤、香味剤、界面活性化剤などの添加剤を適宜含むことができる。アジュバントは投与対象においてインターフェロンγの産生が確認される限りにおいて基本的に必要ないが、必要に応じて添加してもよい。
【００５７】
本発明の免疫誘導剤はアジュバントを含んでもよい。アジュバントは、所望する抗体のアイソタイプによって適宜選択される。例えば、ＩｇＧを優位に産生させる場合では、アジュバントはインターフェロンγ産生を優位に誘導する物質である。インターフェロンγ産生を誘導する物質は特に限定されないが、例えば、α‐ガラクトシルセラミド、α‐ガラクトシルセラミド類縁体、細菌のオリゴヌクレオチドであるＣｐＧなどが挙げられる。α‐ガラクトシルセラミド類縁体としては、例えば国際公開ＷＯ２００７／０９９９９９号（米国特許８１６３７０５号）、国際公開ＷＯ２００９／１１９６９２号（米国特許８５５１９５９号）、国際公開ＷＯ２００８／１０２８８８号（米国特許８２９９２２３号）、国際公開ＷＯ２０１０／０３００１２号（米国特許８５８０７５１号）、国際公開ＷＯ２０１１／０９６５３６号（米国特許８８５３１７３号）、国際公開ＷＯ２０１３／１６２０１６号（米国公開番号２０１５−０１５２１２８）に記載された化合物が挙げられるが、これらに限定されない。また、アジュバントと同様に本発明の免疫誘導剤のＩｇＧ抗体誘導の効果を高めるために、インターフェロンγを含んでもよい。
【００５８】
本発明の免疫誘導剤は、医薬組成物として、鳥インフルエンザウイルス感染の予防、感染拡大防止または治療のために使用することができる。
【００５９】
したがって、本発明はさらに、上記のＭＡＰまたは上記の免疫誘導剤を被験体に投与することを含む、上記疾患の予防または治療方法を提供する。この方法では、抗体の産生は、ＩｇＧ抗体の産生を含み、ＩｇＭ抗体の産生も含みうる。本発明の方法における抗体の産生は、鳥インフルエンザウイルス感染の治療、予防または感染拡大防止の目的で行うことができる。
【００６０】
投与経路は、静脈内投与、経粘膜投与、腹腔内投与、直腸内投与、皮下投与、筋肉内投与、経口投与などであるが、これらに限定されない。
【００６１】
本発明の免疫誘導剤は、製薬的に許容可能な担体をさらに含んで製剤化されていてもよい。
【００６２】
「製薬的に許容可能な」とは、医薬業界で通常使用される意味を有し、場合により、ヒトに投与された場合にアレルギー反応または同様の有害反応を生じさせない分子的実体物質または組成物等の使用が可能であることを表す。タンパク質を活性成分として含む水性組成物の調製は当技術分野で十分に理解されている。典型的に、そのような組成物は、注射剤として、液体溶液または懸濁液として調製され、注射前の液体中での溶解または懸濁に好適な固体剤形を調製することもできる。調製物は乳化することもできる。
【００６３】
「担体」には、任意およびすべての溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張（ｉｓｏｔｏｎｉｃ）および吸収遅延剤、バッファー、担体溶液、懸濁液、コロイド、などが含まれる。担体としては、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸塩のバッファー；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０アミノ酸残基未満）ポリペプチド；タンパク質（例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン）；疎水性ポリマー（例えばポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシン）；グルコース、マンノース又はデキストランを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又は非イオン性界面活性剤（例えば、ポリオキシアルキレン系）といった例も挙げられる。医薬活性物質のためのそのような媒体および物質の使用は当技術分野で周知である。任意の慣用の媒体または物質が活性成分と不適合である場合を除き、治療用組成物でのその使用が想定される。補助活性成分を組成物に組み入れることもできる。
【００６４】
本発明の免疫誘導剤は、製剤に使用される各種の界面活性剤を使用してもよい。界面活性剤の種類は特に限定されず、ノニオン系界面活性剤、カチオン系界面活性剤、アニオン系界面活性剤、または両性界面活性剤等が挙げられ、中でもノニオン系界面活性剤が好ましい。ノニオン系界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレンモノアルキルエーテル、またはポリオキシエチレンモノアリールエーテル等のポリオキシアルキレン系ノニオン界面活性剤；多価アルコール（例えばソルビタン、ソルビトール）の高級脂肪酸エステル；および多価アルコールの高級脂肪酸エステルにエチレンオキシドを重合付加させたもの；等が挙げられる。
【００６５】
本発明の免疫誘導剤は、１つまたは複数の追加成分をさらに含むことができ、限定されないがそのような追加成分として懸濁剤、安定化剤、または分散剤が挙げられる。また、本発明の免疫誘導剤の安定化のための処置として、ＭＡＰの等電点を下げて代謝安定性を向上させることができる。具体的には、酸性アミノ酸（例えばアスパラギン、グルタミン酸）、および／またはデオキシヌクレオチド（例えばＧｐＣオリゴヌクレオチド、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）をさらに免疫誘導剤に含ませることでもよい。一つの態様として、酸性アミノ酸および／またはデオキシオリゴヌクレオチドを本発明のＭＡＰに直接結合させることでもよい。
【実施例】
【００６６】
本発明を以下の実施例によってさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例によって制限されないものとする。
【００６７】
［実施例１］
＜多重抗原ペプチド（ＭＡＰ）の構造＞
ＭＡＰの構造について下記のものを使用した。
【００６８】
【化７】
2018070571.tif 000009
［式中、Ｒは、
【化８】
2018070571.tif 000010
である。
【００６９】
鳥インフルエンザウイルスのヘマグルチニン由来のペプチド、すなわちＳＴＱＫＡＩＤ（配列番号２４）を選択し、ＭＡＰ作製のための抗原ペプチドとして使用した。
【００７０】
＜鳥インフルエンザＭＡＰ４の合成＞
１．略語表
・ＮＨ２−ＳＡＬ−Ｔｒｔ（２−Ｃｌ）−  Ｒｅｓｉｎ：  Ｒｉｎｋ−Ｂｅｒｎａｔｏｗｉｔｚ−ａｍｉｄｅ  Ｂａｒｌｏｓ  Ｒｅｓｉｎ（渡辺化学工業株式会社）
・Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ：Ｎ−α，Ｎ−ε−Ｂｉｓ（９−ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ（渡辺化学工業株式会社）
・Ｂｏｃ−Ｐｒａ−ＯＨ：Ｎ−Ｂｏｃ−Ｌ−ｐｒｏｐａｒｇｙｌｇｌｙｃｉｎｅ（東京化成工業株式会社）
・Ｎ３−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ：１１−Ａｚｉｄｏ−３，６，９−ｔｒｉｏｘａｕｎｄｅｃａｎｏｉｃ  Ａｃｉｄ（東京化成工業株式会社）
・Ｈ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｔｒｔ（２−Ｃｌ）  ｒｅｓｉｎ：Ｌ−Ａｓｐａｒｔｉｃ  ａｃｉｄ  β−ｔ−ｂｕｔｙｌ  ｅｓｔｅｒ  ２−ｃｈｌｏｒｏｔｒｉｔｙｌ  ｒｅｓｉｎ（渡辺化学工業株式会社）
・Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ：  Ｎ−α−（９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）  −Ｌ−ａｌａｎｉｎｅ（渡辺化学工業株式会社）
・Ｆｍｏｃ−Ｉｅｕ−ＯＨ：  Ｎ−α−（９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）−Ｌ−ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ（渡辺化学工業株式会社）
・Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ：  Ｎ−α−（９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）−Ｎ−β−ｔｒｉｔｙｌ−Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（渡辺化学工業株式会社）
・Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ：  Ｎ−α−（９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）−Ｏ−（ｔ−ｂｕｔｙｌ）−Ｌ−ｓｅｒｉｎｅ（渡辺化学工業株式会社）
・Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ：  Ｎ−α−（９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）−Ｏ−（ｔ−ｂｕｔｙｌ）−Ｌ−ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ（渡辺化学工業株式会社）
・ＨＡＴＵ：Ｏ−（７−ａｚａ−１Ｈ−ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌ−１−ｙｌ）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｕｒｏｎｉｕｍ  ｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）
・ＤＩＥＡ：  Ｎ，Ｎ−Ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ（和光純薬・ペプチド合成用）
・ＤＭＦ：  Ｎ，Ｎ−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ（関東化学・ペプチド合成用）
・ＴＦＡ：  ２，２，２−Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ（和光純薬）
・ＴＩＰＳ：  Ｔｒｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｓｉｌａｎｅ（渡辺化学工業株式会社）
・Ｔｈｉｏａｎｉｓｏｌｅ（渡辺化学工業株式会社）
・ｍ−Ｃｒｅｓｏｌ（東京化成）
・ＤＣＭ：  Ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ（関東化学）
・ＡＣＮ：  ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ（関東化学・ＨＰＬＣ用）
・α−ＣＨＣＡ：α−Ｃｙａｎｏ−４−ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｉｃ  Ａｃｉｄ
・分取カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｐｒｏ  Ｃ１８，  ２０ｍｍ（Ｉ．Ｄ．）×２５０ｍｍ（Ｌｅｎｇｔｈ），  粒子径５μｍ，  細孔径１２μｍ（ＹＭＣ）
・分析カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｐｒｏ  Ｃ１８，  ４．６ｍｍ（Ｉ．Ｄ．）×２５０ｍｍ（Ｌｅｎｇｔｈ），  粒子径５μｍ，  細孔径１２μｍ（ＹＭＣ）
・ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＡＳＳ：  Ｍａｔｒｉｘ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  Ｏｆ  Ｆｌｉｇｈｔ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ
・Ｄ．Ｗ．：  ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ  ｗａｔｅｒ
・硫酸銅五水和物（関東化学）
・アスコルビン酸（関東化学）
【００７１】
２．ＭＡＰコアの合成
ＭＡＰ４を例としてＭＡＰコアの合成法を以下に記載する。ＭＡＰコア合成は通常のＦｍｏｃ固相合成法を用い、全ての工程を手動にて行った。具体的にはＮＨ２−ＳＡＬ−Ｔｒｔ（２−Ｃｌ）−  Ｒｅｓｉｎ  １ｍｍｏｌ分を固相担体として以下の手順で合成した。
【００７２】
【表１】
2018070571.tif 000011
【００７３】
合成終了後、固相０．１ｍｍｏｌに対しＤ．Ｗ．（ｍｌ）：ＴＩＰＳ（ｍｌ）：ＴＦＡ（ｍｌ）＝１．５：１．５：３０を加え１．５時間撹拌し切出と脱保護を行った。切出後は、ろ過により溶液を回収しこれを減圧濃縮後、少量の水を加え凍結乾燥した。凍結乾燥後、０．１％ＴＦＡとＡＣＮを溶出液に用いた逆相ＨＰＬＣにて精製を行った。精製物はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＡＳＳを用いた質量分析にて目的物の確認を行った。
【００７４】
精製条件：
・溶出液Ａ：  ０．１％ＴＦＡ，  溶出液Ｂ：  ０．１％ＴＦＡ  ＡＣＮ
・平衡化：溶出液Ａ  １００％，  １０ｍＬ／ｍｉｎ，  １０ｍｉｎ
・溶出：溶出液Ａ  １００％→溶出液Ａ  ７０％／溶出液Ｂ  ３０％，  １０ｍＬ／ｍｉｎ，  ３０ｍｉｎリニアグラジエント
質量分析：
・マトリックス溶液：１０ｍｇ／ｍＬ  α−ＣＨＣＡ  ｉｎ  ０．１％ＴＦＡ  ５０％ＣＡＮ水溶液
・サンプル：ＨＰＬＣ溶出液もしくは０．１％ＴＦＡ  ５０％ＡＣＮ水溶液（概ね１ｍｇ／ｍＬ  ペプチド）
・マトリックス溶液とサンプルを１：１で混合しプレート上で混晶を形成
【００７５】
３．抗原ペプチド合成
抗原ペプチド合成もＭＡＰコア合成と同様にＦｍｏｃ固相合成法を用いて行った。具体的にはＨ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｔｒｔ（２−Ｃｌ）ｒｅｓｉｎ  １ｍｍｏｌ分を固相担体として用い、以下の手順で合成した。
【００７６】
抗原ペプチドの配列はＮ３−ＰＥＧ−ＳＴＱＫＡＩＤ−ＯＨでありＣ末端からＮ末端に向かい、ペプチドを伸長した。
【００７７】
【表２】
2018070571.tif 000012
【００７８】
合成終了後、固相１ｍｍｏｌに対しチオアニソール（ｍｌ）：ｍ−クレゾール（ｍｌ）：ＴＩＰＳ（ｍｌ）：ＴＦＡ（ｍｌ）＝５．４：１．５：０．９：３０を加え１．５時間撹拌し切出と脱保護を行った。切出後は、ろ過により溶液を回収しこれを減圧濃縮。さらにエーテルを加え沈殿を回収し未精製ペプチドを得た。未精製ペプチドは０．１％ＴＦＡとＡＣＮを溶出液に用いた逆相ＨＰＬＣにて精製を行った。
【００７９】
精製物はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＡＳＳを用いた質量分析にて目的物の確認を行った。
精製条件：
・溶出液Ａ：  ０．１％ＴＦＡ，  溶出液Ｂ：  ０．１％ＴＦＡ  ＡＣＮ
・平衡化：溶出液Ａ  ９０％／溶出液Ｂ  １０％，  １０ｍＬ／ｍｉｎ，  １０ｍｉｎ
・溶出：溶出液Ａ  ９０％／溶出液Ｂ  １０％→溶出液Ａ  ６０％／溶出液Ｂ  ４０％，
１０ｍＬ／ｍｉｎ，  ３０ｍｉｎリニアグラジエント
ＨＰＬＣ  分析条件
・溶出液Ａ：  ０．１％ＴＦＡ，  溶出液Ｂ：  ０．１％ＴＦＡ  ＡＣＮ
・平衡化：溶出液Ａ  ９５％／溶出液Ｂ  ５％，  １０ｍＬ／ｍｉｎ，  １０ｍｉｎ
・溶出：溶出液Ａ  ９５％／溶出液Ｂ  ５％→溶出液Ａ  ６０％／溶出液Ｂ  ４０％，  １０ｍＬ／ｍｉｎ，  ３０ｍｉｎリニアグラジエント
質量分析：上述のとおりである。
【００８０】
４．ＭＡＰの合成
ＭＡＰコアと抗原ペプチドはヒュスゲン反応を利用し結合させた。すなわち、ＭＡＰコア中のアルキンをＣｕ＋で活性化し抗原ペプチドＮ末端のアジド基と反応させ、トリアゾールにより結合させた。具体的な工程を以下に記載する。
【００８１】
（工程１）ＭＡＰコアと抗原ペプチドを０．１％ＴＦＡ水溶液に溶解した。このとき混合比はＭＡＰコア２８ｍｇ（３６μｍｏｌ）と抗原ペプチド１４５ｍｇ（１４８μｍｏｌ）とし、これらを０．１％ＴＦＡ水溶液２ｍｌに溶解した（ペプチド溶液）。
【００８２】
（工程２）硫酸銅・５水和物水溶液とアスコルビン酸水溶液の調製を次のように行った。硫酸銅・５水和物５０ｍｇ（２００μｍｏｌ）を１ｍｌのＤ．Ｗ．に溶解した（硫酸銅水溶液）。また、アスコルビン酸１７６ｍｇ（１ｍｍｏｌ）を１ｍｌのＤ．Ｗ．に溶解（アスコルビン酸水溶液）した。次に、硫酸銅水溶液とアスコルビン酸水溶液を全量混和した（Ｃｕ＋溶液）。
【００８３】
（工程３）次にヒュスゲン反応を行った。具体的には、ペプチド溶液２ｍｌとＣｕ＋溶液１．１ｍｌを混和し、室温で数時間反応した。
【００８４】
（工程４）目的物を０．１％ＴＦＡとＡＣＮを溶出液に用いた逆相ＨＰＬＣにて精製し、凍結乾燥した。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＡＳＳを用いた質量分析にて目的物の確認を行った。
精製条件：上記の抗原ペプチドと同様である。
ＨＰＬＣ純度検定条件：上記の抗原ペプチドと同様である。
質量分析：上記と同様である。
【００８５】
合成結果は以下の通りであった。
【００８６】
【表３】
2018070571.tif 000013
【００８７】
【表４】
2018070571.tif 000014
【００８８】
［実施例２］
＜鳥インフルエンザＭＡＰ４投与手順＞
試験:
Ｂａｌｂ／ｃマウスに鳥インフルエンザＭＡＰ４を２％ＤＭＳＯ−１％マウス血清入り生理食塩水に溶解したものを腹腔内注射した。投与量は、Ｂａｌｂ／ｃマウスあたり１００μｇ／１００μＬ／マウス／回投与とした。ＭＡＰ投与方法は、４日間毎日１日１回連日投与し（合計４回投与）、初回投与日から７日目、１４日目に投与した。α−ガラクトシルセラミド投与は、初回のみＭＡＰ４とともに腹腔内投与し、用量は２μｇ／マウスとした。投与前、投与後で眼窩静脈叢から採血し、血清中の抗ＭＡＰ抗体の濃度を測定した。
【００８９】
＜鳥インフルエンザＭＡＰ４のマウス血清中抗体価の測定法＞
抗体ＭＡＰ抗体の測定には、鳥インフルエンザのヘマグルチニンペプチドに牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を結合したものをＥＬＩＳＡプレートに固相化し、その後１００倍希釈した血清を添加し、３７℃で１時間インキュベートした後、それぞれペルオキシダーゼ標識された抗ＩｇＭ抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社）、抗ＩｇＧ抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社）、抗ＩｇＧ１抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社）、抗ＩｇＧ２ａ抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社）、抗ＩｇＧ３抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社）をメーカー推奨濃度で加え、ペルオキシダーゼによる基質分解後の発色（Ａ４５０）をプレートリーダーを用いて測定し、血清中抗体価を測定した。
【００９０】
また、鳥インフルエンザのヘマグルチニンペプチドに牛血清アルブミン（ＢＳＡ）とＦＬＡＧを結合したものをＥＬＩＳＡプレートに固相化し、血清の代わりに抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体（Ｃｌｏｎｅ：  Ｍ２マウスＩｇＧ１、シグマアルドリッチ社）を各種濃度に希釈して添加し、抗ＭＡＰ抗体価測定と同様にして測定することで、抗ＭＡＰ抗体価の定量化のための標準曲線とした。この標準曲線から、抗ＭＡＰ抗体のおおよその血清中抗体濃度を算出した。
【００９１】
＜試験の結果＞
血清中の抗ＭＡＰ抗体の濃度を測定した結果を、図２に示した。
図２から、鳥インフルエンザＭＡＰ４の腹腔内投与（ｉｐ）では、ＩｇＧが明らかに上昇したマウスが５匹中３匹認められた。抗ＦＬＡＧ抗体換算による総ＩｇＧ抗体量は、１４日目で１５７ｎｇ／ｍｌ、１５４ｎｇ／ｍｌ、１０６ｎｇ／ｍｌ、２１日目でそれぞれ１２２ｎｇ／ｍｌ、１４８ｎｇ／ｍｌ、８３ｎｇ／ｍｌであった。
【００９２】
得られたＩｇＧ抗体のサブクラスを測定した結果、図３に示されるように、上昇したＩｇＧ抗体はＩｇＧ１及びＩｇＧ３で構成されることが分かった。また、ＩｇＧ１の上昇から、抗体遺伝子のクラススイッチが起こっていることが分かった。
【００９３】
さらにまた、ＩｇＭ価を測定した結果、図４に示すように、すべて（５匹中５匹）のマウスでＩｇＭが誘導されることが分かった。
【００９４】
さらにまた、上記の投与試験をマウスに対し静脈内投与したときにも鳥インフルエンザウイルスに対するＩｇＧ及びＩｇＭ抗体を誘導することができた。
【００９５】
上記の試験から、次の結果が得られた。
（１）α−ガラクトシルセラミドとともにＭＡＰ４を静脈内投与又は腹腔内投与することによって、鳥インフルエンザウイルスに対するＩｇＧ及びＩｇＭ抗体を誘導することができた。
（Ａ）α−ガラクトシルセラミドと鳥インフルエンザＭＡＰ４を腹腔内投与することによって、鳥インフルエンザウイルスに対するＩｇＧ及びＩｇＭ抗体を誘導することができた。
（Ｂ）ＩｇＧ濃度は１００ｎｇ／ｍｌを超える程度であった。
（Ｃ）ＩｇＧ抗体のサブクラスは、ＩｇＧ１及びＩｇＧ３であった。
（Ｄ）ＩｇＭは投与したすべてのマウスで上昇した。
（２）鳥インフルエンザＭＡＰ４は、抗体価上昇を認め、ワクチンとしての機能をもつことが分かった。
（３）ＩｇＭ及びＩｇＧ３が効率よく誘導できたことから、ＭＡＰ４は腹腔内のＢ１Ｂ細胞に作用すると考えられた。
（４）ＩｇＧ１も誘導されており、Ｂ２Ｂ細胞にも一部作用していると考えられた。
【産業上の利用可能性】
【００９６】
本発明は、鳥インフルエンザウイルス感染に対する免疫誘導剤を提供するものであり、実施例に示すように多重抗原ペプチドによってＩｇＧ抗体及びＩｇＭ抗体の誘導を可能にしたことは鳥インフルエンザウイルスに対する免疫誘導によるワクチンとしての可能性を示した。このことは鳥インフルエンザウイルス感染に対する予防及び治療のために産業上有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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