(57)【要約】【課題】更年期症状改善効果、エストロゲン様効果、抗肥満効果、高脂血症抑制効果、脂肪肝に対する保護効果及び骨粗鬆症抑制効果などで相乗効果を発揮しながらも副作用がない、ザクロとレッドクローバーとの複合抽出物を含む天然組成物及びその多様な用途、特に、薬学的、食品学的、化粧学的用途を提供する。【解決手段】本発明は、ザクロとレッドクローバーとの複合抽出物を有効成分として含む更年期障害改善用組成物に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ザクロとレッドクローバーとの複合抽出物を有効成分として含む更年期障害改善用組成物。
【請求項２】
前記更年期障害が、顔面紅潮、発汗、不眠症、神経過敏、うつ病、めまい、集中力欠乏、関節痛、頭痛、心悸亢進、膣乾燥感、疲れ、興奮、不眠、記憶喪失、心配及びアテローム性動脈硬化症からなる群より選択された１つ以上の更年期症状を示すことを特徴とする請求項１に記載の更年期障害改善用組成物。
【請求項３】
前記更年期障害改善が、更年期症状改善、抗肥満、高脂血症抑制、脂肪肝抑制、骨粗鬆症抑制、肝保護及び子宮保護からなる群より選択された１つ以上の効果を奏することを特徴とする請求項１に記載の更年期障害改善用組成物。
【請求項４】
請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の更年期障害改善用組成物を含む薬学的組成物。
【請求項５】
請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の更年期障害改善用組成物を含む食品組成物。
【請求項６】
請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の更年期障害改善用組成物を含む化粧料組成物。
【請求項７】
ザクロ抽出物対比レッドクローバー抽出物の重量比が１：１〜４であることを特徴とする請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
ザクロ抽出物対比レッドクローバー抽出物の重量比が１：１．５〜２．５であることを特徴とする請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記ザクロとレッドクローバーとの複合抽出物を組成物１００ｍｌ当り５０〜１５０ｍｇで含むことを特徴とする請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
ザクロ抽出物が、全体ザクロ抽出物対比０．５〜１ｍｇ／ｇのエラグ酸を含むことを特徴とする請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
レッドクローバー抽出物が、全体レッドクローバー抽出物対比５０〜１５０ｍｇ／ｇのイソフラボンを含むことを特徴とする請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ザクロとレッドクローバーとの複合抽出物が、３０〜１００ｍｇ／ｇのイソフラボン及び０．１５〜０．４ｍｇ／ｇのエラグ酸を含むことを特徴とする請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
レッドクローバー抽出物が、水、炭素数１〜４の低級アルコールまたはこれらの混合物を溶媒として使用して抽出したことを特徴とする請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
レッドクローバー抽出物が、レッドクローバー抽出粉末であることを特徴とする請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
ザクロ抽出物が、ザクロ抽出粉末であることを特徴とする請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
ザクロ抽出物対比レッドクローバー抽出物の重量比が１：１〜４になるように混合することを特徴とするザクロとレッドクローバーとの複合抽出物を含む組成物の更年期障害改善効果を向上させる方法。
【請求項１７】
（Ｓ１）ザクロの果肉に澱粉分解酵素を添加し加熱濃縮してザクロ果肉抽出物を製造する段階と、
（Ｓ２）レッドクローバーの地上部に水、炭素数１〜４の低級アルコールまたはこれらの混合物を溶媒として添加してレッドクローバー地上部抽出物を製造する段階と、
（Ｓ３）ザクロ果肉抽出物とレッドクローバー地上部抽出物とを混合して撹拌する段階と、を含む更年期症状改善用ザクロとレッドクローバーとの複合抽出物の製造方法。
【請求項１８】
前記レッドクローバー地上部抽出物は、さらに加熱濃縮した後、多糖類を添加し乾燥してレッドクローバー地上部抽出粉末として（Ｓ３）段階に混合されることを特徴とする請求項１７に記載の更年期症状改善用ザクロとレッドクローバーとの複合抽出物の製造方法。
【請求項１９】
前記ザクロ果肉抽出物は、さらに多糖類を添加し乾燥してザクロ果肉抽出粉末として（Ｓ３）段階に混合されることを特徴とする請求項１７に記載の更年期症状改善用ザクロとレッドクローバーとの複合抽出物の製造方法。
【請求項２０】
更年期障害の改善が必要な対象にザクロとレッドクローバーとの複合抽出物を有効成分として含む組成物を投与する段階を含む更年期障害を改善する方法。
【請求項２１】
更年期障害改善用組成物を製造するためのザクロとレッドクローバーとの複合抽出物の用途。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、多様な用途で優れた効果を奏する天然組成物に関し、より詳しくは、更年期症状の改善に優れた効果を奏する天然植物複合抽出物に関する。
【０００２】
本出願は、２０１４年４月１７日出願の韓国特許出願第１０−２０１４−００４６１８５号及び２０１５年４月１７日出願の韓国特許出願第１０−２０１５−００５４５４７号に基づく優先権を主張し、該当出願の明細書及び図面に開示された内容は、すべて本出願に援用される。
【０００３】
〔背景技術〕
エストロゲン（ｅｓｔｒｏｇｅｎ）は、子宮、膣、骨格筋及び心血管系など女性の多様な臓器に対して必須な調節効果を有し、主に異化作用及び活性作用を担当する［Ｃｏｕｓｅ ａｎｄ Ｋｏｒａｃｈ、１９９９；Ｋｏｒａｃｈ ｅｔ ａｌ．、１９９５］。したがって、閉経による女性のエストロゲン不足は、いわゆる更年期障害と呼ばれる多様な臨床症状を引き起こす［Ｔｕｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９９４；Ｖｅｒｓｉ ｅｔ ａｌ．、２００１］。
【０００４】
更年期障害とは、女性の閉経による女性ホルモン（エストロゲン）の急激な減少によってもたらされる多様な症状を通称する用語［Ｄｅｎｎｅｒｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．、２００２；Ｗｏｌｆｆ ｅｔ ａｌ．、２００６］である。更年期障害を改善するため、不足な女性ホルモンを補うホルモン療法が用いられたが［Ｇｒｅｅｎｄａｌｅ ｅｔ ａｌ．、１９９８；Ｎｉｃｈｏｌｓ ｅｔ ａｌ．、１９８４］、長期使用の際、子宮癌、乳癌、脳卒中、肺血栓塞栓症及び多様な副作用を引き起こし［Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．、２００２；Ｂｅｒａｌ ｅｔ ａｌ．、２００５；Ｋａａｒｉ ｅｔ ａｌ．、２００６］、植物来由のフィトエストロゲン（ｐｈｙｔｏｅｓｔｒｏｇｅｎ）が最近代案として注目されている［Ｋｎｉｇｈｔ ａｎｄ Ｅｄｅｎ、１９９６；Ｓｅｔｃｈｅｌｌ、１９９８；ｄｅｌ Ｇｉｏｒｎｏ ｅｔ ａｌ．、２０１０；Ａｔｅｂａ ｅｔ ａｌ．、２０１３］。フィトエストロゲンはエストロゲンと構造的に類似し、エストロゲン受容体ＥＲ‐α及びＥＲ‐βに結合して［Ａｋｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ．、１９８７；Ｋｕｉｐｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９９７、Ｃｏｒｎｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．、２００４］、弱いエストロゲン様効果を示し［Ｋｕｉｐｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９９７］、女性の閉経による多様な代謝症候群の抑制効果［Ｔａｋｕｅｔ ａｌ．、２００７］とともに、比較的に優れた骨量保存効果［Ｍａ ｅｔ ａｌ．、２００８］を奏すると知られている。エストロゲンの不足は、子宮と膣のような女性生殖器の急激な萎縮をもたらし［Ｖｅｒｓｉ ｅｔ ａｌ．、２００１；Ａｔｅｂａ ｅｔ ａｌ．、２０１３］、ＯＶＸによるエストロゲン欠乏の際にも顕著な子宮萎縮がもたらされると知られている［Ｋａｗａｋｉｔａ ｅｔ ａｌ．、２００９；Ａｔｅｂａ ｅｔ ａｌ．、２０１３］。
【０００５】
骨粗鬆症は、骨形成に比べて一層速い骨吸収を特徴とする骨再形成（ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）障害であり、身体の無機質代謝の障害をもたらし、骨折を格段に増加させる代謝性疾患である［Ｓａｋａｉ ｅｔ ａｌ．、１９９８］。特に、股関節周辺の骨折は生命を脅かし得る深刻な問題につながる［Ｙａｍａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．、１９９９］。ＯＶＸラットは閉経期以後の女性に起きる骨粗鬆症とかなり類似の所見を手術後４〜６週に亘って示すため、骨粗鬆症治療剤または骨保護物質の開発に非常に有用に使用されてきた［Ｋａｌｕ、１９９１；Ｗｒｏｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．、１９９１；Ｆｒｏｓｔ ａｎｄ Ｊｅｅ、１９９２］。特に、米国食品医薬品局では、ＯＶＸラットを骨粗鬆症治療剤の開発に必須な薬効検索動物モデルとして提示している［ＵＳ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ、１９９４］。骨重量の減少は、骨粗鬆症の進行過程で骨無機質の損失に直結し［Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．、１９９８］、炭化骨重量減少の抑制は骨粗鬆症に対する治療効果を奏する直接的な証拠として示されている［Ｐｕｅｌ ｅｔ ａｌ．、２００５；Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ．、２００５］。オステオカルシン（Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ）は代表的な骨代謝指標（ｂｏｎｅ ｔｕｒｎｏｖｅｒ ｍａｒｋｅｒ）として用いられ、ｂＡＬＰ含量は代表的な血中骨形成指標として知られている［Ｋｅ ｅｔ ａｌ．、２００４；Ｒｉｓｓａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．、２００８；Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．、２０１１；Ｋｕｏ ｅｔ ａｌ．、２０１２］。一般に、骨粗鬆症の進行に伴って、骨代謝（ｂｏｎｅ ｔｕｒｎｏｖｅｒ）の増加によって血中オステオカルシン含量は増加し、骨形成抑制によって血中ｂＡＬＰ含量は格段に減少する［Ｉｓｍａｉｌ ｅｔ ａｌ．、１９８８；Ｅｄｅｒｖｅｅｎ ａｎｄ Ｋｌｏｏｓｔｅｒｂｏｅｒ、１９９９；Ｒｉｓｓａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．、２００８；Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．、２０１１；Ｋｕｏ ｅｔ ａｌ．、２０１２］。骨密度（ＢＭＤ）及び骨強度は骨の質を示す重要な指標であって、骨粗鬆症では、誘発原因に関係なく、著しい骨密度及び骨強度の減少が起きると知られている［Ｂｉｌｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．、２００２；Ｄｉｅｚ、２００２；Ｓｙｅｄ ａｎｄ Ｋｈａｎ、２００２］。組織学的検査は最も正確な骨の形態学的情報を提供し［Ｙａｍａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．、１９９９；Ｈｅｉｋｋｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．、２００４］、骨粗鬆症の進行に従って骨量及び骨形成に関連する組織形態計測学的指標が格段に減少し、骨再吸収に関連する因子は増加する［Ｈｅｉｋｋｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．、２００４；Ｊａｋｕｂａｓ−Ｐｒｚｅｗｌｏｃｋａ ｅｔ ａｌ．、２００５］。顕著な骨量及び構造の減少と骨吸収活性増加がＯＶＸラットで組織学的に認められるため、その骨の組織病理学的検査は常に直接的な薬効評価基準を提供した［Ｇｌａｔｔ ｅｔ ａｌ．、２００４；Ｊａｋｕｂａｓ−Ｐｒｚｅｗｌｏｃｋａ ｅｔ ａｌ．、２００５］。
【０００６】
〔発明の概要〕
〔発明が解決しようとする課題〕
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、更年期症状の改善に相乗効果を発揮しながらも副作用がない、ザクロとレッドクローバーとの複合抽出物を含む天然組成物及びその多様な用途、特に、薬学的、食品学的、化粧学的用途を提供することを目的とする。
【０００７】
〔課題を解決するための手段〕
上記の課題を達成するため、本発明は、ザクロとレッドクローバーとの複合抽出物を有効成分として含む組成物を提供する。
【０００８】
一様態として、本発明は、ザクロとレッドクローバーとの複合抽出物を有効成分として含む更年期障害改善用組成物を提供する。
【０００９】
また、本発明は、更年期障害の改善が必要な対象にザクロとレッドクローバーとの複合抽出物を有効成分として含む組成物を投与する段階を含む更年期障害を改善する方法を提供する。
【００１０】
また、本発明は、更年期障害改善用組成物を製造するためのザクロとレッドクローバーとの複合抽出物の用途を提供する。
【００１１】
以下、本発明において「ザクロとレッドクローバーとの複合抽出物を有効成分として含む更年期障害改善用組成物」に関する記載は、「更年期障害の改善が必要な対象にザクロとレッドクローバーとの複合抽出物を有効成分として含む組成物を投与する段階を含む更年期障害を改善する方法」及び「更年期障害改善用組成物を製造するためのザクロとレッドクローバーとの複合抽出物の用途」にも同様に適用されるとする。
【００１２】
レッドクローバー（Ｒｅｄ ｃｌｏｖｅｒ、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ ｐｒａｔｅｎｓｅ Ｌ）は、マメ科の多年草であり、紅車軸草、アカツメクサ、紅三葉、または金花菜とも呼ばれる。地中海沿岸と西南アジアが原産地であり、全世界に広く分布栽培されている直立型牧草である。レッドクローバーは飼料用として使用され、春には幼葉を軽くゆでてナムルで食べることもある。レッドクローバーは去痰効果があるため、咳や喘息の治療に効能があると知られている。
【００１３】
レッドクローバーは地上部（ａｅｒｉａｌ ｐａｒｔｓ）と根部とに分けられ、本発明においてはレッドクローバーの地上部抽出物を用いることが望ましいが、これに限定されることはない。
【００１４】
他の様態として、レッドクローバー抽出物は、水、炭素数１〜４の低級アルコールまたはこれらの混合物を溶媒として使用して抽出することが望ましい。
【００１５】
本発明によるレッドクローバー抽出物は、次のような方法で製造することができる。例えば、まず、レッドクローバーを洗浄した後、レッドクローバーの地上部を分離し、望ましくは、水、炭素数１〜４の低級アルコールまたはこれらの混合物を溶媒として添加して、６０℃〜９０℃、０．０１〜０．５ＭＰａで１〜４時間に亘って１〜５回抽出して製造できるが、これに限定されることはない。
【００１６】
また他の様態として、本発明の組成物は、全体レッドクローバー抽出物対比５０〜１５０ｍｇ／ｇのイソフラボンを含む組成物を提供できるが、これに限定されることはない。
【００１７】
ザクロ（Ｐｏｍｅｇｒａｎａｔｅ、Ｐｕｎｉｃａ ｇｒａｎａｔｕｍ Ｌ）は、アジア西南部、インド北西部及び米国カリフォルニアの自生植物であって、現在は亜熱帯及び熱帯の各地に広く広がっている植物である。昔からザクロ、特に赤ザクロは強壮剤として知られ、特に、高血圧と動脈硬化の予防に効果を奏すると知られている。また、水溶性糖質を３８〜４７％と多量含み、多様なビタミンとミネラルを含む。
【００１８】
本発明で用いるザクロの種類に特に制限はないが、赤ザクロが望ましく、具体的な例としてイラン、カリフォルニア、台湾、ウズベキスタン、トルコ及び韓国産の赤ザクロが挙げられる。本発明によるザクロ抽出物は、用られるザクロの産地及び収獲時期などによって差があり得る。
【００１９】
本発明は、果皮と種を含まないザクロの果肉のみを用いた抽出物を提供する。ザクロの果皮と種は副作用を引き起こす恐れがあるが、例えば、ザクロの果皮に含まれた特定アルカロイド（ａｌｋａｌｏｉｄ）は身体機能を低下させる作用をし、呼吸系と筋肉に影響を及ぼして、中毒すれば発作、痙攣、昏睡状態などが起き得る。また、ザクロ種の抽出物を服用すれば、一部でアレルギーである舌の腫れなどの副作用が生じ得る。
【００２０】
本発明によるザクロ抽出物は、次のような方法で製造することができる。例えば、まず、ザクロを洗浄した後、皮と種を完全に除去し、ペクチナーゼ（ｐｅｃｔｉｎａｓｅ）、プロテイナーゼ（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）、アミラーゼ、セルラーゼなどの酵素を添加してザクロに含まれている澱粉など多糖類を分解する。その後、選択的にゼラチン、二酸化ケイ素、ベントナイト、シリカゾル（ｓｉｌｉｃａｓｏｌ）、タンニン、セルロース、カゼインカリウムなどの添加剤を添加してザクロ抽出物の濁度、色相、粘度などを調節し、加熱濃縮してザクロ抽出物を製造できるが、これに限定されることはない。
【００２１】
さらに他の様態として、本発明のザクロ抽出物は、全体ザクロ抽出物対比０．５〜１ｍｇ／ｇのエラグ酸を含むことができるが、これに限定されることはない。
【００２２】
本発明によるザクロとレッドクローバーとの複合抽出物を有効成分として含む更年期障害改善用組成物は、ザクロ抽出物単独またはレッドクローバー抽出物単独の更年期障害改善効果より優れた効果を有し、少量の投与でも顕著な効果を奏することができる。ザクロ抽出物対比レッドクローバー抽出物の重量比は、１：１〜４であることが望ましく、１：１．５〜２．５であることがより望ましいが、これらに限定されることはない。さらに望ましくは、ザクロ抽出物対比レッドクローバー抽出物の重量比は１：２であり得る。
【００２３】
さらに他の様態として、本発明は、ザクロとレッドクローバーとの複合抽出物を組成物１００ｍｌ当り５０〜１５０ｍｇ含むことができる。
【００２４】
さらに他の様態として、前記ザクロとレッドクローバーとの複合抽出物は３０〜１００ｍｇ／ｇのイソフラボン及び０．１５〜０．４ｍｇ／ｇのエラグ酸を含むことが望ましく、５０〜７０ｍｇ／ｇのイソフラボン及び０．２〜０．３ｍｇ／ｇのエラグ酸を含むことがより望ましい。
【００２５】
さらに他の様態として、顔面紅潮、発汗、不眠症、神経過敏、うつ病、めまい、集中力欠乏、関節痛、頭痛、心悸亢進、膣乾燥感、疲れ、興奮、不眠、記憶喪失、心配及びアテローム性動脈硬化症からなる群より選択された１つ以上の更年期症状を改善することを特徴とする組成物を提供する。
【００２６】
本発明において、前記更年期障害は、顔面紅潮、発汗、不眠症、神経過敏、うつ病、めまい、集中力欠乏、関節痛、頭痛、心悸亢進、膣乾燥感、疲れ、興奮、不眠、記憶喪失、心配またはアテローム性動脈硬化症などを意味するが、これらに限定されることはない。
【００２７】
さらに他の様態として、前記更年期障害改善は、更年期症状改善、抗肥満、高脂血症抑制、脂肪肝抑制、骨粗鬆症抑制、肝保護及び子宮保護からなる群より選択された１つ以上の効果を奏することができる。
【００２８】
さらに他の様態として、本発明は、前記組成物のうちいずれか１つの組成物を含む薬学的組成物を提供する。
【００２９】
本発明による薬学的組成物は、薬学的に有効な量のザクロとレッドクローバーとの複合抽出物を単独で含むか、又は、１つ以上の薬学的に許容可能な担体、賦形剤または希釈剤をさらに含むことができる。前記「薬学的に許容可能な」とは、生理学的に許容され、ヒトに投与するとき、活性成分の作用を阻害せず、通常胃腸障害、めまいのようなアレルギー反応、またはこれと類似の反応を起こさない非毒性の組成物を言う。
【００３０】
前記担体、賦形剤または希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アラビアガム、アルジネート、ゼラチン、カルシウムフォスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレート及び鉱物油などが挙げられる。また、前記薬学的組成物は、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤または防腐剤などをさらに含むことができる。
【００３１】
前記「薬学的に有効な量」とは、陰性対照群に比べてそれ以上の反応を示す量であり、望ましくは、更年期障害の予防及び／または治療の効果を奏するための十分な量を言う。
【００３２】
また、本発明の薬学的組成物は、哺乳動物に投与された後、活性成分の迅速、持続、または遅延した放出を提供できるように、当業界で公知の方法を使用して剤形化することができる。剤形は、粉末、顆粒、錠剤、エマルジョン、シロップ、エアロゾル、軟質または硬質ゼラチンカプセル、滅菌注射液、滅菌粉末の形態であり得る。
【００３３】
本発明の薬学的組成物の投与経路は、経口的または非経口的に投与できるが、これらに限定されることはない。非経口的投与経路としては、例えば、経皮、鼻腔、腹腔、筋肉、皮下または静脈などの様々な経路が含まれ得る。
【００３４】
また、本発明の薬学的組成物は、更年期障害の予防及び／または治療効果を有する公知の化合物と並行して投与することができる。
【００３５】
さらに他の様態として、本発明は、前記組成物のうちいずれか１つの組成物を含む食品組成物を提供する。
【００３６】
本発明の食品組成物は、食品、機能性食品、栄養補助剤、健康食品及び食品添加剤などのすべての天然素材の加工形態を含む。前記類型の食品組成物は当業界で公知の通常の方法によって多様な形態で製造することができる。
【００３７】
例えば、健康食品としては、ザクロとレッドクローバーとの複合抽出物自体を、茶、ジュース及びドリンクの形態で製造して飲用するか、又は、顆粒化、カプセル化または粉末化して摂取することができる。また、本発明のザクロとレッドクローバーとの複合抽出物の外に、白芍薬、山茱萸、五加皮、霊芝、陳皮、杜沖、当帰、梔子、皇耆、麦芽、カラタチ、ビタミンＣ、フラクトオリゴ糖、ステビオシド、精製水、マルトデキストリンなどを、本発明の目的から逸脱しない範囲内で単独で又は混合してさらに含むことができるが、本発明の食品組成物がさらに包含できる他の薬効成分及び／または添加剤は上記の例に限定されない。
【００３８】
例えば、本発明による食品組成物は、水溶性ビタミンとしてチアミン（ビタミンＢ１）、リボフラビン、アスコルビン酸、ナイアシン及びビタミンＢ６を含むことができ、脂肪酸としてミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノレン酸などを含むことができ、弱酸成分としてグリコール酸及び酢酸を含むことができ、アミノ酸としてトレオニン、バリン、メチオニン、イソルシン、ルシン、フェニルアラニン、トリプトファン及びリシンの必須アミノ酸８種を含めて、アスパラギン酸、セリン、グルタミン酸、プロリン、グリシン、アルラニン、システイン、チロシン、ヒスチジン、アルギニンなどを含むことができる。
【００３９】
さらに他の様態として、本発明は、前記組成物のうちいずれか１つの組成物を含む化粧料組成物を提供する。
【００４０】
本発明の化粧料組成物に含まれる成分は、有効成分としてザクロとレッドクローバーとの複合抽出物の外に、化粧料組成物に通常用いる成分を含み、例えば、抗酸化剤、安定化剤、溶解化剤、ビタミン、顔料及び香料のような通常の補助剤、そして担体を含む。
【００４１】
本発明による化粧料は、当業界で通常製造される如何なる剤形としても製造することができる。例えば、溶液、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、パウダ、せっけん、界面活性剤を含むクレンジング、オイル、粉末ファンデーション、乳濁液ファンデーション、ワックスファンデーション及びスプレーなどに剤形化できるが、これらに限定されることはない。
【００４２】
より詳細に、柔軟化粧水、栄養化粧水、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、アイクリーム、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パック、スプレーまたはパウダの剤形で製造することができる。
【００４３】
本発明の剤形が溶液または乳濁液である場合は、担体成分として溶媒、溶解化剤または乳濁化剤が用いられ、例えば、水、エタノール、イソプロパノール、エチルカーボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、１，３‐ブチルグリコールオイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコールまたはソルビタンの脂肪酸エステルが挙げられる。
【００４４】
本発明の剤形が懸濁液である場合は、担体成分として水、エタノールまたはプロピレングリコールのような液状の希釈剤、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステル及びポリオキシエチレンソルビタンエステルのような懸濁剤、微小結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天またはトラガントなどを用いることができる。
【００４５】
本発明の剤形が界面活性剤を含むクレンジングである場合は、担体成分として脂肪族アルコールスルフェート、脂肪族アルコールエーテルスルフェート、スルホコハク酸モノエステル、イセチオネート、イミダゾリニウム誘導体、メチルタウレート、サルコシネート、脂肪酸アミドエーテルスルフェート、アルキルアミドベタイン、脂肪族アルコール、脂肪酸グリセリド、脂肪酸ジエタノールアミド、植物性油、ラノリン誘導体またはエトキシ化グリセロール脂肪酸エステルなどを用いることができる。
【００４６】
本発明の剤形がパウダまたはスプレーである場合は、担体成分としてラクトース、タルク、シリカ、アルミニウムヒドロキシド、カルシウムシリケートまたはポリアミドパウダを用いることができ、特に、スプレーである場合は、クロロフルオロヒドロカーボン、プロパン／ブタンまたはジメチルエーテルのような推進体をさらに含むことができる。
【００４７】
本発明の剤形がペースト、クリームまたはゲルである場合は、担体成分として動物性油、植物性油、ワックス、パラフィン、澱粉、トラガント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、シリカ、タルクまたは酸化亜鉛などを用いることができる。
【００４８】
さらに他の様態として、本発明のレッドクローバー抽出物はレッドクローバー抽出粉末であり得る。
【００４９】
さらに他の様態として、本発明のザクロ抽出物はザクロ抽出粉末であり得る。
【００５０】
ここで、「粉末」とは、例えば冷凍乾燥粉末または乾燥粉末を意味するが、これらに限定されない。
【００５１】
さらに他の様態として、本発明は、ザクロ抽出物対比レッドクローバー抽出物の重量比が１：１〜４になるようにレッドクローバー抽出物とザクロ抽出物とを混合し、望ましくはザクロ抽出物対比レッドクローバー抽出物の重量比が１：１．５〜２．５になるようにレッドクローバー抽出物とザクロ抽出物とを混合し、より望ましくはザクロ抽出物対比レッドクローバー抽出物の重量比が１：２になるようにレッドクローバー抽出物とザクロ抽出物とを混合して更年期障害改善効果を向上させる方法を提供する。
【００５２】
さらに他の様態として、本発明は、Ｓ１）ザクロの果肉に澱粉分解酵素を添加し加熱濃縮してザクロ果肉抽出物を製造する段階；（Ｓ２）レッドクローバーの地上部に水、炭素数１〜４の低級アルコールまたはこれらの混合物を溶媒として添加してレッドクローバー地上部抽出物を製造する段階；及び（Ｓ３）ザクロ果肉抽出物とレッドクローバー地上部抽出物とを混合して撹拌する段階を含む更年期症状改善用ザクロとレッドクローバーとの複合抽出物の製造方法を提供する。
【００５３】
本発明において、前記Ｓ１）段階の澱粉分解酵素は、例えば、ペクチナーゼ、プロテイナーゼ、アミラーゼ及びセルラーゼなどの酵素が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５４】
さらに他の様態として、前記レッドクローバー地上部抽出物は、さらに加熱濃縮した後、多糖類を添加し乾燥してレッドクローバー地上部抽出粉末として（Ｓ３）段階に混合される更年期症状改善用ザクロとレッドクローバーとの複合抽出物の製造方法を提供する。
【００５５】
さらに他の様態として、前記ザクロ果肉抽出物は、さらに多糖類を添加し乾燥してザクロ果肉抽出粉末として（Ｓ３）段階に混合されることを特徴とする更年期症状改善用ザクロとレッドクローバーとの複合抽出物の製造方法を提供する。
【００５６】
〔発明の効果〕
本発明によれば、更年期症状改善、抗肥満、高脂血症抑制、脂肪肝抑制、骨粗鬆症抑制、肝保護及び子宮保護からなる群より選択された１つ以上の効果を奏する相乗的な更年期症状改善効果を発揮しながらも副作用がない、ザクロとレッドクローバーとの複合抽出物を含む天然組成物を提供することができる。
【００５７】
〔図面の簡単な説明〕
〔図１〕ＯＶＸラットを用いてレッドクローバー抽出物とザクロ抽出物とを含む複合物の相乗効果を実験するための実験スケジュールを示した図である。
【００５８】
〔図２〕組織病理学的変化を観察したラットの領域を示した図である。
【００５９】
〔図３〕左側は骨密度（ＢＭＤ；Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｄｅｎｓｉｔｙ）測定装置であり、右側は二重エネルギーＸ線吸収測定法（ｄｕａｌ−ｅｎｅｒｇｙ ｘ−ｒａｙ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎｍｅｔｒｙ）（Ｎｏｒｌａｎｄ ｐＤＥＸＡ；Ｆｏｒｔ Ａｔｋｉｎｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）で検出した右側大腿骨（ｆｅｍｕｒ）の全体（ｔｏｔａｌ（Ｔ））、骨端（ｅｐｉｐｈｙｓｅａｌ（Ｅ））及び骨幹（ｄｉａｐｈｙｓｅａｌ（ｍｉｄ−ｓｈａｆｔ；Ｍ））領域、脛骨（ｔｉｂｉａ）及びＬ５の全領域を示した図である。
【００６０】
〔図４〕骨強度測定装置を示した図である。骨強度はＦＬ（破壊荷重、ｆａｉｌｕｒｅｌｏａｄ）によって測定する。
【００６１】
〔図５〕偽手術（ｓｈａｍ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ）対照群またはＯＶＸラットから採取した左側腹壁に蓄積された脂肪を示した図である。Ａは偽手術対照群、ＢはＯＶＸ対照群、Ｃはレッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｄはザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｅはレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｆはレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１複合物（ｇ／ｇ）６０ｍｇ／ｋｇ投与群を示した図である。
【００６２】
〔図６〕偽手術対照群またはＯＶＸラットから採取した子宮を示した図である。上段左側よりＡからＧ。Ａは偽手術対照群、ＢはＯＶＸ対照群、Ｃはレッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｄはザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｅはレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｆはレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１複合物（ｇ／ｇ）６０ｍｇ／ｋｇ投与群を示した図である。
【００６３】
〔図７〕ＯＶＸラットの血清中のエストラジオール（ｅｓｔｒａｄｉｏｌ）数値を示した図である。ａ（ｐ＜０．０１）：マン・ホイットニー検定（以下、「ＭＷテスト」とする）によって偽手術対照群と比較、ｂ（ｐ＜０．０１）：ＭＷテストによってＯＶＸ対照群と比較、ｃ（ｐ＜０．０１）及びｄ（ｐ＜０．０５）：ＭＷテストによってレッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ投与群と比較、ｅ（ｐ＜０．０１）：ＭＷテストによってザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ投与群と比較。
【００６４】
〔図８〕ＯＶＸラットの血清中のオステオカルシン数値を示した図である。ａ（ｐ＜０．０１）及びｂ（ｐ＜０．０５）：最小有意差検定（以下、「ＬＳＤテスト」とする）によって偽手術対照群と比較、ｃ（ｐ＜０．０１）及びｄ（ｐ＜０．０５）：ＬＳＤテストによってＯＶＸ対照群と比較、ｅ（ｐ＜０．０１）及びｆ（ｐ＜０．０５）：ＬＳＤテストによってレッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ投与群と比較、ｇ（ｐ＜０．０１）：ＬＳＤテストによってザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ投与群と比較。
【００６５】
〔図９〕ＯＶＸラットの血清ｂＡＬＰ数値を示した図である。ａ（ｐ＜０．０１）及びｂ（ｐ＜０．０５）：ＭＷテストによって偽手術対照群と比較、ｃ（ｐ＜０．０１）及びｄ（ｐ＜０．０５）：ＭＷテストによってＯＶＸ対照群と比較、ｅ（ｐ＜０．０１）及びｆ（ｐ＜０．０５）：ＭＷテストによってレッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ投与群と比較、ｇ（ｐ＜０．０１）：ＭＷテストによってザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ投与群と比較。
【００６６】
〔図１０〕ＯＶＸラットの大腿骨強度を示した図である。ａ（ｐ＜０．０１）及びｂ（ｐ＜０．０５）：ＬＳＤテストによって偽手術対照群と比較、ｃ（ｐ＜０．０１）：ＬＳＤテストによってＯＶＸ対照群と比較、ｄ（ｐ＜０．０１）及びｅ（ｐ＜０．０５）：ＬＳＤテストによってレッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ投与群と比較、ｆ（ｐ＜０．０１）及びｇ（ｐ＜０．０５）：ＬＳＤテストによってザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ投与群と比較。
【００６７】
〔図１１〕脛骨強度を示した図である。ａ（ｐ＜０．０１）及びｂ（ｐ＜０．０５）：ＭＷテストによって偽手術対照群と比較、ｃ（ｐ＜０．０１）及びｄ（ｐ＜０．０５）：ＭＷテストによってＯＶＸ対照群と比較、ｅ（ｐ＜０．０１）：ＭＷテストによってレッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ投与群と比較、ｆ（ｐ＜０．０１）：ＭＷテストによってザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ投与群と比較。
【００６８】
〔図１２〕偽手術対照群またはＯＶＸラットの背中側腹部筋肉の腹部脂肪から採取した脂肪細胞の組織学的映像を示した図である。Ａは偽手術対照群、ＢはＯＶＸ対照群、Ｃはレッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｄはザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｅはレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｆはレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１複合物（ｇ／ｇ）６０ｍｇ／ｋｇ投与群を示した図である。
【００６９】
〔図１３〕偽手術対照群またはＯＶＸラットから採取した左側子宮角の組織学的映像を示した図である。Ａは偽手術対照群、ＢはＯＶＸ対照群、Ｃはレッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｄはザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｅはレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｆはレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１複合物（ｇ／ｇ）６０ｍｇ／ｋｇ投与群を示した図である。Ｌはルーメン（ｌｕｍｅｎ）；ＭＵは粘膜（ｍｕｃｏｓａ）；ＭＬは筋肉層（ｍｕｓｃｕｌａｒ ｌａｙｅｒ）；Ｅｐは上皮（ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）；ＵＧは子宮腺（ｕｔｅｒｉｎｅ ｇｌａｎｄ）。
【００７０】
〔図１４〕偽手術対照群またはＯＶＸラットから採取した左側面の肝葉（ｌｏｂｅ）の組織学的プロファイルを示した図である。Ａは偽手術対照群、ＢはＯＶＸ対照群、Ｃはレッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｄはザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｅはレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｆはレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１複合物（ｇ／ｇ）６０ｍｇ／ｋｇ投与群を示した図である。ＣＶは中央血管（ｃｅｎｔｒａｌ ｖｅｉｎ）；ＰＴは門脈三つ組（ｐｏｒｔａｌ ｔｒｉａｄ）。
【００７１】
〔図１５〕偽手術対照群またはＯＶＸラットから採取した大腿骨の組織学的プロファイルを示した図である。Ａは偽手術対照群、ＢはＯＶＸ対照群、Ｃはレッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｄはザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｅはレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｆはレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１複合物（ｇ／ｇ）６０ｍｇ／ｋｇ投与群を示した図である。Ｃｂは皮質骨（ｃｏｒｔｉｃａｌ ｂｏｎｅ）；Ｔｂは柱骨（ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｂｏｎｅ）；Ｂｍは骨髄（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ）；Ｇｐは成長板（ｇｒｏｗｔｈ ｐｌａｔｅ）。
【００７２】
〔図１６〕偽手術対照群またはＯＶＸラットから採取した脛骨の組織学的プロファイルを示した図である。Ａは偽手術対照群、ＢはＯＶＸ対照群、Ｃはレッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｄはザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｅはレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｆはレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１複合物（ｇ／ｇ）６０ｍｇ／ｋｇ投与群を示した図である。Ｃｂは皮質骨；Ｔｂは柱骨；Ｂｍは骨髄；Ｇｐは成長板。
【００７３】
〔図１７〕偽手術対照群またはＯＶＸラットから採取したＬ４の組織学的プロファイルを示した図である。Ａは偽手術対照群、ＢはＯＶＸ対照群、Ｃはレッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｄはザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｅはレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｆはレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１複合物（ｇ／ｇ）６０ｍｇ／ｋｇ投与群を示した図である。Ｃｂは皮質骨；Ｔｂは柱骨；Ｂｍは骨髄；Ｇｐは成長板。
【００７４】
〔図１８〕ＯＶＸマウスを用いてレッドクローバー抽出物とザクロ抽出物とを含む複合物の比率による相乗効果を実験するための実験スケジュールを示した図である。
【００７５】
〔図１９〕組織病理学的変化を観察したマウスの領域を示した図である。
【００７６】
〔図２０〕ＢＭＤ測定装置（左側及び中央、ｎＡｌｙｚｅｒ、Ｍｅｄｉｋｏｒｓ、城南、韓国）及びそれを用いて撮影した写真（右側）を示した図である。
【００７７】
〔図２１〕骨強度測定装置（ＳＶ−Ｈ１０００、日本計測システム（株）、日本）を示した図である。骨強度はＦＬ（破壊荷重）によって測定する。
【００７８】
〔図２２〕偽手術対照群またはＯＶＸ ｄｄＹマウスモデルにおける体重変化を示したグラフである。
【００７９】
〔図２３〕偽手術対照群またはＯＶＸ ｄｄＹマウスモデルの腹腔内に蓄積された腹部脂肪パッドの代表総（ｇｒｏｓｓ）写真を示した図である。Ａは偽手術対照群、ＢはＯＶＸ対照群、Ｃは１７β‐エストラジオール０．０３μｇ／頭で処理されたＯＶＸマウス、Ｄはレッドクローバー抽出物１２０ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｅはザクロ抽出物１２０ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｆはレッドクローバー：ザクロ抽出物の１：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（６０：６０ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｇはレッドクローバー：ザクロ抽出物の１：２複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（４０：８０ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｈはレッドクローバー：ザクロ抽出物の１：４複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（２４：９６ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｉはレッドクローバー：ザクロ抽出物の１：６複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（１７：１０３ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｊはレッドクローバー：ザクロ抽出物の１：８複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（１３：１０７ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｋはレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（８０：４０ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｌはレッドクローバー：ザクロ抽出物の４：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（９６：２４ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｍはレッドクローバー：ザクロ抽出物の６：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（１０３：１７ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｎはレッドクローバー：ザクロ抽出物の８：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（１０７：１３ｍｇ／ｋｇ）投与群を示した図である（スケールバー＝１１ｍｍ）。
【００８０】
〔図２４〕偽手術対照群またはＯＶＸ ｄｄＹマウスモデルの子宮の代表総写真を示した図である。Ａは偽手術対照群、ＢはＯＶＸ対照群、Ｃは１７β‐エストラジオール０．０３μｇ／頭で処理されたＯＶＸマウス、Ｄはレッドクローバー抽出物１２０ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｅはザクロ抽出物１２０ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｆはレッドクローバー：ザクロ抽出物の１：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（６０：６０ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｇはレッドクローバー：ザクロ抽出物の１：２複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（４０：８０ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｈはレッドクローバー：ザクロ抽出物の１：４複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（２４：９６ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｉはレッドクローバー：ザクロ抽出物の１：６複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（１７：１０３ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｊはレッドクローバー：ザクロ抽出物の１：８複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（１３：１０７ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｋはレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（８０：４０ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｌはレッドクローバー：ザクロ抽出物の４：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（９６：２４ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｍはレッドクローバー：ザクロ抽出物の６：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（１０３：１７ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｎはレッドクローバー：ザクロ抽出物の８：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（１０７：１３ｍｇ／ｋｇ）投与群を示した図である（スケールバー＝１０ｍｍ）。
【００８１】
〔図２５〕偽手術対照群またはＯＶＸ ｄｄＹマウスの血清中のエストラジオール数値を示した図である。ａ（ｐ＜０．０１）：ＭＷテストによって偽手術対照群と比較、ｂ（ｐ＜０．０１）：ＭＷテストによってＯＶＸ対照群と比較、ｃ（ｐ＜０．０１）：ＭＷテストによってレッドクローバー抽出物単一組成物処理群と比較、ｄ（ｐ＜０．０１）：ＭＷテストによってザクロ抽出物単一組成物処理群と比較（Ｅ２は１７β‐エストラジオール）。
【００８２】
〔図２６〕偽手術対照群またはＯＶＸ ｄｄＹマウスの血清中のオステオカルシン数値を示した図である。ａ（ｐ＜０．０１）及びｂ（ｐ＜０．０５）：ＭＷテストによって偽手術対照群と比較、ｃ（ｐ＜０．０１）：ＭＷテストによってＯＶＸ対照群と比較、ｄ（ｐ＜０．０１）：ＭＷテストによってレッドクローバー抽出物単一組成物処理群と比較、ｅ（ｐ＜０．０１）：ＭＷテストによってザクロ抽出物単一組成物処理群と比較。
【００８３】
〔図２７〕偽手術対照群またはＯＶＸ ｄｄＹマウスの血清ｂＡＬＰ数値を示した図である。ａ（ｐ＜０．０１）：ＬＳＤテストによって偽手術対照群と比較、ｂ（ｐ＜０．０１）及びｃ（ｐ＜０．０５）：ＬＳＤテストによってＯＶＸ対照群と比較、ｄ（ｐ＜０．０１）及びｅ（ｐ＜０．０５）：ＬＳＤテストによってレッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ投与群と比較、ｆ（ｐ＜０．０１）及びｇ（ｐ＜０．０５）：ＬＳＤテストによってザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ投与群と比較。
【００８４】
〔図２８及び図２９〕偽手術対照群またはＯＶＸ ｄｄＹマウスのＤＥＸＡ（二重エネルギーＸ線吸収測定）写真を示した図である。モデルの腹腔内に蓄積された腹部脂肪パッドの代表総写真を示した図である。Ａは偽手術対照群、ＢはＯＶＸ対照群、Ｃは１７β‐エストラジオール０．０３μｇ／頭で処理されたＯＶＸマウス、Ｄはレッドクローバー抽出物１２０ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｅはザクロ抽出物１２０ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｆはレッドクローバー：ザクロ抽出物の１：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（６０：６０ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｇはレッドクローバー：ザクロ抽出物の１：２複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（４０：８０ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｈはレッドクローバー：ザクロ抽出物の１：４複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（２４：９６ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｉはレッドクローバー：ザクロ抽出物の１：６複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（１７：１０３ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｊはレッドクローバー：ザクロ抽出物の１：８複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（１３：１０７ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｋはレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（８０：４０ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｌはレッドクローバー：ザクロ抽出物の４：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（９６：２４ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｍはレッドクローバー：ザクロ抽出物の６：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（１０３：１７ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｎはレッドクローバー：ザクロ抽出物の８：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（１０７：１３ｍｇ／ｋｇ）投与群を示した図である。
【００８５】
〔図３０〕偽手術対照群またはＯＶＸ ｄｄＹマウスの大腿骨強度（破壊荷重、骨強度）を示した図である。ａ（ｐ＜０．０１）及びｂ（ｐ＜０．０５）：ＭＷテストによって偽手術対照群と比較、ｃ（ｐ＜０．０１）及びｄ（ｐ＜０．０５）：ＭＷテストによってＯＶＸ対照群と比較、ｅ（ｐ＜０．０１）及びｆ（ｐ＜０．０５）：ＭＷテストによってレッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ投与群と比較、ｇ（ｐ＜０．０１）及びｈ（ｐ＜０．０５）：ＭＷテストによってザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ投与群と比較。
【００８６】
〔図３１及び図３２〕偽手術対照群またはＯＶＸ ｄｄＹマウスの腹腔脂肪細胞の組織学的映像を示した図である。Ａは偽手術対照群、ＢはＯＶＸ対照群、Ｃは１７β‐エストラジオール０．０３μｇ／頭で処理されたＯＶＸマウス、Ｄはレッドクローバー抽出物１２０ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｅはザクロ抽出物１２０ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｆはレッドクローバー：ザクロ抽出物の１：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（６０：６０ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｇはレッドクローバー：ザクロ抽出物の１：２複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（４０：８０ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｈはレッドクローバー：ザクロ抽出物の１：４複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（２４：９６ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｉはレッドクローバー：ザクロ抽出物の１：６複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（１７：１０３ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｊはレッドクローバー：ザクロ抽出物の１：８複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（１３：１０７ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｋはレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（８０：４０ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｌはレッドクローバー：ザクロ抽出物の４：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（９６：２４ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｍはレッドクローバー：ザクロ抽出物の６：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（１０３：１７ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｎはレッドクローバー：ザクロ抽出物の８：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（１０７：１３ｍｇ／ｋｇ）投与群を示した図である（スケールバー＝１２０μｍ）。
【００８７】
〔図３３及び図３４〕偽手術対照群またはＯＶＸ ｄｄＹマウスから採取した左側子宮角の組織学的映像を示した図である。Ａは偽手術対照群、ＢはＯＶＸ対照群、Ｃは１７β‐エストラジオール０．０３μｇ／頭で処理されたＯＶＸマウス、Ｄはレッドクローバー抽出物１２０ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｅはザクロ抽出物１２０ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｆはレッドクローバー：ザクロ抽出物の１：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（６０：６０ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｇはレッドクローバー：ザクロ抽出物の１：２複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（４０：８０ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｈはレッドクローバー：ザクロ抽出物の１：４複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（２４：９６ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｉはレッドクローバー：ザクロ抽出物の１：６複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（１７：１０３ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｊはレッドクローバー：ザクロ抽出物の１：８複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（１３：１０７ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｋはレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（８０：４０ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｌはレッドクローバー：ザクロ抽出物の４：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（９６：２４ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｍはレッドクローバー：ザクロ抽出物の６：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（１０３：１７ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｎはレッドクローバー：ザクロ抽出物の８：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（１０７：１３ｍｇ／ｋｇ）投与群を示した図である。Ｌはルーメン；ＭＵは粘膜；ＭＬは筋肉層；Ｅｐは上皮；ＭＧは子宮腺（スケールバー＝１２０μｍ）。
【００８８】
〔図３５及び図３６〕偽手術対照群またはＯＶＸ ｄｄＹマウスから採取した左側面の肝葉の組織学的映像を示した図である。Ａは偽手術対照群、ＢはＯＶＸ対照群、Ｃは１７β‐エストラジオール０．０３μｇ／頭で処理されたＯＶＸマウス、Ｄはレッドクローバー抽出物１２０ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｅはザクロ抽出物１２０ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｆはレッドクローバー：ザクロ抽出物の１：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（６０：６０ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｇはレッドクローバー：ザクロ抽出物の１：２複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（４０：８０ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｈはレッドクローバー：ザクロ抽出物の１：４複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（２４：９６ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｉはレッドクローバー：ザクロ抽出物の１：６複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（１７：１０３ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｊはレッドクローバー：ザクロ抽出物の１：８複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（１３：１０７ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｋはレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（８０：４０ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｌはレッドクローバー：ザクロ抽出物の４：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（９６：２４ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｍはレッドクローバー：ザクロ抽出物の６：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（１０３：１７ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｎはレッドクローバー：ザクロ抽出物の８：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（１０７：１３ｍｇ／ｋｇ）投与群を示した図である。ＣＶは中央血管；ＰＴは門脈三つ組（スケールバー＝１２０μｍ）。
【００８９】
〔図３７及び図３８〕偽手術対照群またはＯＶＸ ｄｄＹマウスから採取した左側大腿骨の組織学的プロファイルを示した図である。Ａは偽手術対照群、ＢはＯＶＸ対照群、Ｃは１７β‐エストラジオール０．０３μｇ／頭で処理されたＯＶＸマウス、Ｄはレッドクローバー抽出物１２０ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｅはザクロ抽出物１２０ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｆはレッドクローバー：ザクロ抽出物の１：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（６０：６０ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｇはレッドクローバー：ザクロ抽出物の１：２複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（４０：８０ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｈはレッドクローバー：ザクロ抽出物の１：４複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（２４：９６ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｉはレッドクローバー：ザクロ抽出物の１：６複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（１７：１０３ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｊはレッドクローバー：ザクロ抽出物の１：８複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（１３：１０７ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｋはレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（８０：４０ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｌはレッドクローバー：ザクロ抽出物の４：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（９６：２４ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｍはレッドクローバー：ザクロ抽出物の６：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（１０３：１７ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｎはレッドクローバー：ザクロ抽出物の８：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（１０７：１３ｍｇ／ｋｇ）投与群を示した図である。Ｃｂは皮質骨；Ｔｂは柱骨；Ｂｍは骨髄；Ｇｐは成長板（スケールバー＝２４０μｍ）。
【００９０】
〔発明を実施するための形態〕                       
以下、本発明の理解を助けるために製造例と実施例を挙げて詳細に説明する。しかし、本発明による製造例と実施例は多くの他の形態で変形でき、本発明の範囲が後述される製造例と実施例に限定されると解釈されてはならない。本発明の製造例と実施例は当業界で平均的な知識を持つ者に本発明をより完全に説明するために提供されるものである。
【００９１】
［０．レッドクローバー抽出物とザクロ抽出物とを含む複合物の製造方法］
（１）レッドクローバー抽出物の製造
まず、レッドクローバーを洗浄した。レッドクローバーの地上部のみを分離して総重量８０〜１２０ｋｇのレッドクローバー地上部を準備した。レッドクローバー重量対比約３倍の重量で７０％エタノールを添加し、７５℃〜８０℃、０．０５ＭＰａで２．５時間に亘って２〜３回抽出してレッドクローバー抽出物３００ｋｇを得た。固液分離工程を通じて分離した後、１００ｍｅｓｈで濾過した。濾過されたレッドクローバー抽出物を７０℃、０．０６Ｍｐａで６時間加熱濃縮し、レッドクローバー濃縮抽出物２５ｋｇを得た。濃縮物にマルトデキストリン０〜１ｋｇを添加して噴霧乾燥し、８ｍｅｓｈで粉砕して１０％イソフラボンが含まれたレッドクローバー抽出粉末１０ｋｇを得た。
（２）ザクロ抽出物の製造
まず、ザクロ１０００ｋｇの異物を除去し、割れた果実を分離及び洗浄した。分類した果実を切断して皮を除去し、圧搾して種を分離してザクロの果肉４５０ｋｇを得た。濾過後、１００〜１０５℃で６０秒間殺菌し、４８〜５５℃に冷却した。ペクチナーゼをザクロジュース１０００Ｌ当り７０〜１００ｍｌ投入し、４８〜５５℃で３０分間澱粉を分解した。その後、濁度及び色相の維持、服用に有利な粘度のため、ザクロジュース１００００Ｌ当りベントナイト９００ｇを投入し、４８〜５５℃で１０分間撹拌した。次いで、１．５ｍｍ及び１ｍｍ真空濾過し、加熱濃縮（順次に、８０℃、４７５ｍｂａｒで１２Ｂｒｉｘまで、８７℃、６２６ｍｂａｒで１７Ｂｒｉｘまで、９５℃、８４７ｍｂａｒで３１Ｂｒｉｘまで、７０℃、３１２ｍｂａｒで４３Ｂｒｉｘまで、そして４９℃、１１８ｍｂａｒで６５Ｂｒｉｘまで加熱濃縮）した後、さらに０．１５ｍｍ濾過してエラグ酸１．８〜３．０ｍｇ／ｇを含むザクロ濃縮液を得た。その後、前記ザクロ濃縮液をデキストリンと混合し、噴霧乾燥過程を通じてエラグ酸０．５〜１．０ｍｇ／ｇを含むザクロ濃縮粉末を製造した。
（３）レッドクローバー及びザクロ複合抽出物の製造
上記のようにして製造したレッドクローバー抽出粉末４０ｋｇ（イソフラボン１０％含有）とザクロ抽出粉末２０ｋｇ（０．８ｍｇ／ｇエラグ酸含有）とを混合して撹拌し、最終的なレッドクローバーとザクロとの複合抽出物６０ｋｇ（イソフラボン６６．７ｍｇ／ｇ、エラグ酸０．２６ｍｇ／ｇ含有）を得た。
【００９２】
［１．レッドクローバー抽出物とザクロ抽出物との組合せによる効果］
レッドクローバー抽出物とザクロ抽出物とを特定の比率で組み合わせるとき、イソフラボノイド含有量の多様化による著しい相乗効果が奏されると予想し、実験を計画した。
【００９３】
本研究では、ザクロ抽出物の添加によるレッドクローバー抽出物の更年期障害に対する生理活性増大効果を卵巣摘出（Ｏｖａｒｉｅｃｔｏｍｙ；ＯＶＸ）ラットモデルを用いて評価した。すなわち、ＯＶＸ２８日後から、レッドクローバー抽出物：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物１２０ｍｇ／ｋｇ及び６０ｍｇ／ｋｇを滅菌蒸留水に溶解または希釈し、５ｍｌ／ｋｇの用量で毎日１回ずつ８４日（１２週；３ヶ月）間経口投与して、エストロゲン様効果、抗肥満効果、高脂血症抑制効果、脂肪肝に対する保護効果及び骨粗鬆症抑制効果の５種の薬理効果に区分して評価した。
【００９４】
エストロゲン様効果及び抗肥満効果を評価するため、体重及び増体量、水及び飼料の摂取量、尿量及び糞便の排出量、血清中エストラジオールの含量、蓄積腹部脂肪及び子宮の重量変化、蓄積腹部脂肪の厚さ及び平均脂肪細胞の直径、子宮全体、上皮及び粘膜の厚さ、粘膜内子宮腺が占める比率の変化をそれぞれ評価した。また、肝重量、血清中ＡＳＴ（Ａｓｐａｒｔａｔｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）及びＡＬＴ（Ａｌａｎｉｎｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）の含量、平均肝細胞直径及び脂肪変化を示す肝変性部位の変化を測定して脂肪肝に対する肝保護効果を評価し、高脂血症改善効果を血中総コレステロール（ＴＣ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）及びトリグリセリド（ＴＧ）の含量変化で評価し、骨粗鬆症改善効果、すなわち骨保護効果を評価するため、大腿骨、脛骨及び腰椎骨の湿重量、乾重量及び炭化重量、骨密度（ＢＭＤ）（図３）、骨強度（図４）、血中オステオカルシン及び骨特異的アルカリホスファターゼ（ｂｏｎｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ｂＡＬＰ））の含量、骨量及び構造と骨吸収に対する組織病理学的変化をそれぞれ測定した。本実験において、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物の結果をレッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ及びザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇをそれぞれ投与したラットにおける結果と比較評価した。
【００９５】
（実施例１−１．実験動物及び実験方法）
（１）実験動物
処女雌Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（６週齢、ＯｒｉｅｎｔＢｉｏ、城南、韓国）を使用した。本実験において、すべての実験動物は大邱漢医大学実験動物倫理委員会の動物倫理基準に従って取り扱い、事前承認下で実験を施した［Ａｐｐｒｏｖａｌ Ｎｏ．ＤＨＵ２０１３−０４２］。
（２）実験方法
群分離（総７ヶ群；群当り８匹）して実験した（表１、図１）。
【００９６】
すなわち、偽手術対照群（Ｓｈａｍ ｃｏｎｔｒｏｌ）、ＯＶＸ対照群、ＯＶＸ手術後、レッドクローバー乾燥抽出物の単独組成物４０ｍｇ／ｋｇ投与群、ＯＶＸ手術後、ザクロ抽出物の単独組成物２０ｍｇ／ｋｇ投与群、ＯＶＸ手術後、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合組成物１２０ｍｇ／ｋｇ投与群、及びＯＶＸ手術後、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合組成物６０ｍｇ／ｋｇ投与群に分離して実験した。
【００９７】
適正量のレッドクローバー抽出物、ザクロ抽出物、またはレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物を滅菌蒸留水に懸濁または溶解させ、５ｍｌ／ｋｇの用量でＯＶＸ２８日後から、毎日１回ずつ８４日間経口投与した。すなわち、レッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ、ザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物１２０及び６０ｍｇ／ｋｇをそれぞれ８４日間経口投与し、偽手術対照群及びＯＶＸ対照群では実験物質の代わりに媒体である滅菌蒸留水のみを同じ用量で同期間経口投与した（表１）。
【００９８】
【表１】
2018135395.tif 000002
【００９９】
ＯＶＸ＝両側卵巣摘出術（Ｂｉｌａｔｅｒａｌ ｏｖａｒｉｅｃｔｏｍｙ）
ＰＣＰ＝ザクロ抽出物（Ｐｏｍｅｇｒａｎａｔｅ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ Ｐｏｗｄｅｒ）
ＲＣ＝レッドクローバー乾燥抽出物（Ｒｅｄ ｃｌｏｖｅｒ ｄｒｙ ｅｘｔｒａｃｔｓ）
ＯＶＸによる更年期障害誘発のため、下記のように実験した。
【０１００】
すなわち、偽手術対照群を除いたすべての実験動物を無作為に選定し、両側の卵巣を完全に切除して骨粗鬆症を誘発した。一方、偽手術群では同じ方法で両側の卵巣を確認した後、切除せずに腹腔を閉じた。偽手術群を含むすべての実験動物は手術２８日後、体重（ＯＶＸラット：３２３．８１±４．７７ｇ、３０４〜３５４ｇ；偽手術ラット：２５３．２５±９．０８ｇ、２４０〜２６５ｇ）を基準に、群当り８匹ずつ選定して実験に用いた。
【０１０１】
更年期障害に対する効果をエストロゲン様効果、抗肥満効果、高脂血症抑制効果、脂肪肝に対する保護効果及び骨粗鬆症抑制効果の５種の薬理効果に区分して評価した。
【０１０２】
より具体的に、抗肥満及びエストロゲン様効果は次のように実験した。ＯＶＸ手術日、投与１日前（ＯＶＸ２７日後）、最初投与日、投与１日目から最小週１回ずつ最終犠牲日までの体重をそれぞれ記録し、ＯＶＸ後の回復期（更年期障害誘発期）及び投与開始後１２週間の体重変化量、すなわち増体量を測定した。水及び飼料の摂取量、尿量及び糞便の排出量（投与開始後２８、４９及び８３日目）、血清中エストラジオールの含量、蓄積腹部脂肪及び子宮の重量、子宮及び蓄積腹部脂肪の組織病理学的変化（蓄積腹部脂肪の厚さ及び平均脂肪細胞の直径、子宮全体、上皮及び粘膜の厚さ、粘膜内子宮腺が占める比率の変化）を観察した。
【０１０３】
また、脂肪肝に対する保護効果を確認するため、次のように実験した。肝重量、血清中ＡＳＴ及びＡＬＴの含量、肝の組織病理学的変化（平均肝細胞直径及び脂肪変化を示す肝変性部位の変化）を観察した。
【０１０４】
高脂血症抑制効果は、血中ＴＣ、ＬＤＬ、ＨＤＬ及びＴＧ含量の変化を通じて確認した。
【０１０５】
骨粗鬆症改善効果は、大腿骨、脛骨及び腰椎骨の湿重量、乾重量及び炭化重量、ＢＭＤ（図３）、骨強度、血中オステオカルシン及びｂＡＬＰの含量、骨量及び構造（柱骨量、柱骨髄、厚さ、長さ、皮質骨の厚さ）、骨吸収（破骨細胞数及び破骨細胞面積（ＯＳ／ＢＳ））に対する組織病理学的変化を通じて確認した。
【０１０６】
（実施例１−２．体重及び増体量の変化）
ＯＶＸ手術２８日後、偽手術対照群に比べて体重の増加が顕著な実験動物のみを選定して使用したため（ＯＶＸラット：３２３．８１±１４．７７ｇ、３０４〜３５４ｇ；偽手術ラット：２５３．２５±９．０８ｇ、２４０〜２６５ｇ）、偽手術対照群に比べて有意な（ｐ＜０．０１）体重及びＯＶＸ後誘発期である４週間の増体量の増加が全体ＯＶＸ手術群で認められたが、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物１２０ｍｇ／ｋｇ投与群では投与開始後４９日目からＯＶＸ対照群に比べて有意な（ｐ＜０．０１又はｐ＜０．０５）体重の減少が認められ始め、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物６０ｍｇ／ｋｇ投与群ではそれぞれ投与開始後５６、６３及び７０日目からＯＶＸ対照群に比べて有意な（ｐ＜０．０１又はｐ＜０．０５）体重の減少が認められ始めた。また、すべての実験物質投与群から、ＯＶＸ対照群に比べて有意な（ｐ＜０．０１）投与期間である８４日間の増体量の減少も認められた。特に、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物１２０ｍｇ／ｋｇ投与群では、レッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ及びザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇそれぞれの投与群に比べても有意な（ｐ＜０．０１又はｐ＜０．０５）体重の減少が投与開始後７７日目から認められ、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物１２０及び６０ｍｇ／ｋｇ投与群ではレッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ及びザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇそれぞれの投与群に比べても有意な（ｐ＜０．０１）投与期間である８４日間の増体量の減少も認められた（表２）。
【０１０７】
【表２】
2018135395.tif 000003
【０１０８】
＊すべての動物は夜間に絶食した。
ａ（ｐ＜０．０１）：ＬＳＤテストによって偽手術対照群と比較、
ｂ（ｐ＜０．０１）：ＬＳＤテストによってＯＶＸ対照群と比較、
ｃ（ｐ＜０．０５）：ＬＳＤテストによってレッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ投与群と比較、
ｄ（ｐ＜０．０１）：ＬＳＤテストによってザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ投与群と比較、ｅ（ｐ＜０．０１）：ＭＷテストによって偽手術対照群と比較、
ｆ（ｐ＜０．０１）：ＭＷテストによってＯＶＸ対照群と比較、
ｇ（ｐ＜０．０１）：ＭＷテストによってレッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ投与群と比較
ｈ（ｐ＜０．０１）：ＭＷテストによってザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ投与群と比較
ＯＶＸ対照群の場合、偽手術対照群に比べて投与期間中の増体量が９６．５５％の変化を示し、レッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ、ザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物１２０、６０／ｋｇ投与群では、ＯＶＸ対照群に比べてそれぞれ−２３．６４、−２３．００、−３８．９０、及び−３１．８７％の変化を示した。
【０１０９】
（実施例１−３．飼料摂取量の変化）
ＯＶＸ対照群では、偽手術対照群に比べて有意な（ｐ＜０．０１）飼料摂取量の増加が投与開始後２８、４９及び８３日目にそれぞれ認められた。ＯＶＸ対照群と比べて、レッドクローバー抽出物、ザクロ抽出物及びレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物投与に関連する飼料摂取量の変化は、測定日である２８、４９及び８３日でそれぞれ認められず、すべての用量のレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物投与群の全体からも、レッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ及びザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇそれぞれの投与群に比べて、有意な飼料摂取量の変化が認められなかった（表３）。
【０１１０】
ＯＶＸ対照群の場合、偽手術対照群に比べて投与開始後２８、４９及び８３日目の飼料摂取量がそれぞれ３０．５３、３２．５０及び３７．３５％の変化を示し、レッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ、ザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物１２０、６０ｍｇ／ｋｇ投与群では、ＯＶＸ対照群に比べてそれぞれ−５．６０、−６．４８、−８．８６、−３．１７％の飼料摂取量の変化を投与開始後２８日目に、０．６８、−７．１１、−８．９５、５．９４％の変化を投与開始後４９日目に、−１．４０、−０．９８、−１．７７、４．５７％の変化を投与開始後８３日目にそれぞれ示した。
【０１１１】
【表３】
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【０１１２】
ａ（ｐ＜０．０１）及びｂ（ｐ＜０．０５）：ＬＳＤテストによって偽手術対照群と比較ｃ（ｐ＜０．０５）：ＬＳＤテストによってザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ投与群と比較
ｄ（ｐ＜０．０１）及びｅ（ｐ＜０．０５）：ＭＷテストによって偽手術対照群と比較
（実施例１−４．水摂取量の変化）
ＯＶＸ対照群では、偽手術対照群に比べて有意な（ｐ＜０．０１又はｐ＜０．０５）水摂取量の増加が投与開始後２８、４９及び８３日目にそれぞれ認められた。ＯＶＸ対照群と比べて、レッドクローバー抽出物、ザクロ抽出物及びレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物投与に関連する水摂取量の変化は、測定日である２８、４９及び８３日でそれぞれ認められず、ザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ投与群に比べて有意な（ｐ＜０．０５）水摂取量の減少が投与開始後８３日目に限ってレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物１２０ｍｇ／ｋｇ投与群で認められた以外は、すべての用量のレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物投与群の全体からも、レッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ及びザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ投与群のそれぞれと比べて、有意な水摂取量の変化が認められなかった（表３）。
【０１１３】
ＯＶＸ対照群の場合、偽手術対照群に比べて投与開始後２８、４９及び８３日目の水摂取量がそれぞれ２４．７７、３２．０９及び４０．３１％の変化を示し、レッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ、ザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物１２０、６０ｍｇ／ｋｇ投与群では、ＯＶＸ対照群に比べてそれぞれ４．１２、８．２４、５．９９、１４．９８％の水摂取量の変化を投与開始後２８日目に示し、−５．６３、−３．３２、−５．８８、４．６０％の変化を投与開始後４９日目に示し、−１．１０、１４．９２、−８．５６、１１．６０％の変化を投与開始後８３日目にそれぞれ示した。
【０１１４】
（実施例１−５．尿量の変化）
ＯＶＸ対照群では、測定日である投与開始後２８、４９及び８３日目にそれぞれ偽手術対照群に比べて有意な尿量の変化が認められなかったが、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物１２０及び６０ｍｇ／ｋｇ投与群では、ＯＶＸ対照群に比べて有意な（ｐ＜０．０１）尿量の増加を測定日である投与開始後２８、４９及び８３日目にそれぞれ示し、特にレッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ及びザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ投与群に比べても有意な（ｐ＜０．０１又はｐ＜０．０５）尿量の増加がすべての測定日で認められた（表４）。
【０１１５】
ＯＶＸ対照群の場合、偽手術対照群に比べて投与開始後２８、４９及び８３日目の尿量がそれぞれ１．６１、４．３５及び１１．９９％の変化を示し、レッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ、ザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物１２０、６０ｍｇ／ｋｇ投与群では、ＯＶＸ対照群に比べてそれぞれ５．８２、−１．５９、８０．９５、６５．０８％の尿量の変化を投与開始後２８日目に示し、５３．３３、３３．３３、１１５．８３、８２．０８％の変化を投与開始後４９日目に示し、３６．７０、３４．２５、１６３．００、１１５．２９％の変化を投与開始後８３日目にそれぞれ示した。
【０１１６】
【表４】
2018135395.tif 000005
【０１１７】
ａ（ｐ＜０．０１）：ＬＳＤテストによって偽手術対照群と比較
ｂ（ｐ＜０．０１）及びｃ（ｐ＜０．０５）：ＬＳＤテストによってＯＶＸ対照群と比較ｄ（ｐ＜０．０１）及びｅ（ｐ＜０．０５）：ＬＳＤテストによってレッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ投与群と比較
ｆ（ｐ＜０．０１）及びｇ（ｐ＜０．０５）：ＬＳＤテストによってザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ投与群と比較
ｍ（ｐ＜０．０１）：ＭＷテストによってザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ投与群と比較
ｈ（ｐ＜０．０１）及びｉ（ｐ＜０．０５）：ＭＷテストによって偽手術対照群と比較
ｊ（ｐ＜０．０１）及びｋ（ｐ＜０．０５）：ＭＷテストによってＯＶＸ対照群と比較
ｌ（ｐ＜０．０１）：ＭＷテストによってレッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ投与群と比較
（実施例１−６．糞便排出量の変化）
ＯＶＸ対照群では、測定日である投与開始後２８、４９及び８３日目にそれぞれ偽手術対照群に比べて有意でない軽微な糞便排出量の増加を示したが、ＯＶＸ対照群と比べてレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物１２０ｍｇ／ｋｇ投与群では、投与開始後４９日及び８３日目に有意な（ｐ＜０．０１又はｐ＜０．０５）糞便排出量の増加をそれぞれ示し、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物６０ｍｇ／ｋｇ投与群では、ＯＶＸ対照群に比べて有意な（ｐ＜０．０１又はｐ＜０．０５）糞便排出量の増加を測定日である投与開始後２８、４９及び８３日目にそれぞれ示し、特にレッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ及びザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ投与群に比べても有意な（ｐ＜０．０１又はｐ＜０．０５）糞便排出量の増加が、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物１２０及び６０ｍｇ／ｋｇ投与群で、それぞれ投与開始後４９日及び８３日目に認められた。ＯＶＸ対照群の場合、偽手術対照群に比べて投与開始後２８、４９及び８３日目の糞便の排出量がそれぞれ１３．２９、２６．９６及び２５．７６％の変化を示し、レッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ、ザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物１２０、６０ｍｇ／ｋｇ投与群では、ＯＶＸ対照群に比べてそれぞれ２８．４６、７．８７、２５．１５、３３．６３％の糞便排出量の変化を投与開始後２８日目に示し、４２．８０、３９．５６、９０．１６、７７．５５％の変化を投与開始後４９日目に示し、３５．８９、３２．５４、６０．５８、５７．０３％の変化を投与開始後８３日目にそれぞれ示した。（表４）
（実施例１−７．蓄積腹部脂肪重量の変化）
ＯＶＸ対照群では、偽手術対照群に比べて有意な（ｐ＜０．０１）、左側腹壁に蓄積された脂肪の絶対重量及び体重に対する相対重量の増加がそれぞれ認められたが、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物１２０、６０ｍｇ／ｋｇ投与群では、ＯＶＸ対照群に比べて有意な（ｐ＜０．０１）、腹部脂肪重量の減少がそれぞれ認められた。特に、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物１２０及び６０ｍｇ／ｋｇ投与群では、レッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ及びザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇそれぞれの投与群に比べても有意な（ｐ＜０．０１）腹部脂肪重量の減少がそれぞれ認められた（表５、図５）。
【０１１８】
ＯＶＸ対照群の場合、偽手術対照群に比べて左側腹壁に蓄積された脂肪の絶対重量及び体重に対する相対重量がそれぞれ３０７．４７及び１８３．６８％の変化を示し、レッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ、ザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物１２０、６０ｍｇ／ｋｇ投与群では、ＯＶＸ対照群に比べてそれぞれ−４０．９４、−３６．３８、−６４．８２、−５５．７７％の絶対重量の変化を示し、−３５．４９、−３０．８２、−５９．５９、−５０．８６％の腹部脂肪の相対重量の変化をそれぞれ示した。
【０１１９】
【表５】
2018135395.tif 000006
【０１２０】
ａ（ｐ＜０．０１）：ＬＳＤテストによって偽手術対照群と比較
ｂ（ｐ＜０．０１）：ＬＳＤテストによってＯＶＸ対照群と比較
ｃ（ｐ＜０．０１）及びｄ（ｐ＜０．０５）：ＬＳＤテストによってレッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ投与群と比較
ｅ（ｐ＜０．０１）：ＬＳＤテストによってザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ投与群と比較
ｆ（ｐ＜０．０１）及びｇ（ｐ＜０．０５）：ＭＷテストによって偽手術対照群と比較
ｈ（ｐ＜０．０１）及びｉ（ｐ＜０．０５）：ＭＷテストによってＯＶＸ対照群と比較
ｊ（ｐ＜０．０１）及びｋ（ｐ＜０．０５）：ＭＷテストによってレッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ投与群と比較
ｌ（ｐ＜０．０１）：ＭＷテストによってザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ投与群と比較
（実施例１−８．子宮重量の変化）
ＯＶＸ対照群では、偽手術対照群に比べて有意な（ｐ＜０．０１）子宮の絶対重量及び体重に対する相対重量の減少がそれぞれ認められたが、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物を含むすべての実験物質投与群では、ＯＶＸ対照群に比べて有意な（ｐ＜０．０１）子宮重量の増加がそれぞれ認められた。特に、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物１２０及び６０ｍｇ／ｋｇ投与群では、レッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ及びザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇそれぞれの投与群に比べても有意な（ｐ＜０．０１）子宮重量の増加がそれぞれ認められた（表５、図６）。
【０１２１】
ＯＶＸ対照群の場合、偽手術対照群に比べて子宮の絶対重量及び体重に対する相対重量がそれぞれ−８７．３７及び−９１．３５％の変化を示し、レッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ、ザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物１２０、６０ｍｇ／ｋｇ投与群では、ＯＶＸ対照群に比べてそれぞれ２６．７６、２３．３９、６６．３６、５２．７５％の絶対重量の変化を示し、３８．７８、３３．８０、９１．０２、７０．１７％の子宮の相対重量の変化をそれぞれ示した。
【０１２２】
（実施例１−９．肝重量の変化）
ＯＶＸ対照群では、偽手術対照群に比べて有意な（ｐ＜０．０１）体重に対する肝の相対重量の減少が認められたが、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物を含むすべての候補物質投与群では、ＯＶＸ対照群に比べて有意な（ｐ＜０．０１又はｐ＜０．０５）肝の相対重量の増加がそれぞれ認められた。特に、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物１２０及び６０ｍｇ／ｋｇ投与群では、ＯＶＸ対照群に比べて有意な（ｐ＜０．０１）肝の絶対重量の増加も示し、レッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ及びザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇそれぞれの投与群に比べても有意な（ｐ＜０．０１又はｐ＜０．０５）肝の絶対及び相対重量の増加がそれぞれ認められた（表５）。
【０１２３】
ＯＶＸ対照群の場合、偽手術対照群に比べて肝の絶対重量及び体重に対する相対重量がそれぞれ−０．０３及び−３０．９１％の変化を示し、レッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ、ザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物１２０、６０ｍｇ／ｋｇ投与群では、ＯＶＸ対照群に比べてそれぞれ４．１８、３．９６、１４．９９、１５．４９％の絶対重量の変化を示し、１３．９５、１２．７５、３２．２１、２８．８３％の相対重量の変化をそれぞれ示した。
【０１２４】
（実施例１−１０．骨重量の変化）
ＯＶＸ対照群では、偽手術対照群に比べて有意な（ｐ＜０．０１）、体重に対する大腿骨、脛骨及び腰椎骨（Ｌ５）の湿／乾燥相対重量の減少とともに、大腿骨、脛骨及びＬ５の炭化絶対及び相対重量の減少が認められたが、ザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇを含むすべての実験物質投与群では、ＯＶＸ対照群に比べて著しい骨の湿／乾燥相対重量の増加が認められ、炭化骨の相対及び絶対重量の有意な（ｐ＜０．０１又はｐ＜０．０５）増加がそれぞれ認められた。特に、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物１２０及び６０ｍｇ／ｋｇ投与群では、レッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ及びザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇそれぞれの投与群に比べても著しい骨の湿重量の増加を示し、有意な（ｐ＜０．０１又はｐ＜０．０５）骨の乾燥／炭化絶対及び相対重量の増加がそれぞれ認められた（表６〜表８）。
【０１２５】
ＯＶＸ対照群の場合、偽手術対照群に比べて大腿骨の湿、乾燥及び炭化骨の体重に対する相対重量がそれぞれ−２９．３４、−３１．０２及び−４２．９２％の変化を示し、レッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ、ザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物１２０、６０ｍｇ／ｋｇ投与群では、ＯＶＸ対照群に比べてそれぞれ７．８１、１２．４９、１７．１６、１４．７８％の湿相対重量の変化を示し、１２．８２、１１．１１、２９．５９、２４．５８％の乾燥骨相対重量の変化をそれぞれ示し、２５．３６、２９．７０、５３．２３、４２．７７％の炭化大腿骨相対重量の変化をそれぞれ示した。
【０１２６】
ＯＶＸ対照群の場合、偽手術対照群に比べて脛骨の湿、乾燥及び炭化骨の体重に対する相対重量がそれぞれ−２７．３８、−３２．８２及び−４４．１３％の変化を示し、レッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ、ザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物１２０、６０ｍｇ／ｋｇ投与群では、ＯＶＸ対照群に比べてそれぞれ７．２２、９．７８、２２．７３、１８．１５％の湿相対重量の変化を示し、１３．８３、１９．４４、３６．３０、２９．５５％の乾燥骨相対重量の変化をそれぞれ示し、３０．０３、３２．７７、６２．１８、５０．７７％の炭化脛骨相対重量の変化をそれぞれ示した。
【０１２７】
ＯＶＸ対照群の場合、偽手術対照群に比べてＬ５の湿、乾燥及び炭化骨の体重に対する相対重量がそれぞれ−２９．６２、−３４．８６及び−４４．４９％の変化を示し、レッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ、ザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物１２０、６０ｍｇ／ｋｇ投与群では、ＯＶＸ対照群に比べてそれぞれ６．９１、１０．８４、３４．７９、２７．４６％の湿相対重量の変化を示し、１５．８２、１５．４４、４２．６８、３１．８４％の乾燥骨相対重量の変化をそれぞれ示し、２６．１９、１８．７４、４８．３６、３９．８４％の炭化Ｌ５相対重量の変化をそれぞれ示した。
【０１２８】
【表６】
2018135395.tif 000007
【０１２９】
ａ（ｐ＜０．０１）及びｂ（ｐ＜０．０５）：ＬＳＤテストによって偽手術対照群と比較ｃ（ｐ＜０．０１）及びｄ（ｐ＜０．０５）：ＬＳＤテストによってＯＶＸ対照群と比較ｅ（ｐ＜０．０１）及びｆ（ｐ＜０．０５）：ＬＳＤテストによってレッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ投与群と比較
ｇ（ｐ＜０．０１）及びｈ（ｐ＜０．０５）：ＬＳＤテストによってザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ投与群と比較
【０１３０】
【表７】
2018135395.tif 000008
【０１３１】
ａ（ｐ＜０．０１）及びｂ（ｐ＜０．０５）：ＬＳＤテストによって偽手術対照群と比較ｃ（ｐ＜０．０１）及びｄ（ｐ＜０．０５）：ＬＳＤテストによってＯＶＸ対照群と比較ｅ（ｐ＜０．０１）及びｆ（ｐ＜０．０５）：ＬＳＤテストによってレッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ投与群と比較
ｇ（ｐ＜０．０１）及びｈ（ｐ＜０．０５）：ＬＳＤテストによってザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ投与群と比較
【０１３２】
【表８】
2018135395.tif 000009
【０１３３】
ａ（ｐ＜０．０１）及びｂ（ｐ＜０．０５）：ＬＳＤテストによって偽手術対照群と比較ｃ（ｐ＜０．０１）及びｄ（ｐ＜０．０５）：ＬＳＤテストによってＯＶＸ対照群と比較ｅ（ｐ＜０．０１）及びｆ（ｐ＜０．０５）：ＬＳＤテストによってレッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ投与群と比較
ｇ（ｐ＜０．０１）及びｈ（ｐ＜０．０５）：ＬＳＤテストによってザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ投与群と比較
ｉ（ｐ＜０．０１）及びｊ（ｐ＜０．０５）：ＭＷテストによって偽手術対照群と比較
ｋ（ｐ＜０．０１）及びｌ（ｐ＜０．０５）：ＭＷテストによってＯＶＸ対照群と比較
ｍ（ｐ＜０．０１）及びｎ（ｐ＜０．０５）：ＭＷテストによってレッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ投与群と比較
ｏ（ｐ＜０．０１）及びｐ（ｐ＜０．０５）：ＭＷテストによってザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ投与群と比較
（実施例１−１１．血液の生化学的変化（１）：ＡＳＴ、ＡＬＴ、ＴＣ、ＬＤＬ、ＨＤＬ及びＴＧ）
ＯＶＸ対照群では、偽手術対照群に比べて有意な（ｐ＜０．０１）血中ＡＳＴ、ＡＬＴ、ＴＣ（Ｔｏｔａｌ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）、ＬＤＬ（Ｌｏｗ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）及びＴＧ（Ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ）含量の増加が、有意な（ｐ＜０．０５）ＨＤＬ（Ｈｉｇｈ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）含量の減少とともに認められたが、すべての実験物質投与群では、ＯＶＸ対照群に比べて有意な（ｐ＜０．０１又はｐ＜０．０５）血中ＡＳＴ、ＡＬＴ、ＴＣ、ＬＤＬ及びＴＧ含量の減少が認められ、血中ＨＤＬ含量の増加がそれぞれ認められた。特に、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物１２０及び６０ｍｇ／ｋｇ投与群では、ＯＶＸ対照群に比べて有意な（ｐ＜０．０１）血中ＨＤＬ含量の増加も認められ、レッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ及びザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇそれぞれの投与群に比べても有意な（ｐ＜０．０１又はｐ＜０．０５）血中ＡＳＴ、ＡＬＴ、ＴＣ、ＬＤＬ及びＴＧ含量の減少及びＨＤＬ含量の増加がそれぞれ認められた（表９）。
【０１３４】
ＯＶＸ対照群の場合、偽手術対照群に比べて血中ＡＳＴ及びＡＬＴ含量がそれぞれ７７．０３及び７２．５３％の変化を示し、レッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ、ザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物１２０、６０ｍｇ／ｋｇ投与群では、ＯＶＸ対照群に比べてそれぞれ−１４．５０、−１２．１０、−３１．６３、−２５．８０％のＡＳＴ含量の変化を示し、−２０．７０、−１６．７７、−３４．９３、−２９．３０％の血中ＡＬＴ含量の変化をそれぞれ示した。
【０１３５】
ＯＶＸ対照群の場合、偽手術対照群に比べて血中ＴＣ及びＬＤＬ含量がそれぞれ１０５．００及び１６３．０８％の変化を示し、レッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ、ザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物１２０、６０ｍｇ／ｋｇ投与群では、ＯＶＸ対照群に比べてそれぞれ−２４．００、−２０．９８、−４０．３９、−３６．７８％のＴＣ含量の変化を示し、−２２．３７、−２４．５６、−４４．３０、−３９．６２％の血中ＬＤＬ含量の変化をそれぞれ示した。
【０１３６】
ＯＶＸ対照群の場合、偽手術対照群に比べて血中ＨＤＬ及びＴＧ含量がそれぞれ−１８．６２及び１２１．８１％の変化を示し、レッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ、ザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物１２０、６０ｍｇ／ｋｇ投与群では、ＯＶＸ対照群に比べてそれぞれ５．８８、１３．７３、５２．９２、４１．８３％のＨＤＬ含量の変化を示し、−２７．５１、−２４．６９、−４２．６８、−３６．９２％の血中ＴＧ含量の変化をそれぞれ示した。
【０１３７】
【表９】
2018135395.tif 000010
【０１３８】
（実施例１−１２．血液の生化学的変化（２）：エストラジオール）
ＯＶＸ対照群では、偽手術対照群に比べて有意な（ｐ＜０．０１）血中エストラジオール含量の減少が認められたが、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物１２０、６０ｍｇ／ｋｇ投与群では、ＯＶＸ対照群に比べて有意な（ｐ＜０．０１又はｐ＜０．０５）血中エストラジオール含量の増加がそれぞれ認められた。特に、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物１２０及び６０ｍｇ／ｋｇ投与群では、レッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ及びザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇそれぞれの投与群に比べても有意な（ｐ＜０．０１又はｐ＜０．０５）血中エストラジオール含量の増加がそれぞれ認められた（図７）。
【０１３９】
ＯＶＸ対照群の場合、偽手術対照群に比べて血中エストラジオール含量が−８６．５８％の変化を示し、レッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ、ザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物１２０、６０ｍｇ／ｋｇ投与群では、ＯＶＸ対照群に比べてそれぞれ１６５．５５、１４１．１８、３０７．５６、２４７．９０％の血中エストラジオール含量の変化をそれぞれ示した。
【０１４０】
（実施例１−１３．血液の生化学的変化（３）：オステオカルシン及びｂＡＬＰ）
ＯＶＸ対照群では、偽手術対照群に比べて有意な（ｐ＜０．０１）血中オステオカルシン含量の増加が、有意な（ｐ＜０．０１）ｂＡＬＰ含量の減少とともに認められたが、すべての候補物質投与群では、ＯＶＸ対照群に比べて有意な（ｐ＜０．０１又はｐ＜０．０５）血中オステオカルシン含量の減少が、血中ｂＡＬＰ含量の増加とともにそれぞれ認められた。特に、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物１２０及び６０ｍｇ／ｋｇ投与群では、レッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ及びザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇそれぞれの投与群に比べても有意な（ｐ＜０．０１又はｐ＜０．０５）血中オステオカルシン含量の減少及びｂＡＬＰ含量の増加がそれぞれ認められた（図８、９）。
【０１４１】
ＯＶＸ対照群の場合、偽手術対照群に比べて血中オステオカルシン及びｂＡＬＰ含量がそれぞれ６９．３３及び−４９．９４％の変化を示し、レッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ、ザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物１２０、６０ｍｇ／ｋｇ投与群では、ＯＶＸ対照群に比べてそれぞれ−１７．７５、−１３．８３、−３１．２７、−２７．３６％のオステオカルシン含量の変化を示し、２６．３７、２１．１６、６４．３８、４７．５３％の血中ｂＡＬＰ含量の変化をそれぞれ示した。
【０１４２】
（実施例１−１４．骨密度の変化）
ＯＶＸ対照群では、偽手術対照群に比べて大腿骨及び脛骨の全体、脛部及び中軸部位の骨密度とともに、Ｌ４（第４腰椎）全体の骨密度が有意に（ｐ＜０．０１）減少した一方、すべての実験物質投与群では、ＯＶＸ対照群に比べて有意な（ｐ＜０．０１又はｐ＜０．０５）骨密度増加が全体測定部位でそれぞれ認められた。特に、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物１２０及び６０ｍｇ／ｋｇ投与群では、レッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ及びザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇそれぞれの投与群に比べても著しい骨密度の増加が全体測定部位でそれぞれ認められた（表１０）。
【０１４３】
大腿骨の全体、脛部及び中軸部位の骨密度は、ＯＶＸ対照群では、偽手術対照群に比べてそれぞれ−１８．４２、−２０．０６及び−１６．４４％の変化を示し、レッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ、ザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物１２０、６０ｍｇ／ｋｇ投与群では、ＯＶＸ対照群に比べてそれぞれ５．６７、５．４６、１４．６４、１１．１３％の全体骨密度の変化を示し、９．３３、６．６５、２２．１２、１６．７７％の脛部骨密度の変化を示し、７．９４、５．８１、１６．４７、１３．５１％の中軸骨密度の変化をそれぞれ示した。
【０１４４】
脛骨の全体、脛部及び中軸部位の骨密度は、ＯＶＸ対照群では、偽手術対照群に比べてそれぞれ−２２．６５、−２０．２４及び−２８．６２％の変化を示し、レッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ、ザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物１２０、６０ｍｇ／ｋｇ投与群では、ＯＶＸ対照群に比べてそれぞれ８．９２、６．７５、１９．２８、１６．７５％の全体骨密度の変化を示し、８．３９、６．４５、１８．７１、１４．９５％の脛部骨密度の変化を示し、１３．２２、１１．０１、３０．２１、１９．３８％の中軸骨密度の変化をそれぞれ示した。
【０１４５】
Ｌ４全体部位の骨密度は、ＯＶＸ対照群では、偽手術対照群に比べて−２１．３８％の変化を示し、レッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ、ザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物１２０、６０ｍｇ／ｋｇ投与群では、ＯＶＸ対照群に比べてそれぞれ９．６０、７．４３、１８．７４、１５．２０％変化をそれぞれ示した。
【０１４６】
【表１０】
2018135395.tif 000011
【０１４７】
ａ（ｐ＜０．０１）及びｂ（ｐ＜０．０５）：ＬＳＤテストによって偽手術対照群と比較ｃ（ｐ＜０．０１）及びｄ（ｐ＜０．０５）：ＬＳＤテストによってＯＶＸ対照群と比較ｅ（ｐ＜０．０１）及びｆ（ｐ＜０．０５）：ＬＳＤテストによってレッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ投与群と比較
ｇ（ｐ＜０．０１）及びｈ（ｐ＜０．０５）：ＬＳＤテストによってザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ投与群と比較
ｉ（ｐ＜０．０１）及びｊ（ｐ＜０．０５）：ＭＷテストによって偽手術対照群と比較
ｋ（ｐ＜０．０１）及びｌ（ｐ＜０．０５）：ＭＷテストによってＯＶＸ対照群と比較
ｍ（ｐ＜０．０１）及びｎ（ｐ＜０．０５）：ＭＷテストによってレッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ投与群と比較
ｏ（ｐ＜０．０１）及びｐ（ｐ＜０．０５）：ＭＷテストによってザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ投与群と比較
（実施例１−１５．骨強度の変化）
ＯＶＸ対照群では、偽手術対照群に比べて大腿骨及び脛骨の中軸部位の骨強度がそれぞれ有意に（ｐ＜０．０１）減少した一方、２種の用量のレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物を含むすべての候補物質投与群では、ＯＶＸ対照群に比べて有意な（ｐ＜０．０１又はｐ＜０．０５）大腿骨及び脛骨の骨強度の増加がそれぞれ認められた。特に、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物１２０及び６０ｍｇ／ｋｇ投与群では、レッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ及びザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇそれぞれの投与群に比べても有意な（ｐ＜０．０１又はｐ＜０．０５）骨強度の増加が大腿骨及び脛骨の中軸部位でそれぞれ認められた（図１０、１１）。
【０１４８】
ＯＶＸ対照群の場合、偽手術対照群に比べて大腿骨及び脛骨の中軸部位の骨強度がそれぞれ−５１．０６及び−５３．２２％の変化を示し、レッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ、ザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物１２０、６０ｍｇ／ｋｇ投与群では、ＯＶＸ対照群に比べてそれぞれ５１．６６、４８．９３、８７．２０、７８．０９％の大腿骨中軸部位の骨強度の変化を示し、２６．３８、２４．７５、８０．９０、５０．４９％の脛骨中軸部位の骨強度の変化をそれぞれ示した。
【０１４９】
（実施例１−１６．組織病理学的変化（１）：蓄積腹壁脂肪、子宮及び肝）
（１）蓄積腹壁脂肪
ＯＶＸ対照群では、偽手術対照群に比べて著しい腹部脂肪の腹壁蓄積増加による蓄積腹壁脂肪厚さの有意な（ｐ＜０．０１）増加と脂肪細胞平均直径の有意な（ｐ＜０．０１）増加がそれぞれ認められたが、すべての実験物質投与群では、ＯＶＸ対照群に比べて有意な（ｐ＜０．０１）蓄積腹壁脂肪及び脂肪細胞直径の減少がそれぞれ認められた。特に、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物１２０及び６０ｍｇ／ｋｇ投与群では、レッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ及びザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇそれぞれの投与群に比べても有意な（ｐ＜０．０１又はｐ＜０．０５）脂肪の腹壁蓄積及び脂肪細胞肥大所見の抑制が認められた（表１１、図１２）。
【０１５０】
蓄積腹壁脂肪の厚さ及び脂肪細胞の平均直径は、ＯＶＸ対照群では、偽手術対照群に比べてそれぞれ１２２．５９及び９２．４２％の変化を示し、レッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ、ザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物１２０、６０ｍｇ／ｋｇ投与群では、ＯＶＸ対照群に比べてそれぞれ−２１．８１、−１８．６１、−４３．６６、−３５．３３％の蓄積腹壁脂肪厚さの変化を示し、−２５．７２、−１９．１９、−３７．３９、−３５．６７％の脂肪細胞平均直径の変化をそれぞれ示した。
（２）子宮
ＯＶＸ対照群では、偽手術対照群に比べて著しい子宮粘膜の減少を特徴とする不溶性萎縮が認められ、子宮の全体、上皮及び粘膜の厚さ、そして粘膜内子宮腺が占める比率の有意な（ｐ＜０．０１）減少がそれぞれ認められたが、すべての候補物質投与群では、ＯＶＸ対照群に比べて有意な（ｐ＜０．０１）子宮の全体、上皮及び粘膜の厚さ、粘膜内子宮腺が占める比率の増加がそれぞれ認められ、特にレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物１２０及び６０ｍｇ／ｋｇ投与群では、レッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ及びザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇそれぞれの投与群に比べても有意な（ｐ＜０．０１又はｐ＜０．０５）子宮の不溶性萎縮所見の組織病理学的抑制が認められた（表１１、図１３）。
【０１５１】
子宮の全体及び上皮の平均厚さは、ＯＶＸ対照群では、偽手術対照群に比べてそれぞれ−８３．０８及び−７４．６２％の変化を示し、レッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ、ザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物１２０、６０ｍｇ／ｋｇ投与群では、ＯＶＸ対照群に比べてそれぞれ６２．９９、３４．９４、１６７．１３、１０２．５３％の子宮全体平均厚さの変化を示し、７３．０９、９６．２２、１４８．６６、１３３．６２％の子宮上皮平均厚さの変化をそれぞれ示した。
【０１５２】
子宮粘膜の平均厚さ及び粘膜内子宮腺が占める比率は、ＯＶＸ対照群では、偽手術対照群に比べてそれぞれ−８１．７０及び−８３．１６％の変化を示し、レッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ、ザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物１２０、６０ｍｇ／ｋｇ投与群では、ＯＶＸ対照群に比べてそれぞれ５６．８８、４７．９６、１７４．０２、１３７．７５％の子宮粘膜平均厚さの変化を示し、９１．４１、１２７．５７、３１４．７０、２６４．５３％の粘膜内子宮腺が占める比率の変化をそれぞれ示した。
（３）肝
ＯＶＸ対照群では、偽手術対照群に比べて著しい肝細胞内の脂肪蓄積による肥大を特徴とする肝脂肪病症が引き起こされ、肝の脂肪変性部位及び平均肝細胞直径の有意な（ｐ＜０．０１）増加がそれぞれ認められたが、レッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇを含むすべての実験物質投与群では、ＯＶＸ対照群に比べて有意な（ｐ＜０．０１又はｐ＜０．０５）肝脂肪病症の減少がそれぞれ認められ、特にレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物１２０及び６０ｍｇ／ｋｇ投与群では、レッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ及びザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇそれぞれの投与群に比べても有意な（ｐ＜０．０１）肝脂肪変性部位及び平均肝細胞直径の減少が認められた（表１１、図１４）。
【０１５３】
肝脂肪変性部位及び平均肝細胞直径は、ＯＶＸ対照群では、偽手術対照群に比べてそれぞれ１００１．１９及び１５２．９４％の変化を示し、レッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ、ザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物１２０、６０ｍｇ／ｋｇ投与群では、ＯＶＸ対照群に比べてそれぞれ−３８．９３、−２９．４４、−６５．９７、−５９．１６％の肝脂肪変性部位の変化を示し、−２０．８３、−１９．１１、−４５．４６、−３５．６５％の平均肝細胞直径の変化をそれぞれ示した。
【０１５４】
【表１１】
2018135395.tif 000012
【０１５５】
ａ（ｐ＜０．０１）及びｂ（ｐ＜０．０５）：ＬＳＤテストによって偽手術対照群と比較ｃ（ｐ＜０．０１）：ＬＳＤテストによってＯＶＸ対照群と比較
ｄ（ｐ＜０．０１）及びｅ（ｐ＜０．０５）：ＬＳＤテストによってレッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ投与群と比較
ｆ（ｐ＜０．０１）及びｇ（ｐ＜０．０５）：ＬＳＤテストによってザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ投与群と比較
ｈ（ｐ＜０．０１）：ＭＷテストによって偽手術対照群と比較
ｉ（ｐ＜０．０１）及びｊ（ｐ＜０．０５）：ＭＷテストによってＯＶＸ対照群と比較
ｋ（ｐ＜０．０１）：ＭＷテストによってレッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ投与群と比較
ｌ（ｐ＜０．０１）：ＭＷテストによってザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ投与群と比較
表１１において、略語の意味は次のようである。
Ｔｈ＝ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ、厚さ
ＤＭ＝ｄｉａｍｅｔｅｒ、直径
Ｅｐｉ＝ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ、上皮
ＭＧ＝ｕｔｅｒｉｎｅｇｌａｎｄ、子宮
ＦＣ＝ｆａｔｔｙ ｃｈａｎｇｅ、脂肪変化
（実施例１−１７．組織病理学的変化（２）：大腿骨、脛骨及び腰椎骨（Ｌ４））
偽手術群の大腿骨、脛骨及びＬ４では比較的によく発達した柱骨と皮質骨が観察された一方、ＯＶＸ対照群では破骨細胞（Ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ ｃｅｌｌ）の著しい数的増加及び活性増加による柱骨及び皮質骨の著しい組織学的減少が認められたが、ザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇを含むすべての実験物質投与群では、大腿骨、脛骨及びＬ４の破骨細胞活性抑制による柱骨及び皮質骨の骨量及び厚さの著しい増加が認められ、特にレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物１２０及び６０ｍｇ／ｋｇ投与群では、レッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ及びザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇそれぞれの投与群に比べても著しい破骨細胞活性抑制及び骨量保存効果が認められた（表１２〜１４、図１５〜１７）。
（１）骨質量（Ｂｏｎｅ ｍａｓｓ）及び構造
ＯＶＸ対照群の場合、大腿骨、脛骨及びＬ４の柱骨量、柱骨の平均長さ、厚さ及び数、中軸部分の皮質骨の厚さがそれぞれ偽手術対照群に比べて有意に（ｐ＜０．０１）減少したが、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物を含むすべての候補物質投与群では、ＯＶＸ対照群に比べて有意な（ｐ＜０．０１又はｐ＜０．０５）大腿骨、脛骨及びＬ４の柱骨量、柱骨の平均長さ、厚さ及び数、皮質骨の厚さの増加が認められ、特にレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物１２０及び６０ｍｇ／ｋｇ投与群では、レッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ及びザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇそれぞれの投与群に比べても著しい骨質量及び構造に対する組織病理学的指標の減少抑制効果が認められた。
【０１５６】
大腿骨の柱骨量及び中軸皮質骨の厚さは、ＯＶＸ対照群の場合、偽手術対照群に比べてそれぞれ−６６．４０％及び−２５．６９％の変化を示し、レッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ、ザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物１２０、６０ｍｇ／ｋｇ投与群では、ＯＶＸ対照群に比べてそれぞれ４３．７５、２０．９１、１１１．０４、８２．２１％の柱骨量の変化を示し、１７．００、１４．５４、２７．７３、２４．７６％の皮質骨厚さの変化をそれぞれ示した。
【０１５７】
脛骨の柱骨量及び中軸皮質骨の厚さは、ＯＶＸ対照群の場合、偽手術対照群に比べてそれぞれ−６３．６５及び−４６．８３％の変化を示し、レッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ、ザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物１２０、６０ｍｇ／ｋｇ投与群では、ＯＶＸ対照群に比べてそれぞれ３５．７８、２３．２５、１０１．８７、７２．７８％の柱骨量の変化を示し、１６．０５、１１．６２、５８．６１、２９．８０％の皮質骨厚さの変化をそれぞれ示した。
【０１５８】
Ｌ４の柱骨量及び中軸皮質骨の厚さは、ＯＶＸ対照群の場合、偽手術対照群に比べてそれぞれ−４４．８４及び−３８．５９％の変化を示し、レッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ、ザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物１２０、６０ｍｇ／ｋｇ投与群では、ＯＶＸ対照群に比べてそれぞれ３０．８８、２４．９０、５６．０５、４４．７２％の柱骨量の変化を示し、２３．１６、１７．８６、４０．７８、３９．５３％の皮質骨厚さの変化をそれぞれ示した。
（２）骨吸収
ＯＶＸ対照群の場合、大腿骨、脛骨及びＬ４の破骨細胞の数と比率（ＯＳ／ＢＳ）が、それぞれ偽手術対照群に比べて有意に（ｐ＜０．０１）増加したが、すべての候補物質投与群では、ＯＶＸ対照群に比べて著しい大腿骨、脛骨及びＬ４の破骨細胞の数及びＯＳ／ＢＳの減少が認められ、特にレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物１２０及び６０ｍｇ／ｋｇ投与群では、レッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ及びザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇそれぞれの投与群に比べても著しい骨吸収増加の抑制効果が認められた（表１２〜１４）。
【０１５９】
大腿骨の破骨細胞の数及びＯＳ／ＢＳは、ＯＶＸ対照群の場合、偽手術対照群に比べてそれぞれ２８０．３０及び２２９．４１％の変化を示し、レッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ、ザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物１２０、６０ｍｇ／ｋｇ投与群では、ＯＶＸ対照群に比べてそれぞれ−３７．０５、−３０．２８、−６０．１６、−５２．５９％の破骨細胞数の変化を示し、−２１．９４、−１０．４４、−４４．７８、−３５．８５％のＯＳ／ＢＳの変化をそれぞれ示した。
【０１６０】
脛骨の破骨細胞の数及びＯＳ／ＢＳは、ＯＶＸ対照群の場合、偽手術対照群に比べてそれぞれ１４５．６９及び３５１．０２％の変化を示し、レッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ、ザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物１２０、６０ｍｇ／ｋｇ投与群では、ＯＶＸ対照群に比べてそれぞれ−２９．８２、−２３．８６、−４４．２１、−３７．８９％の破骨細胞数の変化を示し、−２４．３４、−１７．０４、−６８．８３、−５１．８１％のＯＳ／ＢＳの変化をそれぞれ示した。
【０１６１】
Ｌ４の破骨細胞の数及びＯＳ／ＢＳは、ＯＶＸ対照群の場合、偽手術対照群に比べてそれぞれ１８８．８９及び２５４．６２％の変化を示し、レッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ、ザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物１２０、６０ｍｇ／ｋｇ投与群では、ＯＶＸ対照群に比べてそれぞれ−１８．６８、−１３．１９、−５２．７５、−４５．６０％の破骨細胞数の変化を示し、−２１．４１、−１６．０１、−６２．６９、−５４．１６％のＯＳ／ＢＳの変化をそれぞれ示した。
【０１６２】
【表１２】
2018135395.tif 000013
【０１６３】
ａ（ｐ＜０．０１）及びｂ（ｐ＜０．０５）：ＬＳＤテストによって偽手術対照群と比較ｃ（ｐ＜０．０１）：ＬＳＤテストによってＯＶＸ対照群と比較
ｄ（ｐ＜０．０１）及びｅ（ｐ＜０．０５）：ＬＳＤテストによってレッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ投与群と比較
ｆ（ｐ＜０．０１）及びｇ（ｐ＜０．０５）：ＬＳＤテストによってザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ投与群と比較
ｍ（ｐ＜０．０１）：ＭＷテストによってザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ投与群と比較
ｈ（ｐ＜０．０１）及びｉ（ｐ＜０．０５）：ＭＷテストによって偽手術対照群と比較
ｊ（ｐ＜０．０１）及びｋ（ｐ＜０．０５）：ＭＷテストによってＯＶＸ対照群と比較
ｌ（ｐ＜０．０１）：ＭＷテストによってレッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ投与群と比較
【０１６４】
【表１３】
2018135395.tif 000014
【０１６５】
ａ（ｐ＜０．０１）及びｂ（ｐ＜０．０５）：ＬＳＤテストによって偽手術対照群と比較ｃ（ｐ＜０．０１）及びｄ（ｐ＜０．０５）：ＬＳＤテストによってＯＶＸ対照群と比較ｅ（ｐ＜０．０１）：ＬＳＤテストによってレッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ投与群と比較
ｆ（ｐ＜０．０１）：ＬＳＤテストによってザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ投与群と比較
ｇ（ｐ＜０．０１）及びｈ（ｐ＜０．０５）：ＭＷテストによって偽手術対照群と比較
ｉ（ｐ＜０．０１）及びｊ（ｐ＜０．０５）：ＭＷテストによってＯＶＸ対照群と比較
ｋ（ｐ＜０．０１）及びｌ（ｐ＜０．０５）：ＭＷテストによってレッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ投与群と比較
ｍ（ｐ＜０．０１）：ＭＷテストによってザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ投与群と比較
【０１６６】
【表１４】
2018135395.tif 000015
【０１６７】
ａ（ｐ＜０．０１）及びｂ（ｐ＜０．０５）：ＬＳＤテストによって偽手術対照群と比較ｃ（ｐ＜０．０１）及びｄ（ｐ＜０．０５）：ＬＳＤテストによってＯＶＸ対照群と比較ｅ（ｐ＜０．０１）及びｆ（ｐ＜０．０５）：ＬＳＤテストによってレッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ投与群と比較
ｇ（ｐ＜０．０１）及びｈ（ｐ＜０．０５）：ＬＳＤテストによってザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ投与群と比較
ｉ（ｐ＜０．０１）及びｊ（ｐ＜０．０５）：ＭＷテストによって偽手術対照群と比較
ｋ（ｐ＜０．０１）及びｌ（ｐ＜０．０５）：ＭＷテストによってＯＶＸ対照群と比較
ｍ（ｐ＜０．０１）及びｎ（ｐ＜０．０５）：ＭＷテストによってレッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ投与群と比較
ｏ（ｐ＜０．０１）及びｐ（ｐ＜０．０５）：ＭＷテストによってザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ投与群と比較
参考までに、表１２〜表１４における略語の意味は次のようである。
Ｃｂｔ＝Ｃｏｒｔｉｃａｌ ｂｏｎｅ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ（Ｃｒｏｓｓ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ；μｍ）、皮質骨の厚さ
Ｔｂｌ＝Ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｂｏｎｅ ｌｅｎｇｔｈ（Ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ；ｍｍ）、柱骨の長さ
Ｔｂｎ＝Ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｂｏｎｅ ｎｕｍｂｅｒ（Ｎ／ｅｐｉｐｈｙｓｅａｌ）、柱骨の数
Ｔｂｔ＝Ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｂｏｎｅ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ（Ｃｒｏｓｓ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ；μｍ）、柱骨の厚さ
ＴＶ／ＢＶ＝Ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｂｏｎｅ ｖｏｌｕｍｅ（％）、柱骨の体積
ＯＳ／ＢＳ＝Ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ／ｂｏｎｅ ｓｕｒｆａｃｅ（％）、破骨細胞の面積／骨面積
Ｏｃｎ＝Ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ ｃｅｌｌ ｎｕｍｂｅｒ（Ｎ／ｅｐｉｐｈｙｓｅａｌ）、破骨細胞の数
［実施例１のまとめ］
本研究では、ザクロとレッドクローバーとの複合抽出物を含む複合物の更年期障害に対する生理活性増大効果を、ヒトの閉経期による更年期障害と類似すると知られたＯＶＸラットモデル［Ｔｏｍｉｎａｇａ ｅｔ ａｌ．、２００１、２００２；Ｉｗａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．、２００５；Ｃｈｅｎｇ ａｎｄ Ｔｉａｎ、２０１２］を用いて評価した。
【０１６８】
すなわち、ＯＶＸ２８日後から、レッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ、ザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物１２０、６０ｍｇ／ｋｇを滅菌蒸留水に溶解または希釈して、５ｍｌ／ｋｇの用量で毎日１回ずつ８４日（１２週；３ヶ月）間経口投与し、エストロゲン様効果、抗肥満効果、高脂血症抑制効果、脂肪肝に対する保護効果及び骨粗鬆症抑制効果の５種の薬理効果に区分して評価した。
【０１６９】
エストロゲン様効果及び抗肥満効果を評価するため、体重及び増体量、水及び飼料の摂取量、尿量及び糞便の排出量、血清中エストラジオールの含量、蓄積腹部脂肪及び子宮の重量変化、蓄積腹部脂肪の厚さ及び平均脂肪細胞直径、子宮全体、上皮及び粘膜の厚さ、粘膜内子宮腺が占める比率の変化をそれぞれ評価した。また、肝重量、血清中ＡＳＴ及びＡＬＴの含量、平均肝細胞直径及び脂肪変化を示す肝変性部位の変化を測定して脂肪肝に対する肝保護効果を評価し、高脂血症改善効果を血中総コレステロール（ＴＣ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）及びトリグリセリド（ＴＧ）含量の変化で評価し、骨粗鬆症改善効果、すなわち骨保護効果を評価するため、大腿骨、脛骨及び腰椎骨の湿重量、乾重量及び炭化重量、骨密度（ＢＭＤ）、骨強度、血中オステオカルシン及び骨特異的アルカリホスファターゼ（ｂＡＬＰ）の含量、骨量及び構造と骨吸収に対する組織病理学的変化をそれぞれ測定した。本実験において、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物の結果をレッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ及びザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇをそれぞれ投与したラットにおける結果と比較評価した。
【０１７０】
本実験の結果、ＯＶＸ対照群では、偽手術媒体対照群に比べて著しい体重及び増体量、飼料及び水摂取量、蓄積腹部脂肪重量、血清中ＡＳＴ、ＡＬＴ、ＴＣ、ＬＤＬ、ＴＧ及びオステオカルシン含量の増加が、子宮、肝、大腿骨、脛骨及びＬ５の重量と血中ｂＡＬＰ及びエストラジオール含量の減少とともに認められ、著しい腹壁蓄積脂肪厚さの増加及び脂肪細胞の肥大、肝の脂肪病症、子宮の不溶性萎縮、大腿骨、脛骨及びＬ４の骨量及び構造の減少所見が、骨吸収指標（Ｏｃｎ及びＯＳ／ＢＳ）の著しい増加とともに組織病理学的及び組織形態計測学的にそれぞれ認められた。すなわち、肥満、高脂血症、肝脂肪病症及び骨粗鬆症の多様な障害がＯＶＸによって誘発された。一方、このようなＯＶＸによって誘発された障害所見が、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物１２０、６０ｍｇ／ｋｇの８４日間の連続経口投与によって格段に抑制された。特に、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物１２０及び６０ｍｇ／ｋｇ投与群では、レッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ及びザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇそれぞれの投与群に比べても有意な肥満、高脂血症、肝脂肪病症及び骨粗鬆症のようなＯＶＸで誘発される障害の改善効果が認められた。したがって、適切な比率のザクロ抽出物の添加（レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物）は、含有するイソフラボノイドの多様性増加を通じて、ＯＶＸによって誘発される更年期障害に対するレッドクローバー抽出物の改善効果を相乗的に増加させると予想されるが、本発明がこのような内容に限られることはない。
【０１７１】
本研究では、ＯＶＸによって有意な尿及び糞便排出量の変化なく、著しい飼料及び水摂取量の増加が認められ、結果的に著しい体重増加とともに腹壁脂肪の蓄積と脂肪細胞の肥大が引き起こされた。一方、このようなＯＶＸによって誘発された肥満所見が、それぞれレッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ、ザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物１２０、６０ｍｇ／ｋｇの８４日間の連続経口投与によって格段に抑制され、特にレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物１２０及び６０ｍｇ／ｋｇ投与群では、レッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ及びザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇそれぞれの投与群に比べても有意な体脂肪蓄積及び体重増加の抑制所見が認められた。また、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物１２０及び６０ｍｇ／ｋｇ投与ラットでは、レッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ及びザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇそれぞれの投与ラットに比べても著しい尿量及び糞便排出量の増加が測定日（投与開始後２８、４９及び８３日目）にそれぞれ認められた。このような結果は、適切な比率のザクロ抽出物の添加（レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物）が肥満に対するレッドクローバー抽出物の改善効果を相乗的に増加させる証拠であると判断され、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物１２０及び６０ｍｇ／ｋｇは、一般に知られたイソフラボノイドの満腹感に関連する消化ホルモンであるＣＣＫ［Ａｓａｒｉａｎ ａｎｄ Ｇｅａｒｙ、２００７；Ｔｈａｍｍａｃｈａｒｏｅｎ ｅｔ ａｌ．、２００８］及びグルカゴン（ｇｌｕｃａｇｏｎ）［Ｇｅａｒｙ ａｎｄ Ａｓａｒｉａｎ、２００１］の調節を通じたエストロゲン様効果とともに、消化管の連動運動の増加及び利尿効果を通じて肥満に非常に有効な効果を奏すると考えられるが、本発明がこれらに限定されることはない。一般に、消化管連動運動が増加すれば、糞便排出量の増加がもたらされ、結果的に体重減少のような抗肥満効果が奏されて［Ｈｙｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．、２０１０；Ｂｅｒｔｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．、２０１１；Ｓｎｅｄｅｋｅｒ ａｎｄ Ｈａｙ、２０１２］、利尿作用も同様の体重減少効果を奏すると知られている［Ｄａｇｎａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．、１９９６；Ｖｅｒｌａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９９８］。
【０１７２】
本実験の結果をみれば、ＯＶＸによって、有意な子宮重量の減少が引き起こされ、組織病理学的で著しい子宮全体、粘膜及び上皮厚さの減少とともに粘膜内子宮腺の減少が引き起こされたが、このような子宮萎縮所見が、それぞれレッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ、ザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物１２０、６０ｍｇ／ｋｇの経口投与によって格段に抑制され、特に、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物１２０及び６０ｍｇ／ｋｇ投与群では、レッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ及びザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇそれぞれの投与群に比べても有意な子宮萎縮の抑制所見が認められる。
【０１７３】
本研究の結果、レッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ、ザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物１２０、６０ｍｇ／ｋｇの経口投与により、著しい血中ＴＣ、ＬＤＬ及びＴＧ含量の減少とともにＨＤＬ含量の増加が認められ、特に、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物１２０及び６０ｍｇ／ｋｇ投与群では、レッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ及びザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇそれぞれの投与群に比べても有意な抗高脂血症効果がそれぞれ認められ、本発明による比率でザクロ抽出物を添加することでレッドクローバー抽出物の抗高脂血症効果が、少なくとも本実験の条件下で相乗的に増加すると判断され、このような抗高脂血症効果はコレステロール合成に関与する酵素であるＨＭＧ‐ＣｏＡ［Ｄｉ Ｃｒｏｃｅ ｅｔ ａｌ．、１９９６］を経由すると思われる。
【０１７４】
本研究において、ＯＶＸ対照群では、著しい肝脂肪病症が血液生化学的及び組織病理学的にそれぞれ認められた。一方、このようなＯＶＸによる脂肪肝所見が、それぞれレッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ、ザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物１２０、６０ｍｇ／ｋｇの経口投与によって格段に抑制され、特にレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物１２０及び６０ｍｇ／ｋｇ投与群では、レッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ及びザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇそれぞれの投与群に比べても有意な肝保護効果が認められた。このような結果も、適切な比率のザクロ抽出物とレッドクローバー抽出物との複合物の肝保護効果が相乗的に増加したことを示すさらに１つの証拠であると思われる。本実験の結果、ＯＶＸ対照群では、偽手術媒体対照群に比べて著しい血中オステオカルシン含量の増加が、大腿骨、脛骨及びＬ５の重量と血中ｂＡＬＰ含量の減少とともに認められ、大腿骨、脛骨及びＬ４の骨量及び構造の減少所見が骨吸収指標（Ｏｃｎ及びＯＳ／ＢＳ）の著しい増加とともに組織病理学的及び組織形態計測学的にそれぞれ認められ、骨粗鬆症がＯＶＸによって誘発されることが観察された。一方、このような骨粗鬆症所見は、それぞれレッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ、ザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物１２０、６０ｍｇ／ｋｇの８４日間の連続経口投与によって格段に抑制され、特にレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物１２０及び６０ｍｇ／ｋｇ投与群では、レッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ及びザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇそれぞれの投与群に比べても有意な骨粗鬆症の改善効果が認められた。従って、本発明による比率のザクロ抽出物とレッドクローバー抽出物との複合物は、骨粗鬆症改善効果を相乗的に増加させることが観察された。
【０１７５】
［２．ザクロ抽出物とレッドクローバー抽出物との複合比率設定に関する研究］
（実施例２−１．実験動物及び実験方法）
（１）実験動物
処女雌Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（６週齢）を入手して、偽手術対照群を除いたすべての実験動物を無作為に選定し、両側の卵巣を完全に切除して更年期を誘発した。一方、偽手術群では同じ方法で両側の卵巣を確認した後、切除せずに腹腔を閉じた。すべての実験動物は手術２８日後、体重（ＯＶＸラット：３１２．２１±１２．３ｇ、偽手術ラット：２５５．１２±１２．１１ｇ）を基準に、群当り４匹ずつ設定して実験に用いた。
（２）実験方法
更年期障害に対する効果を抗肥満効果、高脂血症抑制効果及び骨粗鬆症抑制効果の３種の薬理効果に区分して評価した。
【０１７６】
試験物質を滅菌蒸留水に懸濁または溶解させ、５ｍｌ／ｋｇの用量でＯＶＸ２８日後から、毎日１回ずつ５６日間経口投与した。偽手術及びＯＶＸ対照群では実験物質の代わりに媒体である滅菌蒸留水のみを同じ用量で同期間経口投与した。
【０１７７】
体重の変化は、ＯＶＸ手術日、投与１日前（ＯＶＸ２７日後）、最初投与日、及び最終犠牲日に測定して記録した。高脂血症抑制効果は最終犠牲日に血液を採取して血中ＴＣを測定し、骨粗鬆症改善効果は大腿骨のＢＭＤ測定を通じて確認した。
【０１７８】
（実施例２−２．ザクロ抽出物とレッドクローバー抽出物との複合比率設定によるエストロゲン活性結果）
レッドクローバー抽出物とザクロ抽出物との複合物の更年期誘導モデルにおける更年期症状改善効果の相乗効果を確認するため、レッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇの摂取量にザクロ抽出物を配合した後、更年期誘導動物モデルにおける抗肥満効果、高脂血症抑制効果及び骨粗鬆症抑制効果を通じてザクロ抽出物の添加による更年期症状改善相乗効果を測定した。
【０１７９】
その結果、ＯＶＸによる更年期誘導モデルにおけるレッドクローバー抽出物（ＲＣ）４０ｍｇ／ｋｇとザクロ抽出物（ＰＣＰ）との複合物の８週間経口投与による更年期症状改善度を確認した。
【０１８０】
ＯＶＸによる更年期誘導モデルでは、体重が約１４６ｇ増加することが確認され、レッドクローバー単独処理群と比べてザクロ抽出物１０ｍｇ／ｋｇ以上を複合処方した場合で改善が確認され、ザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ以上では有意な改善が確認されたが、ザクロ抽出物４０ｍｇ／ｋｇ以上の配合では用量依存的な改善が確認できなかった。
【０１８１】
ＢＭＤの変化でも体重の変化と同様に、２０ｍｇ／ｋｇ以上で有意な改善が確認されたが、用量依存的な改善は確認できなかった。
【０１８２】
血中ＴＣの測定結果、１０ｍｇ／ｋｇで有意な改善が確認されたが、８０ｍｇ／ｋｇ〜１６０ｍｇ／ｋｇでは用量依存的変化は確認されなかった。
【０１８３】
このような結果から、レッドクローバー抽出物（ＲＣ）の単独投与より、ザクロ抽出物（ＰＣＰ）との複合投与によって更年期誘導モデルで有意な改善が確認され、最適な投与濃度は１０〜８０ｍｇ／ｋｇで用量依存的な結果が得られた。
【０１８４】
したがって、レッドクローバー抽出物（ＲＣ）とザクロ抽出物（ＰＣＰ）との複合物製造時の配合は、レッドクローバー抽出物４０〜８０ｍｇ／ｋｇにザクロ抽出物１０〜８０ｍｇ／ｋｇを添加する場合に相乗効果を得ることができる。
【０１８５】
［３．ザクロ抽出物とレッドクローバー抽出物との複合比率設定による相乗効果の確認］
（実施例３−１．実験動物及び実験方法）
（１）実験動物
処女雌ｄｄＹマウス（６週齢、紀和実験動物研究所、和歌山、日本）を使用した。本実験において、すべての実験動物は大邱漢医大学実験動物倫理委員会の動物倫理基準に従って取り扱い、事前承認下で実験を施した［Ａｐｐｒｏｖａｌ Ｎｏ．ＤＨＵ２０１４−０２０］。
（２）実験方法
群分離（総１４ヶ群；群当り８匹）して実験した（表１５、図１８）。
【０１８６】
すなわち、偽手術後滅菌蒸留水１０ｍｌ／ｋｇ投与媒体対照群（以下、偽手術対照群）、ＯＶＸ手術後滅菌蒸留水１０ｍｌ／ｋｇ投与媒体対照群（以下、ＯＶＸ対照群）、ＯＶＸ手術後ザクロ抽出物単独組成物１２０ｍｇ／ｋｇ投与群（ＰＣＰ）、及びＯＶＸ手術後９種のレッドクローバー：ザクロ抽出物複合組成物（ｇ／ｇ）投与群であって、ＯＶＸ手術後レッドクローバー：ザクロ抽出物の１：１（ｇ／ｇ）複合組成物１２０ｍｇ／ｋｇ投与群（１−１）、ＯＶＸ手術後レッドクローバー：ザクロ抽出物の１：２（ｇ／ｇ）複合組成物１２０ｍｇ／ｋｇ投与群（１−２）、ＯＶＸ手術後レッドクローバー：ザクロ抽出物の１：４（ｇ／ｇ）複合組成物１２０ｍｇ／ｋｇ投与群（１−４）、ＯＶＸ手術後レッドクローバー：ザクロ抽出物の１：６（ｇ／ｇ）複合組成物１２０ｍｇ／ｋｇ投与群（１−６）、ＯＶＸ手術後レッドクローバー：ザクロ抽出物の１：８（ｇ／ｇ）複合組成物１２０ｍｇ／ｋｇ投与群（１−８）、ＯＶＸ手術後レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合組成物１２０ｍｇ／ｋｇ投与群（２−１）、ＯＶＸ手術後レッドクローバー：ザクロ抽出物の４：１（ｇ／ｇ）複合組成物１２０ｍｇ／ｋｇ投与群（４−１）、ＯＶＸ手術後レッドクローバー：ザクロ抽出物の６：１（ｇ／ｇ）複合組成物１２０ｍｇ／ｋｇ投与群（６−１）、ＯＶＸ手術後レッドクローバー：ザクロ抽出物の８：１（ｇ／ｇ）複合組成物１２０ｍｇ／ｋｇ投与群（８−１）に分離して実験した。
【０１８７】
適正量のレッドクローバー抽出物またはザクロ抽出物を滅菌蒸留水に懸濁または溶解させ、１０ｍｌ／ｋｇの用量でＯＶＸ２８日後から、毎日１回ずつ８４日間経口投与した。すなわち、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物、レッドクローバー：ザクロ抽出物の１：１、１：２、１：４、１：６、１：８、２：１、４：１、６：１及び８：１（ｇ／ｇ）複合物１２０ｍｇ／ｋｇをそれぞれ８４日間経口投与し、偽手術対照群及びＯＶＸ対照群では実験物質の代わりに媒体である滅菌蒸留水のみを同じ用量で同期間経口投与し、従来研究者の方法［Ｃｈｉｂａ ｅｔ ａｌ．、２００３；Ｍｕｒａｋａｍｉ
ｅｔ ａｌ．、２００７；Ｔｏｕｓｅｎ ｅｔ ａｌ．、２０１１］に従って、０．０３μｇの１７β‐エストラジオール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓｅ、ＭＯ、ＵＳＡ）を０．２ｍｌの滅菌生理食塩水に溶解させて、０．２ｍｌ／マウスの用量（０．０３μｇ／頭／日）でＯＶＸ手術２８日後から毎日１回ずつ８４日間背中の肌に皮下投与した（表１５、図１８）。複合組成物の投与用量は、マウスの体表面積を考慮してヒト臨床用量６００ｍｇの１２倍、すなわち、（６００ｍｇ／６０ｋｇ）×１２＝１２０ｍｇ／ｋｇに選定し、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物の用量も直接的な薬効の比較評価のため１２０ｍｇ／ｋｇにそれぞれ選定した。
【０１８８】
【表１５】
2018135395.tif 000016
【０１８９】
ＯＶＸ＝両側卵巣摘出術
ＰＣＰ＝ザクロ抽出物
ＲＣ＝レッドクローバー乾燥抽出物
ＲＣ：ＰＣＰ＝ＲＣとＰＣＰとで構成された混合剤形（ｇ／ｇ）
ＯＶＸによる更年期障害誘発のため、下記のように実験した。
【０１９０】
すなわち、偽手術対照群を除いたすべての実験動物を無作為に選定し、両側の卵巣を完全に切除してエストロゲン不足更年期障害を誘発した。一方、偽手術群では同じ方法で両側の卵巣を確認した後、切除せずに腹腔を閉じた。偽手術群を含むすべての実験動物は手術２７日後、体重（ＯＶＸマウス：３０．７１±１．６５ｇ、２８．０〜３５．１ｇ；偽手術マウス：２６．９９±１．４６ｇ、２４．４〜２８．７ｇ）を基準に、群当り８匹ずつ選定して実験に用いた。
【０１９１】
更年期障害に対する効果をエストロゲン様効果、抗肥満効果、高脂血症抑制効果、脂肪肝に対する保護効果及び骨粗鬆症抑制効果の５種の薬理効果に区分して評価し、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物のそれぞれと比べて、同時に統計学的に有意な（ｐ＜０．０１又はｐ＜０．０５）薬効相乗を示す複合組成物を、相乗効果を奏するレッドクローバー：ザクロ抽出物複合組成物として最適な複合組成の比率を確認した。
【０１９２】
より具体的に、抗肥満及びエストロゲン様効果は次のように実験した。ＯＶＸ手術日、投与１日前（ＯＶＸ２７日後）、最初投与日、投与１日目から最小週１回ずつ最終犠牲日までの体重をそれぞれ記録し、ＯＶＸ後の回復期（更年期障害誘発期）及び投与開始後１２週間の体重変化量、すなわち増体量を測定した。飼料摂取量（投与開始後１、３、７、２８、５６及び８３日目）、血清中エストラジオールの含量、体脂肪及び腹部脂肪量、蓄積腹部脂肪及び子宮の重量、子宮及び蓄積腹部脂肪の組織病理学的変化（蓄積腹部脂肪の厚さ及び平均脂肪細胞直径、子宮全体、上皮及び粘膜の厚さ、粘膜内子宮腺が占める比率の変化（図１９））を観察した。
【０１９３】
また、脂肪肝に対する保護効果を確認するため、次のように実験した。肝重量、血清中ＡＳＴ及びＡＬＴの含量、肝の組織病理学的変化（平均肝細胞直径及び脂肪変化を示す肝変性部位の変化）を観察した。
【０１９４】
高脂血症抑制効果は、血中ＴＣ、ＬＤＬ、ＨＤＬ及びＴＧ含量の変化を通じて確認した。
【０１９５】
骨粗鬆症改善効果は、大腿骨の湿重量、乾重量及び炭化重量、ＢＭＤ（図２０）、骨強度（図２１）、血中オステオカルシン及びｂＡＬＰの含量、骨量及び構造（柱骨量、柱骨数、厚さ、長さ、皮質骨の厚さ）、骨吸収（破骨細胞数及び破骨細胞面積（ＯＳ／ＢＳ））に対する組織病理学的変化を通じて確認した。
【０１９６】
（実施例３−２．体重及び増体量の変化）
ＯＶＸ手術２８日後、偽手術対照群に比べて体重の増加が顕著な実験動物のみを選定して使用したため（ＯＶＸマウス：３０．７１±１．６５ｇ、２８．０〜３５．１ｇ；偽手術マウス：２６．９９±１．４６ｇ、２４．４〜２８．７ｇ）、偽手術対照群に比べて有意な（ｐ＜０．０１）体重及びＯＶＸ後誘発期である４週間の増体量の増加が全体ＯＶＸ手術群で認められたが、エストラジオール、ザクロ抽出物及びレッドクローバー抽出物の単独組成物投与群では投与開始後１４、２１及び２８日目からＯＶＸ対照群に比べて有意な（ｐ＜０．０１又はｐ＜０．０５）体重の減少が認められ始め、全９種のレッドクローバー：ザクロ抽出物複合物投与群でも投与開始後１４、２１または２８日目からそれぞれＯＶＸ対照群に比べて有意な（ｐ＜０．０１又はｐ＜０．０５）体重の減少が認められ始め、すべての実験物質投与群ではＯＶＸ対照群に比べて有意な（ｐ＜０．０１又はｐ＜０．０５）、投与期間である８４日間の増体量の減少も認められた。特に、レッドクローバー：ザクロ抽出物の１：１、２：１及び４：１複合物投与群では、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物投与群のそれぞれに比べても有意な（ｐ＜０．０１又はｐ＜０．０５）体重の減少が投与開始後２８、４２及び４９日目から認められ始め、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物投与群のそれぞれに比べて有意な（ｐ＜０．０１）投与期間中の増体量の減少がレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１、１：１及び４：１複合物投与群の順に認められた（表１６、図２２）。
【０１９７】
ＯＶＸ対照群の場合、偽手術対照群に比べて投与期間中の増体量が３５１．５４％の変化を示し、エストラジオール、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物、レッドクローバー：ザクロ抽出物の１：１、１：２、１：４、１：６、１：８、２：１、４：１、６：１及び８：１（ｇ／ｇ）複合組成物投与群では、ＯＶＸ対照群に比べてそれぞれ−５２．５６、−４４．４６、−４１．９１、−６７．７２、−５４．５１、−５１．２８、−５３．３３、−５２．３０、−７４．１９、−６４．４０、−４８．８９及び−４４．５５％の変化を示した。
【０１９８】
【表１６】
2018135395.tif 000017
【０１９９】
値はマウス８個体の平均±標準偏差で示した。
＊すべての動物は夜間に絶食した。
ａ（ｐ＜０．０１）：ＬＳＤテストによって偽手術対照群と比較
ｂ（ｐ＜０．０１）：ＬＳＤテストによってＯＶＸ対照群と比較
ｃ（ｐ＜０．０１）及びｄ（ｐ＜０．０５）：ＬＳＤテストによってレッドクローバー抽出物投与群と比較
ｅ（ｐ＜０．０１）：ＬＳＤテストによってザクロ抽出物投与群と比較
ｆ（ｐ＜０．０１）：ＭＷテストによって偽手術対照群と比較
ｇ（ｐ＜０．０１）及びｈ（ｐ＜０．０５）：ＭＷテストによってＯＶＸ対照群と比較
ｉ（ｐ＜０．０１）：ＭＷテストによってレッドクローバー抽出物投与群と比較
ｊ（ｐ＜０．０１）：ＭＷテストによってザクロ抽出物投与群と比較
ＲＣ：ＰＣＰ＝レッドクローバー抽出物とザクロ抽出物との配合物（ｇ／ｇ）。
【０２００】
（実施例３−３．飼料摂取量の変化）
ＯＶＸ対照群では、偽手術対照群に比べて有意な（ｐ＜０．０１）飼料摂取量の増加が投与１日目から８３日目まですべての測定日でそれぞれ認められ、ＯＶＸ対照群と比べて有意な（ｐ＜０．０１又はｐ＜０．０５）飼料摂取量の減少がエストラジオール投与群に限って投与開始後７日目から認められ始めた以外は、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物、９種のレッドクローバー：ザクロ抽出物（ｇ／ｇ）複合組成物投与群で、ＯＶＸ対照群と比べて有意な飼料摂取量の変化は認められず、全９種のレッドクローバー：ザクロ抽出物（ｇ／ｇ）複合組成物投与群でも、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物投与群のそれぞれと比べて、有意な飼料摂取量の変化が認められなかった（表１７）。
【０２０１】
ＯＶＸ対照群の場合、偽手術対照群に比べて投与開始後１、３、７、２８、５６及び８３日目の飼料摂取量がそれぞれ５８．３７、７５．１２、７９．４２、７２．７１、７５．０６及び９５．６９％の変化を示し、エストラジオール、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物、レッドクローバー：ザクロ抽出物の１：１、１：２、１：４、１：６、１：８、２：１、４：１、６：１及び８：１（ｇ／ｇ）複合組成物投与群では、ＯＶＸ対照群に比べてそれぞれ０．８７、−１．２１、４．５２、０．５９、−２．７８、−１．３４、−０．９３、１．９６、２．３６、０．２２、０．７０及び−０．４６％の飼料摂取量の変化を投与１日目に示し、−５．２４、−０．９２、２．２２、−１．１９、−１．４１、２．０２、１．４２、０．４８、１．２３、１．２５、−１．５２及び０．１５％の変化を投与開始後３日目に、−１３．０４、−２．０４、２．０５、−１．４４、０．３７、２．５１、０．６６、０．７０、−２．２７、０．９１、−０．２２及び０．６８％の変化を投与開始後７日目に、−１６．３４、−２．３５、−１．００、−０．７９、−１．７３、４．０５、０．２５、０．４８、−０．５６、−０．３４、２．５２及び０．７４％の変化を投与開始後２８日目に、−２０．０１、−１．１２、−０．５９、−２．８６、１．８９、−２．７６、−１．３５、１．１９、−０．７５、−０．３０、−２．７３及び０．４６％の変化を投与開始後５６日目に、−２７．８２、−１．０１、−０．５７、−１．５７、０．２４、−２．６４、−４．０１、−０．７１、−１．０８、０．５４、−０．８５及び０．９５％の変化を投与開始後８３日目にそれぞれ示した。
【０２０２】
【表１７】
2018135395.tif 000018
【０２０３】
値はマウス８個体の平均±標準偏差で示した。
ａ（ｐ＜０．０１）：ＬＳＤテストによって偽手術対照群と比較
ｂ（ｐ＜０．０１）及びｃ（ｐ＜０．０５）：ＬＳＤテストによってＯＶＸ対照群と比較ｄ（ｐ＜０．０１）：ＭＷテストによって偽手術対照群と比較
ｅ（ｐ＜０．０１）：ＭＷテストによってＯＶＸ対照群と比較
（実施例３−４．蓄積腹部脂肪重量の変化）
ＯＶＸ対照群では、偽手術対照群に比べて有意な（ｐ＜０．０１）蓄積腹部脂肪の絶対重量及び体重に対する相対重量の増加がそれぞれ認められたが、エストラジオールを含むすべての投与群では、ＯＶＸ対照群に比べて有意な（ｐ＜０．０１）腹部脂肪重量の減少がそれぞれ認められ、特にレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１、１：１及び４：１（ｇ／ｇ）複合物投与群の順に、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物投与群のそれぞれに比べても有意な（ｐ＜０．０１又はｐ＜０．０５）腹部脂肪重量の減少が認められた（表１８、図２３）。
【０２０４】
ＯＶＸ対照群の場合、偽手術対照群に比べて蓄積腹部脂肪の絶対重量が２３７５．４８％の変化を示し、エストラジオール、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物、レッドクローバー：ザクロ抽出物の１：１、１：２、１：４、１：６、１：８、２：１、４：１、６：１及び８：１（ｇ／ｇ）複合組成物投与群では、ＯＶＸ対照群に比べてそれぞれ−８２．２０、−５０．３８、−４５．２３、−７３．２９、−４９．８６、−５４．４８、−４５．２７、−４８．５６、−８０．９３、−７０．８９、−５２．７２及び−４９．２８％の変化を示した。
【０２０５】
ＯＶＸ対照群の場合、偽手術対照群に比べて蓄積腹部脂肪の体重に対する相対重量が１４９１．５９％の変化を示し、エストラジオール、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物、レッドクローバー：ザクロ抽出物の１：１、１：２、１：４、１：６、１：８、２：１、４：１、６：１及び８：１（ｇ／ｇ）複合組成物投与群では、ＯＶＸ対照群に比べてそれぞれ−７８．８６、−４１．７６、−３６．５６、−６５．５１、−３９．４８、−４５．６４、−３４．５６、−３８．４６、−７４．７３、−６２．８３、−４２．６８及び−３８．７５％の変化を示した。
【０２０６】
（実施例３−５．子宮重量の変化）
ＯＶＸ対照群では、偽手術対照群に比べて有意な（ｐ＜０．０１）子宮の絶対重量及び体重に対する相対重量の減少がそれぞれ認められたが、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物を含むすべての実験物質投与群では、ＯＶＸ対照群に比べて有意な（ｐ＜０．０１）子宮重量の増加がそれぞれ認められた。特に、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１、１：１及び４：１（ｇ／ｇ）複合物投与群の順に、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物投与群のそれぞれに比べても有意な（ｐ＜０．０１）子宮重量の増加が認められた（表１８、図２４）。
【０２０７】
ＯＶＸ対照群の場合、偽手術対照群に比べて子宮の絶対重量が−８８．５７％の変化を示し、エストラジオール、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物、レッドクローバー：ザクロ抽出物の１：１、１：２、１：４、１：６、１：８、２：１、４：１、６：１及び８：１（ｇ／ｇ）複合組成物投与群では、ＯＶＸ対照群に比べてそれぞれ２８８．６４、４７．７３、４５．００、９０．４５、５０．００、４２．７３、４５．４５、４４．５５、１２５．００、９０．００、７１．８２及び５２．７３％の変化を示した。
【０２０８】
ＯＶＸ対照群の場合、偽手術対照群に比べて子宮の体重に対する相対重量が−９２．５３％の変化を示し、エストラジオール、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物、レッドクローバー：ザクロ抽出物の１：１、１：２、１：４、１：６、１：８、２：１、４：１、６：１及び８：１（ｇ／ｇ）複合組成物投与群では、ＯＶＸ対照群に比べてそれぞれ３７２．５６、７４．５７、６７．５１、１４５．５５、８４．０３、７２．７６、７６．９７、７３．４８、２００．６４、１４２．４６、１０９．４３及び８０．９５％の変化を示した。
【０２０９】
（実施例３−６．肝重量の変化）
ＯＶＸ対照群では、偽手術対照群に比べて有意な（ｐ＜０．０１）体重に対する肝の相対重量の減少が認められたが、全９種のレッドクローバー：ザクロ抽出物複合組成物投与群を含むすべての候補物質投与群では、ＯＶＸ対照群に比べて有意な（ｐ＜０．０１又はｐ＜０．０５）肝の相対重量の増加がそれぞれ認められた。特に、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１、１：１及び４：１（ｇ／ｇ）複合物投与群の順に、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物投与群のそれぞれに比べても有意な（ｐ＜０．０１又はｐ＜０．０５）肝の相対重量の増加が認められた。一方、偽手術対照群と比べて有意な肝の絶対重量の変化はすべてのＯＶＸ対照群で認められず、エストラジオール、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物、９種のレッドクローバー：ザクロ抽出物複合組成物投与群でも、ＯＶＸ対照群に比べて有意な肝の絶対重量の変化が認められなかった（表１８）。
【０２１０】
ＯＶＸ対照群の場合、偽手術対照群に比べて肝の絶対重量が４．２８％の変化を示し、エストラジオール、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物、レッドクローバー：ザクロ抽出物の１：１、１：２、１：４、１：６、１：８、２：１、４：１、６：１及び８：１（ｇ／ｇ）複合組成物投与群では、ＯＶＸ対照群に比べてそれぞれ５．３７、３．３４、４．９５、１０．２９、−１．８０、−０．２４、−１．１０、１．４９、１２．２８、１１．７１、１．６６及び０．５４％の変化を示した。
【０２１１】
ＯＶＸ対照群の場合、偽手術対照群に比べて肝の体重に対する相対重量が−３１．７５％の変化を示し、エストラジオール、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物、レッドクローバー：ザクロ抽出物の１：１、１：２、１：４、１：６、１：８、２：１、４：１、６：１及び８：１（ｇ／ｇ）複合組成物投与群では、ＯＶＸ対照群に比べてそれぞれ２７．１６、２１．９６、２１．２８、４２．２６、１９．７９、２１．１８、１９．７３、２２．５７、４９．９９、４２．５４、２３．１１及び１８．０１％の変化を示した。
【０２１２】
【表１８】
2018135395.tif 000019
【０２１３】
値はマウス８個体の平均±標準偏差で示した。
ａ（ｐ＜０．０１）及びｂ（ｐ＜０．０５）：ＭＷテストによって偽手術対照群と比較
ｃ（ｐ＜０．０１）及びｄ（ｐ＜０．０５）：ＭＷテストによってＯＶＸ対照群と比較
ｅ（ｐ＜０．０１）及びｆ（ｐ＜０．０５）：ＭＷテストによってレッドクローバー抽出物単独投与群と比較
ｇ（ｐ＜０．０１）及びｈ（ｐ＜０．０５）：ＭＷテストによってザクロ抽出物単独投与群と比較
（実施例３−７．大腿骨重量の変化）
ＯＶＸ対照群では、偽手術対照群に比べて有意な（ｐ＜０．０１）体重に対する大腿骨の相対湿重量の減少とともに、乾燥及び炭化骨の絶対及び相対重量の減少が認められたが、エストラジオールを含むすべての実験物質投与群では、ＯＶＸ対照群に比べて著しい大腿骨重量の増加がそれぞれ認められた。特に、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１、１：１及び４：１（ｇ／ｇ）複合物投与群の順に、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物投与群のそれぞれに比べても有意な（ｐ＜０．０１又はｐ＜０．０５）大腿骨の相対湿重量の増加、そして乾燥及び炭化骨の絶対及び相対重量の増加が認められた（表１９）。
【０２１４】
ＯＶＸ対照群の場合、偽手術対照群に比べて大腿骨絶対湿重量及び体重に対する相対湿重量がそれぞれ−４．１９及び−３７．６８％の変化を示し、エストラジオール、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物、レッドクローバー：ザクロ抽出物の１：１、１：２、１：４、１：６、１：８、２：１、４：１、６：１及び８：１（ｇ／ｇ）複合組成物投与群では、ＯＶＸ対照群に比べてそれぞれ５．７９、１．２７、２．６８、３．６７、０．８５、０．５６、２．８２、−０．７１、４．９４、３．３９、０．５６及び０．５８％の絶対湿重量の変化を示し、それぞれ２７．７５、１９．３０、１８．３５、３３．９０、２３．１１、２１．４８、２３．９７、１９．４７、３９．９１、３１．８７、２１．５０及び１８．５４％の相対湿重量の変化を示した。
【０２１５】
ＯＶＸ対照群の場合、偽手術対照群に比べて大腿骨絶対乾燥重量及び体重に対する相対乾燥重量がそれぞれ−２１．６４及び−４９．０５％の変化を示し、エストラジオール、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物、レッドクローバー：ザクロ抽出物の１：１、１：２、１：４、１：６、１：８、２：１、４：１、６：１及び８：１（ｇ／ｇ）複合組成物投与群では、ＯＶＸ対照群に比べてそれぞれ１４．９３、８．９６、８．４６、１７．１６、１０．７０、１０．４５、１２．６９、９．７０、２０．６５、１６．９２、１０．７０及び９．９５％の絶対乾燥重量の変化を示し、それぞれ３８．２２、２８．１８、２４．７０、５０．７５、３５．１３、３３．１４、３５．４３、３１．６９、６０．６５、４８．８３、３３．２９及び２９．００％の相対乾燥重量の変化を示した。
【０２１６】
ＯＶＸ対照群の場合、偽手術対照群に比べて大腿骨絶対炭化重量及び体重に対する相対炭化重量がそれぞれ−３４．７４及び−５７．７７％の変化を示し、エストラジオール、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物、レッドクローバー：ザクロ抽出物の１：１、１：２、１：４、１：６、１：８、２：１、４：１、６：１及び８：１（ｇ／ｇ）複合組成物投与群では、ＯＶＸ対照群に比べてそれぞれ３０．３５、２１．３９、１９．４０、３８．８１、２３．８８、２５．８７、２３．８８、２２．３９、５１．２４、３６．３２、２４．３８及び２１．３９％の絶対炭化重量の変化を示し、それぞれ５７．０３、４３．３５、３７．５３、７９．４４、５１．０３、５２．７４、４９．８０、４７．４０、１０２．３３、７４．１１、５０．５６及び４３．５７％の相対炭化重量の変化を示した。
【０２１７】
【表１９】
2018135395.tif 000020
【０２１８】
値はマウス８個体の平均±標準偏差で示した。
ａ（ｐ＜０．０１）及びｂ（ｐ＜０．０５）：ＬＳＤテストによって偽手術対照群と比較ｃ（ｐ＜０．０１）：ＬＳＤテストによってＯＶＸ対照群と比較
ｄ（ｐ＜０．０１）及びｅ（ｐ＜０．０５）：ＬＳＤテストによってレッドクローバー抽出物単独投与群と比較
ｆ（ｐ＜０．０１）：ＬＳＤテストによってザクロ抽出物単独投与群と比較
ｇ（ｐ＜０．０１）及びｈ（ｐ＜０．０５）：ＭＷテストによって偽手術対照群と比較
ｉ（ｐ＜０．０１）及びｊ（ｐ＜０．０５）：ＭＷテストによってＯＶＸ対照群と比較
ｋ（ｐ＜０．０１）及びｌ（ｐ＜０．０５）：ＭＷテストによってレッドクローバー抽出物単独投与群と比較
ｍ（ｐ＜０．０１）及びｎ（ｐ＜０．０５）：ＭＷテストによってザクロ抽出物単独投与群と比較
（実施例３−８．血液の生化学的変化（１）：ＡＳＴ、ＡＬＴ、ＴＣ、ＬＤＬ、ＨＤＬ及びＴＧ）
ＯＶＸ対照群では、偽手術対照群に比べて有意な（ｐ＜０．０１）血中ＡＳＴ、ＡＬＴ、ＴＣ、ＬＤＬ及びＴＧ含量の増加が、有意な（ｐ＜０．０１）ＨＤＬ含量の減少とともに認められたが、レッドクローバー抽出物単独組成物を含むすべての実験物質投与群では、ＯＶＸ対照群に比べて有意な（ｐ＜０．０１）血中ＡＳＴ、ＡＬＴ、ＴＣ、ＬＤＬ及びＴＧ含量の減少が認められ、血中ＨＤＬ含量の有意な（ｐ＜０．０１）増加がそれぞれ認められた。特に、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１、１：１及び４：１（ｇ／ｇ）複合物投与群の順に、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物投与群のそれぞれに比べても有意な（ｐ＜０．０１又はｐ＜０．０５）血中ＡＳＴ、ＡＬＴ、ＴＣ、ＬＤＬ及びＴＧ含量の減少とともに血中ＨＤＬ含量の増加が認められた（表２０）。
【０２１９】
ＯＶＸ対照群の場合、偽手術対照群に比べて血中ＡＳＴ及びＡＬＴ含量がそれぞれ９２．３０及び１００．６６％の変化を示し、エストラジオール、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物、レッドクローバー：ザクロ抽出物の１：１、１：２、１：４、１：６、１：８、２：１、４：１、６：１及び８：１（ｇ／ｇ）複合組成物投与群では、ＯＶＸ対照群に比べてそれぞれ−３３．９８、−１３．９４、−１２．５６、−２６．７３、−１４．１０、−１３．７１、−１２．２５、−１２．１７、−３２．６７、−２５．９６、−１６．２６及び−１３．１０％の血中ＡＳＴ含量の変化を示し、それぞれ−３１．５８、−１７．１１、−１６．２８、−３１．７４、−１６．７８、−１９．０８、−１８．８２、−１７．６０、−３７．１７、−３０．４３、−１９．７４及び−１８．２６％の血中ＡＳＴ含量の変化を示した。
【０２２０】
ＯＶＸ対照群の場合、偽手術対照群に比べて血中ＴＣ及びＬＤＬ含量がそれぞれ１００．００及び１８９．２６％の変化を示し、エストラジオール、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物、レッドクローバー：ザクロ抽出物の１：１、１：２、１：４、１：６、１：８、２：１、４：１、６：１及び８：１（ｇ／ｇ）複合組成物投与群では、ＯＶＸ対照群に比べてそれぞれ−２５．９４、−２０．０１、−１７．８５、−２８．８７、−２０．６４、−１９．９４、−１８．２７、−１７．５０、−３６．３３、−２６．８５、−２１．２７及び−１９．４６％の血中ＴＣ含量の変化を示し、それぞれ−２６．８７、−１４．９８、−１１．９６、−２６．８７、−１４．５７、−１３．４０、−１２．９２、−１２．０３、−３６．４９、−２３．７１、−１５．４０及び−１５．０５％の血中ＬＤＬ含量の変化を示した。
ＯＶＸ対照群の場合、偽手術対照群に比べて血中ＨＤＬ及びＴＧ含量がそれぞれ−５０．４５及び３０５．７４％の変化を示し、エストラジオール、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物、レッドクローバー：ザクロ抽出物の１：１、１：２、１：４、１：６、１：８、２：１、４：１、６：１及び８：１（ｇ／ｇ）複合組成物投与群では、ＯＶＸ対照群に比べてそれぞれ５２．０９、３７．１７、３３．２５、６０．９９、３６．９１、３２．９８、３４．５５、３４．０３、８７．７０、５９．４２、３９．２７及び３４．２９％の血中ＨＤＬ含量の変化を示し、それぞれ−３４．８０、−１７．９９、−１７．０７、−３１．５６、−１９．４８、−１８．９８、−１８．４８、−１７．７４、−４３．５５、−２８．５６、−１８．６５及び−１８．２３％の血中ＴＧ含量の変化を示した。
【０２２１】
【表２０】
2018135395.tif 000021
【０２２２】
値はマウス８個体の平均±標準偏差で示した。
ａ（ｐ＜０．０１）及びｂ（ｐ＜０．０５）：ＬＳＤテストによって偽手術対照群と比較ｃ（ｐ＜０．０１）：ＬＳＤテストによってＯＶＸ対照群と比較
ｄ（ｐ＜０．０１）及びｅ（ｐ＜０．０５）：ＬＳＤテストによってレッドクローバー抽出物単独投与群と比較
ｆ（ｐ＜０．０１）及びｇ（ｐ＜０．０５）：ＬＳＤテストによってザクロ抽出物単独投与群と比較
（実施例３−９．血液の生化学的変化（２）：エストラジオール）
ＯＶＸ対照群では、偽手術対照群に比べて有意な（ｐ＜０．０１）血中エストラジオール含量の減少が認められたが、ザクロ抽出物の単独組成物を含むすべての実験物質投与群では、ＯＶＸ対照群に比べて有意な（ｐ＜０．０１）血中エストラジオール含量の増加がそれぞれ認められた。特に、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１、１：１及び４：１（ｇ／ｇ）複合物投与群の順に、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物投与群のそれぞれに比べても有意な（ｐ＜０．０１）血中エストラジオール含量の増加が認められた（図２５）。
【０２２３】
ＯＶＸ対照群の場合、偽手術対照群に比べて血中エストラジオール含量が−７２．４６％の変化を示し、エストラジオール、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物、レッドクローバー：ザクロ抽出物の１：１、１：２、１：４、１：６、１：８、２：１、４：１、６：１及び８：１（ｇ／ｇ）複合組成物投与群では、ＯＶＸ対照群に比べてそれぞれ１８５．６９、３７．１４、３０．６２、８４．７８、３７．８６、３６．２３、３５．８７、３１．３４、１１６．３０、８３．７０、４９．６４及び４４．０２％の変化を示した。
【０２２４】
（実施例３−１０．血液の生化学的変化（３）：オステオカルシン及びｂＡＬＰ）
ＯＶＸ対照群では、偽手術対照群に比べて有意な（ｐ＜０．０１）血中オステオカルシン含量の増加とともに有意な（ｐ＜０．０１）ｂＡＬＰ含量の減少が認められたが、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物を含むすべての候補物質投与群では、ＯＶＸ対照群に比べて有意な（ｐ＜０．０１又はｐ＜０．０５）血中オステオカルシン含量の減少が、血中ｂＡＬＰ含量の増加とともにそれぞれ認められた。特に、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１、１：１及び４：１（ｇ／ｇ）複合物投与群の順に、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物投与群のそれぞれに比べても有意な（ｐ＜０．０１）血中オステオカルシン含量の減少及び血中ｂＡＬＰ含量の増加が認められた（図２６、２７）。
【０２２５】
ＯＶＸ対照群の場合、偽手術対照群に比べて血中オステオカルシン及びｂＡＬＰ含量がそれぞれ７７．１１及び−４２．３５％の変化を示し、エストラジオール、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物、レッドクローバー：ザクロ抽出物の１：１、１：２、１：４、１：６、１：８、２：１、４：１、６：１及び８：１（ｇ／ｇ）複合組成物投与群では、ＯＶＸ対照群に比べてそれぞれ−３１．９５、−１８．８０、−１７．２０、−３１．４３、−１９．５４、−１９．３５、−１７．２７、−１６．８３、−３４．２９、−３０．０５、−２０．６２及び−１８．３９％の血中オステオカルシン含量の変化を示し、それぞれ３９．７２、２２．０４、１７．０４、３６．３２、２２．８７、１９．１７、１８．９２、１７．３１、４９．６７、３４．３８、２４．８４及び２２．８４％の血中ｂＡＬＰ含量の変化を示した。
【０２２６】
（実施例３−１１．骨密度の変化）
ＯＶＸ対照群では、偽手術対照群に比べて平均全身骨密度及び大腿骨全体骨密度がそれぞれ有意に（ｐ＜０．０１）減少した一方、全９種のレッドクローバー：ザクロ抽出物複合組成物を含むすべての実験物質投与群では、ＯＶＸ対照群に比べて全身骨密度及び大腿骨全体骨密度の有意な（ｐ＜０．０１）増加がそれぞれ認められた。特に、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１、１：１及び４：１（ｇ／ｇ）複合物投与群の順に、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物投与群のそれぞれに比べても有意な（ｐ＜０．０１）平均全身骨密度及び大腿骨全体骨密度の増加が認められた（表２１、図２８及び２９）。
【０２２７】
ＯＶＸ対照群の場合、偽手術対照群に比べて平均全身骨密度が−１２．７５％の変化を示し、エストラジオール、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物、レッドクローバー：ザクロ抽出物の１：１、１：２、１：４、１：６、１：８、２：１、４：１、６：１及び８：１（ｇ／ｇ）複合組成物投与群では、ＯＶＸ対照群に比べてそれぞれ９．８６、４．４１、３．４８、８．００、５．１０、４．２９、４．００、３．７７、１０．８４、７．４２、５．５７及び５．１６％の変化を示した。
【０２２８】
ＯＶＸ対照群の場合、偽手術対照群に比べて大腿骨全体骨密度が−１２．５６％の変化を示し、エストラジオール、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物、レッドクローバー：ザクロ抽出物の１：１、１：２、１：４、１：６、１：８、２：１、４：１、６：１及び８：１（ｇ／ｇ）複合組成物投与群では、ＯＶＸ対照群に比べてそれぞれ１０．７８、５．２３、５．１８、９．２０、６．７３、５．９３、５．６１、５．３９、１１．５３、８．９７、７．４２及び５．０２％の変化を示した。
【０２２９】
（実施例３−１２．体脂肪及び腹部蓄積脂肪量の変化）
ＯＶＸ対照群では、偽手術対照群に比べて有意な（ｐ＜０．０１）体脂肪及び腹部蓄積脂肪量の増加が認められた一方、エストラジオールを含むすべての実験物質投与群では、ＯＶＸ対照群に比べて体脂肪及び腹部蓄積脂肪量の有意な（ｐ＜０．０１）減少がそれぞれ認められた。特に、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１、１：１及び４：１（ｇ／ｇ）複合物投与群の順に、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物投与群のそれぞれに比べても有意な（ｐ＜０．０１又はｐ＜０．０５）体脂肪及び腹部蓄積脂肪量の減少が認められた（表２１）。
【０２３０】
ＯＶＸ対照群の場合、偽手術対照群に比べて体脂肪量が２１３．３４％の変化を示し、エストラジオール、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物、レッドクローバー：ザクロ抽出物の１：１、１：２、１：４、１：６、１：８、２：１、４：１、６：１及び８：１（ｇ／ｇ）複合組成物投与群では、ＯＶＸ対照群に比べてそれぞれ−３３．０２、−１５．２１、−１３．２０、−３１．０６、−２０．１６、−１５．６７、−１４．２４、−１３．９０、−４６．５６、−２７．５８、−１８．２２及び−１５．３２％の変化を示した。
【０２３１】
ＯＶＸ対照群の場合、偽手術対照群に比べて腹部蓄積脂肪量が２７９．１７％の変化を示し、エストラジオール、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物、レッドクローバー：ザクロ抽出物の１：１、１：２、１：４、１：６、１：８、２：１、４：１、６：１及び８：１（ｇ／ｇ）複合組成物投与群では、ＯＶＸ対照群に比べてそれぞれ−３５．００、−１７．２１、−１５．４３、−３５．３０、−１８．６１、−１７．５４、−１６．０７、−１５．４２、−４３．６９、−３２．０８、−１９．５４及び−１７．６６％の変化を示した。
【０２３２】
【表２１】
2018135395.tif 000022
【０２３３】
値はマウス８個体の平均±標準偏差で示した。
ａ（ｐ＜０．０１）及びｂ（ｐ＜０．０５）：ＬＳＤテストによって偽手術対照群と比較ｃ（ｐ＜０．０１）：ＬＳＤテストによってＯＶＸ対照群と比較
ｄ（ｐ＜０．０１）及びｅ（ｐ＜０．０５）：ＬＳＤテストによってレッドクローバー抽出物単独投与群と比較
ｆ（ｐ＜０．０１）及びｇ（ｐ＜０．０５）：ＬＳＤテストによってザクロ抽出物単独投与群と比較
（実施例３−１３．骨強度の変化）
ＯＶＸ対照群では、偽手術対照群に比べて大腿骨中軸部位の骨強度が有意に（ｐ＜０．０１）減少した一方、レッドクローバー抽出物単独組成物を含むすべての候補物質投与群では、ＯＶＸ対照群に比べて有意な（ｐ＜０．０１又はｐ＜０．０５）大腿骨骨強度の増加がそれぞれ認められた。特に、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１、１：１及び４：１（ｇ／ｇ）複合物投与群の順に、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物投与群のそれぞれに比べても有意な（ｐ＜０．０１又はｐ＜０．０５）大腿骨骨強度の増加が認められた（図３０）。
【０２３４】
ＯＶＸ対照群の場合、偽手術対照群に比べて大腿骨中軸部位の骨強度が−５１．６２％変化を示し、エストラジオール、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物、レッドクローバー：ザクロ抽出物の１：１、１：２、１：４、１：６、１：８、２：１、４：１、６：１及び８：１（ｇ／ｇ）複合組成物投与群では、ＯＶＸ対照群に比べてそれぞれ６１．４１、３５．１７、３２．３１、５９．１１、３９．５８、４４．０６、４０．４０、４０．８５、７８．６５、５６．４４、３３．３３及び３２．６１％の変化を示した。
【０２３５】
（実施例３−１４．組織病理学的変化（１）：蓄積腹部脂肪、子宮及び肝）
（１）蓄積腹部脂肪
ＯＶＸ対照群では、偽手術対照群に比べて著しい腹部脂肪の蓄積によって、腹部脂肪パッド厚さ及び脂肪細胞平均直径の有意な（ｐ＜０．０１）増加がそれぞれ認められたが、ザクロ抽出物の単独組成物を含むすべての実験物質投与群では、ＯＶＸ対照群に比べて有意な（ｐ＜０．０１）腹部脂肪パッド厚さ及び脂肪細胞平均直径の減少がそれぞれ認められた。特に、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１、１：１及び４：１（ｇ／ｇ）複合物投与群の順に、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物投与群のそれぞれに比べても有意な（ｐ＜０．０１又はｐ＜０．０５）腹部脂肪パッド厚さ及び脂肪細胞平均直径の減少が認められた（図３１及び３２）。
【０２３６】
ＯＶＸ対照群の場合、偽手術対照群に比べて腹部脂肪パッド厚さが３２９．０４％の変化を示し、エストラジオール、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物、レッドクローバー：ザクロ抽出物の１：１、１：２、１：４、１：６、１：８、２：１、４：１、６：１及び８：１（ｇ／ｇ）複合組成物投与群では、ＯＶＸ対照群に比べてそれぞれ−５２．２３、−２５．９０、−２２．２５、−４０．７２、−２３．９７、−２４．５９、−２４．４５、−２２．７１、−５５．２１、−３８．８３、−２６．５４及び−２５．９８％の変化を示した。
【０２３７】
ＯＶＸ対照群の場合、偽手術対照群に比べて脂肪細胞の平均直径が２７０．６８％の変化を示し、エストラジオール、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物、レッドクローバー：ザクロ抽出物の１：１、１：２、１：４、１：６、１：８、２：１、４：１、６：１及び８：１（ｇ／ｇ）複合組成物投与群では、ＯＶＸ対照群に比べてそれぞれ−４８．０６、−２８．５４、−２５．１４、−５７．２３、−３１．５７、−３１．５０、−２７．７２、−２６．２９、−６３．７０、−５１．６２、−２８．５５及び−２７．２４％の変化を示した。
（２）子宮
ＯＶＸ対照群では、偽手術対照群に比べて著しい子宮粘膜の減少を特徴とする不溶性萎縮が認められ、子宮の全体、上皮及び粘膜の厚さ、そして粘膜内子宮腺が占める比率の有意な（ｐ＜０．０１）減少がそれぞれ認められたが、９種のレッドクローバー：ザクロ抽出物複合組成物を含むすべての候補物質投与群では、ＯＶＸ対照群に比べて有意な（ｐ＜０．０１又はｐ＜０．０５）子宮の全体、上皮及び粘膜の厚さ、粘膜内子宮腺が占める比率の増加がそれぞれ認められ、特にレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１、１：１及び４：１（ｇ／ｇ）複合物投与群の順に、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物投与群のそれぞれに比べても有意な（ｐ＜０．０１又はｐ＜０．０５）子宮の全体、上皮及び粘膜の厚さ、粘膜内子宮腺が占める比率の増加が認められた（表２２、図３３及び３４）。
【０２３８】
子宮の全体及び上皮の平均厚さは、ＯＶＸ対照群では、偽手術対照群に比べてそれぞれ−７３．９９及び−７７．７９％の変化を示し、エストラジオール、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物、レッドクローバー：ザクロ抽出物の１：１、１：２、１：４、１：６、１：８、２：１、４：１、６：１及び８：１（ｇ／ｇ）複合組成物投与群では、ＯＶＸ対照群に比べてそれぞれ１８１．２７、３７．０５、３０．４６、７７．２３、３９．４３、３７．１２、３３．７０、３１．７９、９８．５８、６１．９５、４０．７４及び４０．６４％の子宮全体平均厚さの変化を示し、それぞれ１７０．１７、５１．２９、４４．０４、１３３．７５、７１．３６、６２．１５、６１．７４、４６．０４、２０５．４４、１１９．５８、８３．７８及び５７．７１％の子宮上皮平均厚さの変化を示した。
【０２３９】
子宮粘膜の平均厚さ及び粘膜内子宮腺が占める比率は、ＯＶＸ対照群では、偽手術対照群に比べてそれぞれ−７８．７４及び−７６．９０％の変化を示し、エストラジオール、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物、レッドクローバー：ザクロ抽出物の１：１、１：２、１：４、１：６、１：８、２：１、４：１、６：１及び８：１（ｇ／ｇ）複合組成物投与群では、ＯＶＸ対照群に比べてそれぞれ１９６．０４、４６．０６、３９．４８、１０２．３７、５５．７２、４７．１６、４４．１５、４１．２０、１２５．２９、８４．０８、５３．６３及び５３．００％の子宮粘膜平均厚さの変化を示し、それぞれ１８０．３７、９２．８８、８０．３７、１６４．１４、１０９．４９、９１．６２、８４．４０、８０．８８、１８６．０５、１５９．７６、１１２．６９及び９８．３４％の子宮粘膜内子宮腺が占める比率の変化を示した。
【０２４０】
【表２２】
2018135395.tif 000023
【０２４１】
ａ（ｐ＜０．０１）及びｂ（ｐ＜０．０５）：ＭＷテストによって偽手術対照群と比較
ｃ（ｐ＜０．０１）及びｄ（ｐ＜０．０５）：ＭＷテストによってＯＶＸ対照群と比較
ｅ（ｐ＜０．０１）及びｆ（ｐ＜０．０５）：ＭＷテストによってレッドクローバー抽出物単独投与群と比較
ｇ（ｐ＜０．０１）：ＭＷテストによってザクロ抽出物単独投与群と比較
（３）肝
ＯＶＸ対照群では、偽手術対照群に比べて著しい肝細胞内の脂肪蓄積による肥大を特徴とする肝脂肪病症が引き起こされ、肝の脂肪変性部位及び平均肝細胞直径の有意な（ｐ＜０．０１）増加がそれぞれ認められたが、エストラジオールを含むすべての実験物質投与群では、ＯＶＸ対照群に比べて有意な（ｐ＜０．０１）の肝脂肪病症の減少がそれぞれ認められ、特にレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１、１：１及び４：１（ｇ／ｇ）複合物投与群の順に、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物投与群のそれぞれに比べても有意な（ｐ＜０．０１）の肝脂肪変性部位及び平均肝細胞直径の減少が認められた（表２３、図３５及び３６）。
【０２４２】
肝脂肪変性部位及び平均肝細胞直径は、ＯＶＸ対照群では、偽手術対照群に比べてそれぞれ５００．６６及び２２４．６５％の変化を示し、エストラジオール、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物、レッドクローバー：ザクロ抽出物の１：１、１：２、１：４、１：６、１：８、２：１、４：１、６：１及び８：１（ｇ／ｇ）複合組成物投与群では、ＯＶＸ対照群に比べてそれぞれ−４４．７３、−２４．３８、−２１．０８、−４３．２０、−２５．７２、−２３．９１、−２３．２０、−２２．２１、−５１．８５、−４１．４７、−２７．３８及び−２３．６７％の肝脂肪変性部位の変化を示し、それぞれ−４２．２１、−２６．５０、−２５．８８、−４９．８７、−３０．２２、−３０．０２、−２９．８０、−２５．３５、−５５．３９、−４５．１０、−２７．１８及び−２６．６８％の平均肝細胞直径の変化を示した。
【０２４３】
【表２３】
2018135395.tif 000024
【０２４４】
値はマウス８個体の平均±標準偏差で示した。
ａ（ｐ＜０．０１）及びｂ（ｐ＜０．０５）：ＬＳＤテストによって偽手術対照群と比較ｃ（ｐ＜０．０１）：ＬＳＤテストによってＯＶＸ対照群と比較
ｄ（ｐ＜０．０１）及びｅ（ｐ＜０．０５）：ＬＳＤテストによってレッドクローバー抽出物単独投与群と比較
ｆ（ｐ＜０．０１）：ＬＳＤテストによってザクロ抽出物単独投与群と比較
（実施例３−１５．組織病理学的変化（２）：大腿骨）
偽手術群の大腿骨では比較的によく発達した柱骨と皮質骨が観察された一方、ＯＶＸ対照群では破骨細胞の著しい数的増加及び活性増加による柱骨及び皮質骨量の減少が認められたが、レッドクローバー抽出物単独組成物を含むすべての実験物質投与群では、大腿骨の破骨細胞活性抑制による柱骨及び皮質骨の骨量及び厚さの著しい増加が認められ、特にレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１、１：１及び４：１（ｇ／ｇ）複合物投与群の順に、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物投与群のそれぞれに比べても著しい破骨細胞活性抑制及び骨量保存効果が認められた（表２４、２５及び図３７、３８）。
（１）骨質量及び構造
ＯＶＸ対照群の場合、大腿骨の柱骨量、柱骨の平均長さ、厚さ及び数、中軸部分の皮質骨の厚さがそれぞれ偽手術対照群に比べて有意に（ｐ＜０．０１）減少したが、ザクロ抽出物の単独組成物を含むすべての候補物質投与群では、ＯＶＸ対照群に比べて有意な（ｐ＜０．０１又はｐ＜０．０５）大腿骨の柱骨量、柱骨の平均長さ、厚さ及び数、皮質骨の厚さの増加が認められ、特にレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１、１：１及び４：１（ｇ／ｇ）複合物投与群の順に、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物投与群のそれぞれに比べても有意な（ｐ＜０．０１）大腿骨の柱骨量、柱骨の平均長さ、厚さ及び数、皮質骨の厚さの増加が認められた。
大腿骨の柱骨量及び柱骨の平均数は、ＯＶＸ対照群では、偽手術対照群に比べてそれぞれ−５３．６６及び−５９．４１％の変化を示し、エストラジオール、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物、レッドクローバー：ザクロ抽出物の１：１、１：２、１：４、１：６、１：８、２：１、４：１、６：１及び８：１（ｇ／ｇ）複合組成物投与群では、ＯＶＸ対照群に比べてそれぞれ７３．０１、３２．４７、２５．５４、５９．９２、３１．０８、３０．５１、２６．５５、２６．４２、８１．７５、５８．５４、３３．７０及び３０．７５％の柱骨量の変化を示し、それぞれ９２．６８、４６．３４、３６．５９、１０２．４４、４６．３４、４３．９０、３６．５９、３４．１５、１３９．０２、９７．５６、５３．６６及び４６．３４％の平均柱骨数の変化を示した。
【０２４５】
大腿骨の柱骨の平均長さ及び厚さは、ＯＶＸ対照群では、偽手術対照群に比べてそれぞれ−５３．４７及び−５５．８２％の変化を示し、エストラジオール、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物、レッドクローバー：ザクロ抽出物の１：１、１：２、１：４、１：６、１：８、２：１、４：１、６：１及び８：１（ｇ／ｇ）複合組成物投与群では、ＯＶＸ対照群に比べてそれぞれ８９．０４、２３．６２、２０．８８、７９．４３、２７．４７、２６．５７、２５．１８、２１．１６、９９．２０、７２．６８、２７．６５及び２４．０４％の柱骨の平均長さの変化を示し、それぞれ７０．５６、３５．６９、３３．２９、１０４．２８、４４．４０、４３．６７、３４．６５、３４．９８、１２９．１０、１０１．２６、４０．１９及び３７．５８％の柱骨の平均厚さの変化を示した。
【０２４６】
大腿骨の皮質骨の厚さは、ＯＶＸ対照群の場合、偽手術対照群に比べて−２７．８０％の変化を示し、エストラジオール、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物、レッドクローバー：ザクロ抽出物の１：１、１：２、１：４、１：６、１：８、２：１、４：１、６：１及び８：１（ｇ／ｇ）複合組成物投与群では、ＯＶＸ対照群に比べてそれぞれ２１．８５、１６．１１、１３．８３、２５．２３、１８．９７、１６．７０、１５．８４、１５．０１、３０．４３、２４．３３、２０．１０及び１４．００％の変化を示した。
【０２４７】
【表２４】
2018135395.tif 000025
【０２４８】
値はマウス８個体の平均±標準偏差で示した。
ａ（ｐ＜０．０１）：ＬＳＤテストによって偽手術対照群と比較
ｂ（ｐ＜０．０１）：ＬＳＤテストによってＯＶＸ対照群と比較
ｃ（ｐ＜０．０１）：ＬＳＤテストによってレッドクローバー抽出物単独投与群と比較
ｄ（ｐ＜０．０１）：ＬＳＤテストによってザクロ抽出物単独投与群と比較
ｅ（ｐ＜０．０１）及びｆ（ｐ＜０．０５）：ＭＷテストによって偽手術対照群と比較
ｇ（ｐ＜０．０１）及びｈ（ｐ＜０．０５）：ＭＷテストによってＯＶＸ対照群と比較
ｉ（ｐ＜０．０１）：ＭＷテストによってレッドクローバー抽出物単独投与群と比較
ｊ（ｐ＜０．０１）：ＭＷテストによってザクロ抽出物単独投与群と比較
（２）骨吸収
ＯＶＸ対照群の場合、大腿骨の破骨細胞の数と比率（ＯＳ／ＢＳ）が、それぞれ偽手術対照群に比べて有意に（ｐ＜０．０１）増加したが、９種のレッドクローバー：ザクロ抽出物複合組成物を含むすべての実験物質投与群では、ＯＶＸ対照群に比べて有意な（ｐ＜０．０１又はｐ＜０．０５）大腿骨の破骨細胞の数とＯＳ／ＢＳの減少がそれぞれ認められ、特にレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１、１：１及び４：１（ｇ／ｇ）複合物投与群の順に、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物投与群のそれぞれに比べても有意な（ｐ＜０．０１）大腿骨の破骨細胞の数とＯＳ／ＢＳの減少が認められた。
【０２４９】
大腿骨の破骨細胞の数及びＯＳ／ＢＳは、ＯＶＸ対照群では、偽手術対照群に比べてそれぞれ２０９．０９及び１４６．３１％の変化を示し、エストラジオール、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物、レッドクローバー：ザクロ抽出物の１：１、１：２、１：４、１：６、１：８、２：１、４：１、６：１及び８：１（ｇ／ｇ）複合組成物投与群では、ＯＶＸ対照群に比べてそれぞれ−５５．１５、−１９．１２、−１６．９１、−４６．３２、−２３．５３、−２０．５９、−１９．８５、−１８．３８、−５８．８２、−４４．８５、−２１．３２及び−１９．８５％の破骨細胞数の変化を示し、それぞれ−３７．５０、−１８．２９、−１５．４７、−３５．８８、−２０．８１、−１８．６７、−１５．９２、−２０．１２、−４５．４３、−３５．０５、−１７．８７及び−１５．１０％のＯＳ／ＢＳの変化を示した。
【０２５０】
【表２５】
2018135395.tif 000026
【０２５１】
値はマウス８個体の平均±標準偏差で示した。
ａ（ｐ＜０．０１）：ＬＳＤテストによって偽手術対照群と比較
ｂ（ｐ＜０．０１）：ＬＳＤテストによってＯＶＸ対照群と比較
ｃ（ｐ＜０．０１）：ＬＳＤテストによってレッドクローバー抽出物単独投与群と比較
ｄはｐ＜０．０１ＬＳＤテストによってザクロ抽出物単独投与群と比較
ｅ（ｐ＜０．０１）及びｆ（ｐ＜０．０５）：ＭＷテストによって偽手術対照群と比較
ｇ（ｐ＜０．０１）及びｈ（ｐ＜０．０５）：ＭＷテストによってＯＶＸ対照群と比較
ｉ（ｐ＜０．０１）：ＭＷテストによってレッドクローバー抽出物単独投与群と比較
ｊ（ｐ＜０．０１）：ＭＷテストによってザクロ抽出物単独投与群と比較
［実施例３のまとめ］
本研究では、レッドクローバー抽出物とザクロ抽出物との最適複合組成を、現在骨粗鬆症を含む多様な更年期障害の実験動物モデルとして用いられているＯＶＸ ｄｄＹマウスモデル［Ｙａｍａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．、１９９９；Ｋｕ ａｎｄ Ｌｅｅ、２００５；Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．、２００７；Ｓｈｉｎ ｅｔ ａｌ．、２００７］を用いて評価した。すなわち、ＯＶＸ２８日後から、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物、９種のレッドクローバー：ザクロ抽出物複合組成物（１：１、１：２、１：４、１：６、１：８、２：１、４：１、６：１及び８：１、ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇを滅菌蒸留水に溶解または希釈して、１０ｍｌ／ｋｇの用量で毎日１回ずつ８４日間経口投与し、エストロゲン様効果、抗肥満効果、高脂血症抑制効果、脂肪肝に対する保護効果及び骨粗鬆症抑制効果の５種の薬理効果に区分して評価した。エストロゲン様効果及び抗肥満効果を評価するため、体重及び増体量、水及び飼料の摂取量、体脂肪量及び腹部脂肪量、血清中エストラジオールの含量、蓄積腹部脂肪及び子宮の重量変化を、蓄積腹部脂肪の厚さ及び平均脂肪細胞直径、子宮全体、上皮及び粘膜の厚さ、粘膜内子宮腺が占める比率などの組織病理学的変化とともに評価し、肝重量、血清中ＡＳＴ及びＡＬＴの含量、組織病理学的変化（平均肝細胞直径及び脂肪変化を示す肝変性部位）を測定して脂肪肝に対する肝保護効果を評価し、高脂血症改善効果を血中ＴＣ、ＬＤＬ、ＨＤＬ及びＴＧ含量の変化で評価し、骨粗鬆症改善効果、すなわち骨保護効果を評価するため、大腿骨の湿重量、乾重量及び炭化重量、ＢＭＤ、骨強度、血中オステオカルシン及びｂＡＬＰの含量、大腿骨の骨量及び構造と骨吸収に対する組織病理学的変化をそれぞれ測定した。本実験において、それぞれのレッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物と比べて、同時に統計学的に有意な（ｐ＜０．０１又はｐ＜０．０５）薬効相乗を示す複合組成物を、相乗効果を奏するレッドクローバー：ザクロ抽出物複合組成物として確認し、１７β‐エストラジオール０．０３μｇ／頭／日の皮下投与マウス［Ｃｈｉｂａ ｅｔ ａｌ．、２００３；Ｍｕｒａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．、２００７；Ｔｏｕｓｅｎ ｅｔ ａｌ．、２０１１］における結果と比較評価した。
【０２５２】
本実験で使用した複合組成物の投与用量は、マウスの体表面積を考慮してヒト臨床用量６００ｍｇの１２倍、すなわち、（６００ｍｇ／６０ｋｇ）×１２＝１２０ｍｇ／ｋｇに選定し、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物の用量も直接的な薬効の比較評価のため１２０ｍｇ／ｋｇにそれぞれ選定した。また、従来研究者の方法［Ｃｈｉｂａ ｅｔ ａｌ．、２００３；Ｍｕｒａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．、２００７；Ｔｏｕｓｅｎ
ｅｔ ａｌ．、２０１１］に従って、０．０３μｇの１７β‐エストラジオールを０．２ｍｌの滅菌生理食塩水に溶解させて、０．２ｍｌ／マウスの用量（０．０３μｇ／頭／日）でＯＶＸ手術２８日後から毎日１回ずつ８４日間背中の肌に皮下投与した。
【０２５３】
本実験の結果、ＯＶＸ対照群では偽手術媒体対照群に比べて著しい体重及び増体量、飼料摂取量、体脂肪及び腹部蓄積脂肪量、腹部蓄積脂肪の重量、血清中ＡＳＴ、ＡＬＴ、ＴＣ、ＬＤＬ、ＴＧ及びオステオカルシン含量の増加が、子宮、肝及び大腿骨の重量、血中ｂＡＬＰ及びエストラジオールの含量、平均全身骨密度及び大腿骨の骨密度の減少とともに認められ、また、著しい腹部蓄積脂肪厚さの増加及び脂肪細胞の肥大、肝の脂肪病症、子宮の不溶性萎縮、大腿骨骨量の減少所見が、骨吸収指標（Ｏｃｎ及びＯＳ／ＢＳ）の著しい増加とともに組織病理学的にそれぞれ認められ、典型的なエストロゲン欠乏性更年期障害（肥満、高脂血症、肝脂肪病症及び骨粗鬆症）がＯＶＸによって誘発された。一方、このようなＯＶＸによって誘発されたエストロゲン欠乏性閉経期関連更年期障害所見は、エストラジオール、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物、全９種のレッドクローバー：ザクロ抽出物複合組成物の８４日間の連続投与によって格段に抑制され、特にレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１、１：１及び４：１（ｇ／ｇ）複合物投与群の順に、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物投与群のそれぞれに比べても有意な肥満、高脂血症、肝脂肪病症及び骨粗鬆症のようなＯＶＸで誘発されるエストロゲン欠乏性更年期障害改善効果が認められた。したがって、適切な比率のレッドクローバー：ザクロ抽出物複合組成、つまりレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１、１：１及び４：１は、含有するイソフラボノイドの多様性増加を通じて、ＯＶＸによって誘発される更年期障害に対するレッドクローバー抽出物とザクロ抽出物との更年期障害改善効果を一層相乗的に増加させることが観察され、なかでもレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１複合組成物が最も優れた更年期障害改善効果を相乗的に増加させることが観察されたが、本発明がこのような内容に限られることはない。
【０２５４】
本研究では、ＯＶＸによって著しい飼料摂取量の増加が認められ、結果的に著しい体重増加とともに脂肪の蓄積と脂肪細胞の肥大が引き起こされた。一方、このようなＯＶＸによって誘発されたエストロゲン欠乏性肥満所見は、それぞれレッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物、９種のすべてのレッドクローバー：ザクロ抽出物複合組成物の８４日間の連続的な投与によって格段に抑制され、特にレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１、１：１及び４：１（ｇ／ｇ）複合物投与群の順に、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物投与群のそれぞれに比べても有意な体脂肪蓄積、脂肪肥大及び体重増加の抑制所見が認められた。このような結果は、適切な比率のレッドクローバー：ザクロ抽出物複合組成物、つまりレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１、１：１及び４：１が更年期障害に関連する肥満に対するレッドクローバー抽出物とザクロ抽出物との改善効果を相乗的に増加させる証拠であると判断され、なかでもレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合組成物が最も優れた抗肥満効果を奏することが観察されたが、本発明がこのような内容に限られることはない。
【０２５５】
本研究では、ＯＶＸによって有意な子宮重量の減少が、血中エストラジオール含量の減少とともに引き起こされ、組織病理学的に著しい子宮全体、粘膜及び上皮厚さの減少とともに粘膜内子宮腺の減少が引き起こされた。一方、このようなエストロゲン欠乏性子宮萎縮所見は、エストラジオール、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物、レッドクローバー：ザクロ抽出物の１：１、１：２、１：４、１：６、１：８、２：１、４：１、６：１及び８：１（ｇ／ｇ）複合組成物投与によって格段に抑制され、特にレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１、１：１及び４：１（ｇ／ｇ）複合物投与群の順に、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物投与群のそれぞれに比べても有意な血中エストラジオール含量の増加とともに子宮萎縮抑制所見が認められ、適切な比率のレッドクローバー：ザクロ抽出物複合組成物、つまりレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１、１：１及び４：１が、含有するイソフラボノイドの多様性増加を通じて、レッドクローバー抽出物とザクロ抽出物とのエストロゲン様効果を相乗的に増加させる証拠であると判断され、なかでもレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合組成物が最も優れたエストロゲン様効果を奏することが観察されたが、本発明がこのような内容に限られることはない。
【０２５６】
本研究では、エストラジオールの皮下投与及びすべてのレッドクローバー抽出物とザクロ抽出物との単独または複合組成物の経口投与によって、著しい血中ＴＣ、ＬＤＬ及びＴＧ含量の減少とともにＨＤＬ含量の増加が認められ、特にレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１、１：１及び４：１（ｇ／ｇ）複合物投与群の順に、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物投与群のそれぞれに比べても有意な抗高脂血症効果の増加が認められ、適切な比率のレッドクローバー：ザクロ抽出物複合組成物、つまりレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１、１：１及び４：１が、少なくとも本実験の条件下でコレステロール合成に関与する酵素であるＨＭＧ‐ＣｏＡ［Ｄｉ Ｃｒｏｃｅ ｅｔ ａｌ．、１９９６］を経由して、レッドクローバー抽出物とザクロ抽出物との抗高脂血症効果を相乗的に増加させる証拠であると判断され、なかでもレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合組成物が最も優れた抗高脂血症効果を奏することが観察されたが、本発明がこのような内容に限られることはない。
【０２５７】
本研究において、ＯＶＸ対照群では著しい肝脂肪病症の誘発が血液生化学的及び組織病理学的にそれぞれ認められた。一方、このようなＯＶＸによる脂肪肝所見は、エストラジオール、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物、９種のレッドクローバー：ザクロ抽出物複合組成物の投与によって格段に抑制され、特にレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１、１：１及び４：１（ｇ／ｇ）複合物投与群の順に、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物投与群のそれぞれに比べても有意な肝保護効果の増加が認められ、適切な比率のレッドクローバー：ザクロ抽出物複合組成物がレッドクローバー抽出物とザクロ抽出物との肝保護効果を相乗的に増加させる証拠であると判断され、なかでもレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合組成物が最も優れた肝保護効果を奏することが観察されたが、本発明がこのような内容に限られることはない。
【０２５８】
本実験の結果、ＯＶＸ対照群では偽手術媒体対照群に比べて著しい血中オステオカルシン含量の増加が大腿骨重量と血中ｂＡＬＰ含量の減少とともに認められ、大腿骨骨量の減少所見が骨吸収指標（Ｏｃｎ及びＯＳ／ＢＳ）の著しい増加とともに組織病理学的に認められ、典型的なエストロゲン欠乏性骨粗鬆症がＯＶＸによって誘発されることが観察された。一方、このようなエストロゲン欠乏性骨粗鬆症所見は、エストラジオール、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物、レッドクローバー：ザクロ抽出物の１：１、１：２、１：４、１：６、１：８、２：１、４：１、６：１及び８：１（ｇ／ｇ）複合組成物投与によって格段に抑制され、特にレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１、１：１及び４：１（ｇ／ｇ）複合物投与群の順に、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物投与群のそれぞれに比べても有意なエストロゲン欠乏性骨粗鬆症改善効果の増加が認められ、適切な比率のレッドクローバー：ザクロ抽出物複合組成物、つまりレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１、１：１及び４：１が、含有するイソフラボノイドの多様性増加を通じて、レッドクローバー抽出物とザクロ抽出物とのエストロゲン欠乏性骨粗鬆症改善効果を相乗的に増加させると判断され、なかでもレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合組成物が最も優れたエストロゲン欠乏性骨粗鬆症に対する改善効果を奏することが観察された。
【０２５９】
本実験の結果、ｄｄＹマウスでＯＶＸによって誘発されたエストロゲン欠乏性閉経期関連更年期障害所見（肥満、高脂血症、肝脂肪病症及び骨粗鬆症）が、エストラジオール、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物、全９種のレッドクローバー：ザクロ抽出物複合組成物の８４日間の連続投与によって格段に抑制され、特にレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１、１：１及び４：１（ｇ／ｇ）複合物投与群の順に、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物投与群のそれぞれに比べても有意な更年期障害改善効果が認められ、適切な比率のレッドクローバー：ザクロ抽出物複合組成、つまりレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１、１：１及び４：１が、含有するイソフラボノイドの多様性増加を通じて、ＯＶＸによって誘発される更年期障害に対するレッドクローバー抽出物とザクロ抽出物との更年期障害改善効果を一層相乗的に増加させることが観察され、なかでもレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１複合組成物が最も優れた更年期障害改善効果を奏すると判断された。従って、レッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１（ｇ／ｇ）複合物は、より効果的且つ新たな更年期障害改善剤としての開発可能性が非常に高いと期待され、特にエストロゲン欠乏性肥満、高脂血症、脂肪肝病症及び骨粗鬆症の改善に有効であると判断される。
【図面の簡単な説明】
【０２６０】
【図１】ＯＶＸラットを用いてレッドクローバー抽出物とザクロ抽出物とを含む複合物の相乗効果を実験するための実験スケジュールを示した図である。
【図２】組織病理学的変化を観察したラットの領域を示した図である。
【図３】左側は骨密度（ＢＭＤ；Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｄｅｎｓｉｔｙ）測定装置であり、右側は二重エネルギーＸ線吸収測定法（ｄｕａｌ−ｅｎｅｒｇｙ ｘ−ｒａｙ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎｍｅｔｒｙ）（Ｎｏｒｌａｎｄ ｐＤＥＸＡ；Ｆｏｒｔ Ａｔｋｉｎｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）で検出した右側大腿骨（ｆｅｍｕｒ）の全体（ｔｏｔａｌ（Ｔ））、骨端（ｅｐｉｐｈｙｓｅａｌ（Ｅ））及び骨幹（ｄｉａｐｈｙｓｅａｌ（ｍｉｄ−ｓｈａｆｔ；Ｍ））領域、脛骨（ｔｉｂｉａ）及びＬ５の全領域を示した図である。
【図４】骨強度測定装置を示した図である。骨強度はＦＬ（破壊荷重、ｆａｉｌｕｒｅ ｌｏａｄ）によって測定する。
【図５】偽手術（ｓｈａｍ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ）対照群またはＯＶＸラットから採取した左側腹壁に蓄積された脂肪を示した図である。Ａは偽手術対照群、ＢはＯＶＸ対照群、Ｃはレッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｄはザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｅはレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｆはレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１複合物（ｇ／ｇ）６０ｍｇ／ｋｇ投与群を示した図である。
【図６】偽手術対照群またはＯＶＸラットから採取した子宮を示した図である。上段左側よりＡからＧ。Ａは偽手術対照群、ＢはＯＶＸ対照群、Ｃはレッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｄはザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｅはレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｆはレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１複合物（ｇ／ｇ）６０ｍｇ／ｋｇ投与群を示した図である。
【図７】ＯＶＸラットの血清中のエストラジオール（ｅｓｔｒａｄｉｏｌ）数値を示した図である。ａ（ｐ＜０．０１）：マン・ホイットニー検定（以下、「ＭＷテスト」とする）によって偽手術対照群と比較、ｂ（ｐ＜０．０１）：ＭＷテストによってＯＶＸ対照群と比較、ｃ（ｐ＜０．０１）及びｄ（ｐ＜０．０５）：ＭＷテストによってレッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ投与群と比較、ｅ（ｐ＜０．０１）：ＭＷテストによってザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ投与群と比較。
【図８】ＯＶＸラットの血清中のオステオカルシン数値を示した図である。ａ（ｐ＜０．０１）及びｂ（ｐ＜０．０５）：最小有意差検定（以下、「ＬＳＤテスト」とする）によって偽手術対照群と比較、ｃ（ｐ＜０．０１）及びｄ（ｐ＜０．０５）：ＬＳＤテストによってＯＶＸ対照群と比較、ｅ（ｐ＜０．０１）及びｆ（ｐ＜０．０５）：ＬＳＤテストによってレッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ投与群と比較、ｇ（ｐ＜０．０１）：ＬＳＤテストによってザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ投与群と比較。
【図９】ＯＶＸラットの血清ｂＡＬＰ数値を示した図である。ａ（ｐ＜０．０１）及びｂ（ｐ＜０．０５）：ＭＷテストによって偽手術対照群と比較、ｃ（ｐ＜０．０１）及びｄ（ｐ＜０．０５）：ＭＷテストによってＯＶＸ対照群と比較、ｅ（ｐ＜０．０１）及びｆ（ｐ＜０．０５）：ＭＷテストによってレッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ投与群と比較、ｇ（ｐ＜０．０１）：ＭＷテストによってザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ投与群と比較。
【図１０】ＯＶＸラットの大腿骨強度を示した図である。ａ（ｐ＜０．０１）及びｂ（ｐ＜０．０５）：ＬＳＤテストによって偽手術対照群と比較、ｃ（ｐ＜０．０１）：ＬＳＤテストによってＯＶＸ対照群と比較、ｄ（ｐ＜０．０１）及びｅ（ｐ＜０．０５）：ＬＳＤテストによってレッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ投与群と比較、ｆ（ｐ＜０．０１）及びｇ（ｐ＜０．０５）：ＬＳＤテストによってザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ投与群と比較。
【図１１】脛骨強度を示した図である。ａ（ｐ＜０．０１）及びｂ（ｐ＜０．０５）：ＭＷテストによって偽手術対照群と比較、ｃ（ｐ＜０．０１）及びｄ（ｐ＜０．０５）：ＭＷテストによってＯＶＸ対照群と比較、ｅ（ｐ＜０．０１）：ＭＷテストによってレッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ投与群と比較、ｆ（ｐ＜０．０１）：ＭＷテストによってザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ投与群と比較。
【図１２】偽手術対照群またはＯＶＸラットの背中側腹部筋肉の腹部脂肪から採取した脂肪細胞の組織学的映像を示した図である。Ａは偽手術対照群、ＢはＯＶＸ対照群、Ｃはレッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｄはザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｅはレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｆはレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１複合物（ｇ／ｇ）６０ｍｇ／ｋｇ投与群を示した図である。
【図１３】偽手術対照群またはＯＶＸラットから採取した左側子宮角の組織学的映像を示した図である。Ａは偽手術対照群、ＢはＯＶＸ対照群、Ｃはレッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｄはザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｅはレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｆはレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１複合物（ｇ／ｇ）６０ｍｇ／ｋｇ投与群を示した図である。Ｌはルーメン（ｌｕｍｅｎ）；ＭＵは粘膜（ｍｕｃｏｓａ）；ＭＬは筋肉層（ｍｕｓｃｕｌａｒ ｌａｙｅｒ）；Ｅｐは上皮（ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）；ＵＧは子宮腺（ｕｔｅｒｉｎｅ ｇｌａｎｄ）。
【図１４】偽手術対照群またはＯＶＸラットから採取した左側面の肝葉（ｌｏｂｅ）の組織学的プロファイルを示した図である。Ａは偽手術対照群、ＢはＯＶＸ対照群、Ｃはレッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｄはザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｅはレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｆはレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１複合物（ｇ／ｇ）６０ｍｇ／ｋｇ投与群を示した図である。ＣＶは中央血管（ｃｅｎｔｒａｌ ｖｅｉｎ）；ＰＴは門脈三つ組（ｐｏｒｔａｌ ｔｒｉａｄ）。
【図１５】偽手術対照群またはＯＶＸラットから採取した大腿骨の組織学的プロファイルを示した図である。Ａは偽手術対照群、ＢはＯＶＸ対照群、Ｃはレッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｄはザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｅはレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｆはレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１複合物（ｇ／ｇ）６０ｍｇ／ｋｇ投与群を示した図である。Ｃｂは皮質骨（ｃｏｒｔｉｃａｌ ｂｏｎｅ）；Ｔｂは柱骨（ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｂｏｎｅ）；Ｂｍは骨髄（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ）；Ｇｐは成長板（ｇｒｏｗｔｈ ｐｌａｔｅ）。
【図１６】偽手術対照群またはＯＶＸラットから採取した脛骨の組織学的プロファイルを示した図である。Ａは偽手術対照群、ＢはＯＶＸ対照群、Ｃはレッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｄはザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｅはレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｆはレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１複合物（ｇ／ｇ）６０ｍｇ／ｋｇ投与群を示した図である。Ｃｂは皮質骨；Ｔｂは柱骨；Ｂｍは骨髄；Ｇｐは成長板。
【図１７】偽手術対照群またはＯＶＸラットから採取したＬ４の組織学的プロファイルを示した図である。Ａは偽手術対照群、ＢはＯＶＸ対照群、Ｃはレッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｄはザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｅはレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｆはレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１複合物（ｇ／ｇ）６０ｍｇ／ｋｇ投与群を示した図である。Ｃｂは皮質骨；Ｔｂは柱骨；Ｂｍは骨髄；Ｇｐは成長板。
【図１８】ＯＶＸマウスを用いてレッドクローバー抽出物とザクロ抽出物とを含む複合物の比率による相乗効果を実験するための実験スケジュールを示した図である。
【図１９】組織病理学的変化を観察したマウスの領域を示した図である。
【図２０】ＢＭＤ測定装置（左側及び中央、ｎＡｌｙｚｅｒ、Ｍｅｄｉｋｏｒｓ、城南、韓国）及びそれを用いて撮影した写真（右側）を示した図である。
【図２１】骨強度測定装置（ＳＶ−Ｈ１０００、日本計測システム（株）、日本）を示した図である。骨強度はＦＬ（破壊荷重）によって測定する。
【図２２】偽手術対照群またはＯＶＸ ｄｄＹマウスモデルにおける体重変化を示したグラフである。
【図２３】偽手術対照群またはＯＶＸ ｄｄＹマウスモデルの腹腔内に蓄積された腹部脂肪パッドの代表総（ｇｒｏｓｓ）写真を示した図である。Ａは偽手術対照群、ＢはＯＶＸ対照群、Ｃは１７β‐エストラジオール０．０３μｇ／頭で処理されたＯＶＸマウス、Ｄはレッドクローバー抽出物１２０ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｅはザクロ抽出物１２０ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｆはレッドクローバー：ザクロ抽出物の１：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（６０：６０ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｇはレッドクローバー：ザクロ抽出物の１：２複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（４０：８０ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｈはレッドクローバー：ザクロ抽出物の１：４複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（２４：９６ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｉはレッドクローバー：ザクロ抽出物の１：６複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（１７：１０３ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｊはレッドクローバー：ザクロ抽出物の１：８複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（１３：１０７ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｋはレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（８０：４０ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｌはレッドクローバー：ザクロ抽出物の４：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（９６：２４ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｍはレッドクローバー：ザクロ抽出物の６：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（１０３：１７ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｎはレッドクローバー：ザクロ抽出物の８：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（１０７：１３ｍｇ／ｋｇ）投与群を示した図である（スケールバー＝１１ｍｍ）。
【図２４】偽手術対照群またはＯＶＸ ｄｄＹマウスモデルの子宮の代表総写真を示した図である。Ａは偽手術対照群、ＢはＯＶＸ対照群、Ｃは１７β‐エストラジオール０．０３μｇ／頭で処理されたＯＶＸマウス、Ｄはレッドクローバー抽出物１２０ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｅはザクロ抽出物１２０ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｆはレッドクローバー：ザクロ抽出物の１：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（６０：６０ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｇはレッドクローバー：ザクロ抽出物の１：２複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（４０：８０ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｈはレッドクローバー：ザクロ抽出物の１：４複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（２４：９６ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｉはレッドクローバー：ザクロ抽出物の１：６複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（１７：１０３ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｊはレッドクローバー：ザクロ抽出物の１：８複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（１３：１０７ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｋはレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（８０：４０ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｌはレッドクローバー：ザクロ抽出物の４：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（９６：２４ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｍはレッドクローバー：ザクロ抽出物の６：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（１０３：１７ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｎはレッドクローバー：ザクロ抽出物の８：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（１０７：１３ｍｇ／ｋｇ）投与群を示した図である（スケールバー＝１０ｍｍ）。
【図２５】偽手術対照群またはＯＶＸ ｄｄＹマウスの血清中のエストラジオール数値を示した図である。ａ（ｐ＜０．０１）：ＭＷテストによって偽手術対照群と比較、ｂ（ｐ＜０．０１）：ＭＷテストによってＯＶＸ対照群と比較、ｃ（ｐ＜０．０１）：ＭＷテストによってレッドクローバー抽出物単一組成物処理群と比較、ｄ（ｐ＜０．０１）：ＭＷテストによってザクロ抽出物単一組成物処理群と比較（Ｅ２は１７β‐エストラジオール）。
【図２６】偽手術対照群またはＯＶＸ ｄｄＹマウスの血清中のオステオカルシン数値を示した図である。ａ（ｐ＜０．０１）及びｂ（ｐ＜０．０５）：ＭＷテストによって偽手術対照群と比較、ｃ（ｐ＜０．０１）：ＭＷテストによってＯＶＸ対照群と比較、ｄ（ｐ＜０．０１）：ＭＷテストによってレッドクローバー抽出物単一組成物処理群と比較、ｅ（ｐ＜０．０１）：ＭＷテストによってザクロ抽出物単一組成物処理群と比較。
【図２７】偽手術対照群またはＯＶＸ ｄｄＹマウスの血清ｂＡＬＰ数値を示した図である。ａ（ｐ＜０．０１）：ＬＳＤテストによって偽手術対照群と比較、ｂ（ｐ＜０．０１）及びｃ（ｐ＜０．０５）：ＬＳＤテストによってＯＶＸ対照群と比較、ｄ（ｐ＜０．０１）及びｅ（ｐ＜０．０５）：ＬＳＤテストによってレッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ投与群と比較、ｆ（ｐ＜０．０１）及びｇ（ｐ＜０．０５）：ＬＳＤテストによってザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ投与群と比較。
【図２８】偽手術対照群またはＯＶＸ ｄｄＹマウスのＤＥＸＡ（二重エネルギーＸ線吸収測定）写真を示した図である。モデルの腹腔内に蓄積された腹部脂肪パッドの代表総写真を示した図である。Ａは偽手術対照群、ＢはＯＶＸ対照群、Ｃは１７β‐エストラジオール０．０３μｇ／頭で処理されたＯＶＸマウス、Ｄはレッドクローバー抽出物１２０ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｅはザクロ抽出物１２０ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｆはレッドクローバー：ザクロ抽出物の１：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（６０：６０ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｇはレッドクローバー：ザクロ抽出物の１：２複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（４０：８０ｍｇ／ｋｇ）投与群を示した図である。
【図２９】偽手術対照群またはＯＶＸ ｄｄＹマウスのＤＥＸＡ（二重エネルギーＸ線吸収測定）写真を示した図である。モデルの腹腔内に蓄積された腹部脂肪パッドの代表総写真を示した図である。Ｈはレッドクローバー：ザクロ抽出物の１：４複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（２４：９６ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｉはレッドクローバー：ザクロ抽出物の１：６複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（１７：１０３ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｊはレッドクローバー：ザクロ抽出物の１：８複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（１３：１０７ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｋはレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（８０：４０ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｌはレッドクローバー：ザクロ抽出物の４：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（９６：２４ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｍはレッドクローバー：ザクロ抽出物の６：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（１０３：１７ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｎはレッドクローバー：ザクロ抽出物の８：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（１０７：１３ｍｇ／ｋｇ）投与群を示した図である。
【図３０】偽手術対照群またはＯＶＸ ｄｄＹマウスの大腿骨強度（破壊荷重、骨強度）を示した図である。ａ（ｐ＜０．０１）及びｂ（ｐ＜０．０５）：ＭＷテストによって偽手術対照群と比較、ｃ（ｐ＜０．０１）及びｄ（ｐ＜０．０５）：ＭＷテストによってＯＶＸ対照群と比較、ｅ（ｐ＜０．０１）及びｆ（ｐ＜０．０５）：ＭＷテストによってレッドクローバー抽出物４０ｍｇ／ｋｇ投与群と比較、ｇ（ｐ＜０．０１）及びｈ（ｐ＜０．０５）：ＭＷテストによってザクロ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ投与群と比較。
【図３１】偽手術対照群またはＯＶＸ ｄｄＹマウスの腹腔脂肪細胞の組織学的映像を示した図である。Ａは偽手術対照群、ＢはＯＶＸ対照群、Ｃは１７β‐エストラジオール０．０３μｇ／頭で処理されたＯＶＸマウス、Ｄはレッドクローバー抽出物１２０ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｅはザクロ抽出物１２０ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｆはレッドクローバー：ザクロ抽出物の１：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（６０：６０ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｇはレッドクローバー：ザクロ抽出物の１：２複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（４０：８０ｍｇ／ｋｇ）投与群を示した図である（スケールバー＝１２０μｍ）。
【図３２】偽手術対照群またはＯＶＸ ｄｄＹマウスの腹腔脂肪細胞の組織学的映像を示した図である。Ｈはレッドクローバー：ザクロ抽出物の１：４複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（２４：９６ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｉはレッドクローバー：ザクロ抽出物の１：６複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（１７：１０３ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｊはレッドクローバー：ザクロ抽出物の１：８複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（１３：１０７ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｋはレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（８０：４０ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｌはレッドクローバー：ザクロ抽出物の４：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（９６：２４ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｍはレッドクローバー：ザクロ抽出物の６：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（１０３：１７ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｎはレッドクローバー：ザクロ抽出物の８：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（１０７：１３ｍｇ／ｋｇ）投与群を示した図である（スケールバー＝１２０μｍ）。
【図３３】偽手術対照群またはＯＶＸ ｄｄＹマウスから採取した左側子宮角の組織学的映像を示した図である。Ａは偽手術対照群、ＢはＯＶＸ対照群、Ｃは１７β‐エストラジオール０．０３μｇ／頭で処理されたＯＶＸマウス、Ｄはレッドクローバー抽出物１２０ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｅはザクロ抽出物１２０ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｆはレッドクローバー：ザクロ抽出物の１：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（６０：６０ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｇはレッドクローバー：ザクロ抽出物の１：２複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（４０：８０ｍｇ／ｋｇ）投与群を示した図である。Ｌはルーメン；ＭＵは粘膜；ＭＬは筋肉層；Ｅｐは上皮；ＭＧは子宮腺（スケールバー＝１２０μｍ）。
【図３４】偽手術対照群またはＯＶＸ ｄｄＹマウスから採取した左側子宮角の組織学的映像を示した図である。Ｈはレッドクローバー：ザクロ抽出物の１：４複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（２４：９６ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｉはレッドクローバー：ザクロ抽出物の１：６複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（１７：１０３ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｊはレッドクローバー：ザクロ抽出物の１：８複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（１３：１０７ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｋはレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（８０：４０ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｌはレッドクローバー：ザクロ抽出物の４：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（９６：２４ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｍはレッドクローバー：ザクロ抽出物の６：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（１０３：１７ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｎはレッドクローバー：ザクロ抽出物の８：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（１０７：１３ｍｇ／ｋｇ）投与群を示した図である。Ｌはルーメン；ＭＵは粘膜；ＭＬは筋肉層；Ｅｐは上皮；ＭＧは子宮腺（スケールバー＝１２０μｍ）。
【図３５】偽手術対照群またはＯＶＸ ｄｄＹマウスから採取した左側面の肝葉の組織学的映像を示した図である。Ａは偽手術対照群、ＢはＯＶＸ対照群、Ｃは１７β‐エストラジオール０．０３μｇ／頭で処理されたＯＶＸマウス、Ｄはレッドクローバー抽出物１２０ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｅはザクロ抽出物１２０ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｆはレッドクローバー：ザクロ抽出物の１：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（６０：６０ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｇはレッドクローバー：ザクロ抽出物の１：２複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（４０：８０ｍｇ／ｋｇ）投与群を示した図である。ＣＶは中央血管；ＰＴは門脈三つ組（スケールバー＝１２０μｍ）。
【図３６】偽手術対照群またはＯＶＸ ｄｄＹマウスから採取した左側面の肝葉の組織学的映像を示した図である。Ｈはレッドクローバー：ザクロ抽出物の１：４複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（２４：９６ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｉはレッドクローバー：ザクロ抽出物の１：６複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（１７：１０３ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｊはレッドクローバー：ザクロ抽出物の１：８複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（１３：１０７ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｋはレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（８０：４０ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｌはレッドクローバー：ザクロ抽出物の４：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（９６：２４ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｍはレッドクローバー：ザクロ抽出物の６：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（１０３：１７ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｎはレッドクローバー：ザクロ抽出物の８：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（１０７：１３ｍｇ／ｋｇ）投与群を示した図である。ＣＶは中央血管；ＰＴは門脈三つ組（スケールバー＝１２０μｍ）。
【図３７】偽手術対照群またはＯＶＸ ｄｄＹマウスから採取した左側大腿骨の組織学的プロファイルを示した図である。Ａは偽手術対照群、ＢはＯＶＸ対照群、Ｃは１７β‐エストラジオール０．０３μｇ／頭で処理されたＯＶＸマウス、Ｄはレッドクローバー抽出物１２０ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｅはザクロ抽出物１２０ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｆはレッドクローバー：ザクロ抽出物の１：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（６０：６０ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｇはレッドクローバー：ザクロ抽出物の１：２複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（４０：８０ｍｇ／ｋｇ）投与群を示した図である。Ｃｂは皮質骨；Ｔｂは柱骨；Ｂｍは骨髄；Ｇｐは成長板（スケールバー＝２４０μｍ）。
【図３８】偽手術対照群またはＯＶＸ ｄｄＹマウスから採取した左側大腿骨の組織学的プロファイルを示した図である。Ｈはレッドクローバー：ザクロ抽出物の１：４複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（２４：９６ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｉはレッドクローバー：ザクロ抽出物の１：６複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（１７：１０３ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｊはレッドクローバー：ザクロ抽出物の１：８複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（１３：１０７ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｋはレッドクローバー：ザクロ抽出物の２：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（８０：４０ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｌはレッドクローバー：ザクロ抽出物の４：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（９６：２４ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｍはレッドクローバー：ザクロ抽出物の６：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（１０３：１７ｍｇ／ｋｇ）投与群、Ｎはレッドクローバー：ザクロ抽出物の８：１複合物（ｇ／ｇ）１２０ｍｇ／ｋｇ（１０７：１３ｍｇ／ｋｇ）投与群を示した図である。Ｃｂは皮質骨；Ｔｂは柱骨；Ｂｍは骨髄；Ｇｐは成長板（スケールバー＝２４０μｍ）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年6月29日(2018.6.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ザクロとレッドクローバーとの複合抽出物を有効成分として含む更年期障害改善用組成物であって、
ザクロ抽出物は、ザクロ果肉の澱粉分解酵素処理物であり、
レッドクローバー抽出物は、レッドクローバー地上部の水、炭素数１〜４の低級アルコールまたはこれらの混合物による抽出物であり、
前記ザクロ抽出物対比前記レッドクローバー抽出物の重量比は、１：１．５〜２．５であることを特徴とする組成物。
【請求項２】
ザクロとレッドクローバーとの複合抽出物を有効成分として含む更年期障害改善用組成物であって、
ザクロ抽出物は、ザクロ果肉の澱粉分解酵素処理物であり、
レッドクローバー抽出物は、レッドクローバー地上部の水、炭素数１〜４の低級アルコールまたはこれらの混合物による抽出物であり、
前記ザクロとレッドクローバーとの複合抽出物は、３０〜１００ｍｇ／ｇのイソフラボン及び０．１５〜０．４ｍｇ／ｇのエラグ酸を含むことを特徴とする組成物。
【請求項３】
ザクロとレッドクローバーとの複合抽出物を有効成分として含む更年期障害改善用組成物であって、
ザクロ抽出物は、ザクロ果肉の澱粉分解酵素処理物であり、全体ザクロ抽出物対比０．５〜１ｍｇ／ｇのエラグ酸を含み、
レッドクローバー抽出物は、レッドクローバー地上部の水、炭素数１〜４の低級アルコールまたはこれらの混合物による抽出物であり、全体レッドクローバー抽出物対比５０〜１５０ｍｇ／ｇのイソフラボンを含むことを特徴とする組成物。
【請求項４】
前記更年期障害が、顔面紅潮、発汗、不眠症、神経過敏、うつ病、めまい、集中力欠乏、関節痛、頭痛、心悸亢進、膣乾燥感、疲れ、興奮、不眠、記憶喪失、心配及びアテローム性動脈硬化症からなる群より選択された１つ以上の更年期症状を示すことを特徴とする請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の更年期障害改善用組成物。
【請求項５】
前記更年期障害改善が、更年期症状改善、抗肥満、高脂血症抑制、脂肪肝抑制、骨粗鬆症抑制、肝保護及び子宮保護からなる群より選択された１つ以上の効果を奏することを特徴とする請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の更年期障害改善用組成物。
【請求項６】
請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の更年期障害改善用組成物を含む薬学的組成物。
【請求項７】
請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の更年期障害改善用組成物を含む食品組成物。
【請求項８】
請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の更年期障害改善用組成物を含む化粧料組成物。
【請求項９】
前記ザクロ抽出物対比前記レッドクローバー抽出物の重量比が１：２であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ザクロ抽出物対比前記レッドクローバー抽出物の重量比が１：１．５〜２．５であることを特徴とする請求項２に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ザクロとレッドクローバーとの複合抽出物を組成物１００ｍｌ当り５０〜１５０ｍｇで含むことを特徴とする請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ザクロ抽出物が、全体ザクロ抽出物対比０．５〜１ｍｇ／ｇのエラグ酸を含むことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記レッドクローバー抽出物が、全体レッドクローバー抽出物対比５０〜１５０ｍｇ／ｇのイソフラボンを含むことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記レッドクローバー抽出物が、レッドクローバー抽出粉末であることを特徴とする請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ザクロ抽出物が、ザクロ抽出粉末であることを特徴とする請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の組成物。