(57)【要約】【課題】イヌの遺伝性消化管腫瘍症の診断等に有用な遺伝子検査法を提供することを課題とする。【解決手段】被検査イヌから採取された核酸検体について、（１）APC遺伝子のc.462A>T変異、及び／又は（２）APC遺伝子のc.463A>T変異を検出する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検査イヌから採取された核酸検体について、以下の（１）の変異又は（２）の変異、或いは以下の（１）の変異と（２）の変異の両方、を検出するステップを含む、遺伝性消化管腫瘍症の検査法：
（１）APC遺伝子のc.462A>T変異；
（２）APC遺伝子のc.463A>T変異。
【請求項２】
（１）の変異又は（２）の変異が検出された場合、或いは（１）の変異と（２）の変異の両方が検出された場合に遺伝性消化管腫瘍症を発症していると判定する、請求項１に記載の検査法。
【請求項３】
（１）の変異又は（２）の変異が検出された場合、或いは（１）の変異と（２）の変異の両方が検出された場合に遺伝性消化管腫瘍症を発症するリスクが高いと判定する、請求項１に記載の検査法。
【請求項４】
被検査イヌがジャックラッセルテリアである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の検査法。
【請求項５】
APC遺伝子のc.462A>T変異を検出するための核酸であって、前記変異位置を含む一定領域に相補的な配列を含み、前記領域に対して特異的にハイブリダイズする核酸を含む、遺伝性消化管腫瘍症の検査用試薬。
【請求項６】
APC遺伝子のc.463A>T変異を検出するための核酸であって、前記変異位置を含む一定領域に相補的な配列を含み、前記領域に対して特異的にハイブリダイズする核酸を含む、遺伝性消化管腫瘍症の検査用試薬。
【請求項７】
請求項５に記載の試薬、及び／又は請求項６に記載の試薬を含む、遺伝性消化管腫瘍症の検査用キット。
【請求項８】
APC遺伝子のc.463A>T変異又はc.463A>T変異からなる、遺伝性消化管腫瘍症マーカー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は獣医療における検査／診断技術に関する。詳しくは、イヌの遺伝性消化管腫瘍症の検査法及びその用途（確定診断、リスク診断など）に関する。
【背景技術】
【０００２】
元来、イヌでは消化管腫瘍の発生は非常に稀である。しかし、近年、ジャックラッセルテリア（J.R.テリア）では消化管腫瘍の発生が増加しており、また、その病態が通常のイヌの消化管腫瘍とは明らかに異なることが示されている。純血種のイヌは遺伝的多様性が低いため、イヌでは犬種に特有の遺伝性疾患が多く認められる。尚、イヌのゲノムの全塩基配列は解読されている（非特許文献１を参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Lindblad-Toh K et al., Genome sequence, comparative analysis and haplotype structure of the domestic dog. Nature 438(7069), 803-19. 2005
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
J.R.テリアで見られる本疾患も遺伝性疾患の可能性が高いと考えられ、その遺伝子診断法の開発が望まれる。上記のとおり、イヌのゲノムの全塩基配列は解読されているものの、本疾患の原因となる遺伝子異常は不明である。従って、現状では、J.R.テリアで見られる本疾患について遺伝子検査を実施することはできない。そこで本発明は、本疾患の罹患犬が特異的に保有する遺伝子異常を明らかにし、その異常を検出できる遺伝子検査法を確立することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題を解決すべく検討を進める中で本発明者らは、J.R.テリアの消化管腫瘍の病態が、APC遺伝子（Adenomatous Polyposis Coli）を原因遺伝子とするヒトの遺伝性疾患である家族性大腸腺腫症（FAP、Familial Polyposis Coli）に類似していることに着目し、本疾患の罹患犬にAPC遺伝子の異常が認められないか検討した。具体的には、APC遺伝子のコーディング領域全域を29領域に分け、それぞれの領域をPCR（ポリメラーゼ連鎖反応）により増幅し、ダイレクトシークエンス法（直接塩基配列決定法）により塩基配列を解析した（PCR-ダイレクトシークエンス法）。J.R.テリアの罹患犬と非罹患犬を対象に解析した結果、罹患犬ではAPC遺伝子に変異（生殖細胞系列変異）が認められ、本疾患がAPC遺伝子を原因遺伝子とする遺伝性疾患であることが明らかとなった。さらに、解析した罹患犬の全頭（5頭）で同一の点突然変異（c.462A>Tとc.463A>T）が検出されたことから、この変異を検出することで、本疾患の遺伝子検査及びそれを利用した確定診断等が可能であることが判明した。以下の発明は当該知見ないし成果に基づく。
［１］被検査イヌから採取された核酸検体について、以下の（１）の変異又は（２）の変異、或いは以下の（１）の変異と（２）の変異の両方、を検出するステップを含む、遺伝性消化管腫瘍症の検査法：
（１）APC遺伝子のc.462A>T変異；
（２）APC遺伝子のc.463A>T変異。
［２］（１）の変異又は（２）の変異が検出された場合、或いは（１）の変異と（２）の変異の両方が検出された場合に遺伝性消化管腫瘍症を発症していると判定する、［１］に記載の検査法。
［３］（１）の変異又は（２）の変異が検出された場合、或いは（１）の変異と（２）の変異の両方が検出された場合に遺伝性消化管腫瘍症を発症するリスクが高いと判定する、［１］に記載の検査法。
［４］被検査イヌがジャックラッセルテリアである、［１］〜［３］のいずれか一項に記載の検査法。
［５］APC遺伝子のc.462A>T変異を検出するための核酸であって、前記変異位置を含む一定領域に相補的な配列を含み、前記領域に対して特異的にハイブリダイズする核酸を含む、遺伝性消化管腫瘍症の検査用試薬。
［６］APC遺伝子のc.463A>T変異を検出するための核酸であって、前記変異位置を含む一定領域に相補的な配列を含み、前記領域に対して特異的にハイブリダイズする核酸を含む、遺伝性消化管腫瘍症の検査用試薬。
［７］［５］に記載の試薬、及び／又は［６］に記載の試薬を含む、遺伝性消化管腫瘍症の検査用キット。
［８］APC遺伝子のc.463A>T変異又はc.463A>T変異からなる、遺伝性消化管腫瘍症マーカー。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】J.R.テリアの腫瘍組織のβカテニン免疫染色像。腫瘍組織におけるβカテニンの蓄積を調べた。左：胃管状乳頭状腺腫（幽門部）、右：胃管状乳頭状腺癌（幽門部）。
【図２】J.R.テリアの腫瘍組織のβカテニン免疫染色像。腫瘍組織におけるβカテニンの蓄積を調べた。左：直腸腺腫、右：直腸腺房腺癌。
【図３】βカテニン免疫染色結果のまとめ。βカテニンの核への蓄積を認めた腫瘍細胞（核陽性細胞）の割合を25％刻みでスコアリングした。
【図４】APC遺伝子のシークエンス解析の結果。罹患個体ではエクソン4に二箇所の点突然変異を認めた。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
１．遺伝性消化管腫瘍症の検査法
本発明の第１の局面はイヌの遺伝性消化管腫瘍症を検査する方法（以下、「本発明の検査法」と略称することがある）に関する。本発明者らの検討によって、消化管腫瘍症を引き起こす原因としてAPC遺伝子の二箇所の点突然変異が特定された。本発明は当該遺伝子変異を検出対象とする。具体的には、本発明の検査法では、被検査イヌから採取された核酸検体について、以下の（１）の変異又は（２）の変異、或いは以下の（１）の変異と（２）の変異の両方を検出する。
（１）APC遺伝子のc.462A>T変異
（２）APC遺伝子のc.463A>T変異
【０００８】
慣例に従い、本明細書では、翻訳開始コドン基準の番号、即ち、翻訳開始コドンのAを1番目（1位塩基）として番号付けした位置で各変異位置を特定する。
【０００９】
野生型（正常型）のAPC遺伝子（Gene ID: 479139）のmRNAの配列を配列番号１（NCBI GenBank ACCESSION XM_014111995, DEFINITION PREDICTED: Canis lupus familiaris adenomatous polyposis coli (APC), mRNA.）に、同アミノ酸配列を配列番号２（NCBI GenPept ACCESSION XP_013967470, DEFINITION PREDICTED: LOW QUALITY PROTEIN: adenomatous polyposis coli protein ［Canis lupus familiaris］.）にそれぞれ示す。
【００１０】
c.462A>T変異はAPC遺伝子の462位塩基（配列番号１の配列では533番目の塩基）のAからTへの置換を表す。この変異は154番アミノ酸（グルタミン酸：Glu）のアスパラギン酸（Asp）への置換（ミスセンス変異）をもたらす。一方、c.463A>T変異はAPC遺伝子の463位塩基（配列番号１の配列では534番目の塩基）のAからTへの置換を表す。この変異は155番アミノ酸（リジン：Lys）の停止コドンへの置換（ナンセンス変異）をもたらす。
【００１１】
本発明では、核酸検体が特定の変異を有するか否か、即ち、特定の塩基位置に関して野生型であるか変異型であるかを明らかにするために「変異の検出」が行われる。従って、変異の有無を調べるための検出ないし測定を「変異の検出」又は「変異を検出する」等と表現する。
【００１２】
本発明の検査法では、まず、被検査イヌから採取された核酸検体を用意する。核酸検体は被検査イヌの血液、唾液、リンパ液、尿、汗、皮膚細胞、粘膜細胞、毛髪、手術により採取あるいは切除した組織等から公知の抽出方法、精製方法を用いて調製することができる。検出対象の変異位置を含むものであれば任意の長さのゲノムDNAを核酸検体として用いることができる。
【００１３】
被検査イヌは特に限定されないが、好ましい被検査イヌの犬種はJ.R.テリアである。また、後述の通り、本発明の検査法は遺伝性消化管腫瘍症の診断に有用であることから、遺伝性消化管腫瘍症を発症していることが疑われるイヌ（典型的には消化管腫瘍症の症状が認められるイヌ）は好適な被検査イヌである。遺伝性消化管腫瘍症を発症していることが疑われるイヌを被検査イヌとした場合、典型的には、本発明の検査法は遺伝性消化管腫瘍症の診断に利用される。
【００１４】
他方、本発明の検査法は遺伝性消化管腫瘍症を発症するリスクの判定（リスク診断）にも有用である。従って、健常犬、即ち、消化管腫瘍症を発症していないイヌも好適な被検査イヌといえる。健常犬を被検査イヌとした場合、典型的には、本発明の検査法は、遺伝性消化管腫瘍症のリスク診断に利用される。尚、ここでの「健常犬」は、遺伝性消化管腫瘍症を発症していないとの意味で「健常」であり、他の疾患を発症しているか否かは問わない。
【００１５】
変異の検出手段は特に限定されるものではなく例えばアレル特異的プライマー（及びプローブ）を用い、PCR法による増幅、及び増幅産物の変異を蛍光又は発光によって検出する方法や、PCR(polymerase chain reaction)法を利用したPCR-RFLP(restriction fragment length polymorphism：制限酵素断片長多型)法、PCR-SSCP(single strand conformation polymorphism：単鎖高次構造多型)法(Orita,M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 86, 2766-2770(1989)等)、PCR-SSO(specific sequence oligonucleotide：特異的配列オリゴヌクレオチド)法、PCR-SSO法とドットハイブリダイゼーション法を組み合わせたASO(allele specific oligonucleotide：アレル特異的オリゴヌクレオチド)ハイブリダイゼーション法(Saiki, Nature, 324, 163-166(1986)等)、TaqMan（登録商標、Roche Molecular Systems社）-PCR法(Livak, KJ, Genet Anal,14,143(1999),Morris, T. et al., J. Clin. Microbiol.,34,2933(1996))に代表されるリアルタイムPCR法、Invader（登録商標、Third Wave Technologies社）法(Lyamichev V et al., Nat Biotechnol,17,292(1999))、FRET（Fluorescence Resonance Energy Transfer）を利用した方法（Heller, Academic Press Inc, pp. 245-256(1985)、Cardullo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8790-8794(1988)、国際公開第99/28500号パンフレット、特開2004-121232号公報など）、ASP-PCR（Allele Specific Primer-PCR)法（国際公開第01/042498号公報など）、プライマー伸長法を用いたMALDI-TOF/MS(matrix)法(Haff LA, Smirnov IP, Genome Res 7,378(1997))、RCA(rolling cycle amplification)法(Lizardi PM et al., Nat  Genet 19,225(1998))、DNAチップ又はマイクロアレイを用いた方法(Wang DG et al., Science 280,1077(1998)等)、プライマー伸長法、サザンブロットハイブリダイゼーション法、ドットハイブリダイゼーション法（Southern,E., J. Mol. Biol. 98, 503-517(1975)）等、公知の方法を採用できる。さらに、検出対象の変異位置を直接シークエンスすることにしてもよい。尚、これらの方法を任意に組み合わせて変異を検出してもよい。また、PCR法又はPCR法を応用した方法などの核酸増幅法により核酸試料を予め増幅（核酸試料の一部領域の増幅を含む）した後、上記いずれかの検出法を適用することもできる。
【００１６】
多数の核酸検体の変異を検出する場合にはアレル特異的PCR法、アレル特異的ハイブリダイゼーション法、TaqMan（登録商標）-PCR法、Invader法、FRETを利用した方法、ASP-PCR法、プライマー伸長法を用いたMALDI-TOF/MS(matrix)法、RCA(rolling cycle amplification)法、又はDNAチップ又はマイクロアレイを用いた方法等、多数の検体を比較的短時間で検出可能な検出法を用いることが特に好ましい。
【００１７】
以上の方法では、各方法に応じたプローブやプライマー等の核酸（本発明において「変異検出用核酸」ともいう）が使用される。プローブとして利用される変異検出用核酸の例としては、検出対象の変異位置を含む染色体領域（部分染色体領域）に特異的にハイブリダイズする核酸を挙げることができる。検出対象の変異がc.462A>T変異であれば、462位を含む染色体領域を標的としてプローブを設計すればよい。c.463A>T変異についても同様である。ここでの「部分染色体領域」の長さは、例えば16〜500塩基長、好ましくは18〜200塩基長、さらに好ましくは20〜50塩基長である。また、当該核酸は好ましくは部分染色体領域に相補的な配列を有するが、特異的なハイブリダイゼーションに支障のない限り、多少のミスマッチがあってもよい。ミスマッチの程度としては、1〜数個、好ましくは1〜3個、更に好ましくは1〜2個である。ここでの「特異的なハイブリダイゼーション」とは、核酸プローブによる検出の際に通常採用されるハイブリダイゼーション条件（好ましくはストリンジェントな条件）の下、標的の核酸（部分染色体領域）に対してハイブリダイズする一方で、他の核酸との間にクロスハイブリダイゼーションを有意に生じないことを意味する。尚、当業者であれば例えばMolecular Cloning（Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)を参考にしてハイブリダイゼーション条件を容易に設定可能である。
【００１８】
プライマーとして利用される変異検出用核酸の例としては、検出対象の変異位置を含む染色体領域（部分染色体領域）に相補的な配列を有し、当該変異部分を含むDNAフラグメントを特異的に増幅できるように設計された核酸を挙げることができる。プライマーとして利用される変異検出用核酸の他の例として、検出対象の変異位置がいずれかの塩基である場合にのみ当該変異位置を含むDNAフラグメントを特異的に増幅するように設計されたプライマーペアを挙げることができる。より具体的には、検出対象の変異位置を含むDNAフラグメントを特異的に増幅するように設計されたプライマーペアであって、変異位置がいずれかの塩基であるアンチセンス鎖の当該変異位置を含む染色体領域（部分染色体領域）に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマーと、センス鎖の一部領域（変異位置の近傍領域）に対して特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマーとからなるプライマーペアを例示することができる。ここで、増幅されるDNAフラグメントの長さはその検出に適した範囲で適宜設定され例えば15〜1000塩基長、好ましくは20〜500塩基長、更に好ましくは30〜200塩基長である。尚、プローブの場合と同様、プライマーとして利用される変異検出用核酸についても、増幅対象（鋳型）に特異的にハイブリダイズし、目的のDNAフラグメントを増幅することができる限り、鋳型となる配列に対して多少のミスマッチがあってもよい。ミスマッチの程度としては、1〜数個、好ましくは1〜3個、更に好ましくは1〜2個である。
【００１９】
変異検出用核酸（プローブ、プライマー）には、検出法に応じて適宜DNA、RNA、ペプチド核酸（PNA: Peptide nucleic acid)等が用いられる。変異検出用核酸の塩基長はその機能が発揮される長さであればよく、プローブとして用いられる場合の塩基長の例としては16〜500塩基長、好ましくは18〜200塩基長、さらに好ましくは20〜50塩基長である。他方、プライマーとして用いられる場合の塩基長の例としては10〜50塩基長、好ましくは15〜40塩基長、更に好ましくは15〜30塩基長である。
【００２０】
変異検出用核酸（プローブ、プライマー）はホスホジエステル法など公知の方法によって合成することができる。尚、変異検出用核酸の設計、合成等に関しては成書（例えばMolecular Cloning，Third Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press, New YorkやCurrent protocols in molecular biology（edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987））を参考にすることができる。
【００２１】
本発明における変異検出用核酸を予め標識物質で標識しておくことができる。このような標識化核酸を用いることにより、例えば、増幅産物の標識量を指標として変異を検出することができる。また、変異型の遺伝子における部分DNA領域に特異的なプローブと、野生型の遺伝子における部分DNA領域に特異的なプローブを異なる標識物質で標識しておけば、増幅産物から検出される標識物質及び標識量によって、変異の有無を判別できる。
【００２２】
変異検出用核酸の標識に用いられる標識物質としてはFAMTM（6-carboxyfluorescein）、VICTM、TETTM（tetrachlorofluorescein）、NEDTM、HEXTM、CAL Fluor Gold 540、CAL Fluor Orange 560（CFO）、CAL Fluor Red 590、CAL Fluor Red 610、CAL Fluor Red 635、Quasar 570、Quasar 670、Quasar 705、T(JOETM）、7-AAD、Alexa Fluor（登録商標）488、Alexa Fluor（登録商標）350、Alexa Fluor（登録商標）546、Alexa Fluor（登録商標）555、Alexa Fluor（登録商標）568、Alexa Fluor（登録商標）594、Alexa Fluor（登録商標）633、Alexa Fluor（登録商標）647、CyTM 2、DsRED、EGFP、EYFP、FITC、PerCPTM、R-Phycoerythrin、Propidium Iodide、AMCA、DAPI、ECFP、MethylCoumarin、Allophycocyanin（APC）、CyTM 3、CyTM 5、Rhodamine-123、Tetramethylrhodamine、テキサスレッド（Texas Red（登録商標））、PE、PE-CyTM5、PE-CyTM5.5、PE-CyTM7、APC-CyTM7、オレゴングリーン（Oregon Green）、カルボキシフルオレセイン、カルボキシフルオレセインジアセテート、量子ドットなどの蛍光色素、32P、131I、125Iなどの放射性同位元素、ビオチンを例示でき、標識方法としてはアルカリフォスファターゼ及びT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いた5'末端標識法、T4 DNAポリメラーゼやKlenow断片を用いた3'末端標識法、ニックトランスレーション法、ランダムプライマー法（Molecular Cloning，Third Edition，Chapter 9，Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）などを例示できる。
【００２３】
変異検出用核酸を不溶性支持体に固定化した状態で用いることもできる。固定化に使用する不溶性支持体をチップ状、ビーズ状などに加工しておけば、これら固定化核酸を用いて変異の検出をより簡便に行うことができる。
【００２４】
本発明の検査法はイヌの遺伝性消化管腫瘍症の確定診断（第１態様）及びリスク診断（第２態様）に利用することができる。
【００２５】
＜遺伝性消化管腫瘍症の確定診断（第１態様）＞
この態様の場合、（１）の変異（即ち、APC遺伝子のc.462A>T変異）又は（２）の変異（即ち、APC遺伝子のc.463A>T変異）が検出された場合、或いは（１）の変異と（２）の変異の両方が検出された場合に遺伝性消化管腫瘍症を発症していると判定する。このように、客観的指標、即ち、特定の遺伝子変異の有無に基づく判定が行われる。従って、獣医療の現場において、発症した個体に対して正確かつ信頼度の高い確定診断が可能になり、適切な治療を行うことができる。また、科学的な根拠に基づいた診療を可能にし、獣医療の進歩にも貢献できる。
【００２６】
＜リスク診断（第２態様）＞
この態様の場合、（１）の変異又は（２）の変異が検出された場合、或いは（１）の変異と（２）の変異の両方が検出された場合に遺伝性消化管腫瘍症を発症するリスク（発症の可能性ないし易罹患性）が高いと判定する。第１の態様と同様、この態様においても客観的指標に基づき判定することから、正確かつ信頼度の高いリスク診断が可能となる。この態様の検査法がもたらす情報、即ちリスク情報は、例えば、動物繁殖業者によって利用されることが想定される。周知の通り純血種には遺伝性疾患が多いことから、現在、繁殖段階で遺伝性疾患を減少させる取組みがされている。JKC（一般社団法人ジャパン  ケネル  クラブ）が発行するイヌの血統証明書には、股関節形成不全症、肘関節異型性症といった代表的なイヌの遺伝性疾患について、祖先犬の疾患の評価結果が記載されるようになった。また、繁殖業者の中では、今後、この取組みが他の遺伝性疾患についても適用されていくと予想され、J.R.テリアの本疾患についても適用される可能性が十分にある。そこで、繁殖に用いている個体が異常遺伝子を保有していないかを動物繁殖業者が検査ないし確認する目的で本発明の検査法を利用することが想定される。
【００２７】
一方、この態様の検査法がもたらす情報（リスク情報）の利用形態として、ペット保険（動物医療保険）に関連した利用も想定される。近年、動物のペット保険（動物医療保険）の加入者が増加しており、市場は急激に拡大し、現在、10社以上が参入している。本疾患の遺伝子検査を受診すること（特にJ.R.テリアの場合）が加入条件となる可能性も考えられる。
【００２８】
尚、リスク情報は遺伝性消化管腫瘍症の予防や早期診断にも役立つ。
【００２９】
２．遺伝性消化管腫瘍症の検査用試薬及びキット
本発明の第２の局面は、イヌの遺伝性消化管腫瘍症の検査に用いられる試薬及びキットを提供する。本発明の試薬は、APC遺伝子のc.462A>T変異を検出するための核酸、又はAPC遺伝子のc.463A>T変異を検出するための核酸からなる。
【００３０】
本発明の試薬である変異検出用核酸は、それが適用される検出法（上述したアリル特異的核酸等を用いたPCR法を利用する方法、PCR-RFLP法、PCR-SSCP法、TaqMan（登録商標）-PCR法、Invader（登録商標）法、DigiTag2法等）に応じて適宜設計される。変異検出用核酸の詳細については既述の通りであるが、キットの成分として利用可能な変異検出用核酸又は変異検出用核酸のセットの具体例を以下に示す。
(1)変異位置の塩基がTである、APC遺伝子の染色体領域（部分染色体領域）に相補的な配列を有する非標識又は標識核酸
(2)変異位置の塩基がAである、APC遺伝子の染色体領域（部分染色体領域）に相補的な配列を有する非標識又は標識核酸
(3)(1)の核酸と(2)の核酸との組合せ
(4)変異位置の塩基がTである場合にのみ、該変異部位を含むDNAフラグメントを特異的に増幅するように設計された核酸セット
(5)変異位置の塩基がAである場合にのみ、該変異部位を含むDNAフラグメントを特異的に増幅するように設計された核酸セット
(6)(4)の核酸セットと(5)の核酸セットとの組合せ
(7)変異位置を含むDNAフラグメントを特異的に増幅するように設計された核酸セットであって、変異位置の塩基がTである、当該変異位置を含む、APC遺伝子の染色体領域（部分染色体領域）に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマー、及び／又は変異位置の塩基がAである、当該変異位置を含む、APC遺伝子の染色体領域（部分染色体領域）に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマーと、当該部分染色体領域の近傍領域に対して特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマーと、からなる核酸セット
【００３１】
本発明のキットには、本発明の試薬（変異検出用核酸）が含まれる。c.462A>T変異用の試薬とc.463A>T変異用の試薬の両方をキットに含めることにしてもよい。変異検出用核酸を使用する際（即ち変異の検出の際）に必要な試薬（DNAポリメラーゼ、制限酵素、緩衝液、発色試薬など）や容器、器具等を本発明のキットに含めてもよい。尚、通常、本発明のキットには取り扱い説明書が添付される。
【実施例】
【００３２】
J.R.テリアに発生する消化管腫瘍が他犬種では見られない特徴的な病態を示すことから、犬種特異的な遺伝性疾患であることを想定するとともに、APC遺伝子を原因遺伝子とするヒトの遺伝性疾患である家族性大腸腺腫症（FAP）に類似していることに着目した。FAPは、大腸に多発性の腺腫が発生する常染色体優性遺伝症候群であり、腺腫を放置するとほぼ100％腺癌が発生する。FAPではAPC遺伝子の変異により古典的Wntシグナル伝達経路の活性化が起き、βカテニンの蓄積が起こるとされている。正常細胞ではβカテニンはAPCをはじめとするこれらのタンパクによって分解されて低値を保つ。Wntがリガントとして受容体に結合するとこの分解が抑制されβカテニンは分解されず、核内で遺伝子発現に関与する転写因子として働き始め、その結果、細胞増殖などが生ずる。このように、正常細胞ではWntによって転写が調節を受け、バランスが保たれている。ここで、調節に関わるAPCに変異が入ると、βカテニンの分解が阻害され、リガンドがない状態でも恒常的に伝達経路の活性化が起こる。また、この変化は組織学的にはβカテニンの蓄積として捉えることができる。そこで、J.R.テリアの腫瘍においてもβカテニン蓄積を認めるか、免疫染色により検討した。その結果、腺腫においては正常細胞で認められる細胞膜での局在と同時に細胞質への蓄積が顕著であり、また核への蓄積も認められた（図１左）。腺癌では核への蓄積が認められる腫瘍細胞（核陽性細胞）がさらに増加した（図１右）。一方、大腸においても同様の変化が認められた（図２）。
【００３３】
図３の表にまとめたように、過形成では細胞膜の陽性のみが認められ、腺腫・腺癌においては細胞質及び核へのβカテニンの蓄積が認められた。また、特に大腸腺癌においては核の陽性率が高く、50％以上を占める腫瘍が多く認められた。これらの結果はAPC遺伝子の変異が存在することを示唆する。
【００３４】
以上の結果を踏まえ、罹患犬と非罹患犬を対象にAPC遺伝子の解析を行うことにした。
Ａ．方法
１．DNA抽出
(1)遺伝性消化管腫瘍を罹患したJ.R.テリア5頭および他疾患で来院したJ.R.テリア6頭から血液を2 ml採取した。
(2)採取した血液はEDTA・2NA（エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム）入りの採血管（テルモ社）に入れ、抗凝固処理を施した。
(3)Wizard（登録商標）Genomic DNA Purification Kit（Promega社）でDNAを抽出した。
【００３５】
２．DNA塩基配列の解析
上記方法で調製したDNA試料を用い、APC遺伝子のコーディング領域を解析した。具体的には、APC遺伝子のコーディング領域全域を29領域に分け、それぞれの領域をPCRにより増幅し、ダイレクトシークエンス法により塩基配列を決定した。以下では、エクソン4を含む領域の解析方法を示す。他の領域についても同様に解析した。
【００３６】
(1)TaKaRa Ex Taq Hot Start Version（タカラバイオ社）を用いてPCR（ポリメラーゼ連鎖反応、Polymerase Chain Reaction）を実施した。血液から抽出したDNAをテンプレート（鋳型）に、イヌAPC遺伝子のエクソン4を含む385 bpの領域をPCRにて増幅した。イヌAPC遺伝子のエクソン4を含む領域をPCRで増幅するため、フォワードプライマー（プライマー配列：5’-agtcccaccttcaaaaatcc-3’：配列番号３）はイントロン3に、リバースプライマー（プライマー配列：5’-aactaaaaatgcaattatcttgaatg -3’：配列番号４）はイントロン4に設計した。PCRは、Thermal Cycler Dice（Model TP600）（タカラバイオ社）を用いて、以下の条件で実施した。
【００３７】
＜反応液＞
Taq酵素  0.15 μl
10X Ex Taq Buffer (Mg2+ plus)  2.0 μl
dNTPs  2.0 μl
フォワードプライマー (15 μM)  0.2 μl
リバースプライマー (15 μM)   0.2 μl
蒸留水  14.45 μl
テンプレート  1.0 μl
（総容量  20.0 μl）
【００３８】
＜増幅条件＞
94℃・5分：1サイクル
95℃・30秒 → 58℃・30秒 → 72℃・30秒：35サイクル
72℃・5分：1サイクル
【００３９】
(2)PCR産物はエチジウムブロマイドを含んだ3％アガロースゲルで電気泳動した（100V、30分）。
(3)UVトランスイルミネーター（UVP社）を用いて、電気泳動後のアガロースゲルに365nm波長の紫外線を照射し、385 bpのDNAを含むゲルを選択的に切り出した。
(4)切り出したゲルからQIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN社）でDNAを抽出した。
(5)Big Dye（登録商標） Terminator v3.1 Cycle sequencing Kit（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて、ゲルから抽出したDNAをテンプレートにシーケンス反応を行った。シーケンス反応は、T100 Thermal Cycler（バイオ・ラッド社）を用いて、以下の条件で実施した。
【００４０】
＜反応液＞
Big Dye  1.0 μl
5X Buffer  4.0 μl
テンプレート  5.0 μl
プライマー(フォワードプライマーまたはリバースプライマー) (1 μM)  5.0 μl
滅菌蒸留水  5.0 μl
（総容量  20.0 μl）
【００４１】
＜反応条件＞
96℃・1分：1サイクル
96℃・10秒 → 50℃・5秒 → 60℃・4分：25サイクル
4℃
【００４２】
(6)シーケンス反応後、反応液からDNAを精製した。
(7)精製したDNAにHi-Di ホルムアミド（ThermoFisher Scientific社）を10.0 μl加え、T100 Thermal Cycler（バイオ・ラッド社）を用いて95℃で2分間処理した後、4℃に冷却した。
(8)ABI Prism 3130 Genetic Analyzer（アプライドバイオシステム社）を用いてDNAの塩基配列を解析した。
【００４３】
Ｂ．結果
上記の解析を行ったところ、消化管腫瘍（胃あるいは大腸の腺癌）を罹患したJ.R.テリア5頭全頭でAPC遺伝子のエクソン4に遺伝子変異（c.462A>Tおよびc.463A>T）が認められた（図４）。一方、消化管腫瘍以外の疾患のJ.R.テリア6頭では上記の変異は認められなかった。
【００４４】
Ｃ．まとめ
消化管腫瘍を罹患したJ.R.テリアに特有の遺伝子変異（生殖細胞系列変異）を特定することに成功し、本疾患がAPC遺伝子を原因遺伝子とする遺伝性疾患であることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明によれば、特定の遺伝子変異の有無という客観的指標に基づき、イヌの遺伝性消化管腫瘍症の確定診断及びリスク診断が可能になる。前者は罹患犬の適切な治療を可能にする。他方、後者がもたらす情報は例えば動物繁殖業及びペット保険に有用である。このように、本発明は獣医療分野及びペット産業の分野で利用可能である。
【００４６】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【配列表フリーテキスト】
【００４７】
配列番号３：人工配列の説明：プライマー
配列番号４：人工配列の説明：プライマー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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