(57)【要約】【課題】本発明の課題は、高い細胞数及び高い血管数を示す細胞構造体を提供することを可能とする生体親和性高分子多孔質体及びその製造方法、並びに生体親和性高分子ブロック及び細胞構造体を提供することである。【解決手段】本発明によれば、生体親和性高分子多孔質体の断面構造の画像の１．５ｍｍ平方視野に対して２次元フーリエ変換を施すことにより得られる２次元フーリエ変換画像に対して、２次元フーリエ変換画像のｙ軸下端から、画像ピクセルサイズの１０分の１ピクセル幅について、ｘ軸座標辺りの輝度値を平均してｙ軸にプロットしたラインプロファイルを作成した場合に、ラインプロファイル上のｘが最大値の半分のところにピークが存在しない、生体親和性高分子多孔質体、生体親和性高分子ブロック及び細胞構造体が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体親和性高分子多孔質体の断面構造の画像の１．５ｍｍ平方視野に対して２次元フーリエ変換を施すことにより得られる２次元フーリエ変換画像に対して、２次元フーリエ変換画像のｙ軸下端から、画像ピクセルサイズの１０分の１ピクセル幅について、ｘ軸座標辺りの輝度値を平均してｙ軸にプロットしたラインプロファイルを作成した場合に、ラインプロファイル上のｘが最大値の半分のところにピークが存在しない、生体親和性高分子多孔質体。
【請求項２】
ラインプロファイルのベースのバラつき値をσとした場合、２次元フーリエ変換画像のラインプロファイル上のｘが最大値の半分のところに、２．０σ以上のピークが検出されない場合を、ピークが存在しないとする、請求項１に記載の生体親和性高分子多孔質体。
【請求項３】
生体親和性高分子が、ゼラチン、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、プロネクチン、ラミニン、テネイシン、フィブリン、フィブロイン、エンタクチン、トロンボスポンジン、レトロネクチン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸・グリコール酸コポリマー、ヒアルロン酸、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、コンドロイチン、セルロース、アガロース、カルボキシメチルセルロース、キチン、又はキトサンである、請求項１又は２に記載の生体親和性高分子多孔質体。
【請求項４】
生体親和性高分子が、リコンビナントゼラチンである、請求項１から３の何れか一項に記載の生体親和性高分子多孔質体。
【請求項５】
リコンビナントゼラチンが、
式：Ａ−［（Gly−Ｘ−Ｙ）n］m−Ｂ
（式中、Ａは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎは３〜１００の整数を示し、ｍは２〜１０の整数を示す。なお、n個のGly-X-Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。）で示される、請求項４に記載の生体親和性高分子多孔質体。
【請求項６】
リコンビナントゼラチンが、
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ生体親和性を有するタンパク質；又は
（ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ生体親和性を有するタンパク質；
の何れかである、請求項４に記載の生体親和性高分子多孔質体。
【請求項７】
リコンビナントゼラチンが、配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ生体親和性を有するタンパク質である、請求項４に記載の生体親和性高分子多孔質体。
【請求項８】
リコンビナントゼラチンが、配列番号１に記載のアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ生体親和性を有するタンパク質である、請求項４に記載の生体親和性高分子多孔質体。
【請求項９】
多孔質体中の生体親和性高分子が熱、紫外線または酵素により架橋されている、請求項１から８の何れか一項に記載の生体親和性高分子多孔質体。
【請求項１０】
請求項１から９の何れか一項に記載の生体親和性高分子多孔質体を粉砕することにより得られる生体親和性高分子ブロック。
【請求項１１】
請求項１０に記載の生体親和性高分子ブロックと、少なくとも一種類の細胞とを含み、複数個の細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックが配置されている、細胞構造体。
【請求項１２】
生体親和性高分子ブロック一つの大きさが２０μｍ以上２００μｍ以下である、請求項１１に記載の細胞構造体。
【請求項１３】
生体親和性高分子ブロック一つの大きさが５０μｍ以上１２０μｍ以下である、請求項１１又は１２に記載の細胞構造体。
【請求項１４】
厚さ又は直径が４００μｍ以上３ｃｍ以下である、請求項１１から１３の何れか一項に記載の細胞構造体。
【請求項１５】
細胞１個当り０．００００００１μｇ以上１μｇ以下の生体親和性高分子ブロックを含む、請求項１１から１４の何れか一項に記載の細胞構造体。
【請求項１６】
血管新生因子を含む、請求項１１から１５の何れか一項に記載の細胞構造体。
【請求項１７】
細胞が、万能細胞、体性幹細胞、前駆細胞および成熟細胞からなる群から選択される細胞である、請求項１１から１６の何れか一項に記載の細胞構造体。
【請求項１８】
細胞が、非血管系の細胞のみである、請求項１１から１７の何れか一項に記載の細胞構造体。
【請求項１９】
細胞が、非血管系の細胞および血管系の細胞の両方を含む、請求項１１から１７の何れか一項に記載の細胞構造体。
【請求項２０】
細胞構造体において、中心部の血管系の細胞の面積が、周辺部の血管系の細胞の面積より多い領域を有する、請求項１９に記載の細胞構造体。
【請求項２１】
前記中心部の血管系の細胞の割合が、血管系の細胞の全面積に対し、６０％〜１００％である領域を有する請求項２０に記載の細胞構造体。
【請求項２２】
細胞構造体の、中心部の血管系の細胞密度が、１．０×１０−４cells/μｍ３以上である領域を有する、請求項１９から２１の何れか一項の何れか一項に記載の細胞構造体。
【請求項２３】
細胞構造体の内部において血管形成されている、請求項１９から２２の何れか一項に記載の細胞構造体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体親和性高分子多孔質体の製造方法、生体親和性高分子多孔質体、生体親和性高分子ブロック並びに細胞構造体に関する。詳しくは、本発明は、高い細胞数及び高い血管数を示す細胞構造体を製造することが可能な生体親和性高分子多孔質体及びその製造方法、並びに前記生体親和性高分子多孔質体から得られる生体親和性高分子ブロック並びに細胞構造体に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、機能障害や機能不全に陥った生体組織・臓器の再生を図る再生医療の実用化が進められている。再生医療は、生体が持っている自然治癒能力だけでは回復できなくなった生体組織を、細胞、足場及び成長因子の三因子を使って元の組織と同じような形態や機能を再び作り出す新たな医療技術である。近年では、細胞を使った治療が徐々に実現されつつある。例えば、自家細胞を用いた培養表皮、自家軟骨細胞を用いた軟骨治療、間葉系幹細胞を用いた骨再生治療、筋芽細胞を用いた心筋細胞シート治療、角膜上皮シートによる角膜再生治療、及び神経再生治療などが挙げられる。これら新たな治療は、従来の人工物による代替医療（例えば、人工骨補填剤やヒアルロン酸注射など）とは異なり、生体組織の修復と再生を図るものであり、高い治療効果を得られる。実際、自家細胞を用いた培養表皮や培養軟骨などの製品が市販されてきた。
【０００３】
例えば、細胞シートを用いた心筋の再生においては、厚みのある組織を再生するには、細胞シートの多層構造体が必要であると考えられる。
さらに、特許文献１および特許文献２には、生体親和性を有する高分子ブロックと細胞とをモザイク状に３次元配置することによって製造される細胞３次元構造体が記載されている。この細胞３次元構造体においては、外部から細胞３次元構造体の内部への栄養送達が可能であり、十分な厚みを有するとともに、構造体中で細胞が均一に存在している。また、特許文献１の実施例においては、リコンビナントゼラチンや天然ゼラチン素材からなる高分子ブロックを用いて高い細胞生存活性が実証されており、特許文献２には、細胞３次元構造体を移植後に移植部位に、血管を形成し得ることが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２０１１／１０８５１７号公報
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１３／０７１４４１号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献１および２に開示されている細胞３次元構造体は、高い細胞生存活性および血管形成能を示しているが、より高い細胞生存活性および血管形成能を示す、生体親和性高分子ブロックおよび細胞構造体が望まれている。
【０００６】
そこで、本発明は、高い細胞数及び高い血管数を示す細胞構造体を提供することを可能とする生体親和性高分子多孔質体及びその製造方法を提供することを解決すべき課題とした。更に本発明は、前記生体親和性高分子多孔質体から得られる生体親和性高分子ブロック並びに細胞構造体を提供することを課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、（ａ）溶液内で最も液温の高い部分の温度と溶液内で最も液温の低い部分の温度との差が２．５℃以下であり、かつ、溶液内で最も液温の高い部分の温度が溶媒の融点以下で、生体親和性高分子の溶液を、未凍結状態に冷却する工程、（ｂ）工程（ａ）で得られた生体親和性高分子の溶液を凍結する工程、および（ｃ）工程（ｂ）で得られた凍結した生体親和性高分子を凍結乾燥する工程によって製造した生体親和性高分子多孔質体においては、多孔質のポアの大きさのばらつきが小さいこと、即ち、多孔質体の構造的均一性が高いことを見出した。更に、本発明者らはこのようにして得た生体親和性高分子多孔質体を用いて製造した細胞構造体が、高い細胞数及び高い血管数を示すことを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
【０００８】
即ち、本発明によれば、
（ａ）溶液内で最も液温の高い部分の温度と溶液内で最も液温の低い部分の温度との差が２．５℃以下であり、かつ、溶液内で最も液温の高い部分の温度が溶媒の融点以下で、生体親和性高分子の溶液を、未凍結状態に冷却する工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られた生体親和性高分子の溶液を凍結する工程、および
（ｃ）工程（ｂ）で得られた凍結した生体親和性高分子を凍結乾燥する工程
を含む、生体親和性高分子多孔質体の製造方法が提供される。
【０００９】
好ましくは、工程（ａ）において、凝固熱発生直前の、溶液内で最も液温の高い部分の温度と溶液内で最も液温の低い部分の温度との差が２．５℃以下である。
好ましくは、工程（ａ）において、溶液内で最も液温の低い部分の温度が、溶媒融点−５℃以下である。
【００１０】
本発明によればさらに、本発明の生体親和性高分子多孔質体の製造方法により製造される生体親和性高分子多孔質体が提供される。
【００１１】
本発明によればさらに、生体親和性高分子多孔質体の断面構造の画像の１．５ｍｍ平方視野に対して２次元フーリエ変換を施すことにより得られる２次元フーリエ変換画像に対して、２次元フーリエ変換画像のｙ軸下端から、画像ピクセルサイズの１０分の１ピクセル幅について、ｘ軸座標辺りの輝度値を平均してｙ軸にプロットしたラインプロファイルを作成した場合に、ラインプロファイル上のｘの最大値の半分のところに、ピークが存在しない、生体親和性高分子多孔質体が提供される。この生体親和性高分子多孔質体は、好ましくは、本発明の生体親和性高分子多孔質体の製造方法により製造されるものである。
好ましくは、ラインプロファイルのベースのバラつき値をσとした場合、ラインプロファイル上のｘの最大値の半分のところに、２．０σ以上のピークが検出されない場合を、ピークが存在しないとする。
【００１２】
好ましくは、生体親和性高分子は、ゼラチン、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、プロネクチン、ラミニン、テネイシン、フィブリン、フィブロイン、エンタクチン、トロンボスポンジン、レトロネクチン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸・グリコール酸コポリマー、ヒアルロン酸、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、コンドロイチン、セルロース、アガロース、カルボキシメチルセルロース、キチン、又はキトサンである。
【００１３】
好ましくは、生体親和性高分子は、リコンビナントゼラチンである。
好ましくは、リコンビナントゼラチンは、
式：Ａ−［（Gly−Ｘ−Ｙ）n］m−Ｂ
（式中、Ａは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎは３〜１００の整数を示し、ｍは２〜１０の整数を示す。なお、n個のGly-X-Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。）で示される。
【００１４】
好ましくは、リコンビナントゼラチンは、
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ生体親和性を有するタンパク質；又は
（ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ生体親和性を有するタンパク質；
の何れかである。
【００１５】
好ましくは、リコンビナントゼラチンは、配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ生体親和性を有するタンパク質である。
好ましくは、リコンビナントゼラチンは、配列番号１に記載のアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ生体親和性を有するタンパク質である。
【００１６】
好ましくは、多孔質体中の生体親和性高分子は熱、紫外線または酵素により架橋されている。
【００１７】
本発明によればさらに、本発明の生体親和性高分子多孔質体を粉砕することにより得られる生体親和性高分子ブロックが提供される。
【００１８】
本発明によればさらに、本発明の生体親和性高分子ブロックと、少なくとも一種類の細胞とを含み、複数個の細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックが配置されている、細胞構造体が提供される。
【００１９】
好ましくは、生体親和性高分子ブロック一つの大きさが２０μｍ以上２００μｍ以下である。
好ましくは、生体親和性高分子ブロック一つの大きさが５０μｍ以上１２０μｍ以下である。
【００２０】
好ましくは、本発明の細胞構造体の厚さ又は直径が４００μｍ以上３ｃｍ以下である。
好ましくは、本発明の細胞構造体は、細胞１個当り０．００００００１μｇ以上１μｇ以下の生体親和性高分子ブロックを含む。
【００２１】
好ましくは、本発明の細胞構造体は、血管新生因子を含む。
好ましくは、細胞は、万能細胞、体性幹細胞、前駆細胞および成熟細胞からなる群から選択される細胞である。
好ましくは、細胞は、非血管系の細胞のみである。
好ましくは、細胞は、非血管系の細胞および血管系の細胞の両方を含む。
【００２２】
好ましくは、細胞構造体において、中心部の血管系の細胞の面積が、周辺部の血管系の細胞の面積より多い領域を有する。
好ましくは、中心部の血管系の細胞の割合が、血管系の細胞の全面積に対し、６０％〜１００％である領域を有する。
【００２３】
好ましくは、細胞構造体の、中心部の血管系の細胞密度が、１．０×１０−４cells/μｍ３以上である領域を有する。
好ましくは、細胞構造体の内部において血管形成されている。
【発明の効果】
【００２４】
本発明による生体親和性高分子多孔質体の製造方法により製造される生体親和性高分子多孔質体を用いることによって製造した細胞構造体は、細胞構造体中において高い細胞数及び高い血管数を示すことができる。本発明により提供される細胞構造体によれば、より効果的な細胞移植治療を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、「ア」に記載した実験の液温プロファイルを示す。
【図２】図２は、「イ」に記載した実験の液温プロファイルを示す。
【図３】図２は、「ウ」に記載した実験の液温プロファイルを示す。
【図４】図４は、「エ」に記載した実験の液温プロファイルを示す。
【図５】図５は、「オ」に記載した実験の液温プロファイルを示す。
【図６】図６は、「カ」に記載した実験の液温プロファイルを示す。
【図７】図７は、「アア」に記載した実験の液温プロファイルを示す。
【図８】図８は、「イイ」に記載した実験の液温プロファイルを示す。
【図９】図９は、「ア」及び「イ」で得られたＣＢＥ３多孔質体の均一性評価（2次元フーリエ変換と軸方向パワースペクトル）を示す。
【図１０】図１０は、「ウ」及び「エ」で得られたＣＢＥ３多孔質体の均一性評価（2次元フーリエ変換と軸方向パワースペクトル）を示す。
【図１１】図１１は、「オ」及び「カ」で得られたＣＢＥ３多孔質体の均一性評価（2次元フーリエ変換と軸方向パワースペクトル）を示す。
【図１２】図１２は、「アア」及び「イイ」で得られたＣＢＥ３多孔質体の均一性評価（2次元フーリエ変換と軸方向パワースペクトル）を示す。
【図１３】図１３は、差温大ブロックAおよびBを用いたhMSCモザイク細胞塊における細胞数と血管の評価を示す。
【図１４】図１４は、差温大ブロックCを用いたhMSCモザイク細胞塊における細胞数と血管の評価を示す。
【図１５】図１５は、差温小ブロックEおよびFを用いたhMSCモザイク細胞塊における細胞数と血管の評価を示す。
【図１６】図１６は、差温大ブロックAおよびBを用いたhMSC+hECFCモザイク細胞塊における細胞数と血管の評価を示す。
【図１７】図１７は、差温小ブロックEおよびFを用いたhMSC+hECFCモザイク細胞塊における細胞数と血管の評価を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
（１）生体親和性高分子多孔質体の製造方法
本発明の生体親和性高分子多孔質体の製造方法は、
（ａ）溶液内で最も液温の高い部分の温度と溶液内で最も液温の低い部分の温度との差が２．５℃以下であり、かつ、溶液内で最も液温の高い部分の温度が溶媒の融点以下で、生体親和性高分子の溶液を、未凍結状態に冷却する工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られた生体親和性高分子の溶液を凍結する工程、および
（ｃ）工程（ｂ）で得られた凍結した生体親和性高分子を凍結乾燥する工程
を含む。
【００２７】
本発明の方法においては、生体親和性高分子の溶液を未凍結状態に冷却する際に、最も液温の高い部分の温度と溶液内で最も液温の低い部分の温度との差が２．５℃以下（好ましくは２．３℃以下、より好ましくは２．１℃以下）、つまり温度の差を小さくすることによって、得られる多孔質のポアの大きさのばらつきが少なくなる。なお最も液温の高い部分の温度と溶液内で最も液温の低い部分の温度との差の下限は特に限定されず、０℃以上であればよく、例えば０．１℃以上、０．５℃以上、０．８℃以上、又は０．９℃以上でもよい。これにより、本発明の方法で製造された多孔質体を用いて製造した生体親和性高分子ブロックを用いた細胞構造体は、高い細胞数及び高い血管数を示すという効果が達成される。
工程（ａ）の冷却は、例えば、水よりも熱伝導率の低い素材（好ましくは、テフロン(登録商標)）を介して冷却することが好ましく、溶液内で最も液温の高い部分は、冷却側から最も遠い部分と擬制することができ、溶液内で最も液温の低い部分は、冷却面の液温と擬制することができる。
【００２８】
好ましくは、工程（ａ）において、凝固熱発生直前の、溶液内で最も液温の高い部分の温度と溶液内で最も液温の低い部分の温度との差が２．５℃以下であり、より好ましくは２．３℃以下であり、さらに好ましくは２．１℃以下である。ここで「凝固熱発生直前の温度差」とは、凝固熱発生時の１秒前〜１０秒前の間で最も温度差が大きくなるときの温度差を意味する。
好ましくは、工程（ａ）において、溶液内で最も液温の低い部分の温度は、溶媒融点−５℃以下であり、より好ましくは溶媒融点−５℃以下かつ溶媒融点−２０℃以上であり、更に好ましくは溶媒融点−６℃以下かつ溶媒融点−１６℃以上である。なお、溶媒融点の溶媒とは、生体親和性高分子の溶液の溶媒である。
【００２９】
工程（ｂ）においては、工程（ａ）で得られた生体親和性高分子の溶液を凍結する。工程（ｂ）にて凍結されるための冷却温度は、特に制限されるものではなく、冷却する機器にもよるが、好ましくは、溶液内で最も液温の低い部分の温度より、３℃から３０℃低い温度であり、より好ましくは、５℃から２５℃低い温度であり、更に好ましくは、１０℃から２０℃低い温度である。
【００３０】
工程（ｃ）においては、工程（ｂ）で得られた凍結した生体親和性高分子を凍結乾燥する。凍結乾燥は、常法により行うことができ、例えば、溶媒の融点より低い温度で真空乾燥を行い、さらに室温（２０℃）で真空乾燥を行うことにより凍結乾燥を行うことができる。
【００３１】
（２）生体親和性高分子多孔質体
本発明によれば、上記した生体親和性高分子多孔質体の製造方法により製造される生体親和性高分子多孔質体が提供される。
さらに本発明によれば、生体親和性高分子多孔質体の断面構造の画像の１．５ｍｍ平方視野に対して２次元フーリエ変換を施すことにより得られる２次元フーリエ変換画像を対して、２次元フーリエ変換画像のｙ軸下端から、画像ピクセルサイズの１０分の１ピクセル幅について、ｘ軸座標辺りの輝度値を平均してｙ軸にプロットしたラインプロファイルを作成した場合に、ラインプロファイルのｘが最大値の半分のところにピークが存在しない、生体親和性高分子多孔質体が提供される。
【００３２】
ここで、「ラインプロファイルのｘが最大値の半分のところにピークが存在しない」とは、好ましくは、ラインプロファイルのベースのバラつき値をσとした場合、ラインプロファイルのｘが最大値の半分のところに、２．０σ以上のピークが検出されない場合を意味する。
【００３３】
生体親和性高分子多孔質体の断面構造の画像の取得方法は特に限定されないが、例えば、凍結切片を作製し、ＨＥ（ヘマトキシリン・エオシン））染色標本を作製することで取得することができる。得られた標本画像中の１．５ｍｍ四方視野に対して２次元フーリエ変換を施すことによって２次元フーリエ変換画像を取得する。２次元フーリエ変換は、例えば、画像解析ソフトＩｍａｇｅＪを用いて行うことができる。
【００３４】
得られた２次元フーリエ変換画像において、生体親和性高分子多孔質体に不均一な方向性が確認される場合は、特に軸方向に強いパワースペクトルが観測される。軸方向のパワースペクトルの有無については、２次元フーリエ変換画像のｙ軸下端についてラインプロファイルをとることで規定することができる。具体的には、ｙ軸下端から、画像ピクセルサイズの１０分の１ピクセル幅について、ｘ軸座標辺りの輝度値を平均してｙ軸にプロットすることによってラインプロファイルを作成する。ラインプロファイルの作成は、例えば、ソフトウェア「Gwyddion２．３１」を用いて行うことができる。上記の通り、輝度値を画像横方向に画像の端から端まで取得し、数値化（ラインスペクトル）することによって、パワースペクトルの有無を規定することができる。なお、ラインプロファイルのｘ座標とは、２次元フーリエ変換画像における左端をゼロとし、右に１ピクセル進んだ位置を０．０００００１とした。つまり、２次元フーリエ変換画像で左端から５１２ピクセル進んだ位置は、ファインプロファイル上でのｘ座標が０．０００５１２となる。
【００３５】
パワースペクトルの有無の判断基準は特に限定されないが、一例としては、得られたラインプロファイルのベースのバラつき値をσとした際、中心部分（ラインプロファイルのｘが最大値の半分のところ）に２．０σ以上のピークが検出されない場合、軸方向にパワースペクトルが存在しないと判断し、中心部分（ラインプロファイルのｘが最大値の半分のところ）に２．０σ以上のピークが検出される場合、軸方向にパワースペクトルが存在すると判断することができる。
【００３６】
本発明における「多孔質体」としては好ましくは、１ｍｍ角の材料として用意した場合に、本体内部に複数の「１０μｍ以上５００μｍ以下の空孔」を有する材料で、かつその本体中で空孔の占める体積が５０％以上の材料を使用することができるが、特に限定されるものではない。これらの材料において、前述した内部の空孔は、互いに連通していてもよく、一部もしくは全部の空孔が材料表面に開口していてもよい。
【００３７】
多孔質体の有する空孔の平均空孔サイズは、当該多孔質体の断面構造観察から得られる。まず、多孔質体の断面構造を薄切標本（例えばＨＥ染色標本）として用意する。その後、高分子で形成されている壁の内、明瞭な突起部については、最接突起部と繋ぎ、空孔を明瞭化させる。そうして得られた区切られた個々の空孔面積を計測し、その後、当該面積を円換算した場合の円直径を算出する。得られた円直径を空孔サイズとし、２０個以上の平均値を平均空孔サイズとすることができる。
【００３８】
本発明の生体親和性高分子多孔質体は、以下に説明する通り生体親和性高分子ブロック（粉砕されたもの）として使用できるが、粉砕せずに多孔質体として用いた場合でも細胞を均一に保持できる。従って、本発明の生体親和性高分子多孔質体は、培養担体、細胞移植担体としても有用である。
【００３９】
（３）生体親和性高分子
本発明で用いる生体親和性高分子は、生体に親和性を有するものであれば、生体内で分解されるか否かは特に限定されないが、生分解性材料で構成されることが好ましい。非生分解性材料として具体的には、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリウレタン、ポリプロピレン、ポリエステル、塩化ビニル、ポリカーボネート、アクリル、ステンレス、チタン、シリコーン、および、ＭＰＣ（2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）の群から選択される少なくとも１つの材料である。生分解性材料としては、具体的にはポリペプチド（例えば、以下に説明するゼラチン等）、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸・グリコール酸コポリマー（ＰＬＧＡ）、ヒアルロン酸、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、コンドロイチン、セルロース、アガロース、カルボキシメチルセルロース、キチン、および、キトサンの群から選択される少なくとも１つの材料である。上記の中でも、ポリペプチドが特に好ましい。尚、これら高分子材料には細胞接着性を高める工夫がなされていてもよく、具体的な方法としては１．「基材表面に対する細胞接着基質（フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン）や細胞接着配列（アミノ酸一文字表記で現わされる、ＲＧＤ配列、ＬＤＶ配列、ＲＥＤＶ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＲＹＶＶＬＰＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ配列、ＩＫＶＡＶ配列、ＬＲＥ配列、ＤＧＥＡ配列、及びＨＡＶ配列）ペプチドによるコーティング」、２．「基材表面のアミノ化、カチオン化」、３．「基材表面のプラズマ処理、コロナ放電による親水性処理」といった方法が利用され得る。
【００４０】
ポリペプチドの種類は生体親和性を有するものであれば特に限定されないが、例えば、ゼラチン、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、プロネクチン、ラミニン、テネイシン、フィブリン、フィブロイン、エンタクチン、トロンボスポンジン、レトロネクチンが好ましく、最も好ましくはゼラチン、コラーゲン、アテロコラーゲンである。本発明で用いるためのゼラチンとしては、天然ゼラチン、又はリコンビナントゼラチンが好ましい。さらに好ましくは、リコンビナントゼラチンである。ここでいう天然ゼラチンとは天然由来のコラーゲンより作られたゼラチンを意味する。リコンビナントゼラチンについては、本明細書中後記する。
【００４１】
本発明で用いる生体親和性高分子の親水性値「１／ＩＯＢ」値は、０から１．０が好ましい。より好ましくは、０から０．６であり、さらに好ましくは０から０．４である。ＩＯＢとは、藤田穆により提案された有機化合物の極性/非極性を表す有機概念図に基く、親疎水性の指標であり、その詳細は、例えば、"Pharmaceutical Bulletin", vol.2, 2, pp.163-173（1954）、「化学の領域」vol.11, 10, pp.719-725（1957）、「フレグランスジャーナル」, vol.50, pp.79-82（1981）等で説明されている。簡潔に言えば、全ての有機化合物の根源をメタン（ＣＨ４）とし、他の化合物はすべてメタンの誘導体とみなして、その炭素数、置換基、変態部、環等にそれぞれ一定の数値を設定し、そのスコアを加算して有機性値（ＯＶ）、無機性値（ＩＶ）を求め、この値を、有機性値をＸ軸、無機性値をＹ軸にとった図上にプロットしていくものである。有機概念図におけるＩＯＢとは、有機概念図における有機性値（ＯＶ）に対する無機性値（ＩＶ）の比、すなわち「無機性値（ＩＶ）／有機性値（ＯＶ）」をいう。有機概念図の詳細については、「新版有機概念図−基礎と応用−」（甲田善生等著、三共出版、２００８）を参照されたい。本明細書中では、ＩＯＢの逆数をとった「１／ＩＯＢ」値で親疎水性を表している。「１／ＩＯＢ」値が小さい（０に近づく）程、親水性であることを表す表記である。
【００４２】
本発明で用いる高分子の「１／ＩＯＢ」値を上記範囲とすることにより、親水性が高く、かつ、吸水性が高くなることから、栄養成分の保持に有効に作用し、結果として、本発明の細胞３次元構造体（モザイク細胞塊）における細胞の安定化・生存しやすさに寄与するものと推定される。
【００４３】
本発明で用いる生体親和性高分子がポリペプチドである場合は、Grand average of hydropathicity（GRAVY）値で表される親疎水性指標において、０．３以下、マイナス９．０以上であることが好ましく、０．０以下、マイナス７．０以上であることがさらに好ましい。Grand average of hydropathicity（GRAVY）値は、『Gasteiger E., Hoogland C., Gattiker A., Duvaud S., Wilkins M.R., Appel R.D., Bairoch A.;Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server;(In) John M. Walker (ed): The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press (2005). pp. 571-607』及び『Gasteiger E., Gattiker A., Hoogland C., Ivanyi I., Appel R.D., Bairoch A.; ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis.; Nucleic Acids Res. 31:3784-3788(2003).』の方法により得ることができる。
本発明で用いる高分子のＧＲＡＶＹ値を上記範囲とすることにより、親水性が高く、かつ、吸水性が高くなることから、栄養成分の保持に有効に作用し、結果として、本発明の細胞３次元構造体（モザイク細胞塊；モザイク状になっている細胞塊）における細胞の安定化・生存しやすさに寄与するものと推定される。
【００４４】
本発明で用いる生体親和性高分子は、架橋されているものでもよいし、架橋されていないものでもよいが、架橋されているものが好ましい。一般的な架橋方法としては、熱架橋、アルデヒド類（例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドなど）による架橋、縮合剤（カルボジイミド、シアナミドなど）による架橋、酵素架橋、光架橋、紫外線架橋、疎水性相互作用、水素結合、イオン性相互作用などが知られているが、本発明ではグルタルアルデヒドを使用しない架橋方法を使用することが好ましい。本発明で使用する架橋方法としては、さらに好ましくは熱架橋、紫外線架橋、又は酵素架橋であり、特に好ましくは熱架橋である。
【００４５】
酵素による架橋を行う場合、酵素としては、高分子材料間の架橋作用を有するものであれば特に限定されないが、好ましくはトランスグルタミナーゼおよびラッカーゼ、最も好ましくはトランスグルタミナーゼを用いて架橋を行うことができる。トランスグルタミナーゼで酵素架橋するタンパク質の具体例としては、リジン残基およびグルタミン残基を有するタンパク質であれば特に制限されない。トランスグルタミナーゼは、哺乳類由来のものであっても、微生物由来のものであってもよく、具体的には、味の素（株）製アクティバシリーズ、試薬として発売されている哺乳類由来のトランスグルタミナーゼ、例えば、オリエンタル酵母工業（株）製、Upstate USA Inc.製、Biodesign International製などのモルモット肝臓由来トランスグルタミナーゼ、ヤギ由来トランスグルタミナーゼ、ウサギ由来トランスグルタミナーゼなど、ヒト由来の血液凝固因子（Factor XIIIa、Haematologic Technologies， Inc.社）などが挙げられる。
【００４６】
架橋剤を使用しない架橋（例えば、熱架橋）を行う際の反応温度は、架橋ができる限り特に限定されないが、好ましくは、−１００℃〜５００℃であり、より好ましくは０℃〜３００℃であり、更に好ましくは５０℃〜３００℃であり、更に好ましくは１００℃〜２５０℃であり、更に好ましくは１２０℃〜２００℃である。
【００４７】
本発明における生体親和性高分子として、特に好ましくは、リコンビナントゼラチンを使用することができる。リコンビナントゼラチンとは遺伝子組み換え技術により作られたゼラチン類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくは蛋白様物質を意味する。本発明で用いることができるリコンビナントゼラチンは、コラーゲンに特徴的なＧｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列（Ｘ及びＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す）の繰り返しを有するものが好ましい（複数個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい）。好ましくは、細胞接着シグナルを一分子中に２配列以上含まれている。本発明で用いるリコンビナントゼラチンとしては、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するリコンビナントゼラチンを用いることができ、例えばEP1014176、US6992172、WO2004/85473、WO2008/103041等に記載のものを用いることができるが、これらに限定されるものではない。本発明で用いるリコンビナントゼラチンとして好ましいものは、以下の態様のリコンビナントゼラチンである。
【００４８】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンは天然のゼラチン本来の性能から、生体適合性に優れ、且つ天然由来ではないことで牛海綿状脳症（ＢＳＥ）などの懸念がなく、非感染性に優れている。また、本発明で用いるリコンビナントゼラチンは天然のものに比して均一であり、配列が決定されているので、強度、分解性においても後述の架橋等によってブレを少なく精密に設計することが可能である。
【００４９】
リコンビナントゼラチンの分子量は２ｋＤａ以上１００ｋＤａ以下であることが好ましい。より好ましくは２．５ｋＤａ以上９５ｋＤａ以下である。より好ましくは５ｋＤａ以上９０ｋＤａ以下である。最も好ましくは、１０ｋＤａ以上９０ｋＤａ以下である。
【００５０】
リコンビナントゼラチンは、コラーゲンに特徴的なＧｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列の繰り返しを有する。ここで、複数個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ において、Ｇｌｙはグリシン、Ｘ及びＹは、任意のアミノ酸（好ましくは、グリシン以外の任意のアミノ酸）を表す。コラーゲンに特徴的なＧＸＹ配列とは、ゼラチン・コラーゲンのアミノ酸組成および配列における、他のタンパク質と比較して非常に特異的な部分構造である。この部分においてはグリシンが全体の約３分の１を占め、アミノ酸配列では３個に１個の繰り返しとなっている。グリシンは最も簡単なアミノ酸であり、分子鎖の配置への束縛も少なく、ゲル化に際してのヘリックス構造の再生に大きく寄与している。Ｘ，Ｙであらわされるアミノ酸はイミノ酸（プロリン、オキシプロリン）が多く含まれ、全体の１０％〜４５％を占めることが好ましい。好ましくはその配列の８０％以上、更に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上のアミノ酸がＧＸＹの繰り返し構造であることが好ましい。
【００５１】
一般的なゼラチンは極性アミノ酸のうち、電荷を持つものと無電荷のものが１：１で存在する。ここで、極性アミノ酸とは具体的にシステイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、アルギニンを指し、このうち極性無電荷アミノ酸とはシステイン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシンを指す。本発明で用いるリコンビナントペプチドにおいては、構成する全アミノ酸のうち、極性アミノ酸の割合が１０〜４０％であり、好ましくは２０〜３０％である。且つ該極性アミノ酸中の無電荷アミノ酸の割合が５％以上２０％未満、好ましくは１０％未満であることが好ましい。さらに、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシン、システインのうちいずれか１アミノ酸、好ましくは２以上のアミノ酸を配列上に含まないことが好ましい。
【００５２】
一般にポリペプチドにおいて、細胞接着シグナルとして働く最小アミノ酸配列が知られている（例えば、株式会社永井出版発行「病態生理」Ｖｏｌ．９、Ｎｏ．７（１９９０年）５２７頁）。本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、これらの細胞接着シグナルを一分子中に２以上有することが好ましい。具体的な配列としては、接着する細胞の種類が多いという点で、アミノ酸一文字表記で現わされる、ＲＧＤ配列、ＬＤＶ配列、ＲＥＤＶ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＲＹＶＶＬＰＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ配列、ＩＫＶＡＶ配列、ＬＲＥ配列、ＤＧＥＡ配列、及びＨＡＶ配列の配列が好ましく、さらに好ましくはＲＧＤ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＩＫＶＡＶ配列及びＨＡＶ配列、特に好ましくはＲＧＤ配列である。ＲＧＤ配列のうち、好ましくはＥＲＧＤ配列である。細胞接着シグナルを有するリコンビナントゼラチンを用いることにより、細胞の基質産生量を向上させることができる。例えば、細胞として、間葉系幹細胞を用いた軟骨分化の場合には、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の産生を向上させることができる。
【００５３】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンにおけるＲＧＤ配列の配置として、ＲＧＤ間のアミノ酸数が０〜１００の間、好ましくは２５〜６０の間で均一でないことが好ましい。
【００５４】
この最小アミノ酸配列の含有量は、細胞接着・増殖性の観点から、タンパク質１分子中３〜５０個が好ましく、さらに好ましくは４〜３０個、特に好ましくは５〜２０個である。最も好ましくは１２個である。
【００５５】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンにおいて、アミノ酸総数に対するＲＧＤモチーフの割合は少なくとも０．４％であることが好ましく、リコンビナントゼラチンが３５０以上のアミノ酸を含む場合に、３５０のアミノ酸の各ストレッチが少なくとも１つのＲＧＤモチーフを含むことが好ましい。アミノ酸総数に対するＲＧＤモチーフの割合は、更に好ましくは少なくとも０．６％であり、更に好ましくは少なくとも０．８％であり、更に好ましくは少なくとも１．０％であり、更に好ましくは少なくとも１．２％であり、最も好ましくは少なくとも１．５％である。リコンビナントペプチド内のＲＧＤモチーフの数は、２５０のアミノ酸あたり、好ましくは少なくとも４、更に好ましくは６、更に好ましくは８、更に好ましくは１２以上１６以下である。ＲＧＤモチーフの０．４％という割合は、２５０のアミノ酸あたり、少なくとも１つのＲＧＤ配列に対応する。ＲＧＤモチーフの数は整数であるので、０．４％の特徴を満たすには、２５１のアミノ酸からなるゼラチンは、少なくとも２つのＲＧＤ配列を含まなければならない。好ましくは、本発明のリコンビナントゼラチンは、２５０のアミノ酸あたり、少なくとも２つのＲＧＤ配列を含み、より好ましくは２５０のアミノ酸あたり、少なくとも３つのＲＧＤ配列を含み、さらに好ましくは２５０のアミノ酸あたり、少なくとも４つのＲＧＤ配列を含む。本発明のリコンビナントゼラチンのさらなる態様としては、少なくとも４つのＲＧＤモチーフ、好ましくは６つ、より好ましくは８つ、さらに好ましくは１２以上１６以下のＲＧＤモチーフを含む。
【００５６】
また、リコンビナントゼラチンは部分的に加水分解されていてもよい。
【００５７】
好ましくは、本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、式：Ａ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎ］ｍ−Ｂで示されるものである。ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。ｍとして好ましくは２〜１０、好ましくは３〜５である。ｎは３〜１００が好ましく、１５〜７０がさらに好ましく、５０〜６５が最も好ましい。Ａは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。
【００５８】
より好ましくは、本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、  式：Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）６３］３−Ｇｌｙ（式中、６３個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、６３個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。なお、６３個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。）で示されるものである。
繰り返し単位には天然に存在するコラーゲンの配列単位を複数結合することが好ましい。ここで言う天然に存在するコラーゲンとは天然に存在するものであればいずれであっても構わないが、好ましくはＩ型、II型、III型、IV型、およびV型である。より好ましくは、I型、II型、III型である。別の形態によると、該コラーゲンの由来は好ましくは、ヒト、ウシ、ブタ、マウス、ラットである。より好ましくはヒトである。
【００５９】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンの等電点は、好ましくは５〜１０であり、より好ましくは６〜１０であり、さらに好ましくは７〜９．５である。
好ましくは、リコンビナントゼラチンは脱アミン化されていない。
好ましくは、リコンビナントゼラチンはテロペプタイドを有さない。
好ましくは、リコンビナントゼラチンは天然コラーゲンをコードする核酸により調製された実質的に純粋なコラーゲン用材料である。
【００６０】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンとしては、好ましくは、
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ生体親和性を有するタンパク質；又は
（ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上（より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上）の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ生体親和性を有するタンパク質；
の何れかである。
【００６１】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンとしては、さらに好ましくは、
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するタンパク質；又は
（ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上（より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上）の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するタンパク質；
の何れかである。
【００６２】
「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」における「１若しくは数個」とは、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個を意味する。
【００６３】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、当業者に公知の遺伝子組み換え技術によって製造することができ、例えばEP1014176A2、US6992172、WO2004-85473、WO2008/103041等に記載の方法に準じて製造することができる。具体的には、所定のリコンビナントゼラチンのアミノ酸配列をコードする遺伝子を取得し、これを発現ベクターに組み込んで、組み換え発現ベクターを作製し、これを適当な宿主に導入して形質転換体を作製する。得られた形質転換体を適当な培地で培養することにより、リコンビナントゼラチンが産生されるので、培養物から産生されたリコンビナントゼラチンを回収することにより、本発明で用いるリコンビナントゼラチンを調製することができる。
【００６４】
（４）生体親和性高分子ブロック
生体親和性高分子ブロック（生体親和性高分子を含有する塊）の製造方法は、特に限定されないが、例えば、生体親和性高分子の多孔質体を粉砕機（ニューパワーミルなど）を用いて粉砕することにより生体親和性高分子ブロックを得ることができる。
【００６５】
本発明における生体親和性高分子ブロックの形状は特に限定されない。
本発明における生体親和性高分子ブロック一つの大きさは、２０μｍ以上２００μｍ以下であることが好ましい。より好ましくは２０μｍ以上１２０μｍ以下であり、さらに好ましくは５０μｍ以上１２０μｍ以下である。生体親和性高分子ブロック一つの大きさを上記の範囲内にすることにより、より優れた細胞生存率を達成することができる。なお、生体親和性高分子ブロック一つの大きさとは、複数個の生体親和性高分子ブロックの大きさの平均値が上記範囲にあることを意味するものではなく、複数個の生体親和性高分子ブロックを篩にかけて得られる、一つ一つの生体親和性高分子ブロックのサイズを意味するものである。
【００６６】
本明細書中後記の通り、本発明の生体親和性高分子ブロックと、少なくとも一種類の細胞とを混合することによって、本発明の細胞構造体を製造することができる。即ち、本発明の生体親和性高分子ブロックは、本発明の細胞構造体を製造するための試薬として有用である。
【００６７】
（５）細胞
本発明で用いる細胞は、本発明の細胞構造体の目的である、細胞移植を行えるものであれば任意の細胞を使用することができ、その種類は特に限定されない。また、使用する細胞は１種でもよいし、複数種の細胞を組合せて用いてもよい。また、使用する細胞として、好ましくは、動物細胞であり、より好ましくは脊椎動物由来細胞、特に好ましくはヒト由来細胞である。脊椎動物由来細胞（特に、ヒト由来細胞）の種類は、万能細胞、体性幹細胞、前駆細胞、又は成熟細胞の何れでもよい。万能細胞としては、例えば、ＥＳ細胞、ＧＳ細胞、又はｉＰＳ細胞を使用することができる。体性幹細胞としては、例えば、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、造血幹細胞、羊膜細胞、臍帯血細胞、骨髄由来細胞、心筋幹細胞、脂肪由来幹細胞、又は神経幹細胞を使用することができる。前駆細胞及び成熟細胞としては、例えば、皮膚、真皮、表皮、筋肉、心筋、神経、骨、軟骨、内皮、脳、上皮、心臓、腎臓、肝臓、膵臓、脾臓、口腔内、角膜、骨髄、臍帯血、羊膜、又は毛に由来する細胞を使用することができる。ヒト由来細胞としては、例えば、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、ＭＳＣ、軟骨細胞、骨芽細胞、骨芽前駆細胞、間充織細胞、筋芽細胞、心筋細胞、心筋芽細胞、神経細胞、肝細胞、ベータ細胞、線維芽細胞、角膜内皮細胞、血管内皮細胞、角膜上皮細胞、羊膜細胞、臍帯血細胞、骨髄由来細胞、又は造血幹細胞を使用することができる。また、細胞の由来は、自家細胞又は他家細胞の何れでも構わない。
【００６８】
例えば、重症心不全、重度心筋梗塞等の心臓疾患においては、自家および他家から摘出した心筋細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、骨格筋由来細胞（特にサテライト細胞）、骨髄細胞（特に心筋様細胞に分化させた骨髄細胞）などを好適に使用することができる。更に、他の臓器においても、適宜移植細胞を選択することができる。例えば、脳虚血・脳梗塞部位への神経前駆細胞または、神経細胞に分化可能な細胞の移植、心筋梗塞部位・骨格筋虚血部位への血管内皮細胞または血管内皮細胞に分化可能な細胞の移植などを挙げることができる。
【００６９】
また、糖尿病性の臓器障害に対する細胞移植に使用される細胞が挙げられる。例えば、腎臓、膵臓、末梢神経、眼、四肢の血行障害などの疾患に対して、種々検討されている細胞移植治療法用の細胞が挙げられる。即ち、インスリン分泌能が低下した膵臓にインスリン分泌細胞を移植する試みや、四肢の血行障害に対する骨髄由来細胞の移植などが検討されており、このような細胞を使用することができる。
【００７０】
また本発明においては、血管系の細胞を使用することもできる。本明細書において、血管系の細胞とは、血管形成に関連する細胞を意味し、血管および血液を構成する細胞、およびその細胞に分化することができる前駆細胞、体性幹細胞である。ここで、血管系の細胞には、ＥＳ細胞、ＧＳ細胞、又はｉＰＳ細胞等の万能細胞や、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）のような、血管および血液を構成する細胞に、自然には分化しないものは含まれない。血管系の細胞として、好ましくは血管を構成する細胞である。脊椎動物由来細胞（特に、ヒト由来細胞）では、血管を構成する細胞は、血管内皮細胞および血管平滑筋細胞を好適に挙げることができる。血管内皮細胞は、静脈内皮細胞および動脈内皮細胞どちらも含む。血管内皮細胞の前駆細胞としては、血管内皮前駆細胞を使用することができる。好ましくは血管内皮細胞および血管内皮前駆細胞である。血液を構成する細胞は、血球細胞が使用でき、リンパ球や好中球などの白血球細胞、単球細胞、それらの幹細胞である造血幹細胞を使用できる。
【００７１】
本明細書において、非血管系の細胞とは、上記の血管系以外の細胞を意味する。例えば、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、心筋幹細胞、心筋細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、軟骨細胞、筋芽細胞、肝細胞または神経細胞を使用することができる。好ましくは、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、軟骨細胞、筋芽細胞、心筋幹細胞、心筋細胞、肝細胞またはｉＰＳ細胞を使用することができる。より好ましくは、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、心筋幹細胞、心筋細胞または筋芽細胞である。
【００７２】
（６）細胞構造体
本発明の細胞構造体は、上記した本発明の生体親和性高分子ブロックと、少なくとも一種類の細胞とを含み、複数個の細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックが配置されている細胞構造体である。本発明の細胞構造体は、細胞移植のために使用することができる。
【００７３】
本発明においては、上記した生体親和性高分子ブロックと上記した細胞とを用いて、複数個の細胞間の隙間に複数個の該高分子ブロックをモザイク状に３次元的に配置させることによって細胞移植のために適した厚みを有することが可能であり、かつ、生体親和性高分子ブロックと細胞とがモザイク状に３次元配置されることにより、構造体中で細胞が均一に存在する細胞３次元構造体を形成され、外部から細胞３次元構造体の内部への栄養送達を可能となる。
【００７４】
本発明の細胞構造体は、複数個の細胞間の隙間に複数個の高分子ブロックが配置されているが、ここで、「細胞間の隙間」とは、構成される細胞により、閉じられた空間である必要はなく、細胞により挟まれていればよい。なお、すべての細胞間に隙間がある必要はなく、細胞同士が接触している箇所があってもよい。高分子ブロックを介した細胞間の隙間の距離、即ち、ある細胞とその細胞から最短距離に存在する細胞を選択した際の隙間距離は特に制限されるものではないが、高分子ブロックの大きさであることが好ましく、好適な距離も高分子ブロックの好適な大きさの範囲である。
【００７５】
また、本発明にかかる高分子ブロックは、細胞により挟まれた構成となるが、すべての高分子ブロック間に細胞がある必要はなく、高分子ブロック同士が接触している箇所があってもよい。細胞を介した高分子ブロック間の距離、即ち、高分子ブロックとその高分子ブロックから最短距離に存在する高分子ブロックを選択した際の距離は特に制限されるものではないが、使用される細胞が１〜数個集まった際の細胞の塊の大きさであることが好ましく、例えば、１０μｍ以上１０００μｍ以下であり、好ましくは１０μｍ以上１００μｍ以下であり、より好ましくは１０μｍ以上５０μｍ以下である。
【００７６】
なお、本明細書中、「構造体中で細胞が均一に存在する細胞３次元構造体」等、「均一に存在する」との表現を使用しているが、完全な均一を意味するものではなく、本発明の作用効果である、外部から細胞３次元構造体の内部への栄養送達を可能とすることを意味するものである。
【００７７】
本発明の細胞構造体の厚さ又は直径は、所望の厚さとすることができるが、下限としては、２１５μｍ以上であることが好ましく、４００μｍ以上がさらに好ましく、７３０μｍ以上であることが最も好ましい。厚さ又は直径の上限は特に限定されないが、使用上の一般的な範囲としては３ｃｍ以下が好ましく、２ｃｍ以下がより好ましく、１ｃｍ以下であることが更に好ましい。また、細胞構造体の厚さ又は直径の範囲として、好ましくは、４００μｍ以上３ｃｍ以下、より好ましくは５００μｍ以上２ｃｍ以下、更に好ましくは７２０μｍ以上１ｃｍ以下である。
【００７８】
本発明の細胞構造体は、好ましくは、高分子ブロックからなる領域と細胞からなる領域がモザイク状に配置されている。尚、本明細書中における「細胞構造体の厚さ又は直径」とは、以下のことを示すものとする。細胞構造体中のある一点Ａを選択した際に、その点Ａを通る直線の内で、細胞構造体外界からの距離が最短になるように細胞構造体を分断する線分の長さを線分Ａとする。細胞構造体中でその線分Ａが最長となる点Ａを選択し、その際の線分Ａの長さのことを「細胞構造体の厚さ又は直径」とする。
【００７９】
また、後述する本発明の細胞構造体の製造方法での融合前の細胞構造体、または第二の高分子ブロック添加前の細胞構造体として、本発明の細胞構造体を使用する場合には、細胞構造体の厚さ又は直径の範囲として、好ましくは、１０μｍ以上１ｃｍ以下、より好ましくは１０μｍ以上２０００μｍ以下、更に好ましくは１５μｍ以上１５００μｍ以下、最も好ましくは、２０μｍ以上１３００μｍ以下である。
【００８０】
本発明の細胞構造体は、細胞と高分子ブロックの比率は特に限定されないが、好ましくは細胞1個当りの高分子ブロックの比率が０．００００００１μｇ以上１μｇ以下であることが好ましく、さらに好ましくは０．０００００１μｇ以上０．１μｇ以下、より好ましくは０．００００１μｇ以上０．０１μｇ以下、最も好ましくは０．００００２μｇ以上０．００６μｇ以下である。上記範囲とするこのより、より細胞を均一に存在させることができる。また、下限を上記範囲とすることにより、上記用途に使用した際に細胞の効果を発揮することができ、上限を上記範囲とすることにより、任意で存在する高分子ブロック中の成分を細胞に供給できる。ここで、高分子ブロック中の成分は特に制限されないが、後述する培地に含まれる成分が挙げられる。
【００８１】
また、本発明の細胞構造体は、血管新生因子を含んでいてもよい。ここで、血管新生因子としては、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）などを好適に挙げることができる。血管新生因子を含む細胞構造体の製造方法は、特に制限されないが、例えば、血管新生因子を含浸させた高分子ブロックを使用することにより、製造することができる。血管新生を促進する観点からは、本発明の細胞構造体は、血管新生因子を含むことが好ましい。
【００８２】
本発明の細胞構造体は、非血管系の細胞を含むものも好適に使用することができる。また、本発明の細胞構造体を構成する細胞が、非血管系の細胞のみであるものも好適に使用することができる。細胞として非血管系の細胞のみを含む本発明の細胞構造体により、移植後、移植部位に、血管を形成することができる。また、本発明の細胞構造体を構成する細胞が二種類以上であり、非血管系の細胞および血管系の細胞の両方を含む場合には、非血管系の細胞のみで構成されている場合と比較して、より血管形成することが可能となり、好ましい。
【００８３】
更にまた、本発明の細胞構造体を構成する細胞が二種類以上であり、細胞構造体の中心部の血管系の細胞の面積が、周辺部の血管系の細胞の面積より多い領域を有する場合、更に血管形成することが可能となり、更に好ましい。ここで、細胞構造体の中心部の血管系の細胞の面積が、周辺部の血管系の細胞の面積より多い領域を有するとは、具体的には、任意の２μｍの薄切標本を作製したときに、上記となる領域を有する標本が存在することを言う。ここで、細胞構造体の中心部とは、中心から、細胞構造体の表面までの距離のうち、中心から８０％までの距離のエリアをいい、細胞構造体の周辺部とは、中心から８０％の場所から構造体表面までのエリアをいう。なお、細胞構造体の中心部は、以下のように定める。
【００８４】
細胞構造体の中心を通る任意の断面において、当該断面の外延に沿って、半径Ｘの円の中心を一周動かし、動かした円と断面の重複部分を除いた部分の面積が、前記断面の断面積の６４％となるような半径Ｘを求める。当該半径Ｘの円の中心を一周動かし、動かした円と断面の重複部分を除いた部分を細胞構造体の中心部とする。このとき、断面積が一番大きくなる断面が最も好ましい。なお、細胞構造体の中心とは、断面積が最大となる断面において、当該断面の外延に沿って、半径Ｙの円の中心を一周動かし、動かした円と断面の重複部分を除いた部分が、一点に決まるような半径Ｙを求める。当該半径Ｙの円の中心を一周動かし、動かした円と断面の重複部分を除いた一点を細胞構造体の中心とする。一点に決まらず線分になる場合、またはその線分が複数個存在する場合は、それぞれの線分について、その長さを二等分する点を中心とする。
【００８５】
具体的には、中心部の血管系の細胞の割合が、血管系の細胞の全面積に対し、６０％〜１００％である領域を有することが好ましく、６５％〜１００％がより好ましく、８０％〜１００％が更に好ましく、９０％〜１００％が更に好ましい。なお、ここで、中心部の血管系の細胞の割合が、血管系の細胞の全面積に対し、６０％〜１００％である領域を有するとは、具体的には、任意の２μｍの薄切標本を作製したときに、当該割合の領域を有する標本が存在することを言う。当該範囲とすることにより、血管形成をより促すことができる。
【００８６】
なお、中心部の血管系の細胞の割合は、例えば、薄切標本を作製したときに、測定対象の血管系の細胞を染色し、画像処理ソフトＩｍａｇｅＪを用い、中心部の色の濃さ（強度）の平均値を求め、中心部の面積×強度を算出し、更に、全体の色の濃さ（強度）の平均値を求め、全体の面積×強度を算出し、全体の面積×強度に対する、中心部の面積×強度の割合を求めることによって算出することもできる。ここで、血管系の細胞を染色する方法は、適宜、公知の染色方法を使用することができ、例えば、細胞として、ヒト血管内皮前駆細胞（ｈＥＣＦＣ）を使用する場合には、ＣＤ３１抗体を使用することができる。
【００８７】
また、細胞構造体の、中心部の血管系の細胞密度が１．０×１０−４cells/μｍ３以上である領域を有することが好ましく、細胞構造体の中心部全体で前記細胞密度となることが、より好ましい。なお、ここで、１．０×１０−４cells/μｍ３以上である領域を有するとは、具体的には、任意の２μｍの薄切標本を作製したときに、当該密度の領域を有する標本が存在することを言う。前記細胞密度は、より好ましくは１．０×１０−４〜１．０×１０−３cells/μｍ３、更に好ましくは１．０×１０−４〜２．０×１０−４cells/μｍ３、更に好ましくは１．１×１０−４〜１．８×１０−４cells/μｍ３、更に好ましくは１．４×１０−４〜１．８×１０−４cells/μｍ３である。当該範囲とすることにより、血管形成をより促すことができる。
【００８８】
ここで、中心部の血管系の細胞密度は、実際に薄切標本の細胞数を数え、細胞数を体積で割って求めることができる。ここでの中心部とは、以下のように定める。前述の中心部に垂直方向に、薄切標本の厚みの分を切り取った部分とする。細胞密度の求め方は、例えば、上記の測定対象の血管系の細胞を染色した薄切標本と、細胞核を染色した薄切標本を重ね合わせ、重なった細胞核の数をカウントすることで、中心部の血管系の細胞数を算出することができ、体積は、ＩｍａｇｅＪを用いて中心部の面積を求め、その薄切標本の厚みをかけることで求められる。
【００８９】
なお、本発明の細胞構造体には、細胞が二種類以上であり、非血管系の細胞および血管系の細胞の両方を含む本発明の細胞構造体を用いて、血管形成されたものも含む。また、ここで、「細胞が二種類以上であり、非血管系の細胞および血管系の細胞の両方を含む本発明の細胞構造体」の好適な範囲は上記と同様である。血管を構築する方法は、例えば、血管部分をトンネル状にくりぬいたゲル材料に、血管系細胞を混合した細胞シートを貼り付け、トンネルに培養液を流しながら培養する方法があげられる。また、細胞シートの間に血管系細胞をサンドイッチ状にはさむことでも、血管を構築できる。
【００９０】
（７）細胞構造体の製造方法
本発明の細胞構造体は、本発明の生体親和性高分子ブロックと、少なくとも一種類の細胞とを混合することによって製造することができる。より具体的には、本発明の細胞構造体は、生体親和性高分子ブロック（生体親和性高分子からなる塊）と、細胞とを交互に配置することにより製造できる。製造方法は特に限定されないが、好ましくは高分子ブロックを形成したのち、細胞を播種する方法である。具体的には、生体親和性高分子ブロックと細胞含有培養液との混合物をインキュベートすることによって、本発明の細胞構造体を製造することができる。例えば、容器中、容器に保持される液体中で、細胞と、予め作製した生体親和性高分子ブロックをモザイク状に配置する。配置の手段としては、自然凝集、自然落下、遠心、攪拌を用いることで、細胞と生体親和性基材からなるモザイク状の配列形成を、促進、制御することが好ましい。
【００９１】
用いられる容器としては、細胞低接着性材料、細胞非接着性材料からなる容器が好ましく、より好ましくはポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ガラス、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレートからなる容器である。容器底面の形状は平底型、Ｕ字型、Ｖ字型であることが好ましい。
【００９２】
上記の方法で得られたモザイク状細胞構造体は、例えば、
（ａ）別々に調整したモザイク状細胞塊同士を融合させる、又は
（ｂ）分化培地又は増殖培地下でボリュームアップさせる、
などの方法により所望の大きさの細胞構造体を製造することができる。融合の方法、ボリュームアップの方法は特に限定されない。
【００９３】
例えば、生体親和性高分子ブロックと細胞含有培養液との混合物をインキュベートする工程において、培地を分化培地又は増殖培地に交換することによって、細胞構造体をボリュームアップさせることができる。好ましくは、生体親和性高分子ブロックと細胞含有培養液との混合物をインキュベートする工程において、生体親和性高分子ブロックをさらに添加することによって、所望の大きさの細胞構造体であって、細胞構造体中に細胞が均一に存在する細胞構造体を製造することができる。
【００９４】
前記別々に調整したモザイク状細胞塊同士を融合させる方法とは、具体的には、複数個の生体親和性高分子ブロックと、複数個の細胞とを含み、前記複数の細胞により形成される複数個の隙間の一部または全部に、一または複数個の前記生体親和性高分子ブロックが配置されている細胞構造体を複数個融合させる工程を含む、細胞構造体の製造方法である。
【００９５】
本発明の細胞構造体の製造方法にかかる「生体親和性高分子ブロック（種類、大きさ等）」、「細胞」、「細胞間の隙間」、「得られる細胞構造体（大きさ等）」、「細胞と高分子ブロックの比率」等の好適な範囲は、本明細書中前記と同様である。
【００９６】
また、前記融合前の各細胞構造体の厚さ又は直径が１０μｍ以上１ｃｍ以下であり、前記融合後の厚さ又は直径が４００μｍ以上３ｃｍ以下であることが好ましい。ここで、前記融合前の各細胞構造体の厚さ又は直径として、より好ましくは１０μｍ以上２０００μｍ以下、更に好ましくは１５μｍ以上１５００μｍ以下、最も好ましくは、２０μｍ以上１３００μｍ以下であり、また、記融合後の厚さ又は直径の範囲として、より好ましくは５００μｍ以上２ｃｍ以下、更に好ましくは７２０μｍ以上１ｃｍ以下である。
【００９７】
前述した生体親和性高分子ブロックをさらに添加することによって、所望の大きさの細胞構造体を製造する方法とは、具体的には、複数個の第一の生体親和性高分子ブロックと、複数個の細胞とを含み、該複数の細胞により形成される複数個の隙間の一部または全部に、一または複数個の前記生体親和性高分子ブロックが配置されている細胞構造体に、更に、第二の生体親和性高分子ブロックを添加しインキュベートする工程を含む細胞構造体の製造方法である。ここで、「生体親和性高分子ブロック（種類、大きさ等）」、「細胞」、「細胞間の隙間」、「得られる細胞構造体（大きさ等）」、「細胞と高分子ブロックの比率」等の好適な範囲は、本明細書中前記と同様である。
【００９８】
ここで、融合させたい細胞構造体同士は、０以上５０μｍ以下の距離に設置することが好ましく、より好ましくは、０以上２０μｍ以下、更に好ましくは０以上５μｍ以下の距離である。細胞構造体同士を融合させる際、細胞の増殖・伸展によって細胞あるいは細胞が産生する基質が接着剤の役割を果たし、接合させることが考えられ、上記範囲とすることにより、細胞構造体同士の接着が容易となる。
【００９９】
本発明の細胞構造体の製造方法により得られる細胞構造体の厚さ又は直径の範囲として、好ましくは、４００μｍ以上３ｃｍ以下、より好ましくは５００μｍ以上２ｃｍ以下、更に好ましくは７２０μｍ以上１ｃｍ以下である。
【０１００】
細胞構造体に、更に、第二の生体親和性高分子ブロックを添加しインキュベートする際の、第二の生体親和性高分子ブロックの添加するペースは、使用する細胞の増殖の速度に合わせて、適宜、選択することが好ましい。具体的には、第二の生体親和性高分子ブロックを添加するペースが早いと細胞が細胞構造体の外側へと移動し、細胞の均一性が低くなり、添加のペースが遅いと、細胞の割合が多くなる箇所ができ、細胞の均一性が低くなるため、使用する細胞の増殖速度を考慮し、選択する。
【０１０１】
非血管系の細胞および血管系の細胞の両方を含む場合の細胞構造体の製造方法として、例えば、下記（ａ）〜（ｃ）の製造方法を好適に挙げることができる。
（ａ）は非血管系の細胞を用いて前述の方法で細胞構造体を形成した後、血管系の細胞および生体親和性高分子ブロックを加える工程を有する製造方法である。ここで、「血管系の細胞および高生体親和性分子ブロックを加える工程」とは、前述した、調整したモザイク状細胞塊同士を融合させる方法、および、分化培地又は増殖培地下でボリュームアップさせる方法、いずれも含むものである。この方法により、(i)細胞構造体の中心部では、血管系の細胞と比較して、非血管系の細胞の面積が多く、周辺部では、非血管系の細胞と比較して、血管系の細胞の面積が多い細胞構造体、(ii)細胞構造体の、中心部の非血管系の細胞の面積が、周辺部の非血管系の細胞の面積より多い細胞構造体、(iii) 細胞構造体の、中心部の血管系の細胞の面積が、周辺部の血管系の細胞の面積より少ない細胞構造体、を製造することが可能となる。
（ｂ）は血管系の細胞を用いて前述の方法で細胞構造体を形成した後、非血管系の細胞および生体親和性高分子ブロックを加える工程を有する製造方法である。ここで、「非血管系の細胞および生体親和性高分子ブロックを加える工程」とは、前述した、調整したモザイク状細胞塊同士を融合させる方法、および、分化培地又は増殖培地下でボリュームアップさせる方法、いずれも含むものである。この方法により、(i)細胞構造体の中心部では、非血管系の細胞と比較して、管系の細胞の面積が多く、周辺部では、血管系の細胞と比較して、非血管系の細胞の面積が多い細胞構造体、(ii)細胞構造体の、中心部の血管系の細胞の面積が、周辺部の血管系の細胞の面積より多い細胞構造体、(iii) 細胞構造体の、中心部の非血管系の細胞の面積が、周辺部の非血管系の細胞の面積より少ない細胞構造体、を製造することが可能となる。
（ｃ）は、非血管系の細胞および血管系の細胞を実質的に同時に使用し、前述の方法で細胞構造体を形成させる製造方法である。この方法では、細胞構造体のいずれの部位も、非血管系の細胞および血管系の細胞のいずれかが、大きく偏在することのない細胞構造体を製造することが可能となる。
【０１０２】
移植後、移植部位に血管を形成する観点では、細胞構造体の中心部では、非血管系の細胞と比較して、血管系の細胞の面積が多く、周辺部では、血管系の細胞と比較して、非血管系の細胞の面積が多い細胞構造体や、中心部の血管系の細胞の面積が、周辺部の血管系の細胞の面積より多い、細胞構造体であることが好ましく、当該細胞構造体とすることにより、血管形成をより促進することができる。更に、当該細胞構造体において、中心部に存在する細胞数が多い方が、血管形成をより促進することができる。
同様の理由で、血管系の細胞により細胞構造体を形成した後、非血管系の細胞および生体親和性高分子ブロックを加える工程を有する製造方法が好ましい。そして、血管系の細胞数を多くすることがさらに好ましい。
【０１０３】
（８）細胞構造体の用途
本発明の細胞構造体は、例えば、重症心不全、重度心筋梗塞等の心臓疾患、脳虚血・脳梗塞といった疾患部位に細胞移植の目的で使用できる。また、糖尿病性の腎臓、膵臓、末梢神経、眼、四肢の血行障害などの疾患に対しても用いることが出来る。移植方法としては、切開、注射、内視鏡といったものが使用可能である。本発明の細胞構造体は、細胞シートといった細胞移植物とは異なり、構造体のサイズを小さくすることができるため、注射による移植といった低侵襲の移植方法が可能となる。
【０１０４】
また、本発明によれば細胞移植方法が提供される。本発明の細胞移植方法は、前記した本発明の細胞構造体を用いることを特徴とするものである。細胞構造体の好適な範囲は前述と同様である。
【０１０５】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【０１０６】
［材料及び容器］
［リコンビナントペプチド（リコンビナントゼラチン）］
リコンビナントペプチド（リコンビナントゼラチン）として以下記載のＣＢＥを用意した（ＷＯ2008-103041に記載）。
ＣＢＥ３
分子量：５１．６ｋＤ
構造： GAP[(GXY)６３]３G
アミノ酸数：５７１個
ＲＧＤ配列：１２個
イミノ酸含量：３３％
ほぼ１００％のアミノ酸がＧＸＹの繰り返し構造である。ＣＢＥ３のアミノ酸配列には、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシン及びシステインは含まれていない。ＣＢＥ３はＥＲＧＤ配列を有している。
等電点：9.34、GRAVY値：-0.682、１／ＩＯＢ値：0.323
【０１０７】
アミノ酸配列（配列表の配列番号１）（WO2008／103041号公報の配列番号３と同じ。但し末尾のＸは「Ｐ」に修正）
GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)3G
【０１０８】
[PTFE厚・円筒形容器]
底面厚さ３ｍｍ、直径５１ｍｍ、側面厚さ８ｍｍ、高さ２５ｍｍのポリテトラフルオロエチレン（PTFE）製円筒カップ状容器を用意した。円筒カップは曲面を側面としたとき、側面は８ｍｍのPTFEで閉鎖されており、底面（平板の円形状）も３ｍｍのPTFEで閉鎖されている。一方、上面は開放された形をしている。よって、円筒カップの内径は４３ｍｍになっている。以後、この容器のことをPTFE厚・円筒形容器と呼称する。
【０１０９】
[アルミ硝子板・円筒形容器]
厚さ１ｍｍ、直径４７ｍｍのアルミ製円筒カップ状容器を用意した。円筒カップは曲面を側面としたとき、側面は１ｍｍのアルミで閉鎖されており、底面（平板の円形状）も１ｍｍのアルミで閉鎖されている。一方、上面は開放された形をしている。また、側面の内部にのみ、肉厚１ｍｍのテフロン(登録商標)を均一に敷き詰め、結果として円筒カップの内径は４５ｍｍになっている。また、この容器の底面にはアルミの外に２．２ｍｍの硝子板を接合した状態にしておく。以後、この容器のことをアルミ硝子・円筒形容器と呼称する。
【０１１０】
[実施例１]  
[差温の小さい凍結工程、および乾燥工程]
PTFE厚・円筒形容器、アルミ硝子板・円筒形容器、にＣＢＥ３水溶液を流し込み、真空凍結乾燥機（ＴＦ５−８５ＡＴＮＮＮ：宝製作所）内で冷却棚板を用いて底面からＣＢＥ３水溶液を冷却した。
この際の容器、ＣＢＥ３水溶液の最終濃度、液量、および棚板温度の設定の組み合わせは、以下に記載の通りで用意した。
【０１１１】
「ア」  ＰＴＦＥ厚・円筒形容器、ＣＢＥ３水溶液の最終濃度４質量％、水溶液量４ｍＬ。  棚板温度の設定は、−１０℃になるまで冷却し、−１０℃で１時間、その後−２０℃で２時間、さらに−４０℃で３時間、最後に−５０℃で１時間凍結を行った。本凍結品はその後、棚板温度を−２０℃設定に戻してから−２０℃で２４時間の真空乾燥を行い、２４時間後にそのまま真空乾燥を続けた状態で棚板温度を２０℃へ上昇させ、十分に真空度が下がる（１．９×１０５Ｐａ）まで、さらに２０℃で４８時間の真空乾燥を実施した後に、真空凍結乾燥機から取り出した。それによって多孔質体を得た。
「イ」  アルミ・硝子板・円筒形容器、ＣＢＥ３水溶液の最終濃度４質量％、水溶液量４ｍＬ。  棚板温度の設定は、−１０℃になるまで冷却し、−１０℃で１時間、その後−２０℃で２時間、さらに−４０℃で３時間、最後に−５０℃で１時間凍結を行った。本凍結品はその後、棚板温度を−２０℃設定に戻してから−２０℃で２４時間の真空乾燥を行い、２４時間後にそのまま真空乾燥を続けた状態で棚板温度を２０℃へ上昇させ、十分に真空度が下がる（１．９×１０５Ｐａ）まで、さらに２０℃で４８時間の真空乾燥を実施した後に、真空凍結乾燥機から取り出した。それによって多孔質体を得た。
「ウ」  ＰＴＦＥ厚・円筒形容器、ＣＢＥ３水溶液の最終濃度４質量％、水溶液量１０ｍＬ。  棚板温度の設定は、−１０℃になるまで冷却し、−１０℃で１時間、その後−２０℃で２時間、さらに−４０℃で３時間、最後に−５０℃で１時間凍結を行った。本凍結品はその後、棚板温度を−２０℃設定に戻してから−２０℃で２４時間の真空乾燥を行い、２４時間後にそのまま真空乾燥を続けた状態で棚板温度を２０℃へ上昇させ、十分に真空度が下がる（１．９×１０５Ｐａ）まで、さらに２０℃で４８時間の真空乾燥を実施した後に、真空凍結乾燥機から取り出した。それによって多孔質体を得た。
【０１１２】
[比較例１]
[差温の大きい凍結工程、および乾燥工程]
アルミ硝子板・円筒形容器にＣＢＥ３水溶液を４ｍＬ流し込み、冷凍庫内で冷却棚板を用いて底面からＣＢＥ３水溶液を冷却した。この際の容器、ＣＢＥ３水溶液の最終濃度、液量、および棚板温度の設定の組み合わせは、以下に記載の通りで用意した。また、棚板温度は予め設定温度になるまで十分冷却しておいたところへ、ＣＢＥ３水溶液入りの容器を設置することで凍結を実施した。
【０１１３】
「エ」  アルミ硝子板・円筒形容器、ＣＢＥ３水溶液の最終濃度４質量％、水溶液量４ｍＬ。  棚板温度の設定は、予め−６０℃に冷却しておいたところへＣＢＥ３水溶液入りのアルミ硝子板・容器を置く形にし、棚板温度はそのまま−６０℃を維持して、凍結を行った。本凍結品に対して、その後、凍結乾燥を行い、多孔質体を得た。
「オ」  アルミ硝子板・円筒形容器、ＣＢＥ３水溶液の最終濃度７．５質量％、水溶液量４ｍＬ。  棚板温度の設定は、予め−６０℃に冷却しておいたところへＣＢＥ３水溶液入りのアルミ硝子板・容器を置く形にし、棚板温度はそのまま−６０℃を維持して、凍結を行った。本凍結品に対して、その後、凍結乾燥を行い、多孔質体を得た。
「カ」  アルミ硝子板・円筒形容器、ＣＢＥ３水溶液の最終濃度４質量％、水溶液量４ｍＬ。  棚板温度の設定は、予め−４０℃に冷却しておいたところへＣＢＥ３水溶液入りのアルミ硝子板・容器を置く形にし、棚板温度はそのまま−４０℃を維持して、凍結を行った。本凍結品に対して、その後、凍結乾燥を行い、多孔質体を得た。
【０１１４】
[実施例２]
[各凍結工程での差温測定]
「ア」〜「カ」のそれぞれについて、溶液内で冷却側から最も遠い場所の液温（非冷却面液温）として容器内の円中心部の水表面液温を、また、溶液内で冷却側に最も近い液温（冷却面液温）として容器内の底部の液温を測定した。
その結果、それぞれの温度とその差温のプロファイルは図１〜図６の通りとなった。
この図１、図２、図３から「ア」、「イ」、「ウ」では棚板温度−１０℃設定区間（−２０℃度に下げる前）において液温が融点である０℃を下回り、かつその状態で凍結が起こっていない（未凍結・過冷却）状態であることがわかる。また、この状態で、冷却面液温と非冷却面液温の差温が２．５℃以下となっていた。その後、棚板温度を−２０℃へ更に下げていくことによって、液温が０℃付近へ急激に上昇するタイミングが確認され、ここで凝固熱が発生し凍結が開始されたことが分かる。また、そのタイミングで実際に氷形成が始まっていることも確認出来た。その後、温度は０℃付近を一定時間経過していく。ここでは、水と氷の混合物が存在する状態となっていた。最後０℃から再び温度降下が始まるが、この時、液体部分はなくなり氷となっている。従って、測定している温度は氷内部の固体温度となり、つまり液温ではなくなる。
【０１１５】
以下に、「ア」、「イ」、「ウ」について、非冷却面液温が融点（０℃）になった時の差温、棚板温度を−１０℃から−２０℃へ下げる直前の差温と、凝固熱発生直前の差温を記載する。尚、本発明で言うところの「直前の差温」とは、当該イベントの１秒前〜２０秒前までの間で検知可能な温度差の内、最も高い温度のことを表している。
【０１１６】
「ア」
非冷却面液温が融点（０℃）になった時の差温：１．１℃
−１０℃から−２０℃へ下げる直前の差温：０．２℃
凝固熱発生直前の差温：１．１℃
【０１１７】
「イ」
非冷却面液温が融点（０℃）になった時の差温：１．０℃
−１０℃から−２０℃へ下げる直前の差温：０．１℃
凝固熱発生直前の差温：０．９℃
【０１１８】
「ウ」
非冷却面液温が融点（０℃）になった時の差温：１．８℃
−１０℃から−２０℃へ下げる直前の差温：１．１℃
凝固熱発生直前の差温：２．１℃
【０１１９】
これらを以後、「差温の小さい凍結工程・多孔質体」と呼称する。
【０１２０】
また、「エ」、「オ」、「カ」について、図４〜図６から−４０℃あるいは−６０℃の棚板で急速に冷却されることによって、液温が融点である０℃以下になった状態（未凍結状態・過冷却状態）において、差温が４℃以上あり、凝固熱発生直前まで差温が大きい状態であることが分かる。
以下に、「エ」、「オ」、「カ」について、非冷却面液温が融点（０℃）になった時の差温と、凝固熱発生直前の差温を記載する。
【０１２１】
「エ」
非冷却面液温が融点（０℃）になった時の差温：５．４℃
凝固熱発生直前の差温：４．２℃
【０１２２】
「オ」
非冷却面液温が融点（０℃）になった時の差温：６．９℃
凝固熱発生直前の差温：５．３℃
【０１２３】
「カ」
非冷却面液温が融点（０℃）になった時の差温：５．９℃
凝固熱発生直前の差温：３．３℃
【０１２４】
これらを以後、「差温の大きい凍結工程・多孔質体」と呼称する。
【０１２５】
[実施例３]
[１質量％エタノール含有溶液での、差温の小さい凍結工程、および乾燥工程]
PTFE厚・円筒形容器、およびアルミ硝子板・円筒形容器に１％（ｗ／ｗ）エタノール含有ＣＢＥ３水溶液を流し込み、真空凍結乾燥機（ＴＦ５−８５ＡＴＮＮＮ：宝製作所）内で冷却棚板を用いて底面からＣＢＥ３水溶液を冷却した。最終濃度１質量％エタノール含有水溶液とすることで、融点は−０．４℃となる。エタノール/水濃度比における融点変化は文献「Pickering S.U.: A Study of the Properties of some Strong Solutions. J.Chem.Soc.London 63 (1893) 998-1027」から計算した。
この際の容器、ＣＢＥ３水溶液の最終濃度、液量、および棚板温度の設定の組み合わせは、以下に記載の通りで用意した。
【０１２６】
「アア」  ＰＴＦＥ厚・円筒形容器、ＣＢＥ３水溶液の最終濃度４質量％、エタノール最終濃度１質量％、水溶液量４ｍＬ。  棚板温度の設定は、−１０℃になるまで冷却し、−１０℃で１時間、その後−２０℃で２時間、さらに−４０℃で３時間、最後に−５０℃で１時間凍結を行った。本凍結品はその後、棚板温度を−２０℃設定に戻してから−２０℃で２４時間の真空乾燥を行い、２４時間後にそのまま真空乾燥を続けた状態で棚板温度を２０℃へ上昇させ、十分に真空度が下がるまで、さらに２０℃で４８時間の真空乾燥を実施した後に、真空凍結乾燥機から取り出した。それによって多孔質体を得た。
【０１２７】
「イイ」  アルミ硝子板・円筒形容器、ＣＢＥ３水溶液の最終濃度４質量％、エタノール最終濃度１質量％、水溶液量４ｍＬ。  棚板温度の設定は、−１０℃になるまで冷却し、−１０℃で１時間、その後−２０℃で２時間、さらに−４０℃で３時間、最後に−５０℃で１時間凍結を行った。本凍結品はその後、棚板温度を−２０℃設定に戻してから−２０℃で２４時間の真空乾燥を行い、２４時間後にそのまま真空乾燥を続けた状態で棚板温度を２０℃へ上昇させ、十分に真空度が下がるまで、さらに２０℃で４８時間の真空乾燥を実施した後に、真空凍結乾燥機から取り出した。それによって多孔質体を得た。
【０１２８】
[１質量％エタノール含有溶液の、凍結工程での差温測定]
「アア」、「イイ」について、溶液内で冷却側から最も遠い場所の液温（非冷却面液温）として容器内の円中心部の水表面液温を、また、溶液内で冷却側に最も近い液温（冷却面液温）として容器内の底部の液温を測定した。尚、ここでは１質量％エタノールが溶媒となる為、溶媒融点は−０．４℃となる。エタノール/水濃度比における融点変化は文献「Pickering S.U.: A Study of the Properties of some Strong Solutions. J.Chem.Soc.London 63 (1893) 998-1027」から計算した。
【０１２９】
その結果、それぞれの温度とその差温のプロファイルは図７、図８の通りとなった。
この図７、８から「アア」、「イイ」では、棚板温度−１０℃設定区間において液温が融点である−０．４℃を下回り、かつその状態で凍結が起こっていない（未凍結・過冷却）状態であることがわかる。また、この状態で、冷却面液温と非冷却面液温の差温が２℃以下となっていた。その後、棚板温度を−２０℃へ更に下げていくことによって、液温が−０．４℃付近へ急激に上昇するタイミングが確認され、ここで凝固熱が発生し凍結が開始されたことが分かる。また、そのタイミングで実際に氷形成が始まっていることも確認出来た。その後、温度は−０．４℃付近を一定時間経過していく。ここでは、水と氷の混合物が存在する状態となっていた。最後０℃から再び温度降下が始まるが、この時、液体部分はなくなり氷となっている。従って、測定している温度は氷内部の固体温度となり、つまり液温ではなくなる。
【０１３０】
以下に、「アア」、「イイ」について、非冷却面液温が融点（−０．４℃）になった時の差温、棚板温度を−１０℃から−２０℃へ下げる直前の差温と、凝固熱発生直前の差温を記載する。
【０１３１】
「アア」
非冷却面液温が融点（−０．４℃）になった時の差温：０．８℃
−１０℃から−２０℃へ下げる直前の差温：０．３℃
凝固熱発生直前の差温：０．８℃
【０１３２】
「イイ」
非冷却面液温が融点（−０．４℃）になった時の差温：１．３℃
−１０℃から−２０℃へ下げる直前の差温：０．０℃
凝固熱発生直前の差温：１．３℃
【０１３３】
これらの結果、「ア」や「イ」と同様、「差温の小さい凍結工程・多孔質体」として作製できた。
【０１３４】
[実施例４]
[多孔質体の構造均一性評価]
「ア」、「イ」、「ウ」、「エ」、「オ」、「カ」、「アア」、「イイ」で得られたＣＢＥ３多孔質体について、多孔質の構造均一性評価を実施した。得られた多孔質体を１６０℃、２０時間の熱架橋を施し、不溶化したのち、十分時間、生理食塩水で膨潤。その後、ミクロトームで凍結組織切片を作製し、ＨＥ（ヘマトキシリン・エオシン））染色標本を作製した。得られた標本画像を図９〜１２に示す。得られた標本画像中の１．５ｍｍ四方視野に対して、画像解析ソフトＩｍａｇｅＪにより、２次元フーリエ変換（ＦＦＴ）を施すと図９〜１２に示される２次元フーリエ変換画像が得られる。この２次元フーリエ変換によって、製剤に不均一な方向性が確認される場合は、特に軸方向に強いパワースペクトルが観測されることとなる。この不均一性の評価手法は、非特許文献「コンクリート工学年次論文集、ｖｏｌ．２２、Ｎｏ．１，２０００、ｐ．２１１、  ２次元フーリエ変換によるコンクリートの汚れの評価手法に関する基礎的研究、兼松学、北垣亮馬、野口貴文、友澤史紀」などで知られる手法を多孔質体の均一性評価に応用したものである。
【０１３５】
更に、本発明では、軸方向のパワースペクトル有無について、２次元フーリエ変換画像のｙ軸下端についてラインプロファイルをとることで規定した。具体的には、ｙ軸下端から、画像ピクセルサイズの１０分の１ピクセル幅について、ｘ軸座標辺りの輝度値を平均してプロットしたグラフを作成した。たとえば５１２ピクセル×５１２ピクセルの２次元フーリエ変換画像から、５１ピクセル幅のラインプロファイルとして、ソフトウェア「Gwyddion２．３１」によってラインプロファイルを計測した。各ラインプロファイルを図９〜１２に示す。これにより、ラインプロファイルのベースのバラつき値をσとした際、中心部分（ラインプロファイルのｘが最大値の半分のところ）に、２．０σ以上のピークが検出された場合、軸方向にパワースペクトルが存在すると判断した。このパワースペクトルが存在する場合が不均一な多孔質体。パワースペクトルが存在しない場合が均一多孔質体、とした。
【０１３６】
これにより、差温の小さい凍結工程・多孔質体である「ア」、「イ」、「ウ」、「アア」、「イイ」は均一多孔質体であると分かった。尚、実施例２および３で示した通り、これら多孔質体製造過程における凝固熱発生直前の差温はそれぞれ１．１℃、０．９℃、２．１℃、０．８℃、１．３℃である。
【０１３７】
一方、差温の大きい凍結工程・多孔質体である「エ」（２．０σ）、「オ」（６．０σ）、「カ」（３．５σ）が不均一多孔質体であると分かった。尚、実施例２で示した通り、これら多孔質体製造過程における凝固熱発生直前の差温はそれぞれ４．２℃、５．３℃、３．３℃である。
【０１３８】
従って、溶媒の融点（水であれば０℃、１質量％エタノール水溶液であれば−０．４℃）以下の過冷却・未凍結状態において、溶液内で冷却側から最も遠い場所の液温（非冷却面液温）と、溶液内で冷却側に最も近い液温（冷却面液温）の差が２．５℃以内となる工程を含むこと、凝固熱発生直前の差温が２．５℃以内とすることで均一な多孔質体が得られていることが分かった。
【０１３９】
[実施例５] 差温の小さい凍結工程・多孔質体からの差温小ブロックの作製（多孔質体の粉砕と架橋）
実施例１（差温測定は実施例２）で得られた「ア」、「イ」のＣＢＥ３多孔質体をニューパワーミル（大阪ケミカル、ニューパワーミルＰＭ−２００５）で粉砕した。粉砕は、ｓ最大回転数で１分間×５回、計５分間の粉砕で行った。得られた粉砕物について、ステンレス製ふるいでサイズ分けし、２５〜５３μｍ、５３〜１０６μｍ、１０６μｍ〜１８０μｍの未架橋ブロックを得た。その後、減圧下１６０℃で熱架橋（架橋時間は８時間、１６時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間の６種類を実施した）を施して、試料ＣＢＥ３ブロックを得た。以下、４８時間架橋を施した「ア」の多孔質体由来ブロックをE、４８時間架橋を施した「イ」の多孔質体由来ブロックをFと呼称する。つまり、E，Fが差温の小さい凍結工程・多孔質体から作られた差温小ブロックである。尚、架橋時間の違いは本願の評価においては性能に影響が見られない為、ここでは４８時間架橋したものを代表として使用している。
【０１４０】
[比較例２] 差温の大きい凍結工程・多孔質体からの差温大ブロックの作製（多孔質体の粉砕と架橋）
比較例１（差温測定は実施例２）で得られた「エ」、「オ」、「カ」のＣＢＥ３多孔質体をニューパワーミル（大阪ケミカル、ニューパワーミルＰＭ−２００５）で粉砕した。粉砕は、最大回転数で１分間×５回、計５分間の粉砕で行った。得られた粉砕物について、ステンレス製ふるいでサイズ分けし、２５〜５３μｍ、５３〜１０６μｍ、１０６μｍ〜１８０μｍの未架橋ブロックを得た。その後、減圧下１６０℃で熱架橋（架橋時間は２４時間、４８時間を実施した）を施して、試料ＣＢＥ３ブロックを得た。以下、４８時間架橋を施した「エ」の多孔質体由来ブロックをA、４８時間架橋を施した「オ」の多孔質体由来ブロックをB、４８時間架橋を施した「カ」の多孔質体由来ブロックをCと呼称する。つまり、A，B，Cが差温の大きい凍結工程・多孔質体から作られた差温大ブロックである。尚、架橋時間の違いは本願の評価においては性能に影響が見られない為、ここでは４８時間架橋したものを代表として使用している。
【０１４１】
[実施例６]  差温小ブロックを用いたモザイク細胞塊の作製（ｈＭＳＣ）
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を増殖培地（タカラバイオ：MSCGM BulletKitTM）にて１０万ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整し、実施例５で作製したＣＢＥ３ブロック５３−１０６μｍを０．１ｍｇ／ｍＬとなるように加えた後、２００μＬをスミロンセルタイトＸ９６Ｕプレート（住友ベークライト、底がＵ字型）に播種し、卓上プレート遠心機で遠心（６００ｇ、５分）し、２４時間静置し、直径１ｍｍの球状の、ＣＢＥ３ブロックとｈＭＳＣ細胞からなるモザイク細胞塊を作製した（細胞1個当たり０．００１μｇのブロック）。なお、Ｕ字型のプレート中で作製したため、本モザイク細胞塊は球状であった。また、これはＥ、Ｆいずれのブロックでも上記と同様に作成できた。
【０１４２】
[比較例３] 差温大ブロックを用いたモザイク細胞塊の作製（ｈＭＳＣ）
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を増殖培地（タカラバイオ：MSCGM BulletKitTM）にて１０万ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整し、比較例２で作製したＣＢＥ３ブロック５３−１０６μｍを０．１ｍｇ／ｍＬとなるように加えた後、２００μＬをスミロンセルタイトＸ９６Ｕプレート（住友ベークライト、底がＵ字型）に播種し、卓上プレート遠心機で遠心（６００ｇ、５分）し、２４時間静置し、直径１ｍｍの球状の、ＣＢＥ３ブロックとｈＭＳＣ細胞からなるモザイク細胞塊を作製した（細胞１個当たり０．００１μｇのブロック）。なお、Ｕ字型のプレート中で作製したため、本モザイク細胞塊は、球状であった。また、これはＡ，B，Cいずれのブロックでも上記と同様に作成できた。
【０１４３】
[実施例７] 差温小ブロックを用いたモザイク細胞塊の作製（ｈＭＳＣ＋ｈＥＣＦＣ）
ヒト血管内皮前駆細胞（ｈＥＣＦＣ）を増殖培地（Ｌｏｎｚａ：ＥＧＭ−２＋ＥＣＦＣ serum supplement）にて１０万ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整し、実施例５で作製したＣＢＥ３ブロック５３−１０６μｍを０．０５ｍｇ／ｍＬとなるように加えた後、２００μＬをスミロンセルタイトＸ９６Ｕプレートに播種し、卓上プレート遠心機で遠心（６００ｇ、５分）し、２４時間静置し、扁平状の、ＥＣＦＣとＣＢＥ３ブロックからなるモザイク細胞塊を作製した。その後、培地を除去し、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を増殖培地（タカラバイオ：MSCGM BulletKitTM）にて１０万ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整し、実施例５で作製したＣＢＥ３ブロック５３−１０６μｍを０．１ｍｇ／ｍＬとなるように加えた後、ｈＥＣＦＣモザイク細胞塊がある２００μＬをスミロンセルタイトＸ９６Ｕプレートに播種し、卓上プレート遠心機で遠心（６００ｇ、５分）し、２４時間静置し、直径１ｍｍの球状の、ｈＭＳＣとｈＥＣＦＣとＣＢＥ３ブロックからなるモザイク細胞塊を作製した。また、これはE、Fいずれのブロックでも上記と同様に作成できた。
【０１４４】
[比較例４] 差温大ブロックを用いたモザイク細胞塊の作製（ｈＭＳＣ＋ｈＥＣＦＣ）
ヒト血管内皮前駆細胞（ｈＥＣＦＣ）を増殖培地（Ｌｏｎｚａ：ＥＧＭ−２＋ＥＣＦＣ serum supplement）にて１０万ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整し、比較例２で作製したＣＢＥ３ブロック５３−１０６μｍを０．０５ｍｇ／ｍＬとなるように加えた後、２００μＬをスミロンセルタイトＸ９６Ｕプレートに播種し、卓上プレート遠心機で遠心（６００ｇ、５分）し、２４時間静置し、扁平状の、ＥＣＦＣとＣＢＥ３ブロックからなるモザイク細胞塊を作製した。その後、培地を除去し、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を増殖培地（タカラバイオ：MSCGM BulletKitTM）にて１０万ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整し、比較例２で作製したＣＢＥ３ブロック５３−１０６μｍを０．１ｍｇ／ｍＬとなるように加えた後、ｈＥＣＦＣモザイク細胞塊がある２００μＬをスミロンセルタイトＸ９６Ｕプレートに播種し、卓上プレート遠心機で遠心（６００ｇ、５分）し、２４時間静置し、直径１ｍｍの球状の、ｈＭＳＣとｈＥＣＦＣとＣＢＥ３ブロックからなるモザイク細胞塊を作製した。また、これはA，B，Cいずれのブロックでも上記と同様に作成できた。
【０１４５】
[実施例８] 差温小ブロックを用いたモザイク細胞塊（ｈＭＳＣ）の融合
実施例６で作製した２日目のモザイク細胞塊（本発明のＣＢＥ３ブロックを使用）５個をスミロンセルタイトＸ９６Ｕプレート中で並べ、２４時間培養を行った。その結果、モザイク細胞塊同士の間を、外周部に配された細胞が結合させることで、モザイク細胞塊が自然に融合することが明らかになった。また、これはE、Fいずれのブロックでも上記と同様に作成できた。
【０１４６】
[実施例９] 差温小ブロックを用いたモザイク細胞塊（ｈＭＳＣ＋ｈＥＣＦＣ）の融合
実施例７で作製した２日目のモザイク細胞塊（本発明のＣＢＥ３ブロックを使用）５個をスミロンセルタイトＸ９６Ｕプレート中で並べ、２４時間培養を行った。その結果、モザイク細胞塊同士の間を、外周部に配された細胞が結合させることで、モザイク細胞塊が自然に融合することが明らかになった。また、これはE、Fいずれのブロックでも上記と同様に作成できた。
【０１４７】
[比較例５] 差温大ブロックを用いたモザイク細胞塊（ｈＭＳＣ）の融合
比較例３で作製した２日目のモザイク細胞塊（比較用のＣＢＥ３ブロック由来）５個をスミロンセルタイトＸ９６Ｕプレート中で並べ、２４時間培養を行った。その結果、モザイク細胞塊同士の間を、外周部に配された細胞が結合させることで、モザイク細胞塊が自然に融合することが明らかになった。また、これはA，B，Cいずれのブロックでも上記と同様に作成できた。
【０１４８】
[比較例６] 差温大ブロックを用いたモザイク細胞塊（ｈＭＳＣ＋ｈＥＣＦＣ）の融合
比較例４で作製した２日目のモザイク細胞塊（比較用のＣＢＥ３ブロック由来）５個をスミロンセルタイトＸ９６Ｕプレート中で並べ、２４時間培養を行った。その結果、モザイク細胞塊同士の間を、外周部に配された細胞が結合させることで、モザイク細胞塊が自然に融合することが明らかになった。また、これはA，B，Cいずれのブロックでも上記と同様に作成できた。
【０１４９】
[実施例１０]  ＣＢＥ３ブロックを用いたモザイク細胞塊の移植
マウスはＮＯＤ／ＳＣＩＤ（チャールズリバー）のオス、４〜６週齢のものを用いた。麻酔下でマウス腹部の体毛を除去し、上腹部の皮下に切れ込みを入れ、切れ込みからはさみを差し込み、皮膚を筋肉からはがした後、実施例８、実施例９、比較例５、及び比較例６で作成したｈＭＳＣモザイク細胞塊およびｈＭＳＣ＋ｈＥＣＦＣモザイク細胞塊をピンセットですくい、切れ込みから１．５ｃｍほど下腹部寄りの皮下に移植し、皮膚の切れ込み部を縫合した。
【０１５０】
[実施例１１]   ＣＢＥ３ブロックを用いたモザイク細胞塊の採取
解剖は移植から２週後に行った。腹部の皮膚をはがし、モザイク細胞塊が付着した皮膚を、約１平方ｃｍの正方形の大きさに切り取った。モザイク細胞塊が腹部の筋肉にも付着している場合は、筋肉と共に採取した。
【０１５１】
[実施例１２] 標本解析
モザイク細胞塊が付着した皮膚片および、移植前のモザイク細胞塊について組織切片を作製した。皮膚を４質量％パラホルムアルデヒドに浸漬し、ホルマリン固定を行った。その後、パラフィンで包埋し、モザイク細胞塊を含む皮膚の組織切片を作製した。切片はＨＥ染色（ヘマトキシリン・エオシン染色）を行った。
【０１５２】
実施例１０で移植したモザイク細胞塊の２週間後のＨＥ標本を図１３〜１７に示す。それぞれのパターンのモザイク細胞塊について、３個体の拡大像を示しており、矢印は血管を指している。AおよびBのｈＭＳＣモザイク細胞塊は、６個体あるが、そのうちの３個体について示している。細胞数は、画像中の全生細胞数であり、血管の数はそれぞれの画像中にある血管の本数を面積あたりに換算した値である。ＣＶ値は、それぞれのブロックを用いたモザイク細胞塊３個体または６個体の標準偏差を平均値で割ったときの割合であり、数値が大きいほど個体間のばらつきが大きいことを示している。また、それらの結果のまとめを以下の表１〜表４に示す。
【０１５３】
【表１】
2018070638.tif 000002
【０１５４】
【表２】
2018070638.tif 000003
【０１５５】
【表３】
2018070638.tif 000004
【０１５６】
【表４】
2018070638.tif 000005
【０１５７】
それぞれのブロックを用いたｈＭＳＣモザイク細胞塊での結果は以下のようになった。
図１３ではAおよびBの差温大ブロックを用いたｈＭＳＣモザイク細胞塊での結果を示している。Aの差温大ブロックでは、平均細胞数は１２２ｃｅｌｌｓ、平均血管数は１２本/ｍｍ２であり、それぞれのＣＶ値は、５９％と１３７％であった。Bの差温大ブロックでは、平均細胞数は１１９ｃｅｌｌｓ、平均血管数は１０本/ｍｍ２であり、それぞれのＣＶ値は、３１％と１５５％であった。切片像からも、モザイク細胞塊どうしでばらつきがあることが伺える。
【０１５８】
図１４では、Cの差温大ブロックを用いたｈＭＳＣモザイク細胞塊での結果を示している。Cの差温大ブロックでは、平均細胞数は１２２ｃｅｌｌｓ、平均血管数は１７本/ｍｍ２であり、それぞれのＣＶ値は、３２％と１２５％であった。こちらも、切片像からも、モザイク細胞塊どうしでばらつきがあることが伺える。
【０１５９】
図１５では、EおよびFの差温小ブロックを用いたｈＭＳＣモザイク細胞塊での結果を示している。Eの差温大ブロックでは、平均細胞数は２５６ｃｅｌｌｓ、平均血管数は５８本/ｍｍ２であり、それぞれのＣＶ値は、７％と１０％であった。Fの差温大ブロックでは、平均細胞数は１９４ｃｅｌｌｓ、平均血管数は５４本/ｍｍ２であり、それぞれのＣＶ値は、２１％と８９％であった。切片像からも、モザイク細胞塊どうしでばらつきが少ないことが分かる。
【０１６０】
それぞれのブロックを用いたｈＭＳＣ＋ｈＥＣＦＣモザイク細胞塊での結果は以下のようになった。
図１６では、AおよびBの差温大ブロックを用いたｈＭＳＣ＋ｈＥＣＦＣモザイク細胞塊での結果を示している。Aの差温大ブロックでは、平均細胞数は８４ｃｅｌｌｓ、平均血管数は３４本/ｍｍ２であり、それぞれのＣＶ値は、７０％と１７３％であった。Bの差温大ブロックでは、平均細胞数は１５８ｃｅｌｌｓ、平均血管数は５１本/ｍｍ２であり、それぞれのＣＶ値は、３９％と８７％であった切片像からも、モザイク細胞塊どうしでばらつきがあることが伺える。
【０１６１】
図１７では、EおよびFの差温小ブロックを用いたｈＭＳＣ＋ｈＥＣＦＣモザイク細胞塊での結果を示している。Eの差温大ブロックでは、平均細胞数は２０２ｃｅｌｌｓ、平均血管数は１２２本/ｍｍ２であり、それぞれのＣＶ値は、２９％と１７％であった。Fの差温大ブロックでは、平均細胞数は１７１ｃｅｌｌｓ、平均血管数は１０９本/ｍｍ２であり、それぞれのＣＶ値は、２９％と２９％であった。切片像からも、モザイク細胞塊どうしでばらつきがないことが分かる。
【０１６２】
全体としては、表１〜表４でまとめたとおりであるが、差温大ブロックを用いた場合では、モザイク細胞塊間の個体差が大きく、ばらついていることが分かる。平均細胞数および平均血管数についても、差温大ブロックの種類の違いで大きな差はないことが分かる。
一方、差温小ブロックを用いた場合では、モザイク細胞塊間の個体差が小さく、ばらつきが少ないことが分かる。平均細胞数および平均血管数についても、差温大ブロックよりも大幅に高い値を示しており、差温小ブロックの方が、血管を形成しやすく、多くの細胞を生存させられると言える。これらは、実施例４で示されたように、差温の小さい凍結工程で得られた多孔質体は構造が均一であったがゆえに、その多孔質体から作られた差温小ブロックでは、生体内での性能にばらつきが少なくなったと考えられる。さらには、予想もしていなかったことに、そのことが血管の形成能力、細胞の生存能力にも寄与することが分かった。また、移植細胞の性能を発揮する上では、血管の形成能力と移植細胞の生存能力は、ともに高めることが非常に重要であり、この二つをともに向上させられるという点で、本発明の多孔質体は高い効果を発揮していた。
【０１６３】
[実施例１３]ｈＭＳＣ＋ｈＥＣＦＣモザイク細胞塊中のＥＣＦＣの割合と濃度の算出
実施例７の内、代表的なEを用いたモザイク細胞塊は、切片をｈＥＣＦＣ染色用にＣＤ３１抗体（EPT  Anti CD31/PECAM-1）にＤＡＢ発色を用いたキット（ダコLSAB2キット  ユニバーサル K0673  ダコLSAB2キット/HRP(DAB) ウサギ・マウス一次抗体両用）による免疫染色を行った。画像処理ソフトＩｍａｇｅＪ、ＣＤ３１抗体による染色方法を使用し、中心部のｈＥＣＦＣ（血管系の細胞）の面積の割合を求めた。なお、ここでいう「中心部」とは前記定義したものである。
【０１６４】
その結果、実施例７の代表的なEのモザイク細胞塊の中心部のｈＥＣＦＣ（血管系の細胞）の面積の割合は９８％であった。さらに実施例７の代表的なEモザイク細胞塊について、上記のＣＤ３１抗体による染色と、ＨＥ染色（ヘマトキシリン・エオシン染色）を重ね合わせることで、中心部に存在するｈＥＣＦＣの細胞密度を算出した。中心部の血管系の細胞密度は、実際に薄切標本の細胞数を数え、細胞数を体積で割って求めることができる。まず、Photoshopを用いて、上記２枚の画像を重ね合わせ、ＣＤ３１抗体による染色と重なったＨＥ染色の細胞核の数をカウントして細胞数を算出した。一方、体積は、ＩｍａｇｅＪを用いて中心部の面積を求め、その薄切標本の厚みの２μｍをかけることで求められた。その結果、実施例７の代表的なEモザイク細胞塊の中心部のｈＥＣＦＣ（血管系の細胞）の細胞数は2.3×10-4cells/μm3であった。
【図１】
2018070638.tif 000006
【図２】
2018070638.tif 000007
【図３】
2018070638.tif 000008
【図４】
2018070638.tif 000009
【図５】
2018070638.tif 000010
【図６】
2018070638.tif 000011
【図７】
2018070638.tif 000012
【図８】
2018070638.tif 000013
【図９】
2018070638.tif 000014
【図１０】
2018070638.tif 000015
【図１１】
2018070638.tif 000016
【図１２】
2018070638.tif 000017
【図１３】
2018070638.tif 000018
【図１４】
2018070638.tif 000019
【図１５】
2018070638.tif 000020
【図１６】
2018070638.tif 000021
【図１７】
2018070638.tif 000022
【配列表】
2018070638000001.app