(57)【要約】      （修正有）【課題】薬剤を有効且つ特異的に送達するための多機能ツールを提供するナノ粒子の提供。【解決手段】カンプトセシン、エポチロン、タキサン等の低分子化学療法剤又は干渉ＲＮＡ等のポリヌクレオチドを薬剤として含み、トランスフェリン又は抗体等の標的リガンドにコンジュゲートしている、ポリオール含有ポリマーを含み、更に前記ポリオール含有ポリマーと可逆的共有結合でカップリングしてナノ粒子の外部環境にボロン酸含有ポリマーを提示する標的化ナノ粒子。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリオール含有ポリマーを含む標的化ナノ粒子であって、単一の標的リガンドにコンジュゲートしている、標的化ナノ粒子。
【請求項２】
前記標的リガンドが、タンパク質、タンパク質断片、又はアミノ酸ペプチドを含む、請求項１に記載の標的化ナノ粒子。
【請求項３】
前記タンパク質が、抗体、トランスフェリン、細胞受容体のリガンド、又は細胞受容体タンパク質を含み、前記標的リガンドが、代替として、抗体の断片、トランスフェリン、細胞受容体のリガンド、アプタマー、又は細胞受容体タンパク質を含んでもよい、請求項２に記載の標的化ナノ粒子。
【請求項４】
前記タンパク質断片が、抗体断片を含む、請求項２又は３に記載の標的化ナノ粒子。
【請求項５】
前記アミノ酸ペプチドが、抗体由来のアミノ酸配列を含む、請求項２又は３に記載の標的化ナノ粒子。
【請求項６】
治療剤を更に含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の標的化ナノ粒子。
【請求項７】
前記治療剤が、低分子化学療法剤又はポリヌクレオチドである、請求項６に記載の標的化ナノ粒子。
【請求項８】
前記ポリヌクレオチドが、干渉ＲＮＡである、請求項７に記載の標的化ナノ粒子。
【請求項９】
前記標的リガンドが、トランスフェリン又は抗体であり、前記ナノ粒子が、カンプトセシン、エポチロン、タキサン、及びポリヌクレオチド、又はこれらの任意の組み合わせから選択される治療剤を更に含む、請求項６〜８のいずれか一項に記載の標的化ナノ粒子。
【請求項１０】
被験体における標的にナノ粒子を送達する方法であって、前記標的に特異的に結合する単一の標的リガンドにコンジュゲートしているナノ粒子を得る工程と、前記単一の標的リガンドにコンジュゲートしているナノ粒子を前記被験体に投与する工程とを含む、方法。
【請求項１１】
前記標的リガンドが、タンパク質、タンパク質断片、又はアミノ酸ペプチドを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記タンパク質が、抗体、トランスフェリン、細胞受容体のリガンド、アプタマー、又は細胞受容体タンパク質を含み、前記標的リガンドが、代替として、抗体の断片、トランスフェリン、細胞受容体のリガンド、又は細胞受容体タンパク質を含んでもよい、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記タンパク質断片が、抗体断片を含む、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記アミノ酸ペプチドが、抗体由来のアミノ酸配列を含む、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記単一の標的リガンドにコンジュゲートしているナノ粒子が、治療剤を更に含む、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記治療剤が、低分子化学療法剤又はポリヌクレオチドである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ポリヌクレオチドが、干渉ＲＮＡである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記標的リガンドが、トランスフェリン又は抗体であり、前記ナノ粒子が、カンプトセシン、エポチロン、タキサン、及びポリヌクレオチド、又はこれらの任意の組み合わせから選択される治療剤を更に含む、請求項１５、１６、又は１７に記載の方法。
【請求項１９】
ポリオール含有ポリマーとボロン酸含有ポリマーとを含む標的化ナノ粒子であって、ボロン酸が、前記ポリオール含有ポリマーと可逆的共有結合でカップリングしており、前記ナノ粒子が、前記ナノ粒子の外部環境に前記ボロン酸含有ポリマーを提示するようになっており、前記ボロン酸含有ポリマーが、前記ナノ粒子とは反対の末端において標的リガンドにコンジュゲートしている、標的化ナノ粒子。
【請求項２０】
前記ポリオール含有ポリマーが、以下の構造単位のうちの少なくとも１つのうちの１つ以上を含む、請求項１９に記載の標的化ナノ粒子：
【化１】
2018070626.tif 000063
［式中、
Ａは、以下の式の有機部分であり：
【化２】
2018070626.tif 000064
（式中、
Ｒ１及びＲ２は、独立して、約１０ｋＤａ以下の分子量を有する任意の炭素ベース又は有機基から選択され、
Ｘは、独立して、−Ｈ、−Ｆ、−Ｃ、−Ｎ、又は−Ｏのうちの１つ以上を含有する脂肪族基から選択され、
Ｙは、独立して、−ＯＨ又は−ＯＨを提示する有機部分から選択される）
Ｂは、前記ポリマーにおいて、第１の前記部分ＡのＲ１及びＲ２のうちの１つを、第２の前記部分ＡのＲ１及びＲ２のうちの１つと連結させる有機部分である］。
【請求項２１】
Ｒ１及びＲ２が、独立して、以下の式を有する、請求項２０に記載の標的化ナノ粒子：
【化３】
2018070626.tif 000065
（式中、
ｄは、０〜１００であり、
ｅは、０〜１００であり、
ｆは、０〜１００であり、
Ｚは、ある有機部分を別の有機部分に連結させる共有結合であり、
Ｚ１は、独立して、−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＳＨ、及び−ＣＯＯＨから選択される）。
【請求項２２】
Ｘが、ＣｎＨ２ｎ＋１（式中、ｎは、０〜５である）であり、
Ｙが、−ＯＨである、請求項２０又は２１に記載の標的化ナノ粒子。
【請求項２３】
Ａが、独立して、以下からなる群から選択される、請求項２０に記載の標的化ナノ粒子：
【化４】
2018070626.tif 000066
（式中、
スペーサーは、独立して、任意の有機基から選択され、
アミノ酸は、遊離アミン及び遊離カルボン酸基を有する任意の有機基から選択され、
ｎは、１〜２０であり、
Ｚ１は、独立して、−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＳＨ、及び−ＣＯＯＨから選択される）。
【請求項２４】
Ａが、独立して、以下からなる群から選択される、請求項２３に記載の標的化ナノ粒子：
【化５】
2018070626.tif 000067
【請求項２５】
Ｂが、以下である、請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の標的化ナノ粒子：
【化６】
2018070626.tif 000068
（式中、
ｑは、１〜２０であり、
ｐは、２０〜２００であり、
Ｌは、脱離基である）。
【請求項２６】
前記式（Ｉ）の構造単位が、以下の通りである、請求項２０に記載の標的化ナノ粒子：
【化７】
2018070626.tif 000069
【請求項２７】
前記式（ＩＩ）の構造単位が、以下の通りである、請求項２０に記載の標的化ナノ粒子：
【化８】
2018070626.tif 000070
【請求項２８】
前記式（ＩＩＩ）の構造単位が、以下の通りである、請求項２０に記載の標的化ナノ粒子：
【化９】
2018070626.tif 000071
（式中、
ｎは、１〜２０である）。
【請求項２９】
前記ポリオール含有ポリマーが、以下の通りである、請求項１９に記載の標的化ナノ粒子：
【化１０】
2018070626.tif 000072
【請求項３０】
前記ボロン酸含有ポリマーが、少なくとも１つの末端ボロン酸基を含み、且つ以下の一般式を有する、請求項１９〜２９のいずれか一項に記載の標的化ナノ粒子：
【化１１】
2018070626.tif 000073
（式中、
Ｒ３及びＲ４は、独立して、親水性有機ポリマーであり、
Ｘ１は、−Ｃ、−Ｎ、又は−Ｂのうちの１つ以上を含有する有機部分であり、
Ｙ１は、式−ＣｍＨ２ｍ−（式中、ｍは１以上である）のアルキル基又は芳香族基であり、
ｒは、１〜１０００であり、
ａは、０〜３であり、
ｂは、０〜３である）。
【請求項３１】
Ｒ３及びＲ４が、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｔ（式中、ｔは、２〜２０００である）である、請求項３０に記載の標的化ナノ粒子。
【請求項３２】
Ｘ１が、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、又は−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−であり、Ｙ１が、フェニル基である、請求項３０又は３１に記載の標的化ナノ粒子。
【請求項３３】
ｒ＝１、ａ＝０、及びｂ＝１である、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の標的化ナノ粒子。
【請求項３４】
官能基１及び官能基２が、同じであるか又は異なり、且つ独立して、−Ｂ（ＯＨ）２、−ＯＣＨ３、−ＯＨから選択される、請求項３０〜３３のいずれか一項に記載の標的化ナノ粒子。
【請求項３５】
前記ボロン酸含有ポリマーが、以下の通りである、請求項１９〜３４のいずれか一項に記載の標的化ナノ粒子：
【化１２】
2018070626.tif 000074
（式中、ｓ＝２０〜３００である）。
【請求項３６】
前記ボロン酸含有ポリマーが、前記ボロン酸とは反対の末端において標的リガンドにコンジュゲートしている、請求項１９〜３５のいずれか一項に記載の標的化ナノ粒子。
【請求項３７】
前記標的リガンドが、抗体、トランスフェリン、細胞受容体のリガンド、アプタマー、又は細胞受容体タンパク質のうちの任意の１つであり、前記標的リガンドが、代替として、抗体の断片、トランスフェリン、細胞受容体のリガンド、又は細胞受容体タンパク質を含んでよい、請求項１９〜３６のいずれか一項に記載の標的化ナノ粒子。
【請求項３８】
治療剤を更に含む、請求項１９〜３７のいずれか一項に記載の標的化ナノ粒子。
【請求項３９】
前記治療剤が、低分子化学療法剤又はポリヌクレオチドである、請求項３８に記載の標的化ナノ粒子。
【請求項４０】
前記ポリヌクレオチドが、干渉ＲＮＡである、請求項３９に記載の標的化ナノ粒子。
【請求項４１】
前記低分子化学療法剤が、カンプトセシン、エポチロン、タキサン、及びポリヌクレオチド、又はこれらの任意の組み合わせから選択される、請求項３９に記載の標的化ナノ粒子。
【請求項４２】
前記ボロン酸含有ポリマーが、ニトロフェニルボロン酸基を含み、且つ以下の一般式を有する、請求項１９〜２９のいずれか一項に記載の標的化ナノ粒子：
【化１３】
2018070626.tif 000075
（式中、
Ｒ３及びＲ４は、独立して、親水性有機ポリマーであり、
Ｘ１は、−Ｃ、−Ｎ、又は−Ｂのうちの１つ以上を含有する有機部分であり、
Ｙ１は、ニトロ基を有するフェニル基であり、
ｒは、１〜１０００であり、
ａは、０〜３であり、
ｂは、０〜３である）。
【請求項４３】
Ｒ３及びＲ４が、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｔ（式中、ｔは、２〜２０００である）である、請求項４２に記載の標的化ナノ粒子。
【請求項４４】
Ｘ１が、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、又は−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−であり、Ｙ１が、ニトロ基を有するフェニル基である、請求項４２又は４３に記載の標的化ナノ粒子。
【請求項４５】
ｒ＝１、ａ＝０、及びｂ＝１である、請求項４２〜４４のいずれか一項に記載の標的化ナノ粒子。
【請求項４６】
官能基１及び官能基２が、同じであるか又は異なり、且つ独立して、−Ｂ（ＯＨ）２、−ＯＣＨ３、−ＯＨから選択される、請求項４２〜４５のいずれか一項に記載の標的化ナノ粒子。
【請求項４７】
ニトロフェニルボロン酸含有ポリマーが、以下のうちの任意の１つである、請求項１９〜２９又は４２〜４６のいずれか一項に記載の標的化ナノ粒子：
【化１４】
2018070626.tif 000076
（式中、ｓ＝２０〜３００である）。
【請求項４８】
前記ニトロフェニルボロン酸含有ポリマーが、ニトロフェニルボロン酸とは反対の末端において標的リガンドにコンジュゲートしている、請求項４２〜４７のいずれか一項に記載の標的化ナノ粒子。
【請求項４９】
前記標的リガンドが、抗体、トランスフェリン、細胞受容体のリガンド、アプタマー、又は細胞受容体タンパク質のうちの任意の１つであり、前記標的リガンドが、代替として、抗体の断片、トランスフェリン、細胞受容体のリガンド、又は細胞受容体タンパク質を含んでよい、請求項４２〜４８のいずれか一項に記載の標的化ナノ粒子。
【請求項５０】
治療剤を更に含む、請求項４２〜４９のいずれか一項に記載の標的化ナノ粒子。
【請求項５１】
前記治療剤が、低分子化学療法剤又はポリヌクレオチドである、請求項５０に記載のナノ粒子。
【請求項５２】
前記ポリヌクレオチドが、干渉ＲＮＡである、請求項５１に記載の標的化ナノ粒子。
【請求項５３】
前記低分子化学療法剤が、カンプトセシン、エポチロン、タキサン、及びポリヌクレオチド、又はこれらの任意の組み合わせから選択される、請求項５１に記載の標的化ナノ粒子。
【請求項５４】
被験体における標的にナノ粒子を送達する方法であって、請求項１９〜５３のいずれか一項に記載の標的化ナノ粒子を得る工程であって、前記ナノ粒子が、前記標的に特異的に結合する単一の標的リガンドにコンジュゲートしている、工程と、前記単一の標的リガンドにコンジュゲートしているナノ粒子を前記被験体に投与する工程と、を含む、方法。
【請求項５５】
前記標的リガンドが、抗体、トランスフェリン、細胞受容体のリガンド、アプタマー、又は細胞受容体タンパク質のうちの任意の１つであり、前記標的リガンドが、代替として、抗体の断片、トランスフェリン、細胞受容体のリガンド、又は細胞受容体タンパク質を含んでよい、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記標的化ナノ粒子が、治療剤を更に含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記治療剤が、低分子化学療法剤又はポリヌクレオチドである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記ポリヌクレオチドが、干渉ＲＮＡである、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記低分子化学療法剤が、カンプトセシン、エポチロン、タキサン、及びポリヌクレオチド、又はこれらの任意の組み合わせから選択される、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
被験体における標的にナノ粒子を送達する方法であって、請求項１９〜５９のいずれか一項に記載のナノ粒子を得る工程であって、前記ナノ粒子が、前記標的に特異的に結合する単一の標的リガンドにコンジュゲートしている、工程と、前記単一の標的リガンドにコンジュゲートしているナノ粒子を前記被験体に投与する工程と、を含む、方法。
【請求項６１】
前記標的リガンドが、抗体、トランスフェリン、細胞受容体のリガンド、アプタマー、又は細胞受容体タンパク質のうちの任意の１つであり、前記標的リガンドが、代替として、抗体の断片、トランスフェリン、細胞受容体のリガンド、又は細胞受容体タンパク質を含んでよい、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記標的化ナノ粒子が、治療剤を更に含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記治療剤が、低分子化学療法剤又はポリヌクレオチドである、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記ポリヌクレオチドが、干渉ＲＮＡである、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記低分子化学療法剤が、カンプトセシン、エポチロン、タキサン、及びポリヌクレオチド、又はこれらの任意の組み合わせから選択される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
ムチン酸含有ポリマーと、治療剤と、フェニルボロン酸含有ポリマーとを含む標的化ナノ粒子であって、フェニルボロン酸が、ムチン酸ポリマーと可逆的共有結合でカップリングしており、前記標的化ナノ粒子が、前記ナノ粒子の外部環境に前記フェニルボロン酸含有ポリマーを提示するようになっており、前記フェニルボロン酸含有ポリマーが、前記ナノ粒子とは反対の末端において標的リガンドにコンジュゲートしており、前記標的化ナノ粒子が、単一の標的リガンドを含む、標的化ナノ粒子。
【請求項６７】
前記治療剤が、カンプトセシン、エポチロン、タキサン、ポリヌクレオチド、又はこれらの任意の組み合わせのうちの任意の１つであり；前記フェニルボロン酸含有ポリマーが、以下のうちの任意の１つであり、
【化１５】
2018070626.tif 000077
（式中、ｓ＝２０〜３００である）、前記標的リガンドが、抗体、トランスフェリン、細胞受容体のリガンド、又は細胞受容体タンパク質のうちの任意の１つを含み、前記標的リガンドが、代替として、抗体の断片、トランスフェリン、細胞受容体のリガンド、又は細胞受容体タンパク質を含んでよい、請求項６６に記載の標的化ナノ粒子。
【請求項６８】
前記治療剤が、カンプトセシンであり、前記フェニルボロン酸含有ポリマーが、以下のうちの任意の１つであり：
【化１６】
2018070626.tif 000078
（式中、ｓ＝２０〜３００である）、前記標的リガンドが、抗体を含む、請求項６６に記載の標的化ナノ粒子。
【請求項６９】
ポリオール含有ポリマーを含むナノ粒子とボロン酸含有ポリマーとをコンジュゲートさせる工程と、前記ボロン酸含有ポリマーと標的リガンドとをコンジュゲートさせる工程とを含み、前記標的化ナノ粒子の、前記ナノ粒子の前記標的リガンドに対する比が、３：１以下、又は２：１以下、又は１：１以下である、請求項１〜９、１９〜５３、又は６６〜６８のいずれか一項に記載の標的化ナノ粒子を製造する方法。
【請求項７０】
前記標的化ナノ粒子の、前記ナノ粒子の前記標的リガンドに対する比が、１：１である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記ポリオール含有ポリマーが、ムチン酸ポリマーであり、前記ボロン酸含有ポリマーが、フェニルボロン酸又はニトロフェニルボロン酸を含み、前記標的リガンドが、抗体、トランスフェリン、細胞受容体のリガンド、アプタマー、又は細胞受容体タンパク質を含む、請求項６９又は７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記フェニルボロン酸含有ポリマー又は前記ニトロフェニルボロン酸含有ポリマーが、以下の化合物のうちの１つである、請求項６９〜７１のいずれか一項に記載の方法：
【化１７】
2018070626.tif 000079
（式中、ｓ＝２０〜３００である）。
【請求項７３】
前記ボロン酸含有ポリマーが、ポリオール含有ポリマーを含む前記ナノ粒子にコンジュゲートする前に、前記標的リガンドにコンジュゲートする、請求項６９〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
ポリオール含有ポリマーを含むナノ粒子と、ボロン酸含有ポリマーと、標的リガンドと、前記ナノ粒子の前記標的リガンドに対する比が、３：１以下、又は２：１以下、又は１：１以下である標的化ナノ粒子を製造するための説明書とを含む、請求項１〜９、１９〜５３、又は６６〜６８のいずれか一項に記載の標的化ナノ粒子を製造するためのキット。
【請求項７５】
前記説明書に、前記ナノ粒子の前記標的リガンドに対する比が１：１である標的化ナノ粒子を製造する方法が記載されている、請求項７４に記載のキット。
【請求項７６】
前記ポリオール含有ポリマーが、ムチン酸ポリマーであり、前記ボロン酸含有ポリマーが、フェニルボロン酸又はニトロフェニルボロン酸を含み、前記標的リガンドが、抗体、トランスフェリン、細胞受容体のリガンド、又は細胞受容体タンパク質を含む、請求項７４又は７５に記載のキット。
【請求項７７】
前記フェニルボロン酸含有ポリマー又は前記ニトロフェニルボロン酸含有ポリマーが、以下の化合物のうちの１つである、請求項７４〜７６のいずれか一項に記載のキット：
【化１８】
2018070626.tif 000080
（式中、ｓ＝２０〜３００である）。
【請求項７８】
前記ボロン酸含有ポリマー及び前記標的リガンドが、単一のコンジュゲート化単位として提供される、請求項７４〜７７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項７９】
前記標的リガンドと前記ボロン酸含有ポリマーとをコンジュゲートするための１つ以上の試薬を更に含む、請求項７４〜７８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項８０】
疾患状態を有する被験体を治療する方法であって、前記疾患状態を治療するための治療剤を更に含む請求項１〜９、１９〜３７、４０、４２〜４９、５２、又は６６〜６７のいずれか一項に記載のナノ粒子を得る工程であって、前記ボロン酸含有ポリマーを、前記疾患状態の原因である細胞に特異的に結合する単一の標的リガンドにコンジュゲートさせる、工程と、前記ナノ粒子を前記被験体に投与する工程と、を含む、方法。
【請求項８１】
前記疾患状態が、癌であり、前記治療剤が、化学療法化合物である、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記化学療法化合物が、カンプトセシン、エポチロン、又はタキサンのうちの任意の１つである、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
疾患状態を有する被験体を治療する方法であって、前記疾患状態を治療するための治療剤を更に含む請求項１〜９、１９〜３７、４０、４２〜４９、５２、又は６６〜６７のいずれか一項に記載のナノ粒子を得る工程であって、前記ニトロフェニルボロン酸含有ポリマーを、前記疾患状態の原因である細胞に特異的に結合する単一の標的リガンドにコンジュゲートさせる、工程と、前記ナノ粒子を前記被験体に投与する工程と、を含む、方法。
【請求項８４】
前記疾患状態が、癌であり、前記治療剤が、化学療法化合物である、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記化学療法化合物が、カンプトセシン、エポチロン、又はタキサンのうちの任意の１つである、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記ボロン酸含有ポリマーが、ポリオール含有ポリマーを含む前記ナノ粒子にコンジュゲートした後に、前記標的リガンドにコンジュゲートする、請求項６９〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
請求項１〜９、１９〜５３、又は６６〜６８のいずれか一項に記載のナノ粒子と、好適なビヒクル及び／又は賦形剤とを含む、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の権利
本発明は、国立癌研究所によって授与された助成金ＣＡ  １１９３４７の下、政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
本開示は、担体ナノ粒子、具体的には、対象化合物を送達するのに好適なナノ粒子、並びに関連する組成物、方法、及び系に関する。
【背景技術】
【０００３】
細胞、組織、器官、及び生物への対象化合物の有効な送達は、様々なサイズ及び寸法の分子を所定の標的に送達することが望ましい生物医学、イメージング、及び他の分野における課題である。
【０００４】
病理学的検査のためであれ、治療上の処置のためであれ、又は基礎的生物学研究のためであれ、幾つかの方法が公知であり、典型的に対象の生物学的及び／又は化学的活性に関連する様々な分類の生体材料及び生体分子を送達するために用いられている。
【０００５】
化学又は生物剤（例えば、薬物、生物製剤、治療薬、又は造影剤）として用いるのに好適な分子の数が増えるにつれて、様々な複雑性、寸法、及び化学的性質の化合物と共に用いるのに好適な送達系の開発が特に困難であることが証明されている。
【０００６】
ナノ粒子は、様々な送達方法を用いて剤を送達するための担体として有用な構造体である。幾つかのナノ粒子送達系が存在し、これは、剤を特定の標的にパッケージ化、輸送、及び送達するための様々な異なるストラテジーを利用する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
幾つかの実施形態において、対象化合物を有効且つ特異的に送達するための多機能ツールを提供するナノ粒子、並びに関連する組成物、方法、及び系を本明細書に提供する。具体的には、幾つかの実施形態では、本明細書に記載するナノ粒子は、様々なサイズ、寸法、及び化学的性質の広範な分子を所定の標的に運搬及び送達するための柔軟な系として用いることができる。
【０００８】
１つの態様によれば、ポリオール含有ポリマー及びボロン酸含有ポリマーを含むナノ粒子について記載する。上記ナノ粒子では、ボロン酸含有ポリマーは、ポリオール含有ポリマーにカップリングしており、上記ナノ粒子は、上記ナノ粒子の外部環境に上記ボロン酸含有ポリマーを提示するようになっている。１つ以上の対象化合物は、ポリオール含有ポリマー及び／又はボロン酸含有ポリマーの一部として又は結合して、ナノ粒子によって運搬され得る。
【０００９】
別の態様によれば、組成物について記載する。上記組成物は、本明細書に記載するナノ粒子と、好適なビヒクル及び／又は賦形剤とを含む。
【００１０】
別の態様によれば、化合物を標的に送達する方法について記載する。上記方法は、本明細書に記載するナノ粒子を標的と接触させる工程を含み、上記化合物は、本明細書に記載するナノ粒子のポリオール含有ポリマー又はボロン酸含有ポリマー中に含まれる。
【００１１】
別の態様によれば、化合物を標的に送達する系について記載する。上記系は、化合物を含む本明細書に記載するナノ粒子を構築する、可逆的共有結合を通して相互結合することができるポリオール含有ポリマー及びボロン酸含有ポリマーを少なくとも含む。
【００１２】
別の態様によれば、化合物を個体に投与する方法について記載する。上記方法は、有効量の本明細書に記載するナノ粒子を個体に投与する工程を含み、上記化合物は、ポリオール含有ポリマー及び／又はボロン酸含有ポリマー中に含まれる。
【００１３】
別の態様によれば、化合物を個体に投与する系について記載する。上記系は、本明細書に記載する方法に従って個体に投与される化合物に結合している本明細書に記載するナノ粒子を構築する、可逆的共有結合を通して相互結合することができるポリオール含有ポリマー及びボロン酸含有ポリマーを少なくとも含む。
【００１４】
別の態様によれば、ポリオール含有ポリマー及びボロン酸含有ポリマーを含むナノ粒子を調製する方法について記載する。上記方法は、ある時間ある条件下でポリオール含有ポリマーをボロン酸含有ポリマーと接触させて、上記ポリオール含有ポリマーと上記ボロン酸含有ポリマーとをカップリングさせる工程を含む。
【００１５】
別の態様によれば、本開示の以下の章に詳細に説明する幾つかのボロン酸含有ポリマーについて記載する。
【００１６】
別の態様によれば、本開示の以下の章に詳細に説明する幾つかのポリオール含有ポリマーについて記載する。
【００１７】
また、そのｐＫａを低下させることによってナノ粒子の安定性を強化する、ニトロフェニルボロン酸基を有するポリマーにコンジュゲートしているポリオール含有ポリマーを有するナノ粒子についても本明細書に記載する。
【００１８】
本開示の別の態様は、粒子の標的リガンドの結合パートナーを発現している細胞等、特定の標的へのナノ粒子の送達を促進することができる、幾つかの実施形態では、標的リガンドを１つしか有し得ない標的化ナノ粒子についての記載を提供する。この種の標的化ナノ粒子は、有している表面リガンドが少ないことにより、例えば、より小さな全体サイズを有する複数の標的リガンドを含むナノ粒子よりも優れており、親和性に基づく相互作用ではなく結合力に基づく相互作用を通して非特異的結合を仲介するためにリガンドが少ない。更に、治療剤を含有又は運搬するナノ粒子は、単一の標的リガンドのみを用いて対象箇所（細胞又は組織等）に成功裏に標的とすることができ、それによって、非常に高い標的リガンド対治療剤比で、治療剤を標的に送達する。記載するナノ粒子のこの態様は、標的化を仲介するために多数の高価な抗体を使用する必要を低減すると同時に、このような治療剤を製造する効率を著しく高めることができる。
【００１９】
本明細書に記載するナノ粒子、並びに関連する組成物、方法、及び系は、様々なサイズ、寸法、及び化学的性質の化合物を運搬するのに好適な柔軟な分子構造として幾つかの実施形態において使用することができる。
【００２０】
本明細書に記載するナノ粒子、並びに関連する組成物、方法、及び系は、運搬される化合物を分解、免疫系による認識、及び血清タンパク質又は血液細胞との組み合わせに起因する喪失から保護することができる送達系として、幾つかの実施形態において用いることができる。
【００２１】
本明細書に記載するナノ粒子、並びに関連する組成物、方法、及び系は、立体安定化、並びに／又は組織、組織内の特定の細胞種、及び更には特定の細胞種内の特定の細胞内部位等の特定の標的に化合物を送達する能力を特徴とする送達系として、幾つかの実施形態において用いることができる。
【００２２】
本明細書に記載するナノ粒子、並びに関連する組成物、方法、及び系は、異なる速度及び／又は時間で同じナノ粒子内の複数の化合物を制御放出することを含む、運搬される化合物を制御された方法で放出するために、幾つかの実施形態において設計され得る。
【００２３】
本明細書に記載するナノ粒子、並びに関連する組成物、方法、及び系は、標的化中の特異性及び／若しくは選択性が強化され、並びに／又は当該技術分野の特定の系に比べて標的による化合物の認識が強化された状態で化合物を送達するために、幾つかの実施形態において用いることができる。
【００２４】
本明細書に記載するナノ粒子、並びに関連する組成物、方法、及び系は、治療、診断、及び臨床用途等の医療用途が挙げられるが、これらに限定されない、対象化合物の制御送達が望ましい用途に関連して、幾つかの実施形態において用いることができる。更なる用途は、生物学的分析、獣医学的用途、並びに動物以外の生物、特に植物における対象化合物の送達を含む。
【００２５】
本開示の１つ以上の実施形態の詳細は、添付図面、並びに以下の詳細な説明及び実施例に記載される。他の特徴、目的、及び利点は、詳細な説明、実施例、及び図面、並びに添付の特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を形成する添付図面は、本開示の原理及び実施について説明するために、詳細な説明及び実施例と共に、本開示の１つ以上の実施形態を例証する。
【図１】ボロン酸含有化合物の非存在下におけるナノ粒子及び関連する形成方法の概略図を示す。パネルＡは、本明細書に記載する一実施形態に係るポリオール（ＭＡＰ，４）含有ポリマー及び対象化合物（核酸）の概略図を示す。パネルＢは、パネルＡに示すポリオール含有ポリマー及び化合物を構築して形成されたナノ粒子を示す。
【図２】本開示の一実施形態に係るナノ粒子及び関連する製造方法の概略図を示す。パネルＡは、本開示の一実施形態に係る対象分子（核酸）と共にポリオール（ＭＡＰ，４）含有ポリマー及びボロン酸（ＢＡ−ＰＥＧ，６）含有ポリマーを示す。パネルＢは、パネルＡに示すポリマー及び化合物を構築して形成されたＢＡ−ペグ化安定化ナノ粒子を示す。
【図３】本明細書に記載する一実施形態に係るポリオール含有ポリマー及び対象化合物を含む複合体の形成を示す。具体的には、図３は、本開示の一実施形態に係るプラスミドＤＮＡを用いたＭＡＰゲル遅延度アッセイの結果を示す。ＤＮＡラダーをレーン１にロードする。レーン２〜８は、電荷比を徐々に増加させたＭＡＰと組み合わせたプラスミドＤＮＡを示す。電荷比は、核酸における負電荷の量で除したＭＡＰにおける正電荷の量として定義される。
【図４】本明細書に記載する一実施形態に係るポリオール含有ポリマー及び対象化合物を含む複合体の形成を示す。具体的には、図４は、本開示の一実施形態に係るｓｉＲＮＡを用いたＭＡＰゲル遅延度アッセイの結果を示す。ＤＮＡラダーをレーン１にロードする。レーン２〜８は、電荷比が徐々に増加するＭＡＰと合わせたｓｉＲＮＡを示す。
【図５】本明細書に記載する幾つかの実施形態に係るナノ粒子の特性を示す。具体的には、図５は、電荷比に対する（動的光散乱（ＤＬＳ）測定から決定された）粒径、及び本開示の一実施形態に係るＭＡＰ−プラスミドナノ粒子の電荷比に対するゼータ電位（ナノ粒子の表面電荷に関連する特性）のプロットを示す図を示す。
【図６】本明細書に記載する幾つかの実施形態に係るナノ粒子の特性を示す。具体的には、図６は、電荷比に対する粒径（ＤＬＳ）、及び本開示の一実施形態に係るＢＡ−ペグ化ＭＡＰ−プラスミドナノ粒子の電荷比に対するゼータ電位のプロットを示す図を示す。
【図７】本明細書に開示する一実施形態に係るＢＡ−ペグ化ＭＡＰ−プラスミドナノ粒子の塩安定性を示す。プロットＡ：５：１  ＢＡ−ＰＥＧ＋ｎｐ＋１×ＰＢＳ  ５分後；プロットＢ：５：１  ＢＡ−ＰＥＧ＋ｎｐ、透析３×  ｗ／１００ｋＤａ＋１×ＰＢＳ  ５分後；プロットＣ：５：１プレペグ化ｗ／ＢＡ−ＰＥＧ＋１×ＰＢＳ  ５分後；プロットＤ：５：１プレペグ化ｗ／ＢＡ−ＰＥＧ、透析３×  ｗ／１００ｋＤａ＋ＰＢＳ  ５分後。
【図８】本明細書に記載する一実施形態に係るナノ粒子を用いたインビトロにおける剤のヒト細胞への送達を示す。具体的には、図８は、本開示の一実施形態に係るＭＡＰ／ｐＧＬ３のＨｅＬａ細胞へのトランスフェクションについての、細胞に送達されたｐＧＬ３プラスミドから発現したルシフェラーゼタンパク質の量の指標である相対光単位（ＲＬＵ）対電荷比のプロットを示す図を示す。
【図９】本明細書に記載する一実施形態に係るナノ粒子を用いた剤の標的への送達を示す。具体的には、図９は、本開示の一実施形態に係るＭＡＰ／ｐＧＬ３トランスフェクション後の細胞生存率対電荷比のプロットを示す図を示す。生存率のデータは、図８に示した実験についてのものである。
【図１０】本明細書に記載する一実施形態に係るナノ粒子を用いた複数の化合物の標的への送達を示す。具体的には、図１０は、本明細書に記載する一実施形態に係る、電荷比＋／−５のｐＧＬ３及びｓｉＧＬ３を含有するＭＡＰ粒子のＨｅＬａ細胞へのコトランスフェクションについての、相対光単位（ＲＬＵ）対粒子の種類のプロットを示す図を示す。ｓｉＣＯＮという表現は、対照配列を有するｓｉＲＮＡを示す。
【図１１】本明細書に記載する一実施形態に係るナノ粒子を用いた化合物の標的への送達を示す。具体的には、図１１は、本明細書に記載する一実施形態に係る、電荷比＋／−５のＭＡＰ／ｓｉＧＬ３のＨｅＬａ−Ｌｕｃ細胞への送達についての、相対光単位（ＲＬＵ）対ｓｉＧＬ３の濃度のプロットを示す図を示す。
【図１２】本明細書に記載する幾つかの実施形態に係る標的リガンドを提示するボロン酸含有ポリマーの合成の概略図を示す。具体的には、図１２は、本開示の一実施形態に係るボロン酸−ＰＥＧジスルフィド−トランスフェリンの合成の概略を示す。
【図１３】本明細書に記載する幾つかの実施形態に係るナノ粒子の合成の概略図を示す。具体的には、図１３は、本開示の一実施形態に係る水中におけるカンプトセシンムチン酸ポリマー（ＣＰＴ−ムチン酸ポリマー）を含むナノ粒子の形成の概略を示す。
【図１４】本開示の一実施形態に従って調製される、水中でコンジュゲートしたＣＰＴ−ムチン酸ポリマーから形成されたナノ粒子の粒径及びゼータ電位を要約する表を示す。
【図１５】本明細書に記載する幾つかの実施形態に係るナノ粒子の合成の概略図を示す。具体的には、図１５は、本開示の一実施形態に係る水中におけるＣＰＴ−ムチン酸ポリマー及びボロン酸−ジスルフィド−ＰＥＧ５０００を用いたボロン酸−ペグ化ナノ粒子の形成を示す。
【図１６】ＰＥＧを用いずに、ニトロＰＥＧ−ＰＥＧを用いて、及び０．２５モル％ハーセプチン−ＰＥＧ−ニトロＰＢＡを用いて安定化したＭＡＰ−４／ｓｉＲＮＡの塩安定性を示す。電荷比３（＋／−）における配合では、得られる溶液が１×ＰＢＳになるように５分で１０×ＰＢＳを添加した。
【図１７】（Ａ）ＢＴ−４７４中におけるハーセプチン（登録商標）−ＰＥＧ−ニトロＰＢＡのナノ粒子に対する比を増加させたときの標的化ＭＡＰ−ＣＰＴナノ粒子、（Ｂ）ＢＴ−４７４（黒棒）及びＭＣＦ−７（白棒）細胞株における、遊離ハーセプチン（登録商標）（１０ｍｇ／ｍＬ）を含む若しくは含まない中ＭＡＰ−ＣＰＴナノ粒子又は標的化ＭＡＰ−ＣＰＴナノ粒子の細胞取り込みを示す。
【図１８】Ａ及びＢは、１０ｍｇＣＰＴ／ｋｇを注入したＢＡＬＢ／ｃマウスにおける短、中、及び長ＭＡＰ−ＣＰＴナノ粒子、並びに標的化ＭＡＰ−ＣＰＴナノ粒子の血漿薬物動態を示す。１０ｍｇ／ｋｇでＣＤ２Ｆ１マウスに注入した遊離ＣＰＴを比較として示す。（Ａ）時間の関数としてのポリマーに結合しているＣＰＴの血漿濃度。（Ｂ）時間の関数としてのコンジュゲートしていないＣＰＴの血漿濃度。
【図１９Ａ】４及び２４時間の処理後のＭＡＰ−ＣＰＴ（５ｍｇＣＰＴ／ｋｇ）及び標的化ＭＡＰ−ＣＰＴ（５ｍｇＣＰＴ／ｋｇ、２９ｍｇハーセプチン（登録商標）／ｋｇ）ナノ粒子の体内分布を示す。（Ａ）腫瘍、心臓、肝臓、脾臓、腎臓、又は肺１グラム当たりの全ＣＰＴの注入量（ＩＤ）率（％）（Ｂ）腫瘍、心臓、肝臓、脾臓、腎臓、及び肺におけるコンジュゲートしていない各器官中の全ＣＰＴの割合（Ｃ）血漿中のＣＰＴの合計濃度（Ｄ）血漿におけるコンジュゲートしていない合計ＣＰＴの割合。
【図１９Ｂ】４及び２４時間の処理後のＭＡＰ−ＣＰＴ（５ｍｇＣＰＴ／ｋｇ）及び標的化ＭＡＰ−ＣＰＴ（５ｍｇＣＰＴ／ｋｇ、２９ｍｇハーセプチン（登録商標）／ｋｇ）ナノ粒子の体内分布を示す。（Ａ）腫瘍、心臓、肝臓、脾臓、腎臓、又は肺１グラム当たりの全ＣＰＴの注入量（ＩＤ）率（％）（Ｂ）腫瘍、心臓、肝臓、脾臓、腎臓、及び肺におけるコンジュゲートしていない各器官中の全ＣＰＴの割合（Ｃ）血漿中のＣＰＴの合計濃度（Ｄ）血漿におけるコンジュゲートしていない合計ＣＰＴの割合。
【図１９Ｃ】４及び２４時間の処理後のＭＡＰ−ＣＰＴ（５ｍｇＣＰＴ／ｋｇ）及び標的化ＭＡＰ−ＣＰＴ（５ｍｇＣＰＴ／ｋｇ、２９ｍｇハーセプチン（登録商標）／ｋｇ）ナノ粒子の体内分布を示す。（Ａ）腫瘍、心臓、肝臓、脾臓、腎臓、又は肺１グラム当たりの全ＣＰＴの注入量（ＩＤ）率（％）（Ｂ）腫瘍、心臓、肝臓、脾臓、腎臓、及び肺におけるコンジュゲートしていない各器官中の全ＣＰＴの割合（Ｃ）血漿中のＣＰＴの合計濃度（Ｄ）血漿におけるコンジュゲートしていない合計ＣＰＴの割合。
【図１９Ｄ】４及び２４時間の処理後のＭＡＰ−ＣＰＴ（５ｍｇＣＰＴ／ｋｇ）及び標的化ＭＡＰ−ＣＰＴ（５ｍｇＣＰＴ／ｋｇ、２９ｍｇハーセプチン（登録商標）／ｋｇ）ナノ粒子の体内分布を示す。（Ａ）腫瘍、心臓、肝臓、脾臓、腎臓、又は肺１グラム当たりの全ＣＰＴの注入量（ＩＤ）率（％）（Ｂ）腫瘍、心臓、肝臓、脾臓、腎臓、及び肺におけるコンジュゲートしていない各器官中の全ＣＰＴの割合（Ｃ）血漿中のＣＰＴの合計濃度（Ｄ）血漿におけるコンジュゲートしていない合計ＣＰＴの割合。
【図２０】（Ａ）４時間におけるＭＡＰ−ＣＰＴ（５ｍｇＣＰＴ／ｋｇ）、（Ｂ）２４時間におけるＭＡＰ−ＣＰＴ（５ｍｇＣＰＴ／ｋｇ）、（Ｃ）４時間における標的化ＭＡＰ−ＣＰＴ（５ｍｇＣＰＴ／ｋｇ、２９ｍｇハーセプチン（登録商標）／ｋｇ）、（Ｄ）２４時間における標的化ＭＡＰ−ＣＰＴ（５ｍｇＣＰＴ／ｋｇ、２９ｍｇハーセプチン（登録商標）／ｋｇ）で処理したＮＣｒヌードマウスから採取したＢＴ−４７４腫瘍切片の共焦点免疫蛍光顕微鏡画像を示す。左のパネル：発光４４０ｎｍ（ＣＰＴ、ピンク）、中央左のパネル：発光５１９ｎｍ（ＭＡＰ、緑）、中央右のパネル：発光６４７ｎｍ（ハーセプチン（登録商標）、青）、右のパネル：画像の重層。
【図２１】ＢＴ−４７４異種移植腫瘍を有するＮＣｒヌードマウスにおける抗腫瘍効果試験を示す。時間の関数としての平均腫瘍体積、週２回ハーセプチンを投与した群、週３回投与した全ての他の群。
【図２２】（Ａ）５．９ｍｇ／ｋｇのハーセプチン、（Ｂ）標的化ＭＡＰ−ＣＰＴナノ粒子（５．９ｍｇハーセプチン（登録商標）／ｋｇ及び１ｍｇＣＰＴ／ｋｇ）で処理したＮＣｒヌードマウスにおける抗腫瘍効果試験を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
対象化合物（本明細書ではカーゴとも呼ぶ）の送達に関連して用いることができるナノ粒子、並びに関連する組成物、方法、及び系、上記ナノ粒子を製造する方法、上記ナノ粒子を用いる治療方法、並びに上記ナノ粒子を構築するためのキットを本明細書に提供する。
【００２８】
用語「ナノ粒子」とは、本明細書で使用するとき、ナノスケール寸法の複合構造体を示す。具体的には、ナノ粒子は、典型的に、約１〜約１０００ｎｍの範囲のサイズの粒子であり、通常、球形であるが、ナノ粒子の組成に依存して異なる形態も可能である。ナノ粒子の外部環境に接触するナノ粒子の部分は、一般的に、ナノ粒子の表面として同定される。本明細書に記載するナノ粒子では、サイズ制限は、二次元に限定され得、その結果、本明細書に記載するナノ粒子は、約１〜約１０００ｎｍの直径を有する複合構造体を含み、この場合、特定の直径は、ナノ粒子の組成及び実験計画に従ったナノ粒子の意図する使用に依存する。例えば、幾つかの治療用途で用いられるナノ粒子は、典型的に、約２００ｎｍ以下のサイズを有し、具体的には、癌治療に関連する送達に用いられるものは、典型的に、約１〜約１００ｎｍの直径を有する。用語「標的化ナノ粒子」とは、標的剤又はリガンドとコンジュゲートしているナノ粒子を指す。
【００２９】
また、表面電荷及び立体安定化等のナノ粒子の更なる望ましい特性は、特定の対象用途を考慮して変動し得る。癌治療等の臨床用途において望ましいことがある例示的な特性の一部が、科学文献に記載されている。更なる特性は、本開示を読んだときに当業者によって特定可能である。ナノ粒子の寸法及び特性は、当該技術分野において周知の技術によって検出され得る。粒子の寸法を検出するための例示的な技術としては、動的光散乱（ＤＬＳ）、並びに透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）及び原子間力顕微法（ＡＦＭ）等の様々な顕微鏡法が挙げられるが、これらに限定されない。粒子の形態を検出するための例示的な技術としては、ＴＥＭ及びＡＦＭが挙げられるが、これらに限定されない。ナノ粒子の表面電荷を検出するための例示的な技術としては、ゼータ電位法が挙げられるが、これらに限定されない。他の化学的特性を検出するのに好適な更なる技術は、１Ｈ、１１Ｂ、及び１３Ｃ、及び１９Ｆ  ＮＭＲ、ＵＶ／Ｖｉｓ及び赤外線／ラマン分光法、並びに蛍光分光法（ナノ粒子を蛍光標識と併用するとき）、並びに当業者によって特定可能な更なる技術を含む。
【００３０】
本明細書に記載するナノ粒子、並びに関連する組成物、方法、及び系を用いて、所定の標的に対象化合物、具体的には剤を送達することができる。
【００３１】
用語「送達する」及び「送達」とは、本明細書で使用するとき、化合物の空間的位置に影響を与える活動、具体的には、上記位置を制御する活動を指す。したがって、本開示の意味における化合物の送達は、特定のセットの条件下で特定の時間、化合物の配置及び移動に影響を与え、その結果、これら条件下における化合物の配置及び移動が、そうではない場合に化合物が有する配置及び移動に対して変化する能力を指す。
【００３２】
具体的には、基準終点に対する化合物の送達は、選択した基準終点に化合物が最終的に配置されるように、化合物の配置及び移動を制御する能力を指す。インビトロ系では、化合物の送達は、通常、化合物の化学的及び／又は生物学的検出可能特性及び活性の対応する改質に関連する。インビボ系では、化合物の送達は、典型的に、化合物の薬物動態及び場合により薬力学の改質に関連する。
【００３３】
化合物の薬物動態は、典型的に、個体の身体によって提供される、系からの化合物の吸収、分布、代謝、及び排泄を指す。具体的には、用語「吸収」とは、物質が身体に入るプロセスを指し、用語「分布」とは、身体の流体及び組織全体にわたる物質の分散又は散在を指し、用語「代謝」とは、親化合物の娘代謝産物への不可逆的な転換を指し、用語「排泄」とは、身体からの物質の排出を指す。化合物が製剤中に存在する場合、薬物動態は、化合物、典型的には薬物の製剤からの放出のプロセスを示す、製剤からの化合物の遊離も含む。用語「薬力学」とは、身体上、又は身体内若しくは身体上の微生物若しくは寄生虫上における化合物の生理学的効果、及び薬物の作用機序、及び薬物濃度と効果との関係を指す。当業者は、対象化合物、具体的には、薬物等の対象剤の薬物動態並びに薬力学特徴及び特性を検出するのに好適な技術及び手順を特定することができる。
【００３４】
用語「剤」とは、本明細書で使用するとき、標的に関連する化学的又は生物学的活性を示すことができる化合物を指す。用語「化学的活性」とは、本明細書で使用するとき、化学反応を実施する分子の能力を指す。用語「生物学的活性」とは、本明細書で使用するとき、生体に影響を与える分子の能力を指す。剤の例示的な化学的活性は、共有結合性又は静電相互作用の形成を含む。剤の例示的な生物学的活性は、内因性分子の生成及び分泌、内因性又は外因性分子の吸収及び代謝、並びに対象遺伝子の転写及び翻訳を含む遺伝子発現の活性化又は不活化を含む。
【００３５】
用語「標的」とは、本明細書で使用するとき、単細胞若しくは多細胞生物又はこれらの一部を含む対象生体系を指し、インビトロ若しくはインビボ生体系又はこれらの一部を含む。
【００３６】
本明細書におけるナノ粒子は、ポリオール含有ポリマーにカップリングしているボロン酸含有ポリマーが、ナノ粒子の外部環境に提示されるようにナノ粒子中で配置されていると記載される。
【００３７】
用語「ポリマー」とは、本明細書で使用するとき、典型的に、共有化学結合によって接続されている繰り返し構造単位からなる大きな分子を指す。好適なポリマーは、直鎖及び／又は分枝鎖であってよく、ホモポリマー又はコポリマーの形態を取り得る。コポリマーが用いられる場合、コポリマーは、ランダムコポリマー又は分枝鎖コポリマーであってよい。例示的なポリマーは、水分散性、特に水溶性ポリマーを含む。例えば、好適なポリマーとしては、多糖類、ポリエステル、ポリアミド、ポリエーテル、ポリカーボネート、ポリアクリレート等が挙げられるが、これらに限定されない。治療及び／又は医療的用途及び適用については、ポリマーは、低毒性プロファイルを有しなければならず、具体的には、毒性でも細胞毒性でもない。好適なポリマーとしては、約５００，０００以下の分子量を有するポリマーが挙げられる。具体的には、好適なポリマーは、約１００，０００以下の分子量を有し得る。
【００３８】
用語「ポリオール含有ポリマー」又は「ポリオールポリマー」とは、本明細書で使用するとき、複数のヒドロキシル官能基を提示するポリマーを指す。具体的には、本明細書に記載するナノ粒子を形成するのに好適なポリオール含有ポリマーは、ボロン酸含有ポリマーの少なくとも１つのボロン酸とカップリング相互作用するためのヒドロキシル官能基の少なくとも一部を提示するポリマーを含む。
【００３９】
用語「提示する」とは、化合物又は官能基に関連して本明細書で使用するとき、結合したときに化合物又は官能基の化学的反応性を維持するように実施される結合を指す。したがって、表面に提示される官能基は、適切な条件下で、官能基を化学的に特徴付ける１つ以上の化学反応を実施することができる。
【００４０】
ポリオール含有ポリマーを形成する構造単位は、ペンタエリスリトール、エチレングリコール、及びグリセリン等のモノマーポリオールを含む。例示的なポリオール含有ポリマーは、ポリエステル、ポリエーテル、及び多糖類を含む。例示的な好適なポリエーテルとしては、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、及びポリ（テトラメチレンエーテル）グリコール等の、ジオール、具体的には、一般式ＨＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐ−Ｈ（式中、ｐは１以上である）を有するジオールが挙げられるが、これらに限定されない。例示的な好適な多糖類としては、シクロデキストリン、デンプン、グリコーゲン、セルロース、キチン、及びβ−グルカンが挙げられるが、これらに限定されない。例示的な好適なポリエステルとしては、ポリカーボネート、ポリブチレート、及びポリエチレンテレフタレート（全て、ヒドロキシル末端基で終端する）が挙げられるが、これらに限定されない。例示的なポリオール含有ポリマーは、約５００，０００以下、特に約３００〜約１００，０００の分子量のポリマーを含む。
【００４１】
ポリオール含有ポリマーは幾つか市販されている、並びに／又は当業者によって特定可能な技術及び手順を用いて生成することができる。例示的なポリオールポリマーを合成するための例示的な手順は、科学文献に既に記載されており、また、他の手順を実施例１〜４に例証する。ポリオール含有ポリマーを作製するための更なる手順は、本開示を考慮して当業者によって特定可能である。
【００４２】
用語「ボロン酸含有ポリマー」又は「ＢＡポリマー」とは、本明細書で使用するとき、ポリオール含有ポリマーのヒドロキシル基に結合するために提示される少なくとも１つのボロン酸基を含有するポリマーを指す。具体的には、本明細書に記載するナノ粒子のボロン酸含有ポリマーは、少なくとも１つの構造単位において、炭素−ホウ素化学結合を含有するアルキル又はアリール置換ボロン酸を含むポリマーを含む。好適なＢＡポリマーは、得られるポリマーに親水性を付与するために、末端構造単位又は任意の他の好適な位置にボロン酸が存在するポリマーを含む。例示的なポリオール含有ポリマーは、約４０，０００以下、特に約２０，０００以下又は約１０，０００以下の分子量のポリマーを含む。
【００４３】
ボロン酸含有ポリマーは幾つか市販されている、並びに／又は当業者によって特定可能な技術及び手順を用いて生成することができる。例示的なポリオールポリマーを合成するための例示的な手順は、科学文献に既に記載されており、他の新規手順を実施例５〜８に例証する。ＢＡポリマーを作製するための更なる手順は、本開示を考慮して当業者によって特定可能である。
【００４４】
本明細書に記載するナノ粒子では、ポリオールポリマーは、ＢＡポリマーにカップリングしている。用語「カップリングする」又は「カップリング」とは、２つの分子間の結合に関連して本明細書で使用するとき、可逆的共有結合を形成する相互作用を指す。具体的には、好適な媒体の存在下で、ＢＡポリマー上に提示されているボロン酸は、急速且つ可逆的な対共有結合性相互作用を介してポリオールのヒドロキシル基と相互作用して、好適な媒体中でボロン酸エステルを形成する。好適な媒体としては、水及び幾つかの水性溶液、並びに当業者によって特定可能な更なる有機媒体が挙げられる。具体的には、水性媒体中で接触したとき、ＢＡポリマーとポリオールポリマーとが反応して、副生成物として水を生成する。ボロン酸−ポリオール相互作用は、一般的に、水性溶液中がより好ましいが、有機媒体中で進行することも知られている。更に、１，２及び１，３ジオールと形成される環状エステルは、一般的に、その非環式エステル対応物よりも安定である。
【００４５】
したがって、本明細書に記載するナノ粒子では、ボロン酸含有ポリマーの少なくとも１つのボロン酸が、可逆的共有結合でポリオール含有ポリマーのヒドロキシル基に結合している。ＢＡポリマーとポリオールポリマーとの間のボロン酸エステルの形成は、ホウ素−１１核磁気共鳴（１１Ｂ  ＮＭＲ）、電位差滴定、ＵＶ／Ｖｉｓ及び蛍光検出技術等の当業者によって特定可能な方法及び技術によって検出することができ、それによって、選択の技術は、ボロン酸及びポリオールを含むナノ粒子の特定の化学的性質及び特性に依存する。
【００４６】
本明細書に記載するＢＡポリマーと本明細書に記載するポリオールポリマーとのカップリング相互作用から得られるナノ粒子は、粒子の表面上にＢＡポリマーを提示する。幾つかの実施形態では、ナノ粒子は、約１〜約１０００ｎｍの直径及び球状形態を有し得るが、粒子の寸法及び形態は、大部分は、ナノ粒子を形成するために用いられる特定のＢＡポリマー及びポリオールポリマーによって、並びに本開示に係るナノ粒子上で運搬される化合物によって決定される。
【００４７】
幾つかの実施形態では、ナノ粒子によって運搬される対象化合物は、ＢＡポリマー及び／又はポリオールポリマーの一部を形成する。このような実施形態の例は、ポリマーの１つ以上の原子が特定の同位体（例えば、１９Ｆ及び１０Ｂ）によって置換されているナノ粒子によって提供されるので、標的を画像化するため及び／又は標的に放射線処理を行うための剤として好適である。
【００４８】
幾つかの実施形態では、対象化合物を運搬するナノ粒子は、共有結合又は非共有結合を介して、ポリマー、典型的にはポリオールポリマーに結合している。このような実施形態の例は、ポリオールポリマー及びＢＡポリマーのうちの少なくとも１つにおける１つ以上の部分が１つ以上の対象化合物に結合しているナノ粒子によって提供される。
【００４９】
用語「結合する」、「結合している」、又は「結合」は、本明細書で使用するとき、２つ以上の成分を互いに保持するための接合、連結、力、又は連携による接続又は一体化を指し、これは、例えば第１の化合物が第２の化合物に直接接合するように、及び第１の化合物と第２の化合物との間に１つ以上の中間体化合物、特に分子が配置されている実施形態のような直接又は間接的結合を包含する。
【００５０】
具体的には、幾つかの実施形態では、化合物は、ポリマーの好適な部分への上記化合物の共有結合を介してポリオールポリマー又はＢＡポリマーに結合することができる。例示的な共有結合は、薬物カンプトセシンのムチン酸ポリマーへの結合が生分解性エステル結合を介して実施される実施例１９、及びトランスフェリンのＢＡ−ＰＥＧ５０００への結合がトランスフェリンのペグ化を介して実施される実施例９に例証する。
【００５１】
幾つかの実施形態では、ポリマーは、例えば、対象化合物における対応する官能基に特異的に結合することができる１つ以上の官能基を付加することによって、特定の対象化合物に結合できるように設計又は修飾することができる。例えば、幾つかの実施形態では、ＢＡ−ＰＥＧ−Ｘ（式中、Ｘは、マレイミド又はヨードアセチル基又はチオールと特異的に反応するか又はアミンと非特異的に反応する任意の脱離基であってよい）でナノ粒子をペグ化することができる。次いで、結合する化合物は、チオール官能基を発現するように修飾した後にマレイミド又はヨードアセチル基に反応することができる。また、結合する化合物は、アルデヒド又はケトン基で修飾してもよく、これらは、ポリオールにおけるジオールと縮合反応を介して反応してアセタール又はケタールを与えることができる。
【００５２】
幾つかの実施形態では、対象化合物は、イオン結合、及び結合する化合物とポリマーの好適な部分との間の分子間相互作用等の非共有結合を介してポリオールポリマー又はＢＡポリマーに結合することができる。例示的な非共有結合は、実施例１０に例証される。
【００５３】
対象化合物は、例えば、微粒子複合材におけるポリマー及び／又は任意の結合する化合物の修飾を介して、ナノ粒子の形成前、形成時、又は形成後にナノ粒子に結合することができる。ナノ粒子における化合物の結合を実施するための例示的な手順は、実施例の項に例証する。本明細書に記載するナノ粒子のＢＡポリマー、ポリオールポリマー又は他の成分（例えば、既に導入されている対象化合物）に化合物を結合させる更なる手順は、本開示を読んだときに当業者によって特定可能である。
【００５４】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載するナノ粒子上に提示されているＢＡポリマーに結合している少なくとも１つの対象化合物は、標的リガンドとして用いることができる剤である。具体的には、幾つかの実施形態では、ナノ粒子は、ＢＡポリマーにおいて標的リガンドとして用いられる１つ以上の剤と、並びにポリオールポリマー及び／又はＢＡポリマーにおいて、選択された標的に送達される１つ以上の剤と結合する。
【００５５】
用語「標的リガンド」又は「標的剤」とは、本開示で用いるとき、特定の標的に会合するために、具体的には、例えば、ナノ粒子が細胞受容体に結合できるようにすることによって特定の細胞を認識する目的のために、ナノ粒子の表面上に提示され得る任意の分子を指す。好適なリガンドの例としては、ビタミン（例えば、葉酸）、タンパク質（例えば、トランスフェリン及びモノクローナル抗体）、単糖類（例えば、ガラクトース）、ペプチド、及び多糖類が挙げられるが、これらに限定されない。具体的には、標的リガンドは、抗ＶＥＧＦ等の特定の表面細胞受容体に対する抗体、葉酸等の低分子、及びホロトランスフェリン等の他のタンパク質であってよい。
【００５６】
当業者であれば理解する通り、リガンドの選択は、所望の送達の種類に依存して変動し得る。別の例として、リガンドは、ＨＩＶ−１由来のＴＡＴタンパク質等の膜透過又は膜透過性剤であってよい。ＴＡＴタンパク質は、細胞核に能動的に移入されるウイルスの転写活性化である。Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ，Ｖ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ，ＰＮＡＳ．９８，８７８６  ８７９１，（２００１）。ＢＡポリマーに結合する好適な標的リガンドは、典型的に、その遠位端にボロン酸が結合しているポリ（エチレンオキシド）等の柔軟性スペーサーを含む（実施例９を参照）。
【００５７】
幾つかの実施形態では、ポリオールポリマー及び／又はＢＡポリマーに含まれるか又は結合している化合物のうちの少なくとも１つ（標的リガンドを含む）は、標的、例えば、化学的又は生物学的活性、例えば、治療活性が発揮される個体に送達される剤、特に薬物であってよい。
【００５８】
本明細書に記載するナノ粒子を形成するのに好適なポリオールポリマー及びＢＡポリマーの選択は、対象化合物及び標的を考慮して実施してよい。具体的には、本明細書に記載するナノ粒子を形成するのに好適なポリオール含有ポリマー及び好適なＢＡポリマーの選択は、候補ポリオールポリマー及びＢＡポリマーを提供し、本開示の意味でカップリング相互作用を形成することができるポリオールポリマー及びＢＡポリマーを選択することによって実施することができ、ここで、選択されるＢＡポリマー及びポリオールポリマーは、ポリオールポリマー及び／又はＢＡポリマーに含まれるか又は結合している対象化合物及び標的リガンドを考慮して、ポリオールポリマーの親水性がＢＡポリマーよりも低いような化学組成を有する。ナノ粒子の表面上におけるＢＡポリマー、及びナノ粒子の外部環境における関連する提示の検出は、実施例１２に例証する通り、ナノ粒子の表面の修飾を示すことができるゼータ電位の検出によって実施することができる。（具体的には、図６を参照）。粒子の表面電荷及び塩溶液中の粒子の安定性を検出するための更なる手順としては、実施例１２に例示されているもの等の粒径の変化の検出（具体的には、図７を参照）、及び当業者によって特定可能な更なる手順が挙げられる。
【００５９】
幾つかの実施形態では、ポリオール含有ポリマーは、以下の構造単位のうちの少なくとも１つのうちの１つ以上を含む：
【００６０】
【化１】
2018070626.tif 000002
［式中、
Ａは、以下の式の有機部分であり：
【００６１】
【化２】
2018070626.tif 000003
（式中、
Ｒ１及びＲ２は、独立して、約１０ｋＤａ以下の分子量を有する任意の炭素ベース又は有機基から選択され、
Ｘは、独立して、−Ｈ、−Ｆ、−Ｃ、−Ｎ、又は−Ｏのうちの１つ以上を含有する脂肪族基から選択され、
Ｙは、独立して、−ＯＨ、又は−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−ＣＦ２ＯＨ、−ＣＦ２ＣＦ２ＯＨ、及びＣ（Ｒ１Ｇ１）（ＲＧ２）（Ｒ１Ｇ３）ＯＨ（式中、Ｒ１Ｇ１、Ｒ１Ｇ２、及びＲ１Ｇ３は、独立して、有機ベース官能基である）が挙げられるがこれらに限定されないヒドロキシル（−ＯＨ）基を有する有機部分から選択される）
Ｂは、第１のＡ部分のＲ１及びＲ２のうちの１つを、第２のＡ部分のＲ１及びＲ２のうちの１つと連結させる有機部分である］。
【００６２】
用語「部分」とは、本明細書で使用するとき、より大きな分子又は分子種の一部を構成する原子の群を指す。具体的には、部分とは、繰り返しポリマー構造単位の構成要素を指す。例示的な部分としては、酸又は塩基種、糖、炭水化物、アルキル基、アリール基、及びポリマー構造単位の形成において有用な任意の他の分子の構成要素が挙げられる。
【００６３】
用語「有機部分」とは、本明細書で使用するとき、炭素原子を含有する部分を指す。具体的には、有機基としては、天然及び合成化合物、並びにヘテロ原子を含む化合物が挙げられる。例示的な天然有機部分としては、大部分の糖、一部のアルカロイド及びテルペノイド、炭水化物、脂質及び脂肪酸、核酸、タンパク質、ペプチド及びアミノ酸、ビタミン、並びに脂肪及び油が挙げられるが、これらに限定されない。合成有機基とは、他の化合物との反応によって調製される化合物を指す。
【００６４】
幾つかの実施形態では、１つ以上の対象化合物が、（Ａ）、（Ｂ）、又は（Ａ）及び（Ｂ）に結合してもよい。
【００６５】
幾つかの実施形態では、Ｒ１及びＲ２は、独立して、以下の式を有する：
【００６６】
【化３】
2018070626.tif 000004
（式中、
ｄは、０〜１００であり、
ｅは、０〜１００であり、
ｆは、０〜１００であり、
Ｚは、１つの有機部分を別の、具体的には本明細書に定義する別の部分Ａ又は部分Ｂに連結させる共有結合であり、
Ｚ１は、独立して、−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＳＨ、及び−ＣＯＯＨから選択される）。
【００６７】
幾つかの実施形態では、Ｚは、独立して、−ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）、−ＳＳ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＨ（＝ＮＨ２＋）−、又は−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−から選択してよい。
【００６８】
幾つかの実施形態では、ポリオール含有ポリマーの構造単位Ａが式（ＩＶ）を有する場合、Ｘは、ＣｖＨ２ｖ＋１（ｖ＝０〜５である）であってよく、Ｙは、−ＯＨであってよい。
【００６９】
幾つかの実施形態では、Ｒ１及び／又はＲ２は、式（Ｖ）（式中、Ｚは、−ＮＨ（＝ＮＨ２＋）−である及び／又はＺ１は、ＮＨ２である）を有する。
【００７０】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載する粒子のポリオール含有ポリマーでは、（Ａ）は、独立して、以下の式から選択してよい：
【００７１】
【化４】
2018070626.tif 000005
（式中、
スペーサーは、独立して、任意の有機部分から選択され、具体的には、硫黄、窒素、酸素、又はフッ素等のヘテロ原子を任意で含有するアルキル、フェニル、又はアルコキシ基を含んでよく、
アミノ酸は、遊離アミン及び遊離カルボン酸基を有する任意の有機基から選択され、
ｎは、１〜２０であり、
Ｚ１は、独立して、−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＳＨ、及び−ＣＯＯＨから選択される）。
【００７２】
幾つかの実施形態では、Ｚ１は、ＮＨ２である及び／又は糖は、グルコース、フルクトース、マンニトール、スクロース、ガラクトース、ソルビトール、キシロース、若しくはガラクトース等の任意の単糖類であってよい。
【００７３】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載する粒子のポリオール含有ポリマーでは、１つ以上の構造単位（Ａ）は、独立して、以下の式を有し得る：
【００７４】
【化５】
2018070626.tif 000006
【００７５】
幾つかの実施形態では、（Ｂ）は、官能基を介して２つの（Ａ）部分を連結する任意の直鎖、分枝鎖、対称又は非対称化合物によって形成され得る。
【００７６】
幾つかの実施形態では、（Ｂ）は、少なくとも２つの架橋性基が２つの（Ａ）部分を連結している化合物によって形成され得る。
【００７７】
幾つかの実施形態では、（Ｂ）は、その性質及び組成が、共有結合的に又は非共有結合的に繋ぎ止められる化合物の化学的性質に依存する中性、カチオン性、又はアニオン性有機基を含有する。
【００７８】
アニオン性カーゴと共に用いるための（Ｂ）の例示的なカチオン性部分としては、アミジン基、四級アンモニウム、一級アミン基、二級アミン基、三級アミン基（そのｐＫａ未満でプロトン化）、及びイミダゾリウムを有する有機基が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７９】
カチオン性カーゴと共に用いるための（Ｂ）に含有される例示的なアニオン性部分としては、式のスルホネート、式のニトレート、式のカルボキシレート、及びホスホネートを有する有機基が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８０】
具体的には、それぞれアニオン性カーゴ及びカチオン性カーゴと共に用いるための１つ以上のカチオン性又はアニオン性部分（Ｂ）は、独立して、以下の一般式を有し得る：
【００８１】
【化６】
2018070626.tif 000007
（式中、Ｒ５は、Ａが求核性基を含有するとき、Ａに共有結合することができる求電子性基である）。この場合のＲ５の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
特に、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｃｌ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＳ、−Ｃ（＝ＮＨ２＋）ＯＭｅ、−Ｓ（＝Ｏ）ＯＣｌ−、−ＣＨ２Ｂｒ、アルキル及び芳香族エステル、末端アルキン、トシレート、及びメシレート。部分Ａが求電子性末端基を含有する場合、Ｒ５は、−ＮＨ２（一級アミン）、−ＯＨ、−ＳＨ、Ｎ３、及び二級アミン等の求核性基を有する。
【００８２】
具体的には、部分（Ｂ）が、アニオン性カーゴと共に用いるためのカチオン性部分（Ｂ）である場合、「有機基」は、ＣｍＨ２ｍ（ｍは、１以上である）からなる一般式を有する骨格と他のヘテロ原子とを有し得る有機部分であり、式（ＸＩＩＩ）のアミジン、式（ＸＩＶ）の四級アンモニウム、式（ＸＶ）の一級アミン基、式（ＸＶＩ）の二級アミン基、式（ＸＶＩＩ）の三級アミン基（そのｐＫａ未満でプロトン化）、及び式（ＸＶＩＩＩ）のイミダゾリウムを含む官能基のうちの少なくとも１つを含有していなければならない：
【００８３】
【化７】
2018070626.tif 000008
【００８４】
実施形態では、部分（Ｂ）が、カチオン性カーゴと共に用いるためのアニオン性部分（Ｂ）である場合、「有機基」は、ＣｍＨ２ｍ（ｍは、１以上である）からなる一般式を有する骨格と他のヘテロ原子とを有し得、式（ＸＩＸ）のスルホネート、式（ＸＸ）のニトレート、式（ＸＸＩ）のカルボキシレート、及び式（ＸＸＩＩ）のホスホネートを含む官能基のうちの少なくとも１つを含有していなければならない：
【００８５】
【化８】
2018070626.tif 000009
【００８６】
（Ｂ）がカルボキシレート（ＸＸＩ）によって含まれる実施形態では、一級アミン又はヒドロキシル基を含有する化合物は、ペプチド又はエステル結合の形成を介して結合することもできる。
【００８７】
（Ｂ）が式（ＸＶ）の一級アミン基及び／又は式（ＸＶＩ）の二級アミン基からなる実施形態では、カルボン酸基を含有する化合物は、ペプチド結合の形成を介して結合することもできる。
【００８８】
幾つかの実施形態では、部分（Ｂ）は、独立して、以下から選択することができる：
【００８９】
【化９】
2018070626.tif 000010
（式中、
ｑは、１〜２０であり、具体的には、５であってよく、
ｐは、２０〜２００であり、
Ｌは、脱離基である）。
【００９０】
用語「脱離基」とは、本明細書で使用するとき、異方性結合開裂において電子対を有して離れる分子断片を指す。具体的には、脱離基は、アニオン又は中性分子であってよく、脱離基が離れる能力は、共役酸のｐＫａと相関し、ｐＫａがより低いことは、より優れた脱離基の能力と関連している。例示的なアニオン性脱離基としては、Ｃｌ−、Ｂｒ−、及びＩ−等のハロゲン化物、並びにパラ−トルエンスルホネート又は「トシレート」（ＴｓＯ−）等のスルホネートエステルが挙げられる。例示的な中性分子脱離基は、水（Ｈ２Ｏ）、アンモニア（ＮＨ３）、及びアルコール（ＲＯＨ）である。
【００９１】
具体的には、幾つかの実施形態では、Ｌは、塩化物（Ｃｌ）、メトキシ（ＯＭｅ）、ｔブトキシ（ＯｔＢＵ）、又はＮヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）であってよい。
【００９２】
幾つかの実施形態では、式（Ｉ）の構造単位は、以下の式を有し得る：
【００９３】
【化１０】
2018070626.tif 000011
【００９４】
幾つかの実施形態では、式（ＩＩ）の構造単位は、以下の式を有し得る：
【００９５】
【化１１】
2018070626.tif 000012
【００９６】
幾つかの実施形態では、式（ＩＩＩ）の構造単位は、以下の式を有し得る：
【００９７】
【化１２】
2018070626.tif 000013
（式中、
ｎは、１〜２０であり、具体的には、１〜４であってよい）。
【００９８】
幾つかの実施形態では、ポリオール含有ポリマーは、以下の式を有し得る：
【００９９】
【化１３】
2018070626.tif 000014
【０１００】
幾つかの実施形態では、ボロン酸含有ポリマーは、少なくとも１つの末端ボロン酸基を含有し、以下の構造を有する：
【０１０１】
【化１４】
2018070626.tif 000015
（式中、
Ｒ３及びＲ４は、独立して、任意の親水性有機ポリマーから選択してよく、具体的には、独立して、任意のポリ（エチレンオキシド）、及び双性ポリマーであってよく、
Ｘ１は、−ＣＨ、−Ｎ、又は−Ｂのうちの１つ以上を含有する有機部分であってよく、
Ｙ１は、場合によりオレフィン若しくはアルキニル基を含有する−ＣｍＨ２ｍ−（ｍは、１以上である）を有するアルキル基、又はアルキニル基、又はフェニル、ビフェニル、ナフチル、若しくはアントラセニル等の芳香族基であってよく、
ｒは、１〜１０００であり、
ａは、０〜３であり、
ｂは、０〜３であり、
官能基１及び官能基２は、同じであるか又は異なり、且つ標的リガンド、具体的には、タンパク質、抗体、又はペプチドに結合することができるか、又は−ＯＨ、−ＯＣＨ３、又は−（Ｘ１）−（Ｙ１）−Ｂ（ＯＨ）２−等の末端基である）。
【０１０２】
幾つかの実施形態では、Ｒ３及びＲ４は、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｔ（式中、ｔは、２〜２０００、特に１００〜３００である）である。
【０１０３】
幾つかの実施形態では、Ｘ１は、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、若しくは−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−であってよく、及び／又はＹ１が、フェニル基であってよい。
【０１０４】
幾つかの実施形態では、ｒは、１であってよく、ａは、０であってよく、ｂは、１であってよい。
【０１０５】
幾つかの実施形態では、官能基１及び官能基２は、同じであるか又は異なり、且つ独立して、−Ｂ（ＯＨ）２、−ＯＣＨ３、−ＯＨから選択される。
【０１０６】
具体的には、式（ＸＸＸＩ）の官能基１及び／又は２は、カーゴ、特に標的リガンド、例えば、タンパク質、抗体、又はペプチドに結合することができる官能基であってよく、又は−ＯＨ、−ＯＣＨ３、若しくは−（Ｘ）−（Ｙ）−Ｂ（ＯＨ）２等の末端基であってよい。
【０１０７】
用語「官能基」とは、本明細書で使用するとき、その構造又は部分の特徴的な化学反応に関与する、その分子構造又は部分内の原子の特定の基を指す。例示的な官能基としては、炭化水素、ハロゲンを含有する基、酸素を含有する基、窒素を含有する基、並びにリン及び硫黄を含有する基が挙げられ、これらは全て当業者によって特定可能である。具体的には、本開示の意味における官能基としては、カルボン酸、アミン、トリアリールホスフィン、アジド、アセチレン、スルホニルアジド、チオ酸、及びアルデヒドが挙げられる。具体的には、例えば、標的リガンド中の対応する官能基に結合することができる官能基は、以下の結合パートナーを含むように選択してよい：カルボン酸基及びアミン基、アジド及びアセチレン基、アジド及びトリアリールホスフィン基、スルホニルアジド及びチオ酸、並びにアルデヒド及び一級アミン。更なる官能基は、本開示を読んだときに当業者によって特定され得る。本明細書で使用するとき、用語「対応する官能基」とは、別の官能基と反応することができる官能基を指す。したがって、互いに反応することができる官能基を、対応する官能基対と称することがある。
【０１０８】
末端基は、巨大分子又はオリゴマー分子の末端に存在する構成単位を指す。例えば、ＰＥＴポリエステルの末端基は、アルコール基又はカルボン酸基であってよい。末端基を用いて分子量を決定することができる。例示的な末端基は、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、ＮＨ２、及びＯＣＨ３を含む。
【０１０９】
幾つかの実施形態では、ボロン酸含有ポリマーは、以下の式を有し得る：
【０１１０】
【化１５】
2018070626.tif 000016
（式中、ｓは、２０〜３００である）。
【０１１１】
本開示のナノ粒子に結合することができる例示的な剤及び標的リガンドは、ポリヌクレオチド、ヌクレオチド、アプタマーポリペプチド、タンパク質、多糖類、巨大分子複合体（タンパク質とポリヌクレオチド、糖類及び／又は多糖類との混合物を含むものが挙げられるが、これらに限定されない）、ウイルス、放射性同位体を含む分子、抗体、又は抗体断片が挙げられる有機又は無機分子を含む。
【０１１２】
用語「ポリヌクレオチド」とは、本明細書で使用するとき、ヌクレオチド、ヌクレオシド、又はこれらの類似体を含む２つ以上のモノマーからなる有機ポリマーを指す。用語「ヌクレオチド」とは、プリン又はピリミジン塩基及びリン酸基に接合しているリボース又はデオキシリボース糖からなり、且つ核酸の基本構造単位である幾つかの化合物のいずれかを指す。用語「ヌクレオシド」とは、デオキシリボース又はリボースと合わせられたプリン又はピリミジン塩基からなり、且つ特に核酸においてみられる化合物（例えば、グアノシン又はアデノシン）を指す。用語「ヌクレオチド類似体」又は「ヌクレオシド類似体」とは、それぞれ、１つ以上の個々の原子が異なる原子又は異なる官能基で置換されているヌクレオチド又はヌクレオシドを指す。したがって、用語「ポリヌクレオチド」は、任意の長さの核酸、特に、ＤＮＡ、ＲＮＡ、これらの類似体及び断片を含む。３つ以上のヌクレオチドのポリヌクレオチドは、「ヌクレオチドオリゴマー」又は「オリゴヌクレオチド」とも呼ばれる。
【０１１３】
用語「アプタマー」とは、本明細書で使用するとき、特定の標的に結合するオリゴ核酸又はペプチド分子を指す。具体的には、核酸アプタマーは、例えば、低分子、タンパク質、核酸、並びに更には細胞、組織、及び生物等の様々な分子標的に結合するようにインビトロセレクションの反復ラウンド、又は同等にＳＥＬＥＸ（試験管内進化法）を通して改変されている核酸種を含み得る。アプタマーは、抗体と競合する分子認識特性を付与するので、バイオテクノロジー及び治療用途において有用である。ぺプチドアプタマーは、細胞内部のタンパク質−タンパク質相互作用に特異的に結合し、干渉するように設計されているペプチドである。具体的には、ペプチドアプタマーは、例えば、酵母ツーハイブリッド（Ｙ２Ｈ）系に由来する選択ストラテジーに従って得ることができる。具体的には、このストラテジーに従って、転写因子結合ドメインに結合している可変ペプチドアプタマーループを、転写因子活性化ドメインに結合している標的タンパク質に対してスクリーニングする。この選択ストラテジーを介するペプチドアプタマーのその標的に対するインビボ結合は、下流の酵母マーカー遺伝子の発現として検出される。
【０１１４】
用語「ポリペプチド」とは、本明細書で使用するとき、２つ以上のアミノ酸モノマー及び／又はこれらの類似体からなる有機直鎖、環状、又は分枝鎖ポリマーを指す。用語「ポリペプチド」は、完全長タンパク質及びペプチドを含む任意の長さのアミノ酸ポリマーに加えて、これらの類似体及び断片を含む。３つ以上のアミノ酸のポリペプチドは、タンパク質オリゴマー、ペプチド、又はオリゴペプチドとも呼ばれる。具体的には、用語「ペプチド」及び「オリゴペプチド」とは、通常、５０未満のアミノ酸モノマーを含むポリペプチドを指す。本明細書で使用するとき、用語「アミノ酸」、「アミノ酸性モノマー」、又は「アミノ酸残基」とは、２０種の天然アミノ酸、非天然アミノ酸、及び人工アミノ酸のいずれかを指し、Ｄ及びＬ光学異性体の両方を含む。具体的には、非天然アミノ酸としては、天然アミノ酸のＤ立体異性体が挙げられる（これらは、酵素分解を受けにくいので、有用なリガンド基本単位を含む）。用語「人工アミノ酸」とは、標準的なアミノ酸カップリング化学反応を用いて互いに容易にカップリングすることができるが、天然アミノ酸には類似していない分子構造を有する分子を指す。用語「アミノ酸類似体」とは、１つ以上の個々の原子が異なる原子、同位体、又は異なる官能基で置換されているが、それ以外は、類似体が由来する元のアミノ酸と同一であるアミノ酸を指す。これらアミノ酸は全て、標準的なアミノ酸カップリング化学反応を用いてペプチド又はポリペプチドに合成で組み込まれ得る。用語「ポリペプチド」とは、本明細書で使用するとき、１つ以上のモノマー又はアミノ酸モノマー以外の基本単位を含むポリマーを含む。モノマー、サブユニット、又は基本単位という用語は、適切な条件下で、同じ又は異なる化学的性質の別のモノマーと化学的に結合してポリマーを形成することができる化学化合物を指す。用語「ポリペプチド」は、更に、アミド又はペプチド結合以外の化学結合によって、基本単位のうちの１つ以上が別の基本単位に共有結合しているポリマーを含むことを意図する。
【０１１５】
用語「タンパク質」とは、本明細書で使用するとき、限定するものではないが、他のタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、脂質、代謝産物、ホルモン、ケモカイン、及び低分子を含む他の生体分子との相互作用に関与し得る特定の二次及び三次構造を有するポリペプチドを指す。本明細書に記載される例示的なタンパク質は、抗体である。
【０１１６】
用語「抗体」とは、本明細書で使用するとき、抗原による刺激の後、活性化Ｂ細胞によって生成され、生体系における免疫応答を促進する抗原に特異的に結合することができる種類のタンパク質を指す。完全抗体は、典型的に、２本の重鎖及び２本の軽鎖を含む４つのサブユニットからなる。用語「抗体」とは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、又はこれらの断片が挙げられるが、これらに限定されない天然及び合成抗体が挙げられる。例示的な抗体としては、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＭ等が挙げられる。例示的な断片としては、Ｆａｂ  Ｆｖ、Ｆａｂ’Ｆ（ａｂ’）２等が挙げられる。モノクローナル抗体は、「エピトープ」と呼ばれる別の生体分子の単一の特定の空間的及び極性的機構に特異的に結合し、それによって相補的であると定義される抗体である。幾つかの形態では、モノクローナル抗体は、同じ構造を有してもよい。ポリクローナル抗体は、異なるモノクローナル抗体の混合物を指す。幾つかの形態では、ポリクローナル抗体は、モノクローナル抗体の少なくとも２つが異なる抗原エピトープに結合するモノクローナル抗体の混合物であってよい。異なる抗原エピトープは、同じ標的に存在していてもよく、異なる標的に存在していてもよく、又はこれらの組み合わせであってもよい。抗体は、ホストの免疫及び血清の回収（ポリクローナル）、又は連続ハイブリドーマ細胞株を調製し、分泌されるタンパク質を回収する（モノクローナル）等の当該技術分野において周知の技術によって調製することができる。
【０１１７】
幾つかの実施形態では、ポリオールポリマーは、図１及び２の概略図に従って送達される１つ以上の対象化合物と非共有結合性複合体又は連結を形成する。
【０１１８】
幾つかの実施形態では、ナノ粒子構造は、剤とポリオール含有ポリマーとを含み、ここで、上記剤は、共有結合によってポリオールポリマーに連結している。剤にコンジュゲートしているポリオールポリマーの例は、実施例１６〜２１に詳述する。これら実施形態では、剤にコンジュゲートしているポリオールポリマー（本明細書では「ポリオールポリマー−剤コンジュゲート」と呼ばれる）は、その構造が、ＢＡ分子との相互作用のために表面上に部位を提示するナノ粒子を形成する。
【０１１９】
これら実施形態の幾つかでは、ナノ粒子は、更に、ナノ粒子に立体安定化及び／又は標的化機能を付与するようになっているＢＡポリマーを含む。具体的には、これら実施形態では、ＢＡポリマーの添加により、自己凝集及び他のナノ粒子との望ましくない相互作用を最小化して、塩及び血清の安定性を強化することができる。例えば、立体安定化は、本明細書では、実施例１２に記載する例示的なナノ粒子によって例証される通り、ＰＥＧを有するＢＡポリマーによって提供される。
【０１２０】
このような実施形態では、このナノ粒子の構造は、１つ以上の剤の制御放出を提供する能力等、従来技術の剤送達方法よりも優れた利点を幾つかもたらす。この特徴は、例えば、剤とポリオールポリマーとの間の生分解性エステル結合の使用によって提供され得る。当業者は、この目的に好適な他の可能な結合を認識するであろう。これら実施形態では、別の利点は、ＢＡポリマーの部分を通して剤の特異的標的化を提供する能力である。
【０１２１】
幾つかの実施形態では、ＢＡポリマーは、ＭＲＩ又は他の類似の技術において造影剤として用いることができるフッ素化ボロン酸（実施例７）又はフッ素化開裂性ボロン酸（実施例８）を含んでよい。このような造影剤は、ナノ粒子によって送達される剤の薬物動態又は薬力学を追跡するために有用であり得る。
【０１２２】
幾つかの実施形態では、ナノ粒子構造は、剤とポリオールポリマーとを含み、上記ナノ粒子は、修飾リポソームである。これら実施形態では、修飾リポソームは、リポソームの表面がポリオールポリマーを提示するように、共有結合を介してポリオールポリマーにコンジュゲートしている脂質を含む。これら実施形態では、送達される剤がリポソームナノ粒子内に含有されるように修飾リポソームを形成する。
【０１２３】
用語「リポソーム」とは、本明細書で使用するとき、脂質からなる多孔構造を指す。脂質は、典型的に、長い炭化水素鎖を含むテイル基及び親水性ヘッド基を有する。脂質は、送達される剤を含有するのに好適な内部水性環境と脂質二重層を形成するように配置される。このようなリポソームは、細胞表面受容体又は他の対象標的によって特異的に認識するための好適な標的リガンド又は分子を含んでよい外側表面を提示する。
【０１２４】
用語「コンジュゲート」とは、本明細書で使用するとき、１つの分子が第２の分子と共有結合を形成したことを指し、原子が別の単一の及び複数の（例えば、二重）結合（例えば、Ｃ＝Ｃ−Ｃ＝Ｃ−Ｃ）と共有結合し、互いに影響を及ぼして電子を非局在化させる結合を含む。
【０１２５】
本開示の更に他の実施形態では、ナノ粒子構造は、剤とポリオールとを含み、上記ナノ粒子は、修飾ミセルである。これら実施形態では、修飾ミセルは、疎水性ポリマーブロックを含有するように修飾されたポリオールポリマーを含む。
【０１２６】
用語「疎水性ポリマーブロック」とは、本開示で使用するとき、自然に疎水性になるポリマーのセグメントを指す。
【０１２７】
用語「ミセル」とは、本明細書で使用するとき、液体に分散している分子の凝集体を指す。典型的なミセルは、水溶液中において、周囲の溶媒と接触している親水性「ヘッド」領域と凝集体を形成し、ミセル中心における疎水性の単一のテイル領域を隔絶する。本開示では、ヘッド領域は、例えば、ポリオールポリマーの表面領域であってよく、一方、テイル領域は、例えば、ポリオールポリマーの疎水性ポリマーブロック領域であってよい。
【０１２８】
これら実施形態では、疎水性ポリマーブロックを有するポリオールポリマーは、送達される剤と混合されたとき、ナノ粒子内に含有されている送達される剤を含む修飾ミセルであるナノ粒子を形成するように配置される。このようなナノ粒子の実施形態は、前述の実施形態に係る標的化機能を有する又は有しないＢＡポリマーと相互作用するのに好適なポリオールポリマーを表面上に提示する。これら実施形態では、この目的のために用いることができるＢＡポリマーは、式（Ｉ）又は（ＩＩ）中に親水性Ａ及び疎水性Ｂを有するものが挙げられる。この相互作用は、上述の他のナノ粒子の実施形態と同じ又は類似の利点をもたらす。
【０１２９】
幾つかの実施形態では、ナノ粒子又は関連成分は、許容し得るビヒクルと共に組成物中に含まれ得る。用語「ビヒクル」とは、本明細書で使用するとき、活性成分として組成物中に含まれるナノ粒子のために、通常、溶媒、担体、結合剤、賦形剤、又は希釈剤として作用する様々な媒体のいずれかを指す。
【０１３０】
組成物が個体に投与される幾つかの実施形態では、組成物は、医薬組成物であってよく、許容し得るビヒクルは、薬学的に許容し得るビヒクルであってよい。
【０１３１】
幾つかの実施形態では、ナノ粒子は、賦形剤又は希釈剤と共に医薬組成物中に含まれ得る。具体的には、幾つかの実施形態では、１つ以上の適合性且つ薬学的に許容し得るビヒクル、具体的には、薬学的に許容し得る希釈剤又は賦形剤と組み合わせてナノ粒子を含有する医薬組成物が開示される。
【０１３２】
用語「賦形剤」とは、本明細書で使用するとき、医薬の活性成分用の担体として用いられる不活性物質を指す。本明細書に開示する医薬組成物に好適な賦形剤としては、ナノ粒子を吸収する個体の身体の能力を強化する任意の物質が挙げられる。また、好適な賦形剤としては、便利に且つ正確に投与できるようにするために、ナノ粒子を含む製剤を嵩増しするために用いることができる任意の物質が挙げられる。単回投与量での使用に加えて、賦形剤は、ナノ粒子の取り扱いに役立つように製造プロセスにおいて用いることができる。投与経路及び医薬の形態に依存して、様々な賦形剤を用いてよい。例示的な賦形剤としては、接着防止剤、結合剤、コーティング、崩壊剤、充填剤、風味剤（例えば、甘味剤）、及び着色剤、流動促進剤、潤滑剤、保存剤、吸着剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３３】
用語「希釈剤」とは、本明細書で使用するとき、組成物の活性成分を希釈又は運搬するための希釈剤を指す。好適な希釈剤としては、医薬製剤の粘度を低下させ得る任意の物質が挙げられる。
【０１３４】
特定の実施形態では、組成物、特に医薬組成物は、非経口投与、より具体的には、静脈内、皮内、及び筋肉内投与を含む全身投与用に配合してよい。
【０１３５】
例示的な非経口投与用組成物としては、ナノ粒子を含む滅菌水溶液、注射溶液、又は懸濁液が挙げられるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、非経口投与用組成物は、生物学的に適合性の水性液体（蒸留水、生理学的溶液、又は他の水溶液）中に、既にフリーズドライした凍結乾燥形態で調製されている粉末化組成物を溶解させることによって、使用時に調製することができる。
【０１３６】
用語「凍結乾燥」（フリーズドライとしても知られている）は、腐敗しやすい材料を保存するため又は材料の輸送により便利にするために通常用いられる脱水プロセスを指す。フリーズドライは、材料を凍結させ、次いで、周囲圧を低下させ、材料中の凍結水を固相から気体に直接昇華させるのに十分な熱を加えることによって行われる。
【０１３７】
医薬用途では、フリーズドライは、多くの場合、ワクチン及び他の注射剤等の製品の貯蔵寿命を延長するために用いられる。材料から水を除去し、バイアルに材料を密閉することによって、材料を容易に保管、輸送、及び後に元の注射用形態に再構成することができる。
【０１３８】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載するナノ粒子は、所定の標的に送達される。幾つかの実施形態では、標的は、インビトロ生体系であり、方法は、標的を本明細書に記載するナノ粒子と接触させる工程を含む。
【０１３９】
幾つかの実施形態では、様々な開示する実施形態に係る好適なナノ粒子を配合する工程を含む、個体に剤を送達する方法を提供する。また、ナノ粒子は、幾つかの開示する実施形態に係る薬学的に許容し得る組成物に配合してよい。方法は、更に、ナノ粒子を被験体に送達する工程を含む。ナノ粒子を個体に送達するために、ナノ粒子又はナノ粒子製剤は、経口的に、非経口的に、局所的に、又は直腸内に投与してよい。これらは、各投与経路に好適な形態で送達される。例えば、ナノ粒子組成物は、錠剤又はカプセル剤で、注射、吸入、点眼剤、軟膏、坐剤、点滴によって；ローション又は軟膏によって局所的に；及び坐剤によって直腸内に投与され得る。
【０１４０】
用語「個体」とは、本明細書で使用するとき、植物又は動物、具体的には、高等動物、具体的には、哺乳類等の脊椎動物、具体的には、ヒトが挙げられるがこれらに限定されない単一の生物を含む。
【０１４１】
語句「非経口投与」及び「非経口的に投与する」とは、本明細書で使用するとき、通常注射による、経腸及び局所投与以外の投与方法を意味し、限定するものではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内（ｉｎｔｒａｄｅｎｎａｌ）、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内、及びストーマ内（ｉｎｔｒａｓｔｅｍａｌ）、注射、及び点滴が挙げられる。
【０１４２】
語句「全身投与」、「全身に投与する」、「末梢投与」、及び「末梢的に投与する」とは、本明細書で使用するとき、個体の系に入って、代謝及び他の類似のプロセスに供されるように、ナノ粒子又はその組成物を中枢神経系に直接以外の方法で投与することを意味し、例えば、皮下投与である。
【０１４３】
本明細書に記載する医薬組成物中の活性成分又は剤の実際の投与レベルは、個体に対して毒性であることなく、特定の個体、組成物、及び投与方法について所望の治療応答を得るのに有効な活性成分の量を得るために変動し得る。
【０１４４】
これら治療ポリマーコンジュゲートは、経口、経鼻、例えばスプレーとして、直腸内、膣内、非経口、大槽内、並びに粉剤、軟膏、又はドロップによって局所的に（口腔内及び舌下を含む）を含む任意の好適な投与経路によって、治療のためにヒト及び他の動物に投与され得る。
【０１４５】
選択される投与経路に関係なく、好適な水和形態で用いられ得る治療ポリマーコンジュゲート及び／又は本発明の医薬組成物は、当業者に公知の従来の方法によって薬学的に許容し得る剤形に配合される。
【０１４６】
具体的には、幾つかの実施形態では、送達される化合物は、個体の状態を治療又は予防するための薬物である。
【０１４７】
用語「薬物」又は「治療剤」とは、個体における状態の治療、予防、若しくは診断において用いることができるか、又は別の方法で個体の肉体的若しくは精神的健康を強化するために用いることができる活性剤を指す。
【０１４８】
用語「状態」とは、本明細書で使用するとき、通常、全体として又はその部分のうちの１つ以上の、完全な肉体的、精神的、及び場合により社会的に健康な状態に関連する個体の身体的状態に一致しない、全体として又はその部分のうちの１つ以上の個体の身体の身体状況を指す。本明細書に記載する状態としては、疾病及び疾患が挙げられるがこれらに限定されず、ここで、用語「疾病」とは、身体又はその部分のいずれかの機能的異常に関連する生体の状態を指し、用語「疾患」とは、身体又はその部分のいずれかの正常な機能を損なわせ、典型的に、徴候及び症状を識別することによって明らかになる生体の状態を指す。例示的な状態としては、傷害、障害、疾病（精神的及び肉体的疾病を含む）、症候群、感染、個体の逸脱行動、並びに個体の身体又はその一部の構造及び機能の非定型変異が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４９】
用語「治療」とは、本明細書で使用するとき、内科的又は外科的な状態の医療的ケア又は処置の一部である任意の活動を指す。
【０１５０】
用語「予防」とは、本明細書で使用するとき、個体における状態から死亡又は罹患の負担を低減する任意の活動を指す。これは、一次、二次、及び三次予防レベルで行われ、ここで、ａ）一次予防は、疾患の発現を避け、ｂ）二次予防活動は、早期に疾患を治療し、それによって、疾患の進行及び症状の出現を防ぐための介入の機会を増やすことを目的とし、ｃ）三次予防は、機能を回復させ、疾患に関連する合併症を低減することによって、既に確立されている疾患の負の影響を低減する。
【０１５１】
本明細書に記載するナノ粒子によって送達され得、薬物として好適な例示的な化合物は、放射線治療（例えば、ホウ素中性子捕獲）において用いられる電磁放射線（例えば、１０Ｂ同位体）を放出することができる化合物を含む。更なる治療剤は、当該技術分野において公知のものを含む、任意の親油性又は親水性の、合成又は天然の生物活性治療剤を含む。Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ，Ａｎ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｄｒｕｇｓ，ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，１３ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１，Ｍｅｒｃｋ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ，Ｎ．Ｊ．このような治療剤の例としては、低分子医薬、抗生物質、ステロイド、ポリヌクレオチド（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ウイルス、及びキメラポリヌクレオチド）、プラスミド、ペプチド、ペプチド断片、低分子（例えば、ドキソルビシン）、キレート剤（例えば、デフェロキサミン（ＤＥＳＦＥＲＡＬ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））、天然生成物（例えば、タキソール、アンフォテリシン）、及び他の生物活性巨大分子、例えば、タンパク質及び酵素が挙げられるが、これらに限定されない。また、本明細書に記載するナノ粒子と共に治療剤として用いることができる活性剤（治療剤）を列挙している米国特許第６，０４８，７３６号も参照。低分子治療剤は、複合粒子内の治療剤であり得るだけでなく、更なる実施形態では、複合材中のポリマーに共有結合していてもよい。幾つかの実施形態では、共有結合は、可逆的であり（例えば、プロドラッグ形態又はジスルフィド等の生分解性結合を通して）、治療剤を送達する別の方法を提供する。幾つかの実施形態では、本明細書に記載するナノ粒子と共に送達され得る治療剤としては、エポチロン、カンプトセシン系薬物、タキソール等の化学療法薬、又はプラスミド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドアプタマー、若しくはこれらの組み合わせ等の核酸、及び本開示を読んだときに当業者によって特定可能である更なる薬物が挙げられる。
【０１５２】
幾つかの実施形態では、送達される化合物は、個体の細胞又は組織を画像化するのに好適な化合物である。本明細書に記載するナノ粒子によって送達され得、且つ画像化に好適な例示的な化合物は、ＭＲイメージング用の１９Ｆ同位体、ＰＥＴイメージング用の１８Ｆ又は６４Ｃｕ同位体等の同位体を含有する化合物を含む。
【０１５３】
具体的には、本明細書に記載するナノ粒子は、１９Ｆ含有ＢＡポリマーを含有するようになっていてよい。例えば、１９Ｆ原子は、非開裂性又は開裂性ＢＡポリマー化合物に組み込まれ得る。１９Ｆ原子の他の位置は、ＢＡポリマー成分、ポリオールポリマー成分、又は送達される剤上が可能である。これら及び他の変形例は、当業者に明らかである。
【０１５４】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載するナノ粒子を用いて、農業において用いられる化学物質を送達することができる。本発明の別の実施形態では、本明細書に記載するナノ粒子によって送達される剤は、殺微生物的及び農業的有用性を有する生物活性化合物である。これら生物活性化合物としては、当該技術分野において公知のものが挙げられる。例えば、好適な農業的生物活性化合物としては、肥料、殺真菌剤、除草剤、殺虫剤、及び防かび剤が挙げられるが、これらに限定されない。殺微生物剤は、都市上水道を処理するための水処理、及び製紙における冷水、白水系等の工業用水系でも用いられる。微生物の攻撃又は分解を受けやすい水系は、皮革工業、繊維工業、及び塗装又は塗料工業でもみられる。このような殺微生物剤及びその使用の例は、参照により本明細書に援用される米国特許第５，６９３，６３１号、同第６，０３４，０８１号、及び同第６，０６０，４６６号に個別に及び組み合わせて記載されている。上で論じたもの等の活性剤を含有する組成物は、活性成分自体について知られているのと同様に用いてよい。なお、このような使用は、薬理学的使用ではないので、複合材のポリマーは、必ずしも、薬学的使用において必要な毒性プロファイルを満たす必要はない。
【０１５５】
特定の実施形態では、ポリオールポリマー及びＢＡポリマーを含むナノ粒子は、本明細書に示されている化合物のいずれか、特に剤をナノ粒子を用いて送達するのに好適な系に含まれ得る。系の幾つかの実施形態では、個体に投与するためのナノ粒子を調製するのに好適な成分を含むナノ粒子が提供される。
【０１５６】
本明細書に記載する系は、キットオブパーツの形態で提供され得る。例えば、ポリオールポリマー及び／又はＢＡポリマーは、分子単独で、又は好適な賦形剤、ビヒクル、若しくは希釈剤の存在下で含まれ得る。
【０１５７】
キットオブパーツでは、ポリオールポリマー、ＢＡポリマー、及び／又は送達される剤は、独立して、好適なビヒクル担体、又は補助剤と共に組成物中に含まれ得るキットに含まれる。例えば、ポリオールポリマー及び／又はＢＡポリマーは、単独で１つ以上の組成物に及び／又は好適なベクターに含まれ得る。また、送達される剤は、好適なビヒクル担体又は補助剤と共に組成物中に含まれ得る。あるいは、剤は、エンドユーザによって供給されてもよく、キットオブパーツに存在しなくてもよい。更に、ポリオールポリマー、ＢＡポリマー、及び／又は剤は、ナノ粒子に適切に組み込むのに好適な様々な形態で含まれ得る。
【０１５８】
また、更なる成分が含まれてもよく、マイクロ流体チップ、参照標準、バッファ、及び本開示を読んだときに当業者によって特定可能な更なる成分を含む。
【０１５９】
本明細書に開示するキットオブパーツでは、キットの構成要素は、本明細書に開示する方法を実施するために、好適な説明書及び他の必要な試薬と共に提供され得る。幾つかの実施形態では、キットは、別個の容器内に組成物を収容し得る。アッセイを実行するための説明書、例えば、書類又はテープ若しくはＣＤ−ＲＯＭ等の電子支援における書面又は音声による説明書もキットに含まれていてよい。また、キットは、用いられる具体的な方法に依存して、他のパッケージ化された試薬及び材料（例えば、洗浄バッファ等）を含み得る。
【０１６０】
組成物の好適な担体剤又は補助剤の特定、並びに一般的にキットの製造及び包装に関する更なる詳細は、本開示を読んだときに当業者によって特定可能であり得る。
【０１６１】
幾つかの実施形態では、ナノ粒子は、ナノ粒子の個々の成分を調製し、次いで、様々な順序で成分を混合して、所望の複合ナノ粒子構造に達することによって調製され得る。成分の調製及び混合は、当業者に公知の好適な溶液中で実施される。
【０１６２】
用語「混合」とは、本明細書で使用するとき、対象分子を含む１つの溶液に別の対象分子を含む別の溶液を添加することを指す。例えば、ポリオールポリマーの水溶液は、本開示の状況においてＢＡポリマーの水溶液と混合してよい。
【０１６３】
用語「溶液」とは、本明細書で使用するとき、対象分子を含有する任意の液相サンプルを指す。例えば、ポリオールポリマーの水溶液は、水又は任意の緩衝溶液、特に水溶液で希釈されたポリオールポリマーを含んでよい。
【０１６４】
幾つかの実施形態では、ナノ粒子は、ポリオールポリマーと送達される剤（図１及び２）とを混合して、ポリオールポリマー−剤ナノ粒子を形成することによって調製することができる。他の実施形態では、ナノ粒子は、ＢＡポリマーとポリオールポリマー−剤ナノ粒子とを更に混合することによって調製することができる。他の実施形態では、ナノ粒子は、ポリオールポリマーとＢＡポリマーとを混合し、次いで、送達される剤を混合することによって調製される。更に他の実施形態では、ナノ粒子は、ポリオールポリマー、ＢＡポリマー、及び送達される剤を同時に混合することによって調製される。
【０１６５】
幾つかの実施形態では、ナノ粒子は、本開示の様々な実施形態に従ってポリオールポリマー−剤コンジュゲートを形成して、ポリオールポリマー−剤コンジュゲートからなるナノ粒子を調製することによって調製される。他の実施形態では、ポリオールポリマー−剤コンジュゲートからなるナノ粒子は、好適な水溶液にナノ粒子を溶解させることによって調製され得る。更なる実施形態では、ポリオールポリマー−剤コンジュゲートからなるナノ粒子は、ポリオールポリマー−剤コンジュゲートと標的リガンドを提供する又は提供しないＢＡポリマーとを混合することによって調製され得る。
【０１６６】
幾つかの実施形態では、ナノ粒子は、疎水性ポリマーブロックを有するポリオールポリマーと送達される剤とを混合して、本開示の実施形態に係る修飾ミセルを調製することによって調製することができる。他の実施形態では、ナノ粒子は、修飾ミセルとＢＡポリマーとを更に混合することによって調製することができる。更に他の実施形態では、ナノ粒子は、ポリオールポリマーとＢＡポリマーとを混合し、次いで、送達される剤を混合して、修飾ミセルであるナノ粒子を調製することによって調製され得る。
【０１６７】
本開示の幾つかの実施形態では、ナノ粒子は、ポリオールポリマーにコンジュゲートしている脂質と、ＢＡポリマー及び／又は送達される剤とを混合して、修飾リポソームを調製することによって調製することができる。様々な実施形態では、ナノ粒子は、ポリオールポリマーにコンジュゲートしている脂質とＢＡポリマーとを混合し、次いで、送達される剤を混合することによって調製され得る。他の実施形態では、ナノ粒子は、ポリオールポリマーにコンジュゲートしている脂質と送達される剤を混合することによって調製され得る。他の実施形態では、ナノ粒子は、ポリオールポリマーにコンジュゲートしている脂質と送達される剤とを混合し、次いで、ＢＡポリマーを混合して、修飾リポソームであるナノ粒子を調製することによって調製され得る。
【０１６８】
本開示の幾つかの実施形態に係るナノ粒子の形成は、当業者に公知の技術及び手順を用いて分析することができる。例えば、幾つかの実施形態では、ゲル遅延度アッセイを用いて、ナノ粒子内の核酸剤の組み込みをモニタリング及び測定する（実施例１０）。幾つかの実施形態では、好適なナノ粒子のサイズ及び／又はゼータ電位は、公知の方法を用いて選択することができる（実施例１１）。
【０１６９】
組成物の好適な担体剤又は補助剤の特定、並びに一般的にキットの製造及び包装に関する更なる詳細は、本開示を読んだときに当業者によって特定可能であり得る。
【０１７０】
ニトロフェニルボロン酸を含むポリマーを有するナノ粒子
ニトロフェニルボロン酸含有ポリマーにコンジュゲートしているポリオール含有ポリマーを有するナノ粒子について本明細書に記載する。本明細書に記載する標的化ナノ粒子のポリオールナノ粒子セグメントを含有するポリマーは、以下の構造単位のうちの任意の１つの１つ以上を有し得る：
【０１７１】
【化１６】
2018070626.tif 000017
［式中、Ａは、以下の式の有機部分であり：
【０１７２】
【化１７】
2018070626.tif 000018
（式中、Ｒ１及びＲ２は、独立して、約１０ｋＤａ以下の分子量を有する任意の炭素ベース又は有機基から選択され；Ｘは、独立して、−Ｈ、−Ｆ、−Ｃ、−Ｎ、又は−Ｏのうちの１つ以上を含有する脂肪族基から選択され；Ｙは、独立して、−ＯＨ又は−ＯＨを提示する有機部分から選択される）、Ｂは、ポリマー中の第１の部分ＡのＲ１及びＲ２のうちの１つと第２の部分ＡのＲ１及びＲ２のうちの１つとを連結させる有機部分である］。幾つかの実施形態では、Ｘは、ＣｎＨ２ｎ＋１（式中、ｎは、０〜５の任意の単一の数である）であってよく、Ｙは、−ＯＨである。幾つかの実施形態では、Ａは、以下のうちの任意の１つであってよい：
【０１７３】
【化１８】
2018070626.tif 000019
［式中、スペーサーは、独立して、任意の有機基から選択され；アミノ酸は、遊離アミン及び遊離カルボン酸基を有する任意の有機基から選択され；ｎは、１〜２０の任意の単一の数であり；Ｚ１は、独立して、−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＳＨ、及び−ＣＯＯＨから選択され；Ｒ１及びＲ２は、独立して、以下の式を有し得：
【０１７４】
【化１９】
2018070626.tif 000020
（式中、ｄは、０〜１００の任意の単一の数であり、ｅは、０〜１００の任意の単一の数であり、ｆは、０〜１００の任意の単一の数であり、Ｚは、１つの有機部分を別の有機部分に連結させる共有結合であり、Ｚ１は、独立して、−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＳＨ、及び−ＣＯＯＨから選択される）；Ｂは、以下のうちの任意の１つであってよく：
【０１７５】
【化２０】
2018070626.tif 000021
（式中、ｑは、１〜２０の任意の単一の数であり；ｐは、２０〜２００の任意の単一の数であり；Ｌは、脱離基である）、これらＢサブユニットは、上記Ａサブユニットのうちの任意の１つと対合する］。より具体的な実施形態では、式（Ｉ）の構造単位に示す標的化ナノ粒子のポリオール含有ポリマーナノ粒子セグメントは、以下であってよく：
【０１７６】
【化２１】
2018070626.tif 000022
式（ＩＩ）の構造単位に示す標的化ナノ粒子のポリオール含有ポリマーナノ粒子セグメントは、以下であってよく：
【０１７７】
【化２２】
2018070626.tif 000023
式（ＩＩＩ）の構造単位に示す標的化ナノ粒子のポリオール含有ポリマーナノ粒子セグメントは、以下であってよい：
【０１７８】
【化２３】
2018070626.tif 000024
（式中、ｎは、１〜２０の任意の単一の数である）。記載する標的化ナノ粒子の幾つかの実施形態では、ポリオール含有ポリマーは、以下である：
【０１７９】
【化２４】
2018070626.tif 000025
【０１８０】
要約すると、サブパートＡについての式のうちの任意の１つ（式ＶＩ、ＶＩＩ、又はＶＩＩＩ）を、サブパートＢについての式のうちの任意の１つ（式ＸＸＩＩＩ又はＸＩＶ）と組み合わせて、記載するナノ粒子のポリオール含有ポリマーを形成することができる。本明細書に記載する特定の態様では、ナノ粒子は、サブパートＡについての式のうちの任意の１つ（ＩＸ、Ｘ、又はＸＩ）とサブパートＢについての式のうちの任意の１つ（式ＸＸＩＩＩ又はＸＩＶ）との組み合わせから形成されるポリオール含有ポリマーを有し得る。
【０１８１】
幾つかの実施形態では、ニトロフェニルボロン酸含有ポリマーは、ニトロフェニルボロン酸基を含み、以下の一般式を有する：
【０１８２】
【化２５】
2018070626.tif 000026
［式中、Ｒ３及びＲ４は、独立して、親水性有機ポリマーであり、Ｘ１は、−Ｃ、−Ｎ、又は−Ｂのうちの１つ以上を含有する有機部分であり、Ｙ１は、式−ＣｍＨ２ｍ−（式中、ｍは１以上である）のアルキル基又は芳香族基であり、ｒは、１〜１０００の任意の単一の数であり、ａは、０〜３の任意の単一の数であり、ｂは、０〜３の任意の単一の数であり、官能基１及び官能基２は、同じであっても異なっていてもよく、且つ独立して、−Ｂ（ＯＨ）２、−ＯＣＨ３、又は−ＯＨのうちの任意の１つから選択してよい］。幾つかの実施形態では、記載するニトロフェニルボロン酸含有ポリマーのこれら可変サブパートは、以下から選択することができる：Ｒ３及びＲ４は、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｔ（式中、ｔは、２〜２０００の任意の単一の数である）であってよく、Ｘ１は、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、又は−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−のうちの任意の１つであり、Ｙ１は、ニトロフェニル基である。幾つかの実施形態では、記載するニトロフェニルボロン酸含有ポリマーのこれら可変サブパートは、以下から選択することができる：Ｒ３及びＲ４は、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｔ（式中、ｔは、２〜２０００の任意の単一の数である）であってよく、Ｘ１は、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、又は−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−のうちの任意の１つであり、Ｙ１は、ニトロフェニル基であり、ｒは、１の値を有してよく、ａは、０の値を有してよく、ｂは、１の値を有してよい。ニトロフェニルボロン酸含有ポリマーの各実施形態では、ニトロ基は、フェニル環のボロン酸基に対してオルト、メタ、又はパラ位のいずれに存在してもよい。更なる実施形態では、ニトロフェニルボロン酸含有ポリマーは、メチル基等、フェニル環上に存在する更なる基を有してよい。特定の一実施形態では、本明細書に記載する標的化ナノ粒子は、以下の式のうちの任意の１つを有するニトロフェニルボロン酸含有ポリマーを含んでよい：
【０１８３】
【化２６】
2018070626.tif 000027
（式中、ｓは、２０〜３００の任意の単一の数である）。式ＸＸＸＩＩＩ、ＸＸＸＩＶ、及びＸＸＸＶのポリマーは、更に修飾して、ボロン酸基に対してオルト、メタ、又はパラ位に存在するようにフェニル環上のＰＥＧの位置を変化させることができる。
【０１８４】
要約すると、サブパートＡについての式のうちの任意の１つ（式ＶＩ、ＶＩＩ、又はＶＩＩＩ）を、サブパートＢについての式のうちの任意の１つ（式ＸＸＩＩＩ又はＸＩＶ）と組み合わせて、記載するナノ粒子のポリオール含有ポリマーナノ粒子セグメントを形成することができ、得られたポリオール含有ポリマーを、次いで、ニトロフェニルボロン酸含有ポリマーにカップリングしてよい。幾つかの実施形態では、記載するポリオール含有ポリマーと記載するニトロフェニルボロン酸含有ポリマーとのコンジュゲートは、ボロン酸基の少なくとも１つのヒドロキシル基によって仲介される。本明細書に記載する特定の態様では、ナノ粒子は、サブパートＡについての式のうちの任意の１つ（ＩＸ、Ｘ、又はＸＩ）とサブパートＢについての式のうちの任意の１つ（式ＸＸＩＩＩ又はＸＩＶ）との組み合わせから形成されるポリオール含有ポリマーを有し得、これを、次いで、式ＸＸＸを有するボロン酸含有ポリマーにカップリングさせてよい。本明細書に記載する幾つかの実施形態では、ナノ粒子は、サブパートＡについての式のうちの任意の１つ（ＩＸ、Ｘ、又はＸＩ）とサブパートＢについての式のうちの任意の１つ（式ＸＸＩＩＩ又はＸＩＶ）との組み合わせから形成されるポリオール含有ポリマーを有し得、これを、次いで、式ＸＸＸＩＩＩ、ＸＸＸＩＶ、又はＸＸＸＶのうちの任意の１つに対応するボロン酸含有ポリマーにカップリングさせてよい。
【０１８５】
本明細書に記載するナノ粒子は、化合物を更に含んでよい。幾つかの実施形態では、化合物は、低分子化学療法剤又はポリヌクレオチド等の１つ以上の治療剤であってよい。幾つかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は干渉ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、又はｍｉＲＮＡ等）のうちの任意の１つ以上であってよい。幾つかの実施形態では、低分子化学療法剤は、カンプトセシン、エポチロン、又はタキサンのうちの１つ以上であってよい。また、本明細書に記載するナノ粒子は、１つ以上のポリヌクレオチドと１つ以上の低分子化学療法剤との組み合わせを含み得る。これに関して、サブパートＡのポリマーのうちの任意の１つ（式ＶＩ、ＶＩＩ、又はＶＩＩＩ）を、サブパートＢのポリマーのうちの任意の１つ（式ＸＸＩＩＩ又はＸＩＶ）と組み合わせて、記載するナノ粒子のポリオール含有ポリマーナノ粒子セグメントを形成することができ、得られたポリオール含有ポリマーを、次いで、ニトロフェニルボロン酸含有ポリマーにカップリングしてよく、上記ポリマーのサブパートＡ、サブパートＢ、又はニトロフェニルボロン酸を有するポリマーは、１つ以上の治療剤（例えば、低分子化学療法剤又はポリヌクレオチド）と共に形成してよい。幾つかの実施形態では、サブパートＡのポリマー（式ＶＩ、ＶＩＩ、又はＶＩＩＩ）を、サブパートＢのポリマーのうちの任意の１つ（式ＸＸＩＩＩ又はＸＩＶ）と組み合わせて、記載するナノ粒子のポリオール含有ポリマーナノ粒子セグメントを形成することができ、得られたポリオール含有ポリマーを、次いで、ニトロフェニルボロン酸含有ポリマーにカップリングしてよく、上記ポリマーのサブパートＡ、サブパートＢ、又はニトロフェニルボロン酸を有するポリマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は干渉ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、又はｍｉＲＮＡ等）のうちの１つ以上と共に形成してよい。幾つかの実施形態では、サブパートＡのポリマー（式ＶＩ、ＶＩＩ、又はＶＩＩＩ）を、サブパートＢのポリマーのうちの任意の１つ（式ＸＸＩＩＩ又はＸＩＶ）と組み合わせて、記載するナノ粒子のポリオール含有ポリマーナノ粒子セグメントを形成することができ、得られたポリオール含有ポリマーを、次いで、ニトロフェニルボロン酸含有ポリマーにカップリングしてよく、上記ポリマーのサブパートＡ、サブパートＢ、又はニトロフェニルボロン酸を有するポリマーは、１つ以上の化学療法剤と共に形成してよい。幾つかの実施形態では、サブパートＡのポリマー（式ＶＩ、ＶＩＩ、又はＶＩＩＩ）を、サブパートＢのポリマーのうちの任意の１つ（式ＸＸＩＩＩ又はＸＩＶ）と組み合わせて、記載するナノ粒子のポリオール含有ポリマーナノ粒子セグメントを形成することができ、得られたポリオール含有ポリマーを、次いで、ニトロフェニルボロン酸含有ポリマーにカップリングしてよく、上記ポリマーのサブパートＡ、サブパートＢ、又はニトロフェニルボロン酸を有するポリマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は干渉ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、又はｍｉＲＮＡ等）のうちの１つ以上と共に形成してよい。幾つかの実施形態では、記載するポリオール含有ポリマーと記載するニトロフェニルボロン酸含有ポリマーとのコンジュゲーションは、ニトロフェニルボロン酸基の少なくとも１つのヒドロキシル基によって仲介される。本明細書に記載する幾つかの実施形態では、治療剤又はポリヌクレオチドを組み込む標的化ナノ粒子は、サブパートＡについての式のうちの任意の１つ（ＩＸ、Ｘ、又はＸＩ）とサブパートＢについての式のうちの任意の１つ（式ＸＸＩＩＩ又はＸＩＶ）との組み合わせから形成されるポリオール含有ポリマーを有し得、これを、次いで、式ＸＸＸＩＩＩ、ＸＸＸＩＶ、又はＸＸＸＶのうちの任意の１つに対応するニトロフェニルボロン酸含有ポリマーにカップリングしてよい。
【０１８６】
標的化ナノ粒子
５、４、３、２、又は１つの標的リガンドのうちのいずれかにコンジュゲートしているポリオール含有ポリマーを有する標的化ナノ粒子について本明細書に記載する。記載する標的化ナノ粒子のポリオール含有ポリマーナノ粒子セグメントは、以下の構造単位のうちの任意の１つの１つ以上を有し得る：
【０１８７】
【化２７】
2018070626.tif 000028
［式中、Ａは、以下の式の有機部分であり：
【０１８８】
【化２８】
2018070626.tif 000029
（式中、Ｒ１及びＲ２は、独立して、約１０ｋＤａ以下の分子量を有する任意の炭素ベース又は有機基から選択され；Ｘは、独立して、−Ｈ、−Ｆ、−Ｃ、−Ｎ、又は−Ｏのうちの１つ以上を含有する脂肪族基から選択され；Ｙは、独立して、−ＯＨ又は−ＯＨを提示する有機部分から選択される）、Ｂは、ポリマー中の第１の部分ＡのＲ１及びＲ２のうちの１つと第２の部分ＡのＲ１及びＲ２のうちの１つとを連結させる有機部分である］。幾つかの実施形態では、Ｘは、ＣｎＨ２ｎ＋１（式中、ｎは、０〜５の任意の単一の数である）であってよく、Ｙは、−ＯＨである。幾つかの実施形態では、Ａは、以下のうちの任意の１つであってよい：
【０１８９】
【化２９】
2018070626.tif 000030
［式中、スペーサーは、独立して、任意の有機基から選択され；アミノ酸は、遊離アミン及び遊離カルボン酸基を有する任意の有機基から選択され；ｎは、１〜２０の任意の単一の数であり；Ｚ１は、独立して、−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＳＨ、及び−ＣＯＯＨから選択され；Ｒ１及びＲ２は、独立して、以下の式を有し得：
【０１９０】
【化３０】
2018070626.tif 000031
（式中、ｄは、０〜１００の任意の単一の数であり、ｅは、０〜１００の任意の単一の数であり、ｆは、０〜１００の任意の単一の数であり、Ｚは、１つの有機部分を別の有機部分に連結させる共有結合であり、Ｚ１は、独立して、−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＳＨ、及び−ＣＯＯＨから選択される）；Ｂは、以下のうちの任意の１つであってよく：
【０１９１】
【化３１】
2018070626.tif 000032
（式中、ｑは、１〜２０の任意の単一の数であり；ｐは、２０〜２００の任意の単一の数であり；Ｌは、脱離基である）、これらＢサブユニットは、上記Ａサブユニットのうちの任意の１つと対合する］。より具体的な実施形態では、式（Ｉ）の構造単位に示す標的化ナノ粒子のポリオール含有ポリマーナノ粒子セグメントは、以下であってよく：
【０１９２】
【化３２】
2018070626.tif 000033
【０１９３】
式（ＩＩ）の構造単位に示す標的化ナノ粒子のポリオール含有ポリマーナノ粒子セグメントは、以下であってよい：
【０１９４】
【化３３】
2018070626.tif 000034
式（ＩＩＩ）の構造単位に示す標的化ナノ粒子のポリオール含有ポリマーナノ粒子セグメントは、以下であってよい：
【０１９５】
【化３４】
2018070626.tif 000035
（式中、ｎは、１〜２０の任意の単一の数である）。記載する標的化ナノ粒子の幾つかの実施形態では、ポリオール含有ポリマーは、以下である：
【０１９６】
【化３５】
2018070626.tif 000036
要約すると、サブパートＡについての式のうちの任意の１つ（式ＶＩ、ＶＩＩ、又はＶＩＩＩ）を、サブパートＢについての式のうちの任意の１つ（式ＸＸＩＩＩ又はＸＩＶ）と組み合わせて、記載する標的化ナノ粒子のポリオール含有ポリマーを形成することができる。本明細書に記載する特定の態様では、標的化ナノ粒子は、サブパートＡについての式のうちの任意の１つ（ＩＸ、Ｘ、又はＸＩ）とサブパートＢについての式のうちの任意の１つ（式ＸＸＩＩＩ又はＸＩＶ）との組み合わせから形成されるポリオール含有ポリマーを有し得る。
【０１９７】
また、記載する標的化ナノ粒子は、可逆的共有結合でポリオール含有ポリマーにカップリングしているボロン酸含有ポリマーを有し得る。幾つかの実施形態では、ナノ粒子は、ボロン酸含有ポリマーをナノ粒子の外部環境に提示するようになる。更なる実施形態では、ボロン酸含有ポリマーは、ナノ粒子とは反対の末端において標的リガンドにコンジュゲートしている。幾つかの実施形態では、ボロン酸含有ポリマーは、少なくとも１つの末端ボロン酸基を含み、且つ以下の一般式を有する：
【０１９８】
【化３６】
2018070626.tif 000037
［式中、Ｒ３及びＲ４は、独立して、親水性有機ポリマーであり、Ｘ１は、−Ｃ、−Ｎ、又は−Ｂのうちの１つ以上を含有する有機部分であり、Ｙ１は、式−ＣｍＨ２ｍ−（式中、ｍは１以上である）のアルキル基又は芳香族基であり、ｒは、１〜１０００の任意の単一の数であり、ａは、０〜３の任意の単一の数であり、ｂは、０〜３の任意の単一の数であり、官能基１及び官能基２は、同じであっても異なっていてもよく、且つ独立して、−Ｂ（ＯＨ）２、−ＯＣＨ３、又は−ＯＨのうちの任意の１つから選択してよい］。幾つかの実施形態では、記載するボロン酸含有ポリマーのこれら可変サブパートは、以下から選択することができる：Ｒ３及びＲ４は、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｔ（式中、ｔは、２〜２０００の任意の単一の数である）であってよく、Ｘ１は、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、又は−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−のうちの任意の１つであり、Ｙ１は、フェニル基である。幾つかの実施形態では、記載するボロン酸含有ポリマーのこれら可変サブパートは、以下から選択することができる：Ｒ３及びＲ４は、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｔ（式中、ｔは、２〜２０００の任意の単一の数である）であってよく、Ｘ１は、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、又は−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−のうちの任意の１つであり、Ｙ１は、フェニル基であり、ｒは、１の値を有してよく、ａは、０の値を有してよく、ｂは、１の値を有してよい。特定の一実施形態では、本明細書に記載する標的化ナノ粒子は、以下の式を有するボロン酸含有ポリマーを含んでよい：
【０１９９】
【化３７】
2018070626.tif 000038
（式中、ｓは、２０〜３００の任意の単一の数である）。
【０２００】
幾つかの実施形態では、ボロン酸含有ポリマーは、ニトロフェニルボロン酸を有する。幾つかの実施形態では、ニトロフェニルボロン酸含有ポリマーは、ニトロフェニルボロン酸基を含み、且つ以下の一般式を有する：
【０２０１】
【化３８】
2018070626.tif 000039
［式中、Ｒ３及びＲ４は、独立して、親水性有機ポリマーであり、Ｘ１は、−Ｃ、−Ｎ、又は−Ｂのうちの１つ以上を含有する有機部分であり、Ｙ１は、式−ＣｍＨ２ｍ−（式中、ｍは１以上である）のアルキル基又は芳香族基であり、ｒは、１〜１０００の任意の単一の数であり、ａは、０〜３の任意の単一の数であり、ｂは、０〜３の任意の単一の数であり、官能基１及び官能基２は、同じであっても異なっていてもよく、且つ独立して、−Ｂ（ＯＨ）２、−ＯＣＨ３、又は−ＯＨのうちの任意の１つから選択してよい］。幾つかの実施形態では、記載するボロン酸含有ポリマーのこれら可変サブパートは、以下から選択することができる：Ｒ３及びＲ４は、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｔ（式中、ｔは、２〜２０００の任意の単一の数である）であってよく、Ｘ１は、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、又は−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−のうちの任意の１つであり、Ｙ１は、ニトロフェニル基である。幾つかの実施形態では、記載するニトロフェニルボロン酸含有ポリマーのこれら可変サブパートは、以下から選択することができる：Ｒ３及びＲ４は、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｔ（式中、ｔは、２〜２０００の任意の単一の数である）であってよく、Ｘ１は、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、又は−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−のうちの任意の１つであり、Ｙ１は、ニトロフェニル基であり、ｒは、１の値を有してよく、ａは、０の値を有してよく、ｂは、１の値を有してよい。ニトロフェニルボロン酸含有ポリマーの各実施形態では、ニトロ基は、フェニル環のボロン酸基に対してオルト、メタ、又はパラ位のいずれに存在してもよい。更なる実施形態では、ニトロフェニルボロン酸含有ポリマーは、メチル基等、フェニル環上に存在する更なる基を有してよい。特定の一実施形態では、本明細書に記載する標的化ナノ粒子は、以下の式のうちの任意の１つを有するボロン酸含有ポリマーを含んでよい：
【０２０２】
【化３９】
2018070626.tif 000040
（式中、ｓは、２０〜３００の任意の単一の数である）。式ＸＸＸＩＩＩ、ＸＸＸＩＶ、及びＸＸＸＶのポリマーは、更に修飾して、ボロン酸基に対してオルト、メタ、又はパラ位に存在するようにフェニル環上のＰＥＧの位置を変化させることができる。
【０２０３】
要約すると、サブパートＡについての式のうちの任意の１つ（式ＶＩ、ＶＩＩ、又はＶＩＩＩ）を、サブパートＢについての式のうちの任意の１つ（式ＸＸＩＩＩ又はＸＩＶ）と組み合わせて、記載する標的化ナノ粒子のポリオール含有ポリマーナノ粒子セグメントを形成することができ、得られたポリオール含有ポリマーを、次いで、ボロン酸含有ポリマーにカップリングしてよく、ここで、ボロン酸含有ポリマーは、フェニルボロン酸又はニトロフェニルボロン酸のいずれかである。幾つかの実施形態では、記載するポリオール含有ポリマーと記載するボロン酸含有ポリマーとのコンジュゲーションは、ボロン酸基の少なくとも１つのヒドロキシル基によって仲介される。本明細書に記載する特定の態様では、標的化ナノ粒子は、サブパートＡについての式のうちの任意の１つ（ＩＸ、Ｘ、又はＸＩ）とサブパートＢについての式のうちの任意の１つ（式ＸＸＩＩＩ又はＸＩＶ）との組み合わせから形成されるポリオール含有ポリマーを有し得、これを、次いで、式ＸＸＸを有するボロン酸含有ポリマーにカップリングしてよい。本明細書に記載する幾つかの実施形態では、標的化ナノ粒子は、サブパートＡについての式のうちの任意の１つ（ＩＸ、Ｘ、又はＸＩ）とサブパートＢについての式のうちの任意の１つ（式ＸＸＩＩＩ又はＸＩＶ）との組み合わせから形成されるポリオール含有ポリマーを有し得、これを、次いで、式ＸＸＸＩ、ＸＸＸＩＩＩ、ＸＸＸＩＶ、又はＸＸＸＶのうちの任意の１つに対応するボロン酸含有ポリマーにカップリングしてよい。
【０２０４】
本明細書に記載する幾つかの態様では、本明細書に記載するポリオール含有ポリマーナノ粒子セグメントから又はポリオール含有ポリマーナノ粒子セグメントとボロン酸含有ポリマーとの組み合わせから形成されるナノ粒子は、標的リガンドにコンジュゲートされて、標的リガンドを有する標的化ナノ粒子のナノ粒子に対する比３：１を形成する。本明細書に記載する幾つかの態様では、本明細書に記載するポリオール含有ポリマーナノ粒子セグメントから又はポリオール含有ポリマーナノ粒子セグメントとボロン酸含有ポリマーとの組み合わせから形成されるナノ粒子は、標的リガンドにコンジュゲートされて、標的リガンドを有する標的化ナノ粒子のナノ粒子に対する比１：１を形成する。本明細書に記載する幾つかの態様では、本明細書に記載するポリオール含有ポリマーナノ粒子セグメントから又はポリオール含有ポリマーナノ粒子セグメントとボロン酸含有ポリマーとの組み合わせから形成されるナノ粒子は、単一の標的リガンドにコンジュゲートされて、標的化ナノ粒子を形成する。幾つかの態様では、記載する標的リガンドは、ボロン酸とは反対の末端においてボロン酸含有ポリマーにコンジュゲートされる。記載する標的化ナノ粒子にコンジュゲートしている標的リガンドは、タンパク質、タンパク質断片、アミノ酸ペプチド、又はアミノ酸若しくはポリヌクレオチド由来のアプタマー、又は対象標的に結合することが知られている他の高親和性分子のうちのいずれか１つであってよい。幾つかの実施形態では、タンパク質又はタンパク質断片である標的リガンドは、抗体、細胞受容体、細胞受容体のリガンド、例えば、トランスフェリン、又はこれらの一部を有するタンパク質若しくはキメラタンパク質のうちのいずれか１つであってよい。標的化リガンドが抗体である場合、抗体は、ヒト、マウス、ウサギ、非ヒト霊長類、イヌ、又はげっ歯類の抗体であってよく、又は任意の２つのこのような抗体からなるキメラであってもよい。更に、抗体は、ＣＤＲセグメント又はＣＤＲセグメントを含む可変領域の小さな部分のみが非ヒトであり、抗体の残りがヒトであるようにヒト化してもよい。本明細書に記載する抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＹ等の任意のアイソタイプ、又は哺乳類によって生成されることが理解されている別の種のアイソタイプであってよい。幾つかの実施形態では、標的リガンドは、その標的への結合に関与する抗体、細胞受容体、細胞受容体のリガンド由来のアミノ酸ペプチドのみを含んでよい。
【０２０５】
幾つかの態様では、ナノ粒子は、記載する標的化ナノ粒子のポリオール含有ポリマーナノ粒子セグメントを形成するために、サブパートＢについての式のうちの任意の１つ（式ＸＸＩＩＩ又はＸＩＶ）と組み合わせたサブパートＡについての式のうちの任意の１つ（式ＶＩ、ＶＩＩ、又はＸＩＶ）から形成され、更に、標的リガンドにコンジュゲートしているフェニルボロン酸又はニトロフェニルボロン酸等のボロン酸を含有するポリマー５、４、３、２、又は１つのうちのいずれかにカップリングする。
【０２０６】
幾つかの態様では、ナノ粒子は、記載する標的化ナノ粒子のポリオール含有ポリマーナノ粒子セグメントを形成するために、サブパートＢについての式のうちの任意の１つ（式ＸＸＩＩＩ又はＸＩＶ）と組み合わせたサブパートＡについての式のうちの任意の１つ（式ＶＩ、ＶＩＩ、又はＸＩＶ）から形成され、更に、標的リガンドにコンジュゲートしているフェニルボロン酸又はニトロフェニルボロン酸等のボロン酸を含有するポリマー１つにカップリングする。
【０２０７】
本明細書に記載する特定の態様では、標的化ナノ粒子は、サブパートＡについての式のうちの任意の１つ（ＩＸ、Ｘ、又はＸＩ）とサブパートＢについての式のうちの任意の１つ（式ＸＸＩＩＩ又はＸＩＶ）との組み合わせから形成されるポリオール含有ポリマーを有し得、これは、ボロン酸とは反対の末端において標的リガンドにカップリングする式ＸＸＸを有するボロン酸含有ポリマー５、４、３、２、又は１つのうちのいずれかにカップリングし得る。
【０２０８】
本明細書に記載する特定の態様では、標的化ナノ粒子は、サブパートＡについての式のうちの任意の１つ（ＩＸ、Ｘ、又はＸＩ）とサブパートＢについての式のうちの任意の１つ（式ＸＸＩＩＩ又はＸＩＶ）との組み合わせから形成されるポリオール含有ポリマーを有し得、これは、ボロン酸とは反対の末端において標的リガンドにカップリングする式ＸＸＸを有するボロン酸含有ポリマー１つにカップリングし得る。
【０２０９】
幾つかの態様では、ナノ粒子は、記載する標的化ナノ粒子のポリオール含有ポリマーナノ粒子セグメントを形成するために、サブパートＢについての式のうちの任意の１つ（式ＸＸＩＩＩ又はＸＩＶ）と組み合わせたサブパートＡについての式のうちの任意の１つ（式ＶＩ、ＶＩＩ、又はＸＩＶ）から形成され、更に、標的リガンドにコンジュゲートしているフェニルボロン酸又はニトロフェニルボロン酸等のボロン酸含有ポリマー５、４、３、２、又は１つのうちのいずれかにカップリングし、ここで、得られた標的化ナノ粒子は、単一の標的リガンドのみにコンジュゲートしている。
【０２１０】
幾つかの態様では、ナノ粒子は、記載する標的化ナノ粒子のポリオール含有ポリマーナノ粒子セグメントを形成するために、サブパートＢについての式のうちの任意の１つ（式ＸＸＩＩＩ又はＸＩＶ）と組み合わせたサブパートＡについての式のうちの任意の１つ（式ＶＩ、ＶＩＩ、又はＸＩＶ）から形成され、更に、標的リガンドにコンジュゲートしているフェニルボロン酸又はニトロフェニルボロン酸等のボロン酸含有ポリマー１つにカップリングし、ここで、得られた標的化ナノ粒子は、単一の標的リガンドのみにコンジュゲートしている。
【０２１１】
本明細書に記載する特定の態様では、標的化ナノ粒子は、サブパートＡについての式のうちの任意の１つ（ＩＸ、Ｘ、又はＸＩ）とサブパートＢについての式のうちの任意の１つ（式ＸＸＩＩＩ又はＸＩＶ）との組み合わせから形成されるポリオール含有ポリマーを有し得、これは、ボロン酸とは反対の末端において標的リガンドにカップリングする式ＸＸＸを有するボロン酸含有ポリマー５、４、３、２、又は１つのうちのいずれかにカップリングし得、ここで、得られた標的化ナノ粒子は、単一の標的リガンドのみにコンジュゲートしている。
【０２１２】
本明細書に記載する特定の態様では、標的化ナノ粒子は、サブパートＡについての式のうちの任意の１つ（ＩＸ、Ｘ、又はＸＩ）とサブパートＢについての式のうちの任意の１つ（式ＸＸＩＩＩ又はＸＩＶ）との組み合わせから形成されるポリオール含有ポリマーを有し得、これは、ボロン酸とは反対の末端において標的リガンドにカップリングする式ＸＸＸを有するボロン酸含有ポリマー１つにカップリングし得、ここで、得られた標的化ナノ粒子は、単一の標的リガンドのみにコンジュゲートしている。
【０２１３】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載する標的化ナノ粒子は、任意の標的リガンドにコンジュゲートしている。幾つかの実施形態では、本明細書に記載する標的化ナノ粒子は、単一の標的リガンドにコンジュゲートしている。本明細書に記載する幾つかの実施形態では、標的化ナノ粒子は、サブパートＡについての式のうちの任意の１つ（ＩＸ、Ｘ、又はＸＩ）とサブパートＢについての式のうちの任意の１つ（式ＸＸＩＩＩ又はＸＩＶ）との組み合わせから形成されるポリオール含有ポリマーを有し得、これを、次いで、タンパク質、タンパク質断片、アミノ酸ペプチド、又はアプタマーのうちの１つ以上から選択される標的リガンドに更にコンジュゲートしている、式ＸＸＸＩ、ＸＸＸＩＩＩ、ＸＸＸＩＶ、又はＸＸＸＶのうちの任意の１つに対応するボロン酸含有ポリマー５、４、３、２、又は１つのうちのいずれかにカップリングしてよい。
【０２１４】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載する標的化ナノ粒子は、単一の標的リガンドにコンジュゲートしている。本明細書に記載する幾つかの実施形態では、標的化ナノ粒子は、サブパートＡについての式のうちの任意の１つ（ＩＸ、Ｘ、又はＸＩ）とサブパートＢについての式のうちの任意の１つ（式ＸＸＩＩＩ又はＸＩＶ）との組み合わせから形成されるポリオール含有ポリマーを有し得、これを、次いで、タンパク質、タンパク質断片、アミノ酸ペプチド、又はアプタマーから選択される単一の標的リガンドに更にコンジュゲートしている、式ＸＸＸＩ、ＸＸＸＩＩＩ、ＸＸＸＩＶ、又はＸＸＸＶのうちの任意の１つに対応するボロン酸含有ポリマー１つにカップリングしてよい。
【０２１５】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載する標的化ナノ粒子は、単一の標的リガンドにコンジュゲートしている。本明細書に記載する幾つかの実施形態では、標的化ナノ粒子は、サブパートＡについての式のうちの任意の１つ（ＩＸ、Ｘ、又はＸＩ）とサブパートＢについての式のうちの任意の１つ（式ＸＸＩＩＩ又はＸＩＶ）との組み合わせから形成されるポリオール含有ポリマーを有し得、これを、次いで、抗体、細胞受容体、細胞受容体のリガンド、又はこれらの一部を有するタンパク質若しくはキメラタンパク質に更にコンジュゲートしている、式ＸＸＸＩ、ＸＸＸＩＩＩ、ＸＸＸＩＶ、又はＸＸＸＶのうちの任意の１つに対応するボロン酸含有ポリマー５、４、３、２、又は１つのうちのいずれかにカップリングしてよい。
【０２１６】
本明細書に記載する幾つかの実施形態では、標的化ナノ粒子は、サブパートＡについての式のうちの任意の１つ（ＩＸ、Ｘ、又はＸＩ）とサブパートＢについての式のうちの任意の１つ（式ＸＸＩＩＩ又はＸＩＶ）との組み合わせから形成されるポリオール含有ポリマーを有し得、これを、次いで、単一の抗体、細胞受容体、細胞受容体のリガンド、又はこれらの一部を有するタンパク質若しくはキメラタンパク質に更にコンジュゲートしている、式ＸＸＸＩ、ＸＸＸＩＩＩ、ＸＸＸＩＶ、又はＸＸＸＶのうちの任意の１つに対応するボロン酸含有ポリマー１つにカップリングしてよい。
【０２１７】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載する標的化ナノ粒子は、単一の標的リガンドにコンジュゲートしている。本明細書に記載する幾つかの実施形態では、標的化ナノ粒子は、サブパートＡについての式のうちの任意の１つ（ＩＸ、Ｘ、又はＸＩ）とサブパートＢについての式のうちの任意の１つ（式ＸＸＩＩＩ又はＸＩＶ）との組み合わせから形成されるポリオール含有ポリマーを有し得、これを、次いで、タンパク質、タンパク質断片、アミノ酸ペプチド、又はアプタマーから選択される単一の標的リガンドに更にコンジュゲートしている、式ＸＸＸＩ、ＸＸＸＩＩＩ、ＸＸＸＩＶ、又はＸＸＸＶのうちの任意の１つに対応するボロン酸含有ポリマーにカップリングしてよく、ここで、得られた標的化ナノ粒子は、単一の標的リガンドのみにコンジュゲートしている。
【０２１８】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載する標的化ナノ粒子は、単一の標的リガンドにコンジュゲートしている。本明細書に記載する幾つかの実施形態では、標的化ナノ粒子は、サブパートＡについての式のうちの任意の１つ（ＩＸ、Ｘ、又はＸＩ）とサブパートＢについての式のうちの任意の１つ（式ＸＸＩＩＩ又はＸＩＶ）との組み合わせから形成されるポリオール含有ポリマーを有し得、これを、次いで、抗体、細胞受容体、細胞受容体のリガンド、又はこれらの一部を有するタンパク質若しくはキメラタンパク質に更にコンジュゲートしている、式ＸＸＸＩ、ＸＸＸＩＩＩ、ＸＸＸＩＶ、又はＸＸＸＶのうちの任意の１つに対応するボロン酸含有ポリマー５、４、３、２、又は１つのうちのいずれかにカップリングしてよく、ここで、得られた標的化ナノ粒子は、単一の標的リガンドのみにコンジュゲートしている。
【０２１９】
本明細書に記載する幾つかの実施形態では、標的化ナノ粒子は、サブパートＡについての式のうちの任意の１つ（ＩＸ、Ｘ、又はＸＩ）とサブパートＢについての式のうちの任意の１つ（式ＸＸＩＩＩ又はＸＩＶ）との組み合わせから形成されるポリオール含有ポリマーを有し得、これを、次いで、単一の抗体、細胞受容体、細胞受容体のリガンド、又はこれらの一部を有するタンパク質若しくはキメラタンパク質に更にコンジュゲートしている、式ＸＸＸＩ、ＸＸＸＩＩＩ、ＸＸＸＩＶ、又はＸＸＸＶのうちの任意の１つに対応するボロン酸含有ポリマーにカップリングしてよく、ここで、得られた標的化ナノ粒子は、単一の標的リガンドのみにコンジュゲートしている。
【０２２０】
本明細書に記載する標的化ナノ粒子は、化合物を更に含んでよい。幾つかの実施形態では、化合物は、低分子化学療法剤又はポリヌクレオチド等の１つ以上の治療剤であってよい。幾つかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は干渉ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、又はｍｉＲＮＡ等）のうちの任意の１つ以上であってよい。幾つかの実施形態では、低分子化学療法剤は、カンプトセシン、エポチロン、又はタキサンのうちの１つ以上であってよい。また、本明細書に記載する標的化ナノ粒子は、１つ以上のポリヌクレオチドと１つ以上の低分子化学療法剤との組み合わせを含み得る。
【０２２１】
本明細書に記載する成分を用いて生成され得る様々な種類のナノ粒子及び標的化ナノ粒子について議論したので、以下の具体的な実施形態を作製することができる。１つの実施形態では、記載する標的化ナノ粒子は、ムチン酸含有ポリマーと、カンプトセシン、エポチロン、タキサン、又は干渉ＲＮＡ配列から選択される治療剤と、可逆的共有結合で上記ムチン酸ポリマーにカップリングしている式ＸＸＸＩ、ＸＸＸＩＩＩ、ＸＸＸＩＶ、又はＸＸＸＶを有するフェニルボロン酸含有ポリマーとを有し、上記標的化ナノ粒子は、ナノ粒子の外部環境に上記フェニルボロン酸含有ポリマーを提示するようになっており、ここで、上記フェニルボロン酸含有ポリマーは、ナノ粒子とは反対の末端において標的リガンドにコンジュゲートしており、上記標的化ナノ粒子は、単一の標的リガンドを含む。
【０２２２】
１つの実施形態では、記載する標的化ナノ粒子は、ムチン酸含有ポリマーと、カンプトセシン、エポチロン、タキサン、又は干渉ＲＮＡ配列から選択される治療剤と、可逆的共有結合で上記ムチン酸ポリマーにカップリングしている式ＸＸＸＩ、ＸＸＸＩＩＩ、ＸＸＸＩＶ、又はＸＸＸＶを有するフェニルボロン酸含有ポリマーとを有し、上記標的化ナノ粒子は、ナノ粒子の外部環境に上記フェニルボロン酸含有ポリマーを提示するようになっており、ここで、上記フェニルボロン酸含有ポリマーは、ナノ粒子とは反対の末端において抗体にコンジュゲートしており、上記標的化ナノ粒子は、単一の抗体を含む。
【０２２３】
１つの実施形態では、記載する標的化ナノ粒子は、ムチン酸含有ポリマーと、カンプトセシン、エポチロン、タキサン、又は干渉ＲＮＡ配列から選択される治療剤と、可逆的共有結合で上記ムチン酸ポリマーにカップリングしている式ＸＸＸＩ、ＸＸＸＩＩＩ、ＸＸＸＩＶ、又はＸＸＸＶを有するフェニルボロン酸含有ポリマーとを有し、上記標的化ナノ粒子は、ナノ粒子の外部環境に上記フェニルボロン酸含有ポリマーを提示するようになっており、ここで、上記フェニルボロン酸含有ポリマーは、ヒト、マウス、ウサギ、非ヒト霊長類、イヌ、若しくはげっ歯類の抗体、又は任意の２つのこのような抗体からなるキメラ抗体（ここで、抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、又はＩｇＹアイソタイプのうちの任意の１つである）のうちの任意の１つに、ナノ粒子とは反対の末端においてコンジュゲートしており、上記標的化ナノ粒子は、単一の抗体を含む。
【０２２４】
１つの実施形態では、記載する標的化ナノ粒子は、ムチン酸含有ポリマーと、カンプトセシン、エポチロン、タキサン、又は干渉ＲＮＡ配列から選択される治療剤と、可逆的共有結合で上記ムチン酸ポリマーにカップリングしている式ＸＸＸＩ、ＸＸＸＩＩＩ、ＸＸＸＩＶ、又はＸＸＸＶを有するフェニルボロン酸含有ポリマーとを有し、上記標的化ナノ粒子は、ナノ粒子の外部環境に上記フェニルボロン酸含有ポリマーを提示するようになっており、ここで、上記フェニルボロン酸含有ポリマーは、ナノ粒子とは反対の末端において細胞受容体にコンジュゲートしており、上記標的化ナノ粒子は、単一の細胞受容体を含む。
【０２２５】
１つの実施形態では、記載する標的化ナノ粒子は、ムチン酸含有ポリマーと、カンプトセシン、エポチロン、タキサン、又は干渉ＲＮＡ配列から選択される治療剤と、可逆的共有結合で上記ムチン酸ポリマーにカップリングしている式ＸＸＸＩ、ＸＸＸＩＩＩ、ＸＸＸＩＶ、又はＸＸＸＶを有するフェニルボロン酸含有ポリマーとを有し、上記標的化ナノ粒子は、ナノ粒子の外部環境に上記フェニルボロン酸含有ポリマーを提示するようになっており、ここで、上記フェニルボロン酸含有ポリマーは、ナノ粒子とは反対の末端において受容体リガンドにコンジュゲートしており、上記標的化ナノ粒子は、単一の受容体リガンドを含む。
【実施例】
【０２２６】
本明細書に記載する方法系について以下の実施例において更に説明するが、これは、例示目的で提供されるものであり、限定することを意図するものではない。当業者は、核酸を検出する方法、及び他の標的（タンパク質、抗原、真核又は原核細胞等）を検出する方法等について詳細に記載する特徴の適応性を理解するであろう。
【０２２７】
全ての化学試薬は、商業的供給元から入手し、更に精製することなく入手したまま用いた。ポリマーサンプルは、示差屈折率（ＲＩ）検出器、示差粘度計、及び小角光散乱検出器からなるＴＤＡ  ３０２トリプル検出器配列を備えるＶｉｓｃｏｔｅｋ  ＧＰＣシステムにおいて分析した。７．５％酢酸溶液を、１ｍＬ／分の流速で溶出剤として用いた。
【０２２８】
ｐＧＬ３、ｐＧＬ３を発現している細菌からホタルルシフェラーゼ遺伝子を含有するプラスミドを抽出し、精製した。ｓｉＧＬ３は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した（配列は、以下に示す）。ｓｉＣＯＮ１（配列は以下に示す）は、Ｄｈａｒｍａｃｏｎから購入した。ＨｅＬａ細胞を用いて、カチオン性ムチン酸ジアミン−ＤＭＳポリマーによるｐＤＮＡ又はｓｉＲＮＡ送達の効果を決定した。
【０２２９】
【表１】
2018070626.tif 000041
【０２３０】
実施例１：ムチン酸ジメチルエステルの合成（１）
５ｇ（２２．８モル）のムチン酸（Ａｌｄｒｉｃｈ）を、メタノール１２０ｍＬ及び濃硫酸０．４ｍＬを収容している５００ｍＬの丸底フラスコに添加した。この混合物を、一定の撹拌下で一晩８５℃にて還流させた。次いで、混合物を濾過し、メタノールで洗浄し、次いで、メタノール８０ｍＬ及びトリエチルアミン０．５ｍＬの混合物から再結晶化させた。一晩真空下で乾燥させた後、８．０ｇ（３３．６ｍｍｏｌ、７１％）のムチン酸ジメチルエステルを得た。１Ｈ  ＮＭＲ（（ＣＤ３）２ＳＯ）δ  ４．８８〜４．９１（ｄ，２Ｈ），４．７８〜４．８１（ｍ，２Ｈ），４．２８〜４．３１（ｄ，２Ｈ），３．７７〜３．７８（ｄ，２Ｈ），３．６３（ｓ，６Ｈ）．ＥＳＩ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：２６１．０  ［Ｍ＋Ｎａ］＋
【０２３１】
【化４０】
2018070626.tif 000042
【０２３２】
実施例２：Ｎ−ＢＯＣ−保護ムチン酸ジアミンの合成（２）
８ｇ（３３．６ｍｍｏｌ）のムチン酸ジメチルエステル（１；実施例１）、１２．４ｍＬ（８８．６ｍｍｏｌ）のトリエチルアミン、及びメタノール１６０ｍＬの混合物を、０．５時間一定の撹拌下で５００ｍＬの丸底フラスコ中にて８５℃で加熱還流させた後、メタノール（３２ｍＬ）に溶解しているＮ−ＢＯＣジアミン（Ｆｌｕｋａ）１４．２ｇ（８８．６ｍｍｏｌ）を添加した。次いで、この反応懸濁液を還流して戻した。一晩還流した後、混合物を濾過し、メタノールで洗浄し、メタノールから再結晶化し、次いで、真空下で乾燥させて、９．４ｇ（１９ｍｍｏｌ、５７％）のＮ−ＢＯＣ−保護ムチン酸ジアミンを得た。１Ｈ  ＮＭＲ（（ＣＤ３）２ＳＯ）  δ  ７．６６（ｍ，２Ｈ），６．７９（ｍ，２Ｈ），５．１３〜５．１５（ｄ，２Ｈ），４．３５〜４．３８（ｄ，２Ｈ），４．０８〜４．１１（ｍ，２Ｈ），３．７８〜３．８０（ｄ，２Ｈ），２．９５〜３．１５（ｍ，８Ｈ），１．３８（ｓ，１８）．ＥＳＩ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：５１７．１  ［Ｍ＋Ｎａ］＋
【０２３３】
【化４１】
2018070626.tif 000043
【０２３４】
実施例３：ムチン酸ジアミンの合成（３）
８ｇ（１６．２ｍｍｏｌ）のＮ−ＢＯＣ−保護ムチン酸ジアミン（２；実施例２）を、メタノール（１６０ｍＬ）中３Ｍ  ＨＣｌを収容している５００ｍＬの丸底フラスコに移し、一定の撹拌下で８５℃にて一晩還流させた。次いで、沈殿を濾過し、メタノールで洗浄し、一晩真空乾燥させて、５．７ｇ（１５．６ｍｍｏｌ、９６％）のムチン酸ジアミンを得た。１Ｈ  ＮＭＲ（（ＣＤ３）２ＳＯ）δ  ７．９７（ｍ，８Ｈ），５．３５〜５．３８（ｍ，２Ｈ），４．１８〜４．２０（ｍ，２Ｈ），３．８２（ｍ，２Ｈ），３．３５〜３．４２（ｍ，８Ｈ），２．８２〜２．９０（ｍ，４Ｈ）．ＥＳＩ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：２９４．３［Ｍ］＋，３１７．１［Ｍ＋Ｎａ］＋，３３３．０［Ｍ＋Ｋ］＋
【０２３５】
【化４２】
2018070626.tif 000044
【０２３６】
実施例４：ムチン酸ジアミン−ＤＭＳコポリマー（ＭＡＰ）（４）
１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに、０．８ｍＬの０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３中８５．５ｍｇ（０．２３３ｍｍｏｌ）の実施例３のビス（ヒドロクロリド）塩（３）の溶液を充填した。スベルイミノ酸ジメチル・２ＨＣｌ（ＤＭＳ、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、６３．６ｍｇ、０．２３３ｍｍｏｌ）を添加し、溶液をボルテックスし、遠心分離して、成分を溶解させた。得られた混合物を、室温で１５時間撹拌した。次いで、混合物を水で８ｍＬに希釈し、１Ｎ  ＨＣｌを添加することによりｐＨを４にした。次いで、この溶液をｄｄＨ２Ｏ中で３５００ＭＷＣＯ透析膜（Ｐｉｅｒｃｅ  ｐｌｅａｔｅｄ  ｄｉａｌｙｓｉｓ  ｔｕｂｉｎｇ）を用いて２４時間透析した。透析した溶液を凍結乾燥乾固させて、白色のふわふわとした粉末４９ｍｇを得た。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ｄＤＭＳＯ）δ  ９．１５（ｂｓ），７．９２（ｂｓ），５．４３（ｂｓ），４．５８（ｂｓ），４．１７（ｂｓ），３．８２（ｂｓ），３．３７（ｂｓ），３．２８（ｂｓ），２．８２（ｂｓ），２．４１（ｂｓ），１．６１（ｂｓ），１．２８（ｂｓ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ｄＤＭＳＯ）δ  １７４．８８（ｓ，１Ｈ），１６８．３８（ｓ，１Ｈ），７１．４５（ｓ，４Ｈ），７１．２２（ｓ，３Ｈ），４２．３４（ｓ，２Ｈ），３６．９６（ｓ，３Ｈ），３２．７４（ｓ，３Ｈ），２８．０９（ｓ，４Ｈ），２６．９０（ｓ，４Ｈ）．Ｍｗ［ＧＰＣ］＝２５２０，Ｍｗ／Ｍｎ＝１．１５。
【０２３７】
【化４３】
2018070626.tif 000045
【０２３８】
ポリマー４は、カチオン性Ａ−Ｂ型（繰り返し構造は、ＡＢＡＢＡＢ．．．である）のポリオール含有ポリマーの例である。
【０２３９】
実施例５：ボロン酸−アミド−ＰＥＧ５０００（５）
核酸、例えば、ｓｉＲＮＡを用いて実施例４のポリマーを構築するとき、これらは、ナノ粒子を形成する。これらナノ粒子は、哺乳類で用いられるために立体安定化を有する必要があり、任意で、標的化剤を含んでよい。これら２つの機能を果たすために、立体安定化及びＰＥＧ標的リガンドのためにナノ粒子をＰＥＧで修飾してよい。このようにするために、ボロン酸を含有するＰＥＧ化合物を調製する。例えば、ボロン酸を含有するＰＥＧは、以下の実施例に従って合成することができる。
【０２４０】
３３２ｍｇの４−カルボキシフェニルボロン酸（２ｍｍｏｌ）を８ｍＬのＳＯＣｌ２に溶解させた。これに、数滴のＤＭＦを添加し、アルゴン下で２時間混合物を還流させた。減圧下で過剰のＳＯＣｌ２を除去し、得られた固体を１０ｍＬの無水ジクロロメタンに溶解させた。この溶液に、アルゴン下で０℃にて５ｍＬのジクロロメタンに溶解している５００ｍｇのＰＥＧ５０００−ＮＨ２（２ｍｍｏｌ）及び４１８μＬのトリエチルアミン（６０ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を室温に加温し、一晩撹拌を続けた。ジクロロメタン溶媒を減圧下で除去し、得られた脂質を２０ｍＬのジエチルエーテルで沈殿させた。沈殿を濾過し、乾燥させ、ｄｄＨ２Ｏに再溶解させた。次いで、水溶液を０．４５μｍのフィルタで濾過し、ｄｄＨ２Ｏ中で３５００ＭＷＣＯ透析膜（Ｐｉｅｒｃｅ  ｐｌｅａｔｅｄ  ｄｉａｌｙｓｉｓ  ｔｕｂｉｎｇ）を用いて２４時間透析した。透析した溶液を凍結乾燥乾固させた。１Ｈ  ＮＭＲ（３００  ＭＨｚ，ｄＤＭＳＯ）δ  ７．９２−７．７７（ｍ），４．４４（ｄ），４．３７（ｔ），３．４９（ｍ），２．９７（ｓ）。
【０２４１】
【化４４】
2018070626.tif 000046
【０２４２】
実施例６：ボロン酸−ジスルフィド−ＰＥＧ５０００（６）
実施例５のＰＥＧ化合物の開裂性バージョン（還元条件下）は、以下の通り合成することもできる。
【０２４３】
２５０ｍｇのＰＥＧ５０００−ＳＨ（０．０５ｍｍｏｌ、ＬａｙＳａｎＢｉｏ  Ｉｎｃ．）を、撹拌棒を備えるガラスバイアルに添加した。これに、４ｍＬのメタノールに溶解している１１０ｍｇのアルドリチオール−２（０．５ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した。溶液を室温で２時間撹拌し、その後、１ｍＬのメタノール中７７ｍｇのメルカプトフェニルボロン酸（０．５ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した。得られた溶液を室温で更に２時間撹拌した。真空下でメタノールを除去し、残渣を２ｍＬのジクロロメタンに再溶解させた。１８ｍＬのジエチルエーテルをジクロロメタン溶液に添加し、混合物を１時間静置した。得られた沈殿を遠心分離を介して回収し、数回ジエチルエーテルで洗浄し、乾燥させた。乾燥した固体を水に再溶解させ、０．４５μｍのフィルタで濾過し、ｄｄＨ２Ｏ中で３５００ＭＷＣＯ透析膜（Ｐｉｅｒｃｅ  ｐｌｅａｔｅｄ  ｄｉａｌｙｓｉｓ  ｔｕｂｉｎｇ）を用いて１５時間透析した。透析した溶液を凍結乾燥乾固させた。１Ｈ  ＮＭＲ（３００  ＭＨｚ，ｄＤＭＳＯ）δ  ８．１２−８．００（ｍ），７．８３−７．７２（ｍ），７．７２−７．６１（ｍ），７．６１−７．４３（ｍ），３．７２（ｄ，Ｊ＝５．４），３．６８−３．１５（ｍ），３．０１−２．８３（ｍ）．
【０２４４】
【化４５】
2018070626.tif 000047
【０２４５】
実施例７：（２，３，５，６）−テトラフルオロフェニルボロン酸−ＰＥＧ５０００の合成（７）
実施例５のボロン酸を含有するＰＥＧ化合物のフッ素化バージョンを合成し、治療用ナノ粒子と共に造影剤として用いることができる。イメージングのためのフッ素原子は、記載の通り、また、以下に例証する通り組み込むことができる。
【０２４６】
（２，３，５，６）−フルオロカルボキシフェニルボロン酸を過剰のＳＯＣｌ２（〜１００当量）に溶解させ、それに、数滴のＤＭＦを添加する。アルゴン下で２時間混合物を還流させた。減圧下で過剰のＳＯＣｌ２を除去し、得られた残渣を無水ジクロロメタンに溶解させる。この溶液に、アルゴン下で０℃にて、ジクロロメタンに溶解しているＰＥＧ５０００−ＮＨ２（１当量）及びトリエチルアミン（３０当量）を添加する。得られた混合物を室温に加温し、一晩撹拌を続ける。ジクロロメタン溶媒を減圧下で除去し、得られた脂質をジエチルエーテルで沈殿させる。沈殿を濾過し、乾燥させ、ｄｄＨ２Ｏに再溶解させる。次いで、水溶液を０．４５μｍのフィルタで濾過し、ｄｄＨ２Ｏ中で３５００ＭＷＣＯ透析膜（Ｐｉｅｒｃｅ  ｐｌｅａｔｅｄ  ｄｉａｌｙｓｉｓ  ｔｕｂｉｎｇ）を用いて２４時間透析する。透析した溶液を凍結乾燥乾固させる。
【０２４７】
【化４６】
2018070626.tif 000048
【０２４８】
フッ素含有化合物は、ナノ粒子中に１９Ｆを提供するのに有用である。１９Ｆは、標準的な患者ＭＲＩを用いて磁気共鳴分光法によって検出することができる。１９Ｆの添加により、ナノ粒子を画像化することができる（画像化だけのために行ってもよく、治療剤を添加して、画像化及び治療を可能にすることもできる）。
【０２４９】
実施例８：（２，３，５，６）−テトラフルオロフェニルボロン酸−ジスルフィド−ＰＥＧ５０００の合成（８）
実施例５のボロン酸を含有する開裂性ＰＥＧ化合物のフッ素化バージョンを合成し、治療用ナノ粒子と共に造影剤として用いることができる。イメージングのためのフッ素原子は、記載の通り、また、以下に例証する通り組み込むことができる。
【０２５０】
２５０ｍｇのＰＥＧ５０００−ＳＨ（０．０５ｍｍｏｌ、ＬａｙＳａｎＢｉｏ  Ｉｎｃ．）を、撹拌棒を備えるガラスバイアルに添加する。これに、４ｍＬのメタノールに溶解している１１０ｍｇのアルドリチオール−２（０．５ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加する。溶液を室温で２時間撹拌し、その後、１ｍＬのメタノール中７７ｍｇの（２，３，５，６）−フルオロ−４−メルカプトフェニルボロン酸（０．５ｍｍｏｌ）を添加する。得られた溶液を室温で更に２時間撹拌する。真空下でメタノールを除去し、残渣を２ｍＬのジクロロメタンに再溶解させる。１８ｍＬのジエチルエーテルをジクロロメタン溶液に添加し、混合物を１時間静置する。得られた沈殿を遠心分離を介して回収し、ジエチルエーテルで数回洗浄し、乾燥させる。乾燥した固体を水に再溶解させ、０．４５μｍのフィルタで濾過し、ｄｄＨ２Ｏ中で３５００ＭＷＣＯ透析膜（Ｐｉｅｒｃｅ  ｐｌｅａｔｅｄ  ｄｉａｌｙｓｉｓ  ｔｕｂｉｎｇ）を用いて１５時間透析する。透析した溶液を凍結乾燥乾固させる。
【０２５１】
【化４７】
2018070626.tif 000049
【０２５２】
実施例９：ボロン酸−ＰＥＧ５０００−トランスフェリンの合成（９）
例えば、トランスフェリンの結合に関連して図１２に概略的に図示するアプローチに従って、実施例５〜８の化合物中のボロン酸からＰＥＧの他端に標的剤を配置することができた。
【０２５３】
したがって、治療剤として核酸を含有する系の成分は、（標的リガンドは、トランスフェリン等のタンパク質（図１２）、抗体又は抗体断片、ＲＧＤ又はＬＨＲＨ等のペプチド、葉酸又はガラクトース等の低分子等）であってよい。ボロン酸ペグ化標的剤は、以下の通り合成することができる。
【０２５４】
具体的には、図１２に概略的に図示するアプローチに従ってボロン酸ＰＥＧ５０００−トランスフェリンを合成するために、以下の手順を実施した。１ｍＬの０．１Ｍ  ＰＢＳバッファ（ｐＨ  ７．２）中１０ｍｇ（０．１３μｍｏｌ）のヒトホロ−トランスフェリン（鉄リッチ）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）の溶液を、３．２ｍｇのＯＰＳＳ−ＰＥＧ５０００−ＳＶＡ（５当量、０．６４μｍｏｌ、ＬａｙｓａｎＢｉｏ  Ｉｎｃ．）に添加した。得られた溶液を室温で２時間撹拌した。Ｕｌｔｒａｃｅｌ  ５０，０００  ＭＷＣＯ（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて未反応ＯＰＳＳ−ＰＥＧ５０００−ＳＶＡから、及びゲル濾過カラムＧ３０００ＳＷｘｌ（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｅｐ）を用いて未反応トランスフェリンからペグ化トランスフェリンを精製した（ＨＰＬＣ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析によって確認された）。次いで、１００μＬ中ＯＰＳＳ−ＰＥＧ５０００ペグ化トランスフェリン１００μｇを、４−メルカプトフェニルボロン酸（１μｇ／μＬ、２０μｇ、１００当量）２０μＬと共に室温で１時間インキュベートした。インキュベート後、ＹＭ−３０，０００  ＮＭＷＩ装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて溶液を２回透析して、過剰の４−メルカプトフェニルボロン酸及びピリジル−２−チオン副生成物を除去した。
【０２５５】
実施例１０：ＭＡＰ−核酸粒子の構築−ゲル遅延度アッセイ
図１に図示する通り、ＤＮＡｓｅ及びＲＮＡＳｅを含まない水中１μｇのプラスミドＤＮＡ又はｓｉＲＮＡ（０．１μｇ／μＬ、１０μＬ）を、ＤＮＡｓｅ及びＲＮＡＳｅを含まない水中様々な濃度のＭＡＰ  １０μＬと混合して、０．５、１、１．５、２、２．５、及び５の電荷比（ポリマーにおける「＋」電荷対核酸における「−」電荷）を得た。得られた混合物を室温で３０分間インキュベートした。２０μＬの溶液のうちの１０μＬを、３．５μＬのローディングバッファと共に１％アガロースゲルにロードし、図３及び４に示す通り、８０Ｖで４５分間ゲルを電気泳動した。ナノ粒子に含まれていない核酸は、ゲル上を移動する。これら結果は、ナノ粒子内に核酸を閉じ込めるのに必要な電荷比に対する指針を提供する。
【０２５６】
実施例１１：ＭＡＰ−核酸粒子の粒径及びゼータ電位
ＤＮＡｓｅ及びＲＮＡＳｅを含まない水中１μｇのプラスミドＤＮＡ（０．１μｇ／μＬ、１０μＬ）を、ＤＮＡｓｅ及びＲＮＡＳｅを含まない水中様々な濃度のＭＡＰ１０μＬと混合して、０．５、１、１．５、２、２．５、及び５の電荷比を得た。得られた混合物を室温で３０分間インキュベートした。次いで、粒径測定のために、２０μＬの混合物をＤＮＡｓｅ及びＲＮＡＳｅを含まない水で７０μＬに希釈した。次いで、ゼータ電位測定のために、この７０μＬの溶液を１ｍＭ  ＫＣｌで１４００μＬに希釈した。粒径及びゼータ電位の測定は、ＺｅｔａＰａｌｓ動的光散乱（ＤＬＳ）装置（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で行った。結果を図５に示す。
【０２５７】
実施例１２：ボロン酸ＰＥＧ５ｋでペグ化することによる粒径の安定化
図２に図示する通り、ＤＮＡｓｅ及びＲＮＡＳｅを含まない水中２μｇのプラスミドＤＮＡ（０．４５μｇ／μＬ、４．４μＬ）を、ＤＮＡｓｅ及びＲＮＡＳｅを含まない水で８０μＬに希釈した。このプラスミド溶液を、４．８９μｇのＭＡＰ（０．５μｇ／μＬ、９．８μＬ）と混合し、これもＤＮＡｓｅ及びＲＮＡＳｅを含まない水で８０μＬに希釈して、３＋／−の電荷比及び０．０１２５μｇ／μＬの最終プラスミド濃度を得た。得られた混合物を室温で３０分間インキュベートした。この溶液に、４８０μｇのボロン酸ＰＥＧ５ｋ（化合物６、実施例６）（２０μｇ／μＬ、２４μＬ）を添加した。次いで、この混合物を更に３０分間インキュベートし、ＤＮＡｓｅ及びＲＮＡＳｅを含まない水中で０．５ｍＬの１００，０００  ＭＷＣＯ膜（ＢＩＯＭＡＸ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて２回透析し、１６０μＬのＤＮＡｓｅ及びＲＮＡＳｅを含まない水で再構成した。ゼータ電位測定のために、この溶液の半分を１．４ｍＬの１ｍＭ  ＫＣｌで希釈した（図６）。なお、ＢＡ含有ナノ粒子のゼータ電位は、含有していないナノ粒子よりも低いゼータ電位を示す。これら結果は、ＢＡ含有ナノ粒子が、ナノ粒子の外部に局在するＢＡを有しているという結論を裏付ける。残り半分を粒径を測定するために用いた。粒径を５分間毎分ごとに測定し、その後、最終的に１×  ＰＢＳ中９０．２μＬの溶液になるように、１０×  ＰＢＳを１０．２μＬ添加した。次いで、図７に示す通り、粒径を更に１０分間毎分ごとに再度測定した。（濾過により）非粒子成分から分離したＢＡ含有ナノ粒子は、ＰＢＳ中で安定であるが、ＢＡを含有しない粒子は、そうではない。これらデータは、ＢＡ含有ナノ粒子が、ＰＢＳ中における凝集に対して安定化されているので、ナノ粒子の外部に局在するＢＡを有しているという結論を裏付ける。
【０２５８】
実施例１３：ＭＡＰ／ｐＤＮＡ粒子のＨｅＬａ細胞へのトランスフェクション
トランスフェクションの４８時間前に、ＨｅＬａ細胞を２４ウェルプレートに２０，０００細胞／ウェルで播種し、１０％  ＦＢＳを添加した培地で増殖させた。ＭＡＰ粒子は、ポリマーのｐＤＮＡに対する様々な電荷比で２００μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ中に１μｇのｐＧＬ３を含有するように配合した（実施例９を参照）。増殖培地を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄し、粒子製剤を添加した。次いで、細胞を３７℃及び５％  ＣＯ２で５時間インキュベートした後、１０％  ＦＢＳを添加した増殖培地８００μＬを添加した。４８時間インキュベートした後、ＭＴＳアッセイを用いて細胞生存率について細胞のある画分を分析した。残りの細胞を、１×ルシフェラーゼ細胞培養溶解試薬１００μＬに溶解させた。１０μＬの細胞溶解物に１００μＬのルシフェラーゼアッセイ試薬を添加することによって、ルシフェラーゼ活性を決定し、Ｍｏｎｏｌｉｇｈｔ照度計を用いて生物発光を定量した。次いで、ルシフェラーゼ活性を１０，０００細胞当たりの相対光単位（ＲＬＵ）として報告する。結果を図８及び図９に示す。
【０２５９】
実施例１４：ＭＡＰ／ｐＤＮＡ及び／又はｓｉＲＮＡ粒子のＨｅＬａ細胞へのコトランスフェクション
トランスフェクションの４８時間前に、ＨｅＬａ細胞を２４ウェルプレートに２０，０００細胞／ウェルで播種し、１０％  ＦＢＳを添加した培地で増殖させた。ＭＡＰ粒子は、５＋／−の電荷比で２００μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ中に１μｇのｐＧＬ３及び５０ｎＭのｓｉＧＬ３を含有するように配合した。ｐＧＬ３のみ、又はｐＧＬ３及びｓｉＣＯＮを含有する粒子を対照として用いた。増殖培地を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄し、粒子製剤を添加した。次いで、細胞を３７℃及び５％  ＣＯ２で５時間インキュベートした後、１０％  ＦＢＳを添加した増殖培地８００μＬを添加した。４８時間インキュベートした後、実施例１２に記載の通り、ルシフェラーゼ活性及び細胞生存率について細胞をアッセイした。結果を図１０に示す。ｓｉＧＬ３（正確な配列）によるトランスフェクションではＲＬＵがより低いので、ｓｉＧＬ３及びｐＧＬ３を共送達しなければならない。
【０２６０】
実施例１５：ＭＡＰ／ｓｉＧＬ３粒子のＨｅＬａ−ＬＵＣ細胞へのトランスフェクション
トランスフェクションの４８時間前に、ＨｅＬａ−ＬＵＣ細胞（ホタルルシフェラーゼタンパク質をコードしている遺伝子を含有）を２４ウェルプレートに２０，０００細胞／ウェルで播種し、１０％  ＦＢＳを添加した培地で増殖させた。ＭＡＰ粒子は、５＋／−の電荷比で２００μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ中に５０及び１００ｎＭのｓｉＧＬ３を含有するように配合した。増殖培地を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄し、粒子製剤を添加した。次いで、細胞を３７℃及び５％  ＣＯ２で５時間インキュベートした後、１０％  ＦＢＳを添加した増殖培地８００μＬを添加した。４８時間インキュベートした後、実施例１２に記載の通り、ルシフェラーゼ活性及び細胞生存率について細胞をアッセイした。結果を図１１に示す。ｓｉＧＬ３の濃度の増大と共にＲＬＵが低下するので、これらデータは、内因性遺伝子の阻害が生じ得ることを示唆する。
【０２６１】
実施例１６：ムチン酸二ヨウ化物の合成（１０）
２５０ｍＬの丸底フラスコ内で１ｇ（２．７ｍｍｏｌ）のムチン酸ジアミン（実施例３）を、３．８ｍＬ（２７．４ｍｍｏｌ）のトリエチルアミン及び５０ｍＬの無水ＤＭＦと混合した後、１．２ｍＬ（１３．７ｍｍｏｌ）のヨードアセチルクロリドを滴下した。この混合物を、室温で一定の撹拌下にて一晩反応させた。次いで、真空ポンプによって溶媒を除去し、生成物を濾過し、メタノールで洗浄し、真空下で乾燥させて、０．８ｇ（１．３ｍｍｏｌ、４６％）のムチン酸二ヨウ化物を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（（ＣＤ３）２ＳＯ）δ  ８．２０（ｓ  ２Ｈ），２Ｈ），７．７７（ｓ，２Ｈ），４．１１（ｍ，２Ｈ），４．０３（ｍ，２Ｈ），３．７９（ｍ，２Ｈ），３．１１〜３．１７（ｍ，２Ｈ），１．７８（ｄ，２Ｈ）．ＥＳＩ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：６５２．８［Ｍ＋Ｎａ］＋
【０２６２】
【化４８】
2018070626.tif 000050
【０２６３】
実施例１７：ムチン酸ジシステインの合成（１１）
７ｍＬの０．１Ｍ脱気炭酸ナトリウムに、１７ｍｇのＬ−システイン及び０．４ｇのムチン酸二ヨウ化物を添加した。得られた懸濁液を、溶液が透明になるまで１５０℃で５時間還流させた。次いで、この混合物を室温に冷却し、１Ｎ  ＨＣｌを介してｐＨ  ３に調整した。次いで、沈殿を生成させるためにアセトンをゆっくり添加した。濾過し、アセトンで洗浄し、真空乾燥させた後、６０ｍｇの粗生成物を得た。
【０２６４】
【化４９】
2018070626.tif 000051
【０２６５】
実施例１７：ムチン酸ジシステインの合成（１１）
５０ｍＬの丸底フラスコ内の０．１Ｍ脱気リン酸ナトリウムバッファ（ｐＨ  ７．５）２０ｍＬに、０．３８ｇのＬ−システイン（３．２ｍｍｏｌ）及び０．４０ｇ（０．６ｍｍｏｌ）のムチン酸二ヨウ化物を添加した。得られた懸濁液を７５℃で一晩還流させ、室温に冷却し、凍結乾燥させた。次いで、この凍結乾燥した薄茶色の粉末に８０ｍＬのＤＭＦを添加し、不溶性の過剰の試薬及びリン酸塩を可溶性生成物から濾過によって分離した。減圧下でＤＭＦを除去し、生成物を真空乾燥させて、１２ｍｇ（０．０２ｍｍｏｌ、３％）のムチン酸ジシステインを得た。
【０２６６】
【化５０】
2018070626.tif 000052
【０２６７】
実施例１８：ポリマーの合成（ポリ（ムチン酸−ジシステイン−ＰＥＧ））（１２）
１２ｍｇ（２１．７μｍｏｌ）のムチン酸ジシステイン及び７４ｍｇ（２１．７μｍｏｌ）のＰＥＧ−ＤｉＳＰＡ  ３４００を真空下で乾燥させた後、１０ｍＬの２つ口丸底フラスコ内でアルゴン下にて０．６ｍＬの無水ＤＭＳＯを添加した。１０分間撹拌した後、９μＬ（６５．１μｍｏｌ）の無水ＤＩＥＡをアルゴン下で反応容器に移した。この混合物をアルゴン下で一晩撹拌した。次いで、ポリマーを含有する溶液を、１０ｋＤａ膜遠心分離装置を用いて透析し、凍結乾燥させて、４７ｍｇ（５８％）のポリ（ムチン酸−ジシステイン−ＰＥＧ）を得た。
【０２６８】
【化５１】
2018070626.tif 000053
このポリオール含有ポリマーは、アニオン性ＡＢポリマーである。
【０２６９】
実施例１９：薬物（カンプトセシン、ＣＰＴ）のムチン酸ポリマーへの共有結合（１３）
１０ｍｇ（２．７μｍｏｌの繰り返し単位）のポリ（ムチン酸−ジシステイン−ＰＥＧ）を、ガラスジャー内の１．５ｍＬの無水ＤＭＳＯに溶解させた。１０分間撹拌した後、１．１μＬのＤＩＥＡ（６．３μｍｏｌ）、３．３ｍｇ（６．３μｍｏｌ）のＴＦＡ−Ｇｌｙ−ＣＰＴ、１．６ｍｇ（８．１μｍｏｌ）のＥＤＣ、及び０．７ｍｇ（５．９μｍｏｌ）のＮＨＳを反応混合物に添加した。８時間撹拌した後、１．５ｍＬのエタノールを添加し、減圧下で溶媒を除去した。沈殿を水に溶解させ、０．２μｍのフィルタを通して濾過することによって不溶性物質を除去した。次いで、ポリマー溶液を、１０ｋＤａ膜を介して水に対して透析し、次いで、凍結乾燥させて、ポリ（ムチン酸−ジシステイン−ＰＥＧ）−ＣＰＴコンジュゲートを得た。
【０２７０】
【化５２】
2018070626.tif 000054
【０２７１】
実施例２０：水中におけるＣＰＴ−ムチン酸ポリマー（１３）を含むナノ粒子の形成（２０）
ポリ（ムチン酸−ジシステイン−ＰＥＧ）及びポリ（ムチン酸−ジシステイン−ＰＥＧ）−ＣＰＴコンジュゲートの有効直径を、再蒸留水（０．１〜１０ｍｇ／ｍＬ）中にポリマーを配合することによって測定し、ＺｅｔａＰＡＬＳ（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ）装置を用いて動的光散乱（ＤＬＳ）を介して評価した。次いで、各１分間の３回の連続ランを記録し、平均化した。両成分のゼータ電位を、ＺｅｔａＰＡＬＳ（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ）装置を用いて１．１ｍＭ  ＫＣｌ溶液中で測定した。次いで、０．０１２の標的残渣における１０回の連続自動化ランを実施し、結果を平均化した（図１４）。具体的には、ポリ（ムチン酸−ジシステイン−ＰＥＧ）−ＣＰＴコンジュゲートについてこれら２つの分布を測定し、主な分布は、５７ｎｍ（全粒子集団の６０％）であった。また、２番目に小さな分布は、２３３ｎｍで測定された。
【０２７２】
実施例２１：水中におけるＣＰＴ−ムチン酸ポリマー（１３）及びボロン酸−ジスルフィド−ＰＥＧ５０００（６）を含むボロン酸−ペグ化ナノ粒子の配合
０．１ｍｇ／ｍＬの濃度で再蒸留水にポリマーを溶解させ、次いで、ポリ（ムチン酸−ジシステイン−ＰＥＧ）−ＣＰＴコンジュゲート中のムチン酸糖におけるＰＢＡ−ＰＥＧのジオールに対する比が１：１になるように、これも水中でポリマー６（ＢＡ−ＰＥＧ）を添加することによって、ボロン酸ペグ化ポリ（ムチン酸−ジシステイン−ＰＥＧ）−ＣＰＴナノ粒子を配合する。混合物を３０分間インキュベートし、その後、ＺｅｔａＰＡＬＳ（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ）装置を用いて有効直径及びゼータ電位を測定する。
【０２７３】
実施例２２：マウスにおいてｐＤＮＡを送達するための標的化ナノ粒子
プラスミドｐＡｐｏＥ−ＨＣＲＬｕｃは、ルシフェラーゼを発現する遺伝子を含有し、肝臓特異的プロモータの制御下にある。ポリマー（ＭＡＰ）４（０．７３ｍｇ）、ポリマー６（７３ｍｇ）、及びポリマー９（０．０７３ｍｇ）を５ｍＬの水中で合わせ、次いで、ｐＡｐｏＥ−ＨＣＲＬｕｃプラスミドを含有する水１．２ｍＬを添加した（ポリマー４のプラスミドに対する電荷比は、＋３になる）。連続スピン濾過によって粒子をＤ５Ｗ（水中５％グルコース）に入れ、次いで、Ｄ５Ｗを添加した（水中に存在していた初期配合から出発）。ヌードマウスにＨｅｐａ−１〜６肝臓癌細胞を移植し、サイズが約２００ｍｍ３になるまで腫瘍を成長させた。５ｍｇプラスミド／ｋｇマウスに等しい量の標的化ナノ粒子を、尾静脈にｉ．ｖ．で注射した。注射の２４時間後にマウスを撮像した。マウスは、毒性の徴候を示さず、腫瘍の領域ではルシフェラーゼ発現が検出されたが、肝臓の領域では検出されなかった。
【０２７４】
実施例２３：ＰＢＡ−ＰＥＧ及びニトロＰＢＡ−ＰＥＧの合成、並びにｐＫａの決定
安定化された標的化ナノ粒子を調製するために、ボロン酸とＭＡＰ（ジオール含有）との間の共有、可逆性結合特性を用いた。フェニルボロン酸（ＰＢＡ）のｐＫａは、８．８と高い。ｐＫａを低下させるために、フェニル環上に電子求引基を有するＰＢＡを使用して、ホウ素原子の酸性を上昇させた。市販の３−カルボキシＰＢＡ及び３−カルボキシ５−ニトロＰＢＡを、塩化オキサリルを用いて塩化アシルに変換した。次いで、これら塩化アシル種をＮＨ２−ＰＥＧと反応させて、それぞれ、ＰＢＡ−ＰＥＧ及びニトロＰＢＡ−ＰＥＧを形成した。合成反応を進行させるために、塩基ＤＭＦ及びＤＩＰＥＡの添加が必要であった。しかし、これら塩基の存在により、酸性ＰＢＡとの四面体付加物が形成される。これら付加物を除去するために、０．５Ｎ  ＨＣｌで後処理し、次いで、水に対して透析することによって中性ｐＨに平衡化した。
【０２７５】
ＰＢＡ−ＰＥＧを合成するために、５ｍＬの無水テトラヒドロフランに溶解している２００ｍｇ（１．２１ｍＭ）の３−カルボキシフェニルボロン酸を、アルゴン下で１８．７μＬ（０．２４ｍＭ）の無水ジメチルホルムアミドに添加した。この反応容器を氷浴に移し、１９５μＬ（２．８９ｍＭ）の塩化オキサリルをアルゴン下でゆっくり添加した。室温で２時間、喚気及び一定の撹拌下で反応を進行させた。溶媒及び過剰の試薬を真空下で除去した。３７ｍｇ（０．２ｍＭ）の得られた乾燥塩化アシル化合物を、アルゴン下で１５ｍＬの無水ジクロロメタンに溶解させた。次いで、アルゴン下で５００ｍｇ（０．１ｍＭ）のＮＨ２−ＰＥＧ５ｋＤａーＣＯ２Ｈ及び５２μＬ（０．３ｍＭ）の乾燥ＤＩＰＥＡを添加した。一定の撹拌下で一晩反応させた後、真空下で溶媒を除去し、乾燥生成物を０．５Ｎ  ＨＣｌで再構成した。この溶液を０．２μｍのフィルタ（Ａｃｒｏｄｉｓｃ（登録商標））に通し、一定のｐＨが得られるまで３ｋＤａ  ＭＷＣＯ膜フィルタ装置（Ａｍｉｃｏｎ（商標））を用いて水に対して透析した。次いで、上清を０．２μｍのフィルタ（Ａｃｒｏｄｉｓｃ（登録商標））で濾過し、凍結乾燥させて、３７７ｍｇ（７３％）のＰＢＡ−ＰＥＧ−ＣＯ２Ｈを得た。１Ｈ  ＮＭＲ（（ＣＤ３）２ＳＯ）δ  １２．５２（ｓ，１Ｈ），８．３９（ｔ，１Ｈ），８．２２（ｓ，１Ｈ），８．１４（ｓ，２Ｈ），７．８８（ｄ，１Ｈ），７．８２（ｄ，１Ｈ），７．３９（ｔ，１Ｈ），３．９９（ｓ，２Ｈ），３．３５〜３．６２（ＰＥＧ  ｐｅａｋ）．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：５６００ｇ／モル（ＮＨ２−ＰＥＧ５ｋＤａ−ＣＯ２Ｈ、５４００ｇ／モル）。
【０２７６】
【化５３】
2018070626.tif 000055
【０２７７】
出発物質が３−カルボキシ５−ニトロフェニルボロン酸であったことを除いて、ＰＢＡ−ＰＥＧ−ＣＯ２Ｈと同じ方法でニトロＰＢＡ−ＰＥＧ−ＣＯ２Ｈの合成を実施した。この反応から、３９３ｍｇ（７６％）のニトロＰＢＡ−ＰＥＧ−ＣＯ２Ｈが得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（（ＣＤ３）２ＳＯ）δ  １２．５２（ｓ，１Ｈ），８．８９（ｔ，１Ｈ），８．７２（ｓ，１Ｈ），８．６８（ｓ，１Ｈ），８．６４（ｓ，１Ｈ），８．６１（ｓ，２Ｈ），３．９９（ｓ，２Ｈ），３．３５〜３．６２（ＰＥＧ  ｐｅａｋ）．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：５６００ｇ／モル（ＮＨ２−ＰＥＧ５ｋＤａ−ＣＯ２Ｈ、５４００ｇ／モル）。
【０２７８】
【化５４】
2018070626.tif 000056
【０２７９】
合成したＰＢＡ化合物のｐＫａは、（低ｐＨにおける）菱面体から（高ｐＨにおける）四面体構造に変換されるときのＰＢＡの吸光度の変化を測定することによって見出された。０．１Ｍ  ＰＢＳ（ｐＨ  ７．４）中１０−３Ｍ  ＰＢＡの溶液に、１Ｎ  ＮａＯＨを滴定した。ｐＨを記録し、対応するサンプルを２６８ｎｍにおける吸光度測定から除去した。
【０２８０】
【表２】
2018070626.tif 000057
【０２８１】
実施例２４：ニトロＰＢＡ−ＰＥＧへの抗体コンジュゲーション
ニトロＰＢＡ−ＰＥＧの生成後、得られた化合物を抗体にコンジュゲートさせた。コンジュゲーションのために、３６ｍｇ（６．４μＭ）のニトロＰＢＡ−ＰＥＧ−ＣＯ２Ｈ、１２．３ｍｇ（６４μＭ）の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、及び１１．１ｍｇ（９６μＭ）のＮＨＳを、２．４ｍＬの０．１Ｍ  ＭＥＳバッファ（ｐＨ  ６．０）に溶解させた。この混合物を室温で回転振盪器上にて１５分間反応させた。過剰の反応物質を３ｋＤａ分子量カットオフ膜フィルタ装置（Ａｍｉｃｏｎ（商標））を用いて透析で除去した。この活性化カルボン酸ＰＥＧ化合物を、０．１Ｍ  ＰＢＳ（ｐＨ  ７．２）中２０ｍｇ（０．１４ｍＭ）のヒトＩｇＧ１抗体（ハーセプチン（登録商標））に添加した。室温で２時間回転振盪器上にて反応を実行し、次いで、５０ｋＤａ分子量カットオフ膜フィルタ装置（Ａｍｉｃｏｎ（商標））を用いて１×ＰＢＳ（ｐＨ  ７．４）に対して４回透析した。質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）によるコンジュゲートの分析は、抗体１つ当たり平均１つ又は２つのニトロＰＢＡ−ＰＥＧ化合物がコンジュゲートしたことを示した。
【０２８２】
実施例２６：標的化ＭＡＰナノ粒子の形成及び特性評価
ＰＢＡ−ＰＥＧ及びニトロＰＢＡ−ＰＥＧのナノ粒子形成及び安定性に対する効果を調べた。ＰＢＡ−ＰＥＧの溶液を、リン酸バッファ（ｐＨ  ７．４）中電荷比３＋／−（ｓｉＲＮＡ由来の負電荷当たりのＭＡＰ由来の正電荷）のＭＡＰ溶液に添加した。ＰＢＡ−ＰＥＧとジオール含有ＭＡＰとの複合体化のために、この混合物を１０分間室温で静置した。次いで、これを水中の等体積のｓｉＲＮＡに添加し、ピペッティングによって混合した。１０分間後、試験及び特性評価を実施した。ニトロＰＢＡ−ＰＥＧで安定化された、様々な電荷比の粒子の配合を同様に実施した。ＰＢＡ−ＰＥＧのコンジュゲーションにより、１５０〜３００ｎｍのサイズのＭＡＰ／ｓｉＲＮＡ粒子が形成された。ＭＡＰ−４（電荷中心（アミジン）と結合部位（ポリオール）との間の４つのメチレン単位を示す）により、ＭＡＰ−２を用いたときよりも小さなナノ粒子が得られた。しかし、塩を添加した際、全ての粒子が凝集し、これは、ＰＢＡ−ＰＥＧがナノ粒子に十分な安定性を提供できないことを示す。ニトロＰＢＡ−ＰＥＧを用い、全ての電荷比における粒子を試験したとき、１及び３（＋／−）は、安定化ナノ粒子を示した。ＰＢＡ−ＰＥＧ及びニトロＰＢＡ−ＰＥＧによって付与される粒子安定性の差は、ポリオールにより強く結合するようにペグ化ボロン酸化合物を修飾することの重要性を示す。
【０２８３】
安定化剤ＰＥＧの非存在下でＭＡＰ−４と縮合したｓｉＲＮＡについては、＋３２ｍＶの高いゼータ電位と共に６４０ｎｍの粒径が観察された。ニトロＰＢＡ−ＰＥＧを添加して粒子を安定化させた場合、−４ｍＶの負の表面電荷と共に直径が１３０ｎｍに減少した。この負電荷は、ボロン酸とジオールとの結合の結果である。０．２５モル％のＩｇＧ（ハーセプチン（登録商標））にコンジュゲートしているニトロＰＢＡ−ＰＥＧを導入したとき、興味深いことに、粒径は更に８２ｎｍに減少したが、ゼータ電位は、同様のままであった。
【０２８４】
様々なＰＥＧ基が結合しているＭＡＰ−４／ｓｉＲＮＡナノ粒子の塩安定性を評価した。ゼータ電位分析機（ＤＬＳ  ＺｅｔａＰＡＬＳ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｈｏｌｔｓｖｉｌｌｅ，ＮＹ））を用いて１分間の５回のランについて粒径を記録した。測定を停止して、得られる粒子製剤が１×ＰＢＳを含有するように１０×ＰＢＳ溶液を粒子製剤に添加することを可能にした。次いで、測定を再度開始し、各１分間の１０回の連続ランを記録して、粒子安定性に対する塩添加の効果について調べた。図１６に示す通り、安定化剤ＰＥＧの非存在下では、粒子が凝集した。ニトロＰＢＡ−ＰＥＧが存在していた場合、粒子は、塩条件でも安定なままであった。
【０２８５】
実施例２７：標的化ＭＡＰ−ＣＰＴナノ粒子の形成及び特性評価
標的化ＭＡＰ−ＣＰＴナノ粒子を調製するために、ボロン酸とＭＡＰ（ジオール含有）との間の共有、可逆性結合特性を用いた。ＰＢＡとＭＡＰとの間の結合定数は、約２０Ｍ−１と低い。結合定数を上昇させるために、フェニル環上に電子求引基を有するＰＢＡを使用して、ホウ素原子の酸性を上昇させて、ＭＡＰとの結合定数を上昇させた。市販の３−カルボキシＰＢＡ及び３−カルボキシ５−ニトロＰＢＡを、塩化オキサリルを用いて塩化アシルに変換した。次いで、これら塩化アシル種をＮＨ２−ＰＥＧーＣＯ２Ｈと反応させて、それぞれ、ＰＢＡ−ＰＥＧーＣＯ２Ｈ及びニトロＰＢＡ−ＰＥＧーＣＯ２Ｈを形成した。合成反応を進行させるために、塩基ＤＭＦ及びＤＩＰＥＡの添加が必要であった。しかし、これら塩基の存在により、酸性ＰＢＡとの四面体付加物が形成される。これら付加物を除去するために、０．５Ｎ  ＨＣｌで後処理し、次いで、水に対して透析することによって中性ｐＨに平衡化した。
【０２８６】
ｐＨが上昇したときの菱面体から四面体形態へのＰＢＡの立体構造の変化に起因する吸光度の変化によって、修飾ＰＢＡのｐＫａ値を決定した。電子求引基を有するＰＢＡからはより低いｐＫａが得られ、ニトロＰＢＡ−ＰＥＧ−ＣＯ２Ｈは、６．８という最低ｐＫａを有していた。したがって、生理学的ｐＨでは、ＰＢＡの大部分が反応性アニオン性四面体形態で存在していた。ＰＢＡとＭＡＰとの間の結合定数は、０．１Ｍ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中におけるＡｌｉｚａｒｉｎ  Ｒｅｄ  Ｓとの競合結合によって見出された。ニトロＰＢＡ−ＰＥＧ−ＣＯ２Ｈについて観察された低いｐＫａ値及びＭＡＰとの高い結合定数により、それが、ＩｇＧ（ハーセプチン（登録商標））とＭＡＰ−ＣＰＴナノ粒子との間のリンカーとして選択された。
【０２８７】
ＩｇＧ（ハーセプチン（登録商標））とニトロＰＢＡ−ＰＥＧ−ＣＯ２Ｈとの間のコンジュゲート反応は、ＥＤＣカップリング（上記）を介して進行した。ＩｇＧ（ハーセプチン（登録商標））抗体１つ当たり平均１〜２個のＰＥＧが結合した。
【０２８８】
【表３】
2018070626.tif 000058
ａムチン酸ジ（アスパラギン酸−アミン）中のアミン基当たり、等量のＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を添加した。ｂＭＷ、（Ｍｗ＋Ｍｎ）／２として求めた分子量；Ｍｗ、重量平均分子量；Ｍｎ、数平均分子量。ｃＭｗ／Ｍｎとして求めた多分散性。
【０２８９】
ＤＬＳ及びｃｒｙｏ−ＥＭによって標的化ＭＡＰ−ＣＰＴナノ粒子について約４０ｎｍの平均粒径が観察された（表３）。この非標的化ナノ粒子からの約１０ｎｍの増加は、ＩｇＧ（ハーセプチン（登録商標））のナノ粒子への結合を示唆する（量は、ナノ粒子１個当たり約１個のハーセプチン（登録商標）抗体であった）。実際、ｃｒｙｏ−ＥＭ画像から、標的化ナノ粒子は、球形ではなく、抗体の結合を示す突起を有しているように見えた。標的化ＭＡＰ−ＣＰＴナノ粒子の表面電荷は、ｐＨ  ７．４の正に帯電しているハーセプチン（ハーセプチン（登録商標）のｐＩ、９．２）の存在に起因して、ＭＡＰ−ＣＰＴナノ粒子よりもわずかに高かった。
【０２９０】
実施例２８：細胞取り込み試験
ＨＥＲ２過剰発現ヒト乳癌細胞株（ＢＴ−４７４）を用いて、非標的化ナノ粒子に対するハーセプチン（登録商標）標的化ＭＡＰ−ＣＰＴナノ粒子の細胞取り込みについて調べた。ＨＥＲ２陰性乳癌細胞株（ＭＣＦ−７）をネガティブコントロールとして用いた。これら試験のために、２４ウェルプレートに１ウェル当たり２０，０００細胞のＢＴ−４７４（１０％ウシ胎仔血清を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地中）又はＭＣＦ−７（１０％ウシ胎仔血清を添加したダルベッコ変法イーグル培地中）（Ｃｅｌｌｇｒｏ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ））を播種し、５％  ＣＯ２を含む加湿オーブン内で３７℃にて維持した。４０時間後、中ＭＡＰ−ＣＰＴ（４０μｇＣＰＴ／ｍＬ）、１０ｍｇ／ｍＬの遊離ハーセプチン（登録商標）を含む中ＭＡＰ−ＣＰＴ、様々な標的化密度の標的化ＭＡＰ−ＣＰＴ（４０μｇＣＰＴ／ｍＬ）、又は１０ｍｇ／ｍＬの遊離ハーセプチン（登録商標）を含む標的化ＭＡＰ−ＣＰＴのいずれかを含有する新鮮培地０．３ｍＬに培地を交換した。３７℃で３０分間トランスフェクションを実施した。次いで、製剤を除去し、冷ＰＢＳで２回細胞を洗浄した。細胞を剥離及び溶解させるために、１ウェル当たり２００μＬのＲＩＰＡバッファを添加した。次いで、溶解した細胞を４℃で１５分間インキュベートし、４℃で１０分間１４，０００ｇにて遠心分離した。上清の一部を、ＢＣＡアッセイを介したタンパク質の定量に用いた。別の部分に、等量の０．１Ｎ  ＮａＯＨを添加し、これを室温で一晩インキュベートし、標準として既知の濃度のＭＡＰ−ＣＰＴを用いて３７０／４４０ｎｍで蛍光を測定した。
【０２９１】
ナノ粒子１個当たり１個のハーセプチン（登録商標）−ＰＥＧ−ニトロＰＢＡが、非標的化ナノ粒子と比べて、約７０％多いＢＴ−４７４細胞株への取り込みを達成するのに十分であることが観察された（図１７Ａ）。ＢＴ−４７４細胞への標的化ＭＡＰ−ＣＰＴの取り込みは、遊離ハーセプチン（登録商標）の存在下における阻害を示した（図１７Ｂ）。対照的に、ＭＣＦ−７へのＭＡＰ−ＣＰＴナノ粒子の取り込みは、標的化にも遊離ハーセプチン（登録商標）の存在にも依存を示さなかった（図２Ｂ）。これらデータは、ＨＥＲ２受容体の会合を介した標的化ＭＡＰ−ＣＰＴナノ粒子によるＢＴ−４７４細胞への受容体媒介取り込みが存在することを示す。非特異的流体相エンドサイトーシスを介して、標的化及び非標的化ＭＡＰ−ＣＰＴナノ粒子の細胞取り込みも生じた。
【０２９２】
実施例２９：インビトロ放出試験
短、中、長ＭＡＰ−ＣＰＴナノ粒子及び標的化ＭＡＰ−ＣＰＴナノ粒子からのＣＰＴの放出を評価するために実験を実施した。これら試験は、ｐＨ  ６．５、７、又は７．４の１×  ＰＢＳ中０．３２ｍｇ  ＣＰＴ／ｍＬ；３ｍｇ／ｍＬの低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、又は１００単位／ｍＬのブチリルコリンエステラーゼ（ＢＣＨＥ）、又はＬＤＬとＢＣＨＥとの組み合わせを含有する、ＢＡＬＢ／ｃマウス血漿、ヒト血漿、及びｐＨ  ７．４の１×  ＰＢＳを用いて実施した。
【０２９３】
９６ウェルプレートにピペッティングした培地を、平衡化するために２時間加湿オーブン内で３７℃にてインキュベートした。製剤を関連培地に混合し、オーブンに戻した。所定の時点でサンプルを採取し、直ちに、分析の時間まで−８０℃で冷凍した。ＢＡＬＢ／ｃマウス血漿及びヒト血漿における放出については、５％  ＣＯ２を含む３７℃の加湿オーブン内でインキュベートして、生理学的ｐＨレベルにおける血漿中でカルボン酸／重炭酸塩バッファ系、主なｐＨバッファ系を維持した。
【０２９４】
まず１０μＬのサンプルを１０μＬの０．１Ｎ  ＨＣｌと混合し、室温で３０分間インキュベートすることによって、コンジュゲートしていないＣＰＴの量を求めた。次いで、８０μＬのメタノールを添加し、タンパク質を沈殿させるために室温で３時間混合物をインキュベートした。この混合物を４℃で１０分間１４，０００ｇにて遠心分離し、上清を０．４５μｍのフィルタ（Ｍｉｌｌｅｘ−ＬＨ）で濾過し、メタノールで２０倍希釈し、１０μＬの得られた溶液をＨＰＬＣに注入した。（７．８分で）溶出したＣＰＴのピーク面積を対照と比較した。ＣＰＴの総量を測定するために、１０μＬのサンプルを６．５μＬの０．１Ｎ  ＮａＯＨと混合した。親ポリマーからＣＰＴを放出させるために、この溶液を１時間室温でインキュベートした。次いで、１０μＬの０．１Ｎ  ＨＣｌを添加して、カルボキシレートＣＰＴ形態をラクトン形態に変換した。次いで、７３．５μＬのメタノールを添加し、室温で３時間混合物をインキュベートした。次いで、サンプルを、上記の通り遠心分離し、処理した。全ＣＰＴ濃度とコンジュゲートしていないＣＰＴの濃度との差から、ポリマーに結合しているＣＰＴ濃度を求めた。
【０２９５】
短、中、及び長ＭＡＰ−ＣＰＴナノ粒子から、及び標的化ＭＡＰ−ＣＰＴナノ粒子からのＣＰＴの放出は、全て、一次速度式を示した。短、中、及び長ＭＡＰ−ＣＰＴナノ粒子からのＣＰＴの放出半減期は、試験した全ての条件において非常に類似していたが、標的化ＭＡＰ−ＣＰＴについてはより長い半減期が観察された（表４）。放出速度のｐＨへの強い依存が観察された。６．５から７．４にｐＨを上昇させたとき、短、中、及び長ＭＡＰ−ＣＰＴナノ粒子については、放出半減期が３３８時間から５８時間に短縮された。これらデータは、加水分解がＣＰＴの放出において重要な役割を果たしていることを示す。５９時間の放出半減期がＢＡＬＢ／ｃマウス血漿において観察されたが、短、中、及び長ＭＡＰ−ＣＰＴナノ粒子については、ヒト血漿において３８時間の著しく短い半減期が得られた。マウス血漿は、ヒト血漿よりも多くのエステラーゼ活性を有するが、ヒト血漿は、マウス血漿よりも多くの「脂肪」を含有することが知られている。したがって、ヒト血漿とマウス血漿との間の放出速度の差を理解するために、ＣＰＴの放出速度に対するエステラーゼ及び脂肪の寄与を個々に試験した。ブチリルコリンエステラーゼ（ＢＣＨＥ）は、マウス及びヒトの血漿中に存在し、放出速度に対するエステラーゼの寄与を試験するために用いた。放出速度に対する「脂肪」の寄与を試験するために、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）を選択した。これら成分は、ＰＢＳ（ｐＨ  ７．４）中で構成した。ＢＣＨＥの存在は、放出速度に影響を与えないことが見出された（短、中、及び長ＭＡＰ−ＣＰＴナノ粒子については、ＰＢＳ（ｐＨ  ７．４）中５８時間と比べて６１時間の半減期）。しかし、ＬＤＬの添加は、放出速度を劇的に増大させた。この効果は、競合疎水性相互作用によるナノ粒子の破壊に起因する可能性が高い。したがって、「脂肪」の存在によるナノ粒子の破壊、及びその後の加水分解によるＣＰＴ開裂は、ＭＡＰ−ＣＰＴナノ粒子からのＣＰＴの放出の別の主な機序であると思われる。ハーセプチン（登録商標）標的化ＭＡＰ−ＣＰＴナノ粒子からのインビトロ放出は、非標的化バージョンよりも長い半減期を示す。ｐＩ  ９．２を有するハーセプチン（登録商標）の存在が、静電相互作用により負に帯電しているナノ粒子の安定性を増大させ、それによって、競合疎水性相互作用の一部からナノ粒子を保護することが可能である。
【０２９６】
【表４】
2018070626.tif 000059
略語：ＰＢＳ、リン酸緩衝生理食塩水；ＬＤＬ、低密度リポタンパク質；ＢＣＨＥ、ブチリルコリンエステラーゼ。ａＰＢＳ、ｐＨ  ７．４、３ｍｇ／ｍＬのＬＤＬを含有ｂＰＢＳ、ｐＨ  ７．４、１００単位／ｍＬのＢＣＨＥを含有ｃＰＢＳ、ｐＨ  ７．４、３ｍｇ／ｍＬのＬＤＬ及び１００単位／ｍＬのＢＣＨＥを含有
【０２９７】
実施例３０：細胞毒性アッセイ
中ＭＡＰ、ニトロＰＢＡ−ＰＥＧ、ＣＰＴ、中ＭＡＰ−ＣＰＴナノ粒子、標的化ＭＡＰ−ＣＰＴナノ粒子、及びハーセプチン（登録商標）のインビトロ細胞毒性を、２つのＨＥＲ２＋乳癌細胞株（ＢＴ−４７４、ＳＫＢＲ−３）及び２つのＨＥＲ２−乳癌細胞株（ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）において評価した（表５）。これら試験では、５％  ＣＯ２を含む加湿オーブン内で３７℃にて細胞を維持した。ＢＴ−４７４、ＭＣＦ−７、ＳＫＢＲ−３、及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株を、それぞれ、ＲＰＭＩ−１６４０培地、ダルベッコ変法イーグル培地、マッコイ５Ａ変法培地、及びダルベッコ変法イーグル培地（全て１０％ウシ胎仔血清を添加）中でインキュベートした。１ウェル当たり３，０００個の細胞を９６ウェルプレートにプレーティングした。２４時間後、培地を除去し、様々な濃度の中ＭＡＰ、ニトロＰＢＡ−ＰＥＧ、ＣＰＴ、中ＭＡＰ−ＣＰＴナノ粒子、標的化ＭＡＰ−ＣＰＴナノ粒子、又はハーセプチン（登録商標）を含有する新鮮培地と交換した。７２時間インキュベートした後、製剤を新鮮培地と交換し、１ウェル当たり２０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ細胞増殖アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加した。これを５％  ＣＯ２を含む３７℃の加湿オーブン内で２時間インキュベートした後、４９０ｎｍで吸光度を測定した。未処理細胞を含有するウェルを対照として用いた。
【０２９８】
中ＭＡＰ及びニトロＰＢＡ−ＰＥＧから、それぞれ、５００μＭ及び１０００μＭ（試験した最高濃度）超のＩＣ５０値が得られ、これは、最低限の毒性を示す。ＣＰＴ、中ＭＡＰ−ＣＰＴナノ粒子、及び標的化ＭＡＰ−ＣＰＴナノ粒子のＩＣ５０濃度は、ＣＰＴの含量に基づいていた。ＣＰＴは、中ＭＡＰ−ＣＰＴナノ粒子及び標的化ＭＡＰ−ＣＰＴナノ粒子から徐々に放出されることに留意されたい（インビトロ放出試験を参照）。更に、エンドソームの酸性の性質に起因して、細胞によるナノ粒子の取り込みにより、放出時間が長くなる。これら要因は、ＣＰＴに比べて中ＭＡＰ−ＣＰＴナノ粒子及び標的化ＭＡＰ−ＣＰＴナノ粒子について観察されたＩＣ５０値がより高いことに寄与する（表５）。ＨＥＲ２＋細胞株では、標的化ＭＡＰ−ＣＰＴナノ粒子からは、ＭＡＰ−ＣＰＴ単独に比べてより低いＩＣ５０値が得られたが、ＨＥＲ２−細胞株では、標的化は、ＩＣ５０に影響を与えなかった。ＢＴ−４７４は、ＣＰＴに対して、したがって、中ＭＡＰ−ＣＰＴナノ粒子に対して最も耐性の高い細胞株であった。０．００１〜０．５μＭの濃度のハーセプチンをＢＴ−４７４又はＳＫＢＲ−３細胞に添加すると、未処理対照に比べて約６０％の一定の細胞生存率が得られた。これら細胞株についてこの濃度範囲にわたって真のＩＣ５０値が存在しないことが既に観察されている（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６８，９２８０〜９２９０（２００８））。０．５μＭ以下のハーセプチン濃度におけるＨＥＲ２−細胞株において効果は観察されなかった。
【０２９９】
【表５】
2018070626.tif 000060
ａ値無し、０．００１〜０．５μＭの濃度範囲にわたってＩＣ５０値が得られなかった。
【０３００】
実施例３１：薬物動態試験
１０ｍｇ／ｋｇ（ＣＰＴ基準）の注射における短、中、長ＭＡＰ−ＣＰＴナノ粒子及び標的化ＭＡＰ−ＣＰＴナノ粒子の血漿薬物動態試験を、メスのＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて実施した（図１８）。これら試験では、０．９重量％  ＮａＣｌ（非標的化ナノ粒子）又はＰＢＳ（標的化ＭＡＰ−ＣＰＴナノ粒子）中で配合したナノ粒子を、１２〜１６週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウスの尾静脈へのボーラス投与を介して投与した。所定の時点で、伏在静脈の出血を介して血液回収チューブ（Ｍｉｃｒｏｖｅｔｔｅ  ＣＢ  ３００  ＥＤＴＡ，Ｓａｒｓｔｅｄｔ）に血液を回収した。直ちにサンプルを４℃で１５分間１０，０００ｇにて遠心分離し、上清を除去し、分析の時間まで−８０℃で保管した。コンジュゲートしていない及びポリマーに結合しているＣＰＴの分析は、以下の通りであった。まず１０μＬのサンプルを１０μＬの０．１Ｎ  ＨＣｌと混合し、室温で３０分間インキュベートすることによって、コンジュゲートしていないＣＰＴの量を求めた。次いで、８０μＬのメタノールを添加し、タンパク質を沈殿させるために室温で３時間混合物をインキュベートした。この混合物を４℃で１０分間１４，０００ｇにて遠心分離し、上清を０．４５μｍのフィルタ（Ｍｉｌｌｅｘ−ＬＨ）で濾過し、メタノールで２０倍希釈し、１０μＬの得られた溶液をＨＰＬＣに注入した。（７．８分で）溶出したＣＰＴのピーク面積を対照と比較した。ＣＰＴの総量を測定するために、１０μＬのサンプルを６．５μＬの０．１Ｎ  ＮａＯＨと混合した。親ポリマーからＣＰＴを放出させるために、この溶液を１時間室温でインキュベートした。次いで、１０μＬの０．１Ｎ  ＨＣｌを添加して、カルボキシレートＣＰＴ形態をラクトン形態に変換した。次いで、７３．５μＬのメタノールを添加し、室温で３時間混合物をインキュベートした。次いで、サンプルを、上記の通り遠心分離し、処理した。全ＣＰＴ濃度とコンジュゲートしていないＣＰＴの濃度との差から、ポリマーに結合しているＣＰＴ濃度を求めた。非コンパートメントモデリングソフトウェアＰＫ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  ２．０（Ｓｕｍｍｉｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（Ｍｏｎｔｒｏｓｅ，ＣＯ））を、薬物動態データ解析に用いた。全ての動物をＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅに従って処理し、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認された。
【０３０１】
全てのナノ粒子について、ポリマーに結合しているＣＰＴは、速再分布相（α）及び長排出相（β）を有する二相プロファイルを示した（図１８Ａ）。中及び長ＭＡＰ−ＣＰＴナノ粒子についての排出相は、それぞれ、１６．６及び１７．６時間の半減期を有する特に長いものであり、それぞれ、２２９８及び３６３６μｇ＊ｈ／ｍＬの高い曲線下面積（ＡＵＣ）値が得られた。更に、これらは、低体積の分布及びクリアランス速度を示した。注射の２４時間後、中ＭＡＰ−ＣＰＴナノ粒子の注入量の１１．３％、及び長ＭＡＰ−ＣＰＴナノ粒子の注入量の２０．５％が、ポリマーに結合しているＣＰＴとして血漿中をまだ循環していた。対照的に、１０ｍｇ／ｋｇのＣＰＴを単独で注入したマウスは、速いクリアランスを示し、ＡＵＣは、わずか１．６μｇ＊ｈ／ｍＬであり、８時間後に注入量の０．０１％が循環中に残っていた。中ＭＡＰ−ＣＰＴナノ粒子の標的化は、再分布相を増大させ、排出相を２１．２時間に延長することによって薬物動態プロファイルに影響を与え、ＡＵＣ値は２７６６μｇ＊ｈ／ｍＬと高かった。全てのナノ粒子について血漿中の結合していないＣＰＴの量は、全ての時点で低かった（図１８Ｂ）。
【０３０２】
実施例３２：ヌードマウスにおける最大耐量（ＭＴＤ）の決定
メスのＮＣｒヌードマウスにおいてＭＴＤ値を求め、体重を１５％未満しか減少させず、処理に関連して死亡することのない最高用量として定義した。これら実験では、１２週齢のメスのＮＣｒヌードマウスを、それぞれ５匹のマウスを含む１３個の群に無作為に分けた。２００ｍｇ／ｋｇの中ＭＡＰ又はニトロＰＢＡ−ＰＥＧ、１０、１５、又は２０ｍｇ／ｋｇ（ＣＰＴ基準）の短ＭＡＰ−ＣＰＴナノ粒子、８、１０、又は１５ｍｇ／ｋｇ（ＣＰＴ基準）の中ＭＡＰ−ＣＰＴナノ粒子、５、８、又は１０ｍｇ／ｋｇ（ＣＰＴ基準）の長ＭＡＰ−ＣＰＴナノ粒子、及び８又は１０ｍｇ／ｋｇ（ＣＰＴ基準）の標的化ＭＡＰ−ＣＰＴナノ粒子の製剤を、尾静脈注射を介して０日目及び７日目に投与した。ＰＢＳ（ｐＨ  ７．４）中で配合した標的化ＭＡＰ−ＣＰＴを除いて、全ての注射を０．９ｗ／ｖ％生理食塩水中で配合した。マウスの体重及び健康を記録し、処理の開始後２週間、毎日モニタリングした。ＭＴＤは、体重を１５％未満しか減少させず、処理に関連して死亡することのない最高用量として定義した。ＭＴＤについての基準を超えたとき又は試験の最後に、動物をＣＯ２窒息によって安楽死させた。
【０３０３】
中ＭＡＰ、ニトロＰＢＡ−ＰＥＧ、短、中、及び長ＭＡＰ−ＣＰＴ、並びに標的化ＭＡＰ−ＣＰＴで処理したマウスの体重を量り、０日目及び７日目に２回毎週投与した後の健康についてモニタリングした（表６）。マウスの体重及び健康は、高用量の中ＭＡＰ又はニトロＰＢＡ−ＰＥＧの処理によって影響を受けず、これは、これらポリマー成分の最低限の毒性を示す。ＣＰＴを含有する群では、各処理の３〜５日間後に最大体重減少がみられた。群の大部分は、減少した体重が元に戻った。体重の減少が続き、平均１５％を超えた場合、試験を終わらせた。１５ｍｇ／ｋｇの中ＭＡＰ−ＣＰＴ、及び１０ｍｇ／ｋｇの長ＭＡＰ−ＣＰＴで処理した群のうちの数匹のマウスは、下痢を示し、弱っているようにみえた。全ての他のマウスは、健康そうにみえた。ＭＴＤ値は、それぞれ、短、中、長ＭＡＰ−ＣＰＴ、並びに標的化ＭＡＰ−ＣＰＴについて２０、１０、８、及び８ｍｇ／ｋｇ（ＣＰＴ基準）であることが見出された。
【０３０４】
【表６】
2018070626.tif 000061
ａＭＡＰ−ＣＰＴを含有する全ての群は、ｍｇ  ＣＰＴ／ｋｇに基づいている。ｂ最大体重減少率（％）ｃ体重減少が１５％を超えたため動物を処分した。
【０３０５】
実施例３３：ヌードマウスにおける体内分布
マウスにおける標的化ナノ粒子の体内分布を評価するために、７週齢のＮＣｒヌードマウスに１７β−エストラジオールペレットを皮下移植した。２日間後、ＲＰＭＩ−１６４０培地に懸濁しているＢＴ−４７４癌細胞を、１０００万細胞／動物で右前側腹部に皮下注射した。腫瘍の平均サイズが２６０ｍｍ３に達した１日後に処理を開始した。動物を１群当たりマウス６匹の２つの群に無作為化し、５ｍｇ  ＣＰＴ／ｋｇのＭＡＰ−ＣＰＴナノ粒子（ＰＢＳ、ｐＨ  ７．４中）、又は５ｍｇ  ＣＰＴ／ｋｇ及び２９ｍｇハーセプチン（登録商標）／ｋｇの標的化ＭＡＰ−ＣＰＴナノ粒子（ＰＢＳ、ｐＨ  ７．４中）で尾静脈への静脈内注射を介して処理した。４時間及び２４時間後、伏在静脈の出血を介して各群３匹の動物から血液を回収した。次いで、ＣＯ２窒息によって動物を安楽死させ、ＰＢＳで灌流した。腫瘍、肺、心臓、脾臓、腎臓、及び肝臓を摘出し、２枚の等しいサイズの切片を作製した。１枚の切片をＴｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ（登録商標）ＯＣＴ（Ｓａｋｕｒａ）に包埋し、もう１枚をエッペンドルフチューブに回収し、両方を処理時間まで−８０℃で直ちに冷凍した。
【０３０６】
器官の重量を量り、０．６４ｃｍ（１／４インチ）のセラミック球（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｓｏｌｏｎ，Ｏｈｉｏ）を添加したＬｙｓｉｎｇ  Ｍａｔｒｉｘ  Ａホモジナイザーチューブにそれぞれを１００ｍｇ入れた。１ｍＬのＲＩＰＡ溶解バッファ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加し、ＦａｓｔＰｒｅｐ（登録商標）−２４ホモジナイザー（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｓｏｌｏｎ，Ｏｈｉｏ）を用いて６ｍ／ｓで３０秒間組織をホモジナイズした。これを３回繰り返し、各ラウンド間に１分間氷上で冷却した。次いで、サンプルを４℃で１５分間１４，０００ｇで遠心分離した。まず１０μＬの上清を１０μＬの０．１Ｎ  ＨＣｌと混合し、室温で３０分間インキュベートすることによって、コンジュゲートしていないＣＰＴの量を求めた。次いで、８０μＬのメタノールを添加し、タンパク質を沈殿させるために室温で３時間混合物をインキュベートした。この混合物を４℃で１０分間１４，０００ｇにて遠心分離し、上清を０．４５μｍのフィルタ（Ｍｉｌｌｅｘ−ＬＨ）で濾過し、１０μＬの得られた混合物をＨＰＬＣに注入した。（７．８分で）溶出したＣＰＴのピーク面積を対照と比較した。ＣＰＴの総量を測定するために、１０μＬのサンプルを６．５μＬの０．１Ｎ  ＮａＯＨと混合した。親ポリマーからＣＰＴを放出させるために、この溶液を１時間室温でインキュベートした。次いで、１０μＬの０．１Ｎ  ＨＣｌを添加して、カルボキシレートＣＰＴ形態をラクトン形態に変換した。次いで、７３．５μＬのメタノールを添加し、室温で３時間混合物をインキュベートした。次いで、サンプルを、上記の通り遠心分離し、処理した。
【０３０７】
腫瘍、心臓、肝臓、脾臓、腎臓、及び肺１グラム当たりの全ＣＰＴの平均注入量（ＩＤ）率（％）を図１９Ａに示す。投与の４時間後、それぞれ、ＭＡＰ−ＣＰＴナノ粒子及び標的化ＭＡＰ−ＣＰＴナノ粒子で処理したマウスにおける腫瘍１グラム当たり５．３及び５．２％  ＩＤの全ＣＰＴが存在していた。処理の２４時間後、ＭＡＰ−ＣＰＴナノ粒子で処理したマウスの腫瘍１グラム当たり２．６％ＩＤの全ＣＰＴが残っていたが、標的化ＭＡＰ−ＣＰＴナノ粒子を投与したマウスの腫瘍１グラム当たり３．２％  ＩＤの全ＣＰＴがみられた。これらデータは、非標的化バージョンと本質的に同じサイズ及び表面電荷の標的化ナノ粒子が、非標的化バージョンよりも腫瘍の局在化を増大させることなく、他者により報告されている観察結果と一致していることを示す。ＭＡＰ−ＣＰＴナノ粒子及び標的化ＭＡＰ−ＣＰＴナノ粒子で処理した動物では、心臓、肝臓、腎臓、及び肺において類似するＣＰＴ分布が得られた。しかし、２４時間において標的化ＭＡＰ−ＣＰＴは、非標的化バージョンに対して脾臓に比較的多量の全ＣＰＴが蓄積していた。この効果は、マウスにおけるヒト化抗体について既に観察されている。
【０３０８】
図１９Ｂは、腫瘍、心臓、肝臓、脾臓、腎臓、及び肺の各器官におけるコンジュゲートしていないＣＰＴの平均割合を示す。心臓、肝臓、脾臓、腎臓、及び肺におけるコンジュゲートしていないＣＰＴの割合は、４時間及び２４時間のいずれでも低く、これは、遊離ＣＰＴがこれら器官から速やかにクリアランスされることを示す。２４時間の腫瘍では、４時間と比べてＭＡＰ−ＣＰＴ及び標的化ＭＡＰ−ＣＰＴナノ粒子の両方についてコンジュゲートしていないＣＰＴの割合が著しく高かった。腫瘍内における遊離ＣＰＴの滞留は、ＣＰＴの細胞内蓄積を示唆する。標的化ナノ粒子は、４時間及び２４時間の両方で、マウスの腫瘍において非標的化ナノ粒子よりもわずかに高いコンジュゲートしていないＣＰＴの割合を示す。
【０３０９】
血漿中のＣＰＴの合計濃度及び血漿中のコンジュゲートしていない全ＣＰＴの割合は、ＭＡＰ−ＣＰＴ及び標的化ＭＡＰ−ＣＰＴナノ粒子の両方について類似していた（図１９Ｃ）。４時間後、それぞれ、ＭＡＰ−ＣＰＴ及び標的化ＭＡＰ−ＣＰＴナノ粒子について血漿中に１７及び２０μｇ／ｍＬの全ＣＰＴが残っていた。２４時間後、血漿中に残る全ＣＰＴの量は、１２μｇ／ｍＬでＭＡＰ−ＣＰＴ及び標的化ＭＡＰ−ＣＰＴナノ粒子の両方について同じであった。血漿中のコンジュゲートしていない全ＣＰＴの割合は、全ての条件について３％未満であり、これは、コンジュゲートしていないＣＰＴが血漿からわずかに放出され、速やかにクリアランスされることを示す（図１９Ｄ）。
【０３１０】
実施例３３：標的化ナノ粒子による腫瘍の処理
ＢＴ−４７４腫瘍を有するＮＣｒヌードマウスを、ＭＡＰ−ＣＰＴ（５ｍｇ  ＣＰＴ／ｋｇ）又は標的化ＭＡＰ−ＣＰＴ（５ｍｇ  ＣＰＴ／ｋｇ、２９ｍｇハーセプチン／ｋｇ）で処理した。４及び２４時間後、マウスを安楽死させ、腫瘍を摘出し、クリアスタットを用いて２０〜３０μｍの厚さの切片を作製した。腫瘍切片をＳｕｐｅｒｆｒｏｓｔ  Ｐｌｕｓ  ｓｌｉｄｅｓ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｈａｍｐｔｏｎ，ＮＨ）上に置き、処理時間まで−８０℃で保管した。スライドを解凍し、組織切片を、１０％ホルマリン溶液で１５分間スライド上に直接固定した。次いで、スライドを、それぞれ５分間ＰＢＳで３回洗浄し、５％ヤギ血清ブロッキングバッファ中で１時間ブロッキングした。ＣＰＴは、天然に、４４０ｎｍで発光する蛍光性である。ＭＡＰの位置を同定するために、ＭＡＰ内のＰＥＧを１４μｇ／ｍＬの内部ＰＥＧ単位を認識するラット抗ＰＥＧ一次抗体で染色し、一晩４℃でインキュベートした。この後、ＰＢＳで３回洗浄し、２μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ヤギ抗ラットＩｇＭ二次抗体と共に１時間インキュベートした。次いで、スライドをＰＢＳで３回洗浄し、２μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６３３ヤギ抗ヒトＩｇＧ二次抗体と共に１時間インキュベートして、ハーセプチン（登録商標）を可視化した。スライドをＰＢＳで更に３回洗浄し、Ｐｒｏｌｏｎｇ  Ｇｏｌｄ  Ａｎｔｉｆａｄｅ試薬を載せ、イメージングの時間まで４℃で保管した。６３×Ｐｌａｎ−Ｎｅｏｆｌｕａｒ  ｏｉｌ対物レンズを用いて、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０  Ｍｅｔａ共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で画像を取得した。７２０ｎｍにおける二光子励起（発光フィルタＢＰ  ３９０〜４６５ｎｍ）を用いてＣＰＴを検出した。４８８ｎｍ（発光フィルタＬＰ  ５３０）及び６３３ｎｍ（発光フィルタＢＰ  ６４５〜７００ｎｍ）における励起を用いて、それぞれ、ＰＥＧ及びハーセプチンを検出した。全てのレーザー及びゲイン設定は、イメージングの最初に設定し、変更しなかった。Ｚｅｉｓｓ  ｌｓｍ画像ブラウザで画像解析を実施した。
【０３１１】
図２０Ａは、４時間後のＭＡＰ−ＣＰＴナノ粒子で処理したマウスの腫瘍切片を示す。ＣＰＴシグナルは、分散していた。ＣＰＴ及びＭＡＰのシグナルは、マージ画像において共局在化しているようにみえた。注射の２４時間後、ＣＰＴシグナルが斑点状の形態で蓄積していた（図２０Ｂ）。マージ画像は、ＣＰＴ及びＭＡＰの共局在化を示唆する。標的化ＭＡＰ−ＣＰＴナノ粒子で処理したマウスでは、ＣＰＴの蓄積を示す斑点が、処理の４及び２４時間後に観察された（図２０Ｃ及び２０Ｄ）。マージ画像では、ＣＰＴ及びＭＡＰシグナルが共局在化していた。標的化ＭＡＰ−ＣＰＴナノ粒子におけるハーセプチンの存在は、非標的化バージョンにおける弱いバックグラウンドシグナルに比べて、ハーセプチンチャネルにおける強い青色シグナルによって示される。
【０３１２】
実施例３３：ヌードマウスにおける抗腫瘍効果試験
ＢＴ−４７４は、カンプトセシンを含む抗癌薬に対して最も耐性の高い乳癌の１つである。ヌードマウスにおける腫瘍の成長を促進するために、ＢＴ−４７４腫瘍細胞を移植する２日前に、７週齢のＮＣｒヌードマウスに１７β−エストラジオールペレットを移植した。０日目（移植の５日後）に、各群の腫瘍サイズは平均２５０ｎｍであった。１日目に処理を開始した。動物を各群６〜８匹のマウスを含む９つの群に無作為に分け、１ｍｇ若しくは８ｍｇ／ｋｇのＭＡＰ−ＣＰＴナノ粒子（ＣＰＴ基準、ＰＢＳ（ｐＨ  ７．４）中）、８ｍｇ／ｋｇのＣＰＴ（２０％  ＤＭＳＯ、２０％  ＰＥＧ  ４００、３０％エタノール、及び３０％  １０ｍＭ  ｐＨ  ３．５リン酸に溶解）、８０ｍｇ／ｋｇのイリノテカン（５ｗ／ｖ％デキストロース溶液、Ｄ５Ｗ中）、２．９若しくは５．９ｍｇ／ｋｇのハーセプチン（登録商標）（ＰＢＳ（ｐＨ  ７．４）中）、０．５ｍｇ  ＣＰＴ／ｋｇ及び２．９ｍｇハーセプチン（登録商標）／ｋｇ若しくは１ｍｇ  ＣＰＴ／ｋｇ及び５．９ｍｇハーセプチン（登録商標）／ｋｇの標的化ＭＡＰ−ＣＰＴナノ粒子（ＰＢＳ（ｐＨ  ７．４）中）、又は生理食塩水で処理した。全ての処理は、新たに調製し、尾静脈への静脈内注射を介して投与した。注射は、マウスの体重２０ｇ当たり１５０μＬで標準化した。ハーセプチン（登録商標）を含有する処理は、２週間にわたって週１回行い、全ての他の群には、３週間にわたって週１回行った。カリパス測定を用いて週３回腫瘍サイズを記録し（長さ×幅２／２）、動物の健康を継続的にモニタリングした。腫瘍体積が１０００ｍｍ３を超えたら、動物を安楽死させた。処理開始の６週間後、ＣＯ２窒息によって動物を安楽死させた。この試験の結果を図２１及び表７に提示する。
【０３１３】
生理食塩水を投与した対照群の腫瘍は、急速に成長した（図２１）。２８日後、８匹のマウスのうちの５匹は、１０００ｍｍ３のサイズ限界を超える腫瘍を有していた。この群の全ての動物をこのとき安楽死させた。
【０３１４】
ＣＰＴ（８ｍｇ／ｋｇ）で処理した群では、対照群に比べて腫瘍は阻害されなかった（Ｐ＞０．０５）。それぞれ、９日目及び１６日目に１匹及び３匹の処理に関連する死亡が記録されたのに加えて、２８日目に腫瘍のサイズ限界を超えたため４匹を安楽死させた。試験の最後まで生存していた動物はいなかった。
【０３１５】
８０ｍｇ／ｋｇのイリノテカンで処理したマウスは、対照群に比べて有意な腫瘍阻害は示さなかった（Ｐ＞０．０５）。１１日目に１匹の処理に関連する死亡が生じた。試験の最後までに腫瘍サイズは平均５７５ｍｍ３に達した。
【０３１６】
８ｍｇ  ＣＰＴ／ｋｇのＭＡＰ−ＣＰＴナノ粒子を投与した動物は、対照群に比べて高度に有意な腫瘍阻害を示した（Ｐ＜０．０１）。試験の最後までに、平均腫瘍サイズは６３ｍｍ３まで減少し、処理した８匹のマウスのうちの３匹がゼロまで退行した腫瘍サイズを有していた。８ｍｇ  ＣＰＴ／ｋｇのＭＡＰ−ＣＰＴで処理した腫瘍を有しないＮＣｒヌードマウスを用いたＭＴＤ試験において死亡は生じなかったが、２１日目にこの試験における体重減少が原因で１匹が死亡した。これは、この試験における腫瘍量の増加及び／又はこの試験で用いたマウスが７週齢であったことが原因である可能性があるので、ＭＴＤ試験では、１２週齢のマウスを用いた。
【０３１７】
５．９ｍｇ／ｋｇのハーセプチン（登録商標）で処理した動物は、対照群に比べて高度に有意な腫瘍阻害を示した（Ｐ＜０．０１）。処理の１１日目に、処理した８匹の動物のうちの７匹は、ゼロに退行した腫瘍を有していた。しかし、試験の最後までに、退行した腫瘍のうちの２つが再発して、腫瘍体積がゼロの動物は合計５匹になり、群の平均腫瘍体積は６０ｍｍ３になった（図２２）。１ｍｇ  ＣＰＴ／ｋｇのＭＡＰ−ＣＰＴナノ粒子で処理したマウスは、抗腫瘍効果が観察されなかったので、早期に終了した。それにもかかわらず、５．９ｍｇ／ｋｇのハーセプチン（登録商標）を、１ｍｇ／ｋｇの低ＣＰＴ用量のＭＡＰ−ＣＰＴナノ粒子（５．９ｍｇハーセプチン（登録商標）／ｋｇ及び１ｍｇ  ＣＰＴ／ｋｇの標的化ＭＡＰ−ＣＰＴナノ粒子）にニトロＰＢＡ−ＢＡリンカーを介して標準化剤として添加したとき、処理の９日目に全ての腫瘍がゼロに退行し、試験の最後までゼロのままであった（図２２）。３７日目に１匹の処理に関連しない死亡が生じた。この結果は、対照群に比べて高度に有意である（Ｐ＜０．０１）。これら３つの群において観察された結果の組み合わせは、ハーセプチン（登録商標）の固有活性に加えてハーセプチン（登録商標）標準化剤を添加することによってＭＡＰ−ＣＰＴナノ粒子の効果が改善されたことを示す。
【０３１８】
２．９ｍｇ／ｋｇのハーセプチン（登録商標）で処理した動物では、２匹の動物が、試験の最後までにゼロに退行した腫瘍を有していた。しかし、平均腫瘍サイズは、試験の開始から２７８ｍｍ３に増加した。この結果は、対照群に比べて有意である（０．０１≦Ｐ≦０．０５）。０．５ｍｇ  ＣＰＴ／ｋｇ及び２．９ｍｇハーセプチン（登録商標）／ｋｇを含有する標的化ＭＡＰ−ＣＰＴナノ粒子で動物を処理したとき、２つの腫瘍がゼロに退行した。平均腫瘍サイズは、試験の最後までに１４１ｍｍ３に減少した。この結果は、対照群に比べて高度に有意である（Ｐ＜０．０１）。これら結果は、腫瘍阻害における標準化の利益を更に示唆する。
【０３１９】
１７β−エストラジオールペレットの移植の５週間後、処理群に関係なく数匹のマウスが、膀胱膨隆及び腹部膨満を有することが観察された。これは、無胸腺ヌードマウスにおいて水腎症及び尿の貯留を引き起こす１７β−エストラジオールペレットの使用によるものである可能性があった。処理の６週間後、状態は悪化し、より多くのマウスが膀胱膨隆及び腹部膨満を発現していることが観察されたので、動物を安楽死させ、実験を終了した。
【０３２０】
【表７】
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ａＮｂｅｇｉｎは、試験の開始時における動物の数であり、Ｎｅｎｄは、試験の最後まで生存していた動物の数である。ｂＮＴＲＤは、処理に関連する死亡数であり、ＮＮＴＲＤは、処理に関連していない死亡数であり、Ｎｅｕｔｈａｎは、１０００ｍｍ３の腫瘍のサイズ限界を超えたために安楽死させた動物の数である。ｃＮｒｅｇ  ｔｏ  ｚｅｒｏは、試験の最後にゼロに退行していた腫瘍を有する動物の数である。
【０３２１】
上記実施例は、本開示の粒子、組成物、系、及び方法の実施形態を作製及び使用する方法に関する完全な開示及び説明を当業者に与えるために提供され、本発明者がその開示であるとみなす範囲を限定することを意図するものではない。当業者に明らかな本開示を実施するための上記方法の変形は、以下の特許請求の範囲の範囲内であることを意図する。本明細書に言及した全ての特許及び刊行物は、本開示が属する分野の当業者の技能レベルを示すものである。本開示に引用した全ての参照文献は、各参照文献の全文が参照により個々に援用されている場合と同程度、参照により援用される。
【０３２２】
背景技術、発明の概要、発明の詳細な説明、及び実施例に引用した各文書の全開示（特許、特許出願、論文、要約、研究室マニュアル、書籍、又は他の開示を含む）は、参照により本明細書に援用される。
【０３２３】
本開示は、特定の組成物又は生体系には限定されず、無論変動し得ることを理解すべきである。本明細書で用いる用語は、特定の実施形態を説明する目的のみのために用いられており、制限的な意図ではないということもまた理解されねばならない。本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、その内容について別段の明確な指示がない限り、複数の指示被験体を包含する。用語「複数」とは、特に明示的に指示しない限り、２つ以上の指示対象を含む。別途記載のない限り、本明細書で使用される全ての技術及び科学用語は、本発明の属する技術分野の業者により一般に理解される意味と同様の意味を持つ。
【０３２４】
本明細書に記載のものに類似又は等価な任意の方法及び材料を、本明細書に記載する適切な材料及び方法の具体例を試験するための実施において用いてよい。
【０３２５】
本開示の多数の実施形態が記載されている。それにもかかわらず、本開示の趣旨及び範囲を逸脱することなく、様々な変形を行い得ることが理解されるであろう。したがって、他の実施形態は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年12月25日(2017.12.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリオール含有ポリマーを含む標的化ナノ粒子であって、単一の標的リガンドにコンジュゲートしている、標的化ナノ粒子。
【外国語明細書】
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