(57)【要約】      （修正有）【課題】トランスサイレチン（ＴＴＲ）関連疾患を治療または予防するＲＮＡｉ剤と前記ＲＮＡｉ剤の使用方法の提供。【解決手段】トランスサイレチン（ＴＴＲ）をコードするｍＲＮＡの一部に相補的な領域のアンチセンス鎖と、少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートしているセンス鎖とを、含む前記二本鎖ＲＮＡｉ剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含む二本鎖ＲＮＡｉ剤であって、前記アンチセンス鎖が、トランスサイレチン（ＴＴＲ）をコードするｍＲＮＡの一部に相補的な領域を含み、前記各鎖が、約１４〜約３０のヌクレオチドを有し、前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩ）によって表され：
センス鎖：５’ｎｐ−Ｎａ−（ＸＸＸ）ｉ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎｂ−（ＺＺＺ）ｊ−Ｎａ−ｎｑ３’
アンチセンス鎖：３’ｎｐ’−Ｎａ’−（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ−Ｎｂ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ’−（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ−Ｎａ’−ｎｑ’５’
（ＩＩＩ）
式中、
ｉ、ｊ、ｋ、およびｌはそれぞれ独立して、０または１であり；
ｐ、ｐ’、ｑ、およびｑ’はそれぞれ独立して、０〜６であり；
各ＮａおよびＮａ’は独立して、修飾されている、修飾されていない、またはこれらの組み合わせである０〜２５のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、前記各配列が、少なくとも２つの異なって修飾されたヌクレオチドを含み；
各ＮｂおよびＮｂ’は独立して、修飾されている、修飾されていない、またはこれらの組み合わせである０〜１０のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
各ｎｐ、ｎｐ’、ｎｑ、およびｎｑ’は独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し；
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、およびＺ’Ｚ’Ｚ’はそれぞれ独立して、３つの連続したヌクレオチドにおける３つの同一の修飾からなる１つのモチーフを表し；
Ｎｂの修飾が、Ｙの修飾とは異なり、Ｎｂ’の修飾が、Ｙ’の修飾とは異なり；かつ
前記センス鎖が、少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートしている、二本鎖ＲＮＡｉ剤。
【請求項２】
ｉが１である；ｊが１である；またはｉとｊの両方が１である、請求項１に記載のＲＮＡｉ剤。
【請求項３】
ｋが１である；ｌが１である；またはｋとｌの両方が１である、請求項１に記載のＲＮＡｉ剤。
【請求項４】
ＸＸＸがＸ’Ｘ’Ｘ’に相補的であり、ＹＹＹがＹ’Ｙ’Ｙ’に相補的であり、かつＺＺＺがＺ’Ｚ’Ｚ’に相補的である、請求項１に記載のＲＮＡｉ剤。
【請求項５】
前記ＹＹＹモチーフが、前記センス鎖の切断部位またはその近傍に存在する、請求項１に記載のＲＮＡｉ剤。
【請求項６】
前記Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフが、前記アンチセンス鎖の５’末端から１１位、１２位、および１３位に存在する、請求項１に記載のＲＮＡｉ剤。
【請求項７】
Ｙ’が２’−Ｏ−メチルである、請求項６に記載のＲＮＡｉ剤。
【請求項８】
前記式（ＩＩＩ）が式（ＩＩＩａ）として表され：
センス鎖：５’ｎｐ−Ｎａ−ＹＹＹ−Ｎｂ−ＺＺＺ−Ｎａ−ｎｑ３’
アンチセンス鎖：３’ｎｐ’−Ｎａ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ’−Ｚ’Ｚ’Ｚ’−Ｎａ’ｎｑ’５’
（ＩＩＩａ）
式中、各ＮｂおよびＮｂ’は独立して、１〜５の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表している、請求項１に記載のＲＮＡｉ剤。
【請求項９】
前記式（ＩＩＩ）が式（ＩＩＩｂ）として表され：
センス鎖：５’ｎｐ−Ｎａ−ＸＸＸ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎａ−ｎｑ３’
アンチセンス鎖：３’ｎｐ’−Ｎａ’−Ｘ’Ｘ’Ｘ’−Ｎｂ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎａ’−ｎｑ’５’
（ＩＩＩｂ）
式中、各ＮｂおよびＮｂ’は独立して、１〜５の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表している、請求項１に記載のＲＮＡｉ剤。
【請求項１０】
前記式（ＩＩＩ）が式（ＩＩＩｃ）として表され：
センス鎖：５’ｎｐ−Ｎａ−ＸＸＸ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎｂ−ＺＺＺ−Ｎａ−ｎｑ３’
アンチセンス鎖：３’ｎｐ’−Ｎａ’−Ｘ’Ｘ’Ｘ’−Ｎｂ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ’−Ｚ’Ｚ’Ｚ’−Ｎａ’−ｎｑ’５’
（ＩＩＩｃ）
式中、各ＮｂおよびＮｂ’は独立して、１〜５の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各ＮａおよびＮａ’は独立して、２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表している、請求項１に記載のＲＮＡｉ剤。
【請求項１１】
二重鎖領域が、１５〜３０のヌクレオチド対の長さである、請求項１に記載のＲＮＡｉ剤。
【請求項１２】
二重鎖領域が、１７〜２３のヌクレオチド対の長さである、請求項１１に記載のＲＮＡｉ剤。
【請求項１３】
二重鎖領域が、１７〜２５のヌクレオチド対の長さである、請求項１１に記載のＲＮＡｉ剤。
【請求項１４】
二重鎖領域が、２３〜２７のヌクレオチド対の長さである、請求項１１に記載のＲＮＡｉ剤。
【請求項１５】
二重鎖領域が、１９〜２１のヌクレオチド対の長さである、請求項１１に記載のＲＮＡｉ剤。
【請求項１６】
二重鎖領域が、２１〜２３のヌクレオチド対の長さである、請求項１３に記載のＲＮＡｉ剤。
【請求項１７】
前記各鎖が、１５〜３０のヌクレオチドを有する、請求項１に記載のＲＮＡｉ剤。
【請求項１８】
前記ヌクレオチドの前記修飾が、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’−メトキシエチル、２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｃ−アリル、２’−フルオロ、２’−デオキシ、２’−ヒドロキシル、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載のＲＮＡｉ剤。
【請求項１９】
前記ヌクレオチドの前記修飾が、２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、またはこれらの両方である、請求項１８に記載のＲＮＡｉ剤。
【請求項２０】
前記リガンドが、二価または三価分岐リンカーによって付着された１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体である、請求項１に記載のＲＮＡｉ剤。
【請求項２１】
前記リガンドが、
【化１】
2018007657.tif 000068
である、請求項１に記載のＲＮＡｉ剤。
【請求項２２】
前記リガンドが、前記センス鎖の３’末端に付着している、請求項１に記載のＲＮＡｉ剤。
【請求項２３】
前記ＲＮＡｉ剤が、以下の式
【化２】
2018007657.tif 000069
に示されているリガンドにコンジュゲートし、
式中、ＸがＯまたはＳである、請求項２２に記載のＲＮＡｉ剤。
【請求項２４】
前記ＲＮＡｉ剤が、以下の式
【化３】
2018007657.tif 000070
に示されているリガンドにコンジュゲートしている、請求項２３に記載のＲＮＡｉ剤。
【請求項２５】
少なくとも１つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合をさらに含む、請求項１に記載のＲＮＡｉ剤。
【請求項２６】
前記ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合が、一方の鎖の３’末端にある、請求項２５に記載のＲＮＡｉ剤。
【請求項２７】
前記鎖が、前記アンチセンス鎖である、請求項２６に記載のＲＮＡｉ剤。
【請求項２８】
前記鎖が、前記センス鎖である、請求項２６に記載のＲＮＡｉ剤。
【請求項２９】
二重鎖のアンチセンス鎖の５’末端の１位にある塩基対がＡＵ塩基対である、請求項１に記載のＲＮＡｉ剤。
【請求項３０】
前記Ｙヌクレオチドが、２’−フルオロ修飾を含む、請求項１に記載のＲＮＡｉ剤。
【請求項３１】
前記Ｙ’ヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル修飾を含む、請求項１に記載のＲＮＡｉ剤。
【請求項３２】
ｐ’＞０である、請求項１に記載のＲＮＡｉ剤。
【請求項３３】
ｐ’＝２である、請求項１に記載のＲＮＡｉ剤。
【請求項３４】
ｑ’＝０であり、ｐ＝０であり、ｑ＝０であり、かつｐ’オーバーハングヌクレオチドが、標的ｍＲＮＡに相補的である、請求項３３に記載のＲＮＡｉ剤。
【請求項３５】
ｑ’＝０であり、ｐ＝０であり、ｑ＝０であり、かつｐ’オーバーハングヌクレオチドが、標的ｍＲＮＡに相補的でない、請求項３３に記載のＲＮＡｉ剤。
【請求項３６】
前記センス鎖が、合計２１のヌクレオチドを有し、前記アンチセンス鎖が、合計２３のヌクレオチドを有する、請求項３３に記載のＲＮＡｉ剤。
【請求項３７】
少なくとも１つのｎｐ’が、ホスホロチオエート連結によって隣接するヌクレオチドに連結されている、請求項３２〜３６の何れか１項に記載のＲＮＡｉ剤。
【請求項３８】
全てのｎｐ’が、ホスホロチオエート連結によって隣接するヌクレオチドに連結されている、請求項３７に記載のＲＮＡｉ剤。
【請求項３９】
表１に列記されているＲＮＡｉ剤の群から選択される、請求項１に記載のＲＮＡｉ剤。
【請求項４０】
ＡＤ−５１５４４、ＡＤ−５１５４５、ＡＤ−５１５４６、およびＡＤ−５１５４７からなる群から選択される、請求項１に記載のＲＮＡｉ剤。
【請求項４１】
前記ＲＮＡｉ剤がＡＤ−５１５４７である、請求項４０に記載のＲＮＡｉ剤。
【請求項４２】
請求項１〜４１の何れか１項に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤を含む細胞。
【請求項４３】
請求項１〜４１の何れか１項に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤を含む医薬組成物。
【請求項４４】
前記ＲＮＡｉ剤が、非緩衝液に溶解されて投与される、請求項４３に記載の医薬組成物。
【請求項４５】
前記非緩衝液が、生理食塩水または水である、請求項４４に記載の医薬組成物。
【請求項４６】
前記ｓｉＲＮＡが、緩衝液を用いて投与される、請求項４３に記載の医薬組成物。
【請求項４７】
前記緩衝液が、酢酸塩、クエン酸塩、プロラミン、炭酸塩、リン酸塩、またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項４６に記載の医薬組成物。
【請求項４８】
前記緩衝液が、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である、請求項４７に記載の医薬組成物。
【請求項４９】
前記医薬組成物がリポソームである、請求項４３に記載の医薬組成物。
【請求項５０】
前記医薬組成物が脂質製剤である、請求項４３に記載の医薬組成物。
【請求項５１】
細胞におけるトランスサイレチン（ＴＴＲ）の発現を阻害する方法であって、請求項１〜４１の何れか１項に記載のＲＮＡｉ剤、または請求項４３〜５０の何れか１項に記載の医薬組成物を、前記細胞における前記ＴＴＲの発現を阻害するのに有効な量、前記細胞に接触させて、前記細胞における前記トランスサイレチン（ＴＴＲ）の発現を阻害するステップを含む、方法。
【請求項５２】
前記ＴＴＲの発現が、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％阻害される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記細胞が、前記ＲＮＡｉ剤にｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させられる、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記細胞が、対象の体内に存在する、請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
前記対象がヒトである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記対象が、ＴＴＲ関連疾患に罹患し、前記有効な量が、治療有効量である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
前記対象が、ＴＴＲ関連疾患の発症のリスクのある対象であり、前記有効な量が、予防有効量である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５８】
前記対象が、ＴＴＲ関連疾患の発症に関連したＴＴＲ遺伝子突然変異を有する、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記ＴＴＲ関連疾患が、老人性全身性アミロイドーシス（ＳＳＡ）、全身性家族性アミロイドーシス、家族性アミロイド多発神経障害（ＦＡＰ）、家族性アミロイド心筋症（ＦＡＣ）、軟髄膜／中枢神経系（ＣＮＳ）アミロイドーシス、および高サイキロシン血症からなる群から選択される、請求項５６または５７に記載の方法。
【請求項６０】
前記対象が、ＴＴＲ関連アミロイドーシスを有し、前記方法が、前記対象のアミロイドＴＴＲ沈着を減少させる、請求項５４に記載の方法。
【請求項６１】
前記ＲＮＡｉ剤が、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、気管支内投与、胸膜内投与、腹腔内投与、動脈内投与、リンパ管投与、脳脊髄投与、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される投与方法によって前記対象に投与される、請求項５４に記載の方法。
【請求項６２】
前記ＲＮＡｉ剤が、皮下投与、筋肉内投与、または静脈内投与によって前記対象に投与される、請求項５４に記載の方法。
【請求項６３】
前記皮下投与が、皮下ポンプまたは皮下貯蔵部による投与を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記ＲＮＡｉ剤が、前記対象の特定の部位に送達されるように前記対象に投与される、請求項５４に記載の方法。
【請求項６５】
前記部位が、肝臓、脈絡叢、網膜、および膵臓からなる群から選択される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記部位が肝臓である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
前記ＲＮＡｉ剤の送達が、肝細胞に存在するアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰ−Ｒ）によって媒介される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６８】
前記ＲＮＡｉ剤が、０．０５〜５０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項５４に記載の方法。
【請求項６９】
前記ＲＮＡｉ剤が、２回またはそれ以上の投与回数で投与される、請求項５４に記載の方法。
【請求項７０】
前記ＲＮＡｉ剤が、約１２時間毎、約２４時間毎、約４８時間毎、約７２時間毎、および約９６時間毎からなる群から選択される時間間隔で投与される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記対象に由来するサンプルにおけるＴＴＲ  ｍＲＮＡの発現またはＴＴＲタンパク質の発現のレベルを評価するステップをさらに含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項７２】
前記ＲＮＡｉ剤の投与が、前記対象に由来するサンプルにおける、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２（ｐ７０）、ＩＬ１β、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＴＮＦα、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるサイトカインまたはケモカインのレベルに基づいて評価される炎症反応を前記対象に引き起こさない、請求項５４に記載の方法。
【請求項７３】
前記ＲＮＡｉ剤が、医薬組成物を用いて投与される、請求項５４に記載の方法。
【請求項７４】
前記ｓｉＲＮＡが、非緩衝液に溶解して投与される、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記非緩衝液が、生理食塩水または水である、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記ｓｉＲＮＡが、緩衝液を用いて投与される、請求項７３に記載の方法。
【請求項７７】
前記緩衝液が、酢酸塩、クエン酸塩、プロラミン、炭酸塩、リン酸塩、またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記緩衝液が、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記医薬組成物がリポソームである、請求項７３に記載の方法。
【請求項８０】
対象のＴＴＲ関連疾患を治療または予防する方法であって、請求項１〜４１の何れか１項に記載のＲＮＡｉ剤、または請求項４３〜５０の何れか１項に記載の医薬組成物を治療有効量または予防有効量、前記対象に投与して、前記対象の前記ＴＴＲ関連疾患を治療または予防するステップを含む、方法。
【請求項８１】
前記対象に由来するサンプルにおけるＴＴＲの発現が、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％阻害される、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記対象がヒトである、請求項８０に記載の方法。
【請求項８３】
前記対象が、ＴＴＲ関連疾患に罹患している対象である、請求項８０に記載の方法。
【請求項８４】
前記対象が、ＴＴＲ関連疾患の発症のリスクのある対象である、請求項８０に記載の方法。
【請求項８５】
前記対象が、ＴＴＲ関連疾患の発症に関連したＴＴＲ遺伝子突然変異を有する、請求項８０に記載の方法。
【請求項８６】
前記ＴＴＲ関連疾患が、老人性全身性アミロイドーシス（ＳＳＡ）、全身性家族性アミロイドーシス、家族性アミロイド多発神経障害（ＦＡＰ）、家族性アミロイド心筋症（ＦＡＣ）、軟髄膜／中枢神経系（ＣＮＳ）アミロイドーシス、および高サイキロシン血症からなる群から選択される、請求項８０に記載の方法。
【請求項８７】
前記対象が、ＴＴＲ関連アミロイドーシスを有し、前記方法が、前記対象のアミロイドＴＴＲ沈着を減少させる、請求項８０に記載の方法。
【請求項８８】
前記ＲＮＡｉ剤が、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、気管支内投与、胸膜内投与、腹腔内投与、動脈内投与、リンパ管投与、脳脊髄投与、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される投与方法によって前記対象に投与される、請求項８０に記載の方法。
【請求項８９】
前記ＲＮＡｉ剤が、皮下投与、筋肉内投与、または静脈内投与によって前記対象に投与される、請求項８０に記載の方法。
【請求項９０】
前記皮下投与が、皮下ポンプまたは皮下貯蔵部による投与を含む、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記ＲＮＡｉ剤が、前記対象の特定の部位に送達されるように前記対象に投与される、請求項８０に記載の方法。
【請求項９２】
前記部位が、肝臓、脈絡叢、網膜、および膵臓からなる群から選択される、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記部位が肝臓である、請求項９１に記載の方法。
【請求項９４】
前記ＲＮＡｉ剤の送達が、肝細胞に存在するアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰ−Ｒ）によって媒介される、請求項９１に記載の方法。
【請求項９５】
前記ＲＮＡｉ剤が、０．０５〜５０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項８０に記載の方法。
【請求項９６】
前記ＲＮＡｉ剤が、２回以上で投与される、請求項８０に記載の方法。
【請求項９７】
前記ＲＮＡｉ剤が、約１２時間毎、約２４時間毎、約４８時間毎、約７２時間毎、および約９６時間毎からなる群から選択される時間間隔で投与される、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
前記対象に由来するサンプルにおけるＴＴＲ  ｍＲＮＡの発現またはＴＴＲタンパク質の発現のレベルを評価するステップをさらに含む、請求項８０に記載の方法。
【請求項９９】
前記ＲＮＡｉ剤の投与が、前記対象に由来するサンプルにおける、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２（ｐ７０）、ＩＬ１β、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＴＮＦα、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるサイトカインまたはケモカインのレベルに基づいて評価される炎症反応を前記対象に引き起こさない、請求項８０に記載の方法。
【請求項１００】
前記ＲＮＡｉ剤が、医薬組成物を用いて投与される、請求項８０に記載の方法。
【請求項１０１】
前記ｓｉＲＮＡが、非緩衝液に溶解して投与される、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記非緩衝液が、生理食塩水または水である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
前記ｓｉＲＮＡが、緩衝液を用いて投与される、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０４】
前記緩衝液が、酢酸塩、クエン酸塩、プロラミン、炭酸塩、リン酸塩、またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記緩衝液が、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
前記医薬組成物がリポソームである、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０７】
細胞におけるトランスサイレチン（ＴＴＲ）の発現を阻害する方法であって、表１に列記されているＲＮＡｉ剤の群から選択される二本鎖ＲＮＡｉ剤を、前記細胞におけるＴＴＲの発現を阻害するのに有効な量、前記細胞と接触させて、前記細胞におけるトランスサイレチン（ＴＴＲ）の発現を阻害するステップを含む、方法。
【請求項１０８】
細胞におけるトランスサイレチン（ＴＴＲ）の発現を阻害する方法であって、ＡＤ−５１５４４、ＡＤ−５１５４５、ＡＤ−５１５４６、およびＡＤ−５１５４７からなる群から選択される二本鎖ＲＮＡｉ剤を、前記細胞におけるＴＴＲの発現を阻害するのに有効な量、前記細胞と接触させて、前記細胞におけるトランスサイレチン（ＴＴＲ）の発現を阻害するステップを含む、方法。
【請求項１０９】
細胞におけるトランスサイレチン（ＴＴＲ）の発現を阻害する方法であって、ＡＤ−５１５４７である二本鎖ＲＮＡｉ剤を、前記細胞におけるＴＴＲの発現を阻害するのに有効な量、前記細胞と接触させて、前記細胞におけるトランスサイレチン（ＴＴＲ）の発現を阻害するステップを含む、方法。
【請求項１１０】
対象のＴＴＲ関連疾患を治療または予防する方法であって、表１に列記されているＲＮＡｉ剤の群から選択される二本鎖ＲＮＡｉ剤を治療有効量または予防有効量、前記対象に投与して、前記対象のＴＴＲ関連疾患を治療または予防するステップを含む、方法。
【請求項１１１】
対象のＴＴＲ関連疾患を治療または予防する方法であって、ＡＤ−５１５４４、ＡＤ−５１５４５、ＡＤ−５１５４６、およびＡＤ−５１５４７からなる群から選択される二本鎖ＲＮＡｉ剤を治療有効量または予防有効量、前記対象に投与して、前記対象のＴＴＲ関連疾患を治療または予防するステップを含む、方法。
【請求項１１２】
対象のＴＴＲ関連疾患を治療または予防する方法であって、ＡＤ−５１５４７である二本鎖ＲＮＡｉ剤を治療有効量または予防有効量、前記対象に投与して、前記対象のＴＴＲ関連疾患を治療または予防するステップを含む、方法。
【請求項１１３】
請求項４６に記載の方法を実施するためのキットであって、
（ａ）前記ＲＮＡｉ剤と、
（ｂ）使用するための取扱説明書と、
を含む、キット。
【請求項１１４】
請求項７４に記載の方法を実施するためのキットであって、
（ａ）前記ＲＮＡｉ剤と、
（ｂ）使用するための取扱説明書と、
（ｃ）任意選択の、前記ＲＮＡｉ剤を前記対象に投与するための手段と、
を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１１年１１月１８日出願の米国仮特許出願第６１／５６１，７１０号、２０１２年３月２６日出願の同第６１／６１５，６１８号、および２０１２年８月６日出願の同第６１／６８０，０９８号の優先権を主張するものであり、これら全ての出願は、参照により全開示内容が本明細書に組み入れられるものとする。
【０００２】
配列表
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で提出された配列表を含み、この配列表は、参照によりその全てが本明細書に組み入れられるものとする。２０１２年１１月１３日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、１２１３０１ＷＯ．ｔｘｔという名称が付され、そのサイズは、５４１，５０８バイトである。
【背景技術】
【０００３】
トランスサイレチン（ＴＴＲ）（プレアルブミンとしても知られる）は、血清および脳脊髄液（ＣＳＦ）に存在する。ＴＴＲは、レチノール結合タンパク質（ＲＢＰ）およびサイロキシン（Ｔ４）を輸送し、血液およびＣＳＦ中のＲＢＰとの結合によりレチノール（ビタミンＡ）の担体としても機能する。トランスサイレチン（ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ）は、そのサイロキシン（ｔｈｙｒｏｘｉｎｅのｔｈｙ）およびレチノール（ｒｅｔｉｎｏｌのｒｅｔｉｎ）の輸送（ｔｒａｎｓｐｏｒｔのｔｒａｎｓ）から名付けられている。ＴＴＲはまた、プロテアーゼとしても機能し、アポＡ−Ｉ（主要なＨＤＬアポリポタンパク質）、アミロイドβ−ペプチド、および神経ペプチドＹを含むタンパク質を切断することができる。非特許文献１を参照されたい。
【０００４】
ＴＴＲは、βシート構造が豊富な４つの同一の１２７個のアミノ酸サブユニット（モノマー）からなる四量体である。各モノマーは、２つの４本鎖βシートおよび扁長楕円体の形状を有する。逆平行βシートの相互作用が、モノマーを連結して二量体にする。各モノマーの短いループが、主要な二量体と二量体との相互作用を形成する。これらの２対のループは、二量体の対向した凸状のβシートを分離させて内部チャネルを形成する。
【０００５】
肝臓は、ＴＴＲ発現の主要部位である。他の重要な発現部位としては、脈絡叢、網膜（特に、網膜色素上皮）、および膵臓が挙げられる。
【０００６】
トランスサイレチンは、アミロイド原線維の形成における前駆タンパク質である少なくとも２７種類のタンパク質の１つである。非特許文献２を参照されたい。器官および組織におけるアミロイド原線維の細胞外沈着は、アミロイドーシスの特徴である。アミロイド原線維は、前駆タンパク質の過剰な産生または前駆タンパク質の特定の突然変異から生じ得るミスフォールドタンパク質凝集体から構成される。ＴＴＲのアミロイド形成の可能性は、広いβシート構造に関連し得る；Ｘ線による結晶学的研究により、特定のアミロイド形成性突然変異が、タンパク質の四量体構造を不安定にすることが示唆されている。例えば、非特許文献３を参照されたい。
【０００７】
アミロイドーシスは、アミロイド沈着によって特徴付けられるアミロイド疾患群の一般的な用語である。アミロイド疾患は、その前駆タンパク質に基づいて分類される；例えば、名称は、アミロイド（ａｍｙｌｏｉｄ）の「Ａ」から始まり、前駆タンパク質の省略形が続く、例えば、ＡＴＴＲは、アミロイド形成性トランスサイレチン（ａｍｌｏｉｄｏｇｅｎｉｃ  ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ）のａｍｌｏｉｄｏｇｅｎｉｃの中の「ａ」とｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎの中の「ｔ」、「ｔ」、および「ｒ」からなる。同一文献同一頁。
【０００８】
多数のＴＴＲ関連疾患が存在し、その殆どがアミロイド疾患である。通常の配列のＴＴＲは、高齢者の心アミロイドーシスに関連し、老人性全身性アミロイドーシス（ＳＳＡ）と呼ばれる（また、老人性心アミロイドーシス（ＳＣＡ）または心アミロイドーシスとも呼ばれる）。ＳＳＡは、しばしば、多くの他の器官における微小沈着物を伴う。ＴＴＲアミロイドーシスは、様々な形態で現れる。末梢神経系により顕著に現れる場合、この疾患は、家族性アミロイド多発神経障害（ＦＡＰ）と呼ばれる。心臓に主に現れるが、神経系に現れない場合は、この疾患は、家族性アミロイド心筋症（ＦＡＣ）と呼ばれる。第３の主要なタイプのＴＴＲアミロイドーシスは、軟髄膜アミロイドーシスであり、軟髄膜もしくは髄膜脳血管アミロイドーシス、中枢神経系（ＣＮＳ）アミロイドーシス、またはアミロイドーシスＶＩＩ型としても知られている。ＴＴＲにおける突然変異は、アミロイド性硝子体混濁、手根管症候群、および甲状腺機能正常型高サイキロシン血症を引き起こすこともある。この甲状腺機能正常型高サイキロシン血症は、サイキロシンに対して高い親和性を有する突然変異ＴＴＲ分子によるサイロキシンとＴＴＲとの結合の増加によって発症すると考えられる非アミロイド性疾患である。例えば、非特許文献４を参照されたい。
【０００９】
異常アミロイド形成性タンパク質は、遺伝性であるか、または体細胞突然変異による後天性であり得る。非特許文献２。トランスサイレチン関連ＡＴＴＲは、遺伝性全身性アミロイドーシスの最も高頻度の形態である。非特許文献５。ＴＴＲ突然変異は、ＴＴＲアミロイド形成のプロセスを加速させ、ＡＴＴＲの発生の最も重要な危険因子である。全身性家族性アミロイドーシスを引き起こす８５を超えるアミロイド形成性ＴＴＲ変異体が知られている。ＴＴＲ突然変異は、通常は、全身性アミロイド沈着を引き起こし、特に末梢神経系に生じるが、一部の突然変異は、心筋症または硝子体混濁に関連する。同一文献同一頁。
【００１０】
Ｖ３０Ｍ突然変異は、最も一般的なＴＴＲ突然変異である。例えば、非特許文献５を参照されたい。Ｖ１２２Ｉ突然変異は、アフリカ系米国人の人口の３．９％が保有者であり、そしてＦＡＣの最も一般的な原因である。非特許文献６。ＳＳＡは、８０歳を超える人口の２５％超で発症すると推定される。非特許文献７。
【００１１】
従って、ＴＴＲ関連疾患の有用な治療法が当分野で要望されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｌｉｚ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２０１０）  ＩＵＢＭＢ  Ｌｉｆｅ，６２（６）：４２９−４３５
【非特許文献２】Ｇｕａｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（Ｎｏｖ．４，２０１１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｏｎ  ｃａｒｄｉａｃ  ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，ｄｏｉ：１０．１１５２／ａｊｐｈｅａｒｔ．００８１５．２０１１
【非特許文献３】Ｓａｒａｉｖａ  Ｍ．Ｊ．Ｍ．（２００２）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，４（１２）：１−１１
【非特許文献４】Ｍｏｓｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８６，２０２５−２０３３
【非特許文献５】Ｌｏｂａｔｏ，Ｌ．（２００３）Ｊ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．，１６：４３８−４４２
【非特許文献６】Ｊａｃｏｂｓｏｎ，Ｄ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３６（７）：４６６-７３
【非特許文献７】Ｗｅｓｔｅｒｍａｒｋ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７（７）：２８４３-５
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、トランスサイレチン（ＴＴＲ）遺伝子を標的とするＲＮＡｉ剤、例えば、二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供する。本発明はまた、ＴＴＲの発現を阻害する方法、および本発明のＲＮＡｉ剤、例えば、二本鎖ＲＮＡｉ剤を用いて対象のＴＴＲ関連疾患を治療または予防する方法を提供する。本発明は、特定の化学修飾を有するＲＮＡｉ剤がＴＴＲの発現を阻害する優れた能力を示すという発見に少なくとも部分的に基づいている。特定のパターンの化学修飾（例えば、交互パターン）およびリガンドを有する作用剤は、ＴＴＲ遺伝子の活性のサイレンシングに有効であることが本明細書で示される。さらに、３つの連続したヌクレオチドにおける３つの同一の修飾からなる１つ以上のモチーフを含み、１つのこのようなモチーフが作用剤の切断部位またはその近傍にある作用剤は、驚くほど強いＴＴＲ遺伝子サイレンシング活性を示す。１つのこのような化学モチーフが作用剤に存在する場合は、このような化学モチーフは、遺伝子サイレンシング活性を高めるために切断部位またはその近傍に存在するのが好ましい。切断領域は、切断部位、即ち、切断が起こる標的ｍＲＮＡにおける部位を取り囲む領域である。
【００１４】
従って、一態様では、本発明は、トランスサイレチン（ＴＴＲ）の発現を阻害するためのＲＮＡｉ剤、例えば、二本鎖ＲＮＡｉ剤を取り上げる。二本鎖ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含む。アンチセンス鎖は、トランスサイレチンをコードするｍＲＮＡの一部に相補的な領域を含む。各鎖は、１４〜３０のヌクレオチドを有し、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、以下の式によって表される：
センス鎖：５’ｎｐ−Ｎａ−（ＸＸＸ）ｉ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎｂ−（ＺＺＺ）ｊ−Ｎａ−ｎｑ３’
アンチセンス鎖：３’ｎｐ’−Ｎａ’−（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ−Ｎｂ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ’−（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ−Ｎａ’−ｎｑ’５’
（ＩＩＩ）。
式ＩＩＩでは、ｉ、ｊ、ｋ、およびｌはそれぞれ独立して、０または１であり；ｐ、ｐ’、ｑ、およびｑ’はそれぞれ独立して、０〜６であり；各ＮａおよびＮａ’は独立して、修飾されている、修飾されていない、またはこれらの組み合わせである０〜２５のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２つの異なって修飾されたヌクレオチドを含み；各ＮｂおよびＮｂ’は独立して、修飾されている、修飾されていない、またはこれらの組み合わせである０〜１０のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；各ｎｐ、ｎｐ’、ｎｑ、およびｎｑ’は独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し；ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、およびＺ’Ｚ’Ｚ’はそれぞれ独立して、３つの連続したヌクレオチドにおける３つの同一の修飾からなる１つのモチーフを表し；Ｎｂの修飾が、Ｙの修飾とは異なり、かつＮｂ’の修飾が、Ｙ’の修飾とは異なる。一実施形態では、センス鎖は、少なくとも１つのリガンド、例えば、少なくとも１つのリガンド、例えば、センス鎖の３’末端に付着した少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートしている。他の実施形態では、リガンドは、アンチセンス鎖にコンジュゲートしても良い。
【００１５】
一部の実施形態では、ｉが１である；ｊが１である；またはｉとｊの両方が１である。
【００１６】
一部の実施形態では、ｋが１である；ｌが１である；またはｋとｌの両方が１である。
【００１７】
一部の実施形態では、ｉが０であり；ｊが１である。
【００１８】
一部の実施形態では、ｉが１であり；ｊが０である。
【００１９】
一部の実施形態では、ｋが０であり；ｌが１である。
【００２０】
一部の実施形態では、ｋが１であり；ｌが０である。
【００２１】
一部の実施形態では、ＸＸＸは、Ｘ’Ｘ’Ｘ’に相補的であり、ＹＹＹは、Ｙ’Ｙ’Ｙ’に相補的であり、かつＺＺＺは、Ｚ’Ｚ’Ｚ’に相補的である。
【００２２】
一部の実施形態では、ＹＹＹモチーフは、センス鎖の切断部位またはその近傍に存在する。
【００２３】
一部の実施形態では、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、アンチセンス鎖の５’末端から１１位、１２位、および１３位に存在する。
【００２４】
一部の実施形態では、Ｙ’は２’−Ｏ−メチルである。
【００２５】
一部の実施形態では、Ｙ’は２’−フルオロである。
【００２６】
一部の実施形態では、式（ＩＩＩ）は、式（ＩＩＩａ）として表される：
センス鎖：５’ｎｐ−Ｎａ−ＹＹＹ−Ｎｂ−ＺＺＺ−Ｎａ−ｎｑ３’
アンチセンス鎖：３’ｎｐ’−Ｎａ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ’−Ｚ’Ｚ’Ｚ’−Ｎａ’ｎｑ’５’
（ＩＩＩａ）。
式ＩＩＩａでは、各ＮｂおよびＮｂ’は独立して、１〜５の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表している。
【００２７】
一部の実施形態では、式（ＩＩＩ）は、式（ＩＩＩｂ）として表される：
センス鎖：５’ｎｐ−Ｎａ−ＸＸＸ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎａ−ｎｑ３’
アンチセンス鎖：３’ｎｐ’−Ｎａ’−Ｘ’Ｘ’Ｘ’−Ｎｂ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎａ’−ｎｑ’５’
（ＩＩＩｂ）。
式ＩＩＩｂでは、各ＮｂおよびＮｂ’は独立して、１〜５の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表している。
【００２８】
一部の実施形態では、式（ＩＩＩ）は、式（ＩＩＩｃ）として表される：
センス鎖：５’ｎｐ−Ｎａ−ＸＸＸ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎｂ−ＺＺＺ−Ｎａ−ｎｑ３’
アンチセンス鎖：３’ｎｐ’−Ｎａ’−Ｘ’Ｘ’Ｘ’−Ｎｂ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ’−Ｚ’Ｚ’Ｚ’−Ｎａ’−ｎｑ’５’
（ＩＩＩｃ）。
式ＩＩＩｃでは、各Ｎｂおよび−Ｎｂ’は独立して、１〜５の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各ＮａおよびＮａ’は独立して、２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表している。
【００２９】
多くの実施形態では、二重鎖領域は、１５〜３０のヌクレオチド対の長さである。一部の実施形態では、二重鎖領域は、１７〜２３のヌクレオチド対の長さ、１７〜２５のヌクレオチド対の長さ、２３〜２７のヌクレオチド対の長さ、１９〜２１のヌクレオチド対の長さ、または２１〜２３のヌクレオチド対の長さである。
【００３０】
特定の実施形態では、各鎖は、１５〜３０のヌクレオチドを有する。
【００３１】
一部の実施形態では、ヌクレオチドの修飾は、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’−メトキシエチル、２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｃ−アリル、２’−フルオロ、２’−デオキシ、２’−ヒドロキシル、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。一部の好ましい実施形態では、ヌクレオチドの修飾は、２’−Ｏ−メチルまたは２’−フルオロである。
【００３２】
一部の実施形態では、リガンドは、二価または三価分岐リンカーによって付着された１つ以上のＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）誘導体である。特定の実施形態では、このリガンドは
【化１】
2018007657.tif 000002
である。
【００３３】
一部の実施形態では、リガンドは、センス鎖の３’末端に付着している。
【００３４】
一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、以下の式に示されているリガンドにコンジュゲートしている：
【化２】
2018007657.tif 000003
式中、ＸはＯまたはＳである。
【００３５】
一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、以下の式
【化３】
2018007657.tif 000004
に示されているリガンドにコンジュゲートしている。
【００３６】
一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、少なくとも１つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合をさらに含む。一部の実施形態では、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合は、一方の鎖の３’末端にある。一部の実施形態では、この鎖はアンチセンス鎖である。一部の実施形態では、この鎖はセンス鎖である。
【００３７】
特定の実施形態では、二重鎖の５’末端の１位にある塩基対がＡＵ塩基対である。
【００３８】
一部の実施形態では、Ｙヌクレオチドは、２’−フルオロ修飾を含む。
【００３９】
一部の実施形態では、Ｙ’ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル修飾を含む。
【００４０】
一部の実施形態では、ｐ’＞０である。一部の実施形態では、各ｎは、標的ｍＲＮＡに相補的である。他のこのような実施形態では、各ｎは、標的ｍＲＮＡに相補的でない。一部の実施形態では、ｐ、ｐ’、ｑ、およびｑ’は１〜６である。一部の好ましい実施形態では、ｐ’＝１または２である。一部の好ましい実施形態では、ｐ’＝２である。一部のこのような実施形態では、ｑ’＝０であり、ｐ＝０であり、ｑ＝０であり、かつｐ’オーバーハングヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡに相補的である。他のこのような実施形態では、ｑ’＝０であり、ｐ＝０であり、ｑ＝０であり、かつｐ’オーバーハングヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡに相補的でない。
【００４１】
一部の実施形態では、センス鎖は、合計２１のヌクレオチドを有し、アンチセンス鎖は、合計２３のヌクレオチドを有する。
【００４２】
特定の実施形態では、ｎｐ’間の連結は、ホスホロチオエートを含む。一部のこのような実施形態では、このｎｐ’間の連結は、ホスホロチオエート連結である。
【００４３】
一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、表１に列記されているＲＮＡｉ剤の群から選択される。
【００４４】
好ましい実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、ＡＤ−５１５４４、ＡＤ−５１５４５、ＡＤ−５１５４６、およびＡＤ−５１５４７からなる群から選択される。
【００４５】
より一層好ましい実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、以下の構造を有するＡＤ−５１５４７である：
センス鎖：５’−ＵｆｇＧｆｇＡｆｕＵｆｕＣｆＡｆＵｆｇＵｆａａｃＣｆａＡｆｇＡｆＬ９６−３’（配列番号：２）
アンチセンス鎖：５’−ｕＣｆｕＵｆｇＧｆＵｆＵｆａＣｆａｕｇＡｆａＡｆｕＣｆｃＣｆａｓＵｆｓｃ−３’（配列番号：３）
配列中、小文字ヌクレオチド（ａ、ｕ、ｇ、ｃ）は、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを示し；Ｎｆ（例えば、Ａｆ）は、２’−フルオロヌクレオチドを示し；ｓは、ホスホチオレート（ｐｈｏｓｐｈｏｔｈｉｏｒａｔｅ）連結を示し；Ｌ９６は、ＧａｌＮＡｃ３リガンドを示している。
【００４６】
別の態様では、本発明は、ＴＴＲの発現を阻害するためのＲＮＡｉ剤を含む細胞を取り上げる。
【００４７】
さらなる態様では、本発明は、ＴＴＲの発現を阻害するためのＲＮＡｉ剤を含む医薬組成物を取り上げる。一部の実施形態では、医薬組成物は、ＲＮＡｉ剤を含む溶液である。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤を含むこの溶液は、非緩衝液、例えば、生理食塩水または水である。他の実施形態では、この溶液は、緩衝液、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の溶液である。他の実施形態では、医薬組成物は、リポソームまたは脂質製剤である。一部の実施形態では、脂質製剤は、ＸＴＣまたはＭＣ３を含む。
【００４８】
なお別の態様では、本発明は、細胞におけるトランスサイレチン（ＴＴＲ）の発現を阻害する方法を取り上げる。この方法は、ＲＮＡｉ剤、例えば、二本鎖ＲＮＡｉ剤を、細胞におけるＴＴＲの発現を阻害するのに有効な量、細胞に接触させて、この細胞におけるＴＴＲの発現を阻害するステップを含む。
【００４９】
一部の実施形態では、ＴＴＲの発現は、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％阻害される。
【００５０】
他の実施形態では、細胞は、ＲＮＡｉ剤にｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させられる。他の実施形態では、細胞は、対象の体内に存在する。好ましい実施形態では、対象はヒトである。
【００５１】
さらなる実施形態では、対象は、ＴＴＲ関連疾患に罹患している対象であり、有効な量は、治療有効量である。他の実施形態では、対象は、ＴＴＲ関連疾患の発症のリスクのある対象であり、有効な量は、予防有効量である。一部の実施形態では、ＴＴＲ関連疾患の発症のリスクのある対象は、ＴＴＲ関連疾患の発症に関連したＴＴＲ遺伝子の突然変異を有する対象である。
【００５２】
特定の実施形態では、ＴＴＲ関連疾患は、老人性全身性アミロイドーシス（ＳＳＡ）、全身性家族性アミロイドーシス、家族性アミロイド多発神経障害（ＦＡＰ）、家族性アミロイド心筋症（ＦＡＣ）、軟髄膜／中枢神経系（ＣＮＳ）アミロイドーシス、および高サイキロシン血症からなる群から選択される。
【００５３】
一部の実施形態では、対象は、ＴＴＲ関連アミロイドーシスを有し、この方法は、対象のアミロイドＴＴＲ沈着を減少させる。
【００５４】
他の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、気管支内投与、胸膜内投与、腹腔内投与、動脈内投与、リンパ管投与、脳脊髄投与、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される投与方法によって対象に投与される。特定の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、皮下投与または静脈内投与によって対象に投与される。好ましい実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、皮下投与によって対象に投与される。一部のこのような実施形態では、皮下投与は、皮下ポンプまたは皮下貯蔵部（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｄｅｐｏｔ）による投与を含む。
【００５５】
特定の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、対象の特定の部位に送達されるようにこの対象に投与される。一部の実施形態では、この部位は、肝臓、脈絡叢、網膜、および膵臓からなる群から選択される。好ましい実施形態では、この部位は肝臓である。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤の送達は、肝細胞に存在するアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰ−Ｒ）によって媒介される。
【００５６】
一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、約０．２５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの用量、例えば、約０．２５ｍｇ／ｋｇ〜約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．２５ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約０．２５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．２５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ〜約３５ｍｇ／ｋｇ、または約４０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
【００５７】
一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、約０．２５ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約１１ｍｇ／ｋｇ、約１２ｍｇ／ｋｇ、約１３ｍｇ／ｋｇ、約１４ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ、約１６ｍｇ／ｋｇ、約１７ｍｇ／ｋｇ、約１８ｍｇ／ｋｇ、約１９ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約２１ｍｇ／ｋｇ、約２２ｍｇ／ｋｇ、約２３ｍｇ／ｋｇ、約２４ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、約２６ｍｇ／ｋｇ、約２７ｍｇ／ｋｇ、約２８ｍｇ／ｋｇ、約２９ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、約３１ｍｇ／ｋｇ、約３２ｍｇ／ｋｇ、約３３ｍｇ／ｋｇ、約３４ｍｇ／ｋｇ、約３５ｍｇ／ｋｇ、約３６ｍｇ／ｋｇ、約３７ｍｇ／ｋｇ、約３８ｍｇ／ｋｇ、約３９ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ、約４１ｍｇ／ｋｇ、約４２ｍｇ／ｋｇ、約４３ｍｇ／ｋｇ、約４４ｍｇ／ｋｇ、約４５ｍｇ／ｋｇ、約４６ｍｇ／ｋｇ、約４７ｍｇ／ｋｇ、約４８ｍｇ／ｋｇ、約４９ｍｇ／ｋｇ、または約５０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
【００５８】
一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、２回またはそれ以上の投与回数で投与される。特定の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、約２時間毎、約３時間毎、約４時間毎、約６時間毎、約８時間毎、約１２時間毎、約２４時間毎、約４８時間毎、約７２時間毎、約９６時間毎、約１２０時間毎、約１４４時間毎、約１６８時間毎、約２４０時間毎、約３３６時間毎、約５０４時間毎、約６７２時間毎、および約７２０時間毎からなる群から選択される時間間隔で投与される。
【００５９】
他の実施形態では、この方法は、対象に由来するサンプルにおけるＴＴＲ  ｍＲＮＡの発現またはＴＴＲタンパク質の発現のレベルを評価するステップをさらに含む。
【００６０】
好ましい実施形態では、ＲＮＡｉ剤の投与は、対象に由来するサンプルにおける、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２（ｐ７０）、ＩＬ１β、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＴＮＦα、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるサイトカインまたはケモカインのレベルに基づいて評価される炎症反応を対象に引き起こさない。
【００６１】
一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、医薬組成物を用いて投与される。
【００６２】
好ましい実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、溶液に溶解して投与される。一部の実施形態では、このｓｉＲＮＡは、非緩衝液に溶解して投与される。一実施形態では、ｓｉＲＮＡは、水に溶解されて投与される。他の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、緩衝液、例えば、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、プロラミン緩衝液、炭酸緩衝液、リン酸緩衝液、またはこれらの任意の組み合わせを用いて投与される。一部の実施形態では、緩衝液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。
【００６３】
別の実施形態では、医薬組成物は、ＳＮＡＬＰまたはＸＴＣを含むリポソームまたは脂質製剤である。一実施形態では、脂質製剤は、ＭＣ３を含む。
【００６４】
別の態様では、本発明は、対象のＴＴＲ関連疾患を治療または予防する方法を提供する。この方法は、治療有効量または予防有効量のＲＮＡｉ剤、例えば、二本鎖ＲＮＡｉ剤を対象に投与して、対象のＴＴＲ関連疾患を治療または予防するステップを含む。
【００６５】
一部の実施形態では、対象に由来するサンプルにおけるＴＴＲの発現は、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％阻害される。
【００６６】
一部の実施形態では、対象はヒトである。
【００６７】
一部の実施形態では、対象は、ＴＴＲ関連疾患に罹患している対象である。他の実施形態では、対象は、ＴＴＲ関連疾患の発症のリスクのある対象である。
【００６８】
一部の実施形態では、対象は、ＴＴＲ関連疾患の発症に関連したＴＴＲ遺伝子突然変異を有する対象である。
【００６９】
特定の実施形態では、ＴＴＲ関連疾患は、老人性全身性アミロイドーシス（ＳＳＡ）、全身性家族性アミロイドーシス、家族性アミロイド多発神経障害（ＦＡＰ）、家族性アミロイド心筋症（ＦＡＣ）、軟髄膜／中枢神経系（ＣＮＳ）アミロイドーシス、および高サイキロシン血症からなる群から選択される。
【００７０】
一部の実施形態では、対象は、ＴＴＲ関連アミロイドーシスを有し、この方法は、対象のアミロイドＴＴＲ沈着を減少させる。
【００７１】
一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、気管支内投与、胸膜内投与、腹腔内投与、動脈内投与、リンパ管投与、脳脊髄投与、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される投与方法によって対象に投与される。特定の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、皮下投与または静脈内投与によって対象に投与される。好ましい実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、皮下投与によって対象に投与される。一部の実施形態では、皮下投与は、皮下ポンプまたは皮下貯蔵部による投与を含む。
【００７２】
特定の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、対象の特定の部位に送達されるように対象に投与される。一部のこのような実施形態では、この部位は、肝臓、脈絡叢、網膜、および膵臓からなる群から選択される。好ましい実施形態では、この部位は肝臓である。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤の送達は、肝細胞に存在するアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰ−Ｒ）によって媒介される。
【００７３】
一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、約０．２５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの用量、例えば、約０．２５ｍｇ／ｋｇ〜約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．２５ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約０．２５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．２５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ〜約３５ｍｇ／ｋｇ、または約４０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
【００７４】
一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、約０．２５ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約１１ｍｇ／ｋｇ、約１２ｍｇ／ｋｇ、約１３ｍｇ／ｋｇ、約１４ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ、約１６ｍｇ／ｋｇ、約１７ｍｇ／ｋｇ、約１８ｍｇ／ｋｇ、約１９ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約２１ｍｇ／ｋｇ、約２２ｍｇ／ｋｇ、約２３ｍｇ／ｋｇ、約２４ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、約２６ｍｇ／ｋｇ、約２７ｍｇ／ｋｇ、約２８ｍｇ／ｋｇ、約２９ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、約３１ｍｇ／ｋｇ、約３２ｍｇ／ｋｇ、約３３ｍｇ／ｋｇ、約３４ｍｇ／ｋｇ、約３５ｍｇ／ｋｇ、約３６ｍｇ／ｋｇ、約３７ｍｇ／ｋｇ、約３８ｍｇ／ｋｇ、約３９ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ、約４１ｍｇ／ｋｇ、約４２ｍｇ／ｋｇ、約４３ｍｇ／ｋｇ、約４４ｍｇ／ｋｇ、約４５ｍｇ／ｋｇ、約４６ｍｇ／ｋｇ、約４７ｍｇ／ｋｇ、約４８ｍｇ／ｋｇ、約４９ｍｇ／ｋｇ、または約５０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
【００７５】
一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、２回またはそれ以上の投与回数で投与される。特定の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、約２時間毎、約３時間毎、約４時間毎、約６時間毎、約８時間毎、約１２時間毎、約２４時間毎、約４８時間毎、約７２時間毎、約９６時間毎、約１２０時間毎、約１４４時間毎、約１６８時間毎、約２４０時間毎、約３３６時間毎、約５０４時間毎、約６７２時間毎、および約７２０時間毎からなる群から選択される時間間隔で投与される。
【００７６】
他の実施形態では、この方法は、対象に由来するサンプルにおけるＴＴＲ  ｍＲＮＡの発現またはＴＴＲタンパク質の発現のレベルを評価するステップをさらに含む。
【００７７】
好ましい実施形態では、ＲＮＡｉ剤の投与は、対象に由来するサンプルにおける、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２（ｐ７０）、ＩＬ１β、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＴＮＦα、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるサイトカインまたはケモカインのレベルに基づいて評価される炎症反応を対象に引き起こさない。
【００７８】
一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、医薬組成物、例えば、リポソームを用いて投与される。
【００７９】
一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、溶液に溶解して投与される。一部の実施形態では、このｓｉＲＮＡは、非緩衝液に溶解して投与される。一実施形態では、ｓｉＲＮＡは、生理食塩水または水に溶解されて投与される。他の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、緩衝液、例えば、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、プロラミン緩衝液、炭酸緩衝液、リン酸緩衝液、またはこれらの任意の組み合わせを用いて投与される。一部の実施形態では、緩衝液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。
【００８０】
別の態様では、本発明は、細胞におけるトランスサイレチン（ＴＴＲ）の発現を阻害する方法であって、ＲＮＡｉ剤、例えば、二本鎖ＲＮＡｉ剤を、細胞におけるＴＴＲの発現を阻害するのに有効な量、細胞に接触させるステップを含む、方法を提供する。一態様では、この二本鎖ＲＮＡｉ剤は、表１に列記されている作用剤の群から選択され、これにより、細胞におけるトランスサイレチン（ＴＴＲ）の発現が阻害される。
【００８１】
別の態様では、本発明は、細胞におけるトランスサイレチン（ＴＴＲ）の発現を阻害する方法であって、ＲＮＡｉ剤、例えば、二本鎖ＲＮＡｉ剤を、細胞におけるＴＴＲの発現を阻害するのに有効な量、細胞に接触させるステップを含む、方法を提供する。一態様では、この二本鎖ＲＮＡｉ剤は、ＡＤ−５１５４４、ＡＤ−５１５４５、ＡＤ−５１５４６、およびＡＤ−５１５４７からなる群から選択され、これにより、細胞におけるトランスサイレチン（ＴＴＲ）の発現が阻害される。
【００８２】
さらなる態様では、本発明は、対象のＴＴＲ関連疾患を治療または予防する方法であって、治療有効量または予防有効量のＲＮＡｉ剤、例えば、二本鎖ＲＮＡｉ剤を対象に投与するステップを含む、方法を提供する。一態様では、この二本鎖ＲＮＡｉ剤は、表１に列記されている作用剤の群から選択され、これにより、対象のＴＴＲ関連疾患が治療または予防される。
【００８３】
なお別の態様では、本発明は、対象のＴＴＲ関連疾患を治療または予防する方法であって、治療有効量または予防有効量のＲＮＡｉ剤、例えば、二本鎖ＲＮＡｉ剤を対象に投与するステップを含む、方法を提供する。一態様では、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、ＡＤ−５１５４４、ＡＤ−５１５４５、ＡＤ−５１５４６、およびＡＤ−５１５４７からなる群から選択され、これにより、対象のＴＴＲ関連疾患が治療または予防される。
【００８４】
さらなる態様では、本発明は、本発明の方法を実施するためのキットを提供する。一態様では、本発明は、ＲＮＡｉ剤、例えば、二本鎖ＲＮＡｉ剤を、細胞におけるＴＴＲの発現を阻害するのに有効な量、前記細胞に接触させて、この細胞におけるＴＴＲの発現を阻害するステップを含む、細胞におけるトランスサイレチン（ＴＴＲ）の発現を阻害する方法を実施するためのキットを提供する。このキットは、ＲＮＡｉ剤、使用するための取扱説明書、および、任意選択の、ＲＮＡｉ剤を対象に投与するための手段を含む。
【００８５】
本発明は、以下の詳細な説明および図面によってさらに例示される。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】ＴＴＲを標的とするＧａｌＮＡｃコンジュゲートＲＮＡｉ剤のマウスへの単回皮下投与により、ＴＴＲ  ｍＲＮＡの用量依存性の抑制が起こることを示すグラフである。
【図２】７．５ｍｇ／ｋｇまたは３０ｍｇ／ｋｇのＴＴＲを標的とするＧａｌＮＡｃコンジュゲートＲＮＡｉ剤のマウスへの単回皮下投与により、ＴＴＲ  ｍＲＮＡの持続的な抑制が起こることを示すグラフである。
【図３】ヒトＴＴＲ  ｍＲＮＡの配列を示している。
【図４】親ＡＤ−４５１６３に対して修飾されたＲＮＡｉ剤の改善されたサイレンシング活性を示すグラフである。
【図５】親ＡＤ−４５１６５に対して修飾されたＲＮＡｉ剤の改善されたサイレンシング活性を示すグラフである。
【図６】親ＡＤ−４５１６３に対して修飾されたＲＮＡｉ剤と共に４時間インキュベートされた後の改善された自由取り込みのサイレンシングを示すグラフである。
【図７】親ＡＤ−４５１６３に対して修飾されたＲＮＡｉ剤と共に２４時間インキュベートされた後の改善された自由取り込みのサイレンシングを示すグラフである。
【図８】親ＡＤ−４５１６５に対して修飾されたＲＮＡｉ剤と共に４時間インキュベートされた後の改善された自由取り込みのサイレンシングを示すグラフである。
【図９】親ＡＤ−４５１６５に対して修飾されたＲＮＡｉ剤と共に２４時間インキュベートされた後の改善された自由取り込みのサイレンシングを示すグラフである。
【図１０Ａ】ＲＮＡｉ剤ＡＤ−５１５４４、ＡＤ−５１５４５、ＡＤ−４５１６３、ＡＤ−５１５４６、ＡＤ−５１５４７、またはＡＤ−４５１６５の単回皮下投与後のｈＴＴＲ  Ｖ３０Ｍを発現するトランスジェニックマウスにおけるＴＴＲ  ｍＲＮＡのサイレンシングを示すグラフである。
【図１０Ｂ】ＲＮＡｉ剤ＡＤ−５１５４４、ＡＤ−５１５４５、ＡＤ−４５１６３、ＡＤ−５１５４６、ＡＤ−５１５４７、またはＡＤ−４５１６５の単回皮下投与後のｈＴＴＲ  Ｖ３０Ｍを発現するトランスジェニックマウスにおけるＴＴＲ  ｍＲＮＡのサイレンシングを示すグラフである。
【図１１】５ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇのＲＮＡｉ剤ＡＤ−５１５４４、ＡＤ−５１５４５、またはＡＤ−４５１６３の単回皮下投与後のｈＴＴＲ  Ｖ３０Ｍを発現するトランスジェニックマウスにおけるＴＴＲタンパク質の抑制を示すグラフである。
【図１２】４７、またはＡＤ−４５１６５の単回皮下投与後のｈＴＴＲ  Ｖ３０Ｍを発現するトランスジェニックマウスにおけるＴＴＲタンパク質の抑制を示すグラフである。
【図１３】５ｍｇ／ｋｇのＲＮＡｉ剤が５回（上側の線）または２５ｍｇ／ｋｇのＲＮＡｉ剤が１回（下側の線）投与されたサルにおける投与後の採血のためのプロトコルを示している。
【図１４】ＡＤ−４５１６３、ＡＤ−５１５４４、ＡＤ−５１５４５、ＡＤ−５１５４６、またはＡＤ−５１５４７の５回の５ｍｇ／ｋｇ（上のグラフ）または２５ｍｇ／ｋｇの１回（下のグラフ）の皮下投与後の非ヒト霊長類におけるＴＴＲタンパク質の抑制を示すグラフである。
【図１５】１回当たり２．５ｍｇ／ｋｇ（白い四角形）、５ｍｇ／ｋｇ（黒い四角形）、もしくは１０ｍｇ／ｋｇ（パターンが形成された四角形）のＡＤ−５１５４７の皮下投与後、または負のコントロールとしてのＰＢＳ（グレーの四角形）の投与後の非ヒト霊長類におけるＴＴＲタンパク質の抑制を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００８７】
本発明は、トランスサイレチン（ＴＴＲ）遺伝子を標的とするＲＮＡｉ剤、例えば、二本鎖ＲＮＡｉ剤および組成物を提供する。本発明はまた、ＴＴＲの発現を阻害する方法、および本発明のＲＮＡｉ剤、例えば、二本鎖ＲＮＡｉ剤を用いて対象のＴＴＲ関連疾患を治療または予防する方法を提供する。本発明は、特定の化学修飾を有するＲＮＡｉ剤がＴＴＲの発現を阻害する優れた能力を示すという発見に少なくとも部分的に基づいている。特定のパターンの化学修飾（例えば、交互パターン）およびリガンドを有する作用剤は、ＴＴＲ遺伝子の活性のサイレンシングに有効であることが本明細書で示される。さらに、３つの連続したヌクレオチドにおける３つの同一の修飾からなる１つ以上のモチーフを含み、１つのこのようなモチーフが作用剤の切断部位またはその近傍にある作用剤は、驚くほど強いＴＴＲ遺伝子サイレンシング活性を示す。１つのこのような化学モチーフが作用剤に存在する場合は、このような化学モチーフは、遺伝子サイレンシング活性を強めるために切断部位またはその近傍に存在するのが好ましい。切断領域は、切断部位、即ち、切断が起こる標的ｍＲＮＡにおける部位を取り囲む領域である。
【００８８】
Ｉ．定義
本明細書で使用される以下の語はそれぞれ、このセクションの語に関連した意味を有する。
【００８９】
本明細書で使用される「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という語は、「限定されるものではないが、〜を含む」という句を意味し、この句と互換的に使用される。
【００９０】
本明細書で使用される「または（ｏｒ）」という語は、特段の記載がない限り、「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」という意味であり、これと互換的に使用される。
【００９１】
本明細書で使用される「トランスサイレチン」（「ＴＴＲ」）は、周知の遺伝子およびタンパク質を指す。ＴＴＲは、プレアルブミン、ＨｓＴ２６５１、ＰＡＬＢ、およびＴＢＰＡとしても知られている。ＴＴＲは、レチノール結合タンパク質（ＲＢＰ）、サイキロシン（Ｔ４）、およびレチノールの輸送体として機能し、かつプロテアーゼとしても作用する。肝臓は、ＴＴＲを血中に分泌し、脈絡叢は、ＴＴＲを脳脊髄液中に分泌する。ＴＴＲは、膵臓および網膜色素上皮でも発現する。ＴＴＲの最も大きな臨床的関連性は、正常なＴＴＲおよび突然変異ＴＴＲの両方が、凝集して細胞外沈着物となってアミロイドーシスを引き起こすアミロイド原線維を形成し得ることである。例えば、考察のためにＳａｒａｉｖａ  Ｍ．Ｊ．Ｍ．（２００２）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，４（１２）：１−１１を参照されたい。ラットトランスサイレチンの分子クローニングおよびヌクレオチド配列、ならびにｍＲＮＡ発現の分布が、Ｄｉｃｋｓｏｎ，Ｐ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０（１３）８２１４−８２１９に記載されている。ヒトＴＴＲのＸ線結晶構造が、Ｂｌａｋｅ、Ｃ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９７４）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ８８、１−１２に記載されている。ヒトＴＴＲ  ｍＲＮＡ転写物の配列は、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）において、ＲｅｆＳｅｑアクセッション番号：ＮＭ＿０００３７１で確認することができる。マウスＴＴＲ  ｍＲＮＡの配列は、ＲｅｆＳｅｑアクセッション番号：ＮＭ＿０１３６９７．２で確認することができ、ラットＴＴＲ  ｍＲＮＡの配列は、ＲｅｆＳｅｑアクセッション番号：ＮＭ＿０１２６８１．１で確認することができる。
【００９２】
本明細書で使用される「標的配列」は、一次転写産物のＲＮＡプロセシングの産物であるｍＲＮＡを含む、ＴＴＲ遺伝子の転写の際に形成されるｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の連続した部分を指す。
【００９３】
本明細書で使用される「配列を含む鎖」という語は、標準的なヌクレオチド命名法を用いて参照されるこの配列によって示されるヌクレオチド鎖を含むオリゴヌクレオチドを指す。
【００９４】
「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」、および「Ｕ」はそれぞれ、一般に、塩基としてグアニン、シトシン、アデニン、およびウラシルを含むヌクレオチドの略号である。「Ｔ」および「ｄＴ」は、本明細書では互換的に使用され、核酸塩基がチミジン、例えば、デオキシリボチミン、２’−デオキシチミジン、またはチミジンであるデオキシリボヌクレオチドを指す。しかしながら、「リボヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、または「デオキシリボヌクレオチド」という語は、詳細が後述される修飾ヌクレオチド、または代理置換部分（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｍｏｉｅｔｙ）も指すことがあることを理解されたい。当業者であれば、グアニン、シトシン、アデニン、およびウラシルを、このような置換部分を有するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対の特性を実質的に変更することなく、他の部分によって置換できることを十分に認識している。例えば、限定されるものではないが、塩基としてイノシンを含むヌクレオチドは、アデニン、シトシン、またはウラシルを含むヌクレオチドと塩基対を形成し得る。従って、ウラシル、グアニン、またはアデニンを含むヌクレオチドは、例えば、イノシンを含むヌクレオチドによって本発明のヌクレオチド配列において置換することができる。このような置換部分を含む配列は、本発明の実施形態である。
【００９５】
本明細書で互換的に使用される、「ｄｓＲＮＡ剤」、「ｄｓＲＮＡ」、「ｓｉＲＮＡ」、「ｉＲＮＡ剤」とも呼ばれる「二本鎖ＲＮＡｉ剤」、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子は、以下に定義される２つの逆平行の実質的に相補的な核酸鎖を含む二重鎖構造を有する、リボ核酸分子の複合体を指す。一般に、各鎖のヌクレオチドの殆どは、リボヌクレオチドであるが、本明細書に詳細に記載されるように、それぞれの鎖または両方の鎖は、１つ以上の非リボヌクレオチド、例えば、デオキシリボヌクレオチドおよび／または修飾ヌクレオチドも含み得る。加えて、本明細書で使用される「ＲＮＡｉ剤」は、化学修飾されたリボヌクレオチドを含むことができ；ＲＮＡｉ剤は、多数のヌクレオチドに相当数の修飾を有することができる。このような修飾は、本明細書に開示される、または当分野で公知のあらゆる種類の修飾を含み得る。ｓｉＲＮＡ型分子に使用されるこのような修飾はいずれも、本明細書および請求項の目的のために「ＲＮＡｉ剤」に包含される。
【００９６】
別の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、標的ｍＲＮＡを阻害するために細胞または器官に導入される一本鎖ｓｉＲＮＡであっても良い。一本鎖ＲＮＡｉ剤は、後に標的ｍＲＮＡを切断するＲＩＳＣエンドヌクレアーゼＡｒｇｏｎａｕｔｅ  ２に結合する。一本鎖ｓｉＲＮＡは、一般に、１５〜３０のヌクレオチドであり、化学修飾されている。一本鎖ｓｉＲＮＡのデザインおよび試験は、それぞれが参照により本明細書に組み入れられる米国特許第８，１０１，３４８号明細書およびＬｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１２）  Ｃｅｌｌ  １５０：８８３−８９４に記載されている。本明細書に記載されるいずれのアンチセンスヌクレオチド配列も、本明細書に記載される一本鎖ｓｉＲＮＡとして使用する、またはＬｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１２）  Ｃｅｌｌ  １５０；：８８３−８９４に記載されている方法によって化学修飾することができる。
【００９７】
二重鎖構造を形成する２本の鎖は、１つの大きいＲＮＡ分子の異なる部分でも良いし、または別個のＲＮＡ分子でも良い。２本の鎖が、１つの大きい分子の一部であり、従って、二重鎖構造を形成する一方の鎖の３’末端と他方の鎖の５’末端との間のヌクレオチドの連続した鎖によって接続されている場合、接続するＲＮＡ鎖は、「ヘアピンループ」と呼ばれる。２本の鎖が、二重鎖構造を形成する一方の鎖の３’末端と他方の鎖の５’末端との間のヌクレオチドの連続した鎖以外の手段によって共有結合で接続されている場合、この接続構造は「リンカー」と呼ばれる。ＲＮＡ鎖は、同数または異なる数のヌクレオチドを有し得る。塩基対の最大数は、ｄｓＲＮＡの最も短い鎖のヌクレオチドの数から二重鎖に存在する全てのオーバーハングを減じた値である。二重鎖構造に加えて、ＲＮＡｉ剤は、１つの以上のヌクレオチドオーバーハングを含み得る。本明細書で使用される「ｓｉＲＮＡ」という語も、上記のようなＲＮＡｉ剤を指す。
【００９８】
別の態様では、ＲＮＡｉ剤は、一本鎖アンチセンスＲＮＡ分子である。アンチセンスＲＮＡ分子は、標的ｍＲＮＡ内の配列に相補的である。アンチセンスＲＮＡは、ｍＲＮＡと塩基対を形成して翻訳機構を物理的に妨げることによって化学量論的に翻訳を阻害することができる。Ｄｉａｓ，  Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  １：３４７−３５５を参照されたい。アンチセンスＲＮＡ分子は、標的ｍＲＮＡに相補的な約１５〜３０のヌクレオチドを有し得る。例えば、アンチセンスＲＮＡ分子は、表１の１つのアンチセンス配列の少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上の連続したヌクレオチドの配列を有し得る。
【００９９】
本明細書で使用される「ヌクレオチドオーバーハング」は、ＲＮＡｉ剤の一方の鎖の３’末端が他方の鎖の５’末端を越えて延びている場合またはその逆の場合に、塩基対を形成していないヌクレオチド、またはＲＮＡｉ剤の二重鎖構造から突き出たヌクレオチドを指す。「平滑」または「平滑末端」とは、二本鎖ＲＮＡｉ剤の端部に塩基対を形成していないヌクレオチドが存在しない、即ち、ヌクレオチドオーバーハングが存在しないことを意味する。「平滑末端」ＲＮＡｉ剤とは、その全長に亘って二本鎖である、即ち、分子のいずれの端部にもヌクレオチドオーバーハングが存在しないｄｓＲＮＡのことである。本発明のＲＮＡｉ剤は、一端にヌクレオチドオーバーハング（即ち、一端がオーバーハングで、他端が平滑末端）を有する、または両端にヌクレオチドオーバーハングを有するＲＮＡｉ剤を含む。
【０１００】
「アンチセンス鎖」という語は、標的配列（例えば、ヒトＴＴＲ  ｍＲＮＡ）に実質的に相補的な領域を含む二本鎖ＲＮＡｉ剤の鎖を指す。本明細書で使用される「トランスサイレチンをコードするｍＲＮＡの一部に相補的な領域」という語は、ＴＴＲ  ｍＲＮＡ配列の一部に実質的に相補的なアンチセンス鎖の領域を指す。相補性の領域が、標的配列に完全には相補的でない場合、ミスマッチは、末端領域で最も許容され、存在する場合は、一般に末端領域、または、例えば、５’および／または３’末端の６、５、４、３、もしくは２ヌクレオチド以内の領域である。
【０１０１】
本明細書で使用される「センス鎖」という語は、アンチセンス鎖の領域に実質的に相補的な領域を含むｄｓＲＮＡの鎖を指す。
【０１０２】
本明細書で使用される「切断領域」という語は、切断部位のすぐ近傍に位置する領域を指す。切断部位は、切断が起こる標的上の部位である。一部の実施形態では、切断領域は、切断部位のいずれかの端部およびこの切断部位のすぐ近傍の３つの塩基を含む。一部の実施形態では、切断領域は、切断部位のいずれかの端部およびこの切断部位のすぐ近傍の２つの塩基を含む。一部の実施形態では、切断部位は、アンチセンス鎖のヌクレオチド１０および１１によって結合された部位に特異的に存在し、切断領域は、ヌクレオチド１１、１２、および１３を含む。
【０１０３】
特段の記載がない限り、本明細書で使用される「相補的な」という語は、第２のヌクレオチド配列に対する第１のヌクレオチド配列を説明するために使用される場合、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、特定の条件下で、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとハイブリダイズして二重鎖構造を形成する能力を指し、当業者には理解される。このような条件は、例えば、ストリンジェント条件とすることができ、このストリンジェント条件は：４００ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのＰＩＰＥＳ  ｐＨ６．４、１ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｏＣまたは７０ｏＣで１２〜１６時間、これに続く洗浄を含み得る。他の条件、例えば、生物体内で遭遇し得る生理的に適切な条件を適用することができる。当業者であれば、ハイブリダイズしたヌクレオチドの最終的な適用に従った２つの配列の相補性の試験に最も適切な一連の条件を決定することができる。
【０１０４】
第１および第２のヌクレオチド配列の全長に亘って、第１のヌクレオチド配列のヌクレオチドと第２のヌクレオチド配列のヌクレオチドとの塩基対合が存在する場合、配列は、互いに対して「完全に相補的」であり得る。しかしながら、本明細書では、第１の配列が、第２の配列に対して「実質的に相補的」であると述べられる場合、２つの配列が、完全に相補的であり得る、または２つの配列が、最終的な適用に対して最も適した条件下でハイブリダイズする能力を維持したまま、ハイブリダイゼーション時に４つ、３つ、または２つを超えない、１つ以上のミスマッチの塩基対を形成し得る。しかしながら、２つのオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイゼーション時に１つ以上の一本鎖オーバーハングを形成するようにデザインされている場合、このようなオーバーハングは、相補性の決定に係るミスマッチとは見なされるべきではない。例えば、２１ヌクレオチド長さの１つのオリゴヌクレオチドと、２３ヌクレオチド長さの別のオリゴヌクレオチドを含み、長い方のオリゴヌクレオチドが、短い方のオリゴヌクレオチドに完全に相補的である２１ヌクレオチドの配列を含むｄｓＲＮＡはなお、本明細書に記載される目的のために「完全に相補的」であると言うことができる。
【０１０５】
本明細書で使用される「相補的な」配列は、相補的な配列のハイブリダイズする能力についての上記の要件が満たされるのであれば、非ワトソン・クリック塩基対および／または非天然の修飾ヌクレオチドから形成された塩基対も含んでも良いし、またはワトソン・クリック塩基対および／または非天然の修飾ヌクレオチドから形成された塩基対から完全に形成されても良い。このような、非ワトソン・クリック塩基対としては、限定されるものではないが、Ｇ：Ｕゆらぎ塩基対形成またはフーグスタイン塩基対形成（Ｈｏｏｇｓｔｅｉｎ  ｂａｓｅ  ｐａｉｒｉｎｇ）が挙げられる。
【０１０６】
本明細書の「相補的な」、「完全に相補的な」、および「実質的に相補的な」という語は、これらの使用の文脈から分かるように、ｄｓＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖との間の塩基のマッチ、またはｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖と標的配列との間の塩基のマッチに対して使用することができる。
【０１０７】
本明細書で使用される、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の「少なくとも一部に実質的に相補的な」ポリヌクレオチドは、５’ＵＴＲ、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、または３’ＵＴＲを含む目的のｍＲＮＡ（例えば、ＴＴＲをコードするｍＲＮＡ）の連続した部分に実質的に相補的なポリヌクレオチドを指す。例えば、ポリヌクレオチドは、その配列が、ＴＴＲをコードするｍＲＮＡの連続した部分に実質的に相補的である場合、ＴＴＲ  ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的である。
【０１０８】
本明細書で使用される「阻害する」という語は、「減少させる」、「サイレンシングする」、「下方制御する」、「抑制する」、および他の同様の語と互換的に使用され、あらゆるレベルの阻害を含む。
【０１０９】
本明細書で使用される「ＴＴＲの発現を阻害する」という句は、あらゆるＴＴＲ遺伝子（例えば、マウスＴＴＲ遺伝子、ラットＴＴＲ遺伝子、サルＴＴＲ遺伝子、またはヒトＴＴＲ遺伝子など）およびＴＴＲ遺伝子の変異体または突然変異体の発現の阻害を含む。従って、ＴＴＲ遺伝子は、野生型ＴＴＲ遺伝子、突然変異ＴＴＲ遺伝子（例えば、全身性アミロイド沈着をもたらす突然変異ＴＴＲ遺伝子）、または遺伝子操作された細胞、細胞群、もしくは生物の文脈における遺伝子組換えＴＴＲ遺伝子であっても良い。
【０１１０】
「ＴＴＲ遺伝子の発現を阻害する」は、ＴＴＲ遺伝子の任意のレベルの阻害、例えば、ＴＴＲ遺伝子の発現の少なくとも部分的な抑制、例えば、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の阻害を含む。
【０１１１】
ＴＴＲ遺伝子の発現は、ＴＴＲ遺伝子の発現に関連した任意の変数のレベル、例えば、ＴＴＲ  ｍＲＮＡのレベル、ＴＴＲタンパク質のレベル、レチノール結合タンパク質のレベル、ビタミンＡのレベル、またはアミロイド沈着の数もしくは範囲に基づいて評価することができる。阻害は、これらの変数の１つ以上の絶対レベル、またはコントロールレベルと比較したこれらの変数の１つ以上の相対レベルの減少によって評価することができる。コントロールレベルは、当分野で利用されるあらゆる種類のコントロールレベル、例えば、投与前基準レベル、または未処置もしくはコントロール（例えば、緩衝液のみのコントロールまたは不活性剤のコントロール）で処置された類似の対象、細胞、もしくはサンプルから決定されるレベルとすることができる。
【０１１２】
本明細書で使用される「細胞にＲＮＡｉ剤を接触させる」という句は、任意の可能な手段によって細胞に接触させることを含む。細胞をＲＮＡｉ剤、例えば、二本鎖ＲＮＡｉ剤に接触させることは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞をＲＮＡｉ剤に接触させること、またはｉｎ  ｖｉｖｏの細胞をＲＮＡｉ剤に接触させることを含む。この接触は、直接的または間接的に行うことができる。従って、例えば、ＲＮＡｉ剤を、この方法を実施する個人が細胞に物理的に接触させても良いし、あるいは、ＲＮＡｉ剤を、後に細胞との接触が可能となる状況、または後に細胞に接触させられる状況においても良い。
【０１１３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞の接触は、例えば、細胞をＲＮＡｉ剤と共にインキュベートすることによって行うことができる。ｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞の接触は、例えば、細胞が位置する組織もしくはその近傍にＲＮＡｉ剤を注入することによって、または接触させられる細胞が位置する組織にＲＮＡｉ剤が後に到達するように別の領域、例えば、血流もしくは皮下腔にＲＮＡｉ剤を注入することによって行うことができる。例えば、ＲＮＡｉ剤は、ＲＮＡｉ剤を目的の部位、例えば、肝臓に誘導するリガンド、例えば、ＧａｌＮＡｃ３リガンドを含んでも良いし、かつ／またはリガンドに結合しても良い。接触させるｉｎ  ｖｉｔｒｏ法とｉｎ  ｖｉｖｏ法の組み合わせも可能である。本発明の方法に関連して、細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏでＲＮＡｉ剤に接触させて、後に対象に移植することができる。
【０１１４】
本明細書で使用される「患者」または「対象」は、ヒトまたは非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、例えば、サルを含むものとする。最も好ましくは、対象または患者はヒトである。
【０１１５】
本明細書で使用される「ＴＴＲ関連疾患」は、ＴＴＲ遺伝子またはＴＴＲタンパク質に関連したあらゆる疾患を含むものとする。このような疾患は、例えば、ＴＴＲタンパク質の過剰な産生、ＴＴＲ遺伝子の突然変異、ＴＴＲタンパク質の異常な切断、ＴＴＲと他のタンパク質または他の内因性物質もしくは外因性物質との異常な相互作用によって引き起こされ得る。「ＴＴＲ関連疾患」は、あらゆる種類のＴＴＲアミロイドーシス（ＡＴＴＲ）を含み、ＡＴＴＲでは、ＴＴＲが、異常な細胞外凝集体またはアミロイド沈着の形成に役割を果たす。ＴＴＲ関連疾患としては、老人性全身性アミロイドーシス（ＳＳＡ）、全身性家族性アミロイドーシス、家族性アミロイド多発神経障害（ＦＡＰ）、家族性アミロイド心筋症（ＦＡＣ）、軟髄膜／中枢神経系（ＣＮＳ）アミロイドーシス、アミロイド性硝子体混濁、手根管症候群、および高サイキロシン血症が挙げられる。ＴＴＲアミロイドーシスの症状としては、感覚性ニューロパシー（例えば、四肢遠位における錯感覚、感覚鈍麻）、自立性神経障害（例えば、胃腸障害、例えば、胃潰瘍、または起立性底血圧症）、運動神経障害、発作、痴呆、ミエロパシー、多発ニューロパシー、手根管症候群、自律神経不全、心筋症、硝子体混濁、腎不全、腎症、ｍＢＭＩ（修正肥満指数）の実質的な減少、脳神経障害、および格子状角膜変性症が挙げられる。
【０１１６】
本明細書で使用される「治療有効量」は、ＴＴＲ関連疾患を治療するために患者に投与されたときに、この疾患を治療する（例えば、既存の疾患または疾患の１つ以上の症状を軽減する、改善する、または維持する）のに十分なＲＮＡｉ剤の量を含むものとする。「治療有効量」は、ＲＮＡｉ剤、ＲＮＡｉ剤が投与される方法、疾患およびその重症度と病歴、年齢、体重、家族歴、遺伝子構造、ＴＴＲ発現によって媒介される病的過程の段階、以前の治療または併用療法の種類（存在する場合）、および治療される患者の他の個人的な特徴によって異なり得る。
【０１１７】
本明細書で使用される「予防有効量」は、ＴＴＲ関連疾患に罹患していない、またはその症状を示していないがこの疾患に罹患する可能性がある患者に投与されたときに、この疾患またはその１つ以上の症状を防止または改善するのに十分なＲＮＡｉ剤の量を含むものとする。改善され得る症状としては、感覚性ニューロパシー（例えば、四肢遠位における錯感覚、感覚鈍麻）、自立性神経障害（例えば、胃腸障害、例えば、胃潰瘍、または起立性底血圧症）、運動神経障害、発作、痴呆、ミエロパシー、多発ニューロパシー、手根管症候群、自律神経不全、心筋症、硝子体混濁、腎不全、腎症、ｍＢＭＩ（修正肥満指数）の実質的な減少、脳神経障害、および格子状角膜変性症が挙げられる。この疾患を改善することは、疾患の進行を遅延させること、または後に発症する疾患の重症度を軽減することを含む。「予防有効量」は、ＲＮＡｉ剤、ＲＮＡｉ剤が投与される方法、疾患のリスクの程度、および病歴、年齢、体重、家族歴、遺伝子構造、以前の治療または併用療法の種類（存在する場合）、および治療される患者の他の個人的な特徴によって異なり得る。
【０１１８】
「治療有効量」または「予防有効量」はまた、あらゆる治療に適用可能な妥当な効果／リスク比である程度の望ましい局所効果または全身効果が得られるＲＮＡｉ剤の量も含む。本発明の方法に利用されるＲＮＡｉ剤は、このような治療に適用可能な妥当な効果／リスク比をもたらす十分な量を投与することができる。
【０１１９】
本明細書で使用される「サンプル」という語は、対象から単離される同様の液体、細胞、または組織の採取物、および対象の体内に存在する液体、細胞、または組織を含む。生体液の例として、血液、血清、および漿膜液、血漿、脳脊髄液、眼液、リンパ液、尿、および唾液などが挙げられる。組織サンプルとしては、組織、器官、または局所領域からのサンプルを挙げることができる。例えば、サンプルは、特定の器官、器官の一部、またはこれらの器官内の液体もしくは細胞に由来し得る。特定の実施形態では、サンプルは、肝臓（例えば、全肝臓、肝臓の特定の部分、もしくは肝臓の特定の種類の細胞、例えば、肝細胞）、網膜もしくは網膜の一部（例えば、網膜色素上皮）、中枢神経系または中枢神経系の一部（例えば、脳室もしくは脈絡叢）、または膵臓もしくは膵臓の特定の細胞や一部に由来し得る。一部の実施形態では、「対象に由来するサンプル」は、対象から採取された脳脊髄液を指す。好ましい実施形態では、「対象に由来するサンプル」は、対象から採取された血液または血漿を指す。さらなる実施形態では、「対象に由来するサンプル」は、対象に由来する肝組織（もしくはその小成分）または網膜組織（もしくはその小成分）を指す。
【０１２０】
ＩＩ．ＲＮＡｉ剤
本発明は、優れた遺伝子サイレンシング活性を有するＲＮＡｉ剤を提供する。３つの連続したヌクレオチドにおける３つの同一の修飾からなる１つ以上のモチーフを、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖および／またはアンチセンス鎖、特に切断部位またはその近傍に導入することによって優れた結果を得ることができることが、本明細書および米国仮特許出願第６１／５６１，７１０号明細書（本出願が優先権を主張する）に示されている。ＲＮＡｉ剤のセンス鎖および／またはアンチセンス鎖は、他の方法で完全に修飾しても良い。このようなモチーフの導入は、センス鎖および／またはアンチセンス鎖に修飾パターンが存在する場合は、この修飾パターンを阻害する。ＲＮＡｉ剤はまた、任意選択で、例えば、センス鎖のＧａｌＮＡｃ誘導体リガンドにコンジュゲートする。得られるＲＮＡｉ剤は、優れた遺伝子サイレンシング活性を示す。
【０１２１】
本発明者らは、驚くべきことに、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖および／またはアンチセンス鎖が完全に修飾されている場合、ＲＮＡｉ剤の少なくとも一方の鎖の切断部位またはその近傍に３つの連続したヌクレオチドにおける３つの同一の修飾からなる１つ以上のモチーフを有することにより、ＲＮＡｉ剤の遺伝子サイレンシング活性が著しく高められることを見出した。
【０１２２】
従って、本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの標的遺伝子（即ち、ＴＴＲ遺伝子）の発現を阻害することができるＲＮＡｉ剤、例えば、二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供する。ＲＮＡｉ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む。ＲＮＡｉ剤の各鎖は、１２〜３０のヌクレオチド長さの範囲とすることができる。例えば、各鎖は、１４〜３０のヌクレオチド長さ、１７〜３０のヌクレオチド長さ、２５〜３０のヌクレオチド長さ、２７〜３０のヌクレオチド長さ、１７〜２３のヌクレオチド長さ、１７〜２１のヌクレオチド長さ、１７〜１９のヌクレオチド長さ、１９〜２５のヌクレオチド長さ、１９〜２３のヌクレオチド長さ、１９〜２１のヌクレオチド長さ、２１〜２５のヌクレオチド長さ、または２１〜２３のヌクレオチド長さの範囲とすることができる。
【０１２３】
センス鎖およびアンチセンス鎖は、典型的には、本明細書では「ＲＮＡｉ剤」とも呼ばれる二重鎖ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ」）を形成する。ＲＮＡｉの二重鎖領域は、１２〜３０のヌクレオチド対の長さとすることができる。例えば、二重鎖領域は、１４〜３０のヌクレオチド対の長さ、１７〜３０のヌクレオチド対の長さ、２７〜３０のヌクレオチド対の長さ、１７〜２３のヌクレオチド対の長さ、１７〜２１のヌクレオチド対の長さ、１７〜１９のヌクレオチド対の長さ、１９〜２５のヌクレオチド対の長さ、１９〜２３のヌクレオチド対の長さ、１９〜２１のヌクレオチド対の長さ、２１〜２５のヌクレオチド対の長さ、または２１〜２３のヌクレオチド対の長さとすることができる。別の例では、二重鎖領域は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、および２７のヌクレオチド対の長さから選択される。
【０１２４】
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、鎖の３’末端、５’末端、または両末端にＲＮＡｉ剤の１つ以上のオーバーハング領域および／またはキャッピング基を含み得る。オーバーハングは、１〜６のヌクレオチド長さ、例えば、２〜６のヌクレオチド長さ、１〜５のヌクレオチド長さ、２〜５のヌクレオチド長さ、１〜４のヌクレオチド長さ、２〜４のヌクレオチド長さ、１〜３のヌクレオチド長さ、２〜３のヌクレオチド長さ、または１〜２のヌクレオチド長さとすることができる。オーバーハングは、一方の鎖が他方の鎖よりも長い結果、または同じ長さの２本の鎖がシフトした結果として起こり得る。オーバーハングは、標的ｍＲＮＡとのミスマッチを形成し得る、またはオーバーハングは、標的とされる遺伝子配列に相補的であっても良いし、もしくは他の配列であっても良い。第１の鎖と第２の鎖は、例えば、ヘアピンを形成する追加の塩基によって、または他の非塩基リンカーによって接続することができる。
【０１２５】
本発明によって提供されるＲＮＡｉ剤は、例えば、参照によりそれらの全開示内容が本明細書に組み入れられる、２０１１年１１月１８日出願の米国仮特許出願第６１／５６１，７１０号明細書、２０１０年９月１５日出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０５１５９７号明細書、およびＰＣＴ国際公開特許ＷＯ２００９／０７３８０９号パンフレットに開示されている化学修飾を有する作用剤を含む。
【０１２６】
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤のオーバーハング領域におけるヌクレオチドはそれぞれ独立して、限定されるものではないが、２’−糖修飾、例えば、２−Ｆ、２’−Ｏ−メチル、チミジン（Ｔ）、２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン（Ｔｅｏ）、２’−Ｏ−メトキシエチルアデノシン（Ａｅｏ）、２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルシチジン（ｍ５Ｃｅｏ）、およびこれらの任意の組み合わせを含め、修飾されたヌクレオチドであっても良いし、または非修飾ヌクレオチドであっても良い。例えば、ＴＴは、いずれかの鎖のいずれかの末端のオーバーハング配列とすることができる。オーバーハングは、標的ｍＲＮＡとのミスマッチを形成し得る、またはオーバーハングは、標的とされる遺伝子配列に相補的であっても良いし、もしくは他の配列であっても良い。
【０１２７】
ＲＮＡｉ剤のセンス鎖、アンチセンス鎖、または両方の鎖における５’または３’オーバーハングは、リン酸化されても良い。一部の実施形態では、オーバーハング領域は、間にホスホロチオエートを有する２つのヌクレオチドを含み、この２つのヌクレオチドは、同じヌクレオチドでも良いし、異なるヌクレオチドでも良い。一実施形態では、オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖、または両方の鎖の３’末端に存在する。一実施形態では、この３’オーバーハングは、アンチセンス鎖に存在する。一実施形態では、この３’オーバーハングは、センス鎖に存在する。
【０１２８】
ＲＮＡｉ剤は、全体の安定性に影響を与えずに、ＲＮＡｉ剤の干渉活性を高めることができる１つのオーバーハングのみを含み得る。例えば、一本鎖オーバーハングは、センス鎖の３’末端、あるいはアンチセンス鎖の３’末端に位置する。ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖の５’末端（またはセンス鎖の３’末端）に位置する平滑末端を有しても良いし、またはこの逆であっても良い。一般に、ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、３’末端のヌクレオチドオーバーハングを有し、５’末端は平滑である。出願者は、理論に拘束されるものではないが、理論的機構では、非対称な、センス鎖の５’末端の平滑末端とアンチセンス鎖の３’末端オーバーハングは、ＲＩＳＣプロセスに添加されるガイド鎖を好む。
【０１２９】
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、１９のヌクレオチド長さの平滑末端二本鎖（ｄｏｕｂｌｅ  ｅｎｄｅｄ  ｂｌｕｎｔｍｅｒ）であり、センス鎖は、５’末端の７位、８位、９位の３つの連続したヌクレオチドにおける３つの２’−Ｆ修飾からなる少なくとも１つのモチーフを含む。アンチセンス鎖は、５’末端の１１位、１２位、１３位の３つの連続したヌクレオチドにおける３つの２’−Ｏ−メチル修飾からなる少なくとも１つのモチーフを含む。
【０１３０】
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、２０のヌクレオチド長さの平滑末端二本鎖であり、センス鎖は、５’末端の８位、９位、１０位の３つの連続したヌクレオチドにおける３つの２’−Ｆ修飾からなる少なくとも１つのモチーフを含む。アンチセンス鎖は、５’末端の１１位、１２位、１３位の３つの連続したヌクレオチドにおける３つの２’−Ｏ−メチル修飾からなる少なくとも１つのモチーフを含む。
【０１３１】
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、２１のヌクレオチド長さの平滑末端二本鎖であり、センス鎖は、５’末端の９位、１０位、１１位の３つの連続したヌクレオチドにおける３つの２’−Ｆ修飾からなる少なくとも１つのモチーフを含む。アンチセンス鎖は、５’末端の１１位、１２位、１３位の３つの連続したヌクレオチドにおける３つの２’−Ｏ−メチル修飾からなる少なくとも１つのモチーフを含む。
【０１３２】
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、２１のヌクレオチド（ｎｔ）長さのセンス鎖および２３のヌクレオチド（ｎｔ）長さのアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、５’末端の９位、１０位、１１位の３つの連続したヌクレオチドにおける３つの２’−Ｆ修飾からなる少なくとも１つのモチーフを含み：アンチセンス鎖は、５’末端の１１位、１２位、１３位の３つの連続したヌクレオチドにおける３つの２’−Ｏ−メチル修飾からなる少なくとも１つのモチーフを含み、ＲＮＡｉ剤の一方の末端は、平滑であり、他方の末端は、２つのヌクレオチドのオーバーハングを有する。好ましくは、２つのヌクレオチドのオーバーハングは、アンチセンス鎖の３’末端にある。任意選択で、ＲＮＡｉ剤は、リガンド（好ましくはＧａｌＮＡｃ３）をさらに含む。
【０１３３】
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、２５〜３０のヌクレオチド残基の長さであり、５’末端のヌクレオチド（１位）から始まり、第１の鎖の１位〜２３位は、少なくとも８つのリボヌクレオチドを含み；アンチセンス鎖は、３６〜６６のヌクレオチド残基の長さであり、３’末端のヌクレオチドから始まり、二重鎖を形成するセンス鎖の１位〜２３位と対を形成する位置に少なくとも８つのリボヌクレオチドを含み；アンチセンス鎖の少なくとも３’末端のヌクレオチドは、センス鎖と対を形成せず、最大６つの連続した３’末端ヌクレオチドが、センス鎖と対を形成せず、これにより、１〜６のヌクレオチドの３’一本鎖オーバーハングが形成され；アンチセンス鎖の５’末端は、センス鎖と対を形成しない１０〜３０の連続したヌクレオチドを含み、これにより、１０〜３０のヌクレオチドの一本鎖５’オーバーハングが形成され；少なくともセンス鎖の５’末端および３’末端のヌクレオチドは、センス鎖とアンチセンス鎖が最大の相補性となるように整列したときに、アンチセンス鎖のヌクレオチドと塩基対を形成し、これにより、センス鎖とアンチセンス鎖との間に実質的に二重鎖領域が形成され；アンチセンス鎖は、二本鎖核酸が哺乳動物の細胞に導入されたときに標的遺伝子の発現を低減するように、アンチセンス鎖の長さの少なくとも１９のリボヌクレオチドに沿って標的ＲＮＡに十分に相補的であり；センス鎖は、３つの連続したヌクレオチドにおける３つの２’−Ｆ修飾からなる少なくとも１つのモチーフを含み、この少なくとも１つのモチーフが、切断部位またはその近傍に存在する。アンチセンス鎖は、切断部位またはその近傍の３つの連続したヌクレオチドにおける３つの２’−Ｏ−メチル修飾からなる少なくとも１つのモチーフを含む。
【０１３４】
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、ＲＮＡｉ剤は、少なくとも２５、最大で２９のヌクレオチド長さを有する第１の鎖、および５’末端から１１位、１２位、１３位にある３つの連続したヌクレオチドにおける３つの２’−Ｏ−メチル修飾からなる少なくとも１つのモチーフを有する、最大で３０のヌクレオチド長さを有する第２の鎖を含み；第１の鎖の３’末端および第２の鎖の５’末端は、平滑末端を形成し、第２の鎖は、３’末端で第１の鎖よりも１〜４ヌクレオチド長く、二重鎖領域は、少なくとも２５のヌクレオチド長さであり、第２の鎖は、ＲＮＡｉ剤が哺乳動物の細胞に導入されたときに標的遺伝子の発現を低減するように、第２の鎖の長さの少なくとも１９のヌクレオチドに沿って標的ｍＲＮＡに十分に相補的であり、ＲＮＡｉ剤のダイサー切断（ｄｉｃｅｒ  ｃｌｅａｖａｇｅ）が、優先的に第２の鎖の３’末端を含むｓｉＲＮＡをもたらし、これにより、哺乳動物における標的遺伝子の発現が低減する。任意選択で、ＲＮＡｉ剤は、リガンドをさらに含む。
【０１３５】
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、３つの連続したヌクレオチドにおける３つの同一の修飾からなる少なくとも１つのモチーフを含み、モチーフの１つは、センス鎖の切断部位に存在する。
【０１３６】
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖も、３つの連続したヌクレオチドにおける３つの同一の修飾からなる少なくとも１つのモチーフを含んでも良く、モチーフの１つは、アンチセンス鎖の切断部位またはその近傍に存在する。
【０１３７】
１７〜２３のヌクレオチド長さの二重鎖領域を有するＲＮＡｉ剤では、アンチセンス鎖の切断部位は、典型的には、５’末端から１０位、１１位、および１２位の付近である。従って、３つの同一の修飾からなるモチーフは、アンチセンス鎖の９位、１０位、１１位；１０位、１１位、１２位；１１位、１２位、１３位；１２位、１３位、１４位；１３位、１４位、１５位に存在しても良く、この位置は、アンチセンス鎖の５’末端から、最初のヌクレオチドから数え始められる、またはアンチセンス鎖の５’末端の二重鎖領域内の最初の対を形成したヌクレオチドから数え始められる。アンチセンス鎖の切断部位はまた、５’末端のＲＮＡｉ剤の二重鎖領域の長さに従って変更され得る。
【０１３８】
ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、その鎖の切断部位の３つの連続したヌクレオチドにおける３つの同一の修飾からなる少なくとも１つのモチーフを含むことができ；アンチセンス鎖は、その鎖の切断部位またはその近傍の３つの連続したヌクレオチドにおける３つの同一の修飾からなる少なくとも１つのモチーフを有し得る。センス鎖とアンチセンス鎖がｄｓＲＮＡ二重鎖を形成する場合は、センス鎖とアンチセンス鎖は、センス鎖の３つのヌクレオチドからなる１つのモチーフおよびアンチセンス鎖の３つのヌクレオチドからなる１つのモチーフが、少なくとも１つのヌクレオチドのオーバーラップ、即ち、センス鎖のモチーフの３つのヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、アンチセンス鎖のモチーフの３つのヌクレオチドのうちの少なくとも１つと塩基対を形成するように整列させることができる。あるいは、少なくとも２つのヌクレオチドがオーバーラップする、または３つ全てのヌクレオチドがオーバーラップしても良い。
【０１３９】
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、３つの連続したヌクレオチドの３つの同一の修飾からなる２つ以上のモチーフを含むことができる。第１のモチーフは、センス鎖の切断部位またはその近傍に存在するべきであり、他方のモチーフは、ウィング修飾（ｗｉｎｇ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）であっても良い。本明細書の「ウィング修飾」という語は、鎖の切断部位またはその近傍のモチーフから離れた同じ鎖の別の部分に存在するモチーフを指す。ウィング修飾は、第１のモチーフの近傍であるか、または少なくとも１つ以上のヌクレオチドによって離隔している。モチーフが、その性質化学的よりも互いに接近している場合は、モチーフは互いに異なり、モチーフが、その化学的性質よりも１つ以上のヌクレオチドによって離隔している場合は、モチーフは、同じであるか、または異なることもある。２つ以上のウィング修飾が存在しても良い。例えば、２つのウィング修飾が存在する場合、各ウィング修飾は、切断部位もしくはその近傍の第１のモチーフに対する一端に、またはリードモチーフ（ｌｅａｄ  ｍｏｔｉｆ）のいずれかの側に存在し得る。
【０１４０】
センス鎖と同様に、ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、３つの連続したヌクレオチドの３つの同一の修飾からなる少なくとも２つのモチーフを含み得、少なくとも１つのモチーフは、アンチセンス鎖の切断部位またはその近傍に存在する。このアンチセンス鎖はまた、センス鎖に存在するウィング修飾と同様の配列で１つ以上のウィング修飾も含み得る。
【０１４１】
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖またはアンチセンス鎖のウィング修飾は、典型的には、鎖の３’末端、５’末端、または両方の末端の最初の１つまたは２つの末端ヌクレオチドを含まない。
【０１４２】
別の実施形態では、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖またはアンチセンス鎖のウィング修飾は、典型的には、鎖の３’末端、５’末端、または両方の末端の二重鎖領域内の最初の１つまたは２つの塩基対形成ヌクレオチドを含まない。
【０１４３】
ＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖がそれぞれ、少なくとも１つのウィング修飾を含む場合、このウィング修飾は、二重鎖領域の同じ末端に存在しても良く、１つ、２つ、または３つのヌクレオチドのオーバーラップを有する。
【０１４４】
ＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖がそれぞれ、少なくとも２つのウィング修飾を含む場合、センス鎖およびアンチセンス鎖は、１つの鎖の２つの修飾がそれぞれ、二重鎖領域の一端に位置して１つ、２つ、または３つのヌクレオチドのオーバーラップを有する；１つの鎖の２つの修飾がそれぞれ、二重鎖領域の他端に位置して１つ、２つ、または３つのヌクレオチドのオーバーラップを有する；１つの鎖の２つの修飾が、リードモチーフの各側に位置して、二重鎖領域に１つ、２つ、または３つのヌクレオチドのオーバーラップを有する、ように整列させることができる。
【０１４５】
一実施形態では、モチーフの一部であるヌクレオチドを含む、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖における各ヌクレオチドを修飾しても良い。各ヌクレオチドは、同じまたは異なる修飾で修飾しても良く、この修飾は、非結合リン酸酸素および／または１つ以上の結合リン酸酸素の一方または両方の１つ以上の変更；リボース糖の成分、例えば、リボース糖の２’ヒドロキシルの変更；リン酸部分の「脱リン酸」リンカー（“ｄｅｐｈｏｓｐｈｏ”ｌｉｎｋｅｒ）での大量の置換；天然の塩基の修飾または置換；およびリボース−リン酸骨格の置換または修飾を含み得る。
【０１４６】
核酸がサブユニットの重合体であるため、多くの修飾、例えば、塩基、リン酸部分、またはリン酸部分の非結合Ｏの修飾は、核酸内の繰り返される位置に存在する。場合によっては、修飾は、核酸内の全ての目的の位置に存在するが、多くの場合はそうではない。一例として、修飾は、３’または５’末端位置のみに存在しても良く、末端領域、例えば、末端ヌクレオチドの位置または鎖の最後の２つ、３つ、４つ、５つ、または１０のヌクレオチドのみに存在しても良い。修飾は、二本鎖領域、一本鎖領域、または両方に存在し得る。修飾は、ＲＮＡの二本鎖領域のみに存在しても良いし、またはＲＮＡの一本鎖領域のみに存在しても良い。例えば、非結合酸素位置でのホスホロチオエート修飾は、一方もしくは両方の末端のみに存在しても良いし、末端領域、例えば、末端ヌクレオチドのある位置、または鎖の最後の２つ、３つ、４つ、５つ、もしくは１０のヌクレオチドのみに存在しても良いし、あるいは二本鎖領域および一本鎖領域、特に末端に存在しても良い。５’末端または両末端は、リン酸化されても良い。
【０１４７】
例えば、安定性を高めること、オーバーハングに特定の塩基を含めること、あるいは一本鎖オーバーハング、例えば、５’もしくは３’オーバーハング、または両方のオーバーハングに修飾ヌクレオチドもしくはヌクレオチド代用物を含めることが可能であろう。例えば、オーバーハングにプリンヌクレオチドを含めることが望ましい場合もある。一部の実施形態では、３’または５’オーバーハングの全てまたは一部の塩基を、例えば、本明細書に記載される修飾で修飾しても良い。修飾は、例えば、当分野で公知の修飾を用いたリボース糖の２’位での修飾の使用、例えば、核酸塩基のリボ糖ではなくデオキシリボヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロ（２’−Ｆ）、または２’−Ｏ−メチル修飾の使用、およびリン酸基の修飾、例えば、ホスホチオエート修飾を含み得る。オーバーハングは、標的配列と相同である必要はない。
【０１４８】
一実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖の各残基は独立して、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’−メトキシエチル、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｃ−アリル、２’−デオキシ、２’−ヒドロキシル、または２’−フルオロで修飾される。センス鎖およびアンチセンス鎖は、２つ以上の修飾を含み得る。一実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖の各残基は独立して、２’−Ｏ−メチルまたは２’−フルオロで修飾される。
【０１４９】
少なくとも２つの異なる修飾が、典型的には、センス鎖およびアンチセンス鎖に存在する。これらの２つの修飾は、２’−Ｏ−メチルもしくは２’−フルオロ、または他のものであっても良い。
【０１５０】
一実施形態では、Ｎａおよび／またはＮｂは、交互パターンの修飾を含む。本明細書で使用される「交互モチーフ」という語は、各修飾が１つの鎖の交互ヌクレオチドに存在する１つ以上の修飾を有するモチーフを指す。交互ヌクレオチドは、１つおきのヌクレオチドに１つ、３つおきのヌクレオチドに１つ、または同様のパターンを指し得る。例えば、Ａ、Ｂ、およびＣがそれぞれ、ヌクレオチドに対する１種類の修飾を表す場合、交互モチーフは、「ＡＢＡＢＡＢＡＢＡＢＡＢ．．．」、「ＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢ．．．」、「ＡＡＢＡＡＢＡＡＢＡＡＢ．．．」、「ＡＡＡＢＡＡＡＢＡＡＡＢ．．．」、「ＡＡＡＢＢＢＡＡＡＢＢＢ．．．」、または「ＡＢＣＡＢＣＡＢＣＡＢＣ．．．」などであり得る。
【０１５１】
交互モチーフに含まれる修飾の種類は、同じであっても良いし、または異なっていても良い。例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄがそれぞれ、ヌクレオチドの１種類の修飾を表す場合、交互パターン、即ち、１つおきのヌクレオチドの修飾は、同じでも良いが、センス鎖またはアンチセンス鎖はそれぞれ、交互モチーフ、例えば、「ＡＢＡＢＡＢ．．．」、「ＡＣＡＣＡＣ．．．」、「ＢＤＢＤＢＤ．．．」、または「ＣＤＣＤＣＤ．．．」などの内部の修飾のいくつかの可能性から選択することができる。
【０１５２】
一実施形態では、本発明のＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖における交互モチーフの修飾パターンに対してシフトしている、センス鎖における交互モチーフの修飾パターンを含む。このシフトは、センス鎖のヌクレオチドの修飾基が、アンチセンス鎖のヌクレオチドの異なる修飾基に対応するようなシフトであっても良いし、この逆のシフトでも良い。例えば、センス鎖は、ｄｓＲＮＡ二重鎖におけるアンチセンス鎖と塩基対を形成した場合、センス鎖における交互モチーフが、センス鎖の５’から３’へ「ＡＢＡＢＡＢ」で始まり、アンチセンス鎖における交互モチーフが、二重鎖領域内のアンチセンス鎖の５’から３’へ「ＢＡＢＡＢＡ」で始まり得る。別の例として、センス鎖における交互モチーフは、センス鎖の５’から３’へ「ＡＡＢＢＡＡＢＢ」で始まり、アンチセンス鎖における交互モチーフは、二重鎖領域内のアンチセンス鎖の５’から３’へ「ＢＢＡＡＢＢＡＡ」で始まり得るため、センス鎖とアンチセンス鎖との間の修飾パターンの完全な、または部分的なシフトが存在する。
【０１５３】
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、最初に、センス鎖における２’−Ｏ−メチル修飾と２’−Ｆ修飾との交互モチーフのパターンを有し、このパターンは、最初に、アンチセンス鎖における２’−Ｏ−メチル修飾と２’−Ｆ修飾との交互モチーフのパターンに対してシフトを有する、即ち、センス鎖における２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドは、アンチセンス鎖における２’−Ｆ修飾ヌクレオチドと塩基対を形成し、逆の場合も同様である。センス鎖の１位は、２’−Ｆ修飾で始まることができ、アンチセンス鎖の１位は、２’−Ｏ−メチル修飾で始まることができる。
【０１５４】
３つの連続したヌクレオチドにおける３つの同一の修飾からなる１つ以上のモチーフのセンス鎖および／またはアンチセンス鎖への導入は、センス鎖および／またはアンチセンス鎖に存在する最初の修飾パターンを中断する。３つの連続したヌクレオチドにおける３つの同一の修飾からなる１つ以上のモチーフのセンス鎖および／またはアンチセンス鎖への導入による、センス鎖および／またはアンチセンス鎖に存在する最初の修飾パターンのこの中断は、標的遺伝子に対する遺伝子サイレンシング活性を驚くほど高める。
【０１５５】
一実施形態では、３つの連続したヌクレオチドにおける３つの同一の修飾からなるモチーフが、いずれの鎖に導入される場合も、モチーフの次のヌクレオチドの修飾は、モチーフの修飾とは異なる修飾である。例えば、モチーフを含む配列の一部は、「．．．ＮａＹＹＹＮｂ．．．」であり、「Ｙ」は、３つの連続したヌクレオチドにおける３つの同一の修飾からなるモチーフの修飾を表し、「Ｎａ」および「Ｎｂ」は、Ｙの修飾とは異なる、モチーフ「ＹＹＹ」の次のヌクレオチドの修飾を表し、ＮａおよびＮｂは、同じ修飾でも異なる修飾でも良い。あるいは、Ｎａおよび／またはＮｂは、ウィング修飾が存在する場合は、存在しても存在しなくても良い。
【０１５６】
ＲＮＡｉ剤は、少なくとも１つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合をさらに含み得る。ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合の修飾は、センス鎖もしくはアンチセンス鎖、または両鎖のいずれかの位置のどのヌクレオチドにも存在し得る。例えば、ヌクレオチド間結合の修飾は、センス鎖およびアンチセンス鎖のどのヌクレオチドにも存在し得る；各ヌクレオチド間結合の修飾は、センス鎖もしくはアンチセンス鎖における交互パターンに存在し得る；あるいはセンス鎖もしくはアンチセンス鎖は、交互パターンにおける両方のヌクレオチド間結合の修飾を含み得る。センス鎖におけるヌクレオチド間結合の修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖と同じでも異なっても良く、センス鎖におけるヌクレオチド間結合の修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖におけるヌクレオチド間結合の修飾の交互パターンに対してシフトを有しても良い。
【０１５７】
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、オーバーハング領域にホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合の修飾を含む。例えば、オーバーハング領域は、２つのヌクレオチド間にホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合を有する２つのヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチド間結合の修飾は、オーバーハングヌクレオチドを二重鎖領域内の末端の塩基対形成ヌクレオチドに結合させるために形成することもできる。例えば、少なくとも２つ、３つ、４つ、または全てのオーバーハングヌクレオチドを、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合によって結合することができ、任意選択で、オーバーハングヌクレオチドをその次の塩基対形成ヌクレオチドに結合する追加的なホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合が存在しても良い。例えば、末端の３つのヌクレオチド間に少なくとも２つのホスホチオエートのヌクレオチド間結合が存在しても良く、この末端の３つのヌクレオチドのうちの２つは、オーバーハングヌクレオチドであり、第３のヌクレオチドは、オーバーハングヌクレオチドの次の塩基対形成ヌクレオチドである。好ましくは、これらの末端の３つのヌクレオチドは、アンチセンス鎖の３’末端に存在し得る。
【０１５８】
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、標的とのミスマッチ（複数可）、二重鎖内のミスマッチ（複数可）、またはこれらの組み合わせを含む。ミスマッチは、オーバーハング領域、または二重鎖領域で生じ得る。塩基対は、解離または融解（例えば、特定の対合の結合または解離の自由エネルギーに対してであり、最も単純なアプローチは、個々の塩基対ベースで塩基対を評価することであるが、類縁または同様の分析を用いることもできる）を促進する傾向に基づいてランク付けすることができる。解離の促進に関しては、Ａ：Ｕは、Ｇ：Ｃよりも好ましく；Ｇ：ＵはＧ：Ｃよりも好ましく；Ｉ：ＣはＧ：Ｃよりも好ましい（Ｉ＝イノシンである）。ミスマッチ、例えば、非正準な対合または正準以外の対合（本明細書の他の部分に記載）は、正準な対合（Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｃ）よりも好ましく；ユニバーサル塩基を含む塩基対は、正準な対合よりも好ましい。
【０１５９】
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｕ、Ｉ：Ｃの群から独立して選択することができるアンチセンス鎖の５’末端からの二重鎖領域内の最初の１つ、２つ、３つ、４つ、または５つの塩基対の少なくとも１つ、および二重鎖の５’末端におけるアンチセンス鎖の解離を促進するためのミスマッチ対合、例えば、非正準な対合もしくは正準以外の対合、またはユニバーサル塩基を含む対合を含む。
【０１６０】
一実施形態では、アンチセンス鎖の５’末端からの二重鎖領域内の１位にあるヌクレオチドは、Ａ、ｄＡ、ｄＵ、Ｕ、およびｄＴからなる群から選択される。あるいは、ンチセンス鎖の５’末端からの二重鎖領域内の最初の１つ、２つ、または３つの塩基対の少なくとも１つは、ＡＵ塩基対である。例えば、アンチセンス鎖の５’末端からの二重鎖領域内の最初の塩基対は、ＡＵ塩基対である。
【０１６１】
一実施形態では、センス鎖配列は、式（Ｉ）で表すことができる：
５’ｎｐ−Ｎａ−（ＸＸＸ）ｉ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎｂ−（ＺＺＺ）ｊ−Ｎａ−ｎｑ３’    （Ｉ）
式中、
ｉおよびｊはそれぞれ独立して、０または１であり；
ｐおよびｑはそれぞれ独立して、０〜６であり；
各Ｎａは独立して、０〜２５の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２つの異なって修飾されたヌクレオチドを含み；
各Ｎｂは独立して、０〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
各ｎｐおよびｎｑは独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し；
ＮｂおよびＹは、同じ修飾を有しておらず；かつ
ＸＸＸ、ＹＹＹ、およびＺＺＺはそれぞれ独立して、３つの連続したヌクレオチドにおける３つの同一の修飾からなる１つのモチーフを表している。好ましくは、ＹＹＹは、２’−Ｆ修飾ヌクレオチドである。
【０１６２】
一実施形態では、Ｎａおよび／またはＮｂは、交互パターンの修飾を含む。
【０１６３】
一実施形態では、ＹＹＹモチーフは、センス鎖の切断部位またはその近傍に存在する。例えば、ＲＮＡｉ剤が、１７〜２３のヌクレオチド長さの二重鎖領域を有する場合、ＹＹＹモチーフは、センス鎖の切断部位またはその近傍に存在し得（例えば、６位、７位、８位；７位、８位、９位；８位、９位、１０位；９位、１０位、１１位；１０位、１１位，１２位；または１１位、１２位、１３位に存在し得）、この位置は、５’末端から、最初のヌクレオチドから数え始められる；または任意選択で、５’末端から、二重鎖領域内の最初の塩基対形成ヌクレオチドから数え始められる。
【０１６４】
一実施形態では、ｉが１でｊが０である、ｉが０でｊが１である、またはｉとｊの両方が１である。従って、センス鎖は、以下の式で表すことができる：
５’ｎｐ−Ｎａ−ＹＹＹ−Ｎｂ−ＺＺＺ−Ｎａ−ｎｑ３’    （Ｉａ）
５’ｎｐ−Ｎａ−ＸＸＸ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎａ−ｎｑ３’    （Ｉｂ）；または
５’ｎｐ−Ｎａ−ＸＸＸ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎｂ−ＺＺＺ−Ｎａ−ｎｑ３’    （Ｉｃ）。
【０１６５】
センス鎖が、式（Ｉａ）で表される場合、Ｎｂは、０〜１０、０〜７、０〜５、０〜４、０〜２、または０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表している。各Ｎａは独立して、２〜２０、２〜１５、または２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表すことができる。
【０１６６】
センス鎖が、式（Ｉｂ）で表される場合、Ｎｂは、０〜１０、０〜７、０〜１０、０〜５、０〜４、０〜２、または０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表している。各Ｎａは独立して、２〜２０、２〜１５、または２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表すことができる。
【０１６７】
センス鎖が、式（Ｉｃ）で表される場合、各Ｎｂは独立して、０〜１０、０〜７、０〜５、０〜４、０〜２、または０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表している。好ましくは、Ｎｂは、０、１、２、３、４、５、または６である。各Ｎａは独立して、２〜２０、２〜１５、または２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表すことができる。
【０１６８】
Ｘ、Ｙ、およびＺはそれぞれ、互いに同じであっても良いし、または異なっていても良い。
【０１６９】
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖配列は、式（ＩＩ）によって表すことができる：
５’ｎｑ’−Ｎａ’−（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｋ−Ｎｂ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ’−（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｌ−Ｎ’ａ−ｎｐ’３’    （ＩＩ）
式中、
ｋおよびｌはそれぞれ独立して、０または１であり；
ｐ’およびｑ’はそれぞれ独立して、０〜６であり；
各Ｎａ’は独立して、０〜２５の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２つの異なって修飾されたヌクレオチドを含み；
各Ｎｂ’は独立して、０〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
各ｎｐ’およびｎｑ’は独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し；
Ｎｂ’およびＹ’は、同じ修飾を有しておらず；かつ
Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、およびＺ’Ｚ’Ｚ’はそれぞれ独立して、３つの連続したヌクレオチドにおける３つの同一の修飾からなる１つのモチーフを表している。
【０１７０】
一実施形態では、Ｎａ’および／またはＮｂ’は、交互パターンの修飾を含む。
【０１７１】
Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、アンチセンス鎖の切断部位またはその近傍に存在する。例えば、ＲＮＡｉ剤は、１７〜２３のヌクレオチド長さの二重鎖領域を有し、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、アンチセンス鎖の９位、１０位、１１位；１０位、１１位、１２位；１１位、１２位、１３位；１２位、１３位、１４位；または１３位、１４位、１５位に存在し得、この位置は、５’末端から、最初のヌクレオチドから数え始められる；または任意選択で、５’末端から、二重鎖領域内の最初の塩基対形成ヌクレオチドから数え始められる。好ましくは、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、１１位、１２位、１３位に存在する。
【０１７２】
一実施形態では、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチドである。
【０１７３】
一実施形態では、ｋが１でｌが０である、ｋが０でｌがｌである、またはｋとｌの両方が１である。
【０１７４】
従って、アンチセンス鎖は、以下の式で表すことができる：
５’ｎｑ’−Ｎａ’−Ｚ’Ｚ’Ｚ’−Ｎｂ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎａ’−ｎｐ’３’    （ＩＩａ）；
５’ｎｑ’−Ｎａ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ’−Ｘ’Ｘ’Ｘ’−ｎｐ’３’    （ＩＩｂ）；または
５’ｎｑ’−Ｎａ’−Ｚ’Ｚ’Ｚ’−Ｎｂ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ’−Ｘ’Ｘ’Ｘ’−Ｎａ’−ｎｐ’３’    （ＩＩｃ）。
【０１７５】
アンチセンス鎖が、式（ＩＩａ）で表される場合、Ｎｂ’は、０〜１０、０〜７、０〜１０、０〜７、０〜５、０〜４、０〜２、または０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表している。各Ｎａ’は独立して、２〜２０、２〜１５、または２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表している。
【０１７６】
アンチセンス鎖が、式（ＩＩｂ）で表される場合、Ｎｂ’は、０〜１０、０〜７、０〜１０、０〜７、０〜５、０〜４、０〜２、または０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表している。各Ｎａ’は独立して、２〜２０、２〜１５、または２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表している。
【０１７７】
アンチセンス鎖が、式（ＩＩｃ）で表される場合、各Ｎｂ’は独立して、０〜１０、０〜７、０〜１０、０〜７、０〜５、０〜４、０〜２、または０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表している。各Ｎａ’は独立して、２〜２０、２〜１５、または２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表している。好ましくは、Ｎｂは、０、１、２、３、４、５、または６である。
【０１７８】
Ｘ’、Ｙ’、およびＺ’はそれぞれ、互いに同じであっても良いし、または異なっていても良い。
【０１７９】
センス鎖およびアンチセンス鎖の各ヌクレオチドは独立して、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’−メトキシエチル、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｃ−アリル、２’−ヒドロキシル、２’−デオキシ、または２’−フルオロで修飾され得る。例えば、センス鎖およびアンチセンス鎖の各ヌクレオチドは独立して、２’−Ｏ−メチルまたは２’−フルオロで修飾される。特に、Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｘ’、Ｙ’、およびＺ’はそれぞれ、２’−Ｏ−メチル修飾または２’−フルオロ修飾を表すことができる。
【０１８０】
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、二重鎖領域が２１のヌクレオチドである場合にセンス鎖の９位、１０位、および１１位に存在するＹＹＹモチーフを含むことができ、この位置は、５’末端から、最初のヌクレオチドから数え始められ、または任意選択で、５’末端から、二重鎖領域内の最初の塩基対形成ヌクレオチドから数え始められ；かつＹは、２’−Ｆ修飾を表している。センス鎖は、二重鎖領域の反対の末端におけるウィング修飾としてＸＸＸモチーフまたはＺＺＺモチーフを追加的に含むことができ；かつＸＸＸおよびＺＺＺはそれぞれ独立して、２’−ＯＭｅ修飾または２’−Ｆ修飾を表している。
【０１８１】
一実施形態では、アンチセンス鎖は、このセンス鎖の１１位、１２位、および１３位に存在するＹ’Ｙ’Ｙ’モチーフを含むことができ、この位置は、５’末端から、最初のヌクレオチドから数え始められる、または任意選択で、５’末端から、二重鎖領域内の最初の塩基対形成ヌクレオチドから数え始められ；かつＹ’は、２’−Ｏ−メチル修飾を表している。アンチセンス鎖は、二重鎖領域の反対の末端におけるウィング修飾としてＸ’Ｘ’Ｘ’モチーフまたはＺ’Ｚ’Ｚ’モチーフを追加的に含むことができ；かつＸ’Ｘ’Ｘ’およびＺ’Ｚ’Ｚ’はそれぞれ独立して、２’−ＯＭｅ修飾または２’−Ｆ修飾を表している。
【０１８２】
上記の式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、および（Ｉｃ）の何れか１つによって表されるセンス鎖はそれぞれ、式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、および（ＩＩｃ）の何れか１つによって表されるアンチセンス鎖と二重鎖を形成する。
【０１８３】
従って、本発明のＲＮＡｉ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み得、各鎖は、１４〜３０のヌクレオチドを有し、ＲＮＡｉ二重鎖は、式（ＩＩＩ）によって表される：
センス鎖：５’ｎｐ−Ｎａ−（ＸＸＸ）ｉ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎｂ−（ＺＺＺ）ｊ−Ｎａ−ｎｑ３’
アンチセンス鎖：３’ｎｐ’−Ｎａ’−（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ−Ｎｂ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ’−（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ−Ｎａ’−ｎｑ’５’
（ＩＩＩ）
式中、
ｉ、ｊ、ｋ、およびｌはそれぞれ独立して、０または１であり；
ｐ、ｐ’、ｑ、およびｑ’はそれぞれ独立して、０〜６であり；
各ＮａおよびＮａ’は独立して、０〜２５の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２つの異なって修飾されたヌクレオチドを含み；
各ＮｂおよびＮｂ’は独立して、０〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
式中、
各ｎｐ’、ｎｐ、ｎｑ’、およびｎｑは独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し；かつ
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、およびＺ’Ｚ’Ｚ’はそれぞれ独立して、３つの連続したヌクレオチドにおける３つの同一の修飾からなる１つのモチーフを表している。
【０１８４】
一実施形態では、ｉが１で、ｊが０である；ｉが０で、ｊが１である；またはｉとｊの両方が１である。別の実施形態では、ｋが１で、ｌが０である；ｋが０で、ｌが１である；またはｋとｌの両方が１である。
【０１８５】
ＲＮＡｉ二重鎖を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖の例示的な組み合わせは、以下の式を含む：
５’ｎｐ−Ｎａ−ＹＹＹ−Ｎｂ−ＺＺＺ−Ｎａ−ｎｑ３’
３’ｎｐ’−Ｎａ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ’−Ｚ’Ｚ’Ｚ’−Ｎａ’ｎｑ’５’
（ＩＩＩａ）
５’ｎｐ−Ｎａ−ＸＸＸ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎａ−ｎｑ３’
３’ｎｐ’−Ｎａ’−Ｘ’Ｘ’Ｘ’−Ｎｂ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎａ’−ｎｑ’５’
（ＩＩＩｂ）
５’ｎｐ−Ｎａ−ＸＸＸ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎｂ−ＺＺＺ−Ｎａ−ｎｑ３’
３’ｎｐ’−Ｎａ’−Ｘ’Ｘ’Ｘ’−Ｎｂ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ’−Ｚ’Ｚ’Ｚ’−Ｎａ−ｎｑ’５’
（ＩＩＩｃ）
【０１８６】
ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩａ）で表される場合、各Ｎｂは独立して、１〜１０、１〜７、１〜５、または１〜４の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表している。各Ｎａは独立して、２〜２０、２〜１５、または２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表している。
【０１８７】
ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｂ）で表される場合、各Ｎｂ、Ｎｂ’は独立して、０〜１０、０〜７、０〜１０、０〜７、０〜５、０〜４、０〜２、または０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表している。各Ｎａは独立して、２〜２０、２〜１５、または２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表している。
【０１８８】
ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｃ）で表される場合、各Ｎｂ、Ｎｂ’は独立して、０〜１０、０〜７、０〜１０、０〜７、０〜５、０〜４、０〜２、または０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表している。各Ｎａ、Ｎａ’は独立して、２〜２０、２〜１５、または２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表している。それぞれのＮａ、Ｎａ’、Ｎｂ、Ｎｂ’は独立して、交互パターンの修飾を含む。
【０１８９】
式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、および（ＩＩＩｃ）におけるＸ、Ｙ、およびＺはそれぞれ、互いに同じであっても良いし、または異なっていても良い。
【０１９０】
ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、または（ＩＩＩｃ）で表される場合、Ｙヌクレオチドの少なくとも１つが、Ｙ’ヌクレオチドの１つと塩基対を形成し得る。あるいは、Ｙヌクレオチドの少なくとも２つが、対応するＹ’ヌクレオチドと塩基対を形成する；またはＹヌクレオチドの３つ全てが、対応するＹ’ヌクレオチドと塩基対を形成する。
【０１９１】
ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩａ）または（ＩＩＩｃ）で表される場合、Ｚヌクレオチドの少なくとも１つが、Ｚ’ヌクレオチドの１つと塩基対を形成し得る。あるいは、Ｚヌクレオチドの少なくとも２つが、対応するＺ’ヌクレオチドと塩基対を形成する；またはＺヌクレオチドの３つ全てが、対応するＺ’ヌクレオチドと塩基対を形成する。
【０１９２】
ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｂ）または（ＩＩＩｃ）で表される場合、Ｘヌクレオチドの少なくとも１つが、Ｘ’ヌクレオチドの１つと塩基対を形成し得る。あるいは、Ｘヌクレオチドの少なくとも２つが、対応するＸ’ヌクレオチドと塩基対を形成する；またはＸヌクレオチドの３つ全てが、対応するＸ’ヌクレオチドと塩基対を形成する。
【０１９３】
一実施形態では、Ｙヌクレオチドの修飾は、Ｙ’ヌクレオチドの修飾とは異なり、Ｚヌクレオチドの修飾は、Ｚ’ヌクレオチドの修飾とは異なり、かつ／またはＸヌクレオチドの修飾は、Ｘ’ヌクレオチドの修飾とは異なる。
【０１９４】
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、または（ＩＩＩｃ）で表される少なくとも２つの二重鎖を含む多量体であり、この二重鎖はリンカーによって結合されている。このリンカーは、切断可能であっても良いし、または切断不可能であっても良い。任意選択で、この多量体は、リガンドをさらに含む。二重鎖はそれぞれ、同じ遺伝子または２つの異なる遺伝子を標的としても良いし；あるいは二重鎖はそれぞれ、２つの異なる標的部位における同じ遺伝子を標的としても良い。
【０１９５】
一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、または（ＩＩＩｃ）で表される３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれ以上の二重鎖を含む多量体であり、この二重鎖は、リンカーによって結合されている。このリンカーは、切断可能であっても良いし、または切断不可能であっても良い。任意選択で、この多量体は、リガンドをさらに含む。二重鎖はそれぞれ、同じ遺伝子または２つの異なる遺伝子を標的としても良いし；あるいは二重鎖はそれぞれ、２つの異なる標的部位における同じ遺伝子を標的としても良い。
【０１９６】
一実施形態では、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、または（ＩＩＩｃ）で表される２つのＲＮＡｉ剤は、５’末端で互いに結合され、その３’末端の一方または両方が、任意選択で、リガンドによってコンジュゲートされる。ＲＮＡｉ剤はそれぞれ、同じ遺伝子または２つの異なる遺伝子を標的としても良いし；あるいはＲＮＡｉ剤はそれぞれ、２つの異なる標的部位における同じ遺伝子を標的としても良い。
【０１９７】
様々な刊行物が、多量体ＲＮＡｉ剤について記載している。このような刊行物としては、参照によりそれらの全開示内容が本明細書に組み入れられる、国際公開第２００７／０９１２６９号パンフレット、米国特許第７８５８７６９号明細書、国際公開第２０１０／１４１５１１号パンフレット、同第２００７／１１７６８６号パンフレット、同第２００９／０１４８８７号パンフレット、および同第２０１１／０３１５２０号パンフレットが挙げられる。
【０１９８】
１つ以上の糖質部分のＲＮＡｉ剤に対するコンジュゲーションを含むＲＮＡｉ剤は、このＲＮＡｉ剤の１つ以上の特性を最適化し得る。多くの場合、糖質部分は、ＲＮＡｉ剤の修飾サブユニットに付着する。例えば、ｄｓＲＮＡ剤の１つ以上のリボヌクレオチドサブユニットのリボース糖を、別の部分、例えば、糖質リガンドが付着する非糖質担体（好ましくは環状）で置換することができる。サブユニットのリボース糖がこのように置換されたリボヌクレオチドサブユニットは、本明細書では、リボース置換修飾サブユニット（ＲＲＭＳ）と呼ばれる。環状担体は、炭素環系、即ち全ての環原子が炭素原子である環系であっても良いし、または複素環系、即ち１つ以上の環原子が、ヘテロ原子、例えば、窒素、酸素、硫黄であり得る環系であっても良い。環状担体は、単環系であっても良いし、または２つ以上の環、例えば、融合環を含んでも良い。環状担体は、完全に飽和した環系であっても良いし、または１つ以上の二重結合を含んでも良い。
【０１９９】
リガンドは、担体によってポリヌクレオチドに付着することができる。担体は、（ｉ）少なくとも１つの「骨格付着点（ｂａｃｋｂｏｎｅ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｐｏｉｎｔ）」、好ましくは２つの「骨格付着点」、および（ｉｉ）少なくとも１つの「テザー付着点（ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｐｏｉｎｔ）」を含む。本明細書で使用される「骨格付着点」は、官能基、例えば、ヒドロキシル基、または一般に、リボ核酸の骨格、例えば、リン酸塩の骨格、もしくは、例えば、硫黄を含有する修飾リン酸塩の骨格への担体の組み込みに利用可能であり、かつ適した結合を指す。「テザー付着点」（ＴＡＰ）は、一部の実施形態では、選択された部分を接続する環状担体の構成環原子、例えば、炭素原子またはヘテロ原子（骨格付着点を提供する原子とは異なる）を指す。この選択された部分は、例えば、糖質、例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、および多糖であり得る。任意選択で、選択された部分は、介在テザー（ｉｎｔｅｒｖｅｎｉｎｇ  ｔｅｔｈｅｒ）によって環状担体に接続される。従って、環状担体は、しばしば、官能基、例えば、アミノ基を含む、または、一般に、別の化学物質、例えば、リガンドの構成環への組み込みまたは連結（ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ）に適した結合を可能にする。
【０２００】
ＲＮＡｉ剤は、担体によってリガンドにコンジュゲートすることができ、この担体は、環状基または非環状基であり；好ましくは、環状基は、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、［１，３］ジオキソラン、オキサゾリジニル、イソキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル、テトラヒドロフリル、およびデカリンから選択され；好ましくは、非環状基は、セリノール骨格またはジエタノールアミン骨格から選択される。
【０２０１】
ある特定の実施形態では、本発明のＲＮＡｉ剤は、表１に列記され、Ｄ１０００、Ｄ１００１、Ｄ１００２、Ｄ１００３、Ｄ１００４、Ｄ１００５、Ｄ１００６、Ｄ１００７、Ｄ１００８、Ｄ１００９、Ｄ１０１０、Ｄ１０１１、Ｄ１０１２、Ｄ１０１３、Ｄ１０１４、Ｄ１０１５、Ｄ１０１６、Ｄ１０１７、Ｄ１０１８、Ｄ１０１９、Ｄ１０２０、Ｄ１０２１、Ｄ１０２２、Ｄ１０２３、Ｄ１０２４、Ｄ１０２５、Ｄ１０２６、Ｄ１０２７、Ｄ１０２８、Ｄ１０２９、Ｄ１０３０、Ｄ１０３１、Ｄ１０３２、Ｄ１０３３、Ｄ１０３４、Ｄ１０３５、Ｄ１０３６、Ｄ１０３７、Ｄ１０３８、Ｄ１０３９、Ｄ１０４０、Ｄ１０４１、Ｄ１０４２、Ｄ１０４３、Ｄ１０４４、Ｄ１０４５、Ｄ１０４６、Ｄ１０４７、Ｄ１０４８、Ｄ１０４９、Ｄ１０５０、Ｄ１０５１、Ｄ１０５２、Ｄ１０５３、Ｄ１０５４、Ｄ１０５５、Ｄ１０５６、Ｄ１０５７、Ｄ１０５８、Ｄ１０５９、Ｄ１０６０、Ｄ１０６１、Ｄ１０６２、Ｄ１０６３、Ｄ１０６４、Ｄ１０６５、Ｄ１０６６、Ｄ１０６７、Ｄ１０６８、Ｄ１０６９、Ｄ１０７０、Ｄ１０７１、Ｄ１０７２、Ｄ１０７３、Ｄ１０７４、Ｄ１０７５、Ｄ１０７６、Ｄ１０７７、Ｄ１０７８、Ｄ１０７９、Ｄ１０８０、Ｄ１０８１、Ｄ１０８２、Ｄ１０８３、Ｄ１０８４、Ｄ１０８５、Ｄ１０８６、Ｄ１０８７、Ｄ１０８８、Ｄ１０８９、Ｄ１０９０、Ｄ１０９１、Ｄ１０９２、Ｄ１０９３、Ｄ１０９４、Ｄ１０９５、Ｄ１０９６、Ｄ１０９７、Ｄ１０９８、Ｄ１０９９、Ｄ１１００、Ｄ１１０１、Ｄ１１０２、Ｄ１１０３、Ｄ１１０４、Ｄ１１０５、Ｄ１１０６、Ｄ１１０７、Ｄ１１０８、Ｄ１１０９、Ｄ１１１０、Ｄ１１１１、Ｄ１１１２、Ｄ１１１３、Ｄ１１１４、Ｄ１１１５、Ｄ１１１６、Ｄ１１１７、Ｄ１１１８、Ｄ１１１９、Ｄ１１２０、Ｄ１１２１、Ｄ１１２２、Ｄ１１２３、Ｄ１１２４、Ｄ１１２５、Ｄ１１２６、Ｄ１１２７、Ｄ１１２８、Ｄ１１２９、Ｄ１１３０、Ｄ１１３１、Ｄ１１３２、Ｄ１１３３、Ｄ１１３４、Ｄ１１３５、Ｄ１１３６、Ｄ１１３７、Ｄ１１３８、Ｄ１１３９、Ｄ１１４０、Ｄ１１４１、Ｄ１１４２、Ｄ１１４３、Ｄ１１４４、Ｄ１１４５、Ｄ１１４６、Ｄ１１４７、Ｄ１１４８、Ｄ１１４９、Ｄ１１５０、Ｄ１１５１、Ｄ１１５２、Ｄ１１５３、Ｄ１１５４、Ｄ１１５５、Ｄ１１５６、Ｄ１１５７、Ｄ１１５８、Ｄ１１５９、Ｄ１１６０、Ｄ１１６１、Ｄ１１６２、Ｄ１１６３、Ｄ１１６４、Ｄ１１６５、Ｄ１１６６、Ｄ１１６７、Ｄ１１６８、Ｄ１１６９、Ｄ１１７０、Ｄ１１７１、Ｄ１１７２、Ｄ１１７３、Ｄ１１７４、Ｄ１１７５、Ｄ１１７６、Ｄ１１７７、Ｄ１１７８、Ｄ１１７９、Ｄ１１８０、Ｄ１１８１、Ｄ１１８２、Ｄ１１８３、Ｄ１１８４、Ｄ１１８５、Ｄ１１８６、Ｄ１１８７、Ｄ１１８８、Ｄ１１８９、Ｄ１１９０、Ｄ１１９１、Ｄ１１９２、Ｄ１１９３、Ｄ１１９４、Ｄ１１９５、Ｄ１１９６、Ｄ１１９７、Ｄ１１９８、Ｄ１１９９、Ｄ１２００、Ｄ１２０１、Ｄ１２０２、Ｄ１２０３、Ｄ１２０４、Ｄ１２０５、Ｄ１２０６、Ｄ１２０７、Ｄ１２０８、Ｄ１２０９、Ｄ１２１０、Ｄ１２１１、Ｄ１２１２、Ｄ１２１３、Ｄ１２１４、Ｄ１２１５、Ｄ１２１６、Ｄ１２１７、Ｄ１２１８、Ｄ１２１９、Ｄ１２２０、Ｄ１２２１、Ｄ１２２２、Ｄ１２２３、Ｄ１２２４、Ｄ１２２５、Ｄ１２２６、Ｄ１２２７、Ｄ１２２８、Ｄ１２２９、Ｄ１２３０、Ｄ１２３１、Ｄ１２３２、Ｄ１２３３、Ｄ１２３４、Ｄ１２３５、Ｄ１２３６、Ｄ１２３７、Ｄ１２３８、Ｄ１２３９、Ｄ１２４０、Ｄ１２４１、Ｄ１２４２、Ｄ１２４３、Ｄ１２４４、Ｄ１２４５、Ｄ１２４６、Ｄ１２４７、Ｄ１２４８、Ｄ１２４９、Ｄ１２５０、Ｄ１２５１、Ｄ１２５２、Ｄ１２５３、Ｄ１２５４、Ｄ１２５５、Ｄ１２５６、Ｄ１２５７、Ｄ１２５８、Ｄ１２５９、Ｄ１２６０、Ｄ１２６１、Ｄ１２６２、Ｄ１２６３、Ｄ１２６４、Ｄ１２６５、Ｄ１２６６、Ｄ１２６７、Ｄ１２６８、Ｄ１２６９、Ｄ１２７０、Ｄ１２７１、Ｄ１２７２、Ｄ１２７３、Ｄ１２７４、Ｄ１２７５、Ｄ１２７６、Ｄ１２７７、Ｄ１２７８、Ｄ１２７９、Ｄ１２８０、Ｄ１２８１、Ｄ１２８２、Ｄ１２８３、Ｄ１２８４、Ｄ１２８５、Ｄ１２８６、Ｄ１２８７、Ｄ１２８８、Ｄ１２８９、Ｄ１２９０、Ｄ１２９１、Ｄ１２９２、Ｄ１２９３、Ｄ１２９４、Ｄ１２９５、Ｄ１２９６、Ｄ１２９７、Ｄ１２９８、Ｄ１２９９、Ｄ１３００、Ｄ１３０１、Ｄ１３０２、Ｄ１３０３、Ｄ１３０４、Ｄ１３０５、Ｄ１３０６、Ｄ１３０７、Ｄ１３０８、Ｄ１３０９、Ｄ１３１０、Ｄ１３１１、Ｄ１３１２、Ｄ１３１３、Ｄ１３１４、Ｄ１３１５、Ｄ１３１６、Ｄ１３１７、Ｄ１３１８、Ｄ１３１９、Ｄ１３２０、Ｄ１３２１、Ｄ１３２２、Ｄ１３２３、Ｄ１３２４、Ｄ１３２５、Ｄ１３２６、Ｄ１３２７、Ｄ１３２８、Ｄ１３２９、Ｄ１３３０、Ｄ１３３１、Ｄ１３３２、Ｄ１３３３、Ｄ１３３４、Ｄ１３３５、Ｄ１３３６、Ｄ１３３７、Ｄ１３３８、Ｄ１３３９、Ｄ１３４０、Ｄ１３４１、Ｄ１３４２、Ｄ１３４３、Ｄ１３４４、Ｄ１３４５、Ｄ１３４６、Ｄ１３４７、Ｄ１３４８、Ｄ１３４９、Ｄ１３５０、Ｄ１３５１、Ｄ１３５２、Ｄ１３５３、Ｄ１３５４、Ｄ１３５５、Ｄ１３５６、Ｄ１３５７、Ｄ１３５８、Ｄ１３５９、Ｄ１３６０、Ｄ１３６１、Ｄ１３６２、Ｄ１３６３、Ｄ１３６４、Ｄ１３６５、Ｄ１３６６、Ｄ１３６７、Ｄ１３６８、Ｄ１３６９、Ｄ１３７０、Ｄ１３７１、Ｄ１３７２、Ｄ１３７３、Ｄ１３７４、Ｄ１３７５、Ｄ１３７６、Ｄ１３７７、Ｄ１３７８、Ｄ１３７９、Ｄ１３８０、Ｄ１３８１、Ｄ１３８２、Ｄ１３８３、Ｄ１３８４、Ｄ１３８５、Ｄ１３８６、Ｄ１３８７、Ｄ１３８８、Ｄ１３８９、Ｄ１３９０、Ｄ１３９１、Ｄ１３９２、Ｄ１３９３、Ｄ１３９４、Ｄ１３９５、Ｄ１３９６、Ｄ１３９７、Ｄ１３９８、Ｄ１３９９、Ｄ１４００、Ｄ１４０１、Ｄ１４０２、Ｄ１４０３、Ｄ１４０４、Ｄ１４０５、Ｄ１４０６、Ｄ１４０７、Ｄ１４０８、Ｄ１４０９、Ｄ１４１０、Ｄ１４１１、Ｄ１４１２、Ｄ１４１３、Ｄ１４１４、Ｄ１４１５、Ｄ１４１６、Ｄ１４１７、Ｄ１４１８、Ｄ１４１９、Ｄ１４２０、Ｄ１４２１、Ｄ１４２２、Ｄ１４２３、Ｄ１４２４、Ｄ１４２５、Ｄ１４２６、Ｄ１４２７、Ｄ１４２８、Ｄ１４２９、Ｄ１４３０、Ｄ１４３１、Ｄ１４３２、Ｄ１４３３、Ｄ１４３４、Ｄ１４３５、Ｄ１４３６、Ｄ１４３７、Ｄ１４３８、Ｄ１４３９、Ｄ１４４０、Ｄ１４４１、Ｄ１４４２、Ｄ１４４３、Ｄ１４４４、Ｄ１４４５、Ｄ１４４６、Ｄ１４４７、Ｄ１４４８、Ｄ１４４９、Ｄ１４５０、Ｄ１４５１、Ｄ１４５２、Ｄ１４５３、Ｄ１４５４、Ｄ１４５５、Ｄ１４５６、Ｄ１４５７、Ｄ１４５８、Ｄ１４５９、Ｄ１４６０、Ｄ１４６１、Ｄ１４６２、Ｄ１４６３、Ｄ１４６４、Ｄ１４６５、Ｄ１４６６、Ｄ１４６７、Ｄ１４６８、Ｄ１４６９、Ｄ１４７０、Ｄ１４７１、Ｄ１４７２、Ｄ１４７３、Ｄ１４７４、Ｄ１４７５、Ｄ１４７６、Ｄ１４７７、Ｄ１４７８、Ｄ１４７９、Ｄ１４８０、Ｄ１４８１、Ｄ１４８２、Ｄ１４８３、Ｄ１４８４、Ｄ１４８５、Ｄ１４８６、Ｄ１４８７、Ｄ１４８８、Ｄ１４８９、Ｄ１４９０、Ｄ１４９１、Ｄ１４９２、Ｄ１４９３、Ｄ１４９４、Ｄ１４９５、Ｄ１４９６、Ｄ１４９７、Ｄ１４９８、Ｄ１４９９、Ｄ１５００、Ｄ１５０１、Ｄ１５０２、Ｄ１５０３、Ｄ１５０４、Ｄ１５０５、Ｄ１５０６、Ｄ１５０７、Ｄ１５０８、Ｄ１５０９、Ｄ１５１０、Ｄ１５１１、Ｄ１５１２、Ｄ１５１３、Ｄ１５１４、Ｄ１５１５、Ｄ１５１６、Ｄ１５１７、Ｄ１５１８、Ｄ１５１９、Ｄ１５２０、Ｄ１５２１、Ｄ１５２２、Ｄ１５２３、Ｄ１５２４、Ｄ１５２５、Ｄ１５２６、Ｄ１５２７、Ｄ１５２８、Ｄ１５２９、Ｄ１５３０、Ｄ１５３１、Ｄ１５３２、Ｄ１５３３、Ｄ１５３４、Ｄ１５３５、Ｄ１５３６、Ｄ１５３７、Ｄ１５３８、Ｄ１５３９、Ｄ１５４０、Ｄ１５４１、Ｄ１５４２、Ｄ１５４３、Ｄ１５４４、Ｄ１５４５、Ｄ１５４６、Ｄ１５４７、Ｄ１５４８、Ｄ１５４９、Ｄ１５５０、Ｄ１５５１、Ｄ１５５２、Ｄ１５５３、Ｄ１５５４、Ｄ１５５５、Ｄ１５５６、Ｄ１５５７、Ｄ１５５８、Ｄ１５５９、Ｄ１５６０、Ｄ１５６１、Ｄ１５６２、Ｄ１５６３、Ｄ１５６４、Ｄ１５６５、Ｄ１５６６、Ｄ１５６７、Ｄ１５６８、Ｄ１５６９、Ｄ１５７０、Ｄ１５７１、Ｄ１５７２、Ｄ１５７３、Ｄ１５７４、Ｄ１５７５、Ｄ１５７６、Ｄ１５７７、Ｄ１５７８、Ｄ１５７９、Ｄ１５８０、Ｄ１５８１、Ｄ１５８２、Ｄ１５８３、Ｄ１５８４、Ｄ１５８５、Ｄ１５８６、Ｄ１５８７、Ｄ１５８８、Ｄ１５８９、Ｄ１５９０、Ｄ１５９１、Ｄ１５９２、Ｄ１５９３、Ｄ１５９４、Ｄ１５９５、Ｄ１５９６、Ｄ１５９７、Ｄ１５９８、Ｄ１５９９、Ｄ１６００、Ｄ１６０１、Ｄ１６０２、Ｄ１６０３、Ｄ１６０４、Ｄ１６０５、Ｄ１６０６、Ｄ１６０７、Ｄ１６０８、Ｄ１６０９、Ｄ１６１０、Ｄ１６１１、Ｄ１６１２、Ｄ１６１３、Ｄ１６１４、Ｄ１６１５、Ｄ１６１６、Ｄ１６１７、Ｄ１６１８、Ｄ１６１９、Ｄ１６２０、Ｄ１６２１、Ｄ１６２２、Ｄ１６２３、Ｄ１６２４、Ｄ１６２５、Ｄ１６２６、Ｄ１６２７、Ｄ１６２８、Ｄ１６２９、Ｄ１６３０、Ｄ１６３１、Ｄ１６３２、Ｄ１６３３、Ｄ１６３４、Ｄ１６３５、Ｄ１６３６、Ｄ１６３７、Ｄ１６３８、Ｄ１６３９、Ｄ１６４０、Ｄ１６４１、Ｄ１６４２、Ｄ１６４３、Ｄ１６４４、Ｄ１６４５、Ｄ１６４６、Ｄ１６４７、Ｄ１６４８、Ｄ１６４９、Ｄ１６５０、Ｄ１６５１、Ｄ１６５２、Ｄ１６５３、Ｄ１６５４、Ｄ１６５５、Ｄ１６５６、Ｄ１６５７、Ｄ１６５８、Ｄ１６５９、Ｄ１６６０、Ｄ１６６１、Ｄ１６６２、Ｄ１６６３、Ｄ１６６４、Ｄ１６６５、Ｄ１６６６、Ｄ１６６７、Ｄ１６６８、Ｄ１６６９、Ｄ１６７０、Ｄ１６７１、Ｄ１６７２、Ｄ１６７３、Ｄ１６７４、Ｄ１６７５、Ｄ１６７６、Ｄ１６７７、Ｄ１６７８、Ｄ１６７９、Ｄ１６８０、Ｄ１６８１、Ｄ１６８２、Ｄ１６８３、Ｄ１６８４、Ｄ１６８５、Ｄ１６８６、Ｄ１６８７、Ｄ１６８８、Ｄ１６８９、Ｄ１６９０、Ｄ１６９１、Ｄ１６９２、Ｄ１６９３、Ｄ１６９４、Ｄ１６９５、Ｄ１６９６、Ｄ１６９７、Ｄ１６９８、Ｄ１６９９、Ｄ１７００、Ｄ１７０１、Ｄ１７０２、Ｄ１７０３、Ｄ１７０４、Ｄ１７０５、Ｄ１７０６、Ｄ１７０７、Ｄ１７０８、Ｄ１７０９、Ｄ１７１０、Ｄ１７１１、Ｄ１７１２、Ｄ１７１３、Ｄ１７１４、Ｄ１７１５、Ｄ１７１６、Ｄ１７１７、Ｄ１７１８、Ｄ１７１９、Ｄ１７２０、Ｄ１７２１、Ｄ１７２２、Ｄ１７２３、Ｄ１７２４、Ｄ１７２５、Ｄ１７２６、Ｄ１７２７、Ｄ１７２８、Ｄ１７２９、Ｄ１７３０、Ｄ１７３１、Ｄ１７３２、Ｄ１７３３、Ｄ１７３４、Ｄ１７３５、Ｄ１７３６、Ｄ１７３７、Ｄ１７３８、Ｄ１７３９、Ｄ１７４０、Ｄ１７４１、Ｄ１７４２、Ｄ１７４３、Ｄ１７４４、Ｄ１７４５、Ｄ１７４６、Ｄ１７４７、Ｄ１７４８、Ｄ１７４９、Ｄ１７５０、Ｄ１７５１、Ｄ１７５２、Ｄ１７５３、Ｄ１７５４、Ｄ１７５５、Ｄ１７５６、Ｄ１７５７、Ｄ１７５８、Ｄ１７５９、Ｄ１７６０、Ｄ１７６１、Ｄ１７６２、Ｄ１７６３、Ｄ１７６４、Ｄ１７６５、Ｄ１７６６、Ｄ１７６７、Ｄ１７６８、Ｄ１７６９、Ｄ１７７０、Ｄ１７７１、Ｄ１７７２、Ｄ１７７３、Ｄ１７７４、Ｄ１７７５、Ｄ１７７６、Ｄ１７７７、Ｄ１７７８、Ｄ１７７９、Ｄ１７８０、Ｄ１７８１、Ｄ１７８２、Ｄ１７８３、Ｄ１７８４、Ｄ１７８５、Ｄ１７８６、Ｄ１７８７、Ｄ１７８８、Ｄ１７８９、Ｄ１７９０、Ｄ１７９１、Ｄ１７９２、Ｄ１７９３、Ｄ１７９４、Ｄ１７９５、Ｄ１７９６、Ｄ１７９７、Ｄ１７９８、Ｄ１７９９、Ｄ１８００、Ｄ１８０１、Ｄ１８０２、Ｄ１８０３、Ｄ１８０４、Ｄ１８０５、Ｄ１８０６、Ｄ１８０７、Ｄ１８０８、Ｄ１８０９、Ｄ１８１０、Ｄ１８１１、Ｄ１８１２、Ｄ１８１３、Ｄ１８１４、Ｄ１８１５、Ｄ１８１６、Ｄ１８１７、Ｄ１８１８、Ｄ１８１９、Ｄ１８２０、Ｄ１８２１、Ｄ１８２２、Ｄ１８２３、Ｄ１８２４、Ｄ１８２５、Ｄ１８２６、Ｄ１８２７、Ｄ１８２８、Ｄ１８２９、Ｄ１８３０、Ｄ１８３１、Ｄ１８３２、Ｄ１８３３、Ｄ１８３４、Ｄ１８３５、Ｄ１８３６、Ｄ１８３７、Ｄ１８３８、Ｄ１８３９、Ｄ１８４０、Ｄ１８４１、Ｄ１８４２、Ｄ１８４３、Ｄ１８４４、Ｄ１８４５、Ｄ１８４６、Ｄ１８４７、Ｄ
１８４８、Ｄ１８４９、Ｄ１８５０、Ｄ１８５１、Ｄ１８５２、Ｄ１８５３、Ｄ１８５４、Ｄ１８５５、Ｄ１８５６、Ｄ１８５７、Ｄ１８５８、Ｄ１８５９、Ｄ１８６０、Ｄ１８６１、Ｄ１８６２、Ｄ１８６３、Ｄ１８６４、Ｄ１８６５、Ｄ１８６６、Ｄ１８６７、Ｄ１８６８、Ｄ１８６９、Ｄ１８７０、Ｄ１８７１、Ｄ１８７２、Ｄ１８７３、Ｄ１８７４、Ｄ１８７５、Ｄ１８７６、Ｄ１８７７、Ｄ１８７８、Ｄ１８７９、Ｄ１８８０、Ｄ１８８１、Ｄ１８８２、Ｄ１８８３、Ｄ１８８４、Ｄ１８８５、Ｄ１８８６、Ｄ１８８７、Ｄ１８８８、Ｄ１８８９、Ｄ１８９０、Ｄ１８９１、Ｄ１８９２、Ｄ１８９３、Ｄ１８９４、Ｄ１８９５、Ｄ１８９６、Ｄ１８９７、Ｄ１８９８、Ｄ１８９９、Ｄ１９００、Ｄ１９０１、Ｄ１９０２、Ｄ１９０３、Ｄ１９０４、Ｄ１９０５、Ｄ１９０６、Ｄ１９０７、Ｄ１９０８、Ｄ１９０９、Ｄ１９１０、Ｄ１９１１、Ｄ１９１２、Ｄ１９１３、Ｄ１９１４、Ｄ１９１５、Ｄ１９１６、Ｄ１９１７、Ｄ１９１８、Ｄ１９１９、Ｄ１９２０、Ｄ１９２１、Ｄ１９２２、Ｄ１９２３、Ｄ１９２４、Ｄ１９２５、Ｄ１９２６、Ｄ１９２７、Ｄ１９２８、Ｄ１９２９、Ｄ１９３０、Ｄ１９３１、Ｄ１９３２、Ｄ１９３３、Ｄ１９３４、Ｄ１９３５、Ｄ１９３６、Ｄ１９３７、Ｄ１９３８、Ｄ１９３９、Ｄ１９４０、Ｄ１９４１、Ｄ１９４２、Ｄ１９４３、Ｄ１９４４、Ｄ１９４５、Ｄ１９４６、Ｄ１９４７、Ｄ１９４８、Ｄ１９４９、Ｄ１９５０、Ｄ１９５１、Ｄ１９５２、Ｄ１９５３、Ｄ１９５４、Ｄ１９５５、Ｄ１９５６、Ｄ１９５７、Ｄ１９５８、Ｄ１９５９、Ｄ１９６０、Ｄ１９６１、Ｄ１９６２、Ｄ１９６３、Ｄ１９６４、Ｄ１９６５、Ｄ１９６６、Ｄ１９６７、Ｄ１９６８、Ｄ１９６９、Ｄ１９７０、Ｄ１９７１、Ｄ１９７２、Ｄ１９７３、Ｄ１９７４、Ｄ１９７５、Ｄ１９７６、Ｄ１９７７、Ｄ１９７８、Ｄ１９７９、Ｄ１９８０、Ｄ１９８１、Ｄ１９８２、Ｄ１９８３、Ｄ１９８４、Ｄ１９８５、Ｄ１９８６、Ｄ１９８７、Ｄ１９８８、Ｄ１９８９、Ｄ１９９０、Ｄ１９９１、Ｄ１９９２、Ｄ１９９３、Ｄ１９９４、Ｄ１９９５、Ｄ１９９６、Ｄ１９９７、Ｄ１９９８、Ｄ１９９９、Ｄ２０００、Ｄ２００１、Ｄ２００２、Ｄ２００３、Ｄ２００４、Ｄ２００５、Ｄ２００６、Ｄ２００７、Ｄ２００８、Ｄ２００９、Ｄ２０１０、Ｄ２０１１、Ｄ２０１２、Ｄ２０１３、Ｄ２０１４、Ｄ２０１５、Ｄ２０１６、Ｄ２０１７、Ｄ２０１８、Ｄ２０１９、Ｄ２０２０、Ｄ２０２１、Ｄ２０２２、Ｄ２０２３、Ｄ２０２４、Ｄ２０２５、Ｄ２０２６、Ｄ２０２７、Ｄ２０２８、Ｄ２０２９、Ｄ２０３０、Ｄ２０３１、Ｄ２０３２、Ｄ２０３３、Ｄ２０３４、Ｄ２０３５、Ｄ２０３６、Ｄ２０３７、Ｄ２０３８、Ｄ２０３９、Ｄ２０４０、Ｄ２０４１、Ｄ２０４２、Ｄ２０４３、Ｄ２０４４、Ｄ２０４５、Ｄ２０４６、Ｄ２０４７、Ｄ２０４８、Ｄ２０４９、Ｄ２０５０、Ｄ２０５１、Ｄ２０５２、Ｄ２０５３、Ｄ２０５４、Ｄ２０５５、Ｄ２０５６、Ｄ２０５７、Ｄ２０５８、Ｄ２０５９、Ｄ２０６０、Ｄ２０６１、Ｄ２０６２、Ｄ２０６３、Ｄ２０６４、Ｄ２０６５、Ｄ２０６６、Ｄ２０６７、Ｄ２０６８、Ｄ２０６９、Ｄ２０７０、Ｄ２０７１、Ｄ２０７２、Ｄ２０７３、Ｄ２０７４、Ｄ２０７５、Ｄ２０７６、Ｄ２０７７、Ｄ２０７８、Ｄ２０７９、Ｄ２０８０、Ｄ２０８１、Ｄ２０８２、Ｄ２０８３、Ｄ２０８４、Ｄ２０８５、Ｄ２０８６、Ｄ２０８７、Ｄ２０８８、Ｄ２０８９、Ｄ２０９０、およびＤ２０９１からなる作用剤の群から選択される作用剤である。
【０２０２】
これらの作用剤は、リガンド、例えば、ＧａｌＮＡｃリガンドをさらに含み得る。
【０２０３】
リガンド
本発明のＲＮＡｉ剤、例えば、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、任意選択で、１つ以上のリガンドにコンジュゲートし得る。このリガンドは、３’末端、５’末端、または両末端において、センス鎖、アンチセンス鎖、または両鎖に付着し得る。例えば、リガンドは、センス鎖にコンジュゲートし得る。好ましい実施形態では、リガンドは、センス鎖の３’末端にコンジュゲートする。好ましい一実施形態では、リガンドは、ＧａｌＮＡｃリガンドである。特に好ましい実施形態では、リガンドはＧａｌＮＡｃ３：
【化４】
2018007657.tif 000005
である。
【０２０４】
多種多様な物質が、本発明のＲＮＡｉ剤に結合することができる。好ましい部分は、直接的にまたは介在テザーを介して間接的に、好ましくは共有結合で結合されるリガンドである。
【０２０５】
好ましい実施形態では、リガンドは、このリガンドが取り込まれる分子の分布、標的化、または寿命を変更する。好ましい実施形態では、リガンドは、例えば、このようなリガンドが存在しない種と比較して、選択される標的、例えば、分子、細胞もしくは細胞型、区画、受容体、例えば、細胞もしくは器官の区画、組織、器官、または体の領域に対する親和性を高める。選択される標的に対する親和性を高めるリガンドは、標的化リガンドとも呼ばれる。
【０２０６】
一部のリガンドは、エンドソーム溶解特性を有し得る。エンドソーム溶解リガンドは、エンドソームの溶解、および／または本発明の組成物もしくはその成分のエンドソームから細胞の細胞質への輸送を促進する。エンドソーム溶解リガンドは、ｐＨ依存性の膜活性および融合性を示すポリアニオン性ペプチドまたはペプチド模倣体であっても良い。一実施形態では、エンドソーム溶解リガンドは、エンドソームのｐＨでその活性型立体構造をとると推定される。「活性型」立体構造とは、エンドソーム溶解リガンドが、エンドソームの溶解、および／または本発明の組成物もしくはその成分のエンドソームから細胞の細胞質への輸送を促進する立体構造のことである。例示的なエンドソーム溶解リガンドとしては、ＧＡＬＡペプチド（Ｓｕｂｂａｒａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８７，２６：２９６４−２９７２）、ＥＡＬＡペプチド（Ｖｏｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９６，１１８：１５８１−１５８６）、およびこれらの誘導体（Ｔｕｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，２００２，１５５９：５６−６８）が挙げられる。一実施形態では、エンドソーム溶解成分は、ｐＨの変化に応じて電荷またはプロトン化の変化を起こす化学基（例えば、アミノ酸）を含み得る。エンドソーム溶解成分は、直鎖であっても、分岐鎖であっても良い。
【０２０７】
リガンドは、輸送、ハイブリダイゼーション、および特異性の特性を向上させることができ、結果として得られる天然オリゴリボヌクレオチドもしくは修飾オリゴリボヌクレオチド、または本明細書に記載されるモノマーおよび／もしくは天然リボヌクレオチドもしくは修飾リボヌクレオチドの任意の組み合わせを含むポリマー分子のヌクレアーゼ耐性も向上させることができる。
【０２０８】
リガンドは、一般に、例えば、取り込みを増強するための治療用修飾因子；例えば、分布を監視するための診断化合物またはレポーター基；架橋剤；およびヌクレアーゼ耐性を付与する部分を含み得る。一般的な例として、脂質、ステロイド、ビタミン、糖、タンパク質、ペプチド、ポリアミン、およびペプチド模倣体が挙げられる。
【０２０９】
リガンドとしては、天然に存在する物質、例えば、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、もしくはグロブリン）；糖質（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン、もしくはヒアルロン酸）；または脂質を挙げることができる。リガンドは、組換え分子または合成分子、例えば、合成ポリマー、例えば、合成ポリアミノ酸、オリゴヌクレオチド（例えば、アプタマー）であっても良い。ポリアミノ酸を含むポリアミノ酸としては、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリＬ−アスパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン−無水マレイン酸コポリマー、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−グリコリエド（ｇｌｙｃｏｌｉｅｄ））コポリマー、ジビニルエーテル無水マレイン酸コポリマー、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２−エチルアクリル酸）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマー、またはポリホスファジンが挙げられる。ポリアミンの例として、ポリエチレンイミン、ポリリジン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、擬似ペプチド−ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの第四級塩、またはアルファへリックスペプチドが挙げられる。
【０２１０】
リガンドとして、標的化基、例えば、細胞標的化剤または組織標的化剤、例えば、腎臓細胞などの特定の細胞型に結合するレクチン、糖タンパク質、脂質、もしくはタンパク質、例えば、抗体も挙げることができる。標的化基は、チロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、界面活性剤タンパク質Ａ、ムチン糖質、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン（ｇｕｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ）、多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸塩、ポリアスパラギン酸塩、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸塩、ビタミンＢ１２、ビオチン、ＲＧＤペプチド、ＲＧＤペプチド模倣体、またはアプタマーであっても良い。
【０２１１】
リガンドの他の例として、色素、挿入剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、プソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼまたはキレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、親油性分子、例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、もしくはフェノキサジン）およびペプチドコンジュゲート（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、リン酸塩、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進剤（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン−イミダゾールコンジュゲート、テトラアザマクロ環のＥｕ３＋複合体）、ジニトロフェニル、ＨＲＰ、またはＡＰが挙げられる。
【０２１２】
リガンドは、タンパク質、例えば、糖タンパク質、またはペプチド、例えば、共リガンドに対して特異的な親和性を有する分子、または抗体、例えば、癌細胞、内皮細胞、もしくは骨細胞などの特定の細胞型に結合する抗体であっても良い。リガンドとして、ホルモンおよびホルモン受容体も挙げることができる。リガンドとして、非ペプチド種、例えば、脂質、レクチン、糖質、ビタミン、コファクター、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、多価マンノース、多価フコース、またはアプタマーも挙げることができる。リガンドは、例えば、リポ多糖、ｐ３８  ＭＡＰキナーゼの活性化因子、またはＮＦ−κＢの活性化因子であっても良い。
【０２１３】
リガンドは、例えば、細胞の細胞骨格を破壊することによって、例えば、細胞の微小管、マイクロフィラメント、および／または中間径フィラメントを破壊することによって、ｉＲＮＡ剤の細胞内への取り込みを増大させることができる物質、例えば、薬物であっても良い。薬物は、例えば、タクソン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャプラキノリド（ｊａｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ）、ラトランクリンＡ、ファロイジン、スウィンホリドＡ、インダノシン、またはミオセルビン（ｍｙｏｓｅｒｖｉｎ）であっても良い。
【０２１４】
リガンドは、例えば、炎症反応を活性化することによって、オリゴヌクレオチドの細胞への取り込みを増加させることができる。このような効果を有し得る例示的なリガンドとしては、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターロイキン−１β、またはγインターフェロンが挙げられる。
【０２１５】
一態様では、リガンドは、脂質または脂質ベースの分子である。このような脂質または脂質ベースの分子は、好ましくは血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合する。ＨＳＡ結合リガンドは、コンジュゲートが、標的組織、例えば、体の非腎臓標的組織に分布するのを可能にする。例えば、標的組織は、肝臓の実質細胞を含む肝臓であっても良い。ＨＳＡに結合し得る他の分子もリガンドとして使用することができる。例えば、ナプロキセンまたはアスピリンを使用することができる。脂質または脂質ベースのリガンドは、（ａ）コンジュゲートの分解に対する耐性を増大させ、（ｂ）標的細胞または細胞膜への標的化または輸送を増大させることができ、かつ／または（ｃ）血清タンパク質、例えば、ＨＳＡに対する結合を調節するために使用することができる。
【０２１６】
脂質ベースのリガンドは、標的組織に対するコンジュゲートの結合を調節、例えば、制御するために使用することができる。例えば、ＨＳＡにより強く結合する脂質または脂質ベースのリガンドは、腎臓を標的とする可能性が低く、従って、体内から除去される可能性が低い。ＨＳＡにそれほど強く結合しない脂質または脂質ベースのリガンドは、コンジュゲートが腎臓を標的にするように使用することができる。
【０２１７】
好ましい実施形態では、脂質ベースのリガンドはＨＳＡに結合する。好ましくは、脂質ベースのリガンドは、コンジュゲートが、好ましくは非腎臓組織に分布するように、十分な親和性でＨＳＡに結合する。しかしながら、好ましくは、この親和性は、ＨＳＡ−リガンド結合が逆行できないほど強力ではない。
【０２１８】
別の好ましい実施形態では、脂質ベースのリガンドは、ＨＳＡに対して弱く結合するかまたは全く結合しないため、コンジュゲートが、好ましくは腎臓に分布する。腎細胞を標的とする他の部分も、脂質ベースのリガンドの代わりに、またはこれに加えて使用することができる。
【０２１９】
別の態様では、リガンドは、標的細胞、例えば、増殖細胞によって取り込まれる部分、例えば、ビタミンである。これらは、例えば、悪性型または非悪性型、例えば、癌細胞の望ましくない細胞増殖を特徴とする障害を治療するのに特に有用である。例示的なビタミンとしては、ビタミンＡ、Ｅ、およびＫが挙げられる。他の例示的なビタミンとしては、ビタミンＢ、例えば、葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサール、または癌細胞によって取り込まれる他のビタミンもしくは栄養素が挙げられる。また、ＨＡＳ、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、および高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）もが挙げられる。
【０２２０】
別の態様では、リガンドは、細胞透過剤、好ましくはヘリックス型の細胞透過剤である。好ましくは、作用剤は両親媒性である。例示的な作用剤は、ペプチド、例えば、ｔａｔまたはアンテナペディア（ａｎｔｅｎｎｏｐｅｄｉａ）である。作用剤がペプチドである場合、ペプチジル模倣体、反転異性体、非ペプチド結合または偽ペプチド結合、およびＤ−アミノ酸の使用を含む修飾を施すことができる。好ましくは、このヘリックス型の細胞透過剤は、好ましくは親油性相および疎油性相を有するアルファヘリックス型の作用剤である。
【０２２１】
リガンドは、ペプチドまたはペプチド模倣体であっても良い。ペプチド模倣体（本明細書ではオリゴペプチド模倣体とも呼ばれる）は、天然ペプチドと同様の定められた３次元構造に折り畳むことができる分子である。ペプチド部分またはペプチド模倣体部分は、約５〜５０のアミノ酸長さ、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０のアミノ酸長さであっても良い。ペプチドまたはペプチド模倣体は、例えば、細胞透過ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、または疎水性ペプチド（例えば、主にＴｙｒ、Ｔｒｐ、もしくはＰｈｅから構成される）であっても良い。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、拘束ペプチド、または架橋ペプチドであっても良い。別の代替では、ペプチド部分は、疎水性の膜輸送配列（ＭＴＳ）を含み得る。例示的な疎水性ＭＴＳ含有ペプチドは、アミノ酸配列ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ（配列番号：４）を有するＲＦＧＦである。疎水性ＭＴＳを含有するＲＦＧＦ類似体（例えば、アミノ酸配列ＡＡＬＬＰＶＬＬＡＡＰ）（配列番号：５）も標的化部分であっても良い。ペプチド部分は、「送達」ペプチドであっても良く、この送達ペプチドは、ペプチド、オリゴヌクレオチド、およびタンパク質を含む大きな極性分子を、細胞膜を通過して運搬することができる。例えば、ＨＩＶ  Ｔａｔタンパク質由来の配列（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ）（配列番号：６）およびショウジョウバエアンテナペディアタンパク質由来の配列（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ）（配列番号：７）は、送達ペプチドとして機能できることが分かっている。ペプチドまたはペプチド模倣体、例えば、ファージディスプレイライブラリー、または１ビーズ１化合物（ＯＢＯＣ）コンビナトリアルライブラリーから特定されたペプチドは、ＤＮＡのランダム配列によってコードされても良い（Ｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５４：８２−８４，１９９１）。好ましくは、組み込まれたモノマー単位を介してｉＲＮＡ剤に連結されたペプチドまたはペプチド模倣体は、細胞標的化ペプチド、例えば、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）−ペプチドまたはＲＧＤ模倣体である。ペプチド部分は、約５つのアミノ酸長さ〜約４０のアミノ酸長さの範囲とすることができる。ペプチド部分は、例えば、安定性または直接的な立体構造特性を高めるための、構造変化を有し得る。下記の構造変化のいずれも利用することができる。ＲＧＤペプチド部分は、内皮腫瘍細胞または乳癌腫瘍細胞などの腫瘍細胞を標的とするために使用することができる（Ｚｉｔｚｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６２：５１３９−４３，２００２）。ＲＧＤペプチドは、肺、腎臓、脾臓、または肝臓を含む種々の他の組織の腫瘍に対するｉＲＮＡ剤の標的化を促進することができる（Ａｏｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ８：７８３−７８７，２００１）。好ましくは、ＲＧＤペプチドは、腎臓に対するｉＲＮＡ剤の標的化を促進する。ＲＧＤペプチドは、直鎖または環状であっても良く、特定の組織に対する標的化を促進するために修飾する、例えば、グリコシル化またはメチル化することができる。例えば、グリ��シル化ＲＧＤペプチドは、αｖβ３を発現する腫瘍細胞にｉＲＮＡ剤を送達することができる（Ｈａｕｂｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，４２：３２６−３３６，２００１）。増殖細胞に豊富なマーカーを標的とするペプチドを使用することができる。例えば、ＲＧＤ含有ペプチドおよびＲＧＤ含有ペプチド模倣体は、癌細胞、特に、インテグリンを提示する細胞を標的とすることができる。従って、ＲＧＤペプチド、ＲＧＤを含有する環状ペプチド、Ｄ−アミノ酸を含むＲＧＤペプチド、および合成ＲＧＤ模倣体を使用することができる。ＲＧＤに加えて、インテグリンリガンドを標的とする他の部分を使用することもできる。一般に、このようなリガンドは、増殖細胞および血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｉｓ）を制御するために使用することができる。この種のリガンドの好ましいコンジュゲートは、ＰＥＣＡＭ−１、ＶＥＧＦ、または他の癌遺伝子、例えば、本明細書に記載される癌遺伝子を標的とする。
【０２２２】
「細胞透過ペプチド」は、細胞、例えば、微生物細胞、例えば、細菌細胞もしくは真菌細胞、または哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞を透過することができる。微生物細胞を透過するペプチドは、例えば、α−ヘリックス直鎖ペプチド（例えば、ＬＬ−３７もしくはセロピンＰ１）、ジスルフィド結合含有ペプチド（例えば、α−ディフェンシン、β−ディフェンシン、もしくはバクテネシン）、または１種もしくは２種の優勢なアミノ酸のみを含有するペプチド（例えば、ＰＲ−３９もしくはインドリシジン）であっても良い。細胞透過ペプチドは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）も含み得る。例えば、細胞透過ペプチドは、ＨＩＶ−１  ｇｐ４１の融合ペプチドドメインおよびＳＶ４０ラージＴ抗原のＮＬＳに由来する二部両親媒性ペプチド、例えば、ＭＰＧであっても良い（Ｓｉｍｅｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：２７１７−２７２４，２００３）。
【０２２３】
一実施形態では、標的化ペプチドは、両親媒性α−ヘリックスペプチドであっても良い。例示的な両親媒性α−ヘリックスペプチドとしては、限定されるものではないが、セクロピン、リコトキシン（ｌｙｃｏｔｏｘｉｎ）、パラダキシン（ｐａｒａｄａｘｉｎ）、ブフォリン、ＣＰＦ、ボンビニン−様ペプチド（ＢＬＰ）、カテリシジン、セラトトキシン（ｃｅｒａｔｏｔｏｘｉｎ）、エボヤ（Ｓ．ｃｌａｖａ）ペプチド、メクラウナギ腸抗菌ペプチド（ＨＦＩＡＰ）、マガイニン、ブレビニン−２、デルマセプチン、メリチン、プレウロシジン、Ｈ２Ａペプチド、アフリカツメガエルペプチド、エスクレンチニス−１（ｅｓｃｕｌｅｎｔｉｎｉｓ−１）、およびカエリンが挙げられる。好ましくは、多数の因子が、ヘリックス安定性の完全性を維持すると見なされる。例えば、最大数のヘリックス安定化残基（例えばｌｅｕ、ａｌａ、またはｌｙｓ）を利用し、最小数のヘリックス不安定化残基（例えばプロリン、または環状モノマー単位を利用する。キャッピング残基も考慮される（例えば、Ｇｌｙは、例示的なＮ−キャッピング残基であり、かつ／またはＣ末端アミド化は、追加的な水素結合を実現してヘリックスを安定させるために使用することができる。ｉ±３位、またはｉ±４位離間した、反対の電荷を有する残基間の塩架橋の形成によって安定させることができる。カチオン性残基、例えば、リジン、アルギニン、ホモ−アルギニン、オルニチン、またはヒスチジンは、アニオン性残基であるグルタミン酸またはアスパラギン酸と塩架橋を形成し得る。
【０２２４】
ペプチドリガンドおよびペプチド模倣体リガンドとしては、天然ペプチドまたは修飾ペプチド、例えば、ＤペプチドもしくはＬペプチド；αペプチド、βペプチド、もしくはγペプチド；Ｎ−メチルペプチド；アザペプチド；１つ以上の尿素結合、チオ尿素結合、カルバミン酸結合、もしくはスルホニル尿素結合で置換された１つ以上のアミド結合、即ち、ペプチ結合を有するペプチド；または環状ペプチドを有するリガンドが挙げられる。
【０２２５】
標的化リガンドは、特定の受容体を標的とすることができるあらゆるリガンドであっても良い。例として、葉酸塩、ＧａｌＮＡｃ、ガラクトース、マンノース、マンノース−６Ｐ、糖クラスター、例えば、ＧａｌＮＡｃクラスター、マンノースクラスター、ガラクトースクラスター、またはアプタマーが挙げられる。クラスターは、２つ以上の糖単位の組み合わせである。標的化リガンドは、インテグリン受容体リガンド、ケモカイン受容体リガンド、トランスフェリン、ビオチン、セロトニン受容体リガンド、ＰＳＭＡ、エンドセリン、ＧＣＰＩＩ、ソマトスタチン、ＬＤＬリガンド、およびＨＤＬリガンドも含む。リガンドは、核酸、例えば、アプタマーをベースにしても良い。アプタマーは、未修飾でも良いし、または本明細書に開示される修飾の任意の組み合わせを有しても良い。
【０２２６】
エンドソーム放出剤としては、イミダゾール、ポリまたはオリゴイミダゾール、ＰＥＩ、ペプチド、融合性ペプチド、ポリカーボキシレート（ｐｏｌｙｃａｂｏｘｙｌａｔｅ）、ポリカチオン（ｐｏｌｙａｃａｔｉｏｎ）、マスクオリゴまたはポリカチオンまたはアニオン、アセタール、ポリアセタール、ケタール／ポリケチアル（ｐｏｌｙｋｅｔｙａｌ）、オルトエステル、マスクまたは非マスクカチオンまたはアニオン電荷を有するポリマー、マスクまたは非マスクカチオンまたはアニオン電荷を有するデンドリマーが挙げられる。
【０２２７】
ＰＫモジュレーターとは、薬物動態学的モジュレーターのことである。ＰＫモジュレーターとしては、脂肪親和物、胆汁酸、ステロイド、リン脂質類似体、ペプチド、タンパク質結合剤、ＰＥＧ、ビタミンなどが挙げられる。例示的なＰＫモジュレーターとしては、限定されるものではないが、コレステロール、脂肪酸、コール酸、リトコール酸、ジアルキルグリセリド、ジアシルグリセリド、リン脂質、スフィンゴ脂質、ナプロキセン、イブプロフェン、ビタミンＥ、ビオチンなどが挙げられる。多数のホスホロチオエート連結を含むオリゴヌクレオチドも、血清タンパク質に結合することが知られており、したがって、骨格に多数のホスホロチオエート連結を含む短鎖オリゴヌクレオチド、例えば、約５塩基、１０塩基、１５塩基、または２０塩基のオリゴヌクレオチドも、リガンドとして（例えば、ＰＫ調節リガンドとして）本発明に適用可能である。
【０２２８】
加えて、血清成分（例えば、血清タンパク質）に結合するアプタマーも、ＰＫ調節リガンドとして本発明に適用可能である。
【０２２９】
本発明に適用可能な他のリガンドコンジュゲートは、参照によりそれらの全開示内容が本明細書に組み入れられる、２００４年８月１０日出願の米国特許出願第１０／９１６，１８５号明細書；２００４年９月２１日出願の同第１０／９４６，８７３号明細書；２００７年８月３日出願の同第１０／８３３，９３４号明細書；２００５年４月２７日出願の同第１１／１１５，９８９号明細書、および２００７年１１月２１日出願の同第１１／９４４，２２７号明細書に記載されている。
【０２３０】
２つ以上のリガンドが存在する場合、リガンドは、全て同じ特性を有しても良いし、全てが異なる特性を有しても良く、または一部のリガンドが、同じ特性を有する一方、他のリガンドが異なる特性を有しても良い。例えば、リガンドは、標的化特性を有しても良いし、エンドソーム的活性を有して良いし、またはＰＫ調節特性を有しても良い。好ましい実施形態では、全てのリガンドが異なる特性を有する。
【０２３１】
リガンドは、様々な位置、例えば３’末端、５’末端、および／または内部位置で、オリゴヌクレオチドに結合することができる。好ましい実施形態では、リガンドは、介在テザー、例えば、本明細書に記載される担体を介してオリゴヌクレオチドに結合している。モノマーが成長している鎖に組み込まれる場合、リガンドまたはテザーリガンドは、このモノマーに存在しても良い。一部の実施形態では、リガンドは、「前駆体」モノマーが、成長している鎖に組み込まれた後で、この「前駆体」モノマーへの結合によって組み込むことができる。例えば、末端がアミノであるテザー（即ち、リガンドが結合されていない）、例えば、ＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎＮＨ２を有するモノマーを、成長しているオリゴヌクレオチド鎖に組み込むことができる。これに続く作業、即ち、前駆体モノマーが鎖に組み込まれた後で、リガンドの求電子基と前駆体モノマーのテザーの末端求核基との結合によって、求電子基、例えば、ペンタフルオロフェニルエステルまたはアルデヒド基を有するリガンドを、その後、前駆体モノマーに結合させることができる。
【０２３２】
別の例では、クリック化学反応に参加するのに適した化学基を有するモノマーを、例えば、末端がアジドまたはアルキンのテザー／リンカーに組み込むことができる。これに続く作業、即ち、前駆体モノマーが鎖に組み込まれた後で、相補的な化学基、例えば、アルキンまたはアジドを有するリガンドを、アルキンおよびアジドを共に結合することによって前駆体モノマーに結合することができる。
【０２３３】
二本鎖オリゴヌクレオチドの場合、リガンドは、一方または両方の鎖に結合することができる。一部の実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤は、センス鎖にコンジュゲートされたリガンドを含有する。他の実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖にコンジュゲートされたリガンドを含有する。
【０２３４】
一部の実施形態では、リガンドは、核酸分子の核酸塩基、糖部分、またはヌクレオシド間結合にコンジュゲートすることができる。プリン核酸塩基またはその誘導体に対するコンジュゲーションは、環内原子および環外原子を含む任意の位置に生じ得る。一部の実施形態では、プリン核酸塩基の２位、６位、７位、または８位が、コンジュゲート部分に結合している。また、ピリミジン核酸塩基またはその誘導体に対するコンジュゲーションは、どの位置で生じても良い。一部の実施形態では、ピリミジン核酸塩基の２位、５位、および６位を、コンジュゲート部分と置換することができる。ヌクレオシドの糖部分に対するコンジュゲーションは、どの炭素原子で生じても良い。コンジュゲート部分に結合することができる糖部分の炭素原子の例には、２’、３’、および５’炭素原子が挙げられる。１’位も、コンジュゲート部分、例えば、脱塩基残基に結合することができる。ヌクレオシド間結合も、コンジュゲート部分を保持することができる。リン含有結合（例えば、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｔｈｉｏｔａｔｅ）、およびホスホロアミデートなど）の場合、コンジュゲート部分は、リン原子に直接結合する、またはリン原子に結合しているＯ、Ｎ、またはＳ原子に結合することができる。アミンまたはアミドを含有するヌクレオシド間結合（例えば、ＰＮＡ）の場合、コンジュゲート部分は、アミンまたはアミドの窒素原子に、または隣接する炭素原子に結合することができる。
【０２３５】
ＲＮＡ干渉の分野におけるあらゆる適切なリガンドを使用することができるが、このようなリガンドは、典型的には、糖質、例えば、単糖（例えば、ＧａｌＮＡｃ）、二糖、三糖、四糖、多糖である。
【０２３６】
リガンドを核酸にコンジュゲートさせるリンカーは、上述のリンカーを含む。例えば、リガンドは、二価または三価の分岐リンカーによって付着された１つ以上のＧａｌＮＡｃ（Ｎ−アセチルグルコサミン）誘導体であっても良い。
【０２３７】
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡは、次の式（Ｖ）〜（ＶＩＩ）の何れかに示されている構造を含む二価および三価の分岐リンカーにコンジュゲートする：
【化５】
2018007657.tif 000006
式中、
ｑ２Ａ、ｑ２Ｂ、ｑ３Ａ、ｑ３Ｂ、ｑ４Ａ、ｑ４Ｂ、ｑ５Ａ、ｑ５Ｂ、およびｑ５Ｃは存在ごとに独立して、０〜２０を表し、反復単位は、同じであっても良いし、異なっていても良く；
Ｐ２Ａ、Ｐ２Ｂ、Ｐ３Ａ、Ｐ３Ｂ、Ｐ４Ａ、Ｐ４Ｂ、Ｐ５Ａ、Ｐ５Ｂ、Ｐ５Ｃ、Ｔ２Ａ、Ｔ２Ｂ、Ｔ３Ａ、Ｔ３Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ４Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ５Ｂ、Ｔ５Ｃはそれぞれ存在ごとに独立して、存在しないか、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨ、またはＣＨ２Ｏを表し；
Ｑ２Ａ、Ｑ２Ｂ、Ｑ３Ａ、Ｑ３Ｂ、Ｑ４Ａ、Ｑ４Ｂ、Ｑ５Ａ、Ｑ５Ｂ、Ｑ５Ｃは存在ごとに独立して、存在しないか、アルキレン、置換アルキレンを表し、１つ以上のメチレンは、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｒ’）＝Ｃ（Ｒ’’）、Ｃ≡Ｃ、またはＣ（Ｏ）の１つ以上によって中断または終了させることができ；
Ｒ２Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３Ａ、Ｒ３Ｂ、Ｒ４Ａ、Ｒ４Ｂ、Ｒ５Ａ、Ｒ５Ｂ、Ｒ５Ｃはそれぞれ存在ごとに独立して、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣＨ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ（Ｒａ）−ＮＨ−、ＣＯ、ＣＨ＝Ｎ−Ｏ、
【化６】
2018007657.tif 000007
、またはヘテロシクリルを表し；
Ｌ２Ａ、Ｌ２Ｂ、Ｌ３Ａ、Ｌ３Ｂ、Ｌ４Ａ、Ｌ４Ｂ、Ｌ５Ａ、Ｌ５Ｂ、およびＬ５Ｃは、リガンドを表す；即ち、それぞれ存在ごとに独立して、単糖（例えば、ＧａｌＮＡｃ）、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、または多糖を表し；かつ
Ｒａは、Ｈまたはアミノ酸側鎖である。
【０２３８】
三価コンジュゲートＧａｌＮＡｃ誘導体、例えば、式（ＶＩＩ）のような誘導体は、標的遺伝子の発現を阻害するためのＲＮＡｉ剤と共に使用すると特に有用である：
【化７】
2018007657.tif 000008
式中、Ｌ５Ａ、Ｌ５Ｂ、およびＬ５Ｃは、単糖、例えば、ＧａｌＮＡｃ誘導体を表している。
適切な二価および三価分岐リンカー基コンジュゲートＧａｌＮＡｃ誘導体は、限定されるものではないが、以下の化合物：
【化８】
2018007657.tif 000009
【化９】
2018007657.tif 000010
を含む。
【０２３９】
他の実施形態では、本発明のＲＮＡｉ剤は、ＡＤ−４５１６３、ＡＤ−４５１６５、ＡＤ−５１５４４、ＡＤ−５１５４５、ＡＤ−５１５４６、およびＡＤ−５１５４７からなる群から選択される作用剤である。
【０２４０】
ＩＩＩ．医薬組成物
本発明のＲＮＡｉ剤は、他の医薬品との類似性によって、ヒトまたは動物用の薬物に使用される任意の便利な方法で投与するために製剤することができる。本発明のＲＮＡｉ剤を含む医薬組成物は、例えば、緩衝剤を含むもしくは含まない溶液、または薬学的に許容される担体を含む組成物とすることができる。このような組成物としては、例えば、水溶性または結晶性組成物、リポソーム製剤、ミセル製剤、エマルション、および遺伝子治療ベクターが挙げられる。
【０２４１】
本発明の方法では、ＲＮＡｉ剤は、溶液に溶解して投与することができる。遊離ＲＮＡｉ剤を、非緩衝液、例えば、生理食塩水または水に溶解して投与することができる。あるいは、遊離ｓｉＲＮＡは、適切な緩衝液に溶解して投与しても良い。緩衝液としては、酢酸塩、クエン酸塩、プロラミン、炭酸塩、リン酸塩、またはこれらの任意の組み合わせを挙げることができる。好ましい実施形態では、緩衝液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。ＲＮＡｉ剤を含む緩衝液のｐＨおよびオスモル濃度は、対象に投与するのに適するように調整することができる。
【０２４２】
一部の実施形態では、緩衝液は、オスモル濃度が、所望の値、例えば、ヒト血漿の生理値に維持されるように、溶液のオスモル濃度を制御するための作用剤をさらに含む。オスモル濃度を制御するために緩衝液に添加することができる溶質としては、限定されるものではないが、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、非代謝性ポリマー、ビタミン、イオン、糖、代謝産物、有機酸、脂質、または塩が挙げられる。一部の実施形態では、溶液のオスモル濃度を制御するための作用剤は塩である。特定の実施形態では、溶液のオスモル濃度を制御するための作用剤は、塩化ナトリウムまたは塩化カリウムである。
【０２４３】
他の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、１つ以上のＲＮＡｉ剤および薬学的に許容される担体を含む組成物として製剤される。本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」という語は、医薬品投与に適合したあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤、および吸収遅延剤などを含む。薬学的に活性な物質用のこのような媒体および作用剤の使用は、当分野で周知である。あらゆる従来の媒体または作用剤が活性化合物と適合性でない場合を除き、その組成物中での使用が想定される。補助活性化合物を組成物に含めても良い。
【０２４４】
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤調製物は、少なくとも第２の治療剤（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ以外の作用剤）を含む。例えば、ＴＴＲ関連疾患、例えば、トランスサイレチン関連遺伝性アミロイドーシス（家族性アミロイド多発神経障害（ＦＡＰ））の治療用のＲＮＡｉ剤組成物としては、ＦＡＰの改善用の公知の薬物、例えば、タファミディス（ＩＮＮ、またはＦｘ−１００６ＡもしくはＶｙｎｄａｑｅｌ）を挙げることができる。
【０２４５】
製剤ＲＮＡｉ剤組成物は、様々な状態をとり得る。一部の例では、この組成物は、少なくとも部分的に結晶、均一に結晶、および／または無水（例えば、８０％未満、５０％未満、３０％未満、２０％未満、または１０％未満の水を含む）である。別の例では、ＲＮＡｉ剤は、水相、例えば、水分を含む溶液に溶解される。
【０２４６】
水相および結晶性組成物は、送達ビヒクル、例えば、リポソーム（特に水相の場合）または粒子（例えば、結晶性組成物に適切であり得る微粒子）に含めることができる。一般に、ＲＮＡｉ剤組成物は、本明細書に記載される意図する投与法に適合するように製剤される。例えば、特定の実施形態では、この組成物は、少なくとも１つの次の方法によって調製される：噴霧乾燥、凍結乾燥、真空乾燥、蒸発、流動床乾燥、もしくはこれらの技術の組み合わせ；または脂質を用いた超音波処理、フリーズドライ、凝縮、および他の自己集合。
【０２４７】
ＲＮＡｉ剤調製物は、別の作用剤、例えば、別の治療剤、またはＲＮＡｉ剤を安定させる作用剤、例えば、ＲＮＡｉ剤と複合体を形成してｉＲＮＰを形成するタンパク質と組み合わせて製剤することができる。なお他の作用剤としては、キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ（例えば、二価のカチオン、例えば、Ｍｇ２＋を除去するための）、塩、およびＲＮＡ分解酵素阻害剤（例えば、特異性の広いＲＮＡ分解酵素阻害剤、例えば、ＲＮＡｓｉｎ）などが挙げられる。
【０２４８】
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤調製物は、別のｓｉＲＮＡ化合物、例えば、第２の遺伝子または同じ遺伝子に対してＲＮＡｉを媒介することができる第２のＲＮＡｉ剤を含む。なお他の調製物は、少なくとも３、５、１０、２０、５０、または１００以上の異なるＲＮＡｉ遺伝子種を含み得る。このようなＲＮＡｉ剤は、同様の数の異なる遺伝子に対してＲＮＡｉを媒介することができる。
【０２４９】
本発明のｉＲＮＡ剤は、医薬用途用に製剤することができる。薬学的に許容される組成物は、単独で、あるいは１種以上の薬学的に許容される担体（添加剤）、賦形剤、および／または希釈剤と共に製剤される、前述の実施形態の何れかの１種以上のｄｓＲＮＡ剤を、治療効果または予防有効量、含む。
【０２５０】
本発明の医薬組成物を調製する方法は、本発明のＲＮＡｉ剤を担体、および任意選択で１種以上の補助成分と結合させるステップを含む。一般に、この組成物は、本発明のＲＮＡｉ剤を液体担体、細かく分割された固体担体、または両方を均一に密着させて結合させ、次いで、必要に応じて製品を成形することによって調製する。
【０２５１】
医薬組成物は、以下のように適合された投与を含め、固体または液体の形態で投与されるように特別に製剤することができる：（１）例えば、水薬（水性もしくは非水性溶液、または懸濁液）、錠剤、例えば、頬側、舌下、および体内吸収用の錠剤、ボーラス、粉末、顆粒、舌に適用するためのペーストの経口投与；（２）例えば、滅菌液もしくは懸濁液、または徐放製剤として、例えば、皮下注射、筋肉注射、静脈注射、もしくは硬膜外注射による非経口投与；（３）例えば、皮膚に適用されるクリーム、軟膏、または放出制御パッチもしくはスプレーとしての局所適用；（４）例えば、ペッサリー、クリーム、フォームとして膣内または直腸内投与；（５）舌下投与；（６）眼内投与；（７）経皮的投与；あるいは（８）鼻内投与。皮下または点滴法を用いる送達は、特に有利であり得る。
【０２５２】
「薬学的に許容される」という句は、本明細書では、妥当な効果／リスク比に見合った、過度な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題や合併症が発生することなく、ヒトおよび動物の組織に接触させるのに適した、正当な医学的判断の範囲内である化合物、材料、組成物、および／または剤形を指すために利用される。
【０２５３】
本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」という句は、目的の化合物をある器官または体の一部から別の器官または体の一部への運搬または輸送に関与する薬学的に許容される材料、組成物、またはビヒクル、例えば、液体もしくは固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、製造補助剤（例えば、潤滑剤、タルク、マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、もしくはステアリン酸（ｓｔｅｒｉｃ  ａｃｉｄ））、もしくは材料を被包する溶媒を意味する。各担体は、組成物の他成分と適合性であって、患者に有害でないという点で「許容可能」ではなければならない。薬学的に許容される担体として役立ち得る材料の一部の例として：（１）糖、例えば、ラクトース、グルコース、およびスクロース；（２）デンプン、例えば、トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプン；（３）セルロースおよびその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロース；（４）粉末トラガカント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）平滑剤、例えば、マグネシウムステート（ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ｓｔａｔｅ）、ラウリル硫酸ナトリウム、およびタルク；（８）賦形剤、例えば、ココアバターおよび座薬ワックス；（９）油、例えば、ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、および大豆油；（１０）グリコール、例えば、ポリエチレングリコール；（１１）ポリオール、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコール；（１２）エステル、例えば、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル；（１３）寒天；（１４）緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム；（１５）アルギン酸；（１６）パイロジェンフリー水；（１７）等張食塩水；（１８）リンガー液；（１９）エチルアルコール；（２０）ｐＨ緩衝液；（２１）ポリエステル、ポリカーボネート、および／またはポリ無水物；（２２）充填剤、例えば、ポリペプチドおよびアミノ酸；（２３）血清成分、例えば、血清アルブミン、ＨＤＬ、およびＬＤＬ；ならびに（２２）医薬組成物に利用される他の無毒適合物質が挙げられる。
【０２５４】
この組成物は、ユニット剤形で便利に提供することができ、薬学の分野で周知の任意の方法で調製することができる。単一剤形を製造するために担体材料と組み合わせることができるＲＮＡｉ剤の量は、治療を受ける者および投与の特定の方式によって異なる。単一剤形を製造するために担体材料と組み合わせることができるＲＮＡｉ剤の量は、一般に、所望の効果、例えば、治療効果または予防効果が得られる量である。一般に、１００％のうち、この量は、ＲＮＡｉ剤の約０．１％〜約９９％、好ましくは約５％〜約７０％、最も好ましくは約１０％〜約３０％の範囲である。
【０２５５】
特定の実施形態では、本発明の組成物としては、シクロデキストリン、セルロース、リポソーム、ミセル形成剤、例えば、胆汁酸、およびポリマー担体、例えば、ポリエステルおよびポリ無水物；および本発明のＲＮＡｉ剤からなる群から選択される賦形剤が挙げられる。特定の実施形態では、上述の組成物は、本発明のＲＮＡｉ剤を経口投与可能にする。
【０２５６】
場合によっては、ＲＮＡｉ剤の効果を持続させるために、皮下注射または筋肉注射によるＲＮＡｉ剤の吸収を遅延させることが望ましい。これは、水に溶けにくい結晶または非晶質材料の液体懸濁液の使用によって達成することができる。次に、ＲＮＡｉ剤の吸収速度は、結晶のサイズおよび結晶の形態に依存し得る溶解速度によって決まる。あるいは、非経口投与されるＲＮＡｉ剤の遅延吸収は、油性ビヒクル中にＲＮＡｉ剤を溶解または懸濁することによって達成することができる。
【０２５７】
リポソーム
本発明のＲＮＡｉ剤は、膜分子集合体、例えば、リポソームまたはミセルで送達するために製剤することができる。本明細書で使用される「リポソーム」という語は、少なくとも１つの二重層、例えば、１つの二重層または複数の二重層で構成された両親媒性脂質からなる小胞を指す。リポソームは、親油性材料および水性内部から形成される膜を有する単層小胞および多層小胞を含む。水性部分は、ＲＮＡｉ剤組成物を含む。親油性材料は、水性内部を水性外部から隔離し、この水性外部は、典型的にはＲＮＡｉ剤組成物を含まないが、一部の例では含むこともある。リポソームは、活性成分の作用部位への移送および送達に有用である。リポソーム膜は、生体膜に構造的に類似しているため、リポソームが組織に接触すると、リポソーム二重層が、細胞膜の二重層と融合する。リポソームと細胞との一体化が進むと、ＲＮＡｉ剤を含む内部水性成分が、細胞内に送達され、そこで、ＲＮＡｉ剤は、標的ＲＮＡに特異的に結合して、ＲＮＡｉを媒介することができる。場合によって、リポソームは、特異的に標的化され、例えば、ＲＮＡｉ剤を特定の細胞型に誘導する。
【０２５８】
ＲＮＡｉ剤を含むリポソームは、様々な方法で調製することができる。一例では、リポソームの脂質成分は、洗剤に溶解され、これにより、ミセルが脂質成分で形成される。例えば、脂質成分は、両親媒性カチオン脂質または脂質コンジュゲートとすることができる。洗剤は、高い臨界ミセル濃度を有することができ、非イオン性であり得る。例示的な洗剤としては、コール酸塩、ＣＨＡＰＳ、オクチルグルコシド、デオキシコール酸塩、およびラウロイルサルコシンが挙げられる。次いで、ＲＮＡｉ剤調製物が、脂質成分を含むミセルに添加される。脂質上のカチオン基が、ＲＮＡｉ剤と相互作用して、ＲＮＡｉ剤の周りに凝縮してリポソームを形成する。凝縮後、洗剤が、例えば、透析によって除去され、ＲＮＡｉ剤のリポソーム調製物が得られる。
【０２５９】
必要に応じて、凝縮を補助する担体化合物を、例えば、制御された添加によって、凝縮反応中に添加することができる。例えば、担体化合物は、核酸以外のポリマー（例えば、スペルミンまたはスペルミジン）とすることができる。ｐＨを、凝縮に適するように調整することもできる。
【０２６０】
送達ビヒクルの構造成分としてポリヌクレオチド／カチオン脂質複合体を包含する安定なポリヌクレオチド送達ビヒクルを形成するための方法が、参照によりその全開示内容が本明細書に組み入れられる国際公開第９６／３７１９４号パンフレットにさらに記載されている。リポソームの形成は、Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ８：７４１３−７４１７，１９８７；  米国特許第４，８９７，３５５号明細書；同第５，１７１，６７８号明細書；Ｂａｎｇｈａｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３：２３８，１９６５；Ｏｌｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ５５７：９，１９７９；Ｓｚｏｋａ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７５：４１９４，１９７８；Ｍａｙｈｅｗ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ７７５：１６９，１９８４；Ｋｉｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ７２８：３３９，１９８３；およびＦｕｋｕｎａｇａ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１１５：７５７，１９８４に記載されている例示的な方法の１つ以上の態様も含み得る。送達ビヒクルとして使用するのに適切なサイズの脂質凝集体を調製するために一般的に使用される技術は、超音波処理および凍結融解と押し出しを含む（例えば、Ｍａｙｅｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ８５８：１６１，１９８６を参照されたい）。一貫して小さく（５０〜２００ｎｍ）比較的均一な凝集体が望ましい場合は、微小流動化を使用することができる（Ｍａｙｈｅｗ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ７７５：１６９，１９８４）。このような方法は、ＲＮＡｉ剤調製物をリポソームの中にパッケージングするために容易に適合される。
【０２６１】
ｐＨ感受性または負に帯電したリポソームは、核酸分子と複合体を形成するのではなく、核酸分子を取り込む。核酸分子および脂質の両方が同様に帯電しているため、複合体が形成されるのではなく反発が起きる。とは言え、一部の核酸分子は、これらのリポソームの水性内部内に取り込まれる。ｐＨ感受性リポソームは、チミジンキナーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを培養中の細胞単層に送達するために使用される。外来遺伝子の発現が標的細胞で検出された（Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，１９，（１９９２）  ２６９−２７４）。
【０２６２】
１つの重要な種類のリポソーム組成物は、天然由来のホスファチジルコリン以外のリン脂質を含む。中性リポソーム組成物は、例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）またはジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から形成することができる。アニオン性リポソーム組成物は、一般に、ジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成され、アニオン性融合性リポソームは、主として、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成される。別の種類のリポソーム組成物は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、例えば、大豆ＰＣおよび卵ＰＣなどから形成される。別の種類は、リン脂質および／またはホスファチジルコリンおよび／またはコレステロールの混合物から形成される。
【０２６３】
リポソームをｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで細胞に導入する他の方法の例として、米国特許第５，２８３，１８５号明細書；同第５，１７１，６７８号明細書；国際公開第９４／００５６９号パンフレット；同第９３／２４６４０号パンフレット；同第９１／１６０２４号パンフレット；Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２５５０，１９９４；Ｎａｂｅｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：１１３０７，１９９３；Ｎａｂｅｌ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．３：６４９，１９９２；Ｇｅｒｓｈｏｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：７１４３，１９９３；およびＳｔｒａｕｓｓ  ＥＭＢＯ  Ｊ．１１：４１７，１９９２が挙げられる。
【０２６４】
一実施形態では、カチオン性リポソームが使用される。カチオン性リポソームは、細胞膜に融合できるという利点を有する。非カチオン性リポソームは、効率的には原形質膜と効率的に融合することができないが、ｉｎ  ｖｉｖｏでマクロファージによって取り込まれるため、ＲＮＡｉ剤をマクロファージに送達するために使用することができる。
【０２６５】
リポソームのさらなる利点としては：天然リン脂質から得られるリポソームが、生体適合性かつ生体分解性であること；リポソームが、種々の水溶性および脂溶性薬物を取り込むことができること；リポソームが、内部区画内に取り込まれたＲＮＡｉ剤を代謝および分解から保護できること（Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ”Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，”Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ  （Ｅｄｓ．），１９８８，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．２４５）が挙げられる。リポソーム製剤の調製における重要な考慮すべき事項は、脂質表面の電荷、小胞サイズ、およびリポソームの水中体積である。
【０２６６】
正に帯電した合成カチオン性脂質、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）を使用して、核酸と自然に相互作用して脂質−核酸複合体を形成する小型リポソームを形成することができ、この脂質−核酸複合体は、組織培養細胞の細胞膜の負に帯電した脂質と融合し、結果としてＲＮＡｉ剤を送達することができる（例えば、Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ８：７４１３−７４１７，１９８７、ならびにＤＯＴＭＡおよびそのＤＮＡとの使用が記載されている米国特許第４，８９７，３５５号明細書を参照されたい）。
【０２６７】
ＤＯＴＭＡ類似体、１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニア）プロパン（ＤＯＴＡＰ）をリン脂質と組み合わせて使用して、ＤＮＡと複合体を形成する小胞を形成することができる。Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ．）は、高度にアニオン性の核酸を生きた組織培養細胞に送達するための有効な作用剤であり、この組織培養細胞は、負に帯電したポリヌクレオチドと自然に相互作用して複合体を形成する正に帯電したＤＯＴＭＡリポソームを含む。十分に正に帯電したリポソームが使用されると、得られる複合体の正味荷電も正である。このように調製される正に帯電した複合体は、負に帯電した細胞表面に自然に付着し、原形質膜に融合し、そして機能性核酸を、例えば、組織培養細胞に有効に送達する。別の市販のカチオン性脂質、１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３，３−（トリメチルアンモニア）プロパン（「ＤＯＴＡＰ」）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａ）は、オレオイル部分が、エーテル結合ではなくエステルによって結合されているという点でＤＯＴＭＡとは異なる。
【０２６８】
他の報告されているカチオン性脂質化合物は、例えば、２種類のうちの１種類の脂質にコンジュゲートして、化合物、例えば、５−カルボキシスペルミルグリシンジオクタオレオイルアミド（「ＤＯＧＳ」）（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）、Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）およびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン５−カルボキシスペルミル−アミド（「ＤＰＰＥＳ」）を含むカルボキシスペルミンを含め、様々な部分にコンジュゲートしたものを含む（例えば、米国特許第５，１７１，６７８号明細書を参照されたい）。
【０２６９】
別のカチオン性脂質コンジュゲートは、ＤＯＰＥと組み合わせてリポソーム内に含められて製剤されたコレステロール（「ＤＣ−Ｃｈｏｌ」）による脂質の誘導体を含む（Ｇａｏ，  Ｘ．ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ，Ｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７９：２８０，１９９１を参照されたい）。ポリリシンをＤＯＰＥにコンジュゲートさせることによって形成されたリポポリリジンは、血清の存在下でのトランスフェクションに有効であることが報告されている（Ｚｈｏｕ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １０６５：８，１９９１）。特定の細胞株では、コンジュゲートカチオン性脂質を含むこのようなリポソームは、ＤＯＴＭＡ含有組成物よりも低い毒性を示し、かつより効率的なトランスフェクションを実現すると言われている。他の市販のカチオン性脂質製品としては、ＤＭＲＩＥおよびＤＭＲＩＥ−ＨＰ（Ｖｉｃａｌ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）およびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（ＤＯＳＰＡ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）が挙げられる。オリゴヌクレオチドの送達に適した他のカチオン性脂質は、国際公開第９８／３９３５９号明細書および同第９６／３７１９４号明細書に記載されている。
【０２７０】
リポソーム製剤は、局所投与に特に適しており、リポソームには、他の製剤よりもいくつかの利点が存在する。このような利点は、投与された薬物の高い全身吸収に関連した副作用の低下、所望の標的における投与された薬物の蓄積の増加、およびＲＮＡｉ剤を皮膚に投与する能力が挙げられる。一部の実施では、リポソームは、ＲＮＡｉ剤を上皮細胞に送達するために、そしてＲＮＡｉ剤の皮膚組織、例えば、皮膚への浸透を促進するためにも使用される。例えば、リポソームは、局所的に適用することができる。リポソームとして製剤された薬物の皮膚への局所送達は実証されている（例えば、Ｗｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，１９９２，ｖｏｌ．２，４０５−４１０  ａｎｄ  ｄｕ  Ｐｌｅｓｓｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１８，１９９２，２５９−２６５；Ｍａｎｎｉｎｏ，Ｒ．Ｊ．ａｎｄ  Ｆｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅ，Ｓ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６８２−６９０，１９８８；Ｉｔａｎｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  ５６：２６７−２７６．１９８７；Ｎｉｃｏｌａｕ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１４９：１５７−１７６，１９８７；Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｍ．ａｎｄ  Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，Ｄ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１０１：５１２−５２７，１９８３；Ｗａｎｇ，Ｃ．Ｙ．ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ，Ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：７８５１−７８５５，１９８７を参照されたい）。
【０２７１】
非イオン性リポソーム系もまた、特に、非イオン性界面活性剤およびコレステロールを含む系において、薬物の皮膚への送達における実用性を決定するために試験された。Ｎｏｖａｓｏｍｅ  Ｉ（ジラウリル酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）およびＮｏｖａｓｏｍｅ  ＩＩ（ジステアリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）を含む非イオン性リポソーム製剤が、マウスの皮膚の真皮に薬物を送達するために使用された。ＲＮＡｉ剤を含むこのような製剤は、皮膚障害を治療するのに有用である。
【０２７２】
ＲＮＡｉ剤を含むリポソームは、高度に変形可能に形成することができる。このような変形性は、リポソームの平均半径よりも小さい孔にリポソームが進入するのを可能にし得る。例えば、トランスファーソームは、変形可能なリポソームの１種である。トランスファーソームは、表面縁活性化因子、通常は界面活性剤を標準的なリポソーム組成物に添加することによって作製することができる。ＲＮＡｉ剤を含むトランスファーソームは、ＲＮＡｉ剤を皮膚内のケラチノサイトに送達するために、例えば、皮下注射によって送達することができる。無傷の哺乳動物の皮膚を通過するためには、脂質小胞は、適当な経皮勾配の影響下で、直径がそれぞれ５０ｎｍ未満の一連の微孔を通って通過しなければならない。加えて、脂質の特性により、このようなトランスファーソームは、自己最適化性（例えば、皮膚の孔の形状に適応すること）、自己修復性であり得ると共に、多くの場合、断片化されずに標的に到達することができ、しばしば自己負荷性（ｓｅｌｆ−ｌｏａｄｉｎｇ）であり得る。
【０２７３】
本発明に適用可能な他の製剤は、２００８年１月２日出願の米国仮特許出願第６１／０１８，６１６号明細書；２００８年１月２日出願の同第６１／０１８，６１１号明細書；２００８年３月２６日出願の同第６１／０３９，７４８号明細書；２００８年４月２２日出願の同第６１／０４７，０８７号明細書；および２００８年５月８日出願の同第６１／０５１，５２８号明細書に記載されている。２００７年１０月３日出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８０３３１号パンフレットにも、本発明に適用可能な製剤が記載されている。
【０２７４】
界面活性剤
界面活性剤は、製剤、例えば、エマルション（マイクロエマルションを含む）およびリポソーム（上記）において幅広い用途が見出されている。ＲＮＡｉ剤（または前駆体、例えば、プロセシングしてｓｉＲＮＡにすることができるより大きなｄｓｉＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡもしくは前駆体をコードするＤＮＡ）組成物は、界面活性剤を含み得る。一実施形態では、ｓｉＲＮＡは、界面活性剤を含むエマルションとして製剤される。多数の異なる種類の天然および合成の両方の界面活性剤の特性を分類およびランク付けする最も一般的な方法は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）の使用によるものである。親水性基の性質は、製剤に使用される異なる界面活性剤を分類するための最も有用な手段となる（Ｒｉｅｇｅｒ，  ｉｎ  “Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，”Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９８８，ｐ．２８５）。
【０２７５】
界面活性剤分子がイオン化されない場合、この界面活性剤分子は、非イオン性界面活性剤として分類される。非イオン性界面活性剤は、薬学的製品において幅広い用途が見出されており、広範囲のｐＨ値に対して使用可能である。一般に、これらのＨＬＢ値は、その構造によって２〜約１８の範囲である。非イオン性界面活性剤としては、非イオン性エステル、例えば、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、スクロースエステル、およびエトキシル化エステルが挙げられる。非イオン性アルカノールアミドおよびエーテル、例えば、脂肪アルコールエトキシレート、プロポキシル化アルコール、およびエトキシル化／プロポキシル化ブロックポリマーもこのクラスに含まれる。ポリオキシエチレン界面活性剤は、非イオン性界面活性剤クラスのうち最も一般的なメンバーである。
【０２７６】
界面活性剤分子が、水に溶解または分散されたときに負の電荷を有する場合、この界面活性剤分子は、アニオン性として分類される。アニオン性界面活性剤としては、カルボン酸塩、例えば、石鹸、アシル乳酸塩、アミノ酸のアシルアミド、硫酸のエステル、例えば、硫酸アルキルおよび硫酸エトキシル化アルキル、スルホン酸塩、例えば、アルキルベンゼンスルホン酸塩、アシルイセチオン酸塩、アシルタウレート、およびスルホコハク酸塩、ならびにリン酸塩が挙げられる。アニオン性界面活性剤クラスのうち最も重要なメンバーは、硫酸アルキルおよび石鹸である。
【０２７７】
界面活性剤分子が、水に溶解または分散されたときに正の電荷を有する場合、この界面活性剤分子は、カチオン性として分類される。カチオン性界面活性剤としては、四級アンモニウム塩およびエトキシル化アミンが挙げられる。四級アンモニウム塩は、このクラスのうちで最も使用されるメンバーである。
【０２７８】
界面活性剤分子が、正または負のいずれの電荷も有する能力がある場合、この界面活性剤分子は、両性として分類される。両性界面活性剤としては、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、Ｎ−アルキルベタイン、およびホスファチドが挙げられる。
【０２７９】
薬物製品、製剤、およびエマルションにおける界面活性剤の使用が概説されている（Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ  “Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ”，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｐ．２８５）。
【０２８０】
ミセルおよび他の膜状製剤
本発明のＲＮＡｉ剤は、ミセル製剤としても提供することができる。「ミセル」は、本明細書では、特定の種類の分子集合体として定義され、この分子集合体では、両親媒性分子の全ての疎水性部分が内側を向き、親水性部分が周囲の水相に接触するように両親媒性分子が球体構造に構成されている。環境が疎水性である場合は、反対の構成で存在する。
【０２８１】
経皮膜を通る送達に適した混合ミセル製剤は、ｓｉＲＮＡ組成物の水溶液とアルカリ金属Ｃ８〜Ｃ２２アルキル硫酸塩とミセル形成化合物との混合によって調製することができる。例示的なミセル形成化合物としては、レシチン、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸の薬学的に許容される塩、グリコール酸、乳酸、カモミール抽出物、キュウリ抽出物、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、モノオレイン、モノオレエート、モノラウレート、ルリヂサ油、月見草油、メントール、トリヒドロキシオキソコラニルグリシンおよびその薬学的に許容される塩、グリセリン、ポリグリセリン、リジン、ポリリジン、トリオレイン、ポリオキシエチレンエーテルおよびその類似体、ポリドカノールアルキルエーテルおよびその類似体、ケノデオキシコール酸塩、デオキシコール酸塩、およびこれらの混合物が挙げられる。ミセル形成化合物は、アルカリ金属アルキル硫酸塩と同時または添加後に、添加することができる。混合ミセルは、実質的にあらゆる種類の成分の混合で形成されるが、より小さいサイズのミセルを提供するためには激しい混合が行われる。
【０２８２】
一方法では、ｓｉＲＮＡ組成物および少なくともアルカリ金属アルキル硫酸塩を含有する第１のミセル組成物が調製される。次いで、第１のミセル組成物が、少なくとも３種類のミセル形成化合物と混合されて混合ミセル組成物が形成される。別の方法では、ミセル組成物は、ｓｉＲＮＡ組成物とアルカリ金属アルキル硫酸塩と少なくとも１種類のミセル形成化合物と混合され、次いで、残りのミセル形成化合物を添加して激しく混合することによって調製される。
【０２８３】
フェノールおよび／またはｍ−クレゾールを混合ミセル組成物に添加して、製剤を安定させて、細菌の増殖から保護することができる。あるいは、フェノールおよび／またはｍ−クレゾールは、ミセル形成成分と共に添加しても良い。等張剤、例えば、グリセリンを、混合ミセル組成物の形成後に添加しても良い。
【０２８４】
ミセル製剤を噴霧として送達するために、製剤をエアロゾルディスペンサーに入れることができ、このディスペンサーに噴霧剤を充填する。加圧下の噴霧剤は、ディスペンサー内で液体の形態である。水相と噴霧剤相とが１つになる、即ち、１つの相のみが存在するように、成分比が調整される。２つの相が存在する場合、内容物の一部を、例えば、計量弁によってディスペンスする前にディスペンサーを振盪する必要がある。医薬品のディスペンス量が、計量弁から微細な霧状で噴霧される。
【０２８５】
噴霧剤としては、水素含有クロロフルオロカーボン、水素含有フルオロカーボン、ジメチルエーテル、およびジエチルエーテルを挙げることができる。特定の実施形態では、ＨＦＡ  １３４ａ（１，１，１，２テトラフルオロエタン）を使用しても良い。
【０２８６】
必須成分の特定濃度を、比較的簡単な実験によって決定することができる。口腔からの吸収では、多くの場合、注射による投与または胃腸管を介した投与の投与量を、例えば、少なくとも２倍または３倍に増量するのが望ましい。
【０２８７】
粒子
別の実施形態では、本発明のＲＮＡｉ剤は、粒子、例えば、微粒子の中に含めることができる。微粒子は、噴霧乾燥によって製造することができるが、凍結乾燥、蒸発、流動床乾燥、真空乾燥、またはこれらの技術の組み合わせを含む他の方法によって製造しても良い。
【０２８８】
ＩＶ．ＴＴＲ発現を阻害するための方法
本発明は、細胞におけるトランスサイレチン（ＴＴＲ）の発現を阻害するための方法も提供する。この方法は、細胞におけるＴＴＲの発現を阻害するのに有効な量のＲＮＡｉ剤、例えば、二本鎖ＲＮＡｉ剤を細胞に接触させて、細胞におけるＴＴＲの発現を阻害するステップを含む。
【０２８９】
細胞にＲＮＡｉ剤、例えば、二本鎖ＲＮＡｉ剤を接触させるステップは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで行うことができる。ｉｎ  ｖｉｖｏの細胞をＲＮＡｉ剤に接触させるステップは、対象、例えば、ヒト対象の体内の細胞または細胞群にＲＮＡｉ剤を接触させるステップを含む。細胞を接触させるｉｎ  ｖｉｔｒｏ法とｉｎ  ｖｉｖｏ法の組み合わせも可能である。細胞を接触させるステップは、上述のように、直接的でも間接的でも良い。さらに、細胞を接触させるステップは、本明細書に記載される、または当分野で公知のあらゆるリガンドを含む標的化リガンドを介して達成することができる。好ましい実施形態では、標的化リガンドは、糖質部分、例えば、ＧａｌＮＡｃ３リガンド、またはＲＮＡｉ剤を目的の部位、例えば、対象の肝臓に誘導する任意の他のリガンドである。
【０２９０】
本明細書で使用される「阻害する」という語は、「低減する」、「サイレンシングする」、「下方制御する」、「抑制する」、および他の同様の語と互換的に使用され、あらゆるレベルの阻害を含む。
【０２９１】
「ＴＴＲの発現を阻害する」という句は、あらゆるＴＴＲ遺伝子（例えば、マウスＴＴＲ遺伝子、ラットＴＴＲ遺伝子、サルＴＴＲ遺伝子、またはヒトＴＴＲ遺伝子）およびＴＴＲ遺伝子の変異体または突然変異体の発現の阻害を指すものとする。従って、ＴＴＲ遺伝子は、野生型ＴＴＲ遺伝子、突然変異ＴＴＲ遺伝子（例えば、全身性アミロイド沈着をもたらす突然変異ＴＴＲ遺伝子）、または遺伝子操作された細胞、細胞群、もしくは生物の文脈における遺伝子組換えＴＴＲ遺伝子であっても良い。
【０２９２】
「ＴＴＲ遺伝子の発現を阻害する」は、ＴＴＲ遺伝子の任意のレベルの阻害、例えば、ＴＴＲ遺伝子の発現の少なくとも部分的な抑制を含む。ＴＴＲ遺伝子の発現は、ＴＴＲ遺伝子の発現に関連した任意の変数のレベル、例えば、ＴＴＲ  ｍＲＮＡのレベル、ＴＴＲタンパク質のレベル、またはアミロイド沈着の数もしくは範囲に基づいて評価することができる。このレベルは、例えば、対象に由来するサンプルを含む個々の細胞または細胞群で評価することができる。
【０２９３】
阻害は、ＴＴＲの発現に関連した１つ以上の変数のコントロールレベルに対する絶対または相対レベルの低下によって評価することができる。コントロールレベルは、当分野で利用されるあらゆる種類のコントロールレベル、例えば、投薬前基準レベル、または未処置もしくはコントロール（例えば、緩衝液のみのコントロールまたは不活性剤のコントロール）で処置された類似の対象、細胞、もしくはサンプルから決定されるレベルであっても良い。
【０２９４】
本発明の方法の一部の実施形態では、ＴＴＲ遺伝子の発現は、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％阻害される。
【０２９５】
ＴＴＲ遺伝子の発現の阻害は、第１の細胞または細胞群（このような細胞は、例えば、対象に由来するサンプル中に存在し得る）によって発現されるｍＲＮＡの量の減少によって示すことができる。この第１の細胞または細胞群は、ＴＴＲ遺伝子が記述され、かつＴＴＲ遺伝子の発現が、第１の細胞または細胞群と実質的に同一であるが処置されていない第２の細胞または細胞群（コントロール細胞（複数可））と比較して阻害されるように処置されている（例えば、１つまたは複数の細胞に本発明のＲＮＡｉ剤を接触させることによって、または本発明のＲＮＡｉ剤を、この細胞が存在する、もしくは存在した対象に投与することによって）。好ましい実施形態では、この阻害は、以下の式を用いて、コントロール細胞におけるｍＲＮＡのレベルのパーセンテージとして、処置された細胞におけるｍＲＮＡのレベルを表すことによって評価される：
【数１】
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【０２９６】
あるいは、ＴＴＲ遺伝子の発現の阻害は、ＴＴＲ遺伝子の発現に機能的に関連したパラメーター、例えば、ＴＴＲタンパク質の発現、レチノール結合タンパク質のレベル、ビタミンＡのレベル、またはＴＴＲを含むアミロイド沈着の存在の減少の観点から評価することができる。ＴＴＲ遺伝子のサイレンシングは、当分野で公知の任意のアッセイによって、構成的にまたはゲノム工学によってＴＴＲを発現するあらゆる細胞で決定することができる。肝臓は、ＴＴＲの発現の主な部位である。発現の他の顕著な部位としては、脈絡叢、網膜、および膵臓が挙げられる。
【０２９７】
ＴＴＲタンパク質の発現の阻害は、細胞または細胞群によって発現されるＴＴＲタンパク質のレベル（例えば、対象に由来するサンプルで発現されるタンパク質のレベル）の低下によって示すことができる。ｍＲＮＡの抑制の評価について上記説明されたように、処置された細胞または細胞群におけるタンパク質の発現レベルの阻害は、コントロール細胞またはコントロール細胞群におけるタンパク質のレベルのパーセンテージとして同様に表すことができる。
【０２９８】
ＴＴＲ遺伝子の発現の阻害を評価するために使用できるコントロール細胞またはコントロール細胞群は、本発明のＲＮＡｉ剤に接触されていない細胞または細胞群を含む。例えば、コントロール細胞またはコントロール細胞群は、対象がＲＮＡｉ剤で処置される前の個々の対象（例えば、ヒトまたは動物対象）に由来し得る。
【０２９９】
細胞または細胞群によって発現されるＴＴＲ  ｍＲＮＡのレベル、または循環ＴＴＲ  ｍＲＮＡのレベルを、ｍＲＮＡの発現を評価するために当分野で公知の任意の方法を用いて決定することができる。一実施形態では、サンプルにおけるＴＴＲの発現レベルは、転写されたポリヌクレオチド、例えば、ＴＴＲ遺伝子のｍＲＮＡ、またはその一部を検出することによって決定される。ＲＮＡは、ＲＮＡ抽出技術、例えば、酸性フェノール／グアニジンイソチオシアネート抽出（ＲＮＡｚｏｌ  Ｂ；  Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）、ＲＮｅａｓｙ  ＲＮＡ調製キット（Ｑｉａｇｅｎ）、またはＰＡＸｇｅｎｅ  （ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉｘ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて細胞から抽出することができる。リボ核酸ハイブリダイゼーションを利用する典型的なアッセイ形式としては、核ランオンアッセイ（ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｕｎ−ｏｎ  ａｓｓａｙ）、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮＡ分解酵素保護アッセイ（Ｍｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：７０３５）、ノーザンブロット法、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、およびマイクロアッセイ分析が挙げられる。循環ＴＴＲ  ｍＲＮＡは、参照によりその全開示内容が本明細書に組み入れられる国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０４３５８４に記載されている方法を用いて検出することができる。
【０３００】
一実施形態では、ＴＴＲの発現レベルは、核酸プローブを用いて決定される。本明細書で使用される「プローブ」という語は、特定のＴＴＲに選択的に結合することができるあらゆる分子を指す。プローブは、当業者が合成しても良いし、または適切な生物学的標本に由来しても良い。プローブは、標識されるように特別にデザインしても良い。プローブとして利用することができる分子の例として、限定されるものではないが、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、抗体、および有機分子が挙げられる。
【０３０１】
単離ｍＲＮＡを、限定されるものではないが、サザン分析、ノーザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析、およびプローブアッセイを含むハイブリダイゼーションまたは増幅アッセイに使用することができる。ｍＲＮＡレベルの決定のための１つの方法では、単離ｍＲＮＡを、ＴＴＲ  ｍＲＮＡにハイブリダイズすることができる核酸分子（プローブ）に接触させる。一実施形態では、ｍＲＮＡを、固体表面に固定し、例えば、単離ｍＲＮＡをアガロースゲル上を移動させてｍＲＮＡをゲルから膜、例えば、ニトロセルロースに移すことによってプローブに接触させる。代替の実施形態では、プローブ（複数可）を固体表面に固定し、ｍＲＮＡを、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ遺伝子チップアレイのプローブ（複数可）に接触させる。当業者であれば、ＴＴＲ  ｍＲＮＡのレベルの決定に使用するために公知のｍＲＮＡ検出方法を容易に適応させることができる。
【０３０２】
サンプルにおけるＴＴＲの発現レベルを決定するための代替の方法では、サンプルにおける、例えば、ｍＲＮＡの核酸増幅および／または逆転写酵素（ｃＤＮＡを調製するため）のプロセスが、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｍｕｌｌｉｓ，１９８７，米国特許第４，６８３，２０２号明細書に記載されている実験の実施形態）、リガーゼ連鎖反応（Ｂａｒａｎｙ  （１９９１）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１８９−１９３）、自立的配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１８７４−１８７８）、転写増幅システム（Ｋｗｏｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１１７３−１１７７）、Ｑ−Ｂｅｔａ  Ｒｅｐｌｉｃａｓｅ（Ｌｉｚａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１１９７）、ローリングサークル複製（Ｌｉｚａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，８５４，０３３号明細書）、または任意の他の核酸増幅法によって行われ、続いて、当業者に周知の技術を用いて増幅された分子の検出が行われる。これらの検出スキームは、このような分子の存在数が非常に少ない場合は、核酸分子の検出に特に有用である。本発明の特定の態様では、ＴＴＲの発現レベルは、定量蛍光ＲＴ−ＰＣＲ（即ち、ＴａｑＭａｎ（商標）システム）によって決定される。
【０３０３】
ＴＴＲ  ｍＲＮＡの発現レベルは、膜ブロット（ハイブリダイゼーション分析に使用されるようなもの、例えば、ノーザン、サザン、およびドット）、またはマイクロウェル、サンプルチューブ、ゲル、ビーズ、もしくはファイバー（または結合した核酸を含む任意の固体支持体）を用いて監視することができる。参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第５，７７０，７２２号明細書、同第５，８７４，２１９号明細書、同第５，７４４，３０５号明細書、同第５，６７７，１９５号明細書、および同第５，４４５，９３４号明細書を参照されたい。ＴＴＲの発現レベルの決定は、溶液中の核酸プローブを使用することも含み得る。
【０３０４】
好ましい実施形態では、ｍＲＮＡの発現レベルは、分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）アッセイまたはリアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を用いて評価される。このような方法の使用は、本明細書に記載される実施例で説明され、例示される。
【０３０５】
ＴＴＲタンパク質の発現レベルは、タンパク質レベルの測定用の当分野で公知の任意の方法を用いて決定することができる。このような方法としては、例えば、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、高拡散クロマトグラフィー、液体またはゲル沈降反応、吸光分光法、比色分析、分光学的定量法、フローサイトメトリー、免疫拡散法（一元または二重）、免疫電気泳動法、ウェスタンブロット法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光分析、および電気化学発光分析などが挙げられる。
【０３０６】
一部の実施形態では、本発明の方法の有効性は、アミロイドＴＴＲ沈着の減少の検出または監視によって監視することができる。本明細書で使用される、アミロイドＴＴＲ沈着の減少には、当分野で公知の任意の方法を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで評価できる、対象の器官または領域内のＴＴＲ沈着のサイズ、数、または重症度におけるあらゆる軽減、またはＴＴＲ沈着の形成の予防もしく低減が含まれる。例えば、アミロイド沈着を評価するいくつかの方法が、Ｇｅｒｔｚ，Ｍ．Ａ．＆  Ｒａｊｕｋｕｍａｒ，Ｓ．Ｖ．（Ｅｄｉｔｏｒｓ）（２０１０），Ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ：Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓに記載されている。アミロイド沈着を評価する方法としては、生化学分析、および視覚化されるアミロイド沈着の視覚的評価またはコンピュータ評価を挙げることができ、この視覚化は、例えば、免疫組織化学的染色、蛍光標識、光学顕微鏡検査、電子顕微鏡検査、蛍光顕微鏡検査、または他の種類の顕微鏡検査を用いて行われる。侵襲性または非侵襲性画像診断方式は、例えば、ＣＴ、ＰＥＴ、もしくはＮＭＲ／ＭＲＩ画像診断を含め、アミロイド沈着を評価するために利用することができる。
【０３０７】
本発明の方法は、限定されるものではないが、心臓、肝臓、脾臓、食道、胃、腸（回腸、十二指腸、および結腸）、脳、坐骨神経、後根神経節、腎臓、および網膜を含む体の様々な組織または器官におけるＴＴＲ沈着を減少させることができる。
【０３０８】
本明細書で使用される「サンプル」という語は、対象から単離される類似の液体、細胞、または組織、および対象の体内に存在する液体、細胞、または組織の採取物を指す。生体液の例としては、血液、血清および漿膜液、血漿、リンパ液、尿、脳脊髄液、唾液、および眼液などが挙げられる。組織サンプルとしては、組織、器官、または局所領域に由来するサンプルを挙げることができる。例えば、サンプルは、特定の器官、器官の一部、またはこのような器官内の液体もしくは細胞に由来し得る。特定の実施形態では、サンプルは、肝臓（例えば、全肝、肝臓の特定の部分、または肝臓の特定の種類の細胞、例えば、肝細胞など）、網膜または網膜の一部（例えば、網膜色素上皮）、中枢神経系または中枢神経解の一部（例えば、脳室または脈絡叢）、あるいは膵臓または膵臓の特性の細胞もしくは一部に由来し得る。好ましい実施形態では、「対象に由来するサンプル」は、対象から採取された血液または血漿を指す。さらなる実施形態では、「対象に由来するサンプル」は、対象に由来する肝組織または網膜組織を指す。
【０３０９】
本発明の方法の一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、このＲＮＡｉ剤が対象の体内の特定の部位に送達されるように対象に投与される。ＴＴＲの発現の阻害は、対象の体内の特定の部位からの液体または組織に由来するサンプルにおけるＴＴＲ  ｍＲＮＡまたはＴＴＲタンパク質のレベルもしくはレベルの変化の測定を用いて評価することができる。好ましい実施形態では、この部位は、肝臓、脈絡叢、網膜、および膵臓からなる群から選択される。この部位は、前述の部位（例えば、肝細胞または網膜色素上皮）の何れか１つに由来する細胞の小区分または部分群であっても良い。この部位は、特定の種類の受容体を発現する細胞（例えば、アシアロ糖タンパク質受容体を発現する肝細胞）も含み得る。
【０３１０】
Ｖ．ＴＴＲ関連疾患を治療または予防するための方法
本発明は、対象のＴＴＲ関連疾患を治療または予防するための方法も提供する。この方法は、治療有効量または予防有効量の本発明のＲＮＡｉ剤を対象に投与するステップを含む。
【０３１１】
本明細書で使用される「対象」は、ヒトまたは非ヒト動物、好ましくは脊椎動物、より好ましくは哺乳動物を含む。対象は、トランスジェニック生物を含み得る。最も好ましくは、対象は、ヒト、例えば、ＴＴＲ関連疾患に罹患している、またはＴＴＲ関連疾患に罹患しやすいヒトである。
【０３１２】
一部の実施形態では、対象は、ＴＴＲ関連疾患に罹患している。他の実施形態では、対象は、ＴＴＲ関連疾患を発症するリスクのある対象、例えば、ＴＴＲ関連疾患の発症に関連したＴＴＲ遺伝子突然変異を有する対象、ＴＴＲ関連疾患の家族歴のある対象、またはＴＴＲアミロイドーシスの発症を示す徴候または症状を有する対象である。
【０３１３】
本明細書で使用される「ＴＴＲ関連疾患」には、原線維前駆体が変異型または野生型ＴＴＲタンパク質からなるアミロイド沈着の形成によって引き起こされるあらゆる疾患、またはこれに関連したあらゆる疾患が含まれる。突然変異型および野生型ＴＴＲは、様々な形態のアミロイド沈着（アミロイドーシス）を引き起こす。アミロイドーシスは、ミスフォールドタンパク質の形成および凝集を伴い、器官の機能を低下させる細胞外沈着をもたらす。ＴＴＲ凝集に関連した臨床症候群（ｃｌｉｍｉｃａｌ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）としては、例えば、老人性全身性アミロイドーシス（ＳＳＡ）；家族性アミロイド多発神経障害（ＦＡＰ）；家族性アミロイド心筋症（ＦＡＣ）；および、軟髄膜もしくは髄膜の脳血管アミロイドーシス、中枢神経系（ＣＮＳ）アミロイドーシス、またはアミロイドーシスＶＩＩ型としても知られている軟髄膜アミロイドーシスが挙げられる。
【０３１４】
本発明の方法の一部の実施形態では、本発明のＲＮＡｉ剤は、家族性アミロイド心筋症（ＦＡＣ）および老人性全身性アミロイドーシス（ＳＳＡ）に罹患している対象に投与される。通常の配列のＴＴＲは、高齢者に心アミロイドーシスを引き起こし、この心アミロイドーシスは、老人性全身性アミロイドーシス（ＳＳＡ）（老人性心アミロイドーシス（ＳＣＡ）または心アミロイドーシスとも呼ばれる）と呼ばれる。ＳＳＡは、しばしば、多くの他の器官における微細な沈着物を伴う。ＴＴＲ突然変異は、ＴＴＲアミロイド形成のプロセスを加速させ、臨床的に顕著なＴＴＲアミロイドーシス（ＡＴＴＲ（アミロイドーシス−トランスサイレチン型）とも呼ばれる）の発症の最も重要な危険因子である。８５を超えるアミロイド生成性ＴＴＲ変異体は、全身性家族性アミロイドーシスを引き起こすことが知られている。
【０３１５】
本発明の方法の一部の実施形態では、本発明のＲＮＡｉ剤は、トランスサイレチン（ＴＴＲ）関連家族性アミロイド多発神経障害（ＦＡＰ）に罹患している対象に投与される。このような対象は、眼の症状、例えば、硝子体混濁および緑内障に罹患し得る。網膜色素上皮（ＲＰＥ）によって合成されたアミロイド生成性トランスサイレチン（ＡＴＴＲ）が、眼アミロイドーシスの進行において重要な役割を果たすことは、当業者には知られている。以前の研究が、レーザーによる凡網膜光凝固が、ＲＰＥ細胞を減少させ、硝子体におけるアミロイド沈着の進行を防止することが示され、ＲＰＥにおけるＡＴＴＲの発現の有効な抑制が、眼アミロイドーシスの新たな療法になり得ることを示唆している（例えば、Ｋａｗａｊｉ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ．（２０１０）１１７：５５２−５５５を参照されたい）。本発明の方法は、ＴＴＲ関連ＦＡＰ、例えば、眼アミロイドーシスの眼の症状の治療に有用である。ＲＮＡｉ剤は、特定の組織、例えば、眼を標的とするのに適した方式で送達することができる。眼送達の方式としては、眼球後方、皮下眼瞼、結膜下、テノン嚢下、前房、または硝子体内の注射（または、内部注射もしくは注入）が挙げられる。眼送達専用の製剤としては、点眼薬または軟膏が挙げられる。
【０３１６】
別のＴＴＲ関連疾患は、「異常トランスサイレチン性高サイロキシン血症（ｄｙｓｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎｅｍｉｃ  ｈｙｐｅｒｔｈｙｒｏｘｉｎｅｍｉａ）」または「異常プレアルブミン性高サイロキシン血症（ｄｙｓｐｒｅａｌｂｕｍｉｎｅｍｉｃ  ｈｙｐｅｒｔｈｙｒｏｘｉｎｅｍｉａ）」としても知られている高サイロキシン血症である。このタイプの高サイロキシン血症は、サイロキシンに対して高い親和性を有する突然変異ＴＴＲ分子によるサイロキシンとＴＴＲとの結合の増加によって発症し得る。例えば、Ｍｏｓｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８６，２０２５−２０３３を参照されたい。
【０３１７】
本発明のＲＮＡｉ剤は、例えば、限定されるものではないが、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、眼内投与、気管支内投与、胸膜内投与、腹腔内投与、動脈内投与、リンパ管投与、脳脊髄投与、およびこれらの任意の組み合わせを含む、当分野で公知の任意の投与方式で投与することができる。好ましい実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、皮下投与される。
【０３１８】
一部の実施形態では、投与は蓄積注射によって行われる。蓄積注射は、長期間に亘ってＲＮＡｉ剤を一貫して放出することができる。従って、蓄積注射は、所望の効果、例えば、ＴＴＲの所望の阻害、または治療効果もしくは予防効果を得るために必要な投与の頻度を下げることができる。蓄積注射は、より一定の血清濃度を実現することもできる。蓄積注射としては、皮下注射または筋肉注射を挙げることができる。好ましい実施形態では、蓄積注射は、皮下注射である。
【０３１９】
一部の実施形態では、投与は、ポンプによって行われる。ポンプは、外部ポンプであっても良いし、または外科的に移植されたポンプであっても良い。特定の実施形態では、ポンプは、皮下移植された浸透圧ポンプである。他の実施形態では、ポンプは輸液ポンプである。輸液ポンプは、静脈内注射、皮下注射、動脈注射、または硬膜外注射に使用することができる。好ましい実施形態では、輸液ポンプは、皮下注入ポンプである。他の実施形態では、ポンプは、ＲＮＡｉ剤を肝臓に送達する、外科的に移植されたポンプである。
【０３２０】
他の投与方式としては、硬膜外投与、脳内投与、脳室内投与、経鼻投与、動脈内投与、心臓内投与、骨内注入、くも膜下腔投与、硝子体内投与、および肺内投与が挙げられる。投与方式は、局所治療または全身治療が望ましいか、および治療される領域に基づいて選択することができる。投与の経路および部位は、標的化を向上させるために選択することができる。
【０３２１】
一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、対象の体内の細胞におけるＴＴＲの発現を阻害するのに有効な量、対象に投与される。対象の体内の細胞におけるＴＴＲの発現を阻害するのに有効な量は、ＴＴＲ  ｍＲＮＡ、ＴＴＲタンパク質、または関連変数、例えば、アミロイド沈着の阻害の評価を行う方法を含む上述の方法を用いて評価することができる。
【０３２２】
一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、治療有効量または予防有効量、対象に投与される。
【０３２３】
本明細書で使用される「治療有効量」は、ＴＴＲ関連疾患を治療するために患者に投与されたときに、この疾患を治療する（例えば、既存の疾患または疾患の１つ以上の症状を軽減する、改善する、または維持する）のに十分なＲＮＡｉ剤の量を含むものとする。「治療有効量」は、ＲＮＡｉ剤、ＲＮＡｉ剤が投与される方法、疾患およびその重症度と病歴、年齢、体重、家族歴、遺伝子構造、ＴＴＲ発現によって媒介される病的過程の段階、以前の治療または併用療法の種類（存在する場合）、および治療される患者の他の個人的な特徴によって異なり得る。
【０３２４】
本明細書で使用される「予防有効量」は、ＴＴＲ関連疾患に罹患していない、またはその症状を示していないがこの疾患に罹患する可能性がある患者に投与されたときに、この疾患またはその１つ以上の症状を防止または改善するのに十分なＲＮＡｉ剤の量を含むものとする。改善され得る症状としては、感覚性ニューロパシー（例えば、四肢遠位における錯感覚、感覚鈍麻）、自立性神経障害（例えば、胃腸障害、例えば、胃潰瘍、または起立性底血圧症）、運動神経障害、発作、痴呆、ミエロパシー、多発ニューロパシー、手根管症候群、自律神経不全、心筋症、硝子体混濁、腎不全、腎症、ｍＢＭＩ（修正肥満指数）の実質的な減少、脳神経障害、および格子状角膜変性症が挙げられる。この疾患を改善することは、疾患の進行を遅延させること、または後に発症する疾患の重症度を軽減することを含む。「予防有効量」は、ＲＮＡｉ剤、ＲＮＡｉ剤が投与される方法、疾患のリスクの程度、および病歴、年齢、体重、家族歴、遺伝子構造、以前の治療または併用療法の種類（存在する場合）、および治療される患者の他の個人的な特徴によって異なり得る。
【０３２５】
「治療有効量」または「予防有効量」はまた、あらゆる治療に適用可能な妥当な効果／リスク比である程度の望ましい局所効果または全身効果が得られるＲＮＡｉ剤の量も含む。本発明の方法に利用されるＲＮＡｉ剤は、このような治療に適用可能な妥当な効果／リスク比が得られる十分な量を投与することができる。
【０３２６】
本明細書で使用される「治療有効量」および「予防有効量」という句はまた、ＴＴＲの発現によって媒介される病的過程または病的過程の症状（複数可）の治療、予防、または管理に恩恵を与える量も含む。ＴＴＲアミロイドーシスの症状としては、感覚性ニューロパシー（例えば、四肢遠位における錯感覚、感覚鈍麻）、自立性神経障害（例えば、胃腸障害、例えば、胃潰瘍、または起立性底血圧症）、運動神経障害、発作、痴呆、ミエロパシー、多発ニューロパシー、手根管症候群、自律神経不全、心筋症、硝子体混濁、腎不全、腎症、ｍＢＭＩ（修正肥満指数）の実質的な減少、脳神経障害、および格子状角膜変性症が挙げられる。
【０３２７】
対象に投与されるＲＮＡｉ剤の用量は、特定の用量のリスクと恩恵のバランスをとるため、例えば、不所望の副作用を回避すると同時に、所望のレベルのＴＴＲ遺伝子の抑制（例えば、上記定義されたように、ＴＴＲ  ｍＲＮＡの抑制、ＴＴＲタンパク質の発現、またはアミロイド沈着の減少に基づいて評価される）または所望の治療効果もしくは予防効果を得るために調製することができる。
【０３２８】
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、約０．２５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの用量、例えば、約０．２５ｍｇ／ｋｇ〜約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．２５ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約０．２５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．２５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ〜約３５ｍｇ／ｋｇ、または約４０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
【０３２９】
一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、約０．２５ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約１１ｍｇ／ｋｇ、約１２ｍｇ／ｋｇ、約１３ｍｇ／ｋｇ、約１４ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ、約１６ｍｇ／ｋｇ、約１７ｍｇ／ｋｇ、約１８ｍｇ／ｋｇ、約１９ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約２１ｍｇ／ｋｇ、約２２ｍｇ／ｋｇ、約２３ｍｇ／ｋｇ、約２４ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、約２６ｍｇ／ｋｇ、約２７ｍｇ／ｋｇ、約２８ｍｇ／ｋｇ、約２９ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、約３１ｍｇ／ｋｇ、約３２ｍｇ／ｋｇ、約３３ｍｇ／ｋｇ、約３４ｍｇ／ｋｇ、約３５ｍｇ／ｋｇ、約３６ｍｇ／ｋｇ、約３７ｍｇ／ｋｇ、約３８ｍｇ／ｋｇ、約３９ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ、約４１ｍｇ／ｋｇ、約４２ｍｇ／ｋｇ、約４３ｍｇ／ｋｇ、約４４ｍｇ／ｋｇ、約４５ｍｇ／ｋｇ、約４６ｍｇ／ｋｇ、約４７ｍｇ／ｋｇ、約４８ｍｇ／ｋｇ、約４９ｍｇ／ｋｇ、または約５０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
【０３３０】
一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、２回以上の投与で投与される。繰り返しまたは頻繁な注入を容易にすることが望ましい場合は、送達装置、例えば、ポンプ、半永久ステント（例えば、静脈内、腹腔内、嚢内、もしくは関節包内）、またはレザバーの移植が望ましいであろう。一部の実施形態では、次の投与の回数または量は、所望の効果、例えば、ＴＴＲ遺伝子の抑制の達成、または治療効果もしくは予防効果の達成、例えば、アミロイド沈着の低減もしくはＴＴＲ関連疾患の症状の軽減によって決まる。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、計画に従って投与される。例えば、ＲＮＡｉ剤は、週２回、週３回、週４回、または週５回投与することができる。一部の実施形態では、この計画は、一定間隔の投与、例えば、１時間毎、４時間毎、６時間毎、８時間毎、１２時間毎、１日毎、２日毎、３日毎、４日毎、５日毎、１週間毎、２週間毎、または１ヶ月毎を含む。他の実施形態では、この計画は、時間間隔の短い投与、これに続くＲＮＡｉ剤が投与されない長い期間を含む。例えば、この計画は、比較的短い時間間隔（例えば、約６時間毎、約１２時間毎、約２４時間毎、約４８時間毎、または約７２時間毎）で投与される最初の一連の投与、これに続くＲＮＡｉ剤が投与されない比較的長い期間（例えば、約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約５週間、約６週間、約７週間、または約８週間）を含み得る。一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、最初は時間毎に投与され、次いで、長い時間間隔（例えば、１日毎、１週間毎、２週間毎、または１ヶ月毎）で投与される。別の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、最初は毎日投与され、次いで、長い時間間隔（例えば、１週間毎、２週間毎、または１ヶ月毎）で投与される。特定の実施形態では、長い時間間隔は、時間と共に長くなる、または所望の効果の達成に基づいて決定される。特定の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、最初の週は１日１回投与され、次いで、投与の８日目から週に１回である。別の特定の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、最初の週は１日おきに投与され、次いで、投与の８日目から週に１回である。
【０３３１】
これらの計画はいずれも、任意選択で、１回以上の反復を繰り返しても良い。反復の回数は、所望の効果の達成、例えば、ＴＴＲ遺伝子の抑制、レチノール結合タンパク質のレベル、ビタミンＡのレベル、および／または治療効果もしくは予防効果の達成、例えば、アミロイド沈着の減少もしくはＴＴＲ関連疾患の症状の軽減によって異なり得る。
【０３３２】
一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、他の治療剤または他の治療法で投与される。例えば、ＴＴＲ関連疾患の治療に適した他の作用剤または他の治療法としては、体内の突然変異ＴＴＲのレベルを低下させることができる肝臓移植；ＴＴＲ四量体を動力学的に安定させて、ＴＴＲアミロイド生成性に必要なＴＴＲ四量体の解離を防止するタファミディス（Ｖｙｎｄａｑｅｌ）；および、例えば、心臓障害を伴うＴＴＲアミロイドーシスにおける浮腫を低減するために利用することができる利尿薬を挙げることができる。
【０３３３】
一実施形態では、対象に、初回量および１回以上の維持量のＲＮＡｉ剤が投与される。１回または複数回の維持量は、初回量と同じ、または初回量よりも少なくする、例えば、初回量の半分とすることができる。維持療法は、１日に付き体重１ｋｇ当たり０．０１μｇ〜１５ｍｇの範囲、例えば、１日に付き体重１ｋｇ当たり１０ｍｇ、１ｍｇ、０．１ｍｇ、０．０１ｍｇ、０．００１ｍｇ、または０．００００１ｍｇの１回または複数回の用量を用いて対象を治療するステップを含み得る。維持量は、例えば、２日に１回以下、５日に１回以下、７日に１回以下、１０日に１回以下、１４日に１回以下、２１日に１回以下、または３０日に１回以下投与される。さらに、治療法は、一定期間継続することができ、この期間は、特定の疾患の性質、その重症度、および患者の全体的な状態によって異なり得る。特定の実施形態では、用量を、１日に１回以下、例えば、２４時間、３６時間、４８時間、またはそれ以上に１回、例えば、５日もしくは８日に１回投与することができる。治療後、患者の状態の変化について、患者を監視することができる。ＲＮＡｉ剤の用量は、患者が現在の用量レベルに有意に応答しない場合は増量しても良いし、あるいは、疾患の状態の症状の緩和が観察された場合、疾患の状態が軽減された場合、または不所望の副作用が観察された場合は減量しても良い。
【０３３４】
ＶＩ．キット
本発明はまた、本発明の任意の方法を実施するためのキットも提供する。このようなキットは、１種以上のＲＮＡｉ剤（複数可）、および使用のための取扱説明書、例えば、ＴＴＲの発現を阻害するのに有効な量のＲＮＡｉ剤（複数可）を細胞に接触させることによって細胞におけるＴＴＲの発現を阻害するための取扱説明書を含む。キットは、任意選択で、細胞をＲＮＡｉ剤に接触させるための手段（例えば、注射器具）、またはＴＴＲの阻害を測定するための手段（例えば、ＴＴＲ  ｍＲＮＡもしくはＴＴＲタンパク質の阻害を測定するための手段）をさらに含み得る。ＴＴＲの阻害を測定するためのこのような手段としては、サンプル、例えば、血漿サンプルを対象から得るための手段を挙げることができる。本発明のキットは、任意選択で、ＲＮＡｉ剤（複数可）を対象に投与するための手段、または治療有効量もしくは予防有効量を決定するための手段をさらに含み得る。
【０３３５】
本発明は、限定として解釈するべきではない以下の実施例によってさらに例示される。本明細書に記載される全ての参考文献、公開特許文献、および特許出願の内容は、参照により本明細書に組み入れられるものとする。
【実施例】
【０３３６】
実施例１：ＴＴＲ−ＧａｌＮＡｃコンジュゲートを用いたＴＴＲの阻害
１回量のＴＴＲ  ＲＮＡｉ剤ＡＤ−４３５２７をマウスに皮下投与して、投与から７２時間後に、ＴＴＲ  ｍＲＮＡのレベルを決定した。
【０３３７】
マウス／ラット交差反応性ＧａｌＮＡｃ−コンジュゲート、ＡＤ−４３５２７を、肝臓におけるＴＴＲ  ｍＲＮＡのサイレンシングについての、ＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏでの評価のために選択した。ＡＤ−４３５２７の各鎖の配列が以下に示される。
【０３３８】
【表１】
2018007657.tif 000012
【０３３９】
使用されたリガンドはＧａｌＮＡｃ３：
【化１０】
2018007657.tif 000013
であった。
このＧａｌＮＡｃ３リガンドは、以下に示されるリンカーおよびテザー：
【化１１】
2018007657.tif 000014
を用いてセンス鎖の３’末端にコンジュゲートさせた。
得られたＧａｌＮＡｃ３がコンジュゲートしたセンス鎖の構造は、以下の式：
【化１２】
2018007657.tif 000015
で示される。
ＴＴＲを標的とし、かつ以下の配列および修飾を有する追加的なＲＮＡｉ剤を合成してアッセイした。
【０３４０】
【表２】
2018007657.tif 000016
【０３４１】
ヒト／イヌ交差反応性ＴＴＲ  ＲＮＡｉ剤；親二重鎖は、ＡＤ−１８３２８［ＧｕＡＡｃｃＡＡＧＡＧｕＡｕｕｃｃＡｕｄＴｄＴ（配列番号：１２）のセンス鎖５’−３’配列、および次の修飾：ＡＳにおける交互２’Ｆ／２’ＯＭｅ  ｗ／２  ＰＳを有するＡＵＧＧＡＡｕＡＣＵＣＵＵＧＧＵｕＡＣｄＴｄＴ（配列番号：１３）アンチセンス鎖５’‐３’配列を有する。
【０３４２】
【表３】
2018007657.tif 000017
【０３４３】
Ｌ９６＝ＧａｌＮＡｃ３であり；小文字のヌクレオチド（ａ、ｕ、ｇ、ｃ）は２’−Ｏ−メチルヌクレオチドであり、Ｎｆ（即ち、Ａｆ）は２’−フルオロヌクレオチドであり；Ｑ１１はコレステロールであり；ｓはホスホロチオエートである。
【０３４４】
３０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、７．５ｍｇ／ｋｇ、３．５ｍｇ／ｋｇ、１．７５ｍｇ／ｋｇ、または０．５ｍｇ／ｋｇのＡＤ−４３５２７を１０μｌ／ｇの投与量で皮下注射により雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６〜１０週間、１群当たり５匹）に投与した。コントロール動物には、ＰＢＳを同じ投与量で皮下投与した。
【０３４５】
約７２時間後に、マウスを２００μｌのケタミンで麻酔し、次いで、右尾動脈を切断して全採血した。肝組織を採取して、急速冷凍し、処置まで−８０℃で保存した。
【０３４６】
治療の効果を、投与の７２時間後に肝臓におけるＴＴＲ  ｍＲＮＡの測定によって評価した。肝臓のＴＴＲ  ｍＲＮＡのレベルを、分岐ＤＮＡアッセイ−ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ  １．０（Ｐａｎｏｍｉｃｓ）を用いてアッセイした。簡単に述べると、マウス肝臓サンプルを粉砕して、組織溶解物を調製した。肝臓溶解混合物（１倍量の溶解混合物、２倍量のヌクレアーゼフリー水、および１０μｌのプロテインキナーゼ−Ｋ／ｍｌの最終濃度が２０ｍｇ／ｍｌの混合物）を、６５℃で３５分間インキュベートした。５μｌの肝臓溶解物および９５μｌの機能プローブセット（ｗｏｒｋｉｎｇ  ｐｒｏｂｅ  ｓｅｔ）（遺伝子標的用のＴＴＲプローブおよび内在性コントロール用のＧＡＰＤＨ）を捕捉プレートに添加した。捕捉プレートを５３℃±１℃でインキュベートした（約１６〜２０時間）。翌日、捕捉プレートを、１×洗浄緩衝液（ヌクレアーゼフリー水、緩衝液成分１、および洗浄緩衝液成分２）で３回洗浄し、次いで、２４０ｇで１分間の遠心分離により乾燥させた。１ウェルに付き１００μｌの増幅プローブミックスを捕捉プレートに添加し、この捕捉プレートをアルミ箔で密閉し、４６℃±１℃で１時間インキュベートした。１時間のインキュベーション後、洗浄ステップを繰り返し、次いで、１ウェルに付き１００μｌの標識プローブミックスを添加した。捕捉プレートを、４６℃±１℃で１時間インキュベートした。次いで、捕捉プレートを１×洗浄緩衝液で洗浄し、乾燥させ、１ウェルに付き１００μｌの基質を捕捉プレートに添加した。捕捉プレートを４６℃で３０分間インキュベートし、次いで、室温で３０分間インキュベートした。プレートを、インキュベーション後にＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒを用いて読み取った。ｂＤＮＡデータを、各２つ組サンプルから平均バックグラウンドを減じ、得られた２つ組ＧＡＰＤＨ（コントロールプローブ）およびＴＴＲ（実験プローブ）の値を平均し、次いで、比：（実験プローブのバックグラウンド）／（コントロールプローブのバックグラウンド）を計算することによって分析した。平均ＴＴＲ  ｍＲＮＡのレベルを、各群について計算し、この値をＰＢＳ群の平均に対して正規化して、ＰＢＳコントロール群の％として相対的なＴＴＲ  ｍＲＮＡを得た。
【０３４７】
この結果は図１に示されている。ＴＴＲを標的とするＧａｌＮＡｃコンジュゲートＲＮＡｉ剤は、ＴＴＲ  ｍＲＮＡノックダウンに対して約５ｍｇ／ｋｇのＥＤ５０を有していた。これらの結果は、ＴＴＲを標的とするＧａｌＮＡｃコンジュゲートＲＮＡｉ剤が、ＴＴＲ  ｍＲＮＡの発現の阻害に有効であることを実証している。
【０３４８】
実施例２：ＴＴＲ−ＧａｌＮＡｃコンジュゲートを用いたＴＴＲの阻害は持続性である
マウスに、皮下投与量（７．５ｍｇ／ｋｇまたは３０．０ｍｇ／ｋｇ）のＡＤ−４３５２７、ＴＴＲを標的とするＧａｌＮＡｃコンジュゲートＲＮＡｉ剤を投与した。肝臓におけるＴＴＲ  ｍＲＮＡのレベルを、実施例１で説明された方法を用いて処置から１日後、３日後、５日後、７日後、１０日後、１３日後、１５日後、１９日後、２６日後、３３日後、および４１日後に評価した。
【０３４９】
この結果は図２に示されている。１９日目に、３０．０ｍｇ／ｋｇのＧａｌＮＡｃコンジュゲートＲＮＡｉ剤の投与は、なお約５０％のサイレンシングを示した。発現の完全な回復は、４１日目であった。
【０３５０】
これらの結果は、ＴＴＲを標的とするＧａｌＮＡｃコンジュゲートｓｉＲＮＡによってもたらされる阻害が、持続性であり、処置から最大３日間、５日間、７日間、１０日間、１３日間、１５日間、１９日間、２６日間、３３日間持続する。
【０３５１】
実施例３．ＲＮＡ合成および二重鎖アニーリング
１．オリゴヌクレオチド合成
オリゴヌクレオチドを、ＡＫＴＡｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ合成機またはＡＢＩ  ３９４合成機で合成した。特段の記載がない限り、オリゴヌクレオチドの合成には、市販の制御された孔を有するガラス固体支持体（ｄＴ−ＣＰＧ，  ５００Å，  Ｐｒｉｍｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、および標準的な保護基を有するＲＮＡホスホラミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル  Ｎ６−ベンゾイル−２’−ｔ−ブチルジメチルシリル−アデノシン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホラミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ４−アセチル−２’−ｔ−ブチルジメチルシリル−シチジン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホラミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ２−イソブチリル（ｉｓｏｂｕｔｒｙｌ）−２’−ｔ−ブチルジメチルシリル−グアノシン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホラミダイト、および５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−ｔ−ブチルジメチルシリル−ウリジン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホラミダイト（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた。２’−Ｆ  ホスホラミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ４−アセチル−２’−フルオロ−シチジン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチル−ホスホラミダイトおよび５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−フルオロ−ウリジン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチル−ホスホラミダイトは（Ｐｒｏｍｅｇａ）から購入した。全てのホスホラミダイトは、１０％  ＴＨＦ／ＡＮＣ（ｖ／ｖ）中、０．２Ｍの濃度で使用したグアノシンを除いて、アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）中、０．２Ｍの濃度で使用した。１６分のカップリング／リサイクリング時間を使用した。活性化物質は、５−エチルチオテトラゾール（０．７５Ｍ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）であり、ＰＯ酸化用にはヨウ素／水／ピリジンを使用し、ＰＳ酸化用には２，６−ルチジン／ＡＣＮ（１：１  ｖ／ｖ）に溶解したＰＡＤＳ（２％）を使用した。
【０３５２】
リガンドコンジュゲート鎖を、対応するリガンドを含む固体支持体を用いて合成した。例えば、配列の３’末端の糖質部分／リガンド（例えば、ＧａｌＮＡｃ用）の導入は、対応する糖質固体支持体で合成を開始することによって達成した。同様に、３’末端のコレステロール部分を、コレステロール支持体で合成を開始することによって導入した。一般に、リガンド部分は、前述の実施例で説明されたものから選択されるテザーを介してトランス−４−ヒドロキシプロリノールに連結してヒドロキシプロリノール−リガンド部分を得た。次いで、ヒドロキシプロリノール−リガンド部分を、コハク酸リンカーを介して固体支持体に結合する、または標準的なホスフィチル化条件によってホスホラミダイトに変換して、所望の糖質コンジュゲート構成要素を得た。フルオロフォア標識ｓｉＲＮＡを、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した対応するホスホラミダイトまたは固体支持体で合成した。オレイルリトコール酸（ＧａｌＮＡｃ）３ポリマー支持体を、３８．６μｍｏｌ／グラムの添加（ｌｏａｄｉｎｇ）で社内で作製した。マンノース（Ｍａｎ）３ポリマー支持体も、４２．０μｍｏｌ／グラムの添加で社内で作製した。
【０３５３】
所望の位置、例えば、配列の５’末端での、選択されたリガンドのコンジュゲーションは、特段の記載がない限り、標準的なホスホラミダイト結合条件下で、対応するホスホラミダイトを成長中の鎖に結合させることによって達成した。固体結合オリゴヌクレオチドに対する、５−（エチルチオ）−１Ｈ−テトラゾール活性化物質の存在下での無水ＣＨ３ＣＮ中の０．１Ｍのホスホラミダイト溶液の１５分間の長時間の結合を行った。Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．（２００８）Ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｓｉＲＮＡ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｄｅｖｅｌ．，１１，２０３-２１６；Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｓ．，Ｗｏｌｆ，Ｊ．ａｎｄ  Ｉｖａｎｏｖ，Ｓ．Ａ．（２００４）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ＲＮＡ．Ｃｕｒｒ．Ｏｒｇ．Ｓｙｎｔｈ．，１，２９３-３０７；Ｘｉａ，Ｊ．，Ｎｏｒｏｎｈａ，Ａ．，Ｔｏｕｄｊａｒｓｋａ，Ｉ．，Ｌｉ，Ｆ．，Ａｋｉｎｃ，Ａ．，Ｂｒａｉｃｈ，Ｒ．，Ｆｒａｎｋ−Ｋａｍｅｎｅｔｓｋｙ，Ｍ．，Ｒａｊｅｅｖ，Ｋ．Ｇ．，Ｅｇｌｉ，Ｍ．ａｎｄ  Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｍ．（２００６）  Ｇｅｎｅ  Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｓｉＲＮＡｓ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｒｉｂｏ−ｄｉｆｌｕｏｒｏｔｏｌｕｙｌ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ．ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，１，１７６-１８３に報告されているように標準的なヨウ素水を用いて、または１０分の酸化待ち時間でコンジュゲートオリゴヌクレオチドをｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド／アセトニトリル／水（１０：８７：３）を用いる処理によって、ヌクレオチド間亜リン酸塩のリン酸塩への酸化を行なった。ホスホロチオエートは、硫黄転移試薬、例えば、ＤＤＴＴ（ＡＭ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社から購入）、ＰＡＤＳ、およびまたはＢｅａｕｃａｇｅ試薬を用いて、亜リン酸塩からホスホロチオエートへの酸化によって導入した。コレステロールホスホラミダイトは、社内で合成し、ジクロロメタン中、０．１Ｍの濃度で使用した。コレステロールホスホラミダイトの結合時間は１６分とした。
【０３５４】
２．脱保護−Ｉ（ヌクレオ塩基脱保護）
合成の完了後、支持体を１００ｍｌガラスボトル（ＶＷＲ）に移した。８０ｍＬのエタノールアンモニア［アンモニア：エタノール（３：１）］の混合物を用いて、５５℃で６．５時間、塩基とリン酸基を脱保護すると同時にオリゴヌクレオチドを支持体から切断した。ボトルを氷上で短時間冷却し、次いで、エタノールアンモニア混合物を濾過して、新しい２５０ｍＬのボトルに入れた。ＣＰＧを２×４０ｍＬ部のエタノール／水（１：１  ｖ／ｖ）で洗浄した。次いで、混合物の容量をロトバップで約３０ｍＬにまで減らした。次いで、この混合物をドライアイス上で凍結させ、スピードバックにより真空下で乾燥させた。
【０３５５】
３．脱保護−ＩＩ（２’ＴＢＤＭＳ基の除去）
乾燥残渣を２６ｍｌのトリエチルアミン、トリエチルアミン三フッ化水素酸塩（ＴＥＡ．３ＨＦ）、またはピリジン−ＨＦとＤＭＳＯ（３：４：６）に再懸濁し、６０℃で９０分間加熱して、２’位のｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）基を除去した。次いで、反応を５０ｍｌの２０ｍＭ酢酸ナトリウムでクエンチし、ｐＨを６．５に調整し、精製までフリーザーで保存した。
【０３５６】
４．分析
オリゴヌクレオチドは、精製の前に高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析し、緩衝液とカラムの選択は、配列およびまたはコンジュゲートしたリガンドの性質によって決まる。
【０３５７】
５．ＨＰＬＣの精製
リガンドがコンジュゲートしたオリゴヌクレオチドを、逆相分取ＨＰＬＣによって精製した。非コンジュゲートオリゴヌクレオチドは、社内で充填されたＴＳＫゲルカラム上のアニオン−交換ＨＰＬＣによって精製した。緩衝液は、１０％ＣＨ３ＣＮ（緩衝液Ａ）中の２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ８．５）および１０％ＣＨ３ＣＮ、１ＭのＮａＢｒ（緩衝液Ｂ）中の２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ８．５）とした。完全長オリゴヌクレオチドを含む分画をプールし、脱塩し、そして凍結乾燥させた。ＯＤが約０．１５の脱塩オリゴヌクレオチドを１５０μｌになるまで水で希釈し、次いで、ＣＧＥおよびＬＣ／ＭＳ分析用の特殊なバイアルにピペットで移した。最後に、化合物をＬＣ−ＥＳＭＳおよびＣＧＥによって分析した。
【０３５８】
６．ＲＮＡｉ剤の調製
ＲＮＡｉ剤の調製のために、等モル量のセンス鎖およびアンチセンス鎖を、１×ＰＢＳ中、９５℃で５分間加熱し、ゆっくりと冷却して室温にした。二重鎖の完全性をＨＰＬＣ分析によって確認した。以下の表１は、ヒトまたはげっ歯類ＴＴＲ  ｍＲＮＡを標的とするＲＮＡｉ剤を示している。
【０３５９】
【表４】
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【０３６０】
【表５】
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【０３６１】
【表６】
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【０３６２】
【表７】
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【０３６３】
【表８】
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【０３６４】
【表９】
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【０３６５】
【表１０】
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【０３６６】
【表１１】
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【０３６７】
【表１２】
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【０３６８】
【表１３】
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【０３６９】
【表１４】
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【０３７０】
【表１５】
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【０３７１】
【表１６】
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【０３７２】
【表１７】
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【０３７３】
【表１８】
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【０３７４】
【表１９】
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【０３７５】
【表２０】
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【０３７６】
【表２１】
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【０３７７】
【表２２】
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【０３７８】
【表２３】
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【０３７９】
【表２４】
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【０３８０】
【表２５】
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【０３８１】
【表２６】
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【０３８２】
【表２７】
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【０３８３】
【表２８】
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【０３８４】
【表２９】
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【０３８５】
【表３０】
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【０３８６】
【表３１】
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【０３８７】
【表３２】
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【０３８８】
【表３３】
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【０３８９】
【表３４】
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【０３９０】
【表３５】
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【０３９１】
【表３６】
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【０３９２】
【表３７】
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【０３９３】
【表３８】
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【０３９４】
【表３９】
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【０３９５】
【表４０】
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【０３９６】
【表４１】
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【０３９７】
【表４２】
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【０３９８】
【表４３】
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【０３９９】
【表４４】
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【０４００】
実施例４：ＲＮＡｉ剤のｉｎ  ｖｉｔｒｏでのスクリーニング
細胞培養およびトランスフェクション
ヒトＨｅｐ３Ｂ細胞またはラットＨ．ＩＩ．４．Ｅ細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を、１０％ＦＢＳ、ストレプトマイシン、およびグルタミン（ＡＴＣＣ）が添加されたＲＰＭＩ（ＡＴＣＣ）中、５％ＣＯ２の大気で、３７℃でほぼコンフルエンスになるまで増殖させてから、トリプシン処理によりプレートから剥離させた。１ウェルに付き１４．８μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭと０．２μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ．ｃａｔ＃１３７７８−１５０）を、９６ウェルプレートの５μｌのｓｉＲＮＡ二重鎖が入っている各ウェルに添加し、室温で１５分間インキュベートすることによってトランスフェクションを行った。約２×１０４  Ｈｅｐ３Ｂ細胞を含む、抗生物質無添加の８０μｌの完全増殖培地をｓｉＲＮＡ混合物に添加した。細胞を、２４時間または１２０時間インキュベートしてから、ＲＮＡを精製した。単回投与実験を、１０ｎＭおよび０．１ｎＭの最終二重鎖濃度で行い、用量反応実験を、１０ｎＭの最終二重鎖濃度の最大投与量で８倍、４倍の段階希釈を用いて行った。
【０４０１】
ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ  ｍＲＮＡ単離キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ｐａｒｔ  ＃：６１０−１２）を用いた全ＲＮＡの単離
細胞を採取し、１５０μｌの溶解／結合緩衝液中で溶解し、次いで、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒを用いて８５０ｒｐｍで５分間混合した（混合速度を全過程で同じとした）。１０μｌの磁気ビーズおよび８０μｌの溶解／結合緩衝液の混合物を丸底プレートに添加し、１分間混合した。磁気ビーズを、磁気スタンドを用いて捕捉し、ビーズをかく乱せずに上清を除去した。上清を除去した後、溶解した細胞を残りのビーズに添加し、５分間混合した。上清を除去した後、磁気ビーズを、１５０μｌの洗浄緩衝液Ａで２回洗浄し、１分間混合した。ビーズを再び捕捉し、上清を除去した。次いで、ビーズを１５０μｌの洗浄緩衝液Ｂで洗浄し、ビーズを捕捉し、上清を除去した。次いで、ビーズを１５０μｌの溶出緩衝液で洗浄し、捕捉し、上清を除去した。次に、ビーズを１５０μｌの溶出緩衝液で洗浄し、捕捉し、上清を除去した。ビーズを２分間乾燥させた。乾燥後、５０μｌの溶出緩衝液を添加し、７０℃で５分間混合した。ビーズを磁気上に５分間捕捉した。４０μｌの上清を取り出し、別の９６ウェルプレートに添加した。
【０４０２】
ＡＢＩ高性能ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ，  Ｃａｔ＃４３６８８１３）を用いたｃＤＮＡ合成
１回の反応に付き、１μｌの１０×緩衝液、０．４μｌの２５×ｄＴＮＰ、１μｌのランダムプライマー、０．５μｌの逆転写酵素、０．５μｌのＲＮＡ分解酵素阻害剤、および１．６μｌのＨ２Ｏを含むマスターミックスを５μｌの全ＲＮＡに添加した。ｃＤＮＡを、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｃ−１０００またはＳ−１０００サーマルサイクラーを用いて、２５℃で１０分、３７℃で１２０分、８５℃で５秒、４℃に保持するステップによって作製した。
【０４０３】
リアルタイムＰＣＲ
２μｌのｃＤＮＡを、３８４ウェルプレート（（Ｒｏｃｈｅ  ｃａｔ＃０４８８７３０１００１）の各ウェルの０．５μｌのＧＡＰＤＨ  ＴａｑＭａｎプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃａｔ＃４３２６３１７Ｅ（ヒト）  Ｃａｔ＃４３０８３１３（げっ歯類））、０．５μｌのＴＴＲ  ＴａｑＭａｎプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ｃａｔ＃ＨＳ００１７４９１４＿ｍ１（ヒト）ｃａｔ＃Ｒｎ００５６２１２４＿ｍ１（ラット））、および５μｌのＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ  ４８０プローブマスターミックス（Ｒｏｃｈｅ  Ｃａｔ＃０４８８７３０１００１）を含むマスターミックスに添加した。リアルタイムＰＣＲを、Ｒｏｃｈｅ  ＬＣ  ４８０  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ装置（Ｒｏｃｈｅ）で行った。特段の記載がない限り、各二重鎖を、少なくとも２つの別個のトランスフェクションで試験し、各トランスフェクションを二連でアッセイした。
【０４０４】
相対的な倍数変化を計算するために、リアルタイムデータをΔΔＣｔ法を用いて分析し、１０ｎＭ  ＡＤ−１９５５でトランスフェクトされた細胞または模擬トランスフェクト細胞を用いて行われたアッセイに対して正規化した。ＩＣ５０を、ＸＬＦｉｔを使用する４パラメーターフィットモデルを用いて計算し、同じ用量範囲もしくはそれ自体の最低用量に対して、ＡＤ−１９５５（センス配列：ｃｕｕＡｃＧｃｕＧＡＧｕＡｃｕｕｃＧＡｄＴｓｄＴ（配列番号：２２０２）；アンチセンス配列：ＵＣＧＡＡＧｕＣＵｃＡＧＣＧｕＡＡＧｄＴｓｄＴ（配列番号：２２０３））でトランスフェクトされた細胞または未処置細胞に対して正規化した。ＩＣ５０を、個々のトランスフェクションおよび組み合わせに対して計算し、１つのＩＣ５０を両方のトランスフェクションからのデータに対してフィットさせた。
【０４０５】
本発明の様々なモチーフ修飾を有する例示的なｓｉＲＮＡ二重鎖の遺伝子サイレンシングの結果が、上の表１に示されている。
【０４０６】
実施例５：ＴＴＲを標的とする化学修飾ＲＮＡｉ剤のｉｎ  ｖｉｔｒｏでのサイレンシング活性
以下の実験は、ＴＴＲを標的とするＲＮＡｉ剤のサイレンシング活性に対する、ＧａｌＮＡｃ３リガンドと共に三塩基反復モチーフを導入することを含む化学修飾の有利な効果を実証した。調べる作用剤の配列は、下の表２に示されている。ＴＴＲ  ｍＲＮＡに相補的な領域は次の通りである：ＲＮＡｉ剤ＡＤ−４５１６５、ＡＤ−５１５４６、およびＡＤ−５１５４７の相補的な領域は、ＧＧＡＴＧＧＧＡＴＴＴＣＡＴＧＴＡＡＣＣＡＡＧＡ（配列番号：２２０４）であり、ＲＮＡｉ剤ＡＤ−４５１６３、ＡＤ−５１５４４、およびＡＤ−５１５４５の相補的な領域は、ＴＴＣＡＴＧＴＡＡＣＣＡＡＧＡＧＴＡＴＴＣＣＡＴ（配列番号：２２０５）である。
【０４０７】
Ｈｅｐ３Ｂ細胞のＩＣ５０の評価用のプロトコル
各修飾ｓｉＲＮＡのＩＣ５０は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸを用いた標準的な逆トランスフェクションによってＨｅｐ３Ｂ細胞（ヒト肝癌細胞株）で決定した。簡単に述べると、逆トランスフェクションは、９６ウェルプレートの各ウェルの５μＬのｓｉＲＮＡ二重鎖に５μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭを、１０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭと０．５μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ．ｃａｔ＃１３７７８−１５０）と共に添加し、室温で１５〜２０分間インキュベートすることによって行った。インキュベーション後、１２，０００〜１５，０００のＨｅｐ３Ｂ細胞を含む、抗生物質無添加の１００μＬの完全増殖培地を各ウェルに添加した。細胞を、５％ＣＯ２の大気、３７℃で２４時間インキュベートしてから溶解し、ｂＤＮＡ（Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ）によりＴＴＲおよびＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡを分析した。１０ｎＭ〜０．６ｐＭの範囲の７つの異なるｓｉＲＮＡ濃度を、ＩＣ５０の決定のために評価し、ｓｉＲＮＡトランスフェクト細胞のＴＴＲ／ＧＡＰＤＨを、１０ｎＭのＬｕｃ  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた細胞に対して正規化した。この結果は表２に示されている。
【０４０８】
自由取り込みのＩＣ５０の評価のためのプロトコル
カニクイザル初代肝細胞における自由取り込みのサイレンシングを、ＴＴＲ  ｓｉＲＮＡと共に４時間または２４時間インキュベーションした後に評価した。サイレンシングは、最初の曝露から２４時間後に測定した。簡単に述べると、９６−ウェル培養プレートを、実験の開始の２４時間前に、０．０５％〜０．１％コラーゲン（Ｓｉｇｍａ  Ｃ３８６７−１ＶＬ）を用いて室温で被覆した。アッセイの日に、ｓｉＲＮＡを、ＧＩＢＣＯ’ｓ  Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  Ｍｅｄｉａ  Ｋｉｔ（Ｓｅｒｕｍ−Ｆｒｅｅ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＣＭ４０００）が添加されたＤＭＥＭからなる、予め温められたプレーティング培地で希釈し、コラーゲン被覆９６−ウェル培養プレートに添加した。凍結保存カニクイザル初代肝細胞を、３７℃の水槽で急速に解凍し、速やかにプレーティング培地で３６０，０００細胞／ｍＬの濃度まで希釈した。一定量の細胞懸濁液を、最終細胞数が１８，０００細胞／ウェルとなるように、予めプレーティングされたｓｉＲＮＡの上部にピペットでそっと添加した。プレートを軽く回転させて混合し、細胞をウェル全体に均等に分散させ、３７℃の５％ＣＯ２インキュベータに２４時間入れてから、細胞を溶解し、ｂＤＮＡ（Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ，Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）によりＴＴＲおよびＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡを分析した。ｓｉＲＮＡとの４時間のインキュベーションの場合は、細胞に４時間曝露した後に培地をデカントし、残りの２０時間のインキュベーションのために新しいプレーティング培地を入れた。ＴＴＲおよびＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの下流分析は上記と同様とした。典型的な用量反応曲線を得るために、ｓｉＲＮＡを、４倍段階希釈によって段階的に１μＭから０．２４ｎＭにした。
【０４０９】
【表４５】
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【０４１０】
この結果は、表２に示され、ＴＴＲを標的とする修飾ＲＮＡｉ剤がサイレンシング活性を高めることを実証した。
【０４１１】
結果：修飾ＲＮＡｉ剤の改善された活性
交互化学修飾を有する親ＲＮＡｉ剤およびＧａｌＮＡｃ３リガンドは、Ｈｅｐ３Ｂ細胞のＩＣ５０を約０．０１ｎＭにした。図４〜図５および表２に示されているように、例えば、２’−フルオロ修飾および２’−メチル修飾の１つ以上の反復三塩基の添加により親ＲＮＡｉ剤に対して修飾されたＲＮＡｉ剤は、予想外に高いサイレンシング活性を示し、対応する親ＲＮＡｉ剤よりも５〜８倍優れたＩＣ５０値をＨｅｐ３Ｂ細胞で達成した。
【０４１２】
結果：Ｈｅｐ３Ｂ細胞における自由取り込みのＩＣ５０
表２および図６〜図７に示されているように、親ＡＤ−４５１６３に対して修飾されたＲＮＡｉ剤も、自由取り込みのサイレンシングの増大を示した。修飾されたＲＮＡｉ剤は、インキュベーションの２４時間後に親ＲＮＡｉ剤のサイレンシング活性の２倍を超えるサイレンシング活性を示し、インキュベーションの４時間後には、親ＲＮＡｉ剤のサイレンシング活性のほぼ１０倍のサイレンシング活性を示した。
【０４１３】
表２および図８〜図９に示されているように、親ＡＤ−４５１６５に対して修飾されたＲＮＡｉ剤も、自由取り込みのサイレンシングの増大を示した。修飾されたＲＮＡｉ剤は、インキュベーションの２４時間後に親ＲＮＡｉ剤のサイレンシング活性の２〜３倍のサイレンシング活性を示し、インキュベーションの４時間後には、親ＲＮＡｉ剤のサイレンシング活性の５〜８倍のサイレンシング活性を示した。
【０４１４】
まとめると、これらの結果は、本明細書に記載される修飾されたＲＮＡｉ剤、例えば、ＡＤ−５１５４４、ＡＤ−５１５４５、ＡＤ−５１５４６、およびＡＤ−５１５４７はすべて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのサイレンシング実験において予想外に優れたＴＴＲ  ｍＲＮＡの阻害を示すことを実証した。
【０４１５】
実施例６：トランスジェニックマウスにおけるＴＴＲ  ｍＲＮＡのサイレンシングおよびＴＴＲタンパク質の抑制
ＲＮＡｉ剤ＡＤ−４５１６３、ＡＤ−５１５４４、ＡＤ−５１５４５、ＡＤ４５１６５、ＡＤ−５１５４６、およびＡＤ−５１５４７の効果を評価するために、これらのＲＮＡｉ剤を、Ｖ３０Ｍ突然変異を有するヒトトランスサイレチンを発現するトランスジェニックマウスに投与した（Ｓａｎｔｏｓ，ＳＤ．，Ｆｅｒｎａａｎｄｅｓ，Ｒ．，ａｎｄ  Ｓａｒａｉｖａ，ＭＪ．（２０１０）  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ａｇｉｎｇ，３１，２８０−２８９を参照されたい）。Ｖ３０Ｍ突然変異は、家族性アミロイド多発ニューロパシーＩ型をヒトに引き起こすことが知られている。例えば、Ｌｏｂａｔｏ，Ｌ．（２００３）  Ｊ  Ｎｅｐｈｒｏｌ．，１６（３）：４３８−４２を参照されたい。
【０４１６】
ＲＮＡｉ剤（ＰＢＳ緩衝液中）またはＰＢＳコントロールを、５ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇの単回皮下投与により１８〜２４カ月齢のマウス（２匹の雄と２匹の雌）に投与した。約４８時間後、２００μｌのケタミンでマウスを麻酔し、次いで、右尾動脈を切断して全採血した。全血を単離し、血漿を単離し、アッセイまで−８０℃で保存した。肝組織を採取して、急速冷凍し、処置まで−８０℃で保存した。
【０４１７】
治療の効果を、（ｉ）投与の４８時間後の肝臓におけるＴＴＲ  ｍＲＮＡの測定、および（ｉｉ）採血前および投与の４８時間後の血漿中のＴＴＲタンパク質の測定によって評価した。肝臓のＴＴＲ  ｍＲＮＡレベルを、分岐ＤＮＡアッセイ−ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ  ２．０  （Ｐａｎｏｍｉｃｓ  ｃａｔ  ＃：ＱＳ００１１）を利用してアッセイした。簡単に述べると、マウス肝臓サンプルを粉砕して、組織溶解物を調製した。肝臓溶解混合物（１倍量の溶解混合物、２倍量のヌクレアーゼフリー水、および１０μｌのプロテインキナーゼ−Ｋ／ｍｌを含む２０ｍｇ／ｍｌの最終濃度の混合物）を、６５℃で３５分間インキュベートした。次いで、２０μｌの機能プローブセット（遺伝子標的用のＴＴＲプローブおよび内在性コントロール用のＧＡＰＤＨ）および８０μｌの組織溶解物を捕捉プレートに添加した。捕捉プレートを、５５℃±１℃でインキュベートした（約１６〜２０時間）。翌日、捕捉プレートを、１×洗浄緩衝液（ヌクレアーゼフリー水、緩衝液成分１、および洗浄緩衝液成分２）で３回洗浄し、次いで、２４０ｇで１分間の遠心分離により乾燥させた。１００μｌの前増幅機能試薬（ｐｒｅ−Ａｍｐｌｉｆｉｅｒ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ）を捕捉プレートに添加し、この捕捉プレートをアルミ箔で密閉し、５５℃±１℃で１時間インキュベートした。１時間のインキュベーション後、洗浄ステップを繰り返し、次いで、１００μｌの前増幅機能試薬を添加した。１時間後、洗浄ステップおよび乾燥ステップを繰り返し、１００μｌの標識プローブを添加した。捕捉プレートを、５０℃±１℃で１時間インキュベートした。次いで、捕捉プレートを１×洗浄緩衝液で洗浄し、乾燥させ、１００μｌの基質を捕捉プレートに添加した。捕捉プレートを、５〜１５分のインキュベーション後にＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒを用いて読み取った。ｂＤＮＡデータを、各３つ組サンプルから平均バックグラウンドを減じ、得られた３つ組ＧＡＰＤＨ（コントロールプローブ）およびＴＴＲ（実験プローブ）の値を平均し、次いで、比：（実験プローブのバックグラウンド）／（コントロールプローブのバックグラウンド）を計算することによって分析した。
【０４１８】
血漿ＴＴＲレベルを、製造者のガイドラインに従って市販のキット「ＡｓｓａｙＭａｘ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅａｌｂｕｍｉｎ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ」（ＡｓｓａｙＰｒｏ，Ｓｔ．Ｃｈａｒｌｅｓ，  ＭＯ，Ｃａｔａｌｏｇ＃ＥＰ３０１０−１）を利用してアッセイした。簡単に述べると、マウス血漿を、１×混合希釈剤で１：１０，０００に希釈し、キットの基準に従って前被覆プレートに添加し、室温で２時間インキュベートし、次いで、キットの洗浄緩衝液で５回洗浄した。５０μｌのビオチン化プレアルブミン抗体を各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートし、次いで、キットの洗浄緩衝液で５回洗浄した。５０μｌのストレプトアビジン−ペルオキシダーゼコンジュゲートを各ウェルに添加し、プレートを室温で３０分間インキュベートし、次いで、上記のように洗浄した。５０μｌ／ウェルの色素原基質の添加によって反応を引き起こし、５０μｌ／ウェルの停止溶液の添加によって反応を停止させた状態で、室温で１０分間インキュベートした。４５０ｎｍでの吸光度を、Ｖｅｒｓａｍａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，  Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，  ＣＡ）で読み取り、データを、Ｓｏｆｔｍａｘ  ４．６ソフトウェアパッケージ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて分析した。
【０４１９】
この結果は図１０〜図１２に示されている。図１０は、親ＲＮＡｉ剤ＡＤ−４５１６３およびＡＤ−４５１６５に対して修飾されたＲＮＡｉ剤が、親ＲＮＡｉ剤のＲＮＡサイレンシング活性と比較して同等またはそれ以上に強いＲＮＡサイレンシング活性を示したことを示している。図１１は、ＲＮＡｉ剤ＡＤ−５１５４４およびＡＤ−５１５４５が、用量依存性サイレンシング活性を示し、５ｍｇ／ｋｇの用量でのこられのＲＮＡｉ剤のサイレンシング活性が、対応する親ＡＤ−４５１６３のサイレンシング活性と同様であったことを示している。図１２は、ＲＮＡｉ剤ＡＤ−５１５４６およびＡＤ−５１５４７も、用量依存性サイレンシング活性を示したことを示している。さらに、５ｍｇ／ｋｇの用量でのＡＤ−５１５４６およびＡＤ−５１５４７のサイレンシング活性は、対応する親ＡＤ−４５１６５のサイレンシング活性よりも優れていた。
【０４２０】
実施例７：マウスにおけるＴＴＲを標的とするＲＮＡｉ剤の血清および肝臓の薬物動態プロファイル
ＲＮＡｉ剤ＡＤ−４５１６３、ＡＤ−５１５４４、ＡＤ−５１５４５、ＡＤ−５１５４６、およびＡＤ−５１５４７の薬物動態プロファイルの薬物動態プロファイルを評価するために、ＰＢＳ緩衝液中のこれらのＲＮＡｉ剤を、単回ＩＶボーラス投与または皮下（ＳＣ）投与によりＣ５７ＢＬ／６マウスに投与した。ＲＮＡｉ剤の血漿濃度および肝臓濃度を、投与後の様々な時点で評価した。
【０４２１】
血漿薬物動態パラメーターが、以下の表３および表４に示されている。血漿中での平均滞留時間（ＭＲＴ）は、ＩＶ投与後は約０．２時間であり、ＳＣ投与後は約１時間であった。２５ｍｇ／ｋｇの用量では、ＲＮＡｉ剤ＡＤ−５１５４４、ＡＤ−５１５４５、ＡＤ−５１５４６、およびＡＤ−５１５４７は、同様の血漿薬物動態特性を示した。こられの各ＲＮＡｉ剤は、皮下腔で７５％を超えるバイオアベイラビリティーを有していた。これらのバイオアベイラビリティーは、３０ｍｇ／ｋｇのより高い用量で投与された親ＲＮＡｉ剤ＡＤ−４５１６３のバイオアベイラビリティーよりも優れていた。ＡＤ−５１５４４およびＡＤ−５１５４７の皮下バイオアベイラビリティーは、約１００％であったが、ＡＤ−５１５４５では約９０％でり、ＡＤ−５１５４６では約７６％であった。
【０４２２】
【表４６】
2018007657.tif 000060
【０４２３】
【表４７】
2018007657.tif 000061
【０４２４】
この結果はまた、ＲＮＡｉ剤ＡＤ−４５１６３、ＡＤ−５１５４４、ＡＤ−５１５４５、ＡＤ−５１５４６、およびＡＤ−５１５４７が、ＩＶボーラスにより投与されたときよりも皮下投与されたときに肝臓で同等以上の濃度を達成したことも示した。肝臓の薬物動態パラメーターが、下の表５および表６に示されている。同一用量での同一作用剤のＩＶ投与と比較すると、皮下投与後に、肝臓におけるピーク濃度（Ｃｍａｘ）および曲線の下の面積（ＡＵＣ０−ｌａｓｔ）が２倍〜３倍大きかった。肝臓の曝露は、ＡＤ−５１５４７で最も高く、ＡＤ−５１５４５で最も低かった。平均滞留時間（ＭＲＴ）および消失半減期は、ＡＤ−５１５４４およびＡＤ−５１５４５と比較してＡＤ−５１５４６およびＡＤ−５１５４７で長かった。皮下投与後、概算のＭＲＴは、ＡＤ−５１５４６で４０時間、ＡＤ−５１５４７で２５時間であったが、ＡＤ−５１５４４およびＡＤ−５１５４５のＭＲＴは、より短かった（約６〜９時間）。ＡＤ−５１５４６およびＡＤ−５１５４７の消失半減期（４１〜５３時間）は、ＡＤ−５１５４４およびＡＤ−５１５４５の消失半減期（６〜１０時間）よりも長かった。
【０４２５】
【表４８】
2018007657.tif 000062
【０４２６】
【表４９】
2018007657.tif 000063
【０４２７】
実施例８：サル血清におけるＲＮＡｉ剤のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの安定性
ＲＮＡｉ剤ＡＤ−５１５４４、ＡＤ−５１５４５、ＡＤ−５１５４６、およびＡＤ−５１５４７の血清安定性をサルでも評価した。この結果は、ＡＤ−５１５４４、ＡＤ−５１５４５、およびＡＤ−５１５４７のアンチセンス鎖およびセンス鎖が、約２４時間の期間に亘る血清安定性を示したことを実証した（データは不図示）。
【０４２８】
実施例９：ＲＮＡｉ剤は非ヒト霊長類におけるＴＴＲタンパク質の抑制を持続させる
ＲＮＡｉ剤ＡＤ−４５１６３、ＡＤ−５１５４４、ＡＤ−５１５４５、ＡＤ−５１５４６、およびＡＤ−５１５４７のＲＮＡサイレンシング活性を、５ｍｇ／ｋｇでの５回（１日１回で５日間）または２５ｍｇ／ｋｇでの１回の皮下投与後に、カニクイザルの血清中のＴＴＲタンパク質の抑制を測定することによって評価した。投与前の血清中のＴＴＲタンパク質のレベルを、最初の投与の１１日前、最初の投与の７日前、および最初の投与の１日前のレベルを平均することによって評価した。投与後のＴＴＲタンパク質の血清レベルを、最終投与から１日後（即ち、５回の５ｍｇ／ｋｇの群では試験５日目であり、１回の２５ｍｇ／ｋｇの群では試験１日目である）から最終投与から４９日後（即ち、５回の５ｍｇ／ｋｇの群では試験５３日目であり、１回の２５ｍｇ／ｋｇの群では試験４９日目である）まで、血清中のレベルを決定することによって評価した。図１３を参照されたい。
【０４２９】
ＴＴＲタンパク質のレベルは、実施例６に記載されたように評価した。この結果は、図１４ならびに表７および表８に示されている。
【０４３０】
最大約５０％のＴＴＲタンパク質の最大抑制が、２５ｍｇ／ｋｇのＡＤ−４５１６３、ＡＤ−５１５４４、ＡＤ−５１５４６、およびＡＤ−５１５４７が投与された群で達成された（表８を参照）。約７０％のＴＴＲタンパク質のより大きい最大抑制が、５回の５ｍｇ／ｋｇのＡＤ−４５１６３、ＡＤ−５１５４４、ＡＤ−５１５４６、およびＡＤ−５１５４７が投与された群で達成された（表７を参照）。ＲＮＡｉ剤ＡＤ−５１５４５は、両方の投与プロトコルでより低い抑制しかもたらさなかった。約２０％以上の有意な抑制が、１回の２５ｍｇ／ｋｇおよび５回の５ｍｇ／ｋｇの両方のプロトコルでのＡＤ−５１５４６およびＡＤ−５１５４７の最終投与から４９日目まで持続した。一般に、優れた抑制は、１回の２５ｍｇ／ｋｇのプロトコルよりも５回の５ｍｇ／ｋｇのプロトコルで達成された。
【０４３１】
【表５０】
2018007657.tif 000064
【０４３２】
【表５１】
2018007657.tif 000065
【０４３３】
実施例１０：ＴＴＲを標的とするＲＮＡｉ剤の認容性
全血アッセイでのサイトカインの評価
ＴＴＲを標的とするＲＮＡｉ剤（ＡＤ−４５１６３、ＡＤ−５１５４４、ＡＤ−５１５４５、ＡＤ−５１５４６、およびＡＤ−５１５４７を含む）の認容性を評価するために、各ＲＮＡｉ剤を、３人のヒトドナーからの血液を用いて全血アッセイで試験した。ＲＮＡｉ剤は、３００ｎＭのＤＯＴＡＰでトランスフェクトされるか、またはトランスフェクション剤を含まない１μＭの（遊離ｓｉＲＮＡ）とした。次のサイトカイン／ケモカイン：Ｇ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２（ｐ７０）、ＩＬ１β、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＴＮＦαでは２倍未満の変化であった（結果は不図示）。
【０４３４】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの評価
ｉｎ  ｖｉｖｏでの認容性を評価するために、ＲＮＡｉ剤を、１２５ｍｇ／ｋｇの用量でＣＤ１マウスに皮下注射した。サイトカインの誘導は、ＡＤ−４５１６３の皮下注射から２時間後、４時間後、６時間後、２４時間後、および４８時間後にも全く観察されなかった。有意なサイトカインの誘導は、ＡＤ−５１５４４、ＡＤ−５１５４５、ＡＤ−５１５４６、またはＡＤ−５１５４７の皮下注射から６時間後にも２４時間後にも全く観察されなかった。
【０４３５】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの認容性をさらに評価するために、複数のＲＮＡｉ剤（ＡＤ−４５１６３、ＡＤ−５１５４４、ＡＤ−５１５４５、ＡＤ−５１５４６、およびＡＤ−５１５４７を含む）を、１部位当たり１〜２ｍｌの投与容量を用いた非ヒト霊長類（カニクイザル）への５〜２５ｍｇの皮下注射によって試験した。紅斑も浮腫も、注射部位で全く観察されなかった。
【０４３６】
単回ＳＣ投与によるラット認容性試験
毒性を評価するために、ラットに、１００ｍｇ／ｋｇ、２５０ｍｇ／ｋｇ、５００ｍｇ／ｋｇ、または７５０ｍｇ／ｋｇのＡＤ−４５１６３を単回皮下注射した（表９を参照されたい）。次の評価を行った；毒性の臨床的徴候、体重、血液学、臨床化学および凝固、器官の重量（肝臓および脾臓）；巨視的および顕微鏡的評価（腎臓、肝臓、肺、リンパ節、脾臓、睾丸、胸腺、大動脈、心臓、腸（小腸および大腸。
【０４３７】
【表５２】
2018007657.tif 000066
【０４３８】
この結果は、被験物質に関連した毒性の臨床的徴候が、体重、器官の重量、または臨床化学に全く影響を与えないことを示した。組織病理学は、心臓、腎臓、睾丸、脾臓、肝臓、および胸腺で全く観察されなかった。７５０ｍｇ／ｋｇでのＷＢＣにおける有害ではない被験物質に関連した僅かな増加が見られた（↑６８％、ＮＥＵＴおよびＭＯＮＯにおける増加に主に起因する）。これらの結果は、ラットでは最大７５０ｍｇ／ｋｇの単回投与が十分に認容性であることを示している。
【０４３９】
ラットにおける反復皮下投与の認容性
ＡＤ−４５１６３の反復皮下投与の認容性を評価するために、３００ｍｇ／ｋｇの皮下投与を毎日５日間行い、６日目に剖検を行った。試験デザインは表１０に示されている。
【０４４０】
【表５３】
2018007657.tif 000067
【０４４１】
次の結果因子を評価した：臨床的徴候、体重、血液学、臨床化学および凝固、器官の重量、巨視的および顕微鏡的評価（肝臓、脾臓、腎臓、肺、胃腸管、および最初と最後の注射部位）。この結果は、被験物質に関連した臨床的徴候、体重、または器官の重量のいずれも影響を与えず、また被験物質に関連した所見が、臨床血液学および化学に全く見られないことを示した。６日目の活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）がやや長期化する可能性がある（２０．４秒対１７．４秒）。組織病理学によると、肝臓、脾臓、心臓、および胃腸管には被験物質に関連した所見が全く見られなかった。腎臓では、最小限から軽度の尿細管上皮の肥大（有害ではない）が観察された。最後の注射部位には、有害ではない最小限の多発性単核浸潤が見られた。これらの結果は、親ＲＮＡｉ剤ＡＤ−４５１６３の１日５回の３００ｍｇ／ｋｇの投与がラットでは十分に許容されることを示している。
【０４４２】
実施例１１：ＲＮＡｉ剤は非ヒト霊長類におけるＴＴＲタンパク質の抑制を持続させる
ＲＮＡｉ剤ＡＤ−５１５４７のＲＮＡサイレンシング活性を、このＲＮＡｉ剤の「負荷段階（ｌｏａｄｉｎｇ  ｐｈａｓｅ）」の皮下投与：５日間毎日の２．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇの投与（１日１回を５日間）、これに続くＲＮＡｉ剤の「維持段階」；毎週２．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇの４週間の投与後に、カニクイザルの血清中のＴＴＲタンパク質の抑制を測定することによって評価した。投与前のＴＴＲタンパク質の血清レベルを、最初の投与の１１日前、最初の投与の７日前、および最初の投与の１日前のレベルを平均することによって評価した。投与後のＴＴＲタンパク質の血清レベルを、負荷段階の１日後から維持段階の最終投与から４０日後（即ち、試験７０日目）までの前投与に対する血清中のレベルを決定することによって評価した。
【０４４３】
ＴＴＲタンパク質のレベルは、実施例６に記載されているように評価した。この結果は、図１５に示されている。
【０４４４】
最大約８０％のＴＴＲタンパク質の最大の抑制は、２．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇのＡＤ−５１５４７が投与された全ての群で達成された。ナディアノックダウン（ｎａｄｉｒ  ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ）が、約１４日目までに全ての群で達成され、抑制が、２．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇのＡＤ−５１５４７の毎週の維持投与でナディアノックダウンレベルに維持された。ＴＴＲのレベルは、５ｍｇ／ｋｇおよび２．５ｍｇ／ｋｇの投与レベルの最後の維持投与の日から４０日を超えても基準値に戻らなかった。
【０４４５】
等価物：
当業者であれば、本明細書に記載される特定の実施形態および方法の様々な等価物を認識し、単なる通常の実験を用いてこのような等価物を確かめることができるであろう。このような等価物は、添付の特許請求の範囲に含まれるものとする。
【図１】
2018007657.tif 000071
【図２】
2018007657.tif 000072
【図３】
2018007657.tif 000073
【図４】
2018007657.tif 000074
【図５】
2018007657.tif 000075
【図６】
2018007657.tif 000076
【図７】
2018007657.tif 000077
【図８】
2018007657.tif 000078
【図９】
2018007657.tif 000079
【図１０Ａ】
2018007657.tif 000080
【図１０Ｂ】
2018007657.tif 000081
【図１１】
2018007657.tif 000082
【図１２】
2018007657.tif 000083
【図１３】
2018007657.tif 000084
【図１４】
2018007657.tif 000085
【図１５】
2018007657.tif 000086
【配列表】
2018007657000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成29年7月14日(2017.7.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含む二本鎖ＲＮＡｉ剤であって、前記アンチセンス鎖が、ヌクレオチド配列ａＵｆｇＧｆａＡｆｕＡｆｃＵｆｃｕｕＧｆｇｕｕＡｆｃＡｆｕｓＧｆｓａ（配列番号２２１４）を含み、前記センス鎖が、ヌクレオチド配列ＡｆｕＧｆｕＡｆＡｆＣｆｃＡｆＡｆＧｆａＧｆｕＡｆｕＵｆｃＣｆａＵｆ（配列番号２２０８）を含み、
ａ、ｇ、ｃおよびｕが２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、ＣおよびＵであり；Ａｆ、Ｇｆ、ＣｆおよびＵｆが２’−フルオロＡ、Ｇ、ＣおよびＵであり；ｓがホスホロチオエート連結であり；センス鎖が少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートしており、リガンドが二価または三価分岐リンカーによって付着された１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体である、二本鎖ＲＮＡｉ剤。
【請求項２】
前記ＲＮＡｉ剤がヌクレオチド配列ＡｆｕＧｆｕＡｆＡｆＣｆｃＡｆＡｆＧｆａＧｆｕＡｆｕＵｆｃＣｆａＵｆ（配列番号２２０８）からなるセンス鎖およびヌクレオチド配列ａＵｆｇＧｆａＡｆｕＡｆｃＵｆｃｕｕＧｆｇｕｕＡｆｃＡｆｕｓＧｆｓａ（配列番号２２１４）からなるアンチセンス鎖を含み、ａ、ｇ、ｃおよびｕが２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、ＣおよびＵであり；Ａｆ、Ｇｆ、ＣｆおよびＵｆが２’−フルオロＡ、Ｇ、ＣおよびＵであり；ｓがホスホロチオエート連結である、請求項１に記載のＲＮＡｉ剤。
【請求項３】
前記リガンドが、
【化１】
2018007657.tif 000087
である、請求項１または２に記載のＲＮＡｉ剤。
【請求項４】
前記リガンドが、前記センス鎖の３’末端に付着している、請求項１または２に記載のＲＮＡｉ剤。
【請求項５】
前記ＲＮＡｉ剤が、以下の式
【化２】
2018007657.tif 000088
に示されているリガンドにコンジュゲートし、
式中、ＸがＯまたはＳである、請求項１または２に記載のＲＮＡｉ剤。
【請求項６】
前記ＲＮＡｉ剤が、以下の式
【化３】
2018007657.tif 000089
に示されているリガンドにコンジュゲートしている、請求項５に記載のＲＮＡｉ剤。
【請求項７】
請求項１、２および６の何れか１項に記載のＲＮＡｉ剤を含む単離された細胞。
【請求項８】
請求項１、２および６の何れか１項に記載のＲＮＡｉ剤を含む医薬組成物。
【請求項９】
前記ＲＮＡｉ剤が、非緩衝液に溶解されて投与される、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記非緩衝液が、生理食塩水または水である、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記ＲＮＡｉ剤が、緩衝液を用いて投与される、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記緩衝液が、酢酸塩、クエン酸塩、プロラミン、炭酸塩、リン酸塩、またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記緩衝液が、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
細胞におけるトランスサイレチン（ＴＴＲ）の発現を阻害するための医薬組成物であって、請求項１、２および６の何れか１項に記載のＲＮＡｉ剤を、前記細胞における前記ＴＴＲの発現を阻害するのに有効な量で含む、医薬組成物。
【請求項１５】
対象のＴＴＲ関連疾患を治療するための医薬組成物であって、請求項１および２の何れか１項に記載のＲＮＡｉ剤を治療有効量で含む、医薬組成物。
【請求項１６】
前記対象がヒトである、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記対象が、ＴＴＲ関連疾患の発症に関連したＴＴＲ遺伝子突然変異を有する、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記ＴＴＲ関連疾患が、老人性全身性アミロイドーシス（ＳＳＡ）、全身性家族性アミロイドーシス、家族性アミロイド多発神経障害（ＦＡＰ）、家族性アミロイド心筋症（ＦＡＣ）、軟髄膜／中枢神経系（ＣＮＳ）アミロイドーシス、および高サイキロシン血症からなる群から選択される、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記対象が、ＴＴＲ関連アミロイドーシスを有し、前記医薬組成物が、前記対象のアミロイドＴＴＲ沈着を減少させる、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記ＲＮＡｉ剤が、皮下投与によって前記対象に投与される、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
細胞におけるトランスサイレチン（ＴＴＲ）の発現を阻害するためのキットであって、
（ａ）請求項１および２の何れか１項に記載のＲＮＡｉ剤と、
（ｂ）使用するための取扱説明書と、
を含む、キット。
【請求項２２】
対象のＴＴＲ関連疾患を治療するためのキットであって、
（ａ）請求項１および２の何れか１項に記載のＲＮＡｉ剤と、
（ｂ）使用するための取扱説明書と、
（ｃ）任意選択の、前記ＲＮＡｉ剤を前記対象に投与するための手段と、
を含む、キット。