(57)【要約】      （修正有）【課題】大きな核酸をクローニングするためのアデノウイルスベクターを作製する手段の提供。【解決手段】第３の核酸分子とも呼ばれる核酸分子に関し、前記第３の核酸分子は、（ａ）場合によりウイルスのゲノムの第１の部分と、（ｂ）ヌクレオチド配列、好ましくはゲノムヌクレオチド配列、または転写単位と、（ｃ）原核生物において調節活性を有する調節核酸配列と、（ｄ）正確に１つの部位特異的組換え部位と、（ｅ）陰性選択マーカーを提供するヌクレオチド配列と、（ｆ）（ｉ）条件付き複製のための細菌ヌクレオチド配列、および（ｉｉ）陽性選択マーカーを提供するヌクレオチド配列を含む細菌ヌクレオチド配列単位と、（ｇ）場合により第１の制限部位とを含む核酸分子、好ましくは、前記生物中に含有される核酸分子は、異種核酸分子である核酸分子を含み、前記第３の核酸分子は、直鎖または環状分子のいずれかである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）以下のエレメント：
（ａ）場合によりウイルスのゲノムの第１の部分と、
（ｂ）ヌクレオチド配列、好ましくはゲノムヌクレオチド配列、または転写単位と、
（ｃ）原核生物において調節活性を有する調節核酸配列と、
（ｄ）部位特異的組換え部位と、
（ｅ）陰性選択マーカーを提供するヌクレオチド配列と、
（ｆ）（ｉ）条件付き複製のための細菌ヌクレオチド配列、および（ｉｉ）陽性選択マ
ーカーを提供するヌクレオチド配列を含む細菌ヌクレオチド配列単位と、
（ｇ）場合により第１の制限部位と
を含む核酸分子、または
（２）配列番号６によるヌクレオチド配列を含む核酸分子、または
（３）受託番号ＤＳＭ２３７５４でブダペスト条約に基づいてＤＳＭＺに寄託された生
物中に含有される核酸分子と同一もしくは類似である核酸分子であって、好ましくは、前
記生物中に含有される核酸分子が、異種核酸分子である核酸分子
を含む、第３の核酸分子とも呼ばれる核酸分子であって、
前記第３の核酸分子が、直鎖分子または環状分子のいずれかである、核酸分子。
【請求項２】
（１）原核生物において調節活性を有する前記調節核酸配列の前記核酸分子において、
前記部位特異的組換え部位および陰性選択マーカーを提供する前記ヌクレオチド配列が、
５’から３’方向に配置される、請求項１に記載の第３の核酸分子。
【請求項３】
前記第３の核酸分子が、正確に１つの部位特異的組換え部位を含有する、請求項１〜２
のいずれか一項に記載の第３の核酸分子。
【請求項４】
前記第３の核酸分子が、直鎖分子であり、エレメント（ａ）から（ｆ）が、好ましくは
、前記第３の核酸分子の環状分子の、第１の制限部位で認識および切断する第１の制限酵
素での切断の際に、以下の順序で以下：
１．場合によりウイルスのゲノムの前記第１の部分、
２．前記核酸配列、好ましくはゲノムヌクレオチド配列、または転写単位、
３．原核生物において調節活性を有する前記調節核酸配列、
４．前記部位特異的組換え部位、
５．陰性選択マーカーを提供する前記ヌクレオチド配列、ならびに
６．（ｉ）条件付き複製のための細菌ヌクレオチド配列、および（ｉｉ）陽性選択マー
カーを提供するヌクレオチド配列を含む前記細菌ヌクレオチド配列単位
のように、５’→３’方向に配置される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の第３の核
酸分子。
【請求項５】
前記第３の核酸分子が、ウイルスのゲノムの第１の部分をさらに含む、請求項１〜４の
いずれか一項に記載の第３の核酸分子。
【請求項６】
ウイルスのあるゲノムまたは前記ゲノムの前記第１の部分が、あるウイルスもしくは前
記ウイルスのあるゲノムもしくは前記ゲノムの末端配列または前記末端配列の１つもしく
は複数の部分を含む、請求項５に記載の第３の核酸分子。
【請求項７】
あるウイルスまたは前記ウイルスのあるゲノムまたは前記ゲノムの前記第１の部分が、
アデノウイルス、好ましくはヒトアデノウイルスのゲノムの第１の部分であり、より好ま
しくは、前記アデノウイルスが、ヒトアデノウイルス５型、最も好ましくはＥ１転写単位
のＴＡＴＡボックスの上流のアデノウイルス５型の左側末端全体またはその１つもしくは
複数の部分である、請求項５〜６のいずれか一項に記載の第３の核酸分子。
【請求項８】
条件付き複製のための前記細菌ヌクレオチド配列が複製起点を含み、好ましくは、前記
複製起点が、ファージｇＲ６Ｋの最小の起点である、請求項１〜７のいずれか一項、好ま
しくは請求項７に記載の第３の核酸分子。
【請求項９】
原核生物において調節活性を有する前記調節配列が、原核生物において、好ましくは原
核生物宿主細胞において、ヌクレオチド配列の発現を指示する配列である、請求項１〜８
のいずれか一項、好ましくは請求項７〜８のいずれか一項に記載の第３の核酸分子。
【請求項１０】
前記陰性選択マーカーまたは前記陰性選択マーカーを提供する前記ヌクレオチド配列の
発現が、選択薬剤および／または選択条件に対する感受性を媒介または付与する、請求項
１〜９のいずれか一項、好ましくは請求項８〜９のいずれか一項に記載の第３の核酸分子
。
【請求項１１】
陰性選択マーカーを提供する前記ヌクレオチド配列が、ｇａｌＫ、ｔｅｔＡＲ、ｐｈｅ
Ｓ、ｔｈｙＡ、ｌａｃｙ、ｃｃｄＢおよびｒｐｓＬ遺伝子を含む群から選択される遺伝子
である、請求項１０に記載の第３の核酸分子。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれかに記載の第３の核酸分子および第２の核酸分子とも呼ばれる
核酸分子の組合せであって、
前記第２の核酸分子が、
（１）以下のエレメント：
（ａ）（ｉ）単一コピー複製のための細菌ヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第２の選
択マーカーを提供するヌクレオチド配列を含む細菌ヌクレオチド配列単位と、
（ｂ）部位特異的組換え部位と、
（ｃ）ウイルスのゲノムの第２の部分と、
（ｄ）場合により、第２の制限部位と呼ばれる制限部位と
を含む核酸分子、または
（２）配列番号２および／もしくは配列番号１３および／もしくは配列番号１４による
ヌクレオチド配列を含む核酸分子、または
（３）受託番号ＤＳＭ２４２９８および／もしくはＤＳＭ２４２９９でブダペスト条約
に基づいてＤＳＭＺに寄託された生物に含有される核酸分子と同一もしくは類似である核
酸分子であって、好ましくは、生物中に含有される前記核酸分子が、異種核酸分子である
核酸分子
を含み、
前記第２の核酸分子および前記第３の核酸分子が各々独立に直鎖分子または環状分子の
いずれかであり、好ましくは、前記第２の核酸分子が環状分子であり、前記第３の核酸分
子が環状分子である組合せ。
【請求項１３】
第１の核酸分子とも呼ばれる核酸分子および第２の核酸分子とも呼ばれる核酸分子の組
合せであって、
前記第１の核酸分子が、
（１）以下のエレメント：
（ａ）部位特異的組換え部位と、
（ｂ）（ｉ）条件付き複製のための細菌ヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第１の選択
マーカーを提供するヌクレオチド配列を含む細菌ヌクレオチド配列単位と、
（ｃ）ウイルスのゲノムの第１の部分と、
（ｄ）転写単位と、
（ｅ）場合により第１の制限部位と
を含む核酸分子、または
（２）配列番号１および／もしくは配列番号１５によるヌクレオチド配列を含む核酸分
子、または
（３）ブダペスト条約に従って受託番号ＤＳＭ２３７５３でＤＳＭＺに寄託された生物
中に含有される核酸分子と類似または同一である核酸分子であって、好ましくは、生物中
に含有される核酸分子が、異種核酸分子である核酸分子
を含み、
前記第２の核酸分子が、
（１）以下のエレメント：
（ａ）（ｉ）単一コピー複製のための細菌ヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第２の選
択マーカーを提供するヌクレオチド配列を含む細菌ヌクレオチド配列単位と、
（ｂ）部位特異的組換え部位と、
（ｃ）ウイルスのゲノムの第２の部分と、
（ｄ）場合により、第２の制限部位とも呼ばれる制限部位と
を含む核酸分子、または
（２）配列番号２および／もしくは配列番号１３および／もしくは配列番号１４による
ヌクレオチド配列を含む核酸分子、または
（３）受託番号ＤＳＭ２４２９８および／もしくはＤＳＭ２４２９９でブダペスト条約
に基づいてＤＳＭＺに寄託された生物に含有される核酸分子と同一もしくは類似である核
酸分子であって、好ましくは、生物中に含有される核酸分子が、異種核酸分子である核酸
分子
を含み、
前記第１の核酸分子および前記第２の核酸分子が各々独立に直鎖分子または環状分子の
いずれかであり、好ましくは、前記第１の核酸分子が環状分子であり、前記第２の核酸分
子が環状分子である組合せ。
【請求項１４】
前記第１の核酸分子が、正確に１つの部位特異的組換え部位を含有する、請求項１３に
記載の組合せ。
【請求項１５】
前記第１の核酸分子のウイルスの前記ゲノムが、ヒトアデノウイルスゲノム、好ましく
は、ヒトアデノウイルス５型ゲノムとは異なるヒトアデノウイルスゲノムであり、より好
ましくは、前記第１の核酸分子のウイルスの前記ゲノムが、ヒトアデノウイルス１９ａ型
ゲノムである、請求項１３および１４のいずれか一項に記載の組合せ。
【請求項１６】
前記第１の核酸分子の条件付き複製のための細菌ヌクレオチド配列が、複製起点を含む
、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の組合せ。
【請求項１７】
前記第１の核酸分子の第１の選択マーカーを提供する前記配列が、酵素をコードする核
酸配列であって、酵素をコードする前記核酸配列を有する宿主細胞に耐性を付与する核酸
配列である、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の組合せ。
【請求項１８】
前記第１の核酸分子のウイルスのゲノムの前記第１の部分が、ウイルス末端反復、好ま
しくはアデノウイルス末端反復である、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の組合せ
。
【請求項１９】
前記第１の核酸分子のウイルスのゲノムの前記第１の部分が、アデノウイルスプロモー
ターｐＩＸを含有し、より好ましくは、前記アデノウイルスプロモーターｐＩＸが、ヒト
アデノウイルス１９ａ由来のｐＩＸプロモーターである、請求項１３〜１８のいずれか一
項に記載の組合せ。
【請求項２０】
前記第２の核酸分子が、正確に１つの部位特異的組換え部位を含有する、請求項１２〜
１９のいずれか一項に記載の組合せ。
【請求項２１】
前記第２の核酸分子の前記ウイルスゲノムが、ヒトアデノウイルスゲノムであり、請求
項１２に記載の組合せの場合には、前記第２の核酸分子の前記ウイルスゲノムが、好まし
くはヒトアデノウイルス５型ゲノムまたはヒトアデノウイルス１９ａ型ゲノムであり、請
求項１３に記載の組合せの場合には、前記第２の核酸分子の前記ウイルスゲノムが、好ま
しくは、ヒトアデノウイルス５型ゲノムとは異なるヒトアデノウイルスゲノムであり、よ
り好ましくは、前記第２の核酸分子の前記ウイルスゲノムが、ヒトアデノウイルス１９ａ
型ゲノムである、請求項１２〜２０のいずれか一項に記載の組合せ。
【請求項２２】
前記第２の核酸分子の単一コピー複製のための前記細菌ヌクレオチド配列が、原核生物
宿主細胞における単一コピー維持のための複製起点を含む、請求項１２〜２１のいずれか
一項に記載の組合せ。
【請求項２３】
前記第２の核酸分子マーカーの第２の選択マーカーを提供する前記ヌクレオチド配列が
、酵素をコードする核酸配列であって、酵素をコードする前記核酸配列を有する宿主細胞
に耐性を付与する核酸配列である、請求項１２〜２２のいずれか一項に記載の組合せ。
【請求項２４】
前記第２の核酸分子のウイルスのゲノムの前記第２の部分が、ウイルスの逆方向末端反
復、好ましくはアデノウイルス逆方向末端反復、より好ましくはアデノウイルス右側逆方
向末端反復を含む、請求項１２〜２３のいずれか一項に記載の組合せ。
【請求項２５】
ウイルスをコードする核酸分子を作製するための方法であって、
ａ）請求項１〜１１のいずれか一項に記載の第３の核酸分子を用意するステップ、
ｂ）請求項１２に記載の第２の核酸分子を用意するステップ、または
ｃ）請求項１２〜２４のいずれか一項に記載の第３の核酸分子および第２の核酸分子の
組合せ、
ｄ）部位特異的組換えが起こるように前記第３の核酸分子および前記第２の核酸分子を
反応させるステップであって、前記部位特異的組換えが、部位特異的リコンビナーゼによ
って媒介され、前記部位特異的組換えが、あるウイルスまたは前記ウイルスのゲノムのコ
ピー、好ましくは単一コピーを含む組換え生成物を形成し、前記ゲノムが、補完された完
全なゲノムであり、前記補完された完全なゲノムが、前記部位特異的組換えによって補完
されるステップ、
ｅ）場合により、前記組換え生成物を選択するステップ、ならびに
ｆ）場合により、前記第１の制限酵素および前記第２の制限酵素を用いて前記組換え生
成物を切断するステップ
を含む、方法。
【請求項２６】
ウイルスをコードする核酸分子を作製するための方法であって、
ａ）請求項１３〜２４のいずれか一項に記載の第１の核酸分子および第２の核酸分子の
組合せ、
ｂ）部位特異的組換えが起こるように前記第１の核酸分子および前記第２の核酸分子を
反応させるステップであって、部位特異的組換えが、部位特異的リコンビナーゼによって
媒介され、前記部位特異的組換えが、あるウイルスまたは前記ウイルスのゲノムのコピー
、好ましくは単一コピーを含む組換え生成物を形成し、前記ゲノムが、補完された完全な
ゲノムであり、前記補完された完全なゲノムが、前記部位特異的組換えによって補完され
るステップ、
ｃ）場合により、前記組換え生成物を選択するステップ、ならびに
ｄ）場合により、前記第１の制限酵素および前記第２の制限酵素を用いて前記組換え生
成物を切断するステップ
を含む、方法。
【請求項２７】
前記第３の核酸分子および前記第２の核酸分子を、ブダペスト条約に従って受託番号Ｄ
ＳＭ２３７４３でＤＳＭＺに寄託された生物と類似または同一である原核生物宿主細胞、
好ましくは大腸菌において反応させる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記第１の核酸分子および前記第２の核酸分子を、ブダペスト条約に従って受託番号Ｄ
ＳＭ２３７４３でＤＳＭＺに寄託された生物と類似または同一である原核生物宿主細胞、
好ましくは大腸菌において反応させる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
ヌクレオチド配列のライブラリーを作製するための方法であって、前記ライブラリーが
、複数の個々のヌクレオチド配列を含み、前記ライブラリーが、複数のウイルスゲノムに
よって表され、各ウイルスゲノムが、単一の前記個々のヌクレオチド配列を含有し、請求
項２５および２７のいずれかに記載の方法のステップを含み、前記個々のヌクレオチド配
列が、前記第３の核酸分子の前記転写単位の部分である方法。
【請求項３０】
ヌクレオチド配列のライブラリーを作製するための方法であって、前記ライブラリーが
、複数の個々のヌクレオチド配列を含み、前記ライブラリーが、複数のウイルスゲノムに
よって表され、各ウイルスゲノムが、単一の前記個々のヌクレオチド配列を含有し、請求
項２６および２８のいずれかに記載の方法のステップを含み、前記個々のヌクレオチド配
列が、前記第１の核酸分子の前記転写単位の部分である方法。
【請求項３１】
場合により添付文書、ならびに適した容器（単数または複数）中に少なくとも請求項１
〜１１のいずれか一項に記載の第３の核酸分子および／または請求項１２〜２４のいずれ
か一項に記載の第３の核酸分子および第２の核酸分子の組合せを含むキット。
【請求項３２】
場合により添付文書、ならびに適した容器（単数または複数）中に少なくとも請求項１
３〜１９のいずれか一項に記載の第１の核酸分子および／または請求項１３〜２４のいず
れか一項に記載の第１の核酸分子および第２の核酸分子の組合せを含むキット。
【請求項３３】
核酸分子（単数または複数）がすぐに使用できる形態で含まれ、かつ／またはキットが
使用説明書を含む、請求項３１および３２のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、第１の核酸分子、第２の核酸分子、第３の核酸分子、第１および第２の核酸
分子の組合せ、第２および第３の核酸分子の組合せ、第４の核酸分子、第５の核酸分子、
ウイルスをコードする核酸分子を作製するための方法、核酸配列のライブラリーを作製す
るための方法、複数の第４の核酸分子、複数の第５の核酸分子、複数の個々のアデノウイ
ルス、およびこれらの核酸分子のうち少なくとも１種を含有するキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
８０年代からの遺伝子発現のための組換えウイルスの開発は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏならび
にｉｎ  ｖｉｖｏでの遺伝子発現ベクターとしてのその幅広い適用につながった。ウイル
スまたは非ウイルス発現ライブラリーを使用する、低分子干渉ＲＮＡなどの非コーディン
グ核酸を含めた多数の遺伝子のクローニングおよび発現は、機能ゲノム科学において最も
強力なツールとして認識されており、すでに、新たな薬物標的遺伝子の発見および検証に
つながっている。ウイルスベースの発現ライブラリーの作製には、好ましくは、陽性の組
換え体をスクリーニングすることおよび増幅の際のＤＮＡベースの構築物におけるウイル
スゲノムの安定性を確実にすることを必要としない、多数の的確なクローンをもたらすク
ローニング手順が必要である。
【０００３】
特に、好ましいウイルスベクターとして、アデノウイルスベクターがある。アデノウイ
ルスベクターの構築は、種々の手段によって達成され得る。文献において提供される第１
のプロトコールは、許容細胞、通常は２９３細胞または９１１細胞などの遺伝子補完細胞
株の、典型的にはＥ１領域が外来ＤＮＡで置換されたウイルスゲノムの左末端を含有する
シャトルプラスミドとの同時トランスフェクションを含み、単離されたウイルスＤＮＡは
、適当な制限酵素によってゲノムの左末端付近で切断される。相同組換えが、シャトルプ
ラスミドとアデノウイルスＤＮＡの重複配列間でｉｎ  ｖｉｖｏで起こり、複製可能な組
み換えられたウイルスゲノムが得られる。ベクター構築のためのこの技術の適応性は、大
きな単離されたウイルスＤＮＡ断片の非効率的なトランスフェクションによって限定され
、さらに、アデノウイルスＤＮＡの部分的にすぎない消化のために、ベクター調製物に野
生型アデノウイルスが混入する場合もある。
【０００４】
この系の１つの変法は、各々アデノウイルスゲノムの一部を提供し、個々には複製でき
ない２つのプラスミドの使用を含み、これらが、相同組換えによって複製可能なウイルス
ＤＮＡを製造するために、補完性製造細胞株へ同時トランスフェクトされる。この方法は
、詳細に記載されている（Ｂｅｔｔら  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：５９２１〜５９２１頁、
１９９３年）。ｗｔ−ウイルス混入とも呼ばれる野生型ウイルス混入の不利点もまた、こ
の変法によって克服された。しかし、多数の組換えアデノウイルスベクターを作製するた
めのこの方法の使用は、２９３などのプロデューサー細胞における大きなベクターＤＮＡ
の低い組換え効率およびトランスフェクション効率によって限定される。一般に、Ｅ１が
欠失したアデノウイルスの複製を支援する、真核細胞における２種のＤＮＡ実体間の相同
組換えによるアデノウイルスベクター構築は、時間のかかるものであり、プラーク精製に
よる個々のウイルスクローンのスクリーニングおよび精製を必要とする。
【０００５】
ウイルスＤＮＡ断片の組換えプロセスに関与している部位特異的リコンビナーゼは、エ
ンドヌクレアーゼおよびリガーゼの特性の両方を有し、複数の生物中に存在するタンパク
質である。これらのリコンビナーゼは、ＤＮＡ中の塩基の特異的配列を認識し、それらの
セグメントのそれぞれの両端に位置するＤＮＡセグメントを交換する。このように得られ
た組換え生成物は、第２の核酸への第１の核酸の挿入物としてなる。このような場合には
、プラスミドは、各核酸上に１つのリコンビナーゼ認識配列を含有する環状プラスミドで
ある。あるいは、同一核酸上の２つのリコンビナーゼ認識配列間における核酸断片の切除
、または各核酸上に存在する２つの認識部位間において交換される核酸の各々を有する２
つの核酸間の核酸の一部の交換がある。各々１つのｌｏｘＰまたは例えば、Ｆｒｔリコン
ビナーゼ認識部位などのその他のリコンビナーゼ結合部位を有する２つのプラスミドが、
単量体、二量体、三量体などの生成物の混合物を形成する。種々の生物に由来する多数の
組換え系が記載されている。（Ｌａｎｄｙ  Ａ．、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｇｅｎｅｔ  Ｄ
ｅｖ．３：６９９〜７０７頁、１９９３年；Ｈｏｅｓｓ  ＲＨ．ら  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：３３９８〜３４０２頁、１９８２年；Ａｂｒｅｍｓ
ｋｉら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６１：３９１〜３９６頁、１９８６年；Ｅｓｐｏｓ
ｉｔｏ  Ｄ、Ｓｃｏｃｃａ  ＪＪ、Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２５：３６０５〜３
６１４頁、１９９７年）。リコンビナーゼのインテグラーゼファミリーの最も研究された
メンバーとして、バクテリオファージλ由来のインテグラーゼ／ａｔｔ系（Ｌａｎｄｙ  
Ａ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅ
ｌ．３：６９９〜７０７頁、１９９３４、バクテリオファージＰ１由来のＣｒｅ／ｌｏｘ
Ｐ系（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第
４巻、ＥｃｋｓｔｅｉｎおよびＬｉｌｌｅｙ編、Ｂｅｒｌｉｎ−Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ：
Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ；９０〜１０９頁中の、Ｈｏｅｓｓ  ＲＨ、Ａｂｒｅｍ
ｓｋｉ  Ｋ．「Ｔｈｅ  Ｃｒｅ−ｌｏｘ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ」
、（１９９０年）ならびにサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）  ２．ｍｕ．環状プラスミド由来のＦｌｐ／ＦＲＴ系（Ｂｒｏａ
ｃｈ  ＪＲ．ら、Ｃｅｌｌ  ２９：２２７〜２３４頁、１９８２年）がある。バクテリオ
ファージＰ１由来のＣｒｅによって媒介される部位特異的組換えによるアデノウイルスベ
クターの構築のための系が開発された（Ｈａｒｄｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：１８４２
〜１８４９頁、１９９７年）。この方法は、Ｃｒｅ発現細胞における２つのｌｏｘＰ部位
間の分子内組換えによる、遺伝子形質導入単位および１つのｌｏｘＰ部位を含有するシャ
トルプラスミドと、そのパッケージングシグナルについて欠失しているヘルパーアデノウ
イルスベクター間の組換えの際に、この領域中に外来ＤＮＡが挿入されたＥ１置換アデノ
ウイルスを作製する手段を提供する。２９３Ｃｒｅ細胞における２つのプラスミド間のＣ
ｒｅ−ｌｏｘ媒介性部位特異的組換えによる組換えアデノウイルスの構築のためのこの方
法の適用は、参照することにより本明細書の一部をなすものとする米国特許第６，３７９
，９４３号において開示された。
【０００６】
異なるアプローチにおいて、ＦａｒｍｅｒおよびＱｕｉｎｎ（米国特許出願ＵＳ２００
３／００５４５５５）は、ドナーベクターと、遺伝子が欠失したアデノウイルスゲノムを
コードするアクセプターベクターとの間のＣｒｅ−ｌｏｘ媒介性部位特異的組換えを使用
して組換えアデノウイルスベクターを作製するための方法を記載している。先行技術のこ
の方法に記載されているベクターとしての高コピープラスミドの使用は、非アデノウイル
ス５型「血清型」組換えアデノウイルス発現ベクターの特定の型の作製を可能にしない。
アデノウイルス１９ａ型のゲノムが、プラスミドにクローニングされ、大腸菌において増
殖された場合に、ゲノムの不安定性が観察された。アデノウイルスゲノムをＢＡＣにクロ
ーニングすることによって溶液が提供され、プラスミドが関連するゲノムの不安定性を伴
わない、細菌における増幅およびゲノム修飾が可能となった（Ｒｕｚｓｉｃｓ  Ｚら  Ｊ
．Ｖｉｒｏｌ．８０：８１００〜８１１３頁、２００６年）。ＦａｒｍｅｒおよびＱｕｉ
ｎｎはまた、両ＩＴＲを含み、２９３細胞などの補完性細胞株において補完され、増殖さ
れ得る、遺伝子が欠失している（Ｅ領域について欠失している）アデノウイルスゲノムを
コードするアクセプターベクターの使用を記載している。ドナーおよびアクセプターベク
ター間の部位特異的組換えの際に、得られた組換え生成物は、ドナーベクターの挿入核酸
を含有する。組換えアデノウイルスゲノムの構築のために提供された先行技術のこの方法
では、これらの２つの配列間の組換えを可能にするように配置されている、２つの配列特
異的組換え標的部位を含有するドナープラスミドが使用される。アクセプタープラスミド
は、１つの配列特異的組換え部位を含有する。ドナー構築物およびアクセプター構築物は
、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは宿主細胞において、部位特異的リコンビナーゼを用いて反応さ
せ、組換えアデノウイルスゲノム構築物である得られた組換え生成物は、所望のドナー断
片を含有する。さらなる実施形態では、選択マーカー（すなわち、ｓａｃＢ）が、ドナー
およびアクセプターベクター間で分割されており、マーカーの第１の部分がアクセプター
ベクター上に存在し、選択マーカーの第２の部分がドナーベクター上に存在する。部位特
異的リコンビナーゼ（Ｃｒｅリコンビナーゼ）の発現によって媒介される部位特異的組換
えの際に、両部分が、得られた組換え構築物において機能的選択マーカーを形成する。選
択マーカーの生成によって、反応生成物の選択が可能となる。Ｃｒｅ媒介性組換え反応は
、両反応、すなわち切り出しおよび挿入を同時に触媒し、最終的に、反応生成物の混合物
を含有する平衡状態に至る。アクセプターベクターおよびドナーベクターを使用する先行
技術のこの方法を適用することによって、８０％の所望の組換え生成物が得られ、提供さ
れた例において分析された合計１０個のクローンが、組換えアデノウイルスベクターであ
った。特に、アクセプターベクターおよびドナーベクター間の部位特異的組換えの数を、
正確に１に制限する機序が全く適用されないので、本明細書に記載された先行技術のこの
方法は、複数の反応生成物を作製しやすい。しかし、これは、未解決の技術的問題であり
、個々のクローンの配列決定および特徴付けを必要とせずに、純粋な、複雑なアデノウイ
ルスベクター発現ライブラリーを作製するための必須条件である。
【０００７】
ヘルパー依存性ガットレスアデノウイルスベクターの構築のための別の方法が記載され
（Ｐａｒｋｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：１３５６
５〜１３５７０頁、１９９６年）、米国特許第６，３７９，９４３号において「Ｈｉｇｈ
−ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ  ｂａｓｅｄ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃｏ
ｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ」のための方法と
して開示された。しかし、ＬｏｘＰ部位がその両端に位置するアデノウイルス（ＡｄＶ）
ＡｄＶゲノム中に組み込まれた遺伝エレメントは、アデノウイルスベクターの増殖の間に
自然切り出しの対象となる。（Ａｎｔｏｎ  Ｍ．およびＧｒａｈａｍ  Ｆ．Ｌ．、「Ｊ．
Ｖｉｒｏｌ．６９：４６００〜４６０６頁、１９９５年）。別の適用では、Ｃｒｅ媒介性
組換えを使用して、２連続組換え事象および組換え後にそのパッケージングシグナルにつ
いて欠失しているアデノウイルスに対する陰性選択後に、アデノウイルスベクターを作製
した（Ｈａｒｄｙ  Ｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：１８４２〜１８４９頁、１９９７年）
。
【０００８】
大腸菌において、または真核細胞において感染性アデノウイルスゲノムの作製のために
２種の核酸間でＣｒｅ媒介性組換えを使用する方法は、安定な、不偏性ライブラリーを作
製できない。Ｃｒｅ−リコンビナーゼの、両方向において反応を触媒する能力は、組換え
されていない親アデノウイルスが依然として混入されている可能性があるアデノウイルス
調製物をもたらす。さらに、２つの機序が、ゲノムライブラリーの構築のためのＣｒｅ／
ｌｏｘＰ部位特異的組換えの使用を制限する。Ｃｒｅリコンビナーゼによって認識される
配列の大きさが小さいために、Ｃｒｅ発現のために誘導可能な系が使用される場合でさえ
、ゲノム中に潜在性のｌｏｘＰ部位が存在し、適合する部位間の組換えを誘導するか、ま
たは一本鎖もしくは二本鎖の切断を導入し、Ｃｒｅを発現する大腸菌株において、ｌｏｘ
Ｐ部位を含有するＢＡＣ、ＰＡＣ、ＣｏｓｍｉｄまたはＦｏｓｍｉｄを増殖および修飾す
る能力に影響を及ぼす（Ｓｅｍｐｒｉｎｉ  Ｓら  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ
．３５：１４０２〜１４１０頁、１９９７年）。このプロセスはまた、哺乳類細胞および
生物において生じ、マウスおよびヒトのゲノム内の潜在性（偽性）ｌｏｘＰ部位間のその
組換え事象が、非正統的染色体再編成を誘導するゲノム不安定性につながる（Ｓｃｈｍｉ
ｄｔ  ＥＥら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９７：１３７０２
〜１３７０７頁、２０００年；ＳａｕｅｒＢ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２３：９１１〜
９２８頁、１９９２年）。したがって、部位特異的Ｃｒｅ媒介性相同組換えによって構築
されたアデノウイルスベクターゲノムのライブラリーは、相当な程度の混入の対象となっ
ている可能性があり、単一クローンを得るための集中的な細胞培養作業およびウイルス学
的方法を必要とする。
【０００９】
アデノウイルスを構築するためにＣｒｅ−ｌｏｘ媒介性組換えを使用する方法は、参照
２３により本明細書の一部をなすものとするＧｒａｈａｍら、米国特許第７，１３２，２
９０号においてさらに洗練され、記載された。２９３などのプロデューサー細胞にトラン
スフェクトされた場合の、アデノウイルスをコードする核酸の低い感染力と関連する制限
を克服するために、ＤＮＡ−ＴＰ複合体の使用が前記特許において具体化された。当業者
には、ＤＮＡ−ＴＰ複合体が、プラスミド由来のＤＮＡの代わりに使用される場合には、
アデノウイルスＤＮＡの感染力が１００倍増強されることは公知である。ウイルスＤＮＡ
は、二本鎖アデノウイルスの各鎖の５’末端と結合している末端タンパク質が、無傷のま
まであるように精製される。Ｃｒｅリコンビナーゼの存在下での部位特異的組換えの際に
、ｌｏｘＰ部位を第２のプラスミド生成複製コンピテントアデノウイルスＤＮＡとともに
保有するＤＮＡ−ＴＰ複合体の同時トランスフェクションは、トランスフェクトされたウ
イルスＤＮＡ１μｇあたりに生じるウイルスプラークの数を、大幅に増大し得る（Ｓｈａ
ｒｐ  ＰＡら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ７５：４４２〜４５６頁、１９７６年；Ｃｈｉｎｎａｄ
ｕｒａｉ  Ｇら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２６：１９５〜１９９頁、１９７８年）。ＤＮＡ−Ｔ
Ｐ複合体（ＤＮＡ−ＴＰＣ）の使用には、制限消化によってＤＮＡ−ＴＰ複合体が由来す
る親の感染性アデノウイルスＤＮＡ形態が混入するリスクがある。
【００１０】
ＤＮＡ−ＴＰＣを使用する２９３細胞における２つの断片の相同組換えによる組換えア
デノウイルスゲノムの構築が、ライブラリー効率を有する陽性選択と組み合わせてさらに
使用された（Ｅｌａｈｉ  ＳＭら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９：１２３８〜１２４６頁、２
００２年）；この方法の特許出願が出願されており、読者には、技術の詳細については米
国特許出願第２００６２１０９６５号が紹介される。ここで、左末端ＩＴＲおよびアデノ
ウイルスプロテアーゼ発現カセットを有するプラスミドの、アデノウイルスプロテアーゼ
遺伝子について欠失しているウイルスＤＮＡ−ＴＰＣと一緒の同時トランスフェクション
によって、多量の組換えウイルスベクターが得られた。しかし、２９３細胞における部位
特異的または相同組換えによって構築されたアデノウイルスベクターゲノムのライブラリ
ーは、可変の増殖特性を有するウイルス突然変異体の選択によって相当な程度の偏りを受
ける可能性があり（例えば、ｃＤＮＡの発現が、増殖利点または不利点を付与するｃＤＮ
Ａ発現ライブラリーの場合において）、したがって、ライブラリー集団中で過剰または過
少提示される。このようなライブラリーの増殖は重大であり、単一クローンを得るための
集中的な細胞培養作業およびウイルス学的方法をさらに必要とする。
【００１１】
先行技術のいくつかの方法によって、親のアデノウイルスゲノムのバックグラウンドを
伴わない組換えアデノウイルスの構築が可能となる。組換えアデノウイルスの構築のため
のＤＮＡ断片のアデノウイルスゲノムとの直接連結を使用する方法が、早い時期に開発さ
れている（Ｂａｌｌａｙ  Ａら、ＥＭＢＯ  Ｊ．３０：３８６１〜５頁、１９８５年）。
しかし、大きな断片の連結は、効率的ではなく、独特の制限部位の不足が、ウイルスゲノ
ムライブラリーを構築するためのこの方法の使用を制限する。
【００１２】
真核細胞ではなく細菌における遺伝エレメント間の組換えを使用して、プラーク精製を
必要とせずにアデノウイルスベクターを構築できる。ＡｄＥａｓｙ（登録商標）システム
として市販されている適用では（Ｈｅ  Ｔ−Ｃら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．Ｕ．Ｓ．９５：２５０９〜２５１４頁、１９９８年）、ＢＪ５１８３細菌において、
同時トランスフェクトされたスーパーコイルアデノウイルスゲノムおよびシャトルプラス
ミド間の組換えが起こる。この細菌株は、アデノウイルスゲノムの遺伝的安定性の維持に
とって好ましい特性を有する。製造者のマニュアルによって与えられる情報によれば、コ
ロニーの２０％超が正しい組換え生成物である。Ｃｈａｒｔｉｅｒら（Ｃｈａｒｔｉｅｒ
Ｃら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：４８０５〜４８１０頁、１９９６年）によって記載され
た別の方法では、２つの相同性アームの長さの増大によって、組換え効率が高まる。この
方法の改善は、Ｃｒｏｕｚｅｔら．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９
４：１４１４〜１４１９頁、１９９７年によって記載された。これでは、陰性選択マーカ
ーを導入することによってバックグラウンドコロニーの数が減少した。しかし、直列反復
または反復ＤＮＡ配列を有する、プラスミドベクターにクローニングされたＤＮＡ配列が
遺伝的不安定性を抱えているので、系の効率および遺伝的安定性は、大きなライブラリー
作製にとって十分ではない。これは、大腸菌において高コピー数で複製するプラスミドベ
クターに特に当てはまる。組換えアデノウイルスの構築のためにこの方法を使用するため
の別の成功した試みでは、酵母における相同組換えを確立した。しかし、この方法は、同
一配列間の組換えを誘導するためにＤＮＡの直線化に頼るものである。大規模（通常、５
００ｍｌ）酵母スフェロプラスト（ｓｐｈｅｒｏｂｌａｓｔ）培養から得られる低いＹＡ
Ｃ  ＤＮＡ収率に加えて、アデノウイルスゲノムにおける独特の制限部位の不足が、この
適用を制限する。
【００１３】
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．によって市販されているＧａｔｅｗａｙ（商標）シ
ステムは、宿主細胞において選択可能である第３の核酸を生成する核酸間のｉｎ  ｖｉｔ
ｒｏでの組換えに部位特異的組換えを使用する。技術的詳細については、両方とも参照す
ることにより本明細書の一部をなすものとする、米国特許第７，２８２，３２６号（Ｉｎ
ｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）および米国特許第５，８８８，７３２号（Ｌｉｆｅ  Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が参照される。この系は、高効率および正確性で組換えプラス
ミドをもたらし、非組換えプラスミドベクターに由来するバックグラウンドがなく、大腸
菌宿主における組換えの際に生じる予測不可能な組換え事象を回避する。組換えアデノウ
イルスゲノム、（ＶｉｒａｌＰｏｗｅｒ（商標）として市販されている）は、高い有効性
で作製され得る、この方法を使用して通常９０％超の正しく組換えられたウイルスゲノム
（自身の観察結果およびマニュアルによって）。
【００１４】
しかし、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  組換えの効率は、ＤＮＡ断片の大きさに伴って低下し（Ｋ
ａｔｚｅｎ，  Ｆ．Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）組換えクローニング：  ａ  ｂｉｏｌｏ
ｇｉｃａｌ  ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｄｒ
ｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ２：５７１〜５８９頁、２００７年）、アデノウイルスゲノ
ムの場合には、適当な大腸菌宿主細胞の形質転換後に得られたコロニーの結果として得ら
れた数は、小さいＤＮＡ分子間のｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換えと比較した場合には数倍減少し
、したがって、大きな大きさのＤＮＡライブラリーの構築のためのＧａｔｅｗａｙシステ
ムの使用を制限する。さらに、ここで、ライブラリー構築の制限因子である細菌形質転換
の効率は、細菌株依存的な方法で形質転換されるＤＮＡの大きさに伴って低下する（Ｓｈ
ｅｎｇ  Ｙら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：１９９０〜１９９６頁、１
９９５年）。
【００１５】
プラスミドベクターの代わりにＢＡＣを使用することによって、大腸菌においてプラス
ミドベクターにクローニングされるゲノム配列の不安定性が回避される。例は、プラスミ
ドベクターにクローニングされる大きなウイルスゲノム（Ｂｚｙｍｅｋ  ＭおよびＬｏｖ
ｅｔｔ  ＳＴ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．９８：８３１９〜
８３２５頁、２００１年；およびその他のサブグループに由来するアデノウイルスベクタ
ーゲノム（Ｒｕｚｓｉｃｓ  Ｚら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８０：８１００〜８１１３頁、２０
０６年）に当てはまる。ウイルスベクターは、大腸菌宿主においてプラスミドベクターで
増殖された場合には不安定であり、細菌人工染色体（ＢＡＣ）プラスミドでの安定なゲノ
ムとしての増殖を必要とする。ゲノムは、ＢＡＣにおいて維持および操作され得るが、選
択手順は複数のステップを含み、このようなゲノムの大きなライブラリーの構築のために
利用可能な方法はまだない。
【００１６】
潜在性Ｆｒｔ部位およびＦｌｐの存在によるゲノムＢＡＣのゲノム不安定性の出現は今
日まで観察されていない。したがって、ここでは、この系が、ゲノムライブラリー構築の
ために本発明において使用される。２種の同一でないＦｒｔ部位が使用される場合には、
Ｆｌｐ媒介性部位特異的組換えの使用によって、２種の核酸間の核酸の部分の標的とされ
る交換が達成され得る。真核細胞のゲノムの標的とされる修飾の方法は、参照することに
より本明細書の一部をなすものとするＰＣＴ特許出願ＷＯ１９９９／０２５８５４におい
て特許請求されている。ゲノムライブラリーの構築のためのこの系の適応は、選択マーカ
ーおよび遺伝子導入単位の交換を必要とする。しかし、ｇａｔｅｗａｙシステムと同様に
、この反応の効率は、交換される核酸断片の大きさに伴って低下し、１００％信頼できる
ものではなく、したがって、得られたライブラリーの詳細な特徴付けを必要にする。Ｃｒ
ｅ媒介性部位特異的相同組換えを使用するアデノウイルスベクターゲノムのライブラリー
の構築は、真核細胞においてただ達成されただけであって、したがって、相当な程度の混
入にさらされ、単一クローンを得るための集中的な細胞培養作業およびウイルス学的方法
を必要とする。大腸菌におけるＣｒｅ媒介性部位特異的組換えの使用は、ゲノムの不安定
性と関連しており、最先端の高コピープラスミドシステムとともに使用され得ない。特に
、ウイルスライブラリーが、真核細胞において構築される場合には、可変の増殖特性を有
するウイルス突然変異体の選択によって相当な程度の偏りが生じ、過剰または過少提示さ
れたウイルスを有するライブラリーにつながる。このようなライブラリーの安定な増殖は
重大であり、単一クローンを得るための集中的な細胞培養作業およびウイルス学的方法を
さらに必要とする。さらに、ウイルスＤＮＡの感染力を増強するためのＤＮＡ−ＴＰＣ断
片の使用には、制限消化によってＤＮＡ−ＴＰ複合体が由来する親の感染性アデノウイル
スＤＮＡで混入されるリスクがある。ゲノムライブラリー構築のための２種の同一でない
組換え部位間の核酸配列の部位特異的組換え媒介性二重相互交換を含む方法の使用は、反
応の効率および忠実度によって限定され、得られたライブラリーの詳細なスクリーニング
および特徴付けを必要にする。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ部位特異的組換えを使用する代替システ
ムは、特に、大きなプラスミドが使用される場合には、組換え反応の効率によって限定さ
れ、さらに、大腸菌中の得られた大きなプラスミドの形質転換効率の低下に見舞われる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明の背景にある問題は、アデノウイルスゲノムの作製における先行技術の方法の欠
点を克服すること、および改善されたそれぞれの方法、およびこのような方法を実施する
ための手段を提供することである。
【００１８】
本発明の背景にあるさらなる問題は、ゲノム核酸配列などの大きな核酸配列を高効率で
クローニングすることを可能にする方法およびこのような方法を実施するための手段を提
供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明の背景にあるこれらおよびその他の問題は、独立クレームの主題によって解決さ
れる。好ましい実施形態は、従属クレームからとられ得る。
【００２０】
本発明の背景にある問題は、第１の態様の第１の実施形態でもある第１の態様において
、
（１）以下のエレメント：
（ａ）部位特異的組換え部位、好ましくは、正確に１つの部位特異的組換え部位と、
（ｂ）（ｉ）条件付き複製のための細菌ヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第１の選択
マーカーを提供するヌクレオチド配列を含む細菌ヌクレオチド配列単位と、
（ｃ）ウイルスのゲノムの第１の部分と、
（ｄ）転写単位と、
（ｅ）場合により第１の制限部位と
を含む核酸分子、または
（２）配列番号１および／もしくは配列番号１５によるヌクレオチド配列を含む核酸分
子、または
（３）ブダペスト条約に従って受託番号ＤＳＭ２３７５３でＤＳＭＺに寄託された生物
に含有される核酸分子と類似もしくは同一である核酸分子であって、好ましくは、生物に
含有される核酸分子は、異種核酸分子である核酸分子
を含む第１の核酸分子によって解決され、
第１の核酸分子は、環状または直鎖分子のいずれかである。
【００２１】
第１の態様の第１の実施形態の一実施形態でもある、第１の態様の第２の実施形態では
、第１の核酸分子は、パッケージングシグナルを含む。
【００２２】
第１の態様の第１および第２の実施形態の一実施形態でもある、第１の態様の第３の実
施形態では、ウイルスのゲノムの第１の部分は、あるウイルスまたは該ウイルスのゲノム
の、好ましくは、該ウイルスのゲノムの末端配列を含む。
【００２３】
第１の態様の第３の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第４の実施形態では、
あるウイルスまたは該ウイルスのゲノムの末端配列は、あるウイルスまたは該ウイルスの
ゲノムの末端反復、好ましくは、ウイルスの逆方向末端反復を含む。
【００２４】
第１の態様の第１、第２、第３および第４の実施形態の一実施形態でもある、第１の態
様の第５の実施形態では、第１の制限部位は、あるウイルスまたは該ウイルスゲノムの第
１の部分および転写単位中に存在しない。
【００２５】
第１の態様の第１、第２、第３、第４および第５の実施形態の一実施形態でもある、第
１の態様の第６の実施形態では、第１の制限部位は、ＡｂｓＩ、ＢｓｔＢＩ、ＰａｃＩ、
ＰｓｒＩ、ＳｇｒＤＩおよびＳｗａＩを含む群から選択される。
【００２６】
第１の態様の第１、第２、第３、第４、第５および第６の実施形態の一実施形態でもあ
る第１の態様の第７の実施形態では、ウイルスは、アデノウイルスである。
【００２７】
第１の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６および第７の実施形態の一実施形態
でもある、第１の態様の第８の実施形態では、ウイルスは、ヒトアデノウイルス５型であ
るか、またはウイルスは、ヒトアデノウイルス１９ａ型である。
【００２８】
第１の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７および第８の実施形態の一実
施形態でもある、第１の態様の第９の実施形態では、エレメント（ａ）〜（ｅ）は、５’
→３’方向に配置される。
【００２９】
第１の態様の第９の実施形態の一実施形態でもある、第１の態様の第１０の実施形態で
は、末端反復は、ウイルス末端反復、好ましくは、左側ウイルス末端反復である。
【００３０】
第１の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７および第８の実施形態の一実
施形態でもある、第１の態様の第１１の実施形態では、第１の核酸分子は、直鎖分子であ
り、ここで、エレメント（ａ）〜（ｄ）は、好ましくは、第１の制限部位で認識および切
断する第１の制限酵素を用いて、第１の核酸分子の環状分子を切断する際に、以下の順序
で５’→３’方向に配置される。
１．ウイルスのゲノムの第１の部分、
２．転写単位、
３．部位特異的組換え部位、
４．（ｉ）条件付き複製のための細菌ヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第１の選択マ
ーカーを提供するヌクレオチド配列を含む細菌ヌクレオチド配列単位、
５．場合により、第１の制限部位と呼ばれる制限部位
【００３１】
第１の態様の第１１の実施形態の一実施形態でもある、第１の態様の第１２の実施形態
では、ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムの第１の部分は、ウイルスのゲノムの末端配
列、好ましくは、ウイルスのゲノムの末端反復配列、より好ましくは、ウイルスのゲノム
の逆方向末端反復配列を含む。
【００３２】
第１の態様の第１２の実施形態の一実施形態でもある、第１の態様の第１３の実施形態
では、ウイルスのゲノムの末端配列は、ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムの末端反復
、好ましくは、あるウイルスまたは該ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムの第１の左側
末端反復を含み、より好ましくは、末端配列は、ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムの
第１の左側逆方向末端反復である。
【００３３】
第１の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１
１、第１２および第１３の実施形態の一実施形態でもある、第１の態様の第１４の実施形
態では、逆方向末端反復は、アデノウイルスの逆方向末端配列であり、好ましくは、約１
８〜１０３塩基対の任意の長さを有する。
【００３４】
第１の態様の第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第
１２、第１３および第１４の実施形態の一実施形態でもある、第１の態様の第１５の実施
形態では、好ましくは、第１の態様の第９の実施形態を直接的または間接的に参照する限
り、パッキングシグナルは、アデノウイルスのパッキングシグナルである。
【００３５】
第１の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１
１、第１２、第１３、第１４および第１５の実施形態の一実施形態でもある、第１の態様
の第１６の実施形態では、転写単位は、プロモーター、場合により、発現させる核酸配列
および終結シグナルを含み、好ましくは、プロモーターおよび発現させる核酸が互いに作
動可能に連結している、より好ましくは、プロモーター、核酸および終結シグナルが互い
に作動可能に連結している。
【００３６】
第１の態様の第１６の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第１７の実施形態で
は、プロモーターは、真核細胞プロモーター、ウイルスプロモーター、ＲＮＡポリメラー
ゼＩＩによって認識されるプロモーターおよびＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって認識さ
れるプロモーターを含む群から選択され、ここで、好ましくは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ
によって認識されるプロモーターは、ＰＧＫプロモーターおよびＣＭＶプロモーターを含
む群から選択され、ここで、好ましくは、ＲＮＡポリメラーゼによって認識されるプロモ
ーターは、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、ｔＲＮＡプロモーターおよびアデノウ
イルスＶＡプロモーターを含む群から選択される。
【００３７】
第１の態様の第１６および第１７の実施形態の一実施形態でもある、第１の態様の第１
８の実施形態では、発現させる配列は、ペプチドをコードする核酸、ポリペプチドをコー
ドする核酸、タンパク質をコードする核酸、非コーディングＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、マイク
ロＲＮＡを含む群から選択される配列である。
【００３８】
第１の態様の第１６、第１７および第１８の実施形態の一実施形態でもある、第１の態
様の第１９の実施形態では、終結シグナルは、真核細胞の終結シグナル、ウイルスの終結
シグナルおよびＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ依存性プロモーターの終結シグナルを含む群か
ら選択され、好ましくは、終結シグナルは、ポリＡシグナルである。
【００３９】
第１の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１
１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８および第１９の実施形態
の一実施形態でもある、第１の態様の第２０の実施形態では、部位特異的組換え部位は、
Ｆｌｐリコンビナーゼの組換え部位を含む群から選択される。
【００４０】
第１の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１
１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９および第２０の
実施形態の一実施形態でもある、第１の態様の第２１の実施形態では、条件付き複製のた
めの細菌配列は、複製起点を含む。
【００４１】
第１の態様の第２１の実施形態の一実施形態でもある、第１の態様の第２２の実施形態
では、条件付き複製のための細菌ヌクレオチド配列は、複製起点を含み、好ましくは、複
製起点は、ファージｇＲ６Ｋの最小の起点である。
【００４２】
第１の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１
１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２
１および第２２の実施形態の一実施形態でもある、第１の態様の第２３の実施形態では、
第１の選択マーカーを提供する配列は、酵素をコードするこのような核酸配列を有する宿
主細胞に耐性を付与する酵素をコードする核酸配列である。
【００４３】
第１の態様の第２３の実施形態の一実施形態でもある、第１の態様の第２４の実施形態
では、耐性は、薬剤に対する耐性、好ましくは、抗生物質に対する耐性であり、より好ま
しくは、このような薬剤は、ゲンタマイシン、カナマイシン、ゼオシン、クロラムフェニ
コール、アンピシリン、テトラサイクリンを含む。
【００４４】
第１の態様の第２４の実施形態の一実施形態でもある、第１の態様の第２５の実施形態
では、耐性を付与する遺伝子は、ｂｌａ、ａｎｔ（３’’）−Ｉａ、ａｐｈ（３’）−Ｉ
Ｉ、ａｐｈ（３’）−ＩＩ、ｃｍｌＡ、ｂｌｅ、ａａｄＡ、ａａｄＢ、ｓａｃＢおよびｔ
ｅｔＡを含む群から選択される。
【００４５】
本発明の背景にある問題は、第２の態様の第１の実施形態でもある第２の態様において
、
（１）以下のエレメント：
（ａ）（ｉ）単一コピー複製のための細菌ヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第２の選
択マーカーを提供するヌクレオチド配列を含む細菌ヌクレオチド配列単位と、
（ｂ）部位特異的組換え部位、好ましくは正確に１つの部位特異的組換え部位と、
（ｃ）ウイルスのゲノムの第２の部分と、
（ｄ）場合により、第２の制限部位と呼ばれる制限部位と
を含む核酸分子、または
（２）配列番号２および／もしくは配列番号１３および／もしくは配列番号１４による
ヌクレオチド配列を含む核酸分子、または
（３）ブダペスト条約に従って受託番号ＤＳＭ２４２９８および／もしくはＤＳＭ２４
２９９でＤＳＭＺに寄託された生物に含有される核酸分子と類似もしくは同一である核酸
分子であって、好ましくは、生物に含有される核酸分子は、異種核酸分子である核酸分子
を含む第２の核酸分子によって解決され、
第２の核酸分子は、環状または直鎖分子のいずれかである。
【００４６】
第２の態様の第１の実施形態の一実施形態でもある、第２の態様の第２の実施形態では
、あるウイルスまたは該ウイルスのゲノムの第２の部分は、あるウイルスまたは該ウイル
スのあるゲノムまたは該ゲノムの１種または数種のその他の部分と組み合わせた場合には
複製能力のある完全なゲノムをもたらす。
【００４７】
第２の態様の第１および第２の実施形態の一実施形態でもある第２の態様の第３の実施
形態では、部位特異的組換え部位は、Ｆｌｐリコンビナーゼの組換え部位を含む群から選
択される。
【００４８】
第２の態様の第１、第２および第３の実施形態の一実施形態でもある第２の態様の第４
の実施形態では、ウイルスは、アデノウイルスである。
【００４９】
第２の態様の第１、第２、第３および第４の実施形態の一実施形態でもある、第２の態
様の第５の実施形態では、ウイルスゲノムは、ヒトアデノウイルス５型ゲノムまたはヒト
アデノウイルス１９ａ型ゲノムである。
【００５０】
第２の態様の第１、第２、第３、第４および第５の実施形態の一実施形態でもある、第
２の態様の第６の実施形態では、あるウイルスまたは該ウイルスのゲノムの第２の部分は
、あるウイルスのゲノムの、好ましくは、該ウイルスのゲノムの末端配列を含む。
【００５１】
第２の態様の第６の実施形態の一実施形態でもある、第２の態様の第７の実施形態では
、あるウイルスまたは該ウイルスのゲノムの配列は、末端反復、好ましくは、ウイルスの
末端配列、より好ましくは、あるウイルスまたは該ウイルスの末端反復、さらにより好ま
しくは、あるウイルスまたは該ウイルスの逆方向末端反復、なおさらにより好ましくは、
あるウイルスまたは該ウイルスの右側逆方向末端反復を含む。
【００５２】
第２の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６および第７の実施形態の一実施形態
でもある、第２の態様の第８の実施形態では、第２の制限部位は、ゲノムの第２の部分中
に存在しない。
【００５３】
第２の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７および第８の実施形態の一実
施形態でもある、第２の態様の第９の実施形態では、第２の制限部位は、制限酵素Ａｂｓ
Ｉ、ＢｓｔＢＩ、ＰａｃＩ、ＰｓｒＩ、ＳｇｒＤＩおよびＳｗａＩの制限部位を含む群か
ら選択され、ウイルスは、好ましくはヒトアデノウイルス５型である。
【００５４】
第２の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８および第９の実施形態
の一実施形態でもある、第２の態様の第１０の実施形態では、複製、好ましくは、単一コ
ピー複製のための細菌ヌクレオチド配列は、原核生物宿主細胞における単一コピー維持の
ための複製起点を含む。
【００５５】
第２の態様の第１０の実施形態の一実施形態でもある、第２の態様の第１１の実施形態
では、複製起点は、ｆ−エピソーム因子またはＰ１複製起点に由来する単一コピー起点で
ある。
【００５６】
第２の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０および
第１１の実施形態の一実施形態でもある、第２の態様の第１２の実施形態では、第２の核
酸分子は、直鎖分子であり、ここで、エレメント（ａ）〜（ｄ）は、好ましくは、第２の
制限部位で認識および切断する第２の制限酵素を用いて、第２の核酸分子の環状分子を切
断する際に、以下の順序で５’→３’方向に配置される。
１．（ｉ）単一コピー複製のための細菌ヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第２の選択
マーカーを提供するヌクレオチド配列を含む細菌ヌクレオチド配列単位、
２．部位特異的組換え部位、好ましくは、正確に１つの部位特異的組換え部位、
３．ウイルスのゲノムの第２の部分、ならびに
４．場合により、第２の制限部位と呼ばれる制限部位。
【００５７】
第２の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１
１および第１２の実施形態の一実施形態でもある、第２の態様の第１３の実施形態では、
第２の選択マーカーを提供する核酸配列は、酵素をコードするこのような核酸配列を有す
る宿主細胞に対する耐性を付与する酵素をコードする核酸配列である。
【００５８】
第２の態様の第１３の実施形態の一実施形態でもある、第２の態様の第１４の実施形態
では、耐性は、ゲンタマイシン、カナマイシン、ゼオシン、クロラムフェニコール、アン
ピシリンおよびストレプトマイシンを含む陽性選択マーカーの群から選択される薬剤に対
する耐性である。
【００５９】
第２の態様の第１３および第１４の実施形態の一実施形態でもある、第２の態様の第１
５の実施形態では、耐性を付与する遺伝子は、ｂｌａ、ａｎｔ（３’’）−Ｉａ、ａｐｈ
（３’）−ＩＩ、ａｐｈ（３’）−ＩＩ、ｃｍｌＡ、ｂｌｅ、ａａｄＡおよびａａｄＢを
含む群から選択される。
【００６０】
第２の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１
１、第１２、第１３、第１４および第１５の実施形態の一実施形態でもある、第２の態様
の第１６の実施形態では、第２の核酸分子は、直鎖分子であり、ここで、エレメント（ａ
）〜（ｃ）は、好ましくは、第２の制限部位で認識および切断する第２の制限酵素を用い
て、第２の核酸分子の環状分子を切断する際に、５’→３’方向に配置される
（１）（ｉ）単一コピー複製のための細菌ヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第２の選
択マーカーを提供するヌクレオチド配列とを含む細菌ヌクレオチド配列単位、
（２）部位特異的組換え部位、ならびに
（３）ウイルスのゲノムの第２の部分。
【００６１】
第２の態様の第１６の実施形態の一実施形態でもある、第２の態様の第１７の実施形態
では、あるウイルスまたは該ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムの第２の部分は、ある
ウイルスまたは該ウイルスのゲノムの、好ましくは、該ウイルスのゲノムの末端配列を含
む。
【００６２】
第２の態様の第１７の実施形態の一実施形態でもある、第２の態様の第１８の実施形態
では、あるウイルスまたは該ウイルスの末端配列は、あるウイルスまたは該ウイルスの末
端反復、好ましくは、あるウイルスまたは該ウイルスの右側末端反復を含む。
【００６３】
第２の態様の第１６、第１７および第１８の実施形態の一実施形態でもある、第２の態
様の第１９の実施形態では、あるウイルスまたは該ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノム
の第２の部分は、パッケージングシグナルを含む。
【００６４】
第２の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１
１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８および第１９の実施形態
の一実施形態でもある、第２の態様の第２０の実施形態では、第２の核酸分子は、ＢＡＣ
である。
【００６５】
本発明の背景にある問題は、第３の態様の第１の実施形態でもある第３の態様では、第
１の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、
第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２１、
第２２、第２３、第２４および第２５の実施形態のいずれかによる第１の核酸分子と、第
２の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、
第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０の実施形態
のいずれかによる第２の核酸分子との組合せによって解決される。
【００６６】
第３の態様の第１の実施形態の一実施形態でもある、第３の態様の第２の実施形態では
、第１の核酸分子および第２の核酸分子の両方が、環状の閉じた核酸分子として存在する
。
【００６７】
第３の態様の第１および第２の実施形態の一実施形態でもある、第３の態様の第３の実
施形態では、第１の核酸分子および第２の核酸分子は、別個の分子として存在する。
【００６８】
第３の態様の第１、第２および第３の実施形態の一実施形態でもある、第３の態様の第
４の実施形態では、ウイルスは、アデノウイルスである。
【００６９】
第３の態様の第１、第２、第３および第４の実施形態の一実施形態でもある、第３の態
様の第５の実施形態では、第１の制限部位および第２の制限部位は、第１の核酸分子およ
び第２の核酸分子の両方上で同一である。
【００７０】
第３の態様の第５の実施形態の一実施形態でもある、第３の態様の第６の実施形態では
、第１および第２の制限部位は、ＡｂｓＩ、ＢｓｔＢＩ、ＰａｃＩ、ＰｓｒＩ、ＳｇｒＤ
ＩおよびＳｗａＩの制限部位を含む群から選択される。
【００７１】
第３の態様の第１、第２、第３、第４、第５および第６の実施形態の一実施形態でもあ
る、第３の態様の第７の実施形態では、あるウイルスまたは該ウイルスのあるゲノムまた
は該ゲノムの第１の部分およびあるウイルスまたは該ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノ
ムの第２の部分は、一緒になると、完全なウイルスゲノムを形成する。
【００７２】
第３の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６および第７の実施形態の一実施形態
でもある第３の態様の第８の実施形態では、あるウイルスまたは該ウイルスのあるゲノム
または該ゲノムの第１の部分およびあるウイルスまたは該ウイルスのあるゲノムまたは該
ゲノムの第２の部分は、一緒になると、許容細胞において複製能力のある、あるウイルス
または該ウイルスのゲノムを形成する。
【００７３】
第３の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７および第８の実施形態の一実
施形態でもある、第３の態様の第９の実施形態では、第１の選択マーカーおよび第２の選
択マーカーは、抗生物質に対する耐性を付与する酵素であり、このような抗生物質は、カ
ナマイシン、ストレプトマイシン、ネオマイシン、ピューロマイシン、アンピシリン、ゼ
オシン、ゲンタマイシンおよびクロラムフェニコールを含む群から選択され、第１の選択
マーカーは、第２の選択マーカーとは異なる。
【００７４】
第３の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７および第８の実施形態の一実
施形態でもある、第３の態様の第１０の実施形態では、第１の選択マーカーは、カナマイ
シンに対する耐性を付与する酵素であり、第２の選択マーカーは、クロラムフェニコール
に対する耐性を付与する酵素である。
【００７５】
第３の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９および第１０の
実施形態の一実施形態でもある、第３の態様の第１１の実施形態では、パッキングシグナ
ルが、第１または第２の核酸分子のいずれかによって提供される。
【００７６】
第３の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０および
第１１の実施形態の一実施形態でもある、第３の態様の第１２の実施形態では、１つの末
端反復が第１の核酸分子によって提供され、１つの末端反復が、第２の核酸分子によって
提供される。
【００７７】
第３の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１
１および第１２の実施形態の一実施形態でもある、第３の態様の第１３の実施形態では、
第１の核酸が、あるウイルスまたは該ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムの第１の部分
、好ましくは、あるウイルスまたは該ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムの末端配列お
よびあるウイルスまたは該ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムの第２の部分、好ましく
は、あるウイルスまたは該ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムの末端配列の両方を提供
し、第２の核酸分子は、あるウイルスまたは該ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムの第
１の部分、好ましくは、あるウイルスまたは該ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムの末
端配列も、あるウイルスまたは該ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムの第２の部分、好
ましくは、あるウイルスまたは該ウイルスのある末端反復または該末端反復のあるゲノム
または該ゲノムの末端配列も提供しない。
【００７８】
第３の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１
１、第１２および第１３の実施形態の一実施形態でもある、第３の態様の第１４の実施形
態では、第１の核酸は、２種の逆方向末端反復を提供し、第２の核酸分子は、いずれの逆
方向末端反復も提供しないか、または第２の核酸分子は、少なくとも１つの逆方向末端反
復を提供する。
【００７９】
第３の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１
１、第１２、第１３および第１４の実施形態の一実施形態でもある、第３の態様の第１５
の実施形態では、第１の制限部位および第２の制限部位は、転写単位中、あるゲノムまた
は該ゲノムの第１および第２の部分中に存在しない。
【００８０】
第３の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１
１、第１２、第１３、第１４および第１５の実施形態の一実施形態でもある、第３の態様
の第１６の実施形態では、ウイルスは、アデノウイルス、より好ましくはヒトアデノウイ
ルス血清型５である。
【００８１】
本発明の背景にある問題は、第４の態様の第１の実施形態でもある、第４の態様におい
て、ａ）第１の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０
、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０
、第２１、第２２、第２３、第２４および第２５の実施形態のいずれかによる第１の核酸
分子を用意するステップ、
ｂ）第２の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、
第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９および第２
０の実施形態のいずれかによる第２の核酸分子を用意するステップ、または
ｃ）第３の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、
第１１、第１２、第１３、第１４、第１５および第１６の実施形態のいずれかによる組合
せを用意するステップ、
ｄ）第１の核酸分子および第２の核酸分子を、部位特異的組換えが生じるよう反応させ
るステップであって、部位特異的組換えが、部位特異的リコンビナーゼによって媒介され
、部位特異的組換えが、あるウイルスまたは該ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムのコ
ピー、好ましくは単一コピーを含む組換え生成物を形成し、ゲノムが、補完された完全な
ゲノムであり、補完された完全なゲノムが、部位特異的組換えによって補完されるステッ
プ、
ｅ）場合により、組換え生成物を選択するステップ、ならびに
ｆ）場合により、組換え生成物を第１の制限酵素または第２の制限酵素を用いて切断す
るステップまたは第１および第２の制限酵素の両方を用いて切断するステップ
を含む、ウイルスをコードする核酸分子を作製するための方法によって解決される。
【００８２】
第４の態様の第１の実施形態の一実施形態でもある、第４の態様の第２の実施形態では
、第１の核酸分子および第２の核酸分子を、原核生物宿主細胞において反応させ、組換え
生成物が選択され、好ましくは、原核生物宿主細胞は大腸菌であり、より好ましくは、宿
主細胞は、ブダペスト条約に従って受託番号ＤＳＭ２３７４３および／またはＤＳＭ２３
７４２でＤＳＭＺに寄託されている生物またはこのような生物と類似の生物である。
【００８３】
第４の態様の第１および第２の実施形態の一実施形態でもある、第４の態様の第３の実
施形態では、宿主細胞は、Ｆ因子を欠き、第１および第２の選択マーカーに対して感受性
である大腸菌株の群から選択される。
【００８４】
第４の態様の第１、第２および第３の実施形態の一実施形態でもある、第４の態様の第
４の実施形態では、宿主細胞は大腸菌Ｋ１２由来型、好ましくは、ＤＨ１０Ｂである。
【００８５】
第４の態様の第１の実施形態の一実施形態でもある、第４の態様の第５の実施形態では
、第１の核酸分子および第２の核酸分子を、部位特異的リコンビナーゼの存在下で、真核
細胞宿主細胞において反応させ、より好ましくは、宿主細胞は、ブダペスト条約に従って
受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ３０７７ｍまたはＤＳＭ  ＡＣＣ３０７７でＤＳＭＺに寄託され
ている生物またはこのような生物と類似の生物であり、組換え生成物を選択するステップ
は存在せず、好ましくは、真核細胞宿主細胞は、許容宿主細胞である。
【００８６】
第４の態様の第５の実施形態の一実施形態でもある、第４の態様の第６の実施形態では
、部位特異的リコンビナーゼが提供され、許容宿主細胞は、２９３細胞、９１１細胞、Ｐ
ＥＲ．Ｃ６細胞およびＣＡＰ細胞を含む群から選択される細胞である。
【００８７】
第４の態様の第１、第２、第３、第４、第５および第６の実施形態の一実施形態でもあ
る、第４の態様の第７の実施形態では、第１の選択マーカーは、カナマイシンであり、第
２の選択マーカーは、クロラムフェニコールである。
【００８８】
第４の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６および第７の実施形態の一実施形態
でもある、第４の態様の第８の実施形態では、第１の核酸分子および第２の核酸分子は、
リコンビナーゼの存在下で反応させる。
【００８９】
第４の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７および第８の実施形態の一実
施形態でもある、第４の態様の第９の実施形態では、リコンビナーゼは、第１の核酸分子
によって提供される部位特異的組換え部位および第２の核酸分子によって提供される部位
特異的組換え部位と相互作用する。
【００９０】
第４の態様の第８および第９の実施形態の一実施形態でもある、第４の態様の第１０の
実施形態では、リコンビナーゼは、Ｆｌｐリコンビナーゼである。
【００９１】
第４の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９および第１０の
実施形態の一実施形態でもある、第４の態様の第１１の実施形態では、リコンビナーゼは
、第１の核酸分子または第２の核酸分子のいずれかによってコードされる。
【００９２】
第４の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９および第１０の
実施形態の一実施形態でもある、第４の態様の第１２の実施形態では、リコンビナーゼは
、原核生物宿主細胞または真核細胞宿主細胞によって提供または製造される。
【００９３】
第４の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１
１および第１２の実施形態の一実施形態でもある、第４の態様の第１３の実施形態では、
組換え、好ましくは、部位特異的組換え後に、リコンビナーゼは不活化される。
【００９４】
第４の態様の第１の実施形態の一実施形態でもある、第４の態様の第１４の実施形態で
は、リコンビナーゼ、好ましくは、Ｆｌｐリコンビナーゼは、誘導性プロモーターまたは
温度感受性レプレッサーによって制御される。
【００９５】
第４の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１
１、第１２、第１３および第１４の実施形態の一実施形態でもある、第４の態様の第１５
の実施形態では、制限酵素は、ＡｂｓＩ、ＢｓｔＢＩ、ＰａｃＩ、ＰｓｒＩ、ＳｇｒＤＩ
およびＳｗａＩを含む群から選択される。
【００９６】
第４の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１
１、第１２、第１３、第１４および第１５の実施形態の一実施形態でもある、第４の態様
の第１６の実施形態では、方法は、さらなるステップとして、あるウイルスまたは該ウイ
ルスの補完されたゲノム、好ましくは、複製可能なウイルスゲノムを許容宿主細胞にトラ
ンスフェクトするステップを含む。
【００９７】
第４の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１
１、第１２、第１３、第１４、第１５および第１６の実施形態の一実施形態でもある、第
４の態様の第１７の実施形態では、リコンビナーゼの発現は、温度感受性複製起点によっ
て制御される。
【００９８】
第４の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１
１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６および第１７の実施形態の一実施形態でも
ある、第４の態様の第１８の実施形態では、遺伝子導入、ワクチンまたは治療用途のため
のベクターの構築において、方法が使用される。
【００９９】
第４の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１
１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７および第１８の実施形態の一実施
形態でもある、第４の態様の第１９の実施形態では、ウイルスゲノムのライブラリーの構
築において、方法が使用される。
【０１００】
本発明の背景にある問題は、第５の態様の第１の実施形態でもある、第５の態様では、
（１）以下のエレメント：
（ａ）場合によりウイルスのゲノムの第１の部分と、
（ｂ）ヌクレオチド配列、好ましくはゲノムヌクレオチド配列、または転写単位と、
（ｃ）原核生物において調節活性を有する調節核酸配列と、
（ｄ）部位特異的組換え部位、好ましくは正確に１つの部位特異的組換え部位と、
（ｅ）陰性選択マーカーを提供するヌクレオチド配列と、
（ｆ）（ｉ）条件付き複製のための細菌ヌクレオチド配列、および（ｉｉ）陽性選択マ
ーカーを提供するヌクレオチド配列を含む細菌ヌクレオチド配列単位と、
（ｇ）場合により第１の制限部位と
を含み、原核生物における調節活性、部位特異的組換え部位および陰性選択マーカーを提
供するヌクレオチド配列を有する細菌ヌクレオチド配列が５’から３’方向に配置される
核酸分子、または
（２）配列番号６によるヌクレオチド配列を含む核酸分子、または
（３）ブダペスト条約に従って受託番号ＤＳＭ  ２３７５４でＤＳＭＺに寄託された生
物に含有される核酸分子と類似または同一である核酸分子であって、好ましくは、生物に
含有される核酸分子が異種核酸分子である核酸分子
を含む第３の核酸分子によって解決され、
第３の核酸分子は、直鎖または環状分子のいずれかである。
【０１０１】
第５の態様の第１の実施形態の一実施形態でもある、第５の態様の第２の実施形態では
、第３の核酸分子は、直鎖分子であり、ここで、エレメント（ａ）〜（ｆ）は、好ましく
は、第１の制限部位を認識および切断する第１の制限酵素を用いて、第３の核酸分子の環
状分子を切断する際に、５’→３’方向に以下の順序で以下：
１．場合によりウイルスのゲノムの第１の部分、
２．ヌクレオチド配列、好ましくはゲノムヌクレオチド配列、または転写単位、
３．原核生物において調節活性を有する調節核酸配列、
４．部位特異的組換え部位、
５．陰性選択マーカーを提供するヌクレオチド配列、ならびに
６．（ｉ）条件付き複製のための細菌ヌクレオチド配列、および（ｉｉ）陽性選択マー
カーを提供するヌクレオチド配列を含む細菌ヌクレオチド配列単位
のとおり配置される。
【０１０２】
第５の態様の第１および第２の実施形態の一実施形態でもある、第５の態様の第３の実
施形態では、第３の核酸分子は、ウイルスのゲノムの第１の部分をさらに含み、ここで、
好ましくは、第１の部分は、あるウイルスまたは該ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノム
の１つまたは複数の末端配列を含む。
【０１０３】
第５の態様の第３の実施形態の一実施形態でもある、第５の態様の第４の実施形態では
、ウイルスのゲノムの第１の部分は、許容細胞におけるあるウイルスまたは該ウイルスの
複製および／またはパッケージングを媒介するか、または必要とする。
【０１０４】
第５の態様の第１、第２、第３および第４の実施形態の一実施形態でもある、第５の態
様の第５の実施形態では、転写単位は、核酸配列の転写単位であり、このような核酸配列
は、異種核酸配列である。
【０１０５】
第５の態様の第１、第２、第３、第４および第５の実施形態の一実施形態でもある、第
５の態様の第６の実施形態では、第３の核酸分子は、細菌プラスミドまたは細菌人工染色
体である。
【０１０６】
第５の態様の第１、第２、第３、第４、第５および第６の実施形態の一実施形態でもあ
る、第５の態様の第７の実施形態では、第３の核酸分子は、第１の制限部位をさらに含む
。
【０１０７】
第５の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６および第７の実施形態の一実施形態
でもある、第５の態様の第８の実施形態では、第３の核酸分子は、ウイルスのゲノムの第
１の部分をさらに含む。
【０１０８】
第５の態様の第８の実施形態の一実施形態でもある、第５の態様の第９の実施形態では
、ウイルスのゲノムの第１の部分は、パッケージングシグナルを含む。
【０１０９】
第５の態様の第９の実施形態の一実施形態でもある、第５の態様の第１０の実施形態で
は、パッケージングシグナルは、アデノウイルスゲノムに由来し、好ましくは、パッケー
ジングシグナルは、ヒトアデノウイルス５型に由来するパッケージングシグナルΨ５であ
る。
【０１１０】
第５の態様の第８、第９および第１０の実施形態の一実施形態でもある、第５の態様の
第１１の実施形態では、ウイルスのゲノムの第１の部分は、あるウイルスまたは該ウイル
スのあるゲノムまたは該ゲノムの末端配列または末端配列の１つもしくはいくつかの部分
を含む。
【０１１１】
第５の態様の第１１の実施形態の一実施形態でもある、第５の態様の第１２の実施形態
では、あるウイルスまたは該ウイルスの末端配列は、あるウイルスまたは該ウイルスのあ
るゲノムまたは該ゲノムの１つまたはいくつかの末端反復を含む。
【０１１２】
第５の態様の第８、第９、第１０、第１１および第１２の実施形態の一実施形態でもあ
る、第５の態様の第１３の実施形態では、あるウイルスまたは該ウイルスのあるゲノムま
たは該ゲノムの第１の部分は、アデノウイルス、好ましくはヒトアデノウイルスのゲノム
の第１の部分であり、より好ましくは、アデノウイルスは、ヒトアデノウイルス５型、最
も好ましくは、Ｅ１転写単位のＴＡＴＡボックスの上流のアデノウイルス５型の左側末端
全体またはその１つもしくはいくつかの部分である。
【０１１３】
第５の態様の第１１、第１２および第１３の実施形態の一実施形態でもある、第５の態
様の第１４の実施形態では、あるウイルスまたは該ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノム
の末端配列または末端配列の１つもしくはいくつかの部分は、逆方向末端反復を含み、こ
こで、好ましくは、逆方向末端反復は、アデノウイルスの逆方向末端反復であり、より好
ましくは、逆方向末端反復は、ヒトアデノウイルス５型の左側末端に由来する。
【０１１４】
第５の態様の第１４の実施形態の一実施形態でもある、第５の態様の第１５の実施形態
では、逆方向末端反復は、約１８〜１０３塩基対の任意の長さを含む。
【０１１５】
第５の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１
１、第１２、第１３、第１４および第１５の実施形態の一実施形態でもある、第５の態様
の第１６の実施形態では、第１の制限部位は、あるウイルスまたは該ウイルスのあるゲノ
ムまたは該ゲノムの第１の部分および転写単位の両方に存在しない。
【０１１６】
第５の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１
１、第１２、第１３、第１４、第１５および第１６の実施形態の一実施形態でもある、第
５の態様の第１７の実施形態では、制限部位は、アデノウイルスゲノムに存在しない。
【０１１７】
第５の態様の第１６および第１７の実施形態の一実施形態でもある、第５の態様の第１
８の実施形態では、ウイルスは、アデノウイルス、好ましくはヒトアデノウイルス、より
好ましくはヒトアデノウイルス５型である。
【０１１８】
第５の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１
１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７および第１８の実施形態の一実施
形態でもある、第５の態様の第１９の実施形態では、制限部位は、制限酵素の制限部位で
あり、制限酵素は、ＡｂｓＩ、ＢｓｔＢＩ、ＰａｃＩ、ＰｓｒＩ、ＳｇｒＤＩおよびＳｗ
ａＩを含む群から選択される。
【０１１９】
第５の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１
１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、および第１９の実施形
態の一実施形態でもある、第５の態様の第２０の実施形態では、第３の核酸分子は、好ま
しくは、５’→３’方向で、
１．原核生物において調節活性を有する調節核酸配列と、
２．部位特異的組換え部位と、
３．陰性選択マーカーを提供するヌクレオチド配列と、
４．（ｉ）条件付き複製のための細菌ヌクレオチド配列、および（ｉｉ）陽性選択マー
カーを提供するヌクレオチド配列を含む細菌ヌクレオチド配列単位と、
５．第１の制限部位と、
６．あるウイルスまたは該ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムの第１の部分と、
７．転写単位と
を含む。
【０１２０】
第５の態様の第２０の実施形態の一実施形態でもある、第５の態様の第２１の実施形態
では、あるウイルスまたは該ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムの第１の部分は、末端
反復を含み、好ましくは、前記末端反復は、左側末端反復であり、より好ましくは、左側
末端反復は、アデノウイルスゲノムの右側逆方向末端反復である。
【０１２１】
第５の態様の第２０の実施形態の一実施形態でもある、第５の態様の第２２の実施形態
では、あるウイルスまたは該ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムの第１の部分は、ウイ
ルスゲノムの末端反復、好ましくは逆方向末端反復、より好ましくは右側末端反復、さら
により好ましくはアデノウイルスの右側末端反復を含む。
【０１２２】
第５の態様の第２２の実施形態の一実施形態でもある、第５の態様の第２３の実施形態
では、アデノウイルスの右側末端反復は、ヒトアデノウイルス５型ウイルスゲノムのゲノ
ムの少なくとも１０３のヌクレオチドを含む。
【０１２３】
第５の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１
１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８および第１９の実施形態
の一実施形態でもある、第５の態様の第２４の実施形態では、あるウイルスまたは該ウイ
ルスのあるゲノムまたは該ゲノムの第１の部分は、パッケージングシグナルを含み、好ま
しくは、パッケージングシグナルは、アデノウイルスパッケージングシグナルであり、よ
り好ましくは、アデノウイルスパッケージングシグナルは、ヒトアデノウイルス５型の左
側末端のΨ５である。
【０１２４】
第５の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１
１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２
１、第２２、第２３および第２４の実施形態の、好ましくは、第５の態様の第２０、第２
１、第２２、第２３および第２４の実施形態の一実施形態でもある、第５の態様の第２５
の実施形態では、転写単位は、プロモーター、発現させる核酸および終結シグナルを含む
。
【０１２５】
第５の態様の第２５の実施形態の一実施形態でもある、第５の態様の第２６の実施形態
では、プロモーターは真核細胞において活性であり、好ましくは、プロモーターは、真核
生物または原核生物プロモーターを含む群から選択される。
【０１２６】
第５の態様の第２５および第２６の実施形態の一実施形態でもある、第５の態様の第２
７の実施形態では、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって認識されるもので
あり、このようなプロモーターは、好ましくは、ＰＧＫプロモーターおよびＣＭＶプロモ
ーターを含む群から選択される。
【０１２７】
第５の態様の第２５および第２６の実施形態の一実施形態でもある、第５の態様の第２
８の実施形態では、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって認識されるもの
であり、このようなプロモーターは、好ましくは、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター
、ｔＲＮＡプロモーター、アデノウイルスＶＡプロモーターを含む群から選択される。
【０１２８】
第５の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１
１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２
１、第２２、第２３、第２４、第２５、第２６、第２７および第２８の実施形態の、好ま
しくは、第５の態様の第２０、第２１、第２２、第２３、第２４、第２５、第２６、第２
７および第２８の実施形態の一実施形態でもある、第５の態様の第２９の実施形態では、
発現させる核酸は、コーディング核酸および非コーディング核酸配列を含む群から選択さ
れる。
【０１２９】
第５の態様の第２９の実施形態の一実施形態でもある、第５の態様の第３０の実施形態
では、発現させる核酸は、コーディング核酸であり、コーディング核酸は、タンパク質、
ポリペプチドまたはペプチドをコードする。
【０１３０】
第５の態様の第２９の実施形態の一実施形態でもある、第５の態様の第３１の実施形態
では、発現させる核酸は、非コーディングＲＮＡであり、好ましくは、発現させる核酸は
、マイクロＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはｓｈＲＮＡである。
【０１３１】
第５の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１
１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２
１、第２２、第２３、第２４、第２５、第２６、第２７、第２８、第２９、第３０および
第３１の実施形態の、好ましくは、第５の態様の第２０、第２１、第２２、第２３、第２
４、第２５、第２６、第２７、第２８、第２９、第３０および第３１の実施形態のいずれ
かの一実施形態でもある、第５の態様の第３２の実施形態では、終結シグナルは、真核生
物またはウイルス遺伝子の終結シグナルであり、好ましくは、終結シグナルは、ＲＮＡ  
Ｐｏｌ  ＩＩＩ転写される遺伝子のｐｏｌｙＡ  シグナルおよび終結シグナルを含む群か
ら選択される。
【０１３２】
第５の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１
１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２
１、第２２、第２３、第２４、第２５、第２６、第２７、第２８、第２９、第３０、第３
１および第３２の実施形態の、好ましくは、第５の態様の第２０、第２１、第２２、第２
３、第２４、第２５、第２６、第２７、第２８、第２９、第３０、第３１および第３２の
実施形態のいずれかの一実施形態でもある、第５の態様の第３３の実施形態では、部位特
異的組換え部位は、Ｆｌｐリコンビナーゼの部位である。
【０１３３】
第５の態様の第３３の実施形態の一実施形態でもある、第５の態様の第３４の実施形態
では、Ｆｌｐリコンビナーゼの部位は、野生型部位またはその誘導体であり、その誘導体
は、Ｆｌｐリコンビナーゼと結合するのに適している。
【０１３４】
第５の態様の第３４の実施形態の一実施形態でもある、第５の態様の第３５の実施形態
では、Ｆｌｐリコンビナーゼの部位の誘導体は、３４ヌクレオチドの長さを有し、野生型
ＦＲＴ部位のＲ２、ＵおよびＲ３エレメントを含む最小組換え部位である。
【０１３５】
第５の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１
１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２
１、第２２、第２３、第２４、第２５、第２６、第２７、第２８、第２９、第３０、第３
１、第３２、第３３、第３４および第３５の実施形態の、好ましくは、第５の態様の第２
０、第２１、第２２、第２３、第２４、第２５、第２６、第２７、第２８、第２９、第３
０、第３１、第３２、第３３、第３４および第３５の実施形態のいずれかの一実施形態で
もある、第５の態様の第３６の実施形態では、条件付き複製のための細菌ヌクレオチド配
列は、複製起点を含み、好ましくは、複製起点は、ファージｇＲ６Ｋの最小起点である。
【０１３６】
第５の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１
１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２
１、第２２、第２３、第２４、第２５、第２６、第２７、第２８、第２９、第３０、第３
１、第３２、第３３、第３４、第３５および第３６の実施形態の、好ましくは、第５の態
様の第２０、第２１、第２２、第２３、第２４、第２５、第２６、第２７、第２８、第２
９、第３０、第３１、第３２、第３３、第３４、第３５および第３６の実施形態のいずれ
かの一実施形態でもある、第５の態様の第３７の実施形態では、陽性選択マーカーは、選
択薬剤に対する耐性を媒介している。
【０１３７】
第５の態様の第３７の実施形態の一実施形態でもある、第５の態様の第３８の実施形態
では、選択薬剤は、アンピシリン、ゼオシン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール、
カナマイシン、ネオマイシンおよびピューロマイシンを含む群から選択される。
【０１３８】
第５の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１
１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２
１、第２２、第２３、第２４、第２５、第２６、第２７、第２８、第２９、第３０、第３
１、第３２、第３３、第３４、第３５、第３６、第３７および第３８の実施形態の、好ま
しくは、第５の態様の第２０、第２１、第２２、第２３、第２４、第２５、第２６、第２
７、第２８、第２９、第３０、第３１、第３２、第３３、第３４、第３５、第３６、第３
７および第３８の実施形態のいずれかの一実施形態でもある、第５の態様の第３９の実施
形態では、陽性選択マーカーを提供するヌクレオチド配列は、ｂｌａ、ａｎｔ（３’’）
−Ｉａ、ａｐｈ（３’）−ＩＩ、ａｐｈ（３’）−ＩＩ、ｂｌｅおよびｃｍｌＡを含む遺
伝子の群から選択される遺伝子である。
【０１３９】
第５の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１
１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２
１、第２２、第２３、第２４、第２５、第２６、第２７、第２８、第２９、第３０、第３
１、第３２、第３３、第３４、第３５、第３６、第３７、第３８および第３９の実施形態
の、好ましくは、第５の態様の第２０、第２１、第２２、第２３、第２４、第２５、第２
６、第２７、第２８、第２９、第３０、第３１、第３２、第３３、第３４、第３５、第３
６、第３７、第３８および第３９の実施形態のいずれかの一実施形態でもある、第５の態
様の第４０の実施形態では、原核生物において調節活性を有する調節配列は、原核生物に
おいて、好ましくは原核生物宿主細胞においてヌクレオチド配列の発現を指示する配列で
ある。
【０１４０】
第５の態様の第４０の実施形態の一実施形態でもある、第５の態様の第４１の実施形態
では、調節配列は、プロモーター、好ましくは、第５の態様の第４０の実施形態に従って
、原核生物プロモーター、さらにより好ましくは、第５の態様の第４０の実施形態に従っ
て、大腸菌ガラクトキナーゼプロモーターである。
【０１４１】
第５の態様の第４１の実施形態の一実施形態でもある、第５の態様の第４２の実施形態
では、プロモーターは、誘導性プロモーター、好ましくは、誘導可能原核生物プロモータ
ーである。
【０１４２】
第５の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１
１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２
１、第２２、第２３、第２４、第２５、第２６、第２７、第２８、第２９、第３０、第３
１、第３２、第３３、第３４、第３５、第３６、第３７、第３８、第３９、第４０、第４
１および第４２の実施形態の、好ましくは、第５の態様の第２０、第２１、第２２、第２
３、第２４、第２５、第２６、第２７、第２８、第２９、第３０、第３１、第３２、第３
３、第３４、第３５、第３６、第３７、第３８、第３９、第４０、第４１および第４２の
実施形態のいずれかの一実施形態でもある、第５の態様の第４３の実施形態では、陰性選
択マーカーまたは陰性選択マーカーを提供するヌクレオチド配列の発現は、選択薬剤およ
び／または選択条件に対する感受性を媒介または付与する。
【０１４３】
第５の態様の第４３の実施形態の一実施形態でもある、第５の態様の第４４の実施形態
では、陰性選択マーカーを提供するヌクレオチド配列は、ｇａｌＫ、ｔｅｔＡＲ、ｐｈｅ
Ｓ、ｔｈｙＡ、ｌａｃｙ、ｃｃｄＢおよびｒｐｓＬ遺伝子を含む群から選択される遺伝子
である。
【０１４４】
第５の態様の第４３および第４４の実施形態の一実施形態でもある、第５の態様の第４
５の実施形態では、選択薬剤は、親油性化合物、スクロース、ｐ−クロロフェニルアラニ
ン、トリメトプリム、ｔ−ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドおよびスト
レプトマイシンを含む群から選択される。
【０１４５】
本発明の背景にある問題は、第６の態様の第１の実施形態でもある第６の態様では、第
２の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、
第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９および第２０の実施
形態のいずれかによる第２の核酸分子と、第５の態様の第１、第２、第３、第４、第５、
第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、
第１７、第１８、第１９、第２０、第２１、第２２、第２３、第２４、第２５、第２６、
第２７、第２８、第２９、第３０、第３１、第３２、第３３、第３４、第３５、第３６、
第３７、第３８、第３９、第４０、第４１、第４２、第４３、第４４および第４５の実施
形態のいずれかによる第３の核酸分子との組合せによって解決される。
【０１４６】
第６の態様の第１の実施形態の一実施形態でもある、第６の態様の第２の実施形態では
、第３の核酸および第２の核酸は両方とも、環状の閉じた核酸分子として存在する。
【０１４７】
第６の態様の第１および第２の実施形態の一実施形態でもある、第６の態様の第３の実
施形態では、第２および第３の核酸分子は、別個の分子として各々存在する。
【０１４８】
第６の態様の第１、第２および第３の実施形態の一実施形態でもある、第６の態様の第
４の実施形態では、第３の核酸分子は、プラスミドであり、第２の核酸分子は、ＢＡＣで
ある。
【０１４９】
第６の態様の第１、第２、第３および第４の実施形態の一実施形態でもある第６の態様
の第５の実施形態では、ウイルスは、アデノウイルスである。
【０１５０】
第６の態様の第１、第２、第３、第４および第５の実施形態の一実施形態でもある、第
６の態様の第６の実施形態では、あるウイルスまたは該ウイルスのあるゲノムまたは該ゲ
ノムの第１の部分およびあるウイルスまたは該ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムの第
２の部分は、一緒になると、ウイルスの完全なゲノムを形成する。
【０１５１】
第６の態様の第６の実施形態の一実施形態でもある、第６の態様の第７の実施形態では
、ウイルスは、アデノウイルス、好ましくはヒトアデノウイルス、より好ましくはヒトア
デノウイルス５型である。
【０１５２】
第６の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６および第７の実施形態の一実施形態
でもある、第６の態様の第８の実施形態では、完全なゲノムは、１つの、好ましくは、正
確に１つの形質導入単位を含有する。
【０１５３】
第６の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７および第８の実施形態の一実
施形態でもある、第６の態様の第９の実施形態では、第１の制限部位および第２の制限部
位は、あるウイルスまたは該ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムの第１の部分およびあ
るウイルスまたは該ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムの第２の部分の両方に存在せず
、好ましくは、ウイルスは、アデノウイルス、より好ましくはヒトアデノウイルス、さら
により好ましくはヒトアデノウイルス５型である。
【０１５４】
第６の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８および第９の実施形態
の一実施形態でもある、第６の態様の第１０の実施形態では、第１の制限酵素および第２
の制限酵素は、ＡｂｓＩ、ＢｓｔＢＩ、ＰａｃＩ、ＰｓｒＩ、ＳｇｒＤＩおよびＳｗａＩ
を含む群から選択される。
【０１５５】
第６の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９および第１０の
実施形態の一実施形態でもある、第６の態様の第１１の実施形態では、完全なゲノムが、
第１および第２の制限酵素を用いる消化によって放出され得、好ましくは、第１の制限酵
素および第２の制限酵素は同一であり、より好ましくは、第１および第２の制限酵素は、
ＰａｃＩである。
【０１５６】
第６の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０および
第１１の実施形態の一実施形態でもある、第６の態様の第１２の実施形態では、完全なゲ
ノムを含むウイルスは、許容宿主細胞、好ましくは、許容細胞株において、生存可能であ
り、複製能力がある。
【０１５７】
第６の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１
１および第１２の実施形態の一実施形態でもある、第６の態様の第１３の実施形態では、
完全なゲノムは、あるウイルスまたは該ウイルスのゲノムの部分の欠失、好ましくは、１
つまたはいくつかの遺伝子またはコーディング領域の欠失を含む。
【０１５８】
第６の態様の第１３の実施形態の一実施形態でもある、第６の態様の第１４の実施形態
では、ウイルスは、アデノウイルスであり、欠失は、アデノウイルスゲノムの領域の欠失
であり、領域は、Ｅ１領域、Ｅ２領域、Ｅ３領域、Ｅ４領域およびそれらの組合せを含む
群から選択される。
【０１５９】
第６の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１
１、第１２、第１３および第１４の実施形態の一実施形態でもある、第６の態様の第１５
の実施形態では、第３の核酸分子の陽性選択マーカーは、カナマイシンに対する耐性を付
与しており、第３の核酸分子の陰性選択マーカーは、ストレプトマイシンに対する感受性
を付与しており、第２の核酸分子の第２の選択マーカーは、クロラムフェニコールに対す
る耐性を付与している。
【０１６０】
第６の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１
１、第１２、第１３、第１４および第１５の実施形態の一実施形態でもある、第６の態様
の第１６の実施形態では、第３の核酸分子の陽性選択マーカーは、カナマイシンに対する
耐性を付与しており、第３の核酸分子の陰性選択マーカーは、ストレプトマイシンに対す
る感受性を付与しており、第２の核酸分子の第２の選択マーカーは、クロラムフェニコー
ルに対する耐性を付与するが、カナマイシンおよび／またはストレプトマイシンに対して
は付与しない。
【０１６１】
第６の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１
１、第１２、第１３、第１４および第１５の実施形態の一実施形態でもある、第６の態様
の第１７の実施形態では、第３の核酸分子の陽性選択マーカーは、第１の選択薬剤に対す
る耐性を付与しており、第３の核酸分子の陰性選択マーカーは、第２の選択薬剤に対する
感受性を付与しており、第２の核酸分子の第２の選択マーカーは、第３の選択薬剤に対す
る耐性を付与しており、ここで、第１の選択薬剤、第２の選択薬剤および第３の選択薬剤
は、互いに異なる。
【０１６２】
第６の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１
１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６および第１７の実施形態の一実施形態でも
ある、第６の態様の第１８の実施形態では、陰性選択マーカーを提供するヌクレオチド配
列は、プロモーターの制御下、好ましくは原核生物プロモーターの制御下にある。
【０１６３】
第６の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１
１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７および第１８の実施形態の一実施
形態でもある、第６の態様の第１９の実施形態では、第２の核酸分子は、単一コピー複製
のための細菌ヌクレオチド配列を含む。
【０１６４】
第６の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１
１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８および第１９の実施形態
の一実施形態でもある、第６の態様の第２０の実施形態では、宿主細胞に導入された際の
組合せによって、第２の核酸分子の複製のみが可能となる。
【０１６５】
第６の態様の第２０の実施形態の一実施形態でもある、第６の態様の第２１の実施形態
では、条件付き複製のための細菌ヌクレオチド配列は、ファージｇＲ６Ｋの最小起点を含
み、単一コピー複製のための配列は、複製のＦ因子起点またはその部分である因子をコー
ドするヌクレオチド配列を含む。
【０１６６】
第６の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１
１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０および
第２１の実施形態の一実施形態でもある、第６の態様の第２２の実施形態では、第３の核
酸分子は、１つの末端反復を提供し、第２の核酸分子は１つの末端反復を提供する。
【０１６７】
本発明の背景にある問題は、第７の態様の第１の実施形態でもある第７の態様では、好
ましくは、第２の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１
０、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９および第２０の
実施形態において定義される第２の核酸分子の以下のエレメント、すなわち、
（ａ）（ｉ）単一コピー複製のための細菌ヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第２の選
択マーカーを提供するヌクレオチド配列を含む細菌ヌクレオチド配列単位と、
（ｂ）部位特異的組換え部位と、
（ｃ）ウイルスのゲノムの第２の部分と、
（ｄ）第２の制限部位と呼ばれる制限部位と、
好ましくは、第１の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、
第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、
第２０、第２１、第２２、第２３、第２４および第２５の実施形態において定義される第
１の核酸分子の以下のエレメント、すなわち、
（ａ）部位特異的組換え部位と、
（ｂ）（ｉ）条件付き複製のための細菌ヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第１の選択
マーカーを提供するヌクレオチド配列を含む細菌ヌクレオチド配列単位と、
（ｃ）ウイルスのゲノムの第１の部分と、
（ｄ）転写単位と、
（ｅ）第１の制限部位と
を含む第４の核酸分子によって解決され、
ここで、第４の核酸分子は、好ましくは、環状分子であり、好ましくは、第４の核酸分
子は、第４の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、
第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８および第１９の実施
形態のいずれかによる方法によって得られる。
【０１６８】
本発明の背景にある問題は、第８の態様の第１の実施形態でもある第８の態様において
、
ａ）第５の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、
第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、
第２１、第２２、第２３、第２４、第２５、第２６、第２７、第２８、第２９、第３０、
第３１、第３２、第３３、第３４、第３５、第３６、第３７、第３８、第３９、第４０、
第４１、第４２、第４３、第４４および第４５の実施形態のいずれかによる第３の核酸分
子を用意するステップ、
ｂ）第２の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、
第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９および第２
０の実施形態のいずれかによる第２の核酸分子を用意するステップ、または
ｃ）第６の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、
第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９および第２
０、第２１および第２２の実施形態のいずれかによる組合せ、
ｄ）部位特異的組換えが生じるように第３および第２の核酸分子を反応させるステップ
であって、部位特異的組換えが、部位特異的リコンビナーゼによって媒介され、部位特異
的組換えが、あるウイルスまたは該ウイルスのゲノムのコピー、好ましくは単一コピーを
含む組換え生成物を形成し、ゲノムが、補完された完全なゲノムであり、補完された完全
なゲノムが、部位特異的組換えによって補完されるステップ、
ｅ）場合により、組換え生成物を選択するステップ、
ｆ）場合により、第１および第２の制限酵素を用いて組換え生成物を切断するステップ
を含む、ウイルスをコードする核酸分子を作製するための方法によって解決される。
【０１６９】
第８の態様の第１の実施形態の一実施形態でもある、第８の態様の第２の実施形態では
、第３および第２の核酸分子を、原核生物宿主細胞、好ましくは大腸菌において反応させ
、より好ましくは、宿主細胞は、ブダペスト条約に従って受託番号ＤＳＭ２３７４３でＤ
ＳＭＺに寄託された生物またはこのような生物と類似の生物である。
【０１７０】
第８の態様の第１および第２の実施形態の一実施形態でもある、第８の態様の第３の実
施形態では、ウイルスは、アデノウイルス、好ましくはヒトアデノウイルス、より好まし
くはヒトアデノウイルス５型である。
【０１７１】
第８の態様の第１、第２および第３の実施形態の一実施形態でもある、第８の態様の第
４の実施形態では、宿主細胞は、Ｆ因子複製起点を欠き、第３および第２の核酸分子の両
方によって提供される選択マーカーに対して感受性である大腸菌の群から選択される。
【０１７２】
第８の態様の第１、第２、第３および第４の実施形態の一実施形態でもある、第８の態
様の第５の実施形態では、宿主細胞は、ｐｉタンパク質の発現が欠損している大腸菌株で
ある。
【０１７３】
第８の態様の第１、第２、第３、第４および第５の実施形態の一実施形態でもある、第
８の態様の第６の実施形態では、宿主細胞は、大腸菌Ｋ１２由来の細胞、好ましくは、Ｄ
Ｈ１０Ｂを含む群から選択される。
【０１７４】
第８の態様の第１の実施形態の一実施形態でもある第８の態様の第７の実施形態では、
第３の核酸分子および第２の核酸分子を、真核生物宿主細胞において反応させ、組換え生
成物を選択するステップは存在せず、ここで、好ましくは、真核生物宿主細胞は、許容宿
主細胞である。
【０１７５】
第８の態様の第７の実施形態の一実施形態でもある、第８の態様の第８の実施形態では
、許容宿主細胞は、２９３細胞、９１１細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞およびＣＡＰ細胞を含む
群から選択される細胞である。
【０１７６】
第８の態様の第１、第２、第３、第４および第５の実施形態の一実施形態でもある、第
８の態様の第９の実施形態では、組換え事象の数は、１つの組換え事象に限定される。
【０１７７】
第８の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８および第９の実施形態
の一実施形態でもある、第８の態様の第１０の実施形態では、組換え生成物の選択は、第
３の核酸分子の陽性選択マーカーおよび第２の核酸分子の第２の選択マーカーを提供する
組換え生成物を有し、陰性選択マーカーに対して感受性ではない宿主細胞（単数または複
数）を選択することによって実施される。
【０１７８】
第８の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９および第１０の
実施形態の一実施形態でもある、第８の態様の第１１の実施形態では、第３の核酸分子の
陽性選択マーカーは、カナマイシンに対する耐性を付与しており、第３の核酸分子の陰性
選択マーカーは、ストレプトマイシンに対する感受性を付与しており、第２の核酸分子の
第２の選択マーカーは、クロラムフェニコールに対する耐性を付与しており、ここで、組
換え生成物の選択は、原核生物宿主細胞を、カナマイシン、ストレプトマイシンおよびク
ロラムフェニコールにさらすことによって得られる。
【０１７９】
第８の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９および第１０の
実施形態の一実施形態でもある、第８の態様の第１２の実施形態では、第３の核酸分子の
陽性選択マーカーは、カナマイシンに対する耐性を付与しており、第３の核酸分子の陰性
選択マーカーは、ストレプトマイシンに対する感受性を付与しており、第２の核酸分子の
第２の選択マーカーは、クロラムフェニコールに対する耐性を付与するが、カナマイシン
および／またはストレプトマイシンに対しては付与せず、ここで、組換え生成物の選択は
、原核生物宿主細胞を、カナマイシン、ストレプトマイシンおよびクロラムフェニコール
にさらすことによって得られる。
【０１８０】
第８の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９および第１０の
実施形態の一実施形態でもある、第８の態様の第１３の実施形態では、第３の核酸分子の
陽性選択マーカーは、第１の選択薬剤に対する耐性を付与しており、第３の核酸分子の陰
性選択マーカーは、第２の選択薬剤に対する感受性を付与しており、第２の核酸分子の第
２の選択マーカーは、第３の選択薬剤に対する耐性を付与しており、ここで、第１の選択
薬剤、第２の選択薬剤および第３の選択薬剤は、互いに異なり、組換え生成物の選択は、
原核生物宿主細胞を、第１、第２および第３の選択薬剤にさらすことによって得られる。
【０１８１】
第８の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１
１、第１２および第１３の実施形態の一実施形態でもある、第８の態様の第１４の実施形
態では、第３および第２の核酸分子は、リコンビナーゼの存在下で反応させる。
【０１８２】
第８の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１
１、第１２、第１３および第１４の実施形態の一実施形態でもある、第８の態様の第１５
の実施形態では、リコンビナーゼは、第３の核酸分子によって提供される部位特異的組換
え部位および第２の核酸分子によって提供される部位特異的組換え部位と相互作用してい
る。
【０１８３】
第８の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１
１、第１２、第１３、第１４および第１５の実施形態の一実施形態でもある、第８の態様
の第１６の実施形態では、リコンビナーゼは、Ｆｌｐリコンビナーゼである。
【０１８４】
第８の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１
１、第１２、第１３、第１４、第１５および第１６の実施形態の一実施形態でもある、第
８の態様の第１７の実施形態では、リコンビナーゼは、第１の核酸分子または第２の核酸
分子のいずれかによってコードされる。
【０１８５】
第８の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１
１、第１２、第１３、第１４、第１５および第１６の実施形態の一実施形態でもある、第
８の態様の第１８の実施形態では、リコンビナーゼは、原核生物宿主細胞または真核生物
宿主細胞によって提供される。
【０１８６】
第８の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１
１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７および第１８の実施形態の一実施
形態でもある、第８の態様の第１９の実施形態では、組換え後、リコンビナーゼは不活化
される。
【０１８７】
第８の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１
１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８および第１９の実施形態
の一実施形態でもある、第８の態様の第２０の実施形態では、リコンビナーゼ、好ましく
は、Ｆｌｐリコンビナーゼは、条件付きプロモーターまたは誘導性プロモーターによって
制御される。
【０１８８】
第８の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１
１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８および第１９の実施形態
の一実施形態でもある、第８の態様の第２１の実施形態では、リコンビナーゼの発現は、
温度感受性複製起点によって制御される。
【０１８９】
第８の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１
１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０および
第２１の実施形態の一実施形態でもある、第８の態様の第２２の実施形態では、制限酵素
は、ＡｂｓＩ、ＢｓｔＢＩ、ＰａｃＩ、ＰｓｒＩ、ＳｇｒＤＩおよびＳｗａＩを含む群か
ら選択される。
【０１９０】
第８の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１
１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２
１および第２２の実施形態の一実施形態でもある、第８の態様の第２３の実施形態では、
第３および第２の核酸分子は、宿主細胞中に別個に導入される。
【０１９１】
第８の態様の第２３の実施形態の一実施形態でもある、第８の態様の第２４の実施形態
では、第２の核酸分子は、第３の核酸分子に先立って宿主細胞中に導入される。
【０１９２】
第８の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１
１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２
１、第２２、第２３および第２４の実施形態の一実施形態でもある、第８の態様の第２５
の実施形態では、組換え生成物の切断によって、許容細胞において複製能力のある、補完
された完全なウイルスゲノムが提供される。
【０１９３】
第８の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１
１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２
１、第２２、第２３、第２４および第２５の実施形態の一実施形態でもある、第８の態様
の第２６の実施形態では、方法は、さらなるステップとして、補完された完全なウイルス
ゲノムを補完性宿主細胞中にトランスフェクトすることを含む。
【０１９４】
第８の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１
１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２
１、第２２、第２３、第２４、第２５および第２６の実施形態の一実施形態でもある、第
８の態様の第２７の実施形態では、方法は、遺伝子導入、ワクチンまたは治療用途のため
のベクターの構築において使用される。
【０１９５】
第８の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１
１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２
１、第２２、第２３、第２４、第２５、第２６および第２７の実施形態の一実施形態でも
ある、第８の態様の第２８の実施形態では、本方法は、ウイルスゲノムのライブラリーの
構築において使用される。
【０１９６】
本発明の背景にある問題は、第９の態様の第１の実施形態でもある第９の態様において
、好ましくは、第２の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、
第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９お
よび第２０の実施形態において定義される第２の核酸分子の以下のエレメント、すなわち
、
（ａ）（ｉ）単一コピー複製のための細菌ヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第２の選
択マーカーを提供するヌクレオチド配列を含む細菌ヌクレオチド配列単位と、
（ｂ）部位特異的組換え部位と、
（ｃ）ウイルスのゲノムの第２の部分と、
（ｄ）第２の制限部位と呼ばれる制限部位と、
好ましくは、第５の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、
第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、
第２０、第２１、第２２、第２３、第２４、第２５、第２６、第２７、第２８、第２９、
第３０、第３１、第３２、第３３、第３４、第３５、第３６、第３７、第３８、第３９、
第４０、第４１、第４２、第４３、第４４および第４５の実施形態において定義される第
３の核酸分子の以下のエレメント、すなわち、
（ａ）場合によりウイルスのゲノムの第１の部分と、
（ｂ）ヌクレオチド配列、好ましくはゲノムヌクレオチド配列、または転写単位と、
（ｃ）原核生物において調節活性を有する調節核酸配列と、
（ｄ）部位特異的組換え部位と、
（ｅ）陰性選択マーカーを提供するヌクレオチド配列と、
（ｆ）（ｉ）条件付き複製のための細菌ヌクレオチド配列、および（ｉｉ）陽性選択マ
ーカーを提供するヌクレオチド配列を含む細菌ヌクレオチド配列単位と、
（ｇ）第１の制限部位
を含む第５の核酸分子によって解決され、
ここで、第５の核酸分子は、好ましくは、環状分子であり、好ましくは、第５の核酸分
子は、第８の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、
第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、
第２１、第２２、第２３、第２４、第２５、第２６、第２７および第２８の実施形態のい
ずれかによる方法によって得られる。
【０１９７】
本発明の背景にある問題は、第１０の態様の第１の実施形態でもある第１０の態様にお
いて、ヌクレオチド配列のライブラリーを作製するための方法によって解決され、前記ラ
イブラリーは、複数の個々のヌクレオチド配列を含み、前記ライブラリーは、複数のウイ
ルスゲノムによって表され、各ウイルスゲノムは、単一の個々のヌクレオチド配列を含有
し、第８の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第
１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第
２１、第２２、第２３、第２４、第２５、第２６、第２７および第２８の実施形態のいず
れかに定義される方法のステップを含み、個々のヌクレオチド配列は、第３の核酸分子の
転写単位の部分である。
【０１９８】
本発明の背景にある問題は、第１１の態様の第１の実施形態でもある第１１の態様にお
いて、ヌクレオチド配列のライブラリーを作製するための方法によって解決され、前記ラ
イブラリーは、複数の個々のヌクレオチド配列を含み、前記ライブラリーは、複数のウイ
ルスゲノムによって表され、第４の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、
第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１
８および第１９の実施形態のいずれかに定義される方法のステップを含み、個々のヌクレ
オチド配列は、第３の核酸分子の転写単位の部分である。
【０１９９】
第１０の態様の第１の実施形態および第１１の態様の第１の実施形態の一実施形態でも
ある、第１０および第１１の態様の第２の実施形態では、個々のヌクレオチド配列は、完
全なウイルスゲノム中に単一コピーとして存在する。
【０２００】
第１０の態様の第１および第２の実施形態ならびに第１１の態様の第１および第２の実
施形態でもある、第１０および第１１の態様の第３の実施形態では、個々のヌクレオチド
配列は、発現させる核酸である。
【０２０１】
本発明の背景にある問題は、第１２の態様の第１の実施形態でもある第１２の態様にお
いて、第７の態様による、好ましくは、第７の態様の第１および任意のその他の実施形態
の複数の第４の核酸分子によって解決され、ここで、複数の核酸分子は、いくつかのこの
ような個々の核酸分子からなり、個々の核酸分子は、転写単位の部分である発現させる核
酸において互いに異なる。
【０２０２】
本発明の背景にある問題は、第１３の態様の第１の実施形態でもある第１３の態様にお
いて、第９の態様、好ましくは、第９の態様の第１および任意のその他の実施形態による
複数の第５の核酸分子によって解決され、ここで、複数の核酸分子は、いくつかのこのよ
うな個々の核酸分子からなり、ここで、個々の核酸分子は、第３の核酸分子のエレメント
（ｂ）において、好ましくは、エレメント（ｂ）のヌクレオチド配列において、またはエ
レメント（ｂ）の転写単位の部分である発現させる核酸において互いに異なる。
【０２０３】
第１２の態様の第１の実施形態および第１３の態様の第１の実施形態の一実施形態でも
ある第１２および第１３の態様の第２の実施形態では、ウイルスは、アデノウイルスであ
る。
【０２０４】
本発明の背景にある問題は、第１４の態様の第１の実施形態でもある第１４の態様にお
いて、複数の個々のアデノウイルスによって解決され、ここで、個々のアデノウイルスは
、第１２の態様の第１および第２の実施形態のいずれかならびに第１３の態様の第１およ
び第２の実施形態のいずれかに定義される個々の核酸を含有する。
【０２０５】
本発明の背景にある問題は、第１５の態様の第１の実施形態でもある第１５の態様にお
いて、場合により添付文書、ならびに適した容器（単数または複数）中に、少なくとも、
第１の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１
、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２１
、第２２、第２３、第２４および第２５実施形態のいずれかに定義される第１の核酸分子
、第２の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１
１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９および第２０の
実施形態のいずれかに定義される第２の核酸分子、場合により、第４の態様の第１２の実
施形態に定義される部位特異的リコンビナーゼを提供する許容細胞株、第３の態様の第１
、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３
、第１４、第１５、第１６の実施形態のいずれかに定義される第１の核酸分子および第２
の核酸分子の組合せ、第５の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、
第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第
１９、第２０、第２１、第２２、第２３、第２４、第２５、第２６、第２７、第２８、第
２９、第３０、第３１、第３２、第３３、第３４、第３５、第３６、第３７、第３８、第
３９、第４０、第４１、第４２、第４３、第４４および第４５の実施形態のいずれかに定
義される第３の核酸分子、第６の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第
８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８
、第１９、第２０、第２１および第２２の実施形態のいずれかに定義される第３の核酸分
子および第２の核酸分子の組合せ、第７の態様の第１の実施形態に定義される第４の核酸
分子、第９の態様の第１の実施形態に定義される第５の核酸分子、第１２の態様の第１お
よび第２の実施形態に定義される複数の第４の核酸分子、第１３の態様の第１および第２
の実施形態に定義される複数の第５の核酸分子または第１４の態様の第１の実施形態に定
義される複数の個々のアデノウイルスを含むキットによって解決される。
【０２０６】
第１５の態様の第１の実施形態の一実施形態でもある第１５の態様の第２の実施形態で
は、核酸分子（単数または複数）は、すぐに使用できる形態で含まれる。
【０２０７】
第１５の態様の第１および第２の実施形態の一実施形態でもある第１５の態様の第３の
実施形態では、キットは、第４の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第
８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８
および第１９の実施形態ならびに第８の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第
７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、
第１８、第１９、第２０、第２１、第２２、第２３、第２４、第２５、第２６、第２７お
よび第２８の実施形態のいずれかに定義される、ウイルスをコードする核酸分子を作製す
るための方法において使用するためのものである。
【０２０８】
第１５の態様の第１、第２および第３の実施形態の一実施形態でもある、第１５の態様
の第４の実施形態では、キットは、第１１の態様の第１、第２および第３の実施形態のい
ずれかに定義されるヌクレオチド配列のライブラリーを作製するための方法において使用
するためのものである。
【０２０９】
本発明の種々の態様のさらに好ましい実施形態は、以下のとおりである。
実施形態１
第３の核酸分子とも呼ばれる核酸分子であって、第３の核酸分子が、
（１）以下のエレメント：
（ａ）場合によりウイルスのゲノムの第１の部分と、
（ｂ）ヌクレオチド配列、好ましくはゲノムヌクレオチド配列、または転写単位と、
（ｃ）原核生物において調節活性を有する調節核酸配列と、
（ｄ）部位特異的組換え部位と、
（ｅ）陰性選択マーカーを提供するヌクレオチド配列と、
（ｆ）（ｉ）条件付き複製のための細菌ヌクレオチド配列、および（ｉｉ）陽性選択マ
ーカーを提供するヌクレオチド配列を含む細菌ヌクレオチド配列単位と、
（ｇ）場合により第１の制限部位と
を含む核酸分子、または
（２）配列番号６によるヌクレオチド配列を含む核酸分子、または
（３）受託番号ＤＳＭ２３７５４でブダペスト条約に基づいてＤＳＭＺに寄託された生
物中に含有される核酸分子と同一もしくは類似である核酸分子であって、好ましくは、生
物中に含有される核酸分子が、異種核酸分子である核酸分子
を含み、
第３の核酸分子が、直鎖または環状分子のいずれかである、核酸分子。
【０２１０】
実施形態２
（１）原核生物において調節活性を有する調節核酸配列の核酸分子において、部位特異
的組換え部位および陰性選択マーカーを提供するヌクレオチド配列が、５’から３’方向
に配置される、実施形態１に記載の第３の核酸分子。
【０２１１】
実施形態３
正確に１つの部位特異的組換え部位を含有する、実施形態１から２のいずれか１つに記
載の第３の核酸分子。
【０２１２】
実施形態４
直鎖分子であり、エレメント（ａ）から（ｆ）が、好ましくは、第３の核酸分子の環状
分子の、第１の制限部位で認識および切断する第１の制限酵素での切断の際に、以下のと
おりの以下の順序：
１．場合によりウイルスのゲノムの第１の部分、
２．核酸配列、好ましくはゲノムヌクレオチド配列、または転写単位、
３．原核生物において調節活性を有する調節核酸配列、
４．部位特異的組換え部位、
５．陰性選択マーカーを提供するヌクレオチド配列、ならびに
６．（ｉ）条件付き複製のための細菌ヌクレオチド配列、および（ｉｉ）陽性選択マー
カーを提供するヌクレオチド配列を含む細菌ヌクレオチド配列単位
で５’→３’方向に配置される、実施形態１から３のいずれか１つに記載の第３の核酸分
子。
【０２１３】
実施形態５
ウイルスのゲノムの第１の部分をさらに含む、実施形態１から４のいずれか１つに記載
の第３の核酸分子。
【０２１４】
実施形態６
ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムの第１の部分が、あるウイルスもしくは該ウイル
スのあるゲノムもしくは該ゲノムの末端配列または末端配列の１つもしくはいくつかの部
分を含む、実施形態５に記載の第３の核酸分子。
【０２１５】
実施形態７
あるウイルスまたは該ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムの第１の部分が、アデノウ
イルス、好ましくはヒトアデノウイルスのゲノムの第１の部分であり、より好ましくは、
アデノウイルスが、ヒトアデノウイルス５型、最も好ましくはＥ１転写単位のＴＡＴＡボ
ックスの上流のアデノウイルス５型の全左側末端またはその１つもしくはいくつかの部分
である、実施形態５から６のいずれか１つに記載の第３の核酸分子。
【０２１６】
実施形態８
条件付き複製のための細菌ヌクレオチド配列が、複製起点を含み、好ましくは、複製起
点が、ファージｇＲ６Ｋの最小の起点である、実施形態１から７のいずれか１つ、好まし
くは、実施形態７に記載の第３の核酸分子。
【０２１７】
実施形態９
原核生物において調節活性を有する調節配列が、原核生物において、好ましくは原核生
物宿主細胞において、ヌクレオチド配列の発現を指示する配列である、実施形態１から８
のいずれか１つ、好ましくは実施形態７から８のいずれか１つに記載の第３の核酸分子。
【０２１８】
実施形態１０
陰性選択マーカーまたは陰性選択マーカーを提供するヌクレオチド配列の発現が、選択
薬剤および／または選択条件に対する感受性を媒介または付与する、実施形態１から９の
いずれか１つ、好ましくは実施形態８から９のいずれか１つに記載の第３の核酸分子。
【０２１９】
実施形態１１
陰性選択マーカーを提供するヌクレオチド配列が、ｇａｌＫ、ｔｅｔＡＲ、ｐｈｅＳ、
ｔｈｙＡ、ｌａｃｙ、ｃｃｄＢおよびｒｐｓＬ遺伝子を含む群から選択される遺伝子であ
る、実施形態１０に記載の第３の核酸分子。
【０２２０】
実施形態１２
実施形態１から１１のいずれかに定義される第３の核酸分子および第２の核酸分子とも
呼ばれる核酸分子の組合せであって、
第２の核酸分子が、
（１）以下のエレメント：
（ａ）（ｉ）単一コピー複製のための細菌ヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第２の選
択マーカーを提供するヌクレオチド配列を含む細菌ヌクレオチド配列単位と、
（ｂ）部位特異的組換え部位と、
（ｃ）ウイルスのゲノムの第２の部分と、
（ｄ）場合により、第２の制限部位と呼ばれる制限部位と
を含む核酸分子、または
（２）配列番号２および／もしくは配列番号１３および／もしくは配列番号１４による
ヌクレオチド配列を含む核酸分子、または
（３）受託番号ＤＳＭ２４２９８および／もしくはＤＳＭ２４２９９でブダペスト条約
に基づいてＤＳＭＺに寄託された生物に含有される核酸分子と同一もしくは類似である核
酸分子であって、好ましくは、生物中に含有される核酸分子が、異種核酸分子である核酸
分子
を含み、
第２の核酸分子および第３の核酸分子が各々独立に直鎖分子または環状分子のいずれか
であり、好ましくは、第２の核酸分子が環状分子であり、第３の核酸分子が環状分子であ
る、組合せ。
【０２２１】
実施形態１３
第１の核酸分子とも呼ばれる核酸分子および第２の核酸分子とも呼ばれる核酸分子の組
合せであって、
第１の核酸分子が、
（１）以下のエレメント：
（ａ）部位特異的組換え部位と、
（ｂ）（ｉ）条件付き複製のための細菌ヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第１の選択
マーカーを提供するヌクレオチド配列を含む細菌ヌクレオチド配列単位と、
（ｃ）ウイルスのゲノムの第１の部分と、
（ｄ）転写単位と
（ｅ）場合により第１の制限部位と
を含む核酸分子、または
（２）配列番号１および／もしくは配列番号１５によるヌクレオチド配列を含む核酸分
子、または
（３）ブダペスト条約に従って受託番号ＤＳＭ２３７５３でＤＳＭＺに寄託された生物
中に含有される核酸分子と類似または同一である核酸分子であって、好ましくは、生物中
に含有される核酸分子が、異種核酸分子である核酸分子
を含み、
第２の核酸分子が、
（１）以下のエレメント：
（ａ）（ｉ）単一コピー複製のための細菌ヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第２の選
択マーカーを提供するヌクレオチド配列を含む細菌ヌクレオチド配列単位と、
（ｂ）部位特異的組換え部位と、
（ｃ）ウイルスのゲノムの第２の部分と、
（ｄ）場合により、第２の制限部位とも呼ばれる制限部位と
を含む核酸分子、または
（２）配列番号２および／もしくは配列番号１３および／もしくは配列番号１４による
ヌクレオチド配列を含む核酸分子、または
（３）受託番号ＤＳＭ２４２９８および／もしくはＤＳＭ２４２９９でブダペスト条約
に基づいてＤＳＭＺに寄託された生物に含有される核酸分子と同一もしくは類似である核
酸分子であって、好ましくは、生物中に含有される核酸分子が、異種核酸分子である核酸
分子
を含み、
第１の核酸分子および第２の核酸分子が各々独立に直鎖分子または環状分子のいずれか
であり、好ましくは、第１の核酸分子が環状分子であり、第２の核酸分子が環状分子であ
る、組合せ。
【０２２２】
実施形態１４
第１の核酸分子が、正確に１つの部位特異的組換え部位を含有する、実施形態１３に記
載の組合せ。
【０２２３】
実施形態１５
第１の核酸分子のウイルスのゲノムが、ヒトアデノウイルスゲノム、好ましくは、ヒト
アデノウイルス５型ゲノムとは異なるヒトアデノウイルスゲノムであり、より好ましくは
、第１の核酸分子のウイルスのゲノムが、ヒトアデノウイルス１９ａ型ゲノムである、実
施形態１３および１４のいずれか１つに記載の組合せ。
【０２２４】
実施形態１６
第１の核酸分子の条件付き複製のための細菌ヌクレオチド配列が、複製起点を含む、実
施形態１３から１５のいずれか１つに記載の組合せ。
【０２２５】
実施形態１７
第１の核酸分子の第１の選択マーカーを提供する配列が、酵素をコードするこのような
核酸配列を有する宿主細胞に耐性を付与する酵素をコードする核酸配列である、実施形態
１３から１６のいずれか１つに記載の組合せ。
【０２２６】
実施形態１８
第１の核酸分子のウイルスのゲノムの第１の部分が、ウイルス末端反復、好ましくはア
デノウイルス末端反復である、実施形態１３から１７のいずれか１つに記載の組合せ。
【０２２７】
実施形態１９
第１の核酸分子のウイルスのゲノムの第１の部分が、アデノウイルスプロモーターｐＩ
Ｘを含有し、より好ましくは、アデノウイルスプロモーターｐＩＸが、ヒトアデノウイル
ス１９ａ由来のｐＩＸプロモーターである、実施形態１３から１８のいずれか１つに記載
の組合せ。
【０２２８】
実施形態２０
第２の核酸分子が、正確に１つの部位特異的組換え部位を含有する、実施形態１２から
１９のいずれか１つに記載の組合せ。
【０２２９】
実施形態２１
第２の核酸分子のウイルスゲノムが、ヒトアデノウイルスゲノムであり、実施形態１２
に記載の組合せの場合には、第２の核酸分子のウイルスゲノムが、好ましくはヒトアデノ
ウイルス５型ゲノムまたはヒトアデノウイルス１９ａ型ゲノムであり、実施形態１３に記
載の組合せの場合には、第２の核酸分子のウイルスゲノムが、好ましくは、ヒトアデノウ
イルス５型ゲノムとは異なるヒトアデノウイルスゲノムであり、より好ましくは、第２の
核酸分子のウイルスゲノムが、ヒトアデノウイルス１９ａ型ゲノムである、実施形態１２
から２０のいずれか１つに記載の組合せ。
【０２３０】
実施形態２２
第２の核酸分子の単一コピー複製のための細菌ヌクレオチド配列が、原核生物宿主細胞
における単一コピー維持のための複製起点を含む、実施形態１２から２１のいずれか１つ
に記載の組合せ。
【０２３１】
実施形態２３
第２の核酸分子マーカーの第２の選択マーカーを提供するヌクレオチド配列が、酵素を
コードするこのような核酸配列を有する宿主細胞に耐性を付与する酵素をコードする核酸
配列である、実施形態１２から２２のいずれか１つに記載の組合せ。
【０２３２】
実施形態２４
第２の核酸分子のウイルスのゲノムの第２の部分が、ウイルスの逆方向末端反復、好ま
しくはアデノウイルス逆方向末端反復、より好ましくはアデノウイルス右側逆方向末端反
復を含む、実施形態１２から２３のいずれか１つに記載の組合せ。
【０２３３】
実施形態２５
ウイルスをコードする核酸分子を作製するための方法であって、
ａ）実施形態１から１１のいずれか１つに定義される第３の核酸分子を用意するステッ
プ、
ｂ）実施形態１２に定義される第２の核酸分子を用意するステップ、または
ｃ）実施形態１２から２４のいずれか１つに記載の第３の核酸分子および第２の核酸分
子の組合せ、
ｄ）部位特異的組換えが起こるように第３および第２の核酸分子を反応させるステップ
であって、部位特異的組換えが、部位特異的リコンビナーゼによって媒介され、部位特異
的組換えが、あるウイルスまたは該ウイルスのゲノムのコピー、好ましくは単一コピーを
含む組換え生成物を形成し、ゲノムが、補完された完全なゲノムであり、補完された完全
なゲノムが、部位特異的組換えによって補完されるステップ、
ｅ）場合により、組換え生成物を選択するステップ、ならびに
ｆ）場合により、第１および第２の制限酵素を用いて組換え生成物を切断するステップ
を含む、方法。
【０２３４】
実施形態２６
ウイルスをコードする核酸分子を作製するための方法であって、
ａ）実施形態１３から２４のいずれか１つに記載の第１の核酸分子および第２の核酸分
子の組合せ、
ｂ）部位特異的組換えが起こるように第１および第２の核酸分子を反応させるステップ
であって、部位特異的組換えが、部位特異的リコンビナーゼによって媒介され、部位特異
的組換えが、あるウイルスまたは該ウイルスのゲノムのコピー、好ましくは単一コピーを
含む組換え生成物を形成し、ゲノムが、補完された完全なゲノムであり、補完された完全
なゲノムが、部位特異的組換えによって補完されるステップ、
ｃ）場合により、組換え生成物を選択するステップ、ならびに
ｄ）場合により、第１および第２の制限酵素を用いて組換え生成物を切断するステップ
を含む、方法。
【０２３５】
実施形態２７
第３および第２の核酸分子を、ブダペスト条約に従って受託番号ＤＳＭ２３７４３でＤ
ＳＭＺに寄託された生物と類似または同一である原核生物宿主細胞、好ましくは大腸菌に
おいて反応させる、実施形態２５に記載の方法。
【０２３６】
実施形態２８
第１および第２の核酸分子を、ブダペスト条約に従って受託番号ＤＳＭ２３７４３でＤ
ＳＭＺに寄託された生物と類似または同一である原核生物宿主細胞、好ましくは大腸菌に
おいて反応させる、実施形態２６に記載の方法。
【０２３７】
実施形態２９
ヌクレオチド配列のライブラリーを作製するための方法であって、前記ライブラリーが
、複数の個々の核酸配列を含み、前記ライブラリーが、複数のウイルスゲノムによって表
され、各ウイルスゲノムが、単一の個々のヌクレオチド配列を含有し、実施形態２５およ
び２７のいずれかに定義される方法のステップを含み、個々のヌクレオチド配列が、第３
の核酸分子の転写単位の部分である、方法。
【０２３８】
実施形態３０
ヌクレオチド配列のライブラリーを作製するための方法であって、前記ライブラリーが
、複数の個々のヌクレオチド配列を含み、前記ライブラリーが、複数のウイルスゲノムに
よって表され、各ウイルスゲノムが、単一の個々のヌクレオチド配列を含有し、実施形態
２６および２８のいずれかに定義される方法のステップを含み、個々のヌクレオチド配列
が、第１の核酸分子の転写単位の部分である、方法。
【０２３９】
実施形態３１
場合により添付文書、ならびに適した容器（単数または複数）中に少なくとも実施形態
１から１１のいずれか１つに定義される第３の核酸分子および／または実施形態１２から
２４のいずれか１つに記載の第３の核酸分子および第２の核酸分子の組合せを含むキット
。
【０２４０】
実施形態３２
場合により添付文書、ならびに適した容器（単数または複数）中に少なくとも実施形態
１３から１９のいずれか１つに定義される第１の核酸分子および／または実施形態１３か
ら２４のいずれか１つに記載の第１の核酸分子および第２の核酸分子の組合せを含むキッ
ト。
【０２４１】
実施形態３３
核酸分子（単数または複数）がすぐに使用できる形態で含有され、かつ／またはキット
が使用説明書を含有する、実施形態３１および３２のいずれか１つに記載のキット。
【発明を実施するための形態】
【０２４２】
当業者ならば、本明細書において、用語「提供すること（ｔｏ  ｐｒｏｖｉｄｅ）」ま
たは「提供すること（ｐｒｏｖｉｄｉｎｇ）」とは、種々の方法に関連して、好ましくは
、このような方法に従う任意のステップを実施するために提供される核酸分子が入手可能
であることおよびこのような核酸分子を、このようなステップの前または直前に合成する
必要がないことも意味するということは理解される。むしろこのような核酸分子は、この
ような核酸分子の任意の貯蔵物から持ち込まれ得る。
【０２４３】
本発明の方法によって、細菌において部位特異的組換えを使用する場合には、組換え事
象の数に関わりなく感染性ウイルスベクターゲノムの構築が可能となり、第２の核酸系に
ついて記載されるように、部位特異的組換えを使用する場合には、組換え事象の数を１に
制限し、第１のこのような系は、本発明の第１の核酸分子および本発明の第２の核酸分子
の組合せからなり、第２のこのような系は、本発明の第３の核酸分子および本発明の第２
の核酸分子の組合せからなる。当業者には、本発明に一致して、組換え事象の特定のパー
センテージは、複数の組換えをもたらすということは認識されよう。好ましくは、このよ
うなパーセンテージは、５％未満、好ましくは、３％未満、より好ましくは、２．５％未
満である。複数の組換え事象の出現は、混入であり、組換え体をスクリーニングし、特徴
付けることを必要とする。このようなスクリーニングは、ウイルスをコードする核酸分子
を作製するための本発明の方法に関連して実施され、組換え型産物の選択と呼ばれる。
【０２４４】
開示された両系を使用して、組換えウイルスベクターゲノムを作製できる。両系におい
て得られた組換え生成物は、組込み事象の数に関わらず、ウイルスゲノムの正確に１つの
コピーを含有する。本発明は、複数の組換えを排除し、複数のウイルスベクターゲノムを
含有するライブラリーのスクリーニングを避けるための溶液を提供した。このようなウイ
ルスゲノムまたは複数のウイルスゲノムは、ウイルス、好ましくはアデノウイルスの補完
された完全なゲノムである。このようなウイルスのゲノムは、ユニークな制限酵素を用い
る制限消化によって放出され、それによって、ウイルスゲノムと接続しているすべての細
菌配列を除去する。したがって、これらの方法によって作製されたウイルスゲノムは、本
質的に、不要な細菌配列は全く含まない。
【０２４５】
第１、第２および第３の核酸分子中の遺伝エレメントの配置は、得られた組換え生成物
が、組込み事象の数に関わらず、補完された完全なウイルスゲノムの正確に１つのコピー
を含有することを暗示する。したがって、本発明において、部位特異的リコンビナーゼの
存在下で該アデノウイルスまたはあるアデノウイルスに対して許容的な真核細胞宿主細胞
において、第１または第３の核酸の直線化された形態を、第２の核酸の直鎖形態と反応さ
せる方法が開示される。この方法は、組換え生成物を選択するステップを必要としない。
【０２４６】
本発明の方法は、技術の現在の制限を実質的に克服し、アデノウイルスゲノムまたは複
数のアデノウイルスゲノムの構築のために、例えば、Ｇａｔｅｗａｙ（商標）システムの
対象のような、部位特異的組換えを使用する。より詳しくは、本発明の第１または第３の
核酸分子のいずれか上、および第２の核酸分子上に存在する１つのＦｒｔ部位間の組換え
によって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、２つの同一でない組換え部位間の組換えと関連している
不利点が回避され、高効率および忠実度での複数のウイルスゲノムの作製が可能となる。
【０２４７】
本発明の方法はまた、酵母人工染色体（ＹＡＣ）におけるキメラ化およびマルチコピー
コスミドまたはプラスミドベクターにおけるゲノムＤＮＡ不安定性の問題を解決する。こ
のような方法と関連して、この効果は、単一コピーのＦ因子レプリコンを使用して複製す
る細菌人工染色体（ＢＡＣ）の使用によって媒介される（Ｋｉｍ  ＵＪら、Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２０：１０８３〜１０８５頁、１９９２年；Ｓｈｉｚｕｙａ
ＨおよびＫｏｕｒｏｓ−Ｍｅｈｒ  Ｈ．、Ｋｅｉｏ  Ｊ．Ｍｅｄ．５０：２６〜３０頁
、２００１年）。さらに、本発明の方法は、複数の組換え事象のパーセンテージに関して
上記の考慮の対象となる大腸菌において生じる組換え反応について、組換え事象の数を１
に制限することによって、純粋なライブラリーの構築のための部位特異的組換えの制限を
克服する。ライブラリーは、単一コピーＢＡＣにおいて安定に維持され得、したがって、
現在のウイルス発現ライブラリーの制限を克服する。アデノウイルスの場合には、ライブ
ラリーは、生命体ウイルスとして維持され、したがって、ｃＤＮＡの発現が増殖利点また
は不利点を付与し、したがって、ライブラリー集団中で過剰または過少提示されるｃＤＮ
Ａ発現ライブラリーの場合には当然である、増殖利点を有するウイルス突然変異体の選択
による偏りの対象となる。さらに、本発明の方法による選択またはスクリーニングの使用
によって、多重挿入を有する組換え生成物は、完全に排除される。本明細書において好ま
しく使用されるように、選択は、第３の核酸分子および第２の核酸分子を使用するウイル
スをコードする核酸分子を作製するための方法の場合には、反応生成物が、両核酸分子に
よって提供された陽性および陰性選択マーカーの組合せの使用によって選択され得、第３
の核酸分子によって提供された陽性選択マーカーが、選択薬剤に対する耐性を付与し、第
３の核酸によって提供された陰性選択マーカーが、選択薬剤に対する感受性を付与し、第
２の核酸によって提供された第２の選択マーカーが、第２の選択薬剤に対する耐性を提供
することを意味する。
【０２４８】
最後に、本発明は、大きなＤＮＡライブラリーの構築を可能にする組換え系およびｉｎ
ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで組換えベクターゲノムの構築のためにＦｒｔ／Ｆｌ
ｐ系に適用される解決法に関する。
【０２４９】
本発明者は、驚くべきことに、条件付きリコンビナーゼ発現を可能にするプラスミドを
有する大腸菌宿主における、各々、リコンビナーゼＦｌｐの１つの認識部位を有する、２
種の核酸間の部位特異的組換えを含む系が、上記の制限を克服することができ、第２の核
酸における、また得られた組換え生成物におけるアデノウイルスゲノムの遺伝的安定性を
保ちながら、２種の核酸間の組換えの数を１に制限しながら、高効率、正確度でのアデノ
ウイルスゲノムおよび複数のアデノウイルスゲノムの構築を可能にすることを見い出した
。結果として、本発明の問題はまた、大腸菌における部位特異的組換えに基づいてウイル
スベクターを構築するための、高効率の信頼性のある簡単な方法を提供する、Ｆｌｐリコ
ンビナーゼによって媒介される部位特異的組換えのための２つの核酸系によって解決され
る。
【０２５０】
Ｆｌｐ−Ｆｒｔ媒介性部位特異的組換えを、開示された２つのベクターＤＮＡ系、すな
わち、第１の核酸分子および第２の核酸分子を含む系ならびに第２の核酸分子および第３
の核酸分子を含む系と一緒に使用することが、本発明のさらなる目的である。これは、ヌ
クレオチド配列を含有する複数の組換えられた核酸を構築するための高効率の信頼性のあ
る簡単な方法を提供する。好ましくは、このようなヌクレオチド配列は、ウイルス、好ま
しくはアデノウイルスのゲノムヌクレオチド配列またはその部分（単数または複数）であ
る。良好な形質転換効率を保つために、３００ｋｂを越えるゲノムを安定に維持するため
の本発明のこの態様を使用することは可能であるが、第１および第３の核酸の大きさは、
１００ｋｂ未満であるべきであり、核酸のライブラリーが構築されるべきである場合には
、好ましくは、４０ｋｂ未満、さらにより好ましくは、１０ｋｂ未満であるべきである。
【０２５１】
本発明はまた、大腸菌において核酸分子を組み換えるために部位特異的組換えを使用す
る、核酸分子、ベクターおよび方法に関する。核酸ライブラリーの作製のための方法が開
示され、本発明の方法の好ましい実施形態では、方法は、ウイルスゲノムおよび複数のそ
のウイルスゲノムを作製するためのものである。核酸分子は、個々に、または組合せとし
て、また本発明に開示される方法は、より信頼性があり、部位特異的組換え系の使用を拡
大し、中でも、補完された完全な、それぞれのウイルスゲノムの構築および偏りのない安
定なウイルスゲノムのライブラリーの作製を可能にする。
【０２５２】
本発明はまた、部位特異的リコンビナーゼの存在下で、許容真核細胞宿主細胞において
核酸分子を組み換えるために、部位特異的組換えを使用する、核酸分子の作製、ウイルス
ゲノムまたはその複数のウイルスゲノムの作製のための方法に関する。ウイルスゲノムま
たは複数のウイルスゲノムの作製のための方法が開示され、本発明の方法の好ましい実施
形態では、方法は、アデノウイルスベクターを作製するためのものである。本発明に開示
される方法は、アデノウイルス作製のための確立された方法よりも相当に迅速であり、部
位特異的組換え系の使用を拡大し、補完性細胞株において複製能力のある、ウイルスゲノ
ムまたは複数のウイルスゲノムの作製を可能にする。
【０２５３】
本発明は、独立して、非複製性であり、組換え後に、ウイルス、好ましくはアデノウイ
ルスの補完された完全なゲノムを形成する２種のＤＮＡをつなぎ合わせるための、Ｆｌｐ
リコンビナーゼによって媒介される部位特異的組換えのための高効率を有する大腸菌にお
ける第１の核酸系を提供する。本発明の核酸分子、より詳しくは、第１の核酸分子、第２
の核酸分子および第３の核酸分子の１つの適用は、Ｅ１、場合により、Ｅ３遺伝子につい
て欠失しており、Ｅ１遺伝子の代わりに外来ＤＮＡを含有するアデノウイルスゲノム（第
１世代アデノウイルスベクター）の構築である。
【０２５４】
本発明のさらなる実施形態では、独立して、非複製性であり、組換え後に、ヒト非５型
アデノウイルス、好ましくはヒト１９ａ型アデノウイルスの補完された完全なゲノムを形
成する２種のＤＮＡをつなぎ合わせるための、Ｆｌｐリコンビナーゼによって媒介される
部位特異的組換えのための高効率を有する大腸菌における第１の核酸系が提供される。本
発明の核酸分子、より詳しくは、第１の核酸分子および第２の核酸分子の１つの適用は、
Ｅ１、場合により、Ｅ３遺伝子について欠失しており、Ｅ１遺伝子の代わりに外来ＤＮＡ
を含有するヒト非５型アデノウイルスゲノム（第１世代血清型アデノウイルスベクター）
の構築である。
【０２５５】
本発明に従って、（ｉ）単一コピー複製のための細菌ヌクレオチド配列、および（ｉｉ
）第２の選択マーカーを提供するヌクレオチド配列を含む細菌ヌクレオチド配列単位、部
位特異的組換え部位、優先的には野生型Ｆｒｔ部位（配列番号８）、ウイルスのゲノムの
第２の部分、優先的にはアデノウイルスのゲノムの第２の部分、ならびにより優先的には
ヒトアデノウイルス５型またはヒトアデノウイルス１９ａ型の第２の部分、ならびに場合
により第２の制限部位を含むベクターｐＢＡＣＳｉｒ２（配列番号２）またはｐＢＡＣＳ
ｉｒ  Ａｄ１９ａ（配列番号１４）と同一または類似である、１つの野生型Ｆｒｔ部位を
含有する、好ましくは、ＢＡＣである第２の核酸分子が開示される。さらに、ウイルスの
ゲノムの第１の部分、優先的にはアデノウイルスのゲノムの第１の部分、さらにより優先
的にはアデノウイルス５型またはヒトアデノウイルス１９ａ型の第２の部分、転写単位、
部位特異的組換え部位、優先的には最小のＦｒｔ部位（配列番号７）、（ｉ）条件付き複
製のための細菌ヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第１の選択マーカーを提供するヌクレ
オチド配列を含む細菌ヌクレオチド配列単位を含む第１の核酸分子に対応する、ｐＤｏｎ
ｏｒＳｉｒ１（配列番号１）またはプラスミドｐＤｏｎｏｒＳｉｒ１９ａ（配列番号１５
）と同一または類似であるプラスミドが提供される。
【０２５６】
開示される第２の核酸系の別の実施形態は、場合によりウイルスのゲノムの第１の部分
、優先的にはアデノウイルスのゲノムの第１の部分、さらにより優先的にはアデノウイル
ス５型ヌクレオチド配列、好ましくはゲノムヌクレオチド配列の第２の部分または転写単
位、原核生物において調節活性を有する調節核酸配列、優先的には細菌プロモーター、部
位特異的Ｆｒｔ部位、優先的には最小のＦｒｔ（配列番号７）、陰性選択マーカーを提供
するヌクレオチド配列、（ｉ）条件付き複製のための細菌ヌクレオチド配列、および（ｉ
ｉ）陽性選択マーカーを提供するヌクレオチド配列を含む細菌ヌクレオチド配列単位、場
合により第１の制限部位を含有する、本発明の第３の核酸分子に対応するｐＤｏｎｏｒＳ
ｉｒ２（配列番号６）と類似または同一であるプラスミドである。
【０２５７】
２種の核酸系を使用するこの方法の１つの適用は、ウイルスゲノムまたはその複数のウ
イルスゲノム、優先的には、アデノウイルスゲノムまたはその複数のアデノウイルスゲノ
ム、より優先的には、アデノウイルス５型ゲノムまたは複数のアデノウイルス５型ゲノム
の構築である。開示された方法の１つのさらなる適用は、ウイルス発現ライブラリーの作
製である。本発明の核酸系およびウイルスゲノムをコードする核酸分子を作製するための
方法は、同等の非アデノウイルス５型ゲノムの操作および構築との類似性によって同様に
適用可能である。さらなる実施形態では、このような核酸分子および方法は、それぞれ、
ミラー設定において適用され得、ヌクレオチド配列は、アデノウイルスゲノムの右側末端
（例えば、Ｅ３）にレスキューされるか、Ｅ４遺伝子を欠失するため、またはこのような
ヌクレオチド配列を保持するアデノウイルスゲノムもしくは複数のアデノウイルスゲノム
を作製するために適用される。「ミラー設定」における２種の核酸系の使用の１つの適用
は、突然変異ウイルスタンパク質を用いるアデノウイルスゲノムまたは複数のアデノウイ
ルスゲノムの構築である。
【０２５８】
本発明は、第１の核酸分子および第２の核酸分子を含む組合せの使用ならびに第３の核
酸分子および第２の核酸分子を含む組合せの使用をそれぞれ開示する。第１と第２または
第３と第２の核酸分子を、Ｆｌｐリコンビナーゼによって媒介される部位特異的組換えに
よって大腸菌において高効率で反応させる。本発明では、第２の核酸分子は、ＢＡＣであ
り、１つの、好ましくは、野生型Ｆｒｔ部位を含有し、第２の核酸分子は、ベクターｐＢ
ＡＣＳｉｒ１、ｐＢＡＣＳｉｒ２またはＢａｃＳｉｒ１９ａと同一または類似である。さ
らに、ｐＤｏｎｏｒＳｉｒ２と同一または類似の第３の核酸が開示される。この系の１つ
の適用は、各々、補完された完全なウイルスゲノムの１つのコピーを含有する、第４、第
５の核酸または複数の第４または第５の核酸分子の構築である。
【０２５９】
実施例の簡単な説明
本発明に提供される方法による第４の核酸分子に対応する反応生成物は、核酸分子ｐＤ
ｏｎｏｒＳｉｒ１またはｐＤｏｎｏｒＳｉｒ１９ａおよびそれぞれｐＢＡＣＳｉｒ１また
はｐＢＡＣＳｉｒ１９ａと同一または類似のヌクレオチド酸分子間の組合せと、それに続
く大腸菌宿主細胞における部位特異的組換えに起因する。２種の核酸分子ｐＤｏｎｏｒＳ
ｉｒ１およびｐＢＡＣＳｉｒ１間の部位特異的組換えに起因する反応生成物を、ＸｈｏＩ
を使用する制限分析によって特徴付けた（図２Ａ）。１回組換えられた反応生成物ｐＲＡ
Ｂ１ｘ（配列番号４）および２回組換えられた反応生成物ｐＲＡＢ２ｘ（配列番号５）の
制限分析が、図２Ａに示されている。得られた反応生成物ｐＲＡＢ１ｘおよびｐＲＡＢ２
ｘは、ＰａｃＩを用いる制限消化によって反応生成物から放出された、補完された完全な
ヒトアデノウイルス５型ゲノムの正確に１つのコピーを含有していた。ＰａｃＩ消化され
たＤＮＡを、２９３細胞にトランスフェクトし、組換えアデノウイルスが得られた。２９
３細胞の増殖性感染後に単離されたアデノウイルス由来のＤＮＡを、ＸｈｏＩを用いる制
限消化によって分析した（図２Ａ）。Ｆｌｐ媒介性組換え反応および得られた１回および
２回組換えられた反応生成物の模式図が、図１に示されている。
【０２６０】
ｐＤｏｎｏｒＳｉｒ２およびｐＢＡＣＳｉｒ２の大腸菌宿主細胞における組合せおよび
部位特異的組換えに起因する、本発明に提供された方法による第５の核酸分子に各々対応
する複数の反応生成物を、ＸｈｏＩを使用する制限分析によって特徴付けた（図２Ｂ）。
１回組換えられた反応生成物ｐＲＡＢ＿ＲＰＳＬ＿１ｘ（配列番号１１）および２回組換
えられた反応生成物ｐＲＡＢ＿ＲＰＳＬ＿２ｘ（配列番号１２）のＸｈｏＩを用いる制限
分析が、図２Ｂに示されている。得られた反応生成物の大部分（８３／８８）は、ｐＤｏ
ｎｏｒＳｉｒ２およびｐＢＡＣＳｉｒ２間の単回組換えに起因していた（図２Ｂ）。（２
／８８）組換え生成物の制限消化パターンは、２重に組み換えられた生成物ｐＲＡＢ＿Ｒ
ＰＳＬ＿２ｘに対応していた。反応スキームおよび反応生成物の模式図が、図３に示され
ている。単回組換えられた生成物ｐＲＡＢ＿ＲＰＳＬ＿１ｘでは、原核生物において調節
活性を有する調節核酸配列、本明細書では、大腸菌ガラクトキナーゼプロモーターおよび
陰性選択マーカー、本明細書では、ＲＰＳＬ遺伝子は、互いに機能的に分離しているが、
驚くべきことに、二重に組換えられた生成物ｐＲＡＢ＿ＲＰＳＬ＿２ｘについては、陰性
選択マーカーは、２種の陽性選択マーカーと組み合わせて、高度に機能的であり、二重に
組換えられた反応生成物の最小のバックグラウンドにつながった。この実施例において得
られた結果に基づいて（図３）、二重組換え生成物ｐＲＡＢ＿ＲＰＳＬ＿２ｘの高効率対
抗選択のための、陽性および陰性選択マーカーの可能性ある組合せを説明するマトリック
スが図６に示されている。
【０２６１】
別の実施例では、第１の核酸分子および第２の核酸分子間のＦｌｐリコンビナーゼによ
って媒介される部位特異的組換えを、部位特異的リコンビナーゼを提供する真核細胞宿主
細胞において行った。核酸分子ｐＤｏｎｏｒＳｉｒ１−ＥＧＦＰ（配列番号９）およびｐ
ＢＡＣＳｉｒ２を、それぞれ、第１および第２の制限部位を認識する酵素を用いて消化し
、直線化された核酸分子を、Ｆｌｐリコンビナーゼを安定に発現する２９３細胞にトラン
スフェクトした。得られた組換え生成物は、２９３細胞において複製能力のあるＥＧＦＰ
遺伝子を発現する補完された完全なヒトアデノウイルス５型ゲノムの１つのコピーを含有
していた（図４）。
【０２６２】
本発明者らは、本明細書に記載されたＦＲＴ／Ｆｌｐベースの技術を別のアデノウイル
ス血清型に移すことができ、ＧＦＰを発現する組換えアデノウイルス型Ａｄ１９ａベクタ
ーを作製した。アデノウイルス１９ａ型ゲノムを、左側ＩＴＲを含むＡｄ１９ａゲノムの
左側末端、パッケージング部位およびポリアデニル化部位を含めたＥ１遺伝子領域につい
て欠失しているＢＡＣ（ｐＢＡＣＳｉｒ１９ａ）に、欠失しているエレメントのコピーを
保持するドナープラスミドのＦｌｐ媒介性挿入を可能にするためにこの部位に導入された
ＦＲＴ部位を用いてクローニングした。さらに、微量のキャプシッドタンパク質をコード
するｐＩＸ遺伝子の発現に必要であるｐＩＸプロモーターが、核酸ｐＢＡＣＳｉｒ１９ａ
中に保存された。さらに、ｐＢＡＣＳｉｒ１９ａはまた、欠失されたＥ３領域も有してい
た。ｐＢＡＣＳｉｒ１９ａベクターの配列は、配列番号１４に提供されている。ｐＩＸプ
ロモーター、より詳しくは、アデノウイルスｐＩＸプロモーターは、当技術分野で公知で
あり、その配列は、公的に入手可能なデータバンクから検索され得る。それに関連して、
当業者ならば、本明細書において好ましく使用されるｐＩＸプロモーターは、アデノウイ
ルスにおいてｐＩＸコード配列と作動可能に連結しているプロモーターであり、このよう
なアデノウイルスは、好ましくは、アデノウイルス５型またはアデノウイルス１９ａ型で
あるということは認識されよう。一実施形態では、ｐＩＸプロモーターは、最小のプロモ
ーターであり、ここで前記の最小のプロモーターは、アデノウイルスｐＩＸ遺伝子の上流
のプロモーター領域に起因する７０ヌクレオチドのＤＮＡエレメントである。さらなる実
施形態では、最小のｐＩＸプロモーターは、Ａｄ５にＴＡＴＡボックスおよびＳｐ１ボッ
クスを含み、アデノウイルスゲノムのヌクレオチド３５１１〜３５８０に対応する。アデ
ノウイルスの多数のその他の（血清）型は、ｐＩＸ遺伝子およびその上流プロモーターを
同様に含有し、これらのｐＩＸプロモーターに起因する最小のプロモーターも、本発明に
同様に包含される。
【０２６３】
ドナー核酸ｐＤｏｎｏｒＳｉｒ１９ａは、ＰａｃＩ部位、Ａｄ１９ａ  ＩＴＲおよびパ
ッケージングシグナルならびにＥＧＦＰ転写単位を保持し、ドナーベクターｐＤｏｎｏｒ
Ｓｉｒ１に匹敵するが、すべてのウイルスシスエレメントは、ヒトアデノウイルス１９ａ
型由来の配列（配列番号１５）によって置き換えられている。本発明において提供された
方法に従って得られた反応生成物は、核酸分子ｐＤｏｎｏｒＳｉｒ１９ａおよびそれぞれ
ｐＢＡＣＳｉｒ１９ａと同一または類似のヌクレオチド酸分子間の大腸菌宿主細胞におけ
る組合せとそれに続く部位特異的組換えに起因する、複製能力のある組換えアデノウイル
ス１９ａ型ゲノム全体を含有していた。得られた反応生成物を、ＫｐｎＩを使用する制限
分析によって特徴付けた（図７）。得られた核酸の２種の独立したクローン（レーン１お
よびレーン４）を精製し、ＰａｃＩを用いて消化し、２９３細胞をトランスフェクトし、
生存可能な組換えＡｄ１９ａベクターが得られた。
【０２６４】
各々、本発明において提供される方法による第５の核酸分子に対応する複数の反応生成
物は、ｐＤｏｎｏｒＳｉｒ２＿Ａｄ１９ａの大腸菌宿主細胞における組合せおよび部位特
異的組換えに起因する。プラスミドｐＤｏｎｏｒＳｉｒ２＿Ａｄ１９ａは、本発明の第３
の核酸分子の実施形態であり、すべてのＡｄ５由来の配列に関してｐＤｏｎｏｒＳｉｒ２
とは異なり、それらは、対応するＡｄ１９ａ配列によって置き換えられている。ｐＤｏｎ
ｏｒＳｉｒ２＿ａｄ１９ａおよびｐＢＡＣＳｉｒ１９ａ間の組換えの結果、本発明に従っ
て、単一の組換え生成物が得られる。この単一の組換えられた生成物では、原核生物にお
いて調節活性を有する調節核酸配列、本明細書では、大腸菌ガラクトキナーゼプロモータ
ーおよび陰性選択マーカー、本明細書では、ＲＰＳＬ遺伝子は、互いに機能的に分離して
いるが、驚くべきことに、二重に組換えられた生成物については、陰性選択マーカーは、
２種の陽性選択マーカーと組み合わせて、高度に機能的であり、二重に組換えられた反応
生成物の最小のバックグラウンドにつながる。この実施例において得られた結果に基づい
て、二重組換え生成物の高効率対抗選択のための、陽性および陰性選択マーカーの可能性
ある相乗的組合せを説明するマトリックスが図６に示されている。
【０２６５】
好ましい実施形態の説明
本発明は、ウイルスのゲノムの第２の部分を含む第２の核酸分子と組み合わせたウイル
スのゲノムの第１の部分を有する第１の核酸を開示し、第１および第２の核酸分子を、部
位特異的リコンビナーゼを提供する大腸菌宿主細胞において組み合わせ、部位特異的組換
えによって反応させる。得られた核酸分子は、あるウイルスまたは該ウイルスの補完され
た完全なゲノムの正確に１つのコピーを含有し、ウイルスゲノムは、許容細胞において複
製能力がある。本発明の概略図が、図１に示されている。本発明のさらなる実施形態では
、第３の核酸分子が記載される。第３の核酸を、部位特異的リコンビナーゼを提供する大
腸菌宿主細胞において、第２の核酸分子と組み合わせ、部位特異的組換えによって反応さ
せる。第３の核酸分子中の遺伝エレメントの機構は、発明性があり、本発明において提供
される方法に従って、９７．５％超の場合において組換え事象の数を１に制限する。この
効率は、複数の第５の核酸分子または第５の核酸分子のライブラリーの構築にとって十分
であり、単一の組換えられた生成物についてこのような複数の核酸またはライブラリーを
スクリーニングする必要性という問題を解決する。本方法の図表示は、図３に示されてい
る。
【０２６６】
第１の核酸分子は、ウイルスのゲノムの第１の部分、優先的には、アデノウイルスのゲ
ノムの第１の部分、さらにより優先的には、ヒトアデノウイルス５型またはヒトアデノウ
イルス１９ａ型の第１の部分を含む。さらに、第１の核酸分子は、転写単位、部位特異的
組換え部位、優先的には最小のＦｒｔ部位（配列番号７）、（ｉ）条件付き複製のための
細菌ヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第１の選択マーカーを提供する核酸配列を含む細
菌ヌクレオチド配列を含む。好ましい実施形態では、第１の核酸は、ウイルスのあるゲノ
ムまたは該ゲノムの第１の部分を含有する細菌プラスミドであり、あるウイルスまたは該
ウイルスのゲノムの第１の部分は、末端反復、好ましくは、逆方向末端反復である。より
好ましい実施形態では、ウイルスは、アデノウイルスであり、末端反復は、アデノウイル
スの逆方向末端反復である。最も好ましい実施形態では、ウイルスは、ヒトアデノウイル
ス５型であり、ヒトアデノウイルス５型のゲノムの第１の部分は、左側逆方向末端反復で
ある。
【０２６７】
本発明の一実施形態では、ウイルスのゲノムの第１の部分は、パッケージングシグナル
を含む。好ましい実施形態では、パッケージングシグナルは、末端配列の部分であり、よ
り好ましい実施形態では、パッケージングシグナルは、ＡＶ５ゲノムのｎｔ１９４からｎ
ｔ３８５に伸びるヒトアデノウイルス５型に由来するパッケージングシグナル（Ψ５）で
ある。アデノウイルスベクターのパッケージングは、一部が他のものよりもより重要であ
る階層的順序で使用される一連の７個の「Ａ」の反復に頼っている。したがって、この領
域に由来する配列の部分を組み合わせることによって合成または最小パッケージング配列
を規定することがあり得る。アデノウイルスゲノムの左側部分へのシス作用性パッケージ
ングエレメントの位置が、アデノウイルスの多数のその他の型について実験的に確認され
ている。さらに、パッケージングプロセスのトランス作用因子の同定によって、サブタイ
プ特異的な方法で作用するいくつかのアデノウイルスタンパク質が同定され、これは、キ
ャプシド形成シグナルΨおよびトランス作用因子が、同一サブタイプに由来するか、適合
性である場合には、ウイルスＤＮＡのパッケージングのみを可能にする。
【０２６８】
本発明のさらなる実施形態では、ｎｔ１からｎｔ３４２（配列番号１０）のＥ１転写単
位のＴＡＴＡボックスの上流のＡＶ５ゲノムの左側末端の全部または部分を含む、ウイル
スのゲノムの第１の部分。
【０２６９】
本発明のさらなる実施形態では、ウイルスのゲノムの第１の部分は、逆方向末端反復（
ＩＴＲ）を含有し、好ましい実施形態では、逆方向反復は、ヒトアデノウイルス５型（Ａ
Ｖ５）の左側末端に由来し、左側逆方向末端反復を含む。左側逆方向末端反復配列（左側
ＩＴＲ）の長さは、ＡＶ５配列のヌクレオチド１からヌクレオチド１０３に伸長する。Ｉ
ＴＲの大きさは、アデノウイルスの血清学的に別個の型の間で変わり、ｉｎ  ｖｉｖｏで
ヒトアデノウイルス４型ウイルス複製を支持する１８ｂｐ（ｎｔ１からｎｔ１８）程度の
短い最小末端ＩＴＲ配列が、規定され得る。ＩＴＲの末端１８ｂｐは、ＤＮＡ複製の基礎
レベルを支持するが、それぞれ、サブグループＣアデノウイルス、ＡＶ２およびＡＶ５で
は最大効率のために補助的領域が必要とされる。その他のウイルス型（例えば、アデノ随
伴ウイルスＡＶＶ）はまた、ウイルス複製のためのＩＴＲの存在に頼っている。ヒトＡＡ
Ｖ２型については、ＩＴＲの長さは、１４５ヌクレオチドであり、ウイルス複製のために
必要な必須の末端配列である。原則はまた、複製およびキャプシド形成に必要なＩＴＲ以
外の末端配列を含有する、その他の型のウイルス（例えば、ＳＶ４０、バキュロウイルス
、γヘルペスウイルス）にも当てはまる。例として、サイトメガロウイルスゲノムのα配
列は、単純ヘルペスウイルス欠損ゲノムの切断／パッケージングシグナルとして機能する
。
【０２７０】
一実施形態では、本発明の第１の核酸は、第１の制限部位を含み、この配列は、ウイル
スのゲノムの第１の部分中、および第１の核酸中に存在する転写単位中には存在しない。
本発明の好ましい実施形態では、制限部位は、アデノウイルスのゲノム中に存在しない制
限部位の群から選択される。より好ましい実施形態では、制限部位は、ＡｂｓＩ、Ｂｓｔ
ＢＩ、ＰａｃＩ、ＰｓｒＩ、ＳｇｒＤＩおよびＳｗａＩを含む、ヒトアデノウイルス５型
（ＡＶ５）中に存在しない部位の群から選択される。
【０２７１】
第１の核酸分子は、以下のエレメント：部位特異的組換え部位、（ｉ）条件付き複製の
ための細菌ヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第１の選択マーカーを提供するヌクレオチ
ド配列を含む細菌ヌクレオチド配列、第１の制限部位、ウイルスのゲノムの第１の部分な
らびに転写単位を含み、好ましい実施形態では、ウイルスは、アデノウイルスであり、よ
り好ましい実施形態では、ウイルスは、ヒトアデノウイルス５型またはヒトアデノウイル
ス１９ａ型である。
【０２７２】
さらなる実施形態では、本発明は、場合により第１の制限酵素を用いる第１の核酸分子
の直鎖化後に得られる５’から３’方向に、以下のエレメントを含む第１の核酸分子を提
供する。ウイルスのゲノムの第１の部分、転写単位、部位特異的組換え部位、（ｉ）条件
付き複製のための細菌ヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第１の選択マーカーを提供する
ヌクレオチド配列を含む細菌ヌクレオチド配列単位、場合により第１の制限部位。発明的
内容によって、これが、第１の核酸分子の遺伝エレメントの好ましい方向である。
【０２７３】
本発明の一実施形態では、第１の核酸は、遺伝エレメントを、５’→３’方向で、部位
特異的組換え部位、転写単位、ウイルスのゲノムの第１の部分、場合により第１の制限部
位、ならびに（ｉ）条件付き複製のための細菌ヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第１の
選択マーカーを提供する配列を含む細菌ヌクレオチド配列単位を含む「ミラーコンホメー
ション」で含有する。発明的内容によって、これが、第１の核酸分子の遺伝エレメントの
さらなる方向である。
【０２７４】
さらなる実施形態では、「ミラーコンホメーション」のウイルスのゲノムの第１の部分
は、末端反復を含む。好ましい実施形態では、ウイルスのゲノムの第１の部分は、逆方向
末端反復を含む。より好ましい実施形態では、ウイルスゲノムの右側末端反復を含み、さ
らにより好ましくは、アデノウイルスの右側末端反復は、ヒトアデノウイルス５型ウイル
スゲノムのゲノムの最後の１０３ヌクレオチドである。
【０２７５】
本発明のさらなる実施形態は、プロモーター、場合により発現させる核酸配列および終
結シグナルを含有する転写単位に関する。
【０２７６】
本発明のさらなる実施形態は、第１の核酸はプロモーターと作動可能に連結している発
現させる核酸配列および終結シグナルを含む転写単位を含有し、プロモーターは、ＰＧＫ
などの真核生物ＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩおよびＣＭＶによって認識される真核生物もしくは
ウイルスプロモーターの群から、またはＵ６、Ｈ１、ｔＲＮＡおよびアデノウイルスＶＡ
プロモーターなどのＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩＩによって認識される真核生物もしくはウイル
スのプロモーターの群から選択されるべきである。
【０２７７】
本発明のさらなる実施形態は、プロモーター、発現させる核酸配列および終結シグナル
を含有する転写単位に関し、発現させる核酸は、タンパク質、ペプチドをコードする核酸
、マイクロＲＮＡおよび低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）およびｓｈＲＮＡを含めた非コ
ーディングＲＮＡをコードする核酸の群から選択される。
【０２７８】
本発明の別の態様では、転写単位は、プロモーター、発現させる配列および転写終結シ
グナルを含有し、それでは、終結シグナルは、ポリＡシグナル、ストレッチＴヌクレオチ
ドなどのＲＮＡ  ＰｏｌＩＩＩによって転写される遺伝子の終結シグナルなどの真核生物
またはウイルスの遺伝子に由来する。
【０２７９】
本発明のさらなる実施形態では、第１の核酸は、Ｆｌｐリコンビナーゼの部位特異的組
換え部位を含む。第１の核酸分子において使用されるＦｒｔ部位は、Ｓ．セレビシエ（ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のμプラスミドに由来する野生型Ｆｒｔ部位に基づいている。本発
明の一実施形態では、使用されるＦｒｔ部位は、野生型の４８種のＦｒｔ部位に由来する
形態に制限されない（配列番号８）。それは、当技術分野で公知の突然変異Ｆｒｔ部位を
含めたその他のＦｒｔ部位の群から選択され得る（Ｓｃｈｌａｋｅ  Ｔ．およびＢｏｄｅ
Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：１２７４６〜１２７５１頁、１９９４年５４；
ＷＯ／１９９９／０２５８５４）。本発明の好ましい実施形態では、第１の核酸分子にお
いて使用されるＦｒｔ部位は、ｗｔ  ＦＲＴ部位のＲ２、ＵおよびＲ３エレメントを含有
する、３４ｎｔの長さの最小の組換え部位である（配列番号７）（Ｃｈｅｒｅｐａｎｏｖ
ＰＰおよびＷａｃｋｅｒｎａｇｅｌ  Ｗ．Ｇｅｎｅ１５８：９〜１４頁、１９９５年）
。
【０２８０】
本発明の一実施形態では、細菌配列単位を有する第１の核酸分子は、（ｉ）条件付き複
製のための細菌配列、および（ｉｉ）第１の選択マーカーを提供する配列を含み、複製の
ための細菌配列は、複製起点（ｏｒｉ）を含有する。
【０２８１】
本発明の別の実施形態では、細菌配列単位を有する第１の核酸分子は、（ｉ）条件付き
複製のための細菌配列、および（ｉｉ）第１の選択マーカーを提供する配列を含み、複製
のための細菌配列は、細菌細胞が必要なすべての機能を提供する特別な条件下での、特別
な大腸菌株における、または正常な大腸菌株における条件付き複製のための複製起点を含
有する。好ましい実施形態では、第１の核酸分子中の細菌配列は、ｐｉタンパク質発現の
存在下でのみ維持され得る条件付きレプリコンとしてファージｇＲ６Ｋの最小のｏｒｉを
含有する（Ｓｈａｆｆｅｒｍａｎ  Ａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６１：５７〜７６頁
、１９８２年）。
【０２８２】
本発明の一実施形態は、第１の選択マーカーを提供する配列を有する第１の核酸分子を
提供し、選択マーカーは、選択薬剤に対するこのような核酸を有する細胞に耐性を付与す
る核酸である。本発明の好ましい実施形態では、第１の選択マーカーは、遺伝子をコード
し、より好ましい実施形態では、第１の選択マーカーは、好ましくは、当技術分野で公知
のものの中でも、アンピシリン、ゼオシン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール、テ
トラサイクリンおよびカナマイシンを含めた抗生物質に対する耐性を媒介する。本発明の
最も好ましい実施形態では、第１の選択マーカーは、カナマイシンに対する耐性を媒介す
る。
【０２８３】
第１の選択マーカーは、当技術分野で公知の遺伝子の中でも、ｂｌａ、ａｎｔ（３’’
）−Ｉａ、ａｐｈ（３’）−ＩＩ、ａｐｈ（３’）−ＩＩ、ｂｌｅおよびｃｍｌＡ、ａａ
ｄＡ、ａａｄＢ、ｓａｃＢおよびｔｅｔＡ遺伝子を含めた抗生物質に対する耐性を媒介す
る遺伝子の群から選択され得る。好ましい実施形態では、カナマイシンに対する耐性を媒
介するタンパク質をコードする遺伝子が、第１の選択マーカーである。
【０２８４】
本発明の一実施形態は、以下のエレメント：（ｉ）単一コピー複製のための細菌ヌクレ
オチド配列、および（ｉｉ）第２の選択マーカーを提供するヌクレオチド配列を含む細菌
ヌクレオチド配列単位、部位特異的組換え部位、ウイルスのゲノムの第２の部分、ならび
に場合により第２の制限部位と呼ばれる制限部位を含む第２の核酸分子である。
【０２８５】
本発明の一実施形態は、ウイルスのゲノムの第２の部分を含有する第２の核酸分子であ
り、ウイルスのゲノムの第１の部分と組み合わせるウイルスのゲノムの第２の部分は、補
完性細胞株において複製できる、補完された完全なウイルスゲノムを形成する。
【０２８６】
好ましい実施形態では、第２の核酸は、アデノウイルスゲノムの第２の部分を含有し、
より好ましい実施形態では、第２の核酸は、ヒトアデノウイルス５型（ＡＶ５）ゲノムの
第２の部分を含有する。より好ましい実施形態では、ウイルスゲノムの第２の部分は、Ａ
Ｖ５の左側ＩＴＲ、Ｅ１領域およびＥ３領域について欠失しており、場合により、キャプ
シド形成シグナルΨ５について欠失しているＡＶ５ゲノムであり、第１の核酸が、このウ
イルスゲノムを、左側ＩＴＲについて、場合により、キャプシド形成シグナルについて補
完する。さらに、許容細胞株が、シスまたはトランスで欠失された配列について補完し得
る限りは、Ｅ２またはＥ４領域に由来するさらなる配列が、同様に欠失され得るので、Ａ
Ｖ５ゲノムの第２の部分の欠失は、Ｅ１およびＥ３に限定されない。
【０２８７】
別の好ましい実施形態では、第２の核酸は、アデノウイルスゲノムの第２の部分を含有
し、より好ましい実施形態では、第２の核酸は、ヒトアデノウイルス１９ａ型（ＡＶ１９
ａ）ゲノムの第２の部分を含有する。より好ましい実施形態では、ウイルスゲノムの第２
の部分は、ＡＶ１９ａの左側ＩＴＲ、Ｅ１領域およびＥ３領域について欠失しており、場
合により、キャプシド形成シグナルΨ５について欠失しているＡＶ１９ａゲノムであり、
第１の核酸が、このウイルスゲノムを、左側ＩＴＲについて、場合により、キャプシド形
成シグナルについて補完する。さらに、許容細胞株が、シスまたはトランスで欠失された
配列について補完し得る限りは、Ｅ２および／またはＥ４領域に由来するさらなる配列が
、同様に欠失され得るので、ＡＶ１９ａゲノムの第２の部分の欠失は、Ｅ１およびＥ３に
限定されない。さらに、微量のキャプシッドタンパク質をコードするｐＩＸ遺伝子の発現
に必要であるｐＩＸプロモーターは、核酸ｐＢＡＣＳｉｒ１９ａにおいて保存された。
【０２８８】
本発明の一実施形態は、部位特異的組換え部位を含有する第２の核酸である。部位特異
的組換え部位は、Ｆｌｐリコンビナーゼの組換え部位を含む群から選択される。本発明の
好ましい実施形態では、使用されるＦｒｔ部位は、Ｓ．セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ）のμプラスミドに由来する野生型Ｆｒｔ４８部位であるが、それに制限されない。当
技術分野で公知の突然変異Ｆｒｔ部位を含めたその他のＦｒｔ部位が使用され得る。
【０２８９】
本発明のさらなる実施形態では、ウイルスのゲノムの第２の部分は、末端反復、好まし
くは、ウイルスの末端反復、より好ましくは、逆方向末端反復を含む。好ましくは、逆方
向末端反復は、アデノウイルスゲノム由来の右側逆方向末端反復であり、最も好ましい実
施形態では、アデノウイルスゲノムは、ヒトアデノウイルス５型またはヒトアデノウイル
ス１９ａ型に由来し、逆方向末端反復は、ヒトアデノウイルス５型またはヒトアデノウイ
ルス１９ａ型の右側逆方向末端反復である。
【０２９０】
本発明の一実施形態は、第２の制限部位を含む第２の核酸分子を提供し、制限部位は、
ウイルスのゲノムの第２の部分中に存在しない。制限部位は、本特許に開示される方法に
従って含有される核酸の直鎖化のために使用される。さらに、第２の制限部位は、第１の
核酸分子によって提供されるウイルスのゲノムの第１の部分中に、また第１の制限部位か
ら組換え部位の範囲の、ウイルスゲノムの第１の部分を包含する第１の核酸の配列部分中
には存在しない。本発明のより好ましい実施形態では、制限部位は、アデノウイルスのゲ
ノム中に存在しない制限部位の群から選択される。さらにより好ましい実施形態では、制
限部位は、ホーミングエンドヌクレアーゼによって認識される部位およびジンクフィンガ
ーヌクレアーゼの合成結合部位のその他の型を含めた、当業者に公知のその他の制限部位
の中でもＡｂｓＩ、ＢｓｔＢＩ、ＰａｃＩ、ＰｓｒＩ、ＳｇｒＤＩおよびＳｗａＩを含む
、ヒトアデノウイルス５型（ＡＶ５）中に存在しない部位の群から選択される。
【０２９１】
本発明の一実施形態は、（ｉ）単一コピー複製のための細菌ヌクレオチド配列、および
（ｉｉ）第２の選択マーカーを提供するヌクレオチド配列を含む細菌ヌクレオチド配列単
位を含有する第２の核酸を提供する。好ましい実施形態では、複製のための細菌ヌクレオ
チド配列（ｏｒｉ）は、大腸菌における低コピー、好ましくは、単一コピー維持に必要な
すべてのエレメントを含有する。より好ましい実施形態では、第２の核酸中のｏｒｉは、
ｆ−エピソーム因子（Ｆ因子）に基づいており、大腸菌における複製および維持に必要な
すべてのエレメントを含有する。
【０２９２】
本発明の１つのさらなる実施形態は、制限酵素、好ましくは、第２の制限部位を認識し
、切断する制限酵素を用いる第２の核酸分子の直鎖化の際に、５’→３’方向で以下のエ
レメント：（ｉ）単一コピー複製のための細菌ヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第２の
選択マーカーを提供するヌクレオチド配列を含む細菌ヌクレオチド配列単位、部位特異的
組換え部位、ウイルスのゲノムの第２の部分、ならびに場合により第２の制限部位を含む
第２の核酸分子である。
【０２９３】
本発明のさらなる実施形態では、第２の核酸分子は、耐性媒介遺伝子、より好ましくは
、酵素をコードする耐性媒介遺伝子をコードする第２の選択マーカーを提供する配列を含
有する。第２の核酸において使用される選択マーカーは、第１の核酸分子中に存在する選
択マーカーとは異なる。好ましい実施形態では、第２の選択マーカーは、当技術分野で公
知のものの中でも、アンピシリン、ゼオシン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコールお
よびカナマイシンを含めた抗生物質に対する耐性を付与する。最も好ましい実施形態では
、第２の選択マーカーは、クロラムフェニコールに対する耐性を媒介する。
【０２９４】
第２の核酸分子中の第２の選択マーカーは、当技術分野で公知のその他の遺伝子の中で
も、ｂｌａ、ａｎｔ（３’’）−Ｉａ、ａｐｈ（３’）−ＩＩ、ａｐｈ（３’）−ＩＩ、
ｂｌｅ、ａａｄＡ、ａａｄＢおよびｃｍｌＡ遺伝子を含めた抗生物質に対する耐性を媒介
する遺伝子の群から選択され得る。より好ましい実施形態では、第２の選択マーカーは、
クロラムフェニコールに対する耐性を媒介するタンパク質をコードする遺伝子である。
【０２９５】
「ミラーコンホメーション」と呼ばれる本発明のさらなる実施形態では、第２の核酸分
子は、５’→３’方向で以下のエレメント：場合により第２の制限部位、ウイルスのゲノ
ムの第２の部分、組換え部位ならびに（ｉ）単一コピー複製のための細菌ヌクレオチド配
列、および（ｉｉ）第２の選択マーカーを提供するヌクレオチド配列を含む細菌ヌクレオ
チド配列単位を提供し、ウイルスのゲノムの第２の部分は、ウイルスゲノムの左側末端反
復、好ましい実施形態では、左側逆方向末端反復（ＩＴＲ）を提供する。より好ましい実
施形態では、ウイルスは、アデノウイルスであり、さらにより好ましい実施形態では、ア
デノウイルスは、ヒトアデノウイルス５型またはヒトアデノウイルス１９ａ型である。
【０２９６】
本発明のさらなる実施形態では、第２の核酸分子は、「ミラーコンホメーション」にお
いて、パッケージングシグナルを提供するウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムの第２の
部分を提供し、好ましい実施形態では、ウイルスは、アデノウイルスであり、より好まし
い実施形態では、アデノウイルスは、ヒトアデノウイルス５型またはヒトアデノウイルス
１９ａ型である。
【０２９７】
本発明の一実施形態では、第２の核酸は、大腸菌において単一コピーベクターとして複
製し、使用されるｏｒｉは、Ｆ因子またはＰ１レプリコンに基づいている。好ましい実施
形態では、第２の核酸は、細菌人工染色体（ＢＡＣ）であるが、ＢＡＣに限定されない。
しかし、この系は、十分な機能性を保持するために、大腸菌における第２の核酸の低コピ
ー、好ましくは、単一コピー維持を必要とする。より好ましい実施形態では、ｐＢＡＣＳ
ｉｒ１、ｐＢＡＣＳｉｒ２またはｐＢＡＣ  Ｓｉｒ１９ａと同一または類似のＢＡＣベク
ターは、左側ＩＴＲおよびキャプシド形成シグナルについて欠失している、第１世代のＥ
１およびＥ３が欠失したＡｄベクターゲノムをコードし、単一コピー維持に必要である複
製起点のエレメントとしてｐａｒＳ  ｔｈｅ  ｐａｒＡ、ｐａｒＢおよびｐａｒＣ遺伝子
を含有する。
【０２９８】
本発明の一実施形態は、第１の核酸分子の環状の閉じた形態の、第２の核酸分子の環状
の閉じた形態との組合せであり、好ましい実施形態では、使用される第１の核酸は、プラ
スミドであり、第２の核酸は、ＢＡＣベクターである。
【０２９９】
本発明のさらなる実施形態は、第１および第２の核酸分子の組合せであり、両核酸分子
は、別個の分子として存在する。用語「別個の分子」とは、各分子が、物理的に別個の構
成成分に解離できることを意味する。本発明の好ましい実施形態では、第１の核酸分子は
、プラスミドであり、第２の核酸分子は、ＢＡＣである。
【０３００】
本発明の一実施形態は、第１の核酸分子の、第２の核酸分子との組合せであり、第１の
核酸によって提供されるウイルスのゲノムの第１の部分および第２の核酸によって提供さ
れるウイルスのゲノムの第２の部分は、一緒になると、完全なウイルスゲノムを形成する
。用語「完全なウイルスゲノム」は、真核細胞株へのトランスフェクションの際に、生存
可能な、複製能力のあるウイルスを生じさせる、ウイルスのゲノム配列をコードする核酸
を説明する。このような細胞株は、許容細胞株と呼ばれる。本発明の好ましい実施形態で
は、ウイルスゲノムは、アデノウイルスゲノムであり、本発明のより好ましい実施形態で
は、ウイルスゲノムは、ヒトアデノウイルス５型ゲノムまたはヒトアデノウイルス１９ａ
型ゲノムである。
【０３０１】
本発明の一実施形態は、第１の核酸分子の、第２の核酸分子との組合せであり、第１の
核酸分子によって提供される第１の制限部位および第２の核酸分子によって提供される第
２の制限部位は、ウイルスのゲノムの第１の部分および第２の部分ならびに転写単位中に
存在しない制限部位を含む群から選択される。好ましい実施形態では、制限部位は、ヒト
アデノウイルス５型ゲノムにおいて切断されない群：ＡｂｓＩ、ＢｓｔＢＩ、ＰａｃＩ、
ＰｓｒＩ、ＳｇｒＤＩおよびＳｗａＩから選択される。さらなる好ましい実施形態では、
第１および第２の制限部位は、同一であり、さらにより好ましい実施形態では、第１およ
び第２の制限部位は、ＰａｃＩである。
【０３０２】
本発明の一実施形態では、完全なウイルスゲノムは、アデノウイルスゲノムであり、よ
り好ましい実施形態では、アデノウイルスは、ヒトアデノウイルス５型またはヒトアデノ
ウイルス１９ａ型である。さらにより好ましい実施形態では、完全なウイルスゲノムは、
第１世代−Ｅ１およびＥ３が欠失しているヒトアデノウイルス５型またはヒトアデノウイ
ルス１９ａ型であるが、Ｅ２領域に由来するさらなる配列がさらに欠失され得るか、また
は複数の領域が変更され得、またはガットレスアデノウイルスベクターにおいては、左側
および右側ＩＴＲならびにパッケージングシグナルを除く完全なウイルスゲノムでさえ欠
失しているので、この型のアデノウイルスゲノムに限定されない。
【０３０３】
本発明の一実施形態は、第１の核酸分子の、第２の核酸分子との組合せであり、第１の
核酸分子によって提供される第１の選択マーカーおよび第２の核酸分子によって提供され
る第２の選択マーカーは、好ましくは、抗生物質に対する耐性を付与する酵素をコードす
る遺伝子である。遺伝子は、当技術分野で公知のものの中でも、カナマイシン、ネオマイ
シン、ピューロマイシン、アンピシリン、ゼオシン、ゲンタマイシンおよびクロラムフェ
ニコールに対する耐性を付与する群から選択され得る。好ましい実施形態では、第１の選
択マーカーは、カナマイシンに対する耐性を付与する遺伝子であり、選択マーカーは、ク
ロラムフェニコールに対する耐性を付与するが、カナマイシンに対しては付与しない遺伝
子である。特に、選択薬剤が抗生物質である場合には、いくつかの遺伝子が、２種以上の
選択薬剤に対する耐性を媒介し（Ｔｅｎｏｒｉｏ  Ｃら  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌ．３９：８２４〜８２５頁、２００１年）、第１および第２の核酸の選択マーカーの
可能性ある組合せを限定することは、当技術分野では公知である。
【０３０４】
本発明の一実施形態は、第１の核酸分子の、第２の核酸分子との組合せであり、第１の
核酸分子によって提供される複製のための細菌配列によって、細菌細胞が必要なすべての
機能を提供する特定の条件下での、特定の大腸菌株における、または正常な大腸菌株にお
ける条件付き複製が可能となる。さらに、第１および第２の核酸の複製のための配列の組
合せによって、宿主細胞における第２の核酸の複製のみが可能となる。細菌複製のための
配列の組合せが、宿主細胞またはその核酸自体によって提供される因子の存在に制限され
ることは、当技術分野で公知である（Ｓｃｏｔｔ  ＪＲ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  
ｐｌａｓｍｉｄ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．４８：１〜２
３頁、１９８４年）。好ましい実施形態では、第１の核酸分子中の細菌配列は、ｐｉタン
パク質発現の存在下でのみ維持され得る条件付きレプリコンとしてファージｇＲ６Ｋの最
小のｏｒｉを含有し、第２の核酸の複製のための配列は、Ｆ因子に基づいており、大腸菌
細胞における単一コピー維持を可能にする。
【０３０５】
本発明の一実施形態は、ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムの第１の部分を提供する
第１の核酸分子およびウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムの第２の部分を提供する第２
の核酸分子の組合せであり、パッケージングシグナルは、ウイルスのゲノムの第１または
第２の部分のいずれかによって提供され得る。好ましい実施形態では、ウイルスは、アデ
ノウイルスであり、より好ましい実施形態では、ウイルスは、ヒトアデノウイルスであり
、さらにより好ましい実施形態では、ウイルスは、ヒトアデノウイルス５型（ＡＶ５）ま
たはヒトアデノウイルス１９ａ型であり、パッケージングシグナルは、ＡＶ５またはヒト
アデノウイルス１９ａ型（Ψ１９ａ）に由来し、第１の核酸分子によって提供される。
【０３０６】
本発明の一実施形態は、第１の核酸分子の、第２の核酸分子との組合せであり、第１の
末端反復配列は、第１の核酸分子によって提供されるあるウイルスまたは該ウイルスのゲ
ノムの第１の部分の部分であり、第２の末端反復配列は、第２の核酸分子によって提供さ
れるウイルスのゲノムの第２の部分の部分である。
【０３０７】
本発明のさらなる実施形態では、第１または第２の核酸分子のいずれかは、すべての末
端反復配列を提供し得る。好ましい実施形態では、末端反復配列は、アデノウイルスに由
来する逆方向末端反復配列であり、さらにより好ましい実施形態では、逆方向末端反復は
、ＡＶ５またはヒトアデノウイルス１９ａ型に由来する。
【０３０８】
本発明の一実施形態は、第１の核酸分子の、第２の核酸分子との組合せを含む、ウイル
スをコードする核酸分子を作製するための方法を開示し、両核酸は、その部位特異的組換
え部位によって反応させ、組換え生成物を形成し、組換え生成物が選択され、完全なウイ
ルスゲノムの１つのみのコピーを含有し、組換え生成物は、第１および第２の制限酵素で
切断される。
【０３０９】
本発明の一実施形態は、第１および第２の核酸分子を、原核生物宿主細胞において組み
合わせ、その部位特異的組換え部位によって反応させる、ウイルスをコードする核酸分子
を作製するための方法を開示する。宿主細胞は、好ましくは、細菌細胞であり、エレクト
ロポレーションされるか、または標準法に従って化学的に能力があるようにされるのいず
れかによって核酸を受容し得る。好ましい実施形態では、細菌宿主細胞は、第２の核酸分
子を有し、エレクトロポレーションによって第１の核酸分子を受容する。最も好ましい実
施形態では、細菌は、大腸菌である。
【０３１０】
本発明のさらなる実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｆ因子を欠き、第１および第２の選
択薬剤に対して感受性である大腸菌細胞の群から選択される。好ましい実施形態では、大
腸菌株は、Ｋ１２由来であり、ｐｉタンパク質を提供または発現しない。ｐｉタンパク質
は、第１の核酸分子の複製を維持するが、第２の核酸分子の複製は維持しない。より好ま
しい実施形態では、大腸菌株は、カナマイシンおよびクロラムフェニコールに対して感受
性であり、当技術分野で公知のものの中でもＤＨ５α、ＤＨ１０Ｂを含む群から選択され
る。
【０３１１】
本発明の一実施形態は、ウイルスをコードする核酸分子を作製するための方法を開示し
、第１の選択マーカーを有する第１の核酸分子および第２の選択マーカーを有する第２の
核酸分子を組み合わせ、部位特異的リコンビナーゼの存在下でその組換え部位によって反
応させ、原核生物宿主細胞において組換え生成物を形成する。方法は、両選択マーカーに
対する耐性を付与することによって、反応生成物が宿主細胞において選択されるようなも
のである。第１の核酸中の条件付き複製起点の使用によって、方法が、もっぱら反応生成
物を選択することが確実になる。好ましい実施形態では、第１の選択マーカーは、カナマ
イシンであり、第２の選択マーカーは、クロラムフェニコールである。
【０３１２】
本発明の一実施形態は、ＡＴＰのようなエネルギーの供給源を必要とせず、第１の核酸
分子によって提供される第１の部位特異的組換え部位および第２の核酸分子によって提供
される第２の部位特異的組換え部位間の組換えを触媒する部位特異的リコンビナーゼの存
在下で、第１の核酸分子および第２の核酸分子を組み合わせ、反応させる、ウイルスをコ
ードする核酸分子を作製するための方法を開示する。好ましい実施形態では、部位特異的
リコンビナーゼは、Ｆｌｐであり、それは、第１の核酸上に存在するＦｒｔ部位特異的組
換え部位および第２の核酸上に存在するＦｒｔ部位特異的組換え部位間の組換えを媒介す
る。Ｆｌｐは、Ｆｒｔ部位間の部位特異的組換えを触媒し、認識された部位特異的組換え
部位は、ヒトおよび細菌ゲノム中に総計的に存在しないよう十分に大きい。本発明によれ
ば、第１の核酸では、最小の野生型Ｆｒｔ３４部位が使用され、第２の核酸中に存在する
野生型Ｆｒｔ４８部位と反応させる。しかし、同等の高い選択性および効率で機能する限
り、当技術分野で公知のその他の部位特異的リコンビナーゼが使用されてもよい。
【０３１３】
本発明の一実施形態は、ウイルスをコードする核酸分子を作製するための方法を開示し
、第１の核酸分子および第２の核酸分子を、部位特異的リコンビナーゼの存在下で組み合
わせ、反応させ、リコンビナーゼが不活化される。大腸菌における部位特異的リコンビナ
ーゼの長期の存在は、ゲノムの安定性を干渉するということは、一般に承認されている。
Ｃｒｅの場合には、潜在性ｌｏｘＰ部位が、哺乳類ゲノムにおいて認識されており、遺伝
的不安定性を引き起こし、ＢＡＣおよびＰＡＣベクターを受け取るためのＣｒｅ含有大腸
菌の使用を制限する（Ｓｅｍｐｒｉｎｉ  Ｓら  Ｃｒｙｐｔｉｃ  ｌｏｘＰ  ｓｉｔｅｓ
ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｇｅｎｏｍｅｓ：ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｄｉｓｔｒｉ
ｂｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｌｅｖａｎｃｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  
ｏｆ  ＢＡＣ／ＰＡＣ  ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３５：１４０２〜１４１０頁、１９９７年）。核酸分子
が、大腸菌において組換えられ、さらに増殖されることを必要とする場合には、好ましく
は、部位特異的組換えの一過性の発現が望ましく、さらにより好ましくは、部位特異的リ
コンビナーゼの発現は、組換えが起こった後および細菌の増殖の間に十分に排除される。
【０３１４】
ウイルスをコードする核酸分子を作製するための方法の好ましい実施形態では、Ｆｌｐ
発現は、λファージに由来する温度感受性レプレッサーによって制御される。Ｆｌｐ発現
は、培養温度を４３℃に移すことによって誘導される。この手順によって、プラスミドの
排除（キュアリング）が同時に可能となる。部位特異的リコンビナーゼの条件付き発現お
よび／または誘導性発現のためのその他の系が、例えば、それに限定されるものではない
が、発現を誘導するためのアラビノース誘導性ＡｒａＣ−ＰＢＡＤプロモーターの使用の
代わりに使用され得る（Ｌｅｅ  ＥＣ．らＧｅｎｏｍｉｃｓ７３：５６〜６５頁、２００
１年）。
【０３１５】
ウイルスをコードする核酸分子を作製するための方法のさらなる実施形態では、細菌細
胞における部位特異的リコンビナーゼの条件付き発現が使用され、Ｆｌｐ部位特異的リコ
ンビナーゼの発現単位を有するプラスミドの複製が、温度感受性複製起点によって制御さ
れる。好ましい実施形態では、第２の核酸分子およびＦｌｐ発現単位を提供する細菌プラ
スミド（ｐＣＰ２０）を有する大腸菌宿主細胞が、アンピシリンの存在下、３０℃で維持
され、増殖され得る。Ｆｌｐ発現は、培養温度を４３℃に移すことによって誘導される。
この手順によって、ｐＣＰ２０の排除（キュアリング）が同時に可能となる（Ｃｈｅｒｅ
ｐａｎｏｖ  ＰＰおよびＷａｃｋｅｒｎａｇｅｌ  Ｗ、Ｇｅｎｅ１５８：９〜１４頁、１
９９５年）。
【０３１６】
ウイルスをコードする核酸分子の作製のために開示される方法では、完全なウイルスを
コードする核酸が、第１および第２の制限酵素での制限消化によって放出され得る。本発
明の好ましい実施形態では、制限部位は、アデノウイルスのゲノム中に存在しない制限部
位の群から選択され、さらにより好ましい実施形態では、制限部位は、ＡｂｓＩ、Ｂｓｔ
ＢＩ、ＰａｃＩ、ＰｓｒＩ、ＳｇｒＤＩおよびＳｗａＩを含む、ヒトアデノウイルス５型
（ＡＶ５）中に存在しない部位の群から選択される。
【０３１７】
本発明の一実施形態は、第１の核酸分子の直鎖形態の、第２の核酸分子の直鎖形態との
組合せを含む、ウイルスをコードする核酸分子を作製するための方法を開示し、両核酸を
、許容細胞においてその部位特異的組換え部位によって反応させて、組換え生成物を形成
し、組換え生成物が選択されず、完全なウイルスゲノムの１つのコピーのみを含有し、部
位特異的リコンビナーゼが、許容細胞によって提供され、部位特異的リコンビナーゼが、
構成的な、条件付きな方法で、または誘導的な方法で発現される。部位特異的リコンビナ
ーゼの条件付き発現または誘導性発現は、当技術分野で公知のその他の系の中でも、テト
ラサイクリン調節発現系を用いて達成され得る。本発明の好ましい実施形態では、許容細
胞は、部位特異的リコンビナーゼを安定に発現し、許容細胞は、２９３、９１１、Ｐｅｒ
．Ｃ６およびＣＡＰ細胞を含む群から選択される。さらにより好ましい実施形態では、許
容細胞は、２９３であり、部位特異的リコンビナーゼＦｌｐは、構成的に発現される。
【０３１８】
本発明の一実施形態は、部位特異的リコンビナーゼの存在下で、第１の核酸分子および
第２の核酸分子を組み合わせ、反応させるウイルスをコードする核酸分子を作製するため
の方法を提供し、本発明に従って、得られた核酸分子は、完全ウイルスゲノムの１つのコ
ピーを含有し、これは、第１および第２の制限酵素での制限消化によって放出され得、許
容細胞株にトランスフェクトされると、生存可能な複製能力のあるウイルスを生成し、許
容細胞は、２９３、９１１、Ｐｅｒ．Ｃ６およびＣＡＰ細胞を含む群から選択される。さ
らにより好ましい実施形態では、許容細胞は、２９３である。
【０３１９】
本発明の一実施形態は、ウイルスをコードする核酸分子を作製するための方法を提供し
、ウイルスは、遺伝子導入ベクターとして、ワクチンとして使用され得るか、または治療
用途のために使用され得る。
【０３２０】
本発明の一実施形態は、ウイルスをコードする核酸分子を作製するための方法を提供し
、方法は、核酸を発現する多数のウイルスまたはウイルスのライブラリーを作製するため
に使用され得る。
【０３２１】
本発明は、第３の核酸を開示し、第３の核酸分子は、以下のエレメント：場合により、
あるウイルスまたは該ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムの第１の部分、ヌクレオチド
配列、好ましくはゲノムヌクレオチド配列または転写単位、原核生物において調節活性を
有する調節核酸配列、部位特異的組換え部位、陰性選択マーカーを提供するヌクレオチド
配列、（ｉ）条件付き複製のための細菌ヌクレオチド配列、および（ｉｉ）陽性選択マー
カーを提供するヌクレオチド配列を含む細菌ヌクレオチド配列単位、ならびに場合により
第１の制限部位を含む。
【０３２２】
本発明のさらなる実施形態では、第３の核酸分子は、好ましくは、第１の制限酵素での
切断の際に、５’から３’方向で以下のエレメント：場合によりあるウイルスまたは該ウ
イルスのあるゲノムまたは該ゲノムの第１の部分、ヌクレオチド配列、好ましくはゲノム
ヌクレオチド配列または転写単位、原核生物において調節活性を有する調節核酸配列、部
位特異的組換え部位、陰性選択マーカーを提供するヌクレオチド配列、（ｉ）条件付き複
製のための細菌ヌクレオチド配列、および（ｉｉ）陽性選択マーカーを提供するヌクレオ
チド配列を含む細菌ヌクレオチド配列を含む。
【０３２３】
本発明の一実施形態では、第３の核酸によって提供されるあるウイルスまたは該ウイル
スのるゲノムまたは該ゲノムの第１の部分は、末端配列の部分を含有する。本発明の好ま
しい実施形態では、末端配列は、末端反復を含む。さらに、あるウイルスまたは該ウイル
スのあるゲノムまたは該ゲノムの第１の部分は、許容細胞株において複製可能である完全
なウイルスゲノムであるために存在しなくてはならない。本発明のより好ましい実施形態
では、あるウイルスまたは該ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムの第１の部分は、アデ
ノウイルスゲノムに由来し、さらにより好ましい実施形態では、ヒトアデノウイルスゲノ
ムの第１の部分は、ヒトアデノウイルス５型（ＡＶ５）ゲノムに由来し、Ｅ１転写単位（
ｎｔ１からｎｔ３４２）（配列番号１０）のＴＡＴＡボックスの上流のＡＶ５ゲノムの左
側末端のすべてまたは部分を含む。本発明のさらなる実施形態では、第３の核酸分子は、
パッケージングシグナルを、ウイルスゲノム部分として含む、あるウイルスまたは該ウイ
ルスのあるゲノムまたは該ゲノムの第１の部分を提供する。より好ましい実施形態では、
パッケージングシグナルは、アデノウイルスゲノムに由来し、さらにより好ましい実施形
態では、アデノウイルスゲノムの第１の部分は、ヒトアデノウイルス５型（ＡＶ５）の左
側末端に由来するパッケージングシグナルΨ５を含有する。
【０３２４】
本発明の一実施形態では、第３の核酸分子によって提供される、あるウイルスまたは該
ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムの第１の部分は、あるウイルスまたは該ウイルスの
あるゲノムまたは該ゲノムの末端配列を含む。より好ましい実施形態では、末端配列は、
逆方向末端反復（ＩＴＲ）であり、さらにより好ましくは、逆方向反復は、アデノウイル
スゲノムに由来し、最もより好ましい実施形態では、アデノウイルスゲノムの第１の部分
は、ヒトアデノウイルス５型（ＡＶ５）の左側末端に由来する逆方向末端反復を含有する
。
【０３２５】
本発明の一実施形態では、第３の核酸は、第１の制限部位を含み、第１の制限部位は、
あるウイルスまたは該ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムの第１の部分中および第３の
核酸中に存在する転写単位中に存在しない。本発明の好ましい実施形態では、制限部位は
、アデノウイルスのゲノム中に存在しない制限部位の群から選択され、より好ましい実施
形態では、制限部位は、ＡｂｓＩ、ＢｓｔＢＩ、ＰａｃＩ、ＰｓｒＩ、ＳｇｒＤＩおよび
ＳｗａＩを含む、ヒトアデノウイルス５型（ＡＶ５）中に存在しない部位の群から選択さ
れる。
【０３２６】
さらなる実施形態では、第３の核酸分子は、好ましくは、第１の制限酵素での切断の際
に５’→３’方向で、ミラーコンホメーションで、原核生物において活性を有する調節核
酸配列、部位特異的組換え部位、陰性選択マーカーを提供するヌクレオチド配列、（ｉ）
条件付き複製のための細菌ヌクレオチド配列、および（ｉｉ）陽性選択マーカーを提供す
るヌクレオチド配列を含む細菌ヌクレオチド配列、第１の制限部位、あるウイルスまたは
該ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムの第１の部分ならびに転写単位を提供し、あるウ
イルスまたは該ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムの第１の部分は、末端反復を含む。
好ましい実施形態では、ミラーコンホメーションで第３の核酸によって提供されるあるウ
イルスまたは該ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムの第１の部分は、逆方向末端反復を
含む。より好ましい実施形態では、逆方向末端反復は、ウイルスゲノムの右側末端反復、
さらにより好ましくはアデノウイルスの右側末端反復であり、最も好ましい実施形態では
、アデノウイルスの右側末端反復は、ＡＶ５の最後の１８〜１０３のヌクレオチドを包含
するヒトアデノウイルス５型に由来する右側ＩＴＲである。
【０３２７】
本発明の一実施形態では、第３の核酸分子は、遺伝子転写単位を含み、転写単位は、プ
ロモーター、発現させる核酸配列および終結シグナルを含有する。プロモーターは、ＰＧ
Ｋなどの真核生物ＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩおよびＣＭＶによって認識される真核細胞もしく
はウイルスプロモーターの群から、またはＵ６、Ｈ１、ｔＲＮＡおよびアデノウイルスＶ
ＡプロモーターなどのＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩＩによって認識される真核生物もしくはウイ
ルスのプロモーターの群から選択される。発現させる核酸は、タンパク質、ペプチドをコ
ードする核酸、マイクロＲＮＡおよび低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）およびｓｈＲＮＡ
を含めた非コーディングＲＮＡをコードする核酸の群から選択される。終結シグナルは、
ポリＡシグナル、ストレッチＴヌクレオチドなどのＰｏｌＩＩＩによって転写される遺伝
子の終結シグナルなどの真核生物またはウイルスの遺伝子に由来する。
【０３２８】
本発明のさらなる実施形態では、第３の核酸は、Ｆｌｐリコンビナーゼによって認識さ
れる部位特異的組換え部位を含む。第３の核酸分子において使用されるＦｒｔ部位は、Ｓ
．セレビシエのμプラスミドに由来する野生型Ｆｒｔ部位に基づいている。本発明のさら
なる実施形態では、使用されるＦｒｔ部位は、野生型４８Ｆｒｔ部位に由来する形態に制
限されない。それは、当技術分野で公知の突然変異Ｆｒｔ部位を含めたその他のＦｒｔ部
位の群から選択され得る。本発明の好ましい実施形態では、第３の核酸分子において使用
されるＦｒｔ部位は、ｗｔ  ＦＲＴ４８部位（配列番号８）のＲ２、ＵおよびＲ３エレメ
ントを含有する、３４ｎｔの長さの最小の組換え部位（Ｆｒｔ３４部位、配列番号７）で
ある。
【０３２９】
本発明の一実施形態では、細菌配列単位を有する第３の核酸分子は、（ｉ）条件付き複
製のための細菌配列、および（ｉｉ）陽性選択マーカーを提供する配列を含み、条件付き
複製のための細菌配列は、細菌細胞が必要なすべての機能を提供する特定の条件下での、
特定の大腸菌株における、または正常な大腸菌における複製のための複製起点（ｏｒｉ）
を含有する。グラム陰性菌におけるプラスミドベクターの複製は、宿主酵素およびプラス
ミドによって提供される決定因子によって制御される。プラスミドの複製は、細菌宿主に
おいて、複製に必要なすべての因子が、シスまたはトランスで存在する場合にのみ起こる
（Ｋｕｅｓ  ＵおよびＳｔａｈｌ  Ｕ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｒｅｖｉｅｗｓ  ５３：４
９１〜５１６頁）。好ましい実施形態では、第３の核酸分子中の細菌配列は、ｐｉタンパ
ク質発現の存在下でのみ維持され得る条件付きレプリコンとしてファージｇＲ６Ｋの最小
のｏｒｉを含有する。
【０３３０】
本発明の一実施形態は、陽性選択マーカーを提供する配列を有する第３の核酸分子を提
供し、選択マーカーは、酵素をコードする核酸であり、酵素は、選択薬剤に対する耐性を
媒介し、陽性選択マーカーは、当技術分野で公知のその他の遺伝子の中でも、ｂｌａ、ａ
ｎｔ（３’’）−Ｉａ、ａｐｈ（３’）−ＩＩ、ａｐｈ（３’）−ＩＩ、ｂｌｅおよびｃ
ｍｌＡを含めた、抗生物質に対する耐性を媒介する遺伝子の群から選択され得る。好まし
い実施形態では、カナマイシンに対する耐性を媒介するタンパク質をコードする遺伝子が
、陽性選択マーカーとして使用される。
【０３３１】
本発明において開示される第３の核酸分子は、陰性選択マーカーを提供し、選択マーカ
ーは、選択薬剤に対する感受性を媒介する酵素をコードする核酸であり、原核生物宿主細
胞における陰性選択マーカーの発現は、原核生物において調節活性を有するヌクレオチド
配列によって制御される。好ましい実施形態では、調節ヌクレオチド配列は、プロモータ
ーであり、プロモーターは、優先的に、原核生物のプロモーターの群から選択される。さ
らにより好ましい実施形態では、プロモーターは、大腸菌ガラクトキナーゼプロモーター
である。
【０３３２】
本発明のさらなる実施形態では、調節ヌクレオチド配列は、誘導性原核生物プロモータ
ーの群から選択され得、プロモーターの活性は、当技術分野で公知のその他の方法および
系の中でも、オペロンの抑制解除、イオンおよび分子による遺伝子の誘導、温度によるプ
ロモーター活性の調節を含めた種々の手段によって調節され得る。
【０３３３】
本発明のさらなる実施形態では、第３の核酸分子によって提供される陰性選択マーカー
は、酵素をコードする遺伝子のクラスから選択され、酵素は、当技術分野で公知のものの
中でも、ストレプトマイシン、親油性化合物（フサリン酸およびキナリン酸（ｑｕｉｎａ
ｒｉｃ  ａｃｉｄ）、スクロース、ｐ−クロロフェニルアラニン、トリメトプリム、ｔ−
ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドに対する感受性を含めた、選択薬剤ま
たは条件に対する感受性を付与する。本発明の好ましい実施形態では、陰性選択マーカー
によってコードされる酵素は、ストレプトマイシンに対する感受性を媒介する。したがっ
て、陰性選択マーカーをコードする核酸は、当技術分野で公知のその他の遺伝子の中でも
、ｇａｌＫ、ｔｅｔＡＲ、ｐｈｅＳ、ｔｈｙＡ、ｌａｃｙ、ｃｃｄＢおよびｒｐｓＬを含
む遺伝子の群から選択され得る。好ましい実施形態では、ストレプトマイシンに対する感
受性を支配的に媒介するタンパク質をコードするｒｐｓＬ遺伝子が、陰性選択マーカーと
して使用される（Ｒｅｙｒａｔ  ＪＭら、Ｇｅｎｅ１５：９９〜１０２頁、１９８１年）
。
【０３３４】
本発明のさらなる実施形態は、第３および第２の核酸分子の組合せであり、両核酸は、
環状の閉じた分子として存在する。好ましい実施形態では、使用される第３の核酸分子は
、プラスミドであり、第２の核酸は、ＢＡＣベクターである。
【０３３５】
本発明のさらなる実施形態は、第３および第２の核酸分子の組合せであり、両核酸分子
が、別個の分子として存在する。用語「別個の分子」とは、各分子が、物理的に別個の構
成成分に解離できることを意味する。本発明の好ましい実施形態では、第３の核酸分子は
、プラスミドであり、第２の核酸分子は、ＢＡＣである。
【０３３６】
好ましい実施形態では、第３の核酸によって提供される核酸は、ウイルスのゲノムの第
１の部分を提供し、第２の核酸分子は、ウイルスのゲノムの第２の部分を提供する。第３
の、第２の核酸分子との組合せ後に得られた核酸は、１コピーの完全なウイルスゲノムを
含有する。本発明の好ましい実施形態では、ウイルスゲノムは、アデノウイルスゲノムで
あり、本発明のより好ましい実施形態では、ウイルスゲノムは、ヒトアデノウイルス５型
ゲノムである。
【０３３７】
本発明のさらなる実施形態は、第３の核酸の、第２の核酸との組合せであり、第３の核
酸によって提供される核酸は、あるウイルスまたは該ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノ
ムの第１の部分であり、遺伝子導入単位を含有し、ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノム
の第２の部分を提供する第２の核酸分子と組み合わせる。得られた核酸分子は、正確に１
つの遺伝子導入単位を含有する、１コピーの完全なウイルスゲノムを含有する。本発明の
好ましい実施形態では、ウイルスゲノムは、アデノウイルスゲノムであり、本発明のより
好ましい実施形態では、ウイルスゲノムは、ヒトアデノウイルス５型ゲノムである。
【０３３８】
本発明によれば、得られた完全なウイルスゲノムは、第１および第２の制限酵素での制
限消化によって放出され得る。本発明の好ましい実施形態では、第１および第２の制限部
位は、両核酸分子に関して同一であり、本発明のより好ましい実施形態では、ＰａｃＩ酵
素によって認識される制限部位が使用される。
【０３３９】
本発明の一実施形態では、第１の制限部位および転写単位を有する、ウイルスのあるゲ
ノムまたは該ゲノムの第１の部分を提供する第３の核酸分子を、第２の制限部位を有する
ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムの第２の部分を提供する第２の核酸分子と組み合わ
せ、制限部位は、あるウイルスまたは該ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムの第１の部
分および第２の部分ならびに転写単位中には存在しない制限部位を含む群から選択される
。好ましい実施形態では、制限部位は、ヒトアデノウイルス５型ゲノム中で切断されない
群：ＡｂｓＩ、ＢｓｔＢＩ、ＰａｃＩ、ＰｓｒＩ、ＳｇｒＤＩおよびＳｗａＩから選択さ
れる。本発明のさらにより好ましい実施形態では、第１および第２の制限部位は、Ｐａｃ
Ｉである。
【０３４０】
本発明の一実施形態は、ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムの第１の部分を提供する
第３の核酸分子の、ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムの第２の部分を提供する第２の
核酸分子との組合せであり、両核酸は、そのＦｒｔ部位によって組換えられ、１コピーの
完全な補完されたウイルスゲノムを含有する分子を形成し得る。得られた完全な補完され
たウイルスゲノムは、第１および第２の制限酵素での制限消化によって放出され得、した
がって、許容細胞株にトランスフェクトされると生存可能であり、複製能力がある。本発
明の好ましい実施形態では、ウイルスは、アデノウイルスであり、より好ましい実施形態
では、アデノウイルスは、ヒトアデノウイルス５型（ＡＶ５）である。さらにより好まし
い実施形態では、得られた完全なウイルスゲノムは、第１世代−Ｅ１およびＥ３が欠失し
ているＡＶ５であり、Ｅ２およびＥ４領域に由来するさらなる配列がさらに欠失され得る
か、または複数の領域が変更され得、またはガットレスアデノウイルスベクターにおいて
は、左側および右側ＩＴＲならびにパッケージングシグナルを除く完全なウイルスゲノム
でさえ欠失しているので、アデノウイルスゲノムの組成は、Ｅ１およびＥ３が欠失したゲ
ノムに限定されない。「許容細胞株」とも呼ばれるウイルスの再構成および増殖のために
使用される細胞株は、欠失しているか、または変更されている領域のすべてをシスまたは
トランスで補完できる。第１世代ＡＶ５ウイルスゲノムの場合には、当技術分野で公知の
ものの中でも、２９３、９１１、Ｐｅｒ．Ｃ６、Ｎ５２．Ｅ６などのＥ１について補完性
である細胞株が使用され得る。必要に応じて、トランスでウイルスゲノムのさらなる成分
を提供するその他の細胞株も、同様に使用され得る。さらに、前記の欠失された成分の一
過性発現または条件付き発現もまた、ウイルス再構成および複製を可能にするために使用
され得る。
【０３４１】
本発明の一実施形態では、第３の核酸分子は、陽性選択マーカーおよび陰性選択マーカ
ーを提供する。第２の核酸分子は、第２の選択マーカーを提供する。第３の、第２の核酸
分子との組合せの際に、得られた核酸分子は、第３の核酸に由来する陽性および陰性選択
マーカーならびに第２の核酸分子に由来する第２の選択マーカーを含む。本発明の好まし
い実施形態では、第３の核酸の陽性選択マーカーは、カナマイシンに対する耐性を付与し
、陰性選択マーカーは、ストレプトマイシンに対する感受性を付与し、第２の核酸分子に
よって提供される選択マーカーは、クロラムフェニコールに対する耐性を付与する。
【０３４２】
第３の核酸分子を、第２の核酸分子と組み合わせ、第２の核酸分子によって提供される
第２の選択マーカーは、第３の核酸分子によって提供される陽性選択薬剤および陰性選択
薬剤とは異なる選択薬剤に対する耐性を付与する酵素をコードする遺伝子を媒介する耐性
である。本発明の好ましい実施形態では、陽性選択マーカーは、カナマイシンに対する耐
性を付与する遺伝子であり、陰性選択マーカーは、ストレプトマイシンに対する感受性を
付与する遺伝子であり、第２の核酸によって提供される第２の耐性マーカーは、クロラム
フェニコールに対する耐性を付与するが、カナマイシンまたはストレプトマイシンに対す
る耐性は付与しない。いくつかの遺伝子が、特に、選択薬剤が抗生物質である場合には、
２種以上の選択薬剤に対する耐性を媒介し（Ｔｅｎｏｒｉｏ  ＣらＪ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ．３９：８２４〜８２５頁、２００１年）、第３および第２の核酸における
選択マーカーの可能性ある組合せを制限することは、当技術分野では公知である。
【０３４３】
本発明のさらなる実施形態は、第３の核酸の、第２の核酸との組合せであり、第３の核
酸分子は、陽性選択マーカーおよび陰性選択マーカーを提供し、陰性選択マーカーの活性
は、原核生物において調節活性を有する、第３の核酸によって提供される核酸配列によっ
て制御される。好ましい実施形態では、陰性選択マーカーの活性を制御する核酸配列は、
プロモーター、より好ましい実施形態では、原核生物のプロモーターである。さらにより
好ましい実施形態では、プロモーターは、大腸菌ガラクトキナーゼプロモーターである。
【０３４４】
本発明の一実施形態は、条件付き複製のための細菌ヌクレオチド配列を含む第３の核酸
分子の、単一コピー複製のためのさらなるヌクレオチド細菌配列を含む第２の核酸分子と
の組合せである。それにより、第３の核酸分子の複製のための細菌配列で、特定の条件下
での、特定の大腸菌株における、または正常な大腸菌株における条件付き複製が可能とな
り、細菌細胞は、必要なすべての機能を提供する。好ましい実施形態では、第３の核酸分
子中の細菌ヌクレオチド配列単位は、ｐｉタンパク質発現の存在下でのみ維持され得る条
件付きレプリコンとしてファージｇＲ６Ｋの最小のｏｒｉを含有し、第２の核酸の複製の
ための配列は、Ｆ因子に基づいており、大腸菌細胞における単一コピー維持を可能にする
（Ｓｃｏｔｔ  ＪＲ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌｓｍｉｄ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉ
ｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．４８：１〜２３頁、１９８４年）。
【０３４５】
本発明の一実施形態は、ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムの第１の部分を提供する
第３の核酸分子およびウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムの第２の部分を提供する第２
の核酸分子の組合せであり、パッケージングシグナルは、ウイルスのあるゲノムまたは該
ゲノムの第１または第２の部分のいずれかによって提供され得る。好ましい実施形態では
、ウイルスはアデノウイルスであり、より好ましい実施形態では、ウイルスはＡＶ５であ
り、パッケージングシグナルは、ＡＶ５のパッケージングシグナルであり、第３の核酸分
子によって提供される。
【０３４６】
本発明の一実施形態は、ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムの第１の部分を提供する
第３の核酸分子およびウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムの第２の部分を提供する第２
の核酸分子の組合せであり、少なくとも１つの末端反復配列が、第３のものによって提供
され、１つの末端反復配列が、第２の核酸によって提供される。本発明のさらなる実施形
態では、１つの核酸は、すべての末端配列を提供し得るが、この場合には、得られた核酸
は、核酸分子の１つの細菌ヌクレオチド配列単位を含有する完全なウイルスゲノムを含有
する。本発明の好ましい実施形態では、末端反復配列は、ウイルスのあるゲノムまたは該
ゲノムの逆方向末端配列（ＩＴＲ）である。さらにより好ましい実施形態では、ＩＴＲは
、アデノウイルスに由来し、第３の核酸分子は、左側ＩＴＲを提供し、第２の核酸分子は
、右側ＩＴＲを提供する。最も好ましい実施形態では、ＩＴＲは、ヒトアデノウイルス５
型に由来するＩＴＲである。
【０３４７】
本発明によれば、第３および第２の核酸は、部位特異的リコンビナーゼの作用によって
、そのＦｒｔ組換え部位によって、宿主細胞において組み合わせ、反応させ得る。得られ
た核酸分子は、補完された完全なウイルスゲノムの正確に１つのコピーを含有し、これは
、第１および第２の制限酵素での制限消化によって放出され得、制限部位は、第３の核酸
によって提供される転写単位、ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムの第１の部分および
ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムの第２の部分中に存在しない。本発明のより好まし
い実施形態では、制限部位は、アデノウイルスのゲノム中に存在しない制限部位の群から
選択され、さらにより好ましい実施形態では、制限部位は、ＡｂｓＩ、ＢｓｔＢＩ、Ｐａ
ｃＩ、ＰｓｒＩ、ＳｇｒＤＩおよびＳｗａＩを含む、ヒトアデノウイルス５型（ＡＶ５）
中に存在しない部位の群から選択される。
【０３４８】
本発明の好ましい実施形態は、第３の核酸分子の、第２の核酸との組合せであり、ウイ
ルスは、アデノウイルスであり、より好ましい実施形態では、ウイルスは、ヒトアデノウ
イルス５型である。
【０３４９】
本発明において提供される方法によれば、第１の、第２の核酸分子を用いた組換え生成
物は、好ましくは、以下のエレメント：（ｉ）単一コピー複製のための細菌配列、および
（ｉｉ）第２の選択マーカーを提供するヌクレオチド配列を含む細菌ヌクレオチド配列単
位、部位特異的組換え部位、ウイルスのゲノムの第２の部分、場合により第２の制限部位
、さらなる部位特異的組換え部位、（ｉ）条件付き複製のための細菌ヌクレオチド配列、
および（ｉｉ）第１の選択マーカーを提供するヌクレオチド配列を含む細菌ヌクレオチド
配列単位、ウイルスのゲノムの第１の部分、好ましくは転写単位ならびに第１の制限部位
を含む、第４の、好ましくは、環状の核酸分子である。
【０３５０】
本発明では、ウイルスゲノムをコードする第４の核酸分子を作製するための方法が開示
され、第１の核酸分子および第２の核酸分子は、提供され、組み合わせ、部位特異的組換
えが起こり、部位特異的組換え生成物が形成するように反応させる。好ましくは、部位特
異的組換えは、宿主細胞において起こり、より好ましくは、宿主細胞は大腸菌である。組
換え生成物は、場合により、選択され得、コピー、好ましくは、あるウイルスまたは該ウ
イルスのあるゲノムまたは該ゲノムの単一コピーを含有し、あるウイルスまたは該ウイル
スのゲノムは、補完された、完全なウイルスゲノムであり、第１および第２の制限酵素の
任意選択の切断の際に、得られた核酸は、許容細胞株およびこの許容細胞株において作製
され、増殖されたあるウイルスまたは該ウイルスにトランスフェクトされ得る。最も好ま
しい実施形態では、ウイルスは、アデノウイルスであり、さらにより好ましい実施形態で
は、ウイルスは、ヒトアデノウイルス５型である。
【０３５１】
本発明の一実施形態では、ウイルスをコードする核酸分子を作製するための方法が提供
され、第１の核酸分子および第２の核酸を組み合わせ、宿主細胞において、部位特異的組
換えが起こり、部位特異的組換え生成物が形成するよう反応させる。宿主細胞は、反応生
成物の選択を可能にし、宿主細胞ゲノムは、第２の核酸の単一コピー複製を可能にするＦ
因子の部分またはＦ因子について欠損しており、宿主細胞は、第１の核酸の条件付き複製
を可能にする因子の発現について欠損している。これは、宿主細胞における任意の反応し
ていない第１の核酸分子に対する選択を可能にする。好ましい実施形態では、宿主細胞は
、原核生物の宿主細胞であり、より好ましくは大腸菌である。さらにより好ましい実施形
態では、宿主細胞は、当技術分野で公知のものの中でも、ＤＨ１０Ｂを含めた、Ｋ１２由
来大腸菌宿主細胞を含む群から選択される。
【０３５２】
本発明のさらなる実施形態では、ウイルスをコードする核酸分子を作製するための方法
が提供され、それにより第１の核酸分子および第２の核酸分子が提供される。第１および
第２の核酸分子は、部位特異的組換えが起こり、部位特異的組換え生成物が形成するよう
に、宿主細胞において組み合わせ、反応させ、反応生成物は選択されることを必要とせず
、あるウイルスまたは該ウイルスの１つの完全な補完されたゲノムを含有する。提供され
る方法によれば、宿主細胞は、真核生物宿主細胞であり、第１および第２の核酸分子は、
好ましくは、第１および第２の制限酵素での切断の際に、好ましくは、直鎖核酸分子であ
り、真核細胞宿主細胞は、好ましくは、許容宿主細胞であり、さらにより好ましくは、宿
主細胞は、当技術分野で公知のものの中でも、２９３、９１１、Ｐｅｒ．Ｃ６、ＣＡＰ細
胞を含む、ヒトアデノウイルス５型の複製を可能にする群から選択される。アデノウイル
スが、ヒトアデノウイルス５型以外である場合には、許容宿主細胞は、このウイルスの複
製を可能にするよう規定される。許容宿主細胞において、１つの完全なアデノウイルスゲ
ノムを含有する直鎖核酸分子は複製可能であることは、当技術分野で公知である。ウイル
ス複製の効率は、アデノウイルスゲノムの末端が、アデノウイルスのＩＴＲで正確に終了
している場合に最適であり、末端タンパク質が、アデノウイルスゲノムの左側末端と結合
している場合には、さらにより効率的であるが、ＩＴＲを伸長する配列を有する、完全な
アデノウイルスゲノムを含有する核酸分子も複製されるので、これは、許容細胞における
アデノウイルス複製にとって必要条件ではない。
【０３５３】
本発明では、ウイルスをコードする第５の核酸分子を作製するための方法が提供され、
第３の核酸分子および第２の核酸分子は、部位特異的組換えが起こり、部位特異的組換え
生成物が形成するように組み合わせ、反応させ、組換え事象の数が１に限定されている反
応生成物が生成する。好ましくは、部位特異的組換えは、宿主細胞において起こり、より
好ましくは、宿主細胞は、大腸菌であり、組換え生成物の選択は、第３の核酸分子の陽性
選択マーカー、第３の核酸分子の陰性選択マーカーおよび第２の核酸分子の第２の選択マ
ーカーを提供する組換え生成物を有する宿主細胞（単数または複数）を選択することによ
って実施され、宿主細胞は、陰性選択マーカーに対して感受性ではない。この方法によれ
ば、陰性選択薬剤に対して感受性ではない宿主細胞が使用され、好ましくは、陰性選択薬
剤は、ストレプトマイシンである。好ましい実施形態では、宿主細胞は、ストレプトマイ
シンに対する耐性を付与するｒｐｓＬ遺伝子の突然変異体形態を発現する大腸菌である。
したがって、宿主細胞は、ｒｐｓＬ遺伝子の突然変異体形態を発現する大腸菌細胞の群か
ら選択され得、好ましくは、宿主細胞は、当技術分野で公知のものの中でも、ＤＨ１０Ｂ
を含む群から選択される。好ましい実施形態では、反応生成物を有する宿主細胞を選択す
るために使用される選択薬剤は、陽性選択マーカーについてはカナマイシンであり、第２
の選択薬剤についてはクロラムフェニコールであり、陰性選択薬剤としてストレプトマイ
シンである。陰性選択マーカーは、ｒｐｓＬの野生型形態をコードし、突然変異体ｒｐｓ
Ｌを発現する宿主細胞によって付与されるストレプトマイシンに対する耐性は、同一宿主
細胞株において、ｒｐｓＬの野生型および突然変異体対立遺伝子が発現される場合には劣
性であり、ストレプトマイシンに対する感受性をもたらす（Ｒｅｙｒａｔ  ＪＭら  Ｉｎ
ｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．１９９８、６６：４０１１〜４０１７頁；Ｌｅｄｅｒｂｅｒｇ  
Ｊ．Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ：  ａ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ
ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ  ｍｕｔａｎｔｉｏｎ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９５１、６１
：５４９〜５５０頁）。
【０３５４】
この方法によれば、部位特異的組換え部位を提供する第３の核酸分子を、部位特異的組
換え部位を提供する第２の核酸分子と組み合わせ、両核酸分子は、宿主細胞において、部
位特異的組換えによって反応させ、部位特異的リコンビナーゼは、原核生物宿主細胞によ
って提供される。それにより、部位特異的リコンビナーゼは、好ましくは、宿主細胞によ
って、宿主細胞ゲノムの部分としてか、または染色体外エレメントのいずれかとして提供
される。好ましい実施形態では、宿主細胞は、部位特異的リコンビナーゼを、染色体外プ
ラスミドとして提供し、より好ましい実施形態では、部位特異的リコンビナーゼはＦｌｐ
であり、プラスミドはｐＣＰ２０である。本発明の方法によれば、部位特異的リコンビナ
ーゼの発現は、反応の間制御され、発現の制御は、発現を誘導するためのアラビノース誘
導性ＡｒａＣ−ＰＢＡＤプロモーターなどの誘導性発現系の使用を含めた種々の方法によ
って達成され得る（Ｌｅｅ  ＥＣ．ら  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ７３：５６−６５、２００１
）が、これに限定されない。好ましい実施形態では、部位特異的リコンビナーゼの発現お
よびこのプラスミドの複製は、温度によって制御され、さらにより好ましい実施形態では
、Ｆｌｐを発現することは、λファージに由来する温度感受性レプレッサーによって制御
され、プラスミドの複製は、温度感受性複製起点によって制御され、温度感受性ＦＬＰ発
現プラスミドｐＣＰ２０が使用される（Ｃｈｅｒｅｐａｎｏｖ  ＰＰおよびＷａｃｋｅｒ
ｎａｇｅｌ  Ｗ．Ｇｅｎｅ１５８：９〜１４頁、１９９５年；Ｂｕｂｅｃｋ  Ａら、Ｊ．
Ｖｉｒｏｌ．７８：８０２６〜８０３５頁、２００４年）。
【０３５５】
この方法によれば、第３の核酸分子および第２の核酸分子の組合せとそれに続く、宿主
細胞における部位特異的組換え反応に起因する選択された反応生成物は、完全なウイルス
ゲノムを含み、選択された核酸分子は、第１の制限部位を有し、第２の制限部位は、好ま
しくは、アデノウイルスゲノム中には存在せず、より好ましくは、ヒトアデノウイルス５
型のゲノム中に存在しない、ＡｂｓＩ、ＢｓｔＢＩ、ＰａｃＩ、ＰｓｒＩ、ＳｇｒＤＩお
よびＳｗａＩを含む制限部位の群から選択される。この方法によれば、第３および第２の
核酸分子は、原核生物宿主細胞中に別個に導入され得、好ましい実施形態では、宿主細胞
は、第２の核酸を有し、最先端の技術を使用する第３の核酸分子を用いる形質転換にとっ
て能力のあるものにされる。提供される方法によれば、選択された組換え生成物は、完全
な補完されたウイルスゲノムを含み、これは、制限消化の際に、好ましくは、１種または
複数の制限酵素結合およびそれぞれ、第１および第２の制限部位での核酸の切断を用いる
制限消化の際に、反応生成物から放出され得る。この方法は、さらなるトランスフェクシ
ョンステップを含み、放出されたウイルスゲノムが、標準法を使用して、好ましくは、当
技術分野で公知のその他の方法の中でも、トランスフェクション試薬ポリエチレンイミン
（ＰＥＩ）またはリン酸カルシウムトランスフェクション法を使用して、許容真核生物宿
主細胞中に導入される。完全な補完されたウイルスゲノムの、真核生物許容宿主細胞への
トランスフェクションによって、複製能力のあるアデノウイルスベクターが得られ、ベク
ターは、遺伝子導入、ワクチンまたは任意の治療用途のために使用される。
【０３５６】
本発明では、ウイルスゲノムをコードする核酸分子のライブラリーを作製するための方
法が提供され、複数の第３の核酸分子および第２の核酸分子が提供され、複数の第３の核
酸分子および複数の第２の核酸分子を、部位特異的組換えが起こり、複数の核酸分子が形
成されるように組み合わせ、反応させ、全体として複数がライブラリーを形成し、ライブ
ラリーが、第２の核酸分子の以下のエレメント：（ｉ）単一コピー複製のための細菌ヌク
レオチド配列、および（ｉｉ）第２の選択マーカーを提供するヌクレオチド配列単位を含
む細菌ヌクレオチド配列単位、部位特異的組換え部位、ウイルスのゲノムの第２の部分な
らびに第２の制限部位と呼ばれる制限部位、ならびに場合によりウイルスのゲノムの第１
の部分、ヌクレオチド配列、好ましくはゲノムヌクレオチド配列または転写単位、原核生
物において調節活性を有する調節核酸配列、部位特異的組換え部位、陰性選択マーカーを
提供するヌクレオチド配列、（ｉ）条件付き複製のための細菌ヌクレオチド配列、および
（ｉｉ）陽性選択マーカーを提供するヌクレオチド配列を含む細菌ヌクレオチド配列単位
ならびに第１の制限部位を含む第３の核酸分子に由来するエレメントを含む複数の第５の
核酸分子からなる。
【０３５７】
本発明の一実施形態は、各々、完全な補完されたウイルスゲノムをコードする複数の第
５の核酸分子または第５の核酸分子のライブラリーを作製するための方法を開示し、複数
の第３の核酸分子および第２の核酸分子を組み合わせ、原核生物宿主細胞において提供さ
れる方法に従って反応させ、宿主細胞は、好ましくは、細菌細胞であり、エレクトロポレ
ーションされるか、または標準法に従って化学的に能力があるようにされるのいずれかに
よって核酸を受容し得る。好ましい実施形態では、細菌宿主細胞は、第２の核酸分子を有
し、エレクトロポレーションによって第３の核酸分子を受容する。より好ましい実施形態
では、細菌は、大腸菌である。
【０３５８】
提供される方法によれば、核酸分子のライブラリーは、多重組換え生成物についてスク
リーニングされる必要がない。方法は、組換え生成物を有する宿主細胞が、第２の選択マ
ーカーおよび陽性選択マーカーに対する耐性を付与し、陰性選択薬剤に対して感受性では
なく、陰性選択マーカーの発現を伴わないようなものである。さらに、提供される方法に
よれば、第３の核酸分子の条件付き複製によって、宿主細胞が、反応生成物のみを複製し
、不要な混入核酸分子をいずれも避けることが確実になる。好ましい実施形態では、陽性
選択マーカーは、カナマイシンに対する耐性を付与し、陰性選択マーカーは、ストレプト
マイシンに対する感受性を付与し、第２の核酸によって提供される第２の選択マーカーは
、クロラムフェニコールに対する耐性を付与する。
【０３５９】
本発明において提供される方法によれば、複数の個々のヌクレオチド配列を含むヌクレ
オチド配列のライブラリーを作製するための方法が提供され、ライブラリーは、各々、単
一の個々のヌクレオチド配列を含有する複数のウイルスゲノムによって表され、ヌクレオ
チド配列は、転写単位の部分である。本発明の好ましい実施形態では、核酸配列は、発現
させる核酸であり、ヌクレオチド配列は、完全なウイルスゲノム中に、単一コピーとして
存在する。より好ましい実施形態では、ウイルスは、アデノウイルスであり、方法は、複
数の個々のアデノウイルスを構築するための手段を提供する。さらにより好ましい実施形
態では、アデノウイルスは、ヒトアデノウイルス５型である。得られたアデノウイルスウ
イルスライブラリーは、遺伝子機能の同定のために、スクリーニング適用において、発現
ライブラリーまたはゲノムライブラリーを構築するために、また遺伝子導入のために使用
され得る。
【０３６０】
提供される方法によれば、各々ヌクレオチド配列を含有する複数の完全な補完されたア
デノウイルスゲノム、それにより各々の完全な補完されたアデノウイルスゲノムが、第１
および第２の制限酵素での制限消化によって放出され、許容宿主細胞へのトランスフェク
ションの際に生存可能な複製能力のあるアデノウイルスを生成し得る。アデノウイルスの
再構成および増殖のために使用される許容細胞株は、すべての欠失された領域をシスまた
はトランスで補完できる。第１世代のＡＶ５ウイルスゲノムの場合には、Ｅ１機能を補完
する許容細胞株が使用され得、細胞株は、当技術分野で公知のものの中でも、２９３、９
１１、Ｐｅｒ．Ｃ６、ＣＡＰを含む群から選択され得る。ウイルスゲノムのさらなる成分
をトランスで提供するその他の細胞株も同様に、必要に応じて使用され得る。さらに、ウ
イルス再構成および複製を可能にするために、前記の欠失された成分の一過性発現も使用
され得る。
【０３６１】
本発明の一実施形態では、場合により添付文書ならびに適した容器（単数または複数）
中に少なくとも第１の核酸分子、第２の核酸分子、場合により、部位特異的リコンビナー
ゼを提供する許容細胞株、第１の核酸分子および第２の核酸の組合せ、第３の核酸分子、
第３の核酸分子および第２の核酸分子の組合せ、第４の核酸分子、第５の核酸、複数の第
４の核酸分子、複数の第５の核酸分子または複数の個々のアデノウイルスを含むキットが
提供される。
【０３６２】
本発明のさらなる実施形態では、キットは、第１の核酸分子、第２の核酸の部分または
第２の核酸、好ましくは、第２の核酸の直鎖形態および部位特異的リコンビナーゼを提供
する許容細胞株を含む。好ましい実施形態では、第２の核酸の部分は、少なくとも部位特
異的組換え部位およびウイルスのゲノムの第２の部分を含む。本発明において提供される
方法によれば、各々、完全な補完されたウイルスゲノムにおいて、ヌクレオチド配列また
はヌクレオチド配列のライブラリーを含む、核酸または前記核酸のライブラリーが構築さ
れ得、核酸分子は、アデノウイルスまたは複数の個々のアデノウイルスを作製するために
、使用される準備ができており、前記許容細胞株中に直接導入され得、好ましい実施形態
では、細胞株は２９３であり、リコンビナーゼは、野生型Ｆｌｐリコンビナーゼであり、
アデノウイルスは、ヒトアデノウイルス５型である。
【０３６３】
本発明に関連して、ウイルスのゲノムのある部分が、本発明の第１の核酸分子および本
発明の第２の核酸分子間の、または本発明の第２の核酸分子および本発明の第３の核酸分
子間の組換えの場合におけるように、ウイルスのゲノムの部分または異なる部分を用いる
組換えの対象となるか、または組換えの対象となるべきである場合には、ウイルスは、同
一種のものである、好ましくは、同一血清型のものであるということは好ましい。より詳
しくは、本発明の第１の核酸分子が、アデノウイルス１９ａ型のゲノムの部分を含有し、
本発明の第２の核酸分子を用いる組換えの対象となるか、組換えの対象となるべきである
場合には、本発明の前記の第２の核酸分子はまた、アデノウイルス１９ａ型の部分を含有
する。本発明の第１の核酸分子は、アデノウイルス５型のゲノムの部分を含有し、本発明
の第２の核酸分子を用いる組換えの対象となるか、組換えの対象となるべきである場合に
は、本発明の前記第２の核酸分子はまた、アデノウイルス５型の部分も含有する。同様に
、本発明の第３の核酸分子が、アデノウイルス１９ａ型のゲノムの部分を含有し、本発明
の第２の核酸分子を用いる組換えの対象となるか、組換えの対象となるべきである場合に
は、本発明の前記第２の核酸分子はまた、アデノウイルス１９ａ型の部分も含有する。ま
た、本発明の第３の核酸分子が、アデノウイルス５型のゲノムの部分を含有し、本発明の
第２の核酸分子を用いる組換えの対象となるか、組換えの対象となるべきである場合には
、本発明の前記第２の核酸分子はまた、アデノウイルス５型の部分も含有する。
【０３６４】
本明細書において、用語核酸および核酸は、好ましくは、同義的な方法で使用される。
【０３６５】
本発明は、ここで、以下の図面および実施例を参照して記載されるが、これらは、単に
例示であって、本発明の範囲の限定と考えられてはならない。
【図面の簡単な説明】
【０３６６】
【図１】第１世代アデノウイルスゲノムを構築するための方法を示す図表示であり、ｐＤｏｎｏｒＳｉｒ１と同一または類似である第１の核酸およびｐＢＡＣＳｉｒ１と同一または類似である第２の核酸分子を組み合わせ、その組換え部位によって反応させ、第４の核酸（ｐＲＡＢ）を組換え生成物として形成し、これは、選択され得、完全な補完されたウイルスゲノムの正確に１つのコピーを含有する。第１および第２の選択マーカーを含有する第４の核酸を有する細菌は、第１および第２の選択薬剤を用いて選択され得る。単回組換え事象（ｐＲＡＢ１ｘ）に起因する第４の核酸分子の組成が、図１Ａに示されており、二重組換え事象（ｐＲＡＢ２ｘ）に起因する第４の核酸分子の組成が、図１Ｂに示されている。
【図２Ａ】制限酵素での制限消化によって分析された組換えアデノウイルスＢＡＣ由来のＤＮＡの組成およびこれらのＢＡＣから、実施例１および実施例２の開示された方法を使用して作製された２種の再構成された補完された第１世代アデノウイルスウイルス由来のＤＮＡの組成を示す。
【図２Ｂ】実施例３の開示された方法を使用して大腸菌において部位特異的組換え後に得られた、制限酵素での制限消化によって分析された組換えアデノウイルスＢＡＣ由来のＤＮＡの組成を示す。
【図３】複数の第５の核酸分子または第５の核酸分子のライブラリーを構築するための実施例３に開示された方法の図表示である。ｐＤｏｎｏｒＳｉｒ２と同一または類似の第３の核酸およびｐＢＡＣＳｉｒ２と同一または類似の第２の核酸を、その組換え部位によって組み合わせ、反応させ、第５の核酸を、選択され得、正確に１コピーの完全な補完されたウイルスゲノムを含有する組換え生成物として形成する（図３Ａ）。第３の核酸に由来する陽性、陰性選択マーカーおよび第２の選択マーカーを含有する第５の核酸を有する細菌が選択され得る。単回組換え事象（ｐＲＡＢ＿ＲＰＳＬ１ｘ）に起因する第５の核酸分子の模式的組成が、図３Ａに示されており、二重組換え事象（（ｐＲＡＢ＿ＲＰＳＬ２ｘ））に起因する第５の核酸分子の模式的組成が、図３Ｂに示されている。
【図４】実施例５の開示された方法を使用して、部位特異的リコンビナーゼＦｌｐを発現する２９３細胞における、第１および第２の核酸の直線化された形態の直接トランスフェクション後に得られた、アデノウイルスベクターを発現するＧＦＰを示す。
【図５】実施例３の開示された方法による、二重組換えＢＡＣ（ｐＲＡＢ＿ＲＰＳＬ２ｘ）を有する、種々の濃度の陰性選択薬剤を含有する培地における細胞の増殖の選択的阻害を示す。
【図６】本発明によって提供される方法による、複数の第５の核酸分子の作製に有用な陽性および陰性選択マーカーの組合せを示す。
【図７】実施例６の開示された方法を使用して、制限酵素での制限消化によって分析された、組換えヒトアデノウイルス１９ａ型ＢＡＣに由来するＤＮＡの組成を示す。
【０３６７】
図１は、第１世代アデノウイルスゲノムを構築するための方法を示す図表示であり、２
種の核酸を組み合わせ、その組換え部位によって反応させ、実施例１および２の開示され
る方法に従って第４の核酸分子に対応する組換え生成物を形成する。作製された第４の核
酸は、選択され得、正確に１コピーの完全な補完されたウイルスゲノムを含有する。反応
生成物は、許容細胞において複製され得る完全なウイルスゲノムを放出するために、場合
により、第１および第２の制限酵素で切断され得る。実施例１によれば、ｐＤｏｎｏｒＳ
ｉｒ１と同一または類似の第１の核酸ベクター（配列番号１）は、野生型Ｆｒｔ部位に由
来する最小のＦｒｔ３４組換え部位（配列番号７）、（ｉ）条件付き複製のための細菌ヌ
クレオチド配列（ＯｒｉＲ６Ｋ）、および宿主細胞にカナマイシンに対する耐性を付与す
る第１の選択マーカーを提供するヌクレオチド配列（ＫｎＲ）を含む細菌ヌクレオチド配
列、第１の制限部位（ＲＳ１）、アデノウイルスゲノムの左側ＩＴＲ（ＩＴＲｌｅｆｔ）
を含有するウイルスのゲノムの第１の部分およびパッケージングシグナルＥＳならびに転
写単位（ＴＵ）を含有する。第２の核酸は、野生型Ｆｒｔ４８組換え（配列番号８）部位
、アデノウイルスゲノムの右側ＩＴＲ（ＩＴＲｒｉｇｔｈ）を含むアデノウイルスのゲノ
ムの第２の部分（Ａｄ）、第２の制限部位（ＲＳ２）、ならびに（ｉ）単一コピー複製の
ための細菌ヌクレオチド配列（Ｆ’ｏｒｉ）、および（ｉｉ）宿主細胞にクロラムフェニ
コールに対する耐性を付与する第２の選択マーカーを提供するヌクレオチド配列（ＣｍＲ
）を含む細菌ヌクレオチド配列を含む、ｐＢＡＣＳｉｒ１（配列番号１３）またはｐＢＡ
ＣＳｉｒ２（配列番号２）と同一または類似であるＢＡＣベクターである。両核酸分子は
、Ｆｌｐリコンビナーゼの存在下で、細菌宿主細胞において、その組換え部位によって反
応させる。得られた第４の核酸分子は、単回組換え生成物または多重組換え生成物のいず
れかからなる、組換えアデノウイルスＢＡＣ（ｐＲＡＢ）である。図１Ａには、単回組換
え生成物（ｐＲＡＢ１ｘ）（配列番号４）の模式的組成が示されている。図１Ｂには、二
重（ｐＲＡＢ２ｘ）組換え生成物（配列番号５）の模式的組成が示されている。第１およ
び第２の制限酵素での第４の核酸のＤＮＡの消化の際に、左側および右側ＩＴＲ、パッケ
ージングシグナルおよび転写単位を含有する完全なアデノウイルスゲノムが、ｐＲＡＢか
ら放出される（図１Ｃ）。実施例１において開示された方法に従って得られ、実施例２に
おいて開示された方法に従って第１および第２の制限酵素で消化された第４の核酸のＤＮ
Ａが、許容２９３細胞にトランスフェクトされる場合には、生存可能な第１世代アデノウ
イルスベクターは、事例の９７％において得られる。
【０３６８】
図２Ａは、実施例１において開示された方法を使用して得られた、２種の再構成された
第１世代アデノウイルスウイルスの組成を示す図である。２つの型の反応生成物のＤＮＡ
は、ｐＢＡＣＳｉｒ１へのｐＤｏｎｏｒＳｉｒ１の単回および二重挿入に起因するｐＲＡ
Ｂ１ｘおよびｐＲＡＢ２ｘであり、ｐＤｏｎｏｒＳｉｒ１は、ブダペスト条約に従って受
託番号ＤＳＭ２３７５３でＤＳＭＺに寄託された生物と同一であり、ｐＢＡｃＳｉｒ１は
、ブダペスト条約に従って受託番号ＤＳＭ  ２４２９８でＤＳＭＺに寄託された生物と同
一である。それぞれの反応生成物を、標準プロトコールに従って、ＤＨ１０Ｂ細菌の増殖
培養物から単離し、ＸｈｏＩを用いる制限消化によって特徴付けた（図２Ａ、レーン３〜
４）。レーン１には、ヌクレオチド長マーカーをロードし、１から１０ｋｂの間の規定の
長さを有する参照断片を提供した。レーン２には、組換えアデノウイルスＢＡＣベクター
ｐＲＡＢｒｅｆ（配列番号３）の制限パターンが、参照として示されている。ｐＲＡＢｒ
ｅｆのコンピュータで作製したＸｈｏＩ制限パターンは、以下のとおりである：１４．５
ｋｂ、１０．２７４ｋｂ、７．４０３ｋｂ、２．４６６ｋｂ、１．４４５ｋｂおよび０．
５９５ｋｂ。単回組換え生成物ＲＡＢ１ｘ（レーン３）の分析によって、それぞれ、６．
２６６ｋｂおよび４．１８７ｋｂの長さの特徴的なさらなるバンドの対が得られる。単回
組換え反応生成物ＲＡＢ１ｘ（配列番号４）のＸｈｏＩを用いる消化のコンピュータで作
製したパターンは、以下のとおりである：１４．５ｋｂ、１０．２７４ｋｂ、６．２６６
ｋｂ、４．１８７ｋｂ、２．４６６ｋｂ、１．４４５ｋｂおよび０．５９５ｋｂ。二重組
換え生成物の場合には、３．０５ｋｂの第３のさらなるバンドが、（レーン４）において
現れる。二重組変え反応生成物ＲＡＢ２ｘ（配列番号５）のＸｈｏＩを用いる消化のコン
ピュータで作製したパターンは、以下のとおりである：１４．５ｋｂ、１０．２７４ｋｂ
、６．２６６ｋｂ、４．１８７ｋｂ、３．０５ｋｂ、２．４６６ｋｂ、１．４４５ｋｂお
よび０．５９５ｋｂ。さらなる実験では、ＲＡＢ１ｘおよびＲＡＢ２ｘ  ＤＮＡを単離し
、ＰａｃＩ制限酵素を用いて切断し（それぞれ、図１中、ＲＳ１およびＲＳ２に対応する
）、許容２９３細胞にトランスフェクトした。図２Ａは、ＰａｃＩ制限されたＲＡＢ１ｘ
（レーン６）およびＲＡＢ２ｘ（レーン７）でトランスフェクトされた２９３細胞から単
離されたウイルスＤＮＡの制限パターンを示す。それぞれ、再構成組換えアデノウイルス
、ＲＡＢ１ｘおよびＲＡＢ２ｘの両方から得られたウイルスＤＮＡの、ＸｈｏＩを用いる
消化のコンピュータで作製されたパターンは、以下のとおりである：１４．５ｋｂ、８．
４９９ｋｂ、３．３６５ｋｂ、２．４６６ｋｂ、１．４４５ｋｂおよび０．５９５ｋｂ。
ＰａｃＩを用いる消化の際に、同一の完全な補完されたアデノウイルスゲノムが、ｐＲＡ
Ｂｓから遊離されるので、制限断片パターンは、両ウイルスについて同一である。ＲＡＢ
１ｘまたはＲＡＢ２ｘの制限パターンを、ＲＡＢ１ｘおよびＲＡＢ２ｘと本質的に同一で
あるが、転写単位を欠く空のアデノウイルスと比較した（図２、レーン５）。それぞれ、
ＲＡＢ１ｘまたはＲＡＢ２ｘから単離されたアデノウイルスＤＮＡのＸｈｏＩを用いる消
化の際のコンピュータによる制限断片パターンは、以下のとおりである：１４．５ｋｂ、
８．４９９ｋｂ、３．３６５ｋｂ、２．４６６ｋｂ、１．４４５ｋｂおよび０．５９５ｋ
ｂ。
【０３６９】
図２Ｂは、実施例３に開示された方法に従って得られたｐＤｏｎｏｒＳｉｒ２およびｐ
ＢＡＣＳｉｒ２間の組換え生成物の制限断片分析を示す図であり、ｐＤｏｎｏｒＳｉｒ２
は、ブダペスト条約に従って受託番号ＤＳＭ  ２３７５４でＤＳＭＺに寄託された生物と
同一であり、ｐＢＡＣＳｉｒ２は、ブダペスト条約に従って受託番号ＤＳＭ  ２４２９９
でＤＳＭＺに寄託された生物と同一である。組換え生成物の選択は、選択薬剤として、カ
ナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）クロラムフェニコール（２５μｇ／ｍｌ）および硫酸スト
レプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有する寒天プレート上で行われた。これらの条件
下で、大腸菌は、組換えられた組換えアデノウイルスＢＡＣ（ｐＲＡＢｓ）を含有してお
り、８８種の分析された反応生成物のうち８３種において反応生成物としてｐＲＡＢ＿Ｒ
ＰＳＬ＿１ｘ（配列番１１）を含有していた。８８の事例のうち２種のみにおいて、二重
組換え反応生成物ｐＲＡＢ＿ＲＰＳＬ＿２ｘ（配列番号１２）が得られた。シングルコロ
ニーを選択プレートから選び取り、クロラムフェニコール（２５μｇ／ｍｌ）を含有する
液体培地中で継代培養し、ｐＲＡＢを含有するコロニーのその後の継代培養物からＢＡＣ
ＤＮＡを単離し、ＸｈｏＩを用いる消化の際の制限断片分析によって、反応生成物の完
全性を分析した（図２Ｂ）。分析された６種の分析された組換え体のすべてが、ｐＲＡＢ
＿ＲＰＳＬ＿１ｘを含有していた。方法の信頼性を調べるために、実験を反復し、さらに
８２種のコロニーを選択プレートから選び取り、上記のように特徴付けた。本発明者らは
、図２Ｂ中Ｄで印が付けられたｐＲＡＢ＿ＲＰＳＬ＿２ｘに対応する多重挿入生成物を含
有する２種のクローンのみ、それぞれ、クローン番号４７および５３を見い出すことがで
きた。さらに７種のＢＡＣ  ＤＮＡ調製物が、親のベクターｐＢＡＣＳｉｒ２によって混
入されており（Ｖで印が付けられている、クローン番号９、１７、２２、３９、４１、６
２、６７）、３種が、再編成に起因する組換え生成物であった（ｒで印が付けられている
、クローン番号２５、４６、６８。さらなる実験では、第５の核酸に対応する合計４４種
のＢＡＣを分析し、１種のみの組換え生成物が、ｐＲＡＢ＿ＲＰＳＬ＿２ｘに対応してお
り、４４種のクローンのうち４３種が、ｐＲＡＢ＿ＲＰＳＬ＿１ｘに対応していた。全部
で１２６／１３２種のＢＡＣが、単回組換え生成物ｐＲＡＢ＿ＲＰＳＬ＿１ｘに対応して
おり（分析された組換え生成物の９５．５％）、多重組換えは、クローンの２．３％に相
当する３／１３２において観察された。
【０３７０】
図３は、補完された完全なアデノウイルスベクターゲノムまたは複数のそれらまたはそ
れらのライブラリーを構築するための実施例３に開示される方法を示す図表示である。第
３の核酸分子および第２の核酸分子間の組換えが、組み合わせ、そのＦｒｔ組換え部位に
よって反応させ、選択され得る組換え生成物を形成し、組換え事象の数は１に限定される
。実施例３によれば、原核生物プロモーター（ＰＫプロモーター）、野生型Ｆｒｔ部位に
由来する最小のＦｒｔ３４組換え部位、陰性選択マーカー（Ｒｐｓｌ）、（ｉ）条件付き
複製のための細菌ヌクレオチド配列（ＯｒｉＲ６Ｋ）、および宿主細胞にカナマイシンに
対する耐性を付与する陽性選択マーカーを提供するヌクレオチド配列を含む細菌ヌクレオ
チド配列（ＫｎＲ）、第１の制限部位（ＲＳ１）、アデノウイルスゲノムの左側ＩＴＲ（
ＩＴＲｌｅｆｔ）およびパッケージングシグナルＥＳを含有するウイルスのゲノムの第１
の部分、転写単位または対象とする遺伝子（ＧＯＩ）を含有する、ｐＤｏｎｏｒＳｉｒ２
と同一または類似である第３の核酸分子。ｐＢＡＣＳｉｒ２（配列番号２）と同一または
類似である第２の核酸は、野生型Ｆｒｔ４８組換え部位（配列番号８）、アデノウイルス
ゲノムの右側ＩＴＲ（ＩＴＲｒｉｇｔｈ）、第２の制限部位（ＲＳ２）ならびに（ｉ）単
一コピー複製のための細菌ヌクレオチド配列（Ｆ’ｏｒｉ）、および（ｉｉ）宿主細胞に
クロラムフェニコールに対する耐性を付与する第２の選択マーカーを提供するヌクレオチ
ド配列（ＣｍＲ）を含む細菌ヌクレオチド配列単位を含むアデノウイルスのゲノムの第２
の部分を含む。両核酸分子は、Ｆｌｐリコンビナーゼの存在下で、細菌宿主細胞において
、その組換え部位によって反応させる。開示される方法を使用して、得られた組換えＢＡ
Ｃは、大部分は（９５％超）、単回組換え生成物からなる。図３Ａには、単回組換え生成
物ｐＲＡＢ＿ＲＰＳＬ＿１ｘの模式的組成が示されている。図３Ｂには、二重組換えが、
図式的に表されている。組換え生成物ｐＲＡＢ＿ＲＰＳＬ＿２ｘでは、原核生物プロモー
ター（ＰＫプロモーター）は、陰性選択マーカー（Ｒｐｓｌ）のオープンリーディングフ
レームに近接している。この生成物は、実施例３に開示される方法に従って、組換え生成
物の２．５％未満で観察される。
【０３７１】
図４は、実施例５に開示された方法による、Ｆｌｐリコンビナーゼを発現する２９３Ｆ
ｌｐ細胞における、補完された感染性アデノウイルスウイルスの再構成を示す図であり、
２９３Ｆｌｐ細胞は、ブダペスト条約に従って受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ３０７７でＤＳＭ
Ｚに寄託された生物と同一である。２９３Ｆｌｐ細胞を、ｐＳｉｒＤｏｎｏｒ１−ＥＧＦ
Ｐ（配列番号９）に対応する第１の核酸分子およびｐＢＡＣＳｉｒ２に対応する第２の核
酸分子を用いてトランスフェクトし、トランスフェクションに先立って、両核酸をＰａｃ
Ｉで処理した。標準細胞培養条件下、３７℃で３日培養した後、２９３細胞における増殖
性アデノウイルス製造に特徴的な細胞変性効果（ＣＰＥ）を示す細胞の彗星型の蛍光集合
体が、顕微鏡下で検出された。
【０３７２】
図５は、ｐＢＡＣＳｉｒ２でのｐＤｏｎｏｒＳｉｒ２の二重組換えから得られたｐＲＡ
Ｂ＿ＲＰＳＬ＿２ｘを保持する大腸菌ＤＨ１０Ｂ細胞の、ストレプトマイシンによる増殖
の選択的阻害を示す図である。それぞれ、空のベクターｐＢＡＣＳｉｒ２、単回組換えｐ
ＲＡＢ＿ＲＰＳＬ＿１ｘ＿番号１または２種の二重組換えアデノウイルスＢＡＣベクター
、ｐＲＡＢ＿ＲＰＳＬ＿２ｘ＿番号４７およびｐＲＡＢ＿ＲＰＳＬ＿２ｘ＿番号５３でト
ランスフェクトした大腸菌ＤＨ１０Ｂ細胞から増殖曲線を作成した。細菌培養物の増殖は
、出発材料として希釈された飽和一晩培養物から出発して、異なる濃度のストレプトマイ
シンで行い、ＯＤ６００を経時的にモニタリングした。対照ＢＡＣベクターｐＢＡＣＳｉ
ｒ２を含有する同型培養物のＯＤ６００の平均が、０．８に達した後、通常、播種の８時
間後、ＯＤ６００値を測定し、光学濃度を算出し、１００％に設定された対照培養物の平
均ＯＤ６００に参照した。各増殖条件の５回の独立実験の結果をプロットし、プロットさ
れた５回の実験内の相対光学密度の標準偏差を、エラーバーとして含めた。対照ＢＡＣベ
クターｐＢＡＣＳｉｒ２または単回組換えＢＡＣベクターｐＲＡＢ＿ＲＰＳＬ＿１ｘを保
持する大腸菌クローンは、極めて高濃度（２００μｇ／ｍｌ）のストレプトマイシンの存
在下でさえも良好に増殖した。対照的に、ｐＤｏｎｏｒＳｉｒ２の二重挿入を保持するク
ローン（ｐＲＡＢ＿ＲＰＳＬ＿２ｘ番号４７）およびｐＲＡＢ＿ＲＰＳＬ＿２ｘ＿番号５
３）の増殖は、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンによって阻害され、一部の阻害は、
２５μｇ／ｍｌのストレプトマイシンの存在下ですでに検出可能であった。
【０３７３】
図６は、選択マーカーの相乗効果マトリックスを示す図である。抗生物質の作用様式に
基づいて、陽性および陰性選択マーカーは、カナマイシンの存在下で相乗的に働く可能性
を有する。組換えアデノウイルスウイルスベクターの作製のための本明細書に記載された
本発明の方法による、多重組換え生成物の対抗選択のために相乗的に働くと期待される、
陽性および陰性選択マーカーの組合せは、表中に「＋」の印が付けられており、相乗的に
働くと期待されていない組合せは、「０」で印が付けられている。
【０３７４】
図７は、実施例６に開示される方法を使用して得られた、２種の組換え第１世代アデノ
ウイルス１９ａ型ベクターの組成を示す図である。標準プロトコールに従って、ＤＨ１０
Ｂ細菌の増殖培養物から反応生成物を単離し、ＫｐｎＩを用いる制限消化によって特徴付
けた。Ｍで印が付けられた最初のレーンには、ヌクレオチド長マーカーをロードし、１か
ら１０ｋｂの間の規定の長さを有する参照ＤＮＡ断片を提供した。単回組換え生成物ｐＲ
ＡＢ１９ａ１ｘ（レーン１、２、３）および二重組換え生成物（レーン４）のＫｐｎＩを
用いる制限分析が示されている。単回組換え反応生成物ｐＲＡＢ１９ａ１ｘ（配列番号１
６）のコンピュータで作製したＫｐｎＩを用いる消化のパターンは、以下のとおりである
：１１．３６１ｋｂ、６．２５４ｋｂ、５．４４７ｋｂ、４．４４３ｋｂ、３．２７１ｋ
ｂ、２．０１６ｋｂ、１．８８６ｋｂ、１．８６８ｋｂ、１．５８５ｋｂおよび２８ｂｐ
。二重組換え生成物の場合には、３．３６４ｋｂのさらなるバンドが現れる（レーン４）
。二重組換え反応生成物ｐＲＡＢ１９ａ２ｘ（配列番号１７）のＫｐｎＩを用いる消化の
コンピュータで作製したパターンは、以下のとおりである：１１．３６１ｋｂ、６．２５
４ｋｂ、５．４４７ｋｂ、４．４４３ｋｂ、３．３６４ｋｂ、３．２７１ｋｂ、２．０１
６ｋｂ、１．８８６ｋｂ、１．８６８ｋｂ、１．５８５ｋｂおよび２８ｂｐ。
【実施例】
【０３７５】
［実施例１：  Ｆｌｐリコンビナーゼを発現する大腸菌における、部位特異的組換えを使
用する組換えアデノウイルスＢＡＣの構築］
組換えアデノウイルスゲノムの構築のために、第１の核酸ｐＤｏｎｏｒＳｉｒ１および
第２の核酸分子ｐＢＡＣＳｉｒ１を組み合わせ、ｐＢＡＣＳｉｒ１およびＦＬＰリコンビ
ナーゼの条件付き発現のためのプラスミドｐＣＰ２０を有するＤＨ１０Ｂ大腸菌細胞にお
いて反応させ、ｐＤｏｎｏｒＳｉｒ１は、ブダペスト条約に従って受託番号ＤＳＭ２３７
５３でＤＳＭＺに寄託された生物と同一であり、ｐＢＡＣＳｉｒ１は、ブダペスト条約に
従って受託番号ＤＳＭ２４２９８でＤＳＭＺに寄託された生物と同一であり、ｐＢＡＣＳ
ｉｒ１およびｐＣＰ２０を有する大腸菌細胞は、ブダペスト条約に従って受託番号ＤＳＭ
２３７４２でＤＳＭＺに寄託された生物と同一である。標準プロトコールを使用するエレ
クトロポレーションによって、プラスミドｐＤｏｎｏｒＳｉｒ１をＤＨ１０Ｂ大腸菌細胞
に導入した。核酸分子ｐＢＡＣＳｉｒ１は、ｐＫＳＯ  ＢＡＣベクターの誘導体であり（
Ｍｅｓｓｅｒｌｅら  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：１４
７５９〜１４７６３頁、１９９７年）、Ｅ１領域およびＥ３領域について欠失しているヒ
トアデノウイルス５型（ＡＶ５）ゲノムの右側部分を含有する。核酸分子ｐＢＡＣＳｉｒ
１は、Ｆｌｐの発現のための条件付き発現系を有する大腸菌ＤＨ１０Ｂ（または同等の、
Ｆ因子を欠く大腸菌Ｋ１２由来株）中で維持した。本明細書では、実施例１において、Ｄ
Ｈ１０Ｂ細胞は、アデノウイルスＢＡＣ  ｐＢＡＣＳｉｒ１を有しており、Ｆｌｐリコン
ビナーゼは、プラスミドｐＣＰ２０によって提供され、その複製は、温度感受性複製起点
によって制御される（Ｂｕｂｅｃｋ  Ａ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：８０２６〜８０３
５頁、２００４年）。ｐＢＡＣＳｉｒ１およびｐＣＰ２０を有するＤＨ１０Ｂ細胞を、ア
ンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）およびクロラムフェニコール（２５μｇ／ｍｌ）の存在下
、３０℃で維持した。次いで、これらのＤＨ１０Ｂ細胞を、ｐＤｏｎｏｒＳｉｒ１を用い
て電気形質転換し、あらゆる抗生物質の不在下、４２℃で６０分間培養した。発現された
Ｆｌｐは、それぞれ、ｐＤｏｎｏｒＳｉｒ１およびｐＢＡＣＳｉｒ１上に存在するＦＲＴ
部位間の部位特異的組換えを誘導した。同時に、ｐＣＰ２０は、高温下で大腸菌において
複製できないので、Ｆｌｐ発現の排除も始まった。形質転換された培養物を、選択薬剤と
してカナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）およびクロラムフェニコール（２５μｇ／ｍｌ）を
含有する寒天プレート上にプレーティングした。これらの条件下で、少なくとも１つのｐ
ＤｏｎｏｒＳｉｒ１プラスミドが、ｐＢＡＣＳｉｒ１で組み換えられている、組み換えら
れた組換えアデノウイルスＢＡＣ（ｐＲＡＢ）を含有する大腸菌を選択した。ｐＲＡＢを
含有するＤＨ１０Ｂ細胞の増殖培養物からＤＮＡを単離し、ＸｈｏＩを用いる制限消化に
よって反応生成物の完全性を分析した（図２Ａ（レーン２〜４）。分析したすべての組換
え生成物が、ｐＲＡＢを含有しており、単回（ｐＲＡＢ１ｘ）または多重組換え生成物（
ｐＲＡＢ２ｘ）のいずれかである。
【０３７６】
［実施例２：  Ｆｌｐリコンビナーゼを発現する大腸菌における部位特異的組換えによっ
て生じた組換えアデノウイルスの再構成］
実施例１に開示される方法による部位特異的組換えから得られた２つの主要な型のＢＡ
Ｃベクターは、それぞれ、ｐＲＡＢ１ｘおよびｐＲＡＢ２ｘである。ＤＨ１０Ｂ細胞にお
けるＦｌｐ−組換えによって生じたｐＲＡＢは、完全な補完されたアデノウイルスゲノム
の１つの、１つのみの連続配列を含有しており、これは、２９３細胞において複製能力が
あった。プラスミド調製のためのキットを使用して、ｐＲＡＢのＤＮＡを、ＬＢ培地中の
飽和大腸菌一晩培養物（１００ｍｌ）から精製した。本明細書では、Ｍａｃｈｅｒｅｙ  
ａｎｄ  Ｎａｇｅｌ、Ｇｅｒｍａｎｙ製のＮｕｃｌｅｏｂｏｎｄ  ＰＣ−１００キットを
、製造業者の推奨に従って使用した。得られたｐＲＢＡの同一性は、ｐＲＡＢ  ＤＮＡの
制限分析によって確認した（図２Ａ、レーン２〜４）。ウイルス再構成のために、精製ｐ
ＲＡＢ  ＤＮＡを、製造業者の推奨に従って、ＤＮＡ１μｇあたり１０ＵのＰａｃＩを用
いて２時間処理した。続いて、ＰａｃＩ消化されたｐＲＡＢ１ｘおよびｐＲＡＢ２ｘ  Ｄ
ＮＡを、標準プロトコールに従ってフェノール−クロロホルムを使用して精製し、その後
、２９３細胞へトランスフェクションした。手短には、１０μｇのｐＲＡＢ  ＤＮＡを、
水浴中、３７℃で、１００μｌの容量中で、１．５時間消化した。続いて、反応試験管（
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆｆカップサイズ１．５ｍｌ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＡＧ、Ｈａｍｂｕ
ｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に５０μｌのフェノール／クロロホルム（１：１混合物）を加え
、２０秒間ボルテックス処理し、ここでは、Ｖｏｒｔｅｘｅｒ  ＭＳ−３  ｂａｓｉｃを
使用した（ＩＫＡＩＫＡ（登録商標）Ｗｅｒｋｅ  ＧｍｂＨ  ＆  Ｃｏ．ＫＧ、Ｓｔａｕ
ｆｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。試験管を、卓上遠心機において、最大速度（２００００×ｇ
）で、室温で５分間遠心分離し、８０μｌの水性上相を、新たな試験管に移し、１０μｌ
の３Ｍ  ＮａＡｃ（ｐＨ４．５）および２００μｌのＥｔＯＨを加えた。すべての試薬お
よび化学物質は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＵＳＡから購入した
。沈殿したＤＮＡが目に見えるようになるまで、試験管を指先で混合した。さらに、試験
管を室温で５分間インキュベートし、ＤＮＡを、卓上遠心機において、最大速度で、室温
で１５分間ペレットにした。上清を定量的に除去し、ペレットを、２０μｌの滅菌脱イオ
ン水に直ちに溶解した。２９３細胞のトランスフェクションは、リポフェクションを使用
して行った。本明細書では、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔトランスフェクション試薬（Ｑｉａｇｅ
ｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、製造業者の推奨に従って使用した。得られたア
デノウイルスは、２９３細胞において複製能力があり、標準プロトコールに従って増殖さ
れ得る（Ｇｒｅｅｎ  ＭおよびＬｏｅｗｅｎｓｔｅｉｎ  Ｐ、Ｈｕｍａｎ  Ａｄｅｎｏｖ
ｉｒｕｓｅｓ：Ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ，Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｑｕａｎｔｉｆｉ
ｃａｔｉｏｎ、ａｎｄ  Ｓｔｏｒａｇｅ  ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  
ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ７９）。この実施例に開示される方法に従って得られた
組換えアデノウイルスベクターの同一性は、ＸｈｏＩを用いるアデノウイルスベクターＤ
ＮＡの制限消化およびアガロースゲル電気泳動を使用するＤＮＡ断片の分析によって確認
した（図２Ａ）。ゲノムアデノウイルスベクターＤＮＡを調製するために、２９３細胞（
２．５×１０７個細胞）を、２９３細胞へのＰａｃＩ消化されたｐＲＡＢのトランスフェ
クション後に得られた組換えアデノウイルスベクターを用い３のＭＯＩで感染させた。細
胞変性効果（ＣＰＥ）が完了した後、感染細胞をＰＢＳ中で１回洗浄し、プレートからか
きとり、ＰＢＳに再懸濁した。細胞（約４×１０６個細胞／ｍｌ）を、細胞懸濁液に等容
積のＴＳＴバッファー（２％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍ
Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０）を加えることと、それに続いて、氷上で３０分間イ
ンキュベートすることによって溶解した。４℃で、２０，０００ｇで１０分間の遠心分離
によって細胞片を除去し、上清を、０．５％  ＳＤＳの存在下、５０μｇ／ｍｌのプロテ
イナーゼＫ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、５６℃で６０分間処理した。フェノール／クロロホ
ルムおよびエタノール沈殿法によって核酸を抽出した後、抽出物をＲＮアーゼＡ（Ｓｉｇ
ｍａ）で処理した。ＲＮＡ不含ウイルスＤＮＡを、再度フェノール／クロロホルム抽出し
、エタノールを用いて沈殿させた。ｐＲＡＢ１ｘおよびｐＲＡＢ２ｘに由来する再構成さ
れたウイルスのＸｈｏＩ制限パターンは、コンピュータで作製したパターンと対応してお
り、得られた組換えアデノウイルスウイルス中のアデノウイルスゲノムの完全性を確認し
た（図２Ａレーン５〜７）。
【０３７７】
［実施例３：  陰性選択による制御された組換えを用いる組換えＲＡＢの作製］
多重挿入を避け、アデノウイルス発現ライブラリーの構築を改善するために、本発明者
らは、本発明の第３の核酸分子の一実施形態であるｐＤｏｎｏｒＳｉｒ２を構築し、ｐＤ
ｏｎｏｒＳｉｒ２は、ブダペスト条約に従って受託番号ＤＳＭ２３７５４でＤＳＭＺに寄
託された生物と同一である。ｐＤｏｎｏｒＳｉｒ２は、そのＦＲＴ遺伝子座でｐＤｏｎｏ
ｒＳｉｒ１とは異なり、次に、このｐＤｏｎｏｒＳｉｒ２は、ＦＲＴ部位の上流に、強力
な大腸菌ガラクトキナーゼプロモーター（Ｗａｒｍｉｎｇ，  Ｓ．、Ｎ．Ｃｏｓｔａｎｔ
ｉｎｏ、Ｃｏｕｒｔ  ＤＬ、Ｎ．Ａ．ＪｅｎｋｉｎｓおよびＮ．Ｇ．Ｃｏｐｅｌａｎｄ．
Ｓｉｍｐｌｅ  ａｎｄ  ｈｉｇｈｌｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ＢＡＣ  ｒｅｃｏｍｂｉｎ
ｅｅｒｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｇａｌＫ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ
ｓ  Ｒｅｓ  ２００５年、３３：ｅ３６）、ＦＲＴ部位の下流に、ｒｐｓＬオープンリー
ディングフレームを含有し、これは、発現されると、ストレプトマイシン感受性を媒介し
た（Ｒｅｙｒａｔ  ＪＭ、Ｐｅｌｉｃｉｃ  Ｖ、Ｇｉｃｑｕｅｌ  Ｂ、Ｒａｐｐｕｏｌｉ
Ｒ．Ｃｏｕｎｔｅｒｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ  ｍａｒｋｅｒｓ：ｕｎｔａｐｐｅｄ  ｔｏ
ｏｌｓ  ｆｏｒ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅ
ｓｉｓ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．１９９８年、６６：４０１１〜４０１７頁）。ｐＤ
ｏｎｏｒＳｉｒ２の使用は、以下のとおりに例示されている：ｐＢＡＣＳｉｒ２およびｐ
ＣＰ２０を有するＤＨ１０Ｂ細胞を、アンピシリンおよびクロラムフェニコールの存在下
、３０℃で維持し、本発明の第２の核酸分子の一実施形態でもあるｐＢＡＣＳｉｒ２は、
ブダペスト条約に従って受託番号ＤＳＭ２４２９９でＤＳＭＺに寄託された生物と同一で
あり、ｐＢＡＣＳｉｒ２およびｐＣＰ２０を有する大腸菌細胞は、ブダペスト条約に従っ
て受託番号ＤＳＭ２３７４３でＤＳＭＺに寄託された生物と同一である。次いで、ＤＨ１
０Ｂ細胞を、ｐＤｏｎｏｒＳｉｒ２を用いて電気形質転換し、あらゆる抗生物質の不在下
、４２℃で１５０分間培養した。発現されたＦｌｐは、それぞれ、ｐＤｏｎｏｒＳｉｒ２
およびｐＢＡＣＳｉｒ２上に存在するＦＲＴ部位間の部位特異的組換えを誘導した。同時
に、ｐＣＰ２０は、高温下で大腸菌において複製できないので、Ｆｌｐ発現の排除も始ま
った。形質転換された培養物を、選択薬剤としてカナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）および
クロラムフェニコール（２５μｇ／ｍｌ）および硫酸ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍ
ｌ）を含有する寒天プレート上にプレーティングした。これらの条件下で、ｐＤｏｎｏｒ
Ｓｉｒ２プラスミドが、ｐＢＡＣＳｉｒ２で組み換えられている、組み換えられた組換え
アデノウイルスＢＡＣ（ｐＲＡＢ＿ＲＰＳＬ）を含有する大腸菌を選択した。シングルコ
ロニーを選択プレートから選び取り、振盪インキュベーターにおいて、クロラムフェニコ
ール（２５μｇ／ｍｌ）を含有する１０ｍｌ液体ＬＢ培地中、３７℃で一晩培養した。使
用したすべての化学物質および培地は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ
、ＵＳＡから購入した。これらの培養物に由来するｐＲＡＢ＿ＲＰＳＬ  ＤＮＡを、ＤＮ
Ａ−プラスミド単離キットを使用して、製造業者の推奨に従って、続いて単離し、Ｘｈｏ
Ｉを用いる制限消化によって、反応生成物の完全性を分析した（図２Ｂ）。本明細書では
、Ｍａｃｈｅｒｅｙ  ａｎｄ  Ｎａｇｅｌ、Ｇｅｒｍａｎｙ製のＮｕｃｌｅｏｂｏｎｄ  
ＰＣ−１００キットを、製造業者の推奨に従って、ｐＲＡＢ＿ＲＰＳＬ−ＤＮＡの単離の
ために使用した。分析された６種のｐＲＡＢすべてのＸｈｏＩ制限パターンは、単回組換
え生成物（ｐＲＡＢ＿ＲＰＳＬ＿１ｘ）に対応していた。適用された対抗選択の信頼性を
調べるために、本発明者らは、選択プレートからさらに８２種のクローンを選び取り、上
記のように試験した。２種のクローンのみが、多重挿入生成物を含有しており（図２Ｂに
おいて「Ｄ」と印が付けられている）、さらなる７種のクローンは、ｐＢＡＣＳｉｒ２が
混入されており（図２Ｂにおいて「Ｖ」と印が付けられている）、３種が、その他の同定
されていない再編成を含有していた（図２Ｂにおいて「ｒ」と印が付けられている）。全
部で、コロニーの大多数（８３／８８）が、ｐＲＡＢ＿ＲＰＳＬ＿１ｘのみを含有してい
た（図２Ｂ）。さらなる実験では、合計４４種のクローンを分析し、１種の組換え生成物
のみがｐＲＡＢ＿ＲＰＳＬ＿２ｘに対応しており、４４種のクローンのうち４３種が、ｐ
ＲＡＢ＿ＲＰＳＬ＿１ｘに対応していた。全部で、１２６／１３２種のＢＡＣが、単回組
換え生成物ｐＲＡＢ＿ＲＰＳＬ＿１ｘに対応するが（分析された組換え生成物の９５．４
５％）、多重組換えは、クローンの２．３％に相当する３／１３２において観察された。
【０３７８】
［実施例４：  組換えアデノウイルスＢＡＣライブラリーを作製するための平均ライブラ
リー効率の決定］
本発明者らの大腸菌組換え系の効率を調べ、組み換えられていないｐＢＡＣＳｉｒ２ベ
クターの実施例３のｐＲＡＢ＿ＲＰＳＬ  ＤＮＡ調製物の混入を避けるために、実施例３
に記載された実験を、以下の修飾を用いてさらに２回反復した。
ｉ）  一次クローニング効率を調べるために、本発明者らは、５０μｌの１０ｍｌの形
質転換後培養を取り出し、段階１０倍希釈物を、選択薬剤としてカナマイシン（２５μｇ
／ｍｌ）、クロラムフェニコール（２５μｇ／ｍｌ）および硫酸ストレプトマイシン（５
０μｇ／ｍｌ）を含有する３連の選択アガロースプレート上にプレーティングした（実験
２）。使用したすべての化学物質および培地は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ  Ｌ
ｏｕｉｓ、ＵＳＡから購入した。６０分後、培養物の残りを、さらに９０分インキュベー
トし、上記のように最終的に１５０分の合計形質転換後培養時間となった（実験３）。２
枚のプレートに、各実験から得た５０μｌのトランスフェクション後培養物の各希釈物（
１：１０１、１：１０２および１：１０３）の１ｍｌの最終容量のうち２００μｌによっ
て播種した。
ｉｉ）ｐＲＡＢを含有するコロニーが選択プレート上に現れた後、本発明者らは、選択
薬剤としてカナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）、クロラムフェニコール（２５μｇ／ｍｌ）
および硫酸ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有する３連の選択プレートの第２
ラウンドでレプリカプレートを作製した。この手順によって、ベクターおよび多重挿入生
成物両方による混入が最小化され、レプリカプレートの作製が、大腸菌ライブラリーの維
持において定期的に適用される。
【０３７９】
レプリカプレート上のコロニー数は、希釈１：１０２を用いた場合、実験２では５２お
よび８９であり、実験３では２０４および１２９であった。ｐＤｏｎｏｒＳｉｒ２の５０
ｎｇのＤＮＡが使用され、形質転換後培養物の容量が５０μｌであり、各希釈物の１／５
がプレーティングされたことを考慮して、平均クローニング効率は、１μｇの投入に対し
て１．８５×１０６コロニーであった。
【０３８０】
［実施例５：  ＦＬＰリコンビナーゼを発現する２９３細胞における、複製能力のあるア
デノウイルスの作製］
Ｆｌｐリコンビナーゼを発現するＨＥＫ２９３  Ｆｌｐ細胞を構築するために、２．５
×１０５個ＨＥＫ２９３細胞を、１０μｇのＰｖｕＩで直線化されたプラスミドｐＦｌｐ
−Ｐｕｒｏを用いるリポフェクションを使用してトランスフェクトし、２９３Ｆｌｐ細胞
は、ブダペスト条約に従って受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ３０７７でＤＳＭＺに寄託された生
物と同一である。本明細書において、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔトランスフェクション試薬（Ｑ
ｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、製造業者の推奨に従って使用した。ト
ランスフェクトされた細胞を、標準細胞培養条件（９５％湿度、５％  ＣＯ２）下、３７
℃で４８時間インキュベートした。使用した細胞培養培地は、１０％  ＦＣＳ、２ｍＭ  
グルタミンおよび１％ペニシリン／ストレプトアビジン（Ｐ／Ｓ））を含有するＤＭＥＭ
とした。選択のために、ピューロマイシンを、培地に１μｇ／μｌの最終濃度に加え、細
胞を、選択条件下で１２日間培養して、ＦＬＰリコンビナーゼを安定に発現する２９３個
の細胞を得た。使用したすべての化学物質および培地は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、
Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＵＳＡから購入した。安定な細胞プールを拡大し、マスター細胞バン
クを確立した。組換えアデノウイルスの再構成のために、ウェルあたり２×１０５個の２
９３ＦｌｐＰ細胞を、６ウェルプレート上にプレーティングし、プレーティングの５時間
後、細胞を、リポフェクションを使用して、ＰａｃＩを用いて両方とも直線化された０．
８μｇのｐＤｏｎｏｒＳｉｒ２−ＥＧＦＰ（配列番号９）および２．５μｇのｐＢＡＣＳ
ｉｒ２を用いて同時トランスフェクトした。本明細書において、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔトラ
ンスフェクション試薬（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、製造業者の
推奨に従って使用した。標準細胞培養条件下、３７℃で３日培養した後、細胞をかきとる
ことによって回収し、その後の２００×ｇで５分の遠心分離によって集めた。細胞ペレッ
トを、４００μｌの細胞培養培地（ＤＭＥＭ、１０％  ＦＣＳ、２ｍＭグルタミン、１％
Ｐ／Ｓ）に再懸濁し、３回の連続凍結／解凍サイクルに付した。細胞片を、４．４００
×ｇで１５分間の遠心分離によって可溶性物質から分離した。ＥＧＦＰ遺伝子を発現する
アデノウイルスベクターのレスキューの成功を実証するために、２×１０５個のＨＥＫ−
２９３細胞／ウェルを、６ウェルプレートにプレーティングし、２００μｌの凍結／解凍
溶解物を用いて１２時間後に感染させ、続いて、標準細胞培養条件下、３７℃で３日イン
キュベーションした。この時点で、増殖性アデノウイルス複製に特徴的な細胞変性効果（
ＣＰＥ）を示す細胞の彗星型の蛍光集合体が、顕微鏡下で検出可能であった（図４参照の
こと）。したがって、本方法によって、２９３Ｆｌｐ細胞への第３の核酸分子の第２の核
酸分子との同時トランスフェクションによる第１世代組換え体複製可能アデノウイルスベ
クターの作製が可能となった。
【０３８１】
［実施例６：  Ｆｌｐリコンビナーゼを発現する大腸菌における部位特異的組換えを使用
する組換えアデノウイルス１９ａ型ＢＡＣの構築］
ヒト非５型組換えアデノウイルスゲノムの構築のために、本発明の第１の核酸分子の一
実施形態である第１のＡｄ１９ａ核酸ｐＤｏｎｏｒＳｉｒ１９ａおよび本発明の第２の核
酸分子の一実施形態である第２のＡｄ１９ａ核酸分子ｐＢＡＣＳｉｒ１９ａを組み合わせ
、ｐＢＡＣＳｉｒ１９ａおよびＦＬＰリコンビナーゼの条件付き発現のためのプラスミド
ｐＣＰ２０を有するＤＨ１０Ｂ大腸菌細胞において反応させる。プラスミドｐＤｏｎｏｒ
Ｓｉｒ１９ａを、標準プロトコールを使用するエレクトロポレーションによってＤＨ１０
Ｂ大腸菌細胞に導入した。核酸Ａｄ１９ａ分子ｐＢＡＣＳｉｒ１９ａは、Ｆｌｐの条件付
き発現系を有する大腸菌ＤＨ１０Ｂ（または同等の、Ｆ因子を欠く大腸菌Ｋ１２由来株）
において維持した。本明細書において、実施例６では、ＤＨ１０Ｂ細胞は、アデノウイル
ス１９ａ型ＢＡＣ  ｐＢＡＣＳｉｒ１９ａを有しており、Ｆｌｐリコンビナーゼは、プラ
スミドｐＣＰ２０によって提供され、その複製は、温度感受性複製起点によって制御され
る。ｐＢＡＣＳｉｒ１９ａおよびｐＣＰ２０を有するＤＨ１０Ｂ細胞は、アンピシリン（
５０μｇ／ｍｌ）およびクロラムフェニコール（２５μｇ／ｍｌ）の存在下、３０℃で維
持した。次いで、これらのＤＨ１０Ｂ細胞を、ｐＤｏｎｏｒＳｉｒ１９ａを用いて電気形
質転換し、あらゆる抗生物質の不在下、４２℃で６０分間培養した。発現されたＦｌｐは
、それぞれ、ｐＤｏｎｏｒＳｉｒ１９ａおよびｐＢＡＣＳｉｒ１９ａ上に存在するＦＲＴ
部位間の部位特異的組換えを誘導した。同時に、ｐＣＰ２０は、高温下で大腸菌において
複製できないので、Ｆｌｐ発現の排除も始まった。形質転換された培養物を、選択薬剤と
してカナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）およびクロラムフェニコール（２５μｇ／ｍｌ）を
含有する寒天プレート上にプレーティングした。これらの条件下で、少なくとも１つのｐ
ＤｏｎｏｒＳｉｒ１９ａプラスミドが、ｐＢＡＣＳｉｒ１９ａで組み換えられている、組
み換えられた組換えアデノウイルス１９ａ型ＢＡＣ（ｐＲＡＢ１９ａ）を含有する大腸菌
を選択した。ｐＲＡＢ１９ａのものを含有するＤＨ１０Ｂ細胞の増殖培養物からＤＮＡを
単離し、ＫｐｎＩを用いる制限消化によって反応生成物の完全性を分析した（図７）。分
析したすべての組換え生成物が、ｐＲＡＢ１９ａのものを含有しており、単回（ｐＲＡＢ
１９ａ１ｘ配列番号１６）または多重組換え生成物（ｐＲＡＢ１９ａ２ｘ、配列番号１７
）のいずれかである。
【０３８２】
［実施例７：  陰性選択による制御された組換えを用いる、ヒト非アデノウイルス５型組
換えＲＡＢの作製］
複数のヒト非５型組換えアデノウイルスゲノムまたはヒト非５型組換えアデノウイルス
ゲノムのライブラリーを構築するために、本発明の第３の核酸分子の一実施形態である第
３のＡｄ１９ａ核酸ｐＤｏｎｏｒＳｉｒ２＿１９ａおよび本発明の第２の核酸分子の一実
施形態である第２のＡｄ１９ａ核酸分子ｐＢＡＣＳｉｒ１９ａを組み合わせ、ｐＢＡＣＳ
ｉｒ１９ａおよびＦＬＰリコンビナーゼの条件付き発現のためのプラスミドｐＣＰ２０を
有するＤＨ１０Ｂ大腸菌細胞において反応させる。プラスミドｐＤｏｎｏｒＳｉｒ２＿Ａ
ｄ１９ａは、そのＦＲＴ遺伝子座でｐＤｏｎｏｒＳｉｒ２と異なり、次いで、このｐＤｏ
ｎｏｒＳｉｒ２＿Ａｄ１９ａは、ＦＲＴ部位の上流に、強力な大腸菌ガラクトキナーゼプ
ロモーター（Ｗａｒｍｉｎｇ  ＳＮら  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２００５
年、３３：ｅ３６）およびＦＲＴ部位の下流に、ｒｐｓＬオープンリーディングフレーム
を含有し、これは、発現されるとストレプトマイシン感受性を媒介した（Ｒｅｙｒａｔ  
ＪＭら  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．１９９８年、６６：４０１１〜４０１７頁）。ドナ
ー核酸ｐＤｏｎｏｒＳｉｒ２＿１９ａは、ＰａｃＩ部位、Ａｄ１９ａ  ＩＴＲおよびパッ
ケージングシグナルを保持する。
【０３８３】
ｐＤｏｎｏｒＳｉｒ２＿Ａｄ１９ａの使用は、以下のとおりに例示される。ｐＢＡＣＳ
ｉｒ１９ａおよびｐＣＰ２０を有するＤＨ１０Ｂ細胞が、アンピシリンおよびクロラムフ
ェニコールの存在下、３０℃で維持される。次いで、ＤＨ１０Ｂ細胞を、ｐＤｏｎｏｒＳ
ｉｒ２＿Ａｄ１９ａを用いて電気形質転換し、あらゆる抗生物質の不在下、４２℃で１５
０分間培養した。発現されたＦｌｐは、それぞれ、ｐＤｏｎｏｒＳｉｒ２＿Ａｄ１９ａお
よびｐＢＡＣＳｉｒ１９ａ上に存在するＦＲＴ部位間の部位特異的組換えを誘導する。同
時に、ｐＣＰ２０は、高温下で大腸菌において複製できないので、Ｆｌｐ発現の排除も始
まる。形質転換された培養物を、選択薬剤としてカナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）および
クロラムフェニコール（２５μｇ／ｍｌ）および硫酸ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍ
ｌ）を含有する寒天プレート上にプレーティングする。これらの条件下で、ｐＤｏｎｏｒ
Ｓｉｒ２＿Ａｄ１９ａプラスミドが、ｐＢＡＣＳｉｒ１９ａで組み換えられている、組み
換えられた組換えアデノウイルスＢＡＣを含有する大腸菌を選択する。シングルコロニー
を選択プレートから選び取り、振盪インキュベーターにおいて、クロラムフェニコール（
２５μｇ／ｍｌ）を含有する液体ＬＢ培地１０ｍｌ中、３７℃で一晩培養した。使用され
るすべての化学物質および培地は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、Ｕ
ＳＡから購入する。これらの培養物に由来する組換え生成物からＤＮＡを、ＤＮＡ−プラ
スミド単離キットを使用して、製造業者の推奨に従って、続いて単離し、ＫｐｎＩを用い
る制限消化によって、反応生成物の完全性を分析した。本明細書において、Ｍａｃｈｅｒ
ｅｙ  ａｎｄ  Ｎａｇｅｌ、Ｇｅｒｍａｎｙ製のＮｕｃｌｅｏｂｏｎｄ  ＰＣ−１００キ
ットを使用する。ＫｐｎＩ制限パターンは、単回組換え生成物に対応する。
【０３８４】
＜生物学的材料＞
本発明は、ブダペスト条約に基づいて寄託された生物学的材料を使用する、および／ま
たは関する。より詳しくは、本明細書において、ＤＳＭＺとも呼ばれる「Ｄｅｕｔｓｃｈ
ｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋ
ｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ  （ＤＳＭＺ）」で以下の寄託が行われている。ＤＳＭ２３７
５３；ＤＳＭ２４２９８；ＤＳＭ２４２９９；ＤＳＭ２３７４３；ＤＳＭ２３７４２；Ｄ
ＳＭ  ＡＣＣ３０７７ｍ；ＤＳＭ  ＡＣＣ３０７７；およびＤＳＭ２３７５４。
【０３８５】
本明細書、特許請求の範囲および／または図面に開示された本発明の特徴は、独立して
、およびその任意の組合せの両方で、本発明をその種々の形態で理解するための材料であ
る。
【図１Ａ】
2018113967.tif 000002
【図１Ｂ】
2018113967.tif 000003
【図１Ｃ】
2018113967.tif 000004
【図２Ａ】
2018113967.tif 000005
【図２Ｂ（１）】
2018113967.tif 000006
【図２Ｂ（２）】
2018113967.tif 000007
【図２Ｂ（３）】
2018113967.tif 000008
【図２Ｂ（４）】
2018113967.tif 000009
【図２Ｂ（５）】
2018113967.tif 000010
【図２Ｂ（６）】
2018113967.tif 000011
【図２Ｂ（７）】
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【図２Ｂ（８）】
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【図２Ｂ（９）】
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【図２Ｂ（１０）】
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【図２Ｂ（１１）】
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【図２Ｂ（１２）】
2018113967.tif 000017
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2018113967.tif 000023
【手続補正書】
【提出日】平成30年3月22日(2018.3.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）以下のエレメント：
（ａ）場合によりウイルスのゲノムの第１の部分と、
（ｂ）ヌクレオチド配列、好ましくはゲノムヌクレオチド配列、または転写単位と、
（ｃ）原核生物において調節活性を有する調節核酸配列と、
（ｄ）部位特異的組換え部位と、
（ｅ）陰性選択マーカーを提供するヌクレオチド配列と、
（ｆ）（ｉ）条件付き複製のための細菌ヌクレオチド配列、および（ｉｉ）陽性選択マ
ーカーを提供するヌクレオチド配列を含む細菌ヌクレオチド配列単位と、
（ｇ）場合により第１の制限部位と
を含む核酸分子、または
（２）配列番号６によるヌクレオチド配列を含む核酸分子、または
（３）受託番号ＤＳＭ２３７５４でブダペスト条約に基づいてＤＳＭＺに寄託された生
物中に含有される核酸分子と同一もしくは類似である核酸分子であって、好ましくは、前
記生物中に含有される核酸分子が、異種核酸分子である核酸分子
を含む、第３の核酸分子とも呼ばれる核酸分子であって、
前記第３の核酸分子が、直鎖分子または環状分子のいずれかである、核酸分子。 
【外国語明細書】
2018113967000001.pdf