(57)【要約】      （修正有）【課題】フィブリノーゲンと結合せず且つ不溶性フィブリンに対する親和性及び特異性が高い抗体の提供。【解決手段】不溶性フィブリンと結合し且つフィブリノーゲンと結合しない抗体であって、特定のアミノ酸配列に示される部位に結合する抗体、該抗体を含む免疫学的測定用試薬、血栓関連疾患の判定用試薬及び血栓可視化剤、該抗体と被験体に由来するサンプルとを接触させるステップを含む被験体における血栓関連疾患を判定するための方法、並びに該抗体と抗腫瘍性部分との複合体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
不溶性フィブリンと結合し且つフィブリノーゲンと結合しない抗体であって、配列番号：１に示される部位又は配列番号：２に示される部位に結合する抗体。
【請求項２】
配列番号：４〜６に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、
配列番号：８〜１０に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と
を保持する、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
配列番号：１２〜１４に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、
配列番号：１６〜１８に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と
を保持する、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
配列番号：３に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、
配列番号：７に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と
を保持する、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
配列番号：１１に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、
配列番号：１５に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と
を保持する、請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体を含む、免疫学的測定用試薬。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体を含む、血栓関連疾患の判定用試薬。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体を含む、血栓可視化剤。
【請求項９】
（ａ）請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体とサンプルとを接触させるステップ、
（ｂ）該抗体がサンプル中の不溶性フィブリンと結合したか否かを検出するステップ
を含む、サンプル中の不溶性フィブリンを検出するための方法。
【請求項１０】
（ａ）請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体と被験体に由来するサンプルとを接触させるステップ、
（ｂ）該抗体がサンプル中の不溶性フィブリンと結合したか否かを検出するステップ
を含む、被験体における血栓関連疾患を判定するための方法。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体と抗腫瘍性部分との複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、不溶性フィブリンと結合し且つフィブリノーゲンと結合しない抗体、及び該抗体を含む不溶性フィブリンを検出するための試薬及び方法に関する。また本発明は、前記抗体を用いた血栓関連疾患を判定するための試薬及び方法に関する。さらに本発明は、前記抗体と抗腫瘍性部分との複合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管が傷つき、血液が傷害血管壁や血管内皮下組織に接触したり、組織因子の血中流入があると、血液凝固反応が開始され、血液中のフィブリノーゲンが不溶性フィブリンに変わり、フィブリンの網が強固な止血栓として傷口を固めることが明らかになっている。
【０００３】
血液凝固は、癌と密接な関係があることが古くから示唆されている（１８００年代のフランスの外科医トルソーの「胃癌患者における四肢の血栓による浮腫」に記載）。最近の臨床疫学データでも、膵臓癌、胃癌、脳腫瘍をはじめとして、殆どの癌において凝固亢進による血栓症の頻度が健常人より有意に高いことが明らかとなっている（非特許文献１）。また、癌組織の内部においても凝固異常に伴う、不溶性フィブリンの蓄積、凝固壊死、血管新生が癌の進展とともに繰り返し起こっているものと考えられている。
【０００４】
不溶性フィブリンは、前駆体のフィブリノーゲンが生体に広く認められるのとは異なり、正常な生理的条件下の組織には存在しない。血管外に漏れ出て活性化されたトロンビンがフィブリノーゲンを切断することにより、フィブリンモノマーが形成されて、そのフィブリンモノマーが重合、架橋してフィブリン繊維が形成されることによって生じる。そのため、不溶性フィブリンは、出血や炎症など病理的状態の組織に特異的な存在であり、癌や心筋梗塞、脳梗塞等の凝固を伴う病態が起きたときに形成される。従って、不溶性フィブリンは、かかる血栓関連疾患のマーカー分子であり、特に心筋梗塞や脳梗塞等の脳循環器疾患がない状況における癌組織中に存在する不溶性フィブリンは、まさに癌特異的分子といえる。このように、不溶性フィブリンは血栓形成や重要な疾患との関連性が示されていることから、フィブリンを特異的に検出するための手段の開発が望まれている。
【０００５】
かかる状況を鑑み、フィブリンを検出するための手段として抗体が開発されている（特許文献１〜６）。また、本発明者らもフィブリンと結合し且つフィブリノーゲンと結合しない抗体を開発し、その有用性についても明らかにしている（特許文献７）。
【０００６】
しかしながら、不溶性フィブリンは、前駆体であるフィブリノーゲンの末端部が切断されて生じるものであるため、不溶性フィブリンとフィブリノーゲンとのアミノ酸配列は、切断されて除かれる部分の有無を除き、完全に一致している。さらに生体内には、プラスミン等によって不溶性フィブリンが分解されることによって生じた溶解性フィブリン（ＦＤＰ、フィブリン分解産物）が存在していることもある。従って、アミノ酸配列上及び構造上極めて相同性の高い分子（フィブリノーゲン、ＦＤＰ等）が存在する中、不溶性フィブリンを検出するためには、不溶性フィブリンに対する親和性及び特異性がより高い抗体が必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００１−３５４７００号公報
【特許文献２】特開２００９−１４９６８６号公報
【特許文献３】特開２００８−２９３５３号公報
【特許文献４】特開平９−１２７１０８号公報
【特許文献５】特開平９−１０４７００号公報
【特許文献６】特開平８−３０１９００号公報
【特許文献７】特開２０１２−７２号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】ＰＤ  Ｓｔｅｉｎら、「癌入院患者における静脈血栓塞栓症の発生率（Ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｖｅｎｏｕｓ  ｔｈｒｏｍｂｏｅｍｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｈｏｓｐｉｔａｌｉｚｅｄ  ｗｉｔｈ  ｃａｎｃｅｒ）」、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊ  Ｍｅｄ．、２００６年、１１６巻、６０〜６８ページ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、フィブリノーゲンと結合せず且つ不溶性フィブリンに対する親和性及び特異性が高い抗体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、上記課題を解決するため、特許文献７に記載のフィブリンと結合し且つフィブリノーゲンと結合しない抗体（１０２−１０抗体）の性状及び機能について鋭意検討を行った。その結果、１０２−１０抗体は、インビトロ及びインビボにおいて、癌、脳梗塞、心筋梗塞及び炎症性疾患等において生じる血栓を検出できることが明らかになった。また、１０２−１０抗体は、フィブリノーゲンには結合しないが、フィブリノーゲンを構成する３種類のポリペプチド鎖（Ａα鎖、Ｂβ鎖、γ鎖）のうち、Ｂβ鎖には結合できることを見出した。さらに、１０２−１０抗体のエピトープがフィブリノーゲンＢβ鎖の第２３１〜２４６位のアミノ酸からなる部位であることも明らかにした。
【００１１】
フィブリノーゲンは、それを構成するフィブリノーゲンＢβ鎖のアミノ末端が切断され、フィブリノーゲンβ鎖が生じること等によって、フィブリンモノマーとなり、さらには該モノマーが重合、架橋化することにより不溶性フィブリンが形成される。本発明者らによるコンピューターシュミレーション解析の結果、フィブリノーゲンにおいて、前記エピトープはフィブリノーゲンＢβ鎖においてフィブリノーゲンγ鎖と結合している部位であることが明らかになった。本発明者らは、かかる結果に基づき、１０２−１０抗体がフィブリノーゲンに結合できないのは、当該抗体のエピトープが分子内に隠れていることが原因であると考えた。また、１０２−１０抗体が不溶性フィブリンに結合できるのは、フィブリンモノマーが重合、架橋化されることによって、フィブリンモノマーにおいて、フィブリノーゲンβ鎖又はフィブリノーゲンＢβ鎖内の前記エピトープが露呈することにあると本発明者らは想定した。
【００１２】
そこで、かかる想定に基づき、フィブリノーゲンＢβ鎖の第２３１〜２４６位のアミノ酸からなる部位と、フィブリノーゲン分子内にて該部位と結合している、フィブリノーゲンγ鎖の第２３２〜２４６位のアミノ酸からなる部位とを、各々抗原としてマウスに免疫し、新たにモノクローナル抗体を作製した。そして、得られた抗体について、フィブリノーゲン又は不溶性フィブリンに対する親和性を評価したところ、いずれの抗体もフィブリノーゲンに対しては結合することなく、不溶性フィブリンに対しては高い親和性を示した。さらに、これら抗体の不溶性フィブリンに対する親和性はいすれも、１０２−１０抗体のそれよりもはるかに高いものであることを見出した。また、今回作製した、フィブリノーゲンＢβ鎖の第２３１〜２４６位のアミノ酸からなる部位に結合する抗体及びフィブリノーゲンγ鎖の第２３２〜２４６位のアミノ酸からなる部位に結合する抗体について、軽鎖及び重鎖の可変領域及び相補性決定領域のアミノ酸配列を決定した。本発明は、上記知見に基づいてなされたものである。すなわち、本発明は、以下の＜１＞〜＜１１＞を提供するものである。
＜１＞  不溶性フィブリンと結合し且つフィブリノーゲンと結合しない抗体であって、配列番号：１に示される部位又は配列番号：２に示される部位に結合する抗体。
＜２＞  配列番号：４〜６に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、
配列番号：８〜１０に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と
を保持する、＜１＞に記載の抗体。
＜３＞  配列番号：１２〜１４に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、
配列番号：１６〜１８に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と
を保持する、＜１＞に記載の抗体。
＜４＞  配列番号：３に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、
配列番号：７に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と
を保持する、＜１＞に記載の抗体。
＜５＞  配列番号：１１に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、
配列番号：１５に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と
を保持する、＜１＞に記載の抗体。
＜６＞  ＜１＞〜＜５＞のいずれか１に記載の抗体を含む、免疫学的測定用試薬。
＜７＞  ＜１＞〜＜５＞のいずれか１に記載の抗体を含む、血栓関連疾患の判定用試薬。
＜８＞  ＜１＞〜＜５＞のいずれか１に記載の抗体を含む、血栓可視化剤。
＜９＞  （ａ）＜１＞〜＜５＞のいずれか１に記載の抗体とサンプルとを接触させるステップ、（ｂ）該抗体がサンプル中の不溶性フィブリンと結合したか否かを検出するステップを含む、サンプル中の不溶性フィブリンを検出するための方法。
＜１０＞  （ａ）＜１＞〜＜５＞のいずれか１に記載の抗体と被験体に由来するサンプルとを接触させるステップ、（ｂ）該抗体がサンプル中の不溶性フィブリンと結合したか否かを検出するステップを含む、被験体における血栓関連疾患を判定するための方法。
＜１１＞  ＜１＞〜＜５＞のいずれか１に記載の抗体と抗腫瘍性部分との複合体。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、フィブリノーゲンと結合せず且つ不溶性フィブリンに対する親和性及び特異性が高い抗体を提供することが可能となる。かかる抗体を用いることにより、高感度に、信頼性をもって、且つ簡便に不溶性フィブリン及び血栓の存在を検出することができ、結果として血栓関連疾患を判定することが可能となる。また、かかる抗体を用いることにより、適当な化合物又は分子を血栓が存在する部位、例えば腫瘍に送達させることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】フィブリンと結合し且つフィブリノーゲンと結合しない抗体（特開２０１２−７２号公報に記載の１０２−１０抗体）の、ヒト又はマウスに由来する不溶性フィブリン又はフィブリノーゲンに対する親和性について、ＥＬＩＳＡ法により解析した結果を示すグラフである。
【図２】１０２−１０抗体の、不溶性フィブリン、それを各種酵素により分解して得られた産物（溶解性フィブリン）又はフィブリノーゲンに対する親和性について、ＥＬＩＳＡ法により解析した結果を示すグラフである。
【図３】１０２−１０抗体及び市販の抗フィブリン抗体（ＮＹＢ−Ｔ２Ｇ１、ＭＨ−１）の、ヒト不溶性フィブリン、ヒトフィブリノーゲン又はＤ−ダイマー（溶解性フィブリン）に対する親和性について、ＥＬＩＳＡ法により解析した結果を示すグラフである。図中、「Ａ」はヒト不溶性フィブリンに対する親和性を示し、「Ｂ」はヒトフィブリノーゲンに対する親和性を示し、「Ｃ」はＤ−ダイマーに対する親和性を示す。
【図４】１０２−１０抗体により、脳、肺及び膵臓の正常な組織又は癌化した組織を免疫染色した結果を示す、顕微鏡写真である。
【図５】１０２−１０抗体により、大腸癌、大腸腺腫又は反応性リンパ節炎の組織を免疫染色した結果を示す、顕微鏡写真である。
【図６】１０２−１０抗体により、脳梗塞（発症後３週間経過）、心筋梗塞（発症後３週間経過）、急性膵炎又は慢性膵炎の組織を免疫染色した結果を示す、顕微鏡写真である。
【図７】１０２−１０抗体により、脳梗塞、関節炎又は損傷した皮膚の組織を免疫染色した結果を示す、顕微鏡写真である。図中の日数は、発症又は創傷してからの経過日数を示し。また矢印は、不溶性フィブリン（血栓）形成部位を示す。
【図８】１０２−１０抗体と、ｐ−イソチシアネートベンジル−デスフェリオキサミンＢと、８９Ｚｒ核種とからなる、ＰＥＴプローブの概略図を示す。
【図９】図８に示したＰＥＴプローブを投与した化学発癌マウスを、ＰＥＴ（ポジトロン断層法）及びＣＴ（コンピューター断層撮影法）により撮影した結果を示す、写真である。図中、左から順に、化学発癌マウスの外観を撮影した写真、ＣＴ画像、ＰＥＴ画像、ＣＴ画像とＰＥＴ画像とを重ね合わせたものを示す。
【図１０】図８に示したＰＥＴプローブを投与した化学発癌マウスから腫瘍を単離し、該腫瘍の断面を観察した結果を示す写真である。図中「ＨＥ」は腫瘍断面をＨＥ染色して観察した結果を示し、「フィブリン」は腫瘍断面を１０２−１０抗体により免疫染色して観察した結果を示し、「オートラジオグラム」は腫瘍断面においてＰＥＴプローブから放出される放射線を検出した結果を示す。
【図１１】１０２−１０抗体により、フィブリンクロットを免疫染色した結果を示す、顕微鏡写真である。
【図１２】還元状態にあるフィブリノーゲン（フィブリノーゲンＡα鎖、フィブリノーゲンＢβ鎖、フィブリノーゲンγ鎖）と、非還元状態にあるフィブリノーゲンとを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより展開し、これらタンパク質を展開したゲルをＣＢＢにて染色した結果を示す、写真である。図中、「ｈｕ」及び「ｍｓ」は、展開したフィブリノーゲンがヒト由来及びマウス由来であることを各々示す。「Ｍｗ」は分子量マーカーを展開したレーンであることを示す（図１３においても同じ）。
【図１３】還元状態にあるフィブリノーゲン（フィブリノーゲンＡα鎖、フィブリノーゲンＢβ鎖、フィブリノーゲンγ鎖）と、非還元状態にあるフィブリノーゲンとを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより展開し、１０２−１０抗体を用いたウェスタンブロッティングにより解析した結果を示す、写真である。
【図１４】フィブリノーゲンＢβ鎖のアミノ酸配列を示す図である。図中マークしてあるアミノ酸配列は、１０２−１０抗体のエピトープが存在することがアミノ酸シークエンス解析により示唆された、フィブリノーゲンＢβ鎖の第１７９位のヒスチジン〜第２６４位のリジンからなる領域（８６アミノ酸）である。
【図１５】前記８６アミノ酸からなる領域の部分配列からなる合成ペプチドを用いた、１０２−１０抗体との結合における競争阻害実験の結果を示すグラフである。
【図１６】フィブリノーゲン分子内の、フィブリノーゲンＢβ鎖とフィブリノーゲンγ鎖との結合状態をコンピューターシュミレーションにて解析した結果を示す図である。図中、矢印は１０２−１０抗体のエピトープ（フィブリノーゲンＢβ鎖の第２３１〜２４６位のアミノ酸からなる部位）を示す。
【図１７】１０２−１０抗体、抗β鎖抗体（Ｆｉｂ−０３５５抗体、Ｆｉｂ−３４３５抗体）又は抗γ鎖抗体（１３−３０抗体、３４−１０５抗体）の、フィブリン又はフィブリノーゲンに対する親和性について、ＥＬＩＳＡ法により解析した結果を示すグラフである。なお、「抗β鎖抗体」は、フィブリノーゲンＢβ鎖の第２３１〜２４６位のアミノ酸からなるポリペプチドをマウスに免疫して得られたモノクローナル抗体を解析した結果を示し、「抗γ鎖抗体」は、フィブリノーゲンγ鎖の第２３２〜２４６位のアミノ酸からなるポリペプチドをマウスに免疫して得られたモノクローナル抗体を解析した結果を示す。
【図１８】抗β鎖抗体（Ｆｉｂ−０３５５抗体）の軽鎖（Ｌ鎖）可変領域及び重鎖（Ｈ鎖）可変領域、並びにこれらのＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を示す図である。
【図１９】抗γ鎖抗体（３４−１０５抗体）の軽鎖（Ｌ鎖）可変領域及び重鎖（Ｈ鎖）可変領域、並びにこれらのＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
＜不溶性フィブリンに対する抗体＞
後述の実施例において示す通り、本発明者らは、フィブリノーゲンＢβ鎖の第２３１〜２４６位のアミノ酸からなる部位若しくはフィブリノーゲンβ鎖の第１８７〜２０２位のアミノ酸からなる部位（共に配列番号：１に示される部位）、又はフィブリノーゲンγ鎖の第２３２〜２４６位のアミノ酸からなる部位（配列番号：２に示される部位）をエピトープとする抗体は、不溶性フィブリンに結合できるが、フィブリノーゲンには結合できないことを明らかにした。
【００１６】
従って、本発明は、不溶性フィブリンと結合し且つフィブリノーゲンと結合しない抗体であって、配列番号：１に示される部位又は配列番号：２に示される部位に結合する抗体を提供する。
【００１７】
本発明において「不溶性フィブリン」とは、フィブリノーゲンからトロンビンの作用によりフィブリンモノマーが産生され、該フィブリンモノマーが重合することにより難溶性のフィブリンポリマーが形成され、さらに該フィブリンポリマー間が第ＸＩＩＩ因子によって架橋化されているものを意味する。また、本発明における「不溶性フィブリン」には、それを構成するフィブリンモノマー及びフィブリンポリマーが含まれるが、不溶性フィブリンがプラスミン等により分解され、可溶化したもの（ＦＤＰ、フィブリン分解産物）は、含まれない。
【００１８】
本発明において「フィブリノーゲン」とは、２つのフィブリノーゲンＡα鎖と、２つのフィブリノーゲンＢβ鎖と、２つのフィブリノーゲンγ鎖とが、架橋化されてなる複合体を意味する。「フィブリノーゲンＢβ鎖」は、ヒト由来のものであれば典型的には、配列番号：１９に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であり、「フィブリノーゲンγ鎖」は、ヒト由来のものであれば典型的には、配列番号：２０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質である。また、本発明において「フィブリノーゲンβ鎖」とは、トロンビンの作用によりフィブリノーゲンＢβ鎖が切断され、そのＮ末端部分であるフィブリノペプチドＢが除去されたタンパク質を意味し、ヒト由来のものであれば典型的には、配列番号：１９に記載の第４５〜４９１位のアミノ酸配列からなるタンパク質である。
【００１９】
配列番号：１に記載のアミノ酸配列は、ヒトフィブリノーゲンＢβ鎖の第２３１〜２４６位のアミノ酸配列又はヒトフィブリノーゲンβ鎖の第１８７〜２０２位のアミノ酸配列であり、配列番号：２に記載のアミノ酸配列は、ヒトフィブリノーゲンγ鎖の第２３２〜２４６位のアミノ酸配列である。
【００２０】
本発明における「抗体」は、免疫グロブリンのすべてのクラス及びサブクラスを含む。「抗体」には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体が含まれ、また、抗体の機能的断片の形態も含む意である。「ポリクローナル抗体」は、異なるエピトープに対する異なる抗体を含む抗体調製物である。また、「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体（抗体断片を含む）を意味する。ポリクローナル抗体とは対照的に、モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を認識するものである。本発明の抗体は、好ましくはモノクローナル抗体である。本発明の抗体は、自然環境の成分から分離され、及び／又は回収された（即ち、単離された）抗体である。
【００２１】
本発明において、抗体が不溶性フィブリンに結合するか、またフィブリノーゲンに結合しないかは、当該技術分野で公知の方法によって判定することができ、かかる公知の方法としては、例えば、後述の実施例において示すような、不溶性フィブリン又はフィブリノーゲンを固相化したプレートを用いたＥＬＩＳＡ法が挙げられる。
【００２２】
また、本発明において、不溶性フィブリンに対する特異性が高い抗体とは、他のペプチド又はタンパク質に対する親和性よりも、フィブリンに対して高い親和性で結合する抗体を意味する。ここで、高い親和性とは、当該技術分野で公知の方法によって、不溶性フィブリンを他のペプチド又はタンパク質から区別して検出することが可能な程度に高い親和性を意味する。
【００２３】
また、本発明の抗体は、後述の実施例において示す通り、ヒト及びマウス由来の不溶性フィブリンと結合することができ、ヒト及びマウス由来のフィブリノーゲンとは結合しない。従って、マウスにおいて本抗体を用いて得られた試験データをヒトに外挿することが可能である。
【００２４】
また、本発明のモノクローナル抗体の好ましい態様は、後述の実施例に記載の、ハイブリドーマＦｉｂ−０３５５が産生するモノクローナル抗体（Ｆｉｂ−０３５５抗体）、ハイブリドーマＦｉｂ−３４３５が産生するモノクローナル抗体（Ｆｉｂ−３４３５抗体）、ハイブリドーマ１３−３０が産生するモノクローナル抗体（１３−３０抗体）、ハイブリドーマ３４−１０５が産生するモノクローナル抗体（３４−１０５抗体）である。
【００２５】
また、本発明のモノクローナル抗体の好ましい別の態様は、前記ハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体の軽鎖ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、重鎖ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域とを保持する抗体又はそれらのアミノ酸配列変異体である。
【００２６】
かかる本発明の好適なモノクローナル抗体としては、
軽鎖ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列（配列番号：４〜６に記載のアミノ酸配列）又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、
重鎖ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列（配列番号：８〜１０に記載のアミノ酸配列）又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と
を保持する抗体、
軽鎖ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列（配列番号：１２〜１４に記載のアミノ酸配列）又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、
重鎖ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列（配列番号：１６〜１８に記載のアミノ酸配列）又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と
を保持する抗体
が挙げられる。
【００２７】
本発明のより好適なモノクローナル抗体としては、
配列番号：３に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、
配列番号：７に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と
を保持する抗体、
配列番号：１１に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、
配列番号：１５に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持する抗体
が挙げられる。
【００２８】
また、本発明の抗体の好ましい別の態様は、後述の実施例２に記載のＥＬＩＳＡにおいて、不溶性フィブリンに対する親和性（波長４９２ｎｍにおける吸光度）が０．５以上（より好ましくは１．０以上、さらに好ましくは１．５以上、特に好ましくは２．０以上）である抗体である。
【００２９】
また、本発明の抗体の好ましい別の態様は、後述の実施例２に記載のＥＬＩＳＡにおいて、不溶性フィブリンに対する親和性（波長４９２ｎｍにおける吸光度）が、特許文献７に記載の１０２−１０抗体と比較して、５倍以上（より好ましくは１０倍以上）である抗体である。
【００３０】
また、本発明の抗体の好ましい別の態様は、後述の実施例２に記載のＥＬＩＳＡにおいて、フィブリノーゲンに対する親和性（４９２ｎｍにおける吸光度）に対する不溶性フィブリンのそれの比率が、１０倍以上（より好ましくは２０倍以上）である抗体である。
【００３１】
本発明の抗体には、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、及びこれら抗体の機能的断片が含まれる。本発明の抗体を医薬としてヒトに投与する場合は、副作用低減の観点から、キメラ抗体、ヒト化抗体、あるいはヒト抗体が望ましい。
【００３２】
本発明において「キメラ抗体」とは、ある種の抗体の可変領域とそれとは異種の抗体の定常領域とを連結した抗体である。キメラ抗体は、例えば、抗原をマウスに免疫し、そのマウスモノクローナル抗体の遺伝子から抗原と結合する抗体可変部（可変領域）を切り出して、ヒト骨髄由来の抗体定常部（定常領域）遺伝子と結合し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入して産生させることにより取得することができる（例えば、特開平８−２８０３８７号公報、米国特許第４８１６３９７号公報、米国特許第４８１６５６７号公報、米国特許第５８０７７１５号公報）。また、本発明において「ヒト化抗体」とは、非ヒト由来の抗体の抗原結合部位（ＣＤＲ）の遺伝子配列をヒト抗体遺伝子に移植（ＣＤＲグラフティング）した抗体であり、その作製方法は、公知である（例えば、ＥＰ２３９４００、ＥＰ１２５０２３、ＷＯ９０／０７８６１、ＷＯ９６／０２５７６参照）。本発明において、「ヒト抗体」とは、すべての領域がヒト由来の抗体である。ヒト抗体の作製においては、ヒトＢ細胞より活性のある抗体の産生をスクリーニングする方法、ファージディスプレイ法、免疫することで、ヒト抗体のレパートリーを生産することが可能なトランスジェニック動物（例えばマウス）を利用すること等が可能である。ヒト抗体の作製手法は、公知である（例えば、Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１３：６５−９３（１９９５）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２２２：５８１−５９７（１９９１）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１５：１４６−１５６（１９９７）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７：７２２−７２７（２０００）、特開平１０−１４６１９４号公報、特開平１０−１５５４９２号公報、特許２９３８５６９号公報、特開平１１−２０６３８７号公報、特表平８−５０９６１２号公報、特表平１１−５０５１０７号公報）。
【００３３】
本発明において抗体の「機能的断片」とは、抗体の一部分（部分断片）であって、配列番号：１に示す部位又は配列番号：２に示す部位に結合するものを意味する。具体的には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、可変領域断片（Ｆｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃ（Ｆｖ）２、ダイアボディー、多特異性抗体、及びこれらの重合体等が挙げられる。
【００３４】
ここで「Ｆａｂ」とは、１つの軽鎖及び重鎖の一部からなる免疫グロブリンの一価の抗原結合断片を意味する。抗体のパパイン消化によって、また、組換え方法によって得ることができる。「Ｆａｂ’」は、抗体のヒンジ領域の１つ又はそれより多いシステインを含めて、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端でのわずかの残基の付加によって、Ｆａｂとは異なる。「Ｆ（ａｂ’）２」とは、両方の軽鎖と両方の重鎖の部分からなる免疫グロブリンの二価の抗原結合断片を意味する。
【００３５】
「可変領域断片（Ｆｖ）」は、完全な抗原認識及び結合部位を有する最少の抗体断片である。Ｆｖは、重鎖可変領域および軽鎖可変領域が非共有結合により強く連結されたダイマーである。「一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）」は、抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、これらの領域は、単一のポリペプチド鎖に存在する。「ｓｃ（Ｆｖ）２」は、２つの重鎖可変領域及び２つの軽鎖可変領域をリンカー等で結合して一本鎖にしたものである。「ダイアボディー」とは、二つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片であり、この断片は、同一ポリペプチド鎖の中に軽鎖可変領域に結合した重鎖可変領域を含み、各領域は別の鎖の相補的領域とペアを形成している。「多特異性抗体」は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。例えば、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現により調製することができる。
【００３６】
本発明の抗体には、望ましい活性（抗原への親和性、抗原に対する特異性、及び／又は他の生物学的特性）を減少させることなく、そのアミノ酸配列が修飾された抗体が含まれる。本発明の抗体のアミノ酸配列変異体は、本発明の抗体鎖をコードするＤＮＡへの変異導入によって、またはペプチド合成によって作製することができる。そのような修飾には、例えば、本発明の抗体のアミノ酸配列内の残基の置換、欠失、付加及び／又は挿入を含む。抗体のアミノ酸配列が改変される部位は、改変される前の抗体と同等の活性を有する限り、抗体の重鎖又は軽鎖の定常領域であってもよく、また、可変領域（フレームワーク領域及びＣＤＲ）であってもよい。ＣＤＲ以外のアミノ酸の改変は、抗原との結合親和性への影響が相対的に少ないと考えられるが、現在では、ＣＤＲのアミノ酸を改変して、抗原へのアフィニティーが高められた抗体をスクリーニングする手法が公知である（ＰＮＡＳ，１０２：８４６６−８４７１（２００５）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２１：４８５−４９３（２００８）、国際公開第２００２／０５１８７０号、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８０：２４８８０−２４８８７（２００５）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２１：３４５−３５１（２００８））。
【００３７】
改変されるアミノ酸数は、好ましくは、１０アミノ酸以内、より好ましくは５アミノ酸以内、最も好ましくは３アミノ酸以内（例えば、２アミノ酸以内、１アミノ酸）である。アミノ酸の改変は、好ましくは、保存的な置換である。本発明において「保存的な置換」とは、化学的に同様な側鎖を有する他のアミノ酸残基で置換することを意味する。化学的に同様なアミノ酸側鎖を有するアミノ酸残基のグループは、本発明の属する技術分野でよく知られている。例えば、酸性アミノ酸（アスパラギン酸及びグルタミン酸）、塩基性アミノ酸（リシン・アルギニン・ヒスチジン）、中性アミノ酸においては、炭化水素鎖を持つアミノ酸（グリシン・アラニン・バリン・ロイシン・イソロイシン・プロリン）、ヒドロキシ基を持つアミノ酸（セリン・トレオニン）、硫黄を含むアミノ酸（システイン・メチオニン）、アミド基を持つアミノ酸（アスパラギン・グルタミン）、イミノ基を持つアミノ酸（プロリン）、芳香族基を持つアミノ酸（フェニルアラニン・チロシン・トリプトファン）で分類することができる。
【００３８】
また「同等の活性を有する」とは、抗原への親和性が対象抗体（代表的には、後述の実施例において示す、Ｆｉｂ−０３５５抗体、Ｆｉｂ−３４３５抗体、１３−３０抗体、３４−１０５抗体）と同等（例えば、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上）であることを意味する。抗原への親和性は、前述の通り、ＥＬＩＳＡ法により評価することができる。
【００３９】
また、本発明においては、抗体の安定性を増加させる等の目的で脱アミド化されるアミノ酸若しくは脱アミド化されるアミノ酸に隣接するアミノ酸を他のアミノ酸に置換することにより脱アミド化を抑制してもよい。また、グルタミン酸を他のアミノ酸へ置換して、抗体の安定性を増加させることもできる。本発明は、こうして安定化された抗体をも提供するものである。
【００４０】
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体であれば、抗原（配列番号：１又は配列番号：２）のアミノ酸配列からなるポリペプチド、その部分ペプチド、またはこれらを発現する細胞等）で免疫動物を免疫し、その抗血清から、従来の手段（例えば、塩析、遠心分離、透析、カラムクロマトグラフィー等）によって、精製して取得することができる。また、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法や組換えＤＮＡ法によって作製することができる。
【００４１】
ハイブリドーマ法としては、代表的には、コーラー及びミルスタインの方法（Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５））が挙げられる。この方法における細胞融合工程に使用される抗体産生細胞は、前記抗原で免疫された動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、サル、ヤギ）の脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血白血球等である。免疫されていない動物から予め単離された上記の細胞又はリンパ球等に対して、抗原を培地中で作用させることによって得られた抗体産生細胞も使用することが可能である。ミエローマ細胞としては公知の種々の細胞株を使用することが可能である。抗体産生細胞及びミエローマ細胞は、それらが融合可能であれば、異なる動物種起源のものでもよいが、好ましくは、同一の動物種起源のものである。ハイブリドーマは、例えば、抗原で免疫されたマウスから得られた脾臓細胞と、マウスミエローマ細胞との間の細胞融合により産生され、その後のスクリーニングにより、配列番号：１又は２に示す部位に特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。配列番号：１又は２に示す部位に特異的なモノクローナル抗体は、ハイブリドーマを培養することにより、また、ハイブリドーマを投与した哺乳動物の腹水から、取得することができる。
【００４２】
組換えＤＮＡ法は、上記本発明の抗体をコードするＤＮＡをハイブリドーマやＢ細胞等からクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主細胞（例えば哺乳類細胞株、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞等）に導入し、本発明の抗体を組換え抗体として産生させる手法である（例えば、Ｐ．Ｊ．Ｄｅｌｖｅｓ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９７  ＷＩＬＥＹ、Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ  ａｎｄ  Ｃ．Ｄｅａｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，２０００  ＯＸＦＯＲＤ  ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ  ＰＲＥＳＳ、Ｖａｎｄａｍｍｅ  Ａ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９２：７６７−７７５（１９９０））。本発明の抗体をコードするＤＮＡの発現においては、重鎖又は軽鎖をコードするＤＮＡを別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換してもよく、重鎖及び軽鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換してもよい（国際公開第９４／１１５２３号公報  参照）。本発明の抗体は、上記宿主細胞を培養し、宿主細胞内又は培養液から分離・精製し、実質的に純粋で均一な形態で取得することができる。抗体の分離・精製は、通常のポリペプチドの精製で使用されている方法を使用することができる。トランスジェニック動物作製技術を用いて、抗体遺伝子が組み込まれたトランスジェニック動物（ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ等）を作製すれば、そのトランスジェニック動物のミルクから、抗体遺伝子に由来するモノクローナル抗体を大量に取得することも可能である。
【００４３】
従って、本発明は、本発明の抗体をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含む発現ベクター、前記ＤＮＡ又は該発現ベクターを含み、本発明の抗体を産生する形質転換体、該形質転換体を培養し、当該形質転換体内又は培養液から抗体を分離・精製するステップを含む、本発明の抗体の製造方法、本発明の抗体を産生する又は本発明の抗体をコードするＤＮＡを含むハイブリドーマを提供することができる。
【００４４】
また、本発明は、配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド又は配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドで免疫、不溶性フィブリンと結合し且つフィブリノーゲンと結合しない抗体の製造方法を提供することもできる。さらに、不溶性フィブリンと結合し且つフィブリノーゲンと結合しない抗体を製造するための、配列番号：１又は配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる抗原を提供することもできる。
【００４５】
＜免疫学的測定用試薬＞
後述の実施例に示す通り、本発明の抗体を用いて、サンプル中の不溶性フィブリンを検出することが可能である。この検出は、抗体を用いる測定方法、すなわち免疫学的測定方法であれば、任意の方法に基づいて実施することができる。例えば、不溶性フィブリンの検出は、免疫組織化学染色法及び免疫電顕法、並びに免疫アッセイ（酵素免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ）、蛍光免疫アッセイ、放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）、免疫クロマト法及びウエスタンブロット法等）等を利用して実施することができる。
【００４６】
対象となるサンプルとしては、特に限定されるものではなく、例えば、組織又は細胞サンプル（胃、十二指腸、大腸、膵、胆嚢、胆管、気管支、肺等の癌の組織又は細胞）、生体液サンプル（胃粘液、十二指腸液、膵液、胆汁、腹水、喀痰、気管支肺胞洗浄液、血液、血清、血漿等）等が挙げられる。例えば、免疫染色の場合には、組織サンプル（生検標本、切除標本）、細胞診サンプルをサンプルとして用いることが好ましい。
【００４７】
本発明の免疫学的測定方法においては、サンプル中の不溶性フィブリンを、本発明の抗体と結合させて、その結合を検出することによって、不溶性フィブリンを検出する。本発明において「検出」とは、不溶性フィブリンの存在の有無を検出することだけではなく、不溶性フィブリンを定量的に検出すること、不溶性フィブリンを免疫染色することも含む。
【００４８】
不溶性フィブリンについての免疫アッセイは、典型的には、試験対象のサンプルを本発明の抗体と接触させ、当該技術分野で公知の手法を用いて結合した抗体を検出することを含む。「接触」は、サンプル中に存在する不溶性フィブリンと本発明の抗体とが結合できるように近接することができる状態にすることを意味し、例えば、固形サンプルに対して抗体含有溶液を塗布すること、抗体含有溶液に固形サンプルを浸漬すること、液状サンプルと抗体含有溶液とを混合すること等の操作が含まれる。
【００４９】
免疫アッセイは、液相系及び固相系のいずれで行ってもよい。また免疫アッセイの形式も限定されるものではなく、直接固相法の他、サンドイッチ法、競合法等であってもよい。
【００５０】
本発明の抗体はまた、免疫組織化学染色法（例えば免疫染色法）又は免疫電顕法のように、不溶性フィブリンのｉｎ  ｓｉｔｕ検出のために、組織学的に用いることも可能である。ｉｎ  ｓｉｔｕ検出は、被験体から組織学的サンプルを切除し（生検組織サンプル、組織のパラフィン包埋切片など）、それに標識した抗体を接触させることにより実施しうる。
【００５１】
免疫アッセイの操作法は、公知の方法（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら編，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １１”ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．１９９５）により行うことができる。あるいは、不溶性フィブリンと抗体との複合体を、公知の分離手段（クロマト法、塩析法、アルコール沈殿法、酵素法、固相法等）によって分離し、標識のシグナルを検出するようにしてもよい。
【００５２】
免疫アッセイの一例として、例えば固相系を利用する場合、抗体を固相支持体又は担体（樹脂プレート、メンブレン、ビーズ等）に固定してもよいし、あるいはサンプルを固定してもよい。例えば、抗体を固相支持体に固定し、支持体を適当なバッファーで洗浄した後、サンプルを用いて処理する。次に固相支持体にバッファーを用いた２回目の洗浄を行って、未結合の抗体を除去する。そして固体支持体上の結合した抗体又を、慣用的な手段により検出することによって、サンプル中の不溶性フィブリンと抗体との結合を検出することができる。あるいはまた、固形サンプルを抗体を含む溶液で処理して、続いてバッファーを用いた洗浄を行って未結合の抗体を除去した後、固形サンプル上の結合した抗体を慣用的な手段により検出することができる。
【００５３】
抗体の結合活性は、周知の方法に従って測定しうる。当業者であれば、採用する免疫アッセイの種類及び形式、使用する標識の種類及び標識の対象等に応じて、各アッセイについての有効且つ最適な測定方法を決定することができる。
【００５４】
本発明においては、本発明の抗体と、サンプル中に存在する不溶性フィブリンとの反応を容易に検出するために、本発明の抗体を標識することにより該反応を直接検出するか、又は標識二次抗体若しくはビオチン−アビジン複合体等を用いることにより間接的に検出する。本発明で使用可能な標識の例とその検出方法について以下に記載する。
【００５５】
酵素免疫アッセイの場合には、例えば、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、アミラーゼ等を用いることができる。また、酵素阻害物質や補酵素等を用いることもできる。これら酵素と抗体との結合は、グルタルアルデヒド、マレイミド化合物等の架橋剤を用いる公知の方法によって行うことができる。
【００５６】
蛍光免疫アッセイの場合には、例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）等を用いることができる。これらの蛍光標識は、慣用の手法により抗体と結合させることができる。
【００５７】
放射性免疫アッセイの場合には、例えば、トリチウム、ヨウ素１２５及びヨウ素１３１等を用いることができる。放射性標識は、クロラミンＴ法、ボルトンハンター法等の公知の方法により、抗体に結合させることができる。
【００５８】
例えば、本発明の抗体を上記のように標識で直接標識する場合には、サンプルを標識した本発明の抗体と接触させて、不溶性フィブリン−抗体の複合体を形成させる。定量の場合には、未結合の標識抗体を分離した後、結合標識抗体量又は未結合標識抗体量よりサンプル中の不溶性フィブリン量を測定することができる。
【００５９】
また例えば、標識二次抗体を用いる場合には、本発明の抗体とサンプルとを反応させ（１次反応）、得られた複合体にさらに標識二次抗体を反応させる（２次反応）。１次反応と２次反応は逆の順序で行ってもよいし、同時に行ってもよいし、又は時間をずらして行ってもよい。１次反応及び２次反応により、フィブリン−本発明の抗体−標識二次抗体の複合体、又は本発明の抗体−フィブリン−標識二次抗体の複合体が形成される。そして定量を行う場合には、未結合の標識二次抗体を分離して、結合標識二次抗体量又は未結合標識二次抗体量よりサンプル中の不溶性フィブリン量を測定することができる。
【００６０】
ビオチン−アビジン複合体系を利用する場合には、ビオチン化した抗体とサンプルとを反応させ、得られた複合体に標識を付加したアビジンを反応させる。アビジンは、ビオチンと特異的に結合することができるため、アビジンに付加した標識のシグナルを検出することによって、抗体と不溶性フィブリンとの結合を測定することができる。アビジンに付加する標識は特に限定されるものではないが、例えば酵素標識（ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等）が好ましい。
【００６１】
標識シグナルの検出もまた、当該技術分野で公知の方法に従って行うことができる。例えば、酵素標識を用いる場合には、酵素作用によって分解して発色する基質を加え、基質の分解量を光学的に測定することによって酵素活性を求め、これを結合抗体量に換算し、標準値との比較から抗体量が算出される。基質は、使用する酵素の種類に応じて異なり、例えば酵素としてペルオキシダーゼを使用する場合には、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）等を、また酵素としてアルカリフォスファターゼを用いる場合には、パラニトロフェノール等を用いることができる。蛍光標識は、例えば蛍光顕微鏡、プレートリーダー等を用いて検出及び定量することができる。放射性標識を用いる場合には、放射性標識の発する放射線量をシンチレーションカウンター等により測定する。
【００６２】
また、本発明は、本発明の抗体を含む、不溶性フィブリンの免疫学的測定用試薬に関する。本発明の免疫学的測定用試薬において、抗体は標識されていてもよい。また、抗体は、遊離形態であってもよいし、固相支持体（例えば、メンブレン、ビーズ等）に固定化されていてもよい。
【００６３】
免疫学的測定用試薬には、本発明の抗体の他、免疫学的測定方法を実施するために有用な成分が含まれてもよい。そのような成分としては、例えば、免疫アッセイにおいて使用するためのバッファー、サンプル処理用試薬、標識、競合物、二次抗体等が挙げられる。本発明の免疫学的測定用試薬を用いることによって、サンプル中の不溶性フィブリンの検出を容易且つ簡便に行うことができる。
【００６４】
＜血栓関連疾患の判定用試薬＞
本発明の抗体は、後述の実施例に示す通り、ヒト不溶性フィブリンと特異的に反応するため、フィブリンに関連する疾患又は障害、例えば血栓関連疾患の判定用試薬において用いることができる。本発明において「血栓関連疾患」とは、その疾患又は障害の状態と血栓の存在との間に相関性がある疾患又は障害を意味する。そのような血栓関連疾患としては、限定されるものではないが、梗塞、例えば心筋梗塞、脳梗塞、脳出血、脳塞栓、脳血栓、くも膜下出血、肺梗塞等、並びに癌、例えば膵癌、胃癌、食道癌、結腸直腸癌、大腸癌、卵巣癌、乳癌及び肺癌が含まれる。不溶性フィブリンの存在を検出することによって、血栓関連疾患の有無の判定、血栓関連疾患の進行状況（悪化、良化）の判定、血栓関連疾患の位置の特定を行うことができる。
【００６５】
本発明の判定用試薬は、上述した本発明の抗体を含むものである。従って、本発明の判定用試薬を用いて、血栓関連疾患（例えば梗塞又は癌）への罹患又はその存在が疑われる被験体から採取したサンプル中に含まれる不溶性フィブリンを検出することによって、該被験体の血栓関連疾患の存在、該被験体の血栓関連疾患の進行状況及び該被験体における血栓関連疾患の位置を迅速且つ簡便に判定することができる。このような免疫学的測定方法を利用した疾患又は障害の判定用試薬は周知であり、当業者であれば、抗体以外の適当な成分を容易に選択することができる。また本発明の判定用試薬は、免疫学的測定方法を行うための手法であればいずれの手法においても利用することができる。
【００６６】
＜血栓の可視化／ｉｎ  ｖｉｖｏイメージング、血栓部位への送達＞
本発明の抗体は、被験体に投与した場合に、被験体内の不溶性フィブリンと結合する。従って、本発明の抗体を利用して、被験体における不溶性フィブリン、すなわち血栓を可視化することが可能である。また、本発明の抗体に化合物又は分子を結合させることにより、被験体における不溶性フィブリン、すなわち血栓部位に該化合物又は分子を送達することが可能である。
【００６７】
本発明の血栓可視化剤は、標識された本発明の抗体を含むことが好ましい。標識は、ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングの分野において公知の任意の標識を用いることができる。そのような標識としては、蛍光物質、例えばＩＲＤｙｅ８００シリーズ、フルオレセイン、ＦＩＴＣ、蛍光放出金属（１５２Ｅｕ、ランタン系列等）等；化学又は生物発光物質、例えばルミノール、イミダゾール、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等；放射性同位体、例えば８９Ｚｒ、９９ｍＴｃ、１２３Ｉ、１３１Ｉ、９７Ｒｕ、６７Ｃｕ、１１Ｃ、１３Ｎ等；常磁性同位体、例えば１５３Ｇｄ、１５７Ｇｄ、５５Ｍｎ、１６２Ｄｙ、５２Ｃｒ、５６Ｆｅ等；造影剤、例えばガドリニウム、ガドリニウム錯体、ヨード造影剤等が挙げられる。抗体と標識との結合は、当該技術分野で公知の方法により行うことができ、例えば直接的に化学結合してもよいし、あるいは適当なリンカーを介して間接的に結合してもよい。かかるリンカーとしては、例えば、ｐ−イソチオシアネートベンジルデスフェリオキサミンＢ、チオカーバメート、アミド、カーバメート、マレイミドが挙げられる。
【００６８】
また、本発明においては、標識の代わりに薬物若しくはプロドラッグ等の化合物又は分子を本発明の抗体に結合させることにより、該化合物又は分子を被験体の不溶性フィブリン存在部位、すなわち血栓部位に送達することが可能である。そのような薬物又はプロドラッグとしては、公知の血栓溶解剤（例えばウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、組織型プラスミノーゲン活性化因子）等が含まれる。そのような薬物又はプロドラッグの血栓への標的化剤も本発明に包含される。
【００６９】
さらに本発明は、本発明の抗体と、抗腫瘍性部分との複合体を提供する。本発明の抗体は、上述の通り、腫瘍における血栓部位（フィブリン）に結合するため、抗腫瘍性部分と結合させることによって、抗腫瘍性部分を腫瘍に送達することができる。本発明の抗体と結合させることができる抗腫瘍性部分は、当技術分野で公知の抗腫瘍性部分であれば特に限定されるものではない。抗腫瘍性部分としては、抗癌剤、例えばイリノテカン（ＣＰＴ−１１）、イリノテカンの代謝産物ＳＮ−３８（１０−ヒドロキシ−７−エチルカンプトテシン）、アドリアマイシン、タキソール、５−フルオロウラシル、ニムスチン、ラミニスチン等のアルキル化剤、ゲムシタビン、ヒドロキシカルバミド等の代謝拮抗剤、エトポシド、ビンクリスチン等の植物アルカロイド、マイトマイシン、ブレオマイシン等の抗癌性抗生物質、シスプラチン等の白金製剤、ソラフェニブ、エルロチニブ等の分子標的剤、メトトレキセート、シトシンアラビノシド、６−チオグアニン、６−メルカプトプリン、シクロフォスファミド、イフォスファミド、ブスルファン、ＭＭＡＥ（モノメチルアウリスタチンＥ）、ＤＭ−１（メルタンシン）、カリキアマイシン等；放射性同位体、例えばホウ素１０（１０Ｂ）、インジウム１１１（１１１Ｉｎ）やイットリウム９０（９０Ｙ）などが挙げられる。抗腫瘍性部分は、本発明の複合体が腫瘍組織中の血栓部位に送達された後、該部位において複合体から遊離し、腫瘍組織全体に到達できる程度の分子量であることが好ましい。
【００７０】
また、抗体と抗腫瘍性部分との結合も、当該技術分野で公知の方法により行うことができ、直接的結合及び間接的結合のいずれでもよい。例えば、直接的な結合として、共有結合を利用することができる。間接的な結合としては、リンカーを介した結合を利用することができる。
【００７１】
本発明においては、抗体と抗腫瘍性部分とがリンカーを介して結合していることが好ましい。リンカーを介して２つの分子が結合することにより、抗腫瘍性部分の抗原性を減弱することができ、被験体への投与に好ましい。リンカーについての一般的な技術は、例えばＨｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６；Ｈａｒｒｉｓ，Ｊ．Ｍ．  ａｎｄ  Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．編，Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ），Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ，１９９７；Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，Ｆ．  ａｎｄ  Ｈａｒｒｉｓ，Ｊ．Ｍ．編，Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ．Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗ  ５４（４），２００２に記載されている。
【００７２】
リンカーとは、２つの化合物を連結する２価以上の基を意味する。本発明において使用することができるリンカーとしては、特に限定されるものではないが、ポリアルキレングリコールリンカー、アルキレン基、ペプチド、糖鎖、及びその他の高分子担体が挙げられる。ポリアルキレングリコールリンカーの構成単位であるアルキレングリコールのアルキレン部分は、炭素数１〜３０００、好ましくは炭素数２〜１０００、より好ましくは炭素数２〜１００である。ポリアルキレングリコールリンカーの分子量は通常３０〜５００００Ｄａ、好ましくは５００〜３００００Ｄａである。ポリアルキレングリコールリンカーは、好ましくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーである。アルキレン基は、直鎖状又は分枝状のいずれであってもよい。
【００７３】
またリンカーには、直鎖状のリンカー（２価のリンカー）と分枝状のリンカー（３価以上のリンカー）が含まれる。直鎖状リンカーは、その一端に抗腫瘍性部分を有し、別の一端に本発明の抗体を有する。分枝状リンカーは、通常、その各分枝（各鎖）に抗腫瘍性部分を有し、別の一端に抗体を有する。
【００７４】
直鎖状のリンカーの具体的な例としては、下記式Ｉのリンカー：
【００７５】
【化１】
2018193386.tif 000002
【００７６】
〔式中、ＰＥＧはポリエチレングリコール鎖であり、ｎ及びｍはエチレングリコール単位の数であり、独立して５〜１００の整数を表す。〕
が挙げられる。式Ｉのリンカーは、通常、スクシンイミジル基を有する末端において抗体と連結し、他の末端において抗腫瘍性部分と連結する。
【００７７】
さらに、直鎖状のリンカーの具体的な例としては、式ＩＩのリンカー：
【００７８】
【化２】
2018193386.tif 000003
【００７９】
〔式中、ＰＥＧはポリエチレングリコール鎖であり、ｘはエチレングリコール単位の数であり、５〜１００の整数を表す。〕
が挙げられる。式ＩＩのリンカーは、通常、スクシンイミジル基を有する末端において抗体と連結し、他の末端において抗腫瘍性部分と連結する。
【００８０】
分枝状のリンカーの具体的な例としては、式ＩＩＩのリンカー：
【００８１】
【化３】
2018193386.tif 000004
【００８２】
〔式中、ＰＥＧはポリエチレングリコール鎖であり、ｎ、ｍ及びｑはエチレングリコール単位の数であり、独立して５〜１００の整数を表す。〕
が挙げられる。式ＩＩＩのリンカーは、通常、スクシンイミジル基を有する末端において抗体と連結し、他の複数の末端において抗腫瘍性部分と連結する。この分枝状のリンカーは、例えば特許文献７の参考例１に記載のように調製することができる。
【００８３】
リンカーを介して抗体と抗腫瘍性部分とを結合する技術は、当技術分野において公知である。例えば、抗体とリンカーとの結合は、共有結合又は非共有結合（イオン結合、疎水性結合等）であり、好ましくは共有結合である。この結合は、本発明の複合体を被験体へ投与した場合に、血液中では抗腫瘍性部分が遊離しにくい結合であることが好ましい。そのような結合としては、マレイミド基とチオール基との結合、ハロエステルとチオールとを反応させて得られる結合、カルボキシル基とアミノ基とのアミド結合、チオール基とチオール基とのジスルフィド結合、アミノ基とアルデヒド基によるシッフ塩基、チオール基とカルボン酸とのチオエステル結合、水酸基とカルボキシル基とのエステル結合、アミノ基とスクアリン酸誘導体（例えばジメチルスクアリン酸）による結合、ジエニルアルデヒド基とアミノ基との結合等が挙げられる。このような結合の具体例としては、リンカーの一端に存在するマレイミド基と、抗体上のシステイン残基に含まれるチオール基との結合、リンカーの一端に存在するスクシンイミド基と、抗体上のリジン残基に含まれるアミノ基との脱水置換結合（例えばＷＯ２００８／０９６７６０号）、リンカーの一端に存在するアミノ基と、抗体上のアスパラギン酸又はグルタミン酸に含まれるカルボン酸との脱水縮合結合（例えばＷＳＣＤＩを使用する）等が挙げられる。抗体とリンカーとの結合の具体的な方法については、例えばＷＯ／２０１０／０５５９５０号を参照されたい。
【００８４】
一方、抗体又はリンカーと抗腫瘍性部分との結合は、共有結合又は非共有結合（イオン結合、疎水結合等）であり、好ましくは共有結合である。特に、抗腫瘍性部分として抗腫瘍性化合物を用いる場合には、該結合は、本発明の複合体を被験体へ投与した場合に、血液中では抗腫瘍性部分が遊離しにくい結合であることが好ましい。このような観点から、抗体又はリンカーと抗腫瘍性部分との結合は、限定されるものではないが、好ましくはエステル結合、カルバメート結合、カーボネート結合、チオカルバメート結合であり、より好ましくはエステル結合である。エステル結合の場合は、腫瘍組織内のカルボキシルエステラーゼにより、又は非酵素的に結合が加水分解されて、本発明の複合体から徐放的に抗腫瘍性部分が遊離することが期待される。カルバメート結合の場合は、細胞内に抗体複合体のままエンドサイトーシスされた後、細胞内のカルボキシルエステラーゼで切断され、本発明の複合体から徐放的に抗腫瘍性部分が遊離することが期待される。カーボネート結合の場合は、非酵素的に結合が加水分解されて、本発明の複合体から徐放的に抗腫瘍性部分が遊離することが期待される。チオカルバメート結合の場合は、非酵素的に結合が加水分解されて、本発明の複合体から徐放的に抗腫瘍性部分が遊離することが期待される。
【００８５】
本発明の複合体において抗腫瘍性部分として抗腫瘍性化合物を用いる場合、抗体１分子へ結合する抗腫瘍性化合物の数は、理論的には特に限定されないが、複合体の安定性や製造容易性等の観点から、通常１〜１０個、好ましくは１〜８個である。
【００８６】
例示的に抗腫瘍性部分としてＳＮ−３８（１０−ヒドロキシー７−エチルカンプトテシン）を、リンカーとしてポリエチレングリコールリンカーを使用する場合について具体的に説明するが、他の組み合わせを用いた場合であっても、当業者であれば適宜反応条件を変更することにより、目的とする本発明の複合体を製造することができる。
（Ｉ）先ず、一方の端にカルボキシル基を有し、他の一方の端にＢｏｃ、Ｆｍｏｃ等で保護されたアミノ基を有するポリエチレングリコールとＳＮ−３８とを脱水縮合させ、ＳＮ−３８の水酸基にポリエチレングリコールリンカーを導入する。
（ＩＩ）一方の端にスクシンイミド基を有し、他の一方の端にマレイミド基を有するポリエチレングリコールと（Ｉ）の生成物とを混合し、スクシンイミド基と（Ｉ）の生成物のアミノ基とを反応させることにより、ポリエチレングリコールリンカーへマレイミド基を導入する。
（ＩＩＩ）（ＩＩ）の生成物と抗体とを混合し、（ＩＩ）の生成物中のマレイミド基と抗体中のチオール基とを反応させ、（ＩＩ）の生成物と抗体とを結合させることにより、本発明の複合体を得る。
【００８７】
本発明の複合体は、腫瘍組織内の不溶性フィブリンに結合して、抗腫瘍性部分を腫瘍に送達することができ、また長い期間にわたり腫瘍組織内に留まり、長い期間にわたって抗腫瘍効果を発揮し続けるという効果を有する。そのため、本発明の複合体は、腫瘍の予防又は治療剤として使用することが可能である。すなわち、本発明の複合体の有効量を被験体に投与することにより、該哺乳動物における腫瘍を予防又は治療することができる。さらに、本発明の複合体は、長い期間にわたり腫瘍組織内に留まり、腫瘍の境界領域で腫瘍に栄養を与える血管の形成を阻害することによっても、長い期間にわたって抗腫瘍効果を発揮し得る。
【００８８】
本発明において治療又は予防の対象となる腫瘍は、限定されるものではなく、固形癌、例えば膵癌、胃癌、食道癌、結腸直腸癌、大腸癌、卵巣癌、乳癌及び肺癌である。
【００８９】
本発明の複合体は、癌細胞そのものに標的化するのではなく、腫瘍血管から漏出したところに存在する不溶性フィブリンに対して標的化する。本発明の抗体は、上述したようにフィブリノーゲンには反応せず、不溶性フィブリンへの親和性が極めて高い。そのため、生体親和性の高い抗体−抗腫瘍性部分複合体はＥＰＲ効果（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｅｆｆｅｃｔ）で腫瘍血管から選択的に漏出し（正常血管からは高分子であるゆえに漏出しない）、漏出後腫瘍間質に存在する不溶性フィブリンと結合し、そこで足場を形成する。つまり長期間にわたって、本発明の複合体は間質フィブリンに存在し続ける。例えば、特許文献７に記載の実施例６を参酌するに、抗腫瘍性部分ＳＮ−３８を本発明の抗体とエステル結合で結合させた場合、腫瘍内のカルボキシルエステラーゼにより、又は自然に、複合体からＳＮ−３８が徐放的に遊離する。ＳＮ−３８は低分子であるために癌組織内を比較的自由に動きまわり、癌全体にいきわたり、癌細胞を効率よく攻撃する可能性が極めて高い。また、ＳＮ−３８はその抗腫瘍効果が時間依存性であるために、このような長時間にわたる癌細胞のＳＮ−３８への暴露は、効率的に癌細胞を死滅させることができる。
【００９０】
上述した血栓可視化剤、及び腫瘍の予防又は治療剤を含む本発明の薬剤は、抗体の他、薬学的に許容される担体又は添加物を共に含むものであってもよい。このような担体及び添加物の例として、水、薬学的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、マンニトール、ソルビトール、ラクトースなどが挙げられる。使用される添加物は、剤形に応じて上記の中から適宜又は組み合わせて選択される。
【００９１】
本発明の薬剤の投与方法は特に限定されるものではなく、経口投与、又は非経口投与、例えば皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、静脈内投与、経皮投与、直腸投与、経鼻投与により行うことができる。
【００９２】
本発明の薬剤を経口投与する場合は、錠剤、カプセル剤（硬カプセル剤、軟カプセル剤、マイクロカプセル等）、顆粒剤、散剤、丸剤、トローチ剤、内用水剤、液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤等のいずれのものであってもよく、使用する際に再溶解させる乾燥生成物にしてもよい。また、本発明の薬剤を非経口投与する場合は、例えば静脈内注射（点滴を含む）、筋肉内注射、腹腔内注射及び皮下注射用の注射剤（例えば溶液、乳剤、懸濁剤）、軟膏剤（特に眼軟膏剤）、クリーム剤、座剤、パップ剤、点眼剤、点鼻剤、吸入剤、リニメント剤、エアゾル剤等の外用剤等の製剤形態を選択することができ、注射剤の場合は単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態で提供される。
【００９３】
これらの各種製剤は、医薬において通常用いられる賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、滑沢剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、ｐＨ調整剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、吸収促進剤、無痛化剤、安定化剤、等張化剤等を適宜選択し、常法により製造することができる。
【００９４】
本発明の薬剤に配合する抗体又は複合体は、抗体の種類、複合体及び複合体に含まれる抗腫瘍性部分の種類、その用途、剤形、投与経路等により異なるが、例えば総重量を基準として１〜９９重量％、好ましくは５〜９０％としうる。
【００９５】
また、本発明の薬剤の投与量及び投与間隔は、薬剤に含まれる抗体の種類、複合体に含まれる抗腫瘍性部分の種類、投与対象、被験体の年齢及び体重、投与経路、投与回数により異なり、広範囲に変更することができる。
【００９６】
本発明の薬剤を投与する被験体は、特に限定されるものではなく、哺乳動物、例えばヒト、家畜（ウシ、ブタ等）、愛玩動物（イヌ、ネコ等）、実験動物（マウス、ラット、サル等）が含まれる。特に、血栓関連疾患の存在が疑われる被験体及び血栓関連疾患を有する被験体に使用することが好ましい。また本発明の複合体を含む薬剤については、特に腫瘍の存在が疑われる被験体及び腫瘍を有する被験体に使用することが好ましい。
【００９７】
血栓可視化剤の場合には、薬剤の投与後、被験体における抗体の存在又は位置を、標識を指標として可視化する。好ましくは、抗体の存在又は位置は、公知の画像化手法により可視化する。画像化手法は、使用する標識、被験体の種類、画像化する部位などにより異なるが、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）、ポジトロン断層法（ＰＥＴ）、核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、その他のｉｎ  ｖｉｖｏイメージングシステムを用いることができる。これにより、抗体の標識に基づいて、被験体内の血栓の存在又は位置を可視化することができる。
【実施例】
【００９８】
以下、実施例及び参考例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００９９】
先ず、本発明者らは、以前に開発したフィブリンと結合し且つフィブリノーゲンと結合しない抗体、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−９２３を有するハイブリドーマ１０２−１０から産生される抗体をキメラ化したもの（以下、この抗体を「１０２−１０抗体」とも称する）について、以下に示す通り、その性状及び機能について評価した。なお、１０２−１０抗体については特許文献７（特開２０１２−７２号公報）参照のこと。
【０１００】
（参考例１）
以下に示す方法にて、１０２−１０抗体のフィブリン特異性について解析した。
【０１０１】
＜ＥＬＩＳＡ＞
フィブリノーゲンをウェル上に固相化したプレート（フィブリノーゲンプレート）は、Ｍａｘｉ  ｓｏａｐプレート（ｎｕｎｃ社製）に、ヒト又はマウス由来のフィブリノーゲン（Ｓｉｇｍａ社製、ＰＢＳにて希釈したもの）を１μｇ／１００μＬ／ウェルになるよう添加し、該プレートにシールをして、４℃にて一晩静置することにより作製した。
【０１０２】
フィブリンプレートは、０．０５ＮＩＨＵ／ｍＬ  トロンビン（Ｓｉｇｍａ社製）、１ｍＭ  ＣａＣｌ２及び７ｍＭ  Ｌ−システイン（Ｍｅｒｃｋ社製）を含有するＴＢＳ  １００μＬを、前記フィブリノーゲンプレートのウェルに添加し、ＴＢＳ−Ｔによる洗浄を行い、Ｎ１０２（日油社製）にてブロッキングを施すことにより作製した。
【０１０３】
また、ペルオキシダーゼラベリングキットＮＨ２（ＤＯＪＩＮＤＯ社製）を用い、１０２−１０抗体にペルオキシダーゼを標識した。さらに、この標識した１０２−１０抗体をブロックエース（ＤＳファーマバイオ・メディカル社製）にて１μｇ／ｍＬになるよう調製した。
【０１０４】
そして、この抗体希釈液１００μＬを、前記フィブリノーゲンプレート及びフィブリンプレートに添加し、室温で３０分振盪した。その後、ＴＢＳ−Ｔで洗浄し、１ｓｔｅｐ  ｓｌｏｗ  ＴＭＢ（Ｔｈｅｒｍｏ社製）１００μＬを添加して比色を行った。停止反応は２規定のＨ２ＳＯ４を１００μＬ加えることによって行った。また、吸光度（Ｏ．Ｄ．）は、ＳＰＥＣＴＲＡ  ＭＡＸ１９０（日本モレキュラーデバイス社製）で吸光波長４５０ｎｍにおける吸収を測定することにより得た。得られた結果を図１に示す。
【０１０５】
＜不溶性フィブリンの酵素処理＞
フィブリノーゲン１０ｍｇ、０．０２Ｍ  ＣａＣｌ２、２．５ＮＩＨＵ／ｍＬ  トロンビン及び７ｍＭ  Ｌ−システインを含有するＴＢＳを、１．５ｍＬチューブ中にて、３７℃、１時間インキュベートすることにより、フィブリンクロットを作製した。
【０１０６】
このようにして得られたフィブリンクロットに、
２μｇ／ｍＬ  エラスターゼ（Ｅｌａｓｔａｓｅ、Ｓｉｇｍａ社製）、
７０μｇ／ｍＬ  カリクレイン（Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ、Ｓｉｇｍａ社製）、
１０μｇ／ｍＬ  カテプシンＢ（Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｂ、Ｓｉｇｍａ社製）、
２１０Ｕｎｉｔｓ／ｍＬ  カテプシンＤ（Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｄ、Ｓｉｇｍａ社製）、
２００ｎｇ／ｍＬ  ＭＭＰ−９（Ｓｉｇｍａ社製）又は
０．１μＭ  プラスミン（Ｐｌａｓｍｉｎ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ社製）を添加することにより、該フィブリンクロットを分解した。そして、各分解物をＥＬＩＳＡプレートに固相化して、前記標識１０２−１０抗体の反応性を解析した。得られた結果を図２に示す。
【０１０７】
＜市販抗体との比較＞
下記市販の抗フィブリン抗体２種をペルオキシダーゼにて標識した。
ＮＹＢ−Ｔ２Ｇ１（Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、
ＭＨ−１（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ社製）
そして、これら標識抗体及び前記標識１０２−１０抗体について、フィブリン、フィブリノーゲン、Ｄ−ダイマー（積水メディカル社製）を各１μｇ固相化したＥＬＩＳＡプレートを用い、各抗体の親和性を解析した。得られた結果を図３に示す。
【０１０８】
図１に示した結果から明らかなように、ヒト及びマウスいずれにおいても、１０２−１０抗体は、不溶性フィブリンに対しては高い親和性を示した一方で、フィブリノーゲンに対する親和性は認められなかった。
【０１０９】
さらに、図２に示す通り、１０２−１０抗体は、不溶性フィブリンとは結合する一方で、不溶性フィブリンを各種酵素にて処理して得られた溶解性フィブリン（ＦＤＰ：フィブリン分解産物）とは結合しないことが明らかになった。
【０１１０】
また、図３に示す通り、ＮＹＢ−Ｔ２Ｇ１は、そのエピトープがフィブリン重合によって覆われてしまうため、不溶性フィブリン及びＤ−ダイマーに対する親和性は低かった。また、ＭＨ−１は可溶性フィブリン（Ｄ−ダイマー）に対しては高い親和性を示すものの、ＮＹＢ−Ｔ２Ｇ１同様に、沈着フィブリン（不溶性フィブリン）に対する親和性は低かった。一方、１０２−１０抗体は、フィブリノーゲン及びＤ−ダイマーとの親和性は認められず、沈着した不溶性フィブリンに対してのみ高い親和性を示した。
【０１１１】
（参考例２）
以下に示す方法にて、１０２−１０抗体による免疫染色を行い、組織サンプルにおけるフィブリン形成の検出を試みた。
【０１１２】
＜組織免疫染色＞
各パラフィン包埋組織サンプルを脱パラフィン処理し、１２０℃で１０分間、１０ｍＭ  クエン酸バッファー（ｐＨ６）にて抗原賦活した。５％スキムミルク／ＰＢＳにてブロッキング処理を施した後、１０μｇ／ｍＬの１０２−１０抗体と共に、室温で１〜２時間インキュベートした。次いで、ぺルオキシダーゼ標識した抗ヒトＩｇＧ二次抗体（ＭＢＬ社製）と共に６０分間インキュベートした。そして、ＤＡＢ（Ｄａｋｏ社製）にて染色した後に、ヘマトキシリン（武藤化学社製）にて核を染色した。得られた結果を図４〜６に示す。
【０１１３】
図４に示した結果から明らかなように、正常な組織においては１０２−１０抗体によってフィブリン形成は認められなかった。それに対し、癌化した脳組織、肺組織及び膵臓の組織いずれにおいてもフィブリンが形成されていることが１０２−１０抗体によって検出された。また、図５に示す通り、前記脳腫瘍、肺癌及び膵臓癌同様に、大腸癌及び大腸腺腫瘍においても、１０２−１０抗体によりフィブリンが検出された。しかし、反応性リンパ節炎（リンパ腫）においてはフィブリン形成が認められなかった。このように、１０２−１０抗体によって、癌特異的なフィブリン形成（無症状下で持続的に形成されるフィブリン）を検出できることが明らかになった。
【０１１４】
さらに、図には示していないが、脳梗塞及び心筋梗塞、これらの発症時においては１０２−１０抗体によりフィブリンが検出された。一方、図６に示す通り、脳梗塞及び心筋梗塞いずれにおいても発症してから３週間後にはフィブリン形成が認められず、フィブリンの消失が確認された。
【０１１５】
また、図６に示す通り、急性膵炎においては１０２−１０抗体によりフィブリンが検出されたが、慢性膵炎においてはかかるフィブリン形成が認められなかった。
【０１１６】
（参考例３）
以下に示す方法にて、血栓が生じる疾患のモデル動物を用い、１０２−１０抗体のフィブリン検出能を評価した。
【０１１７】
＜動物モデル＞
化学発癌モデルは、メスのＦＶＢ／Ｎマウスを剃毛し、アセトンで希釈したＤＭＢＡ（２５０μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ社製）を１回塗布し、１週後からアセトンで希釈したＰＭＡ（２５μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ社製）を毎週塗布し、３２週まで行うことにより、調製した。
【０１１８】
脳梗塞モデルは、メスのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットをイソフルラン（アボット社製）で麻酔して、内頚動脈を暴露して、ポリエチレンチューブ（内径０．５ｍｍ）でカニューレ処置し、また中大脳動脈は３−０のナイロンフィラメント（Ｅｔｈｉｃｏｎ社製）で塞栓形成を促すことにより、調製した。
【０１１９】
炎症モデルの作製においては、メスのＤＢＡ／１Ｊマウスに、抗ｃｏｌｌａｇｅｎ２抗体（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ社製）と、抗ｃｏｌｌａｇｅｎ４抗体（クローン３５−４、本発明者らが所属する研究室にて樹立）とを腹腔内にｄａｙ０で２ｍｇ投与した。さらに、５０μｇのＬＰＳ（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ社製）を３日後に腹腔内投与した。
【０１２０】
創傷治癒モデルは、メスのＦＶＢ／Ｎマウスをイソフルランで麻酔して、１ｃｍの傷をマウスの背中につけることにより、調製した。そして、傷の処置はせずに治癒の様子を毎日観察した。
【０１２１】
以上の３種の血栓形成が生じるモデル動物（脳梗塞モデル、炎症モデル及び創傷治癒モデル）については、１０２−１０抗体を用いた組織免疫染色によっても解析した。得られた結果を図７に示す。
【０１２２】
＜ＰＥＴプローブの作製＞
１０２−１０抗体とｐ−イソチシアネートベンジル−デスフェリオキサミンＢ（ｐ−ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｏｂｅｎｚｙｌ−ｄｅｓｆｅｒｒｉｏｘａｍｉｎｅ  Ｂ、ＤＦ、Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ社製）とを、ＤＦと抗体の比（１：１〜１：３）にて結合させ、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０（ＧＥ）にて精製した。また、８９Ｚｒ−シュウ酸塩（ｏｘａｌａｔｅ）はサイクロトロンで作製した。そして、ＤＦを結合した１０２−１０抗体（１００μｇ／２０μＬ  ＰＢＳ）と５．０−５．６Ｍ  Ｂｑの８９Ｚｒ−ｏｘａｌａｔｅ（３．７−５．６  ＧＢｑ／ｍＬ，ｐＨ７−９）とを１時間室温でインキュベートし、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０で精製した。このようにして得られたＰＥＴプローブ（図８  参照）は、放射化学的収率は７３−９６％を達成し、純度は９６−９８％で、５０ｍＭＤＴＰＡを用いた薄層クロマトグラフィーによる特異活性は３７−４４ｋＢｑ／μｇであった。
【０１２３】
＜ＰＥＴ／ＣＴ＞
化学発癌モデルについては、前記ＰＥＴプローブを用い、ＰＥＴ／ＣＴを行った。すなわち、未標識換算で１００μｇ／マウスの抗体投与量にて、３．７ＭＢｑの前記ＰＥＴプローブを化学発癌モデルマウスに尾静脈から投与した。ＰＥＴのデータは、小動物用ＰＥＴシステム「Ｉｎｖｅｏｎ」（ｓｍａｌｌ−ａｎｉｍａｌ  ＰＥＴ  ｓｙｓｔｅｍ）を用い、麻酔下で１０〜２０分間撮影することにより得た。体温はランプや恒温パットで３７℃になるよう保った。画像は、減衰補正なしで３Ｄ  最大事後確率法（３Ｄ  ｍａｘｉｍｕｍ  ａ  ｐｏｓｔｅｒｉｏｒｉ；１８  ｉｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  １６  ｓｕｂｓｅｔｓ，β＝０．２ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）を用いて処理した。ＰＥＴスキャンの後、ＣＴイメージは９０ｋＶｐ，２００μＡのＸ線光源を用いて、小動物用ＰＥＴシステム「Ｒ＿ｍＣＴ２」（理学社製）にて撮影した。得られた結果を図９に示す。
【０１２４】
またＸ線撮影後、腫瘍を取り出し、凍結組織包埋剤（ｏｐｔｉｍａｌ−ｃｕｔｔｉｎｇ−ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（ＯＣＴ）  ｃｏｍｐｏｕｎｄ、サクラファインテック社製）を用いて−２０℃で包埋した。２０−μｍ厚の乾燥切片をイメージングプレート（富士フィルム社製）で露光し、ヘマトキシリン及びエオジン（武藤化学社製）にて染色（Ｈ＆Ｅ染色）した。また、取り出した腫瘍については、１０２−１０抗体による免疫染色及び該抗体をプローブとするオートラジオグラフィーによっても解析した。得られた結果を図１０に示す。
【０１２５】
図７に示す通り、図６に示した脳梗塞及び心筋梗塞の解析結果同様に、脳梗塞、関節炎及び皮膚損傷においては、発症時又は創傷時には１０２−１０抗体によってフィブリンが検出されたが、いずれの疾患モデル及び創傷モデルにおいても発症等から２〜３週間後にはフィブリンが消失していることが確認された。
【０１２６】
また、図９及び１０に示す通り、化学発癌モデルの体内において、放射性標識した１０２−１０抗体は腫瘍特異的に集積されることが明らかになった。
【０１２７】
従って、１０２−１０抗体はインビトロのみならずインビボにおいてもフィブリンを特異的に検出できることが確認された。また、かかるフィブリンの検出を通して、生体内の癌の検出にも１０２−１０抗体が利用できることも明らかになった。また、脳梗塞、心筋梗塞及び炎症性疾患等の良性疾患においては、かかるフィブリンの検出を通して、その疾患の状態（経過情報）も得ることができることも明らかになった。
【０１２８】
（参考例４）
以下に示す方法にて、１０２−１０抗体によるフィブリンクロット中のフィブリン分子の検出を試みた。また、１０２−１０抗体と、非還元フィブリノーゲン又は還元フィブリノーゲンとの親和性の有無についても解析した。
【０１２９】
＜ヒトフィブリン切片蛍光免疫染色＞
参考例１に記載の方法と同様の方法にて作製したフィブリンクロットを、ＯＣＴｃｏｍｐｏｕｎｄを用いて凍結し、６μｍ厚の凍結切片を調製した。これら凍結切片を風乾させた後、ＰＢＳで洗浄し、５％スキムミルク／ＰＢＳでブロッキングした。次いで、Ａｌｅｘａ  Ｆｏｌｕｒ  ６４７  タンパク質ラベリングキット（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で標識した１０２−１０抗体を添加し、１時間インキュベートした後、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ  Ｇ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃ社製）で封入した。そして、このようにして調製したサンプルを蛍光顕微鏡にて観察した。得られた結果を図１１に示す。
【０１３０】
＜ウェスタン  ブロッティング＞
１μｇのヒト及びマウス由来のフィブリノーゲンを、５％  ２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）含有サンプルバッファー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）又は不含サンプルバッファー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）で各々希釈した。そして、２−ＭＥ含有サンプルバッファーで希釈したサンプルのみを９６℃で５分間熱処理した。次いで、これらサンプルを４−２０％  ＴＧＸゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）にアプライし、２００Ｖの定電圧で３０分間かけ泳動した。泳動後のゲルを、トランスブロットターボミニＰＶＤＦ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）に２．５Ａ、２５Ｖ、７分の条件で転写した。転写後のメンブレンをスナップｉ．ｄ．（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に移し、０．３％スキムミルク／０．１％ＰＢＳ−Ｔでブロッキングした後に、１μｇ／ｍＬのペルオキシダーゼ標識した１０２−１０抗体と共にインキュベートし、抗原抗体反応を行った。次いで、ＰＢＳ−Ｔにて洗浄した後、ＥＣＬプライム（ＧＥ社製）にて化学発光を生じさせ、ペルオキシダーゼ標識した１０２−１０抗体が結合した抗原を検出した。得られた結果を図１３に示す。
【０１３１】
また、この検出後、メンブレンをＰＢＳ−Ｔにて洗浄した後、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）にて染色した。得られた結果を図１２に示す。
【０１３２】
なお、フィブリノーゲンを構成する３本鎖の分子量は、Ａα鎖が約６７ＫＤａであり、Ｂβ鎖が約５６ＫＤａであり、γ鎖が約４８ＫＤａである。
【０１３３】
図１１に示した結果から明らかなように、フィブリンクロットにおいてフィブリン分子どうしが架橋化されている状態を反映し、１０２−１０抗体によってフィブリンクロットは網目状に染色された。
【０１３４】
また、図１２及び１３に示す通り、参考例１〜３に示した結果同様に、１０２−１０抗体によって非還元状態にあるフィブリノーゲンは検出することは出来なかった。しかし、１０２−１０抗体によって還元状態において、複合体形成が解消されたフィブリノーゲンのＢβ鎖（分子量：約５６ｋＤａ）は検出できることが明らかになった。従って、１０２−１０抗体のエピトープは、変性（還元）されることによって露呈されるフィブリノーゲンＢβ鎖内の部位にあることが明らかになった。
【０１３５】
（参考例５）
１０２−１０抗体のエピトープの同定を以下に示す方法にて試みた。
【０１３６】
＜アミノ酸シークエンス＞
参考例４に記載の方法にて、還元・熱処理したフィブリノーゲンをＳＤＳ−ＰＡＧＥにて展開した。次いで、イージーステイン・リバース及びアトプレップＭＦ（共にＡｔｔｏ社製）を用い、ゲルからフィブリノーゲンＢβ鎖を抽出した。抽出したフィブリノーゲンＢβ鎖を、リシルエンドペプチダーゼにて切断した。そして、ウェスタンブロッティングにより、切断されたフィブリノーゲンＢβ鎖ペプチドの中から、１０２−１０抗体に結合する最小分子量のペプチド断片を抽出した。次いで、このペプチド断片についてアミノ酸シークエンスを行った。
【０１３７】
その結果、フィブリノーゲンＢβ鎖（配列番号：１９）の第１７９位のヒスチジン〜第２６４位のリジンからなる領域（８６アミノ酸）内に、１０２−１０抗体のエピトープがあることが明らかになった（図１４  参照）。次に、１０２−１０抗体のエピトープを限定すべく、以下に示す方法にて実験を行った。
【０１３８】
＜競争阻害実験＞
前記８６アミノ酸からなる領域をさらに５分割して、合成ペプチドを作製した。これらペプチドを用いて、競争阻害実験を行った。すなわち、１μｇ／ｍＬの１０２−１０抗体に対し、０．０１〜１００μＭで段階希釈した前記合成ペプチドを加え、室温で３０分インキュベートした。抗体とペプチドとの混合溶液を１００μＬずつフィブリンプレートに添加し、室温で３０分インキュベートした。その後、ＴＢＳ−Ｔで洗浄し、１ｓｔｅｐ  ｓｌｏｗ  ＴＭＢ（Ｔｈｅｒｍｏ社製）１００μＬを添加して５分間比色を行った。停止反応は２規定のＨ２ＳＯ４を１００μＬ加えることによって行った。また、吸光度の測定は、ＳＰＥＣＴＲＡ  ＭＡＸ１９０（日本モレキュラーデバイス社製）で４５０ｎｍの吸光波長を測定することにより得た。得られた結果の一部を図１５に示す。なお、図１５に記載のＦｉｂ−１、Ｆｉｂ−３、Ｎｏ．１及びＮｏ．５の配列は以下の通りである。
Ｆｉｂ−１：ＮＩＰＶＶＳＧＫＥＣＥＥＩＩＲＫＧＧＥＴＳ（フィブリノーゲンＢβ鎖の第１７９〜２５２位、配列番号：２１）
Ｆｉｂ−３：ＣＮＩＰＶＶＳＧＫＥ（フィブリノーゲンＢβ鎖の第２３１〜２４０位、配列番号：２２）
Ｎｏ．１：ＨＱＬＹＩＤＥＴＶＮＳＮＩＰＴＮＬＲＶＬＲＳＩＬＥＮＬＲＳＫ（フィブリノーゲンＢβ鎖の第１７９〜２０８位、配列番号：２３）
Ｎｏ．５：ＣＮＩＰＶＶＳＧＫＥＣＥＥＩＩＲ（フィブリノーゲンＢβ鎖の第２３１〜２４６位、配列番号：１）
また、Ｆｉｂ−１及びＦｉｂ−３については、キャリアタンパク質（ＫＬＨ）をコンジュゲートしたもの（Ｆｉｂ−１  ＫＬＨ及びＦｉｂ−３  ＫＬＨ）も用意し、競争阻害実験に供した。
【０１３９】
図１５に示した結果から明らかなように、前記８６アミノ酸からなる領域（フィブリノーゲンＢβ鎖の第１７９〜２６４位）において、１０２−１０抗体は、第２３１〜２４６位のアミノ酸からなる部位（Ｎｏ．５）のみと結合し、さらにはＮｏ．５に含まれる第２３１〜２４０位のアミノ酸からなる部位（Ｆｉｂ−３  ＫＬＨ）とは結合しなかった。従って、１０２−１０抗体のエピトープは、フィブリノーゲンＢβ鎖の第２３１〜２４６位のアミノ酸（配列番号：１に記載のアミノ酸）からなる部位であることが明らかになった。
【０１４０】
また、フィブリノーゲンＢβ鎖の第４４位のアルギニンと第４５位のグリシンとの間がトロンビンにより切断され、フィブリノペプチドＢ（フィブリノーゲンＢβ鎖の第１〜４４位のアミノ酸からなるポリペプチド）が除去等されることにより、フィブリノーゲンはフィブリンモノマーとなり、該モノマーが重合、架橋化することによって、不溶性フィブリンは形成される。従って、１０２−１０抗体のエピトープは、不溶性フィブリンにおいて、フィブリノーゲンβ鎖（フィブリノーゲンＢβ鎖からフィブリノペプチドＢを除去したタンパク質）の第１８７〜２０２位のアミノ酸からなる部位である。
【０１４１】
また、フィブリノーゲンＢβ鎖が保持されたまま、フィブリノーゲンＡβ鎖のみが切断され、フィブリノペプチドＡが除去されても、フィブリノーゲンから重合可能なフィブリンモノマーは生成される。従って、不溶性フィブリンにおいても、フィブリノーゲンＢβ鎖の第２３１〜２４６位のアミノ酸からなる部位は、１０２−１０抗体のエピトープとなり得る。
【０１４２】
次に、同定した１０２−１０抗体のエピトープについてコンピューターシュミレーションにて解析した。その結果、当該エピトープは、フィブリノーゲン分子においてγ鎖と結合している領域であることが明らかになった（図１６参照、図中の矢印は１０２−１０抗体のエピトープを示す）。また、Ｂβ鎖に結合しているγ鎖の部位は、フィブリノーゲンγ鎖（配列番号：２０）の第２３２位のリジン〜第２４６位のプロリンからなる領域（ＫＮＷＩＱＹＫＥＧＦＧＨＬＳＰ、配列番号：２）であることも明らかになった。
【０１４３】
（実施例１）
本発明の抗体の作製
参考例５に示したコンピューターシュミレーションの結果から、１０２−１０抗体がフィブリノーゲンに結合できないのは、当該抗体のエピトープは分子内に隠れている領域であることが原因であると想定される。また、フィブリノーゲンがトロンビンによって切り出されてフィブリンモノマーを生成し、さらにそれらが重合、架橋化することによって、不溶性フィブリンに変化する。この構造変化によって、フィブリノーゲン分子内に隠れていた前記領域が暴露されることにより、１０２−１０抗体が不溶性フィブリンに結合できるようになると想定される。
【０１４４】
そこで、フィブリノーゲンＢβ鎖の第２３１〜２４６位のアミノ酸からなる部位と、フィブリノーゲンγ鎖の第２３２〜２４６位のアミノ酸からなる部位とは、不溶性フィブリンに結合し且つフィブリノーゲンに結合しない抗体を作製する上で極めて有用であると考え、これら部位を各々抗原とする抗体の作製を、以下に示す方法にて試みた。
【０１４５】
＜抗原の調製＞
先ず、フィブリノーゲンβ鎖の第２３１〜２４６位のアミノ酸からなる部位又はフィブリノーゲンγ鎖の第２３２〜２４６位のアミノ酸からなる部位をコードする抗原遺伝子を、ｐＥＴ２１ｂの制限酵素サイト（ＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ）に挿入することにより、ヒスチジンタグを融合させた抗原ペプチドを発現させることのできるプラスミドＤＮＡを調製した。そして、これらプラスミドＤＮＡを、大腸菌  ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に各々導入した。
【０１４６】
次に、前記大腸菌をＬＢ培地２００ｍＬに植菌し、３７℃、１００ｒｐｍで培養し、培地のＯＤ６００が０．６〜０．８になった時に培養を一旦止め、氷上にて１５分間静置した。その後、終濃度１ｍＭになるようにＩＰＴＧ（イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を培地に添加した後、１８℃、１００ｒｐｍにて低温培養を行った。そして、ＩＰＴＧ添加（抗原遺伝子の発現誘導）後１６時間培養し、４８，８２０ｇ、１５分間遠心し、集菌した。
【０１４７】
集菌した後、５００ｍＭ  ＮａＣｌ含有５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）に懸濁し、氷上で超音波破砕した。破砕後、４８，８２０ｇ、６０分間遠心し、上清を回収した。次いで、回収した上清を、５００ｍＭ  ＮａＣｌ含有５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）にて平衡化した１ｍＬ  Ｎｉ−ＮＴＡアガロース（インビトロジェン社製）に通し、該アガロースを５ｍＭ  イミダゾール及び５００ｍＭ  ＮａＣｌ含有５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）にて洗浄した。そして、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースに捕捉されている抗原ペプチドを１００ｍＭ  イミダゾール含有ＰＢＳ（−）にて溶出した。得られた抗原ペプチドは、アミコン  ウルトラ−１５  １０Ｋ（ミリポア社製）を用いた限外ろ過により、ＰＢＳ（−）にバッファー置換した。また、この抗原ペプチドの精製純度は、ＳＤＳ−ｐａｇｅ  １０−２０％（ＤＲＣ社製）を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥにて確認した。
【０１４８】
＜抗体の作製＞
フィブリノーゲンγ鎖の第２３２〜２４６位のアミノ酸からなる部位に結合する抗体（以下、「抗γ鎖抗体」とも称する）の作製は、ＩＴＭ株式会社に委託した。すなわち、前記にて調製したγ鎖由来の抗原ペプチドをマウスの尾根部筋肉内に注射し、該マウスの腸骨リンパ節を用い、モノクローナル抗体を作製した（マウス腸骨リンパ節法、Ｓａｄｏ  Ｙ．ら、Ａｃｔａ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．、２００６年、３９巻、８９〜９４ページ  参照）。フィブリノーゲンＢβ鎖の第２３１〜２４６位のアミノ酸からなる部位に結合する抗体（以下、「抗β鎖抗体」とも称する）は以下の方法にて作製した。
【０１４９】
先ず、前記にて調製したβ鎖由来の抗原ペプチドのヒスチジンタグを定法に沿って４Ｍ−タグに置換した。そして、４Ｍ−タグを融合させた抗原ペプチド（免疫原）を、マウス６匹に投与した。初回投与においては、ＦＣＡと免疫原とを混和したエマルジョンを、免疫原が５０ｕｇ／マウスとなるように調製して腹腔へ投与した。追加免疫は２〜３週間おきに行い、Ｓｉｇｍａアジュバントシステム  ２００ｕＬに免疫原５０ｕｇを混和し、マウス腹腔に投与した。
【０１５０】
追加免疫３回目以降、投与後７日目に免疫マウス尾静脈より採血を行った。血液を１２，０００ｒ．ｐ．ｍ．、１０分間遠心して血清成分を分離し、−３０℃にて測定まで凍結保管した。そして、これら血清成分（免疫マウス抗血清）に含まれる抗フィブリン抗体の抗体価を、免疫原、フィブリノーゲン又はフィブリンを固相化したプレートを用いたＥＬＩＳＡ法にて評価し、抗体価の推移を検討した。
【０１５１】
その結果、抗体価の上昇が認められたマウスに、ＰＢＳに溶解した免疫原５０ｕｇを尾静脈より投与し、最終免疫を実施した。そして、最終免疫４日後にマウスから脾臓を摘出し、脾細胞を得た。得られた脾細胞全てと、ｐ３．Ｘ６３マウスミエローマ細胞とを、ＰＥＧ法にて融合した。得られた融合細胞を細胞融合用培地に懸濁し、脾細胞換算で２．０×１０５細胞／ウェルとなるように、９６ウェルプレートに播いて培養した。
【０１５２】
培養して得られたハイブリドーマ培養上清を、免疫原を固相化したプレートを用いたＥＬＩＳＡ法によって評価し、一次スクリーニングを行った。次に、一次スクリーニングにおいて陽性と判定されたハイブリドーマについて、免疫原、フィブリノーゲン又はフィブリンを固相化したプレートを用いたＥＬＩＳＡ法にて評価し、二次スクリーニングを行った。そして、二次スクリーニングにおいて陽性と判定されたハイブリドーマを、フィブリンに結合し且つフィブリノーゲンに結合しない抗体を産生するハイブリドーマとして選択し、さらに限界希釈法にてモノクローン化した。
【０１５３】
（実施例２）
実施例１にて作製した抗β鎖抗体及び抗γ鎖抗体と、１０２−１０抗体とを、以下に示すＥＬＩＳＡ法にて比較した。なお、実施例１にて樹立したハイブリドーマのうち、Ｆｉｂ−０３５５及びＦｉｂ−０３４３５を選択し、これらハイブリドーマが産生する抗体を、抗β鎖抗体として以下に示すＥＬＩＳＡ法に供した。また、実施例１にて樹立したハイブリドーマのうち、１３−３０及び３４−１０５を選択し、これらハイブリドーマが産生する抗体を、抗γ鎖抗体として以下に示すＥＬＩＳＡ法に供した。
【０１５４】
＜ＥＬＩＳＡ法＞
各抗体溶液を１０μｇ／ｍＬで１００μＬずつ、前記フィブリンプレートと前記フィブリノゲンプレートとに添加し、１時間室温で静置した。ＴＢＳ−Ｔにて洗浄した後、二次抗体としてｂｅｔｈｙｌ  ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ−ＨＲＰ（×１０００希釈）又はｂｅｔｈｙｌ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ−ＨＲＰ（×１００００希釈）を添加した。そして、ＴＢＳ−Ｔにて洗浄した後、ＯＰＤで１０分間比色し、４９２ｎｍの吸収波長を測定した。得られた結果を図１６に示す。
【０１５５】
図１７に示した結果から明らかなように、今回作製した抗β鎖抗体及び抗γ鎖抗体はいずれもフィブリノーゲンに対しては結合することなく、不溶性フィブリンに対しては高い親和性を示した。
【０１５６】
また、これら抗体の不溶性フィブリンに対する親和性（４９２ｎｍにおける吸光度）はいすれも、１０２−１０抗体のそれよりもはるかに高いものであることが明らかになった。すなわち、Ｆｉｂ−０３５５抗体、Ｆｉｂ−３４３５抗体、１３−３０抗体及び３４−１０５抗体の不溶性フィブリンに対する親和性は、１０２−１０抗体のそれの各々１２倍、９倍、６倍、１６倍であった。
【０１５７】
さらに、フィブリノーゲンに対する親和性（４９２ｎｍにおける吸光度）に対する不溶性フィブリンのそれの比率は、Ｆｉｂ−０３５５抗体、Ｆｉｂ−３４３５抗体、１３−３０抗体、３４−１０５抗体及び１０２−１０抗体において、１３倍、１８倍、１４０倍、２５倍及び３倍であり、今回作製した抗β鎖抗体及び抗γ鎖抗体はいずれも、１０２−１０抗体よりも不溶性フィブリンに対して高い特異性を示した。
【０１５８】
従って、前記参考例において実証された、インビトロ及びインビボにおける不溶性フィブリン（血栓）の検出、血栓関連疾患の判定、血栓の可視化（例えば、ＰＥＴ／ＣＴ）等は、本発明の抗β鎖抗体及び抗γ鎖抗体を利用しても当然行うことができる。さらに、特許文献７において本発明者らが開示した抗腫瘍性化合物等の血栓部位への送達も、本発明の抗β鎖抗体及び抗γ鎖抗体を利用しても当然行うことができる。
【０１５９】
（実施例３）
前述のＦｉｂ−０３５５が産生する抗体（Ｆｉｂ−０３５５抗体）及び３４−１０５が産生する抗体（３４−１０５抗体）について、以下に示す方法にて可変領域及び相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列を決定した。
【０１６０】
先ず、１ｘ１０６個の各ハイブリドーマより、ＲＮＡ  ｉｓｏ  Ｐｌｕｓ（ＴＡＫＡＲＡ社製）及びＲＮｅａｓｙミニキット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、トータルＲＮＡを抽出した。抽出したｍＲＮＡを鋳型として、ハイキャパシティｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）及び付属のランダムプライマーを用い、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡを鋳型に混合プライマーを使用してＰＣＲを行い、抗体可変領域をクローニングした。なお、混合プライマーとして、カッパーＬ鎖可変領域（Ｖκ）５’のセンスプライマー１７種、Ｖκ３’のリバースプライマー３種、Ｈ鎖可変領域（ＶＨ）５’のセンスプライマー１９種、ＶＨ３’のリバースプライマー３種、これらプライマーを一定の割合を混合して使用した。また、このＰＣＲにて、ポリメラーゼはプラチナＴａｑＤＮＡポリメラーゼハイフィデリティ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を使用し、緩衝液等は付属の試薬を使用した。
【０１６１】
次に、得られたＰＣＲプロダクトをアガロースゲル電気泳動にて展開し、サイズより目的とするＶＨ及びＶＬ領域と推測されるバンドを切り出した。次いで、ＱＩＡクイック  ゲル  抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用い、ゲルからｃＤＮＡを抽出した。抽出したｃＤＮＡをｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクターシステム（ｐｒｏｍｅｇａ社製）にＴＡクローニングにて挿入し、目的配列を含むクローンを複数取得した。宿主の大腸菌にはＪＭ１０９又はＤＨ５αを使用し、３７℃、ブルーホワイト選択用ＬＢ培地（５０ｕｇ／ｍｌアンピシリ含む）にて、ＪＭ１０９は約１２時間、ＤＨ５αは約１６時間培養した後、ホワイトコロニーを選択した。そして、得られたホワイトコロニーから、ＱＩＡプレップ  スピン  ミニプレップ  キット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、プラスミドＤＮＡを抽出した。
【０１６２】
次に、抗体可変部領域を含む複数のクローンについて、ビッグダイ  ターミネーター  ｖ３．１  サイクルシークエンシングキット（ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）及びアプライドバイオシステム３１３０ｘｌジェネティックアナライザー（ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ｈｉｔａｃｈｉ社製）を用いてシークエンシングを行い、目的の抗体可変領域の候補配列を取得した。
【０１６３】
そして、取得した候補配列をＮＣＢＩのＩｇＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／）にかけ、抗体配列とミエローマ由来の配列とに選別した。さらに取得した可変領域の配列情報と、ウェブ上のデータベース（ＩＭＧＴ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）に収録されている配列情報とを比較し、ＣＤＲ領域を決定した。得られた結果を図１８及び１９に示す。また、このようにして同定された３４−１０５抗体及びＦｉｂ−０３５５抗体の可変領域及びＣＤＲのアミノ酸配列を、以下に示す配列番号にて配列表においても示す。
３４−１０５抗体のＬ鎖（軽鎖）可変領域のアミノ酸配列：配列番号：３
３４−１０５抗体のＬ鎖ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列：配列番号：４〜６
３４−１０５抗体のＨ鎖（重鎖）可変領域のアミノ酸配列：配列番号：７
３４−１０５抗体のＨ鎖ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列：配列番号：８〜１０。
Ｆｉｂ−０３５５抗体のＬ鎖（軽鎖）可変領域のアミノ酸配列：配列番号：１１
Ｆｉｂ−０３５５抗体のＬ鎖ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列：配列番号：１２〜１４
Ｆｉｂ−０３５５抗体のＨ鎖（重鎖）可変領域のアミノ酸配列：配列番号：１５
Ｆｉｂ−０３５５抗体のＨ鎖ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列：配列番号：１６〜１８。
【産業上の利用可能性】
【０１６４】
以上説明したように、本発明によれば、フィブリノーゲンと結合せず且つ不溶性フィブリンに対する親和性及び特異性が高い抗体を提供することが可能となる。かかる抗体を用いることにより、高感度に、信頼性をもって、且つ簡便に不溶性フィブリン及び血栓の存在を検出することができ、結果として血栓関連疾患を判定することが可能となる。また、かかる抗体を用いることにより、適当な化合物又は分子を血栓が存在する部位、例えば腫瘍に送達させることが可能となる。従って、本発明は、医療診断分野や医薬分野において有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０１６５】
配列番号：３
＜２２３＞  軽鎖可変領域（３４−１０５）
配列番号：４
＜２２３＞  軽鎖ＣＤＲ１（３４−１０５）
配列番号：５
＜２２３＞  軽鎖ＣＤＲ２（３４−１０５）
配列番号：６                                                                           
＜２２３＞  軽鎖ＣＤＲ３（３４−１０５）
配列番号：７
＜２２３＞  重鎖可変領域（３４−１０５）
配列番号：８
＜２２３＞  重鎖ＣＤＲ１（３４−１０５）
配列番号：９
＜２２３＞  重鎖ＣＤＲ２（３４−１０５）
配列番号：１０
＜２２３＞  重鎖ＣＤＲ３（３４−１０５）
配列番号：１１
＜２２３＞  軽鎖可変領域（Ｆｉｂ−０３５５）
配列番号：１２
＜２２３＞  軽鎖ＣＤＲ１（Ｆｉｂ−０３５５）
配列番号：１３
＜２２３＞  軽鎖ＣＤＲ２（Ｆｉｂ−０３５５）
配列番号：１４
＜２２３＞  軽鎖ＣＤＲ３（Ｆｉｂ−０３５５）
配列番号：１５
＜２２３＞  重鎖可変領域（Ｆｉｂ−０３５５）
配列番号：１６
＜２２３＞  重鎖ＣＤＲ１（Ｆｉｂ−０３５５）
配列番号：１７
＜２２３＞  重鎖ＣＤＲ２（Ｆｉｂ−０３５５）
配列番号：１８
＜２２３＞  重鎖ＣＤＲ３（Ｆｉｂ−０３５５）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
2018193386.tif 000021
【図１８】
2018193386.tif 000022
【図１９】
2018193386.tif 000023
【配列表】
2018193386000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年8月2日(2018.8.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
不溶性フィブリンと結合し且つフィブリノーゲンと結合しない抗体であって、配列番号：１に示される部位又は配列番号：２に示される部位に結合する抗体。