(57)【要約】      （修正有）【課題】神経栄養因子を分泌する細胞を作製する方法の提供。【解決手段】未分化間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の集団を、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ヘレグリン、及び、ｃＡＭＰを含む分化用培地においてインキュベーションし、それにより神経栄養因子を分泌する細胞を作製する。【選択図】図２５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経栄養因子を分泌する細胞を作製する方法であって、ヒト未分化間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の集団を、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ヘレグリンおよびｃＡＭＰを含む分化用培地においてインキュベーションし、それにより前記神経栄養因子を分泌する細胞を作製することを含む方法。
【請求項２】
前記分化用培地はＩＢＭＸを欠いている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞を作製することが、ただ１つの分化工程で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記インキュベーションすることが、臨床実施のために十分な産業的な量で細胞を作製する条件のもとで行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記未分化ＭＳＣが、分化を誘導する別の培地中で予め培養されていない、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記神経栄養因子が、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記神経栄養因子を分泌する細胞が、神経成長因子（ＮＧＦ）を分泌しない、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記分化用培地はトリヨードチロニンを欠いている、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記分化用培地は異種由来成分を欠いている、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記方法はさらに、未分化ＭＳＣの前記集団を前記インキュベーションの前に培養することを含み、ただし、前記培養することが、細胞分化を促進させない条件のもとで行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記培養することが、血小板溶解物を含む培養培地において行われる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞の表面におけるＣＤ４４および／またはＣＤ７３の発現を分析することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記神経栄養因子を分泌する細胞から分泌される神経栄養因子の量を測定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
分化用培地の分化剤が、ｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ヘレグリンおよびｃＡＭＰからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ｂＦＧＦの濃度が５〜５０ｎｇ／ｍｌであり、前記ＰＤＧＦの濃度が１〜３０ｎｇ／ｍｌであり、前記ヘレグリンの濃度が５〜１００ｎｇ／ｍｌであり、前記ｃＡＭＰの濃度が０．５〜１０ｍＭである、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ｂＦＧＦの濃度が２０ｎｇ／ｍｌであり、前記ＰＤＧＦの濃度が５ｎｇ／ｍｌであり、前記ヘレグリンの濃度が５０ｎｇ／ｍｌであり、前記ｃＡＭＰの濃度が１ｍＭである、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜１２のいずれかに記載の方法に従って作製されるヒト細胞の単離された集団。
【請求項１８】
フローサイトメトリーによって検出される場合、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５の間葉系幹細胞マーカーのそれぞれを発現するが、フローサイトメトリーによって検出される場合、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５およびＨＬＡ−ＤＲの表面マーカーのいずれをも発現しない、請求項１７に記載の細胞の単離された集団。
【請求項１９】
神経変性疾患、神経疾患または免疫疾患からなる群から選択される疾患の治療において使用するための、請求項１７に記載の細胞の単離された集団。
【請求項２０】
前記ＭＳＣが、骨髄に由来する、請求項１９に記載の細胞の単離された集団。
【請求項２１】
前記神経変性疾患は、パーキンソン病、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、多発性硬化症、てんかん、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、卒中、自己免疫性脳脊髄炎、糖尿病性神経障害、緑内障性神経障害、アルツハイマー病およびハンチントン病からなる群から選択される、請求項１９に記載の細胞の単離された集団。
【請求項２２】
前記免疫疾患は重症筋無力症である、請求項１９に記載の細胞の単離された集団。
【請求項２３】
活性成分としての請求項１７に記載の単離された細胞集団と、医薬的に許容され得るキャリアとを含む医薬組成物。
【請求項２４】
前記神経疾患が自閉症である、請求項１９に記載の細胞の単離された集団。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はそのいくつかの実施形態において、神経栄養因子を分泌する間葉系幹細胞から細胞を作製する方法および該細胞を選択する方法に関連する。
【背景技術】
【０００２】
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は成人における最も一般的な神経変性疾患の１つである。筋萎縮性側索硬化症は、筋機能の急速な喪失および結果として起こる完全な麻痺が随伴する脳および脊髄における運動ニューロンの細胞死によって特徴づけられる致死的な進行性神経変性疾患である。
【０００３】
現在の実験的ＡＬＳ薬物は、推定される病態生理学的機構に基づいて開発される（例えば、抗グルタミン酸作動性薬剤、タンパク質の誤った折り畳みおよび蓄積を標的とする薬物、抗酸化治療、免疫調節剤および幹細胞など）。
【０００４】
現在の治験中の治療法の中で、幹細胞移植が最も大きな可能性を有しているかもしれない。失われた運動ニューロンまたは損なわれた運動ニューロンの置換は別にして、幹細胞埋め込み治療が細胞保護の独立した効果によってＡＬＳ患者のためになるかもしれない。さらに、幹細胞には、神経栄養因子、同様にまた、神経毒性を打ち消す酵素媒介因子およびパラクリン媒介因子を潜在的には産生することができる星状膠細胞およびミクログリアを含めて様々な支持的間質細胞に分化する潜在的能力がある。さらなる実験データは、非ニューロン細胞置換が、運動ニューロンの生存および改善された神経筋機能を促進させることにおける戦略上重要な治療法となり得ることを示している（Ｃｏｒｔｉ  Ｓ他、２０１０）。
【０００５】
パーキンソン病および多発性硬化症を含むさらなる神経変性疾患のための細胞置換治療における細胞源としての幹細胞の使用もまた提案されている。
【０００６】
神経栄養因子（ＮＴＦ）は、ニューロンの発達および生存を支持する天然に存在する小さいポリペプチドであり、したがって、この数年で、ＡＬＳを含めて種々の神経変性疾患のための治療選択肢のための候補として見なされてきている。ＡＬＳ動物モデルにおける研究では、疾患の発症および／または進行における遅れが、様々な神経栄養因子を投与した後で示されている。
【０００７】
しかしながら、ＡＬＳ患者への組換え増殖因子の全身投与またはクモ膜下投与の臨床研究は、部分的にはそれらの短い半減期、標的部位における低い濃度および副作用の高い発生率のためであるとおそらくは考えられるが、これまで効果的ではなかった。
【０００８】
いくつかの研究では、種々の因子にインビトロでさらされた後の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）がそれらの表現型を変化させ、また、ニューロンおよびグリアのマーカーを明らかにすることが示されている［Ｋｏｐｅｎ，Ｇ．Ｃ．，ら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  ＵＳＡ．９６（１９）：１０７１１−６，１９９９；Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｒａｍｏｓ，ら，Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ．１６４（２）：２４７−５６．２０００；Ｗｏｏｄｂｕｒｙ，Ｄ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ．６１（４）：３６４−７０，２０００；Ｗｏｏｄｂｕｒｙ，Ｄ．，ら，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ．６９（６）：９０８−１７，２００２；Ｂｌａｃｋ，Ｉ．Ｂ．，Ｗｏｏｄｂｕｒｙ，Ｄ．Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ｍｏｌ  Ｄｉｓ．２７（３）：６３２−６，２００１；Ｋｏｈｙａｍａ，Ｊ．，ら，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．６８（４−５）：２３５−４４，２００１；Ｌｅｖｙ，Ｙ．Ｓ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２１（２）：１２１−３２，２００３，Ｂｌｏｎｄｈｅｉｍ  Ｎ．Ｒ．，．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ＆  Ｄｅｖ．１５：１４１−１６４，２００６］。
【０００９】
国際公開ＷＯ２００６／１３４６０２および同ＷＯ２００９／１４４７１８は、神経栄養因子分泌細胞を間葉系幹細胞から作製するための分化プロトコルを教示する。
【００１０】
国際公開ＷＯ２００７／０６６３３８は、乏突起膠細胞様細胞を間葉系幹細胞から作製するための分化プロトコルを教示する。
【００１１】
国際公開ＷＯ２００４／０４６３４８は、ニューロン様細胞を間葉系幹細胞から作製するための分化プロトコルを教示する。
【００１２】
Ａｂｂａｓｚａｄｅｈ他［Ｉｒａｎｉａｎ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ、１７（２）：６２〜７０（２０１３年４月）］は、培地の１つが、ＰＤＧＦ、ヘレグリン、ｂＦＧＦおよびトリヨードチロニンを含む、乏突起膠細胞をＭＳＣから作製するための２工程分化プロトコルを教示する。
【発明の概要】
【００１３】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、神経栄養因子（ＮＴＦ）を分泌する細胞を作製する方法であって、未分化間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の集団を、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ヘレグリンおよびｃＡＭＰを含む分化用培地においてインキュベーションすることを含む方法が提供される。
【００１４】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、本明細書中に記載される方法に従って作製される、神経栄養因子を分泌する細胞の単離された集団が提供される。
【００１５】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、神経栄養因子の投与が有益である疾患の処置をその必要性のある対象において行う方法であって、本明細書中に記載される上記単離された細胞集団の治療有効量を前記対象に投与し、それにより、前記疾患を処置することを含む方法が提供される。
【００１６】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、神経栄養因子（ＮＴＦ）を分泌する細胞をＭＳＣの混合集団から選択する方法であって、
ａ）前記混合細胞集団の細胞を、下記のパラメータ：
（ｉ）ＣＤ４４を所定の閾値よりも少なく発現する細胞、
（ｉｉ）ＣＤ７３を所定の閾値よりも多く発現する細胞
の少なくとも１つについて分析すること、および
（ｂ）前記パラメータの少なくとも１つについて陽性である細胞を選択し、それにより、神経栄養因子を分泌する前記細胞を選択すること
を含む方法が提供される。
【００１７】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、活性成分としての本明細書中に記載される上記単離された細胞集団と、医薬的に許容され得るキャリアとを含む医薬組成物が提供される。
【００１８】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、ＭＳＣからエクスビボ分化されており、かつ、神経栄養因子を分泌する、疾患の処置のために有用な細胞の適格性を調べる方法であって、イソブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカイン６、ニューロモジュリン、増殖／分化因子１５、ヒアルロナンシンターゼ１、インターロイキン−１ベータ、インターロイキン−８、インヒビンベータＡ鎖、インスリン受容体基質１、インテグリンアルファ−１、ラッカーゼドメイン含有タンパク質１、ラミニンサブユニットアルファ−４、ルミカン、コラゲナーゼ３、食道正常粘膜特異的遺伝子１タンパク質、プレＢ細胞白血病転写因子相互作用タンパク質１、プレクトストリン相同様ドメインファミリーＡメンバー１、ホスファチジルイノシトール−３，４，５−三リン酸依存性Ｒａｃ交換体１タンパク質、プロスタグランジンＥシンターゼ、プロスタグランジンＧ／Ｈシンターゼ２、Ｒａｓ関連タンパク質Ｒａｂ−２７Ｂ、Ｒｈｏ関連ＧＴＰ結合タンパク質ＲｈｏＢ、シアル酸Ｏ−アセチルエステラーゼ、モノカルボン酸輸送体７、組織因子経路阻害剤２、膜貫通タンパク質６５、Ｖａｍ６／Ｖｐｓ３９様タンパク質、３−オキソ−５−ベータ−ステロイド４−デヒドロゲナーゼ、プロピオニル−ＣｏＡカルボキシラーゼベータ鎖（ミトコンドリア）、インターフェロン調節因子２結合タンパク質様、組織アルファ−Ｌ−フコシダーゼ、アルド−ケトレダクターゼファミリー１メンバーＣ２、イノシトール−１，４，５−三リン酸受容体相互作用タンパク質、タンパク質ＫＩＡＡ１１９９、セレン結合タンパク質１、ホスホリパーゼＤ３、ＧＴＰ：ＡＭＰホスホトランスフェラーゼ（ミトコンドリア）、タンパク質Ｗｎｔ−５ａ；タンパク質Ｗｎｔ、アルド−ケトレダクターゼファミリー１メンバーＣ３、ソーティングネキシン−９、ギャップジャンクションアルファ−１タンパク質、ピルビン酸カルボキシラーゼ（ミトコンドリア）、ＳＨ３／ＰＸドメイン含有タンパク質２Ｂ、インテグリンアルファ−２、シトクロームＰ４５０  １Ｂ１、キチナーゼ−３様タンパク質１、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ、セプラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、アルド−ケトレダクターゼファミリー１メンバーＣ１、ＦＥＲＭ、ＲｈｏＧＥＦおよびプレクトストリンドメイン含有タンパク質１、プロリル４−ヒドロキシラーゼサブユニットアルファ−３、リボヌクレオシド二リン酸レダクターゼサブユニットＭ２Ｂ、コアヒストンマクロ−Ｈ２Ａ．２；ヒストンＨ２Ａ、コリン輸送体様タンパク質１およびニーマン・ピックＣ１タンパク質、リソソームアルファ−グルコシダーゼからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質の発現について前記細胞を分析することを含み、ただし、非分化ＭＳＣと比較して、前記少なくとも１つのタンパク質の発現における増大により、前記細胞が疾患の処置のために有用であることが示される方法が提供される。
【００１９】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、ＭＳＣからエクスビボ分化されており、かつ、神経栄養因子を分泌する、疾患の処置のために有用な細胞の適格性を調べる方法であって、タイトジャンクションタンパク質ＺＯ−２、アルファ−１，３−マンノシル糖タンパク質２−ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、スムーセリン（ｓｍｏｏｔｈｅｌｉｎ）、異所性Ｐ顆粒タンパク質５ホモログ、ＢＲＣＡ１会合ＡＴＭ活性化因子１、ＷＤリピート含有タンパク質３６、ＳＨ３ドメイン結合タンパク質４、ＥＨドメイン結合タンパク質１様タンパク質１、Ｒａｓ  ＧＴＰアーゼ活性化様タンパク質ＩＱＧＡＰ３、リシルオキシダーゼホモログ２、トロポミオシン１（アルファ）、イソ型ＣＲＡ＿ｆ、Ｇｅｍ会合タンパク質５、三者モチーフ含有タンパク質１６、結合組織増殖因子、リンホカイン活性化キラーＴ細胞起源のプロテインキナーゼ、テトラトリコペプチドリピートタンパク質４、乳ガンの抗エストロゲン剤抵抗性タンパク質１、リボヌクレオシド二リン酸レダクターゼサブユニットＭ２、ユビキチン結合酵素Ｅ２Ｃ、好中球デフェンシン１、Ｃｄｃ４２エフェクタータンパク質３、コンデンシン複合体サブユニット２、Ｉｇカッパ鎖Ｃ領域、コンデンシン複合体サブユニット３、シンコイリン（ｓｙｎｃｏｉｌｉｎ）、染色体構造維持タンパク質２、コンデンシン複合体サブユニット１、インターアルファ−トリプシン阻害剤重鎖Ｈ４、チミジル酸シンターゼ、セロトランスフェリン、妊娠領域タンパク質、ＤＮＡ複製ライセンス化因子ＭＣＭ７、ヘモペキシン、ＤＮＡミスマッチ修復タンパク質Ｍｓｈ６、アンキリンリピートドメイン含有タンパク質１３Ａ、ホスデューシン様タンパク質３、１−ホスファチジルイノシトール−４，５−二リン酸ホスホジエステラーゼベータ−３、補体Ｃ３、ＤＮＡ複製ライセンス化因子ＭＣＭ３、ＣＤ９７抗原、ＣＤ９７抗原サブユニットアルファ、ＤＮＡ複製ライセンス化因子ＭＣＭ６、ＤＮＡ複製ライセンス化因子ＭＣＭ４、Ｄｉｓａｂｌｅｄホモログ２、タンパク質ＫＩＡＡ０６６４、ＤＮＡ複製ライセンス化因子ＭＣＭ２、タンパク質−リシン６−オキシダーゼ、リボヌクレオシド二リン酸レダクターゼラージサブユニット、メラノーマ関連抗原Ｄ２、Ｉｇガンマ−１鎖Ｃ領域、ヘパラナーゼ、インポーチンサブユニットアルファ−２、アスパラギンシンセターゼ［グルタミン加水分解性］、アルファ−２−マクログロブリン、コラーゲンアルファ−１（Ｉ）鎖、コラーゲンアルファ−１（Ｖ）鎖、ＤｎａＪホモログサブファミリーＢメンバー４、トロンボスポンジン−１、血清アルブミンおよびコラーゲンアルファ−２（Ｉ）鎖からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質の発現について前記細胞を分析することを含み、ただし、非分化細胞と比較して、前記少なくとも１つのタンパク質の発現における低下により、前記細胞が疾患の処置のために有用であることが示される方法が提供される。
【００２０】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、神経栄養因子を分泌する単離された細胞集団であって、前記細胞が、フローサイトメトリーによって検出される場合、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５の間葉系幹細胞マーカーのそれぞれを発現し、かつ、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５およびＨＬＡ−ＤＲの表面マーカーのいずれをも発現しない単離された細胞集団が提供される。
【００２１】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、ＭＳＣからエクスビボ分化されており、かつ、神経栄養因子を分泌する、疾患の処置のために有用な細胞の適格性を調べる方法であって、ｍｉＲ−５０３−５ｐ、ｍｉＲ−３６５９、ｍｉＲ−３５２９−３ｐ、ｍｉＲ−３２０ｂ、ｍｉＲ−４２４−５ｐ、ｍｉＲ−３２０ａ、ｍｉＲ−２２２−３ｐ、ｍｉＲ−３６６３−３ｐ、ｍｉＲ−７６２、ｍｉＲ−４３２７、ｍｉＲ−３６６５、ｍｉＲ３４ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４３２７、ｍｉＲＮＡ−３６６５およびｍｉＲ１３２−３ｐからなる群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現について前記細胞を分析することを含み、ただし、非分化ＭＳＣと比較して、前記ｍｉＲ−３６６３−３ｐ、ｍｉＲ−７６２、ｍｉＲ−４３２７、ｍｉＲ−３６６５、ｍｉＲ３４ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４３２７、ｍｉＲＮＡ３６６５またはｍｉＲ１３２−３ｐの増大した発現、あるいは、非分化ＭＳＣと比較して、前記ｍｉＲ−５０３−５ｐ、ｍｉＲ−３６５９、ｍｉＲ−３５２９−３ｐ、ｍｉＲ−３２０ｂ、ｍｉＲ−４２４−５ｐ、ｍｉＲ−３２０ａまたはｍｉＲ−２２２−３ｐの低下した発現により、疾患を処置するために有用である細胞が示される方法が提供される。
【００２２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記分化用培地はホスホジエステラーゼ阻害剤を欠いている。
【００２３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記分化用培地はトリヨードチロニンを欠いている。
【００２４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ホスホジエステラーゼ阻害剤はＩＢＭＸを含む。
【００２５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記分化用培地は異種由来成分を欠いている。
【００２６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法はさらに、未分化ＭＳＣの上記集団を上記インキュベーションの前に培養することを含み、ただし、前記培養することが、細胞分化を促進させない条件のもとで行われる。
【００２７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記培養することが、上記未分化ＭＳＣを播種した後の３日間にわたって行われる。
【００２８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記播種することが約６０００細胞／ｃｍ２〜８０００細胞／ｃｍ２の密度で行われる。
【００２９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記培養することが、血小板溶解物を含む培養培地において行われる。
【００３０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記培養培地における上記血小板溶解物の割合が約１０％である。
【００３１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記培養培地はさらに、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウムおよびヘパリンを含む。
【００３２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法はさらに、上記細胞の表面におけるＣＤ４４および／またはＣＤ７３の発現を分析することを含む。
【００３３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法はさらに、上記細胞の表面におけるＣＤ１０５の発現を分析することを含む。
【００３４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法はさらに、上記発現を未分化ＭＳＣの表面におけるＣＤ４４および／またはＣＤ７３の発現と比較することを含む。
【００３５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記細胞は、フローサイトメトリーによって検出される場合、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５の間葉系幹細胞マーカーのそれぞれを発現する。
【００３６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記細胞は、フローサイトメトリーによって検出される場合、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５およびＨＬＡ−ＤＲの表面マーカーのいずれをも発現しない。
【００３７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記細胞は遺伝子改変されない。
【００３８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記細胞は、上記対象に対して自己であるＭＳＣからエクスビボ分化させられる。
【００３９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記細胞は、上記対象に対して同種異系であるＭＳＣからエクスビボ分化させられる。
【００４０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記細胞は、上記対象の骨髄に由来するＭＳＣからエクスビボ分化させられる。
【００４１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記疾患は神経変性疾患または免疫疾患である。
【００４２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記神経変性疾患は、パーキンソン病、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、多発性硬化症、てんかん、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、卒中、自己免疫性脳脊髄炎、糖尿病性神経障害、緑内障性神経障害、アルツハイマー病およびハンチントン病からなる群から選択される。
【００４３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記神経変性疾患はＡＬＳである。
【００４４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記免疫疾患は自己免疫疾患である。
【００４５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記自己免疫疾患は重症筋無力症である。
【００４６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記投与することが筋肉内および／またはクモ膜下腔内に行われる。
【００４７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記投与することが筋肉内に行われるとき、７０ｋｇの対象に投与される細胞の総量が２０×１０６細胞〜１００×１０６細胞の間である。
【００４８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記投与することがクモ膜下腔内に行われるとき、７０ｋｇの対象に投与されるＭＳＣ−ＮＴＦの総量が５０×１０６細胞〜２００×１０６細胞の間である。
【００４９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記投与することが筋肉内およびクモ膜下腔内に行われるとき、７０ｋｇの対象に投与されるＭＳＣ−ＮＴＦの総量が２０×１０６細胞〜５００×１０６細胞の間である。
【００５０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法はさらに、上記細胞におけるＣＤ１０５のレベルを分析すること、および、ＣＤ１０５を所定のレベルよりも少なく発現する細胞を選択することを含む。
【００５１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ＮＴＦはグリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）および脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）を含む。
【００５２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法はさらに、未分化ＭＳＣの集団を、上記分析することに先立って、ＮＴＦを分泌するＭＳＣを生じさせるように分化用培地においてインキュベーションすることを含む。
【００５３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記医薬的に許容され得るキャリアは上記組成物における細胞の数を少なくとも４８時間にわたって維持する。
【００５４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−５０３−５ｐ、ｍｉＲ−３２０ｂ、ｍｉＲ４２４−５ｐ、ｍｉＲ−１３２−３ｐおよびｍｉＲ−３４ａ−５ｐからなる群から選択される。
【００５５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記神経栄養因子は、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＶＥＧＦおよびＨＧＦからなる群から選択される。
【００５６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記神経栄養因子は、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＶＥＧＦおよびＨＧＦを含む。
【００５７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記細胞は遺伝子改変されない。
【００５８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記細胞は、非分化ＭＳＣと比較して、ｍｉＲ３４ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２２２−３ｐ、ｍｉＲ７６２、ｍｉＲＮＡ３６６３−３ｐまたはｍｉＲ１３２−３ｐからなる群から選択されるｍｉＲＮＡの増大した発現を示す。
【００５９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記細胞は、非分化ＭＳＣと比較して、ｍｉＲ−５０３−５ｐ、ｍｉＲ−３２０ｂ、ｍｉＲ−４２４−５ｐ、ｍｉＲ−３２０ａまたはｍｉＲ−２２２−３ｐからなる群から選択されるｍｉＲＮＡの減少した発現を示す。
【００６０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記細胞は、非分化ＭＳＣと比較して、イソブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカイン６、ニューロモジュリン、増殖／分化因子１５、ヒアルロナンシンターゼ１、インターロイキン−１ベータ、インターロイキン−８、インヒビンベータＡ鎖、インスリン受容体基質１、インテグリンアルファ−１、ラッカーゼドメイン含有タンパク質１、ラミニンサブユニットアルファ−４、ルミカン、コラゲナーゼ３、食道正常粘膜特異的遺伝子１タンパク質、プレＢ細胞白血病転写因子相互作用タンパク質１、プレクトストリン相同様ドメインファミリーＡメンバー１、ホスファチジルイノシトール−３，４，５−三リン酸依存性Ｒａｃ交換体１タンパク質、プロスタグランジンＥシンターゼ、プロスタグランジンＧ／Ｈシンターゼ２、Ｒａｓ関連タンパク質Ｒａｂ−２７Ｂ、Ｒｈｏ関連ＧＴＰ結合タンパク質ＲｈｏＢ、シアル酸Ｏ−アセチルエステラーゼ、モノカルボン酸輸送体７、組織因子経路阻害剤２、膜貫通タンパク質６５、Ｖａｍ６／Ｖｐｓ３９様タンパク質、３−オキソ−５−ベータ−ステロイド４−デヒドロゲナーゼ、プロピオニル−ＣｏＡカルボキシラーゼベータ鎖（ミトコンドリア）、インターフェロン調節因子２結合タンパク質様、組織アルファ−Ｌ−フコシダーゼ、アルド−ケトレダクターゼファミリー１メンバーＣ２、イノシトール−１，４，５−三リン酸受容体相互作用タンパク質、タンパク質ＫＩＡＡ１１９９、セレン結合タンパク質１、ホスホリパーゼＤ３、ＧＴＰ：ＡＭＰホスホトランスフェラーゼ（ミトコンドリア）、タンパク質Ｗｎｔ−５ａ；タンパク質Ｗｎｔ、アルド−ケトレダクターゼファミリー１メンバーＣ３、ソーティングネキシン−９、ギャップジャンクションアルファ−１タンパク質、ピルビン酸カルボキシラーゼ（ミトコンドリア）、ＳＨ３／ＰＸドメイン含有タンパク質２Ｂ、インテグリンアルファ−２、シトクロームＰ４５０  １Ｂ１、キチナーゼ−３様タンパク質１、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ、セプラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、アルド−ケトレダクターゼファミリー１メンバーＣ１、ＦＥＲＭ、ＲｈｏＧＥＦおよびプレクトストリンドメイン含有タンパク質１、プロリル４−ヒドロキシラーゼサブユニットアルファ−３、リボヌクレオシド二リン酸レダクターゼサブユニットＭ２Ｂ、コアヒストンマクロ−Ｈ２Ａ．２；ヒストンＨ２Ａ、コリン輸送体様タンパク質１およびニーマン・ピックＣ１タンパク質、リソソームアルファ−グルコシダーゼの１種以上の増大した発現を示す。
【００６１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記細胞は、非分化ＭＳＣと比較して、タイトジャンクションタンパク質ＺＯ−２、アルファ−１，３−マンノシル糖タンパク質２−ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、スムーセリン（ｓｍｏｏｔｈｅｌｉｎ）、異所性Ｐ顆粒タンパク質５ホモログ、ＢＲＣＡ１会合ＡＴＭ活性化因子１、ＷＤリピート含有タンパク質３６、ＳＨ３ドメイン結合タンパク質４、ＥＨドメイン結合タンパク質１様タンパク質１、Ｒａｓ  ＧＴＰアーゼ活性化様タンパク質ＩＱＧＡＰ３、リシルオキシダーゼホモログ２、トロポミオシン１（アルファ）、イソ型ＣＲＡ＿ｆ、Ｇｅｍ会合タンパク質５、三者モチーフ含有タンパク質１６、結合組織増殖因子、リンホカイン活性化キラーＴ細胞起源のプロテインキナーゼ、テトラトリコペプチドリピートタンパク質４、乳ガンの抗エストロゲン剤抵抗性タンパク質１、リボヌクレオシド二リン酸レダクターゼサブユニットＭ２、ユビキチン結合酵素Ｅ２Ｃ、好中球デフェンシン１、Ｃｄｃ４２エフェクタータンパク質３、コンデンシン複合体サブユニット２、Ｉｇカッパ鎖Ｃ領域、コンデンシン複合体サブユニット３、シンコイリン（ｓｙｎｃｏｉｌｉｎ）、染色体構造維持タンパク質２、コンデンシン複合体サブユニット１、インターアルファ−トリプシン阻害剤重鎖Ｈ４、チミジル酸シンターゼ、セロトランスフェリン、妊娠領域タンパク質、ＤＮＡ複製ライセンス化因子ＭＣＭ７、ヘモペキシン、ＤＮＡミスマッチ修復タンパク質Ｍｓｈ６、アンキリンリピートドメイン含有タンパク質１３Ａ、ホスデューシン様タンパク質３、１−ホスファチジルイノシトール−４，５−二リン酸ホスホジエステラーゼベータ−３、補体Ｃ３、ＤＮＡ複製ライセンス化因子ＭＣＭ３、ＣＤ９７抗原、ＣＤ９７抗原サブユニットアルファ、ＤＮＡ複製ライセンス化因子ＭＣＭ６、ＤＮＡ複製ライセンス化因子ＭＣＭ４、Ｄｉｓａｂｌｅｄホモログ２、タンパク質ＫＩＡＡ０６６４、ＤＮＡ複製ライセンス化因子ＭＣＭ２、タンパク質−リシン６−オキシダーゼ、リボヌクレオシド二リン酸レダクターゼラージサブユニット、メラノーマ関連抗原Ｄ２、Ｉｇガンマ−１鎖Ｃ領域、ヘパラナーゼ、インポーチンサブユニットアルファ−２、アスパラギンシンセターゼ［グルタミン加水分解性］、アルファ−２−マクログロブリン、コラーゲンアルファ−１（Ｉ）鎖、コラーゲンアルファ−１（Ｖ）鎖、ＤｎａＪホモログサブファミリーＢメンバー４、トロンボスポンジン−１、血清アルブミンおよびコラーゲンアルファ−２（Ｉ）鎖の１種以上の減少した発現を示す。
【００６２】
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的用語および／または科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載される方法および材料と類似または同等である方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、例示的な方法および／または材料が下記に記載される。矛盾する場合には、定義を含めて、本特許明細書が優先する。加えて、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
本明細書では本発明のいくつかの実施形態を単に例示し添付の図面を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の実施形態を例示考察することだけを目的としていることを強調するものである。この点について、図面について行う説明によって、本発明の実施形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。
【００６４】
【図１Ａ−１Ｂ】図１Ａ−１Ｂは、トリパンブルー排除色素を使用して生細胞計数によって測定されるような、この場合における２つの投与経路のために好適な濃度における最終生成物の安定性を例示するグラフである。ＡＬＳ患者のＭＳＣ−ＮＴＦ最終生成物の安定性を２つの細胞濃度で、すなわち、筋肉内（ＩＭ）移植経路のための１０×１０６細胞／ｍｌ（Ａ）およびクモ膜下腔内（ＩＴ）移植のための３５×１０６細胞／ｍｌ（Ｂ）において採取後７時間まで２℃〜８℃で評価した。細胞を５０ｍｌのチューブにおいて５時間インキュベーションし、その後、さらに２時間にわたって１ｍｌおよび５ｍｌのシリンジにそれぞれ移した。
【００６５】
【図２】図２は、長期間の増殖の後におけるＡＬＳ患者由来のＭＳＣの細胞数を例示するグラフである。７名のＡＬＳ患者の骨髄由来ＭＳＣの増殖が、６０日までの間、５回〜７回の継代にわたって示される。細胞数を継代毎に求め、累積集団倍加（ＰＤ）を計算した。ＰＤ＝Ｌｏｇ１０（継代終了時採取の細胞数）−Ｌｏｇ（継代開始時の播種細胞数）／Ｌｏｇ２。ＰＤの合計数がすべての継代についてのＰＤの増加分に対応した。最初のＰＤを１回目の継代（Ｐ１）の後の細胞数に関して求めた。
【００６６】
【図３Ａ−３Ｉ】図３Ａ−３Ｉは、脂肪細胞（図３Ａ〜図３Ｃ）、骨細胞（図３Ｄ〜図３Ｆ）および軟骨細胞（図３Ｇ〜図３Ｉ）に分化するように誘導された、２回目の継代における３名のドナー（＃６０、＃６１および＃６２）のＭＳＣの写真である。
【００６７】
【図４Ａ−４Ｂ】図４Ａ−４Ｂは、Ｇバンド形成技術によって行われるような染色体分析の結果の写真である。ＡＬＳ患者の培養されたＭＳＣを初期の継代（Ｐ２）（Ａ）および後期の継代（Ｐ５）（Ｂ）において採取した。細胞は正常な核型を両方の継代において示した。
【００６８】
【図５Ａ−５Ｆ】図５Ａ−５Ｆは、脂肪細胞、骨細胞および軟骨細胞に分化するように誘導された、３回目の継代における同じＡＬＳ患者のＭＳＣの凍結保存前の写真（図５Ａ〜図５Ｃ）および凍結保存後の写真（図５Ｄ〜図５Ｆ）である。
【００６９】
【図６Ａ−６Ｂ】図６Ａ−６Ｂは、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞のＧＤＮＦおよびＢＤＮＦの産生性を例示するグラフである。１２名のＡＬＳ患者のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の産生性（赤色）を、同じＥＬＩＳＡアッセイで分析される同じ患者のＭＳＣの産生性（青色）と比較した。ＧＤＮＦの分泌が、同じ患者のＭＳＣと比較してＭＳＣ−ＮＴＦにおいて２倍〜２０倍またはそれ以上誘導され、ＢＤＮＦの分泌が、同じ患者のＭＳＣと比較してＭＳＣ−ＮＴＦにおいて１．５倍〜５倍誘導される。
【００７０】
【図７】図７は、２３名の異なるＡＬＳ患者のＭＳＣ細胞およびＭＳＣ−ＮＴＦ細胞のＢＤＮＦ産生性を例示するグラフである。
【００７１】
【図８】図８は、２３名の異なるＡＬＳ患者のＭＳＣ細胞およびＭＳＣ−ＮＴＦ細胞のＧＤＮＦ産生性を例示するグラフである。
【００７２】
【図９】図９は、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞のＶＥＧＦ産生性を例示するグラフである。２２名のＡＬＳ患者のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の産生性（赤色）を、同じＥＬＩＳＡアッセイで分析される同じ患者のＭＳＣの産生性（青色）と比較した。ＶＥＧＦの分泌が、同じ患者のＭＳＣと比較してＭＳＣ−ＮＴＦにおいて４．１±１．４倍またはそれ以上誘導される。
【００７３】
【図１０】図１０は、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞のＨＧＦ産生性を例示するグラフである。１９名のＡＬＳ患者のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の産生性（赤色）を、同じＥＬＩＳＡアッセイで分析される同じ患者のＭＳＣの産生性（青色）と比較した。ＨＧＦの分泌が、同じ患者のＭＳＣと比較してＭＳＣ−ＮＴＦにおいて６．７±３．９倍またはそれ以上誘導される。
【００７４】
【図１１Ａ−１１Ｂ】図１１Ａ−１１Ｂは、採取時（時間‘０’）、および、‘生体内’環境を模倣する成長培地‘移植’における培養の３日後におけるＭＳＣ−ＮＴＦ細胞によるＧＤＮＦおよびＢＤＮＦの産生を例示するグラフである。結果は、ＡＬＳ患者のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞を用いる４つの独立した実験の平均±ＳＤを示す。
【００７５】
【図１２Ａ−１２Ｂ】図１２Ａ−１２Ｂは、分化終了時におけるＡＬＳ患者ＭＳＣ−ＮＴＦの表面マーカー発現の表現型特徴づけの、同じ患者のＭＳＣと比較したときの結果である。フローサイトメトリーによって分析されるＭＳＣ特徴的な表面マーカーのパネルには、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５の陽性マーカー（Ａ）と、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５およびＨＬＡ−ＤＲの陰性マーカー（Ｂ）とが含まれた。ＭＳＣ細胞およびＭＳＣ−ＮＴＦ細胞が赤色であり、イソ型対照が黒色である（ＡＬＳ患者の頭文字、ＺＨ）。
【００７６】
【図１３Ａ−１３Ｂ】図１３Ａ−１３Ｂは、分化終了時における同じ患者のＭＳＣ細胞（黒色）およびＭＳＣ−ＮＴＦ細胞（赤色）の表面におけるＣＤ４４発現およびＣＤ７３発現のフローサイトメトリー分析を例示するヒストグラムである。左側の点線がイソ型対照である。
【００７７】
【図１４Ａ−１４Ｂ】図１４Ａ−１４Ｂは、分化期間中のＭＳＣ細胞およびＭＳＣ−ＮＴＦ細胞のＣＤ１０５発現のフローサイトメトリー分析を例示するグラフである。分化の２日目および３日目における同じ患者のＭＳＣ細胞（黒色）およびＭＳＣ−ＮＴＦ細胞（赤色）の表面におけるＣＤ１０５発現のフローサイトメトリー分析（それぞれｎ＝１６および２２）。左側の点線がイソ型対照である。
【００７８】
【図１５Ａ−１５Ｂ】図１５Ａ−１５Ｂは、ＭＳＣ細胞およびＭＳＣ−ＮＴＦ分泌細胞の細胞周期分析を例示するヒストグラムである。細胞周期のＧ０／Ｇ１期、Ｓ期およびＧ２／Ｍ期における細胞の分布が示される。Ｇ０／Ｇ１への変化がＭＳＣ−ＮＴＦ細胞集団において明らかである。
【００７９】
【図１６Ａ−１６Ｂ】図１６Ａ−１６Ｂは、２つの細胞タイプを、示される細胞タイプおよびドナーＩＤとともに、１６０個すべての検出されたｍｉＲＮＡに基づいて比較する。Ａ、ドナーＩＤを含めて、８個の異なる細胞サンプルのｍｉＲＮＡプロフィルを３次元ＰＣＡ投影図で表すものである；Ｂ、ドナーＩＤを含めて、８個の異なる細胞サンプルのｍｉＲＮＡプロフィルを階層的クラスター化後のヒートマップ・クラスターグラムプロットとして表すものである。
【００８０】
【図１７】図１７は、ＭＳＣに対してＭＳＣ−ＮＴＦにおいてアップレギュレーションされる１９個の主要なｍｉＲＮＡの、ｌｏｇ２の目盛りでの発現プロフィルである。強い誘導／非常に大きいアップレギュレーションをＭＳＣ−ＮＴＦにおいて受けるｍｉＲＮＡが赤色の楕円により強調される。ｍｉＲＮＡの発現がアレイについての検出レベルに達しなかったときには、名目上の強度値がこれらのデータ点に対して与えられる。この値が、その後のデータ分析のときの計算不能な数学的操作から生じるエラーを回避するために挿入される。正規化プロセスから、これはその後、これらのｍｉＲＮＡについては１．１３７５の正規化された強度値をもたらす。
【００８１】
【図１８】図１８は、ＭＳＣに対してＭＳＣ−ＮＴＦにおいてダウンレギュレーションされる２２個の主要なｍｉＲＮＡの、ｌｏｇ２の目盛りでの発現プロフィルである。非常に大きいダウンレギュレーションをＭＳＣ−ＮＴＦにおいて受けるｍｉＲＮＡが赤色の楕円により強調される。ｍｉＲＮＡの発現がアレイについての検出レベルに達しなかったときには、名目上の強度値がこれらのデータ点に対して与えられる。この値が、その後のデータ分析のときの計算不能な数学的操作から生じるエラーを回避するために挿入される。正規化プロセスから、これはその後、これらのｍｉＲＮＡについては１．１３７５の正規化された強度値をもたらす。
【００８２】
【図１９】図１９は、ｍｉＲ−５０３の発現がＭＳＣに対してＭＳＣ−ＮＴＦにおいてダウンレギュレーションされることを例示する棒グラフである。
【００８３】
【図２０】図２０は、ｍｉＲ１３２−３ｐの発現がＭＳＣに対してＭＳＣ−ＮＴＦにおいてアップレギュレーションされることを例示する棒グラフである。
【００８４】
【図２１】図２１は、これらの細胞の予測された強化されている血管形成促進能をもたらすＭＳＣ−ＮＴＦにおける示差的に発現されたｍｉＲＮＡのプロフィルをまとめるスキームである。
【００８５】
【図２２Ａ−２２Ｂ】図２２Ａ−２２Ｂは、ｍｉＲ−７６２（Ａ）およびｍｉＲ−３４ａ−５ｐ（Ｂ）の発現がＭＳＣに対してＭＳＣ−ＮＴＦにおいてアップレギュレーションされることを例示する。ｍｉＲＮＡの発現がアレイについての検出レベルに達しなかったときには、名目上の強度値がこれらのデータ点に対して与えられる。この値が、その後のデータ分析のときの計算不能な数学的操作から生じるエラーを回避するために挿入される。正規化プロセスから、これはその後、線形目盛りでこれらのｍｉＲＮＡについては２．２の正規化された強度値をもたらす。
【００８６】
【図２３Ａ−２３Ｃ】図２３Ａ−２３Ｃは、ＭＳＣに対してＭＳＣ−ＮＴＦにおいてＤＥであった、確認されたｍＲＮＡ標的を何ら有しない非常に識別的なｍｉＲＮＡの発現プロフィルを例示する。ｍｉＲＮＡの発現がアレイについての検出レベルに達しなかったときには、名目上の強度値がこれらのデータ点に対して与えられる。この値が、その後のデータ分析のときの計算不能な数学的操作から生じるエラーを回避するために挿入される。正規化プロセスから、これはその後、線形目盛りでこれらのｍｉＲＮＡについては２．２の正規化された強度値をもたらす。
【図２３Ｄ−２３Ｅ】図２３Ｄ−２３Ｅは、ＭＳＣに対してＭＳＣ−ＮＴＦにおいてＤＥであった、確認されたｍＲＮＡ標的を何ら有しない非常に識別的なｍｉＲＮＡの発現プロフィルを例示する。ｍｉＲＮＡの発現がアレイについての検出レベルに達しなかったときには、名目上の強度値がこれらのデータ点に対して与えられる。この値が、その後のデータ分析のときの計算不能な数学的操作から生じるエラーを回避するために挿入される。正規化プロセスから、これはその後、線形目盛りでこれらのｍｉＲＮＡについては２．２の正規化された強度値をもたらす。
【００８７】
【図２４Ａ−２４Ｂ】図２４Ａ−２４Ｂは、特定のｍｉＲＮＡの発現をＭＳＣサンプルおよびＭＳＣ−ＮＴＦサンプルにおいて比較する棒グラフである。図２４Ａは、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０３が、ＭＳＣと比較して、ＭＳＣ−ＮＴＦにおいてダウンレギュレーションされることを例示する。図２４Ｂは、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０ｂが、ＭＳＣと比較して、ＭＳＣ−ＮＴＦにおいてダウンレギュレーションされることを例示する。
【図２４Ｃ−２４Ｄ】図２４Ｃ−２４Ｄは、特定のｍｉＲＮＡの発現をＭＳＣサンプルおよびＭＳＣ−ＮＴＦサンプルにおいて比較する棒グラフである。図２４Ｃは、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２４−５ｐが、ＭＳＣと比較して、ＭＳＣ−ＮＴＦにおいてダウンレギュレーションされることを例示する。図２４Ｄは、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐが、ＭＳＣと比較して、ＭＳＣ−ＮＴＦにおいてアップレギュレーションされることを例示する。
【図２４Ｅ−２４Ｆ】図２４Ｅ−２４Ｆは、特定のｍｉＲＮＡの発現をＭＳＣサンプルおよびＭＳＣ−ＮＴＦサンプルにおいて比較する棒グラフである。図２４Ｅは、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３２−３ｐが、ＭＳＣと比較して、ＭＳＣ−ＮＴＦにおいてアップレギュレーションされることを例示する。図２４Ｆは、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０ａが、ＭＳＣと比較して、ＭＳＣ−ＮＴＦにおいて有意にダウンレギュレーションされないことを例示する。
【図２４Ｇ】図２４Ｇは、特定のｍｉＲＮＡの発現をＭＳＣサンプルおよびＭＳＣ−ＮＴＦサンプルにおいて比較する棒グラフである。図２４Ｇは、ｍｉＲ−２２２−３ｐが、ＭＳＣと比較して、ＭＳＣ−ＮＴＦにおいて有意にダウンレギュレーションされないことを例示する。
【００８８】
【図２５】図２５は、ＡＬＳ機能評価スコア（ＡＬＳＦＲＳ−Ｒ）に対するＭＳＣ−ＮＴＦのＩＴ投与の影響を例示するグラフである。
【００８９】
【図２６】図２６は、努力肺活量（ＦＶＣ）に対するＭＳＣ−ＮＴＦのＩＴ投与の影響を例示するグラフである。
【００９０】
【図２７】図２７は、平均筋肉周囲に対するＭＳＣ−ＮＴＦのＩＴ投与の影響を例示するグラフである。
【００９１】
【図２８Ａ−２８Ｃ】図２８Ａ−２８Ｃは、３つのＡＬＳ患者サンプルに対して２工程または１工程の分化プロトコルを使用して得られる収量を比較する棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００９２】
本発明はそのいくつかの実施形態において、神経栄養因子を分泌する間葉系幹細胞から細胞を作製する方法および該細胞を選択する方法に関連する。
【００９３】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明に示される細部、または、実施例によって例示される細部に限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、あるいは、様々な方法で実施、または、実行される。
【００９４】
神経栄養因子（ＮＴＦ）は、ニューロン細胞の生存、機能的維持および表現型発達を調節する分泌タンパク質である。ＮＴＦレベルにおける変化が、プログラム化された細胞死をニューロンにおいて誘発することに関与しており、したがって、パーキンソン病および他の神経変性疾患の病理発生の一因である。
【００９５】
しかしながら、神経栄養因子をそのまま使用することは、神経栄養因子が全身注入後において血液脳関門を通り抜けず、また、適正に分布しないので適用することができない。したがって、他の方策が、それらの治療特性をうまく利用するために開発されなければならない。
【００９６】
ヒト間葉系幹細胞を神経栄養因子分泌細胞に分化させるための様々なプロトコルがこの技術分野では知られている。例えば、国際公開ＷＯ２００６／１３４６０２および同ＷＯ２００９／１４４７１８を参照のこと。
【００９７】
本発明者らは、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）からの神経栄養因子の分泌を高める新しい方法を開発している。この方法は、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ヘレグリンおよびｃＡＭＰを含むただ１つの培地において未分化ＭＳＣを直接に分化させることを初めて含む。グリア由来増殖因子（ＧＤＮＦ）および脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の分泌レベルが分化プロセスの後で一貫してアップレギュレーションされることが示され、この場合、図５Ａ〜図５Ｂに例示されるように、対応する非分化細胞集団と比較して、ＧＤＮＦが２０倍もの多くアップレギュレーションされ、ＢＤＮＦが３倍もの多くアップレギュレーションされた。
【００９８】
本発明者らは、これらの特異な細胞を、図７Ａ〜図７Ｂに例示されるように表面マーカーの発現によって特徴づけている。
【００９９】
従って、本発明の１つの局面によれば、ＮＴＦを分泌する細胞を作製する方法であって、未分化ＭＳＣの集団を、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ヘレグリンおよびｃＡＭＰを含む分化用培地においてインキュベーションすることを含む方法が提供される。
【０１００】
用語「間葉系幹細胞」または用語「ＭＳＣ」は、幹細胞である細胞を生じさせるために分裂することができるか、または、間葉系（軟骨細胞、骨細胞および脂肪細胞）の細胞系譜の細胞を生じさせるために不可逆的に分化する最終分化していない成体細胞について交換可能に使用される。本発明の間葉系幹細胞は少なくともいくつかの実施形態では、同系起源または同種起源のものである場合がある。
【０１０１】
ＭＳＣの集団は典型的には、特定のマーカーをそれらの細胞表面に発現する。特定の実施形態によれば、未分化ＭＳＣは、フローサイトメトリーによって求められるように、ＣＤ１０５、ＣＤ７３およびＣＤ９０を細胞表面に発現し（例えば、９５％を超えて陽性であり）、かつ、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５およびＨＬＡ−ＤＲの発現を欠いている（例えば、２％未満の陽性である）。
【０１０２】
間葉系幹細胞の存在を確認するために使用され得る例示的な抗体には、ＣＤ４４  ＦＩＴＣコンジュゲート化体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ７３  ＰＥコンジュゲート化体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＣＤ７３  ＰＥコンジュゲート化体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ９０  ＰＥ−Ｃｙ５コンジュゲート化体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ９０  ＰＥコンジュゲート化体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ１０５  ＰＥコンジュゲート化体（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）、ＣＤ３  ＰｅｒＣＰコンジュゲート化体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ１４  ＦＩＴＣコンジュゲート化体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ１４  ＦＩＴＣコンジュゲート化体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ１９  ＰＥ−Ｃｙ５コンジュゲート化体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ１９  ＦＩＴＣコンジュゲート化体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ３４  ＦＩＴＣコンジュゲート化体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）、ＣＤ４５  ＰＥコンジュゲート化体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ４５  ＰｅｒＣＰコンジュゲート化体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、および、ＨＬＡ−ＤＲ  ＰＥ−Ｃｙ５コンジュゲート化体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）が含まれる。ＨＬＡ−ＤＲ  ＰｅｒＣＰコンジュゲート化体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。
【０１０３】
間葉系幹細胞の存在を確認するための別の方法が、当該細胞が多系統（例えば、脂肪細胞、骨細胞および軟骨細胞など）に分化することができることを示すことによってである。これは、例えば、Ｈｕｍａｎ  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して行われる場合がある。
【０１０４】
本発明のこの局面の好ましい実施形態によれば、間葉系幹細胞は、本明細書中に記載される細胞および細胞集団を作製するために遺伝子操作されない（すなわち、発現構築物により形質転換されない）。
【０１０５】
本発明の細胞は少なくともいくつかの実施形態では、どのような幹細胞に由来してもよく、だが、好ましくは胚性幹（ＥＳ）細胞に由来しないことが理解されるであろう。
【０１０６】
間葉系幹細胞が、骨髄、末梢血、血液、胎盤および脂肪組織（これらに限定されない）を含めて様々な組織から単離される場合がある。間葉系幹細胞を末梢血から単離する方法が、Ｋａｓｓｉｓ他［Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、２００６年５月、３７（１０）：９６７〜７６］によって記載されている。間葉系幹細胞を胎盤組織から単離する方法が、Ｂｒｏｏｋｅ  Ｇ他［Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ、２００９年２月、１４４（４）：５７１〜９］によって記載されている。
【０１０７】
脂肪組織、胎盤および臍帯血の間葉系幹細胞を単離し、培養する様々な方法が、Ｋｅｒｎ他［Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、２００６；２４：１２９４〜１３０１］によって記載されている。
【０１０８】
本発明のこの局面の好ましい実施形態によれば、間葉系幹細胞はヒト由来である。
【０１０９】
骨髄を吸引によって個体の腸骨稜または胸骨から単離することができる。低密度のＢＭ単核細胞（ＢＭＭＮＣ）がＦＩＣＯＬＬ−ＰＡＱＵＥ密度勾配遠心分離によって分離される場合がある。間葉系幹細胞を得るために、当該間葉系幹細胞（例えば、ＢＭＭＮＣ）を含む細胞集団が、当該細胞を血小板溶解物の存在下で維持および／または拡大培養することができる増殖用培地において培養される場合がある。１つの実施形態によれば、集団が（例えば、フラスコにおいて）プラスチック表面に置床され、間葉系幹細胞が、非接着性細胞を除くことによって単離される。代替では、間葉系幹細胞が、間葉系幹細胞のマーカーを使用してＦＡＣＳによって単離される場合がある。
【０１１０】
単離後、細胞は典型的には、単離された細胞を血小板溶解物の存在下においてエクスビボで維持および／または拡大培養することができる増殖培地における培養によって拡大培養される。増殖培地は、ＤＭＥＭ、アルファ−ＭＥＭまたはＤＭＥＭ／Ｆ１２である場合がある。典型的には、培地におけるグルコース濃度が約０．５グラム／リットル〜３グラム／リットルである。
【０１１１】
培養することが、間葉系幹細胞を培養するために好適であるプラスチック皿およびバイオリアクターを含めて、どのような表面であれ、好適な表面において行われる場合がある。
【０１１２】
血小板溶解物が、どのような方法であれ、この技術分野で知られている方法を使用して調製される場合がある。多血小板血漿（ＰＲＰ）が、感染性病原体（すなわち、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ、ＨＣＶ、ＨＢｓＡｇ）が存在しないことが決定された血液バンク献血物から得られる場合がある。ＰＲＰ含有バッグが−８０℃で貯蔵され、３７℃の水浴で解凍される場合がある。解凍後、多血小板血漿は典型的には、血小板の粒子および膜を除くために遠心分離される。その後、血小板溶解物上清が集められ、使用まで−８０℃で凍結される場合がある。血小板溶解物は、エンドトキシン、ヘモグロビン、ｐＨ、総タンパク質、アルブミン、重量オスモル濃度、無菌性およびマイコプラズマについて試験される。
【０１１３】
増殖培地は、例えば、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウムおよびヘパリンを含めて、さらなる成分を含む場合がある。
【０１１４】
好ましくは、間葉系幹細胞がヒト由来であるとき、血小板溶解物もまたヒトの細胞から得られることが理解されるであろう。
【０１１５】
１つの実施形態によれば、増殖／成長培地は異種混入物を欠いており、すなわち、動物由来成分、例えば、血清、動物由来の増殖因子およびアルブミンなどを含まない。したがって、この実施形態によれば、培養することが異種混入物の非存在下で行われる。
【０１１６】
間葉系幹細胞の単離および増殖のための例示的なプロトコルが本明細書中下記の実施例の節において示される。
【０１１７】
述べられるように、間葉系幹細胞を血小板溶解物含有培地で増殖させ、かつ、十分な数の未分化細胞が得られた後で、細胞は、疾患を処置するために有用である細胞を作製するために分化用培地において分化させられる場合がある。
【０１１８】
特定の実施形態によれば、細胞が、分化培地の添加に先立って１日間、２日間、３日間、４日間または５日間、（例えば、約６０００細胞／ｃｍ２〜８０００細胞／ｃｍ２の密度で）新鮮な増殖／成長培地に再播種される。
【０１１９】
表現「未分化ＭＳＣ」は、分化を誘導する培地で培養されたことがないＭＳＣを示す。したがって、本発明の少なくともいくつかの実施形態によれば、増殖後、ＭＳＣは、介在する分化前の工程を何ら伴うことなく、分化培地と直接に接触させられる。
【０１２０】
分化のために、本発明の未分化ＭＳＣは少なくともいくつかの実施形態では、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ヘレグリンおよびｃ−ＡＭＰを含む培地においてインキュベーションされる。この実施形態によれば、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ヘレグリンおよびｃ−ＡＭＰのそれぞれがただ１つの培地において混合され、培養することがただ１つの工程で行われる。
【０１２１】
１つの実施形態によれば、本発明の未分化ＭＳＣは、この工程の前および拡大培養工程の後において上皮増殖因子（ＥＧＦ）および／またはＮ２補充物の存在下で事前にインキュベーションされない。
【０１２２】
本発明の様々な実施形態の分化培地のために意図されるｂＦＧＦの例示的な濃度が、必要に応じて５ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌの間であり、必要に応じて１０ｎｇ／ｍｌ〜４０ｎｇ／ｍｌの間であり、必要に応じて１０ｎｇ／ｍｌ〜２５ｎｇ／ｍｌの間である。
【０１２３】
本発明の様々な実施形態の分化培地のために意図されるＰＤＧＦ−ＡＡの例示的な濃度が、必要に応じて１ｎｇ／ｍｌ〜３０ｎｇ／ｍｌの間であり、必要に応じて１ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌの間であり、必要に応じて１ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌの間であり、必要に応じて２．５ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌの間である。
【０１２４】
本発明の様々な実施形態の分化培地のために意図されるヘレグリンβ１の例示的な濃度が、必要に応じて５ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌの間であり、１０ｎｇ／ｍｌ〜９０ｎｇ／ｍｌ、必要に応じて２５ｎｇ／ｍｌ〜７５ｎｇ／ｍｌの間であり、必要に応じて４０ｎｇ／ｍｌ〜６０ｎｇ／ｍｌの間である。
【０１２５】
本発明の様々な実施形態の分化培地のために意図されるｄｂｃ−ＡＭＰの例示的な濃度が、必要に応じて０．５ｍＭ〜１０ｍＭの間であり、必要に応じて０．５ｍＭ〜５ｍＭの間であり、必要に応じて０．５ｍＭ〜２．５ｍＭの間である。
【０１２６】
１つの実施形態によれば、本発明のこの局面の分化用培地はホスホジエステラーゼ阻害剤（例えば、ＩＢＭＸ）を欠いており、すなわち、培養することがホスホジエステラーゼ阻害剤の非存在下で行われる。
【０１２７】
別の実施形態によれば、本発明のこの局面の分化用培地はトリヨードチロニンを欠いており、すなわち、培養することがトリヨードチロニンの非存在下で行われる。
【０１２８】
必要に応じて、これらの実施形態および下位実施形態のいずれかが組み合わされる場合があり、その結果、例えば、分化用培地が必要に応じて、ホスホジエステラーゼ阻害剤およびトリヨードチロニンの両方を欠いている場合がある。
【０１２９】
好ましくは、ＭＳＣは、少なくとも１日間、少なくとも２日間または少なくとも３日間、上記の分化用培地において分化させられる。好ましくは、分化工程は５日間を超えて行われない。
【０１３０】
本発明のこの局面に従って使用される分化用培地は好ましくは異種非含有であり（血清を欠いており）、かつ、どのような抗生物質をも欠いており、すなわち、培養することが異種混入物の非存在下で行われる。
【０１３１】
１つの実施形態によれば、細胞が、本明細書中下記で記載される処置方式において使用されるために十分である産業的量で製造される。
【０１３２】
したがって、例えば、１名のドナーからではあるが、少なくとも２０×１０６個の細胞が製造され、より好ましくは少なくとも５０×１０６個の細胞が製造され、より好ましくは少なくとも１１０×１０６個の細胞が製造され、より好ましくは少なくとも２００×１０６個の細胞が製造され、より好ましくは少なくとも３３０×１０６個の細胞が製造され、より好ましくは少なくとも５００×１０６個の細胞が製造され、より好ましくは少なくとも２０×１０６個の細胞が製造され、より好ましくは少なくとも６００×１０６個の細胞が製造され、より好ましくは少なくとも７００×１０６個の細胞が製造され、より好ましくは少なくとも８００×１０６個の細胞が製造され、より好ましくは少なくとも９００×１０６個の細胞が製造され、より好ましくは少なくとも１００×１０７個の細胞が製造されることが想定される。
【０１３３】
本発明ではさらに、分化した幹細胞をバンクにおいて貯蔵することが想定される。
【０１３４】
分化した幹細胞の各アリコートが特定のドナーに対応する場合がある。代替では、２名以上のドナーから得られる分化した幹細胞がプールされ、ただ１つのアリコートで貯蔵される場合がある。バンクはまた、ＭＳＣ集団を拡大培養するために、および／または、ＭＳＣ集団を分化させるために使用されるヒトフィーダー細胞および／または血小板溶解物の１つまたは複数のサンプルを含有する場合がある。
【０１３５】
ＭＳＣ集団は、幹細胞を生存したままで、かつ、機能を有したままで保つために（典型的には凍結によって）適切な条件のもとで貯蔵される。１つの実施形態によれば、ＭＳＣ集団は、凍結保存された集団として貯蔵される。他の保存方法が、米国特許第５６５６４９８号、同第５００４６８１号、同第５１９２５５３号、同第５９５５２５７号および同第６４６１６４５号に記載されている。幹細胞のバンクを作製するための方法が、例えば、米国特許出願公開第２００３／０２１５９４２号に記載されている。
【０１３６】
１つの実施形態によれば、バンクに貯蔵される細胞集団は、少なくとも１つの所定の特徴に従って特徴づけられ、例えば、分泌される神経栄養因子の量に従って特徴づけられる。さらなる所定の特徴には、例えば、形態学的特徴、分化プロフィル、血液型、主要組織適合遺伝子複合体、ドナーの疾患状態、あるいは、疾患に伴うか、または疾患に伴わない遺伝子型情報（例えば、遺伝子あるいはゲノムＤＮＡまたはミトコンドリアＤＮＡに関連する特異的な核酸配列の単一ヌクレオチド多型、すなわち、「ＳＮＰ」）が含まれる。
【０１３７】
カタログ作成は、それぞれの細胞集団について得られる特徴の集中記録、例えば、集められた文書記録、または、情報が入力されているコンピューターデータベース（これらに限定されない）などを新たに作ることの一部となる場合がある。幹細胞バンクは、研究者または臨床医の要求のために好適である特定の間葉系幹細胞サンプルを複数のサンプルから選択することを容易にする。
【０１３８】
１つの実施形態によれば、本明細書中に記載される間葉系幹細胞バンクは幹細胞データベースコンピューターユニットによって維持される。それぞれのコンピューターユニットが、情報を処理するためにそれぞれ、少なくとも１つの処理モジュールを含む。コンピューターユニットは、通信するようにディスプレーに接続される場合がある。間葉系幹細胞集団に関する情報がデータベースコンピューターに記憶される場合があり、この場合、情報はネットワーク接続を介して使用者に伝えられる。そのようなシステムは、間葉系幹細胞集団を評価して、どれが進行中の研究および使用のために好適であるかを決定することができることを顧客に提供し、また、幹細胞を購入するという取引および適正な輸送を容易にするために役立つ場合もある。
【０１３９】
当業者によって理解されるであろうように、本発明の様々な実施形態が、処理モジュール、および／または、少なくとも１つのプログラムコードモジュールを含むコンピュータープログラム製造物を含むデバイスまたはシステムとして具体化される場合がある。したがって、本発明は、完全にハードウエアの実施形態の形態、または、ソフトウエア側面およびハードウエア側面を組み合わせる実施形態の形態を取る場合がある。さらに、本発明は、コンピューター使用可能なプログラムコード手段が当該媒体において具体化されているコンピューター使用可能な記憶媒体におけるコンピュータープログラム製造物を含む場合がある。好適なコンピューター読み取り可能な媒体はどれも利用される場合があり、これには、ハードディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、光学的記憶デバイスまたは磁気記憶デバイスが含まれる。
【０１４０】
述べられるように、この方法の様々な実施形態に従って作製される細胞はいくつかの神経栄養因子を分泌する。
【０１４１】
本明細書中で使用される場合、表現「神経栄養因子」は、ニューロンに対する成長、分化、機能的維持および／または生存の影響を含む中枢神経系に作用する細胞因子を示す。神経栄養因子の例には、下記のものが含まれるが、それらに限定されない：グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｌ１９０６３、同Ｌ１５３０６；脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＣＡＡ６２６３２；ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）；ニューロトロフィン−４／５；ニュールツリン（ＮＴＮ）、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿００４５４９；ニューロトロフィン−４、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｍ８６５２８；パーセフィン、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＣ３９６４０；脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＣＡＡ４２７６１；アルテミン（ＡＲＴ）、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＤ１３１１０；毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０００６０５；およびニューブラスチン（Ｎｅｕｂｌａｓｔｉｎ）、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＤ２１０７５。
【０１４２】
別の実施形態によれば、本発明の様々な実施形態に従って作製される細胞は肝細胞増殖因子（ＨＧＦ；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｄ９０３３４．２）を分泌する。１つの実施形態によれば、当該細胞は、非分化ＭＳＣの少なくとも２倍量の、少なくとも３倍量の、少なくとも４倍量の、少なくとも５倍量の、または、それどころか、少なくとも６倍量のＨＧＦを分泌する。対照の非分化ＭＳＣは好ましくは、神経栄養因子を分泌する細胞を作製するために使用される供給源と同じ供給源（例えば、同じドナー、同じ器官）から得られる。
【０１４３】
別の実施形態によれば、本発明の様々な実施形態に従って作製される細胞は血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を分泌する。１つの実施形態によれば、当該細胞は、非分化ＭＳＣの少なくとも２倍量の、少なくとも３倍量の、少なくとも４倍量の、少なくとも５倍量の、または、それどころか、少なくとも６倍量のＶＥＧＦを分泌する。対照の非分化ＭＳＣは好ましくは、神経栄養因子を分泌する細胞を作製するために使用される供給源と同じ供給源（例えば、同じドナー、同じ器官）から得られる。
【０１４４】
別の実施形態によれば、本発明の様々な実施形態に従って作製される細胞は腫瘍壊死因子誘導遺伝子６タンパク質（ＴＳＧ−６；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＪ４２１５１８．１、Ｇｅｎｅ  ＩＤ：７１３０）を分泌しない。
【０１４５】
別の実施形態によれば、本発明の様々な実施形態に従って作製される細胞は神経成長因子（ＮＧＦ；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｍ５７３９９．１）を分泌しない。
【０１４６】
別の実施形態によれば、本発明の様々な実施形態に従って作製される細胞はインスリン様増殖因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０００６０９）を分泌しない。
【０１４７】
１つの実施形態によれば、本発明の分化細胞の集団の少なくとも、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％またはそれ以上がＧＤＮＦを分泌する。
【０１４８】
好ましくは、本発明の細胞によって分泌されるＧＤＮＦの量が、分化を伴わない間葉系幹細胞の同じ集団の分泌の少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍増大する。
【０１４９】
ＧＤＮＦの典型的な濃度が約２００ｐｇ／１０６細胞〜２０００ｐｇ／１０６細胞である。
【０１５０】
１つの実施形態によれば、本発明の分化細胞の集団の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％またはそれ以上がＢＤＮＦを分泌する。
【０１５１】
好ましくは、本発明の細胞によって分泌されるＢＤＮＦの量が、分化を伴わない間葉系幹細胞の同じ集団の分泌の少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍増大する。
【０１５２】
ＢＤＮＦの典型的な濃度が約５００ｐｇ／１０６細胞〜５０００ｐｇ／１０６細胞である。
【０１５３】
分化され、必要に応じて単離されると、細胞は、ＮＴＦを分泌するそれらの能力について（培養状態で）試験される場合がある。分泌されたＮＴＦの分析のために、上清が、上記で記載される分化手順が終わったときにＭＳＣの培養物またはＮＴＦ分泌細胞の培養物から回収され、また、細胞が採取され、計数される。細胞はまた、分化手順の期間中に、例えば、１日の分化の後または２日の分化の後で分析される場合がある。細胞の培養上清におけるグリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）または脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）などのＮＴＦの量が、例えば、また、限定されないが、ＧＤＮＦまたはＢＤＮＦのＥＬＩＳＡアッセイ（ＧＤＮＦ  ＤｕｏＳｅｔ  ＤＹ２１２；ＢＤＮＦ  ＤｕｏＳｅｔ  ＤＹ２４８；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を製造者のプロトコルに従って使用することによって定量される場合がある。ＩＧＦ−１の量を、例えば、また、限定されないが、ＩＧＦ  ＥＬＩＳＡアッセイ（ＩＧＦ−１  ＤｕｏＳｅｔ、カタログ番号ＤＹ２９１；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）を使用して定量することができる。
【０１５４】
ＶＥＧＦの量を、例えば、また、限定されないが、ＶＥＧＦ  ＥＬＩＳＡアッセイ（ＶＥＧＦ  ＤｕｏＳｅｔ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ：ＤＹ２９３Ｂ）を使用して定量することができる。ＨＧＦの量を、例えば、また、限定されないが、ＨＧＦ  ＥＬＩＳＡアッセイ（ＨＧＦ  ＤｕｏＳｅｔ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ：ＤＹ２９４）を使用して定量することができる。
【０１５５】
神経栄養因子分泌細胞は、非分化ＭＳＣと比較して、高まったレベル（例えば、少なくとも２倍、または、それどころか、少なくとも３倍）のインテグリンアルファ１を発現する場合がある。
【０１５６】
加えて、神経栄養因子分泌細胞は、非分化ＭＳＣと比較して、高まったレベル（例えば、少なくとも２倍、または、それどころか、少なくとも３倍）のＴＧＦベータ、幹細胞因子（ＳＣＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γおよび／またはプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）を発現する場合がある。
【０１５７】
なおさらに別の実施形態によれば、神経栄養因子分泌細胞は、非分化ＭＳＣと比較して、高まったレベルの乏突起膠細胞マーカー（例えば、ＰＤＧＦ受容体、Ｏ４スルファチドマーカー、ガラクトセレブロシド（Ｏ１、ＧａｌＣ）、Ｎｋｘ２．２、Ｓｏｘ１０、乏突起膠細胞特異的タンパク質（ＯＳＰ）、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）、２’，３’−環状ヌクレオチド−３’−ホスホジエステラーゼ（ＣＮＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、大腸腺腫性ポリポーシス（ＡＰＣ）、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）、ＣＮＰアーゼ、ＭＯＳＰおよび／または乏突起膠細胞ＮＳ−１など）を発現しない。
【０１５８】
なおさらに別の実施形態によれば、神経栄養因子分泌細胞は、非分化ＭＳＣと比較して、高まったレベルの神経伝達物質を分泌しない。前記細胞において発現されない神経伝達物質の例には、ドパミン、ノルアドレナリンおよびセロトニンが含まれる。
【０１５９】
本発明の細胞は少なくともいくつかの実施形態では、間葉系幹細胞からエクスビボ分化させられることが理解されるであろう。そのようなものとして、本発明の細胞は依然として、フローサイトメトリーによって検出される場合、間葉系幹細胞のマーカー（例えば、ＣＤ２９、ＣＤ４７、ＭＳＣＡ−１、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ７３およびＣＤ１０５など）を発現する。
【０１６０】
ＭＳＣと同様に、本発明の細胞は少なくともいくつかの実施形態では、フローサイトメトリーによって検出される場合、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５およびＨＬＡ−ＤＲの表面マーカーを発現しない。
【０１６１】
本明細書中に記載される細胞はＭＳＣのある特定のいくつかの特徴を保持するにもかかわらず、例えば、神経栄養因子の分泌ならびに特定のｍｉＲＮＡおよびタンパク質の発現を含めて、いくつかの点でＭＳＣと異なることがさらに理解されるであろう。
【０１６２】
したがって、例えば、本発明者らは、特定の細胞表面マーカーが、非分化のＭＳＣとは対照的に、分化したＮＴＦ分泌細胞において示差的に発現されることを示している。
【０１６３】
分化した間葉系幹細胞によって示差的に発現される表面マーカーには、例えば、平均蛍光強度によって求められる場合、分化細胞においてダウンレギュレーションされるＣＤ４４、および、分化細胞においてアップレギュレーションされるＣＤ７３が含まれる。例えば、少なくともいくつかの実施形態によれば、ＣＤ４４陽性集団の平均蛍光強度が分化細胞では非分化の細胞と比較して低くなっており、例えば、場合により、少なくとも５％低くなっており、場合により、また、好ましくは少なくとも１０％低くなっており、場合により、また、より好ましくは少なくとも１５％、場合により、また、最も好ましくは、少なくとも２０％、２５％、３０％または４０％低くなっており、あるいは、それどころか、５０％低くなっている。同様に、例えば、少なくともいくつかの実施形態によれば、ＣＤ７３陽性集団の平均蛍光強度が分化細胞では非分化の細胞と比較して高くなっており、例えば、場合により、少なくとも５％高くなっており、場合により、また、好ましくは少なくとも１０％高くなっており、場合により、また、より好ましくは少なくとも１５％、場合により、また、最も好ましくは、少なくとも２０％、２５％、３０％または４０％高くなっており、あるいは、それどころか、５０％高くなっている。
【０１６４】
非分化のＭＳＣと比較して、分化したＭＳＣにおいてアップレギュレーションされるｍｉＲＮＡには、例えば、下記のものが含まれる：
2018138044.tif 000003
【０１６５】
非分化のＭＳＣと比較して、分化したＭＳＣにおいてダウンレギュレーションされるｍｉＲＮＡには、例えば、下記のものが含まれる：
2018138044.tif 000004
2018138044.tif 000005
【０１６６】
ダウンレギュレーションされる追加のｍｉＲＮＡには、例えば、下記のものが含まれる：
2018138044.tif 000006
【０１６７】
別の実施形態によれば、細胞集団は、非分化のＭＳＣと比較して、増大したレベルのｍｉＲ−３６６３−３ｐ、ｍｉＲ−７６２、ｍｉＲ−４３２７、ｍｉＲ−３６６５、ｍｉＲ３４ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４３２７、ｍｉＲＮＡ３６６５および／またはｍｉＲ１３２−３ｐを発現する。
【０１６８】
さらに別の実施形態によれば、細胞集団は、増大したレベルのｍｉＲ３４ａ−５ｐおよび／またはｍｉＲ１３２−３ｐを発現する。
【０１６９】
別の実施形態によれば、細胞集団は、非分化のＭＳＣと比較して、減少したレベルのｍｉＲ−５０３−５ｐ、ｍｉＲ−３６５９、ｍｉＲ−３５２９−３ｐ、ｍｉＲ−３２０ｂ、ｍｉＲ−４２４−５ｐ、ｍｉＲ−３２０ａおよび／またはｍｉＲ−２２２−３ｐを発現する。
【０１７０】
さらに別の実施形態によれば、細胞集団は、減少したレベルのｍｉＲ−５０３−５ｐ、ｍｉＲ−３２０ｂ、ｍｉＲ−４２４−５ｐ、ｍｉＲ−３２０ａおよび／またはｍｉＲ−２２２−３ｐを発現する。
【０１７１】
さらに別の実施形態によれば、細胞集団は、減少したレベルのｍｉＲ−１５０−３ｐを発現する。
【０１７２】
さらに別の実施形態によれば、細胞集団は、減少したレベルのｍｉＲ−５０３−５ｐ、ｍｉＲ−３２０ｂおよび／またはｍｉＲ−４２４−５ｐを発現する。
【０１７３】
発現の増大したレベルまたは低下したレベルの上記記載のすべてが非分化のＭＳＣとの比較においてである。
【０１７４】
非分化細胞と比較される分化細胞におけるアップレギュレーションされた発現レベルを有するタンパク質が実施例の節の表７において詳述される。
【０１７５】
非分化細胞と比較される分化細胞におけるダウンレギュレーションされた発現レベルを有するタンパク質が実施例の節の表８において詳述される。
【０１７６】
述べられるように、本発明の少なくともいくつかの実施形態によれば、本発明の細胞および細胞集団は、特定の疾患または障害を処置するために使用される場合がある。細胞集団が、本明細書中下記で記載されるように、分化後にそのまま使用される場合があり、または、特定の表現型について濃縮される場合がある。
【０１７７】
本発明の様々な実施形態に従って作製される細胞は細胞表面マーカーの特定の発現パターンを呈示する。したがって、例えば、分化後、細胞は典型的には、分化前の同じ細胞集団と比較して、特有の増大したレベルのＣＤ７３をそれらの細胞表面に示す。加えて、分化後、細胞は典型的には、分化前の同じ細胞集団と比較して、特有の低下したレベルのＣＤ４４をそれらの細胞表面に示す。
【０１７８】
細胞表面マーカーを分析することが、例えば、フローサイトメトリー、ＨＰＬＣ、免疫組織化学、インシトゥーＰＣＲを含めて、どのような方法であれ、この技術分野で知られている方法を使用することによって行われる場合がある。
【０１７９】
本発明者らは、ＭＳＣの集団が、これらのマーカーを発現する細胞について選択することによってＮＴＦ分泌細胞について濃縮され得ることを提案する。
【０１８０】
従って、本発明の別の局面によれば、神経栄養因子（ＮＴＦ）を分泌する間葉系幹細胞（ＭＳＣ）をＭＳＣの混合集団から選択する方法であって、
ａ）前記混合細胞集団の細胞を、下記のパラメータ：
（ｉ）ＣＤ４４を所定の閾値よりも少なく発現する細胞、
（ｉｉ）ＣＤ７３を所定の閾値よりも多く発現する細胞
の少なくとも１つについて分析すること、および
（ｂ）前記パラメータの少なくとも１つについて陽性である細胞を選択し、それにより、神経栄養因子を分泌する前記ＭＳＣを選択すること
を含む方法が提供される。
【０１８１】
分取することが典型的には、指示された分化プロトコルの開始から２日または３日で行われる。
【０１８２】
ＮＴＦ分泌ＭＳＣが選択される混合細胞集団は、使用される分化方法、および、細胞が分化するために割り当てられる時間に依存して、様々なＮＴＦを異なるレベルで分泌する、異なる分化段階にある様々なＭＳＣを含むであろうことが理解されるであろう。
【０１８３】
述べられるように、ＮＴＦ分泌ＭＳＣが下記の判断基準の１つに従って選択される：
（ｉ）ＣＤ４４を所定の閾値よりも少なく発現する細胞、
（ｉｉ）ＣＤ７３を所定の閾値よりも多く発現する細胞。
【０１８４】
ＣＤ７３を発現する細胞を選択することが典型的には、ＣＤ７３に対して特異的に結合する作用因を使用して行われる。典型的には、そのような細胞は、当該細胞が本明細書中下記でさらに記載されるような方法（例えば、ＦＡＣＳ、ＭＡＣＳおよび免疫パンニングなど）を使用して検出され得るように、十分なＣＤ７３をそれらの膜に発現する。
【０１８５】
所定の閾値の選択が典型的には、本明細書中下記でさらに記載されるように、閾値の選択は分化前の間葉系幹細胞の同一集団におけるその細胞表面マーカーの発現の量に基づくので、それぞれの個々の間葉系幹細胞集団について行われる。
【０１８６】
典型的には、選択することが、この細胞表面タンパク質を特異的に認識することができる抗体を使用して行われ、だが、本発明では、さらなる作用因、例えば、ポリヌクレオチドまたは小分子などが意図される。
【０１８７】
ＣＤ７３またはＣＤ４４を認識する抗体が、この技術分野で知られている方法に従って得られる場合があり、または、市販の供給元から得られる場合がある。
【０１８８】
ＣＤ７３抗体が（直接的、または、同族の結合性分子を介して間接的のどちらかで）磁性成分に結合されるならば、不均一な細胞集団が、磁気活性化細胞分離によって、ＣＤ７３を高発現する細胞について濃縮される場合がある。
【０１８９】
ＣＤ７３抗体が親和性部分に結合されるならば、不均一な細胞集団が、同族の結合性分子を用いたアフィニティー精製によってＣＤ７３＋細胞について濃縮される場合がある。したがって、例えば、ＣＤ７３抗体がビオチンに結合されるならば、不均一な細胞集団から、ＣＤ７３＋細胞が、ストレプトアビジンのビーズまたはカラムを用いた精製によって枯渇化される場合がある。ＣＤ７３＋細胞を続いて回収することができる。例えば、ＣＤ７３抗体が、ある抗体またはある抗体のＦｃに結合されるならば、不均一な細胞集団から、ＣＤ７３＋細胞が、プロテインＡのビーズまたはカラムを用いた精製によって枯渇化される場合がある。ＣＤ７３＋細胞を続いて回収することができる。ＣＤ７３抗体が蛍光性部分に結合されるならば、不均一な細胞集団は、蛍光活性化細胞分取器（ＦＡＣＳ）を使用することによってＣＤ７３＋細胞について濃縮される場合がある。
【０１９０】
本明細書中で使用される場合、用語「フローサイトメトリー」は、サンプル中のある材料（例えば、特定のマーカーを含む腎臓細胞）の割合が、当該材料を（例えば、標識された抗体を当該材料に結合することによって）標識し、当該材料を含有する流体の流れを光のビームの中に通し、サンプルから放射される光を一連のフィルターおよびミラーによって構成波長に分離し、そして、この光を検出することによって決定されるアッセイを示す。
【０１９１】
数多くのフローサイトメーターが市販されており、これらには、例えば、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳｃａｎおよびＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、マウンテンビュー、カリフォルニア）が含まれる。ＦＡＣＳ分析のために使用され得る抗体が、Ｓｃｈｌｏｓｓｍａｎ  Ｓ、Ｂｏｕｍｅｌｌ  Ｌ他［Ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ  Ｔｙｐｉｎｇ  Ｖ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；１９９５］に教示されており、また、広く市販されている。
【０１９２】
ＦＡＣＳ分取器を使用した場合、特定のレベルの表面マーカーを有する細胞について選択することもまた可能であることが理解されるであろう。
【０１９３】
本発明は少なくともいくつかの実施形態では、未分化ＭＳＣ集団におけるＣＤ７３のレベルを分析し、その後、少なくとも１．５倍または少なくとも２倍あるいはそれ以上の発現における増大を有する対応する分化ＭＳＣ集団の細胞集団を選択することを意図する。
【０１９４】
加えて、または、代替において、本発明は少なくともいくつかの実施形態では、未分化ＭＳＣ集団におけるＣＤ４４のレベルを分析し、その後、少なくとも１．５倍または少なくとも２倍あるいはそれ以上の差による発現における低下を有する対応する分化ＭＳＣ集団の細胞集団を選択することを意図する。
【０１９５】
本発明は少なくともいくつかの実施形態ではまた、さらなる細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ１０５など）の発現を分化プロトコルの経過にわたって分析することを意図する。ＣＤ１０５の発現は当初、分化後（第２日の後）は増大し、しかし、ＮＴＦの分泌が最大となったとき（第３日の後）、ＣＤ１０５の発現が低下する。したがって、本発明は少なくともいくつかの実施形態では、ＮＴＦ分泌ＭＳＣを、例えば、少なくとも０．５倍、少なくとも１倍または少なくとも２倍の差によるＣＤ１０５の発現における低下を有するそのような細胞を選択することによって選択することを意図する。
【０１９６】
作製および必要に応じた細胞表面マーカー分析の後、ＮＴＦ分泌ＭＳＣはさらに分析される場合がある（例えば、核型分析、形態学、細胞数および生存性、グラム染色、無菌性）。
【０１９７】
作製された細胞集団は典型的には、細胞分散化剤を使用して培養プレートから取り出される。好ましくは、単一細胞の集団が得られる。細胞を分散させるために使用され得る薬剤の例には、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、アクターゼ（ａｃｃｕｔａｓｅ）、トリプシン（例えば、トリプシン−ＥＤＴＡ、トリプシンの非動物代替物（例えば、ＴｒｙｐＬＥ（商標）など）、パパインが含まれるが、これらに限定されない。代替では、または、加えて、研和もまた、細胞の分散を増大させるために行われる場合がある。
【０１９８】
使用され得るトリプシンの例示的な濃度が０．００５％〜０．５％のトリプシン−ＥＤＴＡである。細胞が、約５分間〜３０分間、約３７℃の温度で分散化剤とインキュベーションされる場合がある。
【０１９９】
細胞を採取することが典型的には、適切な培地、例えば、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ、ＰＢＳなどにおいて行われる。
【０２００】
必要に応じて、細胞はこの段階で保存（例えば、凍結または凍結保存）され、また、保存（例えば、凍結または凍結保存）される場合がある。これは、患者への反復投与のために適する場合がある。
【０２０１】
場合により、細胞は、凍結保存の前に、または、代替では対象への投与の前に、適格性が調べられる場合があり、または、特徴づけが行われる場合がある。適格性が調べられると、細胞にはラベルがそれに従って付けられる場合があり、または、細胞が対象にそのまま投与される場合がある。
【０２０２】
従って、本発明の別の局面によれば、神経栄養因子を分泌する細胞の適格性を調べる方法であって、ｍｉＲ−５０３、ｍｉＲ−３６５９、ｍｉＲ−３５２９−３ｐ、ｍｉＲ−３２０ｂ、ｍｉＲ−４２４−５ｐ、ｍｉＲ−３２０ａ、ｍｉＲ−２２２−３ｐ、ｍｉＲ−３６６３−３ｐ、ｍｉＲ−７６２、ｍｉＲ−４３２７、ｍｉＲ−３６６５、ｍｉＲ３４ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４３２７、ｍｉＲＮＡ−３６６５およびｍｉＲ１３２−３ｐからなる群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現について前記細胞を分析することを含み、ただし、非分化ＭＳＣと比較して、前記ｍｉＲ−３６６３−３ｐ、ｍｉＲ−７６２、ｍｉＲ−４３２７、ｍｉＲ−３６６５、ｍｉＲ３４ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４３２７、ｍｉＲＮＡ３６６５またはｍｉＲ１３２−３ｐの増大した発現、あるいは、非分化ＭＳＣと比較して、前記ｍｉＲ−５０３、ｍｉＲ−３６５９、ｍｉＲ−３５２９−３ｐ、ｍｉＲ−３２０ｂ、ｍｉＲ−４２４−５ｐ、ｍｉＲ−３２０ａまたはｍｉＲ−２２２−３ｐの低下した発現により、神経栄養因子を分泌する細胞が示される方法が提供される。
【０２０３】
特定の実施形態によれば、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−５０３、ｍｉＲ−３２０ｂ、ｍｉＲ４２４−５ｐ、ｍｉＲ−１３２−３ｐおよびｍｉＲ−３４ａ−５ｐからなる群から選択される。
【０２０４】
好ましくは、ｍｉＲＮＡにおける発現での変化は統計学的に有意な量である。
【０２０５】
好ましくは、分化細胞が比較される対照細胞は、神経栄養因子を分泌する細胞を作製するために使用されるのと同じ細胞（すなわち、同じドナーの非分化ＭＳＣおよび同じ器官に由来する非分化ＭＳＣ）である。
【０２０６】
ｍｉＲＮＡの発現について分析することが、ｍｉＲＮＡアレイ分析、ＰＣＲ分析などを含めて、どのような方法であれ、この技術分野で知られている方法を使用して行われる場合がある。
【０２０７】
細胞の適格性を調べる別の方法がタンパク質発現の分析によってである。
【０２０８】
従って、本発明の別の局面によれば、ＭＳＣからエクスビボ分化されており、かつ、神経栄養因子を分泌する細胞の適格性を調べる方法であって、イソブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカイン６、ニューロモジュリン、増殖／分化因子１５、ヒアルロナンシンターゼ１、インターロイキン−１ベータ、インターロイキン−８、インヒビンベータＡ鎖、インスリン受容体基質１、インテグリンアルファ−１、ラッカーゼドメイン含有タンパク質１、ラミニンサブユニットアルファ−４、ルミカン、コラゲナーゼ３、食道正常粘膜特異的遺伝子１タンパク質、プレＢ細胞白血病転写因子相互作用タンパク質１、プレクトストリン相同様ドメインファミリーＡメンバー１、ホスファチジルイノシトール−３，４，５−三リン酸依存性Ｒａｃ交換体１タンパク質、プロスタグランジンＥシンターゼ、プロスタグランジンＧ／Ｈシンターゼ２、Ｒａｓ関連タンパク質Ｒａｂ−２７Ｂ、Ｒｈｏ関連ＧＴＰ結合タンパク質ＲｈｏＢ、シアル酸Ｏ−アセチルエステラーゼ、モノカルボン酸輸送体７、組織因子経路阻害剤２、膜貫通タンパク質６５、Ｖａｍ６／Ｖｐｓ３９様タンパク質、３−オキソ−５−ベータ−ステロイド４−デヒドロゲナーゼ、プロピオニル−ＣｏＡカルボキシラーゼベータ鎖（ミトコンドリア）、インターフェロン調節因子２結合タンパク質様、組織アルファ−Ｌ−フコシダーゼ、アルド−ケトレダクターゼファミリー１メンバーＣ２、イノシトール−１，４，５−三リン酸受容体相互作用タンパク質、タンパク質ＫＩＡＡ１１９９、セレン結合タンパク質１、ホスホリパーゼＤ３、ＧＴＰ：ＡＭＰホスホトランスフェラーゼ（ミトコンドリア）、タンパク質Ｗｎｔ−５ａ；タンパク質Ｗｎｔ、アルド−ケトレダクターゼファミリー１メンバーＣ３、ソーティングネキシン−９、ギャップジャンクションアルファ−１タンパク質、ピルビン酸カルボキシラーゼ（ミトコンドリア）、ＳＨ３／ＰＸドメイン含有タンパク質２Ｂ、インテグリンアルファ−２、シトクロームＰ４５０  １Ｂ１、キチナーゼ−３様タンパク質１、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ、セプラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、アルド−ケトレダクターゼファミリー１メンバーＣ１、ＦＥＲＭ、ＲｈｏＧＥＦおよびプレクトストリンドメイン含有タンパク質１、プロリル４−ヒドロキシラーゼサブユニットアルファ−３、リボヌクレオシド二リン酸レダクターゼサブユニットＭ２Ｂ、コアヒストンマクロ−Ｈ２Ａ．２；ヒストンＨ２Ａ、コリン輸送体様タンパク質１およびニーマン・ピックＣ１タンパク質、リソソームアルファ−グルコシダーゼからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質の発現について前記細胞を分析することを含み、ただし、非分化ＭＳＣと比較して、前記少なくとも１つのタンパク質の発現における増大により、前記細胞が神経栄養因子を分泌することが示される方法が提供される。
【０２０９】
本発明の別の局面によれば、ＭＳＣからエクスビボ分化されており、かつ、神経栄養因子を分泌する細胞の適格性を調べる方法であって、タイトジャンクションタンパク質ＺＯ−２、アルファ−１，３−マンノシル糖タンパク質２−ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、スムーセリン（ｓｍｏｏｔｈｅｌｉｎ）、異所性Ｐ顆粒タンパク質５ホモログ、ＢＲＣＡ１会合ＡＴＭ活性化因子１、ＷＤリピート含有タンパク質３６、ＳＨ３ドメイン結合タンパク質４、ＥＨドメイン結合タンパク質１様タンパク質１、Ｒａｓ  ＧＴＰアーゼ活性化様タンパク質ＩＱＧＡＰ３、リシルオキシダーゼホモログ２、トロポミオシン１（アルファ）、イソ型ＣＲＡ＿ｆ、Ｇｅｍ会合タンパク質５、三者モチーフ含有タンパク質１６、結合組織増殖因子、リンホカイン活性化キラーＴ細胞起源のプロテインキナーゼ、テトラトリコペプチドリピートタンパク質４、乳ガンの抗エストロゲン剤抵抗性タンパク質１、リボヌクレオシド二リン酸レダクターゼサブユニットＭ２、ユビキチン結合酵素Ｅ２Ｃ、好中球デフェンシン１、Ｃｄｃ４２エフェクタータンパク質３、コンデンシン複合体サブユニット２、Ｉｇカッパ鎖Ｃ領域、コンデンシン複合体サブユニット３、シンコイリン（ｓｙｎｃｏｉｌｉｎ）、染色体構造維持タンパク質２、コンデンシン複合体サブユニット１、インターアルファ−トリプシン阻害剤重鎖Ｈ４、チミジル酸シンターゼ、セロトランスフェリン、妊娠領域タンパク質、ＤＮＡ複製ライセンス化因子ＭＣＭ７、ヘモペキシン、ＤＮＡミスマッチ修復タンパク質Ｍｓｈ６、アンキリンリピートドメイン含有タンパク質１３Ａ、ホスデューシン様タンパク質３、１−ホスファチジルイノシトール−４，５−二リン酸ホスホジエステラーゼベータ−３、補体Ｃ３、ＤＮＡ複製ライセンス化因子ＭＣＭ３、ＣＤ９７抗原、ＣＤ９７抗原サブユニットアルファ、ＤＮＡ複製ライセンス化因子ＭＣＭ６、ＤＮＡ複製ライセンス化因子ＭＣＭ４、Ｄｉｓａｂｌｅｄホモログ２、タンパク質ＫＩＡＡ０６６４、ＤＮＡ複製ライセンス化因子ＭＣＭ２、タンパク質−リシン６−オキシダーゼ、リボヌクレオシド二リン酸レダクターゼラージサブユニット、メラノーマ関連抗原Ｄ２、Ｉｇガンマ−１鎖Ｃ領域、ヘパラナーゼ、インポーチンサブユニットアルファ−２、アスパラギンシンセターゼ［グルタミン加水分解性］、アルファ−２−マクログロブリン、コラーゲンアルファ−１（Ｉ）鎖、コラーゲンアルファ−１（Ｖ）鎖、ＤｎａＪホモログサブファミリーＢメンバー４、トロンボスポンジン−１、血清アルブミンおよびコラーゲンアルファ−２（Ｉ）鎖からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質の発現について前記細胞を分析することを含み、ただし、非分化細胞と比較して、前記少なくとも１つのタンパク質の発現における低下により、前記細胞が神経栄養因子を分泌することが示される方法が提供される。
【０２１０】
好ましくは、分析されるタンパク質における発現での変化は統計学的に有意な量（すなわち、統計学的に有意な増大または統計学的に有意な低下）である。
【０２１１】
好ましくは、分化細胞が比較される対照細胞は、神経栄養因子を分泌する細胞を作製するために使用されるのと同じ細胞（すなわち、同じドナーの非分化ＭＳＣおよび同じ器官に由来する非分化ＭＳＣ）である。
【０２１２】
タンパク質の発現について分析することが、ウエスタンブロット、免疫細胞化学、質量分析法、放射免疫アッセイなどを含めて、どのような方法であれ、この技術分野で知られている方法を使用して行われる場合がある。特定の実施形態によれば、分析することが、タンパク質を特異的に認識する抗体を使用して行われる。
【０２１３】
述べられるように、本発明の様々な実施形態の細胞は、医薬品（これは交換可能に、医薬組成物として示される）を調製するために使用することができ、それによって、そのような医薬品は、神経栄養因子を分泌する細胞を用いて有益に処置することができる疾患を処置するために配合される。
【０２１４】
そのような疾患の例には、神経変性疾患および神経系の免疫疾患（例えば、自己免疫疾患）が含まれる。
【０２１５】
用語「神経変性疾患」は、中枢神経系に対する損傷によって引き起こされる疾患を記載するために本明細書中では使用される。本発明による細胞および方法を使用して処置され得る例示的な神経変性疾患には、例えば、下記のものが含まれる：筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、ハンチントン病、アルツハイマー病、レット症候群、リソソーム蓄積病（「白質疾患」またはグリア／脱髄疾患、例えば、Ｆｏｌｋｅｒｔｈ（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏ．、１９９９年９月、５８：９）によって記載されたもの）、例えばサンフィリッポ症候群、ゴーシェ病、テイ・サックス病（ベータヘキソサミニダーゼ欠損症）、他の遺伝的疾患、多発性硬化症（ＭＳ）、虚血、事故、環境的浸襲などによって引き起こされる脳の傷害または外傷、脊髄損傷、運動失調。加えて、本発明は、患者における卒中の中枢神経系に対する影響を軽減および／または排除するために使用される場合があり、そのような卒中は、他の場合には患者の脳内の部位に対する血流の欠如または虚血によって引き起こされるか、あるいは、脳および／または脊髄に対する物理的傷害から生じている。神経変性疾患にはまた、例えば、とりわけ、自閉症および関連する神経学的疾患（例えば、統合失調症など）を含めて、様々な神経発達障害が含まれる。
【０２１６】
本明細書中に記載される細胞を使用して処置され得る神経系の自己免疫疾患には、例えば、多発性硬化症および重症筋無力症、ギラン・バール症候群、多系統萎縮症（ＭＳＡ；様々な程度のパーキンソン症候群、自律神経機能障害および小脳性運動失調を伴う散発性の進行性成人発症型神経変性障害）が含まれる。他の自己免疫疾患が、Ｋｒａｋｅｒ他、Ｃｕｒｒ  Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．、２０１１年９月、９（３）：４００〜４０８に記載されている（その内容は参照によって本明細書中に組み込まれる）。
【０２１７】
本発明の細胞は、様々な移植法（その性質は埋め込み部位に依存する）を使用して個体を治療するために投与することができる。
【０２１８】
「移植」、「細胞置換」または「グラフト化する」注入の用語または表現は、本明細書中では交換可能に使用され、本発明の細胞を標的組織（例えば、脳、灰白質）に導入することを示す。細胞は被移植者に由来し得る（同種）か、あるいは、非同種ドナーまたは異種ドナーに由来し得る。
【０２１９】
細胞は、直接には筋肉（筋肉内、例えば、上腕または大腿の筋肉などにおいて）、呼吸筋、嚥下筋の中に、脊髄（クモ膜下腔内）の中に、静脈内に、直接には脳の中に、または、これらの組合せで（例えば、筋肉内およびクモ膜下腔内に）移植することができる。他の投与様式もまた意図される（例えば、全身投与など）。
【０２２０】
筋肉内投与され得る細胞の例示的な用量が１×１０６細胞／部位〜２０×１０６細胞／部位である。筋肉あたりの投与の数が、処置の経過の期間中に、５から５０まで、１０から３０まで、２０から１００まで、または、１５から２５まで変化する場合がある。１つの実施形態によれば、投与される細胞の総数が２０×１０６個〜２０００×１０６個の間であり、より好ましくは２０×１０６個〜１０００×１０６個の間であり、より好ましくは２０×１０６個〜５００×１０６個の間であり、より好ましくは２０×１０６個〜２００×１０６個の間であり、より好ましくは２０×１０６個〜１００×１０６個の間である。特定の実施形態によれば、それぞれの投与が、２０〜３０の間の投与（例えば、２４の投与）に関して１×１０６個の細胞を含み、または、処置の経過の期間中における２０〜３０の間の投与（例えば、２４の投与）に関して１．５×１０６個の細胞を含み、または、２０〜３０の間の投与（例えば、２４の投与）に関して２×１０６個の細胞を含む。
【０２２１】
クモ膜下腔に投与され得る細胞の例示的な用量が０．５×１０６細胞／Ｋｇ体重〜２０×１０６細胞／Ｋｇ体重であり、より好ましくは０．５×１０６細胞／Ｋｇ体重〜１０×１０６細胞／Ｋｇ体重であり、より好ましくは１×１０６細胞／Ｋｇ体重〜１０×１０６細胞／Ｋｇ体重であり、より好ましくは１×１０６細胞／Ｋｇ体重〜５×１０６細胞／Ｋｇ体重であり、より好ましくは１×１０６細胞／Ｋｇ体重〜２．５×１０６細胞／Ｋｇ体重であり、より好ましくは１×１０６細胞／Ｋｇ体重〜２×１０６細胞／Ｋｇ体重である。
【０２２２】
筋肉内送達およびクモ膜下腔内送達の両方の組合せについては、本発明は少なくともいくつかの実施形態では、約１×１０６細胞／部位〜１０×１０６細胞／部位の筋肉内送達、より好ましくは１×１０６細胞／部位〜５×１０６細胞／部位の間での筋肉内送達、より好ましくは１×１０６細胞／部位〜２．５×１０６細胞／部位の間での筋肉内送達を意図する。部位の数が、５から５０まで、１０から３０まで、２０から１００まで、または、１５から２５まで変化する場合がある（例えば、２４）；クモ膜下腔内送達については１×１０６細胞／Ｋｇ体重〜１０×１０６細胞／Ｋｇ体重であり、より好ましくは１×１０６細胞／Ｋｇ体重〜５×１０６細胞／Ｋｇ体重である。１つの実施形態によれば、７０ｋｇの患者につき約２０×１０６個〜１４００×１０６個の細胞の投与あたりの最大数が意図され、より好ましくは、７０ｋｇの患者につき５０×１０６個〜１０００×１０６個の間の細胞が意図され、より好ましくは、７０ｋｇの患者につき５０×１０６個〜５００×１０６個の間の細胞が意図され、より好ましくは、７０ｋｇの患者につき５０×１０６個〜２００×１０６個の間の細胞が意図される。別の実施形態によれば、７０ｋｇの患者につき約２０×１０６個〜５００×１０６個の細胞の最大数が意図される。別の実施形態によれば、７０ｋｇの患者につき約１００×１０６個〜２０００×１０６個の細胞の最大数が意図され、より具体的には、７０ｋｇの患者につき２００×１０６個の細胞が意図される。
【０２２３】
本明細書中に記載される方法のどれにおいても、細胞は、それ自体で、または、好ましくは、医薬的に許容され得るキャリアをさらに含む医薬組成物の一部としてそのどちらでも投与することができる。
【０２２４】
本明細書中で使用される「医薬組成物」は、本明細書中に記載される化学的コンジュゲートの１つまたは複数と、他の化学的成分（例えば、医薬的に好適な担体（キャリア）および賦形剤など）との調製物を示す。医薬組成物の目的は、対象に対する化合物の投与を容易にすることである。
【０２２５】
本明細書中以降、用語「医薬的に許容され得るキャリア（担体）」は、交換可能に使用され得るが、対象に対する著しい刺激を生じさせず、かつ、投与された化合物の生物学的な活性および性質を妨げないキャリアまたは希釈剤を示す。限定されないが、キャリアの例には、プロピレングリコール；生理的食塩水；エマルション；緩衝液；培養培地、例えば、ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩなど；フリーラジカルを除去し、ｐＨ緩衝作用、膨張／浸透圧支持、エネルギー基質およびイオン濃度を提供する成分で、細胞内状態を低い温度で平衡化する成分を含有する低体温用貯蔵培地；ならびに、有機溶媒と水との混合物がある。
【０２２６】
典型的には、医薬用キャリアは、組成物における細胞の数を少なくとも２４時間にわたって、少なくとも４８時間にわたって、または、それどころか、少なくとも９６時間にわたって保つ（例えば、９０％を超えて低下させない）。
【０２２７】
本明細書中において、用語「賦形剤」は、化合物の投与をさらに容易にするために、および移植／注入前の好適な時間期間の間、予め決められた温度で細胞の生存性を維持するために医薬組成物に添加される不活性な物質を示す。賦形剤の非限定的な例としては、アルブミン、血漿、血清、および脳脊髄液（ＣＳＦ）、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）またはレスベラトールなどの抗酸化剤が挙げられる。
【０２２８】
本発明の好ましい実施形態によれば、医薬用キャリアは、緩衝剤の水溶液または培養培地（例えば、ＤＭＥＭなど）である。
【０２２９】
薬物の配合および投与のための技術が「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、最新版）に見出されることができ、これは参考として本明細書中に組み込まれる。
【０２３０】
本発明の方法において使用されるいかなる調製物についても、投与量または治療有効量は、生体外アッセイおよび細胞培養アッセイから最初に推定されることができる。好ましくは、投与量は、所望の濃度または力価を達成するために動物モデルにおいて決定されることができる。そのような情報は、ヒトにおける有用な投与量をより正確に決定するために使用されることができる。
【０２３１】
本明細書中に記載される有効成分の毒性および治療効力は、生体外、細胞培養物、または実験動物における標準的な薬学的手法によって決定されることができる。例えば、６−ＯＨＤＡ障害のマウスまたはラットがパーキンソン病の動物モデルとして使用される場合がある。加えて、ヒマワリ試験が、動物にヒマワリの種子を特定の期間の間に開けるように促すことによって繊細な運動機能における改善を試験するために使用される場合がある。ＭＳＡ患者における運動機能の改善を試験するための様々な動物モデルが、例えば、Ｓｔｅｆａｎｏｖａ他、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２００５年９月、２８（９）：５０１〜６に開示されている。
【０２３２】
遺伝子組換えマウスがハンチントン病のためのモデルとして使用される場合があり、この場合、遺伝子組換えマウスは増大した数のＣＡＧ反復を含み、かつ、ハンチンチンおよびユビキチンの核内封入体を、この疾患におけるニューロン細胞喪失の部位に厳密に一致して、脳幹、視床または脊髄においてではなく、線条体および大脳皮質のニューロンにおいて有する。
【０２３３】
ＳＯＤ−１の変異を含む遺伝子組換えマウスがＡＬＳ疾患のためのモデルとして使用される場合がある。例えば、Ｕｃｃｅｌｌｉ  Ａ他、Ｍｏｌ  Ｍｅｄ、２０１２年４月２日を参照のこと。
【０２３４】
中隔海馬経路は、海馬采を切断することによって片側性に横切開される場合、アルツハイマー病における中隔海馬経路喪失のコリン作動性欠損を模倣する。したがって、この病変を含む動物モデルが、アルツハイマー病を処置するための本発明の細胞を試験するために使用される場合がある。
【０２３５】
動物の生存および旋回性挙動（例えば、ロータロッド上での旋回性挙動）が本発明の細胞の投与の後で分析される場合がある。
【０２３６】
これらのインビトロアッセイおよび細胞培養アッセイならびに動物研究から得られるデータは、ヒトにおける使用のための投薬量の範囲を定める際に使用することができる。さらなる情報が臨床研究から得られる場合がある。例えば、Ｓａｌｅｍ  ＨＫ他、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、２０１０、２８：５８５〜９６、および、Ｕｃｃｅｌｌｉ他、Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌ、２０１１、１０：６４９〜５６を参照のこと。
【０２３７】
投薬量は、用いられる投薬形態および利用される投与経路に依存して変化する場合がある。正確な配合、投与経路および投薬量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選ぶことができる（例えば、Ｆｉｎｇｌ他、１９７５、“Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”、第１章、１頁を参照のこと）。例えば、ＡＬＳ患者を、処置に対する陽性の応答を示している改善された運動機能について症候的にモニターすることができる。
【０２３８】
注射の場合、医薬組成物の有効成分は、水溶液において、好ましくは生理学的に適合しうる緩衝液（例えば、ハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理学的な食塩緩衝液など）および本明細書中で上述したような追加の薬剤において配合されることができる。
【０２３９】
投薬量および投薬間隔が、埋め込まれた細胞による神経伝達物質の合成を効果的に調節するために十分である有効成分のレベルに個々に調節され場合がある。所望される効果を達成するために必要である投薬量は、個体の特徴および投与経路に依存するであろう。
【０２４０】
処置される状態の重篤度および応答性に依存して、細胞を与えることが、疾患状態の縮小がいつ達成されるかに依存して数日から数週間または数ヶ月にまで続く処置の経過とともに、単回または複数回の投与であることが可能である。
【０２４１】
投与される組成物の量は当然のことながら、処置されている個体、病気の重篤度、投与様式、処方医の判断などに依存しているであろう。投薬量および投与時期が、個体の変化しつつある状態の注意深い連続したモニターリングに応じて変わるであろう。例えば、処置されたＡＬＳ患者には、モニターしている徴候に基づいて、疾患の症状を軽減するために十分である量の細胞が投与されるであろう。
【０２４２】
本発明の細胞は少なくともいくつかの実施形態では、使える状態にあるシリンジにおける単位投薬形態で事前に包装される場合がある。シリンジには、細胞の名称および起源がラベル表示される場合がある。ラベル表示はまた、細胞の機能に関連する情報（例えば、細胞から分泌される神経栄養因子の量）を含む場合がある。シリンジは、細胞に関する情報もまたラベル表示されている包装材で包装される場合がある。
【０２４３】
本発明の細胞は少なくともいくつかの実施形態では、神経変性障害を処置することにおいて有用である治療剤、例えば、ガングリオシド；抗生物質、神経伝達物質、神経ホルモン、トキシン、神経突起促進分子；ならびに、神経伝達物質分子（例えば、Ｌ−ＤＯＰＡなど）の代謝拮抗剤小分子剤および前駆体などと一緒に共投与される場合がある。例えば、ＡＬＳについては、本発明の細胞がＲｉｌｕｔｅｋ（登録商標）（リルゾール、Ｓａｎｏｆｉ  Ａｖｅｎｔｉｓ）と一緒に共投与される場合がある。加えて、または、代替において、本発明の細胞は少なくともいくつかの実施形態では、神経伝達物質を合成することができる他の細胞と一緒に共投与される場合がある。そのような細胞が米国特許出願公開第２００５０２６５９８３号に記載されている（これは参照によって本明細書中に組み込まれる）。
【０２４４】
本明細書中で使用される用語「約」は、±１０％を示す。
【０２４５】
本発明の追加の目的、利点、及び新規な特徴は限定されることを意図されない以下の実施例の精査により当業者に明らかになるだろう。
【０２４６】
用語「含む／備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ、ｉｎｃｌｕｄｅｓ、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、およびそれらの同根語は、「含むが、それらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」ことを意味する。
【０２４７】
用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、「含み、それらに限定される（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」ことを意味する。
【０２４８】
表現「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、さらなる成分、工程および／または部分が、主張される組成物、方法または構造の基本的かつ新規な特徴を実質的に変化させない場合にだけ、組成物、方法または構造がさらなる成分、工程および／または部分を含み得ることを意味する。
【０２４９】
本開示を通して、本発明の様々な態様が範囲形式で提示され得る。範囲形式での記載は単に便宜上および簡潔化のためであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈すべきでないことを理解しなければならない。従って、範囲の記載は、具体的に開示された可能なすべての部分範囲、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値を有すると見なさなければならない。例えば、１〜６などの範囲の記載は、具体的に開示された部分範囲（例えば、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６など）、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値（例えば、１、２、３、４、５および６）を有すると見なさなければならない。このことは、範囲の広さにかかわらず、適用される。
【０２５０】
本明細書中で使用される用語「方法（ｍｅｔｈｏｄ）」は、所与の課題を達成するための様式、手段、技術および手順を示し、これには、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の実施者に知られているそのような様式、手段、技術および手順、または、知られている様式、手段、技術および手順から、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の実施者によって容易に開発されるそのような様式、手段、技術および手順が含まれるが、それらに限定されない。
【０２５１】
本明細書で使用される場合、用語「治療する／処置する」には、状態の進行を取り消すこと、実質的に阻害すること、遅くすること、または、逆向きにすること、状態の臨床的症状または審美的症状を実質的に改善すること、あるいは、状態の臨床的症状または審美的症状の出現を実質的に防止することが含まれる。
【０２５２】
明確にするため別個の実施形態の文脈で説明されている本発明の特定の特徴が、単一の実施形態に組み合わせて提供されることもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施形態で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで、あるいは本発明の他の記載される実施形態において好適なように提供することもできる。種々の実施形態の文脈において記載される特定の特徴は、その実施形態がそれらの要素なしに動作不能である場合を除いては、それらの実施形態の不可欠な特徴であると見なされるべきではない。
【０２５３】
本明細書中上記に描かれるような、および、下記の請求項の節において特許請求されるような本発明の様々な実施形態および態様のそれぞれは、実験的裏付けが下記の実施例において見出される。
【実施例】
【０２５４】
次に下記の実施例が参照されるが、下記の実施例は、上記の説明と一緒に、本発明を非限定様式で例示する。
【０２５５】
本願で使用される用語と、本発明のいくつかの実施形態の非限定的な例において利用される実験方法には、分子生化学、微生物学および組み換えＤＮＡの技法が広く含まれている。これらの技術は文献に詳細に説明されている。例えば以下の諸文献を参照されたい：「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、米国メリーランド州バルチモア（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、米国ニューヨーク（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ、米国ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎら編「Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ」１〜４巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨーク（１９９８）；米国特許の第４６６６８２８号、同第４６８３２０２号、同第４８０１５３１号、同第５１９２６５９号および同第５２７２０５７号に記載される方法；「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；「Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ−Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９４），第三版；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓら編「Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ、米国コネティカット州ノーウォーク（１９９４）；ＭｉｓｈｅｌｌとＳｈｉｉｇｉ編「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、米国ニューヨーク（１９８０）；利用可能な免疫アッセイ法は、特許と科学文献に広範囲にわたって記載されており、例えば：米国特許の第３７９１９３２号、同第３８３９１５３号、同第３８５０７５２号、同第３８５０５７８号、同第３８５３９８７号、同第３８６７５１７号、同第３８７９２６２号、同第３９０１６５４号、同第３９３５０７４号、同第３９８４５３３号、同第３９９６３４５号、同第４０３４０７４号、同第４０９８８７６号、同第４８７９２１９号、同第５０１１７７１号および同第５２８１５２１号；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編（１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編（１９８５）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編（１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編（１９８６）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９８６）；「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．（１９８４）および「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ」ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；これらの文献の全ては、あたかも本願に完全に記載されているように援用するものである。その他の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。それらの文献に記載の方法は当業技術界で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。それらの文献に含まれるすべての情報は本願に援用するものである。
【０２５６】
実施例１
神経栄養因子を分泌する間葉系幹細胞（ＭＳＣ−ＮＴＦ）の作製
非限定的な本実施例において、神経栄養因子を分泌する臨床規格の間葉系骨髄間質細胞（ＭＳＣ−ＮＴＦ）のための製造プロセスは下記の主要な工程を伴う：
１．骨髄吸引（ＢＭＡ）
２．単核細胞（ＭＮＣ）の分離
３．多分化能の間葉系間質細胞（ＭＳＣ）の濃縮および増殖
４．ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞への分化の誘導
５．最終生成物の採取
６．生成物の包装およびラベル表示
７．移植のための生成物の使用許可
【０２５７】
ＭＳＣ−ＮＴＦ分泌細胞への分化が継代２〜継代６の間で誘導される場合がある。
【０２５８】
骨髄吸引（ＢＭＡ）：新鮮な骨髄を、麻酔医による局所麻酔および鎮静のもと、患者の腸骨稜から当医療センターの常法手順に従って吸引した。骨髄（３０〜６０ｍｌ）を、吸引針を使用してヘパリン含有チューブの中に吸引した。骨髄吸引手順に先立って、ＨＢＶ、ＨＣＶおよびＨＩＶについての陰性試験結果を報告する記録が作成される。
【０２５９】
ＭＮＣの分離およびＭＳＣの濃縮：製造プロセスの最初の工程は、単核細胞（ＭＮＣ）を骨髄全体から分離することを伴う。ヒト多分化能間葉系間質細胞（ＭＳＣ）（これらは骨髄ＭＮＣ全体の０．０１％を構成すると見積もられる）が、これらの細胞はプラスチックに接着することができることに基づいてＭＮＣからインビトロ濃縮される。
【０２６０】
骨髄吸引物をハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）において１：１（ｖ：ｖ）で希釈し、ＭＮＣをＦｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離によって骨髄細胞全体から分離した。
【０２６１】
ＭＮＣを計数し、細胞数および生存性をトリパンブルー色素排除試験によって求めた。密度勾配遠心分離後に回収されるＭＮＣの収量がドナー間で変化した。また、ＭＮＣの収量が、収集された骨髄の体積に依存している。ＡＬＳ患者の３０ｍｌ〜５０ｍｌの骨髄吸引物から回収されるＭＮＣの収量は７０×１０６個〜４００×１０６個のＭＮＣの間で変化し、かつ、製造プロセス全体のために必要である数のＭＳＣを単離するためには十分であった。
【０２６２】
初代骨髄単核細胞を播種し、製造プロセスの期間中を通してＭＳＣを増殖させるために使用される培地を、血小板成長培地（ＰＭ）と称した。ＰＭ培地がＭＳＣ製造プロセスの期間中を通して使用され（継代０〜継代６）［Ｐ０〜Ｐ６］、ＰＭ培地は、低グルコースＤＭＥＭ、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、ヘパリンおよび血小板溶解物を含有した。
【０２６３】
ＭＮＣをＰＭ／フラスコにおけるフラスコ中１０００００細胞／ｃｍ２〜４０００００細胞／ｃｍ２の密度で播種し、３７℃／５％ＣＯ２の加湿インキュベータにおいて一晩インキュベーションした。翌日、細胞培養物を顕微鏡で調べた。この段階で、非接着性の単核細胞が培養上清に浮遊しており、プラスチック接着性のＭＳＣがフラスコ表面に付着していた。非接着性の単核細胞を含有する培養上清を除き、接着性細胞をＤＭＥＭにより穏やかに洗浄した。ＤＭＥＭを捨て、新鮮なＰＭを、プラスチック接着性のＭＳＣ細胞を含有するそれぞれのフラスコに加えた。ＭＮＣ播種からＭＳＣ採取までのプロセス相を継代０（Ｐ０）と称した。
【０２６４】
Ｐ０細胞を３７℃／５％ＣＯ２の加湿インキュベータにおいてインキュベーションし、ＰＭを、培養物がサブコンフルエンスになるまで週に二回、新鮮なＰＭと取り換えた。
【０２６５】
継代１を採取したとき、ＭＳＣ細胞集団を、ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５の細胞表面での発現（９５％超の陽性）によってフローサイトメトリーによって特徴づけた。細胞集団の純度を確認するために、かつ、造血細胞の混入の存在を排除するために、これらの細胞は、フローサイトメトリーによって求められる場合、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５およびＨＬＡ−ＤＲの発現を欠いているべきである（２％未満の陽性）。
【０２６６】
ＭＳＣの増殖：ＭＳＣの初代培養物を、プラスチック基体に付着する単一細胞層としてインビトロ成長させた。利用可能な基体表面が細胞によって覆われると（コンフルエントな培養物）、成長が遅くなり、その後、停止した。したがって、細胞が健康かつ活発に成長することを保つために、培養物がサブコンフルエンスになったときには、細胞を定期的な間隔で継代培養することが必要であった。それぞれの継代培養サイクルが継代と称される。培養物は、最大で継代６まで継代培養される場合がある。ＭＳＣ培養物を、製造プロセスの期間中を通して注意深い顕微鏡検査によって継続してモニターし、かつ、ＭＳＣのプラスチック接着性および特徴的な形態学的外観についてモニターした。
【０２６７】
ＭＳＣ培養物を５００細胞／ｃｍ２〜２０００細胞／ｃｍ２の密度で継代した。
【０２６８】
ＭＳＣを継代するために、培養上清をフラスコから除き、トリプシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をそれぞれのフラスコに加えた。フラスコを３７℃で数分間インキュベーションし、得られた細胞懸濁物をフラスコから遠心分離チューブに集め、そして、トリプシンを希釈し、残留する細胞を集めるために、ＤＭＥＭをそれぞれのフラスコに加えた。
【０２６９】
細胞懸濁物を遠心分離し、ＰＭに再懸濁し、計数し、新しい培養容器において５００細胞／ｃｍ２〜２０００細胞／ｃｍ２の密度で再播種した。その後、培養物を３７℃／５％ＣＯ２の加湿インキュベータにおいてインキュベーションした。
【０２７０】
それぞれの継代の過程において、ＰＭを、培養上清のすべてを取り除き、それを同じ体積の新鮮なＰＭと取り換えることによって３日後〜４日毎に取り換えた。
【０２７１】
分化の誘導：継代２（しかし、遅くとも継代６）で開始して、培養物が十分な数の細胞を含有することが見積もられると、ＭＳＣを採取し、ＮＴＦ分泌細胞（ＭＳＣ−ＮＴＦ）への分化を誘導するために再播種した。
【０２７２】
ＭＳＣを、６０００細胞／ｃｍ２〜８０００細胞／ｃｍ２にわたる濃度でＰＭにおける分化の誘導のために播種した。３日後、分化を、ＰＭを、１ｍＭのジブチリル環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）、２０ｎｇ／ｍｌのヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｈｂＦＧＦ）、５ｎｇ／ｍｌのヒト血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ−ＡＡ）および５０ｎｇ／ｍｌのヒトヘレグリンβ１が補充された低グルコースＤＭＥＭを含有する分化培地（Ｓ２Ｍ）と取り換えることによって誘導した。培養物を、採取するまでの３日間、分化培地において維持した。
【０２７３】
分化終了の１日前に、培養上清を、ＧＤＮＦおよびＢＤＮＦの分泌をＥＬＩＳＡまたはＨＰＬＣによって分析するためにサンプル採取し、細胞を細胞表面マーカーの分析のために採取した。
【０２７４】
移植のための最終生成物の採取：分化プロセスが終了したとき、ＮＴＦ分泌細胞（ＭＳＣ−ＮＴＦ）を移植のために採取した。ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞をＤＭＥＭにおいて洗浄し、細胞数および生存性を求めた。８０％超の細胞生存性をもたらす培養物のみを移植のために使用許可とした。細胞をＩＭ移植のための１０×１０６細胞／ｍｌのＤＭＥＭ中濃度で再懸濁し、また、２２．５×１０６個〜３０×１０６個の濃度で再懸濁した（注入のための体積は一定であるので、最終的な細胞濃度は患者重量に基づく）。
【０２７５】
分化プロセスが終了したとき、培養上清を集め、ＮＴＦ（ＧＤＮＦおよびＢＤＮＦ）の分泌のためにサンプル採取した。
【０２７６】
最終生成物の安定性：培地または塩溶液におけるＭＳＣ−ＮＴＦ最終生成物の安定性を２つの細胞濃度、すなわち、１０×１０６細胞／ｍｌ（ＩＭ移植のために使用される細胞濃度）および３５×１０６細胞／ｍｌ（ＩＴ移植のために予想される最大細胞濃度）において採取後７時間までにわたって２℃〜８℃で評価した。細胞を、５０ｍｌのチューブにおいて５時間、２℃〜８℃でインキュベーションし、その後、同じ温度でさらに２時間、１ｍｌおよび５ｍｌのシリンジにそれぞれ移した。結果は、両方の濃度における細胞の数が合計で７時間にわたって安定していたこと、そして、８０％〜１００％の範囲にあることを示している（図１Ａ〜図１Ｂ）。
【０２７７】
生成物の包装およびラベル表示
それぞれの処置用包装物が、神経栄養因子を分泌する新しく採取された自己の培養された間葉系骨髄間質細胞（ＭＳＣ−ＮＴＦ）を臨床研究プロトコルにおける適切な投与経路のために規定された用量にしたがって含有する注入準備のできたシリンジ（１つまたは複数）からなる。
【０２７８】
最も重要なラベルが、個別シリンジケースで包装されるであろうそれぞれのシリンジに添付されるであろう。副次的なラベルがシリンジケースまたは仕切りトレーに添付され、移植のために医師に伝えられるであろう。
【０２７９】
移植の１日前に採取されたＭＳＣ−ＮＴＦ細胞を、同じ患者のＭＳＣの発現と比較して、細胞表面におけるＣＤ４４およびＣＤ７３の発現についてフローサイトメトリーによって分析した。加えて、ＭＳＣ−ＮＴＦを、分泌された神経栄養因子（ＧＤＮＦおよびＢＤＮＦ）についてＥＬＩＳＡによって分析した。このアッセイを、移植当日に採取された培養上清に対して繰り返した。
【０２８０】
無菌性試験が、移植の３日前に、プールされた培養上清に対して行われる。マイコプラズマ培養およびｎＰＣＲ試験が、分化終了の１日前または２日前に無作為に採取されたフラスコから行われる。エンドトキシン試験およびグラム染色試験を移植当日に最終生成物に対して行った。
【０２８１】
ＭＳＣ−ＮＴＦの選択を本明細書中下記の表１における判断基準に従って行った。
2018138044.tif 000007
【０２８２】
結果
ＡＬＳ患者のＭＳＣの単離および増殖：ＡＬＳ患者の骨髄から分離される単核細胞の収量が患者間で変化し、７０×１０６細胞〜４００×１０６細胞の範囲であった。ＡＬＳ患者の単核細胞から濃縮されるＭＳＣの数もまた、５×１０６個〜１５０×１０６個の範囲で一定しなかった。
【０２８３】
ＡＬＳ患者のＭＳＣを成長させ、合計で６０日間までの期間、最大で７回に及ぶ継代（３２回の集団倍加）にわたって継代した（図２）。平均集団倍加時間が０．５日であった。ＭＳＣ細胞数における患者間の変動性にもかかわらず、細胞増殖プロセスは一貫しており、再現性があった（図２）。
【０２８４】
ＭＳＣの表現型特徴づけ：ＡＬＳ患者のＭＳＣ細胞を表面抗原発現のフローサイトメトリー分析によって特徴づけた。ＡＬＳ患者のＭＳＣは、本明細書中下記の表２に例示されるように、フローサイトメトリーによって求められる場合、ＣＤ１０５、ＣＤ７３およびＣＤ９０を細胞表面に発現すること（９５％を超える陽性）、ならびに、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５およびＨＬＡ−ＤＲの発現を欠くこと（２％未満の陽性）（このことから、造血細胞混入の存在が除外される）が見出された。
2018138044.tif 000008
【０２８５】
さらなる特徴づけ：三血球系分化、形態学的分析および細胞遺伝学的分析：ＭＳＣ細胞の同一性を確認するために、製造プロセスの開発の期間中に、ＭＳＣは、脂肪細胞系譜、骨細胞系譜および軟骨細胞系譜への分化を受けることが示された（図３）。骨芽細胞の形成が、ＭＳＣを、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）、アスコルビン酸、グリセロリン酸と一緒に培養することによって誘導され、オステオカルシン抗体を使用して評価された。脂肪細胞が、ＭＳＣを、ヒドロコルチゾン、イソブチルメチルキサンチンおよびインドメタシンが９５％エタノールにおいて補充された基礎培地で培養することによって誘導され、細胞質におけるオイルレッドＯ染色された中性脂質の存在によって特定された。ＭＳＣの軟骨細胞形成が、デキサメタゾン、アスコルビン酸−リン酸、プロリン、ピルビン酸およびＴＧＦ−β３において誘導され、アルシアンブルー染色された硫酸化プロテオグリカンの分泌およびＤａｐｉ対比染色によって決定された（図３Ａ〜図３Ｉ）。細胞遺伝学的分析を、５回の継代の後における染色体安定性および正常な核型を確認するためにＡＬＳ患者のＭＳＣに対して行った。少なくとも１４個の分裂中期細胞をそれぞれの展開サンプルにおいて分析した。トリソミー、４倍体または染色体再配置が、図４Ａ〜図４Ｂに示されるように、全く認められなかった。
【０２８６】
図５Ａ〜図５Ｆに例示されるように、凍結保存は、脂肪細胞系譜、骨細胞系譜および軟骨細胞系譜に分化するＡＬＳ患者のＭＳＣの能力に影響を及ぼさなかった。
【０２８７】
ＭＳＣ−ＮＴＦ分泌細胞へのＭＳＣの分化：ＮＴＦ分泌：ＭＳＣ−ＮＴＦ分泌細胞への分化を、分化培地を使用して、第Ｉ／ＩＩ相臨床研究の期間中に１２名のＡＬＳ患者におけるＭＳＣ継代３の細胞において誘導した。分化後、ＮＴＦ分泌を、ＧＤＮＦおよびＢＤＮＦのためのＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定した。第Ｉ／ＩＩ相臨床研究における１２名の異なるＡＬＳ患者のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞のＧＤＮＦおよびＢＤＮＦの分泌が図６Ａ〜図６Ｂに示される。ＧＤＮＦの分泌が、ＭＳＣと比較して、ＭＳＣ−ＮＴＦにおいて平均で２倍〜２０倍誘導されることが見出され、ＢＤＮＦの分泌が、ＭＳＣと比較して、ＭＳＣ−ＮＴＦにおいて１．５倍〜５倍誘導されることが見出された（ｎ＝１０、図６Ａ〜図６Ｂ）。比産生性におけるこれらの違いは患者間の変動性の結果である。
【０２８８】
分化終了および移植の前日、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞のＧＤＮＦ分泌が分化最終日におけるその分泌の５４±１２％であることが見出され、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞のＢＤＮＦ分泌が分化最終日におけるその分泌の６４±２１％であることが見出された。
【０２８９】
アッセイを患者のより大きいサンプルに対して繰り返した。第Ｉ／ＩＩ相臨床研究および第ＩＩａ相臨床研究における２３名の異なるＡＬＳ患者のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞のＢＤＮＦ分泌が図７に示される。ＢＤＮＦの分泌が、ＭＳＣと比較して、ＭＳＣ−ＮＴＦにおいて平均で２．２±０．７倍誘導されることが見出された（図７）。
【０２９０】
第Ｉ／ＩＩ相臨床研究および第ＩＩａ相臨床研究における２３名の異なるＡＬＳ患者のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞のＧＤＮＦ分泌が図８に示される。ＧＤＮＦの分泌が、ＭＳＣと比較して、ＭＳＣ−ＮＴＦにおいて６．６±２．４倍を超えて誘導されることが見出された（図８）。（注：ＧＤＮＦの発現がＥＬＩＳＡアッセイの検出レベルに達しなかったとき、定量化の最小限界（２３ｐｇ／ｍｌ）に等しい名目的な値が、誘導倍数の計算に備えるために与えられる。したがって、結果が、を超える（＞）として表される）。
【０２９１】
分化終了および移植の前日、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞のＢＤＮＦ分泌が分化最終日におけるその分泌の７６±２３％であることが見出され、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞のＧＤＮＦ分泌が分化最終日におけるその分泌の６６±１８％であることが見出された。
【０２９２】
ＴＮＦ−アルファ誘導タンパク質６（ＴＳＧ−６）の分泌を、ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ（米国）から得られるＥＬＩＳＡキットを使用して、ＭＳＣ培養上清およびＭＳＣ−ＮＴＦ培養上清の１３個のサンプルにおいて試験した。
【０２９３】
試験されたすべてのＭＳＣ培養上清およびＭＳＣ−ＮＴＦ培養上清がＴＳＧ−６について陰性であることが見出された。
【０２９４】
さらなるＭＳＣ−ＮＴＦ上清サンプルがインスリン増殖因子−１（ＩＧＦ−１）および神経成長因子（ＮＧＦ）について陰性であることが、ＩＧＦ−１のためのＥＬＩＳＡキット（ヒトＩＧＦ−１  ＤｕｏＳｅｔ、カタログ番号ＤＹ２９１；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）を使用してＥＬＩＳＡによって測定される場合に、見出された。
【０２９５】
ＶＥＧＦおよびＨＧＦの分泌を、ＭＳＣを本明細書中上記で記載されるようにＡＬＳ患者から分化させることによって作製されるＭＳＣ−ＮＴＦにおいて測定した。それぞれのサイトカインのためのＥＬＩＳＡアッセイが下記の通りであった（ＶＥＧＦ  ＤｕｏＳｅｔ、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ：ＤＹ２９３Ｂ、および、ＨＧＦ  ＤｕｏＳｅｔ、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ：ＤＹ２９４）。ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、２０ｎｇ／１０６細胞〜１００ｎｇ／１０６細胞の範囲における比産生性を伴って、高レベルのＶＥＧＦおよびＨＧＦを分泌することが見出された（図９および図１０）。
【０２９６】
第Ｉ／ＩＩ相臨床研究および第ＩＩａ相臨床研究における２２名の異なるＡＬＳ患者のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞のＶＥＧＦ分泌が図９に示される。ＶＥＧＦの分泌が、ＭＳＣと比較して、ＭＳＣ−ＮＴＦにおいて平均で４．１±１．４倍誘導されることが見出された（図９）。
【０２９７】
第Ｉ／ＩＩ相臨床研究および第ＩＩａ相臨床研究における１９名の異なるＡＬＳ患者のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞のＨＧＦ分泌が図１０に示される。ＨＧＦの分泌が、ＭＳＣと比較して、ＭＳＣ−ＮＴＦにおいて６．７±３．９倍誘導されることが見出された（図１０）。分化終了および移植の前日、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞のＶＥＧＦ分泌が分化最終日におけるその分泌の６９±２５％であることが見出され、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞のＨＧＦ分泌が分化最終日におけるその分泌の７９±３１％であることが見出された（ｎ＝８）。
【０２９８】
移植後の安定性：‘移植後’の、生体内におけるＡＬＳ患者のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞によるＮＴＦの分泌の安定性を評価するために、分化終了時に採取されるＭＳＣ−ＮＴＦ細胞を、‘移植後’の生体内状況を模擬するために成長培地に再播種した。
【０２９９】
３日の期間が終了したとき、細胞を採取し、ＮＴＦの分泌を、細胞が最初に採取された日（分化培地での３日後、時間‘０’）における分泌と比較した。
【０３００】
ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、成長培地における３日間の培養の後でもまた、ＮＴＦ分泌のレベルを維持することが見出された。ＡＬＳ患者の細胞を使用する４つの独立した実験において、‘移植後’３日でのＭＳＣ−ＮＴＦ細胞のＧＤＮＦおよびＢＤＮＦの比産生性が、採取時における比産生性と類似していることが見出された（図１１Ａ〜図１１Ｂ）。
【０３０１】
ＭＳＣ−ＮＴＦ分泌細胞の表現型特徴づけ：ＭＳＣ−ＮＴＦ分泌細胞の表現型特徴づけでは、分化終了時（３日目）において、ＭＳＣ−ＮＴＦ分泌細胞はＭＳＣに特徴的なすべての表面マーカーを発現し、かつ、ＭＳＣ陰性マーカーのどれも発現しないことが示された（図１２Ａ〜図１２Ｂ）。
【０３０２】
それにもかかわらず、ＭＳＣに特徴的な表面マーカーのいくつかがＭＳＣ−ＮＴＦ細胞への分化の期間中にダウンレギュレーションされた。ＭＳＣ表面マーカーのダウンレギュレーションが、骨形成系譜、軟骨形成系譜および脂肪生成系譜に沿った分化について以前に示されている（Ｊｅｏｎｇ  ＪＡ他、２００７；Ｌｅｅ  ＨＪ他、２００９；Ｎｉｅｈａｇｅ  Ｃ他、２０１１；Ｌｉｕ  Ｆ他、２００８）。ＣＤ４４およびＣＤ７３、すなわち、特徴的なＭＳＣ表面マーカーの発現が、分化期間中にＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の表面において調節されることが見出された。ＣＤ４４の発現が、平均蛍光強度（ＭＦＩ）によって求められる場合、同じ日に、かつ、フローサイトメーターの同一装置状況のもとでフローサイトメトリーによって分析されるＭＳＣにおけるその発現と比較して、分化プロセス終了時（３日目）のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞において５９％にダウンレギュレーションされることが見出された（図１３Ａ〜図１３Ｂおよび表５）。同じ実験手法を使用した場合、ＣＤ４４の発現が、ＭＳＣと比較して、ＭＳＣ−ＮＴＦにおいてダウンレギュレーションされ、分化終了前日においてもまた同様な程度にダウンレギュレーションされることが見出された（ＭＳＣ−ＮＴＦ／ＭＳＣのＭＦＩ比が２日目において０．６７である；表３）。ＭＦＩによって求められるように、ＣＤ７３の発現が、ＭＳＣにおけるその発現と比較して、分化プロセス終了時（３日目）のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞において８０％アップレギュレーションされることが見出された（図１３Ａ〜図１３Ｂおよび表３）。ＣＤ７３の発現が、分化終了前日においてもまた同様な程度にＭＳＣ−ＮＴＦにおいてアップレギュレーションされることが見出された（７６％、２日目、表３）。したがって、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の表面におけるＣＤ４４およびＣＤ７３の調節された発現は、同じ日に、かつ、同じ実験条件のもとで分析される同じ患者のＭＳＣ細胞におけるそれらの発現と比較した場合、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の明確な特徴である。
【０３０３】
この発現パターンが、ほぼ同じ程度にではあるが（表３）、（移植当日での）分化終了時（３日目）、同様にまた、分化終了前日（２日目、表３）の両方において、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞に特徴的であり、このことは、これらの表面マーカーが、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞を移植のために特定することのために使用されることを可能にする。
【０３０４】
本明細書中下記の表３では、ＭＳＣと比較して、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞表面における表面マーカー発現の調節がまとめられる。
2018138044.tif 000009
【０３０５】
ＣＤ１０５の発現が、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞へのＭＳＣの分化の期間中、異なるパターンに従った。２日目において、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の９５．８±４．２％（平均±標準偏差）がＣＤ１０５を発現し、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞のＭＦＩが、ＭＳＣと比較して、平均して１．３６±０．２６（平均±標準偏差）にアップレギュレーションされた。分化の３日目には、同じ日に、かつ、同一状況のフローサイトメーターのもとでフローサイトメトリーによって分析されるＭＳＣにおけるその発現と比較して、ＭＳＣ−ＮＴＦの７３．６±１３．８％（平均±標準偏差）のみがＣＤ１０５を発現し、一方、陽性細胞のＭＦＩが平均して０．５０±０．２２（平均±標準偏差）に低下した（図１４Ａ〜図１４Ｂ）。
【０３０６】
本明細書中下記の表４では、ＭＳＣと比較して、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞表面におけるさらなる表面マーカーの発現がまとめられる。
2018138044.tif 000010
【０３０７】
細胞周期分析：ＡＬＳ患者のＭＳＣ−ＮＴＦ分泌細胞の細胞周期分布をフローサイトメトリーによって分析し、同じ患者のＭＳＣの細胞周期分布と比較した。ＭＳＣ−ＮＴＦ分泌細胞は、細胞周期循環の集団に特徴的な分布を呈示するＭＳＣと比較して、分化最終日（３日目）（図１５Ａ〜図１５Ｂ）において、同様にまた、分化終了前日（２日目、表５）において細胞周期のＧ０／Ｇ１期で停止されることが見出された。これらの結果は、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞が細胞周期循環の細胞集団でないことを示している。
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【０３０８】
実施例２
神経栄養因子を分泌する間葉系幹細胞（ＭＳＣ−ＮＴＦ）のｍｉＲＮＡ分析
本研究の目的は、ミクロＲＮＡに基づく（ｍｉＲＮＡ）フィンガープリンティングを行って、４つの独立する一致ドナーサンプルの骨髄由来ＭＳＣおよびＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の特徴づけを、ｍｉＲＮＡ発現プロフィルの間における相違点および類似点を特定すること、ならびに、これら２つの細胞タイプの間における相違点を明確にし、かつ、それらがどのように表されるか（すなわち、神経／星状膠細胞の分化経路、同様にまた、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦおよびＶＥＧＦの発現およびシグナル伝達）を決定する主要なｍｉＲＮＡを特定することによって行うことである。
【０３０９】
本研究では、サンプルのすべてにわたって信頼性よく検出された合計で１６０個のｍｉＲＮＡが特定され、ｍｉＲＮＡプロファイリングを介して明白であるドナー間の変動性が比較的小さかった。また、主成分分析（ＰＣＡ）により、サンプル集合が細胞タイプに基づいて明確なクラスターを形成することが明らかにされた。
【０３１０】
これら２つの異なる細胞タイプについてのｍｉＲＮＡプロフィルの統計学的比較により、４１個の示差的に発現された（ＤＥ）主要なｍｉＲが特定された。
１９個がＭＳＣに対してＭＳＣ−ＮＴＦにおいてアップレギュレーションされた。
２２個がＭＳＣに対してＭＳＣ−ＮＴＦにおいてダウンレギュレーションされた。
【０３１１】
文脈分析により、これらの示差的に発現されたｍｉＲＮＡは、ＶＥＧＦシグナル伝達、神経形成を調節することにおける機能を有するタンパク質、および／または、神経前駆体細胞表現型に関連するタンパク質をコードするｍＲＮＡを標的とすることが明らかにされた。
【０３１２】
材料および方法
サンプル処理および品質管理：総ＲＮＡを４つの無関係なドナーサンプルの一致するＭＳＣおよびＭＳＣ−ＮＴＦの対から単離した。ＲＮＡ濃度を、サンプルの収量および純度の指標としてもまた求められる２６０／２８０ｎｍおよび２６０／２３０ｎｍにおける吸光度比（Ａｂｓ）によって求めた。すべてのサンプルについて、ＲＮＡのさらなるＱＣを、ＲＮＡ  Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  Ｎｕｍｂｅｒ（ＲＩＮ）を求めるために、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２２００  ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎおよびＳｃｒｅｅｎＴａｐｅ  Ｒ６Ｋキットを使用して行った。
【０３１３】
マイクロアレイによるプロファイリング：サンプルを、（Ａｇｉｌｅｎｔ社のＳｕｒｅＰｒｉｎｔ  Ｇ３ヒトｖ１６ミクロＲＮＡ  ８×６０Ｋマイクロアレイスライド（ｍｉＲＢａｓｅバージョン１６．０）を使用して）Ａｇｉｌｅｎｔ  ｍｉＲＮＡプラットフォームで分析した。１００ナノグラムの総ＲＮＡ（これはヌクレアーゼ非含有水における５０ｎｇ／μｌの作業用溶液に由来する）をそれぞれのマイクロアレイ実験のための投入物として使用した。それぞれのスライドが８個の個別的アレイを含有し、それぞれのアレイが１３４９個のミクロＲＮＡ（１２０５個のヒト由来（ｍｉＲｂａｓｅ１８において実際のｍｉＲＮＡとして確認される１１９９個）および１４４個のウイルス由来）を表す。
【０３１４】
マイクロアレイプロセスの４つの主要な工程が下記の通りであった：
１．ＲＮＡを単色のＣｙ３系試薬により標識すること。
２．標識されたＲＮＡサンプルのマイクロアレイへのハイブリダイゼーション。
３．洗浄工程。
４．スライド走査、データ取り込みおよび特徴抽出（アレイのスポットをｍｉＲＮＡのＩＤに対して一致させること）、ならびに、得られた画像およびデータのファイルに対する品質管理検査。
【０３１５】
データの前処理およびＱＣ：マイクロアレイのデータを、前処理およびデータ品質管理（ＱＣ）の方法を使用して正規化した。アレイの品質管理を、下記の計量学に基づく外れ値の検定を使用して行った：
・アレイあたりの平均シグナル
・アレイあたりの平均バックグラウンド
・％存在（発現がそれぞれのアレイで検出されるｍｉＲＮＡの％）
・十分に正規化されたサンプル集合のＰＣＡ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＪＥ、１９９１）から得られる主成分１〜３。
【０３１６】
加えて、サンプル間の相関分析を、ピアソンの相関計量学を使用して、正規化後のデータセットに対して行った。外れ値を、ｐ＜０．０５で判定される有意性によるグラブスの外れ値検定（Ｇｒｕｂｂｓ、１９６９）を使用して特定した。
【０３１７】
データ分析
検出コールの概要：個々のｍｉＲＮＡについての検出コール（存在または非存在）をサンプル全体にわたって比較した。検出コールを、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｆｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ（ＡＦＥ）ソフトウエア（バージョン１０．７．３．１）を使用して計算した。これらのコールがどのようにもたらされるかの詳細な記述が、Ａｇｉｌｅｎｔのウエブサイトで、Ｆｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｇｕｉｄｅにおいて入手可能である。
【０３１８】
ｍｉＲＮＡの発現がアレイについての検出レベルに達しなかったときには、名目上の強度値をこれらのデータ点に対して与えた。この値（ｌｏｇ２の目盛りでの１．１３７５、および、線形目盛りでの２．２０００）をそれぞれの検出されなかったｍｉＲＮＡに割り当て、正規化プロセスの期間中に計算し、そして、その後のデータ分析のときの計算不能な数学的操作から生じるエラーを回避するために使用した。加えて、この正規化方法論では、その結果として、非常に類似する発現強度を有するｍｉＲＮＡの様々な群に対して、同じ平均正規化強度が割り当てられた。
【０３１９】
ｍｉＲＮＡ発現データの要約的な概略可視化：発現データの要約的な描写が、ＰＣＡを使用してもたらされた。ＰＣＡにより、主要な影響が、高次元のデータ、例えば、様々なマイクロアレイ・データセット（これらはそれぞれのサンプルについて、数百個のｍｉＲＮＡからの発現測定値を有する）などから抽出される。これらの主要な影響（主成分）を、データの主要な特性を保持する簡略化されたグラフィック描写で呈示することができる。重要な点が、類似するｍｉＲＮＡプロフィルを有するサンプルがＰＣＡプロットでは同じ空間にクラスターを形成するということである。加えて、ヒートマップが、発現レベルおよびサンプル関連性を可視化するために作製された。ヒートマップに関連するクラスターを、ユークリッド距離をウォード連鎖とともに使用して凝縮型階層的クラスタリングから導いた。
【０３２０】
仮説の検証：種々のサンプル群の間における同等に発現された（ＥＥ）ｍｉＲＮＡおよび示差的に発現された（ＤＥ）ｍｉＲＮＡの特定、ならびに、ＤＥ  ｍｉＲＮＡ集合の機能的分析。同等な発現レベルを有するｍｉＲＮＡ（安定的に発現された不変マーカー）を、両側検定として、２つの片側検定（ＴＯＳＴ）の手法を使用して特定した（例えば、Ｂａｒｋｅｒ  ＬＥ他（２００２）を参照のこと）。この手法はＦＤＡによって生物学的同等性研究のために推奨される（ＦＤＡ指針書、２００１）。下限および上限からそれぞれ０．０５未満である最大値（ｐＦＤＲ）を有するｍｉＲＮＡを、同等に発現されると見なした。同等性のために許される発現レベル範囲（Δ）はｌｏｇ２空間において１．５未満の倍率変化に対応する。
【０３２１】
それぞれの細胞群の間でのｍｉＲＮＡ発現における差を、両側分散分析（ＡＮＯＶＡ）を種々の細胞群の間で行うことによって評価した。ＡＮＯＶＡから得られるｐ値を、ベンジャミニ・ホックベルグ法（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ  ＹおよびＨｏｃｈｂｅｒｇ  Ｙ、１９９５）を使用して多重検定拡大のために調節した。この値がｐＦＤＲと呼ばれる。ｐＦＤＲ＜０．０５での仮説検証からの有意差を有し、同様にまた、１．５以上の絶対倍率変化（ＦＣ）を有するｍｉＲＮＡを、特定のサンプルと、残るサンプルとの間で示差的に発現されると見なした。０．０５のｐ値カットオフが、マイクロアレイのデータを分析するときの一般的な慣行であり、また、１．５の倍率変化閾値の使用は、Ａｇｉｌｅｎｔシステムからの記録されたアレイ間の変動性に基づいている。
【０３２２】
機能的分析（文脈分析）を、示差的に発現された（ＤＥ）ｍｉＲＮＡのリストをＧｅｎｅＧｏ  ＭｅｔａＣｏｒｅＴＭ（ｖ６．１４）に読み込み、それらをそれらの確認されたｍＲＮＡ標的に対してマッピングすることによって行った。加えて、文献調査を、選択されたＤＥ  ｍｉＲＮＡについて行った。
【０３２３】
結果
８個すべてのサンプルの全体にわたって検出されるｍｉＲＮＡの完全なリストが本明細書中下記の表６に示される。
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【０３２４】
完全なサンプル集合のＰＣＡおよびヒートマップ可視化：それぞれの細胞群の中におけるドナー間の変動性およびこれらの異なる細胞群の間における関連性の概略を得るために、完全なデータセットの可視化が、１６０個すべての検出されたｍｉＲＮＡを使用してＰＣＡによってもたらされた。ＰＣＡプロットでは、プロットにおけるそれぞれの完全なミクロＲＮＡ−１データセットの情報量（変動）が主成分（ＰＣ）投影における単一の点として表される。重要な点が、類似するデータセットがまとまってクラスターを形成するということである。
【０３２５】
これを最初、初めの３つのＰＣの投影として行った（図１６Ａ）。それぞれのサンプルにおけるｍｉＲＮＡについての発現パターンおよびサンプル関連性の代替的な可視化を、凝縮型階層的クラスタリングに基づくヒートマップを使用して作製した（図１６Ｂ）。
【０３２６】
ＰＣＡおよびヒートマップ・クラスターグラムは、サンプル集合が、２つの異なったクラスターを細胞タイプに基づいて形成して明瞭に別れることを示す。
【０３２７】
示差的に発現された（ＤＥ）ｍｉＲＮＡの特定
群間における差の仮説検証を、両側ＡＮＯＶＡを使用して行い、有意性をｐＦＤＲ＜０．０５およびＦＣ≧１．５において判定した。群間におけるＤＥ  ｍｉＲＮＡの特定を本明細書中上記で記載されるように行った。
【０３２８】
２つの細胞タイプについてのｍｉＲＮＡプロフィルの統計学的比較により、４１個のＤＥ（示差的に発現された）主要なｍｉＲＮＡが特定された。
ＭＳＣに対するＭＳＣ−ＮＴＦの比較を行ったとき、１９個がアップレギュレーションされた。
ＭＳＣに対するＭＳＣ−ＮＴＦの比較を行ったとき、２２個がダウンレギュレーションされた。
ＤＥ主要ｍｉＲＮＡの発現プロフィルの要約が図１７および図１８に示される。ＭＳＣに対してＭＳＣ−ＮＴＦにおいてアップレギュレーションされる１９個の主要なｍｉＲＮＡが図１７に示され、ＭＳＣに対してＭＳＣ−ＮＴＦにおいてダウンレギュレーションされる２２個の主要なｍｉＲＮＡが図１８に示される。
【０３２９】
選択されたＤＥ  ｍｉＲＮＡの文脈分析
ｍｉＲＮＡ  ＤＥプロフィルによって影響される経路の概要をＭＳＣ−ＮＴＦについて導き出すために、選択されたＤＥ  ｋｍｉＲｓ（商標）を、ＧｅｎｅＧＯ  ＭｅｔａＣｏｒｅＴＭおよび文献調査を使用して、高い信頼度で実験的に確認されたｍＲＮＡ標的に対してマッピングした。
【０３３０】
血管形成：いくつかのＤＥ  ｍｉＲＮＡが、ＶＥＧＦシグナル伝達および／または血管形成を調節することに関与するとして特定された。ｍｉＲＮＡ−５０３が、ＭＳＣ−ＮＴＦにおける最も顕著にダウンレギュレーションされたｍｉＲＮＡであり（８．４倍）、発現が、ＭＳＣ−ＮＴＦ３、ＭＳＣ−ＮＴＦ５およびＭＳＣ−ＮＴＦ７では検出限界未満に低下した。ＭＳＣ−ＮＴＦ２のみが、非常に低いが、検出可能な発現を有した。このことが図１９に示され、図１９では、倍率変化を可視化するための助けとして、発現値が線形目盛りで変換されている。
【０３３１】
加えて、一群のあまり大きくダウンレギュレーションされなかったｍｉＲＮＡ（１．５倍〜２．０倍）もまた、ＶＥＧＦ  Ａを直接に標的とするとして（ｍｉＲ−１４５ａ、２０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３２０ａおよび４２４−５ｐ）、ＶＥＧＦＲ−２を直接に標的とするとして（４２４−５ｐ）、ＦＧＦ２を直接に標的とするものとして特定され（４２４−５ｐ）、または、抗血管形成性であるとして報告されるものとして特定された（ｍｉＲ−２２２−３ｐ）（Ｐｏｌｉｓｅｎｏ他、２００６；Ｃｈａｍｏｒｒｏ−Ｊｏｒｇａｎｅｓ他、２０１１；Ａｎａｎｄ、２０１３；Ｋｉｍ他、２０１３）。
【０３３２】
そのうえ、ｍｉＲ−１３２−３ｐが高度にアップレギュレーションされ、ＭＳＣ−ＮＴＦにおいて強く誘導された（７．９倍）。このことが図２０に示され、図２０では、再度ではあるが、倍率変化を可視化するための助けとして、発現値が線形目盛りで変換されている。
【０３３３】
ｍｉＲ−１３２−３ｐは血管形成促進性であり、ｐ１２０ＲａｓＧＡＰを阻害することを介して、ＶＥＧＦシグナル伝達の負の調節因子である。加えて、ｍｉＲ−１３２−３ｐを阻止することにより、血管形成が低下する（Ａｎａｎｄ、２０１３）。対照的に、ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ、すなわち、抗血管形成性のｍｉＲＮＡ（Ｚｈａｏ他、２０１０；Ｎａｌｌｓ他、２０１１）が両方の細胞タイプにおいて高発現し、しかし、これもまた、ＭＳＣ−ＮＴＦにおいてアップレギュレーションされる（４倍）。図１７および図２２Ｂを参照のこと。しかしながら、ｍｉＲ−３４ａ−５ｐはまた、ニューロン細胞の分化においてある一定の役割を有しており、この影響が、上記で議論される血管形成に対する潜在的な負の影響を上回って優位であるかもしれない。
【０３３４】
明らかに、ＭＳＣ−ＮＴＦにおけるＶＥＧＦシグナル伝達を伴う複雑な相互作用経路が存在する。しかしながら、結局は、このデータを一緒に用いると、とりわけ、ｍｉＲ−５０３およびｍｉＲ−１３２−３ｐの大きな調節は、ＶＥＧＦシグナル伝達が、ＭＳＣに対する比較では、ＭＳＣ−ＮＴＦにおいてアップレギュレーションされ、これにより、これらの細胞における血管形成促進能の強化を引き起こすであろうことを示唆していると考えられる。図２１を参照のこと。
【０３３５】
神経前駆体細胞（ＮＰＣ）／神経形成：いくつかのＤＥ  ｍｉＲＮＡが、ＮＰＣおよび／またはニューロンにおいて富化／アップレギュレーションされ、かつ、神経形成に関与するものとして特定された。
【０３３６】
ｍｉＲ−１３２−３ｐが高度にアップレギュレーションされ、ＭＳＣ−ＮＴＦにおいて強く誘導された（７．９倍）。図１７を参照のこと。ｍｉＲ−１３２−３ｐが、ニューロンの発達および成熟化において重要な役割を果たしており、また、その発現が樹状突起の伸長のために要求され、かつ、（インビトロおよびインビボでの）樹状突起形成を、ｐ２５０ＧＡＰ（ＲａｃおよびＣｄｃ４２の負の調節因子）を阻害することによって促進させる（Ｍａｇｉｌｌ他、２０１０）。
【０３３７】
ｍｉＲ−７６２もまた、ＭＳＣ−ＮＴＦにおいて強くアップレギュレーションされた（５．９倍）。図２２Ａを参照のこと。ｍｉＲ−７６２は、ニューロンに多く存在するｍｉＲＮＡであり、胚性幹細胞からのＮＰＣ分化の期間中にアップレギュレーションされ、重要な役割をこのプロセスにおいて果たしている（Ｚｈａｎｇ他、２０１２）。
【０３３８】
ｍｉＲ−３４ａ−５ｐが両方の細胞タイプにおいて高発現し、ＭＳＣ−ＮＴＦにおいてアップレギュレーションされる（４倍）。図２２Ｂを参照のこと。このｍｉＲＮＡが、その上昇が神経突起の伸長を促進させることが示されている骨髄ＭＳＣ由来のＮＰＣにおいてアップレギュレーションされ、このｍｉＲＮＡはニューロン分化の重要な調節因子である（Ａｇｏｓｔｉｎｉ他、２０１１；Ｃｈａｎｇ他、２０１１）。
【０３３９】
全体として、ＭＳＣ−ＮＴＦにおけるこれらのｍｉＲＮＡのアップレギュレーションは、これらの細胞が、ニューロンに向かう分化軌道を有するニューロン前駆体表現型を有することと一致している。
【０３４０】
知られている生物学的機能を何ら有しない高度に識別的なＤＥ  ｍｉＲＮＡは、候補となる代用の効力マーカーとして使用されるかもしれない：現時点で確認されているｍＲＮＡ標的を何ら有しない一組の高度に識別的なｍｉＲＮＡが、ＭＳＣ−ＮＴＦにおいてＤＥであるとして特定された（図２３Ａ〜図２３Ｅ）。これらの主要なｍｉＲは、ＭＳＣ−ＮＴＦのための、候補となる同一性／効力マーカーを表す。ｍｉＲ−３６５９については、発現レベルが４名のドナーのうちの３名において検出限界未満にダウンレギュレーションされ、ドナー２のみが、低いが、検出可能な発現を有した。
【０３４１】
実施例３
定量的ＰＣＲの妥当性確認研究
サンプル処理および品質管理：すべての総ＲＮＡサンプルをＲＮＡの濃度、収量および品質について調べた。ＲＮＡのＱＣを、ＲＩＮを求めるために、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２２００  ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎおよびＲ６Ｋ  Ｓｃｒｅｅｎ  Ｔａｐｅｓ  ａｎｄ  ＲｅａｇｅｎｔｓをＳｉｓｔｅｍｉｃ’ｓ  ＳＯＰ（ＳＳＯＰ２７）に従って使用して行った。
【０３４２】
フェーズＩで使用される８個のサンプルをＲＮＡの量および品質について事前に調べた。
【０３４３】
ｑＰＣＲプロファイリングおよびデータ分析：ｑＰＣＲを、ｍｉＲＣＵＲＹ  ＬＮＡ（商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＲＴ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ＰＣＲの方法論および試薬（Ｅｘｉｑｏｎ  Ａ／Ｓ）を取り扱いマニュアル（ｖ５．１；プロトコルＡ−個々のアッセイ）に従って使用して行った。簡単に記載すると、ｃＤＮＡを、５ｎｇ／ｕｌの開始ＲＮＡテンプレートを使用して合成した。ＬＮＡ（商標）ＲＮＡ  Ｓｐｉｋｅ−ｉｎ対照ＲＮＡをそれぞれのサンプルに加えた。候補ｍｉＲＮＡ（ｋｍｉＲ（商標））の発現レベルを、ｍｉＲＮＡ特異的プライマー組を使用して、目的とするすべてのサンプルについて技術的な三連で測定した。
【０３４４】
陽性対照（これはＬＮＡ（商標）ＲＮＡ−Ｓｐｉｋｅ−ｉｎ対照を測定する）ならびに‘ＲＮＡテンプレートなし’および‘逆転写酵素なし（ＲＴなし）’の陰性対照が、試験されたサンプルのそれぞれのために含まれた。陰性の‘ｃＤＮＡテンプレートなし’対照が、試験されたｍｉＲＮＡのそれぞれのために含まれた。
【０３４５】
ｑＰＣＲを、ＬＣ４８０  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ  Ｌｔｄ）を使用して行い、計量サイクル（Ｃｑ）値を、二次微分極大法を使用して絶対的定量化分析を行うことによって計算した。
【０３４６】
標準曲線および効率推定：ｍｉＲＮＡ増幅プロセスの効率および直線性を、標準曲線手法を使用して必要な場合には評価した（特注および実験的に確認されていないプライマーのみ）。８個のＭＳＣ−ＮＴＦサンプルからプールされるｃＤＮＡの連続希釈物を技術的な三連でｈｓａ−ｍｉＲ−７６２およびｈｓａ−ｍｉＲ−３６６３−３について処理した。得られたＣｑ値をＢｉｏｇａｚｅｌｌｅ  ｇｂａｓｅ＋（バージョン２．５）（Ｈｅｌｌｅｍａｎｓ  Ｊ他、２００７）に取り込んで、標準曲線を作成し、効率値を計算した。
【０３４７】
最適なｍｉＲＮＡ正規化パネルの選択：候補となる不変ｍｉＲＮＡの発現レベルを８個すべてのサンプルについて技術的な三連で測定した（フェーズＩ）。得られたＣｑ値をＢｉｏｇａｚｅｌｌｅ  ｇｂａｓｅ＋（バージョン２．５）に取り込んだ。不変マーカーの最も安定なサブセットの選択（正規化群の最適な数およびそれらの同一性）を、ｑｂａｓｅ＋において実行されるように、ＧｅＮｏｒｍアルゴリズム［Ｖａｎｄｅｓｏｍｐｅｌｅ  Ｊ他、２００２］を使用して行った。不変遺伝子の１つのサブセットが、それらのＧｅＮｏｒｍ発現安定性値の幾何平均（Ｍ値）が０．５未満であり、増大する数の遺伝子を含有する２つの逐次正規化因子の間における対となる変化（Ｖ値）が０．１５未満であり、かつ、変動係数（Ｃｖ）が０．２５未満であるならば、最適かつ安定的であり、したがって、正規化のために好適であると見なされた。その後、それぞれのサンプルについての正規化因子をこのサンプルにおける選ばれた正規化群の発現の幾何平均として計算した。
【０３４８】
データの前処理：ｍｉＲＮＡの発現レベルをすべてのサンプルについて技術的な三連で測定した。得られたＣｑ値をＢｉｏｇａｚｅｌｌｅ’ｓ  ｑｂａｓｅ＋（ｖ２．５）に取り込んだ。Ｃｑ値が、適用可能な場合には、Ｐｆａｆｆｌ法［Ｐｆａｆｆｌ  ＭＷ、２００１］を使用して増幅効率における差について補正し、サンプル特異的な正規化因子を使用して正規化した［Ｈｅｌｌｅｍａｎｓ  Ｊ他、２００７］。技術的な複製物を平均化し、正規化された相対的量（ＮＲＱ）を、選択された不変ｍｉＲＮＡの幾何平均に対する平均Ｃｑ値の比（正規化因子）を計算することによってそれぞれのｍｉＲＮＡおよびサンプルについて求めた［Ｈｅｌｌｅｍａｎｓ  Ｊ他、２００７］。
【０３４９】
統計学的分析：サンプル群間でのｍｉＲＮＡの発現レベルにおける差を、両側ｔ検定を使用して形式的に検定した。差は、ｔ検定のｐ値が０．０５未満であったならば、有意であると見なした。
【０３５０】
分析されたｍｉＲＮＡのリスト：
ｈｓａ−ｍｉＲ−２２−３ｐ；ｍｉＲ−１９ｂ−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−５０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐおよびｈｓａ−ｍｉＲ−１３２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０ａおよびｍｉＲ−２２２−３ｐ。
【０３５１】
結果
ｈｓａ−ｍｉＲ−２２−３ｐおよびｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ−３ｐの発現レベルがＭＳＣおよびＭＳＣ−ＮＴＦにおいて同一であることが見出された。図２４Ａは、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０３−５ｐが、ＭＳＣと比較して、ＭＳＣ−ＮＴＦにおいてダウンレギュレーションされることを例示する。図２４Ｂは、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０ｂが、ＭＳＣと比較して、ＭＳＣ−ＮＴＦにおいてダウンレギュレーションされることを例示する。図２４Ｃは、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２４−５ｐが、ＭＳＣと比較して、ＭＳＣ−ＮＴＦにおいてダウンレギュレーションされることを例示する。図２４Ｄは、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐが、ＭＳＣと比較して、ＭＳＣ−ＮＴＦにおいてアップレギュレーションされることを例示する。図２４Ｅは、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３２−３ｐが、ＭＳＣと比較して、ＭＳＣ−ＮＴＦにおいてアップレギュレーションされることを例示する。図２４Ｆは、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０ａが、ＭＳＣと比較して、ＭＳＣ−ＮＴＦにおいて有意にダウンレギュレーションされないことを例示する。図２４Ｇは、ｍｉＲ−２２２−３ｐが、ＭＳＣと比較して、ＭＳＣ−ＮＴＦにおいて有意にダウンレギュレーションされないことを例示する。
【０３５２】
実施例４
神経栄養因子を分泌する間葉系幹細胞（ＭＳＣ−ＮＴＦ）のタンパク質分析
材料および方法
タンパク質分解：タンパク質を、９Ｍの尿素、４００ｍＭの重炭酸アンモニウムおよび１０ｍＭのＤＴＴ、ならびに、２サイクルの超音波処理において細胞ペレットから抽出した。それぞれのサンプルから得られる２０μｇのタンパク質を２．８ｍＭのＤＴＴにより還元し（６０℃で３０分間）、４００ｍＭの重炭酸アンモニウムにおいて８．８ｍＭのヨードアセトアミドにより修飾し（暗所において室温で３０分間）、１：５０の酵素対基質比での修飾トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）により、３７℃で一晩、２Ｍの尿素、２５ｍＭの重炭酸アンモニウムにおいて消化した。さらに２回目のトリプシン処理を４時間行った。
【０３５３】
質量分析法による分析：トリプシン消化ペプチドを、Ｃ１８チップ（Ｈａｒｖａｒｄ）を使用して脱塩し、乾燥し、０．１％のギ酸に再懸濁した。
【０３５４】
ペプチドを、Ｒｅｐｒｏｓｉｌ逆相材（Ｄｒ  Ｍａｉｓｃｈ  ＧｍｂＨ、ドイツ）が充填される０．０７５×１８０ｍｍの石英ガラスキャピラリー（Ｊ＆Ｗ）での逆相クロマトグラフィーによって分離した。ペプチドを、０．１５μｌ／分の流速で、水に０．１％のギ酸を含む５％アセトニトリルから２８％アセトニトリルへの１８０分間の直線勾配、２８％アセトニトリルから９５％アセトニトリルへの５分間の勾配、および、９５％アセトニトリルにおける２５分間により溶出した。質量分析を、全体的なＭＳ走査、その後、最初のＭＳ走査から選択される１０個の最も優勢なイオンの衝突誘起解離（ＣＩＤ）を繰り返し使用して正モードでのＱ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ）によって行った。
【０３５５】
３つの生物学的反復物から得られる質量分析データを、１％のＦＤＲによりＵｎｉｐｒｏｔデータベースのヒト部分に対してＭａｘＱｕａｎｔソフトウエア１．３．０．５（Ｍａｔｈｉａｓ  Ｍａｎｎ’ｓ  ｇｒｏｕｐ）を使用して分析した。データを、同じソフトウエアを使用して無標識分析によって定量化した。強度データを、名目的な分布を得るためにｌｏｇ２変換した。欠けているデータを１０で置き換えた。
【０３５６】
Ａ群とＢ群との間における並び替えに基づくＦＤＲによるｔ検定（２５０のランダム化、閾値＝０．０５）を、Ｐｒｅｓｅｕｓｅ  １．３．０．４を使用して行った。同じソフトウエアをさらなる注釈およびデータ相関のために使用した。
【０３５７】
結果
３６２２個のタンパク質が、少なくとも２つのペプチドによる研究で特定された。高い類似性がサンプル間に存在するにもかかわらず、強度プロフィル間における相関により、同じ群のサンプルの間におけるより高い相関が示される。
【０３５８】
本明細書中下記の表７および表８には、最も示差的に発現されたタンパク質が列挙される。（３を超えるか、または−３未満である差に関して０．０５未満のｐ値、および、少なくとも２回の反復における少なくとも２つの特定されたペプチド）。負の値を１０で置き換えた。Ａ＝ＭＳＣ；Ｂ＝分化ＭＳＣ。
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【０３５９】
実施例５
神経栄養因子を分泌する自己の培養された間葉系骨髄間質細胞（ＭＳＣ−ＮＴＦ）の移植の安全性、耐容性および治療効果を評価するための、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）患者における第Ｉ／ＩＩ相非盲検臨床研究
研究目的：神経栄養因子を分泌する自己の培養された間葉系骨髄間質細胞（ＭＳＣ−ＮＴＦ）の注入の安全性、耐容性および治療効果（予備的効力）を、初期疾患段階および進行性疾患段階の筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）患者のための処置として評価すること。
【０３６０】
主要評価項目：１．初期疾患状態のＡＬＳ患者に対する合計で約２４×１０６個の細胞による二頭筋および三頭筋における２４箇所の別個の部位での多数の筋肉内注入（ＩＭ）による、神経栄養因子を分泌する自己の培養された間葉系骨髄間質細胞（ＭＳＣ−ＮＴＦ）の１回だけの処置施与の安全性評価および耐容性。
２．進行性疾患状態のＡＬＳ患者に対する合計で約６０×１０６個の、神経栄養因子を分泌する自己の培養された間葉系骨髄間質細胞（ＭＳＣ−ＮＴＦ）の脳脊髄液（ＣＳＦ）内への１回だけのクモ膜下注入（ＩＴ）の安全性評価および耐容性。
【０３６１】
副次的評価項目：
・ＡＬＳ機能評価尺度（ＡＬＳ−ＦＲＳ−Ｓ）における変化。
・筋チャートによる、また、必要な場合には握ることによる筋力判定（ＭＶＩＣ）における変化。
・努力肺活量における変化（ＦＶＣ％）（進行性疾患状態群のみにおいて）。
・上肢および下肢のＭＲＩによって推定される筋肉量における変化。
・上肢および下肢の周囲（ｃｍ）における変化。
・ＥＭＧパラメータにおける変化。
・気管切開または永続的な補助換気に至る必要性および至るまでの時間。
・全生存期間、これにより死亡までの時間を計算する。
【０３６２】
対象者の数：合計で１２名の対象者−ＡＬＳの初期段階における６名、および、ＡＬＳの進行性疾患段階における６名。
【０３６３】
研究設計：これは、神経栄養因子を分泌する自己の培養された間葉系骨髄間質細胞（ＭＳＣ−ＮＴＦ）の安全性、耐容性および予備的効力を、初期疾患段階および進行性疾患段階の筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）患者のための効力のある処置として評価するための第Ｉ／ＩＩ相の前向き非盲検の２患者群臨床研究である。本研究は単一拠点での試験である。
【０３６４】
登録されるすべての患者が研究登録前にＡＬＳ疾患の記録された病歴を有するであろう。６ヶ月未満の継続期間により初期段階のＡＬＳ疾患として診断される患者、および、６ヶ月〜１２ヶ月の継続期間により進行性段階のＡＬＳ疾患と診断される患者。「素因を有する」として特定されるＡＬＳ患者が打診され、インフォームドコンセント用紙（ＩＣＦ）に署名するように要請されるであろう。全体として、１２名の患者が募集され、患者のＡＬＳ疾患重篤度に基づいて下記の２つの処置群に割り当てられるであろう：
Ａ群−初期ＡＬＳ疾患段階の６名の患者
Ｂ群−進行性ＡＬＳ疾患の６名の患者
【０３６５】
この研究への登録に先立つ患者スクリーニング期間の予想された継続期間は２回目の通院時における研究登録日の２週間前から２日前までの間である（臨床検査室での結果を含む参加基準／除外基準に一致することの確認）。適格患者が研究に登録されるであろうし、かつ、疾患の進行速度を決定するための３ヶ月の「導入期間」（これは±５日の時間窓をすべての通院のために可能にする）の間において２週間毎に観察されるであろう。登録後約６週間の後での「導入期間」の間に、両方の研究群の患者が骨髄吸引（ＭＢＡ）手順を受けるであろうし、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞が、現時点で開示された方法に基づいて骨髄吸引物から製造されるであろう。「導入期間」での最後の通院のとき、両方の研究群の患者は処置を受けるであろうし、ＭＳＣ−ＮＴＦが初期ＡＬＳ患者および進行性ＡＬＳ患者へのＩＭ注入またはＩＴ注入によってそれぞれ移植されるであろう。
【０３６６】
ＭＳＣ−ＮＴＦ移植後、患者は、（±５日の時間窓をすべての通院のために可能にする）６ヶ月の処置後追跡調査期間にわたって毎月、観察されるであろう。処置の安全性、有害事象および調査パラメータが、疾患のＡＬＳ進行速度評価を確定させるために、「導入期間」の継続期間および処置後追跡調査期間の全体を通して記録されるであろう。
【０３６７】
研究期間：全体として、研究プロトコルのもとでは、それぞれの患者が約９ヶ月の研究期間の間に合計で１３回通院するであろう。
【０３６８】
処置用量：本明細書中下記の表９に詳述される通り。
2018138044.tif 000028
【０３６９】
結果
ＩＭ投与またはＩＴ投与のどちらかによるＭＳＣ−ＮＴＦ処置は、６回の毎月の追跡調査通院の期間中において安全であり、十分に許容された。処置に関連した著しい有害事象が、どちらの投与経路によってでも１２名の処置された患者において何ら認められなかった。６名中２名の患者が紫斑および発熱をＩＭ投与後に経験し、６名中３名の患者が、頭痛、頸部硬直および発熱をＩＴ投与後に経験した。
【０３７０】
図２５に例示されるように、ＩＴ処置の患者についてのＡＬＳ機能評価スコア（ＡＬＳＦＲＳ−Ｒ）が、処置前よりも処置後において、より穏やかな月間低下速度を示した：傾きが、３ヶ月間にわたる−１．５から、６ヶ月間にわたる０．０８に改善した。
【０３７１】
図２６に例示されるように、ＩＴ処置の患者についての努力肺活量（ＦＶＣ）が、処置前よりも処置後において、より穏やかな月間低下速度を示した：傾きが、３ヶ月間にわたる−０．１０７から、６ヶ月間にわたる−０．０６に改善した。
【０３７２】
図２７に例示されるように、筋肉周囲もまた、同じように正の傾向を示した。これらの違いは、おそらくは患者数が少ないために、統計学的有意性に達しなかった。
【０３７３】
実施例６
神経栄養因子を分泌する自己の培養された間葉系骨髄間質細胞（ＭＳＣ−ＮＴＦ）の移植の安全性、耐容性および治療効果を評価するための、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）患者における第ＩＩａ相非盲検用量漸増臨床研究
研究目的：研究目的は、神経栄養因子を分泌する自己の培養された間葉系骨髄間質細胞（ＭＳＣ−ＮＴＦ）の漸増する用量のクモ膜下腔内および筋肉内に同時に施される注入の安全性、耐容性および治療効果（予備的効力）を、初期疾患段階の筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）患者のための処置として評価することである。
【０３７４】
主要評価項目：初期疾患状態のＡＬＳ患者に対する脳脊髄液（ＣＳＦ）内への１回だけのクモ膜下注入（ＩＴ）に加えて、二頭筋および三頭筋における２４箇所の別個の部位での多数の筋肉内注入（ＩＭ）によって、漸増する低用量、中間用量および高用量（それぞれ、９４×１０６個、１４１×１０６個および１８８×１０６個）で投与される、神経栄養因子を分泌する自己の培養された間葉系骨髄間質細胞（ＭＳＣ−ＮＴＦ）の１回だけの処置施与の安全性評価および耐容性。
【０３７５】
副次的評価項目：
・ＡＬＳ機能評価尺度（ＡＬＳ−ＦＲＳ−Ｓ）における変化。
・握ることによる筋力判定（ＭＶＩＣ）における変化。
・％努力肺活量（ＦＶＣ）における変化。
・上肢のＭＲＩによって推定される筋肉量における変化。
・上肢および下肢の周囲（ｃｍ）における変化。
・ＥＭＧパラメータにおける変化。
【０３７６】
対象者の数：ＡＬＳ初期疾患状態にある合計で１２名の対象者。
【０３７７】
研究設計：これは、神経栄養因子を分泌する自己の培養された間葉系骨髄間質細胞（ＭＳＣ−ＮＴＦ）の安全性、耐容性および予備的効力を、初期疾患段階の筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）患者のための効力のある処置として評価するための第ＩＩａ相の前向き非盲検用量漸増の３患者群臨床研究である。本研究は単一拠点での試験である。
【０３７８】
登録されるすべての患者が研究登録前にＡＬＳ疾患の記録された病歴を有するであろう。２年未満の継続期間により初期段階のＡＬＳ疾患として診断される患者。「素因を有する」として特定されるＡＬＳ患者が打診され、インフォームドコンセント用紙（ＩＣＦ）に署名するように要請されるであろう。全体として、１２名の患者が募集されるであろう。
【０３７９】
処置が最低用量（９４×１０６細胞）により開始されるであろう。用量は、安全性分析の後でのみ、その次の患者群のためにその次の中間用量および高用量（それぞれ、１４１×１０６個および１８８×１０６個）に増大されるであろう。
【０３８０】
この研究への登録に先立つ患者スクリーニング期間の予想された継続期間は２回目の通院時における研究登録日の２週間前から２日前までの間である（臨床検査室での結果を含む参加基準／除外基準に一致することの確認）。適格患者が研究に登録されるであろうし、かつ、疾患の進行速度を決定するための３ヶ月の「導入期間」（これは±５日の時間窓をすべての通院のために可能にする）の期間中において１ヶ月毎に観察されるであろう。登録後約６週間の後での「導入期間」の間に、両方の研究群の患者が骨髄吸引（ＭＢＡ）手順を受けるであろうし、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞が、Ｂｒａｉｎｓｔｏｒｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｌｔｄが権利を有する方法に基づいて骨髄吸引物から製造されるであろう。「導入期間」での最後の通院のとき、患者は処置を受けるであろうし、ＭＳＣ−ＮＴＦが初期ＡＬＳ患者へのＩＭ＋ＩＴによって移植されるであろう。
【０３８１】
ＭＳＣ−ＮＴＦ移植後、患者は、（±５日の時間窓をすべての通院のために可能にする）６ヶ月の処置後追跡調査期間にわたって毎月、観察されるであろう。処置の安全性、有害事象および調査パラメータが、疾患のＡＬＳ進行速度評価を確定させるために、「導入期間」の継続期間および処置後追跡調査期間の全体を通して記録されるであろう。
【０３８２】
研究期間：全体として、研究プロトコルのもとでは、それぞれの患者が約９ヶ月の研究期間の間に合計で１０回通院するであろう。
【０３８３】
処置用量：本明細書中下記の表１０に詳述される通り。
2018138044.tif 000029
【０３８４】
効力評価：ＭＳＣ−ＮＴＦ処置の予備的効力評価は、研究の処置後追跡調査期間に沿った下記の変数の観察に基づくであろう：ＡＬＳ機能評価尺度（ＡＬＳ−ＦＲＳ−Ｒ）、握ることによる筋力判定（ＭＶＩＣ）、％努力肺活量（ＦＶＣ）、上肢のＭＲＩによって推定される筋肉量、上肢および下肢の周囲（ｃｍ）、ＥＭＧパラメータ。
【０３８５】
安全性評価：
対象者の安全性が、下記の変数の測定値を使用して、ＭＳＣ−ＮＴＦによる処置の後で評価されるであろう：
・理学的検査、
・生命徴候（ＨＲ、ＢＰ、ＲＰ、体温）、
・臨床検査室パラメータ：
・ＣＢＣ−各種指数を伴うＲＢＣ、鑑別を伴うＷＢＣ、血小板数、ヘモグロビン（Ｈｂ）およびヘマトクリット（Ｈｔ）
・凝固機能−プロトロンビン時間（ＰＴ）、ＩＮＲ、部分トロンボプラスチン時間（ＰＴＴ）、フィブリノーゲン
・電解質（ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、塩化物）、グルコース、総タンパク質、トリグリセリド（ＴＧ）、総コレステロール、ＨＤＬ、ＬＤＬについての血液化学
・腎機能（尿素、クレアチニン）
・肝機能（総ビリルビン、ＡＳＴ（ＧＯＴ）、ＡＬＴ（ＧＰＴ）、ＡＬＰ）
・尿検査（ディップ・スティック試験）−比重、ｐＨ、グルコース、タンパク質、ケトン体、血液
・有害事象の記録、および
・併用薬
【０３８６】
統計学的分析：
この研究で得られ、かつ、ＣＲＦにおいて記録されるすべてのデータが適宜、リストに記載され、また、記述的な群統計学（平均、標準偏差、最小値、最大値、有効事例数）とともに表にされるであろう。統計学的な処理および計算が３つの患者群について並行して行われるであろう。離散変数（例えば、性別、状態、有害事象の数（発生、重篤度、ＩＰとの関連性）などについては、頻度、パーセントおよび分布がコンピューター計算されるであろう。３つの群の間における結果が比較され、統計学的分析によって分析されるであろう。
【０３８７】
両側ｔ検定が、ベースラインからの効力パラメータにおける変化を比較するために使用されるであろう。
【０３８８】
さらなるデータ分析が適宜行われるであろう。それぞれの統計学的検定が、０．０５の有意性水準により分析されるであろう：ｐ≦０．０５は有意な結果を意味し、ｐ＞０．０５は、有意でない結果を意味する。
【０３８９】
実施例７
１工程プロトコルまたは２工程プロトコルを使用して得られるＭＳＣ−ＮＴＦの収量の比較
材料および方法
１工程プロトコル：実施例１に記載される通り。
【０３９０】
２工程プロトコル：ヒトＭＳＣ（１２０００細胞／ｃｍ２）を、低グルコースＤＭＥＭ、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、ヘパリンおよび血小板溶解物を含有するＰＭに播種した。２日後、培地を、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）、２０ｎｇ／ｍｌのヒト上皮増殖因子（ｈＥＧＦ）、２０ｎｇ／ｍｌのヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｈｂＦＧＦ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）およびＮ２補充物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が補充された低グルコースＤＭＥＭと置き換えた。７２時間後、培地を、１ｍＭのジブチリル環状ＡＭＰ（ｄｂｃＡＭＰ）、０．５ｍＭのイソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、５ｎｇ／ｍｌのヒト血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、５０ｎｇ／ｍｌのヒトニューレグリン１−β１／ＨＲＧ１−β１  ＥＧＦドメインおよび２０ｎｇ／ｍｌのｈｂＦＧＦ（すべてが、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから得られる）が補充されたＤＭＥＭと、さらに３日間、取り換えた。
【０３９１】
結果
図２８Ａ〜図２８Ｃに例示されるように、１工程プロトコルは、３つの異なる患者サンプルにおいて示されるように、２工程プロトコルを使用して得られる収量と比較して、ＭＳＣ−ＮＴＦの有意により高い収量であって、実施例１および実施例６において概略された用量で患者における臨床試験を支援することができる実行可能な生産的製造プロセスを確立することを可能にする収量をもたらした。
【０３９２】
本発明はその特定の実施態様によって説明してきたが、多くの別法、変更および変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更および変形すべてを包含するものである。
【０３９３】
本明細書で挙げた刊行物、特許および特許出願はすべて、個々の刊行物、特許および特許出願が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用または確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。節の見出しが使用されている程度まで、それらは必ずしも限定であると解釈されるべきではない。
【０３９４】
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【図１Ａ−１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ−３Ｉ】
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【図４Ａ−４Ｂ】
2018138044.tif 000037
【図５Ａ−５Ｆ】
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【図６Ａ−６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
2018138044.tif 000041
【図９】
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【図１０】
2018138044.tif 000043
【図１１Ａ−１１Ｂ】
2018138044.tif 000044
【図１２Ａ−１２Ｂ】
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【図１３Ａ−１３Ｂ】
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【図１４Ａ−１４Ｂ】
2018138044.tif 000047
【図１５Ａ−１５Ｂ】
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【図１６Ａ−１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ−２２Ｂ】
2018138044.tif 000055
【図２３Ａ−２３Ｃ】
2018138044.tif 000056
【図２３Ｄ−２３Ｅ】
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【図２４Ａ−２４Ｂ】
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【図２４Ｃ−２４Ｄ】
2018138044.tif 000059
【図２４Ｅ−２４Ｆ】
2018138044.tif 000060
【図２４Ｇ】
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【図２５】
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【図２６】
2018138044.tif 000063
【図２７】
2018138044.tif 000064
【図２８Ａ−２８Ｃ】
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【配列表】
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