(57)【要約】【課題】培養動物細胞の活性を長期間維持し、多くの物質を産生させる。【解決手段】プリン塩基、プリン塩基誘導体、ピリミジン塩基、およびピリミジン塩基誘導体から選択される１種またはそれ以上の塩基または塩基誘導体を培養前および／または培養中に培地に添加することを特徴とする、動物細胞の培養方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
プリン塩基、プリン塩基誘導体、ピリミジン塩基、およびピリミジン塩基誘導体から選択される１種またはそれ以上の塩基または塩基誘導体を培養前および／または培養中に培地に添加することを特徴とする、動物細胞の培養方法。
【請求項２】
塩基または塩基誘導体がプリンヌクレオシド、プリンヌクレオシド誘導体、ピリミジンヌクレオシド、およびピリミジンヌクレオシド誘導体から選択される１種またはそれ以上のものである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
塩基または塩基誘導体がアデノシン、デオキシアデノシン、シチジン、デオキシシチジン、グアノシン、デオキシグアノシン、チミジン、デオキシチミジン、ウリジン、デオキシウリジン、およびヒポキサンチンから選択される１種またはそれ以上のものである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
塩基または塩基誘導体が培地中において１ｍｇ／Ｌ〜１００ｍｇ／Ｌとなるように添加される、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
流加培養にて行われる請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
請求項５記載の方法を実施するための動物細胞培養用システムであって、プリン塩基、プリン塩基誘導体、ピリミジン塩基、およびピリミジン塩基誘導体から選択される１種またはそれ以上の塩基または塩基誘導体を含むフィード液を含む容器、培養容器、およびポンプを含むシステム。
【請求項７】
プリン塩基、プリン塩基誘導体、ピリミジン塩基、およびピリミジン塩基誘導体から選択される１種またはそれ以上の塩基または塩基誘導体を含む、動物細胞の液体培地に添加されるフィード液。
【請求項８】
プリン塩基、プリン塩基誘導体、ピリミジン塩基、およびピリミジン塩基誘導体から選択される１種またはそれ以上の塩基または塩基誘導体を添加することを特徴とする、動物細胞培養用培地の製造方法。
【請求項９】
塩基または塩基誘導体がプリンヌクレオシド、プリンヌクレオシド誘導体、ピリミジンヌクレオシド、およびピリミジンヌクレオシド誘導体から選択される１種またはそれ以上のものである、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
塩基または塩基誘導体がアデノシン、デオキシアデノシン、シチジン、デオキシシチジン、グアノシン、デオキシグアノシン、チミジン、デオキシチミジン、ウリジン、デオキシウリジン、およびヒポキサンチンから選択される１種またはそれ以上のものである、請求項８記載の方法。
【請求項１１】
塩基または塩基誘導体を培地中において１ｍｇ／Ｌ〜１００ｍｇ／Ｌとなるように添加する、請求項８〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
プリン塩基、プリン塩基誘導体、ピリミジン塩基、およびピリミジン塩基誘導体から選択される１種またはそれ以上の塩基または塩基誘導体を培養前および／または培養中に培地に添加して動物細胞を培養することを特徴とする、有用物質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物細胞の培養方法、動物細胞の培養のためのシステム、および動物細胞の培養のための培地の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
インターフェロン、インターロイキン、ケモカイン、エリスロポエチン、造血因子、細胞傷害因子、様々な増殖因子、および抗体などの有用物質が動物細胞を用いて製造されている。動物細胞の培養用の培地はコストが高いので、連続培養を行うと有用物質のコストも高くなってしまう。そのため、動物細胞を用いた有用物質の生産には主に回分培養が用いられている。しかし、回分培養においては、細胞の増殖に伴って培地中の栄養源が減少し、有害な代謝産物が蓄積するので、細胞を長期間安定して高密度で増殖させ、有用物質を産生させることは困難である。
【０００３】
上記のような問題を解決するために、培地中の炭素源やアミノ酸の濃度を制御することが検討されている（特許文献１、２）。また、栄養源を培養中に補充するために流下培養も行われている（特許文献１〜３）。しかしながら、依然として、動物細胞を用いて有用物質を大量かつ安価に製造することは困難である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２００４−５３２６４２号公報
【特許文献２】特開２００８−４３３０１号公報
【特許文献３】国際公開ＷＯ２０１１／０９３４２６Ａ１公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
動物細胞を長期間安定して高密度で増殖させ、有用物質を大量かつ安価に製造することが本発明の解決すべき課題であった。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、プリン塩基、プリン塩基誘導体、ピリミジン塩基、およびピリミジン塩基誘導体から選択される１種またはそれ以上の塩基または塩基誘導体を培養前および／または培養中に培地に添加することにより上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、以下のものを提供する。
（１）プリン塩基、プリン塩基誘導体、ピリミジン塩基、およびピリミジン塩基誘導体から選択される１種またはそれ以上の塩基または塩基誘導体を培養前および／または培養中に培地に添加することを特徴とする、動物細胞の培養方法。
（２）塩基または塩基誘導体がプリンヌクレオシド、プリンヌクレオシド誘導体、ヒポキサンチン、ピリミジンヌクレオシド、およびピリミジンヌクレオシド誘導体から選択される１種またはそれ以上のものである、（１）記載の方法。
（３）塩基または塩基誘導体がアデノシン、デオキシアデノシン、シチジン、デオキシシチジン、グアノシン、デオキシグアノシン、チミジン、デオキシチミジン、ウリジン、デオキシウリジン、およびヒポキサンチンから選択される１種またはそれ以上のものである、（１）記載の方法。
（４）塩基または塩基誘導体が培地中において約１ｍｇ／Ｌ〜約１００ｍｇ／Ｌとなるように添加される、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）流加培養にて行われる（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）（５）記載の方法を実施するための動物細胞培養用システムであって、プリン塩基、プリン塩基誘導体、ピリミジン塩基、およびピリミジン塩基誘導体から選択される１種またはそれ以上の塩基または塩基誘導体を含むフィード液を含む容器、培養容器、およびポンプを含むシステム。
（７）プリン塩基、プリン塩基誘導体、ピリミジン塩基、およびピリミジン塩基誘導体から選択される１種またはそれ以上の塩基または塩基誘導体を含む、動物細胞の液体培地に添加されるフィード液。
（８）プリン塩基、プリン塩基誘導体、ピリミジン塩基、およびピリミジン塩基誘導体から選択される１種またはそれ以上の塩基または塩基誘導体を添加することを特徴とする、動物細胞培養用培地の製造方法。
（９）塩基または塩基誘導体がプリンヌクレオシド、プリンヌクレオシド誘導体、ピリミジンヌクレオシド、およびピリミジンヌクレオシド誘導体から選択される１種またはそれ以上のものである、（８）記載の方法。
（１０）塩基または塩基誘導体がアデノシン、デオキシアデノシン、シチジン、デオキシシチジン、グアノシン、デオキシグアノシン、チミジン、デオキシチミジン、ウリジン、デオキシウリジン、およびヒポキサンチンから選択される１種またはそれ以上のものである、（８）記載の方法。
（１１）塩基または塩基誘導体を培地中において約１ｍｇ／Ｌ
〜約１００ｍｇ／Ｌとなるように添加する、（８）〜（１０）のいずれかに記載の方法。
（１２）プリン塩基、プリン塩基誘導体、ピリミジン塩基、およびピリミジン塩基誘導体から選択される１種またはそれ以上の塩基または塩基誘導体を培養前および／または培養中に培地に添加して動物細胞を培養することを特徴とする、有用物質の製造方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、動物細胞を長期間安定して高密度で増殖させ、有用物質を大量かつ安価に製造することができる。したがって、インターフェロン、インターロイキン、ケモカイン、エリスロポエチン、造血因子、増殖因子、ホルモン、および抗体などの有用物質を大量かつ安価に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、培地中のヌクレオシド、アミノ酸、有機酸および糖の濃度の経時変化を示すグラフである。各図の右の番号３−８はウイルスクリアランスしていないウシ胎児血清５％を含む培地で培養、９−１４はγ線にてウイルスクリアランスしたウシ胎児血清５％を含む培地で培養、１５−２０はγ線にてウイルスクリアランスしたウシ胎児血清１５％を含む培地で培養、２１−２６は電子線にてウイルスクリアランスしたウシ胎児血清５％を含む培地で培養、２７−３２は電子線にてウイルスクリアランスしたウシ胎児血清１５％を含む培地で培養したことを示す。各図の横軸は培養日数、縦軸は相対量である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、１の態様において、プリン塩基、プリン塩基誘導体、ピリミジン塩基、およびピリミジン塩基誘導体から選択される１種またはそれ以上の塩基または塩基誘導体を培養前および／または培養中に培地に添加することを特徴とする、動物細胞の培養方法を提供する。動物細胞の培養時に炭素源やアミノ酸類を培地に補充することは従来から行われているが、本発明者らは、プリン塩基、プリン塩基誘導体、ピリミジン塩基、および／またはピリミジン塩基誘導体を培地に補充することにより、動物細胞を長期にわたり活性化させ、増殖させることが可能であることを初めて見出した。
【００１１】
本発明においてあらゆる動物細胞を培養することができる。好ましい動物細胞としてはヒト、サル、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ウサギ、モルモット、ラット、マウス、ハムスターなどの哺乳動物に由来する細胞が挙げられるが、これらに限定されない。より好ましい動物細胞としてはヒト由来の細胞が挙げられる。昆虫細胞も動物細胞に包含される。有用物質の生産によく用いられる動物細胞の例としてはＣＨＯ、ＣＯＳ、ＣＶ−１、Ｓｐ２０、ＮＳ０、Veroなどが挙げられるが、これらに限定されない。動物細胞は野生型であってもよく、遺伝子操作、変異操作あるいは細胞融合がなされたものであってもよい。動物細胞は、例えば所望のポリペプチドをコードする遺伝子を導入されたヒト細胞や、所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマであってもよい。細胞は初代細胞であってもよく、継代細胞であってもよい。さらに本発明においてｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞などの幹細胞、ＡＤＰＭＣ（脂肪組織由来多系統前駆細胞）などの前駆細胞を培養してもよい。
【００１２】
本発明において、あらゆるプリン塩基またはプリン塩基誘導体を用いることができる。塩基は核酸を構成する物質であり、プリン塩基、ピリミジン塩基などが包含される。プリン塩基は、プリン骨格を有する塩基性物質であり、核酸の構成要素である。プリン塩基の例としてはプリン、アデニン、グアニン、ヒポキサンチン、キサンチン、テオブロミン、カフェイン、尿酸、イソグアニンなどが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書において、誘導体は、元の化合物に官能基を導入、酸化、還元、原子置換などを行って得られる化合物であって、元の化合物の基本的な構造や性質を維持しているものをいう。プリン塩基誘導体の例としてはプリンヌクレオシド、プリンヌクレオチド、およびそれらの誘導体などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明において好ましいプリン塩基またはプリン塩基誘導体の例としてはプリンヌクレオシド、プリンヌクレオシド誘導体、ヒポキサンチンなどが挙げられるが、これらに限定されない。本発明において好ましいプリンヌクレオシドまたはプリンヌクレオシド誘導体の例としてはアデノシン、デオキシアデノシン、グアノシン、デオキシグアノシン、およびそれらの誘導体などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１３】
本発明において、あらゆるピリミジン塩基またはピリミジン塩基誘導体を用いることができる。ピリミジン塩基は、ピリミジン骨格を有する塩基性物質であり、核酸の構成要素である。ピリミジン塩基の例としてはチミン、シトシン、ウラシル、５−メチイルシトシン、５−（ヒドロキシメチル）シトシンなどが挙げられるが、これらに限定されない。ピリミジン塩基誘導体の例としてはピリミジンヌクレオシド、ピリミジンヌクレオチド、およびそれらの誘導体などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明において好ましいピリミジン塩基またはピリミジン塩基誘導体の例としてはピリミジンヌクレオシド、ピリミジンヌクレオシド誘導体などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明において好ましいピリミジンヌクレオシドまたはピリミジンヌクレオシド誘導体の例としてはシチジン、デオキシシチジン、チミジン、デオキシチミジン、ウリジン、デオキシウリジン、およびそれらの誘導体などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１４】
本発明において、プリン塩基、プリン塩基誘導体、ピリミジン塩基、ピリミジン塩基誘導体から選択される１種またはそれ以上の塩基または塩基誘導体を、動物細胞の培養前および／または培養中に培地に添加する。上記物質を添加することにより、動物細胞を長期間安定して高密度で増殖させ、有用物質を大量かつ安価に製造することができる。したがって、インターフェロン、インターロイキン、ケモカイン、エリスロポエチン、造血因子、増殖因子、ホルモン、および抗体などの有用物質を大量かつ安価に製造することができる。上記物質以外にも細胞の増殖や活性を向上させる物質、例えばグルコースなどの炭素源やアミノ酸類などの窒素源、ビタミン類、微量金属類などを培地に添加してもよい。
【００１５】
塩基または塩基誘導体を動物細胞の培養前に培地に添加してもよく、培養途中で培地に添加してもよい。また、塩基または塩基誘導体を動物細胞の培養前および培養途中で培地に添加してもよい。添加の回数は１回であってもよく、複数回であってもよい。塩基または塩基誘導体の添加形態は、固体のままであってもよく、溶液にしてから添加してもよい。好ましくは、塩基または塩基誘導体を濃厚溶液として培地に添加する。これらの物質の添加量、添加回数、添加期間は、培地中のこれらの物質の濃度、細胞量、細胞の生存率、目的物質の産生量などを適時あるいは連続的にモニターし、これらのデータを考慮して決定することができる。
【００１６】
塩基または塩基誘導体の添加量は、動物細胞の増殖促進、活性増強、あるいは目的物質の収量増加が見られるように決定する。かかる添加量は、当業者が予備試験を行う等により容易に決定することができる。塩基または塩基誘導体の添加量は細胞の種類、培地の種類、その他の培養条件などにもよるが、例えば、培地中の濃度が約１０００ｍｇ／Ｌを下回らないようにしてもよく、例えば約０．１ｍｇ／ｌ〜約１０００ｍｇ／Ｌであってもよく、好ましくは約１ｍｇ／Ｌ〜約１００ｍｇ／Ｌであってもよく、例えば、約２ｍｇ／Ｌ〜約５０ｍｇ／Ｌ、約５ｍｇ／Ｌ〜約２０ｍｇ／Ｌなどであってもよい。本明細書において、塩基または塩基誘導体の培地中の濃度は、添加する各塩基または各塩基誘導体の濃度である。
【００１７】
本発明に用いられる培地は動物細胞培養用であればいずれの培地であってもよい。動物細胞培養用培地の例としてはＤ−ＭＥＭ、Ｅ−ＭＥＭ、Ｇ−ＭＥＭ、ＭＥＭα、ＲＰＭＩ−１６４０、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２、ＩＭＥＭ、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ  Ｌ−１５培地、およびこれらの培地の改変培地、ならびにこれらの培地の混合培地などが挙げられるが、これらの培地に限定されない。当業者は、使用する細胞、所望の有用物質などに応じて適宜培地を選択し使用することができる。また培養温度、ｐＨ、培養時間、培地中の各成分の濃度、撹拌条件などの培養条件についても当業者が容易に定めうる。培養中に培地交換を行ってもよく、行わなくてもよい。
【００１８】
培養容器についても特に限定はなく、所望の有用物質の量、有用物質の種類、細胞の種類などの因子に合わせて適宜選択することができる。様々な種類およびサイズの培養容器が知られており、ディッシュ、プレート、チューブ、フラスコ、ボトル、タンク、バッグなどが例示されるが、これらに限定されない。
【００１９】
本発明の動物細胞の培養方法を流下培養にて実施してもよい。流下培養は当業者によく知られた液体培養方法であり、培養中に特定の基質を培養容器に供給するが、培地（細胞および培地を含む）を抜き取らない培養方法である。本発明においては、動物細胞を液体培養する際に、上で説明した塩基または塩基誘導体を培養容器に供給する。好ましくは、塩基または塩基誘導体を含むフィード液を培地に供給する。通常は、フィード液は高濃度の塩基または塩基誘導体を含み、添加時に培地体積の変化を抑制することが好ましい。本発明の流下培養において、培地中の塩基または塩基誘導体の濃度が、約１０００ｍｇ／Ｌを下回らないように維持してもよく、例えば約０．１ｍｇ／ｌ〜約１０００ｍｇ／Ｌに維持してもよく、好ましくは約１ｍｇ／Ｌ〜約１００ｍｇ／Ｌに維持してもよく、例えば、約２ｍｇ／Ｌ〜約５０ｍｇ／Ｌ、約５ｍｇ／Ｌ〜約２０ｍｇ／Ｌなどに維持してもよい。
【００２０】
本発明の流下培養の具体例において、フィード液はポンプを介して培養容器に接続される。培地中の塩基または塩基誘導体の濃度、および／または細胞数、所望有用物質濃度などを適時測定し、必要に応じてポンプを作動させて塩基または塩基誘導体を培地に供給してもよい。また、１個または複数個のセンサー（検出器および／またはコンピューターに接続されている）を培養容器に設けて培地中の塩基または塩基誘導体の濃度、および／または細胞数、所望有用物質濃度などを測定し、センサーおよび／またはコンピューターを介してポンプを作動させて塩基または塩基誘導体を培地に供給してもよい。従って、本発明は、さらなる態様において、プリン塩基、プリン塩基誘導体、ピリミジン塩基、およびピリミジン塩基誘導体から選択される１種またはそれ以上の塩基または塩基誘導体を含むフィード液を含む容器、培養容器、およびポンプを含む、動物細胞培養用システムを提供する。
【００２１】
本発明はさらなる態様において、プリン塩基、プリン塩基誘導体、ピリミジン塩基、およびピリミジン塩基誘導体から選択される１種またはそれ以上の塩基または塩基誘導体を含む、動物細胞の液体培地に添加されるフィード液を提供する。
【００２２】
本発明は、さらにもう１つの態様において、プリン塩基、プリン塩基誘導体、ピリミジン塩基、およびピリミジン塩基誘導体から選択される１種またはそれ以上の塩基または塩基誘導体を添加することを特徴とする、動物細胞培養用培地の製造方法を提供する。通常は、塩基または塩基誘導体と培地成分とを公知の手段/方法にて混合することにより培地を製造する。塩基または塩基誘導体については上で説明したとおりである。本発明の方法により得られる培地は粉末であってもよく、液体であってもよい。培地が粉末の場合は、これを水などの媒体で希釈して使用する。培地製造時の塩基または塩基誘導体の添加量は、調製した液体培地中において動物細胞の増殖促進、活性増強、あるいは目的物質の収量増加が見られる程度とする。かかる添加量は、当業者が予備試験を行う等により容易に決定することができる。塩基または塩基誘導体の添加量は細胞の種類、培地の種類、その他の培養条件などにもよるが、例えば、培地中の濃度が約１０００ｍｇ／Ｌを下回らないようにしてもよく、例えば約０．１ｍｇ／ｌ〜約１０００ｍｇ／Ｌであってもよく、好ましくは約１ｍｇ／Ｌ〜約１００ｍｇ／Ｌであってもよく、例えば、約２ｍｇ／Ｌ〜約５０ｍｇ／Ｌ、約５ｍｇ／Ｌ〜約２０ｍｇ／Ｌなどであってもよい。本明細書において、塩基または塩基誘導体の培地中の濃度は、添加する塩基または塩基誘導体のそれぞれの濃度の合計である。
【００２３】
本発明は、さらにもう１つの態様において、プリン塩基、プリン塩基誘導体、ピリミジン塩基、およびピリミジン塩基誘導体から選択される１種またはそれ以上の塩基または塩基誘導体を培養前および／または培養中に培地に添加して動物細胞を培養することを特徴とする、有用物質の製造方法を提供する。有用物質は、ヒトにとって役に立つ物質をいい、ポリペプチドなどの高分子化合物であってもよく、中〜低分子化合物であってもよい。有用物質の例として、例えばバイオ医薬品の成分などが挙げられるが、これに限定されない。有用物質の具体例としてインターフェロン、インターロイキン、ケモカイン、エリスロポエチン、造血因子、増殖因子、ホルモン、および抗体などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２４】
以上、本発明について説明したが、以下に実施例を示して本発明をより詳細かつ具体的に説明するが、実施例は本発明を限定するものではない。なお、本明細書中の用語は、特に説明しないかぎり、細胞培養や医薬品の分野で通常理解されている意味に解される。
【実施例１】
【００２５】
表１に示す組成の培地（ＩＴＳの組成を表２に示す）にウシ胎児血清を添加して調製した培地にて
ヒト脂肪組織由来多系統前駆細胞を５日間培養し、培地中のヌクレオシド、アミノ酸、有機酸および糖の濃度の経時変化を調べた。結果を図１に示す。調べた物質はいずれも培養時間とともに減少したが、ウリジン、シチジン、デオキシシチジン、ヒポキサンチンは培養３〜５日目でほとんど消失あるいは完全に消失したことがわかった。
【表１】
2018113907.tif 000002
【表２】
2018113907.tif 000003
【００２６】
上の試験にてほとんど消失あるいは完全に消失した物質はヌクレオシド類であったので、表３に示すヌクレオシド類を含む溶液（溶液Ａ）（１０００倍濃度）を調製し、培地に添加して表３に示す最終濃度として培養を行い、培地中の細胞の生存率および細胞数を調べた。
【表３】
2018113907.tif 000004
【００２７】
第５継代のヒト脂肪組織由来多系統前駆細胞（ＡＤＭＰＣ）をフィブロネクチンコート１０ｃｍ培養ディッシュに２ｘ１０５個／ディッシュで播種し、播種３日目、５日目に培地交換を行い、７日目に細胞を回収し細胞数をカウントした。溶液Ａ添加系と無添加系の２サンプルで試験した。基礎培地は１５％ＦＢＳ、ＩＴＳ含有ＳｔｅＭｅｄｉａであった。結果を表４に示す。溶液Ａ添加系（試料２）では、溶液Ａ無添加系（試料１）に比べて細胞増殖率・速度が高く、培地に溶液Ａを添加してから培養に供することで、効率よい細胞の増殖が得られることがわかった。
【表４】
2018113907.tif 000005
【００２８】
第５継代のＡＤＭＰＣをフィブロネクチンコート１０ｃｍ培養ディッシュに２ｘ１０５個／ディッシュで播種した。播種後３日目、５日目に培地交換を行い、７日目に細胞を回収し細胞数をカウントした。基礎培地は、１５％ＦＢＳ、ＩＴＳ含有ＳｔｅＭｅｄｉａであった。結果を表５に示す。溶液Ａ無添加の培地（試料１および２）で培養した場合において、７日間培地交換していない場合（試料２）は、３日目および５日目に培地交換した場合（試料１）と比較して細胞増殖率・速度は低下していた。このように、培地交換を行わないと細胞増殖が悪くなる。溶液Ａをあらかじめ基礎培地に添加した培地を用い、培地交換を行った場合には（試料３）、溶液Ａ無添加培地（試料２）に比べて遜色のない細胞増殖・速度の向上を示していた。あらかじめ基礎培地に溶液Ａを添加した培地を用いることで、培地交換の間隔を延長し、培地交換回数を低減させることが可能であることがわかった。
【表５】
2018113907.tif 000006
【００２９】
第５継代のＡＤＭＰＣをフィブロネクチンコート１０ｃｍ培養ディッシュ２ｘ１０５個／ディッシュで播種した。播種後３日目、５日目に培地交換を行い、７日目に細胞を回収し細胞数をカウントした。基礎培地は、１５％ＦＢＳ、ＩＴＳ含有ＳｔｅＭｅｄｉａであった。結果を表６に示す。溶液Ａ無添加の培地で培養し、かつ３日以内（培養３日目および５日目）に培地交換を行った場合（試料１）と比較して、培養３日目および５日目に溶液Ａを追加添加した場合（試料２）でも、細胞増殖率・速度は向上していた。溶液Ａを培養途中に追加添加することで、培地交換の間隔を延長し、培地交換回数を低減させることが可能であることがわかった。
【表６】
2018113907.tif 000007
【産業上の利用可能性】
【００３０】
本発明は、動物細胞からの有用物質生産において利用可能である。本発明は、バイオ医薬品の分野などにおいて利用可能である。
【図１】
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