(57)【要約】【課題】関節機能を改善し、関節機能と関係した疼痛を軽減し、骨関節炎を処置するための、改善された特性を有するヒアルロナンベースの組成物を提供する。【解決手段】本発明は、ヒアルロナンを含む組成物であって、該ヒアルロナンが、該組成物中に約３０ｍｇ／ｍＬを超える濃度で存在し；該ヒアルロナンは約１００万〜約２００万の間の平均分子量を有し；該ヒアルロナンは架橋しておらず、および／または化学的改質を実質的に含まず；ここで、該組成物は他の薬学的に活性な物質を実質的に含まない組成物を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
必要とする被験体において疼痛伝達に関与するイオンチャネルの活性化を阻害するための、ヒアルロナンを含む高弾性組成物であって、
該組成物は、５．０Ｈｚの周波数で測定したとき少なくとも約９００パスカルの弾性（Ｇ’）を有し、それにより、該被験体において、疼痛伝達に関与するイオンチャネルの活性化を阻害する、組成物。
【請求項２】
ヒアルロナンが、前記高弾性組成物中に３０ｍｇ／ｍＬを超える濃度で存在する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ヒアルロナンが、前記高弾性組成物中に４０ｍｇ／ｍＬ〜６０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ヒアルロナンが、１００万〜２００万の間の平均分子量を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ヒアルロナンが、２００万未満の平均分子量を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記ヒアルロナンが架橋しておらず、および／または化学的改質を実質的に含まない、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記高弾性組成物が無菌である、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記高弾性組成物が緩衝液をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記緩衝液がリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記緩衝液が、ＮａＣｌ、ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、およびＮａ２ＰＯ４を含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記緩衝液が、８．４７ｇ／ＬのＮａＣｌ、０．０４７ｇ／ＬのＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、および０．２１３ｇ／ＬのＮａ２ＰＯ４を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
疼痛伝達に関与する前記イオンチャネルがＴＲＰＶ１イオンチャネルである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記高弾性組成物の投与が、疼痛伝達に関与する前記イオンチャネルを発現する神経細胞において、侵害受容刺激後の細胞質ゾル内Ｃａ２＋の増加の阻害を生じる、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記高弾性組成物の投与が、疼痛伝達に関与する前記イオンチャネルを発現する神経細胞において、侵害受容刺激後の細胞全体の電流の減少を生じる、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
必要とする被験体において疼痛を処置するための、ヒアルロナンを含む高弾性組成物であって、
該組成物は、５．０Ｈｚの周波数で測定したとき少なくとも約９００パスカルの弾性（Ｇ’）を有し、それにより、該被験体において、疼痛を処置する、組成物。
【請求項１６】
ヒアルロナンが、前記高弾性組成物中に３０ｍｇ／ｍＬを超える濃度で存在する、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
ヒアルロナンが、前記高弾性組成物中に４０ｍｇ／ｍＬ〜６０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記ヒアルロナンが、１００万〜２００万の間の平均分子量を有する、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１９】
前記ヒアルロナンが、２００万未満の平均分子量を有する、請求項１５に記載の組成物。
【請求項２０】
前記ヒアルロナンが架橋しておらず、および／または化学的改質を実質的に含まない、請求項１５に記載の組成物。
【請求項２１】
前記高弾性組成物が無菌である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項２２】
前記高弾性組成物が緩衝液をさらに含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項２３】
前記緩衝液がリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）である、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記緩衝液が、ＮａＣｌ、ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、およびＮａ２ＰＯ４を含む、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記緩衝液が、８．４７ｇ／ＬのＮａＣｌ、０．０４７ｇ／ＬのＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、および０．２１３ｇ／ＬのＮａ２ＰＯ４を含む、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記高弾性組成物の投与が、前記被験体において、痛覚神経インパルスの平均数の減少を生じる、請求項１５に記載の組成物。
【請求項２７】
疼痛伝達に関与する前記イオンチャネルが、前記被験体の関節の神経にある、請求項１に記載の組成物。
【請求項２８】
前記関節が、膝関節、肘関節、股関節、および肩関節からなる群より選択される、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記疼痛が前記被験体の関節にある、請求項１５に記載の組成物。
【請求項３０】
前記関節が、膝関節、肘関節、股関節、および肩関節からなる群より選択される、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
高弾性ヒアルロナン組成物であって、
１３０万〜２００万の間の平均分子量のヒアルロナン；
８．４７ｇ／ＬのＮａＣｌ、０．０４７ｇ／ＬのＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、および０．２１３ｇ／ＬのＮａ２ＰＯ４を含む緩衝液；
を含み、該ヒアルロナンが、該組成物中に３０ｍｇ／ｍＬを超える濃度で存在し、かつ、該組成物は、５．０Ｈｚの周波数で測定したとき少なくとも９００パスカルの弾性（Ｇ’）を有する、組成物。
【請求項３２】
５．５〜７．５のｐＨを有する、請求項３１に記載の高弾性ヒアルロナン組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２０１３年７月１０日に出願した米国仮出願第６１／８４４，６４５号に対する優先権を主張する。米国仮出願第６１／８４４，６４５号の内容全体は、本明細書中に参考として援用される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ヒアルロナン（ＨＡ）は、高い平均分子量の線状多糖類であり、主として細胞外マトリックスおよび細胞周囲のマトリックスにおいて見出されるが、細胞内でも現われることが示されている。ＨＡの生物学的機能には、関節滑液および眼の硝子体などの液体結合組織の弾粘性の維持、組織の水和および水分輸送の制御、細胞外マトリックスにおけるプロテオグリカンの超分子構築、ならびに細胞の離脱、有糸分裂、遊走および腫瘍発達における多数の受容体媒介性の役割が含まれる。
【０００３】
関節痛覚受容器(joint  pain  receptor)についてのＨＡ溶液の鎮痛効果はよく記述されている。高い平均分子量のＨＡは、関節内に注射されたとき、関節痛の軽減で最も効果的になり得ることが以前に示唆されている。高い平均分子量のヒアルロナンは、関節痛覚神経終末における有害な刺激の検知に関与するイオンチャネルへの機械力の伝達を和らげる弾粘性フィルターとして働き、それによってその興奮を減少させることを示唆する実験的証拠がある。しかし、痛覚神経終末の興奮性の変化をもたらす、ＨＡ分子とイオンチャネルとの間の相互作用の種類は不明である。また、関節痛覚受容器へのその鎮痛効果を最大化するのに最も好適なＨＡ溶液のレオロジー特性は、完全には調査されていない。
【０００４】
膝関節機能および骨関節炎と関係した疼痛を含む関節機能と関係した疼痛は、ヒアルロナンを含む組成物の痛みを伴う関節への注射によって処置することができる。しかし、現在の処置方法は、すべての患者においては該疼痛の完全な抑制または疼痛の一様な軽減を結果としてもたらさない。そのため、改善された特性を有するヒアルロナンベースの組成物が当技術分野で必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、高濃度のＨＡを含む組成物、例えば、約３０ｍｇ／ｍＬ（約３％重量／体積）またはそれを超えるＨＡ濃度を有する組成物が関節痛の処置で驚くほど効果的であることを発見した。実際、そのようなＨＡ組成物は、粘性補充に現在使用されている最も好結果のＨＡ市販品であるＳｙｎｖｉｓｃ（登録商標）より関節痛の処置で有意に効果的である。特定の理論に束縛されることは欲しないが、弾性率Ｇ’の高い値によって証拠づけられるように、関節痛の処置で高濃度のＨＡを含む本発明のＨＡ組成物の有効性は、その高い弾性によって決定されると考えられる。また、特定の理論に束縛されることは欲しないが、本発明のＨＡ組成物の有効性は、ＴＲＰＶ１などの痛覚伝達チャネルとのＨＡ分子の相互作用の比較的高い確率によって決定され、それによって侵害受容器興奮性を引き下げると考えられる。
【０００６】
したがって、本発明は、ヒアルロナンを含む組成物であって、該ヒアルロナンが、該組成物中に約３０ｍｇ／ｍＬを超える濃度で存在し；該ヒアルロナンは約１００万〜約２００万の間の平均分子量を有し；該ヒアルロナンは架橋しておらず、および／または化学的改質を実質的に含まず；ここで、該組成物は他の薬学的に活性な物質を実質的に含まない組成物を提供する。
【０００７】
一実施形態において、他の薬学的に活性な物質はタンパク質である。別の実施形態において、他の薬学的に活性な物質はヒアルロナンとは異なるグリコサミノグリカンである。また別の実施形態において、他の薬学的に活性な物質はヒドロキシプロピルメチルセルロースである。さらなる実施形態において、他の薬学的に活性な物質は局所麻酔薬（local  anesthetic）、例えばリドカイン、またはブピバカインである。
【０００８】
幾つかの実施形態において、ヒアルロナンは、約４０ｍｇ／ｍＬ、約４５ｍｇ／ｍＬ、約５０ｍｇ／ｍＬ、約５５ｍｇ／ｍＬまたは約６０ｍｇ／ｍＬの濃度で組成物中に存在する。
【０００９】
本発明の一実施形態において、本組成物は、０．５Ｈｚの周波数で測定したとき少なくとも約２００パスカル、または０．５Ｈｚの周波数で測定したとき少なくとも約１，０００パスカルの弾性を有する。別の態様において、本組成物は、０．５Ｈｚの周波数で測定したとき少なくとも約２，０００パスカルの弾性、または０．５Ｈｚの周波数で測定したとき少なくとも約４，０００パスカルの弾性を有する。
【００１０】
別の態様において、本発明は、ヒアルロナンを含む医薬組成物を提供し、ここでヒアルロナンは、約４０ｍｇ／ｍＬの濃度で組成物中に存在し；ヒアルロナンは約１００万〜約２００万の間の平均分子量を有し；ヒアルロナンは架橋しておらず、および／または化学的改質を実質的に含まず；ここで、組成物は、他の薬学的に活性な物質を実質的に含まない。
【００１１】
一実施形態において、他の薬学的に活性な物質はタンパク質である。別の実施形態において、他の薬学的に活性な物質はヒアルロナンとは異なるグリコサミノグリカンである。また別の実施形態において、他の薬学的に活性な物質はヒドロキシプロピルメチルセルロースである。さらなる実施形態において、他の薬学的に活性な物質は局所麻酔薬（local  anesthetic）、例えばリドカイン、またはブピバカインである。
【００１２】
本発明の一実施形態において、本組成物は、０．５Ｈｚの周波数で測定したとき少なくとも約２００パスカルの弾性、または０．５Ｈｚの周波数で測定したとき少なくとも約１，０００パスカルの弾性を有する。別の態様において、本組成物は、０．５Ｈｚの周波数で測定したとき少なくとも約２，０００パスカルの弾性、または０．５Ｈｚの周波数で測定したとき少なくとも約４，０００パスカルの弾性を有する。
【００１３】
一実施形態において、本発明の組成物は無菌である。別の実施形態において、本組成物は、被験体の関節、例えば膝関節、肘関節、股関節、または他の付属性もしくは軸の関節への注射に適している。
【００１４】
本発明は、また関節機能不全と関係した少なくとも１つの症状を軽減する方法を提供する。本方法は、治療有効量の本発明の組成物を、投与を必要とする被験体に投与し、それによって関節機能不全と関係した少なくとも１つの症状を軽減することを含む。
【００１５】
幾つかの実施形態において、関節機能不全は、骨関節炎、関節鏡検査後、関節形成後（ｏｒｔｈｏｐｌａｓｔｙ）、傷害後もしくは長期の固定化と関係した関節痛または関節機能不全である。特定の実施形態において、関節機能不全は関節痛である。
【００１６】
幾つかの実施形態において、本発明の組成物の投与は、骨関節炎の実験的ラットモデルにおける正常および異常な運動によって誘導される神経インパルスの数の減少、例えば少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍または少なくとも５倍の減少をもたらす。
【００１７】
幾つかの実施形態において、本発明のＨＡ組成物の投与は、骨関節炎の実験的ラットモデルにおける正常な運動によって誘導される神経インパルスの数の減少、例えば少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、または少なくとも８倍の減少をもたらす。
【００１８】
幾つかの実施形態において、ＨＡ組成物の投与は、骨関節炎の実験的ラットモデルにおける異常な運動によって誘導される神経インパルスの数の減少、例えば少なくとも２倍、少なくとも３倍、または少なくとも４倍の減少をもたらす。特定の実施形態において、この減少は、匹敵する量のＳｙｎｖｉｓｃ（登録商標）の投与により引き起こされる減少より大きい。
【００１９】
幾つかの実施形態において、ＨＡ組成物は関節内注射によって投与される。
【００２０】
別の態様において、本発明は、本発明のＨＡ組成物を含むプレフィルドシリンジ、例えば無菌の注射器を、そのようなプレフィルドシリンジを含むキットとともに提供する。
【００２１】
本発明は、以下の詳細な記載および図面によってさらに例示される。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
ヒアルロナンを含む医薬組成物であって、
該ヒアルロナンが、該組成物中に約３０ｍｇ／ｍＬを超える濃度で存在し；
該ヒアルロナンは約１００万〜約２００万の間の平均分子量を有し；
該ヒアルロナンは架橋しておらず、および／または化学的改質を実質的に含まず；
ここで、該組成物は他の薬学的に活性な物質を実質的に含まない組成物。
（項目２）
前記他の薬学的に活性な物質がタンパク質である、項目１に記載の組成物。
（項目３）
前記他の薬学的に活性な物質がヒアルロナンとは異なるグリコサミノグリカンである、項目１に記載の組成物。
（項目４）
前記他の薬学的に活性な物質がヒドロキシプロピルメチルセルロースである、項目１に記載の組成物。
（項目５）
前記他の薬学的に活性な物質が局所麻酔薬である、項目１に記載の組成物。
（項目６）
前記表面麻酔薬がリドカインまたはブピバカインである、項目５に記載の組成物。
（項目７）
ヒアルロナンが、約４０ｍｇ／ｍＬ〜約６０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する、項目１に記載の組成物。
（項目８）
緩衝液をさらに含む、項目１に記載の組成物。
（項目９）
前記緩衝液がリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）である、項目８に記載の組成物。
（項目１０）
０．５Ｈｚの周波数で測定したとき少なくとも約２００パスカルの弾性を有する、項目１に記載の組成物。
（項目１１）
０．５Ｈｚの周波数で測定したとき少なくとも約１，０００パスカルの弾性を有する、項目１に記載の組成物。
（項目１２）
０．５Ｈｚの周波数で測定したとき少なくとも約２，０００パスカルの弾性を有する、項目１に記載の組成物。
（項目１３）
０．５Ｈｚの周波数で測定したとき少なくとも約４，０００パスカルの弾性を有する、項目１に記載の組成物。
（項目１４）
ヒアルロナンを含む医薬組成物であって、
該ヒアルロナンが、該組成物中に約４０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し；
該ヒアルロナンは約１００万〜約２００万の間の平均分子量を有し；
該ヒアルロナンは架橋しておらず、および／または化学的改質を実質的に含まず；
ここで、該組成物は他の薬学的に活性な物質を実質的に含まない組成物。
（項目１５）
前記他の薬学的に活性な物質がタンパク質である、項目１４に記載の組成物。
（項目１６）
前記他の薬学的に活性な物質がヒアルロナンと異なるグリコサミノグリカンである、項目１４に記載の組成物。
（項目１７）
前記他の薬学的に活性な物質がヒドロキシプロピルメチルセルロースである、項目１４に記載の組成物。
（項目１８）
前記薬学的に活性な物質が局所麻酔薬である、項目１４に記載の組成物。
（項目１９）
前記表面麻酔薬がリドカインまたはブピバカインである、項目１８に記載の組成物。
（項目２０）
緩衝液をさらに含む、項目１４に記載の組成物。
（項目２１）
前記緩衝液がリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）である、項目２０に記載の組成物。
（項目２２）
０．５Ｈｚの周波数で測定したとき少なくとも約２００パスカルの弾性を有する、項目１４に記載の組成物。
（項目２３）
０．５Ｈｚの周波数で測定したとき少なくとも約１，０００パスカルの弾性を有する、項目１４に記載の組成物。
（項目２４）
０．５Ｈｚの周波数で測定したとき少なくとも約２，０００パスカルの弾性を有する、項目１４に記載の組成物。
（項目２５）
０．５Ｈｚの周波数で測定したとき少なくとも約４，０００パスカルの弾性を有する、項目１４に記載の組成物。
（項目２６）
無菌である、項目１または１４に記載の組成物。
（項目２７）
被験体への注射に適切である、項目２６に記載の組成物。
（項目２８）
関節機能不全と関係した少なくとも１つの症状を軽減する方法であって、治療有効量の項目１に記載の組成物を、それを必要とする被験体に投与し、それによって関節機能不全と関係した少なくとも１つの症状を軽減することを含む方法。
（項目２９）
前記関節機能不全が、骨関節炎、関節鏡検査後、関節形成後（ｐｏｓｔ−ｏｒｔｈｏｐｌａｓｔｙ）、傷害後または長期間の固定化と関係した関節痛または関節機能不全である、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記関節機能不全が関節痛である、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記組成物の投与が、骨関節炎の実験ラットモデルにおいて正常な運動および異常な運動によって誘導される神経インパルスの数の減少を引き起こす、項目２８に記載の方法。
（項目３２）
前記減少が少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍または少なくとも５倍である、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記組成物の投与が、骨関節炎の実験ラットモデルにおいて正常な運動によって誘導される神経インパルスの数の減少を引き起こす、項目２８に記載の方法。
（項目３４）
前記減少が、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍または少なくとも８倍である、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記組成物の投与が、骨関節炎の実験ラットモデルにおいて異常な運動によって誘導される神経インパルスの数の減少を引き起こす、項目２８に記載の方法。
（項目３６）
前記減少が少なくとも２倍、少なくとも３倍または少なくとも４倍である、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記減少が匹敵する量のＳｙｎｖｉｓｃ（登録商標）の投与により引き起こされる減少より大きい、項目３１、３３および３５に記載の方法。
（項目３８）
前記組成物が関節内注射によって投与される、項目２８に記載の方法。
（項目３９）
項目１または１４に記載の組成物を含むデバイス。
（項目４０）
前記デバイスがプレフィルドシリンジである、項目３９に記載のデバイス。
（項目４１）
前記プレフィルドシリンジが５ｍｌのプレフィルドシリンジである、項目３９に記載のデバイス。
（項目４２）
前記プレフィルドシリンジが殺菌されている、項目４０に記載のデバイス。
（項目４３）
項目４０に記載の前記プレフィルドシリンジを含むキット。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１パネルＡは、粘性補充のために使用される市販ＨＡ組成物について周波数（Ｈｚ）の関数としてのＧ’値（パスカル）を示すグラフである。図１パネルＢは、本発明のＨＡ組成物（Ｅｌａｓｔｏｖｉｓｃ（商標））について周波数（Ｈｚ）の関数としてのＧ’値（パスカル）を示すグラフである。この図は、本発明の組成物が、試験したＨＡ市販品のいずれよりもさらに高いＧ’値を特徴とすることを実証する。
【００２３】
【図２Ａ】図２パネルＡは、Ｓｙｎｖｉｓｃ（登録商標）および本発明の様々なＨＡ組成物の注射後の時間の関数として、炎症を起こした関節の運動当たりの神経インパルスの数を示すグラフである。
【００２４】
【図２Ｂ】図２パネルＢは、炎症を起こした関節において運動当たりの神経インパルスの平均数を、本発明の４％ＨＡ組成物の分子量の関数として示すグラフである。
【００２５】
【図２Ｃ】図２パネルＣは、炎症を起こした関節において運動当たりの神経インパルスの平均数をＨＡ濃度の関数として示すグラフである。
【００２６】
【図２Ｄ】図２パネルＤは、炎症を起こした関節において様々な試験ＨＡ組成物について運動当たりの神経インパルスの平均数を示す棒グラフである。
【００２７】
【図３】図３は、食塩溶液、Ｓｙｎｖｉｓｃ（登録商標）または本発明のＨＡ組成物（Ｅｌａｓｔｏｖｉｓｃ（商標）、４％ＨＡ、平均分子量１００万〜２００万）による注射に続いて、関節運動サイクルについての非有害成分によって誘起された神経インパルスの数を、炎症を起こしたラット関節において測定した時間の関数として示すグラフである。
【００２８】
【図４】図４は、食塩溶液、Ｓｙｎｖｉｓｃ（登録商標）または本発明のＨＡ組成物（Ｅｌａｓｔｏｖｉｓｃ（商標）、４％ＨＡ、平均分子量１００万〜２００万）による注射に続いて、運動サイクルについての有害成分によって誘起された神経インパルスの数を、炎症を起こしたラット関節において測定した時間の関数として示すグラフである。
【００２９】
【図５】図５パネルＡは、炎症の発現、続いて食塩水または本発明の４％ＨＡ組成物の関節内注射後、異なった時間に記録した運動当たりインパルスの平均合計数を示す。図５パネルＢは、食塩水または４％ＨＡの注射後、注射に続く異なった時間に測定した運動当たりインパルスの平均合計数のパーセントの差を示す。
【００３０】
【図６】図６パネルＡは、２４時間前の本発明の４％ＨＡ組成物の関節内注射に続いて、３つの注射されていない無傷の関節（白丸）、および７つの無傷の関節（黒丸）の反復運動を含む運動当たりのインパルスの平均数を示すグラフである。図６パネルＢは、注射されていない無傷の関節、および２４時間前の本発明の４％ＨＡ組成物を注射した無傷の関節で測定した運動当たりの運動誘起インパルスの平均値を示す棒グラフである。図６パネルＣは、無傷の膝関節への４％ＨＡ組成物の関節内注射に続いて異なったラットの２つの異なった関節侵害受容器線維において運動誘起活性の低下の時間経過を示すグラフである。
【００３１】
【図７】図７は、食塩水または異なった３つの体積の本発明のＨＡ組成物（Ｅｌａｓｔｏｖｉｓｃ（商標））での関節内注射に続いて、無傷のラット関節において測定した時間の関数として運動誘起神経インパルスの数を示すグラフである。
【００３２】
【図８】図８パネルＡ１およびＡ２は、食塩水（Ａ１）または４００μｇ／ｍＬ  ＨＡ（Ａ２）を用いる灌流後、ＨＥＫ−ＴＲＰＶ１−ＥＹＦＰ（＋）細胞において熱によって誘起された細胞内カルシウムの上昇を示す。パネルＡ３は、対照食塩溶液中、およびＨＥＫ−ＴＲＰＶ１−ＥＹＦＰ（＋）細胞に対してＨＡを用いる灌流中に逐次的な熱パルスによって誘起される応答間の平均振幅変化の比を示す。図８パネルＢ１およびＢ２は、食塩水（Ｂ１）または４００μｇ／ｍＬ  ＨＡ（Ｂ２）を用いる灌流後、ＤＲＧ成体神経細胞において熱によって誘起される細胞内カルシウムの上昇を示す。パネルＢ３は、対照食塩溶液中、およびＤＲＧ成体神経細胞の４００μｇ／ｍＬ  ＨＡを用いる灌流中に逐次的な熱パルスによって誘起される応答間の平均振幅変化の比を示す。図８パネルＣ１およびＣ２は、ＨＥＫ−ＴＲＰＶ１−ＥＹＦＰ（＋）細胞において対照溶液（Ｃ１）中および４００μｇ／ｍＬ  ＨＡ（Ｃ２）への曝露下での、１００ｎＭカプサイシンおよび１０μＭカルバコールに応答する細胞内カルシウムの上昇を示す。パネルＣ３は、対照食塩溶液を用いるおよびＨＡの存在下での灌流中のＨＥＫ−ＴＲＰＶ１−ＥＹＦＰ（＋）細胞においてカプサイシン（黒い棒）およびカルバコール（縞付き棒）に対する応答の平均振幅を示す。図８パネルＤ１およびＤ２は、食塩水（Ｄ１）および４００μｇ／ｍＬ  ＨＡ（Ｄ２）を用いる灌流中に、１００ｎＭカプサイシンおよび３０ｍＭ  ＫＣｌへのＤＲＧ成体感覚神経細胞の細胞内カルシウムの応答を示す。パネルＤ３は、対照食塩溶液中、およびＨＡの存在下でのカプサイシン（黒い棒）またはＫＣｌ（縞付き棒）に対する細胞内カルシウムの応答の平均振幅を示す。
【００３３】
【図９】図９パネルＡは、食塩溶液中（黒い線）、および４００μｇ／ｍｌ  ＨＡ溶液中（灰色の線）のＨＥＫ−２９３−ＴＲＰＶ１細胞においてカプサイシン誘起電流のＩ−Ｖ関係を示す。図９パネルＢは、パネルＡに示したＩ−Ｖ曲線から得られる、＋８０ｍＶの電位で測定した平均電流を示す。図９パネルＣは、線形コンダクタンスにボルツマン活性化項(Boltzmann  activation  term)を乗じて組み合わせる(combine)関数、Ｉ＝ｇ×（Ｖ−Ｅｒｅｖ）／（１＋ｅｘｐ（（Ｖ１／２−Ｖ／Ｓ））にあてはめた、傾斜から測定された異なったパラメータの値を示す。図９パネルＤは、対照条件（上の線）で、および３０分間予備インキュベートし連続的にＨＡを用いて潅流した細胞（下の線）において１μＭカプサイシンに応答する、−６０ｍＶの電位で測定した細胞全体の電流を示す。図９パネルＥは、食塩水中およびＨＡの存在下で−６０ｍＶでカプサイシンによって誘起されるＨＥＫ−２９３−ＴＲＰＶ１細胞におけるピーク電流の平均値を示す。
【００３４】
【図１０】図１０パネルＡは、食塩溶液を用いる灌流下でのＴＲＰＶ１の単一チャネル活性の試料記録を示す。図１０パネルＢは、ＨＡ中でインキュベートしＨＡ溶液を用いる灌流下に記録した細胞からの単一チャネル活性についての試料記録を示す。挿入図は、各記録の単一チャネルの振幅確率ヒストグラムを表す。図１０パネルＣは、対照条件（黒四角）で、およびＨＡへの曝露後（灰色の円）に得られたＩ−Ｖ曲線を示す。図１０パネルＤは、個々のパッチから得られた単一チャネルの振幅を示し、四角（対照）および丸（ＨＡ処置）として表す。図１０パネルＥは、異なるパッチについて開口状態の確率を示す。より大きな記号は、パネルＡおよびＢに示す線において実施した測定からのデータを表す。
【００３５】
【図１１】図１１パネルＡは、食塩溶液を用いて潅流した単一ＤＲＧ神経細胞においてカプサイシンに対する応答の試料記録を示す。図１１パネルＢは、ＨＡで処置しＨＡの存在下で記録したＤＲＧ神経細胞におけるカプサイシン刺激についての試料記録を示す。図１１パネルＣは、ＨＡで処置したＤＲＧ神経細胞における試料記録を示し、ここでカプサイシンに対する応答は除かれたが、ＫＣｌに対する正常応答はなお誘起された。図１１パネルＤは、対照条件下で、およびＨＡへの曝露後、ＤＲＧ神経細胞の平均発火頻度（左）および個別のデータ（右）を示す。
【００３６】
【図１２】図１２は、野生型（左パネル）、およびＴＲＰＶ１ノックアウトマウス（右パネル）において、１０μｌの無菌食塩水、ＨＡ、ヒアルロニダーゼ（Ｈｙａｓａ  ６Ｕ）またはヒアルロニダーゼの足への皮下注射、続いてＨＡの別の注射の後、プレート温度５２℃へのホットプレート試験でマウスの侵害受容反応の潜伏時間を示す。
【００３７】
【図１３】図１３パネルＡは、麻酔をかけたラットにおいて関節運動によって誘起される神経インパルス活性を示す。図１３パネルＢは、関節運動によって活性化された神経線維の１つについての拡大した線である。パネルＢは、関節動脈（上の線）へのカプサイシンの高速のボーラス注射によってこの神経線維が動員されることを示す。ＨＡの関節内注射に続いて、カプサイシンに対する応答は経時的に徐々に低下する（中間の線、１８０分；下の線、２４０分）。図１３パネルＣは、関節内の食塩水（黒い四角）またはＨＡ（白い四角）の注射を受けた動物で測定して動脈内のカプサイシンに対する発火応答の平均値を示すグラフである。
【００３８】
【図１４】図１４は、異なったサイズの針によって４％ＨＡ溶液を排出するのに必要とする圧力を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
発明の詳細な説明
本発明は、高濃度のヒアルロナン（ＨＡ）を含む組成物を提供する。そのような組成物は、高い弾性、例えば０．１〜１０Ｈｚの周波数で測定されたときに高い弾性率Ｇ’を有すると決定した。高弾性を特徴とするＨＡ組成物、例えば高濃度のＨＡを含む組成物は、骨関節炎によって引き起こされる関節痛などの関節痛の処置で驚くほど効果的であることが今回発見された。本発明の組成物に含まれるＨＡの平均分子量は、２００万またはそれ未満、例えば、約１００万〜２００万の間であってもよい。
【００４０】
以前は、関節痛の処置におけるＨＡ組成物の有効性は、ＨＡの濃度ではなくその平均分子量に依存すると考えられていたので上記発見は意外であった。特に、高い平均分子量のＨＡ組成物、例えば、２００万より大きい平均分子量を有するＨＡを含む組成物が、関節痛を処置するために最も効果的であると考えられていた。
【００４１】
ヒアルロナン（ヒアルロン酸またはヒアルロナートまたはＨＡとも呼ばれる）は、関節液、およびそのまわりの滑膜組織中に存在するグリコサミノグリカンである。この高度に弾粘性で多分散の多糖類は、関節窩を囲む結合組織である滑膜中の細胞間隙を満たす滑液の主成分である。
【００４２】
滑液の弾粘性特性はその生理学的機能に重要である。滑液は、関節内の代謝にとって重要な流体の運動に関与する粘性流動が可能でなければならない。しかし、同じ滑液は、また、組織表面、線維構造、神経終末および細胞の変形を制限する方法で、関節への機械的応力の衝撃を蓄えるために弾性特性を使用し、ショックアブソーバーとして振る舞わなければならない。
【００４３】
滑液および組織中に含まれるＨＡの、異なった型の運動に対する関節の応答を調整する能力は、ＨＡが粘性特性と弾性特性の両方を有するという事実によって説明される。遅い運動中には、組織を満たす滑液は、低い変形周波数にさらされ、エネルギーがヒアルロナンネットワークに伝搬する速度は、ヒアルロナン分子がその配置（ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）を調節し流動の方向に整列する時間を与えるのに十分に低い。このようにして、遅い運動中に、滑液に加えられたエネルギーは、主に粘性流動および熱として放散される。また、ヒアルロナン分子のこの整列は、滑液の擬似塑性（ずり減粘、すなわち流速の増加に伴う粘度の減少）に関与する。しかし、滑液中のヒアルロナンネットワークがランニングまたは跳躍中などの高い変形速度にさらされる場合、応力は急速に移動し、そのため、ヒアルロナン分子はその配置を調節する十分な時間がない。代わりに、ＨＡは、コイル状分子のショックアブソーバーとして働き、弾性変形として伝搬されるエネルギーを保存し弾性固体のように振る舞う。
【００４４】
印加される機械的応力の歪み周波数は、ヒアルロナンが主に、粘性流体としてか、それとも弾性ショックアブソーバーとして働くのかを決定する。２つの値が弾粘性流体のレオロジープロファイルを記載するために使用される：弾性率（Ｇ’）は弾性の指標であるが、粘性率Ｇ”は粘性の指標である。ＨＡが高い変形速度（例えばランニングまたは跳躍中）にさらされる場合、ＨＡ分子はコイル状分子のショックアブソーバーとして働き、弾性固体のように振る舞う。ＨＡが低い変形速度（例えば遅い運動中）にさらされる場合、滑液に加えられたエネルギーは粘性流動および熱として放散される。
【００４５】
１９６０年代に、ヒアルロナンが、炎症を起こした膝関節に注射されたとき、疼痛を軽減することが発見された。この発見の結果、高度に精製されたＨＡ溶液が、ヒトおよび動物の関節痛の処置のために開発された。この新しい治療薬の使用は、粘性補充と呼ばれた。ＨＡは弾粘性の覆いとして働くことができ、有害刺激による痛覚神経線維の活性化に関与するイオンチャネルに達する機械力を低下させ、それによって特定のチャネルの開口確率を減少させて痛覚末端の神経インパルスの数を減少させ、こうして痛覚を軽減する。痛覚受容器に対する保護の増加が関節の治癒プロセスを改善することもまた示された。
【００４６】
健常な個体のヒト滑液中のヒアルロナンの平均分子量は、３００万〜４００万の間にあるが、病的な関節中のヒアルロナンの平均分子量は５０万〜２００万の間にある。関節痛、例えば骨関節炎と関係した関節痛（ｐａｉｎｔ）の処置に使用されるヒアルロナンは、健常な関節中に存在するヒアルロナンと同程度か、またはさらに高い平均分子量がなければならないと考えられた。疼痛および炎症を軽減するために、関節が病的（痛みを伴う）になる前の関節中に存在するのと同じサイズかより大きなサイズである高い平均分子量のヒアルロナンが使用された。
【００４７】
健常なヒト膝関節の滑液において、ヒアルロナンは、およそ３２１ｍｇ／１００ｍＬの平均濃度（２５０〜３６８／ｍｇ／１００ｍＬの範囲）で見出される。病的な関節において、滑液は、たいていは１００ｍＬ当たり４０〜１８８ｍｇの間のより低濃度を有することがわかっている。また、関節痛の、例えば骨関節炎と関係した関節痛において、処置に使用されるヒアルロナンは、健常な関節中に存在するヒアルロナンと同じまたはさらに高濃度で投与されなければならないと考えられた。痛みを伴うか、そうでなければ病的な関節への注射のための市販ヒアルロナン組成物は、最大２．２％（２２ｍｇ／ｍＬ）の濃度を有する。このように、関節への注射に利用可能な組成物中のヒアルロナンの濃度は、健常な関節中のヒアルロナンの濃度よりはるかに高い。
【００４８】
関節機能の改善、および関節機能と関係した疼痛の処置のための世界中の市場には幾つかのヒアルロナン製品がある（例えば実施例１中の表１参照）。これらの製品は、一般に高い平均分子量かつ比較的低濃度（１〜２．２％）のヒアルロナンを有する。上記に認められるように、健常な個体のヒト滑液中のヒアルロナンは３００万〜４００万の平均分子量である。高い平均分子量を有するヒアルロナンは、関節痛の処置において最も効果的であると考えられた。
【００４９】
超高純度のヒアルロナン製品Ｓｙｎｖｉｓｃ（登録商標）（例えばＥｎｄｒｅ  Ａ．Ｂａｌａｚｓによって米国特許第４，１４１，９７３号に記載されている）は、粘性補充に利用可能な最も高い平均分子量（５００万）を有するヒアルロナン製品であり、病的な動物およびヒト関節における最も活性な「鎮痛剤(pain  killer)」であることがわかった。Ｓｙｎｖｉｓｃ（登録商標）は、また２０％の、架橋し高度に水和したヒアルロナンゲルを含む。Ｓｙｎｖｉｓｃ（登録商標）は、正常なおよび炎症を起こした関節の運動によって誘起される感覚線維中のインパルス活性を低下させて、それによって、関節機能と関係した疼痛を軽減する。Ｓｙｎｖｉｓｃ（登録商標）は、疼痛の処置における現在利用可能な市販ＨＡ製品のうちで最も効果的であると考えられる。しかし、高い平均分子量を有する無菌のヒアルロナンの製造は難問であり、これが、Ｓｙｎｖｉｓｃ（登録商標）以外のすべての市販のヒアルロナン製品が著しく低い平均分子量を有するという理由であると考えられる。
【００５０】
現在市場に出回っている多数のヒアルロナン製品が、約０．８％（Ｓｙｎｖｉｓｃ（登録商標））、１．０％（Ｅｕｆｌｅｘｘａ（登録商標）、Ｓｕｐａｒｔｚ（登録商標）、Ｈｙａｌｇａｎ（登録商標）、Ｇｅｌ−Ｏｎｅ（登録商標）、Ｓｙｎｏｃｒｏｍ（登録商標）、Ｓｙｎｏｃｒｏｍ（登録商標）Ｍｉｎｉ）、１．５％（Ｏｒｔｈｏｖｉｓｃ（登録商標））、２％（Ｓｙｎｏｃｒｏｍ（登録商標）Ｆｏｒｔｅ、Ｓｙｎｏｃｒｏｍ（登録商標）Ｆｏｒｔｅ  Ｏｎｅ、Ｓｙｎｏｌｉｓ  Ｖ−Ａ）または２．２％（Ｍｏｎｏｖｉｓｃ（登録商標））のヒアルロナンの濃度を有する。これらのヒアルロナン製品は、０．８〜２．２％以下のヒアルロナンの百分率を有するが、それは、そのような濃度が健常な組織中の濃度より既にはるかに高いからである。０．８〜２．２％よりさらに高い濃度は、健常なヒト関節中のヒアルロナン濃度と比較して高すぎると当技術分野では見なされた。
【００５１】
炎症を起こし痛みを伴う関節は、低弾性を有するＨＡ組成物より、高弾性のＨＡ組成物により応答性であることが、今回初めて認識された。したがって、本発明は、高い弾性特性を有するヒアルロナンの組成物を提供し、低弾性を有するヒアルロナンの現在利用可能な組成物と比較して、高い弾性特性を有するヒアルロナンの組成物（例えばＥｌａｓｔｏｖｉｓｃ（商標））の関節痛の処置において優れた特性を示す。本明細書において開示される高い弾性特性を有するヒアルロナンの組成物（例えばＥｌａｓｔｏｖｉｓｃ（商標））は、関節におけるヒアルロナンの抗疼痛効果が製品の粘性でなくその弾性に依存するという発見に基づく。したがって、本明細書において開示されるヒアルロナンの組成物の治療上の成功は、使用されるヒアルロナン組成物の弾性に依存する。特定のメカニズムに制約されないが、本明細書において提供される高弾性のヒアルロナン濃度は、長い時間（例えば、数週間またはそれより長く）関節中に存続し、痛覚受容器に作用するだけでなく、疼痛を引き起こす化学因子と相互作用し、および／またはそれを除去すると考えられる。
【００５２】
本明細書において開示されるように、一実施形態において、高弾性を有するヒアルロナンの組成物は、組成物中のヒアルロナンの濃度を高めることにより作製することができる。予想外にも、高濃度のヒアルロナンを有する、さらに１００万〜２００万の平均分子量を有するヒアルロナンの組成物が関節痛の処置に使用することができることが本明細書において示される。本発明以前には、高い平均分子量のヒアルロナンの組成物（例えばＳｙｎｖｉｓｃ（登録商標））のみが強い疼痛軽減効果を有し得ると考えられたので、この結果は意外である。本発明以前には、０．８〜２．２％を超える濃度（健常な関節中に見出される濃度より既にはるかに高い）には、追加の有益な効果がないか、または、これが健常な関節中の濃度と比較して高すぎる可能性すらあると考えられたので、この結果はさらに意外である。さらに、本発明者らは、高濃度のＨＡ分子が侵害受容器のＴＲＰＶ１チャネルとの相互作用を容易にし、それによって有害刺激に対する侵害受容器の応答性を減少させることを発見した。
【００５３】
Ｉ．  本発明のヒアルロナン組成物
【００５４】
本発明は、ヒアルロナン（ＨＡ）を含む医薬組成物を提供する。幾つかの実施形態において、本発明の組成物は、約３０ｍｇ／ｍＬより高い（または約３％重量／体積より高い）濃度で組成物中に存在するヒアルロナンを含み；ヒアルロナンは約１００万〜約２００万の間の平均分子量を有し；ヒアルロナンは架橋しておらず、および／または化学的改質を実質的に含まず；ここで、組成物は、他の薬学的に活性な物質を実質的に含まない。
【００５５】
例えば、本発明の組成物中のＨＡ濃度は、約３０ｍｇ／ｍＬ（または約３％ｗ／ｖ）、約３５ｍｇ／ｍＬ（または約３．５％ｗ／ｖ）、約４０ｍｇ／ｍＬ（または約４％ｗ／ｖ）、約４５ｍｇ／ｍＬ（または約４．５％ｗ／ｖ）、約５０ｍｇ／ｍＬ（または約５％ｗ／ｖ）、約５５ｍｇ／ｍＬ（または約５．５％ｗ／ｖ）、約６０ｍｇ／ｍＬ（または約６％ｗ／ｖ）、約６５ｍｇ／ｍＬ（または約６．５％ｗ／ｖ）、約７０ｍｇ／ｍＬ（または約７％ｗ／ｖ）、約７５ｍｇ／ｍＬ（または約７．５％ｗ／ｖ）、約８０ｍｇ／ｍＬ（または約８％ｗ／ｖ）、約８５ｍｇ／ｍＬ（または約８．５％ｗ／ｖ）、約９０ｍｇ／ｍＬ（または約９％ｗ／ｖ）、約９５ｍｇ／ｍＬ（または約９．５％ｗ／ｖ）、約１００ｍｇ／ｍＬ（または約１０％ｗ／ｖ）、約１０５ｍｇ／ｍＬ（または約１０．５％ｗ／ｖ）、約１１０ｍｇ／ｍＬ（または約１１％ｗ／ｖ）、約１１５ｍｇ／ｍＬ（または約１１．５％ｗ／ｖ）、約１２０ｍｇ／ｍＬ（または約１２％ｗ／ｖ）、約１２５ｍｇ／ｍＬ（または約１２．５％ｗ／ｖ）、約１３０ｍｇ／ｍＬ（または約１３％ｗ／ｖ）、約１３５ｍｇ／ｍＬ（または約１３．５％ｗ／ｖ）、約１４０ｍｇ／ｍＬ（または約１４％ｗ／ｖ）、約１４５ｍｇ／ｍＬ（または約１４．５％ｗ／ｖ）、または約１５０ｍｇ／ｍＬ（または約１５％ｗ／ｖ）であり得る。特定の実施形態において、ＨＡは、約４０ｍｇ／ｍＬ（または約４％ｗ／ｖ）の濃度で組成物中に存在する。別の特定の実施形態において、ＨＡは、約６０ｍｇ／ｍＬ（または約６％ｗ／ｖ）の濃度で本発明の組成物中に存在する。
【００５６】
特定の実施形態において、本発明の組成物において使用されるヒアルロナンは架橋しておらず、および／または化学的改質を含まない。例えば、本発明の組成物において使用されるヒアルロナンは、例えば欧州特許第１０９５０６４Ｂ１号明細書に記載されているＨＡのカルボキシル基と誘導体化剤のアミン基との間の反応によって形成され得るアミド化を含まない。また、本発明の組成物において使用されるヒアルロナンは、例えば米国特許第８，３２３，６１７号に記載されている、モノカルボジイミドまたはビスカルボジイミドなどのカルボジイミドとのヒアルロナンの反応から生じ得る化学的改質および／または架橋を含まなくてもよい。
【００５７】
幾つかの実施形態において、本発明のＨＡ組成物は他の薬学的に活性な物質を含まない。本明細書において使用される場合、「薬学的に活性な物質」は、被験体、例えばヒト、または動物被験体に生物学的作用を及ぼすことができる物質である。この用語「薬学的に活性な物質」は、また、ＨＡ組成物が被験体に投与される場合、該組成物の生物学的作用を調整することができる、例えば、ＨＡ組成物が炎症を起こした関節において疼痛を軽減する能力を調整することができる物質を含む。特定の実施形態において、薬学的に活性な物質は、タンパク質、例えばｒｈＧＤＦ−５などの骨形成因子（ＢＭＰ）である。特定の実施形態において、薬学的に活性な物質は、ＨＡとは異なるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、例えばコンドロイチンである。幾つかの実施形態において、薬学的に活性な物質はヒドロキシプロピルメチルセルロースである。他の実施形態において、薬学的に活性な物質は、リドカインまたはブピバカインなどの表面麻酔薬（topical  anesthetic）である。
【００５８】
ある実施形態において、本発明のＨＡ組成物は、ソルビトールなどのフリーラジカルを捕捉することができる分子を含まない。他の実施形態において、本発明のＨＡ組成物は、ＨＡの弾性を減じる分子、例えば、デキストランまたはスクロースを含まない。
【００５９】
幾つかの実施形態において、本発明のＨＡ組成物は、生理学的緩衝液、例えばリン酸緩衝液または重炭酸緩衝液中で約３０ｍｇ／ｍＬ（約３％ｗ／ｖ）より高い、または約４０ｍｇ／ｍＬ（約４％ｗ／ｖ）の濃度で存在し、約１００万〜約２００万の間の平均分子量を有するＨＡから本質的になる。特定の実施形態において、本発明のＨＡ組成物は、約４０ｍｇ／ｍＬ（または約４％ｗ／ｖ）の濃度で存在し、約１００万〜約２００万の間の平均分子量を有するＨＡから本質的になる。
【００６０】
別の実施形態において、本発明のＨＡ組成物は、注射デバイス（針、トロカール、カニューレまたは灌流デバイス）を使用する注射によってそれを必要とする被験体に投与されてもよい。本発明のＨＡ組成物を注射するのに適する注射デバイスは、２．１１ｍｍまたはそれを超える公称直径（１４Ｇの針、または１４の針規格より大きい針に対応する）を有していてもよい。幾つかの実施形態において、より小さい針、例えば公称直径が２．１１ｍｍ未満の針を使用する投与にとって本発明のＨＡ組成物は高粘度過ぎる可能性がある。他の実施形態において、本発明のＨＡ組成物は、２．１１ｍｍ未満の公称直径を有するより小さい注射デバイスを使用して、投与を可能にし得る。
【００６１】
例えば、注射器などの本発明のＨＡ組成物を注射するのに適するデバイスは、それぞれ、３０、２９、２８、２７、２６ｓ、２６、２５．５、２５ｓ、２５、２４．５、２４、２３．５、２３ｓ、２３、２２．５、２２ｓ、２２、２１．５、２１、２０．５、２０、１９．５、１９、１８．５、１８、１７．５、１７、１６．５、１６、１５．５、１５、１４．５、１４、１３．５、１３、１２．５または１２（または３０Ｇ、２９Ｇ、２８Ｇ、２７Ｇ、２６ｓＧ、２６Ｇ、２５．５Ｇ、２５ｓＧ、２５Ｇ、２４．５Ｇ、２４Ｇ、２３．５Ｇ、２３ｓＧ、２３Ｇ、２２．５Ｇ、２２ｓＧ、２２Ｇ、２１．５Ｇ、２１Ｇ、２０．５Ｇ、２０Ｇ、１９．５Ｇ、１９Ｇ、１８．５Ｇ、１８Ｇ、１７．５Ｇ、１７Ｇ、１６．５Ｇ、１６Ｇ、１５．５Ｇ、１５Ｇ、１４．５Ｇ、１４Ｇ、１３．５Ｇ、１３Ｇ、１２．５Ｇまたは１２Ｇの針）の規格に対応する、約０．３１ｍｍ、０．３４ｍｍ、０．３６ｍｍ、０．４１ｍｍ、０．４７４ｍｍ、０．４６ｍｍ、０．４９ｍｍ、０．５１５ｍｍ、０．５１ｍｍ、０．５４ｍｍ、０．５７ｍｍ、０．５９ｍｍ、０．６４２ｍｍ、０．６４ｍｍ、０．６７ｍｍ、０．７１８ｍｍ、０．７２ｍｍ、０．７７ｍｍ、０．８２ｍｍ、０．８７ｍｍ、０．９１ｍｍ、約０．９９ｍｍ、約１．０７ｍｍ、約１．１７ｍｍ、約１．２７ｍｍ、約１．４２ｍｍ、約１．４７ｍｍ、約１．５７ｍｍ、約１．６５ｍｍ、約１．７３ｍｍ、約１．８３ｍｍ、約１．９８ｍｍ、約２．１１ｍｍ、約２．２６ｍｍ、約２．４１ｍｍ、約２．５４ｍｍまたは約２．７７ｍｍの公称直径を有していてもよい。一実施形態において、本発明のＨＡ組成物は、約１．２７ｍｍの公称直径を有する１８Ｇの注射針を使用して投与されてもよい。幾つかの実施形態において、より小さい針、例えば、の公称直径を有する針、を使用する投与にとって本発明のＨＡ組成物は高粘度過ぎる可能性がある。
【００６２】
本発明の組成物中のヒアルロナンは、０．５Ｈｚの周波数で測定したとき少なくとも１００パスカルの弾性、または０．５Ｈｚの周波数で測定したとき少なくとも４００パスカルの弾性、または０．５Ｈｚの周波数で測定したとき少なくとも１，０００パスカルの弾性、または０．５Ｈｚの周波数で測定したとき少なくとも２，０００パスカルの弾性、または０．５Ｈｚの周波数で測定したとき少なくとも４，０００パスカルの弾性、または０．５Ｈｚの周波数で測定したとき４００〜５，０００パスカルの間の弾性を有することができる。
【００６３】
様々な方法がヒアルロナンなどのバイオポリマーの弾性の測定に利用可能であることが認識されるべきである。一実施形態において、本発明は、高弾性を有するヒアルロナンを含む組成物を提供し、ここで、弾性は特定の周波数（ヘルツで表される）で圧力（パスカルで表される）として測定される。幾つかの実施形態において、本明細書において使用される周波数は、特定の関節の運動に対応する。例えば、本明細書において提供されるヒアルロナン組成物の弾性を評価するために使用されてもよい周波数は、０．５Ｈｚ（歩行に対応する）、２．５Ｈｚ（ランニングに対応する）、または５．０Ｈｚ（跳躍に対応する）で測定されてもよい。これらの周波数は膝関節に適用可能であるが、同様の曝露（例えば股、くるぶし（ａｎｋｌｅ））を有する他の関節は同じ応力周波数を経験し得る。さらに、弾性は、膝機能（例えば歩行、ランニング）と関係した特定の機能での圧力として表されていてもよく、弾性はまた、非歩行運動（例えば肘もしくは肩の回転、または手首の運動）によって働かせた圧力として表されてもよい。
【００６４】
さらに弾性を任意の適切な周波数で表わすことができることは認識されるべきである。このように、例えば、一実施形態において、弾性は２．５Ｈｚの「ランニング」周波数に基づいて表され、高弾性を有するヒアルロナンを含む組成物は、２．５Ｈｚの周波数で少なくとも２００Ｐａの弾性を有する組成物である。同様に、一実施形態において、弾性は５．０Ｈｚの「跳躍」周波数に基づいて表され、高弾性を有するヒアルロナンを含む組成物は、５．０Ｈｚの周波数で少なくとも４００Ｐａの弾性を有する組成物である。
【００６５】
一態様において、本発明は、０．５Ｈｚの周波数で測定したとき少なくとも１００パスカルの弾性を有する、ヒアルロナンを含む組成物を提供する。幾つかの実施形態において、本組成物は、２．５Ｈｚの周波数で測定したとき少なくとも３００パスカルの弾性を有する。幾つかの実施形態において、本組成物は、５．０Ｈｚの周波数で測定したとき少なくとも３５０パスカルの弾性を有する。
【００６６】
一態様において、本発明は、０．５Ｈｚの周波数で測定したとき少なくとも４００パスカルの弾性を有する、ヒアルロナンを含む組成物を提供する。幾つかの実施形態において、本組成物は、２．５Ｈｚの周波数で測定したとき少なくとも７５０パスカルの弾性を有する。幾つかの実施形態において、本組成物は、５．０Ｈｚの周波数で測定したとき少なくとも９００パスカルの弾性を有する。
【００６７】
一態様において、本発明は、０．５Ｈｚの周波数で測定したとき少なくとも１０００パスカルの弾性を有する、ヒアルロナンを含む組成物を提供する。幾つかの実施形態において、本組成物は、２．５Ｈｚの周波数で測定したとき、少なくとも１６００パスカルの弾性を有する。幾つかの実施形態において、本組成物は、５．０Ｈｚの周波数で測定したとき少なくとも２０００パスカルの弾性を有する。
【００６８】
一態様において、本発明は、０．５Ｈｚの周波数で測定したとき少なくとも２６００パスカルの弾性を有する、ヒアルロナンを含む組成物を提供する。幾つかの実施形態において、本組成物は、２．５Ｈｚの周波数で測定したとき少なくとも４０００パスカルの弾性を有する。幾つかの実施形態において、本組成物は、５．０Ｈｚの周波数で測定したとき少なくとも４５００パスカルの弾性を有する。
【００６９】
一態様において、本発明は、０．５Ｈｚの周波数で測定したとき少なくとも４０００パスカルの弾性を有する、ヒアルロナンを含む組成物を提供する。幾つかの実施形態において、本組成物は、２．５Ｈｚの周波数で測定したとき少なくとも５０００パスカルの弾性を有する。幾つかの実施形態において、本組成物は、５．０Ｈｚの周波数で測定したとき少なくとも６０００パスカルの弾性を有する。
【００７０】
幾つかの実施形態において、本組成物は、０．５Ｈｚの周波数で測定したとき１００〜１０，０００パスカルの間の弾性を有する。幾つかの実施形態において、本組成物は、０．５Ｈｚの周波数で測定したとき４００〜５，０００パスカルの間の弾性を有する。幾つかの実施形態において、本組成物は、０．５Ｈｚの周波数で測定したとき１，０００〜２，０００パスカルの間の弾性を有する。
【００７１】
幾つかの実施形態において、本組成物は、２．５Ｈｚの周波数で測定したとき３００〜１０，０００パスカルの間の弾性を有する。幾つかの実施形態において、本組成物は、２．５Ｈｚの周波数で測定したとき７５０〜６，０００パスカルの間の弾性を有する。幾つかの実施形態において、本組成物は、２．５Ｈｚの周波数で測定したとき１，５００〜４，０００パスカルの間の弾性を有する。
【００７２】
幾つかの実施形態において、本組成物は、５．０Ｈｚの周波数で測定したとき３００〜１０，０００パスカルの間の弾性を有する。幾つかの実施形態において、本組成物は、５．０Ｈｚの周波数で測定したとき９００〜７，０００パスカルの間の弾性を有する。幾つかの実施形態において、本組成物は、５．０Ｈｚの周波数で測定したとき２，０００〜５，０００パスカルの間の弾性を有する。
【００７３】
幾つかの実施形態において、弾性は適切なデバイス（例えばレオメータ）の使用により測定される。幾つかの実施形態において、弾性は、Ｓｔｒｅｓｓｔｅｃｈ  Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｈｅｏｍｅｔｅｒ（Ｒｅｏｌｏｇｉｃａ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＡＢ）の使用により測定される。幾つかの実施形態において、弾性は周囲温度および周囲圧力で決定される。しかし、弾性が非周囲温度および／または非周囲圧力で測定されてもよいことは認識されるべきである。さらに、当業者が、様々な温度および圧力で決定した弾性の大きさを周囲温度および周囲圧力での弾性の大きさに変換する方法を知っていることは認識されるべきである。
【００７４】
本明細書において開示されるように、ヒアルロナンの高弾性組成物は、組成物中のヒアルロナンの濃度を高めることにより調製することができる。このようにして、一態様において、本発明は、ヒアルロナンの高い百分率を含み、高弾性を有する組成物を提供する。例えば、本発明の組成物は、少なくとも３．０％のヒアルロナン（重量／体積）、少なくとも３．５％のヒアルロナン（重量／体積）、少なくとも４．０％のヒアルロナン（重量／体積）、少なくとも４．５％のヒアルロナン（重量／体積）、少なくとも５．０％のヒアルロナン（重量／体積）、少なくとも５．５％のヒアルロナン（重量／体積）、少なくとも６．０％のヒアルロナン（重量／体積）、少なくとも６．５％のヒアルロナン（重量／体積）、少なくとも７．０％のヒアルロナン（重量／体積）、少なくとも７．５％のヒアルロナン（重量／体積）、少なくとも８．０％のヒアルロナン（重量／体積）、少なくとも８．５％のヒアルロナン（重量／体積）、少なくとも８．９％のヒアルロナン（重量／体積）、少なくとも９．０％のヒアルロナン（重量／体積）、少なくとも１０．０％のヒアルロナン（重量／体積）、少なくとも１１．０％のヒアルロナン（重量／体積）、少なくとも１２．０％のヒアルロナン（重量／体積）、少なくとも１３．０％のヒアルロナン（重量／体積）、少なくとも１４．０％のヒアルロナン（重量／体積）もしくは少なくとも１５．０％、またはそれより多くのヒアルロナン（重量／体積）を含む。
【００７５】
記述された値の中間の範囲もまた本発明の一部であることが意図される。例えば、本発明の組成物中のヒアルロナン含有率は、約３％〜約１５％（重量／体積）の間、約３％〜約１０％（重量／体積）、約３．５％〜約９％（重量／体積）、約４％〜約８％（重量／体積）または約５％〜約７％（重量／体積）の間にあってもよい。
【００７６】
さらに、特定体積中のヒアルロナンの量も、代替手段（例えばグラム／リットルまたはｍｏｌ／リットル）によって表されてもよいことは認識されるべきである。当業者は、特定体積中のヒアルロナンの量を表す様々な手段を変換する方法を知っている。
【００７７】
上記に示されるように、予想外にも、高濃度のヒアルロナンを含むヒアルロナンの組成物、さらに１００万〜２００万の平均分子量を有するヒアルロナンの組成物が、関節痛の処置に特に効果的であることは本明細書において示される。このように、本明細書において提供されるヒアルロナンの組成物の幾つかの実施形態において、ヒアルロナンの平均分子量は、２００万未満、１９０万未満、１８０万未満、１７０万未満、１６０万未満、１５０万未満、１４０万未満、１３０万未満、１２０万未満、１１０万未満、１００万未満、９０万未満、８０万未満、７０万未満、６０万未満または５０万未満である。
【００７８】
記述された値の中間の範囲もまた本発明の一部であることが意図される。例えば、本明細書において提供されるヒアルロナンの組成物において、ヒアルロナンの平均分子量は、１００万〜２００万の間、１００万〜１５０万の間、５０万〜１００万の間、５０万〜２００万の間、または９０万〜１４０万の間である。
【００７９】
本明細書において提供されるヒアルロナンの組成物の幾つかの実施形態において、組成物中に存在する大半のヒアルロナンは、本明細書において提供される平均分子量範囲内にある。このように、例えば、２０万〜２００万の間のヒアルロナンの平均分子量を有する組成物において、組成物中に存在するヒアルロナンの少なくとも９５％は、２０万〜２００万の間の範囲内にある。幾つかの実施形態において、本明細書において提供される組成物中に存在するヒアルロナンの少なくとも５０％は、平均分子量の記述された範囲内にある。幾つかの実施形態において、本明細書において提供される組成物中に存在するヒアルロナンの少なくとも６０％は、平均分子量の記述された範囲内にある。幾つかの実施形態において、本明細書において提供される組成物中に存在するヒアルロナンの少なくとも７０％は、平均分子量の記述された範囲内にある。幾つかの実施形態において、本明細書において提供される組成物中に存在するヒアルロナンの少なくとも８０％は、平均分子量の記述された範囲内にある。幾つかの実施形態において、本明細書において提供される組成物中に存在するヒアルロナンの少なくとも９０％は、平均分子量の記述された範囲内にある。幾つかの実施形態において、本明細書において提供される組成物中に存在するヒアルロナンの少なくとも９５％は、平均分子量の記述された範囲内にある。幾つかの実施形態において、本明細書において提供される組成物中に存在するヒアルロナンの少なくとも９８％は、平均分子量の記述された範囲内にある。幾つかの実施形態において、本明細書において提供される組成物中に存在するヒアルロナンの少なくとも９９％は、平均分子量の記述された範囲内にある。幾つかの実施形態において、本明細書において提供される組成物中に存在するヒアルロナンの少なくとも９９．９％は、平均分子量の記述された範囲内にある。
【００８０】
ＩＩ．  ヒアルロナンの供給源
【００８１】
本明細書において提供される組成物および方法において使用されるヒアルロナンは、任意の供給源から得ることができる。一般に、ヒアルロナンは、その起源（例えば、ニワトリまたはオンドリのとさか、ヒトまたは細菌細胞壁）に関係なく、同じ化学構造を有する。ヒアルロナンは、例えば、ニワトリまたはオンドリのとさか、細菌細胞壁およびヒト組織（眼の硝子体、関節からの滑液など）から得ることができる。幾つかの実施形態において、ヒアルロナンはニワトリのとさかから単離される。幾つかの実施形態において、ヒアルロナンは、ヒト組織、例えば臍帯、眼の硝子体、関節からの滑液から単離される。幾つかの実施形態において、ヒアルロナンは細胞培養物から単離される。幾つかの実施形態において、ヒアルロナンは細菌細胞壁から単離される。様々な供給源からのヒアルロナンの単離は、当業者に知られている。例えば、オンドリのとさかからのヒアルロナンの採取および精製は米国特許第４，１４１，９７３号に記載されているが、バクテリアの供給源からのヒアルロナンの採取および精製は、米国特許第４，５１７．２９５号に記載されている。幾つかの実施形態において、ヒアルロナンは６〜８のｐＨで０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含む溶液に精製され採取される。一般に、様々な供給源から得られたヒアルロナンは、タンパク質またはヒアルロナン以外のグリコサミノグリカンを含まない。
【００８２】
幾つかの実施形態において、単離されたヒアルロナンは所望の平均分子量範囲を有するヒアルロナンを得るためにさらに精製される（例えばカラムクロマトグラフィーによって）。所望の平均分子量範囲を有するヒアルロナンを精製する方法は、当業者に知られている。
【００８３】
一態様において、本明細書において開示される高弾性を有するヒアルロナンは未改質ヒアルロナンである。しかし、幾つかの実施形態において、ヒアルロナンが化学的に改質されてもよいことは認識されるべきである。例えば、ヒアルロナンはヒアルロナンの弾性を高めるために化学的に改質されてもよい。
【００８４】
ＩＩＩ．  本発明のヒアルロナン組成物の滅菌
【００８５】
幾つかの実施形態において、本発明の組成物は無菌である。「無菌組成物」とは、本明細書において使用される場合、被験体、例えばヒト被験体に投与されることが安全な組成物を指す。したがって、無菌組成物は、望ましくない免疫応答、例えば炎症、または感染症などの望ましくない副作用を引き起こす恐れがある剤は極力含まない。
【００８６】
ヒアルロナンの組成物を殺菌する方法は、当技術分野で知られていて、例えば、加熱または例えば、オートクレーブ処理による蒸気殺菌を含む。幾つかの実施形態において、本発明のＨＡ組成物は組成物の加熱により殺菌される。幾つかの実施形態において、本発明のＨＡ組成物は、注射器にＨＡ組成物を含み、ＨＡ含有注射器を１３１℃で２分間または１２１℃で１５分間オートクレーブ処理し、続いて直ちに冷却することによって殺菌される。
【００８７】
ＩＶ．  本発明のヒアルロナン組成物の追加成分
【００８８】
本発明のＨＡ組成物は、ヒアルロナンを安定させ、および／または組成物を被験体への投与により適切にすることができる追加成分を含んでもよい。幾つかの実施形態において、本発明のＨＡ組成物は緩衝液を含んでもよい。緩衝液は安定なｐＨを可能にするために加えられる。本発明で使用される適切な緩衝液はリン酸緩衝液および重炭酸緩衝液を含む。幾つかの実施形態において、緩衝液はトリスリン酸緩衝液である。幾つかの実施形態において、緩衝液は、１ｍＭ〜１００ｍＭの間、２ｍＭ〜５０ｍＭの間、または５ｍＭ〜２０ｍＭの間の濃度で存在する。幾つかの実施形態において、緩衝液濃度は１ｍＭ未満である。幾つかの実施形態において、緩衝液濃度は、１００ｍＭを超える。幾つかの実施形態において、緩衝液濃度は１０ｍＭである。緩衝液濃度が、使用される緩衝液の性質に依存することは認識されるべきである。幾つかの実施形態において、組成物のｐＨは、ｐＨ７〜ｐＨ９の間、またはｐＨ７．５〜ｐＨ８．５の間にある。幾つかの実施形態において、組成物のｐＨは８．０である。幾つかの実施形態において、組成物のｐＨは７．５である。幾つかの実施形態において、組成物のｐＨは８．５である。必要ならば、酸（ＨＣＬなど）または塩基（ＮａＯＨなど）を、所望のｐＨを得るために組成物に加えることができる。
【００８９】
幾つかの実施形態において、ヒアルロナン組成物は、緩衝液、例えば生理学的に適合可能な緩衝液を含むが、追加成分を含まない。
【００９０】
幾つかの実施形態において、本組成物は、カルボン酸またはその塩などの安定化賦形剤を含む。幾つかの実施形態において、本組成物は、モノカルボン酸および／またはその塩を含む。幾つかの実施形態において、本組成物は、グルコン酸および／またはグルコン酸ナトリウムを含む。幾つかの実施形態において、本組成物は、ジカルボン酸および／またはその塩を含む。幾つかの実施形態において、本組成物は、クエン酸、コハク酸、マロン酸、マレイン酸、酒石酸および／またはその塩を含む。幾つかの実施形態において、カルボン酸はクエン酸ナトリウムである。幾つかの実施形態において、本組成物はトリカルボン酸(tricarboxylic  aid)および／またはその塩を含む。幾つかの実施形態において、本組成物はニトリロ三酢酸および／またはニトリロ三酢酸ナトリウムを含む。幾つかの実施形態において、本組成物は、テトラカルボン酸および／またはその塩を含む。幾つかの実施形態において、本組成物はエチレンジアミン四酢酸（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）（ＥＤＴＡ）および／またはＥＤＴＡナトリウムを含む。幾つかの実施形態において、本組成物はペンタカルボン酸および／またはその塩を含む。幾つかの実施形態において、本組成物はジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）および／またはＤＴＰＡナトリウムを含む。適切なカルボン酸は、クエン酸ナトリウムなどのシトラート化合物；タータラート化合物、スクシナート化合物およびＥＤＴＡを含むがこれらに限定されない。ＫａｕｓｈｉｌらはＰｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９９  ８：２２２−２３３に、Ｂｕｓｂｙらはｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｖｏｌｕｍｅ  ２５６，Ｎｕｍｂｅｒ  ２３  ｐｐ  １２１４０−１２１０−１２１４７にカルボン酸およびその使用を記載している。幾つかの実施形態において、安定化賦形剤は、５０〜６００ｍＭの間、２５０〜５００ｍＭの間、または２５０〜３５０ｍＭの間の濃度を有する。幾つかの実施形態において、安定化賦形剤の濃度は３００ｍＭである。幾つかの実施形態において、安定化賦形剤の濃度は１００ｍＭ未満である。幾つかの実施形態において、安定化賦形剤の濃度は、６００ｍＭを超える。
【００９１】
幾つかの実施形態において、本発明のＨＡ組成物は糖（例えば二糖類の塩）を含む。組成物に加えることができる二糖類の塩は、スクロース、ラクツロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、セロビオース、デキストロースおよびデキストランを含むがこれらに限定されない。幾つかの実施形態において、糖は０．５〜５％（重量／体積）の間で存在する。幾つかの実施形態において、糖は１〜２％（重量／体積）の間で存在する。一実施形態において、糖は１％で存在する。幾つかの実施形態において、糖は１％（重量／体積）未満で存在する。幾つかの実施形態において、糖は５％（重量／体積）を超えて存在する。一実施形態において、糖はスクロースまたはトレハロースであり、１％（重量／体積）で存在する。
【００９２】
幾つかの実施形態において、本発明のＨＡ組成物は塩を含む。組成物において使用することができる塩は、塩化ナトリウムおよび他の生理学的に適合可能な塩を含む。幾つかの実施形態において、塩濃度は、１０ｍＭ〜２５０ｍＭの間、２５ｍＭ〜１００ｍＭの間にある。幾つかの実施形態において、塩濃度は５０ｍＭである。幾つかの実施形態において、塩濃度は１０ｍＭ未満である。幾つかの実施形態において、塩濃度は、２５０ｍＭを超える。
【００９３】
幾つかの実施形態において、本発明のＨＡ組成物は１種または複数の抗酸化剤を含む。抗酸化剤は溶液からフリーラジカルを除去することにより酸化を阻害することができる物質である。抗酸化剤は、当業者に周知されており、アスコルビン酸、アスコルビン酸誘導体（例えばパルミチン酸アスコルビル、ステアリン酸アスコルビル、アスコルビン酸ナトリウムまたはアスコルビン酸カルシウム）、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化（ｂｕｙｌａｔｅｄ）ヒドロキシトルエン、没食子酸アルキル、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、亜ジチオン酸ナトリウム、チオグリコール酸ナトリウム、ホルムアルデヒドスルホキシル酸ナトリウム、トコフェロール、およびその誘導体、（ｄ−アルファトコフェロール、酢酸ｄ−アルファトコフェロール、コハク酸ｄ−アルファトコフェロール、ベータトコフェロール、デルタトコフェロール、ガンマトコフェロール、およびｄ−アルファトコフェロールポリオキシエチレングリコール１０００スクシナート）、モノチオグリセロールおよび亜硫酸ナトリウムなどの材料が含まれる。そのような材料は、通常０．０１〜２．０％の範囲で加えられる。
【００９４】
幾つかの実施形態において、本発明のＨＡ組成物は１種または複数の等張剤を含む。この用語は、当技術分野で等浸透圧剤と交換可能に使用され、血漿などのヒト細胞外液と等浸透圧である、０．９％塩化ナトリウム溶液の浸透圧などの浸透圧を高めるために医薬調製物に加えることができる化合物として知られている。本発明の組成物において使用される好ましい等張剤は、塩化ナトリウム、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、デキストロースおよびグリセリンを含む。
【００９５】
幾つかの実施形態において、本発明のＨＡ組成物は１種または複数の防腐剤を含む。適切な防腐剤は、クロロブタノール（０．３〜０．９％ｗ／ｖ）、パラベン（０．０１〜５．０％）、チメロサール（０．００４〜０．２％）、ベンジルアルコール（０．５〜５％）、フェノール（０．１〜１．０％）などを含むがこれらに限定されない。
【００９６】
幾つかの実施形態において、本組成物は、組成物の注射中に望ましくない副作用を最小化する１種または複数の成分を含む（ｉｎｃｕｄｅｓ）。
【００９７】
Ｖ．  本発明のヒアルロナン組成物を含む製造のキットおよび物品
【００９８】
また、本発明のＨＡ組成物および使用のための指示を含むキットは本発明の範囲内である。用語「キット」は、本明細書において使用される場合、疾患または障害、例えば関節痛の処置のために本発明のＨＡ組成物を、それでもって投与するための構成要素を含む、包装された製品を指す。キットは、好ましくはキットの構成要素を保持する箱または容器（ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）を含む。箱または容器は、ラベル、または、食品医薬品局（Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）承認プロトコルが添付される。箱または容器は、好ましくはプラスチック、ポリエチレン、ポリプロピレン、エチレンまたはプロピレン容器（ｖｅｓｓｅｌ）内に含まれる、本発明の構成要素を保持する。該容器は封鎖した管または瓶であってもよい。キットは、また本発明のＨＡ組成物（ｃｏｍｐｏｓｉｔｏｎ）を投与するための指示を含むことができる。
【００９９】
キットは、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）または栄養補給剤、例えば、グルコサミンおよび／またはコンドロイチン硫酸を含むサプリメントなどの、もう１種の追加の試薬および／または薬剤をさらに含むことができる。ＮＳＡＩＤＳの非限定的な例には、アスピリン、ジフルニサール、サルサレート、コリンマグネシウムトリサリチラート、イブプロフェン、デキシイブプロフェン、ナプロキセン、フェノプロフェン（ｆｅｎｏｐｒｅｆｅｎ）、ケトプロフェン、デクスケトプロフェン、フルルビプロフェン、オキサプロジン、ロキソプロフェン、インドメタシン、トルメチン、スリンダク、エトドラク、ケトロラク、ジクロフェナク、アセクロフェナク、ナブメトン、ピロキシカム、メロキシカム、テノキシカム、ドロキシカム、ロルノキシカム、イソキシカム、メフェナム酸（ｍｅｌｆｅｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ）、メクロフェナム酸、フルフェナム酸、フォルフェナム酸、セレコキシブ、ロフェコキシブ、バルデコキシブ、パレコキシブ、ルミラコキシブ、エトリコキシブ、フィロコキシブ、ニメスリド（ｎｉｍｅｓｕｌｆｉｄｅ）またはリコフェロンが含まれる。キットは、一般にキットの内容物の意図する使用を示すラベルを含む。ラベルという用語は、任意の書字、またはキット上にもしくはキットに伴って供給されるか、そうでなければキットに付随する記録した材料を含む。
【０１００】
本発明は、また本発明の組成物が充填された１個または複数の容器を含む医薬品包装またはキットを提供する。一実施形態において、本発明の組成物が充填された容器はプレフィルドシリンジである。特定の実施形態において、本発明の組成物は無菌液体として単回用量バイアルに製剤化されている。場合によって、そのような容器（複数可）が関係し得るのは、医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定される形式の通知であり、その通知は、ヒト投与のための、製造、使用または販売の当局による承認を反映する。
【０１０１】
一実施形態において、本発明の組成物が充填された容器はプレフィルドシリンジである。当業者に知られている任意のプレフィルドシリンジは、本発明の組成物と組み合わせて使用されてもよい。使用されてもよいプレフィルドシリンジは、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ０５０３２６２７、同ＷＯ０８０９４９８４、同ＷＯ９９４５９８５、同ＷＯ０３０７７９７６、米国特許ＵＳ６７９２７４３、同ＵＳ５６０７４００、同ＵＳ５８９３８４２、同ＵＳ７０８１１０７、同ＵＳ７０４１０８７、同ＵＳ５９８９２２７、同ＵＳ６８０７７９７、同ＵＳ６１４２９７６、同ＵＳ５８９９８８９、ＵＳ特許出願公開ＵＳ２００７０１６１９６１Ａ１、同ＵＳ２００５００７５６１１Ａ１、同ＵＳ２００７００９２４８７Ａ１、同ＵＳ２００４０２６７１９４Ａ１、同ＵＳ２００６０１２９１０８Ａ１に記載されているがこれらに限定されない。プレフィルドシリンジは様々な材料で作製されていてもよい。一実施形態において、プレフィルドシリンジはガラス注射器である。別の実施形態において、プレフィルドシリンジはプラスチック注射器である。当業者は、注射器の製造に使用される材料の性質および／または品質が、注射器に保存されるＨＡ組成物の安定性に影響し得ることを理解している。一実施形態において、プレフィルドシリンジはシリコーン系潤滑剤を含む。一実施形態において、プレフィルドシリンジはシリコーン系を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ  ｂａｋｅｄ  ｏｎ  ｓｉｌｉｃｏｎｅ）。別の実施形態において、プレフィルドシリンジはシリコーン系潤滑剤を含まない。当業者は、注射器バレル、注射器先端の蓋、プランジャーまたはストッパーから製剤へ浸出する少量の混入元素もまた組成物の安定性に影響し得ることを理解している。例えば、製造プロセス中に導入されるタングステンが製剤の安定性に悪影響し得ることは理解される。一実施形態において、プレフィルドシリンジは５００ｐｐｂを超える水準でタングステンを含んでもよい。別の実施形態において、プレフィルドシリンジは、低タングステンの注射器である。別の実施形態において、プレフィルドシリンジは、約５００ｐｐｂ〜約１０ｐｐｂの間、約４００ｐｐｂ〜約１０ｐｐｂの間、約３００ｐｐｂ〜約１０ｐｐｂの間、約２００ｐｐｂ〜約１０ｐｐｂの間、約１００ｐｐｂ〜約１０ｐｐｂの間、約５０ｐｐｂ〜約１０ｐｐｂの間、約２５ｐｐｂ〜約１０ｐｐｂの間の水準でタングステンを含んでもよい。
【０１０２】
本発明はまた、最終包装され、ラベル付けされた医薬製品を包含する。この製造品は、ガラスバイアル、プレフィルドシリンジなどの好適な容器（ｖｅｓｓｅｌ）もしくは容器（ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）または密封した他の容器中に好適な単位剤形を含む。一実施形態において、単位剤形は、非経口投与、例えば膝または軸および付属性関節への注射に適切な無菌で微粒子を含まないＨＡ組成物として提供される。
【０１０３】
どの医薬製品とも同様に、包装材料および容器は保存および輸送中に製品の安定性を保護するように設計される。さらに、本発明の製品は、問題の疾患または障害を適切に予防または処置する方法、ならびに医薬品を投与する方法および頻度について、医師、専門技術者もしくは患者に助言する使用のための指示または他の情報材料を含む。言いかえれば、本製造品は、実際の用量、モニター手順および他のモニター情報を含むがこれらに限定されない投薬レジメンを示すか示唆する指示手段を含む。
【０１０４】
ＶＩ．  本発明のヒアルロナン組成物を使用する処置の方法
【０１０５】
本発明は、また関節機能不全と関係した少なくとも１つの症状を処置、軽減または予防する方法を提供する。本方法は、関節機能不全と関係した少なくとも１つの症状が処置、軽減または予防されるように治療有効量の本発明の組成物を、それを必要とする被験体に投与することを含む。他の実施形態において、本発明は、また、骨関節炎が処置または予防されるように治療有効量の本発明の組成物を、それを必要とする被験体に投与することを含む、骨関節炎を処置または予防する方法を提供する。幾つかの実施形態において、本発明は、また関節機能を改善する方法を提供する。
【０１０６】
処置または予防の効果は、疾患状態または病態、例えば骨関節炎の疼痛などの関節機能不全と関係した少なくとも１つの症状の１つまたは複数のパラメータにおける統計的に有意な改善がある場合には明白である。また、処置または予防の効果は、別の方法では予想される、症状を悪化または進行させる失敗によっても明白である。例として、疾患の計測可能なパラメータの少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％またはそれを超える好都合な変化を、効果的な処置の指標とすることができる。用語「予防する」または「予防」は、本明細書において使用される場合、例えば、関節機能不全、例えば骨関節炎の疼痛と関係した少なく１つの症状の再発の予防を、以前にその少なくとも１つの症状を経験した被験体において含む。
【０１０７】
幾つかの実施形態において、被験体は、ヒト、哺乳動物、例えばネコ、イヌ、家畜（ウシ、ヒツジ、ウマ、ロバなど）またはげっ歯類である。特定の実施形態において、被験体はヒトである。別の特定の実施形態において、被験体は競走馬などのウマまたはイヌである。
【０１０８】
幾つかの実施形態において、「関節機能不全と関係した少なくとも１つの症状」は、例えば、病態によって引き起こされてもよい。そのような病態の非限定的な例は、骨関節炎、関節リウマチ、線維筋痛症、関節の感染症または炎症を含む。関節機能不全と関係した少なくとも１つの症状は、また関節鏡検査、関節形成などの医学的処置、傷害または長期固定化によって引き起こされ得る。幾つかの実施形態において、関節機能不全と関係した少なくとも１つの症状は、関節の疼痛または可動性低下である。
【０１０９】
本明細書において使用される場合、用語「少なくとも１つの症状の軽減」は、疼痛または可動性低下などの関節機能不全と関係した少なくとも１つの症状の縮小、寛解または排除を含む。この用語はまた、本発明のＨＡ組成物を投与した後の無傷または炎症を起こした関節において、運動誘起神経インパルスの合計数の減少、または運動当たりのインパルスの平均数の減少を含む。この用語はまた、本発明のＨＡ組成物の投与で、神経細胞における疼痛伝達のプロセスに関与する、ＴＲＰＶ１などのイオンチャネルの活性化の程度を減少させることを含む。そのようなチャネルの活性化は、本発明のＨＡ組成物の投与で、例えば、侵害受容インパルス後の神経細胞中の細胞内Ｃａ２＋の変化を測定することによって、または神経細胞における細胞全体の電流を測定することによって測定することができる。さらに、用語「少なくとも１つの症状の軽減」はまた、本発明のＨＡ組成物の投与で炎症を起こした関節における神経細胞の侵害受容の発火の縮小を含む。幾つかの実施形態において、本発明のＨＡ組成物は、他のＨＡ組成物、例えばＳｙｎｖｉｓｃ（登録商標）などの現在市販の他のＨＡ組成物より、関節機能不全と関係した少なくとも１つの症状の軽減に効果的である。幾つかの実施形態において、本発明のＨＡ組成物は、関節機能不全と関係した少なくとも１つの症状を約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％または約９６％、９７％、９８％または９９％、軽減することができる。
【０１１０】
幾つかの実施形態において、関節機能不全と関係した少なくとも１つの症状を軽減する方法は、治療有効量の本発明の組成物を、それを必要とする被験体に投与することを含む。用語「治療有効量」は、本明細書において使用される場合、関節機能不全と関係した少なくとも１つの症状を処置、予防または軽減するのに十分である、または、骨関節炎を処置または予防するのに十分である量の本発明のＨＡ組成物を、それを必要とする被験体に投与したときに、含むように意図される。当業者、例えば医師は、治療上有効である量のＨＡ組成物を容易に確認することができる。一般に、組成物の治療有効量は、約０．１〜約５００ｍｇ、例えば、約０．１ｍｇ、約１ｍｇ、約５ｍｇ、約１０ｍｇ、約２０ｍｇ、約３０ｍｇ、約４０ｍｇ、約５０ｍｇ、約６０ｍｇ、約７０ｍｇ、約８０ｍｇ、約９０ｍｇ、約１００ｍｇ、約１１０ｍｇ、約１２０ｍｇ、約１３０ｍｇ、約１４０ｍｇ、約１５０ｍｇ、約１６０ｍｇ、約１７０ｍｇ、約１８０ｍｇ、約１９０ｍｇ、約２００ｍｇ、約２１０ｍｇ、約２２０ｍｇ、約２３０ｍｇ、約２４０ｍｇ、約２５０ｍｇ、約２６０ｍｇ、約２７０ｍｇ、約２８０ｍｇ、約２９０ｍｇ、約３００ｍｇ、約３１０ｍｇ、約３２０ｍｇ、約３３０ｍｇ、約３４０ｍｇ、約３５０ｍｇ、約３６０ｍｇ、約３７０ｍｇ、約３８０ｍｇ、約３９０ｍｇ、約４００ｍｇ、約４１０ｍｇ、約４２０ｍｇ、約４３０ｍｇ、約４４０ｍｇ、約４５０ｍｇ、約４６０ｍｇ、約４７０ｍｇ、約４８０ｍｇ、約４９０ｍｇまたは約５００ｍｇである。
【０１１１】
幾つかの実施形態において、治療有効量の本発明のＨＡ組成物は、膝関節の内部の、または他の軸もしくは付属性関節中のＨＡの有効濃度を達成するのに十分である。したがって、有効量のＨＡは、３％を超える、例えば４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％または１０％を超える、関節内のＨＡ濃度を達成するのに十分である。
【０１１２】
今記載された方法の実行の際に、本発明の組成物は、当業者によって適切と決定される任意の投与経路によって投与されてよい。一実施形態において、本発明の組成物は非経口投与によって投与される。特定の実施形態において、本発明のＨＡ組成物は注射によって、例えば関節内注射によって投与されてもよい。幾つかの実施形態において、処置レジメンは単一の関節内注射を含んでもよい。他の実施形態において、処置レジメンは複数の関節内注射、例えば２、３、４、５、６または１０を超える注射を含んでもよい。当業者は、各被験体のための本発明のＨＡ組成物に好適な処置レジメンおよびタイミングを決定することができる。
【０１１３】
本明細書において提供される方法の幾つかの実施形態において、本組成物は、単回の関節内注射として、または複数、例えば２、３、４、５、６回の注射で投与される。一般に、４％の濃度のヒアルロナン組成物２〜６ｍＬが投与される。しかし、投与される組成物の体積がより大きな体積および／またはより高濃度であってもよいことは理解されるべきである。したがって、幾つかの実施形態において、投与されるヒアルロナンの組成物の体積は、少なくとも０．１ｍＬ、少なくとも０．５ｍＬ、少なくとも１ｍＬ、少なくとも２ｍＬ、少なくとも３ｍＬ、少なくとも４ｍＬ、少なくとも５ｍＬ、少なくとも６ｍＬ、少なくとも７ｍＬ、少なくとも８ｍＬ、少なくとも９ｍＬ、少なくとも１０ｍＬ、少なくとも１１ｍＬ、少なくとも１２ｍＬ、少なくとも１３ｍＬ、少なくとも１４ｍＬ、少なくとも１５ｍＬ、少なくとも１６ｍＬ、少なくとも１７ｍＬ、少なくとも１８ｍＬ、少なくとも１９ｍＬ、少なくとも２０ｍＬ、少なくとも３０ｍＬまたはそれより多くである。幾つかの実施形態において、投与されるヒアルロナンの組成物は、１〜３０ｍＬの間、２〜２０ｍＬの間、２〜１０ｍＬの間、２〜８ｍｌの間、３〜６ｍＬの間、または４〜５ｍｌの間である。
【０１１４】
幾つかの実施形態において、被験体に投与される本発明のＨＡ組成物の体積は、被験体の関節、例えば膝、肘、股、他の付属性または軸の関節における空洞を満たすのに十分である。また、ＨＡ組成物の体積は、被験体の関節中の滑膜を被覆するのに十分である。ある実施形態において、被験体に投与される本発明のＨＡ組成物の体積は、関節内部の流体によるＨＡ組成物の希釈を防止するのに十分である。例えば、本発明のＨＡ組成物の体積は、被験体の関節中で３％またはそれを超える、例えば４％のＨＡ濃度を維持するのに十分である。
【０１１５】
ある実施形態において、本発明のＨＡ組成物の、それを必要とする被験体に投与される体積は、関節機能の改善に十分であり、例えば、関節痛の軽減に十分であるが、それでもなお、十分に小さく、関節内部での正の大気圧の増大を防止する。
【０１１６】
一態様において、本発明は、関節機能（例えば膝、肘、股、肩関節または他の軸および付属性関節）を改善する方法を提供する。本明細書において使用される場合、関節機能の改善とは、機械的機能の改善（例えば歩行、ランニングおよび手の使用などによる関節を使用する能力など）、および関節機能と関係した望ましくない副作用（例えば疼痛）を軽減する能力の両方を指す。一態様において、本開示は、関節機能と関係した疼痛を軽減する方法を提供する。しかし、関節機能の改善が、機械的機能の改善および疼痛の軽減に限定されないことは認識されるべきである。炎症の軽減または腫脹の軽減などの関節機能のいかなる改善も本方法に包含される。
【０１１７】
一態様において、本発明は、骨関節炎を処置する方法を提供する。骨関節炎（ＯＡ）は、関節軟骨および肋軟骨下骨を含む関節の劣化を伴う機械的異常の群を特徴とする変形性関節疾患である。骨関節炎と関係した症状は関節痛、柔軟性、剛性、ロッキングを含む。骨関節炎は、身体のどの関節にも影響し得る。最も一般に影響を受ける関節は、手、足、背骨、股および膝である。本明細書において使用される場合、骨関節炎の処置とは、影響を受けた関節の機械的機能の改善（例えば歩行、ランニングおよび手の使用などによる関節を使用する能力など）、および影響を受けた関節の疼痛を軽減する能力の両方を指す。
【０１１８】
一態様において、本発明は、機械的関節機能を改善する方法を提供する。一態様において、本開示は、骨関節炎の影響を受けた関節の機能性を改善する方法を提供する。一態様において、骨関節炎の影響を受けた関節機能および関節の機能性を改善する方法は、治療有効量の本発明の組成物、例えば高弾性を特徴とするヒアルロナンを含む組成物を関節への注射によって導入することを含む。関節機能の改善および機能性の改善は、処置前の機能性に対してまたは処置を受けていない被験体と比較して評価することができる。幾つかの実施形態において、機能性の改善は、本明細書において提供される組成物で処置される前の被験体が経験する機能性のベースラインを参照することによって測定される。例えば、一実施形態において、被験体は、日常生活におけるＫＯＯＳ（膝および骨関節炎アウトカムスコア）機能に基づいた機能性の改善を経験することができる（参照：例えばＲｏｏｓら、Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｓｐｏｒｔｓ．Ｐｈｙｓ．Ｔｈｅｒ．，（１９９８）２８：２２−９６）。本明細書において提供される方法の幾つかの実施形態において、被験体は、処置を受ける前の日常生活におけるＫＯＯＳ機能に基づいたベースラインから少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ポイントの変化を経験することができる。本明細書において提供される方法の幾つかの実施形態において、被験体は、処置を受けない被験体と比較して、日常生活におけるＫＯＯＳ機能に基づいたベースラインから少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ポイントの変化を経験することができる。
【０１１９】
幾つかの実施形態において、被験体は、ＷＯＭＡＣ（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｏｎｔａｒｉｏ  ａｎｄ  ＭａｃＭａｓｔｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｉｅｓ  Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｉｎｄｅｘ）機能サブスケールによって測定される機能の改善を経験することができる（参照：例えばＢｅｌｌａｍｙら、Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．，（２００５），６４：８８１−８８５）。本明細書において提供される方法の幾つかの実施形態において、被験体は、処置を受ける前のＷＯＭＡＣ機能サブスケールに基づいたベースラインから少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％の機能の改善を経験することができる。本明細書において提供される方法の幾つかの実施形態において、被験体は、処置を受けない被験体と比較してＷＯＭＡＣ機能サブスケールに基づいたベースラインから少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％の機能の改善を経験することができる。
【０１２０】
幾つかの実施形態において、関節機能性の改善は、５ポイントのリッカート尺度を有するアンケートを使用して評価されてもよい。
【０１２１】
一態様において、本発明は、関節機能と関係した疼痛を軽減する方法を提供する。別の態様において、本発明は、骨関節炎と関係した疼痛を軽減する方法を提供する。幾つかの実施形態において、疼痛の軽減は、本明細書において提供される組成物の１つで処置される前に被験体が経験する疼痛のベースラインへの参照によって測定される。例えば、幾つかの実施形態において、患者は、要因の公知範囲に基づいた疼痛に対する被験体の経験を定量する、一般に公知のＫＯＯＳ（膝および骨関節炎アウトカムスコア）疼痛サブスケールスコアに基づいた疼痛の軽減を経験する（参照：例えばＲｏｏｓら、Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｓｐｏｒｔｓ．Ｐｈｙｓ．Ｔｈｅｒ．，（１９９８）２８：２２−９６）。例えば、幾つかの実施形態において、被験体は、処置前のＫＯＯＳ疼痛サブスケールに基づいたベースラインから少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ポイントの変化を経験することができる。幾つかの実施形態において、被験体は、処置を受けない被験体と比較してＫＯＯＳ疼痛サブスケールに基づいたベースラインから少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ポイントの変化を経験することができる。
【０１２２】
幾つかの実施形態において、被験体は、ＷＯＭＡＣ（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｏｎｔａｒｉｏ  ａｎｄ  ＭａｃＭａｓｔｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｉｅｓ  Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｉｎｄｅｘ）疼痛サブスケールによって測定される疼痛の軽減を経験することができる（参照：例えばＢｅｌｌａｍｙら、Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．，（２００５），６４：８８１−８８５）。例えば、幾つかの実施形態において、被験体は、処置前のＷＯＭＡＣ疼痛サブスケールに基づいたベースラインから少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％の疼痛の軽減を経験することができる。幾つかの実施形態において、被験体は、処置を受けない被験体と比較してＷＯＭＡＣ疼痛サブスケールに基づいたベースラインから少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％の疼痛の軽減を経験することができる。
【０１２３】
幾つかの実施形態において、被験体における疼痛の軽減は、５ポイントリッカート尺度を用いるアンケートを使用して評価されてもよい。
【０１２４】
様々な処置方式は本明細書において開示される方法によって包含される。例えば、被験体は、本明細書において開示されるヒアルロナン組成物の第１の用量、続いて追加の用量を受けてもよい。幾つかの実施形態において、第１の用量、続いて特定の間隔で第２の用量が投与される。幾つかの実施形態において、第２の用量は、第１の用量の約３０日、約６０日、約９０日、約１２０日、約１５０日、約１８０日、約２１０日、約２４０日、約２７０日、約３００日、約３３０日または約３６０日後に投与される。用量方式が、被験体が経験する機能性の改善、および／または疼痛の軽減に基づいて調節することができることは認識されるべきである。幾つかの実施形態において、被験体は、毎月、２か月毎、３か月毎、４か月毎、５か月毎、６か月毎、７か月毎、８か月毎、９か月毎、１０か月毎、１１か月毎、または１２か月毎に用量を受ける。幾つかの実施形態において、用量は単回または複数回の関節内注射（複数可）として投与される。
【０１２５】
一態様において、本明細書において開示される組成物は、病的な関節に直接投与される。例えば、本組成物は、膝関節、股関節、指もしくは親指関節、足指関節、足首関節、橈骨手根関節、肩関節、肘関節または背骨の関節に直接投与することができる。幾つかの実施形態において、本組成物は膝関節に投与される。幾つかの実施形態において、本組成物は肩関節に投与される。幾つかの実施形態において、本組成物は股関節に投与される。幾つかの実施形態において、本組成物は脚または腕の関節に投与される。幾つかの実施形態において、本組成物は、膝、肩もしくは股関節以外の脚もしくは腕の関節、または軸もしくは付属性関節に投与される。本明細書において提供される方法のいずれかの幾つかの実施形態において、関節は軸骨格の関節である。本明細書において提供される方法のいずれかの幾つかの実施形態において、関節は側頭下顎関節または頭蓋関節である。
【０１２６】
一態様において、本組成物は、治療有効量の組成物の関節への注射によって導入することにより投与される。幾つかの実施形態において、本組成物は関節内注射によって投与される。幾つかの実施形態において、本組成物は注射器および針による注射によって投与される。幾つかの実施形態において、本組成物は、関節の部位で局所的に投与される。幾つかの実施形態において、本組成物は関節周囲に投与される。
【０１２７】
本発明は、以下の実施例によってさらに説明されるが、決してさらに制限すると解釈されるべきでない。本出願の全体にわたって引用された参考文献すべての全体内容（参考文献、刊行された特許および公開された特許出願および同時係争中の特許出願を含む）は、これによって明示的に参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０１２８】
ほかに与えられない限り、本明細書に記載される組成物において使用されるヒアルロナンは、動物、ヒトまたはバクテリアの供給源から得られる。ほかに与えられない限り、本明細書において使用される組成物は生理学的緩衝液中にある。
【０１２９】
実施例１：本発明のＨＡ組成物の弾性特性
【０１３０】
この実験の目的は、本発明のＨＡ組成物の、市販ヒアルロナン（ＨＡ）製品の、弾性特性を調査することであった。その調製において使用されるＨＡは、細菌細胞壁供給源から得られ、１００万〜２００万の平均分子量を有していた。組成物は、生理的食塩水（８．４７ｇ／ＬのＮａＣｌ）または５．５〜７．５のｐＨを有するリン酸緩衝液（８．４７ｇ／ＬのＮａＣｌ、０．０４７ｇ／ＬのＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、０．２１３ｇ／ＬのＮａ２ＰＯ４）中で調製した。試料を調製後加熱殺菌した場合、使用したオートクレーブサイクルは１２１℃１５分間または１３１℃２分間のいずれかであり、そのサイクルに続いて直ちに材料を瞬間冷却した。
【０１３１】
ＨＡ試料の弾性特性の測定は、Ｒｅｏｌｏｇｉｃａ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＡＢ，Ｉｎｃ．からのＳｔｒｅｓｓｔｅｃｈ  Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＲｈｅｏｍｅｔｅｒでＲｈｅｏＥｘｐｌｏｒｅｒソフトウェア５．０．４０．９版を使用して行った。周波数掃引発振試験を行い、弾性率（Ｇ’）を決定した。目的の周波数は、０．１〜１０ヘルツ（Ｈｚまたはサイクル／ｓｅｃ）の範囲であり、これは、起立、歩行、ランニングおよび跳躍中のヒト膝関節の運動または応力の程度に対応する。
【０１３２】
以下の表１は、粘性補充のために選択したＨＡ市販品のＨＡ濃度および平均分子量を示す。
【０１３３】
【表１】
2018138622.tif 000002
【０１３４】
粘性補充のために選択した市販ＨＡ製品の弾性特性は、０．１〜１０ヘルツ（Ｈｚまたはサイクル／ｓｅｃ）の範囲の周波数にわたって弾性率（Ｇ’）を測定することにより評価した。関節は、０．１〜７Ｈｚの範囲の周波数で動作し、その周波数は、関節表面が起立、歩行、ランニングおよび跳躍する際に経験する力を決定する。この周波数範囲のＨＡの弾性挙動は、膝関節の両関節表面への機械力の伝達を決定する。以下の表２は、５種のＨＡ市販品の様々な周波数でのＧ’（パスカル）の測定値を示し、図１パネルＡは同じデータをグラフ方式で示す。
【０１３５】
【表２】
2018138622.tif 000003
【０１３６】
以下の表３は、幾つかの発明の組成物において様々な周波数でのＧ’（パスカル）の測定値を示し、図１パネルＢは、同じデータをグラフ方式で示す。
【０１３７】
【表３】
2018138622.tif 000004
【０１３８】
以下の表４は、選択したＨＡ市販品と選択した本発明のＨＡ組成物のＧ’値の比較を示す。
【０１３９】
【表４】
2018138622.tif 000005
【０１４０】
データからわかるように、本発明の組成物は、試験したＨＡ市販品のいずれよりもはるかに高いＧ’値を特徴とする。ＨＡ組成物のＧ’値は、コイル状分子のショックアブソーバーとして働き弾性固体のように振る舞うＨＡ分子の能力を反映する。
【０１４１】
実施例２：本発明のＨＡ組成物のインビボ鎮痛効果
【０１４２】
オスの成体ウィスターラットの伏在神経からの細い神経フィラメントを切開し、銀ワイヤ電極に置き、機械刺激によって誘起された痛覚神経線維の神経インパルスを評価した。関節を、無害の運動（関節の作業範囲内で）および有害の運動（関節の作業範囲を超えて）を再現するために回転させた。無害の運動、続いて有害の運動を含んだ回転、すなわち運動サイクルを実験中５分毎に繰り返した。神経活性を、個々の運動サイクルのそれぞれの無害な成分中、および有害な成分中の神経インパルスの数を別々に数えることにより分析した。各成分（非有害および有害の）によって誘起される神経インパルスの数を合計して、各時点での運動サイクルのインパルスの合計数を得た。
【０１４３】
異なった平均分子量（２０万〜６００万）および増加する濃度（１％〜６％）のＨＡを含有する組成物の、無傷および炎症を起こした関節の関節痛覚受容器への鎮痛効果を試験するために実験を行った。一群の実験において、カオリン−カラギーナンを関節内に関節注射して関節炎症を誘発させた。１時間後、異なった濃度および平均分子量のＨＡ溶液または食塩水対照を関節内に注射し、鎮痛効果の時間経過を決定した。鎮痛効果は、試験物質の関節内注射に続く８時間の間、痛みのある関節神経線維(pain  joint  nerve  fiber)のインパルスを測定することにより評価した。
【０１４４】
図２はその結果を要約する。パネルＡに、５分毎に反復する完全な運動サイクルによって誘起される運動当たりのインパルスの平均数を示す。右の挿入図に示すように、インパルスは、異なったＨＡ濃度および平均分子量の組成物で２４時間処置した炎症を起こした関節の正中関節神経(median  articular  nerve)の単線維で測定した。１３０万〜１６０万またはそれを超える平均ＭＷおよび４％またはそれを超える濃度のＨＡを含有する溶液が、逐次的運動サイクルによって誘起される神経インパルスの数を減少させるのに最も効果的であることは明らかである。パネルＢは、４％ＨＡ組成物についての平均分子量の関数として運動当たりのインパルスの平均数を示す。結果は、１００万またはそれを超える平均分子量を有する組成物のより高い効能を実証する。パネルＣは、ＨＡ濃度の関数として運動当たりのインパルスの平均数を示す。結果は、４％ＨＡ組成物を用いて得られる最大の効果を証拠づける。Ｓｙｎｖｉｓｃ（登録商標）の注射の効果は黒三角によって印する。パネルＤは、異なった濃度および平均分子量のＨＡ組成物を用いる処置の２４時間後の炎症を起こした膝関節における運動誘起活性への平均効果の要約を示す。ＨＡ２は、Ｃｒｏｍａ−Ｐｈａｒｍａ  ＧｍｂＨによって提供される、１３０万の平均分子量のＨＡに対応する。ＨＡ１は、Ｍａｔｒｉｘ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって提供されるＨＡ組成物に対応する。
【０１４５】
図２に提示した結果は、１００万の平均分子量を有する４％ＨＡ組成物が、炎症を起こした関節の神経インパルスの平均数を減少させるのに非常に効果的であり、したがって炎症を起こした関節における疼痛の軽減に効果的であることを示す。
【０１４６】
したがって、炎症を起こした関節の運動によって誘起される痛覚神経インパルス活性は高く、記録期間を通して安定なままである。１３０万またはそれを超える平均ＭＷを有する４％〜６％ＨＡの注射は、運動誘起インパルス活性に明白な阻害効果を有していた。同様の減少はＭＷ１６０万の６％ＨＡを用いても得られた。一定ＭＷを維持しつつＨＡ濃度を減少させるか、または、より低いＭＷの４％ＨＡ溶液を用いると、阻害効果が減少した。およそ６００万のＭＷを有する０．８％ＨＡを含む市販ＨＡ溶液Ｓｙｎｖｉｓｃ（登録商標）を用いて得られた結果も、比較のために表示した。１３０万を超える平均ＭＷのＨＡが、運動誘起関節侵害受容器活性に強力な阻害効果を発揮すると確かに結論することができる。
【０１４７】
図３および４は、４％ＨＡ組成物が、運動サイクルの無害成分によっておよび有害成分によって誘起される両方の神経インパルス活性に影響することを示す。図３は、食塩水、４％ＨＡまたはＳｙｎｖｉｓｃ（登録商標）を用いて２４時間前に注射した、炎症を起こした関節の運動の非有害部分の間に数えた神経インパルスの数を表す。図４は運動サイクルの有害部分に対応するデータを示す。これらの結果は、運動誘起疼痛活性に対する関節痛覚神経線維(joint  pain  nerve  fiber)の全体の応答性を減少させる４％ＨＡ組成物の効能を確証する。
【０１４８】
図５は、４％ＨＡ組成物の関節内注射の神経インパルス活性への長時間効果を示す。パネルＡは、炎症の発生、続いて食塩水または４％ＨＡ組成物の関節内注射をしてから、１日、１週間、２週間、３週間後に記録した運動当たりインパルスの平均数を示す。パネルＢは、パネルＡと同時点で、食塩水および４％ＨＡ注射後測定したインパルス／運動の平均数のパーセント差を示す。
【０１４９】
運動誘起活性に対するＨＡ  ４％の阻害効果も無傷の関節で観察された。図６パネルＡに示すように、無傷の動物の運動誘起インパルスの合計数は、上の曲線（白丸）のデータによって示すようにサイクル当たりおよそ２１０インパルスであった。４％ＨＡの注射２４時間後に無傷の動物に同じ記録を取った場合は、同じ運動によって誘起されるインパルスの平均数がサイクル当たり５０インパルス未満と、非常に低かった。これは図６の下の曲線（黒丸）に示し、パネルＢは７つの実験の平均データを示す。これは、また、関節侵害受容器へのＨＡの効果が非感作線維(non-sensitized  fiber)中に存在することを実証する。
【０１５０】
ＨＡの阻害効果が進行し始める時点を決定するために、２匹の無傷のラットの関節運動によって誘起される活性を記録した。１０分間隔で６つの運動を実施した後、４％ＨＡ組成物（Ｅｌａｓｔｏｖｉｓｃ（商標））を関節内に注射した。運動は、次の８時間の間に同じ時間間隔で繰り返した。図６パネルＣに示すように、２つの個々の線維において、注射後最初の３０〜６０分の間に運動誘起活性は徐々に増大し、次いで、低下し始めた。対照値は注射のおよそ３時間で回復し、次の２〜３時間の間に徐々に低下し、その時点で実験を中断した。
【０１５１】
図７は、運動誘起活性へのＨＡの阻害効果が、無傷の関節に関節内注射したＨＡの合計体積に依存することを示す。注射体積が２５μｌである場合、運動誘起インパルス活性を表す曲線（黒四角）は、関節内の食塩水を用いて得られたもの（白丸）と類似している。５０μｌ（黒三角）および７５μｌ（白三角）を用いた場合、痛覚線維の運動誘起活性は、対照における活性より有意に低かった。
【０１５２】
実施例３：痛覚伝達に関与するイオンチャネルへの本発明のＨＡ組成物のインビトロ効果
【０１５３】
細胞外ＨＡのレオロジー特性は、関節の痛覚神経終末への力学的エネルギーの伝達のフィルタリングにおけるＨＡの有効性を決定し、局所的な炎症プロセスまたは変性プロセスによって影響される。さらに、傷害および炎症中に、種々様々の局所的に放出された化学伝達物質は、感作を引き起こす周囲の侵害受容器終末に働く。しかし、ＨＡの疼痛を減ずる効果はまた、周囲の侵害受容器の傷害によって活性化された伝達および興奮のメカニズムの修飾によるという可能性が存在する。この修飾はＨＡ分子の濃度およびサイズに関係する。
【０１５４】
一過性受容器電位カチオンチャネルサブファミリーＶメンバー１（ＴＲＰＶ１）は、有害刺激の検出および侵害受容神経終末への炎症伝達物質の感作効果に主要な役割を果たす非選択的なカチオンチャネルである。ＴＲＰＶ１は、ポリモーダル侵害受容器末端における、有害な内因性および外因性の化学刺激ならびに温度刺激の積分器(integrator)として振る舞う。関節において、ＴＲＰＶ１は、長期的な全身性の痛みを伴う関節炎中に放出される媒介物質によって引き起こされた炎症性作用に結び付けられている。
【０１５５】
この実験の目的は、痛覚伝達に関与する主なイオンチャネルであるＴＲＰＶ１の活性化へのＨＡの効果を調査することであった。以下の２種の細胞株を実験に使用した：遺伝子改変してＴＲＰＶ１の発現を増やした細胞株ＳＨ−ＳＹ５Ｙ  ＶＲ１、およびＴＲＰＶ１チャネル発現を誘導し、ＴＲＰＶ１チャネルを含む細胞を視覚的に特定するためにＴＲＰＶ１＋ＥＹＦＰ融合タンパク質をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞。熱およびカプサイシンは、選択的にＴＲＰＶ１チャネルを開き、細胞へのカルシウム（［Ｃａ２＋］）の進入を可能にし、これで光学的画像形成技法を使用して測定することができることは十分に確立されている。したがって、細胞の興奮は、登録し定量的に測定した特定の細胞蛍光の一過性の増加に対応する。天然の有害刺激に応答するＴＲＰＶ１チャネルの開口によって引き起こされる細胞内カルシウム濃度の変化を個々の細胞で測定した。蛍光性カルシウムプローブ（Ｆｕｒａ−２ＡＭ）を細胞にロードした後、細胞を短い熱パルスで４回刺激し、カルシウムイオンの変化を測定した。タキフィラキシー（すなわち反復刺激に対する応答の減少）を除く熱での反復刺激に対する信頼できる応答を定義するために、反復刺激に対するＴＲＰＶ１細胞の応答特性を定義した。最高４７〜４８℃の細胞表面の高速熱パルスを有害刺激として使用し、３０秒間加え、１０分間隔で反復した（図８パネルＡ１に示す例を参照）。刺激の効果を定量するために、制御した条件下に各細胞における初期の熱パルスに応答して現われる細胞内カルシウム（［Ｃａ２＋］ｉ）の変化を測定し、応答を多数の細胞で平均した。一定の時間間隔での反復刺激のプロトコルをその後確立した。第４のパルスが最も安定と考えられ、その振幅のパーセント減少を、第１の刺激（１００％をベースラインの読み取りとして採用した）の振幅と比較して、タキフィラキシーの効果によると考えた。よって、対照溶液を用いて潅流したときの第４のパルスに対する細胞の応答を、第１の応答の大きさにおけるパーセント減少に関して表した。
【０１５６】
ＴＲＰＶ１チャネル発現を誘導するＴＲＰＶ１＋ＥＹＦＰ融合タンパク質をトランスフェクトした蛍光性の培養ＨＥＫ２９３細胞によって、および解離した後根神経節（ＤＲＧ）主要感覚神経細胞によって発現したＴＲＰＶ１チャネルへのＨＡの効果を、ＨＡでの灌流の前後に反復有害刺激（熱またはＴＲＰＶ１アゴニストであるカプサイシンの適用）によって誘起される細胞内カルシウム［Ｃａ２＋］ｉの変化を測定することによって調査した。５６０万の平均ＭＷのＨＡ組成物をこれらの研究に使用し、調製して４００μｇ／ｍｌのＨＡを含有する最終溶液を得た。
【０１５７】
実験の結果を図８に示す。パネルＡ１は、浴溶液を４８℃に加熱し、１０分間隔で反復することによりＨＥＫ−ＴＲＰＶ１−ＥＹＦＰ（＋）細胞中で誘起された細胞内カルシウムの上昇を示す。細胞質ゾルのＣａ２＋の増加は、３４０および３８０ｎｍでの発光蛍光強度の比（Ｆ３４０／３８０：蛍光の任意単位）として表す。パネルＡ２はＡ１と同じ実験を示すが、しかし、４００μｇ／ｍｌ  ＨＡを用いて、灌流は第１の熱刺激の最後に始めた。パネルＡ３は、対照食塩溶液（ＣＳ、黒棒）中、およびＨＡを用いる灌流中（灰色棒）における逐次的熱パルス（横軸に示す）によって誘起される応答間の平均振幅変化の比を示す。阻害がＨＡ灌流の始まり２０分後に現われることは注目すべきである。
【０１５８】
パネルＢ１−Ｂ３は、Ａ１−Ａ３と同じプロトコルを利用する実験の結果を示すが、ＤＲＧ成体神経細胞において実施した。ＨＡの阻害効果は処置３０分後に明白になる（第４対第１の刺激を参照）。
【０１５９】
パネルＣ１−Ｃ３は、対照食塩溶液（Ｃ１）中、および３０分早く開始したＨＡへの曝露下（Ｃ２）での、１００ｎＭカプサイシンおよび１０μＭカルバコール（Ｃｃｈ）に応答するＨＥＫ−ＴＲＰＶ１−ＥＹＦＰ（＋）細胞中の細胞内カルシウム変化を示す。パネルＣ３は、対照食塩溶液を用いる灌流下（黒）、およびＨＡの存在下（灰色）でのカプサイシン（黒棒）およびカルバコール（縞付き棒）に対する応答の平均振幅を示す。
【０１６０】
パネルＤ１−Ｄ２は、食塩水（Ｄ１）およびＨＡ（Ｄ２）を用いる灌流中の１００ｎＭカプサイシンおよび３０ｍＭ  ＫＣｌに対するＤＲＧ成体感覚神経細胞の細胞内カルシウム応答を示す。パネルＤ３は、対照食塩溶液（黒）中、およびＨＡの存在下（灰色）でのカプサイシン（黒棒）またはＫＣｌ（縞付き棒）に対する細胞内カルシウム応答の平均振幅を示す。
【０１６１】
図８の結果は、ＨＡへの３０分の曝露後、食塩水を用いて潅流した対照細胞と比較して、熱パルスに対する培養ＨＥＫ−ＴＲＰＶ１細胞の応答は７７％減少したことを明らかに示す。同一のプロトコルを利用する実験において、熱パルスに対する培養ＤＲＧ神経細胞の応答は、対照と比較して２４％減少した。また、有意により少ない数のＨＥＫ−ＴＲＰＶ１細胞（６３％）が、ＨＡの存在下１００ｎＭカプサイシンでの刺激後、細胞内カルシウムの増加とともに応答し、応答の振幅が、対照条件と比較して３３％低かった。同様に、食塩水を用いて潅流したＤＲＧ神経細胞の６８％は、カプサイシンに対して応答したが、ＨＡを用いて潅流したＤＲＧ神経細胞の３７％のみが応答し、応答の振幅は対照の４４％に減少した。したがって、神経細胞の興奮性の減少によって、ＨＡは効果的に疼痛を軽減することができる。
【０１６２】
別の細胞株、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ  ＶＲ１を、ＴＲＰＶ１の熱に対する応答へのＨＡの濃度の効果を研究する実験に使用した。表５は、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ  ＶＲ１細胞における熱に対する細胞内カルシウム応答への低および高ＭＷ  ＨＡの効果を示す。食塩水（対照）、ならびに２００、４００および８００μｇ／ｍｌの濃度の低ＭＷ  ＨＡ（平均ＭＷ４７００００Ｄａ）または高ＭＷ  ＨＡ（５．２×１０６Ｄａ）を用いる灌流下に第４の熱パルスに対する応答の値を第１のパルスに対する応答の％として表す（ｎ＝各濃度の種々の実験において測定した細胞の合計数；ｔ−スチューデント統計量＊Ｐ＜０．０５、＊＊０．０１＜Ｐ＜０．００１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。表５に示すように、低い（６０００００）または高い（５．６Ｍ）ＭＷのより高濃度ＨＡ溶液をＳＨ−ＳＹ５Ｙ  ＶＲ１細胞に適用したとき、熱に対する応答は有意に減じた。
【０１６３】
【表５】
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【０１６４】
実施例４：本発明のＨＡ組成物による神経細胞の興奮性のインビトロ阻害
【０１６５】
ＨＥＫ−ＴＲＰＶ１細胞のカプサイシン誘起刺激のＨＡ媒介性阻害は、またＨＥＫ−２９３−ＴＲＰＶ１−ＥＧＦＰ（＋）細胞における細胞全体の電流を記録することによって調査した。図９パネルＡに示すのは、食塩溶液（上の線、ｎ＝１９の平均）中および４００μｇ／ｍｌ  ＨＡ溶液（下の線、ｎ＝１８の平均）中の１００ｎＭカプサイシンで活性化したＴＲＰＶ１のＩ−Ｖの関係である。電圧の傾斜は、０．２Ｈｚで−１２０ｍＶ〜＋１０ｍＶであり、０．８ｍＶ／ｍｓの勾配を持ち、ｍＶ／ｓは＋８０ｍＶの電圧で測定した。図９パネルＢは、パネルＡに示すＩ−Ｖ曲線から得られた＋８０ｍＶでの平均電流を示す。図９パネルＣは、線形コンダクタンスにボルツマン活性化項を乗じて組み合わせる関数、Ｉ＝ｇ×（Ｖ−Ｅｒｅｖ）／（１＋ｅｘｐ（（Ｖ１／２−Ｖ／Ｓ））にあてはめた傾斜から測定した種々のパラメータの値を示す。図９パネルＤは、今回、対照条件（上の線）における、および３０分間予めインキュベートし連続的にＨＡを用いて潅流した細胞（下の線）における１μＭカプサイシンに応答する−６０ｍＶでの細胞全体の電流を示す。図９パネルＥは、食塩水中およびＨＡの存在下でのカプサイシンによって誘起される−６０ｍＶでのピーク電流の平均値を示す
【０１６６】
図９に提示した結果は、カプサイシンがＨＥＫ−ＴＲＰＶ１細胞、およびＴＲＰＶ１によって媒介されるＤＲＧ神経細胞において膜電流を誘起することを実証する。カプサイシンに応答してＴＲＰＶ１チャネルを通して流動しパッチクランプ技法を用いて記録した電流の最大振幅は、ＨＡへの曝露後７２％減少した。この阻害効果は、細胞の−６０ｍＶという膜電位の生理学的な値でなお存在した。コンダクタンス（ｇ）は４７％減少したが、ＴＲＰＶ１の電位ゲーティング機構（ｖｏｌｔａｇｅ  ｇａｔｉｎｇ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）および電位依存性がＨＡによって影響を受けなかったこともまた確認された。
【０１６７】
ＴＲＰＶ１単一チャネル活性のＨＡによる調整も調査した。ＨＥＫ−ＴＲＰＶ１細胞へのＨＡによって引き起こされた巨視的電流の観察された減少を、ＨＡへの３０〜６０分の曝露前後に単一チャネル電流を測定することによって調査した。ピペット中に存在する０．２５μＭカプサイシンによって誘起される単一チャネル活性は、ＨＥＫ２９３−ＴＲＰＶ１−ＥＦＹＰ（＋）細胞の細胞付着パッチに記録した。記録は＋６０ｍＶで実施した。
【０１６８】
図１０パネルＡは、食塩溶液を用いる灌流下でＴＲＰＶ１の単一チャネル活性の試料記録を示すが、パネルＢは、ＨＡ中でインキュベートし、ＨＡ溶液を用いる灌流下に記録した細胞からの単一チャネル活性の試料記録を示す。挿入図は、食塩水（黒）の下に、およびＨＡへの曝露後（灰色）記録したパッチの単一チャネル振幅確率ヒストグラムを表す。図１０パネルＣは、対照条件（四角）で、およびＨＡへの曝露（丸）後得られたＩ−Ｖ曲線を示すが、パネルＤは、四角（対照）および丸（ＨＡ処置）として表す、個々のパッチから得られた単一チャネル振幅を示す。より大きな記号は、パネルＡおよびＢに示す線において実施した測定からのデータに対応する。棒は、各条件；ｔ−検定、Ｐ＝０．７３Ｎ．Ｓ．における単一チャネル振幅の平均値±平均値の標準誤差に対応する。
【０１６９】
図１０パネルＥは、種々のパッチの開口状態の確率を示す。より大きな記号は、パネルＡおよびＢに示す線において実施した測定からのデータを表す。棒は、単一チャネルの開口確率の平均値±平均値の標準誤差を表す；ｔ−スチューデント、＊＊Ｐ＝０．００２。特に、対照条件において非常に稀少であった長い閉鎖状態は、ＨＡを用いる処置後、その頻度が増加した。ＨＡ処置条件と対照条件との間で、開口状態の発生率の差を観察することはできなかった。
【０１７０】
図１０に示す結果は、ＨＡの存在下での、カプサイシンに応答するＴＲＰＶ１チャネル活性が約３０％のパッチに存在しないことを実証する。さらに、開口状態の出現確率は、ＨＡの存在下で劇的に減少する。対照条件、およびＨＡの存在下の単一チャネルのＩ−Ｖ関係および単一チャネルの電流振幅は同様であった。しかし、チャネル開閉時間の分布測定によって証拠づけられるように、ＨＡは、閉じた時間のヒストグラムにおいて長い継続時間の事象の数の増加を引き起こした。したがって、結果は、ＨＡがより長い時間閉じたチャネルを維持し、それにより開口の確率を減少させることを示唆する。結果は、侵害受容神経細胞が、ＨＡの存在下でＴＲＰＶ１チャネルを開く有害刺激によってそれほど興奮しなくなるということである。
【０１７１】
ＴＲＰＶ１チャネルを有する侵害受容ＤＲＧ神経細胞において、カプサイシンによるこれらのチャネルの開口は、入力抵抗、脱分極および活動電位発火の減少を引き起こす。１μＭカプサイシンによって誘起される活動電位の発火頻度を、ＴＲＰＶ１を発現する解離したＤＲＧ神経細胞においてパッチクランプを用いて測定した。具体的には、ＤＲＧ神経細胞の電気生理学的記録を細胞付着配置において１μＭカプサイシンの存在下で−６０ｍＶ保持電位で実施した。図１１パネルＡは、食塩溶液を用いて潅流した単一ＤＲＧ神経細胞においてカプサイシンに対する応答の試料記録を示す。応答の平均発火頻度は１６スパイク／秒であった。図１１パネルＢは、ＨＡで処置しＨＡの存在下で記録したＤＲＧ神経細胞におけるカプサイシン刺激の試料記録を示す。応答の平均頻度は４．６スパイク／秒であった。図１１パネルＣは、ＨＡで処置しＨＡ中で記録したＤＲＧ神経細胞の試料記録を示し、ここでは、カプサイシンに対する応答は観察されなかったが、しかし、インパルス発射は６０ｍＭ  ＫＣｌで誘起することができた。挿入図（ｉｎｓｅｔ）は、この神経細胞における熱パルスによって生じた細胞内カルシウムの上昇を示す。２つの異なった神経細胞における同じ熱パルスに対する細胞内カルシウム上昇の欠如は、下の線において明白である。
【０１７２】
図１１パネルＤは、対照条件下（左の棒、ｎ＝８）、およびＨＡへの曝露後（右の棒、ｎ＝９）の、ＤＲＧ神経細胞の平均発火頻度（左）および個別データ（右）を示す。
【０１７３】
図１１に提示した結果は、ＨＡの存在下で、以前はカプサイシンに応答した１０の神経細胞のうちの４つが、他の刺激への無傷の興奮性にもかかわらず、活動電位を発火しなかったことを実証する。対照ＤＲＧ神経細胞におけるカプサイシンによって誘起される平均発火頻度は、ＨＡと共にインキュベートしたＤＲＧ神経細胞において有意に減少した。最後に、炎症媒介物質であるブラジキニンによるＤＲＧ神経細胞のＴＲＰＶ１チャネルの感作は、ＨＡによって有意に減少した。すべて、これらの結果は、ＤＲＧ神経細胞において、ＨＡは選択的にカプサイシンによって誘起されるインパルス発火を阻害し、チャネルとの直接または間接的相互作用によってＴＲＰＶ１の機能を調整することを示す。
【０１７４】
実施例５：本発明のＨＡ組成物による神経インパルス活性の直接阻害
【０１７５】
実験の別の群において、第１の侵害防御機構の応答の潜伏時間を、野生型（ＷＴ）またはＴＲＰＶ１−／−ノックアウト（ＫＯ）マウスで、ホットプレート試験にそれらを供した後、測定した。第１の侵害防御機構応答（なめる、噛む、身を起こす、警戒する、後足を振動するまたは跳躍する）の潜伏時間は、足に作用する有害な熱刺激によって誘起される急性疼痛の行動表現と考えられる。潜伏時間値は、対照動物（ベースライン）間、足に１０μｌの無菌食塩溶液、４００μｇ／ｍｌ  ＨＡまたは痛覚神経終末のまわりの細胞外マトリックスを囲む天然のヒアルロン酸を消化する酵素であるヒアルロニダーゼの皮下注射を受けた動物の間で測定し比較した。
【０１７６】
図１２に示すように、５２℃の熱に対する侵害防御機構応答の潜伏時間は、７日後にヒアルロニダーゼ（ｈｙｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ）によって有意に減少したが、有害な熱への感受性の減少を反映してＨＡは潜伏時間を増加させた。ＨＡ注射の最大の鎮痛効果は、注射の４８時間後に認められた。動物の追加群において、ヒアルロニダーゼ注射の数日後にＨＡを注射して、酵素によって破壊された天然のヒアルロン酸を置き換えた。これらの条件において、潜伏時間は正常値を回復した。このデータは、ＨＡがＴＲＰＶ１を阻害し、それにより、有害刺激に対する侵害受容器終末のＴＲＰＶ１媒介感受性を減少させることを示唆する。実験を遺伝子改変のＴＲＰＶ１−／−マウスで繰り返したとき、野生型動物で認められる処置間のホットプレート試験応答の差は観察されなかった。
【０１７７】
ＨＡによるＴＲＰＶ１チャネルの阻害が、関節回転によって活性化される膝関節の痛覚線維のＴＲＰＶ１チャネルでも生じたことを確証するために（図１３Ａ）、食塩水またはＨＡの関節内注射の前後に、１０μＭカプサイシンを、カテーテルによるボーラスとして、麻酔をかけたラットに規則的な３０分間隔で膝関節に近い伏在動脈へ動脈内注射した。１０μＭカプサイシンの接近した動脈内注射によって誘起されるインパルス活性、および膝関節の制御された回転に対する応答を測定した（図１３参照）。
【０１７８】
カプサイシンのボーラス注射は、調査したフィラメントの一部で神経インパルスの発射を誘発した（図１３パネルＢ）。第１の注射によって誘起されるインパルスの数（対照応答）を１００％にとり、これは、次の注射に対する応答の振幅を表わす役目をした。インパルス発火頻度は、第２または第３の刺激後、常に減少し、全部の注射シリーズの全体にわたって持続し（タキフィラキシー）、関節内に食塩水を注射したときに、平均で１８０分に対照応答の８８±１３（ｎ＝７）まで減少した（図１３、パネルＢ、黒四角）。４％ＨＡを注射したとき、発射のパーセント減少は６５％の減少を表す３１±７（ｎ＝６）であった。この阻害効果は、ＨＡの関節内注射２７０分後、実験の最後でより高く、このとき８４％の活性減少が観察された（図１３、パネルＢ、白四角）。まとめると、これらの知見は、ＨＡが膝関節の痛覚神経線維においてＴＲＰＶ１チャネルを直接阻害することを確認する。
【０１７９】
実施例６。様々な針サイズを通るＨＡの放出のための力の必要条件
【０１８０】
異なった直径（３０−１８Ｇ）の針を用いて３ｍＬの注射器から４％ＨＡ組成物を放出するのに必要とする圧力を測定し、これを図１４に示す。注射器の挿入物（ｅｍｂｏｌｕｓ）に垂直に作用させて、２皿天秤（ｔｗｏ−ｐｌａｔｅ  ｂａｌａｎｃｅ）の一方の皿に力をかけた。反対側の皿に荷重を増やしながら加えた。図１４に示す結果によって実証されるように、本発明のＨＡ組成物は３０−１８Ｇの直径を有する針を使用して、被験体に投与することができる。
【０１８１】
均等論
先に記述した詳細は、当業者が本発明を実施可能にするのに充分であると考えられる。実施例は本発明の一態様の単なる例証として意図され、他の機能的に等価な実施形態は本発明の範囲内であるので、本発明は提供された実施例による範囲に限定されない。本発明の種々の改変は、本明細書中で示され記載されたものに加えて、前述の記載から当業者に明らかであり、添付の特許請求の範囲の範囲内に入る。本発明の利点および対象は、必ずしも本発明の各実施形態によって包含されない。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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