(57)【要約】      （修正有）【課題】人工エクソソームを生成する方法の提供。【解決手段】方法は、幹細胞から人工エクソソームが放出されるよう誘導する有効量のプロスタグランジンＥレセプター４（ＥＰ４）アンタゴニストに単離された幹細胞を接触させるステップと、人工エクソソームを単離するステップと、を含む方法。前記ＥＰ４アンタゴニストが、抗ＰＧＥ２抗体、ＥＰ４に対抗するｓｉＲＮＡ、ＥＰ４に対抗するｓｈＲＮＡ、ＣＯＸ−２アンタゴニスト、ｍＰＧＥＳ−１アンタゴニスト、ＧＷ６２７３６８ｘ、ＡＨ２３８４８、Ｌ−１６１，９８２、ＣＪ−０２３、４２３、ＯＮＯ  ＡＥ３  ２０８、ＢＧＣ２０−１５３１塩酸塩、ＭＦ４９８、および、ＣＪ−４２７９４から選ばれる、好ましくは、ＧＷ６２７３６８Ｘ、または、ＡＨ２３８４８である、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
人工エクソソームを生成する方法であって、
幹細胞から人工エクソソームが放出されるよう誘導する有効量のプロスタグランジンＥレセプター４（ＥＰ４）アンタゴニストに単離された幹細胞を接触させるステップと、
前記人工エクソソームを単離するステップと、
を含む方法。
【請求項２】
前記接触させるステップは、前記ＥＰ４アンタゴニストを含む培地で前記幹細胞を前記人工エクソソームが放出される期間培養することによって実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記幹細胞は、４〜８日間培養される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＥＰ４アンタゴニストは、抗ＰＧＥ２抗体、ＥＰ４に対抗するｓｉＲＮＡ、ＥＰ４に対抗するｓｈＲＮＡ、ＣＯＸ−２アンタゴニスト、ｍＰＧＥＳ−１アンタゴニスト、ＧＷ６２７３６８ｘ、ＡＨ２３８４８、Ｌ−１６１，９８２、ＣＪ−０２３、４２３、ＯＮＯ  ＡＥ３  ２０８、ＢＧＣ２０−１５３１塩酸塩、ＭＦ４９８、および、ＣＪ−４２７９４からなるグループから選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＥＰ４アンタゴニストは、ＧＷ６２７３６８Ｘ、または、ＡＨ２３８４８である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＥＰ４アンタゴニストの有効量は、１．０〜４０μｇ／ｍｌである、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記幹細胞は、胚幹細胞、人工多能性幹細胞、がん幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、乳房幹細胞、神経幹細胞、小腸幹細胞、皮膚幹細胞、臍帯血幹細胞、角膜輪部幹細胞、毛包幹細胞、脂肪組織由来幹細胞、骨髄幹細胞、角膜幹細胞、および、卵巣幹細胞から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記幹細胞は、間葉系幹細胞、乳房上皮幹細胞、がん幹細胞、または、神経幹細胞である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記単離するステップは、前記幹細胞を含む前記培地を遠心分離することにより、前記人工エクソソームを含むペレットを得ることを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１に記載された方法により生成された人工エクソソームを含む組成物。
【請求項１１】
前記人工エクソソームは、
（１）５０ｎｍ〜１５０ｎｍの直径を有し、
（２）ＣＤ４４、ＣＤ９０、インテグリンβ１、インテグリンα６、ＣＤ８１、ＧＡＰＤＨ、Ｎ−カドヘリン、フィブロネクチン、ＣＤ１４６、ＣＤ９１、コフィリン、フィラミンＡ、ＣＤ９１、ＣＮＰ、タリン、トロポミオシン、ガレクチン３、Ｒａｐ１、ＣＤ１４６、β−カテニン、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＬＲＰ６、Ａｇｏ１、Ａｇｏ２、ＦＺＤ５、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、Ｍｅｔ、ＥＰ２、ＰＩ３Ｋ、ＰＤＫ１、Ａｋｔ、ｐ−Ａｋｔ、ｃ−Ｓｒｃ、ｐ−Ｓｒｃ、ＳＡＰＫ／ＪＮＫ、ＰＳＡ、ＶＣＡＭ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ＰＤＧＦβ、ＮＧＦＲ、ＩＬ−２Ｒβ、ＩＬ−１８Ｒβ、ＢＭＰ−７、ＭＩＰ−３α、ＲＡＮＴＥＳ、ＤＲ６、ＬＩＦ、ＢＤＮＦ、ＴＩＭＰ１、ＶＥＧＦａ、および、ＩＬ−１０のうちの１つ以上をコントロールの幹細胞から放出されたエクソソームより高い濃度で含み、
（３）前記コントロールの幹細胞から放出されるエクソソームよりもＥ−カドヘリンの濃度が低く、
（４）前記コントロールの幹細胞から放出されるエクソソームよりもｓｍａｌｌＲＮＡ含量が高く、
（５）ｍｉｒ−１７−９２、ｍｉｒ−１０６ａ−３６３、ｍｉｒ−１０６ｂ−２５クラスター、ｍｉｒ−２４、ｍｉｒ−１３０、ｍｉｒ−１７、ｍｉｒ−１８ａ、ｍｉｒ−２０ａ、ｍｉｒ−２０ｂ、ｍｉｒ−２４、ｍｉｒ−２５、ｍｉｒ−２９ａ、ｍｉｒ−１０６ｂ、ｍｉｒ−１３０ａ、および、ｍｉｒ−１３０ｂのうちの１つ以上を前記コントロールの幹細胞から放出されるエクソソームよりも高い濃度で含み、
（６）前記コントロールの幹細胞から放出されるエクソソームよりも脂質ラフト会合型タンパク質を高い濃度で含み、
（７）前記コントロールの幹細胞から放出されるエクソソームよりもサイトカイン含量が多い、
という特徴のうちの１つ以上を有し、
前記コントロールの幹細胞は、ＥＰ４アンタゴニストによって処理されていない幹細胞である、
請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記組成物は無細胞である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
前記人工エクソソームは、間葉系幹細胞、乳房上皮幹細胞、がん幹細胞、または、神経幹細胞から放出される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１４】
生理学的に許容可能な賦形剤をさらに含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
人工幹細胞を生成する方法であって、非幹細胞集団を請求項９に記載の組成物と接触させることにより人工幹細胞を生成するステップを含む方法。
【請求項１６】
前記接触させるステップは、前記組成物を必要としている被検体に前記組成物を投与することによって実行される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記組成物は、前記組成物を必要としている前記被検体の全身にまたは前記被検体の部位に局所的に投与される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記被検体は、変性疾患、組織もしくは臓器障害、または、細胞欠損を有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記組成物は、前記被検体または他の被検体から得られた幹細胞から放出されたエクソソームを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記組成物は、無細胞である、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の参照
本出願は、２０１６年７月１１日に出願された台湾出願第１０５１２１８２４号の優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
エクソソームは、膜およびサイトゾルタンパク質、脂質、および、ＲＮＡを細胞間で移動させることにより細胞間の情報伝達を媒介することができる（非特許文献１）。これらの移動分子は、受容細胞において機能し得る（非特許文献２）。
【０００３】
また、特許文献１は、培養された神経幹細胞株（ＮＳＣＬ）から単離されたエクソソームを開示している。このエクソソームは、線維芽細胞の移動、ヒト臍帯静脈内皮細胞の分岐、および、神経突起の伸長を促進し得る。特許文献１は、神経幹細胞の幹細胞ホメオスタシスを維持し得る「基礎培養条件」において神経幹細胞株からエクソソームを収集することを開示している。特許文献１は、神経幹細胞株からのエクソソームが、線維芽細胞の移動、ヒト臍帯静脈内皮細胞の分岐、および、ＰＣ−１２細胞株の神経突起の伸長を促進させることを示すインビトロデータを唯一提供している。
【０００４】
また、細胞を幹細胞（ＳＣ）またはがん幹細胞（ＣＳＣ）状態に維持する上でプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）が重要な役割を果たすことが、さまざまな観察によって指摘されている。骨髄では、ＰＧＥ２によるシグナル伝達が造血幹細胞（ＨＳＣ）をサポートしている（非特許文献３）。ＰＧＥ２の生合成における鍵酵素であるシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）を欠損したマウスでは、造血系の再生が損なわれる。また、ゼブラフィッシュでは、ＰＧＥ２が造血幹細胞の自己再生を制御する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１３／１５０３０３号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｓｉｍｏｎｓ  ａｎｄ  Ｒａｐｏｓｏ、Ｃｕｒｒ  ｏｐｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２００９；２１：５７５−５８１
【非特許文献２】Ｓｋｏｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２００８；１０：１４７０〜１４７６；Ｖａｌａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２００７；９：６５４〜６５９
【非特許文献３】Ｇｏｅｓｓｌｉｎｇｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２００９；１３６：１１３６−１１４７；Ｐｏｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２０１３；３１：３７２−３８３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、非特許文献１および２について、エクソソームが媒介する細胞間の情報伝達は、抗原提示、トレランスの向上、および、腫瘍の進行に関与することが明らかにされてはいるものの、エクソソームの機能および制御は理解されていない。
また、特許文献１について、神経幹細胞株からのエクソソームが、生体内での神経の修復を高める、または、脳の記憶力および認識力を促進しつつ、ＰＣ−１２細胞の非幹細胞状態または非幹細胞の変調に何らかの効果をもたらすことを示すデータはない。
さらに、非特許文献３について、造血系外の組織ではＰＧＥ２によるシグナル伝達が幹細胞／がん幹細胞機能に貢献していることを示す証拠は見つけられなかった。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一態様では、人工エクソソームを生成する方法であって、幹細胞から人工エクソソームが放出されるよう誘導する有効量のプロスタグランジンＥレセプター４（ＥＰ４）アンタゴニストに単離された幹細胞を接触させるステップと、人工エクソソームを単離するステップと、を含む方法が提供される。
【０００９】
いくつかの実施形態では、接触させるステップは、ＥＰ４アンタゴニストを含む培地で幹細胞を人工エクソソームを放出させるのに十分な期間培養することによって実行される。  例えば、幹細胞は、４〜８日間培養されてよい。
【００１０】
いくつかの実施形態では、ＥＰ４アンタゴニストは、抗ＰＧＥ２抗体、ＥＰ４に対抗するｓｉＲＮＡ、ＥＰ４に対抗するｓｈＲＮＡ、ＣＯＸ−２アンタゴニスト、ｍＰＧＥＳ−１アンタゴニスト、ＧＷ６２７３６８ｘ、ＡＨ２３８４８、Ｌ−１６１，９８２、ＣＪ−０２３、４２３、ＯＮＯ  ＡＥ３  ２０８、ＢＧＣ２０−１５３１塩酸塩、ＭＦ４９８、および、ＣＪ−４２７９４からなるグループから選ばれる。使用されるＥＰ４アンタゴニストの有効量は、１．０〜４０μｇ／ｍｌであってよい。
【００１１】
幹細胞は、胚幹細胞、人工多能性幹細胞、がん幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、乳房幹細胞、神経幹細胞、小腸幹細胞、皮膚幹細胞、臍帯血幹細胞、角膜輪部幹細胞、毛包幹細胞、脂肪組織由来幹細胞、骨髄幹細胞、角膜幹細胞、および、卵巣幹細胞から選択されてよい。
【００１２】
いくつかの実施形態では、人工エクソソームの単離は、幹細胞を含む培地を超遠心分離または連続遠心分離などで遠心分離することにより、人工エクソソームを含むペレットを得ることを含んでよい。
【００１３】
本発明の他の態様では、記載された方法により幹細胞から生成された人工エクソソームを含む組成物が提供される。いくつかの実施形態では、組成物は無細胞である。組成物は、生理学的に許容可能な賦形剤をさらに含んでよい。
【００１４】
いくつかの実施形態では、人工エクソソームは、（１）５０ｎｍ〜１５０ｎｍの直径を有し、（２）ＣＤ４４、ＣＤ９０、インテグリンβ１、インテグリンα６、ＣＤ８１、ＧＡＰＤＨ、Ｎ−カドヘリン、フィブロネクチン、ＣＤ１４６、ＣＤ９１、コフィリン、フィラミンＡ、ＣＤ９１、ＣＮＰ、タリン、トロポミオシン、ガレクチン３、Ｒａｐ１、ＣＤ１４６、β−カテニン、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＬＲＰ６、Ａｇｏ１、Ａｇｏ２、ＦＺＤ５、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、Ｍｅｔ、ＥＰ２、ＰＩ３Ｋ、ＰＤＫ１、Ａｋｔ、ｐ−Ａｋｔ、ｃ−Ｓｒｃ、ｐ−Ｓｒｃ、ＳＡＰＫ／ＪＮＫ、ＰＳＡ、ＶＣＡＭ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ＰＤＧＦβ、ＮＧＦＲ、ＩＬ−２Ｒβ、ＩＬ−１８Ｒβ、ＢＭＰ−７、ＭＩＰ−３α、ＲＡＮＴＥＳ、ＤＲ６、ＬＩＦ、ＢＤＮＦ、ＴＩＭＰ１、ＶＥＧＦａ、および、ＩＬ−１０のうちの１つ以上をコントロールの幹細胞から放出されたエクソソームより高い濃度で含み、（３）コントロールの幹細胞から放出されるエクソソームよりもＥ−カドヘリンの濃度が低く、（４）コントロールの幹細胞から放出されるエクソソームよりもｓｍａｌｌＲＮＡ含量が高く、（５）ｍｉｒ−１７−９２、ｍｉｒ−１０６ａ−３６３、ｍｉｒ−１０６ｂ−２５クラスター、ｍｉｒ−２４、ｍｉｒ−１３０、ｍｉｒ−１７、ｍｉｒ−１８ａ、ｍｉｒ−２０ａ、ｍｉｒ−２０ｂ、ｍｉｒ−２４、ｍｉｒ−２５、ｍｉｒ−２９ａ、ｍｉｒ−１０６ｂ、ｍｉｒ−１３０ａ、および、ｍｉｒ−１３０ｂのうちの１つ以上をコントロールの幹細胞から放出されるエクソソームよりも高い濃度で含み、（６）コントロールの幹細胞から放出されるエクソソームよりも脂質ラフト会合型タンパク質を高い濃度で含み、（７）コントロールの幹細胞から放出されるエクソソームよりもサイトカイン含量が多い、という特徴のうちの１つ以上を有し、コントロールの幹細胞は、ＥＰ４アンタゴニストによって処理されていない幹細胞である。
【００１５】
いくつかの実施形態では、人工エクソソームは、間葉系幹細胞、乳房上皮幹細胞、がん幹細胞、または、神経幹細胞から放出される。
【００１６】
本発明のさらに他の態様では、人工幹細胞を生成する方法が提供される。
方法は、人工エクソソームを含む組成物と非幹細胞集団を接触させることにより人工幹細胞を生成するステップを含むいくつかの実施形態では、組成物は無細胞である。
【００１７】
いくつかの実施形態では、接触させるステップは、組成物を必要としている被検体に組成物を投与することによって実行される。組成物は、組成物を必要としている被検体の全身にまたは被検体の部位に局所的に投与されてよい。組成物は、被検体または他の被検体から得られた幹細胞から放出されたエクソソームを含んでよい。
【００１８】
いくつかの実施形態では、被検体は、変性疾患、組織もしくは臓器障害、または、細胞欠損を有する。例えば、被検体は、脳および脊髄損傷、卒中、学習障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、心筋梗塞、筋ジストロフィー、脱毛症、聴覚障害、失明、糖尿病、整形外科、および、外傷を患っている可能性がある。
【００１９】
１つ以上の実施形態の詳細は、添付の図面および以下の説明に記載されている。
実施形態の他の特徴、目的、および、長所も明細書、図面、および、特許請求の範囲から明らかになるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ＴＥＭ（透過型電子顕微鏡）像およびグラフを示す。（Ａ）は、ＧＷ６２７３６８Ｘ（ＧＷ）で４日間処理した非接着／間葉系乳房上皮細胞（ＮＡＭＥＣ）のＰ４培地画分のＴＥＭ像である。スケールバーは１μｍである。（Ｂ）は、ナノサイトのナノ粒子トラッキング解析を用いて計数したＮＡＭＥＣの馴化培地（ＣＭ）のＰ４画分における粒子数を示すグラフである。上段のグラフは、エクソソーム放出の数量化を、比率［Ｐ４  ＧＡＰＤＨマーカーの濃度］／［細胞数］として示したものである。データは、平均値±標準誤差（ｎ＝３）である。＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．００５。下段の表は、エクソソーム放出の数量化を、ナノ粒子トラッキング解析により測定された細胞毎のＣＭ−Ｐ４画分の粒子数として示したものである。
【図２】ＧＷで処理したＮＡＭＥＣのＰ４画分の分析を示すグラフおよびブロットである。ＧＷで処理したＮＡＭＥＣのＣＭ−Ｐ４画分を収集し、（Ａ）ナノサイトのナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ）、および、（Ｂ）動的光散乱／ゼータ電位解析（ＤＬＳ）にかけた。ＮＴＡは、粒径および絶対粒子濃度を示している。ＤＬＳは、粒度、平均粒径、および、相対粒子数を示している。Ｄは、粒径であり、ＲＮは、相対数である。（Ｃ）は、指示されたＣＭ−Ｐ４画分および細胞可溶化物において測定されたＣＤ４４幹細胞マーカー、および、ＣＤ８１、ＣＤ９、ＴＳＧ１０１、Ａｌｉｘ、ＨＳＰ７０、および、ＧＡＰＤＨエクソソームマーカーの量を示すブロットである。培地、および、細胞可溶化物は、溶媒（Ｃｒｌ）、ＧＷ６２７３６８Ｘ（ＧＷ）、または、ＰＧＥ２（１μＭ）でそれぞれ４日間処理した同数のＮＡＭＥＣから収集した。（Ｄ）は、溶媒（Ｃｒｌ）またはＧＷで２日間処理されたＮＡＭＥＣ（ＣＤ４４ｈｉ／ＣＤ２４幹細胞）またはＣＤ４４ｌｏ／ＣＤ２４＋非幹細胞（ＨＭＬＥ非幹細胞）のＣＭ−Ｐ４画分で測定されたＧＡＰＤＨおよびＣＤ８１エクソソームマーカーの量、およびＣＤ４４幹細胞マーカーの量を示すブロットである。１Ｘは、１×１０６の細胞から放出されたＰ４エクソソーム画分である。ＧＷで処理したＨＭＬＥサンプルは、長時間曝露においてＧＡＰＤＨ信号がわずかに見えるが、ＧＡＰＤＨ信号は増加していない。（Ｅ）は、溶媒（Ｃｒｌ）、ＧＷ６２７３６８Ｘ（ＧＷ、１μｇ／ｍｌ）、ＡＨ２３８４８（ＥＰ４アンタゴニスト、０．４、２．４μｇ／ｍｌ）、または、ＡＨ６８０９（ＥＰ１／２／３アンタゴニスト、０．８、４．８μｇ／ｍｌ）で処理したＮＡＭＥＣのＣＭ−Ｐ４画分で測定されたＣＤ４４幹細胞マーカーと、ＧＡＰＤＨおよびＣＤ８１エクソソームマーカーとを示すブロットである。（Ｆ）の上段は、溶媒、または、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ、２μｇ／ｍｌ）で処理したＮＡＭＥＣ、ＮＡＭＥＣ−ｓｈＥＰ４−１、および、ＮＡＭＥＣ−ｓｈＥＰ４−２のＣＭ−Ｐ４画分において測定されたＨＳＰ７０、ＧＡＰＤＨ、および、ＣＤ８１エクソソームマーカーを示すブロットである。ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）は、ＮＡＭＥＣ−ｓｈＥＰ４−１におけるＥＰ４  ｓｈＲＮＡの生成を誘導した（下段）。
【図３】１組の画像および２つのグラフを示す。（Ａ）は、溶媒、ＧＷ６２７３６８Ｘ、Ｄｙｎａｓｏｒｅ（１μＭ）、または、ＧＷ６２７３６８Ｘ＋Ｄｙｎａｓｏｒｅ（０．５、１、１．５μＭ）で４日間処理したＮＡＭＥＣの一連の明視野像である（スケールバーは１００μｍ）。（Ｂ）は、溶媒、ＧＷ６２７３６８Ｘ、Ｄｙｎａｓｏｒｅ（１μＭ）、または、ＧＷ６２７３６８Ｘ＋Ｄｙｎａｓｏｒｅ（０．７５および１μＭ））で処理した、０．０５％のトリプシンに耐性のあるＮＡＭＥＣのパーセンテージを示すグラフである。データは平均値±標準誤差（ｎ＝３）である。＊＊＊Ｐ≦０．００１。（Ｃ）は、溶媒（Ｃｒｌ）、ＧＷ６２７３６８Ｘ、Ｄｙｎａｓｏｒｅ（１μＭ）、または、ＧＷ６２７３６８Ｘ＋Ｄｙｎａｓｏｒｅ（０．５、０．７５、１μＭ）で４日間処理したＮＡＭＥＣのボイデンチャンバー移動を示すグラフである。データは平均値±標準誤差（ｎ＝３）である。＊＊Ｐ≦０．００５、＊＊＊Ｐ≦０．００１。
【図４】エクソソーム画分または細胞可溶化物で測定されたタンパク質を示す。溶媒（Ｃｒｌ）、ＧＷ６２７３６８Ｘ（ＧＷ）、または、ＰＧＥ２で４日間処理したＮＡＭＥＣからＰ４エクソソーム画分および細胞可溶化物を収集した。１Ｘは、２．５×１０５個の細胞から放出されたＰ４エクソソーム画分であり、５Ｘは、１２．５×１０５個の細胞から放出されたＰ４エクソソーム画分である。Ｈｇは、Ｈｇ−インテグリンβ１であり、Ｌｇは、Ｌｇ−インテグリンβ１であり、Ｈは、Ｈ−インテグリンα６であり、Ｌは、Ｌ−インテグリンα６であり、ｐｇは、ｐｇ−ＬＲＰ６であり、ｇは、ｇ−ＬＲＰ６であり、Ｎｇは、Ｎｇ−ＬＲＰ６である。
【図５】ＮＡＭＥＣからの細胞表面レセプターの分布に対するＥＰ４アンタゴニストの効果を示す。（Ａ）溶媒（Ｃｒｌ）、ＧＷ６２７３６８Ｘ（ＧＷ、１μｇ／ｍｌ）、または、ＰＧＥ２（１μＭ）で３日間処理したＮＡＭＥＣの表面タンパク質をビオチン化し、アビジンプルダウンした。すべての細胞溶解物のプルダウンおよびインプットにおいて、ＨＥＲ２、ｃ−Ｍｅｔ、ＬＲＰ６、および、ＥＧＦＲタンパク質をウエスタンブロット法で測定した。ＮはコントロールのＮＡＭＥＣであり、ＮＢは、ビオチン化されたＮＡＭＥＣである。（Ｂ）溶媒、または、ＧＷ６２７３６８Ｘ（ＧＷ、１μｇ／ｍｌ）で４日間処理したＮＡＭＥＣにおける細胞表面のＨＥＲ２、ｃ−Ｍｅｔ、ＬＲＰ６、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−５、ＴＧＦβＲ１、ＴＧＦβＲ２、および、ＥＧＦＲを分析した。薄いグレーの線は、特異的一次抗体＋Ａｌｅｘａ４８８に結合した二次抗体で染色した細胞である。濃い線は、Ａｌｅｘａ４８８に結合した二次抗体でのみ染色したコントロールとしての細胞である。
【図６】ＰＣＲアレイによる分析を示す。ＮＡＭＥＣ、および、ＧＷ６２７３６８Ｘで（４８時間）処理したＮＡＭＥＣにおけるさまざまなシグナル伝達経路の標的遺伝子のｍＲＮＡの発現を分析して示す。コントロールのＮＡＭＥＣに対する、ＧＷ６２７３６８Ｘで処理したＮＡＭＥＣにおいて阻害された、変化しない、あるいは、活性化された標的遺伝子のパーセンテージをグラフで示している。
【図７】ＮＡＭＥＣのＲＮＡ、および、ＧＷに誘導されたＮＡＭＥＣからのエクソソームおよびＰＧＥ２に誘導されたＮＡＭＥＣからのエクソソームの分析を示す。（Ａ）は、ＲＮＡの電気泳動分析を示す。（Ｂ）は、同数の、ＧＷによって４日間処理されたＮＡＭＥＣから放出されたエクソソーム（Ｅｘｏ−ＧＷ）またはＰＧＥ２によって４日間処理されたＮＡＭＥＣから放出されたエクソソーム（Ｅｘｏ−ＰＧＥ２）からの総ＲＮＡのエレクトロフェログラムである。分析は、Ａｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザを用いて行った。矢印は、ｍｉＲＭＡ画分を示す。
【図８】Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ｍｉＲＮＡ  ３．０ａｒｒａｙによって決定された、ＧＷに誘導されたエクソソームのｍｉＲＮＡの差次的発現をＰＧＥ２に誘導されたエクソソームと比較して示す図である。濃い点線は、５倍強度の変化のカットオフを示し、薄い点線は、２倍強度の変化のカットオフを示す。エクソソームのＧＡＰＤＨマーカーを用いてｍｉＲＮＡの濃度を正規化した。
【図９Ａ】脂質ラフトが豊富な（ＬＲＦ、画分２〜５）または脂質ラフトのない（非ＬＲＦ、画分７〜９）膜画分における指示タンパク質のウエスタンブロット分析を示す。そのタンパク質は、ガングリオシドＧＭ１（ドットブロット法）およびカベオリン−１（どちらも脂質ラフトのマーカー）、および、ＧＡＰＤＨ（非脂質ラフトのマーカー）と共にウエスタンブロットすることにより、ＧＷに誘導されたＮＡＭＥＣ、および、ＧＷに誘導されたＮＡＭＥＣからのエクソソームの膜画分において検出された。Ｃは細胞、Ｅは、エクソソームである。右の四角は、非脂質ラフトからタンパク質が消失したことを示し、左の四角では、脂質ラフト内にタンパク質が見られる。
【図９Ｂ】ＧＷに誘導されたＮＡＭＥＣからのエクソソーム、および、ＰＧＥ２に誘導されたＮＡＭＥＣからのエクソソームの脂質ラフト内で測定されたタンパク質を示す。画分２〜５について、ＧＷに誘導されたＮＡＭＥＣからのエクソソーム、および、ＰＧＥ２に誘導されたＮＡＭＥＣからのエクソソームの脂質ラフトにおけるタンパク質をウエスタンブロット法で分析した。脂質ラフトのローディングをＧＭ１およびカベオリン−１の濃度で定量化した。
【図９Ｃ】ＮＡＭＥＣ、ｓｉＣａｖ１  ＮＡＭＥＣＳ、または、ｓｉＣａｖ１＋２  ＮＡＭＥＣから放出されるＧＷに誘導されたエクソソームで測定された指示タンパク質を示す。ローディングコントロールは、エクソソームのＧＡＰＤＨおよびβ−アクチンである。
【図９Ｄ】溶媒またはＭβＣＤで処理したＮＡＭＥＣから放出されたＧＷに誘導されたエクソソーム内で測定された指示タンパク質を示す。ローディングコントロールは、エクソソームのＧＡＰＤＨ、β−アクチン、および、ＣＤ８１である。
【図９Ｅ】Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ｍｉＲＮＡ  ４．０ａｒｒａｙによって決定された、ＧＷＭβに誘導されたＮＡＭＥＣからのエクソソームのｍｉＲＮＡの差次的発現をＧＷに誘導されたＮＡＭＥＣからのエクソソームと比較して示す。エクソソームのＧＡＰＤＨマーカーを用いてｍｉＲＮＡの濃度を正規化した。
【図９Ｆ】脂質ラフトが豊富な（ＬＲＦ、画分２〜５）または脂質ラフトのない（非ＬＲＦ、画分７〜９）膜画分におけるＴＧＦβＲ１、ＴＧＦβＲ２、ｐ−Ａｋｔ、Ａｋｔ、および、Ａｇｏ２のウエスタンブロット分析を示す。ＮＡＭＥＣを溶媒（Ｃｒｌ）、ＧＷ６２７３６８Ｘ（１μｇ／ｍｌ）、または、ＰＧＥ２（１μＭ）で４日間処理した。タンパク質は、脂質ラフトのマーカーであるガングリオシドＧＭ１（ドットブロット法）およびカベオリン−１、および、非脂質ラフトのマーカーであるＧＡＰＤＨと共にウエスタンブロットすることにより膜画分において検出された。右の四角は、ＧＷで処理したＮＡＭＥＣの非脂質ラフトからタンパク質が消失したことを示し、左の四角では、ＧＷで処理したＮＡＭＥＣの脂質ラフト内にタンパク質が見られる。
【図１０Ａ】ＧＷで処理した間葉系幹細胞（ＭＳＣ）のＰ４画分の小胞の数の分析を示すグラフである。ＣＭ−Ｐ４画分のＧＷで処理したＭＳＣが収集され、ナノサイトのナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ）にかけられた。細胞外小胞（ＥＶ）／エクソソームの放出の数量化を比率［小胞数］／［細胞数］として示す。データは平均値±標準誤差（ｎ＝３）である。＊＊＊Ｐ≦０．００１。
【図１０Ｂ】溶媒ＤＭＳＯで処理したＭＳＣ、または、ＥＰ４アンタゴニストで処理したＭＳＣ（ＭＳＣＧＷ）から放出されたＥＶ／エクソソーム画分において測定されたタンパク質含量を示す１組のブロットである。溶媒で８日間処理されたＭＳＣまたはＧＷで８日間処理されたＭＳＣ（ＭＳＣＧＷ）から培地（Ｄ１〜４：１〜４日馴化培地；Ｄ５〜８：５〜８日馴化培地）を収集した。
【図１０Ｃ】溶媒ＤＭＳＯまたはＥＰ４アンタゴニストで処理した神経幹細胞（ＮＳＣ）から放出されたＥＶ／エクソソーム画分において測定されたタンパク質含量を示す１組のブロットである。ＤＭＳＯまたはＧＷで４日間処理したＭＳＣから培地を収集した。同数のＮＳＣから放出されたＥＶ／エクソソームのタンパク質をウエスタンブロット法でローディングした。
【図１１】ＭＳＣと、ＥＰ４アンタゴニストであるＧＷで処理したＭＳＣとの間の分化の比較を示す。（Ａ）および（Ｂ）は、ＭＳＣと、ＥＰ４アンタゴニストであるＧＷで処理したＭＳＣとの骨分化を示す。ＭＳＣを骨分化培地で培養した後、アリザリンレッドＳで染色した。アリザリンレッドＳによる染色の光学濃度（ＯＤ）を測定することにより、骨分化を定量化した。（Ｃ）は、ＭＳＣと、ＥＰ４アンタゴニストであるＧＷで処理したＭＳＣとの脂肪細胞分化を示す。ＭＳＣを脂肪細胞分化培地で培養した。その後、細胞をオイルレッドＯで染色した。（Ｄ）は、ＭＳＣと、ＥＰ４アンタゴニストであるＧＷで処理したＭＳＣとの神経分化を示す。ＭＳＣを神経分化培地で７または１４日培養し、その後、ウエスタンブロット法を用いて、神経細胞マーカーであるチューブリンβ３およびＮｅｕＮの発現を分析した。
【図１２】ＧＷで処理した後、溶媒（ＰＢＳ）またはＧＷに誘導されたエクソソームで処理したＮＡＭＥＣの分析を示す。（Ａ）は、ＧＷで処理した後、ＰＢＳまたはＧＷに誘導されたＮＡＭＥＣからのエクソソーム（１μｇ／ｍｌ）で処理したＮＡＭＥＣを示す一組の明視野像である。ＣｒｌはＰＢＳで８日間処理されたものを示す。ＧＷ／ＰＢＳは、ＧＷで４日間、その後ＰＢＳでさらに４日間処理されたものを示す。ＧＷ／ＧＷは、ＧＷで８日間処理されたものを示す。ＧＷ／Ｅｘｏは、ＧＷで４日間、その後ＧＷに誘導されたＮＡＭＥＣからのエクソソームでさらに４日間処理されたものを示す。矢印は、上皮島を指している。スケールバーは１００μｍである。（Ｂ）は、０．０５％のトリプシンに耐性のある、ＧＷの後にＰＢＳで処理した（ＧＷ／ＰＢＳ）か、ＧＷの後にＧＷに誘導されたＮＡＭＥＣからのエクソソーム（１μｇ／ｍｌ）で処理した（ＧＷ／Ｅｘｏ）か、または、ＧＷで２回処理した（ＧＷ／ＧＷ）ＮＡＭＥＣのパーセンテージを示すグラフである。“Ｃｒｌ”は、ＰＢＳで処理したＮＡＭＥＣのデータである。ＮＡＭＥＣは指示通り処理された後、０．０５％のトリプシンで分離される。データは平均値±標準誤差（ｎ＝３）である。＊＊＊Ｐ≦０．００５。（Ｃ）は、ＧＷで処理した後、ＰＢＳ（Ｃｒｌ）またはＧＷに誘導されたＮＡＭＥＣからのエクソソームで処理したＮＡＭＥＣのボイデンチャンバー移動を示すグラフである。ＮＡＭＥＣは（Ａ）に示したように処理された。移動アッセイの間、処理を中断した。データは平均値±標準誤差（ｎ＝３）である。＊Ｐ≦０．０５、＊＊＊Ｐ≦０．００１。（Ｄ）は、ＧＷで処理した後にＰＢＳ（Ｃｒｌ）またはＧＷに誘導されたＮＡＭＥＣからのエクソソームで処理したＮＡＭＥＣの腫瘍様塊形成を示すグラフである。ＮＡＭＥＣは（Ａ）に示したように処理された。腫瘍様塊アッセイの間、処理を中断した。データは平均値±標準誤差（ｎ＝４）である。＊＊＊Ｐ≦０．００１。
【図１３】ＰＢＳ（Ｃｒｌ）、または、１μｇ／ｍｌのＧＷに誘導されたＮＡＭＥＣからのエクソソーム（ＥＶ）で前処理されたＨＭＬＥ（乳房上皮）非幹細胞の分析を示す。（Ａ）は、ＰＢＳ（Ｃｒｌ）、または、１μｇ／ｍｌのＧＷに誘導されたＮＡＭＥＣからのエクソソーム（ＥＶ）で前処理されたＨＭＬＥ非幹細胞の１組の明視野像である。新鮮なエクソソーム（１μｇ／ｍｌ）および培地が２日に一度、２週間供給された。細胞を４日おきに分割した。画像はタイムラプス動画からの抜粋で、ＰＢＳまたはエクソソーム処理開始後１４日目に撮影したものである。スケールバーは１００μｍである。（Ｂ）は、ＰＢＳ（Ｃｒｌ）、または、ＧＷに誘導されたＮＡＭＥＣからのエクソソーム（ＥＶ）で前処理されたＨＭＬＥ非幹細胞の移動を示すグラフである。タイムラプス撮像により細胞移動を２４時間観測した。移動軌跡の平均長をプロットした。データは平均値±標準誤差（ｎ＝２０）である。＊＊＊Ｐ≦０．００１。（Ｃ）は、ＰＢＳで処理した、または、ＧＷに誘導されたＮＡＭＥＣからのエクソソームで処理したＨＭＬＥ非幹細胞のボイデンチャンバー移動を示すグラフである。ＨＭＬＥ非幹細胞を次のように処理した。ＨＭＬＥ＋Ｅｘｏ：７２時間の移動アッセイの間に１μｇ／ｍｌのエクソソームを加えた。Ｅｘｏ−ＨＭＬＥ：ＨＭＬＥをエクソソームで７日間前処理し、移動アッセイの間は薬物による処理を中断した。データは、平均値±標準誤差（ｎ＝３）である。＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．００５。（Ｄ）は、ＰＢＳ、または、ＧＷに誘導されたＮＡＭＥＣからのエクソソームで７日間処理したＨＭＬＥ非幹細胞の腫瘍様塊の形成を示すグラフである。腫瘍様塊アッセイの間、処理を中断した。データは、平均値±標準誤差（ｎ＝５）である。＊Ｐ≦０．０５。
【図１４】マウス初代乳房細胞の乳房形成を示す。マウス初代ＥｐＣＡＭｈｉ／インテグリンα６（ＣＤ４９ｆ）ｌｏ管腔細胞を、ＰＧＥ２もしくはＧＷに誘導された、マウス初代乳房上皮細胞からのエクソソーム、または、ＧＷに誘導されたＮＡＭＥＣからのエクソソーム（１μ／ｍｌ）で細胞培養中に１０日間処理した。処理の後、３週齢のマウスの切除脂肪パッドに、表に示された数の細胞を脂肪パッドごとに移植した。８週間後にマウスを安楽死させて検死を行い、乳房の形成を分析した。グレーの円は、乳房が形成されていない移植パッドである。黒い円は、乳房が形成された移植パッドである。部分的に黒い円は、部分的に乳房が形成された移植パッドである。乳房再構築単位（ＭＲＵ）の頻度をＥＬＤＡ（Ｅｘｔｒｅｍｅ  ｌｉｍｉｔｉｎｇ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ分析）を用いて計算した。スケールバーは、０．７５ｃｍである。
【図１５】ＰＢＳ（Ｃｒｌ）、ＧＷに誘導されたＮＡＭＥＣからのエクソソーム（１μｇ／ｍｌ）、ＰＧＥ２に誘導されたＮＡＭＥＣからのエクソソーム（２μｇ／ｍｌ）、または、ＧＷＭβに誘導されたＮＡＭＥＣからのエクソソーム（１μｇ／ｍｌ）で前処理された細胞を示す。（Ａ）は、ＰＢＳ、ＧＷに誘導されたＮＡＭＥＣからのエクソソーム、ＰＧＥ２に誘導されたＮＡＭＥＣからのエクソソーム、または、ＧＷＭβに誘導されたＮＡＭＥＣからのエクソソームで７日間前処理されたＨＭＬＥ非幹細胞のボイデンチャンバー移動を示す。移動アッセイの間、薬物による処理を中断した。データは、平均値±標準誤差（ｎ＝３）である。＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．００５。（Ｂ）は、ＰＢＳ、ＧＷに誘導されたＮＡＭＥＣからのエクソソーム、ＰＧＥ２に誘導されたＮＡＭＥＣからのエクソソーム、または、ＧＷＭβに誘導されたＮＡＭＥＣからのエクソソームで７日間前処理されたＨＭＬＥ非幹細胞の腫瘍様塊の形成を示す。腫瘍様塊アッセイの間、処理を中断した。データは、平均値±標準誤差（ｎ＝５）である。＊Ｐ≦０．０５。（Ｃ）は、マウス初代乳房細胞による乳房の形成を示す。マウス初代ＥｐＣＡＭｈｉ／インテグリンα６（ＣＤ４９ｆ）ｌｏ管腔細胞をＰＢＳ、ＧＷに誘導されたＮＡＭＥＣからのエクソソーム（１μｇ／ｍｌ）、ＰＧＥ２に誘導されたＮＡＭＥＣからのエクソソーム（２μｇ／ｍｌ）、または、ＧＷＭβに誘導されたＮＡＭＥＣからのエクソソーム（１μｇ／ｍｌ）で１０日間、インビトロで処理した。処理の後、３週齢のマウスの切除脂肪パッドに、表示された数の細胞を脂肪パッドごとに移植した。８週間後にマウスを安楽死させて検死を行い、乳房の形成を分析した。グレーの円は、乳房が形成されていない移植パッドである。黒い円は、乳房が形成された移植パッドである。部分的に黒い円は、部分的に乳房が形成された移植パッドである。ＥＬＤＡ用いてＭＲＵの頻度を計算した。スケールバーは、０．７５ｃｍである。
【図１６】ＥＰ４アンタゴニストに誘導されたＭＳＣからのＥＶ（細胞外小胞）は、ニューロスフェア形成能力などのＮＳＣの性質を向上させ得ることを示す。ＰＢＳ（Ｃｒｌ）、ＭＳＣからのＥＶ、ＧＷに誘導されたＭＳＣからのＥＶ、または、ＧＷに誘導されたＮＡＭＥＣからのＥＶで処理したＮＥ４Ｃ細胞のニューロスフェアの形成を、ニューロスフェアアッセイを用いて決定した。ニューロスフェアアッセイの間、処理を中断した。データは、平均値±標準誤差（ｎ＝５）である。＊＊Ｐ≦０．０１。
【図１７】ＥＰ４アンタゴニストに誘導されたＭＳＣからのＥＶは、神経外胚葉細胞からの神経細胞の分化を促進させ得ることを示す。ＰＢＳ、ＭＳＣからのＥＶ、ＧＷに誘導されたＭＳＣからのＥＶ、または、ＧＷに誘導されたＮＡＭＥＣからのＥＶで前処理されたＮＥ４Ｃ神経外胚葉細胞をレチノイン酸（ＲＡ）で処理することにより、神経細胞の分化を誘導した。レチノイン酸による処理の後の神経細胞を抗β３−チューブリン抗体で染色した。神経突起の数および長さを定量化してプロットした。データは、平均値±標準誤差（ｎ＝４）である。＊Ｐ≦０．０５、＊＊＊Ｐ≦０．００１。
【図１８】ＰＢＳ、または、ＥＰ４アンタゴニストに誘導されたＭＳＣからのエクソソーム（Ｅｘｏ）で処理した、海馬を損傷しているマウスの学習および記憶力を示す。評価は、モリス水迷路を用いて行った。学習および記憶力は、訓練の後に目標を達成するためにかかる時間によって評価された。ＮＩ−ＰＢＳは、ＰＢＳで処理した正常なマウスを示す。ＮＩ−Ｅｘｏは、ＥＰ４アンタゴニストに誘導されたＭＳＣからのエクソソームで処理した正常なマウスを示す。Ｉ−ＰＢＳは、ＰＢＳで処理した海馬損傷マウスを示す。Ｉ−Ｅｘｏは、ＥＰ４アンタゴニストに誘導されたＭＳＣからのエクソソームで処理した海馬損傷マウスを示す。
【図１９】ＥＰ４が媒介するシグナル伝達をＥＰ４アンタゴニストによって遮断することにより、ＭＳＣからのＥＶ／エクソソームの放出が増大し、エクソソームのタンパク質およびサイトカイン含量も増大することを示している。（Ａ）は、ＧＷで処理したＭＳＣのＰ４画分の小胞数の分析を示す。ＣＭ−Ｐ４画分のＧＷで処理したＭＳＣを収集し、ナノサイトのナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ）にかけた。（Ｂ）は、溶媒ＤＭＳＯ、ＥＰ４アンタゴニスト（ＧＷ）、または、ＥＰ４アンタゴニスト（ＰＧＥ２）で処理したＭＳＣから放出されたＥＶ／エクソソームの画分で測定されたタンパク質を示す。溶媒ＤＭＳＯまたはＧＷで８日間処理されたＭＳＣから培地を収集した。同数のＭＳＣから放出されたＥＶ／エクソソームのタンパク質をウエスタンブロットするためにローディングした。（Ｃ）ＤＭＳＯで処理したＭＳＣ（ＭＳＣ）またはＥＰ４アンタゴニストで処理したＭＳＣ（ＭＳＣＧＷ）から放出されたＥＶ／エクソソーム画分におけるサイトカインの測定を示す。溶媒（ＤＭＳＯ）、または、ＧＷで８日間処理されたＭＳＣから培地を収集した。サイトカインアレイ（Ｃ）およびＢｉｏ−Ｐｌｅｘ（Ｄ；ＩＬ−１０）を用いて、同数のＭＳＣから放出されたＥＶ／エクソソームに含まれるサイトカインを測定した。ＧＷで処理したＭＳＣ（ＭＳＣＧＷ）によって放出されたＥＶにおけるタンパク質／サイトカインの増加を（Ｃ）および（Ｄ）に示す。
【図２０】ＰＧＥ２／ＥＰ４レセプターが媒介するシグナル伝達を特異的に遮断することにより、ＥＰ４アンタゴニストであるＧＷが、がん幹細胞／腫瘍開始細胞の性質を弱め、Ｒａｓ転換ＮＡＭＥＣ（ＮＡＭＥＣ−Ｒ）からのＥＶ／エクソソームの放出を誘導したことを示す。（Ａ）溶媒で処理したＮＡＭＥＣ−Ｒ（Ｃｒｌ）、ＧＷ６２７３６８Ｘで処理したＮＡＭＥＣ−Ｒ（１μｇ／ｍｌのＧＷで４日間）、および、ＳＱ２９，５４８で処理したＮＡＭＥＣ−Ｒ（ＳＱ１２０／ＳＱ２４０；１２０ｎＭおよび２４０ｎＭで４日間、エクソソームの放出を誘導しないネガティブコントロールとしてＴＰアンタゴニストを使用）から放出されるＥＶ／エクソソームの数量化を、ＣＭ−Ｐ４画分における各細胞の粒子数として示す。ＮＴＡを用いてＰ４画分における小胞を計数した。データは平均値±標準誤差（ｎ＝６）である。＊＊＊Ｐ≦０．００１。（Ｂ）溶媒（Ｃｒｌ）、ＧＷ６２７３６８Ｘ（ＧＷ、１μｇ／ｍｌ）、および、ＳＱ２９，５４８（ＳＱ１２０／ＳＱ２４０；１２０ｎＭおよび２４０ｎＭ）で処理したＮＡＭＥＣ−ＲのＣＭ−Ｐ４画分においてＡｌｉｘ、ＴＳＧ１０１、ＣＤ６３、ＣＤ８１、および、ＧＡＰＤＨエクソソームマーカーを測定した。（Ｃ）同数の、溶媒で処理したＮＡＭＥＣ−Ｒ（Ｃｒｌ）、ＧＷで処理したＮＡＭＥＣ−Ｒ（ＧＷ、１μｇ／ｍｌのＧＷで４日間）、および、ＳＱ２９，５４８で処理したＮＡＭＥＣ−Ｒ（ＳＱ１２０／ＳＱ２４０；１２０ｎＭおよび２４０ｎＭで４日間）由来のＣＭ−Ｐ４画分において、間葉系マーカーであるＮ−カドヘリン、ＣＳＣマーカー、および、エクソソームマーカーを分析した。より長い曝露（ＧＡＰＤＨ（Ｌ）、および、ＣＤ８１（Ｌ））により、溶媒で処理したＮＡＭＥＣ−Ｒ細胞の馴化培地のＰ４画分においてＧＡＰＤＨおよびＣＤ８１の存在がわずかではあるが検出可能になった。
【図２１】ＥＰ４アンタゴニストＧＷは、ＣＤ４４ｈｉ／ＣＤ２４ヒトがん幹細胞からＥＶ／エクソソームを介してがん幹細胞のタンパク質を放出させることができることを示す。（Ａ）溶媒、または、指示された濃度のＧＷで処理したＭＣＦ−７、および、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳がん細胞から放出されるＥＶ／エクソソームの数量化をＣＭ−Ｐ４画分における各細胞から放出される粒子数として示す。ＮＴＡを用いてＰ４画分における粒子数を計数した。データは、平均値±標準誤差（ｎ＝１０）である。＊Ｐ≦０．０５、＊＊＊Ｐ≦０．００１。（Ｂ）溶媒、または、指示された濃度のＧＷで処理したＭＣＦ−７およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞から放出されたＥＶタンパク質の総量として数量化したものを示す。ＣＭ−Ｐ４画分における各細胞のタンパク質量（μｇ）を示している。データは、平均値±標準誤差（ｎ＝３）である。＊Ｐ≦０．０５。（Ｃ）ＥＶ／エクソソームのＰ４画分におけるタンパク質濃度、および、細胞溶解物をウエスタンブロット法により分析した。溶媒、または、指示された濃度のＧＷで４日間処理した同数のＭＣＦ−７およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞から培地および細胞溶解物を収集した。ＥＶを含む培地のＰ４画分を単離した。ネガティブコントロールＸは、空の培地のＰ４画分として示されている。
【図２２】ＥＰ４アンタゴニストに誘導されたＭＳＣ由来ＥＶ／エクソソームによって海馬を損傷したマウスにおける学習および記憶障害を回復させることができることを示す。（Ａ）新しい位置再認識テスト（ＮＬＲＴ）、（Ｂ）新しい物体認識テスト（ＮＯＲＴ）、および、（Ｃ）モリス水迷路を用いてマウスの学習力および記憶力を評価した。ＮＣは、正常マウス、Ｉｎｄｕｃｅは、海馬障害のあるマウス、ＮＣＥｘｏは、ＥＰ４アンタゴニストで処理されていないＭＳＣから単離されたエクソソームで処理した海馬障害のあるマウス、および、ＧＷＥｘｏは、アンタゴニストに誘導されたＭＳＣからのエクソソームで処理した海馬障害のあるマウスをそれぞれ示す。＊Ｐ≦０．０５、＊＊＊Ｐ≦０．００１。
【図２３】ＥＰ４アンタゴニストに誘導されたＭＳＣからのＥＶ／エクソソームによって、海馬に障害のあるマウスにおける神経細胞の再生、および、炎症の抑制が促されることを示す１組のグラフである。（Ａ）海馬における神経細胞マーカーＭＡＰ２を測定することにより、脳神経細胞の再生を評価した。（Ｂ）炎症は、海馬のミクログリアの数に反映した。ＮＣは、正常マウス、Ｉｎｄｕｃｅは、海馬障害のあるマウス、ＮＣＥｘｏは、ＥＰ４アンタゴニストで処理されていないＭＳＣから単離されたエクソソームで処理した海馬障害のあるマウス、および、ＧＷＥｘｏは、ＥＰ４アンタゴニストに誘導されたＭＳＣからのエクソソームで処理した海馬障害のあるマウスをそれぞれ示す。＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．００５、＊＊＊Ｐ≦０．００１。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本開示は、幹細胞からのエクソソーム放出を誘導すべく、有効量のプロスタグランジンＥレセプター４（ＥＰ４）で単離幹細胞を培養することにより、エクソソームを生成する方法に関する。本方法にて生成されたエクソソームは、幹細胞ホメオスタシスを維持するために必要なタンパク質およびｍｉＲＮＡを豊富に含む。したがって、本方法にて生成されるエクソソームは、幹細胞の性質を伝達し、幹細胞療法に代わるものとして用いることができる。
【００２２】
本明細書において用いられる「非幹細胞」という用語は、自然条件下において特定の細胞へとさらに分化することができない最終分化生体細胞のことを指す。ある状況においては、非幹細胞は、分裂してより多くの非幹細胞を生成することができる。いわゆる「人工幹細胞」とは、成熟した非幹細胞から誘導により直接生成することができ、幹細胞の分化能を示す種類の幹細胞を指す。例えば、ＥＰ４アンタゴニストに誘導されたエクソソームは、乳房上皮非幹細胞を、生体内で乳房を形成し得る乳房幹細胞へと変換させることができる。
【００２３】
潜在的に分化能を有する幹細胞であれば、人工エクソソームを生成する本方法で用いることができる。幹細胞は、これらに限定されないが、胚幹細胞、人工多能性幹細胞、がん幹細胞、および、組織幹細胞を含む。組織幹細胞は、これらに限定されないが、間葉系幹細胞、造血幹細胞、乳房幹細胞、神経幹細胞、小腸幹細胞、皮膚幹細胞、臍帯血幹細胞、角膜上皮幹細胞、毛包幹細胞、脂肪組織由来幹細胞、骨髄幹細胞、角膜幹細胞、および、卵巣幹細胞を含む。
【００２４】
本明細書中で用いられる用語「プロスタグランジンＥレセプター４アンタゴニスト」、または、「ＥＰ４アンタゴニスト」とは、（１）ｓｉＲＮＡ分子、または、ｓｈＲＮＡ分子など、プロスタグランジンＥレセプター４の発現を阻止する分子、あるいは、（２）ＥＰ４とそのリガンドＰＧＥ２との間の相互作用、または、相互作用機能を阻止する分子であって、ＰＧＥ２中和抗体、ＰＧＥ２によるＣＯＸ−２の生成を阻止する阻害剤、および、ＰＧＥ２によるミクロソームプロスタグランジンＥ合成酵素−１（ｍＰＧＥＳ−１）の生成を阻止する阻害剤を含むがこれらに限定されない。
【００２５】
ＥＰ４アンタゴニストは、これらに限定されないが、ＥＰ４  ｓｉＲＮＡ分子、ＧＷ６２７３６８Ｘ、ＡＨ２３８４８、Ｌ−１６１，９８２、ＣＪ−０２３、４２３、ＯＮＯ  ＡＥ３  ２０８、ＢＧＣ２０−１５３１、ＭＦ４９８、および、ＣＪ−４２７９４を含む。
【００２６】
幹細胞は、有効量のＥＰ４アンタゴニストで、幹細胞の種類、および、ＥＰ４アンタゴニストの量にもよるが、４〜８日間培養してよい。例えば、ＥＰ４アンタゴニストの有効量は、１．０〜４０（例えば、１、２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、または、４０）μｇ／ｍｌであってよい。いくつかの実施形態では、方法は、１．０〜１０μｇ／ｍｌのＥＰ４アンタゴニストＧＷ６２７３６８Ｘを含む培地で、乳房幹細胞を４日間培養することにより、エクソソームの放出を誘導する方法を含む。いくつかの実施形態では、方法は、２０μｇ／ｍｌのＥＰ４アンタゴニストＧＷ６２７３６８Ｘを含む培地で、間葉系幹細胞を８日間培養することを含む。培養ステップは、２０〜３０（例えば２５）μｇ／ｍｌのＥＰ４アンタゴニストＧＷ６２７３６８Ｘを含む培地で神経幹細胞を４日間培養することにより、エクソソームの放出を誘導することを含んでよい。
【００２７】
一実施形態では、乳房上皮細胞用基礎培地（ＭＥＢＭ）（２５０ｍｌのＭＣＤＢ−１７０、２５０ｍｌのＤＭＥＭ−Ｆ１２、１．２ｇの重炭酸ナトリウム、２．５μｇのＥＧＦ、０．２５ｍｇのヒドロコルチゾン、２．５ｍｇのインスリン、３５ｍｇのＢＰＥ）を、ＥＰ４アンタゴニスト（例えば、１μｇ／ｍｌのＧＷ６２７３６８Ｘ、または、４μｇ／ｍｌのＡＨ２３８４８）によって４日間培養することにより、エクソソームの放出が誘導された。
【００２８】
他の実施形態では、ＭＳＣ培地（５００ｍｌの低糖ＤＭＥＭ、２５ｍｌの小胞枯渇ウシ血清、および、１％のＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標））において培養された間葉系幹細胞をＥＰ４アンタゴニスト（例えば、１０μｇ／ｍｌのＧＷ６２７３６８Ｘ）で８日間処理することにより、エクソソームの放出が誘導された。
【００２９】
幹細胞および放出されたエクソソームを含む培地を連続的に遠心分離してよい。３００ｇの遠心力で約５分間遠心分離することにより死細胞が除去され、２，０００ｇの遠心力で約２０分間遠心分離することによりセルデブリスが除去され、１０，０００ｇの遠心力で約３０分間、最終的には１１０，０００ｇの遠心力で６０分間遠心分離することにより、培養上清からエクソソームを分離した。エクソソームペレットを例えばリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄してよい。そして洗浄したペレットをＰＢＳ、または、他の適切な培地もしくは賦形剤中に再懸濁してよい。
【００３０】
人工エクソソームは、５０ｎｍから１５０ｎｍの直径を有してよい。ＥＰ４アンタゴニストで処理されていない幹細胞から放出されるエクソソームに比べて、人工エクソソームは、例えば、タンパク質、および、ＲＮＡなどの幹細胞の性質を維持することに関係する特定の分子をより多く含む。例えば、ＥＰ４アンタゴニストで処理されていない幹細胞から放出されたエクソソームに比べ、人工エクソソームは、ＣＤ４４、ＣＤ９０、インテグリンβ１、インテグリンα６、ＣＤ８１、ＧＡＰＤＨ、Ｎ−カドヘリン、フィブロネクチン、ＣＤ１４６、ＣＤ９１、コフィリン、フィラミンＡ、ＣＤ９１、ＣＮＰ、タリン、トロポミオシン、ガレクチン３、Ｒａｐ１、ＣＤ１４６、β−カテニン、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＬＲＰ６、Ａｇｏ１、Ａｇｏ２、ＦＺＤ５、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、Ｍｅｔ、ＥＰ２、ＰＩ３Ｋ、ＰＤＫ１、Ａｋｔ、ｐ−Ａｋｔ、ｃ−Ｓｒｃ、ｐ−Ｓｒｃ、ＳＡＰＫ／ＪＮＫ、ＰＳＡ、ＶＣＡＭ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ＰＤＧＦβ、ＮＧＦＲ、ＩＬ−２Ｒβ、ＩＬ−１８Ｒβ、ＢＭＰ−７、ＭＩＰ−３α、ＲＡＮＴＥＳ、ＤＲ６、ＬＩＦ、ＢＤＮＦ、ＴＩＭＰ１、ＶＥＧＦａ、および、ＩＬ−１０のうちの１つ以上をより高濃度で含む。人工エクソソームは、ｍｉｒ−１７−９２、ｍｉｒ−１０６ａ−３６３、ｍｉｒ−１０６ｂ−２５クラスター、ｍｉｒ−２４、ｍｉｒ−１３０、ｍｉｒ−１７、ｍｉｒ−１８ａ、ｍｉｒ−２０ａ、ｍｉｒ−２０ｂ、ｍｉｒ−２４、ｍｉｒ−２５、ｍｉｒ−２９ａ、ｍｉｒ−１０６ｂ、ｍｉｒ−１３０ａ、および、ｍｉｒ−１３０ｂの１つ以上もより高濃度で含み得る。人工エクソソームは、例えば、ＣＤ４４、ＣＤ９０、インテグリンβ１、インテグリンα６、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、Ｍｅｔ、ＬＲＰ６、ＴＧＦβ−Ｒ１、ＴＧＦβ−Ｒ２、ｐ−Ａｋｔ、Ａｋｔ、Ａｇｏ１、および、Ａｇｏ２などの脂質ラフト会合型タンパク質も豊富に含み得る。
【００３１】
人工エクソソームは、インビトロおよびインビボでの幹細胞形成を誘導するために用いられ得る。例えば、エクソソームを被検体に投与することにより、幹細胞の形成を誘導して変性疾患（例えば、脳および脊髄損傷、卒中、学習障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、心筋梗塞、および、筋ジストロフィー）などのさまざまな病状を治療することができる。人工エクソソームは、心筋細胞形成の促進、脈管形成のシミュレーション、または、血液細胞形成のシミュレーションに用いることもできる。他にも、脱毛症、聴覚障害、失明、糖尿病、整形外科、および、外傷に用いることができる。人工エクソソームは、例えば、局所投与、または、非経口投与などの適切な経路を介して被検体に投与されてよい。
【００３２】
以下の特定の例は、単なる例示として解釈されるべきであり、本開示を限定するものではない。当業者であれば、本明細書に基づき、本開示の全内容を労せずして利用できよう。本明細書にて引用されているすべての公表文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【００３３】
実施例１
ＥＰ４アンタゴニストにより幹細胞からエクソソームを生成し、放出した。
【００３４】
非接着／間葉系乳房上皮幹細胞（ＮＡＭＥＣ）から人工エクソソームを生成し、単離する。
【００３５】
Ｍｒｏｕｅにより記載された（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２０１３；９４５：２２１〜２５０）手順を用いて、１２週齢の処女雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスからマウスのＮＡＭＥＣを単離した。３日間培養した後、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に２０分間浸して細胞を分離し、ＰＢＳ中で５％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）により中和した。細胞集塊をディスパーゼ（登録商標）（ＳＴＥＭＣＥＬＬ）で２０分間さらに処理した。
【００３６】
単離したヒト乳房上皮基底幹細胞（ＮＡＭＥＣ）を、ＥＰ４アンタゴニストを含むまたは含まない、すなわち、１μｇ／ｍｌのＧＷ６２７３６８Ｘ（ＧＷ）、または、４μｇ／ｍｌのＡＨ２３８４８（ＡＨ）を含む乳房上皮細胞基礎培地（２５０ｍｌのＭＣＤＢ−１７０、２５０ｍｌのＤＭＥＭ−Ｆ１２、１．２ｇの重炭酸ナトリウム、２．５μｇのＥＧＦ、０．２５ｍｇのヒドロコルチゾン、２．５ｍｇのインスリン、３５ｍｇのＢＰＥ）で４日間培養した。培養期間の３日目に、０．５μｇ／ｍｌのＧＷ、または、２μｇ／ｍｌのＡＨを培地に供給した。ＥＰ４アンタゴニストに誘導されたエクソソームをマウスの乳房上皮細胞から放出させるべく、１０μｇ／ｍｌのＧＷを含む培地で細胞を４日間培養した。
【００３７】
培地を３００ｇの遠心力で５分間遠心分離して細胞を除去し（Ｐ１）、２，０００ｇで２０分間遠心分離し（Ｐ２）、そして１０，０００ｇで３０分間遠心分離した（Ｐ３）。遠心分離はすべて温度４℃で行った。３００ｇ（Ｐ１）および１，２００ｇ（Ｐ２）の遠心分離で死細胞およびセルデブリスをそれぞれ除去した。最終的に、１１０，０００ｇの遠心分離を６０分間行うことにより、上清からエクソソーム（Ｐ４）を分離した。Ｐ４のエクソソームのペレットをＰＢＳで一旦洗浄し、さらなる応用に向けてＰＢＳ中に再懸濁した。
【００３８】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）から人工エクソソームを生成し、単離する。
【００３９】
単離した間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を、ＥＰ４アンタゴニスト（２０μｇ／ｍｌのＧＷ）を含むまたは含まないＭＳＣ培地（４７５ｍｌの低糖ＤＭＥＭ、２５ｍｌの小胞枯渇ウシ血清、１％のＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標））において８日間培養した。培養期間の３日目に、１０μｇ／ｍｌのＧＷを培地に供給し、４日目に、新たに調製した２０μｇ／ｍｌのＧＷを含む新鮮な培地と交換し、７日目に、１０μｇ／ｍｌのＧＷを供給した。
【００４０】
培地を３００ｇの遠心力で５分間遠心分離することにより死細胞を除去し（Ｐ１）、２，０００ｇの遠心力で２０分間遠心分離することによりセルデブリスを除去し（Ｐ２）、その後、１０，０００ｇの遠心力で３０分間遠心分離した（Ｐ３）。遠心分離はすべて温度４℃で行った。最終的に、１１０，０００ｇの遠心分離を６０分間行うことにより、上清からエクソソーム（Ｐ４）を分離した。細胞外小胞（ＥＶ）／エクソソームのペレットをＰＢＳで一旦洗浄し、さらなる応用に向けてＰＢＳ中に再懸濁した。
【００４１】
神経幹細胞（ＮＳＣ）から人工エクソソームを生成し、単離する。単離した神経幹細胞（ＮＳＣ）を、ＥＰ４アンタゴニスト（２０〜３０μｇ／ｍｌのＧＷ）を含むまたは含まないＮＳＣ培地（２２５ｍｌの低糖ＤＭＥＭ、２２５ｍｌのＦ１２、５０ｍｌの小胞枯渇ウシ血清）において４日間培養した。培養期間の３日目に、１０〜１５μｇ／ｍｌのＧＷを培地に供給した。
【００４２】
培地を３００ｇの遠心力で５分間遠心分離することにより死細胞を除去し（Ｐ１）、２，０００ｇの遠心力で２０分間遠心分離することによりセルデブリスを除去し（Ｐ２）、その後、１０，０００ｇの遠心力で３０分間遠心分離した（Ｐ３）。遠心分離はすべて温度４℃で行った。最終的に、１１０，０００ｇの遠心分離を６０分間行うことにより、上清からエクソソーム（Ｐ４）を分離した。ＥＶ／エクソソームのペレットをＰＢＳで一旦洗浄し、さらなる応用に向けてＰＢＳ中に再懸濁した。
【００４３】
調製されたエクソソーム小胞（Ｐ４）の電子顕微鏡（ＥＭ）解析をｖａｎ  Ｎｉｅｌ等による記載（胃腸医学２００１；１２１：３３７〜３４９）どおりに行った。簡潔に説明すると、上記のように精製されたエクソソームをＰＢＳ中で４％のパラホルムアルデヒドにより固定し、フォームバー／カーボン被膜銅グリッド（ポリサイエンス社）に滴下した。洗浄した後、サンプルを２％のリンタングステン酸で染色し、透過型電子顕微鏡（ＨＴ７７００、日立）を用いて観察した。
【００４４】
図１に示すように、ＴＥＭ分析は、ＧＷで処理したＮＡＭＥＣの馴化培地のＰ４（ＣＭ−Ｐ４）画分が膜小胞を豊富に含んでいることを示した。ナノサイトのナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ）を用いて、ＣＭ−Ｐ４画分における粒子数をさらに分析したところ、ＧＷで処理していないＮＡＭＥＣおよびＰＧＥ２（１μＭ）で処理したＮＡＭＥＣに比べて、ＥＰ４アンタゴニストが膜小胞の放出を誘導していることが際立って示された（図１（Ｂ））。
【００４５】
ナノサイトのナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ）の結果は、ＥＰ４アンタゴニストが８０から１２０ｎｍの膜小胞の放出を誘導していることを示した（濃度：約５．４×１０４粒子／細胞、平均直径：９７ｎｍ、図１（Ｂ）、図２（Ａ）および２（Ｂ）参照）。ＧＷで処理されていないＮＡＭＥＣ、および、ＰＧＥ２で処理したＮＡＭＥＣは、より大きい小胞をより少なく放出した（濃度：約０．５×１０４粒子／細胞、平均直径：１７３ｎｍおよび２０１ｎｍ）。ＧＷで処理したＮＡＭＥＣのＣＭ−Ｐ４画分では、一般的なエクソソームマーカーであるＣＤ８１、ＣＤ９、ＴＳＧ１０１、Ａｌｉｘ、ＨＳＰ７０、および、ＧＡＰＤＨが大量に検出された（図２（Ｃ）を参照）。この結果は、ＥＰ４アンタゴニストに誘導されたエクソソームを介してエクソソームマーカーが放出されることを示唆している。
【００４６】
検出されたエクソソームマーカーＣＤ８１、ＣＤ４４、および、ＧＡＰＤＨによって示されるように、ＥＰ４アンタゴニストＧＷは、乳房上皮（ＨＭＬＥ）非幹細胞からのエクソソームの放出を促進しなかった。ＥＰ４アンタゴニストＧＷは、乳房上皮基底幹細胞（ＮＡＭＥＣ）からは相当数のエクソソームの放出を誘導するが、乳房上皮非幹細胞からは誘導しなかった（図２（Ｄ）参照）。他のＥＰ４アンタゴニストであるＡＨ２３８４８によってもＮＡＭＥＣからのエクソソームの放出が用量依存的に誘導されたが、ＡＨ６８０９、およびＥＰ１／ＥＰ２／ＥＰ３アンタゴニストによってはほとんど誘導されなかった(図２（Ｅ）を参照）。
【００４７】
ＥＰ４に対抗するｓｈＲＮＡを用いて、エクソソーム放出へのＥＰ４シグナル伝達遮断効果を検証した。ドキシサイクリン（ｄｏｘ）誘導可能ＥＰ４ｓｈＲＮＡ  ＮＡＭＥＣ−ｓｈＥＰ４−１、および、ＮＡＭＥＣ−ｓｈＥＰ４−２をドキシサイクリンで処理することにより、ＥＰ４タンパク質の発現をノックダウンした。ＣＭ−Ｐ４画分におけるエクソソームマーカーＧＡＰＤＨ、ＣＤ８１、および、ＨＳＰ７０の増加によって示されるように、９６時間のドキシサイクリンでの処理において、ドキシサイクリンで処理したＮＡＭＥＣ−ｓｈＥＰ４−１、および、ドキシサイクリンで処理したＮＡＭＥＣ−ｓｈＥＰ４−２からエクソソームが放出された（図２（Ｆ）参照）。
【００４８】
ＥＰ４アンタゴニスト、または、ＥＰ４  ｓｈＲＮＡによるＰＧＥ２シグナル伝達の遮断は、乳房上皮基底幹細胞からのエクソソームの放出を誘導し得る。間葉系ＮＡＭＥＣは、ＧＷの存在下において丸石のような上皮島を形成した（ドットで記したもの）。逆に、ＧＷなしで培養されたＮＡＭＥＣは、それらの先在する間葉形態を維持した。完全に間葉上皮転換（ＭＥＴ）したＧＷで処理したＮＡＭＥＣは、０．０５％のトリプシン処理による分離に対してより耐性を示す上皮島を形成した（図３（Ｂ））。発明者らは、ＥＰ４シグナル伝達の遮断がＮＡＭＥＣにおけるＭＥＴを誘導すると結論付けた。また、移動する細胞の数は、ＧＷで前処理することにより約６０％減少し（図３（Ｃ））、ＥＰ４の媒介によるシグナル伝達の遮断により、ＮＡＭＥＣを非幹細胞に変換する乳房上皮基底幹細胞の間葉形態、および、移動能力のいずれも急激に失われることを示した。
【００４９】
実施例２
ＥＰアンタゴニストに誘導されたエクソソームの性質および含量を分析した。
本実施例では、ＥＰ４アンタゴニストＧＷに誘導されたエクソソーム、および、ＥＰ４アゴニストＰＧＥ２に誘導されたエクソソームの含量をさらに分析し、幹細胞の状態を転換するそれらの異なる能力の原因となる相違点を見出した。図４に示すように、ＧＷで処理したＮＡＭＥＣから放出されたエクソソームのタンパク質の総量は、溶媒（Ｃｒｌ）またはＰＧＥ２で処理したＮＡＭＥＣからのエクソソームの総量よりはるかに多かった。また、ＧＷに誘導されたエクソソーム、および、ＰＧＥ２に誘導されたエクソソームにおけるさまざまなタンパク質の相対含量も異なっていた。
【００５０】
これらのうち、ＧＷに誘導されたエクソソームは、間葉／幹のような性状を維持するのに欠かせないタンパク質（例えば、Ｎ−カドヘリン、フィブロネクチン、ＣＤ９０、ＣＤ４４、ＣＤ１４６、および、ＣＤ９１）を運搬した。一方、ＰＧＥ２に誘導されたエクソソームは、ＧＷに誘導されたエクソソームには存在しない上皮マーカーであるＥ−カドヘリンを運搬した。この結果は、乳房上皮基底幹細胞の形態がＰＧＥ２／ＥＰ４シグナル伝達経路によって双方向に調節されること、および、エクソソームによる間葉系マーカーの放出を増やすと共にエクソソームによるＥ−カドヘリンの放出を減らすことによってＥＰ４アンタゴニストはＭＥＴを促進させることを示唆している。
【００５１】
細胞移動に寄与するタンパク質（例えば、インテグリンβ１、インテグリンα６、コフィリン、フィラミンＡ、ＣＤ９１、ＣＮＰ、タリン、トロポミオシン、ガレクチン３、Ｒａｐ１、および、ＣＤ１４６）、基底幹細胞（ＳＣ）マーカー（例えば、ＣＤ４４、ＣＤ９０、インテグリンβ１、インテグリンα６）、および、βカテニンも、ＧＷで処理したＮＡＭＥＣからエクソソームを介して放出された。データは、ＥＰ４アンタゴニストが、幹のような性状を維持するのに重要なタンパク質の喪失を導くと共に、ＧＷで処理した乳房上皮基底幹細胞の間葉形状、細胞運動性、および、幹細胞の同一性の変化に寄与するエクソソームの放出を誘導することを示唆している。
【００５２】
ＮＡＭＥＣをＥＰ４アンタゴニストで処理することにより、エクソソームを介してレセプターおよびシグナル伝達タンパク質の放出を誘導した。ＧＷに誘導されたＮＡＭＥＣからのエクソソームでは、シグナル伝達レセプター（例えば、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＬＲＰ６、ＦＺＤ５、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、Ｍｅｔ、および、ＥＰ２）が検出された（図４）。また、ＧＷで処理したＮＡＭＥＣにおけるレセプターの細胞表面濃度を、細胞表面のタンパク質をビオチン化してフローサイトメトリーで測定したが、ＰＧＥ２／ＥＰ４シグナル伝達を遮断することでシグナル伝達レセプターを放出することにより、細胞表面濃度は低下した。（図５（Ａ）および（Ｂ））。
【００５３】
さらに、ＰＩ３Ｋシグナル伝達（ＰＩ３Ｋ、ＰＤＫ１、Ａｋｔ、ｐ−Ａｋｔ）、正規Ｗｎｔシグナル伝達（β−カテニン）、ＥＧＦシグナル伝達（ｃ−Ｓｒｃ、ｐ−Ｓｒｃ）、および、ＭＡＰＫ／非正規Ｗｎｔシグナル伝達（ＳＡＰＫ／ＪＮＫ）などのシグナル伝達タンパク質もＧＷに誘導されたエクソソームを介してＮＡＭＥＣから放出された。ＥＰ４アンタゴニストであるＧＷで処理した細胞と、放出されたエクソソームにおける総Ａｋｔに対するｐ−Ａｋｔの比率を評価することにより、ｐ−Ａｋｔが優先的にＧＷに誘導されたエクソソームに取り込まれることがわかった（図４）。
【００５４】
他のシグナル伝達経路の成分が選択的に放出されるかどうかを評価すべく、ＧＷで処理したＮＡＭＥＣにおけるシグナル伝達経路の活性化および抑制を、ＲＴ２プロファイラーＰＣＲアレイを用いて分析した。結果は、ＧＷによって最も阻止される経路は、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ、ＴＧＦ−β、Ｗｎｔ、および、アンドロゲン経路であることを示唆している（図６）。ＧＷで処理したＮＡＭＥＣにおけるｐ−Ａｋｔが減少し、ＧＷに誘導されたエクソソームがｐ−Ａｋｔを豊富に含むことにより、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達は不活性化した。よって、ＥＰ４アンタゴニストは、エクソソームの放出を通じて細胞中のｐ−Ａｋｔを減少させることにより、Ａｋｔに依存するシグナル伝達経路を妨げる可能性がある。
【００５５】
さらに、ＧＷに誘導されたエクソソームから放出された、ＧＷで処理したＮＡＭＥＣにおける細胞表面レセプターＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ｃ−Ｍｅｔ、ＴＧＦＲβ１、ＴＧＦＲβ２、ＬＲＰ６、および、ＦＺＤ５の減少により、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ、ＴＧＦ−β、および、正規／非正規Ｗｎｔシグナル伝達経路も不活性化した。これらのデータは、細胞表面レセプターおよび／またはシグナル伝達成分を減少させることにより、ＥＰ４シグナル伝達の遮断が、エクソソーム放出の結果として他の細胞シグナル伝達経路に直接影響し、乳房上皮幹細胞の間葉系／幹細胞状態を上皮状態に転換させ得ることを示唆している。幹細胞マーカー、レセプター、および、シグナル伝達成分に加えて、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）の必須触媒成分もＧＷに誘導されたエクソソーム中に見られ、これは、ＧＷに誘導されたエクソソームがｍｉＲＮＡを含み得ることを示唆している。ＮＡＭＥＣ、および、ＧＷに誘導されたＮＡＭＥＣからのエクソソームにおける１８Ｓ／２６Ｓ  ＲＮＡに対するｍｉＲＮＡの比率を評価すると、ｍｉＲＮＡが優先的にＧＷに誘導されたエクソソームに取り込まれることがわかった（図７Ａ）。さらに、ＧＷに誘導されたエクソソームは、ｍｉＲＮＡを豊富に含むが、ＰＧＥ２に誘導されたエクソソームでは少量のｍｉＲＮＡしか検出されなかった（図７（Ｂ））。
【００５６】
ＧＷに誘導されたエクソソームおよびＰＧＥ２に誘導されたエクソソームにおけるｍｉＲＮＡの含量を、ｍｉＲＮＡマイクロアレイを用いてエクソソームごとに分析した。ＰＧＥ２に誘導されたエクソソームと比べて、ＧＷに誘導されたエクソソームでは分析した１７３３のｍｉＲＮＡの２４％の濃度が（２倍以上）上昇した（図８）。一方、ＰＧＥ２に誘導されたエクソソームでは、（２倍以上）上昇したｍｉＲＮＡはなかった。ＧＷに誘導されたエクソソームにおいて（５倍以上）上昇したｍｉＲＮＡの上位１０％には、幹細胞ホメオスタシスおよび運動性に関与することが知られている多くのｍｉＲＮＡが含まれる（例えば、ｍｉｒ−１７−９２、ｍｉｒ−１０６ａ−３６３、および、ｍｉｒ−１０６ｂ−２５クラスター、ｍｉｒ−２４、および、ｍｉｒ−１３０）。ＰＧＥ２に誘導されたエクソソームと比べて、ＧＷに誘導されたエクソソームには、幹細胞ホメオスタシスに関与するｍｉＲＮＡ、すなわち、ｍｉｒ−１７、ｍｉｒ−１８ａ、ｍｉｒ−２０ａ、ｍｉｒ−２０ｂ、ｍｉｒ−２４、ｍｉｒ−２５、ｍｉｒ−２９ａ、ｍｉｒ−１０６ｂ、ｍｉｒ−１３０ａ、および、ｍｉｒ−１３０ｂも非常に豊富に含まれていた。これらのデータは、ＧＷに誘導されたエクソソームは、幹細胞ホメオスタシスおよび運動性を制御するｍｉＲＮＡを運搬し、幹細胞の性質の変化を伝達することができることを示唆している。
【００５７】
タンパク質（例えば、ＣＤ４４、ＣＤ９０、インテグリン、ＥＧＦＲ、ｃ−Ｍｅｔ、ＨＥＲ２、ＬＲＰ６、Ａｋｔ、および、ＴＧＦβＲ）は、脂質ラフト（ＬＲＦ）中に存在するときと非脂質ラフトに存在するときとでは異なる機能を有し得る。形質膜における脂質ラフト会合型のタンパク質は、常に、積極的にシグナル伝達の媒介となる。図４に示すように、ＮＡＭＥＣは、異なる形態のインテグリンβ１（Ｈｇ−インテグリンβ１、および、Ｌｇ−インテグリンβ１）、インテグリンα６（Ｈ−インテグリンα６、および、Ｌ−インテグリンα６）、および、ＬＲＰ６（ＬＲＰ６、ｐｇ−ＬＲＰ６、ｇ−ＬＰＲ６、および、Ｎｇ−ＬＲＰ６）を発現した。これらの異なる形態は、リン酸化反応、および、グリコシル化によって生じる。ＮＡＭＥＣでは、Ｈｇ−インテグリンβ１、Ｈ−インテグリンα６、および、ｐｇ−ＬＲＰが脂質ラフト中に見られたが、Ｌｇ−インテグリンβ１、インテグリンα６、および、Ｎｇ−ＬＲＰ６は非脂質ラフトにのみ存在した。
【００５８】
脂質ラフト会合型、および、非脂質ラフト会合型であるタンパク質（例えば、インテグリンβ１、インテグリンα６、ＬＲＰ６、および、Ａｋｔ／ｐ−Ａｋｔ）では、非脂質ラフト会合型よりも、脂質ラフト会合型（例えば、Ｈ−インテグリンβ１、Ｈ−インテグリンα６、ｐｇ−ＬＲＰ６、および、ｐ−Ａｋｔ）がＧＷに誘導されたエクソソームに優先的に取り込まれることをエクソソームのタンパク質分析（図４）によって観察した。
【００５９】
脂質ラフト会合型のタンパク質がエクソソームに優先的に取り込まれるのは付加的なエクソソームタンパク質に起きることなのかどうかを検証すべく、ＧＷで処理したＮＡＭＥＣの細胞およびエクソソームのコンパートメントから単離したタンパク質を、密度勾配分画を用いてさらに分析して比較した。ＧＷで処理したＮＡＭＥＣの細胞およびエクソソームのコンパートメントにおけるタンパク質分布を脂質ラフトと非脂質ラフトとで比較することにより、エクソソームコンパートメントには、脂質ラフト会合型タンパク質（例えば、インテグリンβ１、インテグリンα６、ＨＥＲ２、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、ＬＲＰ６、ｐ−Ａｋｔ、Ｓｒｃ、Ａｇｏ１、および、Ａｇｏ２）が豊富に含まれていることを観察した（図９Ａ）。脂質ラフト会合型タンパク質の多くは、非脂質ラフト会合型よりも優先的にＧＷに誘導されたエクソソームに取り込まれた。さらなる分析は、ＧＷに誘導されたエクソソームの脂質ラフトは大量のタンパク質を運搬するが、ＰＧＥ２に誘導されたエクソソームの脂質ラフトは、タンパク質をほとんど含まないことを示した（図９Ｂ）。脂質ラフトは、ＧＷに誘導されたエクソソームとＰＧＥ２に誘導されたエクソソームとの間のエクソソームタンパク質の相違の決定因子であるとデータは示唆している。
【００６０】
カベオラは、その形態維持がカベオリンタンパク質に大きく依存する、形態学的に識別可能な脂質ラフト構造である。カベオリンをノックダウンしたＮＡＭＥＣ（ｓｉＣａｖ１およびｓｉＣａｖ１＋２）から放出されたＧＷに誘導されたエクソソームは、脂質ラフト会合型タンパク質（例えば、ＣＤ４４、ＣＤ９０、インテグリンβ１、インテグリンα６、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、Ｍｅｔ、ＬＲＰ６、ＴＧＦβ−Ｒ１、ＴＧＦβ−Ｒ２、ｐ−Ａｋｔ、Ａｋｔ、Ａｇｏ１、および、Ａｇｏ２）を大量に喪失した。これは、ＧＷに誘導されたエクソソームへのタンパク質の取り込みにカベオラが貢献していることを示唆している（図９Ｃ参照）。
【００６１】
コレステロールは、脂質ラフトの重要な成分であり、細胞膜に結合したコレステロールが枯渇すると、脂質ラフトが破壊される可能性がある。ＮＡＭＥＣの脂質ラフトは、メチル−β−シクロデキストリン（ＭβＣＤ）によって破壊された。ＭβＣＤで処理したＮＡＭＥＣから放出されたＧＷに誘導されたエクソソーム（ＧＷＭβに誘導されたＮＡＭＥＣからのエクソソーム）またはＭβＣＤで処理されないＮＡＭＥＣから放出されたＧＷに誘導されたエクソソーム（ＧＷに誘導されたＮＡＭＥＣからのエクソソーム）におけるタンパク質量を測定し、比較した。コレステロールの抽出によって細胞の脂質ラフトが枯渇したため、ＧＷＭβに誘導されたＮＡＭＥＣからのエクソソームの脂質ラフト会合型タンパク質は大幅に減少したが、エクソソーム中の非脂質ラフト膜マーカーＣＤ７１／ＴｒｆＲおよびサイトゾルタンパク質（例えばβ−アクチン、ＧＡＰＤＨ）は、ＭβＣＤによる処理によって変化しなかった（図９Ｄ参照）。結果は、タンパク質をＧＷによってエクソソームに取り込むには細胞の脂質ラフトが必要であることを示唆している。
【００６２】
ＭβＣＤによって細胞の脂質ラフトが破壊されると、ＥＰ４アンタゴニストに誘導されたエクソソームへ取り込まれるアルゴノートタンパク質Ａｇｏ１およびＡｇｏ２も減少する。アルゴノートタンパク質は、ＲＩＳＣ錯体の必須触媒成分であるため、エクソソームにおけるアルゴノートタンパク質の減少は、エクソソーム中のｍｉＲＮＡ含量も細胞の脂質ラフトの枯渇に影響され得ることを示唆している。ＮＡＭＥＣにおける脂質ラフトの枯渇は、ＥＰ４アンタゴニストであるＧＷに誘導されたエクソソーム中のｍｉＲＮＡの含量を実際に変えた（図９Ｅ）。ＧＷに誘導されたＮＡＭＥＣのエクソソームおよびＧＷＭβに誘導されたＮＡＭＥＣのエクソソームにおけるｍｉＲＮＡを、ｍｉＲＮＡアレイを用いてさらに分析し、比較した。ＧＷに誘導されたＮＡＭＥＣのエクソソームと比べて、ＧＷＭβに誘導されたＮＡＭＥＣのエクソソームでは、ｍｉＲＮＡの８０％が減少した。減少したｍｉＲＮＡは、例えば、ｍｉ−１７、ｍｉｒ−１８ａ、ｍｉｒ１９ｂ、ｍｉｒ−２０ａ、ｍｉｒ−２０ｂ、ｍｉｒ−２４、ｍｉｒ−２５、ｍｉｒ−２９ａ、ｍｉｒ−９２ａ、ｍｉｒ−９３、ｍｉｒ−１０６ａ、ｍｉｒ−１０６ｂ、ｍｉｒ−１３０ａ、および、ｍｉｒ−１３０ｂなどの、ＧＷに誘導されたＮＡＭＥＣのエクソソーム内に豊富に存在する幹細胞ホメオスタシスに関連したｍｉＲＮＡを含む。データは、ＧＷによってｍｉＲＮＡをエクソソームに取り込むには脂質ラフトが必要であることを示唆している。
【００６３】
脂質ラフト画分と非脂質ラフト画分とのタンパク質分布を比較することにより、ＥＰ４アンタゴニストは、レセプタータンパク質およびシグナル伝達成分を非脂質ラフト画分から脂質ラフト画分へと移動させるトリガとなり（図９Ｆ）、その後脂質ラフトと共に取り込まれることが観察された。データは、細胞膜からの脂質ラフトのエンドサイトーシスがＥＰ４アンタゴニストで処理したＮＡＭＥＣにおける幹細胞マーカー、および、シグナル伝達レセプターの含量を減少させることを示唆している。
【００６４】
ＧＷで処理した間葉系幹細胞（ＭＳＣ）でもＮＡＭＥＣと同様の結果が得られた（図１０Ａ、および、Ｂ、図１９（Ａ）〜（Ｄ）参照）。ＥＰ４が媒介するシグナル伝達をＥＰ４アンタゴニストにより遮断することによって、ＥＶ／エクソソームの放出を増大させ、ＧＷに誘導されたエクソソーム中の細胞表面ＭＳＣマーカー、細胞表面レセプター、シグナル伝達タンパク質、および、サイトカインＰＳＡ、ＶＣＡＭ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ＰＤＧＦβ、ＮＧＦＲ、ＭＰＩＦ１、ＩＬ−２Ｒβ、ＩＬ−１８Ｒβ、ＢＭＰ−７、ＭＩＰ−３α、ＲＡＮＴＥＳ  ＤＲ６、ＬＩＦ、ＢＤＮＦ、ＴＩＭＰ１、ＶＥＧＦａ、ＩＬ−１０を含む、ＭＳＣの性質を維持する必須タンパク質の濃度を向上させた（図１０Ｂ、および、図１９（Ｂ）〜（Ｄ）参照）。
【００６５】
ＧＷで処理したＭＳＣを骨分化培地、脂肪分化培地、および、ニューロン分化培地において培養した。図１１に示すように、ＧＷで処理されていないＭＳＣに比べ、ＧＷで処理したＭＳＣの骨細胞、脂肪細胞、または、神経細胞への分化能力は、かなり低かった（図１１（Ａ）〜（Ｄ））。ＧＷで処理したＭＳＣは、それらの本来の幹細胞の性質を著しく喪失したことを結果は示唆している。
【００６６】
ＧＷで処理した神経幹細胞（ＮＳＣ）でも同様の結果が得られた。
ＧＷで処理したＮＳＣの培養中、エクソソームマーカーＣＤ８１およびＧＡＰＤＨの含量が増加した（図１０Ｃ）。ＥＰ４が媒介するシグナル伝達をＥＰ４アンタゴニストによって遮断することにより、神経幹細胞から放出されるＥＶ／エクソソームが増加し、ＮＳＣの幹細胞ホメオスタシスを維持するために必要なＥＶ／エクソソームのタンパク質含有量が増加することをデータは示唆している（図１０Ｃ）。さらに、ＮＳＣマーカーであるＳＯＸ２の発現レベルは、ＧＷで処理しなかったＮＳＣに比べ、ＧＷで処理したＮＳＣがかなり低いことがわかった。これは、ＧＷで処理したＮＳＣがそれらの幹細胞の性質を失ったことを示唆している（図１０Ｃ）。
【００６７】
エクソソーム形成の結果、基底幹細胞の性質（幹細胞ホメオスタシスの維持および移動能力を含む）が失われることを実証すべく、ＧＷで処理したＮＡＭＥＣをＧＷに誘導されたＮＡＭＥＣからのエクソソームと共に培養し、ＥＰ４アンタゴニストに誘導されたＭＥＴの逆転を観察した。図１２に示すように、ＧＷに誘導されたＮＡＭＥＣからのエクソソームと共に培養された場合、ＧＷで処理したＮＡＭＥＣは、それらの間葉系フェノタイプ（図１２（Ａ）および（Ｂ））、移動能力（図１２（Ｃ））、および、腫瘍様塊形成能力（図１２（Ｄ））を回復させた。放出されたエクソソームを捕らえることにより、ＥＰ４アンタゴニストで処理したＮＡＭＥＣがそれらの幹細胞の性質を取り戻すことができることをデータは示唆している。  ＥＰ４の拮抗作用、および、ＴＰレセプターの拮抗作用が、（ＧＷがヒトのＴＰレセプターに対して部分的親和性を有するように）、形質転換された乳房上皮幹細胞からのＥＶ放出に影響するかどうかをさらに調査した。溶媒、ＧＷ、または、ＳＱ（ＴＰアンタゴニスト）で処理したＲａｓ転換ＮＡＭＥＣ（ＮＡＭＥＣ−Ｒ）の４日馴化培地を収集し、密度勾配超遠心分離にかけて細胞から放出されたＥＶを単離した。ＣＭ−Ｐ４画分における小胞の数をＮＴＡを用いて決定した（図２０（Ａ））。ＥＰ４の拮抗作用により、ＮＡＭＥＣ−Ｒから細胞毎に約５０００個の小胞が放出された。一方、溶媒およびＳＱで処理したＮＡＭＥＣ−Ｒからは、１細胞当たり約１０００個の小胞しか放出されなかった（図２０（Ａ））。ＧＷで処理したＮＡＭＥＣ−ＲのＰ４媒体画分にはかなりの量のＥＶ／エクソソームマーカーＡｌｉｘ、ＴＳＧ１０１、ＣＤ８１、および、ＧＡＰＤＨが存在した。これは、ＥＰ４アンタゴニストであるＧＷが、ＮＡＭＥＣ−ＲからＥＶ／エクソソームを放出させるトリガとなることを示唆している。一方、溶媒およびＳＱで処理したＮＡＭＥＣ−Ｒは、Ｐ４画分においてほんのわずかに検出できるエクソソームマーカーしか生成しなかった（図２０（Ｂ））。間葉系マーカーであるＮ−カドヘリン、および、がん幹細胞（ＣＳＣ）マーカーであるＣＤ９０およびＣＤ４４もＧＷで処理したＮＡＭＥＣ−Ｒから放出されたＥＶに存在した（図２０（Ｃ））。これらのデータは、ＥＰ４アンタゴニストで処理したがん幹細胞からＥＶ／エクソソームを介して間葉系マーカーおよびがん幹細胞マーカーを除去することにより、がん幹細胞の性質（例えば、間葉系フェノタイプ、侵襲能力、および、腫瘍様塊形成能力）がＥＰ４アンタゴニストで処理したＮＡＭＥＣ−Ｒによって失われることを示唆している。さらに、これらの変化は、ＥＰ４アンタゴニストであるＧＷによるＰＧＥ２／ＥＰ４シグナル伝達の特異的遮断によるものであって、ＴＰレセプターが媒介するシグナル伝達によるものではない。
【００６８】
次に、ＥＰ４が媒介するシグナル伝達をＥＰ４アンタゴニストによって遮断することにより、ヒト乳がんＭＣＦ−７およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株におけるがん幹細胞タンパク質（例えば、間葉系マーカーおよび幹細胞マーカー）がＥＶを介して除去され得るかどうかを検査した。ＧＷで処理したＭＣＦ−７およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の馴化培地のＰ４画分（ＣＭ−Ｐ４）を、ＮＴＡを用いて解析した（図２１（Ａ））。ＣＭ−Ｐ４画分は、４０〜１３０ｎｍの小胞を含んでいた。ＭＣＦ−７およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞から放出された小胞のサイズは、エクソソームのサイズと一致していた（５０〜１５０ｎｍ）。ＥＰ４アンタゴニストであるＧＷの濃度を高めてＭＣＦ−７およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を処理することにより、ＭＣＦ−７およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のいずれから放出されたＥＶの数もやや増加した（図２１（Ａ））。しかしながら、ＥＶ／エクソソーム画分における細胞毎のタンパク質の量は、ＧＷで処理した“間葉性の”ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞については１０倍になった（図２１（Ｂ））。
【００６９】
“間葉性の”ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳がん細胞、および、“上皮性の”ＭＣＦ−７乳がん細胞から放出された、ＥＰ４アンタゴニストに誘導されたＥＶ／エクソソームは、例えばエクソソームマーカーＣＤ８１およびＧＡＰＤＨタンパク質などの共通のタンパク質を含んでいた（図２１（Ｃ））。しかしながら、“上皮性の”ＭＣＦ−７細胞から放出された、ＥＰ４アンタゴニストに誘導されたＥＶ／エクソソームに存在するタンパク質と比べ、“間葉性の”ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞から放出された、ＥＰ４アンタゴニストに誘導されたＥＶ／エクソソームのタンパク質には、がん幹細胞マーカー（例えば、ＣＤ４４、および、β−カテニン）、間葉性マーカー（例えば、ビメンチン、および、フィブロネクチン）、および、インテグリン（例えば、インテグリンβ１、および、インテグリンα６）が豊富に含まれていた（図２１（Ｃ））。したがって、ＮＡＭＥＣ−Ｒで見られたように（図２０（Ａ）〜（Ｃ））、ＥＰ４が媒介するシグナル伝達を遮断することにより、幹状のヒト乳がん細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１からのＥＶ（例えば、エクソソーム）、および、ＥＶ結合がん幹細胞関連タンパク質の放出を誘導した。
【００７０】
上記結果に基づき、ＥＰ４アンタゴニストによってＥＶ／エクソソームの放出を誘導することにより、幹細胞ホメオスタシスを維持するのに必要なタンパク質／ｍｉＲＮＡを特異的に運搬する。人工ＥＶ／エクソソームにより、幹細胞は、本来有する幹細胞の性質を失い、非幹細胞への性質へと転換され得る。
【００７１】
実施例３
ＥＰ４アンタゴニストの誘導によって放出されたエクソソームは、再計画により非幹組織細胞を幹細胞に転換させることができる。
ＥＰ４アンタゴニストに誘導された乳房上皮基底幹細胞（ＮＡＭＥＣ）からのエクソソームは、乳房上皮（ＨＭＬＥ）非幹細胞の移動性および腫瘍様塊形成能力を向上させた。
【００７２】
幹細胞から放出されるエクソソームを取り込むことにより非幹細胞を幹細胞に転換できるか否かを決定すべく、ＨＭＬＥ非幹細胞をＧＷに誘導されたＮＡＭＥＣからのエクソソームで７日間培養し、さらなるエクソソームでの処理はせずに幹細胞の性質を分析した。ＧＷに誘導されたＮＡＭＥＣからのエクソソームは、非幹細胞を形態的に変化させた。ＧＷに誘導されたＮＡＭＥＣからのエクソソームで処理したＨＭＬＥ非幹細胞には、形態的に識別可能な間葉系細胞亜集団が見られた（図１３（Ａ））。これらのＧＷに誘導されたＮＡＭＥＣからのエクソソームで処理したＨＭＬＥ非幹細胞は、コントロールのＨＭＬＥ非幹細胞より移動性が高かった。これに対し、溶媒で処理したＨＭＬＥ非幹細胞は、ほとんど移動しなかった。ＧＷに誘導されたＮＡＭＥＣからのエクソソームで処理したＨＭＬＥ非幹細胞の平均移動距離は、ＨＭＬＥ非幹細胞の６倍であった（図１３（Ｂ））。データは、ＧＷに誘導されたＮＡＭＥＣからのエクソソームの取り込みにより、ＨＭＬＥ非幹細胞の形態的な上皮間葉転換（ＥＭＴ）が促進され、移動能力が高められることを示唆している。
【００７３】
さらに、ＨＭＬＥ非幹細胞の移動細胞数は、約４倍に増加し（図１３（Ｃ））、ＧＷに誘導されたＮＡＭＥＣからのエクソソームで２週間前処理することにより、ＨＭＬＥ非幹細胞によって形成される腫瘍様塊の数は、約３倍に増加した（図１３（Ｄ））。この結果は、ＥＰ４アンタゴニストに誘導されたＮＡＭＥＣからのエクソソームを取り込むことによって、乳房上皮非幹細胞の移動能力および腫瘍様塊形成能力を高めることができることを示している。
【００７４】
ＥＰ４アンタゴニストに誘導されたエクソソームは、乳房形成能力を初代乳房管腔細胞に伝達する。
【００７５】
ＥＰ４アンタゴニストに誘導されたエクソソームが管腔細胞を乳房形成幹細胞に変換できるかどうかを評価すべく、管腔細胞をソートすると共にＥＰ４アンタゴニストに誘導されたエクソソームを生成するためにいわゆる乳房再構築単位（ＭＲＵ）であるマウス初代乳房上皮細胞を脂肪パッドから単離した。上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）およびインテグリンα６（ＣＤ４９ｆ）の差次的発現を用いて、マウスのＥｐＣＡＭｌｏ／ＣＤ４９ｆｈｉ乳房基底幹細胞と、ＥｐＣＡＭｈｉ／ＣＤ４９ｆｌｏ管腔非幹細胞とをソートした。さらに、マウス初代乳房上皮細胞から、ＰＧＥ２に誘導されたエクソソーム、および、ＧＷに誘導されたエクソソームを収集した。
【００７６】
図１４に示すように、ＥｐＣＡＭｈｉ／ＣＤ４９ｆｌｏ管腔非幹細胞の乳房再構築単位（ＭＲＵ）の頻度は低かった（乳房形成効率：１／６、０／６、＜２／６）。ＥｐＣＡＭｈｉ／ＣＤ４９ｆｌｏ管腔非幹細胞の乳房再構築単位（ＭＲＵ）の頻度（乳房形成効率：５／６、６／６、＜４／６）は、ＧＷに誘導されたＮＡＭＥＣからのエクソソームで１０日間前処理することによって約２０倍になった（乳房形成効率＜２／６、＜１／６、＜２／６）。これらの結果は、ＥＰ４アンタゴニストに誘導されたＮＡＭＥＣからのエクソソームが、乳房再構築能力を管腔非幹細胞に伝達し得ることを示している。
【００７７】
ＥＰ４アンタゴニストに誘導されたＮＡＭＥＣからのエクソソームは、脂質ラフト会合因子を介して幹細胞の性質を伝達する。
【００７８】
ＥＰ４アンタゴニストに誘導されたＮＡＭＥＣからのエクソソームによって幹細胞の性質を伝達することができるのは、脂質ラフト会合因子によるものなのかどうかを検証すべく、ＨＭＬＥ非幹細胞を、同数のＧＷ、ＰＧＥ２、または、ＧＷ＋ＭβＣＤに誘導されたＮＡＭＥＣからのエクソソームによって培養し、処理した細胞の移動能力、および、腫瘍様塊形成能力を観察した。ＨＭＬＥ非幹細胞の移動細胞数は、ＧＷに誘導されたＮＡＭＥＣからのエクソソームで前処理することにより約１０倍に増加したが、ＰＧＥ２に誘導されたＮＡＭＥＣからのエクソソームは、移動細胞数を３倍に増加させただけだった（図１５（Ａ）参照）。さらに、ＧＷＭβに誘導されたＮＡＭＥＣからのエクソソームによって移動能力を向上させる効果は、コントロールであるＧＷに誘導されたＮＡＭＥＣからのエクソソームに比べはるかに低かった。
【００７９】
同様に、ＨＭＬＥ非幹細胞によって形成される腫瘍様塊の数は、ＧＷに誘導されたＮＡＭＥＣからのエクソソームで７日間前処理することにより、約４倍に増加したが、ＰＧＥ２およびＧＷＭβに誘導されたＮＡＭＥＣからのエクソソームのいずれも腫瘍様塊の形成には効果がなかった（図１５（Ｂ））。この結果は、ＥＰ４アンタゴニストに誘導されたＮＡＭＥＣからのエクソソームは、エクソソームにおける脂質ラフト会合因子を介して、ＨＭＬＥ非幹細胞の移動能力および腫瘍様塊形成能力を大きく向上させることができるということを示している。
【００８０】
また、ＥＰ４アンタゴニストに誘導されたＮＡＭＥＣからのエクソソームにおける脂質ラフト会合因子は、乳房形成能力を管腔細胞に伝達するために必要である。ＥｐＣＡＭｌｏ／ＣＤ４９ｆｈｉ基底細胞のＭＲＵ頻度（乳房形成効率：３／４、３／４、３／３）は、ＥｐＣＡＭｈｉ／ＣＤ４９ｆｌｏ管腔細胞（乳房形成効率：３／１２、３／２２、２／３０）のＭＲＵ頻度の７倍だった（図１５（Ｃ）参照）。管腔細胞は、乳房を形成することはまずないが、移植前にＧＷに誘導されたＮＡＭＥＣからのエクソソームで１０日間前処理することにより、効率的に乳房を形成することができる細胞に変換された。（乳房形成効率：６／１２、１５／２４、１５／３０）。管腔細胞のＭＲＵ頻度は、ＧＷに誘導されたＮＡＭＥＣからのエクソソームの前処理によって約６倍に増加し、マウスの乳房基底細胞のＭＲＵ頻度に達した。ＥＰ４アンタゴニストに誘導されたＮＡＭＥＣからのエクソソームは、乳房再構築能力を管腔細胞に伝達できるが、ＰＧＥ２に誘導されたＮＡＭＥＣからのエクソソーム（乳房形成効率０／６．０／１８、０／２４）、および、ＧＷＭβに誘導されたＮＡＭＥＣからのエクソソーム（乳房形成効率：０／６、１／１２、３／２４）は、管腔細胞のＭＲＵ頻度を増大させることはできなかった。これらの結果は、ＥＰ４アンタゴニストに誘導されたＮＡＭＥＣからのエクソソームが乳房再構築能力を管腔細胞に伝達する能力は、エクソソーム中の脂質ラフト会合因子に依存していることを示唆している。
【００８１】
ＥＰ４アンタゴニストに誘導された間葉系幹細胞（ＭＳＣ）からのエクソソーム（ＭＳＣＧＷＥＶ）の取り込みによって転換された神経外胚葉細胞は、非幹細胞の性質、および、神経細胞球形成能力を示した。
【００８２】
ＥＰ４アンタゴニストに誘導されたＭＳＣからのＥＶ／エクソソーム（ＭＳＣＧＷＥＶ）を神経組織に適用することにより、非幹細胞は、神経細胞へと分化する能力を有する神経幹細胞に転換される。図１６に示すように、神経外胚葉細胞とＥＰ４アンタゴニストに誘導されたＭＳＣからのＥＶ／エクソソーム（ＭＳＣＧＷＥＶ）との共培養により、神経細胞球の形成によって比較すると、神経幹細胞の数が増加した。データは、ＥＰ４アンタゴニストに誘導されたＭＳＣからのＥＶ／エクソソーム（ＭＳＣＧＷＥＶ）は、幹細胞の性質を有さない神経外胚葉細胞に幹細胞の性質を伝達することを示唆している。ＥＰ４アンタゴニストに誘導されたＭＳＣからのＥＶ／エクソソーム（ＭＳＣＧＷＥＶ）を取り込んだ神経外胚葉細胞は、神経幹細胞（ＮＳＣ）へと転換される。
【００８３】
ＰＢＳ、ＭＳＣからのＥＶ／エクソソーム（ＭＳＣＥＶ）、ＧＷに誘導されたＭＳＣからのＥＶ／エクソソーム（ＭＳＣＧＷＥＶ）、または、ＧＷに誘導されたＮＡＭＥＣからのＥＶ／エクソソーム（ＮＡＭＥＣＧＷＥＶ）で前処理したＮＥ−４Ｃ神経外胚葉細胞をレチノイン酸（ＲＡ）で処理することにより、神経細胞分化を誘導した。ＲＡ処理の後、得られた神経細胞を抗β３チューブリン抗体で染色してよい。
図１７に示す結果は、ＧＷに誘導されたＭＳＣからのＥＶ／エクソソームによって前処理された神経外胚葉細胞は、より多くのより長い神経突起を有する神経細胞へと分化され得ることを示している。データは、ＥＰ４アンタゴニストに誘導されたＭＳＣからのＥＶ／エクソソームを神経外胚葉細胞に取り込むことにより、神経細胞へと分化する細胞の能力を高めることを示している。
【００８４】
実施例４
ＥＰ４アンタゴニストに誘導される間葉系幹細胞（ＭＳＣ）からのＥＶ／エクソソームは、海馬の退化による認知、学習、記憶能力の障害を回復させた。
本例では、モリス水迷路を用いて、海馬障害を有するマウスの学習および記憶力を評価した。マウスは、処理あり（図１８のＩ−ＰＢＳおよびＩ−ＥＸＯ；図２２（Ｃ）のｉｎｄｕｃｅ、ＮＣｅｘｏおよびＧＷＥｘｏ）と、処理なし（図１８のＮＩ−ＰＢＳおよびＮＩ−ＥＸＯ；図２２（Ｃ）のＮＣ）とを比較した。学習および記憶力は、訓練の後に目標を達成するためにかかる時間によって評価された。図１８および２２（Ｃ）に示すように、海馬を損傷したマウスの学習および記憶能力は、ＧＷに誘導されたＭＳＣからのエクソソーム（図１８のＩ−ＥＸＯおよび図２２（Ｃ）のＧＷＥｘｏ）で処理したものが、ＰＢＳを注射したもの（図１８のＩ−ＰＢＳおよび図２２（Ｃ）のｉｎｄｕｃｅ）、および、ＭＳＣからのエクソソーム（図２２（Ｃ）のＮＣＥｘｏ）で処理しないものよりも著しく優れていた。さらなる認知力テスト（新しい位置再認識テスト、および、新しい物体認識テスト）によって認知の回復がさらに検証された（図２２（Ａ）および（Ｂ）参照）。また、ＭＡＰ２神経細胞マーカー（図２３（Ａ））、および、β３−チューブリン神経細胞マーカー（データなし）を用いて、脳組織における神経細胞、核周部、および、神経細胞樹状突起を視覚化することにより、ＧＷに誘導された間葉系幹細胞（ＭＳＣ）からのエクソソームは、海馬を損傷したマウスの脳における神経細胞の再生を誘導し得ることを示した。さらに、ミクログリアマーカーＩｂａ１を用いて、中枢神経系のミクログリアおよびマクロファージの減少を視覚化することにより、ＧＷに誘導されたＭＳＣからのエクソソームは、海馬を損傷したマウスの脳内炎症を抑えることが可能であることを示した（図２３（Ｂ））。損傷した脳内の炎症を抑制することにより、脳の神経細胞の再生を促す。これらのデータを総合し、例えば、アルツハイマー病およびパーキンソン病など、海馬の退化によって引き起こされる神経変性病へのＥＰ４アンタゴニストに誘導されたＥＶ／エクソソームの治療効果を実証した。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【外国語明細書】
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