(57)【要約】【課題】複数型のヒトパピローマウイルスに由来する核酸の検出の提供。【解決手段】本発明は、生物試料中に存在する可能性のある複数のＨＰＶ型の核酸配列を検出するための組成物及び方法を含む。生物試料中に含有される複数の型のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）核酸配列を検出するための核酸配列及び方法を開示する。インビトロで多型のＨＰＶ核酸を増幅するための核酸オリゴマー及び増幅したＨＰＶ配列を検出するための核酸検出プローブ配列を収容したキットをも開示する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、米国３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１９（ｅ）により、仮特許出願第６０／６３４，４５８号（２００４年１２月８日出願）に基づく優先権を主張し、これを本明細書に援用する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、発ガンリスクに関連する感染因子の診断検出、特に、核酸配列を検出するためのインビトロ核酸増幅及び検出アッセイ方法によりヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）を検出するための組成物及びアッセイ方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）は上皮組織を感染の標的とし、主として、扁平上皮ガン及び腺ガン等の様々なガンの病因である。ＨＰＶ関連のガンとしては、頭頚部（喉頭、口腔、中咽頭、扁桃腺及び食道）、呼吸器、胸部、皮膚、子宮頚及び肛門のガンがあげられる。ＨＰＶ感染はあるガンの発症に必要な要因と考えられるが、他の要因もまた発ガンに影響を及ぼしうる(Braakhuis et al., 2004, J. Natl. Cancer Inst. 96(13): 998-1006; Dahlstrand et al.,2004,Anticancer Res. 24(3b): 1829-35; Daling et al., 2004,Cancer101(2): 270-80;Ha et al., 2004, Crit. Rev. Oral Biol. Med. 15(4): 188-96;Hafkamp et al.,Acta Otolaryngol. 124(4): 520-6; Harwood et al., 2004, Br.J.Dermatol.150(5):949-57; Rees et al., 2004, Clin. Otolaryngol. 29(4): 301-6;Widschwendter et al., 2004, J. Clin. Virol. 31(4): 292-7)。
【０００４】
少なくとも７７の異なる型のＨＰＶが同定されている。そのうち、ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８は頻繁に様々なＨＰＶ関連のガンに関係づけられているが、ＨＰＶ型に関連するリスクレベルはパピローマ関連ガンの形態の相異に応じて異なる場合がある。ガンに対するＨＰＶ感染の関係を解明するために、上皮におけるヒトパピローマウイルスの病原性が研究された。ＨＰＶは重層上皮の基底層細胞に感染して、多コピーのエピソーム又は組み込まれたゲノムとして定着し、これによりウイルスＤＮＡは細胞染色体と共に複製される(Longworth et al.,2004, Microbiol. MoI. Biol. Rev. 68(2):362-72により概説)。細胞分裂時に娘細胞は基底層から移動して分化し、その際、栄養性ＨＰＶウイルス複製及び後期遺伝子発現が活性化されて子孫ＨＰＶが産生される。感染した個体の免疫系が通常１〜２年以内にＨＰＶ感染を浄化することはあるが、感染した基底細胞が数十年間存続する場合もある。ＨＰＶ感染により染色体が不安定となり、異数化し、それによりＨＰＶ組込みが促進される(Melsheimer et al.,2004, Clin. Cancer Res. 10(9): 3059-63; Reidy et al.,2004, Laryngoscope 114(11):1906-9)。ＨＰＶのゲノム組込みに際して、ＨＰＶ Ｅ２遺伝子が破壊され、その結果、調節タンパク質ｐＲｂ及びｐ５３を標的とするガンタンパク質をコードするＨＰＶＥ６／Ｅ７５ガン遺伝子が脱制御発現する可能性がある。このように、細胞調節を変化させる一連の事象の結果、発ガンがおこる可能性がある(Braun et al.,2004,Cancer Lett. 209(1): 37-49; Fan et al., 2004, Crit. Rev. Eukaryot.Gene Expr.14(3):183-202; Fiedler et al., 2004, FASEB J. 18(10): 1120-2; Psyrri et al.,2004,Cancer Res., 64(9): 3079-86; Si et al., 2004, J. Clin. Virol.32(1):19-23)。
【０００５】
子宮頚ガンの発症率は世界的に高く、新たな発症例が年４５０，０００例と推定されており、ＨＰＶ感染と子宮頚ガンの関連が多くの研究及び疫学調査の課題であった。子宮頚ガン発症のリスクが高い関連するＨＰＶ型（ＨＲ−ＨＰＶ）としては、個々の型の疫学的重要性が地理的領域の相異又は臨床試験パラメーターに応じて異なる可能性があるものの、ＨＰＶ型１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６、６８及び７３があげられる(Munoz et al., 2004, Int. J. Cancer 111(2) : 278-85; Chaturvedi et al., 2005, J.Med.Virol. 75(1): 105-13; Smith et al., 2004, Int. J.Gynaecol. Obstet.87(2):131-7)。一般に子宮頚ガン発症のリスクが低い（ＬＲ−ＨＰＶ）と考えられるＨＰＶ感染としては、ＨＰＶ型６、１１、４３、４３、４４、６１、７１及び７２があげられる。
【０００６】
ＨＰＶ感染した女性では、子宮頚感染によりコンジローム（生殖器いぼ）、子宮頚上皮内新生物（ＣＩＮ）、及び子宮頚ガンがおこる可能性がある(Kahn et al.,2004, Adolesc. Med. Clin 15(2):301-21, ix)。子宮頚細胞の細胞学的検査は多くの国で子宮頚ガン検出のための主なスクリーニング手段であり、治療法の決定及び／又はその後のモニタリングのため、通常はＣＩＮ等級システム（１〜３）を用いて前ガン病変を監視している。細胞学的スクリーニングのほか、ＨＰＶ核酸の分子スクリーニングは細胞学的検査の間隔を延ばすことができる、経費的に有効な予後検査となりうる(Wiley et al., 2004, Curr.Oncol.Rep. 6(6): 497-506; Zielinski et al., 2004,Obstet.Gynecol. Surv. 59(7): 543-53;Clavel et al., 2004, Br. J. Cancer 90(9):1803-8)。分子アッセイ方法はヒトの生物検体、例えばパパニコラウス塗抹標本中の特定のＨＰＶタンパク質及び核酸配列を検出するために開発された(Chen et al., 2005, Gynecol. Oncol. 99(3): :578-84; Carozzi et al.,2005, Am. J.Clin.Pathol. 124(5): 716-21; Molden et al., 2005, Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev.14(2): 367-72; Asato et al., 2004, J. Infect.Dis.189(1):1829-32;Federschneider et al., 2004, Am. J. Obstet. Gynecol. 191(3):757-61;Remmerbach et al., J. Clin. Virol. 30(4):302-8)。
【０００７】
共通のＨＰＶ型に対するワクチン接種は、生殖器いぼであるコンジロームの治療若しくは予防、又はガン、特に子宮頚ガンの発症予防に有用であろう。様々な形態のＨＰＶワクチン化が開発又は試験中である(Ault et al.,2004, Vaccine 22(23-24): 3004-7; Corona Gutierrez et al., 2004, Hum.Genet.Ther. 15(5): 421-31; Harper et al., 2004, Lancet 364(9447): 1757-65;Roden et al., 2004, Hum. Pathol. 35(8):971-82)。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ＨＰＶ感染患者、特に子宮頚組織にＨＲ−ＨＰＶ型が感染した女性の診断及び予後情報を医師に提供すべく、生物検体中のＨＰＶの存在を効果的に高感度で検出することが求められる。ワクチン接種の短期及び長期有効性を判定すべく、ＨＰＶ感染のワクチン接種を受けた個体から得た生物検体中のＨＰＶの存在を効果的に高感度で検出することも求められる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の概要
本発明は、生物試料中に存在する可能性のある複数のＨＰＶ型の核酸配列を検出するための組成物及び方法を含む。
【００１０】
本発明の１の側面では、増幅オリゴマー混合物が提供され、混合物中の個々のオリゴマー配列は配列番号１８〜配列番号４２よりなる群から選択され、前記群には前記特定配列の相補的オリゴマー配列又はＲＮＡ均等物が含まれる。本混合物の好ましい態様としては、配列番号１９若しくは４２、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３及び３５の第１増幅オリゴマー、並びに配列番号３７、３８、３９、４０及び４１の第２増幅オリゴマー、又は前記オリゴマー配列の相補的オリゴマー配列若しくはＲＮＡ均等物が含まれる。他の好ましい態様では、配列番号１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４及び３６の第１増幅オリゴマー、並びに配列番号３７、３８、３９、４０及び４１の第２増幅オリゴマー、又は前記オリゴマー配列の相補的オリゴマー配列若しくはＲＮＡ均等物があげられる。他の好ましい態様としては、配列番号１９若しくは４２、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３及び３５の第１増幅オリゴマー、並びに配列番号３８、３９、４０及び４１の第２増幅オリゴマー、又は前記オリゴマー配列の相補的オリゴマー配列若しくはＲＮＡ均等物があげられる。他の好ましい態様としては、配列番号１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４及び３６の第１増幅オリゴマー、並びに配列番号３８、３９、４０及び４１の第２増幅オリゴマー、又は前記オリゴマー配列の相補的オリゴマー配列若しくはＲＮＡ均等物があげられる。オリゴマー混合物のある態様では、１以上の個々のオリゴマーが、少なくとも１つの２’−メトキシＲＮＡ基、少なくとも１つの２’−フルオロ置換ＲＮＡ基、少なくとも１つのペプチド核酸結合、少なくとも１つのホスホロチオエート結合、少なくとも１つのメチルホスホネート結合又は前記いずれかの組合わせを含む主鎖があげられる。前記の混合物の態様は、キットに収容されていてもよい。
【００１１】
本発明の他の側面では、オリゴマー混合物が提供され、混合物中の個々のオリゴマー配列は配列番号１１〜配列番号１７、配列番号４４〜配列番号５４、及び配列番号５８よりなる群から選択され、前記群には前記特定配列の相補的オリゴマー配列又はＲＮＡ均等物が含まれる。この混合物の好ましい態様としては、配列番号１１〜１７又は前記オリゴマー配列の相補的オリゴマー配列若しくはＲＮＡ均等物があげられる。他の好ましい態様としては、配列番号１１〜１５及び１７、又は前記オリゴマー配列の相補的オリゴマー配列若しくはＲＮＡ均等物があげられる。他の好ましい態様としては、配列番号１１〜１５及び１７、並びに少なくとも１つの配列番号４４〜配列番号５４及び配列番号５８のオリゴマー、又は前記オリゴマー配列の相補的オリゴマー配列若しくはＲＮＡ均等物があげられる。他の好ましい態様としては、配列番号１１、１２、１４、１５、１７、４４、４５及び５２、又は前記オリゴマー配列の相補的オリゴマー配列若しくはＲＮＡ均等物があげられる。混合物の好ましい態様としては、各オリゴマー配列が、前記オリゴマーに直接又は間接的に結合した標識を含むものがあげられる。ある好ましい態様では、各オリゴマー配列が化学発光性化合物である標識があげられ、これはより好ましくはアクリジニウムエステル（ＡＥ）化合物である。混合物のある好ましい態様では、各オリゴマー配列が少なくとも１つの２’−メトキシＲＮＡ基を含む主鎖を有する。前記の混合物の態様は、キットに収容されていてもよい。
【００１２】
本発明の他の側面では、少なくとも２つのオリゴマーの混合物が提供され、混合物中の個々のオリゴマー配列は配列番号１〜１０よりなる群から選択され、前記群には前記特定配列の相補的オリゴマー配列又はＲＮＡ均等物があげられる。この混合物の好ましい態様としては、配列番号２、４、６、８及び１０から選択される少なくとも２つのオリゴマーであって、リガンド部分が各オリゴマーに結合したものがあげられる。混合物の他の好ましい態様としては、配列番号２、４、６、８及び１０のオリゴマーであって、リガンド部分が各オリゴマーに結合したものがあげられる。混合物の他の好ましい態様としては、配列番号１、３、５、７及び９から選択される少なくとも２つのオリゴマーがあげられる。混合物の他の好ましい態様としては、配列番号１、３、５、７及び９のオリゴマーがあげられる。ある好ましい態様としては、少なくとも１つのオリゴマーが、少なくとも１つの２’−メトキシＲＮＡ基、少なくとも１つの２’−フルオロ置換ＲＮＡ基、少なくとも１つのペプチド核酸結合、少なくとも１つのホスホロチオエート結合又は少なくとも１つのメチルホスホネート結合を含む主鎖を有する。前記の混合物の好ましい態様は、キットに収容されている。
【００１３】
本発明の他の側面では、生物試料中に存在するヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）核酸を検出するための、下記の工程を含む方法が提供される：ＨＰＶ型１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９及び６８のうち少なくとも１つのＲＮＡを含有する生物試料中の核酸を、Ｅ６／Ｅ７標識領域配列内のＨＰＶ配列を増幅する増幅オリゴマーの混合物と接触させ、前記際、混合物は多型のＨＰＶ標識領域配列を増幅するための第１増幅オリゴマー及び第２増幅オリゴマーから構成され；少なくとも１つのＨＰＶ型中の標識領域配列に由来するＨＰＶ配列を、増幅オリゴマー及び核酸ポリメラーゼによりインビトロで増幅して、ＨＰＶ増幅生成物を生成させ；ＨＰＶ増幅生成物と特異的にハイブリダイズするのに十分に相補的である検出プローブオリゴマーを用いて増幅生成物を検出して、試料中にＨＰＶ１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９及び６８型のうち少なくとも１つが存在することを示す。好ましい態様では、増幅工程に、配列番号１９若しくは４２、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３及び３５の第１増幅オリゴマー、並びに配列番号３７、３８、３９、４０及び４１の第２増幅オリゴマー又は前記オリゴマー配列の相補的オリゴマー配列若しくはＲＮＡ均等物を用いる。他の好ましい態様では、増幅工程に、配列番号１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４及び３６の第１増幅オリゴマー並びに配列番号３７、３８、３９、４０及び４１の第２増幅オリゴマー又は前記オリゴマー配列の相補的オリゴマー配列若しくはＲＮＡ均等物を用いる。好ましい１態様では、増幅工程に、配列番号１９若しくは４２、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３及び３５の第１増幅オリゴマー、並びに配列番号３８、３９、４０及び４１の第２増幅オリゴマー又は前記オリゴマー配列の相補的オリゴマー配列若しくはＲＮＡ均等物を用いる。他の好ましい態様では、増幅工程に、配列番号１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４及び３６の第１増幅オリゴマー並びに配列番号３８、３９、４０及び４１の第２増幅オリゴマー又は前記オリゴマー配列の相補的オリゴマー配列若しくはＲＮＡ均等物を用いる。この方法の好ましい態様はさらに、増幅工程の前に、試料中のＨＰＶＲＮＡと捕捉オリゴマーを接触させることにより、ＨＰＶ型１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９及び６８のうち少なくとも１つのＲＮＡを試料中の他の成分から分離し、そして捕捉オリゴマー及びＨＰＶＲＮＡを含む複合体を試料中の他の成分から分離する工程を含む。この分離工程を含む好ましい態様としては、捕捉オリゴマーは少なくとも２つのオリゴマーから構成される捕捉オリゴマー混合物中に存在し、混合物中の個々のオリゴマー配列は配列番号１〜１０よりなる群から選択され、前記群には前記特定配列の相補的オリゴマー配列又はＲＮＡ均等物があげられる。この分離工程を含む方法の好ましい態様では、捕捉オリゴマーは下記の：配列番号２、４、６、８及び１０から選択される少なくとも２つのオリゴマーであって、リガンド部分が各オリゴマーに結合したもの；又は配列番号２、４、６、８及び１０のオリゴマーであって、リガンド部分が各オリゴマーに結合したもの；又は配列番号１、３、５、７及び９から選択される少なくとも２つのオリゴマー；又は配列番号１、３、５、７及び９のオリゴマーから構成される捕捉オリゴマー混合物中に存在する。この方法の好ましい態様では、増幅工程に実質的に定温（isothermal）である増幅法を用いる。この方法の好ましい態様では増幅工程に転写関連増幅法を用いる。この方法の１態様では、検出工程にプローブオリゴマー混合物を使用し、混合物中の少なくとも１つのプローブオリゴマーがＨＰＶ増幅生成物に特異的に結合して、試料中に少なくとも１つのＨＰＶ型が存在することを示すシグナルを発生させる。好ましい態様では、検出工程に、配列番号１１〜１７又は前記オリゴマー配列の相補的オリゴマー配列若しくはＲＮＡ均等物から構成されるプローブオリゴマー混合物を用いる。検出工程の他の好ましい態様では、検出工程に、配列番号１１〜１５及び１７又は前記オリゴマー配列の相補的オリゴマー配列若しくはＲＮＡ均等物から構成されるプローブオリゴマー混合物を用いる。検出工程の他の好ましい態様では、配列番号１１〜１５及び１７、並びに少なくとも１つの配列番号４４〜配列番号５４及び配列番号５８のオリゴマー又は前記オリゴマー配列の相補的オリゴマー配列若しくはＲＮＡ均等物から構成されるプローブオリゴマー混合物を用いる。検出工程の他の好ましい態様では、配列番号１１、１２、１４、１５、１７、４４、４５及び５２又は前記オリゴマー配列の相補的オリゴマー配列若しくはＲＮＡ均等物から構成されるプローブオリゴマー混合物を用いる。この方法の１態様はさらに、非ＨＰＶ−内部対照配列を増幅及び検出する。内部対照を含む好ましい態様としては、接触工程がさらに、非ＨＰＶ−内部対照配列を試料に導入することがあげあれ、増幅工程がさらに、非ＨＰＶ−内部対照配列を増幅して、増幅した内部対照配列を生成することがあげられ、かつ検出工程がさらに、増幅した内部対照配列を検出して、この工程が適切に行われたことを示すシグナルを発生させることがあげられる。
【００１４】
以下の記述、及び本明細書の一部である添付図面は、本発明の原理を説明するためのものである。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】あるＨＰＶ型の遺伝的関係を示す進化系統樹の図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
発明の詳細な記述
本発明は、ヒトから得た生物試料中に存在する多数のＨＰＶ型（１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６及び６８）に由来する核酸配列を検出するためのオリゴマー配列及び方法を含む。前記配列及び方法はＨＰＶ感染の診断に有用であり、ＨＰＶ配列の検出が発ガン関連の予後情報を提供する持続感染が含まれる。前記配列及びアッセイ方法は、ガンのリスクがある患者の状態のモニタリング、及び／又は治療法に対する患者の応答のモニタリングにも有用である。前記アッセイ方法はＨＰＶ核酸の存在を高感度に検出するので、ＨＰＶ関連ガンの血管空間侵襲又はリンパ節転移を検出するにも有用であり、すなわちさらに予後情報を提供する。前記配列及びアッセイ方法は、ＨＰＶ曝露された個体に抗ＨＰＶワクチン接種した後、接種の有効性をモニタリングするためにも有用である。
【００１７】
標的（ターゲット）としたＨＰＶ型は、子宮頸ガンに関連する高リスク型を累積的に示す。好ましくは、異なるＨＰＶ型間で共通の又は極めて類似するＥ６／Ｅ７遺伝子配列を標的とすることによりグループ内の１より多いＨＰＶ型を検出し、一方で、例えばインビトロ核酸増幅反応又はハイブリダイゼーション検出反応の混合物中に存在した場合に生じる可能性のある不都合なオリゴヌクレオチド間相互作用が起こらないように、オリゴマー配列を設計した。また前記配列は、子宮頸ガンのリスクが低いと特定されたＨＰＶ型にみられる関連配列（例えばＨＰＶ型６、１１、４２、４３及び４４）を検出しないように設計された。標識配列の比較のために、種々のＨＰＶ型を図１に示すような遺伝的関係に基づいて分類し、本明細書中では、ＨＰＶ型１６、３１及び３５を含むグループＡ１、ＨＰＶ型３３、５２及び５８を含むグループＡ２、ＨＰＶ型６、１１、４２、４３及び４４を含むグループＢ、ＨＰＶ型１８、４５及び５９を含むグループＣ１、並びにＨＰＶ型５１、５６及び６６を含むグループＤという。配列の比較のために、公開されたデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ）から入手できる公知配列を手作業又はコンピューター化されたアルゴリズムによりアラインさせ、アラインした配列を用いて、様々な基準に適合するオリゴマーである可能性が示唆されるオリゴヌクレオチド配列を合成及び試験のために選択した。この基準には、約１５〜３０ｎｔの長さの範囲の配列、ＧＣ含量、及び選択した配列を含むハイブリダイゼーション複合体の予測Ｔｍ、並びに自己ハイブリダイゼーション又は選択した他のオリゴマーとの分子間ハイブリダイゼーションによる予測可能な二次構造が実質的に存在しないことが含まれる。グループ内の１又は好ましくは１より多いＨＰＶ型の標識ＨＰＶゲノム配列又はＲＮＡ配列を、選択したすべてのオリゴヌクレオチド配列について実質的に同一のハイブリダイゼーション条件下で特異的に認識するように選択した配列を設計した。アラインメント及び選択に用いた公知配列としては、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ０９２９３２、ＡＦ１２５６７３、ＡＦ４０４６７８、Ｄ９０４００、Ｊ０４３５３、Ｋ０２７１８、Ｍ１２７３２、Ｍ２７０２２、Ｍ７３２３６、Ｍ１４１１９、Ｍ６２８４９、Ｍ７４１１７、Ｘ０５０１５、Ｘ７４４７７、Ｘ７４４７９、Ｘ７４４８１、Ｘ７４４８３、Ｘ７７８５８及びＹ１３２１８があげられた。選択した配列から、インビトロで標準方法によりオリゴマーを合成し、例えばオリゴマーと通常は前記オリゴマー配列の相補配列を含有する合成ＲＮＡとを含むハイブリダイゼーション複合体のＴｍを実験的に測定して前記の合成オリゴマーを特定し、以前報告があった条件（例えば米国特許第５，３９９，４９１号及び５，５５４，５１６号、Ｋａｃｉａｎら；及び第５，２８３，１７４号、Ａｒｎｏｌｄら）を用いて核酸増幅及び検出反応におけるその機能特性を解明した。前記方法に用いるために、ＨＰＶ特異的配列を他の配列に結合させることができる：例えば配列番号１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４及び３６に示す５’側プロモーター配列と結合させるか、又は配列番号１、３、５、７及び９に示すように３’側テール配列と結合させる。
【００１８】
多数の異なるＨＰＶ型を検出するアッセイで機能するオリゴマーを効率的に選択するために下記の方法を用いた。まずＨＰＶグループの検出プローブとして作用するオリゴマーを選択し、増幅すべきＨＰＶゲノム配列又はＲＮＡ配列の標識領域を決定した。次いで、各候補標識領域について増幅オリゴマーを選択し、合成し、検出すべきグループの個々のＨＰＶ型（例えばグループＡ１のＨＰＶ１６、３１及び３５）を用いた増幅反応で試験した。増幅及び検出反応により、あるグループの各ＨＰＶ型について実質的に類似の陽性結果が得られた場合、異なるグループ（例えばＡ１とＡ２）のオリゴマーを多重増幅及び検出反応で組合わせ、この組合わせたグループの各ＨＰＶ型を試験し、本オリゴマー混合物が適正に機能して組合わせたグループの各ＨＰＶ型が陽性結果となるか、又は不都合な相互作用（例えば混合物中のオリゴマー間で）によりアッセイの感度若しくは特異性が低下するか否かを判定した。多重フォーマットのアッセイ結果が許容できなかった場合、１以上のオリゴマーを実質的に同じ様式で再設計、合成及び試験した。このプロセスを種々の組合わせのオリゴマーについて繰返して、ＨＰＶ型１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６及び６８を増幅及び検出する多重アッセイで機能する組合わせのオリゴマーを得た。各標識ＨＰＶ配列について陽性結果が得られ、一方ではオリゴマー間の妨害的な相互作用が最小限に抑えられるように経験的に判定した最適量のオリゴマーを混合物中に用いて、多重アッセイ方法をさらに最適化した。
【００１９】
多数のＨＰＶ型の配列を増幅及び検出するために用いた選択したオリゴマー配列を表１にまとめる。便宜上、前記配列についてＨＰＶグループ表示を示したが、あるオリゴマー配列が多重反応において他のグループの型のＨＰＶ配列を認識する機能をもつ可能性もあることは理解されるであろう。表１中の配列はＤＮＡ配列として示されているが、前記態様で、それらに対応するＲＮＡ配列からなる配列、及び開示したＤＮＡ配列又はそれらに対応するＲＮＡ配列に完全に相補的な配列も含まれることは理解されるであろう。
【００２０】
【表１】
2018138061.tif 000002
【００２１】
【表２】
2018138061.tif 000003
【００２２】
【表３】
2018138061.tif 000004
【００２３】
以下に記載するように、前記オリゴマーのうちあるものは、好ましくは、プロモータープライマーという態様を含む増幅オリゴマーとして用いられ、あるものは好ましくは検出プローブとして用いられ、あるものは好ましくは捕捉プローブオリゴマーとして、ＨＰＶ標識配列を増幅する前に、生物試料の他の成分からのＨＰＶ核酸の分離を促進するために用いられる。捕捉プローブオリゴマーは、好ましくはＥ６／Ｅ７遺伝子配列中の配列を標的とする。これに対し、増幅オリゴマー及び検出オリゴマーは、Ｅ７遺伝子配列を標的とする。前記オリゴマー配列及びそれらを用いる方法は、ヒトで発ガンリスクへの関連が高い多数の異なるＨＰＶ型を検出するのに有用である。それらは、ヒト細胞内で構成的発現するとガンに進行する可能性がある、細胞周期脱制御及び細胞増殖をもたらすＨＰＶ遺伝子Ｅ６及びＥ７の発現を検出するのに有用である。エピソームＨＰＶを有する細胞ではＨＰＶＥ６／Ｅ７遺伝子発現が抑制されるので、本発明のアッセイ方法及びオリゴマー成分は、新生物及び発ガンに関連するＨＰＶ発現を検出することにより予後情報を提供するために、生物試料中に存在するＥ６／Ｅ７ＲＮＡを検出するように設計された。
【００２４】
本発明及びその好ましい態様が理解されるように、以下の定義を示す。本明細書中で用いる他の科学用語及び技術用語は、当業者が一般に理解しているのと同様の意味である。用語の一般的定義は、例えばDictionary of Microbiology and Molecular Biology, 第2版(Singleton et al., 1994, John Wiley &Sons, ニューヨーク州ニューヨーク)、又はThe Harper Collins Dictionary of Biology(Hale &Marham, 1991 , Harper Perennial,ニューヨーク州ニューヨーク)中にある。別途記載しない限り、本明細書中で使用又は意図した技術は当業者に周知の標準的な方法である。
【００２５】
「生物試料」は、標識核酸を含有する可能性のある、生存又は死亡したヒトから得られる組織又は材料であればいかなるものでもよい。これには、例えば喉頭、口腔、中咽頭、扁桃腺、若しくは食道組織、呼吸器若しくは滲出物の試料；子宮頚若しくは肛門のスワブ試料；リンパ節、消化器、便、尿、精液、喀痰、末梢血、血漿、血清又は他の体液を含む生検組織；組織若しくは材料の試料があげられる。生物試料を周知の方法で処理して組織又は細胞構造を物理的又は機械的に破壊し、さらに酵素、緩衝剤、塩類、界面活性剤などを含有しうる溶液中へ細胞内成分を放出させることができる。
【００２６】
「核酸」は、窒素塩基又は塩基類似体を含み、ホスホジエステル結合又はポリヌクレオチドを形成する他の公知の結合で互いに連結した、ヌクレオシド又はヌクレオシド類似体を含む多量体化合物（オリゴマー又はポリマー）をいう。核酸としては、一般的なリボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はキメラＤＮＡ−ＲＮＡ及びこれらの類似体があげられる。核酸の「主鎖」は様々な結合から構成されてもよく、１以上の糖−ホスホジエステル結合、ペプチド−核酸結合（「ペプチド核酸」すなわちＰＮＡ中；参照：国際特許公開第９５／３２３０５号、Ｈｙｄｉｇ−Ｈｉｅｌｓｅｎら）、ホスホロチオエート結合、メチルホスホネート結合又は前記組合わせが含まれる。核酸の糖部分は、リボース若しくはデオキシリボース又はこれに類する化合物であって、公知の置換基、例えば２’−メトキシ置換基及び２’−ハライド置換基（例えば２’−Ｆ）を有するものでもよい。窒素塩基は下記の：一般的な塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、前記類似体（例えばイノシン；The Biochemistry of the Nucleic Acids 5-36, Adams et al.,第11版, 1992）、プリン塩基又はピリミジン塩基の誘導体（例えばＮ４−メチルデオキシグアノシン、デアザ−又はアザ−プリン類、デアザ−又はアザ−ピリミジン類、５又は６位に置換基をもつピリミジン塩基、２、６及び／又は８位に変化又は交換した置換基をもつプリン塩基、例えば２−アミノ−６−メチルアミノプリン、Ｏ６−メチルグアニン、４−チオ−ピリミジン類、４−アミノ−ピリミジン類、４−ジメチルヒドラジン−ピリミジン類、及びＯ４−アルキル−ピリミジン類、並びにピラゾロ化合物、例えば非置換又は３−置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン類；米国特許第５，３７８，８２５号、第６，９４９，３６７号及び国際特許公開第９３／１３１２１号）でもよい。核酸は、１以上の残基について主鎖に窒素塩基を含まない「非塩基」残基を含んでもよい（米国特許第５，５８５，４８１号、Ａｒｎｏｌｄら）。核酸は、ＲＮＡ及びＤＮＡ中にある一般的な糖、塩基及び結合のみを含んでもよく、あるいは一般的な成分と置換体を含んでもよい（例えば２’−メトキシ主鎖により結合した一般的な塩基又は一般的な塩基と１以上の塩基類似体の混合物を含む核酸）。核酸には、「ロックされた核酸」（ＬＮＡ）、二環式フラノース単位がＲＮＡ模倣型糖コンホメーション内にロックされた１以上のＬＮＡヌクレオチドモノマーを含有する類似体を含んでもよく、これは、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）又は二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）中の相補配列に対するハイブリダイゼーション親和性を高める（Vester et al.,2004, Biochemistry 43(42): 13233-41）。インビトロで核酸を製造するための合成方法は当技術分野で周知である。
【００２７】
互換性をもつ用語「オリゴマー」と「オリゴヌクレオチド」は、一般に１，０００個未満の残基がある核酸をいい、下限が約２〜５ヌクレオチドであるサイズ範囲のものをも含む。好ましいオリゴマーは、下限が約５〜約１５ヌクレオチドで上限が約６０〜約１５０ヌクレオチドであるサイズ範囲に含まれる。より好ましくは、オリゴマーは約１５〜約１００ヌクレオチドのサイズ範囲にある。オリゴマーは天然源から精製することができるが、好ましくは、いかなる公知の酵素法又は化学的方法でも合成される。
【００２８】
「増幅オリゴヌクレオチド」又は「増幅オリゴマー」は、標識核酸又は前記相補配列にハイブリダイズしてインビトロ核酸増幅反応に関与するオリゴマーをいう。増幅オリゴマーを「プライマー」又は「プロモータープライマー」としてもよい。一般にプライマーは鋳型核酸鎖にハイブリダイズし、重合反応で延長されて鋳型核酸に相補的な鎖を生成する３’末端がある。プライマーの５’側領域は標識核酸に対して非相補的であってもよく、例えば、それは５’側プロモーター配列を含んでもよく、このオリゴマーはプロモータープライマーという。当業者であれば、標識相補配列があり、プライマーとして機能するいずかなるオリゴマーを、５’側にプロモーター配列を含む、プロモータープライマーとして機能するように修飾できることを認識するであろう。同様に、プロモータープライマーは、そのプロモーター配列とは無関係にプライマーとして機能することができる。増幅オリゴヌクレオチドの好ましい態様は、標識配列（又は前記相補鎖）に対して相補的な少なくとも１０個の連続塩基、より好ましくは少なくとも１２個の連続塩基を含む。前記連続塩基は、前記オリゴマーがハイブリダイズする標識領域に対して少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは約１００％相補的である。増幅オリゴマーの長さは、好ましくは約１０〜約６５ヌクレオチドであり、修飾されたヌクレオチド又は塩基類似体を含んでもよい。
【００２９】
「増幅」は、標識配列、その相補配列又は標識配列のフラグメントの多数コピーを得るためのインビトロ方法をいう。「フラグメント」の増幅は、完全ではない標識領域配列又はその相補配列を含む増幅核酸の生成物をいう。例えば、完全な遺伝子をアッセイのための標識配列ということができるが、増幅は、標識遺伝子配列に含まれる、より小さな配列（例えば約８５〜２００ヌクレオチド）のコピーを作製することができる。公知の増幅方法としては、例えば転写関連増幅、レプリカーゼ介在増幅、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、及び鎖置換増幅（ＳＤＡ）があげられる。レプリカーゼ介在増幅には、自己複製ＲＮＡ分子及びＱＢ−レプリカーゼ等のレプリカーゼを用いる（米国特許第４，７８６，６００号、Ｋｒａｍｅｒら）。ＰＣＲ増幅は、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー及び温度周期を用いて、ＤＮＡ又はｃＤＮＡの２つの相補鎖の多数コピーを合成する（米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号及び第４，８００，１５号９、Ｍｕｌｌｉｓら；並びにMethods in Enzymology, 1987, Vol. 155: 335-350）。ＬＣＲ増幅は、少なくとも４つの別個のオリゴヌクレオチドを用い、多数サイクルのハイブリダイゼーション、ライゲーション及び変性により標識及びその相補鎖を増幅する（例えば米国特許第５，４２７，９３０号、Ｂｉｒｋｅｎｍｅｙｅｒら；米国特許第５，５１６，６６３号、Ｂａｃｋｍａｎら；及び欧州特許出願公開第０３２０３０８号）。ＳＤＡは、制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含むプライマーを用い、これによりエンドヌクレアーゼは標識配列を含む半修飾ＤＮＡ二本鎖の一方の鎖に切れ目を入れ、続いて一連のプライマー延長及び鎖置換の工程で増幅を行う（例えば米国特許第５，４２２，２５２号、Ｗａｌｋｅｒら；米国特許第５，５４７，８６１号、Ｎａｄｅａｕら；米国特許第５，６４８，２１１号、Ｆｒａｉｓｅｒら）。転写関連増幅は、以下に記載する好ましい態様である。当業者であれば、この好ましい態様に示されたオリゴヌクレオチド及び方法を分子生物学の当業者が、プライマー依存型増幅系に使用するために適合できることは自明であろう。
【００３０】
「転写関連増幅（transcription-associated amplification）」又は「転写介在増幅（transcription-mediated amplification）」（ＴＭＡ）は、ＲＮＡポリメラーゼを用いて核酸鋳型から多数のＲＮＡ転写体を生成するあらゆるタイプの核酸増幅法をいう。前記方法は、一般にＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、リボヌクレオシド三リン酸、及び鋳型相補的オリゴヌクレオチド（プロモーター配列を含み、場合により１以上の他のオリゴヌクレオチドを含んでもよい）を用いる。転写関連増幅の変法は以前の報告（米国特許第５，３９９，４９１号及び第５，５５４，５１６号、Ｋａｃｉａｎら；米国特許第５，４３７，９９０号、Ｂｕｒｇら；国際公開第ＷＯ８８／０１３０２号及びＷＯ８８／１０３１５号、Ｇｉｎｇｅｒａｓら；米国特許第５，１３０，２３８号、Ｍａｌｅｋら；米国特許第４，８６８，１０５号及び第５，１２４，２４６号、Ｕｒｄｅａら；国際公開ＷＯ９５／０３４３０号、Ｒｙｄｅｒら；並びに米国特許出願第１１／２１３，５１９号、Ｂｅｃｋｅｒら、２００５年８月２６日出願）のとおり当業者に周知である。ＫａｃｉａｎらのＴＭＡ法が、以下に記載する標識配列検出に用いる増幅法の好ましい態様である。好ましい態様はＴＭＡ又は転写関連増幅を用いて記載されるが、当業者であれば、本明細書に開示する増幅オリゴマーが、オリゴマー配列のポリメラーゼ介在延長に基づく他の増幅法の使用に容易に適用できることを認識するであろう。
【００３１】
「検出プローブ」は、核酸中の、好ましくは増幅した配列中の標識配列に、ハイブリダイゼーションを促進する条件下で特異的にハイブリダイズして、標識配列又は増幅した核酸の検出できるようにする核酸オリゴマーをいう。検出は直接（すなわち、標識又は増幅した核酸に直接ハイブリダイズするプローブによる）又は間接（すなわち、標識又は増幅した核酸にプローブを連結する中間分子構造体にハイブリダイズするプローブによる）のいずれでもよい。プローブの「標識」は、プローブ配列が標識配列に対して１００％相補的である必要はないが、一般に増幅した核酸配列（すなわちサブセット）内にある配列であって、標準的な水素結合（塩基対合）によりプローブオリゴマーの少なくとも一部に特異的に結合する配列をいう。「十分に相補的」である配列は、プローブの標識特異的配列に完全には相補的でない標識配列にプローブオリゴマーを安定にハイブリダイズさせることができる。プローブは、標識特異的配列のほかに、三次元配置又は検出機能に寄与する他の配列を含んでもよい（例えば米国特許第５，１１８，８０１号及び第５，３１２，７２８号、Ｌｉｚａｒｄｉら；米国特許第６，８４９，４１２号、第６，８３５，５４２号、第６，５３４，２７４号及び第６，３６１，９４５号、Ｂｅｃｋｅｒら）。
【００３２】
「十分に相補的」とは、一連の相補的塩基間の水素結合により他の配列にハイブリダイズできる連続核酸配列をいい、標準的な塩基対合（例えばＧ：Ｃ、Ａ：Ｔ又はＡ：Ｕ対合）により前記配列中の各位置で相補的であってもよく、あるいは適当なハイブリダイゼーション条件下で配列全体が他の配列に特異的にハイブリダイズしうる限り、１以上の非相補残基を含んでもよい。連続塩基は、あるオリゴマーを特異的にハイブリダイズさせることを意図した配列に対して、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは約１００％相補的である。適当なハイブリダイゼーション条件は当業者に周知であり、配列組成に基づいて容易に推定できるか、あるいは日常的な試験方法により経験的に判定できる（例えばSambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第2版(Cold Spring Harbor Laboratory Press, ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー, 1989), §§1.90-1.91, 7.37-7.57,9.47-9.51及び11.47-11.57、特に§§9.50-9.51,11.12-11.13,11.45-11.47及び11.55-11.57）。
【００３３】
「捕捉プローブ」又は「捕捉オリゴマー」は、混合物中の他の成分から標識核酸を分離するために、標識配列を支持体に特異的に結合する手段を提供する、少なくとも１つの核酸オリゴマーをいう。捕捉オリゴマーは、標識を支持体に連結させるためにいかなる公知のリガンド相互作用に基づいてもよいく、好ましい態様は支持体に固定化されたオリゴマーに塩基対ハイブリダイゼーションにより標識を連結させる。捕捉オリゴマーの態様は、２つの結合領域、すなわち標識配列結合領域及び固定化プローブ結合領域を、通常は同一オリゴマー上に含むが、前記領域は１以上のリンカーで互いに結合した２つの異なるオリゴマー上にあってもよい。「固定化プローブ」は、捕捉オリゴマーを直接又は間接的に固定化支持体に結合させる核酸をいう。固体支持体に結合した固定化オリゴマーは、混合物中の結合していない物質から結合した標識配列を分離するのを促進する。例えばニトロセルロース、ナイロン、ガラス、ポリアクリラート、混合ポリマー、ポリスチレン、シランポリプロピレン等の公知のいかなる支持体材料、及び金属粒子、好ましくは磁性付着可能な粒子から作製した公知の固体支持体、例えば溶液中のマトリックス又は粒子をも使用できる。好ましい標識捕捉材料及び方法は以前の報告（米国特許第６，１１０６７８号及び第６，２８０，９５２号、Ｗｅｉｓｂｕｒｇら）のとおりである。
【００３４】
「分離」又は「精製」とは、生物試料中の１以上の成分を生物試料中の他の１以上の成分から分離することをいう。例えば、試料成分には一般に、例えばタンパク質、炭水化物、脂質及び細胞小器官又は細胞屑を含有しうる水溶液中の核酸が含まれる。好ましくは、分離又は精製工程により、試料中に存在する他の成分が少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約９０％、さらに好ましくは少なくとも約９５％除去される。
【００３５】
「標識」は、検出できる、又は検出可能な応答をもたらしうる、分子部分又は化合物をいう。標識を核酸プローブに直接又は間接的に結合させることができる。直接標識化は、標識をプローブに連結する結合又は相互作用で行うことができ、これには共有結合又は非共有相互作用、例えば水素結合、疎水性及びイオン性相互作用又はキレート若しくは配位錯体の形成が含まれる。間接的標識化は、検出可能なシグナルを増強できる直接又は間接的に標識された架橋部分、すなわち「リンカー」を用いて行うことができる。標識は、いずれか公知の検出可能部分、例えば放射性核種、配位子、酵素若しくは酵素基質、反応性基、又は、例えば検出可能な色を付与する色素、ビーズ若しくは粒子、発光性化合物（例えば生物発光性、リン光性又は化学発光性の標識）、並びに蛍光性化合物等の発色団でもよい。好ましくは、標識プローブ上の標識は均一アッセイ系で検出でき、すなわち、結合していないプローブを含有する混合物中に存在する結合した標識プローブが、結合していないプローブと比較して、例えば安定性又は識別可能な分解等の検出可能な変化を示す。均一アッセイ系に使用するのに好ましい標識は化学発光性化合物であり、好ましい化学発光性化合物はアクリジニウムエステル（「ＡＥ」）化合物である。これには標準的ＡＥ又は前記誘導体（例えばナフチル−ＡＥ、オルト−ＡＥ、１−又は３−メチル−ＡＥ、２，７−ジメチル−ＡＥ、４，５−ジメチル−ＡＥ、オルト−ジブロモ−ＡＥ、オルト−ジメチル−ＡＥ、メタ−ジメチル−ＡＥ、オルト−メトキシ−ＡＥ、オルト−メトキシ（シンナミル）−ＡＥ、オルト−メチル−ＡＥ、オルト−フルオロ−ＡＥ、１−又は３−メチル−オルト−フルオロ−ＡＥ、１−又は３−メチル−メタ−ジフルオロ−ＡＥ、及び２−メチル−ＡＥ）が含まれる（米国特許第５，６５６，２０７号、Ｗｏｏｄｈｅａｄら；第５，６５８，７３７号、Ｎｅｌｓｏｎら；及び第５，６３９，６０４号、Ａｒｎｏｌｄ，Ｊｒ．ら）。標識を核酸に結合させる合成法及び標識を検出する方法は周知である（Sambrook et al.,Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第２版 (Cold Spring Harbor Laboratory Press,ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー, 1989), 10章；米国特許第５，６５８，７３７号、Ｎｅｌｓｏｎら；第５，６５６，２０７号、Ｗｏｏｄｈｅａｄら；第５，５４７，８４２号、Ｈｏｇａｎら；第５，２８３，１７４号、Ａｒｎｏｌｄら；第４，５８１，３３３号、Ｋｏｕｒｉｌｓｋｙら；及び欧州特許出願公開第Ｏ７４７７０６、Ｂｅｃｋｅｒら）。
【００３６】
「本質的に・・からなる」とは、開示した増幅オリゴマー態様によるインビトロ増幅反応及び開示した検出プローブ態様による検出によりグループＡ１、Ａ２、Ｃ１、Ｃ２及びＤのうちいずれか１つ又はすべての特定多数のＨＰＶ標識配列を検出する能力が実質的に変化しない他の１以上の成分、組成物又は工程が、本発明の組成物、キット又は方法に含まれてもよいことをいう。前記材料又は操作がグループＡ１、Ａ２、Ｃ１、Ｃ２及びＤのうちいずれか１つ又はすべての特定多数のＨＰＶ標識配列をインビトロ増幅及び検出反応により検出することを妨げる１以上の成分、組成物又は工程は、いずれもこの用語に含まれない。
【００３７】
本発明には、ヒトの生物試料中のＨＰＶ核酸を検出するための組成物（核酸捕捉オリゴマー、増幅オリゴマー及びプローブ）及び方法が含まれる。捕捉プローブ、増幅オリゴマー及び検出プローブとして用いるのに適当なオリゴマー配列を選択するために、公開されたデータベース（例えばＧｅｎＢａｎｋ）から入手できる３１の公知のサブタイプの公知のＨＰＶＲＮＡ又はＤＮＡ配列（部分配列を含む）を、Ｅ６／Ｅ７遺伝子配列中の同一又は類似配列の領域を一致させることによりアラインし、周知の分子生物学的方法で比較した。オリゴマーを設計する際に考慮した他の事項としては、配列の相対ＧＣ含量、予測二次構造（例えば分子内ハイブリッドを形成するヘアピンターン）が相対的に存在しないこと、当技術分野で周知の方法によるハイブリダイゼーション条件下でオリゴマーが混合物中に存在する際に予測される分子内相互作用が相対的に存在しないことがあげられる。この比較及び予測はコンピューター化されたアルゴリズムを用いて促進できるが、当業者であれば比較を手作業で容易に実施できる。ＨＰＶＥ６／Ｅ７配列を比較して、実質的な配列類似性をもつ近縁タイプの配列をグループＡ１、Ａ２、Ｂ、Ｃ１、Ｃ２及びＤに分けた。近縁グループ内とグループ間の両方で配列比較を行い、グループ内でＥ６／Ｅ７配列の配列変動が比較的少ない部分（すなわちコンセンサス領域）を同定し、１以上のＨＰＶ型中の標識配列へのハイブリダイゼーションに適当な合成オリゴマーを設計するための基礎として選択した。検出すべき個々のＨＰＶ型それぞれに特異的な増幅オリゴマーと検出オリゴマーの組合わせではなく、コンセンサス配列に対するオリゴマーを設計することにより、反応混合物中のオリゴマーの総数が少なくなり、増幅反応で生じることが知られている意図しないオリゴマー相互作用（例えば「プライマー二量体」又は非標識増幅生成物の形成）の確率が低くなり、一般に単一反応に用いる検出プローブの数に正比例するバックグラウンドシグナルも低下する。ただし、コンセンサス配列を用いることに基づくオリゴマーは、一般に設計するのがより困難である。コンセンサス配列の設計に利用できる標識領域はより制限され、設計したオリゴマーのうちあるものは意図した１以上の標識配列に対して完全に相補的ではない場合があるからである。すなわち、前記オリゴマー組合わせを用いて検出すべき１以上のＨＰＶ型について、オリゴマー配列とグループ内の１以上のＨＰＶ型に関してオリゴマーが意図した相補的標識配列との間で、１以上の不適正塩基対合が起きる可能性がある。また、オリゴマーがグループ内の１つのＨＰＶ型（例えばグループＡ１内のＨＰＶ１６）の標識配列には完全に一致し、前記グループ内の他のＨＰＶ型（例えばＨＰＶ３１及び／又は３５）に対しては不適正塩基対合（１以上）を含むものの前記グループ内の型の増幅及び／又は検出に際して機能する場合もある。同様に、ある１つの１グループに機能するように設計したオリゴマー（例えばグループＡ２に対する増幅オリゴマー）が、他の増幅オリゴマーとの組合わせで１より多いグループの複数型（例えばグループＡ１とＡ２の型）の配列を増幅する機能をもつ場合もある。これらを考慮して、増幅オリゴマーは、Ｅ７遺伝子内のＨＰＶ遺伝子配列（センス鎖又は相補鎖配列）にハイブリダイズして、一般に約８０〜約１５０ヌクレオチドの配列を増幅するように設計された（例えば各態様では下記の：ＨＰＶ１６の１０７ｎｔ、ＨＰＶ１８の１５２ｎｔ、ＨＰＶ３１の１１８ｎｔ、ＨＰＶ３３の８２ｎｔ、ＨＰＶ３５の１０９ｎｔ、ＨＰＶ３９の９６ｎｔ、ＨＰＶ４５の１５２ｎｔ、ＨＰＶ５１の１３３ｎｔ、ＨＰＶ５２の８６ｎｔ、ＨＰＶ５６の１４６ｎｔ、ＨＰＶ５８の８３〜８５ｎｔ、ＨＰＶ５９の１３２ｎｔ及びＨＰＶ６８の９９ｎｔの配列が増幅された）。検出プローブは、対応するプライマー対を用いて増幅した配列に含まれる標識配列にハイブリダイズするように、特定の対のプライマーの標識配列間の配列を検出するように設計された。捕捉プローブオリゴマーを設計するための標識領域は、Ｅ６／Ｅ７遺伝子配列でＨＰＶ型又はグループの増幅のための標識配列に対して一般に５’側にあった。多くの場合、設計及び経験的試験を繰返して行い、表１に示したオリゴマーの選択を最適化した。
【００３８】
捕捉プローブの態様としては、配列番号１〜１０の態様があげられ、好ましい態様としては、配列番号１、３、５、７及び９に示す実質的にホモポリマー型の３’テール領域（Ｔ３Ａ３０）があげられる。
【００３９】
検出プローブオリゴマーの態様としては、配列番号１１〜１７、４１、４４〜５４及び５８の態様があげられる。オリゴマーとして合成し、試験した約５０のデザインから、好ましいプローブオリゴマーのサイズは２０〜２３ｎｔの範囲、ＧＣ含量は約４０〜５０％及び推定融解温度（Ｔｍ）は約５５〜７０℃であった。プローブの各態様を合成し、非ヌクレオチドリンカー部分及び以前報告された方法（米国特許第５，１８５，４３９号、第５，５８５，４８１号及び第５，６５６，７４４号、ＡｒｎｏｌｄＪｒ．ら；並びに米国特許第５，６３９，６０４号、Ａｒｎｏｌｄら、第１０欄第６行〜第１１欄３行目、及び実施例８）を用いて、化学発光性ＡＥ化合物（例えば２−メチル−ＡＥ）で標識した。好ましい標識位置は、オリゴマーの中心領域、Ａ／Ｔ塩基対領域の付近、３’若しくは５’末端、又は検出に際して避けるべき公知の非標的配列がある不適正塩基対合の位置若しくはその付近である。ＡＥ−標識プローブの態様は、下記の位置：配列番号１５及び５３はｎｔ４と５の間；配列番号１１、１４、１７、４４、５０及び５２ではｎｔ５と６の間；配列番号１５、１７、４７、４８、５２及び５４ではｎｔ７と８の間；配列番号１２、１４、４１、４５、４７、４９、５４及び５８ではｎｔ８と９の間；配列番号４７及び４８ではｎｔ９と１０の間；配列番号１７、４４及び４７ではｎｔ１０と１１の間；配列番号１３、４４、４５、４６、４７、５０、５１及び５３ではｎｔ１１と１２の間；配列番号１３、１５、５１及び５３につきではｎｔ１２と１３の間；配列番号１４、１６、４５、４７及び５４ではｎｔ１３と１４の間；配列番号１３、１４、４９及び５２ではｎｔ１４と１５の間；配列番号１３及び５２ではｎｔ１５と１６の間；配列番号４４ではｎｔ１６と１７の間；配列番号４４、４７及び５８ではｎｔ１７と１８の間；配列番号５１ではｎｔ１９と２０の間；配列番号５０ではｎｔ２０と２１の間、；並びに配列番号４４ではｎｔ２１と２２の間；で標識されたものが含まれる。好ましい態様では、下記の：配列番号１１はｎｔ５と６の間；配列番号１５及び１７はｎｔ７と８の間；配列番号１２はｎｔ８と９の間、；配列番号４４はｎｔ１０と１１の間；配列番号４５はｎｔ１１と１２の間；配列番号１４はｎｔ１３と１４の間；並びに配列番号５２はｎｔ１４と１５の間；の位置で標識されたＡＥ−標識プローブが含まれる。好ましい態様の検出プローブを、２’−メトキシ主鎖で連結したＲＮＡ塩基配列として合成した。配列番号４９〜５４のプローブ態様は、累積的に配列番号５５の配列を標的とし、重複する配列番号４９〜５３のプローブは全て配列番号５６の配列を含む。
【００４０】
前記検出プローブの態様では、グループＡ１、Ａ２、Ｃ２、Ｃ２及びＤに含まれる複数のＨＰＶ型、すなわちＨＰＶ型１６、３１、３５、３３、５２、５８、１８、４５、５９、３９、６８、５１及び５６中のＨＰＶ配列を検出するプローブの混合物が含まれる。前記混合物の好ましい態様は、配列番号１１〜１５及び１７の検出プローブから構成される。特に好ましい態様は、下記のＡＥ−標識プローブの混合物：ｎｔ５と６の間に標識された配列番号：１１；ｎｔ８と９の間に標識された配列番号：１２；ｎｔ１５と１６の間に標識された配列番号：１３；ｎｔが１３と１４の間に標識された配列番号：１４；ｎｔ７と８の間に標識された配列番号：１５；並びにｎｔ７と８の間に標識された配列番号：１７；である。前記混合物の他の好ましい態様は、配列番号１１、１２、１４、１５、１７、４４、４５及び５２のプローブから構成される。特に好ましい態様は、下記のＡＥ−標識プローブの混合物：ｎｔ５と６の間に標識された配列番号：１１；ｎｔ８と９の間に標識された配列番号：１２；ｎｔ１３と１４の間に標識された配列番号：１４；ｎｔ７と８の間に標識された配列番号：１５；ｎｔ７と８の間に標識された配列番号：１７；ｎｔ１０と１１の間に標識された配列番号４４；ｎｔ１１と１２の間に標識された配列番号４５；並びにｎｔ１４と１５の間に標識された配列番号５２；である。当業者であれば、検出プローブを、例えばグループＡ１、Ａ２、Ｃ１、Ｃ２若しくはＤ内のＨＰＶ型又は関連型の組合わせ、例えばグループＡ１とＡ２個々のグループのＨＰＶを検出するために用いることができることを認識するであろう。上記各標識グループにより同定された前記検出プローブの好ましい態様としては、下記の：配列番号：１１がグループＡ１；配列番号：１２がグループＡ２；配列番号：１３又は配列番号４４、４５及び５２の混合物がグループＣ１；配列番号：１４がグループＣ２；並びに配列番号１５及び１７がグループＤ；が含まれる。
【００４１】
増幅オリゴマーの態様としては、配列番号１８〜４２があげられる。ある態様はＨＰＶ配列を標的とする配列のみ：配列番号１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３８、３９、４０、４１及び４２の配列を含むが、その他は他の機能性配列、すなわちプロモーター配列を含む。配列番号４３のプロモーター配列をオリゴマーの５’末端に含むプロモータープライマーの態様としては、配列番号１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４及び３６の配列があげられる。ＨＰＶ特異的配列と、ＨＰＶ特異的配列に結合した５’側プロモーターを含むプロモータープライマーとして構造的に関連する配列は、下記の：配列番号１９と１８、配列番号４２と１８、配列番号２１と２０、配列番号２３と２２、配列番号２５と２４、配列番号２７と２６、配列番号２９と２８、配列番号３１と３０、配列番号３３と３２、配列番号３５と３４、及び配列番号３７と３６である。ＨＰＶ型の配列をグループ毎に増幅するために好ましい増幅オリゴマーの混合物又は組合わせとしては、下記の：グループＡ１は、配列番号１８又は１９、配列番号２０又は２１、及び配列番号２２又は２３と配列番号３８；グループＡ２は、配列番号２４又は２５、及び配列番号２６又は２７と配列番号３８；グループＣ１は配列番号２８又は２９及び配列番号３０又は３１と配列番号３９；グループＣ２は配列番号３２又は３３と配列番号４０；並びにグループＤは配列番号３４又は３５及び配列番号３６又は３７と配列番号；があげられる。好ましい態様は、ＨＰＶ型１６、３１、３５、３３、５２、５８、１８、４５、５９、３９、６８、５１及び５６由来の配列（すなわちグループＡ１、Ａ２、Ｃ１、Ｃ２及びＤの全てに含まれるＨＰＶ）を共に増幅する増幅オリゴマー混合物を用いる。ＨＰＶ型１６、３１、３５、３３、５２、５８、１８、４５、５９、３９、６８、５１及び５６に対する前記増幅オリゴマー混合物の好ましい１態様としては、配列番号１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、３９、４０及び４１があげられる。ＨＰＶ型１６、３１、３５、３３、５２、５８、１８、４５、５９、３９、６８、５１及び５６に対する前記増幅オリゴマー混合物の好ましい他の態様としては、配列番号１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３８、３９、４０及び４１があげられる。
【００４２】
生物試料中の複数のＨＰＶ配列を検出するためのアッセイ方法は、下記の：ＨＰＶグループＡ１、Ａ２、Ｃ１、Ｃ２及びＤに含まれるＨＰＶ型に由来するＥ６／Ｅ７標識領域の少なくとも１つのＨＰＶ核酸配列をプライマーとして少なくとも２つの増幅オリゴマーを用いて、好ましくは転写関連増幅反応により増幅し、増幅した核酸を生成させる工程；増幅した核酸に含まれる配列に対して十分に相補的である検出プローブ配列とハイブリダイズさせて増幅した核酸を検出する工程を含む。好ましい態様は、配列番号１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、３９、４０及び４１の増幅オリゴマー混合物を増幅反応、すなわち転写関連増幅反応に用いる。他の好ましい態様は、配列番号１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３８、３９、４０及び４１の増幅オリゴマー混合物を増幅反応に用いる。増幅した配列に検出プローブが特異的に結合することにより発生するシグナルを検出して増幅した核酸を検出するが、前記特異的結合は、検出プローブ配列に完全に相補的な増幅核酸中の配列のハイブリダイゼーションでおこるものでなくてもよい。シグナルは、増幅した配列が標識されておらず、標識された検出プローブに結合して検出される場合があり、この場合は結合した標識された検出プローブが検出可能なシグナルを発生する。シグナルは、増幅した配列が標識されていない検出プローブに結合した後、増幅した核酸とプローブを含む複合体を検出することにより検出される場合があり、これは例えば検出プローブと増幅した核酸から構成されるハイブリダイゼーション複合体の形成により発生するシグナル、例えば電気シグナルを検出することにより行われる。好ましい態様では、化学発光性化合物で標識した配列番号１１〜１７の検出プローブを用いる。好ましい態様では、増幅したＨＰＶ型１６、３１、３５、３３、５２、５８、１８、４５、５９、３９、６８、５１及び５６のＨＰＶ配列を検出する検出プローブ混合物を用いる。検出に用いるプローブ混合物の好ましい態様は、配列番号１１〜１５及び１７のプローブ、より好ましくは化学発光性化合物で標識したものから構成される。検出に用いるプローブ混合物の他の好ましい態様は、ＡＥ−標識した配列番号１１〜１５及び１７のプローブ混合物である。検出に用いるプローブ混合物の他の好ましい態様は、配列番号１１、１２、１４、１５、１７、４４、４５及び５２のプローブ、より好ましくは化学発光性化合物で標識したものから構成される。検出に用いるプローブ混合物の他の好ましい態様は、ＡＥ−標識した配列番号１１、１２、１４、１５、１７、４４、４５及び５２のプローブ混合物である。アッセイの他の態様は、グループＡ１、Ａ２、Ｃ１、Ｃ２又はＤのＨＰＶ型を検出するための増幅した核酸の確認アッセイの場合のように個々のグループのＨＰＶ型を検出するために、又はグループＡ１とＡ２等のＨＰＶ型の組合わせを検出するために検出プローブを使用できる。前記アッセイの好ましい態様では、下記の検出プローブ：グループＡ１のＨＰＶ型の検出に配列番号１１；グループＡ２のＨＰＶ型の検出に配列番号１２；グループＣ１のＨＰＶ型の検出に配列番号１３又は配列番号４４、４５及び５２の混合物；グループＣ２のＨＰＶ型の検出に配列番号１４；あるいはグループＤのＨＰＶ型の検出に配列番号１５及び１７；を用いる。
【００４３】
このアッセイの他の態様では、試験する生物試料各々に２つの増幅及び検出反応を用いる。第１反応は、グループＡ１、Ａ２、Ｃ１、Ｃ２又はＤのＨＰＶ型を増幅して、少なくとも１つのＨＰＶ型から少なくとも１つの増幅したＨＰＶ型を生成できる増幅オリゴマー混合物を含む。第２反応は、ＨＰＶ型１６と１８両方の配列を増幅する増幅オリゴマー混合物が含まれる。その後前記２つの増幅反応の増幅生成物を別個に検出できる。第１増幅反応は、グループＡ１、Ａ２、Ｃ１、Ｃ２又はＤのＨＰＶ型を検出する検出プローブ混合物で増幅生成物を検出して、試料中に前記のＨＰＶ型のうち少なくとも１つが存在することを検出する。第２反応は、ＨＰＶ１６とＨＰＶ１８の増幅配列の検出に特異的な検出プローブ混合物で増幅生成物を検出して、試料中にＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８又は両型が存在することを検出する。このアッセイは、下記の理由で他の診断情報を提供する。第１の増幅及び検出反応により陽性結果が得られた場合は前記試料はグループＡ１、Ａ２、Ｃ１、Ｃ２又はＤのＨＰＶ型のいずれか１つを含有していたことになる。第２の増幅及び検出反応によっても陽性結果が得られた場合、前記被験試料は最も一般的なＨＲ−ＨＰＶ型であるＨＰＶ１６及び／又はＨＰＶ１８のうち少なくとも１つを含有していたことになる。第１反応により陽性結果が得られ、第２反応により陰性結果が得られた場合、ＨＲ−ＨＰＶ型が前記試料中に存在するが、ＨＰＶ１６又はＨＰＶ１８ではない。当該情報に基づいて、医療関係者は前記患者に適する追跡モニタリングを選択できる。本アッセイの態様は、第１反応に配列番号１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、３９、４０及び４１の増幅オリゴマー混合物、又は配列番号１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３８、３９、４０及び４１の増幅オリゴマー混合物を用い、増幅生成物を配列番号１１〜１５及び１７のプローブオリゴマー混合物、又はプローブ配列番号１１、１２、１４、１５、１７、４４、４５及び５２から構成される混合物で検出する。ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８検出のための第２反応には、配列番号１８、２８及び３９の増幅オリゴマー混合物、又は配列番号１９、２９及び３９の増幅オリゴマー混合物を増幅工程で用い、検出工程では配列番号１１と１３の検出プローブ混合物を用いる。単一試料の他のアッセイ態様は、３つの反応を含む：前記のようにグループＡ１、Ａ２、Ｃ１、Ｃ２又はＤのＨＰＶ型のうちいずれか１つを増幅及び検出する第１反応、ＨＰＶ１６配列のみを増幅及び検出する第２反応、並びにＨＰＶ１８配列のみを増幅及び検出する第３反応。この３部アッセイは、比較的少ない反応を用いて試料中に存在するＨＰＶ核酸のタイプに関する重要な診断情報を提供する。
【００４４】
ＨＰＶ検出のためのアッセイには、増幅工程の前に捕捉工程を用いて標識ＨＰＶＲＮＡを単離又は精製する工程も含まれる。好ましい態様では、捕捉プローブオリゴマー混合物をハイブリダイゼーション条件下で用いる。捕捉オリゴマーの一部はグループＡ１、Ａ２、Ｃ１、Ｃ２又はＤの少なくとも１つのＨＰＶ型のＨＰＶＥ６／Ｅ７標識配列に特異的にハイブリダイズし、捕捉オリゴマーの他の部分は、増幅工程の前に捕捉したＲＮＡを他の試料成分から分離するのを促進するために、捕捉したＨＰＶＲＮＡを固体支持体に固定化する結合対（リガンド）の一方として作用する。後続の増幅反応に用いる１以上の増幅オリゴマーがＨＰＶ捕捉工程に際して含有されていてもよい。増幅オリゴマーはＨＰＶＲＮＡ中において捕捉プローブオリゴマーの標識配列とは別個の標識配列にハイブリダイズし、標識捕捉を妨げることなく標識上のプライマーを増幅反応の開始のために提示するからである。好ましい態様では、配列番号２、４、６、８，及び１０を含む捕捉プローブ混合物を用いる。他の好ましい態様では、配列番号１、３、５、７及び９の捕捉プローブ混合物の場合のように、３’テール部分に共有結合した配列番号２、４、６、８及び１０のＨＰＶ特異的配列を含む捕捉プローブオリゴマー混合物を用いる。捕捉プローブのＨＰＶ特異的配列はＨＰＶ標識配列にハイブリダイズし、このテール部分は固体支持体に固定化された相補配列（オリゴ−ｄＴ）にハイブリダイズする。溶液相核酸ハイブリダイゼーションに伴うハイブリダイゼーション動態を利用するために、捕捉工程のハイブリダイゼーションは溶液中に遊離している捕捉オリゴマー及びＨＰＶ標識ＲＮＡを用いて行われることが好ましい。このハイブリダイゼーションにより捕捉オリゴマー：ＨＰＶＲＮＡ複合体が生成し、次いでこれが、捕捉オリゴマーのテール部分と固定化された相補配列とのハイブリダイゼーションにより固定化プローブに結合し、生成した複合体は標準法（例えば濾過、遠心分離、磁気分離）により他の試料成分から分離される。当業者であれば、捕捉工程を実施するため、テール部分と固定化プローブの間のいかなる結合対リガンド又は相補配列組をも使用できることを理解するであろう。好ましい態様において、固定化プローブは磁気結合可能な単分散粒子に付着したオリゴ−ｄＴであり、したがって反応混合物を収容した容器に磁力を付与することにより、ＨＰＶＲＮＡを含有するハイブリダイゼーション複合体は溶液から容易に分離される。捕捉されたＨＰＶ標識ＲＮＡを１回以上洗浄して、標識を潜在インヒビターからさらに精製する（例えばＨＰＶＲＮＡ：捕捉オリゴマー：固定化プローブ複合体が付着した粒子を洗浄液中に再懸濁し、複合体が付着した粒子を洗浄液から回収する）。操作工程数を少なくするために、ＨＰＶ標識核酸を捕捉オリゴマーから放出させずに増幅してもよい。標識捕捉工程中に増幅オリゴマーが存在すれば、捕捉されたＨＰＶ標識ＲＮＡにハイブリダイズした増幅オリゴマーの３’末端からの重合により初回増幅反応（ｃＤＮＡ形成）を達成できる。
【００４５】
ＨＰＶ検出のためのアッセイは、場合により非ＨＰＶ−内部対照（ＩＣ）核酸を含んでもよく、これが同一アッセイ反応混合物中でＩＣ配列に特異的な増幅オリゴマー及び検出オリゴマーにより増幅及び検出され、ＨＰＶ関連のシグナルとは異なる陽性シグナルを発する（例えば、ＩＣ特異的プローブにはＨＰＶプローブと対比して異なるＡＥ標識を用い、前記識別可能なシグナルを周知の方法（例えば米国特許５，６５８，７３７号、第５，７５６，７０６号、第５，８２７，６５６号及び第５，８４０，８７３号、Ｎｅｌｓｏｎら）で別個に検出する）。増幅され、増幅したＩＣ配列からシグナルが検出されたことは、ＨＰＶ標識に関するシグナルが得られない場合に（例えばＨＰＶの存在に関して陰性結果を示す試料）、アッセイ工程のアッセイ試薬、条件及び性能が前記アッセイで適切に用いられたことを証明する。ＩＣは、定量的結果が必要な場合にアッセイの内部検量物質として使用できる。すなわち、ＩＣの増幅及び検出から得られたシグナルを用いて、増幅したＨＰＶ標識配列に関して得られたシグナルに基づいて試料中のＨＰＶ核酸の量を定量するためのアルゴリズムに用いるパラメーターを設定する。ＩＣの好ましい態様は、天然源由来のランダム化配列である（例えばランダムに再配列したＨＰＶ配列）。好ましいＩＣは、反応毎の正確なＩＣ量を得るためにインビトロで合成したＲＮＡ転写体、例えばクローン化したランダム化配列から作製された転写物である。インビトロで合成したＩＣ標識配列特異的なプライマー及びプローブを用いて、ＨＰＶ配列の増幅及び検出に用いるのと実質的に同一のアッセイ条件によりＩＣ標識を増幅し、増幅したＩＣ配列を検出する。標識捕捉工程を含む好ましい態様では、アッセイはさらに、ＨＰＶ標識の精製に用いたものと同一の捕捉工程でＩＣ特異的な捕捉プローブを含む。したがってＩＣは、アッセイのあらゆる工程でＨＰＶ被分析体と同様に処理される。
【００４６】
捕捉されたＨＰＶ標識領域の増幅は、様々な公知の核酸増幅反応を用いて達成できるが、好ましくは転写関連増幅反応を用いる。前記態様では、単一コピーの標識核酸から多数の核酸鎖が生成し、したがって増幅した配列に結合している検出プローブにより標識を検出できる。転写関連増幅は、以前報告があったように（例えばＫａｃｉａｎらが米国特許第５，３９９，４９１号及び第５，５５４，５１６号に記載した転写介在増幅（ＴＭＡ）、及びＤａｖｅｙらが米国特許第５，４０９，８１８号に記載した核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ））実質的に定温条件下で行われる。要するに、転写関連増幅は、標識特異的配列及びＲＮＡポリメラーゼに対するプロモーター配列を含有するプロモータープライマー、もうひとつのプライマー、合成活性と分解活性を供給する酵素（逆転写酵素（ＲＴ）、ＤＮＡ依存性ＲＮａｓｅ、及びＲＮＡポリメラーゼ）、基質（デオキシリボヌクレオシド三リン酸、リボヌクレオシド三リン酸）、並びに適当な塩類、緩衝剤及び補因子を溶液中に用いて、核酸鋳型から複数のＲＮＡ転写体を生成する。要するに、プロモータープライマーが標識ＲＮＡ配列に特異的にハイブリダイズし、逆転写酵素がプロモータープライマーの３’末端から延長して第１鎖ｃＤＮＡを形成する。このｃＤＮＡは、いかなる方法（例えば二本鎖の変性）でも第２プライマーとのハイブリダイゼーションに利用できるが、好ましくはｃＤＮＡ：ＲＮＡ二本鎖中のＲＮＡ鎖を消化するＲＮａｓｅＨ活性（例えばＲＴ酵素により供給される）を用いる。第２プライマーがこのｃＤＮＡに結合し、第２プライマーの３’末端からＲＴによって新たなＤＮＡ鎖が合成され、一端に機能性プロモーター配列をもつ二本鎖ＤＮＡが形成される。ＲＮＡポリメラーゼがプロモーター配列に結合し、多数の転写体（「アンプリコン」）を転写する。前記アンプリコンが増幅プロセス後の工程で用いられ、各々新たなラウンドの複製のための鋳型として作用し、多量の増幅核酸が生成する（各ＲＮＡ鋳型鎖から約１００〜３，０００コピーが合成される）。
【００４７】
プロモータープライマーオリゴヌクレオチドは、適当なＲＮＡポリメラーゼが結合するとプロモーターとして機能する５’側プロモーター配列、及び標識領域配列に特異的にハイブリダイズする３’側配列を含む。好ましい態様としては、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼに特異的なＴ７プロモーター配列があげられる。プロモータープライマーの好ましい態様としては、配列番号１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４及び３６があげられ、配列番号３８〜４１のプライマーと組合わせて用いられる。
【００４８】
ＨＰＶ配列の転写介在増幅では、ＨＰＶ ＲＮＡが例えば配列番号１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４及び３６のうち１以上のプロモータープライマーにハイブリダイズし、ＲＴ活性によりプロモータープライマーから、ＨＰＶＲＮＡを鋳型として用いてｃＤＮＡが合成される。次いで例えば配列番号３８〜４１のうち１以上の第２プライマーがこのｃＤＮＡ鎖にハイブリダイズし、ＲＴ−介在重合によりＤＮＡ二本鎖が形成されて機能性二本鎖プロモーターが形成され、それに特異的ＲＮＡポリメラーゼが結合してＨＰＶ配列からＲＮＡ転写体を転写してＨＰＶ増幅生成物を生成する。このハイブリダイゼーション工程及び重合工程、ｃＤＮＡ合成工程を繰返すと、ＲＮＡ転写体が産生され、こうしてＨＰＶ標識特異的な増幅生成物が生成する。
【００４９】
増幅オリゴマーを用いる他のインビトロ核酸増幅方式（例えばＰＣＲ又はＳＤＡ）を用いてＨＰＶ標識配列を増幅することもでき、それはプライマー上にプロモーター配列を必要としないことは認識されるであろう。前記増幅方法で、好ましい増幅オリゴマー混合物には配列番号１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５及び３７の第１プライマーオリゴマー並びに配列番号３８〜４１の第２プライマーオリゴマーを用いる。
【００５０】
検出工程では一般に、試料中に存在する可能性のある標識ＨＰＶ型のいずれか１つを検出するためのＨＰＶ特異的プローブ混合物を用いる。すなわち、増幅したＨＰＶ配列（例えばＲＮＡ転写体又はアンプリコン）に少なくとも１つのプローブが特異的に結合した場合、陽性結果が得られる。グループＡ１、Ａ２、Ｃ１、Ｃ２及びＤのＨＰＶ型を検出するアッセイについて、検出工程には検出プローブ混合物、好ましくは配列番号１１〜１５及び１７の混合物、又は配列番号１１、１２、１４、１５、１７、４４、４５及び５２の混合物を用いる。２又は３つの増幅反応及び検出反応を伴うアッセイで、１つの反応でグループＡ１、Ａ２、Ｃ１、Ｃ２及びＤのＨＰＶ型のいずれか１つの存在を検出し、他の反応でＨＰＶのサブセット、例えばＨＰＶ１６及び／又はＨＰＶ１８を検出するために、サブセットのＨＰＶ型の検出工程に単一プローブ又はプローブサブセット混合物を用いる（例えば配列番号１１、配列番号１３若しくは配列番号４４を個別に、又は配列番号１１及び配列番号１３及び４４の混合物）。好ましい態様では、結合したプローブを結合していないプローブから精製せずに（すなわち均一検出系）検出されるシグナルを発生する標識プローブを用いる。より好ましくは、プローブをアクリジニウムエステル（ＡＥ）化合物で標識して、検出可能な化学発光性シグナルを発生させる（米国特許第５，２８３，１７４号及び第５，６５６，７４４号、Ａｒｎｏｌｄら；米国特許第５，６５８，７３７号、Ｎｅｌｓｏｎら）。
【００５１】
本明細書に記載した方法では、捕捉オリゴマー、増幅オリゴマー及び検出プローブオリゴマーは、ＨＰＶ型１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９及び６８のＥ６／Ｅ７遺伝子領域中にある多型のＨＰＶ標識配列の検出に有用と同定された特異的配列がある。多数のＨＰＶ型に共通の標識配列を選択して、又は多数のＨＰＶ型に共通の構造的特徴があるが標的（ターゲット）とするグループ内の全ての型に（又は１つの型についてすら）同一ではないコンセンサス配列を作製して、遺伝的に関連するグループ内の１より多いＨＰＶ型にハイブリダイズする多数のオリゴマーを設計した。増幅オリゴマーの態様は、配列番号１８〜４２であり、検出プローブオリゴマーの態様は配列番号１１〜１７、４１、４４〜５４及び５８である。化学発光性化合物で標識したプローブは、プローブオリゴマーに対して実質的に相補的な他のオリゴマーをプローブオリゴマーにハイブリダイズさせて、保存時に標識プローブを安定にすることができる。前記プローブ保護オリゴマーの態様は、配列番号５９〜６４である。捕捉プローブオリゴマーの好ましい態様は、標識領域配列を回収可能な固相に連結するための結合パートナーとして作用するいかなる部分（すなわちリガンド、例えばビオチン又はアビジン）に結合できる、配列番号２、４、６、８及び１０のＨＰＶ標識結合配列がある。捕捉プローブの態様は、３’テール配列ｄＴ３Ａ３０を含む配列番号１、３、５、７及び９のように、固定化した相補的オリゴマーにハイブリダイズするテール配列を含んでもよい。前記オリゴマーは一般に連続ＤＮＡ配列として開示されているが、ＲＮＡ均等配列、あるいは１以上の位置に塩基類似体（例えばイノシン）又は合成プリン及びピリミジン誘導体、例えばＰ又はＫ塩基による置換を含む類似配列（Lin&Brown, 1989, Nucl. Acids Res. 17:10373-83; Lin &Brown, 1992, Nucl.Acids Res. 20: 5149-52）が実質的に同一の態様で機能することは認識されるであろう。ＲＮＡ標識に結合するオリゴマーの各態様は核酸主鎖の１以上の結合に２’−メトキシ主鎖を含んでもよい。２’−メトキシ主鎖を用いて合成された好ましい態様では、一般に２’−メトキシ主鎖で連結された位置にＲＮＡ塩基を用いる。
【００５２】
本発明の態様としては、検体中のＨＰＶ核酸を検出するための工程を実施するのに有用な材料の様々な組合わせから構成されるキットがあげられる。好ましいキットは、グループＡ１、Ａ２、Ｃ１、Ｃ２及びＤのＨＰＶ型の核酸配列をインビトロ増幅するためのプライマーとして作用する増幅オリゴヌクレオチドを収容する。キットの一例は、ＨＰＶ標識配列の対鎖に相補的で増幅すべきＨＰＶ配列の両端をフランキングする第１及び第２増幅オリゴヌクレオチドを収容する。各態様では、配列番号１８又は１９、２０又は２１、２２又は２３、２４又は２５、２６又は２７、２８又は２９、３０又は３１、３２又は３３、３４又は３５、及び３６又は３７を第１増幅オリゴマーとして含み、配列番号３８〜４１を第２プライマーとして含む、増幅オリゴマーが収容される。第１増幅オリゴヌクレオチドの長さは、好ましくは最高１００ｎｔ、より好ましくは２０〜６０ｎｔで、ＨＰＶ標識領域配列に相補的な前記のヌクレオチド塩基には、１以上の塩基類似体の置換が含まれてもよい。第２増幅オリゴヌクレオチドの長さは、好ましくは最高１００ｎｔ、より好ましくは１５〜２５ｎｔで、１以上の窒素塩基類似体を含んでもよい。キットの態様は、さらにＨＰＶ増幅生成物を検出する１以上のプローブオリゴマーを収容することができる。前記のプローブの態様としては、配列番号１１〜１７、４４〜５４及び５８のオリゴマー、好ましくは配列番号１１、１２、１４、１５、１７、４４、４５及び５２のプローブがあげられる。キットの態様はさらに、使用前にプローブオリゴマーの機能性成分を安定化するためにプローブオリゴマーとの混合物として装填された、例えば配列番号５７及び５９〜６４の他のオリゴマーを収容することができる。キットは、標識核酸を試料から精製するための捕捉オリゴマーとして作用するオリゴマーをも収容することができる。キットに用いる捕捉オリゴマーの例としては、グループＡ１、Ａ２、Ｃ１、Ｃ２及びＤのＨＰＶ型中のＨＰＶＥ６／Ｅ７遺伝子領域内のＨＰＶ標識配列に相補的な約２５〜３０ｎｔのものを含有するオリゴマーがあげられる。キットに収容される捕捉オリゴマーの態様としては、好ましくは、捕捉オリゴマーを固体支持体に結合させるリガンドに付着した配列番号２、４、６、８及び１０のＨＰＶ特異的配列を含むオリゴマーがあげられる。キット中の捕捉オリゴマーの好ましい態様としては、配列番号１、３、５、７及び９のオリゴマー混合物があげられる。これは配列番号２、４、６、８及び１０のＨＰＶ特異的配列の３’末端に付着した実質的にホモポリマー状のテール配列を含有する。前記のキットの態様では、オリゴマーが特定配列の相補配列、ＲＮＡ及びＤＮＡ均等物、又は特定配列のＲＮＡ／ＤＮＡキメラ、又は特定配列中に１以上のヌクレオチド類似体置換を含んでもよい実質的に均等な配列からなるキットが含まれることは、理解されるであろう。キットの態様はオリゴマーを個別に包装された成分として収容できるが、好ましくはオリゴマーの混合物、例えば標識捕捉オリゴマーと第１増幅オリゴマーの混合物、又はプローブオリゴマーの混合物を収容できることも理解されるであろう。本発明方法を実施するのに有用なキットとしては、本明細書に開示する増幅オリゴマー及び／又は検出プローブのいずれかを互いに組合わせて包装されたものがあげられる。キットは、増幅オリゴヌクレオチド及び／又は検出プローブと組合わせて包装できる捕捉オリゴマーを収容してもよい。本発明方法を実施するのに有用なキットはさらに、本明細書に開示する標識捕捉、インビトロ増幅、及び／又は増幅生成物の検出の工程に使用する１以上の試薬を収容できる。当業者には、本発明に様々なキット形態が含まれることは自明であろう。
【００５３】
標識捕捉工程で試料からＨＰＶ ＲＮＡを捕捉し、捕捉したＨＰＶ標識配列を転写介在増幅反応で増幅し、増幅した配列を標識した検出プローブで均一反応で検出し、結合したプローブから発生する被験試料中のＨＰＶの存在を指示する化学発光性シグナルを検出するアッセイ方法で、本明細書に記載のオリゴマーを試験した。前記アッセイに用いた一般的な工程は以前報告された（米国特許第６，１１０，６７８号、第６２８０，９５２号及び第６，５３４，２７３号、Ｗｅｉｓｂｕｒｇら、標識捕捉関連；米国特許第５，３９９，４９１号及び第５，５５４，５１６号、Ｋａｃｉａｎら、転写介在増幅関連；並びに米国特許第５，２８３，１７４号及び第５，６５６，７４４号、Ａｒｎｏｌｄら、並びに米国特許第５，６５８，７３７号、Ｎｅｌｓｏｎら、化学発光性標識及び検出に関連）。
【００５４】
本明細書に記載するＨＰＶ検出アッセイには、一般に下記の試薬を用いた。試料輸送溶液は、１５ｍＭ一塩基性リン酸ナトリウム、１５ｍＭ二塩基性リン酸ナトリウム、１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭＥＧＴＡ、及び１１０ｍＭラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）（ｐＨ６．７）を含有した。標識捕捉試薬は、２５０ｍＭＨＥＰＥＳ、３１０ｍＭ水酸化リチウム、１．８８Ｍ塩化リチウム、１００ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ６．４、及び２５０μｇ／ｍｌ磁性粒子（１ミクロンのＳＥＲＡ−ＭＡＧ（商標）ＭＧ−ＣＭ粒子、Seradyn,Inc.、インディアナ州インディアナポリス）に（ｄＴ）１４オリゴマーが共有結合したものを含有した。洗浄液は、１０ｍＭＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、６．５ｍＭ水酸化ナトリウム、１ｍＭＥＤＴＡ、０．３％（ｖ／ｖ）エタノール、０．０２％（ｗ／ｖ）メチルパラベン、０．０１％（ｗ／ｖ）プロピルパラベン、及び０．１％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸ナトリウム（ｐＨ７．５）を含有した。プローブ試薬は、１以上の標識された検出プローブを、１００ｍＭコハク酸リチウム、２％（ｗ／ｖ）ＬＬＳ、１５ｍＭメルカプトエタンスルホネート、１．２Ｍ塩化リチウム、２０ｍＭＥＤＴＡ、及び３％（ｖ／ｖ）エタノールからなる溶液（ｐＨ４．７）を含有した。増幅試薬は、他の反応成分と混合して、４７．６ｍＭＮａ−ＨＥＰＥＳ、１２．５ｍＭＮ−アセチル−Ｌ−システイン、２．５％ ＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−１００、５４．８ｍＭＫＣｌ、２３ｍＭ ＭｇＣｌ２、３ｍＭＮａＯＨ、各０．３５ｍＭｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、７．０６ｍＭ ｒＡＴＰ、１．３５ｍＭ ｒＣＴＰ、１．３５ｍＭＵＴＰ、８．８５ｍＭｒＧＴＰ、０．２６ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ、５％ｖ／ｖグリセロール、２．９％トレハロース、０．２２５％エタノール、０．０７５％メチルパラベン、０．０１５％プロピルパラベン、及び０．００２％フェノールレッドを含有する混合物（ｐＨ７．５〜７．６）を生成する濃厚混合物であるが、増幅試薬の他の配合物も同様に良好に機能しうる。プライマーを増幅試薬に添加するか、又は増幅試薬とは別に増幅反応に添加してもよい。酵素は、モロニーネズミ白血病ウイルス逆転写酵素（Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase）（ＭＭＬＶ−ＲＴ）及びバクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼであり、その単位は機能的に下記のように規定されている：１ＵＭＭＬＶ−ＲＴは、２００〜４００μｍｏｌオリゴｄＴ−プライムド−ポリ（Ａ）を鋳型として用いて１ｎｍｏｌｄＴＴＰを３７℃１０分で取り込み、１ＵＴ７ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７プロモーターを含むＤＮＡ鋳型を用いて１ｎｍｏｌＡＴＰをＲＮＡ中へ３７℃で１時間取り込む。ハイブリダイゼーション試薬は、１００ｍＭコハク酸、２％（ｗ／ｖ）のＬＬＳ、１００ｍＭ水酸化リチウム、１５ｍＭアルドリチオール−２（ａｌｄｒｉｔｈｉｏｌ−２）、１．２Ｍの塩化リチウム、２０ｍＭのＥＤＴＡ、及び３．０％（ｖ／ｖ）のエタノール（ｐＨ４．７）から構成された。選択試薬は、６００ｍＭホウ酸、１８２．５ｍＭ水酸化ナトリウム、１％（ｖ／ｖ）オクトキシノール（ｏｃｔｏｘｙｎｏｌ）（ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００）（ｐＨ８．５）であった。検出試薬は、１ｍＭの硝酸及び３２ｍＭの過酸化水素を含有する検出試薬Ｉであり、検出試薬ＩＩは１．５Ｍの水酸化ナトリウムであった。ＨＰＶアッセイのオリゴマーを一般に下記の濃度：各捕捉プローブオリゴマーは反応当たり２．５ｐｍｏｌ、標識捕捉試薬に含まれる各プロモータープライマーは反応当たり２．５ｐｍｏｌ、増幅混合物に含まれる各非プロモータープライマーは反応当たり１５ｐｍｏｌ、増幅混合物に含まれる各プロモータープライマーは反応当たり１．２５〜７．５ｐｍｏｌ、並びに各検出プローブは反応当たり０．０３ｐｍｏｌで用いた。実施した試験で、ＨＰＶ標識は一般にインビトロで合成された転写体であり、検出すべきＨＰＶ型（１以上）のＥ６／Ｅ７遺伝子配列の全て又は一部を含み、反応当たり２５〜１００，０００コピー、通常は反応当たり１００又は１０００コピーの濃度で用いられた。さらに詳細を以下の実施例に示す。前記は本発明の若干の態様の代表例である。
【実施例１】
【００５５】
ＨＰＶ Ｅ６／Ｅ７配列の標識の捕捉、増幅及び検出
本実施例は、試料中のＨＰＶ型１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９及び６８由来の標識配列を検出する多くの試験に用いられるアッセイ工程及び条件を記載する。
【００５６】
標識捕捉工程では、オリゴマー配列番号１、３、５、７及び９の混合物（各２．５ｐｍｏｌ）を、各試験に適当な１００又は１０００コピーのＨＰＶ標識ＲＮＡ（すなわちＨＰＶ型１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９及び６８の１以上のＥ６／Ｅ７転写体）を含有する標識捕捉試薬０．５ｍｌを含む反応に用いた。前記の反応混合物は、各２．５ｐｍｏｌの配列番号１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４及び３６のオリゴマーをも含有した。混合物を６２℃で３０分間、次いで室温で３０分間インキュベートして、オリゴマーを標識配列にハイブリダイズさせ、次いで容器の外側に磁力を付与して（約５〜１０分間）、磁性粒子上のハイブリダイゼーション複合体を他の反応成分から分離し、他の試料成分を吸引除去し、粒子上のハイブリダイゼーション複合体を１ｍｌの洗浄液により室温で洗浄し、上記同様に磁力を付与し、吸引して磁性粒子上のハイブリダイゼーション複合体を洗浄液から分離した。
【００５７】
少なくとも１つのＴ７プロモータープライマーを含むハイブリダイゼーション複合体中に捕捉されたＨＰＶ標識ＲＮＡをその後増幅反応に用いた。反応は、各４０ｍＭＴｒｉｚｍａ塩基、ｐＨ７．５、１７．５ｍＭＫＣｌ、２０ｍＭＭｇＣｌ２、５％ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、各１ｍＭｄＮＴＰ、各４ｍＭｒＮＴＰ、及び反応当たり各１５ｐｍｏｌの配列番号３８〜４１オリゴマー、並びに各反応に最適量の下記のＴ７プライマーオリゴマー：配列番号１８（１．２５ｐｍｏｌ）、配列番号２０（７．５ｐｍｏｌ）、配列番号２２（１．２５ｐｍｏｌ）、配列番号２４（２．５ｐｍｏｌ）、配列番号２６（２．５ｐｍｏｌ）、配列番号２８（２．５ｐｍｏｌ）、配列番号３０（２．５ｐｍｏｌ）、配列番号３２（７．５ｐｍｏｌ）、配列番号３４（１．２５ｐｍｏｌ）、及び配列番号３６（１．２５ｐｍｏｌ）を含有した。蒸発を防ぐために反応物を不活性油の層（２００μｌ）で覆い、６２℃で１０〜１５分間の後、４２℃で３〜５分間インキュベートした。次いで酵素（反応当たり約７５０ＵＭＭＬＶＲＴ及び約２０００ＵのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ）を添加し、混合し、増幅反応物を４２℃で約１時間インキュベートした。
【００５８】
増幅した配列を検出するため、ＡＥ化合物で標識した、反応当たり各０．０３ｐｍｏｌの配列番号１１〜１６のオリゴマー混合物又は配列番号１１〜１５及び１７のオリゴマー混合物を含有するプローブ試薬０．１ｍｌを増幅混合物に添加し、６２℃で約２０分間インキュベートした後０．２５ｍｌの選択試薬を添加し、混合物を６２℃で約１０分間インキュベートし、次いで反応物を室温に冷却し（約１５分間）、検出試薬Ｉ及びＩＩを順に添加した後、実質的に以前の報告（米国特許第５，６５８，７３７号、第２５欄第２７−４６行目；Nelson et al.,1996, Biochem. 35: 8429-8438, 8432）に従い、結合プローブから化学発光を発生させ、シグナル（相対光単位、すなわちＲＬＵ）をルミノメーター（ＬｅａｄｅｒＨＣ＋，Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ Ｉｎｃ．，カリフォルニア州サンディエゴ）で検出した（２秒間）。
【００５９】
一連の多重アッセイでは、ＨＰＶ型１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６８毎に、前記アッセイ方法で既知量の各標識（反応当たり２５〜１０００コピー）を含有する試料を用いて増幅して検出した。このＨＰＶ型全てが２００コピー以上の各標識ＨＰＶＲＮＡを含有する試料について一般に約６５０，０００ＲＬＵ〜２，０００，０００ＲＬＵ以上の範囲の陽性シグナルが生じたが、ＨＰＶ型３１、３５、１８、４５、５９及び６８は試料中に２５コピーしか標識ＲＮＡが存在しない場合でも陽性シグナル（５００，０００ＲＬＵ以上）が生じた。この結果より、多重アッセイのおおよその感度は、ＨＰＶ１８、３１、３５、４５、５１、５６、５９及び６８では反応当たり２５コピー、ＨＰＶ１６では反応当たり５０コピー、ＨＰＶ３３、３９及び５８では反応当たり２００コピー、ＨＰＶ５２では反応当たり４００コピーであった。
【００６０】
この多重アッセイが、アッセイで検出することを想定しないＨＰＶ型、すなわち低リスクＨＰＶ型と交差反応しないことを示すため、低リスクＨＰＶ型６、１１、４２、４３及び４４から調製したインビトロＥ６／Ｅ７転写体を標識核酸として用いて（反応当たり１，０００，０００及び１０，０００，０００コピーを使用）、同じ多重増幅及び検出反応工程を実施した。すなわち、低リスクＨＰＶ型はこのアッセイで検出されたグループＡ１、Ａ２、Ｃ１、Ｃ２及びＤの高リスクＨＰＶ型より反応当たり１，０００〜１０，０００倍多いコピー数で試験した。本アッセイで試験した低リスクＨＰＶ標識は、陽性対照（各標識ＨＰＶにつき個々の反応で１０００コピーのＨＰＶ１６、１８、３３、３９及び５１インビトロＥ６／Ｅ７転写体を試験した）と比較して陰性結果であった。陽性対照は１，０００，０００ＲＬＵ以上ないし２，０００，０００ＲＬＵ以上の陽性シグナルが生じ、これに対し低リスクＨＰＶ型は陰性シグナルが生じた（約１４，０００ＲＬＵ以下）。
【実施例２】
【００６１】
グループＡ２、Ｃ１、Ｃ２及びＤのＨＰＶ型の増幅及び検出
本実施例は、異なるグループの個々のＨＰＶ型の増幅及び検出を増幅オリゴマーと検出オリゴマーの組合わせにより実施したいくつかの試験を示す。Ｅ７領域の既知量のインビトロ転写体（反応当たり１００〜１００，０００コピー）を用いて調製した被験試料中の標識配列を効率的に検出するために、増幅工程及び検出工程のみを用いて、実質的に上記のとおり反応を行った。陰性対照は、同一試験を行ったが標識転写体を含有しない試料であった。前記グループの反応で試験したそれぞれの非プロモータープライマー（１５ｐｍｏｌ）及びそれぞれのプロモータープライマー（５〜７．５ｐｍｏｌ）（下記のデータ表と共にその配列番号で示す）を反応当たり同一量で用いて、増幅反応を各グループごとに実施した。既知量の各ＨＰＶ標識ＲＮＡを含有する調製試料を、増幅試薬（４０ｍＭＴｒｉｚｍａ塩基、ｐＨ７．５、１７．５ｍＭＫＣｌ、２０ｍＭＭｇＣｌ２、５％ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、各１ｍＭｄＮＴＰ、各４ｍＭｒＮＴＰ）及び各グループにつき下記のデータ表に示した各増幅オリゴマーと混合した。蒸発を防ぐために反応物を不活性油の層で覆い、６２℃で１０〜１５分間、次いで４２℃で３〜５分間インキュベートし、次いで酵素（反応当たり約７５０ＵＭＭＬＶＲＴ及び約２０００ＵのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ）を添加し、混合し、増幅反応物を４２℃で約１時間インキュベートした。増幅反応の後、一定部分の各増幅反応物を、ハイブリダイゼーション試薬及び各グループにつき下記のデータ表に示したＡＥ標識プローブ（反応当たり１００ｆｍｏｌ）と混合し、混合物をインキュベートしてプローブを増幅生成物にハイブリダイズさせ（６２℃で約２０分間）、次いで選択試薬を添加して非結合プローブ上の標識を不活性化した（６２℃で約１０分間）。この検出反応混合物を室温に冷却し、検出試薬Ｉ及びＩＩを順に添加して結合プローブからの化学発光を誘導し、この化学発光シグナル（ＲＬＵ）を実質的に以前の報告（米国特許第５，６５８，７３７号；Nelson et al., 1996, Biochem. 35: 8429-8438, 8432）と同様にルミノメーターで検出した。グループＡ２、Ｃ１、Ｃ２及びＤのＨＰＶ型についての試験結果を下記に示す。
【００６２】
【表４】
2018138061.tif 000005
【００６３】
【表５】
2018138061.tif 000006
【００６４】
結果は、選択したオリゴマーがグループ内の異なるＨＰＶ型の増幅及び検出に有効で、反応当たりわずか１００コピーの標識ＲＮＡで多くの場合陽性結果が得られたことを示す。本明細書に開示した他の増幅オリゴマーと検出オリゴマー組合わせを各ＨＰＶ標識転写体と共に用いて多数の同様な試験を実施し、反応当たりわずか１００コピーの標識ＲＮＡで多くの場合陽性結果が得られ、反応当たり１０００コピーで常に陽性結果であった。
【実施例３】
【００６５】
グループＡ１、Ａ２、Ｃ１、Ｃ２及びＤのＨＰＶ型を増幅及び検出する多重アッセイ
本実施例は、ＨＰＶ型１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６８を検出した実施例１に記載したものと同様な多重アッセイで得た結果を示す。この多重アッセイはさらに内部対照（ＩＣ）ＲＮＡ（ランダム化した非ＨＰＶＲＮＡ配列）を含有し、ＨＰＶ被分析体の検出に用いたのと同一のアッセイ条件でＩＣ特異的なプライマー及びプローブで同時に増幅及び検出して、識別可能な化学発光シグナルを発生させた。
【００６６】
アッセイの標識捕捉部分で、標識捕捉試薬及び既知量のＨＰＶ標識ＲＮＡ（ＨＰＶ型１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９又は６８のＥ６／Ｅ７遺伝子領域のインビトロ転写体；反応当たり１００〜１，０００コピー）を含む試料を含有する反応物内に、配列番号１（０．６５ｐｍｏｌ／μｌ）、配列番号３及び配列番号９（各２．５ｐｍｏｌ／μｌ）並びに配列番号５及び配列番号７（各０．５ｐｍｏｌ／μｌ）の捕捉オリゴマー混合物を用いた。この捕捉反応混合物を順に６２℃で３０分間、室温で３０分間インキュベートして、固体支持体粒子上のＨＰＶＲＮＡ：捕捉オリゴマー：固定化プローブから構成されるハイブリダイゼーション複合体を形成させた。上記同様容器の外側に磁力を付与して粒子上のハイブリダイゼーション複合体を他の試料成分から分離し、他の試料成分を吸引除去し、粒子上のハイブリダイゼーション複合体を実質的に洗浄した。
【００６７】
次いでハイブリダイゼーション複合体中に捕捉されたＨＰＶ標識ＲＮＡを、増幅試薬及び増幅オリゴマー（プロモータープライマー混合物及び非プロモータープライマー混合物から反応に供給される）を含有する転写介在増幅反応物中で増幅した。用いたプロモータープライマーは、配列番号１８（１．２５ｐｍｏｌ／μｌ）、配列番号２０（７．５ｐｍｏｌ／μｌ）、配列番号２２（１．２５ｐｍｏｌ／μｌ）、配列番号２４（７．５ｐｍｏｌ／μｌ）、配列番号２６（７．５ｐｍｏｌ／μｌ）、配列番号２８（２．５ｐｍｏｌ／μｌ）、配列番号３０（２．５ｐｍｏｌ／μｌ）、配列番号３２（７．５ｐｍｏｌ／μｌ）、配列番号３４（１．２５ｐｍｏｌ／μｌ）、及び配列番号３６（１．２５ｐｍｏｌ／μｌ）であった。他方のプライマーは、配列番号３８、３９、４０及び４１であった（各１５ｐｍｏｌ／μｌ）。内部対照に特異的なプロモータープライマー及びプライマーを、内部対照ＲＮＡを含有する反応物に同様に添加した。蒸発を防ぐために混合物を不活性油の層で覆い、順に６２℃で１０〜１５分間、４２℃で約５分間インキュベートした。実質的に上記同様酵素（ＭＭＬＶＲＴ及びＴ７ＲＮＡポリメラーゼ）を添加し、混合し、増幅反応物を４２℃で約６０分間（４５〜７５分間）インキュベートした。
【００６８】
増幅したＨＰＶ配列を検出するために、一定部分の増幅混合物を、プローブ試薬並びに配列番号１１、１２、１４、１５、１７、４４、４５及び５２（それぞれ２−メチル−ＡＥで標識し、反応当たり１．５×１０６ＲＬＵの量となるように添加した）のプローブオリゴマー混合物と混合した。増幅した内部対照配列の検出には、内部対照に特異的な合成オリゴマーを識別可能なＡＥ化合物（２’−フルオロ−ＡＥ）で標識したものを用い、反応当たり８．５×１０５ＲＬＵの量となるように添加した。検出混合物を６２℃で約２０分間インキュベートし、次いで室温に約５分間冷却し、選択試薬を添加し、混合物を６２℃で約１０分間インキュベートし、次いで室温に約１５分間冷却した時点で、順に検出試薬Ｉ及びＩＩを用いて化学発光を発生させ、結合したプローブ中のＡＥ標識から発生する化学発光シグナル（ＲＬＵ）を、実質的に上記と同様に検出した。
【００６９】
前記アッセイで、各ＨＰＶ標識につき合計１０の複製試料を試験し、コピー数をアッセイした。これに関して、用いた２つの異なるロットの増幅試薬について代表データを下記に示す。複製反応の型ごとに、増幅した標識ＨＰＶについて平均した検出ＲＬＵ（平均）、及びＨＰＶ標識ＲＮＡを含有しない同一処理した試料において得られたバックグラウンドレベルを検出ＲＬＵが超えた場合に陽性とみなした試験の％を共に示す。本結果は、結果に若干の変動がみられた（例えば個々の検体、個々のアッセイの性能又は試薬ロット間）ものの、本多重アッセイによりＨＰＶ型１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９及び６８が検出されたことを示す。上記結果は、異なる被験ＨＰＶ型に関するアッセイの相対感度も示す。
【００７０】
【表６】
2018138061.tif 000007
【００７１】
【表７】
2018138061.tif 000008
【００７２】
以上の実施例は、特許請求の範囲に記載の本発明の側面及び好ましい態様を説明する。
［項目１］
増幅オリゴマー混合物であって、混合物中の個々のオリゴマー配列は配列番号１８〜配列番号４２よりなる群から選択され、前記群には前記特定配列の相補的オリゴマー配列又はＲＮＡ均等物が含まれる、下記の：
配列番号１９若しくは４２、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３及び３５の第１増幅オリゴマー、並びに配列番号３７、３８、３９、４０及び４１の第２増幅オリゴマー、又は前記オリゴマー配列の相補的オリゴマー配列若しくはＲＮＡ均等物；
配列番号１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４及び３６の第１増幅オリゴマー、並びに配列番号３７、３８、３９、４０及び４１の第２増幅オリゴマー、又は前記オリゴマー配列の相補的オリゴマー配列若しくはＲＮＡ均等物；
配列番号１９若しくは４２、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３及び３５の第１増幅オリゴマー、並びに配列番号３８、３９、４０及び４１の第２増幅オリゴマー、又は前記オリゴマー配列の相補的オリゴマー配列若しくはＲＮＡ均等物；あるいは
配列番号１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４及び３６の第１増幅オリゴマー、並びに配列番号３８、３９、４０及び４１の第２増幅オリゴマー、又は前記オリゴマー配列の相補的オリゴマー配列若しくはＲＮＡ均等物；
を含む混合物。
［項目２］
１以上の個々のオリゴマーが、少なくとも１つの２’−メトキシＲＮＡ基、少なくとも１つの２’−フルオロ置換ＲＮＡ基、少なくとも１つのペプチド核酸結合、少なくとも１つのホスホロチオエート結合、少なくとも１つのメチルホスホネート結合、又は前記いずれかの組合わせを含む主鎖を含む、項目１のオリゴマー混合物。
［項目３］
キットに収容された、項目１のオリゴマー混合物。
［項目４］
オリゴマー混合物であって、混合物中の個々のオリゴマー配列は配列番号１１〜配列番号１７、配列番号４４〜配列番号５４、及び配列番号５８よりなる群から選択され、前記群には前記特定配列の相補的オリゴマー配列又はＲＮＡ均等物が含まれる、下記の：
配列番号１１〜１７、又は前記オリゴマー配列の相補的オリゴマー配列若しくはＲＮＡ均等物；
配列番号１１〜１５及び１７、又は前記オリゴマー配列の相補的オリゴマー配列若しくはＲＮＡ均等物；
配列番号１１〜１５及び１７、並びに少なくとも１つの配列番号４４〜配列番号５４及び配列番号５８のオリゴマー、又は前記オリゴマー配列の相補的オリゴマー配列若しくはＲＮＡ均等物；あるいは
配列番号１１、１２、１４、１５、１７、４４、４５及び５２、又は前記オリゴマー配列の相補的オリゴマー配列若しくはＲＮＡ均等物；
を含む混合物。
［項目５］
各オリゴマー配列が、前記オリゴマーに直接又は間接的に結合した標識を含む、項目４のオリゴマー混合物。
［項目６］
各オリゴマー配列が、化学発光性化合物である標識を含む、項目４のオリゴマー混合物。
［項目７］
各オリゴマー配列が、少なくとも１つの２’−メトキシＲＮＡ基を含む主鎖を有する、項目４のオリゴマー混合物。
［項目８］
キットに収容された、項目４のオリゴマー混合物。
［項目９］
少なくとも２つのオリゴマーの混合物であって、混合物中の個々のオリゴマー配列は配列番号１〜１０よりなる群から選択され、前記群には前記特定配列の相補的オリゴマー配列又はＲＮＡ均等物が含まれる、下記の：
配列番号２、４、６、８及び１０から選択される少なくとも２つのオリゴマーであって、リガンド部分が各オリゴマーに結合したもの；
配列番号２、４、６、８及び１０のオリゴマーであって、リガンド部分が各オリゴマーに結合したもの；
配列番号１、３、５、７及び９から選択される少なくとも２つのオリゴマー；又は
配列番号１、３、５、７及び９のオリゴマー；
を含む混合物。
［項目１０］
少なくとも１つのオリゴマーが、少なくとも１つの２’−メトキシＲＮＡ基、少なくとも１つの２’−フルオロ置換ＲＮＡ基、少なくとも１つのペプチド核酸結合、少なくとも１つのホスホロチオエート結合、又は少なくとも１つのメチルホスホネート結合を含む主鎖を含む、項目９のオリゴマー混合物。
［項目１１］
キットに収容された、項目９のオリゴマー混合物。
［項目１２］
生物試料中に存在するヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）核酸を検出する方法であって、
ＨＰＶ１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９及び６８型のうち少なくとも１つのＲＮＡを含有する生物試料中の核酸を、Ｅ６／Ｅ７標識領域配列内のＨＰＶ配列を増幅する増幅オリゴマーの混合物と接触させる工程であって、前記混合物は、以下の：
配列番号１９若しくは４２、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３及び３５の第１増幅オリゴマー、並びに配列番号３７、３８、３９、４０及び４１の第２増幅オリゴマー、又は前記オリゴマー配列の相補的オリゴマー配列若しくはＲＮＡ均等物；
配列番号１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４及び３６の第１増幅オリゴマー、並びに配列番号３７、３８、３９、４０及び４１の第２増幅オリゴマー、又は前記オリゴマー配列の相補的オリゴマー配列若しくはＲＮＡ均等物；
配列番号１９若しくは４２、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３及び３５の第１増幅オリゴマー、並びに配列番号３８、３９、４０及び４１の第２増幅オリゴマー、又は前記オリゴマー配列の相補的オリゴマー配列若しくはＲＮＡ均等物；あるいは
配列番号１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４及び３６の第１増幅オリゴマー、並びに配列番号３８、３９、４０及び４１の第２増幅オリゴマー、又は前記オリゴマー配列の相補的オリゴマー配列若しくはＲＮＡ均等物；
から構成される；
少なくとも１つのＨＰＶ型中の標識領域配列に由来するＨＰＶ配列を、前記増幅オリゴマー及び核酸ポリメラーゼを用いてインビトロで増幅して、ＨＰＶ増幅生成物を生成させる工程；及び
ＨＰＶ増幅生成物と特異的にハイブリダイズするのに十分に相補的である検出プローブオリゴマーを用いて増幅生成物を検出して、試料中にＨＰＶ１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９及び６８型のうち少なくとも１つが存在することを示す工程；
を含む方法。
［項目１３］
さらに、増幅工程の前に、試料中のＨＰＶ ＲＮＡと捕捉オリゴマーを接触させることにより、ＨＰＶ型１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９及び６８のうち少なくとも１つのＲＮＡを試料中の他の成分から分離し、そして捕捉オリゴマー及びＨＰＶ  ＲＮＡを含む複合体を試料中の他の成分から分離する工程を含む、項目１２の方法。
［項目１４］
捕捉オリゴマーが、少なくとも２つのオリゴマーから構成される捕捉オリゴマー混合物中に存在し、混合物中の個々のオリゴマー配列は配列番号１〜１０よりなる群から選択され、前記群には前記特定配列の相補的オリゴマー配列又はＲＮＡ均等物が含まれる、請求項１３の方法。
［項目１５］
捕捉オリゴマーが以下の：
配列番号２、４、６、８及び１０から選択される少なくとも２つのオリゴマーであって、リガンド部分が各オリゴマーに結合したもの；
配列番号２、４、６、８及び１０のオリゴマーであって、リガンド部分が各オリゴマーに結合したもの；
配列番号１、３、５、７及び９から選択される少なくとも２つのオリゴマー；又は
配列番号１、３、５、７及び９のオリゴマー；
から構成される捕捉オリゴマー混合物中に存在する、項目１３の方法。
［項目１６］
増幅工程に、実質的に定温（ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ）である増幅方法を用いる、項目１２の方法。
［項目１７］
増幅工程に転写関連増幅法を用いる、項目１２の方法。
［項目１８］
検出工程にプローブオリゴマー混合物を使用し、混合物中の少なくとも１つのプローブオリゴマーがＨＰＶ増幅生成物に特異的に結合して、試料中に少なくとも１つのＨＰＶ型が存在することを示すシグナルを発生させる、項目１２の方法。
［項目１９］
検出工程に以下の：
配列番号１１〜１７、又は前記オリゴマー配列の相補的オリゴマー配列若しくはＲＮＡ均等物；
配列番号１１〜１５及び１７、又は前記オリゴマー配列の相補的オリゴマー配列若しくはＲＮＡ均等物；
配列番号１１〜１５及び１７、並びに少なくとも１つの配列番号４４〜配列番号５４及び配列番号５８、又は前記オリゴマー配列の相補的オリゴマー配列若しくはＲＮＡ均等物；あるいは
配列番号１１、１２、１４、１５、１７、４４、４５及び５２、又は前記オリゴマー配列の相補的オリゴマー配列若しくはＲＮＡ均等物；
から構成されるプローブオリゴマー混合物を用いる、項目１８の方法。
［項目２０］
接触工程がさらに、非ＨＰＶ−内部対照配列を試料に導入することを含み、
増幅工程がさらに、非ＨＰＶ−内部対照配列を増幅して、増幅した内部対照配列を生成させることを含み、かつ
検出工程がさらに、増幅した内部対照配列を検出して、本工程が適切に行われたことを示すシグナルを発生させることを含む、
項目１２の方法。
【図１】
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【配列表】
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