(57)【要約】【課題】哺乳動物における受胎率を向上させる受胎性促進剤を提供することを目的とする。【解決手段】レスベラトロール若しくはその誘導体又はそれらの塩を有効成分として含有する、哺乳動物における受胎性促進剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
レスベラトロール若しくはその誘導体又はそれらの塩を有効成分として含有する、哺乳動物における受胎性促進剤。
【請求項２】
哺乳動物がウシである、請求項１記載の受胎性促進剤。
【請求項３】
子宮内投与されるものである、請求項１又は２記載の受胎性促進剤。
【請求項４】
発情後16〜32時間の間に投与されるものである、請求項２又は３記載の受胎性促進剤。
【請求項５】
レスベラトロール若しくはその誘導体又はそれらの塩の投与量が、5μmolである、請求項２〜４のいずれか１項記載の受胎性促進剤。
【請求項６】
投与後5〜7日の間に胚移植が行われる、請求項２〜５のいずれか１項記載の受胎性促進剤。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項記載の受胎性促進剤を含む、哺乳動物における受胎性促進キット。
【請求項８】
レスベラトロール若しくはその誘導体又はそれらの塩を非ヒト哺乳動物に投与する工程を含む、非ヒト哺乳動物における受胎性の促進方法。
【請求項９】
非ヒト哺乳動物がウシである、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
投与が子宮内投与である、請求項８又は９記載の方法。
【請求項１１】
投与時期が発情後16〜32時間の間である、請求項９又は１０記載の方法。
【請求項１２】
レスベラトロール若しくはその誘導体又はそれらの塩の投与量が、5μmolである、請求項９〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
投与後5〜7日の間に胚移植を行う工程をさらに含む、請求項９〜１２のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば哺乳動物において受胎率を向上させる受胎性促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウシの人工授精による受胎率は、ここ20年で肉牛では67.5％から58.4％に、乳牛にいたっては62.2％から45.6％に低下している。低受胎による生産性の低下は畜産及び酪農業における経営を圧迫するだけでなく担い手不足にも拍車をかけており、低受胎解決は喫緊の課題となっている。
【０００３】
ところで、従来において、胚の着床率を増加させる方法が知られている。
【０００４】
特許文献１は、哺乳動物の子宮における胚の着床率を増加させるための方法において、ベータ-ガラクトシド結合レクチン又はその誘導体を哺乳動物の子宮に投与する方法を開示する。
【０００５】
特許文献２は、医療又は獣医分野での生殖補助における子宮内への着床不全の予防におけるN-アセチル-5-メトキシトリプタミン又はその類縁体の使用を開示する。
【０００６】
特許文献３は、胚移植を受けた対象において胚の着床率を増加させる方法において、結晶性(3Z,5S)-5-(ヒドロキシメチル)-1-[(2'-メチル-1,1'-ビフェニル-4-イル)カルボニル]ピロリジン-3-オンO-メチルオキシムを対象に投与する方法を開示する。
【０００７】
また、非特許文献１は、子宮受容性の調節におけるSirtuin 1(SIRT1)遺伝子の役割を調べる上で、子宮内膜細胞由来のIshikawa細胞及びRL95-2細胞を子宮内膜細胞のモデルとしてin vitroで検討したことを開示する。その結果、SIRT1遺伝子が当該細胞におけるE-カドヘリンの発現を上昇させたこと、レスベラトロールがSIRT1遺伝子の発現を上昇させたことが記載されている。さらに、Ishikawa細胞を子宮内膜細胞のモデルとして、且つJAR細胞から成るスフェロイドを胚盤胞のモデルとした実験において、Ishikawa細胞をレスベラトロール処理すると、Ishikawa細胞におけるE-カドヘリンの発現が高まり、その結果、Ishikawa細胞とJAR細胞から成るスフェロイドとの細胞間接着が強まることが示されている。
【０００８】
しかしながら、非特許文献１は、レスベラトロールの投与がウシ等の哺乳動物における受胎率を向上させたことを開示していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特表2014-500279号公報
【特許文献２】特表2015-525210号公報
【特許文献３】米国特許出願公開第2016/0002160号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Shirane A.ら, Biochemical and Biophysical Research Communications, 2012年, Vol. 424, Issue 3, pp. 604-610
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、上述の実情に鑑み、低受胎牛の子宮環境に着目して低受胎要因を解明し、その要因をターゲットとした子宮環境改善技術を開発し、受胎率を向上させることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、低受胎牛では子宮内膜においてマイトファジーが低下することでミトコンドリアの機能が低下しており、レスベラトロールの投与により、子宮内膜においてマイトファジーが亢進することでミトコンドリアの機能が改善し、受胎率が向上することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち、本発明は、以下を包含する。
（１）レスベラトロール若しくはその誘導体又はそれらの塩を有効成分として含有する、哺乳動物における受胎性促進剤。
（２）哺乳動物がウシである、（１）記載の受胎性促進剤。
（３）子宮内投与されるものである、（１）又は（２）記載の受胎性促進剤。
（４）発情後16〜32時間の間に投与されるものである、（２）又は（３）記載の受胎性促進剤。
（５）レスベラトロール若しくはその誘導体又はそれらの塩の投与量が、5μmolである、（２）〜（４）のいずれか１記載の受胎性促進剤。
（６）投与後5〜7日の間に胚移植が行われる、（２）〜（５）のいずれか１記載の受胎性促進剤。
（７）（１）〜（６）のいずれか１記載の受胎性促進剤を含む、哺乳動物における受胎性促進キット。
（８）レスベラトロール若しくはその誘導体又はそれらの塩を非ヒト哺乳動物に投与する工程を含む、非ヒト哺乳動物における受胎性の促進方法。
（９）非ヒト哺乳動物がウシである、（８）記載の方法。
（１０）投与が子宮内投与である、（８）又は（９）記載の方法。
（１１）投与時期が発情後16〜32時間の間である、（９）又は（１０）記載の方法。
（１２）レスベラトロール若しくはその誘導体又はそれらの塩の投与量が、5μmolである、（９）〜（１１）のいずれか１記載の方法。
（１３）投与後5〜7日の間に胚移植を行う工程をさらに含む、（９）〜（１２）のいずれか１記載の方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、ウシ等の哺乳動物において受胎率を向上させることができる。特に、ウシの胚移植に本発明を適用することで、簡便にウシの受胎率を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】正常受胎牛と低受胎牛の子宮内膜における遺伝子発現の違い(DNAマイクロアレイ解析結果)を示す図である。
【図２】正常受胎牛と低受胎牛の子宮内膜における（A)組織重量当たりのATP量と(B)ミトコンドリア数(ミトコンドリアDNAコピー数)の比較(リアルタイムPCR解析結果)を示すグラフである。
【図３】正常受胎牛と低受胎牛の子宮内膜における(A)-(B)Sirtuin遺伝子(脱アセチル化酵素、ミトコンドリア機能調節に関与)と(C)CSNK2∂1及び(D)BCL2L13(マイトファジー制御に関与する遺伝子)の発現比較(リアルタイムPCR解析結果)を示すグラフである。
【図４】正常受胎牛と低受胎牛とレスベラトロールを投与した低受胎牛の子宮における(A)-(B)Sirtuin遺伝子と（C)CSNK2∂1及び(D)BCL2L13の発現比較（リアルタイムPCR解析結果)を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１７】
本発明に係る哺乳動物における受胎性促進剤(以下、「本発明に係る受胎性促進剤」という)は、レスベラトロール若しくはその誘導体又はそれらの塩を有効成分として含有するものである。本発明に係る受胎性促進剤の投与によれば、ウシ等の哺乳動物の子宮内膜においてマイトファジーが亢進することでミトコンドリアの機能が改善し、受胎率を向上させることができる。また、本発明に係る受胎性促進剤の投与によれば、ウシ等の哺乳動物の子宮における胚移植において、当該胚の着床率を増加させることができる。従って、本発明に係る受胎性促進剤は、哺乳動物における胚の着床促進剤ということもできる。
【００１８】
本発明において、哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、例えばウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ等の非ヒト哺乳動物やヒトが挙げられ、ウシが好ましい。また、低受胎症状を有する哺乳動物を、本発明に係る受胎性促進剤を投与する対象哺乳動物とすることができる。
【００１９】
本発明に係る受胎性促進剤における有効成分は、レスベラトロール(系統名：3,5,4'-トリヒドロキシ-trans-スチルベン)若しくはその誘導体又はそれらの塩である。レスベラトロールの誘導体としては、例えばピセアタノール、プテロスチルベン等が挙げられる。また、レスベラトロール又はその誘導体の薬学的に許容される塩としては、例えば、塩酸、硫酸、リン酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、ピロ硫酸、メタリン酸等の無機酸との塩、クエン酸、安息香酸、酢酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、スルホン酸(例えば、メタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸)等の有機酸との塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩が挙げられる。これら化合物は、市販のものを使用することができ、例えばレスベラトロールとしては、レスベラトロールプラス、ナチュラルレスベラトロール等の市販のものを使用することができる。あるいは、レスベラトロール等のこれら化合物は、例えばM.B.Andrus et al. Tetrahedron Lett. 2003, 44, 4819-4822やM. Guiso et al. Tetrahedron Lett. 2002, 43, 597-598等に記載の方法に準じて化学合成することもできる。
【００２０】
本発明に係る受胎性促進剤は、その剤形に応じてそれ自体公知の種々の方法で投与することが可能であり、その投与量、投与経路、投与時期等は、対象哺乳動物の年齢や体重、病状あるいは他の薬剤や治療法と併用した場合等を考慮して適宜決定することができる。
【００２１】
本発明に係る受胎性促進剤の投与経路としては、特に制限されないが、子宮内投与が好ましい。
【００２２】
また、本発明に係る受胎性促進剤の投与時期としては、ウシ等の非ヒト哺乳動物の場合、例えば発情後16〜32時間の間、好ましくは発情後24時間前後である。
【００２３】
本発明に係る受胎性促進剤の投与量は、その剤形、投与方法又は症状により異なるが、例えば、有効成分(レスベラトロール若しくはその誘導体又はそれらの塩)換算で5μmolとすることができる。本発明に係る受胎性促進剤の投与回数は、例えば左右の子宮角に対してそれぞれ1回である。
【００２４】
本発明に係る受胎性促進剤の剤形としては、例えば、注射剤、点滴、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、坐剤等が挙げられるが、特に制限されない。また、本発明に係る受胎性促進剤は、例えば製剤担体、賦形剤、安定剤等の成分を含有することもできる。さらに、本発明に係る受胎性促進剤は、他の受胎性促進剤(例えば、メラトニン(又はN-アセチル-5-メトキシトリプタミン；特許文献２)等)と併用しても、又は他の受胎性促進剤の有効成分を含有してもよい。
【００２５】
本発明に係る受胎性促進剤は、自然妊娠、人工授精、胚移植等による受胎を促進することができる。胚移植の場合には、例えばウシ等の非ヒト哺乳動物に対して本発明に係る受胎性促進剤を投与した後5〜7日の間に、好ましくは6日目に胚移植を行うことで、子宮内に胚を着床させる。
【００２６】
また、本発明は、本発明に係る受胎性促進剤を含む、哺乳動物における受胎性促進(又は胚の着床促進)キットに関する。当該キットは、本発明に係る受胎性促進剤に加えて、例えば当該キットの取り扱い説明書、子宮内注入カテーテル等の本発明に係る受胎性促進剤の投与手段等を含むことができる。
【００２７】
さらに、本発明は、レスベラトロール若しくはその誘導体又はそれらの塩を哺乳動物(非ヒト哺乳動物又はヒト)に投与する工程を含む、哺乳動物における受胎性の促進方法(又は胚の着床率の増加方法)に関する。レスベラトロール若しくはその誘導体又はそれらの塩の投与様式(投与経路、投与時期等)、投与量、剤形等は、上述の本発明に係る受胎性促進剤に準じて決定することができる。
【実施例】
【００２８】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２９】
〔参考例１〕正常受胎牛と低受胎牛の子宮内膜における遺伝子発現の違い
１．材料及び方法
正常受胎牛(n=6)及び低受胎牛(n=5)における黄体側子宮内膜を、発情後7日目(胚移植時)にバイオプシーによって採取し、DNAマイクロアレイ解析(1色法)によって正常受胎牛と低受胎牛との間で発現の異なる遺伝子を明らかにした。
【００３０】
なお、以下の参考例では、正常受胎牛及び低受胎牛を以下のように定義した：
・正常受胎牛：バイオプシーをする前まで3回以内の胚移植又は人工授精によって受胎していた牛；
・低受胎牛：バイオプシーをする前に生殖器、発情周期、臨床徴候に異常を認めないが、3回以上胚移植又は人工授精を行っても受胎しない牛。
【００３１】
２．結果
結果を表１及び図１に示す。
【００３２】
【表１】
2018070456.tif 000002
【００３３】
正常受胎牛と低受胎牛では遺伝子の発現パターンが異なることが示された。
正常受胎牛と比較して低受胎牛で発現が高い遺伝子が713遺伝子、低い遺伝子が97遺伝子であった。
低受胎牛で発現が高い上位10遺伝子には、ミトコンドリアリボソームRNAが多く含まれていた。
【００３４】
３．考察
低受胎牛のミトコンドリア機能に何か問題があると考えられた。
【００３５】
〔参考例２〕正常受胎牛と低受胎牛の子宮内膜におけるミトコンドリア数(ミトコンドリアDNAコピー数)と組織重量当たりのATP量の比較
１．材料及び方法
正常受胎牛(n=14)及び低受胎牛(n=15)における黄体側子宮内膜を、発情後7日目(胚移植時)にバイオプシーによって採取した。次いで、ATPアッセイキット(TOYO B-Net)を用いて、組織1mg当たりのATP量を測定した。また、採取したバイオプシーからDNAを抽出し、リアルタイムPCR法により、SOX遺伝子数を基準にしてミトコンドリアDNAコピー数を定量した。
【００３６】
２．結果
結果を図２に示す。
組織重量当たりのATP量は低受胎牛で低い傾向であった。
ミトコンドリアDNAコピー数は、正常受胎牛と比較して低受胎牛で有意に多かった。
【００３７】
３．考察
低受胎牛ではミトコンドリアの機能が低下している可能性が考えられた。
【００３８】
〔参考例３〕正常受胎牛と低受胎牛の子宮内膜におけるSirtuin遺伝子(脱アセチル化酵素、ミトコンドリア機能調節に関与)とCSNK2∂1及びBCL2L13(マイトファジー制御に関与する遺伝子)の発現比較
１．材料及び方法
正常受胎牛(n=10)及び低受胎牛(n=10)における黄体側子宮内膜を、発情後7日目(胚移植時)にバイオプシーによって採取した。採取したバイオプシーからRNAを抽出し、リアルタイムPCR法により、GAPDH遺伝子発現量を基準にしてSIRT1、SIRT6、CSNK2∂1、BCL2L13遺伝子の発現量を定量した。
【００３９】
２．結果
結果を図３に示す。
脱アセチル化酵素でミトコンドリアの機能調節に関与するSirtuin遺伝子(SIRT1、SIRT6)の発現量は低受胎牛で低かった。
マイトファジー(＝ミトコンドリアにおけるオートファジー)制御に関与する遺伝子(CSNK2∂1、BCL2L13)の発現量は低受胎牛で低かった。
【００４０】
３．考察
低受胎牛ではマイトファジーが低下し、ミトコンドリアの機能が低下している可能性が考えられた。
【００４１】
〔参考例４〕正常受胎牛と低受胎牛とレスベラトロールを投与した低受胎牛の子宮におけるSirtuin遺伝子とCSNK2∂1及びBCL2L13の発現比較
１．材料及び方法
正常受胎牛(n=10)及び低受胎牛(n=6)における黄体側子宮内膜を、発情後7日目(胚移植時)にバイオプシーによって採取した。
【００４２】
さらに、低受胎牛(n=6)において、バイオプシー実施後に1発情周期以上期間を空け、発情日の翌日にレスベラトロール(100μM；SIGMA社製)を、動物用子宮内注入カテーテル(モ4号又はモ5号)を用いて左右の子宮角に各々25ml投与し、発情後7日目に黄体側子宮内膜をバイオプシーによって採取した。
【００４３】
採取したバイオプシーからRNAを抽出し、リアルタイムPCR法により、GAPDH遺伝子発現量を基準にしてSIRT1、SIRT6、CSNK2∂1、BCL2L13遺伝子の発現量を定量した。
【００４４】
２．結果
結果を図４に示す。
脱アセチル化酵素でミトコンドリアの機能調節に関与するSirtuin遺伝子(SIRT1、SIRT6)の発現量は低受胎牛で低く、レスベラトロールの投与により増加した。
マイトファジー(＝ミトコンドリアにおけるオートファジー)制御に関与する遺伝子(CSNK2∂1、BCL2L13)の発現量は低受胎牛で低く、レスベラトロールの投与により増加した。
【００４５】
３．考察
低受胎牛ではレスベラトロールの子宮内投与によりマイトファジーが亢進し、ミトコンドリアの機能が改善した可能性が考えられた。
【００４６】
〔実施例１〕レスベラトロールを繁殖牛の子宮内に投与した場合の受胎成績
１．材料及び方法
一般管理された繁殖牛(n=26)を用い、発情日の翌日にレスベラトロール(100μM；SIGMA社製)又は対照溶液(0.001％EtOHを含む生理食塩水)を、動物用子宮内注入カテーテル(モ4号又はモ5号)を用いて左右の子宮角に各々25ml投与し、発情後7日目に胚移植を行った。
発情後30日以降に超音波画像診断により妊娠鑑定を行った。
【００４７】
２．結果
結果を表２に示す。
【００４８】
【表２】
2018070456.tif 000003
【００４９】
レスベラトロールの子宮内投与により受胎率が有意に上昇した。
【００５０】
３．考察
レスベラトロールの子宮内投与によりマイトファジーが亢進し、ミトコンドリアの機能が改善し、受胎率が上昇した可能性が考えられた。
【図１】
2018070456.tif 000004
【図２】
2018070456.tif 000005
【図３】
2018070456.tif 000006
【図４】
2018070456.tif 000007