(57)【要約】【課題】マーカーリサイクル法の提供。【解決手段】  目的遺伝子１、第一の組換え酵素認識配列１、プロモーター１、開始コドン配列、第二の組換え酵素認識配列、第一の選択マーカー遺伝子及びターミネーター１をこの順で含む第一エレメントと、第二の組換え酵素認識配列、第一の組換え酵素遺伝子、ターミネーター２及び第一の組換え酵素認識配列２をこの順で含む第二エレメントとを含むベクターであって、宿主のゲノムに導入されたときに前記第一エレメントは発現可能に機能するが前記第二エレメントは発現可能に機能しないように前記第一及び第二エレメントが連結されたベクター、並びに目的遺伝子２、第一の組換え酵素認識配列１、プロモーター２、第二の組換え酵素遺伝子、ターミネーター３、プロモーター３、第二の選択マーカー遺伝子、ターミネーター４及び第一の組換え酵素認識配列２をこの順で含むベクターを用いる、マーカーリサイクル法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的遺伝子１、第一の組換え酵素認識配列１、プロモーター１、開始コドン配列、第二の組換え酵素認識配列、第一の選択マーカー遺伝子及びターミネーター１をこの順で含む第一エレメントと、第二の組換え酵素認識配列、第一の組換え酵素遺伝子、ターミネーター２及び第一の組換え酵素認識配列２をこの順で含む第二エレメントとを含むベクターであって、宿主のゲノムに導入されたときに前記第一エレメントは発現可能に機能するが前記第二エレメントは発現可能に機能しないように前記第一及び第二エレメントが連結されたベクター。
【請求項２】
第一の組換え酵素認識配列１がloxP又はその変異配列である請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
第二の組換え酵素認識配列がFRT配列である請求項１又は２に記載のベクター。
【請求項４】
第一の組換え酵素がCreである請求項１〜３のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項５】
第二の組換え酵素がFLPである請求項１〜４のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項６】
第一の選択マーカー遺伝子がHygR遺伝子である請求項１〜５のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項７】
目的遺伝子２、第一の組換え酵素認識配列１、プロモーター２、第二の組換え酵素遺伝子、ターミネーター３、プロモーター３、第二の選択マーカー遺伝子、ターミネーター４及び第一の組換え酵素認識配列２をこの順で含むベクター。
【請求項８】
第一の組換え酵素認識配列１がloxP又はその変異配列である請求項７に記載のベクター。
【請求項９】
第二の組換え酵素がFLPである請求項７又は８に記載のベクター。
【請求項１０】
第一の組換え酵素がCreである請求項７〜９のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１１】
第二の選択マーカー遺伝子が、NeoR遺伝子又はBlaR遺伝子である請求項７〜１０のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１２】
第二の選択マーカー遺伝子にさらにレポーター遺伝子が連結された、請求項７〜１１のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１３】
レポーター遺伝子がグルクロニダーゼをコードする遺伝子である請求項１２に記載のベクター。
【請求項１４】
宿主における遺伝子操作方法であって、以下の工程：
（ａ）請求項１〜６のいずれか１項に記載のベクター（第一コンストラクト）を宿主のゲノムに導入して宿主の形質転換株を得る工程、
（ｂ）前記形質転換株から、目的遺伝子１及び第一の選択マーカー遺伝子を発現する株を選別する工程、
（ｃ）工程（ｂ）により選別された株に、請求項７〜１３のいずれか１項に記載のベクター（第二コンストラクト）を導入し、第二の選択マーカーにより目的遺伝子２及び第二の組換え酵素遺伝子を発現する株を選別する工程、並びに
（ｄ）工程（ｃ）により選別された株の第二コンストラクトから発現された第二の組換え酵素により、前記第一コンストラクト中の第一エレメントから、第二の組換え酵素認識配列、第一の選択マーカー遺伝子及びターミネーター１を脱落させるとともに、当該脱落により前記第二エレメント中の第一の組換え酵素遺伝子を発現させて、第一コンストラクト及び第二コンストラクト中の第一の組換え酵素認識配列遺伝子１及び２で挟まれた領域の遺伝子を脱落させる工程
を含む、前記方法。
【請求項１５】
宿主において、選択マーカー遺伝子を繰り返し利用する方法であって、以下の工程：
（ａ）請求項１〜６のいずれか１項に記載のベクター（第一コンストラクト）を宿主のゲノムに導入して宿主の形質転換株を得る工程、
（ｂ）前記形質転換株から、目的遺伝子１及び第一の選択マーカー遺伝子を発現する株を選別する工程、
（ｃ）工程（ｂ）により選別された株に、請求項７〜１３のいずれか１項に記載のベクター（第二コンストラクト）を導入し、第二の選択マーカーにより目的遺伝子２及び第二の組換え酵素遺伝子を発現する株を選別する工程、
（ｄ）工程（ｃ）により選別された株の第二コンストラクトから発現された第二の組換え酵素により、前記第一コンストラクト中の第一エレメントから、第二の組換え酵素認識配列、第一の選択マーカー遺伝子及びターミネーター１を脱落させるとともに、当該脱落により前記第二エレメント中の第一の組換え酵素遺伝子を発現させて、第一コンストラクト及び第二コンストラクト中の第一の組換え酵素認識配列遺伝子１及び２で挟まれた領域の遺伝子を脱落させる工程、並びに
（ｅ）前記工程（ａ）〜（ｄ）を繰り返す工程
を含む、前記方法。
【請求項１６】
前記第一の組換え酵素認識配列遺伝子１及び２で挟まれた領域の遺伝子が脱落した株を、レポーター遺伝子の発現を指標として選別する、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
宿主がラビリンチュラ類に属する宿主である請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の方法により目的遺伝子が導入された形質転換体。
【請求項１９】
請求項１８に記載の形質転換体を培養し、得られる培養物から目的遺伝子の発現産物を採取することを特徴とする、当該発現産物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、選択マーカーを再利用可能にするマーカーリサイクル法、すなわち多重遺伝子発現法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ラビリンチュラ類はストラメノパイルに属する真核単細胞微生物であり、高い脂質生産及び蓄積能力並びに優れた増殖能を持ち、機能性脂質として知られるDHA (22:6n-3)などの高度不飽和脂肪酸、バイオ燃料源となる飽和脂肪酸、食品・化粧品素材として知られるセラミドや植物ステロールなどを生産する能力を有することで知られる（非特許文献1,2)(1,2)。本発明者は、これまでにラビリンチュラ類のC20エロンガーゼ遺伝子を破壊することでEPA(20:5n-3)を、D4デサチュラーゼ遺伝子を破壊することでDPA(22:5n-3)を生産する方法を開発した。
【０００３】
これらの株は機能性脂質や飼料などの新規供給源として期待されるが、ラビリンチュラ類を用いて有用脂質を産業レベルで生産する為には、遺伝子組換え技術によりラビリンチュラ類を分子育種することが有効となる。任意の遺伝子を過剰発現または欠損させた形質転換体を獲得する為には、それらを選別する際に抗生物質耐性遺伝子（選択マーカー）を利用する必要があるが、ラビリンチュラ類に適用できる選択マーカーには限りがある(非特許文献3)(3)。
【０００４】
現状ではハイグロマイシン、ネオマイシンおよびブラストサイジン耐性遺伝子、計３つの選択マーカーを使用することが出来るが、この数を超える回数の遺伝子組換えを行うことは極めて困難である。ラビリンチュラ類のなかには2倍体のものも存在している為、このような場合は1つの遺伝子を欠損させるために2つの選択マーカーが必要となる。通常、任意の脂質を高レベルで生産・蓄積するような生産株を樹立するためには、複数回の遺伝子改変を重ねていく必要があるが(非特許文献4)(4)、形質転換回数の制約はラビリンチュラ類を産業応用する上で大きな障壁となる。また、抗生物質耐性遺伝子はラビリンチュラ類とは異なる生物に由来する外来性のものを異種発現している為、組換え株を樹立した後も選択マーカーが残存することは、ラビリンチュラ類の生育や製品の安全・安心面という点で望ましくない。これらの問題を解決するには、遺伝子改変時にゲノムに組み込まれた選択マーカーを脱落させ、同一の選択マーカーを再利用することが可能になるような技術、即ち選択マーカーリサイクル法の開発が必要不可欠である。
【０００５】
選択マーカーの脱落、再利用には、一般的にバクテリオファージP1に由来するCre-loxPシステムが広く利用されている(非特許文献5)(5)。Cre-loxPシステムとは、loxP配列と呼称されるDNA配列に対しDNA組換え酵素Creが働くことにより生じる部位特異的組換え反応を利用した遺伝子工学的手法である(非特許文献6)(6)。loxP配列で選択マーカーを挟んでおくと、Creによって部位特異的反応が起こる結果、選択マーカーを含むDNA配列を脱落させることが可能となる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Lee Chang, K. J., et al. (2014) Comparison of Thraustochytrids Aurantiochytrium sp., Schizochytrium sp., Thraustochytrium sp., and Ulkenia sp. for production of biodiesel, long-chain omega-3 oils, and exopolysaccharide. Mar Biotechnol (NY) 16, 396-411
【非特許文献２】Chen, J., et al. (2014) Algal sterols are as effective as beta-sitosterol in reducing plasma cholesterol concentration. J. Agric. Food Chem. 62, 675-681
【非特許文献３】Sakaguchi, K., et al. (2012) Versatile transformation system that is applicable to both multiple transgene expression and gene targeting for Thraustochytrids. Appl. Environ. Microbiol. 78, 3193-3202
【非特許文献４】Xue, Z., et al. (2013) Production of omega-3 eicosapentaenoic acid by metabolic engineering of Yarrowia lipolytica. Nat. Biotechnol. 31, 734-740
【非特許文献５】Taniguchi, M., et al. (1998) Efficient production of Cre-mediated site-directed recombinants through the utilization of the puromycin resistance gene, pac: a transient gene-integration marker for ES cells. Nucleic Acids Res. 26, 679-680
【非特許文献６】Van Duyne, G. D. (2001) A structural view of cre-loxp site-specific recombination. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 30, 87-104
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、任意の物質を高レベルで生産、蓄積するような生産株を樹立するため、複数回の遺伝子改変を行うマーカーリサイクル法を提供することを目的とする。
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、ラビリンチュラ類でCre-loxPシステムが機能することを実証し、選択マーカーを脱落させる時のみにCreを一過的に発現させる方法を考案して、ラビリンチュラ類における選択マーカーリサイクル法を利用し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）目的遺伝子１、第一の組換え酵素認識配列１、プロモーター１、開始コドン配列、第二の組換え酵素認識配列、第一の選択マーカー遺伝子及びターミネーター１をこの順で含む第一エレメントと、第二の組換え酵素認識配列、第一の組換え酵素遺伝子、ターミネーター２及び第一の組換え酵素認識配列２をこの順で含む第二エレメントとを含むベクターであって、宿主のゲノムに導入されたときに前記第一エレメントは発現可能に機能するが前記第二エレメントは発現可能に機能しないように前記第一及び第二エレメントが連結されたベクター。
（２）第一の組換え酵素認識配列１がloxP又はその変異配列である（１）に記載のベクター。
（３）第二の組換え酵素認識配列がFRT配列である（１）又は（２）に記載のベクター。
（４）第一の組換え酵素がCreである（１）〜（３）のいずれか１項に記載のベクター。
（５）第二の組換え酵素がFLPである（１）〜（４）のいずれか１項に記載のベクター。
（６）第一の選択マーカー遺伝子がHygR遺伝子である（１）〜（５）のいずれか１項に記載のベクター。
（７）目的遺伝子２、第一の組換え酵素認識配列１、プロモーター２、第二の組換え酵素遺伝子、ターミネーター３、プロモーター３、第二の選択マーカー遺伝子、ターミネーター４及び第一の組換え酵素認識配列２をこの順で含むベクター。
（８）第一の組換え酵素認識配列１がloxP又はその変異配列である（７）に記載のベクター。
（９）第二の組換え酵素がFLPである（７）又は（８）に記載のベクター。
（１０）第一の組換え酵素がCreである（７）〜（９）のいずれか１項に記載のベクター。
（１１）第二の選択マーカー遺伝子が、NeoR遺伝子又はBlaR遺伝子である（７）〜（１０）のいずれか１項に記載のベクター。
（１２）第二の選択マーカー遺伝子にさらにレポーター遺伝子が連結された、（７）〜（１１）のいずれか１項に記載のベクター。
（１３）レポーター遺伝子がグルクロニダーゼをコードする遺伝子である（１２）に記載のベクター。
（１４）宿主における遺伝子操作方法であって、以下の工程：
（ａ）（１）〜（６）のいずれか１項に記載のベクター（第一コンストラクト）を宿主のゲノムに導入して宿主の形質転換株を得る工程、
（ｂ）前記形質転換株から、目的遺伝子１及び第一の選択マーカー遺伝子を発現する株を選別する工程、
（ｃ）工程（ｂ）により選別された株に、（７）〜（１３）のいずれか１項に記載のベクター（第二コンストラクト）を導入し、第二の選択マーカーにより目的遺伝子２及び第二の組換え酵素遺伝子を発現する株を選別する工程、並びに
（ｄ）工程（ｃ）により選別された株の第二コンストラクトから発現された第二の組換え酵素により、前記第一コンストラクト中の第一エレメントから、第二の組換え酵素認識配列、第一の選択マーカー遺伝子及びターミネーター１を脱落させるとともに、当該脱落により前記第二エレメント中の第一の組換え酵素遺伝子を発現させて、第一コンストラクト及び第二コンストラクト中の第一の組換え酵素認識配列遺伝子１及び２で挟まれた領域の遺伝子を脱落させる工程
を含む、前記方法。
（１５）宿主において、選択マーカー遺伝子を繰り返し利用する方法であって、以下の工程：
（ａ）（１）〜（６）のいずれか１項に記載のベクター（第一コンストラクト）を宿主のゲノムに導入して宿主の形質転換株を得る工程、
（ｂ）前記形質転換株から、目的遺伝子１及び第一の選択マーカー遺伝子を発現する株を選別する工程、
（ｃ）工程（ｂ）により選別された株に、（７）〜（１３）のいずれか１項に記載のベクター（第二コンストラクト）を導入し、第二の選択マーカーにより目的遺伝子２及び第二の組換え酵素遺伝子を発現する株を選別する工程、
（ｄ）工程（ｃ）により選別された株の第二コンストラクトから発現された第二の組換え酵素により、前記第一コンストラクト中の第一エレメントから、第二の組換え酵素認識配列、第一の選択マーカー遺伝子及びターミネーター１を脱落させるとともに、当該脱落により前記第二エレメント中の第一の組換え酵素遺伝子を発現させて、第一コンストラクト及び第二コンストラクト中の第一の組換え酵素認識配列遺伝子１及び２で挟まれた領域の遺伝子を脱落させる工程、並びに
（ｅ）前記工程（ａ）〜（ｄ）を繰り返す工程
を含む、前記方法。
（１６）前記第一の組換え酵素認識配列遺伝子１及び２で挟まれた領域の遺伝子が脱落した株を、レポーター遺伝子の発現を指標として選別する、（１４）又は（１５）に記載の方法。
（１７）宿主がラビリンチュラ類に属する宿主である（１４）〜（１６）のいずれか１項に記載の方法。
（１８）（１４）〜（１７）のいずれか１項に記載の方法により目的遺伝子が導入された形質転換体。
（１９）（１８）に記載の形質転換体を培養し、得られる培養物から目的遺伝子の発現産物を採取することを特徴とする、当該発現産物の製造方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、ラビリンチュラ類におけるマーカーリサイクル法が提供される。本発明はラビリンチュラ類における初めての実践的な選択マーカーの除去及びリサイクル方法であり、ラビリンチュラ類を本格的に産業利用する上で必要不可欠な技術となる点で有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の方法の概略を示す図である。
【図２】本発明で用いたプラスミドベクターを示す図である。
【図３】ゲノムPCRによるFLP-FRT組換え反応の確認実験を行った結果を示す図である。
【図４】ハイグロマイシン感受性試験を行った結果を示す図である。
【図５】G418感受性試験を行った結果を示す図である。
【図６】ゲノムPCRによるCre-loxP組換え反応の確認実験を行った結果を示す図である。
【図７】選択マーカーを再利用した形質転換を行った結果を示す図である。
【図８】本発明で用いたプラスミドベクターを示す図である。
【図９】FLP発現によるHygR遺伝子の脱落、及びGUS-NeoRの発現を示す図である。
【図１０】GUSによるNeoR脱落株の選別法を示す図である。
【図１１】カラーセレクションによりGUS-NeoR脱落株の選別を行った結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、目的遺伝子１、第一の組換え酵素認識配列１、プロモーター１、開始コドン配列、第二の組換え酵素認識配列、第一の選択マーカー遺伝子及びターミネーター１をこの順で含む第一エレメントと、第二の組換え酵素認識配列、第一の組換え酵素遺伝子、ターミネーター２及び第一の組換え酵素認識配列２をこの順で含む第二エレメントとを含むベクターであって、宿主のゲノムに導入されたときに前記第一エレメントは発現可能に機能するが、前記第二エレメントは発現可能に機能しないように前記第一及び第二エレメントが連結されたベクターに関する。このベクターを「第一コンストラクト」という。
また本発明は、目的遺伝子２、第一の組換え酵素認識配列１、プロモーター２、第二の組換え酵素遺伝子、ターミネーター３、プロモーター３、第二の選択マーカー遺伝子、ターミネーター４及び第一の組換え酵素認識配列２をこの順で含むベクターに関する。このベクターを「第二コンストラクト」という。
【００１３】
さらに本発明は、上記ベクターを用いて、ラビリンチュラ類に等の宿主における遺伝子を操作する方法に関する。本発明の方法では、以下の工程を含む。
（ａ）前記第一コンストラクトを宿主のゲノムに導入して宿主の形質転換株を得る工程、
（ｂ）前記形質転換株から、目的遺伝子１及び第一の選択マーカー遺伝子を発現する株を選別する工程、
（ｃ）工程（ｂ）により選別された株に、前記第二コンストラクトを導入し、第二の選択マーカーにより目的遺伝子２及び第二の組換え酵素遺伝子を発現する株を選別する工程、並びに
（ｄ）工程（ｃ）により選別された株の第二コンストラクトから発現された第二の組換え酵素により、前記第一コンストラクト中の第一エレメントから、第二の組換え酵素認識配列、第一の選択マーカー遺伝子及びターミネーター１を脱落させるとともに、当該脱落により前記第二エレメント中の第一の組換え酵素遺伝子を発現させて、第一コンストラクト及び第二コンストラクト中の第一の組換え酵素認識配列遺伝子１及び２で挟まれた領域の遺伝子を脱落させる工程。
さらに本発明は、マーカー遺伝子のリサイクル法を提供し、この方法では、上記工程（ａ）〜（ｄ）を繰り返す工程を含む。
【００１４】
本発明者は、ラビリンチュラ類でCre-loxPシステムが機能することを実証し、選択マーカーを脱落させる時のみにCreを一過的に発現させる方法を考案して、ラビリンチュラ類における選択マーカーリサイクル法を完成させた。
一般的には、loxPで挟まれた選択マーカーを脱落させる際、プラスミドを用いてCreを発現させた後、複数回継代培養することでプラスミドを脱落させる方法、または誘導型プロモーターを用いて任意の時期にCreを発現させる方法などによってCreを一過的に発現させている(7-9)。一方、本発明の対象生物であるラビリンチュラ類においては、プラスミドの発現系ならびに誘導型プロモーターは知られておらず、現状では利用することは出来ない。
【００１５】
目的遺伝子の過剰発現または欠損株を取得する場合、形質転換体を選別する際の目印として抗生物質耐性遺伝子が利用される。このような遺伝子は選択マーカーと呼ばれる。本発明の対象生物は特に限定されるものではなく、円石藻などの微細藻類が挙げられるが、ヤブレツボカビ科に属する11属のラビリンチュラ類であることが好ましい。属によって利用できる抗生物質耐性遺伝子の数と種類は異なるが、共通して利用できるのはハイグロマイシン耐性遺伝子（HygR）、ネオマイシン耐性遺伝子（NeoR）、ブラストサイジン耐性遺伝子（BlaR）である。
【００１６】
本発明において用いられるラビリンチュラ類を以下に例示する。
オーランチオキトリウム(Aurantiochytrium）属：Aurantiochytrium limacinum、Aurantiochytrium mangrovei
シゾキトリウム(Shizochytrium)属：Shizochytrium aggregatum
スラウストキトリウム(Thraustochytrium)属：Thraustochytrium aureum
パリエティキトリウム(Parietichytrium)属：Parietichytrium sarkarianum
アルトルニア(Althornia)属：Althornia crouchii
アプラノキトリウム（Aplanochytrium）属：Aplanochytrium kerguelensis 
ジャポノキトリウム（Japonochytrium）属：Japonochytrium marinum
オブロンギキトリウム（Oblongichytrium）属：Oblongichytrium minutum
ウルケニア（Ulkenia）属：Ulkenia visurgensis
ボトリオキトリウム（Botryochytrium）属：Botryochytrium radiatum
シシオイドキトリウム（Sicyoidochytrium）属：Sichyoidochytrium minutum
ラビリンチュラ（Labyrinthula）属:Labyrinthuloides minuta
【００１７】
前記の通り、1度の形質転換につき、選択マーカーを１つ使用するため、現状では最大でも3回までしか遺伝子改変を行うことが出来ない。ラビリンチュラ類のなかには2倍体のものも存在しており、このような場合は1つの遺伝子を欠損させるために2つの選択マーカーが必要となり、形質転換できる機会はあと残り1回だけとなる。ラビリンチュラ類を用いて、任意の脂質を高レベルで生産・蓄積させるためには、複数回に渡る遺伝子操作による代謝経路の改変が必要である。その為には、一度利用した選択マーカーを何度でも再利用できる、マーカーリサイクル法の開発が必要不可欠である。
本発明では、２つの部位特異的組換え反応を利用することで、ラビリンチュラ類におけるマーカーリサイクル法を可能にしている。
以降、選択マーカーの脱落法を含むラビリンチュラ類のマーカーリサイクル法について述べる。
【００１８】
本発明の方法に使用されるベクターを以下に示す。
まず一つ目のベクター（第一コンストラクト）において、第一のエレメントは、目的遺伝子１、第一の組換え酵素認識配列１、プロモーター１、開始コドン配列（ATG配列）、第二の組換え酵素認識配列、第一の選択マーカー遺伝子及びターミネーター１をこの順で含むものであり、第二のエレメントは、第二の組換え酵素認識配列、第一の組換え酵素遺伝子（例えば開始コドン以降の配列）、ターミネーター２及び第一の組換え酵素認識配列２をこの順で含む。
二つ目のベクター（第二コンストラクト）は、目的遺伝子２、第一の組換え酵素認識配列１、プロモーター２、第二の組換え酵素遺伝子、ターミネーター３、プロモーター３、第二の選択マーカー遺伝子、ターミネーター４及び第一の組換え酵素認識配列２をこの順で含む。
【００１９】
目的遺伝子１及び目的遺伝子２は、ラビリンチュラ類等の宿主のゲノムに組み込んで発現産物として取得する対象の物質をコードする遺伝子、遺伝子の発現カスケードにより最終産物に至るための途中のカスケードを構成する遺伝子、ゲノム編集に用いる配列特異的DNA切断酵素遺伝子あるいは任意の遺伝子の発現量を向上させる転写関連遺伝子である。遺伝子の種類に特に限定されるものではなく、例えば高度不飽和脂肪酸（PUFA）の合成及び蓄積に関与する遺伝子であり、以下の酵素をコードする遺伝子を例示することができる。
C16エロンガーゼ
Δ９デサチュラーゼ
C18エロンガーゼ
Δ１２デサチュラーゼ
Δ６デサチュラーゼ
Δ５デサチュラーゼ
Δ17デサチュラーゼ
C20エロンガーゼ
Δ４デサチュラーゼ
ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ
リン脂質ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ
リン脂質ステロールアシルトランスフェラーゼ
リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ
グリセロール3リン酸アシルトランスフェラーゼ
リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ
ホスファチジン酸ホスファターゼ
アシルCoAシンテターゼ
HGM-CoAレダクターゼ
スクアレンエポキシダーゼ
【００２０】
第一の組換え酵素認識配列とは、最終的にゲノムから選択マーカー遺伝子や制御配列（プロモーター、ターミネーター等）を脱落させて目的遺伝子をゲノムに残すために作用する組換え酵素（第一の組換え酵素）が認識する配列である。第一の組換え酵素認識配列は、それぞれのベクター中に第一の組換え酵素認識配列１、第一の組換え酵素認識配列２等として、複数連結することができる。
例えば、第一の組換え酵素遺伝子と第一の組換え酵素認識配列との組み合わせとして、Cre-loxPシステムが挙げられる。従って、第一の組換え酵素遺伝子はCre遺伝子、第一の組換え酵素認識配列はloxP又はその変異配列を利用することができる。
1oxPは、以下の34塩基からなる配列であり、Cre結合部位、組換え部位及びCre結合部位からなる。
5’-ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT-3’ （配列番号１）
【００２１】
本発明においては、Creによる予期せぬ組換え反応が起きないよう、変異型loxP配列を用いることができる。変異型loxPを以下に例示する。
loxLE：5’-TACCGTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT-3’（配列番号２）
loxRE：5’-ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAACGGTA-3’（配列番号３）
lox511：5'-ATAACTTCGTATAGTATACATTATACGAAGTTAT-3'（配列番号４）
lox2272：5'-ATAACTTCGTATAGGATACTTTATACGAAGTTAT-3'（配列番号５）
【００２２】
本発明において使用されるプロモーター１、２、３としては、転写因子が結合して下流に連結された遺伝子の発現（転写）を起こさせる限り特に限定されるものではない。例えばユビキチンプロモーター（UbiP）、ウィルス前初期遺伝子プロモーター（Smp1P）、伸長因子1αプロモーター（EF1αP）、アクチンプロモーター（ActP）などが挙げられ、これらを単独で、又は適宜組み合わせて使用することができる。従って、本発明において、前記第一コンストラクト及び第二コンストラクトに使用するプロモーター１、２及び３の組み合わせは任意である。
【００２３】
また、本発明において使用されるターミネーター１、２、３、４としては、転写を終結させる機能を有する限り特に限定されるものではない。例えばユビキチンターミネーター（UbiT）、シミアンウィルス４０ターミネーター（SV40T）、伸長因子１αターミネーター（EF1αT）などが挙げられ、これらを単独で、又は適宜組み合わせて使用することができる。従って、本発明において、前記第一コンストラクト及び第二コンストラクトに使用するターミネーター１、２、３及び４の組み合わせは任意である。
【００２４】
第二の組換え酵素認識配列は、前記第一コンストラクトに含まれる第二の組換え酵素により認識される配列である。第二の組換え酵素認識配列は、第二の組換え酵素認識配列１、第二の組換え酵素認識配列２等として、複数連結することができる。
本発明においては、前記Cre-loxPと類似のシステムを利用することができ、例えば出芽酵母で見いだされたFLP-FRTシステムなどが挙げられる。従って、第二の組換え酵素認識配列１、２として、いずれもFRT配列（下記）を用いることが好ましい。
FRT配列：5’-GAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTC-3’（配列番号６）
また、第二の組換え酵素は例えばFLPであり、FLPはFRT配列を認識する。
【００２５】
第一の選択マーカー遺伝子は、第一コンストラクト中に連結される遺伝子であり、目的遺伝子１の発現株を選別する際に利用するマーカー遺伝子である。第二の選択マーカー遺伝子は、第二コンストラクト中に連結される遺伝子であり、目的遺伝子１の発現株を選別する際に利用するマーカー遺伝子である。
第一及び第二の選択マーカー遺伝子はハイグロマイシン耐性遺伝子(HygR)、ネオマイシン耐性遺伝子(NeoR)およびブラストサイジン耐性遺伝子(BlaR)の中から、単独で、又は適宜組み合わせて使用することができる。
【００２６】
前記の通り、FLP-FRTは出芽酵母で見いだされたCre-loxPと類似のシステムであり、DNA組換え酵素FLPによってFRT配列間で特異的に組換え反応を起こす(10)。本発明ではプラスミドを使用することなく、FLP-FRTシステムを利用することでラビリンチュラ類の細胞内でCre遺伝子を一過的に発現させ、ゲノムに組み込まれたloxPで挟まれた選択マーカーを脱落させる方法が有効であることが実証された（図1）。
【００２７】
本発明において使用されるベクターの具体的構成例を以下に示す。
第一コンストラクト：
目的遺伝子１-loxRE-UbiP-(ATG)-FRT-HygR-SV40T-FRT-(ATG-less Cre)-UbiT-loxLE
「ATG-less」とは、開始コドンが付加されていないCreを意味し、第二エレメント中の目的遺伝子１及び第一の選択マーカー遺伝子（この場合HygR）は発現可能に機能するが第二エレメント中の第一の組換え酵素遺伝子（この場合Cre）は第一の選択マーカーによる選択の時点では発現可能に機能しないようにしたものである。これにより、目的遺伝子１の発現株を選別する段階ではCreは発現しない。
第二コンストラクト：
目的遺伝子２-loxRE-Smp1P-FLP-UbiT-UbiP-(NeoR又はBlaR)-SV40T-loxLE
【００２８】
本発明のベクターの作製、宿主の形質転換などの基本的遺伝子操作は、公知方法（Sambrook J. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (4th edition)（Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012)等）、あるいは実施例に記載の方法を利用することができる。
【００２９】
以下、便宜上、上記第一及び第二インテグレテートの具体例を用いて説明する。
本発明では、２つの部位特異的組換え反応、Cre/loxPシステムとFLP/FRTシステムを利用することで、ラビリンチュラ類におけるマーカーリサイクル法を可能にしている。Cre/loxPシステムでは、組換え酵素Creが2つのloxPと呼ばれる塩基配列に対して、FLP/FRTシステムでは組換え酵素FLPが2つのFRTと呼ばれる塩基配列に対して特異的に組換え反応を起こす。
【００３０】
目的遺伝子の過剰発現株取得時に本発明の方法を利用する際の仕組みを説明する。
まず、開始コドン下流にFRT配列をもつHygR遺伝子を選択マーカーとして、目的遺伝子１（GOI1）の過剰発現株を取得する（図１、最上パネル）。この際、選択マーカーの下流に、プロモーターおよび開始コドンをもたないCre遺伝子を融合させておくことがポイントである。この状態では、GOI1およびHygR遺伝子は転写・翻訳されるが、Cre遺伝子はプロモーターおよび開始コドンを持たない為、実際にタンパクとして発現することは無い。この遺伝子コンストラクトにはHygRのプロモーターの上流、そして開始コドン欠損Creのターミネーターの下流にloxP配列を組み込んでいるが、この時点ではCreが発現していないため、loxP間における遺伝子の組み換え反応、HygR遺伝子の脱落は起こらない。
【００３１】
次に、 NeoRまたはBlaRを選択マーカーとして、FLPおよびGOI2を発現する形質転換体を取得する（図１、２段目のパネル）。この株はFLPを発現するため、最初にゲノムに導入したコンストラクトのFRT間において組換え反応が起こる。その結果、HygRとそのターミネーター（SV40T）が脱落すると同時に、HygRのプロモーター（UbiP）および開始コドンとして機能していた配列が、Cre遺伝子と融合し、Creの発現コンストラクトが形成される（図１、３段目のパネル）。
【００３２】
Creが発現するようになる事で、loxP配列で挟まれたCre発現コンストラクトおよびFLP、NeoR/BlaR発現コンストラクトが脱落する（図１、最下段パネル）。この結果、使用した選択マーカーは全てゲノムから脱落するため、同種の選択マーカーを再利用することが可能となる。このようにして、本発明のベクターを用いて、目的遺伝子をゲノム中に組み込むとともに、前記第一コンストラクト中の第一エレメントから、第二の組換え酵素認識配列、第一の選択マーカー遺伝子及びターミネーター１を脱落させるとともに、当該脱落により第一の組換え酵素遺伝子を発現させて、第一コンストラクト及び第二コンストラクト中の第一の組換え酵素認識配列遺伝子１及び２で挟まれた領域の遺伝子を脱落させることができる。
【００３３】
本発明の方法では、Creによる予期せぬ組換え反応が起きないよう、変異型loxP配列（loxRE, loxLE）を利用している。これらの配列は、一度組換えが起こると、Creに認識されない配列に変化する。
本発明の別の態様では、第一コンストラクト及び第二コンストラクト中の第一の組換え酵素認識配列遺伝子１及び２で挟まれた領域の遺伝子が脱落したか否かは、レポーター遺伝子を用いることにより効率よく確認することができる。レポーター遺伝子としては、例えば、GUS(グルクロニダーゼ）をコードする遺伝子、ガラクトシダーゼ遺伝子、緑色蛍光タンパク遺伝子などが挙げられ、前記第二の選択マーカー遺伝子に連結することができる。
【００３４】
例えば、NeoRに、レポーター遺伝子として利用されるGUSをコードする遺伝子を連結する（図８）。FLPによってFRT間で組換えが起こり、プロモーターと開始コドンATGがCreに付与されると、HygR遺伝子が脱落し、代わりにCreが発現する。組換えが起きたものはハイグロマイシンの感受性で選別する（図９）。CreによってloxPで挟まれたCre、FLP、およびGUS-NeoRが脱落する。GUSはX-Glucという化合物に作用し、青色色素を形成するため、X-Glucを含む寒天培地で株を培養すると、GUS-NeoRがゲノム組み込まれた株（GUS-NeoRがゲノムに残存している株）は青色コロニーを形成するが、GUS-NeoRがゲノムから脱落した株は青色コロニーは形成されない（図１０）。つまり、青色コロニーが形成されたということは、ベクターの脱落が行われていないことの指標となり、このようにして、レポーター遺伝子の発現を指標として、目的の株を選択することができる（カラーセレクション）。
【００３５】
本発明の方法では、上記のようにして目的遺伝子がゲノムに組み込まれた宿主に対し、再度本発明のベクターを用いて新たに目的遺伝子をゲノムに組み込むことができる。この場合は、上記第一コンストラクト及び第二コンストラクト中の第一の組換え酵素認識配列遺伝子１及び２で挟まれた領域の遺伝子が脱落した株に対し、第一コンストラクト及び第二コンストラクトの導入を繰り返し行えばよい。導入する目的遺伝子は、先に組み込んだ遺伝子と同じ遺伝子であっても、別の遺伝子であってもよく、限定されるものではない。
【００３６】
本発明は、Cre/loxPおよびFLP/FRTという2つの部位特異的組換え反応を利用した全く新しいマーカーリサイクル法であり、ラビリンチュラ類の産業利用を強く推進する基盤技術になる。本発明によって、ラビリンチュラ類を代謝改変、産業利用する上で大きな障壁となっている選択マーカーの数的制限、遺伝子改変の回数制限をなくす事ができる。近年、ラビリンチュラ類の有用性は広く認められ、多くの企業、研究機関がラビリンチュラ類の研究、開発に参入している。
本発明ではCreがFLP依存的に発現し、その発現したCreによって、loxPで挟まれたCreそのものがゲノムから脱落する。つまり、必要な時に一過的にCreを発現させる事が可能であり、プラスミドや誘導型プロモーターに依存しないという点が特徴である。さらに、本発明の方法は、ラビリンチュラ類のみならず、プラスミドや誘導型プロモーターが利用出来ない微生物にも適用可能であり、有用性は高い。
【００３７】
本発明は、前記の通り遺伝子操作された宿主（形質転換体）を培養し、得られる培養物から目的遺伝子の発現産物を採取することを特徴とする、当該発現産物の製造方法を提供する。「培養物」とは、(ａ)培養上清、(ｂ)培養細胞若しくは培養菌体又はその破砕物のいずれをも意味するものである。
培養後、目的産物が宿主内に生産される場合には、宿主を破砕することにより当該産物を抽出する。また、目的産物が宿主外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により宿主を除去する。その後、目的産物の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、目的産物を単離精製することができる。
【００３８】
本発明においては、無細胞合成系を用いたin vitro翻訳により目的産物を得ることもできる。この場合は、RNAを鋳型にする方法とDNAを鋳型にする方法（転写／翻訳）の２通りの方法を用いることができる。無細胞合成系としては、市販のシステム、例えばExpresswayTMシステム（インビトロジェン社）等を用いることができる。
【００３９】
実施例
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の範囲はこれらの実施例により限定されるものではない。本実施例は、産業利用への期待が高いオーランチオキトリウム属のゲノム中に組み込まれた選択マーカーの脱落、および同一選択マーカーによる形質転換に関するものである。
【実施例１】
【００４０】
材料と方法
ラビリンチュラ類の培養：
本発明では主にオーランチオキトリウム属(Aurantiochytrium limacinum mh0186)を用いたが、本発明はシゾキトリウム属、スラウストキトリウム属、パリエティキトリウム属にも応用可能であると考えている。液体培地はグルコース3%, Yeast Extract 1%, SeaLife（人工海水）1.8%から構成されるGYをオートクレーブ滅菌後、VitaminB1, B2, B21がそれぞれ0.2, 0.001, 0.001%ずつ含まれるVitamin Mix、およびElement solution（表１）を添加したものを使用した。寒天培地はPotato dextrose agar (PDA) 0.8%、Sealife 1.7%, Agar 1.2%から構成されるPDAを用いた。抗生物質はハイグロマイシンを1 mg/ml、G418を0.5 mg/mlの濃度になるようにGYまたはPDA培地に添加した。
【００４１】
【表１】
2018064551.tif 000002
【００４２】
プラスミドベクターの作製：
本発明で作製したプラスミドベクターの構成を図2に示す。ベクターAに含まれるユビキチンプロモーター (UbiP)はスラウストキトリウム属(Thraustochytrium aureumATCC 34304)に、ハイグロマイシン耐性遺伝子（HygR）は pcDNA3.1/Hygro(+)に、SV40ターミネーター(SV40T)はpcDNA3.1 Myc-Hisにそれぞれ由来し、これらを融合したベクターは先行研究によって作製されている(11)。このベクターを鋳型とし、配列内にloxRE配列およびloxLE配列を含むプライマーを用いてHygRの両端に改変loxP配列(12)が配置されるベクター（ベクター１）を作製した。ベクター１を鋳型として、FRT配列を含むプライマーFRT-HygR-SおよびUbiP-FRT-HygR-Aを用いてHygRの開始コドンATGとORFの間にFRTを含むベクター（ベクター２）を作製した。Cre遺伝子は、オーランチオキトリウム属、スラウストキトリウム属、パリエティキトリウム属のラビリンチュラ類の高発現遺伝子の予測ORFよりコドン使用頻度を算出し、それに基づき配列を最適化した人工合成遺伝子（Eurofins）を用いた。このCre遺伝子の下流にT. aureum ATCC 34304に由来するユビキチンターミネーター(UbiT)を組み込んだベクター（ベクター３）を作製し、ベクター３を鋳型とし配列内にFRTを含むFRT-Cre-SおよびUbiTの3’末端側にloxPLE配列が付与するように設計したUbiT-loxP-LE-AをプライマーとしてPCRを行った。この増幅断片と、loxP LE-SおよびSV40T-FRT-Aによってベクター２を増幅した産物とをインフュージョン反応によって連結させ、最終的なプラスミドベクターAを作製した。
【００４３】
ベクターBのSmp1プロモーター（Smp1P）は、ラビリンチュラ類に特異的に感染する2本鎖DNAウィルスであるSmDNAVの前初期遺伝子のプロモーターにおける約600 bpの領域を単離したものを使用した(13)。ネオマイシン耐性遺伝子（NeoR）はT. aureum ATCC34304のコドン使用頻度をもとにラビリンチュラ類に最適化した遺伝子を人工合成した(3)。また、FLP遺伝子はオーランチオキトリウム属、スラウストキトリウム属、パリエティキトリウム属のラビリンチュラ類の高発現遺伝子の予測ORFよりコドン使用頻度を算出し、それに基づき配列を最適化した人工合成遺伝子（Eurofins）を用いた。ベクター１を鋳型として、SV40T-SおよびUbiP-AをプライマーとしてHygRを除く領域を増幅し、ここにUbiP-NeoR-SおよびNeoR-Aによって最適化NeoRをインフュージョン反応によって組込みベクター４とした。また、Smp1PとUbiTに挟まれた領域に蛍光タンパク遺伝子を組み込んだベクターを鋳型として、UbiT-SおよびSmp1P-Aをプライマーとして蛍光タンパク遺伝子を除去した断片と、Smp1-FLP-SおよびFLP-biT-Aによって人工合成したFLP遺伝子を増幅したものとをインフュージョン反応によって連結しベクター５を得た。ベクター４を鋳型とし、UbiP-SおよびloxPRE-Aをプライマーとして増幅したPCR産物と、ベクター５を鋳型としloxP RE-SmpiP-SおよびUbiT-AをプライマーとしたPCR産物とをインフュージョン反応によって連結しベクターBを作製した。NeoRの代わりにブラストサイジン耐性遺伝子(BlaR)を組み込んだベクターをベクターCとした。このBlaRはpTracer-CV/Bsd/acZに由来し、UbiP-BlaR-SおよびBlaR-Aによって増幅させたものをNeoRと同様の方法によってベクターに連結させた。PCRは主にTks Glex DNA polymerase (Takara Bio Inc.)を用い、条件は添付プロトコルに準じた。またインフュージョン反応はIn-Fusion（登録商標）HD Cloning Kit (Takara Bio Inc.)を用いた。得られたプラスミドベクターはシーケンス解析によって配列を確認した。プライマーの配列を表２に示す。
【００４４】
【表２】
2018064551.tif 000003
【００４５】
遺伝子コンストラクトの導入：
オーランチオキトリウム属への遺伝子コンストラクトの導入はエレクトロポレーション法によって行った。まず、ベクターAを鋳型としloxP-SおよびloxP-Aをプライマーとして導入コンストラクトを増幅し、エタノール沈殿によってPCR産物を調製した。オーランチオキトリウム属は、まず2 mlのdGPY培地(グルコース0.2%, Yeast Extract 0.05%, SeaLife1.8%, polypeptone 0.1%をオートクレーブ滅菌後、Vitamin MixおよびElement solutionを添加し調整)によって25oC 、24時間培養した。
【００４６】
この内、200 μlの培養液を回収し、3000 x g、3 min  遠心し、培地を除去した後に、200 μlのOpti-MEMを用いて懸濁し、再度同条件で遠心を行い、オーランチオキトリウム属を洗浄、回収した。60 μlのOpti-MEMを加えて懸濁し、ここに1.2 μgのコンストラクトを加え、あらかじめ氷冷していた1 mm幅のキュベット電極に移した。このキュベット電極をGene Pulser XcellTM システム（Bio-Rad）にセットし、750V、25 μF、50 Wの条件で2回印加し、700 μlのGY培地を添加しサンプルを回収した。25oC 、24時間回転培養した後、低速遠心によって培地を650 μl除去し、残りの培地で細胞を懸濁した後に1 mg/mlのハイグロマイシンを含むPDA培地に塗布した。
【００４７】
得られたコロニーを2 mlのGY(1 mg/ml ハイグロマイシン)に植菌し、25oC 、48時間培養したサンプルから20 μlの培養液を回収し、5000 x g, 3 min遠心し培地を除去し、沈殿画分に20 mMのNaOHを100 μl添加し37℃で10 minインキュベーションした。これを鋳型とし、複数のプライマーセットを用いてゲノム上への第一コンストラクトの組込みを評価した。第一コンストラクトの組込みが確認されたサンプルを上記と同様の方法で調整し、ベクターBを鋳型としtransfection PCR-Sおよびtransfection PCR-AをプライマーとしたPCRによって増幅した第二コンストラクトの導入を行った。上記ど同様の条件でエレクトロポレーション、回転培養行った後、サンプルを0.5 mg/mlのG418を含むPDA培地に塗布して第二コンストラクトの導入サンプルを選別した。
【００４８】
選択マーカーの除去と確認：
第二コンストラクトが導入されたサンプルを2 mlの抗生物質を含まないGY培地に植菌し、25℃、48時間培養し、上記の方法でPCRの鋳型を調製し、各種プライマーを用いてCreおよびFLPの組換え反応、ゲノムからの選択マーカーの除去を評価した。また、残りのサンプルを一部、白金耳を用いてPDA (1 mg/ml ハイグロマイシン)およびPDA (0.5 mg/ml G418)に植菌し、その抗生物質感受性を評価した。
【００４９】
結果と考察
第一コンストラクトの機能評価：オーランチオキトリウム属に第一コンストラクトを導入した結果、ハイグロマイシン耐性能を獲得した複数の株を獲得した。このうちの3株からゲノムDNAを抽出し、それらを鋳型として複数条件でPCRを行った結果、第一コンストラクトの導入が確認された（図3A）。この結果より、FLP配列がHygR遺伝子に付与されていてもその抗生物質耐性能に影響はないことが示された。
【００５０】
第二コンストラクトの導入とFLP-FRTシステムの評価：第一コンストラクトが導入された株に第二コンストラクトを導入し、G418含有PDA培地で耐性を示す複数の形質転換株を取得した。第二コンストラクトに含まれるFLPが発現すると、第一コンストラクトに組み込まれたFRTに作用し、その間で配列特異的に組換え反応が起こる。その結果、FRT間で挟まれた第一コンストラクト上のHygR遺伝子が脱落し、そのプロモーターであったUbiPが、それまでは開始コドンおよびプロモーターをもたず発現しなかったCre遺伝子が、開始コドンとプロモーターを獲得することでRNAへの転写、タンパクへの翻訳が可能となる。このシステムの要であるFLP-FRTがラビリンチュラ類においても機能するか、ゲノムPCRで確認した結果を図３Bに示す。第二コンストラクトが導入されたサンプル（FLP導入）では、FRT間に挟まれたHygR遺伝子が脱落した分、増幅産物のサイズが減少していることが確認された（図3B）。この結果より、FLP-FRTシステムがラビリンチュラ類においても機能することが示された。
【００５１】
第二コンストラクト導入による抗生物質感受性への影響：PCRによってHygRが脱落していることが確認されたサンプルが、実際にハイグロマイシン感受性が回復しているかを評価した。その結果、完全にハイグロマイシン感受性が回復する株がおよそ50％の確率で得られることが示された（図4）。ハイグロマイシン感受性が回復した株をさらに培養し、抗生物質を含まないPDA培地上に画線培養し、コロニーを形成させた。複数コロニーを釣菌し、抗生物質を含まないGY培地で48時間培養し、それぞれ株のG418感受性を評価した。その結果、一部のサンプルにおいて、G418感受性が完全に回復した株が確認された（図5）。
【００５２】
FLP-FRTシステムによって発現したCreによる組換え反応の評価：第一コンストラクト導入株（A）、およびそれに第二コンストラクトを導入した株（B）、その結果G418耐性能が回復した株（C）のゲノムPCRの結果を図６に示す。G418耐性能が回復した株では、Bで出現していたNeoRおよびFLPに由来する増幅バンドが認められなかった（図６）。この結果は、FLP-FRTシステムによってCreが発現した結果、loxP配列で挟まれたFLP遺伝子およびNeoR遺伝子が脱落したことを示している（図1、最下段パネル）。
【００５３】
選択マーカーを再利用した形質転換：第一コンストラクト、第二コンストラクトの導入によって一度獲得したハイグロマイシンおよびG418耐性能を喪失した株に対し、再度第一コンストラクトによる形質転換が可能かを検証した。エレクトロポレーション法によって対象株に第一コンストラクトを導入し、ハイグロマイシンを含むPDA培地を用いて選別した結果、複数のハイグロマイシン耐性株を獲得することが出来た。これらの株からゲノムを抽出しPCRを行った結果、第一コンストラクトのゲノムへの組込みが確認された（図7A）。
【００５４】
この結果より、一度利用した抗生物質耐性遺伝子を再利用することで、また新たに形質転換体を獲得することが可能であることが示された。第一コンストラクト、第二コンストラクトの導入および選択マーカーの再利用によって得られた形質転換体の抗生物質耐性能を図７Bに示す。この結果より、本発明で構築したシステムによって、ラビリンチュラ類において選択マーカーの脱落、および同一選択マーカーの再利用が可能であることが実証された。
【００５５】
本発明では主にオーランチオキトリウム属を対象生物として実験を行ったが、使用したプロモーター、ターミネーターおよび各種遺伝子は他属のラビリンチュラ類においても機能することが示されている(3, 11)。ラビリンチュラ類の種類によって脂質組成は大きく異なるため、対象とする脂質によって異なる属、種を使い分ける必要がある。本発明はラビリンチュラ類の属を問わず普遍的に利用できる可能性が高く、適用範囲は広いだろう。また、本発明ではCreの発現にプラスミドベクターを用いる必要がないため、プラスミドベクターによる遺伝子の一過性発現が確立されていない他の微生物にも適用可能である。ラビリンチュラ類をはじめとする有用微生物の産業利用を目指す上で、本発明は有用な基盤技術となる。
【実施例２】
【００５６】
CreによってFLPおよびGUS-NeoRが脱落した株は、X-Glucを用いたカラーセレクション法により選別可能である。GUS-NeoRが残存している株は青に染色されるが、脱落した株は染色されないため白いコロニーとなる（図11、カラーセレクション部）。青、白のコロニーをそれぞれ培養し、抗生物質耐性能を検証した結果、青コロニー由来の株は依然としてG418耐性能を示したが、白コロニー由来の株はNeoRが脱落したことによりG418感受性が回復した（図11、抗生物質感受性テスト部）。この結果より、GUSを連結した抗生物質耐性遺伝子を用いることで、組換え反応により抗生物質耐性遺伝子が脱落した株を効率よく選別できることが実証された。
【００５７】
参考文献
1. Lee Chang, K. J., et al. (2014) Comparison of Thraustochytrids Aurantiochytrium sp., Schizochytrium sp., Thraustochytrium sp., and Ulkenia sp. for production of biodiesel, long-chain omega-3 oils, and exopolysaccharide. Mar Biotechnol (NY) 16, 396-411
2. Chen, J., et al. (2014) Algal sterols are as effective as beta-sitosterol in reducing plasma cholesterol concentration. J. Agric. Food Chem. 62, 675-681
3.Sakaguchi, K., et al. (2012) Versatile transformation system that is applicable to both multiple transgene expression and gene targeting for Thraustochytrids. Appl. Environ. Microbiol. 78, 3193-3202
4.Xue, Z., et al. (2013) Production of omega-3 eicosapentaenoic acid by metabolic engineering of Yarrowia lipolytica. Nat. Biotechnol. 31, 734-740
5.Taniguchi, M., et al. (1998) Efficient production of Cre-mediated site-directed recombinants through the utilization of the puromycin resistance gene, pac: a transient gene-integration marker for ES cells. Nucleic Acids Res. 26, 679-680
6.Van Duyne, G. D. (2001) A structural view of cre-loxp site-specific recombination. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 30, 87-104
7.Belteki, G., et al. (2005) Conditional and inducible transgene expression in mice through the combinatorial use of Cre-mediated recombination and tetracycline induction. Nucleic Acids Res. 33, e51
8.Ikushima, S., et al. (2009) Efficient gene disruption in the high-ploidy yeast Candida utilis using the Cre-loxP system. Biosci Biotechnol Biochem 73, 879-884
9.Krappmann, S., et al. (2005) Deletion and allelic exchange of the Aspergillus fumigatus veA locus via a novel recyclable marker module. Eukaryot. Cell 4, 1298-1307
10.Broach, J. R., et al. (1982) Recombination within the yeast plasmid 2mu circle is site-specific. Cell 29, 227-234
11.Matsuda, T., et al. (2012) Analysis of Delta12-fatty acid desaturase function revealed that two distinct pathways are active for the synthesis of PUFAs in T. aureum ATCC 34304. J. Lipid Res. 53, 1210-1222
12.Arakawa, H., et al. (2001) Mutant loxP vectors for selectable marker recycle and conditional knock-outs. BMC Biotechnol. 1, 7
13.Takao, Y., et al. (2015) Ecological Dynamics of Two Distinct Viruses Infecting Marine Eukaryotic Decomposer Thraustochytrids (Labyrinthulomycetes, Stramenopiles). PloS one 10, e0133395
【配列表フリーテキスト】
【００５８】
配列番号１〜３１：合成DNA
【図１】
2018064551.tif 000004
【図２】
2018064551.tif 000005
【図３】
2018064551.tif 000006
【図４】
2018064551.tif 000007
【図５】
2018064551.tif 000008
【図６】
2018064551.tif 000009
【図７】
2018064551.tif 000010
【図８】
2018064551.tif 000011
【図９】
2018064551.tif 000012
【図１０】
2018064551.tif 000013
【図１１】
2018064551.tif 000014
【配列表】
2018064551000001.app