(57)【要約】      （修正有）【課題】修飾又は変異呼吸器合胞ウイルス融合（ＲＳＶ−Ｆ）タンパク質、並びに呼吸器合胞ウイルス（ＲＳＶ）感染の治療及び／又は予防のための、ワクチン等の免疫原生組成物、及び作製法と使用方法の提供。【解決手段】前記ＲＳＶ−Ｆタンパク質をコードする核酸を昆虫宿主細胞に導入し、前記コードされたタンパク質が野生型ＲＳＶ−Ｆタンパク質の特定の配列に対応するアミノ酸の１又は複数が欠失し、更に、変異によって不活性化した前記野生型ＲＳＶ−Ｆタンパク質特定の配列に対応する一次フェーリング接合部位を含み、前記細胞ブロセッシングがＮ末端シグナルペプチド切断を含む、前記昆虫宿主細胞を、前記ＲＳＶ−Ｆタンパク質の発現、及び前記細胞プロセッシングに適切な条件で培養し、遠心分離により前記昆虫細胞を回収する精製工程からなる前記ＲＳＶ−Ｆタンパク質の製造法。【選択図】図１１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）融合（Ｆ）タンパク質であって、宿主細胞における前記ＲＳＶ  Ｆタンパク質の発現を増加させる少なくとも１つの修飾又は変異を含むＲＳＶ  Ｆタンパク質。
【請求項２】
ＲＳＶ  Ｆタンパク質であって、宿主細胞における前記ＲＳＶ  Ｆタンパク質の細胞毒性を低減する少なくとも１つの修飾又は変異を含むＲＳＶ  Ｆタンパク質。
【請求項３】
ＲＳＶ  Ｆタンパク質であって、非修飾ＲＳＶ  Ｆタンパク質と比較して前記ＲＳＶ  Ｆタンパク質の免疫原性特性を亢進する少なくとも１つの修飾又は変異を含むＲＳＶ  Ｆタンパク質。
【請求項４】
前記Ｆタンパク質が、野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質（配列番号２）のプロリン１０２位残基に対応するアミノ酸位置にアミノ酸置換をさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＲＳＶ  Ｆタンパク質。
【請求項５】
前記プロリン１０２位残基がアラニン残基に置換される、請求項４に記載のＲＳＶ  Ｆタンパク質。
【請求項６】
野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質（配列番号２）のイソロイシン３７９位残基に対応するアミノ酸位置にアミノ酸置換をさらに含む、請求項４又は５に記載のＲＳＶ  Ｆタンパク質。
【請求項７】
前記イソロイシン３７９位残基がバリン残基に置換される、請求項６に記載のＲＳＶ  Ｆタンパク質。
【請求項８】
野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質（配列番号２）のメチオニン４４７位残基に対応するアミノ酸位置にアミノ酸置換をさらに含む、請求項４〜７のいずれか一項に記載のＲＳＶ  Ｆタンパク質。
【請求項９】
前記メチオニン４４７位残基がバリン残基に置換される、請求項８に記載のＲＳＶ  Ｆタンパク質。
【請求項１０】
ロリポップ形態をとる、請求項１〜９のいずれか一項に記載のＲＳＶ  Ｆタンパク質。
【請求項１１】
少なくとも１つのフューリン切断部位を不活性化させる変異を含む、請求項４〜１０のいずれか一項に記載のＲＳＶ  Ｆタンパク質。
【請求項１２】
前記フューリン切断部位が一次切断部位である、請求項１１に記載のＲＳＶ  Ｆタンパク質。
【請求項１３】
少なくとも１つのフューリン切断部位の不活性化が、野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質（配列番号２）のアルギニン１３３位、アルギニン１３５位、及びアルギニン１３６位に対応する位置に少なくとも１つのアミノ酸置換を導入することにより達成される、請求項１１〜１２のいずれか一項に記載のＲＳＶ  Ｆタンパク質。
【請求項１４】
野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質（配列番号２）のアルギニン１３３位、アルギニン１３５位、及びアルギニン１３６位に対応する位置に少なくとも２つのアミノ酸置換が導入される、請求項１３に記載のＲＳＶ  Ｆタンパク質。
【請求項１５】
野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質（配列番号２）のアルギニン１３３位、アルギニン１３５位、及びアルギニン１３６位に対応する位置に３つのアミノ酸置換が導入される、請求項１４に記載のＲＳＶ  Ｆタンパク質。
【請求項１６】
前記アルギニン１３３位残基がグルタミンに置換される、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載のＲＳＶ  Ｆタンパク質。
【請求項１７】
前記アルギニン１３５位残基がグルタミンに置換される、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載のＲＳＶ  Ｆタンパク質。
【請求項１８】
前記アルギニン１３６位残基がグルタミンに置換される、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載のＲＳＶ  Ｆタンパク質。
【請求項１９】
Ｆ２のクリプティックポリ（Ａ）部位の、少なくとも１つの修飾をさらに含む、請求項４〜１８のいずれか一項に記載のＲＳＶ  Ｆタンパク質。
【請求項２０】
野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質（配列番号２）のおよそアミノ酸１３７〜１４６位に対応する融合ドメインのＮ末端半分に欠失をさらに含む、請求項４〜１９のいずれか一項に記載のＲＳＶ  Ｆタンパク質。
【請求項２１】
前記修飾又は変異が、
（ｉ）少なくとも１つのフューリン切断部位の不活性化、
（ｉｉ）Ｆ２のクリプティックポリ（Ａ）部位の修飾、及び
（ｉｉｉ）野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質（配列番号２）のおよそアミノ酸１３７〜１４６位に対応する融合ドメインのＮ末端半分における欠失、
からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＲＳＶ  Ｆタンパク質。
【請求項２２】
（ｉ）野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質（配列番号２）のプロリン１０２位、イソロイシン３７９位、及びメチオニン４４７位に対応する位置における少なくとも１つのアミノ酸置換、
（ｉｉ）少なくとも１つのフューリン切断部位の不活性化、
（ｉｉｉ）Ｆ２のクリプティックポリ（Ａ）部位の修飾、並びに
（ｉｖ）野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質（配列番号２）のおよそアミノ酸１３７〜１４６位に対応する融合ドメインのＮ末端半分における欠失、
からなる群から選択される、少なくとも２つの変異を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＲＳＶ  Ｆタンパク質。
【請求項２３】
（ｉ）野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質（配列番号２）のプロリン１０２位、イソロイシン３７９位、及びメチオニン４４７位に対応する位置における少なくとも１つのアミノ酸置換、
（ｉｉ）少なくとも１つのフューリン切断部位の不活性化、
（ｉｉｉ）Ｆ２のクリプティックポリ（Ａ）部位の修飾、並びに
（ｉｖ）野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質（配列番号２）のおよそアミノ酸１３７〜１４６位に対応する融合ドメインのＮ末端半分における欠失、
からなる群から選択される、少なくとも３つの変異を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＲＳＶ  Ｆタンパク質。
【請求項２４】
（ｉ）野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質（配列番号２）のプロリン１０２位、イソロイシン３７９位、及びメチオニン４４７位に対応する位置における少なくとも１つのアミノ酸置換、
（ｉｉ）少なくとも１つのフューリン切断部位の不活性化、
（ｉｉｉ）Ｆ２のクリプティックポリ（Ａ）部位の修飾、並びに
（ｉｖ）野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質（配列番号２）のおよそアミノ酸１３７〜１４６位に対応する融合ドメインのＮ末端半分における欠失、
からなる群から選択される、４つの変異を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＲＳＶ  Ｆタンパク質。
【請求項２５】
野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質（配列番号２）のプロリン１０２位、イソロイシン３７９位、及びメチオニン４４７位に対応する位置に、少なくとも２つのアミノ酸置換を有する、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載のＲＳＶ  Ｆタンパク質。
【請求項２６】
野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質（配列番号２）のプロリン１０２位、イソロイシン３７９位、及びメチオニン４４７位に対応する位置に、３つのアミノ酸置換を有する、請求項２１〜２５のいずれか一項に記載のＲＳＶ  Ｆタンパク質。
【請求項２７】
配列番号３、配列番号５、配列番号７、及び配列番号９からなる群から選択される核酸配列によりコードされるＲＳＶ  Ｆタンパク質。
【請求項２８】
配列番号４、配列番号６、配列番号８、及び配列番号１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＲＳＶ  Ｆタンパク質。
【請求項２９】
野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質と比較して宿主細胞における発現の増加を示す、請求項１〜２８のいずれか一項に記載のＲＳＶ  Ｆタンパク質。
【請求項３０】
野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質と比較して免疫原性特性の亢進を示す、請求項１〜２９のいずれか一項に記載のＲＳＶ  Ｆタンパク質。
【請求項３１】
前記宿主細胞が真核細胞である、請求項１〜３０のいずれか一項に記載のＲＳＶ  Ｆタンパク質。
【請求項３２】
前記真核細胞が昆虫細胞である、請求項３１に記載のＲＳＶ  Ｆタンパク質。
【請求項３３】
前記昆虫細胞がＳｆ９細胞である、請求項３２に記載のＲＳＶ  Ｆタンパク質。
【請求項３４】
前記ＲＳＶ  Ｆタンパク質が、ヒトＲＳＶのＡ株、ヒトＲＳＶのＢ株、ウシＲＳＶの株、及びトリＲＳＶの株からなる群から選択されるＲＳＶ株に由来する、請求項１〜３３のいずれか一項に記載のＲＳＶ  Ｆタンパク質。
【請求項３５】
請求項１〜３４のいずれか一項に記載のＲＳＶ  Ｆタンパク質を１又は複数含む、精製ミセル。
【請求項３６】
請求項１〜３４のいずれか一項に記載のＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項３７】
マトリクス（Ｍ）タンパク質をさらに含む、請求項３６に記載のＶＬＰ。
【請求項３８】
前記Ｍタンパク質がＲＳＶのヒト株に由来する、請求項３７に記載のＶＬＰ。
【請求項３９】
前記Ｍタンパク質がＲＳＶのウシ株に由来する、請求項３７に記載のＶＬＰ。
【請求項４０】
前記Ｍタンパク質がインフルエンザウイルス株由来のＭ１である、請求項３７に記載のＶＬＰ。
【請求項４１】
前記インフルエンザウイルス株がトリインフルエンザウイルス株である、請求項４０に記載のＶＬＰ。
【請求項４２】
前記トリインフルエンザウイルス株がＨ５Ｎ１株である、請求項４１に記載のＶＬＰ。
【請求項４３】
前記Ｈ５Ｎ１株がＡ／Indonesia／５／０５である、請求項４２に記載のＶＬＰ。
【請求項４４】
前記Ｍタンパク質がニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）株に由来する、請求項３７に記載のＶＬＰ。
【請求項４５】
ＲＳＶ糖タンパク質（Ｇ）をさらに含む、請求項３６〜４４のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
【請求項４６】
ＲＳＶ糖タンパク質（ＳＨ）をさらに含む、請求項３６〜４５のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
【請求項４７】
ＲＳＶヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）をさらに含む、請求項３６〜４６のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
【請求項４８】
ＶＬＰの形成を可能にする条件下で、前記ＶＬＰが真核細胞において発現する、請求項３６〜４７のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
【請求項４９】
前記真核細胞が、酵母、昆虫、両生類、鳥類、哺乳類、又は植物細胞からなる群から選択される、請求項４９に記載のＶＬＰ。
【請求項５０】
請求項１〜３４のいずれか一項に記載のＲＳＶ  Ｆタンパク質を含む免疫原性組成物。
【請求項５１】
請求項３５に記載の精製ミセルを含む免疫原性組成物。
【請求項５２】
請求項３６〜４９のいずれか一項に記載のＶＬＰを含む免疫原性組成物。
【請求項５３】
請求項１〜３４のいずれか一項に記載のＲＳＶ  Ｆタンパク質を含む薬学的に許容可能なワクチン組成物であって、前記ＲＳＶ  Ｆタンパク質が宿主における免疫応答の誘発能を有する組成物。
【請求項５４】
請求項３５に記載の精製ミセルを含む薬学的に許容可能なワクチン組成物であって、前記ミセルが宿主における免疫応答の誘発能を有する組成物。
【請求項５５】
請求項３６〜４９のいずれか一項に記載のＶＬＰを含む薬学的に許容可能なワクチン組成物であって、前記ＶＬＰが宿主における免疫応答の誘発能を有する組成物。
【請求項５６】
請求項１〜３４のいずれか一項に記載のＲＳＶ  Ｆタンパク質を含む、ヒト対象をウイルス感染に対して免疫するためのキット。
【請求項５７】
請求項３５に記載の精製ミセルを含む、ヒト対象をウイルス感染に対して免疫するためのキット。
【請求項５８】
請求項３６〜４９のいずれか一項に記載のＶＬＰを含む、ヒト対象をウイルス感染に対して免疫するためのキット。
【請求項５９】
前記ウイルス感染がＲＳＶ感染である、請求項５４〜５６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項６０】
哺乳動物に、ウイルス感染に対するワクチン接種をする方法であって、薬学的に許容可能な製剤中の請求項１〜３４のいずれか一項に記載のＲＳＶ  Ｆタンパク質をヒト対象に投与する工程を含む方法。
【請求項６１】
哺乳動物に、ウイルス感染に対するワクチン接種をする方法であって、薬学的に許容可能な製剤中の請求項３５に記載の精製ミセルをヒト対象に投与する工程を含む方法。
【請求項６２】
哺乳動物に、ウイルス感染に対するワクチン接種をする方法であって、薬学的に許容可能な製剤中の請求項３６〜４９のいずれか一項に記載のＶＬＰをヒト対象に投与する工程を含む方法。
【請求項６３】
前記薬学的に許容可能な製剤がアジュバントを含む、請求項６０〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記アジュバントが非リン脂質リポソームである、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
ウイルス感染に対して免疫応答を生じさせる方法であって、ヒト対象に対する、薬学的に許容可能な製剤中の請求項１〜３４のいずれか一項に記載のＲＳＶ  Ｆタンパク質を含む方法。
【請求項６６】
ウイルス感染に対して免疫応答を生じさせる方法であって、薬学的に許容可能な製剤中の請求項３５に記載の精製ミセルをヒト対象に投与する工程を含む方法。
【請求項６７】
ウイルス感染に対して免疫応答を生じさせる方法であって、薬学的に許容可能な製剤中の請求項３６〜４９のいずれか一項に記載のＶＬＰをヒト対象に投与する工程を含む方法。
【請求項６８】
請求項１〜３０のいずれか一項に記載のＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードする単離された核酸。
【請求項６９】
請求項６８に記載の核酸を含む単離された細胞。
【請求項７０】
請求項６８に記載の核酸を含むベクター。
【請求項７１】
ＲＳＶ  Ｆタンパク質を作製する方法であって：
（ａ）請求項６８に記載の核酸を発現するよう、宿主細胞を形質転換する工程；及び
（ｂ）前記ＲＳＶ  Ｆタンパク質の産生を導く条件下で前記宿主細胞を培養する工程；
を含む方法。
【請求項７２】
ＲＳＶ  Ｆタンパク質ミセルを作製する方法であって：
（ａ）請求項６８に記載の核酸を発現するよう、宿主細胞を形質転換する工程；及び
（ｂ）前記ＲＳＶ  Ｆタンパク質ミセルの産生を導く条件下で前記宿主細胞を培養する工程
を含む方法。
【請求項７３】
前記宿主細胞が昆虫細胞である、請求項７１又は７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記昆虫細胞が、請求項６８に記載の核酸を含むバキュロウイルスベクターをトランスフェクトされた昆虫細胞である、請求項７３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２００８年１２月９日に出願された米国仮特許出願第６１／１２１，１２６号、２００９年４月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／１６９，０７７号、及び２００９年７月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／２２４，７８７号に対する優先権を主張し、その各々が、全ての目的のために全体として参照により本明細書に援用される。
【０００２】
技術分野
本発明は、概して、修飾又は変異呼吸器合胞体ウイルス融合（Ｆ）タンパク質、並びにＲＳＶ感染の治療及び／又は予防のための、ワクチンなどの免疫原性組成物を含む、それらの作製方法及び使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）は、パラミクソウイルス科（Paramyxoviridae）のニューモウイルス属（Pneumovirus）のメンバーである。ヒトＲＳＶ（ＨＲＳＶ）は、低年齢小児における重篤な下気道疾患の主な原因であり、ヒトにおける高い罹患率及び死亡率に関与している。ＲＳＶはまた、免疫障害のある成人における、及び高齢者における重要な病原体としても認識されている。自然感染後の感染宿主におけるＲＳＶ抵抗性は不完全なため、小児期及び成人期の間にＲＳＶは複数回感染し得る。
【０００４】
このウイルスは、一本鎖ネガティブセンスＲＮＡから構成されるゲノムを有し、それがウイルスタンパク質と緊密に結合してヌクレオカプシドを形成している。ウイルスエンベロープは、ウイルスによりコードされた構造タンパク質を含む細胞膜由来の脂質二重層から構成される。ウイルスポリメラーゼがビリオンでパッケージングされ、ゲノムＲＮＡをｍＲＮＡに転写する。ＲＳＶゲノムは、３つの膜貫通型構造タンパク質Ｆ、Ｇ、及びＳＨ、２つのマトリクスタンパク質Ｍ及びＭ２、３つのヌクレオカプシドタンパク質Ｎ、Ｐ、及びＬ、並びに２つの非構造タンパク質ＮＳ１及びＮＳ２をコードする。
【０００５】
ＨＲＳＶと細胞膜との融合は、細胞表面で起こるものと考えられており、感染初期における細胞質へのウイルスリボ核タンパク質の導入に必須の工程である。この過程は融合（Ｆ）タンパク質によって媒介され、Ｆタンパク質はまた、感染細胞の膜を隣接細胞の膜と融合することによる特徴的な合胞体の形成も促進し、この合胞体の形成は、顕著な細胞変性効果であるとともに、さらなるウイルス伝播機構でもある。従って、宿主免疫においては融合活性の中和が重要である。実際、Ｆタンパク質に対して作られたモノクローナル抗体は、ウイルス感染力を中和し、膜融合を阻害することが示されている（Calder et al., 2000, Virology 271: 122-131）。
【０００６】
ＲＳＶのＦタンパク質は、他のパラミクソウイルスのＦ糖タンパク質と構造上の特徴及び限定的だが重要なアミノ酸配列同一性を共有している。これは、５７４アミノ酸の不活性前駆体（Ｆ０）として合成され、小胞体においてアスパラギンに対して共翻訳によりグリコシル化され、そこで集合してホモオリゴマーとなる。細胞表面に達する前に、Ｆ０前駆体はプロテアーゼにより切断され、Ｎ末端からのＦ２とＣ末端からのＦ１となる。Ｆ２鎖及びＦ１鎖は、１又は複数のジスルフィド結合により共有結合したままである。
【０００７】
イムノアフィニティー精製した完全長Ｆタンパク質は、他の完全長ウイルス膜糖タンパク質で観察されるものと類似したミセルの形態（ロゼットとしてもまた特徴付けられる）で蓄積することが分かっている（Wrigley et al., 1986, in Electron Microscopy of Proteins, Vol 5, p. 103-163, Academic Press, London）。電子顕微鏡下では、ロゼット中の分子は、逆円錐形のロッド（約７０％）又はロリポップ形（約３０％）のいずれかの構造であって、その広いほうの端部がロゼットの中心から離れる方に突出している構造として現れる。ロッドの立体構造状態は、融合前の不活性状態におけるＦ糖タンパク質に関連している一方、ロリポップの立体構造状態は、融合後の活性状態におけるＦ糖タンパク質に関連している。
【０００８】
Calder et al., 2000, Virology 271:122-131により示されるとおり、電子顕微鏡写真を使用して前融合と後融合との（或いは、前融合性及び融合性と表される）コンホメーションを区別することができる。前融合コンホメーションはまた、リポソーム会合アッセイによっても融合性（後融合）コンホメーションと区別することができる。加えて、前融合コンホメーションと融合性コンホメーションとは、ＲＳＶ  Ｆタンパク質の前融合又は融合性のいずれか一方の形態に存在するが、他方の形態には存在しないコンホメーションエピトープを特異的に認識する抗体（例えば、モノクローナル抗体）を使用して区別することができる。かかるコンホメーションエピトープは、分子の表面上にある抗原決定基の選択的な露出に起因するものであり得る。或いは、コンホメーションエピトープは、直鎖状ポリペプチドにおいて非連続的なアミノ酸が並ぶことにより生じ得る。
【０００９】
過去に、Ｆ前駆体が２つの部位で切断されることが示されており（部位Ｉ、残基１０９位の後、及び部位ＩＩ、残基１３６位の後）、双方ともフューリン様プロテアーゼによって認識されるモチーフが先行する。部位ＩＩは融合ペプチドに隣接し、膜融合には双方の部位でのＦタンパク質の切断が必要である（Gonzalez-Reyes et al., 2001, PNAS 98(17): 9859-9864）。双方の部位における切断が完了したときに、円錐形ロッドからロリポップ形ロッドへの移行があると考えられる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本明細書に記載されるとおり、本発明者らは、驚くことに、ＲＳＶ  Ｆタンパク質の構造に対して特定の修飾が加えられると、融合（Ｆ）タンパク質の高レベルの発現が実現され得ることを発見した。かかる修飾はまた、意外にも、宿主細胞におけるＲＳＶ  Ｆタンパク質の細胞毒性を低減する。加えて、本発明の修飾Ｆタンパク質は、前融合「ロッド」形態との対照としての後融合「ロリポップ」形態を呈する能力の向上を示す。従って、一態様において、本発明の修飾Ｆタンパク質はまた、野生型Ｆタンパク質と比較して免疫原性の向上を呈することもできる。こうした修飾は、ＲＳＶの治療及び／又は予防用ワクチンの開発並びに前記ワクチンの使用方法に多大な応用を有する。本発明は、野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質と比較して、発現の増加、細胞毒性の低減、及び／又は免疫原性特性の亢進を示す組換えＲＳＶ  Ｆタンパク質を提供する。
【００１１】
一態様において、本発明は、野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質と比較して修飾された、又は変異したアミノ酸配列を含む組換えＲＳＶ  Ｆタンパク質を提供する。一般に、こうした修飾又は変異は、野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質と比較して、ＲＳＶ  Ｆタンパク質の発現を増加させ、細胞毒性を低減し、及び／又は免疫原性特性を亢進する。特定の例示的実施形態において、ＲＳＶ  Ｆタンパク質はヒトＲＳＶ  Ｆタンパク質である。
【００１２】
ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、好ましくは、野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質（例えば配列番号２に例示される）と比較して修飾された、又は変異したアミノ酸配列を含む。一実施形態において、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質（配列番号２）のＰ１０２位に対応するアミノ酸に修飾又は変異を含む。別の実施形態において、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質（配列番号２）のＩ３７９位に対応するアミノ酸に修飾又は変異を含む。別の実施形態において、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質（配列番号２）のＭ４４７位に対応するアミノ酸に修飾又は変異を含む。
【００１３】
一実施形態において、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、上記に記載される位置に対応するアミノ酸に２つ以上の修飾又は変異を含む。別の実施形態において、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、上記に記載される位置に対応するアミノ酸に３つの修飾又は変異を含む。
【００１４】
具体的な一実施形態において、本発明は、１０２位のプロリンがアラニンに置換されているＲＳＶ  Ｆタンパク質に関する。別の具体的な実施形態において、本発明は、３７９位のイソロイシンがバリンに置換されているＲＳＶ  Ｆタンパク質に関する。さらに別の具体的な実施形態において、本発明は、４４７位のメチオニンがバリンに置換されているＲＳＶ  Ｆタンパク質に関する。特定の実施形態において、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、これらの具体的な実施形態に記載される位置に対応するアミノ酸に２つ以上の修飾又は変異を含む。特定の他の実施形態において、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、これらの具体的な実施形態に記載される位置に対応するアミノ酸に３つの修飾又は変異を含む。例示的実施形態において、ＲＳＶタンパク質は配列番号４に記載されるアミノ酸配列を有する。
【００１５】
一実施形態において、ＲＳＶ  Ｆタンパク質のコード配列は、好適な宿主細胞におけるその発現を亢進させるようにさらに最適化される。一実施形態において、宿主細胞は昆虫細胞である。例示的実施形態において、昆虫細胞はＳｆ９細胞である。
【００１６】
一実施形態において、コドン最適化ＲＳＶ  Ｆ遺伝子のコード配列は配列番号３である。別の実施形態において、コドン最適化ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、配列番号４に記載されるアミノ酸配列を有する。
【００１７】
一実施形態において、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、Ｆ２のクリプティックポリ（Ａ）部位に少なくとも１つの修飾をさらに含む。別の実施形態において、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、一次切断部位（ＣＳ）に１又は複数のアミノ酸変異をさらに含む。一実施形態において、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質（配列番号２）又はコドン最適化ＲＳＶ  Ｆタンパク質（配列番号４）のＲ１３３位に対応するアミノ酸に修飾又は変異を含む。別の実施形態において、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質（配列番号２）又はコドン最適化ＲＳＶ  Ｆタンパク質（配列番号４）のＲ１３５位に対応するアミノ酸に修飾又は変異を含む。さらに別の実施形態において、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質（配列番号２）又はコドン最適化ＲＳＶ  Ｆタンパク質（配列番号４）のＲ１３６位に対応するアミノ酸に修飾又は変異を含む。
【００１８】
具体的な一実施形態において、本発明は、１３３位のアルギニンがグルタミンに置換されているＲＳＶ  Ｆタンパク質に関する。別の具体的な実施形態において、本発明は、１３５位のアルギニンがグルタミンに置換されているＲＳＶ  Ｆタンパク質に関する。さらに別の具体的な実施形態において、本発明は、１３６位のアルギニンがグルタミンに置換されているＲＳＶ  Ｆタンパク質に関する。特定の実施形態において、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、これらの具体的な実施形態に記載される位置に対応するアミノ酸に２つ以上の修飾又は変異を含む。特定の他の実施形態において、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、これらの具体的な実施形態に記載される位置に対応するアミノ酸に３つの修飾又は変異を含む。例示的実施形態において、ＲＳＶタンパク質は、配列番号６に記載されるアミノ酸配列を有する。
【００１９】
別の実施形態において、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、配列番号２、配列番号４、及び配列番号６のアミノ酸１３７〜１４６位に対応する融合ドメインのＮ末端半分に欠失をさらに含む。例示的実施形態において、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、配列番号８に記載されるアミノ酸配列を有する。代替的実施形態において、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、配列番号１０に記載されるアミノ酸配列を有する。
【００２０】
さらに、本発明の範囲内には、上記に示すものに対応する改変を含む、ヒトＲＳＶ  Ｆタンパク質（配列番号２）以外のＲＳＶ  Ｆタンパク質が含まれる。かかるＲＳＶ  Ｆタンパク質には、限定はされないが、ヒトＲＳＶのＡ株、ヒトＲＳＶのＢ株、ウシＲＳＶの株、及びトリＲＳＶの株由来のＲＳＶ  Ｆタンパク質が含まれ得る。
【００２１】
いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号２に示されるものなどの野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質と比較して、宿主細胞における発現の増加を示す修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質に関する。他の実施形態において、本発明は、配列番号２に示されるものなどの野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質と比較して、宿主細胞における細胞毒性の低減を示す修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質に関する。さらに他の実施形態において、本発明は、配列番号２に示されるものなどの野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質と比較して、免疫原性特性の亢進を示す修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質に関する。
【００２２】
さらなる態様において、本発明は、本明細書に記載されるとおりの１又は複数の修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含む免疫原性組成物を提供する。一実施形態において、本発明は、１又は複数の修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質から構成されるミセル（例えばＲＳＶ  Ｆミセル）を提供する。
【００２３】
別の実施形態において、本発明は、修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）を提供する。いくつかの実施形態において、ＶＬＰは、１又は複数のさらなるタンパク質をさらに含む。
【００２４】
一実施形態において、ＶＬＰは、マトリクス（Ｍ）タンパク質をさらに含む。一実施形態において、Ｍタンパク質は、ＲＳＶのヒト株に由来する。別の実施形態において、Ｍタンパク質は、ＲＳＶのウシ株に由来する。他の実施形態において、マトリクスタンパク質は、インフルエンザウイルス株由来のＭ１タンパク質であってもよい。一実施形態において、インフルエンザウイルス株はトリインフルエンザウイルス株である。他の実施形態において、Ｍタンパク質は、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）株に由来してもよい。
【００２５】
さらなる実施形態において、ＶＬＰは、ＲＳＶ糖タンパク質Ｇをさらに含む。別の実施形態において、ＶＬＰは、ＲＳＶ糖タンパク質ＳＨをさらに含む。さらに別の実施形態において、ＶＬＰは、ＲＳＶヌクレオカプシドＮタンパク質をさらに含む。
【００２６】
修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、ＲＳＶ感染の予防及び／又は治療に使用し得る。従って、別の態様において、本発明は、ＲＳＶに対する免疫応答を誘発する方法を提供する。方法は、修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含む組成物の免疫学的有効量を、ヒト又は動物対象などの対象に投与する工程を含む。
【００２７】
別の態様において、本発明は、修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセル、又は修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰを含む薬学的に許容可能なワクチン組成物を提供する。
【００２８】
一実施形態において、本発明は、修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質の少なくとも１つの有効用量を含む免疫原性製剤を含む。別の実施形態において、本発明は、修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセルの少なくとも１つの有効用量を含む免疫原性製剤を含む。さらに別の実施形態において、本発明は、修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰの少なくとも１つの有効用量を含む免疫原性製剤を含む。
【００２９】
別の実施形態において、本発明は、本発明のワクチン製剤の成分の１又は複数で充填された１又は複数の容器を含む医薬パック又はキットを提供する。
【００３０】
別の実施形態において、本発明は、哺乳動物に対して感染又はその疾患症状の少なくとも１つに対する免疫を誘導するワクチン又は抗原組成物を製剤化する方法であって、製剤に対し、修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセル、又は修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰの有効用量を添加することを含む方法を提供する。好ましい実施形態において、感染はＲＳＶ感染である。
【００３１】
本発明の修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、感染病原体に対する免疫又は実質的な免疫を付与する免疫応答を刺激する組成物の調製に有用である。従って、一実施形態において、本発明は、対象における感染又はその疾患症状の少なくとも１つの対する免疫を誘導する方法であって、修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセル、又は修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰの少なくとも１つの有効用量を投与する工程を含む方法を提供する。
【００３２】
さらに別の態様において、本発明は、対象におけるＲＳＶウイルス感染又はその疾患症状の少なくとも１つに対する実質的な免疫を誘導する方法であって、修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセル、又は修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰの少なくとも１つの有効用量を投与する工程を含む方法を提供する。
【００３３】
本発明の組成物は、脊椎動物（例えばヒト）に投与されるとき、脊椎動物において実質的な免疫を誘導することができる。従って、一実施形態において、本発明は、対象におけるＲＳＶウイルス感染又はその疾患症状の少なくとも１つに対する実質的な免疫を誘導する方法であって、修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセル、又は修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰの少なくとも１つの有効用量を投与する工程を含む方法を提供する。別の実施形態において、本発明は、哺乳動物に、ＲＳＶに対するワクチン接種をする方法であって、修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセル、又は修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰの防御誘導量を哺乳動物に投与する工程を含む方法を提供する。
【００３４】
別の実施形態において、本発明は、対象における感染又はその症状の少なくとも１つに対する防御抗体応答を誘導する方法であって、修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセル、又は修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰの少なくとも１つの有効用量を投与する工程を含む方法を含む。
【００３５】
別の実施形態において、本発明は、対象におけるＲＳＶ感染又はその疾患症状の少なくとも１つに対する防御細胞性応答を誘導する方法であって、修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質の少なくとも１つの有効用量を投与する工程を含む方法を含む。別の実施形態において、本発明は、対象におけるＲＳＶ感染又はその疾患症状の少なくとも１つに対する防御細胞性応答を誘導する方法であって、修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセルの少なくとも１つの有効用量を投与する工程を含む方法を含む。さらに別の実施形態において、本発明は、対象におけるＲＳＶ感染又はその疾患症状の少なくとも１つに対する防御細胞性応答を誘導する方法であって、少なくとも１つのＶＬＰの有効用量を投与する工程を含む方法を含み、ここでＶＬＰは修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含む。
【００３６】
さらに別の態様において、本発明は、本発明の修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードする単離された核酸を提供する。例示的実施形態において、修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードする単離された核酸は、配列番号３、配列番号５、配列番号７、又は配列番号９からなる群から選択される。
【００３７】
さらに別の態様において、本発明は、本発明の修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードする核酸を含む単離された細胞を提供する。例示的実施形態において、修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードする単離された核酸は、配列番号３、配列番号５、配列番号７、又は配列番号９からなる群から選択される。
【００３８】
さらに別の態様において、本発明は、本発明の修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードする核酸を含むベクターを提供する。例示的実施形態において、修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードする単離された核酸は、配列番号３、配列番号５、配列番号７、又は配列番号９からなる群から選択される。一実施形態において、ベクターはバキュロウイルスベクターである。
【００３９】
さらに別の態様において、本発明は、ＲＳＶ  Ｆタンパク質を作製する方法であって：（ａ）本発明の修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードする核酸を発現するよう、宿主細胞を形質転換する工程；及び（ｂ）前記ＲＳＶ  Ｆタンパク質の産生を導く条件下で前記宿主細胞を培養する工程；を含む方法を提供する。一実施形態において、修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードする核酸は、配列番号３、配列番号５、配列番号７、又は配列番号９からなる群から選択される。別の実施形態において、宿主細胞は昆虫細胞である。さらなる実施形態において、宿主細胞は、本発明の修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むバキュロウイルスベクターをトランスフェクトした昆虫細胞である。
【００４０】
さらに別の態様において、本発明は、ＲＳＶ  Ｆタンパク質ミセルを作製する方法であって：（ａ）本発明の修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードする核酸を発現するよう、宿主細胞を形質転換する工程；及び（ｂ）前記ＲＳＶ  Ｆタンパク質ミセルの産生を導く条件下で前記宿主細胞を培養する工程；を含む方法を提供する。一実施形態において、修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードする核酸は、配列番号３、配列番号５、配列番号７、又は配列番号９からなる群から選択される。一実施形態において、宿主細胞は昆虫細胞である。例示的実施形態において、宿主細胞は、本発明の修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むバキュロウイルスベクターをトランスフェクトした昆虫細胞である。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
図面の簡単な説明
【図１】野生型ＨＲＳＶ  Ｆ0タンパク質の構造を示す。
【図２】実施例３に記載の、切断部位変異を有する修飾ＲＳＶ  Ｆ0タンパク質の構造を示す。
【図３】修飾ＨＲＳＶ  Ｆタンパク質ＢＶ  ＃５４１（配列番号６）の一次切断部位における保存的置換（Ｒ１３３Ｑ、Ｒ１３５Ｑ及びＲ１３６Ｑ）を示す。
【図４】修飾ＨＲＳＶ  Ｆタンパク質ＢＶ  ＃５４１（配列番号６）の配列及び構造を示す。
【図５】修飾ＨＲＳＶ  Ｆタンパク質ＢＶ  ＃６２２（配列番号１０）の配列及び構造を示す。
【図６】βＭＥの存在下又は不在下での、精製組換えＨＲＳＶ  Ｆタンパク質ＢＶ  ＃６２２のＳＤＳ−ＰＡＧＥクーマシー染色ゲルを示す。
【図７】修飾ＨＲＳＶ  Ｆタンパク質ＢＶ  ＃６８３（配列番号８）の構造を示す。
【図８】βＭＥの存在下又は不在下での、精製組換えＨＲＳＶ  Ｆタンパク質ＢＶ  ＃６２２及びＢＶ  ＃６８３の、ＳＤＳ−ＰＡＧＥクーマシー染色ゲル（左）、及びそれらの構造を示す。
【図９】βＭＥの存在下又は不在下での、精製組換えＨＲＳＶ  Ｆタンパク質ＢＶ  ＃６８３の、ＳＤＳ−ＰＡＧＥクーマシー染色ゲル（左）及びウエスタンブロット（右）分析を示す。
【図１０】精製組換えＨＲＳＶ  Ｆタンパク質ＢＶ  ＃６８３の、走査デンシトメトリー（左）及びウエスタンブロット（右）による純度分析において用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥクーマシー染色ゲルを示す。
【図１１】ネガティブ染色電子顕微鏡で撮影した精製組換えＨＲＳＶ  Ｆタンパク質ＢＶ  ＃６８３ミセル（ロゼット）の像を示す。
【図１２】ＨＲＳＶ  Ｆタンパク質ＢＶ  ＃６８３ミセルの粒径分析を示す。
【図１３】粗細胞培養回収物（細胞内）又は３０％スクロース勾配分離によるペレット状試料中の、ＨＲＳＶ  ＮとＢＲＳＶ  Ｍタンパク質の共発現を伴うか又は伴わない修飾ＨＲＳＶ  Ｆタンパク質ＢＶ  ＃６２２及びＢＶ  ＃６２３（配列番号２１）の、ＳＤＳ−ＰＡＧＥクーマシー染色ゲル（左）及びウエスタンブロット（右）分析、並びにＢＶ  ＃６２２及びＢＶ  ＃６２３の構造を示す。
【図１４】粗細胞培養回収物（細胞内）試料中の、ＨＲＳＶ  ＮとＢＲＳＶ  Ｍタンパク質の共発現を伴うか又は伴わない、修飾ＨＲＳＶ  Ｆタンパク質ＢＶ  ＃６２２、ダブルタンデムキメラＢＶ  ＃６３６（ＢＶ  ＃５４１＋ＢＲＳＶ  Ｍ）、ＢＶ  ＃６８３、ＢＶ  ＃６８４（ＹＩＡＬ  Ｌ−ドメインを有するＢＶ  ＃５４１）、及びＢＶ  ＃６８５（ＹＫＫＬ  Ｌ−ドメインを有するＢＶ  ＃５４１）の、ＳＤＳ−ＰＡＧＥクーマシー染色ゲル（左）及びウエスタンブロット（右）分析、並びに分析した各修飾ＨＲＳＶ  Ｆタンパク質の構造を示す。
【図１５】３０％スクロース勾配分離によるペレット状試料中の、ＨＲＳＶ  ＮとＢＲＳＶ  Ｍタンパク質の共発現を伴うか又は伴わない、修飾ＲＳＶ  Ｆタンパク質ＢＶ  ＃６２２（配列番号１０）、ダブルタンデムキメラＢＶ  ＃６３６（ＢＶ  ＃５４１＋ＢＲＳＶ  Ｍ）、ＢＶ  ＃６８３（配列番号８）、ＢＶ  ＃６８４（ＹＩＡＬ  Ｌ−ドメインを有するＢＶ  ＃５４１）、及びＢＶ  ＃６８５（ＹＫＫＬ  Ｌ−ドメインを有するＢＶ  ＃５４１）の、ＳＤＳ−ＰＡＧＥクーマシー染色ゲル（左）及びウエスタンブロット（右）分析、並びに分析した各修飾ＨＲＳＶ  Ｆタンパク質の構造を示す。
【図１６】実施例９に記載の各修飾ＲＳＶ  Ｆタンパク質についての構造、クローン名、説明、ウエスタンブロット及びＳＤＳ−ＰＡＧＥクーマシー結果、及び結論を示す。
【図１７】実施例１０に記載のＲＳＶチャレンジ試験の実験手順を示す。
【図１８】ＰＢＳ、生ＲＳＶ、ＦＩ−ＲＳＶ、１ｕｇのＰＦＰ、１ｕｇのＰＦＰ＋ミョウバン、１０ｕｇのＰＦＰ、１０ｕｇのＰＦＰ＋ミョウバン、３０ｕｇのＰＦＰ、及び陽性対照（抗Ｆヒツジ）で免疫したマウスの、３１日目及び４６日目におけるＲＳＶ中和アッセイの結果を示す。
【図１９】感染性ＲＳＶのチャレンジ後４日目における、ＰＢＳ、生ＲＳＶ、ＦＩ−ＲＳＶ、１ｕｇのＰＦＰ、１ｕｇのＰＦＰ＋ミョウバン、１０ｕｇのＰＦＰ、１０ｕｇのＰＦＰ＋ミョウバン、及び３０ｕｇのＰＦＰで免疫したマウスの肺組織におけるＲＳＶ力価を示す。
【図２０】２〜８℃で０、１、２、４、及び５週間保存した精製組換えＲＳＶ  Ｆタンパク質ＢＶ  ＃６８３の、クーマシーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【図２１】生ＲＳＶ（ＲＳＶ）、ホルマリン不活性化ＲＳＶ（ＦＩ−ＲＳＶ）、アルミニウムを伴うか又は伴わないＲＳＶ−Ｆタンパク質ＢＶ  ＃６８３（ＰＦＰ及びＰＦＰ＋アルミニウムアジュバント）、及びＰＢＳ対照による免疫後のＲＳＶ  Ａ及びＲＳＶ  Ｂ中和抗体応答を示す。
【図２２】生ＲＳＶ、ホルマリン不活性化ＲＳＶ（ＦＩ−ＲＳＶ）、アルミニウムを伴うか又は伴わないＲＳＶ−Ｆタンパク質ＢＶ  ＃６８３（Ｆ−ミセル（３０ｕｇ）及びＦ−ミセル（３０ｕｇ）＋アルミニウムアジュバント）、及びＰＢＳ対照で免疫したラットにおけるＲＳＶによるチャレンジ後の肺病理を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
詳細な説明
定義
本明細書において、用語「アジュバント」は、製剤中で特定の免疫原（例えば修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセル、又は修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰ）と組み合わせて使用されるとき、得られる免疫応答を増強するか、あるいは改変若しくは修飾する化合物を指す。免疫応答の修飾には、抗体応答及び細胞性免疫応答の一方又は双方の特異性の強化又は拡大が含まれる。免疫応答の修飾はまた、特定の抗原特異的免疫応答の低下又は抑制も意味し得る。
【００４３】
本明細書において用語「抗原製剤」又は「抗原組成物」は、脊椎動物、特に鳥類又は哺乳類に投与されると免疫応答を誘導し得る調製物を指す。
【００４４】
本明細書において用語「トリインフルエンザウイルス」は、主として鳥類に見られるが、ヒト又は他の動物にも感染し得るインフルエンザウイルスを指す。あるケースでは、トリインフルエンザウイルスはヒトからヒトに伝染又は伝播し得る。ヒトに感染するトリインフルエンザウイルスは、インフルエンザの大流行を引き起こし、すなわちヒトにおける罹患率及び／又は死亡率の原因となる可能性を有する。大流行は、新種のインフルエンザウイルス株（ヒトが自然免疫を有しないウイルス）が現れたときに起こり、個々の地域を越えて、場合によっては全世界的に伝播し、多くの人に同時に感染する。
【００４５】
本明細書において「有効用量」は、概して、免疫を誘導し、感染を予防及び／又は改善するか、又は感染若しくは疾患の少なくとも１つの症状を軽減し、及び／又は別の用量の修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセル、又は修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰの効力を亢進させるのに十分な、本発明の修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセル、又は修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰの量を指す。有効用量は、感染又は疾患の発症を遅延させ、又は最小限に抑えるのに十分な、修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセル、又は修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰの量を指すこともある。有効用量はまた、感染又は疾患の治療又は管理において治療利益を提供するのに十分な、修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセル、又は修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰの量を指すこともある。さらに、有効用量は、単独で、又は他の療法との組み合わせで、感染又は疾患の治療又は管理において治療利益を提供する本発明の修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセル、又は修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰに関する量である。有効用量はまた、後の感染病原体又は疾患への曝露に対する対象の（例えば、ヒトの）自己免疫応答を亢進させるのに十分な量であってもよい。免疫レベルは、例えば、中和分泌及び／又は血清抗体の量を、例えばプラーク中和、相補体固定、酵素結合免疫吸着、若しくはマイクロ中和アッセイによって計測することによって、又は細胞性応答、限定はされないが、細胞傷害性Ｔ細胞、抗原提示細胞、ヘルパーＴ細胞、樹状細胞及び／又は他の細胞性応答などを計測することによって、モニタすることができる。Ｔ細胞応答は、例えば、蛍光フローサイトメトリーか、又はＴ細胞アッセイ、限定はされないが、Ｔ細胞増殖アッセイ、Ｔ細胞傷害性アッセイ、テトラマーアッセイ、及び／又はＥＬＩＳＰＯＴアッセイなどにより特異的マーカーを使用して、例えばＣＤ４+及びＣＤ８+細胞の存在量を計測することにより、モニタすることができる。ワクチンの場合、「有効用量」は、疾患を予防し、及び／又は症状の重症度を軽減する用量である。
【００４６】
本明細書において、用語「有効量」は、所望の生物学的効果を実現するのに必要な又は十分な、修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセル、又は修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰの量を指す。組成物の有効量は、選択された結果を実現する量とすることもでき、及びかかる量は、当業者によりルーチン実験の問題として決定されることが可能である。例えば、感染を予防、治療、及び／又は改善するための有効量は、本発明の修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセル、又は修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰに曝露後、免疫系の活性化を引き起こし、それにより抗原特異的な免疫応答を生じさせるために必要な量であり得る。この用語はまた、「十分量」と同義語でもある。
【００４７】
本明細書において、用語「発現」は、ポリ核酸がｍＲＮＡに転写され、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質に翻訳される過程を指す。ポリ核酸がゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、適切な真核宿主細胞又は生物が選択される場合には、ｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。本発明の文脈では、この用語はまた、ＲＳＶ  Ｆ遺伝子ｍＲＮＡ及びその発現後に得られるＲＳＶ  Ｆタンパク質の産生も包含する。
【００４８】
本明細書において、用語「Ｆタンパク質」又は「融合タンパク質」又は「Ｆタンパク質ポリペプチド」又は「融合タンパク質ポリペプチド」は、ＲＳＶ融合タンパク質ポリペプチドのアミノ酸配列の全て又は一部を有するポリペプチド又はタンパク質を指す。同様に、用語「Ｇタンパク質」又は「Ｇタンパク質ポリペプチド」は、ＲＳＶ付着タンパク質ポリペプチドのアミノ酸配列の全て又は一部を有するポリペプチド又はタンパク質を指す。多数のＲＳＶ融合及び付着タンパク質が記載されており、当業者に公知である。全体として参照により本明細書に援用される国際公開第２００８／１１４１４９号が、例示的なＦ及びＧタンパク質変異体（例えば、天然に存在する変異体）について詳説している。
【００４９】
本明細書において、用語「免疫原」又は「抗原」は、免疫応答の誘発能を有するタンパク質、ペプチド、ペプチド、核酸などの物質を指す。双方の用語とも、エピトープも包含し、同義的に用いられる。
【００５０】
本明細書において用語「免疫刺激剤」は、生体自身の化学的メッセンジャー（サイトカイン）を介した免疫応答を亢進させる化合物を指す。こうした分子は、免疫刺激活性、免疫強化活性、及び炎症誘発活性を有する様々なサイトカイン、リンホカイン及びケモカイン、例えば、インターフェロン（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３）；成長因子（例えば、顆粒球マクロファージ（ＧＭ）コロニー刺激因子（ＣＳＦ））；及び他の免疫刺激分子、例えば、マクロファージ炎症性因子、Ｆｌｔ３リガンド、Ｂ７．１；Ｂ７．２等を含む。免疫刺激剤分子は本発明のＶＬＰと同じ製剤で投与されてもよく、又は別個に投与されてもよい。タンパク質又はタンパク質をコードする発現ベクターのいずれかを投与して、免疫刺激効果をもたらすことができる。
【００５１】
本明細書において、用語「免疫原性製剤」は、脊椎動物、例えば哺乳動物に投与されると免疫応答を誘導し得る調製物を指す。
【００５２】
本明細書での使用時、用語「感染病原体」は、脊椎動物に感染を引き起こす微生物を指す。通常、生物は、ウイルス、細菌、寄生体、原生動物及び／又は真菌である。
【００５３】
本明細書において、用語「変異した」、「修飾された」、「変異」、又は「修飾」は、改変された核酸又はポリペプチドをもたらす核酸及び／又はポリペプチドの任意の修飾を指し示す。変異は、例えば、遺伝子のタンパク質コード領域内に生じる改変、並びに限定はされないが、調節配列又はプロモーター配列などのタンパク質コード配列の外側の領域における改変を含むポリヌクレオチドの単一又は複数の残基の点変異、欠失、又は挿入を含む。遺伝子改変は、いかなるタイプの変異であってもよい。例えば、変異は、遺伝子の一部又は全ての点変異、フレームシフト変異、挿入、又は欠失を構成し得る。いくつかの実施形態において、変異は天然に生じるものである。他の実施形態において、変異は人工的な変異圧の結果である。さらに他の実施形態において、ＲＳＶ  Ｆタンパク質における変異は、遺伝子操作の結果である。
【００５４】
本明細書において、用語「多価」は、複数のタイプ又は株の感染病原体又は疾患に対する１又は複数の抗原タンパク質／ペプチド又は免疫原を有する組成物を指す。
【００５５】
本明細書において、用語「薬学的に許容可能なワクチン」は、本発明の修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセル、又は修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰを含有する製剤を指し、これは脊椎動物に投与することが可能な形態であり、且つこれは感染又は疾患を予防及び／又は改善し、及び／又は感染又は疾患の少なくとも１つの症状を軽減し、及び／又は別の用量の修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセル、又は修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰの効力を亢進させる免疫を誘導するのに十分な防御免疫応答を誘導するものである。典型的には、ワクチンは従来の生理食塩水又は緩衝水溶液媒質を含み、そこに本発明の組成物が懸濁又は溶解される。この形態において、本発明の組成物を感染の予防、改善又はその他の形での治療に好都合に用いることができる。宿主に導入されると、ワクチンは、限定はされないが、抗体及び／又はサイトカインの産生、及び／又は細胞傷害性Ｔ細胞、抗原提示細胞、ヘルパーＴ細胞、樹状細胞の活性化及び／又は他の細胞性応答を含めた免疫応答を引き起こすことができる。
【００５６】
本明細書において、語句「防御免疫応答」又は「防御応答」は、脊椎動物（例えば、ヒト）が呈する、感染病原体又は疾患に対する抗体により媒介される免疫応答であって、感染を予防若しくは改善し、又はその疾患症状の少なくとも１つを軽減する免疫応答を指す。本発明の修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセル、又は修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰは、例えば、感染病原体を中和し、感染病原体が細胞に侵入するのを阻止し、感染病原体の複製を阻止し、及び／又は宿主細胞を感染及び破壊から保護する抗体の産生を刺激することができる。この用語はまた、脊椎動物（例えば、ヒト）が呈する、感染病原体又は疾患に対するＴリンパ球及び／又は他の白血球細胞により媒介される免疫応答であって、感染又は疾患を予防若しくは改善し、又はその少なくとも１つの症状を軽減する免疫応答を指すこともできる。
【００５７】
本明細書において、用語「脊椎動物」又は「対象」又は「患者」は、限定なしに、ヒト、並びにチンパンジー及び他の類人猿及びサル種などの非ヒト霊長類を含めた他の霊長類を含む脊索動物亜門（subphylum cordata）の任意のメンバーを指す。ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ及びウマなどの農場動物；イヌ及びネコなどの家畜化された哺乳動物；マウス、ラット（コットンラットを含む）及びモルモットなどのげっ歯類を含めた実験動物；ニワトリ、シチメンチョウ及び他のキジ類の鳥、アヒル、ガチョウなどの、家禽、野鳥及び狩猟鳥を含む鳥類もまた、非限定的な例である。用語「哺乳動物」及び「動物」は、この定義に含まれる。成体及び新生児の双方の個体が包含されることが意図される。特に、乳児及び低年齢幼児が、ＲＳＶワクチンに適した対象又は患者である。
【００５８】
本明細書において、用語「ウイルス様粒子」（ＶＬＰ）は、少なくとも１つの属性がウイルスに類似しているが、伝染性であると実証されたことがない構造を指す。本発明に係るウイルス様粒子は、ウイルス様粒子のタンパク質をコードする遺伝情報を有しない。一般に、ウイルス様粒子はウイルスゲノムを欠いており、従って非伝染性である。加えて、ウイルス様粒子は多くの場合に異種発現によって大量に産生することができ、且つ容易に精製することができる。
【００５９】
本明細書において、用語「キメラＶＬＰ」は、少なくとも２つの異なる感染病原体由来のタンパク質、又はその一部分を含有するＶＬＰを指す（異種タンパク質）。通常、タンパク質のうちの一つは、宿主細胞からのＶＬＰの形成を駆動することのできるウイルスに由来する。例示を目的とした例は、ＢＲＳＶ  Ｍタンパク質及び／又はＨＲＳＶ  Ｇ若しくはＦタンパク質である。用語のＲＳＶ  ＶＬＰとキメラＶＬＰとは、適切な場合には同義的に用いることができる。
【００６０】
本明細書において、用語「ワクチン」は、死滅させた、若しくは弱毒化した病原体の、又は誘導された抗原決定基の調製物であって、病原体に対する抗体又は免疫の形成を誘導するために使用される調製物を指す。ワクチンは、疾患、例えばインフルエンザウイルスによって引き起こされるインフルエンザに対する免疫を提供するために投与される。加えて、用語「ワクチン」はまた、脊椎動物に投与されることで防御免疫、すなわち、感染に付随する疾患を予防し、又はその重症度を軽減する免疫をもたらす免疫原（例えば、修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセル、又は修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰ）の懸濁液又は溶液も指す。本発明は、免疫原性であり、且つ感染に付随する疾患に対する防御を提供し得るワクチン組成物を提供する。
【００６１】
ＲＳＶ  Ｆタンパク質
２つの構造膜タンパク質であるＦ及びＧタンパク質は、ＲＳＶの表面上で発現し、中和抗体の標的であることが示されている（Sullender, W., 2000, Clinical Microbiology Review 13, 1-15）。これらの２つのタンパク質はまた、ウイルス認識及び標的細胞への侵入にも主として関与している；Ｇタンパク質は特定の細胞受容体に結合し、Ｆタンパク質はウイルスの細胞との融合を促進する。Ｆタンパク質はまた、感染細胞の表面上でも発現し、合胞体の形成をもたらす他の細胞との続く融合にも関与している。従って、Ｆタンパク質に対する抗体は、ウイルスを中和し、又はウイルスの細胞への侵入を阻止し、又は合胞体の形成を防止することができる。サブタイプＡとＢとの抗原性及び構造の違いが、Ｇタンパク質及びＦタンパク質の双方について記載されているが、Ｇタンパク質にはより大きい抗原性の違いが存在し、ここではアミノ酸配列が５３％しか相同でなく、抗原性における関連性は５％である（Walsh et al. (1987) J. Infect. Dis. 155, 1198-1204；及びJohnson et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 5625-5629）。逆に、Ｆタンパク質に対して生じる抗体は、サブタイプＡ及びＢウイルスの間で高度な交差反応性を示す。
【００６２】
ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、ビリオンのエンベロープタンパク質と宿主細胞の細胞膜との間の融合によるＲＳＶの貫通を誘導する。感染後期には、細胞表面上で発現したＦタンパク質が隣接細胞との融合を媒介し、合胞体を形成し得る。Ｆタンパク質は、Ｎ末端の切断されたシグナルペプチドとＣ末端近傍の膜アンカーとを有するＩ型膜貫通表面タンパク質である。ＲＳＶ  Ｆは、集合してホモ三量体となる不活性Ｆ0前駆体として合成され、細胞エンドプロテアーゼによりトランス−ゴルジ複合体において切断を受けて活性化され、２つのジスルフィド結合したサブユニットであるＦ1及びＦ2サブユニットを生じる。切断により作られるＦ1サブユニットのＮ末端は、標的膜に直接挿入して融合を開始する疎水性ドメイン（融合ペプチド）を含む。Ｆ1サブユニットはまたヘプタッドリピートも含み、これらは融合中に会合し、ウイルス膜と細胞膜とをごく近接させるコンホメーションシフトを駆動する（Collins and Crowe, 2007, Fields Virology, 5th ed., D.M Kipe et al., Lipincott, Williams and Wilkons, p. 1604）。配列番号２（GenBank受託番号ＡＡＢ５９８５８）は代表的なＲＳＶ  Ｆタンパク質を示し、これは配列番号１（GenBank受託番号Ｍ１１４８６）に示される遺伝子によりコードされる。
【００６３】
事実上、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、５７４アミノ酸長の、ＦＯと命名される単一のポリペプチド前駆体として発現する。生体内では、ＦＯは小胞体においてオリゴマー化し、２つの保存されたフューリンコンセンサス配列（フューリン切断部位）であるＲＡＲＲ（配列番号２３）（二次）とＫＫＲＫＲＲ（配列番号２４）（一次）とにおいてフューリンプロテアーゼによるタンパク分解性のプロセシングを受けることで、２つのジスルフィド結合した断片からなるオリゴマーを生成する。これらの断片のうち小さいほうはＦ２と称され、ＦＯ前駆体のＮ末端部分から生じる。当業者は、略称ＦＯ、Ｆ１及びＦ２が、科学論文では一般にＦ0、Ｆ1及びＦ2と表されることを認識するであろう。大きいほうのＣ末端Ｆ１断片は、２４アミノ酸の細胞質テールに隣接する疎水性アミノ酸の配列を介してＦタンパク質を膜に固定する。３つのＦ２−Ｆ１二量体が会合して成熟Ｆタンパク質を形成し、これは、標的細胞膜と接触すると誘発されてコンホメーション変化を起こす準安定前融合性（「前融合」）コンホメーションをとる。このコンホメーション変化により、融合ペプチドとして知られる疎水性配列が露出し、これが宿主細胞膜と結合して、ウイルスの膜、又は感染細胞の標的細胞膜との融合を促進する。
【００６４】
Ｆ１断片は、ＨＲＡ及びＨＲＢと命名される少なくとも２つのヘプタッドリピートドメインを含み、これらはそれぞれ、融合ペプチドドメイン及び膜貫通アンカードメインに近接して位置する。前融合コンホメーションでは、Ｆ２−Ｆ１二量体は球状ヘッドとストークの構造を形成し、ここでＨＲＡドメインは、球状ヘッドにおいてセグメント化された（伸展した）コンホメーションにある。対照的に、ＨＲＢドメインは、ヘッド領域から伸展する三本鎖コイルドコイルストークを形成する。前融合コンホメーションから後融合コンホメーションに移行する間、ＨＲＡドメインは折り畳まれ、ＨＲＢドメインに近接するようになって逆平行の６つのヘリックス束を形成する。後融合状態では、融合ペプチドドメインと膜貫通ドメインとが隣り合って並び、膜融合が促進される。
【００６５】
上記に提供されるコンホメーションについての説明は、結晶学的データの分子モデリングに基づいているが、前融合コンホメーションと後融合コンホメーションとの構造上の差異は、結晶学に頼ることなくモニタすることができる。例えば、その技術的教示を目的として参照により本明細書に援用されるCalder et al., Virology, 271:122-131 (2000)及びMorton et al., Virology, 311: 275-288に示されるとおり、電子顕微鏡写真を使用して前融合と後融合との（或いは、前融合性及び融合性と表される）コンホメーションを区別することができる。前融合コンホメーションはまた、同様にその技術的教示を目的として参照により本明細書に援用されるConnolly et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:17903-17908 (2006)に記載のリポソーム会合アッセイによっても、融合性（後融合）コンホメーションと区別することができる。加えて、前融合コンホメーションと融合性コンホメーションとは、ＲＳＶ  Ｆタンパク質の前融合又は融合性のいずれか一方の形態に存在するが、他方の形態には存在しないコンホメーションエピトープを特異的に認識する抗体（例えば、モノクローナル抗体）を使用して区別することができる。かかるコンホメーションエピトープは、分子の表面上にある抗原決定基の選択的な露出に起因するものであり得る。或いは、コンホメーションエピトープは、直鎖状ポリペプチド中では非連続的なアミノ酸が、並ぶことにより生じ得る。
【００６６】
修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質
本発明者らは、驚くことに、ＲＳＶ  Ｆタンパク質の構造に対して特定の修飾が加えられると、融合（Ｆ）タンパク質の高レベルの発現が実現され得ることを発見した。かかる修飾はまた、意外にも、宿主細胞におけるＲＳＶ  Ｆタンパク質の細胞毒性を低減する。加えて、本発明の修飾Ｆタンパク質は、前融合「ロッド」形態との対照としての後融合「ロリポップ」形態を呈する能力の向上を示す。従って、一態様において、本発明の修飾Ｆタンパク質はまた、野生型Ｆタンパク質（例えば配列番号２により例示される、これはGenBank受託番号ＡＡＢ５９８５８に対応する）と比較して免疫原性の向上（例えば亢進）を呈することもできる。こうした修飾は、ＲＳＶの治療及び／又は予防用ワクチンの開発及び前記ワクチンの使用方法に多大な応用を有する。
【００６７】
本発明に従えば、天然又は野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質に対して任意の数の変異を加えることができ、及び好ましい態様では、複数の変異を加えることにより、天然又は野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質と比較して発現及び／又は免疫原性特性の向上をもたらすことができる。かかる変異には、点変異、フレームシフト変異、欠失、及び挿入が含まれ、１又は複数（例えば、１つ、２つ、３つ、又は４つ等）の変異が好ましい。
【００６８】
天然Ｆタンパク質ポリペプチドは、ＲＳＶ  Ａ株、ＲＳＶ  Ｂ株、ＨＲＳＶ  Ａ株、ＨＲＳＶ  Ｂ株、ＢＲＳＶ株、若しくはトリＲＳＶ株の任意のＦタンパク質から、又はその変異体（上記に定義されるとおり）から選択することができる。特定の例示的実施形態において、天然Ｆタンパク質ポリペプチドは、配列番号２（GenBank受託番号ＡＡＢ５９８５８）によって表されるＦタンパク質である。本開示の理解を促進するため、全てのアミノ酸残基位置が、株にかかわらず、例示的Ｆタンパク質のアミノ酸位置に対して示される（すなわち、アミノ酸残基位置がそれに対応する）。他のＲＳＶ株由来のＦタンパク質の同等のアミノ酸位置については、当業者は、容易に利用可能な周知のアラインメントアルゴリズムを用いて（ＢＬＡＳＴなど、例えばデフォルトパラメータを使用して）選択されたＲＳＶ株のアミノ酸配列を例示的配列のアミノ酸配列と整列させることにより容易に決定することができる。種々のＲＳＶ株由来のＦタンパク質ポリペプチドの多数のさらなる例が、国際公開第２００８／１１４１４９号（これは全体として参照により本明細書に援用される）に記載されている。さらなる変異体が遺伝的浮動を通じて生じることがあり、又は部位特異的若しくはランダム変異誘発を用いて、又は２個以上の既存の変異体の組換えにより、人工的に産生され得る。かかるさらなる変異体もまた、本明細書に開示される修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質との関連において好適である。
【００６９】
変異は、当業者に公知の任意の方法論を用いて本発明のＲＳＶ  Ｆタンパク質に導入され得る。変異は、例えば、二価金属イオン補因子としてのマンガンの存在下でＰＣＲ反応を行うことにより、ランダムに導入されてもよい。或いは、コードＤＮＡ分子に沿った任意の特定の部位における全ての可能なクラスの塩基対変化を可能にするオリゴヌクレオチド特異的変異誘発を使用して、変異体又は修飾ＲＳＶ  Ｆタンパク質を作製してもよい。一般に、この技法には、目的のＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードする一本鎖ヌクレオチド配列と（１又は複数のミスマッチを除いて）相補的なオリゴヌクレオチドのアニーリングが関わる。次にミスマッチオリゴヌクレオチドがＤＮＡポリメラーゼにより伸長され、一方の鎖の配列中に所望の変化を含む二本鎖ＤＮＡ分子が生成される。配列の変化は、例えば、アミノ酸の欠失、置換、又は挿入をもたらすことができる。次に二本鎖ポリヌクレオチドを適当な発現ベクターに挿入することができ、このようにして変異体又は修飾ポリペプチドが産生され得る。上述のオリゴヌクレオチド特異的変異誘発は、例えばＰＣＲにより行うことができる。
【００７０】
さらなるＲＳＶタンパク質
本発明はまた、ＲＳＶ感染又はその疾患症状の少なくとも１つから脊椎動物（例えばヒト）を防御するためのワクチン又は抗原製剤に製剤化することのできる、修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶウイルス様粒子（ＶＬＰ）も包含する。いくつかの実施形態において、修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰはさらに、Ｍ、Ｎ、Ｇ、及びＳＨなどのさらなるＲＳＶタンパク質を含む。他の実施形態において、修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰはさらに、インフルエンザウイルスタンパク質ＨＡ、ＮＡ、及びＭ１などの異種ウイルス株由来のタンパク質を含む。一実施形態において、インフルエンザウイルスタンパク質Ｍ１は、トリインフルエンザウイルス株に由来する。
【００７１】
ＲＳＶ  Ｎタンパク質はゲノムＲＮＡ及び複製中間体抗ゲノムＲＮＡの双方と緊密に結合してＲＮアーゼ抵抗性ヌクレオカプシドを形成する。配列番号１６（野生型）及び１８（コドン最適化型）がＲＳＶ  Ｎタンパク質の代表的なアミノ酸配列を示し、配列番号１５（野生型）及び１７（コドン最適化型）が、ＲＳＶ  Ｎタンパク質をコードする代表的な核酸配列を示す。本発明には、配列番号１８と少なくとも約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％又は約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％同一であるＲＳＶ  Ｎタンパク質、並びにその全ての断片及び変異体（キメラタンパク質を含む）が包含される。
【００７２】
ＲＳＶ  Ｍタンパク質は、ウイルスの形態形成においてＲＳＶ  Ｆタンパク質及び他の因子と相互作用する、細胞膜に蓄積するグリコシル化されていない内在性のビリオンタンパク質である。特定の好ましい実施形態において、ＲＳＶ  Ｍタンパク質はウシＲＳＶ（ＢＲＳＶ）Ｍタンパク質である。配列番号１２（野生型）及び１４（コドン最適化型）がＢＲＳＶ  Ｍタンパク質の代表的なアミノ酸配列を示し、配列番号１１（野生型）及び１３（コドン最適化型）が、ＢＲＳＶ  Ｍタンパク質をコードする代表的な核酸配列を示す。本発明には、配列番号１２及び１４と少なくとも約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％又は約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％同一であるＲＳＶ（限定はされないが、ＢＲＳＶを含む）Ｍタンパク質、並びにその全ての断片及び変異体（キメラタンパク質を含む）が包含される。
【００７３】
ＲＳＶ  Ｇタンパク質は、切断されていないシグナルペプチド及び膜アンカーの双方として機能する単一の疎水性領域をＮ末端近傍に有し、分子のＣ末端３分の２が外側に向いた状態にあるＩＩ型膜貫通糖タンパク質である。ＲＳＶ  Ｇはまた、シグナル／アンカー内にあるＯＲＦの第２のＡＵＧにおける（ほぼアミノ酸４８位における）翻訳開始から生じる分泌タンパク質としても発現する。ＲＳＶ  Ｇの外部ドメインのほとんどは、ＲＳＶ株間で高い多様性がある（同上、p. 1607）。配列番号２６が代表的なＲＳＶ  Ｇタンパク質を示し、これは配列番号２５に示される遺伝子配列によってコードされる。本発明には、配列番号２６と少なくとも約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％又は約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％同一であるＲＳＶ  Ｇタンパク質、並びにその全ての断片及び変異体（キメラタンパク質を含む）が包含される。
【００７４】
ＲＳＶのＳＨタンパク質は、６４個（ＲＳＶ亜群Ａ）又は６５個（ＲＳＶ亜群Ｂ）のアミノ酸残基を含むＩＩ型膜貫通タンパク質である。いくつかの研究では、ＲＳＶ  ＳＨタンパク質がウイルス融合において、又は膜貫通性の変化において役割を有し得ることが示唆されている。しかしながら、ＳＨ遺伝子を持たないＲＳＶが生存可能であり、合胞体形成を引き起こし、及び野生型ウイルスと同じく良好に成長することから、ＳＨタンパク質がウイルスの宿主細胞への侵入又は合胞体形成に必須ではないことが示される。ＲＳＶのＳＨタンパク質については、ＴＮＦ−αシグナル伝達を阻害する能力が示されている。配列番号２７が、ＲＳＶ  ＳＨタンパク質の代表的なアミノ酸配列を示す。本発明には、配列番号２７と少なくとも約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％又は約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％同一であるＲＳＶ  ＳＨタンパク質、並びにその全ての断片及び変異体（キメラタンパク質を含む）が包含される。
【００７５】
ＲＳＶワクチン
現在、ＲＳＶ疾患の予防に対して唯一認可が下りている手法は、受動免疫法である。ＩｇＧの防御的役割を示唆する初期のエビデンスは、フェレット（Prince, G. A., Ph.D. diss., University of California, Los Angeles, 1975）及びヒト（Lambrecht et al., (1976) J. Infect. Dis. 134, 211-217；及びGlezen et al. (1981) J. Pediatr. 98,708-715）における移行抗体(maternal antibldy)が関わる観察から得られた。Hemming et al.（Morell et al., eds., 1986, Clinical Use of Intravenous Immunoglobulins, Academic Press, London 285-294頁）は、新生児敗血症を有することが疑われる新生児における静注用免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）の薬物動態が関わる研究のなかで、ＲＳＶ感染の治療又は予防にＲＳＶ抗体が有用である可能性を認識した。彼らは、呼吸器分泌物からＲＳＶが得られた１人の乳児が、ＩＶＩＧ注入後に急速に回復したことを指摘した。続くＩＶＩＧロットの分析から、著しく高いＲＳＶ中和抗体力価が明らかとなった。次に、この同じ研究者グループは、ＲＳＶ中和抗体を濃縮した高度免疫血清又は免疫グロブリンの、ＲＳＶ感染からコットンラット及び霊長類を防御する能力を調べた（Prince et al. (1985) Virus Res. 3, 193-206；Prince et al. (1990) J. Virol. 64, 3091-3092。これらの研究の結果から、予防的に投与されたＲＳＶ中和抗体がコットンラットにおいて気道でのＲＳＶ複製を阻害することが示唆された。治療的に投与されるとき、ＲＳＶ抗体は、コットンラット及び非ヒト霊長類モデルの双方において肺でのウイルス複製を低減した。さらに、免疫血清又は免疫グロブリンの受動注入が、続いてＲＳＶによりチャレンジしたコットンラットにおいて肺病理の亢進をもたらすことはなかった。
【００７６】
ＲＳＶ感染は、脊椎動物に中和抗体を提供することにより予防することができるため、修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むワクチンは、脊椎動物に投与されると、生体内で中和抗体を誘導し得る。修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、有利にはＲＳＶ感染の予防及び／又は治療に使用される。従って、本開示の別の態様は、ＲＳＶに対する免疫応答を誘発する方法に関する。前記方法は、対象（ヒト又は動物対象など）に修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含む組成物の免疫学的有効量を投与する工程を含む。組成物の免疫学的有効量の投与が、修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質に存在するエピトープに特異的な免疫応答を誘発する。かかる免疫応答には、Ｂ細胞応答（例えば、中和抗体の産生）及び／又はＴ細胞応答（例えば、サイトカインの産生）が含まれ得る。好ましくは、修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質により誘発される免疫応答は、修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質に存在する少なくとも１つのコンホメーションエピトープに特異的なエレメントを含む。一実施形態において、免疫応答は、「ロリポップ」後融合活性状態に見られるＲＳＶ  Ｆタンパク質に存在するエピトープに特異的である。ＲＳＶ  Ｆタンパク質及び組成物は、ＲＳＶとの接触後にウイルス性疾患を亢進させることなく、対象に投与されることができる。好ましくは、本明細書に開示される修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質及び好適に製剤化された免疫原性組成物は、ＲＳＶ感染を軽減若しくは予防し、及び／又はＲＳＶ感染後の病理学的応答を軽減若しくは予防するＴｈ１バイアス免疫応答を誘発する。
【００７７】
一実施形態において、本発明のＲＳＶ  Ｆタンパク質はミセル（例えばロゼット）の形態で見られる。本発明に従い得ることのできるミセルは、ロゼット様構造を有する免疫原性的に活性のＦスパイクタンパク質凝集体からなる。ロゼットは、電子顕微鏡で見ることができる（Calder et al., 2000, Virology 271: 122-131）。好ましくは、修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含む本発明のミセルは、後融合活性状態を示す「ロリポップ」形態を呈する。一実施形態において、ミセルは宿主細胞における発現後に精製される。対象に投与されると、本発明のミセルは好ましくは中和抗体を誘導する。いくつかの実施形態において、ミセルはアジュバントと共に投与され得る。他の実施形態において、ミセルはアジュバントなしで投与され得る。
【００７８】
別の実施形態において、本発明は、ＲＳＶ感染又はその疾患症状の少なくとも１つから脊椎動物（例えばヒト）を防御するためのワクチン又は抗原製剤に製剤化することのできる、修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶウイルス様粒子（ＶＬＰ）を包含する。本発明はまた、宿主細胞にトランスフェクトされるとＲＳＶタンパク質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）を産生し得る、異なるＲＳＶウイルス株に由来する野生型及び変異ＲＳＶ遺伝子又はそれらの組み合わせを含むＲＳＶ  ＶＬＰ及びベクターにも関する。
【００７９】
いくつかの実施形態において、ＲＳＶウイルス様粒子は、少なくとも１つのウイルスマトリクスタンパク質（例えばＲＳＶ  Ｍタンパク質）をさらに含み得る。一実施形態において、Ｍタンパク質はＲＳＶのヒト株に由来する。別の実施形態において、Ｍタンパク質はＲＳＶのウシ株に由来する。他の実施形態において、マトリクスタンパク質は、インフルエンザウイルス株由来のＭ１タンパク質であってもよい。一実施形態において、インフルエンザウイルス株はトリインフルエンザ株である。好ましい実施形態において、トリインフルエンザ株はＨ５Ｎ１株Ａ／Indonesia／５／０５である。他の実施形態において、マトリクスタンパク質はニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）由来であってもよい。
【００８０】
いくつかの実施形態において、ＶＬＰは、ＲＳＶ  Ｇタンパク質をさらに含み得る。一実施形態において、Ｇタンパク質は、ＨＲＳＶ  Ａ群由来であってもよい。別の実施形態において、Ｇタンパク質は、ＨＲＳＶ  Ｂ群由来であってもよい。さらに別の実施形態において、ＲＳＶ  Ｇは、ＨＲＳＶ  Ａ群及び／又はＢ群に由来してもよい。
【００８１】
いくつかの実施形態において、ＶＬＰは、ＲＳＶ  ＳＨタンパク質をさらに含み得る。一実施形態において、ＳＨタンパク質は、ＨＲＳＶ  Ａ群由来であってもよい。別の実施形態において、ＳＨタンパク質は、ＨＲＳＶ  Ｂ群由来であってもよい。さらに別の実施形態において、ＲＳＶ  ＳＨは、ＨＲＳＶ  Ａ群及び／又はＢ群に由来してもよい。
【００８２】
いくつかの実施形態において、ＶＬＰは、ＲＳＶ  Ｎタンパク質をさらに含み得る。一実施形態において、Ｎタンパク質は、ＨＲＳＶ  Ａ群由来であってもよい。別の実施形態において、Ｎタンパク質は、ＨＲＳＶ  Ｂ群由来であってもよい。さらに別の実施形態において、ＲＳＶ  Ｎは、ＨＲＳＶ  Ａ群及び／又はＢ群に由来してもよい。
【００８３】
さらなる実施形態において、本発明のＶＬＰは、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）及び／又はノイラミニダーゼ（ＮＡ）などの１又は複数の異種免疫原を含み得る。
【００８４】
いくつかの実施形態において、本発明はまた、１又は複数のＶＬＰにおける同じ、及び／又は異なる株由来の異なるＲＳＶ  Ｍ、Ｆ、Ｎ、ＳＨ、及び／又はＧタンパク質の組み合わせも含む。加えて、ＶＬＰは、免疫応答を亢進させるための１又は複数のさらなる分子を含むことができる。
【００８５】
本発明の別の実施形態において、ＲＳＶ  ＶＬＰは、核酸、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、化学療法剤、造影剤、及び／又は患者に送達される必要がある他の薬剤などの薬剤を含むことができる。
【００８６】
本発明のＶＬＰは、ワクチン及び免疫原性組成物の調製に有用である。ＶＬＰの一つの重要な特徴は、脊椎動物の免疫系が目的のタンパク質に対する免疫応答を誘導するように目的の表面タンパク質を発現する能力である。しかしながら、全てのタンパク質がＶＬＰの表面上で発現することができるとは限らない。特定のタンパク質がＶＬＰの表面上で発現しない、又は発現しにくい理由は多くあり得る。一つの理由は、タンパク質が宿主細胞の膜に特異的でないこと、又はタンパク質が膜貫通ドメインを有しないことである。例として、インフルエンザ赤血球凝集素のカルボキシル末端近傍の配列は、成熟インフルエンザのエンベロープを有するヌクレオカプシドの脂質二重層へのＨＡの取り込みに重要であり、かつインフルエンザマトリクスタンパク質Ｍ１とのＨＡ三量体相互作用の組み立てに重要であり得る（Ali, et al., (2000) J. Virol. 74, 8709-19）。
【００８７】
従って、本発明の一実施形態は、ＲＳＶ由来の修飾又は変異Ｆタンパク質と、通常は細胞表面上で効率的に発現しない、又は通常のＲＳＶタンパク質ではない少なくとも１つの免疫原とを含むキメラＶＬＰを含む。一実施形態において、修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、目的の免疫原と融合し得る。別の実施形態において、修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、異種ウイルス表面膜タンパク質、例えばＭＭＴＶエンベロープタンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質テールを介して免疫原と会合する。
【００８８】
本発明の他のキメラＶＬＰは、修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質と、異種感染病原体由来の少なくとも１つのタンパク質とを含むＶＬＰを含む。異種感染病原体の例には、限定はされないが、ウイルス、細菌、原生動物、真菌及び／又は寄生体が含まれる。一実施形態において、別の感染病原体由来の免疫原は異種ウイルスタンパク質である。別の実施形態において、異種感染病原体由来のタンパク質はエンベロープ関連タンパク質である。別の実施形態において、別の異種感染病原体由来のタンパク質はＶＬＰの表面上で発現する。別の実施形態において、感染病原体由来のタンパク質は、脊椎動物において防御免疫応答を生じさせ得るエピトープを含む。一実施形態において、別の感染病原体由来のタンパク質は、修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質と共発現する。別の実施形態において、別の感染病原体由来のタンパク質は修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質と融合する。別の実施形態において、別の感染病原体由来のタンパク質の一部分のみが修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質と融合する。別の実施形態において、別の感染病原体由来のタンパク質の一部分のみが修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質の一部分と融合する。別の実施形態において、修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質と融合する別の感染病原体由来のタンパク質の一部分は、ＶＬＰの表面上で発現する。
【００８９】
本発明はまた、本発明のＶＬＰ上又はＶＬＰ内で発現するタンパク質の変異体も包含する。変異体は、構成タンパク質のアミノ酸配列の改変を含み得る。タンパク質に関連して用語「変異体」は、参照配列に対して１又は複数のアミノ酸が改変されているアミノ酸配列を指す。変異体は「保存的な」変化を有することができ、ここでは置換されたアミノ酸が同様の構造的又は化学的特性を有し、例えばロイシンのイソロイシンとの置換である。或いは、変異体は「非保存的な」変化を有することもでき、例えばグリシンのトリプトファンとの置換である。類似した小さい変異としてはまた、アミノ酸欠失又は挿入、又はその双方が含まれ得る。生物学的又は免疫学的活性を失うことなくどのアミノ酸残基が置換、挿入、又は欠失され得るかを判断する際の指針は、当該技術分野において周知のコンピュータプログラム、例えばDNASTARソフトウェアを使用して見出すことができる。
【００９０】
天然変異体は、タンパク質における変異に起因して生じ得る。こうした変異は、感染病原体、例えばインフルエンザの個々の群内における抗原性のばらつきをもたらし得る。従って、例えばインフルエンザ株に感染した人は、当該ウイルスに対する抗体を作り出し、新しいウイルス株が現れると、古い株に対する抗体はもはや新しいウイルスを認識せず、再感染が起こり得る。本発明は、ＶＬＰを作製するための感染病原体由来のタンパク質の全ての抗原性の及び遺伝的なばらつきを包含する。
【００９１】
クローニング、変異、細胞培養などの、本発明に適用可能な分子生物学的技法について記載している一般的なテキストには、Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, Calif.（Berger）；Sambrook et al., Molecular Cloning--A Laboratory Manual (3rd Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 2000（「Sambrook」）及びCurrent Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, Greene Publishing Associates, Inc.とJohn Wiley & Sons, Inc.,との合弁事業（「Ausubel」）が含まれる。これらのテキストは、変異誘発、ベクターの使用、プロモーター、並びに例えばＲＳＶのＦ及び／又はＧ分子のクローニング及び変異導入等に関連する他の多くの関連トピックについて記載している。従って、本発明はまた、本発明のＶＬＰ上又はＶＬＰ内で発現するタンパク質の特性を改良又は改変するためのタンパク質工学及び組換えＤＮＡ技術の公知の方法の使用も包含する。様々なタイプの変異誘発を使用して、タンパク質分子をコードする変異核酸を産生及び／又は単離し、及び／又は本発明のＶＬＰ内又はＶＬＰ上のタンパク質をさらに修飾し／変異させることができる。これには、限定はされないが、部位特異的ランダム点変異誘発、相同組換え（ＤＮＡシャフリング）、ウラシル含有鋳型を使用する変異誘発、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発、ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ変異誘発、ギャップドデュプレックスＤＮＡを使用する変異誘発などが含まれる。さらなる好適な方法には、点ミスマッチ修復、修復欠損宿主株を使用する変異誘発、制限選択及び制限精製、欠失変異誘発、全遺伝子合成による変異誘発、二本鎖切断修復などが含まれる。例えばキメラコンストラクトが関わる変異誘発もまた、本発明に含まれる。一実施形態において、変異誘発は、天然に存在する分子、又は改変された若しくは変異した天然に存在する分子の既知の情報、例えば、配列、配列比較、物理的特性、結晶構造などを指針とし得る。
【００９２】
本発明は、実質的な生物活性を示し、例えば、本発明のＶＬＰ上又はＶＬＰ内で発現すると有効な抗体応答を誘発することが可能なタンパク質変異体をさらに含む。かかる変異体は、当該技術分野において公知の通則に従い活性に対してほとんど影響を有しないように選択される欠失、挿入、逆位、反復、及び置換を含む。
【００９３】
タンパク質のクローニング方法は、当該技術分野において公知である。例えば、特定のＲＳＶタンパク質をコードする遺伝子は、ＲＳＶウイルスに感染させた細胞から抽出したポリアデニル化ｍＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによって単離することができる。得られる産物遺伝子は、ＤＮＡインサートとしてベクターにクローニングすることができる。用語「ベクター」は、核酸を増殖させたり、及び／又は生物、細胞、若しくは細胞成分間で移動したりすることができる手段を指す。ベクターには、自己複製する、又は宿主細胞の染色体に組み込まれることのできるプラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、プロウイルス、ファージミド、トランスポゾン、人工染色体などが含まれる。ベクターはまた、自己複製しないネイキッドＲＮＡポリヌクレオチド、ネイキッドＤＮＡポリヌクレオチド、同じ株内のＤＮＡとＲＮＡとの双方から構成されるポリヌクレオチド、ポリ−リジン結合ＤＮＡ又はＲＮＡ、ペプチド結合ＤＮＡ又はＲＮＡ、リポソーム結合ＤＮＡなどであってもよい。全てではないが、多くの共通する実施形態では、本発明のベクターはプラスミド又はバクミドである。
【００９４】
従って、本発明は、本発明のＶＬＰの形成を誘導する細胞内で発現することのできる発現ベクターにクローニングされた、キメラ分子を含めたタンパク質をコードするヌクレオチドを含む。「発現ベクター」は、発現の促進、並びにそこに組み込まれた核酸の複製が可能なプラスミドなどのベクターである。典型的には、発現させる核酸は、プロモーター及び／又はエンハンサーに「作動可能に連結」されており、プロモーター及び／又はエンハンサーによる転写調節制御を受ける。一実施形態において、ヌクレオチドは修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質（上記に考察されるとおり）をコードする。別の実施形態において、ベクターは、Ｍ及び／又はＧ  ＲＳＶタンパク質をコードするヌクレオチドをさらに含む。別の実施形態において、ベクターは、Ｍ及び／又はＮ  ＲＳＶタンパク質をコードするヌクレオチドをさらに含む。別の実施形態において、ベクターは、Ｍ、Ｇ及び／又はＮ  ＲＳＶタンパク質をコードするヌクレオチドをさらに含む。別の実施形態において、ベクターは、ＢＲＳＶ  Ｍタンパク質及び／又はＮ  ＲＳＶタンパク質をコードするヌクレオチドをさらに含む。別の実施形態において、ベクターは、ＢＲＳＶ  Ｍ及び／又はＧタンパク質、又はインフルエンザＨＡ及び／又はＮＡタンパク質をコードするヌクレオチドをさらに含む。別の実施形態において、ヌクレオチドは、修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆ及び／又はＲＳＶ  Ｇタンパク質をインフルエンザＨＡ及び／又はＮＡタンパク質と共にコードする。別の実施形態において、発現ベクターはバキュロウイルスベクターである。
【００９５】
本発明のいくつかの実施形態において、タンパク質は、サイレント置換、付加、又は欠失を生じさせるが、しかしコードされるタンパク質の特性若しくは活性又はタンパク質の作られ方は改変させないような改変を含む変異を含み得る。ヌクレオチド変異体は、様々な理由（、例えば、特定の宿主に対してコドン発現を最適化するため）により産生され得る（ヒトｍＲＮＡにおけるコドンをＳｆ９細胞などの昆虫細胞に好ましいものに変化させる。全ての目的のために全体として参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００５／０１１８１９１号を参照のこと。
【００９６】
加えて、ヌクレオチドを配列決定して、正しいコード領域がクローニングされたこと、及びいかなる不要な変異も含まないことを確実にすることができる。ヌクレオチドは、任意の細胞において発現させるため発現ベクター（例えばバキュロウイルス）にサブクローニングすることができる。上記は、ＲＳＶウイルスタンパク質をクローニングすることのできる方法の一例に過ぎない。当業者は、さらなる方法を利用することができ、それが可能であることを理解するであろう。
【００９７】
本発明はまた、Ｆ、Ｍ、Ｇ、Ｎ、ＳＨ、又はその一部分、及び／又は上記に記載される任意のキメラ分子を含めたＲＳＶ構造遺伝子をコードするＲＳＶヌクレオチドを含むコンストラクト及び／又はベクターも提供する。ベクターは、例えば、ファージ、プラスミド、ウイルス、又はレトロウイルスベクターであってもよい。Ｆ、Ｍ、Ｇ、Ｎ、ＳＨ、又はその一部分、及び／又は上記に記載される任意のキメラ分子を含めたＲＳＶ構造遺伝子を含むコンストラクト及び／又はベクターは、適切なプロモーターに作動可能に連結されなければならず、ＡｃＭＮＰＶポリヘドリンプロモーター（又は他のバキュロウイルス）、ファージλＰＬプロモーター、大腸菌（E. coli）ｌａｃ、ｐｈｏＡ及びｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期及び後期プロモーター、並びにレトロウイルスＬＴＲのプロモーターなどが非限定的な例である。他の好適なプロモーターは、宿主細胞及び／又は所望の発現速度に応じて当業者に周知であろう。発現コンストラクトは、転写開始、終結のための部位、及び転写領域のなかに、翻訳のためのリボソーム結合部位をさらに含み得る。コンストラクトによって発現する転写産物のコード部分は、好ましくは、翻訳されるポリペプチドの始端に翻訳開始コドンを、及び終端に適切に位置決めされた終止コドンを含み得る。
【００９８】
発現ベクターは、好ましくは少なくとも１つの選択可能なマーカーを含み得る。かかるマーカーには、真核細胞培養用のジヒドロ葉酸還元酵素、Ｇ４１８又はネオマイシン耐性、並びに大腸菌（E. coli）及び他の細菌における培養のためのテトラサイクリン、カナマイシン又はアンピシリン耐性遺伝子が含まれる。ベクターのなかで好ましいのは、バキュロウイルス、ポックスウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、アビポックスウイルス、カナリア痘ウイルス、鷄痘ウイルス、アライグマポックスウイルス、豚痘ウイルス等）、アデノウイルス（例えば、イヌアデノウイルス）、ヘルペスウイルス、及びレトロウイルスなどのウイルスベクターである。本発明で使用することのできる他のベクターは、pQE70、pQE60及びpQE-9、pBluescriptベクター、Phagescriptベクター、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A、ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5を含む、細菌において使用されるベクターを含む。好ましい真核生物ベクターのなかには、pFastBac1  pWINEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1及びpSG、pSVK3、pBPV、pMSG、及びpSVLがある。他の好適なベクターは当業者に容易に明らかであろう。一実施形態において、修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆ遺伝子、及びＭ、Ｇ、Ｎ、ＳＨ又はその一部分、及び／又は上記に記載される任意のキメラ分子の遺伝子を含めたＲＳＶ遺伝子をコードするヌクレオチドを含むベクターは、pFastBacである。
【００９９】
上述の組換えコンストラクトを使用して、修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質及び少なくとも１つの免疫原を含めたＲＳＶタンパク質をトランスフェクトし、感染させ、又は形質転換させて、それを発現させることが可能となり得る。一実施形態において、組換えコンストラクトは、真核細胞及び／又は原核細胞中に、修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆ、Ｍ、Ｇ、Ｎ、ＳＨ、又はその一部分、及び／又は上記に記載される任意の分子を含む。このように、本発明は、修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆ；及び限定はされないが、ＲＳＶ  Ｇ、Ｎ、及びＳＨ、又はその一部分などの少なくとも１つの免疫原、及び／又は上記に記載される任意の分子を含めたＲＳＶ構造遺伝子をコードする核酸を含むあるベクター（又は複数のベクター）であって、ＶＬＰの形成を可能にする条件下で宿主細胞においてＲＳＶ  Ｆ、Ｇ、Ｎ、Ｍ、又はＳＨ又はその一部分、及び／又は上記に記載される任意の分子を含めた遺伝子の発現を可能にするベクターを含む宿主細胞を提供する。
【０１００】
真核宿主細胞のなかには、酵母、昆虫、鳥類、植物、Ｃ．エレガンス（C. elegans）（すなわち線虫）及び哺乳動物宿主細胞がある。昆虫細胞の非限定的な例は、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）（Ｓｆ）細胞、例えばＳｆ９、Ｓｆ２１、トリコプルシア・ニ（Trichoplusia ni）細胞、例えばHigh Five細胞、及びショウジョウバエ属（Drosophila）Ｓ２細胞である。真菌（酵母を含む）宿主細胞の例は、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）、クルイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）（Ｋ．ラクチス（K. lactis））、Ｃ．アルビカンス（C. albicans）及びＣ．グラブラタ（C. glabrata）を含むカンジダ属（Candida）の種、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）（Ｓ．ポンベ（S. pombe））、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、及びヤロウイア・リポリチカ（Yarrowia lipolytica）である。哺乳動物細胞の例は、ＣＯＳ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、マウスＬ細胞、ＬＮＣａＰ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞、及びアフリカミドリザル細胞、ＣＶ１細胞、ヒーラー細胞、ＭＤＣＫ細胞、ベロ及びＨｅｐ−２細胞である。アフリカツメガエル卵母細胞、又は両生類起源の他の細胞もまた、用いられ得る。原核宿主細胞の例としては、細菌細胞、例えば、大腸菌（E. coli）、Ｂ．スブチリス（B. subtilis）、サルモネラ・チフィ（Salmonella typhi）及びマイコバクテリアが含まれる。
【０１０１】
ベクター、例えば、修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質；及び限定はされないが、ＲＳＶ  Ｇ、Ｎ、又はＳＨ又はその一部分を含めた少なくとも１つの免疫原、及び／又は上記に記載される任意のキメラ分子のポリヌクレオチドを含むベクターは、当該技術分野において周知の方法により宿主細胞にトランスフェクトされ得る。例えば、真核細胞への核酸の導入は、リン酸カルシウム共沈殿、電気穿孔、マイクロインジェクション、リポフェクション、及びポリアミントランスフェクション試薬を用いるトランスフェクションによることができる。一実施形態において、ベクターは組換えバキュロウイルスである。別の実施形態において、組換えバキュロウイルスは真核細胞にトランスフェクトされる。好ましい実施形態において、細胞は昆虫細胞である。別の実施形態において、昆虫細胞はＳｆ９細胞である。
【０１０２】
本発明はまた、ＶＬＰ産生の効率を高め得るコンストラクト及び方法も提供する。例えば、ＲＳＶ  Ｆ、Ｍ、Ｇ、Ｎ、ＳＨ、又はその一部分、及び／又は上記に記載される任意のキメラ又は異種分子に対してリーダー配列を付加すると、細胞内でのタンパク質輸送の効率を向上させることができる。例えば、異種シグナル配列を、Ｆ、Ｍ、Ｇ、Ｎ、ＳＨ、又はその一部分、及び／又は上記に記載される任意のキメラ又は異種分子と融合させることができる。一実施形態において、シグナル配列は、昆虫細胞の遺伝子から誘導し、Ｍ、Ｆ、Ｇ、Ｎ、ＳＨ、又はその一部分、及び／又は上記に記載される任意のキメラ又は異種分子と融合させることができる。別の実施形態において、シグナルペプチドはキチナーゼシグナル配列であり、これはバキュロウイルス発現系で効率的に機能する。
【０１０３】
ＶＬＰ産生の効率を高める別の方法は、修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、Ｍ、Ｇ、Ｎ、ＳＨ又はその一部分、及び／又は上記に記載される任意のキメラ又は異種分子を含めたＲＳＶをコードするヌクレオチドを、特定の細胞型に対してコドン最適化することである。Ｓｆ９細胞における発現についてのコドン最適化核酸の例については、配列番号３、５、７、９、１３、１７、１９、及び２５を参照のこと。
【０１０４】
本発明はまた、ＶＬＰを産生する方法も提供し、前記方法は、修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、及び限定はされないが、ＲＳＶ  Ｍ、Ｇ、Ｎ、ＳＨ、又はその一部分を含めた少なくとも１つのさらなるタンパク質、及び／又は上記に記載される任意のキメラ又は異種分子を含むＲＳＶ遺伝子を、ＶＬＰの形成を可能にする条件下で発現させることを含む。選択された発現系及び宿主細胞に応じて、ＶＬＰは、組換えタンパク質が発現してＶＬＰが形成される条件下で発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を成長させることにより産生される。一実施形態において、本発明は、ＶＬＰを産生する方法であって、少なくとも１つの修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードするベクターを好適な宿主細胞にトランスフェクトする工程、及びＶＬＰの形成を可能にする条件下で修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を発現させる工程を含む方法を含む。別の実施形態において、真核細胞は、酵母、昆虫、両生類、鳥類又は哺乳動物細胞からなる群から選択される。適切な成長条件の選択は、当該技術分野の技術又は当該技術分野の通常の技術の当業者の範囲内である。
【０１０５】
本発明のＶＬＰを産生するように操作された細胞を成長させる方法には、限定はされないが、バッチ、フェドバッチ、連続及び灌流細胞培養技法が含まれる。細胞培養とは、細胞が増殖し、且つ精製及び単離されるタンパク質（例えば組換えタンパク質）を発現するバイオリアクター（発酵チャンバ）内での細胞の成長及び増殖を意味する。典型的には、細胞培養は、バイオリアクターにおける無菌の、制御された温度及び気圧条件下で実施される。バイオリアクターは細胞を培養するために使用されるチャンバであり、温度、気圧、撹拌及び／又はｐＨなどの環境条件を監視することができるものである。一実施形態において、バイオリアクターはステンレス鋼チャンバである。別の実施形態において、バイオリアクターは予め滅菌されたプラスチック袋（例えばCellbag（登録商標）、Wave Biotech、Bridgewater、NJ）である。他の実施形態において、予め滅菌されたプラスチック袋は、約５０Ｌ〜１０００Ｌの袋である。
【０１０６】
次にＶＬＰは、勾配遠心分離、例えば、塩化セシウム、スクロース及びイオジキサノール、並びに、例えばイオン交換及びゲルろ過クロマトグラフィーを含めた標準的な精製技法により、その完全性を保つ方法を用いて単離される。
【０１０７】
以下は、本発明のＶＬＰを作製し、単離し、及び精製することができる方法の例である。通常、ＶＬＰは、細胞が細胞培養（上記を参照）で成長するとＶＬＰを作り出すように操作された組換え細胞系から産生される。当業者は、本発明のＶＬＰの作製及び精製に利用することのできるさらなる方法があり、従って本発明は記載される方法に限定されないことを理解するであろう。
【０１０８】
本発明のＶＬＰの産生は、Ｓｆ９細胞（非感染）を振盪フラスコに播種し、細胞の成長及び増加に伴い細胞を拡大及びスケールアップする（例えば１２５ｍｌフラスコから５０Ｌのウェーブバッグ（Wave bag）に）ことから開始され得る。細胞を成長させるために使用される培地は、適切な細胞系に対して配合される（好ましくは無血清培地、例えば昆虫培地ExCe11-420、JRH）。次に、細胞を最も効率的な感染多重度（例えば、細胞当たり約１〜約３プラーク形成単位）で組換えバキュロウイルスに感染させる。感染が起こると、修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、Ｍ、Ｇ、Ｎ、ＳＨ、又はその一部分、及び／又は上記に記載される任意のキメラ又は異種分子がウイルスゲノムから発現し、ＶＬＰ内に自己組織化し、感染の約２４〜７２時間後に細胞から分泌される。通常、感染は、細胞が成長の対数期中期にあるとき最も効率的であり（４〜８×１０6細胞／ｍｌ）、少なくとも約９０％が生存可能である。
【０１０９】
本発明のＶＬＰは、感染の約４８〜９６時間後、細胞培養培地中のＶＬＰのレベルがほぼ最大になったときに、しかし広範な細胞溶解の前に、回収することができる。回収時点でのＳｆ９細胞密度及び生存率は、色素排除アッセイにより示されるとき約０．５×１０6細胞／ｍｌ〜約１．５×１０6細胞／ｍｌで、少なくとも２０％の生存率であり得る。次に、培地を取り除き、清澄化する。培地にＮａＣｌを約０．４〜約１．０Ｍ、好ましくは約０．５Ｍの濃度まで添加して、ＶＬＰの凝集を回避することができる。本発明のＶＬＰを含む細胞培養培地からの細胞及び細胞デブリの除去は、使い捨ての予め滅菌された中空糸０．５又は１．００μｍフィルタカートリッジ又は同様のデバイスによるタンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）により達成することができる。
【０１１０】
次に、清澄化した培養培地中のＶＬＰを、使い捨ての予め滅菌された５００，０００分子量カットオフ中空糸カートリッジを使用することによる限外ろ過により濃縮することができる。濃縮したＶＬＰは、０．５ＭのＮａＣｌを含有する１０容量ｐＨ７．０〜８．０のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で透析ろ過し、残留培地成分を除去することができる。
【０１１１】
濃縮し、透析ろ過したＶＬＰは、０．５ＭのＮａＣｌを含むｐＨ７．２のＰＢＳ緩衝液中の２０％〜６０％不連続スクロース勾配で、約４℃〜約１０℃において６，５００×ｇで１８時間遠心することによりさらに精製することができる。通常、ＶＬＰは、約３０％〜約４０％スクロースに、又は界面に（２０％及び６０％ステップ勾配において）特徴的な目に見えるバンドを形成し、これを勾配から回収して保存することができる。この生成物は、精製プロセスにおける次の工程のため、調製物中に２００ｍＭのＮａＣｌを含むまで希釈することができる。この生成物はＶＬＰを含有するとともに、無傷のバキュロウイルス粒子を含有し得る。
【０１１２】
ＶＬＰのさらなる精製は、陰イオン交換クロマトグラフィー、又は４４％等密度スクロースクッション遠心分離により実現することができる。陰イオン交換クロマトグラフィーでは、スクロース勾配（上記を参照）からの試料が、陰イオンを含む媒質（例えばMatrix Fractogel EMD TMAE）が入ったカラムに負荷され、ＶＬＰを他の混入物（例えばバキュロウイルス及びＤＮＡ／ＲＮＡ）と分離することができる塩勾配（約０．２Ｍ〜約１．０ＭのＮａＣｌ）を介して溶出される。スクロースクッション方法では、ＶＬＰを含む試料が４４％スクロースクッションに添加され、３０，０００ｇで約１８時間遠心される。ＶＬＰは４４％スクロースの最上部にバンドを形成し、一方、バキュロウイルスは底に沈殿し、及び他の夾雑タンパク質は最上部の０％スクロース層に留まる。ＶＬＰピーク又はバンドは回収される。
【０１１３】
必要であれば、無傷のバキュロウイルスは不活性化されてもよい。不活性化は、化学的な方法、例えばホルマリン又はβ−プロピオラクトン（ＢＰＬ）により達成することができる。無傷のバキュロウイルスの除去及び／又は不活性化はまた、大部分は、上記に例示されるとおりの当該技術分野において公知の選択的沈殿及びクロマトグラフ方法を用いることにより達成することができる。不活性化の方法は、ＶＬＰを含む試料を０．２％のＢＰＬ中で３時間、約２５℃〜約２７℃でインキュベートすることを含む。バキュロウイルスはまた、ＶＬＰを含む試料を０．０５％ＢＰＬにおいて４℃で３日間、次に３７℃で１時間インキュベートすることにより不活性化することもできる。
【０１１４】
不活性化／除去工程後、ＶＬＰを含む生成物は別の透析ろ過工程に通して不活性化工程からの任意の試薬及び／又は任意の残留スクロースを除去し、ＶＬＰを所望の緩衝液（例えばＰＢＳ）中に入れることができる。ＶＬＰを含む溶液は当該技術分野において公知の方法により滅菌し（例えば滅菌ろ過）、冷蔵庫又は冷凍庫で保管することができる。
【０１１５】
上記の技法は、様々な規模にわたり実践することができる。例えば、Ｔ型フラスコ、振盪フラスコ、スピナーボトル、工業規模のバイオリアクターに至るまでである。バイオリアクターは、ステンレス鋼タンク又は予め滅菌されたプラスチック袋（例えば、Wave Biotech、Bridgewater、NJにより販売されるシステム）のいずれかを含み得る。当業者は、こうした目的に最も望ましいものが何か、分かるであろう。
【０１１６】
バキュロウイルス発現ベクターの展開及び産生並びに細胞の組換えバキュロウイルス感染による組換えＲＳＶ  ＶＬＰの産生は、先述のとおり昆虫細胞、例えばＳｆ９昆虫細胞で達成することができる。一実施形態において、細胞は、ＲＳＶ  ＶＬＰを産生するように操作された組換えバキュロウイルスに感染したＳＦ９である。
【０１１７】
医薬製剤又はワクチン製剤及び投与
本明細書で有用な医薬組成物は、任意の好適な希釈剤又は賦形剤を含めた、それ自体が組成物を投与される脊椎動物に有害な免疫応答の生成を誘導することはない任意の薬学的作用物質を含み、且つ過度の毒性なしに投与され得る薬学的に許容可能な担体と、本発明の修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセル、又は修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰとを含有する。本明細書において、用語「薬学的に許容可能な」とは、連邦政府若しくは州政府の規制当局により承認されているか、又はU.S. Pharmacopia、European Pharmacopia若しくはその他の、哺乳動物、及びより詳細にはヒトにおける使用についての一般的に認められている薬局方に掲載されていることを意味する。これらの組成物は、脊椎動物において防御免疫応答を誘導するためのワクチン及び／又は抗原組成物として有用であり得る。
【０１１８】
本発明は、少なくとも１つの修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、及び限定はされないが、ＲＳＶ  Ｍ、Ｇ、Ｎ、ＳＨ、又はその一部分を含めた少なくとも１つのさらなるタンパク質、及び／又は上記に記載される任意のキメラ又は異種分子を含むＶＬＰを含む薬学的に許容可能なワクチン組成物を包含する。一実施形態において、薬学的に許容可能なワクチン組成物は、少なくとも１つの修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質と、少なくとも１つのさらなる免疫原とを含むＶＬＰを含む。別の実施形態において、薬学的に許容可能なワクチン組成物は、少なくとも１つの修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質と、少なくとも１つのＲＳＶ  Ｍタンパク質とを含むＶＬＰを含む。別の実施形態において、薬学的に許容可能なワクチン組成物は、少なくとも１つの修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質と、少なくとも１つのＢＲＳＶ  Ｍタンパク質とを含むＶＬＰを含む。別の実施形態において、薬学的に許容可能なワクチン組成物は、少なくとも１つの修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質と、少なくとも１つのインフルエンザＭ１タンパク質とを含むＶＬＰを含む。別の実施形態において、薬学的に許容可能なワクチン組成物は、少なくとも１つの修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質と、少なくとも１つのトリインフルエンザＭ１タンパク質とを含むＶＬＰを含む。
【０１１９】
別の実施形態において、薬学的に許容可能なワクチン組成物は、限定はされないが、ＨＲＳＶ、ＢＲＳＶ又はトリＲＳＶ  Ｇタンパク質を含めたＲＳＶ  Ｇタンパク質をさらに含むＶＬＰを含む。別の実施形態において、薬学的に許容可能なワクチン組成物は、限定はされないが、ＨＲＳＶ、ＢＲＳＶ又はトリＲＳＶ  Ｎタンパク質を含めたＲＳＶ  Ｎタンパク質をさらに含むＶＬＰを含む。別の実施形態において、薬学的に許容可能なワクチン組成物は、限定はされないが、ＨＲＳＶ、ＢＲＳＶ又はトリＲＳＶ  ＳＨタンパク質を含めたＲＳＶ  ＳＨタンパク質をさらに含むＶＬＰを含む。
【０１２０】
別の実施形態において、本発明は、ＢＲＳＶ  Ｍと、修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質及び／又はＲＳＶ由来のＧ、Ｈ、又はＳＨタンパク質と、場合によりインフルエンザウイルスに由来するＨＡ又はＮＡタンパク質とを含むＶＬＰなどのキメラＶＬＰを含む薬学的に許容可能なワクチン組成物を包含し、ここでＨＡ又はＮＡタンパク質は、ＲＳＶ  Ｆ及び／又はＧタンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質テールと融合する。
【０１２１】
本発明はまた、上記に記載したとおりの修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセル、又は修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰを含む薬学的に許容可能なワクチン組成物も包含する。
【０１２２】
一実施形態において、薬学的に許容可能なワクチン組成物は、修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質と、少なくとも１つのさらなるタンパク質とを含むＶＬＰを含む。別の実施形態において、薬学的に許容可能なワクチン組成物は、限定はされないが、ＢＲＳＶ  Ｍタンパク質などのＲＳＶ  Ｍタンパク質をさらに含むＶＬＰを含む。別の実施形態において、薬学的に許容可能なワクチン組成物は、限定はされないが、ＨＲＳＶ  Ｇタンパク質を含めたＲＳＶ  Ｇタンパク質をさらに含むＶＬＰを含む。別の実施形態において、薬学的に許容可能なワクチン組成物は、限定はされないが、ＨＲＳＶ、ＢＲＳＶ又はトリＲＳＶ  Ｎタンパク質を含めたＲＳＶ  Ｎタンパク質をさらに含むＶＬＰを含む。別の実施形態において、薬学的に許容可能なワクチン組成物は、限定はされないが、ＨＲＳＶ、ＢＲＳＶ又はトリＲＳＶ  ＳＨタンパク質を含めたＲＳＶ  ＳＨタンパク質をさらに含むＶＬＰを含む。別の実施形態において、薬学的に許容可能なワクチン組成物は、ＢＲＳＶ  Ｍタンパク質とＨＲＳＶ  Ａ群由来のＦ及び／又はＧタンパク質とを含むＶＬＰを含む。別の実施形態において、薬学的に許容可能なワクチン組成物は、ＢＲＳＶ  Ｍタンパク質とＨＲＳＶ  Ｂ群由来のＦ及び／又はＧタンパク質とを含むＶＬＰを含む。別の実施形態において、本発明は、ＢＲＳＶ由来のキメラＭタンパク質と、場合によりインフルエンザウイルスに由来するＨＡタンパク質とを含むＶＬＰなどのキメラＶＬＰを含む薬学的に許容可能なワクチン組成物を包含し、ここでＭタンパク質はインフルエンザＨＡタンパク質と融合する。別の実施形態において、本発明は、ＢＲＳＶ  Ｍと、ＲＳＶ由来のキメラＦ及び／又はＧタンパク質と、場合によりインフルエンザウイルスに由来するＨＡタンパク質とを含むＶＬＰなどのキメラＶＬＰを含む薬学的に許容可能なワクチン組成物を包含し、ここでキメラインフルエンザＨＡタンパク質は、ＲＳＶ  Ｆ及び／又はＧタンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質テールと融合する。別の実施形態において、本発明は、ＢＲＳＶ  Ｍと、ＲＳＶ由来のキメラＦ及び／又はＧタンパク質と、場合によりインフルエンザウイルスに由来するＨＡ又はＮＡタンパク質とを含むＶＬＰなどのキメラＶＬＰを含む薬学的に許容可能なワクチン組成物を包含し、ここでＨＡ又はＮＡタンパク質は、ＲＳＶ  Ｆ及び／又はＧタンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質テールと融合する。
【０１２３】
本発明はまた、少なくとも１つのＲＳＶタンパク質を含むキメラＶＬＰを含む薬学的に許容可能なワクチン組成物も包含する。一実施形態において、薬学的に許容可能なワクチン組成物は、修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質と、異種感染病原体又は罹患細胞由来の少なくとも１つの免疫原とを含むＶＬＰを含む。別の実施形態において、異種感染病原体由来の免疫原はウイルスタンパク質である。別の実施形態において、異種感染病原体由来のウイルスタンパク質は、エンベロープ関連タンパク質である。別の実施形態において、異種感染病原体由来のウイルスタンパク質は、ＶＬＰの表面上で発現する。別の実施形態において、感染病原体由来のタンパク質は、脊椎動物において防御免疫応答を生じさせ得るエピトープを含む。
【０１２４】
本発明はまた、ヒト対象などの脊椎動物を免疫するためのキットであって、少なくとも１つのＲＳＶタンパク質を含むＶＬＰを含むキットも包含する。一実施形態において、キットは、修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰを含む。一実施形態において、キットは、ＢＲＳＶ  Ｍタンパク質などのＲＳＶ  Ｍタンパク質をさらに含む。別の実施形態において、キットは、ＲＳＶ  Ｇタンパク質をさらに含む。別の実施形態において、本発明は、ＢＲＳＶ由来のキメラＭタンパク質と、場合によりインフルエンザウイルスに由来するＨＡタンパク質とを含むＶＬＰを含むキットを包含し、ここでＭタンパク質はＢＲＳＶ  Ｍと融合する。別の実施形態において、本発明は、ＢＲＳＶ由来のキメラＭタンパク質と、ＲＳＶ  Ｆ及び／又はＧタンパク質と、異種感染病原体由来の免疫原とを含むＶＬＰを含むキットを包含する。別の実施形態において、本発明は、ＢＲＳＶ由来のＭタンパク質と、キメラＲＳＶ  Ｆ及び／又はＧタンパク質と、場合によりインフルエンザウイルスに由来するＨＡタンパク質とを含むＶＬＰを含むキットを包含し、ここでＨＡタンパク質は、ＲＳＶ  Ｆ又はＧタンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質テールと融合する。別の実施形態において、本発明は、ＢＲＳＶ由来のＭタンパク質と、キメラＲＳＶ  Ｆ及び／又はＧタンパク質と、場合によりインフルエンザウイルスに由来するＨＡ又はＮＡタンパク質とを含むＶＬＰを含むキットを包含し、ここでＨＡタンパク質は、ＲＳＶ  Ｆ及び／又はＧタンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質テールと融合する。
【０１２５】
一実施形態において、本発明は、修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質の少なくとも１つの有効用量を含む免疫原性製剤を含む。別の実施形態において、本発明は、修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセルの少なくとも１つの有効用量を含む免疫原性製剤を含む。さらに別の実施形態において、本発明は、上記に記載したとおりの修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰの少なくとも１つの有効用量を含む免疫原性製剤を含む。
【０１２６】
本発明の免疫原性製剤は、修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセル、又は修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰと、薬学的に許容可能な担体又は賦形剤とを含む。薬学的に許容可能な担体には、限定はされないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、無菌等張水性緩衝液、及びそれらの組み合わせが含まれる。薬学的に許容可能な担体、希釈剤、及び他の賦形剤についての十分な議論は、Remington's Pharmaceutical Sciences（Mack Pub. Co. N.J. 最新版）に示されている。製剤は、投与様式に適合していなければならない。好ましい実施形態において、製剤はヒトへの投与に好適であり、好ましくは無菌で、非粒子状で、及び／又は非発熱性である。
【０１２７】
組成物はまた、必要であれば、少量の湿潤剤若しくは乳化剤、又はｐＨ緩衝剤も含有することができる。組成物は、再構成するのに好適な凍結乾燥粉末などの固形形態、液体溶液、懸濁液、乳剤、錠剤、丸薬、カプセル、徐放性製剤、又は粉末であってもよい。経口製剤は、医薬品級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等の標準的な担体を含むことができる。
【０１２８】
本発明はまた、本発明のワクチン製剤の成分の１又は複数で充填された１又は複数の容器を含む医薬パック又はキットも提供する。好ましい実施形態において、キットは２つの容器を含み、一方は修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセル、又は修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰを含み、他方はアジュバントを含む。かかる１つ若しくは複数の容器は、医薬品又は生物学的製品の製造、使用又は販売を規制する政府機関により規定される形式の注意書きを伴ってもよく、この注意書きは、機関によるヒト投与に対する製造、使用又は販売の許可を反映するものである。
【０１２９】
本発明はまた、製剤が、組成物の分量を示すアンプル又はサシェットなどの気密密閉容器にパッケージされることも提供する。一実施形態において、組成物は液体として、別の実施形態では乾燥滅菌された凍結乾燥粉末又は水を含まない濃縮物として気密密閉容器に供給され、例えば水又は生理食塩水により、対象への投与に適切な濃度に再構成することができる。
【０１３０】
代替的実施形態において、組成物は、組成物の分量及び濃度を示す気密密閉容器に液体形態で供給される。好ましくは、組成物の液体形態は、気密密閉容器に少なくとも約５０μｇ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも約１００μｇ／ｍｌ、少なくとも約２００μｇ／ｍｌ、少なくとも５００μｇ／ｍｌ、又は少なくとも１μｇ／ｍｌ供給される。
【０１３１】
例として、本発明の修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むキメラＲＳＶ  ＶＬＰは、各々が１又は複数のＲＳＶ株に対する応答である免疫応答を刺激するのに十分な有効量又は有効分量（上記に定義されるとおり）で投与される。本発明の修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセル、又はＶＬＰの投与が、ＲＳＶに対する免疫を誘発する。典型的には、用量は、例えば、年齢、健康状態、体重、性別、食習慣、投与時間、及び他の臨床的要因に基づき、この範囲内で調整することができる。予防ワクチン製剤は、例えば、皮下又は筋肉内注射により針及びシリンジ、又は無針注射デバイスを使用して全身投与される。或いは、ワクチン製剤は、点鼻液、大粒子エアロゾル（約１０ミクロンより大きい）、又は上気道への噴霧のいずれかにより鼻腔内投与される。上記の送達経路のいずれも免疫応答を生じさせるが、鼻腔内投与は、ＲＳＶ及びインフルエンザを含めた多くのウイルスの侵入部位における粘膜免疫の誘発というさらなる利益をもたらす。
【０１３２】
従って、本発明はまた、哺乳動物に対して感染又はその疾患症状の少なくとも１つに対する免疫を誘導するワクチン又は抗原組成物を製剤化する方法であって、修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセル、又は修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰの有効用量を製剤に添加する工程を含む方法も含む。一実施形態において、感染はＲＳＶ感染である。
【０１３３】
単回用量による免疫の刺激は可能であるが、同じ、又は異なる経路によりさらなる投薬量を投与して所望の効果を実現することができる。例えば新生児及び乳児では、十分なレベルの免疫を誘発するために複数回投与が必要となり得る。投与は、必要に応じて小児期全体を通じて間隔を置きながら継続することで、感染、例えばＲＳＶ感染に対する十分なレベルの防御を維持することができる。同様に、特に反復される又は重篤な感染に罹りやすい成人、例えば、ヘルスケア従事者、デイケア従事者、低年齢小児の家族構成員、高齢者、及び心肺機能不全を有する個人などは、防御免疫応答を確立し、及び／又は維持するために複数回の免疫を必要とし得る。誘導される免疫のレベルは、例えば分泌液中及び血清中の中和抗体量を計測することによりモニタし、及び所望の防御レベルを誘発及び維持する必要に応じて投薬量を調整し、又はワクチン接種を反復することができる。
【０１３４】
修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセル、又は修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰを含む組成物（例えばワクチン及び／又は抗原製剤）の投与方法には、限定はされないが、非経口投与（例えば、皮内、筋肉内、静脈内及び皮下）、硬膜外、及び粘膜（例えば、鼻腔内及び経口若しくは経肺経路又は坐薬により）が含まれる。特定の実施形態において、本発明の組成物は、筋肉内に、静脈内に、皮下に、経皮的に又は皮内に投与される。組成物は、任意の従来の経路により、例えば注入又はボーラス注射により、上皮又は皮膚粘膜内層（例えば、口腔粘膜、結腸、結膜、鼻咽腔、中咽頭、腟、尿道、膀胱及び腸粘膜等）を通じた吸収により投与されてもよく、及び他の生物学的に活性な薬剤と共に投与されてもよい。いくつかの実施形態において、本発明の組成物の鼻腔内又は他の粘膜投与経路は、他の投与経路より実質的に高い抗体又は他の免疫応答を誘導し得る。別の実施形態において、本発明の組成物の鼻腔内又は他の粘膜投与経路は、他のＲＳＶ株に対する交差防御を誘導し得る抗体又は他の免疫応答を誘導し得る。投与は全身的であっても、又は局所的であってもよい。
【０１３５】
さらに別の実施形態において、ワクチン及び／又は免疫原性製剤は、免疫部位に免疫応答を誘発するため、粘膜組織を標的とするような方法で投与される。例えば、特定の粘膜を標的化する特性を有するアジュバントを含有する組成物の経口投与を用いることにより、消化管関連リンパ組織（ＧＡＬＴ）などの粘膜組織を免疫化の標的とすることができる。鼻咽頭リンパ組織（ＮＡＬＴ）及び気管支関連リンパ組織（ＢＡＬＴ）などのさらなる粘膜組織もまた、標的化することができる。
【０１３６】
本発明のワクチン及び／又は免疫原性製剤はまた、ある投薬スケジュールで、例えば、ワクチン組成物の初回投与と、それに続く追加免疫投与で投与されてもよい。詳細な実施形態において、組成物の第２の用量は、初回投与後２週間から１年間まで、好ましくは約１、約２、約３、約４、約５ヶ月から約６ヶ月までのどこかで投与される。加えて、第３の用量が、第２の用量後に、且つ初回投与後約３ヶ月から約２年間、又はさらにより長く、好ましくは約４、約５、又は約６ヶ月、又は約７ヶ月から約１年間で投与されてもよい。第３の用量は、場合により、第２の用量後に対象の血清及び／又は尿中の、又は粘膜分泌物中の特定の免疫グロブリンが検出されない、又は低い検出レベルであるときに投与されてもよい。好ましい実施形態において、第２の用量は第１の投与の約１ヶ月後に投与され、第３の用量は第１の投与の約６ヶ月後に投与される。別の実施形態において、第２の用量は第１の投与の約６ヶ月後に投与される。別の実施形態において、本発明の組成物は、併用療法の一部として投与することができる。例えば、本発明の組成物は、他の免疫原性組成物、抗ウイルス薬及び／又は抗生物質と共に製剤化することができる。
【０１３７】
医薬組成物の投薬量は、例えば、初めに予防的又は治療的免疫応答を誘発するのに有効な用量を、例えば、ウイルス特異的免疫グロブリンの血清力価を計測することによるか、又は血清試料、若しくは尿試料中、又は粘膜分泌物中の抗体の阻害率を計測することによって特定することにより、当業者が容易に決定することができる。投薬量は動物試験から決定することができる。ワクチンの効力を調べるために使用される動物の非限定的なリストには、モルモット、ハムスター、フェレット、チンチラ、マウス及びコットンラットが含まれる。ほとんどの動物は感染病原体にとって天然宿主ではないが、しかし疾患の様々な面の研究においてなお機能することができる。例えば、上記の動物のいずれも、ワクチン候補、例えば、本発明の修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセル、又はＶＬＰを投与することにより、誘導された免疫応答を部分的に特徴付け、及び／又は任意の中和抗体が産生されたかどうかを決定することができる。例えば、マウスはサイズが小さいため多くの研究はマウスモデルで行われており、その費用の低さから、研究者は研究を大規模で行うことが可能である。
【０１３８】
加えて、当業者がヒト臨床試験を実施してヒトに好ましい有効用量を決定することができる。かかる臨床試験はルーチンであり、当該技術分野において周知である。用いられる正確な用量はまた、投与経路に依存し得る。有効用量は、インビトロ又は動物試験系から得られた用量反応曲線から推定してもよい。
【０１３９】
同様に当該技術分野において周知のとおり、特定の組成物の免疫原性は、アジュバントとして知られる非特異的な免疫応答刺激剤を使用することにより亢進させることができる。アジュバントは、未知の抗原に対する免疫の全般的な増加を促進するために実験的に使用されている（例えば、米国特許第４，８７７，６１１号）。長年、免疫プロトコルでは応答を刺激するためアジュバントが使用されており、そのため、アジュバントは当業者に周知である。いくつかのアジュバントは、抗原の提示のされ方に影響を与える。例えば、ミョウバンによりタンパク質抗原を沈殿させると、免疫応答は増加する。抗原の乳化もまた、抗原提示の持続期間を延ばす。全ての目的のために全体として参照により本明細書に援用されるVogel et al., 「A Compendium of Vaccine Adjuvants and Excipients (2nd Edition)」に記載される任意のアジュバントを含むことが、本発明の範囲内に想定される。
【０１４０】
例示的に、アジュバントとしては、完全フロイントアジュバント（死滅させた結核菌（Mycobacterium tuberculosis）を含有する非特異的な免疫応答刺激剤）、不完全フロイントアジュバント及び水酸化アルミニウムアジュバントが含まれる。他のアジュバントには、ＧＭＣＳＰ、ＢＣＧ、水酸化アルミニウム、ＭＤＰ化合物、例えば、thur−ＭＤＰ及びnor−ＭＤＰ、ＣＧＰ（ＭＴＰ−ＰＥ）、リピドＡ、及びモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）が含まれる。細菌から抽出された３つの成分であるＭＰＬと、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）と、細胞壁骨格（ＣＷＳ）とを２％スクアレン／Tween 80乳剤中に含有するRIBIもまた企図される。MF-59、Novasomes（登録商標）、ＭＨＣ抗原もまた使用され得る。
【０１４１】
本発明の一実施形態において、アジュバントは、水層により分離された、実質的に球状のシェルの形態で配置された約２〜１０の二重層が、脂質二重層がない大きい無定形の中心腔を取り囲む、少重膜（paucilamellar）脂質小胞である。少重膜脂質小胞は、非特異的刺激剤として、抗原用の担体として、さらなるアジュバントの担体として、及びそれらの組み合わせとして、いくつかの様式で免疫応答を刺激するよう働き得る。例えば、抗原が小胞に対して細胞外に留まるように抗原を予め形成された小胞と混ぜ合わせることによってワクチンが調製されるとき、少重膜脂質小胞は非特異的免疫刺激剤として働く。抗原を小胞の中心腔内に封入することにより、小胞は免疫刺激剤及び抗原用担体の双方として働く。別の実施形態において、小胞は主に非リン脂質小胞から構成される。他の実施形態において、小胞はNovasomes（登録商標）である。Novasomes（登録商標）は、約１００ｎｍ〜約５００ｎｍの範囲の少重膜非リン脂質小胞である。これは、Brij 72、コレステロール、オレイン酸及びスクアレンを含む。Novasomesは、インフルエンザ抗原に有効なアジュバントであることが示されている（全ての目的のために全体として参照により本明細書に援用される米国特許第５，６２９，０２１号、同第６，３８７，３７３号、及び同第４，９１１，９２８号を参照のこと）。
【０１４２】
本発明の組成物はまた、「免疫刺激剤」と共に製剤化することもできる。これらは、免疫系の応答を増加させる生体自身の化学的メッセンジャー（サイトカイン）である。免疫刺激剤には、限定はされないが、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３）；成長因子（例えば、顆粒球マクロファージ（ＧＭ）コロニー刺激因子（ＣＳＦ））；及び他の免疫刺激分子、例えば、マクロファージ炎症性因子、Ｆｌｔ３リガンド、Ｂ７．１；Ｂ７．２等の、免疫刺激、免疫強化、及び炎症誘発活性を有する様々なサイトカイン、リンホカイン及びケモカインが含まれる。免疫刺激分子は、本発明の組成物と同じ製剤で投与することができ、又は別個に投与することもできる。タンパク質又はタンパク質をコードする発現ベクターのいずれかを投与して、免疫刺激効果をもたらすことができる。従って一実施形態において、本発明は、アジュバント及び／又は免疫刺激剤を含む抗原製剤及びワクチン製剤を含む。
【０１４３】
免疫応答の刺激方法
本発明の修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセル、又はＶＬＰは、感染病原体に対する免疫又は実質的な免疫を付与する免疫応答を刺激する組成物の調製に有用である。粘膜免疫及び細胞性免疫の双方が、感染病原体及び疾患に対する免疫に寄与し得る。上気道において局所的に分泌される抗体は、自然感染に対する抵抗性の主因子である。分泌性免疫グロブリンＡ（ｓＩｇＡ）が上気道の防御に関わり、及び血清ＩｇＧが下気道の防御に関わる。感染によって誘導された免疫応答は、同じウイルス又は抗原的に類似したウイルス株による再感染を防御する。例えば、ＲＳＶは頻繁な予測不可能な変化を受ける；従って、自然感染後、宿主の免疫により提供される防御の有効期間は、コミュニティに循環するウイルスの新株に対しては数年間のみ有効であり得る。
【０１４４】
従って、本発明は、対象における感染又はその疾患症状の少なくとも１つに対する免疫を誘導する方法であって、修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセル、又は修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰの少なくとも１つの有効用量を投与する工程を含む方法を包含する。一実施形態において、前記方法は、修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質と少なくとも１つのさらなるタンパク質とを含むＶＬＰを投与する工程を含む。別の実施形態において、前記方法は、ＲＳＶ  Ｍタンパク質、例えばＢＲＳＶ  Ｍタンパク質をさらに含むＶＬＰを投与する工程を含む。別の実施形態において、前記方法は、ＲＳＶ  Ｎタンパク質をさらに含むＶＬＰを投与する工程を含む。別の実施形態において、前記方法は、ＲＳＶ  Ｇタンパク質をさらに含むＶＬＰを投与する工程を含む。別の実施形態において、前記方法は、ＲＳＶ  ＳＨタンパク質をさらに含むＶＬＰを投与する工程を含む。別の実施形態において、前記方法は、ＨＲＳＶ  Ａ群及び／又はＢ群由来のＦ及び／又はＧタンパク質をさらに含むＶＬＰを投与する工程を含む。別の実施形態において、前記方法は、ＢＲＳＶ由来のＭタンパク質と、キメラＲＳＶ  Ｆ及び／又はＧタンパク質又はＭＭＴＶエンベロープタンパク質、例えばインフルエンザウイルスに由来するＨＡ又はＮＡタンパク質とを含むＶＬＰを投与する工程を含み、ここでＨＡ及び／又はＮＡタンパク質は、ＲＳＶ  Ｆ及び／又はＧタンパク質又はＭＭＴＶエンベロープタンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質テールと融合する。別の実施形態において、前記方法は、ＢＲＳＶ由来のＭタンパク質と、キメラＲＳＶ  Ｆ及び／又はＧタンパク質と、場合によりインフルエンザウイルスに由来するＨＡ又はＮＡタンパク質とを含むＶＬＰを投与する工程を含み、ここでＨＡ又はＮＡタンパク質は、ＲＳＶ  Ｆ及び／又はＧタンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質テールと融合する。別の実施形態において、対象は哺乳動物である。別の実施形態において、哺乳動物はヒトである。別の実施形態において、ＲＳＶ  ＶＬＰは、アジュバント又は免疫刺激剤と共に製剤化される。
【０１４５】
一実施形態において、本発明は、対象におけるＲＳＶ感染又はその疾患症状の少なくとも１つに対する免疫を誘導する方法であって、修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質の少なくとも１つの有効用量を投与する工程を含む方法を含む。別の実施形態において、本発明は、対象におけるＲＳＶ感染又はその疾患症状の少なくとも１つに対する免疫を誘導する方法であって、修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセルの少なくとも１つの有効用量を投与する工程を含む方法を含む。さらに別の実施形態において、本発明は、対象におけるＲＳＶ感染又はその疾患症状の少なくとも１つに対する免疫を誘導する方法であって、ＲＳＶ  ＶＬＰの少なくとも１つの有効用量を投与する工程を含む方法を含み、ここでＶＬＰは、修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、Ｍ、Ｇ、ＳＨ、及び／又はＮタンパク質を含む。別の実施形態において、対象におけるＲＳＶ感染又はその少なくとも１つの症状に対する免疫を誘導する方法は、ＲＳＶ  ＶＬＰの少なくとも１つの有効用量を投与する工程を含み、ここでＶＬＰは、ＢＲＳＶ  Ｍ（キメラＭを含む）と、ＲＳＶ  Ｆ、Ｇ、及び／又はＮタンパク質とから本質的になる。ＶＬＰは、さらなるＲＳＶタンパク質及び／又はタンパク質夾雑物を無視できる濃度で含み得る。別の実施形態において、対象におけるＲＳＶ感染又はその少なくとも１つの症状に対する免疫を誘導する方法は、ＲＳＶ  ＶＬＰの少なくとも１つの有効用量を投与する工程を含み、ここでＶＬＰは、ＢＲＳＶ  Ｍ（キメラＭを含む）、ＲＳＶ  Ｇ及び／又はＦからなる。別の実施形態において、対象におけるＲＳＶ感染又はその疾患症状の少なくとも１つに対する免疫を誘導する方法は、ＲＳＶタンパク質を含むＲＳＶ  ＶＬＰの少なくとも１つの有効用量を投与する工程を含み、ここでＲＳＶタンパク質は、ＢＲＳＶ  Ｍ（キメラＭを含む）、キメラＦ、Ｇ、及び／又はＮタンパク質を含めたＦ、Ｇ、及び／又はＮタンパク質からなる。これらのＶＬＰは、ＢＲＳＶ  Ｍ（キメラＭを含む）、ＲＳＶ  Ｆ、Ｇ、及び／又はＮタンパク質を含有し、細胞タンパク質、バキュロウイルスタンパク質、脂質、炭水化物等のさらなる細胞構成要素を含有し得るが、さらなるＲＳＶタンパク質（ＢＲＳＶ  Ｍ（キメラＭを含む）、ＢＲＳＶ／ＲＳＶ  Ｆ、Ｇ、及び／又はＮタンパク質の断片以外のもの）は含有しない。別の実施形態において、対象は脊椎動物である。一実施形態において、脊椎動物は哺乳動物である。別の実施形態において、哺乳動物はヒトである。別の実施形態において、前記方法は、製剤を１回用量で投与することによりＲＳＶ感染又はその疾患症状の少なくとも１つに対する免疫を誘導する工程を含む。別の実施形態において、前記方法は、製剤を複数回用量で投与することによりＲＳＶ感染又はその疾患症状の少なくとも１つに対する免疫を誘導する工程を含む。
【０１４６】
本発明はまた、修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセル、又は修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰの少なくとも１つの有効用量を投与する工程を含む、感染病原体によって引き起こされた対象における感染又はその症状の少なくとも１つに対する免疫を誘導することを含む。一実施形態において、前記方法は、修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質と、異種感染病原体由来の少なくとも１つのタンパク質とを含むＶＬＰを投与する工程を含む。一実施形態において、前記方法は、修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質と、同じ又は異種の感染病原体由来の少なくとも１つのタンパク質とを含むＶＬＰを投与する工程を含む。別の実施形態において、異種感染病原体由来のタンパク質は、ウイルスタンパク質である。別の実施形態において、感染病原体由来のタンパク質は、エンベロープ関連タンパク質である。別の実施形態において、感染病原体由来のタンパク質は、ＶＬＰの表面上で発現する。別の実施形態において、感染病原体由来のタンパク質は、脊椎動物において防御免疫応答を生じさせ得るエピトープを含む。別の実施形態において、感染病原体由来のタンパク質は、ＢＲＳＶ  Ｍタンパク質などのＲＳＶ  Ｍタンパク質、ＲＳＶ  Ｆ、Ｇ及び／又はＮタンパク質と会合することができる。別の実施形態において、感染病原体由来のタンパク質は、ＢＲＳＶ  Ｍタンパク質、ＲＳＶ  Ｆ、Ｇ及び／又はＮタンパク質などのＲＳＶタンパク質と融合する。別の実施形態において、感染病原体由来のタンパク質の一部分のみが、ＢＲＳＶ  Ｍタンパク質、ＲＳＶ  Ｆ、Ｇ及び／又はＮタンパク質などのＲＳＶタンパク質と融合する。別の実施形態において、感染病原体由来のタンパク質の一部分のみが、ＢＲＳＶ  Ｍタンパク質、ＲＳＶ  Ｆ、Ｇ及び／又はＮタンパク質などのＲＳＶタンパク質の一部分と融合する。別の実施形態において、ＲＳＶタンパク質と融合する感染病原体由来のタンパク質の一部分は、ＶＬＰの表面上で発現する。他の実施形態において、感染病原体由来のタンパク質と融合するＲＳＶタンパク質、又はその一部分は、ＲＳＶ  Ｍタンパク質と会合する。他の実施形態において、ＲＳＶタンパク質、又はその一部分は、ＲＳＶ  Ｆ、Ｇ、Ｎ及び／又はＰに由来する。別の実施形態において、キメラＶＬＰは、ＲＳＶ由来のＮ及び／又はＰタンパク質をさらに含む。別の実施形態において、キメラＶＬＰは、同じ及び／又は異種の感染病原体由来の２つ以上のタンパク質を含む。別の実施形態において、キメラＶＬＰは２つ以上の感染病原体タンパク質を含み、それにより多価ＶＬＰを作り出す。
【０１４７】
本発明の組成物は、脊椎動物（例えばヒト）において、脊椎動物に投与されると実質的な免疫を誘導することができる。実質的な免疫は、脊椎動物における感染を防御若しくは改善し、又は感染の症状を少なくとも軽減する本発明の組成物に対する免疫応答によってもたらされる。あるケースでは、脊椎動物を感染させる場合、感染は無症状であり得る。応答は完全防御応答ではないこともあり得る。その場合、脊椎動物を感染病原体に感染させる場合、脊椎動物は、非免疫脊椎動物と比較して症状の軽減又は症状の持続時間の短縮を経験し得る。
【０１４８】
一実施形態において、本発明は、対象におけるＲＳＶウイルス感染又はその疾患症状の少なくとも１つに対する実質的な免疫を誘導する方法であって、修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセル、又は修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰの少なくとも１つの有効用量を投与する工程を含む方法を含む。別の実施形態において、本発明は、哺乳動物に、ＲＳＶに対するワクチン接種をする方法であって、修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセル、又は修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰの防御誘導量を哺乳動物に投与する工程を含む方法を含む。一実施形態において、前記方法は、ＢＲＳＶ  Ｍタンパク質などのＲＳＶ  Ｍタンパク質をさらに含むＶＬＰを投与する工程を含む。別の実施形態において、前記方法は、ＲＳＶ  Ｇタンパク質、例えばＨＲＳＶ  Ｇタンパク質を含むＶＬＰを投与する工程をさらに含む。別の実施形態において、前記方法は、ＨＲＳＶ  Ａ群由来のＮタンパク質を含むＶＬＰを投与する工程をさらに含む。別の実施形態において、前記方法は、ＨＲＳＶ  Ｂ群由来のＮタンパク質を含むＶＬＰを投与する工程をさらに含む。別の実施形態において、前記方法は、ＢＲＳＶ由来のキメラＭタンパク質と、ＲＳＶ由来のＦ及び／又はＧタンパク質とを含むＶＬＰを投与する工程を含み、ここでＦ及び／又はＧタンパク質は、Ｍタンパク質の膜貫通及び細胞質テールと融合する。別の実施形態において、前記方法は、ＢＲＳＶ由来のＭタンパク質と、キメラＲＳＶ  Ｆ及び／又はＧタンパク質とを含むＶＬＰを投与する工程を含み、ここでＦ及び／又はＧタンパク質は、インフルエンザＨＡ及び／又はＮＡタンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質テールと融合する。別の実施形態において、前記方法は、ＢＲＳＶ由来のＭタンパク質と、キメラＲＳＶ  Ｆ及び／又はＧタンパク質と、場合によりインフルエンザＨＡ及び／又はＮＡタンパク質とを含むＶＬＰを投与する工程を含み、ここでＦ及び／又はＧタンパク質は、ＨＡタンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質テールと融合する。別の実施形態において、前記方法は、ＢＲＳＶ由来のＭタンパク質と、キメラＲＳＶ  Ｆ及び／又はＧタンパク質と、場合によりインフルエンザＨＡ及び／又はＮＡタンパク質とを含むＶＬＰを投与する工程を含み、ここでＨＡ及び／又はＮＡタンパク質は、ＲＳＶ  Ｆ及び／又はＧタンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質テールと融合する。
【０１４９】
本発明はまた、感染病原体によって引き起こされた対象における感染、又はその疾患症状の少なくとも１つに対する実質的な免疫を誘導する方法であって、修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセル、又は修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰの少なくとも１つの有効用量を投与する工程を含む方法も包含する。一実施形態において、前記方法は、ＢＲＳＶ  Ｍタンパク質などのＲＳＶ  Ｍタンパク質と、別の感染病原体由来の少なくとも１つのタンパク質とをさらに含むＶＬＰを投与する工程を含む。一実施形態において、前記方法は、ＢＲＳＶ  Ｍタンパク質と、同じ又は異種の感染病原体由来の少なくとも１つのタンパク質とをさらに含むＶＬＰを投与する工程を含む。別の実施形態において、感染病原体由来のタンパク質は、ウイルスタンパク質である。別の実施形態において、感染病原体由来のタンパク質は、エンベロープ関連タンパク質である。別の実施形態において、感染病原体由来のタンパク質は、ＶＬＰの表面上で発現する。別の実施形態において、感染病原体由来のタンパク質は、脊椎動物において防御免疫応答を生じさせ得るエピトープを含む。別の実施形態において、感染病原体由来のタンパク質は、ＲＳＶ  Ｍタンパク質と会合することができる。別の実施形態において、感染病原体由来のタンパク質は、ＢＲＳＶ  Ｍタンパク質と会合することができる。別の実施形態において、感染病原体由来のタンパク質は、ＲＳＶタンパク質と融合する。別の実施形態において、感染病原体由来のタンパク質の一部分のみが、ＲＳＶタンパク質と融合する。別の実施形態において、感染病原体由来のタンパク質の一部分のみが、ＲＳＶタンパク質の一部分と融合する。別の実施形態において、ＲＳＶタンパク質と融合する感染病原体由来のタンパク質の一部分は、ＶＬＰの表面上で発現する。他の実施形態において、感染病原体由来のタンパク質と融合するＲＳＶタンパク質、又はその一部分は、ＲＳＶ  Ｍタンパク質と会合する。他の実施形態において、感染病原体由来のタンパク質と融合するＲＳＶタンパク質、又はその一部分は、ＢＲＳＶ  Ｍタンパク質と会合する。他の実施形態において、ＲＳＶタンパク質、又はその一部分は、ＲＳＶ  Ｆ、Ｇ、Ｎ及び／又はＰに由来する。別の実施形態において、ＶＬＰは、ＲＳＶ由来のＮ及び／又はＰタンパク質をさらに含む。別の実施形態において、ＶＬＰは、感染病原体由来の２つ以上のタンパク質を含む。別の実施形態において、ＶＬＰは２つ以上の感染病原体タンパク質を含み、それにより多価ＶＬＰを作り出す。
【０１５０】
別の実施形態において、本発明は、対象における感染又はその少なくとも１つの症状に対する防御抗体応答を誘導する方法であって、修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセル、又は上記に記載したとおりの修飾若しくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰの少なくとも１つの有効用量を投与する工程を含む方法を含む。
【０１５１】
本明細書において、「抗体」は、免疫グロブリン遺伝子又は免疫グロブリン遺伝子の断片により実質的に又は部分的にコードされる１又は複数のポリペプチドを含むタンパク質である。認識される免疫グロブリン遺伝子には、κ、λ、α、γ、δ、ε及びμ定常領域遺伝子、並びに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖は、κ又はλのいずれかとして分類される。重鎖は、γ、μ、α、δ、又はεとして分類され、それが次に、それぞれ、免疫グロブリンクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥを規定する。典型的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は四量体を含む。各四量体は２つの同一のポリペプチド鎖対から構成され、各対が１つの「軽」鎖（約２５ｋＤ）と１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤ）とを有する。各鎖のＮ末端が、主に抗原認識に関与する約１００〜１１０個又はそれ以上のアミノ酸の可変領域を規定する。抗体は、無傷の免疫グロブリンとして、又は様々なペプチダーゼによる消化によって産生される多数の十分に特徴付けられた断片として、存在する。
【０１５２】
一実施形態において、本発明は、対象におけるＲＳＶ感染又はその疾患症状の少なくとも１つに対する防御細胞性応答を誘導する方法であって、修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質の少なくとも１つの有効用量を投与する工程を含む方法を含む。別の実施形態において、本発明は、対象におけるＲＳＶ感染又はその疾患症状の少なくとも１つに対する防御細胞性応答を誘導する方法であって、修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含む少なくとも１つの有効用量ＲＳＶ  Ｆミセルを投与する工程を含む方法を含む。さらに別の実施形態において、本発明は、対象におけるＲＳＶ感染又はその疾患症状の少なくとも１つに対する防御細胞性応答を誘導する方法であって、少なくとも１つの有効用量ＶＬＰを投与する工程を含む方法を含み、ここでＶＬＰは、上記に記載したとおりの修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含む。細胞媒介免疫はまた、ＲＳＶ感染からの回復において役割を果たし、ＲＳＶ関連合併症を予防し得る。ＲＳＶ特異的細胞リンパ球が、感染した対象の血液及び下気道分泌物中に検出されている。ＲＳＶ感染細胞の細胞溶解は、ＲＳＶ特異的抗体及び相補体と協働してＣＴＬにより媒介される。一次的な細胞傷害性応答は、感染した又はワクチン接種された個人において６〜１４日後の血液中に検出可能であり、２１日目までに消失する（Ennis et al., 1981）。細胞媒介免疫はまた、ＲＳＶ感染からの回復において役割を果たすことができ、ＲＳＶ関連合併症を予防し得る。ＲＳＶ特異的細胞リンパ球が、感染した対象の血液及び下気道分泌物中で検出されている。
【０１５３】
上述されるとおり、本発明の免疫原性組成物は、対象におけるＲＳＶ感染の少なくとも１つの症状を予防又は軽減する。ＲＳＶの症状は当該技術分野において周知である。それらには、鼻漏、咽頭痛、頭痛、嗄声、咳、喀痰、発熱、ラ音、喘鳴音、及び呼吸困難が含まれる。従って、本発明の方法は、ＲＳＶ感染に関連する少なくとも１つの症状の予防又は軽減を含む。症状の軽減は、主観的又は客観的に、例えば、対象による自己評価、臨床医の評価によるか、又は、例えば、クオリティ・オブ・ライフ評価、ＲＳＶ感染若しくはさらなる症状の進行遅延、ＲＳＶ症状の重症度の軽減又は好適なアッセイ（例えば抗体価及び／又はＴ細胞活性化アッセイ）を含めた適切なアッセイ又は計測（例えば体温）を行うことにより判断されてもよい。客観的な評価は、動物評価及びヒト評価の双方を含む。
【０１５４】
限定として解釈されてはならない以下の例により、本発明をさらに説明する。本願全体を通じて引用される全ての参考文献、特許及び公開済み特許出願の内容、並びに図及び配列表は、全ての目的のために参照により本明細書に援用される。
【実施例】
【０１５５】
実施例１
組換えバクミドの生成、昆虫細胞のトランスフェクションによる組換えウイルスストックの作製、プラーク精製、及び一次ウイルスストックによる昆虫細胞の感染。
組換えウイルスを構築するため、目的のウイルス遺伝子をＳｆ９昆虫細胞発現に対してコドン最適化し、pFastBac（商標）ベクターにクローニングした。
【０１５６】
所望のコンストラクトを確認して精製した後、各コンストラクトにつきMAX Efficiency（登録商標）DH10Bac（商標）コンピテント細胞の１本のバイアルを氷上で解凍した。約１ｎｇ（５μｌ）の所望のpFastBac（商標）コンストラクトプラスミドＤＮＡを細胞に添加し、軽く混合した。細胞を氷上で３０分間インキュベートした。それに続き、細胞を４２℃で４５秒間、振盪なしに熱ショック処理した。次に、試験管を氷に移して２分間冷却した。続いて９００μｌの室温Ｓ．Ｏ．Ｃ．培地を各試験管に添加した。試験管を３７℃、２２５ｒｐｍで４時間振盪機にかけた。各pFastBac（商標）の形質転換について、Ｓ．Ｏ．Ｃ．培地を使用して細胞の１０倍段階希釈（１０−１、１０−２及び１０−３）を調製した。次に、１００μｌの各希釈を、５０μｇ／ｍｌのカナマイシン、７μｇ／ｍｌのゲンタマイシン、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン、１００μｇ／ｍｌのブルオ−ガル、及び４０μｇ／ｍｌのＩＰＴＧを含有するＬＢ寒天プレートに植菌した。プレートを３７℃で４８時間インキュベートした。白色コロニーを分析用に選んだ。
【０１５７】
上記から種々のバクミドＤＮＡを各コンストラクトについて作製し、単離した。それらのＤＮＡを沈殿させてＳｆ９細胞に５時間添加した。
【０１５８】
次に、３０ｍｌのＳｆ９昆虫細胞（２×１０6細胞／ｍｌ）を、０．３ｍｌのプラーク溶出液により目的のウイルスタンパク質を発現するバキュロウイルスに感染させ、４８〜７２時間インキュベートした。約１ｍｌの粗培養物（細胞＋培地）及び清澄化した培養回収物を発現解析のために保存し、残りは精製目的のために保存した。
【０１５９】
実施例２
修飾ＨＲＳＶ  Ｆタンパク質の発現、精製、及び分析
目的の修飾ＨＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードする遺伝子を重複オリゴヌクレオチドとしてインビトロで合成し、宿主細胞にクローニングして発現させた。修飾ＲＳＶ  Ｆ遺伝子のクローニング及び発現は、当該技術分野において公知の方法に従い実現した。
【０１６０】
目的のウイルスタンパク質を含有する組換えプラークを選び、確認した。次にＳｆ９昆虫細胞を感染させることにより組換えウイルスを増幅した。あるケースでは、Ｓｆ９昆虫細胞は、修飾Ｆタンパク質を発現する組換えウイルスと、他のウイルスタンパク質（例えば、ＢＲＳＶ  Ｍタンパク質及び／又はＨＲＳＶ  Ｎタンパク質）を発現する別の組換えウイルスとによって重感染させた。昆虫細胞の培養物を、様々なコンストラクトを有するバキュロウイルスに約３ＭＯＩ（感染多重度＝ウイルスｆｆｕ又はｐｆｕ／細胞）で感染させた。感染後４８〜７２で培養物及び上清を回収した。粗回収物の約３０ｍＬを、約８００×ｇで１５分間の遠心により清澄化した。修飾ＨＲＳＶ  Ｆタンパク質を含有する得られた粗細胞回収物を、以下に記載するとおり精製した。
【０１６１】
感染Ｓｆ９昆虫細胞培養回収物から目的の修飾ＨＲＳＶ  Ｆタンパク質を精製した。膜タンパク質抽出プロトコルにおいて非イオン性界面活性剤テルギトール（Tergitol）（登録商標）NP-9（ノニルフェノールエトキシレート）を使用した。粗抽出物を、陰イオン交換クロマトグラフィー、レンチルレクチン親和性／ＨＩＣ、及び陽イオン交換クロマトグラフィーに通すことによってさらに精製した。
【０１６２】
タンパク質発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、クーマシー染色によって全タンパク質を染色した。粗回収物からの等量の細胞試料及びβＭＥ（β−メルカプトエタノール）を含有する２×試料緩衝液を、約１５〜２０μｌ（約７．５〜１０μｌの培養物）／レーンでＳＤＳレムリゲルに負荷した。
【０１６３】
あるケースでは、クロマトグラフィーの代わりに、粗細胞回収物中の修飾ＨＲＳＶ  Ｆタンパク質を３０％スクロース勾配分離方法により濃縮し、次に、クーマシーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ、又は抗ＲＳＶ  Ｆモノクローナル抗体を使用したウエスタンブロットにより分析した。
【０１６４】
修飾組換えＦタンパク質、精製組換えＦタンパク質、又はスクロース勾配により濃縮された組換えＦタンパク質を含有する粗細胞回収物は、抗ＲＳＶ  Ｆモノクローナル抗体及び／又は抗ＲＳＶ  Ｆポリクローナル抗体を使用するウエスタンブロットによりさらに分析することができる。
【０１６５】
実施例３
Ｆタンパク質ＢＶ  ＃５４１をコードする修飾ＨＲＳＶ  Ｆ遺伝子
完全長ＨＲＳＶ  Ｆタンパク質を発現させる最初の試みでは、高レベルの実現は不成功であることが判明した。発現に使用したＦ遺伝子配列は、配列番号１（野生型ＨＲＳＶ  Ｆ遺伝子、GenBank受託番号Ｍ１１４８６）であった。これは、５７４アミノ酸の不活性前駆体（Ｆ0）をコードする。この前駆体は、成熟する間にフューリン様プロテアーゼにより２回切断され、Ｎ末端からのサブユニットＦ2とＣ末端からのＦ1との２つのジスルフィド結合したポリペプチドをもたらす（図１）。２つの切断部位は残基１０９位及び１３６位であり、これらにフューリン認識モチーフが先行する（ＲＡＲＲ、ａａ  １０６〜１０９（配列番号２３）及びＫＫＲＫＲＲ、ａａ  １３１〜１３６（配列番号２４））。配列番号１のＦ遺伝子配列は、Ｓｆ９昆虫細胞における発現について準最適コドン使用頻度を含み、３個のエラーを内包して、最適以下の折り畳みを呈し得るタンパク質（配列番号２、GenBank受託番号ＡＡＢ５９８５８）を産生する。加えて、Ｆ2サブユニットをコードする領域に可能性のあるポリ（Ａ）アデニリル化部位（ＡＴＡＡＡＡ）が同定された。さらに、野生型Ｆ遺伝子配列は約６５％のＡＴリッチであり、一方、Ｓｆ９昆虫細胞発現系における遺伝子配列の所望のＧＣ−ＡＴ比は約１：１である。
【０１６６】
ＨＲＳＶ  Ｆタンパク質の不十分な発現レベルを解消しようとする試みとして、新しいＦ遺伝子配列を以下のように設計した：
（ａ）３つのGenBank配列決定エラーを修正した；
（ｂ）Ｆ2サブユニットをコードする領域におけるクリプティックポリ（Ａ）部位を修飾した；
（ｃ）Ｆ遺伝子コドンを最適化した；及び
（ｄ）Ｆ遺伝子が、不活性化された一次切断部位を有する修飾Ｆタンパク質をコードする。
【０１６７】
３つの修正したアミノ酸エラーはＰ１０２Ａ、Ｉ３７９Ｖ、及びＭ４４７Ｖであった。アミノ酸配列を変化させることなしにＨＲＳＶ  Ｆ遺伝子におけるクリプティックポリ（Ａ）部位を修正した。
【０１６８】
コドン最適化スキームは、以下の基準に基づいた：（１）Levin, D.B. et al.（Journal of General Virology, 2000, vol. 81, pp. 2313-2325）に記載の、所与のアミノ酸に対する昆虫細胞の鱗翅目（Lepidopteran）種における特定のコドンについてのアミノアシル−ｔＲＮＡの存在量、（２）遺伝子配列における約１：１のＧＣ−ＡＴ比の維持、（３）パリンドローム又はステムループＤＮＡ構造の最小限の導入、及び（４）転写及び転写後抑制エレメント配列の最小限の導入。最適化されたＦ遺伝子配列の例を配列番号１９（ＲＳＶ−Ｆ  ＢＶ  ＃３６８）として示した。
【０１６９】
ＨＲＳＶ  Ｆタンパク質の一次切断部位（１°ＣＳ、ＫＫＲＫＲＲ、ａａ  １３１〜１３６）を不活性化するため、フューリン認識部位をＫＫＱＫＱＱ（配列番号２８）又はＧＲＲＱＱＲ（配列番号２９）のいずれかに変異させた。かかる切断部位変異を有するいくつかの修飾Ｆタンパク質を評価して切断防止効率を判断した。図２は、評価した修飾Ｆタンパク質のいくつかを示す。結果は、３つの保存的アミノ酸変化Ｒ１３３Ｑ、Ｒ１３５Ｑ、及びＲ１３６ＱによりＨＲＳＶ  Ｆタンパク質の一次切断部位が不活性化され得ることを示している。これらの、極性的に帯電した分子であるアルギニン（Ｒ）から、極性的に中性の分子であるグルタミン（Ｑ）への保存的アミノ酸変化により、これらの部位で荷電状態が変わり、Ｆタンパク質３Ｄ構造はなお維持されながら、フューリン様プロテアーゼによる切断が防止された（図３を参照）。１°ＣＳでの切断の防止により、Ｆタンパク質の膜融合活性の低減が生じた。
【０１７０】
上述した全ての修飾を有するように設計した非限定的な例示的修飾ＨＲＳＶ  Ｆ遺伝子配列を図４に示す。この修飾Ｆ遺伝子（配列番号５、ＲＳＶ−Ｆ  ＢＶ  ＃５４１）は、配列番号６の修飾Ｆタンパク質をコードする。遺伝子配列は、重複オリゴヌクレオチドとしてインビトロで合成し、宿主細胞にクローニングして発現させた。修飾ＨＲＳＶ  Ｆタンパク質ＢＶ  ＃５４１を感染Ｓｆ９昆虫細胞培養回収物から精製し、クーマシーにより染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。精製及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の方法は、実施例２に記載している。Ｆタンパク質ＲＳＶ−Ｆ  ＢＶ  ＃５４１（例えばＦタンパク質５４１）の発現レベルは、Ｓｆ９昆虫細胞における野生型Ｆ0タンパク質と比較して向上した。
【０１７１】
実施例４
Ｆ1サブユニット融合ドメイン部分欠失を有する修飾ＨＲＳＶ  Ｆタンパク質
ＲＳＶ  Ｆタンパク質の発現をさらに向上させるため、以下の修飾を含む、さらに修飾したＨＲＳＶ  Ｆ遺伝子を設計した：
（ａ）３つのGenBank配列決定エラーを修正した；
（ｂ）Ｆ２サブユニットをコードする領域におけるクリプティックポリ（Ａ）部位を修飾した；
（ｃ）Ｆ遺伝子コドンを最適化した；及び
（ｄ）Ｆ1サブユニット融合ドメインをコードするヌクレオチド配列を部分的に欠失させた。一実験では、Ｆ1サブユニット融合ドメインの最初の１０アミノ酸（配列番号２のアミノ酸１３７〜１４６位に対応する）をコードするヌクレオチド配列を欠失させた。
【０１７２】
配列番号９（ＲＳＶ−Ｆ  ＢＶ  ＃６２２、例えばＦタンパク質６２２）として指定された、配列番号１０の修飾Ｆタンパク質をコードする、前記修飾を含む非限定的な例示的修飾ＲＳＶ  Ｆ遺伝子を図５に示す。感染Ｓｆ９昆虫細胞培養回収物から修飾ＨＲＳＶ  Ｆタンパク質ＢＶ  ＃６２２を精製し、クーマシーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。精製及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の方法は、実施例２に記載している。図６のＳＤＳ−ＰＡＧＥに示されるとおり、ＨＲＳＶ  Ｆタンパク質ＢＶ  ＃６２２の高発現レベルが観察された。
【０１７３】
実施例５
不活性化した一次切断部位とＦ1融合ドメイン部分欠失との双方を有する修飾ＨＲＳＶ  Ｆタンパク質
不活性化した一次切断部位とＦ1融合ドメイン部分欠失との組み合わせが、特にＳｆ９昆虫細胞におけるＲＳＶ  Ｆタンパク質の発現をさらに促進し得るかどうかを判断するため、以下の修飾を含む別の修飾ＲＳＶ  Ｆ遺伝子を設計した：
（ａ）３つのGenBank配列決定エラーを修正した；
（ｂ）Ｆ２サブユニットをコードする領域におけるクリプティックポリ（Ａ）部位を修飾した；
（ｃ）Ｆ遺伝子コドンを最適化した；
（ｄ）一次切断部位を不活性化した；及び
（ｅ）Ｆ１サブユニット融合ドメインをコードするヌクレオチド配列を部分的に欠失させた。一実験において、Ｆ1サブユニット融合ドメインの最初の１０アミノ酸（配列番号２のアミノ酸１３７〜１４６位に対応する）をコードするヌクレオチド配列を欠失させた。
【０１７４】
配列番号７（ＲＳＶ−Ｆ  ＢＶ  ＃６８３、例えばＦタンパク質６８３）として指定された、配列番号８の修飾Ｆタンパク質をコードする、前記修飾を含む非限定的な例示的修飾ＲＳＶ  Ｆ遺伝子を図７に示す。感染Ｓｆ９昆虫細胞培養回収物から修飾ＲＳＶ  Ｆタンパク質ＢＶ  ＃６８３（例えばＦタンパク質６８３）を精製し、クーマシーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。精製及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の方法は、実施例２に記載している。図８のＳＤＳ−ＰＡＧＥに示されるとおり、発現レベルのさらなる亢進が実現された。
【０１７５】
実施例６
修飾ＨＲＳＶ  Ｆタンパク質ＢＶ  ＃６８３の発現及び精製
修飾ＨＲＳＶ  Ｆタンパク質ＢＶ  ＃６８３（例えばＦタンパク質６８３、配列番号８）を、実施例１に記載されるとおりバキュロウイルス発現系で発現させて、ＨＲＳＶ  Ｆタンパク質ＢＶ  ＃６８３を発現する組換えプラークを選んで確認した。次にＳｆ９昆虫細胞を感染させることにより組換えウイルスを増幅した。昆虫細胞の培養物をバキュロウイルスに３ＭＯＩ（感染多重度＝ウイルスｆｆｕ又はｐｆｕ／細胞）で感染させた。感染の４８〜７２時間後に培養物及び上清を回収した。粗回収物の約３０ｍＬを、約８００×ｇで１５分間遠心することにより清澄化した。ＨＲＳＶ  Ｆタンパク質ＢＶ  ＃６８３を含む得られた粗細胞回収物を以下に記載されるとおり精製した。
【０１７６】
感染Ｓｆ９昆虫細胞培養回収物からＨＲＳＶ  Ｆタンパク質ＢＶ  ＃６８３を精製した。膜タンパク質抽出プロトコルでは非イオン性界面活性剤テルギトール（Tergitol）（登録商標）NP-9（ノニルフェノールエトキシレート）を使用した。陰イオン交換クロマトグラフィー、レンチルレクチン親和性／ＨＩＣ及び陽イオン交換クロマトグラフィーを通過させることにより、粗抽出物をさらに精製した。
【０１７７】
精製したＨＲＳＶ  Ｆタンパク質ＢＶ  ＃６８３を、実施例２に記載されるとおり、クーマシーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び抗ＲＳＶ  Ｆモノクローナル抗体を使用するウエスタンブロットにより分析した。結果を図９に示した。ＨＲＳＶ  Ｆタンパク質ＢＶ  ＃６８３（例えばＦタンパク質６８３、配列番号８）の優れた発現レベルが実現された。粗細胞培養物で発現レベルは１０ｍｇ／Ｌを上回り、回収されたＦタンパク質ＢＶ  ＃６８３は約３．５ｍｇ／Ｌ細胞培養物であると推定された。あるケースでは、２０ｍｇ／Ｌを上回る発現レベルが実現され、約５ｍｇ／Ｌの修飾Ｆタンパク質ＢＶ  ＃６８３が回収された（図１０を参照）。回収されたＦタンパク質ＢＶ  ＃６８３の純度は、走査デンシトメトリーにより測定するとき、約９８％に達した（図１０を参照）。
【０１７８】
実施例７
精製ＨＲＳＶ  Ｆタンパク質ＢＶ  ＃６８３ミセル（ロゼット）
精製ＨＲＳＶ  Ｆタンパク質ＢＶ  ＃６８３を、ネガティブ染色電子顕微鏡法により分析した（図１１を参照）。Ｆタンパク質は、野生型ＨＲＳＶ  Ｆタンパク質（Calder et al., 2000, Virology 271, pp. 122-131）、及び他の完全長ウイルス膜糖タンパク質（Wrigley et al., Academic Press, London, 1986, vol. 5, pp. 103-163）について観察されるものと同様に、ミセル（ロゼット）の形態に凝集した。電子顕微鏡下では、Ｆスパイクは、幅広のほうの端部がロゼットの中心から離れる方に突出しているロリポップ形状のロッド形態を呈する。単一の三量体の長さは約２０ｎｍであり、ミセル粒径は約４０ｎｍであった（図１２を参照）。これらの結果は、ＨＲＳＶ  Ｆタンパク質ＢＶ  ＃６８３が、天然の活性タンパク質についての３Ｄ構造を修正したことを示している。
【０１７９】
要約すれば、修飾組換えＨＲＳＶ  Ｆタンパク質（例えば、ＢＶ  ＃６８３）を設計し、発現させて精製した。この修飾完全長Ｆはグリコシル化されている。一次切断部位及び融合ドメインの修飾が共になってＦタンパク質の発現レベルを大幅に亢進する。加えて、この修飾Ｆタンパク質は、ジスルフィド結合したＦ1サブユニットとＦ2サブユニットとに切断され得る。Ｆ１及びＦ２サブユニットの三量体はロリポップ形状の１９．６ｎｍのスパイク及び４０．２ｎｍの粒子を形成する。さらに、この修飾Ｆタンパク質は、Ｓｆ９昆虫細胞において高度に発現する。精製後には９８％超のミセルの純度が実現される。この修飾タンパク質のスパイクがロリポップ形態を有し、さらに４０ｎｍのミセル粒子を形成することができるという事実は、修飾Ｆタンパク質ＢＶ  ＃６８３が天然タンパク質の３Ｄ構造を修正したことを示している。
【０１８０】
実施例８
ＶＬＰ産生における修飾ＨＲＳＶ  Ｆタンパク質のＢＲＳＶ  Ｍ及び／又はＨＲＳＶ  Ｎとの共発現
本発明はまた、修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰも提供する。かかるＶＬＰは、ウイルスタンパク質抗原に対する中和抗体を誘導するのに有用であり、従ってＲＳＶに対する免疫を確立するために投与することができる。例えば、かかるＶＬＰは、修飾ＲＳＶ  Ｆタンパク質とＢＲＳＶ  Ｍ及び／又はＨＲＳＶ  Ｎタンパク質とを含み得る。ＢＲＳＶ  Ｍ（配列番号１４）又はＨＲＳＶ  Ｎ（配列番号１８）タンパク質をコードする遺伝子のコドンは、昆虫細胞における発現に対して最適化され得る。例えば、最適化されたＢＲＳＶ  Ｍ遺伝子配列が配列番号１３に示され、最適化されたＲＳＶ  Ｎ遺伝子配列が配列番号１７に示される。
【０１８１】
一実験では、修飾Ｆタンパク質ＢＶ  ＃６２２及び別の修飾Ｆタンパク質ＢＶ  ＃６２３（配列番号２１、双方の切断部位が不活性化されるように修飾されている）を、単独で発現させるか、或いはＨＲＳＶ  Ｎタンパク質及びＢＲＳＶ  Ｍタンパク質と共発現させた。ＶＬＰを含有する粗細胞回収物（細胞内）及び３０％スクロース勾配分離から回収したＶＬＰペレットの双方を、クーマシーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び抗ＲＳＶ  Ｆモノクローナル抗体を用いるウエスタンブロットにより分析した。図１３は、修飾Ｆタンパク質ＢＶ  ＃６２２及びＢＶ  ＃６２３の構造、並びにＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット分析の結果を示す。ＢＶ  ＃６２２は高度にそれ自体で発現し、又はＨＲＳＶ  Ｎタンパク質及びＢＲＳＶ  Ｍタンパク質と共発現したが、一方、ＢＶ  ＃６２３は極めて不十分な発現であり、双方の切断部位の不活性化がＦタンパク質発現を阻害することを示している。
【０１８２】
別の実験では、修飾Ｆタンパク質ＢＶ  ＃６２２、ダブルタンデム遺伝子ＢＶ  ＃６３６（ＢＶ  ＃５４１＋ＢＲＳＶ  Ｍ）、ＢＶ  ＃６８３、ＢＶ  ＃６８４（ＢＶ  ＃５４１、ＹＩＡＬ  Ｌ−ドメインがＣ末端に導入されている）、及びＢＶ  ＃６８５（ＢＶ  ＃５４１、ＹＫＫＬ  Ｌ−ドメインがＣ末端に導入されている）を、単独で発現させるか、又はＨＲＳＶ  Ｎタンパク質及びＢＲＳＶ  Ｍタンパク質と共発現させた。Ｌ−ドメイン（後期ドメイン）はレトロウイルスの保存配列であり、細胞タンパク質と共に作用して細胞の表面からビリオンを効率的に放出させるＧａｇ内に存在する（Ott et al., 2005, Journal of Virology 79: 9038-9045）。各修飾Ｆタンパク質の構造を図１４に示す。ＶＬＰを含有する粗細胞回収物（細胞内）及び３０％スクロース勾配分離から回収されたＶＬＰペレットの双方を、クーマシーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び抗ＲＳＶ  Ｆモノクローナル抗体を使用するウエスタンブロットにより分析した。図１４は、ＶＬＰを含有する粗細胞回収物（細胞内）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット分析の結果を示し、図１５は、３０％スクロース勾配分離から回収されたＶＬＰペレットのＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット分析の結果を示す。ＢＶ  ＃６２２及びＢＶ  ＃６８３は高度にそれ自体で発現し、又はＨＲＳＶ  Ｎタンパク質及びＢＲＳＶ  Ｍタンパク質と共発現したが、一方、ＢＶ  ＃６３６、ＢＶ  ＃６８４、及びＢＶ  ＃６８５は不十分な発現であった。
【０１８３】
実施例９
高発現を伴うキメラＨＲＳＶ  Ｆタンパク質のスクリーニング
昆虫細胞において可溶形態で高度に発現することができ、より良好な収率でＶＬＰを形成することができるさらなるＲＳＶ  Ｆタンパク質をスクリーニングするための試行がなされた。様々なＦ遺伝子を設計し、発現させて分析した。ウエスタンブロット及びＳＤＳ−ＰＡＧＥの双方を使用して発現を評価した。
【０１８４】
図１６ａ〜図１６ｄは、各キメラＨＲＳＶ  Ｆクローンについての構造、クローン名、説明、ウエスタンブロット／クーマシー分析の結果、及び結論を要約する。
【０１８５】
結果が示すとおり、野生型完全長Ｆタンパク質は発現が不良であった；Ｆ1サブユニットを含有するが、しかしＦ2サブユニットを含有しないキメラＨＲＳＶ  Ｆタンパク質は良好に発現することができたが、産物は不溶性であるか（これはミスフォールディングに起因した可能性がある）、又は重感染後、他のウイルスタンパク質と集合してＶＬＰを良好な収量で形成することができないかのいずれかであった。一次切断部位の不活性化だけでは、発現の実質的な増加は生じなかったが、一次切断部位の不活性化を、クリプティックポリ（Ａ）部位の欠失及びGenBankアミノ酸エラーの修正などの他の修飾と組み合わせると（例えば、ＢＶ  ＃５４１）、より良好な発現が実現された。ＢＶ  ＃５４１のＣ末端にＹＫＫＬ  Ｌ−ドメインを導入すると、ＢＲＳＶ  Ｍ及びＨＲＳＶ  Ｎタンパク質との共発現において修飾Ｆタンパク質を含有するＶＬＰの分泌が約２〜３倍に亢進された。結果から、ＢＶ  ＃５４１遺伝子とＢＲＳＶ  Ｍ遺伝子とからなるダブルタンデムキメラ遺伝子が、ＢＶ  ＃５４１とＢＲＳＶ  Ｍタンパク質の重感染と比較して細胞内及びＶＬＰ収量の双方の向上を示したことがさらに分かり、ＢＲＳＶ  Ｍタンパク質がタンデム発現時に昆虫細胞における修飾ＨＲＳＶ  Ｆタンパク質を含有するＶＬＰの産生を促進し得ることを示している。ＢＶ  ＃５４１と、ＢＲＳＶ  Ｍと、ＨＲＳＶ  Ｎとからなるトリプルタンデムキメラ遺伝子は、上述のダブルタンデムキメラ遺伝子又はＢＶ  ＃５４１と、ＢＲＳＶ  Ｍと、ＨＲＳＶ  Ｎタンパク質の重感染と比較してさらにより高い細胞内及びはるかに良好なＶＬＰ収量を有した。さらに、結果から、キメラＨＲＳＶ  Ｆタンパク質ＢＶ＃６８３（例えばＦタンパク質６８３、配列番号８）が最良の細胞内発現を有することが示唆された。ＢＶ＃６８３とＢＲＳＶ  Ｍ遺伝子とからなるダブルタンデムキメラ遺伝子の発現、又はＢＶ＃６８３と、ＢＲＳＶ  Ｍと、ＨＲＳＶ  Ｎ遺伝子とからなるトリプルタンデムキメラ遺伝子もまた、本明細書で具体化される。これらのダブル及びトリプルタンデムキメラ遺伝子は、重感染と比較してＶＬＰ産生をさらに向上させるはずである。
【０１８６】
実施例１０
マウスにおけるＲＳＶ中和アッセイ及びＲＳＶチャレンジ試験
ＲＳＶ感染の予防における修飾ＨＲＳＶ  Ｆタンパク質ＢＶ  ＃６８３を含むワクチンの効率を試験するため、マウスにおいて中和アッセイ及びＲＳＶチャレンジ試験を行った。実験手順を図１７に示す。
【０１８７】
マウス群（ｎ＝１０）に、プラセボ（ＰＢＳ溶液）、生ＲＳＶ（鼻腔内投与）、ホルマリン不活性化ＲＳＶワクチン（ＦＩ−ＲＳＶ）、１ｕｇの精製Ｆ粒子（ＰＦＰ、修飾Ｆタンパク質ＢＶ  ＃６８３）、ミョウバンを伴う１ｕｇの精製Ｆ粒子（ＰＦＰ＋ミョウバン）、１０ｕｇの精製Ｆ粒子、ミョウバンを伴う１０ｕｇの精製Ｆ粒子（ＰＦＰ＋ミョウバン）、又は３０ｕｇの精製Ｆ粒子を、０日目及び２１日目に筋肉内注射（生ＲＳＶを除く）した。免疫した各群を４２日目（２回目の免疫後２１日目）に生ＲＳＶによりチャレンジした。０日目、３１日目（２回目の免疫後１０日目）、及び４６日目（生ＲＳＶによるチャレンジ後４日目）に、各群からマウス血清を回収した。
【０１８８】
各治療群からのマウス血清を、抗ＲＳＶ中和抗体の存在についてアッセイした。免疫したマウスからの血清の希釈液を感染性ＲＳＶと共に９６ウェルマイクロタイタープレートにおいてインキュベートした。血清は１：２０〜１：２５６０に希釈した。各ウェルにおいて５０ｕｌの希釈血清を５０ｕｌの生ＲＳＶウイルス（４００ｐｆｕ）と混合した。ウイルス／血清混合液を最初に室温で６０分間インキュベートし、次に１００ｕｌのＨＥｐ−２細胞と混合して４日間インキュベートした。次に感染性ウイルスプラークの数を、クリスタルバイオレットで染色した後に計数した。各血清試料についての中和価は、１００％のＲＳＶ中和（例えば、プラークなし）をもたらした血清の最高希釈度の逆数として定義し、各動物について決定した。３１日目（追加免疫後１０日目）及び４６日目（生ＲＳＶによるチャレンジ後４日目）の幾何平均血清中和抗体価をワクチン群ごとにグラフ化した。図１８は、中和アッセイの結果を示す。結果から、１０ｕｇ又は３０ｕｇの精製Ｆタンパク質が、生ＲＳＶと比較してはるかに高い中和価をもたらすことが示される。加えて、ミョウバンアジュバントの共投与に伴いＰＦＰの中和価は亢進される。
【０１８９】
免疫化が、免疫した動物の肺におけるＲＳＶ複製を予防及び／又は阻害することができるかどうかを決定するためＲＳＶチャレンジ試験を行った。ＨＥｐ−２細胞を用いるプラークアッセイにより、免疫したマウスの肺におけるＲＳＶの量を測定した。４２日目（２回目の免疫後１１日目）に上述したマウスの免疫群を１×１０6ｐｆｕの感染性ＲＳＶロング株に鼻腔内感染させた。４６日目（ＲＳＶ感染後４日目）、マウスの肺を摘出し、計量し、及びホモジナイズした。ホモジナイズした肺組織を清澄化した。清澄化溶液の上清を希釈し、ＨＥｐ−２細胞を使用するプラークアッセイに供して肺組織におけるＲＳＶ力価を測定した（ｐｆｕ／ｇ肺組織として計算した）。結果を図１９に示し、組換えＲＳＶ  Ｆタンパク質ＢＶ  ＃６８３で免疫したマウスの全てが肺においてＲＳＶを検出不可能であったとともに、アジュバントを伴わない１ｕｇの精製組換えＲＳＶ  Ｆタンパク質ＢＶ  ＃６８３であってもＲＳＶ複製の阻害に優れた効率を示した（プラセボと比較して１０００倍超低減した）ことを示している。
【０１９０】
上記で使用したＲＳＶ  ＰＦＰワクチンの安定性を決定するため、ワクチンを２〜８℃で０、１、２、４、及び５週間保存し、次にクーマシーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した（図２０）。結果は、このＲＳＶ  ＰＦＰワクチンが２〜８℃で極めて安定しており、検出可能な分解はないことを示している。
【０１９１】
実施例１１
コットンラットにおける組換えＲＳＶ  Ｆミセル活性
この例では、動物群は、生ＲＳＶ（ＲＳＶ）、ホルマリン不活性化ＲＳＶ（ＦＩ−ＲＳＶ）、アルミニウムを伴う及び伴わないＲＳＶ−Ｆタンパク質ＢＶ  ＃６８３（ＰＦＰ及びＰＦＰ＋アルミニウムアジュバント）、並びにＰＢＳ対照による０日目及び２１日目の免疫化を含んだ。
【０１９２】
図２１に示されるとおり、アルミニウムを伴う及び伴わない３０ｕｇのＦ−ミセルワクチン（ＲＳＶ−Ｆタンパク質ＢＶ  ＃６８３、すなわちＦタンパク質６８３、配列番号８）による免疫化は、ＲＳＶ  Ａ及びＲＳＶ  Ｂのいずれに対する曝露後も、ロバストな中和抗体応答をもたらした。加えて、アルミニウムが抗体応答を有意に亢進することが観察された。さらに、ＲＳＶ  Ａ及びＲＳＶ  Ｂにおいて、それぞれ４６日目又は４９日目の追加免疫後に中和抗体が増加した。
【０１９３】
ホルマリン不活性化ＲＳＶ（ＦＩ−ＲＳＶ）で免疫したラットにおいては重大な肺病理が観察された一方、Ｆ−ミセルワクチンによる疾患の亢進は認められなかった（図２２）。Ｆ−ミセルワクチン及びアジュバントを伴うＦ−ミセルワクチンの使用により、一次ＲＳＶ感染（ＰＢＳ＋ＲＳＶチャレンジ）対照群（５．８）より低い炎症スコアがもたらされた（それぞれ４．０及び２．８）。上述のとおり、ＦＩ−ＲＳＶ治療群は、一次ＲＳＶ感染（ＰＢＳ＋ＲＳＶチャレンジ）対照群より高い炎症スコアを有した（９．０対５．８）。さらに、ＦＩ−ＲＳＶ治療群は、非チャレンジプラセボ対照、生ＲＳＶ＋ＲＳＶチャレンジ、Ｆ−ミセル＋ＲＳＶチャレンジ、及びＦ−ミセル＋アルミニウム＋ＲＳＶチャレンジと比べて有意に高い平均炎症スコア（９．０）を有した。
【０１９４】
前述の詳細な説明は理解を明瞭にするために与えられているに過ぎず、当業者には変更が明らかであろうから、そこから不必要な限定が理解されてはならない。これは、本明細書に提供される情報のいずれかがここに特許請求される発明の先行技術若しくは従来技術であること、又は明確に若しくは黙示的に参照される任意の刊行物が先行技術であることを認めるものではない。
【０１９５】
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、この発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。
【０１９６】
本願は、読者の注意が具体的な実施形態に向くよう節ごとに分割されているが、かかる節が実施形態間の区分であると解釈されてはならない。各節及びそこに記載される実施形態の教示は、他の節に適用可能である。
【０１９７】
本発明はその特定の実施形態に関連して記載されているが、さらなる変更が可能であり、本願が、概して本発明の原理に従う、且つ本発明が関わる技術分野の範囲内の公知の又は慣習的な実施の範囲内に含まれるとおりの、及び以上に示され、且つ以下の添付の特許請求の範囲に従う本質的な特徴が適用され得るとおりの、本開示からのかかる逸脱を含む、本発明の任意の変形例、使用、又は適応を網羅するよう意図されることは理解されるであろう。
【図１】
2018007655.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６ａ】
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【図１６ｂ】
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【図１６ｃ】
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【図１６ｄ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年6月29日(2017.6.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）融合（Ｆ）タンパク質の製造方法であって：
（ｉ）ＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードする核酸を昆虫宿主細胞に導入する工程であって、前記コードされたタンパク質が、
（ａ）  野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質（配列番号２）の１３７〜１４６位に対応するアミノ酸の１又は複数の欠失；及び
（ｂ）変異によって不活性化した一次フューリン切断部位であって、野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質（配列番号２）の１３１〜１３６位のアミノ酸に対応する一次フューリン切断部位；
を含む、工程；
（ｉｉ）前記昆虫宿主細胞を、前記ＲＳＶ  Ｆタンパク質の発現及び細胞プロセシングに適切な条件下で培養する工程であって、前記細胞プロセシングがＮ末端シグナルペプチドの切断を含む、工程；
（ｉｉｉ）遠心分離によって、前記昆虫細胞を回収する工程；
（ｉｖ）回収した昆虫細胞から界面活性剤を用いて前記ＲＳＶ  Ｆタンパク質を抽出する工程；及び
（ｖ）前記ＲＳＶ  Ｆタンパク質を精製する工程；
を含む、方法。
【請求項２】
前記ＲＳＶ  Ｆタンパク質を精製する工程が、陰イオン交換クロマトグラフィー、レンチルレクチン親和性クロマトグラフィー及び陽イオン交換クロマトグラフィーの１又は複数を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
抽出に用いられる前記界面活性剤がＮＰ−９である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
（ｖｉ）精製ＲＳＶ  Ｆタンパク質を薬学的に許容可能な担体と合わせる工程を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記薬学的に許容可能な担体が、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、無菌等張水性緩衝液、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
（ｖｉｉ）アジュバントを、精製ＲＳＶ  Ｆタンパク質及び薬学的に許容可能な担体と合わせる工程を含む、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
前記アジュバントが、フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、ＧＭＣＳＰ、ＢＣＧ、thur−ＭＤＰ、nor−ＭＤＰ、ＣＧＰ（ＭＴＰ−ＰＥ）、リピドＡ、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、RIBI、MF-59およびアラムからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記アジュバントがアラムである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
コードされるＲＳＶ  Ｆタンパク質が、野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質（配列番号２）のアルギニン１３３位、アルギニン１３５位、及びアルギニン１３６位からなる群から選択されるアミノ酸に対応する位置に少なくとも１つのアミノ酸変異を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
コードされるＲＳＶ  Ｆタンパク質が、野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質（配列番号２）のアルギニン１３３位、アルギニン１３５位、及びアルギニン１３６位からなる群から選択されるアミノ酸に対応する位置に少なくとも２つのアミノ酸置換を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
コードされるＲＳＶ  Ｆタンパク質が、野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質（配列番号２）のアルギニン１３３位、アルギニン１３５位、及びアルギニン１３６位のアミノ酸に対応する位置に３つのアミノ酸置換を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質（配列番号２）のアルギニン１３３位、アルギニン１３５位、及びアルギニン１３６位からなる群から選択されるアミノ酸に対応する位置の少なくとも１つのアミノ酸がグルタミン酸に置換される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質（配列番号２）のアルギニン１３３位、アルギニン１３５位、及びアルギニン１３６位からなる群から選択されるアミノ酸に対応する位置の少なくとも２つのアミノ酸がグルタミン酸に置換される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質（配列番号２）のアルギニン１３３位、アルギニン１３５位、及びアルギニン１３６位のアミノ酸に対応する位置の３つのアミノ酸がグルタミン酸に置換される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
導入される核酸が配列番号７の配列を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記昆虫宿主細胞がＳｆ９細胞である、請求項１〜１５のいずれか一項にに記載の方法。
【外国語明細書】
2018007655000001.pdf