(57)【要約】【課題】  段差が生じているクロマトグラムであっても、安定的な定量結果が得られる処理方法を提供する。【解決手段】  クロマトグラムの微分曲線を取得し、極大値又は極小値のいずれか一方のみを有する微分信号変化をスパイクノイズ処理により排除し、得られた微分曲線を微小時間区分で積分することで、クロマトグラムに再変換することを特徴とするクロマトグラムの平滑化方法。【選択図】    図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロマトグラムの微分曲線を取得し、極大値又は極小値のいずれか一方のみを有する微分信号変化をスパイクノイズ処理により排除し、得られた微分曲線を微小時間区分で積分することで、クロマトグラムに再変換することを特徴とするクロマトグラムの平滑化方法。
【請求項２】
クロマトグラムの段差が生じている時間領域の微分曲線のみを対象とした請求項１に記載のクロマトグラムの平滑化方法。
【請求項３】
クロマトグラムが液体クロマトグラフィから得られたクロマトグラムであることを特徴とする請求項１又は２に記載のクロマトグラムの平滑化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クロマトグラムのベースライン上に生じてしまった段差を処理し、安定的な定量結果が得られる処理方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
クロマトグラフィは幅広い分野で、定量や定性目的で使用されている。定量や定性を正確に行うには、安定的なクロマトグラムを取得することが重要であり、そのためにも、ベースラインの安定化が必要となる。
【０００３】
液体クロマトグラフィでのベースラインは、送液を行うポンプの脈動、検出器の光学的ノイズ、電気的ノイズ、溶離液由来のノイズ、環境依存由来のノイズ等、様々な要因のノイズが重畳してくる。
【０００４】
図１ａに示すような送液ポンプなどの送液周期由来の短形波ノイズが重畳した場合、一般的な数学的手法である「単純移動平均法」が有効である。図１ｂに示す通り、単純移動平均法により１０１点の平滑化処理を施すと、容易に平滑化することが可能である。
【０００５】
一方、図２ａに示すような短周期のノイズが重畳し、更にベースライン上に段差が生じた場合、単純移動平均法で平滑化処理を行っても、図２ｂに示す通り、段差を平滑化することはできない。
【０００６】
このようなベースラインの階段的な変動は、検出器セル内で気泡が突然発生したり、溶離液の送液中にポンプ内で僅かな気泡が発生したり、装置に何らかの振動がかかってしまったり、あるいは想定外の電気ノイズ、電源電圧変動等が重畳したりと言った不確定要素で生じてしまうことは決して珍しいことではない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、段差が生じているクロマトグラムであっても、定量性を維持したまま、段差およびノイズを平滑化する手法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、鋭意検討を行った結果、クロマトグラムのベースライン上に生じてしまった段差を平滑化することによって、安定的な定量結果が得られる処理方法を見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１０】
本発明は、クロマトグラムの微分曲線を取得し、極大値又は極小値のいずれか一方のみを有する微分信号変化をスパイクノイズ処理により排除し、得られた微分曲線を微小時間区間で積分処理することで、クロマトグラムに再変換することを特徴とするクロマトグラムの平滑化方法である。
【００１１】
また、上述したクロマトグラムの平滑化方法は、クロマトグラムの全時間領域の微分曲線を対象としてもよく、クロマトグラムの段差が生じている時間領域の微分曲線のみを対象としてもよい。
【００１２】
また、本発明は、クロマトグラフィの方法を限定することなく利用することが可能であるが、液体クロマトグラフィから得られたクロマトグラムに対して特に好適に利用することができる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、段差が生じているクロマトグラムであっても、安定的な定量結果が得られる処理方法を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下に、本発明の実施形態について詳細に説明する。
【００１５】
本発明のスパイクノイズの除去方法として、フーリエ変換を使用した方法、Ｓａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙ法、５０パーセンタイルフィルタ法、メディアンフィルタ法など数学的手法が種々挙げられるが、効率的にスパイクノイズを除去できる方法であれば特に限定されない。さらに、微分曲線上の段差由来の変動（スパイクノイズ）が明確な場合、用手法によりスパイクノイズを排除しても良い。
【００１６】
本発明の実施形態を分かりやすく説明するために、正規分布関数を組み合わせた疑似クロマトグラムを基に、ステップ毎に説明する。
【００１７】
図３ａは２つの正規分布ピークを有する疑似クロマトグラムである。横軸は経過時間、縦軸は吸光度（ｍＡＢＵ）に相当するものである。図３ｂは０．５〜０．７分に０．５ｍＡＢＵ、および３．０〜３．５分に出力１．０ｍＡＢＵの段差を加えた疑似クロマトグラムである。いずれも、溶出時間で５０ｍｓｅｃ相当のサンプリング間隔で作製したものである。
【００１８】
（ステップ１）
まず、クロマトグラムの時間当たりの出力の変化量つまり微分を取得する（図４参照）。これにより、通常のピークはある一定の幅を有し、正規分布様の形態をとることから、ピーク部では、微分値はゼロから徐々に増加し、極大値を経て、減少、ゼロ、減少、極小値を経て、増加しゼロに近づく形態となる。極大値と極小値の間の微分値がゼロになる時間が、ほぼピークの頂点（溶出時間）となる。
【００１９】
一方、段差が生じている部分では、時間当たりの出力の変化量が極端に大きくなる。出力が急激に上昇した部分では、微分値はゼロから急激に増加し、極大値を経て、急激に減少しゼロとなる。出力が急激に減少した部分では、微分値はゼロから急激に減少し、極小値、急激に増加しゼロとなる。すなわち、段差部分の微分曲線は、スパイクノイズ状となるため、極大値又は極小値のいずれか一方のみしか有さない。
【００２０】
（ステップ２）
ステップ１で得られた微分曲線を、フーリエ変換を使用した方法、Ｓａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙ法、５０パーセンタイルフィルタ法、メディアンフィルタ法などの数学的手法により、平滑化を実施し、段差部由来のスパイクノイズを除去した微分曲線を取得する。
【００２１】
（ステップ３）
ステップ２で得られた微分曲線に対して、微小時間区間で面積を計算し、微小区間の面積の総和を算出、つまり積分処理する。これにより、時間に対する出力、つまりクロマトグラムが再構築する。一連の操作により得られた再構築クロマトグラムは、段差が排除された状態となる。
【００２２】
本発明は、ベースライン上の段差のみならず、ピーク成分が溶出している最中に発生した段差に対しても、同様に有効に平滑化を行うことができる。
【００２３】
図５は４．７〜５．３分にかけてピークが溶出している最中の、４．９分に２ｍＡＢＵの段差を加えた疑似クロマトグラムである。いずれも、溶出時間で５０ｍｓｅｃ相当のサンプリング間隔で作製したものである。
【００２４】
（ステップ１）
まず、クロマトグラムの時間当たりの出力の変化量つまり微分を取得する。これにより、通常のピークはある一定の幅を有し、正規分布様の形態をとることから、ピーク部では、微分値はゼロから徐々に増加し、極大値を経て、減少、ゼロ、減少、極小値を経て、増加しゼロに近づく形態となる。極大と極小の間の微分値がゼロになる時間が、ほぼピークの頂点（溶出時間）となる。その最中、出力が急激に上昇した部分（４．９分）では、微分値は急激に増加し、極大値を経て、急激に減少しており、ピークが溶出している領域と、ピークが溶出している領域内の段差部でも、微分曲線に大きな差があることが分かる（図６参照）。
【００２５】
（ステップ２）
ステップ１で得られた微分曲線を、フーリエ変換を使用した方法、Ｓａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙ法、５０パーセンタイルフィルタ法、メディアンフィルタ法などの数学的手法により、平滑化を実施し、段差部由来のスパイクノイズを除去した微分曲線を取得する。
【００２６】
（ステップ３）
ステップ２で得られた微分曲線に対して、微小時間区間で微分値に対する面積を計算し、得られた微小区間の面積の総和を算出、つまり積分処理する。これにより、時間に対する出力、つまりクロマトグラムが再構築する。
【００２７】
以上のように、ピーク成分が溶出していない領域での段差だけでなく、ピーク成分が溶出している領域での段差に対しても、本発明の手法により、平滑化を行うことが可能であることが分かる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】短波形ノイズを含む信号を単純移動平均法により平滑化した例を示した図である。
【図２】短波形ノイズおよびベースライン段差を含む信号を単純移動平均法により平滑化した例を示した図である。
【図３】ａ．正規関数による、ベース変動のない模擬クロマトグラムを示した図である。ｂ．正規関数による、段差が生じている模擬クロマトグラムを示した図である。
【図４】図３ｂのクロマトグラムを本発明の方法で平滑化する手順を示した図である。
【図５】正規関数による、ピーク溶出領域に段差が生じている模擬クロマトグラムを示した図である。
【図６】図５のクロマトグラムを本発明の方法で平滑化する手順を示した図である。
【図７】本発明の実施例で使用したシステム構成を示した図である。
【図８】ａ．実施例１での検証用のクロマトグラムを示したものである。ｂ．約７分に段差を生じさせたクロマトグラムを示したものである。
【図９】実施例１のクロマトグラムを本発明の方法で平滑化する手順を示した図である。
【図１０】ａ．実施例１のクロマトグラムを単純移動平均法で処理した際の、段差部分を示したものである。ｂ．実施例１のクロマトグラムを単純移動平均法で処理した際の、ピーク１部分を示したものである。
【図１１】ａ．各処理によるピーク高さへの影響減少度を示したものである。ｂ．各処理によるピーク半値幅への影響を示している。いずれも、処理を施す前の値を１００として変動を示している。
【図１２】ａ．実施例２での検証用のクロマトグラムを示したものである。ｂ．約１８．５分に段差を生じさせたクロマトグラムを示したものである。
【図１３】実施例２のクロマトグラムを本発明の方法で平滑化する手順を示した図である。
【図１４】実施例２のクロマトグラムを単純移動平均法で処理した際の、段差部分を示したものである。
【図１５】ａ．各処理によるピーク高さへの影響減少度を示したものである。ｂ．各処理によるピーク半値幅への影響を示している。いずれも、処理を施す前の値を１００として変動を示している。
【図１６】ａ．ピーク溶出中に段差が生じてしまった場合の、未処理状態でのピーク検出を示した図である。ｂ．ピーク溶出中に段差が生じてしまった場合の、単純移動平均法による平滑化後でのピーク検出を示した図である。ｃ．ピーク溶出中に段差が生じてしまった場合の、本発明による平滑化後でのピーク検出を示した図である。
【実施例】
【００２９】
次に、実施例を示して本発明を具体的に説明する。しかし、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではなく、クロマトグラムシステムに接続された電子計算機で、プログラムに従って演算させても問題ない。
【００３０】
図７に示す、液体クロマトグラムシステムを使用し、実際の測定を行い、生のクロマトグラムを取得後、本発明の段差処理を施した。システムは、溶媒脱気装置（ＳＤ−８０２０）２、送液ポンプ（ＤＰ−８０２０）３、試料注入装置（ＡＳ−８０２０）４、カラムオーブン（ＣＯ−８０２０）６、紫外可視検出器（ＵＶ−８０２０）７、およびデータ処理装置（ＬＣ−８０２０ＩＩ）９で構成した（いずれも、東ソー（株）製）。
【００３１】
分析カラム５としては、東ソー（株）製  ＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−１００Ｚ（５μｍ、４．６ｍｍＩ．Ｄ．×１５ｃｍ）、溶離液１はＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ＝５０／５０を用い、ｐ−ヒドロキシ安息香酸類の分離を行った。その他の条件は下記の通り
サンプル：ｐ−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ  Ａｃｉｄ、Ｍｅｔｈｙｌ  ｐ−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏａｔｅ、Ｅｔｈｙｌ  ｐ−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏａｔｅ、Ｐｒｏｐｙｌ  ｐ−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏａｔｅ、Ｂｕｔｙｌ  ｐ−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏａｔｅ、Ｈｅｘｙｌ  ｐ−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏａｔｅ、Ｈｅｐｔｙｌ  ｐ−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏａｔｅ  各８μｇ／１ｍＬ
注入量：３０μＬ、カラム温度：４０℃、流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
データ収集サンプリングピッチ：５０ｍｓｅｃ。
【００３２】
（実施例１）
まず、前記測定条件にて、正常なクロマトグラムを取得した後、１）〜３）の操作を行い、クロマトグラム上に故意に段差を生じさせたクロマトグラムを得た。これにより、試料注入後、約７分後に１０ｍＡＢＵ程度の段差があるクロマトグラムとなる。
１）測定開始前にベースライン位置を０＿ｍＡＢＵに設定（オートゼロ実行）。
２）測定開始（試料注入／データ収集開始）。
３）約７分後にベースライン位置を１０ｍＡＢＵに設定（オートバランス実行）。
【００３３】
図８ａに正常なクロマトグラム、図８ｂに上記操作により段差が生じているクロマトグラムを示す。図８ｂによれば、約７分に約１０ｍＡＢＵの段差が生じていることが分かる。
【００３４】
このようにして得られたクロマトグラムを下記の手順に従い処理を実施した。なお、一連の処理は、データ処理装置ＬＣ−８０２０ＩＩで得られたクロマトグラムデータをテキストデータに変換し、市販の表計算ソフトを使用して諸計算を実施した。
【００３５】
（ステップ１）
取得データに対して、微分Δｆ／Ｓｐを計算した（Ｓｐ：サンプリングピッチ）。このようにして得られた微分曲線を図９に示す。７．３〜７．８分間に生じている極大、極小点を有する変動は、正規分布関数様のピーク４に由来する微分曲線である。ベースラインの段差はスパイクノイズ様の微分曲線となる（約７分）。
【００３６】
（ステップ２）
「５０％パーセンタルフィルタ」を使用してスパイクノイズ処理を実施した。７．３〜７．８分間に生じている極大、極小点を有する変動は、正規分布関数様のピーク４に由来する微分曲線である。約７分に生じていたスパイクノイズ様の信号は除去できていることが分かる。
【００３７】
（ステップ３）
スパイクノイズ処理を施した微分曲線に対して、微小時間区間面積を計算し、微小時間区間面積の累計を計算した。この操作によりクロマトグラムを再構築することができる。約７分に生じていた段差は、上記、一連の操作により解消されていることが分かる。
【００３８】
（比較例１）
実施例１と同様の未処理のクロマトグラムを、使用するデータ点を５点、１１点、２１点、５１点、１０１点で単純移動平均法により平滑化したが、図１０ａに示されるように、約７．００分に生じているような急激なベース変動（段差）に対して、一般的な「単純移動平均法」では解消できなかった。また、図１０ｂに示されるように、ピーク１の部分が平滑化の影響を受けてしまった。
【００３９】
図１１ａに未処理のクロマトグラムのピーク１の高さに対する高さ％、図１１ｂに同様にピーク半値幅％を示す。本発明の方法は、ピーク高さ、ピーク半値幅のいずれにも与える影響は小さいことが分かる。
【００４０】
（実施例２）
まず、前記測定条件（実施例１と同じ条件）にて、正常なクロマトグラムを取得した後、１）〜３）の操作を行い、クロマトグラム上に故意に段差を生じさせたクロマトグラムを得た。これにより、試料注入後約１８．５分後に約８０ｍＡＢＵ程度の段差があるクロマトグラムとなる。
１）測定開始前にベースライン位置を０＿ｍＡＢＵ  に設定（オートゼロ実行）。
２）測定開始（試料注入／データ収集開始）。
３）約１８．５分後にベースライン位置を１０＿ｍＡＢＵに設定（オートゼロ実行）。
【００４１】
図１２ａに正常なクロマトグラム、図１２ｂに上記操作により段差が生じているクロマトグラムを示す。また、図１２ｂによれば、ピーク５が溶出している最中に約８０ｍＡＢＵの段差が生じていることが分かる。このようにして得られたクロマトグラムを実施例１の手順と同様に処理を実施した。
【００４２】
（ステップ１）
取得データに対して、微分Δｆ／Ｓｐを計算した（Ｓｐ：サンプリングピッチ）。このようにして得られた微分曲線を図１３に示す。１８．０〜１９．２０分間に生じている極大、極小点を有する変動は、正規分布関数様のピーク５に由来する微分曲線である。ピーク中にある段差はスパイクノイズ様の微分曲線となる（約１８．５分）。
【００４３】
（ステップ２）
「５０％パーセンタルフィルタ」を使用してスパイクノイズ処理を実施した。１８．０〜１９．２０分間に生じている極大、極小点を有する変動は、正規分布関数様のピーク５に由来する微分曲線である。約１８．５分に生じていたスパイクノイズ様の信号は除去できていることが分かる。
【００４４】
（ステップ３）
スパイクノイズ処理を施した微分曲線に対して、微小時間区間面積を計算し、微小時間区間面積の累計を計算した。この操作によりクロマトグラムを再構築することができる。約１８．５分に生じていた段差は、上記、一連の操作により解消されていることが分かる。
【００４５】
（比較例２）
実施例２と同様の未処理のクロマトグラムを、使用するデータ点を５点、１１点、２１点、５１点、１０１点で「単純移動平均法」により平滑化したが、図１４に示されるように、約１９．００分に生じているような急激なベース変動（段差）に対して、一般的な「単純移動平均法」では解消できていなかった。
【００４６】
図１５ａに未処理のクロマトグラムのピーク５の高さに対する高さ％、図１５ｂに同様にピーク半値幅％を示す。単純移動平均法では、データ点数に関わらず、ピーク５の面積が極端に大きく、ピーク半値幅は極端に小さく計算されてしまう。これは、図１６ａに示すように、ピーク５に対するベースラインが大きく負に傾き、ピーク面積が異常に高く計算され、半値幅が異常に小さく計算されてしまうためである。一方、本発明の方法は、ピーク高さ、ピーク半値幅のいずれにも与える影響は小さいことが分かる。
【符号の説明】
【００４７】
１．溶離液
２．脱気装置
３．送液ポンプ（サンプル側）
４．試料注入バルブ
５．分析カラム
６．カラム恒温槽
７．紫外可視検出器
８．廃液
９．システム制御およびデータ処理装置
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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