(57)【要約】      （修正有）【課題】生理活性物質を固定化し得る機能を有するとともに、親水性が向上された共重合体、ならびに共重合体を含む生理活性物質固定化ポリマー、コーティング組成物および物品を提供する。【解決手段】構造単位Ａおよび構造単位Ｂを含む共重合体であって、構造単位Ａは、式（１）で表される構造単位であり、構造単位Ｂは、生理活性物質を固定化し得る機能を有する特定の（メタ）アクリレートおよび／又は（メタ）アクリルアミドに由来する構造単位である、共重合体。2018070716.tif 000028（Ｒ１１はＨ又はメチル基；Ｒ１２はＮＨ又はＯ；＊は結合；ｍは１〜４の整数）【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造単位Ａおよび構造単位Ｂを含む共重合体であって、
構造単位Ａは、式（１）で表される構造単位であり、
構造単位Ｂは、式（２）で表される構造単位および式（３）で表される構造単位から選択される少なくとも１つの構造単位である、共重合体：
【化１】
2018070716.tif 000019
（式（１）において、Ｒ１１は、水素原子、またはメチル基であり、Ｒ１２は、ＮＨ、または酸素原子であり、＊は結合を表し、ｍは、１〜４の整数である）；
【化２】
2018070716.tif 000020
（式（２）において、Ｒ２１は、水素原子、またはメチル基であり、Ｙは、式（２−１）または式（２−２）で表される基であり、Ｚは、酸素原子、またはＮＨであり、＊は、結合を表す。）
【化２−１】
2018070716.tif 000021
（式（２−１）および式（２−２）中、ｔおよびｕは、１〜２０の整数であり、＊は、結合を表す。）
【化３】
2018070716.tif 000022
（式（３）中、Ｒ３１は、水素原子、またはメチル基であり、Ｘは、炭素数１〜１０のアルキレングリコール基、またはアルキレン基であり、ｖは、１〜１００の整数であり、ｖが２以上の場合、複数のＸは、それぞれ同一であっても異なっていてもよく、Ｗは、活性エステル基であり、＊は、結合を表す。）。
【請求項２】
式（４）で表される構造単位Ｃを含む、請求項１に記載の共重合体。
【化４】
2018070716.tif 000023
（式（４）において、Ｒ４１は、水素原子、またはメチル基であり、Ｒ４２、Ｒ４３およびＲ４４は、独立して、メトキシ基、エトキシ基、水素原子またはメチル基であり、ただし、Ｒ４２、Ｒ４３およびＲ４４のうち１つ、２つまたは３つは、独立して、メトキシ基、またはエトキシ基であり、＊は、結合を表し、ｐは、２〜１０の整数である）
【請求項３】
式（５）で表される構造単位Ｄを含む、請求項１または２に記載の共重合体。
【化５】
2018070716.tif 000024
（式（５）において、Ｒ５１は、水素原子、またはメチル基であり、ｓは、４であり、Ｒ５２は、独立して、水素原子、またはメチル基であり、＊は、結合を表す。）
【請求項４】
式（６）で表される構造単位および式（７）で表される構造単位から選択される少なくとも１つの構造単位Ｅを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の共重合体。
【化６】
2018070716.tif 000025
（式（６）において、Ｒ６１は、水素原子、またはメチル基であり、＊は結合を表す）；
【化７】
2018070716.tif 000026
（式（７）において、Ｒ７１は、水素、またはメチル基であり、Ｒ７２は、水素原子、またはメチル基であり、＊は結合を表し、ｎは、２〜１００の整数である。）
【請求項５】
式（８）で表される構造単位Ｆを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の共重合体。
【化８】
2018070716.tif 000027
（式（８）において、Ｒ８１は、水素原子、またはメチル基であり、Ｒ８２は、炭素数１〜１０の直鎖または分枝鎖のアルキル、あるいは炭素数３〜８の脂環式アルキル、あるいはこれらの組み合わせであり、＊は、結合を表す。）
【請求項６】
ポリスチレン基板に、０．３ｗｔ％水またはアルコール溶液を塗布し、乾燥したとき、当該共重合体が塗布された前記ポリスチレン基板の、純水に対する接触角が、５°以上８０°以下である、請求項１〜５に記載の共重合体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の共重合体と、前記共重合体に固定化された生理活性物質とを含む、生体分子捕捉用の生理活性物質固定化ポリマー。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の共重合体および溶剤を含む、コーティング組成物。
【請求項９】
請求項７に記載の生理活性物質固定化ポリマーおよび溶剤を含む、コーティング組成物。
【請求項１０】
基材と、前記基材上に形成された請求項１〜６のいずれか一項に記載の共重合体を含むポリマー層とを備える物品。
【請求項１１】
前記ポリマー層の、純水に対する接触角が、５°以上８０°以下である、請求項１０に記載の物品。
【請求項１２】
前記ポリマー層が、１ｎｍ以上１００ｎｍ以下の厚みを有する、請求項１０または１１に記載の物品。
【請求項１３】
バイオアッセイ用である、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の物品。
【請求項１４】
前記ポリマー層に固定化された生理活性物質をさらに含む、請求項１０〜１３のいずれかに記載の物品。
【請求項１５】
基材と、前記基材上に形成された請求項７に記載の生理活性物質固定化ポリマーを含む生理活性物質固定化ポリマー層とを備える物品。
【請求項１６】
前記生理活性物質固定化ポリマー層の、純水に対する接触角が、５°以上８０°以下である、請求項１５に記載の物品。
【請求項１７】
前記生理活性物質固定化ポリマー層が、１ｎｍ以上１００ｎｍ以下の厚みを有する、請求項１５または１６に記載の物品。
【請求項１８】
バイオアッセイ用である、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の物品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、共重合体、生体分子捕捉用の生理活性物質固定化ポリマー、コーティング組成物、および物品に関する。より詳細には、バイオアッセイ等に用いることができる生体適合性を有する共重合体、ならびにこのような共重合体を含む、生理活性物質固定化ポリマー、コーティング組成物、および物品に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的に、バイオアッセイ等に用いられる生理活性物質を固定化するための担体は、粒子、基板、繊維、フィルター、膜、シートの形態で提供される。このような担体は、目的の生理活性物質を固定化するために、特定の生理活性物質と化学的に相互作用し得る機能性物質を導入する表面処理がなされている。
【０００３】
たとえば、特許文献１には、入手容易な汎用樹脂製マイクロビーズの表面に、親水性のスペーサー分子を介して機能性物質を結合させて得られる生理活性物質固定化マイクロビーズが記載されている。同文献では、基材であるマイクロビーズの表面を加水分解し、加水分解により生じたカルボン酸に、親水性のスペーサー分子を結合させ、このスペーサー分子に機能性物質を結合させている。ここでこの機能性物質は目的の生理活性物質に結合し得る選択結合性物質である。スペーサー分子の主鎖としては、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール等の、親水性を有する分子が用いられ、スペーサー分子が有する親水性により、生理活性物質の非特異的結合が抑制される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００９−０３１１３０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、引用文献１に記載の技術は、実用化を考慮した場合、基材の表面処理にともなう煩雑性や、用いる基材の材料が限定される等の問題があった。そこで、本発明者らは、それ自体が親水性を有することにより生理活性物質に対して親和性が高く、かつ基材への適用が簡便であり、簡略化された工程により生理活性物質を固定化できる材料の探索という、従来とは異なる発想のもと鋭意検討した。その結果、特定の構造を有する共重合体が、高い親水性を有し、例えば、バイオアッセイ用材料として有用であることを見出した。
【０００６】
上記課題を解決する本発明によれば、目的の生理活性物質を固定化し得る機能を有するとともに、親水性が向上された共重合体、当該共重合体に生理活性物質が固定化された生理活性物質固定化ポリマー、ならびに当該共重合体または当該生理活性物質固定化ポリマーを含むコーティング組成物および物品が提供される。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明によれば、構造単位Ａおよび構造単位Ｂを含む共重合体であって、
構造単位Ａは、式（１）で表される構造単位であり、
構造単位Ｂは、式（２）で表される構造単位および式（３）で表される構造単位から選択される少なくとも１つの構造単位である、共重合体が提供される：
【化１】
2018070716.tif 000002
（式（１）において、Ｒ１１は、水素原子、またはメチル基であり、Ｒ１２は、ＮＨ、または酸素原子であり、＊は結合を表し、ｍは、１〜４の整数である）；
【化２】
2018070716.tif 000003
（式（２）において、Ｒ２１は、水素原子、またはメチル基であり、Ｙは、式（２−１）または式（２−２）で表される基であり、Ｚは、酸素原子、またはＮＨであり、＊は、結合を表す。）
【化２−１】
2018070716.tif 000004
（式（２−１）および式（２−２）中、ｔおよびｕは、１〜２０の整数であり、＊は、結合を表す。）
【化３】
2018070716.tif 000005
（式（３）中、Ｒ３１は、水素原子、またはメチル基であり、Ｘは、炭素数１〜１０のアルキレングリコール基、またはアルキレン基であり、ｖは、１〜１００の整数であり、ｖが２以上の場合、複数のＸは、それぞれ同一であっても異なっていてもよく、Ｗは、活性エステル基であり、＊は、結合を表す。）
【０００８】
また、本発明によれば、上記共重合体と、上記共重合体に固定化された生理活性物質とを含む、生体分子捕捉用の生理活性物質固定化ポリマーが提供される。
また、本発明によれば、上記共重合体および溶剤を含むコーティング組成物が提供される。
また、本発明によれば、上記生理活性物質固定化ポリマーおよび溶剤を含む、コーティング組成物が提供される。
また、本発明によれば、基材と、前記基材上に形成された上記共重合体を含むポリマー層とを備える物品が提供される。
また、本発明によれば、基材と、前記基材上に形成された上記生理活性物質固定化ポリマーを含む生理活性物質固定化ポリマー層とを備える物品が提供される。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、目的の生理活性物質を固定化し得る機能を有するとともに、親水性が向上された生体適合性の共重合体、ならびにこれを用いた生理活性物質固定化ポリマー、コーティング組成物および物品が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
【００１１】
本実施形態に従う共重合体であるポリマーＰは、以下の構造単位Ａおよび構造単位Ｂを含む。
ここで、構造単位Ａは、式（１）で表される構造単位であり、構造単位Ｂは、式（２）で表される構造単位および式（３）で表される構造単位から選択される少なくとも１つの構造単位である：
【化１】
2018070716.tif 000006
式（１）において、Ｒ１１は、水素原子、またはメチル基であり、Ｒ１２は、ＮＨ、または酸素原子であり、＊は結合を表し、ｍは、１〜４の整数である。式（１）において、得られるポリマーＰの親水性を向上させる観点から、ｍは、好ましくは、２または３である。
【化２】
2018070716.tif 000007
式（２）において、Ｒ２１は、水素原子、またはメチル基であり、Ｙは、式（２−１）または式（２−２）で表される基であり、Ｚは、酸素原子、またはＮＨであり、＊は、結合を表す。
【化２−１】
2018070716.tif 000008
式（２−１）および式（２−２）において、ｔおよびｕは、１〜２０の整数であり、＊は、結合を表す。
【化３】
2018070716.tif 000009
式（３）において、Ｒ３１は、水素原子、またはメチル基であり、Ｘは、炭素数１〜１０のアルキレングリコール基、またはアルキレン基であり、ｖは、１〜１００の整数であり、ｖが２以上の場合、複数のＸは、それぞれ同一であっても異なっていてもよく、Ｗは、活性エステル基であり、＊は、結合を表す。式（３）中のＷにおける活性エステル構造としては、例えば、ｐ−ニトロフェニル活性エステル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル基、フタル酸イミド活性エステル基、５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド活性エステル基等が挙げられる。中でもｐ−ニトロフェニル活性エステル基またはＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル基が好ましく、ｐ−ニトロフェニル活性エステル基が最も好ましい。
【００１２】
なお、本明細書において使用される、「活性エステル基」は、エステル基の片方の置換基に酸性度の高い電子求引性基を有して求核反応に対して活性化されたエステル群、すなわち反応活性の高いエステル基を意味するものとして、各種の化学合成、例えば高分子化学、ペプチド合成等の分野で慣用されているものである。実際的には、例えばある化合物中のカルボキシル基と、水酸基又はメルカプト基を有する化合物とが脱水縮合することにより生じるエステル基である。エステル基が導入されて生じるエステルとしては、フェノールエステル類、チオフェノールエステル類、Ｎ−ヒドロキシアミンエステル類、複素環ヒドロキシ化合物のエステル類等がアルキルエステル等に比べてはるかに高い活性を有する活性エステル基を有するものとして知られている。
【００１３】
ポリマーＰは、式（１）で表される構造単位Ａを含むことにより、優れた親水性を有する。また、ポリマーＰは、式（２）で表される構造単位および式（３）で表される構造単位から選択される少なくとも１つの構造単位で表される構造単位Ｂを含むことにより、特定の生理活性物質を固定化することができる。本発明の共重合体に固定化され得る生理活性物質としては、糖、糖鎖、糖ペプチド、抗体、タンパク質等が挙げられる。さらに、構造単位Ａを含むポリマーＰは、目的の生理活性物質以外のタンパク質等の物質の非特異的吸着を抑制する機能を有する。このようなポリマーＰで表面処理された基材は、高い親水性を有し、細胞傷害性がほとんどなく、固定化される生理活性物質の機能への影響がなく、優れた生体適合性を有するため、バイオアッセイ等の生体物質と接触する環境で用いることができる。
【００１４】
構造単位Ａの原料となるモノマーとしては、式（１）の構造に対応する（メタ）アクリレートを使用でき、これらは１種単独で、または２種以上を組み合わせて用いることができる。このようなモノマーとしては、例えば、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）アクリルアミド（ＨＥＡＡ）、メタクリル酸２−ヒドロキシエチル（ＨＥＭＡ）等が挙げられる。また、構造単位Ｂの原料となるモノマーとしては、構造単位Ｂが式（３）で表される場合、式（３）の構造に対応する（メタ）アクリレートを使用することができる。構造単位Ｂが式（２）で表される場合、式（２ａ）で表されるような、１級アミノ基が保護基により保護されたアクリレートモノマーを使用できる。これらのモノマーは、１種単独で、または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【化２ａ】
2018070716.tif 000010
式（２ａ）において、Ｒ２１、ＹおよびＺは、式（２）における定義と同様であり、Ｐｒは、保護基を表す。保護基としては、ｔ−ブトキシカルボニル基、ベンジロキシカルボニル基、９−フルオレニルメトキシカルボニル基が好適に用いられる。
【００１５】
一実施形態において、ポリマーＰは、式（４）で表される構造単位Ｃを含んでもよい。
【化４】
2018070716.tif 000011
式（４）において、Ｒ４１は、水素原子、またはメチル基であり、Ｒ４２、Ｒ４３およびＲ４４は、独立して、メトキシ基、エトキシ基、水素原子またはメチル基であり、ただし、Ｒ４２、Ｒ４３およびＲ４４のうち１つ、２つまたは３つは、独立して、メトキシ基、またはエトキシ基であり、＊は、結合を表し、ｐは、２〜１０の整数である。好ましい実施形態において、式（４）におけるｐは、２〜６であり、より好ましくは、２〜４である。
【００１６】
このような構造単位Ｃを有することにより、ポリマーＰを基材に適用した場合、ポリマーＰと基材との結合性を向上させることができる。したがって、ポリマーＰが適用された基材が、加熱処理や洗浄処理等に供された場合、ポリマーＰは基材から脱離することなくその表面に留まる。そのため、このような基材は、ポリマーＰの脱離にともなう機能の低下が低減され、持続的な生理活性物質固定化能や親水性を有し得る。
構造単位Ｃの原料となるモノマーとしては、式（４）の構造に対応する（メタ）アクリレートを使用でき、これは１種単独で、または２種以上を組み合わせて用いることができる。このようなモノマーとしては、３−（メタクリロキシ）プロピルジメチルメトキシシラン、３−（メタクリルオキシ）プロピルジメチルエトキシシラン、３−（メタクリルオキシ）プロピルメチルジエトキシシラン、３−（メタクリルオキシ）プロピルメチルジメトキシシラン、３−（メタクリルオキシ）プロピルトリメトキシシラン、３−（メタクリルオキシ）プロピルトリエトキシシラン等が挙げられる。
【００１７】
一実施形態において、ポリマーＰは、式（５）で表される構造単位Ｄを含んでもよい。
【化５】
2018070716.tif 000012
式（５）において、Ｒ５１は、水素原子、またはメチル基であり、ｓは、４であり、Ｒ５２は、独立して、水素原子、またはメチル基であり、＊は、結合を表す。式（５）において、好ましくは、Ｒ５２はすべて水素原子であり、−Ｎ３は、パラ位に置換されている。
【００１８】
このような構造単位Ｄを有することにより、ポリマーＰを基材に適用した場合、ポリマーＰと基材との結合性を向上させることができる。そのため、ポリマーＰが適用された基材は、持続的な生理活性物質固定化能や親水性を有し得る。
構造単位Ｄの原料となるモノマーとしては、式（５）の構造に対応する（メタ）アクリレートを使用でき、これらは１種単独で、または２種以上を組み合わせて用いることができる。このようなモノマーの例としては、メタクリロイルオキシエチル４−アジド桂皮酸エステル（ＭＥＣＡｚ）が挙げられる。
【００１９】
一実施形態において、ポリマーＰは、式（６）で表される構造単位および式（７）で表される構造単位から選択される少なくとも１つの構造単位Ｅを含んでもよい。
【化６】
2018070716.tif 000013
式（６）において、Ｒ６１は、水素原子、またはメチル基であり、＊は結合を表す。
【化７】
2018070716.tif 000014
式（７）において、Ｒ７１は、水素、またはメチル基であり、Ｒ７２は、水素原子、またはメチル基であり、＊は結合を表し、ｎは、２〜１００の整数である。式（７）において、様々なタンパク質に対する非特異的吸着の抑制の汎用性を高める観点から、ｎは、４〜５０であることが好ましい。
ポリマーＰが式（６）で表される構造単位および式（７）で表される構造単位から選択される少なくとも１つの構造単位で表される構造単位Ｅを含むことにより、ポリマーＰへの様々なタンパク質の非特異的吸着の抑制の汎用性を高めることが可能となる。
構造単位Ｅの原料となるモノマーとしては、式（６）または式（７）の構造に対応する（メタ）アクリレートを使用でき、これらは１種単独で、または２種以上を組み合わせて用いることができる。式（６）の構造に対応する（メタ）アクリレートモノマーとしては、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）が挙げられる。また、式（７）の構造に対応する（メタ）アクリレートモノマーとしては、メトキシポリエチレングリコールメタクリレート（ＰＥＧＭＡ）、メタクリル酸ジエチレングリコールモノメチルエーテル（ＤＥＧＭ）等が挙げられる。
【００２０】
一実施形態において、ポリマーＰは、式（８）で表される構造単位Ｆを含む。
【化８】
2018070716.tif 000015
式（８）において、Ｒ８１は、水素原子、またはメチル基であり、Ｒ８２は、炭素数１〜１０の直鎖または分枝鎖のアルキル、あるいは炭素数３〜８の脂環式アルキル、あるいはこれらの組み合わせであり、＊は、結合を表す。
炭素数１〜１０の直鎖または分枝鎖のアルキルとしては、メチル、エチル、プロピル、メチルエチル、ブチル、１，２−ジメチルエチル、ペンチル、１−メチルブチル、２−メチルブチル、およびヘキシル等が挙げられる。炭素数３〜８の脂環式アルキルとしては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル等が挙げられる。
【００２１】
このような構造単位Ｆを有することにより、ポリマーＰを基材に適用した場合、ポリマーＰと基材との結合性を向上させることができる。そのため、ポリマーＰが適用された基材は、持続的な生理活性物質固定化能や親水性を有し得る。
構造単位Ｆの原料となるモノマーとしては、式（８）の構造に対応する（メタ）アクリレートを使用でき、これは１種単独で、または２種以上を組み合わせて用いることができる。このようなモノマーとしては、ｎ−ブチルメタクリレート、シクロヘキシルメタクリレート等が挙げられる。
【００２２】
ポリマーＰは、ランダム共重合体またはブロック共重合体であり得る。ランダム共重合体は、これを塗布した基材表面において均一な細胞非接着性が得られるため好ましい。
【００２３】
ポリマーＰにおける構造単位Ａの含有率（モル％）は、１０モル％以上９９モル％以下であり、好ましくは、１５モル％以上７０％モル％以下であり、より好ましくは、１５モル％以上５０モル％以下である。また、ポリマーＰにおける構造単位Ｂの含有率（モル％）は、１モル％以上５０モル％以下であり、好ましくは２モル％以上４０モル％以下である。上記範囲で構造単位Ａおよび構造単位Ｂが含まれることにより、得られるポリマーＰは、生理活性物質を固定化する機能を有するとともに、優れた親水性を有する。
【００２４】
ポリマーＰが、構造単位Ｃ〜Ｆの少なくとも１つを含む場合、ポリマーＰにおける構造単位Ｃ〜Ｆの合計の含有率は、１モル％以上８９モル％以下であり、好ましくは、１０モル％以上７０モル％以下であり、より好ましくは、２０モル％以上６０モル％以下である。上記範囲で構造単位Ｃ〜Ｆの少なくとも１つを含むポリマーＰは、良好な親水性および生理活性物質固定化能を維持しつつ、基材への結合性を有する。
【００２５】
ポリマーＰにおける各構造単位の含有量および組成は、以下で説明するポリマーＰの製造において、重合反応に用いる原料モノマーの量を調整することにより制御できる。
【００２６】
また、ポリマーＰの重量平均分子量Ｍｗは、１００００〜１００００００であり、好ましくは、２００００〜５０００００である。一実施形態において、ポリマーＰの数平均分子量Ｍｎは、５０００〜１０００００であり、好ましくは、１００００〜８００００である。重量平均分子量および数平均分子量が上記範囲内であることにより、ポリマーＰは合成時の取扱い性が良好であるとともに、優れた親水性を有する。
【００２７】
なお、重量平均分子量（Ｍｗ）、および数平均分子量（Ｍｎ）は、ＧＰＣ測定により得られる標準ポリスチレン（ＰＳ）の検量線から求めた、換算値を用いる。本実施形態において、測定条件は、以下の通りである。
装置：ゲルパーミエーションクロマトグラフィー装置（日本分光株式会社製、ＬＣ−２０００Ｐｌｕｓシリーズ）
カラム：東ソー社製、ＴＳＫ−ＧＥＬＡＬＰＨＡ−Ｍ、ＡＬＰＨＡ−２５００
検出器：液体クロマトグラム用ＲＩ検出器
測定温度：４０℃
溶媒：メタノール／水＝７／３（ｖｏｌ／ｖｏｌ）混合溶媒
試料濃度：０．０５ｗｔ％
【００２８】
（ポリマーＰの製造方法）
本発明のポリマーＰの合成は、モノマー化合物の調製およびこれらの重合を含め、当該分野で公知の方法を用いて行うことができる。モノマー化合物は、市販の化合物を使用することができる。重合方法としては、例えば、ラジカル重合法が挙げられる。また、ラジカル重合法を用いる場合、ラジカル重合開始剤を用いて重合する方法が好適である。この場合、懸濁重合、溶液重合、分散重合、乳化重合等の方法を取ることができる。中でも、溶液重合が好ましい。溶液重合の際には、各モノマーを全量一括仕込みで行ってもよいし、一部を反応容器に仕込み、残りを滴下して行ってもよい。また、後述するように、基材上に重合性官能基や連鎖移動基等を導入し、基材上で上記ポリマーＰを合成してもよい。
【００２９】
ラジカル重合法に用いることができるラジカル重合開始剤としては、アゾ化合物および有機過酸化物のうちのいずれか１種以上を使用できる。
アゾ化合物としては、たとえば２，２'−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、ジメチル２，２'−アゾビス（２−メチルプロピオネート）、１，１'−アゾビス（シクロヘキサンカルボニトリル）（ＡＢＣＮ）等が挙げられ、これらのうち、いずれか１種以上を使用できる。
また、有機過酸化物としては、たとえば、ジターシャリブチルパーオキサイド（ＤＴＢＰ）、過酸化ベンゾイル（ベンゾイルパーオキサイド，ＢＰＯ）および、メチルエチルケトンパーオキサイド（ＭＥＫＰ）等を挙げることができ、これらのうち、いずれか１種以上を使用できる。
ラジカル重合開始剤の量（モル数）は、原料として用いるモノマーの合計モル数の０．０５％〜３％とすることが好ましい。重合開始剤の量を前記範囲内で適宜設定し、かつ、反応温度、反応時間を適宜設定することで、得られるポリマーの重量平均分子量（Ｍｗ）を１００００〜１００００００に調整することができる。
【００３０】
ポリマーＰの製造に用いられる重合溶媒は、重合反応に関与せず、かつ重合体と相溶性のある溶媒であれば特に制限されず、例えば、水、メタノール、エタノール、プロパノール、ｔ−ブタノール、ベンゼン、トルエン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、クロロホルム、メチルエチルケトン等のケトン系溶媒およびこれらの混合溶媒等が挙げられる。これらの溶媒は、１種単独で、または２種以上を組み合わせて用いることができる。
重合溶媒には、必要に応じて、他の添加剤を含めてもよい。
【００３１】
（ポリマーＰの用途）
（ポリマーＰの基材への適用）
本発明のポリマーＰは、ポリマーＰを含むコーティング組成物を基材へ塗布することにより、当該基材の表面に適用される。基材は、無機または有機材料からなる基材を用いることができる。この場合、コーティング組成物は、ポリマーＰに加え、溶剤、および必要に応じて界面活性剤等の添加剤を含み得る。溶剤としては、水、エタノール、メタノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｔ−ブチルアルコール、ｎ−ペンタノール、シクロヘキサノール等のアルコール、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトン、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、メチルエチルケトン、メチルブチルケトン、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル、シクロヘキサノン等が挙げられる。これらの溶媒は、単独で、または２種以上を組み合わせて用いることができる。中でも、アルコールが、プラスチック基材を変性させず、乾燥させやすいため好ましい。
【００３２】
コーティング組成物に含まれるポリマーＰの量は、適用される基材の種類、得られる膜の厚み、コーティング方法に依存して調整することができる。コーティング組成物中のポリマーＰの濃度は、例えば、０．０１重量％以上１．５重量％以下とすることができる。
【００３３】
本発明に用いる基材としては、スライド形状基板、マイクロウェルプレート、容器、マイクロフルイディスク基板等を用いることができるが、これらに限定されることはなく、適時最適な形状を選択できる。基材の材料としては、例えば、無機物質、有機高分子物質等が挙げられる。無機物質としては、シリカ、アルミナ、ガラス、金属等が挙げられる。有機高分子物質としては、熱可塑性樹脂等が挙げられ、熱可塑性樹脂としては、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン等の直鎖状ポリオレフィン樹脂；ポリスチレン樹脂；環状ポリオレフィン樹脂；含フッ素樹脂；ポリカーボネート樹脂等が挙げられる。中でも、耐熱性、耐薬品性、低蛍光性、成形性に特に優れる飽和環状ポリオレフィン樹脂を用いることが好ましい。本明細書において、飽和環状ポリオレフィン樹脂とは、環状オレフィン構造を有する単独重合体又は環状オレフィンとα−オレフィンとの共重合体に水素添加した飽和重合体を指す。
【００３４】
ポリマーＰを含むコーティング組成物を用いて基材の表面修飾を行う方法としては、基材をコーティング組成物に浸漬する方法、またはコーティング組成物を、例えば、スプレー塗布により基材に塗布する方法が挙げられるが、これらに限定されず、当該分野において公知の他の手法により表面修飾を行うことができる。なお、表面修飾とは、すべてまたは連続であるものに限られず、一部または非連続であるものも含む。
【００３５】
基材表面と、これを被覆するポリマーＰを含むコーティング組成物との密着性を高めるために、基材表面を活性化することが好ましい。活性化する手段としては酸素雰囲気下、アルゴン雰囲気下、窒素雰囲気下、空気雰囲気下などの条件下でプラズマ処理する方法、フッ化アルゴン、フッ化クリプトンなどのエキシマレーザーで処理する方法があるが、酸素雰囲気下でプラズマ処理する方法が好ましい。
【００３６】
ポリマーＰが構造単位Ｃを有する場合、基材を、ポリマーＰを含むコーティング組成物で表面修飾した後に、５０〜１２０℃で５分間〜１００時間加熱処理するのが好ましい。構造単位Ｃから産生するシラノール基が基材の官能基またはポリマーＰのシラノール基などと脱水縮合することにより、ポリマーＰを含むコーティング組成物と基材との結合性を向上させることができる。これにより前述のように、ポリマーＰを含むコーティング組成物を適用した基材が加熱処理や洗浄処理等に供された場合、ポリマーＰは基材から脱離することなくその表面に留まりやすくなる。このような基材は、ポリマーＰの脱離にともなう機能の低下が低減され、持続的な生理活性物質固定化能や親水性を有し得る。
【００３７】
ポリマーＰが構造単位Ｄを有する場合、基材を、ポリマーＰを含むコーティング組成物で表面修飾した後に、光照射するのが好ましい。光照射する条件としては、１０ｍＪ／ｃｍ２以上１０００ｍＪ／ｃｍ２以下が挙げられ、５０ｍＪ／ｃｍ２以上８００ｍＪ／ｃｍ２以下であることが好ましく、１００ｍＪ／ｃｍ２以上７００ｍＪ／ｃｍ２以下であることがさらに好ましい。光照射により、構造単位Ｄからナイトレンを発生し、基材またはポリマーＰと反応する。これにより、ポリマーＰを含むコーティング組成物と基材との結合性を向上させることができる。その結果、ポリマーＰを含むコーティング組成物を適用した基材が、加熱処理や洗浄処理等に供された場合、ポリマーＰは基材から脱離することなくその表面に留まりやすくなる。このような基材は、ポリマーＰの脱離にともなう機能の低下が低減され、持続的な生理活性物質固定化能や親水性を有し得る。
【００３８】
（ポリマーＰへの生理活性物質の固定化）
本発明のポリマーＰが担持された基材（以下、担体という）には、各種の生理活性物質または生理活性物質含有物質を固定化することができる。生理活性物質としては、例えば、糖、糖質、糖鎖、ペプチド、タンパク質、核酸、細胞、脂質などが挙げられる。また、糖鎖または糖鎖を含む物質としては、単糖、２糖以上の糖鎖、糖アミノ酸、糖ペプチド、糖タンパク質、糖脂質、グリコサミノグリカン、グリコシルホスファチジルイノシトール、ペプチドグリカン、リポ多糖、およびそれらの誘導体などがある。なお、あらかじめポリマーＰに生理活性物質または生理活性物質含有物質を固定化して生理活性物質固定化ポリマーを作製し、その後これを基材に担持させてもよい。このような生理活性物質固定化ポリマーは、基材に担持せず、粒子状等にして単独で、生体物質捕捉用のポリマーとして使用することもできる。
【００３９】
基材表面に担持した本発明のポリマーＰにおける生理活性物質または生理活性物質含有物質を固定化する官能基が式（２）で表される構造単位であって、生理活性物質が、糖、糖質、糖鎖などの還元末端と反応する官能基を有する場合は、還元末端を有する生理活性物質をｐＨ４．０〜６．０の緩衝液中に溶解し、基材上にその溶液を室温〜１００℃、１０分〜２４時間静置することにより、生理活性物質をポリマーＰに固定化できる。
【００４０】
一方、ポリマーＰにおける生理活性物質または生理活性物質含有物質を固定化する官能基が、式（３）で表される活性エステル基など、求核性の官能基と反応する基である場合は、生理活性物質または生理活性物質含有物質は求核性の官能基を有する必要がある。求核性の官能基の一例としては、アミノ基が挙げられる。アミノ基を有する生理活性物質または生理活性物質含有物質をｐＨ７．０〜１０．０の緩衝液中に溶解し、基材上でその溶液を室温〜１００℃、１０分〜２４時間静置することにより、このような生理活性物質をポリマーＰに固定化できる。アミノ基を持たない生理活性物質または生理活性物質含有物質を用いる場合は、固定化の前にこれにアミノ基を導入する必要があるが、この場合アミノ基は生理活性物質または生理活性物質含有物質の末端に導入されることが好ましい。
こうして得られた生理活性物質または生理活性物質含有物質を固定化した担体は、十分な量の生理活性物質または生理活性物質含有物質が化学結合で強固に固定化され、さらに検出対象以外の非特異吸着を抑制できることから、該生理活性物質または生理活性物質含有物質と特異的に結合し得る物質を選択的に捕捉することができ、生体物質捕捉用担体として使用できる。例えば、担体が板状である場合、バイオチップとして好適に用いることができる。
【００４１】
本発明において生理活性物質または生理活性物質含有物質をバイオチップ用担体上に固定化する際には、生理活性物質または生理活性物質含有物質を溶解または分散した液体を点着する方法を用いることが好ましい。点着後、静置すると、生理活性物質または生理活性物質含有物質が担体上の官能基と化学的に結合し、生理活性物質または生理活性物質含有物質が表面に固定化される。
【００４２】
生理活性物質または生理活性物質含有物質をバイオチップ用担体上に固定化した後は、生理活性物質または生理活性物質含有物質を固定化した部分以外の担体表面の官能基を不活性化処理するのが好ましい。例えば、担体の官能基が活性エステル基やアルデヒド基などの場合はアルカリ化合物、あるいは一級アミノ基を有する化合物で行うことが好ましい。
【００４３】
アルカリ化合物としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、ホウ酸ナトリウム、水酸化リチウム、リン酸カリウムなどを好ましく用いることができる。一級アミノ基を有する化合物としては、メチルアミン、エチルアミン、ブチルアミン、グリシン、９−アミノアクアジン、アミノブタノール、４−アミノ酪酸、アミノカプリル酸、アミノエタノール、５−アミノ−２，３−ジヒドロ−１，４−ペンタノール、アミノエタンチオール塩酸塩、アミノエタンチオール硫酸、２−（２−アミノエチルアミノ）エタノール、リン酸二水素２−アミノエチル、硫酸水素アミノエチル、４−（２−アミノエチル）モルホリン、５−アミノフルオレセイン、６−アミノヘキサン酸、アミノヘキシルセルロース、ｐ−アミノ馬尿酸、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール、５−アミノイソフタル酸、アミノメタン、アミノフェノール、２−アミノオクタン、２−アミノオクタン酸、１−アミノ−２−プロパノール、３−アミノ−１−プロパノール、３−アミノプロペン、３−アミノプロピオニトリル、アミノピリジン、１１−アミノウンデカン酸、アミノサリチル酸、アミノキノリン、４−アミノフタロニトリル、３−アミノフタルイミド、ｐ−アミノプロピオフェノン、アミノフェニル酢酸、アミノナフタレンなどを好ましく用いることができ、アミノエタノール、グリシンが最も好ましい。
【００４４】
また、担体の官能基がヒドラジド基又はアミノオキシ基などの場合は、例えば、酸無水物との反応やオキソ酸との縮合により行うことができる。酸無水物は特に限定されないが、反応性からカルボン酸無水物が好ましい。カルボン酸無水物の例としては、無水酢酸、無水プロピオン酸、無水コハク酸、無水マレイン酸、無水フタル酸、無水安息香酸などが挙げられるが、中でも無水酢酸、無水コハク酸がより好ましい。また、オキソ酸も特に限定されないが、反応性からカルボン酸が好ましい。カルボン酸の例としては、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、カプロン酸、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸等が挙げられるが、中でもギ酸、酢酸が好ましい。
【００４５】
また、前記不活性化処理工程では、担体の官能基と結合しなかった生理活性物質または生理活性物質含有物質も同時に洗浄・除去することができることが多い。除去できない場合は、不活性化処理前に基材を洗浄することで除去することが好ましい。例えば担体を超純水、界面活性剤含有緩衝液等で１〜５分間浸漬し洗浄することで、除去できる。
【００４６】
生理活性物質固定化担体は、上記ポリマーＰを準備する工程と、前記ポリマーＰを、基材の表面に担持させる工程と、前記ポリマーＰが担持された基材（担体）に、生理活性物質を固定化する工程と、前記生理活性物質が固定化された前記担体を純水またはバッファで洗浄する工程を用いて作製され得る。
純水またはバッファで洗浄する工程としては、上記のように担体の官能基と結合しなかった生理活性物質または生理活性物質含有物質も同時に洗浄・除去する工程や、過剰な検出対象物または非検出対象物を洗浄・除去する工程が挙げられる。また、担体は、前記記載のとおり、基材上に重合性官能基や連鎖移動基等を導入し、基材上で上記ポリマーＰを合成することにより作製してもよいし、あらかじめポリマーＰに生理活性物質または生理活性物質含有物質を固定化し、その後基材に担持させてもよい。
【００４７】
このように生理活性物質または生理活性物質含有物質を固定化することによって得られた基材は免疫診断システム、マイクロアレイシステム、マイクロフルイディスクデバイスを含めた多くの分析システムにおいて使用することができる。
【００４８】
上記コーティング組成物を基材に塗布し、乾燥して得られるポリマーＰを含むポリマー層、または上述のような生理活性物質固定化ポリマーを含む生体分子捕捉ポリマー層の厚みは、親水性の発現とポリマー層または生体分子捕捉ポリマー層の均一性の観点から、１ｎｍ以上１００ｎｍ以下とすることができる。ポリマーＰを含むポリマー層または生理活性物質固定化ポリマー層の厚みは、基材の用途に基づいて適宜変更することができる。
【００４９】
上記表面修飾された基材は、ポリマーＰを含むポリマー層または生理活性物質固定化ポリマーを含む生体分子捕捉ポリマー層を設けることにより、その表面の純水に対する接触角を、５°以上８０°以下とすることができる。
ここで、本発明において、優れた親水性とは、純水との接触角が８０°以下の水濡れ性を呈する状態をいう。接触角の測定方法は、公知の方法を採用でき、たとえば、協和界面化学株式会社製「ＣＡ−Ｚ」等の市販の装置を用いて測定する方法を採用することができる。上記方法により、純水に対する接触角が８０°以下であれば、ポリマーＰ又は生理活性物質固定化ポリマーは優れた親水性を有し、優れた生体適合性を有すると判断することができる。
なお、好ましくは、この接触角は、５°以上６０°以下であり、さらに好ましくは５°以上４０°以下である。ポリマーＰを含むポリマー層、または生理活性物質固定化ポリマー層の接触角は、基材の用途に基づいて変更することができ、例えば、ポリマーＰを含むポリマー層、生理活性物質固定化ポリマー層の厚み、ポリマーＰを構成するモノマーの種類およびその組成、ポリマー層の形成方法等を選択することにより、調整できる。
【００５０】
より具体的には、本実施形態のポリマーＰまたは生理活性物質固定化ポリマーは、ポリスチレン基板に、ポリマーＰ又は生理活性物質固定化ポリマーの０．３重量％水またはアルコール溶液を塗布し、乾燥したとき、このポリスチレン基板の、純水に対する接触角が、５°以上８０°以下となり得る。好ましくは、この接触角は、５°以上６０°以下であり、より好ましくは、５°以上４０°以下である。
【００５１】
ポリマーＰは、特定の生理活性物質を固定化し得る機能を有するとともに、優れた親水性を有し、生体適合性材料として有用である。そのため、ポリマーＰが塗布された基材は、生体活性物質を固定化してバイオアッセイ用機器等の物品として使用され得る。
【００５２】
以上、本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。
【実施例】
【００５３】
以下、実施例を参照して本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの例示に限定されるものではない。
【００５４】
（合成例１）
（ＨＥＡＡ／ＡＥＧ／シランカップリング剤ポリマーの合成）
２．１２ｇ（１８．４ｍｍｏｌ）のＮ−（２−ヒドロキシエチル）アクリルアミド（ＨＥＡＡ、東京化成工業製）、０．４７ｇ（１．０ｍｍｏｌ）のｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−４，５−ポリエチレングリコールメタクリレート（ＡＥＧ、株式会社ナード研究所製）、０．１３５ｇ（０．６ｍｍｏｌ）の３−（メタクリロキシ）プロピルジメチルメトキシシラン（Ｇｅｌｅｓｔ社製）、および０．０６６ｇ（０．４ｍｍｏｌ）の２，２'−アゾビス（イソブチロニトリル）をエタノール１０ｍＬに溶解させた後、得られた混合溶液を反応容器内に導入した。次に、１０分間アルゴンガスを吹き込んだ後密閉し、６０℃で２０時間反応させた。
得られた溶液を、撹拌しながら、ヘキサン：アセトン：エタノール混合溶媒（体積比６：３：１）４００ｍＬ中に徐々に滴下し、滴下終了後１時間撹拌した後、静置して析出物を沈降させた。上清を除去し、残った析出物をエタノール２００ｍＬに再溶解し、エバポレーターで濃縮して、目的のポリマーを含むエタノール溶液を得た。得られたポリマー溶液の一部をサンプル瓶に移し、４８時間真空乾燥させた後の重量を測定して、このポリマー溶液の濃度を算出し、この値を基に、塗布用の０．３ｗｔ％エタノール溶液を作製した。
【００５５】
（合成例２）
（ＨＥＡＡ／ＡＥＧ／シランカップリング剤／ＭＰＣポリマーの合成）
０．５７６ｇ（５ｍｍｏｌ）のＮ−（２−ヒドロキシエチル）アクリルアミド（ＨＥＡＡ、東京化成工業製）、０．２３５ｇ（０．５ｍｍｏｌ）のｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−４，５−ポリエチレングリコールメタクリレート（ＡＥＧ、株式会社ナード研究所製）、０．１１４ｇ（０．５ｍｍｏｌ）の３−（メタクリロキシ）プロピルジメチルメトキシシラン（Ｇｅｌｅｓｔ社製）、１．１８ｇ（４ｍｍｏｌ）の２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）、および０．０３３ｇ（０．２ｍｍｏｌ）の２，２'−アゾビス（イソブチロニトリル）をエタノール１０ｍＬに溶解させた後、得られた混合溶液を反応容器内に導入した。次に、１０分間アルゴンガスを吹き込んだ後密閉し、６０℃で２０時間反応させた。
得られた溶液を、撹拌しながら、ヘキサン：アセトン：エタノール混合溶媒（体積比６：３：１）４００ｍＬ中に徐々に滴下し、滴下終了後１時間撹拌した後、静置して析出物を沈降させた。上清を除去し、残った析出物をエタノール２００ｍＬに再溶解し、エバポレーターで濃縮して、目的のポリマーを含むエタノール溶液を得た。得られたポリマー溶液の一部をサンプル瓶に移し、４８時間真空乾燥させた後の重量を測定して、このポリマー溶液の濃度を算出し、この値を基に、塗布用の０．３ｗｔ％エタノール溶液を作製した。
【００５６】
（合成例３）
（ＨＥＡＡ／ＡＥＧ／シランカップリング剤／ＰＥＧポリマーの合成）
０．５７６ｇ（５ｍｍｏｌ）のＮ−（２−ヒドロキシエチル）アクリルアミド（ＨＥＡＡ、東京化成工業製）、０．２３５ｇ（０．５ｍｍｏｌ）のｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−４，５−ポリエチレングリコールメタクリレート（ＡＥＧ、株式会社ナード研究所製）、０．１１４ｇ（０．５ｍｍｏｌ）の３−（メタクリロキシ）プロピルジメチルメトキシシラン（Ｇｅｌｅｓｔ社製）、１．８７ｇ（４ｍｍｏｌ）のポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート（分子量４７５、アルドリッチ社製）、および０．０３３ｇ（０．２ｍｍｏｌ）の２，２'−アゾビス（イソブチロニトリル）をエタノール１０ｍＬに溶解させた後、得られた混合溶液を反応容器内に導入した。次に、１０分間アルゴンガスを吹き込んだ後密閉し、６０℃で２０時間反応させた。
得られた溶液を、撹拌しながら、ヘキサン：アセトン：エタノール混合溶媒（体積比６：３：１）４００ｍＬ中に徐々に滴下し、滴下終了後１時間撹拌した後、静置して析出物を沈降させた。上清を除去し、残った析出物をエタノール２００ｍＬに再溶解し、エバポレーターで濃縮して、目的のポリマーを含むエタノール溶液を得た。得られたポリマー溶液の一部をサンプル瓶に移し、４８時間真空乾燥させた後の重量を測定して、このポリマー溶液の濃度を算出し、この値を基に、塗布用の０．３ｗｔ％エタノール溶液を作製した。
【００５７】
（合成例４）
（ＨＥＡＡ／アミノオキシ／シランカップリング剤ポリマーの合成）
０．８６４ｇ（７．５ｍｍｏｌ）のＮ−（２−ヒドロキシエチル）アクリルアミド（ＨＥＡＡ、東京化成工業製）、０．８６４ｇ（２ｍｍｏｌ）のＮ−［２−［２−［２−（ｔ−ブトキシカルボニルアミノオキシアセチルアミノ）エトキシ］エトキシ］エチル］−メタクリルアミド（アミノオキシ、株式会社ナード研究所製）、０．１１４ｇ（０．５ｍｍｏｌ）の３−（メタクリロキシ）プロピルジメチルメトキシシラン（Ｇｅｌｅｓｔ社製）、および０．０３３ｇ（０．２ｍｍｏｌ）の２，２'−アゾビス（イソブチロニトリル）をエタノール７ｍＬに溶解させた後、得られた混合溶液を反応容器内に導入した。次に、１０分間アルゴンガスを吹き込んだ後密閉し、６０℃で２０時間反応させた。
得られた溶液を、撹拌しながら、ヘキサン：アセトン：エタノール混合溶媒（体積比６：３：１）４００ｍＬ中に徐々に滴下し、滴下終了後１時間撹拌した後、静置して析出物を沈降させた。上清を除去し、残った析出物をエタノール２００ｍＬに再溶解し、エバポレーターで濃縮して、目的のポリマーを含むエタノール溶液を得た。得られたポリマー溶液の一部をサンプル瓶に移し、４８時間真空乾燥させた後の重量を測定して、このポリマー溶液の濃度を算出し、この値を基に、塗布用の０．３ｗｔ％エタノール溶液を作製した。
【００５８】
（合成例５）
（ＨＥＡＡ／ＡＥＧ／ＢＭＡポリマーの合成）
０．５７６ｇ（５ｍｍｏｌ）のＮ−（２−ヒドロキシエチル）アクリルアミド（ＨＥＡＡ、東京化成工業製）、０．２３５ｇ（０．５ｍｍｏｌ）のｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−４，５−ポリエチレングリコールメタクリレート（ＡＥＧ、株式会社ナード研究所製）、０．６４ｇ（４．５ｍｍｏｌ）のメタクリル酸ｎ−ブチル（ＢＭＡ、関東化学株式会社製）、０．０３３ｇ（０．２ｍｍｏｌ）の２，２'−アゾビス（イソブチロニトリル）をエタノール７ｍＬに溶解させた後、得られた混合溶液を反応容器内に導入した。次に、１０分間アルゴンガスを吹き込んだ後密閉し、６０℃で２０時間反応させた。
得られた溶液を、撹拌しながら、ヘキサン：アセトン：エタノール混合溶媒（体積比６：３：１）４００ｍＬ中に徐々に滴下し、滴下終了後１時間撹拌した後、静置して析出物を沈降させた。上清を除去し、残った析出物をエタノール２００ｍＬに再溶解し、エバポレーターで濃縮して、目的のポリマーを含むエタノール溶液を得た。得られたポリマー溶液の一部をサンプル瓶に移し、４８時間真空乾燥させた後の重量を測定して、このポリマー溶液の濃度を算出し、この値を基に、塗布用の０．３ｗｔ％エタノール溶液を作製した。
【００５９】
（合成例６）
（ＨＥＡＡ／ＡＥＧポリマーの合成１）
１．１ｇ（９．５ｍｍｏｌ）のＮ−（２−ヒドロキシエチル）アクリルアミド（ＨＥＡＡ、東京化成工業製）、０．２３５ｇ（０．５ｍｍｏｌ）のｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−４，５−ポリエチレングリコールメタクリレート（ＡＥＧ、株式会社ナード研究所製）、０．０３３ｇ（０．２ｍｍｏｌ）の２，２'−アゾビス（イソブチロニトリル）をエタノール７ｍＬに溶解させた後、得られた混合溶液を反応容器内に導入した。次に、１０分間アルゴンガスを吹き込んだ後密閉し、６０℃で２０時間反応させた。
得られた溶液を、撹拌しながら、ヘキサン：アセトン：エタノール混合溶媒（体積比６：３：１）４００ｍＬ中に徐々に滴下し、滴下終了後１時間撹拌した後、静置して析出物を沈降させた。上清を除去し、残った析出物をエタノール２００ｍＬに再溶解し、エバポレーターで濃縮して、目的のポリマーを含むエタノール溶液を得た。得られたポリマー溶液の一部をサンプル瓶に移し、４８時間真空乾燥させた後の重量を測定して、このポリマー溶液の濃度を算出し、この値を基に、塗布用の０．３ｗｔ％エタノール溶液を作製した。
【００６０】
（合成例７）
（ＨＥＡＡ／ＡＥＧポリマーの合成２）
１．１４ｇ（９．９ｍｍｏｌ）のＮ−（２−ヒドロキシエチル）アクリルアミド（ＨＥＡＡ、東京化成工業製）、０．０４５ｇ（０．１ｍｍｏｌ）のｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−４，５−ポリエチレングリコールメタクリレート（ＡＥＧ、株式会社ナード研究所製）、０．０３３ｇ（０．２ｍｍｏｌ）の２，２'−アゾビス（イソブチロニトリル）をエタノール７ｍＬに溶解させた後、得られた混合溶液を反応容器内に導入した。次に、１０分間アルゴンガスを吹き込んだ後密閉し、６０℃で２０時間反応させた。
得られた溶液を、撹拌しながら、ヘキサン：アセトン：エタノール混合溶媒（体積比６：３：１）４００ｍＬ中に徐々に滴下し、滴下終了後１時間撹拌した後、静置して析出物を沈降させた。上清を除去し、残った析出物をエタノール２００ｍＬに再溶解し、エバポレーターで濃縮して、目的のポリマーを含むエタノール溶液を得た。得られたポリマー溶液の一部をサンプル瓶に移し、４８時間真空乾燥させた後の重量を測定して、このポリマー溶液の濃度を算出し、この値を基に、塗布用の０．３ｗｔ％エタノール溶液を作製した。
【００６１】
（合成例８）
（ＨＥＡＡ／ＡＥＧポリマーの合成３）
１．１３ｇ（９．８ｍｍｏｌ）のＮ−（２−ヒドロキシエチル）アクリルアミド（ＨＥＡＡ、東京化成工業製）、０．０９０ｇ（０．２ｍｍｏｌ）のｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−４，５−ポリエチレングリコールメタクリレート（ＡＥＧ、株式会社ナード研究所製）、および０．０３３ｇ（０．２ｍｍｏｌ）の２，２'−アゾビス（イソブチロニトリル）をエタノール７ｍＬに溶解させた後、得られた混合溶液を反応容器内に導入した。次に、１０分間アルゴンガスを吹き込んだ後密閉し、６０℃で２０時間反応させた。
得られた溶液を、撹拌しながら、ヘキサン：アセトン：エタノール混合溶媒（体積比６：３：１）４００ｍＬ中に徐々に滴下し、滴下終了後１時間撹拌した後、静置して析出物を沈降させた。上清を除去し、残った析出物をエタノール２００ｍＬに再溶解し、エバポレーターで濃縮して、目的のポリマーを含むエタノール溶液を得た。得られたポリマー溶液の一部をサンプル瓶に移し、４８時間真空乾燥させた後の重量を測定して、このポリマー溶液の濃度を算出し、この値を基に、塗布用の０．３ｗｔ％エタノール溶液を作製した。
【００６２】
（接触角の測定）
以下の方法を用いて、上記ポリマーからなるポリマー層の純水に対する接触角を測定した。
プラズマ処理済みの環状ポリオレフィン製のプラスチック基板を、上記の０．３重量％コーティング組成物に浸して１分間静置した。その後、この基板をコーティング組成物より取り出した。次いで、この基板の表面を乾燥させ、１００℃、真空中で一晩静置することにより、表面がポリマーでコーティングされたプラスチック基板を得た。これを実施例のプラスチック基板として用いた。
比較例１として、プラズマ処理した、環状ポリオレフィン製のプラスチック基板を用いた。
【００６３】
次に協和界面化学社製のＣＡ−Ｖ型接触角計を用いて、準備したプラスチック基板の、純水に対する接触角を測定した。接触角の値は、超純水２．０μＬを、測定対象の表面に滴下した後８５秒の時点で測定した。結果を以下の表１に、「接触角−１」として示す。
【００６４】
（生理活性物質の固定化能の測定、および生体分子の捕捉能の測定）
以下の方法を用いて、上記ポリマーからなるポリマー層への生理活性物質固定化能、および得られた生理活性物質固定化担体の生体分子に対する捕捉能を測定した。
（生理活性物質固定化能の測定）
実施例１、２、３、５、６、７、および８において、プラズマ処理済みの環状ポリオレフィン製のプラスチック基板を、それぞれ、上述の合成例１、２、３、５、６、７、８で得られた０．３重量％コーティング組成物に浸して１分間静置した後、この基板をコーティング組成物より取り出した。次いで、この基板の表面を乾燥させ、１００℃、真空中で一晩静置する事で、表面がポリマーでコーティングされたプラスチック基板を得た。これを実施例のプラスチック基板として用いた。
比較例１として、プラズマ処理した、環状ポリオレフィン製のプラスチック基板を用いた。
【００６５】
次に、上述のようにして得られたポリマーがコーティングされたプラスチック基板を、生理活性物質の固定化について評価した。合成例１、２、３、５、６、７、８で得られたポリマーを塗布したプラスチック基板上に、リン酸緩衝液で１ｍＭに調製したビオチンヒドラジド溶液を１μＬ滴下し、３７℃で１時間静置し、乾燥させた。基板を純水で洗浄後に、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸緩衝液で２ｇ／ｍＬに調製したＣｙ３標識ストレプトアビジン溶液の中に基板を浸し、室温で１時間反応させた。基板を純水で洗浄して乾燥させた後、マイクロアレイ用スキャナ（ＧｅｎｅＰｉｘ  ４０００Ｂ、株式会社インターメディカル製）を用いて、シグナルとしてビオチンヒドラジド溶液を滴下した部分と、バックグラウンドとして滴下していない部分の、ぞれぞれのＣｙ３の蛍光強度を測定した。測定結果を以下の表２に「蛍光強度−１」として示す。
【００６６】
実施例４において、合成例４で得られたポリマーがコーティングされたプラスチック基板、および比較例のプラスチック基板を、以下の方法で生理活性物質の固定化について評価した。
まず、ポリマー合成例４で得られたポリマーを塗布したプラスチック基板を２ｍｏｌ／Ｌ  塩酸に浸し、室温で３時間反応させた。基板を塩酸から取り出した後、純水で洗浄し、乾燥させた。塩酸と反応させた基板と、比較例として用いた基板とに、ｐＨ５．０の３００ｍＭ  酢酸ナトリウム溶液で１ｍＭに調製したルイスＸ糖鎖の溶液  １μＬを滴下し、８０℃で１時間反応させた。基板を純水で洗浄後に、２価の金属イオンを含有したトリス緩衝液で１μｇ／ｍＬに調製したＢｉｏｔｉｎ標識ＡＡＬレクチン溶液に基板を浸し、室温で１時間反応させた。基板を純水で洗浄後、２価の金属イオンを含有したトリス緩衝液で２μｇ／ｍＬに調製したＣｙ３標識ストレプトアビジン溶液の中に基板を浸し、室温で１時間反応させた。基板を純水で洗浄して乾燥させた後、マイクロアレイ用スキャナ（ＧｅｎｅＰｉｘ  ４０００Ｂ）を用いて、シグナルとしてルイスＸ糖鎖溶液を滴下した部分と、バックグラウンドとして滴下していない部分の、ぞれぞれのＣｙ３の蛍光強度を測定した。結果を以下の表２に、「蛍光強度−１」として合わせて示す。
【００６７】
（生体分子捕捉能の測定）
実施例１−８において、以下の方法を用いて、生理活性物質を固定化したポリマーからなるポリマー層の、生体分子に対する吸着量を測定した。
プラズマ処理済みのポリスチレン製９６ウェルプレートの各ウェルに、上記の０．３重量％コーティング組成物を１００μＬ分注し、３０分静置した。溶液を排出した後、ウェルの表面を乾燥させ、６０℃、真空中で一晩静置する事で、表面がポリマーでコーティングされた９６ウェルプレートを得た。また、ポリスチレン製９６ウェルプレートをプラズマ処理したものを、比較例１として用いた。
【００６８】
次に、作製した９６ウェルプレートへの、ペルオキシダーゼ標識アビジンの吸着量を測定した。まず、合成例１−８で得られたポリマーを塗布した９６ウェルプレートの各ウェルに０．１Ｍ  エタノールアミン水溶液を１００μＬ分注し、室温で１時間反応させた。溶液を排出した後、純水でウェルを洗浄した。その後、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸緩衝液で２．５μｇ／ｍＬに調製したペルオキシダーゼ標識アビジン溶液を、ポリマー合成例４で得られたポリマーを塗布したプレートを含む、全てのプレートの各ウェルに１００μＬ分注し、室温で１時間反応させた。別のウェルには、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸緩衝液のみを陰性検体として各ウェルに１００μＬ分注し、室温で１時間反応させた。溶液を排出後、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸緩衝液で各ウェルを洗浄し、市販のＴＭＢ発色キットを用いて１５分発色反応を行い、反応停止後、プレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定した。結果を以下の表３に、「吸光度−１」として示す。
【００６９】
（測定結果）
【表１】
2018070716.tif 000016
【表２】
2018070716.tif 000017
＊65535はシグナルの上限値を超えていることを示している。
【表３】
2018070716.tif 000018
【００７０】
ポリマー合成例１〜８で調製したポリマーのコーティング膜を有するプラスチック表面は全て、生理活性物質の固定化能と、特異的な生体分子の捕捉能、および非特異的な生体分子の吸着を抑制する性能を示した。一方で、比較例であるプラズマ処理のみを実施したプラスチック基板では生理活性物質を特異的に固定化できず、また生体分子の非特異的な吸着も抑制できていない事が示されており、ポリマーのコーティング膜による効果が示された。
【００７１】
純水の接触角の測定結果から、合成例１〜８で調製したポリマーのコーティング膜を有するプラスチック表面の接触角は全て１０°〜８０°の範囲に入っている事が確認され、構成成分の変更により接触角が調整できる事が示された。また、実施例６〜８に示されるように、構造単位Ａの含有率を上げる事で有意に接触角が低下しており、４０°以下の接触角を達成できる事が示された。