(57)【要約】      （修正有）【課題】モノクローナル抗体の種特異性は、それらをヒト治療剤として開発する上で重大な障害である。ＣＤ３に対する異種間特異的抗体の提供。【解決手段】特定のアミノ酸配列の一部であり、ヒト及び非チンパンジー霊長動物のＣＤ３イプシロン鎖のエピトープに結合することが可能な第１の結合ドメインと、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、Ｂリンパ球抗原ＣＤ１９（ＣＤ１９）、肝細胞増殖因子受容体（Ｃ−ＭＥＴ）、エンドシアリン、エクソン２によりコードされるＥｐＣＡＭのＥＧＦ様ドメイン１、線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰアルファ）、及びインスリン様増殖因子Ｉ受容体（ＩＧＦ−ＩＲまたはＩＧＦ−１Ｒ）から選択される抗原に結合することが可能な第２の結合ドメインとを含む二重特異性単鎖抗体分子。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２、４、６、または８に含まれるアミノ酸配列の一部であり、少なくとも、アミノ酸配列Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｕを含み、ヒト、およびコモンマーモセット、ワタボウシタマリン、またはコモンリスザルのＣＤ３ε（イプシロン）鎖エピトープに結合することが可能な、抗原との相互作用部位である第１の結合ドメインと、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、Ｂリンパ球抗原ＣＤ１９（ＣＤ１９）、肝細胞増殖因子受容体（Ｃ−ＭＥＴ）、エンドシアリン、エクソン２によりコードされるＥｐＣＡＭのＥＧＦ様ドメイン１、線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰアルファ）、およびインスリン様増殖因子Ｉ受容体（ＩＧＦ−ＩＲまたはＩＧＦ−１Ｒ）からなる群から選択される抗原に結合することが可能な第２の結合ドメインとを含む二重特異性単鎖抗体分子。
【請求項２】
第１の結合ドメインが、
（ａ）配列番号２７に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号２８に示されるＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号２９に示されるＣＤＲ−Ｌ３と；
（ｂ）配列番号１１７に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１１８に示されるＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号１１９に示されるＣＤＲ−Ｌ３と；
（ｃ）配列番号１５３に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１５４に示されるＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号１５５に示されるＣＤＲ−Ｌ３と
から選択されるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬ領域を含む、請求項１に記載の二重特異性単鎖抗体分子。
【請求項３】
第１の結合ドメインが、
（ａ）配列番号１２に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１３に示されるＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号１４に示されるＣＤＲ−Ｈ３と；
（ｂ）配列番号３０に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３１に示されるＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３２に示されるＣＤＲ−Ｈ３と；
（ｃ）配列番号４８に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４９に示されるＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号５０に示されるＣＤＲ−Ｈ３と；
（ｄ）配列番号６６に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号６７に示されるＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号６８に示されるＣＤＲ−Ｈ３と；
（ｅ）配列番号８４に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号８５に示されるＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号８６に示されるＣＤＲ−Ｈ３と；
（ｆ）配列番号１０２に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１０３に示されるＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号１０４に示されるＣＤＲ−Ｈ３と；
（ｇ）配列番号１２０に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１２１に示されるＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号１２２に示されるＣＤＲ−Ｈ３と；
（ｈ）配列番号１３８に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１３９に示されるＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号１４０に示されるＣＤＲ−Ｈ３と；
（ｉ）配列番号１５６に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１５７に示されるＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号１５８に示されるＣＤＲ−Ｈ３と；
（ｊ）配列番号１７４に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１７５に示されるＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号１７６に示されるＣＤＲ−Ｈ３と
から選択されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ領域を含む、請求項１または２に記載の二重特異性単鎖抗体分子。
【請求項４】
第１の結合ドメインが、配列番号３５、３９、１２５、１２９、１６１、または１６５に示されるＶＬ領域からなる群から選択されるＶＬ領域を含む、請求項１または２に記載の二重特異性単鎖抗体分子。
【請求項５】
第１の結合ドメインが、配列番号１５、１９、３３、３７、５１、５５、６９、７３、８７、９１、１０５、１０９、１２３、１２７、１４１、１４５、１５９、１６３、１７７、または１８１に示されるＶＨ領域からなる群から選択されるＶＨ領域を含む、請求項１または２に記載の二重特異性単鎖抗体分子。
【請求項６】
第１の結合ドメインが、
（ａ）配列番号１７または２１に示されるＶＬ領域、および配列番号１５または１９に示されるＶＨ領域と；
（ｂ）配列番号３５または３９に示されるＶＬ領域、および配列番号３３または３７に示されるＶＨ領域と；
（ｃ）配列番号５３または５７に示されるＶＬ領域、および配列番号５１または５５に示されるＶＨ領域と；
（ｄ）配列番号７１または７５に示されるＶＬ領域、および配列番号６９または７３に示されるＶＨ領域と；
（ｅ）配列番号８９または９３に示されるＶＬ領域、および配列番号８７または９１に示されるＶＨ領域と；
（ｆ）配列番号１０７または１１１に示されるＶＬ領域、および配列番号１０５または１０９に示されるＶＨ領域と；
（ｇ）配列番号１２５または１２９に示されるＶＬ領域、および配列番号１２３または１２７に示されるＶＨ領域と；
（ｈ）配列番号１４３または１４７に示されるＶＬ領域、および配列番号１４１または１４５に示されるＶＨ領域と；
（ｉ）配列番号１６１または１６５に示されるＶＬ領域、および配列番号１５９または１６３に示されるＶＨ領域と；
（ｊ）配列番号１７９または１８３に示されるＶＬ領域、および配列番号１７７または１８１に示されるＶＨ領域と
からなる群から選択されるＶＬ領域およびＶＨ領域を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の二重特異性単鎖抗体分子。
【請求項７】
第１の結合ドメインが、配列番号２３、２５、４１、４３、５９、６１、７７、７９、９５、９７、１１３、１１５、１３１、１３３、１４９、１５１、１６７、１６９、１８５、または１８７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の二重特異性単鎖抗体分子。
【請求項８】
第２の結合ドメインが、ヒト前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）および／または非ヒト霊長動物のＰＳＣＡに結合することが可能な結合ドメイン、ヒトＢリンパ球抗原ＣＤ１９（ＣＤ１９）および／または非ヒト霊長動物のＣＤ１９に結合することが可能な結合ドメイン、ヒト肝細胞増殖因子受容体（Ｃ−ＭＥＴ）および／または非ヒト霊長動物のＣ−ＭＥＴに結合することが可能な結合ドメイン、ヒトエンドシアリンおよび／または非ヒト霊長動物のエンドシアリンに結合することが可能な結合ドメイン、ヒトＥｐＣＡＭおよび／または非ヒト霊長動物のＥｐＣＡＭに結合することが可能な結合ドメイン、ヒト線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰアルファ）および／または非ヒト霊長動物のＦＡＰアルファに結合することが可能な結合ドメイン、および、ヒトインスリン様増殖因子Ｉ受容体（ＩＧＦ−ＩＲまたはＩＧＦ−１Ｒ）および／または非ヒト霊長動物のＩＧＦ−１Ｒに結合することが可能な結合ドメインからなる群より選択される、請求項１から７のいずれか一項に記載の二重特異性単鎖抗体分子。
【請求項９】
ａ）配列番号３８２〜３８４のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号３７７〜３７９のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｂ）配列番号４００〜４０２のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号３９５〜３９７のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｃ）配列番号４１４〜４１６のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号４０９〜４１１のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｄ）配列番号４３２〜４３４のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号４２７〜４２９のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｅ）配列番号１２１５〜１２１７のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号１２２０〜１２２２のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｆ）配列番号１１８７〜１１８９のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号１１９２〜１１９４のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｇ）配列番号１１７３〜１１７５のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号１１７８〜１１８０のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｈ）配列番号１２２９〜１２３１のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号１２３４〜１２３６のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｉ）配列番号１２０１〜１２０３のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号１２０６〜１２０８のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｋ）配列番号１２５７〜１２５９のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号１２６２〜１２６４のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｌ）配列番号１２４３〜１２４５のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号１２４８〜１２５０のＣＤＲ Ｌ１〜３と
から選択される配列群を、第２の結合ドメイン内におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲ Ｈ２、ＣＤＲ Ｈ３、ＣＤＲ Ｌ１、ＣＤＲ Ｌ２、およびＣＤＲ Ｌ３として含む、請求項８に記載のヒト前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）および／または非ヒト霊長動物のＰＳＣＡに結合することが可能な二重特異性単鎖抗体分子。
【請求項１０】
ａ）配列番号４７８〜４８０のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号４７３〜４７５のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｂ）配列番号５３０〜５３２のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号５２５〜５２７のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｃ）配列番号５１８〜５２０のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号５１３〜５１５のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｄ）配列番号５０６〜５０８のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号５０１〜５０３のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｅ）配列番号４９４〜４９６のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号４８９〜４９１のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｆ）配列番号５４２〜５４４のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号５３７〜５３９のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｇ）配列番号５５４〜５５６のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号５４９〜５５１のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｈ）配列番号５６６〜５６８のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号５６１〜５６３のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｉ）配列番号５７８〜５８０のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号５７３〜５７５のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｊ）配列番号５９０〜５９２のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号５８５〜５８７のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｋ）配列番号６０２〜６０４のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号５９７〜５９９のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｌ）配列番号６１４〜６１６のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号６０９〜６１１のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｍ）配列番号６２６〜６２８のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号６２１〜６２３のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｎ）配列番号６３８〜６４０のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号６３３〜６３５のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｏ）配列番号６５０〜６５２のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号６４５〜６４７のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｐ）配列番号６６２〜６６４のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号６５７〜６５９のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｑ）配列番号６７４〜６７６のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号６６９〜６７１のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｒ）配列番号６８６〜６８８のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号６８１〜６８３のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｓ）配列番号６９８〜７００のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号６９３〜６９５のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｔ）配列番号７１０〜７１２のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号７０５〜７０７のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｕ）配列番号７２２〜７２４のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号７１７〜７１９のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｖ）配列番号７３４〜７３６のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号７２９〜７３１のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｗ）配列番号７４６〜７４８のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号７４１〜７４３のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｘ）配列番号７５８〜７６０のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号７５３〜７５５のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｙ）配列番号１２７１〜１２７３のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号１２７６〜１２７８のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｚ）配列番号１２８５〜１２８７のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号１２９０〜１２９２のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ａａ）配列番号１２９９〜１３０１のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号１３０４〜１３０６のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ａｂ）配列番号１３１３〜１３１５のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号１３１８〜１３２０のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ａｃ）配列番号１３２７〜１３２９のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号１３３２〜１３３４のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ａｄ）配列番号１３４１〜１３４３のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号１３４６〜１３４８のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ａｅ）配列番号１３５５〜１３５７のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号１３６０〜１３６２のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ａｆ）配列番号１３６９〜１３７１のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号１３７４〜１３７６のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ａｇ）配列番号１３８３〜１３８５のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号１３８８〜１３９０のＣＤＲ Ｌ１〜３と
から選択される配列群を、第２の結合ドメイン内におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲ Ｈ２、ＣＤＲ Ｈ３、ＣＤＲ Ｌ１、ＣＤＲ Ｌ２、およびＣＤＲ Ｌ３として含む、請求項８に記載のヒトＢリンパ球抗原ＣＤ１９（ＣＤ１９）および／または非ヒト霊長動物のＣＤ１９に結合することが可能な二重特異性単鎖抗体分子。
【請求項１１】
ａ）配列番号８２１〜８２３のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号８１６〜８１８のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｂ）配列番号８３６〜８３８のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号８３３〜８３５のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｃ）配列番号８４５〜８４７のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号８４０〜８４２のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｄ）配列番号８６３〜８６５のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号８５８〜８６０のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｅ）配列番号８８１〜８８３のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号８７６〜８７８のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｆ）配列番号８９９〜９０１のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号８９４〜８９６のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｇ）配列番号１４０１〜１４０３のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号１４０６〜１４０８のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｈ）配列番号１４１５〜１４１７のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号１４２０〜１４２２のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｉ）配列番号１４２９〜１４３１のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号１４３４〜１４３６のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｊ）配列番号１４４３〜１４４５のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号１４４８〜１４５０のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｋ）配列番号１４５７〜１４５９のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号１４６２〜１４６４のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｌ）配列番号１４７１〜１４７３のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号１４７６〜１４７８のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｍ）配列番号１６３９〜１６４１のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号１６４４〜１６４６のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｎ）配列番号１６２５〜１６２７のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号１６３０〜１６３２のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｏ）配列番号１６１１〜１６１３のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号１６１６〜１６１８のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｐ）配列番号１５９７〜１５９９のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号１６０２〜１６０４のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｑ）配列番号１５６９〜１５７１のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号１５７４〜１５７６のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｒ）配列番号１５５５〜１５５７のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号１５６０〜１５６２のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｓ）配列番号１５８３〜１５８５のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号１５８８〜１５９０のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｔ）配列番号１５４１〜１５４３のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号１５４６〜１５４８のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｕ）配列番号１５１３〜１５１５のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号１５１８〜１５２０のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｖ）配列番号１５２７〜１５２９のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号１５３２〜１５３４のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｗ）配列番号１４９９〜１５０１のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号１５０４〜１５０６のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｘ）配列番号１４８５〜１４８７のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号１４９０〜１４９２のＣＤＲ Ｌ１〜３と
から選択される配列群を、第２の結合ドメイン内におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲ Ｈ２、ＣＤＲ Ｈ３、ＣＤＲ Ｌ１、ＣＤＲ Ｌ２、およびＣＤＲ Ｌ３として含む、請求項８に記載のヒト肝細胞増殖因子受容体（Ｃ−ＭＥＴ）および／または非ヒト霊長動物のＣ−ＭＥＴに結合することが可能な二重特異性単鎖抗体分子。
【請求項１２】
ａ）配列番号１６５３〜１６５５のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号１６５８〜１６６０のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｂ）配列番号１６６７〜１６６９のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号１６７２〜１６７４のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｃ）配列番号１６８１〜１６８３のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号１６８６〜１６８８のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｄ）配列番号１６９５〜１６９７のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号１７００〜１７０２のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｅ）配列番号１７０９〜１７１１のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号１７１４〜１７１６のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｆ）配列番号１７２３〜１７２５のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号１７２８〜１７３０のＣＤＲ Ｌ１〜３と
から選択される配列群を、第２の結合ドメイン内におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲ Ｈ２、ＣＤＲ Ｈ３、ＣＤＲ Ｌ１、ＣＤＲ Ｌ２、およびＣＤＲ Ｌ３として含む、請求項８に記載のヒトエンドシアリンおよび／または非ヒト霊長動物のエンドシアリンに結合することが可能な二重特異性単鎖抗体分子。
【請求項１３】
ａ）配列番号９４０〜９４２のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号９３５〜９３７のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｂ）配列番号９５６〜９５８のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号９５１〜９５３のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｃ）配列番号９６８〜９７０のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号９６３〜９６５のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｄ）配列番号９８０〜９８２のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号９７５〜９７７のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｅ）配列番号９９２〜９９４のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号９８７〜９８９のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｆ）配列番号１００４〜１００６のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号９９９〜１００１のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｇ）配列番号１０２８〜１０３０のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号１０２３〜１０２５のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｈ）配列番号１０４０〜１０４２のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号１０３５〜１０３７のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｉ）配列番号１０５２〜１０５４のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号１０４７〜１０４９のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｊ）配列番号１０７４〜１０７６のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号１０６９〜１０７１のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｋ）配列番号１０８６〜１０８８のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号１０８１〜１０８３のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｌ）配列番号１０９８〜１０００のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号１０９３〜１０９５のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｍ）配列番号１１１０〜１１１２のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号１１０５〜１１０７のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｎ）配列番号１１２２〜１１２４のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号１１１７〜１１１９のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｏ）配列番号１０１６〜１０１８のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号１０１１〜１０１３のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｐ）配列番号１７６５〜１７６７のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号１７７０〜１７７２のＣＤＲ Ｌ１〜３と
から選択される配列群を、第２の結合ドメイン内におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲ Ｈ２、ＣＤＲ Ｈ３、ＣＤＲ Ｌ１、ＣＤＲ Ｌ２、およびＣＤＲ Ｌ３として含む、請求項８に記載のヒトＥｐＣＡＭおよび／または非ヒト霊長動物のＥｐＣＡＭに結合することが可能な二重特異性単鎖抗体分子。
【請求項１４】
ａ）配列番号１１３７〜１１３９のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号１１３２〜１１３４のＣＤＲ Ｌ１〜３と
ｂ）配列番号１８４９〜１８５１のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号１８５４〜１８５６のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｃ）配列番号１８３５〜１８３７のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号１８４０〜１８４２のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｄ）配列番号１７７９〜１７８１のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号１７８４〜１７８６のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｅ）配列番号１７９３〜１７９５のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号１７９８〜１８００のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｆ）配列番号１８６３〜１８６５のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号１８６８〜１８７０のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｇ）配列番号１８０７〜１８０９のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号１８１２〜１８１４のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｈ）配列番号１８２１〜１８２３のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号１８２６〜１８２８のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｉ）配列番号１８９１〜１８９３のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号１８９６〜１８９８のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｊ）配列番号１８７７〜１８７９のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号１８８２〜１８８４のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｋ）配列番号１９６１〜１９６３のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号１９６６〜１９６８のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｌ）配列番号１９４７〜１９４９のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号１９５２〜１９５４のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｍ）配列番号１９７５〜１９７７のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号１９８０〜１９８２のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｎ）配列番号１９３３〜１９３５のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号１９３８〜１９４０のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｏ）配列番号１９１９〜１９２１のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号１９２４〜１９２６のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｐ）配列番号１９０５〜１９０７のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号１９１０〜１９１２のＣＤＲ Ｌ１〜３と
から選択される配列群を、第２の結合ドメイン内におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲ Ｈ２、ＣＤＲ Ｈ３、ＣＤＲ Ｌ１、ＣＤＲ Ｌ２、およびＣＤＲ Ｌ３として含む、請求項８に記載のヒト線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰアルファ）および／または非ヒト霊長動物のＦＡＰアルファに結合することが可能な二重特異性単鎖抗体分子。
【請求項１５】
ａ）配列番号２０１６〜２０１８のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号２０２１〜２０２３のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｂ）配列番号２０３０〜２０３２のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号２０３５〜２０３７のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｃ）配列番号２０４４〜２０４６のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号２０４９〜２０５１のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｄ）配列番号２０５８〜２０６０のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号２０６３〜２０６５のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｅ）配列番号２０７２〜２０７４のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号２０７７〜２０７９のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｆ）配列番号２０８６〜２０８８のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号２０９１〜２０９３のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｇ）配列番号２１００〜２１０２のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号２１０５〜２１０７のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｈ）配列番号２１１４〜２１１６のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号２１１９〜２１２１のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｉ）配列番号２１２８〜２１３０のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号２１３３〜２１３５のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｊ）配列番号２１４２〜２１４４のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号２１４７〜２１４９のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｋ）配列番号２１５６〜２１５８のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号２１６１〜２１６３のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｌ）配列番号２１７０〜２１７２のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号２１７５〜２１７７のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｍ）配列番号２１８４〜２１８６のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号２１８９〜２１９１のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｎ）配列番号２１９８〜２２００のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号２２０３〜２２０５のＣＤＲ Ｌ１〜３と；
ｏ）配列番号２２１２〜２２１４のＣＤＲＨ１〜３、および配列番号２２１７〜２２１９のＣＤＲ Ｌ１〜３と
から選択される配列群を、第２の結合ドメイン内におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲ Ｈ２、ＣＤＲ Ｈ３、ＣＤＲ Ｌ１、ＣＤＲ Ｌ２、およびＣＤＲ Ｌ３として含む、請求項８に記載のヒトインスリン様増殖因子Ｉ受容体（ＩＧＦ−ＩＲまたはＩＧＦ−１Ｒ）および／または非ヒト霊長動物のＩＧＦ−１Ｒに結合することが可能な二重特異性単鎖抗体分子。
【請求項１６】
請求項１から１５のいずれか一項に記載の二重特異性単鎖抗体分子をコードする核酸分子。
【請求項１７】
請求項１６に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１８】
請求項１７に記載のベクターにより形質転換されるか、またはこれをトランスフェクトした宿主。
【請求項１９】
請求項１から１５のいずれかに記載の二重特異性単鎖抗体分子を作製するためのプロセスであって、請求項１８に記載の宿主を、請求項１から１５のいずれかに記載のポリペプチドを発現させる条件下で培養するステップと、生成されたポリペプチドを前記培養物から回収するステップとを含むプロセス。
【請求項２０】
請求項１から１５のいずれか一項に記載の二重特異性単鎖抗体分子を含む医薬組成物。
【請求項２１】
癌または自己免疫疾患を予防、治療、または改善するのに用いられる、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
請求項１から１５のいずれか一項に記載の二重特異性単鎖抗体分子であって、癌または自己免疫疾患を予防、治療、または改善するのに用いられる二重特異性単鎖抗体分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、配列番号２、４、６、および８からなる群に含まれるアミノ酸配列の一部である、ヒト、および非チンパンジー霊長動物のＣＤ３イプシロン鎖のエピトープに結合することが可能な第１の結合ドメインと、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、Ｂリンパ球抗原ＣＤ１９（ＣＤ１９）、肝細胞増殖因子受容体（Ｃ−ＭＥＴ）、エンドシアリン、エクソン２によりコードされるＥｐＣＡＭのＥＧＦ様ドメイン１、線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰアルファ）、およびインスリン様増殖因子Ｉ受容体（ＩＧＦ−ＩＲまたはＩＧＦ−１Ｒ）からなる群から選択される抗原に結合することが可能な第２の結合ドメインとを含む二重特異性単鎖抗体分子に関する。本発明はまた、前記二重特異性単鎖抗体分子をコードする核酸のほか、それを作製するためのベクターおよび宿主細胞、ならびにプロセスも提供する。本発明はさらに、前記二重特異性単鎖抗体分子を含む医薬組成物、および前記二重特異性単鎖抗体分子の医療的使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｔ細胞による認識は、ペプチドを取り込んだペプチド：ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）分子と相互作用する、クローン型によりアルファ：ベータおよびガンマ：デルタに区分されたＴ細胞受容体（ＴｃＲ）を介する（ＤａｖｉｓおよびＢｊｏｒｋｍａｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ３３４（１９８８）、３９５〜４０２）。抗原特異的なＴｃＲ鎖は、シグナル伝達ドメインを保有しないが、その代わりに、保存的なマルチサブユニットからなるシグナル伝達装置であるＣＤ３と結合している（Ｃａｌｌ、Ｃｅｌｌ  １１１（２００２）、９６７〜９７９；Ａｌａｒｃｏｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１９１（２００３）、３８〜４６；Ｍａｌｉｓｓｅｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１９１（２００３）、７〜２７）。ＴｃＲによるリガンド結合が、どのような機構により、このシグナル伝達装置へと直接的に伝達されるのかは、依然として、Ｔ細胞生物学における根本的な問題である（Ａｌａｒｃｏｎ、前出；Ｄａｖｉｓ、Ｃｅｌｌ  １１０（２００２）２８５〜２８７）。持続的なＴ細胞反応が、共受容体の係合、ＴｃＲのオリゴマー化、また、免疫学的シナプスにおいて、ＴｃＲ−ｐＭＨＣ複合体が、より高次元的な形で配置されることを伴うことは明らかであると考えられる（Ｄａｖｉｓおよびｖａｎ  ｄｅｒ  Ｍｅｒｗｅ、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１１（２００１）、Ｒ２８９〜Ｒ２９１；Ｄａｖｉｓ、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４（２００３）、２１７〜２２４）。しかし、これらのイベントの不在下にあるごく初期においてもＴｃＲによるシグナル伝達は生じ、これは、リガンドに誘導される、ＣＤ３イプシロンの立体構造変化を伴いうる（Ａｌａｒｃｏｎ、前出；Ｄａｖｉｓ（２００２）、前出；Ｇｉｌ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（２００１）、１１１７４〜１１１７９；Ｇｉｌ、Ｃｅｌｌ  １０９（２００２）、９０１〜９１２）。このシグナル伝達複合体のイプシロンサブユニット、ガンマサブユニット、デルタサブユニット、ゼータサブユニットは、互いに会合し合って、ＣＤ３イプシロン：ガンマヘテロ二量体、ＣＤ３イプシロン：デルタヘテロ二量体、およびＣＤ３ゼータ：ゼータホモ二量体を形成する（Ｃａｌｌ、前出）。ＣＤ３分子は、アルファ：ベータＴｃＲが細胞表面において適正な形で発現し、また、Ｔ細胞が正常な形で発生するのに重要であることが、様々な研究により示されている（Ｂｅｒｋｈｏｕｔ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３（１９８８）、８５２８〜８５３６；Ｗａｎｇ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８（１９９８）、１３７５〜１３８０；Ｋａｐｐｅｓ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７（１９９５）、４４１〜４４７）。マウスＣＤ３イプシロン：ガンマヘテロ二量体の外部ドメイン断片の溶液構造は、このイプシロン：ガンマサブユニットがいずれも、互いに相互作用し合って、隣り合わせのまれな二量体の立体構造を形成する、Ｃ２セットのＩｇドメインであることを示した（Ｓｕｎ、Ｃｅｌｌ  １０５（２００１）、９１３〜９２３）。システインに富むストークも、ＣＤ３の二量体化を駆動するのに重要な役割を果たすと考えられる（Ｓｕ、前出；Ｂｏｒｒｏｔｏ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（１９９８）、１２８０７〜１２８１６）が、これらのタンパク質がＴｃＲベー���と会合するには、ＣＤ３イプシロンおよびＣＤ３ガンマの細胞外ドメインによる相互作用で十分である（Ｍａｎｏｌｉｏｓ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４（１９９４）、８４〜９２；ＭａｎｏｌｉｏｓおよびＬｉ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７３（１９９５）、５３２〜５３６）。異論の余地はあるが、ＴｃＲの主要な化学量論的組成は、１つのアルファ：ベータＴｃＲ、１つのＣＤ３イプシロン：ガンマヘテロ二量体、１つのＣＤ３イプシロン：デルタヘテロ二量体、および１つのＣＤ３ゼータ：ゼータホモ二量体を含む可能性が極めて高い（Ｃａｌｌ、前出）。免疫反応におけるヒトＣＤ３イプシロン：ガンマヘテロ二量体の中心的な役割を踏まえ、治療用抗体であるＯＫＴ３に結合させたこの複合体の結晶構造が、近年になって明らかにされた（Ｋｊｅｒ−Ｎｉｅｌｓｅｎ、ＰＮＡＳ  １０１（２００４）、７６７５〜７６８０）。
【０００３】
ＴｃＲシグナル伝達を標的とすることによりＴ細胞の免疫作用を調節する治療戦略は数多く、特に、抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、免疫抑制レジームにおいて臨床的に広く用いられている。ヒトにおける使用について初めて承認されたｍＡｂは、ＣＤ３特異性マウスｍＡｂであるＯＫＴ３であり（Ｓｇｒｏ、Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  １０５（１９９５）、２３〜２９）、これは、移植（Ｃｈａｔｅｎｏｕｄ、Ｃｌｉｎ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ７（１９９３）、４２２〜４３０；Ｃｈａｔｅｎｏｕｄ、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３（２００３）、１２３〜１３２；Ｋｕｍａｒ、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．Ｐｒｏｃ．３０（１９９８）、１３５１〜１３５２）、１型糖尿病（Ｃｈａｔｅｎｏｕｄ（２００３）、前出）、および乾癬（Ｕｔｓｅｔ、Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２９（２００２）、１９０７〜１９１３）における免疫抑制剤として臨床的に広く用いられている。さらに、抗ＣＤ３  ｍＡｂは、部分的なＴ細胞シグナル伝達およびクローンアネルギーも誘導しうる（Ｓｍｉｔｈ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５（１９９７）、１４１３〜１４２２）。文献において、ＯＫＴ３は、強力なＴ細胞マイトジェンとして（Ｖａｎ  Ｗａｕｖｅ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２４（１９８０）、２７０８〜１８）のほか、強力なＴ細胞殺滅剤として（Ｗｏｎｇ、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ５０（１９９０）、６８３〜９）も説明されている。ＯＫＴ３は、これらの活性の両方を時間依存的な形で示す；初期にＴ細胞を活性化させ、サイトカインを放出させた後で、さらに投与すると、その後、ＯＫＴ３は、既知のすべてのＴ細胞機能を遮断する。ＯＫＴ３が、同種移植組織の拒絶を軽減するか、またはこれをさらに消失させるための治療レジメンにおいても、免疫抑制剤としてこのように広く適用されているのは、このように、後期においてＴ細胞機能を遮断するためである。
【０００４】
ＯＫＴ３が同種移植組織の拒絶を可逆化するのは、急性拒絶において主要な役割を果たす、すべてのＴ細胞機能を遮断することによる可能性がきわめて高い。ＯＫＴ３は、Ｔ細胞（ＴＣＲ）の抗原認識構造と関連し、また、シグナル伝達に不可欠な、ヒトＴ細胞膜内のＣＤ３複合体と反応し、この機能を遮断する。ＴＣＲ／ＣＤ３のどのサブユニットにＯＫＴ３が結合するかは、複数の研究の主題となっている。一部の証拠は、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体のイプシロンサブユニットに対するＯＫＴ３の特異性を指摘している（Ｔｕｎｎａｃｌｉｆｆｅ、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１（１９８９）、５４６〜５０；Ｋｊｅｒ−Ｎｉｅｌｓｅｎ、ＰＮＡＳ  １０１（２００４）、７６７５〜７６８０）が、さらなる証拠は、ＯＫＴ３がＴＣＲ／ＣＤ３複合体に結合するには、この複合体の他のサブユニットの存在が必要であることを示している（Ｓａｌｍｅｒｏｎ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（１９９１）、３０４７〜５２）。
【０００５】
ＣＤ３分子に特異的な他のよく知られる抗体は、Ｔｕｎｎａｃｌｉｆｆｅ、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１（１９８９）、５４６〜５０で列挙されている。上記で示した通り、このようなＣＤ３特異性抗体は、リンパ球の生成（Ｖｏｎ  Ｗｕｓｓｏｗ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２７（１９８１）、１１９７；Ｐａｌａｃｉｏｕｓ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２８（１９８２）、３３７）、リンパ球の増殖（Ｖａｎ  Ｗａｕｖｅ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２４（１９８０）、２７０８〜１８）、また、サプレッサーＴ細胞の誘導（Ｋｕｎｉｃｋａ、「Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ｔｙｐｉｎｇ  ＩＩ」、１（１９８６）、２２３）など、各種のＴ細胞反応を誘導することが可能である。すなわち、実験条件に応じて、ＣＤ３特異性モノクローナル抗体は、細胞傷害作用を阻害する場合もあり、これを誘導する場合もある（Ｌｅｅｗｅｎｂｅｒｇ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３４（１９８５）、３７７０；Ｐｈｉｌｌｉｐｓ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３６（１９８６）１５７９；Ｐｌａｔｓｏｕｃａｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８（１９８１）、４５００；Ｉｔｏｈ、Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０８（１９８７）、２８３〜９６；Ｍｅｎｔｚｅｒ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３５（１９８５）、３４；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５５（１９８２）、１５７９；Ｃｈｏｉ（２００１）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１、９４〜１０６；Ｘｕ（２０００）、Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００、１６〜２６；Ｋｉｍｂａｌｌ（１９９５）、Ｔｒａｎｓｐｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３、２１２〜２２１）。
【０００６】
当技術分野で説明されるＣＤ３抗体の多くは、ＣＤ３複合体のうちのＣＤ３イプシロンサブユニットを認識することが報告されているが、実際のところ、これらのうちの大半は立体構造エピトープに結合し、したがって、ＴＣＲの天然環境にあるＣＤ３イプシロンだけを認識する。立体構造エピトープは、一次配列では分離されているが、ポリペプチドが、天然のタンパク質／抗原へと折り畳まれると、この分子の表面上において一体化する、２つ以上の不連続のアミノ酸残基の存在を特徴とする（Ｓｅｌａ（１９６９）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １６６、１３６５；およびＬａｖｅｒ、（１９９０）、Ｃｅｌｌ  ６１、５５３〜６）。当技術分野において説明される、ＣＤ３イプシロン抗体が結合する立体構造エピトープは、２つの群に分類することができる。主要な群において、前記エピトープは、例えば、ＣＤ３イプシロン鎖およびＣＤ３ガンマ鎖、またはＣＤ３イプシロン鎖およびＣＤ３デルタ鎖の、２つのＣＤ３サブユニットにより形成されている。例えば、最も広く用いられているＣＤ３イプシロンモノクローナル抗体であるＯＫＴ３、ＷＴ３１、ＵＣＨＴ１、７Ｄ６、およびＬｅｕ−４は、ＣＤ３イプシロン鎖だけをトランスフェクトした細胞には結合しないことが複数の研究で分かっている。しかし、ＣＤ３イプシロンにＣＤ３ガンマまたはＣＤ３デルタを加えた組合せを２重にトランスフェクトした細胞を、これらの抗体は染色した（Ｔｕｎｎａｃｌｉｆｆｅ、前出；Ｌａｗ、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４（２００２）、３８９〜４００；Ｓａｌｍｅｒｏｎ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（１９９１）、３０４７〜５２；Ｃｏｕｌｉｅ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１（１９９１）、１７０３〜９）。第２のより小さな群において、立体構造エピトープは、ＣＤ３イプシロンサブユニット自体の内部において形成されている。例えば、この群のメンバーは、変性ＣＤ３イプシロンに対して作製されているｍＡｂである、ＡＰＡ  １／１である（Ｒｉｓｕｅｎｏ、Ｂｌｏｏｄ  １０６（２００５）、６０１〜８）。まとめると、当技術分野で説明されるＣＤ３イプシロン抗体のうちの大半は、ＣＤ３の２つ以上のサブユニット上に位置する立体構造エピトープを認識する。これにより、これらのエピトープの３次元構造を形成する不連続のアミノ酸残基は、ＣＤ３イプシロンサブユニット自体の上に位置する場合もあり、ＣＤ３イプシロンサブユニットと、ＣＤ３ガンマまたはＣＤ３デルタなど、他のＣＤ３サブユニットとの上に位置する場合もある。
【０００７】
ＣＤ３抗体に関する別の問題は、多くのＣＤ３抗体が、種特異的であると分かっていることである。抗ＣＤ３モノクローナル抗体は（他の任意のモノクローナル抗体について一般に成り立つように）、それらの標的分子に対する高度に特異的な認識により機能する。ＣＤ３抗体は、それらの標的であるＣＤ３分子上における単一の部位またはエピトープだけを認識する。例えば、ＣＤ３複合体に特異的なモノクローナル抗体で最も広く用いられ、また、最もよく特徴づけられているのは、ＯＫＴ−３である。この抗体は、チンパンジーのＣＤ３とは反応するが、マカクザルなど他の霊長動物のＣＤ３相同体、またはイヌＣＤ３とは反応しない（Ｓａｎｄｕｓｋｙら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｐｒｉｍａｔｏｌ．１５（１９８６）、４４１〜４５１）。同様に、ＷＯ２００５／１１８６３５またはＷＯ２００７／０３３２３０は、ヒトＣＤ３イプシロンとは反応するが、マウス、ラット、ウサギ、または、アカゲザル、カニクイザル、もしくはヒヒなど、非チンパンジー霊長動物のＣＤ３イプシロンとは反応しない、ヒトＣＤ３イプシロンモノクローナル抗体について説明している。抗ＣＤ３モノクローナル抗体であるＵＣＨＴ−１もまた、チンパンジーに由来するＣＤ３とは反応するが、マカクザルに由来するＣＤ３とは反応しない（本発明者らによるデータ）。他方、マカクザル抗原は認識するが、それらのヒト対応物は認識しないモノクローナル抗体の例も見られる。この群の一例は、マカクザルに由来するＣＤ３を指向するモノクローナル抗体であるＦＮ−１８である（Ｕｄａら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｐｒｉｍａｔｏｌ．３０（２００１）、１４１〜１４７）。興味深いことに、ＣＤ３抗原はマカクザル内でも多型であるため、カニクイザルのうち約１２％に由来する末梢リンパ球は、抗アカゲザルＣＤ３モノクローナル抗体（ＦＮ−１８）との反応性を欠くことが分かっている。Ｕｄａらは、ＦＮ−１８抗体と反応しないカニクイザルのＣＤ３配列中では、２つのアミノ酸が、ＦＮ−１８抗体と反応する動物に由来するＣＤ３と比較して置換されていることについて説明した（Ｕｄａら、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｐｒｉｍａｔｏｌ．３２（２００３）、１０５〜１０；Ｕｄａら、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｐｒｉｍａｔｏｌ．３３（２００４）、３４〜７）。
【０００８】
ＣＤ３モノクローナル抗体（およびこれらの断片）だけでなく、モノクローナル抗体一般においても固有の識別能、すなわち、種特異性は、それらを、ヒト疾患を治療するための治療剤として開発する上でも重大な障害である。市販承認を得るために、任意の新規の候補薬は、厳格な試験を通過しなければならない。この試験は、前臨床相および臨床相に区分される：後者（周知の臨床第Ｉ相、第ＩＩ相、および第ＩＩＩ相へとさらに区分される）が、ヒト患者において実施されるのに対し、前者は動物において実施される。前臨床試験の目的は、候補薬物が所望の活性を有することを示し、また、これが最も重要なことだが、その安全を示すことである。前臨床試験により、候補薬物が、動物において安全であり、また、有効性を持ちうることが確立された場合に限り、この候補薬物は、各規制機関により、ヒトにおける臨床試験についての承認を受ける。以下の３つの方法、（ｉ）関連種、すなわち、候補薬物がそのオーソログ抗原を認識する種を対象とすること、（ｉｉ）ヒト抗原を含有するトランスジェニック動物を対象とすること、また、（ｉｉｉ）動物に存在するオーソログ抗原に結合しうる、候補薬物のサロゲートを用いることにより、候補薬物を動物における安全性について調べることができる。トランスジェニック動物の限界は、この技法が、典型的に、げっ歯動物に限定されるということである。げっ歯動物とヒトとでは、生理学的特性の差違が著明であり、安全性についての結果をヒトへと容易に外挿することはできない。候補薬物のサロゲートの限界は、実際の候補薬物と比較して材料組成が異なり、また、用いられる動物も、多くの場合、上記で論じた限界を有するげっ歯動物であるということである。したがって、げっ歯動物において作製された前臨床データは、候補薬物に関する予測力が限定されている。安全性試験に最適の手法は、関連種、好ましくは下等霊長動物の使用である。当技術分野で説明される、ヒトにおける治療的介入に適するモノクローナル抗体は、現時点において、関連種が高等霊長動物、特に、チンパンジーであるという限界を有する。チンパンジーは、存続の危機にある種であると考えられており、このような動物を、それらがヒト様の性質を有する理由で薬物の安全性試験に用いることは、欧州において禁止されており、他の地域でも厳しく制限されている。ＣＤ３はまた、細胞傷害性Ｔ細胞を病理学的細胞へと再指向させ、その結果として、各内臓から疾患細胞を枯渇させる目的で、二重特異性単鎖抗体の標的としても用いられて成功を収めている（ＷＯ９９／５４４４０；ＷＯ０４／１０６３８０）。例えば、近年、Ｂａｒｇｏｕら（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２１（２００８）、９７４〜７）は、ヒト患者におけるすべての細胞傷害性Ｔ細胞に係合して、癌細胞を溶解させる可能性を有する、ブリナツモマブと称するＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性抗体構築物の臨床活性について報告している。非ホジキンリンパ腫患者において、１日につき１平方メートル当たり０．００５ミリグラムの低用量で、血中の標的細胞が消失した。腫瘍の部分退縮および完全退縮が初めて観察されたのは０．０１５ミリグラムの用量レベルであり、０．０６ミリグラムの用量レベルで治療された７��の患者すべてが、腫瘍の退縮を経験した。ブリナツモマブはまた、骨髄および肝臓からも腫瘍細胞を消失させた。この研究は、血液細胞に由来する癌を治療する場合に、二重特異性単鎖抗体フォーマットが有する治療的効力についての臨床的概念実証を確立したが、他の種類の癌の治療についても、成功概念が依然として必要である。
【０００９】
２００８年において、米国では、推定１８６，３２０人の男性が新たに前立腺癌と診断され、約２８，６６０人の男性が同疾患により死亡する。癌の死亡率について知りうる最新の報告は、２００４年において、米国人男性における前立腺癌による総死亡率が、１００，０００人当たり２５人であったことを示す。１９８０年代後半において、前立腺特異性抗原（ＰＳＡ）検査の広範な採用により、前立腺癌の管理は大きく改善された。この検査では、前立腺癌を有する患者において上昇することが多い、血中のＰＳＡタンパク質量が測定される。１９８６年に米国食品医薬品局は、ＰＳＡ検査を、前立腺癌を有する患者のモニタリングに用いることを承認し、さらに１９９４年には、この疾患についてのスクリーニング検査として用いることも承認した。米国においてＰＳＡ検査が広範にわたって実装されたことにより、今日では、全前立腺癌のうちの約９０％が、初期段階で診断され、その結果、診断後の生存が延長されている。しかし、ＰＳＡスクリーニングにより、実際に生命が救助されるかどうかを判定するには、ＮＣＩを依頼者として進行中の２つの臨床試験である、「前立腺、肺、結腸直腸、および卵巣（ＰＬＣＯ）についてのスクリーニング試験」、ならびに「欧州前立腺癌スクリーニング試験（ＥＲＳＰＣ）」の結果が必要とされる。過去２５年間にわたって進行中の臨床試験では、前立腺癌を予防するのに、どの天然化合物および合成化合物が有効であるかが探索されてきた。例えば、約１９，０００人の健常男性が登録された「前立腺癌予防試験（ＰＣＰＴ）」では、前立腺の非癌性肥大である、良性前立腺過形成（ＢＰＨ）の治療について承認された薬物であるフィナステリドにより、前立腺癌の発生危険性が２５パーセント低下することが判明した。別の試験である、「セレニウムおよびビタミンＥによる癌予防試験（ＳＥＬＥＣＴ）」では、セレニウムおよびビタミンＥを毎日補給することにより、健常男性における前立腺癌の発生率が低下しうるかどうかを判定する目的で、３５，０００人超の男性について調べつつある。現在のところ、他の前立腺癌予防試験では、マルチビタミン、ビタミンＣおよびＤ、大豆、緑茶、また、トマト中に見出される天然化合物であるリコペンの潜在的保護能について評価しつつある。２００５年に報告された一研究は、解析された前立腺癌のうちの６０〜８０パーセントにおいて、特定の遺伝子が融合していることを示した。この研究は、前立腺癌における、ランダムでない遺伝子再配列についての最初の観察を表わす。最終的には、この遺伝子変化をバイオマーカーとして用いて、この疾患の診断、またおそらくは、治療における一助とすることができる。他の研究は、第８染色体の特定の領域における遺伝子変化により、男性の前立腺癌を発生させる危険性が増大しうることを示した。これらの遺伝子変異は、白人男性において発生する前立腺癌のうちの約２５パーセントの原因となる。これらは、前立腺癌を発生させる危険性を増大させ、また、研究者らがこの疾患の遺伝子的原因をよりよく理解する一助となりうることが検証された、最初の遺伝子変異体である。また、患者の血中を循環するタンパク質をどのように用いれば、前立腺癌および他の癌の診断を改善しうるかについて検討する研究も進行中である。２００５年に研究者らは、前立腺癌に反応して、患者の免疫系により生成される特異的なタンパク質群を同定した。ある種の自己抗体であるこれらのタンパク質により、９０パーセントを超える正確さで、血液標本中における前立腺癌細胞の存在を検出することができた。最終的に、これらおよび他の血液タンパク質をＰＳＡと組み合わせて用いれば、単独のＰＳＡ検査で得られる偽陽性結果の数を減らし、したがって、偽陽性のＰＳＡ検査結果により毎年実施される多数の不要な前立腺生検を低減することができる。
【００１０】
ＰＳＡ以外にも、例えば、前立腺上皮６回膜貫通型抗原（ＳＴＥＡＰ）（Ｈｕｂｅｒｔら、ＰＮＡＳ  ９６（１９９９）、１４５２３〜１４５２８）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭ／ＰＳＭＡ）（Ｉｓｒａｅｌｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３（１９９３）、２２７〜２３０）、および前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）（Ｒｅｉｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５、１７３５〜１７４０、１９９８）を含め、前立腺癌の他の複数のマーカーが同定されている。前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）は、ＬＡＰＣ−４前立腺異種移植モデルで、癌の進行時に上方調節される遺伝子を探索するうちに初めて同定された、１２３アミノ酸のタンパク質である（Ｒｅｉｔｅｒら、前出）。それは、グリコシルホスファチジルイノシトールにより繋留された細胞表面タンパク質であり、Ｔｈｙ−１／Ｌｙ−６表面抗原ファミリーに属する。ＰＳＣＡは、２型幹細胞抗原に対して３０％の相同性を有する。ＰＳＣＡの機能はいまだ解明されていないが、ＰＳＣＡの相同体は、多様な活性を有し、それら自体も発癌性に関与している。２型幹細胞抗原は、未成熟胸腺細胞におけるアポトーシスを阻止することが示されている（ＣｌａｓｓｏｎおよびＣｏｖｅｒｄａｌｅ、ＰＮＡＳ  ９１（１９９４）、５２９６〜５３００）。Ｔｈｙ−１は、ｓｒｃチロシンキナーゼを介するシグナル伝達によりＴ細胞を活性化する（Ａｍｏｕｉら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７（１９９７）、１８８１〜８６）。Ｌｙ−６遺伝子は、腫瘍形成および細胞接着に関与している（Ｓｃｈｒｉｊｖｅｒら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．１９６（１９９１）、２６４〜６９）。初期のメッセンジャーＲＮＡについての研究、また、その後のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）による染色は、ＰＳＣＡが、正常前立腺細胞および悪性前立腺細胞の細胞表面上において発現することを示した（Ｒｅｉｔｅｒら、前出；Ｇｕら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９（２０００）、１２８８〜９６；Ｒｏｓｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６２（２００２）、２５４６〜５３）。正常前立腺では、基底細胞および分泌細胞のサブセット内において、ＰＳＣＡ  ｍＲＮＡが検出されている。前立腺癌では、原発性癌の約５０〜８０％、また、転移性癌の約７０％において、ＰＳＣＡ  ｍＲＮＡの発現が検出されている（Ｒｅｉｔｅｒら、前出）。１１２例の原発性前立腺癌、また、９例の骨転移性前立腺癌について、免疫組織化学が報告されている（Ｇｕら、前出）。臨床的に位置特定された前立腺癌の９４％においてＰＳＣＡの発現が検出され、また、その４０％においてその過剰発現がみられた。検討された９例の前立腺癌骨転移のうちの９例においてもまた、高レベルのＰＳＣＡタンパク質の発現が検出された。前立腺以外でも、ＰＳＣＡは、移行上皮のアンブレラ細胞層、一部の腎集合管、胃の神経内分泌細胞、および胎盤栄養膜において検出される。近年の研究が、大部分の膵臓癌、また、浸潤性および非浸潤性の移行細胞癌におけるＰＳＣＡの過剰発現について報告していることは重要である（Ａｍａｒａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１（２００１）、４６６０〜４６６５；Ａｒｇａｎｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６１（２００１）、４３２０〜２４）。その細胞表面にお���る発現、また、各種癌の大部分におけるその過剰発現のために、ＰＳＣＡは、癌における治療戦略の標的として論じられている。しかし、この可能性を検証するには、今後の臨床相関が必要となる。
【００１１】
特定のＣＤ抗原の発現は、特定系列のリンパ造血細胞に高度に制約され、過去数年間にわたり、リンパ特異抗原を指向する抗体を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは動物モデルにおいて有効であった治療が開発されている。この点において、ＣＤ１９は、極めて有用な標的であることが分かっている。ＣＤ１９は、前Ｂ細胞から成熟Ｂ細胞までの全Ｂ細胞系列において発現し、すべてのリンパ腫細胞上では減少することなく均一に発現するが、幹細胞には存在しない（Ｈａａｇｅｎ、Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９０（１９９２）、３６８〜７５；Ｕｃｋｕｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５（１９８８）、８６０３〜７）。ＣＤ１９は、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞媒介性自己免疫疾患、またはＢ細胞枯渇など多様な形態にわたる、特定のＢ細胞媒介性疾患の発生に関与する。
【００１２】
多種にわたるヒト癌の進行および拡大に関与する分子のさらなる例は、肝細胞増殖因子受容体であるＭＥＴ（Ｃ−ＭＥＴ）である。肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）および分散因子（ＳＦ）の受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）をコードするＭＥＴ癌遺伝子は、細胞の増殖、浸潤、およびアポトーシスからの保護をもたらす遺伝子プログラムを制御する。ＭＥＴ活性化の制御異常は、発癌特性の獲得に極めて重要であるだけでなく、浸潤性表現型の達成にも極めて重要である（Ｔｒｕｓｏｌｉｎｏ，Ｌ．およびＣｏｍｏｇｌｉｏ，Ｐ．Ｍ．（２００２）、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ２、２８９〜３００）。ヒト腫瘍におけるＭＥＴの役割は、複数の実験法から明らかになったものであり、癌の遺伝形態において、ＭＥＴを活性化させる突然変異が発見されたことにより、明確に実証された（Ｓｃｈｍｉｄｔら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１６（１９９７）、６８〜７３；Ｋｉｍら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．４０（２００３）、ｅ９７）。ＭＥＴの構成的活性化は、散発性癌において高頻度であり、複数の研究は、ＭＥＴ癌遺伝子が、特定の組織型の腫瘍において過剰発現するか、または自己分泌機構を介して活性化することを示している（一覧については、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｖａｉ．ｏｒｇ／ｍｅｔ／を参照されたい）。さらに、ＭＥＴ遺伝子は、結腸直腸癌の血行性転移においても増幅される（Ｄｉ  Ｒｅｎｚｏら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１（１９９５）、１４７〜１５４）。
【００１３】
培養物中において線維芽細胞により分泌され、上皮細胞の細胞間における解離を誘導する能力を有する分散因子（ＳＦ）と、急性肝不全患者の血小板または血液に由来する培養物中おいて肝細胞の強力なマイトジェンである肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）とは、Ｍｅｔリガンドとして個別に同定されたが、同じ分子であることが分かった。ＭｅｔおよびＳＦ／ＨＧＦは、各種の組織中において広く発現する。ＳＦ／ＨＧＦ（リガンド）の発現が間葉由来の細胞に制約されるのに対し、Ｍｅｔ（受容体）の発現は通常、上皮由来の細胞に制約される。
【００１４】
Ｍｅｔは、単鎖の前駆体として生成される膜貫通タンパク質である。この前駆体は、タンパク質分解によりフリン部位において切断されて、高度にグリコシル化され、完全に細胞外にある５０ｋｄのαサブユニット、また、大きな細胞外領域（リガンドに対する結合に関与する）を有する１４５ｋｄのβサブユニット、膜貫通セグメント、ならびに細胞内領域（触媒活性を含有する）をもたらす（Ｇｉｏｒｄａｎｏ（１９８９）３３９、１５５〜１５６）。α鎖およびβ鎖は、ジスルフィド結合している。Ｍｅｔの細胞外部分は、セマフォリンに対して相同的な領域（Ｍｅｔの完全なα鎖、また、そのβ鎖のＮ末端部分を包含するＳｅｍａドメイン）、システインに富むＭｅｔ関連配列（ＭＲＳ）、次いで、グリシン−プロリン（Ｇ−Ｐ）に富む反復配列、また、４つの免疫グロブリン様構造を含有する（Ｂｉｒｃｈｍｅｉｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．４（２００３）、９１５〜２５）。Ｍｅｔの細胞内領域は、３つの領域：（１）（ａ）プロテインキナーゼＣにより、またはＣａ２＋カルモジュリン依存性キナーゼによりリン酸化されると、受容体キナーゼ活性を下方調節するセリン残基（Ｓｅｒ９８５）（Ｇａｎｄｉｎｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９（１９９４）、１８１５〜２０）；また、（ｂ）Ｍｅｔのポリユビキチン化、エンドサイトーシス、および分解の一因となるユビキチンリガーゼＣｂｌに結合するチロシン（Ｔｙｒ１００３）（Ｐｅｓｃｈａｒｄら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  ８（２００１）、９９５〜１００４）を含有する膜近接セグメント；（２）受容体が活性化すると、Ｔｙｒ１２３４およびＴｙｒ１２３５上においてリン酸基転移を受けるチロシンキナーゼドメイン；（３）大半の受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）が、異なるチロシンを用いて特定のシグナル伝達分子に結合するのに伴い、Ｍｅｔ受容体のＳｒｃ相同性２（ＳＨ２）ドメインを含有する複数のアダプターを下流において動員することが可能な、多重基質ドッキング部位を表わす縮重モチーフ内に挿入される、２つの極めて重要なチロシン（Ｔｙｒ１３４９およびＴｙｒ１３５６）を含むＣ末端領域を含有する。ドッキング部位の２つのチロシンは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方において、シグナル伝達に必要かつ十分であることが示されている（Ｍａｉｎａら、Ｃｅｌｌ  ８７（１９９６）、５３１〜５４２；Ｐｏｎｚｅｔｔｏら、Ｃｅｌｌ ７７（１９９４）、２６１〜７１）。
【００１５】
Ｃ−ＭＥＴを腫瘍標的として用いる強力かつ選択的な前臨床候補薬物が開発されているが、その後の臨床試験により、これらの薬物がヒトにおいて実際に安全であり、治療効果を示すかどうかを示さなければならない。これらの不確実性に照らすと、癌についての新規の治療概念が依然として必要である。
【００１６】
２００５年に、癌は、８５歳未満の米国人の第１の死亡原因として、心疾患を上回った。今日、ドイツにおいて、癌は、心血管疾患に次ぎ、第２の死亡原因としてランクされている。心血管疾患に対して達成されたブレークスルーと同等の劇的なブレークスルーが、今後数年間のうちに癌予防において達成されない限り、癌は、１５〜２０年以内に、ドイツにおける第１の死亡原因となる。腫瘍血管新生の阻害は、ここ数年間において、臨床医および癌研究者の間で大きな興奮を呼び起こした抗癌戦略のうちの１つである。これらの研究努力の過程において、複数の腫瘍内皮マーカーが同定された。腫瘍血管新生においては、腫瘍内皮マーカー（ＴＥＭ）様エンドシアリン（ＴＥＭ１またはＣＤ２４８）が過剰発現する（Ｓｔ．Ｃｒｏｉｘら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８９（２０００）、１１９７〜１２０２）。これまでのところ、それらの機能が詳細に特徴づけられることがなかったという事実にもかかわらず、胚発生研究および腫瘍研究では、それらが血管内皮細胞上において強く発現することは十分に確立されている（Ｃａｒｓｏｎ−Ｗａｌｔｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１、６６４９〜６６５５、２００１）。したがって、１６５ｋＤａのＩ型膜貫通タンパク質であるエンドシアリンは、広範囲にわたるヒト癌における腫瘍血管内皮細胞の細胞表面上では発現するが、多くの正常組織における血管細胞型または他の細胞型においては検出されない。それは、シグナルリーダーペプチド、５つの球形細胞外ドメイン（Ｃ型レクチンドメイン、Ｓｕｓｈｉ／ｃｃｐ／ｓｃｒパターンに類似する１つのドメイン、および３つのＥＧＦ反復配列）、次いで、ムチン様領域、膜貫通セグメント、および短い細胞質内テールからなる７５７アミノ酸のＣ型レクチン様分子である（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６、７４０８〜７４１４、２００１）。エンドシアリンのコアタンパク質は、豊富にシアリル化してＯが結合したオリゴ糖を保有し、また、Ｏ−シアロ糖タンパク質のエンドペプチダーゼに対して感受性であることから、シアロムチン様分子群内に位置付けられている。エンドシアリンのＮ末端における３６０のアミノ酸は、血液凝固の調節に関与する受容体であるトロンボモジュリンに対する相同性、また、補体受容体であるＣ１ｑＲｐに対する相同性を示す。この構造的関係は、腫瘍内皮受容体としてのエンドシアリンの機能を示す。エンドシアリンｍＲＮＡは、正常なヒトおよびマウスの体細胞組織内の内皮細胞上において遍在的に発現するが、エンドシアリンタンパク質は、多くの場合、黄体、また、治癒しつつある創傷または腫瘍の顆粒組織など、高度に血管新生性の組織に制約される（Ｏｐａｖｓｋｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（２００１）、３８７９５〜３８８０７；Ｒｅｔｔｉｇら、ＰＮＡＳ  ８９（１９９２）、１０８３２〜３６）。エンドシアリンタンパク質の発現は、癌（乳癌、腎癌、肺癌、結腸直腸癌、結腸癌、膵臓中皮腫）、肉腫、および神経外胚葉性腫瘍（黒色腫、神経膠腫、神経芽細胞腫）の腫瘍内皮細胞上において上方調節される（Ｒｅｔｔｉｇら、前出）。加えて、エンドシアリンは、腫瘍間質線維芽細胞のサブセット上においても低レベルながら発現する（Ｂｒａｄｙら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．６３（２００４）、１２７４〜８３；Ｏｐａｖｓｋｙら、前出）。正常組織においてはその分布が制約され、多くの異なる種類の充実性腫瘍の腫瘍内皮細胞上においては豊富に発現するため、エンドシアリンは、抗体に基づく、癌に対する抗血管新生治療戦略の標的として論じられている。しかし、これまでのところ、エンドシアリンを腫瘍内皮標的として用いる有効な治療法は見られない。
【００１７】
大半のヒト腺癌および複数の扁平上皮細胞癌細胞上で極めて高頻度かつ高度に発現する分子は、ＥｐＣＡＭ（ＣＤ３２６）である（Ｗｅｎｔら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ９４（２００６）、１２８〜１３５）。近年の研究は、ＥｐＣＡＭが、発癌遺伝子であるｃ−Ｍｙｃおよびサイクリンの核内における発現を上方調節しうるシグナル伝達分子であることを示している（Ｍｕｎｚら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２３（２００４）、５７４８〜５８）。休眠細胞内で過剰発現すると、ＥｐＣＡＭは、発癌性タンパク質の特徴である、細胞増殖、増殖因子の独立性、および軟寒天内におけるコロニーの増殖を誘導する。乳癌細胞内において、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によりＥｐＣＡＭの発現をノックダウンすると、このような細胞は、増殖、遊走、および浸潤を停止する（Ｏｓｔａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６４（２００４）、５８１８〜２４）。ＥｐＣＡＭによるこの発癌性のシグナル伝達により、ＥｐＣＡＭの過剰発現が、乳癌および卵巣癌を含めた多くのヒト悪性腫瘍における総生存率の低さと相関する理由を説明することができる（Ｓｐｉｚｚｏら、Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．１０３（２００６）、４８３〜８）。ＥｐＣＡＭは、ヒト抗体（Ｏｂｅｒｎｅｄｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４２（２００６）、２５３０〜８）、また、ＭＴ１１０と称する、ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３単鎖二重特異性抗体を含めた、抗体に基づく複数の治療法において、標的抗原として既に用いられている。近年、ＭＴ１１０の特徴が詳細に説明された（Ｂｒｉｓｃｈｗｅｉｎら、４３（２００６）、１１２９〜４３）。この抗体は、標的抗原を発現する各種のヒト癌細胞株に対して活性であり、目下のところ第Ｉ相試験において、安全性および有効性の初期徴候について調べられている。
【００１８】
より具体的に述べると、２００５年において、癌は、８５歳未満の米国人の第１の死亡原因として、心疾患を上回った。今日、ドイツにおいて、癌は、心血管疾患に次ぎ、第２の死亡原因としてランクされている。心血管疾患に対して達成されたブレークスルーと同等の劇的なブレークスルーが、今後数年間のうちに癌予防において達成されない限り、癌は、１５〜２０年以内に、ドイツにおける第１の死亡原因となる。１００種を超える異なる癌のうちで、上皮癌は、ドイツにおける第１の癌死亡原因である。上皮癌において、正常組織内への悪性上皮細胞の浸潤および転移は、間葉に由来する標的内臓支持間質の適応的変化を伴う。これらの形質転換されない間質細胞における遺伝子発現の変化は、治療についての潜在的な標的を提供すると論じられている。細胞表面プロテアーゼである、線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰアルファ）は、活性化した腫瘍線維芽細胞のこのような標的の一例である。線維芽細胞活性化タンパク質アルファは、元は、モノクローナル抗体Ｆ１９を用いて培養線維芽細胞中において同定された誘導性細胞表面糖タンパク質である。免疫組織化学的研究により、特定の正常な胚間葉組織内ではＦＡＰアルファが一過性に発現するが、正常な成熟組織のほか、悪性上皮細胞、悪性神経細胞、および悪性造血細胞も一般に、ＦＡＰアルファ陰性であることが示された。しかし、上皮癌の一般的な種類の大半は、豊富なＦＡＰアルファ反応性間質線維芽細胞を含有する。Ｓｃａｎｌａｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１、５６５７〜５６６１、１９９４）は、抗体Ｆ１９を用いる免疫選択により、ＷＩ−３１ヒト線維芽細胞ｃＤＮＡ発現ライブラリーから、ＦＡＰアルファｃＤＮＡをクローニングした。７６０アミノ酸の推定ヒトＦＡＰアルファタンパク質は、６つの潜在的なＮ−グリコシル化部位、１３のシステイン残基、また、セリンプロテアーゼの高度に保存された触媒ドメインに対応する３つのセグメント；疎水性の膜貫通セグメント；ならびに短い細胞質内テールを含有する、大型のＣ末端細胞外ドメインを有するＩＩ型内在性膜タンパク質である。ＦＡＰアルファは、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ４）との４８％のアミノ酸同一性、また、ＤＰＰ４関連タンパク質（ＤＰＰＸ）との３０％の同一性を示す。ノーザンブロット解析は、線維芽細胞内において、２．８ｋｂのＦＡＰアルファｍＲＮＡを検出した。セプラーゼは、その発現が、ヒト黒色腫細胞および癌細胞の浸潤性と相関する、１７０ｋＤの内在性膜ゼラチナーゼである。Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １３６１、１１〜１９、１９９７）は、対応するセプラーゼのｃＤＮＡをクローニングし、特徴づけした。同著者らは、セプラーゼとＦＡＰアルファとが同じタンパク質であり、同じ遺伝子の産物であることを見出した。Ｐｉｎｅｉｒｏ−Ｓａｎｃｈｅｚら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２、７５９５〜７６０１、１９９７）は、ヒト黒色腫ＬＯＸ細胞の細胞膜からセプラーゼ／ＦＡＰアルファタンパク質を単離し、その小胞を除去した。セリンプロテアーゼ阻害剤により、セプラーゼ／ＦＡＰアルファのゼラチナーゼ活性が遮断されたことは、セプラ���ゼ／ＦＡＰアルファが、（１または複数の）触媒的に活性なセリン残基を含有することを示唆する。同著者らは、セプラーゼ／ＦＡＰアルファが、単量体で、Ｎ−グリコシル化された、タンパク質分解的には不活性の９７ｋＤのサブユニットからなることを見出した。彼らは、セプラーゼ／ＦＡＰアルファが、それらのタンパク質分解活性がサブユニットの会合に依存する点で、ＤＰＰ４に類似すると結論付けた。ゼラチン、ならびに熱変性Ｉ型コラーゲンおよび熱変性ＩＶ型コラーゲンに対するその分解活性のために、セプラーゼ／ＦＡＰアルファには、細胞外マトリックスのリモデリング、腫瘍増殖、および癌転移における役割が示唆されている。さらに、セプラーゼ／ＦＡＰアルファは、正常組織においては発現パターンが制約され、また、多くの悪性腫瘍の支持間質内においては発現が均一である。したがって、セプラーゼ／ＦＡＰアルファは、ヒト上皮癌の免疫療法のための腫瘍間質標的化の概念を探索するための標的として用いることができる。しかし、腫瘍抗原標的としてのセプラーゼ／ＦＡＰアルファの役割を精査する複数の臨床試験が着手されているが、セプラーゼ／ＦＡＰアルファの酵素活性に対する従来の免疫療法、またはこれに対する阻害は、これまでのところ、いまだ治療有効性を結果としてもたらしていない（例えば、Ｗｅｌｔら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１２．１１９３〜２０３、１９９４；Ｎａｒｒａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．６、１６９１〜９、２００７；Ｈｅｎｒｙら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １３、１７３６〜１７４１、２００７を参照されたい）。
【００１９】
インスリン様増殖因子Ｉ受容体（ＩＧＦ−ＩＲまたはＩＧＦ−１Ｒ）は、チロシンキナーゼ活性を有し、インスリン受容体（ＩＲ）との７０％の相同性を有する受容体である。ＩＧＦ−１Ｒは、分子量約３５０，０００の糖タンパク質である。それは、その各半分ずつ（ジスルフィド架橋により連結される）が、細胞外におけるａサブユニットと、膜貫通［ベータ］サブユニットとからなる、ヘテロ４量体の受容体である。ＩＧＦ−１Ｒは、極めて高度のアフィニティーによりＩＧＦ  １およびＩＧＦ  ２に結合するが、１００〜１０００分の１のアフィニティーながら、インスリンに結合することも同様に可能である。逆に、ＩＲが、インスリンと極めて高度のアフィニティーにより結合する一方、ＩＧＦは、インスリン受容体とは１００分の１のアフィニティーによってしか結合しない。ＩＧＦ−１ＲおよびＩＲのチロシンキナーゼドメインは、極めて高度の配列相同性を有するが、相同性の低い帯域は、それぞれ、アルファサブユニット、また、［ベータ］サブユニットのＣ末端部分に位置する、システインに富む領域に関する。ａサブユニットにおいて観察される配列の差違は、リガンドの結合帯域に位置し、したがって、それぞれ、ＩＧＦおよびインスリンに対する、ＩＧＦ−１ＲおよびＩＲの相対的なアフィニティーの起源となっている。［ベータ］サブユニットのＣ末端部分における差違は、２つの受容体のシグナル伝達経路の分岐を結果としてもたらす；ＩＧＦ−１Ｒが、有糸分裂効果、分化効果、および抗アポトーシス効果を媒介するのに対し、ＩＲは主に、代謝経路のレベルにおける効果を伴う（Ｂａｓｅｒｇａら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１３３２、Ｆ１０５〜１２６、１９９７；Ｂａｓｅｒｇａ  Ｒ．、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．、２５３、１〜６、１９９９）。細胞質のチロシンキナーゼタンパク質は、受容体の細胞外ドメインに対するリガンドの結合により活性化される。このキナーゼの活性化は、ＩＲＳ−１、ＩＲＳ−２、Ｓｈｃ、およびＧｒｂ  １０を含めた、異なる細胞内基質の刺激を伴う（Ｐｅｒｕｚｚｉ  Ｆ．ら、Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、１２５、１６６〜１７３、１９９９）。ＩＧＦ−ＩＲの２つの主要な基質はＩＲＳおよびＳｈｃであり、これらは、下流における多数のエフェクターを活性化することにより、この受容体に対するＩＧＦの結合と関連する増殖効果および分化効果の大半を媒介する。基質の結合可能性が、結果として、ＩＧＦ−１Ｒの活性化と関連する最終的な生物学的効果を決定しうる。ＩＲＳ−１が卓越する場合、細胞は増殖および形質転換する傾向にある。Ｓｈｃが優越する場合、細胞は分化する傾向にある（Ｖａｌｅｎｔｉｎｉｓ  Ｂ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４、１２４２３〜１２４３０、１９９９）。アポトーシスに対する保護効果に主に関与する経路は、ホスファチジル−イノシトール３キナーゼ（ＰＩ３キナーゼ）経路であると考えられる（Ｐｒｉｓｃｏ  Ｍ．ら、Ｈｏｒｍ．Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｓ．、３１、８０〜８９、１９９９；Ｐｅｒｕｚｚｉ  Ｆ．ら、Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、１２５、１６６〜１７３、１９９９）。発癌におけるＩＧＦ系の役割は、最近１���年間における活発な研究の対象となっている。この関心は、その有糸分裂特性および抗アポトーシス特性に加えて、ＩＧＦ−１Ｒが、形質転換した表現型の確立および維持にも必要であると考えられるという事実の発見から発している。実際、ＩＧＦ−１Ｒの過剰発現または構成的活性化は、多種多様な細胞において、ウシ胎仔血清を欠く培地内における、補助物質に依存しない細胞の増殖をもたらし、またヌードマウスにおける腫瘍の形成をもたらす。大多数の増殖因子受容体を含め、過剰発現した遺伝子の多種多様な産物は細胞を形質転換しうるので、このこと自体は固有の特性ではない。しかし、形質転換においてＩＧＦ−１Ｒが果たす主要な役割を明確に裏付けた極めて重要な発見は、ウシパピローマウイルスのＥ５タンパク質、ＥＧＦＲもしくはＰＤＧＦＲの過剰発現、ＳＶ  ４０のＴ抗原、活性化したｒａｓ、またはこれら最後の２つの因子の組合せなど、通常は細胞を形質転換することが可能な異なる作用物質による形質転換に対して、ＩＧＦ−１Ｒをコードする遺伝子が不活化されているＲ細胞は完全に不応であるという実証であった（Ｓｅｌｌ  Ｃ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０、１１２１７〜１１２２１、１９９３；Ｓｅｌｌ  Ｃ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１４、３６０４〜３６１２、１９９４；Ｍｏｒｒｉｏｎｅ  Ａ．Ｊ．、Ｖｉｒｏｌ．、６９、５３００〜５３０３、１９９５；Ｃｏｐｐｏｌａ Ｄ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１４、４５８ａ〜４５９５、１９９４；ＤｅＡｎｇｅｌｉｓ  Ｔら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１６４、２１４〜２２１、１９９５）。ＩＧＦ−１Ｒは、多種多様な腫瘍および腫瘍細胞株において発現し、ＩＧＦは、ＩＧＦ−１Ｒに対するそれらの結合を介して腫瘍増殖を増幅する。発癌におけるＩＧＦ−ＩＲの役割を支持する他の議論は、この受容体を指向するマウスモノクローナル抗体を用いる研究、またはＩＧＦ−ＩＲの優勢阻害体（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｄｏｍｉｎａｎｔ）を用いる研究に由来する。実際、ＩＧＦ−１Ｒを指向するマウスモノクローナル抗体は、培養物中における多数の細胞株の増殖、また、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける腫瘍細胞の増殖を阻害する（Ａｒｔｅａｇａ  Ｃ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、４９、６２３７〜６２４１、１９８９；Ｌｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ．、１９６、９２〜９８、１９９３；Ｚｉａ  Ｆら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、２４、２６９〜２７５、１９９６；Ｓｃｏｔｌａｎｄｉ  Ｋら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５８、４１２７〜４１３１、１９９８）。Ｊｉａｎｇら（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、１８、６０７１〜６０７７、１９９９）による研究では、ＩＧＦ−１Ｒの優勢阻害体が、腫瘍増殖を阻害しうることもまた示されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
癌の治療法のための新規の標的を同定することに多大の努力が払われているが、癌は、依然として、診断されることが最も多い疾患の１つである。このことに照らすと、癌に対する有効な治療が依然として必要である。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明は、配列番号２、４、６、および８からなる群に含まれるアミノ酸配列の一部である、ヒト、および非チンパンジー霊長動物のＣＤ３ε（イプシロン）鎖エピトープに結合することが可能な第１の結合ドメインと、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、Ｂリンパ球抗原ＣＤ１９（ＣＤ１９）、肝細胞増殖因子受容体（Ｃ−ＭＥＴ）、エンドシアリン、エクソン２によりコードされるＥｐＣＡＭのＥＧＦ様ドメイン１、線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰアルファ）、およびインスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ−ＩＲまたはＩＧＦ−１Ｒ）からなる群から選択される抗原に結合することが可能な第２の結合ドメインとを含む二重特異性単鎖抗体分子を提供する。
【００２２】
当技術分野で説明される、Ｔ細胞に係合する二重特異性単鎖抗体は、悪性疾患の治療に対して大きな治療的可能性を有するが、これらの二重特異性分子の大半は、それらが種特異的であり、ヒト抗原、また、（遺伝子の類似性により）おそらくは、チンパンジーの対応物だけを認識するという点で限定されている。本発明の利点は、ヒト、および非チンパンジー霊長動物に対して異種間特異的な、ＣＤ３イプシロン鎖結合ドメインを含む二重特異性単鎖抗体を提供することである。
【００２３】
本発明では、驚くべきことに（当技術分野で説明される他のすべての既知のＣＤ３イプシロンエピトープと対照的に）、ＣＤ３複合体（また、場合によって、ＥｐＣＡＭまたは免疫グロブリンのＦｃ部分など、異種アミノ酸配列に融合させた）内におけるその天然環境から取り出されたときの、その３次元構造における完全性を維持する、ＣＤ３イプシロン細胞外ドメインのＮ末端におけるアミノ酸残基１〜２７のポリペプチド断片が同定された。
【００２４】
したがって、本発明は、配列番号２、４、６、および８からなる群に含まれるアミノ酸配列の一部である、ヒト、および少なくとも１つの非チンパンジー霊長動物のＣＤ３イプシロン鎖によるＣＤ３イプシロン（このＣＤ３イプシロンは、例えば、その天然環境から取り出され、かつ／またはＴ細胞に含まれる（Ｔ細胞の表面上に存在する））細胞外ドメインのＮ末端におけるアミノ酸残基１〜２７のポリペプチド断片エピトープに結合することが可能な第１の結合ドメインと；前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に結合することが可能な第２の結合ドメインとを含む二重特異性単鎖抗体分子を提供する。好ましい非チンパンジー霊長動物は、本明細書の別の箇所で言及される。コモンマーモセット、ワタボウシタマリン、コモンリスザル、およびカニクイザル（配列番号２２２５もしくは２２２６、またはこれらの両方）から選択される少なくとも１つの（１または複数の）霊長動物（またはそのうちのいずれかもしくはすべて）が、特に好ましい。アカゲザル（Ｒｈｅｓｕｓ  Ｍｏｎｋｅｙ）としても知られるアカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）もまた、別の好ましい霊長動物として意図される。したがって、本発明の抗体は、ヒトならびにコモンマーモセット、ワタボウシタマリン、コモンリスザル、およびカニクイザル（配列番号２２２５もしくは２２２６、またはこれらの両方）、また、場合によって、アカゲザルのＣＤ３イプシロン細胞外ドメインのＮ末端におけるアミノ酸残基１〜２７のポリペプチド断片による、環境に依存しない（ｃｏｎｔｅｘｔ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）エピトープに結合する（結合することが可能である）ことを意図する。本明細書で定義される第１の結合ドメインを含む二重特異性単鎖抗体分子は、別記の実施例（特に、実施例２）においてデザインされるプロトコールに従って得ることもでき（得られ）、作製することもできる。この目的のために、（ａ）ヒトおよび／またはコモンリスザルのＣＤ３イプシロン細胞外ドメインのＮ末端におけるアミノ酸残基１〜２７のポリペプチド断片でマウスを免疫化すること；（ｂ）マウス免疫抗体であるｓｃＦｖのライブラリーを作製すること；（ｃ）少なくとも配列番号２、４、６、および８に結合する能力について調べることにより、ＣＤ３イプシロン特異的結合剤を同定することを意図する。
【００２５】
本発明で提供される、環境に依存しないＣＤ３エピトープは、ＣＤ３イプシロンのＮ末端における最初の２７アミノ酸、またはこの２７アミノ酸の連なりによる機能的断片に対応する。ＣＤ３エピトープとの関連において本明細書で用いられる「環境に依存しない」という語句は、本明細書に記載の本発明による結合分子／抗体分子の結合が、抗原決定基またはエピトープの周囲における立体構造、配列、または構造の変化または改変をもたらさないことを意味する。これに対し、従来のＣＤ３結合分子（例えば、ＷＯ９９／５４４４０またはＷＯ０４／１０６３８０で開示される）は、Ｎ末端におけるアミノ酸１〜２７による環境に依存しないエピトープに対してＣ末端側のＣＤ３イプシロン鎖上に局在するが、この場合、それが該イプシロン鎖の残りの部分の中に埋め込まれ、該イプシロン鎖がＣＤ３ガンマ鎖またはＣＤ３デルタ鎖とヘテロ二量体化することによりそれが適正な立体構造位置において保持される場合に限って、該分子は適正な立体構造を帯びる。本明細書で記載され、環境に依存しないＣＤ３エピトープに対して作製される（また、これを指向する）二重特異性単鎖抗体分子の一部としての抗ＣＤ３結合分子／ドメインは、Ｔ細胞の再分布に関して驚くべき臨床的改善をもたらし、また、このため、より好ましい安全性プロファイルをもたらす。理論に拘束されることなしに述べると、該ＣＤ３エピトープは環境に依存せず、ＣＤ３複合体の残りの部分に対してさほどの影響を及ぼすことなく、自律的な自己充足的サブドメインを形成するので、本明細書に記載のＣＤ３結合分子／ドメインが誘導するＣＤ３立体構造のアロステリック変化は、環境に依存するＣＤ３エピトープを認識する従来のＣＤ３結合分子（例えば、ＷＯ９９／５４４４０またはＷＯ０４／１０６３８０で開示される）が誘導する同変化より小さい。
【００２６】
本発明による二重特異性単鎖抗体（ＰＳＣＡ×ＣＤ３、ＣＤ１９×ＣＤ３、Ｃ−ＭＥＴ×ＣＤ３、エンドシアリン×ＣＤ３、ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３、ＩＧＦ−１Ｒ×ＣＤ３、またはＦＡＰα×ＣＤ３）のＣＤ３結合ドメインは、環境に依存しないＣＤ３エピトープを認識するが、これは、本発明の前記二重特異性単鎖抗体による治療の開始期において、Ｔ細胞の再分布（Ｔ細胞の再分布とは、絶対Ｔ細胞カウントが初期に低下するエピソード、およびその後の回復と同じである）がより低度であるか、またはそれが見られないことと関連する。この結果、環境に依存するＣＤ３エピトープを認識する、当技術分野で知られる従来のＣＤ３結合分子と比較して、本発明の二重特異性単鎖抗体による、より良好な安全性プロファイルがもたらされる。特に、ＣＤ３結合分子による治療の開始期におけるＴ細胞の再分布は、ＣＮＳ有害事象などの有害事象の主要な危険因子であるため、本発明の二重特異性単鎖抗体は、環境に依存するＣＤ３エピトープではなく、環境に依存しないＣＤ３エピトープを認識することにより、当技術分野で知られるＣＤ３結合分子を凌駕する、実質的な安全性の利点を有する。従来のＣＤ３結合分子による治療の開始期におけるＴ細胞の再分布と関連するこのようなＣＮＳ有害事象を有する患者は通常、錯乱および失見当を患い、場合によってはまた、尿失禁も患う。錯乱とは、患者が、その通常レベルの明晰さで思考することができない精神状態の変化である。患者は通常、集中することが困難であり、思考は、ぼやけて不明瞭なだけでなく、著明に緩慢となることが多い。従来のＣＤ３結合分子による治療の開始期におけるＴ細胞の再分布と関連するＣＮＳ有害事象を有する患者はまた、記憶喪失も患う場合がある。錯乱は、人、場所、時間、または日付を認識する能力を喪失させることが多い。錯乱においては、失見当感が一般的であり、意思決定能力が損なわれる。従来のＣＤ３結合分子による治療の開始期におけるＴ細胞の再分布と関連するＣＮＳ有害事象は、言語不明瞭および／または適語発見の困難をさらに含みうる。この障害は、言語の表現および理解、すなわち、読み書きの両方を損ないうる。患者によって、従来のＣＤ３結合分子による治療の開始期におけるＴ細胞の再分布と関連するＣＮＳ有害事象には、尿失禁のほか、回転性眩暈および眩暈も付随しうる。
【００２７】
言及されたＣＤ３イプシロンのＮ末端における２７アミノ酸のポリペプチド断片内における３次元構造の維持を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＮ末端ＣＤ３イプシロンポリペプチド断片、および同じ結合アフィニティーでｉｎ  ｖｉｖｏのＴ細胞上における天然のＣＤ３複合体（のＣＤ３イプシロンサブユニット）に結合することが可能な、好ましくはヒト結合ドメインを作製することができる。これらのデータは、本明細書に記載のＮ末端断片が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて通常存在するその構造に類似する３次構造を形成することを強く示す。ＣＤ３イプシロンのＮ末端ポリペプチド断片のアミノ酸１〜２７の構造的完全性の重要性についての極めて高感度の試験を実施した。ＣＤ３イプシロンのＮ末端ポリペプチド断片のアミノ酸１〜２７のうちの個々のアミノ酸を、アラニンに変化させ（アラニン走査）、わずかな撹乱に対するＣＤ３イプシロンのＮ末端ポリペプチド断片のアミノ酸１〜２７の感受性を調べた。本発明の二重特異性単鎖抗体の一部としてのＣＤ３結合ドメインを用いて、ＣＤ３イプシロンのＮ末端ポリペプチド断片のアミノ酸１〜２７のアラニン突然変異体に対する結合について調べた（別記の実施例５を参照されたい）。該断片の最Ｎ末端にある最初の５つのアミノ酸残基、また、ＣＤ３イプシロンのＮ末端ポリペプチド断片のアミノ酸１〜２７のうちの２３位および２５位にある２つのアミノ酸の個々の変化が、該抗体分子の結合にとって極めて重要であった。残基Ｑ（１位におけるグルタミン）、Ｄ（２位におけるアスパラギン酸）、Ｇ（３位におけるグリシン）、Ｎ（４位におけるアスパラギン）、およびＥ（５位におけるグルタミン酸）を含む第１〜５位の領域内にあるアミノ酸をアラニンへと置換したところ、前記断片に対する、本発明の、好ましくはヒト二重特異性単鎖抗体の結合が消失した一方、本発明の、好ましくはヒト二重特異性単鎖抗体のうちの少なくとも一部について、言及された断片のＣ末端における２つのアミノ酸残基であるＴ（２３位におけるトレオニン）およびＩ（２５位におけるイソロイシン）をアラニンへと置換したところ、本発明の、好ましくはヒト二重特異性単鎖抗体に対する結合エネルギーが低下した。
【００２８】
予測外のことに、このようにして単離された、本発明の、好ましくは、ヒト二重特異性単鎖抗体は、ヒトＣＤ３イプシロンＮ末端断片を認識するだけでなく、新世界ザル（マーモセット、コモンマーモセット；ワタボウシタマリン；リスザル）、および旧世界ザル（カニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  Ｍｏｎｋｅｙ）としても知られるカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）；またはアカゲザル（Ｒｈｅｓｕｓ  Ｍｏｎｋｅｙ）としても知られるアカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ））を含めた各種の霊長動物によるＣＤ３イプシロンの対応する相同断片も認識することが判明した。したがって、本発明の二重特異性単鎖抗体による、複数の霊長動物に対する特異性が検出された。以下の配列解析により、ヒトおよび霊長動物は、ＣＤ３イプシロン細胞外ドメインのＮ末端において高度に相同性である配列の連なりを共有することが確認された。
【００２９】
前述のＣＤ３イプシロンのＮ末端断片のアミノ酸配列は、配列番号２（ヒト）、配列番号４（コモンマーモセット）；配列番号６（ワタボウシタマリン）；配列番号８（リスザル）；配列番号２２２５：ＱＤＧＮＥＥＭＧＳＩＴＱＴＰＹＱＶＳＩＳＧＴＴＩＬＴＣ、または配列番号２２２６：ＱＤＧＮＥＥＭＧＳＩＴＱＴＰＹＱＶＳＩＳＧＴＴＶＩＬＴ（カニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  Ｍｏｎｋｅｙ）としても知られるカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ））、および配列番号２２２７：ＱＤＧＮＥＥＭＧＳＩＴＱＴＰＹＨＶＳＩＳＧＴＴＶＩＬＴＱＤＧＮＥＥＭＧＳＩＴＱＴＰＹＨＶＳＩＳＧＴＴＶＩＬＴ（アカゲザル（Ｒｈｅｓｕｓ  Ｍｏｎｋｅｙ）としても知られるアカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ））において示される。
【００３０】
本発明の一実施形態において、本発明のＰＳＣＡ×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体の第２の結合ドメインは、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）に結合する。代替的な実施形態において、該第２の結合ドメインは、ＣＤ１９、Ｃ−ＭＥＴ、エンドシアリン（ＣＤ２４８）、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰα、またはＩＧＦ−１Ｒに結合する。以下の実施例において示される通り、本発明のＥｐＣＡＭ×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体の第２の結合ドメインは、ＥｐＣＡＭ遺伝子のエクソン２によりコードされる、ＥｐＣＡＭのＥＧＦ様ドメイン１のアミノ酸残基２６〜６１に結合する。ヒトＥｐＣＡＭのＥＧＦ様ドメイン１の前記アミノ酸残基２６〜６１を配列番号５７１に示す。したがって、本発明のＥｐＣＡＭ指向性二重特異性単鎖分子は、既に記載されているＥｐＣＡＭ結合剤であるＨＤ６９に基づくＥｐＣＡＭ結合分子とは明確に区別される、ＥｐＣＡＭ結合分子の独自の固有のクラスを形成する。前記ＥｐＣＡＭ結合剤であるＨＤ６９は、異なるエピトープ（すなわち、ヒトＥｐＣＡＭのＥＧＦ様ドメイン１に局在しないエピトープ）に結合する。
【００３１】
ＰＳＣＡ×ＣＤ３（ＣＤ１９×ＣＤ３、Ｃ−ＭＥＴ×ＣＤ３、エンドシアリン×ＣＤ３、ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３、ＩＧＦ−１Ｒ×ＣＤ３、またはＦＡＰα×ＣＤ３それぞれの）二重特異性単鎖抗体の第２の結合ドメインは、ヒトＰＳＣＡ（ＣＤ１９、Ｃ−ＭＥＴ、エンドシアリン、ＥｐＣＡＭ、ＩＧＦ−１Ｒ、またはＦＡＰαのそれぞれ）、または非チンパンジー霊長動物のＰＳＣＡ（ＣＤ１９、Ｃ−ＭＥＴ、エンドシアリン、ＥｐＣＡＭ、ＩＧＦ−１Ｒ、またはＦＡＰαのそれぞれ）に結合することが好ましく；それは、ヒトＰＳＣＡ（ＣＤ１９、Ｃ−ＭＥＴ、エンドシアリン、ＥｐＣＡＭ、ＩＧＦ−１Ｒ、またはＦＡＰαのそれぞれ）、および非チンパンジー霊長動物のＰＳＣＡ（ＣＤ１９、Ｃ−ＭＥＴ、エンドシアリン、ＥｐＣＡＭ、ＩＧＦ−１Ｒ、またはＦＡＰαのそれぞれ）に結合し、したがって、異種間特異的であることがより好ましく；ヒトＰＳＣＡ（ＣＤ１９、Ｃ−ＭＥＴ、エンドシアリン、ＥｐＣＡＭ、ＩＧＦ−１Ｒ、またはＦＡＰαのそれぞれ）、およびマカクザルのＰＳＣＡ（ＣＤ１９、Ｃ−ＭＥＴ、エンドシアリン、ＥｐＣＡＭ、ＩＧＦ−１Ｒ、またはＦＡＰαのそれぞれ）に結合する（したがって、異種間特異的でもある）ことがさらにより好ましい。マカクザルのＰＳＣＡ（ＣＤ１９、Ｃ−ＭＥＴ、エンドシアリン、ＥｐＣＡＭ、ＩＧＦ−１Ｒ、またはＦＡＰαのそれぞれ）は、カニクイザルのＰＳＣＡ（ＣＤ１９、Ｃ−ＭＥＴ、エンドシアリン、ＥｐＣＡＭ、ＩＧＦ−１Ｒ、またはＦＡＰαのそれぞれ）、および／またはアカゲザルのＰＳＣＡ（ＣＤ１９、Ｃ−ＭＥＴ、エンドシアリン、ＥｐＣＡＭ、ＩＧＦ−１Ｒ、またはＦＡＰαのそれぞれ）であることが特に好ましい。本発明のＥｐＣＡＭ×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体の第２の結合ドメインは、非チンパンジー霊長動物のＥｐＣＡＭ遺伝子のエクソン２によりコードされる、非チンパンジー霊長動物のＥｐＣＡＭのＥＧＦ様ドメイン１に結合することが好ましいことを理解されたい。上記で示した通り、非チンパンジー霊長動物のＥｐＣＡＭは、マカクザルのＥｐＣＡＭであることが好ましく、カニクイザルのＥｐＣＡＭおよび／またはアカゲザルのＥｐＣＡＭであることがより好ましい。
【００３２】
しかし、該第２の結合ドメインが、チンパンジーのＰＳＣＡ（ＣＤ１９、Ｃ−ＭＥＴ、エンドシアリン、ＥｐＣＡＭ、ＩＧＦ−１Ｒ、またはＦＡＰαのそれぞれ）、またはげっ歯動物におけるＰＳＣＡ（ＣＤ１９、Ｃ−ＭＥＴ、エンドシアリン、ＥｐＣＡＭ、ＩＧＦ−１Ｒ、またはＦＡＰαのそれぞれ）相同体など、他の種のＰＳＣＡ（ＣＤ１９、Ｃ−ＭＥＴ、エンドシアリン、ＥｐＣＡＭ、ＩＧＦ−１Ｒ、またはＦＡＰαのそれぞれ）相同体にも結合しうることが、本発明の範囲から除外されることはない。
【００３３】
好ましい実施形態において、本発明の抗体の第１の結合ドメインおよび第２の結合ドメインの異種間特異性は同一であることが理解される。
【００３４】
前立腺癌は、男性において２番目に多い癌である。２００８年の米国では、１８６，３２０人が新たに前立腺癌と診断され、約２８，６６０人が同疾患により死亡すると推定されている（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／ｃａｎｃｅｒｔｏｐｉｃｓ／ｔｙｐｅｓ／ｐｒｏｓｔａｔｅを参照されたい）。前立腺癌の危険性は、年齢と強く関連している：５０歳未満の男性で登録された症例は極めて少数であり、症例の４分の３は６５歳を超える男性において発生している。症例の最多数は、７０〜７４歳の患者で診断されている。現在のところ、老齢人口の増加率は、総人口の増加率より著明に高い。予測が示す通り、２０２５〜２０３０年までに、６０歳を超える人口は、総人口の３．５倍の速さで増加する。老齢者の比率は、次の半世紀には世界全体で２倍を超えると予測され、これは、診断による前立腺癌の発生率のさらなる増大を予測しなければならないことを意味する。しかし、ＰＳＣＡは、前立腺癌の標的であるだけでない。そうではなくて、ＰＳＣＡの過剰発現はまた、膀胱癌（Ａｍａｒａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１（２００１）、４６６０〜４６６５）および膵臓癌（Ａｒｇａｎｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１（２００１）、４３２０〜４３２４）においても見出されている。上記に照らし、本発明のＰＳＣＡ×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体は、ヒトにおける前立腺癌、膀胱癌、または膵臓癌が含まれるがこれらに限定されない癌のＰＳＣＡ発現癌細胞を死滅させるための有利なツールを提供する。以下の実施例で示す通り、本発明のＰＳＣＡ×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体の細胞傷害活性は、当技術分野で説明される抗体の細胞傷害活性より高度である。
【００３５】
有利なことに、本発明はまた、ヒトＰＳＣＡと、マカクザルＰＳＣＡ相同体、すなわち、非チンパンジー霊長動物による相同体との両方に結合する第２の結合ドメインを含むＰＳＣＡ×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体も提供する。したがって、好ましい実施形態において、二重特異性単鎖抗体は、ヒト、および非チンパンジー霊長動物の前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）に対して異種間特異的な第２の結合ドメインを含む。この場合、同一の二重特異性単鎖抗体分子を、霊長動物におけるこれらの結合ドメインの安全性、活性、および／または薬物動態プロファイルの前臨床評価用に、また、ヒトにおける薬物としての両方に用いることができる。言い換えれば、同じ分子を、前臨床動物研究のほか、ヒトにおける臨床研究にも用いることができる。これにより、種特異的なサロゲート分子と比較して、動物研究の結果が高度に比較可能となり、また、動物研究による予測力が大幅に増大する。本発明のＰＳＣＡ×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体のＣＤ３結合ドメインおよびＰＳＣＡ結合ドメインは共に、異種間特異的である、すなわち、ヒト、および非チンパンジー霊長動物と反応するので、これを、霊長動物におけるこれらの結合ドメインの安全性、活性、および／または薬物動態プロファイルの前臨床評価用に、また、同一の形態でヒトにおける薬物としての両方に用いることができる。
【００３６】
ＣＤ１９は、造血系のＢリンパ球および濾胞樹状細胞だけが発現させる細胞表面分子である。ＣＤ１９は、Ｂ細胞系列に制約されて発現する抗原のうちの最初期のものであり、大半の前Ｂ細胞、および大半の非Ｔ細胞型急性リンパ球性白血病細胞、およびＢ細胞型慢性リンパ球性白血病細胞上に存在する。
【００３７】
好ましい実施形態において、本発明の二重特異性単鎖抗体は、ヒト、および非チンパンジー霊長動物のＣＤ１９に対して異種間特異的な第２の結合ドメインを含む。この場合、同一の二重特異性単鎖抗体分子を、霊長動物におけるこれらの結合ドメインの安全性、活性、および／または薬物動態プロファイルの前臨床評価用に、また、ヒトにおける薬物としての両方に用いることができる。これにより、種特異的なサロゲート分子と比較して、動物研究の結果が高度に比較可能となり、また、動物研究による予測力が大幅に増大する。本発明のＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体のＣＤ３結合ドメインおよびＣＤ１９結合ドメインは共に、異種間特異的である、すなわち、ヒト、および非チンパンジー霊長動物と反応するので、これを、霊長動物におけるこれらの結合ドメインの安全性、活性、および／または薬物動態プロファイルの前臨床評価用に、また、同一の形態でヒトにおける薬物としての両方に用いることができる。
【００３８】
上記で説明した通り、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）および分散因子（ＳＦ）の受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）をコードするＭＥＴ癌遺伝子は、細胞の増殖、浸潤、およびアポトーシスからの保護をもたらす遺伝子プログラムを制御する。したがって、以下の実施例で示す通り、本発明のＣ−ＭＥＴ×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体は、ヒトＣ−ＭＥＴ陽性乳癌細胞株であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１により例示される通り、Ｃ−ＭＥＴ発現癌細胞を死滅させるための有利なツールを提供する。本発明のＣ−ＭＥＴ×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体の細胞傷害活性は、当技術分野で説明される抗体の細胞傷害活性より高度である。好ましくは本発明のＣ−ＭＥＴ×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体のＣＤ３結合ドメインおよびＣ−ＭＥＴ結合ドメインは共に、異種間特異的である、すなわち、ヒト、および非チンパンジー霊長動物の抗原と反応するので、本発明のＣ−ＭＥＴ×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体を、霊長動物におけるこれらの結合ドメインの安全性、活性、および／または薬物動態プロファイルの前臨床評価用に、また、同じ形態でヒトにおける薬物としての両方に用いることができる。
【００３９】
有利なことに、本発明はまた、さらなる代替的な実施形態において、ヒトＣ−ＭＥＴと、マカクザルＣ−ＭＥＴ相同体、すなわち、非チンパンジー霊長動物による相同体との両方に結合する第２の結合ドメインを含むＣ−ＭＥＴ×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体も提供する。したがって、好ましい実施形態において、二重特異性単鎖抗体は、ヒト、および非チンパンジー霊長動物のＣ−ＭＥＴに対して異種間特異的な第２の結合ドメインを含む。この場合、同一の二重特異性単鎖抗体分子を、霊長動物におけるこれらの結合ドメインの安全性、活性、および／または薬物動態プロファイルの前臨床評価用に、また、ヒトにおける薬物としての両方に用いることができる。言い換えれば、同じ分子を、前臨床動物研究のほか、ヒトにおける臨床研究にも用いることができる。これにより、種特異的なサロゲート分子と比較して、動物研究の結果が高度に比較可能となり、また、動物研究による予測力が大幅に増大する。本発明のＣ−ＭＥＴ×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体のＣＤ３結合ドメインおよびＣ−ＭＥＴ結合ドメインは共に、異種間特異的である、すなわち、ヒト、および非チンパンジー霊長動物の抗原と反応するので、これを、霊長動物におけるこれらの結合ドメインの安全性、活性、および／または薬物動態プロファイルの前臨床評価用に、また、同一の形態でヒトにおける薬物としての両方に用いることができる。
【００４０】
血管新生、すなわち、新血管の形成は、正常生理および病態生理両方で重要な、多数の生理学的イベントに不可欠である。近年、充実性腫瘍のコントロールにおける血管新生阻害剤の潜在的な治療的価値のために、この過程に対する阻害剤の精製および特徴づけに注目が集まることが多くなっている。正常組織においてはその分布が制約され、また、多くの異なる種類の充実性腫瘍の腫瘍内皮細胞上においてはその発現が豊富なため、エンドシアリンは、癌に対する抗体に基づく抗血管新生治療戦略の標的として用いることができる。特に、癌細胞の代わりに、腫瘍内皮細胞を標的とすることは、形質転換していない腫瘍血管内皮細胞上における標的の発現が、遺伝子的に不安定な癌細胞上における標的の発現より安定的であるという利点を有する。本発明のエンドシアリン×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体は、腫瘍の増殖の支持において主要な役割を果たす、充実性腫瘍中における新毛細血管の形成を阻害するための有利なツールを提供する。この新規の発明による治療法において、標的とされるのは腫瘍細胞ではなく、腫瘍血管である。本発明のエンドシアリン×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体は、細胞傷害性Ｔ細胞を、癌（乳癌、腎癌、肺癌、結腸直腸癌、結腸癌、膵臓中皮腫）、肉腫、および神経外胚葉性腫瘍（黒色腫、神経膠腫、神経芽細胞腫）が含まれるがこれらに限定されない腫瘍中における、エンドシアリン陽性内皮細胞へと動員し、その結果、腫瘍からエンドシアリンを発現する内皮細胞を枯渇させる。このようにして、腫瘍による血管新生が阻害され、その結果、腫瘍の退縮、さらにまたは腫瘍の枯渇がもたらされる。以下の実施例で示す通り、本発明のエンドシアリン×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体の細胞傷害活性は、当技術分野で説明される抗体の細胞傷害活性より高度である。充実性新生物の増殖には、支持血管の動員が必要とされるので、本発明のエンドシアリン×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体の治療的使用は、腫瘍内皮を標的化してこれを死滅させるための新規の発明による手法を提供する。
【００４１】
有利なことに、本発明はまた、ヒトエンドシアリンと、マカクザルエンドシアリン相同体、すなわち、非チンパンジー霊長動物による相同体との両方に結合する第２の結合ドメインを含むエンドシアリン×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体も提供する。したがって、好ましい実施形態において、二重特異性単鎖抗体は、ヒト、および非チンパンジー霊長動物のエンドシアリンに対して異種間特異的な第２の結合ドメインを含む。この場合、同一の二重特異性単鎖抗体分子を、霊長動物におけるこれらの結合ドメインの安全性、活性、および／または薬物動態プロファイルの前臨床評価用に、また、ヒトにおける薬物としての両方に用いることができる。言い換えれば、同じ分子を、前臨床動物研究のほか、ヒトにおける臨床研究にも用いることができる。これにより、種特異的なサロゲート分子と比較して、動物研究の結果が高度に比較可能となり、また、動物研究による予測力が大幅に増大する。本発明のエンドシアリン×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体のＣＤ３結合ドメインおよびエンドシアリン結合ドメインは共に、異種間特異的である、すなわち、ヒト、および非チンパンジー霊長動物と反応するので、これを、霊長動物におけるこれらの結合ドメインの安全性、活性、および／または薬物動態プロファイルの前臨床評価用に、また、同一の形態でヒトにおける薬物としての両方に用いることができる。
【００４２】
ＥｐＣＡＭは、近年、いわゆる「癌幹細胞」上で発現することが判明した（Ｄａｌｅｒｂａら、ＰＮＡＳ  １０４（２００７）、１０１５８〜６３；Ｄａｌｅｒｂａら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．５８（２００７）、２６７〜８４）。これに照らすと、本発明のＥｐＣＡＭ×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体は、上皮癌または微小残存癌中におけるＥｐＣＡＭ発現癌細胞を死滅させるための有利なツールを提供するだけでなく、治療後において腫瘍が再発する一因となる推定責任病変を除去するのにも有用でありうる。加えて、本発明のＥｐＣＡＭ×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体の細胞傷害活性は、当技術分野で説明される抗体の細胞傷害活性より高度である。
【００４３】
好ましい実施形態において、本発明の二重特異性単鎖抗体は、ヒト、および非チンパンジー霊長動物のＥｐＣＡＭに対して異種間特異的な第２の結合ドメインを含む。この場合、同一の二重特異性単鎖抗体分子を、霊長動物におけるこれらの結合ドメインの安全性、活性、および／または薬物動態プロファイルの前臨床評価用に、また、ヒトにおける薬物としての両方に用いることができる。これにより、種特異的なサロゲート分子と比較して、動物研究の結果が高度に比較可能となり、また、動物研究による予測力が大幅に増大する。本実施形態において、本発明のＥｐＣＡＭ×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体のＣＤ３結合ドメインおよびＥｐＣＡＭ結合ドメインは共に、異種間特異的である、すなわち、ヒト、および非チンパンジー霊長動物と反応するので、これを、霊長動物におけるこれらの結合ドメインの安全性、活性、および／または薬物動態プロファイルの前臨床評価用に、また、同一の形態でヒトにおける薬物としての両方に用いることができる。
【００４４】
本発明のＦＡＰアルファ×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体は、腫瘍の増殖および腫瘍による新血管形成の支持において主要な役割を果たす、上皮腫瘍などの充実性腫瘍の間質を攻撃するための有利なツールを提供する。この新規の発明による治療法において、標的とされるのは腫瘍細胞ではなく、活性化した間質線維芽細胞である。先行研究は、原発性および悪性の乳癌、肺癌、および結腸直腸癌のうちの９０％超を含めた、上皮癌の一般的な種類の大半が、豊富なＦＡＰアルファ反応性間質線維芽細胞を含有することを示している（Ｓｃａｎｌａｎら、ＰＮＡＳ  ９１（１９９４）、５６５７〜５６６１；また、該文献に引用されている参照文献）。これに対し、正常組織、ならびに良性上皮病変および前悪性上皮病変がＦＡＰアルファ陽性間質細胞を含有することはごくまれである。本発明のＦＡＰアルファ×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体は、細胞傷害性Ｔ細胞を、原発性および悪性の上皮腫瘍中における、ＦＡＰアルファ陽性の活性化間質線維芽細胞へと動員し、その結果、腫瘍から該間質細胞を枯渇させる。特に、癌細胞の代わりに、腫瘍間質細胞を標的とすることは、形質転換していない間質細胞上における標的の発現が、遺伝子的に不安定な癌細胞上における標的の発現より安定的であるという利点を有する。以下の実施例で示す通り、本発明のＦＡＰアルファ×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体の細胞傷害活性は、当技術分野で説明される抗体の細胞傷害活性より高度である。充実性新生物の増殖には、支持間質の動員が必要とされるので、本発明のＦＡＰアルファ×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体の治療的使用は、腫瘍間質を標的化してこれを死滅させるための新規の発明による手法を提供する。
【００４５】
有利なことに、本発明はまた、ヒトＦＡＰアルファと、マカクザルＦＡＰアルファ相同体、すなわち、非チンパンジー霊長動物による相同体との両方に結合する第２の結合ドメインを含むＦＡＰアルファ×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体も提供する。したがって、好ましい実施形態において、二重特異性単鎖抗体は、ヒト、および非チンパンジー霊長動物のＦＡＰアルファに対して異種間特異的な第２の結合ドメインを含む。この場合、同一の二重特異性単鎖抗体分子を、霊長動物におけるこれらの結合ドメインの安全性、活性、および／または薬物動態プロファイルの前臨床評価用に、また、ヒトにおける薬物としての両方に用いることができる。言い換えれば、同じ分子を、前臨床動物研究のほか、ヒトにおける臨床研究にも用いることができる。これにより、種特異的なサロゲート分子と比較して、動物研究の結果が高度に比較可能となり、また、動物研究による予測力が大幅に増大する。本発明のＦＡＰアルファ×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体のＣＤ３結合ドメインおよびＦＡＰアルファ結合ドメインは共に、異種間特異的である、すなわち、ヒト、および非チンパンジー霊長動物と反応するので、これを、霊長動物におけるこれらの結合ドメインの安全性、活性、および／または薬物動態プロファイルの前臨床評価用に、また、同じ形態でヒトにおける薬物としての両方に用いることができる。
【００４６】
本明細書の上記で説明した通り、ＩＧＦ−１Ｒは、チロシンキナーゼ活性を有し、インスリン受容体（ＩＲ）との７０％の相同性を有する受容体（したがって、細胞表面抗原）である。ＩＧＦ−１Ｒは、多種態様の腫瘍および腫瘍細胞株において発現し、ＩＧＦは、ＩＧＦ−１Ｒに対するそれらの結合を介して腫瘍増殖を増幅する。
【００４７】
好ましい実施形態において、本発明の二重特異性単鎖抗体は、ヒト、および非チンパンジー霊長動物のＩＧＦ−１Ｒに対して異種間特異的な第２の結合ドメインを含む。この場合、同一の二重特異性単鎖抗体分子を、霊長動物におけるこれらの結合ドメインの安全性、活性、および／または薬物動態プロファイルの前臨床評価用に、また、ヒトにおける薬物としての両方に用いることができる。これにより、種特異的なサロゲート分子と比較して、動物研究の結果が高度に比較可能となり、また、動物研究による予測力が大幅に増大する。本実施形態において、本発明のＩＧＦ−１Ｒ×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体のＣＤ３結合ドメインおよびＩＧＦ−１Ｒ結合ドメインは共に、異種間特異的である、すなわち、ヒト、および非チンパンジー霊長動物と反応するので、これを、霊長動物におけるこれらの結合ドメインの安全性、活性、および／または薬物動態プロファイルの前臨床評価用に、また、同一の形態でヒトにおける薬物としての両方に用いることができる。
【００４８】
本発明では、同一の分子を、前臨床動物試験のほか、ヒトにおける臨床研究、さらにまた、ヒトにおける治療において用いうる、好ましくはヒトＰＳＣＡ×ＣＤ３（ＣＤ１９×ＣＤ３、Ｃ−ＭＥＴ×ＣＤ３、エンドシアリン×ＣＤ３、ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３、ＩＧＦ−１Ｒ×ＣＤ３、またはＦＡＰα×ＣＤ３それぞれの）二重特異性単鎖抗体を作製することが可能であることが判明した。これは、ヒトＣＤ３イプシロンおよびＰＳＣＡ（ＣＤ１９、Ｃ−ＭＥＴ、エンドシアリン、ＥｐＣＡＭ、ＩＧＦ−１Ｒ、またはＦＡＰαのそれぞれ）（ならびに、遺伝子の類似性により、おそらくは、チンパンジーの対応物）のそれぞれに対する結合に加えて、新世界ザルおよび旧世界ザルを含めた、非チンパンジー霊長動物の前記抗原の相同体にもまた結合する、好ましくはヒトＰＳＣＡ×ＣＤ３（ＣＤ１９×ＣＤ３、Ｃ−ＭＥＴ×ＣＤ３、エンドシアリン×ＣＤ３、ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３、ＩＧＦ−１Ｒ×ＣＤ３、またはＦＡＰα×ＣＤ３それぞれの）二重特異性単鎖抗体が予測外に同定されたためである。以下の実施例で示される通り、前記本発明の、好ましくはヒトＰＳＣＡ×ＣＤ３（ＣＤ１９×ＣＤ３、Ｃ−ＭＥＴ×ＣＤ３、エンドシアリン×ＣＤ３、ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３、ＩＧＦ−１Ｒ×ＣＤ３、またはＦＡＰα×ＣＤ３それぞれの）二重特異性単鎖抗体は、癌が含まれるがこれらに限定されない各種の疾患に対する治療剤または治療薬として用いることができる。
【００４９】
ＰＳＣＡ×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体は、前立腺癌、膀胱癌、または膵臓癌の治療に特に有利である。
【００５０】
前記本発明の、好ましくはヒトＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体は、癌、好ましくは、非ホジキンリンパ腫などのＢ細胞悪性腫瘍、Ｂ細胞媒介性自己免疫疾患、またはＢ細胞枯渇が含まれるがこれらに限定されない各種の疾患に対する治療剤として用いることができる。
【００５１】
前記本発明の、好ましくはヒトｃ−ＭＥＴ×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体は、癌（ｃａｎｃｅｒ）、好ましくは、癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肉腫、神経膠芽腫／星状細胞腫、黒色腫、中皮腫、ウィルムス腫瘍、または白血病、リンパ腫、もしくは多発性骨髄腫などの造血系悪性腫瘍が含まれるがこれらに限定されない各種の疾患に対する治療剤として用いることができる。
【００５２】
前記本発明の、好ましくはヒトエンドシアリン×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体は、癌（乳癌、腎癌、肺癌、結腸直腸癌、結腸癌、膵臓中皮腫）、肉腫、および神経外胚葉性腫瘍（黒色腫、神経膠腫、神経芽細胞腫）が含まれる（がこれらに限定されない）腫瘍中における内皮細胞を標的としてこれらを死滅させるための新規の発明による手法を提供する。本発明のエンドシアリン×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体は、充実性腫瘍から、それらの支持血管を除去し、これにより血管新生を阻害し、また結果として、前記新生物の増殖を阻害することが可能である。
【００５３】
前記本発明の、好ましくはヒトＥｐＣＡＭ×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体は、癌、好ましくは、上皮癌が含まれるがこれに限定されない各種の疾患に対する治療剤として用いることができる。
【００５４】
前記本発明の、好ましくはヒトＩＧＦ−１Ｒ×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体は、癌、好ましくは、骨癌または軟組織癌（例えば、ユーイング肉腫）、乳癌、肝癌、肺癌、頭頚部癌、結腸直腸癌、前立腺癌、平滑筋肉腫、子宮頚癌および子宮内膜癌、卵巣癌、前立腺癌、ならびに膵臓癌が含まれるがこれらに限定されない各種の疾患に対する治療剤として用いることができる。本発明のＩＧＦ−１Ｒ×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体は、自己免疫疾患、好ましくは、乾癬に対する治療剤として用いることができる。
【００５５】
上記を考慮すると、系統発生的に遠隔の（ヒトから）種における試験のためのサロゲートＰＳＣＡ×ＣＤ３（ＣＤ１９×ＣＤ３、Ｃ−ＭＥＴ×ＣＤ３、エンドシアリン×ＣＤ３、ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３、ＩＧＦ−１Ｒ×ＣＤ３、またはＦＡＰα×ＣＤ３それぞれの）二重特異性単鎖抗体を構築する必要は消滅する。結果として、臨床試験のほか、市販承認後、および治療薬投与においてヒトに投与することを意図するのと同様に、前臨床動物試験においても同一の分子を用いることができる。ヒトに対するその後の投与における分子と同じ分子を前臨床動物試験にも用いることができれば、前臨床動物試験において得られたデータをヒトの場合に適用する可能性が限定される危険が、事実上取り除かれるか、または少なくとも大幅に低減される。つまり、ヒトに対して実際に投与される分子と同じ分子を用いて、動物における前臨床安全性データを得ることは、該データをヒトに対して関与性の高いシナリオに適用する可能性を裏付けることに寄与する。これに対し、サロゲート分子を用いる従来の手法では、前記サロゲート分子を、前臨床安全性評価に用いられる動物試験系に分子適応させなければならない。したがって、ヒト治療において実際に用いられる分子が、薬物動態パラメータおよび／または生物学的活性の前臨床試験で用いられるサロゲート分子とは、配列において、また、おそらくは構造においても異なり、前臨床動物試験で得られたデータをヒトの場合に適用する可能性／移し替える可能性が限定されるという結果がもたらされる。サロゲート分子の使用は、完全に新たな構築物の構築、作製、精製、および特徴づけを必要とする。これにより、その分子を得るのに必要な開発費用および時間がかさむことになる。つまり、ヒト治療において用いられる実際の薬物に加えて、サロゲートを別個に開発しなければならず、そのため、２つの分子のための２系統の開発を実施しなければならない。したがって、本明細書で説明される異種間特異性を示す、本発明の、好ましくはヒトＰＳＣＡ×ＣＤ３（ＣＤ１９×ＣＤ３、Ｃ−ＭＥＴ×ＣＤ３、エンドシアリン×ＣＤ３、ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３、ＩＧＦ−１Ｒ×ＣＤ３、またはＦＡＰα×ＣＤ３それぞれの）二重特異性単鎖抗体の主要な利点は、ヒトにおける治療用に、また、前臨床動物試験において、同一の分子を用いうることである。
【００５６】
本発明の二重特異性単鎖抗体の前記第１または第２の結合ドメインのうちの少なくとも１つは、以下でより詳細に記載される通り、ＣＤＲ移植ドメイン、ヒト化ドメイン、またはヒトドメインであることが好ましい。本発明の二重特異性単鎖抗体の第１および第２の結合ドメインは、ＣＤＲ移植ドメイン、ヒト化ドメイン、またはヒトドメインであることが好ましい。本発明の、好ましくはヒトＰＳＣＡ×ＣＤ３（ＣＤ１９×ＣＤ３、Ｃ−ＭＥＴ×ＣＤ３、エンドシアリン×ＣＤ３、ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３、ＩＧＦ−１Ｒ×ＣＤ３、またはＦＡＰα×ＣＤ３それぞれの）二重特異性単鎖抗体の場合、ヒト患者に該分子を投与すると、前記結合分子に対する免疫反応の発生が可能な範囲で最大限に除去される。
【００５７】
本発明の、好ましくはヒトＰＳＣＡ×ＣＤ３（ＣＤ１９×ＣＤ３、Ｃ−ＭＥＴ×ＣＤ３、エンドシアリン×ＣＤ３、ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３、ＩＧＦ−１Ｒ×ＣＤ３、またはＦＡＰα×ＣＤ３それぞれの）二重特異性単鎖抗体の別の主要な利点は、各種の霊長動物における前臨床試験にそれを適用する可能性である。動物における候補薬物の挙動は、理想的には、ヒトに対する投与におけるこの候補薬物の予測される挙動を示すべきである。したがって、結果として、このような前臨床試験から得られるデータは一般に、ヒトの場合に対する高度な予測力を有するべきである。しかし、近年におけるＴＧＮ１４１２（ＣＤ２８モノクローナル抗体）についての第Ｉ相臨床試験による痛ましい結果から学ばれる通り、候補薬物は、霊長動物種において、ヒトにおける作用とは異なる形で作用する場合がある：カニクイザルにより実施された前記抗体の前臨床動物試験では有害作用がまったく観察されないか、または極めて限定された形でしか観察されなかったのに対し、前記抗体を投与したところ、６名のヒト患者が多臓器不全を発生させた（Ｌａｎｃｅｔ  ３６８（２００６）、２２０６〜７）。これらの劇的で望ましくない、否定的事象を示す結果により、前臨床試験を唯一の（非チンパンジー霊長動物）種に限定するのでは不十分でありうることが示唆される。本発明のＰＳＣＡ×ＣＤ３（ＣＤ１９×ＣＤ３、Ｃ−ＭＥＴ×ＣＤ３、エンドシアリン×ＣＤ３、ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３、ＩＧＦ−１Ｒ×ＣＤ３、またはＦＡＰα×ＣＤ３それぞれの）二重特異性単鎖抗体が、一連の新世界ザルおよび旧世界ザルに結合するという事実は、上記に述べた場合において直面する問題を克服する一助となりうる。したがって、本発明は、ヒト治療用の薬物を開発し、これらを試験にかける場合における作用の種間差違を最小化する手段および方法を提供する。
【００５８】
本発明の、好ましくはヒト異種間特異的ＰＳＣＡ×ＣＤ３（ＣＤ１９×ＣＤ３、Ｃ−ＭＥＴ×ＣＤ３、エンドシアリン×ＣＤ３、ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３、ＩＧＦ−１Ｒ×ＣＤ３、またはＦＡＰα×ＣＤ３それぞれの）二重特異性単鎖抗体により、例えば、トランスジェニック動物の作製など、ヒトに対する投与が意図される候補薬物に対して試験動物を適合させることもまた、もはや必要でなくなる。本発明の使用および方法に従い、異種間特異性を示す、本発明の、好ましくはヒトＰＳＣＡ×ＣＤ３（ＣＤ１９×ＣＤ３、Ｃ−ＭＥＴ×ＣＤ３、エンドシアリン×ＣＤ３、ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３、ＩＧＦ−１Ｒ×ＣＤ３、またはＦＡＰα×ＣＤ３それぞれの）二重特異性単鎖抗体を、非チンパンジー霊長動物に対する遺伝子操作なしに、該動物における前臨床試験に直接用いることができる。当業者によく知られている通り、試験動物を候補薬物に適合させる手法は、動物を改変するために、前臨床安全性試験において得られた結果が、ヒトの場合を示す程度、また、これを予測する程度が低下するという危険性を常にはらむ。例えば、トランスジェニック動物において、トランス遺伝子によりコードされるタンパク質は、高度に過剰発現されることが多い。したがって、このタンパク質抗原がはるかにより低く、より生理学的なレベルで発現されるヒトの場合、該タンパク質に対する抗体の生物学的活性について得られるデータの予測的価値は限定されたものでありうる。
【００５９】
異種間特異性を示す、本発明の、好ましくはヒトＰＳＣＡ×ＣＤ３（ＣＤ１９×ＣＤ３、Ｃ−ＭＥＴ×ＣＤ３、エンドシアリン×ＣＤ３、ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３、ＩＧＦ−１Ｒ×ＣＤ３、またはＦＡＰα×ＣＤ３それぞれの）二重特異性単鎖抗体の使用によるさらなる利点は、絶滅の危機にある種としてのチンパンジーを、動物試験にかけずに済むということである。チンパンジーは、ヒトに対する最も近い類縁種であり、近年、ゲノム配列決定データに基づき、ヒト科へと群分けされた（Ｗｉｌｄｍａｎら、ＰＮＡＳ  １００（２００３）、７１８１）。したがって、チンパンジーについて得られたデータは一般に、ヒトについての予測性が高度であると考えられる。しかし、それらが絶滅の危機にある種としての状態にあるため、医学実験に用いうるチンパンジーの数は、極めて制約されている。したがって、上述の通り、チンパンジーを動物試験用に維持することには、費用および倫理の両面において問題がある。本発明の、好ましくはヒトＰＳＣＡ×ＣＤ３（ＣＤ１９×ＣＤ３、Ｃ−ＭＥＴ×ＣＤ３、エンドシアリン×ＣＤ３、ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３、ＩＧＦ−１Ｒ×ＣＤ３、またはＦＡＰα×ＣＤ３それぞれの）二重特異性単鎖抗体の使用により、得られる動物試験データの質、すなわち、適用可能性を偏向させることなく、前臨床試験の際の倫理的障害および財政的負担の両方が回避される。このことに照らし、本発明の、好ましくはヒトＰＳＣＡ×ＣＤ３（ＣＤ１９×ＣＤ３、Ｃ−ＭＥＴ×ＣＤ３、エンドシアリン×ＣＤ３、ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３、ＩＧＦ−１Ｒ×ＣＤ３、またはＦＡＰα×ＣＤ３それぞれの）二重特異性単鎖抗体の使用は、チンパンジーにおける研究に対する理にかなった代替法を提供する。
【００６０】
本発明の、好ましくはヒトＰＳＣＡ×ＣＤ３（ＣＤ１９×ＣＤ３、Ｃ−ＭＥＴ×ＣＤ３、エンドシアリン×ＣＤ３、ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３、ＩＧＦ−１Ｒ×ＣＤ３、またはＦＡＰα×ＣＤ３それぞれの）二重特異性単鎖抗体のまたさらなる利点は、例えば、薬物動態動物試験を実施する中で、前臨床動物試験の一部としてそれを用いる場合に、複数の血液試料を抽出しうることである。非チンパンジー霊長動物によれば、下等動物、例えば、マウスによるよりはるかに容易に複数の血液抽出物を得ることができる。複数の血液試料を抽出することにより、本発明の、好ましくはヒトＰＳＣＡ×ＣＤ３（ＣＤ１９×ＣＤ３、Ｃ−ＭＥＴ×ＣＤ３、エンドシアリン×ＣＤ３、ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３、ＩＧＦ−１Ｒ×ＣＤ３、またはＦＡＰα×ＣＤ３それぞれの）二重特異性単鎖抗体により誘導される生物学的効果を決定するための血液パラメータの持続的な検査が可能となる。さらに、複数の血液試料を抽出することで、研究者は、本明細書で定義される、本発明の、好ましくはヒトＰＳＣＡ×ＣＤ３（ＣＤ１９×ＣＤ３、Ｃ−ＭＥＴ×ＣＤ３、エンドシアリン×ＣＤ３、ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３、ＩＧＦ−１Ｒ×ＣＤ３、またはＦＡＰα×ＣＤ３それぞれの）二重特異性単鎖抗体の薬物動態プロファイルを評価することが可能である。加えて、血液パラメータに反映される、前記本発明の、好ましくはヒトＰＳＣＡ×ＣＤ３（ＣＤ１９×ＣＤ３、Ｃ−ＭＥＴ×ＣＤ３、エンドシアリン×ＣＤ３、ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３、ＩＧＦ−１Ｒ×ＣＤ３、またはＦＡＰα×ＣＤ３それぞれの）二重特異性単鎖抗体により誘導されうる潜在的な副作用を、前記抗体を投与する中で抽出される異なる血液試料において測定することもできる。これにより、本明細書で定義される、本発明の、好ましくはヒトＰＳＣＡ×ＣＤ３（ＣＤ１９×ＣＤ３、Ｃ−ＭＥＴ×ＣＤ３、エンドシアリン×ＣＤ３、ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３、ＩＧＦ−１Ｒ×ＣＤ３、またはＦＡＰα×ＣＤ３それぞれの）二重特異性単鎖抗体の潜在的な毒性プロファイルを決定することができる。
【００６１】
異種間特異性を示す、本明細書で定義される、本発明の、好ましくはヒトＰＳＣＡ×ＣＤ３（ＣＤ１９×ＣＤ３、Ｃ−ＭＥＴ×ＣＤ３、エンドシアリン×ＣＤ３、ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３、ＩＧＦ−１Ｒ×ＣＤ３、またはＦＡＰα×ＣＤ３それぞれの）二重特異性単鎖抗体の利点は、以下の通りに簡略にまとめることができる。
【００６２】
第１に、前臨床試験で用いられる、本明細書で定義される、本発明の、好ましくはヒトＰＳＣＡ×ＣＤ３（ＣＤ１９×ＣＤ３、Ｃ−ＭＥＴ×ＣＤ３、エンドシアリン×ＣＤ３、ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３、ＩＧＦ−１Ｒ×ＣＤ３、またはＦＡＰα×ＣＤ３それぞれの）二重特異性単鎖抗体は、ヒト治療において用いられる抗体と同じである。したがって、それらの薬物動態特性および生物学的活性において異なりうる、２つの個別の分子を開発することは、もはや必要でなくなる。これは、例えば、薬物動態結果を、例えば、従来のサロゲート法の場合より直接的に、ヒト状況へと移し替えることが可能であり、また、適用することが可能である点において、極めて有利である。
【００６３】
第２に、ヒトにおける治療剤を調製するための、本明細書で定義される、本発明の、好ましくはヒトＰＳＣＡ×ＣＤ３（ＣＤ１９×ＣＤ３、Ｃ−ＭＥＴ×ＣＤ３、エンドシアリン×ＣＤ３、ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３、ＩＧＦ−１Ｒ×ＣＤ３、またはＦＡＰα×ＣＤ３それぞれの）二重特異性単鎖抗体の使用は、サロゲート法より費用集約性および労働集約性が低い。
【００６４】
第３に、本明細書で定義される、本発明の、好ましくはヒトＰＳＣＡ×ＣＤ３（ＣＤ１９×ＣＤ３、Ｃ−ＭＥＴ×ＣＤ３、エンドシアリン×ＣＤ３、ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３、ＩＧＦ−１Ｒ×ＣＤ３、またはＦＡＰα×ＣＤ３それぞれの）二重特異性単鎖抗体は、１つの霊長動物種における前臨床試験に用いることができるだけでなく、一連の異なる霊長動物種における前臨床試験にも用いることができ、このため、霊長動物とヒトとの潜在的な種間差違の危険性を制限することができる。
【００６５】
第４に、動物試験用として絶滅の危機にある種としてのチンパンジーを、所望の場合、用いずに済ますことができる。
【００６６】
第５に、広範な薬物動態研究用に、複数の血液試料を抽出することができる。
【００６７】
第６に、本発明の好ましい実施形態による、好ましくは、ヒト結合分子は、ヒト由来であるため、ヒト患者に投与した場合、前記結合分子に対する免疫反応の発生が最小化される。マウス由来の治療分子に対してヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）を発生させる、例えば、マウスなど、非ヒト種に由来する候補薬物に特異的な抗体による免疫反応の誘導が取り除かれる。
【００６８】
最後になるが重要なことは：
・本発明のＰＳＣＡ×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体の治療的使用は、前立腺癌、膀胱癌、または膵臓癌が含まれるがこれらに限定されない癌に対する新規の発明による治療法を提供する。以下の実施例は、各構築物が、ＰＳＣＡに陽性の細胞に対して、ヒトおよびマカクザルのエフェクター細胞による細胞傷害活性を強力に動員することを明確に示す。
・本発明のＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体の治療的使用は、癌、好ましくは、非ホジキンリンパ腫などのＢ細胞悪性腫瘍、Ｂ細胞媒介性自己免疫疾患、またはＢ細胞枯渇に対する新規の発明による治療法を提供する。以下の実施例で示す通り、本発明のＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体の細胞傷害活性は、当技術分野で説明される抗体の細胞傷害活性より高度である。
・本発明のＣ−ＭＥＴ×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体の治療的使用は、癌（ｃａｎｃｅｒ）、好ましくは、癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肉腫、神経膠芽腫／星状細胞腫、黒色腫、中皮腫、ウィルムス腫瘍、または白血病、リンパ腫、もしくは多発性骨髄腫などの造血系悪性腫瘍に対する新規の発明による治療法を提供する。以下の実施例で示す通り、本発明のＣ−ＭＥＴ×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体の細胞傷害活性は、当技術分野で説明される抗体の細胞傷害活性より高度である。
・本発明のエンドシアリン×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体の治療的使用は、癌（乳癌、腎癌、肺癌、結腸直腸癌、結腸癌、膵臓中皮腫）、肉腫、および神経外胚葉性腫瘍（黒色腫、神経膠腫、神経芽細胞腫）が含まれる（がこれらに限定されない）腫瘍中における内皮細胞を標的としてこれらを死滅させるための新規の発明による手法を提供する。本発明のエンドシアリン×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体は、充実性腫瘍から、それらの支持血管を除去し、これにより血管新生を阻害し、また結果として、前記新生物の増殖を阻害することが可能である。
・本発明のＥｐＣＡＭ×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体の治療的使用は、癌、好ましくは、上皮癌または微小残存癌に対する新規の発明による治療法を提供する。本発明のＥｐＣＡＭ×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体は、癌、好ましくは、上皮癌または微小残存癌中におけるＥｐＣＡＭ発現癌細胞を死滅させるための有利なツールを提供するだけでなく、治療後において腫瘍が再発する一因となる推定責任病変を除去するのにも有用でありうる。加えて、本発明のＥｐＣＡＭ×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体の細胞傷害活性は、当技術分野で説明される抗体の細胞傷害活性より高度である。
・本発明のＦＡＰアルファ×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体の治療的使用は、腫瘍間質を標的とし、これを死滅させる新規の発明による手法を提供する：本発明のＦＡＰアルファ×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体は、上皮腫瘍などの充実性腫瘍から、それらの支持間質を除去し、これにより、充実性新生物の増殖および新血管形成を阻害する。
・本発明のＩＧＦ−１Ｒ×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体の治療的使用は、癌（好ましくは、骨癌または軟組織癌（例えば、ユーイング肉腫）、乳癌、肝癌、肺癌、頭頚部癌、結腸直腸癌、前立腺癌、平滑筋肉腫、子宮頚癌および子宮内膜癌、卵巣癌、前立腺癌、ならびに膵臓癌）、または自己免疫疾患（好ましくは、乾癬）に対する新規の発明による治療法を提供する。
【００６９】
本明細書の上記で言及した通り、本発明は、ヒト、および非チンパンジー霊長動物のＣＤ３ε鎖のエピトープに結合することが可能な第１の結合ドメインと、ＰＳＣＡ（それぞれ、ＣＤ１９、Ｃ−ＭＥＴ、エンドシアリン、ＥｐＣＡＭ、ＩＧＦ−１Ｒ、またはＦＡＰα）に結合することが可能な第２の結合ドメインとを含むポリペプチド、すなわち、二重特異性単鎖抗体分子であって、該第２の結合ドメインがまた、ヒト、および非チンパンジー霊長動物のＰＳＣＡ（それぞれ、ＣＤ１９、Ｃ−ＭＥＴ、エンドシアリン、ＥｐＣＡＭ、ＩＧＦ−１Ｒ、またはＦＡＰα）にも結合することが好ましいポリペプチドを提供する。好ましい本発明の二重特異性単鎖抗体の要件を満たす候補薬物としての二重特異性単鎖抗体の利点は、このような分子を、前臨床動物試験のほか、臨床試験において、さらにまた、ヒトにおける治療用にも用いることである。本発明の異種間特異的二重特異性単鎖抗体の好ましい実施形態において、細胞表面抗原に結合する第２の結合ドメインは、ヒトである。本発明による異種間特異的二重特異性単鎖抗体において、ヒト、および非チンパンジー霊長動物のＣＤ３イプシロン鎖のエピトープに結合する結合ドメインは、該二重特異性分子のＮ末端またはＣ末端において、ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨの順序で配置される。第１および第２の結合ドメインにおいてＶＨ鎖およびＶＬ鎖の配列が異なる、本発明による異種間特異的二重特異性分子の例は、別記の実施例において説明する。
【００７０】
本明細書で用いられる「二重特異性単鎖抗体」とは、２つの結合ドメインを含む単一のポリペプチド鎖を指す。各結合ドメインは、抗体の重鎖に由来する１つの可変領域（「ＶＨ領域」）を含み、第１の結合ドメインのＶＨ領域はＣＤ３ε分子に特異的に結合し、第２の結合ドメインのＶＨ領域は、ＰＳＣＡ、ＣＤ１９、Ｃ−ＭＥＴ、エンドシアリン、ＥｐＣＡＭ、ＩＧＦ−１Ｒ、またはＦＡＰαに特異的に結合する。２つの結合ドメインは、場合によって、短いポリペプチドスペーサーにより互いに連結される。ポリペプチドスペーサーの非限定的な例は、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｓ）およびその反復配列である。各結合ドメインはさらに、抗体軽鎖に由来する１つの可変領域（「ＶＬ領域」）を含む場合もあり、第１および第２の結合ドメインの各々の内にあるＶＨ領域およびＶＬ領域は、例えば、ＥＰ６２３６７９Ｂ１において開示および特許請求される種類のポリペプチドリンカーであるが、いずれにせよ、それらが一体で、第１および第２の結合ドメインそれぞれに特異的に結合しうるように、第１の結合ドメインのＶＨ領域およびＶＬ領域、ならびに第２の結合ドメインのＶＨ領域およびＶＬ領域が、互いと対合することを可能とするのに十分な長さのポリペプチドリンカーにより互いに連結される。
【００７１】
「タンパク質」という用語は当技術分野でよく知られており、生物学的化合物について述べる用語である。タンパク質は、アミノ酸がペプチド結合により互いの間で結合される、１または複数のアミノ酸鎖（ポリペプチド）を含む。本明細書で用いられる「ポリペプチド」という用語は、３０を超えるアミノ酸からなる分子群について述べる用語である。本発明によれば、ポリペプチド群は、それらが単一のポリペプチド鎖からなる限りにおいて、「タンパク質」を含む。また、この定義に沿って述べると、「ポリペプチド」という用語は、それらの断片が３０を超えるアミノ酸からなる限りにおいて、タンパク質の断片についても述べる用語である。ポリペプチドは、二量体、三量体、また、より高次のオリゴマーなど、多量体をさらに形成する、すなわち、複数のポリペプチド分子からなる場合がある。このような二量体、三量体などを形成するポリペプチド分子は、同一の場合もあり、同一でない場合もある。結果として、このような多量体の対応する高次構造は、ホモ二量体またはヘテロ二量体、ホモ三量体またはヘテロ三量体などと呼ばれる。ヘテロ多量体の例は、その天然形態において、２つの同一の軽鎖ポリペプチド、および２つの同一の重鎖ポリペプチドからなる抗体分子である。「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語はまた、天然修飾ポリペプチド／タンパク質も指し、この場合、修飾は、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化などの翻訳後修飾により実施される。このような修飾は、当技術分野でよく知られている。
【００７２】
本発明との関連における「結合ドメイン」という用語は、所与の標的構造／抗原／エピトープに特異的に結合する／これらと特異的に相互作用するポリペプチドドメインを特徴づける。したがって、結合ドメインは、「抗原との相互作用部位」である。「抗原との相互作用部位」という用語は、本発明によれば、特異的抗原または特異的抗原群、例えば、異なる種における同一の抗原と特異的に相互作用しうるポリペプチドモチーフを定義する。前記結合／相互作用はまた、「特異的認識」を定義するとも理解される。本発明による、「特異的に認識する」という用語は、抗体分子が、抗原、例えば、本明細書で定義されるヒトＣＤ３抗原の少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、より好ましくは少なくとも４つのアミノ酸と特異的に相互作用し、かつ／またはこれらに特異的に結合することが可能なことを意味する。このような結合は、「鍵と鍵穴の原理」の特異性により例示することができる。したがって、結合ドメインのアミノ酸配列中における特異的モチーフ、および抗原は、一次構造、二次構造、または三次構造の結果として、ならびに、前記構造の副次的修飾の結果として互いに結合する。抗原との相互作用部位が、その特異的抗原と特異的に相互作用する結果、前記部位が、該抗原に単純に結合する場合もある。さらに代替的に、結合ドメイン／抗原との相互作用部位が、その特異的抗原と特異的に相互作用する結果、例えば、抗原の立体構造変化、抗原のオリゴマー化などが誘導されるために、シグナルが誘発される場合もある。本発明に沿った結合ドメインの好ましい例は、抗体である。結合ドメインは、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の場合もあり、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体に由来する場合もある。
【００７３】
「抗体」という用語は、結合特異性をなおも保持するその派生体または機能的断片を含む。抗体を作製するための技法は当技術分野でよく知られており、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８８；ならびにＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、「Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９９において説明されている。「抗体」という用語はまた、異なるクラス（すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ）およびサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２など）の免疫グロブリン（Ｉｇ）も含む。
【００７４】
「抗体」という用語の定義はまた、キメラ抗体、単鎖抗体、およびヒト化抗体のほか、とりわけＦａｂ断片などの抗体断片などの実施形態も包含する。抗体の断片または派生体は、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ断片、または単一ドメイン抗体、単一可変ドメイン抗体、もしくは、他のＶ領域またはＶドメインに依存しない形で、抗原またはエピトープに特異的に結合する、ＶＨの場合もあり、ＶＬの場合もある、１つだけの可変ドメインを含む、免疫グロブリン単一可変ドメインをさらに含む；例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）および（１９９９）、前出を参照されたい。このような免疫グロブリン単一可変ドメインは、単離された抗体の単一可変ドメインポリペプチドだけでなく、抗体の単一可変ドメインのポリペプチド配列による１または複数の単量体を含むより高分子のポリペプチドも包含する。
【００７５】
当技術分野では各種の手順が知られており、これらを用いてこのような抗体および／または断片を作製することができる。したがって、ペプチド模倣体により、（抗体）派生体もまた作製することができる。さらに、単鎖抗体の作製について説明される方法（例えば、とりわけ、米国特許第４，９４６，７７８号を参照されたい）を適合させて、選択された（１または複数の）ポリペプチドに特異的な単鎖抗体を作製することもできる。また、トランスジェニック動物を用いて、本発明のポリペプチドおよび融合タンパク質に特異的なヒト化抗体を発現させることもできる。モノクローナル抗体を調製するには、持続的な細胞株培養物により抗体を生成させる、任意の技法を用いることができる。このような技法の例には、ハイブリドーマ法（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６（１９７５）、４９５〜４９７）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４（１９８３）、７２）、およびヒトモノクローナル抗体を作製するためのＥＢＶハイブリドーマ法（Ｃｏｌｅら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．（１９８５）、７７〜９６）が含まれる。ＢＩＡｃｏｒｅシステムで用いられる表面プラズモン共鳴を用いて、ＣＤ３イプシロン、ＰＳＣＡ、ＣＤ１９、Ｃ−ＭＥＴ、エンドシアリン、ＥｐＣＡＭ、ＩＧＦ−１Ｒ、またはＦＡＰαなどの標的ポリペプチドエピトープに結合するファージ抗体の有効性を増大させることができる（Ｓｃｈｉｅｒ、Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ７（１９９６）、９７〜１０５；Ｍａｌｍｂｏｒｇ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ１８３（１９９５）、７〜１３）。本発明の文脈ではまた、「抗体」という用語が、本明細書の以下で説明される宿主内で発現されうる抗体構築物、例えば、とりわけ、ウイルスベクターまたはプラスミドベクターによりトランスフェクトおよび／またはこれにより形質導入されうる抗体構築物を含むことも意図される。
【００７６】
本発明により用いられる「特異的相互作用」という用語は、結合ドメインが、それが結合するポリペプチドと同様の構造を有するポリペプチド、また、対象のポリペプチドと同じ細胞により発現されうるポリペプチドと交差反応しないか、または著明には交差反応しないことを意味する。被験結合ドメインパネルの交差反応性は、例えば、通常の条件下において、前記結合ドメインパネルの結合を評価することにより調べることができる（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８８；ならびに「Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９９を参照されたい）。結合ドメインが特異的抗原と特異的に相互作用する例は、リガンドがその受容体に対して特異的な場合を含む。前記定義は特に、その相互作用により、リガンドがその特異的受容体に結合するとシグナルが誘導される場合を含む。これもまた前記定義が特に含む前記相互作用の例は、抗原決定基（エピトープ）が、抗体の結合ドメイン（抗原結合部位）と相互作用する場合である。
【００７７】
本明細書で用いられる「異種間特異的」または「種間特異性」という用語は、本明細書に記載の結合ドメインが、ヒト、および非チンパンジー霊長動物における同じ標的分子に結合することを意味する。したがって、「異種間特異的」または「種間特異性」とは、異なる種において発現する同じ分子である「Ｘ」（すなわち、相同体）に対する種間反応性ではあるが、「Ｘ」以外の分子に対する種間反応性ではないものとして理解されたい。例えば、ヒトＣＤ３イプシロンを認識するモノクローナル抗体が、非チンパンジー霊長動物のＣＤ３イプシロン、例えば、マカクザルＣＤ３イプシロンに対して異種間特異的であるかどうかは、例えば、ＦＡＣＳ解析により決定することができる。ＦＡＣＳ解析は、前記ヒト、および非チンパンジー霊長動物それぞれのＣＤ３イプシロン抗原を発現する、ヒト、および非チンパンジー霊長動物の細胞、例えば、マカクザルの細胞に対する結合について、それぞれのモノクローナル抗体を調べる形で実施する。適切なアッセイは、以下の実施例で示す。上述の対象物質は、適宜変更して、ＰＳＣＡ抗原、ＣＤ１９抗原、Ｃ−ＭＥＴ抗原、エンドシアリン抗原、ＥｐＣＡＭ抗原、ＩＧＦ−１Ｒ抗原、およびＦＡＰα抗原にあてはまる：例えば、ヒトのＰＳＣＡ、ＣＤ１９、Ｃ−ＭＥＴ、エンドシアリン、ＥｐＣＡＭ、ＩＧＦ−１Ｒ、またはＦＡＰαを認識するモノクローナル抗体が、非チンパンジー霊長動物のＰＳＣＡ、ＣＤ１９、Ｃ−ＭＥＴ、エンドシアリン、ＥｐＣＡＭ、ＩＧＦ−１Ｒ、またはＦＡＰα、例えば、マカクザルのＰＳＣＡ、ＣＤ１９、Ｃ−ＭＥＴ、エンドシアリン、ＥｐＣＡＭ、ＩＧＦ−１Ｒ、またはＦＡＰαに対して異種間特異的であるかどうかは、例えば、ＦＡＣＳ解析により決定することができる。ＦＡＣＳ解析は、前記ヒト、および非チンパンジー霊長動物それぞれのＰＳＣＡ抗原、ＣＤ１９抗原、Ｃ−ＭＥＴ抗原、エンドシアリン抗原、ＥｐＣＡＭ抗原、ＩＧＦ−１Ｒ抗原、およびＦＡＰα抗原を発現する、ヒト、および非チンパンジー霊長動物の細胞、例えば、マカクザルの細胞に対する結合について、各モノクローナル抗体を調べる形で実施する。
【００７８】
本明細書で用いられるＣＤ３イプシロンとは、Ｔ細胞受容体の一部として発現する分子を指し、先行技術においてそれが有すると典型的にみなされる意味を有する。ヒトにおいて、それは、個別の形態または個別に組み合わせた形態において、既知のすべてのＣＤ３サブユニット、例えば、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ３アルファ、およびＣＤ３ベータを包含する。本明細書で言及される、非チンパンジー霊長動物の非ヒトＣＤ３抗原は、例えば、カニクイザルＣＤ３およびアカゲザルＣＤ３である。カニクイザルにおいて、それは、ＣＤ３イプシロンＦＮ−１８陰性、およびＣＤ３イプシロンＦＮ−１８陽性、ＣＤ３ガンマ、およびＣＤ３デルタを包含する。アカゲザルにおいて、それは、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、およびＣＤ３デルタを包含する。本明細書で用いられる前記ＣＤ３は、ＣＤ３イプシロンであることが好ましい。
【００７９】
ヒトＣＤ３イプシロンは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００７３３において示されており、配列番号１を含む。ヒトＣＤ３ガンマは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００００７３において示されている。ヒトＣＤ３デルタは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００７３２において示されている。
【００８０】
カニクイザルのＣＤ３イプシロン「ＦＮ−１８陰性」（すなわち、上記の多形のため、モノクローナル抗体であるＦＮ−１８により認識されないＣＤ３イプシロン）は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ０７３９９４において示されている。
【００８１】
カニクイザルのＣＤ３イプシロン「ＦＮ−１８陽性」（すなわち、モノクローナル抗体であるＦＮ−１８により認識されるＣＤ３イプシロン）は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ０７３９９３において示されている。カニクイザルのＣＤ３ガンマは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ０７３９９２において示されている。カニクイザルのＣＤ３デルタは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ０７３９９１において示されている。
【００８２】
アカゲザルのＣＤ３イプシロン相同体、ＣＤ３ガンマ相同体、およびＣＤ３デルタ相同体それぞれの核酸配列およびアミノ酸配列は、当技術分野（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、第３版、２００１）で説明される組換え法により同定および単離することができる。これは、適宜変更して、本明細書で定義される他の非チンパンジー霊長動物のＣＤ３イプシロン相同体、ＣＤ３ガンマ相同体、およびＣＤ３デルタ相同体にも適用される。コモンマーモセット、リスザル、およびワタボウシタマリンのアミノ酸配列の同定は、別記の実施例において説明する。コモンマーモセットのＣＤ３イプシロン細胞外ドメインのアミノ酸配列を配列番号３に示し、ワタボウシタマリンのアミノ酸配列を配列番号５に示し、リスザルのアミノ酸配列を配列番号７に示す。
【００８３】
ヒトＰＳＣＡは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５６７２に示されている。対応するｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号４４４および４４３に示す。マカクザルのＰＳＣＡ相同体のクローニングを以下の実施例に示し、対応するＣＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号４４６および４４５に示す。
【００８４】
ヒトＣＤ１９は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１７７０に示されている。この配列情報に基づき、当業者は、発明の苦労なしに、マカグザルのＣＤ１９分子をクローニングする（および発現させる）ことが可能である。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１７７０に示されるヒトＣＤ１９  ｃＤＮＡまたはその断片は、適切なハイブリダイゼーション条件下でマカクザルのｃＤＮＡライブラリー（例えば、カニクイザルまたはアカゲザルのｃＤＮＡライブラリー）をスクリーニングするためのハイブリダイゼーションプローブとして用いることができる。分子生物学における組換え法およびスクリーニング法（ハイブリダイゼーション法を含めた）は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、第３版、２００１において説明されている。
【００８５】
ヒトＣ−ＭＥＴは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００２４５に示されている。対応するｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号７７６および７７７に示す。マカクザルのＣ−ＭＥＴ相同体のクローニングを以下の実施例に示し、対応するｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号７８８および７８９に示す。
【００８６】
ヒトエンドシアリンは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０２０４０４に示す。対応するｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号９１３および９１４に示す。マカクザルのエンドシアリン相同体のクローニングを以下の実施例に示し、対応するｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号９１５および９１６に示す。
【００８７】
ヒトＥｐＣＡＭは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２３５４に示されている。対応するｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号１０２９および１０２８に示す。以下の実施例において示される通り、本発明のＥｐＣＡＭ×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体の第２の結合ドメインは、ＥｐＣＡＭ遺伝子のエクソン２によりコードされる、ＥｐＣＡＭのＥＧＦ様ドメイン１のアミノ酸残基２６〜６１に局在するエピトープに結合する。ヒトＥｐＣＡＭのＥＧＦ様ドメイン１の前記アミノ酸残基２６〜６１を、配列番号１１３０に示す。この配列情報に基づき、当業者は、発明の苦労なしに、マカクザルのＥｐＣＡＭ分子をクローニングする（および発現させる）ことが可能である。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２３５４に示されるヒトＥｐＣＡＭ  ｃＤＮＡまたはその断片は、適切なハイブリダイゼーション条件下でマカクザルのｃＤＮＡライブラリー（例えば、カニクイザルまたはアカゲザルのｃＤＮＡライブラリー）をスクリーニングするためのハイブリダイゼーションプローブとして用いることができる。分子生物学における組換え法およびスクリーニング法（ハイブリダイゼーション法を含めた）は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、第３版、２００１において説明されている。
【００８８】
ヒトＦＡＰアルファは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４４６０に示されている。対応するｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号１１４９および１１５０に示す。マカクザルのＦＡＰアルファ相同体のクローニングを以下の実施例に示し、対応するｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号１１５１および１１５２に示す。
【００８９】
ヒトＩＧＦ−１Ｒは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００８７５に示されている。対応するｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号１９８８および１９８９に示す。マカクザルのＩＧＦ−１Ｒのコード配列はＧｅｎＢａｎｋ（受託番号ＸＭ＿００１１００４０７）で公表されている。対応するｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号１９９８および１９９９に示す。
【００９０】
上記に沿って、「エピトープ」という用語は、本明細書で定義される結合ドメインが特異的に結合／同定する抗原決定基を定義する。結合ドメインは、標的構造、例えば、ヒト、および非チンパンジー霊長動物のＣＤ３イプシロン鎖またはヒト、および非チンパンジー霊長動物のＰＳＣＡ、ＣＤ１９、Ｃ−ＭＥＴ、エンドシアリン、ＥｐＣＡＭ、ＩＧＦ−１Ｒ、またはＦＡＰαに固有の、立体構造的エピトープまたは連続エピトープに特異的に結合しうる／これと特異的に相互作用しうる。立体構造的エピトープまたは不連続エピトープは、ポリペプチド抗原について、一次配列では分離されているが、該ポリペプチドが天然のタンパク質／抗原へと折り畳まれると分子表面上では一体となる、２つ以上の個別のアミノ酸残基の存在により特徴づけられる（Ｓｅｌａ（１９６９）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １６６、１３６５；およびＬａｖｅｒ（１９９０）、Ｃｅｌｌ  ６１、５５３〜６）。エピトープに寄与する２つ以上の個別のアミノ酸残基は、１または複数のポリペプチド鎖の個別の区画上に存在する。これらの残基は、（１または複数の）該ポリペプチド鎖が３次元構造へと折り畳まれてエピトープを構成すると、分子表面上では一体となる。これに対し、連続エピトープまたは直鎖状エピトープは、ポリペプチド鎖の単一の直鎖状セグメント内に存在する、２つ以上の個別のアミノ酸残基からなる。本発明内において、「環境に依存する」ＣＤ３エピトープとは、前記エピトープの立体構造を指す。ＣＤ３のイプシロン鎖上に局在する、このような環境に依存するエピトープは、それが残りのイプシロン鎖内に埋め込まれ、また、該イプシロン鎖がＣＤ３ガンマ鎖またはＣＤ３デルタ鎖とヘテロ二量体化することにより、それが適正な位置に保持される場合に限り、その適正な立体構造を発生させうる。これに対し、本明細書に記載の、環境に依存しないＣＤ３エピトープとは、ＣＤ３イプシロンのＮ末端におけるアミノ酸残基１〜２７のポリペプチド、またはその機能的断片を指す。このＮ末端におけるアミノ酸残基１〜２７のポリペプチド、またはその機能的断片は、ＣＤ３複合体内におけるその天然環境から取り出しても、その３次元構造的完全性、および適正な立体構造を維持する。したがって、Ｎ末端におけるアミノ酸残基１〜２７のポリペプチド、またはＣＤ３イプシロン細胞外ドメインの一部であるその機能的断片が環境に依存しないということは、ＷＯ２００４／１０６３８０においてヒト結合分子を調製する方法との関連で説明されるＣＤ３イプシロンのエピトープとは完全に異なるエピトープであることを意味する。前記方法では、単独で発現させた組換えＣＤ３イプシロンを用いた。この単独で発現させた組換えＣＤ３イプシロンの立体構造は、その天然形態、すなわち、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体のＣＤ３イプシロンサブユニットが、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体のＣＤ３デルタサブユニットまたはＣＤ３ガンマサブユニットと非共有結合する複合体の一部として存在する形態において採用される形態とは異なっていた。このような単独で発現させた組換えＣＤ３イプシロンタンパク質を、抗体ライブラリーから抗体を選択するための抗原として用いると、この抗原に特異的な抗体がライブラリーから同定されるが、このようなライブラリーは、自己抗原（ｓｅｌｆ−ａｎｔｉｇｅｎ／ａｕｔｏａｎｔｉｇｅｎ）に対して特異的な抗体を含有しない。これは、単独で発現させた組換えＣＤ３イプシロンタンパク質がｉｎ  ｖｉｖｏでは存在せず、それが自己抗原ではないという事実に起因する。結果として、このタンパク質に特異的な抗体を発現させるＢ細胞の部分集団はｉｎ  ｖｉｖｏにおいて枯渇しなかったが、このようなＢ細胞から構築された抗体ライブラリーならば、単独で発現させた組換えＣＤ３イプシロンタンパク質に特異的な抗体の遺伝物質を含有するであろう。
【００９１】
しかし、環境に依存しない、Ｎ末端におけるアミノ酸残基１〜２７のポリペプチド、またはその機能的断片は、その天然形態において折り畳まれるエピトープであるため、本発明に沿った結合ドメインを、ＷＯ２００４／１０６３８０に記載の手法に基づく方法によって同定することはできない。したがって、試験では、ＷＯ２００４／１０６３８０で開示される結合分子が、ＣＤ３イプシロン鎖のＮ末端におけるアミノ酸残基１〜２７に結合不可能であることを検証しうるであろう。こうして、従来の抗ＣＤ３結合分子、または抗ＣＤ３抗体分子（例えば、ＷＯ９９／５４４４０で開示される）は、本明細書に記載の、環境に依存しない、Ｎ末端におけるアミノ酸残基１〜２７のポリペプチド、またはその機能的断片よりＣ末端側に定められる位置において、ＣＤ３イプシロン鎖に結合する。先行技術による抗体分子であるＯＫＴ３およびＵＣＨＴ−１もまた、アミノ酸残基３５〜８５において、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体のイプシロンサブユニットに特異的であり、したがって、これらの抗体のエピトープもまた、よりＣ末端側に位置する。加えて、ＵＣＨＴ−１は、アミノ酸残基４３〜７７の領域においてＣＤ３イプシロン鎖に結合する（Ｔｕｎｎａｃｌｉｆｆｅ、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１（１９８９）、５４６〜５０；Ｋｊｅｒ−Ｎｉｅｌｓｅｎ、ＰＮＡＳ  １０１（２００４）、７６７５〜７６８０；Ｓａｌｍｅｒｏｎ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（１９９１）、３０４７〜５２）。したがって、先行技術による抗ＣＤ３分子は、本明細書で定義される、環境に依存しない、Ｎ末端におけるアミノ酸残基１〜２７エピトープ（またはその機能的断片）に結合せず、また、これを指向しない。特に、最新技術でも、環境に依存しない、Ｎ末端におけるアミノ酸残基１〜２７エピトープに特異的に結合し、また、異種間特異的である、すなわち、ヒト、および非チンパンジー霊長動物のＣＤ３イプシロンに結合する抗ＣＤ３分子は提供されていない。
【００９２】
本発明の二重特異性単鎖抗体分子内に含まれる、好ましくはヒト結合ドメインを作製するには、例えば、ヒト、および非チンパンジー霊長動物のＣＤ３イプシロン（例えば、マカクザルのＣＤ３イプシロン）の両方に結合するモノクローナル抗体、またはヒト、および／もしくは非チンパンジー霊長動物のＰＳＣＡ（ＣＤ１９、Ｃ−ＭＥＴ、エンドシアリン、ＥｐＣＡＭ、ＩＧＦ−１Ｒ、またはＦＡＰαのそれぞれ）に結合するモノクローナル抗体を用いることができる。
【００９３】
本明細書で用いられる「ヒト（ｈｕｍａｎ）」および「ヒト（ｍａｎ）」とは、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）種を指す。本明細書に記載の構築物の医療的な使用に関する限り、ヒト患者は、同じ分子により治療されるものとする。
【００９４】
本発明の二重特異性単鎖抗体の前記第１または第２の結合ドメインのうちの少なくとも１つは、ＣＤＲ移植ドメイン、ヒト化ドメイン、またはヒトドメインであることが好ましい。本発明の二重特異性単鎖抗体の第１および第２の結合ドメインは共に、ＣＤＲ移植ドメイン、ヒト化ドメイン、またはヒトドメインであることが好ましい。
【００９５】
本明細書で用いられる「ヒト」抗体という用語は、本明細書で定義される二重特異性単鎖抗体が、ヒト生殖細胞系列の抗体レパートリー内に含有される（１または複数の）アミノ酸配列を含むことを意味するものとして理解されたい。したがって、本明細書における定義を目的とするなら、前記二重特異性単鎖抗体は、それが、このようなヒト生殖細胞系列の（１または複数の）アミノ酸配列からなる場合に、すなわち、問題となる二重特異性単鎖抗体の（１または複数の）アミノ酸配列が、発現させたヒト生殖細胞系列の（１または複数の）アミノ酸配列と同一である場合に、ヒト抗体であると考えることができる。体細胞超変異による刷り込みのために、それが、その（それらの）最も近い（１または複数の）ヒト生殖細胞系列配列から予測の範囲を超えて逸脱することはない（１または複数の）配列からなる場合にもまた、本明細書で定義される二重特異性単鎖抗体をヒト抗体とみなすことができる。加えて、多くの非ヒト哺乳動物、例えば、マウスおよびラットなどのげっ歯動物の抗体もまた、発現させたヒト抗体レパートリー内に存在すると予測されうるＶＨ  ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。本発明の目的では、発現させたヒトレパートリー内に存在すると予測されうる、ヒト由来または非ヒト由来の、（１または複数の）任意のこのような配列もまた、「ヒト」配列と考えられるであろう。
【００９６】
本明細書で用いられる、「ヒト化した」、「ヒト化」、「ヒト様」、またはこれらの文法的に類縁の変化形は、互換的に用いられて、その結合ドメインのうちの少なくとも１つにおいて、非ヒト抗体またはその断片に由来する、少なくとも１つの相補性決定領域（「ＣＤＲ」）を含む、二重特異性単鎖抗体を指す。ヒト化法は、例えば、ＷＯ９１／０９９６８およびＵＳ６，４０７，２１３において説明されている。非限定的な例として述べると、該用語は、少なくとも１つの結合ドメインの可変領域が、別の非ヒト動物、例えば、げっ歯動物に由来する単一のＣＤＲ領域、例えば、ＶＨの第３のＣＤＲ領域（ＣＤＲＨ３）を含む場合のほか、一方または両方の可変領域が、そのそれぞれの第１、第２、および第３のＣＤＲの各々において、前記非ヒト動物に由来するＣＤＲを含む場合も包含する。二重特異性単鎖抗体の結合ドメインのすべてのＣＤＲが、例えば、げっ歯動物に由来する、それらに対応する同等物により置換されている場合は、「ＣＤＲ移植」であると述べることが典型的であり、この用語は、本明細書で用いられる「ヒト化」またはこれに類縁の文法的変化形により包含されるものとして理解されたい。「ヒト化」またはこれに類縁の文法的変化形はまた、第１および／または第２の結合ドメインのＶＨおよび／またはＶＬ内において、１または複数のＣＤＲ領域を置換させることに加え、ＣＤＲ間において、フレームワーク（「ＦＲ」）領域内の少なくとも１つのアミノ酸残基をさらに突然変異（例えば、置換）させる場合も包含し、この場合、その／それらの位置におけるアミノ酸が、置換に用いられる該１または複数のＣＤＲ領域の由来元の動物の、その／それらの位置における該１または複数のアミノ酸に対応するように突然変異させる。当技術分野で知られる通り、このような個々の突然変異は、その標的分子のＣＤＲドナーとして用いられる非ヒト抗体の元の結合アフィニティーを回復させるために、ＣＤＲ移植後のフレー厶ワーク領域内において作製されることが多い。「ヒト化」という用語は、上記で説明した、フレームワーク領域におけるアミノ酸置換に加え、非ヒト動物に由来するＣＤＲ領域内において、（１または複数の）アミノ酸が、ヒト抗体に由来する、対応するＣＤＲ領域の（１または複数の）アミノ酸へと置換されることもさらに包含しうる。
【００９７】
本明細書で用いられる「相同体」または「相同性」という用語は、以下の通りに理解されたい：タンパク質間およびＤＮＡ間における相同性とは、とりわけ、バイオインフォマティックスにおける配列類似性に基づいて結論付けられることが多い。例えば、一般に、２つ以上の遺伝子が高度に類似するＤＮＡ配列を有する場合、それらは相同である可能性が高い。しかし、配列類似性は、異なる始祖から生じる場合もある：短い配列は偶然類似する場合があり、また、配列は、両方が、転写因子など、特定のタンパク質に結合するように選択されたために類似する場合もある。このような配列は、類似するが、相同ではない。相同な配列領域はまた、保存的であるとも呼ばれる。これは、特定の位置におけるアミノ酸が変化しているが、該アミノ酸の生理学的−化学的特性は変化せずに維持される、アミノ酸配列における保存と混同されるべきではない。相同配列には２つの種類：オーソログおよびパラログがある。相同配列は、それらが、種分化イベントにより分離される場合、オーソログである：種が２つの個別の種に分岐する場合、結果として生じる種における単一遺伝子の分岐コピーをオーソログという。オーソログまたはオーソログ遺伝子は、それらが共通の始祖に由来するために互いに類似する、異なる種における遺伝子である。類似する２つの遺伝子がオーソログであることの最も強力な証拠は、遺伝子系統についての系統発生解析の結果である。１つの分岐群内において見出される遺伝子は、共通の始祖に由来するオーソログである。オーソログは、常にというわけではないが、同じ機能を有することが多い。オーソログ配列は、生物の分類学的分類研究において有用な情報をもたらす。遺伝学的分岐のパターンを用いて、生物の類縁性を追跡することができる。極めて密接な類縁性を示す２つの生物は、２つのオーソログ間において、極めて類似するＤＮＡ配列を示す可能性が高い。逆に、別の生物から進化的に遠く隔たっている生物は、研究対象のオーソログ配列において、より大きな相違を示す可能性が高い。相同配列は、それらが、遺伝子複製イベントにより分離される場合、パラログである：ある生物内における遺伝子が複製されて、おなじゲノム内における異なる２つの位置を占める場合、この２つのコピーはパラログである。パラログである配列セットを、互いに対するパラログと呼ぶ。パラログは、同じであるかまたは類似の機能を有することが典型的であるが、そうでない場合：複製される遺伝子の１つのコピーに対して元の選択圧がかからないために、このコピーが自由に突然変異し、新たな機能を獲得する場合もある。例は、ラットおよびマウスなどのげっ歯動物において見出すことができる。機能の相違が生じているかどうかは不明であるが、げっ歯動物は、インスリンのパラログ遺伝子対を有する。パラログ遺伝子は、同じ種に属することが多いが、必ずしもそうではない：例えば、ヒトのヘモグロビン遺伝子と、チンパンジーのミオグロビン遺伝子とはパラログである。これは、バイオインフォマティックスにおける共通の問題である：異なる種のゲノムが配列決定され、相同遺伝子が見つかった場合、これらの遺伝子は、それらの機能が相違しているパラログでもありうるため、これらが同じであるかまたは類似の機能を有すると即座に結論付けることはできない。
【００９８】
本明細書で用いられる「非チンパンジー霊長動物（ｎｏｎ−ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅ  ｐｒｉｍａｔｅ）」もしくは「非チンパンジー霊長動物（ｎｏｎ−ｃｈｉｍｐ ｐｒｉｍａｔｅ）」、またはこれらの文法的変化形は、チンパンジー（ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅ）以外の、すなわち、チンパンジー（Ｐａｎ）属に属し、また、これには、ボノボ種、また、チンパンジー（Ａｎｔｈｒｏｐｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）としても知られるチンパンジー（Ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）種が含まれる動物またはオランウータン以外の任意の霊長動物（すなわち、ヒト以外の動物）を指す。しかし、本発明の抗体はまた、それらの第１および／または第２の結合ドメインにより、前記チンパンジーのそれぞれのエピトープ／断片などにも結合しうることが可能であると理解される。意図は、所望の場合、チンパンジーにより実施される動物試験を回避することだけである。したがって、別の実施形態において、本発明の抗体はまた、それらの第１および／または第２の結合ドメインにより、チンパンジーのそれぞれのエピトープに結合することも意図される。「霊長動物（ｐｒｉｍａｔｅ）」、「霊長動物種」、「霊長動物（ｐｒｉｍａｔｅｓ）」、またはこれらの文法的変化形は、真獣類哺乳動物の１つの目を示し、これは、原猿および真猿（ａｎｔｈｒｏｐｏｉｄｓ）の２つの亜目に分類され、類人猿、サル、およびキツネザル（ｌｅｍｕｒｓ）を含む。具体的に述べると、本明細書で用いられる「霊長動物」は、曲鼻猿亜目（非メガネザル原猿）を含み、これには、キツネザル（Ｌｅｍｕｒｉｆｏｒｍｅｓ）下目（キツネザル下目には、コビトキツネザル上科およびキツネザル（Ｌｅｍｕｒｏｉｄｅａ）上科が含まれる）、アイアイ（Ｃｈｉｒｏｍｙｉｆｏｒｍｅｓ）下目（アイアイ下目には、アイアイ（Ｄａｕｂｅｎｔｏｎｉｉｄａｅ）科が含まれる）、およびロリス（Ｌｏｒｉｓｉｆｏｒｍｅｓ）下目（ロリス下目には、ロリス（Ｌｏｒｉｓｉｄａｅ）科およびガラゴ科が含まれる）が含まれる。本明細書で用いられる「霊長動物」はまた、直鼻猿亜目も含み、これには、メガネサル（Ｔａｒｓｉｉｆｏｒｍｅｓ）下目（メガネザル下目には、メガネザル（Ｔａｒｓｉｉｄａｅ）科が含まれる）、真猿（Ｓｉｍｉｉｆｏｒｍｅｓ）下目（真猿下目には、広鼻下目または新世界ザル、また、狭鼻下目（これには、オナガザル科（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｉｄｅａ）が含まれる）または旧世界ザルが含まれる）が含まれる。
【００９９】
本発明の意味の範囲内で、非チンパンジー霊長動物種とは、キツネザル（ｌｅｍｕｒ）、メガネザル（ｔａｒｓｉｅｒ）、テナガザル、マーモセット（オマキザル科の新世界ザルに属する）、または旧世界ザル（オナガザル（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｏｉｄｅａ）上科に属する）であると理解することができる。
【０１００】
本明細書で用いられる「旧世界ザル」は、オナガザル（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｏｉｄｅａ）上科に分類される任意のサルを含み、オナガザル上科は、オナガザル（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｉｎａｅ）亜科（オナガザル亜科は主にアフリカ産であるが、これにはアジア産および北アフリカ産であるマカクザルの多様な属も含まれる）；およびコロブス（Ｃｏｌｏｂｉｎａｅ）亜科（コロブス亜科にはアジア産の属が多く含まれるが、これにはアフリカ産のコロブス（ｃｏｌｏｂｕｓ）ザルも含まれる）に細分される。
【０１０１】
具体的に述べると、非チンパンジー有利な霊長動物は、オナガザル（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｉｎａｅ）亜科内のオナガザル（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｉｎｉ）族に由来する場合があり、これは、アレンモンキー（Ａｌｌｅｎｏｐｉｔｈｅｃｕｓ）属（アレンモンキー（Ａｌｌｅｎ’ｓ  Ｓｗａｍｐ  Ｍｏｎｋｅｙ、Ａｌｌｅｎｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｎｉｇｒｏｖｉｒｉｄｉｓ））内の場合もあり；タラポアン（Ｍｉｏｐｉｔｈｅｃｕｓ）属（タラポアン（Ａｎｇｏｌａｎ  Ｔａｌａｐｏｉｎ、Ｍｉｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｔａｌａｐｏｉｎ）；北部タラポアン（Ｇａｂｏｎ  Ｔａｌａｐｏｉｎ、Ｍｉｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｏｇｏｕｅｎｓｉｓ））内の場合もあり；パタスモンキー（Ｅｒｙｔｈｒｏｃｅｂｕｓ）属（パタスモンキー（Ｐａｔａｓ  Ｍｏｎｋｅｙ、Ｅｒｙｔｈｒｏｃｅｂｕｓ  ｐａｔａｓ））内の場合もあり；サバンナモンキー（Ｃｈｌｏｒｏｃｅｂｕｓ）属（ミドリザル（Ｇｒｅｅｎ  Ｍｏｎｋｅｙ、Ｃｈｌｏｒｏｃｅｂｕｓ  ｓａｂａｃｅｕｓ）；サバンナモンキー（Ｇｒｉｖｅｔ、Ｃｈｌｏｒｏｃｅｂｕｓ  ａｅｔｈｉｏｐｓ）；ベールマウンテンズベルベットモンキー（Ｂａｌｅ Ｍｏｕｎｔａｉｎｓ  Ｖｅｌｖｅｔ、Ｃｈｌｏｒｏｃｅｂｕｓ  ｄｊａｍｄｊａｍｅｎｓｉｓ）；タンタルスモンキー（Ｔａｎｔａｌｕｓ Ｍｏｎｋｅｙ、Ｃｈｌｏｒｏｃｅｂｕｓ  ｔａｎｔａｌｕｓ）；ベルベットモンキー（Ｖｅｌｖｅｔ  Ｍｏｎｋｅｙ、Ｃｈｌｏｒｏｃｅｂｕｓ  ｐｙｇｅｒｙｔｈｒｕｓ）；マルブラウクモンキー（Ｍａｌｂｒｏｕｃｋ、Ｃｈｌｏｒｏｃｅｂｕｓ  ｃｙｎｏｓｕｒｏｓ））内の場合もあり；オナガザル（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ）属（ドリアスモンキー（Ｄｒｙａｓ  ＭｏｎｋｅｙまたはＳａｌｏｎｇｏ  Ｍｏｎｋｅｙ、Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｄｒｙａｓ）；ダイアナモンキー（Ｄｉａｎａ  Ｍｏｎｋｅｙ、Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｄｉａｎａ）；ロロウェイモンキー（Ｒｏｌｏｗａｙ  Ｍｏｎｋｅｙ、Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｒｏｌｏｗａｙ）；オオハナジログエノン（Ｇｒｅａｔｅｒ  Ｓｐｏｔ−ｎｏｓｅｄ  Ｍｏｎｋｅｙ、Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｎｉｃｔｉｔａｎｓ）；ブルーモンキー（Ｂｌｕｅ  Ｍｏｎｋｅｙ、Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｍｉｔｉｓ）；シルバーモンキー（Ｓｉｌｖｅｒ  Ｍｏｎｋｅｙ、Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｄｏｇｇｅｔｔｉ）；ゴールデンモンキー（Ｇｏｌｄｅｎ  Ｍｏｎｋｅｙ、Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｋａｎｄｔｉ）；サイクスモンキー（Ｓｙｋｅｓ’ｓ  Ｍｏｎｋｅｙ、Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ａｌｂｏｇｕｌａｒｉｓ）；モナモンキー（Ｍｏｎａ  Ｍｏｎｋｅｙ、Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｍｏｎａ）；キャンベルモンキー（Ｃａｍｐｂｅｌｌ’ｓ  Ｍｏｎａ  Ｍｏｎｋｅｙ、Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｃａｍｐｂｅｌｌｉ）；ロウモンキー（Ｌｏｗｅ’ｓ  Ｍｏｎａ  Ｍｏｎｋｅｙ、Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｌｏｗｅｉ）；クラウングエノン（Ｃｒｅｓｔｅｄ  Ｍｏｎａ  Ｍｏｎｋｅｙ、Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｐｏｇｏｎｉａｓ）；ウォルフグエノン（Ｗｏｌｆ’ｓ  Ｍｏｎａ  Ｍｏｎｋｅｙ、Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｗｏｌｆｉ）；デントグエノン（Ｄｅｎｔ’ｓ  Ｍｏｎａ  Ｍｏｎｋｅｙ、Ｃ��ｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｄｅｎｔｉ）；ショウハナジログエノン（Ｌｅｓｓｅｒ  Ｓｐｏｔ−ｎｏｓｅｄ  Ｍｏｎｋｅｙ、Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｐｅｔａｕｒｉｓｔａ）；アカハラグエノン（Ｗｈｉｔｅ−ｔｈｒｏａｔｅｄ  Ｇｕｅｎｏｎ、Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｇａｓｔｅｒ）；スクレーターグエノン（Ｓｃｌａｔｅｒ’ｓ  Ｇｕｅｎｏｎ、Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｓｃｌａｔｅｒｉ）；アカミミグエノン（Ｒｅｄ−ｅａｒｅｄ  Ｇｕｅｎｏｎ、Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｔｉｓ）；クチヒゲグエノン（Ｍｏｕｓｔａｃｈｅｄ  Ｇｕｅｎｏｎ、Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｃｅｐｈｕｓ）；アカオザル（Ｒｅｄ−ｔａｉｌｅｄ  Ｍｏｎｋｅｙ、Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ａｓｃａｎｉｕｓ）；ロエストグエノン（Ｌ’Ｈｏｅｓｔ’ｓ  Ｍｏｎｋｅｙ、Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｌｈｏｅｓｔｉ）；プロイスグエノン（Ｐｒｅｕｓｓ’ｓ  Ｍｏｎｋｅｙ、Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｐｒｃｕｓｓｉ）；サンテールモンキー（Ｓｕｎ−ｔａｉｌｅｄ  Ｍｏｎｋｅｙ、Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｓｏｌａｔｕｓ）；フクロウグエノン（Ｈａｍｌｙｎ’ｓ  ＭｏｎｋｅｙまたはＯｗｌ−ｆａｃｅｄ  Ｍｏｎｋｅｙ、Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｈａｍｌｙｎｉ）；ブラッザグエノン（Ｄｅ  Ｂｒａｚｚａ’ｓ  Ｍｏｎｋｅｙ、Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｎｅｇｌｅｃｔｕｓ）内の場合もある。
【０１０２】
代替的に、非チンパンジー有利な霊長動物は、これらもまたオナガザル亜科内であるがそのうちのヒヒ族内であり、マカク属（バーバリーザル（Ｂａｒｂａｒｙ  Ｍａｃａｑｕｅ、Ｍａｃａｃａ  ｓｙｌｖａｎｕｓ）；シシオザル（Ｌｉｏｎ−ｔａｉｌｅｄ  Ｍａｃａｑｕｅ、Ｍａｃａｃａ  ｓｉｌｅｎｕｓ）；ブタオザル（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｐｉｇ−ｔａｉｌｅｄ  ＭａｃａｑｕｅもしくはＢｅｒｕｋ、Ｍａｃａｃａ  ｎｅｍｅｓｔｒｉｎａ）；キタブタオザル（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｐｉｇ−ｔａｉｌｅｄ  Ｍａｃａｑｕｅ、Ｍａｃａｃａ  ｌｅｏｎｉｎａ）；メンタワイブタオザル（Ｐａｇａｉ  Ｉｓｌａｎｄ  ＭａｃａｑｕｅまたはＢｏｋｋｏｉ、Ｍａｃａｃａ  ｐａｇｅｎｓｉｓ）；シブルー島マカク（Ｓｉｂｅｒｕｔ  Ｍａｃａｑｕｅ、Ｍａｃａｃａ  ｓｉｂｅｒｕ）；ムーアザル（Ｍｏｏｒ  Ｍａｃａｑｕｅ、Ｍａｃａｃａ  ｍａｕｒａ）；ブーツザル（Ｂｏｏｔｅｄ  Ｍａｃａｑｕｅ、Ｍａｃａｃａ  ｏｃｈｒｅａｔａ）；トンケアンザル（Ｔｏｎｋｅａｎ  Ｍａｃａｑｕｅ、Ｍａｃａｃａ  ｔｏｎｋｅａｎａ）；ヘックザル（Ｈｅｃｋ’ｓ  Ｍａｃａｑｕｅ、Ｍａｃａｃａ  ｈｅｃｋｉ）；ゴロンタロザル（Ｇｏｒｏｎｔａｌｏ  Ｍａｃａｑｕｅ、Ｍａｃａｃａ  ｎｉｇｒｉｓｃｅｎｓ）；クロザル（Ｃｅｌｅｂｅｓ  Ｃｒｅｓｔｅｄ  ＭａｃａｑｕｅまたはＢｌａｃｋ  “Ａｐｅ”、Ｍａｃａｃａ  ｎｉｇｒａ）；カニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  ｍｏｎｋｅｙまたはＣｒａｂ−ｅａｔｉｎｇＭａｃａｑｕｅまたはＬｏｎｇ−ｔａｉｌｅｄ  ＭａｃａｑｕｅまたはＫｅｒａ、Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）；ベニガオザル（Ｓｔｕｍｐ−ｔａｉｌｅｄ  ＭａｃａｑｕｅまたはＢｅａｒ  Ｍａｃａｑｕｅ、Ｍａｃａｃａ  ａｒｃｔｏｉｄｅｓ）；アカゲザル（Ｒｈｅｓｕｓ  Ｍａｃａｑｕｅ、Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）；タイワンザル（Ｆｏｒｍｏｓａｎ  Ｒｏｃｋ  Ｍａｃａｑｕｅ、Ｍａｃａｃａ  ｃｙｃｌｏｐｓｉｓ）；ニホンザル（Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｍａｃａｑｕｅ、Ｍａｃａｃａ  ｆｕｓｃａｔａ）；トクモンキー（Ｔｏｑｕｅ  Ｍａｃａｑｕｅ、Ｍａｃａｃａ  ｓｉｎｉｃａ）；ボンネットザル（Ｂｏｎｎｅｔ  Ｍａｃａｑｕｅ、Ｍａｃａｃａ  ｒａｄｉａｔａ）；バーバリーザル（Ｂａｒｂａｒｙ  Ｍａｃａｑｕｅ、Ｍａｃａｃａ  ｓｙｌｖａｎｍｕｓ）；アッサムザル（Ａｓｓａｍ  Ｍａｃａｑｕｅ、Ｍａｃａｃａ  ａｓｓａｍｅｎｓｉｓ）；チベットモンキー（Ｔｉｂｅｔａｎ  ＭａｃａｑｕｅまたはＭｉｌｎｅ−Ｅｄｗａｒｄｓ’Ｍａｃａｑｕｅ、Ｍａｃａｃａ  ｔｈｉｂｅｔａｎａ）；アルナーチャルモンキー（Ａｒｕｎａｃｈａｌ ＭａｃａｑｕｅまたはＭｕｎｚａｌａ、Ｍａｃａｃａ  ｍｕｎｚａｌａ））内の場合もあり；ロフォセブス属（ホホジロマンガベイ（Ｇｒａｙ−ｃｈｅｅｋｅｄＭａｎｇａｂｅｙ、Ｌｏｐｈｏｃｅｂｕｓ  ａｌｂｉｇｅｎａ）；ロフォセブス・アルビゲナ・アルビゲナ；ロフォセブス・アルビゲナ・オスマーニ；ロフォセブス・アルビゲナ・ジョンストーニ；ブラックマンガベイ（Ｂｌａｃｋ  Ｃｒｅｓｔｅｄ  Ｍａｎｇａｂｅｙ、Ｌｏｐｈｏｃｅｂｕｓ  ａｔｅｒｒｉｍｕｓ）；オプデンボッシュマンガベイ（Ｏｐｄｅｎｂｏｓｃｈ’ｓ Ｍａｎｇａｂｅｙ、Ｌｏｐｈｏｃ���ｂｕｓ  ｏｐｄｅｎｂｏｓｃｈｉ）；ハイランドマンガベイ（Ｈｉｇｈｌａｎｄ  Ｍａｎｇａｂｅｙ、Ｌｏｐｈｏｃｅｂｕｓ  ｋｉｐｕｎｊｉ））内の場合もあり；パピオ属（マントヒヒ（Ｈａｍａｄｒｙａｓ  Ｂａｂｏｏｎ、Ｐａｐｉｏ  ｈａｍａｄｒｙａｓ）；ギニアヒヒ（Ｇｕｉｎｅａ  Ｂａｂｏｏｎ、Ｐａｐｉｏ  ｐａｐｉｏ）；アヌビスヒヒ（Ｏｌｉｖｅ  Ｂａｂｏｏｎ、Ｐａｐｉｏ  ａｎｕｂｉｓ）；キイロヒヒ（Ｙｅｌｌｏｗ  Ｂａｂｏｏｎ、Ｐａｐｉｏ  ｃｙｎｏｃｅｐｈａｌｕｓ）；チャクマヒヒ（Ｃｈａｃｍａ  Ｂａｂｏｏｎ、Ｐａｐｉｏ  ｕｒｓｉｎｕｓ））内の場合もあり；ゲラダ（Ｔｈｅｒｏｐｉｔｈｅｃｕｓ）属（ゲラダ（Ｇｅｌａｄａ、Ｔｈｅｒｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｇｅｌａｄａ））内の場合もあり；マンガベイ（Ｃｅｒｃｏｃｅｂｕｓ）属（スーティーマンガベイ（Ｓｏｏｔｙ  Ｍａｎｇａｂｅｙ、Ｃｅｒｃｏｃｅｂｕｓ  ａｔｙｓ）；セルコセブス・アティス・アティス；セルコブス・アティス・ルヌラートゥス；シロエリマンガベイ（Ｃｏｌｌａｒｅｄ  Ｍａｎｇａｂｅｙ、Ｃｅｒｃｏｃｅｂｕｓ  ｔｏｒｑｕａｔｕｓ）；アジルマンガベイ（ＡｇｉｌｅＭａｎｇａｂｅｙ、Ｃｅｒｃｏｃｅｂｕｓ  ａｇｉｌｉｓ）；ゴールデンマンガベイ（Ｇｏｌｄｅｎ−ｂｅｌｌｉｅｄ Ｍａｎｇａｂｅｙ、Ｃｅｒｃｏｃｅｂｕｓ  ｃｈｒｙｓｏｇａｓｔｅｒ）；タナリバーマンガベイ（Ｔａｎａ  Ｒｉｖｅｒ  Ｍａｎｇａｂｅｙ、Ｃｅｒｃｏｃｅｂｕｓ  ｇａｌｅｒｉｔｕｓ）；サンジェマンガベイ（Ｓａｎｊｅ  Ｍａｎｇａｂｅｙ、Ｃｅｒｃｏｃｅｂｕｓ  ｓａｎｊｅｉ））内の場合もあり；マンドリル（Ｍａｎｄｒｉｌｌｕｓ）属（マンドリル（Ｍａｎｄｒｉｌｌ、Ｍａｎｄｒｉｌｌｕｓ  ｓｐｈｉｎｘ）；ドリル（Ｄｒｉｌｌ、Ｍａｎｄｒｉｌｌｕｓ  ｌｅｕｃｏｐｈａｅｕｓ））内の場合もある。
【０１０３】
カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）（カニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  ｍｏｎｋｅｙ）としても知られ、したがって、実施例では「カニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ）」と称する）、およびアカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）（「アカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ）」と称するアカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ  ｍｏｎｋｅｙ））が最も好ましい。
【０１０４】
非チンパンジー有利な霊長動物は、コロブス亜科内のアフリカ群に由来する場合があり、これは、コロブス（Ｃｏｌｏｂｕｓ）属（クロコロブス（Ｂｌａｃｋ  Ｃｏｌｏｂｕｓ、Ｃｏｌｏｂｕｓ  ｓａｔａｎａｓ）；アンゴラコロブス（Ａｎｇｏｌａ  Ｃｏｌｏｂｕｓ、Ｃｏｌｏｂｕｓ  ａｎｇｏｌｅｎｓｉｓ）；キングコロブス（Ｋｉｎｇ  Ｃｏｌｏｂｕｓ、Ｃｏｌｏｂｕｓ  ｐｏｌｙｋｏｍｏｓ）；クマコロブス（Ｕｒｓｉｎｅ  Ｃｏｌｏｂｕｓ、Ｃｏｌｏｂｕｓ  ｖｅｌｌｅｒｏｓｕｓ）；アビシニアコロブス（Ｍａｎｔｌｅｄ  Ｇｕｅｒｅｚａ、Ｃｏｌｏｂｕｓ  ｇｕｅｒｅｚａ））内の場合もあり；アカコロブス（Ｐｉｌｉｏｃｏｌｏｂｕｓ）属（アカコロブス（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｄ  Ｃｏｌｏｂｕｓ、Ｐｉｌｉｏｃｏｌｏｂｕｓ  ｂａｄｉｕｓ）；ピリオコロブス・バディス・バディス；ピリオコロブス・バディス・テミンキー；ピリオコロブス・バディス・ワルドローナエ；ペナントアカコロブス（Ｐｅｎｎａｎｔ’ｓ  Ｃｏｌｏｂｕｓ、Ｐｉｌｉｏｃｏｌｏｂｕｓ  ｐｅｎｎａｎｔｉｉ）；ピリコロブス・ペナンティー・ペナンティー；ピリコロブス・ペナンティー・エピエニー；ピリコロブス・ペナンティー・ブビエリー；プロイスアカコロブス（Ｐｒｅｕｓｓ’ｓ  Ｒｅｄ  Ｃｏｌｏｂｕｓ、Ｐｉｌｉｏｃｏｌｏｂｕｓ  ｐｒｅｕｓｓｉ）；トロンアカコロブス（Ｔｈｏｌｌｏｎ’ｓ  Ｒｅｄ  Ｃｏｌｏｂｕｓ、Ｐｉｌｉｏｃｏｌｏｂｕｓ  ｔｈｏｌｌｏｎｉ）；中央アフリカアカコロブス（Ｃｅｎｔｒａｌ  Ａｆｒｉｃａｎ  Ｒｅｄ  Ｃｏｌｏｂｕｓ、Ｐｉｌｉｏｃｏｌｏｂｕｓ  ｆｏａｉ）；ピリオコロブス・フォアイー・フォアイー；ピリオコロブス・フォアイー・エリオティー；ピリオコロブス・フォアイー・ウスタレティー；ピリオコロブス・フォアイー・セムリキエンシス；ピリオコロブス・フォアイー・パルメンティエロールム；ウガンダアカコロブス（Ｕｇａｎｄａｎ  Ｒｅｄ  Ｃｏｌｏｂｕｓ、Ｐｉｌｉｏｃｏｌｏｂｕｓ  ｔｅｐｈｒｏｓｃｅｌｅｓ）；ウジングワアカコロブス（Ｕｚｙｎｇｗａ Ｒｅｄ  Ｃｏｌｏｂｕｓ、Ｐｉｌｉｏｃｏｌｏｂｕｓ ｇｏｒｄｏｎｏｒｕｍ）；ザンジバルアカコロブス（Ｚａｎｚｉｂａｒ  Ｒｅｄ  Ｃｏｌｏｂｕｓ、Ｐｉｌｉｏｃｏｌｏｂｕｓ  ｋｉｒｋｉｉ）；タナリバーアカコロブス（Ｔａｎａ  Ｒｉｖｅｒ  Ｒｅｄ  Ｃｏｌｏｂｕｓ、Ｐｉｌｉｏｃｏｌｏｂｕｓ  ｒｕｆｏｍｉｔｒａｔｕｓ））内の場合もあり；オリーブコロブス（Ｐｒｏｃｏｌｏｂｕｓ）属（オリーブコロブス（Ｏｌｉｖｅ  Ｃｏｌｏｂｕｓ、Ｐｒｏｃｏｌｏｂｕｓ  ｖｅｒｕｓ））内の場合もある。
【０１０５】
代替的に、非チンパンジー有利な霊長動物は、コロブス亜科内のラングール（リーフモンキー）群に由来する場合もあり、これは、セムノピテクス属（ネパールグレイラングール（Ｎｅｐａｌ  Ｇｒａｙ  Ｌａｎｇｕｒ、Ｓｅｍｎｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｓｃｈｉｓｔａｃｅｕｓ）；カシミールグレイラングール（Ｋａｓｈｍｉｒ Ｇｒａｙ  Ｌａｎｇｕｒ、Ｓｅｍｎｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ａｊａｘ）；タライグレイラングール（Ｔａｒａｉ  Ｇｒａｙ  Ｌａｎｇｕｒ、Ｓｅｍｎｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｈｅｃｔｏｒ）；ハヌマンラングール（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｐｌａｉｎｓ  Ｇｒａｙ  Ｌａｎｇｕｒ、Ｓｅｍｎｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｅｎｔｅｌｌｕｓ）；クロアシラングール（Ｂｌａｃｋ−ｆｏｏｔｅｄ  Ｇｒａｙ  Ｌａｎｇｕｒ、Ｓｅｍｎｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｈｙｐｏｌｅｕｃｏｓ）；南部平野グレイラングール（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｐｌａｉｎｓ  Ｇｒａｙ  Ｌａｎｇｕｒ、Ｓｅｍｎｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｄｕｓｓｕｍｉｅｒｉ）；タフテッドグレイラングール（Ｔｕｆｔｅｄ Ｇｒａｙ  Ｌａｎｇｕｒ、Ｓｅｍｎｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ｐｒｉａｍ））内の場合もあり；トラキピテクス属のカオムラサキラングール群（カオムラサキラングール（Ｐｕｒｐｌｅ−ｆａｃｅｄ  Ｌａｎｇｕｒ、Ｔｒａｃｈｙｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｖｅｔｕｌｕｓ）；ニルギリラングール（Ｎｉｌｇｉｒｉ  Ｌａｎｇｕｒ、Ｔｒａｃｈｙｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｊｏｈｎｉｉ））内の場合もあり；トラキピテクス属のシルバールトン群（ジャワルトン（Ｊａｖａｎ  Ｌｕｔｕｎｇ、Ｔｒａｃｈｙｐｉｔｈｅｃｕｓ  ａｕｒａｔｕｓ）；シルバールトン（Ｓｉｌｖｅｒｙ  Ｌｅａｆ  ＭｏｎｋｅｙまたはＳｉｌｖｅｒｙ  Ｌｕｔｕｎｇ、Ｔｒａｃｈｙｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｃｒｉｓｔａｔｕｓ）；インドシナルトン（Ｉｎｄｏｃｈｉｎｅｓｅ  Ｌｕｔｕｎｇ、Ｔｒａｃｈｙｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｇｅｒｍａｉｎｉ）；テナセリムルトン（Ｔｅｎａｓｓｅｒｉｍ  Ｌｕｔｕｎｇ、Ｔｒａｃｈｙｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｂａｒｂｅｉ））内の場合もあり；トラキピテクス属のダスキールトン群（ダスキールトン（Ｄｕｓｋｙ  Ｌｅａｆ  ＭｏｎｋｅｙまたはＳｐｅｃｔａｃｌｅｄＬｅａｆ  Ｍｏｎｋｅｙ、Ｔｒａｃｈｙｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｏｂｓｃｕｒｕｓ）；ファイールルトン（Ｐｈａｙｒｅ’ｓ  Ｌｅａｆ  Ｍｏｎｋｅｙ、Ｔｒａｃｈｙｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｐｈａｙｒｅｉ））内の場合もあり；トラキピテクス属のボウシラングール群（ボウシラングール（Ｃａｐｐｅｄ  Ｌａｎｇｕｒ、Ｔｒａｃｈｙｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｐｉｌｅａｔｕｓ）；ショートリッジラングール（Ｓｈｏｒｔｒｉｄｇｅ’ｓ  Ｌａｎｇｕｒ、Ｔｒａｃｈｙｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｓｈｏｒｔｒｉｄｇｅｉ）；ゴールデンラングール（Ｇｅｅ’ｓ  Ｇｏｌｄｅｎ  Ｌａｎｇｕｒ、Ｔｒａｃｈｙｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｇｅｅｉ））内の場合もあり；トラキピテクス属のフランソワルトン群（フランソワルトン（Ｆｒａｎｃｏｉｓ’Ｌａｎｇｕｒ、Ｔｒａｃｈｙｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｆｒａｎｃｏｉｓｉ）；ハティンラングール（Ｈａｔｉｎｈ  Ｌａｎｇｕｒ、Ｔｒａｃｈｙｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｈａｔｉｎｈｅｎｓｉｓ）；ワタボウシルトン（Ｗｈｉｔｅ−ｈｅａｄｅｄ Ｌａｎｇｕｒ、Ｔｒａｃｈｙｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｐｏｌｉｏｃｅｐｈａｌｕｓ）��ラオスラングール（Ｌａｏｔｉａｎ  Ｌａｎｇｕｒ、Ｔｒａｃｈｙｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｌａｏｔｕｍ）；コシジロラングール（Ｄｅｌａｃｏｕｒ’ｓ  Ｌａｎｇｕｒ、Ｔｒａｃｈｙｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｄｅｌａｃｏｕｒｉ）；インドシナクロラングール（Ｉｎｄｏｃｈｉｎｅｓｅ  Ｂｌａｃｋ  Ｌａｎｇｕｒ、Ｔｒａｃｈｙｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｅｂｅｎｕｓ））内の場合もあり；プレスビティス属（クロカンムリリーフモンキー（Ｓｕｍａｔｒａｎ  Ｓｕｒｉｌｉ、Ｐｒｅｓｂｙｔｉｓ  ｍｅｌａｌｏｐｈｏｓ）；シマコノハザル（Ｂａｎｄｅｄ  Ｓｕｒｉｌｉ、Ｐｒｅｓｂｙｔｉｓ  ｆｅｍｏｒａｌｉｓ）；サラワクスリリ（Ｓａｒａｗａｋ  Ｓｕｒｉｌｉ、Ｐｒｅｓｂｙｔｉｓ  ｃｈｒｙｓｏｍｅｌａｓ）；シロモモスリリ（Ｗｈｉｔｅ−ｔｈｉｇｈｅｄ  Ｓｕｒｉｌｉ、Ｐｒｅｓｂｙｔｉｓ  ｓｉａｍｅｎｓｉｓ）；シロビタイスリリ（Ｗｈｉｔｅ−ｆｒｏｎｔｅｄ  Ｓｕｒｉｌｉ、Ｐｒｅｓｂｙｔｉｓ  ｆｒｏｎｔａｔａ）；ジャワスリリ（Ｊａｖａｎ  Ｓｕｒｉｌｉ、  Ｐｒｅｓｂｙｔｉｓ  ｃｏｍａｔａ）；トーマスラングール（Ｔｈｏｍａｓ’ｓ  Ｌａｎｇｕｒ、Ｐｒｅｓｂｙｔｉｓ  ｔｈｏｍａｓｉ）；ホーズラングール（Ｈｏｓｅ’ｓ  Ｌａｎｇｕｒ、Ｐｒｅｓｂｙｔｉｓ  ｈｏｓｅｉ）；クリイロリーフモンキー（Ｍａｒｏｏｎ  Ｌｅａｆ  Ｍｏｎｋｅｙ、Ｐｒｅｓｂｙｔｉｓ  ｒｕｂｉｃｕｎｄａ）；オナガラングール（Ｍｅｎｔａｗａｉ  ＬａｎｇｕｒまたはＪｏｊａ、Ｐｒｅｓｂｙｔｉｓ  ｐｏｔｅｎｚｉａｎｉ）；ナトゥナ島スリリ（Ｎａｔｕｎａ  Ｉｓｌａｎｄ  Ｓｕｒｉｌｉ、Ｐｒｅｓｂｙｔｉｓ  ｎａｔｕｎａｅ））内の場合もある。
【０１０６】
代替的に、非チンパンジー有利な霊長動物は、オナガザル亜科内の異鼻貌（Ｏｄｄ−Ｎｏｓｅｄ）群に由来し、ドゥクモンキー属（ドゥクラングール（Ｒｅｄ−ｓｈａｎｋｅｄＤｏｕｃ、Ｐｙｇａｔｈｒｉｘ  ｎｅｍａｅｕｓ）；クロアシドゥクラングール（Ｂｌａｃｋ−ｓｈａｎｋｅｄ Ｄｏｕｃ、Ｐｙｇａｔｈｒｉｘ  ｎｉｇｒｉｐｅｓ）；ハイイロアシドゥクラングール（Ｇｒａｙ−ｓｈａｎｋｅｄ  Ｄｏｕｃ、Ｐｙｇａｔｈｒｉｘ  ｃｉｎｅｒｅａ））内の場合もあり；ゴールデンモンキー（Ｒｈｉｎｏｐｉｔｈｅｃｕｓ）属（ゴールデンモンキー（Ｇｏｌｄｅｎ  Ｓｎｕｂ−ｎｏｓｅｄ  Ｍｏｎｋｅｙ、Ｒｈｉｎｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｒｏｘｅｌｌａｎａ）；クロキンシコウ（Ｂｌａｃｋ  Ｓｎｕｂ−ｎｏｓｅｄ  Ｍｏｎｋｅｙ、Ｒｈｉｎｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｂｉｅｔｉ）；ハイイロキンシコウ（Ｇｒａｙ  Ｓｎｕｂ−ｎｏｓｅｄ  Ｍｏｎｋｅｙ、Ｒｈｉｎｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｂｒｅｌｉｃｈｉ）；トンキンシシバナザル（Ｔｏｎｋｉｎ  Ｓｎｕｂ−ｎｏｓｅｄＬａｎｇｕｒ、Ｒｈｉｎｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ａｖｕｎｃｕｌｕｓ））内の場合もあり；テングザル（Ｎａｓａｌｉｓ）属（テングザル（Ｐｒｏｂｏｓｃｉｓ  Ｍｏｎｋｅｙ、Ｎａｓａｌｉｓ  ｌａｒｖａｔｕｓ））内の場合もあり；シマコブ（Ｓｉｍｉａｓ）属（シマコブ（Ｐｉｇ−ｔａｉｌｅｄ  Ｌａｎｇｕｒ、Ｓｉｍｉａｓ  ｃｏｎｃｏｌｏｒ）内の場合もある。
【０１０７】
本明細書で用いられる「マーモセット（ｍａｒｍｏｓｅｔ）」という用語は、マーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ）属の任意の新世界ザル、例えば、カリトリクス（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ）亜属の大西洋マーモセット（コモンマーモセット（Ｃｏｍｍｏｎ  Ｍａｒｍｏｓｅｔ、Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ）ｊａｃｃｈｕｓ；クロミミマーモセット（Ｂｌａｃｋ−ｔｕｆｔｅｄ  Ｍａｒｍｏｓｅｔ、Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ）ｐｅｎｉｃｉｌｌａｔａ）；ウィードマーモセット（Ｗｉｅｄ’ｓ  Ｍａｒｍｏｓｅｔ、Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ）ｋｕｈｌｉｉ）；シロガオマーモセット（Ｗｈｉｔｅ−ｈｅａｄｅｄ  Ｍａｒｍｏｓｅｔ、Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ）ｇｅｏｆｆｒｏｙｉ）；キクガシラコモンマーモセット（Ｂｕｆｆｙ−ｈｅａｄｅｄ  Ｍａｒｍｏｓｅｔ、Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ）ｆｌａｖｉｃｅｐｓ）；ミミナガコモンマーモセット（Ｂｕｆｆｙ−ｔｕｆｔｅｄ  Ｍａｒｍｏｓｅｔ、Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ）ａｕｒｉｔａ））に属する新世界ザルか；ミコ亜属のアマゾンマーモセット（リオアカリマーモセット（Ｒｉｏ  Ａｃａｒｉ  Ｍａｒｍｏｓｅｔ、Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ（Ｍｉｃｏ）ａｃａｒｉｅｎｓｉｓ）；マニコレマーモセット（Ｍａｎｉｃｏｒｅ  Ｍａｒｍｏｓｅｔ、Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ（Ｍｉｃｏ）ｍａｎｉｃｏｒｅｎｓｉｓ）；シルバーマーモセット（Ｓｉｌｖｅｒｙ  Ｍａｒｍｏｓｅｔ、Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ（Ｍｉｃｏ）ａｒｇｅｎｔａｔａ）；ホワイトマーモセット（Ｗｈｉｔｅ  Ｍａｒｍｏｓｅｔ、Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ（Ｍｉｃｏ）ｌｅｕｃｉｐｐｅ）；エミリアマーモセット（Ｅｍｉｌｉａ’ｓ  Ｍａｒｍｏｓｅｔ、Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ（Ｍｉｃｏ）ｅｍｉｌｉａｅ）；クロテマーモセット（Ｂｌａｃｋ−ｈｅａｄｅｄ  Ｍａｒｍｏｓｅｔ、Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ（Ｍｉｃｏ）ｎｉｇｒｉｃｅｐｓ）；マルカマーモセット（Ｍａｒｃａ’ｓ  Ｍａｒｍｏｓｅｔ、Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ（Ｍｉｃｏ）ｍａｒｃａｉ）；オグロマーモセット（Ｂｌａｃｋ−ｔａｉｌｅｄ  Ｍａｒｍｏｓｅｔ、Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ（Ｍｉｃｏ）ｍｅｌａｎｕｒａ）；サンタレムマーモセット（Ｓａｎｔａｒｅｍ  Ｍａｒｍｏｓｅｔ、Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ（Ｍｉｃｏ）ｈｕｍｅｒａｌｉｆｅｒａ）；マウエスマーモセット（Ｍａｕｅｓ  Ｍａｒｍｏｓｅｔ、Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ（Ｍｉｃｏ）ｍａｕｅｓｉ）；キンシロフサミミマーモセット（Ｇｏｌｄ−ａｎｄ−ｗｈｉｔｅ  Ｍａｒｍｏｓｅｔ、Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ（Ｍｉｃｏ）ｃｈｒｙｓｏｌｅｕｃａ）；フサミミマーモセット（Ｈｅｒｓｈｋｏｖｉｔｚ’ｓ  Ｍａｒｍｏｓｅｔ、Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ（Ｍｉｃｏ）ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）；サテレマーモセット（Ｓａｔｅｒｅ  Ｍａｒｍｏｓｅｔ、Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ（Ｍｉｃｏ）ｓａｔｅｒｅｉ））に属する新世界ザルか；カリベラ亜属に属するルースマレンコビトマーモセット（Ｒｏｏｓｍａｌｅｎｓ’  Ｄｗａｒｆ  Ｍａｒｍｏｓｅｔ（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ（Ｃａｌｌｉｂｅｌｌａ）ｈｕｍｉｌｉｓ）か；またはセブエラ亜属に属するピグミーマーモセット（Ｐｙｇｍｙ  Ｍａｒｍｏｓｅｔ（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ（Ｃｅｂｕｅｌｌａ）ｐｙｇｍａｅａ）を指す。
【０１０８】
新世界ザルの他の属は、タマリン（Ｓａｇｕｉｎｕｓ）属のタマリン（ｔａｍａｒｉｎｓ）（ワタボウシタマリン群、アカテタマリン群、クロクビタマリン群、クチヒゲタマリン群、フタイロタマリン群、およびマダラガオタマリン群を含む）、およびリスザル（Ｓａｉｍｉｒｉ）属のリスザル（ｓｑｕｉｒｒｅｌ  ｍｏｎｋｅｙｓ）（例えば、コモンリスザル、セアカリスザル、クロリスザル、ボリビアリスザル、サイミリ・バンゾリニ）を含む。
【０１０９】
本発明の二重特異性単鎖抗体分子の好ましい実施形態において、非チンパンジー霊長動物は、旧世界ザルである。該ポリペプチドのより好ましい実施形態において、該旧世界ザルは、パピオ属、マカク属のサルである。マカク属のサルは、アッサムザル（Ａｓｓａｍｅｓｅ  ｍａｃａｑｕｅ（Ｍａｃａｃａ  ａｓｓａｍｅｎｓｉｓ））、バーバリーザル（Ｂａｒｂａｒｙ  ｍａｃａｑｕｅ（Ｍａｃａｃａ  ｓｙｌｖａｎｕｓ））、ボンネットザル（Ｂｏｎｎｅｔ  ｍａｃａｑｕｅ（Ｍａｃａｃａ  ｒａｄｉａｔａ））、ブーツザル（Ｂｏｏｔｅｄ  ｍａｃａｑｕｅもしくはＳｕｌａｗｅｓｉ−Ｂｏｏｔｅｄ  ｍａｃａｑｕｅ（Ｍａｃａｃａ  ｏｃｈｒｅａｔａ））、クロザル（Ｓｕｌａｗｅｓｉ−ｃｒｅｓｔｅｄ ｍａｃａｑｕｅ（Ｍａｃａｃａ  ｎｉｇｒａ））、タイワンザル（Ｆｏｒｍｏｓａｎｒｏｃｋ  ｍａｃａｑｕｅ（Ｍａｃａｃａ  ｃｙｃｌｏｐｓｉｓ））、ニホンザル（Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｓｎｏｗ  ｍａｃａｑｕｅもしくはＪａｐａｎｅｓｅ  ｍａｃａｑｕｅ（Ｍａｃａｃａ  ｆｕｓｃａｔａ））、カニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｏｇｕｓ  ｍｏｎｋｅｙもしくはｃｒａｂ−ｅａｔｉｎｇ  ｍａｃａｑｕｅもしくはｌｏｎｇ−ｔａｉｌｅｄｍａｃａｑｕｅもしくはＪａｖａ  ｍａｃａｑｕｅ（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ））、シシオザル（Ｌｉｏｎ−ｔａｉｌｅｄ  ｍａｃａｑｕｅ（Ｍａｃａｃａ  ｓｉｌｅｎｕｓ））、ブタオザル（Ｐｉｇｔａｉｌｅｄ  ｍａｃａｑｕｅ（Ｍａｃａｃａ  ｎｅｍｅｓｔｒｉｎａ））、アカゲザル（Ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅ（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ））、チベットモンキー（Ｔｉｂｅｔａｎ  ｍａｃａｑｕｅ（Ｍａｃａｃａ  ｔｈｉｂｅｔａｎａ））、トンケアンザル（Ｔｏｎｋｅａｎ  ｍａｃａｑｕｅ（Ｍａｃａｃａ  ｔｏｎｋｅａｎａ））、トクモンキー（Ｔｏｑｕｅ  ｍａｃａｑｕｅ（Ｍａｃａｃａ  ｓｉｎｉｃａ））、ベニガオザル（Ｓｔｕｍｐ−ｔａｉｌｅｄ  ｍａｃａｑｕｅもしくはＲｅｄ−ｆａｃｅｄ  ｍａｃａｑｕｅもしくはＢｅａｒ  ｍｏｎｋｅｙ（Ｍａｃａｃａ  ａｒｃｔｏｉｄｅｓ））、またはムーアザル（Ｍｏｏｒ  ｍａｃａｑｕｅ（Ｍａｃａｃａ  ｍａｕｒｕｓ））であることが最も好ましい。パピオ属のサルは、マントヒヒ（Ｈａｍａｄｒｙａｓ  Ｂａｂｏｏｎ、Ｐａｐｉｏ  ｈａｍａｄｒｙａｓ）；ギニアヒヒ（Ｇｕｉｎｅａ  Ｂａｂｏｏｎ、Ｐａｐｉｏ  ｐａｐｉｏ）；アヌビスヒヒ（Ｏｌｉｖｅ  Ｂａｂｏｏｎ、Ｐａｐｉｏ  ａｎｕｂｉｓ）；キイロヒヒ（Ｙｅｌｌｏｗ  Ｂａｂｏｏｎ、Ｐａｐｉｏ  ｃｙｎｏｃｅｐｈａｌｕｓ）；チャクマヒヒ（Ｃｈａｃｍａ  Ｂａｂｏｏｎ、Ｐａｐｉｏ  ｕｒｓｉｎｕｓ）であることが最も好ましい。
【０１１０】
本発明の二重特異性単鎖抗体分子の代替的に好ましい実施形態において、非チンパンジー霊長動物は、新世界ザルである。該ポリペプチドのより好ましい実施形態において、該新世界ザルは、マーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ）属（マーモセット（ｍａｒｍｏｓｅｔ））、タマリン属、またはリスザル属のサルである。マーモセット属のサルはコモンマーモセットであり、タマリン属のサルはワタボウシタマリンであり、リスザル属のサルはコモンリスザルであることが最も好ましい。
【０１１１】
本明細書で用いられる「細胞表面抗原」という用語は、細胞表面上において提示される分子を指す。大半の場合において、この分子は、この分子の少なくとも一部が、３次形態おいて、細胞の外側からの結合可能性を維持するように、該細胞の細胞膜内または細胞膜上に位置する。細胞膜内に位置する細胞表面分子の非限定的な例は、その３次立体構造において、親水性領域および疎水性領域を含む膜貫通タンパク質である。この場合、少なくとも１つの疎水性領域により、細胞表面分子が、細胞の疎水性細胞膜内に埋め込まれるか、または挿入されることが可能となるのに対し、親水性領域は、細胞膜の両側において、それぞれ、細胞質内および細胞外腔内へと延びる。細胞膜上に位置する細胞表面分子の非限定的な例は、システイン残基においてパルミトイル基を保有するように修飾されたタンパク質、Ｃ末端のシステイン残基においてファルネシル基を保有するように修飾されたタンパク質、またはＣ末端においてグリコシルホスファチジルイノシトール（「ＧＰＩ」）アンカーを保有するように修飾されたタンパク質である。これらの基により、細胞膜の外面に対するタンパク質の共有結合が可能となり、ここにおいて、それらは、抗体などの細胞外分子による認識可能性を維持する。細胞表面抗原の例は、ＣＤ３イプシロンおよびＰＳＣＡ（ＣＤ１９、Ｃ−ＭＥＴ、エンドシアリン、ＥｐＣＡＭ、ＩＧＦ−１Ｒ、またはＦＡＰαのそれぞれ）である。
【０１１２】
本明細書の上記で説明した通り、ＰＳＣＡは、前立腺癌、膀胱癌、または膵臓癌が含まれるがこれらに限定されない各種の癌を治療するための標的である、細胞表面抗原である。
【０１１３】
これもまた本明細書の上記で説明した通り、ＣＤ１９は、非ホジキンリンパ腫などのＢ細胞悪性腫瘍が含まれるがこれらに限定されない各種の癌、Ｂ細胞媒介性自己免疫疾患、またはＢ細胞枯渇を治療するための標的である、細胞表面抗原である。
【０１１４】
本明細書の上記でさらに説明した通り、Ｃ−ＭＥＴは、癌、肉腫、神経膠芽腫／星状細胞腫、黒色腫、中皮腫、ウィルムス腫瘍、または白血病、リンパ腫、もしくは多発性骨髄腫などの造血系悪性腫瘍が含まれるがこれらに限定されない各種の癌を治療するための標的である、細胞表面抗原である。
【０１１５】
さらに、本明細書の上記で説明した通り、エンドシアリンは、癌（乳癌、腎癌、肺癌、結腸直腸癌、結腸癌、膵臓中皮腫）、肉腫、および神経外胚葉性腫瘍（黒色腫、神経膠腫、神経芽細胞腫）が含まれるがこれらに限定されない各種の癌を治療するための標的である、細胞表面抗原である。
【０１１６】
これもまた本明細書の上記で説明した通り、ＥｐＣＡＭは、上皮癌または微小残存癌が含まれるがこれらに限定されない各種の癌を治療するための標的である、細胞表面抗原である。
【０１１７】
さらにまた、本明細書の上記で説明した通り、ＦＡＰアルファは、上皮癌が含まれるがこれに限定されない各種の癌を治療するための標的である、細胞表面抗原である。
【０１１８】
さらに、本明細書の上記で説明した通り、ＩＧＦ−１Ｒは、骨癌または軟組織癌（例えば、ユーイング肉腫）、乳癌、肝癌、肺癌、頭頚部癌、結腸直腸癌、前立腺癌、平滑筋肉腫、子宮頚癌および子宮内膜癌、卵巣癌、前立腺癌、ならびに膵臓癌が含まれるがこれらに限定されない各種の癌、また、好ましくは、乾癬が含まれるがこれに限定されない自己免疫疾患に対する治療の標的である、細胞表面抗原である。
【０１１９】
これに照らし、ＰＳＣＡ（ＣＤ１９、Ｃ−ＭＥＴ、エンドシアリン、ＥｐＣＡＭ、ＩＧＦ−１Ｒ、またはＦＡＰαのそれぞれ）はまた、腫瘍抗原としても特徴づけることができる。本明細書で用いられる「腫瘍抗原」という用語は、腫瘍細胞上において提示される抗原として理解することができる。これらの抗原は、該分子の膜貫通部分および細胞質部分と組み合わされることが多い細胞外部分により、細胞表面上に提示されうる。これらの抗原は、場合により、腫瘍細胞だけによって提示されることが可能であり、正常細胞によっては提示されることはない。腫瘍抗原は、もっぱら腫瘍細胞上において発現する場合もあり、正常細胞と比較して、腫瘍特異的な突然変異を示す場合もある。この場合、それらは、腫瘍特異的抗原と呼ばれる。腫瘍細胞および正常細胞により提示される抗原がより一般的であり、それらは、腫瘍関連抗原と呼ばれる。これらの腫瘍関連抗原は、正常細胞の場合と比較して過剰発現する場合もあり、腫瘍組織の構造が、正常組織と比較してそれほど稠密でないために、腫瘍細胞内において抗体結合が可能となる場合もある。本発明に沿った腫瘍抗原の例は、ＰＳＣＡ、ＣＤ１９、Ｃ−ＭＥＴ、エンドシアリン、ＥｐＣＡＭ、ＩＧＦ−１Ｒ、およびＦＡＰαである。
【０１２０】
本明細書の上記で説明した通り、本発明の二重特異性単鎖抗体分子は、第１の結合ドメインにより、ヒト、および非チンパンジー霊長動物のＣＤ３ε（イプシロン）鎖エピトープに結合するが、該エピトープは、配列番号２、４、６、もしくは８に示される２７のアミノ酸残基からなる群に含まれるアミノ酸配列の一部、またはその機能的断片である。
【０１２１】
本発明に沿って述べると、本発明の二重特異性単鎖抗体分子の場合、前記エピトープが、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、または５アミノ酸を含むアミノ酸配列の一部であることが好ましい。
【０１２２】
前記エピトープが、少なくとも、アミノ酸配列Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ（Ｑ−Ｄ−Ｇ−Ｎ−Ｅ）を含むことがより好ましい。
【０１２３】
本発明の範囲内で、Ｎ末端におけるアミノ酸残基１〜２７の機能的断片とは、前記機能的断片が、ＣＤ３複合体（ＥｐＣＡＭ、または、例えば、実施例３．１で示す通り、免疫グロブリンＦｃ部分などの異種アミノ酸配列に融合させた）内におけるその天然環境から取り出してもやはり、その３次元構造的完全性を維持する、環境に依存しないエピトープであることを意味する。ＣＤ３イプシロンのＮ末端における２７アミノ酸のポリペプチド、またはその機能的断片内における３次元構造が維持されることを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＮ末端ＣＤ３イプシロンポリペプチド断片、また、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＴ細胞上における天然のＣＤ３複合体（のＣＤ３イプシロンサブユニット）に対して、同じ結合アフィニティーで結合する結合ドメインを作製することができる。本発明の範囲内で、Ｎ末端におけるアミノ酸残基１〜２７の機能的断片とは、本明細書に記載のＣＤ３結合ドメインが、環境に依存しない形で、やはりこのような機能的断片に結合しうることを意味する。当業者は、エピトープのどのアミノ酸残基が、このような抗ＣＤ３結合ドメインにより認識されるかを決定する、エピトープマッピングの方法（例えば、アラニン走査；別記の実施例を参照されたい）について承知している。
【０１２４】
本発明の一実施形態において、本発明の二重特異性単鎖抗体分子は、ヒト、および非チンパンジー霊長動物のＣＤ３ε鎖エピトープに結合することが可能な（第１の）結合ドメインと、細胞表面抗原であるＰＳＣＡに結合することが可能な第２の結合ドメインとを含む。本発明の代替的な実施形態において、前記第２の結合ドメインは、細胞表面抗原であるＣＤ１９、Ｃ−ＭＥＴ、エンドシアリン、ＥｐＣＡＭ、ＩＧＦ−１Ｒ、またはＦＡＰαに結合することが可能である。
【０１２５】
本発明の範囲内において、第２の結合ドメインは、ヒト細胞表面抗原であるＰＳＣＡ（ＣＤ１９、Ｃ−ＭＥＴ、エンドシアリン、ＥｐＣＡＭ、ＩＧＦ−１Ｒ、またはＦＡＰαのそれぞれ）、および／または非チンパンジー霊長動物のＰＳＣＡ（ＣＤ１９、Ｃ−ＭＥＴ、エンドシアリン、ＥｐＣＡＭ、ＩＧＦ−１Ｒ、またはＦＡＰαのそれぞれ）に結合することがさらに好ましい。第２の結合ドメインは、ヒト細胞表面抗原であるＰＳＣＡ（ＣＤ１９、Ｃ−ＭＥＴ、エンドシアリン、ＥｐＣＡＭ、ＩＧＦ−１Ｒ、またはＦＡＰαのそれぞれ）、および非チンパンジー霊長動物のＰＳＣＡ（ＣＤ１９、Ｃ−ＭＥＴ、エンドシアリン、ＥｐＣＡＭ、ＩＧＦ−１Ｒ、またはＦＡＰαのそれぞれ）、好ましくは、マカクザルのＰＳＣＡ（ＣＤ１９、Ｃ−ＭＥＴ、エンドシアリン、ＥｐＣＡＭ、ＩＧＦ−１Ｒ、またはＦＡＰαのそれぞれ）に結合することが特に好ましい。第２の結合ドメインは、非チンパンジー霊長動物の少なくとも１つのＰＳＣＡ（ＣＤ１９、Ｃ−ＭＥＴ、エンドシアリン、ＥｐＣＡＭ、ＩＧＦ−１Ｒ、またはＦＡＰαのそれぞれ）に結合するが、それはまた、非チンパンジー霊長動物の２つ、３つ以上のＰＳＣＡ相同体（それぞれ、ＣＤ１９相同体、Ｃ−ＭＥＴ相同体、エンドシアリン相同体、ＥｐＣＡＭ相同体、ＩＧＦ−１Ｒ相同体、またはＦＡＰα相同体）にも結合しうることを理解されたい。例えば、第２の結合ドメインは、カニクイザルのＰＳＣＡ（ＣＤ１９、Ｃ−ＭＥＴ、エンドシアリン、ＥｐＣＡＭ、ＩＧＦ−１Ｒ、またはＦＡＰαのそれぞれ）、およびアカゲザルのＰＳＣＡ（ＣＤ１９、Ｃ−ＭＥＴ、エンドシアリン、ＥｐＣＡＭ、ＩＧＦ−１Ｒ、またはＦＡＰαのそれぞれ）に結合しうる。
【０１２６】
本発明の二重特異性単鎖抗体分子、例えば、本明細書で定義される二重特異性単鎖抗体の第２の結合ドメインを作製するには、ＰＳＣＡ（ＣＤ１９、Ｃ−ＭＥＴ、エンドシアリン、ＥｐＣＡＭ、ＩＧＦ−１Ｒ、またはＦＡＰαのそれぞれ）など、ヒト、および／または非チンパンジー霊長動物それぞれの細胞表面抗原の両方に結合するモノクローナル抗体を用いることができる。本明細書で定義される二重特異性ポリペプチドに適切な結合ドメインは、例えば、当技術分野で説明される組換え法による、異種間特異的モノクローナル抗体に由来しうる。上記の通り、ヒト細胞表面抗原、また、非チンパンジー霊長動物における前記細胞表面抗原の相同体に結合するモノクローナル抗体は、ＦＡＣＳアッセイにより調べることができる。異種間特異的抗体はまた、文献（ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＫｏｅｈｌｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６（１９７５）、４９５〜７）で説明されるハイブリドーマ法によっても作製することができる。例えば、代替的に、ＰＳＣＡ（ＣＤ１９、Ｃ−ＭＥＴ、エンドシアリン、ＥｐＣＡＭ、ＩＧＦ−１Ｒ、またはＦＡＰαのそれぞれ）など、ヒト、および非チンパンジー霊長動物の細胞表面抗原によりマウスを免疫化することもできる。上記の通り、これらのマウスから、ハイブリドーマ法により異種間特異的抗体を生成するハイブリドーマ細胞を単離し、ＦＡＣＳにより解析する。本明細書で説明される異種間特異性を示す二重特異性単鎖抗体などの二重特異性ポリペプチドの作製および解析については、以下の実施例に示す。異種間特異性を示す二重特異性単鎖抗体の利点には、本明細書で列挙される点が含まれる。
【０１２７】
本発明の二重特異性単鎖抗体分子には、ヒト、および非チンパンジー霊長動物のＣＤ３ε鎖エピトープに結合することが可能な第１の結合ドメインが、
（ａ）配列番号２７に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号２８に示されるＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号２９に示されるＣＤＲ−Ｌ３と；
（ｂ）配列番号１１７に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１１８に示されるＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号１１９に示されるＣＤＲ−Ｌ３と；
（ｃ）配列番号１５３に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１５４に示されるＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号１５５に示されるＣＤＲ−Ｌ３と
から選択されるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬ領域を含むことが特に好ましい。
【０１２８】
当技術分野において、可変領域、すなわち、可変軽鎖（「Ｌ」鎖または「ＶＬ」鎖）および可変重鎖（「Ｈ」鎖または「ＶＨ」鎖）は、抗体の結合ドメインをもたらすと理解されている。これらの可変領域は、相補性決定領域を保有する。当技術分野において、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）という用語は、抗体の抗原特異性を決定することがよく知られている。「ＣＤＲ−Ｌ」または「Ｌ  ＣＤＲ」または「ＬＣＤＲ」という用語が、ＶＬにおけるＣＤＲを指すのに対し、「ＣＤＲ−Ｈ」または「Ｈ  ＣＤＲ」または「ＨＣＤＲ」という用語は、ＶＨにおけるＣＤＲを指す。
【０１２９】
本発明の二重特異性単鎖抗体分子の代替的に好ましい実施形態では、ヒト、および非チンパンジー霊長動物のＣＤ３ε鎖エピトープに結合することが可能な第１の結合ドメインが、
（ａ）配列番号１２に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１３に示されるＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号１４に示されるＣＤＲ−Ｈ３と；
（ｂ）配列番号３０に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３１に示されるＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３２に示されるＣＤＲ−Ｈ３と；
（ｃ）配列番号４８に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４９に示されるＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号５０に示されるＣＤＲ−Ｈ３２と；
（ｄ）配列番号６６に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号６７に示されるＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号６８に示されるＣＤＲ−Ｈ３と；
（ｅ）配列番号８４に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号８５に示されるＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号８６に示されるＣＤＲ−Ｈ３と；
（ｆ）配列番号１０２に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１０３に示されるＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号１０４に示されるＣＤＲ−Ｈ３と；
（ｇ）配列番号１２０に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１２１に示されるＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号１２２に示されるＣＤＲ−Ｈ３と；
（ｈ）配列番号１３８に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１３９に示されるＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号１４０に示されるＣＤＲ−Ｈ３と；
（ｉ）配列番号１５６に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１５７に示されるＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号１５８に示されるＣＤＲ−Ｈ３と；
（ｊ）配列番号１７４に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１７５に示されるＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号１７６に示されるＣＤＲ−Ｈ３と
から選択されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ領域を含む。
【０１３０】
ヒト、および非チンパンジー霊長動物のＣＤ３ε鎖エピトープに結合することが可能な結合ドメインは、配列番号３５、３９、１２５、１２９、１６１、または１６５に示されるＶＬ領域からなる群から選択されるＶＬ領域を含むことがさらに好ましい。
【０１３１】
ヒト、および非チンパンジー霊長動物のＣＤ３ε鎖エピトープに結合することが可能な第１の結合ドメインは、配列番号１５、１９、３３、３７、５１、５５、６９、７３、８７、９１、１０５、１０９、１２３、１２７、１４１、１４５、１５９、１６３、１７７、または１８１に示されるＶＨ領域からなる群から選択されるＶＨ領域を含むことが代替的に好ましい。
【０１３２】
本発明の二重特異性単鎖抗体分子は、
（ａ）配列番号１７または２１に示されるＶＬ領域、および配列番号１５または１９に示されるＶＨ領域と；
（ｂ）配列番号３５または３９に示されるＶＬ領域、および配列番号３３または３７に示されるＶＨ領域と；
（ｃ）配列番号５３または５７に示されるＶＬ領域、および配列番号５１または５５に示されるＶＨ領域と；
（ｄ）配列番号７１または７５に示されるＶＬ領域、および配列番号６９または７３に示されるＶＨ領域と；
（ｅ）配列番号８９または９３に示されるＶＬ領域、および配列番号８７または９１に示されるＶＨ領域と；
（ｆ）配列番号１０７または１１１に示されるＶＬ領域、および配列番号１０５または１０９に示されるＶＨ領域と；
（ｇ）配列番号１２５または１２９に示されるＶＬ領域、および配列番号１２３または１２７に示されるＶＨ領域と；
（ｈ）配列番号１４３または１４７に示されるＶＬ領域、および配列番号１４１または１４５に示されるＶＨ領域と；
（ｉ）配列番号１６１または１６５に示されるＶＬ領域、および配列番号１５９または１６３に示されるＶＨ領域と；
（ｊ）配列番号１７９または１８３に示されるＶＬ領域、および配列番号１７７または１８１に示されるＶＨ領域と
からなる群から選択されるＶＬ領域およびＶＨ領域を含む、ヒト、および非チンパンジー霊長動物のＣＤ３ε鎖エピトープに結合することが可能な第１の結合ドメインを特徴とすることがより好ましい。
【０１３３】
本発明の二重特異性単鎖抗体分子の好ましい実施形態によれば、ＣＤ３イプシロンに結合する第１の結合ドメイン内におけるＶＨ領域およびＶＬ領域の対は、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）のフォーマットである。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨの順序に並べられる。ＶＨ領域は、リンカー配列に対してＮ末端側に位置することが好ましい。ＶＬ領域は、リンカー配列に対してＣ末端側に位置することが好ましい。言い換えれば、本発明の二重特異性単鎖抗体分子のＣＤ３結合ドメインにおけるドメイン配列はＶＨ−ＶＬであることが好ましく、前記ＣＤ３結合ドメインは、第２の（ＰＳＣＡ、ＣＤ１９、Ｃ−ＭＥＴ、エンドシアリン、ＥｐＣＡＭ、ＩＧＦ−１Ｒ、またはＦＡＰαなど、細胞表面抗原の）結合ドメインに対してＣ末端側に位置する。該ＶＨ−ＶＬは、配列番号１８５を含むか、または配列番号１８５であることが好ましい。
【０１３４】
上記で説明した、本発明の二重特異性単鎖抗体分子の好ましい実施形態は、配列番号２３、２５、４１、４３、５９、６１、７７、７９、９５、９７、１１３、１１５、１３１、１３３、１４９、１５１、１６７、１６９、１８５、または１８７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ヒト、および非チンパンジー霊長動物のＣＤ３ε鎖エピトープに結合することが可能な第１の結合ドメインを特徴とする。
【０１３５】
本発明は、上記で説明した二重特異性単鎖抗体であって、第２の結合ドメインが、細胞表面抗原であるＰＳＣＡ、ＣＤ１９、Ｃ−ＭＥＴ、エンドシアリン、ＥｐＣＡＭ、ＩＧＦ−１Ｒ、またはＦＡＰαに結合する抗体にさらに関する。
【０１３６】
ＰＳＣＡ×ＣＤ３
本発明の好ましい実施形態によれば、上記で特徴づけられた二重特異性単鎖抗体分子は、
ａ）配列番号３８２〜３８４のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号３７７〜３７９のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｂ）配列番号４００〜４０２のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号３９５〜３９７のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｃ）配列番号４１４〜４１６のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号４０９〜４１１のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｄ）配列番号４３２〜４３４のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号４２７〜４２９のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｅ）配列番号１２１５〜１２１７のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号１２２０〜１２２２のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｆ）配列番号１１８７〜１１８９のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号１１９２〜１１９４のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｇ）配列番号１１７３〜１１７５のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号１１７８〜１１８０のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｈ）配列番号１２２９〜１２３１のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号１２３４〜１２３６のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｉ）配列番号１２０１〜１２０３のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号１２０６〜１２０８のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｋ）配列番号１２５７〜１２５９のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号１２６２〜１２６４のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｌ）配列番号１２４３〜１２４５のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号１２４８〜１２５０のＣＤＲ  Ｌ１〜３と
からなる群から選択される配列群を、第２の結合ドメイン内におけるＣＤＲ  Ｈ１、ＣＤＲ  Ｈ２、ＣＤＲ  Ｈ３、ＣＤＲ  Ｌ１、ＣＤＲ  Ｌ２、およびＣＤＲ  Ｌ３として含む。
【０１３７】
本発明の二重特異性単鎖抗体分子の第２の結合ドメインに対応するＶＬ領域およびＶＨ領域の配列のほか、それぞれのｓｃＦｖ配列も配列表に示す。
【０１３８】
本発明の二重特異性単鎖抗体分子において、結合ドメインは、別記の実施例で例示する通り、ＶＬ−ＶＨ−ＶＨ−ＶＬ、ＶＬ−ＶＨ−ＶＬ−ＶＨ、ＶＨ−ＶＬ−ＶＨ−ＶＬ、またはＶＨ−ＶＬ−ＶＬ−ＶＨの順序に並べられる。結合ドメインは、ＶＨ  ＰＳＣＡ−ＶＬ  ＰＳＣＡ−ＶＨ  ＣＤ３−ＶＬ  ＣＤ３、またはＶＬ  ＰＳＣＡ−ＶＨ  ＰＳＣＡ−ＶＨ  ＣＤ３−ＶＬ  ＣＤ３の順序に並べられることが好ましい。
【０１３９】
本発明の特に好ましい実施形態は、上記で特徴づけられたポリペプチドに関し、該二重特異性単鎖抗体分子は、
（ａ）配列番号３８９、４２１、４３９、３９１、４０５、４２３、４４１、１２２６、１１９８、１１８４、１２４０、１２１２、１２６８、または１２５４のうちのいずれかに示されるアミノ酸配列と；
（ｂ）配列番号３９０、４２２、４４０、３９２、４０６、４２４、４４２、１２２７、１１９９、１１８５、１２４１、１２１３、１２６９、または１２５５のうちのいずれかに示される核酸配列によりコードされるアミノ酸配列と；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％同一であり、より好ましくは少なくとも９５％同一であり、最も好ましくは少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列と
から選択される配列を含む。
【０１４０】
本発明は、配列番号３８９、４２１、４３９、３９１、４０５、４２３、４４１、１２２６、１１９８、１１８４、１２４０、１２１２、１２６８、または１２５４のうちのいずれかに示されるアミノ酸配列を含む二重特異性単鎖抗体分子のほか、配列番号３８９、４２１、４３９、３９１、４０５、４２３、４４１、１２２６、１１９８、１１８４、１２４０、１２１２、１２６８、または１２５４に記載のアミノ酸配列に対して、少なくとも８５％同一であり、好ましくは９０％、より好ましくは少なくとも９５％同一であり、最も好ましくは少なくとも９６、９７、９８、または９９％同一のアミノ酸配列にも関する。本発明はまた、配列番号３９０、４２２、４４０、３９２、４０６、４２４、４４２、１２２７、１１９９、１１８５、１２４１、１２１３、１２６９、または１２５５のうちのいずれかに示される、対応する核酸配列のほか、配列番号３９０、４２２、４４０、３９２、４０６、４２４、４４２、１２２７、１１９９、１１８５、１２４１、１２１３、１２６９、または１２５５に示される核酸配列に対して、少なくとも８５％同一であり、好ましくは９０％、より好ましくは少なくとも９５％同一であり、最も好ましくは少なくとも９６、９７、９８、または９９％同一の核酸配列にも関する。配列同一性は、全ヌクレオチド配列または全アミノ酸配列にわたって決定されることを理解されたい。配列アライメントを行うには、例えば、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ  ５３７１１（１９９１））内に含有される、ＧａｐプログラムまたはＢｅｓｔＦｉｔプログラムを用いることができる（ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８（１９７０）、４４３〜４５３；ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ  ２（１９８１）、４８２〜４８９）。本発明の二重特異性単鎖抗体のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に対して、例えば、８５％（９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の配列同一性を有するヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を決定および同定することは、当業者にとって日常的な方法である。例えば、クリックのゆらぎ仮説によるなら、アンチコドン上の５’塩基は、該他の２つの塩基ほど空間的に制約されておらず、したがって、非標準的な塩基対合を示しうるであろう。言い換えれば、コドントリプレット内の３位は、この３位を異にする２つのトリプレットが同じアミノ酸残基をコードしうるように変化しうる。前記仮説は、当業者によく知られている（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｗｏｂｂｌｅ＿Ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ；Ｃｒｉｃｋ、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９（１９６６）、５４８〜５５を参照されたい）。
【０１４１】
本発明のＰＳＣＡ×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体構築物において好ましいドメイン配列を、以下の実施例において示す。
【０１４２】
本発明の好ましい実施形態において、二重特異性単鎖抗体は、ＣＤ３イプシロンと、それらの第２の結合ドメインにより認識される、ヒト、および非チンパンジー霊長動物の細胞表面抗原であるＰＳＣＡとに対して異種間特異的である。
【０１４３】
ＣＤ１９×ＣＤ３
本発明の代替的に好ましい実施形態によれば、上記で特徴づけられた二重特異性単鎖抗体分子は、
ａ）配列番号４７８〜４８０のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号４７３〜４７５のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｂ）配列番号５３０〜５３２のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号５２５〜５２７のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｃ）配列番号５１８〜５２０のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号５１３〜５１５のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｄ）配列番号５０６〜５０８のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号５０１〜５０３のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｅ）配列番号４９４〜４９６のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号４８９〜４９１のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｆ）配列番号５４２〜５４４のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号５３７〜５３９のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｇ）配列番号５５４〜５５６のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号５４９〜５５１のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｈ）配列番号５６６〜５６８のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号５６１〜５６３のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｉ）配列番号５７８〜５８０のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号５７３〜５７５のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｊ）配列番号５９０〜５９２のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号５８５〜５８７のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｋ）配列番号６０２〜６０４のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号５９７〜５９９のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｌ）配列番号６１４〜６１６のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号６０９〜６１１のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｍ）配列番号６２６〜６２８のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号６２１〜６２３のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｎ）配列番号６３８〜６４０のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号６３３〜６３５のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｏ）配列番号６５０〜６５２のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号６４５〜６４７のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｐ）配列番号６６２〜６６４のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号６５７〜６５９のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｑ）配列番号６７４〜６７６のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号６６９〜６７１のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｒ）配列番号６８６〜６８８のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号６８１〜６８３のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｓ）配列番号６９８〜７００のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号６９３〜６９５のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｔ）配列番号７１０〜７１２のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号７０５〜７０７のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｕ）配列番号７２２〜７２４のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号７１７〜７１９のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｖ）配列番号７３４〜７３６のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号７２９〜７３１のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｗ）配列番号７４６〜７４８のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号７４１〜７４３のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｘ）配列番号７５８〜７６０のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号７５３〜７５５のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｙ）配列番号１２７１〜１２７３のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号１２７６〜１２７８のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｚ）配列番号１２８５〜１２８７のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号１２９０〜１２９２のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ａａ）配列番号１２９９〜１３０１のＣＤＲ Ｈ１〜３、および配列番号１３０４〜１３０６のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ａｂ）配列番号１３１３〜１３１５のＣＤＲ Ｈ１〜３、および配列番号１３１８〜１３２０のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ａｃ）配列番号１３２７〜１３２９のＣＤＲ Ｈ１〜３、および配列番号１３３２〜１３３４のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ａｄ）配列番号１３４１〜１３４３のＣＤＲ Ｈ１〜３、および配列番号１３４６〜１３４８のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ａｅ）配列番号１３５５〜１３５７のＣＤＲ Ｈ１〜３、および配列番号１３６０〜１３６２のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ａｆ）配列番号１３６９〜１３７１のＣＤＲ Ｈ１〜３、および配列番号１３７４〜１３７６のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ａｇ）配列番号１３８３〜１３８５のＣＤＲ Ｈ１〜３、および配列番号１３８８〜１３９０のＣＤＲ  Ｌ１〜３と
からなる群から選択される配列群を、第２の結合ドメイン内におけるＣＤＲ  Ｈ１、ＣＤＲ  Ｈ２、ＣＤＲ  Ｈ３、ＣＤＲ  Ｌ１、ＣＤＲ  Ｌ２、およびＣＤＲ  Ｌ３として含む。
【０１４４】
配列表には、本発明の二重特異性単鎖抗体分子の第２の結合ドメインに対応するＶＬ領域およびＶＨ領域の配列のほか、それぞれのｓｃＦｖ配列も示す。
【０１４５】
本発明の二重特異性単鎖抗体分子において、結合ドメインは、別記の実施例で例示する通り、ＶＬ−ＶＨ−ＶＨ−ＶＬ、ＶＬ−ＶＨ−ＶＬ−ＶＨ、ＶＨ−ＶＬ−ＶＨ−ＶＬ、またはＶＨ−ＶＬ−ＶＬ−ＶＨの順序に並べられる。結合ドメインは、ＶＨ  ＣＤ１９−ＶＬ  ＣＤ１９−ＶＨ  ＣＤ３−ＶＬ  ＣＤ３、またはＶＬ  ＣＤ１９−ＶＨ  ＰＳＣＡ−ＶＨ  ＣＤ３−ＶＬ  ＣＤ３の順序に並べられることが好ましい。結合ドメインは、ＶＬＣＤ１９−ＶＨ  ＣＤ１９−ＶＨ  ＣＤ３−ＶＬ  ＣＤ３の順序に並べられることがより好ましい。
【０１４６】
本発明の特に好ましい実施形態は、上記で特徴づけられたポリペプチドに関し、該二重特異性単鎖抗体分子は、
（ａ）配列番号４８１、４８５、４８３、５３３、５２１、５０９、４９７、５４５、５５７、５６９、５８１、５９３、６０５、６１７、６２９、６４１、６５３、６６５、６７７、６８９、７０１、７１３、７２５、７３７、７４９、７６１、１２８２、１２９６、１３１０、１３２４、１３３８、１３５２、１３６６、１３８０、または１３９４のうちのいずれかに示されるアミノ酸配列と；
（ｂ）配列番号４８２、４８６、４８４、５３４、５２２、５１０、４９８、５４６、５５８、５７０、５８２、５９４、６０６、６１８、６３０、６４２、６５４、６６６、６７８、６９０、７０２、７１４、７２６、７３８、７５０、７６２、１２８３、１２９７、１３１１、１３２５、１３３９、１３５３、１３６７、１３８１、または１３９５のうちのいずれかに示される核酸配列によりコードされるアミノ酸配列と；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％同一であり、より好ましくは少なくとも９５％同一であり、最も好ましくは少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列と
から選択される配列を含む。
【０１４７】
本発明は、配列番号４８１、４８５、４８３、５３３、５２１、５０９、４９７、５４５、５５７、５６９、５８１、５９３、６０５、６１７、６２９、６４１、６５３、６６５、６７７、６８９、７０１、７１３、７２５、７３７、７４９、７６１、１２８２、１２９６、１３１０、１３２４、１３３８、１３５２、１３６６、１３８０、または１３９４のうちのいずれかに示されるアミノ酸配列を含む二重特異性単鎖抗体分子のほか、配列番号４８１、４８５、４８３、５３３、５２１、５０９、４９７、５４５、５５７、５６９、５８１、５９３、６０５、６１７、６２９、６４１、６５３、６６５、６７７、６８９、７０１、７１３、７２５、７３７、７４９、７６１、１２８２、１２９６、１３１０、１３２４、１３３８、１３５２、１３６６、１３８０、または１３９４に記載のアミノ酸配列に対して、少なくとも８５％同一であり、好ましくは９０％、より好ましくは少なくとも９５％同一であり、最も好ましくは少なくとも９６、９７、９８、または９９％同一のアミノ酸配列にも関する。本発明はまた、配列番号４８２、４８６、４８４、５３４、５２２、５１０、４９８、５４６、５５８、５７０、５８２、５９４、６０６、６１８、６３０、６４２、６５４、６６６、６７８、６９０、７０２、７１４、７２６、７３８、７５０、７６２、１２８３、１２９７、１３１１、１３２５、１３３９、１３５３、１３６７、１３８１、または１３９５のうちのいずれかに示される、対応する核酸配列のほか、配列番号４８２、４８６、４８４、５３４、５２２、５１０、４９８、５４６、５５８、５７０、５８２、５９４、６０６、６１８、６３０、６４２、６５４、６６６、６７８、６９０、７０２、７１４、７２６、７３８、７５０、７６２、１２８３、１２９７、１３１１、１３２５、１３３９、１３５３、１３６７、１３８１、または１３９５に示される核酸配列に対して、少なくとも８５％同一であり、好ましくは９０％、より好ましくは少なくとも９５％同一であり、最も好ましくは少なくとも９６、９７、９８、または９９％同一の核酸配列にも関する。配列同一性は、全ヌクレオチド配列または全アミノ酸配列にわたって決定されることを理解されたい。配列アライメントを行うには、例えば、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ  ５３７１１（１９９１））内に含有される、ＧａｐプログラムまたはＢｅｓｔＦｉｔプログラムを用いることができる（ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８（１９７０）、４４３〜４５３；ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ  ２（１９８１）、４８２〜４８９）。本発明の二重特異性単鎖抗体のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に対して、例えば、８５％（９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の配列同一性を有するヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を決定および同定することは、当業者にとって日常的な方法である。例えば、クリックのゆらぎ仮説によるなら、アンチコドン上の５’塩基は、該他の２つの塩基ほど空間的に制約されておらず、したがって、非標準的な塩基対合を示しうるであろう。言い換えれば、コドントリプレット内の３位は、この３位を異にする２つのトリプレットが同じアミノ酸残基をコードしうるように変化しうる。前記仮説は、当業者によく知られている（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｗｏｂｂｌｅ＿Ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ；Ｃｒｉｃｋ、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９（１９６６）、５４８〜５５を参照されたい）。
【０１４８】
本発明のＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体構築物において好ましいドメイン配列を、以下の実施例において示す。
【０１４９】
本発明の好ましい実施形態において、二重特異性単鎖抗体は、ＣＤ３イプシロンと、それらの第２の結合ドメインにより認識される、ヒト、および非チンパンジー霊長動物の細胞表面抗原であるＣＤ１９とに対して異種間特異的である。
【０１５０】
ｃ−ＭＥＴ×ＣＤ３
本発明の好ましい実施形態によれば、上記で特徴づけられた二重特異性単鎖抗体分子は、
ａ）配列番号８２１〜８２３のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号８１６〜８１８のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｂ）配列番号８３６〜８３８のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号８３３〜８３５のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｃ）配列番号８４５〜８４７のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号８４０〜８４２のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｄ）配列番号８６３〜８６５のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号８５８〜８６０のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｅ）配列番号８８１〜８８３のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号８７６〜８７８のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｆ）配列番号８９９〜９０１のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号８９４〜８９６のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｇ）配列番号１４０１〜１４０３のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号１４０６〜１４０８のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｈ）配列番号１４１５〜１４１７のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号１４２０〜１４２２のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｉ）配列番号１４２９〜１４３１のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号１４３４〜１４３６のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｊ）配列番号１４４３〜１４４５のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号１４４８〜１４５０のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｋ）配列番号１４５７〜１４５９のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号１４６２〜１４６４のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｌ）配列番号１４７１〜１４７３のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号１４７６〜１４７８のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｍ）配列番号１６３９〜１６４１のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号１６４４〜１６４６のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｎ）配列番号１６２５〜１６２７のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号１６３０〜１６３２のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｏ）配列番号１６１１〜１６１３のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号１６１６〜１６１８のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｐ）配列番号１５９７〜１５９９のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号１６０２〜１６０４のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｑ）配列番号１５６９〜１５７１のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号１５７４〜１５７６のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｒ）配列番号１５５５〜１５５７のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号１５６０〜１５６２のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｓ）配列番号１５８３〜１５８５のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号１５８８〜１５９０のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｔ）配列番号１５４１〜１５４３のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号１５４６〜１５４８のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｕ）配列番号１５１３〜１５１５のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号１５１８〜１５２０のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｖ）配列番号１５２７〜１５２９のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号１５３２〜１５３４のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｗ）配列番号１４９９〜１５０１のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号１５０４〜１５０６のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｘ）配列番号１４８５〜１４８７のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号１４９０〜１４９２のＣＤＲ  Ｌ１〜３と
からなる群から選択される配列群を、第２の結合ドメイン内におけるＣＤＲ  Ｈ１、ＣＤＲ  Ｈ２、ＣＤＲ  Ｈ３、ＣＤＲ  Ｌ１、ＣＤＲ  Ｌ２、およびＣＤＲ  Ｌ３として含む。
【０１５１】
配列表には、本発明の二重特異性単鎖抗体分子の第２の結合ドメインに対応するＶＬ領域およびＶＨ領域の配列のほか、それぞれのｓｃＦｖ配列も示す。
【０１５２】
本発明の二重特異性単鎖抗体分子において、結合ドメインは、別記の実施例で例示する通り、ＶＬ−ＶＨ−ＶＨ−ＶＬ、ＶＬ−ＶＨ−ＶＬ−ＶＨ、ＶＨ−ＶＬ−ＶＨ−ＶＬ、またはＶＨ−ＶＬ−ＶＬ−ＶＨの順序に並べられる。結合ドメインは、ＶＨ  Ｃ−ＭＥＴ−ＶＬ  Ｃ−ＭＥＴ−ＶＨ  ＣＤ３−ＶＬ  ＣＤ３、またはＶＬ  Ｃ−ＭＥＴ−ＶＨ  Ｃ−ＭＥＴ−ＶＨ  ＣＤ３−ＶＬ  ＣＤ３の順序に並べられることが好ましい。
【０１５３】
本発明の特に好ましい実施形態は、上記で特徴づけられたポリペプチドに関し、該二重特異性単鎖抗体分子は、
（ａ）配列番号８２９、８５３、８７１、８８９、８３１、８５５、８７３、８９１、９０５、１４１２、１４２６、１４４０、１４５４、１４６８、または１４８２のうちのいずれかに示されるアミノ酸配列と；
（ｂ）配列番号８３０、８５４、８７２、８９０、８３２、８５６、８７４、８９２、９０６、１４１３、１４２７、１４４１、１４５５、１４６９、または１４８３のうちのいずれかに示される核酸配列によりコードされるアミノ酸配列と；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％同一であり、より好ましくは少なくとも９５％同一であり、最も好ましくは少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列と
から選択される配列を含む。
【０１５４】
本発明は、配列番号８２９、８５３、８７１、８８９、８３１、８５５、８７３、８９１、９０５、１４１２、１４２６、１４４０、１４５４、１４６８、または１４８２のうちのいずれかに示されるアミノ酸配列を含む二重特異性単鎖抗体分子のほか、配列番号８２９、８５３、８７１、８８９、８３１、８５５、８７３、８９１、９０５、１４１２、１４２６、１４４０、１４５４、１４６８、または１４８２に記載のアミノ酸配列に対して、少なくとも８５％同一であり、好ましくは９０％、より好ましくは少なくとも９５％同一であり、最も好ましくは少なくとも９６、９７、９８、または９９％同一のアミノ酸配列にも関する。本発明はまた、配列番号８３０、８５４、８７２、８９０、８３２、８５６、８７４、８９２、９０６、１４１３、１４２７、１４４１、１４５５、１４６９、または１４８３のうちのいずれかに示される、対応する核酸配列のほか、配列番号８３０、８５４、８７２、８９０、８３２、８５６、８７４、８９２、９０６、１４１３、１４２７、１４４１、１４５５、１４６９、または１４８３に示される核酸配列に対して、少なくとも８５％同一であり、好ましくは９０％、より好ましくは少なくとも９５％同一であり、最も好ましくは少なくとも９６、９７、９８、または９９％同一の核酸配列にも関する。配列同一性は、全ヌクレオチド配列または全アミノ酸配列にわたって決定されることを理解されたい。配列アライメントを行うには、例えば、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ  ５３７１１（１９９１））内に含有される、ＧａｐプログラムまたはＢｅｓｔＦｉｔプログラムを用いることができる（ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８（１９７０）、４４３〜４５３；ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ  ２（１９８１）、４８２〜４８９）。本発明の二重特異性単鎖抗体のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に対して、例えば、８５％（９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の配列同一性を有するヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を決定および同定することは、当業者にとって日常的な方法である。例えば、クリックのゆらぎ仮説によるなら、アンチコドン上の５’塩基は、該他の２つの塩基ほど空間的に制約されておらず、したがって、非標準的な塩基対合を示しうるであろう。言い換えれば、コドントリプレット内の３位は、この３位を異にする２つのトリプレットが同じアミノ酸残基をコードしうるように変化しうる。前記仮説は、当業者によく知られている（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｗｏｂｂｌｅ＿Ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ；Ｃｒｉｃｋ、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９（１９６６）、５４８〜５５を参照されたい）。
【０１５５】
本発明のＣ−ＭＥＴ×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体構築物において好ましいドメイン配列を、以下の実施例において示す。
【０１５６】
本発明の好ましい実施形態において、二重特異性単鎖抗体は、ＣＤ３イプシロンと、それらの第２の結合ドメインにより認識される、ヒト、および非チンパンジー霊長動物の細胞表面抗原であるＣ−ＭＥＴとに対して異種間特異的である。
【０１５７】
エンドシアリン×ＣＤ３
本発明の好ましい実施形態によれば、上記で特徴づけられた二重特異性単鎖抗体分子は、
配列番号９１０〜９１２のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号９０７〜９０９のＣＤＲＬ１〜３
からなる群から選択される配列群を、第２の結合ドメイン内におけるＣＤＲ  Ｈ１、ＣＤＲ  Ｈ２、ＣＤＲ  Ｈ３、ＣＤＲ  Ｌ１、ＣＤＲ  Ｌ２、およびＣＤＲ  Ｌ３として含む。
【０１５８】
第２の結合ドメインのこれらの重鎖ＣＤＲ配列および軽鎖ＣＤＲ配列から出発して、当業者は、さらなる発明の苦労なしに、本発明の二重特異性単鎖抗体分子を作製することができる。特に、ＣＤＲ配列は、ＶＬ鎖およびＶＨ鎖のフレームワーク内に配置し、ｓｃＦｖ形態に並べることができる。
【０１５９】
本発明の好ましい実施形態によれば、上記で特徴づけられた二重特異性単鎖抗体分子は、
ａ）配列番号１６５３〜１６５５のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号１６５８〜１６６０のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｂ）配列番号１６６７〜１６６９のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号１６７２〜１６７４のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｃ）配列番号１６８１〜１６８３のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号１６８６〜１６８８のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｄ）配列番号１６９５〜１６９７のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号１７００〜１７０２のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｅ）配列番号１７０９〜１７１１のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号１７１４〜１７１６のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｆ）配列番号１７２３〜１７２５のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号１７２８〜１７３０のＣＤＲ  Ｌ１〜３と
からなる群から選択される配列群を、第２の結合ドメイン内におけるＣＤＲ  Ｈ１、ＣＤＲ  Ｈ２、ＣＤＲ  Ｈ３、ＣＤＲ  Ｌ１、ＣＤＲ  Ｌ２、およびＣＤＲ  Ｌ３として含む。
【０１６０】
本発明の二重特異性単鎖抗体分子において、結合ドメインは、別記の実施例で例示する通り、ＶＬ−ＶＨ−ＶＨ−ＶＬ、ＶＬ−ＶＨ−ＶＬ−ＶＨ、ＶＨ−ＶＬ−ＶＨ−ＶＬ、またはＶＨ−ＶＬ−ＶＬ−ＶＨの順序に並べられる。結合ドメインは、ＶＨエンドシアリン−ＶＬエンドシアリン−ＶＨ  ＣＤ３−ＶＬ  ＣＤ３、またはＶＬエンドシアリン−ＶＨエンドシアリン−ＶＨ  ＣＤ３−ＶＬ  ＣＤ３の順序に並べられることが好ましい。
【０１６１】
本発明の特に好ましい実施形態は、上記で特徴づけられたポリペプチドに関し、該二重特異性単鎖抗体分子は、ヒト、および非チンパンジー霊長動物のＣＤ３ε鎖エピトープに結合することが可能な上記で特徴づけられた第１の結合ドメインと、エンドシアリンに結合することが可能であり、配列番号９１０〜９１２のＣＤＲ  Ｈ１、２、および３、ならびに配列番号９０７〜９０９のＣＤＲ  Ｌ１、２、および３、または上記で定義されたＣＤＲそれぞれのアミノ酸配列の各々に対して少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％同一であり、より好ましくは少なくとも９５％同一であり、最も好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％同一なＣＤＲアミノ酸配列を含む第２の結合ドメインとを含む。配列同一性は、全ＣＤＲＨアミノ酸配列または全ＣＤＲＬのアミノ酸配列にわたって決定されることを理解されたい。
【０１６２】
本発明の特に好ましい実施形態は、上記で特徴づけられたポリペプチドに関し、該二重特異性単鎖抗体分子は、
（ａ）配列番号１６６４、１６７８、１６９２、１７０６、１７２０、または１７３４のうちのいずれかに示されるアミノ酸配列と；
（ｂ）配列番号１６６５、１６７９、１６９３、１７０７、１７２１、または１７３５のうちのいずれかに示される核酸配列によりコードされるアミノ酸配列と；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％同一であり、より好ましくは少なくとも９５％同一であり、最も好ましくは少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列と
から選択される配列を含む。
【０１６３】
本発明は、配列番号１６６４、１６７８、１６９２、１７０６、１７２０、または１７３４のうちのいずれかに示されるアミノ酸配列を含む二重特異性単鎖抗体分子のほか、配列番号１６６４、１６７８、１６９２、１７０６、１７２０、または１７３４に記載のアミノ酸配列に対して、少なくとも８５％同一であり、好ましくは９０％、より好ましくは少なくとも９５％同一であり、最も好ましくは少なくとも９６、９７、９８、または９９％同一のアミノ酸配列にも関する。本発明はまた、配列番号１６６５、１６７９、１６９３、１７０７、１７２１、または１７３５のうちのいずれかに示される、対応する核酸配列のほか、配列番号１６６５、１６７９、１６９３、１７０７、１７２１、または１７３５に示される核酸配列に対して、少なくとも８５％同一であり、好ましくは９０％、より好ましくは少なくとも９５％同一であり、最も好ましくは少なくとも９６、９７、９８、または９９％同一の核酸配列にも関する。
【０１６４】
他に示されなければ、配列同一性は、全ヌクレオチド配列または全アミノ酸配列にわたって決定されることを理解されたい。配列アライメントを行うには、例えば、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ  ５３７１１（１９９１））内に含有される、ＧａｐプログラムまたはＢｅｓｔＦｉｔプログラムを用いることができる（ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８（１９７０）、４４３〜４５３；ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ  ２（１９８１）、４８２〜４８９）。本発明の二重特異性単鎖抗体のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列またはＣＤＲ配列に対して、例えば、５０％（６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の配列同一性を有するヌクレオチド配列またはアミノ酸配列またはＣＤＲ配列を決定および同定することは、当業者にとって日常的な方法である。例えば、クリックのゆらぎ仮説によるなら、アンチコドン上の５’塩基は、該他の２つの塩基ほど空間的に制約されておらず、したがって、非標準的な塩基対合を示しうるであろう。言い換えれば、コドントリプレット内の３位は、この３位を異にする２つのトリプレットが同じアミノ酸残基をコードしうるように変化しうる。前記仮説は、当業者によく知られている（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｗｏｂｂｌｅ＿Ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ；Ｃｒｉｃｋ、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９（１９６６）、５４８〜５５を参照されたい）。
【０１６５】
本発明のエンドシアリン×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体構築物において好ましいドメイン配列を、以下の実施例において示す。
【０１６６】
本発明の好ましい実施形態において、二重特異性単鎖抗体は、ＣＤ３イプシロンと、それらの第２の結合ドメインにより認識される、ヒト、および非チンパンジー霊長動物の細胞表面抗原であるエンドシアリンとに対して異種間特異的である。
【０１６７】
ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３
本発明の好ましい実施形態によれば、上記で特徴づけられた二重特異性単鎖抗体分子は、
ａ）配列番号９４０〜９４２のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号９３５〜９３７のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｂ）配列番号９５６〜９５８のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号９５１〜９５３のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｃ）配列番号９６８〜９７０のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号９６３〜９６５のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｄ）配列番号９８０〜９８２のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号９７５〜９７７のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｅ）配列番号９９２〜９９４のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号９８７〜９８９のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｆ）配列番号１００４〜１００６のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号９９９〜１００１のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｇ）配列番号１０２８〜１０３０のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号１０２３〜１０２５のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｈ）配列番号１０４０〜１０４２のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号１０３５〜１０３７のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｉ）配列番号１０５２〜１０５４のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号１０４７〜１０４９のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｊ）配列番号１０７４〜１０７６のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号１０６９〜１０７１のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｋ）配列番号１０８６〜１０８８のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号１０８１〜１０８３のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｌ）配列番号１０９８〜１０００のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号１０９３〜１０９５のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｍ）配列番号１１１０〜１１１２のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号１１０５〜１１０７のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｎ）配列番号１１２２〜１１２４のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号１１１７〜１１１９のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｏ）配列番号１０１６〜１０１８のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号１０１１〜１０１３のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｐ）配列番号１７６５〜１７６７のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号１７７０〜１７７２のＣＤＲ  Ｌ１〜３と
からなる群から選択される配列群を、第２の結合ドメイン内におけるＣＤＲ  Ｈ１、ＣＤＲ  Ｈ２、ＣＤＲ  Ｈ３、ＣＤＲ  Ｌ１、ＣＤＲ  Ｌ２、およびＣＤＲ  Ｌ３として含む。
【０１６８】
配列表には、本発明の二重特異性単鎖抗体分子の第２の結合ドメインに対応するＶＬ領域およびＶＨ領域の配列のほか、それぞれのｓｃＦｖ配列も示す。
【０１６９】
本発明の二重特異性単鎖抗体分子において、結合ドメインは、別記の実施例で例示する通り、ＶＬ−ＶＨ−ＶＨ−ＶＬ、ＶＬ−ＶＨ−ＶＬ−ＶＨ、ＶＨ−ＶＬ−ＶＨ−ＶＬ、またはＶＨ−ＶＬ−ＶＬ−ＶＨの順序に並べられる。結合ドメインは、ＶＨ  ＥｐＣＡＭ−ＶＬ  ＥｐＣＡＭ−ＶＨ  ＣＤ３−ＶＬ  ＣＤ３、またはＶＬ  ＥｐＣＡＭ−ＶＨ  ＥｐＣＡＭ−ＶＨ  ＣＤ３−ＶＬ  ＣＤ３の順序に並べられることが好ましい。結合ドメインは、ＶＬ  ＥｐＣＡＭ−ＶＨ  ＥｐＣＡＭ−ＶＨ  ＣＤ３−ＶＬ  ＣＤ３の順序に並べられることがより好ましい。
【０１７０】
本発明の特に好ましい実施形態は、上記で特徴づけられたポリペプチドに関し、該二重特異性単鎖抗体分子は、
（ａ）配列番号９４４、９４８、９４６、９６０、９７２、９８４、９９６、１００８、１０３２、１０４４、１０５６、１０７８、１０９０、１１０２、１１１４、１１２６、１０２０、または１７７６のうちのいずれかに示されるアミノ酸配列と；
（ｂ）配列番号９４５、９４９、９４７、９６１、９７３、９８５、９７９、１００９、１０３３、１０４５、１０５７、１０７９、１０９１、１１０３、１１１５、１１２７、１０２１、または１７７７のうちのいずれかに示される核酸配列によりコードされるアミノ酸配列と；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％同一であり、より好ましくは少なくとも９５％同一であり、最も好ましくは少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列と
から選択される配列を含む。
【０１７１】
本発明は、配列番号９４４、９４８、９４６、９６０、９７２、９８４、９９６、１００８、１０３２、１０４４、１０５６、１０７８、１０９０、１１０２、１１１４、１１２６、１０２０、または１７７６のうちのいずれかに示されるアミノ酸配列を含む二重特異性単鎖抗体分子のほか、配列番号９４４、９４８、９４６、９６０、９７２、９８４、９９６、１００８、１０３２、１０４４、１０５６、１０７８、１０９０、１１０２、１１１４、１１２６、１０２０、または１７７６に記載のアミノ酸配列に対して、少なくとも８５％同一であり、好ましくは９０％、より好ましくは少なくとも９５％同一であり、最も好ましくは少なくとも９６、９７、９８、または９９％同一のアミノ酸配列にも関する。本発明はまた、配列番号９４５、９４９、９４７、９６１、９７３、９８５、９７９、１００９、１０３３、１０４５、１０５７、１０７９、１０９１、１１０３、１１１５、１１２７、１０２１、または１７７７のうちのいずれかに示される、対応する核酸配列のほか、配列番号９４５、９４９、９４７、９６１、９７３、９８５、９７９、１００９、１０３３、１０４５、１０５７、１０７９、１０９１、１１０３、１１１５、１１２７、１０２１、または１７７７に示される核酸配列に対して、少なくとも８５％同一であり、好ましくは９０％、より好ましくは少なくとも９５％同一であり、最も好ましくは少なくとも９６、９７、９８、または９９％同一の核酸配列にも関する。配列同一性は、全ヌクレオチド配列または全アミノ酸配列にわたって決定されることを理解されたい。配列アライメントを行うには、例えば、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ  ５３７１１（１９９１））内に含有される、ＧａｐプログラムまたはＢｅｓｔＦｉｔプログラムを用いることができる（ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８（１９７０）、４４３〜４５３；ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ  ２（１９８１）、４８２〜４８９）。本発明の二重特異性単鎖抗体のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に対して、例えば、８５％（９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の配列同一性を有するヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を決定および同定することは、当業者にとって日常的な方法である。例えば、クリックのゆらぎ仮説によるなら、アンチコドン上の５’塩基は、該他の２つの塩基ほど空間的に制約されておらず、したがって、非標準的な塩基対合を示しうるであろう。言い換えれば、コドントリプレット内の３位は、この３位を異にする２つのトリプレットが同じアミノ酸残基をコードしうるように変化しうる。前記仮説は、当業者によく知られている（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｗｏｂｂｌｅ＿Ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ；Ｃｒｉｃｋ、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９（１９６６）、５４８〜５５を参照されたい）。
【０１７２】
本発明のＥｐＣＡＭ×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体構築物において好ましいドメイン配列を、以下の実施例において示す。
【０１７３】
本発明の好ましい実施形態において、二重特異性単鎖抗体は、ＣＤ３イプシロンと、それらの第２の結合ドメインにより認識される、ヒト、および非チンパンジー霊長動物の細胞表面抗原であるＥｐＣＡＭとに対して異種間特異的である。
【０１７４】
ＦＡＰα×ＣＤ３
本発明の好ましい実施形態によれば、上記で特徴づけられた二重特異性単鎖抗体分子は、
配列番号１１３７〜１１３９のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号１１３２〜１１３４のＣＤＲ  Ｌ１〜３
からなる群から選択される配列群を、第２の結合ドメイン内におけるＣＤＲ  Ｈ１、ＣＤＲ  Ｈ２、ＣＤＲ  Ｈ３、ＣＤＲ  Ｌ１、ＣＤＲ  Ｌ２、およびＣＤＲ  Ｌ３として含む。
【０１７５】
配列表には、本発明の二重特異性単鎖抗体分子の第２の結合ドメインに対応するＶＬ領域およびＶＨ領域の配列のほか、それぞれのｓｃＦｖ配列も示す。
【０１７６】
本発明の好ましい実施形態によれば、上記で特徴づけられた二重特異性単鎖抗体分子は、
ａ）配列番号１１３７〜１１３９のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号１１３２〜１１３４のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｂ）配列番号１８４９〜１８５１のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号１８５４〜１８５６のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｃ）配列番号１８３５〜１８３７のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号１８４０〜１８４２のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｄ）配列番号１７７９〜１７８１のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号１７８４〜１７８６のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｅ）配列番号１７９３〜１７９５のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号１７９８〜１８００のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｆ）配列番号１８６３〜１８６５のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号１８６８〜１８７０のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｇ）配列番号１８０７〜１８０９のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号１８１２〜１８１４のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｈ）配列番号１８２１〜１８２３のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号１８２６〜１８２８のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｉ）配列番号１８９１〜１８９３のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号１８９６〜１８９８のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｊ）配列番号１８７７〜１８７９のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号１８８２〜１８８４のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｋ）配列番号１９６１〜１９６３のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号１９６６〜１９６８のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｌ）配列番号１９４７〜１９４９のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号１９５２〜１９５４のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｍ）配列番号１９７５〜１９７７のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号１９８０〜１９８２のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｎ）配列番号１９３３〜１９３５のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号１９３８〜１９４０のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｏ）配列番号１９１９〜１９２１のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号１９２４〜１９２６のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｐ）配列番号１９０５〜１９０７のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号１９１０〜１９１２のＣＤＲ  Ｌ１〜３と
からなる群から選択される配列群を、第２の結合ドメイン内におけるＣＤＲ  Ｈ１、ＣＤＲ  Ｈ２、ＣＤＲ  Ｈ３、ＣＤＲ  Ｌ１、ＣＤＲ  Ｌ２、およびＣＤＲ  Ｌ３として含む。
【０１７７】
本発明の二重特異性単鎖抗体分子において、結合ドメインは、別記の実施例で例示する通り、ＶＬ−ＶＨ−ＶＨ−ＶＬ、ＶＬ−ＶＨ−ＶＬ−ＶＨ、ＶＨ−ＶＬ−ＶＨ−ＶＬ、またはＶＨ−ＶＬ−ＶＬ−ＶＨの順序に並べられる。結合ドメインは、ＶＨ  ＦＡＰアルファ−ＶＬ  ＦＡＰアルファ−ＶＨ  ＣＤ３−ＶＬ  ＣＤ３、またはＶＬ  ＦＡＰアルファ−ＶＨ  ＦＡＰアルファ−ＶＨ  ＣＤ３−ＶＬ  ＣＤ３の順序に並べられることが好ましい。結合ドメインは、ＶＬ  ＦＡＰアルファ−ＶＨ  ＦＡＰアルファ−ＶＨ  ＣＤ３−ＶＬ  ＣＤ３の順序に並べられることがより好ましい。
【０１７８】
本発明の特に好ましい実施形態は、上記で特徴づけられたポリペプチドに関し、該二重特異性単鎖抗体分子は、
（ａ）配列番号１１４３、１１４７、１１４５、１８６０、１８４６、１７９０、１８０４、１８７４、１８１８、または１８３２のうちのいずれかに示されるアミノ酸配列と；
（ｂ）配列番号１１４４、１１４８、１１４６、１８６１、１８４７、１７９１、１８０５、１８７５、１８１８、または１８３３のうちのいずれかに示される核酸配列によりコードされるアミノ酸配列と；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％同一であり、より好ましくは少なくとも９５％同一であり、最も好ましくは少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列と
から選択される配列を含む。
【０１７９】
本発明は、配列番号１１４３、１１４７、１１４５、１８６０、１８４６、１７９０、１８０４、１８７４、１８１８、または１８３２のうちのいずれかに示されるアミノ酸配列を含む二重特異性単鎖抗体分子のほか、配列番号１１４３、１１４７、１１４５、１８６０、１８４６、１７９０、１８０４、１８７４、１８１８、または１８３２に記載のアミノ酸配列に対して、少なくとも８５％同一であり、好ましくは９０％、より好ましくは少なくとも９５％同一であり、最も好ましくは少なくとも９６、９７、９８、または９９％同一のアミノ酸配列にも関する。本発明はまた、配列番号１１４４、１１４８、１１４６、１８６１、１８４７、１７９１、１８０５、１８７５、１８１８、または１８３３のうちのいずれかに示される、対応する核酸配列のほか、配列番号１１４４、１１４８、１１４６、１８６１、１８４７、１７９１、１８０５、１８７５、１８１８、または１８３３に示される核酸配列に対して、少なくとも８５％同一であり、好ましくは９０％、より好ましくは少なくとも９５％同一であり、最も好ましくは少なくとも９６、９７、９８、または９９％同一の核酸配列にも関する。配列同一性は、全ヌクレオチド配列または全アミノ酸配列にわたって決定されることを理解されたい。配列アライメントを行うには、例えば、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ  ５３７１１（１９９１））内に含有される、ＧａｐプログラムまたはＢｅｓｔＦｉｔプログラムを用いることができる（ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８（１９７０）、４４３〜４５３；ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ  ２（１９８１）、４８２〜４８９）。本発明の二重特異性単鎖抗体のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に対して、例えば、８５％（９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の配列同一性を有するヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を決定および同定することは、当業者にとって日常的な方法である。例えば、クリックのゆらぎ仮説によるなら、アンチコドン上の５’塩基は、該他の２つの塩基ほど空間的に制約されておらず、したがって、非標準的な塩基対合を示しうるであろう。言い換えれば、コドントリプレット内の３位は、この３位を異にする２つのトリプレットが同じアミノ酸残基をコードしうるように変化しうる。前記仮説は、当業者によく知られている（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｗｏｂｂｌｅ  Ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ；Ｃｒｉｃｋ、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９（１９６６）、５４８〜５５を参照されたい）。
【０１８０】
本発明のＦＡＰアルファ×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体構築物において好ましいドメイン配列を、以下の実施例において示す。
【０１８１】
本発明の好ましい実施形態において、二重特異性単鎖抗体は、ＣＤ３イプシロンと、それらの第２の結合ドメインにより認識される、ヒト、および非チンパンジー霊長動物の細胞表面抗原であるＦＡＰアルファとに対して異種間特異的である。
【０１８２】
ＩＧＦ−１Ｒ×ＣＤ３
本発明の好ましい実施形態によれば、上記で特徴づけられた二重特異性単鎖抗体分子は、
ａ）配列番号２０１６〜２０１８のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号２０２１〜２０２３のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｂ）配列番号２０３０〜２０３２のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号２０３５〜２０３７のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｃ）配列番号２０４４〜２０４６のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号２０４９〜２０５１のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｄ）配列番号２０５８〜２０６０のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号２０６３〜２０６５のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｅ）配列番号２０７２〜２０７４のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号２０７７〜２０７９のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｆ）配列番号２０８６〜２０８８のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号２０９１〜２０９３のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｇ）配列番号２１００〜２１０２のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号２１０５〜２１０７のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｈ）配列番号２１１４〜２１１６のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号２１１９〜２１２１のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｉ）配列番号２１２８〜２１３０のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号２１３３〜２１３５のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｊ）配列番号２１４２〜２１４４のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号２１４７〜２１４９のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｋ）配列番号２１５６〜２１５８のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号２１６１〜２１６３のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｌ）配列番号２１７０〜２１７２のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号２１７５〜２１７７のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｍ）配列番号２１８４〜２１８６のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号２１８９〜２１９１のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｎ）配列番号２１９８〜２２００のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号２２０３〜２２０５のＣＤＲ  Ｌ１〜３と；
ｏ）配列番号２２１２〜２２１４のＣＤＲ  Ｈ１〜３、および配列番号２２１７〜２２１９のＣＤＲ  Ｌ１〜３と
からなる群から選択される配列群を、第２の結合ドメイン内におけるＣＤＲ  Ｈ１、ＣＤＲ  Ｈ２、ＣＤＲ  Ｈ３、ＣＤＲ  Ｌ１、ＣＤＲ  Ｌ２、およびＣＤＲ  Ｌ３として含む。
【０１８３】
配列表には、本発明の二重特異性単鎖抗体分子の第２の結合ドメインに対応するＶＬ領域およびＶＨ領域の配列のほか、それぞれのｓｃＦｖ配列も示す。
【０１８４】
本発明の二重特異性単鎖抗体分子において、結合ドメインは、別記の実施例で例示する通り、ＶＬ−ＶＨ−ＶＨ−ＶＬ、ＶＬ−ＶＨ−ＶＬ−ＶＨ、ＶＨ−ＶＬ−ＶＨ−ＶＬ、またはＶＨ−ＶＬ−ＶＬ−ＶＨの順序に並べられる。結合ドメインは、ＶＨ  ＩＧＦ−１Ｒ−ＶＬ  ＩＧＦ−１Ｒ−ＶＨ  ＣＤ３−ＶＬ  ＣＤ３、またはＶＬ  ＩＧＦ−１Ｒ−ＶＨＩＧＦ−１Ｒ−ＶＨ  ＣＤ３−ＶＬ  ＣＤ３の順序に並べられることが好ましい。
【０１８５】
本発明の特に好ましい実施形態は、上記で特徴づけられたポリペプチドに関し、該二重特異性単鎖抗体分子は、
（ａ）配列番号２０２７、２０４１、２０５５、２０６９、２０８３、２０９７、２１１１、２１２５、２１３９、２１５３、２１６７、２１８１、２１９５、２２０９、または２２２３のうちのいずれかに示されるアミノ酸配列と；
（ｂ）配列番号２０２８、２０４２、２０５６、２０７０、２０８４、２０９８、２１１２、２１２６、２１４０、２１５４、２１６８、２１８２、２１９６、２２１０、または２２２４のうちのいずれかに示される核酸配列によりコードされるアミノ酸配列と；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％同一であり、より好ましくは少なくとも９５％同一であり、最も好ましくは少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列と
から選択される配列を含む。
【０１８６】
本発明は、配列番号２０２７、２０４１、２０５５、２０６９、２０８３、２０９７、２１１１、２１２５、２１３９、２１５３、２１６７、２１８１、２１９５、２２０９、または２２２３のうちのいずれかに示されるアミノ酸配列を含む二重特異性単鎖抗体分子のほか、配列番号２０２７、２０４１、２０５５、２０６９、２０８３、２０９７、２１１１、２１２５、２１３９、２１５３、２１６７、２１８１、２１９５、２２０９、または２２２３に記載のアミノ酸配列に対して、少なくとも８５％同一であり、好ましくは９０％、より好ましくは少なくとも９５％同一であり、最も好ましくは少なくとも９６、９７、９８、または９９％同一のアミノ酸配列にも関する。本発明はまた、配列番号２０２８、２０４２、２０５６、２０７０、２０８４、２０９８、２１１２、２１２６、２１４０、２１５４、２１６８、２１８２、２１９６、２２１０、または２２２４のうちのいずれかに示される、対応する核酸配列のほか、配列番号２０２８、２０４２、２０５６、２０７０、２０８４、２０９８、２１１２、２１２６、２１４０、２１５４、２１６８、２１８２、２１９６、２２１０、または２２２４に示される核酸配列に対して、少なくとも８５％同一であり、好ましくは９０％、より好ましくは少なくとも９５％同一であり、最も好ましくは少なくとも９６、９７、９８、または９９％同一の核酸配列にも関する。配列同一性は、全ヌクレオチド配列または全アミノ酸配列にわたって決定されることを理解されたい。配列アライメントを行うには、例えば、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ  ５３７１１（１９９１））内に含有される、ＧａｐプログラムまたはＢｅｓｔＦｉｔプログラムを用いることができる（ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８（１９７０）、４４３〜４５３；ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ  ２（１９８１）、４８２〜４８９）。本発明の二重特異性単鎖抗体のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に対して、例えば、８５％（９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の配列同一性を有するヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を決定および同定することは、当業者にとって日常的な方法である。例えば、クリックのゆらぎ仮説によるなら、アンチコドン上の５’塩基は、該他の２つの塩基ほど空間的に制約されておらず、したがって、非標準的な塩基対合を示しうるであろう。言い換えれば、コドントリプレット内の３位は、この３位を異にする２つのトリプレットが同じアミノ酸残基をコードしうるように変化しうる。前記仮説は、当業者によく知られている（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｗｏｂｂｌｅ＿Ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ；Ｃｒｉｃｋ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９（１９６６）、５４８〜５５を参照されたい）。
【０１８７】
本発明のＩＧＦ−１Ｒ×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体構築物において好ましいドメイン配列を、以下の実施例において示す。
【０１８８】
本発明の好ましい実施形態において、二重特異性単鎖抗体は、ＣＤ３イプシロンと、それらの第２の結合ドメインにより認識される、ヒト、および非チンパンジー霊長動物の細胞表面抗原であるＩＧＦ−１Ｒとに対して異種間特異的である。
【０１８９】
代替的な実施形態において、本発明は、上記で説明した、本発明の二重特異性単鎖抗体分子をコードする核酸配列を提供する。
【０１９０】
本発明はまた、本発明の核酸分子を含むベクターにも関する。
【０１９１】
その選択が所望の機能に依存する多くの適切なベクターが分子生物学の当業者に知られており、これらには、遺伝子操作において従来用いられている、プラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ、および他のベクターが含まれる。当業者によく知られる方法を用いて、各種のプラスミドおよびベクターを構築することができる；例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）、およびＡｕｓｕｂｅｌ、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）、（１９９４）において説明される技法を参照されたい。代替的に、本発明のポリヌクレオチドおよびベクターを、リポソーム内へと再構成して、標的細胞へと送達することもできる。以下でさらに詳しく論じる通り、クローニングベクターを用いて、個々のＤＮＡ配列を単離した。関与する配列を、特定のポリペプチドの発現が必要とされる発現ベクター内へと形質導入することができる。典型的なクローニングベクターには、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ、ｐＧＥＭ、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２、およびｐＧＢＴ９が含まれる。典型的な発現ベクターには、ｐＴＲＥ、ｐＣＡＬ−ｎ−ＥＫ、ｐＥＳＰ−１、ｐＯＰ１３ＣＡＴが含まれる。
【０１９２】
前記ベクターは、本明細書で定義される前記核酸配列に作動的に連結された調節配列である核酸配列を含むことが好ましい。
【０１９３】
「調節配列」という用語は、それらがライゲーションされるコード配列を発現させるのに必要なＤＮＡ配列を指す。このような制御配列の性質は、宿主生物に応じて異なる。原核生物の場合、制御配列には一般に、プロモーター、リポソーム結合部位、およびターミネーターが含まれる。真核生物の場合、制御配列には一般に、プロモーター、ターミネーター、また場合によって、エンハンサー、トランス活性化因子、または転写因子が含まれる。「制御配列」という用語は、少なくとも、その存在が発現に必要なすべてのコンポーネントを包含することを意図し、また、さらなる有利なコンポーネントも包含しうる。
【０１９４】
「作動的に連結された」という用語は、このように説明されるコンポーネントを、それらに意図される形で機能することを可能とする関係に置く並べ方を指す。コード配列に対して「作動的に連結された」制御配列は、コード配列の発現が、制御配列と適合的な状態で達成されるようにライゲーションされている。制御配列がプロモーターの場合、二本鎖核酸を用いることが好ましいことは、当業者に明らかである。
【０１９５】
したがって、列挙されるベクターは、発現ベクターであることが好ましい。「発現ベクター」とは、選択された宿主を形質転換するのに用いうる構築物であり、該選択された宿主内におけるコード配列の発現をもたらす。発現ベクターは、例えば、クローニングベクター、バイナリーベクター、または組込みベクターでありうる。発現は、好ましくは、翻訳可能なｍＲＮＡへの核酸分子の転写を含む。原核生物および／または真核細胞内における発現を確保する調節エレメントは、当業者によく知られている。真核細胞の場合、それらは通常、転写の開始を確保するプロモーターと、場合によって、転写の終結および転写の安定化を確保するポリＡシグナルとを含む。原核生物宿主細胞内における発現を可能とする可能な調節エレメントは、例えば、大腸菌におけるＰＬプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、またはｔａｃプロモーターを含み、真核宿主細胞における発現を可能とする調節エレメントの例は、酵母におけるＡＯＸ１プロモーターまたはＧＡＬ１プロモーター、または哺乳動物細胞および他の動物細胞におけるＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、ＣＭＶエンハンサー、ＳＶ４０エンハンサー、またはグロビンイントロンである。
【０１９６】
転写開始の一因となるエレメント以外に、このような調節エレメントはまた、ポリヌクレオチドの下流において、ＳＶ４０ポリＡ部位またはｔｋポリＡ部位などの転写終結シグナルも含みうる。さらに、用いられる発現系に応じて、ポリペプチドを細胞内コンパートメントへと誘導することが可能であるか、またはポリペプチドを媒体内へと分泌することが可能なリーダー配列を、列挙した核酸配列のコード配列へと付加することができ、これらは当技術分野でよく知られている；別記の実施例もまた参照されたい。（１または複数の）リーダー配列は、翻訳配列、開始配列、および終結配列と適切に同調する形で構築し、また、リーダー配列は、ペリプラズム腔内または細胞外媒体内への、翻訳されたタンパク質またはその一部の分泌を誘導しうることが好ましい。場合によって、異種配列は、所望の特徴、例えば、発現される組換え産物の安定性、またはその精製の簡略さを付与する、Ｎ末端同定ペプチドを包含する融合タンパク質をコードしうる；前出を参照されたい。この文脈において、当技術分野では、岡山−ＢｅｒｇによるｃＤＮＡ発現ベクターであるｐｃＤＶ１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＣＤＭ８、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ１、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ社製）、ｐＥＦ−ＤＨＦＲ、ｐＥＦ−ＡＤＡ、もしくはｐＥＦ−ｎｅｏ（Ｍａｃｋら、ＰＮＡＳ（１９９５）、９２、７０２１〜７０２５；およびＲａｕｍら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ（２００１）、５０（３）、１４１〜１５０）、またはｐＳＰＯＲＴ１（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）など適切な発現ベクターが知られている。
【０１９７】
発現制御配列は、真核宿主細胞にトランスフェクトすることが可能なベクター内における真核細胞プロモーター系であることが好ましいが、原核生物宿主用の制御配列もまた用いることができる。ベクターを適切な宿主内へと組み込んだら、該宿主を、高レベルの核酸配列発現に適する条件下に維持し、その後、所望の場合は、本発明の二重特異性単鎖抗体分子の回収および精製を行うことができる；例えば、別記の実施例を参照されたい。
【０１９８】
細胞周期と相互作用するタンパク質を発現させるのに用いうる代替的な発現系は、昆虫系である。このような系の１つでは、ヨウトガ細胞において、またはイラクサギンウワバ細胞において外来遺伝子を発現させるためのベクターとして、キンウワバ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）を用いる。列挙した核酸分子のコード配列は、ポリヘドリン遺伝子など、該ウイルスの非エッセンシャル領域内へとクローニングし、ポリヘドリンプロモーターの制御下に置くことができる。前記コード配列の挿入が成功すると、ポリヘドリン遺伝子が不活化され、被覆タンパク質を欠く組換えウイルスが作製される。次いで、組換えウイルスを用いて、ヨウトガ細胞またはイラクサギンウワバ細胞に感染させ、そこで本発明のタンパク質を発現させる（Ｓｍｉｔｈ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４６（１９８３）、５８４；Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１（１９９４）、３２２４〜３２２７）。
【０１９９】
さらなる調節エレメントには、転写エンハンサーのほか、翻訳エンハンサーも含まれうる。本発明の上記で説明したベクターは、選択マーカーおよび／またはスコアリングマーカーを含むと有利である。
【０２００】
形質転換細胞、また、例えば、植物組織および植物の選択に有用な選択マーカー遺伝子は当業者によく知られており、例えば、メトトレキサートに対する耐性を付与するｄｈｆｒの選択ベースとしての抗代謝物質耐性（Ｒｅｉｓｓ、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．Ａｄｖ．）１３（１９９４）、１４３〜１４９）；アミノグリコシドであるネオマイシン、カナマイシン、およびパロマイシンに対する耐性を付与するｎｐｔ（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ、ＥＭＢＯ  Ｊ．２（１９８３）、９８７〜９９５）；また、ハイグロマイシンに対する耐性を付与するハイグロ（Ｍａｒｓｈ、Ｇｅｎｅ  ３２（１９８４）、４８１〜４８５）を含む。さらなる選択遺伝子、すなわち、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを用いることを可能とするｔｒｐＢ；細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを用いることを可能とするｈｉｓＤ（Ｈａｒｔｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５（１９８８）、８０４７）；細胞がマンノースを用いることを可能とするマンノース−６−リン酸イソメラーゼ（ＷＯ９４／２０６２７）；また、オルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤である２−（ジフルオロメチル）−ＤＬ−オルニチン（ＤＦＭＯ）に対する耐性を付与するＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼ）（ＭｃＣｏｎｌｏｇｕｅ、１９８７、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ編）；または、ブラスチシジンＳに対する耐性を付与する、アスペルギルス・テレウスに由来するデアミナーゼ（Ｔａｍｕｒａ、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９（１９９５）、２３３６〜２３３８）についても説明されている。
【０２０１】
有用なスコアリングマーカーもまた、当業者に知られており、市販されている。前記マーカーは、ルシフェラーゼ（Ｇｉａｃｏｍｉｎ、Ｐｌ．Ｓｃｉ．１１６（１９９６）、５９〜７２；Ｓｃｉｋａｎｔｈａ、Ｊ．Ｂａｃｔ．１７８（１９９６）、１２１）、緑色蛍光タンパク質（Ｇｅｒｄｅｓ、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３８９（１９９６）、４４〜４７）、またはβ−グルクロニダーゼ（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ、ＥＭＢＯ  Ｊ．６（１９８７）、３９０１〜３９０７）をコードする遺伝子である。この実施形態は、列挙したベクターを含有する細胞、組織、および生物の、簡略で迅速なスクリーニングに特に有用である。
【０２０２】
上記で説明した通り、列挙した核酸分子は、例えば、精製を目的とするが、また、遺伝子治療を目的としても、単独で、または、細胞内において本発明の二重特異性単鎖抗体分子を発現するベクターの一部として用いることができる。上記で説明した、本発明の二重特異性単鎖抗体分子をコードする（１または複数の）ＤＮＡ配列のうちのいずれか１つを含有する核酸分子またはベクターを細胞内へと導入し、これにより対象のポリペプチドを作製する。ｅｘ  ｖｉｖｏ法またはｉｎ  ｖｉｖｏ法により治療遺伝子を細胞内へと導入することに基づく遺伝子治療は、遺伝子導入の最も重要な適用の１つである。ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおける遺伝子治療に適するベクター、方法、または遺伝子送達系は文献において説明されており、当業者に知られている；例えば、Ｇｉｏｒｄａｎｏ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２（１９９６）、５３４〜５３９；Ｓｃｈａｐｅｒ、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７９（１９９６）、９１１〜９１９；Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６（１９９２）、８０８〜８１３；Ｖｅｒｍａ、Ｎａｔｕｒｅ  ３８９（１９９４）、２３９；Ｉｓｎｅｒ、Ｌａｎｃｅｔ  ３４８（１９９６）、３７０〜３７４；Ｍｕｈｌｈａｕｓｅｒ、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７７（１９９５）、１０７７〜１０８６；Ｏｎｏｄｅｒａ、Ｂｌｏｏｄ  ９１（１９９８）、３０〜３６；Ｖｅｒｍａ、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５（１９９８）、６９２〜６９９；Ｎａｂｅｌ、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１１（１９９７）、２８９〜２９２；Ｖｅｒｚｅｌｅｔｔｉ、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９（１９９８）、２２４３〜５１；Ｗａｎｇ、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２（１９９６）、７１４〜７１６；ＷＯ９４／２９４６９；ＷＯ９７／００９５７；ＵＳ５，５８０，８５９；ＵＳ５，５８９，４６６；またはＳｃｈａｐｅｒ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７（１９９６）、６３５〜６４０；ｄｏｓ  Ｓａｎｔｏｓ  ＣｏｕｒａおよびＮａｒｄｉ、Ｖｉｒｏｌ  Ｊ．（２００７）、４、９９を参照されたい。列挙した核酸分子およびベクターは、細胞内への直接的な導入用、または、リポソームもしくはウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター）を介する導入用にデザインすることができる。前記細胞は、生殖細胞系列細胞、胚細胞、もしくは卵細胞、またはこれらに由来する細胞であることが好ましく、前記細胞は、幹細胞であることが最も好ましい。胚性幹細胞の例は、とりわけ、Ｎａｇｙ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０（１９９３）、８４２４〜８４２８において説明される幹細胞でありうる。
【０２０３】
本発明はまた、本発明のベクターにより形質転換されるか、またはこれをトランスフェクトした宿主も提供する。前記宿主は、上記で説明した本発明のベクター、または上記で説明した本発明の核酸分子を宿主内へと導入することにより作製することができる。宿主内において、少なくとも１つのベクター、または少なくとも１つの核酸分子が存在すれば、上記で説明した単鎖抗体構築物をコードする遺伝子の発現が媒介されうる。
【０２０４】
宿主内に導入することを説明した、本発明の核酸分子またはベクターは、該宿主のゲノム内へと組み込むこともでき、染色体外に保持することもできる。
【０２０５】
宿主は、任意の原核生物または真核細胞でありうる。
【０２０６】
「原核生物」という用語は、本発明のタンパク質を発現させるためのＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子により形質転換されうるすべての細菌を包含することを意図する。原核生物宿主には、例えば、大腸菌、ネズミチフス菌、霊菌、および枯草菌など、グラム陰性菌ならびにグラム陽性菌が含まれうる。「真核細胞の」という用語は、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、また好ましくは、哺乳動物細胞を包含することを意味する。組換え作製手順において用いられる宿主に応じて、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質は、グリコシル化される場合もあり、グリコシル化されない場合もある。本発明の二重特異性単鎖抗体分子、ならびにこれに遺伝子融合させたＮ末端ＦＬＡＧタグおよび／またはＣ末端Ｈｉｓタグのコード配列を含有するプラスミドまたはウイルスの使用がとりわけ好ましい。前記ＦＬＡＧタグの長さは、約４〜８アミノ酸であることが好ましく、８アミノ酸であることが最も好ましい。上記で説明したポリヌクレオチドは、当業者に一般的に知られる技法のうちのいずれかを用いて、宿主を形質転換するか、またはこれにトランスフェクトするのに用いることができる。さらに、融合され、作動的に連結された遺伝子を調製し、例えば、哺乳動物細胞内および細菌内でそれらを発現させる方法も、当技術分野ではよく知られている（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、前出）。
【０２０７】
前記宿主は、細菌細胞、または昆虫細胞、真菌細胞、植物細胞、もしくは動物細胞であることが好ましい。
【０２０８】
列挙した宿主は、哺乳動物細胞でありうることが特に意図される。特に好ましい宿主細胞は、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＳＰ２／０またはＮＳ／０などの骨髄腫細胞株を含む。別記の実施例において例示する通り、宿主としては、ＣＨＯ細胞が特に好ましい。
【０２０９】
前記宿主細胞は、ヒト細胞またはヒト細胞株、例えば、ｐｅｒ．ｃ６であることがより好ましい（Ｋｒｏｏｓ、Ｂｉｏｔｃｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．、２００３、１９、１６３〜１６８）。
【０２１０】
したがって、さらなる実施形態において、本発明は、本発明の二重特異性単鎖抗体分子を作製するためのプロセスであって、本発明の宿主を、本発明の二重特異性単鎖抗体分子の発現を可能とする条件下で培養するステップと、生成されたポリペプチドを該培養物から回収するステップとを含むプロセスに関する。
【０２１１】
形質転換した宿主は、発酵器内で増殖させ、また、当技術分野で知られる技法により培養して、最適の細胞増殖を達成することができる。次いで、増殖培地、細胞溶解物、または細胞膜画分から、本発明の二重特異性単鎖抗体分子を単離することができる。例えば、微生物に発現させた二重特異性単鎖抗体分子の単離および精製は、例えば、予備的なクロマトグラフィーによる分離、また、例えば、本発明の、または別記の実施例に記載の二重特異性単鎖抗体分子のタグを指向するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の使用を伴う分離などの免疫学的分離など、従来の任意の手段を介しうる。
【０２１２】
当技術分野において、発現を可能とする宿主の培養条件は、このようなプロセスで用いられる宿主系および発現系／発現ベクターに依存することが知られている。組換えポリペプチドの発現を可能とする条件を達成するために変更すべきパラメータは、当技術分野で知られている。したがって、適切な条件は、発明のためのさらなる努力なしに、当業者により決定されうる。
【０２１３】
発現させたら、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを含めた、当技術分野の標準的な手順により、本発明の二重特異性単鎖抗体分子をすることができる；Ｓｃｏｐｅｓ、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．（１９８２）を参照されたい。医薬用には、少なくとも約９０〜９５％の均一性を有する、実質的に純粋なポリペプチドが好ましく、９８〜９９％以上の均一性が最も好ましい。次いで、部分的に、または所望の均一性まで精製したら、本発明の二重特異性単鎖抗体分子を、治療（体外治療を含めた）、またはアッセイ手順の開発および実施に用いることができる。さらに、本発明の二重特異性単鎖抗体分子を培養物から回収する方法の例も、別記の実施例において詳細に説明する。回収はまた、ヒト、および非チンパンジー霊長動物のＣＤ３イプシロン（ＣＤ３ε）エピトープに結合することが可能な、本発明の二重特異性単鎖抗体分子を単離する方法であって、
（ａ）（１または複数の）ポリペプチドを、アミノ酸配列Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ（配列番号３４１）またはＧｌｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ（配列番号３４２）を含み、そのＣ末端を介して固相へと固定した、最大２７アミノ酸によるＣＤ３εの細胞外ドメインのＮ末端断片と接触させるステップと；
（ｂ）前記断片から、結合した（１または複数の）ポリペプチドを溶出させるステップと；
（ｃ）（ｂ）の溶出物から、（１または複数の）ポリペプチドを単離するステップと
を含む方法によっても達成することができる。
【０２１４】
本発明の上記の方法により単離される（１または複数の）ポリペプチドは、ヒトポリペプチドであることが好ましい。
【０２１５】
本発明の二重特異性単鎖抗体分子を単離するこの方法は、複数の候補ポリペプチドから、そのＮ末端においてアミノ酸配列Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ（配列番号３４１）またはＧｌｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ（配列番号３４２）を含む、ＣＤ３εの細胞外ドメイン断片に対して同じ特異性を有する、１または複数の異なるポリペプチドを単離する方法のほか、溶液からポリペプチドを精製する方法としても理解される。二重特異性単鎖抗体分子を溶液から精製する後者の方法の非限定的な例は、例えば、組換えにより発現させた二重特異性単鎖抗体分子を培養物上清から精製する方法、またはこのような培養物からの調製である。
【０２１６】
前述の通り、この方法で用いる断片は、霊長動物ＣＤ３ε分子の細胞外ドメインのＮ末端断片である。異なる種によるＣＤ３ε分子の細胞外ドメインのアミノ酸配列を、配列番号１、３、５、および７に示す。Ｎ末端八量体の２つの形態を、配列番号３４１および３４２に示す。このＮ末端は、本発明の方法により同定されるポリペプチドに、フリーで結合可能であることが好ましい。本発明の文脈において、「フリーで結合可能」という用語は、Ｈｉｓタグなど、さらなるモチーフを含まないこととして理解される。本発明の方法により同定される結合分子に対して、このようなＨｉｓタグが干渉することについては、別記の実施例６および２０で説明する。
【０２１７】
この方法によれば、前記断片は、そのＣ末端を介して固相へと固定される。当業者は、本発明の方法で用いる実施形態に応じて、適切な固相支持体を、容易に、また、発明の努力なしに選択するであろう。固体支持体の例は、ビーズ（例えば、アガロースビーズ、セファロースビーズ、ポリスチロールビーズ、デキストランビーズ）、プレート（培養プレートまたはマルチウェルプレート）のほか、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）社製が知られるチップなどのマトリックスを含むが、これらに限定されない。前記固体支持体に断片を固定／固定化するための手段および方法の選択は、該固体支持体の選択に依存する。固定／固定化に一般的に用いられる方法は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルによる結合である。この結合のほか、例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）によるものなど、固定／固定化のための代替的な方法の根本をなす化学反応は、当業者に知られている。クロマトグラフィー支持体上において固定／固定化するためには、一般に、以下の手段：ＮＨＳ活性化セファロース（例えば、ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ−Ａｍｅｒｓｈａｍ社製のＨｉＴｒａｐ−ＮＨＳ）、ＣｎＢｒ活性化セファロース（例えば、ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ−Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）、ＮＨＳ活性化デキストランビーズ（Ｓｉｇｍａ社製）、または活性化ポリメタクリレートを用いる。これらの試薬は、バッチ法でも用いることができる。さらに、バッチ法では、酸化鉄を含むデキストランビーズ（例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社製）を用いることができる。これらのビーズは、溶液からビーズを分離するための磁石と組み合わせて用いることができる。ポリペプチドは、ＮＨＳ活性化カルボキシメチルデキストランを用いることにより、Ｂｉａｃｏｒｅチップ（例えば、ＣＭ５チップ）上に固定化することができる。適切な固体支持体のさらなる例は、アミン反応性マルチウェルプレート（例えば、Ｎｕｎｃ社製のＩｍｍｏｂｉｌｉｚｅｒ（商標）プレート）である。
【０２１８】
この方法により、ＣＤ３イプシロン細胞外ドメインによる前記断片を、直接的に、またはリンカーの場合もあり、別のタンパク質／ポリペプチド部分の場合もあるアミノ酸の連なりを介して、固体支持体へと連結することができる。代替的に、ＣＤ３イプシロン細胞外ドメインを、１または複数のアダプター分子を介して間接的に連結することもできる。
【０２１９】
固定化させたエピトープに結合したペプチドまたはポリペプチドを溶出させる手段および方法は、当技術分野においてよく知られている。同じことは、同定した（１または複数の）ポリペプチドを、溶出物から単離する方法についてもあてはまる。
【０２２０】
複数の候補ポリペプチドから、Ｎ末端においてアミノ酸配列Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ｇｌｙ（Ｘは、ＭｅｔまたはＩｌｅである）を含み、ＣＤ３εの細胞外ドメイン断片に対して同じ特異性を有する、１または複数の異なる二重特異性単鎖抗体分子を単離する方法は、抗原特異的実体を選択するための以下の方法の１または複数のステップを含みうる。
【０２２１】
ＣＤ３ε特異性結合ドメインは、抗体由来のレパートリーから選択することができる。ファージディスプレイライブラリーは、例えば、「Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｅｄ．Ｂａｒｂａｓ、Ｂｕｒｔｏｎ、Ｓｃｏｔｔ、およびＳｉｌｖｅｒｍａｎ編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、２００１で開示される標準的な手順に基づき構築することができる。抗体ライブラリー内における抗体断片のフォーマットは、ｓｃＦｖでありうるが、また一般的に、Ｆａｂ断片の場合もあり、さらに、単一ドメイン抗体断片の場合もある。抗体断片を単離するには、ナイーブ抗体断片のライブラリーを用いることができる。その後治療的に用いる際、潜在的に免疫原性の低い結合実体を選択するのに、ヒト抗体断片を直接的に選択するには、ヒト抗体断片のライブラリーが好都合でありうる。場合によって、それらは、合成的な抗体ライブラリーのための基盤を形成しうる（Ｋｎａｐｐｉｋら、Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２０００、２９６、５７以下）。対応するフォーマットは、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ（以下で説明する）、またはドメイン抗体（Ｈｏｌｔら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２００３、２１、４８４以下で総説されるｄＡｂ）でありうる。
【０２２２】
当技術分野ではまた、多くの場合において、標的抗原に対して、ヒト免疫抗体供給源が入手できないことも知られている。したがって、標的抗原により動物を免疫化し、例えば、脾臓またはＰＢＭＣなどの動物組織から、それぞれの抗体ライブラリーを単離する。Ｎ末端断片は、ビオチニル化することもでき、ＫＬＨまたはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などのタンパク質に共有結合させることもできる。一般的な手法によれば、免疫化にはげっ歯動物が用いられる。他の理由で、例えば、ラクダ科動物種に由来して単一米イン抗体（ＶＨＨ）（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ、Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４、２７７；ＤｅＧｅｎｓｔら、Ｄｅｖ  Ｃｏｍｏ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００６、３０、１８７以下で説明される）が存在する理由で、非ヒト由来の一部の免疫抗体レパートリーがとりわけ好ましい場合もある。したがって、抗体ライブラリーの対応するフォーマットは、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ（以下で説明する）、または単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）でありうる。
【０２２３】
可能な一手法では、ｂａｌｂ／ｃ×Ｃ５７ｂｌａｃｋ交配による１０週齢のＦ１マウスを、例えば、成熟ＣＤ３ε鎖のＮ末端におけるアミノ酸１〜２７を、Ｎ末端において翻訳融合体として提示する、膜貫通ＥｐＣＡＭを発現する全細胞により免疫化することができる。代替的に、ＣＤ３イプシロン１〜２７−Ｆｃ融合タンパク質によりマウスを免疫化することもできる（対応する手法を、別記の実施例２において説明する）。（１または複数回にわたる）追加投与による免疫化の後、血液試料を採取し、例えば、ＦＡＣＳ解析において、ＣＤ３陽性Ｔ細胞に対する抗体の血清力価を調べることができる。通常、血清力価は、免疫化しない動物より、免疫化した動物において著明に高い。
【０２２４】
免疫化した動物は、免疫抗体ライブラリーを構築するための基盤を形成しうる。このようなライブラリーの例は、ファージディスプレイライブラリーを含む。このようなライブラリーは一般に、例えば、「Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｂａｒｂａｓ、Ｂｕｒｔｏｎ、Ｓｃｏｔｔ、およびＳｉｌｖｅｒｍａｎ編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、２００１において開示される標準的な手順に基づき構築することができる。
【０２２５】
より可変的な抗体ライブラリーを発生させ、これをその後の選択時において結合剤について濃縮しうるため、非ヒト抗体はまた、ファージディスプレイによってもヒト化することができる。
【０２２６】
ファージディスプレイ法では、抗体ライブラリーを提示するファージプールのうちのいずれか１つが、それぞれの抗原を標的分子として用いて、結合実体を選択するための基盤を形成する。抗原特異性の抗原結合ファージが単離される中心的な段階を、パニングと称する。ファージ表面上において抗体断片が提示されるため、この一般的な方法を、ファージディスプレイと呼ぶ。選択の好ましい一方法は、ファージにより提示されるｓｃＦｖのＮ末端へと翻訳融合させた線維状ファージのＮ２ドメインなど、低分子タンパク質の使用である。結合実体を単離するのに用いうる、当技術分野で知られる別のディスプレイ法は、リボソームディスプレイ法である（ＧｒｏｖｅｓおよびＯｓｂｏｕｒｎ、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ．、２００５、５、１２５以下；ＬｉｐｏｖｓｅｋおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００４、２９０、５２以下において総説されている）。ＣＤ３ε  １〜２７−Ｆｃ融合体タンパク質に対するｓｃＦｖファージ粒子の結合を示すには、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）により、それぞれの培養物上清から、クローニングされたｓｃＦｖレパートリーを保有するファージライブラリーを採取することができる。ＳｃＦｖファージ粒子は、固定化させたＣＤ３ε−Ｆｃ融合体タンパク質と共にインキュベートすることができる。固定化させたＣＤ３ε−Ｆｃ融合体タンパク質は、固相にコーティングすることができる。結合実体を溶出させ、該溶出物を用いて、新鮮な未感染の細菌宿主に感染させることができる。ヒトｓｃＦｖ断片をコードするファージミドコピーの形質導入に成功した細菌宿主を、さらに、カルベニシリン耐性について選択し、その後、これに、例えば、ＶＣＭＳ  １３ヘルパーファージを感染させて、抗体提示およびｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける選択の第２ラウンドを開始させる。通常、計４〜５ラウンドの選択を実施する。単離された結合実体の結合については、フローサイトメトリーアッセイを用いて、ＣＤ３イプシロン陽性のＪｕｒｋａｔ細胞、ＨＰＢａｌｌ細胞、ＰＢＭＣ、または、表面提示されたＥｐＣＡＭに融合させた、Ｎ末端におけるＣＤ３ε配列を保有する、トランスフェクトされた真核細胞上において調べることができる（別記の実施例４を参照されたい）。
【０２２７】
上記の方法は、ＣＤ３εの細胞外ドメイン断片が、配列番号２、４、６、または８に示されるいずれか１つによるアミノ酸配列を有するポリペプチドの１または複数の断片からなる方法でありうることが好ましい。前記断片は、長さ８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７のアミノ酸残基であることがより好ましい。
【０２２８】
二重特異性単鎖抗体分子を同定するこの方法は、ヒト、および非チンパンジー霊長動物のＣＤ３εに結合する異種間特異的結合ドメインを含む、複数の二重特異性単鎖抗体分子をスクリーニングする方法でありうる。代替的に、該同定法は、ヒト、および非チンパンジー霊長動物のＣＤ３εに結合する異種間特異的結合ドメインを含む、二重特異性単鎖抗体分子の精製／単離法である。
【０２２９】
さらに、本発明は、本発明の二重特異性単鎖抗体分子、または上記で開示したプロセスにより作製される二重特異性単鎖抗体を含む組成物を提供する。前記組成物は、医薬組成物であることが好ましい。
【０２３０】
本発明はまた、本明細書で定義されるか、または本明細書で定義されるプロセスにより作製される二重特異性単鎖抗体分子であって、癌または自己免疫疾患を予防、治療、または改善するのに用いられる二重特異性単鎖抗体分子も提供する。
【０２３１】
ＰＳＣＡ×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体分子の場合、前記癌は、前立腺癌、膀胱癌、または膵臓癌であることが好ましい。
【０２３２】
ＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体分子の場合、前記癌は、Ｂ−ＮＨＬ（Ｂ細胞性非ホジキンリンパ腫）、Ｂ−ＡＬＬ（Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病）、Ｂ−ＣＬＬ（Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病）、または多発性骨髄腫（この場合、本発明の二重特異性単鎖抗体分子は、ＣＤ１９陽性癌幹細胞／癌誘発細胞を枯渇させて有利である）などのＢ細胞悪性腫瘍であることが好ましい。しかし、二重特異性単鎖抗体分子はまた、関節リウマチまたはＢ細胞枯渇など、Ｂ細胞媒介性自己免疫疾患、またはＢ細胞の病理学的寄与を伴う自己免疫疾患を予防、治療、または改善するのにも用いられる。
【０２３３】
ｃ−ＭＥＴ×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体分子の場合、前記癌（ｃａｎｃｅｒ）は、癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肉腫、神経膠芽腫／星状細胞腫、黒色腫、中皮腫、ウィルムス腫瘍、または白血病、リンパ腫、もしくは多発性骨髄腫などの造血系悪性腫瘍であることが好ましい。二重特異性単鎖抗体分子により治療されうる癌の各種類についての包括的なリストは、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｖａｉ．ｏｒｇ／ｍｅｔ／において見出すことができる。
【０２３４】
エンドシアリン×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体分子の場合、前記癌には、癌（乳癌、腎癌、肺癌、結腸直腸癌、結腸癌、膵臓中皮腫）、肉腫、および神経外胚葉性腫瘍（黒色腫、神経膠腫、神経芽細胞腫）が含まれるがこれらに限定されないことが好ましい。
【０２３５】
ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体分子の場合、前記癌は、上皮癌または微小残存癌であることが好ましい。
【０２３６】
ＦＡＰα×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体分子の場合、前記癌は、上皮癌であることが好ましい。
【０２３７】
ＩＧＦ−１Ｒ×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体分子の場合、前記癌は、骨癌または軟組織癌（例えば、ユーイング肉腫）、乳癌、肝癌、肺癌、頭頚部癌、結腸直腸癌、前立腺癌、平滑筋肉腫、子宮頚癌および子宮内膜癌、卵巣癌、前立腺癌、ならびに膵臓癌であることが好ましい。代替的に、本発明のＩＧＦ−１Ｒ×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体分子はまた、自己免疫疾患、好ましくは、乾癬を予防、治療、または改善するのにも用いられる。
【０２３８】
二重特異性単鎖抗体は、担体、安定化剤、および／または賦形剤による適切な製剤をさらに含むことが好ましい。さらに、前記二重特異性単鎖抗体分子は、さらなる薬物との組合せ投与に適することも好ましい。前記薬物は、非タンパク質性化合物でもタンパク質性化合物でもよく、本明細書で定義される二重特異性単鎖抗体分子と同時に投与しても同時に投与しなくてもよい。
【０２３９】
本発明によれば、「医薬組成物」という用語は、患者、好ましくはヒト患者に投与するための組成物に関する。本発明の特に好ましい医薬組成物は、環境に依存しないＣＤ３エピトープを指向し、また、これに対して作製される二重特異性単鎖抗体を含む。医薬組成物は、担体、安定化剤、および／または賦形剤による適切な製剤を含むことが好ましい。好ましい実施形態において、医薬組成物は、非経口投与用、経皮投与用、管腔内投与用、動脈内投与用、髄腔内投与用、および／もしくは鼻腔内投与用、または組織内への直接的な注射用の組成物を含む。特に、前記組成物は、注入または注射により患者に投与されることが意図される。適切な組成物の投与は、異なる方式、例えば、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、筋肉内投与、局所投与、または皮内投与により実施することができる。特に、本発明は、適切な組成物の中断されない投与を提供する。非限定的な例として述べると、中断されない投与、すなわち、持続投与は、患者により装着されて患者の体内への治療剤の流入量を測定する、小型のポンプシステムにより実施することができる。前記ポンプシステムを用いることにより、本発明の、環境に依存しないＣＤ３エピトープを指向し、また、これに対して作製される二重特異性単鎖抗体を含む医薬組成物投与することができる。このようなポンプシステムは、当技術分野で一般に知られており、一般的に、注入される治療剤を含有するカートリッジの定期的な交換に依拠する。このようなポンプシステム内においてカートリッジを交換する場合、その他の場合には中断されない、患者の体内への治療剤の流れの一時的な中断が結果として生じる場合がある。このような場合、カートリッジ交換前における投与相、およびカートリッジ交換後における投与相もなお、本発明の薬学的な手段および方法の意図の範囲内にあると考えられ、併せて、このような治療剤による１つの「中断されない投与」を構成する。
【０２４０】
本発明の、環境に依存しないＣＤ３エピトープを指向し、また、これに対して作製されるこれらの二重特異性単鎖抗体の持続投与または中断されない投与は、容器から流体を駆出する駆出機構、また、該駆出機構を作動させる作動機構を含めた、流体送達デバイスまたは小型ポンプシステムによる静脈内投与または皮下投与でありうる。皮下投与用のポンプシステムは、患者の皮膚に穿刺して、適切な組成物を患者の体内へと送達する注射針またはカニューレを包含しうる。前記ポンプシステムは、静脈、動脈、または血管とは別に、患者の皮膚に直接固定するかまたは取り付けることができ、これにより、ポンプシステムと、患者の皮膚との間の直接的な接触が可能となる。ポンプシステムは、２４時間〜数日間にわたり患者の皮膚に取り付けることができる。ポンプシステムは、小容量の容器を伴う小型サイズでありうる。非限定的な例として述べると、投与される適切な医薬組成物用の容器の用量は、０．１〜５０ｍｌでありうる。
【０２４１】
持続投与は、皮膚上に貼付され、一定間隔で貼りかえられるパッチによる経皮投与でありうる。当業者は、この目的に適する薬物送達用のパッチシステムについて承知している。例えば、第１の使用済みパッチのすぐ近傍の皮膚表面において、第１の使用済みパッチをはがす直前に、第１の使用済みパッチの交換を、新たな第２のパッチの貼付と同時に達成することができて有利であるため、経皮投与は、中断されない投与にとりわけ適することが注目に値する。流れの中断または電源セルの故障による問題は生じない。
【０２４２】
特に、環境に依存しないＣＤ３エピトープを指向し、また、これに対して作製される二重特異性単鎖抗体を含む、本発明の組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含みうる。適切な医薬担体は当技術分野でよく知られており、これらには、例えば、リン酸緩衝生理食塩液、水、油／水エマルジョンなどのエマルジョン、各種の保湿剤、滅菌溶液、リポソームなどが含まれる。このような担体を含む組成物は、よく知られた従来の方法により調合することができる。製剤は、炭水化物、緩衝液、アミノ酸、および／または界面活性剤を含みうる。炭水化物は、非還元性の糖、好ましくは、トレハロース、スクロース、オクタスルフェート、ソルビトール、またはキシリトールでありうる。このような製剤は、静脈内投与の場合もあり、皮下投与の場合もあり、ポンプシステムを伴う場合もあり、かつ／またはこれを伴わない場合もある持続投与に用いることができる。アミノ酸は、荷電アミノ酸、好ましくは、リシン、酢酸リシン、アルギニン、グルタミン酸、および／またはヒスチジンでありうる。界面活性剤は、好ましくは分子量が＞１．２ＫＤである洗浄剤、好ましくは分子量が＞３ＫＤであるポリエーテルでありうる。好ましい洗浄剤の非限定的な例は、Ｔｗｅｅｎ  ２０、Ｔｗｅｅｎ  ４０、Ｔｗｅｅｎ  ６０、ＴＷｅｅｎ  ８０、またはＴｗｅｅｎ  ８５である。好ましいポリエーテルの非限定的な例は、ＰＥＧ  ３０００、ＰＥＧ  ３３５０、ＰＥＧ  ４０００、またはＰＥＧ  ５０００である。本発明で用いられる緩衝液系は、その好ましいｐＨが５〜９でありえ、また、クエン酸、コハク酸、リン酸、ヒスチジン、および酢酸を含みうる。本発明の組成物は、非チンパンジー霊長動物、例えば、マカクザルに対して、本明細書で説明される異種間特異性を示す、本発明の二重特異性単鎖抗体分子の用量を増加させて投与することによる、例えば、用量漸増研究を介して決定しうる適切な用量で対象に投与することができる。上記の通り、本明細書で説明される異種間特異性を示す、本発明の二重特異性単鎖抗体分子は、非チンパンジー霊長動物を対象とする前臨床試験において、また、ヒトにおける薬物として、同一の形態で用いることができて有利である。これらの組成物はまた、他のタンパク質性薬物および非タンパク質性薬物と組み合わせても投与することができる。これらの薬物は、本明細書で定義される、本発明の二重特異性単鎖抗体分子を含む組成物と同時に投与することもでき、適時に規定された間隔および用量により、前記ポリペプチドの投与前または投与後において別個に投与することもできる。投与レジメンは、主治医および臨床的因子により決定される。医療技術分野でよく知られている通り、任意の一患者に対する用量は、患者の体格、体表面積、年齢、投与される具体的な化合物、性別、投与回数および投与経路、一般的な健康状態、ならびに同時に投与される他の薬物を含めた多くの因子に依存する。非経口投与用の調製物には、滅菌の水溶液または非水溶液、懸濁液、およびエマルジョンが含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルである。水性担体には、水、アルコール溶液／水溶液、エマルジョン、または生理食塩液および緩衝媒体を含めた懸濁液が含まれる。非経口媒体には、塩化ナトリウム液、リンゲルデキストロース液、デキストロースおよび塩化ナトリウムによるリンゲル液、乳酸加リンゲル液、または固定油が含まれる。静脈内媒体には、体液および栄養素の補給物質、電解質補給物質（リンゲルデキストロース液ベースの補給物質など）などが含まれる。例えば、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート化剤、不活性ガスなどの防腐剤および他の添加剤もまた存在しうる。加えて、本発明の組成物は、例えば、好ましくはヒト由来の血清アルブミンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質性担体を含む場合もありうる。本発明の組成物は、本明細書で定義される、本発明の二重特異性単鎖抗体分子に加え、該組成物の使用意図に応じて、さらなる生物学的活性剤も含む場合がありうる。このような薬剤は、当技術分野で知られる、消化器系に作用する薬物、細胞増殖抑制剤として作用する薬物、高尿酸血症を予防する薬物、免疫反応を阻害する薬物（例えば、コルチコステロイド）、炎症反応を調節する薬物、循環系に作用する薬物、および／またはサイトカインなどの薬剤の可能性がありうる。
【０２４３】
本明細書で定義される医薬組成物の生物学的活性は、例えば、以下の実施例、ＷＯ９９／５４４４０、またはＳｃｈｌｅｒｅｔｈら（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０（２００５）、１〜１２）において説明される細胞傷害作用アッセイにより決定することができる。本明細書で用いられる「有効性」または「ｉｎ  ｖｉｖｏにおける有効性」とは、例えば、ＮＣＩにより標準化された応答基準を用いる、本発明の医薬組成物による治療に対する応答を指す。本発明の医薬組成物を用いる治療の奏効またはｉｎ  ｖｉｖｏにおける有効性とは、その意図する目的に対する該組成物の有効性、すなわち、該組成物が、その所望の効果、すなわち、病原性細胞、例えば、腫瘍細胞の枯渇をもたらす能力を指す。ｉｎ  ｖｉｖｏにおける有効性は、白血球カウント、白血球分類、蛍光活性化細胞分類、骨髄吸引が含まれるがこれらに限定されない、それぞれの疾患実体に対応する、確立された標準的方法によりモニタリングすることができる。加えて、各種の疾患特異的な臨床化学パラメータ、また、他の確立された標準的な方法を用いることができる。さらに、コンピュータ断層撮影、Ｘ線、核磁気共鳴断層撮影（例えば、米国国立癌研究所基準に基づく応答評価［Ｃｈｅｓｏｎ  ＢＤ，Ｈｏｒｎｉｎｇ  ＳＪ、Ｃｏｉｆｆｉｅｒ  Ｂ、Ｓｈｉｐｐ  ＭＡ，Ｆｉｓｈｅｒ  ＲＩ、Ｃｏｎｎｏｒｓ  ＪＭ、ＬｉＳｔｅｒ  ＴＡ、Ｖｏｓｅ  Ｊ、Ｇｒｉｌｌｏ−Ｌｏｐｅｚ  Ａ、Ｈａｇｅｎｂｅｅｋ  Ａ、Ｃａｂａｎｉｌｌａｓ  Ｆ、Ｋｌｉｐｐｅｎｓｔｅｎ  Ｄ、Ｈｉｄｄｅｍａｎｎ  Ｗ、Ｃａｓｔｅｌｌｉｎｏ  Ｒ、Ｈａｒｒｉｓ  ＮＬ、Ａｒｍｉｔａｇｅ  ＪＯ、Ｃａｒｔｅｒ  Ｗ、Ｈｏｐｐｅ  Ｒ、Ｃａｎｅｌｌｏｓ  ＧＰ、「Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ａｎ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｗｏｒｋｓｈｏｐ  ｔｏ  ｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｆｏｒ  ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  ｌｙｍｐｈｏｍａｓ．ＮＣＩ  Ｓｐｏｎｓｏｒｅｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ」、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．１９９９年４月、１７（４）、２４４］のための）、陽電子放射断層撮影走査、白血球カウント、白血球分類、蛍光活性化細胞分類、骨髄吸引、リンパ節生検／組織学、また、各種の癌特異的な臨床化学パラメータ（例えば、乳酸デヒドロゲナーゼ）、ならびに他の確立された標準的方法を用いることができる。
【０２４４】
本発明の医薬組成物などの薬物を開発する場合の別の主要な難題は、薬物動態特性の予測可能な調節である。この目的で、候補薬物の薬物動態プロファイル、すなわち特定の薬物が所与の状態を治療する能力に影響する薬物動態パラメータのプロファイルを確立する。特定の疾患実体を治療する薬物の能力に影響する薬物の薬物動態パラメータには、半減期、分布容積、肝臓における初回通過代謝、および血清結合度が含まれるがこれらに限定されない。所与の薬剤の有効性は、上述のパラメータの各々により影響されうる。
【０２４５】
「半減期」とは、投与された薬物の５０％が、生物学的過程、例えば、代謝、分泌などにより消失することを意味する。
【０２４６】
「肝臓における初回通過代謝」とは、薬物が、肝臓との最初の接触時、すなわち、肝臓におけるその最初の通過時において代謝される傾向を意味する。
【０２４７】
「分布容積」とは、例えば、細胞内腔および細胞外腔、組織、ならびに内臓など、体内の各種コンパートメント全体における薬物の貯留度、ならびにこれらのコンパートメント内における薬物の分布を意味する。
【０２４８】
「血清結合度」とは、薬物が、アルブミンなどの血清蛋白質と相互作用してこれらに結合し、該薬物の生物学的活性の低下または喪失をもたらす傾向を意味する。
【０２４９】
薬物動態パラメータにはまた、投与された所与量の薬物のバイオアベイラビリティー、遅延時間（Ｔｌａｇ）、Ｔｍａｘ、吸収速度、作用開始の迅速度、および／またはＣｍａｘも含まれる。
【０２５０】
「バイオアベイラビリティー」とは、血液コンパートメント内における薬物量を意味する。
【０２５１】
「遅延時間」とは、薬物を投与する時点と、血中または血漿中においてそれが検出されて測定可能となる時点との間の時間の遅延を意味する。
【０２５２】
「Ｔｍａｘ」とは、薬物の最大血中濃度が達せられるまでの時間であり、「Ｃｍａｘ」とは、所与の薬物により得られる最大血中濃度である。その生物学的効果に必要な薬物の血中濃度または組織内濃度に達するまでの時間は、すべてのパラメータにより影響される。上記で概説した非チンパンジー霊長動物を対象とする前臨床動物試験において決定されうる、異種間特異性を示す二重特異性単鎖抗体の薬物動態パラメータについてはまた、例えば、Ｓｃｈｌｅｒｅｔｈらによる刊行物（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０（２００５）、１〜１２）でも説明されている。
【０２５３】
本明細書で用いられる「毒性」という用語は、有害事象または重篤な有害事象において発現する、薬物の毒性作用を指す。これらの副作用事象は、投与後における薬物の全身における忍容性の欠如を指す可能性もあり、かつ／または局所的な忍容性の欠如を指す可能性もありうる。
【０２５４】
本明細書で用いられる「安全性」、「ｉｎ  ｖｉｖｏにおける安全性」、または「忍容性」という用語は、薬物の投与（局所的な忍容）後において、また、長期間にわたる薬物の適用期間中において、直接的に重篤な有害事象を誘発することのない薬物投与を規定する。
【０２５５】
「安全性」、「ｉｎ  ｖｉｖｏにおける安全性」、または「忍容性」は、例えば、治療期間および追跡期間において、定期的な間隔で評価することができる。測定には、臨床評価、例えば、内臓症状、および検査値異常のスクリーニングが含まれる。臨床評価を実施し、ＮＣＩ−ＣＴＣ基準および／またはＭｅｄＤＲＡ基準に従い、正常所見からの逸脱を記録／コード化することができる。内臓症状には、例えば、有害事象についての「共通用語法基準」ｖ３．０（ＣＴＣＡＥ）に記載される、アレルギー症状／免疫学的症状、血液症状／骨髄症状、心不整脈、凝血などの基準が含まれうる。検査されうる検査パラメータには、例えば、血液学パラメータ、臨床化学パラメータ、凝血プロファイルパラメータ、および尿検査パラメータ、ならびに、血清、血漿、リンパ、または髄液（ｓｐｉｎａｌ  ｆｌｕｉｄ、ｌｉｑｕｏｒ）など、他の体液の検査が含まれる。したがって、安全性は、例えば、身体所見、造影法（すなわち、超音波、ｘ線、ＣＴスキャン、磁気共鳴造影（ＭＲＩ））、技術デバイスによる他の測定（すなわち、心電図）、バイタルサインによって評価することもでき、検査パラメータを測定し、有害事象を記録することによって評価することもできる。例えば、本発明による使用および方法では、非チンパンジー霊長動物における有害事象を、組織病理学的方法および／または組織化学的方法により検査することができる。
【０２５６】
本明細書で用いられる「有効用量および非毒性用量」という用語は、主要な毒性作用なしに、または本質的にこれらなしに、病理学的細胞の枯渇、腫瘍の消失、腫瘍の退縮、または疾患の安定化をもたらすのに十分な高量の、本明細書で定義される二重特異性単鎖抗体の忍容可能な用量を指す。このような有効用量および非毒性用量は、例えば、当技術分野で説明される用量漸増研究により決定することができ、重篤な有害副作用（用量制限毒性、ＤＬＴ）を誘発する用量未満であるべきである。
【０２５７】
上記の用語はまた、例えば、「Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ｓａｆｅｔｙ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｓ６」、ＩＣＨ  Ｈａｒｍｏｎｉｓｅｄ  Ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ、ＩＣＨ  Ｓｔｅｅｒｉｎｇ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｍｅｅｔｉｎｇ、１９９７年７月１６日においても言及されている。
【０２５８】
さらに、本発明は、本発明の二重特異性単鎖抗体を含むか、または癌もしくは自己免疫疾患を予防、治療、もしくは改善するために、本発明によるプロセスに従い作製された医薬組成物に関する。
【０２５９】
ＰＳＣＡ×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体の場合、前記癌は、前立腺癌、膀胱癌、または膵臓癌であることが好ましい。
【０２６０】
ＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体の場合、前記癌は、非ホジキンリンパ腫などのＢ細胞悪性腫瘍、Ｂ細胞媒介性自己免疫疾患、またはＢ細胞枯渇であることが好ましい。
【０２６１】
ｃ−ＭＥＴ×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体の場合、前記癌（ｃａｎｃｅｒ）は、癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肉腫、神経膠芽腫／星状細胞腫、黒色腫、中皮腫、ウィルムス腫瘍、または白血病、リンパ腫、もしくは多発性骨髄腫などの造血系悪性腫瘍であることが好ましい。
【０２６２】
エンドシアリン×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体の場合、前記癌（ｃａｎｃｅｒ）は、癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）（乳癌、腎癌、肺癌、結腸直腸癌、結腸癌、膵臓中皮腫）、肉腫、および神経外胚葉性腫瘍（黒色腫、神経膠腫、神経芽細胞腫）であることが好ましい。
【０２６３】
ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体の場合、前記癌は、上皮癌または微小残存癌であることが好ましい。
【０２６４】
ＦＡＰα×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体の場合、前記癌は、上皮癌であることが好ましい。
【０２６５】
ＩＧＦ−１Ｒ×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体の場合、前記癌は、骨癌または軟組織癌（例えば、ユーイング肉腫）、乳癌、肝癌、肺癌、頭頚部癌、結腸直腸癌、前立腺癌、平滑筋肉腫、子宮頚癌および子宮内膜癌、卵巣癌、前立腺癌、ならびに膵臓癌であることが好ましい。代替的に、本明細書の上記で定義したＩＧＦ−１Ｒ×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体はまた、自己免疫疾患、好ましくは乾癬を予防、治療、または改善するのにも用いられる。
【０２６６】
前記医薬組成物は、担体、安定化剤、および／または賦形剤による適切な製剤をさらに含むことが好ましい。
【０２６７】
本発明のさらなる態様は、疾患を予防、治療、または改善する医薬組成物を調製するための、本明細書の上記で定義したか、または本発明の上記で定義したプロセスに従い作製される、二重特異性単鎖抗体分子／ポリペプチドの使用にも関する。前記疾患は、癌または自己免疫疾患であることが好ましい。
【０２６８】
本明細書の上記で定義したＰＳＣＡ×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体分子／ポリペプチドの場合、前記癌は、前立腺癌、膀胱癌、または膵臓癌であることがより好ましい。
【０２６９】
本明細書の上記で定義したＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体分子／ポリペプチドの場合、前記癌は、非ホジキンリンパ腫などのＢ細胞悪性腫瘍、Ｂ細胞媒介性自己免疫疾患、またはＢ細胞枯渇であることがより好ましい。
【０２７０】
本明細書の上記で定義したｃ−ＭＥＴ×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体分子／ポリペプチドの場合、前記癌（ｃａｎｃｅｒ）は、癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肉腫、神経膠芽腫／星状細胞腫、黒色腫、中皮腫、ウィルムス腫瘍、または白血病、リンパ腫、もしくは多発性骨髄腫などの造血系悪性腫瘍であることがより好ましい。
【０２７１】
本明細書の上記で定義したエンドシアリン×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体分子／ポリペプチドの場合、前記癌（ｃａｎｃｅｒ）は、癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）（乳癌、腎癌、肺癌、結腸直腸癌、結腸癌、膵臓中皮腫）、肉腫、および神経外胚葉性腫瘍（黒色腫、神経膠腫、神経芽細胞腫）であることがより好ましい。
【０２７２】
本明細書の上記で定義したＥｐＣＡＭ×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体分子／ポリペプチドの場合、前記癌は、上皮癌または微小残存癌であることがより好ましい。
【０２７３】
本明細書の上記で定義したＦＡＰα×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体分子／ポリペプチドの場合、前記癌は、上皮癌であることがより好ましい。
【０２７４】
本明細書の上記で定義したＩＧＦ−１Ｒ×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体分子／ポリペプチドの場合、前記癌は、骨癌または軟組織癌（例えば、ユーイング肉腫）、乳癌、肝癌、肺癌、頭頚部癌、結腸直腸癌、前立腺癌、平滑筋肉腫、子宮頚癌および子宮内膜癌、卵巣癌、前立腺癌、ならびに膵臓癌であることがより好ましい。代替的に、本明細書の上記で定義したＩＧＦ−１Ｒ×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体分子／ポリペプチドはまた、自己免疫疾患、好ましくは乾癬を予防、治療、または改善するのにも用いられる。
【０２７５】
本発明の二重特異性単鎖抗体分子の使用についての別の好ましい実施形態において、前記医薬組成物は、さらなる薬物と組み合わせて、すなわち、共治療の一部として投与するのに適する。前記共治療において、活性薬剤は、場合によって、本発明の二重特異性単鎖抗体分子と同じ医薬組成物中に包含される場合もあり、別個の医薬組成物中に包含される場合もある。この後者の場合、前記別個の医薬組成物は、本発明の二重特異性単鎖抗体分子を含む前記医薬組成物の投与前において、この投与と同時に、またはこの投与後において投与するのに適する。さらなる薬物または医薬組成物は、非タンパク質性化合物の場合もあり、タンパク質性化合物の場合もある。さらなる薬物がタンパク質性化合物の場合、タンパク質性化合物は、免疫エフェクター細胞に対する活性化シグナルをもたらすことができると有利である。
【０２７６】
前記タンパク質性化合物または非タンパク質性化合物は、本発明の二重特異性単鎖抗体分子、本明細書の上記で定義した核酸分子、本明細書の上記で定義したベクター、または本明細書の上記で定義した宿主と同時に投与しても同時に投与しなくてもよいことが好ましい。
【０２７７】
本発明の別の態様は、それを必要とする対象において疾患を予防、治療、または改善する方法であって、有効量の、本発明の医薬組成物を投与するステップを含む方法に関する。前記疾患は、癌または自己免疫疾患であることが好ましい。
【０２７８】
本明細書の上記で定義したＰＳＣＡ×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体分子／ポリペプチドの場合、前記癌は、前立腺癌、膀胱癌、または膵臓癌であることがより好ましい。
【０２７９】
本明細書の上記で定義したＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体分子／ポリペプチドの場合、前記癌は、非ホジキンリンパ腫などのＢ細胞悪性腫瘍、Ｂ細胞媒介性自己免疫疾患、またはＢ細胞枯渇であることがより好ましい。
【０２８０】
本明細書の上記で定義したｃ−ＭＥＴ×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体分子／ポリペプチドの場合、前記癌（ｃａｎｃｅｒ）は、癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肉腫、神経膠芽腫／星状細胞腫、黒色腫、中皮腫、ウィルムス腫瘍、または白血病、リンパ腫、もしくは多発性骨髄腫などの造血系悪性腫瘍であることがより好ましい。
【０２８１】
本明細書の上記で定義したエンドシアリン×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体分子／ポリペプチドの場合、前記癌（ｃａｎｃｅｒ）は、癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）（乳癌、腎癌、肺癌、結腸直腸癌、結腸癌、膵臓中皮腫）、肉腫、および神経外胚葉性腫瘍（黒色腫、神経膠腫、神経芽細胞腫）であることがより好ましい。
【０２８２】
本明細書の上記で定義したＥｐＣＡＭ×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体分子／ポリペプチドの場合、前記癌は、上皮癌または微小残存癌であることがより好ましい。
【０２８３】
本明細書の上記で定義したＦＡＰα×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体分子／ポリペプチドの場合、前記癌は、上皮癌であることがより好ましい。
【０２８４】
本明細書の上記で定義したＩＧＦ−１Ｒ×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体分子／ポリペプチドの場合、前記癌は、骨癌または軟組織癌（例えば、ユーイング肉腫）、乳癌、肝癌、肺癌、頭頚部癌、結腸直腸癌、前立腺癌、平滑筋肉腫、子宮頚癌および子宮内膜癌、卵巣癌、前立腺癌、ならびに膵臓癌であることがより好ましい。代替的に、本明細書の上記で定義したＩＧＦ−１Ｒ×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体分子／ポリペプチドはまた、自己免疫疾患、好ましくは乾癬を予防、治療、または改善するのにも用いられる。
【０２８５】
本発明の方法の別の好ましい実施形態において、前記医薬組成物は、さらなる薬物と組み合わせて、すなわち、共治療の一部として投与するのに適する。前記共治療において、活性薬剤は、場合によって、本発明の二重特異性単鎖抗体分子と同じ医薬組成物中に包含される場合もあり、別個の医薬組成物中に包含される場合もある。この後者の場合、前記別個の医薬組成物は、本発明の二重特異性単鎖抗体分子を含む前記医薬組成物の投与前において、この投与と同時に、またはこの投与後において投与するのに適する。さらなる薬物または医薬組成物は、非タンパク質性化合物の場合もあり、タンパク質性化合物の場合もある。さらなる薬物がタンパク質性化合物の場合、タンパク質性化合物は、免疫エフェクター細胞に対する活性化シグナルをもたらすことができると有利である。
【０２８６】
前記タンパク質性化合物または非タンパク質性化合物は、本発明の二重特異性単鎖抗体分子、本明細書の上記で定義した核酸分子、本明細書の上記で定義したベクター、または本明細書の上記で定義した宿主と同時に投与しても同時に投与しなくてもよいことが好ましい。
【０２８７】
上記で説明した本発明の方法の場合、前記対象はヒトであることが好ましい。
【０２８８】
さらなる態様において、本発明は、本発明の二重特異性単鎖抗体分子、本発明の核酸分子、本発明のベクター、または本発明の宿主を含むキットに関する。
【０２８９】
これらおよび他の実施形態は、本発明についての説明および実施例により開示および包含される。免疫学における組換えの技法および方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、第３版、２００１；Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ、「Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ：Ｔｈｅ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｓｏｕｒｃｅｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９７；Ｇｏｌｅｍｉｓ、「Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：Ａ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、２００２において説明されている。本発明に従い用いられる抗体、方法、使用、および化合物のうちのいずれか１つに関するさらなる文献は、例えば、電子デバイスを用いる公共の図書館および公開データベースから検索することができる。例えば、インターネット上で閲覧できる公開データベースである「Ｍｅｄｌｉｎｅ」は、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＰｕｂＭｅｄ／ｍｅｄｌｉｎｅ．ｈｔｍｌにおいて用いることができる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／などのさらなるデータベースおよびアドレス、またはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｍｂｌ．ｄｅ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌのＥＭＢＬサービスによるホームページにおいて一覧されるさらなるデータベースおよびアドレスは当業者に知られており、これらはまた、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｏｏｇｌｅ．ｃｏｍを用いても入手することができる。
【図面の簡単な説明】
【０２９０】
【図１】異種可溶性タンパク質に対する、霊長動物ＣＤ３イプシロンのＮ末端におけるアミノ酸１〜２７による融合体を示す図である。
【図２】一過性にトランスフェクトした２９３細胞の上清中において、ヒトＩｇＧ１のヒンジ部分およびＦｃガンマ部分、ならびにＣ末端における６ヒスチジンタグに融合させた、成熟ヒトＣＤ３イプシロン鎖のＮ末端におけるアミノ酸１〜２７からなる構築物の存在を検出するＥＬＩＳＡアッセイにおいて測定された、４連試料の平均吸光値を示す図である。「ヒトＣＤ３イプシロンの２７アミノ酸」と表示された第１のカラムは、該構築物の平均吸光値を示し、「非関与上清」と表示された第２のカラムは、陰性対照としての非関与構築物をトランスフェクトした２９３細胞の上清についての平均値を示す。該構築物について得られる値を、陰性対照について得られる値と比較する図である。
【図３】ヒトＩｇＧ１のヒンジ部分およびＦＣガンマ部分、ならびにＣ末端におけるＨｉｓ６タグに融合させた、成熟ヒトＣＤ３イプシロン鎖のＮ末端におけるアミノ酸１〜２７を含む構築物に対して、ペリプラズム内において発現させた単鎖抗体の粗調製物の形態にある、異種間特異的抗ＣＤ３結合分子の結合を検出するＥＬＩＳＡアッセイにおいて測定された、４連試料の平均吸光値を示す図である。カラムは、左から右へ、Ａ２Ｊ ＨＬＰ、Ｉ２Ｃ  ＨＬＰ、Ｅ２Ｍ  ＨＬＰ、Ｆ７Ｏ  ＨＬＰ、Ｇ４Ｈ  ＨＬＰ、Ｈ２Ｃ  ＨＬＰ、Ｅ１Ｌ  ＨＬＰ、Ｆ１２Ｑ  ＨＬＰ、Ｆ６Ａ  ＨＬＰ、およびＨ１Ｅ  ＨＬＰと指定した特異性抗体についての平均吸光値を示す。「陰性対照」と表示された右端カラムは、陰性対照としてのマウス抗ヒトＣＤ３抗体の単鎖調製物についての平均値を示す。抗ＣＤ３特異性抗体について得られる値を、陰性対照について得られる値と比較することにより、成熟ヒトＣＤ３イプシロン鎖のＮ末端におけるアミノ酸１〜２７に対する、抗ＣＤ３特異性抗体の強力な結合が明確に示される。
【図４】異種膜結合タンパク質に対する、霊長動物ＣＤ３イプシロンのＮ末端におけるアミノ酸１〜２７による融合体を示す図である。
【図５】カニクイザルＥｐＣＡＭ、ならびにヒトＣＤ３イプシロン鎖、マーモセットＣＤ３イプシロン鎖、タマリンＣＤ３イプシロン鎖、リスザルＣＤ３イプシロン鎖、および家畜ブタＣＤ３イプシロン鎖のそれぞれのＮ末端におけるアミノ酸１〜２７からなる、組換え膜貫通融合タンパク質の存在を検出するＦＡＣＳアッセイにおいて調べた異なるトランスフェクタントについて、ヒストグラムの重ね合わせを示す図である。左から右へ、また、上から下へのヒストグラムの重ね合わせにより、ヒトの２７マー、マーモセットの２７マー、タマリンの２７マー、リスザルの２７マー、およびブタの２７マーのそれぞれを含む構築物を発現するトランスフェクタントについての結果が示される。個々の重ね合わせにおいて、細線は、陰性対照として、抗Ｆｌａｇ  Ｍ２抗体の代わりに２％ＦＣＳを伴うＰＢＳと共にインキュベートした試料を表わし、太線は、抗Ｆｌａｇ  Ｍ２抗体と共にインキュベートした試料を示す。各構築物について、ヒストグラムの重ね合わせにより、トランスフェクタントに対する抗Ｆｌａｇ  Ｍ２抗体の結合が示され、これにより、該トランスフェクタント上における組換え構築物の発現が明確に裏付けられる。
【図６】カニクイザルＥｐＣＡＭに融合させた、ヒトＣＤ３イプシロン鎖、マーモセットＣＤ３イプシロン鎖、タマリンＣＤ３イプシロン鎖、およびリスザルＣＤ３イプシロン鎖のそれぞれのＮ末端におけるアミノ酸１〜２７に対して、ペリプラズム内において発現させた単鎖抗体の粗調製物の形態にある、異種間特異的抗ＣＤ３結合分子の結合を検出するＦＡＣＳアッセイにおいて調べた異なるトランスフェクタントについて、ヒストグラムの重ね合わせを示す図である。  図６Ａ：左から右へ、また、上から下へのヒストグラムの重ね合わせにより、それぞれ、Ｈ２Ｃ  ＨＬＰ、Ｆ１２Ｑ  ＨＬＰ、Ｅ２Ｍ  ＨＬＰ、およびＧ４Ｈ  ＨＬＰと指定したＣＤ３特異性結合分子により調べた、ヒトの２７マーを含むＣＤ３  １〜２７−ＥｐＣＡＭを発現するトランスフェクタントについての結果が示される。  図６Ｂ：左から右へ、また、上から下へのヒストグラムの重ね合わせにより、それぞれ、Ｈ２Ｃ  ＨＬＰ、Ｆ１２Ｑ  ＨＬＰ、Ｅ２Ｍ  ＨＬＰ、およびＧ４Ｈ  ＨＬＰと指定したＣＤ３特異性結合分子により調べた、マーモセットの２７マーを含むＣＤ３  １〜２７−ＥｐＣＡＭを発現するトランスフェクタントについての結果が示される。  図６Ｃ：左から右へ、また、上から下へのヒストグラムの重ね合わせにより、それぞれ、Ｈ２Ｃ  ＨＬＰ、Ｆ１２Ｑ  ＨＬＰ、Ｅ２Ｍ  ＨＬＰ、およびＧ４Ｈ  ＨＬＰと指定したＣＤ３特異性結合分子により調べた、タマリンの２７マーを含むＣＤ３  １〜２７−ＥｐＣＡＭを発現するトランスフェクタントについての結果が示される。  図６Ｄ：左から右へ、また、上から下へのヒストグラムの重ね合わせにより、それぞれ、Ｈ２Ｃ  ＨＬＰ、Ｆ１２Ｑ  ＨＬＰ、Ｅ２Ｍ  ＨＬＰ、およびＧ４Ｈ  ＨＬＰと指定したＣＤ３特異性結合分子により調べた、リスザルの２７マーを含むＣＤ３  １〜２７−ＥｐＣＡＭを発現するトランスフェクタントについての結果が示される。  図６Ｅ：左から右へ、また、上から下へのヒストグラムの重ね合わせにより、それぞれ、Ｈ２Ｃ  ＨＬＰ、Ｆ１２Ｑ  ＨＬＰ、Ｅ２Ｍ  ＨＬＰ、およびＧ４Ｈ  ＨＬＰと指定したＣＤ３特異性結合分子により調べた、ブタの２７マーを含むＣＤ３  １〜２７−ＥｐＣＡＭを発現するトランスフェクタントについての結果が示される。個々の重ね合わせにおいて、細線は、陰性対照としてのマウス抗ヒトＣＤ３抗体による単鎖調製物と共にインキュベートした試料を表わし、太線は、表示される各抗ＣＤ３結合分子と共にインキュベートした試料を示す。ブタの２７マーによるトランスフェクタントに対する結合の欠如、また、図５に示される構築物の発現レベルを考慮すると、ヒストグラムの重ね合わせにより、カニクイザルＥｐＣＡＭに融合させた、ヒトＣＤ３イプシロン鎖、マーモセットＣＤ３イプシロン鎖、タマリンＣＤ３イプシロン鎖、およびリスザルＣＤ３イプシロン鎖のそれぞれのＮ末端におけるアミノ酸１〜２７を含む組換え膜貫通融合タンパク質を発現する細胞に対する、完全に異種間特異的なヒト二重特異性単鎖抗体による、被験抗ＣＤ３特異性抗体の特異的で強力な結合が示され、したがって、複数霊長動物に対する、抗ＣＤ３結合分子の異種間特異性が示される。
【図７】トランスフェクトされたマウスＥＬ４  Ｔ細胞上において、ヒトＣＤ３イプシロンを検出するためのＦＡＣＳアッセイを示す図である。グラフ解析は、ヒストグラムの重ね合わせを示す。太線は、抗ヒトＣＤ３抗体であるＵＣＨＴ−１と共にインキュベートしたトランスフェクト細胞を示す。細線は、マウスＩｇＧ１アイソタイプ対照と共にインキュベートした細胞を表わす。抗ＣＤ３抗体であるＵＣＨＴ１は、トランスフェクトされたマウスＥＬ４  Ｔ細胞の細胞表面上における、ヒトＣＤ３イプシロン鎖の発現を明確に示す。
【図８】アラニン走査実験における、アラニン突然変異体に対する異種間特異的抗ＣＤ３抗体の結合を示す図である。個々の図において、カラムは、左から右へ、野生型のトランスフェクタント（ＷＴ）について、また、１〜２７位のすべてのアラニン突然変異体について、対数スケールの任意単位により計算した結合値を示す。結合値は、以下の式：
【数１】
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【図９】Ｎ末端においてＨｉｓ６タグを伴うヒトＣＤ３、およびこれを伴わないヒトＣＤ３に対する、異種間特異的抗ＣＤ３結合分子であるＨ２Ｃ  ＨＬＰの結合を検出するＦＡＣＳアッセイを示す図である。野生型のヒトＣＤ３イプシロン鎖（左側のヒストグラム）、または異種間特異的な結合分子であるＨ２Ｃ  ＨＬＰの結合を検出するＦＡＣＳアッセイにおいて調べた、Ｎ末端においてＨｉｓ６タグを伴うヒトＣＤ３イプシロン鎖（右側のヒストグラム）をトランスフェクトしたＥＬ４細胞株について実施した、ヒストグラムの重ね合わせを示す図である。陰性対照としての適切なアイソタイプ対照（細線）、陽性対照としての抗ヒトＣＤ３抗体であるＵＣＨＴ−１（点線）、およびキメラＩｇＧ分子の形態にある異種間特異的抗ＣＤ３結合分子であるＨ２Ｃ  ＨＬＰ（太線）と共に試料をインキュベートした。ヒストグラムの重ね合わせは、ＵＣＨＴ−１抗体が、アイソタイプ対照と比較して、両方のトランスフェクタントに対して同等に結合することを示し、これにより、両方の組換え構築物の発現が裏付けられる。ヒストグラムの重ね合わせはまた、抗ＣＤ３結合分子であるＨ２Ｃ  ＨＬＰは、野生型のヒトＣＤ３イプシロン鎖だけに結合し、Ｈｉｓ６−ヒトＣＤ３イプシロン鎖には結合しないことも示す。これらの結果により、異種間特異的抗ＣＤ３結合分子であるＨ２Ｃ  ＨＬＰの結合には、フリーなＮ末端が不可欠であることが裏付けられる。
【図１０】ＦＡＣＳによる、ヒトＭＣＳＰ  Ｄ３をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋  Ｔ細胞株であるＨＰＢ−ＡＬＬ、カニクイザルＭＣＳＰ  Ｄ３をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞、およびマカクザルＴ細胞株である４１１９ＬｎＰｘに対する、指定の異種間特異的二重特異性単鎖構築物の結合についての解析を示す図である。ＦＡＣＳによる染色は、実施例１０で説明する通りに実施する。太線は、２μｇ／ｍｌの精製タンパク質と共にインキュベートし、その後、抗ヒス抗体、また、ＰＥで標識化した検出抗体と共にインキュベートした細胞を表わす。細線によるヒストグラムは、陰性対照：抗ヒス抗体および検出抗体だけと共にインキュベートした細胞を示す。
【図１１】ＦＡＣＳによる、ヒトＭＣＳＰ  Ｄ３をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋  Ｔ細胞株であるＨＰＢ−ＡＬＬ、カニクイザルＭＣＳＰ  Ｄ３をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞、およびマカクザルＴ細胞株である４１１９ＬｎＰｘに対する、指定の異種間特異的二重特異性単鎖構築物の結合についての解析を示す図である。ＦＡＣＳによる染色は、実施例１０で説明する通りに実施する。太線は、２μｇ／ｍｌの精製タンパク質と共にインキュベートし、その後、抗ヒス抗体、また、ＰＥで標識化した検出抗体と共にインキュベートした細胞を表わす。細線によるヒストグラムは、陰性対照：抗ヒス抗体および検出抗体だけと共にインキュベートした細胞を示す。
【図１２】ＦＡＣＳによる、ヒトＭＣＳＰ  Ｄ３をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋  Ｔ細胞株であるＨＰＢ−ＡＬＬ、カニクイザルＭＣＳＰ  Ｄ３をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞、およびマカクザルＴ細胞株である４１１９ＬｎＰｘに対する、指定の異種間特異的二重特異性単鎖構築物の結合についての解析を示す図である。ＦＡＣＳによる染色は、実施例１０で説明する通りに実施する。太線は、２μｇ／ｍｌの精製タンパク質と共にインキュベートし、その後、抗ヒス抗体、また、ＰＥで標識化した検出抗体と共にインキュベートした細胞を表わす。細線によるヒストグラムは、陰性対照：抗ヒス抗体および検出抗体だけと共にインキュベートした細胞を示す。
【図１３】指定の異種間特異的ＭＣＳＰ特異性単鎖構築物により、表示の標的細胞株を再指向するように誘導された細胞傷害活性を示す図である。Ａ）刺激ヒトＣＤ４−／ＣＤ５６−ＰＢＭＣをエフェクター細胞として用い、ヒトＭＣＳＰ  Ｄ３をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を標的細胞として用いる。Ｂ）マカクザルＴ細胞株である４１１９ＬｎＰｘをエフェクター細胞として用い、カニクイザルＭＣＳＰ  Ｄ３をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を標的細胞として用いる。アッセイは、実施例１１で説明する通りに実施する。
【図１４】指定の異種間特異的ＭＣＳＰ特異性単鎖構築物により、表示の標的細胞株を再指向するように誘導された細胞傷害活性を示す図である。Ａ）およびＢ）マカクザルＴ細胞株である４１１９ＬｎＰｘをエフェクター細胞として用い、カニクイザルＭＣＳＰＤ３をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を標的細胞として用いる。アッセイは、実施例１１で説明する通りに実施する。
【図１５】指定の異種間特異的ＭＣＳＰ特異性単鎖構築物により、表示の標的細胞株を再指向するように誘導された細胞傷害活性を示す図である。Ａ）およびＢ）刺激ヒトＣＤ４−／ＣＤ５６−ＰＢＭＣをエフェクター細胞として用い、ヒトＭＣＳＰ  Ｄ３をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を標的細胞として用いる。アッセイは、実施例１１で説明する通りに実施する。
【図１６】指定の異種間特異的ＭＣＳＰ特異性単鎖構築物により、表示の標的細胞株を再指向するように誘導された細胞傷害活性を示す図である。Ａ）刺激ヒトＣＤ４−／ＣＤ５６−ＰＢＭＣをエフェクター細胞として用い、ヒトＭＣＳＰ  Ｄ３をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を標的細胞として用いる。Ｂ）マカクザルＴ細胞株である４１１９ＬｎＰｘをエフェクター細胞として用い、カニクイザルＭＣＳＰ  Ｄ３をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を標的細胞として用いる。アッセイは、実施例１１で説明する通りに実施する。
【図１７】指定の異種間特異的ＭＣＳＰ特異性単鎖構築物により、表示の標的細胞株を再指向するように誘導された細胞傷害活性を示す図である。Ａ）刺激ヒトＣＤ４−／ＣＤ５６−ＰＢＭＣをエフェクター細胞として用い、ヒトＭＣＳＰ  Ｄ３をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を標的細胞として用いる。Ｂ）マカクザルＴ細胞株である４１１９ＬｎＰｘをエフェクター細胞として用い、カニクイザルＭＣＳＰ  Ｄ３をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を標的細胞として用いる。アッセイは、実施例１１で説明する通りに実施する。
【図１８】５０％ヒト血清と共に、それぞれ３７℃および４℃で２４時間にわたりインキュベートした指定の単鎖構築物試料、または細胞傷害作用試験の直前に５０％ヒト血清を添加するか、もしくは血清を添加せずにインキュベートした指定の単鎖構築物試料により誘導される細胞傷害活性を測定することにより調べた、ＭＣＳＰおよびＣＤ３に対する異種間特異的二重特異性単鎖抗体の血漿安定性を示す図である。ヒトＭＣＳＰをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を標的細胞株として用い、刺激ヒトＣＤ４−／ＣＤ５６−ＰＢＭＣをエフェクター細胞として用いる。アッセイは、実施例１２で説明する通りに実施する。
【図１９】循環ＣＤ１９陽性標的Ｂ細胞（黒色三角）を本質的に有さないＢ−ＮＨＬ患者（表４の患者番号１、７、２３、３０、３１、および３３）の末梢血中における絶対Ｔ細胞カウント（白色四角）が、環境に依存するＣＤ３エピトープを認識する、従来のＣＤ３結合分子であるＣＤ１９×ＣＤ３による静脈内注入の開始期において、初め減少して回復する（すなわち、再分布する）ことを示す図である。絶対細胞カウントは、血液マイクロリットル当たり細胞１０００個の単位で示す。最初のデータ点は、注入開始直前におけるベースラインのカウントを示す。患者番号の後のカッコ内に、ＣＤ１９×ＣＤ３の用量を示す。
【図２０】（Ａ）循環ＣＤ１９陽性標的Ｂ細胞（黒色三角）を有さず、５μｇ／ｍ２／２４時間の開始用量で１日間にわたる、ＣＤ１９×ＣＤ３による持続的静脈内注入の後、１５μｇ／ｍ２／２４時間へと急激に用量を増大させたところ、ＣＮＳ症状を発生させたＢ−ＮＨＬ患者１９（表４）における、Ｔ細胞（白色四角）再分布の反復を示す図である。絶対細胞カウントは、血液マイクロリットル当たり細胞１０００個の単位で示す。最初のデータ点は、注入開始直前におけるベースラインのカウントを示す。５ｕｇ／ｍ２／２４時間で治療を開始したことにより再分布の最初のエピソードが誘発され、そこから循環Ｔ細胞が回復した後で、５μｇ／ｍ２／２４時間から１５μｇ／ｍ２／２４時間へと段階的に用量を増加させたところ、錯乱および失見当を中心とするＣＮＳ症状の発生と関連するＴ細胞再分布の第２のエピソードが誘発された。（Ｂ）１．５μｇ／ｍ２でＣＤ１９×ＣＤ３による静脈内ボーラス注入を反復したところ、ＣＮＳ症状を発生させたＢ−ＮＨＬ患者におけるＴ細胞再分布の反復を示す図である。絶対細胞カウントは、血液マイクロリットル当たり細胞１０００個の単位で示す。各ボーラス投与の注入時間は、２〜４時間ずつであった。垂直の矢印は、ボーラス注入の開始を示す。各ボーラス投与の開始時におけるデータ点は、ボーラス注入開始直前におけるＴ細胞カウントを示す。ボーラス注入を行うたびに、Ｔ細胞再分布のエピソードが誘発され、その後、次回のボーラス注入を行う前に、Ｔ細胞カウントが回復した。この患者においては、最終的に、Ｔ細胞再分布の３回目のエピソードに関連してＣＮＳ症状が発生した。
【図２１】循環ＣＤ１９陽性標的Ｂ細胞（黒色三角）を有さないＢ−ＮＨＬ患者２０（表４）において、ランプでＣＤ１９×ＣＤ３の注入を開始したとき、すなわち、治療の最初の２４時間において流速をほぼ０μｇ／ｍ２／２４時間から１５μｇ／ｍ２／２４時間へと均等に漸増させたときの、Ｔ細胞（白色四角）再分布の複雑なパターンを示す図である。絶対細胞カウントは、血液マイクロリットル当たり細胞１０００個の単位で示す。最初のデータ点は、注入開始直前におけるベースラインのカウントを示す。患者番号の後のカッコ内に、ＣＤ１９×ＣＤ３の用量を示す。ＣＤ１９×ＣＤ３に対する初回の曝露により最初の再分布が誘発された後、Ｔ細胞は循環血中に再出現するが、ランプ相におけるＣＤ１９×ＣＤ３レベルがなおも上昇することにより、Ｔ細胞は部分的に循環血から再消滅するように誘導される。
【図２２】著明数の循環ＣＤ１９陽性標的Ｂ（リンパ腫）細胞（黒色三角）を有するＢ−ＮＨＬ患者１３（表４）を、ＣＤ１９×ＣＤ３により治療したときの、Ｔ細胞カウントおよびＢ細胞カウントを示す図である。絶対細胞カウントは、血液マイクロリットル当たり細胞１０００個の単位で示す。最初のデータ点は、注入開始直前におけるベースラインのカウントを示す。患者番号の後のカッコ内に、ＣＤ１９×ＣＤ３の用量を示す。ＣＤ１９×ＣＤ３の注入を開始すると、Ｔ細胞（白色四角）は循環から完全に消滅し、循環ＣＤ１９陽性Ｂ（リンパ腫）細胞（黒色三角）が末梢血から枯渇するまで再出現しない。
【図２３】循環ＣＤ１９陽性標的Ｂ細胞（黒色三角）を本質的に有さず、その安定化に必要とされるＨＳＡを添加せずにＣＤ１９×ＣＤ３の注入を開始したところ、ＣＮＳ症状を発生させたＢ−ＮＨＬ患者２４（表４）における、Ｔ細胞（白色四角）再分布の反復を示す図である。循環Ｔ細胞が、最初の再分布から初めて回復した後で、安定化のためのＨＳＡを欠くため、薬物流動が不均等であることにより、錯乱および失見当を中心とするＣＮＳ症状の発生と関連する、Ｔ細胞再分布の第２のエピソードが誘発された。薬物を安定化させるために添加されるＨＳＡを含有するＣＤ１９×ＣＤ３溶液により、同じ患者に適正な形で注入を再開したところ、Ｔ細胞再分布の反復は観察されず（下方のパネル）、患者が再度ＣＮＳ症状を発生させることはなかった。絶対細胞カウントは、血液マイクロリットル当たり細胞１０００個の単位で示す。最初のデータ点は、注入開始直前におけるベースラインのカウントを示す。患者番号の後のカッコ内に、ＣＤ１９×ＣＤ３の用量を示す。
【図２４】環境に依存しないＣＤ３エピトープに対する一価結合により誘導される、内皮細胞に対するＴ細胞付着のモデルを示す図である。従来のＣＤ３結合分子が、ＣＤ３イプシロン上における、その環境に依存するエピトープと一価的に相互作用すると、ＣＤ３の立体構造においてアロステリック変化が生じた後で、Ｎｃｋ２がＣＤ３イプシロンの細胞質ドメインへと動員されうる（Ｇｉｌら（２００２）、Ｃｅｌｌ  １０９、９０１）。Ｎｃｋ２は、ＰＩＮＣＨおよびＩＬＫ（Ｌｅｇａｔｅら（２００６）、Ｎａｔ  ＲｅｖＭｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ７、２０）によりインテグリンに直接的に連結されるため、従来のＣＤ３結合分子（実施例１３のＣＤ１９×ＣＤ３など）が、ＣＤ３イプシロン上においてその環境に依存するエピトープに一価的に結合することにより、ＣＤ３立体構造がアロステリック変化し、その後、ＣＤ３イプシロンの細胞質ドメインにＮｃｋ２が動員されると、内から外へのシグナル伝達を介して、Ｔ細胞表面上におけるインテグリンが、それらのより付着性のアイソフォームへと一過性に転換されることにより、内皮細胞に対するＴ細胞の付着性が増大しうる。
【図２５】実施例１４で説明する、カニクイザルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ研究に用いられる被験物質である、ＣＤ３３−ＡＦ５  ＶＨ−ＶＬ×Ｉ２Ｃ  ＶＨ−ＶＬの細胞傷害活性を示す図である。ＣＤ３３−ＡＦ５  ＶＨ−ＶＬ×Ｉ２Ｃ  ＶＨ−ＶＬの濃度を増大させる、標準的な５１クロム放出アッセイにおいて、ＣＤ３３陽性標的細胞の特異的溶解を決定した。アッセイ時間は１８時間であった。マカクザルＴ細胞株である４１１９ＬｎＰｘを、エフェクター細胞の供給源として用いた。カニクイザルＣＤ３３をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を、標的細胞として用いた。エフェクター細胞対標的細胞比（Ｅ：Ｔ比）は１０：１であった。最大半量の標的細胞溶解に必要なＣＤ３３−ＡＦ５  ＶＨ−ＶＬ×Ｉ２Ｃ  ＶＨ−ＶＬの濃度（ＥＣ５０）は、２．７ｎｇ／ｍｌと決定された。
【図２６】（Ａ）実施例１４で説明する通り、ＣＤ３３−ＡＦ５  ＶＨ−ＶＬ×Ｉ２Ｃ  ＶＨ−ＶＬの持続的な静脈内注入により、カニクイザルの末梢血から、ＣＤ３３陽性単球が用量依存的かつ時間依存的に枯渇することを示す図である。用量レベルにつき２匹ずつのカニクイザルの各々について、カラムの上方に示される治療期間の後における、循環ＣＤ３３陽性単球絶対カウントのベースライン（すなわち、１００％）に対する比率を示す。用量レベル（すなわち、注入の流速）をカラムの下方に示す。３０μｇ／ｍ２／２４時間の用量で７日間にわたり治療された動物１および２では、循環ＣＤ３３陽性単球の枯渇が観察されなかった。６０μｇ／ｍ２／２４時間の用量で７日間にわたり治療された動物３および４では、循環ＣＤ３３陽性単球カウントが、ベースラインのそれぞれ６８％および４０％まで低下した。２４０μｇ／ｍ２／２４時間では、３日間の治療後において、循環ＣＤ３３陽性単球が、末梢血からほぼ完全に枯渇した（動物５および６）。１０００μｇ／ｍ２／２４時間では、末梢血からの循環ＣＤ３３陽性単球の枯渇が、既に１日間の治療後に完了した（動物７および８）。（Ｂ）２匹のカニクイザルの末梢血中において、１２０μｇ／ｍ２／２４時間で１４日間にわたりＣＤ３３−ＡＦ５  ＶＨ−ＶＬ×Ｉ２Ｃ  ＶＨ−ＶＬを持続的に注入したときの、Ｔ細胞カウントおよびＣＤ３３単球カウントの推移を示す図である。絶対細胞カウントは、血液マイクロリットル当たり細胞１０００個の単位で示す。最初のデータ点は、注入開始直前におけるベースラインのカウントを示す。注入を開始すると、最初の１２時間で、初期におけるＣＤ３３単球の動員が生じ、その後、注入がさらに経過するにつれて、末梢血中のＣＤ３３単球（黒色三角）は、それぞれのベースラインカウントと比べて、３分の２（動物１０）および５０％（動物９）枯渇する。循環Ｔ細胞カウント（白色四角）は、初期における限定的な減少の後、なおも循環ＣＤ３３陽性単球標的細胞が存在するうちに回復する。
【図２７】実施例１５で説明する、カニクイザルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ研究に用いられる被験物質である、ＭＣＳＰ−Ｇ４  ＶＨ−ＶＬ×Ｉ２Ｃ  ＶＨ−ＶＬの細胞傷害活性を示す図である。ＭＣＳＰ−Ｇ４  ＶＨ−ＶＬ×Ｉ２Ｃ  ＶＨ−ＶＬの濃度を増大させる、標準的な５１クロム放出アッセイにおいて、ＭＣＳＰ陽性標的細胞の特異的溶解を決定した。アッセイ時間は１８時間であった。マカクザルＴ細胞株である４１１９ＬｎＰｘを、エフェクター細胞の供給源として用いた。カニクイザルＭＣＳＰをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を、標的細胞として用いた。エフェクター細胞対標的細胞比（Ｅ：Ｔ比）は１０：１であった。最大半量の標的細胞溶解に必要なＭＣＳＰ−Ｇ４  ＶＨ−ＶＬ×Ｉ２Ｃ  ＶＨ−ＶＬの濃度（ＥＣ５０）は、１．９ｎｇ／ｍｌと決定された。
【図２８】本質的に環境に依存しないＣＤ３エピトープを認識するＣＤ３結合分子であるＭＣＳＰ−Ｇ４  ＶＨ−ＶＬ×Ｉ２Ｃ  ＶＨ−ＶＬによる静脈内注入の開始期において、カニクイザル末梢血中の絶対Ｔ細胞カウントが、初期に減少し、その後回復する（すなわち、再分布する）エピソードがみられないことを示す図である。絶対細胞カウントは、血液マイクロリットル当たり細胞１０００個の単位で示す。最初のデータ点は、注入開始直前におけるベースラインのカウントを示す。患者番号の後のカッコ内に、ＭＣＳＰ−Ｇ４  ＶＨ−ＶＬ×Ｉ２Ｃ  ＶＨ−ＶＬの用量を示す。カニクイザルの循環血には、ＭＣＳＰ陽性標的細胞が不在であることが知られるので、標的細胞を介するＣＤ３の架橋形成により、Ｔ細胞再分布（すなわち、初期に絶対Ｔ細胞カウントが減少し、その後回復すること）が誘導されることはない。さらに、本質的に環境に依存しないＣＤ３エピトープを認識する、ＭＣＳＰ−Ｇ４  ＶＨ−ＶＬ×Ｉ２Ｃ  ＶＨ−ＶＬなどのＣＤ３結合分子を用いることにより、もっぱらＣＤ３結合部位との相互作用だけを介してＴ細胞が受容しうるシグナルによるＴ細胞再分布（すなわち、初期に絶対Ｔ細胞カウントが低下し、その後回復すること）の誘導を回避することもできる。
【図２９】ＦＡＣＳによる、ヒトＣＤ３３をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋  Ｔ細胞株であるＨＰＢ−ＡＬＬ、マカクザルＣＤ３３をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞、およびマカクザルＰＢＭＣのそれぞれに対する、指定の異種間特異的二重特異性単鎖構築物の結合についての解析を示す図である。ＦＡＣＳによる染色は、実施例１６．４で説明する通りに実施する。太線は、５μｇ／ｍｌの精製二重特異性単鎖構築物、または異種間特異的二重特異性構築物を発現するトランスフェクト細胞の細胞培養物上清と共にインキュベートした細胞を表わす。実線によるヒストグラムは、陰性対照を示す。トランスフェクトされなかったＣＨＯ細胞を、陰性対照として用いた。各異種間特異的二重特異性単鎖構築物について、ヒストグラムの重ね合わせにより、ヒトＣＤ３３およびマカクザルＣＤ３３、ならびにヒトＣＤ３およびマカクザルＣＤ３に対する該構築物の特異的結合が示される。
【図３０】指定の異種間特異的ＣＤ３３特異性単鎖構築物により、表示の標的細胞株を再指向するように誘導された細胞傷害活性を測定する、クロム放出アッセイの結果を示すダイアグラムである。エフェクター細胞もまた、表示の通りに用いた。アッセイは、実施例１６．５で説明する通りに実施する。各構築物が、ヒトＣＤ３３をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞、また、マカクザルＣＤ３３をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞のそれぞれに対して、ヒトおよびマカクザルのエフェクター細胞による細胞傷害活性を強力に動員することを、ダイアグラムは明確に裏付ける。
【図３１】Ｅ２９２Ｆ３  ＨＬ×Ｉ２Ｃ  ＨＬと称する異種間特異的二重特異性単鎖分子の精製をモニタリングする、ＳＤＳ  ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットを示す図である。示される通り、溶出物、細胞培養物上清（ＳＮ）、およびカラムの流過物（ＦＴ）に由来する試料を解析した。タンパク質マーカー（Ｍ）を、サイズ基準として適用した。ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲル中における、分子量５０〜６０ｋＤａの強いタンパク質バンドは、実施例１７．２で説明するワンステップの精製方法により、異種間特異的二重特異性単鎖分子が、極めて高純度まで効率的に精製されることを示す。ヒスチジン６タグを検出するウェスタンブロットにより、該溶出物中におけるタンパク質が、異種間特異的二重特異性単鎖分子と同一であることが確認される。この高感度の検出方法における流過物試料についての弱いシグナルは、該精製方法による二重特異性単鎖分子のほぼ完全な捕捉をさらに示す。
【図３２】Ｖ２０７Ｃ１２  ＨＬ×Ｈ２Ｃ  ＨＬと称する異種間特異的二重特異性単鎖分子の精製をモニタリングするＳＤＳ  ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットを示す図である。示される通り、溶出物、細胞培養物上清（ＳＮ）、およびカラムの流過物（ＦＴ）に由来する試料を解析した。サイズ基準として、タンパク質マーカー（Ｍ）を適用した。ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲル中における、分子量５０〜６０ｋＤａの強いタンパク質バンドは、実施例１７．２で説明するワンステップの精製方法により、異種間特異的二重特異性単鎖分子が、極めて高純度まで効率的に精製されることを示す。ヒスチジン６タグを検出するウェスタンブロットにより、該溶出物中におけるタンパク質が、異種間特異的二重特異性単鎖分子と同一であることが確認される。この高感度の検出方法における流過物試料に応じる弱いシグナルは、該精製方法による二重特異性単鎖分子のほぼ完仝な捕捉をさらに示す。
【図３３】ＡＦ５ＨＬ×Ｆ１２ＱＨＬと称する異種間特異的二重特異性単鎖分子の精製をモニタリングするＳＤＳ  ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットを示す図である。示される通り、溶出物、細胞培養物上清（ＳＮ）、およびカラムの流過物（ＦＴ）に由来する試料を解析した。サイズ基準として、タンパク質マーカー（Ｍ）を適用した。ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲル中における、分子量５０〜６０ｋＤａの強いタンパク質バンドは、実施例１７．２で説明するワンステップの精製方法により、異種間特異的二重特異性単鎖分子が、極めて高純度まで効率的に精製されることを示す。ヒスチジン６タグを検出するウェスタンブロットにより、該溶出物中におけるタンパク質が、異種間特異的二重特異性単鎖分子と同一であることが確認される。この高感度の検出方法における流過物試料中のシグナルは、該上清中における二重特異性単鎖分子が高濃度であるために、アフィニティーカラムが飽和することにより説明される。
【図３４】５０％マカクザル血清中におけるＡＦ５ＨＬ×Ｉ２ＣＨＬの標準曲線を示す図である。上方のダイアグラムは、実施例１８．２で説明するアッセイについて作製された標準曲線を示す。下方のダイアグラムは、５０％マカクザル血清中におけるＡＦ５ＨＬ×Ｉ２ＣＨＬの品質管理試料についての結果を示す。回収率は、高級ＱＣ試料および中級ＱＣ試料について９０％を上回り、低級ＱＣ試料についても８０％を上回る。  したがって、アッセイは、１０ｎｇ／ｍｌ〜２００ｎｇ／ｍｌ（希釈前）の範囲で、血清試料中におけるＡＦ５ＨＬ×Ｉ２ＣＨＬの検出を可能とする。
【図３５】５０％マカクザル血清中におけるＭＣＳＰ−Ｇ４  ＨＬ×Ｉ２Ｃ  ＨＬの標準曲線を示す図である。上方のダイアグラムは、実施例１８．２で説明するアッセイについて作製された標準曲線を示す。下方のダイアグラムは、５０％マカクザル血清中におけるＭＣＳＰ−Ｇ４  ＨＬ×Ｉ２Ｃ  ＨＬの品質管理試料についての結果を示す。回収率は、高級ＱＣ試料および中級ＱＣ試料について９８％を上回り、低級ＱＣ試料についても８５％を上回る。  したがって、アッセイは、１０ｎｇ／ｍｌ〜２００ｎｇ／ｍｌ（希釈前）の範囲で、血清中におけるＭＣＳＰ−Ｇ４  ＨＬ×Ｉ２Ｃ  ＨＬの検出を可能とする。
【図３６】ＦＡＣＳによる、カニクイザルＥｐＣＡＭに融合させた、指定種のＣＤ３イプシロンのＮ末端におけるアミノ酸１〜２７をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に対する、抗Ｆｌａｇ抗体の結合についての解析を示す図である。ＦＡＣＳによる染色は、実施例１９．１で説明する通りに実施した。太線は、抗Ｆｌａｇ抗体と共にインキュベートした細胞を表わす。実線によるヒストグラムは、陰性対照を示す。２％ＦＣＳを伴うＰＢＳを、陰性対照として用いた。ヒストグラムは、すべてのトランスフェクタントに対する抗Ｆｌａｇ抗体の結合が強力かつ同等であることを示し、これにより、トランスフェクトされた構築物の強力かつ同等な発現が示される。
【図３７】ＦＡＣＳによる、カニクイザルＥｐＣＡＭに融合させた、指定種のＣＤ３イプシロンのＮ末端におけるアミノ酸１〜２７を発現するＣＨＯ細胞に対する、Ｉ２Ｃ  ＩｇＧ１構築物の結合についての解析を示す図である。ＦＡＣＳによる染色は、実施例１９．３で説明する通りに実施する。太線は、Ｉ２Ｃ  ＩｇＧ１構築物を発現する細胞の細胞培養物上清５０μｌと共にインキュベートした細胞を表わす。実線によるヒストグラムは、陰性対照を示す。カニクイザルＥｐＣＡＭに融合させた、ブタのＣＤ３イプシロンのＮ末端におけるアミノ酸１〜２７を発現する細胞を、陰性対照として用いた。ヒストグラムは、ヒト、マーモセット、タマリン、およびリスザルのＣＤ３イプシロンのＮ末端におけるアミノ酸１〜２７に対するＩ２Ｃ  ＩｇＧ１構築物の結合を、陰性対照と比較して明確に裏付ける。
【図３８】ＦＡＣＳによる、実施例６．１および５．１のそれぞれで説明する、Ｎ末端においてＨｉｓ６タグを伴うヒトＣＤ３およびこれを伴わないヒトＣＤ３に対する、実施例１９．２で説明する、Ｉ２Ｃ  ＩｇＧ１構築物の結合についての解析を示す図である。太線は、示される通り、それぞれ、抗ヒトＣＤ３抗体であるＵＣＨＴ−１、ペンタＨｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ社製）、およびＩ２Ｃ  ＩｇＧ１構築物を発現する細胞の細胞培養物上清と共にインキュベートした細胞を表わす。実線によるヒストグラムは、陰性対照としての非関与マウスＩｇＧ１抗体と共にインキュベートした細胞を示す。上方の２つのヒストグラムの重ね合わせは、ＵＣＨＴ−１抗体が、両方のトランスフェクタントに対して、アイソタイプ対照と比較して同等に結合することを示し、これにより両方の組換え構築物の発現が裏付けられる。中央のヒストグラムの重ね合わせは、ペンタヒス抗体が、Ｈｉｓ６−ヒトＣＤ３イプシロン鎖（Ｈｉｓ６−ＣＤ３）を発現する細胞には結合するが、野生型のＣＤ３イプシロン鎖（ＷＴ−ＣＤ３）を発現する細胞には結合しないことを示す。下方のヒストグラムの重ね合わせは、Ｉ２Ｃ  ＩｇＧ１構築物が、野生型のヒトＣＤ３イプシロン鎖には結合するが、Ｈｉｓ６−ヒトＣＤ３イプシロン鎖には結合しないことを示す。これらの結果により、異種間特異的抗ＣＤ３結合分子であるＩ２Ｃが、ＣＤ３イプシロン鎖に結合するには、フリーなＮ末端が不可欠であることが裏付けられる。
【図３９】ＦＡＣＳによる、ヒトＭＣＳＰ  Ｄ３をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋  Ｔ細胞株であるＨＰＢ−ＡＬＬ、カニクイザルＭＣＳＰ  Ｄ３をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞、およびマカクザルＴ細胞株である４１１９ＬｎＰｘのそれぞれに対する、指定の異種間特異的二重特異性単鎖構築物の結合についての解析を示す図である。ＦＡＣＳによる染色は、実施例１０で説明する通りに実施した。太線は、それぞれ、２μｇ／ｍｌの精製二重特異性単鎖構築物、または二重特異性単鎖構築物を含有する細胞上清と共にインキュベートした細胞を表わす。実線によるヒストグラムは、陰性対照を示す。Ｔ細胞株に対する結合についての陰性対照としては、トランスフェクトされなかったＣＨＯ細胞の上清を用いた。ＭＣＳＰ  Ｄ３をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に対する結合についての陰性対照としては、非関与標的特異性を示す単鎖構築物を用いた。各異種間特異的二重特異性単鎖構築物について、ヒストグラムの重ね合わせは、ヒトＭＣＳＰＤ３およびマカクザルのＭＣＳＰ  Ｄ３、ならびにヒトＣＤ３およびマカクザルＣＤ３に対する、該構築物の特異的結合を示す。
【図４０】指定の異種間特異的ＭＣＳＰ  Ｄ３特異性単鎖構築物により、表示の標的細胞株を再指向するように誘導された細胞傷害活性を示す図である。エフェクター細胞、およびエフェクター対標的比もまた、示される通りに用いた。アッセイは、実施例１１で説明する通りに実施する。各構築物が、異種間特異的な細胞傷害活性を強力に動員することを、ダイアグラムは明確に裏付ける。
【図４１】ＦＡＣＳによる、ヒトＣＤ３３をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋  Ｔ細胞株であるＨＰＢ−ＡＬＬ、マカクザルＣＤ３３をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞、およびマカクザルＰＢＭＣのそれぞれに対する、指定の異種間特異的二重特異性単鎖構築物の結合についての解析を示す図である。ＦＡＣＳによる染色は、実施例２１．２で説明する通りに実施した。太線は、異種間特異的二重特異性抗体構築物を発現するトランスフェクト細胞の細胞培養物上清と共にインキュベートした細胞を表わす。実線によるヒストグラムは、陰性対照を示す。トランスフェクトされなかったＣＨＯ細胞の上清を、陰性対照として用いた。各異種間特異的二重特異性単鎖構築物について、ヒストグラムの重ね合わせは、ヒトＣＤ３３およびマカクザルＣＤ３３、ならびにヒトＣＤ３およびマカクザルＣＤ３に対する該構築物の特異的結合を示す。
【図４２】指定の異種間特異的ＣＤ３３特異性単鎖構築物により、表示の標的細胞株を再指向するように誘導された細胞傷害活性を測定する、クロム放出アッセイの結果を示すダイアグラムである。エフェクター細胞もまた、表示の通りに用いた。アッセイは、実施例２１．３で説明する通りに実施する。各構築物が、ヒトＣＤ３３をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞、また、マカクザルＣＤ３３をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞のそれぞれに対して、ヒトおよびマカクザルのエフェクター細胞による細胞傷害活性を強力に動員することを、ダイアグラムは明確に裏付ける。
【図４３】用量１．６、２．０、３．０、および４．５μｇ／ｋｇのＰＢＳ／５％ＨＳＡにより、また、ＰＢＳ／５％ＨＳＡに加えて、単鎖ＥｐＣＡＭ／ＣＤ３二重特異性抗体構築物により、静脈内ボーラス注入を毎週行ったチンパンジーにおけるＴ細胞再分布を示す図である。各ボーラス投与の注入時間は、２時間ずつであった。垂直の矢印は、ボーラス注入の開始を示す。各ボーラス投与の開始時におけるデータ点は、ボーラス注入を開始する直前におけるＴ細胞カウントを示す。環境に依存するＣＤ３エピトープを認識する、従来の単鎖ＥｐＣＡＭ／ＣＤ３二重特異性抗体構築物のボーラス注入を行うたびに、Ｔ細胞再分布のエピソードが誘発され、その後、次回のボーラス注入を行う前に、Ｔ細胞がベースライン値へと回復した。
【図４４】ＥＬＩＳＡによる、選択されたクローンに由来する、Ｆｌａｇタグを付したｓｃＦｖタンパク質断片を含有するペリプラズム調製物のＣＤ３特異性についての解析を示す図である。可溶性ヒトＣＤ３イプシロン（アミノ酸１〜２７）−Ｆｃ融合タンパク質によりコーティングし、さらに、ＰＢＳ／３％ＢＳＡによりブロッキングしたＥＬＩＳＡプレートのウェルに、可溶性ｓｃＦｖタンパク質断片のペリプラズム調製物を添加した。抗Ｆｌａｇ−ビオチン標識化モノクローナル抗体の後、ペルオキシダーゼをコンジュゲートさせたストレプトアビジンにより、検出を実施した。ＡＢＴＳ基質溶液によりＥＬＩＳＡを発光させた。ＯＤ値（ｙ軸）は、ＥＬＩＳＡリーダーにより、４０５ｎｍで測定した。クローン名は、ｘ軸上に示す。
【図４５】ＥＬＩＳＡによる、選択されたクローンに由来する、Ｆｌａｇタグを付したｓｃＦｖタンパク質断片を含有するペリプラズム調製物についての解析を示す図である。ヒトＣＤ３イプシロン（アミノ酸１〜２７）−Ｆｃ融合タンパク質ではなく、ｈｕＩｇＧ１（Ｓｉｇｍａ社製）によりコーティングし、さらに、ＰＢＳ／３％ＢＳＡによりブロッキングしたＥＬＩＳＡプレートのウェルに、図４４の場合と同じ可溶性ｓｃＦｖタンパク質断片のペリプラズム調製物を添加した。  抗Ｆｌａｇ−ビオチン標識化モノクローナル抗体の後、ペルオキシダーゼをコンジュゲートさせたストレプトアビジンにより、検出を実施した。ＡＢＴＳ基質溶液によりＥＬＩＳＡを発光させた。ＯＤ値（ｙ軸）は、ＥＬＩＳＡリーダーにより、４０５ｎｍで測定した。クローン名は、ｘ軸上に示す。
【図４６】図４６Ａ〜Ｇ：ＦＡＣＳによる、ヒトＰＳＣＡをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋  Ｔ細胞株であるＨＰＢ−ＡＬＬ、マカクザルＰＳＣＡをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞、およびマカクザルＴ細胞株である４１１９ＬｎＰｘのそれぞれに対する、指定の異種間特異的二重特異性単鎖構築物の結合についての解析を示す図である。ＦＡＣＳによる染色は、実施例２４．５で説明する通りに実施した。太線は、異種間特異的二重特異性抗体構築物を発現するトランスフェクト細胞の細胞培養物上清と共にインキュベートした細胞を表わす。実線によるヒストグラムは、陰性対照を示す。トランスフェクトされなかったＣＨＯ細胞の上清を、陰性対照として用いた。各異種間特異的二重特異性単鎖構築物について、ヒストグラムの重ね合わせは、ヒトＰＳＣＡおよびマカクザルＰＳＣＡ、ならびにヒトＣＤ３およびマカクザルＣＤ３に対する該構築物の特異的結合を示す。
【図４７】図４７Ａ〜Ｃ：指定の異種間特異的二重特異性単鎖構築物により、表示の標的細胞株を再指向するように誘導された細胞傷害活性を測定する、クロム放出アッセイの結果を示すダイアグラムである。エフェクター細胞もまた、表示の通りに用いた。アッセイは、実施例２４．６で説明する通りに実施した。各構築物が、ヒトＰＳＣＡ陽性細胞およびマカクザルＰＳＣＡ陽性細胞のそれぞれに対して、ヒトおよびマカクザルのエフェクター細胞による細胞傷害活性を強力に動員することを、ダイアグラムは明確に裏付ける。
【図４８】ＦＡＣＳによる、ヒトＰＳＣＡをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋  Ｔ細胞株であるＨＰＢ−ＡＬＬ、マカクザルＰＳＣＡをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞、およびマカクザルＴ細胞株である４１１９ＬｎＰｘのそれぞれに対する、指定の異種間特異的二重特異性単鎖構築物の結合についての解析を示す図である。ＦＡＣＳによる染色は、実施例４５．５で説明する通りに実施した。太線は、異種間特異的二重特異性抗体構築物を発現するトランスフェクト細胞の細胞培養物上清と共にインキュベートした細胞を表わす。実線によるヒストグラムは、陰性対照を示す。トランスフェクトされなかったＣＨＯ細胞の上清を、陰性対照として用いた。各異種間特異的二重特異性単鎖構築物について、ヒストグラムの重ね合わせは、ヒトＰＳＣＡおよびマカクザルＰＳＣＡ、ならびにヒトＣＤ３およびマカクザルＣＤ３に対する該構築物の特異的結合を示す。
【図４９】指定の異種間特異的二重特異性単鎖構築物により、表示の標的細胞株を再指向するように誘導された細胞傷害活性を測定する、クロム放出アッセイの結果を示すダイアグラムである。エフェクター細胞もまた、表示の通りに用いた。アッセイは、実施例２４．６で説明する通りに実施した。各構築物が、ヒトＰＳＣＡ陽性標的細胞およびマカクザルＰＳＣＡ陽性標的細胞のそれぞれに対して、ヒトおよびマカクザルのエフェクターＴ細胞による細胞傷害活性を強力に動員することを、ダイアグラムは明確に裏付ける。
【図５０】ＦＡＣＳによる、ヒトＣＤ１９をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋  Ｔ細胞株であるＨＰＢ−ＡＬＬ、およびマカクザルＴ細胞株である４１１９ＬｎＰｘに対する、指定の異種間特異的二重特異性単鎖構築物の結合についての解析を示す図である。ＦＡＣＳによる染色は、実施例２５．４で説明する通りに実施する。太線によるヒストグラムは、細胞培養物上清と共にインキュベートし、その後、マウス抗Ｈｉｓタグ抗体の後に、ＰＥで標識化した抗マウスＩｇ検出抗体と共にインキュベートした細胞を表わす。細線によるヒストグラムは、陰性対照、すなわち、抗Ｈｉｓタグ抗体および抗マウスＩｇ検出抗体だけと共にインキュベートした細胞を表わす。
【図５１】指定の異種間特異的特異性単鎖構築物により、表示の標的細胞株を再指向する、細胞傷害性のＴ細胞活性を示す図である。Ａ）刺激ヒトＣＤ４／ＣＤ５６枯渇ＰＢＭＣをエフェクター細胞として用い、ヒトＣＤ１９をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を標的細胞として用いる。Ｂ）マカクザルＴ細胞株である４１１９ＬｎＰｘをエフェクター細胞の供給源として用い、ヒトＣＤ１９をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を標的細胞として用いる。アッセイは、実施例２５．５で説明する通りに実施する。
【図５２】ＦＡＣＳによる、ヒトＣ−ＭＥＴ陽性乳癌細胞株であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ヒトＣＤ３＋  Ｔ細胞株であるＨＰＢ−ＡＬＬ、およびマカクザルＴ細胞株である４１１９ＬｎＰｘのそれぞれに対する、指定の異種間特異的二重特異性単鎖構築物の結合についての解析を示す図である。ＦＡＣＳによる染色は、実施例２６．５で説明する通りに実施した。太線は、異種間特異的二重特異性抗体構築物を発現するトランスフェクト細胞の細胞培養物上清と共にインキュベートした細胞を表わす。実線によるヒストグラムは、陰性対照を示す。トランスフェクトされなかった細胞の上清を、陰性対照として用いた。各異種間特異的二重特異性単鎖構築物について、ヒストグラムの重ね合わせは、Ｃ−ＭＥＴ、ならびにヒトＣＤ３およびマカクザルＣＤ３に対する該構築物の特異的結合を示す。
【図５３】指定の異種間特異的二重特異性単鎖構築物により、表示の標的細胞株を再指向するように誘導された細胞傷害活性を測定する、クロム放出アッセイの結果を示すダイアグラムである。エフェクター細胞もまた、表示の通りに用いた。アッセイは、実施例２６．６で説明する通りに実施した。各構築物が、Ｃ−ＭＥＴ陽性細胞に対して、ヒトエフェクター細胞による細胞傷害活性を強力に動員することを、ダイアグラムは明確に裏付ける。
【図５４】ＦＡＣＳによる、実施例２７．１で説明されるヒトｃＭＥＴを発現するＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋  Ｔ細胞株であるＨＰＢ−ＡＬＬ、実施例２７．１で説明されるマカクザルｃＭＥＴを発現するＣＨＯ細胞、およびマカクザルＴ細胞株である４１１９ＬｎＰｘのそれぞれに対する、指定の異種間特異的二重特異性単鎖構築物の結合についての解析を示す図である。ＦＡＣＳによる染色は、実施例２７．２で説明する通りに実施した。太線は、異種間特異的二重特異性抗体構築物を発現するトランスフェクト細胞の細胞培養物上清と共にインキュベートした細胞を表わす。実線によるヒストグラムは、陰性対照を示す。トランスフェクトされなかったＣＨＯ細胞の上清を、陰性対照として用いた。各異種間特異的二重特異性単鎖構築物について、ヒストグラムの重ね合わせは、ヒトｃＭＥＴおよびマカクザルｃＭＥＴ、ならびにヒトＣＤ３およびマカクザルＣＤ３に対する該構築物の特異的結合を示す。
【図５５】指定の異種間特異的ｃＭＥＴ特異性単鎖構築物により、実施例２７．１で説明する通りに作製される表示の標的細胞株を再指向するように誘導された細胞傷害活性を測定する、クロム放出アッセイの結果を示すダイアグラムである。エフェクター細胞もまた、表示の通りに用いた。アッセイは、実施例２７．４で説明する通りに実施した。各構築物が、マカクザルｃＭＥＴ陽性標的細胞に対して、マカクザルエフェクターＴ細胞による細胞傷害活性を強力に動員することを、ダイアグラムは明確に裏付ける。
【図５６】ＦＡＣＳによる、実施例２７．１で説明されるヒトｃＭＥＴを発現するＣＨＯ細胞、実施例２７．１で説明されるマカクザルｃＭＥＴを発現するＣＨＯ細胞のそれぞれに対する、指定の異種間特異的ｓｃＦｖ抗体の結合についての解析を示す図である。ＦＡＣＳによる染色は、実施例２７．３で説明する通りに実施した。太線は、異種間特異的ｓｃＦｖ抗体を含有するペリプラズム調製物とインキュベートした細胞を表わす。実線によるヒストグラムは、陰性対照を示す。ペリプラズム調製物に用いられた緩衝液を、陰性対照として用いた。各異種間特異的ｓｃＦｖ抗体について、ヒストグラムの重ね合わせは、ヒトｃＭＥＴおよびマカクザルｃＭＥＴに対する該構築物の特異的結合を示す。
【図５７】ＦＡＣＳによる、ヒトエンドシアリンをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞、マカクザルエンドシアリンをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に対する、異種間特異的ｓｃＦｖ抗体断片の結合についての解析を示す図である。ＦＡＣＳによる染色は、実施例２８．３で説明する通りに実施した。太線は、ｓｃＦｖ抗体断片を含有するペリプラズム調製物とインキュベートした細胞を表わす。細線は、陰性対照を示す。トランスフェクトされなかったＣＨＯ細胞を、陰性対照として用いた。ヒストグラムの重ね合わせは、ヒトエンドシアリンおよびマカクザルエンドシアリンに対するｓｃＦｖ抗体断片の特異的結合を示す。
【図５８】ＦＡＣＳによる、ヒトＣＤ２４８をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋  Ｔ細胞株であるＨＰＢ−ＡＬＬ、マカクザルＣＤ２４８をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞、およびマカクザルＴ細胞株である４１１９ＬｎＰｘのそれぞれに対する、指定の異種間特異的二重特異性単鎖構築物の結合についての解析を示す図である。ＦＡＣＳによる染色は、実施例２９．１で説明する通りに実施した。太線は、異種間特異的二重特異性抗体構築物を発現するトランスフェクト細胞の細胞培養物上清と共にインキュベートした細胞を表わす。細線は、陰性対照を示す。トランスフェクトされなかったＣＨＯ細胞の上清を、陰性対照として用いた。各異種間特異的二重特異性単鎖構築物について、ヒストグラムの重ね合わせは、ヒトＣＤ２４８およびマカクザルＣＤ２４８、ならびにヒトＣＤ３およびマカクザルＣＤ３に対する該構築物の特異的結合を示す。
【図５９】指定の異種間特異的ＣＤ２４８特異性単鎖構築物により、表示の標的細胞株を再指向するように誘導された細胞傷害活性を測定する、クロム放出アッセイの結果を示すダイアグラムである。エフェクター細胞もまた、表示の通りに用いた。アッセイは、実施例２９．１で説明する通りに実施した。各構築物が、ヒトＣＤ２４８陽性標的細胞およびマカクザルＣＤ２４８陽性標的細胞のそれぞれに対して、ヒトおよびマカクザルのエフェクターＴ細胞による細胞傷害活性を強力に動員することを、ダイアグラムは明確に裏付ける。
【図６０】ＦＡＣＳによる、ヒトＥｐＣＡＭをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋  Ｔ細胞株であるＨＰＢ−ＡＬＬ、およびマカクザルＴ細胞株である４１１９ＬｎＰｘに対する、指定の異種間特異的二重特異性単鎖構築物の結合についての解析を示す図である。ＦＡＣＳによる染色は、実施例３０．４で説明する通りに実施した。太線は、細胞培養物上清と共にインキュベートし、その後、抗ヒス抗体、また、ＰＥで標識化した検出抗体と共にインキュベートした細胞を表わす。細線によるヒストグラムは、陰性対照：抗ヒス抗体および検出抗体だけと共にインキュベートした細胞を表わす。
【図６１】指定の異種間特異的特異性単鎖構築物により、表示の標的細胞株を再指向するように誘導された細胞傷害活性を示す図である。Ａ）刺激ヒトＣＤ４−／ＣＤ５６−ＰＢＭＣをエフェクター細胞として用い、ヒトＥｐＣＡＭをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を標的細胞として用いる。Ｂ）マカクザルＴ細胞株である４１１９ＬｎＰｘをエフェクター細胞として用い、ヒトＥｐＣＡＭをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を標的細胞として用いた。アッセイは、実施例３０．５で説明する通りに実施した。
【図６２】指定の異種間特異的二重特異性単鎖構築物により、表示の標的細胞株を再指向するように誘導された細胞傷害活性を示す図である。Ａ）刺激ヒトＣＤ４−／ＣＤ５６−ＰＢＭＣをエフェクター細胞として用い、ヒトＥｐＣＡＭをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を標的細胞として用いる。Ｂ）マカクザルＴ細胞株である４１１９ＬｎＰｘをエフェクター細胞として用い、ヒトＥｐＣＡＭをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を標的細胞として用いる。アッセイは、実施例３０．５で説明する通りに実施した。
【図６３】指定の異種間特異的二重特異性単鎖構築物により、表示の標的細胞株を再指向するように誘導された細胞傷害活性を示す図である。Ａ）およびＢ）刺激ヒトＣＤ４−／ＣＤ５６−ＰＢＭＣをエフェクター細胞として用い、ヒトＥｐＣＡＭをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を標的細胞として用いる。アッセイは、実施例３０．５で説明する通りに実施した。
【図６４】指定の異種間特異的二重特異性単鎖構築物により、表示の標的細胞株を再指向するように誘導された細胞傷害活性を示す図である。Ａ）およびＢ）マカクザルＴ細胞株である４１１９ＬｎＰｘをエフェクター細胞として用い、ヒトＥｐＣＡＭをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を標的細胞として用いた。アッセイは、実施例１１で説明する通りに実施した。
【図６５】指定の異種間特異的二重特異性単鎖構築物により、表示の標的細胞株を再指向するように誘導された細胞傷害活性を示す図である。Ａ）およびＢ）マカクザルＴ細胞株である４１１９ＬｎＰｘをエフェクター細胞として用い、ヒトＥｐＣＡＭをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を標的細胞として用いた。アッセイは、実施例１１で説明する通りに実施した。
【図６６】指定の異種間特異的二重特異性単鎖構築物により、表示の標的細胞株を再指向するように誘導された細胞傷害活性を示す図である。Ａ）刺激ヒトＣＤ４−／ＣＤ５６−ＰＢＭＣをエフェクター細胞として用い、ヒトＥｐＣＡＭをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を標的細胞として用いる。Ｂ）マカクザルＴ細胞株である４１１９ＬｎＰｘをエフェクター細胞として用い、ヒトＥｐＣＡＭをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を標的細胞として用いた。アッセイは、実施例３０．５で説明する通りに実施した。
【図６７】ＦＡＣＳによる、ヒトＥｐＣＡＭ、マウスＥｐＣＡＭ、またはヒト−マウスハイブリッドＥｐＣＡＭをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に対する、指定の異種間特異的二重特異性単鎖構築物の結合についての解析を示す図である。ＦＡＣＳによる染色は、実施例３０．７で説明する通りに実施した。バーは、言及されたＥｐＣＡＭ抗原に対する指定の構築物による蛍光強度のメジアンを表わす。
【図６８】ＦＡＣＳ解析において、表示の構築物は、陰性対照と比較して、ＣＤ３およびＦＡＰアルファに対する結合を示した。ヒトおよびマカクザルのＣＤ３抗原およびＦＡＰアルファ抗原のそれぞれに対する二重特異性抗体の異種間特異性が裏付けられた。アッセイは、実施例３１で説明する通りに実施した。
【図６９】作製した異種間特異的二重特異性単鎖抗体構築物のすべては、ヒトＦＡＰアルファ陽性標的細胞に対して、刺激ヒトＣＤ４／ＣＤ５６枯渇ＰＢＭＣにより誘発される細胞傷害活性、また、マカクザルＦＡＰアルファ陽性標的細胞に対して、マカクザルＴ細胞株である４１１９ＬｎＰｘにより誘発される細胞傷害活性を示した。アッセイは、実施例３１で説明する通りに実施した。
【図７０】ＦＡＣＳによる、ヒトＦＡＰアルファをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋  Ｔ細胞株であるＨＰＢ−ＡＬＬ、マカクザルＦＡＰアルファをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞、およびマカクザルＴ細胞株である４１１９ＬｎＰｘのそれぞれに対する、指定の異種間特異的二重特異性単鎖構築物の結合についての解析を示す図である。ＦＡＣＳによる染色は、実施例３２．１で説明する通りに実施した。太線は、異種間特異的二重特異性抗体構築物を発現するトランスフェクト細胞の細胞培養物上清と共にインキュベートした細胞を表わす。細線は、陰性対照を示す。トランスフェクトされなかったＣＨＯ細胞の上清を、陰性対照として用いた。各異種間特異的二重特異性単鎖構築物について、ヒストグラムの重ね合わせは、ヒトＦＡＰアルファおよびマカクザルＦＡＰアルファ、ならびにヒトＣＤ３およびマカクザルＣＤ３に対する該構築物の特異的結合を示す。
【図７１】指定の異種間特異的ＦＡＰアルファ特異性単鎖構築物により、表示の標的細胞株を再指向するように誘導された細胞傷害活性を測定する、クロム放出アッセイの結果を示すダイアグラムである。エフェクター細胞もまた、表示の通りに用いた。アッセイは、実施例３２．１で説明する通りに実施した。各構築物が、ヒトＦＡＰアルファ陽性標的細胞およびマカクザルＦＡＰアルファ陽性標的細胞のそれぞれに対して、ヒトおよびマカクザルのエフェクターＴ細胞による細胞傷害活性を強力に動員することを、ダイアグラムは明確に裏付ける。
【図７２】ＦＡＣＳによる、ヒトＦＡＰアルファを発現するＣＨＯ細胞、また、マカクザルＦＡＰアルファを発現するＣＨＯ細胞のそれぞれに対する、指定の異種間特異的ｓｃＦｖ抗体の結合についての解析を示す図である。ＦＡＣＳによる染色は、実施例３２．２で説明する通りに実施した。太線は、異種間特異的ｓｃＦｖ抗体を含有するペリプラズム調製物とインキュベートした細胞を表わす。実線によるヒストグラムは、陰性対照を示す。ペリプラズム調製物に用いられた緩衝液を、陰性対照として用いた。各異種間特異的ｓｃＦｖ抗体について、ヒストグラムの重ね合わせは、ヒトＦＡＰアルファおよびマカクザルＦＡＰアルファに対する該構築物の特異的結合を示す。
【図７３】ＦＡＣＳによる、ヒトＩＧＦ−１ＲをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋  Ｔ細胞株であるＨＰＢ−ＡＬＬ、マカクザルＩＧＦ−１ＲをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞、およびマカクザルＴ細胞株である４１１９ＬｎＰｘのそれぞれに対する、指定の異種間特異的二重特異性単鎖構築物の結合についての解析を示す図である。ＦＡＣＳによる染色は、実施例３３．３で説明する通りに実施した。太線は、異種間特異的二重特異性抗体構築物を発現するトランスフェクト細胞の細胞培養物上清と共にインキュベートした細胞を表わす。実線によるヒストグラムは、陰性対照を示す。細胞培地を陰性対照として用いた。各異種間特異的二重特異性単鎖構築物について、ヒストグラムの重ね合わせは、ヒトＩＧＦ−１ＲおよびマカクザルＩＧＦ−１Ｒ、ならびにヒトＣＤ３およびマカクザルＣＤ３に対する該構築物の特異的結合を示す。
【図７４】指定の異種間特異的ＩＧＦ−１Ｒ特異性単鎖構築物により、表示の標的細胞株を再指向するように誘導された細胞傷害活性を測定する、クロム放出アッセイの結果を示すダイアグラムである。エフェクター細胞もまた、表示の通りに用いた。アッセイは、実施例３３．３で説明する通りに実施した。各構築物が、ヒトＩＧＦ−１Ｒ陽性標的細胞およびマカクザルＩＧＦ−１Ｒ陽性標的細胞のそれぞれに対して、ヒトおよびマカクザルのエフェクターＴ細胞による細胞傷害活性を強力に動員することを、ダイアグラムは明確に裏付ける。
【発明を実施するための形態】
【０２９１】
本発明およびその多くの利点をよりよく理解させる、以下の例示的で非限定的な実施例により、本発明をさらに説明する。
【実施例１】
【０２９２】
１．非ヒト霊長動物の血液試料に由来するＣＤ３イプシロン配列の同定
以下の非ヒト霊長動物：コモンマーモセット、ワタボウシタマリン、およびリスザルの血液試料を用いて、ＣＤ３イプシロンを同定した。製造元のプロトコール（Ｑｉａｇｅｎ社製、ＱＩＡａｍｐ  ＲＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉキット）に従い、全細胞ＲＮＡを単離するため、ヘパリンで処理した新鮮な全血液試料を調製した。公表されているプロトコールに従い、抽出したｍＲＮＡをｃＤＮＡへと転写した。略述すると、沈殿させた１０μｌのＲＮＡを、１０倍濃度のヘキサヌクレオチドミックス（Ｒｏｃｈｅ社製）１．２μｌと共に、７０℃で１０分間にわたりインキュベートし、氷上で保存した。４μｌの５倍濃度ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ緩衝液、０．２μｌの０．１Ｍジチオトレイトール、０．８μｌのｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、１．２μｌのデオキシリボヌクレオシド三リン酸（２５μＭ）、０．８μｌのＲＮアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ社製）、および１．８μｌのＤＮアーゼ、およびＲＮアーゼ非含有水（Ｒｏｔｈ社製）からなる反応混合物を添加した。室温で１０分開にわたり反応混合物をインキュベートした後に、４２℃で５０分間にわたるインキュベーション、また、９０℃で５分間にわたるインキュベーションを行った。反応物を氷上で冷却した後に、０．８μｌのＲＮアーゼＨ（１Ｕ／μｌ、Ｒｏｃｈｅ社製）を添加し、３７℃で２０分間にわたりインキュベートした。
【０２９３】
各種に由来する第１鎖のｃＤＮＡを、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｉｇｍａ社製）を用い、データベースの検索によりデザインした以下のプライマーの組合せ：順方向プライマー：５’−ＡＧＡＧＴＴＣＴＧＧＧＣＣＴＣＴＧＣ−３’（配列番号２５３）；逆方向プライマー：５’−ＣＧＧＡＴＧＧＧＣＴＣＡＴＡＧＴＣＴＧ−３’（配列番号２５４）に従う、３５サイクルにわたる個別のポリメラーゼ連鎖反応にかけた。増幅された５５０ｂｐのバンドをゲル精製（Ｑｉａｇｅｎ社製、ゲル抽出キット）し、配列決定（ドイツ、ファーターシュテッテン、Ｓｅｑｕｉｓｅｒｖｅ社製；配列表を参照されたい）した。
【０２９４】
コモンマーモセットＣＤ３イプシロン
ヌクレオチド
ＣＡＧＧＡＣＧＧＴＡＡＴＧＡＡＧＡＡＡＴＧＧＧＴＧＡＴＡＣＴＡＣＡＣＡＧＡＡＣＣＣＡＴＡＴＡＡＡＧＴＴＴＣＣＡＴＣＴＣＡＧＧＡＡＣＣＡＣＡＧＴＡＡＣＡＣＴＧＡＣＡＴＧＣＣＣＴＣＧＧＴＡＴＧＡＴＧＧＡＣＡＴＧＡＡＡＴＡＡＡＡＴＧＧＣＴＣＧＴＡＡＡＴＡＧＴＣＡＡＡＡＣＡＡＡＧＡＡＧＧＴＣＡＴＧＡＧＧＡＣＣＡＣＣＴＧＴＴＡＣＴＧＧＡＧＧＡＣＴＴＴＴＣＧＧＡＡＡＴＧＧＡＧＣＡＡＡＧＴＧＧＴＴＡＴＴＡＴＧＣＣＴＧＣＣＴＣＴＣＣＡＡＡＧＡＧＡＣＴＣＣＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＧＣＧＡＧＣＣＡＴＴＡＴＣＴＣＴＡＣＣＴＧＡＡＧＧＣＡＡＧＡＧＴＧＴＧＴＧＡＧＡＡＣＴＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＴ
【０２９５】
アミノ酸（配列番号３）
ＱＤＧＮＥＥＭＧＤＴＴＱＮＰＹＫＶＳＩＳＧＴＴＶＴＬＴＣＰＲＹＤＧＨＥＩＫＷＬＶＮＳＱＮＫＥＧＨＥＤＨＬＬＬＥＤＦＳＥＭＥＱＳＧＹＹＡＣＬＳＫＥＴＰＡＥＥＡＳＨＹＬＹＬＫＡＲＶＣＥＮＣＶＥＶＤ
【０２９６】
ワタボウシタマリンＣＤ３イプシロン
ヌクレオチド
ＣＡＧＧＡＣＧＧＴＡＡＴＧＡＡＧＡＡＡＴＧＧＧＴＧＡＴＡＣＴＡＣＡＣＡＧＡＡＣＣＣＡＴＡＴＡＡＡＧＴＴＴＣＣＡＴＣＴＣＡＧＧＡＡＣＣＡＣＡＧＴＡＡＣＡＣＴＧＡＣＡＴＧＣＣＣＴＣＧＧＴＡＴＧＡＴＧＧＡＣＡＴＧＡＡＡＴＡＡＡＡＴＧＧＣＴＴＧＴＡＡＡＴＡＧＴＣＡＡＡＡＣＡＡＡＧＡＡＧＧＴＣＡＴＧＡＧＧＡＣＣＡＣＣＴＧＴＴＡＣＴＧＧＡＧＧＡＴＴＴＴＴＣＧＧＡＡＡＴＧＧＡＧＣＡＡＡＧＴＧＧＴＴＡＴＴＡＴＧＣＣＴＧＣＣＴＣＴＣＣＡＡＡＧＡＧＡＣＴＣＣＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＧＣＧＡＧＣＣＡＴＴＡＴＣＴＣＴＡＣＣＴＧＡＡＧＧＣＡＡＧＡＧＴＧＴＧＴＧＡＧＡＡＣＴＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＴ
【０２９７】
アミノ酸（配列番号５）
ＱＤＧＮＥＥＭＧＤＴＴＱＮＰＹＫＶＳＩＳＧＴＴＶＴＬＴＣＰＲＹＤＧＨＥＩＫＷＬＶＮＳＱＮＫＥＧＨＥＤＨＬＬＬＥＤＦＳＥＭＥＱＳＧＹＹＡＣＬＳＫＥＴＰＡＥＥＡＳＨＹＬＹＬＫＡＲＶＣＥＮＣＶＥＶＤ
【０２９８】
リスザルＣＤ３イプシロン
ヌクレオチド
ＣＡＧＧＡＣＧＧＴＡＡＴＧＡＡＧＡＧＡＴＴＧＧＴＧＡＴＡＣＴＡＣＣＣＡＧＡＡＣＣＣＡＴＡＴＡＡＡＧＴＴＴＣＣＡＴＣＴＣＡＧＧＡＡＣＣＡＣＡＧＴＡＡＣＡＣＴＧＡＣＡＴＧＣＣＣＴＣＧＧＴＡＴＧＡＴＧＧＡＣＡＧＧＡＡＡＴＡＡＡＡＴＧＧＣＴＣＧＴＡＡＡＴＧＡＴＣＡＡＡＡＣＡＡＡＧＡＡＧＧＴＣＡＴＧＡＧＧＡＣＣＡＣＣＴＧＴＴＡＣＴＧＧＡＡＧＡＴＴＴＴＴＣＡＧＡＡＡＴＧＧＡＡＣＡＡＡＧＴＧＧＴＴＡＴＴＡＴＧＣＣＴＧＣＣＴＣＴＣＣＡＡＡＧＡＧＡＣＣＣＣＣＡＣＡＧＡＡＧＡＧＧＣＧＡＧＣＣＡＴＴＡＴＣＴＣＴＡＣＣＴＧＡＡＧＧＣＡＡＧＡＧＴＧＴＧＴＧＡＧＡＡＣＴＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＴ
【０２９９】
アミノ酸（配列番号７）
ＱＤＧＮＥＥＩＧＤＴＴＱＮＰＹＫＶＳＩＳＧＴＴＶＴＬＴＣＰＲＹＤＧＱＥＩＫＷＬＶＮＤＱＮＫＥＧＨＥＤＨＬＬＬＥＤＦＳＥＭＥＱＳＧＹＹＡＣＬＳＫＥＴＰＴＥＥＡＳＨＹＬＹＬＫＡＲＶＣＥＮＣＶＥＶＤ
【実施例２】
【０３００】
２．ヒト、および異なる非チンパンジー霊長動物のＣＤ３イプシロンのＮ末端におけるアミノ酸１〜２７に結合する異種間特異的単鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）の作製
２．１．可溶性の異種タンパク質への融合によりその天然のＣＤ３環境から分離されたＣＤ３イプシロンのＮ末端を用いるマウスの免疫化
ｂａｌｂ／ｃ×Ｃ５７ｂｌａｃｋ交配による１０週齢のＦ１マウスを、ヒトおよび／またはコモンリスザルの成熟ＣＤ３イプシロン鎖の最Ｎ末端におけるアミノ酸１〜２７を保有するＣＤ３イプシロン−Ｆｃ融合タンパク質（ＣＤ３  １〜２７−Ｆｃ）により免疫化した。この目的のために、マウス１匹当たり、３００ｕｌのＰＢＳ中に１０ナノモルのチオエート修飾されたＣｐＧ−オリゴヌクレオチド（５’−ｔｃｃａｔｇａｃｇｔｔｃｃｔｇａｔｇｃｔ−３’）（配列番号３４３）を伴う４０μｇのＣＤ３  １〜２７−Ｆｃ融合タンパク質を腹腔内投与した。２１日後、４２日後、また、場合によって、６３日後に、同じ方法で、マウスに追加投与による免疫化を施した。最初の追加投与による免疫化の１０日後において、血液試料を採取し、ＥＬＩＳＡにより、ＣＤ３  １〜２７−Ｆｃ融合タンパク質に対する抗体血清力価を調べた。さらに、標準的なプロトコールに従うフローサイトメトリーにより、ＣＤ３陽性のヒトＴ細胞株であるＨＰＢａｌｌに対する力価を調べた。血清力価は、免疫化しなかった動物におけるより、免疫化した動物において著明に高かった。
【０３０１】
２．２．マウス免疫抗体ｓｃＦｖライブラリーの作製：抗体組合せライブラリーおよびファージディスプレイの構築
最後の注射の３日後において、標準的なプロトコールに従い、マウス脾臓細胞を回収し、全ＲＮＡを調製した。
【０３０２】
マウス免疫グロブリン（Ｉｇ）軽鎖（カッパ）可変領域（ＶＫ）、およびＩｇ重鎖可変領域（ＶＨ）のＤＮＡ断片によるライブラリーを、マウス脾臓ＲＮＡに対してＶＫ特異的プライマーおよびＶＨ特異的プライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲにより構築した。
【０３０３】
増幅された重鎖Ｖ断片には５’−ＸｈｏＩ認識部位および３’−ＢｓｔＥＩＩ認識部位、また、増幅されたＶＫ  ＤＮＡ断片には５’−ＳａｃＩ認識部位および３’−ＳｐｅＩ認識部位をもたらす形で、プライマーをデザインした。
【０３０４】
ＶＨ  ＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅には、８つの異なる５’−ＶＨファミリー特異的プライマー（ＭＶＨ１（ＧＣ）ＡＧ  ＧＴＧ  ＣＡＧ ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＧＡＧ  ＴＣＡ  ＧＧＡ ＣＣＴ（配列番号３４４）；ＭＶＨ２  ＧＡＧ ＧＴＣ  ＣＡＧ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＣＡＧ ＴＣＴ  ＧＧＡ  ＣＣＴ（配列番号３４５）；ＭＶＨ３  ＣＡＧ  ＧＴＣ ＣＡＡ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＣＡＧ  ＣＣＴ ＧＧＧ  ＧＣＴ（配列番号３４６）；ＭＶＨ４ ＧＡＧ  ＧＴＴ  ＣＡＧ  ＣＴＣ  ＧＡＧ ＣＡＧ  ＴＣＴ  ＧＧＧ  ＧＣＡ（配列番号３４７）；ＭＶＨ５  ＧＡ（ＡＧ）  ＧＴＧ  ＡＡＧ ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＧＡＧ  ＴＣＴ  ＧＧＡ ＧＧＡ（配列番号３４８）；ＭＶＨ６  ＧＡＧ ＧＴＧ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＣＴＣ  ＧＡＧ ＴＣＴ  ＧＧＡ  ＧＧＴ（配列番号３４９）；ＭＶＨ７  ＧＡＡ  ＧＴＧ ＡＡＧ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＧＡＧ  ＴＣＴ ＧＧＧ  ＧＧＡ（配列番号３５０）；ＭＶＨ８ ＧＡＧ  ＧＴＴ  ＣＡＧ  ＣＴＣ  ＧＡＧ ＣＡＧ  ＴＣＴ  ＧＧＡ  ＧＣＴ（配列番号３５１））の各々を、１つの３’−ＶＨプライマー（３’ＭｕＶＨＢｓｔＥＩＩ  ｔｇａ  ｇｇａ ｇａｃ  ｇｇｔ  ｇａｃ  ｃｇｔ  ｇｇｔ ｃｃｃ  ｔｔｇ  ｇｃｃ  ｃｃａ  ｇ（配列番号３５２））と組み合わせ；ＶＫ鎖断片のＰＣＲ増幅には、７つの異なる５’−ＶＫファミリー特異的プライマー（ＭＵＶＫ１  ＣＣＡ  ＧＴＴ ＣＣＧ  ＡＧＣ  ＴＣＧ  ＴＴＧ  ＴＧＡ ＣＴＣ  ＡＧＧ  ＡＡＴ  ＣＴ（配列番号３５３）；ＭＵＶＫ２  ＣＣＡ  ＧＴＴ  ＣＣＧ ＡＧＣ  ＴＣＧ  ＴＧＴ  ＴＧＡ  ＣＧＣ ＡＧＣ  ＣＧＣ  ＣＣ（配列番号３５４）；ＭＵＶＫ３  ＣＣＡ  ＧＴＴ ＣＣＧ  ＡＧＣ  ＴＣＧ  ＴＧＣ  ＴＣＡ ＣＣＣ  ＡＧＴ  ＣＴＣ  ＣＡ（配列番号３５５）；ＭＵＶＫ４  ＣＣＡ  ＧＴＴ  ＣＣＧ ＡＧＣ  ＴＣＣ  ＡＧＡ  ＴＧＡ  ＣＣＣ ＡＧＴ  ＣＴＣ  ＣＡ（配列番号３５６）；ＭＵＶＫ５  ＣＣＡ  ＧＡＴ ＧＴＧ  ＡＧＣ  ＴＣＧ  ＴＧＡ  ＴＧＡ ＣＣＣ  ＡＧＡ  ＣＴＣ  ＣＡ（配列番号３５７）；ＭＵＶＫ６  ＣＣＡ  ＧＡＴ  ＧＴＧ ＡＧＣ  ＴＣＧ  ＴＣＡ  ＴＧＡ  ＣＣＣ ＡＧＴ  ＣＴＣ  ＣＡ（配列番号３５８）；ＭＵＶＫ７  ＣＣＡ  ＧＴＴ ＣＣＧ  ＡＧＣ  ＴＣＧ  ＴＧＡ  ＴＧＡ ＣＡＣ  ＡＧＴ  ＣＴＣ  ＣＡ（配列番号３５９））の各々を、１つの３’−ＶＫプライマー（３’ＭｕＶｋＨｉｎｄＩＩＩ／ＢｓｉＷ１  ｔｇｇ  ｔｇｃ ａｃｔ  ａｇｔ  ｃｇｔ  ａｃｇ  ｔｔｔ ｇａｔ  ｃｔｃ  ａａｇ  ｃｔｔ  ｇｇｔ ｃｃｃ（配列番号３６０））と組み合わせた。
【０３０５】
以下のＰＣＲプログラム：９４℃で２０秒間にわたる変性；５２℃で５０秒間にわたるプライマーアニーリング；および７２℃で６０秒間にわたるプライマー伸長を用い、４０サイクルにわたり増幅した後に、７２℃で１０分間にわたり最後の伸長を行った。
【０３０６】
４５０ｎｇのカッパ軽鎖断片（ＳａｃＩ−ＳｐｅＩで消化した）を、１４００ｎｇのファージミドであるｐＣｏｍｂ３Ｈ５Ｂｈｉｓ（ＳａｃＩ−ＳｐｅＩで消化した；大型断片）とライゲーションした。次いで、結果として得られる抗体組合せライブラリーを、電気穿孔（２．５ｋＶ、０．２ｃｍのギャップキュベット、２５ｕＦＤ、２００オーム、Ｂｉｏｒａｄ社製、ｇｅｎｅ−ｐｕｌｓｅｒ）により、３００ｕｌのエレクトロコンピテント大腸菌ＸＬ１  Ｂｌｕｅ細胞内へと形質転換し、その結果として、サイズが個別クローン１０７個を超えるライブラリーを得た。１時間にわたる表現型発現の後、陽性の形質転換体を、一晩にわたり、１００ｍｌの液体スーパーブロース（ＳＢ）培地中においてｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＨｉｓベクターによりコードされるカルベニシリン耐性について選択した。次いで、遠心分離により細胞を回収し、市販されるプラスミド調製キット（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて、プラスミド調製を実施した。
【０３０７】
ＶＫライブラリーを含有する、２８００ｎｇのこのプラスミドＤＮＡ（ＸｈｏＩ−ＢｓｔＥＩＩで消化した；大型断片）を、９００ｎｇの重鎖Ｖ断片（ＸｈｏＩ−ＢｓｔＥＩＩで消化した）とライゲーションし、再度、電気穿孔（２．５ｋＶ、０．２ｃｍのギャップキュベット、２５ｕＦＤ、２００オーム）により、エレクトロコンピテント大腸菌ＸＬ１  Ｂｌｕｅ細胞による２つの３００ｕｌアリコート中へと形質転換し、その結果として、サイズが個別クローン１０７個を超える、全ＶＨ−ＶＫ  ｓｃＦｖ（単鎖可変断片）ライブラリーを得た。
【０３０８】
表現型を発現させ、カルベニシリンに対して緩徐に適応させた後で、抗体ライブラリーを含有する大腸菌細胞を、ＳＢ−カルベニシリン（５０ｕｇ／ｍＬ）選択培地へと移した。次いで、抗体ライブラリーを含有する大腸菌細胞に、感染用量である１０１２個のヘルパーファージＶＣＳＭ１３粒子を感染させ、その結果として、線維状Ｍ１３ファージを生成および分泌させるが、この場合、ファージ粒子は、マウスｓｃＦｖ断片をコードする一本鎖のｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＨｉｓ−ＤＮＡを含有し、ファージコートタンパク質ＩＩＩへの翻訳融合体として、対応するｓｃＦｖタンパク質を提示した。その後、抗体ライブラリーを提示するこのファージプールを用いて、抗原結合実体を選択した。
【０３０９】
２．３．ファージディスプレイに基づくＣＤ３特異性結合剤の選択
ＰＥＧ８０００／ＮａＣｌ沈殿および遠心分離により、個々の培養物上清から、クローニングされたｓｃＦｖレパートリーを保有するファージライブラリーを回収した。約１０１１〜１０１２個のｓｃＦｖファージ粒子を、０．４ｍｌのＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ中に再懸濁させ、緩徐に撹拌しながら、氷上で１時間にわたり、１０５〜１０７個のＪｕｒｋａｔ細胞（ＣＤ３陽性ヒトＴ細胞株）と共にインキュベートした。これらのＪｕｒｋａｔ細胞は、ウシ胎仔血清（１０％）、グルタミン、およびペニシリン／ストレプトマイシンにより強化したＲＰＭＩ培地中であらかじめ培養し、遠心分離により回収し、ＰＢＳ中で洗浄し、ＰＢＳ／１％ＦＣＳ（Ｎａアジドを含有する）中に再懸濁させた。Ｊｕｒｋａｔ細胞に特異的に結合しないｓｃＦｖファージは、ＰＢＳ／１％ＦＣＳ（Ｎａアジドを含有する）を伴う最大５回にわたる洗浄ステップにより除去する。洗浄後、ｐＨ２．２のＨＣｌ−グリシン中で細胞を再懸濁させる（その後のボルテクシングを伴う１０分間にわたるインキュベーション）ことにより、細胞から結合実体を溶出させ、ｐＨ１２の２Ｍトリスにより中和させた後に、溶出物を用いて、新鮮な未感染の大腸菌ＸＬ１  Ｂｌｕｅ培養物に感染させた（ＯＤ６００＞０．５）。ヒトｓｃＦｖ断片をコードするファージミドコピーの形質導入に成功した大腸菌細胞を含有する大腸菌培養物を、さらに、カルベニシリン耐性について選択し、その後、これにＶＣＭＳ  １３ヘルパーファージを感染させて、抗体ディスプレイおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける選択の第２ラウンドを開始させた。通常、計４〜５ラウンドにわたり選択を実施した。
【０３１０】
２．４．ＣＤ３特異性結合剤についてのスクリーニング
選択後、大腸菌培養物から、４〜５ラウンドのパニングに対応するプラスミドＤＮＡを単離した。可溶性のｓｃＦｖタンパク質を作製するため、プラスミドからＶＨ−ＶＬ−ＤＮＡ断片を切り出した（ＸｈｏＩ−ＳｐｅＩ）。発現構築物（例えば、ｓｃＦｖ）が、ｓｃＦｖとＨｉｓ６タグとの間にＦｌａｇタグ（ＴＧＤ  ＹＫＤＤＤＤＫ）を包含し、また、さらなるファージタンパク質を欠失させる点で元のｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＨｉｓとは異なるプラスミドである、ｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＦｌａｇ／Ｈｉｓ内における同じ制限部位により、これらの断片をクローニングした。ライゲーション後、プラスミドＤＮＡの各プール（パニングのラウンドが異なる）を、熱ショックコンピテント大腸菌のＴＧ１株またはＸＬＩ  ｂｌｕｅ株１００μｌ中へと形質転換し、カルベニシリンＬＢ寒天上へと播種した。単一のコロニーを採取して、１００ｕｌのＬＢカルベニシリン（５０ｕｇ／ｍｌ）中へと播種した。
【０３１１】
ＶＬセグメントおよびＶＨセグメントを含有するｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＦｌａｇ／Ｈｉｓにより形質転換された大腸菌は、遺伝子ＩＩＩ断片を切除し、また、１ｍＭ  ＩＰＴＧにより誘導した後で、十分な量で可溶性のｓｃＦｖを生成する。適切なシグナル配列により、ｓｃＦｖ鎖はペリプラズム内へと移出され、そこで、機能的な立体構造へと折り畳まれる。
【０３１２】
小スケールのペリプラズム調製物用に、形質転換プレートから単一の大腸菌ＴＧ１株による細菌コロニーを採取し、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを補充したＳＢ培地（例えば、１０ｍｌ）中で培養した（また、回収後、ＰＢＳ（例えば、１ｍｌ）中に再溶解させた）。−７０℃における凍結および３７℃における融解の４ラウンドを介する温度ショックにより細菌の外膜を破壊し、ｓｃＦｖを包含する可溶性のペリプラズムタンパク質を上清中へと放出させた。遠心分離により、完全細胞および細胞破砕物を除去した後で、ヒト抗ヒトＣＤ３−ｓｃＦｖを含有する上清を回収し、さらなる検討に用いた。
【０３１３】
２．５．ＣＤ３特異性結合剤の同定
そのＮ末端において、ＣＤ３イプシロンのＮ末端における最初の２７アミノ酸を提示する異種タンパク質を、それらの表面において発現する真核細胞上におけるフローサイトメトリーにより、単離ｓｃＦｖの結合について調べた。
【０３１４】
実施例４で説明する通り、ヒトＴ細胞受容体複合体の成熟ＣＤ３イプシロン鎖のＮ末端配列のうちの最初のアミノ酸１〜２７（アミノ酸配列：ＱＤＧＮＥＥＭＧＧＩＴＱＴＰＹＫＶＳＩＳＧＴＴＶＩＬＴ：配列番号２）を、該Ｎ末端が、細胞の外面に位置するように、膜貫通タンパク質ＥｐＣＡＭのＮ末端に融合させた。さらに、Ｎ末端における１〜２７のＣＤ３イプシロン配列と、ＥＰＣＡＭ配列との間に、ＦＬＡＧエピトープを挿入した。ヒト胚性腎（ＨＥＫ）細胞およびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞内において、この融合生成物を発現させた。
【０３１５】
他の霊長動物種の成熟ＣＤ３イプシロンの最Ｎ末端における２７アミノ酸を提示する真核細胞も、コモンリスザル（リスザル）（ＣＤ３イプシロンのＮ末端におけるアミノ酸配列：ＱＤＧＮＥＥＩＧＤＴＴＱＮＰＹＫＶＳＩＳＧＴＴＶＴＬＴ：配列番号８）、コモンマーモセット（ＣＤ３イプシロンのＮ末端におけるアミノ酸配列：ＱＤＧＮＥＥＭＧＤＴＴＱＮＰＹＫＶＳＩＳＧＴＴＶＴＬＴ：配列番号４）、およびワタボウシタマリン（ＣＤ３イプシロンのＮ末端におけるアミノ酸配列：ＱＤＧＮＥＥＭＧＤＴＴＱＮＰＹＫＶＳＩＳＧＴＴＶＴＬＴ：配列番号６）について、同じ方式で調製した。
【０３１６】
フローサイトメトリーのため、２．５×１０５個の細胞を、５０ｕｌの上清、または２％ＦＣＳを伴う５０μｌのＰＢＳ中に５μｇ／ｍｌの精製構築物と共にインキュベートした。構築物の結合は、２％ＦＣＳを伴う５０μｌのＰＢＳ中に２μｇ／ｍｌの抗Ｈｉｓ抗体（ドイツ、ヒルデン、Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ社製、ＢＳＡ非含有、ペンタＨｉｓ抗体）により検出した。第２ステップの試薬として、２％ＦＣＳ（ドイツ、ハンブルグ、Ｄｉａｎｏｖａ社製）を伴う５０μｌのＰＢＳ中において１：１００に希釈した、アフィニティー精製Ｒ−フィコエリトリンコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃガンマ断片特異的）Ｆ（ａｂ’）２断片を、用いた。試料は、ＦＡＣＳｓｃａｎ（ドイツ、ハイデルベルク、ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）上において測定した。
【０３１７】
常に、ヒトおよび異なる霊長動物（例えば、リスザル、コモンマーモセット、ワタボウシタマリン）の初代Ｔ細胞上における、前出の段落で説明したフローサイトメトリーにより、結合を確認した。
【０３１８】
２．６．非ヒトＣＤ３イプシロン特異的ｓｃＦｖのヒト／ヒト化同等物の作製
マウス抗ＣＤ３  ｓｃＦｖのＶＨ領域を、ヒト生殖細胞系列抗体のアミノ酸配列に対して整列した。非ヒトＶＨに対して最も緊密な相同性を有するヒト生殖細胞系列抗体のＶＨ配列を選択し、２つのアミノ酸配列の直接的なアライメントを実施した。ヒトＶＨフレームワーク領域と異なる非ヒトＶＨのフレームワーク残基（「異なるフレームワーク位置」）が多数存在した。これらの残基のうちの一部は、その標的に対する抗体の結合および活性に寄与しうる。
【０３１９】
マウスＣＤＲを含有し、また、選択されたヒトＶＨ配列と異なる各フレームワーク位置において両方の可能性（ヒトアミノ酸残基、また、母体であるマウスアミノ酸残基）を含有するライブラリーを構築するため、縮退オリゴヌクレオチドを合成した。これらのオリゴヌクレオチドは、異なる位置において、７５％の確率でヒト残基、また、２５％の確率でマウス残基を組み込む。１つのヒトＶＨの場合、例えば、これらのオリゴヌクレオチドのうち、末端の約２０ヌクレオチドの連なりにおいて重複する６オリゴヌクレオチドを合成しなければならなかった。この目的に適う第２のプライマーはいずれも、アンチセンスプライマーであった。オリゴヌクレオチド内におけるその後のクローニングに必要な制限部位は欠失させた。
【０３２０】
全Ｖ配列の範囲にわたるのに必要とされたプライマーの数に応じて、これらのプライマーは、６０〜９０ヌクレオチドの長さでありうる。
【０３２１】
これらの、例えば、６つのプライマーを等量で混合し（例えば、２０μｌのＰＣＲ反応物に対して１μｌずつの各プライマー（２０〜１００μＭのプライマー原液））、ＰＣＲ緩衝液、ヌクレオチド、およびＴａｑポリメラーゼからなるＰＣＲ混合物に添加した。この混合物を、ＰＣＲサイクラー内において、９４℃で３分間、６５℃で１分間、６２℃で１分間、５９℃で１分間、５６℃で１分間、５２℃で１分間、５０℃で１分間、また、７２℃で１０分間にわたりインキュベートした。その後、標準的な方法に従い、産物をアガロースゲル電気泳動にかけ、該ゲルから、２００〜４００のサイズの産物を単離した。
【０３２２】
次いで、このＰＣＲ産物を、Ｎ末端およびＣ末端において適切なクローニング制限部位を組み込むプライマーを用いる標準的なＰＣＲ反応のための鋳型として用いた。標準的な方法に従うアガロースゲル電気泳動により、適正なサイズ（ＶＨの場合、約３５０ヌクレオチド）のＤＮＡ断片を単離した。この方法で、十分なＶＨ  ＤＮＡ断片を増幅した。こうして、このＶＨ断片を、各々が、それぞれの異なるフレームワーク位置において異なる量のヒト残基およびマウス残基を有するＶＨ断片のプール（ヒト化ＶＨのプール）とした。マウス抗ＣＤ３  ｓｃＦｖのＶＬ領域についても同じ手順を実施した（ヒト化ＶＬのプール）。
【０３２３】
次いで、ファージディスプレイベクターｐＣｏｍｂ３Ｈ５Ｂｈｉｓ内において、ヒト化ＶＨのプールをヒト化ＶＬのプールと組み合わせて、そこから（線維状ファージ上における提示後に）抗ＣＤ３結合剤が、非ヒト（マウス）抗ＣＤ３親ｓｃＦｖについて上記で説明した通りに、選択、スクリーニング、同定、および確認される、機能的ｓｃＦｖのライブラリーを形成した。次いで、好ましい特性およびアミノ酸配列について、単一のクローンを解析した。アミノ酸配列の相同性においてヒト生殖細胞系列Ｖセグメントに最も緊密なｓｃＦｖが好ましく、ＶＨのＣＤＲ  ＩおよびＩＩ、ならびにＶＬカッパのＣＤＲ  ＩおよびＩＩ、またはＶＬラムダのＣＤＲ  ＩおよびＩＩのうちの少なくとも１つのＣＤＲが、すべてのヒト生殖細胞系列Ｖセグメントのうちで最も緊密なそれぞれのＣＤＲに対して、８０％を超えるアミノ酸配列の同一性を示すｓｃＦｖが特に好ましい。以下の実施例９、１６、および２４で説明する通り、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖを、組換え二重特異性単鎖抗体へと転換した。
【実施例３】
【０３２４】
３．ヒトＣＤ３イプシロン鎖のＮ末端におけるアミノ酸１〜２７をＩｇＧ１のＦｃ部分に融合させた組換え融合タンパク質（ＣＤ３  １〜２７−Ｆｃ）の作製
３．１．ＣＤ３  １〜２７−Ｆｃのクローニングおよび発現
標準的なプロトコールに従う遺伝子合成により、ヒト免疫グロブリンＩｇＧ１のヒンジ領域およびＦｃガンマ領域に融合させた、ヒトＣＤ３イプシロン鎖のＮ末端におけるアミノ酸１〜２７のコード配列、ならびに６ヒスチジンタグを得た（該組換え融合タンパク質のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、配列番号２３０および２２９に列挙する）。遺伝子合成断片は、まず、真核細胞内において該構築物を発現させるためのコザック部位、次いで、１９アミノ酸の免疫グロブリンリーダーペプチド、次いで、インフレームで、成熟ヒトＣＤ３イプシロン鎖の細胞外部分のうちの最初の２７アミノ酸のコード配列、次いで、インフレームで、ヒトＩｇＧ１のヒンジ領域およびＦｃガンマ部分のコード配列、次いで、インフレームで、６ヒスチジンタグのコード配列、ならびに終止コドンを含有するようにデザインした（図１）。遺伝子合成断片はまた、融合タンパク質をコードするｃＤＮＡの始点および終点には、制限部位を導入するようにもデザインした。５’端においてＥｃｏＲＩ、また、３’端においてＳａｌＩの制限部位を導入し、以下のクローニング手順で用いる。標準的なプロトコールに従い、ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩを介して、遺伝子合成断片を、ｐＥＦ−ＤＨＦＲ（ｐＥＦ−ＤＨＦＲは、Ｍａｃｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２（１９９５）、７０２１〜７０２５；およびＲａｕｍら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ５０（２００１）、１４１〜１５０において説明されている）と称するプラスミド内へとクローニングした。製造元のプロトコールに従い、配列を検証したプラスミドを用いて、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３発現システム（ドイツ、カールスルーエ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＧｍｂＨ社製）内においてトランスフェクションを行った。３日後において、トランスフェクタントの細胞培養物上清を回収し、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、組換え構築物の存在について調べた。ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃガンマ断片特異性抗体（英国、サフォーク州、ニューマーケット、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｕｒｏｐｅ社から購入した）を、ＰＢＳ中において５μｇ／ｍｌまで希釈し、ウェル当たり１００μｌで、ＭａｘｉＳｏｒｐ９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（ドイツ、ヴィースバーデン、Ｎｕｎｃ  ＧｍｂＨ  ＆ Ｃｏ．ＫＧ社製）上へとコーティングし、４℃で一晩にわたり静置した。ウェルを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を伴うＰＢＳ（ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ）により洗浄し、室温（ＲＴ）で６０分間にわたり、ＰＢＳ中３％のＢＳＡ（ウシアルブミン、画分Ｖ；ドイツ、タウフキルヒェン、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ社製）によりブロッキングした。その後、ウェルを、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎにより再度洗浄し、次いで、ＲＴで６０分間にわたり、細胞培養物上清と共にインキュベートした。洗浄後、ウェルを、ＲＴで６０分間にわたり、１％ＢＳＡを伴うＰＢＳ中において１：５００に希釈した、ペルオキシダーゼコンジュゲート抗Ｈｉｓ６抗体（ドイツ、マンハイム、ＳＩＧＭＡＦＡＳＴ社、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ社）と共にインキュベートした。その後、ウェルを、２００μｌの���ＢＳ／Ｔｗｅｅｎにより洗浄し、また、製造元のプロトコールに従い、１００μｌのＳＩＧＭＡＦＡＳＴ  ＯＰＤ（ＳＩＧＭＡＦＡＳＴ  ＯＰＤ［ｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロリド］基質溶液（ドイツ、タウフキルヒェン、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ社製））を添加した。１００μｌの１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を添加することにより反応を停止させた。ＰｏｗｅｒＷａｖｅＸマイクロプレート分光光度計（米国、バーモント州、ウィヌースキー、ＢｉｏＴｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）上で、４９０ｎｍにおける発色反応を測定し、６２０ｎｍにおけるバックグラウンドの吸収を差し引いた。図２に示す通り、陰性対照として用いた、モックトランスフェクトＨＥＫ  ２９３細胞による非関連上清と比較して、構築物の存在が明確に検出された。
【０３２５】
３．２．ＣＤ３  １〜２７−Ｆｃに対する異種間特異的単鎖抗体の結合についてのアッセイ
ＥＬＩＳＡアッセイにより、ＣＤ３  １〜２７−Ｆｃに対する、ペリプラズム内で発現させた、ＣＤ３イプシロンに特異的な異種間特異的単鎖抗体の粗調製物の結合について調べた。ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃガンマ断片特異性抗体（英国、サフォーク州、ニューマーケット、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｕｒｏｐｅ社）を、ＰＢＳ中において５μｇ／ｍｌまで希釈し、ウェル当たり１００μｌで、ＭａｘｉＳｏｒｐ  ９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（ドイツ、ヴィースバーデン、Ｎｕｎｃ ＧｍｂＨ  ＆  Ｃｏ．ＫＧ社製）上へとコーティングし、４℃で一晩にわたり静置した。ウェルを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を伴うＰＢＳ（ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ）により洗浄し、室温（ＲＴ）で６０分間にわたり、ＰＢＳ中３％のＢＳＡ（ウシアルブミン、画分Ｖ；ドイツ、タウフキルヒェン、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ社製）によりブロッキングした。その後、ウェルを、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎにより洗浄し、ＲＴで６０分間にわたり、ＣＤ３  １〜２７−Ｆｃ構築物を発現する細胞培養物上清と共にインキュベートした。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎによりウェルを洗浄し、室温で６０分間にわたり、上記で説明した通りにペリプラズム内で発現させた、異種間特異的単鎖抗体の粗調製物と共にインキュベートした。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎによる洗浄後、ウェルを、１％ＢＳＡを伴うＰＢＳ中において１：１００００に希釈した、ペルオキシダーゼコンジュゲート抗Ｆｌａｇ  Ｍ２抗体（ドイツ、タウフキルヒェン、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ社製）と共にインキュベートした。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎによりウェルを洗浄し、また、製造元のプロトコールに従い、１００μｌのＳＩＧＭＡＦＡＳＴ  ＯＰＤ（ＳＩＧＭＡＦＡＳＴ  ＯＰＤ［ｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロリド］基質溶液（ドイツ、タウフキルヒェン、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ社製））と共にインキュベートした。１００μｌの１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を添加することにより発色反応を停止させ、ＰｏｗｅｒＷａｖｅＸマイクロプレート分光光度計（米国、バーモント州、ウィヌースキー、ＢｉｏＴｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）上で、４９０ｎｍにおける発色反応を測定し、６２０ｎｍにおけるバックグラウンドの吸収を差し引いた。マウス抗ＣＤ３単鎖抗体と比較して、ＣＤ３  １〜２７−Ｆｃ構築物に対する、ＣＤ３イプシロンに特異的な異種間特異的単鎖抗体の強力な結合が観察された（図３）。
【実施例４】
【０３２６】
４．異なる非チンパンジー霊長動物に由来するＣＤ３イプシロンのＮ末端におけるアミノ酸１〜２７を、カニクイザルに由来するＥｐＣＡＭに融合させた、組換え膜貫通融合タンパク質（ＣＤ３  １〜２７−ＥｐＣＡＭ）の作製
４．１．ＣＤ３  １〜２７−ＥｐＣＡＭのクローニングおよび発現
異なる非チンパンジー霊長動物（マーモセット、タマリン、リスザル）およびブタから、ＣＤ３イプシロンを単離した。標準的なプロトコールに従う遺伝子合成により、Ｆｌａｇタグを付したカニクイザルＥｐＣＡＭのＮ末端に融合させた、成熟ヒト、成熟コモンマーモセット（ｃｏｍｍｏｎ  ｍａｒｍｏｓｅｔ（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ  ｊａｃｃｈｕｓ））、成熟ワタボウシタマリン（ｃｏｔｔｏｎｔｏｐ  ｔａｍａｒｉｎ（Ｓａｇｕｉｎｕｓ  ｏｅｄｉｐｕｓ））、成熟コモンリスザル（ｃｏｍｍｏｎ  ｓｑｕｉｒｒｅｌ  ｍｏｎｋｅｙ（Ｓａｉｍｉｒｉ  ｓｃｉｕｒｅｕｓ））、および成熟家畜ブタ（ｄｏｍｅｓｔｉｃ  ｓｗｉｎｅ（Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ）；陰性対照として用いた）のＣＤ３イプシロン鎖のＮ末端におけるアミノ酸１〜２７のコード配列を得た（該組換え融合タンパク質のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、配列番号２３１〜２４０に列挙する）。遺伝子合成断片は、まず、標的発現ベクター内に既に存在する１９アミノ酸の免疫グロブリンリーダーペプチドのコード配列との、適正なリーディングフレーム内における融合を可能とするＢｓｒＧＩ部位、次いで、インフレームで、成熟ＣＤ３イプシロン鎖の細胞外部分のうちのＮ末端におけるアミノ酸１〜２７のコード配列、次いで、インフレームで、Ｆｌａｇタグのコード配列、次いで、インフレームで、成熟カニクイザルＥｐＣＡＭ膜貫通タンパク質を含有するようにデザインした（図４）。遺伝子合成断片はまた、融合タンパク質をコードするｃＤＮＡの終点において制限部位を導入するようにもデザインした。５’端においてＢｓｒＧＩ、また、３’端においてＳａｌＩの制限部位を導入し、以下のクローニング手順で用いた。次いで、標準的なプロトコールに従い、ＢｓｒＧＩおよびＳａｌＩを介して、遺伝子合成断片を、１９アミノ酸の免疫グロブリンリーダーペプチドのコード配列を既に含有する、ｐＥＦ−ＤＨＦＲ（ｐＥＦ−ＤＨＦＲは、Ｍａｃｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２（１９９５）、７０２１〜７０２５において説明されている）と称するプラスミドの派生物内へとクローニングした。製造元のプロトコールに従い、ＭＡＴｒａ−Ａ試薬（ドイツ、ゲッティンゲン、ＩＢＡ  ＧｍｂＨ社製）、また、１７５ｍｌの細胞培養フラスコ内における付着性２９３−ＨＥＫ細胞用の１２μｇのプラスミドＤＮＡを用いて、２９３−ＨＥＫ細胞に一過性にトランスフェクトするのに、配列を検証したプラスミドを用いた。細胞培養の３日後において、標準的なプロトコールに従うＦＡＣＳアッセイにより、トランスフェクタントを、組換え膜貫通タンパク質の細胞表面における発現について調べた。この目的のために、２．５×１０５個の細胞を、２％ＦＣＳを伴うＰＢＳ中に５μｇ／ｍｌの抗Ｆｌａｇ  Ｍ２抗体（ドイツ、タウフキルヒェン、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ社製）と共にインキュベートした。２％ＦＣＳを伴うＰＢＳ中において１：１００に希釈した、アフィニティー精製Ｒ−フィコエリトリンコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃガンマ断片特異的Ｆ（ａｂ’）２断片（英国、サフォーク州、ニューマーケット、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｕｒｏ���ｅ社製）により、結合した抗体を検出した。試料は、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（ドイツ、ハイデルベルク、ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）上で測定した。トランスフェクトされた細胞上における、カニクイザルＥｐＣＡＭ、ならびにヒトＣＤ３イプシロン鎖、マーモセットＣＤ３イプシロン鎖、タマリンＣＤ３イプシロン鎖、リスザルＣＤ３イプシロン鎖、およびブタＣＤ３イプシロン鎖それぞれのＮ末端におけるアミノ酸１〜２７からなる、Ｆｌａｇタグを付した組換え膜貫通融合タンパク質の発現が、明確に検出された。
【０３２７】
４．２．ＣＤ３  １〜２７−ＥｐＣＡＭに対する異種間特異的抗ＣＤ３単鎖抗体の結合
標準的なプロトコールに従うＦＡＣＳアッセイにより、カニクイザルＥｐＣＡＭに融合させた、ヒトＣＤ３イプシロン鎖、マーモセットＣＤ３イプシロン鎖、タマリンＣＤ３イプシロン鎖、およびリスザＣＤ３イプシロン鎖それぞれのＮ末端におけるアミノ酸１〜２７に対する、ペリプラズム内で発現させた異種間特異的抗ＣＤ３単鎖抗体の粗調製物の結合について調べた。この目的のために、２．５×１０５個の細胞を、ペリプラズム内で発現させた異種間特異的抗ＣＤ３単鎖抗体の粗調製物（調製は、上記で説明した通り、また、標準的なプロトコールに従い実施した）と共に、また、陰性対照としてのマウス抗ヒトＣＤ３単鎖抗体と共にインキュベートした。二次抗体として、２％ＦＣＳを伴う５０μｌのＰＢＳ中において５μｇ／ｍｌのペンタＨｉｓ抗体（ドイツ、ヒルデスハイム、Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ社製）を用いた。２％ＦＣＳを伴うＰＢＳ中において１：１００に希釈した、アフィニティー精製Ｒ−フィコエリトリンコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃガンマ断片特異的Ｆ（ａｂ’）２断片（英国、サフォーク州、ニューマーケット、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｕｒｏｐｅ社製）により、抗体の結合を検出した。試料はＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ドイツ、ハイデルベルク、ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）上で測定した。図６（Ａ〜Ｅ）に示す通り、カニクイザルＥｐＣＡＭに融合させた、ヒト、マーモセット、タマリン、またはリスザルのＣＤ３イプシロン鎖のＮ末端におけるアミノ酸１〜２７からなる、組換え膜貫通融合タンパク質を発現するトランスフェクタントに対する単鎖抗体の結合が観察された。陰性対照として用いた、カニクイザルＥｐＣＡＭに融合させた、ブタのＣＤ３イプシロン鎖のＮ末端におけるアミノ酸１〜２７からなる融合タンパク質に対する、異種間特異的単鎖抗体の結合は観察されなかった。複数の霊長動物に対する抗ＣＤ３単鎖抗体の異種間特異性が示された。抗Ｆｌａｇ  Ｍ２抗体により得られたシグナルと、異種間特異的単鎖抗体により得られたシグナルとは同等であり、これにより、ＣＤ３イプシロンのＮ末端におけるアミノ酸１〜２７に対する、異種間特異的単鎖抗体の強力な結合活性が示された。
【実施例５】
【０３２８】
５．ヒトＣＤ３イプシロン鎖およびそのアラニン突然変異体をトランスフェクトされたマウス細胞のアラニン走査による、異種間特異的抗ＣＤ３単鎖抗体の結合についての解析
５．１．ヒト野生型ＣＤ３イプシロンのクローニングおよび発現
標準的なプロトコールに従う遺伝子合成により、ヒトＣＤ３イプシロン鎖のコード配列を得た（ヒトＣＤ３イプシロン鎖のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、配列番号２４２および２４１に列挙する）。遺伝子合成断片は、真核細胞内において該構築物を発現させるためのコザック部位、また、ヒトＣＤ３イプシロンをコードするｃＤＮＡの始点および終点における制限部位を含有するようにデザインした。５’端においてＥｃｏＲＩ、また、３’端においてＳａｌＩの制限部位を導入し、以下のクローニング手順で用いた。次いで、標準的なプロトコールに従い、ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩを介して、遺伝子合成断片を、ｐＥＦ  ＮＥＯと称するプラスミド内へとクローニングした。ｐＥＦ  ＮＥＯは、従来の分子クローニングにより、ＤＨＦＲのｃＤＮＡを、ネオマイシン耐性を有するｃＤＮＡにより置換することにより、ｐＥＦ  ＤＨＦＲ（Ｍａｃｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２（１９９５）、７０２１〜７０２５）から派生させた。配列を検証したプラスミドを用いて、３７℃、湿度９５％、および７％ＣＯ２において、安定化Ｌ−グルタミンを伴い、１０％ＦＣＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１％ＨＥＰＥＳ、１％ピルビン酸、１％非必須アミノ酸（すべて、ドイツ、ベルリン、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ社製）を補充した、ＲＰＭＩ中で培養されたマウスＴ細胞株であるＥＬ４（ＡＴＣＣ受託番号ＴＩＢ−３９）にトランスフェクトした。トランスフェクションは、製造元のプロトコールに従い、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔトランスフェクション試薬（ドイツ、ヒルデン、Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ社製）、および２μｇのプラスミドＤＮＡにより実施した。２４時間後にＰＢＳで細胞を洗浄し、６００μｇ／ｍｌの選択用Ｇ４１８（オーストリア、パシング、ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＧｍｂＨ社製）を伴う前述の細胞培地中において再度これを培養した。トランスフェクションの１６〜２０日後において、耐性細胞の増殖が観察された。さらに７〜１４日後、標準的なプロトコールに従うＦＡＣＳ解析により、ヒトＣＤ３イプシロンの発現について細胞を調べた。２．５×１０５個の細胞を、２％ＦＣＳを伴うＰＢＳ中に５μｇ／ｍｌの抗ヒトＣＤ３抗体であるＵＣＨＴ−１（ドイツ、ハイデルベルク、ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）と共にインキュベートした。２％ＦＣＳを伴うＰＢＳ中において１：１００に希釈した、アフィニティー精製Ｒ−フィコエリトリンコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃガンマ断片特異的Ｆ（ａｂ’）２断片（英国、サフォーク州、ニューマーケット、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｕｒｏｐｅ社製）により、抗体の結合を検出した。試料は、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（ドイツ、ハイデルベルク、ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）上で測定した。トランスフェクトされたＥＬ４細胞上におけるヒト野生型ＣＤ３の発現を、図７に示す。
【０３２９】
５．２．ＩｇＧ１抗体としての異種間特異的抗ＣＤ３単鎖抗体のクローニングおよび発現
異種間特異的単鎖抗ＣＤ３抗体の結合を検出する手段を改善するため、Ｈ２Ｃ  ＨＬＰ、Ａ２Ｊ  ＨＬＰ、およびＥ２Ｍ  ＨＬＰを、マウスＩｇＧ１およびヒトラムダ定常領域を伴うＩｇＧ１抗体へと転換した。標準的なプロトコールに従う遺伝子合成により、それぞれのＩｇＧ１抗体の重鎖および軽鎖をコードするｃＤＮＡ配列を得た。各特異性抗体のための遺伝子合成断片は、まず、真核細胞内において該構築物を発現させるためのコザック部位、次いで、１９アミノ酸の免疫グロブリンリーダーペプチド（配列番号２４４および２４３）、次いで、インフレームで、それぞれの重鎖可変領域、またはそれぞれの軽鎖可変領域のコード配列、次いで、インフレームで、それぞれ、マウスＩｇＧ１の重鎖定常領域のコード配列（配列番号２４６および２４５）、またはヒトラムダ軽鎖定常領域のコード配列（配列番号２４８および２４７）を含有するようにデザインした。融合タンパク質をコードするｃＤＮＡの始点および終点には、制限部位を導入した。５’端におけるＥｃｏＲＩ、また、３’端におけるＳａｌＩの制限部位を、以下のクローニング手順で用いた。標準的なプロトコールに従い、ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩを介して、遺伝子合成断片を、重鎖構築物はｐＥＦ  ＤＨＦＲ（Ｍａｃｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２（１９９５）、７０２１〜７０２５）と称するプラスミド内へ、軽鎖構築物はｐＥＦ  ＡＤＡ（ｐＥＦ  ＡＤＡは、Ｒａｕｍら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ５０（３）（２００１）、１４１〜１５０において説明されている）と称するプラスミド内へとクローニングした。製造元のプロトコールに従い、配列を検証したプラスミドを用いて、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３発現システム（ドイツ、カールスルーエ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＧｍｂＨ社製）内において、それぞれの軽鎖構築物および重鎖構築物の共トランスフェクションを行った。３日後において、トランスフェクタントの細胞培養物上清を回収し、アラニン走査実験に用いた。
【０３３０】
５．３．アラニン走査のための、ヒトＣＤ３イプシロンのアラニン突然変異体のクローニングおよび発現
遺伝子合成により、成熟ヒトＣＤ３イプシロン鎖の細胞外ドメインのアミノ酸１〜２７のうちの各アミノ酸について、ヒトＣＤ３イプシロンの野生型配列の１つのコドンを、それぞれ、アラニンをコードするコドン（ＧＣＣ）へと置換したヒトＣＤ３イプシロン鎖をコードする、２７のｃＤＮＡ断片を得た。置換されたコドンを除き、該ｃＤＮＡ断片は、前述のヒト野生型ＣＤ３のｃＤＮＡ断片と同一であった。各構築物では、上記で説明したヒト野生型ＣＤ３のｃＤＮＡ断片と比較して、１つのコドンだけが置換された。制限部位であるＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩは、野生型構築物と比較して同一の位置において、ｃＤＮＡ断片内へと導入した。すべてのアラニン走査構築物をｐＥＦ  ＮＥＯ内へとクローニングし、配列を検証したプラスミドをＥＬ４細胞内へとトランスフェクトした。上記で説明した通りに、トランスフェクタントによるトランスフェクションおよびその選択を実施した。結果として、発現構築物のパネルが得られ、そこでは、ヒトＣＤ３イプシロン鎖の第１のアミノ酸である、１位におけるグルタミン（Ｑ、Ｇｌｎ）が、アラニンにより置換された。アラニンにより置換された最後のアミノ酸は、成熟ヒト野生型ＣＤ３イプシロンの２７位におけるトレオニンであった。グルタミン１とトレオニン２７との間の各アミノ酸について、野生型のアミノ酸をアラニンへと置換したそれぞれのトランスフェクタントが作製された。
【０３３１】
５．４．アラニン走査実験
５．２で説明したキメラＩｇＧ抗体、およびＣＤ３イプシロンに特異的な異種間特異的単鎖抗体を、アラニン走査実験で調べた。標準的なプロトコールに従うＦＡＣＳアッセイにより、５．３で説明した、ヒトＣＤ３イプシロンのアラニン突然変異体構築物をトランスフェクトしたＥＬ４細胞株に対する抗体の結合について調べた。それぞれのトランスフェクタントによる２．５×１０５個の細胞を、キメラＩｇＧ抗体を含有する５０μｌの細胞培養物上清と共に、または、ペリプラズム内で発現させた単鎖抗体による５０μｌの粗調製物と共にインキュベートした。ペリプラズム内で発現させた単鎖抗体による粗調製物と共にインキュベートした試料には、２％ＦＣＳを伴う５０μｌのＰＢＳ中に５μｇ／ｍｌの二次抗体として、抗Ｆｌａｇ  Ｍ２抗体（ドイツ、タウフキルヒェン、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ社製）を用いた。キメラＩｇＧ抗体と共にインキュベートした試料には、二次抗体は不要であった。すべての試料について、２％ＦＣＳを伴うＰＢＳ中において１：１００に希釈した、アフィニティー精製Ｒ−フィコエリトリンコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃガンマ断片特異的Ｆ（ａｂ’）２断片（英国、サフォーク州、ニューマーケット、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｕｒｏｐｅ社製）により、抗体分子の結合を検出した。試料はＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ドイツ、ハイデルベルク、ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）上で測定した。ヒトＣＤ３イプシロンのアラニン突然変異体をトランスフェクトしたＥＬ４細胞株に対する、キメラＩｇＧ分子、または異種間特異的単鎖抗体の示差的な結合が検出された。アイソタイプ対照、または非関与の特異性を有する、ペリプラズム内で発現させた単鎖抗体による粗調製物を、それぞれ陰性対照として用いた。ヒトＣＤ３イプシロンのアラニン突然変異体の発現レベルについての陽性対照として、ＵＣＨＴ−１抗体を用いた。成熟ＣＤ３イプシロン鎖の１５位におけるアミノ酸チロシン、１７位におけるアミノ酸バリン、１９位におけるアミノ酸イソロイシン、２４位におけるアミノ酸バリン、または２６位におけるアミノ酸ロイシンに対するアラニン突然変異体をトランスフェクトしたＥＬ４細胞株は、発現レベルが極めて低かった（データは示さない）ため、評価しなかった。ヒトＣＤ３イプシロンのアラニン突然変異体をトランスフェクトしたＥＬ４細胞株に対する、異種間特異的単鎖抗体、およびキメラＩｇＧフォーマットにおける単鎖抗体の結合を、図８（Ａ〜Ｄ）において、それぞれの全試料の幾何平均による蛍光値から、それぞれの陰性対照の幾何平均による蛍光値を減じた、任意の単位による相対結合として示す。次いで、異なる発現レベルを補正するため、特定のトランスフェクタントに対する全試料による値を、それぞれのトランスフェクタントに対するＵＣＨＴ−１抗体の幾何平均による蛍光値で除した。最後に、ある特異性抗体についての野生型試料による値と比較するため、それぞれの特異性抗体についての全試料による値を、野生型試料による値で除し、これにより、野生型試料による値を、任意の１結合単位に設定した。
【０３３２】
用いた計算を、以下の式：
【数２】
2018064565.tif 000003
において詳細に示す。
【０３３３】
この式において、ｖａｌｕｅ＿Ｓａｍｐｌｅとは、図８（Ａ〜Ｄ）に示す通り、特定のアラニン突然変異体に対する、抗ＣＤ３特異性抗体の結合度を示す、任意の結合単位による値を意味し、Ｓａｍｐｌｅとは、特定のアラニン走査トランスフェクタント上においてアッセイされた、特定の抗ＣＤ３抗体について得られる、幾何平均による蛍光値を意味し、ｎｅｇ＿Ｃｏｎｔｒ．とは、特定のアラニン突然変異体上においてアッセイされた、陰性対照について得られる、幾何平均による蛍光値を意味し、ＵＣＨＴ−１とは、特定のアラニン突然変異体上においてアッセイされた、ＵＣＨＴ−１抗体について得られる、幾何平均による蛍光値を意味し、ＷＴとは、野生型のトランスフェクタント上においてアッセイされた、特定の抗ＣＤ３抗体について得られる、幾何平均による蛍光値を意味し、ｘは、それぞれのトランスフェクタントを指定し、ｙは、それぞれの抗ＣＤ３抗体を指定し、また、ｗｔは、それぞれのトランスフェクタントが野生型であることを指定する。
【０３３４】
図８（Ａ〜Ｄ）において見られる通り、ＩｇＧ抗体Ａ２Ｊ ＨＬＰは、成熟ＣＤ３イプシロン鎖の４位におけるアミノ酸アスパラギン、２３位におけるアミノ酸トレオニン、および２５位におけるアミノ酸イソロイシンについて、顕著な結合の喪失を示した。成熟ＣＤ３イプシロン鎖の１位におけるアミノ酸グルタミン、２位におけるアミノ酸アスパラギン酸、３位におけるアミノ酸グリシン、５位におけるアミノ酸グルタミン酸については、ＩｇＧ抗体Ａ２Ｊ  ＨＬＰの結合の完全な喪失が観察された。ＩｇＧ抗体Ｅ２Ｍ  ＨＬＰは、成熟ＣＤ３イプシロン鎖の４位におけるアミノ酸アスパラギン、２３位におけるアミノ酸トレオニン、および２５位におけるアミノ酸イソロイシンについて、顕著な結合の喪失を示した。ＩｇＧ抗体Ｅ２Ｍ  ＨＬＰは、成熟ＣＤ３イプシロン鎖の１位におけるアミノ酸グルタミン、２位におけるアミノ酸アスパラギン酸、３位におけるアミノ酸グリシン、５位におけるアミノ酸グルタミン酸について完全な喪失を示した。ＩｇＧ抗体Ｈ２Ｃ  ＨＬＰは、成熟ＣＤ３イプシロン鎖の４位におけるアミノ酸アスパラギンについて中程度の喪失を示し、また、成熟ＣＤ３イプシロン鎖の１位におけるアミノ酸グルタミン、２位におけるアミノ酸アスパラギン酸、３位におけるアミノ酸グリシン、５位におけるアミノ酸グルタミン酸について完全な喪失を示した。単鎖抗体Ｆ１２Ｑ  ＨＬＰは、成熟ＣＤ３イプシロン鎖の１位におけるアミノ酸グルタミン、２位におけるアミノ酸アスパラギン酸、３位におけるアミノ酸グリシン、また、成熟ＣＤ３イプシロン鎖の５位におけるアミノ酸グルタミン酸について本質的に完全な喪失を示した。
【実施例６】
【０３３５】
６．マウスＴ細胞株ＥＬ４内へとトランスフェクトされた、Ｎ末端においてＨｉｓ６タグを伴うかまたは伴わないヒトＣＤ３イプシロン鎖に対する、異種間特異的抗ＣＤ３結合分子であるＨ２Ｃ  ＨＬＰの結合についての解析
６．１．Ｎ末端における６つのヒスチジンタグ（Ｈｉｓ６タグ）を伴うヒトＣＤ３イプシロン鎖のクローニングおよび発現
遺伝子合成により、Ｎ末端においてＨｉｓ６タグを伴うヒトＣＤ３イプシロン鎖をコードするｃＤＮＡ断片を得た。遺伝子合成断片は、まず、真核細胞内において該構築物を発現させるためのコザック部位、次いで、インフレームで、１９アミノ酸の免疫グロブリンリーダーペプチド、次いで、インフレームで、Ｈｉｓ６タグのコード配列、次いで、インフレームで、成熟ヒトＣＤ３イプシロン鎖のコード配列を含有するようにデザインした（該構築物のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、配列番号２５６および２５５に列挙する）。遺伝子合成断片はまた、ｃＤＮＡの始点および終点において制限部位を含有するようにもデザインした。５’端においてＥｃｏＲＩ、また、３’端においてＳａｌＩの制限部位を導入し、以下のクローニング手順で用いた。次いで、標準的なプロトコールに従い、ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩを介して、遺伝子合成断片をｐＥＦ  ＮＥＯと称するプラスミド（上記で説明した）内へとクローニングした。配列を検証したプラスミドを用いて、マウスＴ細胞株であるＥＬ４にトランスフェクトした。細胞培養の３４日後において、トランスフェクタントを、以下で説明するアッセイに用いた。
【０３３６】
６．２．Ｎ末端においてＨｉｓ６タグを伴うかまたは伴わないヒトＣＤ３イプシロン鎖に対する、異種間特異的抗ＣＤ３結合分子であるＨ２Ｃ  ＨＬＰの結合
ＣＤ３イプシロンに特異的な結合特異性抗体であるＨ２Ｃ ＨＬＰとのキメラＩｇＧ抗体を、Ｎ末端においてＨｉｓ６タグを伴うかまたは伴わないヒトＣＤ３イプシロンに対する結合について調べた。標準的なプロトコールに従うＦＡＣＳアッセイにより、ＥＬ４細胞株にトランスフェクトしたＨｉｓ６−ヒトＣＤ３イプシロン、および野生型のヒトＣＤ３イプシロンのそれぞれに対する該抗体の結合について調べた。２．５×１０５個のトランスフェクタント細胞を、キメラＩｇＧ抗体を含有する５０μｌの細胞培養物上清、または、２％ＦＣＳを伴うＰＢＳ中に５μｇ／ｍｌずつの各対照抗体５０μｌと共にインキュベートした。構築物の発現についての陰性対照としては、適切なアイソタイプ対照、また、陽性対照としては、ＣＤ３特異性抗体であるＵＣＨＴ−１をそれぞれ用いた。２％ＦＣＳを伴うＰＢＳ中において１：１００に希釈した、アフィニティー精製Ｒ−フィコエリトリンコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃガンマ断片特異的Ｆ（ａｂ’）２断片（英国、サフォーク州、ニューマーケット、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈＥｕｒｏｐｅ社製）により、抗体の結合を検出した。試料は、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（ドイツ、ハイデルベルク、ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）上で測定した。野生型のヒトＣＤ３イプシロンをトランスフェクトしたＥＬ４細胞株と比較して、Ｎ末端においてＨｉｓ６タグを伴うヒトＣＤ３イプシロンに対して、結合特異性抗体であるＨ２Ｃ  ＨＬＰとのキメラＩｇＧによる結合の喪失が明確に検出された。これらの結果は、ヒトＣＤ３イプシロン鎖に対する異種間特異的抗ＣＤ３結合特異性抗体であるＨ２Ｃの結合には、ＣＤ３イプシロンのフリーなＮ末端が不可欠であることを示した。
【実施例７】
【０３３７】
７．ヒトＭＣＳＰのＣ末端ドメイン、膜貫通ドメイン、切断細胞外ドメインのクローニングおよび発現
標準的なプロトコールに従う遺伝子合成により、ヒトＭＣＳＰのＣ末端ドメイン、膜貫通ドメイン、切断細胞外ドメイン（アミノ酸１５３８〜２３２２）を得た（ヒトＭＣＳＰのＣ末端ドメイン、膜貫通ドメイン、切断細胞外ドメイン（ヒトＤ３と称する）を発現するための組換え構築物のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、配列番号２５０および２４９に列挙する）。遺伝子合成断片は、まず、真核細胞内において該構築物を発現させるためのコザック部位、次いで、１９アミノ酸の免疫グロブリンリーダーペプチド、次いで、インフレームで、ＦＬＡＧタグ、次いで、インフレームで、クローニングを目的とする複数の制限部位を含有し、また、９アミノ酸による人工的リンカー（ＳＲＴＲＳＧＳＱＬ）をコードする配列、次いで、インフレームで、ヒトＭＣＳＰのＣ末端ドメイン、膜貫通ドメイン、切断細胞外ドメインのコード配列、および終止コドンを含有するようにデザインした。制限部位は、該ＤＮＡ断片の始点および終点に導入した。５’端におけるＥｃｏＲＩ、また、３’端におけるＳａｌＩの制限部位を、以下のクローニング手順で用いた。標準的なプロトコールに従い、該断片を、ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩにより消化させ、ｐＥＦ−ＤＨＦＲ（ｐＥＦ−ＤＨＦＲは、Ｍａｃｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２（１９９５）、７０２１〜７０２５において説明されている）内へとクローニングした。配列を検証したプラスミドを用いて、ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ  ９０９６）にトランスフェクトした。細胞は、３７℃、湿度９５％、および７％ＣＯ２のインキュベーター内において、安定化グルタミンを伴い、１０％ＦＣＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（すべて、ドイツ、ベルリン、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ社から購入した）を補充し、また、細胞培養グレードの試薬原液（ドイツ、タウフキルヒェン、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ社製）によるヌクレオシドを、１０μｇ／ｍｌアデノシン、１０μｇ／ｍｌデオキシアデノシン、および１０μｇ／ｍｌチミジンの最終濃度まで補充した、ＲＰＭＩ  １６４０中で培養した。トランスフェクションは、製造元のプロトコールに従い、ＰｏｌｙＦｅｃｔトランスフェクション試薬（ドイツ、ヒルデン、Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ社製）、および５μｇのプラスミドＤＮＡにより実施した。２４時間にわたる培養後にＰＢＳで１回細胞を洗浄し、安定化グルタミン、および１％のペニシリン／ストレプトマイシンを伴うＲＰＭＩ  １６４０中で再度培養した。したがって、細胞培地はヌクレオシドを含有せず、これにより、トランスフェクトされた細胞に対して選択を適用した。トランスフェクションの約１４日後において、耐性細胞の増殖が観察された。さらに７〜１４日後、ＦＡＣＳ解析により、構築物の発現についてトランスフェクタントを調べた。２．５×１０５個の細胞を、２％ＦＣＳを伴うＰＢＳ中に５μｇ／ｍｌまで希釈された、５０μｌの抗Ｆｌａｇ−Ｍ２抗体（ドイツ、タウフキルヒェン、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ社製）と共にインキュベートした。２％ＦＣＳを伴うＰＢＳ中において１：１００に希釈した、アフィニティー精製Ｒ−フィコ��リトリンコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃガンマ断片特異的Ｆ（ａｂ’）２断片（英国、サフォーク州、ニューマーケット、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｕｒｏｐｅ社製）により、抗体の結合を検出した。試料は、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（ドイツ、ハイデルベルク、ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）上で測定した。
【実施例８】
【０３３８】
８．マカクザルＭＣＳＰのＣ末端ドメイン、膜貫通ドメイン、切断細胞外ドメインのクローニングおよび発現
以下の反応条件：９４℃で３分間にわたる１サイクル、９４℃で０．５分間、５２℃で０．５分間、また、７２℃で１．７５分間にわたる４０サイクル、７２℃で３分間にわたる最終サイクルを用いて、マカクザル皮膚のｃＤＮＡについての３つのＰＣＲセット（ドイツ、ハイデルベルク、ＢｉｏＣａｔ  ＧｍｂＨ社製、型番Ｃ１５３４２１８−Ｃｙ−ＢＣ）により、マカクザルＭＣＳＰのＣ末端ドメイン、膜貫通ドメイン、切断細胞外ドメイン（マカクザルＤ３と称する）のｃＤＮＡ配列を得た。以下のプライマー：
順方向プライマー：５’−ＧＡＴＣＴＧＧＴＣＴＡＣＡＣＣＡＴＣＧＡＧＣ−３’（配列番号３６１）
逆方向プライマー：５’−ＧＧＡＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＣＴＣＡＧＴＧＡＧＧ−３’（配列番号３６２）
順方向プライマー：５’−ＴＴＣＣＡＧＣＴＧＡＧＣＡＴＧＴＣＴＧＡＴＧＧ−３’（配列番号３６３）
逆方向プライマー：５’−ＣＧＡＴＣＡＧＣＡＴＣＴＧＧＧＣＣＣＡＧＧ−３’（配列番号３６４）
順方向プライマー：５’−ＧＴＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＣＴＣＡＧＣＡＧＧＡＣＣ−３’（配列番号３６５）
逆方向プライマー：５’−ＧＣＣＴＴＣＡＣＡＣＣＣＡＧＴＡＣＴＧＧＣＣ−３’（配列番号３６６）
を用いた。
【０３３９】
これらのＰＣＲにより、該ＰＣＲプライマーを用いる標準的なプロトコールに従い単離および配列決定される３つの重複する断片（Ａ：１〜１３２９、Ｂ：１２２９〜２４２８、Ｃ：１７８２〜２５４７）が生成され、これにより、Ｃ末端ドメインのコード配列の７４ｂｐ上流から、終止コドンの１２１ｂｐ下流まで、マカクザルＭＣＳＰのｃＤＮＡ配列のうちの２５４７ｂｐの部分（マカクザルＭＣＳＰのこの部分のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、配列番号２５２および２５１に列挙する）がもたらされた。以下の反応条件：９４℃で３分間にわたる１サイクル、９４℃で１分間、５２℃で１分間、また、７２℃で２．５分間にわたる１０サイクル、７２℃で３分間にわたる最終サイクルを用いる別のＰＣＲを用いて、前述の反応ＡおよびＢによるＰＣＲ産物を融合した。以下のプライマー：
順方向プライマー：５’−ｔｃｃｃｇｔａｃｇａｇａｔｃｔｇｇａｔｃｃｃａａｔｔｇｇａｔｇｇｃｇｇａｃｔｃｇｔｇｃｔｇｔｔｃｔｃａｃａｃａｇａｇｇ−３’（配列番号３６７）
逆方向プライマー：５’−ａｇｔｇｇｇｔｃｇａｃｔｃａｃａｃｃｃａｇｔａｃｔｇｇｃｃａｔｔｃｔｔａａｇｇｇｃａｇｇｇ−３’（配列番号３６８）
が用いられる。
【０３４０】
このＰＣＲのプライマーは、マカクザルＭＣＳＰのＣ末端ドメイン、膜貫通ドメイン、切断細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡ断片の始点および終点において制限部位を導入するようにデザインした。５’端におけるＭｆｅＩ、また、３’端におけるＳａｌＩの制限部位を導入し、以下のクローニング手順で用いた。次いで、ＭｆｅＩおよびＳａｌＩを介して、ヒトＭＣＳＰのＣ末端ドメイン、膜貫通ドメイン、切断細胞外ドメインを置換することにより、前述のプラスミドｐＥＦ  ＤＨＦＲ（ｐＥＦ−ＤＨＦＲは、Ｒａｕｍら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ５０（２００１）、１４１〜１５０において説明されている）のＥｃｏＲＩ／ＭｆｅＩ断片を含有するＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド内へとクローニングした。遺伝子合成断片は、マカクザルＭＣＳＰのＣ末端ドメイン、膜貫通ドメイン、切断細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡ断片の５’端側に、インフレームで、免疫グロブリンリーダーペプチドおよびＦＬＡＧタグのほか、人工的リンカー（ＳＲＴＲＳＧＳＱＬ）のコード配列を含有した。このベクターを用いて、ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ  ９０９６）にトランスフェクトした。細胞は、３７℃、湿度９５％、および７％ＣＯ２のインキュベーター内において、安定化グルタミンを伴い、１０％ＦＣＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（すべて、ドイツ、ベルリン、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ社製）を補充し、また、細胞培養グレードの試薬原液（ドイツ、タウフキルヒェン、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ社製）によるヌクレオシドを、１０μｇ／ｍｌアデノシン、１０μｇ／ｍｌデオキシアデノシン、および１０μｇ／ｍｌチミジンの最終濃度まで補充した、ＲＰＭＩ  １６４０中で培養した。トランスフェクションは、製造元のプロトコールに従い、ＰｏｌｙＦｅｃｔトランスフェクション試薬（ドイツ、ヒルデン、Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ社製）、および５μｇのプラスミドＤＮＡにより実施した。２４時間にわたる培養後にＰＢＳで１回細胞を洗浄し、安定化グルタミン、および１％のペニシリン／ストレプトマイシンを伴うＲＰＭＩ  １６４０中で再度培養した。したがって、細胞培地はヌクレオシドを含有せず、これにより、トランスフェクトされた細胞に対して選択を適用した。トランスフェクションの約１４日後において、耐性細胞の増殖が観察された。さらに７〜１４日後、ＦＡＣＳ解析により、組換え構築物の発現についてトランスフェクタントを調べた。２．５×１０５個の細胞を、２％ＦＣＳを伴うＰＢＳ中に５μｇ／ｍｌまで希釈された、５０μｌの抗Ｆｌａｇ−Ｍ２抗体（ドイツ、タウフキルヒェン、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ社製）と共にインキュベートした。２％ＦＣＳを伴うＰＢＳ中において１：１００に希釈した、アフィニティー精製Ｒ−フィコエリトリンコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃガンマ断片特異的Ｆ（ａｂ’）２断片（英国、サフォーク州、ニューマーケット、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｕｒｏｐｅ社製）により、抗体の結合を検出した。試料は、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（ドイツ、ハイデルベルク、ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）上で測定した。
【実施例９】
【０３４１】
９．ＭＣＳＰおよびＣＤ３に対する異種間特異的二重特異性単鎖抗体分子の作製および特徴づけ
各々が、ヒト、および非チンパンジー霊長動物のＣＤ３イプシロンに対して異種間特異的な結合ドメイン、ならびにヒト、および非チンパンジー霊長動物のＭＣＳＰに対して異種間特異的な結合ドメインを含む、二重特異性単鎖抗体分子を、以下の表１に記載の通りにデザインする。
【０３４２】
【表１】
2018064565.tif 000004
【０３４３】
遺伝子合成により、ヒトＭＣＳＰ  Ｄ３およびマカクザルＭＣＳＰ  Ｄ３に対して異種間特異的な重鎖（ＶＨ）可変ドメインおよび軽鎖（ＶＬ）可変ドメイン、ならびにヒトＣＤ３およびマカクザルＣＤ３に対して異種間特異的なＶＨドメインおよびＶＬドメインを含有する前述の構築物を得た。遺伝子合成断片は、まず、真核細胞内において該構築物を発現させるためのコザック部位、次いで、１９アミノ酸の免疫グロブリンリーダーペプチド、次いで、インフレームで、各二重特異性単鎖抗体分子のコード配列、次いで、インフレームで、ヒスチジン６タグ、および終止コドンを含有するようにデザインした。遺伝子合成断片はまた、Ｎ末端およびＣ末端における適切な制限部位を導入するようにもデザインした。標準的なプロトコール（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｄｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１））に従い、これらの制限部位を介して、遺伝子合成断片を、ｐＥＦ−ＤＨＦＲと称するプラスミド（ｐＥＦ−ＤＨＦＲは、Ｒａｕｍら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ５０（２００１）、１４１〜１５０において説明されている）内へとクローニングした。構築物は、電気穿孔により、ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ  ９０９６）内へと、安定的もしくは一過性にトランスフェクトするか、または、代替的に、標準的なプロトコールに従い、ＨＥＫ  ２９３（ヒト胚性腎細胞；ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１５７３）内へと一過性にトランスフェクトした。
【０３４４】
Ｋａｕｆｍａｎｎ  Ｒ．Ｊ．（１９９０）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５、５３７〜５６６により説明される通り、ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞内において、真核細胞内のタンパク質発現を実施した。メトトレキサート（ＭＴＸ）濃度を、最高２０ｎＭ  ＭＴＸの最終濃度まで上昇させることにより、該構築物の遺伝子増幅を誘導した。静置培養による２代にわたる継代後、７日間にわたり、ヌクレオシド非含有ＨｙＱ  ＰＦ  ＣＨＯ液体ダイズ培地（４．０ｍＭのＬ−グルタミン、および０．１％のプルロニックＦ−６８（ＨｙＣｌｏｎｅ社製）を伴う）を伴うローラーボトル内で培養した。遠心分離により細胞を除去し、発現したタンパク質を含有する上清を−２０℃で保存した。
【０３４５】
クロマトグラフィーには、Ａｋｔａ（登録商標）Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）およびＵｎｉｃｏｒｎ（登録商標）ソフトウェアを用いた。製造元により提供されるプロトコールに従い、ＺｎＣｌ２を充填したＦｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤキレート（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ社製）を用いて、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（「ＩＭＡＣ」）を実施した。緩衝液Ａ（ｐＨ７．２の２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、０．１Ｍ  ＮａＣｌ）によりカラムを平衡化させ、３ｍｌ／分の流速で、細胞培養物上清（５００ｍｌ）をカラム（１０ｍｌ）に適用した。緩衝液Ａによりカラムを洗浄して、結合しなかった試料を除去した。以下：
段階１：６カラム容量中における２０％の緩衝液Ｂ
段階２：６カラム容量中における１００％の緩衝液Ｂ
に従う２段階勾配の緩衝液Ｂ（ｐＨ７．２の２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、０．１ＭＮａＣｌ、０．５Ｍイミダゾール）を用いて、結合したタンパク質を溶出させた。段階２により溶出させたタンパク質画分を、さらなる精製のためにプールした。すべての化学物質は研究グレードであり、Ｓｉｇｍａ社（ダイゼンホーフェン）またはＭｅｒｃｋ社（ダルムシュタット）から購入した。
【０３４６】
Ｅｑｕｉ−ｂｕｆｆｅｒ（２５ｍＭクエン酸、２００ｍＭリシン、５％グリセロール、ｐＨ７．２）により平衡化させたＨｉｌｏａｄ  １６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００調製グレードカラム（ＧＥ／Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）上において、ゲル濾過クロマトグラフィーを実施した。溶出させたタンパク質試料（流速１ｍｌ／分）を、標準的なＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットにかけ、検出した。精製前に、分子量の決定についてカラムを校正した（分子量マーカーキット；Ｓｉｇｍａ社製、ＭＷ  ＧＦ−２００）。ＯＤ２８０ｎｍを用いて、タンパク質濃度を決定した。
【０３４７】
精製した二重特異性単鎖抗体タンパク質は、４〜１２％のプレキャストビストリスゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）により還元条件下で実施されるＳＤＳ  ＰＡＧＥにより解析した。製造元により提供されるプロトコールに従い、試料の調製および適用を実施した。ＭｕｌｔｉＭａｒｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）により、分子量を決定した。コロイド性クーマシー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社によるプロトコール）により、ゲルを染色した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定される通り、単離タンパク質の純度は＞９５％である。
【０３４８】
リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）中におけるゲル濾過により決定される通り、二重特異性単鎖抗体は、天然状態で約５２ｋＤａの分子量を有する。すべての構築物を、この方法に従い精製した。
【０３４９】
製造元により提供されるプロトコールに従い、Ｏｐｔｉｔｒａｎ（登録商標）ＢＡ−Ｓ８３膜およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製のＢｌｏｔ  Ｍｏｄｕｌｅを用いて、ウェスタンブロットを実施した。二重特異性単鎖抗体タンパク質を検出するには、抗Ｈｉｓタグ抗体（Ｑｉａｇｅｎ社製、ペンタＨｉｓ）を用いた。二次抗体として、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）（Ｓｉｇｍａ社製）により標識化したヤギ抗マウスＩｇ抗体、また、基質として、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ（Ｓｉｇｍａ社製）を用いた。精製された二重特異性単鎖抗体に対応する５２ｋＤにおいて、単一のバンドが検出された。
【０３５０】
代替的に、構築物は、ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞内で一過性発現させた。略述すると、トランスフェクションの１日前に、構築物当たり４×１０５個の細胞を、３７℃、湿度９５％、および７％ＣＯ２のインキュベーター内において、安定化グルタミンを伴い、１０％ＦＣＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（すべて、ドイツ、ベルリン、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ社製）を補充し、また、細胞培養グレードの試薬原液（ドイツ、タウフキルヒェン、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ社製）によるヌクレオシドを、１０μｇ／ｍｌアデノシン、１０μｇ／ｍｌデオキシアデノシン、および１０μｇ／ｍｌチミジンの最終濃度まで補充した、ＲＰＭＩ  １６４０中で培養した。トランスフェクションは、製造元のプロトコールに従い、Ｆｕｇｅｎｅ  ６トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ社製、型番１１８１５０９１００１）により実施した。９４μｌのＯｐｔｉＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）および６μｌのＦｕｇｅｎｅ  ６を混合し、室温で５分間にわたりインキュベートした。その後、構築物当たり１．５μｇのＤＮＡを添加、混合し、室温で１５分間にわたりインキュベートした。その間、１倍濃度のＰＢＳによりＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞を洗浄し、１．５ｍｌのＲＰＭＩ  １６４０  ａｌｌ培地中に再懸濁させた。６００μｌのＲＰＭＩ  １６４０  ａｌｌ培地によりトランスフェクション混合物を希釈し、細胞へと添加し、３７℃、９５％の湿度、および７％ＣＯ２で一晩にわたりインキュベートした。トランスフェクションの翌日、各手法のインキュベーション容量を、５ｍｌのＲＰＭＩ  １６４０  ａｌｌ培地まで拡大した。インキュベーションの３日後に上清を回収した。
【実施例１０】
【０３５１】
１０．フローサイトメトリーによる、ＭＣＳＰおよびＣＤ３に対する異種間特異的二重特異性抗体の結合についての解析
ヒトおよびマカクザルのＭＣＳＰ  Ｄ３およびＣＤ３のそれぞれに結合する能力に関して、異種間特異的二重特異性抗体構築物の機能性を調べるため、ＦＡＣＳ解析を実施した。この目的のために、ヒトＭＣＳＰ  Ｄ３をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞（実施例７で説明した）、およびヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞白血病細胞株であるＨＰＢ−ＡＬＬ（ブラウンシュヴァイク、ＤＳＭＺ社製、ＡＣＣ４８３）を用いて、ヒト抗原に対する結合について調べた。マカクザル抗原に対する結合反応性は、作製したマカクザルＭＣＳＰ  Ｄ３トランスフェクタント（実施例８で説明した）、およびマカクザルＴ細胞株である４１１９ＬｎＰｘ（エアランゲン−ニュルンベルグ、衛生研究所、ウイルス学部門、Ｆｉｃｋｅｎｓｃｈｅｒ教授による恵与；Ｋｎａｐｐｅ  Ａら、およびＦｉｃｋｅｎｓｃｈｅｒ  Ｈ．、Ｂｌｏｏｄ  ２０００、９５、３２５６〜６１において公表されている）を用いることにより調べた。各細胞株２００，０００個ずつを、異種間特異的二重特異性抗体構築物による精製タンパク質（２μｇ／ｍｌ）、または、異種間特異的二重特異性抗体構築物を発現するトランスフェクト細胞の細胞培養物上清５０μｌと共に、氷上において３０分間にわたりインキュベートした。２％ＦＣＳを伴うＰＢＳ中で２回にわたり細胞を洗浄し、マウス抗Ｈｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ社製、ペンタＨｉｓ抗体；２％ＦＣＳを伴う５０μｌのＰＢＳ中で１：２０に希釈）により、構築物の結合を検出した。洗浄後、２％ＦＣＳを伴うＰＢＳ中において１：１００に希釈した、フィコエリトリンにコンジュゲートさせたＦｃガンマ特異性抗体（Ｄｉａｎｏｖａ社製）により、結合した抗Ｈｉｓ抗体を検出した。トランスフェクトされなかったＣＨＯ細胞の上清を、Ｔ細胞株に対する結合についての陰性対照として用いた。非関与の標的特異性を有する単鎖構築物を、ＭＣＳＰ−Ｄ３をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に対する結合についての陰性対照として用いた。
【０３５２】
ＦＡＣＳ−Ｃａｌｉｂｕｒ装置上において、フローサイトメトリーを実施した；ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを用いてデータを取り込み、解析した（ハイデルベルク、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）。「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（Ｃｏｌｉｇａｎ、Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ、Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ、Ｓｈｅｖａｃｈ、およびＳｔｒｏｂｅｒ、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、２００２）において説明される通りに、ＦＡＣＳによる染色および蛍光強度の測定を実施した。
【０３５３】
図１０、１１、１２、および３９に示す通り、ＭＣＳＰ Ｄ３に対して異種間特異的であり、また、ヒトＣＤ３およびマカクザルＣＤ３に対して異種間特異的な、上記で列挙した単鎖分子による二重特異性結合が明確に検出された。ＦＡＣＳ解析において、すべての構築物は、それぞれの陰性対照と比較して、ＣＤ３およびＭＣＳＰ  Ｄ３に対する結合を示した。ヒトおよびマカクザルのＣＤ３抗原およびＭＣＳＰ Ｄ３抗原に対する二重特異性抗体の異種間特異性が裏付けられた。
【実施例１１】
【０３５４】
１１．ＭＣＳＰおよびＣＤ３に対する異種間特異的二重特異性単鎖抗体の生体活性
実施例７および８で説明したＭＣＳＰ  Ｄ３陽性細胞株を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏクロム５１（５１Ｃｒ）放出細胞傷害作用アッセイにより、作製した二重特異性単鎖抗体の生体活性を解析した。エフェクター細胞としては、それぞれの図中で指定した通り、刺激ヒトＣＤ４／ＣＤ５６枯渇ＰＢＭＣ、刺激ヒトＰＢＭＣ、またはマカクザルＴ細胞株である４１１９ＬｎＰｘを用いた。
【０３５５】
刺激ＣＤ４／ＣＤ５６枯渇ＰＢＭＣの作製は、以下の通りに実施した。３７℃で１時間にわたり、１μｇ／ｍｌの最終濃度にある市販の抗ＣＤ３特異性抗体（例えば、Ｏｔｈｏｃｌｏｎｅ社製のＯＫＴ３）により、ペトリディッシュ（直径１４５ｍｍ；クレムスミュンスター、Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ  ＧｍｂＨ社製）をコーティングした。結合しなかったタンパク質は、ＰＢＳによる１回の洗浄ステップにより除去した。標準的なプロトコールに従うＦｉｃｏｌｌ勾配遠心分離により、末梢血（３０〜５０ｍｌのヒト血液）から新鮮なＰＢＭＣを単離した。安定化グルタミン／１０％ＦＣＳ／２０Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２（Ｃｈｉｒｏｎ社製、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）を伴う１２０ｍｌのＲＰＭＩ １６４０中における３〜５×１０７個のＰＢＭＣを、あらかじめコーティングしたペトリディッシュへと添加し、２日間にわたり刺激した。３日目に細胞を回収し、ＲＰＭＩ  １６４０により１回洗浄した。２０Ｕ／ｍｌの最終濃度までＩＬ−２を添加し、再度１日間にわたり、上記と同じ細胞培地中において細胞を培養した。標準的なプロトコールに従いＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ５６＋  ＮＫ細胞を枯渇させることにより、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を濃縮した。
【０３５６】
ＰＢＳにより標的細胞を２回にわたり洗浄し、３７℃で４５分間にわたり、５０％ＦＣＳを伴う、最終容量１００μｌのＲＰＭＩ中において１１．１ＭＢｑの５１Ｃｒによりこれらを標識化した。その後、５ｍｌのＲＰＭＩにより３回にわたり、標識化した標的細胞を洗浄し、次いで、細胞傷害作用アッセイにおいて用いた。９６ウェルプレート内の総容量２５０μｌの補充ＲＰＭＩ（上記の）中において、Ｅ：Ｔ比１０：１でアッセイを実施した。１μｇ／ｍｌの異種間特異的二重特異性単鎖抗体分子、また、それらの２０段階にわたる３倍希釈系列を適用した。異種間特異的二重特異性単鎖抗体分子を含有する上清を用いる場合は、それらの２１段階にわたる２倍希釈系列および２０段階にわたる３倍希釈系列を、それぞれ、マカクザルおよびヒトにおける細胞傷害作用アッセイに適用した。アッセイ時間は１８時間であり、最大溶解量（Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを添加した場合）と、自発溶解量（エフェクター細胞なしの場合）との差と比べた、上清中において放出されるクロムの相対値として、細胞傷害作用を測定した。すべての測定は４連で実施した。上清中におけるクロム活性の測定は、ＷＩＺＡＲＤ  ３’’ガンマカウンター（ドイツ、ケルン、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＧｍｂＨ社製）により実施した。実験データの解析は、Ｐｒｉｓｍ  ４  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（米国、カリフォルニア州、サンディエゴ、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社製；ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．０２）により実施した。ソフトウェアにより決定される通り、Ｓ字型の用量反応曲線は、＞０．９０のＲ２値を有することが典型的であった。解析プログラムにより計算されるＥＣ５０値を、生体活性の比較に用いた。
【０３５７】
図１３〜１７および４０に示す通り、作製した異種間特異的二重特異性単鎖抗体構築物は、ヒトＭＣＳＰ  Ｄ３陽性標的細胞に対して、刺激ヒトＣＤ４／ＣＤ５６枯渇ＰＢＭＣ、または刺激ＰＢＭＣにより誘発される細胞傷害活性、また、マカクザルＭＣＳＰ  Ｄ３陽性標的細胞に対して、マカクザルＴ細胞株である４１１９ＬｎＰｘにより誘発される細胞傷害活性を示した。
【実施例１２】
【０３５８】
１２．ＭＣＳＰおよびＣＤ３に対する異種間特異的二重特異性単鎖抗体の血漿安定性
５０％ヒト血漿中において３７℃および４℃で２４時間にわたり、作製した二重特異性単鎖抗体をインキュベートし、その後、生体活性を調べることにより、ヒト血漿中における、該二重特異性単鎖抗体の安定性を解析した。ＭＣＳＰ陽性ＣＨＯ細胞株（実施例１４または１５に従いクローニングされるＭＣＳＰを発現する）を標的として、また、刺激ヒトＣＤ８陽性Ｔ細胞をエフェクター細胞として用いる、ｉｎ  ｖｉｔｒｏクロム５１（５１Ｃｒ）放出細胞傷害作用アッセイにおいて生体活性を調べた。
【０３５９】
上記で説明した解析プログラムにより計算されるＥＣ５０値を用いて、３７℃および４℃で２４時間にわたり５０％ヒト血漿と共にインキュベートした二重特異性単鎖抗体の生体活性を、血漿を添加しない二重特異性単鎖抗体、またはアッセイの直前に同量の血漿と混合する二重特異性単鎖抗体のそれぞれと比較した。
【０３６０】
図１８および表２に示す通り、Ｇ４  Ｈ−Ｌ×Ｉ２Ｃ  Ｈ−Ｌ二重特異性抗体、Ｇ４  Ｈ−Ｌ×Ｈ２Ｃ  Ｈ−Ｌ二重特異性抗体、およびＧ４  Ｈ−Ｌ×Ｆ１２Ｑ  Ｈ−Ｌ二重特異性抗体の生体活性は、血漿を添加しない対照、または生体活性を調べる直前に血漿を添加する対照と比較して、それほど低下しなかった。
【０３６１】
【表２】
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【実施例１３】
【０３６２】
１３・従来の、すなわち、環境に依存するＣＤ３エピトープを指向するＣＤ３結合分子に対する初期の曝露による、循環標的細胞の不在下における循環Ｔ細胞の再分布は、治療の開始と関連する有害事象の主要な危険因子である
従来のＣＤ３結合分子による治療開始後における、Ｂ細胞性非ホジキンリンパ腫（Ｂ−ＮＨＬ）患者におけるＴ細胞再分布
従来のＣＤ１９×ＣＤ３結合分子は、二重特異性のタンデムｓｃＦｖフォーマット（Ｌｏｆｆｌｅｒ（２０００、Ｂｌｏｏｄ、９５巻、６号）、またはＷＯ９９／５４４４０）によるＣＤ３結合分子である。それは、（ｉ）正常ヒトＢ細胞および悪性ヒトＢ細胞の表面上におけるＣＤ１９、ならびに（ｉｉ）ヒトＴ細胞上におけるＣＤ３を指向する２つの異なる結合部分からなる。Ｔ細胞上におけるＣＤ３を、Ｂ細胞上におけるＣＤ１９と架橋することにより、この構築物は、Ｔ細胞の細胞傷害活性により再指向される、正常Ｂ細胞および悪性Ｂ細胞の溶解を誘発する。
【０３６３】
このような従来のＣＤ３結合分子により認識されるＣＤ３エピトープは、ＣＤ３イプシロン鎖上に局在するが、この場合、該エピトープが適正な立体構造を帯びるのは、それが該イプシロン鎖の残りの部分の内に埋め込まれ、また、該イプシロン鎖がＣＤ３ガンマ鎖またはＣＤ３デルタ鎖とヘテロ二量体化することにより、それが適正な立体構造位置に保持される場合に限られる。この環境に高度に依存するエピトープが、従来のＣＤ３結合分子（例えば、Ｌｏｆｆｌｅｒ（２０００、Ｂｌｏｏｄ、９５巻、６号）、またはＷＯ９９／５４４４０を参照されたい）と相互作用する（それが純粋に一価形態で生じ、架橋がなされない場合であっても）と、ＣＤ３の立体構造においてアロステリック変化が誘導され、この変化がなければＣＤ３イプシロンの細胞質ドメイン内に隠されている、プロリンに富む領域が露出する。該プロリンに富む領域は、露出すると、さらなる細胞内シグナルを誘発することが可能なシグナル伝達分子であるＮｃｋ２を動員しうる。これは、例えば、Ｂ細胞表面上における複数のＣＤ１９分子により、Ｔ細胞上において、複数のＣＤ３分子に結合した複数の抗ＣＤ３分子が架橋されることを介して、Ｔ細胞表面上において、複数のＣＤ３分子が架橋されることを決定的に必要とする、Ｔ細胞の完全な活性化には不十分であるが、それでも、従来のＣＤ３結合分子が、ＣＤ３イプシロン上において、それらの環境に依存するエピトープに対して一価的に相互作用すれば、これは、シグナル伝達に関し、Ｔ細胞に対して不活性ではない。理論に拘束されることなしに述べると、従来の一価ＣＤ３結合分子（当技術分野で知られる）は、ヒトに注入されると、ＣＤ３架橋に用いられる循環標的細胞が存在しない場合であっても、ある程度のＴ細胞反応を誘導しうる。循環ＣＤ１９陽性Ｂ細胞を本質的に有さないＢ−ＮＨＬ患者に、従来の一価ＣＤ１９×ＣＤ３結合分子を静脈内注入した場合、これに対する重要なＴ細胞反応は、治療開始後におけるＴ細胞再分布である。ある第Ｉ相臨床試験では、ＣＤ１９×ＣＤ３結合分子を静脈内注入する開始期に、循環ＣＤ１９陽性標的Ｂ細胞を有さないすべての個体において、ＣＤ１９×ＣＤ３結合分子の用量には本質的に依存せずに、このＴ細胞反応が生じることが判明している（図１９）。しかし、ＣＤ１９×ＣＤ３結合分子に対する曝露が急激に増加すると、治療開始の初期にＣＤ１９×ＣＤ３結合分子に対してＴ細胞が曝露される場合と事実上同じ、再分布性Ｔ細胞反応が、これらの患者において誘発されることが判明しており（図２０Ａ）、また、ＣＤ１９×ＣＤ３結合分子に対する曝露が徐々に増加する場合であっても、やはり、これにより、循環Ｔ細胞に対する再分布効果が及びうる（図２１）。さらに、治療されるすべての固体のうちの１００％において、ＣＤ１９×ＣＤ３結合分子（例えば、ＷＯ９９／５４４４０で開示される）など、従来のＣＤ３結合分子により誘発される、循環標的細胞の不在下において本質的に用量に依存しないこの再分布性Ｔ細胞反応が、治療の開始と関連する有害事象の主要な危険因子であるであることも判明している。
【０３６４】
研究プロトコールに従い、マントル細胞リンパ腫を含め、組織学的に確認された、再発性緩慢性Ｂ細胞性非ホジキンリンパ腫（Ｂ−ＮＨＬ）を有する患者を、オープンラベル、多施設、第Ｉ相、患者間用量漸増試験に登録した。研究プロトコールは、すべての参加施設による個別の倫理委員会により承認され、責任規制機関へと送付され、通知された。研究への組入れには、ＣＴスキャンにより記録された測定可能な疾患（少なくとも１つの病変≧１．５ｃｍ）が必要とされた。患者には、一定の流量（すなわち、用量レベル）で４週間にわたる、携帯用ミニポンプシステムによる持続的な静脈内注入を介して、従来のＣＤ１９×ＣＤ３結合分子を施した。患者は、最初の２週間の治療で入院した後に、退院し、自宅で治療を継続した。４週間後に疾患進行の証拠が見られなかった患者には、さらに４週間にわたり治療を継続した。これまでのところ、最大耐量（ＭＴＤ）に達することなしに、６つの異なる用量レベル：０．５、１．５、５、１５、３０、および６０μｇ／ｍ２／２４時間が試みられた。研究プロトコールによりＤＬＴ（用量制限毒性）と規定される有害事象が観察されない限り、コホートは、各々３例ずつの患者からなった。最初の３例の患者のうちに１例のＤＬＴが見られる場合は、コホートを患者６例に拡張したが、これにより、（２例目のＤＬＴが見られない限りは）さらなる用量漸増が可能となった。したがって、患者３例のコホートでＤＬＴが見られないか、または患者６例のコホートでＤＬＴが１例の用量レベルは、安全であるとみなした。ＤＬＴを発生させた患者すべてにおいて、研究治療を中止した。１５および３０μｇ／ｍ２／２４時間では、複数のさらなるコホートにおいて、最初の２４時間で異なる治療開始方式について調べた：（ｉ）最初の２４時間にわたる５μｇ／ｍ２／２４時間の後で、１５μｇ／ｍ２／２４時間の維持用量へと段階的に増加させる方式（１５ステップの患者コホート）、（ｉｉ）ほぼゼロから１５または３０μｇ／ｍ２／２４時間へと、流速を均等かつ連続的に増加させる方式（１５ランプおよび３０ランプの患者コホート）、および（ｉｉｉ）開始当初から維持用量で開始する方式（１５フラット、３０フラット、および６０フラットの患者コホート）。用量レベル０．５、１．５、および５μｇ／ｍ２／２４時間の患者コホートは、すべて、開始当初から維持用量で開始した（すなわち、フラットによる開始）。
【０３６５】
以下の４色ＦＡＣＳ解析により、末梢血中における絶対Ｂ細胞カウントおよび絶対Ｔ細胞カウントの時間的推移を決定した。
【０３６６】
血液試料の採取およびルーチン解析
１５ランプ、１５フラット、３０ランプ、３０フラット、および６０フラットの患者コホートでは、ＣＤ１９×ＣＤ３結合分子（ＷＯ９９／５４４４０で開示される）注入の開始前において、また、この０．７５、２、６、１２、２４、３０、４８時間後において、ならびに解析用に４℃で出荷された、ＥＤＴＡを含有するＶａｃｕｔａｉｎｅｒ（商標）試験管（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）を用いる、従来のＣＤ１９×ＣＤ３結合分子注入終了後の治療８、１５、１７、２２、２４、２９、３６、４３、５０、５７日目、および４週間目において、血液試料（６ｍｌずつ）を得た。１５ステップの患者コホートでは、ＣＤ１９×ＣＤ３結合分子注入の開始前において、また、この６、２４、３０、４８時間後において、ならびにＣＤ１９×ＣＤ３結合分子注入終了後の治療８、１５、２２、２９、３６、４３、５０、５７日目、および４週間目において、血液試料（６ｍｌずつ）を得た。用量レベル０．５、１．５、および５μｇ／ｍ２／２４時間では、ＣＤ１９×ＣＤ３結合分子注入の開始前において、また、この６、２４、４８時間後において、ならびにＣＤ１９×ＣＤ３結合分子注入終了後の治療８、１５、２２、２９、３６、４３、５０、５７日目、および４週間目において、血液試料（６ｍｌずつ）を得た。一部の場合には、作業上の理由により、これらの時点に若干の変更が生じた。血液試料採取後の２４〜４８時間以内において、リンパ球部分集団についてのＦＡＣＳ解析を実施した。血液試料中における白血球部分集団の絶対数は、ＣｏｕｌｔｅｒＣｏｕｎｔｅｒ（商標）（Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）上における血球分類解析により決定した。
【０３６７】
血液試料からのＰＢＭＣの単離
適合させたＦｉｃｏｌｌ（商標）勾配分離プロトコールにより、ＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）の単離を実施した。室温で、３ｍｌのＢｉｏｃｏｌｌ（商標）液（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ社製）をあらかじめ充填した、１０ｍｌのＬｅｕｃｏｓｅｐ（商標）試験管（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）内へと、血液を移した。遠心分離は、スイングアウトローター内において、１７００×ｇおよび２２℃で１５分間にわたり、減速せずに実施した。Ｂｉｏｃｏｌｌ（商標）層の上部にあるＰＢＭＣを単離し、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ／２％ＦＢＳ［ウシ胎仔血清；Ｂｉｏｃｈｒｏｍ社製］）により１回洗浄し、遠心分離し、ＦＡＣＳ緩衝液中で再懸濁させた。すべての洗浄ステップにおける遠心分離は、スイングアウトローター内において、８００×ｇおよび４℃で４分間にわたり実施した。必要な場合、単離したＰＢＭＣを、室温で５分間にわたり、３ｍｌの赤血球溶解緩衝液（８．２９ｇのＮＨ４Ｃｌ、１．００ｇのＫＨＣＯ３、０．０３７ｇのＥＤＴＡ、および１．０１のＨ２Ｏ再蒸留、ｐＨ７．５）中においてインキュベートすることにより、赤血球を溶解させた後で、ＦＡＣＳ緩衝液による洗浄ステップを実施した。
【０３６８】
細胞表面分子に対する、蛍光標識化した抗体による、ＰＢＭＣの染色
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（１型番ＭＨＣＤ１３０１、２型番ＭＨＣＤ１４０１）、Ｄａｋｏ社（５型番Ｃ７２２４）、またはＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社（３型番５５５５１６、４型番３４５７６６）からモノクローナル抗体を購入し、製造元の推奨に従い用いた。以下の抗体組合せ：抗ＣＤ１３１／抗ＣＤ１４２（ＦＩＴＣ）×抗ＣＤ５６３（ＰＥ）×抗ＣＤ３４（ＰｅｒＣＰ）×抗ＣＤ１９５（ＡＰＣ）により、５×１０５〜１×１０６個の細胞を染色した。Ｖ字型の９６ウェル多重滴定プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）内において細胞をペレット化し、上清を除去した。ＦＡＣＳ緩衝液中において希釈した、特異性抗体を含有する総容量１００μｌ中において、細胞ペレットを再懸濁させた。４℃の暗所で３０分間にわたりインキュベーションを実施した。その後、ＦＡＣＳ緩衝液により２回にわたり試料を洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液中において細胞ペレットを再懸濁させ、フローサイトメトリー解析を行った。
【０３６９】
フローサイトメトリーによる、ＦＡＣＳにより染色されたリンパ球の検出
４色ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）により、データ採取を実施した。各測定につき、規定のリンパ球部分集団１×１０４個ずつを採取した。ＣｅｌｌＱｕｅｓｔＰｒｏ（商標）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）プログラムにより統計学的解析を実施し、リンパ球部分集団の百分率を求め、細胞表面分子の発現強度を分類した。その後、ＦＡＣＳにより決定された、総リンパ球（すなわち、ＣＤ１３／１４染色により骨髄細胞を除外した、Ｂ細胞およびＴ細胞およびＮＫ細胞）に対する単一のリンパ球部分集団の百分率を、血球分類解析によるリンパ球カウントと相関させて、Ｔ細胞（ＣＤ３＋、ＣＤ５６−、ＣＤ１３／１４−）およびＢ細胞（ＣＤ１９＋、ＣＤ１３／１４−）の細胞絶対数を計算した。
【０３７０】
治療開始時において循環ＣＤ１９陽性Ｂ細胞を本質的に有さないすべての患者における、従来のＣＤ１９×ＣＤ３結合分子（例えば、ＷＯ９９／５４４４０で開示される）による治療開始期のＴ細胞再分布を示す（図１９）。比較のため、著明数の循環ＣＤ１９陽性Ｂ細胞を有する患者における、従来のＣＤ１９×ＣＤ３結合分子による治療開始期のＴ細胞再分布の代表例を、図２２に示す。
【０３７１】
いずれの場合（すなわち、循環Ｂ細胞を本質的に含まない場合、または循環Ｂ細胞を多く含む場合）においても、治療を開始すると、循環Ｔ細胞カウントが急速に減少する。しかし、循環Ｂ細胞の不在下では、循環血中へのＴ細胞の回復が極めて早期となる傾向にあるのに対し、治療開始時において著明数の循環Ｂ細胞を有する患者の循環血中へのＴ細胞の回復は、これらの循環Ｂ細胞が枯渇するまで通常遅延する。したがって、Ｔ細胞再分布のパターンは、循環血中におけるＴ細胞再出現の動態において主に異なる。
【０３７２】
ＣＴスキャンに基づく有効性の評価は、中央基準放射線検査施設が、４週間の治療後において実施し、また、さらに４週間の治療を受ける患者では、８週間の治療後においてもこれを実施し、加えて、すべての症例で、治療終了の４週間後においてもこれを実施した。骨髄浸潤症例において、既知のすべての病変（脾臓の肥大を含めた）が消滅し、かつ／またはそれらのサイズが正常化し、加えて、リンパ腫細胞から骨髄細胞が消失していれば、完全寛解（ＣＲ）とカウントした。あらかじめ規定した各標的病変についての、２つの最大直径の積の和（ＳＰＤ）が、ベースラインから少なくとも５０％低下していれば、部分寛解（ＰＲ）と定め；これが少なくとも２５％低下していれば、軽度寛解（ＭＲ）とみなした。ベースラインからのＳＰＤの偏差が＋５０％〜−２５％であれば、安定（ＳＤ）とみなした。
【０３７３】
患者３４例における、患者の人口学的特徴、施された用量、および臨床転帰を、表３にまとめる。ＣＤ１９×ＣＤ３結合分子の臨床的な抗腫瘍活性は、明らかに用量依存的であった：５μｇ／ｍ２／２４時間により、末梢血からの循環ＣＤ１９陽性Ｂ（リンパ腫）細胞の一貫した枯渇が観察された。１５μｇ／ｍ２／２４時間および３０μｇ／ｍ２／２４時間では、客観的な臨床的寛解（ＰＲおよびＣＲ）が初めて記録されたほか、浸潤された骨髄からＢリンパ腫細胞が部分的かつ完全に消失した症例も記録された。最後に、６０μｇ／ｍ２／２４時間では、評価可能なすべての症例において、寛解率が１００％（ＰＲおよびＣＲ）へと上昇し、Ｂリンパ腫細胞からの骨髄のクリアランスも完全であった。
【０３７４】
ＣＤ１９×ＣＤ３結合分子は、大半の患者による忍容が良好であった。患者３４例における最も高頻度であったグレード１〜４の有害事象を、原因を問わず、表４にまとめる。ＣＤ１９×ＣＤ３結合分子に関連する有害事象は通常、一過性であり、完全に可逆性であった。特に、本質的に循環ＣＤ１９陽性Ｂ細胞を伴わず、ＣＤ１９×ＣＤ３結合分子を注入する開始期におけるＴ細胞再分布の反復と関連するＣＮＳ有害事象（主要な症状：錯乱および失見当）のため、その治療を早期に停止させた患者が２例（表３における患者番号１９および２４）見られた。
【０３７５】
これらの患者のうちの１例（番号１９）は、１５ステップコホートの患者であった。この患者は、最初の２４時間にわたり５μｇ／ｍ２／２４時間のＣＤ１９×ＣＤ３結合分子を施された後で、１５μｇ／ｍ２／２４時間の維持用量へと急激に増量された。対応するＴ細胞再分布パターンは、循環ＣＤ１９陽性Ｂ細胞を本質的に有さない循環血中において、５μｇ／ｍ２／２４時間で注入を開始したところ、循環Ｔ細胞カウントが急激に減少し、その後、早期にＴ細胞が再出現したことを示す。結果として、２４時間後において、ＣＤ１９×ＣＤ３結合分子の用量を５μｇ／ｍ２／２４時間から１５μｇ／ｍ２／２４時間へと増大させたところ、末梢Ｔ細胞カウントが完全に回復した。したがって、図２０Ａに示す通り、用量ステップが、Ｔ細胞再分布の第２のエピソードを誘発した可能性がある。この患者において、このＴ細胞再分布の反復は、ＣＮＳ副作用（主要な症状：錯乱および失見当）と関連し、このため、注入を停止させた。Ｔ細胞再分布の反復と、このようなＣＮＳ有害事象との関連はまた、ＣＤ１９×ＣＤ３結合分子（例えば、ＷＯ９９／５４４４０で開示される）を、２〜４時間にわたるボーラス注入の反復として施され、通常各回の後、２日間にわたる非治療間隔を伴った、Ｂ−ＮＨＬ患者を対象とするかつての第Ｉ相臨床試験においても観察された（図２０Ｂ）。１回のボーラス注入を行うたびに、循環Ｔ細胞カウントの急速な減少と、次回のボーラス注入前におけるＴ細胞の回復とからなる、Ｔ細胞再分布のエピソードが１回ずつ誘発された。全体では、患者２１例中５例において、Ｔ細胞再分布の反復と関連するＣＮＳ有害事象が観察された。図２０Ｂは、Ｔ細胞再分布の３回目のエピソード後においてＣＮＳ症状を発生させた、ボーラス注入試験に由来する代表的な１例の患者を示す。ボーラス注入試験においてＣＮＳ有害事象を示す患者はまた、循環Ｂ細胞カウントが少ないことが典型的である。
【０３７６】
ＣＤ１９×ＣＤ３結合分子を注入する開始期におけるＴ細胞再分布の反復と関連するＣＮＳ有害事象（主要な症状：錯乱および失見当）のため、早期に治療を停止させた第２の患者（番号２４）は、１５フラットコホートの患者であった。過誤により、この患者には、薬物の安定化に必要とされるＨＳＡを添加することなく、ＣＤ１９×ＣＤ３結合分子の注入が施された。結果として生じる、薬物流動の不均等により、Ｔ細胞再分布エピソードの反復が１度だけではなく誘発され（図２３Ａ）、ＣＮＳ症状を発生させたために、注入を停止させなければならない結果となった。しかし、薬物を安定化させるための追加のＨＳＡを含有するＣＤ１９×ＣＤ３結合分子溶液（例えば、ＷＯ９９／５４４４０で開示される）により、適正な形で同じ患者への注入を再開したところ、Ｔ細胞再分布の反復は観察されず、患者がＣＮＳ症状を再発させることはなかった（図２３Ｂ）。この患者はまた、循環Ｂ細胞も本質的に有さなかったので、循環Ｔ細胞は、観察された薬物曝露の微妙な変化に対しても、急速な再分布動態により反応した可能性がある。循環標的細胞を本質的に有さない患者におけるＴ細胞再分布と関連するＣＮＳ有害事象は、内皮細胞に対するＴ細胞の付着性が一過性に増大し、その後、大量の循環Ｔ細胞が血管壁に同時に付着し、この結果として観察される通り、循環血中におけるＴ細胞数が減少することにより説明することができる。大量のＴ細胞が血管壁に同時に付着することにより、内皮透過性の上昇および内皮細胞の活性化がもたらされうる。内皮透過性が上昇する結果として、体液が、血管内コンパートメントから、ＣＮＳ間質を含めた、組織の間質コンパートメント内へと移動する。Ｔ細胞の付着による内皮細胞の活性化は、凝血促進効果（Ｍｏｎａｃｏら、Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ  ７１（２００２）、６５９〜６６８）を示す場合があり、特に、毛細血管の微細循環に関して、血流（脳内血流を含めた）障害をもたらす可能性がある。したがって、循環標的細胞を本質的に有さない患者における、Ｔ細胞再分布と関連するＣＮＳ有害事象は、Ｔ細胞が内皮細胞に付着することにより、毛細血管漏洩、および／または毛細血管の微細循環における障害が生じる結果でありうる。１回のＴ細胞再分布エピソードにより引き起こされる内皮ストレスが、大半の患者により忍容されるのに対し、Ｔ細胞再分布の反復により引き起こされる内皮ストレスの上昇は、ＣＮＳ有害事象を高頻度で引き起こす。複数回のＴ細胞再分布エピソードがそれほど危険でない場合は、ベースラインの循環Ｔ細胞カウントが少ない患者に限られうる。しかし、ＣＤ１９×ＣＤ３結合分子によるボーラス注入試験の患者２１例中１例において観察される通り、このような事象に対する感受性が上昇したまれな症例では、１回のＴ細胞再分布エピソードにより引き起こされる限定的な内皮ストレスもまた、ＣＮＳ有害事象を引き起こしうる。
【０３７７】
理論に拘束されずに述べると、循環標的細胞を本質的に有さない患者において、内皮細胞に対するＴ細胞の付着性が一過性に上昇することは、上記で説明した通り、ＣＤ１９×ＣＤ３結合分子（例えば、ＷＯ９９／５４４４０）など、従来のＣＤ３結合分子が、ＣＤ３イプシロン上において、その環境に依存するエピトープに対して一価的に相互作用する結果、ＣＤ３立体構造のアロステリック変化がもたらされ、その後、ＣＤ３イプシロンの細胞質ドメインへとＮｃｋ２が動員されることに対する、Ｔ細胞の反応として説明することができる。Ｎｃｋ２は、ＰＩＮＣＨおよびＩＬＫによりインテグリンに直接的に連結されるため、ＣＤ１９×ＣＤ３結合分子など、従来のＣＤ３結合分子が、ＣＤ３イプシロン上においてその環境に依存するエピトープに結合することにより、ＣＤ３立体構造がアロステリック変化し、その後、ＣＤ３イプシロンの細胞質ドメインにＮｃｋ２が動員されると、内から外へのシグナル伝達を介して、Ｔ細胞表面上におけるインテグリンが、それらのより付着性のアイソフォームへと一過性に転換されることにより、内皮細胞に対するＴ細胞の付着性が増大しうる。
【０３７８】
【表３】
2018064565.tif 000006
【０３７９】
【表４】
2018064565.tif 000007
【０３８０】
用いた略号は、ＡＥ：有害事象；ＡＰ：アルカリホスファターゼ；ＬＤＨ：乳酸デヒドロゲナーゼ；ＣＲＰ：Ｃ反応性タンパク質；ＡＬＴ：アラニントランスアミナーゼ；ＡＳＴ：アスパラギン酸トランスアミナーゼ；ＧＧＴ：ガンマ−グルタミルトランスフェラーゼである；患者３４のさらなる治療サイクルからのＡＥデータは、いまだ組み込まれていない。
【０３８１】
上記で説明した通り、官能基を介して環境に依存するエピトープに結合することが可能な従来のＣＤ３結合分子（例えば、ＷＯ９９／５４４４０で開示される）は、患者において望ましくないＴ細胞再分布作用をもたらし、これにより、ＣＮＳ有害事象が引き起こされる。これに対し、本発明の結合分子は、ＣＤ３イプシロン鎖のうち、環境に依存しない、Ｎ末端におけるアミノ酸１〜２７に結合することにより、このようなＴ細胞再分布作用をもたらさない。結果として、本発明のＣＤ３結合分子は、従来のＣＤ３結合分子と比較して、より良好な安全性プロファイルと関連する。
【実施例１４】
【０３８２】
１４．表面における標的抗原を認識することによりＴ細胞を介する標的細胞溶解を誘導する本発明の二重特異性ＣＤ３結合分子は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて標的抗原陽性細胞を枯渇させる
標的抗原としてのＣＤ３３を認識する、本発明の二重特異性ＣＤ３結合分子は、カニクイザルの末梢血から、循環ＣＤ３３陽性単球を枯渇させる
ＣＨＯ細胞において、配列番号２６８のコードヌクレオチド配列を用いて発現させることにより、ＣＤ３３−ＡＦ５  ＶＨ−ＶＬ×Ｉ２Ｃ  ＶＨ−ＶＬ（アミノ酸配列：配列番号２６７）を作製した。（ｉ）コンセンサスのコザック配列内に埋め込まれた開始コドンを含む、Ｎ末端における免疫グロブリン重鎖リーダーのコード配列、また、（ｉｉ）停止コドンを後続させる、Ｃ末端におけるＨｉｓ６タグのコード配列の両方を、配列番号２６８のヌクレオチド配列にインフレームで結合させた後で、遺伝子合成により結果として得られるＤＮＡ断片を、発現ベクターであるｐＥＦ−ＤＨＦＲ（Ｒａｕｍら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ５０（２００１）、１４１〜１５０）の多重クローニング部位内へと挿入した。説明される通り（Ｍａｃｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２（１９９５）、７０２１〜７０２５）に、ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞を安定的にトランスフェクトし、ＣＤ３結合分子であるＣＤ３３−ＡＦ５  ＶＨ−ＶＬ×Ｉ２Ｃ  ＶＨ−ＶＬを培養物上清内へと分泌するＤＨＦＲ陽性トランスフェクタントを選択し、また、メトトレキサートによる遺伝子増幅を行い、発現レベルを上昇させた。カニクイザルにおいて用いられるＣＤ３３−ＡＦ５  ＶＨ−ＶＬ×Ｉ２Ｃ  ＶＨ−ＶＬについての解析的なＳＥＣプロファイルは、被験物質が、ほぼもっぱら単量体からなることを明らかにした。カニクイザルＣＤ３３をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を標的細胞として用い、また、マカクザルＴ細胞株である４１１９ＬｎＰｘをエフェクター細胞供給源として用いる、実施例１６．５で説明される細胞傷害作用アッセイにおいて、被験物質の効力を測定した（図２５）。エフェクターＴ細胞による最大半量の標的細胞溶解に必要なＣＤ３３−ＡＦ５  ＶＨ−ＶＬ×Ｉ２Ｃ  ＶＨ−ＶＬの濃度（ＥＣ５０）は、２．７ｎｇ／ｍｌと決定された。
【０３８３】
異なる流速（すなわち、用量レベル）で、ＣＤ３結合分子であるＣＤ３３−ＡＦ５  ＶＨ−ＶＬ×Ｉ２Ｃ  ＶＨ−ＶＬを持続的に静脈内注入することにより、若齢（約３歳）の成体カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  ｍｏｎｋｅｙｓ）（カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｉｃｕｌａｒｉｓ））を治療し、末梢血からの循環ＣＤ３３陽性単球の枯渇について調べた。この状況は、循環ＣＤ１９陽性標的Ｂ細胞を有するＢ−ＮＨＬ患者に対する、従来のＣＤ３結合分子であるＣＤ１９×ＣＤ３（Ｂ細胞上におけるＣＤ１９およびＴ細胞上におけるＣＤ３に特異的）による治療（例えば、ＷＯ９９／５４４４０を参照されたい）と同等である。末梢血から循環ＣＤ１９陽性標的Ｂ細胞が枯渇したことにより、Ｂ−ＮＨＬなどのＣＤ１９陽性のＢ細胞悪性腫瘍を有する患者において、従来のＣＤ３結合分子（ＷＯ９９／５４４４０に記載のＣＤ１９×ＣＤ３結合分子）が、一般的な臨床有効性についての正当なサロゲートであることが分かった。同様に、末梢血から循環ＣＤ３３陽性単球が枯渇すれば、ＡＭＬ（急性骨髄性白血病）など、ＣＤ３３陽性の骨髄性悪性腫瘍を有する患者において、ＣＤ３３−ＡＦ５  ＶＨ−ＶＬ×Ｉ２Ｃ  ＶＨ−ＶＬなど、本発明のＣＤ３３を指向する二重特異性ＣＤ３結合分子が、一般的な臨床有効性についての正当なサロゲートであるとみなされる。
【０３８４】
以下の通り、スイベル法により、持続的注入を実施した：静脈カテーテルを用いて、サルの大腿静脈を介し、下大静脈内へとカテーテルを挿入する。カテーテルを、皮下にくぐらせて、背側肩領域へと到達させ、肩甲骨後縁において体外へと露出させる。次いで、拘束衣および保護スプリング内に挿管を通す。動物の体周に拘束衣を固定させ、挿管を介して、カテーテルを注入ポンプへと接続する。
【０３８５】
動物を注入状態に馴らすために、４８ｍｌ／２４時間で７日間にわたり、被験物質を伴わない投与溶液（１．２５Ｍリシン、０．１％ｔＷｅｅｎ８０、ｐＨ７）を持続的に注入した後で、治療を開始した。被験物質であるＣＤ３３−ＡＦ５  ＶＨ−ＶＬ×Ｉ２Ｃ  ＶＨ−ＶＬを、被験対象である各個別の用量レベル（すなわち、ＣＤ３３−ＡＦ５  ＶＨ−ＶＬ×Ｉ２Ｃ  ＶＨ−ＶＬの流速）に必要とされる量で投与溶液へと添加することにより、治療を開始した。馴致期および治療期の全体を通して、毎日注入容器を交換した。動物に１４日間の治療を施す１２０μｇ／ｍ２／２４時間の場合を除き、計画治療期間は７日間であった。
【０３８６】
循環Ｔ細胞および循環ＣＤ３３陽性単球の絶対カウントの推移は、それぞれ、４色または３色のＦＡＣＳ解析により決定した。
【０３８７】
血液試料の採取およびルーチン解析
ＭＣＳＰ−Ｇ４  ＶＨ−ＶＬ×Ｉ２Ｃ  ＶＨ−ＶＬによる持続的注入の開始前、また、この０．７５、２、６、１２、２４、３０、４８、７２時間後において、ならびに解析用に４℃で出荷された、ＥＤＴＡを含有するＶａｃｕｔａｉｎｅｒ（商標）試験管（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）を用いる治療の７および４日後（また、１２０μｇ／ｍ２／２４時間の用量レベルでは、９日後）において、血液試料（１ｍｌずつ）を得た。一部の場合では、作業上の理由により、これらの時点に若干の変更が生じた。血液試料採取の２４〜４８時間以内において、リンパ球部分集団についてのＦＡＣＳ解析を実施した。血液試料中における白血球部分集団の絶対数は、ルーチンの獣医学実験室における血球分類解析により決定した。
【０３８８】
血液試料からのＰＢＭＣの単離
用いられる容量に適合させながら、上記の実施例１３で説明したプロトコールと同様に、ＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）を単離した。
【０３８９】
細胞表面分子に対する、蛍光標識化した抗体による、ＰＢＭＣの染色
Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社（１型番３４５７８４、２型番５５６６４７、３型番５５２８５１、６型番５５７７１０）、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社（４型番ＩＭ２４７０）、およびＭｉｌｔｅｎｙｉ社（５型番１３０−０９１−７３２）から、カニクイザル抗原と反応するモノクローナル抗体を購入し、製造元の推奨に従い用いた。以下の抗体組合せ：抗ＣＤ１４１（ＦＩＴＣ）×抗ＣＤ５６２（ＰＥ）×抗ＣＤ３３（ＰｅｒＣＰ）×抗ＣＤ１９４（ＡＰＣ）、および抗ＣＤ１４１（ＦＩＴＣ）×抗ＣＤ３３５（ＰＥ）×抗ＣＤ１６６（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７（商標））により、５×１０５〜１×１０６個の細胞を染色した。さらなるステップは、上記の実施例１３において説明した通りに実施した。
【０３９０】
フローサイトメトリーによる、ＦＡＣＳにより染色されたリンパ球の検出
４色ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）により、データ採取を実施した。各測定につき、規定のリンパ球部分集団１×１０４個ずつを採取した。ＣｅｌｌＱｕｅｓｔＰｒｏ（商標）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）プログラムにより統計学的解析を実施し、リンパ球部分集団の百分率を求め、細胞表面分子の発現強度を分類した。その後、ＦＡＣＳにより決定された、総リンパ球（すなわち、ＣＤ１４染色により骨髄細胞を除外した、Ｂ細胞およびＴ細胞およびＮＫ細胞）に対する単一のリンパ球部分集団の百分率を、血球分類解析によるリンパ球カウントと相関させて、Ｔ細胞（ＣＤ３＋、ＣＤ５６−、ＣＤ１４−）の細胞絶対数を計算した。血球分類解析による単球カウントを、ＦＡＣＳにより決定された、全単球（ＣＤ１４＋）に対するＣＤ３３陽性単球（ＣＤ３３＋、ＣＤ１４＋）の対応する比率で乗じることにより、ＣＤ３３陽性単球の絶対数を計算した。
【０３９１】
３０μｇ／ｍ２／２４時間から、６０および２４０μｇ／ｍ２／２４時間を経て１０００μｇ／ｍ２／２４時間へと至る、コホート間における用量漸増を伴う、カニクイザル２匹ずつによる４コホートにおける、ＣＤ３３−ＡＦ５  ＶＨ−ＶＬ×Ｉ２Ｃ  ＶＨ−ＶＬによる治療終了時における、循環ＣＤ３３陽性単球絶対カウントのベースライン（すなわち、１００％）と比較した百分率を、図２６Ａに示す。
【０３９２】
図２６Ａに示す通り、ＣＤ３３−ＡＦ５  ＶＨ−ＶＬ×Ｉ２Ｃ  ＶＨ−ＶＬを静脈内において持続的に注入することにより、用量依存的な形で、循環ＣＤ３３陽性単球の枯渇が誘導される。７日間の治療後において、３０μｇ／ｍ２／２４時間では、循環ＣＤ３３陽性単球の検出可能な枯渇がまだ見られなかったのに対し、６０μｇ／ｍ２／２４時間では、ＣＤ３３陽性単球カウントが減少する最初の傾向が見られるようになった。２４０μｇ／ｍ２／２４時間では、３日間の治療後において、循環ＣＤ３３陽性単球は、ほぼ完全に末梢血から枯渇した。１０００μｇ／ｍ２／２４時間では、これにさらにより迅速に到達し、末梢血からの循環ＣＤ３３陽性単球の枯渇は、既に治療の１日後において完了した。この知見は、１２０μｇ／ｍ２／２４時間で１４日間にわたり、ＣＤ３３−ＡＦ５  ＶＨ−ＶＬ×Ｉ２Ｃ  ＶＨ−ＶＬを持続的に注入することにより治療した２匹のカニクイザルにおいて、それぞれのベースラインと比較して、循環ＣＤ３３陽性単球が３分の２および５０％枯渇したことを示す、図２６Ｂで示される結果により裏付けられた。
【０３９３】
この結果は、特に、ＡＭＬなど、ＣＤ３３陽性悪性腫瘍の治療に対して、本発明のＣＤ３結合分子一般、また、本発明のＣＤ３３を指向する二重特異性ＣＤ３結合分子が臨床的に有効であることの明確な徴候である。さらに、図２２に示す通り、循環標的細胞（すなわち、ＣＤ３３陽性単球）の存在下において、ＣＤ３３−ＡＦ５  ＶＨ−ＶＬ×Ｉ２Ｃ  ＶＨ−ＶＬにより治療した場合の開始期におけるＴ細胞再分布は、著明数の循環標的細胞（すなわち、ＣＤ１９陽性Ｂ細胞）を有するＢ−ＮＨＬ患者において、ＷＯ９９／５４４４０で説明される、従来のＣＤ１９×ＣＤ３構築物により治療した場合の開始期におけるＴ細胞再分布ほど顕著ではないと考えられる。ＣＤ１９×ＣＤ３の注入を開始したところ、Ｔ細胞が循環から完全に消滅し、循環ＣＤ１９陽性標的Ｂ細胞が末梢血から枯渇するまでは再出現しない（図２２）のに対し、ＣＤ３３−ＡＦ５  ＶＨ−ＶＬ×Ｉ２Ｃ  ＶＨ−ＶＬにより注入を開始しても、初期における循環Ｔ細胞の消滅は不完全であり、循環ＣＤ３３陽性標的細胞がまだ存在するうちにＴ細胞カウントが回復する（図２６Ｂ）。これにより、本発明のＣＤ３結合分子（ヒト、および非チンパンジーＣＤ３ε（イプシロン）鎖エピトープを指向し、これに対して作製され、また、配列番号２、４、６、または８で示されるアミノ酸配列の一部もしくは断片または全長である）は、環境に依存しないＣＤ３エピトープを認識することにより、ＷＯ９９／５４４４０に記載の結合分子など、環境に依存するＣＤ３エピトープを認識する、従来のＣＤ３結合分子より好ましいＴ細胞再分布プロファイルを示すことが裏付けられる。
【実施例１５】
【０３９４】
１５．本質的に環境に依存しないＣＤ３エピトープを指向する本発明のＣＤ３結合分子は、循環標的細胞の不在下において循環Ｔ細胞の再分布を誘導することがより少なく、治療開始に関連する有害事象の危険性を軽減する
本発明の代表的な異種間特異的ＣＤ３結合分子による治療開始後のカニクイザルにおけるＴ細胞再分布の軽減
ＣＨＯ細胞において、配列番号１９４のコードヌクレオチド配列を用いて発現させることにより、ＭＣＳＰ−Ｇ４  ＶＨ−ＶＬ×Ｉ２Ｃ  ＶＨ−ＶＬ（アミノ酸配列：配列番号１９３）を作製した。（ｉ）コンセンサスのコザック配列内に埋め込まれた開始コドンを含む、Ｎ末端における免疫グロブリン重鎖リーダーのコード配列、また、（ｉｉ）停止コドンを後続させる、Ｃ末端におけるＨｉｓ６タグのコード配列の両方を、配列番号１９４のヌクレオチド配列にインフレームで結合させた後で、遺伝子合成により結果として得られるＤＮＡ断片を、発現ベクターであるｐＥＦ−ＤＨＦＲ（Ｒａｕｍら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ５０（２００１）、１４１〜１５０）の多重クローニング部位内へと挿入した。説明される通り（Ｍａｃｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２（１９９５）、７０２１〜７０２５）に、ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞を安定的にトランスフェクトし、ＣＤ３結合分子であるＭＣＳＰ−Ｇ４  ＶＨ−ＶＬ×Ｉ２Ｃ  ＶＨ−ＶＬを培養物上清内へと分泌するＤＨＦＲ陽性トランスフェクタントを選択し、また、メトトレキサートによる遺伝子増幅を行い、発現レベルを上昇させた。カニクイザルを治療するための被験物質は、２００リットルの発酵槽内で作製した。ＭＣＳＰ−Ｇ４  ＶＨ−ＶＬ×Ｉ２Ｃ  ＶＨ−ＶＬのＣ末端におけるＨｉｓ６タグを標的とするＩＭＡＣアフィニティークロマトグラフィー、その後の予備的なサイズ除外クロマトグラフィー（ＳＥＣ）に基づき、回収物からタンパク質を精製した。内毒素を含まない、最終的な被験物質の総収量は、４０ｍｇであった。被験物質は、７０％の単量体、３０％の二量体、また、より高次の多量体による少量の汚染物質からなった。カニクイザルＭＣＳＰをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を標的細胞として用い、また、マカクザルＴ細胞株である４１１９ＬｎＰｘをエフェクター細胞供給源として用いる、実施例１１で説明した細胞傷害作用アッセイにおいて、被験物質の効力を測定した（図２７）。エフェクターＴ細胞による最大半量の標的細胞溶解に必要なＭＣＳＰ−Ｇ４  ＶＨ−ＶＬ×Ｉ２Ｃ  ＶＨ−ＶＬの濃度（ＥＣ５０）は、１．９ｎｇ／ｍｌと決定された。
【０３９５】
異なる流速（すなわち、用量レベル）で、ＣＤ３結合分子であるＭＣＳＰ−Ｇ４  ＶＨ−ＶＬ×Ｉ２Ｃ  ＶＨ−ＶＬを持続的に静脈内注入することにより、若齢（約３歳）の成体カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  ｍｏｎｋｅｙｓ）（カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｉｃｕｌａｒｉｓ））を治療し、循環標的細胞の不在下で治療を開始した後における循環Ｔ細胞の再分布について調べた。ＣＤ３結合分子であるＭＣＳＰ−Ｇ４  ＶＨ−ＶＬ×Ｉ２Ｃ  ＶＨ−ＶＬは、カニクイザルＭＣＳＰおよびカニクイザルＣＤ３の両方を認識しうるが、ＭＣＳＰを発現する循環血液細胞は存在しない。したがって、循環血中において可能な相互作用は、Ｔ細胞上におけるＣＤ３に対する、ＭＣＳＰ−Ｇ４  ＶＨ−ＶＬ×Ｉ２Ｃ  ＶＨ−ＶＬのＣＤ３特異性アームの結合だけである。この状況は、実施例１３で説明した通り、循環ＣＤ１９陽性標的Ｂ細胞を有さないＢ−ＮＨＬ患者に対する、従来のＣＤ３結合分子（Ｂ細胞上におけるＣＤ１９およびＴ細胞上におけるＣＤ３に特異的なＣＤ１９×ＣＤ３結合分子）による治療と同等である。
【０３９６】
以下の通り、スイベル法により、持続的注入を実施した：静脈カテーテルを用いて、該サルの大腿静脈を介し、下大静脈内へとカテーテルを挿入する。カテーテルを、皮下にくぐらせて、背側肩領域へと到達させ、肩甲骨後縁において体外へと露出させる。次いで、拘束衣および保護スプリング内に挿管を通す。動物の体周に拘束衣を固定させ、挿管を介して、カテーテルを注入ポンプへと接続する。
【０３９７】
動物を注入状態に馴らすために、４８ｍｌ／２４時間で７日間にわたり、被験物質を伴わない投与溶液（１．２５Ｍリシン、０．１％ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ７）を持続的に注入した後で、治療を開始した。被験物質であるＭＣＳＰ−Ｇ４  ＶＨ−ＶＬ×Ｉ２Ｃ  ＶＨ−ＶＬを、被験対象である各個別の用量レベル（すなわち、ＭＣＳＰ−Ｇ４  ＶＨ−ＶＬ×Ｉ２Ｃ  ＶＨ−ＶＬの流速）に必要とされる量で投与溶液へと添加することにより、治療を開始した。馴致期および治療期の全体を通して、毎日注入容器を交換した。計画治療期間は７日間であった。
【０３９８】
末梢血中における絶対Ｔ細胞カウントの推移は、以下の通り、４色ＦＡＣＳ解析により決定した。
【０３９９】
血液試料の採取およびルーチン解析
ＭＣＳＰ−Ｇ４  ＶＨ−ＶＬ×Ｉ２Ｃ  ＶＨ−ＶＬによる持続的注入の開始前、また、この０．７５、２、６、１２、２４、３０、４８、７２時間後において、ならびに解析用に４℃で出荷された、ＥＤＴＡを含有するＶａｃｕｔａｉｎｅｒ（商標）試験管（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）を用いる治療の７日後において、血液試料（１ｍｌずつ）を得た。一部の場合では、作業上の理由により、これらの時点に若干の変更が生じた。血液試料採取の２４〜４８時間以内において、リンパ球部分集団についてのＦＡＣＳ解析を実施した。血液試料中における白血球部分集団の絶対数は、ルーチンの獣医学実験室における血球分類解析により決定した。
【０４００】
血液試料からのＰＢＭＣの単離
用いられる容量に適合させながら、上記の実施例１３で説明したプロトコールと同様に、ＰＢＭＣを単離した。
【０４０１】
細胞表面分子に対する、蛍光標識化した抗体による、ＰＢＭＣの染色
Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社（１型番３４５７８４、２型番５５６６４７、３型番５５２８５１）、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社（４型番ＩＭ２４７０）から、カニクイザル抗原と反応するモノクローナル抗体を購入し、製造元の推奨に従い用いた。以下の抗体組合せ：抗ＣＤ１４１（ＦＩＴＣ）×抗ＣＤ５６２（ＰＥ）×抗ＣＤ３３（ＰｅｒＣＰ）×抗ＣＤ１９４（ＡＰＣ）により、５×１０５〜１×１０６個の細胞を染色した。さらなるステップは、上記の実施例１３において説明した通りに実施した。
【０４０２】
フローサイトメトリーによる、ＦＡＣＳにより染色されたリンパ球の検出
４色ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）により、データ採取を実施した。各測定につき、規定のリンパ球部分集団１×１０４個ずつを採取した。ＣｅｌｌＱｕｅｓｔＰｒｏ（商標）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）プログラムにより統計学的解析を実施し、リンパ球部分集団の百分率を求め、細胞表面分子の発現強度を分類した。その後、ＦＡＣＳにより決定された、総リンパ球（すなわち、ＣＤ１４染色により骨髄細胞を除外した、Ｂ細胞およびＴ細胞およびＮＫ細胞）に対する単一のリンパ球部分集団の百分率を、血球分類解析によるリンパ球カウントと相関させて、Ｔ細胞（ＣＤ３＋、ＣＤ５６−、ＣＤ１４−）の細胞絶対数を計算した。
【０４０３】
カニクイザルにおける、用量レベル６０、２４０、および１０００μｇ／ｍ２／２４時間のＭＣＳＰ−Ｇ４  ＶＨ−ＶＬ×Ｉ２Ｃ  ＶＨ−ＶＬにより治療した場合の開始期におけるＴ細胞再分布を、図２８に示す。これらの動物は、治療開始期において、Ｔ細胞再分布の徴候をまったく示さなかった、すなわち、治療開始時において、Ｔ細胞カウントは、減少せずに増加した。環境に依存するＣＤ３エピトープに対する従来のＣＤ３結合分子（例えば、ＷＯ９９／５４４４０で説明されるＣＤ１９×ＣＤ３構築物）により治療を開始したところ、循環標的細胞を有さない全患者のうちの１００％において、Ｔ細胞再分布が一貫して観察されたことを踏まえると、配列番号２、４、６、もしくは８、またはこれらの断片のうちのいずれかによるアミノ酸配列により定義される、ヒト、および非チンパンジー霊長動物のＣＤ３イプシロン鎖のエピトープを指向し、またこれに対して作製された、本発明のＣＤ３結合分子では、治療開始時の循環標的細胞不在下において、実質的により低度のＴ細胞再分布が観察されうることが裏付けられた。これは、ＷＯ９９／５４４４０で説明される構築物など、環境に依存するＣＤ３エピトープを指向するＣＤ３結合分子とは明らかに対照的である。（とりわけ）配列番号２、４、６、または８（またはこれらの配列の断片）のうちのいずれか１つで示される、環境に依存しないＣＤ３エピトープに対する結合分子がもたらすＴ細胞再分布は、実質的に低度である（有害性が低く、また、望ましくない程度が低い）。ＣＤ３結合分子による治療の開始期におけるＴ細胞再分布は、ＣＮＳ有害事象の主要な危険因子なので、本明細書で記載され、環境に依存しないＣＤ３エピトープを認識することが可能なＣＤ３結合分子は、当技術分野で知られ、環境に依存するＣＤ３エピトープを指向するＣＤ３結合分子を上回る、実質的な利点を有する。実際、ＭＣＳＰ−Ｇ４  ＶＨ−ＶＬ×Ｉ２Ｃ  ＶＨ−ＶＬにより治療したカニクイザルは、ＣＮＳ症状の徴候を全く示さなかった。
【０４０４】
本発明では、環境に依存しないＣＤ３エピトープを提供するが、これは、ＣＤ３イプシロンのＮ末端における２７アミノ酸、またはこの２７アミノ酸の連なりによる断片に対応する。この環境に依存しないエピトープは、ＣＤ３複合体内におけるその天然環境から取り出し、その構造的完全性を喪失させずに、異種アミノ酸配列へと融合させる。本明細書で記載され、環境に依存しないＣＤ３エピトープに対して作製された（また、これを指向する）抗ＣＤ３結合分子は、Ｔ細胞再分布に関して驚くべき臨床的改善をもたらし、したがって、より良好な安全性プロファイルをもたらす。理論に拘束されずに述べると、本明細書に記載のＣＤ３結合分子は、それらのＣＤ３エピトープが環境に依存せず、ＣＤ３複合体の残りの部分に対してさほどの影響を及ぼすことなく、自律的で自足的なサブドメインを形成するので、ＣＤ３立体構造において誘導するアロステリック変化が、環境に依存するＣＤ３エピトープを認識する従来のＣＤ３結合分子（ＷＯ９９／５４４４０に記載の分子など）より小さい。結果として（ここでもまた、理論に拘束されずに述べると）、本明細書に記載のＣＤ３結合分子により誘導される細胞内ＮｃＫ２の動員もまた低下し、その結果、Ｔ細胞インテグリンアイソフォームの転換が低下し、また、内皮細胞へのＴ細胞の付着も低下する。本発明のＣＤ３結合分子（本明細書で定義される環境に依存しないエピトープを指向し、また、これに対して作製される）は、本質的に、単量体からなることが好ましい。これらの単量体分子は、治療開始期におけるＴ細胞再分布を回避し、したがって、ＣＮＳ有害事象の危険性を回避するのにさらにより有効（二量体分子または多量体分子より）である。
【実施例１６】
【０４０５】
１６．ＣＤ３３およびＣＤ３に対する異種間特異的二重特異性単鎖抗体分子の作製および特徴づけ
１６．１．ヒトＣＤ３３を発現するＣＨＯ細胞の作製
標準的なプロトコールに従う遺伝子合成により、ＧｅｎＢａｎｋで公表されているヒトＣＤ３３のコード配列（受託番号ＮＭ＿００１７７２）を得た。遺伝子合成断片は、まず、真核細胞内において該構築物を発現させるためのコザック部位、次いで、１９アミノ酸の免疫グロブリンリーダーペプチド、次いで、インフレームで、成熟ヒトＣＤ３３タンパク質のコード配列、次いで、インフレームで、セリン−グリシンジペプチド、ヒスチジン６タグのコード配列、および終止コドンを含有するようにデザインした（該構築物のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、配列番号３０５および３０６に列挙する）。遺伝子合成断片はまた、該断片の始点および終点において制限部位を導入するようにもデザインした。５’端においてＥｃｏＲＩ、また、３’端においてＳａｌＩの制限部位を導入し、以下のクローニング手順で用いた。標準的なプロトコールに従い、ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩを介して、遺伝子合成断片を、ｐＥＦ−ＤＨＦＲ（ｐＥＦ−ＤＨＦＲは、Ｒａｕｍら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ５０（２００１）、１４１〜１５０において説明されている）と称するプラスミド内へとクローニングした。標準的なプロトコール（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１））に従い、前述の手順を実施した。真核細胞内において該構築物を発現させるため、ヌクレオチド配列を検証したクローンをＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞内へとトランスフェクトした。Ｋａｕｆｍａｎｎ  Ｒ．Ｊ．（１９９０）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５、５３７〜５６６により説明される通り、ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞内において、真核細胞内のタンパク質発現を実施した。メトトレキサート（ＭＴＸ）濃度を、最高２０ｎＭ  ＭＴＸの最終濃度まで上昇させることにより、該構築物の遣伝子増幅を誘導した。
【０４０６】
１６．２．マカクザルＣＤ３３の細胞外ドメインを発現するＣＨＯ細胞の作製
標準的なプロトコールに従い調製されたマカクザルの骨髄に由来するｃＤＮＡに対する３つのＰＣＲセットにより、マカクザルＣＤ３３のｃＤＮＡ配列を得た。以下の反応条件：９４℃で３分間にわたる１サイクル、次いで、９４℃で１分間、５３℃で１分間、また、７２℃で２分間にわたる３５サイクル、次いで、７２℃で３分間にわたる最終サイクル、および以下のプライマーを用いた：
１．順方向プライマー：５’−ｇａｇｇａａｔｔｃａｃｃａｔｇｃｃｇｃｔｇｃｔｇｃｔａｃｔｇｃｔｇｃｃｃｃｔｇｃｔｇｔｇｇｇｃａｇｇｇｇｃｃｃｔｇｇｃｔａｔｇｇ−３’（配列番号３６９）
逆方向プライマー：５’−ｇａｔｔｔｇｔａａｃｔｇｔａｔｔｔｇｇｔａｃｔｔｃｃ−３’（配列番号３７０）
２．順方向プライマー：５’−ａｔｔｃｃｇｃｃｔｃｃｔｔｇｇｇｇａｔｃｃ−３’（配列番号３７１）
逆方向プライマー：５’−ｇｃａｔａｇｇａｇａｃａｔｔｇａｇｃｔｇｇａｔｇｇ−３’（配列番号３７２）
３．順方向プライマー：５’−ｇｃａｃｃａａｃｃｔｇａｃｃｔｇｔｃａｇｇ−３’（配列番号３７３）
逆方向プライマー：５’−ａｇｔｇｇｇｔｃｇａｃｔｃａｃｔｇｇｇｔｃｃｔｇａｃｃｔｃｔｇａｇｔａｔｔｃｇ−３’（配列番号３７４）
【０４０７】
これらのＰＣＲにより、該ＰＣＲプライマーを用いる標準的なプロトコールに従い単離および配列決定される３つの重複する断片が生成され、これにより、その成熟タンパク質のコドン＋２の第２のヌクレオチドから、コドン＋３４０の第３のヌクレオチドまでにわたる、マカクザルＣＤ３３のｃＤＮＡ配列の一部がもたらされた。マカクザルＣＤ３３を発現させる構築物を作製するため、標準的なプロトコールに従う遺伝子合成により、ｃＤＮＡ断片を得た（該構築物のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、配列番号３０７および３０８に列挙する）。この構築物では、その成熟タンパク質のアミノ酸＋３〜＋３４０に由来するマカクザルＣＤ３３のコード配列を、ヒトＣＤ３３のコード配列内へと融合させて、アミノ酸＋３〜＋３４０のヒトコード配列を置換した。遺伝子合成断片はまた、真核細胞内において該構築物を発現させるためのコザック部位、また、マカクザルのＣＤ３３全細胞外ドメイン、マカクザルのＣＤ３３膜貫通ドメイン、およびマカクザル−ヒトキメラのＣＤ３３細胞内ドメインを本質的にコードするｃＤＮＡを含有する断片の始点および終点において制限部位を含有するようにもデザインした。５’端においてＸｂａＩ、また、３’端においてＳａｌＩの制限部位を導入し、以下のクローニング手順で用いた。次いで、ＸｂａＩおよびＳａｌＩを介して、遺伝子合成断片を、ｐＥＦ−ＤＨＦＲ（ｐＥＦ−ＤＨＦＲは、Ｒａｕｍら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ５０（２００１）、１４１〜１５０において説明されている）と称するプラスミド内へとクローニングした。上記で説明した通り、このプラスミドの配列を検証したクローンを用いて、ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞にトランスフェクトした。
【０４０８】
１６．３．ＣＤ３３およびＣＤ３に対する異種間特異的二重特異性単鎖抗体分子の作製
異種間特異的結合分子のクローニング
一般に、各々が、ヒト、および非チンパンジー霊長動物のＣＤ３イプシロンに対して異種間特異的な結合特異性を有するドメイン、ならびにヒト、および非チンパンジー霊長動物のＣＤ３３に対して異種間特異的な結合特異性を有するドメインを含む二重特異性単鎖抗体分子を、以下の表５に示す通りにデザインした。
【０４０９】
【表５】
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【０４１０】
遺伝子合成により、ヒトＣＤ３３およびマカクザルＣＤ３３に対して異種間特異的な軽鎖（Ｌ）可変ドメインおよび重鎖（Ｈ）可変ドメインと、ヒトおよびマカクザルのＣＤ３に対して異種間特異的なＣＤ３特異性ＶＨおよびＣＤ３特異性ＶＬの組合せとを含有する前述の構築物を得た。ＭＣＳＰおよびＣＤ３に対する異種間特異的単鎖分子について実施例９で説明したのと同様に、遺伝子合成断片をデザインし、真核細胞内のタンパク質発現を実施した。ＣＤ３３およびＣＤ３に対する異種間特異的単鎖分子の発現および精製にも同じことがあてはまる。
【０４１１】
ウェスタンブロットでは、精製された二重特異性抗体に対応する５２ｋＤにおいて、単一のバンドが検出された。
【０４１２】
１６．４．フローサイトメトリーによる、ＣＤ３３およびＣＤ３に対する異種間特異的二重特異性抗体の結合についての解析
ヒトおよびマカクザルのＣＤ３３およびＣＤ３のそれぞれに結合する能力に関して、異種間特異的二重特異性抗体構築物の機能性を調べるために、ヒトＣＤ３３またはマカクザルＣＤ３３の細胞外ドメインを発現するＣＨＯ細胞（実施例１６．１および１６．２を参照されたい）を用い、実施例１０において、ＭＣＳＰおよびＣＤ３に対する異種間特異的二重特異性抗体について説明した解析と同様のＦＡＣＳ解析を実施した。
【０４１３】
図２９に示す通り、本発明のＣＤ３結合分子による、ヒト、および非チンパンジー霊長動物のＣＤ３に対する特異的結合が明確に検出された。ＦＡＣＳ解析において、すべての構築物は、それぞれの陰性対照と比較して、ＣＤ３およびＣＤ３３に対する結合を示す。ヒトおよびマカクザルのＣＤ３抗原およびＣＤ３３抗原に対する二重特異性抗体の異種間特異性が裏付けられる。
【０４１４】
１６．５．ＣＤ３３およびＣＤ３に対する異種間特異的二重特異性単鎖抗体の生体活性
実施例１６．１および１６．２で説明したＣＤ３３陽性細胞株を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏクロム５１（５１Ｃｒ）放出細胞傷害作用アッセイにより、作製した二重特異性単鎖抗体の生体活性を解析した。エフェクター細胞としては、それぞれの図中で指定した通り、刺激ヒトＣＤ４／ＣＤ５６枯渇ＰＢＭＣ、またはマカクザルＴ細胞株である４１１９ＬｎＰｘを用いた。ヒトＣＤ３３またはマカクザルＣＤ３３の細胞外ドメインを発現するＣＨＯ細胞（実施例１６．１および１６．２を参照されたい）を標的細胞として用い、実施例１１において、ＭＣＳＰおよびＣＤ３に対する異種間特異的二重特異性抗体の生体活性の解析について説明した状況と同様の細胞傷害作用アッセイを実施した。
【０４１５】
図３０に示す通り、作製した異種間特異的二重特異性構築物のすべては、ヒトＣＤ３３陽性標的細胞に対して、刺激ヒトＣＤ４／ＣＤ５６枯渇ＰＢＭＣにより誘発される細胞傷害活性、また、マカクザルＣＤ３３陽性標的細胞に対して、マカクザルＴ細胞株である４１１９ＬｎＰｘにより誘発される細胞傷害活性を示す。
【実施例１７】
【０４１６】
１７．Ｎ末端におけるアミノ酸１〜２７に対応する、環境に依存しないＣＤ３イプシロンエピトープに基づくアフィニティー手順による、異種間特異的二重特異性単鎖分子の精製１７．１．Ｎ末端におけるアミノ酸１〜２７に対応する、環境に依存しない単離ヒトＣＤ３イプシロンエピトープを提示するアフィニティーカラムの作製
真核細胞内において該構築物を発現させるため、上記で説明した、ヒト免疫グロブリンＩｇＧ１のヒンジ領域およびＦｃガンマ領域に融合させた、ヒトＣＤ３イプシロン鎖のＮ末端におけるアミノ酸１〜２７からなる構築物であるＣＤ３  １〜２７−Ｆｃ（実施例３；該組換え融合タンパク質のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、配列番号２３０および２２９に列挙する）を発現させるためのプラスミドを、ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞内へとトランスフェクトした。Ｋａｕｆｍａｎｎ  Ｒ．Ｊ．（１９９０）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５、５３７〜５６６により説明される通り、ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞内において、真核細胞内のタンパク質発現を実施した。メトトレキサート（ＭＴＸ）濃度を、最高２０ｎＭ  ＭＴＸの最終濃度まで上昇させることにより、該構築物の遺伝子増幅を誘導した。静置培養による２代にわたる継代後、７日間にわたり、ヌクレオシド非含有ＨｙＱ  ＰＦ  ＣＨＯ液体ダイズ培地（４．０ｍＭのＬ−グルタミン、および０．１％のプルロニックＦ−６８（ＨｙＣｌｏｎｅ社製）を伴う）を伴うローラーボトル内で培養した。遠心分離により細胞を除去し、発現したタンパク質を含有する上清を−２０℃で保存した。融合タンパク質を単離するため、ウシ、ウマ、およびマウスの血清タンパク質に対する交差反応が最小限度である、市販のアフィニティー精製ヤギ抗ヒトＩｇＧ  ｆｃ断片特異性抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｕｒｏｐｅ社製）を用いる標準的なプロトコールに従い、ヤギ抗ヒトｆｃアフィニティーカラムを調製した。このアフィニティーカラムを用いて、Ａｅｋｔａ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ  Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）上において、細胞培養物上清から融合タンパク質を単離し、クエン酸により溶出させた。溶出物を中和させ、濃縮した。アミン非含有結合緩衝液に対して透析した後で、精製された融合タンパク質を、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドＮＨＳで活性化した１ｍｌのＨｉＴｒａｐカラム（ＧＥ  Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）に結合させた。
【０４１７】
結合後、残りのＮＨＳ基を保護し、カラムを洗浄し、０．１％アジ化ナトリウムを含有する保存用緩衝液中において５℃で保存した。
【０４１８】
１７．２．ヒトＣＤ３ペプチドアフィニティーカラムを用いる、異種間特異的二重特異性単鎖分子の精製
異種間特異的二重特異性単鎖分子を発現する細胞による、２００ｍｌの細胞培養物上清を、０．２μｍの滅菌フィルターにより濾過し、Ａｅｋｔａ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ  Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いるＣＤ３ペプチドアフィニティーカラムに適用した。
【０４１９】
次いで、ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩液によりカラムを洗浄し、結合しなかった試料を洗い流した。２０ｍＭクエン酸および１Ｍ塩化ナトリウムを含有するｐＨ３．０の酸性緩衝液により溶出を実施した。画分回収器の回収チューブ内に含有される、ｐＨ８．３の１Ｍトリスヒドロキシメチルアミンであるトリスにより、溶出したタンパク質を速やかに中和した。
【０４２０】
ＳＤＳ  ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットにより、タンパク質の解析を実施した。
【０４２１】
ＳＤＳ  ＰＡＧＥには、４〜１２％のビストリスゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いた。ランニングバッファーは、１倍濃度のＭＥＳ−ＳＤＳ−Ｐｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）であった。タンパク質の標準物質として、１５μｌのあらかじめ染色したＳｈａｒｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を適用した。最大２００ボルト、１２０ｍＡで６０分間にわたり、電気泳動を実施した。脱イオン化水中でゲルを洗浄し、１時間にわたり、クーマシーで染色した。３時間にわたり、脱イオン化水中でゲルを脱色した。Ｓｙｎｇｅｎｅ社製のゲル撮影システムにより、撮影した。
【０４２２】
ウェスタンブロットを行うため、ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルのコピーを作製し、タンパク質を、ニトロセルロース膜上へと電気ブロットした。ＰＢＳ中において２％のウシ血清アルブミンにより膜をブロッキングし、マウスペンタＨｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ社製）と共にインキュベートした。二次試薬として、ストレプトアビジンアルカリホスファターゼコンジュゲート（ＤＡＫＯ社製）を用いた。ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質溶液（Ｐｉｅｒｃｅ社製）によりブロットを現像した。
【０４２３】
図３１、３２、および３３に示す通り、上記で説明したヒトＣＤ３ペプチドによるアフィニティーカラムを用いることにより、二重特異性単鎖分子を、細胞培養物上清からきわめて効率的に精製することが可能となる。したがって、二重特異性単鎮分子中に含有される、異種間特異的抗ＣＤ３単鎖抗体は、それらの特異的結合特性により、精製だけを目的として結合させるタグを必要とすることなく、異種間特異的二重特異性単鎖分子を精製するための、効率的で一般的なワンステップの方法を可能とする。
【実施例１８】
【０４２４】
１８．異種間特異的二重特異性単鎖分子についての一般的な薬物動態アッセイ
１８．１．薬物動態アッセイで用いられるＣＤ３  １〜２７−Ｆｃの作製
標準的なプロトコールに従う遺伝子合成により、ヒト免疫グロブリンＩｇＧ１のヒンジ領域およびＦｃガンマ領域に融合させた、ヒトＣＤ３イプシロン鎖のＮ末端におけるアミノ酸１〜２７のコード配列を得た（該組換え融合タンパク質のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、配列番号３０９および３１０に列挙する）。遺伝子合成断片は、まず、真核細胞内において該構築物を発現させるためのコザック部位、次いで、１９アミノ酸の免疫グロブリンリーダーペプチド、次いで、インフレームで、成熟ヒトＣＤ３イプシロン鎖の細胞外部分のうちの最初の２７アミノ酸のコード配列、次いで、インフレームで、ヒトＩｇＧ１のヒンジ領域およびＦｃガンマ部分のコード配列、ならびに終止コドンを含有するようにデザインした。遺伝子合成断片はまた、前出の実施例３．１で説明した通りにデザインおよびクローニングした。真核細胞内において該構築物を発現させるため、ヌクレオチド配列を検証したクローンをＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞内へとトランスフェクトした。前出の実施例９で説明した通り、ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞内において、真核細胞内のタンパク質発現を実施した。融合タンパク質を単離するため、ウシ、ウマ、およびマウスの血清タンパク質に対する交差反応が最小限度である、市販のアフィニティー精製ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ断片特異性抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｕｒｏｐｅ社製）を用いる標凖的なプロトコールに従い、ヤギ抗ヒトｆｃアフィニティーカラムを調製した。このアフィニティーカラムを用いて、Ａｅｋｔａ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ  Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）上において、細胞培養物上清から融合タンパク質を単離し、クエン酸により溶出させた。溶出物を中和させ、濃縮した。
【０４２５】
１８．２．異種間特異的二重特異性単鎖分子についての薬物動態アッセイ
アッセイは、Ｓｅｋｔｏｒ  Ｉｍａｇｅｒデバイス（ＭＳＤ社製）上で測定される、炭素プレート上におけるルテニウム標識による検出を用いるＥＣＬ−ＥＬＩＳＡ法に基づく。第１のステップでは、炭素プレート（ＭＳＤ社製Ｈｉｇｈ  Ｂｉｎｄ  ９６ウェルプレート；型番Ｌ１５ＸＢ−３）を、実施例１８．１で説明した、５０ｎｇ／ｍｌで５μｌ／ウェルの精製ＣＤ３  １〜２７−Ｆｃによりコーティングした。次いで、プレートを、２５℃で一晩にわたり乾燥させた。その後、プレートを、１５０μｌ／ウェルのＰＢＳ中に５％のＢＳＡ（Ｐｅｓｅｌ＆Ｌｏｒｅｉ社製；型番１００５６８）により、インキュベーター内において振とうしながら（７００ｒｐｍ）、２５℃で１時間にわたりブロッキングした。次のステップでは、ＰＢＳ中に０．０５％のＴｗｅｅｎにより、３回にわたりプレートを洗浄した。アッセイで検出される、それぞれの異種間特異的二重特異性単鎖分子について、１００ｎｇ／ｍｌから始める１：４の希釈系列により、ＰＢＳ中５０％のマカクザル血清中における標準曲線を作製した。品質管理（ＱＣ）試料は、ＰＢＳ中に５０％のマカクザル血清中において、試料血清中の予測濃度に応じ、それぞれの異種間特異的二重特異性単鎖分子１ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌの範囲で作製した。標準試料、ＱＣ試料、または未知の試料を、１０μｌ／ウェルで炭素プレートへと移し、インキュベーター内において振とうしながら（７００ｒｐｍ）、２５℃で９０分間にわたりインキュベートした。その後、ＰＢＳ中に０．０５％のＴｗｅｅｎにより３回にわたりプレートを洗浄した。検出には、２５μｌ／ウェルのペンタＨｉｓ−ビオチン抗体（Ｑｉａｇｅｎ社製；ＰＢＳ中に０．０５％のＴｗｅｅｎ中において２００μｇ／ｍｌ）を添加し、インキュベーター内において振とうしながら（７００ｒｐｍ）、２５℃で１時間にわたりインキュベートした。第２の検出ステップでは、２５μｌ／ウェルのストレプトアビジン−Ｓｕｌｆｏ  Ｔａｇ液（ＭＳＤ社製；型番Ｒ３２ＡＤ−１；ロット番号Ｗ００１０９０３）を添加し、インキュベーター内において振とうしながら（７００ｒｐｍ）、２５℃で１時間にわたりインキュベートした。その後、ＰＢＳ中に０．０５％のＴｗｅｅｎにより３回にわたりプレートを洗浄した。最後に１５０μｌ／ウェルのＭＳＤ  Ｒｅａｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＭＳＤ社製；型番Ｒ９ＺＣ−１）を添加し、Ｓｅｋｔｏｒ社製Ｉｍａｇｅｒデバイスによりプレートを読み取った。
【０４２６】
図３４および３５は、マカクザルの血清試料中における異種間特異的二重特異性単鎖分子検出の妥当性を裏付ける。したがって、二重特異性単鎖分子内に含有される異種開特異的抗ＣＤ３単鎖抗体は、それらの特異的結合特性により、異種間特異的二重特異性単鎖分子を検出するための一般的な高感度アッセイを可能とする。上記で示したアッセイは、薬物開発に必要とされる公式の毒性研究との関連で用いることができ、また、異種間特異的二重特異性単鎖分子の臨床的適用との関連で、患者試料の測定にも容易に適合させることができる。
【実施例１９】
【０４２７】
１９．カニクイザルに由来するＥｐＣＡＭに、異なる非チンパンジー霊長動物に由来するＣＤ３イプシロンのＮ末端におけるアミノ酸１〜２７を融合させた、組換え膜貫通融合タンパク質（ＣＤ３  １〜２７−ＥｐＣＡＭ）の作製
１９．１．ＣＤ３  １〜２７−ＥｐＣＡＭのクローニングおよび発現
異なる非チンパンジー霊長動物（マーモセット、タマリン、リスザル）およびブタから、ＣＤ３イプシロンを単離した。標準的なプロトコールに従う遺伝子合成により、Ｆｌａｇタグを付したカニクイザルＥｐＣＡＭのＮ末端に融合させた、成熟ヒト、成熟コモンマーモセット（ｃｏｍｍｏｎ  ｍａｒｍｏｓｅｔ（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ  ｊａｃｃｈｕｓ））、成熟ワタボウシタマリン（ｃｏｔｔｏｎｔｏｐ  ｔａｍａｒｉｎ（Ｓａｇｕｉｎｕｓ  ｏｅｄｉｐｕｓ））、成熟コモンリスザル（ｃｏｍｍｏｎ  ｓｑｕｉｒｒｅｌ  ｍｏｎｋｅｙ（Ｓａｉｍｉｒｉ  ｓｃｉｕｒｅｕｓ））、および成熟家畜ブタ（ｄｏｍｅｓｔｉｃ  ｓｗｉｎｅ（Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ）；陰性対照として用いた）のＣＤ３イプシロン鎖のＮ末端におけるアミノ酸１〜２７のコード配列を得た（該組換え融合タンパク質のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、配列番号２３１〜２４０に列挙する）。遺伝子合成断片は、まず、標的発現ベクター内に既に存在する１９アミノ酸の免疫グロブリンリーダーペプチドのコード配列との、適正なリーディングフレーム内における融合を可能とするＢｓｒＧＩ部位、次いで、インフレームで、成熟ＣＤ３イプシロン鎖の細胞外部分のうちのＮ末端におけるアミノ酸１〜２７のコード配列、次いで、インフレームで、Ｆｌａｇタグのコード配列、次いで、インフレームで、成熟カニクイザルＥｐＣＡＭ膜貫通タンパク質のコード配列を含有するようにデザインした。５’端においてＢｓｒＧＩ、また、３’端においてＳａｌＩの制限部位を導入し、以下のクローニング手順で用いた。次いで、標準的なプロトコールに従い、ＢｓｒＧＩおよびＳａｌＩを介して、遺伝子合成断片を、１９アミノ酸の免疫グロブリンリーダーペプチドのコード配列を既に含有する、ｐＥＦ−ＤＨＦＲ（ｐＥＦ−ＤＨＦＲは、Ｒａｕｍら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ５０（２００１）、１４１〜１５０において説明されている）と称するプラスミドの派生物内へとクローニングした。真核細胞内において該構築物を発現させるため、配列を検証したプラスミドを用いて、ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞内へとトランスフェクトした。Ｋａｕｆｍａｎｎ  Ｒ．Ｊ．（１９９０）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５、５３７〜５６６により説明される通り、ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞内において、真核細胞内のタンパク質発現を実施した。メトトレキサート（ＭＴＸ）濃度を、最高２０ｎＭ  ＭＴＸの最終濃度まで上昇させることにより、該構築物の遺伝子増幅を誘導した。
【０４２８】
標準的なプロトコールに従うＦＡＣＳアッセイにより、トランスフェクタントを、組換え膜貫通タンパク質の細胞表面における発現について調べた。この目的のために、２．５×１０５個の細胞を、２％ＦＣＳを伴うＰＢＳ中において５０μｇ／ｍｌの抗Ｆｌａｇ  Ｍ２抗体（ドイツ、タウフキルヒェン、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ社製）と共にインキュベートした。２％ＦＣＳを伴うＰＢＳ中において１：１００に希釈した、アフィニティー精製Ｒ−フィコエリトリンコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃガンマ断片特異的Ｆ（ａｂ’）２断片（英国、サフォーク州、ニューマーケット、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｕｒｏｐｅ社製）により、抗体の結合を検出した。ＦＡＣＳ−Ｃａｌｉｂｕｒ装置上において、フローサイトメトリーを実施し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを用いてデータを取り込み、解析した（ハイデルベルク、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）。「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（Ｃｏｌｉｇａｎ、Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ、Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ、Ｓｈｅｖａｃｈ、およびＳｔｒｏｂｅｒ、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、２００２）において説明される通りに、ＦＡＣＳによる染色および蛍光強度の測定を実施した。
【０４２９】
トランスフェクトされた細胞上における、カニクイザルＥｐＣＡＭ、ならびにヒトＣＤ３イプシロン鎖、マーモセットＣＤ３イプシロン鎖、タマリンＣＤ３イプシロン鎖、リスザルＣＤ３イプシロン鎖、およびブタＣＤ３イプシロン鎖それぞれのＮ末端におけるアミノ酸１〜２７からなる、Ｆｌａｇタグを付した組換え膜貫通融合タンパク質の発現が、明確に検出された（図３６）。
【０４３０】
１９．２．ＩｇＧ１抗体の形態にある異種間特異的抗ＣＤ３単鎖抗体であるＩ２Ｃ  ＨＬのクローニングおよび発現
異種間特異的単鎖抗ＣＤ３抗体の結合を検出する手段を改善するため、特異性抗体であるＩ２Ｃ  ＶＨＶＬを、マウスＩｇＧ１およびマウスカッパ定常領域を伴うＩｇＧ１抗体へと転換する。標準的なプロトコールに従う遺伝子合成により、ＩｇＧ１抗体の重鎖をコードするｃＤＮＡ配列を得た。遺伝子合成断片は、まず、真核細胞内において該構築物を発現させるためのコザック部位、次いで、１９アミノ酸の免疫グロブリンリーダーペプチド、次いで、インフレームで、重鎖可変領域または軽鎖可変領域のコード配列、次いで、インフレームで、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋで公表されているマウスＩｇＧ１の重鎖定常領域のコード配列（受託番号ＡＢ０９７８４９）、またはＧｅｎＢａｎｋで公表されているマウス軽鎖カッパ定常領域のコード配列（受託番号Ｄ１４６３０）を含有するようにデザインした。
【０４３１】
融合タンパク質をコードするｃＤＮＡの始点および終点には、制限部位を導入した。５’端においてＥｃｏＲＩ、また、３’端においてＳａｌＩの制限部位を導入し、以下のクローニング手順で用いた。標準的なプロトコールに従い、ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩを介して、遺伝子合成断片を、重鎖構築物はｐＥＦ  ＤＨＦＲ（ｐＥＦ  ＤＨＦＲは、Ｒａｕｍら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ５０（２００１）、１４１〜１５０において説明されている）と称するプラスミド内へ、軽鎖構築物はｐＥＦＡＤＡ（ｐＥＦＡＤＡは、Ｒａｕｍら、前出において説明されている）と称するプラスミド内へとクローニングした。真核細胞内において該構築物を発現させるため、配列を検証したプラスミドを用いて、それぞれの軽鎖構築物および重鎖構築物を、ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞内へと共トランスフェクトした。Ｋａｕｆｍａｎｎ  Ｒ．Ｊ．（１９９０）、前出により説明される通り、ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞内において、真核細胞内のタンパク質発現を実施した。メトトレキサート（ＭＴＸ）濃度を、最高２０ｎＭ  ＭＴＸの最終濃度まで、また、デオキシコホルマイシン（ｄＣＦ）濃度を、最高３００ｎＭ  ｄＣＦの最終濃度まで上昇させることにより、構築物の遺伝子増幅を誘導した。静置培養による２代にわたる継代後、細胞培養物上清を回収し、後続の実験で用いた。
【０４３２】
１９．３．ＣＤ３  １〜２７−ＥｐＣＡＭに対する、ＩｇＧ１抗体の形態にある異種間特異的抗ＣＤ３単鎖抗体であるＩ２Ｃ  ＨＬの結合
標準的なプロトコールに従うＦＡＣＳアッセイにより、実施例１９．１で説明した、カニクイザルＥｐＣＡＭに融合させた、ヒトＣＤ３イプシロン鎖、マーモセットＣＤ３イプシロン鎖、タマリンＣＤ３イプシロン鎖、およびリスザルＣＤ３イプシロン鎖それぞれのＮ末端におけるアミノ酸１〜２７に対する、作製されたＩ２Ｃ  ＩｇＧ１構築物の結合について調べた。この目的のために、２．５×１０５個の細胞を、実施例１９．２で説明したＩ２Ｃ  ＩｇＧ１構築物を含有する、５０μｇ／ｍｌの細胞培養物上清と共にインキュベートした。２％ＦＣＳを伴うＰＢＳ中において１：１００に希釈した、アフィニティー精製Ｒ−フィコエリトリンコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃガンマ断片特異的Ｆ（ａｂ’）２断片（英国、サフォーク州、ニューマーケット、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｕｒｏｐｅ社製）により、抗体の結合を検出した。ＦＡＣＳ−Ｃａｌｉｂｕｒ装置上において、フローサイトメトリーを実施し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを用いてデータを取り込み、解析した（ハイデルベルク、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）。「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（Ｃｏｌｉｇａｎ、Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ、Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ、Ｓｈｅｖａｃｈ、およびＳｔｒｏｂｅｒ、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、２００２）において説明される通りに、ＦＡＣＳによる染色および蛍光強度の測定を実施した。
【０４３３】
図３７に示す通り、カニクイザルＥｐＣＡＭに融合させた、ブタのＣＤ３イプシロンのＮ末端におけるアミノ酸１〜２７からなる陰性対照の場合と比較して、カニクイザルＥｐＣＡＭに融合させた、ヒト、マーモセット、タマリン、またはリスザルのＣＤ３イプシロンのＮ末端におけるアミノ酸１〜２７からなる、組換え膜貫通融合タンパク質を発現するトランスフェクタントに対する、Ｉ２Ｃ  ＩｇＧ１構築物の結合が観察された。複数の霊長動物に対するＩ２Ｃの異種間特異性が示された。抗Ｆｌａｇ  Ｍ２抗体により得られたシグナルと、Ｉ２Ｃ  ＩｇＧ１構築物により得られたシグナルとは同等であり、これにより、ＣＤ３イプシロンのＮ末端におけるアミノ酸１〜２７に対する、異種間特異的特異性抗体であるＩ２Ｃの強力な結合活性が示された。
【実施例２０】
【０４３４】
２０．Ｎ末端においてＨｉｓ６タグを伴うかまたは伴わないヒトＣＤ３イプシロン鎖に対する、異種間特異的抗ＣＤ３結合分子であるＩ２Ｃの結合
実施例１９．２で説明した、ＣＤ３イプシロンに特異的な結合特異性抗体であるＩ２ＣとのキメラＩｇＧ１抗体を、Ｎ末端においてＨｉｓ６タグを伴うかまたは伴わないヒトＣＤ３イプシロンに対する結合について調べた。標準的なプロトコールに従うＦＡＣＳアッセイにより、実施例６．１で説明した、Ｈｉｓ６−ヒトＣＤ３イプシロンをトランスフェクトしたＥＬ４細胞株、また、実施例５．１で説明した、野生型のヒトＣＤ３イプシロンをトランスフェクトしたＥＬ４細胞株のそれぞれに対する該抗体の結合について調べた。２．５×１０５個のトランスフェクタント細胞を、Ｉ２Ｃ  ＩｇＧ１構築物を含有する５０μ１の細胞培養物上清、または、２％ＦＣＳを伴うＰＢＳ中に５μｇ／ｍｌずつの各対照抗体５０μｌと共にインキュベートした。構築物の発現についての陰性対照としては、適切なアイソタイプ対照、また、陽性対照としては、ＣＤ３特異性抗体であるＵＣＨＴ−１をそれぞれ用いた。Ｈｉｓ６タグの検出は、ペンタＨｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ社製）により実施した。２％ＦＣＳを伴うＰＢＳ中において１：１００に希釈した、アフィニティー精製Ｒ−フィコエリトリンコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃガンマ断片特異的Ｆ（ａｂ’）２断片（英国、サフォーク州、ニューマーケット、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｕｒｏｐｅ社製）により、抗体の結合を検出した。ＦＡＣＳ−Ｃａｌｉｂｕｒ装置上において、フローサイトメトリーを実施し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを用いてデータを取り込み、解析した（ハイデルベルク、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）。「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（Ｃｏｌｉｇａｎ、Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ、Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ、Ｓｈｅｖａｃｈ、およびＳｔｒｏｂｅｒ、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、２００２）において説明される通りに、ＦＡＣＳによる染色および蛍光強度の測定を実施した。
【０４３５】
両方のトランスフェクタントに対する抗ヒトＣＤ３抗体であるＵＣＨＴ−１による同等の結合により、該構築物のほぼ同等レベルの発現が示される。ペンタＨｉｓ抗体の結合により、Ｈｉｓ６−ヒトＣＤ３構築物上においてはＨｉｓ６タグの存在が確認されたが、野生型構築物上においてはこれが確認されなかった。
【０４３６】
野生型のヒトＣＤ３イプシロンをトランスフェクトしたＥＬ４細胞株と比較して、Ｎ末端においてＨｉｓ６タグを伴うヒトＣＤ３イプシロンに対しては、Ｉ２Ｃ  ＩｇＧ１構築物による結合の喪失が明確に検出された。これらの結果は、ヒトＣＤ３イプシロン鎖に対して、異種間特異的抗ＣＤ３結合特異性抗体であるＩ２Ｃが結合するには、ＣＤ３イプシロンのフリーなＮ末端が不可欠であることを示す。
【実施例２１】
【０４３７】
２１．ＣＤ３３およびＣＤ３に対する異種間特異的二重特異性単鎖分子の作製
２１．１．ＣＤ３３およびＣＤ３に対する異種間特異的二重特異性単鎖分子の作製
一般に、各々が、ヒトＣＤ３イプシロンおよびマカクザルＣＤ３イプシロンに対して異種間特異的な結合特異性を有するドメイン、ならびにヒトＣＤ３３およびマカクザルＣＤ３３に対して異種間特異的な結合特異性を有するドメインを含む二重特異性単鎖抗体分子を、以下の表６に示す通りにデザインした。
【０４３８】
【表６】
2018064565.tif 000009
【０４３９】
遺伝子合成により、ヒトＣＤ３３およびマカクザルＣＤ３３に対して異種間特異的な軽鎖（Ｌ）可変ドメインおよび重鎖（Ｈ）可変ドメインと、ヒトＣＤ３およびマカクザルＣＤ３に対して異種間特異的なＣＤ３特異性ＶＨおよびＣＤ３特異性ＶＬの組合せとを含有する前述の構築物を得た。ＭＣＳＰおよびＣＤ３に対する異種間特異的単鎖分子について実施例９で説明した手順と同様に、遺伝子合成断片をデザインした。真核細胞内において該構築物を発現させるため、ヌクレオチド配列を検証したクローンをＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞内へとトランスフェクトした。これもまたＭＣＳＰおよびＣＤ３に対する異種間特異的単鎖分子について実施例９で説明した通り、ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞内において、真核細胞内のタンパク質発現を実施し、後続の実験において用いた。
【０４４０】
２１．２．フローサイトメトリーによる、ＣＤ３３およびＣＤ３に対する異種間特異的二重特異性抗体の結合についての解析
ヒトおよびマカクザルのＣＤ３３およびＣＤ３のそれぞれに結合する能力に関して、異種間特異的二重特異性抗体構築物の機能性を調べるため、ヒトＣＤ３３またはマカクザルＣＤ３３の細胞外ドメインを発現するＣＨＯ細胞（実施例１６．１および１６．２を参照されたい）を用い、実施例１０において、ＭＣＳＰおよびＣＤ３に対する異種間特異的二重特異性抗体について説明した解析と同様のＦＡＣＳ解析を実施する。
【０４４１】
図４１に示す通り、ＣＤ３３に対して異種間特異的であり、また、ヒトＣＤ３および非チンパンジー霊長動物のＣＤ３に対して異種間特異的な、上記で列挙した単鎖分子による二重特異性結合が明確に検出された。ＦＡＣＳ解析において、すべての構築物は、それぞれの陰性対照と比較して、ＣＤ３およびＣＤ３３に対する結合を示した。ヒトおよびマカクザルのＣＤ３抗原およびＣＤ３３抗原に対する二重特異性抗体の異種間特異性が裏付けられた。
【０４４２】
２１．３．ＣＤ３３およびＣＤ３に対する異種間特異的二重特異性単鎖抗体の生体活性
実施例１６．１および１６．２で説明したＣＤ３３陽性細胞株を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏクロム５１（５１Ｃｒ）放出細胞傷害作用アッセイにより、作製した二重特異性単鎖抗体の生体活性を解析した。エフェクター細胞としては、それぞれの図中で指定した通り、刺激ヒトＣＤ４／ＣＤ５６枯渇ＰＢＭＣ、またはマカクザルＴ細胞株である４１１９ＬｎＰｘを用いた。ヒトまたはマカクザルのＣＤ３３細胞外ドメインを発現するＣＨＯ細胞（実施例１６．１および１６．２を参照されたい）を標的細胞として用い、実施例１１において、ＭＣＳＰおよびＣＤ３に対する異種間特異的二重特異性抗体に対する解析について説明した手順と同様の細胞傷害作用解析を実施した。
【０４４３】
図４２に示す通り、作製した異種間特異的二重特異性単鎖抗体構築物のすべては、ヒトＣＤ３３陽性標的細胞に対して、刺激ヒトＣＤ４／ＣＤ５６枯渇ＰＢＭＣにより誘発される細胞傷害活性、また、マカクザルＣＤ３３陽性標的細胞に対して、マカクザルＴ細胞株である４１１９ＬｎＰｘにより誘発される細胞傷害活性を示す。
【実施例２２】
【０４４４】
２２．循環血液細胞に不在の標的分子を指向する、従来の二重特異性ＣＤ３結合分子に対する曝露時における、チンパンジー循環Ｔ細胞の再分布
雄チンパンジー１匹を、静脈内単鎖ＥｐＣＡＭ／ＣＤ３二重特異性抗体構築物（Ｓｃｈｌｅｒｅｔｈ（２００５）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６５、２８８２）による用量漸増下に置いた。従来の単鎖ＣＤ１９／ＣＤ３二重特異性抗体構築物（Ｌｏｆｆｌｅｒ（２０００、Ｂｌｏｏｄ、９５巻、６号）、またはＷＯ９９／５４４４０）における場合と同様、前記ＥｐＣＡＭ／ＣＤ３構築物のＣＤ３アームもまた、ヒトＣＤ３およびチンパンジーＣＤ３による、従来の環境に依存するエピトープを指向する。０日目において、動物には、被験物質を伴わない５０ｍｌ  ＰＢＳ／５％ＨＳＡを施した後に、７、１４、２１、および２８日目に、それぞれ、５０ｍｌ  ＰＢＳ／５％ＨＳＡに加えて、１．６、２．０、３．０、および４．５μｇ／ｋｇの単鎖ＥｐＣＡＭ／ＣＤ３二重特異性抗体構築物を施した。注入時間は、１回の投与当たり２時間であった。毎週、各回の注入を行うため、２〜３ｍｇ／ｋｇの筋肉内テラゾールによりチンパンジーを鎮静させ、これに挿管し、その平均血圧を安定させながら、これをイソフルラン／Ｏ２麻酔にかけた。循環血液細胞についてＦＡＣＳ解析を行うため、図４３に示した時点において、対側肢に第２の静脈内カテーテルを配置し、（ヘパリン化させた）全血液試料を採取した。標準的な赤血球溶解後、チンパンジーＣＤ２と反応するＦＩＴＣ標識化抗体（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）によりＴ細胞を染色し、フローサイトメトリーにより、全リンパ球に対するＴ細胞の比率を決定した。図４３に示す通り、各回において単鎖ＥｐＣＡＭ／ＣＤ３二重特異性抗体構築物を投与するたびに、循環標的Ｂ（リンパ腫）細胞を本質的に有さないＢ−ＮＨＬ患者における単鎖ＣＤ１９／ＣＤ３二重特異性抗体構築物について観察された通り、循環Ｔ細胞の急速な減少が誘導された。ヒトおよびチンパンジーの循環血液中にＥｐＣＡＭ陽性標的細胞は存在しないので、単鎖ＥｐＣＡＭ／ＣＤ３二重特異性抗体構築物に曝露すると、循環Ｔ細胞が減少したことは、該構築物のＣＤ３アームが、標的細胞を介する架橋形成の不在下において、純粋に、従来の環境に依存するＣＤ３エピトープと相互作用することを介して、Ｔ細胞が受容するシグナルだけを原因としうる。循環標的Ｂ（リンパ腫）細胞を本質的に有さないＢ−ＮＨＬ患者において、それらを単鎖ＣＤ１９／ＣＤ３二重特異性抗体構築物に曝露することによりＴ細胞の再分布が誘導されたのと同様、チンパンジーにおいても、単鎖ＥｐＣＡＭ／ＣＤ３二重特異性抗体構築物に曝露すると、Ｔ細胞の再分布が生じたことは、環境に依存するＣＤ３エピトープに対する結合イベントに続いて、ＣＤ３の立体構造が変化し、さらに結果として、血管内皮に対してＴ細胞の付着が一過性に増大することにより説明できる（実施例１３を参照されたい）。この知見は、環境に依存するＣＤ３エピトープを指向する従来のＣＤ３結合分子により（もっぱらこの相互作用を介して）、実施例１３で説明した、ヒトにおけるＣＮＳ有害事象の危険性と関連する、末梢血におけるＴ細胞の再分布パターンがもたらされうる。
【実施例２３】
【０４４５】
２３．ヒトＣＤ３イプシロンのＮ末端に対するｓｃＦｖクローンの特異的結合
２３．１．大腸菌ＸＬ１  Ｂｌｕｅ細胞内における、ｓｃＦｖ構築物の細菌内発現
既に述べた通り、ＶＬセグメントおよびＶＨセグメントを含有するｐＣｏｍｂ３Ｈ５Ｂｈｉｓ／Ｆｌａｇにより形質転換した大腸菌ＸＬ１  Ｂｌｕｅ細胞は、遺伝子ＩＩＩ断片を切除し、また、１ｍＭ  ＩＰＴＧにより誘導した後で、十分な量で可溶性のｓｃＦｖを生成する。ｓｃＦｖ鎖はペリプラズム内へと移出され、そこで、機能的な立体構造へと折り畳まれる。
【０４４６】
この実験には、以下のｓｃＦｖクローンが選択された：
ｉ）ＷＯ２００４／１０６３８０で説明されるＳｃＦｖである４−１０、３−１０６、３−１１４、３−１４８、４−４８、３−１９０、および３−２７１；
ｉｉ）本明細書で説明される、ヒト抗ＣＤ３イプシロン結合クローンに由来するｓｃＦｖであるＨ２Ｃ、Ｆ１２Ｑ、およびＩ２Ｃ。
【０４４７】
ペリプラズム調製物用に、ペリプラズム内における発現を可能とする、それぞれのｓｃＦｖを含有するプラスミドにより形質転換した細菌細胞を、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを補充したＳＢ培地中で培養し、回収後、ＰＢＳ中に再溶解させた。−７０℃における凍結および３７℃における融解の４ラウンドを介する浸透圧ショックにより細菌の外膜を破壊し、ｓｃＦｖを包含する可溶性のペリプラズムタンパク質を上清中へと放出させた。遠心分離により、完全細胞および細胞破砕物を除去した後で、ヒト抗ヒトＣＤ３−ｓｃＦｖを含有する上清を回収し、さらなる検討に用いた。ｓｃＦｖを含有するこれらの粗上清を、ペリプラズム調製物（ＰＰＰ）とさらに称する。
【０４４８】
２３．２．ヒトＣＤ３イプシロン（アミノ酸１〜２７）−Ｆｃ融合タンパク質に対するｓｃＦｖの結合
典型的には、４℃で一晩にわたり、プラスチック製の９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ社製、ＭａｘｉＳｏｒｐ）のウェルに、ヒトＣＤ３イプシロン（アミノ酸１〜２７）−Ｆｃ融合タンパク質をコーティングすることにより、ＥＬＩＳＡ実験を実施した。次いで、抗原コーティング液を除去し、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０によりウェルを１回洗浄し、その後、少なくとも１時間にわたり、ＰＢＳ／３％ＢＳＡによりブロッキングした。ブロッキング液を除去した後に、ＰＰＰおよび対照溶液をウェルに添加し、典型的には室温で１時間にわたりインキュベートした。次いで、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０により、３回にわたりウェルを洗浄した。ビオチンで標識化した抗ＦＬＡＧタグ抗体（典型的には、１μｇ／ｍｌ  ＰＢＳの最終濃度；Ｓｉｇｍａ社製、Ｍ２抗Ｆｌａｇ−Ｂｉｏ抗体）を用いて、また、ペルオキシダーゼにより標識化したストレプトアビジン（１μｇ／ｍｌ  ＰＢＳ；Ｄｉａｎｏｖａ社製）により、固定化した抗原に対するｓｃＦｖの結合を検出した。ＡＢＴＳ基質溶液を添加することによりシグナルを発生させ、４０５ｎｍの波長で測定した。ヒトＩｇＧ１（Ｓｉｇｍａ社製）によりコーティングしたＥＬＩＳＡプレート上において、同一の試薬および同一の時間経過で同一のアッセイを実施することにより、ブロッキング剤および／またはヒトＣＤ３イプシロン（アミノ酸１〜２７）−Ｆｃ融合タンパク質のヒトＩｇＧ１部分に対する被験試料の非特異的結合を検討した。陰性対照としては、ＰＢＳを用いた。
【０４４９】
図４４に示す通り、ｓｃＦｖであるＨ２Ｃ、Ｆ１２Ｑ、およびＩ２Ｃは、ヒトＣＤ３イプシロン（アミノ酸１〜２７）−Ｆｃ融合タンパク質に対する強力な結合シグナルを示す。ヒトｓｃＦｖである３−１０６、３−１１４、３−１４８、３−１９０、３−２７１、４−１０、および４−４８（ＷＯ２００４／１０６３８０で説明される）は、上記の陰性対照のレベルを上回る著明な結合を示さない。
【０４５０】
ヒトＣＤ３イプシロン（アミノ酸１〜２７）−Ｆｃ融合タンパク質によりコーティングしたウェルに対する、ｓｃＦｖであるＨ２Ｃ、Ｆ１２Ｑ、およびＩ２Ｃの明確な結合が、ＢＳＡ（ブロッキング剤として用いた）および／またはヒトＣＤ３イプシロン（アミノ酸１〜２７）−Ｆｃ融合タンパク質のヒトＩｇＧＩ  Ｆｃガンマ部分に対する結合に起因しうる可能性を除外するため、第２のＥＬＩＳＡ実験を並行して実施した。第２のＥＬＩＳＡ実験では、ヒトＣＤ３イプシロン（アミノ酸１〜２７）−Ｆｃ融合タンパク質ではなく、ヒトＩｇＧ１（Ｓｉｇｍａ社製）によりウェルをコーティングしたことを除き、この第２のＥＬＩＳＡ実験では、すべてのパラメータが、第１のＥＬＩＳＡ実験におけるパラメータと同一であった。図４５に示す通り、被験ｓｃＦｖは、ＢＳＡおよび／またはヒトＩｇＧ１に対して、バックグラウンドレベルを上回る著明な結合を示さなかった。
【０４５１】
まとめると、これらの結果は、ＣＤ３イプシロンの環境に依存するエピトープを認識する従来のＣＤ３結合分子（例えば、ＷＯ２００４／１０６３８０で開示される）が、ヒトＣＤ３イプシロン（アミノ酸１〜２７）領域に特異的に結合しないのに対し、ＣＤ３イプシロンの環境に依存しないエピトープに結合するｓｃＦｖであるＨ２Ｃ、Ｆ１２Ｑ、およびＩ２Ｃは、ヒトＣＤ３イプシロンのＮ末端における２７アミノ酸に対する特異的な結合を明確に示す。
【実施例２４】
【０４５２】
２４．ＰＳＣＡおよびＣＤ３に対する異種間特異的二重特異性単鎖抗体分子の作製および特徴づけ
２４．１．ヒトＰＳＣＡを発現するＣＨＯ細胞の作製
標準的なプロトコールに従う遺伝子合成により、ＧｅｎＢａｎｋで公表されているヒトＰＳＣＡのコード配列（受託番号ＮＭ＿００５６７２）を得た。遺伝子合成断片は、まず、真核細胞内において該構築物を発現させるためのコザック部位、次いで、１９アミノ酸の免疫グロブリンリーダーペプチド、次いで、インフレームで、ＦＬＡＧタグのコード配列、次いで、インフレームで、成熟ヒトＰＳＣＡタンパク質のコード配列、および終止コドンを含有するようにデザインした（該構築物に対応する配列を、配列番号４４３および４４４に列挙する）。遺伝子合成断片はまた、該断片の始点および終点において制限部位を導入するようにもデザインした。５’端においてＥｃｏＲＩ、また、３’端においてＳａｌＩの制限部位を導入し、以下のクローニング手順で用いた。標準的なプロトコールに従い、ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩを介して、遺伝子合成断片を、ｐＥＦ−ＤＨＦＲ（ｐＥＦ−ＤＨＦＲは、Ｒａｕｍら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ５０（２００１）、１４１〜１５０において説明されている）と称するプラスミド内へとクローニングした。標準的なプロトコール（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１））に従い、前述の手順を実施した。真核細胞内において該構築物を発現させるため、ヌクレオチド配列を検証したクローンをＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞内へとトランスフェクトした。Ｋａｕｆｍａｎｎ  Ｒ．Ｊ．（１９９０）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５、５３７〜５６６により説明される通り、ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞内において、真核細胞内のタンパク質発現を実施した。メトトレキサート（ＭＴＸ）濃度を、最高２０ｎＭ  ＭＴＸの最終濃度まで上昇させることにより、該構築物の遺伝子増幅を誘導した。
【０４５３】
２４．２．マカクザルＰＳＣＡを発現するＣＨＯ細胞の作製
標準的なプロトコールに従い調製されたマカクザル（カニクイザル）の前立腺に由来するｃＤＮＡに対するＰＣＲにより、マカクザルＰＳＣＡのｃＤＮＡ配列を得た。以下の反応条件：９４℃で２分間にわたる１サイクル、次いで、９４℃で１分間、５５℃で１分間、また、７２℃で１分間にわたる４０サイクル、次いで、７２℃で３分間にわたる最終サイクル、および以下のプライマーを用いた：
順方向プライマー：５’−ＣＡＣＣＡＣＡＧＣＣＣＡＣＣＡＧＴＧＡＣＣ−３’（配列番号４４７）
逆方向プライマー：５’−ＧＡＧＧＣＣＴＧＧＧＧＣＡＣＣＡＣＡＣＣＣ−３’（配列番号４４８）
【０４５４】
ＰＣＲ反応は、１Ｍの最終濃度に、ＰＣＲグレードのベタインを添加することにより実施した。このＰＣＲにより、該ＰＣＲプライマーを用いる標準的なプロトコールに従い単離および配列決定されるＤＮＡ断片が生成され、これにより、マカクザルＰＳＣＡをコードするｃＤＮＡ配列がもたらされた。マカクザルＰＳＣＡを発現させる構築物を作製するため、標準的なプロトコールに従う遺伝子合成により、ｃＤＮＡ断片を得た（対応する配列を、配列番号４４５および４４６に列挙する）。遺伝子合成断片は、まず、真核細胞内において該構築物を発現させるためのコザック部位、次いで、１９アミノ酸の免疫グロブリンリーダーペプチド、次いで、インフレームで、ＦＬＡＧタグのコード配列、次いで、インフレームで、成熟マカクザルＰＳＣＡタンパク質のコード配列、および終止コドンを含有するようにデザインした。遺伝子合成断片はまた、該断片の始点および終点において制限部位を導入するようにもデザインした。５’端においてＥｃｏＲＩ、また、３’端においてＳａｌＩの制限部位を導入し、以下のクローニング手順で用いた。標準的なプロトコールに従い、ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩを介して、遺伝子合成断片を、ｐＥＦ−ＤＨＦＲ（ｐＥＦ−ＤＨＦＲは、Ｒａｕｍら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ５０（２００１）、１４１〜１５０において説明されている）と称するプラスミド内へとクローニングした。標準的なプロトコール（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１））に従い、前述の手順を実施した。真核細胞内において該構築物を発現させるため、ヌクレオチド配列を検証したクローンをＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞内へとトランスフェクトした。Ｋａｕｆｍａｎｎ  Ｒ．Ｊ．（１９９０）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５、５３７〜５６６により説明される通り、ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞内において、真核細胞内のタンパク質発現を実施した。メトトレキサート（ＭＴＸ）濃度を、最高２０ｎＭ  ＭＴＸの最終濃度まで上昇させることにより、該構築物の遺伝子増幅を誘導した。
【０４５５】
２４．３．ＰＳＣＡおよびＣＤ３に対する異種間特異的二重特異性単鎖抗体分子の作製
異種間特異的ＰＳＣＡ×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体分子のクローニング
一般に、各々が、ヒト、および非チンパンジー霊長動物のＣＤ３イプシロンに対して異種間特異的な結合特異性を有するドメイン、ならびにヒト、および非チンパンジー霊長動物のＰＳＣＡに対して異種間特異的な結合特異性を有するドメインを含む二重特異性単鎖抗体分子を、以下の表７に示す通りにデザインした。
【０４５６】
【表７】
2018064565.tif 000010
【０４５７】
遺伝子合成により、ヒトＰＳＣＡおよびマカクザルＰＳＣＡに対して異種間特異的な軽鎖（Ｌ）可変ドメインおよび重鎖（Ｈ）可変ドメインと、ヒトＣＤ３およびマカクザルＣＤ３に対して異種開特異的なＣＤ３特異性ＶＨおよびＣＤ３特異性ＶＬの組合せとを含有する前述の構築物を得た。ＭＣＳＰおよびＣＤ３に対する異種間特異的単鎖分子について実施例９で説明した手順と同様に、遺伝子合成断片をデザインし、真核細胞内のタンパク質発現を実施した。
【０４５８】
２４．４．ＰＳＣＡ×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体分子の発現および精製
ＭＣＳＰ×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体について本明細書の上記で説明した通り、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＨＥＫ２９３細胞内において、二重特異性単鎖抗体分子を発現させた。
【０４５９】
発現させた二重特異性単鎖抗体の単離および解析については、本明細書上記の実施例９でも説明した。
【０４６０】
２４．５．フローサイトメトリーによる、ＰＳＣＡおよびＣＤ３に対する異種間特異的二重特異性抗体の結合についての解析
ヒトおよびマカクザルのＰＳＣＡおよびＣＤ３のそれぞれに結合する能力に関して、異種間特異的二重特異性抗体構築物の機能性を調べるため、ＦＡＣＳ解析を実施した。この目的のために、実施例２４．１で説明した通りにヒトＰＳＣＡをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞、また、ヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞白血病細胞株であるＨＰＢ−ＡＬＬ（ブラウンシュヴァイク、ＤＳＭＺ社製、ＡＣＣ４８３）を用いて、ヒト抗原に対する結合について調べた。マカクザル抗原に対する結合反応性は、実施例２４．２で説明した通りに作製したマカクザルＰＳＣＡトランスフェクタント、また、マカクザルＴ細胞株である４１１９ＬｎＰｘ（エアランゲン−ニュルンベルグ、衛生研究所、ウイルス学部門、Ｆｉｃｋｅｎｓｃｈｅｒ教授による恵与；Ｋｎａｐｐｅ  Ａら、およびＦｉｃｋｅｎｓｃｈｅｒ  Ｈ．、Ｂｌｏｏｄ  ２０００、９５、３２５６〜６１において公表されている）を用いることにより調べた。各細胞株２００，０００個ずつを、異種間特異的二重特異性抗体構築物を発現するトランスフェクト細胞の細胞培養物上清５０μｌと共に、氷上において３０分間にわたりインキュベートした。２％ＦＣＳを伴うＰＢＳ中で２回にわたり細胞を洗浄し、マウスペンタＨｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ社製；２％ＦＣＳを伴う５０μｌのＰＢＳ中で１：２０に希釈）により、構築物の結合を検出した。洗浄後、２％ＦＣＳを伴うＰＢＳ中において１：１００に希釈した、フィコエリトリンにコンジュゲートさせたＦｃガンマ特異性抗体（Ｄｉａｎｏｖａ社製）により、結合した抗Ｈｉｓ抗体を検出した。トランスフェクトされなかった細胞の上清を、陰性対照として用いた。
【０４６１】
ＦＡＣＳ−Ｃａｌｉｂｕｒ装置上において、フローサイトメトリーを実施した；ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを用いてデータを取り込み、解析した（ハイデルベルク、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）。「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（Ｃｏｌｉｇａｎ、Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ、Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ、Ｓｈｅｖａｃｈ、およびＳｔｒｏｂｅｒ、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、２００２）において説明される通りに、ＦＡＣＳによる染色および蛍光強度の測定を実施した。
【０４６２】
図４６および４８に示す通り、ＰＳＣＡおよびＣＤ３に対して異種間特異的な、上記で列挙した単鎖分子による二重特異性結合が明確に検出された。ＦＡＣＳ解析において、すべての構築物は、陰性対照と比較して、ＣＤ３およびＰＳＣＡに対する結合を示した。ヒトおよびマカクザルのＣＤ３抗原およびＰＳＣＡ抗原のそれぞれに対する二重特異性抗体の異種間特異性が裏付けられた。
【０４６３】
２４．６．ＰＳＣＡおよびＣＤ３に対する異種間特異的二重特異性単鎖抗体の生体活性
実施例２４．１で説明した、ヒトＰＳＣＡをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞、また、２４．２で説明した、マカクザルＰＳＣＡをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏクロム５１（５１Ｃｒ）放出細胞傷害作用アッセイにより、作製した二重特異性単鎖抗体の生体活性を解析した。エフェクター細胞としては、それぞれ、刺激ヒトＣＤ４／ＣＤ５６枯渇ＰＢＭＣ、またはマカクザルＴ細胞株である４１１９ＬｎＰｘを用いた。
【０４６４】
刺激ヒトＰＢＭＣの作製については、本明細書上記の実施例１１において説明した。
【０４６５】
実施例１１において、ＭＣＳＰ×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体について説明した手順と同様に、標的細胞を調製し、アッセイを実施した。
【０４６６】
図４７および４９に示す通り、作製した異種間特異的二重特異性単鎖抗体構築物のすべては、ヒトＰＳＣＡ陽性標的細胞に対して、刺激ヒトＣＤ４／ＣＤ５６枯渇ＰＢＭＣにより誘発される細胞傷害活性、また、マカクザルＰＳＣＡ陽性標的細胞に対して、マカクザルＴ細胞株である４１１９ＬｎＰｘにより誘発される細胞傷害活性を示した。
【０４６７】
２４．７．ヒト、および非チンパンジー霊長動物のＣＤ３およびＰＳＣＡを指向する二重特異性単鎖抗体構築物
ヒト生殖細胞系列抗体のＶＨ配列であるＶＨ１ １−ｆ（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）を、ＣＤＲＨ１（配列番号４１４）、ＣＤＲＨ２（配列番号４１５）、およびＣＤＲＨ３（配列番号４１６）のフレームワーク環境として選択する。同様に、同じヒト生殖細胞系列抗体のＶＨ配列を、ＣＤＲＨ１（配列番号４００）、ＣＤＲＨ２（配列番号４０１）、およびＣＤＲＨ３（配列番号４０２）のフレームワーク環境として選択する。各ヒトＶＨには、末端の約１５〜２０ヌクレオチドの連なりにおいて重複する複数の縮退オリゴヌクレオチドを合成しなければならない。この目的に適う第２のプライマーはいずれも、アンチセンスプライマーである。ＶＨ１  １−ｆには、以下のオリゴヌクレオチドセット：
５’Ｐ３−ＶＨ−Ａ−ＸｈｏＩ
ＣＣＴ  ＧＡＴ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＡＧＣ  ＧＧＣ  ＳＣＡ  ＧＡＳ  ＳＴＧ  ＲＡＡ  ＡＡＧ  ＣＣＡ  ＧＧＣ  ＧＣＣ  ＡＣＧ  ＧＴＧ  ＡＡＧ  ＡＴＴ（配列番号４４９）
５’Ｐ３−ＶＨ−Ｂ
ＧＧＣ  ＧＣＣ  ＡＣＧ  ＧＴＧ  ＡＡＧ  ＡＴＴ  ＴＣＣ  ＴＧＣ  ＡＡＧ  ＳＹＣ  ＡＧＣ  ＧＧＣ  ＷＡＣ  ＡＣＧ  ＴＴＣ  ＡＣＣ  ＧＧＣ  ＴＡＣ  ＴＡＣ  ＡＴＣ  ＣＡＣ  ＴＧＧ  ＧＴＧ（配列番号４５０）
３’Ｐ３−ＶＨ−Ｃ
ＧＴＡ  ＧＧＡ  ＧＧＴ  ＧＡＡ  ＧＣＣ  ＧＴＴ  ＧＴＴ  ＧＧＧ  ＧＴＣ  ＣＡＣ  ＴＣＴ  ＧＣＣ  ＳＡＴ  ＣＣＡ  ＴＴＣ  ＣＡＧ  ＧＣＹ  ＣＴＴ  ＣＣＣ  ＧＫＧ  ＧＧＭ  ＣＴＧ  ＴＴＫ  ＣＡＣ  ＣＣＡ  ＧＴＧ  ＧＡＴ  ＧＴＡ  ＧＴＡ（配列番号４５１）
５’Ｐ３−ＶＨ−Ｄ
ＡＡＣ  ＧＧＣ  ＴＴＣ  ＡＣＣ  ＴＣＣ  ＴＡＣ  ＡＡＣ  ＣＡＧ  ＡＡＧ  ＴＴＣ  ＡＡＧ  ＧＧＣ  ＡＲＧ  ＧＹＣ  ＡＹＡ  ＭＴＫ  ＡＣＣ  ＧＹＧ  ＧＡＣ  ＡＭＧ  ＡＧＣ  ＡＣＣ  ＲＲＣ  ＡＣＣ  ＧＣＣ  ＴＡＣ  ＡＴＧ  ＧＡＡ  ＣＴＧ（配列番号４５２）
３’Ｐ３−ＶＨ−Ｅ
ＧＣＴ  ＧＴＣ  ＧＡＡ  ＧＡＡ  ＧＴＴ  ＧＣＣ  ＣＲＣ  ＧＣＡ  ＡＴＡ  ＧＴＡ  ＣＡＣ  ＧＧＣ  ＧＧＴ  ＧＴＣ  ＣＴＣ  ＧＣＴ  ＧＳＫ  ＣＡＧ  ＧＣＴ  ＫＣＴ  ＣＡＧ  ＴＴＣ  ＣＡＴ  ＧＴＡ  ＧＧＣ  ＧＧＴ（配列番号４５３）
３’Ｐ３−ＶＨ−Ｆ−ＢｓｔＥＩＩ
ＣＡＣ  ＧＴＣ  ＧＧＴ  ＧＡＣ  ＣＧＴ  ＧＧＴ  ＴＣＣ  ＣＴＧ  ＧＣＣ  ＣＣＡ  ＧＣＴ  ＧＴＣ  ＧＡＡ  ＧＡＡ  ＧＴＴ  ＧＣＣ（配列番号４５４）
を用いる。ＶＨ１  １−ｆの別のオリゴヌクレオチドセットとしては、以下のプライマー：
５’−ＰＳＣＡ２ＶＨ−Ａ−ＸＨＯ１
ＣＡＧ  ＧＴＧ  ＣＴＣＧＡＧ  ＹＣＡ  ＧＧＣ  ＧＣＣ  ＧＡＡ  ＳＴＧ  ＲＷＧ  ＡＡＧ  ＣＣＴ  ＧＧＣ  ＧＣＣ  ＭＣＡ  ＧＴＧ  ＡＡＧ  ＭＴＡ  ＴＣＣ  ＴＧＣ  ＡＡＧ  ＧＹＣ  ＡＧＣ  ＧＧＣ  ＴＡＣ  ＡＣＣ  ＴＴＣ  ＡＣＣ  ＡＡＣ（配列番号４５５）
３’−ＰＳＣＡ２ＶＨ−Ｂ
ＧＣＴ  ＧＴＣ  ＧＣＴ  ＧＧＧ  ＧＴＣ  ＧＡＴ  ＣＣＴ  ＧＣＣ  ＹＡＴ  ＣＣＡ  ＴＴＣ  ＣＡＧ  ＧＣＣ  ＣＹＴ  ＧＣＣ  ＧＧＧ  ＣＳＹ  ＣＴＧ  ＴＴＫ  ＣＡＣ  ＣＣＡ  ＧＴＴ  ＣＡＧ  ＣＣＡ  ＧＴＡ  ＧＴＴ  ＧＧＴ  ＧＡＡ  ＧＧＴ  ＧＴＡ  ＧＣＣ（配列番号４５６）
５’−ＰＳＣＡ２ＶＨ−Ｃ
ＡＧＧ  ＡＴＣ  ＧＡＣ  ＣＣＣ  ＡＧＣ  ＧＡＣ  ＡＧＣ  ＧＡＧ  ＡＴＣ  ＣＡＣ  ＴＡＣ  ＧＡＣ  ＣＡＧ  ＡＡＧ  ＴＴＣ  ＡＡＧ  ＧＡＣ  ＡＲＡ  ＧＹＣ  ＡＣＣ  ＭＴＡ  ＡＣＣ  ＧＹＧ  ＧＡＣ  ＡＭＧ  ＡＧＣ  ＡＣＣ  ＲＲＣ  ＡＣＣ  ＧＣＣ  ＴＡＣ（配列番号４５７）
３’−ＰＳＣＡ２ＶＨ−Ｄ
ＧＧＣ  ＣＡＧ  ＧＧＣ  ＧＣＡ  ＡＴＡ  ＧＴＡ  ＣＡＣ  ＧＧＣ  ＧＧＴ  ＧＴＣ  ＣＴＣ  ＧＣＴ  ＴＳＴ  ＣＡＧ  ＧＣＴ  ＧＧＡ  ＣＡＧ  ＣＴＳ  ＳＡＴ  ＧＴＡ  ＧＧＣ  ＧＧＴ  ＧＹＹ  ＧＧＴ  ＧＣＴ  Ｃ（配列番号４５８）
３’−ＰＳＣＡ２ＶＨ−Ｅ−ＢＳＴＥ２
ＡＧＡ  ＣＡＣ  ＧＧＴ  ＧＡＣ  ＣＧＴ  ＧＧＴ  ＧＣＣ  ＣＴＧ  ＧＣＣ  ＣＣＡ  ＧＴＡ  ＧＧＣ  ＣＡＴ  ＧＧＣ  ＧＴＡ  ＧＡＴ  ＧＣＣ  ＧＧＴ  ＣＡＧ  ＧＧＣ  ＧＣＡ  ＡＴＡ  ＧＴＡ  ＣＡＣ（配列番号４５９）
を用いる。これらのプライマーセットの各々は、対応するＶＨ配列全体にわたる。
【０４６８】
各セット内ではプライマーを等量で混合し（例えば、２０μｌのＰＣＲ反応物に対して１μｌずつの各プライマー（２０〜１００μＭのプライマー原液））、ＰＣＲ緩衝液、ヌクレオチド、およびＴａｑポリメラーゼからなるＰＣＲ混合物に添加する。この混合物を、ＰＣＲサイクラー内において、９４℃で３分間、６５℃で１分間、６２℃で１分間、５９℃で１分間、５６℃で１分間、５２℃で１分間、５０℃で１分間、また、７２℃で１０分間にわたりインキュベートする。その後、標準的な方法により、該産物を、アガロースゲル電気泳動において泳動させ、該ゲルから、２００〜４００のサイズの産物を単離する。
【０４６９】
次いで、各ＶＨ  ＰＣＲ産物を、Ｎ末端およびＣ末端において適切なクローニング制限部位を組み込むプライマーを用いる、標準的なＰＣＲ反応の鋳型として用いる。標準的な方法に従うアガロースゲル電気泳動により、適正なサイズ（ＶＨの場合、約３５０ヌクレオチド）のＤＮＡ断片を単離する。この方法で、十分なＶＨ  ＤＮＡ断片を増幅する。
【０４７０】
ヒト生殖細胞系列抗体のＶＬ配列であるＶｋＩＩ Ａ１（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）を、ＣＤＲＬ１（配列番号４０９）、ＣＤＲＬ２（配列番号４１０）、およびＣＤＲＬ３（配列番号４１１）のフレームワーク環境として選択する。同様に、ヒト生殖細胞系列抗体のＶＬ配列であるＶｋＩＩ  Ａ１９（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）を、ＣＤＲＬ１（配列番号３９５）、ＣＤＲＬ２（配列番号３９６）、およびＣＤＲＬ３（配列番号３９７）のフレームワーク環境として選択する。各ヒトＶＬには、末端の約１５〜２０ヌクレオチドの連なりにおいて重複する複数の縮退オリゴヌクレオチドを合成しなければならない。この目的に適う第２のプライマーはいずれも、アンチセンスプライマーである。オリゴヌクレオチド内における、その後のクローニングに必要とされる制限部位は欠失させる。ＶｋＩＩ  Ａ１には、以下のオリゴヌクレオチド：
５’Ｐ３−ＶＬ−Ａ−ＳａｃＩ
ＣＣＴ  ＧＴＡ  ＧＡＧ  ＣＴＣ  ＧＴＣ  ＡＴＧ  ＡＣＣ  ＣＡＧ  ＴＣＣ  ＣＣＣ  ＣＴＧ  ＴＣＣ  ＣＴＧ  ＭＳＣ  ＧＴＧ  ＡＣＣ  ＭＴＣ  ＧＧＣ  ＣＡＧ  ＣＣＡ  ＧＣＣ  ＡＧＣ  ＡＴＣ（配列番号４６０）
３’Ｐ３−ＶＬ−Ｂ
ＣＣＡ  ＧＴＴ  ＣＡＧ  ＧＴＡ  ＧＧＴ  ＣＴＴ  ＧＣＣ  ＧＴＣ  ＧＣＴ  ＧＴＣ  ＣＡＧ  ＣＡＧ  ＧＧＡ  ＣＴＧ  ＧＣＴ  ＧＧＡ  ＣＴＴ  ＧＣＡ  ＡＧＡ  ＧＡＴ  ＧＣＴ  ＧＧＣ  ＴＧＧ  ＣＴＧ  ＧＣＣ（配列番号４６１）
５’Ｐ３−ＶＬ−Ｃ
ＡＡＧ  ＡＣＣ  ＴＡＣ  ＣＴＧ  ＡＡＣ  ＴＧＧ  ＹＴＳ  ＣＷＧ  ＣＡＧ  ＡＧＧ  ＣＣＡ  ＧＧＣ  ＣＡＧ  ＡＧＣ  ＣＣＣ  ＡＲＧ  ＡＧＧ  ＣＴＧ  ＡＴＣ  ＴＡＣ  ＣＴＧ  ＧＴＧ  ＴＣＣ  ＡＣＣ  ＣＴＧ（配列番号４６２）
３’Ｐ３−ＶＬ−Ｄ
ＧＧＴ  ＧＡＡ  ＧＴＣ  ＧＧＴ  ＧＣＣ  ＧＧＡ  ＧＣＣ  ＧＣＴ  ＧＣＣ  ＧＧＡ  ＧＡＡ  ＴＣＴ  ＧＴＣ  ＴＧＧ  ＣＡＣ  ＧＣＣ  ＧＣＴ  ＧＴＣ  ＣＡＧ  ＧＧＴ  ＧＧＡ  ＣＡＣ  ＣＡＧ  ＧＴＡ（配列番号４６３）
５’Ｐ３−ＶＬ−Ｅ
ＴＣＣ  ＧＧＣ  ＡＣＣ  ＧＡＣ  ＴＴＣ  ＡＣＣ  ＣＴＧ  ＡＡＧ  ＡＴＣ  ＡＧＣ  ＡＧＧ  ＧＴＧ  ＧＡＧ  ＧＣＣ  ＧＡＧ  ＧＡＣ  ＳＴＧ  ＧＧＣ  ＧＴＧ  ＴＡＣ  ＴＡＣ  ＴＧＣ  ＴＧＧ  ＣＡＧ  ＧＧＣ  ＡＣＣ（配列番号４６４）
３’Ｐ３−ＶＬ−Ｆ−ＢｓｉＷＩ／ＳｐｅＩ
ＣＣＡ  ＧＡＣ  ＡＣＴ  ＡＧＴ  ＣＧＴ  ＡＣＧ  ＣＴＴ  ＧＡＴ  ＴＴＣ  ＣＡＧ  ＣＴＴ  ＧＧＴ  ＣＣＣ  ＴＣＣ  ＧＣＣ  ＧＡＡ  ＧＧＴ  ＣＣＴ  ＴＧＧ  ＧＡＡ  ＧＴＧ  ＧＧＴ  ＧＣＣ  ＣＴＧ  ＣＣＡ  ＧＣＡ  ＧＴＡ（配列番号４６５）
を用いる。ＶｋＩＩ  Ａ１９の場合、オリゴヌクレオチドは、以下：
５’−ＰＳＣＡ２ＶＬ−ａ−ＳＡＣ１
ＣＡＧ  ＡＣＡ  ＧＡＧ  ＣＴＣ  ＧＴＧ  ＡＴＧ  ＡＣＣ  ＣＡＧ  ＫＣＡ  ＳＣＴ  ＣＹＡ  ＡＧＣ  ＳＴＧ  ＣＣＡ  ＧＴＧ  ＡＣＣ  ＣＣＡ  ＧＧＣ  ＧＡＧ  ＹＣＡ  ＧＹＧ  ＴＣＣ  ＡＴＣ  ＡＧＣ  ＴＧＣ  ＡＧＧ  ＴＣＣ  ＡＧＣ（配列番号４６６）
３’−ＰＳＣＡ２ＶＬ−ｂ
ＣＴＧ  ＧＧＧ  ＧＣＴ  ＣＴＧ  ＧＣＣ  ＴＧＧ  ＣＹＴ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＡＷＡ  ＣＣＡ  ＧＴＡ  ＣＡＧ  ＧＴＡ  ＧＧＴ  ＧＴＴ  ＧＣＣ  ＧＴＴ  ＧＣＴ  ＧＴＧ  ＣＡＧ  ＣＡＧ  ＧＣＴ  ＣＴＴ  ＧＣＴ  ＧＧＡ  ＣＣＴ  ＧＣＡ  ＧＣＴ  ＧＡＴ  Ｇ（配列番号４６７）
５’−ＰＳＣＡ２ＶＬ−ｃ
ＣＣＡ  ＧＧＣ  ＣＡＧ  ＡＧＣ  ＣＣＣ  ＣＡＧ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＡＴＣ  ＴＡＣ  ＡＧＧ  ＡＴＧ  ＡＧＣ  ＡＡＣ  ＣＴＧ  ＧＣＴ  ＡＧＣ  ＧＧＣ  ＧＴＧ  ＣＣＡ  ＧＡＣ  ＡＧＡ  ＴＴＣ  ＡＧＣ  ＧＧＣ  ＡＧＣ  ＧＧＣ  ＴＣＴ  ＧＧＡ  ＡＣＣ（配列番号４６８）
３’−ＰＳＣＡ２ＶＬ−ｄ
ＣＡＧ  ＧＣＡ  ＧＴＡ  ＧＴＡ  ＣＡＣ  ＧＣＣ  ＣＡＣ  ＧＴＣ  ＣＴＣ  ＧＧＣ  ＣＴＣ  ＣＡＣ  ＣＣＴ  ＧＣＴ  ＧＡＴ  ＣＹＴ  ＣＡＧ  ＧＧＴ  ＧＡＡ  ＧＫＣ  ＧＧＴ  ＴＣＣ  ＡＧＡ  ＧＣＣ  ＧＣＴ  ＧＣＣ（配列番号４６９）
３’−ＰＳＣＡ２ＶＬ−ｅ−ＢｓｉＷ１−Ｓｐｅ１
ＧＴＧ  ＣＴＧ  ＡＣＴ  ＡＧＴ  ＣＧＴ  ＡＣＧ  ＣＴＴ  ＧＡＴ  ＴＴＣ  ＣＡＧ  ＣＴＴ  ＧＧＴ  ＣＣＣ  ＴＴＧ  ＧＣＣ  ＧＡＡ  ＧＧＴ  ＧＴＡ  ＧＧＧ  ＧＴＡ  ＴＴＣ  ＣＡＧ  ＧＴＧ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＧＣＡ  ＧＴＡ  ＧＴＡ  ＣＡＣ  ＧＣＣ（配列番号４７０）
の通りである。これらのプライマーセットの各々は、対応するＶＬ配列全体にわたる。
【０４７１】
各セット内ではプライマーを等量で混合し（例えば、２０μｌのＰＣＲ反応物に対して１μｌずつの各プライマー（２０〜１００μＭのプライマー原液））、ＰＣＲ緩衝液、ヌクレオチド、およびＴａｑポリメラーゼからなるＰＣＲ混合物に添加する。この混合物を、ＰＣＲサイクラー内において、９４℃で３分間、６５℃で１分間、６２℃で１分間、５９℃で１分間、５６℃で１分間、５２℃で１分間、５０℃で１分間、また、７２℃で１０分間にわたりインキュベートする。その後、標準的な方法により、該産物を、アガロースゲル電気泳動において泳動させ、該ゲルから、２００〜４００のサイズの産物を単離する。
【０４７２】
次いで、各ＶＬ  ＰＣＲ産物を、Ｎ末端およびＣ末端において適切なクローニング制限部位を組み込むプライマーを用いる、標準的なＰＣＲ反応の鋳型として用いる。標準的な方法に従うアガロースゲル電気泳動により、適正なサイズ（ＶＬの場合、約３３０ヌクレオチド）のＤＮＡ断片を単離する。この方法で、十分なＶＬ  ＤＮＡ断片を増幅する。
【０４７３】
次いで、ファージディスプレイベクターであるｐＣｏｍｂ３Ｈ５Ｂｈｉｓ内において、ＶＨ１  １−ｆ（Ｐ３）に基づく最終ＶＨ  ＰＣＲ産物（すなわち、ヒト／ヒト化ＶＨのレパートリー）を、ＶｋＩＩ  Ａ１に基づく最終ＶＬ  ＰＣＲ産物（すなわち、ヒト／ヒト化ＶＬのレパートリー）と、また、ＶＨ１  １−ｆ（ＰＳＣＡ２）に基づく最終ＶＨＰＣＲ産物（すなわち、ヒト／ヒト化ＶＨのレパートリー）を、ＶｋＩＩ  Ａ１９に基づく最終ＶＬ  ＰＣＲ産物（すなわち、ヒト／ヒト化ＶＬのレパートリー）と組み合わせ、そこから（線維状ファージ上における提示後に）抗ＰＳＣＡ結合剤が、以下の通りに、選択、スクリーニング、同定、および確認される、機能的ｓｃＦｖの２つの異なるライブラリーを形成する。
【０４７４】
４５０ｎｇの軽鎖断片（ＳａｃＩ−ＳｐｅＩにより消化した）を、１４００ｎｇのファージミドであるｐＣｏｍｂ３Ｈ５Ｂｈｉｓ（ＳａｃＩ−ＳｐｅＩにより消化した；大型断片）とライゲーションする。次いで、結果として得られる抗体組合せライブラリーを、電気穿孔（２．５ｋＶ、０．２ｃｍのギャップキュベット、２５ｕＦＤ、２００オーム；Ｂｉｏｒａｄ社製ジーンパルサー）により、３００ｕｌのエレクトロコンピテント大腸菌ＸＬ１  Ｂｌｕｅ細胞内へと形質転換し、その結果として、サイズが個別クローン１０７個を超えるライブラリーを得る。１時間にわたる表現型発現の後、陽性の形質転換体を、一晩にわたり、１００ｍｌの液体スーパーブロース（ＳＢ）培地中においてｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＨｉｓベクターによりコードされるカルベニシリン耐性について選択する。次いで、遠心分離により細胞を回収し、市販されるプラスミド調製キット（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて、プラスミド調製を実施する。
【０４７５】
ＶＬライブラリーを含有する、２８００ｎｇのこのプラスミドＤＮＡ（ＸｈｏＩ−ＢｓｔＥＩＩで消化した；大型断片）を、９００ｎｇの重鎖Ｖ断片（ＸｈｏＩ−ＢｓｔＥＩＩで消化した）とライゲーションし、再度、電気穿孔（２．５ｋＶ、０．２ｃｍのギャップキュベット、２５ｕＦＤ、２００オーム；Ｂｉｏｒａｄ社製ジーンパルサー）により、エレクトロコンピテント大腸菌ＸＬ１  Ｂｌｕｅ細胞による２つの３００ｕｌアリコート中へと形質転換し、その結果として、サイズが個別クローン１０７個を超える、全ＶＨ−ＶＬ  ｓｃＦｖ（単鎖可変断片）ライブラリーを得る。
【０４７６】
表現型を発現させ、カルベニシリンに対して緩徐に適応させた後で、抗体ライブラリーを含有する大腸菌細胞を、ＳＢ−カルベニシリン（５０ｕｇ／ｍＬ）選択培地へと移す。次いで、抗体ライブラリーを含有する大腸菌細胞に、感染用量である１０１２個のヘルパーファージＶＣＳＭ１３粒子を感染させ、その結果として、線維状Ｍ１３ファージを生成および分泌させるが、この場合、ファージ粒子は、ｓｃＦｖ断片をコードする一本鎖のｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＨｉｓ−ＤＮＡを含有し、ファージコートタンパク質ＩＩＩへの翻訳融合体として、対応するｓｃＦｖタンパク質を提示する。抗体ライブラリーを提示するこのファージプールを用いて、抗原結合実体を選択する。
【０４７７】
この目的のために、ＰＥＧ８０００／ＮａＣｌ沈殿および遠心分離により、個々の培養物上清から、クローニングされたｓｃＦｖレパートリーを保有するファージライブラリーを回収する。約１０１１〜１０１２個のｓｃＦｖファージ粒子を、０．４ｍｌのＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ中に再懸濁させ、緩徐に撹拌しながら、氷上で１時間にわたり、ＰＳＣＡをトランスフェクトした１０５〜１０７個のＣＨＯ細胞（実施例２４．１を参照されたい）と共にインキュベートする。これらのＰＳＣＡをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を、あらかじめ遠心分離により回収し、ＰＢＳ中で洗浄し、ＰＢＳ／１％ＦＣＳ（Ｎａアジドを含有する）中に再懸濁させる。ＰＳＣＡをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に特異的に結合しないｓｃＦｖファージは、ＰＢＳ／１％ＦＣＳ（Ｎａアジドを含有する）を伴う最大５回にわたる洗浄ステップにより除去する。洗浄後、ｐＨ２．２のＨＣｌ−グリシン中で細胞を再懸濁させる（その後のボルテクシングを伴う１０分間にわたるインキュベーション）ことにより、細胞から結合実体を溶出させ、ｐＨ１２の２Ｍトリスにより中和させた後に、溶出物を用いて、新鮮な未感染の大腸菌ＸＬ１  Ｂｌｕｅ培養物に感染させる（ＯＤ６００＞０．５）。ヒト／ヒト化ｓｃＦｖ断片をコードするファージミドコピーの形質導入に成功した大腸菌細胞を含有する大腸菌培養物を、さらに、カルベニシリン耐性について選択し、その後、これにＶＣＭＳ  １３ヘルパーファージを感染させて、抗体ディスプレイおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける選択の第２ラウンドを開始させる。通常、計４〜５ラウンドにわたり選択を実施する。
【０４７８】
ＰＳＣＡに特異的な結合剤をスクリーニングするため、選択後、大腸菌培養物から、４〜５ラウンドのパニングに対応するプラスミドＤＮＡを単離する。可溶性のｓｃＦｖタンパク質を作製するため、プラスミドからＶＨ−ＶＬ−ＤＮＡ断片を切り出す（ＸｈｏＩ−ＳｐｅＩ）。発現構築物（例えば、ｓｃＦｖ）が、ｓｃＦｖとＨｉｓ６タグとの間にＦｌａｇタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）を包含し、また、さらなるファージタンパク質を欠失させる点で元のｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＨｉｓとは異なるプラスミドである、ｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＦｌａｇ／Ｈｉｓ内への同じ制限部位により、これらの断片をクローニングした。ライゲーション後、プラスミドＤＮＡの各プール（パニングのラウンドが異なる）を、熱ショックコンピテント大腸菌のＴＧ１株またはＸＬＩ  ｂｌｕｅ株１００μｌ中へと形質転換し、カルベニシリンＬＢ寒天上へと播種する。単一のコロニーを採取して、１００ｕｌのＬＢカルベニシリン（５０ｕｇ／ｍｌ）中へと播種する。
【０４７９】
ＶＬセグメントおよびＶＨセグメントを含有するｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＦｌａｇ／Ｈｉｓにより形質転換された大腸菌は、遺伝子ＩＩＩ断片を切除し、また、１ｍＭ  ＩＰＴＧにより誘導した後で、十分な量で可溶性のｓｃＦｖを生成する。適切なシグナル配列により、ｓｃＦｖ鎖はペリプラズム内へと移出され、そこで、機能的な立体構造へと折り畳まれる。
【０４８０】
小スケールのペリプラズム調製物用に、形質転換プレートから単一の大腸菌ＴＧ１株による細菌コロニーを採取し、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを補充したＳＢ培地（例えば、１０ｍｌ）中で培養する（また、回収後、ＰＢＳ（例えば、１ｍｌ）中に再溶解させる）。−７０℃における凍結および３７℃における融解の４ラウンドを介する温度ショックにより細菌の外膜を破壊し、ｓｃＦｖを包含する可溶性のペリプラズムタンパク質を上清中へと放出させる。遠心分離により、完全細胞および細胞破砕物を除去した後で、抗ＰＳＣＡ  ｓｃＦｖを含有する上清を回収し、以下のＰＳＣＡ特異的結合剤の同定に用いる。
【０４８１】
ＰＳＣＡに対するｓｃＦｖの結合は、ＰＳＣＡをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞（実施例２４．１を参照されたい）に対するフローサイトメトリーにより調べる；トランスフェクトされなかったＣＨＯ細胞を陰性対照として用いる。
【０４８２】
フローサイトメトリーのため、２．５×１０５個の細胞を、５０ｕｌのｓｃＦｖペリプラズム調製物、または２％ＦＣＳを伴う５０μｌのＰＢＳ中に５μｇ／ｍｌの精製ｓｃＦｖと共にインキュベートする。ｓｃＦｖの結合は、２％ＦＣＳを伴う５０μｌのＰＢＳ中に２μｇ／ｍｌの抗Ｈｉｓ抗体（ドイツ、ヒルデン、Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ社製、ＢＳＡ非含有、ペンタＨｉｓ抗体）により検出する。第２ステップの試薬として、アフィニティー精製Ｒ−フィコエリトリンコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃガンマ断片特異的）Ｆ（ａｂ’）２断片を、２％ＦＣＳ（ドイツ、ハンブルグ、Ｄｉａｎｏｖａ社製）を伴う５０μｌのＰＢＳ中において１：１００に希釈して用いた。試料は、ＦＡＣＳｓｃａｎ（ドイツ、ハイデルベルク、ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）上において測定する。
【０４８３】
次いで、好ましい特性およびアミノ酸配列について、単一のクローンを解析する。Ｇｌｙ４Ｓｅｒ１リンカーを介して、それらを、ＣＤ３特異性ｓｃＦｖであるＩ２Ｃ（配列番号１８５）、または本発明の他の任意のＣＤ３特異性ｓｃＦｖと接合することにより、ＰＳＣＡ特異的ｓｃＦｖを、組換え二重特異性単鎖抗体へと転換し、その結果として、例えば、ドメイン配列ＶＨＰＳＣＡ−（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ１）３−ＶＬＰＳＣＡ−Ｇｌｙ４Ｓｅｒ１−ＶＨＣＤ３−（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ１）３−ＶＬＣＤ３、もしくはＶＬＰＳＣＡ−（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ１）３−ＶＨＰＳＣＡ−Ｇｌｙ４Ｓｅｒ１−ＶＨＣＤ３−（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ１）３−ＶＬＣＤ３、または代替的なドメイン配列を伴う構築物を得る。ＣＨＯ細胞内において発現させるには、（ｉ）コンセンサスのコザック配列内に埋め込まれた開始コドンを含む、Ｎ末端における免疫グロブリン重鎖リーダーのコード配列、また、（ｉｉ）停止コドンを後続させる、Ｃ末端におけるＨｉｓ６タグのコード配列の両方を、二重特異性単鎖抗体をコードするヌクレオチド配列にインフレームで結合させた後で、遺伝子合成により結果として得られるＤＮＡ断片を、発現ベクターであるｐＥＦ−ＤＨＦＲ（Ｒａｕｍら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ５０（２００１）、１４１〜１５０）の多重クローニング部位内へと挿入する。説明される通り（Ｍａｃｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２（１９９５）、７０２１〜７０２５）に、ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞を安定的にトランスフェクトし、二重特異性単鎖抗体を培養物上清内へと分泌するＤＨＦＲ陽性トランスフェクタントを選択し、また、メトトレキサートによる遺伝子増幅を行い、発現レベルを上昇させる。他のすべての最新手順は、標準的なプロトコール（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１））に従い実施する。
【０４８４】
トランスフェクトされたＣＨＯ細胞に由来する培養物上清にフローサイトメトリー解析を施すことにより、機能的な二重特異性単鎖抗体構築物を同定する。この目的のために、ヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞白血病細胞株であるＨＰＢ−ＡＬＬ（ブラウンシュヴァイク、ＤＳＭＺ社製、ＡＣＣ４８３）、およびマカクザルＴ細胞株である４１１９ＬｎＰｘ上におけるＣＤ３に対する結合を調べる。腫瘍特異的ＰＳＣＡエピトープに対する結合は、ＰＳＣＡをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞上において調べる（実施例２４．１を参照されたい）。各細胞株２００，０００個ずつを、５０μｌの細胞培養物上清と共に、氷上において３０分間にわたりインキュベートする。２％ＦＣＳを伴うＰＢＳ中で２回にわたり細胞を洗浄し、マウス抗Ｈｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ社製、ペンタＨｉｓ抗体；２％ＦＣＳを伴う５０μｌのＰＢＳ中で１：２０に希釈）により、結合した二重特異性単鎖抗体構築物を検出する。洗浄後、２％ＦＣＳを伴うＰＢＳ中において１：１００に希釈した、フィコエリトリンにコンジュゲートさせたＦｃガンマ特異性抗体（Ｄｉａｎｏｖａ社製）により、結合した抗Ｈｉｓ抗体を検出する。トランスフェクトされなかったＣＨＯ細胞の上清を、Ｔ細胞株に対する結合についての陰性対照として用いる。
【０４８５】
ＦＡＣＳ−Ｃａｌｉｂｕｒ装置上において、フローサイトメトリーを実施する；ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを用いてデータを取り込み、解析する（ハイデルベルク、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）。「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（Ｃｏｌｉｇａｎ、Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ、Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ、Ｓｈｅｖａｃｈ、およびＳｔｒｏｂｅｒ、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、２００２）において説明される通りに、ＦＡＣＳによる染色および蛍光強度の測定を実施する。
【０４８６】
ヒトＣＤ３およびマカクザルＣＤ３、ならびにヒトＰＳＣＡおよびマカクザルＰＳＣＡに対する二重特異性結合を示す構築物だけを、さらなる使用のために選択する。
【０４８７】
タンパク質を作製するには、完全に機能的な二重特異性単鎖抗体を発現するＣＨＯ細胞を、７日間にわたり、ヌクレオシド非含有ＨｙＱ  ＰＦ  ＣＨＯ液体ダイズ培地（４．０ｍＭのＬ−グルタミン、および０．１％のプルロニックＦ−６８（ＨｙＣｌｏｎｅ社製）を伴う）を伴うローラーボトル内で増殖させる。遠心分離により細胞から培養物上清を除去し、精製するまで−２０℃でこれを保存した。培養物上清から二重特異性単鎖抗体を生成するためのクロマトグラフィー装置としては、Ａｅｋｔａ（登録商標）Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）およびＵｎｉｃｏｒｎ（登録商標）ソフトウェアを用いる。製造元により提供されるプロトコールに従い、ＺｎＣｌ２を充填したＦｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤキレート（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ社製）を用いて、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（「ＩＭＡＣ」）を実施する。緩衝液Ａ（ｐＨ７．２の２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、０．１Ｍ  ＮａＣｌ）によりカラムを平衡化させ、３ｍｌ／分の流速で、細胞培養物上清（５００ｍｌ）をカラム（１０ｍｌ）に適用する。緩衝液Ａによりカラムを洗浄して、結合しなかった試料を除去する。
以下：
段階１：６カラム容量中における２０％の緩衝液Ｂ
段階２：６カラム容量中における１００％の緩衝液Ｂ
に従う２段階勾配の緩衝液Ｂ（ｐＨ７．２の２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、０．５Ｍイミダゾール）を用いて、結合したタンパク質を溶出させる。段階２により溶出させたタンパク質画分を、さらなる精製のためにプールする。すべての化学物質は研究グレードであり、Ｓｉｇｍａ社（ダイゼンホーフェン）またはＭｅｒｃｋ社（ダルムシュタット）から購入する。
【０４８８】
Ｅｑｕｉ−ｂｕｆｆｅｒ（２５ｍＭクエン酸、２００ｍＭリシン、５％グリセロール、ｐＨ７．２）により平衡化させたＨｉｌｏａｄ  １６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００調製グレードカラム（ＧＥ／Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）上において、ゲル濾過クロマトグラフィーを実施する。溶出させたタンパク質試料（流速１ｍｌ／分）を、標準的なＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットにかけ、検出する。精製前に、分子量の決定についてカラムを校正する（分子量マーカーキット；Ｓｉｇｍａ社製、ＭＷ  ＧＦ−２００）。ＯＤ２８０ｎｍを用いて、タンパク質濃度を決定する。
【０４８９】
精製した二重特異性単鎖抗体タンパク質は、４〜１２％のプレキャストビストリスゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）により還元条件下で実施されるＳＤＳ  ＰＡＧＥにより解析する。製造元により提供されるプロトコールに従い、試料の調製および適用を実施した。ＭｕｌｔｉＭａｒｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）により、分子量を決定する。コロイド性クーマシー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社によるプロトコール）により、ゲルを染色する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定される通り、単離タンパク質の純度は＞９５％である。
【０４９０】
ＰＢＳ中におけるゲル濾過により決定される通り、二重特異性単鎖抗体は、天然状態で約５２ｋＤａの分子量を有する。すべての構築物は、この方法に従い精製される。
【０４９１】
製造元により提供されるプロトコールに従い、Ｏｐｔｉｔｒａｎ（登録商標）ＢＡ−Ｓ８３膜およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製のＢｌｏｔ  Ｍｏｄｕｌｅを用いて、ウェスタンブロットを実施する。二重特異性単鎖抗体タンパク質を検出するには、抗Ｈｉｓタグ抗体（Ｑｉａｇｅｎ社製、ペンタＨｉｓ）を用いる。二次抗体として、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）（Ｓｉｇｍａ社製）により標識化したヤギ抗マウスＩｇ抗体、また、基質として、ＢＣＩＰ／ＮＢＴを用いる。５２ｋＤにおいて、単一のバンドが検出され、これは、精製された二重特異性単鎖抗体に対応する。
【０４９２】
ヒトＣＤ３およびマカクザルＣＤ３、ならびにヒトＰＳＣＡおよびマカクザルＰＳＣＡと相互作用する二重特異性単鎖抗体のヒト系および非チンパンジー霊長動物系における効力は、ＰＳＣＡをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を標的細胞として（実施例２４．１を参照されたい）、また、刺激ヒトＣＤ４／ＣＤ５６枯渇ＰＢＭＣ、またはマカクザルＴ細胞株である４１１９ＬｎＰｘをエフェクター細胞として用いる、クロム５１（５１Ｃｒ）に基づく細胞傷害作用アッセイにより決定される。
【０４９３】
刺激ヒトＰＢＭＣの作製は、以下の通りに実施される。３７℃で１時間にわたり、１μｇ／ｍｌの最終濃度にある市販の抗ＣＤ３特異性抗体（例えば、Ｏｔｈｏｃｌｏｎｅ社製のＯＫＴ３）により、ペトリディッシュ（直径８５ｍｍ；Ｎｕｎｃ社製）をコーティングする。結合しなかったタンパク質は、ＰＢＳによる１回の洗浄ステップにより除去する。標準的なプロトコールに従うＦｉｃｏｌｌ勾配遠心分離により、末梢血（３０〜５０ｍｌのヒト血液）から新鮮なＰＢＭＣを単離する。安定化グルタミン／１０％ＦＣＳ／２０Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２（Ｃｈｉｒｏｎ社製、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）を伴う５０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０中に３〜５×１０７個のＰＢＭＣを、あらかじめコーティングしたペトリディッシュへと添加し、２日間にわたり刺激する。３日目に細胞を回収し、ＲＰＭＩ  １６４０により１回洗浄する。上記と同じ細胞培地中において、２０Ｕ／ｍｌの最終濃度までＩＬ−２を添加し、再度１日間にわたり細胞を培養する。
【０４９４】
ＰＢＳにより標的細胞を２回にわたり洗浄し、３７℃で４５分間にわたり、５０％ＦＣＳを伴う、最終容量１００μｌのＲＰＭＩ中において１１．１ＭＢｑの５１Ｃｒによりこれらを標識化する。その後、５ｍｌのＲＰＭＩにより３回にわたり、標識化した標的細胞を洗浄し、次いで、細胞傷害作用アッセイにおいて用いる。９６ウェルプレート内の総容量２５０μｌの補充ＲＰＭＩ（上記の）中において、Ｅ：Ｔ比１０：１でアッセイを実施する。１μｇ／ｍｌの異種間特異的二重特異性単鎖抗体分子、およびそれらの２０段階にわたる３倍希釈系列を適用する。アッセイ時間は１８時間であり、最大溶解量（Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを添加した場合）と、自発溶解量（エフェクター細胞なしの場合）との差と比べた、上清中において放出されるクロムの相対値として、細胞傷害作用を測定する。すべての測定は４連で実施する。上清中におけるクロム活性の測定は、Ｗｉｚａｒｄ  ３’’ガンマカウンター（ドイツ、ケルン、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＧｍｂＨ社製）により実施する。実験データの解析は、Ｐｒｉｓｍ  ４  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（米国、カリフォルニア州、サンディエゴ、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社製；ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．０２）により実施する。ソフトウェアにより決定される通り、Ｓ字型の用量反応曲線は、＞０．９０のＲ２値を有することが典型的である。効力の測定値としてのＥＣ５０値は、解析プログラムにより計算する。
【実施例２５】
【０４９５】
２５．ＣＤ１９およびＣＤ３に対する異種間特異的二重特異性単鎖抗体分子の作製および特徴づけ
２５．１．ＣＨＯ細胞上におけるヒトＣＤ１９抗原のクローニングおよび発現
標準的なプロトコールに従う遺伝子合成により、ヒトＣＤ１９抗原の配列（ＮＭ＿００１７７０のヒトＣＤ１９分子（ＣＤ１９）、ｍＲＮＡ；米国国立バイオテクノロジー情報センター、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ）を用いて、合成分子を得た。遺伝子合成断片はまた、真核細胞内において該構築物を発現させるためのコザック部位、また、該ＤＮＡの始点および終点において制限部位を含有するようにもデザインした。５’端においてＥｃｏＲＩ、また、３’端においてＳａｌＩの制限部位を導入し、ｐＥＦ−ＤＨＦＲ（Ｒａｕｍら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ５０（２００１）、１４１〜１５０）と称するプラスミド内へのクローニングステップで用いた。配列を検証した後で、該プラスミドを用い、以下の通りにＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞にトランスフェクトした。配列を検証したプラスミドを用いて、ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ  ９０９６；３７℃、湿度９５％、および７％ＣＯ２のインキュベーター内において、ドイツ、ベルリン、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ社から購入した、安定化グルタミンを伴い、すべて、ドイツ、ベルリン、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ社から購入した、１０％ＦＣＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充し、また、ドイツ、タウフキルヒエン、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ社から購入した、細胞培養グレードの試薬原液によるヌクレオシドを、１０μｇ／ｍｌアデノシン、１０μｇ／ｍｌデオキシアデノシン、および１０μｇ／ｍｌチミジンの最終濃度まで補充した、ＲＰＭＩ  １６４０中で培養した）にトランスフェクトした。トランスフェクションは、製造元のプロトコールに従い、ＰｏｌｙＦｅｃｔトランスフェクション試薬（ドイツ、ヒルデン、Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ社製）、および５μｇのプラスミドＤＮＡにより実施した。２４時間にわたる培養後にＰＢＳで１回細胞を洗浄し、前述の細胞培地中で再度培養したが、該培地にはヌクレオシドを補充せず、透析したＦＣＳ（ドイツ、ベルリン、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ社から購入した）を用いた。したがって、細胞培地はヌクレオシドを含有せず、これにより、トランスフェクトされた細胞に対して選択を適用した。トランスフェクションの約１４日後において、耐性細胞の増殖が観察された。さらに７〜１４日後、ＦＡＣＳにより、構築物の発現が陽性であるかどうかについてトランスフェクタントを調べた。Ｋａｕｆｍａｎｎ  Ｒ．Ｊ．（１９９０）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５、５３７〜５６６により説明される通り、ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞内において、真核細胞内のタンパク質発現を実施した。メトトレキサート（ＭＴＸ）濃度を、最高２０ｎＭ  ＭＴＸの最終濃度まで上昇させることにより、該構築物の遺伝子増幅を誘導した。
【０４９６】
２５．２．ＣＤ１９およびＣＤ３に対する異種間特異的二重特異性単鎖分子の作製
一般に、各々が、ヒトＣＤ３抗原およびマカクザルＣＤ３抗原に対して結合特異性を有するドメイン、ならびにヒトＣＤ１９抗原に対して結合特異性を有するドメインを含む二重特異性単鎖抗体分子を、以下の表８に示す通りにデザインした。
【０４９７】
【表８】
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【０４９８】
遺伝子合成により、ヒトＣＤ１９に対して特異的な軽鎖（Ｌ）可変ドメインおよび重鎖（Ｈ）可変ドメインと、ヒトＣＤ３およびマカクザルＣＤ３に対して異種間特異的なＣＤ３特異性ＶＨおよびＣＤ３特異性ＶＬの組合せとを含有する前述の構築物を得た。ＭＣＳＰ×ＣＤ３異種間特異的単鎖分子について実施例９で説明した手順と同様に、遺伝子合成断片をデザインし、真核細胞内のタンパク質発現を実施した。
【０４９９】
２５．３．二重特異性単鎖抗体分子の発現および精製
ＭＣＳＰ×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体について本明細書の上記で説明した通り、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＨＥＫ２９３細胞内において、二重特異性単鎖抗体分子を発現させた。
【０５００】
発現させた二重特異性単鎖抗体の単離および解析については、本明細書上記の実施例９でも説明した。
【０５０１】
２５．４．フローサイトメトリーによる、ＣＤ１９およびＣＤ３に対する異種間特異的二重特異性抗体の結合についての解析
ヒトＣＤ１９、ならびにヒトＣＤ３およびマカクザルＣＤ３に結合する能力に関して、異種間特異的二重特異性抗体構築物の機能性を調べるため、ＦＡＣＳ解析を実施した。この目的のために、実施例２５．１で説明した通りにヒトＣＤ１９をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞、また、ヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞白血病細胞株であるＨＰＢ−ＡＬＬ（ブラウンシュヴァイク、ＤＳＭＺ社製、ＡＣＣ４８３）を用いて、ヒト抗原に対する結合を確認した。マカクザルＣＤ３に対する結合反応性は、マカクザルＴ細胞株である４１１９ＬｎＰｘ（エアランゲン−ニュルンベルグ、衛生研究所、ウイルス学部門、Ｆｉｃｋｅｎｓｃｈｅｒ教授による恵与；Ｋｎａｐｐｅ  Ａら、およびＦｉｃｋｅｎｓｃｈｅｒ  Ｈ．、Ｂｌｏｏｄ  ２０００、９５、３２５６〜６１において公表されている）を用いることにより調べた。各細胞集団２００，０００個ずつを、異種間特異的二重特異性抗体構築物による５０μｌの精製タンパク質（たとえば２μｇ／ｍｌ）と共に、氷上において３０分間にわたりインキュベートした。代替的に、一過性に生成されたタンパク質の細胞培養物上清も用いた。ＰＢＳ中で２回にわたり細胞を洗浄し、標識化されないマウスペンタＨｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ社製；２％ＦＣＳを伴う５０μｌのＰＢＳ中で１：２０に希釈）により、構築物の結合を検出した。洗浄後、２％ＦＣＳを伴う５０μｌのＰＢＳ中において１：１００に希釈した、フィコエリトリンにコンジュゲートさせたＦｃガンマ特異性抗体（Ｄｉａｎｏｖａ社製）により、結合した抗Ｈｉｓ抗体を検出した。新鮮な培地を、陰性対照として用いた。
【０５０２】
ＦＡＣＳ−Ｃａｌｉｂｕｒ装置上において、フローサイトメトリーを実施し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを用いてデータを取り込み、解析した（ハイデルベルク、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）。「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（Ｃｏｌｉｇａｎ、Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ、Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ、Ｓｈｅｖａｃｈ、およびＳｔｒｏｂｅｒ、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、２００２）において説明される通りに、ＦＡＣＳによる染色および蛍光強度の測定を実施した。
【０５０３】
図５０に示すＦＡＣＳ解析において、すべての構築物は、ヒトＣＤ３およびマカクザルＣＤ３、ならびにヒトＣＤ１９に対する結合を示した。
【０５０４】
２５．５．ＣＤ１９およびＣＤ３に対する異種間特異的二重特異性単鎖抗体の生体活性
実施例２５．１で説明したＣＤ１９陽性細胞株を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏクロム５１（５１Ｃｒ）放出細胞傷害作用アッセイにより、二重特異性単鎖抗体の生体活性を解析した。エフェクター細胞としては、刺激ヒトＣＤ８陽性Ｔ細胞、またはマカクザルＴ細胞株である４１１９ＬｎＰｘを用いた。
【０５０５】
刺激ヒトＰＢＭＣの作製については、本明細書上記の実施例１１において説明した。
【０５０６】
実施例１１において、ＭＣＳＰ×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体について説明した手順と同様に、標的細胞を調製し、アッセイを実施した。
【０５０７】
図５１に示す、Ｔ細胞による細胞傷害作用アッセイにおいて、被験二重特異性単鎖抗体構築物のすべては、ヒトＣＤ１９陽性標的細胞に対して、ヒトＣＤ８＋細胞により誘発される細胞傷害活性、また、ヒトＣＤ１９陽性標的細胞に対して、マカクザルＴ細胞株である４１１９ＬｎＰｘにより誘発される細胞傷害活性を示した。
【０５０８】
２５．６．ＣＤ３およびＣＤ１９に対するさらなる異種間特異的二重特異性単鎖分子の作製
ヒト生殖細胞系列抗体のＶＨ配列であるＶＨ１ １−４６（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）を、ＣＤＲＨ１（配列番号４７３）、ＣＤＲＨ２（配列番号４７４）、およびＣＤＲＨ３（配列番号４７５）のフレームワーク環境として選択する。該ヒトＶＨには、末端の約１５〜２０ヌクレオチドの連なりにおいて重複する複数の縮退オリゴヌクレオチドを合成しなければならない。この目的に適う第２のプライマーはいずれも、アンチセンスプライマーである。ＶＨ１  １−４６には、以下のオリゴヌクレオチド（５’〜３’）：
５’−３７ＶＨ−ａＸｈｏ１
ＣＡＧ  ＣＴＧ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＴＣＴ  ＧＧＧ  ＧＣＴ  ＧＡＧ  ＳＴＧ  ＲＷＧ  ＡＲＧ  ＣＣＴ  ＧＧＧ  ＫＣＣ  ＴＣＡ  ＧＴＧ  ＡＡＧ  ＲＴＴ  ＴＣＣ  ＴＧＣ  ＡＡＧ  ＧＣＴ  ＴＣＴ  ＧＧＣ（配列番号７６３）
３’−３７ＶＨ−ｂ
ｃｃａ  ｃｔｃ  ａａｇ  ａｃｃ  ｃｔｇ  ｔｃｃ  ａｇｇ  ＧＳＳ  ｃｔｇ  ｃＹｔ  ｃａｃ  ｃｃａ  ｇｔｔ  ｃａｔ  ｃｃａ  ｇｔａ  ｇｃｔ  ａＧｗ  ｇａａ  ｔｇＹ  ａｔａ  ｇｃｃ  ａｇａ  ａｇｃ  ｃｔｔ  ｇｃａ  ｇｇａ（配列番号７６４）
５’−３７ＶＨ−ｃ
ＧＧＡ  ＣＡＧ  ＧＧＴ  ＣＴＴ  ＧＡＧ  ＴＧＧ  ＡＴＫ  ＧＧＡ  ＣＡＧ  ＡＴＴ  ＴＧＧ  ＣＣＴ  ＧＧＡ  ＧＡＴ  ＧＧＴ  ＧＡＴ  ＡＣＴ  ＡＡＣ  ＴＡＣ  ＡＡＴ  ＧＧＡ  ＡＡＧ  ＴＴＣ  ＡＡＧ（配列番号７６５）
３’−３７ＶＨ−ｄ
ｃａｇ  ｇｃｔ  ｇｃｔ  ｇａｇ  ｔｔＳ  ｃａｔ  ｇｔａ  ｇＲｃ  ｔｇｔ  ｇｃｔ  ｇｇｔ  ｇｇａ  ｔＫＹ  ｇｔｃ  ＡＳＳ  ａｇｔ  ｃａＫ  ａｇｔ  ｇＲｃ  ｔＹｔ  ａｃｃ  ｃｔｔ  ｇａａ  ｃｔｔ  ｔｃｃ  ａｔｔ  ｇｔａ  ｇ（配列番号７６６）
５’−３７ＶＨ−ｅ
Ｃ  ＡＴＧ  ＳＡＡ  ＣＴＣ  ＡＧＣ  ＡＧＣ  ＣＴＧ  ＳＳＡ  ＴＣＴ  ＧＡＧ  ＧＡＣ  ＡＣＴ  ＧＣＧ  ＧＴＣ  ＴＡＴ  ＴＷＣ  ＴＧＴ  ＧＣＡ  ＡＧＡ  ＣＧＧ  ＧＡＧ  ＡＣＴ  ＡＣＧ  ＡＣＧ  Ｇ（配列番号７６７）
３’−３７ＶＨ−ｆＢｓｔＥ２
ｇｇａ  ｇａｃ  ｇｇｔ  ｇａｃ  ｃｇｔ  ｇｇｔ  ｃｃｃ  ｔｔｇ  ｇｃｃ  ｃｃａ  ｇｔａ  ｇｔｃ  ｃａｔ  ａｇｃ  ａｔａ  ｇｔａ  ａｔａ  ａｃｇ  ｇｃｃ  ｔａｃ  ｃｇｔ  ｃｇｔ  ａｇｔ  ｃｔｃ  ｃｃｇ  ｔｃｔ  ｔｇｃ（配列番号７６８）
を用いる。このプライマーセットは、対応するＶＨ配列全体にわたる。
【０５０９】
該セット内ではプライマーを等量で混合し（例えば、２０μｌのＰＣＲ反応物に対して１μｌずつの各プライマー（２０〜１００μＭのプライマー原液））、ＰＣＲ緩衝液、ヌクレオチド、およびＴａｑポリメラーゼからなるＰＣＲ混合物に添加する。この混合物を、ＰＣＲサイクラー内において、９４℃で３分間、６５℃で１分間、６２℃で１分間、５９℃で１分間、５６℃で１分間、５２℃で１分間、５０℃で１分間、また、７２℃で１０分間にわたりインキュベートする。その後、標準的な方法により、該産物を、アガロースゲル電気泳動において泳動させ、該ゲルから、２００〜４００のサイズの産物を単離する。
【０５１０】
次いで、ＶＨ  ＰＣＲ産物を、Ｎ末端およびＣ末端において適切なクローニング制限部位を組み込むプライマーを用いる、標準的なＰＣＲ反応の鋳型として用いる。標準的な方法に従うアガロースゲル電気泳動により、適正なサイズ（ＶＨの場合、約３５０ヌクレオチド）のＤＮＡ断片を単離する。この方法で、十分なＶＨ  ＤＮＡ断片を増幅する。
【０５１１】
ヒト生殖細胞系列抗体のＶＬ配列であるＶｋＩ Ｏ１２（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）を、ＣＤＲＬ１（配列番号４７８）、ＣＤＲＬ２（配列番号４７９）、およびＣＤＲＬ３（配列番号４８０）のフレームワーク環境として選択する。ヒトＶＬには、末端の約１５〜２０ヌクレオチドの連なりにおいて重複する複数の縮退オリゴヌクレオチドを合成しなければならない。この目的に適う第２のプライマーはいずれも、アンチセンスプライマーである。オリゴヌクレオナド内における、その後のクローニングに必要とされる制限部位は欠失させる。ＶｋＩ  Ｏ１２には、以下のオリゴヌクレオチド（５’〜３’）：
５’−３７ＶＬ−Ａ−ＳａｃＩ
ＣＡＧ  ＣＴＧ  ＧＡＧ  ＣＴＣ  ＣＡＧ  ＡＴＧ  ＡＣＣ  ＣＡＧ  ＴＣＴ  ＣＣＡ  ＫＣＴ  ＴＣＴ  ＴＴＧ  ＫＣＴ  ＧＹＧ  ＴＣＴ  ＳＴＡ  ＧＧＧ  ＳＡＳ  ＡＧＡ  ＧＹＣ  ＡＣＣ  ＡＴＣ  ＷＣＣ  ＴＧＣ  ＡＡＧ  ＧＣＣ  ＡＧＣ（配列番号７６９）
３’−３７ＶＬ−Ｂ
ｃｔｇ  ｔｔｇ  ｇｔａ  ｃｃａ  ｇｔｔ  ｃａａ  ａｔａ  ａＳｔ  ＳＮＮ  ａｃｃ  ａｔｃ  ａｔａ  ａｔｃ  ａａｃ  ａｃｔ  ｔｔｇ  ｇｃｔ  ｇｇｃ  ｃｔｔ  ｇｃａ  ｇｇｔ  ｇａｔ  ｇｇｔ（配列番号７７０）
５’−３７ＶＬ−Ｃ
ＴＴＧ  ＡＡＣ  ＴＧＧ  ＴＡＣ  ＣＡＡ  ＣＡＧ  ＡＷＡ  ＣＣＡ  ＧＧＡ  ＭＡＧ  ＳＣＡ  ＣＣＣ  ＡＡＡ  ＣＴＣ  ＣＴＣ  ＡＴＣ  ＴＡＴ  ＧＡＴ  ＧＣＡ  ＴＣＣ  ＡＡＴ  ＣＴＡ  ＧＴＴ  ＴＣＴ（配列番号７７１）
３’−３７ＶＬ−Ｄ
ｇａｇ  ｇｇｔ  ｇａａ  ｇｔｃ  ｔｇｔ  ｃｃｃ  ａｇａ  ｃｃｃ  ａｃｔ  ｇｃｃ  ａｃｔ  ａａａ  ｃｃｔ  ｇｇＲ  ｔｇｇ  ｇａＹ  ｃｃｃ  ａｇａ  ａａｃ  ｔａｇ  ａｔｔ  ｇｇａ  ｔｇｃ（配列番号７７２）
５’−３７ＶＬ−Ｅ
ＧＧＧ  ＡＣＡ  ＧＡＣ  ＴＴＣ  ＡＣＣ  ＣＴＣ  ＡＭＣ  ＡＴＣ  ＭＲＴ  ＹＣＴ  ＳＴＧ  ＳＡＧ  ＭＭＧ  ＧＷＧ  ＧＡＴ  ＫＹＣ  ＧＣＡ  ＡＣＣ  ＴＡＴ  ＹＡＣ  ＴＧＴ  ＣＡＧ  ＣＡＡ  ＡＧＴ  ＡＣＴ  ＧＡＧ（配列番号７７３）
３’−３７ＶＬ−Ｆ−ＢｓｉＷ１Ｓｐｅ１
ＡＣＴ  ＣＡＧ  ＡＣＴ  ＡＧＴ  ＣＧＴ  ＡＣＧ  ｔｔｔ  ｇａｔ  ｃｔｃ  ｃａｃ  ｃｔｔ  ｇｇｔ  ｃｃｃ  ｔｔｇ  ａｃｃ  ｇａａ  ｃｇｔ  ｃｃａ  ｃｇｇ  ａｔｃ  ｃｔｃ  ａｇｔ  ａｃｔ  ｔｔｇ  ｃｔｇ  ａｃａ  ｇ（配列番号７７４）
を用いる。このプライマーセットは、対応するＶＬ配列全体にわたる。
【０５１２】
セット内ではプライマーを等量で混合し（例えば、２０μｌのＰＣＲ反応物に対して１μｌずつの各プライマー（２０〜１００μＭのプライマー原液））、ＰＣＲ緩衝液、ヌクレオチド、およびＴａｑポリメラーゼからなるＰＣＲ混合物に添加する。この混合物を、ＰＣＲサイクラー内において、９４℃で３分間、６５℃で１分間、６２℃で１分間、５９℃で１分間、５６℃で１分間、５２℃で１分間、５０℃で１分間、また、７２℃で１０分間にわたりインキュベートする。その後、標準的な方法により、該産物を、アガロースゲル電気泳動において泳動させ、該ゲルから、２００〜４００のサイズの産物を単離する。
【０５１３】
次いで、ＶＬ  ＰＣＲ産物を、Ｎ末端およびＣ末端において適切なクローニング制限部位を組み込むプライマーを用いる、標準的なＰＣＲ反応の鋳型として用いる。標準的な方法に従うアガロースゲル電気泳動により、適正なサイズ（ＶＬの場合、約３３０ヌクレオチド）のＤＮＡ断片を単離する。この方法で、十分なＶＬ  ＤＮＡ断片を増幅する。
【０５１４】
次いで、ファージディスプレイベクターであるｐＣｏｍｂ３Ｈ５Ｂｈｉｓ内において、ＶＨ１  １−４６に基づく最終ＶＨ  ＰＣＲ産物（すなわち、ヒト／ヒト化ＶＨのレパートリー）を、ＶｋＩ  Ｏ１２に基づく最終ＶＬ  ＰＣＲ産物（すなわち、ヒト／ヒト化ＶＬのレパートリー）と組み合わせ、そこから（線維状ファージ上における提示後に）抗ＣＤ１９結合剤が、以下の通りに、選択、スクリーニング、同定、および確認される、機能的ｓｃＦｖのライブラリーを形成する。
【０５１５】
４５０ｎｇの軽鎖断片（ＳａｃＩ−ＳｐｅＩにより消化した）を、１４００ｎｇのファージミドであるｐＣｏｍｂ３Ｈ５Ｂｈｉｓ（ＳａｃＩ−ＳｐｅＩにより消化した；大型断片）とライゲーションする。次いで、結果として得られる抗体組合せライブラリーを、電気穿孔（２．５ｋＶ、０．２ｃｍのギャップキュベット、２５μＦＤ、２００オーム；Ｂｉｏｒａｄ社製ジーンパルサー）により、３００μｌのエレクトロコンピテント大腸菌ＸＬ１  Ｂｌｕｅ細胞内へと形質転換し、その結果として、サイズが個別クローン１０７個を超えるライブラリーを得る。１時間にわたる表現型発現の後、陽性の形質転換体を、一晩にわたり、１００ｍｌの液体スーパーブロース（ＳＢ）培地中においてｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＨｉｓベクターによりコードされるカルベニシリン耐性について選択する。次いで、遠心分離により細胞を回収し、市販されるプラスミド調製キット（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて、プラスミド調製を実施する。
【０５１６】
ＶＬライブラリーを含有する、２８００ｎｇのこのプラスミドＤＮＡ（ＸｈｏＩ−ＢｓｔＥＩＩで消化した；大型断片）を、９００ｎｇの重鎖Ｖ断片（ＸｈｏＩ−ＢｓｔＥＩＩで消化した）とライゲーションし、再度、電気穿孔（２．５ｋＶ、０．２ｃｍのギャップキュベット、２５μＦＤ、２００オーム；Ｂｉｏｒａｄ社製ジーンパルサー）により、エレクトロコンピテント大腸菌ＸＬ１  Ｂｌｕｅ細胞による２つの３００μｌアリコート中へと形質転換し、その結果として、サイズが１０７個を超えるｓｃＦｖライブラリーを得る。
【０５１７】
表現型を発現させ、カルベニシリンに対して緩徐に適応させた後で、抗体ライブラリーを含有する大腸菌細胞を、ＳＢ−カルベニシリン（５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンを伴うＳＢ）選択培地へと移す。次いで、抗体ライブラリーを含有する大腸菌細胞に、感染用量である１０１２個のヘルパーファージＶＣＳＭ１３粒子を感染させ、その結果として、線維状Ｍ１３ファージを生成および分泌させるが、この場合、各ファージ粒子は、ｓｃＦｖ断片をコードする一本鎖のｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＨｉｓ−ＤＮＡを含有し、ファージコートタンパク質１１１への翻訳融合体として、対応するｓｃＦｖタンパク質を提示する。抗体ライブラリーを提示するこのファージプールを用いて、抗原結合実体を選択する。
【０５１８】
この目的のために、ＰＥＧ８０００／ＮａＣｌ沈殿および遠心分離により、個々の培養物上清から、クローニングされたｓｃＦｖレパートリーを保有するファージライブラリーを回収する。約１０１１〜１０１２個のｓｃＦｖファージ粒子を、０．４ｍｌのＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ中に再懸濁させ、緩徐に撹拌しながら、氷上で１時間にわたり、ＣＤ１９をトランスフェクトした１０５〜１０７個のＣＨＯ細胞（実施例１を参照されたい）と共にインキュベートする。これらのＣＤ１９をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を、あらかじめ遠心分離により回収し、ＰＢＳ中で洗浄し、ＰＢＳ／１％ＦＣＳ（Ｎａアジドを含有する）中に再懸濁させる。ＣＤ１９をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に特異的に結合しないｓｃＦｖファージは、ＰＢＳ／１％ＦＣＳ（Ｎａアジドを含有する）を伴う最大５回にわたる洗浄ステップにより除去する。洗浄後、ｐＨ２．２のＨＣｌ−グリシン中で細胞を再懸濁させる（その後のボルテクシングを伴う１０分間にわたるインキュベーション）ことにより、細胞から結合実体を溶出させ、ｐＨ１２の２Ｍトリスにより中和させた後に、溶出物を用いて、新鮮な未感染の大腸菌ＸＬ１  Ｂｌｕｅ培養物に感染させる（ＯＤ６００＞０．５）。ヒト／ヒト化ｓｃＦｖ断片をコードするファージミドコピーの形質導入に成功した大腸菌細胞を含有する大腸菌培養物を、さらに、カルベニシリン耐性について選択し、その後、これにＶＣＭＳ  １３ヘルパーファージを感染させて、抗体ディスプレイおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける選択の第２ラウンドを開始させる。通常、計４〜５ラウンドにわたり選択を実施する。
【０５１９】
ＣＤ１９に特異的な結合剤をスクリーニングするため、選択後、大腸菌培養物から、４〜５ラウンドのパニングに対応するプラスミドＤＮＡを単離する。可溶性のｓｃＦｖタンパク質を作製するため、プラスミドからｓｃＦｖ−ＤＮＡ断片を切り出す（ＸｈｏＩ−ＳｐｅＩ）。発現構築物（すなわち、ｓｃＦｖ）が、Ｈｉｓ６タグの上流にあるそのＣ末端においてＦｌａｇタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ；配列番号７７５）を包含し、また、ファージタンパク質ＩＩＩ／Ｎ２ドメインおよびタンパク質ＩＩＩ／ＣＴドメインが欠失されている点で、元のｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＨｉｓとは異なるプラスミドである、ｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＦｌａｇ／Ｈｉｓ内への同じ制限部位により、これらの断片をクローニングした。ライゲーション後、プラスミドＤＮＡの各プール（パニングのラウンドが異なる）を、熱ショックコンピテント大腸菌のＴＧ１株またはＸＬＩ  ｂｌｕｃ株１００μｌ中へと形質転換し、カルベニシリンＬＢ寒天上へと播種する。単一のコロニーを採取して、１００μｌのＬＢカルベニシリン（５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを伴うＬＢ）中へと播種する。
【０５２０】
ｓｃＦＶ−ＤＮＡを含有するｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＦｌａｇ／Ｈｉｓにより形質転換された大腸菌は、１ｍＭ  ＩＰＴＧによる誘導の後、十分な量で可溶性のｓｃＦｖタンパク質を生成する。適切なシグナル配列により、ｓｃＦｖはペリプラズム内へと移出され、そこで、機能的な立体構造へと折り畳まれる。
【０５２１】
小スケールのペリプラズム調製物用に、形質転換プレートから単一の大腸菌ＴＧ１株による細菌コロニーを採取し、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを補充したＳＢ培地（例えば、１０ｍｌ）中で培養する（また、回収後、ＰＢＳ（例えば、１ｍｌ）中に再溶解させる）。−７０℃における凍結および３７℃における融解の４ラウンドを介して温度ショックを適用し、これにより細菌の外膜を破壊し、ｓｃＦｖを包含する可溶性のペリプラズムタンパク質を上清中へと放出させる。遠心分離により、完全細胞および細胞破砕物を除去した後で、抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖを含有する上清を回収し、以下のＣＤ１９特異的結合剤の同定に用いる。
【０５２２】
ＣＤ１９に対するｓｃＦｖの結合は、ＣＤ１９をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞（実施例２５．１を参照されたい）に対するフローサイトメトリーにより調べる；トランスフェクトされなかったＣＨＯ細胞を陰性対照として用いる。
【０５２３】
フローサイトメトリーのため、２．５×１０５個の細胞を、５０μｌのｓｃＦｖペリプラズム調製物、または２％ＦＣＳを伴う５０μｌのＰＢＳ中に５μｇ／ｍｌの精製ｓｃＦｖと共にインキュベートする。ｓｃＦｖの結合は、２％ＦＣＳを伴う５０μｌのＰＢＳ中に２μｇ／ｍｌの抗Ｈｉｓ抗体（ドイツ、ヒルデン、Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ社製、ＢＳＡ非含有、ペンタＨｉｓ抗体）により検出する。第２ステップの試薬として、アフィニティー精製Ｒ−フィコエリトリンコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃガンマ断片特異的）Ｆ（ａｂ’）２断片を、２％ＦＣＳ（ドイツ、ハンブルグ、Ｄｉａｎｏｖａ社製）を伴う５０μｌのＰＢＳ中において１：１００に希釈して用いた。試料は、ＦＡＣＳｓｃａｎ（ドイツ、ハイデルベルク、ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）上において測定する。
【０５２４】
次いで、好ましい特性およびアミノ酸配列について、単一のクローンを解析する。Ｇｌｙ４Ｓｅｒ１リンカーを介して、それらを、ＣＤ３特異性ｓｃＦｖであるＩ２Ｃ（アミノ酸配列：配列番号１８５、核酸配列：配列番号１８６）、または本発明の他の任意のＣＤ３特異性ｓｃＦｖと接合することにより、ＣＤ１９特異的ｓｃＦｖを、組換え二重特異性単鎖抗体へと転換し、その結果として、例えば、ドメイン配列ＶＬＣＤ１９−（Ｇｌｙ４Ｓｃｒ１）３−ＶＨＣＤ１９−Ｇｌｙ４Ｓｅｒ１−ＶＨＣＤ３−（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ１）３−ＶＬＣＤ３を伴う構築物を得る。ＣＨＯ細胞内において発現させるには、（ｉ）コンセンサスのコザック配列内に埋め込まれた開始コドンを含む、Ｎ末端における免疫グロブリン重鎖リーダーのコード配列、また、（ｉｉ）停止コドンを後続させる、Ｃ末端におけるＨｉｓ６タグのコード配列の両方を、二重特異性単鎖抗体をコードするヌクレオチド配列にインフレームで結合させた後で、遺伝子合成により結果として得られるＤＮＡ断片を、発現ベクターであるｐＥＦ−ＤＨＦＲ（Ｒａｕｍら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ５０（２００１）、１４１〜１５０）の多重クローニング部位内へと挿入する。実施例２５．２および２５．３で説明した通りに、作製した発現プラスミドのトランスフェクション、異種間特異的二重特異性抗体構築物によるタンパク質の発現および精製を実施する。他のすべての最新手順は、標準的なプロトコール（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１））に従い実施する。
【０５２５】
異種間特異的二重特異性抗体構築物を発現する、トランスフェクト細胞に由来する培養物上清に、フローサイトメトリーによる結合解析を施すことにより、機能的な二重特異性単鎖抗体構築物を同定する。解析は、実施例２５．４で説明した通りに実施する。
【０５２６】
ヒトＣＤ３およびマカクザルＣＤ３、ならびにＣＤ１９に対する二重特異性結合を示す構築物だけを、さらなる使用のために選択する。
【０５２７】
ＣＤ１９陽性標的細胞に対して、エフェクターＴ細胞により誘発される異種間特異的二重特異性単鎖抗体構築物の細胞傷害活性は、実施例２５．５で説明した通りに解析する。ヒトＣＤ１９をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を標的細胞として、また、刺激ヒトＣＤ４／ＣＤ５６枯渇ＰＢＭＣ、またはマカクザルＴ細胞株である４１１９ＬｎＰｘをエフェクターＴ細胞として用いる。ＣＤ１９陽性標的細胞に対する、再指向Ｔ細胞による強力な細胞傷害作用を示す構築物だけを、さらなる使用のために選択する。
【実施例２６】
【０５２８】
２６．Ｃ−ＭＥＴおよびＣＤ３に対する異種間特異的二重特異性単鎖抗体分子の作製および特徴づけ
２６．１．ヒトＣ−ＭＥＴを発現するＣＨＯ細胞の作製
標準的なプロトコールに従う遺伝子合成により、ＧｅｎＢａｎｋで公表されているヒトＣ−ＭＥＴのコード配列（受託番号ＮＭ＿０００２４５）を得た。遺伝子合成断片は、まず、真核細胞内において該構築物を発現させるためのコザック部位、次いで、ヒトＣ−ＭＥＴタンパク質のコード配列、および停止コドンを含有するようにデザインした。（該構築物のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、配列番号７７６および７７７に列挙する）。遺伝子合成断片はまた、該断片の始点および終点において制限部位を導入するようにもデザインした。５’端においてＥｃｏＲＩ、また、３’端においてＳａｌＩの制限部位を導入し、以下のクローニング手順で用いた。遺伝子合成断片内におけるコード配列のサイレント突然変異により、内部制限部位を除去した（ＳａｌＩ：ヌクレオチド３６６をＣからＧへ；ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ：ヌクレオチド２０５９〜２０６１をＴＣＴからＡＧＣへ；ＥｃｏＲＩ：ヌクレオチド２３０４をＴからＣへ）。標準的なプロトコールに従い、ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩを介して、遺伝子合成断片を、ｐＥＦ−ＤＨＦＲ（ｐＥＦ−ＤＨＦＲは、Ｒａｕｍら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ５０（２００１）、１４１〜１５０において説明されている）と称するプラスミド内へとクローニングした。標準的なプロトコール（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１））に従い、前述の手順を実施した。真核細胞内において該構築物を発現させるため、ヌクレオチド配列を検証したクローンをＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞内へとトランスフェクトした。Ｋａｕｆｍａｎｎ  Ｒ．Ｊ．（１９９０）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５、５３７〜５６６により説明される通り、ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞内において、真核細胞内のタンパク質発現を実施した。メトトレキサート（ＭＴＸ）濃度を、最高２０ｎＭ  ＭＴＸの最終濃度まで上昇させることにより、該構築物の遺伝子増幅を誘導した。
【０５２９】
２６．２．マカクザルＣ−ＭＥＴを発現するＣＨＯ細胞の作製
標準的なプロトコールに従い調製されたマカクザルの肝臓に由来するｃＤＮＡに対する５つのＰＣＲセットにより、マカクザル（カニクイザル）Ｃ−ＭＥＴのｃＤＮＡ配列を得た。以下の反応条件：９４℃で２分間にわたる１サイクル、次いで、９４℃で１分間、５６℃で１分間、また、７２℃で３分間にわたる４０サイクル、次いで、７２℃で３分間にわたる最終サイクル、および以下のプライマーを用いた：
４．順方向プライマー：５’−ａｇｇａａｔｔｃａｃｃａｔｇａａｇｇｃｃｃｃｃｇｃｔｇｔｇｃｔｔｇｃａｃｃ−３’（配列番号７７８）
逆方向プライマー：５’−ｃｔｃｃａｇａｇｇｃａｔｔｔｃｃａｔｇｔａｇｇ−３’（配列番号７７９）
５．順方向プライマー：５’−ｇｔｃｃａａａｇｇｇａａａｃｔｃｔａｇａｔｇｃ−３’（配列番号７８０）
逆方向プライマー：５’−ｇｇａｇａｃａｃｔｇｇａｔｇｇｇａｇｔｃｃａｇｇ−３’（配列番号７８１）
６．順方向プライマー：５’−ｃａｔｃａｇａｇｇｇｔｃｇｃｔｔｃａｔｇｃａｇｇ−３’（配列番号７８２）
逆方向プライマー：５’−ｇｃｔｔｔｇｇｔｔｔｔｃａｇｇｇｇｇａｇｔｔｇｃ−３’（配列番号７８３）
７．順方向プライマー：５’−ａｔｃｃａａｃｃａａａｔｃｔｔｔｔａｔｔａｇｔｇｇｔｇｇ−３’（配列番号７８４）
逆方向プライマー：５’−ｇａｃｔｔｃａｔｔｇａａａｔｇｃａｃａａｔｃａｇｇ−３’（配列番号７８５）
８．順方向プライマー：５’−ｔｇｃｔｃｔａａａｔｃｃａｇａｇｃｔｇｇｔｃｃ−３’（配列番号７８６）
逆方向プライマー：５’−ｇｔｃａｇａｔａａｇａａａｔｔｃｃｔｔａｇａａｔｃｃ−３’（配列番号７８７）
【０５３０】
これらのＰＣＲにより、該ＰＣＲプライマーを用いる標準的なプロトコールに従い単離および配列決定される５つの重複する断片が生成され、これにより、その成熟タンパク質のリーダーペプチドのコドン１０から最終コドンまでにわたる、マカクザルＣ−ＭＥＴをコードするｃＤＮＡ配列の部分がもたらされた。マカクザルＣ−ＭＥＴを発現させる構築物を作製するため、標準的なプロトコールに従う遺伝子合成により、ｃＤＮＡ断片を得た（該構築物のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、配列番号７８８および７８９に列挙する）。この構築物では、その成熟タンパク質のリーダーペプチドのアミノ酸１０から、終止コドンを後続させる最後のアミノ酸までにわたる、マカクザルＣ−ＭＥＴのコード配列を、ヒトＣ−ＭＥＴタンパク質リーダーペプチドのアミノ酸１〜９のコード配列へとインフレームで融合した。遺伝子合成断片はまた、真核細胞内において該構築物を発現させるためのコザック部位、また、該ｃＤＮＡを含有する断片の始点および終点において制限部位を含有するようにもデザインした。５’端においてＥｃｏＲＩ、また、３’端においてＳａｌＩの制限部位を導入し、以下のクローニング手順で用いた。遺伝子合成断片内におけるコード配列のサイレント突然変異により、内部制限部位を除去した（ＳａｌＩ：ヌクレオチド３６６をＣからＧへ；ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ：ヌクレオチド２０５９〜２０６１をＴＣＴからＡＧＣへ；ＥｃｏＲＩ：ヌクレオチド２３０４をＴからＣへ）。標準的なプロトコールに従い、ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩを介して、遺伝子合成断片を、ｐＥＦ−ＤＨＦＲ（ｐＥＦ−ＤＨＦＲは、Ｒａｕｍら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ５０（２００１）、１４１〜１５０において説明されている）と称するプラスミド内へとクローニングした。標準的なプロトコール（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１））に従い、前述の手順を実施した。真核細胞内において該構築物を発現させるため、ヌクレオチド配列を検証したクローンをＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞内へとトランスフェクトした。ＫａｕｆｍａｎｎＲ．Ｊ．（１９９０）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５、５３７〜５６６により説明される通り、ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞内において、真核細胞内のタンパク質発現を実施した。メトトレキサート（ＭＴＸ）濃度を、最高２０ｎＭ  ＭＴＸの最終濃度まで上昇させることにより、該構築物の遺伝子増幅を誘導した。
【０５３１】
２６．３．Ｃ−ＭＥＴおよびＣＤ３に対する異種間特異的二重特異性単鎖分子の作製
異種間特異的結合分子のクローニング
一般に、各々が、ヒト、および非チンパンジー霊長動物のＣＤ３イプシロンに対して異種間特異的な結合特異性を有するドメイン、ならびにＣ−ＭＥＴに対して結合特異性を有するドメインを含む二重特異性単鎖抗体分子を、以下の表９に示す通りにデザインした。
【０５３２】
【表９】
2018064565.tif 000012
【０５３３】
遺伝子合成により、Ｃ−ＭＥＴに対して特異的な軽鎖（Ｌ）可変ドメインおよび重鎖（Ｈ）可変ドメインと、ヒトＣＤ３およびマカクザルＣＤ３に対して異種間特異的なＣＤ３特異性ＶＨおよびＣＤ３特異性ＶＬの組合せとを含有する前述の構築物を得た。ＭＣＳＰ×ＣＤ３異種間特異的単鎖分子について実施例９で説明した手順と同様に、遺伝子合成断片をデザインし、真核細胞内のタンパク質発現を実施した。ＭＣＳＰ×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体について本明細書の上記で説明した通り、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＨＥＫ２９３細胞内において、二重特異性単鎖抗体分子を発現させた。
【０５３４】
発現させた二重特異性単鎖抗体の単離および解析については、本明細書上記の実施例９でも説明した。
【０５３５】
図５５に示す通り、作製した異種間特異的二重特異性単鎖抗体構築物のすべては、マカクザルｃＭＥＴ陽性標的細胞に対して、マカクザルＴ細胞株である４１１９ＬｎＰｘにより誘発される細胞傷害活性を示した。
【０５３６】
２６．５．フローサイトメトリーによる、Ｃ−ＭＥＴおよびＣＤ３に対する異種間特異的二重特異性抗体の結合についての解析
Ｃ−ＭＥＴ、ならびにヒトＣＤ３およびマカクザルＣＤ３に結合する能力に関して、異種間特異的二重特異性抗体構築物の機能性を調べるため、ＦＡＣＳ解析を実施した。この目的のために、ヒトＣ−ＭＥＴ陽性乳癌細胞株であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＡＴＣＣ受託番号ＨＴＢ−２６）、また、ヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞白血病細胞株であるＨＰＢ−ＡＬＬ（ブラウンシュヴァイク、ＤＳＭＺ社製、ＡＣＣ４８３）を用いて、ヒト抗原に対する結合について調べた。マカクザルＣＤ３に対する結合反応性は、マカクザルＴ細胞株である４１１９ＬｎＰｘ（エアランゲン−ニュルンベルグ、衛生研究所、ウイルス学部門、Ｆｉｃｋｅｎｓｃｈｅｒ教授による恵与；Ｋｎａｐｐｅ  Ａら、およびＦｉｃｋｅｎｓｃｈｅｒ  Ｈ．、Ｂｌｏｏｄ  ２０００、９５、３２５６〜６１において公表されている）を用いることにより調べた。各細胞株２００，０００個ずつを、異種間特異的二重特異性抗体構築物を発現するトランスフェクト細胞による５０μｌの細胞培養物上清と共に、氷上において３０分間にわたりインキュベートした。２％ＦＣＳを伴うＰＢＳ中で２回にわたり細胞を洗浄し、マウスペンタＨｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ社製；２％ＦＣＳを伴う５０μｌのＰＢＳ中で１：２０に希釈）により、構築物の結合を検出した。洗浄後、２％ＦＣＳを伴うＰＢＳ中において１：１００に希釈した、フィコエリトリンにコンジュゲートさせたＦｃガンマ特異性抗体（Ｄｉａｎｏｖａ社製）により、結合した抗Ｈｉｓ抗体を検出した。トランスフェクトされなかった細胞を、陰性対照として用いた。
【０５３７】
ＦＡＣＳ−Ｃａｌｉｂｕｒ装置上において、フローサイトメトリーを実施し、Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔソフトウェアを用いてデータを取り込み、解析した（ハイデルベルク、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）。「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（Ｃｏｌｉｇａｎ、Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ、Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ、Ｓｈｅｖａｃｈ、およびＳｔｒｏｂｅｒ、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、２００２）において説明される通りに、ＦＡＣＳによる染色および蛍光強度の測定を実施した。
【０５３８】
図５２に示す通り、Ｃ−ＭＥＴに対して特異的であり、また、ヒトＣＤ３および非チンパンジー霊長動物のＣＤ３に対して異種間特異的な、上記で列挙した単鎖分子による二重特異性結合が明確に検出された。ＦＡＣＳ解析において、すべての構築物は、陰性対照と比較して、ＣＤ３およびＣ−ＭＥＴに対する結合を示した。ヒトＣＤ３およびマカクザルＣＤ３に対する二重特異性抗体の異種間特異性が裏付けられた。
【０５３９】
２６．６．Ｃ−ＭＥＴおよびＣＤ３に対する異種間特異的二重特異性単鎖抗体の生体活性
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏクロム５１（５１Ｃｒ）放出細胞傷害作用アッセイにより、作製した二重特異性単鎖抗体の生体活性を解析した。エフェクター細胞としては、刺激ヒトＣＤ４／ＣＤ５６枯渇ＰＢＭＣを用いた。
【０５４０】
刺激ヒトＰＢＭＣの作製については、本明細書上記の実施例１１において説明した。実施例１１において、ＭＣＳＰ×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体について説明した手順と同様に、標的細胞を調製し、アッセイを実施した。
【０５４１】
図５３に示す通り、作製した異種間特異的二重特異性単鎖抗体構築物のすべては、Ｃ−ＭＥＴ陽性標的細胞に対して、刺激ヒトＣＤ４／ＣＤ５６枯渇ＰＢＭＣにより誘発される細胞傷害活性を示した。
【０５４２】
２６．７．Ｃ−ＭＥＴおよびＣＤ３に対して異種間特異的な、さらなる二重特異性単鎖分子の作製
ヒト生殖細胞系列抗体のＶＨ配列であるＶＨ１ １−０３（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）を、ＣＤＲＨ１（配列番号８２１）、ＣＤＲＨ２（配列番号８２２）、およびＣＤＲＨ３（配列番号８２３）のフレームワーク環境として選択する。同様に、ヒト生殖細胞系列抗体のＶＨ配列であるＶＨ１  １−４６（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）を、ＣＤＲＨ１（配列番号８３６）、ＣＤＲＨ２（配列番号８３７）、およびＣＤＲＨ３（配列番号８３８）のフレームワーク環境として選択する。各ヒトＶＨには、末端の約１５〜２０ヌクレオチドの連なりにおいて重複する複数の縮退オリゴヌクレオチドを合成しなければならない。この目的に適う第２のプライマーはいずれも、アンチセンスプライマーである。ＶＨ１  １−０３には、以下のオリゴヌクレオチド：
５’ＣＭ１−ＶＨ−Ａ−ＸｈｏＩ（配列番号７９０）
ＣＣＡ  ＴＧＴ  ＣＴＣ ＧＡＧ  ＴＣＴ  ＧＧＧ  ＳＣＴ  ＧＡＡ ＳＴＧ  ＲＷＧ  ＡＲＧ  ＣＣＴ  ＧＧＧ ＧＣＴ  ＴＣＡ  ＧＴＧ  ＡＡＡ  ＲＴＧ ＴＣＣ  ＴＧＣ  ＡＲＧ  ＧＣＴ  ＴＣＧ ＧＧＣ  ＴＡＴ  ＡＣＣ  ＴＴＣ
３’ＣＭ１−ＶＨ−Ｂ（配列番号７９１）
ＡＴ  ＣＣＡ  ＣＴＣ ＡＡＧ  ＣＣＹ  ＴＴＧ  ＴＣＣ  ＡＧＧ ＣＳＹ  ＣＴＧ  ＴＹＴ  ＡＡＣ  ＣＣＡ ＧＴＧ  ＣＡＡ  ＣＣＡ  ＧＴＡ  ＧＣＴ ＧＧＴ  ＧＡＡ  ＧＧＴ  ＡＴＡ  ＧＣＣ ＣＧＡ  ＡＧＣ
５’ＣＭ１−ＶＨ−Ｃ（配列番号７９２）
ＧＧ  ＣＴＴ  ＧＡＧ ＴＧＧ  ＡＴＫ  ＧＧＣ  ＡＴＧ  ＡＴＴ ＧＡＴ  ＣＣＴ  ＴＣＣ  ＡＡＴ  ＡＧＴ ＧＡＣ  ＡＣＴ  ＡＧＧ  ＴＴＴ  ＡＡＴ ＣＣＧ  ＡＡＣ  ＴＴＣ  ＡＡＧ  ＧＡＣ
３’ＣＭ１−ＶＨ−Ｄ（配列番号７９３）
ＧＣＴ  ＧＣＴ  ＧＡＧ ＣＷＳ  ＣＡＴ  ＧＴＡ  ＧＧＣ  ＴＧＴ ＧＹＴ  ＧＧＭ  ＡＧＡ  ＴＳＴ  ＧＴＣ ＴＭＹ  ＡＫＴ  ＳＡＷ  ＴＧＴ  ＧＲＣ ＣＹＴ  ＧＴＣ  ＣＴＴ  ＧＡＡ  ＧＴＴ ＣＧＧ  ＡＴＴ
５’ＣＭ１−ＶＨ−Ｅ（配列番号７９４）
ＧＣＣ  ＴＡＣ  ＡＴＧ ＳＷＡ  ＣＴＣ  ＡＧＣ  ＡＧＣ  ＣＴＧ ＡＳＡ  ＴＣＴ  ＧＭＧ  ＧＡＣ  ＡＣＴ ＧＣＡ  ＧＴＣ  ＴＡＴ  ＴＡＣ  ＴＧＴ ＧＣＣ  ＡＳＡ  ＴＡＴ  ＧＧＴ  ＡＧＣ ＴＡＣ  ＧＴＴ
３’ＣＭ１−ＶＨ−Ｆ−ＢｓｔＥＩＩ（配列番号７９５）
ＣＡＴ  ＧＴＡ  ＧＧＴ ＧＡＣ  ＣＧＡ  ＧＧＴ  ＴＣＣ  ＴＴＧ ＡＣＣ  ＣＣＡ  ＧＴＡ  ＧＴＣ  ＣＡＧ ＡＧＧ  ＧＧＡ  ＡＡＣ  ＧＴＡ  ＧＣＴ ＡＣＣ  ＡＴＡ  を用いる。ＶＨ１  １−４６のオリゴヌクレオチドとしては、以下：
５’ＣＭ３−ＶＨ−Ａ−ＸｈｏＩ（配列番号７９６）
ＣＣＡ  ＴＧＴ  ＣＴＣ ＧＡＧ  ＴＣＴ  ＧＧＧ  ＲＣＴ  ＧＡＡ ＳＴＧ  ＲＷＧ  ＡＡＧ  ＣＣＴ  ＧＧＧ ＧＣＴ  ＴＣＡ  ＧＴＧ  ＡＡＧ  ＳＴＧ ＴＣＣ  ＴＧＣ  ＡＡＧ  ＧＣＴ  ＴＣＴ
３’ＣＭ３−ＶＨ−Ｂ（配列番号７９７）
ＣＴＣ  ＡＡＧ  ＧＣＣ ＴＴＧ  ＴＣＣ  ＡＧＧ  ＣＳＹ  ＣＴＧ ＣＹＴ  ＣＡＣ  ＣＣＡ  ＧＴＧ  ＴＡＴ ＣＣＡ  ＧＴＡ  ＡＣＴ  ＧＧＴ  ＧＡＡ ＧＧＴ  ＧＴＡ  ＧＣＣ  ＡＧＡ  ＡＧＣ ＣＴＴ  ＧＣＡ  ＧＧＡ
５’ＣＭ３−ＶＨ−Ｃ（配列番号７９８）
ＣＣＴ  ＧＧＡ  ＣＡＡ ＧＧＣ  ＣＴＴ  ＧＡＧ  ＴＧＧ  ＡＴＫ ＧＧＡ  ＧＡＧ  ＡＴＴ  ＡＡＴ  ＣＣＴ ＡＧＣ  ＡＧＣ  ＧＧＴ  ＣＧＴ  ＡＣＴＡ  ＡＣ  ＴＡＣ ＡＡＣ  ＧＡＧ  ＡＡＡ  ＴＴＣ
３’ＣＭ３−ＶＨ−Ｄ（配列番号７９９）
Ｃ ＴＧＴ  ＧＧＡ  ＧＧＴ  ＡＧＡ  ＴＫＴ ＧＴＣ  ＴＭＹ  ＡＧＴ  ＣＡＹ  ＴＧＴ ＧＡＣ  ＣＹＴ  ＧＴＴ  ＣＴＴ  ＧＡＡ ＴＴＴ  ＣＴＣ  ＧＴＴ  ＧＴＡ  ＧＴＴ
５’ＣＭ３−ＶＨ−Ｅ（配列番号８００）
Ａ ＴＣＴ  ＡＣＣ  ＴＣＣ  ＡＣＡ  ＧＹＣ ＴＡＣ  ＡＴＧ  ＳＡＡ  ＣＴＣ  ＡＧＣ ＡＲＣ  ＣＴＧ  ＡＳＡ  ＴＣＴ  ＧＡＧ ＧＡＣ  ＡＣＴ  ＧＣＧ  ＧＴＣ  ＴＡＴ ＴＡＣ  ＴＧＴ  ＧＣＡ
３’ＣＭ３−ＶＨ−Ｆ−ＢｓｔＥＩＩ（配列番号８０１）
ＣＡＴ  ＧＴＡ  ＧＧＴ ＧＡＣ  ＣＧＴ  ＧＧＴ  ＧＣＣ  ＴＴＧ ＧＣＣ  ＣＣＡ  ＧＴＡ  ＧＣＣ  ＣＣＴ ＷＣＴ  ＴＧＣ  ＡＣＡ  ＧＴＡ  ＡＴＡ ＧＡＣ  ＣＧＣ  を用いる。これらのプライマーセットの各々は、対応するＶＨ配列全体にわたる。
【０５４３】
各セット内ではプライマーを等量で混合し（例えば、２０μｌのＰＣＲ反応物に対して１μｌずつの各プライマー（２０〜１００μＭのプライマー原液））、ＰＣＲ緩衝液、スクレオナド、およびＴａｑポリメラーゼからなるＰＣＲ混合物に添加する。この混合物を、ＰＣＲサイクラー内において、９４℃で３分間、６５℃で１分間、６２℃で１分間、５９℃で１分間、５６℃で１分間、５２℃で１分間、５０℃で１分間、また、７２℃で１０分間にわたりインキュベートする。その後、標準的な方法により、該産物を、アガロースゲル電気泳動において泳動させ、該ゲルから、２００〜４００のサイズの産物を単離する。
【０５４４】
次いで、各ＶＨ  ＰＣＲ産物を、Ｎ末端およびＣ末端において適切なクローニング制限部位を組み込むプライマーを用いる、標準的なＰＣＲ反応の鋳型として用いる。標準的な方法に従うアガロースゲル電気泳動により、適正なサイズ（ＶＨの場合、約３５０ヌクレオチド）のＤＮＡ断片を単離する。この方法で、十分なＶＨ  ＤＮＡ断片を増幅する。
【０５４５】
ヒト生殖細胞系列抗体のＶＬ配列であるＶｋＩＩ Ｏ１１（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）を、ＣＤＲＬ１（配列番号８１６）、ＣＤＲＬ２（配列番号８１７）、およびＣＤＲＬ３（配列番号８１８）のフレームワーク環境として選択する。同様に、ヒト生殖細胞系列抗体のＶＬ配列であるＶｋＩＩ  Ａ１（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）を、ＣＤＲＬ１（配列番号８３３）、ＣＤＲＬ２（配列番号８３４）、およびＣＤＲＬ３（配列番号８３５）のフレームワーク環境として選択する。各ヒトＶＬには、末端の約１５〜２０ヌクレオチドの連なりにおいて重複する複数の縮退オリゴヌクレオチドを合成しなければならない。この目的に適う第２のプライマーはいずれも、アンチセンスプライマーである。オリゴヌクレオチド内における、その後のクローニングに必要とされる制限部位は欠失させる。ＶｋＩＩ  Ｏ１１には、以下のオリゴヌクレオチド：
５’ＣＭ１−ＶＬ−Ａ−ＳａｃＩ（配列番号８０２）
ＣＣＴ  ＧＴＡ  ＧＡＧ ＣＴＣ  ＧＴＧ  ＡＴＧ  ＡＣＣ  ＣＡＧ ＡＣＴ  ＣＣＡ  ＹＹＣ  ＴＣＣ  ＣＴＡ ＭＣＴ  ＧＴＧ  ＡＣＡ  ＳＹＴ  ＧＧＡ ＧＡＧ  ＭＭＧ  ＧＹＴ  ＴＣＴ  ＲＴＣ ＡＧＣ  ＴＧＣ  ＡＡＧ  ＴＣＣ  ＡＧＴ
３’ＣＭ１−ＶＬ−Ｂ（配列番号８０３）
ＧＴＡ  ＣＣＡ  ＧＧＣ ＣＡＡ  ＧＴＡ  ＧＴＴ  ＣＴＴ  ＣＴＧ ＡＣＴ  ＧＣＴ  ＡＧＴ  ＡＴＡ  ＴＡＡ ＡＡＧ  ＧＧＡ  ＣＴＧ  ＡＣＴ  ＧＧＡ ＣＴＴ  ＧＣＡ  ＧＣＴ  ＧＡ
５’ＣＭ１−ＶＬ−Ｃ（配列番号８０４）
ＴＡＣ  ＴＴＧ  ＧＣＣ ＴＧＧ  ＴＡＣ  ＣＷＧ  ＣＡＧ  ＡＡＡ ＣＣＡ  ＧＧＴ  ＣＡＧ  ＴＣＴ  ＣＣＴ ＭＡＡ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＡＴＴ  ＴＡＣ ＴＧＧ  ＧＣＡ  ＴＣＣ  ＡＣＴ  ＡＧＧ
３’ＣＭ１−ＶＬ−Ｄ（配列番号８０５）
ＧＡＧ  ＡＧＴ  ＧＡＡ ＡＴＣ  ＴＧＴ  ＣＣＣ  ＡＧＡ  ＴＣＣ ＡＣＴ  ＧＣＣ  ＴＧＡ  ＧＡＡ  ＧＣＧ ＡＴＣ  ＡＧＧ  ＧＡＣ  ＣＣＣ  ＡＧＡ ＴＴＣ  ＣＣ  ＴＡＧＴ  ＧＧＡ  ＴＧＣ ＣＣＡ  ＧＴＡ
５’ＣＭ１−ＶＬ−Ｅ（配列番号８０６）
ＡＣＡ  ＧＡＴ  ＴＴＣ ＡＣＴ  ＣＴＣ  ＡＭＡ  ＡＴＣ  ＴＣＣ ＡＧＷ  ＧＴＧ  ＲＡＧ  ＧＣＴ  ＧＡＳ ＧＡＣ  ＳＴＧ  ＧＳＡ  ＧＴＴ  ＴＡＴ ＴＡＣ  ＴＧＴ  ＣＡＧ  ＣＡＡ  ＴＡＴ
３’ＣＭ１−ＶＬ−Ｆ−ＢｓｉＷＩ／ＳｐｅＩ（配列番号８０７）
ＣＣＴ  ＣＡＧ  ＡＣＴ ＡＧＴ  ＣＧＴ  ＡＣＧ  ＴＴＴ  ＧＡＴ ＣＴＣ  ＣＡＡ  ＣＴＴ  ＴＧＴ  ＧＣＣ ＴＣＣ  ＡＣＣ  ＧＡＡ  ＣＧＴ  ＣＣＡ ＣＧＧ  ＡＴＡ  ＧＧＣ  ＡＴＡ  ＡＴＡ  ＴＴＧ ＣＴＧ  ＡＣＡ  ＧＴＡ  ＡＴＡ
を用いる。ＶｋＩＩ  Ａ１の場合、オリゴヌクレオチドは以下：
５’ＣＭ３−ＶＬ−Ａ−ＳａｃＩ（配列番号８０８）
ＣＣＴ  ＧＴＡ  ＧＡＧ ＣＴＣ  ＧＴＧ  ＡＴＧ  ＡＣＣ  ＣＡＡ ＴＣＴ  ＣＣＡ  ＳＹＴ  ＴＣＴ  ＴＴＧ ＳＣＴ  ＧＴＧ  ＡＣＴ  ＣＴＡ  ＧＧＧ ＣＡＧ  ＣＳＧ  ＧＣＣ  ＴＣＣ  ＡＴＣ ＴＣＣ  ＴＧＣ
３’ＣＭ３−ＶＬ−Ｂａ（配列番号８０９）
ＧＡＡ  ＣＣＡ  ＡＣＴ ＣＡＴ  ＡＴＡ  ＡＣＴ  ＡＣＣ  ＡＣＣ ＡＴＣ  ＡＴＡ  ＡＴＣ  ＡＡＣ  ＡＣＴ ＴＴＧ  ＧＣＴ  ＧＧＣ  ＣＴＴ  ＧＣＡ ＧＧＡ  ＧＡＴ  ＧＧＡ  ＧＧＣ
３’ＣＭ３−ＶＬ−Ｂｂ（配列番号８１０）
ＧＡＡ  ＣＣＡ  ＡＣＴ ＣＡＴ  ＡＴＡ  ＡＣＴ  ＡＣＣ  ＡＣＣ ＡＴＣ  ＡＴＡ  ＡＴＣ  ＡＡＣ  ＡＣＴ ＡＧＡ  ＴＴＧ  ＧＣＴ  ＧＧＣ  ＣＴＴ ＧＣＡ  ＧＧＡ  ＧＡＴ  ＧＧＡ  ＧＧＣ
５’ＣＭ３−ＶＬ−Ｃ（配列番号８１１）
ＡＧＴ  ＴＡＴ  ＡＴＧ ＡＧＴ  ＴＧＧ  ＴＴＣ  ＣＡＡ  ＣＡＧ ＡＧＡ  ＣＣＡ  ＧＧＡ  ＣＡＧ  ＹＣＡ ＣＣＣ  ＡＲＡ  ＣＫＣ  ＣＴＣ  ＡＴＣ ＴＭＴ  ＧＣＴ  ＧＣＡ  ＴＣＣ  ＡＡＴ ＣＴＡ
３’ＣＭ３−ＶＬ−Ｄ（配列番号８１２）
ＧＧＴ  ＧＡＡ  ＧＴＣ ＴＧＴ  ＣＣＣ  ＡＧＡ  ＧＣＣ  ＡＣＴ ＧＣＣ  ＡＣＴ  ＡＡＡ  ＣＣＴ  ＧＫＣ ＴＧＧ  ＧＡＹ  ＣＣＣ  ＡＧＡ  ＴＴＣ ＴＡＧ  ＡＴＴ  ＧＧＡ  ＴＧＣ  ＡＧＣ
５’ＣＭ３−ＶＬ−Ｅ（配列番号８１３）
ＴＣＴ  ＧＧＧ  ＡＣＡ ＧＡＣ  ＴＴＣ  ＡＣＣ  ＣＴＣ  ＡＡＫ ＡＴＣ  ＹＭＴ  ＣＳＴ  ＧＴＧ  ＧＡＧ ＧＭＧ  ＧＡＧ  ＧＡＴ  ＧＴＴ  ＧＳＡ ＲＹＣ  ＴＡＴ  ＴＡＣＴ  ＧＴ  ＣＡＧ ＣＡＡ  ＡＧＴ
３’ＣＭ３−ＶＬ−Ｆ−ＢｓｉＷＩ／ＳｐｅＩ（配列番号８１４）
ＣＣＴ  ＣＡＧ  ＡＣＴ ＡＧＴ  ＣＧＴ  ＡＣＧ  ＴＴＴ  ＧＡＴ ＣＴＣ  ＣＡＧ  ＣＴＴ  ＧＧＴ  ＣＣＣ ＣＴＧ  ＡＣＣ  ＧＡＡ  ＣＧＴ  ＧＡＧ  ＣＧＧ  ＡＴＣ  ＣＴＣ ＡＴＡ  ＡＣＴ  ＴＴＧ  ＣＴＧ  ＡＣＡ ＧＴＡ  ＡＴＡ
の通りである。これらのプライマーセットの各々は、対応するＶＬ配列全体にわたる。
【０５４６】
各セット内ではプライマーを等量で混合し（例えば、２０μｌのＰＣＲ反応物に対して１μｌずつの各プライマー（２０〜１００μＭのプライマー原液））、ＰＣＲ緩衝液、ヌクレオチド、およびＴａｑポリメラーゼからなるＰＣＲ混合物に添加する。この混合物を、ＰＣＲサイクラー内において、９４℃で３分間、６５℃で１分間、６２℃で１分間、５９℃で１分間、５６℃で１分間、５２℃で１分間、５０℃で１分間、また、７２℃で１０分間にわたりインキュベートする。その後、標準的な方法により、該産物を、アガロースゲル電気泳動において泳動させ、該ゲルから、２００〜４００のサイズの産物を単離する。
【０５４７】
次いで、各ＶＬ  ＰＣＲ産物を、Ｎ末端およびＣ末端において適切なクローニング制限部位を組み込むプライマーを用いる、標準的なＰＣＲ反応の鋳型として用いる。標準的な方法に従うアガロースゲル電気泳動により、適正なサイズ（ＶＬの場合、約３３０ヌクレオチド）のＤＮＡ断片を単離する。この方法で、十分なＶＬ  ＤＮＡ断片を増幅する。
【０５４８】
次いで、ファージディスプレイベクターであるｐＣｏｍｂ３Ｈ５Ｂｈｉｓ内において、ＶＨ１  １−０３に基づく最終ＶＨ  ＰＣＲ産物（すなわち、ヒト／ヒト化ＶＨのレパートリー）を、ＶｋＩＩ  Ｏ１１に基づく最終ＶＬ  ＰＣＲ産物（すなわち、ヒト／ヒト化ＶＬのレパートリー）と、また、ＶＨ１  １−４６に基づく最終ＶＨ  ＰＣＲ産物（すなわち、ヒト／ヒト化ＶＨのレパートリー）を、ＶｋＩＩ  Ａ１に基づく最終ＶＬ  ＰＣＲ産物（すなわち、ヒト／ヒト化ＶＬのレパートリー）と組み合わせ、そこから（線維状ファージ上における提示後に）抗Ｃ−ＭＥＴ結合剤が、以下の通りに、選択、スクリーニング、同定、および確認される、機能的ｓｃＦｖの２つの異なるライブラリーを形成する。
【０５４９】
４５０ｎｇの軽鎖断片（ＳａｃＩ−ＳｐｅＩにより消化した）を、１４００ｎｇのファージミドであるｐＣｏｍｂ３Ｈ５Ｂｈｉｓ（ＳａｃＩ−ＳｐｅＩにより消化した；大型断片）とライゲーションする。次いで、結果として得られる抗体組合せライブラリーを、電気穿孔（２．５ｋＶ、０．２ｃｍのギャップキュベット、２５μＦＤ、２００オーム：Ｂｉｏｒａｄ社製ジーンパルサー）により、３００μｌのエレクトロコンピテント大腸菌ＸＬ１  Ｂｌｕｅ細胞内へと形質転換し、その結果として、サイズが個別クローン１０７個を超えるライブラリーを得る。１時間にわたる表現型発現の後、陽性の形質転換体を、一晩にわたり、１００ｍｌの液体スーパーブロース（ＳＢ）培地中においてｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＨｉｓベクターによりコードされるカルベニシリン耐性について選択する。次いで、遠心分離により細胞を回収し、市販されるプラスミド調製キット（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて、プラスミド調製を実施する。
【０５５０】
ＶＬライブラリーを含有する、２８００ｎｇのこのプラスミドＤＮＡ（ＸｈｏＩ−ＢｓｔＥＩＩで消化した；大型断片）を、９００ｎｇの重鎖Ｖ断片（ＸｈｏＩ−ＢｓｔＥＩＩで消化した）とライゲーションし、再度、電気穿孔（２．５ｋＶ、０．２ｃｍのギャップキュベット、２５μＦＤ、２００オーム；Ｂｉｏｒａｄ社製ジーンパルサー）により、エレクトロコンピテント大腸菌ＸＬ１  Ｂｌｕｅ細胞による２つの３００μｌアリコート中へと形質転換し、その結果として、サイズが個別クローン１０７個を超える、全ＶＨ−ＶＬ  ｓｃＦｖ（単鎖可変断片）ライブラリーを得る。
【０５５１】
表現型を発現させ、カルベニシリンに対して緩徐に適応させた後で、抗体ライブラリーを含有する大腸菌細胞を、ＳＢ−カルベニシリン（５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンを伴うＳＢ）選択培地へと移す。次いで、抗体ライブラリーを含有する大腸菌細胞に、感染用量である１０１２個のヘルパーファージＶＣＳＭ１３粒子を感染させ、その結果として、線維状Ｍ１３ファージを生成および分泌させるが、この場合、各ファージ粒子は、ｓｃＦｖ断片をコードする一本鎖のｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＨｉｓ−ＤＮＡを含有し、ファージコートタンパク質ＩＩＩへの翻訳融合体として、対応するｓｃＦｖタンパク質を提示する。抗体ライブラリーを提示するこのファージプールを用いて、抗原結合実体を選択する。
【０５５２】
この目的のために、ＰＥＧ８０００／ＮａＣｌ沈殿および遠心分離により、個々の培養物上清から、クローニングされたｓｃＦｖレパートリーを保有するファージライブラリーを回収する。約１０１１〜１０１２個のｓｃＦｖファージ粒子を、０．４ｍｌのＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ中に再懸濁させ、緩徐に撹拌しながら、氷上で１時間にわたり、Ｃ−ＭＥＴをトランスフェクトした１０５〜１０７個のＣＨＯ細胞（実施例２６．１を参照されたい）と共にインキュベートする。これらのＣ−ＭＥＴをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を、あらかじめ遠心分離により回収し、ＰＢＳ中で洗浄し、ＰＢＳ／１％ＦＣＳ（Ｎａアジドを含有する）中に再懸濁させる。Ｃ−ＭＥＴをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に特異的に結合しないｓｃＦｖファージは、ＰＢＳ／１％ＦＣＳ（Ｎａアジドを含有する）を伴う最大５回にわたる洗浄ステップにより除去する。洗浄後、ｐＨ２．２のＨＣｌ−グリシン中で細胞を再懸濁させる（その後のボルテクシングを伴う１０分間にわたるインキュベーション）ことにより、細胞から結合実体を溶出させ、ｐＨ１２の２Ｍトリスにより中和させた後に、溶出物を用いて、新鮮な未感染の大腸菌ＸＬ１  Ｂｌｕｅ培養物に感染させる（ＯＤ６００＞０．５）。ヒト／ヒト化ｓｃＦｖ断片をコードするファージミドコピーの形質導入に成功した大腸菌細胞を含有する大腸菌培養物を、さらに、カルベニシリン耐性について選択し、その後、これにＶＣＭＳ  １３ヘルパーファージを感染させて、抗体ディスプレイおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける選択の第２ラウンドを開始させる。通常、計４〜５ラウンドにわたり選択を実施する。
【０５５３】
Ｃ−ＭＥＴに特異的な結合剤をスクリーニングするため、選択後、大腸菌培養物から、４〜５ラウンドのパニングに対応するプラスミドＤＮＡを単離する。可溶性のｓｃＦｖタンパク質を作製するため、プラスミドからＶＨ−ＶＬ−ＤＮＡ断片を切り出す（ＸｈｏＩ−ＳｐｅＩ）。発現構築物（すなわち、ｓｃＦｖ）が、ｓｃＦｖとＨｉｓ６タグとの間にＦｌａｇタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）を包含し、また、さらなるファージタンパク質が欠失されている点で、元のｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＨｉｓとは異なるプラスミドである、ｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＦｌａｇ／Ｈｉｓ内への同じ制限部位により、これらの断片をクローニングした。ライゲーション後、プラスミドＤＮＡの各プール（パニングのラウンドが異なる）を、熱ショックコンピテント大腸菌のＴＧ１株またはＸＬＩ  ｂｌｕｅ株１００μｌ中へと形質転換し、カルベニシリンＬＢ寒天上へと播種する。単一のコロニーを採取して、１００μｌのＬＢカルベニシリン（５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを伴うＬＢ）中へと播種する。
【０５５４】
ＶＬセグメントおよびＶＨセグメントを含有するｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＦｌａｇ／Ｈｉｓにより形質転換された大腸菌は、遺伝子ＩＩＩ断片を切除し、また、１ｍＭ  ＩＰＴＧにより誘導した後で、十分な量で可溶性のｓｃＦｖを生成する。適切なシグナル配列により、ｓｃＦｖはペリプラズム内へと移出され、そこで、機能的な立体構造へと折り畳まれる。
【０５５５】
小スケールのペリプラズム調製物用に、形質転換プレートから単一の大腸菌ＴＧ１株による細菌コロニーを採取し、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを補充したＳＢ培地（例えば、１０ｍｌ）中で培養する（また、回収後、ＰＢＳ（例えば、１ｍｌ）中に再溶解させる）。−７０℃における凍結および３７℃における融解の４ラウンドを介して温度ショックを適用し、これにより細菌の外膜を破壊し、ｓｃＦｖを包含する可溶性のペリプラズムタンパク質を上清中へと放出させる。遠心分離により、完全細胞および細胞破砕物を除去した後で、抗Ｃ−ＭＥＴ  ｓｃＦｖを含有する上清を回収し、以下のＣ−ＭＥＴ特異的結合剤の同定に用いる。
【０５５６】
Ｃ−ＭＥＴに対するｓｃＦｖの結合は、Ｃ−ＭＥＴをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞（実施例２４７．１を参照されたい）に対するフローサイトメトリーにより調べる；トランスフェクトされなかったＣＨＯ細胞を陰性対照として用いる。
【０５５７】
フローサイトメトリーのため、２．５×１０５個の細胞を、５０μｌのｓｃＦｖペリプラズム調製物、または２％ＦＣＳを伴う５０μｌのＰＢＳ中に５μｇ／ｍｌの精製ｓｃＦｖと共にインキュベートする。ｓｃＦｖの結合は、２％ＦＣＳを伴う５０μｌのＰＢＳ中に２μｇ／ｍｌの抗Ｈｉｓ抗体（ドイツ、ヒルデン、Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ社製、ＢＳＡ非含有、ペンタＨｉｓ抗体）により検出する。第２ステップの試薬として、アフィニティー精製Ｒ−フィコエリトリンコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃガンマ断片特異的）Ｆ（ａｂ’）２断片を、２％ＦＣＳ（ドイツ、ハンブルグ、Ｄｉａｎｏｖａ社製）を伴う５０μｌのＰＢＳ中において１：１００に希釈して用いた。試料は、ＦＡＣＳｓｃａｎ（ドイツ、ハイデルベルク、ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）上において測定する。
【０５５８】
次いで、好ましい特性およびアミノ酸配列について、単一のクローンを解析する。Ｇｌｙ４Ｓｅｒ１リンカーを介して、それらを、ＣＤ３特異性ｓｃＦｖであるＩ２Ｃ（配列番号１８５）、または本発明の他の任意のＣＤ３特異性ｓｃＦｖと接合することにより、Ｃ−ＭＥＴ特異的ｓｃＦｖを、組換え二重特異性単鎖抗体へと転換し、その結果として、例えば、ドメイン配列ＶＨＣ−ＭＥＴ−（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ１）３−ＶＬＣ−ＭＥＴ−Ｓｅｒ１Ｇｌｙ４Ｓｅｒ１−ＶＨＣＤ３−（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ１）３−ＶＬＣＤ３、または代替的なドメイン配列を伴う構築物を得る。ＣＨＯ細胞内において発現させるには、（ｉ）コンセンサスのコザック配列内に埋め込まれた開始コドンを含む、Ｎ末端における免疫グロブリン重鎖リーダーのコード配列、また、（ｉｉ）停止コドンを後続させる、Ｃ末端におけるＨｉｓ６タグのコード配列の両方を、二重特異性単鎖抗体をコードするヌクレオチド配列にインフレームで結合させた後で、遺伝子合成により結果として得られるＤＮＡ断片を、発現ベクターであるｐＥＦ−ＤＨＦＲ（Ｒａｕｍら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ５０（２００１）、１４１〜１５０）の多重クローニング部位内へと挿入する。実施例２６．３および２６．４で説明した通りに、作製した発現プラスミドのトランスフェクション、異種間特異的二重特異性抗体構築物によるタンパク質の発現および精製を実施する。他のすべての最新手順は、標準的なプロトコール（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１））に従い実施する。
【０５５９】
異種間特異的二重特異性抗体構築物を発現する、トランスフェクト細胞に由来する培養物上清に、フローサイトメトリーによる結合解析を施すことにより、機能的な二重特異性単鎖抗体構築物を同定する。解析は、実施例２６．５で説明した通りに実施するが、加えて、実施例２６．１および２６．２で説明した、Ｃ−ＭＥＴをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を用いる。
【０５６０】
ヒトＣＤ３およびマカクザルＣＤ３、ならびにＣ−ＭＥＴに対する二重特異性結合を示す構築物だけを、さらなる使用のために選択する。
【０５６１】
Ｃ−ＭＥＴ陽性標的細胞に対して、エフェクター細胞により誘発される、作製された異種間特異的二重特異性単鎖抗体構築物の細胞傷害活性は、実施例２６．６で説明した通りに解析するが、加えて、実施例２６．１および２６．２で説明した、Ｃ−ＭＥＴをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を標的細胞として用い、また、マカクザルＴ細胞株である４１１９ＬｎＰｘをエフェクター細胞として用いる。Ｃ−ＭＥＴ陽性細胞に対して、エフェクター細胞による細胞傷害活性を強力に動員する構築物だけを、さらなる使用のために選択する。
【実施例２７】
【０５６２】
２７．ｃＭＥＴおよびＣＤ３に対して異種間特異的な、さらなる二重特異性単鎖分子の作製および特徴づけ
２７．１．ヒトｃＭＥＴ細胞外ドメインの発現が増強ざれたＣＨＯ細胞、およびマカクザルｃＭＥＴ細胞外ドメインの発現が増強されたＣＨＯ細胞の作製
上記で説明した、ヒトｃＭＥＴおよびマカクザルｃＭＥＴの改変コード配列を用いて、ヒトｃＭＥＴおよびマカクザルｃＭＥＴそれぞれの細胞外ドメインによる、ヒトＥｐＣＡＭの切断変異体との融合タンパク質をコードする人工ｃＤＮＡ配列を構築した。これらのｃＭＥＴ融合タンパク質を発現させる構築物を作製するため、標準的なプロトコールに従う遺伝子合成により、ｃＤＮＡ断片を得た（該構築物のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、ヒトｃＭＥＴについては配列番号７６７および７７７に、また、マカクザルｃＭＥＴについては配列番号７８８および７８９に列挙する）。遺伝子合成断片は、まず、真核細胞内において該構築物を発現させるためのコザック部位、次いで、１９アミノ酸の免疫グロブリンリーダーペプチド、次いで、インフレームで、ヒトｃＭＥＴの細胞外ドメイン、およびマカクザルｃＭＥＴの細胞外ドメインにそれぞれ対応する、ヒトｃＭＥＴ成熟タンパク質、またはマカクザルｃＭＥＴ成熟タンパク質のアミノ酸１〜９０８のコード配列、次いで、インフレームで、人工によるＳｅｒ１−Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ１−Ｇｌｙ１リンカーのコード配列、次いで、インフレームで、ヒトＥｐＣＡＭの膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインのコード配列（ＧｅｎＢａｎｋで公表されている；受託番号ＮＭ＿００２３５４：バリンの代わりにイソロイシンを伴う、２７９位における点突然変異を除き、アミノ酸２６６〜３１４［開始コドンから数えて］）、ならびに終止コドンを含有するようにデザインした。遺伝子合成断片はまた、該断片の始点および終点において制限部位を導入するようにもデザインした。５’端においてＥｃｏＲＩ、また、３’端においてＳａｌＩの制限部位を導入し、以下のクローニング手順で用いた。標準的なプロトコールに従い、ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩを介して、遺伝子合成断片を、ｐＥＦ−ＤＨＦＲ（ｐＥＦ−ＤＨＦＲは、Ｒａｕｍら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ５０（２００１）、１４１〜１５０において説明されている）と称するプラスミド内へとクローニングした。真核細胞内において該構築物を発現させるため、ヌクレオチド配列を検証したクローンをＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞内へとトランスフェクトした。Ｋａｕｆｍａｎｎ  Ｒ．Ｊ．（１９９０）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５、５３７〜５６６により説明される通り、ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞内において、真核細胞内のタンパク質発現を実施した。メトトレキサート（ＭＴＸ）濃度を、最高２０ｎＭ  ＭＴＸの最終濃度まで上昇させることにより、該構築物の遺伝子増幅を誘導した。
【０５６３】
２７．２．ｃＭＥＴおよびＣＤ３に対する異種間特異的二重特異性単鎖分子の作製
異種間特異的結合分子のクローニング
ヒト、および非チンパンジー霊長動物のＣＤ３イプシロンに対して異種間特異的な結合特異性、ならびにヒト、および非チンパンジー霊長動物のｃＭＥＴに対して異種間特異的な結合特異性を有する二重特異性単鎖抗体分子を、以下の表１０に示す通りにデザインした。
【０５６４】
【表１０】
2018064565.tif 000013
【０５６５】
これらの異種間特異的二重特異性単鎖分子の作製、発現、および精製は、上記で説明した通りに実施した。
【０５６６】
フローサイトメトリーによる、ｃＭＥＴおよびＣＤ３に対する異種間特異的二重特異性抗体の結合についての解析は、上記で説明した通りに実施した。図５４に示す通り、ｃＭＥＴに対して異種間特異的であり、また、ヒト、および非チンパンジー霊長動物のＣＤ３に対して異種間特異的な、上記で列挙した単鎖分子による二重特異性結合が明確に検出された。ＦＡＣＳ解析において、すべての構築物は、陰性対照と比較して、ＣＤ３およびｃＭＥＴに対する結合を示した。ヒトおよびマカクザルのＣＤ３抗原およびｃＭＥＴ抗原に対する二重特異性抗体の異種間特異性が裏付けられた。ｉｎ  ｖｉｔｒｏクロム５１（５１Ｃｒ）放出細胞傷害作用アッセイによる生体活性の解析は、上記で説明した通りに実施する。裏付けられた異種間特異的な二重特異性結合、また、動員された細胞傷害作用に基づき、異種間特異的結合分子をさらなる使用のために選択する。
【０５６７】
２７．３．ｃＭＥＴに結合する異種間特異的単鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）の作製、また、フローサイトメトリーによるその結合についての解析
ｃＭＥＴに対して異種間特異的なｓｃＦｖを、上記で説明した通りに作製し、以下の表１１に示す通りに名づけた。
【０５６８】
【表１１】
2018064565.tif 000014
【０５６９】
上記で説明した通り、実施例２７．１で説明したヒトｃＭＥＴを発現するＣＨＯ細胞、および実施例２７．１で説明したマカクザルｃＭＥＴを発現するＣＨＯ細胞を用いて、フローサイトメトリーにより、ｃＭＥＴに対して異種間特異的なｓｃＦｖを含有するペリプラズム調製物の結合についての解析を実施した。図５６に示す通り、ｃＭＥＴに対して異種間特異的な、上記で列挙したｓｃＦｖによる結合が明確に検出された。ＦＡＣＳ解析において、すべての構築物は、陰性対照と比較して、ｃＭＥＴに対する結合を示した。ヒトｃＭＥＴ抗原およびマカクザルｃＭＥＴ抗原に対するｓｃＦｖ抗体の異種間特異性が裏付けられた。
【０５７０】
ｓｃＦｖに基づく異種間特異的結合分子のクローニング、ならびにこれらの異種間特異的二重特異性単鎖分子の発現および精製は、上記で説明した通りに実施する。フローサイトメトリーによる異種間特異的二重特異性結合の解析、また、ｉｎ  ｖｉｔｒｏクロム５１（５１Ｃｒ）放出細胞傷害作用アッセイによる生体活性の解析は、上記で説明した通りに実施する。裏付けられた異種間特異的な二重特異性結合、また、動員された細胞傷害作用に基づき、異種間特異的結合分子をさらなる使用のために選択する。
【０５７１】
選択された異種間特異的二重特異性単鎖分子中に含有される、ｃＭＥＴに対して異種間特異的な非ヒトｓｃＦｖのヒト／ヒト化同等物を、本明細書で説明した通りに作製する。これらのヒト／ヒト化ｓｃＦｖに基づく異種間特異的結合分子のクローニング、ならびにこれらの異種間特異的二重特異性単鎖分子の発現および精製は、上記で説明した通りに実施する。フローサイトメトリーによる異種間特異的二重特異性結合の解析、また、ｉｎ  ｖｉｔｒｏクロム５１（５１Ｃｒ）放出細胞傷害作用アッセイによる生体活性の解析は、上記で説明した通りに実施する。裏付けられた異種間特異的な二重特異性結合、また、動員された細胞傷害作用に基づき、異種間特異的結合分子をさらなる使用のために選択する。
【実施例２８】
【０５７２】
２８．エンドシアリンおよびＣＤ３に対する異種間特異的二重特異性単鎖抗体分子の作製および特徴づけ
２８．１．ヒトエンドシアリンを発現するＣＨＯ細胞の作製
標準的なプロトコールに従う遺伝子合成により、ＧｅｎＢａｎｋで公表されているヒトエンドシアリンのコード配列（受託番号ＮＭ＿０２０４０４）を得た。遺伝子合成断片は、まず、真核細胞内において該構築物を発現させるためのコザック部位、次いで、ヒトエンドシアリンのコード配列、次いで、インフレームで、ＦＬＡＧタグのコード配列、および停止コドンを含有するようにデザインした。（該構築物のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、配列番号９１３および９１４に列挙する）。遺伝子合成断片はまた、該断片の始点および終点において制限部位を導入するようにもデザインした。５’端においてＥｃｏＲＩ、また、３’端においてＳａｌＩの制限部位を導入し、以下のクローニング手順で用いた。標準的なプロトコールに従い、ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩを介して、遺伝子合成断片を、ｐＥＦ−ＤＨＦＲ（ｐＥＦ−ＤＨＦＲは、Ｒａｕｍら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ５０（２００１）、１４１〜１５０において説明されている）と称するプラスミド内へとクローニングした。標準的なプロトコール（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１））に従い、前述の手順を実施した。真核細胞内において該構築物を発現させるため、ヌクレオチド配列を検証したクローンをＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞内へとトランスフェクトした。Ｋａｕｆｍａｎｎ  Ｒ．Ｊ．（１９９０）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５、５３７〜５６６により説明される通り、ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞内において、真核細胞内のタンパク質発現を実施した。メトトレキサート（ＭＴＸ）濃度を、最高２０ｎＭ  ＭＴＸの最終濃度まで上昇させることにより、該構築物の遺伝子増幅を誘導した。
【０５７３】
２８．２．マカクザルエンドシアリンを発現するＣＨＯ細胞の作製
標準的なプロトコールに従い調製されたマカクザル（カニクイザル）の結腸に由来するｃＤＮＡに対する２つのＰＣＲセットにより、マカクザルエンドシアリンのｃＤＮＡ配列を得た。以下の反応条件：９５℃で５分間にわたる１サイクル、次いで、９５℃で４５秒間、５０℃で４５秒間、また、７２℃で２分間にわたる４０サイクル、次いで、７２℃で５分間にわたる最終サイクル、および以下のプライマーを第１のプライマーに用いた：
順方向プライマー：５’−ａｔａｔｇａａｔｔｃｇｃｃａｃｃａｔｇｃｔｇｃｔｇｃｇｃｃｔｇｔｔｇｃｔｇｇｃｃ−３’：配列番号９１７
逆方向プライマー：５’−ｇｔｃｔｔｃａｔｃｔｔｃｃｔｃａｔｃｃｔｃｃｃｃ−３’：配列番号９１８
以下の反応条件：９５℃で５分間にわたる１サイクル、次いで、９５℃で４５秒間、５８℃で４５秒間、また、７２℃で２分間にわたる４０サイクル、次いで、７２℃で５分間にわたる最終サイクル、および以下のプライマーを第２のプライマーに用いた：
順方向プライマー：５’−ｇｔｃａａｃｔａｃｇｔｔｇｇｔｇｇｃｔｔｃｇａｇｔｇ−３’：配列番号９１９
逆方向プライマー：５’−ｇｇｔｃｔａｇａｔｃａｃｔｔａｔｃｇｔｃａｔｃａｔｃｔｔｔｇｔａｇｔｃｃａｃｇｃｔｇｇｔｔｃｔｇｃａｇｇｔｃｔｇｃ−３’：配列番号９２０
【０５７４】
ＰＣＲ反応は、１Ｍの最終濃度に、ＰＣＲグレードのベタインを添加することにより実施した。これらのＰＣＲにより、該ＰＣＲプライマーを用いる標準的なプロトコールに従い単離および配列決定される２つの重複する断片が生成され、これにより、その成熟タンパク質のリーダーペプチドのコドン９からコドン７３３までにわたる、マカクザルエンドシアリンをコードするｃＤＮＡ配列の部分がもたらされた。マカクザルエンドシアリンを発現させる構築物を作製するため、標準的なプロトコールに従う遺伝子合成により、ｃＤＮＡ断片を得た（該構築物のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、配列番号９１５および９１６に列挙する）。この構築物では、その成熟タンパク質のリーダーペプチドのアミノ酸９からアミノ酸７３３までにわたる、マカクザルエンドシアリンのコード配列、次いで、インフレームで、成熟ヒトエンドシアリンタンパク質のアミノ酸７３４から最後のアミノ酸にわたるコード配列、次いで、インフレームで、ＦＬＡＧタグのコード配列、および終止コドンを、ヒトエンドシアリンタンパク質リーダーペプチドのアミノ酸１〜８のコード配列へとインフレームで融合した。遺伝子合成断片はまた、真核細胞内において該構築物を発現させるためのコザック部位、また、該ｃＤＮＡを含有する断片の始点および終点において制限部位を含有するようにもデザインした。５’端においてＥｃｏＲＩ、また、３’端においてＳａｌＩの制限部位を導入し、以下のクローニング手順で用いた。標準的なプロトコールに従い、ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩを介して、遺伝子合成断片を、ｐＥＦ−ＤＨＦＲ（ｐＥＦ−ＤＨＦＲは、Ｒａｕｍら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ５０（２００１）、１４１〜１５０において説明されている）と称するプラスミド内へとクローニングした。標準的なプロトコール（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１））に従い、前述の手順を実施した。真核細胞内において該構築物を発現させるため、ヌクレオチド配列を検証したクローンをＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞内へとトランスフェクトした。ＫａｕｆｍａｎｎＲ．Ｊ．（１９９０）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５、５３７〜５６６により説明される通り、ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞内において、真核細胞内のタンパク質発現を実施した。メトトレキサート（ＭＴＸ）濃度を、最高２０ｎＭ  ＭＴＸの最終濃度まで上昇させることにより、該構築物の遺伝子増幅を誘導した。
【０５７５】
２８．３．エンドシアリンに対するｓｃＦｖ抗体断片の異種間特異的結合
標準的なプロトコールに従う遺伝子合成により、ｓｃＦｖ抗体断片のｃＤＮＡを得た。発現構築物（例えば、ｓｃＦｖ）が、ｓｃＦｖとＨｉｓ６タグとの間にＦｌａｇタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ；配列番号９３３）を包含し、また、さらなるファージタンパク質が欠失されている点で、元のｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＨｉｓ（以下に記載される）とは異なるプラスミドである、ｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＦｌａｇ／Ｈｉｓ内への適切な制限部位により、ｃＤＮＡの断片をクローニングした。ライゲーション後、プラスミドＤＮＡの配列を検証したクローンを、熱ショックコンピテント大腸菌のＴＧ１株またはＸＬＩ  ｂｌｕｅ株１００μｌ中へと形質転換し、カルベニシリンＬＢ寒天上へと播種した。単一のコロニーを採取して、１００μｌのＬＢカルベニシリン（５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを伴うＬＢ）中へと播種した。
【０５７６】
１ｍＭ  ＩＰＴＧによる誘導の後、異種間特異的単鎖抗体のコード配列を含有するｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＦｌａｇ／Ｈｉｓにより形質転換された大腸菌は十分な量で可溶性のｓｃＦｖを生成した。適切なシグナル配列により、ｓｃＦｖはペリプラズム内へと移出され、そこで、機能的な立体構造へと折り畳まれる。
【０５７７】
小スケールのペリプラズム調製物用に、形質転換プレートから単一の大腸菌株による細菌コロニーを採取し、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを補充したＳＢ培地（例えば、１０ｍｌ）中で培養した（また、回収後、ＰＢＳ（例えば、１ｍｌ）中に再溶解させた）。−７０℃における凍結および３７℃における融解の４ラウンドを介して温度ショックを適用したが、これにより細菌の外膜を破壊し、ｓｃＦｖを包含する可溶性のペリプラズムタンパク質を上清中へと放出させる。遠心分離により、完全細胞および細胞破砕物を除去した後で、ｓｃＦｖ抗体断片を含有する上清を回収し、実施例２８．１で説明したヒトエンドシアリンをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞、また、実施例２８．２で説明したマカクザルエンドシアリンのトランスフェクタントを伴う、その後のフローサイトメトリーによる結合解析で用いた。
【０５７８】
この目的のために、各細胞株２００，０００個ずつを、異種間特異的単鎖抗体を含有する５０μｌのペリプラズム調製物と共に、氷上において３０分間にわたりインキュベートした。２％ＦＣＳを伴うＰＢＳ中で２回にわたり細胞を洗浄し、マウスペンタＨｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ社製；２％ＦＣＳを伴う５０μｌのＰＢＳ中で１：２０に希釈）により、構築物の結合を検出した。洗浄後、２％ＦＣＳを伴うＰＢＳ中において１：１００に希釈した、フィコエリトリンにコンジュゲートさせたＦｃガンマ特異性抗体（Ｄｉａｎｏｖａ社製）により、結合した抗Ｈｉｓ抗体を検出した。トランスフェクトされなかったＣＨＯ細胞の上清を、Ｔ細胞株に対する結合についての陰性対照として用いた。
【０５７９】
ＦＡＣＳ−Ｃａｌｉｂｕｒ装置上において、フローサイトメトリーを実施した；ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを用いてデータを取り込み、解析した（ハイデルベルク、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）。「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（Ｃｏｌｉｇａｎ、Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ、Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ、Ｓｈｅｖａｃｈ、およびＳｔｒｏｂｅｒ、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、２００２）において説明される通りに、ＦＡＣＳによる染色および蛍光強度の測定を実施した。
【０５８０】
図４６に示す通り、陰性対照と比較して、ヒトエンドシアリンおよびマカクザルエンドシアリンの両方に対するｓｃＦｖ抗体断片の特異的結合を裏付けることができた。
【０５８１】
２８．４．エンドシアリンおよびＣＤ３に対する異種間特異的二重特異性単鎖分子の作製  ヒト生殖細胞系列抗体のＶＨ配列であるＶＨ１  １−０３（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）を、ＣＤＲＨ１（配列番号９１０）、ＣＤＲＨ２（配列番号９１１）、およびＣＤＲＨ３（配列番号９１２）のフレームワーク環境として選択する。ヒトＶＨには、末端の約１５〜２０ヌクレオチドの連なりにおいて重複する複数の縮退オリゴヌクレオチドを合成しなければならない。この目的に適う第２のプライマーはいずれも、アンチセンスプライマーである。ＶＨ１  １−０３には、以下のオリゴヌクレオチドのセット：
５’ＥＤ−ＶＨ−Ａ−ＸｈｏＩ
ＣＣＡ  ＧＣＴ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＴＣＡ  ＧＧＡ  ＳＣＴ  ＧＡＧ  ＳＴＧ  ＲＷＧ  ＡＡＧ  ＣＣＴ  ＧＧＧ  ＧＣＴ  ＴＣＡ  ＧＴＧ  ＡＡＧ  ＲＴＧ  ＴＣＣ  ＴＧＣ  ＡＡＧ  ＧＣＴ  ＴＣＴ  ＧＧＡ  ＴＡＣ  ＡＣＡ  ＴＴＣ  ＡＣＴ  配列番号９２１
３’ＥＤ−ＶＨ−Ｂ
ＡＡＴ  ＡＴＡ  ＴＣＣ  ＭＡＴ  ＣＣＡ  ＣＴＣ  ＡＡＧ  ＧＣＫ  ＣＴＫ  ＴＣＣ  ＡＫＫ  ＴＳＹ  ＣＴＧ  ＣＹＴ  ＣＡＹ  ＣＣＡ  ＧＴＧ  ＴＡＴ  ＡＡＣ  ＡＴＡ  ＧＴＣ  ＡＧＴ  ＧＡＡ  ＴＧＴ  ＧＴＡ  ＴＣＣ  ＡＧＡ  配列番号９２２
５’ＥＤ−ＶＨ−Ｃ
ＣＴＴ  ＧＡＧ  ＴＧＧ  ＡＴＫ  ＧＧＡ  ＴＡＴ  ＡＴＴ  ＡＡＴ  ＣＣＴ  ＴＡＴ  ＧＡＴ  ＧＡＴ  ＧＡＴ  ＡＣＴＡ  ＣＣ  ＴＡＣ  ＡＡＣ  ＣＡＧ  ＡＡＧ  ＴＴＣ  ＡＡＧ  ＧＧＣ    配列番号９２３
３’ＥＤ−ＶＨ−Ｄ
Ｔ  ＧＡＧ  ＣＴＳ  ＣＡＴ  ＧＴＡ  ＧＧＣ  ＴＧＴ  ＧＹＴ  ＧＧＭ  ＧＧＡ  ＴＫＴ  ＧＷＣ  ＴＭＳ  ＡＧＴ  ＭＡＷ  ＴＧＴ  ＧＲＣ  ＣＹＧ  ＧＣＣ  ＣＴＴ  ＧＡＡ  ＣＴＴ  ＣＴＧ  ＧＴＴ  配列番号９２４
５’ＥＤ−ＶＨ−Ｅ
Ｃ  ＡＣＡ  ＧＣＣ  ＴＡＣ  ＡＴＧ  ＳＡＡ  ＣＴＣ  ＡＲＣ  ＡＧＣ  ＣＴＧ  ＡＳＡ  ＴＣＴ  ＧＡＧ  ＧＡＣ  ＡＣＴ  ＧＣＡ  ＧＴＣ  ＴＡＴ  ＴＡＣ  ＴＧＴ  ＧＣＡ  ＡＧＡ  ＡＧＧ  ＧＧＧ  配列番号９２５
３’ＥＤ−ＶＨ−Ｆ−ＢｓｔＥＩＩ
ＣＣＴ  ＧＡＴ  ＧＧＴ  ＧＡＣ  ＣＡＡ  ＧＧＴ  ＴＣＣ  ＴＴＧ  ＡＣＣ  ＣＣＡ  ＧＴＡ  ＧＴＣ  ＣＡＴ  ＡＧＡ  ＡＴＡ  ＧＴＣ  ＧＡＡ  ＧＴＡ  ＡＣＣ  ＡＴＣ  ＡＴＡ  ＧＧＡ  ＧＴＴ  ＣＣＣ  ＣＣＴ  ＴＣＴ  ＴＧＣ  ＡＣＡ  ＧＴＡ    配列番号９２６
を用いる。このプライマーセットは、対応するＶＨ配列全体にわたる。
【０５８２】
該セット内ではプライマーを等量で混合し（例えば、２０μｌのＰＣＲ反応物に対して１μｌずつの各プライマー（２０〜１００μＭのプライマー原液））、ＰＣＲ緩衝液、ヌクレオチド、およびＴａｑポリメラーゼからなるＰＣＲ混合物に添加する。この混合物を、ＰＣＲサイクラー内において、９４℃で３分間、６５℃で１分間、６２℃で１分間、５９℃で１分間、５６℃で１分間、５２℃で１分間、５０℃で１分間、また、７２℃で１０分間にわたりインキュベートする。その後、標準的な方法により、該産物を、アガロースゲル電気泳動において泳動させ、該ゲルから、２００〜４００のサイズの産物を単離する。
【０５８３】
次いで、該ＶＨ  ＰＣＲ産物を、Ｎ末端およびＣ末端において適切なクローニング制限部位を組み込むプライマーを用いる、標準的なＰＣＲ反応の鋳型として用いる。標準的な方法に従うアガロースゲル電気泳動により、適正なサイズ（ＶＨの場合、約３５０ヌクレオチド）のＤＮＡ断片を単離する。この方法で、十分なＶＨ  ＤＮＡ断片を増幅する。
【０５８４】
ヒト生殖細胞系列抗体のＶＬ配列であるＶｋＩ Ｌ８（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）を、ＣＤＲＬ１（配列番号９０７）、ＣＤＲＬ２（配列番号９０８）、およびＣＤＲＬ３（配列番号９０９）のフレームワーク環境として選択する。ヒトＶＬには、末端の約１５〜２０ヌクレオチドの連なりにおいて重複する複数の縮退オリゴヌクレオチドを合成しなければならない。この目的に適う第２のプライマーはいずれも、アンチセンスプライマーである。オリゴヌクレオチド内における、その後のクローニングに必要とされる制限部位は欠失させる。ＶｋＩ  Ｌ８には、以下のオリゴヌクレオチド：
５’ＥＤ−ＶＬ−Ａ−ＳａｃＩ
ＣＣＡ  ＧＴＣ  ＧＡＧ  ＣＴＣ  ＣＡＧ  ＣＴＧ  ＡＣＣ  ＣＡＧ  ＴＣＴ  ＣＭＡ  ＡＲＭ  ＴＴＣ  ＭＴＧ  ＴＣＣ  ＲＣＡ  ＴＣＡ  ＧＴＡ  ＧＧＡ  ＧＡＣ  ＡＧＡ  ＧＴＣ  ＮＮＳ  ＡＴＣ  ＡＣＣ  ＴＧＣ  ＡＧＧ  ＧＣＣ  ＡＧ（配列番号９２７）
３’ＥＤ−ＶＬ−Ｂ
ＴＣＣ  ＴＧＧ  ＴＴＴ  ＣＴＧ  ＴＴＧ  ＡＴＡ  ＣＣＡ  ＧＧＣ  ＴＡＣ  ＡＧＣ  ＡＧＴ  ＡＣＣ  ＣＡＣ  ＡＴＴ  ＣＴＧ  ＡＣＴ  ＧＧＣ  ＣＣＴ  ＧＣＡ  ＧＧＴ  ＧＡＴ（配列番号９２８）
５’ＥＤ−ＶＬ−Ｃ
ＴＡＴ  ＣＡＡ  ＣＡＧ  ＡＡＡ  ＣＣＡ  ＧＧＡ  ＭＡＡ  ＫＣＣ  ＣＣＴ  ＡＡＡ  ＴＴＡ  ＣＴＧ  ＡＴＴ  ＴＡＣＴ  ＣＧ  ＧＣＡ  ＴＣＧ  ＡＡＴ  ＣＧＧ  ＴＡＣ  ＡＣＴ  ＧＧＡ  ＧＴＣ  ＣＣＴ（配列番号９２９）
３’ＥＤ−ＶＬ−Ｄ
ＧＣＴ  ＧＡＴ  ＧＧＴ  ＧＡＧ  ＡＧＴ  ＧＡＡ  ＭＴＣ  ＴＧＴ  ＣＣＣ  ＡＧＡ  ＴＣＣ  ＡＣＴ  ＧＣＣ  ＴＧＡ  ＧＡＡ  ＧＣＧ  ＡＹＹ  ＡＧＧ  ＧＡＣ  ＴＣＣ  ＡＧＴ  ＧＴＡ  ＣＣＧ（配列番号９３０）
５’ＥＤ−ＶＬ−Ｅ
ＴＴＣ  ＡＣＴ  ＣＴＣ  ＡＣＣ  ＡＴＣ  ＡＧＣ  ＡＲＴ  ＭＴＧ  ＣＡＧ  ＹＣＴ  ＧＡＡ  ＧＡＣ  ＹＴＳ  ＧＣＡ  ＲＭＴ  ＴＡＴ  ＴＷＣ  ＴＧＣ  ＣＡＧ  ＣＡＡ  ＴＡＴ  ＡＣＣ  ＡＡＣ（配列番号９３１）
３’ＥＤ−ＶＬ−Ｆ−ＢｓｉＷＩ／ＳｐｅＩ
ＣＣＴ  ＧＡＴ  ＡＣＴ  ＡＧＴ  ＣＧＴ  ＡＣＧ  ＴＴＴ  ＴＡＴ  ＴＴＣ  ＣＡＧ  ＣＴＴ  ＧＧＴ  ＣＣＣ  ＣＴＧ  ＴＣＣ  ＡＡＡ  ＣＧＴ  ＡＴＡ  ＣＡＴ  ＧＧＧ  ＡＴＡ  ＧＴＴ  ＧＧＴ  ＡＴＡ  ＴＴＧ  ＣＴＧ  ＧＣＡ（配列番号９３２）
を用いる。このプライマーセットは、対応するＶＨ配列全体にわたる。
【０５８５】
該セット内ではプライマーを等量で混合し（例えば、２０μｌのＰＣＲ反応物に対して１μｌずつの各プライマー（２０〜１００μＭのプライマー原液））、ＰＣＲ緩衝液、ヌクレオチド、およびＴａｑポリメラーゼからなるＰＣＲ混合物に添加する。この混合物を、ＰＣＲサイクラー内において、９４℃で３分間、６５℃で１分間、６２℃で１分間、５９℃で１分間、５６℃で１分間、５２℃で１分間、５０℃で１分間、また、７２℃で１０分間にわたりインキュベートする。その後、標準的な方法により、該産物を、アガロースゲル電気泳動において泳動させ、該ゲルから、２００〜４００のサイズの産物を単離する。
【０５８６】
次いで、該ＶＬ  ＰＣＲ産物を、Ｎ末端およびＣ末端において適切なクローニング制限部位を組み込むプライマーを用いる、標準的なＰＣＲ反応の鋳型として用いる。標準的な方法に従うアガロースゲル電気泳動により、適正なサイズ（ＶＬの場合、約３３０ヌクレオチド）のＤＮＡ断片を単離する。この方法で、十分なＶＬ  ＤＮＡ断片を増幅する。
【０５８７】
次いで、ファージディスプレイベクターであるｐＣｏｍｂ３Ｈ５Ｂｈｉｓ内において、ＶＨ１  １−０３に基づく最終ＶＨ  ＰＣＲ産物（すなわち、ヒト／ヒト化ＶＨのレパートリー）を、ＶｋＩ  Ｌ８に基づく最終ＶＬ  ＰＣＲ産物（すなわち、ヒト／ヒト化ＶＬのレパートリー）と組み合わせ、そこから（線維状ファージ上における提示後に）抗エンドシアリン結合剤が、以下の通りに、選択、スクリーニング、同定、および確認される、機能的ｓｃＦｖのライブラリーを形成する。
【０５８８】
４５０ｎｇの軽鎖断片（ＳａｃＩ−ＳｐｅＩにより消化した）を、１４００ｎｇのファージミドであるｐＣｏｍｂ３Ｈ５Ｂｈｉｓ（ＳａｃＩ−ＳｐｅＩにより消化した；大型断片）とライゲーションする。次いで、結果として得られる抗体組合せライブラリーを、電気穿孔（２．５ｋＶ、０．２ｃｍのギャップキュベット、２５μＦＤ、２００オーム；Ｂｉｏｒａｄ社製ジーンパルサー）により、３００ｕｌのエレクトロコンピテント大腸菌ＸＬ１  Ｂｌｕｅ細胞内へと形質転換し、その結果として、サイズが個別クローン１０７個を超えるライブラリーを得る。１時間にわたる表現型発現の後、陽性の形質転換体を、一晩にわたり、１００ｍｌの液体スーパーブロース（ＳＢ）培地中においてｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＨｉｓベクターによりコードされるカルベニシリン耐性について選択する。次いで、遠心分離により細胞を回収し、市販されるプラスミド調製キット（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて、プラスミド調製を実施する。
【０５８９】
ＶＬライブラリーを含有する、２８００ｎｇのこのプラスミドＤＮＡ（ＸｈｏＩ−ＢｓｔＥＩＩで消化した；大型断片）を、９００ｎｇの重鎖Ｖ断片（ＸｈｏＩ−ＢｓｔＥＩＩで消化した）とライゲーションし、再度、電気穿孔（２．５ｋＶ、０．２ｃｍのギャップキュベット、２５μＦＤ、２００オーム；Ｂｉｏｒａｄ社製ジーンパルサー）により、エレクトロコンピテント大腸菌ＸＬ１  Ｂｌｕｅ細胞による２つの３００ｕｌアリコート中へと形質転換し、その結果として、サイズが個別クローン１０７個を超える、全ＶＨ−ＶＬ  ｓｃＦｖ（単鎖可変断片）ライブラリーを得る。
【０５９０】
表現型を発現させ、カルベニシリンに対して緩徐に適応させた後で、抗体ライブラリーを含有する大腸菌細胞を、ＳＢ−カルベニシリン（５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンを伴う）選択培地へと移す。次いで、抗体ライブラリーを含有する大腸菌細胞に、感染用量である１０１２個のヘルパーファージＶＣＳＭ１３粒子を感染させ、その結果として、線維状Ｍ１３ファージを生成および分泌させるが、この場合、各ファージ粒子は、ｓｃＦｖ断片をコードする一本鎖のｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＨｉｓ−ＤＮＡを含有し、ファージコートタンパク質ＩＩＩへの翻訳融合体として、対応するｓｃＦｖタンパク質を提示する。その後、抗体ライブラリーを提示するこのファージプールを用いて、抗原結合実体を選択する。
【０５９１】
この目的のために、ＰＥＧ８０００／ＮａＣｌ沈殿および遠心分離により、個々の培養物上清から、クローニングされたｓｃＦｖレパートリーを保有するファージライブラリーを回収する。約１０１１〜１０１２個のｓｃＦｖファージ粒子を、０．４ｍｌのＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ中に再懸濁させ、緩徐に撹拌しながら、氷上で１時間にわたり、エンドシアリンをトランスフェクトした１０５〜１０７個のＣＨＯ細胞（実施例２８．１を参照されたい）と共にインキュベートする。これらのエンドシアリンをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を、あらかじめ遠心分離により回収し、ＰＢＳ中で洗浄し、ＰＢＳ／１％ＦＣＳ（Ｎａアジドを含有する）中に再懸濁させる。エンドシアリンをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に特異的に結合しないｓｃＦｖファージは、ＰＢＳ／１％ＦＣＳ（Ｎａアジドを含有する）を伴う最大５回にわたる洗浄ステップにより除去する。洗浄後、ｐＨ２．２のＨＣｌ−グリシン中で細胞を再懸濁させる（その後のボルテクシングを伴う１０分間にわたるインキュベーション）ことにより、細胞から結合実体を溶出させ、ｐＨ１２の２Ｍトリスにより中和させた後に、溶出物を用いて、新鮮な未感染の大腸菌ＸＬ１  Ｂｌｕｅ培養物に感染させる（ＯＤ６００＞０．５）。ヒト／ヒト化ｓｃＦｖ断片をコードするファージミドコピーの形質導入に成功した大腸菌細胞を含有する大腸菌培養物を、さらに、カルベニシリン耐性について選択し、その後、これにＶＣＭＳ  １３ヘルパーファージを感染させて、抗体ディスプレイおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける選択の第２ラウンドを開始させる。通常、計４〜５ラウンドにわたり選択を実施する。
【０５９２】
エンドシアリンに特異的な結合剤をスクリーニングするため、選択後、大腸菌培養物から、４〜５ラウンドのパニングに対応するプラスミドＤＮＡを単離する。可溶性のｓｃＦｖタンパク質を作製するため、プラスミドからＶＨ−ＶＬ−ＤＮＡ断片を切り出す（ＸｈｏＩ−ＳｐｅＩ）。発現構築物（すなわち、ｓｃＦｖ）が、ｓｃＦｖとＨｉｓ６タグとの間にＦｌａｇタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）を包含し、また、さらなるファージタンパク質が欠失されている点で、元のｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＨｉｓとは異なるプラスミドである、ｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＦｌａｇ／Ｈｉｓ内への同じ制限部位により、これらの断片をクローニングする。ライゲーション後、各プール（パニングのラウンドが異なる）を、熱ショックコンピテント大腸菌のＴＧ１株またはＸＬＩ  ｂｌｕｅ株１００μｌ中へと形質転換し、カルベニシリンＬＢ寒天上へと播種する。単一のコロニーを採取して、１００μｌのＬＢカルベニシリン（５０μｇ／ｍｌ）中へと播種する。
【０５９３】
１ｍＭ  ＩＰＴＧによる誘導の後、異種間特異的単鎖抗体のコード配列を含有するｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＦｌａｇ／Ｈｉｓにより形質転換された大腸菌は、十分な量で可溶性のｓｃＦｖを生成する。適切なシグナル配列により、ｓｃＦｖはペリプラズム内へと移出され、そこで、機能的な立体構造へと折り畳まれる。
【０５９４】
小スケールのペリプラズム調製物用に、形質転換プレートから単一の大腸菌ＴＧ１株による細菌コロニーを採取し、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを補充したＳＢ培地（例えば、１０ｍｌ）中で培養する（また、回収後、ＰＢＳ（例えば、１ｍｌ）中に再溶解させる）。−７０℃における凍結および３７℃における融解の４ラウンドを介して温度ショックを適用し、これにより細菌の外膜を破壊し、ｓｃＦｖを包含する可溶性のペリプラズムタンパク質を上清中へと放出させる。遠心分離により、完全細胞および細胞破砕物を除去した後で、抗エンドシアリンｓｃＦｖを含有する上清を回収し、以下のエンドシアリン特異的結合剤の同定に用いる。
【０５９５】
エンドシアリンに対するｓｃＦｖの結合は、エンドシアリンをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞（実施例２８．１を参照されたい）に対するフローサイトメトリーにより調べる；トランスフェクトされなかったＣＨＯ細胞を陰性対照として用いる。
【０５９６】
フローサイトメトリーのため、２．５×１０５個の細胞を、５０μｌのｓｃＦｖペリプラズム調製物、または２％ＦＣＳを伴う５０μｌのＰＢＳ中に５μｇ／ｍｌの精製ｓｃＦｖと共にインキュベートする。ｓｃＦｖの結合は、２％ＦＣＳを伴う５０μｌのＰＢＳ中に２μｇ／ｍｌの抗Ｈｉｓ抗体（ドイツ、ヒルデン、Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ社製、ＢＳＡ非含有、ペンタＨｉｓ抗体）により検出する。第２ステップの試薬として、アフィニティー精製Ｒ−フィコエリトリンコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃガンマ断片特異的）Ｆ（ａｂ’）２断片を、２％ＦＣＳ（ドイツ、ハンブルグ、Ｄｉａｎｏｖａ社製）を伴う５０μｌのＰＢＳ中において１：１００に希釈して用いた。試料は、ＦＡＣＳｓｃａｎ（ドイツ、ハイデルベルク、ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）上において測定する。
【０５９７】
次いで、好ましい特性およびアミノ酸配列について、単一のクローンを解析する。Ｇｌｙ４Ｓｅｒ１リンカーを介して、それらを、ＣＤ３特異性ｓｃＦｖであるＩ２Ｃ（配列番号１８５）、または本発明の他の任意のＣＤ３特異性ｓｃＦｖと接合することにより、エンドシアリン特異的ｓｃＦｖを、組換え二重特異性単鎖抗体へと転換し、その結果として、例えば、ドメイン配列ＶＨエンドシアリン−（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ１）３−ＶＬ  エンドシアリン−Ｓｅｒ１Ｇｌｙ４Ｓｅｒ１−ＶＨＣＤ３−（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ１）３  −ＶＬＣＤ３、または代替的なドメイン配列を伴う構築物を得る。ＣＨＯ細胞内において発現させるには、（ｉ）コンセンサスのコザック配列内に埋め込まれた開始コドンを含む、Ｎ末端における免疫グロブリン重鎖リーダーのコード配列、また、（ｉｉ）停止コドンを後続させる、Ｃ末端におけるＨｉｓ６タグのコード配列の両方を、二重特異性単鎖抗体をコードするヌクレオチド配列にインフレームで結合させた後で、遺伝子合成により結果として得られるＤＮＡ断片を、発現ベクターであるｐＥＦ−ＤＨＦＲ（Ｒａｕｍら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ５０（２００１）、１４１〜１５０）の多重クローニング部位内へと挿入する。真核細胞内において該構築物を発現させるため、ヌクレオチド配列を検証したクローンをＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞内へとトランスフェクトする。Ｋａｕｆｍａｎｎ  Ｒ．Ｊ．（１９９０）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５、５３７〜５６６により説明される通り、ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞内において、真核細胞内のタンパク質発現を実施する。メトトレキサート（ＭＴＸ）濃度を、最高２０ｎＭ  ＭＴＸの最終濃度まで上昇させることにより、該構築物の遺伝子増幅を誘導する。
【０５９８】
２８．５．二重特異性単鎖抗体分子の発現および精製
ＭＣＳＰ×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体について本明細書の上記で説明した通り、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＨＥＫ２９３細胞内において、二重特異性単鎖抗体分子を発現させた。
【０５９９】
発現させた二重特異性単鎖抗体の単離および解析については、本明細書上記の実施例９でも説明した。
【０６００】
２８．６．フローサイトメトリーによる、エンドシアリンおよびＣＤ３に対する異種間特異的二重特異性抗体の結合についての解析
ヒトおよびマカクザルのエンドシアリンおよびＣＤ３のそれぞれに結合する能力に関して、異種開特異的二重特異性抗体構築物の機能性を調べるため、ＦＡＣＳ解析を実施する。この目的のために、実施例２８．１で説明した通りにヒトエンドシアリンをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞、また、ヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞白血病細胞株であるＨＰＢ−ＡＬＬ（ブラウンシュヴァイク、ＤＳＭＺ社製、ＡＣＣ４８３）を用いて、ヒト抗原に対する結合を調べる。マカクザル抗原に対する結合反応性は、実施例２８．２で説明した通りに作製したマカクザルエンドシアリントランスフェクタント、また、マカクザルＴ細胞株である４１１９ＬｎＰｘ（エアランゲン−ニュルンベルグ、衛生研究所、ウイルス学部門、Ｆｉｃｋｅｎｓｃｈｅｒ教授による恵与；Ｋｎａｐｐｅ  Ａら、およびＦｉｃｋｅｎｓｃｈｅｒ  Ｈ．、Ｂｌｏｏｄ  ２０００、９５、３２５６〜６１において公表されている）を用いることにより調べる。各細胞株２００，０００個ずつを、異種間特異的二重特異性抗体構築物を発現するトランスフェクト細胞による５０μｌの細胞培養物上清と共に、氷上において３０分間にわたりインキュベートする。２％ＦＣＳを伴うＰＢＳ中で２回にわたり細胞を洗浄し、マウスペンタＨｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ社製；２％ＦＣＳを伴う５０μｌのＰＢＳ中で１：２０に希釈）により、結合した二重特異性単鎖抗体構築物を検出する。洗浄後、２％ＦＣＳを伴うＰＢＳ中において１：１００に希釈した、フィコエリトリンにコンジュゲートさせたＦｃガンマ特異性抗体（Ｄｉａｎｏｖａ社製）により、結合した抗Ｈｉｓ抗体を検出する。トランスフェクトされなかった細胞を、陰性対照として用いる。
【０６０１】
ＦＡＣＳ−Ｃａｌｉｂｕｒ装置上において、フローサイトメトリーを実施し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを用いてデータを取り込み、解析する（ハイデルベルク、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）。「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（Ｃｏｌｉｇａｎ、Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ、Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ、Ｓｈｅｖａｃｈ、およびＳｔｒｏｂｅｒ、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、２００２）において説明される通りに、ＦＡＣＳによる染色および蛍光強度の測定を実施する。
【０６０２】
ヒトＣＤ３およびマカクザルＣＤ３、ならびにエンドシアリンに対する二重特異性結合を示す構築物だけを、さらなる使用のために選択する。
【０６０３】
２８．７．エンドシアリンおよびＣＤ３に対する異種間特異的二重特異性単鎖抗体の生体活性
実施例２８．１で説明した、ヒトエンドシアリンをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞、また、２８．２で説明した、マカクザルエンドシアリンをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏクロム５１（５１Ｃｒ）放出細胞傷害作用アッセイにより、作製した二重特異性単鎖抗体の生体活性を解析する。エフェクター細胞としては、それぞれ、刺激ヒトＣＤ４／ＣＤ５６枯渇ＰＢＭＣ、またはマカクザルＴ細胞株である４１１９ＬｎＰｘを用いる。
【０６０４】
刺激ヒトＰＢＭＣの作製については、本明細書上記の実施例１１において説明した。
【０６０５】
実施例１１において、ＭＣＳＰ×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体について説明した手順と同様に、標的細胞を調製し、アッセイを実施した。
【０６０６】
エンドシアリン陽性細胞に対して、エフェクター細胞による細胞傷害活性を強力に動員する構築物だけを、さらなる使用のために選択する。
【実施例２９】
【０６０７】
２９．ＣＤ２４８（エンドシアリン）およびＣＤ３に対する異種間特異的二重特異性単鎖分子の作製および特徴づけ
２９．１．ＣＤ２４８およびＣＤ３に対する異種間特異的二重特異性単鎖分子の作製
異種間特異的結合分子のクローニング
ヒト、および非チンパンジー霊長動物のＣＤ３イプシロンに対して異種間特異的な結合特異性、ならびにヒト、および非チンパンジー霊長動物のＣＤ２４８に対して異種間特異的な結合特異性を有する二重特異性単鎖抗体分子を、以下の表１３に示す通りにデザインした。
【０６０８】
(表１２)
（欠番）
【表１３】
2018064565.tif 000015
【０６０９】
これらの異種間特異的二重特異性単鎖分子の作製、発現、および精製は、上記で説明した通りに実施した。
【０６１０】
フローサイトメトリーによる、ＣＤ２４８およびＣＤ３に対する異種間特異的二重特異性抗体の結合についての解析は、上記で説明した通りに実施した。図５８に示す通り、ＣＤ２４８に対して異種間特異的であり、また、ヒト、および非チンパンジー霊長動物のＣＤ３に対して異種間特異的な、上記で列挙した単鎖分子による二重特異性結合が明確に検出された。ＦＡＣＳ解析において、すべての構築物は、陰性対照と比較して、ＣＤ３およびＣＤ２４８に対する結合を示した。ヒトおよびマカクザルのＣＤ３抗原およびＣＤ２４８抗原に対する二重特異性抗体の異種間特異性が裏付けられた。
【０６１１】
上記で説明した通り、ｉｎ  ｖｉｔｒｏクロム５１（５１Ｃｒ）放出細胞傷害作用アッセイにより、作製した二重特異性単鎖抗体の生体活性を解析した。図５９に示す通り、作製した異種間特異的二重特異性構築物のすべては、ヒトＣＤ２４８陽性標的細胞に対して、刺激ヒトＣＤ４／ＣＤ５６枯渇ＰＢＭＣにより誘発される細胞傷害活性、また、マカクザルＣＤ２４８陽性標的細胞に対して、マカクザルＴ細胞株である４１１９ＬｎＰｘにより誘発される細胞傷害活性を示した。
【実施例３０】
【０６１２】
３０．ＥｐＣＡＭおよびＣＤ３に対する異種間特異的二重特異性単鎖抗体分子の作製および特徴づけ
３０．１．ＣＨＯ細胞上におけるヒトＥｐＣＡＭ抗原のクローニングおよび発現
標準的なプロトコールに従う遺伝子合成により、ヒトＥｐＣＡＭ抗原の配列（ＮＭ＿００２３５４、ヒト腫瘍関連カルシウムシグナル伝達物質１（ＴＡＣＳＴＤ１）、ｍＲＮＡ；米国国立バイオテクノロジー情報センター、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ）を用いて、合成分子を得た。遺伝子合成断片はまた、真核細胞内において該構築物を発現させるためのコザック部位、また、該ＤＮＡの始点および終点において制限部位を含有するようにもデザインした。５’端においてＥｃｏＲＩ、また、３’端においてＳａｌＩの制限部位を導入し、Ｒａｕｍら（前出）で説明されるｐＥＦＤＨＦＲと称するプラスミド内へのクローニングステップで用いた。配列を検証した後で、該プラスミドを用い、以下の通りにＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞にトランスフェクトした。配列を検証したプラスミドを用いて、ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ  ９０９６；３７℃、湿度９５％、および７％ＣＯ２のインキュベーター内において、ドイツ、ベルリン、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ社から購入した、安定化グルタミンを伴い、すべて、ドイツ、ベルリン、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ社から購入した、１０％ＦＣＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充し、また、ドイツ、タウフキルヒェン、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ社から購入した、細胞培養グレードの試薬原液によるヌクレオシドを、１０μｇ／ｍｌアデノシン、１０μｇ／ｍｌデオキシアデノシン、および１０μｇ／ｍｌチミジンの最終濃度まで補充した、ＲＰＭＩ  １６４０中で培養した）にトランスフェクトした。トランスフェクションは、製造元のプロトコールに従い、ＰｏｌｙＦｅｃｔトランスフェクション試薬（ドイツ、ヒルデン、Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ社製）、および５μｇのプラスミドＤＮＡにより実施した。２４時間にわたる培養後にＰＢＳで１回細胞を洗浄し、前述の細胞培地中で再度培養したが、該培地にはヌクレオシドを補充せず、透析したＦＣＳ（ドイツ、ベルリン、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ社から購入した）を用いた。したがって、細胞培地はヌクレオシドを含有せず、これにより、トランスフェクトされた細胞に対して選択を適用した。トランスフェクションの約１４日後において、耐性細胞の増殖が観察された。さらに７〜１４日後、ＦＡＣＳ解析により、ＥｐＣＡＭの発現についてトランスフェクタントを調べた。Ｋａｕｆｍａｎｎ  Ｒ．Ｊ．（１９９０）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５、５３７〜５６６により説明される通り、ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞内において、真核細胞内のタンパク質発現を実施した。メトトレキサート（ＭＴＸ）濃度を、最高２０ｎＭ  ＭＴＸの最終濃度まで上昇させることにより、該構築物の遺伝子増幅を誘導した。
【０６１３】
３０．２．ＥｐＣＡＭおよびＣＤ３に対する異種間特異的二重特異性単鎮分子の作製
一般に、各々が、ヒトＣＤ３抗原およびマカクザルＣＤ３抗原に対して結合特異性を有するドメイン、ならびにヒトＥｐＣＡＭ抗原に対して結合特異性を有するドメインを含む二重特異性単鎖抗体分子を、以下の表１４に示す通りにデザインした。
【０６１４】
【表１４】
2018064565.tif 000016
【０６１５】
遺伝子合成により、ヒトＥｐＣＡＭに対して特異的な軽鎖（Ｌ）可変ドメインおよび重鎖（Ｈ）可変ドメインと、ヒトＣＤ３およびマカクザルＣＤ３に対して異種間特異的なＣＤ３特異性ＶＨおよびＣＤ３特異性ＶＬの組合せとを含有する前述の構築物を得た。ＭＣＳＰ×ＣＤ３異種間特異的単鎖分子について実施例９で説明した手順と同様に、遺伝子合成断片をデザインし、真核細胞内のタンパク質発現を実施した。
【０６１６】
３０．３．単一ドメインによる二重特異性単鎖抗体分子の発現および精製
ＭＣＳＰ×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体について本明細書の上記で説明した通り、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＨＥＫ２９３細胞内において、単一ドメインによる二重特異性単鎖抗体分子を発現させた。
【０６１７】
発現させた二重特異性単鎖抗体の単離および解析については、本明細書上記の実施例９でも説明した。
【０６１８】
３０．４．フローサイトメトリーによる、ＥｐＣＡＭおよびＣＤ３に対する異種間特異的二重特異性抗体の結合についての解析
ヒトＥｐＣＡＭ、およびヒト／マカクザルＣＤ３に結合する能力に関して、異種間特異的二重特異性抗体構築物の機能性を調べるため、ＦＡＣＳ解析を実施した。この目的のために、実施例３０．１で説明した通りにヒトＥｐＣＡＭをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞、また、ヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞白血病細胞株であるＨＰＢ−ＡＬＬ（ブラウンシュヴァイク、ＤＳＭＺ社製、ＡＣＣ４８３）を用いて、ヒト抗原に対する結合を確認した。マカクザルＣＤ３に対する結合反応性は、マカクザルＴ細胞株である４１１９ＬｎＰｘ（エアランゲン−ニュルンベルグ、衛生研究所、ウイルス学部門、Ｆｉｃｋｅｎｓｃｈｅｒ教授による恵与；Ｋｎａｐｐｅ  Ａら、およびＦｉｃｋｅｎｓｃｈｅｒ  Ｈ．、Ｂｌｏｏｄ  ２０００、９５、３２５６〜６１において公表されている）を用いることにより調べた。各細胞集団２００，０００個ずつを、異種間特異的二重特異性抗体構築物による５０μｌの精製タンパク質（例えば、２μｇ／ｍｌ）と共に、氷上において３０分間にわたりインキュベートした。代替的に、一過性に生成されたタンパク質の細胞培養物上清も用いた。ＰＢＳ中で２回にわたり細胞を洗浄し、標識化されないマウスペンタＨｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ社製；２％ＦＣＳを伴う５０μｌのＰＢＳ中で１：２０に希釈）により、結合した二重特異性単鎖抗体構築物を検出した。洗浄後、２％ＦＣＳを伴うＰＢＳ中において１：１００に希釈した、フィコエリトリンにコンジュゲートさせたＦｃガンマ特異性抗体（Ｄｉａｎｏｖａ社製）により、結合した抗Ｈｉｓ抗体を検出した。新鮮な培地を、陰性対照として用いた。
【０６１９】
ＦＡＣＳ−Ｃａｌｉｂｕｒ装置上において、フローサイトメトリーを実施し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを用いてデータを取り込み、解析した（ハイデルベルク、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）。「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（Ｃｏｌｉｇａｎ、Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ、Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ、Ｓｈｅｖａｃｈ、およびＳｔｒｏｂｅｒ、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、２００２）において説明される通りに、ＦＡＣＳによる染色および蛍光強度の測定を実施した。
【０６２０】
図６０に示す通り、ＥｐＣＡＭを指向する二重特異性単鎖分子が明確に検出された。ＦＡＣＳ解析において、すべての構築物は、培地ならびに１．および２．における検出抗体を用いる陰性対照と比較して、ヒトＣＤ３およびマカクザルＣＤ３、ならびにヒトＥｐＣＡＭに対する結合を示した。まとめると、ヒトＣＤ３およびマカクザルＣＤ３、ならびにヒトＥｐＣＡＭに対する二重特異性抗体の異種間特異性が裏付けられた。
【０６２１】
３０．５．ＥｐＣＡＭおよびＣＤ３に対する異種間特異的二重特異性単鎖抗体の生体活性
実施例３０．１で説明したＥｐＣＡＭ陽性細胞株を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏクロム５１放出細胞傷害作用アッセイにより、作製した二重特異性単鎖抗体の生体活性を解析した。エフェクター細胞としては、刺激ヒトＣＤ８陽性Ｔ細胞、またはマカクザルＴ細胞株である４１１９ＬｎＰｘを用いた。
【０６２２】
刺激ＣＤ８＋細胞は、以下の通りに得た。
【０６２３】
刺激ヒトＰＢＭＣの作製については、本明細書上記の実施例１１において説明した。
【０６２４】
実施例１１において、ＭＣＳＰ×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体について説明した手順と同様に、標的細胞を調製し、アッセイを実施した。
【０６２５】
図６１〜６６に示す通り、異種間特異的二重特異性単鎖抗体構築物のすべては、ヒトＥｐＣＡＭ陽性標的細胞に対して、ヒトＣＤ８＋細胞により誘発される細胞傷害活性、また、ヒトＥｐＣＡＭ陽性標的細胞に対して、マカクザルＴ細胞株である４１１９ＬｎＰｘにより誘発される細胞傷害活性を示した。陰性対照としては、非関与性の二重特異性単鎖抗体を用いた。
【０６２６】
３０．６．ＣＨＯ細胞上におけるマウスＥｐＣＡＭ抗原およびヒト−マウスＥｐＣＡＭハイブリッド抗原のクローニングおよび発現
標準的なプロトコールに従う遺伝子合成により、マウスＥｐＣＡＭ抗原の配列（ＮＭ  ００８５３２、ハツカネズミ腫瘍関連カルシウムシグナル伝達物質１（Ｔａｃｓｔｄ１）、ｍＲＮＡ；米国国立バイオテクノロジー情報センター、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ）を用いて、合成分子を得た。遺伝子合成断片はまた、真核細胞内において該構築物を発現させるためのコザック部位、また、該ＤＮＡの始点および終点において制限部位を含有するようにもデザインした。５’端においてＸｂａＩ、また、３’端においてＳａｌＩの制限部位を導入し、ｐＥＦＤＨＦＲと称するプラスミド内へのクローニングステップで用いた。配列を検証した後で、該プラスミドを用い、実施例３０．１で説明した通りにＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞にトランスフェクトした。ヒトエクソン２アミノ酸をマウスエクソン２（アミノ酸番号２６〜６１）に置換することにより、ヒト−マウスＥｐＣＡＭハイブリッド抗原を作製し、異種間特異的二重特異性抗体構築物により認識されるエピトープの同定を可能とした。上記で説明した通り、推定される配列を用いて、遺伝子合成により合成分子を得、ＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。
【０６２７】
３０．７．フローサイトメトリーによる、ＥｐＣＡＭおよびＣＤ３に対する異種間特異的二重特異性抗体の、異なるＥｐＣＡＭ抗原に対する結合についての解析
ヒトＥｐＣＡＭもしくはマウスＥｐＣＡＭ、またはヒト−マウスハイブリッドＥｐＣＡＭ上における異なるエピトープに結合する能力に関して、異種間特異的二重特異性抗体構築物の結合能力を解析するため、ＦＡＣＳによるフローサイトメトリーを実施した。この目的のために、実施例１で説明した通りにヒトＥｐＣＡＭをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞、また、マウスＥｐＣＡＭをトランスフェクトしたＣｈＯ細胞（実施例３０．６）、ならびにヒト−マウスＥｐＣＡＭハイブリッドをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞（実施例３０．６）を用いて、異なる結合パターンを確認した。各細胞集団２００，０００個ずつを、一過性に生成されたタンパク質の細胞培養物上清５０μｌと共に、氷上において３０分間にわたりインキュベートした。ＰＢＳ中で２回にわたり細胞を洗浄し、標識化されないマウスペンタＨｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ社製；２％ＦＣＳを伴う５０μｌのＰＢＳ中で１：２０に希釈）により、構築物の結合を検出した。洗浄後、２％ＦＣＳを伴う５０μｌのＰＢＳ中において１：１００に希釈した、フィコエリトリンにコンジュゲートさせたＦｃガンマ特異性抗体（Ｄｉａｎｏｖａ社製）により、結合した抗Ｈｉｓ抗体を検出した。各二重特異性卿鎮抗体分子をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に由来する細胞培養物上清ではなく、新鮮な培地を、陰性対照として用いた。マウスＥｐＣＡＭの発現についての陽性対照としては、マウスＥｐＣＡＭに特異的な、ラット由来の非標識抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製、型番５５２３７０、Ｒａｔ  ＩｇＧ２ａ、ｋ）により検出した後で、ＰＥ標識化抗ラットＩｇＧ２ａ抗体、κ特異性抗体（ハイデルベルク、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製、型番５５３９３０）を用いた。
【０６２８】
ＦＡＣＳ−Ｃａｌｉｂｕｒ装置上において、フローサイトメトリーを実施し、Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔソフトウェアを用いてデータを取り込み、解析した（ハイデルベルク、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）。「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（Ｃｏｌｉｇａｎ、Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ、Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ、Ｓｈｅｖａｃｈ、およびＳｔｒｏｂｅｒ、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、２００２）において説明される通りに、ＦＡＣＳによる染色および蛍光強度の測定を実施した。比較の目的で、蛍光強度のメジアン値を用いて棒グラフを作製した。
【０６２９】
図６７に示す通り、ヒトＥｐＣＡＭをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に対する、ＥｐＣＡＭを指向するすべての二重特異性単鎖分子の結合能力が、明確に検出された。マウスＥｐＣＡＭに対する結合を解析したところ、ヒトＥｐＣＡＭ特異的分子のうちのいずれも、陰性対照を著明に上回るメジアン値をもたらすことはなかった。ヒト−マウスＥｐＣＡＭハイブリッド抗原に対するヒトＥｐＣＡＭ特異的二重特異性単鎖抗体分子の結合特性は、２つの分子サブセットを明らかにした。ヒト−マウスＥｐＣＡＭハイブリッド抗原に対して検出可能な結合を示さない分子（ＨＤ６９  ＨＬ×Ｉ２Ｃ  ＨＬ）、また、メジアンの蛍光強度が、ほぼヒトＥｐＣＡＭ抗原に対する結合強度のレベルにある分子（ｈＥｐ  １４−Ａ１  ＬＨ×Ｉ２Ｃ  ＨＬ；ｈＥｐ  １４−Ｈ８  ＬＨ×Ｉ２Ｃ  ＨＬ；ｈＥｐ  １４−Ａ６  ＬＨ×Ｉ２Ｃ  ＨＬ；ｈＥｐ  １４−Ｄ１  ＬＨ×Ｉ２Ｃ  ＨＬ；ｈＥｐ  １４−Ｈ４  ＬＨ×Ｉ２Ｃ  ＨＬ；ｈＥｐ  １７−Ａ６  ＬＨ×Ｉ２Ｃ  ＨＬ；ｈＥｐ  １７−Ｅ９  ＬＨ×Ｉ２Ｃ  ＨＬ；ｈＥｐ  １８−Ｅ３  ＬＨ×Ｉ２Ｃ  ＨＬ；ｈＥｐ  １８−Ｆ１１  ＬＨ×Ｉ２Ｃ  ＨＬ；ｈＥｐ  １８−Ｆ１２  ＬＨ×Ｉ２Ｃ  ＨＬ；ｈＥｐ  １８−Ｇ１  ＬＨ×Ｉ２Ｃ  ＨＬ；ｈＥｐ  １８−Ｇ９  ＬＨ×Ｉ２Ｃ  ＨＬ；構築物の配列番号については、表１４を参照されたい）。ヒトＥｐＣＡＭに特異的な二重特異性単鎖抗体分子によるこれら２つのサブセットの異なる結合パターンは、ヒトＥｐＣＡＭ抗原上における異なるエピトープを裏付ける。マウスＥｐＣＡＭの骨格内にヒトＥｐＣＡＭのエクソン２ドメインを移植したところ、本発明のＥｐＣＡＭを指向する二重特異性単鎖分子による結合は増大したが、ＨＤ６９  ＨＬ×Ｉ２Ｃ  ＨＬによる結合は増大しなかった。
【０６３０】
したがって、本発明のＥｐＣＡＭ−ＣＤ３二重特異性単鎮抗体の第２の結合ドメインは、ＥｐＣＡＭ遺伝子のエクソン２によりコードされる、ＥｐＣＡＭのＥＧＦ様ドメイン１のアミノ酸残基２６〜６１に局在化するエピトープに結合する。ＥｐＣＡＭ遺伝子のエクソン２によりコードされる、ヒトＥｐＣＡＭのＥＧＦ様ドメイン１の前記アミノ酸残基２６〜６１を配列番号１１３０に示す。
【０６３１】
したがって、本発明のＥｐＣＡＭを指向する二重特異性単鎖分子のエピトープが、ヒトＥｐＣＡＭのエクソン２領域にマップされるのに対し、ＥｐＣＡＭの他の領域は、ＨＤ６９  ＨＬ×Ｉ２Ｃ  ＨＬ分子によるエピトープの形成に関与する。したがって、本発明のＥｐＣＡＭを指向する二重特異性単鎖分子は、ＥｐＣＡＭ結合分子の固有のクラスを形成する、すなわち、ＥｐＣＡＭ結合剤であるＨＤ６９に基づく、従来のＥｐＣＡＭ結合分子とは明確に差別化される。
【実施例３１】
【０６３２】
３１．ＦＡＰアルファおよびＣＤ３に対する異種間特異的二重特異性単鎖抗体分子の作製および特徴づけ
３１．１．ヒトＦＡＰアルファを発現するＣＨＯ細胞の作製
標準的なプロトコールに従う遺伝子合成により、ＧｅｎＢａｎｋで公表されているヒトＦＡＰアルファのコード配列（受託番号ＮＭ＿００４４６０）を得た。遺伝子合成断片は、まず、真核細胞内において該構築物を発現させるためのコザック部位、次いで、ヒトＦＡＰアルファタンパク質のコード配列、および終止コドンを含有するようにデザインした（該構築物のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、配列番号１１４９および１１５０に列挙する）。遺伝子合成断片はまた、該断片の始点および終点において制限部位を含有するようにもデザインした。５’端においてＸｍａＩ、また、３’端においてＳａｌＩの制限部位を導入し、以下のクローニング手順で用いた。標準的なプロトコールに従い、ＸｍａＩおよびＳａｌＩを介して、遺伝子合成断片を、ｐＥＦ−ＤＨＦＲ（ｐＥＦ−ＤＨＦＲは、Ｒａｕｍら、ＣａｎＣｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ５０（２００１）、１４１〜１５０において説明されている）と称するプラスミド内へとクローニングした。標準的なプロトコール（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１））に従い、前述の手順を実施した。真核細胞内において該構築物を発現させるため、ヌクレオチド配列を検証したクローンをＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞内へとトランスフェクトした。Ｋａｕｆｍａｎｎ  Ｒ．Ｊ．（１９９０）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５、５３７〜５６６により説明される通り、ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞内において、真核細胞内のタンパク質発現を実施した。メトトレキサート（ＭＴＸ）濃度を、最高２０ｎＭ  ＭＴＸの最終濃度まで上昇させることにより、該構築物の遺伝子増幅を誘導した。
【０６３３】
３１．２．マカクザルＦＡＰアルファを発現するＣＨＯ細胞の作製
標準的なプロトコールに従い調製されたマカクザル（カニクイザル）の皮膚に由来するｃＤＮＡに対する４つのＰＣＲセットにより、マカクザルＦＡＰアルファのＣＤＮＡ配列を得た。以下の反応条件：９４℃で３分間にわたる１サイクル、次いで、９４℃で０．５分間、５６℃で０．５分間、また、７２℃で３分間にわたる４０サイクル、次いで、７２℃で３分間にわたる最終サイクル、および以下のプライマーを用いた：
順方向プライマー：５’−ｃａｇｃｔｔｃｃａａｃｔａｃａａａｇａｃａｇａｃ−３’（配列番号１１５３）
逆方向プライマー：５’−ｔｔｔｃｃｔｃｔｔｃａｔａａａｃｃｃａｇｔｃｔｇｇ−３’（配列番号１１５４）
順方向プライマー：５’−ｔｔｇａａａｃａａａｇａｃｃａｇｇａｇａｔｃｃａｃｃ−３’（配列番号１１５５）
逆方向プライマー：５’−ａｇａｔｇｇｃａａｇｔａａｃａｃａｃｔｔｃｔｔｇｃ−３’（配列番号１１５６）
順方向プライマー：５’−ｇａａｇａａａｃａｔｃｔａｃａｇａａｔｔａｇｃａｔｔｇｇ−３’（配列番号１１５７）
逆方向プライマー：５’−ｃａｃａｔｔｔｇａａａａｇａｃｃａｇｔｔｃｃａｇａｔｇｃ−３’（配列番号１１５８）
順方向プライマー：５’−ａｇａｔｔａｃａｇｃｔｇｔｃａｇａａａａｔｔｃａｔａｇａａａｔｇｇ−３’（配列番号１１５９）
逆方向プライマー：５’−ａｔａｔａａｇｇｔｔｔｔｃａｇａｔｔｃｔｇａｔａｃａｇｇｃ−３’（配列番号１１６０）
【０６３４】
これらのＰＣＲにより、該ＰＣＲプライマーを用いる標準的なプロトコールに従い単離および配列決定される４つの重複する断片が生成され、これにより、マカクザルＦＡＰアルファをコードするｃＤＮＡ配列がもたらされた。マカクザルＦＡＰアルファを発現させる構築物を作製するため、標準的なプロトコールに従う遺伝子合成により、ｃＤＮＡ断片を得た（該構築物のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、配列番号１１５１および１１５２に列挙する）。この構築物は、マカクザルＦＡＰアルファの完全コード配列、次いで、終止コドンを含有する。遺伝子合成断片はまた、真核細胞内において該構築物を発現させるためのコザック部位、また、該ＤＮＡの始点および終点において制限部位を含有するようにもデザインした。５’端においてＥｃｏＲＩ、また、３’端においてＳａｌＩの制限部位を導入し、以下のクローニング手順で用いた。標準的なプロトコールに従い、ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩを介して、遺伝子合成断片を、ｐＥＦ−ＤＨＦＲ（ｐＥＦ−ＤＨＦＲは、Ｒａｕｍら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ５０（２００１）、１４１〜１５０において説明されている）と称するプラスミド内へとクローニングした。標準的なプロトコール（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１））に従い、前述の手順を実施した。真核細胞内において該構築物を発現させるため、ヌクレオチド配列を検証したクローンをＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞内へとトランスフェクトした。Ｋａｕｆｍａｎｎ  Ｒ．Ｊ．（１９９０）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５、５３７〜５６６により説明される通り、ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞内において、真核細胞内のタンパク質発現を実施した。メトトレキサート（ＭＴＸ）濃度を、最高２０ｎＭ  ＭＴＸの最終濃度まで上昇させることにより、該構築物の遺伝子増幅を誘導した。
【０６３５】
３１．３．ＦＡＰアルファおよびＣＤ３に対する異種間特異的二重特異性単鎖分子の作製
異種間特異的結合分子のクローニング
一般に、各々が、ヒト、および非チンパンジー霊長動物のＣＤ３イプシロンに対して異種間特異的な結合特異性を有するドメイン、ならびにヒト、および非チンパンジー霊長動物のＦＡＰアルファに対して異種間特異的な結合特異性を有するドメインを含む二重特異性単鎖抗体分子を、以下の表１５に示す通りにデザインした。
【０６３６】
【表１５】
2018064565.tif 000017
【０６３７】
遺伝子合成により、ヒトおよびマカクザルのＦＡＰアルファに対して異種間特異的な軽鎖（Ｌ）可変ドメインおよび重鎖（Ｈ）可変ドメインと、ヒトおよびマカクザルのＣＤ３に対して異種間特異的なＣＤ３特異性ＶＨおよびＣＤ３特異性ＶＬの組合せとを含有する前述の構築物を得た。ＭＣＳＰ×ＣＤ３異種間特異的単鎖分子について実施例９で説明した手順と同様に、遺伝子合成断片をデザインし、真核細胞内のタンパク質発現を実施した。
【０６３８】
３１．４．二重特異性単鎖抗体分子の発現および精製
ＭＣＳＰ×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体について本明細書の上記で説明した通り、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＨＥＫ２９３細胞内において、二重特異性単鎖抗体分子を発現させた。
【０６３９】
発現させた二重特異性単鎖抗体の単離および解析については、本明細書上記の実施例９でも説明した。
【０６４０】
３１．５．フローサイトメトリーによる、ＦＡＰアルファおよびＣＤ３に対する異種間特異的二重特異性抗体の結合についての解析
ヒトおよびマカクザルのＦＡＰアルファおよびＣＤ３のそれぞれに結合する能力に関して、異種間特異的二重特異性抗体構築物の機能性を調べるため、ＦＡＣＳ解析を実施した。この目的のために、実施例３１．１で説明した通りにヒトＦＡＰアルファをトランスフエクトしたＣＨＯ細胞、また、ヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞白血病細胞株であるＨＰＢ−ＡＬＬ（ブラウンシュヴァイク、ＤＳＭＺ社製、ＡＣＣ４８３）を用いて、ヒト抗原に対する結合について調べた。マカクザル抗原に対する結合反応性は、実施例３１．２で説明した通りに作製したマカクザルＦＡＰアルファトランスフェクタント、また、マカクザルＴ細胞株である４１１９ＬｎＰｘ（エアランゲン−ニュルンベルグ、衛生研究所、ウイルス学部門、Ｆｉｃｋｅｎｓｃｈｅｒ教授による恵与；Ｋｎａｐｐｅ  Ａら、およびＦｉｃｋｅｎｓｃｈｅｒ  Ｈ．、Ｂｌｏｏｄ  ２０００、９５、３２５６〜６１において公表されている）を用いることにより調べた。各細胞株２００，０００個ずつを、異種間特異的二重特異性抗体構築物を発現するトランスフェクト細胞の細胞培養物上清５０μｌと共に、氷上において３０分間にわたりインキュベートした。２％ＦＣＳを伴うＰＢＳ中で２回にわたり細胞を洗浄し、マウス抗Ｈｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ社製、ペンタＨｉｓ抗体；２％ＦＣＳを伴う５０μｌのＰＢＳ中で１：２０に希釈）により、結合した二重特異性単鎖抗体構築物を検出した。洗浄後、２％ＦＣＳを伴うＰＢＳ中において１：１００に希釈した、フィコエリトリンにコンジュゲートさせたＦｃガンマ特異性抗体（Ｄｉａｎｏｖａ社製）により、結合した抗Ｈｉｓ抗体を検出した。トランスフェクトされなかった細胞の上清を、陰性対照として用いた。
【０６４１】
ＦＡＣＳ−Ｃａｌｉｂｕｒ装置上において、フローサイトメトリーを実施した；ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを用いてデータを取り込み、解析した（ハイデルベルク、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）。「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（Ｃｏｌｉｇａｎ、Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ、Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ、Ｓｈｅｖａｃｈ、およびＳｔｒｏｂｅｒ、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、２００２）において説明される通りに、ＦＡＣＳによる染色および蛍光強度の測定を実施した。
【０６４２】
図６８に示す通り、ＦＡＰアルファに対して異種間特異的であり、また、ヒトＣＤ３および非チンパンジー霊長動物のＣＤ３に対して異種間特異的な、上記で列挙した単鎖分子による二重特異性結合が明確に検出された。ＦＡＣＳ解析において、すべての構築物は、陰性対照と比較して、ＣＤ３およびＦＡＰアルファに対する結合を示した。ヒトおよびマカクザルのＣＤ３抗原およびＦＡＰアルファ抗原に対する二重特異性抗体の異種間特異性が裏付けられた。
【０６４３】
３１．６．ＦＡＰアルファおよびＣＤ３に対する異種間特異的二重特異性単鎖抗体の生体活性
実施例３１．１で説明した、ヒトＦＡＰアルファをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞、また、３１．２で説明した、マカクザルＦＡＰアルファをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏクロム５１（５１Ｃｒ）放出細胞傷害作用アッセイにより、作製した二重特異性単鎖抗体の生体活性を解析した。エフェクター細胞としては、それぞれ、刺激ヒトＣＤ４／ＣＤ５６枯渇ＰＢＭＣ、またはマカクザルＴ細胞株である４１１９ＬｎＰｘを用いた。
【０６４４】
刺激ヒトＰＢＭＣの作製については、本明細書上記の実施例１１において説明した。
【０６４５】
実施例１１において、ＭＣＳＰ×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体について説明した手順と同様に、標的細胞を調製し、アッセイを実施した。
【０６４６】
図６９に示す通り、作製した異種間特異的二重特異性単鎖抗体構築物のすべては、ヒトＦＡＰアルファ陽性標的細胞に対して、刺激ヒトＣＤ４／ＣＤ５６枯渇ＰＢＭＣにより誘発される細胞傷害活性、また、マカクザルＦＡＰアルファ陽性標的細胞に対して、マカクザルＴ細胞株である４１１９ＬｎＰｘにより誘発される細胞傷害活性を示した。
【０６４７】
３１．７．ＦＡＰアルファおよびＣＤ３に対して異種間特異的な、さらなる二重特異性単鎖抗体分子の作製
ヒト生殖細胞系列抗体のＶＨ配列であるＶＨ１ １−０３（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）を、ＣＤＲＨ１（配列番号１１３７）、ＣＤＲＨ２（配列番号１１３８）、およびＣＤＲＨ３（配列番号１１３９）のフレームワーク環境として選択する。該ヒトＶＨには、末端の約１５〜２０ヌクレオチドの連なりにおいて重複する複数の縮退オリゴヌクレオチドを合成しなければならない。この目的に適う第２のプライマーはいずれも、アンチセンスプライマーである。ＶＨ１  １−０３には、以下のオリゴヌクレオチドセット：
５’ＦＡＰ−ＶＨ−Ａ−ＸｈｏＩ
ＣＣＧ  ＣＴＡ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＴＣＴ  ＧＧＡ  ＳＣＴ  ＧＡＧ  ＳＴＧ  ＲＷＧ  ＡＡＧ  ＣＣＴ  ＧＧＧ  ＧＣＴ  ＴＣＡ  ＧＴＡ  ＡＡＧ（配列番号１１６１）
３’ＦＡＰ−ＶＨ−Ｂ
ＣＴＧ  ＴＣＴ  ＣＡＣ  ＣＣＡ  ＧＴＧ  ＴＡＴ  ＧＧＴ  ＧＴＡ  ＴＴＣ  ＡＧＴ  ＧＡＡ  ＴＧＴ  ＧＴＡ  ＴＣＹ  ＡＧＡ  ＡＧＹ  ＣＴＴ  ＧＣＡ  ＧＧＡ  ＣＡＹ  ＣＴＴ  ＴＡＣ  ＴＧＡ  ＡＧＣ  ＣＣＣ（配列番号１１６２）
５’ＦＡＰ−ＶＨ−Ｃ
ＣＡＣ  ＴＧＧ  ＧＴＧ  ＡＧＡ  ＣＡＧ  ＫＣＣ  ＣＭＴ  ＧＧＡ  ＭＡＧ  ＡＧＭ  ＣＴＴ  ＧＡＧ  ＴＧＧ  ＡＴＫ  ＧＧＡ  ＧＧＴ  ＡＴＴ  ＡＡＴ  ＣＣＴ  ＡＡＣ  ＡＡＴ  ＧＧＴ  ＡＴＴ  ＣＣＴ  ＡＡＣ  ＴＡＣ（配列番号１１６３）
３’ＦＡＰ−ＶＨ−Ｄ
ＣＡＴ  ＧＴＡ  ＧＧＣ  ＧＧＴ  ＧＣＴ  ＧＧＭ  ＧＧＡ  ＣＫＴ  ＧＹＣ  ＴＭＹ  ＡＧＴ  ＴＡＷ  ＴＧＴ  ＧＲＣ  ＣＣＴ  ＧＣＣ  ＣＴＴ  ＧＡＡ  ＣＴＴ  ＣＴＧ  ＡＴＴ  ＧＴＡ  ＧＴＴ  ＡＧＧ  ＡＡＴ  ＡＣＣ（配列番号１１６４）
５’ＦＡＰ−ＶＨ−Ｅ
ＡＧＣ  ＡＣＣ  ＧＣＣ  ＴＡＣ  ＡＴＧ  ＧＡＧ  ＣＴＣ  ＭＧＣ  ＡＧＣ  ＣＴＧ  ＡＳＡ  ＴＣＴ  ＧＡＧ  ＧＡＴ  ＡＣＴ  ＧＣＧ  ＧＴＣ  ＴＡＴ  ＴＷＣ  ＴＧＴ  ＧＣＡ  ＡＧＡ  ＡＧＡ  ＡＧＡ  ＡＴＣ  ＧＣＣ（配列番号１１６５）
３’ＦＡＰ−ＶＨ−Ｆ−ＢｓｔＥＩＩ
ＣＣＡ  ＧＴＡ  ＧＧＴ  ＧＡＣ  ＣＡＧ  ＧＧＴ  ＴＣＣ  ＴＴＧ  ＡＣＣ  ＣＣＡ  ＧＴＡ  ＧＴＣ  ＣＡＴ  ＡＧＣ  ＡＴＧ  ＧＣＣ  ＣＴＣ  ＧＴＣ  ＧＴＡ  ＡＣＣ  ＡＴＡ  ＧＧＣ  ＧＡＴ  ＴＣＴ  ＴＣＴ  ＴＣＴ  ＴＧＣ  ＡＣＡ（配列番号１１６６）
を用いる。このプライマーセットは、対応するＶＨ配列全体にわたる。
【０６４８】
該セット内ではプライマーを等量で混合し（例えば、２０μｌのＰＣＲ反応物に対して１μｌずつの各プライマー（２０〜１００μＭのプライマー原液））、ＰＣＲ緩衝液、ヌクレオチド、およびＴａｑポリメラーゼからなるＰＣＲ混合物に添加する。この混合物を、ＰＣＲサイクラー内において、９４℃で３分間、６５℃で１分間、６２℃で１分間、５９℃で１分間、５６℃で１分間、５２℃で１分間、５０℃で１分間、また、７２℃で１０分間にわたりインキュベートする。その後、標準的な方法により、該産物を、アガロースゲル電気泳動において泳動させ、該ゲルから、２００〜４００のサイズの産物を単離する。
【０６４９】
次いで、該ＶＨ  ＰＣＲ産物を、Ｎ末端およびＣ末端において適切なクローニング制限部位を組み込むプライマーを用いる、標準的なＰＣＲ反応の鋳型として用いる。標準的な方法に従うアガロースゲル電気泳動により、適正なサイズ（ＶＨの場合、約３５０ヌクレオチド）のＤＮＡ断片を単離する。この方法で、十分なＶＨ  ＤＮＡ断片を増幅する。
【０６５０】
ヒト生殖細胞系列抗体のＶＬ配列であるＶｋＩＩ Ｏ１１（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）を、ＣＤＲＬ１（配列番号１１３２）、ＣＤＲＬ２（配列番号１１３３）、およびＣＤＲＬ３（配列番号１１３４）のフレームワーク環境として選択する。このヒトＶＬには、末端の約１５〜２０ヌクレオチドの連なりにおいて重複する複数の縮退オリゴヌクレオチドを合成しなければならない。この目的に適う第２のプライマーはいずれも、アンチセンスプライマーである。オリゴヌクレオチド内における、その後のクローニングに必要とされる制限部位は欠失させる。ＶｋＩＩ  Ｏ１１には、以下のオリゴヌクレオチド：
５’ＦＡＰ−ＶＬ−Ａ−ＳａｃＩ
ＣＧＡ  ＣＣＴ  ＧＡＧ  ＣＴＣ  ＧＴＧ  ＡＴＧ  ＡＣＡ  ＣＡＧ  ＡＣＴ  ＣＣＡ  ＹＹＣ  ＴＣＣ  ＣＴＡ  ＳＣＴ  ＧＴＧ  ＡＣＡ  ＳＹＴ  ＧＧＡ  ＧＡＧ  ＭＭＧ  ＧＹＴ  ＴＣＴ  ＡＴＳ  ＡＧＣ  ＴＧＣ  ＡＡＧ  ＴＣＣ  ＡＧＴ  ＣＡＧ（配列番号１１６７）
３’ＦＡＰ−ＶＬ−Ｂ
ＡＧＡ  ＣＴＧ  ＣＣＣ  ＴＧＧ  ＣＴＴ  ＣＴＧ  ＣＷＧ  ＧＷＡ  ＣＣＡ  ＧＧＣ  ＣＡＡ  ＧＴＡ  ＧＴＴ  ＣＴＴ  ＴＴＧ  ＡＴＴ  ＡＣＧ  ＡＣＴ  ＡＴＡ  ＴＡＡ  ＡＡＧ  ＧＣＴ  ＣＴＧ  ＡＣＴ  ＧＧＡ  ＣＴＴ  ＧＣＡ  ＧＣＴ（配列番号１１６８）
５’ＦＡＰ−ＶＬ−Ｃ
ＣＡＧ  ＡＡＧ  ＣＣＡ  ＧＧＧ  ＣＡＧ  ＴＣＴ  ＣＣＴ  ＭＡＡ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＡＴＴ  ＴＷＣ  ＴＧＧ  ＧＣＡ  ＴＣＣ  ＡＣＴＡ  ＧＧ  ＧＡＡ  ＴＣＴ  ＧＧＧ  ＧＴＣ  ＣＣＴ  ＧＡＴ  ＣＧＣ  ＴＴＣ  ＴＣＡ  ＧＧＣ  ＡＧＴ  ＧＧＡ（配列番号１１６９）
３’ＦＡＰ−ＶＬ−Ｄ
ＡＴＡ  ＴＴＧ  ＣＴＧ  ＡＣＡ  ＧＴＭ  ＡＴＡ  ＡＡＣ  ＴＳＣ  ＣＡＳ  ＧＴＣ  ＣＴＣ  ＡＧＣ  ＣＴＳ  ＣＡＣ  ＷＣＴ  ＧＣＴ  ＧＡＴ  ＣＫＴ  ＧＡＧ  ＡＫＴ  ＧＡＡ  ＡＴＣ  ＣＧＴ  ＣＣＣ  ＡＲＡ  ＴＣＣ  ＡＣＴ  ＧＣＣ  ＴＧＡ  ＧＡＡ（配列番号１１７０）
３’ＦＡＰ−ＶＬ−Ｅ−ＢｓｉＷＩ／ＳｐｅＩ
ＣＣＡ  ＧＴＡ  ＡＣＴ  ＡＧＴ  ＣＧＴ  ＡＣＧ  ＴＴＴ  ＧＡＴ  ＣＴＣ  ＣＡＣ  ＣＴＴ  ＧＧＴ  ＣＣＣ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＧＡＡ  ＣＧＴ  ＧＡＧ  ＣＧＧ  ＡＴＡ  ＧＣＴ  ＡＡＡ  ＡＴＡ  ＴＴＧ  ＣＴＧ  ＡＣＡ  ＧＴ（配列番号１１７１）
を用いる。このプライマーセットは、対応するＶＬ配列全体にわたる。
【０６５１】
該セット内ではプライマーを等量で混合し（例えば、２０μｌのＰＣＲ反応物に対して１μｌずつの各プライマー（２０〜１００μＭのプライマー原液））、ＰＣＲ緩衝液、ヌクレオチド、およびＴａｑポリメラーゼからなるＰＣＲ混合物に添加する。この混合物を、ＰＣＲサイクラー内において、９４℃で３分間、６５℃で１分間、６２℃で１分間、５９℃で１分間、５６℃で１分間、５２℃で１分間、５０℃で１分間、また、７２℃で１０分間にわたりインキュベートする。その後、標準的な方法により、該産物を、アガロースゲル電気泳動において泳動させ、該ゲルから、２００〜４００のサイズの産物を単離する。
【０６５２】
次いで、該ＶＬ  ＰＣＲ産物を、Ｎ末端およびＣ末端において適切なクローニング制限部位を組み込むプライマーを用いる、標準的なＰＣＲ反応の鋳型として用いる。標準的な方法に従うアガロースゲル電気泳動により、適正なサイズ（ＶＬの場合、約３３０ヌクレオチド）のＤＮＡ断片を単離する。この方法で、十分なＶＬ  ＤＮＡ断片を増幅する。
【０６５３】
次いで、ファージディスプレイベクターであるｐＣｏｍｂ３Ｈ５Ｂｈｉｓ内において、ＶＨ１  １−０３に基づく最終ＶＨ  ＰＣＲ産物（すなわち、ヒト／ヒト化ＶＨのレパートリー）を、ＶｋＩＩ  Ｏ１１に基づく最終ＶＬ  ＰＣＲ産物（すなわち、ヒト／ヒト化ＶＬのレパートリー）と組み合わせ、そこから（線維状ファージ上における提示後に）抗ＦＡＰアルファ結合剤が、以下の通りに、選択、スクリーニング、同定、および確認される、機能的ｓｃＦｖのライブラリーを形成する。
【０６５４】
４５０ｎｇの軽鎖断片（ＳａｃＩ−ＳｐｅＩにより消化した）を、１４００ｎｇのファージミドであるｐＣｏｍｂ３Ｈ５Ｂｈｉｓ（ＳａｃＩ−ＳｐｅＩにより消化した；大型断片）とライゲーションする。次いで、結果として得られる抗体組合せライブラリーを、電気穿孔（２．５ｋＶ、０．２ｃｍのギャップキュベット、２５μＦＤ、２００オーム；Ｂｉｏｒａｄ社製ジーンパルサー）により、３００ｕｌのエレクトロコンピテント大腸菌ＸＬ１  Ｂｌｕｅ細胞内へと形質転換し、その結果として、サイズが個別クローン１０７個を超えるライブラリーを得る。１時間にわたる表現型発現の後、陽性の形質転換体を、一晩にわたり、１００ｍｌの液体スーパーブロース（ＳＢ）培地中においてｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＨｉｓベクターによりコードされるカルベニシリン耐性について選択する。次いで、遠心分離により細胞を回収し、市販されるプラスミド調製キット（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて、プラスミド調製を実施する。
【０６５５】
ＶＬライブラリーを含有する、２８００ｎｇのこのプラスミドＤＮＡ（ＸｈｏＩ−ＢｓｔＥＩＩで消化した；大型断片）を、９００ｎｇの重鎖Ｖ断片（ＸｈｏＩ−ＢｓｔＥＩＩで消化した）とライゲーションし、再度、電気穿孔（２．５ｋＶ、０．２ｃｍのギャップキュベット、２５μＦＤ、２００オーム；Ｂｉｏｒａｄ社製ジーンパルサー）により、エレクトロコンピテント大腸菌ＸＬ１  Ｂｌｕｅ細胞による２つの３００ｕｌアリコート中へと形質転換し、その結果として、サイズが個別クローン１０７個を超える、全ＶＨ−ＶＬ  ｓｃＦｖ（単鎖可変断片）ライブラリーを得る。
【０６５６】
表現型を発現させ、カルベニシリンに対して緩徐に適応させた後で、抗体ライブラリーを含有する大腸菌細胞を、ＳＢ−カルベニシリン（５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンを伴う）選択培地へと移す。次いで、抗体ライブラリーを含有する大腸菌細胞に、感染用量である１０１２個のヘルパーファージＶＣＳＭ１３粒子を感染させ、その結果として、線維状Ｍ１３ファージを生成および分泌させるが、この場合、各ファージ粒子は、ｓｃＦｖ断片をコードする一本鎖のｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＨｉｓ−ＤＮＡを含有し、ファージコートタンパク質ＩＩＩへの翻訳融合体として、対応するｓｃＦｖタンパク質を提示する。その後、抗体ライブラリーを提示するこのファージプールを用いて、抗原結合実体を選択する。
【０６５７】
この目的のために、ＰＥＧ８０００／ＮａＣｌ沈殿および遠心分離により、個々の培養物上清から、クローニングされたｓｃＦｖレパートリーを保有するファージライブラリーを回収する。約１０１１〜１０１２個のｓｃＦｖファージ粒子を、０．４ｍｌのＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ中に再懸濁させ、緩徐に撹拌しながら、氷上で１時間にわたり、ＦＡＰアルファをトランスフェクトした１０５〜１０７個のＣＨＯ細胞（実施例３１．１を参照されたい）と共にインキュベートする。これらのＦＡＰアルファをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を、あらかじめ遠心分離により回収し、ＰＢＳ中で洗浄し、ＰＢＳ／１％ＦＣＳ（Ｎａアジドを含有する）中に再懸濁させる。ＦＡＰアルファをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に特異的に結合しないｓｃＦｖファージは、ＰＢＳ／１％ＦＣＳ（Ｎａアジドを含有する）を伴う最大５回にわたる洗浄ステップにより除去する。洗浄後、ｐＨ２．２のＨＣｌ−グリシン中で細胞を再懸濁させる（その後のボルテクシングを伴う１０分間にわたるインキュベーション）ことにより、細胞から結合実体を溶出させ、ｐＨ１２の２Ｍトリスにより中和させた後に、溶出物を用いて、新鮮な末感染の大腸菌ＸＬ１  Ｂｌｕｅ培養物に感染させる（ＯＤ６００＞０．５）。ヒト／ヒト化ｓｃＦｖ断片をコードするファージミドコピーの形質導入に成功した大腸菌細胞を含有する大腸菌培養物を、さらに、カルベニシリン耐性について選択し、その後、これにＶＣＭＳ  １３ヘルパーファージを感染させて、抗体ディスプレイおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける選択の第２ラウンドを開始させる。通常、計４〜５ラウンドにわたり選択を実施する。
【０６５８】
ＦＡＰアルファに特異的な結合剤をスクリーニングするため、選択後、大腸菌培養物から、４〜５ラウンドのパニングに対応するプラスミドＤＮＡを単離する。可溶性のｓｃＦｖタンパク質を作製するため、プラスミドからＶＨ−ＶＬ−ＤＮＡ断片を切り出す（ＸｈｏＩ−ＳｐｅＩ）。発現構築物（例えば、ｓｃＦｖ）が、ｓｃＦｖとＨｉｓ６タグとの間にＦｌａｇタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）を包含し、また、さらなるファージタンパク質を欠失させる点で元のｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＨｉｓとは異なるプラスミドである、ｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＦｌａｇ／Ｈｉｓ内への同じ制限部位により、これらの断片をクローニングする。ライゲーション後、各プール（パニングのラウンドが異なる）を、熱ショックコンピテント大腸菌のＴＧ１株またはＸＬＩ  ｂｌｕｅ株１００μｌ中へと形質転換し、カルベニシリンＬＢ寒天上へと播種する。単一のコロニーを採取して、１００μｌのＬＢカルベニシリン（５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを伴うＬＢ）中へと播種する。
【０６５９】
ＶＬセグメントおよびＶＨセグメントを含有するｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＦｌａｇ／Ｈｉｓにより形質転換された大腸菌は、遺伝子ＩＩＩ断片を切除し、また、１ｍＭ  ＩＰＴＧにより誘導した後で、十分な量で可溶性のｓｃＦｖを生成する。適切なシグナル配列により、ｓｃＦｖはペリプラズム内へと移出され、そこで機能的な立体構造へと折り畳まれる。
【０６６０】
小スケールのペリプラズム調製物用に、形質転換プレートから単一の大腸菌株による細菌コロニーを採取し、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを補充したＳＢ培地（例えば、１０ｍｌ）中で培養する（また、回収後、ＰＢＳ（例えば、１ｍｌ）中に再溶解させる）。−７０℃における凍結および３７℃における融解の４ラウンドを介して温度ショックを適用し、これにより細菌の外膜を破壊し、ｓｃＦｖを包含する可溶性のペリプラズムタンパク質を上清中へと放出させる。遠心分離により、完全細胞および細胞破砕物を除去した後で、抗ＦＡＰアルファｓｃＦｖを含有する上清を回収し、以下のＦＡＰアルファ特異的結合剤の同定に用いる。
【０６６１】
ＦＡＰアルファに対するｓｃＦｖの結合は、ＦＡＰアルファをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞（実施例３１．１を参照されたい）に対するフローサイトメトリーにより調べる；トランスフェクトされなかったＣＨＯ細胞を陰性対照として用いる。
【０６６２】
フローサイトメトリーのため、２．５×１０５個の細胞を５０ｕｌのｓｃＦｖペリプラズム調製物、または２％ＦＣＳを伴う５０μｌのＰＢＳ中に５μｇ／ｍｌの精製ｓｃＦｖと共にインキュベートする。ｓｃＦｖの結合は、２％ＦＣＳを伴う５０μｌのＰＢＳ中に２μｇ／ｍｌの抗Ｈｉｓ抗体（ドイツ、ヒルデン、Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ社製、ＢＳＡ非含有、ペンタＨｉｓ抗体）により検出する。第２ステップの試薬として、アフィニティー精製Ｒ−フィコエリトリンコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃガンマ断片特異的）Ｆ（ａｂ’）２断片を、２％ＦＣＳ（ドイツ、ハンブルグ、Ｄｉａｎｏｖａ社製）を伴う５０μｌのＰＢＳ中において１：１００に希釈して用いた。試料は、ＦＡＣＳｓｃａｎ（ドイツ、ハイデルベルク、ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）上において測定する。
【０６６３】
次いで、好ましい特性およびアミノ酸配列について、単一のクローンを解析する。Ｇｌｙ４Ｓｅｒ１リンカーを介して、それらを、ＣＤ３特異性ｓｃＦｖであるＩ２Ｃ（配列番号１８５）、または本発明の他の任意のＣＤ３特異性ｓｃＦｖと接合することにより、ＦＡＰアルファ特異的ｓｃＦｖを、組換え二重特異性単鎖抗体へと転換し、その結果として、例えば、ドメイン配列ＶＬＦＡＰアルファ−（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ１）３−ＶＨＦＡＰアルファ−Ｓｅｒ１Ｇｌｙ４Ｓｅｒ１−ＶＨＣＤ３−（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ１）３−ＶＬＣＤ３、または代替的なドメイン配列を伴う構築物を得る。ＣＨＯ細胞内において発現させるには、（ｉ）コンセンサスのコザック配列内に埋め込まれた開始コドンを含む、Ｎ末端における免疫グロブリン重鎖リーダーのコード配列、また、（ｉｉ）停止コドンを後続させる、Ｃ末端におけるＨｉｓ６タグのコード配列の両方を、二重特異性単鎖抗体をコードするヌクレオチド配列にインフレームで結合させた後で、遺伝子合成により結果として得られるＤＮＡ断片を、発現ベクターであるｐＥＦ−ＤＨＦＲ（Ｒａｕｍら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ５０（２００１）、１４１〜１５０）の多重クローニング部位内へと挿入する。実施例３１．３および３１．４で説明される通りに、作製した発現プラスミドのトランスフェクション、異種間特異的二重特異性抗体構築物によるタンパク質の発現および精製を実施する。他のすべての最新手順は、標準的なプロトコール（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１））に従い実施する。
【０６６４】
異種間特異的二重特異性抗体構築物を発現する、トランスフェクト細胞に由来する培養物上清に、フローサイトメトリーによる結合解析を施すことにより、機能的な二重特異性単鎖抗体構築物を同定する。解析は、実施例３１．５で説明した通りに実施する。ヒトＣＤ３およびマカクザルＣＤ３、ならびにＦＡＰアルファに対する二重特異性結合を示す構築物だけを、さらなる使用のために選択する。
【０６６５】
ＦＡＰアルファ陽性標的細胞に対して、エフェクター細胞により誘発される、作製された異種間特異的二重特異性単鎖抗体構築物の細胞傷害活性は、実施例３１．６で説明した通りに解析する。ＦＡＰアルファ陽性細胞に対して、エフェクター細胞による細胞傷害活性を強力に動員する構築物だけを、さらなる使用のために選択する。
【実施例３２】
【０６６６】
３２．ＦＡＰアルファおよびＣＤ３に対する異種間特異的二重特異性単鎖分子の作製および特徴づけ
３２．１．ＦＡＰアルファおよびＣＤ３に対する異種間特異的二重特異性単鎖分子の作製異種間特異的結合分子のクローニング
ヒト、および非チンパンジー霊長動物のＣＤ３イプシロンに対して異種間特異的な結合特異性、ならびにヒト、および非チンパンジー霊長動物のＦＡＰアルファに対して異種間特異的な結合特異性を有する二重特異性単鎖抗体分子を、以下の表１６に示す通りにデザインした。
【０６６７】
【表１６】
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【０６６８】
これらの異種間特異的二重特異性単鎖分子の作製、発現、および精製は、上記で説明した通りに実施した。
【０６６９】
フローサイトメトリーによる、ＦＡＰアルファおよびＣＤ３に対する異種間特異的二重特異性抗体の結合についての解析は、上記で説明した通りに実施した。図７０に示す通り、ＦＡＰアルファに対して異種間特異的であり、また、ヒト、および非チンパンジー霊長動物のＣＤ３に対して異種間特異的な、上記で列挙した単鎖分子による二重特異性結合が明確に検出された。ＦＡＣＳ解析において、すべての構築物は、陰性対照と比較して、ＣＤ３およびＦＡＰアルファに対する結合を示した。ヒトおよびマカクザルのＣＤ３抗原およびＦＡＰアルファ抗原に対する二重特異性抗体の異種間特異性が裏付けられた。
【０６７０】
上記で説明した通り、ｉｎ  ｖｉｔｒｏクロム５１（５１Ｃｒ）放出細胞傷害作用アッセイにより、作製した二重特異性単鎖抗体の生体活性を解析した。図７１に示す通り、作製した異種間特異的二重特異性単鎖抗体構築物のすべては、ヒトＦＡＰアルファ陽性標的細胞に対して、刺激ヒトＣＤ４／ＣＤ５６枯渇ＰＢＭＣにより誘発される細胞傷害活性、また、マカクザルＦＡＰアルファ陽性標的細胞に対して、マカクザルＴ細胞株である４１１９ＬｎＰｘにより誘発される細胞傷害活性を示した。
【０６７１】
３２．２．ＦＡＰアルファに結合する異種間特異的単鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）の作製、また、フローサイトメトリーによるその結合についての解析
ＦＡＰアルファに対して異種間特異的なｓｃＦｖを、上記で説明した通りに作製し、以下の表１７に示す通りに名づけた。
【０６７２】
【表１７】
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【０６７３】
上記で説明した通り、ヒトＦＡＰアルファをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞、また、マカクザルＦＡＰアルファをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を用いて、フローサイトメトリーにより、ＦＡＰアルファに対して異種間特異的なｓｃＦｖを含有するペリプラズム調製物の結合についての解析を実施した。図７２に示す通り、ＦＡＰアルファに対して異種間特異的な、上記で列挙したｓｃＦｖによる結合が明確に検出された。ＦＡＣＳ解析において、すべての構築物は、陰性対照と比較して、ＦＡＰアルファに対する結合を示した。ヒトＦＡＰアルファ抗原およびマカクザルＦＡＰアルファ抗原に対するｓｃＦｖ抗体の異種間特異性が裏付けられた。
【０６７４】
ｓｃＦｖに基づく異種間特異的結合分子のクローニング、ならびにこれらの異種間特異的二重特異性単鎖分子の発現および精製は、上記で説明した通りに実施する。フローサイトメトリーによる異種間特異的二重特異性結合の解析、また、ｉｎ  ｖｉｔｒｏクロム５１（５１Ｃｒ）放出細胞傷害作用アッセイによる生体活性の解析は、上記で説明した通りに実施する。裏付けられた異種間特異的な二重特異性結合、また、動員された細胞傷害作用に基づき、異種間特異的結合分子をさらなる使用のために選択する。
【０６７５】
選択された異種間特異的二重特異性単鎖分子中に含有される、ＦＡＰアルファに対して異種間特異的な非ヒトｓｃＦｖのヒト／ヒト化同等物を、本明細書で説明した通りに作製する。これらのヒト／ヒト化ｓｃＦｖに基づく異種間特異的結合分子のクローニング、ならびにこれらの異種間特異的二重特異性単鎖分子の発現および精製は、上記で説明した通りに実施する。フローサイトメトリーによる異種間特異的二重特異性結合の解析、また、ｉｎ  ｖｉｔｒｏクロム５１（５１Ｃｒ）放出細胞傷害作用アッセイによる生体活性の解析は、上記で説明した通りに実施する。裏付けられた異種間特異的な二重特異性結合、また、動員された細胞傷害作用に基づき、異種間特異的結合分子をさらなる使用のために選択する。
【実施例３３】
【０６７６】
３３．ＩＧＦ−１ＲおよびＣＤ３に対する異種間特異的二重特異性単鎖分子の作製および特徴づけ
３３．１．ヒトＩＧＦ−１Ｒを発現するＣＨＯ細胞の作製
標準的なプロトコールに従う遺伝子合成により、ＧｅｎＢａｎｋで公表されているヒトＩＧＦ−１Ｒのコード配列（受託番号ＮＭ＿０００８７５）を得た。遺伝子合成断片は、まず、真核細胞内において該構築物を発現させるためのコザック部位、次いで、ヒトＩＧＦ−１Ｒタンパク質のコード配列、および終止コドンを含有するようにデザインした（該構築物のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、配列番号２０１１および２０１２に列挙する）。遺伝子合成断片はまた、該断片の始点および終点において制限部位を含有するようにもデザインした。５’端においてＥｃｏＲＩ、また、３’端においてＳａｌＩの制限部位を導入し、以下のクローニング手順で用いた。遺伝子合成断片内におけるコード配列のサイレント突然変異により、望ましくない内部制限部位を除去した。標準的なプロトコールに従い、ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩを介して、遺伝子合成断片を、ｐＥＦ−ＤＨＦＲ（ｐＥＦ−ＤＨＦＲは、Ｒａｕｍら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ５０（２００１）、１４１〜１５０において説明されている）と称するプラスミド内へとクローニングした。標準的なプロトコール（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１））に従い、前述の手順を実施した。真核細胞内において該構築物を発現させるため、ヌクレオチド配列を検証したクローンをＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞内へとトランスフェクトした。Ｋａｕｆｍａｎｎ  Ｒ．Ｊ．（１９９０）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５、５３７〜５６６により説明される通り、ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞内において、真核細胞内のタンパク質発現を実施した。メトトレキサート（ＭＴＸ）濃度を、最高２０ｎＭ  ＭＴＸの最終濃度まで上昇させることにより、該構築物の遺伝子増幅を誘導した。
【０６７７】
３３．２．マカクザルＩＧＦ−１Ｒを発現するＣＨＯ細胞の作製
標準的なプロトコールに従う遺伝子合成により、ＧｅｎＢａｎｋで公表されているマカクザルＩＧＦ−１Ｒのコード配列（受託番号ＸＭ＿００１１００４０７）を得た。遺伝子合成断片は、まず、真核細胞内において該構築物を発現させるためのコザック部位、次いで、マカクザルＩＧＦ−１Ｒタンパク質のコード配列、および終止コドンを含有するようにデザインした（該構築物のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、配列番号２０１３および２０１４に列挙する）。遺伝子合成断片はまた、該断片の始点および終点において制限部位を含有するようにもデザインした。５’端においてＥｃｏＲＩ、また、３’端においてＳａｌＩの制限部位を導入し、以下のクローニング手順で用いた。遺伝子合成断片内におけるコード配列のサイレント突然変異により、望ましくない内部制限部位を除去した。標準的なプロトコールに従い、ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩを介して、遺伝子合成断片を、ｐＥＦ−ＤＨＦＲ（ｐＥＦ−ＤＨＦＲは、Ｒａｕｍら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ５０（２００１）、１４１〜１５０において説明されている）と称するプラスミド内へとクローニングした。標準的なプロトコール（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１））に従い、前述の手順を実施した。真核細胞内において該構築物を発現させるため、ヌクレオチド配列を検証したクローンをＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞内へとトランスフェクトした。Ｋａｕｆｍａｎｎ  Ｒ．Ｊ．（１９９０）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５、５３７〜５６６により説明される通り、ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞内において、真核細胞内のタンパク質発現を実施した。メトトレキサート（ＭＴＸ）濃度を、最高２０ｎＭ  ＭＴＸの最終濃度まで上昇させることにより、該構築物の遺伝子増幅を誘導した。
【０６７８】
３３．３．ＩＧＦ−１ＲおよびＣＤ３に対する異種間特異的二重特異性単鎖分子の作製
異種間特異的結合分子のクローニング
一般に、各々が、ヒト、および非チンパンジー霊長動物のＣＤ３イプシロンに対して異種間特異的な結合特異性を有するドメイン、ならびにヒト、および非チンパンジー霊長動物のＩＧＦ−１Ｒに対して異種間特異的な結合特異性を有するドメインを含む二重特異性単鎖抗体分子を、以下の表１８に示す通りにデザインした。
【０６７９】
【表１８】
2018064565.tif 000020
【０６８０】
これらの異種間特異的二重特異性単鎖分子の作製、発現、および精製は、上記で説明した通りに実施した。
【０６８１】
フローサイトメトリーによる、ＩＧＦ−１ＲおよびＣＤ３に対する異種間特異的二重特異性抗体の結合についての解析は、上記で説明した通りに実施した。図７３に示す通り、ＩＧＦ−１Ｒに対して異種間特異的であり、また、ヒト、および非チンパンジー霊長動物のＣＤ３に対して異種間特異的な、上記で列挙した単鎖分子による二重特異性結合が明確に検出された。ＦＡＣＳ解析において、すべての構築物は、陰性対照と比較して、ＣＤ３およびＩＧＦ−１Ｒに対する結合を示した。ヒトおよびマカクザルのＣＤ３抗原およびＩＧＦ−１Ｒ抗原に対するｓｃＦｖ抗体の異種間特異性が裏付けられた。
【０６８２】
上記で説明した通り、ｉｎ  ｖｉｔｒｏクロム５１（５１Ｃｒ）放出細胞傷害作用アッセイにより、作製した二重特異性単鎖抗体の生体活性を解析した。図７４に示す通り、すべての異種間特異的二重特異性単鎖抗体構築物は、ヒトＩＧＦ−１Ｒ陽性標的細胞に対して、刺激ヒトＣＤ４／ＣＤ５６枯渇ＰＢＭＣにより誘発される細胞傷害活性、また、マカクザルＩＧＦ−１Ｒ陽性標的細胞に対して、マカクザルＴ細胞株である４１１９ＬｎＰｘにより誘発される細胞傷害活性を示した。
【０６８３】
異種間特異的二重特異性単鎖分子中に含有される、ＩＧＦ−１Ｒに対して異種間特異的な非ヒトｓｃＦｖのヒト／ヒト化同等物を、本明細書で説明した通りに作製する。これらのヒト／ヒト化ｓｃＦｖに基づく異種間特異的結合分子のクローニング、ならびにこれらの異種間特異的二重特異性単鎖分子の発現および精製は、上記で説明した通りに実施する。フローサイトメトリーによる異種間特異的二重特異性結合についての解析、また、ｉｎ  ｖｉｔｒｏクロム５１（５１Ｃｒ）放出細胞傷害作用アッセイによる生体活性の解析は、上記で説明した通りに実施する。裏付けられた異種間特異的な二重特異性結合、また、動員された細胞傷害作用に基づき、異種間特異的結合分子をさらなる使用のために選択する。
【０６８４】
【表１９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８（１）】
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【図１８（２）】
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【図１８（３）】
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【図１９ａ】
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【図１９ｂ】
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【図１９ｃ】
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【図１９ｄ】
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【図１９ｅ】
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【図１９ｆ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ（１）】
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【図２６Ｂ（２）】
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【図２７】
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【図２８（１）】
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【図２８（２）】
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【図２９（１）】
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【図２９（２）】
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【図２９（３）】
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【図２９（４）】
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【図２９（５）】
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【図２９（６）】
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【図２９（７）】
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【図２９（８）】
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【図２９（９）】
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【図２９（１０）】
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【図２９（１１）】
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【図２９（１２）】
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【図３０（１）】
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【図３０（２）】
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【図３０（３）】
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【図３０（４）】
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【図３０（５）】
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【図３０（６）】
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【図３０（７）】
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【図３０（８）】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９ａ】
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【図３９ｂ】
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【図３９ｃ】
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【図３９ｄ】
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【図３９ｅ】
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【図３９ｆ】
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【図３９ｇ】
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【図３９ｈ】
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【図３９ｉ】
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【図３９ｊ】
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【図３９ｋ】
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【図３９ｌ】
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【図４０ａ】
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【図４０ｂ】
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【図４０ｃ】
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【図４０ｄ】
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【図４１ａ】
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【図４１ｂ】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６Ａ】
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【図４６Ｂ】
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【図４６Ｃ】
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【図４６Ｄ】
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【図４６Ｅ】
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【図４６Ｆ】
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【図４６Ｇ】
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【図４７Ａ】
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【図４７Ｂ】
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【図４７Ｃ】
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【図４８ａ】
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【図４８ｂ】
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【図４８ｃ】
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【図４８ｄ】
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【図４９ａ】
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【図４９ｂ】
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【図５０ａ】
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【図５０ｂ】
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【図５０ｃ】
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【図５０ｄ】
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【図５０ｅ】
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【図５０ｆ】
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【図５０ｇ】
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【図５０ｈ】
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【図５０ｉ】
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【図５１（１）】
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【図５１（２）】
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【図５１（３）】
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【図５１（４）】
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【図５１（５）】
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【図５２ａ】
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【図５２ｂ】
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【図５２ｃ】
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【図５２ｄ】
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【図５２ｅ】
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【図５３ａ】
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【図５３ｂ】
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【図５４ａ】
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【図５４ｂ】
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【図５４ｃ】
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【図５４ｄ】
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【図５５ａ】
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【図５５ｂ】
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【図５６ａ】
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【図５６ｂ】
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【図５６ｃ】
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【図５７】
2018064565.tif 000321
【図５８（１）】
2018064565.tif 000322
【図５８（２）】
2018064565.tif 000323
【図５９（１）】
2018064565.tif 000324
【図５９（２）】
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【図６０．１】
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【図６０．２】
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【図６０．３】
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【図６０．４】
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【図６０．５】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
2018064565.tif 000337
【図６８】
2018064565.tif 000338
【図６９】
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【図７０（１）】
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【図７０（２）】
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【図７１（１）】
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【図７１（２）】
2018064565.tif 000343
【図７２（１）】
2018064565.tif 000344
【図７２（２）】
2018064565.tif 000345
【図７３ａ】
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【図７３ｂ】
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【図７３ｃ】
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【図７３ｄ】
2018064565.tif 000349
【図７３ｅ】
2018064565.tif 000350
【図７３ｆ】
2018064565.tif 000351
【図７３ｇ】
2018064565.tif 000352
【図７３ｈ】
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【図７４ａ】
2018064565.tif 000354
【図７４ｂ】
2018064565.tif 000355
【図７４ｃ】
2018064565.tif 000356
【図７４ｄ】
2018064565.tif 000357
【図７４ｅ】
2018064565.tif 000358
【配列表】
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