(57)【要約】【課題】硫化水素又は活性イオウ分子種の簡便及び/又は迅速な測定のためのツール及び方法を開発すること。【解決手段】式(Ｉ)で表される化合物に結合し、式(II)で表される化合物に結合しない新規抗体を提供する。2018135302.tif 000030【選択図】図２
2018135302.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式(Ｉ)で表される化合物：
【化１】
2018135302.tif 000020
(Ｉ)
(式中、
Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3及びＸ4は、各々独立して、Ｎ又はＣＲ'(ここで、Ｒ'は、水素、又はヒドロキシル基、カルボキシル基、カルバモイル基、Ｃ1〜Ｃ4直鎖アルキル基若しくはＣ1〜Ｃ4直鎖アルコキシル基で置換していてもよいＣ1〜Ｃ6直鎖アルキル基である)であり、
Ｒ1及びＲ2の少なくとも一方並びにＲ5及びＲ6の少なくとも一方は、各々独立して、−Ｃ(＝Ｏ)Ｒ(ここで、Ｒは、ヒドロキシル基、カルボキシル基、カルバモイル基、Ｃ1〜Ｃ4直鎖アルキル基若しくはＣ1〜Ｃ4直鎖アルコキシル基で置換していてもよいＣ1〜Ｃ6直鎖アルキル基である)、−Ｃ(＝Ｏ)ＯＲ'及び−Ｃ(＝Ｏ)ＮＲ'Ｒ”(ここで、Ｒ'及びＲ”は、独立して、水素、又はヒドロキシル基、カルボキシル基、カルバモイル基、Ｃ1〜Ｃ4直鎖アルキル基若しくはＣ1〜Ｃ4直鎖アルコキシル基で置換していてもよいＣ1〜Ｃ6直鎖アルキル基である)から選択される電子吸引性基であり、残りは各々独立して、水素、又はヒドロキシル基、カルボキシル基、カルバモイル基、Ｃ1〜Ｃ4直鎖アルキル基若しくはＣ1〜Ｃ4直鎖アルコキシル基で置換していてもよいＣ1〜Ｃ6直鎖アルキルであり、
Ｒ3及びＲ7は、水素、又はヒドロキシル基、カルボキシル基、カルバモイル基、Ｃ1〜Ｃ4直鎖アルキル基若しくはＣ1〜Ｃ4直鎖アルコキシル基で置換していてもよいＣ1〜Ｃ6直鎖アルキルであり、
Ｒ1の一部とＲ2の一部及びＲ5の一部とＲ6の一部は、各々独立して、結合して環構造を形成していてもよい)
に結合するが、式(II)で表される化合物：
【化２】
2018135302.tif 000021
(II)
(式中、Ｘ1、Ｘ2、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は上記と同義である)
とは結合しないことを特徴とする抗体。
【請求項２】
Ｘ1＝Ｘ3、Ｘ2＝Ｘ4、Ｒ1＝Ｒ5、Ｒ2＝Ｒ6及びＲ3＝Ｒ7である請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
式(III)で表される化合物：
【化３】
2018135302.tif 000022
(III)
(式中、Ｗ1及びＷ2は各々独立してＯ、ＮＲ'又はＣＲ'Ｒ”であり、Ｒ3及びＲ7並びに各Ｒ'及び各Ｒ”は請求項１で定義したとおりである)
に結合し、式(IV)で表される化合物：
【化４】
2018135302.tif 000023
(IV)
(式中、Ｗ1及びＲ3は上記と同義である)
には結合しないことを特徴とする請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項４】
式(Ｖ)で表される化合物：
【化５】
2018135302.tif 000024
(Ｖ)
(式中、Ｒ'及びＲ”は、請求項１に定義したとおりである)
に結合し、式(VI)で表される化合物：
【化６】
2018135302.tif 000025
(VI)
(式中、Ｒ'は上記と同義である)
には結合しないことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項５】
モノクローナルである請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項６】
請求項５に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体を含んでなることを特徴とする硫化水素及び活性イオウ分子種の測定用試薬又はキット。
【請求項８】
式(VII)で表される化合物：
【化７】
2018135302.tif 000026
(VII)
(式中、
Ｘ1及びＸ2は、各々独立して、Ｎ又はＣＲ'(ここで、Ｒ'は水素、又はヒドロキシル基、カルボキシル基、カルバモイル基、Ｃ1〜Ｃ4直鎖アルキル基若しくはＣ1〜Ｃ4直鎖アルコキシル基で置換していてもよいＣ1〜Ｃ6直鎖アルキル基である)であり、
Ｒ1及びＲ2の少なくとも一方は、独立して、−Ｃ(＝Ｏ)Ｒ(ここで、Ｒは、ヒドロキシル基、カルボキシル基、カルバモイル基、Ｃ1〜Ｃ4直鎖アルキル基若しくはＣ1〜Ｃ4直鎖アルコキシル基で置換していてもよいＣ1〜Ｃ6直鎖アルキル基であり)、−Ｃ(＝Ｏ)ＯＲ'及び−Ｃ(＝Ｏ)ＮＲ'Ｒ”(ここで、Ｒ'及びＲ”は、独立して、水素、又はヒドロキシル基、カルボキシル基、カルバモイル基、Ｃ1〜Ｃ4直鎖アルキル基若しくはＣ1〜Ｃ4直鎖アルコキシル基で置換していてもよいＣ1〜Ｃ6直鎖アルキル基である)から選択される電子吸引性基であり、残りは、各々独立して、水素、又はヒドロキシル基、カルボキシル基、カルバモイル基、Ｃ1〜Ｃ4直鎖アルキル基若しくはＣ1〜Ｃ4直鎖アルコキシル基で置換していてもよいＣ1〜Ｃ6直鎖アルキル基であり、
Ｒ1の一部とＲ2の一部は結合して環構造を形成していてもよい)
を更に含んでなる請求項７に記載のキット。
【請求項９】
式(Ｉ)で表される化合物：
【化８】
2018135302.tif 000027
(Ｉ)
(式中、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5、Ｒ6及びＲ7は、請求項１で定義したとおりである)
を更に含んでなる請求項８又は９に記載のキット。
【請求項１０】
サンプルに式(VII)で表される化合物：
【化９】
2018135302.tif 000028
(VII)
(式中、Ｘ1、Ｘ2、Ｒ1及びＲ2は、請求項８で定義したとおりである)
を添加する工程、及び
式(VII)で表される化合物と硫化水素又は活性イオウ分子種との反応生成物を請求項１に記載の抗体を用いて測定する工程
を含んでなることを特徴とする、サンプル中の硫化水素又は活性イオウ分子種を測定する方法。
【請求項１１】
測定が、式(Ｉ)で表される化合物：
【化１０】
2018135302.tif 000029
(Ｉ)
(式中、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5、Ｒ6及びＲ7は、請求項１で定義したとおりである)
を用いる競合アッセイにより行われる請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定のサルファイド化合物に結合する抗体及びその使用に関する。より具体的には、本発明は、硫化水素又は活性イオウ分子種の測定に有用な抗体、並びにその抗体を用いる硫化水素又は活性イオウ分子種の測定のためのキット又は方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、活性イオウ分子種(RSS)及び硫化水素が生体内で様々な機能を発揮することが明らかになっている。
RSSは生命システムにおいて発見された硫黄を含む分子ファミリーである。RSSにはS-ニトロソチオールのようなS-修飾システインやスルフェン酸、パーサルファイド、ポリサルファイド、無機硫黄誘導体が含まれる。パーサルファイド(R-S-SH)、ポリサルファイド(R-S-Sn-S-R)などはサルフェン硫黄を含有する分子種である。サルフェン硫黄には他の硫黄原子に可逆的に付属し、多様な生命システムに対し制御作用を発揮するという独自の反応性をもっている。それらの機能には、tRNAの転写後修飾や硫黄含有補因子やビタミンの合成、酵素の活性化および阻害が含まれる。例えば、システインパーサルファイドは、極めて強力な活性酸素の消去能力を有し、体内で活性酸素の働きをコントロールする極めて重要な役割を担っている(非特許文献１)。
【０００３】
硫化水素は、新しいガス状メディエーターとして認識されており、多くの症状に対し保護効果を発揮することが検証されている(非特許文献２)。また、硫化水素は、体内で活性イオウ分子となって働いているとも考えられている。硫化水素とサルフェン硫黄は常に共存しており、最近の研究では硫化水素由来のサルフェン硫黄はシグナル伝達分子になると考えられている。
更に、RSS及び硫化水素は様々な疾患との関連性も報告されている。例えば、活性イオウ分子は血管拡張や細胞の酸化ストレスからの保護に関与しているため、その濃度の低下は血圧の上昇や細胞機能の低下を引き起こすことなどが明らかにされている。したがって、血液、尿、組織中の硫化水素やRSSを測定することは、例えば心疾患のような病気の予防、診断やリスク評価に利用できると考えられている。
【０００４】
しかしながら、これまでに報告されている硫化水素や活性イオウ分子の測定系(非特許文献１及び２)は、操作が煩雑であり、感度や費用の面でも問題があった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2014) 111, 21: 7606-7611
【非特許文献２】実験医学 (2012) Vol. 30 No. 17 208-213 (2884-2889)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
よって、本発明の目的は、硫化水素及び/又は活性イオウ分子種の簡便及び/又は迅速な測定のためのツール及び方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、硫化水素又は活性イオウ分子種から誘導されたサルファイド化合物に結合する抗体の開発に成功した。
したがって、本発明は、式(Ｉ)で表される化合物：
【化１】
2018135302.tif 000003
(Ｉ)
(式中、
Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3及びＸ4は、各々独立して、Ｎ又はＣＲ'であり、
Ｒ1及びＲ2の少なくとも一方並びにＲ5及びＲ6の少なくとも一方は、各々独立して、−Ｃ(＝Ｏ)Ｒ、−Ｃ(＝Ｏ)ＯＲ'及び−Ｃ(＝Ｏ)ＮＲ'Ｒ”から選択される電子吸引性基であり、
Ｒ3及びＲ7並びにＲ1、Ｒ2、Ｒ5及びＲ6のうち電子吸引性基でないものは、各々独立して、水素又は置換していてもよいＣ1〜Ｃ6直鎖アルキルであり、
Ｒ1の一部とＲ2の一部及びＲ5の一部とＲ6の一部は、各々独立して、結合して環構造を形成していてもよく、
ここで、各Ｒ'及び各Ｒ”は、独立して、水素又は置換していてもよいＣ1〜Ｃ6直鎖アルキル基であり、各Ｒは、独立して、置換していてもよいＣ1〜Ｃ6直鎖アルキル基であり、アルキル基の置換基はヒドロキシル基、カルボキシル基、カルバモイル基、Ｃ1〜Ｃ4直鎖アルキル基又はＣ1〜Ｃ4直鎖アルコキシル基である)
に結合し、式(II)で表される化合物：
【化２】
2018135302.tif 000004
(II)
(式中、Ｘ1、Ｘ2、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は上記と同義である)
とは結合しないことを特徴とする抗体を提供する。
【０００８】
本発明はまた、モノクローナルである上記抗体を産生するハイブリドーマを提供する。
本発明はまた、上記抗体を含むことを特徴とする硫化水素及び/又は活性イオウ分子種の測定用試薬又はキットを提供する。
本発明は更に、サンプルに式(VII)で表される化合物：
【化３】
2018135302.tif 000005
(VII)
(式中、Ｘ1、Ｘ2、Ｒ1及びＲ2は上記と同義である)
を添加する工程、及び、式(VII)で表される化合物と硫化水素又は活性イオウ分子種との反応生成物を上記の抗体を用いて測定する工程を含んでなる、サンプル中の硫化水素又は活性イオウ分子種を測定する方法を提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、硫化水素及び/又は活性イオウ分子種の簡便及び/又は迅速な測定が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実施例で得られた本発明のポリクローナル抗体の結合特性を示す。
【図２】実施例で得られた本発明のモノクローナル抗体の結合特性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
＜サルファイド化合物に結合する抗体＞
本発明の抗体は、式(Ｉ)で表される化合物：
【化４】
2018135302.tif 000006
(Ｉ)
に結合し、式(II)で表される化合物：
【化５】
2018135302.tif 000007
(II)
とは結合しないことを特徴とする。
【００１２】
本発明の抗体は、その結合選択性に起因して、硫化水素及び/又は活性イオウ分子種の測定に利用することができる。
本明細書において、「活性イオウ分子種」とは、当該分野において一般に用いられている定義に従う。活性イオウ分子種は、過剰に付加した可動性イオウを含み、このイオウの求核性が活性の本体である。このため、活性イオウ分子種は親電子性物質(Ｅ)と反応して、サルファイド(Ｅ'-Ｓ-Ｅ”；ビス型であり得る)を生成し得る。
【００１３】
活性イオウ分子種の例として、サルフェン硫黄(sulfane surfur)含有分子種(サルフェン硫黄化合物)が挙げられる。「サルフェン硫黄」とは硫黄原子にのみ共有結合した硫黄原子をいう。サルフェン硫黄化合物には、例えば、パーサルファイド(Ｒa-Ｓ-Ｓ-又はＲa-Ｓ-ＳＨ)やポリサルファイド(Ｒb-Ｓn-Ｒc；ｎ≧３)(ここで、Ｒa、Ｒb、Ｒcは任意の有機基である)、ポリチオン酸（H2SnO6；ｎ≧３）、チオ硫酸（H2S2O3）が含まれ、具体例として、システイン(CysSH)やグルタチオン(GSH)のパーサルファイド(CysS-SH、GS-SH)やポリサルファイド(CysS-(S)n-SH、GS-(S)n-SH)、３チオン酸（H2S3O6）、４チオン酸（H2S4O6）が挙げられる。
本明細書において、「測定」とは、測定対象の検出又は定量(量の推定も含む)をいう。本発明において、測定対象は、硫化水素、活性イオウ分子種(例えば、サルフェン硫黄化合物)及び/又はサルフェン硫黄であり得る。
【００１４】
上記式(Ｉ)及び(II)において、
Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3及びＸ4は、各々独立して、Ｎ又はＣＲ'であり、好ましくはＣＲ'である。ここで、各Ｒ'は、独立して、水素又は置換していてもよいＣ1〜Ｃ6、好ましくはＣ1〜Ｃ4の直鎖アルキル基である。置換基として、ヒドロキシル基、カルボキシル基、カルバモイル基、Ｃ1〜Ｃ4直鎖アルキル基及びＣ1〜Ｃ4直鎖アルコキシル基を挙げ得る。置換アルキル基の炭素数は例えば１〜６、好ましくは１〜４であり得る。Ｒ'及びＲ”の具体例としては、水素、メチル基、エチル基及びプロピル基、カルボキシメチル基、カルボキシエチル基、カルボキシプロピル基、カルバモイルメチル基、カルバモイルエチル基、カルバモイルプロピル基が挙げられる。
１つの実施形態において、Ｘ1＝Ｘ3及びＸ2＝Ｘ4であり得る。
【００１５】
Ｒ1及びＲ2の少なくとも一方並びにＲ3及びＲ4の少なくとも一方は、各々独立して、−Ｃ(＝Ｏ)Ｒ、−Ｃ(＝Ｏ)ＯＲ'及び−Ｃ(＝Ｏ)ＮＲ'Ｒ”から選択される電子吸引性基である。
ここで、各Ｒ'及び各Ｒ”については上記のとおりであり、各Ｒは、独立して、置換していてもよいＣ1〜Ｃ6、好ましくはＣ1〜Ｃ4の直鎖アルキル基である。置換基及び置換アルキル基の炭素数はＲ'及びＲ”について上記したとおりである。Ｒの具体例としては、メチル基、エチル基及びプロピル基、カルボキシメチル基、カルボキシエチル基、カルボキシプロピル基、カルバモイルメチル基、カルバモイルエチル基、カルバモイルプロピル基が挙げられる。
【００１６】
Ｒ3及びＲ7並びにＲ1、Ｒ2、Ｒ5及びＲ6のうち電子吸引性基でないものは、各々独立して、水素又は置換していてもよいＣ1〜Ｃ6、好ましくはＣ1〜Ｃ4の直鎖アルキル基である。置換基として、ヒドロキシル基、カルボキシル基、カルバモイル基、Ｃ1〜Ｃ4直鎖アルキル基及びＣ1〜Ｃ4直鎖アルコキシル基を挙げ得る。置換アルキル基の炭素数は例えば１〜６、好ましくは１〜４であり得る。
Ｒ3及びＲ7並びにＲ1、Ｒ2、Ｒ5及びＲ6のうち電子吸引性基でないものの具体例としては、水素、メチル基、エチル基及びプロピル基、カルボキシメチル基、カルボキシエチル基、カルボキシプロピル基、カルバモイルメチル基、カルバモイルエチル基、カルバモイルプロピル基が挙げられる。
１つの実施形態において、Ｒ3及びＲ7は水素である。
【００１７】
Ｒ1の一部とＲ2の一部は結合して環構造を形成していてもよい。この場合、電子吸引性基は＝ＣＯであり得る。同時に、Ｒ3の一部とＲ4の一部も結合して環構造を形成していてもよい。環構造は、例えば５員又は６員の炭素環又はヘテロ環であり、好ましくは５員の炭素環又はヘテロ環である。ヘテロ環は、好ましくは、１つのＯ及び/又は１若しくは２つのＮを含有する環である。好ましい環構造の具体例としては、
【化６】
2018135302.tif 000008
が挙げられる。ここで、−(Ｓ)は環構造へのイオウの結合部位を示し、各Ｒ'は上記のとおりである。
１つの実施形態において、Ｒ1＝Ｒ5、Ｒ2＝Ｒ6及びＲ3＝Ｒ7である。
【００１８】
１つの特定の実施形態において、本発明の抗体は、式(III)で表される化合物：
【化７】
2018135302.tif 000009
(III)
に結合し、式(IV)で表される化合物：
【化８】
2018135302.tif 000010
(IV)
には結合しない抗体であり得る。
上記式(III)及び(IV)において、Ｗ1及びＷ2は各々独立してＯ、ＮＲ'又はＣＲ'Ｒ”であり、Ｒ3及びＲ7並びに各Ｒ'及び各Ｒ”は上記式(Ｉ)について定義したとおりである。
１つの実施形態においては、Ｗ1＝Ｗ2である。
別の１つの実施形態においては、Ｗ1＝Ｗ2及びＲ3＝Ｒ7である。
【００１９】
１つの具体的実施形態において、本発明の抗体は、式(Ｖ)で表される化合物：
【化９】
2018135302.tif 000011
(Ｖ)
に結合し、式(VI)で表される化合物：
【化１０】
2018135302.tif 000012
(VI)
には結合しない抗体であり得る。
上記式(Ｖ)及び(VI)において、Ｒ'及びＲ”は上記式(Ｉ)について定義したとおりである。
１つの好適な実施形態においては、Ｒ'＝Ｒ”である。
【００２０】
式(II)、(IV)及び(VI)において、アミノプロピオン酸部分(又はアミノプロパン酸部分若しくは2-カルボキシ-2-アミノエチル部分)の窒素(Ｎ)は、アセチル基で置換されていることがあり得る。加えて又は或いは、式(II)、(IV)及び(VI)で表される化合物のアミノプロピオン酸部分のカルボキシル基は、他の化合物(例えば、アミノ酸、ペプチド又はタンパク質[例えば、BSA又はOVA])とのアミド結合に用いられていることがあり得る。
【００２１】
本明細書において、「抗体」には、従来型の抗体(２本の重鎖及び２本の軽鎖からなる抗体)のみならず、その抗原結合部位を有するフラグメント(Fab、F(ab')2、Fab'、Fv、scFv、Fdを含む)、ダイアボディ、ナノボディ、単一ドメイン抗体を含む。抗体は、いずれのクラス(サブクラス)のものであってもよい。抗体は、モノクローナルであってもポリクローナルであってもよい。
【００２２】
抗体は、当該分野において公知の方法を用いて作製することができる。
抗体がモノクローナル抗体である場合、例えば、以下のようにして、当該抗体を産生するハイブリドーマを作製することにより取得することができる。簡潔には、ハイブリドーマは、(１)抗原の調製、(２)抗原による動物の免疫化及び免疫動物からの抗体産生細胞の単離、(３)抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合(ハイブリドーマの作製)、及び(４)ハイブリドーマのスクリーニング及びクローニングにより作製する。
より詳細には、以下のとおりである。
【００２３】
(１)抗原の調製
免疫用抗原には、上記式(Ｉ)、(III)又は(Ｖ)で表される化合物を含む抗原を用いる。
式(Ｉ)、(III)又は(Ｖ)で表される化合物を含む抗原は、好ましくは、式(Ｉ)、(III)又は(Ｖ)で表される化合物と、免疫学的手法において該化合物に結合して免疫原性を生じさせるに適切なキャリアー分子とのコンジュゲートであり得る。
キャリアー分子としては、免疫学的手法において通常用いられ、ハプテンに結合して免疫原性を生じさせる分子であればよく、例えばウシ血清アルブミン(BSA)、卵白アルブミン(OVA)、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、ジフテリア毒素、破傷風毒素などが挙げられる。
ハプテンとキャリアー分子とのコンジュゲートとしては、一般に、カルボキシル基とα‐アミノ基とを反応させたアミド結合を有するコンジュゲート、架橋剤を用いて両者を架橋して結合したコンジュゲートなどが挙げられる。そのようなコンジュゲートを得る方法としては、カルボジイミド法、グルタルアルデヒド法、ジアゾ縮合法、マレイミドベンゾイルオキシスクシンイミド(MBS)法などを用い得る。
【００２４】
(２)抗原による動物の免疫化
免疫動物は、例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ハムスター、ニワトリなどであり得る。
上記抗原を動物に投与する方法は、皮下注射、腹腔内注射、静脈注射、皮内注射又は筋肉内注射のいずれであってもよい。免疫は、１回又は２回以上行うことができる。２回以上行う場合には、例えば１〜５週間の間隔で行うことができる。
免疫に際して、上記抗原は、適当な緩衝液(例えば、リン酸緩衝液など)に溶解又は懸濁して投与することができる。抗原は、アジュバント(例えば、完全若しくは不完全フロイントアジュバント、水酸化アルミニウム又はリン酸化アルミニウム(ミョウバン))などの補助剤と共に投与してもよい。
免疫後、適宜、動物の血清中の抗体力価を測定してもよい。抗体力価が低い場合、追加の免疫を行なってもよい。
【００２５】
(３)抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合(ハイブリドーマの作製)
免疫した動物の脾臓、胸腺、リンパ節及び/又は末梢血から抗体産生細胞(好ましくは、脾臓細胞又はリンパ節Ｂ細胞)を単離する。
ミエローマ細胞は、ハイブリドーマの作製に一般的に用いられる細胞から、抗体産生細胞が由来する動物に応じて適宜選択できる。そのようなミエローマ細胞としては、例えばマウス由来のP3U1、X63.653、Sp2/0、X63-Ag8、NS-1、MPC-11、P3X63-Ag8.653など、ラット由来のAG1、AG2、AG3、RCY3、210などが挙げられる。なお、培養培地は、公知のものから、用いる細胞に応じて適宜選択することができる。
細胞融合は、公知の方法、例えば、センダイウィルスを用いる方法、PEG法(例えば、KohlerおよびMilstein，Nature，256: 495-497，1975)、電気融合法により行うことができる。
ハイブリドーマの選択は、用いたミエローマに応じた適切な選択培地(例えば、HAT培地又はHaz培地)で培養することにより行うことができる。例えば、ミエローマ細胞としてHGPRT(ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ)欠損株を用いる場合、HAT含有培地が有用である。
【００２６】
(４)ハイブリドーマのスクリーニング及びクローニング
ハイブリドーマ培養物から、本発明の抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングする。簡潔には、ハイブリドーマの培養上清中に本発明のモノクローナル抗体が存在するか否か及び抗体が存在する場合はその力価を、例えば、抗原に用いた式(Ｉ)、(III)又は(Ｖ)で表される化合物を用いるELISA法により評価する。
スクリーニングにより得た、本発明の抗体を産生するハイブリドーマをクローニングする。クローニングは、例えば、限界希釈法により行う。スクリーニング及びクローニングは複数回繰り返してもよい。
本発明のモノクローナル抗体は、上記のようにして作製したハイブリドーマの培養上清から、又は当該ハイブリドーマを適切な動物(例えば、ヌードマウス)の体内(例えば腹腔内)で増殖させて得られる体液(例えば腹水)から得ることができる。
【００２７】
本発明の抗体がポリクローナル抗体である場合、簡潔には、以下のようにして取得することができる。
上記と同様にして得られる抗原を、免疫動物(例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ラクダ、ラマ、アルパカ、ニワトリ、ダチョウ、アヒル、シチメンチョウなど抗体産生に使用できる動物)に、上記と同様にして投与する。免疫動物の血液から、例えば免疫グロブリン画分として取得することができる。
【００２８】
上記のようにして得られた抗体は、タンパク質について用いられる通常の分離・精製技法を使用して均質にまで精製することができる。抗体の分離・精製には、例えば、(プロテインＡ、プロテインＧ、抗Ig抗体又は抗原若しくはその抗原性フラグメントなどの適切な親和性物質を用いる)アフィニティークロマトグラフィーやハイドロキシ又はフルオロアパタイトクロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーカラム、ゲル電気泳動、塩析、透析、ポリエチレングリコール分画、エタノール分画、硫酸アンモニウム分画、ゲル濾過、限外濾過、及びこれらの組合せを用いることができる。
【００２９】
本発明の抗体は、検出可能な標識が付されていてもよい。抗体の標識は、当該分野で公知であり、使用する検出手段に応じて適宜選択できる。検出可能な標識は、それ自体が検出可能であるか、又は、更なる物質と反応させてそれ自体検出可能な産物を生成することにより検出することができる。標識は、抗体に直接付されていてもよい。或いは、標識は、(ストレプト)アビジン-ビオチンのような結合対の一方のパートナー(例えば、(ストレプト)アビジン)に付着されていることにより、他方のパートナー(例えば、ビオチン)が付着した抗体と結合可能にされていてもよい。
【００３０】
例えば、標識には、酵素、放射性同位体、蛍光物質、発色物質、化学発光物質、電気化学的標識、着色物質などが使用できる。酵素としては、例えばペルオキシダーゼ(特にはHRP)、β-ガラクトシダーゼ、ホスファターゼ(特にはアルカリホスファターゼ、酸ホスファターゼ)、ルシフェラーゼ、グルコースオキシダーゼ、β-グルコシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、β-ラクタマーゼなどが挙げられる。放射性同位体としては、例えば、3Ｈ、14Ｃ、32Ｐ、35Ｓ、125Ｉ、131Ｉが挙げられる。蛍光物質としては、フルオレセイン及びその誘導体(例えばFITC)、ローダミン及びその誘導体(例えばRITC)、Cy2、Cy3などが挙げられる。発色物質としては、3,3'-ジアミノベンジジン(DAB)、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(TMB)などが挙げられる。発光物質としては、ルミノール、ルシフェリンなどが挙げられる。電気化学的標識としてはルテニウム錯体などが挙げられる。着色物質としては、金コロイド粒子や銀コロイド粒子のような金属コロイド粒子、着色樹脂微粒子などが挙げられる。
【００３１】
１つの好適な実施形態において、本発明の抗体は、式(Ｉ)、(III)又は(Ｖ)で表される化合物の検出限界が１μM以下である。
１つの好適な実施形態において、本発明の抗体は、式(Ｉ)、(III)又は(Ｖ)で表される化合物との結合に関して、それぞれ式(II)、(IV)又は(VI)で表される化合物が10μMで競合しない抗体である。
１つの好適な実施形態において、本発明の抗体は、式(Ｉ)、(III)又は(Ｖ)で表される化合物の検出限界が１μM以下であり、且つ、式(Ｉ)、(III)又は(Ｖ)で表される化合物との結合に関して、それぞれ式(II)、(IV)又は(VI)で表される化合物が10μMで競合しない抗体である。
１つの好適な実施形態において、本発明の抗体は、2017年２月21日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センターに、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−＿＿＿＿号(受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２４３４)で寄託したハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体である。
【００３２】
＜硫化水素及び活性イオウ分子種の測定用試薬＞
本発明の硫化水素及び活性イオウ分子種の測定用試薬は、上記した本発明の抗体のいずれかを含んでなることを特徴とする。
本発明の試薬は、硫化水素、活性イオウ分子種(例えば、サルフェン硫黄化合物)及び/又はサルフェン硫黄の測定方法において、測定対象を直接又は間接的に検出する試薬として使用できる。本発明の試薬はまた、硫化水素、活性イオウ分子種(例えば、サルフェン硫黄化合物)及び/又はサルフェン硫黄の測定用キットの構成要素として使用できる。
本発明の試薬は、上記したいずれかの抗体を含んでなる、硫化水素、活性イオウ分子種(例えば、サルフェン硫黄化合物)及び/又はサルフェン硫黄の測定用組成物と表現することもできる。
【００３３】
本発明の試薬において、抗体は、ビーズ(例えば磁性ビーズ)や粒子のような支持体に不動態化されていてもよい。本明細書において、「不動態化」とは、免疫測定法で通常に用いられる洗浄工程により洗い流されない程度に固定されていることを意味する。
【００３４】
本発明の試薬には、緩衝剤、pH調整剤、安定化剤、等張化剤、抗酸化剤、防腐剤、界面活性剤、及び/又は消泡剤などが添加されていてもよい。
緩衝剤及び/又はpH調整剤としては、例えば、リン酸、炭酸、クエン酸、コハク酸、酢酸、ホウ酸、塩酸及びそれらの塩(例えば、アルカリ金属塩及びアルカリ土類金属)、トリス、HEPES、ヒスチジン及びグルタミン酸のようなアミノ酸、水酸化ナトリウムなどが挙げられる。
安定化剤としては、例えば、アルブミン；ゼラチン；ソルビトール、マンニトール、スクロース、キシリトール、トレハロース、デキストラン、グリセリンなどのような糖及び糖アルコール；ヒスチジン及びメチオニンのようなアミノ酸などが挙げられる。
【００３５】
等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、上記のような糖及び糖アルコールなどが挙げられる。
抗酸化剤としては、例えば、アスコルビン酸塩、亜硫酸塩、α-トコフェロールなどが挙げられる。
防腐剤としては、例えば、アジ化ナトリウム、パラオキシ又はパラヒドロキシ安息香酸エステル、クロロブタノールなどが挙げられる。
界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤が好ましく、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートのようなポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテルなどが挙げられる。
媒体は、好ましくは、水性媒体(例えば、水、水及び水と混和性の有機溶媒の混合媒体)である。
【００３６】
本発明の硫化水素及び活性イオウ分子種の測定用試薬は、溶液形態若しくは懸濁液形態(例えば、ラテックス形態)で提供されてもよいし、凍結乾燥形態で提供されてもよい。溶液形態又は懸濁液形態で提供される場合、凍結状態で提供されてもよい。
【００３７】
＜硫化水素及び活性イオウ分子種の測定用キット＞
本発明のキットは、上記した抗体を含んでなることを特徴とする。本発明のキットは、硫化水素、活性イオウ分子種(例えば、サルフェン硫黄化合物)及び/又はサルフェン硫黄の測定に使用できる。
【００３８】
本発明のキットは、好ましくは、抗体が不動態化された支持体を含んでなる。支持体の形態は、当該分野において公知のものから適宜選択でき、例えば、プレート(例えば、マイクロタイタープレート)、チューブ、キャピラリチューブ、ビーズ(例えば、磁性ビーズ)、粒子、濾紙、フィルター、膜、不織布、ディスク、スティック、ストリップ、スライドグラス、チップなどであり得る。
支持体の材料は、当該分野において公知のものをいずれも使用でき、例えば、ガラス、樹脂(例えば、ポリスチレン、ポリエステル、ポリオレフィン、ポリアミド、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリプロピレン、ポリビニルブチレート、ポリ塩化ビニル、ポリテトラフルオロエチレン、ポリフッ化ビニリデン、ナイロン、レーヨン)、セルロース及びその誘導体(例えば、ニトロセルロース、酢酸セルロース)などであり得る。特定の実施形態においては、支持体は吸水性材料からなる。
【００３９】
支持体への抗体の不動態化は、当該分野において公知の方法により行うことができる。例えば、不動態化は、物理的吸着、共有結合又は非共有結合(イオン結合、静電結合、疎水性相互作用など)を利用するものであり得る。
抗体は、支持体に直接結合/吸着していてもよいし、マレイミド化合物のようなリンカー物質を介して間接的に結合/吸着していてもよい。
【００４０】
支持体は非特異的吸着を防止するためにブロッキング処理されていることが好ましい。ブロッキング剤は、当該分野において公知のものをいずれも使用できるが、例えば血清アルブミン(例えば、BSA)、脱脂粉乳、カゼインなどであり得る。
抗体が不動態化され、ブロッキング処理された支持体の表面は、水溶性高分子(例えば、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、又はヒドロキシプロピルメチルセルロース及びヒドロキシエチルセルロースのようなセルロースエステル)又は非還元多糖類(例えば、スクロース、トレハロース、ラフィノース)などでコーティングされていてもよい。このようなコーディングにより、支持体上の抗体を含む固相は非常に安定化し、長期間の保存に適する。
【００４１】
本発明のキットは、式(VII)で表される化合物：
【化１１】
2018135302.tif 000013
(VII)
を更に含んでいてもよい。
【００４２】
式(VII)で表される化合物は、硫化水素及び活性イオウ分子種(例えば、サルフェン硫黄化合物)と反応して、キット中の抗体(本発明の抗体)により認識される特定のサルファイド化合物(式(Ｉ)、(III)又は(Ｖ)で表される化合物)を生じる。一方、式(VII)で表される化合物は、システイン又はシステイン残基とも反応するが、その反応生成物にはキット中の抗体(本発明の抗体)は結合しない。
【００４３】
上記式(VII)において、
Ｘ1及びＸ2は、各々独立して、Ｎ又はＣＲ'であり、好ましくはＣＲ'である。
Ｒ1及びＲ2の少なくとも一方は、独立して、−Ｃ(＝Ｏ)Ｒ、−Ｃ(＝Ｏ)ＯＲ'及び−Ｃ(＝Ｏ)ＮＲ'Ｒ”から選択される電子吸引性基である。
Ｒ1及びＲ2のうち電子吸引性基でないものは、各々独立して、Ｒ'である。
Ｒ1の一部とＲ2の一部は結合して環構造を形成していてもよい。
ここで、各Ｒは、独立して、置換していてもよいＣ1〜Ｃ6直鎖アルキル基であり、各Ｒ'及び各Ｒ”は、独立して、水素又は置換していてもよいＣ1〜Ｃ6直鎖アルキル基であり、アルキル基の置換基として、ヒドロキシル基、カルボキシル基、カルバモイル基、Ｃ1〜Ｃ4直鎖アルキル基及びＣ1〜Ｃ4直鎖アルコキシル基を挙げ得る。置換アルキル基の炭素数は例えば１〜６、好ましくは１〜４であり得る。
【００４４】
式(VII)で表される化合物は、Ｒ1の一部とＲ2の一部が結合して環構造を形成している場合には、式(VIII)で表される化合物：
【化１２】
2018135302.tif 000014
(VIII)
(式中、Ｗ1は式(IV)について定義したとおりである)であり得、更に、式(IX)で表される化合物：
【化１３】
2018135302.tif 000015
(IX)
(式中、Ｒ'は式(Ｉ)について定義したとおりである)であり得る。
【００４５】
上記式(VII)、(VIII)又は(IX)で表される化合物にはタグ又は標識が付されていてもよい。タグ又は標識は、例えば、式(VII)、(VIII)又は(IX)で表される化合物中のＲ、Ｒ'及びＲ”(特に、置換基としてヒドロキシル基、カルボキシル基又はカルバモイル基を有するもの)のうちの１つに結合していてもよい。
標識については、抗体について上記したとおりである。
タグは、当該分野において用いられるものから適宜選択できる。タグは、抗体により認識されるものが好ましい。そのようなタグとしては、FLAGタグ、６×Hisタグ、Strepタグ、HAタグ、c-Mycタグ、DNPタグ、VSタグ、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンなどが挙げられる。
式(VII)、(VIII)又は(IX)で表される化合物への標識又はタグの付加は、カルボジイミド法、MBS法など当該分野において公知の技法により行うことができる。例えば、当該化合物中のＲ、Ｒ'及びＲ”のいずれかで、置換基としてのカルボキシル基とタグ又は標識が有するα‐アミノ基とを反応させることにより、両者をアミド結合で結合させることができる。
【００４６】
また、本発明のキットは、上記式(Ｉ)、(III)又は(Ｖ)で表される化合物を含んでいてもよい。該化合物は、当該キットに含まれる本発明の抗体が結合し得るものである。
式(Ｉ)、(III)又は(Ｖ)で表される化合物は、測定対象を上記抗体を用いる競合ELISA法により測定するに際して、競合剤として用いることができる。加えて又は或いは、当該化合物は、ポジティブコントロールとして用いることができる。
【００４７】
競合ELISA法の競合剤として用いる場合、式(Ｉ)、(III)又は(Ｖ)で表される化合物は、キットについて上記したような支持体に不動態化されていてもよい。この場合、キット中の抗体は支持体に不動態化されていない。
支持体への不動態化は、当該分野において公知の方法により行うことができる。例えば、不動態化は、物理的吸着、共有結合又は非共有結合(イオン結合、静電結合、疎水性相互作用など)を利用するものであり得る。
【００４８】
競合ELISA法の競合剤として用いる場合、式(Ｉ)、(III)又は(Ｖ)で表される(不動態化されていない)化合物には、標識が付されていてもよい。この場合、キット中の抗体は支持体に不動態化されている。
標識は、抗体について上記したとおりである。標識は、例えば、式(Ｉ)、(III)又は(Ｖ)で表される化合物中の置換していてもよいＣ1〜Ｃ6直鎖アルキル(特に、置換基としてヒドロキシル基、カルボキシル基又はカルバモイル基を有するもの)のうちの１つに結合していてもよい。式(III)で表される化合物においては、標識は、Ｗ1又はＷ2がＮＲ'又はＣＲ'Ｒ”である場合のＲ'又はＲ”に付することが好ましい。式(Ｖ)で表される化合物においては、標識は、Ｒ'又はＲ”のいずれかに付することが好ましい。
式(Ｉ)、(III)又は(Ｖ)で表される化合物への標識の付加は、上記のとおり、公知の技法により行うことができる。
【００４９】
本発明のキットが、タグが付された式(VII)、(VIII)又は(IX)で表される化合物を含む場合、当該タグに対する抗体(第２の抗体)を更に含んでいてもよい。タグに対する抗体には、本発明の抗体について上記したように標識が付されていてもよい。
或いは、本発明のキットが、支持体に不動態化された式(Ｉ)、(III)又は(Ｖ)で表される化合物を含む場合、本発明の抗体に結合する抗体(二次抗体)を更に含んでいてもよい。二次抗体は、キットに含まれる本発明の抗体に応じて適切に選択することができる。例えば、キット中の本発明にの抗体がマウスIgGである場合、二次抗体は例えば抗マウスIgGウサギ抗体であり得る。
【００５０】
本発明のキットは、必要に応じて、標識シグナル生成剤及び/又は反応停止液を更に含んでいてもよい。
標識シグナル生成剤は、標識に応じて公知のものから適宜選択できる。例えば、標識がペルオキシダーゼ(POD)である場合には、TMB、DAB、o-フェニレンジアミン(OPD)、2,2-アジノ-ジ-(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)(ABTS)、10-アセチル-3,7-ジヒドロキシフェノキサジン(ADHP)などであり得、アルカリホスファターゼである場合には、p-ニトロフェニルリン酸(pNPP)、4-メチルウンベリフェリルリン酸(4-MUP)などであり得る。
反応停止液は、例えば、硫酸又は水酸化ナトリウムであり得る。
【００５１】
本発明のキットは、洗浄用の溶液を備えていてもよい。代替的又は追加的に、サンプル希釈用の溶液を備えていてもよい。更に、キットに含まれる抗体の少なくとも１つが凍結乾燥形態で提供される場合には、再構成用の液体を備えていてもよい。
これら溶液は、好ましくは生理食塩水、より好ましくは緩衝化生理食塩水である。
緩衝液は、当該分野において公知のものから適宜選択できるが、例えば、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、クエン酸緩衝液、炭酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、コハク酸緩衝液、酢酸緩衝液などである。緩衝液は、必要に応じて、NaCl、界面活性剤(例えば、Tween 20、Triton X-100)及び/又は防腐剤(例えば、アジ化ナトリウム)を含んでいてもよい。緩衝液の具体例としては、PBS、PBS-T、TBS又はTBS-Tが挙げられる。
本発明のキットはまた、インキュベーションの間に支持体をシールするシーリング材(例えば、支持体がプレートである場合、プレートカバー又はプレートシール)を含んでいてもよい。
【００５２】
本発明のキットを用いる対象の検体は、硫化水素又は活性イオウ分子種(例えば、サルフェン硫黄化合物)の有無及び/又はその存在量(特に、サルフェン硫黄の量)が関心の対象となり得るいずれのサンプルであってもよい。サンプルとしては、生物学的サンプルや食物・食品由来のサンプル(例えば、ホモジネート、溶解物又は抽出物)が挙げられる。「生物学的サンプル」は、例えば、血液や尿を含む体液又はその画分；血管などの組織(ホモジネート、溶解物又は抽出物を含む)などである。生物学的サンプルは、ヒトを含む動物(好ましくはヒトを含む哺乳動物、より好ましくはヒト)に由来する。
本発明のキットを用いる対象の検体は、好ましくは生物学的サンプル、より好ましくは血液サンプル(全血サンプル、血清サンプル及び血漿サンプルを含む)、特に好ましくは血清サンプルである。
【００５３】
＜硫化水素又は活性イオウ分子種の測定方法＞
本発明の方法は、サンプルに式(VII)で表される化合物を添加する工程、及び、該化合物と硫化水素及び活性イオウ分子種との反応生成物を上記した抗体を用いて測定する工程  を含んでなることを特徴とする。
式(VII)で表される化合物は、式(VIII)又は(IX)で表される化合物であり得る。
【００５４】
サンプルは、本発明のキットについて上記したような生物学的サンプル又は食物・食品由来のサンプルであり得る。
サンプルは、式(VII)で表される化合物を添加する前に、希釈、濾過や遠心分離による夾雑物の除去などの前処理を行なってもよい。希釈には、例えば、上記のような緩衝液を用いることができる。
【００５５】
サンプルに式(VII)で表される化合物を添加する。
式(VII)で表される化合物は、(存在する場合には)サンプル中の硫化水素又は活性イオウ分子種と反応して、式(Ｉ)で表される化合物(以下、サンプル中の硫化水素又は活性イオウ分子種に由来するものを「被検化合物(Ｉ)」と呼ぶ)を生じる一方、システイン又はシステイン含有化合物と反応した場合には、式(II)で表される化合物又は式(II')
【化１４】
2018135302.tif 000016
(II')
(式中、Ｘ1、Ｘ2、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は式(II)で定義したとおりであり、「-ＣＨ2-ＣＨ(ＮＨ2)-Ｃ(＝Ｏ)-Ｏ-」のイオウ(Ｓ)に結合しない側の結合手は、反応前のシステイン含有化合物においてシステイン残基に結合していたアミノ酸残基に結合する結合手である(すなわち、「-Ｃ(＝Ｏ)-Ｏ-」はアミド結合の一部を構成している))で表される部分/構造を有する化合物を生じる。
【００５６】
添加後、式(VII)で表される化合物がサンプル中の硫化水素又は活性イオウ分子種及びシステイン又はシステイン残基と反応するに適切な条件下でインキュベートする。条件の例は、４〜50℃の温度(好ましくは室温：約20〜30℃)にて、数分間〜数十時間の間(通常、１時間〜一晩)である。インキュベーションの間、サンプルを撹拌してもよい。インキュベーションは遮光下で行うことが好ましい。
【００５７】
サンプル中の被検化合物(Ｉ)は、上記のとおりの本発明の抗体を用いて測定する。測定は、当該分野において公知の免疫測定法による。免疫測定法の具体例としては、酵素免疫測定法(EIA；特にELISA)、イムノクロマト法、ラテックス凝集(LA)法、蛍光免疫測定法、免疫比濁法、放射免疫測定法、免疫組織化学的染色が挙げられる。
測定は、例えば、次のように行うことができる。
サンプルを、本発明の抗体が不動態化されている支持体と接触させる。この接触により、サンプル中の被検化合物(Ｉ)は、支持体に不動態化されている本発明の抗体によって捕捉される。捕捉された被検化合物(Ｉ)は、例えば、サンプルに添加された式(VII)で表される化合物に付された標識からのシグナルを介して測定することができる。
【００５８】
測定はまた、サンドイッチ法により行うこともできる。
サンドイッチ法のためには、サンプルに添加する式(VII)で表される化合物として、タグが付されているものを用い、支持体に不動態化された本発明の抗体(捕捉抗体)と、該タグを認識する第２の抗体(検出抗体)の２種類の抗体を用いて測定する。検出抗体には、通常、上記のような標識が付されている。検出抗体に標識が付されていない場合には、追加的に、検出抗体に特異的に結合し、かつ標識が付されている物質(例えば二次抗体)を用いる。
サンドイッチ法においては、先ず、サンプルと、捕捉抗体が不動態化された支持体とを接触させ、次いで(例えば、洗浄後)、該支持体を検出抗体と接触させてもよいし、或いは、サンプルと検出抗体との混合液を、捕捉抗体が不動態化された支持体と接触させてもよい。後者の場合、混合は該支持体上(支持体内部を含む)で行なってもよいし、別の容器内で行なってもよい。
【００５９】
また、測定は、競合法により行うこともできる。
競合法では、本発明の抗体が不動態化された支持体を用いてもよいし、競合剤としての式(Ｉ)で表される化合物(以下、被検化合物としての式(Ｉ)で表される化合物と区別するために「競合化合物(Ｉ)」と呼ぶ)が不動態化された支持体を用いてもよい。
前者の場合には、支持体に競合化合物(Ｉ)及びサンプルを接触させる。競合化合物(Ｉ)及びサンプル中の被検化合物(Ｉ)はいずれも支持体に不動態化された本発明の抗体に結合し得るため、支持体に不動態化されている本発明の抗体によって捕捉される競合化合物(Ｉ)の量は、サンプル中の被検化合物(Ｉ)の存在(量)に依存する。よって、支持体に不動態化されている本発明の抗体によって捕捉される競合化合物(Ｉ)を測定することにより、間接的に、サンプル中の被検化合物(Ｉ)を測定することになる。捕捉された競合化合物(Ｉ)は、例えば、競合化合物(Ｉ)に付された標識からのシグナルを介して測定することができる。
【００６０】
競合化合物(Ｉ)が不動態化された支持体を用いる場合には、該支持体に本発明の抗体及びサンプルを接触させる。競合化合物(Ｉ)及び被検化合物(Ｉ)はいずれも本発明の抗体に結合し得るため、支持体に不動態化されている競合化合物(Ｉ)に結合する本発明の抗体の量は、サンプル中の被検化合物(Ｉ)の存在(量)に依存する。よって、支持体に不動態化されている競合化合物(Ｉ)に結合した本発明の抗体を測定することにより、間接的に、サンプル中の被検化合物(Ｉ)を測定することになる。競合化合物(Ｉ)に結合した本発明の抗体は、例えば、該抗体に付された標識からのシグナルを介して測定することができる。本発明の抗体に標識が付されていない場合には、追加的に、本発明の抗体に特異的に結合し、かつ標識が付されている抗体(二次抗体)を用いる。
【００６１】
サンプルと本発明の抗体との接触は、サンプルに当該抗体を添加することにより行なってもよいし、当該抗体が不動態化された支持体にサンプルを添加することにより行なってもよい。
接触は、本発明の抗体がサンプル中の被検化合物(Ｉ)(該当する場合には、及び競合化合物(Ｉ))と結合するに適切な条件下で、例えば、４〜50℃の温度(通常４℃〜40℃、好ましくは15℃〜40℃、より好ましくは15℃〜35℃、更に好ましくは20〜30℃にて、数秒間〜数十時間の間(通常数秒間〜数時間、好ましくは十数秒間〜数時間、より好ましくは数十秒間〜数十分間、更に好ましくは数分間〜十数分間)行う(インキュベーション)。
必要に応じて、更に、標識が付された二次抗体を接触させてもよい。この場合、接触は、二次抗体が本発明の抗体と結合するに適切な条件(例えば上記のような条件)下で行う。
【００６２】
用いる標識に応じた方法により、標識に起因するシグナル(例えば、発光、発色/着色、蛍光、放射活性、磁気、電気伝導度)を測定する。例えば、標識が蛍光物質である場合、励起光を照射して生じる蛍光発光を測定する。また、例えば、酵素である場合、適切な基質を添加し、生成物による発光又は発色を測定する。また、例えば、標識が着色粒子である場合、(必要に応じて所定位置での)着色の有無を観察する。
シグナルの測定は、分光光度計、蛍光光度計、CCDカメラ、CMOSカメラ、フォトダイオード、光電子増倍管などから適宜選択したものを、必要に応じて光源及び/又はフィルターと共に使用して行うことができる。測定が検出である場合には、肉眼又は顕微鏡観察による発色/着色の有無又は位置の観察/確認によることもできる。
【００６３】
測定の前には、タンパク質を除去する操作を行なってもよい。除タンパクは、例えば、エタノールを加えることにより行うことができる。エタノール添加後、上清を遠心乾固し、ギ酸(例えば0.1％)に溶解することができる。
【００６４】
測定の前に、サンプルにシステインを添加してもよい。サンプルは、除タンパク後のサンプルであり得る。システインは例えば過剰量で添加し得る。システイン添加後のサンプルは、疎水性相互作用の差を利用する分離・抽出操作に付する。
添加されたシステインはサンプル中の未反応のままの式(VII)で表される化合物と反応して、式(II)で表される化合物を生じる。式(VII)で表される化合物が式(VIII)又は(IX)で表される化合物である場合、システインとの反応で生じる式(IV)又は(VI)で表される化合物は、式(III)又は(Ｖ)で表される化合物及び式(VIII)又は(IX)で表される化合物と比べて疎水性が高い(極性が小さい)ため(疎水性：化合物(IV)又は(VI)＞化合物(VIII)又は(IX)＞化合物(III)又は(Ｖ))、例えばオクタデシルシリカゲルを用いる固相抽出により、式(IV)又は(VI)で表される化合物は例えば0.1％メタノールで溶出する一方、式(III)又は(Ｖ)で表される化合物は例えば100％メタノールで溶出する。このため、サンプル中の標的化合物(III)又は(Ｖ)の測定が更に容易となる。
【００６５】
本発明の方法によれば、硫化水素、活性イオウ分子種(例えば、サルフェン硫黄化合物)及び/又はサルフェン硫黄を、簡便及び/又は安価で、比較的迅速に測定することが可能になる。
本発明の方法は、様々な生理機能を有することが知られているイオウ含有食品の科学的評価に利用でき、科学的知見に基いた適切なイオウ含有食品の(健康増進や疾患予防につながる)摂取方法の確立に役立つ。また、本発明の方法は、硫化水素や活性イオウ分子種に関する生化学的基礎研究に用いることができる。
また、本発明の方法により得られる、硫化水素又は活性イオウ分子種(例えば、サルフェン硫黄化合物)の有無及び/又はその存在量(特に、サルフェン硫黄の量)に関するデータは、心疾患(例えば心筋梗塞)や動脈硬化の診断及びそのリスクの評価に用いることができる。
【実施例】
【００６６】
１．抗原の作製
下記の式(Ｘ)
【化１５】
2018135302.tif 000017
(Ｘ)
で表されるサルファイド化合物(以下、「NEM-Ｓ-MPA」と呼ぶ)を作製した。
NEM-Ｓ-MPAは、200 mM N-エチルマレイミド(NEM)溶液(2.0 mL)、200 mM 3-マレイミドプロピオン酸(MPA)溶液(2.0 mL)、400 mM リン酸バッファーpH 7.0 (5.0 mL)及び１Ｍ NaHS(1.0 mL)をこの順に混合し、遮光下で室温にて攪拌しながら一晩反応させることにより作製した。
【００６７】
反応液を以下のHPLC条件で分取した。
カラム        Mightysil RP18 GP 250-20 (5μm)
Ａ液          0.1％ FA
Ｂ液          MetOH
流量          3 mL/min
グラジェント  30〜40％ 120 min
分画          2 min/tube
NEM-Ｓ-MPA含有画分を一緒にして遠心濃縮した後、重量を測定し、50％ MetOHに溶解した。これをNEM-Ｓ-MPAとして以後の実験に用いた。
【００６８】
ここで、得られた抗体の結合特性を評価するための競合ELISAに用いる競合剤として、下記の式(XI)
【化１６】
2018135302.tif 000018
(XI)
で表されるサルファイド化合物(以下、「NEM-Ｓ-NEM」と呼ぶ)も作製した。
NEM-Ｓ-NEMは、200 mM NEM溶液(4.0 mL)、400 mM リン酸バッファーpH 7.0 (5.0 mL)及び１Ｍ NaHS(1.0 mL)をこの順に混合し、遮光下で室温にて攪拌しながら１時間反応させることにより作製した。
【００６９】
次に、下記の溶液を用いて、NEM-Ｓ-MPAにタンパク質(BSA)を結合させた。
NEM-Ｓ-MPA                                   0.3 mL
10  mg/ml BSA in 0.1 M MES (pH5.5)           0.3 mL
90 mM WSC in 0.1 M MES (pH5.5)               0.3 mL
MES：2-モルホリノエタンスルホン酸一水和物
WSC：水溶性カルボジイミド
上記溶液を混合し、遮光下に室温で攪拌しながら一晩反応させた後、遠心(3000 rpm, ４℃, ５ min)により、沈殿物として抗原NEM-Ｓ-MPA-BSAを得た。
ELISA用抗原NEM-Ｓ-MPA-OVAについても、タンパク質としてBSAに代えてOVAを用いることを除き、NEM-Ｓ-MPAと同様にしてNEM-Ｓ-MPA-OVAを得た。
【００７０】
２．NEM-S-MPA抗体の作製
2-1．ポリクローナル抗体の作製
(１)免疫
上記の抗原(NEM-Ｓ-MPA-BSA)(1280μg/ml)1000μlと完全フロイントアジュバント1000μlとを混合し、乳化して抗原液を調製した。この抗原液200μlを10週齢の日本白色種ウサギの背部に皮内注射により投与した(初回免疫)。
初回免疫の後、アジュバントとして完全フロイントアジュバントを用いて以外は上記と同様の抗原液200μlを、２週間間隔で５回皮内投与した(追加免疫)。
【００７１】
(２)ポリクローナル抗体の取得
最後の免疫から３日後に、ウサギの心臓から採血し、血清(全血清)を調製した。
血清から免疫吸収により部分精製ポリクローナル抗体を得た。
免疫吸収カラムとして、下記式(XII)
【化１７】
2018135302.tif 000019
(XII)
で表されるサルファイド化合物(以下、「NEM-Ｓ-NAC」と呼ぶ；NAC：N-アセチル-L-システイン)を固定化した樹脂カラムを用いた。
【００７２】
NEM-Ｓ-NACは、１Ｍシステイン塩酸塩溶液(0.5 mL)、200 mM NEM溶液(in DW)(2.5 mL)及び0.2 Ｍリン酸バッファー(pH 7.0)(2.5 mL)を混合し、遮光下室温で１時間反応させて合成した。NEM-Ｓ-NACを公知のカルボジイミド法により樹脂(アミノトヨパール)に結合した。得られたNEM-Ｓ-NAC固定化樹脂をプラスチック製カラムに充填した。
カラムの５倍量の結合バッファー(10 mM Na-Piバッファー，pH 7.0，7.5mL)でカラムを平衡化した後、上記で得られた全血清を結合バッファーで２倍希釈し、カラムに添加し、素通り画分を回収した。
【００７３】
(３)ポリクローナル抗体の結合特性の評価
免疫吸収後の血清について、ELISA用抗原NEM-Ｓ-MPA-OVAを吸着させたプレートを用いる競合ELISAにより結合特性を評価した。
PBSで希釈したELISA用抗原(NEM-Ｓ-MPA-OVA)をIWAKIサンプルプレートに0.2μg/well加え、４℃で通夜インキュベートして、抗原をウェルに吸着させた。TBSTで３回洗浄後、TBSTに溶解した５ mg/mLゼラチンをプレートに200μL/wellで加え、37℃にて30分間攪拌して、プレートをブロッキングした。
TBSTで希釈した免疫吸収後抗体と競合剤を混合し、室温で15分間インキュベートした。競合剤はNEM、NEM-Ｓ-Cys、NEM-Ｓ-NEMを、終濃度0.24μM〜１mMとなるように抗体と混合した。TBSTで３回洗浄したプレートに、競合剤と抗体の混合液又は抗体のみ(競合剤なし)を50μL/well加えて37℃で１時間インキュベートした。
【００７４】
TBSTで３回洗浄後、二次抗体としてTBSTで5000倍希釈したAnti-Rabbit IgG HRP(Santa Cruz Biotechnology) を50μL/well加え、37℃で30分間攪拌した。TBSTで３回洗浄後、POD発色系ELISA用発色液(OPD/H2O2)を50μL/well加え、室温で30分間静置した。2 N硫酸を50μL/well加えて反応を停止させた後、490 nmの吸光度を測定した。
結果を図１に示す(Ａ：免疫吸収前の血清；Ｂ：免疫吸収後の血清)。
免疫吸収前の血清と固相化抗原(NEM-Ｓ-MPA-OVA)との結合に関しては、NEM-Ｓ-NEMは0.24μMで50％競合し、10μMでほぼ完全に競合した。また、NEM-Ｓ-Cys及びNEMもそれぞれ3.9μM及び15.6μMで50％競合した。免疫吸収後の血清と固相化抗原(NEM-Ｓ-MPA-OVA)との結合に関して、NEM-Ｓ-NEMは１μMで競合した一方、NEM-Ｓ-Cys及びNEMは10μMでもほとんど競合しなかった。
【００７５】
2-1．モノクローナル抗体の作製
(１)免疫
免疫用抗原(NEM-Ｓ-MPA-BSA)(2000μg/ml)1000μlを完全フロイントアジュバント(Aduvant complete freund，Difco)1000μlと混合し、乳化して、ラットに腹腔内注射した。免疫は１頭当たり抗原が200μgになるように合計３回２週間間隔で行った。
【００７６】
(２)細胞融合(ハイブリドーマの作製)
最後の免疫から３日後に、ラットから脾臓を無菌的に摘出した。脾臓に付着した脂肪を取り除いた後、DMEM Free 15 mLが入った100 mmディッシュにおいて、脾臓から脾細胞を培地中に取り出した。その際、溶血バッファーを用いて赤血球を溶血させた。
得られた脾臓細胞とマウスミエローマ細胞(P3X63-Ag653)とを、脾細胞：ミエローマ細胞の比＝４:１となるように混合した。脾臓細胞とミエローマ細胞との細胞融合はPEG法により行った。
細胞をすべて回収し、400 mLのHAT培地(GIT (10％ FBS、１％ PS 5.0 ml)及びHATサプリメント(SIGMA))に懸濁した後、96ウェルプレートに200μL/wellで播種し、37℃で約１週間培養することにより、ハイブリドーマを選択的に培養した。
【００７７】
(３)ELISA法によるハイブリドーマのスクリーニング
抗原としてNEM-Ｓ-MPA-OVAを吸着させたプレートを用いる競合ELISAにより、各ハイブリドーマの培養上清に含まれる抗体の結合特性を評価し、目的の抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングした。
PBSで希釈した抗原をIWAKIサンプルプレートに50μL/well加え、37℃で30分間攪拌することにより、抗原をプレートに吸着させた。TBSTで３回洗浄後、TBSTに溶解した５ mg/mLゼラチンをプレートに200μL/wellで加え、37℃にて30分間攪拌して、プレートをブロッキングした。
【００７８】
次いで、上記ハイブリドーマの培養上清を採取し、競合剤と混合し、室温で15分静置した。競合剤はNEM-Ｓ-NEM、NEM-Ｓ-Cys及びNEMを用いた。TBSTで３回洗浄したプレートに、競合剤と培養上清の混合液を50μL/well加えて37℃で30分間攪拌した。
TBSTで３回洗浄後、二次抗体としてTBSTで5000倍希釈したAnti-Rat IgG HRP(Santa Cruz Biotechnology)を50μL/well加え、37℃で30分間攪拌した。TBSTで３回洗浄後、POD発色系ELISA用発色液を50μL/well加え、室温で30分間静置した。２Ｎ硫酸を50μL/well加えて反応を停止させた後、490 nmの吸光度を測定した。
上記のスクリーニングにより、NEM-Ｓ-NEMに結合する一方、NEM-Ｓ-Cysには結合しない抗体を産生するハイブリドーマを選抜することができた。
選抜したハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体の結合特性の評価結果を図２に示す。
得られたモノクローナル抗体と固相化抗原NEM-Ｓ-NEMとの結合について、NEM-Ｓ-NEMは用量依存的に競合する一方、NEM-Ｓ-Cys及びNEMは競合しない。
このモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ(識別表示：MEM-S-MPA)を、2017年(平成29年)２月21日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター(NITE；〒292-0818  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８)に寄託した(受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−＿＿＿＿号；受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２４３４号)。
【図１】
2018135302.tif 000031
【図２】
2018135302.tif 000032