(57)【要約】      （修正有）【課題】幹細胞の培養に用いられるフィーダー細胞を代替する技術である細胞培養用の足場材として、幹細胞を効率的に培養できる足場材の提供。【解決手段】細胞接着配列の典型的な例であるＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）を含まない細胞接着配列において、幹細胞が効率的に培養できることを見出したことに基づく、フィブロイン様タンパク質の繰り返し構造中にＲＧＤを含まない細胞接着配列を導入したフィブロイン様タンパク質改変体、該タンパク質がコーティングされた細胞培養容器、および該容器を利用した幹細胞等の培養方法。【選択図】図１
2018064542.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
繰り返し構造と細胞接着配列を含むタンパク質であって、
前記繰り返し構造が、繰り返し単位の３回〜１５回の繰り返しからなり、
各繰り返し単位が、Ａｌａリッチ部位とＡｌａ非リッチ部位が連結してなり、
各Ａｌａリッチ部位が、８残基〜５４残基のアミノ酸配列からなり、
各Ａｌａリッチ部位におけるＡｌａ残基の比率が、３０％以上であり、
各Ａｌａリッチ部位が、同部位中のいずれの連続する４アミノ酸残基中にも少なくとも１個のＡｌａ残基を含み、
各Ａｌａ非リッチ部位が、４残基以上のアミノ酸配列からなり、
各Ａｌａ非リッチ部位におけるＡｌａ残基の比率が、２０％以下であり、
前記細胞接着配列が、前記繰り返し構造を構成する繰り返し単位から選択される１つまたはそれ以上の繰り返し単位中に含まれており、
各細胞接着配列が、細胞接着性タンパク質の部分アミノ酸配列であって、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐを含まない、５残基以上のアミノ酸配列からなる、タンパク質。
【請求項２】
前記細胞接着配列が、前記繰り返し構造を構成する繰り返し単位から選択される２つまたはそれ以上の繰り返し単位中に含まれている、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
前記タンパク質に含まれる前記細胞接着配列の総数が、１個〜５０個である、請求項１または２に記載のタンパク質。
【請求項４】
各細胞接着配列が、Ａｌａ非リッチ部位中、またはＡｌａリッチ部位とＡｌａ非リッチ部位の連結部に挿入されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項５】
前記細胞接着性タンパク質が、ラミニンまたはビトロネクチンである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項６】
各細胞接着配列が、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のアミノ酸配列からなる、請求項１〜５のいずれか１項に記載のタンパク質：
（ａ）配列番号７１のアミノ酸番号２１１３〜２１２４に示すアミノ酸配列；配列番号６のアミノ酸番号２８６６〜２８８０、２９０５〜２９１５、３１０２〜３１１１、３２０４〜３２０９、３２６０〜３２７０、３２６４〜３２７０、３２７６〜３２８６、または３３０６〜３３１９に示すアミノ酸配列；配列番号２２のアミノ酸番号１５６７〜１５８１、または１７３６〜１７４４に示すアミノ酸配列；配列番号２５のアミノ酸番号１４１１〜１４１９に示すアミノ酸配列；配列番号２８のアミノ酸番号２２１０〜２２１６、２３９７〜２４０２、２７４２〜２７５３、または２７４５〜２７５２に示すアミノ酸配列；配列番号３３のアミノ酸番号３６７〜３７７に示すアミノ酸配列；それらのアミノ酸番号の開始位置および／または終了位置が１〜５残基前後してなるアミノ酸配列；またはそれらのアミノ酸配列の組み合わせ；
（ｂ）前記（ａ）に示すアミノ酸配列において１〜３個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含み、且つＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐを含まないアミノ酸配列；（ｃ）前記（ａ）に示すアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有し、且つＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐを含まないアミノ酸配列。
【請求項７】
各細胞接着配列が、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のアミノ酸配列からなる、請求項１〜６のいずれか１項に記載のタンパク質：
（ａ）配列番号３４〜４４、４７、４９、５０、および７２〜７４のいずれかに示すアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号３４〜４４、４７、４９、５０、および７２〜７４のいずれかに示すアミ
ノ酸配列において１〜３個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含み、且つＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐを含まないアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号３４〜４４、４７、４９、５０、および７２〜７４のいずれかに示すアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有し、且つＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐを含まないアミノ酸配列。
【請求項８】
各細胞接着配列が、人工多能性幹細胞の細胞足場材への接着を阻害する機能を示すアミノ酸配列からなる、請求項１〜７のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項９】
各Ａｌａリッチ部位が、８残基〜１５残基のアミノ酸配列からなる、請求項１〜８のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項１０】
各Ａｌａリッチ部位が、９残基のアミノ酸配列からなる、請求項１〜９のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項１１】
各Ａｌａリッチ部位が、Ｇｌｙ残基およびＳｅｒ残基をそれぞれ１個以上含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項１２】
各Ａｌａリッチ部位におけるＡｌａ残基の比率が、５０％以上である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項１３】
各Ａｌａリッチ部位におけるＡｌａ残基、Ｇｌｙ残基、およびＳｅｒ残基の比率が、合計で、９０％以上である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項１４】
各Ａｌａリッチ部位が、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のアミノ酸配列からなる、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のタンパク質：
（ａ）配列番号７、８、９、または１０に示すアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号７、８、９、または１０に示すアミノ酸配列において、１〜３個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号７、８、９、または１０に示すアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列。
【請求項１５】
各Ａｌａ非リッチ部位が、１５残基〜１００残基のアミノ酸配列からなる、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項１６】
各Ａｌａ非リッチ部位におけるＡｌａ残基の比率が、５％以下である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項１７】
各Ａｌａ非リッチ部位におけるＧｌｙ残基、Ｓｅｒ残基、Ｇｌｎ残基、Ｐｒｏ残基、Ｔｙｒ残基の比率が、合計で、９０％以上である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項１８】
各Ａｌａ非リッチ部位が、下記（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）に記載のアミノ酸配列から選択される１種またはそれ以上のアミノ酸配列を含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のタンパク質：
（ａ）配列番号１１〜２１に示すアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１１〜２１に示すアミノ酸配列において、１〜３個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号１１〜２１に示すアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列。
【請求項１９】
各Ａｌａ非リッチ部位が、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のアミノ酸配列からなる、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のタンパク質：
（ａ）配列番号２のアミノ酸番号６２〜９１、１０１〜１２０、１３０〜１５１、１６１〜１８５、１９５〜２１８、２２８〜２５７、２６７〜２９１、３０１〜３２５、３３５〜３６９、３７９〜４３８、４４８〜４９７、または５０７〜５３６に示すアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸番号６２〜９１、１０１〜１２０、１３０〜１５１、１６１〜１８５、１９５〜２１８、２２８〜２５７、２６７〜２９１、３０１〜３２５、３３５〜３６９、３７９〜４３８、４４８〜４９７、または５０７〜５３６に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸番号６２〜９１、１０１〜１２０、１３０〜１５１、１６１〜１８５、１９５〜２１８、２２８〜２５７、２６７〜２９１、３０１〜３２５、３３５〜３６９、３７９〜４３８、４４８〜４９７、または５０７〜５３６に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載のタンパク質を含有する、組成物。
【請求項２１】
細胞足場材料である、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記細胞足場材料が、幹細胞の培養用である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記幹細胞が、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞である、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
細胞培養容器のコーティング剤である、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２５】
前記細胞培養容器が、幹細胞の培養用である、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記幹細胞が、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞である、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載のタンパク質を備える、器具。
【請求項２８】
医療用または研究用の器具である、請求項２７に記載の器具。
【請求項２９】
細胞培養容器である、請求項２７または２８に記載の器具。
【請求項３０】
細胞足場材料である、請求項２７または２８に記載の器具。
【請求項３１】
細胞培養面が前記タンパク質でコーティングされている、請求項２９に記載の器具。
【請求項３２】
幹細胞の培養用である、請求項２７〜３１のいずれか１項に記載の器具。
【請求項３３】
前記幹細胞が、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞である、請求項３２に記載の器具。
【請求項３４】
請求項２７〜３３のいずれか１項に記載の器具で細胞を培養することを含む、培養細胞を製造する方法。
【請求項３５】
前記培養される細胞が幹細胞である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記幹細胞が、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項３８】
請求項３７に記載の遺伝子を搭載するベクター。
【請求項３９】
請求項３７に記載の遺伝子を有する宿主。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フィブロイン様タンパク質改変体およびそれを用いた細胞培養方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞、特に胚性幹細胞（ES細胞）や人工多能性幹細胞（iPS細胞）等の多能性幹細胞
は、再生医療への応用が期待されている。幹細胞の培養には、通常、フィーダー細胞が用いられている。しなしながら、臨床応用における制約等から、フィーダー細胞を代替する技術の開発が進められている。
【０００３】
例えば、フィブロネクチンやラミニン等の細胞接着性タンパク質を細胞培養用の足場材として用いて幹細胞を培養することが知られている。また、クモやカイコのフィブロインに細胞接着配列を導入したフィブロイン改変体を細胞培養用の足場材として用いて幹細胞を培養することが知られている（特許文献１〜２、非特許文献１）。細胞接着配列として、典型的には、ＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）を含むアミノ酸配列が知られている。一方、例えばラミニンにおいて、ＲＧＤを含まない細胞接着配列も見出されている。
【０００４】
しかしながら、フィブロインの繰り返し構造中にＲＧＤを含まない細胞接着配列を導入したフィブロイン改変体を細胞培養用の足場材として用いることにより、幹細胞を効率的に培養できることは知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】WO2015/036619
【特許文献２】特表2013-523174
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Bini E, Foo CW, Huang J, Karageorgiou V, Kitchel B, Kaplan DL., Biomacromolecules. 2006 Nov;7(11):3139-45., RGD-functionalized bioengineered spider dragline silk biomaterial.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、効率的に幹細胞等の細胞を培養する技術を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本願発明者は、鋭意検討の結果、ＲＧＤを含まない細胞接着配列を細胞接着性タンパク質のアミノ酸配列中に見出し、さらに、フィブロイン様タンパク質の繰り返し構造中にＲＧＤを含まない細胞接着配列を導入したフィブロイン様タンパク質改変体を細胞培養用の足場材として用いることにより、幹細胞を効率的に培養できることを見出し、本発明を完成させた。
【０００９】
すなわち本発明は、以下のとおり例示できる。
［１］
繰り返し構造と細胞接着配列を含むタンパク質であって、
前記繰り返し構造が、繰り返し単位の３回〜１５回の繰り返しからなり、
各繰り返し単位が、Ａｌａリッチ部位とＡｌａ非リッチ部位が連結してなり、
各Ａｌａリッチ部位が、８残基〜５４残基のアミノ酸配列からなり、
各Ａｌａリッチ部位におけるＡｌａ残基の比率が、３０％以上であり、
各Ａｌａリッチ部位が、同部位中のいずれの連続する４アミノ酸残基中にも少なくとも１個のＡｌａ残基を含み、
各Ａｌａ非リッチ部位が、４残基以上のアミノ酸配列からなり、
各Ａｌａ非リッチ部位におけるＡｌａ残基の比率が、２０％以下であり、
前記細胞接着配列が、前記繰り返し構造を構成する繰り返し単位から選択される１つまたはそれ以上の繰り返し単位中に含まれており、
各細胞接着配列が、細胞接着性タンパク質の部分アミノ酸配列であって、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐを含まない、５残基以上のアミノ酸配列からなる、タンパク質。
［２］
前記細胞接着配列が、前記繰り返し構造を構成する繰り返し単位から選択される２つまたはそれ以上の繰り返し単位中に含まれている、前記タンパク質。
［３］
前記タンパク質に含まれる前記細胞接着配列の総数が、１個〜５０個である、前記タンパク質。
［４］
各細胞接着配列が、Ａｌａ非リッチ部位中、またはＡｌａリッチ部位とＡｌａ非リッチ部位の連結部に挿入されている、前記タンパク質。
［５］
前記細胞接着性タンパク質が、ラミニンまたはビトロネクチンである、前記タンパク質。
［６］
各細胞接着配列が、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のアミノ酸配列からなる、前記タンパク質：
（ａ）配列番号７１のアミノ酸番号２１１３〜２１２４に示すアミノ酸配列；配列番号６のアミノ酸番号２８６６〜２８８０、２９０５〜２９１５、３１０２〜３１１１、３２０４〜３２０９、３２６０〜３２７０、３２６４〜３２７０、３２７６〜３２８６、または３３０６〜３３１９に示すアミノ酸配列；配列番号２２のアミノ酸番号１５６７〜１５８１、または１７３６〜１７４４に示すアミノ酸配列；配列番号２５のアミノ酸番号１４１１〜１４１９に示すアミノ酸配列；配列番号２８のアミノ酸番号２２１０〜２２１６、２３９７〜２４０２、２７４２〜２７５３、または２７４５〜２７５２に示すアミノ酸配列；配列番号３３のアミノ酸番号３６７〜３７７に示すアミノ酸配列；それらのアミノ酸番号の開始位置および／または終了位置が１〜５残基前後してなるアミノ酸配列；またはそれらのアミノ酸配列の組み合わせ；
（ｂ）前記（ａ）に示すアミノ酸配列において１〜３個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含み、且つＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐを含まないアミノ酸配列；（ｃ）前記（ａ）に示すアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有し、且つＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐを含まないアミノ酸配列。
［７］
各細胞接着配列が、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のアミノ酸配列からなる、前記タンパク質：
（ａ）配列番号３４〜４４、４７、４９、５０、および７２〜７４のいずれかに示すアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号３４〜４４、４７、４９、５０、および７２〜７４のいずれかに示すアミノ酸配列において１〜３個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含み、且つＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐを含まないアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号３４〜４４、４７、４９、５０、および７２〜７４のいずれかに示すアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有し、且つＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐを含まないアミノ酸配列。
［８］
各細胞接着配列が、人工多能性幹細胞の細胞足場材への接着を阻害する機能を示すアミノ酸配列からなる、前記タンパク質。
［９］
各Ａｌａリッチ部位が、８残基〜１５残基のアミノ酸配列からなる、前記タンパク質。［１０］
各Ａｌａリッチ部位が、９残基のアミノ酸配列からなる、前記タンパク質。
［１１］
各Ａｌａリッチ部位が、Ｇｌｙ残基およびＳｅｒ残基をそれぞれ１個以上含む、前記タンパク質。
［１２］
各Ａｌａリッチ部位におけるＡｌａ残基の比率が、５０％以上である、前記タンパク質。
［１３］
各Ａｌａリッチ部位におけるＡｌａ残基、Ｇｌｙ残基、およびＳｅｒ残基の比率が、合計で、９０％以上である、前記タンパク質。
［１４］
各Ａｌａリッチ部位が、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のアミノ酸配列からなる、前記タンパク質：
（ａ）配列番号７、８、９、または１０に示すアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号７、８、９、または１０に示すアミノ酸配列において、１〜３個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号７、８、９、または１０に示すアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列。
［１５］
各Ａｌａ非リッチ部位が、１５残基〜１００残基のアミノ酸配列からなる、前記タンパク質。
［１６］
各Ａｌａ非リッチ部位におけるＡｌａ残基の比率が、５％以下である、前記タンパク質。
［１７］
各Ａｌａ非リッチ部位におけるＧｌｙ残基、Ｓｅｒ残基、Ｇｌｎ残基、Ｐｒｏ残基、Ｔｙｒ残基の比率が、合計で、９０％以上である、前記タンパク質。
［１８］
各Ａｌａ非リッチ部位が、下記（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）に記載のアミノ酸配列から選択される１種またはそれ以上のアミノ酸配列を含む、前記タンパク質：
（ａ）配列番号１１〜２１に示すアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１１〜２１に示すアミノ酸配列において、１〜３個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号１１〜２１に示すアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列。
［１９］
各Ａｌａ非リッチ部位が、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のアミノ酸配列からなる、前記タンパク質：
（ａ）配列番号２のアミノ酸番号６２〜９１、１０１〜１２０、１３０〜１５１、１６１〜１８５、１９５〜２１８、２２８〜２５７、２６７〜２９１、３０１〜３２５、３３５〜３６９、３７９〜４３８、４４８〜４９７、または５０７〜５３６に示すアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸番号６２〜９１、１０１〜１２０、１３０〜１５１、１６１〜１８５、１９５〜２１８、２２８〜２５７、２６７〜２９１、３０１〜３２５、３３５
〜３６９、３７９〜４３８、４４８〜４９７、または５０７〜５３６に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸番号６２〜９１、１０１〜１２０、１３０〜１５１、１６１〜１８５、１９５〜２１８、２２８〜２５７、２６７〜２９１、３０１〜３２５、３３５〜３６９、３７９〜４３８、４４８〜４９７、または５０７〜５３６に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列。
［２０］
前記タンパク質を含有する、組成物。
［２１］
細胞足場材料である、前記組成物。
［２２］
前記細胞足場材料が、幹細胞の培養用である、前記組成物。
［２３］
前記幹細胞が、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞である、前記組成物。
［２４］
細胞培養容器のコーティング剤である、前記組成物。
［２５］
前記細胞培養容器が、幹細胞の培養用である、前記組成物。
［２６］
前記幹細胞が、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞である、前記組成物。
［２７］
前記タンパク質を備える、器具。
［２８］
医療用または研究用の器具である、前記器具。
［２９］
細胞培養容器である、前記器具。
［３０］
細胞足場材料である、前記器具。
［３１］
細胞培養面が前記タンパク質でコーティングされている、前記器具。
［３２］
幹細胞の培養用である、前記器具。
［３３］
前記幹細胞が、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞である、前記器具。
［３４］
前記器具で細胞を培養することを含む、培養細胞を製造する方法。
［３５］
前記培養される細胞が幹細胞である、前記方法。
［３６］
前記幹細胞が、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞である、前記方法。
［３７］
前記タンパク質をコードする遺伝子。
［３８］
前記遺伝子を搭載するベクター。
［３９］
前記遺伝子を有する宿主。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、効率的に幹細胞等の細胞を培養することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ラミニン部分配列挿入フィブロイン様タンパク質を細胞培養プレートにコーティングし、ｉＰＳ細胞足場機能を評価した結果を示す図である。
【図２】ラミニン部分配列挿入フィブロイン様タンパク質を細胞培養プレートにコーティングし、ｉＰＳ細胞足場機能を2週間にわたって評価した結果を示す図である。横軸は「週」を示す。
【図３】iMatrixをコートした細胞培養プレートにおいてラミニン部分配列RKRLQVQLSIRTのｉＰＳ細胞接着阻害機能を評価した結果を示す図である。
【図４】マトリゲルをコートした細胞培養プレートにおいてラミニン部分配列RKRLQVQLSIRTのｉＰＳ細胞接着阻害機能を評価した結果を示す図である。
【図５】iMatrixをコートした細胞培養プレートにおいてラミニン部分配列GCISNVFVQRLLのｉＰＳ細胞接着阻害機能を評価した結果を示す図である。
【図６】iMatrixをコートした細胞培養プレートにおいてラミニン部分配列AASIKVAVSADRのｉＰＳ細胞接着阻害機能を評価した結果を示す図である。
【図７】iMatrixをコートした細胞培養プレートにおいて改変ラミニン部分配列PGASIKVAVSAGPSのｉＰＳ細胞接着阻害機能を評価した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１３】
＜１＞本発明のタンパク質
＜１−１＞本発明のタンパク質
本発明のタンパク質は、繰り返し構造と細胞接着配列を含むタンパク質である。
【００１４】
本発明のタンパク質は、具体的には、細胞接着配列が挿入されたフィブロイン様タンパク質であってよい。すなわち、本発明のタンパク質を「細胞接着配列挿入フィブロイン様タンパク質」ともいう。
【００１５】
本発明において、「フィブロイン様タンパク質」とは、フィブロインおよびそれに準ずる構造を有するタンパク質の総称である。
【００１６】
「フィブロイン」とは、クモの糸やカイコの糸を構成する繊維状タンパク質である。すなわち、フィブロインとしては、クモのフィブロインやカイコのフィブロインが挙げられる。クモの種類、カイコの種類、糸の種類は、特に制限されない。クモとしては、ニワオニグモ（Araneus diadematus）やアメリカジョロウグモ（Nephila clavipes）が挙げられる。クモとしては、他にも、Araneus bicentenarius、Argiope amoena、Argiope aurantia、Argiope trifasciata、Cyrtophora moluccensis、Dolomedes tenebrosus、Euprosthenops australis、Gasteracantha mammosa、Latrodectus geometricus、Latrodectus hesperus、Macrothele holsti、Nephila pilipes、Nephila madagascariensis、Nephila senegalensis、Octonoba varians、Psechrus sinensis、Tetragnatha kauaiensis、Tetragnatha versicolorが挙げられる。クモのフィブロインとしては、大瓶状腺で産生するしおり糸、枠糸、縦糸のタンパク質（大瓶状腺タンパク質）、小瓶状腺で産生する足場糸のタンパク質（小瓶状腺タンパク質）、鞭状腺で産生する横糸のタンパク質（鞭状腺タンパク質）が挙げられる。クモのフィブロインとして、具体的には、例えば、ニワオニグモの大瓶状腺タンパク質ADF3およびADF4や、アメリカジョロウグモの大瓶状腺タンパク質MaSp1およ
びMaSp2が挙げられる。カイコとしては、家蚕（Bombyx mori）やエリ蚕（Samia cynthia
）が挙げられる。これらフィブロインのアミノ酸配列、及びこれらフィブロインをコードする遺伝子（「フィブロイン遺伝子」ともいう）の塩基配列は、例えば、NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）等の公用データベースから取得できる。
【００１７】
「フィブロインに準ずる構造を有するタンパク質」とは、フィブロインが有する反復配列と同様の配列を有するタンパク質をいう。「フィブロインが有する反復配列と同様の配列」とは、実際にフィブロインが有する配列であってもよく、それと類似する配列であってもよい。フィブロインが有する反復配列と同様の配列としては、本発明において規定される「繰り返し構造」が挙げられる。フィブロインに準ずる構造を有するタンパク質としては、WO2012/165476に記載の大吐糸管しおり糸タンパク質に由来するポリペプチドや、WO2006/008163に記載の組換えスパイダーシルクタンパク質が挙げられる。また、フィブロインに準ずる構造を有するタンパク質としては、実施例で用いたADF3タンパク質も挙げられる。実施例で用いたADF3遺伝子の塩基配列を配列番号１に、同遺伝子がコードするADF3タンパク質のアミノ酸配列を配列番号２に示す。なお、配列番号１の７位〜１９８９位の塩基配列が、配列番号２に示すアミノ酸配列をコードする。フィブロインに準ずる構造を有するタンパク質は、繊維状タンパク質であってもよく、なくてもよい。
【００１８】
「繊維状タンパク質」とは、所定の条件下で繊維状の形態を取るタンパク質をいう。すなわち、繊維状タンパク質は、繊維状の形態で発現するタンパク質であってもよく、発現時には繊維状の形態ではないが繊維状の形態に加工可能なタンパク質であってもよい。繊維状タンパク質は、例えば、封入体として発現し、その後、適当な手法により繊維状の形態に加工可能なタンパク質であってもよい。タンパク質を繊維状の形態に加工する手法としては、例えば、WO2012/165476に記載の方法が挙げられる。
【００１９】
すなわち、フィブロイン様タンパク質は、例えば、上記データベースや文献に開示されたフィブロイン様タンパク質のアミノ酸配列または配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。また、フィブロイン様タンパク質は、例えば、それらのアミノ酸配列の一部を有するタンパク質であってもよい。アミノ酸配列の一部としては、フィブロインが有する反復配列と同様の配列を有する部分が挙げられる。アミノ酸配列の一部として、具体的には、例えば、配列番号２の２５位〜６１０位のアミノ酸配列や５３位〜５３６位のアミノ酸配列が挙げられる。同様に、フィブロイン様タンパク質をコードする遺伝子（「フィブロイン様タンパク質遺伝子」ともいう）は、例えば、上記データベースや文献に開示されたフィブロイン遺伝子の塩基配列または配列番号１の７位〜１９８９位の塩基配列を有する遺伝子であってよい。また、フィブロイン様タンパク質遺伝子は、例えば、それらの塩基配列の一部を有する遺伝子であってもよい。塩基配列の一部としては、フィブロインが有する反復配列と同様の配列を有するアミノ酸配列をコードする部分が挙げられる。なお、「（アミノ酸または塩基）配列を有する」という表現は、当該「（アミノ酸または塩基）配列を含む」場合および当該「（アミノ酸または塩基）配列からなる」場合を包含する。
【００２０】
フィブロイン様タンパク質は、元の機能が維持されている限り、上記例示したフィブロイン様タンパク質（すなわち、上記例示したフィブロインまたはそれに準ずる構造を有するタンパク質）のバリアントであってもよい。同様に、フィブロイン様タンパク質遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記例示したフィブロイン様タンパク質遺伝子（すなわち、上記例示したフィブロインまたはそれに準ずる構造を有するタンパク質をコードする遺伝子）のバリアントであってもよい。なお、このような元の機能が維持されたバリアントを「保存的バリアント」という場合がある。保存的バリアントとしては、例えば、上記例示したフィブロイン様タンパク質やそれをコードする遺伝子のホモログや人為的な改変体が挙げられる。
【００２１】
「元の機能が維持されている」とは、遺伝子やタンパク質のバリアントが、元の遺伝子やタンパク質の機能（活性や性質）に対応する機能（活性や性質）を有することをいう。すなわち、「元の機能が維持されている」とは、フィブロイン様タンパク質にあっては、
タンパク質のバリアントが、細胞接着配列の挿入により幹細胞等の細胞に対する足場機能を示すことをいう。また、「元の機能が維持されている」とは、フィブロイン様タンパク質遺伝子にあっては、遺伝子のバリアントが、元の機能が維持されたタンパク質（すなわち細胞接着配列の挿入により幹細胞等の細胞に対する足場機能を示すタンパク質）をコードすることをいう。
【００２２】
フィブロイン様タンパク質のホモログとしては、例えば、上記フィブロイン様タンパク質のアミノ酸配列を問い合わせ配列として用いたBLAST検索やFASTA検索によって公開データベースから取得されるタンパク質が挙げられる。また、上記フィブロイン様タンパク質遺伝子のホモログは、例えば、各種生物の染色体を鋳型にして、上記フィブロイン様タンパク質遺伝子の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲにより取得することができる。
【００２３】
以下、フィブロイン様タンパク質およびフィブロイン様タンパク質遺伝子の保存的バリアントについて例示する。
【００２４】
フィブロイン様タンパク質は、元の機能が維持されている限り、上記フィブロイン様タンパク質のアミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。なお上記「１若しくは数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には、例えば、１〜５０個、１〜４０個、１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個を意味する。
【００２５】
上記の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、および／または付加は、タンパク質の機能が正常に維持される保存的変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸
性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln
、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、および／または付加には、タンパク質が由来する生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。
【００２６】
また、フィブロイン様タンパク質は、元の機能が維持されている限り、上記フィブロイン様タンパク質のアミノ酸配列全体に対して、80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、さらに好ましくは97％以上、特に好ましくは99％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。尚、本明細書において、「相同性」（homology）は、「同一性」（identity）を指す。
【００２７】
また、フィブロイン様タンパク質は、元の機能が維持されている限り、上記フィブロイ
ン様タンパク質遺伝子の塩基配列から調製され得るプローブ、例えば同塩基配列の全体または一部に対する相補配列、とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAにコ
ードされるタンパク質であってもよい。そのようなプローブは、例えば、同塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、同塩基配列を含むDNA断片を鋳型
とするPCRによって作製することができる。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる
特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いDNA同士、例えば80％以上、好ましくは90％以上、より好ま
しくは95％以上、さらに好ましくは97％以上、特に好ましくは99％以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1×SSC、0.1
％ SDS、好ましくは60℃、0.1×SSC、0.1％ SDS、より好ましくは68℃、0.1×SSC、0.1％
SDSに相当する塩濃度および温度で、１回、好ましくは２〜３回洗浄する条件を挙げることができる。また、例えば、プローブとして、300 bp程度の長さのDNA断片を用いる場合
には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件としては、50℃、2×SSC、0.1％ SDSが挙げ
られる。
【００２８】
また、フィブロイン様タンパク質遺伝子は、任意のコドンをそれと等価のコドンに置換したものであってもよい。すなわち、フィブロイン様タンパク質遺伝子は、コドンの縮重による上記例示したフィブロイン様タンパク質遺伝子のバリアントであってもよい。例えば、フィブロイン様タンパク質遺伝子は、使用する宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを有するように改変されてよい。
【００２９】
２つの配列間の配列同一性のパーセンテージは、例えば、数学的アルゴリズムを用いて決定できる。このような数学的アルゴリズムの限定されない例としては、Myers and Miller (1988) CABIOS 4:11-17のアルゴリズム、Smith et al (1981) Adv. Appl. Math. 2:482の局所ホモロジーアルゴリズム、Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453のホモロジーアライメントアルゴリズム、 Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-2448の類似性を検索する方法、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877に記載されているような、改良された、Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264のアルゴリズムが挙げられる。
【００３０】
これらの数学的アルゴリズムに基づくプログラムを利用して、配列同一性を決定するための配列比較（アラインメント）を行うことができる。プログラムは、適宜、コンピュータにより実行することができる。このようなプログラムとしては、特に限定されないが、PC/GeneプログラムのCLUSTAL（Intelligenetics, Mountain View, Calif.から入手可能）、ALIGNプログラム（Version 2.0）、並びにWisconsin Genetics Software Package, Version 8（Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Drive, Madison, Wis., USAから入手可能）のGAP、BESTFIT、BLAST、FASTA、及びTFASTAが挙げられる。これらのプログラムを用いたアライメントは、例えば、初期パラメーターを用いて行うことができる。CLUSTALプログラムについては、Higgins et al. (1988) Gene 73:237-244、Higgins et al. (1989) CABIOS 5:151-153、Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90、Huang et al. (1992) CABIOS 8:155-65、及びPearson et al. (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307-331によく記載されている。
【００３１】
対象のタンパク質をコードするヌクレオチド配列と相同性があるヌクレオチド配列を得るために、具体的には、例えば、BLASTヌクレオチド検索を、BLASTNプログラム、スコア
＝100、ワード長＝12にて行うことができる。対象のタンパク質と相同性があるアミノ酸
配列を得るために、具体的には、例えば、BLASTタンパク質検索を、BLASTXプログラム、
スコア＝50、ワード長＝3にて行うことができる。BLASTヌクレオチド検索やBLASTタンパ
ク質検索については、http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照されたい。また、比較を目的
としてギャップを加えたアライメントを得るために、Gapped BLAST（BLAST 2.0）を利用
できる。また、PSI-BLAST（BLAST 2.0）を、配列間の離間した関係を検出する反復検索を行うのに利用できる。Gapped BLASTおよびPSI-BLASTについては、Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389を参照されたい。BLAST、Gapped BLAST、またはPSI-BLASTを利用する場合、例えば、各プログラム（例えば、ヌクレオチド配列に対してBLASTN、アミノ酸配列に対してBLASTX）の初期パラメーターが用いられ得る。アライメントは、手動にて行われてもよい。
【００３２】
２つの配列間の配列同一性は、２つの配列を最大一致となるように整列したときに２つの配列間で一致する残基の比率として算出される。
【００３３】
本発明のタンパク質は、細胞接着配列を含むこと以外は、上記例示したフィブロイン様タンパク質やその保存的バリアントと同一のアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。また、本発明のタンパク質をコードする遺伝子は、細胞接着配列をコードする塩基配列を含むこと以外は、上記例示したフィブロイン様タンパク質遺伝子やその保存的バリアントと同一の塩基配列を有する遺伝子であってよい。
【００３４】
本発明のタンパク質として、具体的には、実施例で用いた細胞接着配列挿入フィブロイン様タンパク質が挙げられる。実施例で用いた細胞接着配列挿入フィブロイン様タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号３および５１〜６０に、同遺伝子がコードする細胞接着配列挿入フィブロイン様タンパク質のアミノ酸配列を配列番号４および６１〜７０に示す。すなわち、本発明のタンパク質は、例えば、配列番号４および６１〜７０のいずれかに示すアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。また、本発明のタンパク質として、具体的には、実施例で用いた細胞接着配列挿入フィブロイン様タンパク質の保存的バリアントであって細胞接着配列を有しているものも挙げられる。細胞接着配列挿入フィブロイン様タンパク質の保存的バリアントについては、フィブロイン様タンパク質の保存的バリアントについての記載を準用できる。細胞接着配列挿入フィブロイン様タンパク質についての「元の機能が維持されている」とは、タンパク質のバリアントが、幹細胞等の細胞に対する足場機能を示すことをいう。
【００３５】
なお、本発明において、「遺伝子」という用語は、目的のタンパク質をコードする限り、ＤＮＡに限られず、任意のポリヌクレオチドを包含してよい。すなわち、「本発明のタンパク質をコードする遺伝子」とは、本発明のタンパク質をコードする任意のポリヌクレオチドを意味してよい。本発明のタンパク質をコードする遺伝子は、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよく、その組み合わせであってもよい。本発明のタンパク質をコードする遺伝子は、一本鎖であってもよく、二本鎖であってもよい。本発明のタンパク質をコードする遺伝子は、一本鎖ＤＮＡであってもよく、一本鎖ＲＮＡであってもよい。本発明のタンパク質をコードする遺伝子は、二本鎖ＤＮＡであってもよく、二本鎖ＲＮＡであってもよく、ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖からなるハイブリッド鎖であってもよい。本発明のタンパク質をコードする遺伝子は、単一のポリヌクレオチド鎖中に、ＤＮＡ残基とＲＮＡ残基の両方を含んでいてもよい。本発明のタンパク質をコードする遺伝子がＲＮＡを含む場合、上記例示した塩基配列等のＤＮＡに関する記載は、ＲＮＡに合わせて適宜読み替えてよい。本発明のタンパク質をコードする遺伝子の態様は、その利用態様等の諸条件に応じて適宜選択できる。
【００３６】
以下、本発明のタンパク質の構造について、具体的に説明する。
【００３７】
本発明のタンパク質は、繰り返し構造と細胞接着配列を含む。前記繰り返し構造は、繰り返し単位の繰り返しからなる。各繰り返し単位は、Ａｌａリッチ部位とＡｌａ非リッチ部位が連結してなる。各繰り返し単位において、Ａｌａリッチ部位がＮ末側、Ａｌａ非リ
ッチ部位がＣ末側である。すなわち、前記繰り返し構造は、具体的には、Ｎ末端からＣ末端に向けて、Ａｌａリッチ部位とＡｌａ非リッチ部位が交互に連結してなる。
【００３８】
繰り返し単位の繰り返し数は、３回〜１５回である。繰り返し単位の繰り返し数は、例えば、４回以上、５回以上、６回以上、７回以上、８回以上、９回以上、または１０回以上であってもよい。繰り返し単位の繰り返し数は、例えば、１２回以下、１０回以下、８回以下、または６回以下であってもよい。繰り返し単位の繰り返し数は、例えば、上記例示した範囲の矛盾しない組み合わせの範囲であってもよい。繰り返し単位の繰り返し数は、具体的には、例えば、３回〜１２回、３回〜１０回、３回〜８回、３回〜６回、５回〜１５回、７回〜１５回、または１０回〜１５回であってもよい。
【００３９】
繰り返し単位の構成は、各繰り返しにおいて、同一であってもよく、そうでなくてもよい。すなわち、Ａｌａリッチ部位の構成は、各繰り返しにおいて、同一であってもよく、そうでなくてもよい。また、Ａｌａ非リッチ部位の構成は、各繰り返しにおいて、同一であってもよく、そうでなくてもよい。すなわち、繰り返し単位の構成、Ａｌａリッチ部位の構成、およびＡｌａ非リッチ部位の構成は、各繰り返しにおいてそれぞれ独立に設定できる。すなわち、繰り返し単位、Ａｌａリッチ部位、およびＡｌａ非リッチ部位としては、それぞれ、１種のアミノ酸配列を用いてもよく、２種またはそれ以上のアミノ酸配列を組み合わせて用いてもよい。
【００４０】
＜Ａｌａリッチ部位＞
「Ａｌａリッチ部位」とは、Ａｌａ残基の比率が高い部位（高い比率でＡｌａ残基を含む部位）をいう。
【００４１】
Ａｌａリッチ部位の長さは、８残基〜５４残基である。すなわち、Ａｌａリッチ部位は、８残基〜５４残基のアミノ酸配列からなる。Ａｌａリッチ部位の長さは、例えば、４０残基以下、３０残基以下、２０残基以下、１５残基以下、または１０残基以下であってもよい。Ａｌａリッチ部位の長さは、例えば、上記例示した範囲の組み合わせの範囲であってもよい。Ａｌａリッチ部位の長さは、具体的には、例えば、８残基〜１５残基、または８残基〜１０残基であってもよい。Ａｌａリッチ部位の長さは、より具体的には、例えば、９残基であってもよい。
【００４２】
Ａｌａリッチ部位は、Ａｌａ残基からなるものであってもよく、Ａｌａ残基と他のアミノ酸残基（Ａｌａ残基以外のアミノ酸残基）との組み合わせからなるものであってもよい。
【００４３】
Ａｌａリッチ部位におけるＡｌａ残基の比率は、３０％以上である。Ａｌａリッチ部位におけるＡｌａ残基の比率は、例えば、４０％以上、５０％以上、６０％以上、または７０％以上であってもよい。Ａｌａリッチ部位におけるＡｌａ残基の比率は、例えば、１００％以下、９５％以下、９０％以下、８５％以下、または８０％以下であってもよい。Ａｌａリッチ部位におけるＡｌａ残基の比率は、例えば、上記例示した範囲の組み合わせの範囲であってもよい。Ａｌａリッチ部位におけるＡｌａ残基の比率は、具体的には、例えば、３０％〜１００％、５０％〜９０％、または６０％〜８５％であってもよい。「Ａｌａリッチ部位におけるＡｌａ残基の比率」とは、Ａｌａリッチ部位を構成するアミノ酸残基の総数に対する同Ａｌａリッチ部位に含まれるＡｌａ残基の個数の比率である。Ａｌａリッチ部位における他の任意のアミノ酸残基の比率も、同様に算出できる。
【００４４】
他のアミノ酸残基（Ａｌａ残基以外のアミノ酸残基）としては、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐが挙げられる。他のアミノ酸残基
として、具体的には、例えば、Ｇｌｙ残基およびＳｅｒ残基が挙げられる。Ａｌａリッチ部位は、他のアミノ酸残基を、１種のみ含んでいてもよく、２種またはそれ以上含んでいてもよい。Ａｌａリッチ部位は、例えば、Ｇｌｙ残基を１個以上含んでいてもよく、Ｓｅｒ残基を１個以上含んでいてもよく、Ｇｌｙ残基およびＳｅｒ残基をそれぞれ１個以上含んでいてもよい。Ａｌａリッチ部位の両端（Ｎ末端およびＣ末端）は、それぞれ、例えば、Ａｌａ残基、Ｇｌｙ残基、またはＳｅｒ残基であってよい。具体的には、例えば、Ａｌａリッチ部位のＮ末端がＡｌａ残基またはＧｌｙ残基で、Ａｌａリッチ部位のＣ末端がＡｌａ残基またはＳｅｒ残基であってもよい。Ａｌａリッチ部位におけるＡｌａ残基、Ｇｌｙ残基、およびＳｅｒ残基の比率は、合計で、例えば、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、または１００％であってよい。
【００４５】
Ａｌａリッチ部位は、同部位中のいずれの連続する４アミノ酸残基中にも、少なくとも１個のＡｌａ残基を含む。すなわち、Ａｌａリッチ部位には、Ａｌａ残基を含まない連続する４アミノ酸残基は存在しない。また、Ａｌａリッチ部位は、同部位中のいずれの連続する７、６、または５アミノ酸残基中にも、少なくとも２個のＡｌａ残基を含んでいてもよい。すなわち、Ａｌａリッチ部位には、Ａｌａ残基を含まない、あるいは、Ａｌａ残基を１個のみ含む、連続する７、６、または５アミノ酸残基は存在しなくてもよい。
【００４６】
Ａｌａリッチ部位のアミノ酸配列としては、例えば、フィブロイン様タンパク質のアミノ酸配列中の、上述したようなＡｌａリッチ部位の要件を満たす部分のアミノ酸配列が挙げられる。フィブロイン様タンパク質については上述した通りである。配列番号２に示すアミノ酸配列の内、上述したようなＡｌａリッチ部位の要件を満たす部分としては、アミノ酸番号５３〜６１、９２〜１００、１２１〜１２９、１５２〜１６０、１８６〜１９４、２１９〜２２７、２５８〜２６６、２９２〜３００、３２６〜３３４、３７０〜３７８、４３９〜４４７、４９８〜５０６の部分が挙げられる。それらＡｌａリッチ部位の要件を満たす部分のアミノ酸配列として、具体的には、例えば、GASAAAAAA（配列番号７）、GSSAAAAAA（配列番号８）、GASAASAAS（配列番号９）、GASAAAGAA（配列番号１０）が挙げられる。すなわち、Ａｌａリッチ部位は、例えば、それらＡｌａリッチ部位の要件を満たす部分のアミノ酸配列（例えば、配列番号７、８、９、または１０）を有するものであってよい。
【００４７】
また、Ａｌａリッチ部位は、それらＡｌａリッチ部位の要件を満たす部分のアミノ酸配列（例えば、配列番号７、８、９、または１０）のバリアントであってもよい。それらＡｌａリッチ部位の要件を満たす部分のバリアントについては、フィブロイン様タンパク質の保存的バリアントについての記載を準用できる。Ａｌａリッチ部位は、例えば、それらＡｌａリッチ部位の要件を満たす部分のアミノ酸配列（例えば、配列番号７、８、９、または１０）において、１若しくは数個の位置での１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有するものであってもよい。なお上記「１若しくは数個」とは、それらＡｌａリッチ部位の要件を満たす部分の長さ等にもよるが、例えば、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、１個であってもよい。また、Ａｌａリッチ部位は、例えば、それらＡｌａリッチ部位の要件を満たす部分のアミノ酸配列（例えば、配列番号７、８、９、または１０）全体に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するものであってもよい。それらＡｌａリッチ部位の要件を満たす部分のバリアントについては、改変後のアミノ酸配列が上述したようなＡｌａリッチ部位の要件を満たす限り、特に制限されない。
【００４８】
＜Ａｌａ非リッチ部位＞
「Ａｌａ非リッチ部位」とは、Ａｌａ残基の比率が低い部位をいう。
【００４９】
Ａｌａ非リッチ部位の長さは、４残基以上である。すなわち、Ａｌａ非リッチ部位は、４残基以上のアミノ酸配列からなる。Ａｌａ非リッチ部位の長さは、例えば、１０残基以上、１５残基以上、２０残基以上、３０残基以上、４０残基以上、または５０残基以上であってもよい。Ａｌａ非リッチ部位の長さは、例えば、２００残基以下、１５０残基以下、１００残基以下、８０残基以下、６０残基以下、または４０残基以下であってもよい。Ａｌａ非リッチ部位の長さは、上記の矛盾しない組み合わせの範囲であってもよい。Ａｌａ非リッチ部位の長さは、具体的には、例えば、４残基〜２００残基、１０残基〜１５０残基、または１５残基〜１００残基であってもよい。
【００５０】
Ａｌａ非リッチ部位は、Ａｌａ残基を含んでいてもよく、含んでいなくてもよい。Ａｌａ非リッチ部位におけるＡｌａ残基の比率は、２０％以下である。Ａｌａ非リッチ部位におけるＡｌａ残基の比率は、例えば、１６％以下、１４％以下、１０％以下、５％以下、または０％であってもよい。
【００５１】
Ａｌａ非リッチ部位は、具体的には、例えば、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ｔｙｒから選択される１種またはそれ以上、例えば全て、のアミノ酸残基を含んでいてもよい。Ａｌａ非リッチ部位におけるＧｌｙ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ｔｙｒの比率は、合計で、例えば、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、または１００％であってよい。Ａｌａ非リッチ部位は、Ａｌａ残基を含まない連続する４アミノ酸残基を含んでいてよい。Ａｌａ非リッチ部位は、例えば、Ａｌａ残基を含まない連続する４アミノ酸残基を両端（Ｎ末端およびＣ末端）に含んでいてもよい。
【００５２】
Ａｌａ非リッチ部位のアミノ酸配列としては、例えば、フィブロイン様タンパク質のアミノ酸配列中の、上述したようなＡｌａ非リッチ部位の要件を満たす部分のアミノ酸配列が挙げられる。フィブロイン様タンパク質については上述した通りである。配列番号２に示すアミノ酸配列の内、上述したようなＡｌａ非リッチ部位の要件を満たす部分としては、アミノ酸番号６２〜９１、１０１〜１２０、１３０〜１５１、１６１〜１８５、１９５〜２１８、２２８〜２５７、２６７〜２９１、３０１〜３２５、３３５〜３６９、３７９〜４３８、４４８〜４９７、５０７〜５３６の部分が挙げられる。すなわち、Ａｌａ非リッチ部位は、例えば、それらＡｌａ非リッチ部位の要件を満たす部分のアミノ酸配列を有するものであってよい。また、それらＡｌａ非リッチ部位の要件を満たす部分に含まれるモチーフとして、具体的には、例えば、GGYGPGSGQQG（配列番号１１）、GGNGPGSGQQG（配列番号１２）、GGYGPGYGQQG（配列番号１３）、GGYGPGSGQG（配列番号１４）、PGQQG（配列番号１５）、AGQQG（配列番号１６）、SGQQG（配列番号１７）、PSQQG（配列番号１８
）、PGGQG（配列番号１９）、PYGP（配列番号２０）、AYGP（配列番号２１）が挙げられ
る。配列番号１１〜１４に示すモチーフを総称して「モチーフＡ」、配列番号１５〜１９に示すモチーフを総称して「モチーフＢ」、配列番号２０〜２１に示すモチーフを総称して「モチーフＣ」ともいう。すなわち、Ａｌａ非リッチ部位は、より一般的には、例えば、これらのモチーフから選択される１種またはそれ以上を有するものであってよい。Ａｌａ非リッチ部位は、具体的には、例えば、モチーフＡおよびＢを有していてもよく、さらにモチーフＣを有していてもよい。Ａｌａ非リッチ部位がこれらのモチーフから選択される２種またはそれ以上のモチーフを有する場合、それらの順序は特に制限されない。Ａｌａ非リッチ部位は、例えば、Ｎ末端からＣ末端に向けて、モチーフＡおよびＢを有していてもよく、モチーフＡ、Ｂ、およびＣを有していてもよい。Ａｌａ非リッチ部位は、これらのモチーフを、いずれも、１個のみ有していてもよく、２個またはそれ以上有していてもよい。Ａｌａ非リッチ部位がいずれかのモチーフを２個またはそれ以上有する場合、同モチーフは、Ａｌａ非リッチ部位中で、タンデムに並んでいてもよく、そうでなくてもよい。Ａｌａ非リッチ部位は、例えば、モチーフＢを、１個のみ有していてもよく、２個またはそれ以上有していてもよい。１つのＡｌａ非リッチ部位に含まれるモチーフＢの数は、例えば、１個以上、２個以上、３個以上、５個以上、または７個以上であってもよく、
１５個以下、１０個以下、７個以下、または５個以下であってもよく、それらの矛盾しない組み合わせであってもよい。
【００５３】
また、Ａｌａ非リッチ部位は、それらＡｌａ非リッチ部位の要件を満たす部分のアミノ酸配列のバリアントやそれらに含まれるモチーフのバリアントであってもよい。それらＡｌａ非リッチ部位の要件を満たす部分のアミノ酸配列のバリアントやそれらに含まれるモチーフのバリアントについては、フィブロイン様タンパク質の保存的バリアントについての記載を準用できる。Ａｌａ非リッチ部位は、例えば、それらＡｌａ非リッチ部位の要件を満たす部分のアミノ酸配列やそれらに含まれるモチーフにおいて、１若しくは数個の位置での１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有するものであってもよい。なお上記「１若しくは数個」とは、それらＡｌａ非リッチ部位の要件を満たす部分の長さ等にもよるが、例えば、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、または１個であってもよい。また、Ａｌａ非リッチ部位は、例えば、それらＡｌａ非リッチ部位の要件を満たす部分のアミノ酸配列全体やそれらに含まれるモチーフ全体に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するものであってもよい。それらＡｌａ非リッチ部位の要件を満たす部分のアミノ酸配列のバリアントやそれらに含まれるモチーフのバリアントについては、改変後のアミノ酸配列が上述したようなＡｌａ非リッチ部位の要件を満たす限り、特に制限されない。
【００５４】
＜細胞接着配列＞
「細胞接着配列」とは、幹細胞等の細胞に対する足場機能をフィブロイン様タンパク質等のタンパク質に付与できるアミノ酸配列を意味する。「細胞接着配列」とは、具体的には、フィブロイン様タンパク質等のタンパク質に挿入することにより幹細胞等の細胞に対する足場機能を同タンパク質に付与できるアミノ酸配列を意味する。このような性質（すなわち、幹細胞等の細胞に対する足場機能をフィブロイン様タンパク質等のタンパク質に付与できる性質）を「細胞接着配列としての性質」ともいう。
【００５５】
細胞接着配列は、ＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）を含まない、５残基以上のアミノ酸配列からなる。すなわち、細胞接着配列の長さは、５残基以上である。細胞接着配列の長さは、例えば、５０残基以下、３０残基以下、または１８残基以下であってもよい。細胞接着配列の長さは、上記の矛盾しない組み合わせの範囲であってもよい。細胞接着配列の長さは、具体的には、例えば、５残基〜５０残基、５残基〜３０残基、または５残基〜１８残基であってもよい。細胞接着配列としては、細胞接着性タンパク質の部分アミノ酸配列（細胞接着性タンパク質のアミノ酸配列の一部）であってＲＧＤを含まないもの（細胞接着性タンパク質の非ＲＧＤ配列）が挙げられる。細胞接着性タンパク質として、具体的には、例えば、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン、オステオポンチン、ラミニンが挙げられる。細胞接着性タンパク質としては、特に、ラミニンやビトロネクチンが挙げられる。細胞接着性タンパク質として、さらに特には、ラミニンが挙げられる。ラミニンは、α鎖、β鎖、およびγ鎖からなるヘテロ三量体構造を有する。ヒトやマウス等の哺乳類のラミニンのサブユニット鎖としては、５種のα鎖（α１〜α５）、３種のβ鎖（β１〜β３）、３種のγ鎖（γ１〜γ３）が挙げられる。ラミニンは、これらサブユニット鎖の組み合わせによって種々のアイソフォームを構成する。ヒトラミニンとして、具体的には、α５β１γ１からなるヒトラミニン５１１、α５β２γ１からなるヒトラミニン５２１、α３β３γ２からなるヒトラミニン３３２が挙げられる。ヒトラミニンα１鎖（NP_005550）、ヒトラミニンα３鎖（NP_937762）、ヒトラミニンα５鎖（NP_005551
）、ヒトラミニンβ１鎖（NP_002282）、ヒトラミニンβ２鎖（NP_002283）、ヒトラミニンβ３鎖（NP_000219）、ヒトラミニンγ１鎖（NP_002284）、およびヒトラミニンγ２鎖（NP_005553）のアミノ酸配列を、配列番号７１、５、６、２２〜２６にそれぞれ示す。
ヒトラミニンとして、具体的には、ヒトラミニン５１１−Ｅ８も挙げられる。ヒトラミニン５１１−Ｅ８は、ヒトラミニン５１１の部分断片であり、α５−Ｅ８断片、β１−Ｅ８断片、γ１−Ｅ８断片からなるヘテロ三量体構造を有する。α５−Ｅ８断片は、配列番号６のアミノ酸番号２５３４〜３３２７に相当する。β１−Ｅ８断片は、配列番号２２のアミノ酸番号１５６１〜１７８６に相当する。γ１−Ｅ８断片は、配列番号２５のアミノ酸番号１３６４〜１６０９に相当する。また、マウスラミニンα１鎖（NP_032506）、マウ
スラミニンα２鎖（NP_032507）、マウスラミニンα３鎖（NP_034810）、マウスラミニンα５鎖（NP_001074640）、マウスラミニンβ１鎖（NP_032508）、マウスラミニンβ３鎖
（NP_032510）のアミノ酸配列を、配列番号２７〜３２にそれぞれ示す。ビトロネクチン
しては、ヒトビトロネクチンが挙げられる。ヒトビトロネクチンのアミノ酸配列を、配列番号３３に示す。細胞接着配列は、ＲＧＤを含まず、且つ、細胞接着配列としての性質を有する限り、これらの細胞接着性タンパク質のいずれの部分のアミノ酸配列を有するものであってもよい。
【００５６】
細胞接着性タンパク質の非ＲＧＤ配列としては、例えば、ヘパリン結合配列や抗インテグリン抗体阻害配列が挙げられる。細胞接着性タンパク質の非ＲＧＤ配列として、具体的には、配列番号７１に示すヒトラミニンα１鎖のアミノ酸配列の内、アミノ酸番号２１１３〜２１２４の部分；配列番号６に示すヒトラミニンα５鎖のアミノ酸配列の内、アミノ酸番号２８６６〜２８８０、２９０５〜２９１５、３１０２〜３１１１、３２０４〜３２０９、３２６０〜３２７０、３２６４〜３２７０、３２７６〜３２８６、３３０６〜３３１９の部分；配列番号２２に示すヒトラミニンβ１鎖のアミノ酸配列の内、アミノ酸番号１５６７〜１５８１、１７３６〜１７４４の部分；配列番号２５に示すヒトラミニンγ１鎖のアミノ酸配列の内、アミノ酸番号１４１１〜１４１９の部分；配列番号２８に示すマウスラミニンα１鎖のアミノ酸配列の内、アミノ酸番号２２１０〜２２１６、２３９７〜２４０２、２７４２〜２７５３、２７４５〜２７５２の部分；配列番号３３に示すヒトビトロネクチンのアミノ酸配列の内、アミノ酸番号３６７〜３７７の部分が挙げられる。それら細胞接着性タンパク質の非ＲＧＤ配列として、具体的には、例えば、AASIKVAVSADR（配列番号７３）、LLNLRPDDFVFYVGG（配列番号３４）、LNEEVVSLYNF（配列番号３５）、LKRLNTTGV（配列番号３６）、VAFYSN（配列番号３７）、GCISNVFVQRLL（配列番号７２）、NVFVQRL（配列番号３８）、VFDLQQNLGSV（配列番号３９）、RGLQATARKASRRS（配列番号４
０）、DIARAEMLLEEAKRA（配列番号４１）、KLQLLKDLE（配列番号４２）、ALGSAAADA（配
列番号４３）、SIYITRF（配列番号４４）、IAFQRN（配列番号４５）、LQVQLSIR（配列番
号４６）、RKRLQVQLSIRT（配列番号４７）、KKQRFRHRNRK（配列番号４８）が挙げられる
。すなわち、細胞接着配列は、例えば、それら細胞接着性タンパク質の非ＲＧＤ配列（例えば、配列番号３４〜４８、７２、および７３のいずれか）を有するものであってよい。
【００５７】
また、上記例示した細胞接着性タンパク質の非ＲＧＤ配列のアミノ酸番号の開始位置および／または終了位置は、１または数残基前後してもよい。すなわち、細胞接着配列は、例えば、それら細胞接着性タンパク質の非ＲＧＤ配列のアミノ酸番号の開始位置および／または終了位置が１または数残基前後してなるアミノ酸配列を有するものであってもよい。「１または数残基」とは、例えば、１〜５残基、１〜４残基、１〜３残基、１〜２残基、または１残基であってよい。なお、例えば、「配列番号６に示すアミノ酸配列のアミノ酸番号２８６６〜２８８０の開始位置および／または終了位置がＮ残基前後してなるアミノ酸配列」（Ｎは正の整数）とは、配列番号６に示すアミノ酸配列のアミノ酸番号２８６６±Ｎ〜２８８０、２８６６〜２８８０±Ｎ、または２８６６±Ｎ〜２８８０±Ｎに示すアミノ酸配列を意味する。他のアミノ酸配列および他のアミノ酸番号についても同様である。
【００５８】
また、細胞接着配列は、上記例示した細胞接着配列の組み合わせであってもよい。すなわち、細胞接着配列は、上記例示した細胞接着配列から選択される２つまたはそれ以上の
組み合わせであってもよい。なお、「細胞接着性タンパク質のアミノ酸配列」という用語（例えば、「細胞接着性タンパク質の部分アミノ酸配列」や「細胞接着性タンパク質の非ＲＧＤ配列」）には、細胞接着性タンパク質のアミノ酸配列の組み合わせも包含されるものとする。組み合わせとして、具体的には、例えば、LQVQLSIRIAFQRN（配列番号４９）が挙げられる。
【００５９】
また、細胞接着配列は、ＲＧＤを含まない限り、それらアミノ酸配列（例えば、配列番号３４〜４９、７２、７３等の細胞接着性タンパク質の部分アミノ酸配列またはそれらの組み合わせ）のバリアントであってもよい。なお、「細胞接着性タンパク質のアミノ酸配列」という用語（例えば、「細胞接着性タンパク質の部分アミノ酸配列」や「細胞接着性タンパク質の非ＲＧＤ配列」）には、実際に天然の細胞接着性タンパク質に見出されるアミノ酸配列に限られず、それらのバリアントも包含されるものとする。それらアミノ酸配列のバリアントについては、フィブロイン様タンパク質の保存的バリアントについての記載を準用できる。細胞接着配列は、例えば、それらアミノ酸配列（例えば、配列番号３４〜４９、７２、７３等の細胞接着性タンパク質の部分アミノ酸配列またはそれらの組み合わせ）において、ＲＧＤ以外の１若しくは数個の位置での１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加され、且つＲＧＤを含まないアミノ酸配列を有するものであってもよい。なお上記「１若しくは数個」とは、それら細胞接着配列の要件を満たす部分の長さ等にもよるが、例えば、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、または１個であってよい。また、細胞接着配列は、例えば、それら細胞接着配列の要件を満たす部分のアミノ酸配列（例えば、配列番号３４〜４９、７２、７３等の細胞接着性タンパク質の部分アミノ酸配列またはそれらの組み合わせ）全体に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上の同一性を有し、且つＲＧＤを含まないアミノ酸配列を有するものであってもよい。それらアミノ酸配列のバリアントについては、ＲＧＤを含まず、且つ、同バリアントが細胞接着配列としての性質を有する（同バリアントが幹細胞等の細胞に対する足場機能をフィブロイン様タンパク質等のタンパク質に付与できる）限り、特に制限されない。バリアントとして、具体的には、例えば、KKQRFRHRNRK（配列番号４８）の両端にGを付加してなるGKKQRFRHRNRKG（配列番号５０）やヒトラミニンα１の部分配列のバリアン
トであるPGASIKVAVSAGPS（配列番号７４）が挙げられる。また、細胞接着配列は、配列番号５０または７４に示すアミノ酸配列のさらなるバリアントであってもよい。
【００６０】
すなわち、細胞接着配列は、例えば、配列番号３４〜５０および７２〜７４のいずれかに示すアミノ酸配列を有するもの、またはそのバリアントであってもよい。また、細胞接着配列は、例えば、特に、配列番号３４〜４４、４７、４９、５０、および７２〜７４のいずれかに示すアミノ酸配列を有するもの、またはそのバリアントであってもよい。
【００６１】
或るアミノ酸配列が細胞接着配列としての性質を有するか否かは、例えば、当該アミノ酸配列が挿入されたフィブロイン様タンパク質が幹細胞等の細胞に対する足場機能を示すか否かを確認することにより、確認することができる。当該タンパク質が幹細胞等の細胞に対する足場機能を示すか否かは、例えば、当該タンパク質で細胞培養面をコーティングした培養容器を用いて幹細胞等の細胞を培養することにより、確認できる。すなわち、当該タンパク質で細胞培養面をコーティングすることにより幹細胞等の細胞の増殖が向上した場合に、当該タンパク質が幹細胞等の細胞に対する足場機能を示すと判断できる。
【００６２】
また、或るアミノ酸配列が細胞接着配列としての性質を有するか否かは、例えば、当該アミノ酸配列が幹細胞等の細胞の細胞足場材への接着を阻害する機能（細胞接着阻害機能）を示すか否かを確認することにより、確認することができる。すなわち、当該アミノ酸配列が細胞接着配列としての性質を有する場合、当該アミノ酸配列を有するペプチドを細胞と共存させると、細胞表面の足場認識部位が当該ペプチドによりマスクされ、以て当該
細胞の細胞足場材への接着が阻害されると考えられる。当該アミノ酸配列が細胞接着阻害機能を示すか否かは、例えば、当該アミノ酸配列を有するペプチドの存在下または非存在下で、細胞足場材でコーティングした細胞培養プレートで細胞を培養し、生細胞数を比較することにより、確認することができる。すなわち、当該ペプチドによる生細胞数の低下が認められた場合に、当該アミノ酸配列が細胞接着阻害機能を示すと判断できる。細胞としては、例えば、201B7株等の人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を用いることができる。
細胞足場材としては、例えば、ラミニン等の細胞接着タンパク質やそれを含有する素材を用いることができる。そのような細胞足場材として、具体的には、iMatrix（ニッピ社製
）やマトリゲル（日本ベクトンディッキンソン社製）が挙げられる。細胞接着阻害機能の評価は、より具体的には、実施例に記載の条件で実施することができる。すなわち、細胞接着配列は、例えば、細胞接着阻害機能を示すアミノ酸配列を有するものであってよい。細胞接着配列は、具体的には、例えば、ｉＰＳ細胞の細胞足場材への接着を阻害する機能を示すアミノ酸配列を有するものであってよい。細胞接着配列は、より具体的には、例えば、ｉＰＳ細胞のラミニンへの接着を阻害する機能を示すアミノ酸配列を有するものであってよい。
【００６３】
また、言い換えると、細胞接着阻害機能を指標として細胞接着配列をスクリーニングすることができる。具体的には、例えば、細胞接着タンパク質の部分アミノ酸配列やそのバリアントを含むペプチドライブラリーを対象として細胞接着阻害機能の評価を実施することにより、細胞接着配列をスクリーニングすることができる。すなわち、細胞接着配列は、例えば、細胞接着阻害機能を指標としてスクリーニングされたアミノ酸配列を有するものであってよい。
【００６４】
本発明のタンパク質は、繰り返し構造中に細胞接着配列を含む。すなわち、細胞接着配列は、繰り返し構造中に挿入されている。言い換えると、本発明のタンパク質が有する繰り返し構造は、細胞接着配列が挿入された繰り返し構造である。細胞接着配列は、具体的には、繰り返し構造を構成する繰り返し単位から選択される１つまたはそれ以上の繰り返し単位中に挿入されて（含まれて）いる。細胞接着配列は、例えば、繰り返し構造を構成する繰り返し単位から選択される２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、または７つ以上の繰り返し単位中に挿入されて（含まれて）いてもよい。細胞接着配列は、例えば、繰り返し構造を構成する全ての繰り返し単位中に挿入されて（含まれて）いてもよい。１つの繰り返し単位は、細胞接着配列を、１個のみ有していてもよく、２個またはそれ以上有していてもよい。１つの繰り返し単位が細胞接着配列を２個またはそれ以上有する場合、同細胞接着配列は、繰り返し単位中で、タンデムに並んでいてもよく、そうでなくてもよい。１つの繰り返し単位に含まれる細胞接着配列の数は、例えば、１個以上、２個以上、または３個以上であってもよく、５個以下、３個以下、または２個以下であってもよく、それらの矛盾しない組み合わせであってもよい。１つの繰り返し単位に含まれる細胞接着配列の数は、具体的には、例えば、１個〜３個であってもよい。本発明のタンパク質に含まれる細胞接着配列の総数は、例えば、１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、または７個以上であってもよく、５０個以下、４０個以下、３０個以下、２５個以下、２０個以下、１５個以下、または１０個以下であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。繰り返し構造に含まれる細胞接着配列の総数は、具体的には、例えば、１個〜５０個、３個〜３０個、または５個〜１５個であってもよい。本発明のタンパク質が２個以上の細胞接着配列を含む場合、細胞接着配列の構成はそれぞれ独立に設定できる。すなわち、細胞接着配列としては、１種の細胞接着配列を用いてもよく、２種またはそれ以上の細胞接着配列を組み合わせて用いてもよい。
【００６５】
繰り返し単位における細胞接着配列の位置は、特に制限されない。各細胞接着配列は、例えば、Ａｌａ非リッチ部位中、またはＡｌａリッチ部位と前記Ａｌａ非リッチ部位の連結部に挿入されていてよい。細胞接着配列が挿入されるＡｌａ非リッチ部位としては、例
えば、配列番号２に示すアミノ酸配列の内、アミノ酸番号６２〜９１、１０１〜１２０、１３０〜１５１、１６１〜１８５、１９５〜２１８、２２８〜２５７、２６７〜２９１、３０１〜３２５、３３５〜３６９、３７９〜４３８、４４８〜４９７、５０７〜５３６の部分が挙げられる。細胞接着配列が挿入されるＡｌａ非リッチ部位として、より具体的には、例えば、配列番号２に示すアミノ酸配列の内、アミノ酸番号１０９と１１０、１７０と１７１、２０３と２０４、２７６と２７７、３１０と３１１、４０３と４０４、４７２と４７３の間が挙げられる。細胞接着配列が挿入されるＡｌａリッチ部位とＡｌａ非リッチ部位の連結部としては、例えば、配列番号２に示すアミノ酸配列の内、アミノ酸番号６１と６２、９１と９２、１００と１０１、１２０と１２１、１２９と１３０、１５１と１５２、１６０と１６１、１８５と１８６、１９４と１９５、２１８と２１９、２２７と２２８、２５７と２５８、２６６と２６７、２９１と２９２、３００と３０１、３２５と３２６、３３４と３３５、３６９と３７０、３７８と３７９、４３８と４３９、４４７と４４８、４９７と４９８、５０６と５０７の間が挙げられる。細胞接着配列は、Ａｌａ非リッチ部位中、および／またはＡｌａリッチ部位とＡｌａ非リッチ部位の連結部に挿入されることに加え、さらにその他の部位に挿入されてもよい。その他の部位としては、Ａｌａリッチ部位や、後述のＮ末領域およびＣ末領域が挙げられる。
【００６６】
＜その他の部位＞
本発明のタンパク質は、最初の繰り返し単位の前に、すなわち繰り返し構造の前に、さらに、Ｎ末領域を含んでいてよい。Ｎ末領域のアミノ酸配列は特に制限されない。Ｎ末領域の長さは、例えば、１残基以上、３残基以上、５残基以上、１０残基以上、３０残基以上、５０残基以上、または１００残基以上であってもよく、２００残基以下、１５０残基以下、１００残基以下、８０残基以下、６０残基以下、または４０残基以下であってもよく、それらの矛盾しない組み合わせであってもよい。Ｎ末領域は、具体的には、例えば、１残基〜２００残基であってもよい。Ｎ末領域は、例えば、Ａｌａ非リッチ部位の要件を満たすアミノ酸配列を含んでいてよい。
【００６７】
本発明のタンパク質は、最後の繰り返し単位の後に、すなわち繰り返し構造の後に、さらに、Ｃ末領域を含んでいてよい。Ｃ末領域のアミノ酸配列は特に制限されない。Ｃ末領域の長さは、例えば、１残基以上、３残基以上、５残基以上、１０残基以上、３０残基以上、５０残基以上、または１００残基以上であってもよく、２００残基以下、１５０残基以下、１００残基以下、８０残基以下、６０残基以下、または４０残基以下であってもよく、それらの矛盾しない組み合わせであってもよい。Ｃ末領域は、具体的には、例えば、１残基〜２００残基であってもよい。Ｃ末領域は、例えば、Ａｌａリッチ部位の要件を満たすアミノ酸配列を含んでいてよい。また、Ｃ末領域は、例えば、クモのフィブロインのＣ末端付近のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含んでいてよい。クモのフィブロインのＣ末端付近のアミノ酸配列としては、例えば、クモのフィブロインのＣ末端５０残基のアミノ酸配列、Ｃ末端５０残基からＣ末端２０残基を除去したアミノ酸配列、Ｃ末端５０残基からＣ末端２９残基を除去したアミノ酸配列が挙げられる。クモのフィブロインのＣ末端付近のアミノ酸配列として、具体的には、例えば、ニワオニグモのADF3（partial；NCBI AAC47010.1 GI:1263287）の５８７位〜６３６位（Ｃ末端５０
残基）のアミノ酸配列、５８７位〜６１６位のアミノ酸配列、５８７位〜６０７位のアミノ酸配列が挙げられる。Ｃ末端にニワオニグモのADF3（partial；NCBI AAC47010.1 GI:1263287）の５８７位〜６３６位のアミノ酸配列を有する本発明のタンパク質として、具体
的には、例えば、配列番号４および６１〜７０のいずれかに示すアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。
【００６８】
また、Ｎ末領域およびＣ末領域は、いずれも、例えば、ペプチドタグやプロテアーゼの認識配列等の機能性配列を含んでいてよい。機能性配列としては、１種の機能性配列を用いてもよく、２種またはそれ以上の機能性配列を組み合わせて用いてもよい。ペプチドタ
グとして、具体的には、Hisタグ、FLAGタグ、GSTタグ、Mycタグ、MBP（maltose binding protein）、CBP（cellulose binding protein）、TRX（thioredoxin）、GFP（green fluorescent protein）、HRP（horseradish peroxidase）、ALP（alkaline phosphatase）、
抗体のFc領域が挙げられる。ペプチドタグは、例えば、発現したタンパク質の検出や精製に利用できる。プロテアーゼの認識配列として、具体的には、HRV3Cプロテアーゼ認識配
列、Factor Xaプロテアーゼ認識配列、proTEVプロテアーゼ認識配列が挙げられる。プロ
テアーゼの認識配列は、例えば、発現したタンパク質の切断に利用できる。Ｎ末端にHis
タグとHRV3Cプロテアーゼ認識配列を有する本発明のタンパク質として、具体的には、例
えば、配列番号４および６１〜７０のいずれかに示すアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。
【００６９】
＜１−２＞本発明のタンパク質の製造
本発明のタンパク質は、本発明のタンパク質をコードする遺伝子を有する宿主に本発明のタンパク質をコードする遺伝子を発現させることにより製造できる。なお、「本発明のタンパク質をコードする遺伝子を有する」ことを、「本発明のタンパク質を有する」ともいう。すなわち、例えば、本発明のタンパク質をコードする遺伝子を有する宿主を、「本発明のタンパク質を有する宿主」ともいう。また、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の発現を、「本発明のタンパク質の発現」ともいう。また、本発明のタンパク質は、本発明のタンパク質をコードする遺伝子を無細胞タンパク質合成系で発現させることによっても製造できる。
【００７０】
本発明のタンパク質をコードする遺伝子を有する宿主は、適当な宿主に本発明のタンパク質をコードする遺伝子を導入することにより得られる。
【００７１】
本発明のタンパク質をコードする遺伝子を導入する宿主は、本発明のタンパク質を発現できるものであれば特に制限されない。宿主としては、例えば、細菌、放線菌、酵母、真菌、植物細胞、昆虫細胞、および動物細胞が挙げられる。好ましい宿主としては、細菌や酵母等の微生物が挙げられる。より好ましい宿主としては、細菌が挙げられる。細菌としては、グラム陰性細菌やグラム陽性細菌が挙げられる。グラム陰性細菌としては、例えば、エシェリヒア（Escherichia）属細菌、エンテロバクター（Enterobacter）属細菌、パ
ントエア（Pantoea）属細菌等の腸内細菌科（Enterobacteriaceae）に属する細菌が挙げ
られる。グラム陽性細菌としては、バチルス（Bacillus）属細菌、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属細菌等のコリネ型細菌が挙げられる。エシェリヒア属細菌としては
、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）が挙げられる。コリネ型細菌としては、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）やコリネバクテリウム・アンモニアゲネス（コリネバクテリウム・スタティオニス）（Corynebacterium ammoniagenes (Corynebacterium stationis)）が挙げられる。宿主としては、中でも、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）を好適に用いることができる。エシェリヒア・コリとして、具体的には、例えば、W3110株（ATCC 27325）やMG1655株（ATCC 47076）等のエシェリヒア・コリK-12株；エシェリヒア・コリK5株（ATCC 23506）；BL21(DE3)株やそのrecA-株であるBLR(DE3)株等のエシェリヒア・コリB株；およびそれらの派生株が挙げられる。
【００７２】
これらの菌株は、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America）より分譲を受けることが出来る。すなわち各菌株に対応する
登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることが出来る（http://www.atcc.org/参照）。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。また、BL21(DE3)株は、例えば、ライフテ
クノロジーズ社より入手可能である（製品番号 C6000-03）。また、BLR(DE3)株は、例え
ば、メルクミリポア社より入手可能である（製品番号 69053）。
【００７３】
本発明のタンパク質をコードする遺伝子は、例えば、フィブロイン様タンパク質遺伝子に細胞接着配列をコードする塩基配列を挿入することにより取得できる。フィブロイン様タンパク質遺伝子は、クモやカイコ等のフィブロイン様タンパク質遺伝子を有する生物からのクローニングにより取得できる。クローニングには、同遺伝子を含むゲノムDNAやcDNA等の核酸を利用できる。取得したフィブロイン様タンパク質遺伝子は、そのまま、ある
いは適宜改変して、本発明のタンパク質をコードする遺伝子のベースとして利用できる。細胞接着配列をコードする塩基配列の挿入等の遺伝子の改変は、公知の手法により行うことができる。例えば、部位特異的変異法により、DNAの目的の部位に目的の変異を導入す
ることができる。すなわち、例えば、部位特異的変異法により、コードされるタンパク質の特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、および／または付加を含むように、遺伝子のコード領域を改変することができる。部位特異的変異法としては、PCRを用いる方
法（Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, H. A. Eds., Stockton press (1989)；Carter, P., Meth. in Enzymol., 154, 382 (1987)）や、ファージを用いる方法（Kramer, W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987)；Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)）が挙げられる。また、本発明のタンパク質をコードする遺伝子は、例えば、化学合成によっても取得できる（Gene, 60(1), 115-127 (1987)）。
【００７４】
本発明のタンパク質をコードする遺伝子を宿主に導入する手法は特に制限されない。宿主において、本発明のタンパク質をコードする遺伝子は、当該宿主で機能するプロモーターの制御下で発現可能に保持されていればよい。宿主において、本発明のタンパク質をコードする遺伝子は、プラスミドのように染色体外で自律複製するベクター上に存在していてもよく、染色体上に導入されていてもよい。宿主は、本発明のタンパク質をコードする遺伝子を１コピーのみ有していてもよく、２またはそれ以上のコピーで有していてもよい。宿主は、１種類の本発明のタンパク質をコードする遺伝子のみを有していてもよく、２またはそれ以上の種類の本発明のタンパク質をコードする遺伝子を有していてもよい。
【００７５】
本発明のタンパク質をコードする遺伝子を発現させるためのプロモーターは、宿主において機能するものであれば特に制限されない。「宿主において機能するプロモーター」とは、宿主においてプロモーター活性を有するプロモーターをいう。プロモーターは、宿主由来のプロモーターであってもよく、異種由来のプロモーターであってもよい。プロモーターは、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の固有のプロモーターであってもよく、他の遺伝子のプロモーターであってもよい。プロモーターは、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の固有のプロモーターよりも強力なプロモーターであってもよい。エシェリヒア・コリ等の腸内細菌科の細菌において機能する強力なプロモーターとしては、例えば、T7プロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター、lacプロモーター、tacプロモーター、tetプロモーター、araBADプロモーター、rpoHプロモーター、PRプロモーター、お
よびPLプロモーターが挙げられる。また、コリネ型細菌において機能する強力なプロモーターとしては、人為的に設計変更されたP54-6プロモーター（Appl. Microbiol. Biotechnolo., 53, 674-679(2000)）、コリネ型細菌内で酢酸、エタノール、ピルビン酸等で誘導
できるpta、aceA、aceB、adh、amyEプロモーター、コリネ型細菌内で発現量が多い強力なプロモーターであるcspB、SOD、tuf（EF-Tu）プロモーター（Journal of Biotechnology 104 (2003) 311-323, Appl Environ Microbiol. 2005 Dec;71(12):8587-96.）、lacプロ
モーター、tacプロモーター、trcプロモーターが挙げられる。また、プロモーターとしては、各種レポーター遺伝子を用いることにより、在来のプロモーターの高活性型のものを取得し利用してもよい。例えば、プロモーター領域内の−３５、−１０領域をコンセンサス配列に近づけることにより、プロモーターの活性を高めることができる（国際公開第００／１８９３５号）。高活性型プロモーターとしては、各種tac様プロモーター（Katashk
ina JI et al. Russian Federation Patent application 2006134574）やpnlp8プロモー
ター（WO2010/027045）が挙げられる。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモ
ーターの例は、Goldsteinらの論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995)）等に記載されている。
【００７６】
また、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の下流には、転写終結用のターミネーターを配置することができる。ターミネーターは、宿主において機能するものであれば特に制限されない。ターミネーターは、宿主由来のターミネーターであってもよく、異種由来のターミネーターであってもよい。ターミネーターは、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の固有のターミネーターであってもよく、他の遺伝子のターミネーターであってもよい。ターミネーターとして、具体的には、例えば、T7ターミネーター、T4ターミネーター、fdファージターミネーター、tetターミネーター、およびtrpAターミネーターが挙げ
られる。
【００７７】
本発明のタンパク質をコードする遺伝子は、例えば、同遺伝子を含むベクターを用いて宿主に導入することができる。本発明のタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の発現ベクターまたは組み換えベクターともいう。本発明のタンパク質をコードする遺伝子の発現ベクターは、例えば、本発明のタンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を宿主で機能するベクターと連結することにより、構築することができる。本発明のタンパク質をコードする遺伝子の発現ベクターで宿主を形質転換することにより、同ベクターが導入された形質転換体が得られる、すなわち、同遺伝子を宿主に導入することができる。ベクターとしては、宿主の細胞内において自律複製可能なベクターを用いることができる。ベクターは、マルチコピーベクターであるのが好ましい。また、ベクターは、形質転換体を選択するために、抗生物質耐性遺伝子などのマーカーを有することが好ましい。また、ベクターは、挿入された遺伝子を発現するためのプロモーターやターミネーターを備えていてもよい。ベクターは、例えば、細菌プラスミド由来のベクター、酵母プラスミド由来のベクター、バクテリオファージ由来のベクター、コスミド、またはファージミド等であってよい。エシェリヒア・コリ等の腸内細菌科の細菌において自律複製可能なベクターとして、具体的には、例えば、pUC19、pUC18、pHSG299、pHSG399、pHSG398、pBR322、pSTV29（いずれもタカラバイオ社より入手可）
、pACYC184、pMW219（ニッポンジーン社）、pTrc99A（ファルマシア社）、pPROK系ベクター（クロンテック社）、pKK233‐2（クロンテック社製）、pET系ベクター（ノバジェン社）、pQE系ベクター（キアゲン社）、pACYC、広宿主域ベクターRSF1010が挙げられる。コ
リネ型細菌で自律複製可能なベクターとして、具体的には、例えば、pHM1519（Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984)）；pAM330（Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984)）；これらを改良した薬剤耐性遺伝子を有するプラスミド；特開平3-210184号公報に記
載のプラスミドpCRY30；特開平2-72876号公報及び米国特許5,185,262号明細書公報に記載のプラスミドpCRY21、pCRY2KE、pCRY2KX、pCRY31、pCRY3KE及びpCRY3KX；特開平1-191686号公報に記載のプラスミドpCRY2およびpCRY3；特開昭58-192900号公報に記載のpAJ655、pAJ611及びpAJ1844；特開昭57-134500号公報に記載のpCG1；特開昭58-35197号公報に記載
のpCG2；特開昭57-183799号公報に記載のpCG4およびpCG11が挙げられる。発現ベクターの構築の際には、例えば、固有のプロモーター領域を含む本発明のタンパク質をコードする遺伝子をそのままベクターに組み込んでもよく、本発明のタンパク質のコード領域を上記のようなプロモーターの下流に結合してからベクターに組み込んでもよく、ベクター上にもともと備わっているプロモーターの下流に本発明のタンパク質のコード領域を組み込んでもよい。
【００７８】
各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネーターに関しては、例えば「微生物学基礎講座８  遺伝子工学、共立出版、1987年」に詳細に記載されており、それらを利用することが可能である。
【００７９】
また、本発明のタンパク質をコードする遺伝子は、例えば、宿主の染色体上へ導入することができる。染色体への遺伝子の導入は、例えば、相同組み換えを利用して行うことができる（Miller, J. H. Experiments in Molecular Genetics, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory）。相同組み換えを利用する遺伝子導入法としては、例えば、Redドリブン
インテグレーション（Red-driven integration）法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方
法、温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で機能する複製起点を持たないスイサイドベクターを用いる方法、ファージを用いたtransduction法が挙げられる。遺伝子は、１コピーのみ導入されてもよく、２コピーまたはそれ以上導入されてもよい。例えば、染色体上に多数のコピーが存在する配列を標的として相同組み換えを行うことで、染色体へ遺伝子の多数のコピーを導入することができる。染色体上に多数のコピーが存在する配列としては、反復DNA配列（repetitive DNA）、トランスポゾンの両端に存在するインバーテッド・リピートが挙げられる。
また、本発明の実施に不要な遺伝子等の染色体上の適当な配列を標的として相同組み換えを行ってもよい。また、遺伝子は、トランスポゾンやMini-Muを用いて染色体上にランダ
ムに導入することもできる（特開平2-109985号公報、US5,882,888、EP805867B1）。染色
体への遺伝子の導入の際には、例えば、固有のプロモーター領域を含む本発明のタンパク質をコードする遺伝子をそのまま染色体に組み込んでもよく、本発明のタンパク質のコード領域を上記のようなプロモーターの下流に結合してから染色体に組み込んでもよく、染色体上にもともと存在するプロモーターの下流に本発明のタンパク質のコード領域を組み込んでもよい。
【００８０】
染色体上に遺伝子が導入されたことは、例えば、同遺伝子の全部又は一部と相補的な塩基配列を有するプローブを用いたサザンハイブリダイゼーション、または同遺伝子の塩基配列に基づいて作成したプライマーを用いたPCRによって確認できる。
【００８１】
形質転換法は特に限定されず、従来知られた方法を用いることができる。形質転換法としては、例えば、エシェリヒア・コリ K-12について報告されているような、受容菌細胞
を塩化カルシウムで処理してDNAの透過性を増す方法（Mandel, M. and Higa, A.,J. Mol.
Biol. 1970, 53, 159-162）、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してDNAを導入する方法（Duncan, C. H., Wilson, G. A. and Young, F. E.., 1997. Gene 1: 153-167）などが挙げられる。また、形質転換法としては、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母について知られているような、DNA受容菌の細胞を、組換えDNAを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えDNAをDNA受容菌に導入する方法（Chang, S. and Choen, S. N., 1979. Mol. Gen. Genet. 168: 111-115; Bibb, M. J., Ward, J. M. and Hopwood, O. A. 1978. Nature 274: 398-400; Hinnen, A., Hicks, J. B. and Fink, G. R. 1978. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929-1933）も応用できる。また、形質転換法としては、コリ
ネ型細菌について報告されているような、電気パルス法（特開平2-207791号公報）を利用することもできる。
【００８２】
本発明のタンパク質をコードする遺伝子を有する宿主を培養することにより、本発明のタンパク質を発現させることができる。その際、必要に応じて、遺伝子の発現誘導を行う。宿主の培養条件や遺伝子の発現誘導の条件は、マーカーの種類、プロモーターの種類、および宿主の種類等の諸条件に応じて適宜選択すればよい。培養に用いる培地は、宿主が増殖でき、且つ、本発明のタンパク質を発現できるものであれば特に制限されない。培地としては、例えば、炭素源、窒素源、イオウ源、無機イオン、及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地を用いることができる。
【００８３】
炭素源としては、グルコース、フラクトース、シュクロース、糖蜜、でんぷんの加水分解物等の糖類、グリセロール、エタノール等のアルコール類、フマル酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類が挙げられる。
【００８４】
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水が挙げられる。
【００８５】
イオウ源としては、硫酸塩、亜硫酸塩、硫化物、次亜硫酸塩、チオ硫酸塩等の無機硫黄化合物が挙げられる。
【００８６】
無機イオンとしては、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、マンガンイオン、カリウムイオン、鉄イオン、リン酸イオンが挙げられる。
【００８７】
その他の有機成分としては、有機微量栄養源が挙げられる。有機微量栄養源としては、ビタミンB1などの要求物質や、それらを含む酵母エキス等が挙げられる。
【００８８】
培養温度は、例えば、20℃〜45℃、好ましくは24℃〜45℃、より好ましくは30℃〜37℃であってよい。培養は、通気培養が好ましい。その際の酸素濃度は、例えば、飽和濃度に対して5〜50%に、好ましくは20〜40％に調節してよい。培養中のpHは、5〜9が好ましい。尚、pH調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、例えば炭酸カルシウム、アンモニアガス、アンモニア水等、を使用することができる。培養時間は、例えば、10時間〜120時間であってよい。
【００８９】
特に、エシェリヒア・コリを宿主として用いる場合、本発明のタンパク質の発現誘導時の有機酸蓄積を低減させること（WO2015/178465）や本発明のタンパク質の発現誘導後の
菌体増殖を低減すること（WO2015/178466）により、本発明のタンパク質を効率的に製造
することができると期待される。
【００９０】
上記のようにして本発明のタンパク質をコードする遺伝子を有する宿主を培養することにより、培地中および／または菌体内に本発明のタンパク質が蓄積する。本発明のタンパク質は、例えば、菌体内に封入体として蓄積し得る。
【００９１】
本発明のタンパク質の回収および定量は、例えば、異種発現させたタンパク質を回収および定量する既知の方法（例えば、「新生化学実験講座  タンパク質VI  合成及び発現」日本生化学会編、東京化学同人(1992) pp183-184を参照）により行うことができる。
【００９２】
以下、本発明のタンパク質が菌体内に封入体として蓄積する場合の回収および定量の手順について例示する。まず、培養液から菌体を遠心操作にて集菌後、緩衝液で懸濁する。菌体懸濁液を、超音波処理やフレンチプレス等の処理に供し、菌体を破砕する。菌体破砕の前に、菌体懸濁液にリゾチームを終濃度0-200mg/lで添加し、氷中に30分から20時間放
置してもよい。次いで、破砕物から、低速遠心分離（6000-15000 rpm, 5-10分、4℃）に
より、不溶性画分を沈殿として得る。不溶性画分は、必要により、適宜緩衝液で洗浄する。洗浄回数は特に制限されず、例えば、１回、２回、または３回以上であってもよい。不溶性画分を緩衝液で懸濁することにより、本発明のタンパク質の懸濁液が得られる。菌体や本発明のタンパク質の懸濁用の緩衝液としては、本発明のタンパク質の溶解性が低いものを好ましく用いることができる。そのような緩衝液としては、例えば、NaClを含むTris-HCl緩衝液が挙げられる。緩衝液のｐＨは、例えば、通常4〜12、好ましくは6〜9であっ
てよい。また、不溶性画分をSDS溶液や尿素溶液で溶解することにより、本発明のタンパ
ク質の溶液が得られる。回収される本発明のタンパク質は、本発明のタンパク質以外に、
細菌菌体、培地成分、及び細菌の代謝副産物等の成分を含んでいてもよい。本発明のタンパク質は、所望の程度に精製されていてよい。本発明のタンパク質の精製は、タンパク質の精製に用いられる公知の方法により行うことができる。そのような方法としては、例えば、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、等電点沈殿、透析が挙げられる。これらの方法は、１種を単独で用いてもよく、２種またはそれ以上を適宜組み合わせて用いてもよい。本発明のタンパク質の量は、例えば、懸濁液や溶液等の本発明のタンパク質を含むサンプルをSDS-PAGEに供して染色し、目的の本発明のタンパク質の分子量に相当する位置のバンドの強度に基づいて決定することができる。染色は、CBB染色、蛍光染色、
銀染色等により行うことができる。定量の際には、濃度既知のタンパク質を標準として利用することができる。そのようなタンパク質としては、例えば、アルブミンや、別途濃度を決定した本発明のタンパク質が挙げられる。
【００９３】
本発明のタンパク質の用途は、特に制限されない。本発明のタンパク質は、例えば、医療用途や研究用途に利用してよい。本発明のタンパク質は、幹細胞等の細胞に対する足場機能を示す。よって、本発明のタンパク質は、例えば、幹細胞等の細胞の培養に利用してよい。本発明のタンパク質は、具体的には、例えば、細胞培養用の足場タンパク質として利用してもよい。また、本発明のタンパク質は、例えば、細胞培養用器具等の器具の構成要素として利用してよい。本発明のタンパク質は、具体的には、例えば、細胞培養容器等の器具の表面にコーティングして利用してもよい。器具や細胞培養については、後述する本発明の器具や本発明の方法についての説明を準用できる。
【００９４】
＜２＞本発明の組成物
本発明の組成物は、本発明のタンパク質を含有する組成物である。本発明の組成物の用途は、特に制限されない。本発明の組成物は、例えば、医療用途や研究用途に利用してよい。すなわち、本発明の組成物は、例えば、医療用または研究用の組成物であってよい。本発明の組成物は、具体的には、例えば、幹細胞等の細胞の培養に利用してよい。すなわち、本発明の組成物は、具体的には、例えば、細胞培養用の組成物であってよい。本発明の組成物は、より具体的には、例えば、細胞足場材料であってもよい。「細胞足場材料」とは、細胞の足場として機能する構造物をいい、具体的には、細胞培養時に細胞の足場として機能する構造物をいう。細胞足場材料は、例えば、細胞培養に利用できる。すなわち、細胞足場材料を足場として細胞を培養することができる。細胞足場材料を利用して得られた細胞培養の結果物（培養細胞、細胞シート、組織、臓器、等）は、例えば、細胞足場材料から回収して、あるいは細胞足場材料ごと、治療等の所望の用途に利用することができる。また、細胞足場材料は、生体内にインプラントされ、生体内での細胞の培養（細胞の接着および増殖を介した組織形成、等）に利用されてもよい。また、本発明の組成物は、より具体的には、例えば、細胞培養容器等の器具のコーティング剤であってもよい。器具や細胞培養については、後述する本発明の器具や本発明の方法についての説明を準用できる。
【００９５】
本発明の組成物は、本発明のタンパク質からなるものであってもよく、そうでなくてもよい。本発明の組成物は、本発明のタンパク質と他の成分との組み合わせからなるものであってもよい。すなわち、本発明のタンパク質は、単独で、あるいは他の成分を組み合わせて、本発明の組成物として利用できる。他の成分は、本発明の組成物の利用態様に応じた許容可能な性質を有するものであれば特に制限されない。他の成分としては、例えば、医薬品や試薬に配合して利用されるものが挙げられる。そのような成分として、具体的には、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定化剤、矯味剤、矯臭剤、香料、希釈剤、界面活性剤等の添加剤が挙げられる。
【００９６】
本発明の組成物における本発明のタンパク質の濃度（含有量）は、特に制限されない。
本発明の組成物における本発明のタンパク質の濃度は、本発明の組成物の利用態様等の諸条件に応じて適宜設定できる。本発明の組成物における本発明のタンパク質の濃度は、例えば、０．０１％（ｗ／ｗ）以上、０．１％（ｗ／ｗ）以上、１％（ｗ／ｗ）以上、５％（ｗ／ｗ）以上、または１０％（ｗ／ｗ）以上であってもよく、１００％（ｗ／ｗ）以下、９９．９％（ｗ／ｗ）以下、７０％（ｗ／ｗ）以下、５０％（ｗ／ｗ）以下、３０％（ｗ／ｗ）以下、１０％（ｗ／ｗ）以下、または５％（ｗ／ｗ）以下、または１％（ｗ／ｗ）以下であってもよく、それらの矛盾しない組み合わせであってもよい。
【００９７】
本発明の組成物の形状は、特に制限されない。本発明の組成物の形状は、本発明の組成物の利用態様等の諸条件に応じて適宜設定できる。本発明の組成物は、所望の形状で製剤化されていてもよい。本発明の組成物の形状として、具体的には、例えば、液体（溶液や懸濁液、等）、ペースト、粉末、顆粒、球体、タブレット、泡沫、スポンジ、繊維、フィルム、シート、メンブレン、メッシュ、チューブが挙げられる。
【００９８】
本発明の組成物は、例えば、そのまま、あるいは適宜、水や水性緩衝液等の媒体を用いて希釈、分散、又は溶解等し、所望の用途（例えば器具のコーティング）に用いてよい。このように希釈、分散、又は溶解等した場合にも、本発明の組成物の範囲に含まれることは言うまでもない。
【００９９】
＜３＞本発明の器具
本発明の器具は、本発明のタンパク質を備える器具である。本発明の器具の用途は、特に制限されない。本発明の器具は、例えば、医療用途や研究用途に利用してよい。すなわち、本発明の器具は、例えば、医療用または研究用の器具であってよい。本発明の器具は、具体的には、例えば、幹細胞等の細胞の培養に利用してよい。すなわち、本発明の器具は、具体的には、例えば、細胞培養用器具であってよい。細胞培養用器具としては、細胞培養容器や細胞足場材料が挙げられる。細胞培養容器である本発明の器具を、特に「本発明の培養容器」ともいう。また、細胞足場材料である本発明の器具を、特に「本発明の細胞足場材料」ともいう。本発明の器具は、本発明のタンパク質を、本発明のタンパク質の機能が発揮される態様で備えていればよい。本発明の器具は、例えば、本発明のタンパク質を表面に備えていてよい。すなわち、本発明の器具は、具体的には、例えば、本発明のタンパク質で表面がコーティングされた器具であってよい。また、本発明のタンパク質や本発明の組成物がそのまま器具として使用可能な態様に構成されている場合は、本発明のタンパク質や本発明の組成物をそのまま本発明の器具として利用してもよい。具体的には、例えば、本発明の組成物が細胞足場材料として構成されている場合は、本発明の組成物をそのまま本発明の細胞足場材料として利用してもよい。細胞培養については、後述する本発明の方法についての説明を準用できる。
【０１００】
以下、主に培養容器を参照して本発明の器具について説明するが、当該説明は他の器具にも準用できる。すなわち、以下の説明は、そのまま、あるいは器具の態様や用途等の諸条件に応じて適宜変更して、他の器具にも適用できる。
【０１０１】
培養容器は、細胞を培養できる材質と形状を有する限り、特に制限されない。培養容器は、例えば、細胞と培地を保持できる材質と形状を有していてよい。培養容器の形状として、具体的には、例えば、ディッシュ、マルチウェルプレート、フラスコ、セルインサート、メンブレンが挙げられる。培養容器の材質として、具体的には、例えば、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、トリアセチルセルロース（ＴＡＣ）、ポリイミド（ＰＩ）、ナイロン（Ｎｙ）、低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）、中密度ポリエチレン（ＭＤＰＥ）、塩化ビニル、塩化ビニリデン、ポリフェニレンサルファイド、ポリエーテルサルフォン、ポリエチレンナフタレート、ポリプロピレン、ウレタンアクリレート等のプラスチック類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸
、ポリカプロラクタン、それらの共重合体等の生分解性ポリマー類、ガラス、改質ガラス等のガラス類、セラミックス類、金属類、セルロース、その他各種高分子化合物が挙げられる。
【０１０２】
本発明の培養容器は、少なくともその細胞培養面に本発明のタンパク質を備える。すなわち、本発明の培養容器は、例えば、その細胞培養面が本発明のタンパク質でコーティングされていてよい。「細胞培養面」とは、細胞の培養が実施される面をいい、具体的には、細胞培養時に細胞と接触し得る部位をいう。本発明のタンパク質は、本発明の培養容器を利用して幹細胞等の細胞を培養できる限り、培養容器の細胞培養面の全体をコーティングしていてもよく、そうでなくてもよい。培養容器の細胞培養面の総面積に対する本発明のタンパク質にコーティングされている部分の面積の比率は、例えば、５０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上であってよい。本発明のタンパク質は、通常は、培養容器の細胞培養面全体をコーティングしているのが好ましい。例えば、培養容器がディッシュ形状であれば、底面全体を本発明のタンパク質でコーティングするのが好ましい。
【０１０３】
培養容器の細胞培養面を本発明のタンパク質でコーティングする手法は、特に制限されない。培養容器の細胞培養面を本発明のタンパク質でコーティングすることは、例えば、培養容器表面を機能性材料でコーティングする公知の手法を利用して実施できる。例えば、本発明のタンパク質を含有する溶液を培養容器の細胞培養面にアプライすることにより、培養容器の細胞培養面を本発明のタンパク質でコーティングすることができる。具体的には、例えば、本発明のタンパク質を含有する溶液を培養容器の細胞培養面にアプライして乾燥（溶媒を揮発）させることにより、培養容器の細胞培養面を本発明のタンパク質でコーティングすることができる。また、具体的には、例えば、本発明のタンパク質を含有する溶液を培養容器の細胞培養面にアプライして時間（以下、「コーティング時間」ともいう）が経過することにより、培養容器の細胞培養面を本発明のタンパク質でコーティングすることができる。コーティング時間は、所望の程度に培養容器の細胞培養面を本発明のタンパク質でコーティングできる限り、特に制限されない。コーティング時間は、例えば、３０分以上、１時間以上、６時間以上、１２時間以上、または１８時間以上であってもよく、７２時間以下、４８時間以下、または３０時間以下であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。コーティング時間の経過後は、適宜、残存する溶液を除去することができ、また、乾燥させることができる。培養容器は、適宜滅菌することができる。培養容器は、例えば、培養容器の細胞培養面を本発明のタンパク質でコーティングした後に滅菌することができる。滅菌には、例えば、エタノールや２−プロパノール等のアルコールを用いることができる。アルコールは、例えば、７０％エタノール等の含水アルコールとして利用してもよい。滅菌は、例えば、細胞培養面にアルコールをアプライすることや、培養容器をアルコールに浸漬することにより、実施できる。このように細胞培養前の滅菌はアルコールを用いて実施できるが、より万全を期すために、本発明のタンパク質を含有する溶液をフィルター滅菌等により滅菌してから培養容器の細胞培養面にアプライし、以降の操作を無菌条件下で行ってもよい。フィルター滅菌には、例えば、メルクミリポア社製マイレクス等のフィルターを用いることができる。適宜無菌操作を行うことができる。本発明の培養容器は、製造後（本発明のタンパク質のコーティング後）すぐに利用してもよいし、適宜保存してから利用してもよい。本発明の培養容器は、製造後すぐに利用しない場合にも、幹細胞等の細胞の培養に有効である。保存温度は、例えば、０℃〜５０℃、０℃〜４０℃、０℃〜２５℃、または０℃〜１０℃であってよい。保存期間は、例えば、１年以下、６月以下、または１月以下であってよい。本発明の培養容器は、乾燥状態で保存してもよいし、湿潤状態で保存してもよい。例えば、細胞培養面をＰＢＳ等の緩衝液で湿潤させた状態で保存してもよい。
【０１０４】
培養容器表面への本発明のタンパク質のコーティング量は、本発明の培養容器を利用し
て幹細胞等の細胞を培養できる限り、特に制限されない。培養容器表面への本発明のタンパク質のコーティング量は、例えば、０．１μｇ／ｃｍ2以上、０．２μｇ／ｃｍ2以上、０．４μｇ／ｃｍ2以上、１μｇ／ｃｍ2以上、または５μｇ／ｃｍ2以上であってもよく
、５００μｇ／ｃｍ2以下、２５０μｇ／ｃｍ2以下、１００μｇ／ｃｍ2以下、または５
０μｇ／ｃｍ2以下であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。培養容器表面
への本発明のタンパク質のコーティング量は、具体的には、例えば、０．１μｇ／ｃｍ2
〜５００μｇ／ｃｍ2、好ましくは０．２μｇ／ｃｍ2〜２５０μｇ／ｃｍ2、より好まし
くは０．４μｇ／ｃｍ2〜１００μｇ／ｃｍ2であってもよい。
【０１０５】
同様に、本発明の細胞足場材料も適宜取得できる。細胞足場材料は、細胞を培養できる材質と形状を有する限り、特に制限されない。細胞足場材料は、例えば、目的とする細胞培養の結果物（細胞シート、組織、臓器、等）の形状に応じた形状を有していてよい。細胞足場材料は、例えば、細胞足場材料の内部に細胞が充填されるよう、多孔質等の空隙を有する形態に構成されていてよい。細胞足場材料の材質としては、例えば、生体内にインプラントするのに適している等の観点から、生体吸収性高分子が好ましく挙げられる。生体吸収性高分子として、具体的には、例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸とグリコール酸の共重合体、ポリカプロラクトン、コラーゲン、ゼラチン、グリコサミノグリカン、キチン、キトサン、ヒアルロン酸、ポリペプチドが挙げられる。本発明の細胞足場材料は、例えば、細胞足場材料の表面（具体的には、細胞培養面）を本発明のタンパク質でコーティングすることにより得られる。なお、「細胞足場材料の表面」には、細胞足場材料が空隙を有する形態に構成されている場合は、空隙内部の表面も含まれる。また、例えば、上述の通り、細胞足場材料として構成された本発明の組成物をそのまま本発明の細胞足場材料として用いてもよい。
【０１０６】
＜４＞本発明の方法
本発明のタンパク質を利用して、幹細胞等の細胞を効率よく培養することができる。具体的には、本発明のタンパク質を備える器具（本発明の器具）を利用して、幹細胞等の細胞を効率よく培養することができる。より具体的には、本発明の培養容器や本発明の細胞足場材料等の、本発明のタンパク質を備える培養器具を利用して、幹細胞等の細胞を効率よく培養することができる。すなわち、本発明は、本発明の培養容器や本発明の細胞足場材料等の本発明の器具で細胞を培養することを含む、細胞を培養する方法を提供する。同方法を、「本発明の方法」ともいう。本発明のタンパク質は、特に、iPS細胞等の幹細胞
の増殖に高い効果を示す。すなわち、本発明のタンパク質およびそれを備える細胞培養容器や細胞足場材料等の細胞培養用器具は、例えば、iPS細胞等の幹細胞を増殖させるため
に使用することが可能である。また、本発明のタンパク質およびそれを備える細胞培養容器や細胞足場材料等の細胞培養用器具は、iPS細胞等の幹細胞の増殖に限られず、例えば
、その前段階であるiPS細胞等の幹細胞の樹立、ならびに、その後段階であるiPS細胞等の幹細胞の分化にも使用することが可能である。すなわち、本発明において、「細胞の培養」には、細胞の増殖に限られず、例えば、幹細胞や前駆細胞等の分化能を有する細胞の樹立、幹細胞や前駆細胞等の分化能を有する細胞から他の細胞への分化も包含される。具体的には、「幹細胞の培養」には、幹細胞の増殖に限られず、例えば、幹細胞の樹立（例えば、iPS細胞やES細胞等の万能性幹細胞または多能性幹細胞の樹立）や幹細胞の分化（例
えば、iPS細胞やES細胞等の幹細胞からのその他の幹細胞、前駆細胞、または成熟細胞へ
の分化）も包含される。本発明の方法により、培養された細胞（培養細胞）が得られる。すなわち、本発明の方法の一態様は、本発明の培養容器や本発明の細胞足場材料等の本発明の器具で細胞を培養することを含む、培養細胞を製造する方法である。本発明の方法により得られる培養細胞は、分化していてもよく、していなくてもよい。すなわち、本発明の方法により得られる培養細胞は、例えば、未分化状態が維持されていてもよく、未分化状態を獲得していてもよい。本発明の方法により得られる培養細胞は、例えば、幹細胞や前駆細胞等の分化能を有する細胞であってもよいし、前駆細胞や成熟細胞等の分化した細
胞であってもよい。本発明の方法により得られる培養細胞は、例えば、遊離の細胞（個々の独立した細胞）であってもよいし、細胞シート、組織、臓器、等の組織化した細胞であってもよい。
【０１０７】
培養される細胞の種類は特に制限されない。本発明の方法は、特に、幹細胞の培養に好適に利用できる。幹細胞として、具体的には、例えば、胚性幹細胞（ES細胞）、人工多能性幹細胞（iPS細胞）、多能性生殖幹細胞（mGS細胞）、神経幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞が挙げられる。幹細胞として、より具体的には、例えば、胚性幹細胞（ES細胞）や人工多能性幹細胞（iPS細胞）が挙げられる。細胞は、いずれの生体組織に由来するもの
であってもよい。生体組織としては、皮膚、角膜、肝臓、消化器官、乳腺、前立腺、毛根、気管、口腔粘膜が挙げられる。細胞が由来する生物は特に制限されず、使用目的等に応じて適宜選択することができる。細胞が由来する生物として、例えば、哺乳類が挙げられる。哺乳類として、具体的には、例えば、ヒト、ラット、マウス、モルモット、マーモセット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、チンパンジーが挙げられる。哺乳類は、免疫不全動物であってもよい。培養した細胞をヒトの治療に用いる場合、細胞が由来する生物としては、例えば、ヒト、ブタ、チンパンジーから選択される哺乳類が好ましい。本発明の方法においては、１種の細胞のみを培養してもよく、２種またはそれ以上の細胞を共培養してもよい。
【０１０８】
培養条件は、所望の培養結果（細胞の増殖、幹細胞の樹立、細胞の分化、等）が得られる条件であれば特に制限されない。培養条件は、本発明の培養容器や本発明の細胞足場材料等の本発明の器具を用いること以外は、例えば、ES細胞やiPS細胞等の細胞の培養に用
いられる通常の条件と同じであってよい。培養条件は、本発明の器具の態様、細胞の種類、細胞が由来する生物種等の諸条件に応じて適宜設定できる。
【０１０９】
培地の組成は、培養する細胞の性質等の諸条件に応じて適宜設定できる。培地成分としては、例えば、グルコース等の炭素源、アミノ酸、ビタミン、リン酸塩、緩衝剤、成長因子、血清、血清アルブミンが挙げられる。細胞の培養に用いられる通常の培地として、具体的には、例えば、α−ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＫＣＭが挙げられる。また、胚性幹細胞（ES細胞）や人工多能性幹細胞（iPS細胞）の培養に用いられる通常の培地として、具体的に
は、例えば、Essential 8培地（インビトロジェン社製）、StemFit(R)培地（味の素社製
）、その他実施例で用いた培地が挙げられる。
【０１１０】
本発明の方法によれば、フィーダー細胞や他の細胞接着タンパク質（本発明のタンパク質以外の細胞接着タンパク質）を使用することなく、幹細胞等の細胞を効率よく培養することができる。しかしながら、このことは、フィーダー細胞や他の細胞接着タンパク質を使用することを妨げるものではない。すなわち、本発明の方法においては、フィーダー細胞や他の細胞接着タンパク質（本発明のタンパク質以外の細胞接着タンパク質）を使用してもよいし、しなくてもよい。本発明の方法においては、フィーダー細胞や他の細胞接着タンパク質の使用量を、細胞の培養に使用される通常の量と比較して低減するのが好ましい。本発明の方法においては、フィーダー細胞や他の細胞接着タンパク質を使用しないのがより好ましい。
【０１１１】
培養開始時に播種する細胞数は、例えば、１×１０3ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2以上、１×１０4ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2以上、または２×１０4ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2以上であってもよく、１×１０6ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2以下、１×１０5ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2以下、または５×１０4ｃｅ
ｌｌｓ／ｃｍ2以下であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。培養温度は、
例えば、３６℃〜３８℃であってよく、好ましくは約３７℃であってよい。培養ｐＨは、例えば、ｐＨ６．８〜７．２であってよい。培養時の気相は、例えば、空気と炭酸ガスの混合ガスであってよい。具体的には、例えば、５％炭酸ガスと９５％空気の雰囲気下で培
養を行ってよい。培養期間は、例えば、５〜３０日、好ましくは７〜１６日であってよい。培養中、培地交換を実施してもよい。
【０１１２】
このようにして細胞培養を実施することにより、培養細胞が得られる。
【実施例】
【０１１３】
以下、本発明を実施例に基づいて更に具体的に説明する。
【０１１４】
実施例１：ラミニン部分配列挿入フィブロイン様タンパク質の作製
＜１＞ラミニン部分配列挿入フィブロイン様タンパク質発現株の構築
フィブロイン様タンパク質ADF3をコードする遺伝子を発現するプラスミドpET22b-ADF3
は、pET22b(+)ベクター（Novagen）を制限酵素NdeIとEcoRIによって切断した後、全合成
したフィブロイン様タンパク質遺伝子ADF3をDNA Ligation Kit（TaKaRa）を用いて挿入して構築した。ADF3遺伝子の塩基配列を配列番号１に、同遺伝子がコードするフィブロイン様タンパク質ADF3のアミノ酸配列を配列番号２に示す。なお、配列番号２に示すADF3タンパク質は、Ｎ末端にHisタグとHRV3Cプロテアーゼ認識配列を有する。
【０１１５】
ラミニン部分配列挿入フィブロイン様タンパク質ADF3Laminin#39をコードする遺伝子を発現するプラスミドpET22b-ADF3Laminin#39は、pET22b(+)ベクター（Novagen）を制限酵
素NdeIとEcoRIによって切断した後、全合成したフィブロイン様タンパク質遺伝子ADF3Laminin#39をDNA Ligation Kit（TaKaRa）を用いて挿入して構築した。ADF3Laminin#39遺伝
子の塩基配列を配列番号３に、同遺伝子がコードするフィブロイン様タンパク質ADF3Laminin#39のアミノ酸配列を配列番号４に示す。ADF3Laminin#39は、配列番号２に示すADF3タンパク質のＡｌａ非リッチ部位１０個の内７個にラミニン部分配列「RGLDATARKASRRS」（配列番号４０）が１個ずつ（計７個）挿入されてなるものである。
【０１１６】
同様に、ラミニン部分配列挿入フィブロイン様タンパク質ADF3Laminin#34、ADF3Laminin#37、ADF3Laminin#38、ADF3Laminin#42、ADF3Laminin#43、ADF3Laminin#44、ADF3Laminin#45、ADF3Laminin#46、ADF3Laminin#47、およびADF3Laminin#48をコードする遺伝子をそれぞれ全合成し、pET22b(+)ベクターに導入して、これらの遺伝子を発現するプラスミドpET22b-ADF3Laminin#34、pET22b-ADF3Laminin#37、pET22b-ADF3Laminin#38、pET22b-ADF3Laminin#42、pET22b-ADF3Laminin#43、pET22b-ADF3Laminin#44、pET22b-ADF3Laminin#45、pET22b-ADF3Laminin#46、pET22b-ADF3Laminin#47、およびpET22b-ADF3Laminin#48を構築
した。これらの遺伝子の塩基配列を配列番号５１〜６０に、同遺伝子がコードするフィブロイン様タンパク質のアミノ酸配列を配列番号６１〜７０に示す。これらのフィブロイン様タンパク質は、配列番号２に示すADF3タンパク質のＡｌａ非リッチ部位１０個の内７個に、それぞれ、ラミニン部分配列であるSIYITRF（配列番号４４）、NVFVQRL（配列番号３８）、VAFYSN（配列番号３７）、LLNLRPDDFVFYVGG（配列番号３４）、LKRLNTTGV（配列番号３６）、VFDLQQNLGSV（配列番号３９）、LNEEVVSLYNF（配列番号３５）、DIARAEMLLEEAKRA（配列番号４１）、KLQLLKDLE（配列番号４２）、ALGSAAADA（配列番号４３）が１個
ずつ（計７個）挿入されてなるものである。
【０１１７】
なお、ADF3Laminin#39を「ADF3#39」と略記する場合がある。他のラミニン部分配列挿
入フィブロイン様タンパク質についても同様である。
【０１１８】
上記pET22b-ADF3、pET22b-ADF3Laminin#39、pET22b-ADF3Laminin#34、pET22b-ADF3Laminin#37、pET22b-ADF3Laminin#38、pET22b-ADF3Laminin#42、pET22b-ADF3Laminin#43、pET22b-ADF3Laminin#44、pET22b-ADF3Laminin#45、pET22b-ADF3Laminin#46、pET22b-ADF3Laminin#47、およびpET22b-ADF3Laminin#48でそれぞれエシェリヒア・コリBL21(DE3)ΔrecA
株を形質転換することにより、フィブロイン様タンパク質生産菌BL21(DE3)ΔrecA/pET22b
-ADF3、BL21(DE3)ΔrecA/pET22b-ADF3Laminin#39、BL21(DE3)ΔrecA/pET22b-ADF3Laminin#34、BL21(DE3)ΔrecA/pET22b-ADF3Laminin#37、BL21(DE3)ΔrecA/pET22b-ADF3Laminin#38、BL21(DE3)ΔrecA/pET22b-ADF3Laminin#42、BL21(DE3)ΔrecA/pET22b-ADF3Laminin#43
、BL21(DE3)ΔrecA/pET22b-ADF3Laminin#44、BL21(DE3)ΔrecA/pET22b-ADF3Laminin#45、BL21(DE3)ΔrecA/pET22b-ADF3Laminin#46、BL21(DE3)ΔrecA/pET22b-ADF3Laminin#47、およびBL21(DE3)ΔrecA/pET22b-ADF3Laminin#48を得た。BL21(DE3)ΔrecA株は、BL21(DE3)
株からλRed法によりrecA遺伝子を欠損することで得られる。
【０１１９】
＜２＞ラミニン部分配列挿入フィブロイン様タンパク質の発現
上記で得られたフィブロイン様タンパク質発現株BL21(DE3)ΔrecA/pET22b-ADF3、BL21
ΔrecA/pET22b-ADF3Laminin#39、BL21(DE3)ΔrecA/pET22b-ADF3Laminin#34、BL21(DE3)ΔrecA/pET22b-ADF3Laminin#37、BL21(DE3)ΔrecA/pET22b-ADF3Laminin#38、BL21(DE3)ΔrecA/pET22b-ADF3Laminin#42、BL21(DE3)ΔrecA/pET22b-ADF3Laminin#43、BL21(DE3)ΔrecA/pET22b-ADF3Laminin#44、BL21(DE3)ΔrecA/pET22b-ADF3Laminin#45、BL21(DE3)ΔrecA/pET22b-ADF3Laminin#46、BL21(DE3)ΔrecA/pET22b-ADF3Laminin#47、およびBL21(DE3)ΔrecA/pET22b-ADF3Laminin#48を、（1）に示すシード培地を用いて、1vvm、37℃、1500rpm、pH6.7の条件下でグルコースを全て消費するまで培養し、種培養液を得た。その後、種培
養液45mLを（2）に示す生産培地255mLに添加し、1vvm、37℃、700rpm、pH6.9の条件下で
本培養を実施した。培養30分後に（3）に示すフィード培地を2.6mL/hの流速で添加し、培養液の620nmでのOD値が50になるまで培養した。その後、培養温度を30℃に下げ、イソプ
ロピル−β−チオガラクトピラノシド（IPTG）を1mM添加してタンパク質発現を誘導した
。IPTG添加後24時間で培養を終了し、培養液を得た。菌体破砕液を調製してSDS-PAGEに供したところ、目的サイズのバンドが観察され、フィブロイン様タンパク質が菌体内に発現していることが確認された。
【０１２０】
（1）シード培地
グルコース40g/L、硫酸マグネシウム七水和物1.0g/L、コーンスティープリカー1.0g/L（
窒素重量換算）、リン酸二水素カリウム2.0g/L、硫酸鉄七水和物10mg/L、硫酸マンガン七水和物10mg/L、GD-113（消泡剤）0.1ml/L、アンピシリン100mg/L
【０１２１】
（2）生産培地
グルコース2.5g/L、硫酸マグネシウム七水和物2.4g/L、コーンスティープリカー1.0g/L（窒素重量換算）、リン酸二水素カリウム5.4g/L、硫酸鉄七水和物40mg/L、硫酸マンガン七水和物40mg/L、塩化カルシウム二水和物40mg/L、GD-113（消泡剤）0.1ml/L、アンピシリ
ン100mg/L
【０１２２】
（3）フィード培地
グルコース700g/L、アンピシリン100mg/L
【０１２３】
＜３＞ラミニン部分配列挿入フィブロイン様タンパク質の精製
上記で得られた培養液をOD値が30となるように（1）に示すLysisバッファーで希釈し、超音波処理した。処理液を遠心し、沈殿のみを回収した。沈殿に遠心前の処理液と等量の3％SDS溶液を添加し、ホモジナイザーで30 min懸濁した。懸濁液を遠心し、再度沈殿のみを回収した。沈殿に（2）に示す可溶化バッファーを目的タンパク質濃度が5 mg/mlとなるように添加し、ボルテックスで懸濁した。懸濁液を遠心し、上清のみを回収した。
【０１２４】
得られた上清について、500-1000Daの透析膜を用いて、外液をNaOH水(pH10)として透析を実施し、フィブロイン様タンパク質ADF3、ADF3Laminin#39、ADF3Laminin#34、ADF3Laminin#37、ADF3Laminin#38、ADF3Laminin#42、ADF3Laminin#43、ADF3Laminin#44、ADF3Laminin#45、ADF3Laminin#46、ADF3Laminin#47、およびADF3Laminin#48の水溶液を得た。
【０１２５】
（1）Lysis バッファー
30 mM Tris-HCl、100 mM NaCl、pH7.5
【０１２６】
（2）可溶化バッファー
50 mM NaOH
【０１２７】
実施例２：フィブロイン様タンパク質の細胞足場機能の評価
＜１＞細胞培養プレートへのコーティング
上記実施例１＜３＞で得た透析後のフィブロイン様タンパク質の水溶液を6ウェル細胞
培養プレート（コーニング社Falcon培養プレート）に１〜４ml/ウェル投入し、室温で一
昼夜もしくは二昼夜放置して水を揮発させた。細胞培養プレートを70%エタノール水溶液
に浸漬した後、リン酸緩衝生理食塩水（ナカライテスク社）で洗浄した。
【０１２８】
＜２＞コーティングの確認
島津製作所社製IR Prestige-21ならびにATR測定機器であるSmiths社製Dura Sampl IR IIを用いて、コーティング表面のFT-IR全反射測定（FT-IR-ATR）を行った。得られたスペ
クトルにおいて、タンパク質主鎖アミド基（αアミド結合）由来のピークが1620〜1700cm-1の範囲に現れていることにより、フィブロイン様タンパク質が細胞培養プレート上にコーティングされたことを確認した。なお、フィブロイン様タンパク質のコーティング量は、10μg/cm2程度であると考えられる。
【０１２９】
＜３＞ｉＰＳ細胞増殖系での評価
フィブロイン様タンパク質をコーティングした表面での人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の接着増殖効果を評価した。ｉＰＳ細胞は、ｉＰＳポータル社より購入した201Ｂ7株を用いた。細胞培養は、ｉＰＳ細胞用培地であるEssential 8培地（インビトロジェン社製
）にヒト血清アルブミンを添加（最終濃度2.6mg/ml、シグマアルドリッチ社製）した培地、または、StemFit(R)培地（味の素社製）を用いて、5%CO2/37℃の条件で行った。フィブロイン様タンパク質を細胞培養プレート上にコーティングして直ちに培養に用いることにより、その効果を検討した。1ウェルあたり10万個の生細胞をシングルセル播種した。培
地にはY-27632を添加（最終濃度10μM、ナカライテスク社製）し、2〜4日毎に培地交換を行った。6〜7日間の培養後、細胞解離酵素（ライフテクノロジーズ社TrypLE Select）処
理により剥離した細胞の個数を、細胞数測定装置（ベックマン・コールター社ViCell）を用いて測定した。
【０１３０】
結果を図１および図２に示す。
【０１３１】
図１に示すように、ラミニンの部分配列を挿入したフィブロイン様タンパク質は、何れも、6日後の生細胞数が播種時に比べ２〜１１倍に増大しており、良好なｉＰＳ細胞足場
機能を有していること（すなわち、これらラミニン部分配列が細胞接着配列としての性質を有していること）が明らかとなった。
【０１３２】
また、ラミニンの部分配列が挿入されていないフィブロイン様タンパク質であるADF3を、同様の方法で評価したところ、播種した細胞が殆ど接着せず、播種して6日後の生細胞
数は皆無であった（図示せず）。これは、ラミニンの部分配列を挿入することでｉＰＳ細胞足場機能が発現することを示すものである。
【０１３３】
また、足場タンパク質であるフィブロネクチンのＲＧＤを含む細胞接着配列を挿入したカイコのフィブロインであるプロネクチン（三洋化成工業）を、同様の方法で評価したところ、ADF3と同様、播種して6日後の生細胞数は皆無であった（図示せず）。これは、本
発明が予見困難であることを示すものである。
【０１３４】
図２に示すように、ラミニンの部分配列を挿入したフィブロイン様タンパク質であるADF3#39は、途中1回の継代により2週間にわたって培養を行うことができた。2週間の培養を行った後、アルカリフォスファターゼ染色キット（シグマアルドリッチ社：86-R）を用いて染色を行った結果、細胞の未分化状態が維持されていることを確認した。これは、本発明品を利用することにより、長期培養において、ｉＰＳ細胞の未分化状態を維持した状態で増殖することが可能であることを示すものである。
【０１３５】
実施例３：各種ペプチドの細胞接着阻害機能の評価
＜１＞各種ペプチドの調製
各種ペプチドを、ペプチド合成受託機関において通常の固相合成法により調製した。
【０１３６】
＜２＞ｉＰＳ細胞接着阻害機能の評価
各種ペプチドの人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）接着阻害機能を評価した。ｉＰＳ細胞は、ｉＰＳポータル社より購入した201B7株を用いた。細胞培養は、ｉＰＳ細胞用培地で
あるEssential 8培地（インビトロジェン社製）にヒト血清アルブミンを添加（最終濃度2.6mg/ml、シグマアルドリッチ社製）した培地、または、StemFit(R)培地（味の素社製）
を用いて、5%CO2/37℃の条件で行った。各種ペプチドを所定量含んだ培地にｉＰＳ細胞を5分〜2時間懸濁させた後、iMatrix（ニッピ社製）やマトリゲル（日本ベクトンディッキ
ンソン社製）等の細胞足場材を製品プロトコルの方法に従いコートした細胞培養プレートに、1ウェルあたりの生細胞数が13,000〜40,000個となるようにシングルセル播種した。
培地にはY-27632（最終濃度10μM、ナカライテスク社製）を添加し、翌日以降はY-27632
および各種ペプチドともに添加していない培地で培養した。1〜3日毎に培地交換を行い、5〜7日間の培養後、細胞解離酵素TrypLE Select（ライフテクノロジーズ社）処理により
剥離した細胞の個数を、細胞数測定装置ViCell（ベックマン・コールター社）を用いて測定した。
【０１３７】
図３および図４に、マウスラミニンα１の部分配列ペプチドであるRKRLQVQLSIRT（配列番号４７）を0〜100μM含んだ培地にｉＰＳ細胞を懸濁させた後、iMatrix（図３）またはマトリゲル（図４）をコートした細胞培養プレートに、1ウェルあたりの生細胞数が13,000個（図３）または40,000個（図４）となるようにシングルセル播種して5日間培養を行った結果を示す。RKRLQVQLSIRTは、いずれの細胞足場材をコートした細胞培養プレートに対しても細胞接着増殖を阻害する効果を示したことから、RKRLQVQLSIRTを挿入したフィブロイン様タンパク質は、良好なｉＰＳ細胞足場機能を有することが期待できる。
【０１３８】
図５に、ヒトラミニンα５の部分配列ペプチドであるGCISNVFVQRLL（配列番号７２）を0〜100μM含んだ培地にｉＰＳ細胞を懸濁させた後、iMatrixをコートした細胞培養プレートに、1ウェルあたりの生細胞数が13,000個となるようにシングルセル播種して5日間培養を行った結果を示す。
【０１３９】
図６に、ヒトラミニンα１の部分配列ペプチドであるAASIKVAVSADR（配列番号７３）を0〜100μM含んだ培地にｉＰＳ細胞を懸濁させた後、iMatrixをコートした細胞培養プレートに、1ウェルあたりの生細胞数が13,000個となるようにシングルセル播種して5日間培養を行った結果を示す。
【０１４０】
図７に、ヒトラミニンα１の部分配列を改変したアミノ酸配列からなるペプチドであって、特開2010-220611に記載のプロネクチンL等の部分配列ペプチドでもあるPGASIKVAVSAGPS（配列番号７４）を0〜100μM含んだ培地にｉＰＳ細胞を懸濁させた後、iMatrixをコートした細胞培養プレートに、1ウェルあたりの生細胞数が13,000個となるようにシングル
セル播種して5日間培養を行った結果を示す。
【０１４１】
これらのペプチドも細胞接着増殖を阻害する効果を示したことから、これらのペプチドを挿入したフィブロイン様タンパク質は、良好なｉＰＳ細胞足場機能を有することが期待できる。
【０１４２】
＜配列表の説明＞
配列番号１：フィブロイン様タンパク質遺伝子ADF3の塩基配列
配列番号２：フィブロイン様タンパク質ADF3のアミノ酸配列
配列番号３：ラミニン部分配列挿入フィブロイン様タンパク質遺伝子ADF3Laminin#39の塩基配列
配列番号４：ラミニン部分配列挿入フィブロイン様タンパク質ADF3Laminin#39のアミノ酸配列
配列番号５：ヒトラミニンα３鎖のアミノ酸配列
配列番号６：ヒトラミニンα５鎖のアミノ酸配列
配列番号７〜１０：Ａｌａリッチ部位の要件を満たす部分のアミノ酸配列
配列番号１１〜２１：Ａｌａ非リッチ部位の要件を満たす部分に含まれるモチーフのアミノ酸配列
配列番号２２：ヒトラミニンβ１鎖のアミノ酸配列
配列番号２３：ヒトラミニンβ２鎖のアミノ酸配列
配列番号２４：ヒトラミニンβ３鎖のアミノ酸配列
配列番号２５：ヒトラミニンγ１鎖のアミノ酸配列
配列番号２６：ヒトラミニンγ２鎖のアミノ酸配列
配列番号２７：マウスラミニンα１鎖のアミノ酸配列
配列番号２８：マウスラミニンα２鎖のアミノ酸配列
配列番号２９：マウスラミニンα３鎖のアミノ酸配列
配列番号３０：マウスラミニンα５鎖のアミノ酸配列
配列番号３１：マウスラミニンβ１鎖のアミノ酸配列
配列番号３２：マウスラミニンβ３鎖のアミノ酸配列
配列番号３３：ヒトビトロネクチンのアミノ酸配列
配列番号３４〜５０：ＲＧＤを含まない細胞接着配列のアミノ酸配列
配列番号５１：ラミニン部分配列挿入フィブロイン様タンパク質遺伝子ADF3Laminin#34の塩基配列
配列番号５２：ラミニン部分配列挿入フィブロイン様タンパク質遺伝子ADF3Laminin#37の塩基配列
配列番号５３：ラミニン部分配列挿入フィブロイン様タンパク質遺伝子ADF3Laminin#38の塩基配列
配列番号５４：ラミニン部分配列挿入フィブロイン様タンパク質遺伝子ADF3Laminin#42の塩基配列
配列番号５５：ラミニン部分配列挿入フィブロイン様タンパク質遺伝子ADF3Laminin#43の塩基配列
配列番号５６：ラミニン部分配列挿入フィブロイン様タンパク質遺伝子ADF3Laminin#44の塩基配列
配列番号５７：ラミニン部分配列挿入フィブロイン様タンパク質遺伝子ADF3Laminin#45の塩基配列
配列番号５８：ラミニン部分配列挿入フィブロイン様タンパク質遺伝子ADF3Laminin#46の塩基配列
配列番号５９：ラミニン部分配列挿入フィブロイン様タンパク質遺伝子ADF3Laminin#47の塩基配列
配列番号６０：ラミニン部分配列挿入フィブロイン様タンパク質遺伝子ADF3Laminin#48の
塩基配列
配列番号６１：ラミニン部分配列挿入フィブロイン様タンパク質ADF3Laminin#34のアミノ酸配列
配列番号６２：ラミニン部分配列挿入フィブロイン様タンパク質ADF3Laminin#37のアミノ酸配列
配列番号６３：ラミニン部分配列挿入フィブロイン様タンパク質ADF3Laminin#38のアミノ酸配列
配列番号６４：ラミニン部分配列挿入フィブロイン様タンパク質ADF3Laminin#42のアミノ酸配列
配列番号６５：ラミニン部分配列挿入フィブロイン様タンパク質ADF3Laminin#43のアミノ酸配列
配列番号６６：ラミニン部分配列挿入フィブロイン様タンパク質ADF3Laminin#44のアミノ酸配列
配列番号６７：ラミニン部分配列挿入フィブロイン様タンパク質ADF3Laminin#45のアミノ酸配列
配列番号６８：ラミニン部分配列挿入フィブロイン様タンパク質ADF3Laminin#46のアミノ酸配列
配列番号６９：ラミニン部分配列挿入フィブロイン様タンパク質ADF3Laminin#47のアミノ酸配列
配列番号７０：ラミニン部分配列挿入フィブロイン様タンパク質ADF3Laminin#48のアミノ酸配列
配列番号７１：ヒトラミニンα１鎖のアミノ酸配列
配列番号７２〜７４：ＲＧＤを含まない細胞接着配列のアミノ酸配列
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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