(57)【要約】      （修正有）【課題】試料中の標的オリゴヌクレオチドの検出方法の提供。【解決手段】増幅反応における特異的産物を検出する方法であって、（ａ）標的核酸分子を含む試験試料を、実質的に等温条件下で、ポリメラーゼ、それぞれが前記標的核酸分子上の相補的配列に特異的に結合する２つ以上のプライマーオリゴヌクレオチド、およびニッキング酵素と接触させるステップであって、前記プライマーオリゴヌクレオチドのそれぞれは、前記標的核酸分子と相補的な配列の３’末端に位置する１つ以上の２’修飾ヌクレオチドを含むステップ；（ｂ）前記標的核酸分子の配列の少なくとも一部を含むアンプリコンを生成するステップ；ならびに（ｃ）アンプリコンへのオリゴヌクレオチドプローブハイブリダイゼーションに特異的なシグナルを検出するステップであって、前記シグナルは、前記試験試料中の前記標的核酸分子またはそのアンプリコンの検出を示すステップを含む方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニッキングおよび伸長増幅の反応中の特異的産物を定量する方法であって、
（ａ）標的核酸分子を、実質的に等温条件下で、ポリメラーゼ、それぞれが前記標的核酸分子上の相補的配列に特異的に結合する２つ以上のプライマー／テンプレートオリゴヌクレオチド、ニッキング酵素、および検出可能なポリヌクレオチドプローブと接触させるステップであって、前記プライマー／テンプレートオリゴヌクレオチドのそれぞれは、前記標的核酸分子と相補的な配列中に１つ以上の２’修飾ヌクレオチドを含むステップ；
（ｂ）前記標的核酸分子の少なくとも一部を含むアンプリコンを生成するステップ；ならびに
（ｃ）前記標的核酸分子またはそのアンプリコンへのオリゴヌクレオチドプローブハイブリダイゼーションに特異的なシグナルを検出するステップであって、前記シグナルは、試料中に存在する前記標的核酸分子またはそのアンプリコンの量を示すステップ
を含む方法。
【請求項２】
前記２’修飾は、２’−Ｏ−メチル、２’−メトキシエトキシ、２’−フルオロ、２’−ヒドロキシル、２’−アリル、２’−Ｏ−［２−（メチルアミノ）−２−オキソエチル］、４’−チオ、４’−ＣＨ２−Ｏ−２’−架橋、４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’−架橋、２’−ＬＮＡ、および２’−Ｏ−（Ｎ−メチルカルバメート）または塩基アナログを含むものからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記１つ以上の２’修飾ヌクレオチドは、前記標的核酸分子と相補的な配列の３’末端において位置する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記１つ以上の２’修飾ヌクレオチドは、前記標的核酸分子と相補的な配列の５’末端において位置する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記標的核酸分子と相補的な配列の５’末端において位置する前記１つ以上の２’修飾ヌクレオチドは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれを超える非修飾ヌクレオチドによりニック部位から離隔している、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
２つ以上の２’修飾ヌクレオチドが連続している、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
５つの連続する２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドが、前記標的核酸分子と相補的な配列の３’末端において位置する、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
５つの連続する２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドが、前記標的核酸分子と相補的な配列の５’末端において位置する、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記検出ステップは、非標的分子のアンプリコンを検出しない、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
リアルタイムで実施される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
増幅前に生物試料中に存在する核酸分子の量を測定する半定量的および／または量閾値方法を提供する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記１つ以上の２’修飾ヌクレオチドを、前記標的核酸分子と相補的な配列のより５’末端近傍に位置調節することにより、増幅の検出時間を増加させる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
プライマー／テンプレートオリゴヌクレオチドの比を使用して、異なる量の出発標的材料から生じる反応産物の分解能増加を提供することをさらに含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
増幅速度改変剤を使用して、異なる量の出発標的材料から生じる反応産物の分解能増加を提供することをさらに含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記標的核酸分子は、ＤＮＡまたはＲＮＡ核酸分子である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記プローブは、ＳＹＢＲグリーンまたはモレキュラービーコンである請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記プローブは、標的配列と相補的な少なくとも約１０ヌクレオチド、検出可能な部分、およびポリメラーゼ停止分子を含む、非増幅性の検出可能なポリヌクレオチドプローブであり、前記ポリメラーゼ停止分子は、通常はポリメラーゼ活性を支持する条件下でポリメラーゼが前記プローブを増幅することを妨害する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
単一反応の過程で産生された複数の異なる反応産物を検出する方法であって、
（ａ）標的核酸分子を、実質的に等温条件下で、ポリメラーゼ、それぞれが前記標的核酸分子上の相補的配列に特異的に結合する２つ以上のプライマー／テンプレートオリゴヌクレオチド、ニッキング酵素、および検出可能なポリヌクレオチドプローブと接触させるステップであって、前記プライマー／テンプレートオリゴヌクレオチドのそれぞれは、前記標的核酸分子と相補的な配列中に１つ以上の２’修飾ヌクレオチドを含むステップ；
（ｂ）前記標的核酸分子の少なくとも一部を含むアンプリコンを生成するステップ；ならびに
（ｃ）前記標的核酸分子またはそのアンプリコンへのオリゴヌクレオチドプローブハイブリダイゼーションに特異的なシグナルを検出するステップであって、前記シグナルは、試料中に存在する前記標的核酸分子またはそのアンプリコンの量を示すステップ
を含む方法。
【請求項１９】
ニッキングおよび伸長増幅の反応中の特異的産物を定量する方法であって、
（ａ）標的核酸分子を、実質的に等温条件下で、ポリメラーゼ、それぞれが前記標的核酸分子上の相補的配列に特異的に結合する２つのプライマー／テンプレートオリゴヌクレオチド、ニッキング酵素、および検出可能なポリヌクレオチドプローブと接触させるステップであって、前記プライマー／テンプレートオリゴヌクレオチドのそれぞれは、前記標的核酸分子と相補的な配列の３’末端において位置する５つの連続する２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含むステップ；
（ｂ）前記標的核酸分子の少なくとも一部を含むアンプリコンを生成するステップ；ならびに
（ｃ）前記標的核酸分子またはそのアンプリコンへのオリゴヌクレオチドプローブハイブリダイゼーションに特異的なシグナルを検出するステップであって、前記シグナルは、試料中に存在する前記標的核酸分子またはそのアンプリコンの量を示すステップ
を含む方法。
【請求項２０】
ステップ（ｃ）をリアルタイムで実施して前記反応中に存在する標的の量を測定する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
ニッキングおよび伸長増幅の反応をリアルタイムでモニタリングする方法であって、
（ａ）試験試料を、実質的に等温条件下で、ポリメラーゼ、それぞれが前記標的核酸分子上の相補的配列に特異的に結合する２つ以上のプライマー／テンプレートオリゴヌクレオチド、ニッキング酵素、および検出可能なポリヌクレオチドプローブと接触させるステップであって、前記プライマー／テンプレートオリゴヌクレオチドのそれぞれは、前記標的核酸分子と相補的な配列中に１つ以上の２’修飾ヌクレオチドを含むステップ；
（ｂ）前記標的核酸分子の少なくとも一部を含むアンプリコンを生成するステップ；ならびに
（ｃ）シグナルをリアルタイムで検出し、それにより前記標的核酸分子を定量するステップ
を含む方法。
【請求項２２】
前記試験試料は、病原体を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記病原体は、ウイルス、細菌、酵母または真菌である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記試験試料は、生物試料である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記生物試料は、生物体液、細胞、または組織試料である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記生物体液は、尿、精液、膣分泌液、または糞便である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記試験試料は、環境試料である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
ステップ（ｃ）が、リアルタイムで実施される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
ＮＥＡＲ反応中の標的核酸分子をリアルタイムでモニタリングする方法であって、
（ａ）標的核酸分子を、実質的に等温条件下で、ポリメラーゼ、それぞれが前記標的核酸分子上の相補的配列に特異的に結合する２つ以上のプライマー／テンプレートオリゴヌクレオチド、ニッキング酵素、ヘテロ二本鎖特異的ニッキング酵素、および検出可能なポリヌクレオチドプローブと接触させるステップであって、前記プライマー／テンプレートオリゴヌクレオチドのそれぞれは、前記標的核酸分子と相補的な配列中に１つ以上の２’修飾ヌクレオチドを含むステップ；
（ｂ）前記検出可能なオリゴヌクレオチドプローブに結合する標的配列を含むアンプリコンを生成するステップ；ならびに
（ｃ）シグナルをリアルタイムで検出し、それにより前記標的核酸分子を定量するステップ
を含む方法。
【請求項３０】
試験試料中の標的核酸分子をリアルタイムでモニタリングする方法であって、
（ａ）標的核酸分子を、実質的に等温条件下で、ポリメラーゼ、それぞれが前記標的核酸分子上の相補的配列に特異的に結合する２つ以上のプライマー／テンプレートオリゴヌクレオチド、ニッキング酵素、修復酵素またはプルーフリーディング酵素、および検出可能なポリヌクレオチドプローブと接触させるステップであって、前記プライマー／テンプレートオリゴヌクレオチドのそれぞれは、前記標的核酸分子と相補的な配列中に１つ以上の２’修飾ヌクレオチドを含むステップ；
（ｂ）前記検出可能なオリゴヌクレオチドプローブに結合する標的配列を含むアンプリコンを生成するステップ；ならびに
（ｃ）シグナルをリアルタイムで検出し、それにより前記標的核酸分子を定量するステップ
を含む方法。
【請求項３１】
前記試験試料は、病原体を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記病原体は、ウイルス、細菌、酵母または真菌である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記試験試料は、生物試料である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記生物試料は、生物体液、細胞、または組織試料である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記生物体液は、尿、精液、膣分泌液、または糞便である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記試験試料は、環境試料である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３７】
ステップ（ｃ）が、リアルタイムで実施される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３８】
ＮＥＡＲ反応中の標的配列を検出するためのキットであって、
標的核酸分子上の相補的配列に特異的に結合し、前記標的核酸分子と相補的な配列中に１つ以上の２’修飾ヌクレオチドを含む、１つ以上のプライマー／テンプレートオリゴヌクレオチド、および
本発明の方法における前記プライマー／テンプレートオリゴヌクレオチドの使用のための説明書
を含むキット。
【請求項３９】
５’から３’に、
ｉ）第１の領域、および
ｉｉ）第２の領域
を含み、前記第１の領域は、ニッキング酵素認識配列を含み；前記第２の領域は、標的核酸分子上の相補的配列に特異的に結合する少なくとも９ヌクレオチドを含み；前記第２の領域は、１つ以上の２’修飾ヌクレオチドを含む
単離オリゴヌクレオチド。
【請求項４０】
前記２’修飾は、２’−Ｏ−メチル、２’−メトキシエトキシ、２’−フルオロ、２’−ヒドロキシル、２’−アリル、２’−Ｏ−［２−（メチルアミノ）−２−オキソエチル］、４’−チオ、４’−ＣＨ２−Ｏ−２’−架橋、４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’−架橋、２’−ＬＮＡ、および２’−Ｏ−（Ｎ−メチルカルバメート）または塩基アナログを含むものからなる群から選択される、請求項３６に記載の単離オリゴヌクレオチド。
【請求項４１】
前記１つ以上の２’修飾ヌクレオチドは、前記標的核酸分子と相補的な配列の３’末端において位置する、請求項３９または４０に記載の単離オリゴヌクレオチド。
【請求項４２】
前記１つ以上の２’修飾ヌクレオチドは、前記標的核酸分子と相補的な配列の５’末端において位置する、請求項３９または４０に記載の単離オリゴヌクレオチド。
【請求項４３】
前記標的核酸分子と相補的な配列の５’末端において位置する前記１つ以上の２’修飾ヌクレオチドは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれを超える非修飾ヌクレオチドによりニック部位から離隔している、請求項４２に記載の単離オリゴヌクレオチド。
【請求項４４】
２つ以上の２’修飾ヌクレオチドが連続している、請求項３９〜４３のいずれか一項に記載の単離オリゴヌクレオチド。
【請求項４５】
連続する２’修飾ヌクレオチドの数は、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれを超える、請求項４４に記載の単離オリゴヌクレオチド。
【請求項４６】
前記ニッキング酵素認識配列は、５’−ＧＡＧＴ−３’である、請求項３９〜４５のいずれか一項に記載の単離オリゴヌクレオチド。
【請求項４７】
５つの連続する２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドが、前記標的核酸分子と相補的な配列の３’末端において位置する、請求項４１に記載の単離オリゴヌクレオチド。
【請求項４８】
５つの連続する２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドが、前記標的核酸分子と相補的な配列の５’末端において位置する、請求項４２に記載の単離オリゴヌクレオチド。
【請求項４９】
図１に記載のものである、単離オリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照により全体として本明細書に組み込まれる２０１２年４月９日に出願された米国仮特許出願第６１／６２１，９７５号明細書の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
核酸増幅技術は、複雑な生物学的プロセスの理解、病原性および非病原性生物の検出、同定および定量、法医犯罪学分析、疾患関連研究、ならびに遺伝子組換え生物におけるイベントの検出などの手段を提供している。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、ＤＮＡ融解のための反応の反復的加熱および冷却ならびにＤＮＡポリメラーゼを使用したＤＮＡの酵素的複製のサイクルからなる、ＤＮＡを増幅するために使用される一般的なサーマルサイクリング依存性核酸増幅技術である。リアルタイム定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）は、生物試料中の所与の核酸配列のコピー数を定量するために使用される技術である。現在、ｑＰＣＲは、反応全体にわたりリアルタイムで反応産物の検出を利用し、その増幅プロファイルを、それぞれの反応の開始時に既知量の核酸を含有する対照の増幅と比較する（または既知の核酸の相対比を未知の試験核酸と比較する）。対照の結果を使用し、典型的には、標準反応増幅曲線の対数部分に基づく標準曲線を構築する。これらの値を使用し、それらの増幅曲線が標準対照量と比較される場所に基づき未知物の量を内挿する。
【０００３】
ＰＣＲに加え、非サーマルサイクリング依存性増幅系または等温核酸増幅技術、例として、限定されるものではないが：ニッキングおよび伸長増幅の反応（Ｎｉｃｋｉｎｇ  ａｎｄ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）（ＮＥＡＲ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）、ループ介在性増幅（ＬＡＭＰ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、転写介在性増幅（ＴＭＡ）、自立配列複製（Ｓｅｌｆ−Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）（３ＳＲ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、単一プライマー等温増幅（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＳＰＩＡ）、Ｑ−βレプリカーゼ系、ならびにリコンビナーゼポリメラーゼ増幅（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＲＰＡ）が存在する。
【０００４】
ＮＥＡＲ増幅は、ＰＣＲサーモサイクリングと類似性を有する。ＰＣＲと同様に、ＮＥＡＲ増幅は、ＰＣＲにおいてプライマーと称されＮＥＡＲにおいてテンプレートと称される、標的配列と相補的なオリゴヌクレオチド配列を用いる。さらに、標的配列のＮＥＡＲ増幅は、標準的ＰＣＲと同様に標的配列の対数増加をもたらす。標準的ＰＣＲとは異なり、ＮＥＡＲ反応は等温的に進行する。標準的ＰＣＲでは、温度を上昇させてＤＮＡの２本の鎖を分離させる。ＮＥＡＲ反応では、標的核酸配列が、試験試料中に存在する特異的ニッキング部位においてニッキングされる。ポリメラーゼは、ニック部位に侵入し、既存の相補的ＤＮＡ鎖を置換しながら、ニッキングされた標的ヌクレオチド配列の相補鎖合成（添加される外因性ＤＮＡ）を開始する。鎖置換複製プロセスにより、温度上昇の必要性が除かれる。この時点で、テンプレート／プライマー分子が、添加された外因性ＤＮＡから置換された相補的配列にアニーリングする。ここで、ポリメラーゼがテンプレートの３’末端から伸長し、既に置換された鎖に対する相補鎖を創成する。次いで、第２のテンプレート／プライマーオリゴヌクレオチドが、新たに合成された相補鎖にアニーリングして伸長し、ニッキング酵素認識配列を含むＤＮＡの二本鎖を作製する。次いで、この鎖がニックを受けてポリメラーゼによる後続の鎖置換伸長が起こり、そのことは、元の標的ＤＮＡの両側上にニック部位を有するＤＮＡの二本鎖の産生をもたらす。これが合成されると、この分子は、新たなテンプレート分子により、置換された鎖の複製を介して指数関数的に増幅され続ける。さらに、テンプレート導入ニック部位におけるニックトランスレーション合成の反復作用を介して、それぞれの産物分子からも増幅が線形的に進行する。結果として、標的シグナル増幅は極めて迅速に増加し、それはＰＣＲサーモサイクリングよりもはるかに迅速であり、１０分未満で増幅がもたらされる。
【０００５】
しかしながら、定量化には問題があった。リアルタイムＮＥＡＲ系の最適な性能は、特異的産物の生成および増幅に依存する。ＮＥＡＲ系は、反応酵素により、特異的産物に加え、顕著なレベルの非特異的バックグラウンド産物を生成することが公知である。これらのバックグラウンド産物は、増幅可能な実体となり得、それらの生成は、特異的産物の生成を上回り得る。所望の標的に特異的な検出プローブを設計することが可能である（そのようにして複雑なバックグラウンドの中で特異的産物を検出可能である）一方、顕著なレベルの非特異的バックグラウンド産物は、通常ならば特異的産物の増幅に利用され得たはずの反応成分を封じ込めてしまう。したがって、非特異的バックグラウンド産物生成に起因する反応成分の封じ込めは、最適未満の反応をもたらす。これは、標的核酸が最初に極めて低いアバンダンスである場合、および高度に最適化された反応が標的の信頼性のある検出のために要求される場合に、特に問題となる。さらに、最適未満の反応は、標的核酸が検出可能だとしても、標的核酸の真の定量を表し得ない。非特異的バックグラウンド産物の増幅を排除する最適化ＮＥＡＲ反応を生成することが有利である。それを行うことは、標準曲線ベース系または相対的定量のいずれによる定量にも好適な反応を提供する。
【０００６】
さらに、質量分析を使用してＮＥＡＲ反応を評価することが慣行である。高レベルのバックグラウンド産物により、質量分析データの解釈が不明瞭になり得る。例えば、反応が、バックグラウンド産物、（関連はするが異種である標的からの）非特異的増幅に由来する１つ以上の産物、および特異的産物を含有する場合、それらのマトリックス由来産物をバックグラウンド産物から同定することは困難である。バックグラウンド産物の排除は、特定のアッセイの性能／特異性の明確な測定をもたらす。
【０００７】
さらに、高レベルのバックグラウンド産物は、意図的にデュプレックスまたはマルチプレックスとした反応の最適な増幅を妨げ得る。異なる標識がされた複数の検出プローブをリアルタイム検出に適合させることができる一方、非特異的産物形成に起因する反応物質の制限の課題が依然として存在する。デュプレックスまたはマルチプレックスの反応は、バックグラウンド産物の複雑な集団を潜在的に形成し得る３つ以上のテンプレート／プライマーを含有するため、このことはデュプレックスまたはマルチプレックスの反応には特に当てはまる。バックグラウンド産物の増幅を排除するＮＥＡＲ反応系は、意図的なデュプレックスまたはマルチプレックス反応のリアルタイムでの検出のための条件も提供する。増幅可能なバックグラウンド産物を排除し、したがって、ＮＥＡＲ反応中の特異的産物を生成する潜在性を最大化する手段を提供することは高度に有利である。反応の進行の正確なモニタリングにより定量的結果をリアルタイムで提供することができることが望ましい。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
以下に記載のとおり、本発明は、バックグラウンド産物の生成を低減させ、または排除し、試料標的オリゴヌクレオチドの定量を可能とする、試料中の標的オリゴヌクレオチドをリアルタイムで検出するための組成物および方法を特徴とする。これらの方法は、ＮＥＡＲ反応を使用して増幅される標的オリゴヌクレオチドと適合性である。本発明は、少なくとも部分的に、シングルプレックスＮＥＡＲ反応中の特異的産物をバックグラウンド産物の生成なしで生成することができるという発見に基づく。これらの反応組成物および方法は、未知試験試料の相対的定量、デュプレックス反応、およびマルチプレックス反応、ならびに未知試験試料の絶対的定量のための標準曲線の創成を提供する。
【０００９】
一態様において、本発明は、ニッキングおよび伸長増幅の反応中の特異的産物を定量する方法であって、標的核酸分子を、実質的に等温条件下で、エキソヌクレアーゼ欠損ポリメラーゼ、それぞれが標的核酸分子上の相補的配列に特異的に結合する２つ以上のプライマー／テンプレートオリゴヌクレオチド、ニッキング酵素、および検出可能なポリヌクレオチドプローブと接触させるステップであって、プライマー／テンプレートオリゴヌクレオチドのそれぞれは、標的核酸分子と相補的な配列中に１つ以上の２’修飾ヌクレオチドを有するステップ；前記標的核酸分子の少なくとも一部を有するアンプリコンを生成するステップ；ならびに標的核酸分子またはそのアンプリコンへのオリゴヌクレオチドプローブハイブリダイゼーションに特異的なシグナルを検出するステップであって、シグナルは、試料中に存在する標的核酸分子またはそのアンプリコンの量を示すステップ、を含む方法を提供する。
【００１０】
別の態様において、本発明は、単一反応の過程で産生された複数の異なる反応産物を検出する方法であって、標的核酸分子を、実質的に等温条件下で、エキソヌクレアーゼ欠損ポリメラーゼ、それぞれが標的核酸分子上の相補的配列に特異的に結合する２つ以上のプライマー／テンプレートオリゴヌクレオチド、ニッキング酵素、および検出可能なポリヌクレオチドプローブと接触させるステップであって、プライマー／テンプレートオリゴヌクレオチドのそれぞれは、標的核酸分子と相補的な配列中に１つ以上の２’修飾ヌクレオチドを有するステップ；前記標的核酸分子の少なくとも一部を有するアンプリコンを生成するステップ；ならびに標的核酸分子またはそのアンプリコンへのオリゴヌクレオチドプローブハイブリダイゼーションに特異的なシグナルを検出するステップであって、シグナルは、試料中に存在する標的核酸分子またはそのアンプリコンの量を示すステップ、を含む方法を提供する。
【００１１】
特定の態様において、本発明は、ニッキングおよび伸長増幅の反応中の特異的産物を定量する方法であって、標的核酸分子を、実質的に等温条件下で、エキソヌクレアーゼ欠損ポリメラーゼ、それぞれが標的核酸分子上の相補的配列に特異的に結合する２つのプライマー／テンプレートオリゴヌクレオチド、ニッキング酵素、および検出可能なポリヌクレオチドプローブと接触させるステップであって、プライマー／テンプレートオリゴヌクレオチドのそれぞれは、標的核酸分子と相補的な配列の３’末端（例えば、オリゴヌクレオチドの３’末端）においてまたはそれに隣接して位置する少なくとも約５つの連続する２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを有するステップ；前記標的核酸分子の少なくとも一部を有するアンプリコンを生成するステップ；ならびに標的核酸分子またはそのアンプリコンへのオリゴヌクレオチドプローブハイブリダイゼーションに特異的なシグナルを検出するステップであって、シグナルは、試料中に存在する標的核酸分子またはそのアンプリコンの量を示すステップ、を含む方法を提供する。
【００１２】
一態様において、本発明は、ニッキングおよび伸長増幅の反応をリアルタイムでモニタリングする方法であって、試験試料を、実質的に等温条件下で、エキソヌクレアーゼ欠損ポリメラーゼ、それぞれが標的核酸分子上の相補的配列に特異的に結合する２つ以上のプライマー／テンプレートオリゴヌクレオチド、ニッキング酵素、および検出可能なポリヌクレオチドプローブと接触させるステップであって、プライマー／テンプレートオリゴヌクレオチドのそれぞれは、標的核酸分子と相補的な配列中に１つ以上の２’修飾ヌクレオチドを有するステップ；前記標的核酸分子の少なくとも一部を有するアンプリコンを生成するステップ；ならびにシグナルをリアルタイムで検出し、それにより標的核酸分子を定量するステップを含む方法を提供する。
【００１３】
別の態様において、本発明は、ＮＥＡＲ反応中の標的核酸分子をリアルタイムでモニタリングする方法であって、標的核酸分子を、実質的に等温条件下で、エキソヌクレアーゼ欠損ポリメラーゼ、それぞれが標的核酸分子上の相補的配列に特異的に結合する２つ以上のプライマー／テンプレートオリゴヌクレオチド、ニッキング酵素、ヘテロ二本鎖特異的ニッキング酵素、および検出可能なポリヌクレオチドプローブと接触させるステップであって、プライマー／テンプレートオリゴヌクレオチドのそれぞれは、標的核酸分子と相補的な配列中に１つ以上の２’修飾ヌクレオチドを有するステップ；検出可能なオリゴヌクレオチドプローブに結合する標的配列を有するアンプリコンを生成するステップ；ならびにシグナルをリアルタイムで検出し、それにより標的核酸分子を定量するステップを含む方法を提供する。
【００１４】
さらに別の態様において、本発明は、試験試料中の標的核酸分子をリアルタイムでモニタリングする方法であって、標的核酸分子を、実質的に等温条件下で、ポリメラーゼ、それぞれが標的核酸分子上の相補的配列に特異的に結合する２つ以上のプライマー／テンプレートオリゴヌクレオチド、ニッキング酵素、修復酵素またはプルーフリーディング酵素、および検出可能なポリヌクレオチドプローブと接触させるステップであって、プライマー／テンプレートオリゴヌクレオチドのそれぞれは、標的核酸分子と相補的な配列中に１つ以上の２’修飾ヌクレオチドを有するステップ；検出可能なオリゴヌクレオチドプローブに結合する標的配列を有するアンプリコンを生成するステップ；ならびにシグナルをリアルタイムで検出し、それにより標的核酸分子を定量するステップを含む方法を提供する。
【００１５】
さらに別の態様において、本発明は、ＮＥＡＲ反応中の標的配列を検出するためのキットであって、標的核酸分子上の相補的配列に特異的に結合し、標的核酸分子と相補的な配列中に１つ以上の２’修飾ヌクレオチドを有する１つ以上のプライマー／テンプレートオリゴヌクレオチド、および、本発明の方法におけるプライマー／テンプレートオリゴヌクレオチドの使用のための説明書を含有するキットを提供する。
【００１６】
一態様において、本発明は、５’から３’に、の第１の領域、および第２の領域を有する単離オリゴヌクレオチドであって、第１の領域は、ニッキング酵素認識配列を有し；第２の領域は、標的核酸分子上の相補的配列に特異的に結合する少なくとも９つ以上のヌクレオチド（例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０以上の連続するヌクレオチド）を有し；第２の領域は、１つ以上の２’修飾ヌクレオチドを有する、単離オリゴヌクレオチドを提供する。他の実施形態において、単離オリゴヌクレオチドは、図１に記載のものである。
【００１７】
本明細書に記載の態様の種々の実施形態において、オリゴヌクレオチド（例えば、プライマー／テンプレートオリゴヌクレオチド、単離オリゴヌクレオチド）は、修飾ヌクレオチド、例として、２’修飾ヌクレオチドを含有する。本明細書に記載の任意の態様の種々の実施形態において、２’修飾は、２’−Ｏ−メチル、２’−メトキシエトキシ、２’−フルオロ、２’−ヒドロキシル、２’−アリル、２’−Ｏ−［２−（メチルアミノ）−２−オキソエチル］、４’−チオ、４’−ＣＨ２−Ｏ−２’−架橋、４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’−架橋、２’−ＬＮＡ、２’−アルキル、および２’−Ｏ−（Ｎ−メチルカルバメート）の１つ以上であり、または修飾ヌクレオチドは塩基アナログを含有する。本明細書に記載の任意の態様の種々の実施形態において、１つ以上の２’修飾ヌクレオチドは、標的核酸分子と相補的な配列の３’末端（例えば、オリゴヌクレオチドの３’末端）においてまたはそれに隣接して位置する。本明細書に記載の任意の態様の他の実施形態において、１つ以上の２’修飾ヌクレオチドは、標的核酸分子と相補的な配列の５’末端において位置する。本明細書に記載の任意の態様の種々の実施形態において、標的核酸分子と相補的な配列の５’末端において位置する１つ以上の２’修飾ヌクレオチドは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上の非修飾ヌクレオチドによりニック部位から離隔している。本明細書に記載の任意の態様の種々の実施形態において、２つ以上の２’修飾ヌクレオチドは、連続的（２、３、４、５つ以上）である。本明細書に記載の任意の態様の他の実施形態において、２つ以上の２’修飾ヌクレオチドは、非修飾ヌクレオチドと交互になっている。本明細書に記載の任意の態様の種々の実施形態において、ニッキング酵素認識配列は、５’−ＧＡＧＴＣ−３’である。本明細書に記載の任意の態様の種々の実施形態において、５つの連続する２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドは、標的核酸分子と相補的な配列の３’末端（例えば、オリゴヌクレオチドの３’末端）においてまたはそれに隣接して位置する。本明細書に記載の任意の態様の他の実施形態において、５つの連続する２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドは、標的核酸分子と相補的な配列の５’末端において位置する。本明細書に記載の任意の態様の他の実施形態において、非修飾ヌクレオチドと交互になっている２つ以上の２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドは、標的核酸分子と相補的な配列（すなわち、標的特異的領域）の５’末端において位置する。
【００１８】
本明細書に記載の任意の態様の種々の実施形態において、検出ステップは、非標的分子のアンプリコンを検出しない。本明細書に記載の任意の態様の種々の実施形態において、本方法はリアルタイムで実施される。本明細書に記載の任意の態様のある実施形態において、アンプリコンを生成するステップは（例えば、反応中に存在する標的の量を測定するために）リアルタイムで実施される。
【００１９】
本明細書に記載の任意の態様の種々の実施形態において、本方法は、増幅前において生物試料中に存在する核酸分子の量を測定する、半定量的および／または量閾値方法を提供する。本明細書に記載の任意の態様の種々の実施形態において、１つ以上の２’修飾ヌクレオチドを、標的核酸分子と相補的な配列のより５’末端近傍に位置調節することにより、増幅の検出時間を増加させる。本明細書に記載の任意の態様の種々の実施形態において、本方法は、プライマー／テンプレートオリゴヌクレオチドの比を使用して、異なる量の出発標的材料から生じる反応産物の分解能増加を提供することをさらに含む。認識配列の３’末端において１つ以上の２’修飾ヌクレオチドを有するプライマー／テンプレートオリゴの、認識配列の５’末端において１つ以上の２’修飾ヌクレオチドを有するプライマー／テンプレートオリゴに対する比の増加により、シグナル曲線が縮小し、曲線の傾きがシフトすることが見出された。
【００２０】
本明細書に記載の任意の態様の種々の実施形態において、本方法は、増幅速度改変剤を使用して、異なる量の出発標的材料から生じる反応産物の分解能増加を提供することをさらに含む。本明細書に記載の任意の態様の種々の実施形態において、標的核酸分子は、ＤＮＡまたはＲＮＡ核酸分子である。本明細書に記載の任意の態様の種々の実施形態において、検出可能なプローブは、ＳＹＢＲグリーン（ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ）またはモレキュラービーコン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎ）である。本明細書に記載の任意の態様の種々の実施形態において、検出可能なプローブは、標的配列と相補的な少なくとも約１０ヌクレオチド、検出可能な部分、およびポリメラーゼ停止分子を有する、非増幅性の検出可能なポリヌクレオチドプローブであり、そのポリメラーゼ停止分子は、通常ならばポリメラーゼ活性を支持する条件下でポリメラーゼがプローブを増幅することを防止する。
【００２１】
本明細書に記載の任意の態様の種々の実施形態において、試験試料は、病原体を含有する。本明細書に記載の任意の態様の種々の実施形態において、病原体は、ウイルス、細菌、酵母または真菌である。本明細書に記載の任意の態様の種々の実施形態において、試験試料は、生物試料である。本明細書に記載の任意の態様の種々の実施形態において、生物試料は、細胞、組織試料、または生物体液（例えば、尿、精液、膣分泌液、または糞便）である。本明細書に記載の任意の態様の種々の実施形態において、試験試料は、環境試料である。
【００２２】
本発明は、ＮＥＡＲ反応を使用して増幅された標的核酸分子を検出するための組成物および方法を提供する。本発明により定義される組成物および物品は、以下に提供される実施例に関連して単離され、あるいは製造された。本発明の他の特徴および利点は、詳細な説明、および特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
【００２３】
定義
本開示において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する」および「有する」などは、米国特許法においてそれらに属する意味を有し得、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味し得る。「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」または「本質的に〜なる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ）」も同様に、米国特許法に属する意味を有し、その用語は拡張可能であり、言及されるものの基本的なまたは新規な特徴が、言及されるもの以外のものの存在により変更されない限り、言及されるもの以外のものの存在を許容するが、先行技術の実施形態は除く。
【００２４】
「ポリメラーゼ停止分子」は、ポリヌクレオチドテンプレート上でのポリメラーゼの進行を妨害しまたは顕著に低減させる、ポリヌクレオチドテンプレート／プライマーに付随する部分を意味する。好ましくは、この部分は、ポリヌクレオチド中に組み込まれる。１つの好ましい実施形態において、この部分は、ポリメラーゼがテンプレート上で進行することを妨害する。
【００２５】
「ポリメラーゼ伸長」は、アクセス可能な３’−ヒドロキシル基からのポリメラーゼの順方向の進行であって、入ってくるモノマーをテンプレートポリヌクレオチド鎖上の相対するヌクレオチドに相補的に取り込むものを意味する。
【００２６】
「エキソヌクレアーゼ欠損ポリメラーゼ」は、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を欠き、またはそのような活性を実質的に検出不能なレベルで有する、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよび／またはＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを意味する。
【００２７】
「ヌクレオチドアダクト」は、標準的なヌクレオチド塩基に共有結合またはその他の方法で固定されている部分を意味する。
【００２８】
本明細書において使用される用語「検出可能なポリヌクレオチドプローブ」は、標的配列の少なくとも一方の鎖と相補的な配列領域を有し、検出可能な部分により標識された、少なくとも部分的に一本鎖である任意のポリヌクレオチドを指し、それは、標的配列への結合時に検出可能な部分から検出可能なシグナルを放出するが、その検出可能な部分によるシグナル生成は、非特異的５’−３’エキソヌクレアーゼ活性による検出可能なポリヌクレオチドプローブの開裂に依存する。本明細書において使用される「検出可能なポリヌクレオチドプローブ」の一例は、限定されるものではないが、先行技術に記載の蛍光モレキュラービーコン（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎ）プローブである。
【００２９】
本明細書において使用される用語「核酸」は、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、または修飾ヌクレオチド、および一本鎖もしくは二本鎖形態のそれらのポリマーを指す。この用語は、参照核酸と類似の結合特性を有し、参照ヌクレオチドと同様の様式で代謝される、合成、天然存在、および非天然存在の公知のヌクレオチドアナログまたは修飾骨格の残基または結合を含有する核酸を包含する。このようなアナログの例としては、限定されるものではないが、２’修飾リボヌクレオチド（例えば、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、２’−Ｆヌクレオチド）が挙げられる。
【００３０】
本明細書において使用される用語「修飾ヌクレオチド」は、ヌクレオシド、ヌクレオ塩基、ペントース環、またはリン酸基への１つ以上の修飾を有するヌクレオチドを指す。例えば、修飾ヌクレオチドは、アデノシン一リン酸、グアノシン一リン酸、ウリジン一リン酸、およびシチジン一リン酸を含有するリボヌクレオチドならびにデオキシアデノシン一リン酸、デオキシグアノシン一リン酸、デオキシチミジン一リン酸、およびデオキシシチジン一リン酸を含有するデオキシリボヌクレオチドを除く。修飾としては、ヌクレオチドを修飾する酵素、例えば、メチルトランスフェラーゼによる修飾から生じる天然存在のものが挙げられる。修飾ヌクレオチドとしては、合成または非天然存在のヌクレオチドも挙げられる。ヌクレオチド中の合成または非天然存在の修飾としては、２’修飾、例えば、２’−アルキル、例えば、２’−Ｏ−メチルおよび２’−メトキシエトキシ、２’−フルオロ、２’−ヒドロキシル（ＲＮＡ）、２’−アリル、２’−Ｏ−［２−（メチルアミノ）−２−オキソエチル］、４’−チオ、４’−ＣＨ２−Ｏ−２’−架橋、４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’−架橋、２’−ＬＮＡ、および２’−Ｏ−（Ｎ−メチルカルバメート）を有するものまたは塩基アナログを含むものが挙げられる。
【００３１】
「塩基置換」は、相補的ヌクレオチド鎖間のハイブリダイゼーションの顕著な破壊を引き起こさないヌクレオ塩基ポリマーの置換物を意味する。
【００３２】
「特異的産物」は、テンプレートオリゴヌクレオチドの相補的標的配列へのハイブリダイゼーションおよびそれに続く標的配列のポリメラーゼ介在性伸長から生じる、ポリヌクレオチド産物を意味する。
【００３３】
「ニッキングおよび伸長増幅の反応」は、関心対象のポリヌクレオチドの増幅をもたらす、ニッキングおよび伸長の交互のサイクルを意味する。
【００３４】
「実質的に等温条件」は、単一温度におけるもの、または顕著に変動しない温度の狭い範囲内であるものを意味する。一実施形態において、実質的に等温条件下で実施される反応は、約１〜５℃だけしか変動しない（例えば、１、２、３、４または５度だけ変動する）温度において実施される。別の実施形態において、反応は、利用される装置の操作パラメータ内の単一温度において実施される。
【００３５】
「ニッキング酵素」は、二本鎖核酸分子中の特異的構造を認識し、それに結合し、その認識した特異的構造への結合時に一本鎖上の隣接ヌクレオチド間のホスホジエステル結合を切断し、それにより、そのニック部位の上流の末端ヌクレオチド上に、エキソヌクレアーゼ欠損ポリメラーゼにより伸長させることができる遊離３’ヒドロキシル基を創成することができる、ポリペプチドを意味する。
【００３６】
「ニック部位」は、ニッキング酵素により加水分解された二本鎖核酸分子の一方の鎖中の「切断された」ホスホジエステル結合の位置を意味する。
【００３７】
「アンプリコン」は、関心対象のポリヌクレオチドの増幅の際に生成された一のポリヌクレオチドまたは複数のポリヌクレオチドを意味する。一例において、アンプリコンは、ポリメラーゼ連鎖反応の際に生成される。
【００３８】
「半定量的」は、内部対照に基づく相対量の推定値を提供することを意味する。
【００３９】
「量閾値方法」は、比較標準の量の超過または非超過のいずれかに基づく量の推定値を提供することを意味する。
【００４０】
「増幅速度改変剤」は、ポリメラーゼ伸長の速度またはニッキング酵素による一本鎖ニッキングの速度のいずれかまたはその両方に影響を及ぼし得る薬剤を意味する。
【００４１】
「反応をモニタリングすること」は、反応の進行を検出することを意味する。一実施形態において、反応進行をモニタリングすることは、ポリメラーゼ伸長を検出することおよび／または完結したＮＥＡＲ反応を検出することを含む。
【００４２】
「検出する」は、検出すべき分析物の存在、不存在または量を同定することを指す。
【００４３】
「検出可能な部分」は、関心対象の分子に結合した場合にその分子を分光光度的、光化学的、生化学的、免疫化学的、または化学的手段を介して検出可能とする組成物を意味する。例えば、有用な標識としては、放射性同位体、磁気ビーズ、金属ビーズ、コロイド粒子、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡにおいて一般に使用されるもの）、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテンが挙げられる。
【００４４】
「断片」は、核酸分子の一部を意味する。この一部は、好ましくは、参照核酸分子またはポリペプチドの全長の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％を含有する。断片は、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ヌクレオチドを含有し得る。
【００４５】
「ハイブリダイゼーション」は、相補的ヌクレオ塩基間のワトソン・クリック、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン水素結合であり得る水素結合を意味する。例えば、アデニンおよびチミンは、水素結合の形成を介して対合する相補的ヌクレオ塩基である。
【００４６】
「単離ポリヌクレオチド」は、本発明の核酸分子が由来する生物の天然ゲノム中における当該遺伝子の隣接遺伝子から分離された核酸（例えば、ＤＮＡ）を意味する。したがって、この用語は、例えば、ベクター中；自己複製プラスミドもしくはウイルス中；もしくは原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡ中に組み込まれた；または、他の配列と独立した別個の分子（例えば、ＰＣＲまたは制限エンドヌクレアーゼ消化により産生されたｃＤＮＡまたはゲノム断片もしくはｃＤＮＡ断片）として存在する、組換えＤＮＡを含む。さらに、この用語は、ＤＮＡ分子から転写されたＲＮＡ分子、および追加のポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡを含む。
【００４７】
用語「単離」、「精製」または「生物学的に純粋な」は、天然状態では通常付随して見出される成分が様々な程度で除去された物質を指す。「単離する」は、元の資源または環境からのある程度の分離を示す。「精製する」は、単離よりも高度な分離の程度を示す。「精製された」または「生物学的に純粋な」タンパク質は、何らかの不純物がタンパク質の生物学的特性に実質的に影響を及ぼさず他の有害結果も引き起こさない程度に、他の物質が除去されている。すなわち、本発明の核酸またはペプチドは、それが組換えＤＮＡ技術により産生される場合には、細胞性物質、ウイルス性物質、あるいは培養培地が実質的に除去されており、化学合成される場合には、化学前駆体その他の化学物質が実質的に除去されている場合、精製されている。純度および均質性は、典型的には、分析化学技術、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーを使用して測定される。用語「精製」は、核酸またはタンパク質が電気泳動ゲル中で本質的に１つのバンドを生じさせることを示し得る。修飾、例えば、リン酸化またはグリコシル化に供することができるタンパク質については、異なる修飾により、別個に精製され得る異なる単離タンパク質が生じ得る。
【００４８】
本明細書において使用される、「薬剤を得ること」という場合のような「得ること」は、その薬剤を合成すること、購入すること、またはその他の方法で取得することを含む。
【００４９】
「参照」は、標準または対照条件を意味する。当業者に明らかなとおり、適切な参照は、ある要素の効果を決定するためにその要素を変更したものである。
【００５０】
「ハイブリダイズする」は、種々のストリンジェンシーの条件下で相補的ポリヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記載の遺伝子）間、またはその一部の間で二本鎖分子を形成するペアを意味する。（例えば、Ｗａｈｌ，Ｇ．Ｍ．ａｎｄ  Ｓ．Ｌ．Ｂｅｒｇｅｒ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：３９９；Ｋｉｍｍｅｌ，Ａ．Ｒ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：５０７参照）。
【００５１】
「対象」は、哺乳動物、例として、限定されるものではないが、ヒトまたは非ヒト哺乳動物、例えば、ウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ、またはネコを意味する。
【００５２】
「標的核酸分子」は、分析すべきポリヌクレオチドを意味する。このようなポリヌクレオチドは、標的配列のセンスまたはアンチセンス鎖であり得る。用語「標的核酸分子」は、元の標的配列のアンプリコンも指す。
【００５３】
本明細書に提供される範囲は、その範囲内の値の全てについての略記であると解される。例えば、１から５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０からなる群からの任意の数字、数字の組合せ、または部分範囲を含むと解される。
【００５４】
特に記載されていたり文脈から明らかであったりしない限り、本明細書において使用される用語「または」は、包含的であると解される。特に記載されていたり文脈から明らかであったりしない限り、本明細書において使用される用語「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、単数形または複数形であると解される。
【００５５】
特に記載されていたり文脈から明らかであったりしない限り、本明細書において使用される用語「約」は、当技術分野における通常の許容範囲内、例えば、平均から２標準偏差以内と解される。約は、記述値から１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、または０．０１％以内と解することができる。特に文脈から明らかでない限り、本明細書に提供される全ての数値は、約という用語により修飾される。
【００５６】
本明細書における可変要素の定義における化学基の列挙の記載は、任意の単一基または列記される基の組合せとしてのその可変要素の定義を含む。本明細書における可変要素または態様についての実施形態の記載は、任意の単一の実施形態としての、または任意の他の実施形態またはその一部との組合せにおける実施形態を含む。
【００５７】
本明細書に提供されるあらゆる組成物または方法は、本明細書に提供される他の組成物および方法のいずれかの１つ以上と組み合わせることができる。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】例示的なポリメラーゼ停止実体構造を示す。黒色＝安定化配列、青色＝ニッキング酵素認識配列、緑色＝ニッキング酵素スペーサー配列、赤色＝標的特異的認識配列、Ａ＝アデニン、Ｔ＝チミン、Ｇ＝グアニン、Ｃ＝シトシン、Ｕ＝ウラシル、ｍＸ＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ塩基。下線で示される塩基は、修飾配列セグメントを表す。
【図２Ａ】図２Ａ〜Ｃは、クラビバクター・ミシガネンシス・セピドニクス（Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ  ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ  ｓｅｐｉｄｏｎｉｃｕｓ）（Ｃｍｓ）標的ＤＮＡに対するダイナミックレンジ合成ロングマーの評価を示す。Ｃｍｓ合成「ロングマー」標的のタイトレーションおよびフルオロビーコン（ｆｌｕｏｒｏｂｅａｃｏｎ）を介する検出からの例示的結果を示す。インプット標的核酸なしで実施されたＣｍｓについてのＮＥＡＲアッセイを、無標的対照（Ｎｏ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＮＴＣ））として示す。図２Ａは、無標的対照（ＮＴＣ）におけるシグナルが、２’−Ｏ−メチル修飾プライマー／テンプレート含有反応中では抑制されたことを示すグラフである。
【図２Ｂ】図２Ｂは、２’−Ｏ−メチルテンプレート反応を使用して標準曲線が広いダイナミックレンジを示したことを示すグラフである。
【図２Ｃ】図２Ｃは、非修飾プライマー／テンプレート（左パネル）と比較した、２’−Ｏ−メチル修飾プライマー／テンプレート（右パネル）を使用するＣｍｓアッセイ系の無標的対照（ＮＴＣ）における非特異的増幅産物の排除を示す例示的な質量スペクトルデータの比較である。バックグラウンド産物の生成に対する２’−Ｏ−メチル修飾プライマー／テンプレートの効果を測定するため、図２Ａに示される無標的対照反応の試料（１０μｌ）を、ＨＰＬＣ／質量分析を介して分析した。２’−Ｏ−メチル修飾プライマー／テンプレートの存在下では、予期される分子種のみの存在が検出され、非修飾プライマー／テンプレートの存在下で生成される複雑なバックグラウンド産物が排除されたことを、質量スペクトルデータが明確に実証している。
【図３】テンプレート／プライマーの２’−Ｏ−メチル修飾が、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ検出を使用するＮＥＡＲアッセイにおいてバックグラウンドシグナルを排除したことを示す。２’−Ｏ−メチル修飾プライマー／テンプレートを使用する例示的な増幅データおよび非特異的増幅産物の排除を示す。図３Ａは、無標的対照（ＮＴＣ）において顕著なシグナルが観察されたことを示すグラフであり、標的ＤＮＡの不存在下でのバックグラウンド産物生成を示す。図３Ｂは、２’−Ｏ−メチル修飾テンプレート含有反応中で、無標的対照（ＮＴＣ）におけるシグナルが抑制されたことを示すグラフである。
【図４】テンプレート／プライマーの２’−Ｏ−メチル修飾が、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎ検出を使用するＮＥＡＲアッセイにおいてバックグラウンドシグナルを排除したことを示す。２’−Ｏ−メチル修飾プライマー／テンプレートを使用する例示的な増幅データおよび非特異的増幅産物の排除を示す。図４Ａは、無標的対照（ＮＴＣ）において顕著なシグナルが観察されたことを示すグラフであり、標的ＤＮＡの不存在下でのバックグラウンド産物生成を示す。図４Ｂは、２’−Ｏ−メチル修飾テンプレート含有反応中で、無標的対照（ＮＴＣ）におけるシグナルが抑制されたことを示すグラフである。
【図５】２’−Ｏ−メチル修飾プライマー／テンプレート、または２’−Ｏ−メチル修飾プライマー／テンプレートの比を使用した、例示的なポリメラーゼ停止実体を用いて、検出までの時間および反応の効率の両方を操作し、したがって反応を「チューニング」することができることを示す。特異的反応のチューニングのための例示的な２’−Ｏ−メチル修飾テンプレート／プライマーの略図、例として、３’末端において５つの２’−Ｏ−メチルヌクレオチドのブロックを有するプライマー／テンプレート（「末端側」テンプレート；左）およびニック部位の後から３番目のヌクレオチドから始まる５つの２’−Ｏ−メチルヌクレオチドのブロックを有するプライマー／テンプレート（「ニック＋２」テンプレート；右）を示す。それぞれのチューニング条件は、特定の比の順方向および逆方向テンプレートを含み、それぞれのテンプレートのセットが様々な構造を有する。
【図６】特異的反応の「チューニング」のためのテンプレート／プライマーの２’−Ｏ−メチル修飾の有用性を実証する増幅プロットを示す。２’−Ｏ−メチル修飾プライマー／テンプレートを使用する例示的な増幅データを示す。反応（二重実験）の全ては、１０，０００ゲノム当量のＣｍｓ  ＤＮＡを含有した。それぞれのチューニング条件は、規定比の順方向および逆方向テンプレートを用い、それぞれのテンプレートのセットが様々な構造を有する。赤色の円は、それぞれのチューニング条件についての検出までの時間のシフトを実証する。さらに、それぞれの条件の対数期は縮小され、曲線の傾きはシフトされた。
【図７】トウモロコシＡＤＨ１遺伝子の断片を増幅するためのＮＥＡＲアッセイに使用される２つのプライマー／テンプレートセット（ＴＳ３およびＴＳ６）の設計を示す。ＴＳ３およびＴＳ６プライマー／テンプレートセットの配列中の標的特異的領域は、先行技術における典型的なＮＥＡＲアッセイのプライマー／テンプレートセットにおけるもの（９から１２塩基）よりも顕著に長い（１５〜１７塩基）。ＴＳ３プライマー／テンプレートセットにおいて、３’末端に隣接する５つの連続する２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドのブロックは、ニック部位からそれぞれ５または４ヌクレオチド下流の２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドから始まり非修飾ヌクレオチドと交互になっている２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドの上流領域により先行される。ＴＳ３とは対照的に、ＴＳ６セットのプライマー／テンプレートのそれぞれにおいては、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドは５つだけ存在し、これらが非修飾３’末端側ヌクレオチドに隣接して連続ヌクレオチドのブロックを形成している。
【図８】ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ色素検出チャンネルにおいて記録された、プライマー／テンプレートの２つのセット（ＴＳ３およびＴＳ６）を使用するＡＤＨ１アッセイの増幅プロットを示す。
【図９】ＲＯＸチャンネルにおいて記録された同じアッセイ反応の増幅プロットを示す。
【図１０】記録されたＮＴＣ  ＡＤＨ１アッセイ反応の増幅プロットを示す。図８および９に示される結果を比較すると、プライマー／テンプレートセットＴＳ３のみがＡＤＨ１特異的アンプリコンを産生する一方、セットＴＳ６により生成されるシグナルは、ほとんどが、ＳＹＢＲｇｒｅｅｎによってのみ検出されるバックグラウンド産物の非特異的増幅に基づくことが明白になる。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
本発明は、等温反応中の標的核酸分子の定量に有用な組成物および方法を特徴とする。特定の実施形態において、本発明は、ＮＥＡＲ反応中の（例えば、リアルタイムでの）標的核酸分子の定量のための組成物および方法を提供する。
【００６０】
本発明は、少なくとも部分的に、２’修飾（例えば、２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ）ヌクレオチドを含むプライマー−テンプレートオリゴヌクレオチドが、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼＩの５’−３’エキソヌクレアーゼ欠損誘導体による不当な増幅を低減させ、または排除するという驚くべき発見に基づく。
【００６１】
ＮＥＡＲ反応
ＮＥＡＲ反応は、標的オリゴヌクレオチドの非定量的検出を提供するエンドポイント反応として使用されている。従来型のＮＥＡＲアッセイは、（１）標的核酸分子；（２）ＰＣＲのプライマー分子と類似する２つのオリゴヌクレオチド分子；「テンプレート−プライマー」と呼ばれ、標的核酸分子と相補的ないくらかの数のオリゴヌクレオチドおよびニッキング酵素により開裂することができる部位を含む；（３）ｄＮＴＰ；（４）鎖置換性５’−３’−エキソヌクレアーゼ欠損ポリメラーゼ；ならびに（５）ニッキング酵素を含む。ＮＥＡＲ反応を定量する現在の方法、特にリアルタイムで定量するものは、試料中に存在する非標的分子の不当な増幅を部分的な理由として不適切であり、これは従来型ＮＥＡＲ反応中の標的配列の検出を不明瞭にし得る。例えば、ＮＥＡＲ反応中に望ましくない増幅が一貫して存在し、それは、標的分子の不存在下で検出可能なシグナルをもたらし、または、反応中に存在する標的核酸分子の量をシグナルが正確に反映しない。これはエンドポイント産物の検出を提供するが、反応のリアルタイムのモニタリングを提供し得ない。
【００６２】
本発明は、ＮＥＡＲ反応中の標的核酸分子を正確に定量するという課題を解決する修飾プライマー／テンプレートオリゴヌクレオチドを提供する。これは、リアルタイムでのＮＥＡＲ反応中の標的核酸分子の定量に特に有用である。本発明は、少なくとも部分的に、２’修飾（例えば、２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ）を含むプライマー−テンプレートオリゴヌクレオチドが、不当な増幅を低減させ、または排除し、それらの修飾プライマー／テンプレートの伸長を妨害せずに特異的産物を増幅するという発見に基づく。本発明のプライマー／テンプレートオリゴヌクレオチドは、上記ＮＥＡＲ成分の１つ以上を含むＮＥＡＲ反応中で有用である。
【００６３】
他の実施形態において、本発明は、プライマー−テンプレートの３’末端においてまたはそれに隣接して位置する２’修飾（例えば、２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ）を含む、プライマー−テンプレートオリゴヌクレオチドを提供する。驚くべきことに、プライマー−テンプレートの３’末端領域中に位置する２’−Ｏ−メチルヌクレオチドは、等温ＤＮＡ増幅反応中のＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼＩの５’−３’−エキソヌクレアーゼ欠損誘導体のための有効なプライミング基質を含むだけでなく、そのような修飾プライマー−テンプレートの使用は、非特異的プライマー−ダイマー増幅を完全に抑制する。このことは、特に驚くべきことである。なぜならば、等温ＤＮＡ増幅の分野における従来の考えは、修飾ヌクレオチド（例えば、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、非修飾リボヌクレオチド）は３’末端から離れたプライマー／テンプレートの５’末端側領域においてのみ導入することができることを教示するためであり、それというのも、プライマーの３’末端から６ヌクレオチド以内の２’−Ｏ−メトイル（ｍｅｔｈｏｙｌ）あるいはリボヌクレオチドの配置が、ＤＮＡポリメラーゼによるプライマー伸長を阻害することが実証されているためである（参照としてＡｍｅｒｓｈａｍの特許出願およびＱｉａｇｅｎの特許が挙げられる）。ＮＥＡＲおよび他の等温増幅技術（ＬＡＭＰ）において使用されるＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼＩの５’−３’エキソヌクレアーゼ欠損誘導体は、低合成フィデリティーＤＮＡ修復プロセスに関与するｐｏｌＡタイプの細菌ＤＮＡポリメラーゼに属する。対照的に、細菌中の高フィデリティーゲノム複製は、もっぱらＲＮＡプライマーを利用してＤＮＡ複製を開始するＤＮＡＥ−およびＰＯＬＣタイプＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素により触媒される。刊行されている先行技術においては、このＲＮＡおよびＤＮＡプライマー間の区別が、高エラー率ＤＮＡポリメラーゼＩ酵素が高フィデリティーゲノム複製に干渉することを防止するための１つの機序と考えられていた。この文脈において、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼＩの誘導体が２’−修飾リボヌクレオチドをＤＮＡ合成のためのプライマーとして効率的に利用し得るという驚くべき発見は、卓越し、直観に反するものである。
【００６４】
プライマー−テンプレート設計
例示的なポリメラーゼ停止実体構造は、５’から３’に、安定化配列、ニッキング酵素認識配列、ニッキング酵素スペーサー配列、および標的特異的認識配列を含み、標的特異的認識配列は、１つ以上の２’修飾ヌクレオチド（例えば、２’−Ｏ−メチル、２’−メトキシエトキシ、２’−フルオロ、２’−アリル、２’−Ｏ−［２−（メチルアミノ）−２−オキソエチル］、２’−ヒドロキシル（ＲＮＡ）、４’−チオ、４’−ＣＨ２−Ｏ−２’−架橋、４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’−架橋、２’−ＬＮＡ、および２’−Ｏ−（Ｎ−メチルカルバメート））を含む。理論に拘束されるものではないが、認識領域に１つ以上の２’修飾ヌクレオチドを組み込むことにより、それらの修飾領域が、プライマー／テンプレートの相互作用により形成される非特異的な分子間および／または分子内複合体（例えば、プライマー−ダイマー形成）においてポリメラーゼ伸長のためのテンプレートとして機能することが不適になり、それにより、等温増幅におけるバックグラウンドシグナルが低減または排除されることが仮定される。２’修飾ヌクレオチドは、好ましくは、標的配列と塩基対形成する塩基を有する。特定の実施形態において、標的特異的認識領域中の２つ以上の２’修飾ヌクレオチド（例えば、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれを超える２’修飾ヌクレオチド）は、連続的（例えば、修飾ヌクレオチドのブロック）である。一部の実施形態において、２’修飾ヌクレオチドのブロックは、標的特異的認識領域の３’末端において位置する。他の実施形態において、２’修飾ヌクレオチドのブロックは、標的特異的認識領域の５’末端において位置する。２’修飾ヌクレオチドのブロックが標的特異的認識領域の５’末端において位置する場合、２’修飾ヌクレオチドは、１つ以上の非修飾ヌクレオチド（例えば、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれを超える２’非修飾ヌクレオチド）によりニック部位から離隔されていてよい。本出願人らは、１つ以上の２’修飾ヌクレオチドの位置調節あるいは２’修飾ヌクレオチドのブロックの位置調節により、増幅のキネティックスが変化することを見出した。１つ以上の２’修飾ヌクレオチドまたは２’修飾ヌクレオチドのブロックが、認識領域の５’末端もしくはその近傍において、またはニック部位に近接して位置する場合、リアルタイム増幅反応は、検出までの時間の減少を示した。さらに、シグナル曲線は縮小され、曲線の傾きはシフトされた。本出願人らは、１２ヌクレオチド長を超過する認識領域において、５つの連続する２’−修飾ヌクレオチドの単一ブロックが非特異的増幅を抑制するために十分でなく、したがって、ニック部位から４または５ヌクレオチドまで下流の全認識領域を、非修飾ヌクレオチドと交互になっている２’−修飾ヌクレオチドにより置換しなければならないことも見出した。
【００６５】
関連実施形態において、１つ以上の２’修飾ヌクレオチドを有するプライマー／テンプレートオリゴの比を使用して、反応の「チューニング」のために検出までの時間および／または反応の効率を変え、増幅キネティックスに対する予測可能な制御をもたらすことができる。認識配列の３’末端において１つ以上の２’修飾ヌクレオチドを有するプライマー／テンプレートオリゴの、認識配列の５’末端において１つ以上の２’修飾ヌクレオチドを有するプライマー／テンプレートオリゴに対する比の増加により、シグナル曲線が縮小し、曲線の傾きがシフトした。反応を「チューニング」し、検出までの時間および反応の効率の両方を操作する手段を提供することができることが有利である。内部対照を使用する相対的定量は、２つの重要な条件が満たされることを要求する。第１に、反応の検出までの時間を改変し、非競合反応条件を創成することができることが有益である。したがって、対照反応を（関心対象の標的に対して）後の時点において検出可能とすることにより、関心対象の標的の初期アバンダンスが低い場合であっても、対照反応が関心対象の特異的標的を打ち負かさない。第２に、真の相対的アバンダンスの計算を確保するため、対照および特異的標的反応が同等の効率を有することが要求される。「チューニング」を使用してそれぞれの反応の効率を制御することにより、条件は同等の反応を可能とし、十分な相対的定量計算を許容する。反応のチューニングを使用して定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）における標的核酸増幅および参照核酸増幅（例えば、内部標準）の効率を合致させることができる。さらに、標的核酸および内部標準の増幅曲線は、標的核酸増幅および内部標準増幅について同一の効率を提供しながらそれらの増幅産物の検出の時間が分離するように改変し得る。反応内のオリゴヌクレオチド構造の特定の組合せおよび比を使用することを介して、反応性能のチューニングを可能とする条件を創成することが可能である。
【００６６】
種々の実施形態において、プライマー／テンプレートペアは、ステムとループの構成を伴って構築される。プライマー／テンプレートオリゴヌクレオチドの５’末端は、ステムの少なくとも一部を形成する自己相補的領域を含む。本発明の一部の実施形態において、ステムは、ニッキング酵素認識配列の少なくとも一部または全部をさらに包含する。本発明の他の種々の実施形態において、プライマー−テンプレート中のニッキング酵素認識配列は、二本鎖ステム構造の一部でなく、ほぼ一本鎖であるループ内に位置する。このニッキング酵素認識部位は、その３’末端において、ニッキング部位（標的配列と相補的な配列に３’末端において連結している）を含む二次構造非含有部位に連結している。所望により、標的配列と相補的な配列は、二次構造を含んでもよいし、または二次構造を含まなくてもよい。自己相補的領域を含み得る二次構造の存在または不存在は、特定のＮＥＡＲアッセイを最適化するために決定される。
【００６７】
一実施形態において、本発明の方法は、標準的なＮＥＡＲ成分を含むが、相補的ＤＮＡ鎖とのヘテロ二本鎖で存在する場合にＲＮＡヌクレオチドをニッキングし得る酵素をも含む、ＮＥＡＲ反応を提供する。一例において、開裂されるＲＮＡヌクレオチドは、ＰＴＯの標的相補的領域の５’末端側に向かう４〜１５の非開裂可能なＲＮＡヌクレオチド（すなわち、Ｏ−２−Ｍｅ−ＲＮＡ）の連なりの中に存在し、テンプレートオリゴヌクレオチドの３’末端は、３’末端「キャップ」を有する。テンプレートオリゴヌクレオチドの完全な適正なハイブリダイゼーション時にのみ、ヘテロ二本鎖開裂分子（すなわち、ＲＮアーゼ（ＲＮａｓｅ）Ｈ）がＲＮＡ塩基を開裂し、ニックトランスレーション酵素の伸長のための３’末端を創成し；ＮＥＡＲ反応の完了への進行を可能とし得る。異常なテンプレート結合（プライマーダイマー、部分的な非標的ハイブリダイゼーションなど）は、上記ＲＮＡ−ＤＮＡヘテロ二本鎖の形成をもたらさない；したがって、ＮＥＡＲ反応の進行を妨害する。これらのテンプレートは、相補的ヌクレオチド配列への結合後、３’ポリメラーゼ伸長「キャップ」の除去を介してのみ増幅される。このことは、ＮＥＡＲ反応の特異性および感度のレベルの増加をもたらす。
【００６８】
本発明のテンプレートオリゴヌクレオチドは、（１）標的核酸分子；（２）標的核酸分子と相補的ないくらかの数のオリゴヌクレオチドと、ニッキング酵素により開裂することができ４〜１５ＲＮＡヌクレオチド（その１つはＲＮアーゼ感受性）からなる部位とを含む、２つのテンプレートオリゴヌクレオチド分子；（３）ｄＮＴＰ；（４）鎖置換ポリメラーゼ；（５）ニッキング酵素；ならびに（６）ＤＮＡ−ＲＮＡヘテロ二本鎖ＲＮＡニッキング酵素、および３’末端ポリメラーゼ伸長キャップを含む、ＮＥＡＲ反応中に含まれる。したがって、本発明は、それらの成分を使用して標的核酸分子を定量する方法を提供する。
【００６９】
本方法は、標的核酸分子を、実質的に等温条件下で、ポリメラーゼ、それぞれが標的ヌクレオチド分子上の相補的配列に特異的に結合する２つのテンプレートオリゴヌクレオチド、ニッキング酵素、および３’末端ポリメラーゼ伸長キャップを伴うＤＮＡ−ＲＮＡヘテロ二本鎖ニッキング酵素（例えば、ＲＮアーゼＨ）と接触させること；標的配列に結合するテンプレートオリゴヌクレオチドの少なくとも一部を含む検出可能なアンプリコンを生成すること、を含む。
【００７０】
標的核酸分子
本発明の方法および組成物は、試験試料中の標的核酸分子の同定に有用である。標的配列は、標的核酸分子を含む実質的に任意の試料、例として、限定されるものではないが、真菌、胞子、ウイルス、または細胞（例えば、原核細胞、真核細胞）を含む試料から増幅される。規定の実施形態において、本発明の組成物および方法は、（トマトかいよう病菌（Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ  ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ）、ジャガイモ輪腐病菌（Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ  ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｓｅｐｅｄｏｎｉｃｕｓ）、トマト斑葉細菌病菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐｖ  Ｔｏｍａｔｏ）、斑点細菌病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  ｐｖ  Ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ）、アルテルナリア属種（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｓｐｐ）、クラドスポリウム属種（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｐｐ）、フザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、バーティシリウム・ダーリア（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｉｕｍ  ｄａｈｌｉａ）、シュードモナス・クルガタ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｕｒｒｕｇａｔａ）、エルウィニア・カロトボラ（Ｅｒｗｉｎａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）、および青枯病菌（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）を検出する。例示的な試験試料としては、体液（例えば、血液、血清、血漿、羊水、唾液、尿、脳脊髄液、リンパ液、涙液、糞便または胃液）、組織抽出物、培養培地（例えば、病原細胞のような細胞が培養された液体）、環境試料、農産物または他の食料、およびそれらの抽出物、ＤＮＡ同定タグが挙げられる。所望により、試料は、ＮＥＡＲ反応中に含ませる前に、生物試料からの核酸分子の単離に典型的に使用される任意の標準的な方法を使用して精製される。
【００７１】
一実施形態において、プライマー／テンプレートオリゴヌクレオチドは、病原体の標的核酸を増幅して試料中の病原体の存在を検出する。例示的な病原体としては、真菌、細菌、ウイルスおよび酵母が挙げられる。このような病原体は、病原体タンパク質、例えば、毒素をコードする核酸分子を試験試料中において同定により検出することができる。例示的な毒素としては、限定されるものではないが、アフラトキシン、コレラ毒素、ジフテリア毒素、サルモネラ毒素、志賀毒素、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）毒素、エンドトキシン、およびマイコトキシンが挙げられる。環境用途について、試験試料としては、水、空気濾過器の液体抽出物、土壌試料、建築材料（例えば、乾式壁、天井タイル、壁板、布、壁紙、および床仕上げ材）、環境スワブ、または任意の他の試料を挙げることができる。
【００７２】
本明細書に開示される一実施形態において、プライマー／テンプレートオリゴヌクレオチドは、例えば、干ばつに対する植物耐性、除草剤や有害昆虫による捕食に対する植物耐性の改善を対象とする分子育種実験において内部対照として使用される植物の標的核酸を増幅する。本明細書において実施に帰着されるこのような内部対照標的核酸の一例は、トウモロコシからのＡＤＨ１遺伝子（アルコールデヒドロゲナーゼ１）である。
【００７３】
標的核酸分子としては、二本鎖および一本鎖核酸分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および本明細書に記載の核酸分子とハイブリダイズし得る当技術分野において公知の他のヌクレオ塩基ポリマー）が挙げられる。本発明の検出可能なオリゴヌクレオチドプローブまたは検出可能なプライマー／テンプレートオリゴヌクレオチドを用いた検出に好適なＲＮＡ分子としては、限定されるものではないが、標的配列を含む二本鎖および一本鎖ＲＮＡ分子（例えば、メッセンジャーＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、マイクロＲＮＡおよびマイクロＲＮＡ前駆体、ならびにｓｉＲＮＡまたは本明細書に記載のもしくは当技術分野において公知の他のＲＮＡ）が挙げられる。本発明の検出可能なオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマー／テンプレートオリゴヌクレオチドを用いた検出に好適なＤＮＡ分子としては、限定されるものではないが、二本鎖ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、および合成二本鎖ＤＮＡ）が挙げられる。一本鎖ＤＮＡ標的核酸分子としては、例えば、ウイルスＤＮＡ、ｃＤＮＡ、および合成一本鎖ＤＮＡ、または当技術分野において公知の他のタイプのＤＮＡが挙げられる。
【００７４】
一般に、検出のための標的配列は、１０から１００ヌクレオチド長（例えば、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００ヌクレオチド）である。標的核酸分子のＧＣ含有率は、約４５、５０、５５、または６０％未満になるように選択される。望ましくは、標的配列およびニッキング酵素は、その標的配列が、反応混合物中に含まれるいかなるニッキング酵素についてのニッキング部位も含有しないように選択される。
【００７５】
検出可能なオリゴヌクレオチドプローブ
本発明は、少なくとも１つのポリメラーゼ停止分子（例えば、オリゴヌクレオチドの標的核酸分子への結合を可能とするが、その検出可能オリゴヌクレオチドプローブを標的として利用するテンプレート伸長の支持を可能としない、ヌクレオチド修飾または他の部分）を含む非増幅性の検出可能なポリヌクレオチドプローブを使用して、ＮＥＡＲ反応中の標的核酸分子またはそのアンプリコンの定量的検出を提供する。理論により拘束されるものではないが、ポリメラーゼ進行を可能としない１つ以上の部分の存在が、オリゴヌクレオチドへの非核酸骨格付加において、または複製ポリメラーゼの停滞を介して、ポリメラーゼ停止を引き起こす可能性が高い（すなわち、Ｃ３−スペーサー、損傷ＤＮＡ塩基、他のスペーサー部分、Ｏ−２−Ｍｅ塩基）。したがって、これらの構築物は、ＮＥＡＲ反応過程の間のプローブの不当な増幅を防止し、または低減させる。このことにより、これらの構築物は、プローブの増幅を防止するためにＮＥＡＲ反応の終了時において添加しなければならない従来型検出プローブと区別される。
【００７６】
従来型の検出プローブは、リアルタイムでのＮＥＡＲ反応の定量には実用的でないことが証明されている。従来型の検出プローブがＮＥＡＲ反応中に組み入れられる場合、それらの従来型検出プローブは、標的と同時に増幅される。これらの検出分子の増幅は、反応開始時のこれら検出プローブの出発分子の数により、正当な標的アンプリコンの検出を覆い隠してしまう。
【００７７】
本発明は、少なくとも１つのポリメラーゼ停止分子を含む非増幅性の検出可能なポリヌクレオチドプローブを提供する。本発明のポリメラーゼ停止分子としては、限定されるものではないが、複製ＤＮＡポリメラーゼによるプライマー−テンプレート伸長を遮断しそれにより検出分子の増幅を防止するが、標的分子または標的分子の増幅されたコピーに対して適正なハイブリダイゼーションあるいはヌクレオチド間隔を可能とし得る、ヌクレオチド修飾または他の部分が挙げられる。一実施形態において、本発明の検出可能なポリヌクレオチドプローブは、検出分子の不当な増幅を防止し、または低減させる、３炭素スペーサー（Ｃ３−スペーサー）を含む。
【００７８】
一実施形態において、本発明の検出可能なポリヌクレオチドプローブは、検出可能な部分を含むヘアピン形状オリゴヌクレオチドである。別の実施形態において、非増幅性の検出可能なポリヌクレオチドプローブは、一方の末端上に蛍光団を、反対側の末端上に消光色素を含むヘアピン形状オリゴヌクレオチドである。ヘアピンのループは、標的配列と相補的であり標的配列とハイブリダイズし得る配列を含む。ヘアピンのステムは、ループの両側に位置する相補的アーム配列のアニーリングにより形成される。蛍光団および消光分子は、それぞれのアームの反対側の端部において共有結合している。検出可能なオリゴヌクレオチドプローブがヘアピン構成をとる場合、蛍光および消光分子が互いに近接し、それにより蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）および蛍光団の蛍光の消光をもたらす。検出可能なオリゴヌクレオチドプローブが標的分子と接触する場合、ハイブリダイゼーションが生じ、ループ構造は標的分子との二本鎖構成に変換され、蛍光団と消光分子の分離を引き起こし、蛍光をもたらす（Ｔｙａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：Ｍａｒｃｈ  １９９６，３０３−３０８）。
【００７９】
検出可能なオリゴヌクレオチドプローブは、標的配列に特異的である。一実施形態において、検出可能なオリゴヌクレオチドプローブは、相補的ヌクレオチドに対する向上した結合親和性を有する１つ以上の修飾ヌクレオチド塩基を含む。塩基の例としては、限定されるものではないが、ロックド核酸（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）（ＬＮＡ）、２’フルオロアミダイト、および２’ＯＭｅ  ＲＮＡアミダイト（ポリメラーゼ停止分子としても機能する）が挙げられる。本発明の検出可能なオリゴヌクレオチドプローブは、異なる色の蛍光団を用いて合成することができ、実質的にあらゆる標的配列とハイブリダイズするように設計することができる。それらの卓越した特異性の観点から、本発明の非増幅性の検出可能なポリヌクレオチドプローブは、試料中の単一の標的核酸分子を検出するために使用され、またはそれぞれが異なる標的核酸分子に結合する検出可能なオリゴヌクレオチドプローブとの組合せで使用される。したがって、本発明の非増幅性の検出可能なポリヌクレオチドプローブは、同一反応中の１つ以上の標的核酸分子を検出するために使用することができ、それらの標的の同時定量を可能とする。本発明は、本明細書に記載の検出可能なオリゴヌクレオチドプローブと併せたそのような蛍光団の使用を包含する。
【００８０】
非増幅性の検出可能なポリヌクレオチドプローブの使用
非増幅性の検出可能なポリヌクレオチドプローブは、ニッキングおよび伸長増幅の反応（ＮＥＡＲ）中の標的核酸分子を定量する方法において有用である。本方法は、標的核酸分子を、実質的に等温条件下で、ポリメラーゼ、それぞれが標的ヌクレオチド分子上の相補的配列に特異的に結合する２つのプライマー／テンプレートオリゴヌクレオチド、ニッキング酵素、および検出可能なオリゴヌクレオチドプローブと、好適な緩衝液およびｄＮＴＰの存在下で接触させること、前記標的核酸分子の少なくとも一部を含むアンプリコンを生成すること；ならびに、標的核酸分子にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを、反応中のプローブ分子からの蛍光強度に基づいて、反応の間にリアルタイムで定量することにより、反応中に存在する標的核酸分子のレベルを測定することを含む。有利なことに、そのような方法は、リアルタイムでのＮＥＡＲのモニタリングに有用である。
【００８１】
一般に、本発明の非増幅性の検出可能なポリヌクレオチドプローブは、（１）標的核酸分子；（２）標的核酸分子と相補的ないくらかの数のオリゴヌクレオチドとニッキング酵素により開裂することができる部位とを含む２つのテンプレートオリゴヌクレオチド分子；（３）ｄＮＴＰ；（４）鎖置換ポリメラーゼ；ならびに（５）ニッキング酵素を含むＮＥＡＲ反応中に含まれる。したがって、本発明は、それらの成分を使用して標的核酸分子を定量する方法を提供する。
【００８２】
ＮＥＡＲアッセイ
本発明は、ＮＥＡＲアッセイにおいて増幅された標的核酸分子の検出を提供する。このようなアッセイは、当技術分野において公知であり、本明細書に記載される。例えば、米国特許出願公開第２００９／００８１６７０号明細書、ＰＣＴ出願国際公開第２００９／０１２２４６号パンフレット、および米国特許第７，１１２，４２３号明細書および米国特許第７，２８２，３２８号明細書参照（それらのそれぞれは、全体として本明細書に組み込まれる）。本明細書に記載の方法において有用なポリメラーゼは、ヌクレオチドの取り込みを触媒し、標的核酸分子に結合しているオリゴヌクレオチド（例えば、プライマー／テンプレートオリゴヌクレオチドまたは他のプライマー）の３’ヒドロキシル末端を伸長し得る。このようなポリメラーゼとしては、好熱性のものおよび／または鎖置換し得るものが挙げられる。本明細書に記載の方法において有用なポリメラーゼは、普通ならば置換された一本鎖核酸鎖を分解するであろう５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く。ポリメラーゼは、逆転写酵素活性も有する（例えば、Ｂｓｔ（大断片）ＤＮＡポリメラーゼの誘導体、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＩ  ＤＮＡポリメラーゼ）。例示的なポリメラーゼとしては、限定されるものではないが、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼＩのＢｓｔ大断片、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノー断片）、クレノー断片（３’−５’エキソ−）、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ  ＶｅｎｔＲ．（エキソ−）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ  ＶｅｎｔＲ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＩ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＡｍｐｌｉＴｈｅｒｍ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６  ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。逆転写酵素（ＲＴ）の以下の非限定的な例は、本発明の方法の反応中のＲＮＡ配列を検出する場合の性能を改善するために使用することができる：ＯｍｎｉＳｃｒｉｐｔ（Ｑｉａｇｅｎ）、ＳｅｎｓｉＳｃｒｉｐｔ（Ｑｉａｇｅｎ）、ＭｏｎｓｔｅｒＳｃｒｉｐｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ（Ｒｏｃｈｅ）、ＨＩＶ  ＲＴ（Ａｍｂｉｏｎ）、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｔｈｅｒｍｏ−Ｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＩｍＰｒｏｍ  ＩＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）。
【００８３】
ニッキング酵素は、二本鎖ＤＮＡ中の認識配列に結合し、二本鎖へリックスの一方の鎖を開裂させる。ニッキング酵素は、それらの認識部位の上流もしくは下流または酵素認識部位内のいずれかで開裂させ得る。本明細書に開示される方法のためには、認識部位の下流の上鎖を開裂させるニッキング酵素のみを使用し、基質ＤＮＡニッキングおよびポリメラーゼによるニック伸長の反復サイクルを開始させてプライマー−テンプレート間の標的核酸断片の指数関数的増幅を駆動させることができる。理想的には、ニッキング酵素は、ポリメラーゼと同一の反応条件下で機能的である。本発明の好ましい実施形態において、ニッキング酵素は熱安定性であり、５０℃から６０℃で活性である。本明細書に開示される方法に有用な例示的なニッキング酵素としては、限定されるものではないが、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ（ＮＥＢ）、Ｎｔ．ＢｓｐＤ６Ｉ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ（ＮＥＢ）、Ｎｔ．ＡｌｗＩ（ＮＥＢ）、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ（ＮＥＢ）、Ｎ．Ｂｓｔ９Ｉ（Ｓｉｂｅｎｚｙｍｅ）、およびＮｔ．ＢｓｔＮＢＩ（ＮＥＢ）が挙げられる。
【００８４】
ＮＥＡＲ反応は、典型的には、ヌクレオチド、例えば、ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）などを含む。この反応は、検出可能な部分、例として、限定されるものではないが、放射性標識（例えば、３２Ｐ、３３Ｐ、１２５Ｉ、３５Ｓ）、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ）、蛍光標識（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ））、ビオチン、アビジン、ジゴキシゲニン、抗原、ハプテン、または蛍光色素を含むｄＮＴＰの存在下で実施することもできる。ＮＥＡＲ反応は、ニッキング酵素およびポリメラーゼの活性を提供するある塩および緩衝液をさらに含む。
【００８５】
有利なことに、ＮＥＡＲ反応は、反応の温度が増幅反応の過程のあいだ事実上一定である、実質的な等温条件下で実施される。高温と低温の間で温度をサイクリングさせる必要がないため、ＮＥＡＲ反応は、従来型のＰＣＲを実施するためには困難である条件下で実施することができる。典型的には、反応は、約３５℃から９０℃（例えば、３５、３７、４２、６０、６５、７０、７５、８０、または８５℃）において実施される。有利なことに、温度を極めて正確な程度で維持することは必須ではない。温度のいくらかの変動が許容可能である。
【００８６】
融点（Ｔｍ）および反応速度の改変因子、例えば（限定されるものではないが）、エチレングリコールおよびグリセロールを使用して、オリゴヌクレオチドの融点を低下させることもできる。さらに、ＤＮＡポリメラーゼ反応速度改変因子（例えば、ｄＮＴＰおよびマグネシウムの濃度）を使用して反応速度を変えてより正確な定量をもたらすことができる。
【００８７】
本発明は、上記のならびに特許の米国特許第００７１１２４２３Ｂ２号明細書および米国特許出願公開第２００９００１７４５２Ａ１号明細書におけるＮＥＡＲ増幅戦略を利用したＮＥＡＲ反応をリアルタイムでモニタリングする方法を提供する。一実施形態において、定量的ＮＥＡＲは、既知量の対照増幅と同時の標的核酸増幅を利用する。標的核酸の量は、対照の出所（外因性または内因性対照）に基づいて、絶対的定量または相対的定量（半定量的）として計算することができる。
【００８８】
未知のヌクレオチド配列の定量は、その未知物の対数閾値増幅を、別個の反応セットもしくは同一反応のいずれかにおける一連の既知標的配列と比較することを介して；または陽性結果（未知物が閾値を超過する場合）もしくは陰性結果（未知物が閾値を超過しない場合）のいずれかを示す閾値を産生する内因性もしくは外因性の同時増幅内部産物として、達成することができる。
【００８９】
適用
本発明は、出発標的核酸の量の定量的尺度を提供し得る等温増幅ＮＥＡＲ反応のリアルタイムのモニタリングを提供する。本発明の組成物および方法は、迅速な定量的回答が望まれるヒト診断（例えば、１５、１０、９、８、７、６、５分以下足らずの検出可能な増幅）において有用である。特定の実施形態において、本発明は、臨床的場面でのヒト診断におけるＮＥＡＲ反応アッセイの使用を提供する。他の実施形態において、本発明は、サーモサイクリング装置へのアクセスが利用不可能である、または非常に高価となる、実地的診断におけるＮＥＡＲ反応アッセイの使用を提供する。さらに他の実施形態において、本発明は、迅速な定量的回答が望まれる学術的場面におけるＮＥＡＲ反応アッセイの使用を提供する。
【００９０】
キット
本発明は、標的核酸分子の増幅のためのキットも提供する。このようなキットは、対象から得られた生物試料中の標的核酸の検出または定量に有用である。本発明のキットは、例えば、本明細書に記載の１つ以上のポリメラーゼ、順方向および逆方向プライマー−テンプレート、ならびに１つ以上のニッキング酵素を含み得る。１つの標的を増幅すべき場合に、１つまたは２つのニッキング酵素をキット中に含めることができる。複数の標的配列を増幅すべきであり、それらの標的配列のために設計されたプライマー−テンプレートが同一のニッキング酵素についてのニッキング酵素部位を含む場合、１または２つのニッキング酵素を含めることができる。プライマー−テンプレートが異なるニッキング酵素により認識される場合、より多く、例えば、３つ以上などのニッキング酵素をキット中に含めることができる。
【００９１】
一態様において、本発明は、ＤＮＡポリメラーゼ；一次プライマー−テンプレート、二次プライマー−テンプレート、プライマー−テンプレート内のニッキング酵素認識部位に対する特異性を有するニッキング酵素、およびデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を（例えば、増幅に十分な成分を含有する緩衝溶液中で）含む、核酸増幅のためのキットを提供する。種々の実施形態において、一次プライマー−テンプレートおよび二次プライマー−テンプレートは、それぞれ、標的配列と相補的または実質的に相補的な３’末端特異的認識領域配列を有し、その末端特異的認識領域は、１つ以上の２’修飾ヌクレオチド；３’末端特異的認識領域配列の上流にニッキング酵素認識部位を含有する５’末端テール配列；およびニッキング酵素結合部位の上流（５’）の安定化配列を含む。
【００９２】
一態様において、本発明のキットは、全てのＮＥＡＲ反応成分、例として、限定されるものではないが、ｄＮＴＰ、順方向および逆方向プライマー−テンプレート、ニッキング酵素、ポリメラーゼ、検出可能な標的特異的ポリヌクレオチドプローブ、反応緩衝液ならびに安定剤の均質混合物を含み、但し標的核酸を除く。
【００９３】
本発明のキットは、任意数の別個の容器、パケット、チューブ（例えば、＜０．２ｍｌ、０．２ｍｌ、０．６ｍｌ、１．５ｍｌ、５．０ｍｌ、＞５．０ｍｌ）、バイアル、マイクロタイタープレート（例えば、＜９６ウェル、９６ウェル、３８４ウェル、１５３６ウェル、＞１５３６ウェル）、ＡｒｒａｙＴａｐｅなどの中の１つ以上の成分も含み得、またはこれらの成分は、そのような容器中で種々の組合せで合わせることができる。種々の実施形態において、キットは、参照配列に結合し参照配列を増幅し得るプライマー−テンプレートオリゴヌクレオチドのペアをさらに含む。さらに他の実施形態において、キットは、プライマー−テンプレートオリゴヌクレオチドを含有する無菌容器を含み、そのような容器は、箱、アンプル、瓶、バイアル、チューブ、袋、パウチ、ブリスターパック、または当技術分野において公知の他の好適な容器形態であり得る。このような容器は、プラスチック、ガラス、ラミネート紙、金属箔、または核酸の保持に好適な他の材料から作製されていてよい。
【００９４】
キットの成分は、例えば、１つ以上の容器中に存在し得、例えば、成分の全てが１つの容器中に存在し得、または、例えば、酵素はテンプレートとは別個の容器中に存在し得る。成分は、例えば、乾燥させ（例えば、乾燥残留物）、凍結乾燥させ（例えば、乾燥ケーキ）、または安定緩衝液（例えば、化学的安定、熱的安定）中に存在させ得る。乾燥成分は、例えば、凍結乾燥、真空および遠心分離支援乾燥および／もしくは常圧乾燥により調製することができる。種々の実施形態において、ポリメラーゼおよびニッキング酵素は、単一容器中で凍結乾燥形態にあり、テンプレートは、異なる容器中で凍結乾燥、フリーズドライされており、または緩衝液中に存在する。一部の実施形態において、ポリメラーゼ、ニッキング酵素、およびテンプレートは、単一容器中で凍結乾燥形態である。他の実施形態において、ポリメラーゼおよびニッキング酵素は、異なる容器中に分けることができる。
【００９５】
キットは、例えば、反応中で使用されるｄＮＴＰ、または修飾ヌクレオチド、キュベットもしくは反応に使用される他の容器、または凍結乾燥成分を再水和するための水もしくは緩衝液のバイアルをさらに含み得る。使用される緩衝液は、例えば、ポリメラーゼおよびニッキング酵素活性の両方に適切であり得る。
【００９６】
本発明のキットは、本明細書に記載の１つ以上の方法を実施するための指示書および／または本明細書に記載の１つ以上の組成物もしくは試薬の説明も含み得る。指示書および／または説明は、印刷形態であり得、キットインサート中に含めることができる。キットは、そのような指示書または説明を提供するインターネットロケーションの書面による説明も含み得る。
【００９７】
キットは、検出方法（例えば、リアルタイムまたはエンドポイント）に使用される試薬、例えば、ハイブリダイゼーションプローブまたはＤＮＡ結合色素などをさらに含み得る。キットは、検出方法に使用される試薬、例えば、ＦＲＥＴに使用される試薬、側方流動装置、ディップスティック、蛍光色素、コロイド金粒子、ラテックス粒子、モレキュラービーコン、またはポリスチレンビーズなどをさらに含み得る。検出成分は、側方流動装置中に組み入れることができる。側方流動装置は、ポイント・オブ・ケアにおいて使用することができる。
【００９８】
本発明の実施は、特に記載のない限り、十分に当業者の技能の範囲内である分子生物学（例として、組換え技術）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来的技術を用いる。このような技術は、文献、例えば、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，１９８９）；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｇａｉｔ，１９８４）；“Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ”（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，１９８７）；“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”“Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（Ｗｅｉｒ，１９９６）；“Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ”（Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｃａｌｏｓ，１９８７）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ａｕｓｕｂｅｌ，１９８７）；“ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ”，（Ｍｕｌｌｉｓ，１９９４）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（Ｃｏｌｉｇａｎ，１９９１）において十分に説明されている。これらの技術は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの産生に適用可能であり、したがって、本発明の作製および実施において考慮することができる。特定の実施形態に特に有用な技術を以下の節において考察する。
【００９９】
以下の実施例は、本発明のアッセイ、スクリーニング、および治療方法の作製および使用の仕方の完全な開示および説明を当業者に提供するために提示され、本発明者らが発明としてみなすものの範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０１００】
現在、ＮＥＡＲ反応は、試料中の標的オリゴヌクレオチドの存在または不存在を迅速におよび等温的に検出するために使用されている。技術的制限のために、従来型のＮＥＡＲ法は、標的アンプリコンの検出および正確な定量を不明瞭にする試料中の非標的分子の不当な増幅に少なくとも部分的に起因して、リアルタイムでの標的オリゴヌクレオチドの定量に不適である。本発明は、不当な増幅を受けにくい検出可能なプライマー／テンプレートを提供することにより、それらの制限を解決する組成物および方法を提供する。一実施形態において、定量可能なＮＥＡＲアッセイは、ＮＥＡＲ反応の際の非標的分子の不当な増幅を防止し、または低減させる、１つ以上の２’−Ｏ−Ｍｅ修飾を含むプライマーを用いる。現在、ＮＥＡＲ増幅アッセイの設計は、少なくとも１つの天然存在のニッキング酵素認識部位をごく近くに有する標的核酸内の極めて短い領域に制限されている。このニック部位から開始される鎖置換合成は、短い標的特異的領域を有するプライマー−テンプレートが結合してニッキング／ポリメラーゼ伸長標的増幅反応のサイクルを開始し得る、一本鎖標的ＤＮＡ分子を提供する。本発明は、より長い標的特異的領域を有し従って増幅反応の第１段階において５０℃から６０℃で鎖置換合成の支援なしで鎖侵入し得るプライマー−テンプレートを利用することにより、この制限を解決する、組成物および方法を提供する。プライマー−テンプレート中の標的特異的領域をより長くすることには、非特異的増幅産物の合成を開始し得る伸長可能な３’末端を有する非特異的ＤＮＡハイブリッドを形成するためにより多くの場（ｒｅａｌ  ｅｓｔａｔｅ）を提供してしまうという欠点が伴う。本発明における組成物は、５つの連続する修飾ヌクレオチドの３’末端側ブロックを超えて２’修飾ヌクレオチドの配置を伸長し、２’修飾ヌクレオチドおよび非修飾ヌクレオチドの交互配列を利用して全標的特異的領域をカバーすることにより、その欠点を軽減する。
【０１０１】
［実施例１：２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含むプライマー−テンプレートオリゴヌクレオチドは、ＮＥＡＲ増幅におけるバックグラウンドシグナルを低減させ、または排除する。］
ＮＥＡＲ増幅を、インプット標的核酸無し（すなわち、無標的対照；ＮＴＣ）で実施する場合、テンプレートの不存在にかかわらずシグナルが生成される。したがって、バックグラウンドシグナルの生成は、ＮＥＡＲ増幅を使用する標的核酸定量の精度を減少させる潜在性を有する。バックグラウンドシグナルは、部分的に、プライマー／テンプレートオリゴヌクレオチドによるプライマー−ダイマー形成により生成されることが仮定された。理論に拘束されるものではないが、２’修飾ヌクレオチドを含むポリメラーゼ停止構造を使用してプライマー／テンプレートの分子間および／または分子内相互作用（例えば、プライマー−ダイマー形成）を低減させ、または排除し、それにより、ＮＥＡＲアッセイにおけるバックグラウンドシグナルを低減させ、または排除することができた。
【０１０２】
例示的なポリメラーゼ停止実体構造は、５’から３’に、安定化配列、ニッキング酵素認識配列、ニッキング酵素スペーサー配列、および標的特異的認識配列を含み、標的特異的認識配列は、１つ以上の２’修飾ヌクレオチド（例えば、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド）を含む。２つ以上の２’修飾ヌクレオチドが標的特異的認識配列中に存在する場合、２’修飾ヌクレオチドは、連続的（例えば、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれを超える２’修飾ヌクレオチド）であり得る。クラビバクター・ミシガネンシス・セピドニクス（Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ  ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ  ｓｅｐｉｄｏｎｉｃｕｓ）（Ｃｍｓ）合成二本鎖標的ＤＮＡ分子のタイトレーションを、フルオロビーコンを介する検出を使用して評価した。標的ＤＮＡは、標的配列および単一ニック部位を伴って設計された合成２５０塩基対ＤＮＡ「ロングマー」の原液から段階希釈した。
【０１０３】
無標的対照（ＮＴＣ）におけるシグナルは、２’−Ｏ−メチル修飾テンプレート含有反応中で抑制された（図２Ａ）。標準曲線は、２’−Ｏ−メチルテンプレート反応を使用して広いダイナミックレンジを示した（図２Ｂ）。無標的対照反応の試料（１０μｌ）を、ＨＰＬＣ／質量分析を介して分析し、バックグラウンド増幅産物の抑制を確認した（図２Ｃ）。非修飾オリゴを使用した反応に由来するスペクトルは、未反応テンプレートとともに非特異的バックグラウンド産物に由来する複数の増幅産物から構成される複雑なスペクトルを示した（図２Ｃ、左パネル）。２’−Ｏ−メチル修飾オリゴを使用した反応に由来するスペクトルでは、非特異的バックグラウンド産物が存在せず、未反応テンプレートから構成される簡素なスペクトルを示した（図２Ｃ、右パネル）。
【０１０４】
生物試料の増幅に対する２’−Ｏ−メチル修飾テンプレート含有反応の効果を試験するために、クラビバクター・ミシガネンシス・セピドニクス（Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ  ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ  ｓｅｐｉｄｏｎｉｃｕｓ）（Ｃｍｓ）ゲノムを標的ＤＮＡとして使用した。増幅産物は、二本鎖ＤＮＡを検出するＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ（図３Ａおよび３Ｂ）または特異的産物を検出するＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎ（図４Ａおよび４Ｂ）により検出した。標準反応は、ＤＮＡオリゴヌクレオチドテンプレートを用いて実施し（図３Ａおよび４Ａ）、２’−Ｏ−メチル修飾テンプレート含有反応（ＤＮＡｂｌｅ）の反応は、標的特異的認識配列中の３’末端において５つの連続する２’−Ｏ−メチルヌクレオチドのブロックを含有するオリゴヌクレオチドを用いて実施した（図３Ｂおよび４Ｂ）。無標的対照（ＮＴＣ）におけるシグナルは、２’−Ｏ−メチル修飾テンプレート含有反応中では抑制された（図３Ｂおよび４Ｂ）一方、無標的対照（ＮＴＣ）において顕著なシグナルが観察され（図４Ａおよび４Ｂ）、そのことは、標的ＤＮＡの不存在下でのバックグラウンド産物の生成を示していた。
【０１０５】
したがって、これらの結果は、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含むプライマーがＮＥＡＲ増幅におけるバックグラウンドシグナルを低減させ、または排除することを示す。
【０１０６】
［実施例２：プライマー／テンプレートオリゴヌクレオチド中の２’−Ｏ−メチルヌクレオチドの位置調節により、検出までの時間およびＮＥＡＲ反応の効率が変化した。］
特異性領域内の異なる位置において２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを有する例示的なポリメラーゼ停止実体をＮＥＡＲ増幅反応中で使用し、それらの反応キネティックスを試験した。特に、試験プライマー／テンプレートは、特異性領域の３’末端においてまたは特異性領域の５’末端（ニック部位の２ヌクレオチド下流）において配置された５つの２’−Ｏ−メチルヌクレオチドのブロックを有するオリゴヌクレオチドのペアを含んだ（図５）。標準反応は、３’末端において若しくはニック部位の後から３番目のヌクレオチドから開始して５塩基続く２’−Ｏ−メチルヌクレオチドのブロックを用いて、または示されているようにそれらの２つの構造を混合したものを用いて、二重実験で実施した。標的ＤＮＡは、クラビバクター・ミシガネンシス・セピドニクス（Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ  ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ  ｓｅｐｉｄｏｎｉｃｕｓ）（Ｃｍｓ）ゲノムであった。検出は、１００ｎＭの最終濃度におけるＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎに基づいた。
【０１０７】
プライマー／テンプレートオリゴヌクレオチドの特異性領域内の異なる位置において２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを有する反応速度改変実体は、異なる増幅キネティックスを示した（図６）。３’末端において５つの２’−Ｏ−メチルヌクレオチドのブロックを有するプライマー／テンプレートを使用する反応（「末端側」テンプレート；１７０秒）は、ニック部位の後から３番目のヌクレオチドから始まる５つの２’−Ｏ−メチルヌクレオチドのブロックを有するプライマー／テンプレート（「ニック＋２」テンプレート」；４３０秒）と比較して、検出までの時間の減少を示した。したがって、２つのプライマー／テンプレートオリゴの比を使用して、反応の「チューニング」のために検出までの時間および／または反応の効率を操作することができることが仮定された。様々な比の「末端側」テンプレート：「ニック＋２」テンプレートを用いる反応は、２つのテンプレートの間の、中間的な、検出までの時間を示した（図６）。さらに、「末端側」テンプレート：「ニック＋２」テンプレートの比が増加するにつれ、曲線は縮小され、曲線の傾きはシフトされた。したがって、プライマー／テンプレートオリゴヌクレオチド中の２’修飾ヌクレオチドの位置調節、および異なった位置に２’修飾ヌクレオチドを有するプライマー／テンプレートオリゴヌクレオチド間の比により、検出までの時間およびＮＥＡＲ反応の効率が変化することが示された。本発明は、少なくとも部分的に、それらの発見に基づく。
【０１０８】
［実施例３：長い標的特異的領域を有するプライマー−テンプレートを利用するＮＥＡＲアッセイにおける非特異的増幅の完全な抑制］
トウモロコシアルコールデヒドロゲナーゼ１遺伝子（ＡＤＨ１）の定量のためのＮＥＡＲアッセイを、順方向および逆方向プライマー−テンプレートの２つの代替セット（ＴＳ３およびＴＳ３）を利用して設計した。好適なニッキング酵素認識部位は、トウモロコシｇＤＮＡ中の標的配列領域から５００ヌクレオチド以内の上流にも、下流にも、見出されなかった。プライマー−テンプレートの両方のセットは、標的ＤＮＡと鎖侵入媒介性ハイブリダイズをし得る、より長い標的相補的領域（それぞれ、１６および１９ヌクレオチド）を特徴とする。第１のセット（ＴＳ３）において、順方向および逆方向プライマー−テンプレートの標的相補的領域は、３’末端デオキシヌクレオチドからすぐ上流に５つの連続する２’−Ｏ−メチル修飾リボヌクレオチドのブロックを含有する。標的配列相補的領域の残部は、ニック部位から５ヌクレオチド（順方向プライマー−テンプレート）または４ヌクレオチド（逆方向プライマー−テンプレート）下流から始まる、非修飾デオキシヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドが交互になった配列を含む。プライマー−テンプレートの第２のセット（ＴＳ６）は、３’末端非修飾デオキシヌクレオチドに隣接する５つの２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドのブロックのみを有し、標的相補的領域の残部は、非修飾デオキシヌクレオチドのみを含む。
【０１０９】
１０マイクロリットルのＮＥＡＲ反応物を、５０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８．０、１５ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１５ｍＭのＮａ２ＳＯ４、および１５ｍＭのＭｇＳＯ４中に調製し、３．８４ＵのＷａｒｍｓｔａｒｔ２．０  Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ１（ＮＥＢ）、トウモロコシＡＤＨ１標的合成ＤＮＡの１０Ｋのコピー、０．３ｍＭのｄＮＴＰ、３ＵのＮｔ．ＢｓｔＮＢＩニッキング酵素、２００ｎＭのＲＯＸ／ＢＨＱ標識ＡＤＨ１  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎプローブ、０．５×ＳＹＢＲｇｒｅｅｎ色素（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１０００ｎＭのＴＳ３またはＴＳ６逆方向プライマー−テンプレートおよび１００ｎＭのＴＳ３またはＴＳ６順方向プライマー−テンプレートを使用した。無標的ＤＮＡ対照反応（ＮＴＣ）のセットは、トウモロコシＡＤＨ１標的合成ＤＮＡを除いた同一成分から構成した。全ての反応物を５６℃において１５分間インキュベートし、蛍光シグナルを５２０ｎｍ（ＳＹＢＲｇｒｅｅｎ）および６１０ｎｍ（ＲＯＸ）において記録した。
【０１１０】
ＳＹＢＲｇｒｅｅｎ（図８）およびＲＯＸ（図９）検出チャンネルにおける標的ＤＮＡ含有反応の増幅プロットと、ＳＹＢＲｇｒｅｅｎ検出チャンネルにおけるＮＴＣ反応の増幅プロット（図１０）との比較。
【０１１１】
本明細書に報告される結果は、特に記載のない限り、以下の方法および材料を使用して得た。
【０１１２】
ＮＥＡＲ増幅反応
反応物（５０μｌ）は、１５ｍＭのＭｇＳＯ４、０．３ｍＭのｄＮＴＰ、１９．２単位のＢｓｔポリメラーゼ、１５単位のｎ．ＢｓｔＮＢＩ、１０００ｎＭのテンプレート１、および２００ｎＭのテンプレート２を含有した。標的ＤＮＡは、クラビバクター・ミシガネンシス・セピドニクス（Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ  ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ  ｓｅｐｉｄｏｎｉｃｕｓ）（Ｃｍｓ）ゲノム、またはＣｍｓ配列に基づく「ロングマー」であった。テンプレートおよび標的を１０μｌの総容量で一緒に５６℃において３０秒間プレインキュベートした。残りの反応成分のマスターミックスを４０μｌの総容量で５６℃において３０秒間プレインキュベートした。マスターミックスをテンプレートおよび標的と合わせて、５６℃において１０分間インキュベートし、インキュベーションの間に１０秒毎に蛍光検出（ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎまたはＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎ）を採った。反応物を９５℃２分間のステップにより「熱殺傷」し、次いで室温に戻した。サイクル閾値（Ｃｔ）当量を、Ｂｉｏｒａｄ  ＩＱ５ソフトウェアにおける曲線フィット公式に基づきそれぞれの反応物について決定し、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌを使用して値をグラフ上でプロットした。線形回帰を実施し、相関係数（Ｒ２）を決定した。
【０１１３】
［他の実施形態］
上記説明から、本明細書に記載の本発明に変更および改変を行って本発明を種々の使用法および条件に採用することができることが明らかである。このような実施形態も、以下の特許請求の範囲内である。
【０１１４】
本明細書における可変要素の定義における要素の列記の引用は、いずれかの単一要素または列記要素の組合せ（または部分組合せ）としてのその可変要素の定義を含む。本明細書における実施形態の引用は、いずれかの単一実施形態としての、またはあらゆる他の実施形態もしくはその一部との組合せにおけるその実施形態を含む。
【０１１５】
本出願は、２０１０年８月１３日に出願された米国仮特許出願第６１／３７３，６９５号明細書の利益を主張する２０１１年８月９日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０４７０４９号明細書に関連し得、それらの全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１６】
本明細書において言及される全ての特許および刊行物は、それぞれの独立した特許および刊行物が個別具体的に参照により組み込まれることが示されるのと同一の程度において、参照により本明細書に組み込まれる。
【図１−１】
2018007658.tif 000002
【図１−２】
2018007658.tif 000003
【図１−３】
2018007658.tif 000004
【図２Ａ】
2018007658.tif 000005
【図２Ｂ】
2018007658.tif 000006
【図２Ｃ】
2018007658.tif 000007
【図３】
2018007658.tif 000008
【図４】
2018007658.tif 000009
【図５】
2018007658.tif 000010
【図６】
2018007658.tif 000011
【図７】
2018007658.tif 000012
【図８】
2018007658.tif 000013
【図９】
2018007658.tif 000014
【図１０】
2018007658.tif 000015
【配列表】
2018007658000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成29年7月28日(2017.7.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
増幅反応における特異的産物を検出する方法であって、
（ａ）標的核酸分子を含む試験試料を、実質的に等温条件下で、ポリメラーゼ、それぞれが前記標的核酸分子上の相補的配列に特異的に結合する２つ以上のプライマーオリゴヌクレオチド、およびニッキング酵素と接触させるステップであって、前記プライマーオリゴヌクレオチドのそれぞれは、前記標的核酸分子と相補的な配列の３’末端に位置する１つ以上の２’修飾ヌクレオチドを含むステップ；
（ｂ）前記標的核酸分子の配列の少なくとも一部を含むアンプリコンを生成するステップ；ならびに
（ｃ）検出可能なポリヌクレオチドプローブに前記アンプリコンを接触させて、前記アンプリコンへのオリゴヌクレオチドプローブハイブリダイゼーションに特異的なシグナルを検出するステップであって、前記シグナルは、前記試験試料中の前記標的核酸分子またはそのアンプリコンの検出を示すステップ
を含む方法。
【請求項２】
前記試験試料は、病原体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記病原体は、ウイルス、細菌、酵母または真菌である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記試験試料は、生物試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記生物試料は、生物体液、細胞、または組織試料である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記生物体液は、尿、精液、膣分泌液、または糞便である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記検出可能なポリヌクレオチドプローブは側方流動装置中に組み入れられている、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ポイント・オブ・ケアにおいて実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
検出は増幅反応のエンドポイントにおいて実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
増幅反応における特異的産物を検出する方法であって、
（ａ）試験試料中の標的核酸分子を、実質的に等温条件下で、ポリメラーゼ、それぞれが前記標的核酸分子上の相補的配列に特異的に結合する２つ以上のプライマーオリゴヌクレオチド、およびニッキング酵素と接触させるステップであって、前記プライマーオリゴヌクレオチドのそれぞれは、前記標的核酸分子と相補的な配列の３’末端に位置する１つ以上の２’修飾ヌクレオチドを含むステップ；ならびに
（ｂ）前記標的核酸分子の配列の少なくとも一部および検出可能な部分を含む、検出可能なアンプリコンを生成するステップであって、シグナルの検出が特異的産物の検出を示すステップ
を含む方法。
【請求項１１】
前記検出可能な部分は、放射性同位体、磁気ビーズ、金属ビーズ、コロイド粒子、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテンである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記検出可能な部分は、分光光度的、光化学的、生化学的、免疫化学的、または化学的手段を介して検出される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記試験試料は、病原体を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記病原体は、ウイルス、細菌、酵母または真菌である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記試験試料は、生物試料である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記生物試料は、生物体液、細胞、または組織試料である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記生物体液は、尿、精液、膣分泌液、または糞便である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記検出可能なアンプリコンは側方流動装置中で検出される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１９】
ポイント・オブ・ケアにおいて実施される、請求項１０に記載の方法。
【請求項２０】
検出は増幅反応のエンドポイントにおいて実施される、請求項１０に記載の方法。
【外国語明細書】
2018007658000001.pdf