(57)【要約】【課題】  天然の植物に由来し、安全かつ強力なTie2活性化組成物等を提供すること。【解決手段】  ラビットアイ系ブルーベリー（Rabbiteye Blueberry）の茎から抽出されたものであることを特徴とするTie2活性化組成物によって達成される。このとき、ラビットアイ系ブルーベリーが、くにさと35号であることが好ましい。また、ラビットアイ系ブルーベリーの茎が、11月〜3月に収穫されたものであることが好ましい。【選択図】          図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラビットアイ系ブルーベリー（Rabbiteye Blueberry）の茎から抽出されたものであることを特徴とするTie2活性化組成物。
【請求項２】
前記ラビットアイ系ブルーベリーが、くにさと35号であることを特徴とする請求項１に記載のTie2活性化組成物。
【請求項３】
前記ラビットアイ系ブルーベリーの茎が、11月〜3月に収穫されたものであることを特徴とする請求項１または２に記載のTie2活性化組成物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一つに記載のTie2活性化組成物の製造方法であって、下記工程を備えたもの、（１）ラビットアイ系ブルーベリーの茎に2〜3倍量の水を加え、90℃〜100℃の温度で90分の間保持する熱水抽出工程、（２）熱水抽出後の茎と液体を分離する固液分離工程、（３）固液分離後の液体を濾過し、茎の熱水抽出物を得る濾過工程。
【請求項５】
更に、濾過工程後の液体を減圧機によって処理することで水分を蒸発させて濃縮する減圧濃縮工程、減圧濃縮後の液体を殺菌する殺菌工程、濃縮した液体を凍結させ、凍結乾燥機により水分を蒸発させて、粉体を得る粉体調製工程を備える請求項４に記載のTie2活性化組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Tie2活性化組成物及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ある種の疾患では、無秩序に血管新生が起こることがある。例えば、腫瘍、慢性関節リウマチ、糖尿病網膜症、高脂血症、高血圧などの疾患において、血管新生が観察される。血管新生は、血管内皮細胞に発現する受容体型チロシンキナーゼTie2（Tyrosine kinase with Ig and EGF homology domain 2）を活性化させることにより、抑制されることが知られている。Tie2は、血管やリンパ管の細胞に存在する受容体で、生体内ではアンジオポエチン−１により活性化し、毛細血管の働きを助ける。加齢によりアンジオポエニン−１の分泌量が減少すると、Tie2活性が弱まり、毛細血管にダメージを与えるとされている。
【０００３】
また、虚血性疾患においては、Tie2の活性化により、血管腔が拡大化されて疾患が改善し得るとの報告がある。Tie2の活性化により、血管内皮細胞の細胞死を抑制するとの報告がある。
このように、Tie2の活性化により、血管新生が抑制されるだけでなく、血管（毛細血管を含む）を正常化及び安定化させるとの知見がある。Tie2の活性化により血管新生を抑制する天然物としては、桂皮の抽出物などが提案されている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００９−２６３３５８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、桂皮抽出物のTie2活性化は、不十分であるため、更に強力かつ安全なTie2活性化組成物が求められていた。
本発明は、上記した課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、天然の植物に由来し、安全かつ強力なTie2活性化組成物等を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するためのTie2活性化組成物は、ラビットアイ系ブルーベリー（Rabbiteye Blueberry）の茎から抽出されたものであることを特徴とする。このとき、ラビットアイ系ブルーベリーとしては、くにさと35号を用いることが好ましい。また、収穫時期としては、冬（11月〜3月、より好ましくは12月〜2月）に収穫されたものを用いることが好ましい。
また、上記Tie2活性化組成物の製造方法は、下記工程を備える。各工程は、（１）ラビットアイ系ブルーベリーの茎に2〜3倍量の水を加え、90℃〜100℃の温度で90分間保持する熱水抽出工程、（２）熱水抽出後の茎と液体を分離する固液分離工程、（３）固液分離工程後の液体を濾過し、茎の熱水抽出物を得る濾過工程である。濾過工程を経て得られた液体部分が、Tie2活性化組成物（液体）である。このTie2活性化組成物は、液体のまま、または液体を飛ばして粉体として用いることができる。
熱水抽出工程においては、ラビットアイ系ブルーベリーの茎は、適当な長さ、例えば3cm〜10cm（好ましくは4cm〜8cm、更に好ましくは4cm〜6cm）程度に切断しておくと取り扱いの点で好ましい。また、熱水抽出工程においては、金属製（例えばステンレス製）のタンクなどを用いる。固液分離工程では、適当なメッシュ（例えばメッシュ＃100程度）の濾過布・濾紙などを用いることができる。
また、取り扱い・保存上の観点から、Tie2活性化組成物（液体）は、粉体化することができる。すなわち、Tie2活性化組成物（液体）を減圧機（エバポレーター）等によって処理することで水分を蒸発させて濃縮する（減圧濃縮工程）。その後、必要に応じて、熱処理等により殺菌することが好ましい（殺菌工程）。更に、濃縮液体を凍結させ、凍結乾燥機により水分を蒸発させて、粉体を得る（粉体調製工程）。こうして、Tie2活性化組成物（粉体）を得ることができる。
【０００７】
ラビットアイ系ブルーベリーは、ブルーベリーに含まれる品種である。ブルーベリーは、ツツジ科スノキ属シアノコカス節に分類される北アメリカ原産の落葉低木果樹の総称であり、６系統に分けられる。このうち食用としては、ハイブッシュ系ブルーベリー、ローブッシュ系ブルーベリー及びラビットアイ系ブルーベリーの３系統がある。本発明においては、ラビットアイ系ブルーベリーを用いる。ラビットアイ系ブルーベリーには、様々な種類の品種がある。例えば、くにさと35号、クライマックス（Climax）、アラパハ（Alapaha）、モンゴメリー（Montgomery）、ベッキーブルー（Beckyblue）、ボニータ（Bonita）、ブルージェム（Bluegem）、ブルーベル（Bluebelle）、ウッダード（Woodard）、ブライトウェル（Brightwell）、プレミア（Premier）、アリスブルー（Aliceblue）、コロンブス（Columbus）、オースチン（Austin）、ホームベル（Homebell）、ガーデンブルー（Gardenblue）、スワニー（Suwannee）、ティフブルー（Tifblue）、パウダーブルー（Powderblue）、プリンス（Prince）、ベルノン（Vernon）、オクロッコニー（Ochlockonee）などが含まれる。本発明においては、これらのラビットアイ系ブルーベリーのいずれを用いることもできるが、好ましくは、くにさと35号を用いる。くにさと35号は、宮崎県において開発されたラビットアイ系ブルーベリーであり、抗酸化活性や総ポリフェノール含量が高い品種として、近年に特定されたものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、天然の植物であるラビットアイ系ブルーベリー（特に茎）に由来し、安全かつ強力なTie2活性化組成物を提供できる。このTie2活性化組成物は、（医薬品のように高純度を担保することなく）粗精製の状態で飲食品として（例えばサプリメント、清涼飲料など）提供できる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】Tie2抗体及びリン酸化Tie2抗体を用いたウエスタン・ブロッティングの結果を示す写真図である。
【図２】コントロール（DMSO）を100％としたときの被検体(3)〜被検体(8)のTie2活性化率を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
次に、本発明の実施形態について、図表を参照しつつ説明する。本発明の技術的範囲は、これらの実施形態によって限定されるものではなく、発明の要旨を変更することなく様々な形態で実施することができる。また、本発明の技術的範囲は、均等の範囲にまで及ぶ。
＜試験方法＞
１．Tie2活性化組成物の調製
2016年夏に収穫したラビットアイ系ブルーベリー（くにさと35号）の茎、2016年冬に収穫したラビットアイ系ブルーベリー（くにさと35号）の茎と葉から、下記のようにして、Tie2活性化組成物を調製した。
ラビットアイ系ブルーベリーの茎（または茎と葉）を約5cm程度となるように切断し、ステンレス製タンクに投入した。ここに2〜3倍量の水を加えた後、90℃〜100℃の温度で90分間保持した（熱水抽出工程）。
次いで、熱を冷まして、上方の液体部分を茎（または茎と葉）から、液体部分を取った（固液分離工程）。
次に、メッシュ＃100の濾過布を用いて、液体を濾過し、茎（または茎と葉）の熱水抽出物を得た（濾過工程）。こうして、Tie2活性化組成物（液体）を得た。この抽出物には、Tie2活性化物質が含まれているので、そのまま用いることもできる。しかしながら、保存上の観点から、次のようにして乾燥物を作製した。
すなわち、Tie2活性化組成物（液体）をエバポレーターにより濃縮し（減圧濃縮工程）、その後95℃で60分加熱し殺菌した（殺菌工程）。殺菌後は-40℃で予備凍結を行い、その後凍結乾燥法にて処理した（粉体調製工程）。得られた凍結乾燥物を粉砕したものをTie2活性化組成物とした。このTie2活性化組成物（粉体）を下記試験に用いた。
【００１１】
２．Tie2刺激試験
マウスpro-B細胞（Ba/F3）にhuman Tie2を過剰発現させた細胞（Ba/F3-human Tie2）をTie2リン酸化解析に用いた。Tie2の生理的リガンドAngiopoietin-1 (Ang1)、ネガティブコントロール（PBS）及びラビットアイ系ブルーベリーの茎または葉を原料として作製した被検体(3)〜(8)を用いて、Ba/F3-human Tie2の刺激が見られるか否かを確認した。
【００１２】
３．被検体の内容
下記(1)〜(8)の物質を被検体とした。
(1)Positive Control (angiopoietin-1; 500ng/ml)
(2)Negative Control (DMSO)
(3)A: 2016年夏に収穫した茎を原料として作製した粉末（100μg/mL）
(4)A: 2016年夏に収穫した茎を原料として作製した粉末（500μg/mL）
(5)B: 2016年冬に収穫した茎を原料として作製した粉末（100μg/mL）
(6)B: 2016年冬に収穫した茎を原料として作製した粉末（500μg/mL）
(7)C: 2016年冬に収穫した茎と葉を原料として作製した粉末（100μg/mL）
(8)C: 2016年冬に収穫した茎と葉を原料として作製した粉末（500μg/mL）
各被験体は、試験開始時まで、4℃の冷蔵庫にて保存し、使用時にDMSOで至適濃度に溶解した。
【００１３】
４．Tie2活性の検出（ウエスタン・ブロッティング）
通常培養用培地（10%FBS RPMI1640 + 1pg/ml mouse IL-3）に検体を種々の濃度で添加して15分後、細胞をice-cold phosphate-buffered saline (PBS) で洗浄した。RIPA lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH7.5, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS)を用いて細胞抽出液を回収した。
細胞抽出液を7.5% SDS ゲルに電気泳動し、nylon membranes に転写した。転写されたnylon membranes を5% skim milk/TBSTで60分間、非特異的蛋白をブロックし、抗Tie2抗体（Ab33：Upstate社、Tie2値）、抗リン酸化Tie2抗体（Tyr992：Cell Signaling Technology社、Phosphorylated Tie2(P-Tie2)）でブロットした。
その後、HRP標識した２次抗体でブロットし、得られた反応物はECL溶液で可視化して撮影した。バンドの濃度は、Imageソフトウエアを用いて計測し、P-Tie2(各検体)／Tie2(コントロール)として計算した。
【００１４】
＜試験結果＞
Image Jソフトウエアにより、バンド濃度を実測し（Tie2及びP-Tie2）、Tie2/リン酸化Tie2(P-Tie2)比及びDMSO(ネガティブ・コントロール)の測定値を１としたときの各サンプルの比（Signal/DMSO）を比較した。結果を図１，２及び表１に示した。
【００１５】
【表１】
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【００１６】
Tie2の生理的リガンドであるアンジオポエチン−１は、Tie2のリン酸化を誘導しており、本解析が成立していることを示した。今回解析したサンプルでは、A、B、C群とも500μg/mlの濃度において、ウエスタン・ブロッティング解析によって、リン酸化Tie2がバンドとして目視によって確認された。Image Jによるデジタル解析でも目視と同様の結果が確認された。A群〜C群のサンプル内では、B群（2016年冬に収穫した茎）の500g/mlが最も強くTie2を活性化する効果が確認された。このことから、ラビットアイ系ブルーベリーの茎（特に、冬に収穫したもの）から抽出した組成物に最もTie2活性化組成物が多量に含まれていることが分かった。
【００１７】
また、Tie2活性化組成物の活性本体として、植物由来の物質として従来知られている物質（特に、ウルソール酸）との物理化学的特徴を比較したところ、一致しなかった。このため、成分は未知であるが、ラビットアイ系ブルーベリー（特に、くにさと35号）の茎から、強力なTie2活性化組成物を調製できることが分かった。
このように本実施形態によれば、天然の植物であるラビットアイ系ブルーベリー（特に、冬に収穫されたものの茎）に由来し、安全かつ強力なTie2活性化組成物を提供できた。本実施形態により得られたTie2活性化組成物は、（医薬品のように高純度を担保することなく）そのままで飲食品として（例えばサプリメント、清涼飲料など）提供できる。
【図１】
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【図２】
2018193346.tif 000005