(57)【要約】      （修正有）【課題】キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法に関連する免疫寛容を低下させるための組成物及び方法の提供。【解決手段】改変プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）をコードする核酸配列及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を含み、前記改変ＰＤ−１及び前記ＣＡＲが別個のポリペプチドである遺伝子産物として発現される、単離核酸配列を含むヒトＴ細胞を含むヒトＴ細胞集団を抗腫瘍有効量で含有する医薬組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
改変プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）をコードする核酸配列及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を含み、前記改変ＰＤ−１及び前記ＣＡＲが別個のポリペプチドである遺伝子産物として発現される、単離核酸配列。
【請求項２】
前記ＣＡＲが癌細胞に存在する腫瘍抗原に特異的であり、前記癌細胞又は前記癌細胞に関連する細胞がＰＤ−Ｌ１を発現する、請求項１に記載の単離核酸配列。
【請求項３】
前記腫瘍抗原がＣＤ１９を含む、請求項２に記載の単離核酸配列。
【請求項４】
前記改変ＰＤ−１をコードする前記核酸配列が、ワイド型ＰＤ−１の細胞内部分をコードする核酸配列と比較して、１又は複数のヌクレオチドの置換又は欠失を含む、請求項１に記載の単離核酸配列。
【請求項５】
前記改変ＰＤ−１をコードする前記核酸配列が、ワイド型ＰＤ−１の細胞内部分をコードする核酸配列と比較して、複数のヌクレオチドの欠失を含む、請求項１に記載の単離核酸配列。
【請求項６】
前記改変ＰＤ−１が、配列番号１４の核酸配列を含む、請求項５に記載の単離核酸配列。
【請求項７】
前記改変ＰＤ−１をコードする前記核酸配列が、細胞内ドメインを含まない切断型ＰＤ−１をコードする核酸を含む、請求項４に記載の単離核酸配列。
【請求項８】
前記改変ＰＤ−１をコードする前記核酸配列が、配列番号１２の核酸配列を含む、請求項７に記載の単離核酸配列。
【請求項９】
前記改変ＰＤ−１が、ワイド型ＰＤ−１と比較して点突然変異を含む、請求項１に記載の単離核酸配列。
【請求項１０】
前記点突然変異が、ワイド型ＰＤ−１のリン酸化部位の１又は２のアミノ酸点突然変異を含む、請求項９に記載の単離核酸配列。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれかに記載の前記単離核酸配列を含む、発現ベクター。
【請求項１２】
前記発現ベクターが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、及びアデノ随伴ウイルスベクターからなる群から選択されるウイルスベクターである、請求項１１に記載の発現ベクター。
【請求項１３】
請求項１１に記載の前記発現ベクターを含む、細胞。
【請求項１４】
前記細胞が、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、オヨbＮＫＴ細胞からなる群から選択される、請求項
１３に記載の細胞。
【請求項１５】
請求項１から１０のいずれかに記載の前記単離核酸配列を含むヒトＴ細胞を含むヒトＴ細胞集団を抗腫瘍有効量で含有する、医薬組成物。
【請求項１６】
前記集団のヒトＴ細胞のサイトカイン産生に対するＰＤ−Ｌ１の阻害効果が、改変ＰＤ−１をコードする前記核酸配列の少なくとも一部を含まないヒトＴ細胞のサイトカイン産
生に対するＰＤ−Ｌ１の阻害効果より低い、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１６に記載の医薬組成物を前記ヒト患者に投与する工程を含む、ヒト患者の癌を治療する方法。
【請求項１８】
改変ＰＤ−１及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように操作された細胞であって、前記改変ＰＤ−１が、ＰＤ−１の膜貫通部分若しくは細胞内部分、又はそれらの組み合わせを含まない、細胞。
【請求項１９】
前記細胞が、ＰＤ−Ｌ−１へのＰＤ−１の結合を破壊するような可溶性ＰＤ−１を発現する、請求項１８に記載の細胞。
【請求項２０】
前記可溶性ＰＤ−１が前記細胞の細胞膜に付着しない、請求項１９に記載の細胞。
【請求項２１】
細胞質ドメインが切断された受容体ポリペプチドを含み、該受容体ポリペプチドは、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）受容体ポリペプチド、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）受容体ポリペプチド、又はＢ−及びＴ−リンパ球アテニュエータ（ＢＴＬＡ）受容体の少なくとも１つである、改変細胞。
【請求項２２】
疾患を有する対象に細胞を投与する工程を含み、
前記細胞は、細胞質ドメインが切断された受容体ポリペプチドを含み、該受容体ポリペプチドは、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）受容体ポリペプチド、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）受容体ポリペプチド、又はＢ−及びＴ−リンパ球アテニュエータ（ＢＴＬＡ）受容体の少なくとも１つであり；並びに、抗原に結合する特異的抗体の抗原認識ドメイン及び細胞内ドメイン又は改変型若しくはワイド型のＴ細胞受容体を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子改変された細胞である、疾患を有する対象を治療するための方法。
【請求項２３】
前記受容体ポリペプチドが前記ＰＤ−１受容体ポリペプチドであり、前記ＰＤ−１受容体ポリペプチドの細胞質ドメインが免疫受容体チロシン依存性モチーフを含む、請求項２１又は２２に記載の改変細胞又は方法。
【請求項２４】
前記特異的抗体が抗原に結合する、請求項２１又は２２に記載の改変細胞又は方法。
【請求項２５】
プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）、細胞障害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）、又はＢ−及びＴ−リンパ球アテニュエータ（ＢＴＬＡ）の少なくとも１つを含む１又は複数の受容体を、対応する野生型細胞と比較して減少した量で含む、改変細胞。
【請求項２６】
疾患を有する対象に細胞を投与する工程を含み、
前記細胞は、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）、細胞障害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）、又はＢ−及びＴ−リンパ球アテニュエータ（ＢＴＬＡ）の少なくとも１つを含む１又は複数の受容体を、対応する野生型細胞と比較して減少した量で発現するように改変されている、疾患を有する対象を治療するための方法。
【請求項２７】
前記改変細胞が、特異的抗体の抗原認識ドメイン及び細胞内ドメイン、又は改変型若しくはワイド型Ｔ細胞受容体を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を更に含む、請求項２１又は２５に記載の改変細胞。
【請求項２８】
前記改変細胞が、抗原に結合する特異的抗体の抗原認識ドメイン及び細胞内ドメイン、
又は改変型若しくはワイド型Ｔ細胞受容体を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を更に含む、請求項２２又は２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記改変細胞が、対応する野生型細胞と比較して、１又は複数の受容体の生合成経路若しくは輸送経路又はそれらの組み合わせに関連する１又は複数の遺伝子の発現が減少する、請求項２５又は２６に記載の改変細胞又は方法。
【請求項３０】
前記改変細胞が、１又は複数の遺伝子の破壊を含む、請求項２５又は２６に記載の改変細胞又は方法。
【請求項３１】
前記改変細胞が、ＰＤ−１遺伝子の部分的または競合的欠失を含む、請求項２５又は２６に記載の改変細胞又は方法。
【請求項３２】
前記遺伝子改変細胞が、前記ヒト患者においてインビボで複製される、請求項２２又は２６に記載の方法。
【請求項３３】
前記改変細胞が、前記ヒト患者において記憶細胞を形成する、請求項２２又は２６に記載の方法。
【請求項３４】
前記改変細胞が、前記ヒト患者に静脈内投与される、請求項２２又は２６に記載の方法。
【請求項３５】
前記改変細胞が前記ヒト患者において存続する、請求項２２又は２６に記載の方法。
【請求項３６】
前記改変細胞が自己Ｔ細胞である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
前記細胞が、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、胚細胞、又は樹状細胞の少なくとも１つを含む、請求項２１、２２、２５、又は２６に記載の改変細胞又は方法。
【請求項３８】
前記疾患が、癌、免疫不全、自己免疫疾患、及び肥満の少なくとも１つを含む、請求項２２又は２６に記載の方法。
【請求項３９】
対象の癌を治療及び／又は阻害する方法であって、ＰＤ−１の細胞外ドメインを含む可溶性受容体を治療有効量で前記対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項４０】
前記可溶性受容体がＰＤ−Ｌ１タンパク質に結合し、癌細胞のＰＤ−１シグナル伝達を破壊及び／又はＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１への結合を破壊する、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
前記可溶性受容体ポリペプチドが、配列番号９のアミノ酸残基２０〜５１９を含む、請求項３６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
＜関連特許出願の相互参照＞
本出願は、「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ  ｔｈｅｒｅｏｆ」と題された２０１５年３月２日出願の米国特許仮出願第６２／１２６，８０４号の優先権を主張するものであり、当該出願はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
本開示は、改変された細胞及び使用、特にＣＡＲ  Ｔ細胞療法に関連する免疫寛容を低下させるための組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
Ｔ細胞療法は、癌を治療するための有効性及び治癒可能性が実証されている。しかしながら、それらの使用は、免疫抑制微小環境の存在によって制限される。免疫抑制微小環境には、プログラム死１−（ＰＤ−１）とＰＤ−Ｌ１リガンド（ＰＤ−Ｌ１）との間の相互作用によって誘導される免疫寛容が含まれる。ＰＤ−１は、Ｔ細胞及び抗原提示細胞に対する負の共調節受容体である。ＰＤ−Ｌ１は、いくつかの細胞型（例えば、腫瘍細胞及び他の組織細胞）で発現され、免疫微小環境によって動的に調節されると思われる。従って、Ｔ細胞療法の有効性を改善するために、ＰＤ−Ｌ１によって誘導される免疫寛容に対処する必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本開示の実施形態は、改変プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）をコードする核酸配列及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を含む単離核酸配列に関する。特定の実施形態において、改変ＰＤ−１及びＣＡＲは、別個のポリペプチドである遺伝子産物として発現される。
【０００６】
いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、ＰＤ−Ｌ１を発現する癌細胞に存在する腫瘍抗原に特異的である。
【０００７】
いくつかの実施形態において、腫瘍抗原は、ＨＥＲ２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、カッパ又は軽鎖、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ３８、ＲＯＲ１、ＥｒｂＢ３／４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐｈＡ２、ＦＡＰ、癌胎児性抗原、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、メソテリン、ＴＡＧ７２、ＰＳＭＡ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、Ｂ７−Ｈ６、ＩＬ−１３受容体α２、ＩＬ−１１受容体α、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＣＡ９、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＭＷ‐ＭＡＡ、ＣＤ１７１、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、Ｇ２５０／ＣＡＩＸ、ＨＬＡ‐ＡＩ
ＭＡＧＥ  Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２  ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＣ１、葉酸受容体−α、ＣＤ４４ｖ７／８、８Ｈ９、ＮＣＡＭ、ＶＥＧＦ受容体、５Ｔ４、Ｆｅｔａｌ  ＡｃｈＲ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＣＤ４４ｖ６、ＴＥＭ１、ＴＥＭ８、又は腫瘍により発現されるウイルス関連抗原を含む。
【０００８】
いくつかの実施形態において、改変ＰＤ−１をコードする核酸配列は、ワイド型ＰＤ−１の細胞内部分をコードする核酸配列と比較して、１又は複数のヌクレオチドの置換又は欠失を含む。
【０００９】
いくつかの実施形態において、改変ＰＤ−１をコードする核酸配列は、ワイド型ＰＤ−１の細胞内部分をコードする核酸配列と比較して、複数のヌクレオチドの欠失を含む。特定の実施形態において、改変ＰＤ−１は、配列番号１４の核酸配列を含む。
【００１０】
いくつかの実施形態において、改変ＰＤ−１をコードする核酸配列は、細胞内ドメインを含まない切断型ＰＤ−１をコードする核酸を含む。特定の実施形態において、改変ＰＤ−１をコードする核酸配列は、配列番号１２の核酸配列を含む。
【００１１】
いくつかの実施形態において、改変ＰＤ−１は、ワイド型ＰＤ−１と比較して１又は複数の点突然変異を含む。特定の実施形態において、点突然変異は、ワイド型ＰＤ−１のリン酸化部位の１つ又は２つのアミノ酸点突然変異を含む。
【００１２】
実施形態はさらに、上記のような核酸配列を含む発現ベクターに関する。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、及びアデノ随伴ウイルスベクターからなる群から選択されるウイルスベクターである。
【００１３】
実施形態は更に、本開示の発現ベクターを含む細胞に関する。いくつかの実施形態において、細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及びＮＫＴ細胞からなる群より選択される。
【００１４】
実施形態は更に、上記の単離核酸配列を含むヒトＴ細胞を含む、ヒトＴ細胞集団の抗腫瘍有効量を含む医薬組成物に関する。いくつかの実施形態において、該集団のヒトＴ細胞のサイトカイン産生に対するＰＤ−Ｌ１の阻害効果は、改変ＰＤ−１をコードする核酸の少なくとも一部を含まないヒトＴ細胞のサイトカイン産生に対するＰＤ−Ｌ１の阻害効果より低い。
【００１５】
実施形態は更に、ヒト患者の癌を治療する方法であって、本開示に記載の医薬組成物をヒト患者に投与するステップを含む方法に関する。
【００１６】
実施形態は更に、改変ＰＤ−１及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように操作された細胞であって、改変ＰＤ−１がＰＤ−１の膜貫通部分若しくは細胞内部分、又はそれらの組み合わせを含まない細胞に関する。いくつかの実施形態において、該細胞は、ＰＤ−Ｌ−１へのＰＤ−１の結合を破壊するような可溶性ＰＤ−１を発現する。例えば、可溶性ＰＤ−１は、該細胞の細胞膜に付着していない。
【００１７】
実施形態は更に、対象の癌を治療及び／又は阻害する方法に関する。該方法は、ＰＤ−１の細胞外ドメインを含む治療有効量の可溶性受容体を対象に投与するステップを含む。いくつかの実施形態において、可溶性受容体はＰＤ−Ｌ１タンパク質に結合し、癌細胞のＰＤ−１シグナル伝達を破壊、及び／又はＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１への結合を破壊する。特定の実施形態において、単離可溶性受容体ポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸残基２０〜５１９を含む。
【００１８】
実施形態は更に、細胞質ドメインが切断された受容体ポリペプチドを含み、該受容体ポリペプチドは、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）受容体ポリペプチド、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）受容体ポリペプチド、又はＢ−及びＴ−リンパ球アテニュエータ（ＢＴＬＡ）受容体の少なくとも１つである、改変細胞に関する。
【００１９】
実施形態は更に、疾患を有する対象を治療するための方法に関する。この方法は、疾患を有する対象に細胞を投与するステップを含み、該細胞は、細胞質ドメインが切断された
受容体ポリペプチドであって、該受容体ポリペプチドは、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）受容体ポリペプチド、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）受容体ポリペプチド、又はＢ−及びＴ−リンパ球アテニュエータ（ＢＴＬＡ）受容体の少なくとも１つである；並びに、抗原に結合する特異的抗体の抗原認識ドメイン及び細胞内ドメイン又は改変型若しくはワイド型のＴ細胞受容体を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子改変された細胞である。
【００２０】
いくつかの実施形態において、受容体ポリペプチドはＰＤ−１受容体ポリペプチドであり、ＰＤ−１受容体ポリペプチドの細胞質ドメインは免疫受容体チロシン依存性モチーフを含む。
【００２１】
実施形態は更に、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）、細胞障害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）、又はＢ−及びＴ−リンパ球アテニュエータ（ＢＴＬＡ）の少なくとも１つを含む１又は複数の受容体を、対応する野生型細胞と比較して減少した量で含む改変細胞に関する。
【００２２】
実施形態は更に、疾患を有する対象を治療するための方法に関する。本方法は、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）、細胞障害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）、又はＢ−及びＴ−リンパ球アテニュエータ（ＢＴＬＡ）の少なくとも１つを含む１又は複数の受容体を、対応する野生型細胞と比較して減少した量で発現するように改変された細胞を、疾患を有する対象に投与するステップを含む。
【００２３】
いくつかの実施形態において、改変細胞は、特異的抗体の抗原認識ドメイン及び細胞内ドメイン、又は改変型若しくはワイド型Ｔ細胞受容体を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を更に含む。特定の実施形態において、改変細胞は、抗原に結合する特異的抗体の抗原認識ドメイン及び細胞内ドメイン又は改変型若しくはワイド型Ｔ細胞受容体を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を更に含む。
【００２４】
いくつかの実施形態において、改変細胞は、対応する野生型細胞と比較して、１又は複数の受容体の生合成経路若しくは輸送経路又はそれらの組み合わせに関連する１又は複数の遺伝子の発現が減少する。特定の実施形態において、改変細胞は、１又は複数の遺伝子の破壊を含む。特定の実施形態において、改変細胞は、１又は複数の遺伝子の部分的又は競合的欠失を含む。特定の実施形態において、遺伝子改変細胞は、ヒト患者においてインビボで複製する。
【００２５】
いくつかの実施形態において、改変細胞は、ヒト患者において記憶細胞を形成する。これらの場合、改変細胞は、ヒト患者に静脈内投与される。特定の実施形態において、改変細胞はヒト患者において存続される。例えば、改変細胞は自己Ｔ細胞である。別の例では、この細胞は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、胚細胞、又は樹状細胞の少なくとも１つを含み得る。
【００２６】
いくつかの実施形態において、疾患は、癌、免疫不全、自己免疫疾患、又は肥満の少なくとも１つを含み得る。
【００２７】
この発明の概要は、以下の「発明を実施するための形態」で更に説明する概念を選択して簡単に紹介するために提供している。この発明の概要は、特許請求する主題の重要な特徴又は本質的な特徴の特定を意図するものではなく、特許請求する主題の範囲を限定するための使用も意図していない。
【００２８】
発明を実施するための形態は、添付図面を参照して説明される。異なる図面における同
じ参照番号の使用は、類似又は同一の項目を示す。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】Ｐ０：ＣＤ１９ＢＢＺＥＴＡ、Ｐ１：ＣＤ１９ＢＢＺＥＴＡ−ｉｒｅｓ−可溶性ＰＤ１、Ｐ２：ＣＤ１９ＢＢＺＥＴＡ−ｉｒｅｓ−切断型ＰＤ１、Ｐ３：ＣＤ１９ＢＢＺＥＴＡ−ｉｒｅｓ−点突然変異ＰＤ１、Ｐ４：ＣＤ１９ＢＢＺＥＴＡ−ｉｒｅｓ−欠失ＰＤ１のＤＮＡ構築体を示す概略図である。
【図２】形質導入された２９３Ｔ及びＫ５６２細胞におけるＣＡＲ及び改変ＰＤ−１の発現を示す一連の画像である。図２Ａは、形質導入された２９３Ｔ及びＫ５６２細胞におけるＣＡＲの発現を示す。図２Ｂは、形質導入された２９３Ｔ及びＫ５６２細胞における改変ＰＤ−１の発現を示す。
【図３】初代Ｔ細胞におけるＣＡＲ及び改変ＰＤ−１の発現を示す一連の画像である。図３Ａは、形質導入された初代Ｔ細胞におけるＣＡＲの発現を示す。図３Ｂ及び３Ｃは、形質導入された初代Ｔ細胞における改変ＰＤ−１の発現を示す。
【図４】ＣＡＲ及び改変ＰＦ−１を形質導入されたＴ細胞の細胞傷害性を示す一連の画像である。図４Ａは、ＣＲＡ及び改変ＰＤ−１を形質導入し、Ｅ：Ｔ比１０：１でＣＤ１９＋と共に２４時間培養したＴ細胞１０４当たりのＩＦＮ−ガンマ放出を示す図である。図４Ｂは、ＣＲＡ及び改変ＰＤ−１を形質導入し、Ｅ：Ｔ比１０：１で２４時間培養した１０４のＴ細胞が、ＣＤ１９＋細胞を死滅させたことを示す図である。
【図５】形質導入されたＮａｌＭ６細胞におけるＰＤ−Ｌ１の発現を示す図である。
【図６】改変ＰＤ−１がＰＤ−Ｌ１によって誘導される免疫寛容を低下させることを示す一連の画像である。図６Ａは、ＣＲＡ及び改変ＰＤ−１を形質導入し、Ｅ：Ｔ比１０：１でＣＤ１９＋細胞及びＣＤ１９＋／ＰＤ−Ｌ１＋細胞と共に２４時間培養したＴ細胞１０４当たりのＩＦＮ−ガンマ放出を示す図である。これらの結果は、ＣＡＲ及び改変ＰＤ−１を形質導入したＴ細胞において、ＰＤ−Ｌ１によって誘導される細胞傷害性の阻害が低下することを示す。図６Ｂは、ＣＡＲ単独を形質導入したＴ細胞と比較して、ＣＡＲ及び改変ＰＤ−１を形質導入したＴ細胞において、ＰＤ−Ｌ１の減少によって誘導される細胞傷害性の喪失が低下すること示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
概略
本開示は、ＣＡＲ  Ｔ細胞に基づく療法において、ＰＤ−Ｌ１によって誘導される免疫寛容が、これらのＴ細胞における遺伝子改変ＰＤ−１の発現によって低下し得るという発見に関する。いくつかの実施形態において、これらのＴ細胞は、改変ＰＤ−１及びＣＡＲが、これらのＴ細胞において別個のポリペプチドである遺伝子産物として発現されるように、ＣＡＲ及び遺伝子改変ＰＤ−１をコードする核酸配列を含む。遺伝子改変の例には、ＰＤ−１の発現又は細胞内部分の機能に関連する１又は複数のヌクレオチドの置換又は欠失が含まれる。
【００３１】
いくつかの実施形態において、本開示は、ＣＤ１９に対するＣＡＲ並びにＴ細胞のサイトカイン産生に対するＰＤ−Ｌ１の阻害効果が、改変ＰＤ−１をコードする核酸配列の少なくとも一部を含まないＴ細胞のサイトカイン産生に対するＰＤ−Ｌ１の阻害効果より有意に低いように改変されたＰＤ−１を発現するように操作されたＴ細胞を提供する。場合によっては、ＣＡＲは、ＰＤ−Ｌ１を発現する腫瘍細胞に存在する腫瘍抗原に特異的である。従って、本開示の操作されたＴ細胞は、患者に注入された場合、腫瘍細胞のＰＤ−Ｌ１によって誘導される免疫寛容を低下させることができ、患者の生体内でこれらの腫瘍細胞を更に排除することができる。
【００３２】
定義
他に定義されない限り、本明細書において使用する全ての技術用語及び科学用語は、本
開示が属する当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似又は等価な任意の方法及び材料を、本開示の実施又は試験において使用することができるが、好ましい方法及び材料を記載する。本開示の目的のために、以下の用語を下記に定義する。
【００３３】
冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、本明細書では、１又は複数の（即ち、少なくとも１つの）該冠詞の文法的目的語を指すために使用される。例として、「ある要素（ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの要素又は複数の要素を意味する。
【００３４】
「約」とは、言及された分量、レベル、値、数値、頻度、百分率、寸法、サイズ、総量、重量又は長さに対して３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１％ほど変動した分量、レベル、値、数値、頻度、百分率、寸法、サイズ、総量、重量又は長さを意味する。
【００３５】
本明細書で使用する「活性化」という用語は、検出可能な細胞増殖を誘導するために十分に刺激されたＴ細胞の状態を指す。活性化はまた、誘導されたサイトカイン産生及び検出可能なエフェクター機能に関連し得る。「活性化Ｔ細胞」という用語は、とりわけ、細胞分裂を受けているＴ細胞を指す。
【００３６】
用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）及び所望の生物学的活性又は機能を示す限り抗体断片を含む。本開示における抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆｖ、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ）２、並びに一本鎖抗体及びヒト化抗体を含むさまざまな形態で存在し得る（Ｈａｒｌｏｗら、１９９９年、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ；  Ｈａｒｌｏｗら、１９８９年、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；  Ｈｏｕｓｔｏｎら、１９８８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３；  Ｂｉｒｄら、１９８８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６頁）。
【００３７】
「抗体断片」は、完全長抗体の一部、概して抗体の抗原結合領域又は可変領域を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；二重抗体（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）；線形抗体；一本鎖抗体分子；並びに抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれる。
【００３８】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識部位及び抗原結合部位を含む最小抗体断片である。この断片は、緊密で非共有結合的な、１つの重鎖及び１つの軽鎖可変領域ドメインの二量体からなる。これらの２つのドメインの折りたたみから、抗原結合のためのアミノ酸残基に寄与し、抗原結合特異性を抗体に与える６つの超可変ループ（それぞれＨ鎖及びＬ鎖から３ループ）が生じる。しかし、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的な３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）のみを含むＦｖの半分）であっても抗原を認識して結合する能力を有するが、結合部位全体よりも親和性は低い。本明細書において使用する「抗体重鎖」は、天然に存在する立体配座の全抗体分子中に存在する２つの型のポリペプチド鎖のうち大きい方を指す。本明細書において使用する「抗体軽鎖」は、天然に存在する立体配座の全抗体分子中に存在する２つの型のポリペプチド鎖のうち小さい方を指す。κ及びλ軽鎖は、２つの主要な抗体軽鎖アイソタイプを指す。
【００３９】
本明細書において使用する「合成抗体」という用語は、例えば、本明細書に記載のバクテリオファージによって発現される抗体のような、組換えＤＮＡ技術を用いて作製される
抗体を意味する。この用語はまた、抗体をコードするＤＮＡ分子及び抗体タンパク質を発現するＤＮＡ分子の合成によって生成された抗体、又は抗体を特定するアミノ酸配列を意味すると解釈されるべきであり、これらのＤＮＡ又はアミノ酸配列は当該分野において利用可能で周知の合成ＤＮＡ又はアミノ酸配列技術を用いて得られている。
【００４０】
本明細書において使用する用語「抗原」は、抗体産生若しくは特異的な免疫学的コンピテント細胞の活性化、又はその両方に関与できる、免疫応答を誘発する分子として定義される。抗原は、事実上組換えＤＮＡ又はゲノムＤＮＡに由来する全てのタンパク質若しくはペプチド、又は分子を含む任意の高分子を含み得る。例えば、免疫応答を誘発するタンパク質をコードするヌクレオチド配列又は部分ヌクレオチド配列を含むＤＮＡは、本明細書において使用する用語「抗原」をコードする。更に、抗原は、遺伝子の完全長ヌクレオチド配列によってのみコードされる必要はない。更に、抗原は、組織試料、腫瘍試料、細胞又は生物学的液体を含む生体試料から生成、合成又は誘導することができる。
【００４１】
本明細書において使用する「抗腫瘍効果」という用語は、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞の数の減少、転移の数の減少、腫瘍細胞を有する対象の平均余命の延長又は癌状態に関連する様々な生理学的症状の改善に関連する生物学的効果を指す。「抗腫瘍効果」は、まず第１に、腫瘍発生の予防において本開示のペプチド、ポリヌクレオチド、細胞及び抗体の能力によって明らかにされ得る。
【００４２】
用語「自己抗原」は、免疫系によって誤って外来であると認識された抗原を指す。自己抗原には、細胞タンパク質、リンタンパク質、細胞表面タンパク質、細胞脂質、核酸、糖タンパク質（細胞表面受容体を含む）が含まれる。
【００４３】
「自己」という用語は、後に個体に再導入される、同じ個体に由来する物質を説明するために使用される。
【００４４】
「同種異系」は、同じ種の異なる動物に由来する移植片を表すために使用される。
【００４５】
「異種性」は、異なる種の動物由来の移植片を記述するために使用される。
【００４６】
本明細書において使用される「癌」という用語は、異常細胞の迅速且つ制御されない増殖によって特徴付けられる疾患として定義される。癌細胞は、局所的に、又は血流及びリンパ系を通して体の他の部分に広がることができる。様々な癌の例としては、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、皮膚癌、膵臓癌、結腸直腸癌、腎臓癌、肝臓癌、脳腫瘍、リンパ腫、白血病、肺癌等が挙げられる。
【００４７】
本明細書を通じて、文脈が他の意味を要求しない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という語は、記載されたステップ若しくは要素又はステップ若しくは要素の群を含むが、任意の他のステップ若しくは要素又はステップ若しくは要素の群を排除しないことを意味すると理解されるものとする。
【００４８】
「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」とは、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という語句に続く全てのものを含み、これに限定されることを意味する。従って、「からなる」という語句は、列挙された要素が必要又は必須であり、他の要素が存在してはいけないことを示す。
【００４９】
「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」とは、その語句の後に列挙される任意の要素を含み、列挙された要素に関して本開示におい
て特定された活性若しくは作用に干渉しないか、又は寄与しない他の要素に限定されることを意味する。従って、「本質的に〜からなる」という語句は、列挙された要素が必要又は必須であるが、他の要素は任意選択であり、列挙された要素の活性若しくは作用に影響を及ぼすか否かに依存して存在しても、又は存在しなくてもよい。
【００５０】
用語「相補的」及び「相補性」は、塩基対形成規則により関連するポリヌクレオチド（即ち、ヌクレオチドの配列）を指す。例えば、配列「Ａ−Ｇ−Ｔ」は、配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」に相補的である。相補性は、核酸の塩基の一部のみが塩基対形成規則に従って一致する「部分的」なものであってもよい。あるいは、核酸間に「完全な」又は「全体的な」相補性が存在してもよい。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率及び強度に有意な効果を有する。
【００５１】
「に対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｓ  ｔｏ）」又は「に対応している（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ  ｔｏ）」とは、（ａ）参照ポリヌクレオチド配列の全部若しくは一部と実質的に同一若しくは相補的であるヌクレオチド配列を有するか、又はペプチド若しくはタンパク質中のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、あるいは（ｂ）参照ペプチド又はタンパク質中のアミノ酸の配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するペプチド又はポリペプチドを意味する。
【００５２】
「共刺激リガンド」には、Ｔ細胞上の同族共刺激分子に特異的に結合し、それによって、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体とペプチドが負荷されたＭＨＣ分子との結合によって提供される一次シグナルに加えて、増殖、活性化、分化等を含むＴ細胞応答を媒介する、抗原提示細胞（例えば、ＡＰＣ、樹状細胞、Ｂ細胞など）上の分子を含む。共刺激リガンドとしては、ＣＤ７、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、誘導性共刺激リガンド（ＩＣＯＳ−Ｌ）、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０  ＣＤ７０、ＣＤ８３、ＨＬＡ−Ｇ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＨＶＥＭ、リンホトキシンベータ受容体、３／ＴＲ６、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、ＨＶＥＭ、Ｔｏｌｌリガンド受容体に結合するアゴニスト又は抗体、Ｂ７−Ｈ３と特異的に結合するリガンドを挙げることができる。共刺激リガンドは、とりわけ、Ｔ細胞上に存在する共刺激分子、例えば、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３及びＣＤ８３と特異的に結合するリガンドと特異的に結合する抗体も包含する。
【００５３】
「共刺激分子」は、共刺激リガンドと特異的に結合して、それによって増殖等のＴ細胞による共刺激応答を媒介するＴ細胞上の同族結合パートナーを指す。共刺激分子には、ＭＨＣクラスＩ分子、ＢＴＬＡ及びＴｏｌｌ様受容体が含まれる。
【００５４】
「共刺激シグナル」とは、ＴＣＲ／ＣＤ３ライゲーション等の一次シグナルと組み合わせて、Ｔ細胞増殖及び／又は主要分子の上方制御又は下方制御を導くシグナルを指す。
【００５５】
本明細書において使用する用語「疾患」及び「状態」は互換的に使用することができ、又は特定の病症若しくは状態が既知の原因物質を有さず（よって、病因が未だ解明されておらず）、従って、未だ疾患として認識されていないが、望ましくない状態又は症候群としてのみ認識され、多かれ少なかれ特異的な症状のセットが臨床医によって同定されているという点で異なっていてもよい。本明細書において使用する「疾患」とは、対象が恒常性を維持できず、疾患が改善されない場合、対象の健康が悪化し続ける対象の健康状態である。対照的に、対象における「障害」は、動物が恒常性を維持できるが、その動物の健康状態は、障害がない場合よりも好ましくない健康状態である。未治療のまま放置しても、障害が必ずしも動物の健康状態を更に低下させるとは限らない。
【００５６】
本明細書において使用する用語「有効な」は、所望の、期待された、又は意図された結果を達成するのに適切であることを意味する。例えば、「有効量」は、治療的又は予防的な利益を生じるのに十分な化合物の量であり得る。
【００５７】
「コードする」とは、所定のヌクレオチド配列（即ち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ及びｍＲＮＡ）又は所定のアミノ酸配列のいずれかを有する、生物学的プロセス中の他のポリマー及び巨大分子の合成のための鋳型として機能するポリヌクレオチド中の特定のヌクレオチド配列、例えば、遺伝子、ｃＤＮＡ又はｍＲＮＡの固有な特性並びにそれから生じる生物学的特性を指す。従って、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写及び翻訳が、細胞又は他の生物学的系においてタンパク質を産生する場合、遺伝子はタンパク質をコードする。ヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一であり、通常は配列リストに提供されるコード鎖及び遺伝子又はｃＤＮＡの転写の鋳型として使用される非コード鎖の両方が、タンパク質又はその遺伝子もしくはｃＤＮＡの他の産物をコードすると言うことができる。
【００５８】
ポリヌクレオチドに関して、「外因性」という用語は、野生型細胞又は生物において天然に存在しないが、典型的には、分子生物学的技術によって細胞に導入されるポリヌクレオチド配列を指す。外因性ポリヌクレオチドの例には、ベクター、プラスミド、及び／又は所望のタンパク質をコードする人工核酸構築物が含まれる。ポリヌクレオチドに関して、「内因性」又は「天然」という用語は、所与の野生型細胞又は生物に見出すことができる天然に存在するポリヌクレオチド配列を指す。また、第１の生物から単離され、分子生物学的技術によって第２の生物に移入される特定のポリヌクレオチド配列は、典型的には、第２の生物に対して「外因性」ポリヌクレオチドとみなされる。特定の実施形態において、ポリヌクレオチド配列は、分子生物学的技術によって、そのようなポリヌクレオチド配列を既に含む微生物に「導入」することができ、例えば、別の天然に存在するポリヌクレオチド配列の１又は複数の追加コピーを作製し、それによってコードされたポリペプチドの過剰発現を促進することができる。
【００５９】
本明細書において使用する用語「発現」は、そのプロモータによって駆動される特定のヌクレオチド配列の転写及び／又は翻訳として定義される。
【００６０】
「発現ベクター」とは、発現されるヌクレオチド配列に動作可能に連結された発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現のための十分なシス作用性要素を含み、発現のための他の要素は、宿主細胞によって、又はインビトロ発現系において供給され得る。発現ベクターには、組換えポリヌクレオチドを組み込んだコスミド、プラスミド（例えば、裸の又はリポソームに含まれる）、及びウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）等、当技術分野で知られているもの全てが含まれる。
【００６１】
「相同な」とは、２つのポリペプチド間又は２つの核酸分子間の配列類似性又は配列同一性を指す。２つの比較される配列の両方のある位置が同じ塩基又はアミノ酸モノマーサブユニットによって占有される場合（例えば、２つのＤＮＡ分子のそれぞれの位置がアデニンによって占有される場合）、この分子はその位置において相同である。２つの配列間の相同性パーセンテージは、２つの配列によって共有される一致数又は相同位置数を、比較した位置の数で割って１００を掛けた関数である。例えば、２つの配列中の１０の位置のうち６が一致又は相同である場合、２つの配列は６０％相同である。一例として、ＤＮＡ配列ＡＴＴＧＣＣ及びＴＡＴＧＧＣは、５０％の相同性を共有する。一般に、２つの配列が最大の相同性を与えるように整列された場合に比較が行われる。
【００６２】
「免疫グロブリン」又は「Ｉｇ」という用語は、抗体として機能するタンパク質のクラ
スを指す。このクラスのタンパク質に含まれる５つのメンバーは、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＥである。ＩｇＡは、唾液、涙、母乳、胃腸分泌物等の身体分泌物並びに呼吸器及び泌尿生殖路の粘液分泌物に存在する一次抗体である。ＩｇＧは最も一般的な循環抗体である。ＩｇＭは、ほとんどの対象において、一次免疫応答において産生される主要な免疫グロブリンである。それは、凝集、補体固定、及び他の抗体応答において最も効率的な免疫グロブリンであり、細菌及びウイルスに対する防御において重要である。ＩｇＤは、既知の抗体機能を有さないが、抗原受容体として機能し得る免疫グロブリンである。ＩｇＥは、アレルゲンへの暴露時に肥満細胞及び好塩基球からメディエーターを放出させることにより、即時過敏症を媒介する免疫グロブリンである。
【００６３】
「単離」とは、天然の状態で通常それに付随する成分を実質的に又は本質的に含まない物質を意味する。例えば、本明細書において使用する「単離ポリヌクレオチド」は、自然に存在する状態でそれに隣接する配列から精製されたポリヌクレオチド、例えば、通常は隣接する配列から取り外されたＤＮＡ断片を指す。あるいは、本明細書において使用する「単離ペプチド」又は「単離ポリペプチド」等は、その天然の細胞環境及び細胞の他の関連要素からのペプチド又はポリペプチド分子のインビトロ単離及び／又は精製を指す。
【００６４】
本開示の文脈において、一般的に生じる核酸塩基に関して以下の略語を使用する。「Ａ」はアデノシンを示し、「Ｃ」はシトシンを示し、「Ｇ」はグアノシンを示し、「Ｔ」はチミジンを示し、「Ｕ」はウリジンを示す。
【００６５】
他に特定されない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いに縮重したバージョンであり、同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列を含む。タンパク質又はＲＮＡをコードするヌクレオチド配列という語句はまた、タンパク質をコードするヌクレオチド配列が同じバージョンでイントロンを含み得る範囲でイントロンを含むことができる。
【００６６】
本明細書において使用する「レンチウイルス」は、レトロウイルス科の属を指す。レンチウイルスは、非分裂細胞に感染することができるレトロウイルス間で独特であり、宿主細胞のＤＮＡに相当量の遺伝情報を送達することができるので、遺伝子送達ベクターの最も効率的な方法の１つである。ＨＩＶ、ＳＩＶ及びＦＩＶは、全てレンチウイルスの例である。レンチウイルス由来のベクターは、インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で有意なレベルの遺伝子移入を達成する手段を提供する。
【００６７】
本明細書において使用する「調節する」という用語は、治療又は化合物が存在しない対象における応答のレベルと比較した、及び／又は他の点では同一であるが治療されていない対象における応答のレベルと比較した、対象における応答のレベルの検出可能な増加又は減少を媒介することを意味する。この用語は、天然のシグナル又は応答を混乱させ、及び／又は影響を及ぼし、それにより、対象、好ましくはヒトにおいて有益な治療応答を媒介することを包含する。
【００６８】
核酸は、別の核酸配列と機能的関係に置かれた場合、「動作可能に連結される」。例えば、プレ配列又は分泌リーダーのためのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドのＤＮＡに動作可能に連結され、プロモータ又はエンハンサーは、その配列の転写に影響を及ぼす場合にはコード配列に動作可能に連結され、リボソーム結合部位は、翻訳を容易にするように配置される場合、コード配列に動作可能に連結される。概して、「動作可能に連結されている」とは、連結されているＤＮＡ配列が隣接しており、分泌リーダーの場合には隣接し、リーディング相（ｒｅａｄｉｎｇ  ｐｈａｓｅ）内にあることを意味する。しかし、エンハンサーは隣接している必要はない。連結は、都合のよい制限部位においてライゲーションによって達成される。そ
のような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが従来の方法に従って使用される。
【００６９】
「過剰発現」腫瘍抗原又は腫瘍抗原の「過剰発現」という用語は、患者の特定の組織又は器官内の固形腫瘍等の疾患領域由来の細胞における、その組織又は器官からの正常細胞における発現レベルと比較して、異常なレベルの腫瘍抗原の発現を示すことを意図している。腫瘍抗原の過剰発現を特徴とする固形腫瘍又は血液悪性腫瘍を有する患者は、当該分野で公知の標準的なアッセイによって決定することができる。
【００７０】
免疫原性組成物の「非経口」投与には、例えば、皮下（ｓ．ｃ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、又は胸骨内の注射若しくは注入技術が含まれる。
【００７１】
「患者」、「対象」、「個体」等の用語は本明細書において互換的に使用され、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）又はインサイチュ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）に関わらず、本明細書に記載の方法を受けることができる任意の動物又はその細胞を指す。特定の非限定的な実施形態において、患者、対象、又は個体はヒトである。いくつかの実施形態において、用語「対象」は、免疫応答が誘発され得る生物（例えば、哺乳動物）を含むことが意図される。対象の例には、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、及びそれらのトランスジェニック種が含まれる。
【００７２】
本明細書において使用する「ポリヌクレオチド」又は「核酸」とは、ｍＲＮＡ、ＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｃＤＮＡ、又はＤＮＡを指す。この用語は、典型的には、少なくとも１０塩基長のポリマー型ヌクレオチドの、リボヌクレオチド若しくはデオキシヌクレオチドのいずれか、又はいずれかのタイプのヌクレオチドの改変型のいずれかを指す。この用語は、一本鎖及び二本鎖形態のＤＮＡ及びＲＮＡを含む。
【００７３】
用語「ポリヌクレオチド変異体」及び「変異体」等は、参照ポリヌクレオチド配列と実質的な配列同一性を示すポリヌクレオチド、又は以下に定義されるストリンジェントな条件下で参照配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドを指す。これらの用語はまた、少なくとも１つのヌクレオチドの付加、欠失、又は置換によって参照ポリヌクレオチドと区別されるポリヌクレオチドを包含する。従って、用語「ポリヌクレオチド変異体」及び「変異体」には、１又は複数のヌクレオチドが付加又は欠失しているか、又は異なるヌクレオチドで置換されているポリヌクレオチドが含まれる。これに関して、変異、付加、欠失、及び置換を含む特定の改変を参照ポリヌクレオチドに対して行い、改変されたポリヌクレオチドが参照ポリヌクレオチドの生物学的機能又は活性を保持するか、又は参照ポリヌクレオチドと比較して活性を増加（即ち、最適化）させることが可能であることは当該分野において十分理解されている。ポリヌクレオチド変異体には、本明細書に記載の参照ポリヌクレオチド配列と、少なくとも５０％（及び少なくとも５１％〜少なくとも９９％及びその間の全ての整数百分率、例えば９０％、９５％、又は９８％）の配列同一性を有するポリヌクレオチドが含まれる。用語「ポリヌクレオチド変異体」及び「変異体」はまた、これらの酵素をコードする天然の対立遺伝子変異体及びオルソログも含む。
【００７４】
「ポリペプチド」、「ポリペプチド断片」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は、本明細書において互換的に使用され、アミノ酸残基のポリマー並びにそれらの変異体及び合成類似体を指す。従って、これらの用語は、１又は複数のアミノ酸残基が合成の非天然アミノ酸、例えば、対応する天然アミノ酸の化学的類似体であるアミノ酸ポリマー、並びに天然に存在するアミノ酸ポリマーに適用される。特定の態様において、ポリペプチドは、典型的には様々な化学反応を触媒する（即ち、その速度を増加させる）酵素ポリペプチド又は「酵素」を含み得る。
【００７５】
記載のポリペプチド「変異体」は、少なくとも１つのアミノ酸残基の付加、欠失、又は置換によって参照ポリペプチド配列と区別されるポリペプチドを指す。特定の実施形態において、ポリペプチド変異体は、保存的又は非保存的であり得る１又は複数の置換によって参照ポリペプチドと区別される。特定の実施形態において、ポリペプチド変異体は保存的置換を含み、この点で、ポリペプチドの活性の性質を変化させることなく、いくつかのアミノ酸を広く類似の性質を有する他のものに変更できることが当該分野において十分理解されている。ポリペプチド変異体はまた、１又は複数のアミノ酸が付加若しくは欠失しているか、又は異なるアミノ酸残基で置換されたポリペプチドを包含する。
【００７６】
本明細書において使用する「プロモータ」という用語は、ポリヌクレオチド配列の特異的転写の開始に必要とされる、細胞の合成機構又は導入された合成機構によって認識されるＤＮＡ配列として定義される。「制御配列」という表現は、特定の宿主生物において動作可能に連結されたコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を指す。原核生物に適した制御配列は、例えば、プロモータ、場合によりオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核細胞は、プロモータ、ポリアデニル化シグナル、及びエンハンサーを利用することが知られている。
【００７７】
「結合する（ｂｉｎｄ）」、「結合する（ｂｉｎｄｓ）」、又は「相互作用する（ｉｎｔｅｒａｃｔｓ  ｗｉｔｈ）」という用語は、１つの分子が、試料又は生物中の特定の第２分子を認識して付着するが、試料中の他の構造的に無関係の分子は実質的に認識又は付着しないことを意味する。抗体に関して本明細書において使用する「特異的に結合する」という用語は、特異的抗原を認識するが、試料中の他の分子は実質的に認識又は結合しない抗体を意味する。例えば、１つの種由来の抗原に特異的に結合する抗体はまた、１又は複数の種由来のその抗原に結合してもよい。しかし、そのような異種間反応性は、それ自体は特異的な抗体の分類を変更するものではない。別の例において、ある抗原に特異的に結合する抗体はまた、その抗原の異なる対立遺伝子型に結合し得る。しかし、そのような交差反応性は、それ自体は特異的な抗体の分類を変更するものではない。場合によっては、用語「特異的結合」又は「特異的な結合」は、抗体、タンパク質、又はペプチドと、第２の化学種との相互作用に関して使用され、この相互作用が前記化学種の特定の構造（例えば、抗原決定基又はエピトープ）の存在に依存すること、例えば、抗体が、特定のタンパク質構造を他の一般的タンパク質より特異的に認識し、結合することを意味する。抗体がエピトープ「Ａ」に特異的である場合、標識された「Ａ」と抗体とを含む反応においてエピトープＡを含む分子（又は遊離の非標識Ａ）の存在は、抗体に結合される標識されたＡの量を減少させる。
【００７８】
「可溶性受容体」は、細胞膜に結合しない受容体ポリペプチドである。可溶性受容体は、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを欠く最も一般的なリガンド結合受容体ポリペプチドである。可溶性受容体は、ポリペプチドの精製を提供する、若しくは基質へのポリペプチドの結合のための部位を提供する親和性タグ、又は免疫グロブリン定常領域配列等の更なるアミノ酸残基を含むことができる。多くの細胞表面受容体は、タンパク質分解によって生成される、天然に存在する可溶性対応物を有する。可溶性受容体ポリペプチドが、膜アンカリング又はシグナル伝達を提供するための、それぞれ膜貫通及び細胞内ポリペプチドセグメントの十分な部分を欠いている場合、可溶性受容体ポリペプチドはこれらのセグメントを実質的に含まないと言われる。
【００７９】
「統計的に有意な」とは、結果が偶然に発生した可能性が低いことを意味する。統計学的有意性は、当該分野で公知の任意の方法によって決定することができる。有意性の一般的に使用される尺度には、帰無仮説が当てはまる場合、観察される事象が起こる頻度又は確率であるｐ値が含まれる。得られたｐ値が有意水準よりも小さい場合、帰無仮説は棄却される。単純な場合、有意水準はｐ値０．０５以下で定義される。「低減した」又は「減
少した」又は「より少ない」量は、典型的には、「統計的に有意な」又は生理的に有意な量であり、約１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、若しくは５０倍又はそれ以上（例えば、１００、５００、１０００倍）（１より大きい全ての整数及びその間の小数点、例えば、１．５、１．６、１．７．１．８等を含む）の本明細書に記載された量又はレベルの減少を含み得る。
【００８０】
用語「刺激」は、刺激分子（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体）とその同族リガンドとの結合、その結果のＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介したシグナル伝達等のシグナル伝達事象の媒介によって誘導される一次応答を意味する。刺激は、ＴＧＦ−βの下方制御及び／又は細胞骨格構造の再編成等の、特定の分子の発現変化を媒介することができる。
【００８１】
「刺激分子」は、抗原提示細胞に存在する同族刺激リガンドと特異的に結合するＴ細胞上の分子を指す。
【００８２】
「刺激リガンド」とは、抗原提示細胞（例えば、ＡＰＣ、樹状細胞、Ｂ細胞等）に存在する場合、Ｔ細胞の同族結合パートナー（本明細書において、「刺激分子」とも称される）と特異的に結合し、それによって活性化、免疫応答の開始、増殖等を含むＴ細胞による一次応答を媒介することができる。刺激リガンドは当該分野において周知であり、とりわけ、ペプチドが負荷されたＭＨＣクラスＩ分子、抗ＣＤ３抗体、スーパーアゴニスト抗ＣＤ２８抗体、及びスーパーアゴニスト抗ＣＤ２抗体を包含する。
【００８３】
本明細書において使用する場合、「実質的に精製された」細胞は、他の細胞型を本質的に含まない細胞である。実質的に精製された細胞はまた、天然に存在する状態で通常会合している他の細胞型から分離された細胞を指す。場合によっては、実質的に精製された細胞の集団は、均質な細胞集団を指す。他の例では、この用語は、それらが天然状態で自然に会合している細胞から分離された細胞を単に指す。いくつかの実施形態において、細胞はインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で培養される。他の実施形態において、細胞はインビトロで培養されない。
【００８４】
本明細書で使用する「治療用」という用語は、治療及び／又は予防を意味する。治療効果は、疾患状態の抑制、寛解、又は根絶によって得られる。
【００８５】
「治療有効量」という用語は、研究者、獣医、医師、又は他の臨床医が求める組織、系、又は対象の生物学的又は医学的応答を誘発する対象化合物の量を指す。「治療有効量」という用語は、投与されると、治療される障害又は疾患の１又は複数の徴候又は症状の発症を予防するか、或いはある程度緩和するのに十分な化合物の量を含む。治療有効量は、化合物、疾患、及びその重症度並びに治療される対象の年齢、体重等に応じて変化する。
【００８６】
本明細書において使用する、疾患を「治療する」という用語は、対象が経験する疾患又は障害の少なくとも１つの徴候又は症状の頻度又は重症度を低減させることを意味する。
【００８７】
本明細書において使用する「トランスフェクトされた」、「形質転換された」、又は「形質導入された」という用語は、外因性核酸が宿主細胞に移入又は導入されるプロセスを指す。「トランスフェクトされた」、「形質転換された」、又は「形質導入された」細胞は、外因性核酸によりトランスフェクト、形質転換又は形質導入された細胞である。細胞は、初代対象細胞及びその子孫を含む。
【００８８】
本明細書において使用する「転写制御下」又は「動作可能に連結された」の語句は、プロモータがＲＮＡポリメラーゼによる転写及びポリヌクレオチドの発現の開始を制御する
ポリヌクレオチドに関して正しい位置及び配向にあることを意味する。
【００８９】
「ベクター」は、単離核酸を含み、単離核酸を細胞の内部に送達するために使用できる組成物である。線形ポリヌクレオチド、イオン性又は両親媒性化合物に関連するポリヌクレオチド、プラスミド、及びウイルスを含む多くのベクターが当該分野において公知である。従って、用語「ベクター」は、自律的に複製するプラスミド又はウイルスを含む。この用語はまた、細胞への核酸の移入を容易にする非プラスミド及び非ウイルス化合物、例えばポリリジン化合物、リポソーム等を含むと解釈されるべきである。ウイルスベクターの例としては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター等が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、レンチウイルスは複雑なレトロウイルスであり、一般的なレトロウイルス遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖに加えて、調節機能又は構造機能を有する他の遺伝子を含む。レンチウイルスベクターは当該分野において周知である。レンチウイルスのいくつかの例には、ヒト免疫不全ウイルス：ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、及びシミアン免疫不全ウイルス：ＳＩＶが含まれる。レンチウイルスベクターは、ＨＩＶ毒性遺伝子を多重に弱毒化することによって生成されており、例えば遺伝子ｅｎｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、及びｎｅｆが欠失しており、ベクターを生物学的に安全にしている。
【００９０】
範囲：本開示を通じて、この開示のさまざまな態様を範囲形式で提示することができる。範囲の形式での記述は、単に便宜上及び簡潔さのためのものであり、本開示の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈されるべきではないことを理解されたい。従って、範囲の記載は、その範囲内の全ての可能な部分範囲及び個々の数値を具体的に開示したものとみなされるべきである。例えば、１〜６のような範囲の記載は、具体的に開示した部分範囲、例えば、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６など、ならびにその範囲内の個々の数字、例えば１、２、２．７、３、４、５、５．３、及び６を有するとみなすべきである。このことは、範囲の幅に関係なく適用される。
【００９１】
本開示は、単離核酸配列、該単離核酸配列を含むベクター、該単離核酸配列を含む細胞及びこれらの細胞を用いて癌を治療する方法に関する。
【００９２】
組成物及び治療適用
本明細書の実施形態は、改変プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）をコードする核酸配列及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を含む単離核酸配列に関する。いくつかの実施形態において、改変ＰＤ−１及びＣＡＲは、別個のポリペプチドである遺伝子産物として発現される。これらの例において、ＣＡＲは、ＰＤ−Ｌ１を発現する癌細胞上に存在する腫瘍抗原に特異的である。
【００９３】
ＣＡＲは、一般に、細胞外及び細胞内ドメインを含む分子である。細胞外ドメインは、標的特異的結合要素を含む。細胞内ドメイン（例えば、細胞質ドメイン）は、共刺激シグナル伝達領域及びゼータ鎖部分を含む。共刺激シグナル伝達領域は、共刺激分子の細胞内ドメインを含むＣＡＲの一部を指す。共刺激分子は、抗原に対するリンパ球の効率的な応答に必要とされる抗原受容体又はそのリガンド以外の細胞表面分子である。
【００９４】
ＣＡＲの細胞外ドメインと膜貫通ドメインとの間にスペーサードメインが組み込まれていてもよい。本明細書において使用する場合、用語「スペーサードメイン」は、一般に、膜貫通ドメインを、ポリペプチド鎖中の細胞外ドメイン又は細胞質ドメインのいずれかに連結するように機能する任意のオリゴペプチド又はポリペプチドを意味する。スペーサードメインは、３００アミノ酸まで、好ましくは１０〜１００アミノ酸、最も好ましくは２５〜５０アミノ酸を含むことができる。
【００９５】
いくつかの実施形態において、本開示のＣＡＲの標的特異的結合要素は、腫瘍抗原を認識することができる。腫瘍抗原は、免疫応答、特にＴ細胞媒介免疫応答を誘発する、腫瘍細胞によって産生されるタンパク質である。腫瘍抗原は当該分野において周知であり、例えば、神経膠腫関連抗原、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、β−ヒト絨毛性ゴナドトロピン、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン反応性ＡＦＰ、チログロブリン、ＲＡＧＥ−１、ＭＮ−ＣＡ−ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸管カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、Ｍ−ＣＳＦ、プロスターゼ（ｐｒｏｓｔａｓｅ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−１ａ、ｐ５３、プロステイン（ｐｒｏｓｔｅｉｎ）、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、サバイビン及びテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原−１（ＰＣＴＡ−１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インスリン成長因子（ＩＧＦ）−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＧＦ−Ｉ受容体、並びにメソセリンが挙げられる。
【００９６】
いくつかの実施形態において、腫瘍抗原としては、ＨＥＲ２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、カッパ又は軽鎖、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ３８、ＲＯＲ１、ＥｒｂＢ３／４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐｈＡ２、ＦＡＰ、癌胎児性抗原、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、メソテリン、ＴＡＧ７２、ＰＳＭＡ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、Ｂ７−Ｈ６、ＩＬ−１３受容体α２、ＩＬ−１１受容体α、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＣＡ９、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＣＤ１７１、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、Ｇ２５０／ＣＡＩＸ、ＨＬＡ−ＡＩ  ＭＡＧＥ  Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２  ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＣ１、葉酸受容体−α、ＣＤ４４ｖ７／８、８Ｈ９、ＮＣＡＭ、ＶＥＧＦ受容体、５Ｔ４、Ｆｅｔａｌ  ＡｃｈＲ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＣＤ４４ｖ６、ＴＥＭ１、ＴＥＭ８、又は腫瘍により発現されるウイルス関連抗原が挙げられる。
【００９７】
いくつかの実施形態において、本開示のＣＡＲの抗原結合要素は、ＣＤ１９を標的とする。場合によっては、本開示のＣＡＲの抗原結合要素は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ１９  ｓｃＦＶを含む。
【００９８】
いくつかの実施形態において、本開示のＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ８及びＣＤ９膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態において、本開示のＣＡＲの細胞内ドメインは、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）又はＣＤ２８の細胞内ドメインを含む。ＣＤ２８ファミリーのメンバーであるＰＤ−１は、単一の免疫グロブリン（Ｉｇ）様可変ドメインを含む細胞外ドメイン及び免疫受容体チロシン依存性抑制モチーフを含む細胞内ドメインを有する１型膜貫通タンパク質である。ＰＤ−１は、活性化Ｔ細胞、Ｂリンパ球、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞、及び活性化単球において発現される。ＰＤ−１と、そのリガンドＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２との間の相互作用は、Ｔ細胞の枯渇、不活性化、及びアポトーシスをもたらす。
【００９９】
枯渇したＴリンパ球は、ＩＬ−２、腫瘍壊死因子−α、及びインターフェロンγを含む前炎症性サイトカインを産生する能力を失う。多様な組織によるＰＤ−Ｌ１の発現は、末梢免疫寛容を媒介し、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１軸の活性化は、免疫／炎症応答の持続後の組織損傷を制限する。ＰＤ−１発現腫瘍浸潤リンパ球は、抗腫瘍効果の障害及びＰＤ−１の上方制御と関連しており、ＰＤ−Ｌ１は、いくつかの腫瘍型の転帰と関連している。
【０１００】
実施形態は、改変ＰＤ−１をコードする核酸配列及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を含む単離核酸配列に関する。いくつかの実施形態において、改変ＰＤ−１をコードする核酸配列は、ワイド型ＰＤ−１の細胞内部分をコードする核酸配列と比較して、１又は複数のヌクレオチドの置換又は欠失を含むことができる。特定の実施形態において、改変ＰＤ−１をコードする核酸配列は、ワイド型ＰＤ−１の細胞内部分をコードする核酸配列と比較して、１又は複数のヌクレオチドの欠失を含むことができる。例え
ば、改変ＰＤ−１は、配列番号１４の核酸配列を含むヒトＰＤ−１である。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、改変ＰＤ−１をコードする核酸配列は、細胞内ドメインを含まない切断型ＰＤ−１をコードする核酸を含む。例えば、改変ＰＤ−１をコードする核酸配列は、配列番号１２の核酸配列を含む。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、改変ＰＤ−１は、ワイド型ＰＤ−１と比較して１又は複数の点突然変異を含む。特定の実施形態において、点突然変異は、ワイド型ＰＤ−１のリン酸化部位の１つ又は２つのアミノ酸点突然変異を含むことができる。例えば、このアミノ酸点突然変異は、チロシン残基２２３及び／又はチロシン残基２４８の点突然変異を含む。
【０１０３】
本開示の実施形態は更に、ＣＡＲ及び改変ＰＤ−１をコードする配列を含むＤＮＡ構築物に関する。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ３−ゼータ、ＣＤ２８、４−１ＢＢ等の任意の組み合わせを含むことができる。例えば、本開示のＣＡＲは、抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ、ヒトＣＤ８ヒンジ、及び膜貫通ドメイン、並びにヒト４−１ＢＢ及びＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む。一実施形態において、本開示のＣＡＲは、配列番号１に記載の核酸配列を含む。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）要素を用いて、多重遺伝子、又はポリシストロニック又はメッセージを作製する。例えば、ＩＲＥＳ要素は、ＣＡＲをコードする核酸配列と、様々な改変ＰＤ−１の１つをコードする核酸配列とを連結することができる（表１を参照）。
【０１０５】
所望の分子をコードする核酸配列は、当該分野において公知の組換え方法、例えば遺伝子を発現する細胞由来のスクリーニングライブラリにより、遺伝子含むことが知られているベクターからの遺伝子の誘導、標準的な技術を使用して、遺伝子を含有する細胞及び組織からの直接単離により得ることができる。あるいは、目的の遺伝子をクローン化するのではなく、合成的に作製することができる。
【０１０６】
本開示の実施形態は更に、本開示のＤＮＡが挿入されたベクターに関する。レンチウイルス等のレトロウイルス由来のベクターは、導入遺伝子の長期間の安定した組込み及び娘細胞へのその伝播を可能にするので、長期遺伝子移入を達成するのに適したツールである。レンチウイルスベクターは、肝細胞等の非増殖細胞を形質導入できるという点で、マウス白血病ウイルスのようなオンコレトロウイルス由来ベクターを上回る付加的利点を有する。レンチウイルスベクターは更に、免疫原性が低いという付加的利点を有する。
【０１０７】
ＣＡＲ及び改変ＰＤ−１をコードする天然又は合成の核酸の発現は、典型的には、ＣＡＲポリペプチド又はその一部をコードする核酸を１又は複数のプロモータに動作可能に連結し、その構築物を発現ベクターに組み込むことによって達成される。このベクターは、真核生物の複製及び真核生物への組込みに適していると思われる。典型的なクローニングベクターは、転写及び翻訳ターミネータ、開始配列、及び所望の核酸配列の発現の調節に有用なプロモータを含む。
【０１０８】
ＣＡＲ及び改変ＰＤ−１をコードする合成核酸の発現及び哺乳動物細胞への遺伝子移入に関連する更なる情報は、その全体が参照により組み込まれる米国特許第８，９０６，６８２号明細書に提供されている。
【０１０９】
実施形態は更に、ＣＡＲ及び改変ＰＤ−１を発現する遺伝子改変細胞（例えば、Ｔ細胞）に関する。いくつかの実施形態において、ドミナントネガティブＰＤ−１は、腫瘍細胞
のＰＤ−Ｌ１によって誘導されるワイド型ＰＤ−１活性を阻害するようにＴ細胞に導入される。特定の実施形態において、遺伝子改変Ｔ細胞は非機能性ＰＤ−１を発現する。例えば、遺伝子改変Ｔ細胞は、細胞内ドメインを含まない、細胞内ドメイン及び膜貫通ドメインの両方を含まない、又は本開示に記載の点突然変異を含むＰＤ−１分子を発現する。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、本開示の遺伝子改変Ｔ細胞のサイトカイン産生に対するＰＤ−Ｌ１の阻害効果は、改変ＰＤ−１をコードする核酸配列の少なくとも一部を含まないＴ細胞のサイトカイン産生に対するＰＤ−Ｌ１の阻害効果より有意に低い。例えば、本開示の遺伝子改変Ｔ細胞のサイトカイン産生に対するＰＤ−Ｌ１の阻害効果は、改変ＰＤ−１をコードする核酸配列の少なくとも一部を含まないＴ細胞のサイトカイン産生に対するＰＤ−Ｌ１の阻害効果の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％減少させるために十分である。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、遺伝子改変Ｔ細胞は、ワイド型ＰＤ−１と比較して１又は複数の点突然変異を有する改変ＰＤ−１をコードする核酸配列を含む。例えば、点突然変異は、ワイド型ＰＤ−１のリン酸化部位の１つ又は２つのアミノ酸点突然変異を含む。特定の実施形態において、遺伝子改変Ｔ細胞は、改変ＰＤ−１をコードする核酸配列を含み、ワイド型ＰＤ−１の細胞内部分をコードする核酸配列と比較して、１又は複数のヌクレオチドの欠失を含む。例えば、改変ＰＤ−１をコードする核酸配列は、配列番号１２又は配列番号１４の核酸配列を含む。
【０１１２】
本実施形態は更に、本開示の操作された細胞の有効量を患者に投与するステップを含む、病気の患者を治療するための方法に関する。卵巣癌、乳癌、結腸癌、多形性神経膠芽腫、前立腺癌、及び白血病等の癌を含む様々な病気を、本方法に従って治療することができる。いくつかの実施形態において、この方法は、本開示に記載の核酸配列を含むヒトＴ細胞を含む、ヒトＴ細胞集団の抗腫瘍有効量を含む医薬組成物を、ヒト患者に投与するステップを含む。
【０１１３】
治療可能な癌としては、血管新生されていないか、又は未だ実質的に血管新生されていない腫瘍、並びに血管新生腫瘍が挙げられる。癌は、非固形腫瘍（例えば、血液学的腫瘍、例えば、白血病及びリンパ腫）又は固形腫瘍を含み得る。本開示のＣＡＲで治療される癌のタイプには、癌腫、芽腫及び肉腫並びに特定の白血病又はリンパ性悪性腫瘍、良性及び悪性腫瘍並びに肉腫、癌腫及び黒色腫等の悪性腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。成人の腫瘍／癌及び小児の腫瘍／癌も含まれる。
【０１１４】
血液学的癌は、血液又は骨髄の癌である。血液学的（又は造血性）癌の例には、急性白血病（急性リンパ球性白血病、急性骨髄球性白血病、急性骨肉腫性白血病及び骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病及び赤血白血病等）、慢性白血病（慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病、慢性骨肉腫性白血病及び慢性リンパ球性白血病等）、真性赤血球増加症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（無痛性及び高悪性度の形態）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病、骨髄異形成症候群、有毛細胞白血病、及び骨髄形成異常症が含まれる。
【０１１５】
固形腫瘍は、通常は嚢胞又は液体領域を含まない、組織の異常な腫瘤である。固形腫瘍は良性又は悪性であり得る。異なるタイプの固形腫瘍は、それらを形成する細胞のタイプに関して命名される（肉腫、癌腫及びリンパ腫など）。肉腫及び癌腫等の固形腫瘍の例には、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫及び他の肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、リンパ様悪性腫瘍、膵臓癌、乳癌、
肺癌、卵巣癌、前立腺癌、肝細胞癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髄様癌、甲状腺乳頭癌、褐色細胞腫、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭状腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、ヘパトーマ、胆管癌、絨毛癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、セミノーマ、膀胱癌、黒色腫、及びＣＮＳ腫瘍（例えば、神経膠腫（脳幹神経膠腫及び混合神経膠腫など）、神経膠芽腫（多形性神経膠芽腫としても知られている）、星状細胞腫、ＣＮＳリンパ腫、胚細胞腫、髄芽細胞腫、シュワン細胞腫、頭蓋咽頭腫（ｃｒａｎｉｏｐｈａｒｙｏｇｉｏｍａ）、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫瘍、乏突起神経膠腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫及び脳転移）を含むが、これらに限定されない。
【０１１６】
概して、本明細書に記載のように活性化され増殖された細胞は、免疫無防備状態の個体において生じる疾患の治療及び予防に利用することができる。特に、本開示の操作された細胞は、癌の治療に使用される。特定の実施形態において、本開示の細胞は、癌を発症するリスクのある患者の治療に使用される。従って、本開示は、癌を治療又は予防するための方法であって、本開示の操作されたＴ細胞の治療有効量を、それを必要とする対象に投与するステップを含む。
【０１１７】
本開示の操作されたＴ細胞は、単独で、又は希釈剤及び／若しくはＩＬ−２若しくは他のサイトカイン若しくは細胞集団等の他の成分と組み合わせて医薬組成物として投与することができる。簡潔には、本開示の医薬組成物は、本明細書に記載の標的細胞集団を、１又は複数の医薬的又は生理学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤と組み合わせて含むことができる。このような組成物は、中性緩衝化生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水等の緩衝液；グルコース、マンノース、スクロース又はデキストランのような炭水化物、マンニトール；タンパク質；ポリペプチド又はグリシン等のアミノ酸；酸化防止剤；ＥＤＴＡ又はグルタチオン等のキレート剤；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；並びに防腐剤を含むことができる。本開示の組成物は、好ましくは、静脈内投与のために製剤化される。
【０１１８】
本開示の医薬組成物は、治療される（又は予防される）疾患に適切な様式で投与することができる。投与の量及び頻度は、患者の状態、患者の疾患のタイプ及び重症度等の因子によって決定され、臨床試験によって適切な用量を決定することができる。
【０１１９】
「免疫学的有効量」、「抗腫瘍有効量」、「腫瘍阻害有効量」、又は「治療量」が示される場合、投与される本開示の組成物の正確な量は、患者（対象）の年齢、体重、腫瘍の大きさ、感染又は転移の程度及び状態の個人差を考慮して、医師によって決定される。本明細書に記載のＴ細胞を含む医薬組成物は、概して１０４〜１０９細胞／ｋｇ体重、好ましくは１０５〜１０６細胞／ｋｇ体重の投与量で投与することができ、これらの範囲内の全ての整数値を含むということができる。Ｔ細胞組成物は、これらの投薬量で複数回投与することもできる。細胞は、免疫療法において一般に知られている注入技術を用いて投与することができる（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．、Ｍｅｄ．３１９：１６７６、１９８８年を参照）。特定の患者に対する最適な投薬量及び治療計画は、疾患の徴候について患者をモニターし、それに応じて治療を調整することによって、医学分野の当業者によって容易に決定され得る。
【０１２０】
特定の実施形態において、活性化Ｔ細胞を対象に投与し、続いて再度採血し（又はアフェレーシスを行い）、そこから本開示に従ってＴ細胞を活性化し、これらの活性化及び増殖Ｔ細胞をその患者に再注入することが望ましいと思われる。このプロセスは数週間ごとに複数回行うことができる。特定の実施形態において、Ｔ細胞は、１０ｃｃ〜４００ｃｃの採取血液から活性化することができる。特定の実施形態において、Ｔ細胞は、２０ｃｃ、３０ｃｃ、４０ｃｃ、５０ｃｃ、６０ｃｃ、７０ｃｃ、８０ｃｃ、９０ｃｃ、又は１０
０ｃｃの採取血液から活性化される。理論に束縛されるものではないが、この複数の血液採取／複数の再注入プロトコルを使用して、Ｔ細胞の特定の集団を選択することができる。
【０１２１】
対象組成物の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、注入、インプランテーション、又はトランスプランテーションを含む任意の好都合な様式で行うことができる。本明細書に記載の組成物は、患者に皮下、皮内、腫瘍内、髄腔内、髄内、筋肉内、静脈内（ｉ．ｖ．）注射によって、又は腹腔内投与することができる。一実施形態において、本開示のＴ細胞組成物は、皮内又は皮下注射によって患者に投与される。別の実施形態において、本開示のＴ細胞組成物は、好ましくはｉ．ｖ．注射によって投与される。Ｔ細胞組成物は、腫瘍、リンパ節、又は感染部位に直接注射することができる。
【０１２２】
本開示の特定の実施形態において、本明細書に記載の方法、又はＴ細胞を治療レベルに増殖させる当該分野で公知の他の方法を用いて活性化及び増殖させた細胞は、限定するものではないが、抗ウイルス療法、シドフォビル及びインターロイキン−２、シタラビン（ＡＲＡ−Ｃとしても知られている）等の薬剤による治療、又はＭＳ患者のためのナタリズマブ治療若しくは乾癬患者のためのエファリズマブ治療若しくはＰＭＬ患者のための他の治療を含む、任意の数の関連する治療様式と（例えば、その前、同時又は後に）併せて患者に投与される。更なる実施形態において、本開示のＴ細胞は、化学療法、放射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキセート、ミコフェノレート、及びＦＫ５０６等の免疫抑制剤（ｉｒｒｉｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）、抗体、又はＣＡＭ  ＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体若しくは他の抗体療法等の他の免疫除去剤（ｉｍｍｕｎｏａｂｌａｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）、シトキシン（ｃｙｔｏｘｉｎ）、フルダリビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカイン、及び照射と組み合わせて使用することができる。これらの薬物は、カルシウム依存性ホスファターゼカルシニューリンのいずれかを阻害するか（シクロスポリン及びＦＫ５０６）、又は成長因子誘発シグナル伝達に重要なｐ７０Ｓ６キナーゼを阻害する（ラパマイシン）。（Ｌｉｕら、Ｃｅｌｌ  ６６：８０７−８１５頁、１９９１年；  Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら、Ｉｍｍｕｎ  ７３：３１６−３２１頁、１９９１年；  Ｂｉｅｒｅｒら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎ  ５：７６３−７７３頁、１９９３年；  Ｉｓｏｎｉｅｍｉ（上記））。更なる実施形態において、本開示の細胞組成物は、骨髄移植、フルダラビン等の化学療法剤、体外照射療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミド、又はＯＫＴ３又はＣＡＭＰＡＴＨ等の抗体を用いたＴ細胞除去療法と（例えば、その前、同時又は後に）併せて患者に投与される。別の実施形態において、本開示の細胞組成物は、Ｂ細胞除去療法、例えばＣＤ２０と反応する薬剤、例えばリツキサンの後に投与される。例えば、一実施形態において、対象は、高用量の化学療法及びその後の末梢血幹細胞移植による標準的な治療を受けることができる。特定の実施形態において、移植に続いて、対象は、本開示の増殖された免疫細胞の注入を受ける。更なる実施形態において、増殖された細胞は外科手術の前又は後に投与される。
【０１２３】
患者に投与される上記治療の投与量は、治療される状態及び治療のレシピエントの正確な性質によって変化する。ヒト投与のための投薬量のスケーリングは、当業界で受け入れられている方法に従って行うことができる。ＣＡＭＰＡＴＨの用量は、例えば、成人患者の場合、概して１〜約１００ｍｇの範囲であり、通常は１日〜３０日の間、毎日投与される。好ましい一日用量は１〜１０ｍｇ／日であるが、場合によっては４０ｍｇ／日までのより大きな用量を使用することもできる（米国特許第６，１２０，７６６号明細書に記載されており、当該特許はその全体が参照により組み込まれる）。
【０１２４】
操作されたＴ細胞を用いた癌治療の方法に関する更なる情報は、米国特許第８，９０６，６８２号明細書に記載されており、当該特許はその全体が参照により組み込まれる。
【０１２５】
実施形態は更に、対象の癌を治療及び／又は阻害する方法に関する。該方法は、ＰＤ−１の細胞外ドメインを含む治療有効量の可溶性受容体を対象に投与するステップを含む。いくつかの実施形態において、可溶性受容体はＰＤ−Ｌ１タンパク質に結合し、癌細胞のＰＤ−１シグナル伝達を破壊、及び／又はＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１への結合を破壊する。特定の実施形態において、単離可溶性受容体ポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸残基２０〜５１９を含む。
【０１２６】
「可溶性受容体」は、細胞膜に結合しない受容体ポリペプチドである。可溶性受容体は、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを欠く最も一般的なリガンド結合受容体ポリペプチドである。可溶性受容体は、ポリペプチドの精製を提供する、若しくは基質へのポリペプチドの結合のための部位を提供する親和性タグ、又は免疫グロブリン定常領域配列等の更なるアミノ酸残基を含むことができる。多くの細胞表面受容体は、タンパク質分解によって生成される、天然に存在する可溶性対応物を有する。可溶性受容体ポリペプチドが、膜アンカリング又はシグナル伝達を提供するための、それぞれ膜貫通及び細胞内ポリペプチドセグメントの十分な部分を欠いている場合、可溶性受容体ポリペプチドはこれらのセグメントを実質的に含まないと言われる。
【０１２７】
実施形態は更に、細胞質ドメインが切断された受容体ポリペプチドを含み、該受容体ポリペプチドは、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）受容体ポリペプチド、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）受容体ポリペプチド、又はＢ−及びＴ−リンパ球アテニュエータ（ＢＴＬＡ）受容体の少なくとも１つである、改変細胞に関する。
【０１２８】
実施形態は更に、疾患を有する対象を治療するための方法に関する。この方法は、疾患を有する対象に細胞を投与するステップを含み、該細胞は、細胞質ドメインが切断された受容体ポリペプチドであって、該受容体ポリペプチドは、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）受容体ポリペプチド、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）受容体ポリペプチド、又はＢ−及びＴ−リンパ球アテニュエータ（ＢＴＬＡ）受容体の少なくとも１つである；並びに、抗原に結合する特異的抗体の抗原認識ドメイン及び細胞内ドメイン又は改変型若しくはワイド型のＴ細胞受容体を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子改変された細胞である。
【０１２９】
いくつかの実施形態において、受容体ポリペプチドはＰＤ−１受容体ポリペプチドであり、ＰＤ−１受容体ポリペプチドの細胞質ドメインは免疫受容体チロシン依存性モチーフを含む。
【０１３０】
実施形態は更に、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）、細胞障害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）、又はＢ−及びＴ−リンパ球アテニュエータ（ＢＴＬＡ）の少なくとも１つを含む１又は複数の受容体を、対応する野生型細胞と比較して減少した量で含む改変細胞に関する。
【０１３１】
実施形態は更に、疾患を有する対象を治療するための方法に関する。本方法は、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）、細胞障害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）、又はＢ−及びＴ−リンパ球アテニュエータ（ＢＴＬＡ）の少なくとも１つを含む１又は複数の受容体を、対応する野生型細胞と比較して減少した量で発現するように改変された細胞を、疾患を有する対象に投与するステップを含む。
【０１３２】
いくつかの実施形態において、改変細胞は、特異的抗体の抗原認識ドメイン及び細胞内ドメイン、又は改変型若しくはワイド型Ｔ細胞受容体を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
を更に含む。特定の実施形態において、改変細胞は、抗原に結合する特異的抗体の抗原認識ドメイン及び細胞内ドメイン、又は改変型若しくはワイド型Ｔ細胞受容体を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を更に含む。
【０１３３】
いくつかの実施形態において、改変細胞は、対応する野生型細胞と比較して、１又は複数の受容体の生合成経路若しくは輸送経路又はそれらの組み合わせに関連する１又は複数の遺伝子の発現が減少する。特定の実施形態において、改変細胞は、１又は複数の遺伝子の破壊を含む。特定の実施形態において、改変細胞は、１又は複数の遺伝子の部分的又は競合的欠失を含む。特定の実施形態において、遺伝子改変細胞は、ヒト患者においてインビボで複製する。
【０１３４】
いくつかの実施形態において、改変細胞は、ヒト患者において記憶細胞を形成する。これらの場合、改変細胞は、ヒト患者に静脈内投与される。特定の実施形態において、改変細胞はヒト患者において存続される。例えば、改変細胞は自己Ｔ細胞である。別の例では、この細胞は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、胚細胞、又は樹状細胞の少なくとも１つを含み得る。
【０１３５】
いくつかの実施形態において、疾患は、癌、免疫不全、自己免疫疾患、又は肥満の少なくとも１つを含み得る。
【実施例】
【０１３６】
本開示を、以下の実施例を参照することによってさらに記載する。これらの実施例は、例示のみを目的として提供しており、特記しない限り、限定することを意図するものではない。従って、本開示は、以下の実施例に限定されるものと決して解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書で提供される教示の結果として明らかになる全ての変形を包含すると解釈されるべきである。
【０１３７】
実施例１；ＨＥＫ２９３Ｔ及びＫ５６２細胞におけるＣＡＲ及びＰＤ−１の発現
脳心筋炎ウイルスのリボソーム内進入配列によって分離されたＣＤ１９  ＣＡＲ及び改変ＰＤ−１をコードするレンチウイルスベクターを作製した（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ＣＤ１３７  Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｄｏｍａｉｎｓ  Ｍｅｄｉａｔｅ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ
Ｔ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  Ａｎｔｉｌｅｕｋｅｍｉｃ  Ｅｆｆｉｃａｃｙ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｖｏｌ．１７  ｎｏ．８，  １４５３-１４６４頁２００９年８月を参照されたい、当文献は参照により本明
細書に組み込まれる）。ＣＡＲ及び改変ＰＤ−１をコードするＤＮＡ構築物の情報を、図１及び表１に提供する。これらの構築物とモジュールの概要を表１−３に列挙する。
【０１３８】
【表１】
2018064568.tif 000002
【０１３９】
ＨＥＫ２９３Ｔ及びＫ５６２細胞に、レンチウイルスベクターを用いて形質導入した。フローサイトメトリによる収集を行い、分析して、これらの細胞におけるＣＡＲ及びＰＤ−１の発現を決定した。図２Ａ及び２Ｂに示すように、ＫＥＣＫ２９３Ｔ及びＫ５６２細胞の両方が、ＣＡＲ（図２Ａのボックスを参照）及びＰＤ−１を発現した（図２Ｂのボックスを参照）。
【０１４０】
ＨＥＫ２９３Ｔ及びＫ５６２細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手した。細胞培養、レンチウイルスベクターの構築及びフローサイトメトリに関する技術は、本明細書に参照により組み込まれるＣｈｉｍｅｒｉｃ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ＣＤ１３７  Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｄｏｍａｉｎｓ  Ｍｅｄｉａｔｅ
Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  Ａｎｔｉｌｅｕｋｅｍｉｃ  Ｅｆｆｉｃａｃｙ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｖｏｌ．１７  ｎｏ．８，１４５３−１４６４頁２００９年８月に見出すことができ、当文献は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１４１】
【表２】
2018064568.tif 000003
【０１４２】
実施例２；初代Ｔ細胞におけるＣＡＲ及びＰＤ−１の発現
初代Ｔ細胞は患者から得た。得られた初代Ｔ細胞に、レンチウイルスベクターを用いて形質導入した。フローサイトメトリによる収集を行い、分析して、初代Ｔ細胞におけるＣＡＲ及びＰＤ−１の発現を決定した。図３Ａ、３Ｂ、及び３Ｃに示すように、初代Ｔ細胞はＣＡＲ（図３Ａのボックス参照）及びＰＤ−１を発現した（図３Ｂ及び３Ｃのボックス参照）。
【０１４３】
細胞培養、レンチウイルスベクターの構築、及びフローサイトメトリに関連する技術は、Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｌａｒｇｅ，  ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ  ｔｕｍｏｒ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ  ｗｉｔｈ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｒｅｔａｒｇｅｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ＣＤ２８  ａｎｄ  ＣＤ１３７  ｄｏｍａｉｎｓ．３３６０−３３６５頁、ＰＮＡＳ  ２００９年３月、ｖｏｌ．１０６  ｎｏ．９に見出すことができ、当該文献は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１４４】
【表３】
2018064568.tif 000004
2018064568.tif 000005
2018064568.tif 000006
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【０１４５】
実施例３；細胞傷害性Ｔリンパ球アッセイ
このアッセイでは、標的細胞（即ち、Ｋ５６２‐ＣＤ１９）に対する細胞障害性を、エフェクター細胞（即ち、形質導入されたＴ細胞）と共に培養した標的細胞の生存と、陰性対照細胞（非形質導入Ｔ細胞）と共に培養した標的細胞の生存とを比較することによって測定した。標的細胞と、エフェクター細胞又は陰性対照細胞とを、標的細胞とエフェクター細胞又は陰性対照細胞との間の数比が約１０：１で約２４時間培養した。標的細胞の生存率及び形質導入Ｔ細胞と非形質導入Ｔ細胞とのＩＦＮ−ガンマ産生を測定した。図４Ａ及び４Ｂに示すように、ＣＡＲ及び様々なＰＤ−１をコードする核酸配列を含む形質導入Ｔ細胞は、ＩＦＮ−γを放出し、ＣＤ１９細胞を死滅させることができる。全てのエラーバーは標準偏差を表す。
【０１４６】
細胞培養、細胞傷害性Ｔリンパ球アッセイの構築に関連する技術は、Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｌａｒｇｅ，  ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ  ｔｕｍｏｒ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ  ｗｉｔｈ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｒｅｔａｒｇｅｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ
ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ＣＤ２８  ａｎｄ  ＣＤ１３７  ｄｏｍａｉｎｓ．３３６０−３３６５頁、ＰＮＡＳ  ２００９年３月、ｖｏｌ．１０６  ｎｏ．９に見出すことができ、当該文献は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１４７】
実施例４；ＰＤ−Ｌ１−ｉｒｅｓ−ＥＧＦＰ  Ｎａｌｍ−６細胞系の構築
ＰＤ−Ｌ１−ｉｒｅｓ−ＥＧＦＰ（配列番号７）をコードするレンチウイルスベクターを作製した。Ｎａｌｍ−６細胞に、レンチウイルスベクターＴ細胞を用いてＭＯＩが３０又はＭＯＩが１００で形質導入した。フローサイトメトリによる収集を行い、分析して、これらの細胞におけるＣＡＲ及びＰＤ−１の発現を決定した。図５に示すように、ＮａｌＭ−６  ＰＤ−Ｌ１はＰＤ−Ｌ１を発現した。
【０１４８】
Ｎａｌｍ−６細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；  Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手した。細胞培養、レンチウイルスベクターの構築、及びフローサイトメトリに関連する技術は、Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ  ｗｉｔｈ  ｍＲＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ．ＨＵＭＡＮ  ＧＥＮＥ  ＴＨＥＲＡＰＹ  ２２：１５７５−１５８６頁（２０１１年１２月）に見出すことができ、当該文献は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１４９】
実施例５；ＰＤ−Ｌ１によって誘導される細胞傷害性の阻害は、ＣＡＲ及び改変ＰＤ−１
を形質導入されたＴ細胞において低下する。
【０１５０】
標的細胞（即ち、ＰＤ−Ｌ１発現ＮａｌＭ−６又はＮａｌＭ−６）及び様々なエフェクター細胞（即ち、形質導入Ｔ細胞）又は陰性対照細胞（即ち、非形質導入Ｔ細胞）を、標的細胞とエフェクター細胞又は陰性対照細胞との間の数比が約１０：１で約２４時間培養した。形質導入Ｔ細胞のＩＦＮ−ガンマ産生を測定した。図６Ａ及び６Ｂに示すように、ＣＡＲ  Ｔ細胞によるＩＦＮ−ガンマ産生が減少し、これはＮａｌＭ−６細胞におけるＰＤ−Ｌ１の発現に応答した細胞傷害性の喪失を示した。更に、改変ＰＤ−１を有さないＣＡＴ  Ｔ細胞と比較して、ＰＤ−Ｌ１によって誘導される細胞傷害性の喪失は、改変ＰＤ−１を形質導入されたＣＡＲ  Ｔ細胞において減少する。例えば、点突然変異を有するＣＡＲ及びＰＤ−１（即ち、Ｐ３）を形質導入されたＴ細胞の細胞傷害性の喪失は約２２％であり、これは改変ＰＤ−１を有さないＣＡＲ  Ｔ細胞（即ちＰ０）の４３％より低い。これは、ＰＤ−Ｌ１によって誘導される細胞傷害性の阻害が、ＣＡＲ及び改変ＰＤ−１を形質導入されたＴ細胞において減少することを示す。全てのエラーバーは標準偏差を表す。
【０１５１】
細胞培養、細胞障害性Ｔリンパ球細胞アッセイの構築に関する技術は、Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ＣＤ１３７  Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｄｏｍａｉｎｓ  Ｍｅｄｉａｔｅ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  Ａｎｔｉｌｅｕｋｅｍｉｃ
Ｅｆｆｉｃａｃｙ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｖｏｌ．１７  ｎｏ．８，１４５３−１４６４頁，２００９年８月に見出すことができ、当文献は参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
2018064568.tif 000009
【図２Ａ】
2018064568.tif 000010
【図２Ｂ】
2018064568.tif 000011
【図３Ａ】
2018064568.tif 000012
【図３Ｂ】
2018064568.tif 000013
【図３Ｃ】
2018064568.tif 000014
【図４Ａ】
2018064568.tif 000015
【図４Ｂ】
2018064568.tif 000016
【図５】
2018064568.tif 000017
【図６Ａ】
2018064568.tif 000018
【図６Ｂ】
2018064568.tif 000019
【配列表】
2018064568000001.app
【外国語明細書】
2018064568000001.pdf