(57)【要約】【課題】本発明は、副作用が少なく且つ免疫賦活活性が強い新規多糖類、当該新規多糖類を有効成分とする免疫賦活剤、および、当該新規多糖類の製造方法を提供することを目的とする。【解決手段】本発明に係る多糖類は、構成糖として中性糖を含み、上記中性糖が、少なくとも、ガラクトース、グルコース、ラムノース、マンノースおよびアラビノースであり、全中性糖中、ガラクトースの含有量が４０質量％以上であり且つグルコースの含有量が１５質量％以上であることを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
構成糖として中性糖を含み、
上記中性糖が、少なくとも、ガラクトース、グルコース、ラムノース、マンノースおよびアラビノースであり、
全中性糖中、ガラクトースの含有量が４０質量％以上であり且つグルコースの含有量が１５質量％以上であることを特徴とする多糖類。
【請求項２】
全中性糖に対して、上記ラムノースおよびマンノースの含有量がそれぞれ５質量％以上であり、上記アラビノースの含有量が１質量％以上である請求項１に記載の多糖類。
【請求項３】
請求項１または２に記載の多糖類を有効成分として含むことを特徴とする免疫賦活剤。
【請求項４】
請求項１または２に記載の多糖類を製造する方法であって、
微細藻類およびその培養液の少なくとも一方より熱水抽出する工程、
上記熱水抽出工程で得られた抽出物をイオン交換カラムクロマトグラフィーに付す工程、および、
上記イオン交換カラムクロマトグラフィーで得られたフラクションを免疫賦活試験に付し、免疫賦活活性を有するフラクションを特定する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項５】
上記微細藻類がパラクロレラ属藻類である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
上記パラクロレラ属藻類がパラクロレラ属ケスレリ種藻類である請求項５に記載の方法。    
【請求項７】
上記パラクロレラ属ケスレリ種藻類がＫＮＫ−Ａ００１株（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２２５６）である請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫賦活活性を有する新規多糖類、当該新規多糖類を有効成分とする免疫賦活剤、および、当該新規多糖類の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
生体にとって免疫機構は極めて重要であるといえる。例えば最近、健康なヒトでも１日あたり約５０００個の細胞ががん化していることが明らかにされているが、免疫力やアポトーシスなどによりその拡大は抑制されている。しかし何らかの原因により免疫力が低下すると、がんが進行することになる。
【０００３】
免疫賦活活性を有する化合物としては、βグルカン、ペプチドグリカン、リポ多糖、フコイダン等の硫酸化多糖など、様々な多糖類が知られている（特許文献１〜４）。これらの内、その免疫賦活活性が特に強いとされているものはリポ多糖である。
【０００４】
しかしリポ多糖はグラム陰性菌細胞壁の外膜構成成分であり、内毒素あるいはパイロジェンとも呼ばれ、直接血中に取り込まれると発熱や敗血症などの致死性ショック症状を起こす場合もあり、免疫賦活剤としての生体への適用においては強い副作用発現が懸念されている。そのため、リポ多糖の無毒化が検討されたり（特許文献５，６）、或いは免疫賦活剤を選択するに当たり、免疫賦活効果はリポ多糖より劣るものの副作用が少ないβグルカンなどが選択されるなど、期待する効果よりもその副作用が一定のレベルに留まるものが優先して用いられているのが実情である。
【０００５】
なお、本発明者らの研究グループは、微細藻類の一種であるパラクロレラ藻類自体に免疫賦活活性があることを見出している（特許文献７，８）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第３４４４６２４号公報
【特許文献２】特開平１１−２５５６６４号公報
【特許文献３】特許第４０４３５３３号公報
【特許文献４】特許第４０３４１４６号公報
【特許文献５】国際公開第２００５／０４７３１３号パンフレット
【特許文献６】特開２０１６−１４５２２４号公報
【特許文献７】特開２０１４−９７９４０号公報
【特許文献８】国際公開第２０１５／８０１９８号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで本発明は、副作用が少なく且つ免疫賦活活性が強い新規多糖類、当該新規多糖類を有効成分とする免疫賦活剤、および、当該新規多糖類の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、非リポ多糖系の多糖類であることから副作用が小さく、且つ既存の低副作用免疫賦活剤であるβグルカンより明らかに優れた免疫賦活活性を有する新規多糖類を微細藻類から精製することに成功し、本発明を完成した。
【０００９】
以下、本発明を示す。
【００１０】
［１］  構成糖として中性糖を含み、
上記中性糖が、少なくとも、ガラクトース、グルコース、ラムノース、マンノースおよびアラビノースであり、
全中性糖中、ガラクトースの含有量が４０質量％以上であり且つグルコースの含有量が１５質量％以上であることを特徴とする多糖類。
【００１１】
［２］  全中性糖に対して、上記ラムノースおよびマンノースの含有量がそれぞれ５質量％以上であり、上記アラビノースの含有量が１質量％以上である上記［１］に記載の多糖類。
【００１２】
［３］  上記［１］または［２］に記載の多糖類を有効成分として含むことを特徴とする免疫賦活剤。
【００１３】
［４］  上記［１］または［２］に記載の多糖類を製造する方法であって、
微細藻類およびその培養液の少なくとも一方より熱水抽出する工程、
上記熱水抽出工程で得られた抽出物をイオン交換カラムクロマトグラフィーに付す工程、および、
上記イオン交換カラムクロマトグラフィーで得られたフラクションを免疫賦活試験に付し、免疫賦活活性を有するフラクションを特定する工程を含むことを特徴とする方法。
【００１４】
［５］  上記微細藻類がパラクロレラ属藻類である上記［４］に記載の方法。
【００１５】
［６］  上記パラクロレラ属藻類がパラクロレラ属ケスレリ種藻類である上記［５］に記載の方法。
【００１６】
［７］  上記パラクロレラ属ケスレリ種藻類がＫＮＫ−Ａ００１株（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２２５６）である上記［６］に記載の方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明に係る新規多糖類はリポ多糖でないことから、発熱などの副作用を示す可能性が極めて低いといえる。また、その免疫賦活活性は、既存の主要な免疫賦活剤であるβグルカンより明らかに強い。さらに本発明に係る新規多糖類は、微細藻類から精製することができる。よって本発明は、もともと副作用が少なく、且つ少量で効果を示すことでより安全な免疫賦活剤をより低コストで提供することを可能にするものであり、医療、水産、畜産などの分野において、産業上非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、パラクロレラ・ケスレリＫＮＫ−Ａ００１株の産生成分を精製した陰イオンカラムクロマトグラフィーのチャートである。
【図２】図２は、パラクロレラ・ケスレリＫＮＫ−Ａ００１株の各産生成分の免疫賦活試験の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明に係る多糖類は、構成糖として中性糖を含む。ここで「多糖類」とは、数個以上の単糖類がグリコシド結合によって脱水縮合した糖類である。多糖類を構成する単糖類の数は、広義には２以上であり、一般的には５以上である。また、「グリコシド結合」とは、糖のヒドロキシ基が他の糖やアルコールのヒドロキシ基と反応して脱水してできる結合である。「中性糖」とは、グルコサミンなどのアミノ糖や、ウロン酸、アルドン酸、シアル酸などの酸性糖のように、塩基性官能基や酸性官能基を有さない糖をいう。
【００２０】
本発明の多糖類を構成している中性糖は、少なくとも、ガラクトース、グルコース、ラムノース、マンノースおよびアラビノースである。全中性糖に対するガラクトースの含有量は４０質量％以上である。当該割合としては５０質量％以下が好ましい。なお、一般的なリポ多糖はガラクトースを主要な構成糖とするものではないため、この点でも本発明の多糖類はリポ多糖ではないといえる。また、全中性糖に対するグルコースの含有量が１５質量％以上であり、当該割合としては１８質量％以上が好ましく、２５質量％以下が好ましい。さらに、本発明の多糖類はリポ多糖でないことから、脂質部分を含まない。
【００２１】
全中性糖に対して、上記ラムノースおよびマンノースの含有量としてはそれぞれ５質量％以上が好ましく、上記アラビノースの含有量としては１質量％以上が好ましく、また、全中性糖に対するラムノース、マンノースおよびアラビノースの含有量としては、それぞれ、５質量％以上、１５質量％以下、５質量％以上、１５質量％以下、５質量％以上、１０質量％以下が好ましい。
【００２２】
本発明において、全中性糖に対する各中性糖の含有量割合は、多糖類を加水分解した上でＡＢＥＥ化試薬にて蛍光標識したサンプルを、逆相カラムを用い、Ｅｘ：３０５ｎｍ、Ｅｍ：３６０ｎｍの蛍光強度を検出し、各ピークの強度からサンプル１ｍＬ当たりの各中性糖の含有量を求め、その合計に対する各中性糖の含有量割合として算出することができる。分析に際しては、多糖類またはその加水分解物をＮ−アセチル化しておいても構わない。
【００２３】
本発明に係る多糖類は、リポ多糖ではなく、また、少なくともマクロファージ細胞による腫瘍壊死因子ＴＮＦ−αの産生を促進することから、安全性の高い免疫賦活剤の有効成分として用いることができる。免疫賦活剤とは、一般的には生体において免疫系である細胞性免疫および／または液性免疫を亢進するものである。本発明に係る多糖類はリポ多糖ではなく、非常に安全である。よって、食品や医薬組成物に配合し、長期にわたる継続的な摂取も可能であり、それにより、疾患や症状を治療できるのみならず、予防することも可能になり得る。
【００２４】
このような免疫賦活剤の剤形は特に制限されず、適宜選択すればよい。例えば、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、コーティング製剤などの固形製剤；溶液剤、懸濁液剤、エアゾール剤などの液剤などとすることができる。また、製剤形態に応じて、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤、コーティング剤、蒸留水や生理食塩水などの溶媒、乳化剤、抗酸化剤などの安定剤、ｐＨ調整剤などを添加してもよい。
【００２５】
本発明に係る多糖類は、食品や飼料に配合してもよい。食品や飼料に配合することにより、ヒト以外の動物やヒトの免疫力を改善もしくは増強することができる。例えば、食品や飼料の材料として用いたり、食品や飼料に添加混合することが考えられる。また、いわゆる病院食に添加することも好適である。さらに、本発明に係る多糖類は、免疫力を改善または増強するための医薬組成物へ配合することも考えられる。
【００２６】
本発明に係る免疫賦活剤の投与頻度や投与量は、摂取者の症状、年齢、性別、状態などに応じて適宜調整すればよい。例えばヒトに対する投与量は、本発明に係る多糖類について、経口投与の場合で１日当たり０．００１６ｍｇ／ｋｇ体重以上、０．４ｍｇ／ｋｇ体重以下程度とすることが好ましい。また、一日当たりの投与回数としては、１回以上、５回以下が好ましく、１回以上、３回以下がより好ましい。
【００２７】
以下、本発明に係る多糖類の製造方法を工程毎に説明する。
【００２８】
１．熱水抽出工程
本工程では、微細藻類およびその培養液の少なくとも一方と水系溶媒とを混合して加熱することにより、熱水抽出を行う。
【００２９】
「微細藻類」とは単細胞性の藻類全般をいい、一般的には、クロレラ、ユウグレナ、ナンノクロロプシスなどが知られている。一般的に、微細藻類は、野外で採取した海水または淡水サンプルから、一般的な培地を使った継代培養によりコロニーを分離し、最終的に分子系統学的解析により属種を特定することにより得ることができる。また、市販のものなどがあれば、入手して使用すればよい。
【００３０】
本発明で用いる微細藻類としては、パラクロレラ属藻類が好ましい。パラクロレラ属は、トレボキシア藻綱（Ｔｒｅｂｏｕｘｉｏｐｈｙｃｅａｅ）と緑藻綱（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｃｅａｅ）とにまたがるクロレラ属のうち、トレボキシア藻綱に属するものであるが、１８Ｓ  ｒＤＮＡおよび１６Ｓ  ｒＤＮＡを用いた分子系統学的解析によれば他のクロレラ属とは別のグループを形成するものである。パラクロレラ属藻類にはクロレラ属藻類のような強固な細胞壁構造が認められず、代わりに多糖類を主体とした厚い膜で覆われている。パラクロレラ属藻類は、淡水培地やＬＢ培地などの一般的な培地中、好気条件、嫌気条件のいずれでも生育可能であるが、室温〜３０℃、明条件、好気条件で特によく増殖する。
【００３１】
パラクロレラ属藻類としては、例えば、Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉ、Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｂｅｙｅｒｉｎｃｋｉｉ、Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｍａｒｉｎｉｃｈｌｏｒｅｌｌａ、Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｄｉｃｔｙｏｓｈａｅｒｉｕｍ、Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｍｕｃｉｄｏｓｐｈａｅｒｉｕｍ、Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｃｌｏｓｔｅｒｉｏｐｓｉｓ、Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｄｉｃｌｏｓｔｅｒが挙げられる。これらの中でも特にＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉ（パラクロレラ属ケスレリ種）が好適である。
【００３２】
パラクロレラ属ケスレリ種藻類のうち、特に好適なＫＮＫ−Ａ００１株（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２２５６）は、下記の通り寄託機関に寄託されている。
（ｉ）  寄託機関の名称およびあて名
名称：  独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター
あて名：  日本国  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２０号室
（ｉｉ）  受託日：  ２０１３年９月３日
（ｉｉｉ）  受託番号：  ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２２５６
本発明に係るＫＮＫ−Ａ００１株の形態的特徴などは、以下のとおりである。
【００３３】
【表１】
2018193446.tif 000002
【００３４】
また、ＫＮＫ−Ａ００１株の１８Ｓ  ｒＲＮＡの部分塩基配列を配列番号１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）に示す。
【００３５】
また、その１８Ｓ  ｒＲＮＡが、配列番号１に相当する（１）の塩基配列に対して、下記（２）または（３）の塩基配列を有する場合には、ＫＮＫ−Ａ００１株と同じくパラクロレラ属藻類に属し、且つＫＮＫ−Ａ００１株と同様に本発明の多糖類を産生できると考えられる。
【００３６】
（２）  上記（１）に規定される塩基配列において、１以上、３１以下の塩基が欠失、置換および／または付加された塩基配列
（３）  上記（１）に規定される塩基配列に対して９８．５％以上の配列同一性を有する塩基配列
なお、欠失などの変異の導入により１８Ｓ  ｒＲＮＡの塩基配列の塩基数が変化する場合においても、変異数が上記のとおり１以上、３１以下の範囲内にあるか、配列同一性のパーセンテージが上記のとおり９８．５％以上の範囲内にあれば、変異導入後の配列において、変異導入前の特定位置に相当する位置を特定することは当業者にとり容易である。具体的には、塩基配列の多重アライメント用プログラムで比較すべき配列をアライメントし、位置を決定することが可能である。また、塩基配列の同一性も、多重アライメント用プログラムで容易に求めることができる。
【００３７】
上記塩基配列（２）において、欠失などの変異の数としては、３０以下、２０以下または１０以下がより好ましく、９以下、８以下、６以下または５以下がさらに好ましく、４以下、３以下、２以下または１個がさらに好ましい。
【００３８】
また、上記塩基配列（３）において、塩基配列の同一性のパーセンテージとしては、９９．０％以上、９９．２％以上または９９．４％以上がより好ましく、９９．５％以上、９９．６％以上または９９．７％以上がさらに好ましく、９９．８％以上または９９．９％以上がさらに好ましい。
【００３９】
本発明で用いる微細藻類としては、少なくとも最終の培養段階で従属栄養培養したものが好ましい。微細藻類は、独立栄養培養した場合と従属栄養培養した場合とでは細胞の構成や細胞に含まれる成分に相違が生じる場合があり得るが、少なくとも従属栄養培養した微細藻類による免疫賦活活性は確認されている。また、微細藻類としては、その生細胞を用いてもよいが、乾燥体を用いてもよい。さらに、抽出操作に付す前に、培養液などに由来する低分子化合物を透析などにより除去してもよい。
【００４０】
本発明に係る多糖類は、ペリプラズム領域を含む微細藻類細胞内に存在する場合や、細胞壁の代わりの膜として細胞を被覆している場合の他、細胞から分泌されて培養液内に存在する可能性があり得る。よって本工程では、微細藻類とその培養液の両方を熱水抽出に付すことが好ましい。しかし目的とする多糖類の所在が明らかである場合には、その所在に応じて微細藻類またはその培養液のいずれか一方を熱水抽出に付してもよい。熱水抽出には微細藻類とその培養液の乾燥体を用いる場合も同様であり、微細藻類をその培養液と共に乾燥することが好ましいが、微細藻類またはその培養液のいずれか一方を乾燥してもよい。乾燥手段としては、凍結乾燥、薄膜乾燥、減圧乾燥などの常法を用いることができる。
【００４１】
本発明の多糖類は、水系溶媒を用いて微細藻類およびその培養液の少なくとも一方から抽出する。「水系溶媒」とは、水、または水と水混和性有機溶媒との混合溶媒であって水を主要成分とするものをいう。使用する水は、超純水、純水、蒸留水、水道水、井戸水など、特に制限されない。また、メタノールやエタノールなどの水混和性有機溶媒を適量添加してもよい。水混和性有機溶媒を用いる場合、全体に対する水混和性有機溶媒の割合としては４０容量％以下が好ましく、２０容量％以下または１０容量％以下がより好ましく、５容量％以下または２容量％以下がよりさらに好ましい。
【００４２】
水系溶媒の使用量は適宜調整すればよいが、例えば、微細藻類およびその培養液の少なくとも一方の乾燥体の質量に対して５ｍＬ／ｇ以上、３０ｍＬ／ｇ以下程度とすることができる。
【００４３】
抽出条件は適宜調整すればよいが、例えば、８０℃以上、１５０℃以下程度で、１分間以上、１時間以下程度抽出することにより、多糖類の抽出液を得ればよい。また、抽出後には、遠心分離や濾過などの常法により固形成分を除去してもよい。
【００４４】
２．カラムクロマトグラフィー工程
次に、上記熱水抽出工程で得られた抽出物をイオン交換カラムクロマトグラフィーに付し、多糖類を精製する。イオン交換カラムクロマトグラフィーによれば、電荷の違いにより成分を分離できるため、中性多糖が主成分であると考えられる本発明に係る多糖類は、高電荷化合物と良好に分離できるといえる。使用するカラムとしては、陰イオン交換カラムがより好適である。藻類由来の多糖類としてはアルギン酸など酸性多糖類が多いため、陰イオン交換カラムクロマトグラフィーにより本発明に係る多糖類をより効率的に精製でき得る。
【００４５】
溶離液は適宜選択すればよいが、例えば、ｐＨが６．５以上、７．５以下程度、より好ましくはｐＨが６．８以上、７．２以下程度の水や緩衝液を用いることが好ましい。また、溶離液には、多糖類の溶出を促進するためにＮａＣｌなどを添加してもよい。
【００４６】
イオン交換カラムクロマトグラフィーにより得られた各フラクションは、凍結乾燥、薄膜乾燥、減圧乾燥などの常法により濃縮または乾燥してもよい。
【００４７】
３．免疫賦活試験
本工程では、上記カラムクロマトグラフィー工程で得られたフラクションを免疫賦活試験に付し、免疫賦活活性を有する多糖類を含むフラクションを特定する。
【００４８】
免疫賦活試験としては様々なものが用いられており、本発明では特に制限されない。例えば、免疫賦活試験としては、細胞を用いるインビトロでの評価と、実際に動物を用いるインビボの評価がある。インビトロ評価としては、ＮＫ細胞やマクロファージ細胞を用いるものが主である。マクロファージを用いた評価では、異物除去機能としてのマクロファージの貪食作用を測定する系とマクロファージ活性化の指標となる一酸化窒素（ＮＯ）あるいはＴＮＦ（腫瘍壊死因子）などサイトカインの産生を測定する系が一般的である。例えば、後記の実施例のようにマクロファージ細胞による腫瘍壊死因子ＴＮＦ−αの産生促進作用を測定することができる。免疫賦活活性の評価に際しては、βグルカンに比して優れた免疫賦活活性を有するか否かを基準とすることができる。
【実施例】
【００４９】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
【００５０】
実施例１：  多糖類の製造
（１）  ＫＮＫ−Ａ００１株の培養
殺菌した液体培地にパラクロレラ・ケスレリ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉ）ＫＮＫ−Ａ００１株（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２２５６）を接種し、アルミホイルで遮光した後、３０℃で７２時間前培養した。次に、より大容量の殺菌液体培地に前培養培地を加え、アルミホイルで遮光した後、内温３０℃、通気量２Ｌ／分、撹拌数４５０ｒｐｍ、ｐＨ６〜７で１４３時間培養した。次いで、ダブルドラム型乾燥機により培養液を乾燥し、得られた乾燥凝集体をフェザーミルで粉砕することによりＫＮＫ−Ａ００１株の細胞乾燥物を得た。
【００５１】
（２）  多糖類の精製
上記ＫＮＫ−Ａ００１株の細胞乾燥物２０ｇを２００ｍＬの蒸留水に懸濁し、分子量カット８，０００の透析バックを用い、４℃で３日間透析して低分子化合物を除去した。透析後、バッグ内サンプルを三角フラスコに移し、１２１℃で１０分間オートクレーブした。放冷後、５０ｍＬチューブに移し、４℃、１７，０００×ｇで３０分間遠心処理した。遠心後、２ｍＬチューブに移し、さらに４℃、１５，０００×ｇで３０分間遠心処理した。上清を孔径０．２２μｍのフィルターを用いて濾過して抽出液とした。
【００５２】
上記熱抽出液８０ｍＬ（濃度：７．５ｍｇ／ｍＬ，溶質量：６００ｍｇ）を、陰イオン交換クロマトグラフィー用充填剤（「Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＤＥＡＥ−６５０Ｓ」東ソー社製）を用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィーに供し、６ｍＬのフラクションを６０本得た後、溶離液を０〜１Ｍ  ＮａＣｌに変更してさらにフラクションを得た。クロマトグラフィーチャートを図１に示す。図１の通り、５つのピークをもつパターンが得られた。以下、各ピークのフラクションをＦ１〜Ｆ５とする。各フラクションをエバポレーターにより濃縮し、４℃で３日間透析し、分子量８，０００以下の成分を除去した。その後、各フラクションを凍結乾燥し、粉末を得た。各フラクションの収量と収率は、質量基準で、Ｆ１：１７０ｍｇ（２８．３％）、Ｆ２：３０ｍｇ（５％）、Ｆ３：１１０ｍｇ（１８．３％）、Ｆ４：３２０ｍｇ（５３．３％）、Ｆ５：３０ｍｇ（５％）であった。
【００５３】
得られた各乾燥粉末を１０ｍｇ／ｍＬの濃度で超純水に溶解し、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベート後、１５，０００×ｇで１０分間遠心処理し、上清を孔径０．４５μｍのフィルターを用いて濾過した。得られた濾液を凍結乾燥した後、１０ｍｇ／ｍＬの濃度でリン酸緩衝液に溶解し、さらに孔径０．２２μｍのフィルターを用いて濾過した。
【００５４】
実施例２：  免疫賦活試験
マウスマクロファージ株細胞ＲＡＷ２６４．７を９６ウェルプレートに１ウェルあたり５×１０4個となるように１００μＬ播種後、一夜培養して付着細胞とした。各ウェルから培地を除去し、上記実施例１で得られたフラクションＦ１〜Ｆ５を１，０００μｇ／ｍＬの濃度で含む培地を添加し、５％ＣＯ2インキュベーター内で２４時間培養した。その後、細胞培養上清に含まれる腫瘍壊死因子ＴＮＦ−αの単位重量あたり及び単位糖濃度あたりの濃度をＥＬＩＳＡ法により求めた。結果を図２に示す。図２の通り、単位重量あたり及び単位糖濃度あたりの濃度ともに、Ｆ２とＦ５に免疫賦活活性が認められ、且つＦ２の活性に比べてＦ５の免疫賦活活性は明らかに高いものであった。
【００５５】
実施例３：  組成分析
上記免疫賦活試験で活性が認められたＦ２およびＦ５の各サンプル５０μＬに８Ｍトリフルオロ酢酸５０μＬを添加し、１００℃で３時間加水分解処理した。反応液を乾固させた後、超純水１００μＬに溶解した。当該溶液を４℃、１０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清を回収した。得られた上清を超純水にて１０倍希釈した希釈液５０μＬを無水酢酸でＮ−アセチル化し、さらにＡＢＥＥ化試薬にて蛍光標識した。次いで、水／クロロホルム抽出により水層から蛍光標識化単糖を回収し、分析に供した。分析は、タンパク質精製装置（「ＢｉｏＡｓｓｉｓｔ  ｅＺ」東ソー社製）を用い、カラムとして逆相カラム（「ＰＮ−ＰＡＫ  Ｃ１８」Ｗａｌｔｅｒｓ社製）を用い、溶離液としてホウ酸バッファー／アセトニトリル混合溶媒を用い、流速を０．５ｍＬ／分に調製し、Ｅｘ：３０５ｎｍ，Ｅｍ：３６０ｎｍの条件で蛍光を検出する逆相液体クロマトグラフィーにより行い、サンプル１ｍＬ当たりに含まれる各単糖の重量から、糖全体に対する各糖の含有割合を算出した。分析結果を表２に示す。なお、上記条件では未検出（ＮＤ）の糖であっても、その含有量が完全に０質量％であるとは限らないため、各糖の含有割合の合計は１００質量％とはならないことが多い。
【００５６】
【表２】
2018193446.tif 000003
【００５７】
Ｆ２は、その構成糖の８０質量％超がグルコースであり且つ免疫賦活活性を有することから、βグルカンであると考えられる。
【００５８】
Ｆ５に関しては、一般的なリポ多糖はガラクトースを主要な構成糖として含まないことから、ガラクトースを多く含むＦ５はリポ多糖ではないと考えられる。また、ＫＮＫ−Ａ００１株はリポ多糖を含むがその含有量は極僅かであるのに対して、Ｆ５の収率は５質量％と遥かに大きいことからも、Ｆ５はリポ多糖でないと判断される。
【００５９】
また、ゲルろ過クロマトグラフィー担体（「Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ」ＧＥヘルスケア・ライフサイエンス社製）を用いたゲルろ過クロマトグラフィー解析により、Ｆ５の分子量は４０〜５０万と推定された。
【図１】
2018193446.tif 000004
【図２】
2018193446.tif 000005
【配列表】
2018193446000001.app