(57)【要約】【課題】成人Ｔ細胞性白血病・リンパ腫の新規の治療剤を提供すること。【解決手段】ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）に起因する疾患の治療用医薬組成物であって、組換えＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）を発現する組換えリンパ球を含み、前記リンパ球がＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）であり、前記組換えＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）が、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性であり、ＨＴＬＶ−ＩがコードするＴａｘタンパク質のＴａｘ３０１〜３０９に対する特異性を有し、配列番号１〜２８からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含むβ鎖タンパク質を含み、Ｔ細胞輸注療法において用いられる医薬組成物が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）に起因する疾患の治療用医薬組成物であって、
組換えＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）を発現する組換えリンパ球を含み、
前記リンパ球がＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）であり、
前記組換えＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）タンパク質が、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性であり、ＨＴＬＶ−ＩがコードするＴａｘタンパク質のＴａｘ３０１〜３０９（配列番号１５）に対する特異性を有し、配列番号３のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含むβ鎖タンパク質を含み、
Ｔ細胞輸注療法において用いられる、医薬組成物。
【請求項２】
前記疾患が成人Ｔ細胞白血病・リンパ腫である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記リンパ球が前記疾患に罹患した患者に由来する、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記リンパ球が前記疾患に罹患した患者とは異なる供給源に由来する、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記ＨＬＡ−Ａ２４拘束性がＨＬＡ−Ａ＊２４０２拘束性である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記β鎖タンパク質が配列番号３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含み、前記組換えＴＣＲが配列番号６のアミノ酸配列を含むβ鎖タンパク質を含むＴＣＲと実質的に同等のＴＣＲ活性を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記β鎖タンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、および配列番号３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含み、前記組換えＴＣＲが配列番号６のアミノ酸配列を含むβ鎖タンパク質を含むＴＣＲと実質的に同等のＴＣＲ活性を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記β鎖タンパク質が配列番号４のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するポリペプチドを含むβ鎖可変領域（Ｖβ領域）を含み、前記組換えＴＣＲが配列番号６のアミノ酸配列を含むβ鎖タンパク質を含むＴＣＲと実質的に同等のＴＣＲ活性を有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記β鎖タンパク質が配列番号６のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するポリペプチドを含み、前記組換えＴＣＲが配列番号６のアミノ酸配列を含むβ鎖タンパク質を含むＴＣＲと実質的に同等のＴＣＲ活性を有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記ＴＣＲが、配列番号９のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含むα鎖タンパク質を含み、配列番号６のアミノ酸配列を含むβ鎖タンパク質および配列番号１２のアミノ酸配列を含むα鎖タンパク質を含むＴＣＲと実質的に同等のＴＣＲ活性を有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記α鎖タンパク質が、配列番号１０のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するポリペプチドを含むα鎖可変領域（Ｖα領域）を含み、前記組換えＴＣＲが、配列番号６のアミノ酸配列を含むβ鎖タンパク質および配列番号１２のアミノ酸配列を含むα鎖タンパク質を含むＴＣＲと実質的に同等のＴＣＲ活性を有する、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記α鎖タンパク質が、配列番号１２のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するポリペプチドを含み、前記組換えＴＣＲが、配列番号６のアミノ酸配列を含むβ鎖タンパク質および配列番号１２のアミノ酸配列を含むα鎖タンパク質を含むＴＣＲと実質的に同等のＴＣＲ活性を有する、請求項１０または１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記リンパ球が、ＨＴＬＶ−Ｉに感染しておりＨＬＡ−Ａ＊２４０２を有する標的細胞と接触される場合に、該標的細胞の傷害を引き起こす作用、インターフェロン−γを産生する作用、およびＩＬ−２を産生する作用のうちの少なくとも１つを示す、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記組換えリンパ球が、造血幹細胞、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、骨髄細胞（ＢＭ）、リンパ球系共通前駆細胞、Ｔ細胞前駆細胞（ナイーブＴ細胞）、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞、または成熟ＣＤ８＋Ｔ細胞に由来する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
ビヒクルを含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
組換えＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）を発現する組換えリンパ球であって、
前記リンパ球はＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）であり、
前記組換えＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）タンパク質は、ＨＴＬＶ−ＩがコードするＴａｘタンパク質のＴａｘ３０１〜３０９（配列番号１５）に対する特異性を有し、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性であり、配列番号４のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するβ鎖可変領域（Ｖβ領域）を含むβ鎖タンパク質を含む、組換えリンパ球。
【請求項１７】
前記ＴＣＲが、配列番号１０のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するα鎖可変領域（Ｖα領域）を含むα鎖タンパク質を含み、配列番号１２のアミノ酸配列を含むα鎖タンパク質を含む組換えＴＣＲと実質的に同等のＴＣＲ活性を有する、請求項１６に記載の組換えリンパ球。
【請求項１８】
組換えＴＣＲを発現するリンパ球を取得する方法であって、
ヒトの造血幹細胞、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、骨髄細胞（ＢＭ）、リンパ球系共通前駆細胞、Ｔ細胞前駆細胞（ナイーブＴ細胞）、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞、または成熟ＣＤ８＋Ｔ細胞からなる群より選択される細胞に対して、組換えＴＣＲα及びＴＣＲβをコードするポリヌクレオチドを導入する工程、及び
組換えＴＣＲαおよびＴＣＲβを発現する細胞を単離する工程
を含み、
前記ＴＣＲαは配列番号１０のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するα鎖可変領域（Ｖα領域）を含み、前記ＴＣＲβは配列番号４のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するβ鎖可変領域（Ｖβ領域）を含む、方法。
【請求項１９】
前記ＴＣＲが、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＴＣＲαおよび配列番号６のアミノ酸配列を含むＴＣＲβを含む組換えＴＣＲと実質的に同等のＴＣＲ活性を有する、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）に起因する疾患、特に成人Ｔ細胞性白血病・リンパ腫(adult T-cell leukemia/lymphoma：ＡＴＬ)に対する免疫療法に関する。従来、成人Ｔ細胞性白血病に対する治療は重篤な有害事象を伴う同種造血幹細胞移植療法のみであり、安全かつ有効な治療法はなかったが、腫瘍特異的に働く免疫療法を開発することにより、安全で有効な治療を可能にした。
【背景技術】
【０００２】
ＡＴＬはヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ−Ｉ）を原因とする難治性の造血器腫瘍である。特に白血病型・リンパ腫型の患者の予後はきわめて不良であり、多剤併用の化学療法を行っても長期生存者は１０％未満である。近年、ＡＴＬに対して同種造血幹細胞移植が行われるようになり、一部の患者に根治が得られるようになった。
【０００３】
本願発明者は以前に、骨髄バンクを介した非血縁者間移植においても一部の患者に根治が得られることを報告した（非特許文献１、非特許文献２）。同種造血幹細胞移植の抗腫瘍効果は大量の抗がん剤や全身への放射線照射を用いた移植前処置の役割が大きいが、移植後にドナーの免疫担当細胞による抗腫瘍効果（ＧＶＬ効果）が発揮されることも知られている。その根拠となっているのは、移植後に移植片対宿主病（ＧＶＨＤ、ドナー免疫細胞が患者臓器を攻撃する合併症）を発症した患者において白血病の再発率が低下するという事実、そして移植後にドナーリンパ球を輸注することによって腫瘍が縮小することがあるという事実である。特にＡＴＬはこのＧＶＬ効果が強く発揮される疾患であり、実際、本願発明者はＡＴＬに対する同種造血幹細胞移植後にＧＶＨＤを発症した患者はＧＶＨＤを発症しなかった患者と比較して最終的な生存率が優れているということを示した（非特許文献３）。
【０００４】
ＡＴＬに対して強力なＧＶＬ効果が発揮される理由の一つとして、ＡＴＬの腫瘍細胞はＨＴＬＶ−Ｉに感染しているため、このウイルスに由来する抗原を標的とする免疫力が働いているということが推測される。しかし、ＧＶＨＤとＧＶＬは表裏一体の関係にあるため、単純に免疫抑制剤の減量などによってＧＶＬ効果の増強を図ると、ＧＶＨＤの増悪のために臓器障害や感染症による死亡率が高くなってしまう。そこで、より腫瘍特異的に働く免疫療法の開発が熱望されている。
【０００５】
ＡＴＬの発症には、その原因ウイルスであるＨＴＬＶ−Ｉの転写活性化因子Ｔａｘが重要であるとされているが、近年、このＨＬＡ−Ａ２４拘束性Ｔａｘ３０１−３０９エピトープがワクチン抗原として有用であることが示されている（特許文献１）。本願発明者もこれまでにＨＬＡ−Ａ２４を有する４症例のＡＴＬ患者において、同種造血幹細胞移植後のＣＴＬの検討を行い、移植後にＴａｘ特異的ＣＴＬが増加することを確認した（非特許文献４）。さらに、本願発明者は、移植後のＴａｘ特異的ＣＴＬのＴＣＲレパトアの多様性は制限されていること、移植後に特徴的なアミノ酸配列（「Ｐ−Ｄ／Ｐ−Ｒ」）を有するＴＣＲレパトアを持つＣＴＬが増加すること、この配列は全ての患者において、そして一人の患者においては移植前後の両方に認められたこと、このアミノ酸配列を有するＣＴＬは患者ＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞に対して強力な細胞傷害活性を有することを報告した（非特許文献４）。
【０００６】
非特許文献５には、患者由来のＣＴＬが他の患者のＨＴＬＶ−１感染細胞に対する細胞傷害性も示すことが開示されている。さらに、該ＣＴＬからクローニングしたＴＣＲ  α/β遺伝子をＴ細胞に導入することによる細胞療法を計画していることがDiscussionに記載されている。
【０００７】
非特許文献６には、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２陽性ＡＴＬ癌患者の末梢血より得たhTERT461-469に特異的なＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）のα鎖およびβ鎖の遺伝子をsiTCRベクターにクローニングして、得られたhTERT-siTCR vector（特許文献２、タカラバイオ株式会社）をＣＤ８＋Ｔ細胞に導入して得られた組換えＣＴＬは、ＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞に対してのみ傷害させることができたことが開示されている。非特許文献７には、組換えＴＣＲの発現をさらに向上させる組換えベクターやこのベクターを用いた実験結果が示されている。
【０００８】
特許文献３には、遺伝子組換えを行ったＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）に関して、ＷＴ１特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）のＶβ領域中のＣＤＲ３をコードする特定のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ、またはその相補的ＲＮＡ、またはそれらの相補配列を有するポリヌクレオチド配列を含むＴ細胞レセプター遺伝子を導入したＨＬＡ−Ａ＊２４０２陽性癌患者のリンパ球のセットが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開WO 2004/092373 パンフレット
【特許文献２】国際公開WO 2008/153029 パンフレット
【特許文献３】国際公開WO 2008/108257 パンフレット
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Izutsuら、Blood 2004 103:1955-1960
【非特許文献２】Katoら、Biol Blood Marrow Transplant 2007;13:90-99
【非特許文献３】神田ら、Blood 2012 119: 2409-2416
【非特許文献４】Tanakaら、Cancer Research 70(15) August 1, 2010, p6181-6192
【非特許文献５】Tanakaら、Immunology Letters 158 (2014) p120-125
【非特許文献６】Miyazakiら、Blood 2013 121: 4894-4901
【非特許文献７】Okamotoら、Molecular Therapy-Nucleic Acids (2012) 1, e63; doi:10.1038/mtna.2012.52
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）に起因する疾患、特に成人Ｔ細胞性白血病に対する、安全かつ有効である新規の治療法、例えば免疫療法の開発が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題を解決するため、本願発明者らは鋭意研究を行った結果、特定のTCR遺伝子導入細胞がHLA-A24拘束性に、かつＨＴＬＶ−１感染細胞特異的に強力な細胞傷害活性を示すことを見出し、さらに研究を進めて本願発明を完成させた。
【００１３】
本出願は、例えば以下の発明を提供するものである。
[１］  ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）に起因する疾患の治療用医薬組成物であって、
組換えＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）を発現する組換えリンパ球を含み、
前記リンパ球がＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）であり、
前記組換えＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）タンパク質が、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性であり、ＨＴＬＶ−ＩがコードするＴａｘタンパク質のＴａｘ３０１〜３０９（配列番号１５）に対する特異性を有し、配列番号３のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含むβ鎖タンパク質を含み、
Ｔ細胞輸注療法において用いられる、医薬組成物。
[２］  前記疾患が成人Ｔ細胞白血病・リンパ腫である、[１]に記載の医薬組成物。
[３］  前記リンパ球が前記疾患に罹患した患者に由来する、[１]または[２]に記載の医薬組成物。
[４］  前記リンパ球が前記疾患に罹患した患者とは異なる供給源に由来する、[１]または[２に記載の医薬組成物。
[５]  前記ＨＬＡ−Ａ２４拘束性がＨＬＡ−Ａ＊２４０２拘束性である、[１]〜[４]のいずれか１項に記載の医薬組成物。
[６]  前記β鎖タンパク質が配列番号３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含み、前記組換えＴＣＲが配列番号６のアミノ酸配列を含むβ鎖タンパク質を含むＴＣＲと実質的に同等のＴＣＲ活性を有する、[１]〜[５]のいずれか１項に記載の医薬組成物。
[７]  前記β鎖タンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、および配列番号３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含み、前記組換えＴＣＲが配列番号６のアミノ酸配列を含むβ鎖タンパク質を含むＴＣＲと実質的に同等のＴＣＲ活性を有する、[１]〜[６]のいずれか１項に記載の医薬組成物。
[８]  前記β鎖タンパク質が配列番号４のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するポリペプチドを含むβ鎖可変領域（Ｖβ領域）を含み、前記組換えＴＣＲが配列番号６のアミノ酸配列を含むβ鎖タンパク質を含むＴＣＲと実質的に同等のＴＣＲ活性を有する、[１]〜[７]のいずれか１項に記載の医薬組成物。
[９]  前記β鎖タンパク質が配列番号６のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するポリペプチドを含み、前記組換えＴＣＲが配列番号６のアミノ酸配列を含むβ鎖タンパク質を含むＴＣＲと実質的に同等のＴＣＲ活性を有する、[１]〜[８]のいずれか１項に記載の医薬組成物。
[１０]  前記ＴＣＲが、配列番号９のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含むα鎖タンパク質を含み、配列番号６のアミノ酸配列を含むβ鎖タンパク質および配列番号１２のアミノ酸配列を含むα鎖タンパク質を含むＴＣＲと実質的に同等のＴＣＲ活性を有する、[１]〜[９]のいずれか１項に記載の医薬組成物。
[１１]  前記α鎖タンパク質が、配列番号１０のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するポリペプチドを含むα鎖可変領域（Ｖα領域）を含み、前記組換えＴＣＲが、配列番号６のアミノ酸配列を含むβ鎖タンパク質および配列番号１２のアミノ酸配列を含むα鎖タンパク質を含むＴＣＲと実質的に同等のＴＣＲ活性を有する、[１０]に記載の医薬組成物。
[１２]  前記α鎖タンパク質が、配列番号１２のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するポリペプチドを含み、前記組換えＴＣＲが、配列番号６のアミノ酸配列を含むβ鎖タンパク質および配列番号１２のアミノ酸配列を含むα鎖タンパク質を含むＴＣＲと実質的に同等のＴＣＲ活性を有する、[１０]または[１１]に記載の医薬組成物。
[１３]  前記リンパ球が、ＨＴＬＶ−Ｉに感染しておりＨＬＡ−Ａ＊２４０２を有する標的細胞と接触される場合に、該標的細胞の傷害を引き起こす作用、インターフェロン−γを産生する作用、およびＩＬ−２を産生する作用のうちの少なくとも１つを示す、[１]〜[１２]のいずれか１項に記載の医薬組成物。
[１４]  前記組換えリンパ球が、造血幹細胞、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、骨髄細胞（ＢＭ）、リンパ球系共通前駆細胞、Ｔ細胞前駆細胞（ナイーブＴ細胞）、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞、または成熟ＣＤ８＋Ｔ細胞に由来する、[１]〜[１３]のいずれか１項に記載の医薬組成物。
[１５]  ビヒクルを含む、[１]〜[１４]のいずれか１項に記載の医薬組成物。
[１６]  組換えＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）を発現する組換えリンパ球であって、
前記リンパ球はＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）であり、
前記組換えＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）タンパク質は、ＨＴＬＶ−ＩがコードするＴａｘタンパク質のＴａｘ３０１〜３０９（配列番号１５）に対する特異性を有し、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性であり、配列番号４のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するβ鎖可変領域（Ｖβ領域）を含むβ鎖タンパク質を含む、組換えリンパ球。
[１７]  前記ＴＣＲが、配列番号１０のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するα鎖可変領域（Ｖα領域）を含むα鎖タンパク質を含み、配列番号１２のアミノ酸配列を含むα鎖タンパク質を含む組換えＴＣＲと実質的に同等のＴＣＲ活性を有する、[１６]に記載の組換えリンパ球。
[１８]  組換えＴＣＲを発現するリンパ球を取得する方法であって、
ヒトの造血幹細胞、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、骨髄細胞（ＢＭ）、リンパ球系共通前駆細胞、Ｔ細胞前駆細胞（ナイーブＴ細胞）、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞、または成熟ＣＤ８＋Ｔ細胞からなる群より選択される細胞に対して、組換えＴＣＲα及びＴＣＲβをコードするポリヌクレオチドを導入する工程、及び
組換えＴＣＲαおよびＴＣＲβを発現する細胞を単離する工程
を含み、
前記ＴＣＲαは配列番号１０のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するα鎖可変領域（Ｖα領域）を含み、前記ＴＣＲβは配列番号４のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するβ鎖可変領域（Ｖβ領域）を含む、方法。
[１９]  前記ＴＣＲが、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＴＣＲαおよび配列番号６のアミノ酸配列を含むＴＣＲβを含む組換えＴＣＲと実質的に同等のＴＣＲ活性を有する、[１８]に記載の方法。
[２０]  上記リンパ球を患者に投与することを含む、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）に起因する疾患（例えば、成人Ｔ細胞白血病）の治療方法。
[２１］  配列番号１４に記載されるポリペプチド。
[２２］  配列番号１４に記載されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
[２３］  配列番号１３に記載されるポリヌクレオチド。
【発明の効果】
【００１４】
本願発明は、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）に起因する疾患、特に成人Ｔ細胞性白血病に対する、安全かつ有効である新規の治療法、例えば免疫療法を提供できる。ここで、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２拘束性を有するＡＴＬ患者は、日本では最もコモン（約６０％）である。したがって、例えばＨＬＡ−Ａ＊２４０２陽性の癌患者または健常人に由来するリンパ球を用いて本願発明に係るリンパ球を調製することによって、現在は有効な治療法が乏しいＡＴＬ患者の多くにとって有用な腫瘍免疫治療を提供できることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、本発明に係るＰＤＲ＋ＣＴＬを用いた免疫療法のｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験の結果を示す。図中、「Ａ２４＋」及び「Ａ２４−」はそれぞれＨＬＡ−Ａ＊２４０２陽性及び陰性であることを表す。また、Ｘ軸の「ＥＴ  ｒａｔｉｏ」は、エフェクター細胞対標的細胞の比を表し、縦軸のＣＴＬ（％）は死滅した細胞率を表す。
【図２】図２は、本発明に係るＰＤＲ＋ＣＴＬを用いた免疫療法のｉｎ  ｖｉｖｏ実験の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本願発明は、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）に起因する疾患、特に成人Ｔ細胞白血病・リンパ腫の治療用医薬組成物を提供するものである。
【００１７】
１．ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）について
ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）は、ヒトの成人Ｔ細胞白血病・リンパ腫（ＡＴＬ）の原因として公知であるレトロウイルスである。ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）に起因する疾患としては、ＡＴＬが代表的であるが、その他にＨＴＬＶ−１関連ミエロパチー、ＨＴＶＬ−１ブドウ膜炎を引き起こす場合もある。ＨＴＬＶには、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−２、ＨＴＬＶ−３などの複数の型が挙げられる。このうちＨＴＬＶ−１は、長さ約９ｋｂのプロウイルス遺伝子を有する。ＨＴＬＶ−１のプロウイルス遺伝子は、Ｔａｘ、Ｒｅｘ、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ等の種々のタンパク質をコードする。このうちＴａｘタンパク質は、完全長として約３５３アミノ酸残基を有し、宿主細胞内でＮＦ−κＢ、ＳＲＦ、ＣＲＥＢなどの宿主の転写因子の活性化、ｐ５３等のタンパク質の機能抑制など、多数の機能を有する。
【００１８】
ＨＴＬＶ−１の生体内の感染対象細胞として具体的には、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、単球、樹状細胞が挙げられる。これら細胞は、ＨＴＬＶ−１に感染すると、ＨＴＬＶ−１がコードするＴａｘ等のタンパク質の部分ペプチド（例えばＴａｘ部分ペプチド）を、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）を介して提示する。そこで、このＨＴＬＶ−１特異的な部分ペプチドを提示する細胞（すなわちＨＴＬＶ−１感染細胞）を標的とする細胞であって、生体内で免疫応答を惹起できるＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞、ＣＤ８＋ＣＴＬともいう）を用いる免疫療法が、ＨＴＬＶ−１関連疾患、例えばＡＴＬの有用な免疫療法として報告されている（特開2008-22702、特開2014-133712、非特許文献６など）。本願発明において使用できるＴａｘタンパク質のエピトープの例は、Ｔａｘの任意の部分ペプチド、好ましくは、Ｔａｘ３０１〜３０９のアミノ酸配列「ＳＦＨＳＬＨＬＬＦ（配列番号１５）」、Ｔａｘ１１〜１９、Ｔａｘ８８〜９６、Ｔａｘ２７２〜２８０、Ｔａｘ３０１〜３１５、Ｔａｘ１５５〜１６７等の部分ペプチドが公知であるが、これらに限定されない。
【００１９】
２．本願発明の組換えＴＣＲ
本願発明は、一実施形態において、ＨＬＡ−Ａ拘束性であり、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ−Ｉ）のＴａｘ３０１〜３０９に特異性を有する組換えＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）を提供する。本願発明に係るＴＣＲは、好ましくはＨＬＡ−Ａ２４拘束性であり、さらに好ましくはＨＬＡ−Ａ＊２４０２拘束性である。本願発明において、１種類以上の組換えＴＣＲを用いることも可能である。
【００２０】
Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）は、Ｔ細胞の抗原認識機能を担うものであり、ＴＣＲは、α鎖、β鎖、γ鎖、δ鎖などのタンパク質から構成される。このうち、ＴＣＲα鎖タンパク質（ＴＣＲα）とＴＣＲβ鎖タンパク質（ＴＣＲβ）とのヘテロ二量体、またはγ鎖とδ鎖とのヘテロ二量体が、補助分子としてのＣＤ３複合体（γ、δ、ε、ζを含む）、ＣＤ４またはＣＤ８などと一緒になってＴＣＲを形成している。
【００２１】
ＴＣＲは、生体内において、標的とする細胞（食細胞、ウイルス感染細胞、癌細胞等）が主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）を介して提示するペプチド等の異種タンパク質（抗原エピトープ）に対して免疫応答を行う機能を担う。ヒトのＭＨＣは、ヒト組織適合性白血球抗原（ＨＬＡ）系とも称される。ＨＬＡはクラスＩ及びクラスＩＩに区分されており、クラスＩにはＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｊが含まれ、クラスＩＩにはＨＬＡ−ＤＲ、ＤＱ、ＤＰが含まれる。ＨＬＡもまたＴＣＲと同様にα鎖およびβ鎖の複合体によって形成されており、これら鎖を介して抗原エピトープをＴ細胞に提示する。ＨＬＡクラスＩは、生体のほぼすべての細胞に存在し、約９アミノ酸残基の長さの抗原エピトープをＣＴＬに提示する。例えば、ウイルス感染細胞がウイルス由来の抗原エピトープをＨＬＡを介して提示すると、その抗原エピトープに特異的なＴＣＲを有するＴ細胞（ＣＴＬなど）が活性化されて、その結果、生体の免疫応答（例えば、ウイルス感染細胞の細胞死）がもたらされて生体防御が行なわれている。
【００２２】
ＴＣＲは、通常は抗原エピトープ−ＨＬＡ複合体との結合によってのみ免疫応答を行うことができる。この制限は「ＨＬＡ拘束性」といわれる。本明細書においてＨＬＡ（またはＭＨＣ）拘束性の用語は、ＴＣＲに加えて、そのようなＴＣＲを発現しているＴ細胞、または提示される抗原−ＨＬＡ複合体を意味するために、各種のペプチド、細胞等と組み合せて使用され得る。ＴＣＲと抗原エピトープ−ＨＬＡ複合体との結合によって免疫応答が生じるが、この免疫応答の例としては、ＣＤ８＋Ｔ細胞によるサイトカイン（インターフェロンγ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２等）の分泌が挙げられる。ＴＣＲと抗原エピトープ−ＨＬＡ複合体との結合は、上記サイトカインの分泌を測定することによって間接的に測定可能である。また、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の標識を有するＨＬＡ（又はそのペプチド断片）と抗原エピトープとの複合体に対してＴＣＲが結合することを検出することによって、ＴＣＲと抗原−ＨＬＡとの結合を直接的に測定可能である。あるいは、２分子以上の分子の近接によって発光・消光する作用を利用した公知の光学的な検出手段も利用できる。
【００２３】
本願発明に係る組換えＴ細胞レセプターは、好ましくはヒト白血球抗原Ａ（ＨＬＡ−Ａ）拘束性である。ＨＬＡの種類に関して、例えば造血幹細胞移植の場合、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤＲの４つ（４座８抗原）の一致、および、各対立遺伝子（添え字＊が付される）の数などが考慮される。よって、例えばこれらＨＬＡの一致が認められると、自家移植のみならず他者への移植の可能性も存在する。日本のＡＴＬ患者は、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２拘束性を有する場合が一般的であり、約６０％ともいわれる。特定のＨＬＡに拘束性であるＴＣＲは、例えば、ＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ＊２４０２を示すヒト（健常人、患者を含む）由来のナイーブＴ細胞または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から、当該分野で公知の技法により単離することができる（例えば、下記のCurrent Protocol、Molecular Cloningなど）。本願明細書において、「ＨＬＡ−Ａ２４」はＨＬＡ−Ａ＊２４０２などのサブタイプを含むＨＬＡ−Ａ２４型を指す。よって、本願発明に係る組換えＴＣＲは、好ましくはＨＬＡ−Ａ拘束性でり、より好ましくはＨＬＡ−Ａ２４拘束性であり、さらに好ましくはＨＬＡ−Ａ＊２４０２拘束性である。
【００２４】
本願発明の組換えＴＣＲは、ＣＤ８＋Ｔ細胞において発現する場合、元のＴＣＲと同等の能力を発揮する。このような機能の例としては、細胞膜上でＣＤ３複合体（γ、δ、ε、ζを含む）およびＣＤ８と一緒になって複合体を形成する能力が挙げられる。また、本願発明の組換えＴＣＲは、好ましくは、ＴＣＲαおよびＴＣＲβを含み、抗原エピトープ−ＨＬＡ(α/β)の３量体複合体と結合する能力を有する。さらにまた、本願発明の組換えＴＣＲは、ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞膜上に存在して、免疫応答を行う能力、例えば、抗原エピトープ−ＨＬＡ複合体と結合する能力を有するものであり、さらにこの結合によって、抗原エピトープ−ＨＬＡ依存性に抗原エピトープ提示細胞を傷害する能力、インターフェロンγ、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、サイトカインＩＬ−２などのサイトカインの１つ以上を産生する能力など、上記の能力のうちの１つ以上を有する。本願明細書において、「ＴＣＲ活性を有する」とは、上記ＴＣＲの各能力の１つ以上を有することを指す。
【００２５】
ＴＣＲαおよびＴＣＲβは各々、可変領域（Ｖセグメント＋（Ｄセグメント）＋Ｊセグメント）、及び定常領域（Ｃ領域）を有しており、各Ｖ領域内には相補性決定領域１〜３（ＣＤＲ１〜３）が存在する。ＴＣＲαおよびＴＣＲβの各ＣＤＲ１及びＣＤＲ２は、対象細胞のＨＬＡ（ＭＨＣ）とＴＣＲとの結合を担い、一方、各ＣＤＲ３は抗原エピトープ−ＨＬＡ（α鎖およびβ鎖を含む）の３量体複合体とＴＣＲとの結合を担う領域であり、とりわけＴＣＲβのＣＤＲ３は、ＴＣＲのＣＤＲの中でも最も多様性に富む領域と考えられている。ＴＣＲのＣＤＲ３は、通常、１０〜１８個のアミノ酸残基を有する。本願発明において、各ＴＣＲ中に含まれる各ＣＤＲ１〜３の位置を特定するために、公知の解析手段（（例えば、IMGT/V-QUEST Search page（http://www.imgt.org/IMGT_vquest/vquest?livret=0&Option=humanTcR）、Brochet, X. et al., Nucl. Acids Res. 36, W503-508 (2008)、など。参考文献： Giudicelli, V., Brochet, X., Lefranc, M.-P., Cold Spring Harb Protoc. 2011 Jun 1;2011(6). pii: pdb.prot5633. doi: 10.1101/pdb.prot5633. PMID: 21632778））を利用できる。また、同様の結果が得られる限り当該分野で公知の任意の他の手段も利用できる。
【００２６】
本願発明に用いるＴＣＲは、β鎖タンパク質（ＴＣＲβ）が、配列番号１のアミノ酸配列と９０％以上（９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列と９０％以上（例えば、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、および／または配列番号３のアミノ酸配列と９０％以上（例えば、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む。好ましくは、本願発明に用いるＴＣＲは、ＴＣＲβが、配列番号１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、および／または配列番号３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む。より好ましくは、本願発明に用いるＴＣＲは、ＴＣＲβが、配列番号１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、および／または配列番号３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む。ただし、これらＴＣＲβはいずれも、ＴＣＲを形成する場合に、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性であり、配列番号６のアミノ酸配列を有するＴＣＲβおよび配列番号１２のアミノ酸配列を有するＴＣＲαを含むＴＣＲと実質的に同等のＴＣＲ活性（例えば、少なくとも５０％以上、好ましくは６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上の比活性）を有する。本明細書中、β鎖のＣＤＲ１〜３はそれぞれＣＤＲ１β、ＣＤＲ２β、ＣＤＲ３βとも表される。
【００２７】
本願発明に用いるＴＣＲβは、好ましくは配列番号３のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含み、より好ましくは配列番号３のアミノ酸配列と９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含み、最も好ましくは、配列番号３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む。ただし、本願発明に用いるＴＣＲβは、ＴＣＲα等と一緒になってＴＣＲを形成する場合に、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性であり、配列番号６のアミノ酸配列を有するＴＣＲβおよび配列番号１２のアミノ酸配列を有するＴＣＲαを含むＴＣＲと実質的に同等のＴＣＲ活性（例えば、少なくとも５０％以上、好ましくは６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上の比活性）を有するものである。
【００２８】
また、本願発明に用いるＴＣＲβは、配列番号４のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するβ鎖可変領域（Ｖβ領域）を含むものであり、より好ましくは、配列番号４のアミノ酸配列と９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の相同性を有するＶβ領域を含むものであり、最も好ましくは、配列番号５のアミノ酸配列を含むＶβ領域を含むものである。ただし、これらＴＣＲβはいずれも、ＴＣＲα等と一緒になってＴＣＲを形成する場合に、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性であり、配列番号６のアミノ酸配列を有するＴＣＲβおよび配列番号１２のアミノ酸配列を有するＴＣＲαを含むＴＣＲと実質的に同等のＴＣＲ活性（例えば、少なくとも５０％以上、好ましくは６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上の比活性）を有する。なお、特に記載のない限り、Ｖβ領域はβ鎖のＶセグメント、Ｄセグメント及びＪセグメント、又はＶセグメント及びＪセグメントを含む。
【００２９】
さらにまた、本願発明に用いるＴＣＲβは、配列番号６のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するポリペプチドを含むものであり、より好ましくは、配列番号６のアミノ酸配列と９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の相同性を有するポリペプチドを含むものであり、最も好ましくは、配列番号６のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むものである。ただし、これらＴＣＲβはいずれも、ＴＣＲα等と一緒になってＴＣＲを形成する場合に、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性であり、配列番号６のアミノ酸配列を有するＴＣＲβおよび配列番号１２のアミノ酸配列を有するＴＣＲαを含むＴＣＲと実質的に同等のＴＣＲ活性を有する。
【００３０】
本願発明に用いるα鎖タンパク質（ＴＣＲα）は、配列番号７のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、および／または配列番号９のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む。好ましくは、本願発明に用いるＴＣＲαは、配列番号７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、および／または配列番号９のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む。より好ましくは、本願発明に用いるＴＣＲαは、配列番号７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、および／または配列番号９のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む。ただし、これらＴＣＲαはいずれも、ＴＣＲβ等と一緒になってＴＣＲを形成する場合に、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性であり、配列番号６のアミノ酸配列を有するＴＣＲβおよび配列番号１２のアミノ酸配列を有するＴＣＲαを含むＴＣＲと実質的に同等のＴＣＲ活性を有する。本明細書中、α鎖のＣＤＲ１〜３はそれぞれＣＤＲ１α、ＣＤＲ２α、ＣＤＲ３αとも表される。
【００３１】
また、本願発明に用いるＴＣＲαは、配列番号１０のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するα鎖可変領域（Ｖα領域）を含むものであり、より好ましくは、配列番号１０のアミノ酸配列と９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の相同性を有するＶＪセグメントを含み、最も好ましくは、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＪセグメントを含む。ただし、これらＴＣＲαはいずれも、ＴＣＲβ等と一緒になってＴＣＲを形成する場合に、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性であり、配列番号６のアミノ酸配列を有するＴＣＲβおよび配列番号１２のアミノ酸配列を有するＴＣＲと実質的に同等のＴＣＲ活性を有するタンパク質である。なお、特に記載のない限り、Ｖα領域はＴＣＲαのＶセグメント及びＪセグメントを含む。
【００３２】
さらにまた、本願発明に用いるＴＣＲαは、配列番号１２のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するポリペプチドを含むものであり、より好ましくは、配列番号１２のアミノ酸配列と９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の相同性を有するポリペプチドを含むものであり、最も好ましくは、配列番号１２のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。ただし、これらＴＣＲαはいずれも、ＴＣＲβ等と一緒になってＴＣＲを形成する場合に、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性であり、配列番号６のアミノ酸配列を有するＴＣＲβおよび配列番号１２のアミノ酸配列を有するＴＣＲと実質的に同等のＴＣＲ活性を有するタンパク質である。
【００３３】
本願発明に用いるＴＣＲは、上記のいずれかのＴＣＲαとＴＣＲβとを任意の組み合わせで用いることができる。例えば、上記のＣＤＲ１〜３αの少なくとも１つを有するＶα領域と、上記のＣＤＲ１〜３βの少なくとも１つを有するＶβ領域を組み合わせて含むことができる。ただし、これらＴＣＲαおよびＴＣＲβはいずれも、ＣＤ８等の他のＴＣＲ構成タンパク質と一緒になってＴＣＲを形成する場合に、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性であり、配列番号１２のアミノ酸配列を有するＴＣＲαおよび配列番号６のアミノ酸配列を有するＴＣＲβを含むＴＣＲと実質的に同等のＴＣＲ活性を有する。
【００３４】
本願発明に係る組換えＴＣＲが含み得る、上記の様々な相同性を有するアミノ酸配列は、ＴＣＲ活性を実質的に有する限り、遺伝子組み換えなどの公知技術を利用して適宜作製できる。例えば、本願発明に用いるＴＣＲβは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３の各アミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸の欠失、置換、挿入および／または付加を含み得る。好ましくは、本願発明に用いるＴＣＲβは、ＣＤＲ３以外の位置において１個以上のアミノ酸の欠失、置換、挿入および／または付加を含み得る。より好ましくは、本願発明に用いるＴＣＲβは、ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列以外の位置において１個以上のアミノ酸の欠失、置換、挿入および／または付加を含み得る。さらに好ましくは、本願発明に用いるＴＣＲβは、Ｖβ領域のアミノ酸配列以外の位置において１個以上のアミノ酸の欠失、置換、挿入および／または付加を含み得る。上記のアミノ酸の欠失、置換、挿入および／または付加は、合計で、例えば1〜50個、1〜40個、1〜39個、1〜38個、1〜37個、1〜36個、1〜35個、1〜34個、1〜33個、1〜32個、1〜31個、1〜30個、1〜29個、1〜28個、1〜27個、1〜26個、1〜25個、1〜24個、1〜23個、1〜22個、1〜21個、1〜20個、1〜19個、1〜18個、1〜17個、1〜16個、1〜15個、1〜14個、1〜13個、1〜12個、1〜11個、1〜10個、1〜9個（1〜数個）、1〜8個、1〜7個、1〜6個、1〜5個、1〜4個、1〜3個、1〜2個または１個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列であり得る。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の数は、一般的に小さい程好ましい。さらにまた、本願発明に用いるＴＣＲαについても、上記と同様に１個以上のアミノ酸の欠失、置換、挿入および／または付加を含み得る。より具体的には、本願発明に用いるＴＣＲαは、ＣＤＲ３以外の位置において１個以上のアミノ酸の欠失、置換、挿入および／または付加を含み得る。より好ましくは、本願発明に用いるＴＣＲαは、ＣＤＲ１〜３以外の位置において１個以上のアミノ酸の欠失、置換、挿入および／または付加を含み得る。さらに好ましくは、本願発明に用いるＴＣＲαは、Ｖα領域以外の位置において１個以上のアミノ酸の欠失、置換、挿入および／または付加を含み得る。ただし、これら組換えＴＣＲαおよびＴＣＲβはいずれも、組み合せてＴＣＲを形成する場合に、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性であり、配列番号６のアミノ酸配列を有するＴＣＲβおよび配列番号１２のアミノ酸配列を有するＴＣＲαを含むＴＣＲと実質的に同等のＴＣＲ活性を有する。好ましくは、本願発明に係るＴＣＲは、配列番号３および配列番号９のアミノ酸配列を含むものであり、より好ましくは配列番号４及び配列番号１０のアミノ酸配列を含むものであり、さらに好ましくは配列番号６及び配列番号１２を含む。また、本願発明に係るＴＣＲは、配列番号１４に記載されるポリペプチドより生成され得る。
【００３５】
また、本願発明に係るＴＣＲを形成するタンパク質は、上記の免疫応答能力を維持する限り、必要に応じてアミノ酸配列を適宜改変することも可能である。タグ等のタンパク質断片を、例えばＮ末端またはＣ末端に含み得る。このようなタグの例としては、Ｈｉｓ残基が４個〜８個、好ましくは６個連続すするＨｉｓタグ（USP 4,569,794など）、Ｆｌａｇタグ（Sigma-Aldrichなど）、ＨＡタグ（Clontechなど）、c-mycタグ（Clontechなど）、ＧＳＴタグ（Clontechなど）などの公知のものが挙げられる。これらタグは、１〜１５個のアミノ酸を含むリンカーを介して上記ＴＣＲα又はＴＣＲβと連結することができる。さらに本願発明のＴＣＲは、本願発明の目的である上記の免疫応答能力を維持する限り、公知のリンカーを用いてＴＣＲαとＴＣＲβとが連結された状態で発現されてもよい。このようなリンカーの例としては、２Ａペプチドのような翻訳後に自己切断されるリンカー（Szymczakら、Nat Biotechnol 22:589-594, 2004、非特許文献７）、一本鎖抗体やCARTなどで用いられる非切断型のリンカーなどが挙げられる。２Ａペプチドとしてはporcine teschovirus-1由来のＰ２Ａペプチド、thosea asigna virus由来のＴ２Ａペプチド、equine rhinitis A virus由来のＥ２Ａペプチド等が例示される。例えば、本願発明に係る配列番号１６に記載されるポリペプチドは、Ｐ２Ａペプチドを含有しており、翻訳後に自己切断されてＴＣＲαおよびＴＣＲβを生成する。
【００３６】
本発明のタンパク質（ポリペプチド）において相互に置換可能なアミノ酸残基の例を以下に示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、o-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン；
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸；
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン；
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸；
Ｅ群：プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン；
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン；
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン。
【００３７】
また、本願発明において用いられる好ましいポリヌクレオチドとしては、上記の種々のアミノ酸配列を有するＴＣＲαおよびＴＣＲβをコードする種々のポリヌクレオチドが挙げられる。このようなＴＣＲαおよびＴＣＲβのポリヌクレオチドの最も好ましい例として、それぞれ配列番号５および１１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。例えば、本願発明の実施において、宿主細胞が保有するＴＣＲをコードするポリヌクレオチドとの差別化等の理由により、本願発明に係るＴＣＲ（αおよびβ）をコードする各ヌクレオチド配列を改変できる。このようなポリヌクレオチドの例としては、例えば、配列番号５または１１のポリヌクレオチド配列において、１個以上（例えば、1〜50個、1〜40個、1〜30個、1〜25個、1〜20個、1〜15個、1〜10個、1〜9個（1〜数個）、1〜8個、1〜7個、1〜6個、1〜5個、1〜4個、1〜3個、1〜2個、1個など）のヌクレオチドの欠失、置換、挿入および／または付加（またはこれらの組合せ）を有するポリヌクレオチドが挙げられる。ただし、これら改変したポリヌクレオチドは、好ましくは改変する前と実質的に同等のＴＣＲ活性を有するポリペプチドをコードするものであり、より好ましくは改変する前と同じポリペプチドをコードするものである。また、本発明に係るポリヌクレオチドは、発現させる種におけるコドン優先度を考慮してヌクレオチドを適宜改変することもできる。
【００３８】
本願発明において適宜利用されるアミノ酸置換またはヌクレオチド置換は、当業者に公知である種々の遺伝子操作技術を用いて作製することができる。このような遺伝子操作手順については、例えば、Molecular Cloning 3rd Edition, J.Sambrook et al.,Cold Spring Harbor Lab. Press. 2001、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997などを参照することができる。
【００３９】
上記のアミノ酸配列やポリヌクレオチド配列の同一性または相同性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムBLAST（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264-2268,1990； Proc. Natl. Acad. Sci USA 90: 5873, 1993）を用いて決定できる。BLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTNやBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403,1990）。本願発明においてBLASTNを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターとしてscore＝100、wordlength＝12を用いるものとする。また、BLASTXを用いてアミノ酸配列を解析する場合、パラメーターとしてscore＝50、wordlength＝3を用いるものとする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
【００４０】
本願発明に係る組換えＴＣＲとして利用可能である、さらなるＴＣＲのアミノ酸配列又はヌクレオチド配列は、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）に起因する疾患、例えはＡＴＬに罹患した患者より採取したＴＣＲを解析すること、又はＴＣＲレパトア解析等の公知の方法によって取得することができる（特開2013-176373など）。ＴＣＲレパトア解析において、目的の抗原に応答するＴＣＲを有する細胞集団から、各細胞のＴＣＲ（ＴＣＲα及びＴＣＲβ）をコードするヌクレオチド配列（遺伝子上のＶ領域、Ｄ領域、Ｊ領域、Ｃ領域のヌクレオチド配列）の配列決定を網羅的に行って、体内における利用頻度、存在期間、抗原結合性等の各種パラメーターを考慮して、適切なＴＣＲを選定して利用することが可能である。
【００４１】
３．本願発明の組換えリンパ球及びその調製方法
本願発明は、本願発明の上記の組換えＴ細胞レセプターを有するリンパ球に係るものである。好ましくは当該リンパ球はヒト由来のＣＤ８＋Ｔ細胞であり、より好ましくはＨＬＡ−Ａ２４を有するＣＤ８＋Ｔ細胞であり、さらに好ましくはＨＬＡ−Ａ＊２４０２を有するヒトＣＤ８＋Ｔ細胞である。このようなリンパ球は、例えば、Ｔ細胞に分化可能な細胞に対して、当該分野で公知の技法を用いて遺伝子組換えおよび分化誘導を行うことによって、単離して取得することができる（例えば、前出のCurrent Protocol、Molecular Cloningなど）。
【００４２】
本願発明は、一実施形態において組換えヒトリンパ球を提供する。本願発明において、１種類以上のＴＣＲを用いるために、１種以上のリンパ球を組み合わせて用いることができる。本願発明に係るリンパ球を調製する方法は、例えば、上記の本願発明の組換えＴ細胞レセプターをコードするポリヌクレオチドを対象の細胞に導入する工程、目的のＴＣＲを発現する細胞を選択する工程を含む。選択された細胞がＴＣＲ活性を備えることを確認する工程を含み得る。ここで、本願発明の組換えＴＣＲαおよびＴＣＲβをコードするポリヌクレオチドは、別々のプロモーター配列によって発現制御されてもよいし、ＩＲＥＳを用いるなどによって１種のプロモーター配列によって発現制御されてもよい。プロモーター配列は、前記のリンパ球において機能するものであれば特に限定はなく、哺乳動物由来のプロモーター（ＰＧＫプロモーター、ＥＦ１−αプロモーター、β−グロビンプロモーター等）やウイルス由来のプロモーター（ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＭＭＬＶ−ＬＴＲプロモーター、ＨＩＶ−ＬＴＲプロモーター等）が使用できる。本願発明の組換えＴＣＲαおよびＴＣＲβをコードするポリヌクレオチドは、種々の公知のベクター、例えばウイルスベクターに組み込むことができる。そのような公知のウイルスベクターとしては、レトロウイルス由来のベクター（例えば、レンチウイルス由来のベクター、具体例としてはＨＩＶ由来のベクター）、アデノウイルス由来のベクター、アデノ随伴ウイルス由来のベクターが挙げられるがこれらに限定されない。本願発明の組換えＴ細胞レセプターをコードするポリヌクレオチド（ＴＣＲαをコードするポリヌクレオチドおよび／またはＴＣＲβをコードするポリヌクレオチド）、ならびに前記ポリヌクレオチドが組み込まれたベクターは、いずれも本発明の一実施形態である。
【００４３】
本願発明において、長期にわたって安定して導入遺伝子を発現するために、好ましくはレトロウイルスに由来するウイルスベクターを用いる。本願発明に用いるウイルスベクターは、具体的には、Clontech社から市販されるpMSCVneo（カタログ番号：631461）、siTCRベクター（WO 2008/153029、WO 2012/157742）などの公知のプラスミドベクターを用いて調製できる。siTCRベクターにはヒトＴＣＲα鎖、β鎖の発現を抑制するｓｉＲＮＡ発現ユニットが搭載されている。このｓｉＲＮＡはヒトＴＣＲα鎖、β鎖のｍＲＮＡの、定常領域をコードする部分の塩基配列の一部を標的として認識する。本願発明の組換えＴ細胞レセプターをコードするポリヌクレオチドについて、コードされているアミノ酸配列を変えることなくｓｉＲＮＡの標的となる塩基配列を変更したうえでsiTCRベクターに組み込むことができる。こうして作製されたウイルスベクターで遺伝子導入された細胞では、内在性のＴＣＲ発現は抑制され、本発明の組換えＴ細胞レセプターが優勢に発現される。これらプラスミドベクターから組換え遺伝子を収容したウイルスベクターを調製する方法もまた公知であり、例えばpMSCVneoの場合は、公知のパッケージング細胞PG13（ATCC：CRL-10686）を用いることができる。あるいは、例えば組換えウイルスの構造タンパク質を発現するためのパッケージングプラスミドと一緒に上記レトロウイルスベクターを培養細胞（293T細胞など）に導入して組換えウイルスを調製することもできる。得られた組換えウイルス粒子を、目的のＴ細胞に分化可能な細胞に感染させることによって、目的の組換えＴＣＲαおよびＴＣＲβを発現する組換えリンパ球が得られる。必要な場合、得られた組換えリンパ球を増殖させ分化せることによって、必要量のＣＤ８＋ＣＴＬを得ることができる。
【００４４】
本願発明の組換えリンパ球は、不要な免疫応答（例えば移植拒絶）を避けるため、治療対象となる患者から採取した細胞に対して遺伝子組換えを行うことによって得ることも可能である。代替として、造血幹細胞の移植の場合と同様に、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤＲの４つ（４座８抗原）の一致、および各対立遺伝子（＊を付される）の数などを考慮した上で、治療対象とは異なるヒト個体から採取したリンパ球を用いて得ることも可能である。
【００４５】
本願発明の一実施形態において、ＣＤ８＋ＣＴＬに分化可能な細胞を用いて本願発明に係るリンパ球を調製する方法が提供される。さらに本願発明に係る方法において、上記の細胞に対して、遺伝子導入操作を行って本願発明に係る組換えＴＣＲを発現させる工程、組換えＴＣＲを発現する成熟ＣＤ８＋ＣＴＬを得る工程を含む方法が提供される。必要な場合、組換えＴＣＲを発現する成熟ＣＤ８＋Ｔ細胞を得るために、細胞を分化させる工程を含み得る。本願発明に用いるＣＤ８＋ＣＴＬに分化可能な細胞の供給源は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物であり、好ましくはヒトであり、さらに好ましくはＨＬＡ−Ａ２４を有するヒトであり、さらにより好ましくはＨＬＡ−Ａ＊２４０２を有するヒトであり、最も好ましくはＨＬＡ−Ａ＊２４０２を有する治療対象であるヒト患者である。これら供給源のより具体的な細胞としては、造血幹細胞、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、骨髄細胞（ＢＭ）、リンパ球系共通前駆細胞、Ｔ細胞前駆細胞（ナイーブＴ細胞）、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞、および成熟ＣＤ８＋Ｔ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。上記の各細胞に組換え遺伝子を導入して発現させる方法は公知であり、例えば、前出のCurrent Protocol、Molecular Cloning等に記載の方法が挙げられる。
【００４６】
ＣＤ８＋ＣＴＬに分化可能な細胞をインビトロでＣＤ８＋ＣＴＬに分化させる方法もまた公知であり、例えば、特開平5-336960、特許文献２などに記載の方法が挙げられる。例えば、Ｔ細胞又はその前駆細胞に対して予備刺激を行うことができる。この予備刺激の具体的な通常の手順の例としては、ＣＤ３リガンドの存在下にＴ細胞又はその前駆細胞、あるいはこれらを含む細胞集団を培養する手順が挙げられる。ＣＤ３リガンドとしては、抗ＣＤ３抗体、ＰＨＡ、ＰＭＡ＋イオノマイシンなどが公知である。刺激後の分化した細胞は、フローサイトメーター等の公知の細胞分離手段を用いて分離して、目的のリンパ球である組換えＣＴＬを得ることができる。
【００４７】
４．本願発明の医薬組成物
本願発明は、一実施形態において、本願発明に係る組換えリンパ球を含む医薬組成物を提供する。本願発明の医薬組成物は、本願発明に用いることができる上記の組換えＴＣＲを発現する、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）である組換えリンパ球を含む。また、本願発明の医薬組成物は、本願発明に係る組換えリンパ球に加えて、ビヒクルを含み得る。ビヒクルは組換えリンパ球細胞に対して等張性であり薬学的に許容可能であることが好ましい。そのようなビヒクルの例として、生理食塩水、リンゲル液などが挙げられる。さらに本願発明の組成物は、必要に応じて、保存剤、着色剤などの公知の薬学的に許容可能な添加物を含むことができる。
【００４８】
本願発明の医薬組成物は、好ましくはＴ細胞輸注療法において用いられる。このＴ細胞輸注療法は、一般的には、(1)患者から血液や骨髄中に含まれるリンパ球（腫瘍浸潤リンパ球、末梢血リンパ球を含む）を採取する工程、（2）採取したリンパ球を体外で培養する工程（抗原、サイトカインで刺激する）、(3)腫瘍細胞特異的Ｔ細胞を増殖させる工程、(4)前処置として患者の体内リンパ球を除去する工程、(5)増殖した腫瘍細胞特異的Ｔ細胞を患者に輸注する工程、を含み得る。Ｔ細胞輸注療法の公知の例として、転移性悪性黒色腫瘍に関するMART-I、大腸がんに関するCEAまたはHer2/neu、転移性悪性黒色腫用等に関するMAGE-A3、慢性リンパ性白血病等に関するCD19、濾胞性リンパ腫等に関するCD20を標的としたＴ細胞輸注療法の臨床例が報告されている（実験医学2013年Vol.31、No.12(増刊)、179(2003)-184(2008)頁、実験医学 2015年Vol.33、No.14、2201〜2209頁）。
【００４９】
Ｔ細胞輸注療法における(1)患者から血液や骨髄中に含まれるリンパ球を採取する工程として、例えば、全血サンプルから末梢血単核球（Peripheral Blood Mononuclear Cell; PBMC）を、Ficoll を用いた密度勾配遠心分離によって分離し取得する方法が挙げられる。およそ血液１ｍＬから１０６個以上のＰＢＭＣを取得することが可能であり、操作の点から１×１０１０個を採取目標とする場合もあるが、これ以外の公知の数が用いられても。また、細胞表面マーカー（ＣＤ８など）に対する抗体および磁気ビーズを用いて、目的のリンパ球を単離する方法も公知である（STEMCELL TECHNOLOGIES社、カタログ番号ST-18000など）。
【００５０】
また、上記工程(4)の前処置は、Ｔ細胞輸注の効果を高めるために行われる。治療効果が向上する一例として、輸注療法単独によるレスポンスレートが約４０％、骨髄非破壊的前処置を加えることによって約５０％、全身照射を含めた骨髄破壊性前処置を加えることによって約７０％に向上し得る。この前処置の程度は、本来の造血機能が低下することとのバランスが医師によって検討される必要がある。また、組換えＴＣＲを用いる場合、体内でのネガティブセレクションを経ていない自己応答性のＴＣＲが細胞表面に元から存在し得ること、抗原が自己のものと交差反応性を有することなどに起因して、副作用が生じ得ることが公知である。
【００５１】
Ｔ細胞輸注療法における代替の手順として、標的に特異的なリンパ球を遺伝子組み換えによって調製する方法も存在する（実験医学2013年Vol.31、No.12(増刊)、179(2003)-184(2008)頁、実験医学 2015年Vol.33、No.14、2201〜2209頁）。例えば、採取した血液中に目的の腫瘍細胞特異的リンパ球が存在しないか非常に少ないなどの場合に有用である。この手順の概要としては、例えば、上記工程(2)及び(3)の代替として、（2’）組換えＴＣＲをコードする遺伝子を導入する工程、(3’)遺伝子組換えＴＣＲを発現する腫瘍細胞特異的Ｔ細胞を増殖させる工程、を含み得る。本願発明の背景の項において説明したとおり、移植後に移植片対宿主病（ＧＶＨＤ、ドナー免疫細胞が患者臓器を攻撃する合併症）を発症する可能性を考慮して、好ましくは患者から採取した細胞を用いるのが最適であるが、場合によっては、ＨＬＡ適合性の他人から採取した細胞を使うことも可能である。また、ＴＣＲをキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に代替する方法も公知であり（Eshharら、Proc Natl Acad Sci USA 90: 720-724, 1993）、実際の治験に利用されている。
【００５２】
本発明の医薬組成物の投与量は特に限定されず、疾患の種類、患者の年齢や症状、投与経路、治療の目的、併用薬剤の有無等の種々の条件に応じて適切な投与量を選択することが可能である。本発明の医薬組成物の投与量は、例えば、成人（例えば、体重60kg）に対して、１回当たり１０５〜１０８個、好ましくは１０６〜１０７個、より好ましくは１０６個の本願発明に係る組換えリンパ球（すなわち、ＣＤ８＋ＣＴＬ）を患者に注射することによって投与できる。投与頻度は、投与される患者の全体的な健康状態を考慮して担当の医師が適宜決定できる。具体的な投与頻度として、単回投与、１〜４週間間隔もしくは毎週１〜２回で合計２〜５回の反復投与などが挙げられる。また、ドナー・リンパ球（ＤＬＩ）輸注療法に準じた公知の用量、投与頻度を用いることもできる。
【００５３】
５．本願発明のその他の用語について
本明細書中に用いられる各用語が示す意味は以下のとおりである。本明細書中、特には説明されない用語については、当業者が通常理解する用語が意味する範囲を指すことが意図される。
【００５４】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「核酸」、「遺伝子」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「ヌクレオチド配列」は、「核酸配列」または「塩基配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。例えば、「配列番号１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドまたはそのフラグメント」とは、配列番号１の各デオキシヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃおよび／またはＴによって示される配列を含むポリヌクレオチドまたはその断片部分が意図される。
【００５５】
本発明に係る「ウイルスゲノム」および「ポリヌクレオチド」は各々、DNAの形態（例えば、cDNAまたはゲノムDNA）で存在し得るが、場合によってはRNA（例えば、mRNA）の形態であってもよい。本明細書において使用されるウイルスゲノムおよびポリヌクレオチドは各々、二本鎖または一本鎖のDNAであり得る。一本鎖DNAまたはRNAの場合、コード鎖（センス鎖としても知られる）であっても、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であってもよい。
【００５６】
本明細書において、「タンパク質」と「ポリペプチド」とは相互に交換可能に用いられ、アミノ酸の重合体が意図される。本明細書において使用されるポリペプチドは、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。本発明のポリペプチドの部分ペプチド（本明細書中、本発明の部分ペプチドと略記する場合がある）としては、前記した本発明のポリペプチドの部分ペプチドで、好ましくは、前記した本発明のポリペプチドと同様の性質を有するものである。また、本出願において、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）タンパク質を表す場合にＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）とのみ記載することもある。
【００５７】
本明細書において、用語「プラスミド」は、種々の公知の遺伝子要素、例えば、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体等を意味する。プラスミドは特定の宿主において複製することができ、そして細胞間で遺伝子配列を輸送できる。本明細書において、プラスミドは、種々の公知のヌクレオチド（DNA、RNA、PNAおよびその混合物）を含み、一本鎖であっても二本鎖であってもよいが、好ましくは二本鎖である。本発明において使用されるプラスミドは、直鎖状であっても環状であってもよい。
【実施例】
【００５８】
以下、本願発明に係る実験例及び実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実験例又は実施例に限定されるものではない。
【００５９】
（１）ＨＴＬＶ−１  Ｔａｘ特異的ＣＴＬクローンＰＤＲ＋ＣＴＬの同定とそのＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）α鎖及びβ鎖の遺伝子配列の決定
同種造血幹細胞移植を施行したＨＬＡ−Ａ＊２４０２を有する成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）患者あるいはＨＴＬＶ−１無症候性キャリア健常人（ＡＣ）から採取した末梢血サンプルから、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性Ｔａｘ３０１−３０９ペプチド（ＳＦＨＳＬＨＬＬＦ）／ＨＬＡテトラマー試薬を用いてＨＴＬＶ−１  Ｔａｘ特異的ＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）をフローサイトメトリーで同定した。
【００６０】
同定したＴａｘ特異的ＣＴＬ（Ｔａｘ−ＣＴＬ）集団をセルソーター（ＦＡＣＳ  ＡｒｉａＩＩ）で一細胞ずつＰＣＲチューブ中に単離し、ＴＣＲβ鎖Ｃ領域特異的プライマー（ＢＣ−ｐｒｉｍｅｒ）（配列番号４０）及びＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  逆転写酵素等を含む反応用緩衝液を用いて逆転写反応を行い、１細胞ごとにＴＣＲβ鎖のｃＤＮＡを合成した。
【００６１】
次に、得られたｃＤＮＡを鋳型として、２４種類のＴＣＲ−β鎖Ｖ遺伝子領域特異的プライマー群（配列番号１６〜３９）と３’ＢＣ−ｐｒｉｍｅｒ（配列番号４１）、３’ＢＣ−ｐｒｉｍｅｒより上流に設定したＴＣＲ−β鎖Ｃ領域特異的プライマー（５’ＢＣ−ｐｒｉｍｅｒ）（配列番号４２）を用いて、合計７５サイクルのＰＣＲ反応を行い、ＴＣＲ−β鎖の相補性決定領域３（ＣＤＲ３）の遺伝子を増幅させた。ＰＣＲ反応は、９５℃で２分間保持後に、９４℃で４５秒（変性）、５７℃で４５秒（アニーリング）、７２℃で５０秒（伸長）のサイクルで行った。その他の詳細な条件及び結果などについては、Yukie Tanaka-Harada et al.( Cancer Sci. 2010 Mar; 101(3):594-600. doi: 10.1111/j.1349-7006.2009.01453.x. Epub 2009 Dec 4)も参照のこと。
用いたプライマー群の各配列及び用いた５’側プライマー混合物（Ｓ１〜Ｓ８）を下記表１に示す。
【表１】
2018070540.tif 000002
【００６２】
ＰＣＲ反応で増幅後のｃＤＮＡに特異的なＶ遺伝子プライマーを用いて、自動ＤＮＡシークエンサーでＤＮＡ遺伝子解析を行い、単細胞レベルでＴＣＲ−β鎖ＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を決定した。このような単細胞レベルでのＴａｘ３０１−３０９特異的ＣＴＬのＴＣＲレパトア解析を、１サンプルにつき１２０細胞程度、ＡＴＬ患者及びＡＣ複数例で行った。
【００６３】
解析の結果、ＴＣＲ−β鎖ＣＤＲ３領域にＰ（プロリン）−Ｄ（アスパラギン酸）−Ｒ（アルギニン）という特徴的アミノ酸配列を持つＴａｘ−ＣＴＬが、Ｔａｘ３０１−３０９特異的ＣＴＬのＴＣＲβ鎖に含まれている事が判明した。
【表２】
2018070540.tif 000003
【００６４】
さらに、上記ＨＴ−９由来のＴａｘ−ＣＴＬ（ＰＤＲ＋ＣＴＬ）クローンを細胞培養によって樹立した。樹立後のＰＤＲ＋ＣＴＬクローンからＲＮＡを抽出後、５’ＲＡＣＥ法にてＴＣＲα及びβ鎖全長遺伝子をクローニングし、各４８クローンずつシークエンス解析を行い、ＰＤＲ＋ＣＴＬのＴＣＲα鎖及びβ鎖の遺伝子配列を決定し（α鎖：配列番号１１；β鎖：配列番号５）、ＴＣＲα鎖及びβ鎖のアミノ酸配列を決定した（α鎖：配列番号１２；β鎖；配列番号６）。
【００６５】
（２）ＰＤＲ＋ＣＴＬのＴＣＲ遺伝子導入細胞の作成
まず、非特許文献７（Okamotoら、2012）に記載されるpSplice-b2Aa-siTCRを使用して本願発明に係る組換えＴＣＲ発現レトロウイルスベクタープラスミドを以下の手順により構築した。構築に使用したpSplice-b2Aa-siTCRの概要は以下のとおりである（非特許文献７より）。
【化１】
2018070540.tif 000004
（Ψ：パッケージングシグナル、5’LTR：マウス白血病ウイルスMLV由来のもの、3’LTR：マウス幹細胞ウイルスMSCV由来のもの、SD:スプライシングドナー、SA：スプライシングアクセプター、siRNA：低分子干渉RNA、P2A：-SGSG-リンカーペプチド＋T2Aペプチド、TCRα/β：TCRα/β鎖）
ＨＴ−９由来のＴａｘ−ＣＴＬクローン細胞（以下、ＰＤＲ＋ＣＴＬ）が発現するＴＣＲα及びＴＣＲβの全長ｃＤＮＡを以下の手順でクローニングした。当該クローン細胞から全ＲＮＡを採取し、市販のキット（CapFishing Full-length cDNA Premix kit：SeeGeen社、K2000）及び逆転写酵素を用いて、当該キットに添付の手順書に従って、５’末端にアダプター配列を含むｃＤＮＡライブラリーを合成した。得られたｃＤＮＡライブラリーをテンプレートとして、５’末端のアダプター配列のプライマー（前記キットに添付のもの）と、ＴＣＲα／βのＣ末側と対応するプライマーである３−ＴＲａ−Ｃ、３−ＴＲｂ−Ｃ１または３−ＴＲｂ−Ｃ２（それぞれ配列番号４３〜４５）とを組み合わせてＰＣＲ反応を行い、ＴＣＲα及びＴＣＲβＣ２のＰＣＲ産物をＴＡクローニングベクターにクローニングし、ヌクレオチド配列決定を行って、目的のＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の全長ｃＤＮＡを得た（それぞれ配列番号１１および配列番号５）。
得られたｃＤＮＡの可変領域部分(Ｖ領域、すなわちV(D)JセグメントまたはVJセグメント)を、ＭＡＧＥ−Ａ４特異的ＴＣＲ遺伝子が搭載されたpSplice-b2Aa-siTCR（非特許文献７）の該当する部分に挿入し、さらに、pSplice-b2Aa-siTCRのT2Aペプチドをコードする配列をporcine teschovirus-1由来のP2Aペプチドをコードする配列に置換して本願発明のＴＣＲα及びＴＣＲβを発現するためのベクターpMu1-HTLV-Tax-siTCRを得た。
次に、得られたpMu1-HTLV-Tax-siTCRをＰＧ１３細胞に３回感染させてｐｒｏｄｕｃｅｒ細胞を作製し、このｐｒｏｄｕｃｅｒ細胞より取得した組換えＧａｌｖレトロウイルスを健常ドナー由来のＰＢＭＣに感染させ、本願発明に係るＴａｘ301-309特異的ＴＣＲ遺伝子導入リンパ球（以下、ＰＤＲ＋ＣＴＬともいう）を作成した。
【００６６】
（３）ＰＤＲ＋ＣＴＬのＴａｘ認識能とＨＴＬＶ−１  Ｔａｘ特異的なサイトカイン産生能
ＴａｘペプチドとＨＬＡ分子の複合体との４量体であるＴａｘテトラマーに対するＣＴＬの結合反応を利用して、上記（２）から得られた本願発明に係るＰＤＲ＋ＣＴＬのＴａｘペプチド−ＨＬＡ複合体の認識能を評価した。使用したテトラマーの構成は、Ｔａｘ３０１〜３０９アミノ酸（SFHSLHLLF）を含むものである。２名の健常人ドナーから得られたＰＢＭＣより作成したＰＤＲ＋ＣＴＬについて、蛍光標識されたＴａｘテトラマー及び抗ＣＤ８抗体を使用したフローサイトメトリーによってテトラマー陽性細胞、ＣＤ８陽性細胞それぞれの存在率を測定した。その結果、両ドナー由来のＰＤＲ＋ＣＴＬにおける「テトラマー陽性かつＣＤ８陽性」の細胞の存在比率はそれぞれ５６．８％、７０、９％であった。また、ＣＤ８陽性細胞画分におけるテトラマー陽性細胞の比率はそれぞれ７５．３％、８１．３％となった。陰性対照として測定に供した、ウイルスを感染させていないＰＢＭＣではテトラマーとの結合は認められなかった。この結果、ＰＤＲ＋ＣＴＬがＴａｘ３０１−３０９ペプチドとＨＬＡ分子との複合体に結合可能なＴＣＲを発現していることを確認した。
次に、Ｔａｘ特異的なサイトカイン産生能を評価するために、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２であるＡＴＬ患者由来のＨＴＬＶ−１感染細胞と、上記（２）で得たＰＤＲ＋ＣＴＬとを加えて、ＩＦＮ−γの産生をＥＬＩＳＡで評価した。
上記の評価実験の結果、本願発明に係るＰＤＲ＋ＣＴＬは、ＨＴＬＶ−１感染細胞の表面抗原複合体（すなわちＴａｘ３０１−３０９ペプチドとＨＬＡ分子との複合体）に結合する能力、この抗原複合体に依存してＩＦＮ−γを産生する能力を有することを確認した。
【００６７】
（４）Ｔａｘ特異的ＴＣＲ遺伝子導入細胞を用いた免疫療法のｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験
標的細胞（ＭＴ−２（ＨＴＬＶ−１感染細胞株：Ａ２４＋）、ＭＴ−４（ＨＴＬＶ−１感染細胞株：Ａ２４−）、患者細胞（Ａ２４＋：２種、Ａ２４−：１種））をカルセイン染色した後、（２）で作成したＴａｘ特異的ＴＣＲ遺伝子導入細胞（ＰＤＲ＋ＣＴＬ）、または陰性コントロール細胞を加えて６時間共培養した後、テラスキャンシステム（テラスキャンＶＰＣ２）で蛍光強度を自動測定し、標的細胞に対する細胞傷害性を評価した（図１）。
図１に示すとおり、本願発明に係るＰＤＲ＋ＣＴＬは、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２陽性であるＨＴＬＶ−１感染細胞ＭＴ−２、及びＨＬＡ−Ａ＊２４０２陽性である患者細胞に特異的に細胞傷害性を示すことを確認した。
【００６８】
（５）Ｔａｘ特異的ＴＣＲ遺伝子導入細胞を用いた免疫療法のｉｎ  ｖｉｖｏ実験
６週齢のＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ，ＩＬ−２ＲγＫＯ（ＮＯＧ）マウスにＨＬＡ−Ａ＊２４０２陽性ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）遺伝子導入ＨＴＬＶ−１感染細胞株（ＬＵＣ＋ＭＴ２）１×１０６個を腹腔内注射する。その３週後、マウス体内でＬＵＣ＋ＭＴ２が増殖していることを確認した（図２：day0）。治療の開始を、上記（２）のＰＤＲ＋ＣＴＬあるいは陰性コントロール細胞を２×１０６個ずつ毎週１回繰り返し尾静脈から投与して行った（合計４回）。腫瘍浸潤の経過、あるいは投与されたＰＤＲ＋ＣＴＬによる抗腫瘍効果等のマウス生体内での様子を、ｉｎ  ｖｉｖｏイメージング（ＩＶＩＳ）で体外からモニタリングした。同時に末梢血中の免疫細胞分画などの評価を、尾静脈より採血後、フローサイトメーター（ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｆｕｓｉｏｎ）で解析した（図２：day7〜day35）。
この実験の結果、本願発明に係るＰＤＲ＋ＣＴＬを注射したマウスにおいて、腫瘍細胞の増殖を抑えて宿主の長期生存が可能であること、腫瘍の縮退や完治もまた見込めることが示された（図２：day35など）。したがって、本願発明のＣＴＬは、ＡＴＬの輸注療法において高い有効性を有することを実証した。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本願発明は、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）に起因する疾患、特に成人Ｔ細胞性白血病に対する、安全かつ有効である新規の医薬組成物、この医薬組成物を用いる治療法、特にＴ細胞輸注療法を提供することができる。本願発明に係るＨＬＡ−Ａ＊２４０２拘束性を有するＡＴＬ患者は、日本では最もコモン（約６０％）であり、さらに、アジア諸国ではパプア・ニューギニアを中心としたオセアニア地域のメラネシア人の間にも ＨＴＬＶ−１キャリアが観察されている。よって、本願発明は、日本および海外においても、成人Ｔ細胞性白血病の治療のための安全かつ有効である医薬組成物を提供することが可能である。
【配列表フリーテキスト】
【００７０】
配列番号１：HT-9のβ鎖CDR1アミノ酸配列
配列番号２：HT-9のβ鎖CDR2アミノ酸配列
配列番号３：HT-9のβ鎖CDR3アミノ酸配列
配列番号４：HT-9のＶβ領域のアミノ酸配列
配列番号５：HT-9のＴＣＲβ全長のｃＤＮＡ配列
配列番号６：HT-9のＴＣＲβ全長のアミノ酸配列
配列番号７：HT-9のα鎖CDR1アミノ酸配列
配列番号８：HT-9のα鎖CDR2アミノ酸配列
配列番号９：HT-9のα鎖CDR3アミノ酸配列
配列番号１０：HT-9のＶα領域のアミノ酸配列
配列番号１１：HT-9のＴＣＲα全長のｃＤＮＡ配列
配列番号１２：HT-9のＴＣＲα全長のアミノ酸配列
配列番号１３：ＴＣＲβ−Ｐ２Ａ−ＴＣＲαポリペプチドのｃＤＮＡ配列
配列番号１４：ＴＣＲβ−Ｐ２Ａ−ＴＣＲαポリペプチドのアミノ酸配列
配列番号１５：Ｔａｘ３０１〜３０９のアミノ酸配列
配列番号１６：プライマー１/２：TRBV9/TRBV5
配列番号１７：プライマー３：TRBV25
配列番号１８：プライマー４：TRBV10
配列番号１９：プライマー５：TRBV20
配列番号２０：プライマー６：TRBV28
配列番号２１：プライマー７：TRBV2
配列番号２２：プライマー８：TRBV29
配列番号２３：プライマー９：TRBV7
配列番号２４：プライマー１０：TRBV27
配列番号２５：プライマー１１：TRBV7
配列番号２６：プライマー１２：TRBV12
配列番号２７：プライマー１３：TRBV11
配列番号２８：プライマー１４：TRBV19
配列番号２９：プライマー１５：TRBV30
配列番号３０：プライマー１６：TRBV4
配列番号３１：プライマー１７：TRBV3
配列番号３２：プライマー１８：TRBV18
配列番号３３：プライマー１９：TRBV21
配列番号３４：プライマー２０：TRBV14
配列番号３５：プライマー２１：TRBV23
配列番号３６：プライマー２２：TRBV6
配列番号３７：プライマー２３：TRBV24
配列番号３８：プライマー２４：TRBV13
配列番号３９：プライマー２５：TRBV15
配列番号４０：プライマー２６：BC
配列番号４１：プライマー２６：3’BC
配列番号４２：プライマー２７：5’BC
配列番号４３：ＴＣＲα用 ３−ＴＲａ−Ｃ
配列番号４４：ＴＣＲβＣ１用 Ｃ−ＴＣｂ−Ｃ１
配列番号４５：ＴＣＲβＣ２用 Ｃ−ＴＲｂ−Ｃ２
【図１】
2018070540.tif 000005
【図２】
2018070540.tif 000006
【配列表】
2018070540000001.app