(57)【要約】      （修正有）【課題】臓器同種移植片拒絶反応の治療など自己免疫疾患およびこれに関連する障害の治療に利用される、６つの鎖を有する多タンパク質複合体として知られるＣＤ３に結合する、先行技術のＣＤ３結合ポリペプチドと比較して向上した特性を有するＣＤ３結合ポリペプチドの提供。【解決手段】特定の配列からなるアミノ酸配列を有する結合ドメインの等電点と比較して少なくとも約０．２５単位、等電点が低下したＣＤ３結合ドメインを含み、前記ＣＤ３結合ドメインがヒト化されたＶＨ領域とヒト化されたＶＬ領域とを含み、前記ヒト化されたＶＨ領域と前記ヒト化されたＶＬ領域とがフレームワーク領域を含み、かつ前記ＶＨ領域が特定の配列からなるアミノ酸配列と約９０％から約１００％未満一致するアミノ酸配列を含むＣＤ３結合ポリペプチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ３結合ポリペプチドであって、配列番号４１のアミノ酸配列を有する結合ドメインの等電点と比較して少なくとも約０．２５単位、等電点が低下したＣＤ３結合ドメインを含み、
前記ＣＤ３結合ドメインがヒト化されたＶＨ領域とヒト化されたＶＬ領域とを含み、前記ヒト化されたＶＨ領域と前記ヒト化されたＶＬ領域とがフレームワーク領域を含み、かつ前記ＶＨ領域が配列番号２６または配列番号２６と約９０％から約１００％未満一致するアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ領域が配列番号３４または配列番号３４と約９０％から約１００％未満一致するアミノ酸配列を含む、
ＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項２】
前記ＶＨ領域が配列番号２８を含む、請求項１に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項３】
２個以上のアミノ酸が、正荷電アミノ酸を中性アミノ酸で置換することおよび／または中性アミノ酸を負荷電アミノ酸で置換することによって、ＶＨおよび／またはＶＬのフレームワーク領域内で修飾されている、請求項１に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項４】
前記フレームワーク領域の前記修飾されたアミノ酸が、対応するヒト生殖系列ＩｇＧ配列内に含まれるアミノ酸で置換されている、請求項３に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項５】
前記ヒト生殖系列ＩｇＧ配列が配列番号４３を含む、請求項４に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項６】
前記ヒト生殖系列ＩｇＧ配列が配列番号４４を含む、請求項４に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項７】
プレヒンジ領域をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項８】
前記プレヒンジ領域が、ＲＲＴプレヒンジ領域を有するＣＤ３結合ポリペプチドと比較して低下した等電点を有する、請求項７に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項９】
フレームワーク領域と、プレヒンジ領域と、ヒンジ領域とを有するＣＤ３結合ドメインを含む、ＣＤ３結合ポリペプチドであって、
前記ＣＤ３結合ドメインがヒト化されたＶＨ領域とヒト化されたＶＬ領域とを含み、前記ヒト化されたＶＨ領域と前記ヒト化されたＶＬ領域とがフレームワーク領域を含み、かつ前記ＶＨ領域が配列番号２６または配列番号２６と約９０％から約１００％未満一致するアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ領域が配列番号３４または配列番号３４と約９０％から約１００％未満一致するアミノ酸配列を含み、
配列番号４２と比較して修飾されたアミノ酸を３個以上有し、前記修飾が、フレームワーク領域および／またはプレヒンジ領域内の正荷電アミノ酸から中性アミノ酸への置換および／または中性アミノ酸から負荷電アミノ酸への置換であり、前記ＣＤ３結合ドメインが配列番号４１のアミノ酸配列を有する結合ドメインの等電点と比較して少なくとも約０．２５単位、等電点が低下したＣＤ３結合ドメインを含む、
ＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項１０】
少なくとも２個以上のアミノ酸が、正荷電アミノ酸を中性アミノ酸で置換することおよび／または中性アミノ酸を負荷電アミノ酸で置換することによって、ＶＨおよび／またはＶＬのフレームワーク領域内で修飾されている、請求項９に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項１１】
少なくとも４個以上のアミノ酸が、正荷電アミノ酸を中性アミノ酸で置換することおよび／または中性アミノ酸を負荷電アミノ酸で置換することによって、ＶＨおよび／またはＶＬのフレームワーク領域内で修飾されている、請求項３または９に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項１２】
３〜５個のアミノ酸が、正荷電アミノ酸を中性アミノ酸で置換することおよび／または中性アミノ酸を負荷電アミノ酸で置換することによって、ＶＨおよび／またはＶＬのフレームワーク領域内で修飾されている、請求項３または９に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項１３】
３〜１０個のアミノ酸が、正荷電アミノ酸を中性アミノ酸で置換することおよび／または中性アミノ酸を負荷電アミノ酸で置換することによって、ＶＨおよび／またはＶＬのフレームワーク領域内で修飾されている、請求項３または９に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項１４】
前記ＣＤ３結合ポリペプチドプレヒンジ領域がアミノ酸配列ＳＳＳまたはＳＳＴを含む、請求項８または９に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項１５】
ヒンジ領域と定常領域とをさらに含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項１６】
配列番号４のポリペプチドよりも実験的等電点が少なくとも１ｐＩ単位低い、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項１７】
ヒト化抗体、または一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である、請求項１に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項１８】
アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、前記ＣＤ３結合ドメイン、前記ヒンジ領域および前記定常領域を含む、請求項１５に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項１９】
アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、前記定常領域、前記ヒンジ領域および前記ＣＤ３結合ドメインを含む、請求項１５に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項２０】
第二の結合ドメインをさらに含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項２１】
アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、前記ＣＤ３結合ドメイン、前記ヒンジ領域、前記定常領域および前記第二の結合ドメインを含む、請求項２０に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項２２】
アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、前記第二の結合ドメイン、前記ヒンジ領域、前記定常領域および前記ＣＤ３結合ドメインを含む、請求項２０に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項２３】
ヘテロ二量体化ドメインをさらに含む、請求項１５に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項２４】
アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、前記ＣＤ３結合ドメイン、前記ヒンジ領域、前記定常領域および前記ヘテロ二量体化ドメインを含む、請求項２３に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項２５】
第二の結合ドメインをさらに含む、請求項１〜２４のいずれか１項に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項２６】
前記第二の結合ドメインが標的分子と相互作用し、前記ＣＤ３結合ポリペプチドがＴ細胞細胞傷害性を誘導する、請求項２５に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項２７】
前記第二の結合ドメインが腫瘍関連抗原と相互作用する、請求項２６に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項２８】
Ｔ細胞を誘導して腫瘍細胞を溶解させる、請求項２７に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項２９】
腫瘍近傍で多クローン性Ｔ細胞の活性化および拡大を誘導する、請求項２７に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項３０】
前記腫瘍関連抗原が、ＲＯＮ、ｃ−Ｍｅｔ、ＣＥＡＣＡＭ−６、ＰＳＭＡ、ＥｐＣＡＭ、ＣＥＡ、ＰＣＴＡ−１、ＳＴＥＡＰ−１、ＳＴＥＡＰ−２、ＰＳＣＡ、ＰＳＡ、ＰＡＰ、ＡＬＣＡＭ（ＣＤ１６６）、ＰＥＣＡＭ−１、ＥｐｈＡ２、ＣＤ１５１、ＣＡ−１２５／ＭＵＣ１６、ＭＵＣ−１、ＭＡＧＥ−１、ＴＲＯＰ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＴＧＦＢＲ２、ＧＨＲＨＲ、ＧＨＲ、ＩＬ−６Ｒ、ｇｐ１３０、ＴＮＦＲ２、ＯＳＭＲβ、Ｐａｔｃｈｅｄ−１、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ、Ｒｏｂｏ１、ＬＴβＲ、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ６３、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８６、ＣＤ１００、ＣＤ１５１、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ５、ＨＥＲ−２／ＥｒｂＢ１、ＨＥＲ−３／ＥｒｂＢ３、ＨＥＲ−４／ＥｒｂＢ４、ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ１、ＥＧＦＲｖＩＩＩアイソフォーム、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５ｂ、ＭＵＣ７、βｈＣＧ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、ガングリオシドＧＤ３、９−Ｏ−アセチル−ＧＤ３、ＧＭ２、Ｇｌｏｂｏ  Ｈ、フコシルＧＭ１、ポリＳＡ、ＧＤ２、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＭＮ／ＣＡ  ＩＸ）、ソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）、Ｗｕｅ−１、形質細胞抗原、膜結合ＩｇＥ、黒色腫コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、ＣＣＲ８、ＴＮＦ−α前駆体、メソテリン、Ａ３３抗原、Ｌｙ−６；デスモグレイン４、Ｅ−カドヘリンネオエピトープ、胎児アセチルコリン受容体、ＣＡ１９−９マーカー、ミュラー管抑制物質（ＭＩＳ）受容体ＩＩ型、ｓＴｎ（シアル化Ｔｎ抗原；ＴＡＧ−７２）、ＦＡＰ（線維芽細胞活性化抗原）、エンドシアリン、ＬＧ、ＳＡＳ、ＢＣＭＡ、ＴＷＥＡＫＲ／Ｆｎ１４、ＦＧＦＲ４、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＳＳＸ１およびＳＳＸ２からなる群より選択される、請求項２７〜２９のいずれか１項に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項３１】
Ｔ細胞上のＴ細胞受容体複合体のＣＤ３εサブユニットと結合または相互作用する、請求項１〜３０のいずれか１項に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項３２】
Ｔ細胞受容体複合体の内部移行を誘導する、請求項１〜３１のいずれか１項に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項３３】
前記ＣＤ３結合ドメインが、マウスＣｒｉｓ−７モノクローナル抗体またはＨｕＭ２９１に由来するヒト化ＣＤ３結合ドメインである、請求項１〜３２のいずれか１項に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項３４】
前記ＣＤ３結合ドメインが、マウスＣｒｉｓ−７抗体またはＨｕＭ２９１の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３とを含む、請求項３３に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項３５】
前記ＣＤ３結合ドメインが、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３８および配列番号４０からなる群より選択されるＶＨ領域配列またはＶＬ領域配列を含む、請求項１または９に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項３６】
前記ＣＤ３結合ドメインが、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、および配列番号３０からなる群より選択されるＶＨ領域と、配列番号３８および配列番号４０からなる群より選択されるＶＬ領域とを含む、請求項１または９に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項３７】
前記ＣＤ３結合ドメインが、配列番号２８、および配列番号３０からなる群より選択されるＶＨ領域と、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８および配列番号４０からなる群より選択されるＶＬ領域とを含む、請求項１または９に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項３８】
前記ＶＨ領域が配列番号２８を含み、前記ＶＬ領域が配列番号３４を含む、請求項１または９に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項３９】
前記ＶＨ領域が配列番号２８を含み、前記ＶＬ領域が配列番号３８を含む、請求項１または９に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項４０】
前記ＶＨ領域が配列番号２６を含み、前記ＶＬ領域が配列番号３８を含む、請求項１または９に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項４１】
前記ＶＨ領域が配列番号２６を含み、前記ＶＬ領域が配列番号３４を含む、請求項１、９および１４のいずれか１項に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項４２】
配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１８および配列番号２０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１または９に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項４３】
前記ＣＤ３結合ドメインが重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３とを含み、前記重鎖ＣＤＲ３が配列番号５１を含む、請求項１または９に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項４４】
前記重鎖ＣＤＲ１が配列番号４９を含み、前記重鎖ＣＤＲ２が配列番号５０を含み、前記重鎖ＣＤＲ３が配列番号５１を含み、前記軽鎖ＣＤＲ１が配列番号５２を含み、前記軽鎖ＣＤＲ２が配列番号５３を含み、前記軽鎖ＣＤＲ３が配列番号５４を含む、請求項４３に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項４５】
前記定常領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤもしくはその任意の組合せのＣＨ２およびＣＨ３ドメイン；ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭもしくはその任意の組合せの免疫グロブリンＣＨ３ドメイン；またはＩｇＥ、ＩｇＭもしくはその組合せの免疫グロブリンＣＨ３およびＣＨ４ドメインを含む、請求項１５に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項４６】
前記定常領域がＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとを含む、請求項１５に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項４７】
前記定常領域が、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとから実質的になる、請求項１５に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項４８】
前記定常領域が、エフェクター機能が低下または消失するよう修飾されている、請求項４５〜４７のいずれか１項に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項４９】
前記定常領域が、補体と結合しないよう修飾されている、請求項４５〜４７のいずれか１項に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項５０】
前記定常領域が、Ｆｃγ受容体と結合しないよう修飾されている、請求項４５〜４７のいずれか１項に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項５１】
前記Ｆｃγ受容体がＣＤ１６、ＣＤ３２およびＣＤ６４からなる群より選択される、請求項５０に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項５２】
前記定常領域が配列番号５５のアミノ酸配列を含む、請求項１５に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項５３】
請求項１〜５２のいずれか１項に記載のＣＤ３結合ポリペプチドをコードする、核酸。
【請求項５４】
配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２７および配列番号３７からなる群より選択される核酸を含む、単離核酸。
【請求項５５】
請求項５３または５４に記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項５６】
請求項５５に記載の発現ベクターを含む、組換え宿主細胞。
【請求項５７】
請求項１〜５２のいずれか１項に記載のＣＤ３結合ポリペプチドと、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤とを含む、組成物。
【請求項５８】
癌または自己免疫障害を治療するための請求項５７に記載の組成物であって、必要とする患者に治療有効量の前記組成物を投与することによって治療する、請求項５７に記載の組成物。
【請求項５９】
癌または自己免疫障害を治療するための請求項１〜５２のいずれか１項に記載のＣＤ３結合ポリペプチドであって、必要とする患者に治療有効量の前記ＣＤ３結合ポリペプチドを投与することによって治療する、請求項請求項１〜５２のいずれか１項に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項６０】
二量体を形成する、請求項１〜５２のいずれか１項に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項６１】
前記二量体がホモ二量体またはヘテロ二量体である、請求項６０に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項６２】
ＶＬ領域のＪカッパ（Ｊｋ）領域内に、Ｃｒｉｓ−７  ＶＬ  Ｊｋ領域マウス配列ＬＱＩＴ（配列番号２５２）と比較して少なくとも１つのアミノ酸修飾が存在する、請求項３に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項６３】
前記Ｊｋ領域がアミノ酸配列ＶＥＩＫ（配列番号２５３）を含む、請求項６２に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項６４】
前記第二の結合ドメインが、配列番号２１２のアミノ酸１〜１０７および１２４〜２４３；配列番号２２６のアミノ酸１〜１０７および１２４〜２４３；配列番号２１６のアミノ酸１〜１０７および１２４〜２４３；ならびに配列番号１９６の１〜１１１および１２８〜２５１からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％一致するアミノ酸配列を含む、請求項２５に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項６５】
配列番号５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、１８６、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４または２０６と少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％一致するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項６６】
ヘテロ二量体の一部である、請求項１に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項６７】
前記ヘテロ二量体が１対の一本鎖ポリペプチドを含み、前記一本鎖の対が、配列番号２１０と２４７、配列番号２１０と２１８、配列番号２１０と２２０、配列番号２０８と２４９、配列番号２０８と２２２または配列番号２０８と２２４、配列番号２１２と２１８、配列番号２１６と２２２、配列番号２２８と２２６または配列番号２１４と２１８から選択される対と少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％一致するアミノ酸配列を含む、請求項６６に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項６８】
前記ＣＤ３結合ドメインが配列番号４１と約９０％〜約９９％一致する、請求項１または９に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項６９】
前記ＣＤ３結合ドメインが配列番号４１と約９６％〜約９９％一致する、請求項１または９に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連する発明）
本発明は、２０１１年４月２２日に出願された米国特許仮出願第６１／４７８，４４９号の優先権を主張する２０１２年４月２０日に出願された「Ｐｒｏｓｔａｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  Ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ」と題する国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１２／０３４５７５号に関連するとともに、米国特許出願第６１／６３６，５５７号に関連するものであり、上記３つの出願はいずれもその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、ＣＤ３と結合または相互作用する単特異性タンパク質治療剤および多特異性タンパク質治療剤に関する。これには抗体、そのフラグメント、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ｄｉ−ｓｃＦｖ単一ドメイン抗体および抗体または抗体フラグメントを含むポリペプチドが含まれる。
【０００３】
（添付の配列表）
本明細書とともに電子形式で提出されたテキストファイル（名称：「２４７９＿１１３ＰＣ０３＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ＿ａｓｃｉｉ．ｔｘｔ」；大きさ：４５９，７２２バイト；作成日：２０１３年４月１６日）の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【背景技術】
【０００４】
臓器同種移植片拒絶反応の治療など自己免疫疾患およびこれに関連する障害の治療には、抗ＣＤ３モノクローナル抗体によるヒトＴ細胞上のＴＣＲ複合体の標的化が使用または提案されてきた。ＯＫＴ３などのヒトＣＤ３特異的マウスモノクローナル抗体（Ｋｕｎｇら（１９７９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０６：３４７−９）がこのような治療の第一世代であった。ＯＫＴ３には強力な免疫抑制能があるが、その潜在的な免疫原性および分裂原性に関連する重篤な副作用によってその臨床使用は阻まれた（Ｃｈａｔｅｎｏｕｄ（２００３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ３：１２３−１３２）。ＯＫＴ３によって抗グロブリン反応が誘導され、ＯＫＴ３自体の迅速除去および中和が促進された（Ｃｈａｔｅｎｏｕｄら（１９８２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：８３０−８）。さらに、ＯＫＴ３はｉｎ  ｖｉｔｒｏでＴ細胞増殖およびサイトカイン産生を誘導し、ｉｎ  ｖｉｖｏでサイトカインの大規模な放出を引き起こした（Ｈｉｒｓｃｈら（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ１４２：７３７−４３，１９８９）。このサイトカイン放出（「サイトカインストーム」とも呼ばれる）は次いで、発熱、悪寒、頭痛、嘔気、嘔吐、下痢、呼吸困難、化膿性髄膜炎および低血圧症を特徴とする「インフルエンザ様」症候群を引き起こす（Ｃｈａｔｅｎｏｕｄ、２００３）。このような重篤な副作用は、ＯＫＴ３の移植での使用をさらに普及させ、自己免疫など他の臨床分野にもその使用を拡大することを制限するものであった（同文献）。
【０００５】
第一世代の抗ＣＤ３モノクローナル抗体の副作用を軽減するため、マウス抗ＣＤ３モノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒトＩｇＧ配列中に移植したうえ、ＦｃＲに結合しない変異をＦｃに導入し、サイトカインストームの発生を減少させることによって、第二世代の遺伝子操作された抗ＣＤ３モノクローナル抗体が開発されている（Ｃｏｌｅら（１９９９）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６８：５６３；Ｃｏｌｅら（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：３６１３）。このほか、全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１０／０４２９０４号を参照されたい。
【０００６】
ＣＤ３を標的とする単一特異性治療剤に加えて、Ｔ細胞および腫瘍細胞と選択的に結合する多重特異性ポリペプチドによって、腫瘍細胞に対してＴ細胞の細胞傷害性を再誘導する機序および癌の治療をもたらすことができた。しかし、二重特異性または多重特異性のＴ細胞動員抗体を設計する１つの問題点に、特異性を維持すると同時に多数の調節経路によるＴ細胞活性化の調節を打ち消すことがあった。
【０００７】
依然として抗ＣＤ３単一特異性および多重特異性分子の改良が必要とされている。これまでサイトカインストームの可能性を減らすため、ＣＤ３標的分子のＦｃ部分に改良が施されてきたが、先行技術の分子よりも半減期が長く、効率的な製造が可能であり、Ｔ細胞との結合および／またはＴ細胞毒性の再誘導の向上がみられる（癌治療のために設計された多重特異性分子の場合）抗ＣＤ３治療剤が依然として必要とされている。
【発明の概要】
【０００８】
一態様では、本発明は、配列番号４１のアミノ酸配列を有する結合ドメインと比較して等電点が低下したＣＤ３結合ドメインを含むＣＤ３結合ポリペプチドを含む。特定の実施形態では、ＣＤ３結合ドメインはＶＨおよびＶＬ領域を含み、ＶＨ領域およびＶＬ領域はそれぞれフレームワーク領域を含む。結合ドメインおよび／またはポリペプチドの等電点（ｐＩ）を低下させるため、正荷電アミノ酸を中性アミノ酸で置換することによって、および／または中性アミノ酸を負荷電アミノ酸で置換することによって、フレームワーク領域内で２つ以上のアミノ酸を修飾することができる。例えば、ＲおよびＴをＳで置換することができ、ＱをＥで置換することができ、ＹをＦで置換することができ、ＴをＶで置換することができる。一実施形態では、例えば、免疫原性のリスクを低減するため、配列内に置換されたアミノ酸がヒト生殖系列ＩｇＧ配列中に広く存在するか、ヒト生殖系列配列の同じ位置またはほぼ同じ位置、例えば、対応するヒト生殖系列ＩｇＧ配列中に含まれている。いくつかの実施形態では、ヒト生殖系列ＩｇＧ配列は配列番号４３または４４を含む。
【０００９】
本発明の別の実施形態では、ＣＤ３結合ポリペプチドは、プレヒンジ領域にプレヒンジ領域またはポリペプチド全体のｐＩを低下させる修飾を含む。プレヒンジ領域は結合ドメインとヒンジ領域の接合部分に存在する。例えば、配列ＲＲＴを有する３アミノ酸プレヒンジ領域を配列ＳＳＳに置き換えて等電点を低下させることができる。いくつかの実施形態では、プレヒンジ領域は、ＲＲＴプレヒンジ領域を有するＣＤ３結合ポリペプチドと比較して等電点が低下している。
【００１０】
ＣＤ３結合ポリペプチドは、例えば、ＶＨおよび／またはＶＬ領域のフレームワーク領域（１つまたは複数）ならびに／あるいはプレヒンジ領域を変異させることによって、等電点が低くなるよう設計することができる。等電点の低下は０．５〜２．５以上の単位であってよい。
【００１１】
本発明の一実施形態では、ＣＤ３結合ポリペプチドは抗体、例えばヒト化抗体である。別の実施形態では、ＣＤ３結合ポリペプチドは小モジュール免疫薬タンパク質（ＳＭＩＰ）である。いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合ポリペプチドは一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。
【００１２】
さらに別の実施形態では、ＣＤ３結合ポリペプチドは多特異性または二重特異性ポリペプチドである。例えば、ＣＤ３結合ポリペプチドはＣＤ３結合ドメインと腫瘍抗原結合ドメインとを含み得る。一実施形態では、二重特異性または多重特異性分子は、Ｔ細胞の細胞傷害性を腫瘍細胞に対して再誘導する。
【００１３】
本発明の別の実施形態では、ＣＤ３ポリペプチドはホモ二量体またはヘテロ二量体として存在する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】これまでに作製されたヒト化Ｃｒｉｓ−７  ＳＭＩＰポリペプチドの理論的ｐＩを約２００の他のＳＭＩＰポリペプチドの理論的ｐＩと比較して示したグラフである。
【図２Ａ−Ｂ】ｐＩが本発明のＣＤ３ポリペプチドよりも高いＣＤ３結合ＳＭＩＰポリペプチドのクリッピングを示す図である。図２Ａは、精製タンパク質の低分子量のクリップの含有量を定量化したＳＤＳでのキャピラリー電気泳動である。図２Ｂは、クリップされたＣＤ３  ＳＭＩＰ分子を図示したものである。図２Ｂに示される配列は、配列番号４のアミノ酸２５２〜２６０、配列番号４の２４３〜２５２および配列番号２４０の２５１〜２６０に対応する。
【図３】Ｃｒｉｓ−７マウスＶＨおよびそれに由来するヒト化ＶＨ配列のアミノ酸配列アライメントである。Ｃｒｉｓ７  ＶＨマウス、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６およびコンセンサス配列は、それぞれ配列番号４５、２２、２４、２６、２８、３０、３２および２２９に対応する。
【図４】Ｃｒｉｓ−７  マウスＶＬおよびそれに由来するヒト化ＶＬ配列のアミノ酸配列アライメントである。Ｃｒｉｓ７  ＶＬマウス、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４およびコンセンサス配列は、それぞれ配列番号４６、３４、３６、３８、４０および２３０に対応する。
【図５】Ｈ３ならびに生殖系列配列ＩＧＨＶ１−６９＊０１およびＩＧＨＶ３−３０＊０１のアミノ酸配列アライメントである。Ｈ３、ＩＧＨＶ１−６９＊０１、ＩＧＨＶ３−３０＊０１およびコンセンサス配列は、それぞれ配列番号２６、４３、４４および３３１に対応する。
【図６】生殖系列配列（ＩＧＫＶ１−５＊）のＶＬ領域およびＬ１のＪカッパ領域のアミノ酸配列アライメントである。ＶＬ領域（ＩＧＫＶ１−５＊０１）、Ｌ１鎖およびコンセンサス配列のＪカッパ領域は、それぞれ配列番号２３２、３４および２３３に対応する。列挙されているＩＧＫＪ１＊０１、ＩＧＫＪ２＊０１、ＩＧＫＪ３＊０１、ＩＧＫＪ４＊０１およびＩＧＫＪ５＊０１配列は、それぞれ配列番号２３４〜２３８に対応する。
【図７Ａ−Ｂ】ＤＲＡ２０９と比較して理論的ｐＩが低下した様々なＣＤ３結合ポリペプチドＳＭＩＰ分子のアミノ酸配列アライメントである。ＤＲＡ２０９、ＤＲＡ２１９、ＤＲＡ２２２、ＤＲＡ２２１、ＤＲＡ２２３、ＤＲＡ２２４、ＤＲＡ２２５およびコンセンサス配列に対して列挙されている配列は、配列番号４のアミノ酸１〜４２３、配列番号６のアミノ酸１〜４２３、配列番号８のアミノ酸１〜４２３、配列番号１０のアミノ酸１〜４２３、配列番号１２のアミノ酸１〜４２３、配列番号１４のアミノ酸１〜４２６、配列番号１６のアミノ酸１〜４２６および配列番号２３９に対応する。
【図８】ｐＩ変異体ＤＲＡ２３３およびＤＲＡ２３４とＤＲＡ１６１とを比較したアミノ酸配列アライメントである。ＤＲＡ１６１、ＤＲＡ２３３、ＤＲＡ２３４およびコンセンサス配列に対して列挙されている配列は、それぞれ配列番号２４０、１８、２０および２４１に対応する。
【図９】実験的ｐＩを求める方法を示す図である。
【図１０】ＤＲＡ２０９のＳＭＩＰおよびｓｃＦｖの実験的ｐＩを示すグラフである。
【図１１】ｐＩ変異体ＤＲＡ２３３およびＤＲＡ２３４と比較したＤＲＡ１６１  ＳＭＩＰの実験的ｐＩを示すグラフである。
【図１２】ＤＲＡ２２７を除くＳＭＩＰ  ｐＩ変異体がＤＲＡ２０９およびＤＲＡ１６１と同じＴ細胞と結合したことを示すグラフである。ＤＲＡ２２７  ＳＭＩＰは対照として用いられており、ＣＤ３またはＴ細胞結合ドメインを含まない。各分子の名称の後にある文字「ａ」は、特定の分子がＣＨＯ細胞で産生されたことを示し、４桁の数字はロット番号である。
【図１３】ＣＤ３結合ＳＭＩＰ構築物ＤＲＡ２３３およびＤＲＡ２３４の方がＳＭＩＰ  ＤＲＡ１６１（ＤＲＡ２０９と同じＶＨおよびＶＬを有する）よりも断片化しにくいことを示す非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ像である。
【図１４】ＣＤ３結合ＳＭＩＰ構築物ＤＲＡ２３３およびＤＲＡ２３４の方がＳＭＩＰ  ＤＲＡ１６１（ＤＲＡ２０９と同じＶＨおよびＶＬを有する）よりも断片化しにくいことを示す還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ像である。
【図１５】ｐＩ変異体ＤＲＡ２３３およびＤＲＡ２３４の大部分がインタクトな状態（例えば、クリッピングがない状態）で発現することを示すグラフおよび表である。
【図１６】ＤＲＡ１６１（精製）の非還元ＣＥ−ＳＤＳを示す像である。
【図１７】ＤＲＡ２３４およびＤＲＡ２３３のＰＫ試験のデータを示す図である。
【図１８】実施例１４に記載されるＤＲＡ２３３およびＤＲＡ２３４のＷｉｎＮｏｎＬｉｎ解析から得られたデータを示す図である。
【図１９】ＤＲＡ２３３およびＤＲＡ２３４のＰＫ評価の表である。
【図２０】ＤＲＡ１６１とＤＲＡ２３３（５０４時間の時点を含むものおよび含まないもの）およびＤＲＡ２３４とを比較したＰＫパラメータの表である。
【図２１】ＣＤ１９を標的とする異なるホモ二量体二重特異性ポリペプチド分子を用いた標的依存性Ｔ細胞増殖アッセイから得られた結果を示す図である。図２１Ａおよび２１Ｂは、それぞれ実施例１０に記載されるＣＤ４＋Ｔ細胞増殖およびＣＤ８＋Ｔ細胞増殖の結果を示している。
【図２２】ＣＤ１９を標的とするヘテロ二量体二重特異性ポリペプチド分子を用いた標的依存性Ｔ細胞増殖アッセイから得られた結果を示す図である。図２２Ａおよび２２Ｂは、それぞれ実施例１０に記載されるＣＤ８＋Ｔ細胞増殖およびＣＤ４＋Ｔ細胞増殖の結果を示している。
【図２３】ＣＤ１９を標的とする異なるポリペプチドヘテロ二量体およびホモ二量体を用いた再誘導されたＴ細胞の細胞傷害性アッセイから得られた結果を示す図である。図２３Ａは、ホモ二量体二重特異性ポリペプチド、ＴＳＣ１２９ａ、ＴＳＣ２３３およびＴＳＣ２３４の結果を示している。図２３Ｂは、ヘテロ二量体二重特異性ポリペプチド、ＴＳＣ１２７、ＴＳＣ２２７およびＴＳＣ２２８の結果を示している。
【図２４】ＲＯＮを標的とする異なる二重特異性ポリペプチドホモ二量体、ＴＳＣ２７５、ＴＳＣ２７７、ＴＳＣ２７８およびＴＳＣ２７９を用いた再誘導されたＴ細胞の細胞傷害性アッセイから得られた結果を示す図である。
【図２５】二重特異性ポリペプチドヘテロ二量体およびホモ二量体のＴ細胞結合の結果を示す図である。図２５Ａおよび２５Ｂは、二重特異性分子ＴＳＣ２２８（ヘテロ二量体）およびＴＳＣ２４９（ホモ二量体）と、Ｊｕｒｋａｔ細胞との用量依存性の結合を示している。
【図２６】ＰＳＭＡを標的とするポリペプチドホモ二量体による標的依存性Ｔ細胞増殖の結果を示す図である。図２６Ａは、標的ＰＳＭＡ抗原を発現するＣ４−２Ｂ細胞のＴＳＣ２４９で処置したときの結果を示している。図２６Ｂは、標的ＰＳＭＡ抗原を発現しないＤＵ−１４５細胞のＴＳＣ２４９で処置したときの結果を示している。図２６Ｃは、単離Ｔ細胞をＴＳＣ２４９で処置したときの結果を示している。
【図２７】ともにＰＳＭＡを標的とするホモ二量体二重特異性ポリペプチド、ＴＳＣ１９４およびＴＳＣ２４９を用いた再誘導されたＴ細胞の細胞傷害性アッセイの結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、先行技術のＣＤ３結合ポリペプチドと比較して向上した特性を有するＣＤ３結合ポリペプチドを提供する。本発明の分子は、重鎖および／または軽鎖フレームワーク領域ならびに／またはプレヒンジ領域のアミノ酸を修飾して分子の等電点を低下させることによって、等電点が低くなるよう設計したものである。一実施形態では、ＶＬ領域のＪカッパ領域に修飾を施す。いくつかの実施形態では、正電荷を有するアミノ酸を中性電荷を有するアミノ酸で置換し、かつ／または中性電荷を有するアミノ酸を負電荷で置換することによって修飾を施す。
【００１６】
いくつかの実施形態では、本発明のＣＤ３結合ポリペプチドは、理論的ｐＩが抗ＣＤ３  ＤＲＡ２０９  ＳＭＩＰ（配列番号４）よりも０．５〜２．５単位低い。例えば、ＤＲＡ２０９は理論的ｐＩが９であるのに対して、ｐＩ変異体のＤＲＡ２１９（配列番号６）は理論的ｐＩが８．４であり、ＤＲＡ２２１（配列番号１０）は理論的ｐＩが８．２であり、ＤＲＡ２２２（配列番号８）は理論的ｐＩが７．５であり、ＤＲＡ２２３（配列番号１２）は理論的ｐＩが７．２であり、ＤＲＡ２２４（配列番号１４）は理論的ｐＩが６．８である。いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合ポリペプチドは、実験的等電点が配列番号４のポリペプチドよりも少なくとも１ｐＩ単位低い。
【００１７】
驚くべきことに、ｐＩ変異体にはＤＲＡ２０９よりも半減期の向上がみられ、ＣＨＯ細胞での発現が良好であり、例えば、半減期の測定方法を記載した下の実施例４を参照されたい。さらに、ＤＲＡ２２２  ｓｃＦｖを含む多重特異性構築物には、ＤＲＡ２０９結合ドメインのような他の抗ＣＤ３結合ドメインを有する同様の構築物と比較して特性の向上がみられた（関連する国際公開第２０１２／１４５７１４号を参照されたい）。
【００１８】
本明細書に使用される節の見出しは、単に構成上の目的のためのものであり、記載される主題を限定するものとして理解されるべきではない。特に限定されないが特許、特許出願、記事、書籍おおび論文を含め本明細書に引用される文書またはその一部はすべて、任意の目的でその全体が本明細書に明示的に組み込まれる。１つまたは複数の文書または文書の一部が、本願における用語の定義に矛盾する形でその用語を定義する場合、本願の定義が優先されるものとする。
【００１９】
本記載では、任意の濃度の範囲、百分率の範囲、比の範囲または整数の範囲には、特に明示されない限り、記載される範囲内にある任意の整数値および必要に応じてその小数部分（整数の１０分の１および１００分の１など）が含まれると理解されるべきである。本明細書で使用される。本明細書で使用される「約」は、特に明示されない限り、示される範囲、値または構造の±２０％を意味する。本明細書で使用される「ａ」および「ａｎ」という用語は、特に明示されない限り、「１つまたは複数の」列挙される構成要素を指すことを理解するべきである。選択肢（例えば、「ｏｒ」）の使用は、その選択肢の一方、両方またはその任意の組合せのいずれかを意味することを理解するべきである。本明細書で使用される「ｉｎｃｌｕｄｅ」および「ｃｏｍｐｒｉｓｅ｝（ともに「含む」）という用語は同義的に使用される。さらに、本明細書に記載される構成要素（例えば、ドメインや領域）および置換基の様々な組合せを含むポリペプチドが、各ポリペプチドが個々に記載された場合と同様に本願によって開示されることを理解するべきである。したがって、個々のポリペプチドの特定の構成要素の選択が本開示の範囲に含まれる。
【００２０】
本明細書で使用される「結合ドメイン」または「結合領域」という用語は、抗原、リガンド、受容体、基質、阻害剤などの標的分子（例えば、ＣＤ３またはＲＯＮ、ＣＤ１９、ＣＤ３７もしくはＰＳＭＡなどの腫瘍関連抗原）を特異的に認識して結合する能力を有するタンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチドまたはペプチドのドメイン、領域、部分または部位を指す。例示的な結合ドメインとしては、一本鎖抗体可変領域（例えば、ドメイン抗体、ｓＦｖ、ｓｃＦｖおよびｓｃＦａｂ）、受容体外部ドメインおよびリガンド（例えば、サイトカイン、ケモカイン）が挙げられる。特定の実施形態では、結合ドメインは、抗原結合部位（例えば、重鎖可変配列と軽鎖可変配列または抗体に由来し代替のフレームワーク領域（ＦＲ）（例えば、任意選択で１つまたは複数のアミノ酸置換を含むヒトＦＲ）に組み込まれた３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と３つの重鎖ＣＤＲを含む）を含むか、これよりなる。ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ファージディスプレイライブラリースクリーニングおよびＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）相互作用解析を含め、特定の標的と特異的に結合する本開示の結合ドメインを同定する各種アッセイが知られている。本明細書で使用される「ＣＤ３結合ポリペプチド」は、「ＣＤ３結合ドメイン」および任意選択で「第二の結合ドメイン」を有し得る。ＣＤ３結合ドメインは、アミノ末端にあってもカルボキシル末端にあってもよい。特定の実施形態では、ＣＤ３結合ドメインは、マウスモノクローナル抗体（例えば、Ｃｒｉｓ−７やＨｕＭ２９１）に由来するヒト化ｓｃＦｖを含む。例えば、ＣＤ３結合ドメインは、マウスモノクローナル抗体に由来するＶＨ領域とＶＬ領域とからなるものであってよく、この場合、ＶＨ領域とＶＬ領域は（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号７６）リンカーなどのリンカーによって連結している。他の実施形態では、ＣＤ３結合ドメインは、マウスモノクローナル抗体に由来するヒト化ｓｃＦｖから実質的になるか、これよりなる。いくつかの実施形態では、本発明のＣＤ３結合ドメインは、マウスＣｒｉｓ−７抗体またはＨｕＭ２９１の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と、同抗体の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３とを含む。
【００２１】
結合ドメインは、標的と１０５Ｍ−１以上の親和性すなわちＫａ（すなわち、１／Ｍを単位とする特定の結合相互作用の平衡結合定数）で結合するが、被験試料中に存在する他の成分とは有意に結合しない場合、標的と「特異的に結合する」ことになる。結合ドメインは「高親和性」結合ドメイン」と「低親和性」結合ドメインとに分類することができる。「高親和性」結合ドメインは、Ｋａが少なくとも１０７Ｍ−１、少なくとも１０８Ｍ−１、少なくとも１０９Ｍ−１、少なくとも１０１０Ｍ−１、少なくとも１０１１Ｍ−１、少なくとも１０１２Ｍ−１または少なくとも１０１３Ｍ−１の結合ドメインを指す。「低親和性」結合ドメインは、Ｋａが１０７Ｍ−１以下、１０６Ｍ−１以下、１０５Ｍ−１以下の結合ドメインを指す。あるいは、Ｍを単位とする特定の結合相互作用の平衡解離定数（Ｋｄ）（例えば、１０−５Ｍ〜１０−１３Ｍ）として親和性を定義することができる。従来の技術を用いて、本開示による結合ドメインポリペプチドおよび一本鎖ポリペプチドの親和性を容易に求めることができる（例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄら（１９４９）Ａｎｎ．Ｎ  Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０；および米国特許第５，２８３，１７３号、同第５，４６８，６１４号またはその同等物を参照されたい）。
【００２２】
「ＣＤ３」は当該技術分野では６つの鎖を有する多タンパク質複合体として知られ（例えば、ＡｂｂａｓおよびＬｉｃｈｔｍａｎ，２００３；Ｊａｎｅｗａｙら，ｐ．１７２および１７８，１９９９を参照されたい）、Ｔ細胞受容体複合体のサブユニットである。哺乳動物では、Ｔ細胞受容体複合体のＣＤ３サブユニットはＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、２つのＣＤ３ε鎖およびホモ二量体のＣＤ３ζ鎖である。ＣＤ３γ、ＣＤ３δおよびＣＤ３ε鎖は、単一の免疫グロブリンドメインを含み、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する極めて近縁の細胞表面タンパク質である。ＣＤ３γ、ＣＤ３δおよびＣＤ３ε鎖の膜貫通領域は負に帯電しており、これは、この３種類の鎖が正に帯電しているＴ細胞受容体鎖と結合することを可能にする特徴である。ＣＤ３γ、ＣＤ３δおよびＣＤ３εの各細胞内尾部には免疫受容体チロシン活性化モチーフ、すなわちＩＴＡＭとして知られる保存されたモチーフが１つだけ含まれるのに対して、ＣＤ３ε鎖はそれぞれこのモチーフを３つ有する。ＩＴＡＭはＴＣＲ複合体のシグナル伝達能に重要であると考えられている。本開示で使用されるＣＤ３は、ヒト、サル、マウス、ラットをはじめとする哺乳動物を含めた様々な動物種に由来するものであり得る。
【００２３】
本明細書で使用される「保存的置換」は、当該技術分野では、１つのアミノ酸を同様の特性を有する別のアミノ酸で置換することとして認識されている。例示的な保存的置換は当該技術分野で周知である（例えば、国際公開第９７／０９４３３号，１０ページ，１９９７年３月１３日に公開；Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第２版；Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．ＮＹ：ＮＹ（１９７５），ｐｐ．７１−７７；Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ  ＩＶ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ（１９９０），ｐ．８を参照されたい）。特定の実施形態では、保存的置換にはロイシンからセリンへの置換が含まれる。
【００２４】
本明細書で使用される「誘導体」という用語は、酵素を用いる、または用いない化学的または生物学的手段、例えば、グリコシル化、アルキル化、アシル化、エステル形成またはアミド形成によって、ペプチドの１つまたは複数のアミノ酸残基を修飾することを指す。
【００２５】
本明細書で使用される、指定されるポリペプチドまたはタンパク質に「由来する」ポリペプチドまたはアミノ酸配列は、そのポリペプチドの起源を指す。一実施形態では、特定の配列に由来するポリペプチドまたはアミノ酸配列とは、その特定の配列または少なくとも１０〜２０個のアミノ酸、少なくとも２０〜３０個のアミノ酸、少なくとも３０〜５０個のアミノ酸もしくは少なくとも５０〜１５０個のアミノ酸からなるその一部分と実質的に同一のアミノ酸配列を有するか、配列中にその起源を有することが当業者に認識されるものである。一実施形態では、ヒト化またはキメラ結合ドメインは、別の動物によって生成された抗体のＶＨおよび／またはＶＬに由来する。例えば、ヒト化結合ドメインまたはキメラ結合ドメインは、マウス抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域に由来するものであり得る。例えば、当該技術分野で公知の方法でフレームワーク領域を修飾することによって、マウス抗体のヒト化を実施することができる。
【００２６】
別のポリペプチドに由来するポリペプチドは、出発ポリペプチドに対して１つまたは複数の変異を有し得る、例えば、別のアミノ酸残基で置換されているか、アミノ酸残基の挿入または削除を１つまたは複数有する、１つまたは複数のアミノ酸残基を有し得る。ポリペプチドは、天然に存在しないアミノ酸配列を含み得る。このような変異には、出発ポリペプチドと１００％未満の配列同一性または配列類似性が必ずみられる。一実施形態では、変異体は、出発ポリペプチドのアミノ酸配列と約６０％〜１００％未満のアミノ酸配列同一性または類似性のアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、変異体は、出発ポリペプチドと約７５％〜１００％未満、約８０％〜１００％未満、約８５％〜１００％未満、約９０％〜１００％未満、約９５％〜１００％未満のアミノ酸配列同一性または類似性のアミノ酸配列を有する。
【００２７】
本明細書で使用される場合、特に明記されない限り、免疫グロブリン分子可変領域のアミノ酸残基の位置にはＫａｂａｔ番号付けの慣例に従って番号が付され（Ｋａｂａｔ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版．Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ：Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ（１９９１））、免疫グロブリン分子定常領域のアミノ酸残基の位置にはＥＵ命名法（Ｗａｒｄら，１９９５  Ｔｈｅｒａｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：７７−９４）に従って番号が付される。
【００２８】
本明細書で使用される「二量体」という用語は、共有結合（例えば、ジスルフィド結合）およびその他の相互作用（例えば、静電相互作用、塩橋、水素結合および疎水性相互作用）を含めた１つまたは複数の形態の分子内力を介して互いに結合した２つのサブユニットからなり、しかるべき条件下（例えば、生理的条件下、組換えタンパク質を発現、精製および／または保管するのに適した水溶液中、あるいは非変性および／または非還元電気泳動の条件下）で安定な生物学的実体を指す。本明細書で使用される「ヘテロ二量体」または「ヘテロ二量体タンパク質」は、２つの異なるポリペプチドから形成される二量体を指す。ヘテロ二量体には、４つのポリペプチド（すなわち、２つの軽鎖および２つの重鎖）から形成される抗体は含まれない。本発明の一実施形態では、ヘテロ二量体化ドメインを含むＥｍｅｒｇｅｎｔ社のＩｎｔｅｒｃｅｐｔｏｒプラットフォームを用いてヘテロ二量体を作製する。本明細書で使用される「ホモ二量体」または「ホモ二量体タンパク質」は、２つの同一のポリペプチドから形成される二量体を指す。本発明の特定の実施形態では、Ｅｍｅｒｇｅｎｔ社のＳＭＩＰ、ＰＩＭＳまたはＳｃｏｒｐｉｏｎプラットフォームを用いてホモ二量体を作製する。
【００２９】
本明細書で使用される「ヒンジ領域」または「ヒンジ」は、（ａ）膜貫通タンパク質（例えば、Ｉ型膜貫通タンパク質）のドメイン間領域；または（ｂ）ＩＩ型Ｃレクチンのストーク領域に由来するポリペプチドを指す。例えば、ヒンジ領域は免疫グロブリンスーパーファミリーメンバーのドメイン間領域に由来するものであってよく；この特定のクラス内の適切なヒンジ領域としては、（ｉ）免疫グロブリンヒンジ領域（例えば、上部領域および／またはコア領域（１つまたは複数）からなる）または野生型免疫グロブリンヒンジおよび変化した免疫グロブリンヒンジを含めたその機能的変異体および（ｉｉ）免疫グロブリンＶ様ドメインまたは免疫グロブリンＣ様ドメインを連結する領域（またはその機能的変異体）が挙げられる。
【００３０】
「野生型免疫グロブリンヒンジ領域」は、抗体の重鎖にみられ、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間に介在しこれを連結するか（ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＤの場合）、ＣＨ１ドメインとＣＨ３ドメインとの間に介在しこれを連結する（ＩｇＥおよびＩｇＭの場合）、天然に存在する上部および中間部のヒンジアミノ酸配列を指す。特定の実施形態では、野生型免疫グロブリンヒンジ領域配列はヒトであり、ヒトＩｇＧヒンジ領域を含み得る。
【００３１】
「変化した野生型免疫グロブリンヒンジ領域」または「変化した免疫グロブリンヒンジ領域」は、（ａ）最大３０％のアミノ酸変化（例えば、最大２５％、２０％、１５％、１０％または５％のアミノ酸置換または削除）を有する野生型免疫グロブリンヒンジ領域または（ｂ）約５アミノ酸（例えば、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０アミノ酸）から約１２０アミノ酸までの長さ（例えば、約１０〜約４０アミノ酸、約１５〜約３０アミノ酸、約１５〜約２０アミノ酸または約２０〜約２５アミノ酸の長さ）であり、最大約３０％のアミノ酸変化（例えば、最大約２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％または１％のアミノ酸置換もしくは削除またはその組合せ）を有し、国際公開第２０１１／０９０７６２号および同第２０１１／０９０７５４号に開示されているＩｇＧコアヒンジ領域を有する、野生型免疫グロブリンヒンジ領域の一部分を指す。
【００３２】
本明細書で使用される「ヒト化」という用語は、遺伝子工学技術を用いて、ヒトに対する免疫原性が低いが、依然として元の抗体の抗原結合特性を保持するヒト以外の種（例えば、マウスやラット）由来の抗体または免疫グロブリン結合タンパク質およびポリペプチドを作製する工程を指す。いくつかの実施形態では、抗体または免疫グロブリン結合タンパク質およびポリペプチドの結合ドメイン（１つまたは複数）（例えば、軽鎖および重鎖可変領域、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ）をヒト化する。「再形成」（Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら，１９８８ Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，１９８８  Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３３７；Ｔｅｍｐｅｓｔら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ  １９９１  ９：２６６−２７１）、「超キメラ化（ｈｙｐｅｒｃｈｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）」（Ｑｕｅｅｎら，１９８９  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６：１００２９−１００３３；Ｃｏら，１９９１  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ８８：２８６９−２８７３；Ｃｏら，１９９２  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４８：１１４９−１１５４）および「ベニア化（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）」（Ｍａｒｋら，“Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ａｎｄ  ｖｅｎｅｅｒｅｄ  ａｎｔｉ−ＣＤ１８  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｉｎ：Ｍｅｔｃａｌｆ  ＢＷ，Ｄａｌｔｏｎ  ＢＪ編，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｄｈｅｓｉｏｎ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，１９９４：２９１−３１２）を含めたＣＤＲ移植（Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２（１９８６））として知られる技術ならびにその変形を用いて、非ヒト結合ドメインをヒト化することができる。ヒト以外の入手源に由来する場合、抗体または免疫グロブリン結合タンパク質およびポリペプチドのヒンジ領域および定常領域ドメインなどの他の領域をヒト化してもよい。
【００３３】
「免疫グロブリン定常領域」または「定常領域」とは、本明細書において、１つまたは複数の定常領域ドメインの一部または全部に対応するか、これに由来するペプチドまたはポリペプチド配列を指すと定義される用語である。一実施形態では、定常領域は、入手源抗体の定常領域ドメインをすべて含むわけではない。一実施形態では、定常領域はＩｇＧのＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン、例えば、ＩｇＧ１のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む。いくつかの実施形態では、定常領域はＣＨ１ドメインを含まない。特定の実施形態では、定常サブ領域を構成する定常領域ドメインはヒトである。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質の定常領域ドメインは、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体活性化および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）のエフェクター機能をもたないか、これらを最小限有する一方で、一部のＦｃ受容体（ＦｃＲｎ、新生児Ｆｃ受容体など）と結合する能力を保持し、比較的長いｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を保持している。
【００３４】
他の変形形態では、本開示の融合タンパク質は、ＡＤＣＣおよびＣＤＣの一方または両方のエフェクター機能を保持する定常ドメインを含む。特定の実施形態では、本開示の結合ドメインをヒトＩｇＧ定常領域（例えば、ＩｇＧ１）と融合し、定常領域の次に挙げるアミノ酸のうちの１つまたは複数を変異させる：２３４位のロイシン（Ｌ２３４）、２３５位のロイシン（Ｌ２３５）、２３７位のグリシン（Ｇ２３７）、３１８位のグルタミン酸（Ｅ３１８）、３２０位のリジン（Ｋ３２０）、３２２位のリジン（Ｋ３２２）またはその任意の組合せ（ＥＵによる番号付け）。例えば、上に挙げたアミノ酸のいずれか１つまたは複数をアラニンに変化させることができる。また別の実施形態では、ＩｇＧ１などのＩｇＧ  ＦｃドメインのＬ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７、Ｅ３１８、Ｋ３２０およびＫ３２２（ＥＵ番号付けによる）をそれぞれ、例えばアラニンに変異させ（例えば、それぞれＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｅ３１８Ａ、Ｋ３２０ＡおよびＫ３２２Ａ）、任意選択でＮ２９７Ａ変異も施す（すなわち、実質的にＣＨ２ドメインのグリコシル化を除去する）。
【００３５】
本明細書で使用される「小モジュール免疫薬タンパク質」または「ＳＭＩＰ」という用語は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００３／０１３３９３９号、同第２００３／０１１８５９２号および同第２００５／０１３６０４９号に一般に開示されているタンパク質足場を指すのに使用される。本明細書の実施例および開示全体を通して記載される「ＳＭＩＰ分子」は、例えば、アミノ末端からからカルボキシル末端に向かって第一の結合ドメイン、ヒンジ領域、免疫グロブリン定常領域の順でＳＭＩＰ足場を含む結合タンパク質であると理解するべきである。「ＣＤ３特異的ＳＭＩＰ分子」は、ＳＭＩＰ足場を含むＣＤ３結合タンパク質であると理解するべきである。
【００３６】
本明細書で使用される「ＰＩＭＳ」という用語は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００９／０１４８４４７号に一般に開示されているタンパク質足場を指すのに使用される。本明細書の実施例および開示全体を通して記載される「ＰＩＭＳ分子」は、例えば、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって免疫グロブリン定常領域、ヒンジ領域、第一の結合ドメインの順でＰＩＭＳ足場を含む結合タンパク質であると理解されるべきである。「ＣＤ３特異的ＰＩＭＳ分子」は、ＰＩＭＳ足場を含むＣＤ３結合タンパク質であると理解されるべきである。
【００３７】
「Ｆｃ領域」または「Ｆｃドメイン」は、入手源抗体の一部分に対応するか、これに由来し、細胞上の抗体受容体および補体のＣ１ｑ成分との結合に関与するポリペプチド配列を指す。Ｆｃはタンパク質結晶を形成しやすい抗体フラグメント、「結晶性フラグメント」を意味する。本来タンパク質消化によって表された異なるタンパク質フラグメントにより、免疫グロブリンタンパク質の一般構造全体を定義することができる。Ｆｃフラグメントは、文献通りの本来の定義では、ジスルフィド結合した重鎖ヒンジ領域と、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとからなる。しかし、ごく最近では、ＣＨ３と、ＣＨ２と、第二の一本鎖とともにジスルフィド結合した二量体を形成するのに十分なヒンジの少なくとも一部分とからなる一本鎖にこの用語が用いられている。免疫グロブリンの構造および機能の概説については、Ｐｕｔｎａｍ，Ｔｈｅ  Ｐｌａｓｍａ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ．Ｖ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７），ｐｐ．４９−１４０；およびＰａｄｌａｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：１６９−２１７，１９９４を参照されたい。本明細書で使用されるＦｃという用語には、天然に存在する配列の変異体が包含される。
【００３８】
本明細書で使用される「等電点」またはｐＩとは、正味荷電がゼロになるｐＨのことである。
【００３９】
本明細書で使用される「Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔｏｒ」は、国際公開第２０１１／０９０７６２号および同第２０１１／０９０７５４号に一般に開示されている単一特異性または多重特異性ヘテロ二量体タンパク質足場を指すのに使用される。本明細書に記載されるＩｎｔｅｒｃｅｐｔｏｒ分子は、２つの同一でないポリペプチド鎖を含み、各ポリペプチド鎖が免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインを含むＣＤ３結合タンパク質であると理解されるべきである。この結合している２つの免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインは異なるものである。一実施形態では、免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインはＣＨ１ドメインまたはその誘導体を含む。別の実施形態では、免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインはＣＬドメインまたはその誘導体を含む。一実施形態では、ＣＬドメインは、ＣｋもしくはＣλアイソタイプまたはその誘導体である。
【００４０】
本明細書で使用されるＩＩ型Ｃレクチンの「ストーク領域」という用語は、Ｃ型レクチン様ドメイン（ＣＴＬＤ；例えば、ナチュラルキラー細胞受容体のＣＴＬＤと類似しているもの）と膜貫通ドメインとの間に位置するＩＩ型Ｃレクチンの細胞外ドメインの部分を指す。例えば、ヒトＣＤ９４分子（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＡＣ５０２９１．１，ＰＲＩ  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ３０，１９９５）では、細胞外ドメインはアミノ酸残基３４〜１７９に対応し、ＣＴＬＤはアミノ酸残基６１〜１７６に対応する。したがって、ヒトＣＤ９４分子のストーク領域はアミノ酸残基３４〜６０を含み、これは膜とＣＴＬＤとの間にみられる（Ｂｏｙｉｎｇｔｏｎら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １０：７５，１９９９を参照されたい；他のストーク領域の説明についてはこのほか、Ｂｅａｖｉｌら，Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：７５３，１９９２；およびＦｉｇｄｏｒら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：７７，２００２を参照されたい）。上に挙げたＩＩ型Ｃレクチンはこのほか、ストーク領域と膜貫通またはＣＴＬＤとの間に接合部アミノ酸を６〜１０個有し得る。別の例では、２３３アミノ酸のヒトＮＫＧ２Ａタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｐ２６７１５．１，ＰＲＩ  Ｊｕｎｅ  １５，２０１０）は、アミノ酸７１〜９３の膜貫通ドメインとアミノ酸９４〜２３３の細胞外ドメインとを有する。ＣＴＬＤはアミノ酸１１9〜２３１からなり、ストーク領域はアミノ酸９９〜１１6を含み、これに５個および２個のアミノ酸からなる接合部が隣接している。その他のＩＩ型Ｃレクチンならびにその細胞外リガンド結合ドメイン、ドメイン間またはストーク領域およびＣＴＬＤは当該技術分野で公知である（例えば、ヒトＣＤ２３、ＣＤ６９、ＣＤ７２、ＮＫＧ２ＡおよびＮＫＧ２Ｄの配列ならびにその説明については、それぞれＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＰ＿００１９９３．２；ＡＡＨ０７０３７．１，ＰＲＩ  Ｊｕｌｙ  １５，２００６；ＮＰ＿００１７７３．１，ＰＲＩ  Ｊｕｎｅ  ２０，１０１０；ＡＡＬ６５２３４．１，ＰＲＩ  Ｊａｎｕａｒｙ  １７，２００２；およびＣＡＡ０４９２５．１，ＰＲＩ  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  １４，２００６を参照されたい）。
【００４１】
本明細書で使用される膜貫通タンパク質（例えば、Ｉ型膜貫通タンパク質）の「ドメイン間領域」は、膜貫通タンパク質の隣接する２つのドメインの間に位置する細胞外ドメインの一部分を指す。ドメイン間領域の例としては、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバーの隣接するＩｇドメインを連結している領域（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤもしくはＩｇＥの免疫グロブリンヒンジ領域；ＣＤ２のＩｇＶドメインとＩｇＣ２ドメインとを連結している領域；またはＣＤ８０もしくはＣＤ８６のＩｇＶドメインとＩｇＣドメインとを連結している領域）が挙げられる。ドメイン間領域の別の例には、ＣＤ２２、Ｉ型シアル酸結合Ｉｇ様レクチンの非ＩｇドメインとＩｇＣ２ドメインとを連結している領域がある。
【００４２】
ＩＩ型Ｃレクチンのストーク領域に「由来する」または膜貫通タンパク質ドメイン間領域（例えば、免疫グロブリンヒンジ領域）に「由来する」ポリペプチド領域は、全部または少なくとも一部が、（ｉ）野生型ストーク領域もしくはドメイン間領域の配列；（ｉｉ）野生型ストーク領域もしくはドメイン間領域の配列のフラグメント；（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）と少なくとも８０％、８５％、９０％もしくは９５％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド；または（ｉｖ）１個、２個、３個、４個もしくは５個のアミノ酸に削除、挿入、置換もしくはその組合せを有する、例えば、１つもしくは複数の変化が置換であるか、１つもしくは複数の変異が削除１つのみを含む、（ｉ）もしくは（ｉｉ）を含む約５個〜約１５０個のアミノ酸配列を指す。いくつかの実施形態では、ストーク領域の誘導体の方が、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２３、ＣＤ６４、ＣＤ７２またはＣＤ９４の約８個〜約２０個、約１０個〜約２５個または約１５個〜約２５個のアミノ酸に由来する配列などの野生型ストーク領域配列よりもタンパク質分解による切断に対する耐性が高い。
【００４３】
本明細書で使用される「接合部アミノ酸」または「接合部アミノ酸残基」という用語は、ポリペプチドの隣接する２つの領域またはドメインの間、例えば、ヒンジと、隣接する免疫グロブリン定常サブ領域との間、ヒンジと、隣接する結合ドメインとの間、２つの免疫グロブリン可変ドメインを連結するペプチドリンカーと、隣接する免疫グロブリン可変ドメインとの間などにある１つまたは複数（例えば、約２〜１０個）のアミノ酸残基を指す。接合部アミノ酸はポリペプチドの構築物設計によって生じ得る（例えば、ポリペプチドをコードする核酸分子の構築時に制限酵素部位を使用することによって生じるアミノ酸残基）。本明細書では、結合ドメインとヒンジ領域との間の接合部アミノ酸をプレヒンジ領域と呼び、この領域は例えば、コードヌクレオチド配列内に制限部位を加えることによって生じ得る。一実施形態では、プレヒンジ領域は約１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個または１５個のアミノ酸からなる。ＤＲＡ２０９およびＤＲＡ１６１のプレヒンジ領域配列は、マウスＣｒｉｓ−７の配列の一部でもヒト免疫グロブリン生殖系列の配列の一部でもない。ＤＲＡ２０９およびＤＲＡ１６１のプレヒンジ領域がアミノ酸配列ＲＲＴであるのに対して、ＤＲＡ２１９、ＤＲＡ２２１、ＤＲＡ２２２、ＤＲＡ２２３、ＤＲＡ２２４、ＤＲＡ２２５、ＤＲＡ２２８、ＤＲＡ２２９、ＤＲＡ２３３、ＤＲＡ２３４、ＴＳＣ２４９、ＴＳＣ２５０、ＴＳＣ２５１、ＴＳＣ２５２、ＴＳＣ２９５、ＴＳＣ２９６、ＴＳＣ３０１およびＴＳＣ３０２ではＳＳＳである。本発明の結合分子は、プレヒンジ領域を含んでも含まなくてもよい。
【００４４】
本明細書で使用される「ＣＨ３とＣＨ１またはＣＬの間のリンカー」という語は、ＣＨ３ドメイン（例えば、野生型ＣＨ３または変異ＣＨ３）のＣ−末端とＣＨ１ドメインまたはＣＬドメイン（例えば、Ｃｋ）のＮ末端との間に存在する１つまたは複数（例えば、約２〜１２個）のアミノ酸残基を指す。
【００４５】
本明細書で使用される「必要とする患者」という用語は、本明細書に提供されるＣＤ３結合タンパク質もしくはポリペプチドまたはその組成物によって治療または改善が可能な疾患、障害または病態のリスクがあるか、これに罹患している患者を指す。
【００４６】
本明細書で使用される「ペプチドリンカー」という用語は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを連結し、生じたポリペプチドが同じ軽鎖および重鎖可変領域を含む抗体と同じ標的分子に対して特異性を保持するよう２つのサブ結合ドメインの相互作用と適合するスペーサー機能をもたらす、アミノ酸配列を指す。特定の実施形態では、リンカーは５個〜約３５個のアミノ酸、例えば、約１５個〜約２５個のアミノ酸からなる。
【００４７】
本明細書で使用される「薬学的に許容される」という用語は、当該技術分野で周知の経路を用いて投与したとき、大部分の対象にアレルギー反応をはじめとする重篤な有害反応を引き起こさない分子的実体および組成物を指す。動物、より具体的にはヒトに使用できるものとして、連邦政府もしくは州政府の規制当局に承認されているか、米国薬局方をはじめとする一般に認められている薬局方に記載されている分子的実体および組成物であれば「薬学的に許容される」と見なされる。
【００４８】
本明細書で使用される「プロモーター」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼと結合して転写を開始することに関与するＤＮＡの領域を指す。
【００４９】
本明細書で使用される「核酸」、「核酸分子」または「ポリヌクレオチド」という用語は、一本鎖型または二本鎖型のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそのポリマーを指す。特に限定されない限り、この用語には、基準核酸とほぼ同じ結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドとほぼ同じ方法で代謝される天然ヌクレオチドの類似体を含む核酸が包含される。特に明示されない限り、特定の核酸配列には、明示される配列のほか、その保存的に修飾された変異体（例えば、縮重コドンによる置換）および相補的配列が黙示的に包含される。具体的には、１つまたは複数の選択された（またはすべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作製することによって、縮重コドンによる置換を達成することができる（Ｂａｔｚｅｒら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１；Ｏｈｔｓｕｋａら（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８；Ｃａｓｓｏｌら（１９９２）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８）。核酸という用語は遺伝子、ｃＤＮＡおよび遺伝子によってコードされるｍＲＮＡと互換的に使用される。本明細書で使用される「核酸」、「核酸分子」または「ポリヌクレオチド」という用語には、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡやゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ヌクレオチド類似体を用いて作製されるＤＮＡまたはＲＮＡの類似体ならびにその誘導体、フラグメントおよびホモログが包含されるものとする。
【００５０】
「発現」という用語は、核酸によってコードされる産物の生合成を指す。例えば、目的とするポリペプチドをコードする核酸セグメントの場合、発現には、核酸セグメントのｍＲＮＡへ転写およびｍＲＮＡの１つまたは複数のポリペプチドへの翻訳が含まれる。
【００５１】
「発現単位」および「発現カセット」という用語は、本明細書で互換的に使用され、目的とするポリペプチドをコードする核酸セグメントを意味し、宿主細胞内での核酸セグメントの発現をもたらすことができる。発現単位は通常、転写プロモーター、目的とするポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームおよび転写ターミネーターをすべて作動可能な配置で含む。転写プロモーターおよびターミネーターに加えて、発現単位は他の核酸セグメント、例えばエンハンサーまたはポリアデニル化シグナルなどをさらに含み得る。
【００５２】
本明細書で使用される「発現ベクター」という用語は、１つまたは複数の発現単位を含む直線状または環状の核酸分子を指す。１つまたは複数の発現単位に加えて、発現ベクターは追加の核酸セグメント、例えば、１つまたは複数の複製起点または１つもしくは複数の選択マーカーなども含み得る。発現ベクターは一般に、プラスミドまたはウイルスＤＮＡに由来し、また両方のエレメントを含み得る。
【００５３】
本明細書で使用されるＳｃｏｒｐｉｏｎは、多特異性結合タンパク質足場を指すのに使用される用語である。多特異性結合タンパク質およびポリペプチドは、例えば、国際公開第２００７／１４６９６８号、米国特許出願公開第２００６／００５１８４４号、国際公開第２０１０／０４０１０５号、同第２０１０／００３１０８号および米国特許第７，１６６，７０７号に開示されている。Ｓｃｏｒｐｉｏｎポリペプチドは２つの結合ドメイン（このドメインは同じ標的または異なる標的と特異的に結合するよう設計することが可能である）、２つのリンカーおよび免疫グロブリン定常サブ領域を含む。Ｓｃｏｒｐｉｏｎ分子のリンカーは国際公開第２０１０／００３１０８号に記載されている。いくつかの実施形態では、リンカー配列は約２〜４５個のアミノ酸、２〜３８個のアミノ酸または５〜４５個のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、リンカーは抗体ヒンジ領域（例えば、ＩｇＧ由来）またはＣレクチンストーク領域である。Ｓｃｏｒｐｉｏｎタンパク質は、ジスルフィド結合した２つの同一のＳｃｏｒｐｉｏｎポリペプチドを含むホモ二量体タンパク質である。
【００５４】
本明細書で使用される「配列同一性」という用語は、２つ以上のポリヌクレオチド配列の間または２つ以上のポリペプチド配列の間の関係を指す。１つの配列内のある位置が比較配列の対応する位置にある同じ核酸塩基またはアミノ酸残基によって占められている場合、その配列は上記位置において「同一」であると言う。「配列同一性」の百分率は、両配列において同一の核酸塩基またはアミノ酸残基がみられる位置の数を求めて「同一」位置数を得ることによって計算する。次いで、「同一」位置数を比較ウィンドウ内にある位置の総数で除し、これに１００を乗じて「配列同一性」の百分率が得られる。比較ウィンドウに最適に整列させた２つの配列を比較することによって、「配列同一性」の百分率を求める。核酸配列の比較ウィンドウは、例えば、長さが少なくとも２０、３０、４０、５０、6０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００核酸またはそれ以上であり得る。ポリペプチド配列の比較ウィンドウは、例えば、長さが少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、３００アミノ酸またはそれ以上であり得る。比較する配列を最適に整列させるため、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の一部分にギャップと呼ばれる追加または削除を含ませる一方で、基準配列を一定に保ってもよい。最適な整列は、ギャップを含んでいても、基準配列と比較配列との間で「同一」位置の数が最大限に得られる整列である。２配列間の「配列同一性」の百分率は、２００４年９月１日現在、米国国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）から入手可能であった「ＢＬＡＳＴ２  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」バージョンのプログラムを用いて求めることが可能であり、このプログラムはＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズム（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０（１２）：５８７３−５８７７，１９９３）に基づくものであり、ＢＬＡＳＴＮ（ヌクレオチド配列の比較用）およびＢＬＡＳＴＰ（ポリペプチド配列の比較用）プログラムが組み込まれている。「ＢＬＡＳＴ２  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」を用いる場合、ワードサイズ（３）、開始ギャップペナルティ（１１）、伸長ギャップペナルティ（１）、ギャップドロップオフ（５０）、期待値（１０）および特に限定されないが行列オプションを含めたその他の任意の必要なパラメータに２００４年９月１日現在デフォルトパラメータであったパラメータを用いることができる。２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が互いに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する場合、この２つの配列は「実質的にほぼ同じ配列同一性」または「実質的な配列同一性」を有すると見なされる。
【００５５】
本明細書で使用される「ポリペプチド」または「ポリペプチド鎖」とは、共有結合したアミノ酸が１本の直線状に連続して配列したもののことである。これには、鎖間ジスルフィド結合を介するなど直線状以外の形状で連結した２つのポリペプチド鎖（例えば、軽鎖と重鎖がジスルフィド結合を介して連結している半分の免疫グロブリン分子）は含まれない。ポリペプチドは、１つまたは複数の鎖内ジスルフィド結合を有していても形成してもよい。本明細書に記載されるポリペプチドに関して、配列番号によって明記されるアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基に言及する場合、その残基の翻訳後修飾がこれに含まれる。
【００５６】
「タンパク質」とは、１つまたは複数のポリペプチド鎖を含む高分子のことである。タンパク質はほかにも、炭水化物基などのペプチド以外の構成要素を含み得る。炭水化物をはじめとするペプチド以外の置換基は、タンパク質を産生する細胞によってそのタンパク質に付加され得るものであり、細胞の種類によって異なるものとなる。本明細書ではタンパク質はアミノ酸骨格の構造から定義されるため、炭水化物基などの置換基は一般に明記されないが、存在していてもよい。
【００５７】
「アミノ末端（Ｎ末端）（側）」および「カルボキシル末端（Ｃ末端）（側）」という用語は、本明細書ではポリペプチド内での位置を表すために使用される。文脈上可能な場合、近接性または相対位置を表すために、上記用語をポリペプチドの特定の配列または部分に関して使用する。例えば、ポリペプチド内の基準配列に対してカルボキシル末端側に位置する特定の配列は、基準配列のカルボキシル末端の近位に位置するが、必ずしもポリペプチド全体のカルボキシル末端に存在するとは限らない。
【００５８】
「Ｔ細胞受容体」（ＴＣＲ）とは、Ｔ細胞表面にみられ、一般にＣＤ３とともに、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子と結合する抗原の認識に関与する分子のことである。ほとんどのＴ細胞において、Ｔ細胞受容体は、極めて可変性に富むα鎖およびβ鎖がジスルフィド結合したヘテロ二量体からなる。それ以外のＴ細胞には、可変性のγ鎖およびδ鎖で構成される別の受容体が発現する。ＴＣＲの各鎖は免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、１つのＮ末端免疫グロブリン可変ドメイン、１つの免疫グロブリン定常ドメイン、膜貫通領域およびＣ末端の短い細胞質側末端を有する（ＡｂｂａｓおよびＬｉｃｈｔｍａｎ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第５版），編者：Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，２００３；Ｊａｎｅｗａｙら，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ，第４版，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐ１４８，１４９および１７２，１９９９を参照されたい）。本開示で使用するＴＣＲは、ヒト、マウス、ラットをはじめとする哺乳動物を含めた様々な動物種に由来するものであってよい。
【００５９】
本明細書で使用される「ＴＣＲ複合体」は、ＣＤ３鎖と他のＴＣＲ鎖との結合によって形成される複合体を指す。例えば、ＴＣＲ複合体はＣＤ３γ鎖１つ、ＣＤ３δ鎖１つ、ＣＤ３ε鎖２つ、ＣＤ３ζ鎖のホモ二量体１つ、ＴＣＲα鎖１つおよびＴＣＲβ鎖１つから構成され得る。あるいは、ＴＣＲ複合体はＣＤ３γ鎖１つ、ＣＤ３δ鎖１つ、ＣＤ３ε鎖２つ、ＣＤ３ζ鎖のホモ二量体１つ、ＴＣＲγ鎖１つおよびＴＣＲδ鎖１つから構成され得る。
【００６０】
本明細書で使用される「ＴＣＲ複合体の構成要素」は、ＴＣＲ鎖（例えば、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγまたはＴＣＲδ）、ＣＤ３鎖（例えば、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３εまたはＣＤ３ζ）または２つ以上のＴＣＲ鎖もしくはＣＤ３鎖によって形成される複合体（例えば、ＴＣＲαとＴＣＲβの複合体、ＴＣＲγとＴＣＲδの複合体、ＣＤ３εとＣＤ３δの複合体、ＣＤ３γとＣＤ３εの複合体またはＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖および２つのＣＤ３ε鎖のサブＴＣＲ複合体）を指す。
【００６１】
本明細書で使用される「抗体依存性細胞性細胞傷害」および「ＡＤＣＣ」は、ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびマクロファージなどの単球細胞）が標的細胞上の結合抗体（またはＦｃγＲと結合することができるその他のタンパク質）を認識し、次いでこの標的細胞の溶解を引き起こす、細胞仲介性の過程を指す。原則的に、活性化ＦｃγＲを有するエフェクター細胞であれば、ＡＤＣＣの仲介を引き起こすことができる。ＡＤＣＣを仲介する主要な細胞はＮＫ細胞であり、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対して、単球はその活性化、局在または分化の状態に応じて、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩを発現し得る。造血細胞のＦｃγＲ発現については、例えば、Ｒａｖｅｔｃｈら，１９９１，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９：４５７−９２を参照されたい。
【００６２】
ポリペプチドまたはタンパク質に関して本明細書で使用される「ＡＤＣＣ活性を有する」という用語は、ポリペプチドまたはタンパク質（例えば、免疫グロブリンヒンジ領域と、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１）などに由来するＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを有する免疫グロブリン定常サブ領域とを含むもの）が、Ｆｃ受容体を発現する細胞溶解性免疫エフェクター細胞（例えば、ＮＫ細胞）上の細胞溶解性Ｆｃ受容体（例えば、ＦｃγＲＩＩＩ）と結合することによって、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を仲介することができることを意味する。
【００６３】
本明細書で使用される「補体依存性細胞傷害」および「ＣＤＣ」という用語は、正常血清中の成分（「補体」）が、標的抗原と結合した抗体などのＣ１ｑ補体結合タンパク質とともに、その標的抗原を発現する標的細胞の溶解を示す過程を指す。補体は、規則正しく協調的に作用してその作用を発揮する１群の血清タンパク質からなる。
【００６４】
本明細書で使用される「古典的補体経路」および「古典的補体系」という用語は、補体活性化の特定の経路と同義であり、これを指す用語である。古典経路には開始するのに抗原−抗体複合体が必要であり、Ｃ１〜Ｃ９と命名される９種類の主要なタンパク質成分が規則正しく活性化する。活性化過程のいくつかの段階では、生成物は次の段階を触媒する酵素である。このカスケードにより、比較的小さい開始シグナルによって大量の補体の増幅および活性化がもたらされる。
【００６５】
ポリペプチドまたはタンパク質に関して本明細書で使用される「ＣＤＣ活性を有する」という用語は、ポリペプチドまたはタンパク質（例えば、免疫グロブリンヒンジ領域と、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１）などに由来するＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを有する免疫グロブリン定常サブ領域とを含むもの）が、Ｃ１ｑ補体タンパク質との結合および古典的補体系の活性化によって補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を仲介することができることを意味する。
【００６６】
本明細書で使用される「再誘導されたＴ細胞細胞傷害性」および「ＲＴＣＣ」は、細胞傷害性Ｔ細胞と標的細胞の両方に特異的に結合することができる多特異性タンパク質を用いて細胞傷害性Ｔ細胞が標的細胞に動員され、それにより標的細胞に対して標的依存性の細胞傷害性Ｔ細胞応答が誘発される、Ｔ細胞仲介性の過程を指す。
【００６７】
本明細書で使用される「治療（処置）」、「治療（処置）すること」または「改善すること」という用語は、治療的処置または予防的処置を指す。処置を受けている個体の疾患の症状が少なくとも１つ改善する、または処置により進行性疾患の悪化を遅らせるか、ほかの関連する疾患の開始を防ぐことができる場合、処置は治療的なものである。
【００６８】
本明細書で使用される「形質転換」、「遺伝子導入」および「形質導入」という用語は、核酸（例えば、ヌクレオチドポリマー）の細胞内への移入を指す。本明細書で使用される「遺伝子形質転換」という用語は、ＤＮＡ、特に組換えＤＮＡの細胞内への移入および組込みを指す。移入する核酸は、発現ベクターを介して細胞内に導入することができる。
【００６９】
本明細書で使用される「変異体（１つまたは複数）」という用語は、基準の核酸またはポリペプチドとは異なるが、その基本的特性は保持している核酸またはポリペプチドを指す。変異体は一般に、全体的には基準の核酸またはポリペプチドと極めて類似しており、多くの領域でこれと一致している。例えば、変異体は、基準の核酸またはポリペプチドの活性な部分または全長と比較して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％の配列同一性を示し得る。
【００７０】
「軽鎖可変領域」（「軽鎖可変ドメイン」または「ＶＬ」とも呼ばれる”）および「重鎖可変領域」（「重鎖可変ドメイン」または「ＶＨ」とも呼ばれる）という用語は、それぞれ抗体の軽鎖および重鎖の可変結合領域を指す。可変結合領域は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）として知られる個別の明確に区別されるサブ領域と、「フレームワーク領域」（ＦＲ）とからなる。一実施形態では、ＦＲはヒト化されている。「ＣＬ」という用語は「免疫グロブリン軽鎖定常領域」または「軽鎖定常領域」、すなわち抗体軽鎖の定常領域を指す。「ＣＨ」という用語は「免疫グロブリン重鎖定常領域」または「重鎖定常領域」を指し、この領域は抗体アイソタイプに応じて、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ）またはＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４ドメイン（ＩｇＥ、ＩｇＭ）にさらに分けられる。「Ｆａｂ」（抗原結合フラグメント）とは、抗体の抗原と結合する部分のことであり、鎖間ジスルフィド結合を介して軽鎖と連結した重鎖の可変領域およびＣＨ１ドメインを含む。
【００７１】
本開示は特に、結合ドメイン、特にＣＤ３と特異的に結合する第一の結合ドメインを含むポリペプチドおよびタンパク質を提供する。本開示の結合ドメインを含むポリペプチドおよびタンパク質は、以下に挙げるものを１つまたは複数含み得る：免疫グロブリン定常サブ領域（１つまたは複数）、リンカーペプチド（１つまたは複数）、ヒンジ領域（１つまたは複数）、免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメイン（１つまたは複数）、免疫グロブリン二量体化ドメイン（１つまたは複数）、１つまたは複数の接合アミノ酸、タグなど。上に挙げた本開示のポリペプチドおよびタンパク質の構成要素は、本明細書にさらに詳細に記載される。
【００７２】
さらに、本明細書に開示されるＣＤ３結合ポリペプチドおよびタンパク質は、様々な形式のいずれかの抗体または融合タンパク質の形態であり得る（例えば、融合タンパク質はＳＭＩＰタンパク質、ＰＩＭＳタンパク質、Ｓｃｏｒｐｉｏｎタンパク質またはＩｎｔｅｒｃｅｐｔｏｒタンパク質の形態であり得る）。
【００７３】
いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合ポリペプチドは第二の結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合ポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシル末端に向かってＣＤ３結合ドメイン、ヒンジ領域、定常領域および第二の結合ドメインを含む。他の実施形態では、ＣＤ３結合ポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって第二の結合ドメイン、ヒンジ領域、定常領域およびＣＤ３結合ドメインを含む。
【００７４】
本発明によるＣＤ３結合タンパク質は一般に、本明細書に記載するＣＤ３結合ドメインを含む少なくとも１つのＣＤ３結合ポリペプチド鎖（ａ）を含む。特定の変形形態では、ＣＤ３結合ポリペプチドは、（ｂ）ＣＤ３結合ドメインのカルボキシル末端側のヒンジ領域と、（ｃ）免疫グロブリン定常領域とをさらに含む（例えば、ＳＭＩＰポリペプチド）。また別の変形形態では、ＣＤ３結合ポリペプチドは、（ｄ）免疫グロブリン定常サブ領域のカルボキシル末端側の第二のヒンジ領域と、（ｅ）第二のヒンジ領域のカルボキシル末端側の第二の結合ドメインとをさらに含む（例えば、Ｓｃｏｒｐｉｏｎポリペプチド）。いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合ポリペプチドは、フレームワーク領域を有するＣＤ３結合ドメイン、プレヒンジ領域およびヒンジ領域を含む。
【００７５】
いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合ポリペプチドは、配列番号４２と比較して修飾されたアミノ酸を３個以上含み、例えば、この修飾は、例えばフレームワーク領域および／またはプレヒンジ領域における、正荷電アミノ酸から中性アミノ酸への置換および／または中性アミノ酸から負荷電アミノ酸への置換である。いくつかの実施形態では、ＶＨおよび／またはＶＬのフレームワーク領域において、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、３〜５個または３〜１０個のアミノ酸が、正荷電アミノ酸を中性アミノ酸で置換することによって、および／または中性アミノ酸を負荷電アミノ酸で置換することによって修飾されている。
【００７６】
本発明のいくつかの実施形では、ＣＤ３結合ポリペプチドはプレヒンジ領域に、例えばプレヒンジ領域またはポリペプチド全体のｐＩの低下をもたらす、修飾を含む。プレヒンジ領域は結合ドメインとヒンジ領域との間の接合部に存在する。例えば、配列ＲＲＴを有する３アミノ酸のプレヒンジ領域を配列ＳＳＳまたはＳＳＴに置き換えて、等電点を低下させることができる。いくつかの実施形態では、プレヒンジ領域は、ＲＲＴプレヒンジ領域を有するＣＤ３結合ポリペプチドと比較して等電点が低下している。
【００７７】
一実施形態では、免疫原性のリスクを低減するため、アミノ酸を、ヒト生殖系列ＩｇＧ配列中に広く存在するか、例えば、対応するヒト生殖系列ＩｇＧ配列中のヒト生殖系列配列の同じ位置またはほぼ同じ位置に含まれる配列に置換する。いくつかの実施形態では、ヒト生殖系列ＩｇＧ配列は配列番号４３または４４を含む。
【００７８】
いくつかの実施形態では、Ｃｒｉｓ−７  ＶＬ  Ｊｋ領域マウス配列ＬＱＩＴ（配列番号２５２）と比較して、少なくとも１つのアミノ酸修飾がＪカッパ（Ｊｋ）領域内に存在する。いくつかの実施形態では、Ｊｋ領域は、例えばＬＱＩＴ（配列番号２５２）の代わりに、アミノ酸配列ＶＥＩＫ（配列番号２５３）を含む。
【００７９】
いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合ポリペプチドはヒンジ領域と定常領域とを含み、例えば、ＣＤ３結合ポリペプチドは、（ａ）ＣＤ３結合ドメインのアミノ末端側のヒンジ領域と、（ｂ）ヒンジ領域のアミノ末端側の免疫グロブリン定常領域とを含み得る（例えば、ＰＩＭＳポリペプチド）。いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合ポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシル末端に向かってＤ３結合ドメイン、ヒンジ領域および定常領域を含む。いくつかの実施形態では。ＣＤ３結合ポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって定常領域、ヒンジ領域およびＣＤ３結合ドメインを含む。
【００８０】
通常、上記形態のＣＤ３結合ポリペプチド（ＳＭＩＰ、ＳｃｏｒｐｉｏｎまたはＰＩＭＳ）は、免疫グロブリン定常領域および／またはヒンジ領域を介して（例えば、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインとＩｇＧヒンジ領域とを含む免疫グロブリン定常領域を介して）、通常はジスルフィド結合により、ホモ二量体化が可能である。したがって、本発明の特定の態様では、２つの同一のＣＤ３結合ポリペプチドが二量体化して、二量体ＣＤ３結合タンパク質を形成する。
【００８１】
他の実施形態では、ＣＤ３結合ポリペプチドは、同一でない第二のポリペプチド鎖内の異なるヘテロ二量体化ドメインとのヘテロ二量体化が可能なヘテロ二量体化ドメインをさらに含む。特定の変形形態では、ヘテロ二量体化する第二のポリペプチド鎖は第二の結合ドメインを含む。したがって、本発明の特定の態様では、一方の鎖がＣＤ３結合ドメインを含み、第二の鎖が任意選択で第二の結合ドメインを含む、２つの同一でないポリペプチド鎖が二量体化して、１〜４個の結合ドメインを有するヘテロ二量体タンパク質を形成する。いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合ポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシル末端に向かってＣＤ３結合ドメイン、ヒンジ領域、定常領域、ヘテロ二量体化ドメインおよび任意選択で第二の結合ドメインを含む。
【００８２】
いくつかの実施形態では、第二の結合ドメインが標的分子と結合または相互作用し、ＣＤ３結合ポリペプチドがＴ細胞の細胞傷害を誘導する。これは二量体以外、ヘテロ二量体またはホモ二量体の形態であり得る。いくつかの実施形態では、第二の結合ドメインが腫瘍関連抗原と結合または相互作用する。いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合ポリペプチドによりＴ細胞の腫瘍細胞溶解を誘導し、かつ／または腫瘍近傍での多クローン性Ｔ細胞の活性化および拡大を誘導する。
【００８３】
本発明の抗ＣＤ３結合ドメインを含むポリペプチドは、抗体または結合特異性を保持する機能的抗体フラグメントもしくはフラグメント誘導体であるか、これを含み得る。いくつかの実施形態では、本発明は、可変重鎖および／または軽鎖ドメインを含む、融合タンパク質をはじめとするポリペプチドを含む。
【００８４】
本発明のいくつかの実施形態では、ＣＤ３結合ポリペプチドは、配列番号２８、３０、３２、３８および４０からなる群より選択されるＶＨ領域配列またはＶＬ領域配列を含む、ＣＤ３結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合ドメインは、配列番号２２、２４、２６、２８、３０および３２からなる群より選択されるＶＨ領域と、配列番号３８および４０からなる群より選択されるＶＬ領域とを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合ドメインは、配列番号２８、３０および３２からなる群より選択されるＶＨ領域と、配列番号３４、３６、３８および４０からなる群より選択されるＶＬ領域とを含む。いくつかの実施形態では、ＶＨ領域が配列番号２８を含み、ＶＬ領域が配列番号３４を含むか、ＶＨ領域が配列番号２８を含み、ＶＬ領域が配列番号３８を含むか、ＶＨ領域が配列番号２６を含み、ＶＬ領域が配列番号３８を含むか、ＶＨ領域が配列番号２６を含み、ＶＬ領域が配列番号３４を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合ポリペプチドは、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３とを含み、重鎖ＣＤＲ３が配列番号５１を含む、ＣＤ３結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合ポリペプチドは、配列番号４９を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号５０を含むＣＤＲ２および配列番号５１を含むＣＤＲ３と、配列番号５２を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５３を含むＣＤＲ２および配列番号５４を含むＣＤＲ３とを含む。
【００８５】
いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合ポリペプチドは、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８および２０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【００８６】
本発明には、二量体化した一本鎖ポリペプチドを含み、各一本鎖ポリペプチドがアミノ末端からカルボキシル末端に向かって第一の結合ドメイン、Ｎ末端リンカー、免疫グロブリン定常領域、Ｃ末端リンカーおよび本発明のＣＤ３結合ドメインを含む、多重特異性結合タンパク質が含まれる。同様に、本発明には、二量体化した一本鎖ポリペプチドを含み、各一本鎖ポリペプチドがアミノ末端からカルボキシル末端に向かって本発明のＣＤ３結合ドメイン、Ｎ末端リンカー、免疫グロブリン定常領域、Ｃ末端リンカーおよび第一の結合ドメインを含む、多重特異性結合タンパク質が含まれる。いくつかの実施形態では、Ｎ末端リンカーは、免疫グロブリンヒンジ領域を含むか、免疫グロブリンヒンジ領域から実質的になるものであり得る。
【００８７】
本発明の別の態様では、多重特異性結合タンパク質は、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって第一の結合ドメイン、Ｎ末端リンカー、免疫グロブリン定常領域、Ｃ末端リンカーおよびＣＤ３結合ドメインを含む、一本鎖ポリペプチドを含む。同様に、本発明には、アミノ末端からカルボキシル末端に向かってＣＤ３結合ドメイン、Ｎ末端リンカー、免疫グロブリン定常領域、Ｃ末端リンカーおよび第一の結合ドメインを含む、多重特異性結合タンパク質が含まれる。
【００８８】
本発明には、リンカードメインを介して第二の結合ドメインと連結した第一の結合ドメイン（例えば、リンカーを介して別のｓｃＦｖと連結したｓｃＦｖ）を含む、多重特異性結合タンパク質が含まれる。例えば、本発明には、ペプチドリンカードメインを介してＣＤ３結合ドメイン（ＶＨ−Ｌｎｋｅｒ−ＶＬまたはＶＬ−リンカー−ＶＨの配向）と連結した第一の結合ドメイン（ＶＨ−リンカー−ＶＬまたはＶＬ−リンカー−ＶＨの配向）を含む、多重特異性結合タンパク質が含まれる。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖ−リンカー−ｓｃＦｖ形態の二重特異性タンパク質は、特に限定されないが本明細書に開示される可変ドメインを含めた、Ｔ細胞抗原（ＣＤ３など）に対する抗体に由来する可変重ドメインおよび可変軽ドメインを含み得る。ｓｃＦｖドメインを隔てるリンカーは、ｎ＝１〜５の（（Ｇｌｙ４）Ｓｅｒ）ｎ（配列番号７４〜７８）を含み得る。一実施形態では、リンカーは（（Ｇｌｙ４）Ｓｅｒ）３（配列番号７６）である。リンカーはほかにも、約８〜１２個のアミノ酸を含み得る。いくつかの実施形態では、この形態（「二重特異性一本鎖抗体」）の本発明のタンパク質はＦｃ領域を含まず、その結果、Ｆｃに関連するエフェクター機能がない。
【００８９】
本発明には、本明細書に記載される１つまたは複数の結合ドメインを含む任意のタイプのポリペプチドが実質的に含まれる。これには抗体、そのフラグメント、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ｄｉ−ｓｃＦｖ一本鎖ドメイン抗体、ダイアボディ、二重可変ドメイン結合タンパク質および抗体または抗体フラグメントを含むポリペプチドが含まれる。本発明に含まれるまた別のタイプのポリペプチドが本明細書に記載される。
【００９０】
いくつかの実施形態では、ＶＨおよびＶＬドメインをｓｃＦｖとして使用し、ｓｃＦｖおよびＶＨ／ＶＬが標的と結合できるように他のポリペプチドまたはアミノ酸配列と結合／融合させる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＶＨおよびＶＬドメインを抗体またはそのフラグメント中に用いる。例えば、ＶＨおよびＶＬドメインを抗体中のＶＨおよびＶＬドメインの天然の位置に組み込む。いくつかの実施形態では、本発明のＣＤ３結合ポリペプチドは、例えば、本明細書に記載されるＶＬ鎖およびＶＨ鎖を有する抗体である。
【００９１】
本発明の一実施形態では、多重特異性タンパク質は、全抗体ではなくｓｃＦｖ二量体またはダイアボディである。ダイアボディおよびｓｃＦｖ二量体は、可変ドメインのみを用いて、Ｆｃ領域を含まずに構築することができる。ダイアボディは二価の二重特異性抗体であり、ＶＨおよびＶＬドメインが単一ポリペプチド鎖に発現するが、同じ鎖の２つのドメイン間で対形成するには短いペプチドリンカーを用いることにより、両鎖に別の鎖の相補的なドメインと対形成させ、２つの抗原結合部位を形成したものである（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．ら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８；Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．ら（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１  １２１−１１２３を参照されたい）。このような抗体結合部分は当該技術分野で公知である（ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎおよびＤｕｂｅｌ編，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（２００１）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．７９０ｐｐ．（ＩＳＢＮ  ３−５４０−４１３５４−５）。
【００９２】
本発明の一実施形態では、多重特異性タンパク質はジスルフィドで安定化したダイアボディである。例えば、多重特異性抗体は、同時発現して、２つの特異性それぞれに対して結合部位を１つ有する共有結合したヘテロ二量体複合体を形成する、２つの異なるポリペプチドを含み得る。この実施形態では、一方の鎖上にあるＶＬパートナーと第二の鎖上にあるＶＨパートナーがＶＬＡ−ＶＨＢ（第一の鎖）およびＶＬＢ−ＶＨＡ（第二の鎖）の配置で結合することによって、各Ｆｖが形成される。これを選択可能な２つのカルボキシ末端ヘテロ二量体化ドメインのいずれかによって安定化させることができる。すなわち、一方の鎖上のＶＥＰＫＳＣ（配列番号２５４）と他方の鎖上のＦＮＲＧＥＣ（配列番号２５５）で対を形成させるか、反対に荷電したコイルドコイルドメイン同士で対を形成させる。例えば、Ｍｏｏｒｅら，２０１１，Ｂｌｏｏｄ．１１７：４５４２−４５５１を参照されたい。この実施形態では、多重特異性結合タンパク質は第一の結合ドメインＶＬと連結したＣＤ３結合ドメインＶＨを有する第一の鎖を含み得、第二の鎖は第一の結合ドメインＶＨと連結したＣＤ３結合ドメインＶＬを含み、両鎖はＣ末端でジスルフィド結合を介して連結している。ジスルフィドで安定化したダイアボディは、例えば本明細書に開示される可変重鎖および軽鎖を含めた既知の抗体に由来する可変重鎖および軽鎖を用いて、設計することができる。
【００９３】
別の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、第一の結合部位（例えば、腫瘍抗原）およびＴＣＲ複合体と特異的に結合することができる二重可変ドメイン結合タンパク質である。この実施形態では、組換えタンパク質はポリペプチド鎖を含み、前記ポリペプチド鎖はＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、ＶＤ１は第一の可変ドメインであり、ＶＤ２は第二の可変ドメインであり、Ｃは定常ドメインであり、Ｘ１はリンカー（例えば、長さ約１０〜２０アミノ酸のポリペプチドリンカー）であり、Ｘ２はＦｃ領域を表し、ｎは０または１である。例えば、米国特許第８，２５８，２６８号を参照されたい。
【００９４】
本発明の一実施形態では、多重特異性結合タンパク質は１つ、２つ、３つまたはそれ以上のポリペプチド鎖を含む。例えば、本発明には、ＶＨ１−ＶＬ２を含む第一の鎖と、ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＬ１−ＶＨ２を含む第二の鎖と、ＣＨ２−ＣＨ３を含む第三の鎖とを有する、多重特異性タンパク質が含まれる。この実施形態では、ＶＨ１およびＶＬ１が第一の結合ドメインの可変ドメインに対応し、ＶＨ２およびＶＬ２が抗ＣＤ３可変ドメインに対応し得る。あるいは、ＶＨ１およびＶＬ１が抗ＣＤ３可変ドメインに対応し、ＶＨ２およびＶＬ２が第一の結合ドメインの可変ドメインに対応し得る。
【００９５】
他の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、異なる一本鎖ポリペプチドを含む二量体化した一本鎖ポリペプチド鎖（ヘテロ二量体）からなる。この形態（「多重特異性ヘテロ二量体」）では、各ポリペプチド鎖が結合ドメイン、Ｎ末端リンカー、定常領域、Ｃ末端リンカーおよび任意選択で別の結合ドメインを含み、さらにヘテロ二量体化ドメインを含む。特定の変形形態では、ヘテロ二量体化する第二のポリペプチド鎖は、追加の結合ドメインを含む。したがって、本発明の特定の実施形態では、ヘテロ二量体組換えタンパク質は、２つ、３つまたは４つの異なる結合ドメインを含み得る。いくつかの例および関連する方法については、国際公開第２０１１／０９０７６２号を参照されたい。
【００９６】
前述の通り、本開示のＣＤ３結合ポリペプチドは、ＣＤ３と特異的に結合する結合ドメインを含む。いくつかの変形形態では、ＣＤ３結合ドメインは、ＣＤ３との結合で、配列番号４１で示されるアミノ酸配列を有する一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）と競合することができる。特定の実施形態では、ＣＤ３結合ドメインは、（ｉ）ＣＤＲのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域と、（ｉｉ）ＣＤＲのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。適切なＣＤ３結合ドメインとしては、マウスモノクローナル抗体Ｃｒｉｓ−７（Ｒｅｉｎｈｅｒｚ，Ｅ．Ｌら（編），Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｔｙｐｉｎｇ  ＩＩ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８６））に由来するＶＬおよびＶＨ領域を含む結合ドメインが挙げられる。いくつかのこのような実施形態では、ＬＣＤＲ３が配列番号５４に記載されるアミノ酸配列を有し、かつ／またはＨＣＤＲ３が配列番号５１に記載されるアミノ酸配列を有し；ＬＣＤＲ１およびＬＣＤＲ２が任意選択で、それぞれ配列番号５２および配列番号５３に記載されるアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１およびＨＣＤＲ２が任意選択で、それぞれ配列番号４９および配列番号５０に記載されるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、例えば、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３が、それぞれ配列番号５２、５３および５４で示されるアミノ酸配列を有し；かつ／またはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３が、それぞれ配列番号４９、５０および５１で示されるアミノ酸配列を有する。
【００９７】
本開示の結合ドメインが由来し得る例示的な抗ＣＤ３抗体としては、Ｃｒｉｓ−７  モノクローナル抗体（Ｒｅｉｎｈｅｒｚ，Ｅ．Ｌ．ら（編），Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｔｙｐｉｎｇ  ＩＩ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８６）
（ＶＬ＝ＱＶＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＦＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＳＳＫＬＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＴＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＲＮＰＰＴＦＧＧＧＴＫＬＱＩＴＲ（配列番号４６）および
ＶＨ＝ＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＲＳＴＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＳＳＡＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＳＰＱＶＨＹＤＹＮＧＦＰＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（配列番号４５））；ＨｕＭ２９１（Ｃｈａｕら（２００１）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ７１：９４１−９５０
（ＶＬ＝ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＲＬＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＰＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号７２）および
ＶＨ＝ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＩＳＹＴＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＹＩＮＰＲＳＧＹＴＨＹＮＱＫＬＫＤＫＡＴＬＴＡＤＫＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＡＹＹＤＹＤＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号７３））；ＢＣ３モノクローナル抗体（Ａｎａｓｅｔｔｉら（１９９０）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：１６９１）；ＯＫＴ３モノクローナル抗体（Ｏｒｔｈｏ  ｍｕｌｉｉｃｅｎｉｅｒ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｓｔｕｄｙ  Ｇｒｏｕｐ（１９８５）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１３：３３７）およびＯＫＴ３  ａｌａ−ａｌａ（ＯＫＴ３  ＡＡ−ＦＬまたはＯＫＴ３  ＦＬとも呼ばれる）、２３４と２３５の位置にアラニン置換を有するヒト化Ｆｃ変異体などのその誘導体（Ｈｅｒｏｌｄら（２００３）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１：４０９）；ビジリズマブ（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒら（２００２）Ｂｌｏｏｄ  ９９：２７１２）、Ｇ１９−４モノクローナル抗体（Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒら，１９８６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３６：３９４５）ならびに１４５−２Ｃ１１モノクローナル抗体（Ｈｉｒｓｃｈら（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：３７６６）が挙げられる。例示的な抗ＴＣＲ抗体にはＢＭＡ０３１モノクローナル抗体がある（Ｂｏｒｓｔら（１９９０）Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２９：１７５−１８８）。
【００９８】
いくつかの実施形態では、結合ドメインは、目的とする標的に特異的なＶＨおよびＶＬ領域を含む一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）である。特定の実施形態では、ＶＨおよびＶＬ領域はヒトである。
【００９９】
本発明の一実施形態では、ＣＤ３結合ポリペプチドは、実験的および／または理論的ｐＩがＤＲＡ２０９  ＳＭＩＰより少なくとも０．２５、０．５、０．７５、１、１．２５、１．５、２、２．５単位またはそれ以上低い。いくつかの実施形態では、本発明のＣＤ３結合ポリペプチドは、実験的および／または理論的ｐＩがＤＲＡ２０９  ＳＭＩＰより約０．２５〜約２．５、０．５〜約２．５、約０．５〜約２．０、約０．５〜約１．５、約０．５〜約１．２５、約０．５〜約１．０、約０．５〜約０．７５、約０．７５〜約１．０、約０．７５〜約１．２５、約０．７５〜約１．５、約０．７５〜約２．０、約１．０〜約１．５、約１．０〜約２．０または約１．０〜約２．５単位低い。いくつかの実施形態では、本発明のＣＤ３ポリペプチドは、実験的または理論的ｐＩが約８．９、８．８、８．７、８．６、８．５、８．４、８．３、８．２、８．１、８、７．５、７．２５、７．０または６．７５未満である。いくつかの実施形態では、本発明のＣＤ３ポリペプチドは、実験的または理論的ｐＩが約８．９、８．８、８．７、８．６、８．５、８．４、８．３、８．２、８．１、８、７．５、７．２５、７．２、７．０、６．８または６．７５である。いくつかの実施形態では、本発明のＣＤ３ポリペプチドは、実験的または理論的ｐＩが約７．９〜約８．７、７．９〜約８．６、８．０〜約８．６、８．０〜約８．５、８．０〜約８．４、８．０〜約８．３、８．０〜約８．２、８．０〜約８．１、約８．１〜約８．６、約８．２〜約８．６、約８．３〜約８．６、約８．４〜約８．６、約８．５〜約８．６、約８．５〜約８．３、約８．４〜約８．２または約８．３〜約８．１である。
【０１００】
特定の実施形態では、ＣＤ３結合ドメインは、ｐＩ（実験値および／または理論値）が配列番号４１のｓｃＦｖと比較して少なくとも約０．２５、０．５、１、１．２５、１．５、２、２．５単位またはそれ以上低下したｓｃＦｖを含むか、このようなｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合ドメインは、ｐＩ（実験値および／または理論値）が配列番号４１のｓｃＦｖより約０．２５〜約２．５、０．５〜約２．５、約０．５〜約２．０、約０．５〜約１.５、約０．５〜約１．２５、約０．５〜約１．０、約０．５〜約０．７５、約０．７５〜約１．０、約０．７５〜約１．２５、約０．７５〜約１．５、約０．７５〜約２．０、約１．０〜約1．５、約１．０〜約２．０または約１．０〜約２．５単位低いｓｃＦｖを含むか、このようなｓｃＦｖである。このようなｓｃＦｖとしては、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８および２０に含まれるｓｃＦｖならびに配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８および２０に含まれるｓｃＦｖのアミノ酸配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％または１００％一致するｓｃＦｖが挙げられる。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、本発明のＣＤ３結合ドメインは、配列番号４１と約８０％〜約９９％、約８２％〜約９９％、約８４％〜約９９％、約８６％〜約９９％、約８８％〜約９９％、約９０％〜約９９％、約９２％〜約９９％、約９４％〜約９９％、約９６％〜約９９％、約９７％〜約９９％、約９８％〜約９９％、約８０％〜約８５％、約８５％〜約９０％、約８５％〜約９５％、約９０％〜約９７％、約９０％〜約９５％、約９０％〜約９３％、約９０％〜約９１％、約９５％〜約９６％、約９６％〜約９７％、約９７％〜約９８％、約９６％〜約９７％または約９６％〜約９８％一致する。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、本発明のＣＤ３結合ドメインは、配列番号４１の変異体であり、アミノ酸配列中の１つまたは複数のアミノ酸には、結合ドメインのｐＩが低下するよう変異が施されている。変異としては、結合ドメインのｐＩを低下させる、あるアミノ酸（１つまたは複数）から別のアミノ酸（１つまたは複数）への置換、結合分子のｐＩを低下させるアミノ酸（１つまたは複数）挿入および／または結合ドメインのｐＩを低下させるアミノ酸（１つまたは複数）削除が挙げられる。一実施形態では、変異は置換である。いくつかの実施形態では、変異（１つまたは複数）は可変鎖（１つまたは複数）のフレームワーク領域内に存在する。いくつかの実施形態では、変異体は１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれ以上のアミノ酸の変異を有する。
【０１０３】
一実施形態では、ＣＤ３結合ドメインは、配列番号２８，３０，３２，３８および４０からなる群より選択される重鎖または軽鎖を含むｓｃＦｖを含むか、このようなｓｃＦｖである。別の実施形態では、ＣＤ３結合ドメインは、配列番号２２，２４，２６，２８，３０および３２からなる群より選択されるＶＨ領域と、配列番号３８および４０からなる群より選択されるＶＬ領域とを含む。別の実施形態では、ＣＤ３結合ドメインは、配列番号２８，３０および３２からなる群より選択されるＶＨ領域と、配列番号３４，３６，３８および４０からなる群より選択されるＶＬ領域とを含む。別の実施形態では、ＣＤ３結合ドメインは配列番号２８と配列番号３４とを含む。別の実施形態では、ＣＤ３結合ドメインは配列番号２８と配列番号３８とを含む。別の実施形態では、ＣＤ３結合ドメインは配列番号２６と配列番号３８とを含む。別の実施形態では、ＣＤ３結合ドメインは配列番号２６と配列番号３４とを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合ドメインは、配列番号３８および４０からなる群より選択されるＶＬ領域と、配列番号２２，２４，２６，２８，３０および３２からなる群より選択されるＶＨ領域とを含む。また別の実施形態では、各ＣＤＲが、目的とする標的（例えば、ＣＤ３）と特異的に結合するモノクローナル抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体のＣＤＲと比較して、１つ以下、２つ以下または３つ以下の置換を含む。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合ドメインは、Ｔ細胞上のＴ細胞受容体複合体のＣＤ３εサブユニットと結合または相互作用する。いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合ドメインは、ＣＤ３εとの結合でＣｒｉｓ−７またはＨｕＭ２９１モノクローナル抗体と競合する。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合ポリペプチドはＴ細胞受容体複合体の内部移行を誘導する。
【０１０６】
いくつかの変形形態では、結合ドメインは、ペプチドリンカーによって連結された免疫グロブリンＶＬ領域とＶＨ領域とを含む、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である。ＶＬ領域とＶＨ領域とを連結するのにペプチドリンカーを使用することは当該技術分野で周知であり、この特定の分野には刊行物が多数存在する。広く用いられているペプチドリンカーには、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号７４）の３回反復からなる１５ｍｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号７６）がある。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは配列番号７４〜７８のいずれか１つを含むか、これよりなる。これ以外のリンカーも使用されており、またしかるべきリンカー配列を多様化させて選択するのにファージディスプレイ技術および選択的感染性ファージ技術が用いられている（Ｔａｎｇら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，１５６８２−１５６８６，１９９６；Ｈｅｎｎｅｃｋｅら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１１，４０５−４１０，１９９８）。特定の実施形態では、ＶＨ領域とＶＬ領域は、ｎ＝１〜５である式（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（それぞれ配列番号７４〜７８）を含むアミノ酸配列を有するペプチドリンカーによって連結されている。単純なリンカー（例えば、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ）をランダム変異誘発により最適化することによって、他の適切なリンカーを得てもよい。
【０１０７】
特定の実施形態では、結合ドメインは、ヒト化免疫グロブリンのＶＬおよび／またはＶＨ領域を含む。免疫グロブリンのＶＬおよびＶＨ領域をヒト化する技術は当該技術分野で公知であり、例えば、米国特許出願公開第２００６／０１５３８３７号で論じられている。
【０１０８】
「ヒト化」により、免疫原性が低下し元の分子の抗原結合性を完全に保持している抗体が得られることが期待される。元の抗体の抗原結合性がすべて保持されるためには、その抗原結合部位の構造が「ヒト化」型において再現される必要がある。これは、重要なフレームワーク残基を保持するかしないかに関係なく非ヒトＣＤＲのみをヒト可変フレームワークドメインおよび定常領域に移植することによって（Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２（１９８６）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３９（１９８８））、あるいは非ヒト可変ドメイン全体を再結合させる（リガンド結合性を維持するため）とともに、露出している残基を慎重に置き換えることにより、それをヒト様表面で「覆う」（抗原性を低下させる）ことによって（Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９（１９９１））、達成することができる．
【０１０９】
ＣＤＲ移植によるヒト化では基本的に、非ヒト抗体のＣＤＲのみをヒト可変領域フレームワークおよびヒト定常領域に再結合させる。理論的には、この操作により、実質的に免疫原性が低下または消失するはずである（アロタイプまたはイディオタイプの違いが存在する場合は除く）。しかし、元の抗体のフレームワーク残基も一部残しておくことが必要な場合があることが報告されている（Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３（１９８８）；Ｑｕｅｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：１０，０２９（１９８９））。
【０１１０】
残しておく必要のあるフレームワーク残基は、コンピュータモデリングにより特定することが可能である。あるいは、既知の抗原結合部位の構造を比較することによって、重要なフレームワーク残基を特定できる可能性もある（Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３１（３）：１６９−２１７（１９９４）、参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１１１】
抗原結合に影響を及ぼす可能性のある残基はいくつかのグループに分けられる。第一のグループには、抗原部位表面に隣接しているため抗原と直接接触する可能性のある残基が含まれる。このような残基としては、アミノ末端残基およびＣＤＲに隣接する残基が挙げられる。第二のグループには、ＣＤＲまたは抗体中の別のペプチド鎖と接触することによって、ＣＤＲの構造または相対的配列を変化させる可能性のある残基が含まれる。第三のグループには、可変ドメインの構造的完全性に影響を及ぼす可能性のある埋もれた側鎖を有するアミノ酸が含まれる。上に挙げたグループの残基は通常、同じ位置にみられるが（Ｐａｄｌａｎ、１９９４，同上）、特定されるその位置は番号付けの方式によって異なり得る（Ｋａｂａｔら，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，Ｐｕｂ．Ｎｏ．９１−３２４２，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ＆  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９９１を参照されたい）。
【０１１２】
本明細書に記載されるいくつかの例にはｓｃＦｖ、ＳＭＩＰ、ＳｃｏｒｐｉｏｎおよびＩｎｔｅｒｃｅｐｔｏｒ分子のヒト化が含まれ、抗体のヒト化は含まれていないが、当該技術分野におけるヒト化抗体に関する知識を本発明によるポリペプチドに適用することができる。
【０１１３】
特定の実施形態では、ヒンジは野生型ヒト免疫グロブリンヒンジ領域である。他の特定の実施形態では、融合タンパク質構築物の設計の一部として、野生型免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ末端またはカルボキシル末端に１つまたは複数のアミノ酸残基を付加し得る。例えば、ヒンジのアミノ末端では追加の接合部アミノ酸残基が「ＲＴ」、「ＲＳＳ」、「ＴＧ」または「Ｔ」であってよく、ヒンジのカルボキシル末端ではこれが「ＳＧ」であってよく、またヒンジの削除を、カルボキシル末端に付加された「ＳＧ」を有するΔＰなどの付加と組み合わせてもよい。
【０１１４】
特定の実施形態では、ヒンジは、野生型免疫グロブリンヒンジ領域の１つまたは複数のシステイン残基が１つまたは複数の他のアミノ酸残基（例えば、セリンまたはアラニン）で置換されて変化した免疫グロブリンヒンジである。
【０１１５】
例示的な変化した免疫グロブリンヒンジとしては、特に限定されないが、野生型ヒトＩｇＧ１ヒンジにみられる１個、２個または３個のシステイン残基が、１個、２個または３個の別のアミノ酸残基（例えば、セリンまたはアラニン）で置換された免疫グロブリンヒトＩｇＧ１ヒンジ領域が挙げられる。変化した免疫グロブリンヒンジはさらに、プロリンが別のアミノ酸（例えば、セリンまたはアラニン）で置換されていてよい。例えば、上記変化したヒトＩｇＧ１ヒンジはさらに、野生型ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域の３個のシステインのカルボキシル末端側に位置するプロリンが、別のアミノ酸残基（例えば、セリン、アラニン）で置換されていてよい。一実施形態では、コアヒンジ領域のプロリンは置換されていない。
【０１１６】
特定の実施形態では、ヒンジポリペプチドは、野生型ヒトＩｇＧ１ヒンジ、野生型ヒトＩｇＧ２ヒンジまたは野生型ヒトＩｇＧ４ヒンジなどの野生型免疫グロブリンヒンジ領域と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％一致する配列を含むか、このような配列である。
【０１１７】
また別の実施形態では、ＣＤ３結合ポリペプチド内に存在するヒンジは、免疫グロブリンヒンジをベースにしたものでも、これに由来するものでもない（すなわち、野生型免疫グロブリンヒンジでも変化した免疫グロブリンヒンジでもない）ヒンジであり得る。このようなヒンジの例としては、膜貫通タンパク質のドメイン間領域またはＩＩ型Ｃレクチンのストーク領域に由来する約５〜約１５０アミノ酸のペプチド、例えば、約８〜２５アミノ酸のペプチドおよび約７〜１８アミノ酸のペプチドが挙げられる。
【０１１８】
特定の実施形態では、ドメイン間領域またはストーク領域ヒンジは７〜１８個のアミノ酸を有し、αヘリックスコイルドコイル構造を形成し得る。特定の実施形態では、ドメイン間領域またはストーク領域ヒンジは０個、１個、２個、３個または４個のシステインを含む。例示的なドメイン間領域またはストーク領域ヒンジにはドメイン間領域またはストーク領域のペプチドフラグメント、例えばＣＤ６９、ＣＤ７２、ＣＤ９４、ＮＫＧ２ＡおよびＮＫＧ２Ｄのストーク領域に由来する１０〜１５０アミノ酸のフラグメントなどがある。
【０１１９】
特定の実施形態では、ヒンジ配列は約５〜１５０個のアミノ酸、５〜１０個のアミノ酸、１０〜２０個のアミノ酸、２０〜３０個のアミノ酸、３０〜４０個のアミノ酸、４０〜５０個のアミノ酸、５０〜６０個のアミノ酸、５〜６０個のアミノ酸、５〜４０個のアミノ酸、８〜２０個のアミノ酸または１０〜１５個のアミノ酸を有する。ヒンジは主として柔軟なものであり得るが、より柔軟性の少ない特性を備えたものであっても、最小限のβシート構造を有するαヘリックス構造を主として含むものであってもよい。ヒンジの長さまたは配列は、ヒンジが直接的または間接的に（ヘテロ二量体化ドメインなどの別の領域またはドメインを介して）接合している結合ドメインの結合親和性およびヒンジが直接的または間接的に接合しているＦｃ領域部分の１つまたは複数の作用に影響を及ぼし得る。
【０１２０】
特定の実施形態では、ヒンジ配列は血漿および血清中で安定であり、タンパク質分解による切断に対して耐性がある。ＩｇＧ１上部ヒンジ領域の最初のリジンを変異させてタンパク質分解による切断を最小限に抑えてもよく、例えば、リジンをメチオニン、トレオニン、アラニンまたはグリシンで置換するか、削除してもよい。
【０１２１】
本発明のいくつかの実施形態では、ＣＤ３結合ポリペプチドは、第二のポリペプチド鎖とヘテロ二量体を形成することができ、以下のようなヒンジ領域を含む：（ａ）免疫グロブリン定常領域のすぐアミノ末端側（例えば、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む免疫グロブリン定常領域のＣＨ２ドメインのアミノ末端側またはＣＨ３およびＣＨ４ドメインを含む免疫グロブリン領域のＣＨ３ドメインのアミノ末端側）に位置する、（ｂ）結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）と免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインの間に介在し、これを接合している、（ｃ）免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインと免疫グロブリン定常領域（例えば、この免疫グロブリン定常領域がＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインまたはＣＨ３ドメインとＣＨ４ドメインを含む）の間に介在し、これを接合している、（ｄ）免疫グロブリン定常領域と結合ドメインの間に介在し、これを接合している、（ｅ）ポリペプチド鎖のアミノ末端に位置する、または（ｆ）ポリペプチド鎖のカルボキシル末端に位置している。本明細書に記載されるヒンジ領域を含むポリペプチド鎖は、別のポリペプチド鎖と結合して、本明細書に提供されるホモ二量体またはヘテロ二量体タンパク質を形成することが可能であり、形成される二量体は、標的特異性および／または特異的な標的結合親和性を保持する結合ドメインを含むことになる。
【０１２２】
特定の実施形態では、別のポリペプチド鎖とヘテロ二量体を形成するポリペプチド中に存在するヒンジは、野生型免疫グロブリンヒンジ領域またはその変化した免疫グロブリンヒンジ領域などの免疫グロブリンヒンジであり得る。特定の実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質の一方のポリペプチド鎖のヒンジは、ヘテロ二量体の他方のポリペプチド鎖の対応するヒンジと同一である。他の特定の実施形態では、一方の鎖のヒンジは、他方の鎖のヒンジと異なっている（例えば、長さおよび／または配列が異なっている）。異なる鎖のヒンジ同士が異なっていれば、ヒンジが接合している結合ドメインの結合親和性に異なる操作を施すことが可能であり、これにより、ヘテロ二量体が一方の結合ドメインの標的と、他方の結合ドメインの標的よりも優先的に結合することが可能になる。例えば、特定の実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質は、一方の鎖にＣＤ３結合ドメインまたはＴＣＲ結合ドメインを有し、もう一方の鎖に第二の結合ドメイン（腫瘍抗原結合ドメインなど）を有する。２つの鎖に２種類の異なるヒンジを有することにより、ヘテロ二量体が最初に腫瘍抗原と結合し、次いでＣＤ３をはじめとするＴＣＲ成分と結合することが可能になる。したがって、このヘテロ二量体は、腫瘍抗原発現細胞（例えば、ＰＳＭＡ発現腫瘍細胞）にＣＤ３＋Ｔ細胞を動員し、次いで、その腫瘍抗原発現細胞を傷害または破壊し得る。
【０１２３】
本発明による使用に適した例示的ヒンジ領域を下の表１および２に示す。
【０１２４】
【表１】
2018138039.tif 000002
2018138039.tif 000003
【０１２５】
【表２】
2018138039.tif 000004
2018138039.tif 000005
【０１２６】
特定の実施形態では、本発明のＣＤ３結合ポリペプチドまたはタンパク質は、「免疫グロブリン二量体化ドメイン」または「免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメイン」を含み得る。
【０１２７】
本明細書で使用される「免疫グロブリン二量体化ドメイン」または「免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメイン」は、第二のポリペプチド鎖の第二の免疫グロブリンドメインと相互作用または結合するポリペプチド鎖の免疫グロブリンドメインを指し、第一の免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインと第二の免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインとの相互作用は、第一のポリペプチド鎖と第二のポリペプチド鎖とのヘテロ二量体化（すなわち、２つの異なるポリペプチド鎖間の二量体の形成のことであり、この二量体は「ヘテロ二量体」または「ヘテロ二量体タンパク質」とも呼ばれる）に実質的に寄与するか、これを効率的に促進する。第一のポリペプチド鎖の免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインおよび／または第二のポリペプチド鎖の免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインの非存在下で、第一のポリペプチド鎖と第二のポリペプチド鎖の間の二量体形成に統計的に有意な減少がみられる場合、免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメイン間の相互作用は、第一のポリペプチド鎖と第二のポリペプチド鎖とのヘテロ二量体化に「実質的に寄与するか、これを効率的に促進する」ことになる。特定の実施形態では、第一のポリペプチド鎖と第二のポリペプチド鎖が同時発現する場合、第一のポリペプチド鎖と第二のポリペプチド鎖の少なくとも６０％、少なくとも約６０％〜約７０％、少なくとも約７０％〜約８０％、少なくとも８０％〜約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％が互いにヘテロ二量体を形成する。代表的な免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインとしては、野生型免疫グロブリンＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインならびに本明細書に提供されるような変化した（または変異した）免疫グロブリンＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインを含めた、免疫グロブリンＣＨ１ドメイン、免疫グロブリンＣＬドメイン（例えば、ＣｋまたはＣλアイソタイプ）またはその誘導体が挙げられる。
【０１２８】
二量体化／ヘテロ二量体化ドメインは、２つの同一でないポリペプチド鎖がヘテロ二量体を形成することが望まれ、一方または両方のポリペプチド鎖が結合ドメインを含む場合に使用され得る。特定の実施形態では、本明細書に記載される特定のヘテロ二量体の一方のポリペプチド鎖要素が結合ドメインを含まない。前述の通り、本開示のヘテロ二量体タンパク質は、各ポリペプチド鎖に免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインを含む。ヘテロ二量体のポリペプチド鎖内の免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインは互いに異なるものであるため、それぞれ異なる修飾を施して両鎖のヘテロ二量体化を促進し、片方の鎖でのホモ二量体形成を最小限に抑えることができる。国際公開第２０１１／０９０７６２号に示される通り、本明細書に提供される免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインによって、異なるポリペプチド間の効率的なヘテロ二量体化が可能になり、生じるヘテロ二量体タンパク質の精製が容易になる。
【０１２９】
本明細書に記載される通り、本開示による２つの異なる一本鎖ポリペプチド（例えば、一方が短く、他方が長い）のヘテロ二量体化を促進するのに有用な免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインは、免疫グロブリンＣＨ１ドメインおよびＣＬドメイン、例えば、ヒトＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインを含む。特定の実施形態では、免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインは、野生型ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭ  ＣＨ１ドメインなどの野生型ＣＨ１ドメインである。また別の実施形態では、免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインは、それぞれ国際公開第２０１１／０９０７６２号の配列番号１１４、１８６〜１９２および１９４に記載される野生型ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭ  ＣＨ１ドメインである（前記配列は参照により本明細書に組み込まれる）。特定の実施形態では、免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインは、国際公開第２０１１／０９０７６２号の配列番号１１４に記載される野生型ヒトＩｇＧ１  ＣＨ１ドメインであり（前記配列は参照により本明細書に組み込まれる）、このドメインは本願の配列番号８０と同じものである。
【０１３０】
また別の実施形態では、免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインは、変化したＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭ  ＣＨ１ドメインなどの変化した免疫グロブリンＣＨ１ドメインである。特定の実施形態では、免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインは、変化したヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭ  ＣＨ１ドメインである。さらにまた別の実施形態では、変化した免疫グロブリンＣＨ１ドメインにおいて、変化したＣＨ１ドメインと野生型ＣＬドメインとの間にジスルフィド結合が形成されないように、野生型免疫グロブリンＣＬドメイン（例えば、ヒトＣＬ）とのジスルフィド結合形成に関与する野生型ＣＨ１ドメイン（例えば、ヒトＣＨ１）のシステイン残基が削除または置換されている。
【０１３１】
特定の実施形態では、免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインは、野生型Ｃｋドメインや野生型Ｃλドメインなどの野生型ＣＬドメインである。特定の実施形態では、免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインは、それぞれ国際公開第２０１１／０９０７６２号の配列番号１１２および１１３に記載される野生型ヒトＣｋまたはヒトＣλドメインであり（前記配列は参照により本明細書に組み込まれる）、上記ドメインは、それぞれ本願の配列番号８１および８２と同じものである。また別の実施形態では、免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインは、変化したＣｋまたはＣλドメイン、例えば変化したヒトＣｋまたはヒトＣλドメインなどの変化した免疫グロブリンＣＬドメインである。
【０１３２】
特定の実施形態では、変化した免疫グロブリンＣＬドメインにおいて、野生型免疫グロブリンＣＨ１ドメイン（例えば、ヒトＣＨ１）とのジスルフィド結合形成に関与する野生型ＣＬドメイン（例えば、ヒトＣＬ）のシステイン残基が削除または置換されている。このような変化したＣＬドメインは、そのアミノ末端にアミノ酸削除をさらに含む。例示的なＣｋドメインは国際公開第２０１１／０９０７６２号の配列番号１４１で表され（前記配列は参照により本明細書に組み込まれ、本願の配列番号８３である）、野生型ヒトＣｋドメインの最初のアルギニンと最後のシステインがともに削除されている。特定の実施形態では、カルボキシル末端にアルギニンを有し、変化したＣｋドメインのアミノ末端と別のドメイン（例えば、免疫グロブリンＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含むサブ領域などの免疫グロブリンサブ領域）とを連結するリンカーによって、野生型ヒトＣｋドメインから最初のアルギニンが削除され得るため、変化したＣｋドメインにおいて、野生型ヒトＣｋドメインの最後のシステインのみが削除されている。例示的なＣλドメインは国際公開第２０１１／０９０７６２号の配列番号１４０で表され（前記配列は参照により本明細書に組み込まれ、本願の配列番号８４である）、野生型ヒトＣλドメインの最初のアルギニンが削除され、ＣＨ１ドメインのシステインとのジスルフィド結合形成に関与するシステインがセリンで置換されている。
【０１３３】
また別の実施形態では、免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインは、野生型Ｃｋドメインと比較して、Ｃｋ−Ｃｋ接合部分における鎖間の水素結合ネットワークの形成に関与し得る位置に１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、変化したＣｋドメインである。例えば、特定の実施形態では、免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインは、Ｎ２９、Ｎ３０、Ｑ５２、Ｖ５５、Ｔ５６、Ｓ６８またはＴ７０の位置に別のアミノ酸で置換された１つまたは複数のアミノ酸を有する、変化したヒトＣｋドメインである。アミノ酸の番号付けは、国際公開第２０１１／０９０７６２号の配列番号１４１に記載される変化したヒトＣｋ配列（前記配列は参照により本明細書に組み込まれ、本願の配列番号８３である）における位置に基づくものである。特定の実施形態では、免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインは、Ｎ２９、Ｎ３０、Ｖ５５またはＴ７０の位置に１つ、２つ、３つまたは４つのアミノ酸置換を有する、変化したヒトＣｋドメインである。上記の位置における置換基として用いられるアミノ酸は、アラニンまたはかさ高い側鎖部分を有するアミノ酸残基、例えばアルギニン、トリプトファン、チロシン、グルタミン酸、グルタミンもしくはリジンなどであり得る。上記の位置（例えば、Ｎ３０）において野生型ヒトＣｋ配列のアミノ酸残基を置換するのに使用し得るほかのアミノ酸残基としては、アスパラギン酸、メチオニン、セリンおよびフェニルアラニンが挙げられる。例示的なヒトＣｋドメインは、国際公開第２０１１／０９０７６２号の配列番号１４２〜１７８に記載されている（前記配列は参照により本明細書に組み込まれる）。変化したヒトＣｋドメインは、ＣＨ１ドメインとのヘテロ二量体化を促進するが、別のＣｋドメインとのホモ二量体化を最小限に抑えるものである。代表的な変化したヒトＣｋドメインは、国際公開第２０１１／０９０７６２号の配列番号１６０（Ｎ２９Ｗ  Ｖ５５Ａ  Ｔ７０Ａ）、１６１（Ｎ２９Ｙ  Ｖ５５Ａ  Ｔ７０Ａ）、２０２（Ｔ７０Ｅ  Ｎ２９Ａ  Ｎ３０Ａ  Ｖ５５Ａ）、１６７（Ｎ３０Ｒ  Ｖ５５Ａ  Ｔ７０Ａ）、１６８（Ｎ３０Ｋ  Ｖ５５Ａ  Ｔ７０Ａ）、１７０（Ｎ３０Ｅ  Ｖ５５Ａ  Ｔ７０Ａ）、１７２（Ｖ５５Ｒ  Ｎ２９Ａ  Ｎ３０Ａ）、１７５（Ｎ２９Ｗ  Ｎ３０Ｙ  Ｖ５５Ａ  Ｔ７０Ｅ）、１７６（Ｎ２９Ｙ  Ｎ３０Ｙ  Ｖ５５Ａ  Ｔ７０Ｅ）、１７７（Ｎ３０Ｅ  Ｖ５５Ａ  Ｔ７０Ｅ）、１７８（Ｎ３０Ｙ  Ｖ５５Ａ  Ｔ７０Ｅ）、８３８（Ｎ３０Ｄ  Ｖ５５Ａ  Ｔ７０Ｅ）、８３９（Ｎ３０Ｍ  Ｖ５５Ａ  Ｔ７０Ｅ）、８４０（Ｎ３０Ｓ  Ｖ５５Ａ  Ｔ７０Ｅ）および８４１（Ｎ３０Ｆ  Ｖ５５Ａ  Ｔ７０Ｅ）に記載されている（前記配列は参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１３４】
特定の実施形態では、本明細書に記載されるＣｋドメインの変異に加えて、またはこれに代えて、生じた免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインが変異部位のアミノ酸残基との間に塩橋（すなわち、イオン性相互作用）を形成するように、ポリペプチドヘテロ二量体の両方の免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメイン（例えば、免疫グロブリンＣＨ１ドメインおよびＣＬドメイン）が変異を有する。例えば、ポリペプチドヘテロ二量体の免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインは、変異Ｃｋドメインと組み合わさった変異ＣＨ１ドメインであり得る。変異ＣＨ１ドメインでは、野生型ヒトＣＨ１ドメインの６８位のバリン（Ｖ６８）が負電荷を有するアミノ酸残基（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）で置換され、最初のアルギニンおよび最後のシステインが削除されている変異ヒトＣｋドメインの２９位のロイシン（Ｌ２９）が、正電荷を有するアミノ酸残基（例えば、リジン、アルギニンまたはヒスチジン）で置換されている。生じた変異ＣＨ１ドメインの負電荷を有するアミノ酸残基と、生じた変異Ｃｋドメインの正電荷を有するアミノ酸残基との間の電荷間相互作用によって塩橋が形成され、これにより、変異したＣＨ１ドメインとＣｋドメインとの間のヘテロ二量体接合部分が安定化する。あるいは、野生型ＣＨ１のＶ６８が正電荷を有するアミノ酸残基でされ、最後のアルギニンおよび最後のシステインが削除されている変異ヒトＣｋドメインのＬ２９が、負電荷を有するアミノ酸残基で置換されていてもよい。Ｖ６８が負電荷または正電荷を有するアミノ酸で置換された例示的な変異ＣＨ１配列は、国際公開第２０１１／０９０７６２号の配列番号８４４および８４５に記載されている（前記配列は参照により本明細書に組み込まれる）。Ｌ２９が負電荷または正電荷を有するアミノ酸で置換された例示的な変異Ｃｋ配列は、国際公開第２０１１／０９０７６２号の配列番号８４２および８４３に記載されている（前記配列は参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１３５】
ＣＨ１ドメインのＶ６８およびＣｋドメインのＬ２９における変異に加えて、またはこれに代えて、ヒトＣＨ１ドメインのＶ６８およびヒトＣｋドメインのＬ２９以外の位置を反対の電荷を有するアミノ酸で置換して、アミノ酸同士のイオン性相互作用を生じさせてもよい。このような位置は、ランダム変異誘発、ＣＨ１−Ｃｋ接合部分のアミノ酸残基を特定するＣＨ１−Ｃｋ対の結晶構造の解析、さらには一連の基準（例えば、イオン性相互作用に関与する傾向、パートナーになる可能性のある残基との近接性など）を用いてＣＨ１−Ｃｋ接合部分のアミノ酸残基の中で適切な位置を特定することを含めた任意の適切な方法によって特定することができる。
【０１３６】
特定の実施形態では、本開示のポリペプチドヘテロ二量体は、免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインを１組のみ含む。例えば、ポリペプチドヘテロ二量体の第一の鎖が免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインとしてＣＨ１ドメインを含み、第二の鎖が免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインとしてＣＬドメイン（例えば、ＣｋまたはＣλ）を含み得る。あるいは、第一の鎖が免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインとしてＣＬドメイン（例えば、ＣｋまたはＣλ）を含み、第二の鎖が免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインとしてＣＨ１ドメインを含み得る。本明細書に記載される通り、第一の鎖および第二の鎖の免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインは、結合して本開示のヘテロ二量体タンパク質を形成することが可能である。
【０１３７】
他の特定の実施形態では、本開示のヘテロ二量体タンパク質は、免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインを２組有し得る。例えば、ヘテロ二量体の第一の鎖が２つのＣＨ１ドメインを含み、第二の鎖が、第一の鎖の２つのＣＨ１ドメインと結合する２つのＣＬドメインを有し得る。あるいは、第一の鎖が２つのＣＬドメインを含み、第二の鎖が、第一の鎖の２つのＣＬドメインと結合する２つのＣＨ１ドメインを有し得る。特定の実施形態では、第一のポリペプチド鎖がＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインを含み、第二のポリペプチド鎖が、それぞれ第一のポリペプチド鎖のＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインと結合するＣＬドメインおよびＣＨ１ドメインを含む。
【０１３８】
ヘテロ二量体タンパク質がヘテロ二量体化対を１つ（例えば、各鎖に免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインを１つ）のみ含む実施形態では、各鎖の免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインは、その鎖の免疫グロブリン定常サブ領域のアミノ末端側に位置し得る。あるいは、各鎖の免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインは、その鎖の免疫グロブリン定常サブ領域のカルボキシル末端側に位置し得る。
【０１３９】
ヘテロ二量体タンパク質がヘテロ二量体化対を２つ（例えば、各鎖に免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインを２つ）含む実施形態では、各鎖の両方の免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインが、その鎖の免疫グロブリン定常サブ領域のアミノ末端側に位置し得る。あるいは、各鎖の両方の免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインが、その鎖の免疫グロブリン定常サブ領域のカルボキシ末端側に位置し得る。また別の実施形態では、各鎖の一方の免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインが、その鎖の免疫グロブリン定常サブ領域のアミノ末端側に位置し、各鎖の他方の免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインが、その鎖の免疫グロブリン定常サブ領域のカルボキシ末端側に位置し得る。換言すれば、ここに挙げた実施形態では、免疫グロブリン定常サブ領域が各鎖の２つの免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインの間に介在している。
【０１４０】
本明細書に示される通り、特定の実施形態では、本開示のＣＤ３結合ポリペプチド（例えば、小モジュール免疫薬タンパク質（ＳＭＩＰ）、ホモ二量体二重特異性分子（例えば、Ｓｃｏｒｐｉｏｎ）、ヘテロ二量体単一特異性および多特異性治療剤（例えば、Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔｏｒ））は、各ポリペプチド鎖に免疫グロブリン定常領域を含む。「定常領域」という用語は、本明細書の定常サブ領域および免疫グロブリン定常領域と互換的に使用される。免疫グロブリン定常領域を含ませることによって、２つのＣＤ３結合ポリペプチド鎖から形成されるホモ二量体およびヘテロ二量体タンパク質を対象に投与した後の循環中からのクリアランスを遅くすることができる。
【０１４１】
当該技術分野で知られる通り、また本明細書に記載する通り、免疫グロブリン定常領域はほかにも、変異をはじめとする変化を受けることによって、二量体ポリペプチドのエフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、ＣＤＣ、補体結合およびＦｃ受容体との結合）の比較的容易な調節を可能にし、治療する疾患に応じてこのエフェクター機能を増大させることも、低下させることもできる。
【０１４２】
特定の実施形態では、本開示のポリペプチドホモ二量体およびヘテロ二量体の一方または両方のポリペプチド鎖の免疫グロブリン定常領域は、１つまたは複数の上記エフェクター機能を仲介することが可能である。
【０１４３】
他の実施形態では、本開示のポリペプチドホモ二量体およびヘテロ二量体の一方または両方のポリペプチド鎖の免疫グロブリン定常領域において、１つまたは複数の上記エフェクター機能を、対応する野生型免疫グロブリン定常領域と比較して低下または消失させる。例えば、対応する野生型免疫グロブリン定常領域と比較してエフェクター機能が低下または消失した免疫グロブリン定常領域を有することは、例えば再誘導されたＴ細胞毒性（ＲＴＣＣ）を誘発するよう設計された、単一特異性ＣＤ３結合ポリペプチドおよび第二の結合ドメインを含むＣＤ３結合ポリペプチドには特に有用である。一実施形態では、定常領域を補体と結合しないよう修飾する。このほか、定常領域をＣＤ１６、ＣＤ３２およびＣＤ６４などの１つまたは複数のＦｃγ受容体と結合しないよう修飾することができる。
【０１４４】
本開示のＣＤ３結合ポリペプチド中に存在する免疫グロブリン定常サブ領域は、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメインまたはその任意の組合せの一部分または全部からなるか、これに由来するものであり得る。例えば、免疫グロブリン定常サブ領域は、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ２とＣＨ３の両ドメイン、ＣＨ３とＣＨ４の両ドメイン、２つのＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメイン、２つのＣＨ４ドメインおよびＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインの一部分を含み得る。いくつかの実施形態では、定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤもしくはその任意の組合せのＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン；ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭもしくはその任意の組合せの免疫グロブリンＣＨ３ドメイン；またはＩｇＥ、ＩｇＭもしくはその組合せの免疫グロブリンＣＨ３ドメインおよびＣＨ４ドメインを含む。いくつかの実施形態では、定常領域はＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとから実質的になる。
【０１４５】
本開示のＣＤ３結合ポリペプチドの免疫グロブリン定常領域を形成し得るＣＨ２ドメインは、特定の免疫グロブリンクラスまたはサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２またはＩｇＤ）および様々な種（ヒト、マウス、ラットをはじめとする哺乳動物）の野生型免疫グロブリンＣＨ２ドメインであっても、その変化した免疫グロブリンＣＨ２ドメインであってもよい。いくつかの実施形態では、エフェクター機能が低下または消失し、補体との結合が減少するかこれと結合せず、かつ／またはＦｃγ受容体との結合が減少するかこれと結合しないよう定常領域を修飾する。いくつかの実施形態では、Ｆｃγ受容体はＣＤ１６、ＣＤ３２およびＣＤ６４からなる群より選択される。
【０１４６】
特定の実施形態では、ＣＨ２ドメインは野生型ヒト免疫グロブリンＣＨ２ドメイン、例えば、それぞれ国際公開第２０１１／０９０７６２号の配列番号１１５、１９９〜２０１および１９５〜１９７に記載されるヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２またはＩｇＤの野生型ＣＨ２ドメイン（前記配列は参照により本明細書に組み込まれる）などである。特定の実施形態では、ＣＨ２ドメインは、国際公開第２０１１／０９０７６２号の配列番号１１５に記載される野生型ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインである（前記配列は参照により本明細書に組み込まれ、本願の配列番号８５である）。いくつかの実施形態では、定常領域は、配列番号５５のアミノ酸配列を含むか、これよりなる。
【０１４７】
特定の実施形態では、ＣＨ２ドメインは、２９７位のアスパラギンにアミノ酸置換（例えば、アスパラギンからアラニン）を含む、変化した免疫グロブリンＣＨ２領域（例えば、変化したヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメイン）である。このようなアミノ酸は、この部位のグリコシル化を減少または消失させ、ＦｃとＦｃγＲおよびＣ１ｑとの効率的な結合を抑制する。２９７位にＡｓｎからＡｌａへの置換を有する変化したヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインの配列は、国際公開第２０１１／０９０７６２号の配列番号３２４に記載されている（前記配列は参照により本明細書に組み込まれ、本願の配列番号８６である）。
【０１４８】
特定の実施形態では、ＣＨ２ドメインは、２３４〜２３８位に少なくとも１つの置換または削除を含む、変化した免疫グロブリンＣＨ２領域（例えば、変化したヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメイン）である。例えば、免疫グロブリンＣＨ２領域は、２３４位、２３５位、２３６位、２３７位もしくは２３８位、２３４位と２３５位、２３４位と２３６位、２３４位と２３７位、２３４位と２３８位、２３４〜２３６位、２３４位と２３５位と２３７位、２３４位と２３６位と２３８位、２３４位と２３５位と２３７位と２３８位、２３６〜２３８位または２３４〜２３８位の２個、３個、４個もしくは５個のアミノ酸の他の任意の組合せに置換を含み得る。上記に加えて、またはこれに代えて、変化したＣＨ２領域は、２３４〜２３８位に１つまたは複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つまたは５つ）のアミノ酸削除を含んでよく、例えば、２３６位または２３７位の一方にアミノ酸削除を含み、他方の位置が置換されていてよい。上記変異（１つまたは複数）は、変化したＣＨ２ドメインを含むポリペプチドヘテロ二量体の抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性またはＦｃ受容体結合能を低下または消失させる。特定の実施形態では、２３４〜２３８位のうち１つまたは複数の位置にあるアミノ酸残基が１つまたは複数のアラニン残基に置き換わっている。また別の実施形態では、２３４〜２３８位のアミノ酸残基のうち１つのみが削除されており、また２３４〜２３８位の１つまたは複数の残りのアミノ酸が別のアミノ酸（例えば、アラニンまたはセリン）で置換されていてよい。
【０１４９】
他の特定の実施形態では、ＣＨ２ドメインは、２５３位、３１０位、３１８位、３２０位、３２２位および３３１位に１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、変化した免疫グロブリンＣＨ２領域（例えば、変化したヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメイン）である。例えば、免疫グロブリンＣＨ２領域は、２５３位、３１０位、３１８位、３２０位、３２２位もしくは３３１位、３１８位と３２０位、３１８位と３２２位、３１８位と３２０位と３２２位または２５３位、３１０位、３１８位、３２０位、３２２位および３３１位の２個、３個、４個、５個もしくは６個のアミノ酸の他の任意の組合せに置換を含み得る。上記変異（１つまたは複数）は、変化したＣＨ２ドメインを含むポリペプチドヘテロ二量体の補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を低下または消失させる。
【０１５０】
他の特定の実施形態では、変化したＣＨ２領域（例えば、変化したヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメイン）は、２９７位におけるアミノ酸置換に加えて、１つまたは複数の（例えば、２つ、３つ、４つまたは５つ）の２３４〜２３８位に追加の置換をさらに含み得る。例えば、免疫グロブリンＣＨ２領域は、２３４位と２９７位、２３４位と２３５位と２９７位、２３４位と２３６位と２９７位、２３４〜２３６位と２９７位、２３４位と２３５位と２３７位と２９７位、２３４位と２３６位と２３８位と２９７位、２３４位と２３５位と２３７位と２３８位と２９７位、２３６〜２３８位と２９７位または２３４〜２３８位の２個、３個、４個または５個のアミノ酸の任意の組合せに置換を含み得る。上記に加えて、またはこれに代えて、変化したＣＨ２領域は、２３４〜２３８位、例えば２３６位または２３７位などに１つまたは複数（例えば、２つ、３つ、４つまたは５つ）のアミノ酸削除を含み得る。追加の変異（１つまたは複数）は、変化したＣＨ２ドメインを含むポリペプチドヘテロ二量体の抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性またはＦｃ受容体結合能を低下または消失させる。特定の実施形態では、２３４〜２３８位のうち１つまたは複数の位置のアミノ酸残基が、１つまたは複数のアラニン残基で置換されている。また別の実施形態では、２３４〜２３８位のうち１つのアミノ酸残基のみが削除されており、２３４〜２３８位の１つまたは複数の残りのアミノ酸が別のアミノ酸（例えば、アラニンまたはセリン）で置換されていてよい。
【０１５１】
特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質の変異ＣＨ２領域（例えば、変化したヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメイン）は、２３４〜２３８位における１つまたは複数（例えば、２つ、３つ、４つまたは５つ）のアミノ酸置換に加えて、補体結合に関与する１つまたは複数の位置（例えば、Ｉ２５３、Ｈ３１０、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２またはＰ３３１の位置）に１つまたは複数（例えば、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つ）の追加のアミノ酸置換を含み得る（例えば、アラニンで置換されている）。変異免疫グロブリンＣＨ２領域としては、２３４位、２３５位、２３７位（存在する場合）、３１８位、３２０位および３２２位にアラニン置換を有するヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４およびマウスＩｇＧ２ａ  ＣＨ２領域が挙げられる。例示的な変異免疫グロブリンＣＨ２領域には、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７、Ｅ３１８、Ｋ３２０およびＫ３２２にアラニン置換を有するマウスＩＧＨＧ２ｃ  ＣＨ２領域がある。
【０１５２】
さらにまた別の実施形態では、変化したＣＨ２領域（例えば、変化したヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメイン）は、２９７位におけるアミノ酸置換および２３４〜２３８位における追加の削除（１つまたは複数）または置換（１つまたは複数）に加えて、２５３位、３１０位、３１８位、３２０位、３２２位および３３１位に１つまたは複数（例えば、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つ）の追加の置換をさらに含み得る。例えば、免疫グロブリンＣＨ２領域は、（１）２９７位における置換、（２）２３４〜２３８位における１つまたは複数の置換もしくは削除またはその組合せならびにＩ２５３、Ｈ３１０、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２およびＰ３３１の位置における１つまたは複数（例えば、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つ）のアミノ酸置換、例えばＥ３１８、Ｋ３２０およびＫ３２２における１つ、２つ、３つの置換などを含み得る。上記位置のアミノ酸は、アラニンまたはセリンで置換されていてよい。
【０１５３】
特定の実施形態では、免疫グロブリンＣＨ２領域ポリペプチドは、（ｉ）２９７位のアスパラギンにおけるアミノ酸置換と、２３４位、２３５位、２３６位もしくは２３７位におけるアミノ酸置換；（ｉｉ）２９７位のアスパラギンにおけるアミノ酸置換と、２３４〜２３７位のうち２つの位置におけるアミノ酸置換；（ｉｉｉ）２９７位のアスパラギンにおけるアミノ酸置換と、２３４〜２３７位のうち３つの位置におけるアミノ酸置換；（ｉｖ）２９７位のアスパラギンにおけるアミノ酸置換と、２３４位、２３５位および２３７位におけるアミノ酸置換と、２３６位におけるアミノ酸削除；（ｖ）２３４〜２３７位のうち３つの位置におけるアミノ酸置換と、３１８位、３２０位および３２２位におけるアミノ酸置換；または（ｖｉ）２３４〜２３７位のうち３つの位置におけるアミノ酸置換と、２３６位におけるアミノ酸削除と、３１８位、３２０位および３２２位におけるアミノ酸置換を含む。
【０１５４】
２９７位のアスパラギンにアミノ酸置換を有する例示的な変化した免疫グロブリンＣＨ２領域としては、以下のものが挙げられる：Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７およびＮ２９７の位置におけるアラニンと、Ｇ２３６における削除とを有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ２領域（国際公開第２０１１／０９０７６２号の配列番号３２５、前記配列は参照により本明細書に組み込まれる）、Ｖ２３４、Ｇ２３６およびＮ２９７にアラニン置換を有するヒトＩｇＧ２  ＣＨ２領域（国際公開第２０１１／０９０７６２号の配列番号３２６、前記配列は参照により本明細書に組み込まれる）、Ｆ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７およびＮ２９７におけるアラニン置換と、Ｇ２３６の削除とを有するヒトＩｇＧ４  ＣＨ２領域（国際公開第２０１１／０９０７６２号の配列番号３２２、前記配列は参照により本明細書に組み込まれる）、Ｆ２３４およびＮ２９７にアラニン置換を有するヒトＩｇＧ４  ＣＨ２領域（国際公開第２０１１／０９０７６２号の配列番号３４３、前記配列は参照により本明細書に組み込まれる）、Ｌ２３５およびＮ２９７にアラニン置換を有するヒトＩｇＧ４  ＣＨ２領域（国際公開第２０１１／０９０７６２号の配列番号３４４、前記配列は参照により本明細書に組み込まれる）、Ｇ２３６およびＮ２９７にアラニン置換を有するヒトＩｇＧ４  ＣＨ２領域（国際公開第２０１１／０９０７６２号の配列番号３４５、前記配列は参照により本明細書に組み込まれる）ならびにＧ２３７およびＮ２９７にアラニン置換を有するヒトＩｇＧ４  ＣＨ２領域（国際公開第２０１１／０９０７６２号の配列番号３４６、前記配列は参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１５５】
特定の実施形態では、変化したＣＨ２領域（例えば、変化したヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメイン）は、上記アミノ酸置換に加えて、上記位置以外の１つまたは複数の位置に１つまたは複数の追加のアミノ酸置換を含み得る。このようなアミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換であっても非保存的アミノ酸置換であってもよい。例えば、特定の実施形態では、変化したＩｇＧ２  ＣＨ２領域（例えば、国際公開第２０１１／０９０７６２号の配列番号３２６を参照されたい。前記配列は参照により本明細書に組み込まれる）において、Ｐ２３３がＥ２３３に変化していてもよい。上記に加えて、またはこれに代えて、特定の実施形態では、変化したＣＨ２領域は、１つまたは複数のアミノ酸挿入、削除またはその両方を含み得る。挿入（１つまたは複数）、削除（１つまたは複数）または置換（１つまたは複数）は、免疫グロブリンＣＨ２領域の任意の場所、例えば、ヒンジ介してＣＨ２領域と別の領域（例えば、結合ドメインまたは免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメイン）とを連結することによって生じた野生型免疫グロブリンＣＨ２領域のＮ末端またはＣ末端などに存在し得る。
【０１５６】
特定の実施形態では、本開示のポリペプチド変化したＣＨ２領域は、野生型免疫グロブリンＣＨ２領域、例えば野生型ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４またはマウスＩｇＧ２ａ（例えば、ＩＧＨＧ２ｃ）のＣＨ２領域などと少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％一致する配列を含むか、このような配列である。
【０１５７】
本開示のＣＤ３結合ポリペプチドの変化した免疫グロブリンＣＨ２領域は、様々な種（ヒト、マウス、ラットをはじめとする哺乳動物を含む）の様々な免疫グロブリンアイソタイプ、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２およびＩｇＤなどに由来するものであり得る。特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質の変化した免疫グロブリンＣＨ２領域は、ＣＨ２領域に由来するものであり得る。国際公開第２０１１／０９０７６２号の配列番号１１５、１９９、２０１および３２０に記載されているヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４またはマウスＩｇＧ２ａ（例えば、ＩＧＨＧ２ｃ）（前記配列は参照により本明細書に組み込まれる）に由来するものであり得る。
【０１５８】
特定の実施形態では、変化したＣＨ２ドメインは、２３５位、３１８位、３２０位および３２２位にアラニン置換を有し（すなわち、Ｌ２３５Ａ、Ｅ３１８Ａ、Ｋ３２０ＡおよびＫ３２２Ａ置換を有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメイン）（国際公開第２０１１／０９０７６２号の配列番号、前記配列は参照により本明細書に組み込まれる）、任意選択でＮ２９７変異（例えば、アラニンへの変異）を有する、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインである。他の特定の実施形態では、変化したＣＨ２ドメインは、２３４位、２３５位、２３７位、３１８位、３２０位および３２２位にアラニン置換を有し（すなわち、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｅ３１８Ａ、Ｋ３２０ＡおよびＫ３２２Ａ置換を有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメイン）（国際公開第２０１１／０９０７６２号の配列番号５９６、前記配列は参照により本明細書に組み込まれる）、任意選択でＮ２９７変異（例えば、アラニンへの変異）を有する、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインである。
【０１５９】
特定の実施形態では、変化したＣＨ２ドメインは、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、ＣＤＣ、補体結合、Ｆｃ受容体結合またはその組合せなどの免疫学的活性を増強する当該技術分野で公知の変異を有する、変化したヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインである。
【０１６０】
本開示のＣＤ３結合ポリペプチドの免疫グロブリン定常領域を形成し得るＣＨ３ドメインは、様々な種（ヒト、マウス、ラットをはじめとする哺乳動物を含む）の特定の免疫グロブリンクラスまたはサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ）に由来する、野生型免疫グロブリンＣＨ３ドメインまたはその変化した免疫グロブリンＣＨ３ドメインであり得る。特定の実施形態では、ＣＨ３ドメインは野生型ヒト免疫グロブリンＣＨ３ドメイン、例えば、それぞれ国際公開第２０１１／０９０７６２号の配列番号１１６、２０８〜２１０、２０４〜２０７および２１２に記載されている、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭの野生型ＣＨ３ドメインなど（前記配列は参照により本明細書に組み込まれる）である。特定の実施形態では、ＣＨ３ドメインは、国際公開第２０１１／０９０７６２号の配列番号１１６に記載されている野生型ヒトＩｇＧ１  ＣＨ３ドメイン（前記配列は参照により本明細書に組み込まれる）である。特定の実施形態では、ＣＨ３ドメインは、変化したヒト免疫グロブリンＣＨ３ドメイン、例えばヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭ抗体の野生型ＣＨ３ドメインに基づくか、これに由来する変化したＣＨ３ドメインなどである。例えば、変化したＣＨ３ドメインは、Ｈ４３３およびＮ４３４の位置（位置はＥＵ番号付けに従って番号が付されている）に１つまたは２つの変異を有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインであり得る。このような位置の変異は補体結合に関与し得る。他の特定の実施形態では、変化したＣＨ３ドメインはヒトＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインであり得るが、Ｆ４０５またはＹ４０７の位置に１つまたは２つのアミノ酸置換を有する。このような位置のアミノ酸は、他のＣＨ３ドメインとの相互作用に関与し得る。特定の実施形態では、変化したＣＨ３ドメインは、最後のリジンが削除されている、変化したヒトＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインであり得る。この変化したＣＨ３ドメインの配列は、国際公開第２０１１／０９０７６２号の配列番号７６１に記載されている（前記配列は参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１６１】
特定の実施形態では、ポリペプチドヘテロ二量体を形成するＣＤ３結合ポリペプチドは、いわゆる「ノブと穴（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）」変異（ＭａｒｖｉｎおよびＺｈｕ，Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａ  Ｓｉｎｉｃａ  ２６：６４９−５８，２００５；Ｒｉｄｇｗａｙら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ９：６１７−２１，１９６６を参照されたい）を含む、ＣＨ３対を含む。より具体的には、ＣＨ３／ＣＨ３結合に必要な立体的相補性によって各ポリペプチド鎖の２つのＣＨ３ドメインが互いに対を形成するよう、この２つのＣＨ３ドメインそれぞれに変異を導入し得る。例えば、ポリペプチドヘテロ二量体の一方の一本鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインがＴ３６６Ｗ変異（小さいアミノ酸を大きいアミノ酸に置換する「ノブ」変異）を含み、ポリペプチドヘテロ二量体の他方の一本鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインがＹ４０７Ａ変異（大きいアミノ酸を小さいアミノ酸に置換する「穴」変異）を含み得る。他の例示的なノブと穴（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）変異としては、（１）一方のＣＨ３ドメインにおけるＴ３６６Ｙ変異と、他方のＣＨ３ドメインにおけるＹ４０７Ｔ変異ならびに（２）一方のＣＨ３ドメインにおけるＴ３６６Ｗ変異と、他方のＣＨ３ドメインにおけるＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ変異が挙げられる。
【０１６２】
本開示のＣＤ３結合ポリペプチドの免疫グロブリン定常領域を形成し得るＣＨ４ドメインは、ＩｇＥおよびＩｇＭ分子に由来する野生型免疫グロブリンＣＨ４ドメインまたはその変化した免疫グロブリンＣＨ４ドメインであり得る。特定の実施形態では、ＣＨ４ドメインは野生型ヒト免疫グロブリンＣＨ４ドメイン、例えば、それぞれ国際公開第２０１１／０９０７６２号配列番号２１３および２１４に記載されているヒトＩｇＥおよびＩｇＭ分子の野生型ＣＨ４ドメインなどである（前記配列は参照により本明細書に組み込まれる）。特定の実施形態では、ＣＨ４ドメインは変化したヒト免疫グロブリンＣＨ４ドメイン、例えば、ヒトＩｇＥまたはＩｇＭ分子のＣＨ４ドメインに基づくか、これに由来し、ＩｇＥまたはＩｇＭ  Ｆｃ領域に関連することが知られている免疫学的活性を増大または低下させる変異を有する、変化したＣＨ４ドメインなどである。
【０１６３】
特定の実施形態では、本開示のＣＤ３結合ポリペプチドの免疫グロブリン定常領域は、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４ドメインの組合せ（すなわち、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４から選択される２つ以上の定常領域ドメイン）を含む。例えば、免疫グロブリン定常サブ領域は、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインまたはＣＨ３ドメインとＣＨ４ドメインを含み得る。他の特定の実施形態では、免疫グロブリン定常領域は、２つのＣＨ３ドメインを含み、ＣＨ２ドメインもＣＨ４ドメインも含まない（すなわち、２つ以上のＣＨ３のみを含む）ものであり得る。免疫グロブリン定常サブ領域を形成する複数の定常領域ドメインは、同じ免疫グロブリン分子または同じクラスもしくはサブクラスの免疫グロブリン分子に基づくか、これに由来し得る。特定の実施形態では、免疫グロブリン定常サブ領域はＩｇＧ  ＣＨ２ＣＨ３（例えば、ＩｇＧ１  ＣＨ２ＣＨ３、ＩｇＧ２  ＣＨ２ＣＨ３およびＩｇＧ４  ＣＨ２ＣＨ３）であり、ヒト（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４）ＣＨ２ＣＨ３であり得る。例えば、特定の実施形態では、免疫グロブリン定常サブ領域は、（１）野生型ヒトＩｇＧ１のＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメイン、（２）Ｎ２９７Ａ置換を有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ２（すなわち、ＣＨ２（Ｎ２９７Ａ））と野生型ヒトＩｇＧ１  ＣＨ３、または（３）ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２（Ｎ２９７Ａ）と、最後のリジンが削除されている変化したヒトＩｇＧ１  ＣＨ３を含む。
【０１６４】
あるいは、複数の定常領域ドメインは、異なる免疫グロブリン分子または異なるクラスもしくはサブクラス免疫グロブリン分子に基づくか、これに由来するものであってもよい。例えば、特定の実施形態では、免疫グロブリン定常サブ領域は、ヒトＩｇＭ  ＣＨ３ドメインとヒトＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインの両方を含む。免疫グロブリン定常サブ領域を形成する複数の定常領域ドメインは、直接連結していても、１つまたは複数（例えば、約２〜１０個）のアミノ酸を介して連結していてもよい。
【０１６５】
例示的な免疫グロブリン定常サブ領域は、国際公開第２０１１／０９０７６２号の配列番号３０５〜３０９、３２１、３２３、３４１、３４２および７６２に記載されている（前記配列は参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１６６】
特定の実施形態では、ホモ二量体またはヘテロ二量体の両ＣＤ３結合ポリペプチド鎖の免疫グロブリン定常領域が互いに一致する。他の特定の実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質の一方のポリペプチド鎖の免疫グロブリン定常サブ領域が、ヘテロ二量体の他方のポリペプチド鎖の免疫グロブリン定常サブ領域と異なっている。例えば、ヘテロ二量体タンパク質の一方の免疫グロブリン定常サブ領域が「ノブ」変異を有するＣＨ３ドメインを含み、ヘテロ二量体タンパク質の他方の免疫グロブリン定常サブ領域が「穴」変異を有するＣＨ３ドメインを含み得る。
【０１６７】
本発明のいくつかの実施形態では、（ｉ）ヒトＴ細胞上のＴＣＲ複合体（例えば、ＣＤ３）および（ｉｉ）細胞表面タンパク質を標的とする二重特異性または多重特異性結合分子を用いて、例えば、細胞表面タンパク質を有する細胞に対して、例えば、癌治療のために腫瘍抗原を発現する腫瘍細胞に対して、Ｔ細胞細胞傷害性を再誘導する。
【０１６８】
特定の実施形態では、ＣＤ３結合タンパク質は、ＣＤ３以外の標的と結合する１つまたは複数の追加の結合ドメイン（例えば、第二の結合ドメイン）を含み得る。このような他の標的分子は、例えば腫瘍関連抗原を含み得る。本発明の一実施形態では、１つまたは複数の追加の結合ドメインは、以下に挙げる腫瘍抗原のうちの１つまたは複数と結合または相互作用する：ＲＯＮ、ｃ−Ｍｅｔ、ＣＥＡＣＡＭ−６、ＰＳＭＡ、ＥｐＣＡＭ、ＣＥＡ、ＰＣＴＡ−１、ＳＴＥＡＰ−１、ＳＴＥＡＰ−２、ＰＳＣＡ、ＰＳＡ、ＰＡＰ、ＡＬＣＡＭ（ＣＤ１６６）、ＰＥＣＡＭ−１、ＥｐｈＡ２、ＣＤ１５１、ＣＡ−１２５／ＭＵＣ１６、ＭＵＣ−１、ＭＡＧＥ−１、ＴＲＯＰ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＴＧＦＢＲ２、ＧＨＲＨＲ、ＧＨＲ、ＩＬ−６Ｒ、ｇｐ１３０、ＴＮＦＲ２、ＯＳＭＲβ、Ｐａｔｃｈｅｄ−１、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ、Ｒｏｂｏ１、ＬＴβＲ、ＣＤ１９、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ６３、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８６、ＣＤ１００、ＣＤ１５１、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ５、ＨＥＲ−２／ＥｒｂＢ１、ＨＥＲ−３／ＥｒｂＢ３、ＨＥＲ−４／ＥｒｂＢ４、ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ１、ＥＧＦＲｖＩＩＩアイソフォーム、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５ｂ、ＭＵＣ７、βｈＣＧ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、ガングリオシドＧＤ３、９−Ｏ−アセチル−ＧＤ３、ＧＭ２、Ｇｌｏｂｏ  Ｈ、フコシルＧＭ１、ポリＳＡ、ＧＤ２、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＭＮ／ＣＡ  ＩＸ）、ソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）、Ｗｕｅ−１、形質細胞抗原、（膜結合）ＩｇＥ、黒色腫コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、ＣＣＲ８、ＴＮＦ−α前駆体、メソテリン、Ａ３３抗原、Ｌｙ−６；デスモグレイン４、Ｅ−カドヘリンネオエピトープ、胎児アセチルコリン受容体、ＣＡ１９−９マーカー、ミュラー管抑制物質（ＭＩＳ）受容体ＩＩ型、ｓＴｎ（シアル化Ｔｎ抗原；ＴＡＧ−７２）、ＦＡＰ（線維芽細胞活性化抗原）、エンドシアリン、ＬＧ、ＳＡＳ、ＢＣＭＡ、ＴＷＥＡＫＲ／Ｆｎ１４、ＦＧＦＲ４、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＳＳＸ１およびＳＳＸ２。
【０１６９】
特定の実施形態では、ＣＤ３結合ドメインは、腫瘍抗原を発現する標的細胞にＴ細胞を動員するためのＴＣＲ結合ドメインと結合する。特定の実施形態では、ＣＤ３結合ポリペプチドは、ＴＣＲ複合体またはその構成要素（例えば、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δおよびＣＤ３ε）と特異的に結合するＣＤ３結合ドメインと、腫瘍関連抗原と特異的に結合する別の結合ドメインとを含み得る。
【０１７０】
ＰＳＭＡは、極めて限局された前立腺癌関連細胞膜抗原である。前立腺癌細胞には、ＰＳＭＡが正常な前立腺上皮の１００倍発現する（Ｓｕら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９５  ４４：１４４１−１４４３）。ＰＳＭＡの発現は前立腺癌の進行に伴って増加し、通常、転移性疾患、ホルモン抵抗性症例および悪性度の比較的高い病変で最も高い（Ｉｓｒａｅｌｉら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９４，５４：１８０７−１８１１；Ｗｒｉｇｈｔら，Ｕｒｏｌｏｇｉｃ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ：Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ａｎｄ  Ｏｒｉｇｉｎａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ  １９９５  １：１８−２８；Ｗｒｉｇｈｔら，Ｕｒｏｌｏｇｙ  １９９６  ４８：３２６−３３２；Ｓｗｅａｔら，Ｕｒｏｌｏｇｙ  １９９８  ５２：６３７−６４０）。ＰＳＭＡはさらに、膀胱癌、膵臓癌、黒色腫、肺癌および腎臓癌を含めた他の様々な固形腫瘍の新生血管構造に大量に発現するが、正常な新生血管構造には発現しない（Ｃｈａｎｇら，Ｕｒｏｌｏｇｙ  ２００１  ５７：８０１−８０５；Ｄｉｖｇｉら，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９８  ４：２７２９−３２７９）。ＰＳＭＡを標的とする結合ドメインとしては、特に限定されないが、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１２／１４５７１４号に記載されている結合ドメインが挙げられる。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、ＰＳＭＡ結合ドメインは、（ｉ）配列番号２１２のアミノ酸１〜１０７および１２４〜２４３；（ｉｉ）配列番号２２６のアミノ酸１〜１０７および１２４〜２４３；または（ｉｉｉ）配列番号２１６のアミノ酸１〜１０７および１２４〜２４３からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％一致するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明のタンパク質または分子は、配列番号２１２、２１４、２１６および２２６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。本発明に従って使用することができるＰＳＭＡ結合ドメインはほかにも、国際公開第２０１２／１４５７１４号の配列番号１９、２１、３０、３１、３４または３５のアミノ酸配列を含むＰＳＭＡ結合ドメインを含め国際公開第２０１２／１４５７１４号に記載されているか、配列番号５および２３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＶＬ鎖と、国際公開第２０１２／１４５７１４号の配列番号２、２５および２７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＶＨ鎖とを含む。
【０１７２】
ＲＯＮ（ｒｅｃｅｐｔｅｕｒ  ｄ’ｏｒｉｇｉｎｅ  Ｎａｎｔａｉｓｅ、ＭＳＴ１Ｒとしても知られる）は、胚発生に不可欠であることに加えて、炎症性応答に重要な役割を果たしている受容体型タンパク質チロシンキナーゼである（Ｃａｍｐら，Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．１２：２７３−２８１（２００５））。ＲＯＮは主として上皮由来細胞型に発現し、また他の多数の受容体型チロシンキナーゼと同様に悪性上皮癌の進行に何らの役割を演じている可能性があることが示唆されている（Ｗａｎｇら，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２３：１２９１−１２９７（２００３））。ＲＯＮの活性化により、細胞増殖、アポトーシス阻害および細胞運動性などの腫瘍原性作用に関与すると考えられている下流のシグナル伝達経路が開始される。ＲＯＮは、特にそのシグナル伝達特性ならびに／または結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌および膵臓癌における過剰発現により、上皮癌の治療標的となる。
【０１７３】
ＲＯＮを標的化するための結合ドメインとしては、特に限定されないが、実施例の節に記載されている結合ドメインおよびその全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１１／０９０７６１号に記載されている結合ドメインが挙げられる。いくつかの実施形態では、抗ＲＯＮ結合ドメインは、（ａ）ｉ．配列番号８７のＣＤＲ１アミノ酸配列と、配列番号８８のＣＤＲ２アミノ酸配列と、配列番号８９のＣＤＲ３アミノ酸配列；もしくはｉｉ．配列番号９０のＣＤＲ１アミノ酸配列と、配列番号９１のＣＤＲ２アミノ酸配列と、配列番号９２のＣＤＲ３アミノ酸配列とを含む、ＶＬドメイン；または（ｂ）ｉ．配列番号９３のＣＤＲ１アミノ酸配列と、配列番号９４のＣＤＲ２アミノ酸配列と、配列番号９５のＣＤＲ３アミノ酸配列；もしくはｉｉ．配列番号９６のＣＤＲ１アミノ酸配列と、配列番号９７のＣＤＲ２アミノ酸配列と、配列番号９８のＣＤＲ３アミノ酸配列とを含む、ＶＨドメイン；または（ｃ）（ａ）のＶＬと（ｂ）のＶＨとを含む。一実施形態では、ＶＬドメインが配列番号９９または１００のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、ＶＨドメインが配列番号１０１、１０２および１０３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ＶＬドメインおよびＶＨドメインはヒト化されている。特定の実施形態では、ヒト化ＶＬが配列番号１０４、１０５および１０６のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、ヒト化ＶＨドメインが配列番号１０７〜１１１のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＲＯＮ結合ドメインが、配列番号９９および１００のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含み、ＶＨドメインが、配列番号１０１、１０２および１０３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの施形態では、抗ＲＯＮ結合ドメインが、配列番号１０４、１０５および１０６のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含み、ＶＨドメインが、配列番号１０７〜１１１のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、ＲＯＮ結合ドメインは、配列番号１８７と少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％一致するアミノ酸配列を含み、かつ／または配列番号１８８と少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％一致するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＯＮ結合ドメインは、（ｉ）アミノ酸４３（アラニン）が別のアミノ酸、例えば、リジン（Ａ４３Ｋ）またはトレオニン（Ａ４３Ｔ）で置換されている配列番号１８７、（ｉｉ）アミノ酸３８（グルタミン）および／または１１３（グルタミン）が別のアミノ酸、例えば、Ｑ３８Ｒおよび／またはＱ１１３Ｅなどのグルタミン酸および／またはアルギニンで置換されている配列番号１８８、あるいは（ｉｉｉ）その任意の組合せを含む。いくつかの実施形態では、抗ＲＯＮ／抗ＣＤ３二重特異性分子は、配列番号１８６、１９０、１９２または１９４のいずれか１つと少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％一致するアミノ酸配列を含むか、これよりなる。いくつかの実施形態では、本発明は、抗ＲＯＮ／抗ＣＤ３二重特異性分子をコードし、配列番号１８５、１８９、１９１または１９３のいずれか１つと少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％一致するヌクレオチド配列を含む、核酸を提供する。
【０１７５】
ＣＤ１９は、最も悪性のＢ細胞を含めたＢ細胞の表面にみられる。ＣＤ１９の標的化を用いて、Ｂ細胞による疾患、白血病およびリンパ腫を抑制することができる。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、ＣＤ１９結合ドメインは、配列番号１９６のアミノ酸１〜１１１と少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％一致するアミノ酸配列を含み、かつ／または配列番号１９６のアミノ酸１２８〜２５１と少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％一致するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９／抗ＣＤ３二重特異性分子は、配列番号１９６、１９８、２００、２０２、２０４または２０６のいずれか１つと少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％一致するアミノ酸配列を含むか、これよりなる。いくつかの実施形態では、本発明は、抗ＣＤ１９／抗ＣＤ３二重特異性分子をコードし、配列番号１９５、１９７、１９９、２０１、２０３または２０６のいずれか１つと少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％一致するヌクレオチド配列を含む、核酸を提供する。
【０１７７】
ＨＥＲ２はヒトＥｒｂＢ２としても知られている。このほか、乳癌、卵巣癌ならびに胃癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、肺癌、腎臓癌、結腸癌、甲状腺癌、膵臓癌および膀胱癌を含めたその他の癌にＨＥＲ２の過剰発現（一様にというわけではないが多くの場合、遺伝子増幅による）が観察されている。ＨＥＲ２を標的化するための結合ドメインとしては、特に限定されないが、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００９／０５５０７４号に記載されている結合ドメインが挙げられる。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合ポリペプチドは、配列番号５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、１８６、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４または２０６と少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％一致するアミノ酸配列を含む。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合ポリペプチドはヘテロ二量体の一部分である。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体は１対の一本鎖ポリペプチドを含み、この一本鎖対は、配列番号２１０と２４７、配列番号２１０と２１８、配列番号２１０と２２０、配列番号２０８と２４９、配列番号２０８と２２２、または配列番号２０８と２２４、配列番号２１２と２１８、配列番号２１６と２２２、配列番号２２８と２２６、または配列番号２１４と２１８から選択される対と少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％一致するアミノ酸配列を含む。
【０１８０】
本発明にはほかにも、本明細書に記載されるＣＤ３結合ポリペプチドまたは本明細書に記載される二量体もしくはヘテロ二量体ＣＤ３結合タンパク質の１つもしくは複数のポリペプチド鎖をコードする核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）が含まれる。本発明の核酸には、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２７、２９、３１、３７および３９に記載されるポリヌクレオチドと実質的に一致する領域を有する核酸または同じもしくはほぼ同じポリペプチドをコードするコード領域を含む核酸が含まれる。特定の実施形態では、本発明による核酸は、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２７、２９、３１、３７および３９に記載される、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも８０％、典型的には少なくとも約９０％、さらに典型的には少なくとも約９５％または少なくとも約９８％の同一性を有する。本発明の核酸にはこのほか、相補的な核酸が含まれる。いくつかの場合には、配列は整列させたときに完全に相補的である（ミスマッチが存在しない）。他の場合には、配列中に最大約２０％のミスマッチが存在し得る。本発明のいくつかの実施形態では、本発明のヘテロ二量体ＣＤ３結合タンパク質の第一と第二両方のポリペプチド鎖をコードする核酸が提供される。コドン最適化、縮重配列、サイレント変異をはじめとするＤＮＡ技術を用いて、本明細書に提供される核酸配列を宿主での発現が最適化されるよう開発することが可能であり、本発明はこのような配列の改変を包含する。
【０１８１】
所望のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子をベクターに組み込むことによって増殖させる。本発明には、本発明の核酸を含み、かつ／または本発明のポリペプチドを発現するベクターも含まれる。ウイルスベクターおよびプラスミドを含めた非ウイルスベクターを使用する。プラスミドの選択は、増殖を望む細胞のタイプおよび増殖の目的によって決まる。特定のベクターは、所望のＤＮＡ配列を大量に増幅および生成するのに有用である。別のベクターは培養細胞で発現させるのに適している。また別のベクターは、動物またはヒトそのものの細胞に移入し発現させるのに適している。しかるべきベクターの選択は当業者の技能範囲内である。このようなベクターの多くが市販されている。通常、ベクター内の切断された制限酵素部位にＤＮＡリガーゼで結合させることによって、一部または完全長のポリヌクレオチドをベクターに挿入する。あるいは、所望のヌクレオチド配列をｉｎ  ｖｉｖｏの相同組換えによって挿入することができる。この操作は通常、所望のヌクレオチド配列の隣にベクターと相同な領域を結合させることによって実施する。相同な領域は例えば、オリゴヌクレオチドのライゲーションによって、あるいは相同な領域と所望のヌクレオチド配列の一部をともに含むプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応によって付加する。
【０１８２】
発現には発現カセットまたは発現系を用い得る。本明細書に開示されるポリペプチドをコードする核酸を発現させるためには、ポリペプチドをコードし、発現ベクター内で転写発現を調節する制御配列と作動可能に連結され核酸分子を宿主細胞内に導入する。本発明には、本発明の核酸および／または発現ベクター、例えば、本発明のポリペプチドをコードする核酸および／または発現ベクターを含む宿主細胞が含まれる。発現ベクターは、プロモーターおよびエンハンサーなどの転写調節配列に加えて、翻訳制御配列と、発現ベクターを保有する細胞の選択に適したマーカー遺伝子とを含み得る。本発明のポリヌクレオチドによってコードされる遺伝子産物は、例えば細菌系、酵母系、昆虫系、両生類系および哺乳動物系を含めた任意の好都合な発現系で発現させる。発現ベクター内では、所望の発現特性が得られるよう、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを必要に応じて制御配列と連結させる。これにはプロモーター、エンハンサー、ターミネーター、オペレーター、リプレッサーおよびインデューサーが含まれ得る。プロモーターは、制御されたプロモーター（例えば、ステロイド誘導性ｐＩＮＤベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のプロモーター）であっても構成的プロモーター（例えば、ＣＭＶ、ＳＶ４０、伸長因子またはＬＴＲ配列のプロモーター）であってもよい。ベクターと連結させる上記技術を用いて、これらを所望のヌクレオチド配列と連結させる。当該技術分野で公知の任意の技術を用いることができる。したがって、発現ベクターは一般に、転写開始領域の転写制御下でコード領域が作動可能に連結された誘導性のまたは構成的な転写および翻訳開始領域と、転写および翻訳終止領域とを備えることになる。
【０１８３】
様々なベクター、例えば、プラスミド、ＢＡＣ、ＹＡＣ、バクテリオファージ（ラムダ、Ｐ１、Ｍ１３など）、植物または動物ウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベースのベクター、アデノウイルスベクター）などに発現カセット（「発現単位」）を導入することができ、このようなベクターは通常、発現ベクターを含む細胞の選択を可能にする能力を特徴とする。ベクターは、染色体外で、具体的にはプラスミドまたはウイルスとして維持することも、宿主染色体に組み込むことも可能である。染色体外で維持することを望む場合、元の配列を低コピー数または高コピー数のプラスミド複製に供する。多種多様なマーカー、具体的には毒素、より具体的には抗生物質から保護するマーカーを選択に用いることができる。選択される具体的なマーカーは宿主の性質に従って選択され、いくつかの場合には、栄養要求性宿主に保管を用い得る。ＤＮＡ構築物の導入には、例えばコンジュゲーション、細菌形質転換、カルシウム沈殿ＤＮＡ、エレクトロポレーション、融合、遺伝子導入、ウイルスベクター感染、遺伝子銃などを含めた任意の好都合は方法を用いることができる。
【０１８４】
したがって、本発明で使用するタンパク質は、従来の技術に従い、遺伝子操作された宿主細胞に産生させることができる。適切な宿主細胞は、外来性ＤＮＡにより形質転換または遺伝子移入し培養で増殖させることが可能なタイプの宿主細胞であり、このような細胞としては、細菌、真菌細胞および培養高等真核細胞（多細胞生物の培養細胞を含む）、具体的には培養哺乳動物細胞が挙げられる。クローン化ＤＮＡ分子を操作し様々な宿主細胞内に外来性ＤＮＡを導入するための技術は、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２００１）ならびにＡｕｓｕｂｅｌら，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（第４版，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９９）によって開示されている。
【０１８５】
例えば、本明細書に記載される同一のＣＤ３結合ポリペプチド鎖を２つ含むホモ二量体ＣＤ３結合タンパク質の組換え発現では、発現ベクターは一般に、ＣＤ３結合ポリペプチドをコードしプロモーターと作動可能に連結された核酸を含む。第一と第二の異なるポリペプチド鎖を含むヘテロ二量体ＣＤ３結合タンパク質の組換え発現では、宿主細胞内の別個のベクターから第一と第二のポリペプチド鎖を同時発現させて、ヘテロ二量体タンパク質全体を発現させ得る。あるいは、ヘテロ二量体ＣＤ３結合タンパク質を発現させるために、宿主細胞の同じベクター内にある別個の発現単位から第一と第二のポリペプチド鎖を同時発現させて、ヘテロ二量体タンパク質全体を発現させてもよい。発現ベクター（１つまたは複数）を従来の技術によって宿主細胞に移入し、次いで、遺伝子導入した細胞を従来の技術によって培養し、コードされるポリペプチド（１つまたは複数）を産生させて、対応するＣＤ３結合タンパク質を生成する。
【０１８６】
組換えタンパク質を宿主細胞の分泌経路内に方向付けるために、発現ベクターに分泌シグナル配列（リーダー配列としても知られる）を含ませる。分泌シグナル配列は、天然型の組換えタンパク質のものであってよく、また別の分泌タンパク質に由来するものであっても、ｄｅ  ｎｏｖｏ合成されたものであってもよい。分泌シグナル配列はポリペプチドをコードするＤＮＡ配列と作動可能に連結されている、すなわち、２つの配列は適切なリーディングフレーム内で連結され、新たに合成されたポリペプチドが宿主細胞の分泌経路内に方向付けられるような位置にある。分泌シグナル配列は通常、目的とするポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の５’側に位置するが、目的とするＤＮＡ配列の他の箇所に特定のシグナル配列が位置していてもよい（例えば、Ｗｅｌｃｈら，米国特許第５，０３７，７４３号；Ｈｏｌｌａｎｄら，米国特許第５，１４３，８３０号を参照されたい）。特定の変形形態では、本発明に従って使用する分泌シグナル配列は、アミノ酸配列ＭＥＡＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ（配列番号７９）を有する。
【０１８７】
本発明で使用する組換えタンパク質の産生には、培養哺乳動物細胞が適切な宿主である。哺乳動物宿主細胞内に外来性ＤＮＡを導入する方法としては、リン酸カルシウムを介した遺伝子導入（Ｗｉｇｌｅｒら，Ｃｅｌｌ  １４：７２５，１９７８；ＣｏｒｓａｒｏおよびＰｅａｒｓｏｎ，Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７：６０３，１９８１：ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：４５６，１９７３），エレクトロポレーション（Ｎｅｕｍａｎｎら，ＥＭＢＯ  Ｊ．１：８４１−８４５，１９８２），ＤＥＡＥ−デキストランを介した遺伝子導入（Ａｕｓｕｂｅｌら，同上）およびリポソームを介した遺伝子導入（Ｈａｗｌｅｙ−Ｎｅｌｓｏｎら，Ｆｏｃｕｓ  １５：７３，１９９３；Ｃｉｃｃａｒｏｎｅら，Ｆｏｃｕｓ  １５：８０，１９９３）が挙げられる。培養哺乳動物細胞での組換えポリペプチドの産生は、例えば、Ｌｅｖｉｎｓｏｎら，米国特許第４，７１３，３３９号；Ｈａｇｅｎら，米国特許第４，７８４，９５０号；Ｐａｌｍｉｔｅｒら，米国特許第４，５７９，８２１号；およびＲｉｎｇｏｌｄ，米国特許第４，８５８，１３４号によって開示されている。適切な哺乳動物宿主細胞の例としては、アフリカミドリザル腎細胞（Ｖｅｒｏ；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５８７）、ヒト胎児腎細胞（２９３−ＨＥＫ；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５７３）、ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ−２１、ＢＨＫ−５７０；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  ８５４４、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １０３１４）、イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ；ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１；ＡＴＣＣ  ＣＣＬ６１；ＣＨＯ  ＤＧ４４；ＣＨＯ  ＤＸＢ１１（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）；このほか、例えばＣｈａｓｉｎら，Ｓｏｍ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．１２：５５５，１９８６を参照されたい））、ラット下垂体細胞（ＧＨ１；ＡＴＣＣ  ＣＣＬ８２）、ＨｅＬａ  Ｓ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２．２）、ラット肝細胞癌（Ｈ−４−ＩＩ−Ｅ；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５４８）、ＳＶ４０形質転換サル腎細胞（ＣＯＳ−１；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５０）およびマウス胚細胞（ＮＩＨ−３Ｔ３；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５８）が挙げられる。ほかにも適切な細胞系が当該技術分野で知られており、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａなどの公的寄託機関から入手可能である。ＳＶ−４０またはサイトメガロウイルスのプロモーターなどの強力な転写プロモーターを使用してもよい。例えば、米国特許第４，９５６，２８８号を参照されたい。その他の適切なプロモーターとしては、メタロチオネイン遺伝子（米国特許第４，５７９，８２１号および同第４，６０１，９７８号）のプロモーターおよびアデノウイルスメジャー後期プロモーターが挙げられる。
【０１８８】
外来ＤＮＡが挿入された培養哺乳動物細胞の選択には、一般に薬剤選択が用いられる。このような細胞は一般に、「トランスフェクタント」と呼ばれる。選択薬剤の存在下で培養され、目的とする遺伝子を子孫に伝えることのできる細胞を「安定なトランスフェクタント」と呼ぶ。例示的な選択マーカーとしては、抗生物質ネオマイシンに対する耐性をコードし、Ｇ−４１８などのネオマイシン型薬剤の存在下での選択を可能にする遺伝子；ミコフェノール酸／キサンチンの存在下で宿主細胞の増殖を可能にするキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼのｇｐｔ遺伝子；ならびにゼオシン，ブレオマイシン，ブラストサイジンおよびヒグロマイシンに対する耐性をもたらすマーカーが挙げられる（例えば、Ｇａｔｉｇｎｏｌら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０７：３４２，１９８７；Ｄｒｏｃｏｕｒｔら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：４００９，１９９０）を参照されたい。このほか選択系を用いて、「増幅」と呼ばれる過程である、目的とする遺伝子の発現レベルの増大を実施することができる。「増幅」は、低濃度の選択薬剤の存在下でトランスフェクタントを培養し、次第に選択薬剤の量を増加させて、導入遺伝子の産物を高レベルで産生する細胞を選択することによって実施する。例示的な増幅可能な選択マーカーには、メトトレキサート耐性を付与するジヒドロ葉酸還元酵素がある。これ以外の薬剤耐性遺伝子（例えば、ヒグロマイシン耐性、多剤耐性、ピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ）を用いてもよい。
【０１８９】
昆虫細胞、植物細胞および鳥類細胞を含めた他の高等真核細胞を宿主として用いてもよい。植物細胞内で遺伝子を発現させるのにアグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）をベクターとして使用することについては、Ｓｉｎｋａｒら，Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．（Ｂａｎｇａｌｏｒｅ）１１：４７−５８，１９８７によって概説されている。昆虫細胞の形質転換およびその細胞での外来ポリペプチド産生は、Ｇｕａｒｉｎｏら，米国特許第５，１６２，２２２号および国際公開第９４／０６４６３号によって開示されている。
【０１９０】
昆虫細胞を通常はオートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）に由来する、組換えバキュロウイルスに感染させることができる。Ｓｅｅ  ＫｉｎｇおよびＰｏｓｓｅｅ，Ｔｈｅ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｇｕｉｄｅ（Ｃｈａｐｍａｎ  ＆  Ｈａｌｌ，Ｌｏｎｄｏｎ）；Ｏ’ＲｅｉｌｌｙらＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９４）；ならびにＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ編，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，１９９５）を参照されたい。このほか、Ｌｕｃｋｏｗら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：４５６６−４５７９，１９９３）によって記載されているトランスポゾンベースの系により組換えバキュロウイルスを作製してもよい。この系は遺伝子移入ベクターを用いるものであり、キットの形態（ＢＡＣ−ＴＯ−ＢＡＣキット；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）で市販されている。遺伝子移入ベクター（例えば、ＰＦＡＳＴＢＡＣ１；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）には、「バクミド」と呼ばれる大型のプラスミドとして大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内に維持されているバキュロウイルスゲノム内に目的とするタンパク質をコードするＤＮＡを移動させるＴｎ７トランスポゾンが含まれている。Ｈｉｌｌ−ＰｅｒｋｉｎｓおよびＰｏｓｓｅｅ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７１：９７１−９７６，１９９０；Ｂｏｎｎｉｎｇら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７５：１５５１−１５５６，１９９４；ならびにＣｈａｚｅｎｂａｌｋおよびＲａｐｏｐｏｒｔ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１５４３−１５４９，１９９５を参照されたい。さらに、遺伝子移入ベクターは、上に開示されるポリペプチド伸長またはアフィニティータグをコードするＤＮＡとのインフレーム融合を含み得る。当該技術分野で公知の技術を用いて、タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む遺伝子移入ベクターで大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞を形質転換させ、組換えバキュロウイルスの指標となる分断されたｌａｃＺ遺伝子を含むバクミドについて細胞をスクリーニングする。通常の技術を用いて、組換えバキュロウイルスゲノムを含むバクミドＤＮＡを単離し、これを用いてＳｆ９細胞などのツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）の細胞に遺伝子移入する。次いで、目的とするタンパク質を発現する組換えウイルスが産生される。当該技術分野で一般的に用いられている方法により組換えウイルスのストックを作製する。
【０１９１】
タンパク質産生では、組換えウイルスを用いて宿主細胞、通常はツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）の幼虫に由来する細胞系（例えば、Ｓｆ９またはＳｆ２１細胞）またはイラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）の幼虫に由来する細胞系（例えば、ＨＩＧＨ  ＦＩＶＥ細胞；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）に感染させる。一般的にはＧｌｉｃｋおよびＰａｓｔｅｒｎａｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ＆  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ（ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９９４）を参照されたい。このほか、米国特許第５，３００，４３５号を参照されたい。無血清培地を用いて細胞を培養し維持する。適切な調合培地は当該技術分野で公知であり、販売業者から入手することができる。約２〜５×１０５細胞の植菌密度から１〜２×１０６細胞の密度まで細胞を増殖させ、この時点で感染多重度（ＭＯＩ）０．１〜１０、より典型的には約３で組換えウイルスのストックを添加する。用いる方法は、入手可能な実験マニュアルに一般に記載されているものである（例えば、ＫｉｎｇおよびＰｏｓｓｅｅ，同上；Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら，同上；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，同上を参照されたい）。
【０１９２】
ほかにも、酵母細胞を含めた真菌細胞を本発明に用いることができる。これに関連して特に関心のある酵母種としては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）およびピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）が挙げられる。Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞を外来性ＤＮＡで形質転換し、その細胞に組換えポリペプチドを産生させる方法は、例えば、Ｋａｗａｓａｋｉ，米国特許第４，５９９，３１１号；Ｋａｗａｓａｋｉら，米国特許第４，９３１，３７３号；Ｂｒａｋｅ，米国特許第４，８７０，００８号；Ｗｅｌｃｈら，米国特許第５，０３７，７４３号；およびＭｕｒｒａｙら，米国特許第４，８４５，０７５号によって開示されている。形質転換細胞は、通常は薬物耐性または特定の栄養素（例えば、ロイシン）の非存在下での増殖能の選択マーカーにより判定される表現型によって選択する。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に使用される例示的なベクター系には、Ｋａｗａｓａｋｉら（米国特許第４，９３１，３７３号）によって開示されているＰＯＴ１ベクター系があり、このベクター系により、グルコース含有培地での増殖によって形質転換細胞を選択することが可能である。酵母に使用される適切なプロモーターおよびターミネーターとしては、糖分解酵素遺伝子に由来するもの（例えば、Ｋａｗａｓａｋｉ，米国特許第４，５９９，３１１号；Ｋｉｎｇｓｍａｎら，米国特許第４，６１５，９７４号；およびＢｉｔｔｅｒ，米国特許第４，９７７，０９２号を参照されたい）およびアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子に由来するものが挙げられる。このほか、米国特許第４，９９０，４４６号；同第５，０６３，１５４号；同第５，１３９，９３６号；および同第４，６６１，４５４号を参照されたい。ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、クルイベロミセス・フラギリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）、トウモロコシ黒穂病菌（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピキア・ギリエルモンディイ（Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｅｒｍｏｎｄｉｉ）およびカンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）を含めたその他の酵母の形質転換系は当該技術分野で公知である。例えば、Ｇｌｅｅｓｏｎら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３２：３４５９−３４６５，１９８６；Ｃｒｅｇｇ，米国特許第４，８８２，２７９号；およびＲａｙｍｏｎｄら，Ｙｅａｓｔ  １４：１１−２３，１９９８を参照されたい。ＭｃＫｎｉｇｈｔら，米国特許第４，９３５，３４９号の方法に従ってアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の細胞を用いてもよい。アクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）を形質転換する方法はＳｕｍｉｎｏら，米国特許第５，１６２，２２８号によって開示されている。アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）を形質転換する方法は、Ｌａｍｂｏｗｉｔｚ，米国特許第４，４８６，５３３号によって開示されている。ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）における組換えタンパク質の産生は、米国特許第５，７１６，８０８号；同第５，７３６，３８３号；同第５，８５４，０３９号；および同第５，８８８，７６８号に開示されている。
【０１９３】
このほか、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）をはじめとする属の菌株を含めた原核宿主細胞が本発明において有用な宿主細胞である。このような宿主を形質転換し、そこでクローン化された外来ＤＮＡ配列を発現させる技術は当該技術分野で周知である（例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ，同上を参照されたい）。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌で組換えタンパク質を発現させる場合、タンパク質は、通常は不溶性の顆粒として細胞質内に保持されるか、細菌分泌配列によって細胞周辺腔へ方向付けられ得る。前者の場合、細胞を溶解し、顆粒を回収し、例えばグアニジンイソチオシアナートまたは尿素を用いて変性させる。次いで、尿素および還元型グルタチオンと酸化型グルタチオンとの組合せの溶液に対する透析とそれに続く緩衝生理食塩溶液に対する透析などの変性剤の希釈によって、変性タンパク質をリフォールディングおよび二量体化することができる。別法では、タンパク質を可溶型として細胞質から回収し、変性剤を使用せずに単離し得る。タンパク質は、例えばリン酸緩衝生理食塩水中の水性抽出物として、細胞から回収される。目的とするタンパク質を捕捉するため、抽出物を固定化抗体またはヘパリン−セファロースカラムなどのクロマトグラフィー媒体に直接加える。分泌タンパク質は、細胞を（例えば、超音波処理または浸透圧ショックによって）破壊して細胞周辺腔の内容物を放出させ、タンパク質を回収することによって、細胞周辺腔から可溶性の機能的形態として回収することが可能であり、これにより、変性およびリフォールディングが不要になる。一本鎖抗体を含めた抗体は、既知の方法に従って細菌宿主細胞内で産生させることができる。例えば、Ｂｉｒｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２８，１９８８；Ｈｕｓｔｏｎら，Ｐｒｏａ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  ＳｃＬ  ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３，１９８８；およびＰａｎｔｏｌｉａｎｏら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０：１０１１７−１０１２５，１９９１を参照されたい。
【０１９４】
形質転換または遺伝子導入した宿主細胞を従来の方法に従って、選択した宿主細胞の増殖に必要な栄養素をはじめとする成分を含有する培地で培養する。規定培地および複合培地を含めた様々な培地が当該技術分野で公知であり、一般に炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミンおよびミネラルを含む。培地はほかにも、必要に応じて増殖因子のような成分または血清を含有し得る。増殖培地では一般に、細胞外から加えたＤＮＡを含む細胞が、例えば、発現ベクターが保有するか、宿主細胞内に同時遺伝子導入された選択マーカーによって補完される薬剤選択または必須栄養素の欠乏によって選択される。
【０１９５】
ＣＤ３結合タンパク質は従来のタンパク質精製法によって、通常はクロマトグラフィー技術の組合せによって精製することができる。一般的には、Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ＆  Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ，１９８８）；Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９４）を参照されたい。固定化プロテインＡまたはタンパク質Ｇでのアフィニティークロマトグラフィーによって、免疫グロブリンＦｃ領域を含むタンパク質を精製することができる。ゲルろ過などの追加の精製段階を用いて、所望のレベルの純度を得るか、脱塩、緩衝液交換などに供することができる。
【０１９６】
本発明にはほかにも、本発明のＣＤ３結合ポリペプチド、薬学的に許容される担体、希釈剤および／または賦形剤を含む組成物が含まれる。
【０１９７】
本発明の一実施形態では、関節リウマチなどの自己免疫疾患に罹患している患者に単一特異性ＣＤ３結合ポリペプチドを投与する。本発明の別の実施形態では、臓器移植を受ける予定の対象に本発明の単一特異性ＣＤ３結合ポリペプチドを投与する。
【０１９８】
別の態様では、本発明は、癌などの腫瘍抗原の過剰発現を特徴とする障害を治療する方法を提供する。このような方法は一般に、このような治療を必要とする対象に、治療有効量の本明細書に記載の腫瘍抗原と結合する第二の結合ドメインを含むＣＤ３結合タンパク質を投与することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合タンパク質は、対象の腫瘍抗原発現細胞に対して再誘導されたＴ細胞細胞傷害性（ＲＴＣＣ）を誘導する。
【０１９９】
この方法の特定の変形形態では、障害は癌である。他の変形形態では、障害は自己免疫疾患である。本発明はほかにも、必要とする患者に治療有効量の本明細書に記載の組成物またはＣＤ３結合ポリペプチドを投与することを含む、癌または自己免疫障害を治療する方法を提供する。
【０２００】
本明細書に記載される治療方法の各実施形態では、治療が求められる疾患または障害の管理に関連する従来の方法論に一致する方法でＣＤ３結合タンパク質を送達する。本明細書の開示によれば、疾患または障害を予防または治療するのに十分な期間および条件下で、このような治療を必要とする対象に有効量のＣＤ３結合タンパク質を投与する。
【０２０１】
投与には、ＣＤ３結合タンパク質を医薬組成物として製剤化する。薬学的に有用な組成物を調製する既知の方法に従ってＣＤ３結合タンパク質を含む医薬組成物を製剤化することにより、治療分子を混合物の形で薬学的に許容される担体と組み合わせることができる。組成物は、その投与に被投与患者による耐容性が認められる場合、「薬学的に許容される担体」であると言う。無菌リン酸緩衝生理食塩水が薬学的に許容される担体の一例である。その他の適切な担体は当業者によく知られている（例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ（編），Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，第１９版．１９９５）を参照されたい）。製剤は、１つまたは複数の賦形剤、保存剤、可溶化剤、緩衝剤、バイアル表面でのタンパク質喪失を防ぐためのアルブミンをさらに含み得る。
【０２０２】
ＣＤ３結合タンパク質を含む医薬組成物を治療有効量で対象に投与する。本発明の方法によれば、ＣＤ３結合タンパク質を、例えば筋肉内、皮下、静脈内、心房内、関節内、非経口、鼻腔内、肺内、経皮、胸腔内、髄腔内および経口の諸投与経路を含めた様々な投与方法によって対象に投与し得る。予防および治療目的には、対象への投与を例えば、長時間にわたる持続送達（例えば、持続経皮送達）による単回ボーラス送達または反復投与プロトコル（例えば、毎時、毎日または毎週）で実施し得る。
【０２０３】
分子または組成物の「治療有効量（または治療有効用量）」または「有効量（有効用量）」とは、障害の１つまたは複数の症状の改善に統計的に有意な効果、例えば、疾患進行の統計的に有意な軽減や臓器機能の統計的に有意な改善などが得られる量のことである。正確な用量は、臨床医が治療の対象となる病態の性質および重症度、患者の形質などを考慮に入れ、認められている基準に従って決定する。用量の決定は当業者の水準の範囲内にある。併用について述べる場合、治療有効用量は、逐次に投与する場合にも同時に投与する場合（例えば、同じ製剤で、または別個の製剤で同時に投与する場合）にも、治療効果をもたらす有効成分の合計量を指す。
【０２０４】
この文脈での有効用量の決定は通常、動物モデル試験とその後に実施されるヒト臨床試験に基づくものであり、モデル対象における対象障害の頻度または重症度を有意に低下させるのに有効な用量および投与プロトコルを決定することによって導かれる。本発明の組成物の有効用量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトおよび動物のいずれであるのか、投与を受けている他の薬剤、治療が予防目的および治療目的のいずれであるのか、ならびに組成物自体の比活性および組成物が個体に所望の応答を誘発する能力を含めた多数の様々な因子によって異なるものとなる。通常、患者はヒトであるが、一部の疾患では、患者はヒト以外の哺乳動物であり得る。通常、最適な治療効果が得られるよう、例えば、安全性および有効性が最適となるよう投与レジメンを調整する。
実施例
【０２０５】
実施例１：理論的ｐＩが低下した抗−ＣＤ３  ＳＭＩＰ分子の設計および構築
Ｌ１、Ｌ２、Ｈ１、Ｈ２およびＨ３（図３および４を参照されたい）は、事前に構築し、結合および活性について分析したヒト化Ｃｒｉｓ−７の重鎖および軽鎖である。Ｈ３Ｌ１を用いてＳＭＩＰ  ＤＲＡ２０９（配列番号３および４；ＩｇＧ４  ＡＡ  ＡＤＣＣ−ＣＤＣヌルＦｃ）およびＳＭＩＰ  ＤＲＡ１６１（ＩｇＧ４  ＡＡ  Ｎ２９７Ａ  Ｆｃ）を作製した。この２つの構築物をＣＨＯ細胞で発現させると、先行技術のＯＫＴ３をはじめとする他の抗ＣＤ３治療剤よりも改善された特徴を示すが、他のＳＭＩＰ分子と比較して半減期が大幅に短く、理論的ｐＩが低く（図１を参照されたい）、結合ドメインまたはプレヒンジ領域に「クリッピング」がみられる（図２Ａおよび２Ｂを参照されたい）。
【０２０６】
結合ドメインおよび／またはプレヒンジ領域のｐＩを低下させるため、抗ＣＤ３  ｐＩ変異体を設計した。抗ＣＤ３  ｐＩ変異体を作製するため、新たな重鎖および軽鎖（Ｌ３、Ｌ４、Ｈ４、Ｈ５およびＨ６）をＢｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ社に委託合成した。表３ならびに図３および４を参照されたい。
【０２０７】
【表３】
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【０２０８】
Ｈ４にはＨ３と比較して点変異が２つある。一方の変異により正荷電残基を置き換え（ＫからＱ）、他方の変異により負電荷を導入した（ＱからＥ）。２つの変化はともに、タンパク質のｐＩを低下させるよう設計したものである（正電荷を除去するか、負電荷を導入することによる）。親和性の喪失を回避するためフレームワーク配列を変異させ、免疫原性のリスクを回避するため、導入された新たな残基が生殖系列配列のその位置に存在することを確認した。既にヒト化されている結合ドメインのｐＩを低下させるガイドとして生殖系列配列を用いることによって、アミノ酸置換を実施して生殖系列配列中に広く存在するアミノ酸を付加することができる。このようなアミノ酸は生殖系列配列中の同じ位置に存在していても、近接する位置に存在していてもよい。図５を参照されたい。
【０２０９】
Ｈ５は、ｐＩがＤＲＡ２０９およびＤＲＡ１6１よりも低くなるよう重鎖配列を「再ヒト化」（ＤＲＡ２０９およびＤＲＡ１6１と比較して）することによって設計したものである。ＩＧＨＶ１−３＊０１重鎖生殖系列配列のＶＨ１フレームワークと比較して重鎖を設計することによりこれを行った。
【０２１０】
Ｈ６は、ｐＩがＤＲＡ２０９およびＤＲＡ１６１よりも低くなるよう重鎖配列を「再ヒト化」（ＤＲＡ２０９およびＤＲＡ１６１と比較して）することによって設計したものである。換言すれば、Ｈ６を設計するのに使用した出発配列を、事前にヒト化した配列ではなく生殖系列配列とした。具体的には、ＩＧＨＶ３−２１＊０１重鎖配列のＶＨ３フレームワークを用いて重鎖を設計することによりこれを行った。
【０２１１】
Ｌ３にはＬ１と比較して点変異が６つあり、ＲＷをＬＬ（ＬＬはＬＷよりも生殖系列配列に高頻度でみられるため、ＬＬを用いた）に変異させ（すなわち、正荷電残基ＲをＬに置き換え）、Ｊカッパ（Ｊｋ）領域（ＬＱＩＴ；配列番号２５２）の一部をＪｋ４配列（ＶＥＩＫ；配列番号２５３）に置き換えたものである。Ｊｋ４は、Ｃｒｉｓ−７  Ｈ＿ＣＤＲ３配列を基準にすれば他のＪｋ領域よりもよくマッチするＪｋ領域である。図６を参照されたい。この場合も同様に、フレームワーク領域のみを変異させ、免疫原性のリスクを回避するため、導入された新たな残基が生殖系列配列のその位置に存在することを確認した。
【０２１２】
Ｌ４は、ｐＩがＤＲＡ２０９およびＤＲＡ１６１よりも低くなるよう軽鎖配列を「再ヒト化」（ＤＲＡ２０９およびＤＲＡ１６１と比較して）することによって設計したものである。ＩＧＫＶ３−１１＊０１軽鎖配列のＶｋ３のフレームワークをガイドとして用いてＬ４を再ヒト化した。
【０２１３】
新たな軽鎖および重鎖はいずれも、理論的計算に基づきｐＩが低くなっていることが予想される。配列を組み立てる（配列を結合させる）のにベクターＮＴＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。生殖系列配列はＮＣＢＩウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／）から入手した。
【０２１４】
ＳＭＩＰ分子のプレヒンジ領域に置換アミノ酸を含み、それ以外はＤＲＡ２０９およびＤＲＡ１６１と一致する変異体を構築した。プレヒンジ領域は結合ドメインとヒンジ領域とを連結する短いアミノ酸配列であり、例えば、コードヌクレオチド配列内に制限部位を付加することによって生じ得る。
【０２１５】
作製した１つの変異体では、ＰＣＲ変異誘発によりＤＲＡ２０９のプレヒンジ領域のＲＲＴ配列をＳＳＳで置き換えた。これは、２つの正荷電残基（アルギニン）を除去するために意図的に行ったものである。本発明者らは、この変化がタンパク質のｐＩ低下として現れることを実験的に示した。この構築物は依然としてＨ３Ｌ１の組合せを有しており、新たにＤＲＡ２１９と命名した。正荷電残基（２つのアルギニン）の除去のほかにも、このＳＳＳ変異によって、さらに新たなｐＩ変異体構築物の容易な組み立てを可能にするＸｈｏＩ制限部位が導入された。
【０２１６】
ＤＲＡ２０９と同じＦｃ尾部を使用し、標準的な分子生物学技術を用い、以下に挙げるＨとＬの組合せを用いてＳＭＩＰ構築物を構築した：ａ）Ｈ４Ｌ１（ＩｇＧ４  ＡＡ  ＡＤＣＣ−ＣＤＣヌルＦＣを有する；本明細書ではＤＲＡ２２２とも呼ばれる；配列番号７および８）、ｂ）Ｈ４Ｌ３（ＩｇＧ４  ＡＡ  ＡＤＣＣ−ＣＤＣヌルＦｃを有する；本明細書ではＤＲＡ２２１とも呼ばれる；配列番号９および１０）、ｃ）Ｈ３Ｌ３（ＩｇＧ４  ＡＡ  ＡＤＣＣ−ＣＤＣヌルＦｃを有する；本明細書ではＤＲＡ２２３とも呼ばれる；配列番号１１および１２）、ｄ）Ｈ５Ｌ４（ＩｇＧ４  ＡＡ  ＡＤＣＣ−ＣＤＣヌルＦｃを有する；本明細書ではＤＲＡ２２４とも呼ばれる；配列番号１３および１４）、およびｅ）Ｈ６Ｌ４（ＩｇＧ４  ＡＡ  ＡＤＣＣ−ＣＤＣヌルＦｃを有する；本明細書ではＤＲＡ２２５とも呼ばれる；配列番号１５および１６）。図７Ａおよび７Ｂを参照されたい。
【０２１７】
上に挙げた構築物をすべて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの結合試験のためにＨＥＫ細胞に遺伝子導入してタンパク質を生成させた。ＤＲＡ２２５構築物以外の構築物はいずれも所望のタンパク質を発現し、ＤＲＡ２２５構築物には明らかな発現がみられなかった。これ以外の構築物はいずれも、（ｉ）様々な程度でＣＤ３と結合し（ＤＲＡ２２２が最もよく結合した）、（ｉｉ）親分子ＤＲＡ２０９よりもｐＩが低いことがわかった。ｐＩの測定値を表４に示す。
【０２１８】
【表４】
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【０２１９】
ＤＲＡ２１９、ＤＲＡ２２１、ＤＲＡ２２２、ＤＲＡ２２３およびＤＲＡ２２４はいずれもヒト混合リンパ球反応を示し（ＭＬＲ；データ不掲載）、阻害の量と測定されたＣＤ３との結合能との間に相関がみられた。
【０２２０】
ＤＲＡ２１９（Ｈ３Ｌ１  ＩｇＧ４  ＡＡ  ＡＤＣＣ−ＣＤＣヌルＦＣ；配列番号５および６）およびＤＲＡ２２２（配列番号７および８）はともにＣＤ３との結合を保持し、ｐＩの測定値が低く、異なるＦｃ尾部（ＩｇＧ４  ＡＡ  Ｎ２９７Ａ）をコードするｐＥＥ１２．４ベクター内にさらにクローン化して、さらに２つの構築物、すなわちそれぞれＤＲＡ２３３（Ｈ３Ｌ１；配列番号１７および１８）およびＤＲＡ２３４（Ｈ４Ｌ１；配列番号１９および２０）を生成した。さらに、ＤＲＡ２１９およびＤＲＡ２２２をｐＥＥ１２．４ベクター内にクローン化してＣＨＯで発現させ、それぞれＤＲＡ２２８およびＤＲＡ２２９と命名した。実質的には、ＤＲＡ２１９はＤＲＡ２２８と同等のものであり、ＤＲＡ２２２はＤＲＡ２２９と同等のものである。次いで、結合試験、タンパク質の特徴付けおよびＰＫ試験のために、全構築物（ＤＲＡ２２８、ＤＲＡ２２９、ＤＲＡ２３３およびＤＲＡ２３４）をＣＨＯ細胞内に遺伝子導入してタンパク質を生成させた。図８を参照されたい。
【０２２１】
ＡＫＴＡ  Ｐｕｒｉｆｉｅｒ  ＨＰＬＣシステムを用いて、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによりタンパク質を細胞上清から精製した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの調製物には予め充填されたＰＯＲＯＳ  Ａカラム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用し、ｉｎ  ｖｉｖｏの材料には予め充填されたＭａｂＳｕＲｅ  ＰｒｏｔｅｉｎＡカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した。ＰＢＳの存在下で試料を負荷し、クエン酸緩衝液で溶離した。溶離液をＴＲＩＳ緩衝液で中和した。
【０２２２】
Ｂｅｃｋｍａｎ  ＰＡ８００機器でキャピラリー等電点電気泳動を実施し、精製タンパク質の等電点（ｐＩ）の決定に用いた。標準的なＢｅｃｋｍａｎｃｌＥＦプロトコルに従って分析を実施した。Ｐｈａｒｍａｉｙｔｅ  ３−１０両性電解質（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、陰極および陽極安定剤ならびに合成ペプチドｐＩマーカー（Ｂｅｃｋｍａｎ）を添加したｃｌＥＦゲル（Ｂｅｃｋｍａｎ）に尿素を溶かした３Ｍ溶液で試料を調製した。中性キャピラリー（Ｂｅｃｋｍａｎ）に試料を注入し、次いで、キャピラリーの注入口を陽極液に浸し、出口を陰極液に浸して収束させ、キャピラリーに１５分間、２５ｋＶの電位を印加した。収束後、化学的手段によって試料を移動させて、分離した全成分が２８０ｎｍでの吸光度を測定する固定した波長検出器を通過するようにした。合成ペプチドｐＩマーカーの結果に基づいて作製した標準曲線から全試料の等電点（ｐＩ）を算出した。図９〜１１を参照されたい。構築物のｐＩの測定値は以下の通りであった：ＤＲＡ２２８＝８．４；ＤＲＡ２２９＝７．５；ＤＲＡ２３３＝８．６；ＤＲＡ２３４＝８．０に対して、ＤＲＡ１６１＝９．２およびＤＲＡ２０９＝８．８。したがって、発現したｐＩ変異体はいずれも、ｐＩがそれぞれの親構築物、ＤＲＡ１６１またはＤＲＡ２０９よりも低かった。
【０２２３】
実施例２：抗ＣＤ３  ＳＭＩＰ分子はＴ細胞と結合する
標準的な密度勾配遠心分離を用いて、新鮮な全血からヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を単離し、０．２％ＢＳＡを含有するＰＢＳで３回洗浄した。９６ウェルＵ底プレートに細胞を２００，０００ＰＢＭＣ／ウェルで播き、図１２に示すｎＭ濃度の抗体５０ｕｌで氷上にて３０分間標識した。プレートを３回洗浄し、至適濃度の抗ＣＤ５−ＡＰＣおよびＦ（ａｂ’）２ヤギ抗ｈｕ  ＩｇＧ  Ｆｃ−ＰＥを含有する抗体カクテルで３０分間標識した。プレートを３回洗浄し、４℃で一晩、パラホルムアルデヒドの１％ＰＢＳ溶液１２０ｕｌで固定した。抗体インキュベーションおよび洗浄はすべて、冷ＰＢＳ、０．２％ＢＳＡ、２ｎＭ  ＥＤＴＡにより氷上で実施した。ＢＤ  ＬＳＲＩＩアナライザーを用いて、フローサイトメトリーにより試料を解析した。各ウェルから６０マイクロリットルを収集した。Ｔ細胞（ＦＣＳ対ＳＳＣ、ＣＤ５＋細胞）にゲートをかけることにより、収集した試料をＦｌｏｗｊｏソフトウェアを用いて解析した。ＰＥチャンネルでの平均蛍光強度（ＭＦＩ）がグラフで示される。ＤＲＡ２２７  ＳＭＩＰは対照としてのみ使用したものであり、ＣＤ３またはＴ細胞結合ドメインは含まず、ｐＩを低下させる修飾は施されていない。図１２を参照されたい。試験したｐＩ変異体はいずれもＣＤ３と結合し、ＤＲＡ２２８およびＤＲＡ２２９は、その親構築物とほぼ同じ結合活性を保持していた。
【０２２４】
実施例３：ｐＩが低下した抗ＣＤ３  ＳＭＩＰ分子はＣＨＯ細胞で比較的良好に発現する
サイズ排除クロマトグラフィー：サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、精製タンパク質の高分子量凝集体の含有量を評価した。ＨＰＬＣシステムは、クォータナリポンプ、溶媒脱ガス装置、ＤＡＤおよび温度制御オートサンプラーを備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １２００シリーズであった。クロマトグラフィーによる分離には、２００ｍＭリン酸カリウムおよび２５０ｍＭ塩化カリウムのｐＨ７．２のランニング緩衝液で平衡化したＴｏｓｏｈ  ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷｘｌカラムを用いた。溶媒流速を１ｍＬ／分、試料注入量を５０μｇとした。Ａｇｉｌｅｎｔ  ＤＡＤ検出器によりカラム溶出液を２８０ｎｍの波長でモニターした。
【０２２５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：変性ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いて、精製タンパク質の完全性を評価した。Ｎｏｖｅｘ試料緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で試料を調製し、４〜２０％Ｎｏｖｅｘトリス−グリシンゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に負荷する前に８５℃で３分間加熱して完全に変性させた。任意選択で、加熱段階の前にＮｏｖｅｘ還元剤を添加して試料を還元した。トリス−グリシン緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１０倍ストックのもの）を満たした電気泳動槽で１１０分間、ゲルに１２５Ｖを印加することによりタンパク質を移動させて分離した。ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ  Ｓａｆｅ  Ｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色することによりタンパク質のバンドを可視化した。図１３〜１４を参照されたい。試験したｐＩ変異体には、親分子ＤＲＡ１６１と比較してクリッピングの減少がみられた。
【０２２６】
ＣＥ−ＳＤＳ：Ｂｅｃｋｍａｎ  ＰＡ  ８００機器でＳＤＳのキャピラリー電気泳動を実施し、精製タンパク質の低分子量のクリップ含有量の定量に用いた。５０％ＳＤＳ試料緩衝液（Ｂｅｃｋｍａｎ）で１ｍｇ／ｍＬの濃度の試料を調製し、分析前に８５℃で３分間加熱して完全に変性させた。ＳＤＳゲル（Ｂｅｃｋｍａｎ）を満たした未処理のフューズドシリカキャピラリーに試料を界面動電注入（１０ｋＶで２０秒間）し、キャピラリーに１５ｋＶの電圧を３０分間印加（逆極性）することによって分離した。検出窓において２２０ｎｍおよび２８０ｎｍでの吸光度を測定した。図１５〜１６を参照されたい。これにより、例えば、本明細書で「クリッピング」と呼ばれる場合もある見かけのタンパク質分解が親分子よりも少ないことから、ｐＩ変異体のタンパク質の品質が親分子よりも高いことが示された。
【０２２７】
実施例４：抗ＣＤ３  ＳＭＩＰ  ｐＩ変異体分子は半減期の増大を示す
０時間にＤＲＡ２３４またはＤＲＡ２３３を２００μｇ含有するＰＢＳ  ２００μＬを雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに静脈内（ＩＶ）注射した。各時点で１グループ当たり３匹のマウスに注射を実施した。以下に記載する通り、注射後の示される時間に、麻酔をかけたマウスから心臓穿刺により放血し血清を採取した。酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いてＤＲＡ２３４およびＤＲＡ２３３の血清中濃度を求めた。ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（商標）Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌソフトウェア（ｖ５．３）を使用し、予めコンパイルされたモデル２０１をＩＶボーラス投与および少数サンプリングに適用して、各タンパク質の薬物動態パラメータを非コンパートメント解析により評価した。
【０２２８】
０時間にＤＲＡ２３３またはＤＲＡ２３４を２００μｇ（約１０ｍｇ／ｋｇ）含有するＰＢＳ  ２００μＬをマウスにＩＶ注射した。各時点で１グループ当たり３匹のマウスに注射を実施した。注射後、ｔ＝１５分、２時間、６時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１６８時間、３３６時間および５０４時間に、麻酔をかけたマウスから心臓穿刺により放血し血清を採取した。特異的サンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いて各タンパク質の血清中濃度を求めた。結果を平均血清中濃度（ｇ／ｍＬ）±ＳＤで経時的に表す。データを直線（Ａ）およびｌｏｇ（Ｂ）の形式で示す。図１７を参照されたい。
【０２２９】
プレートにＡＤＡを捕捉するＤＲＡ１６１（ＤＲＡ２３３およびＤＲＡ２３４の元の形態）をコーティングし、結合したＡＤＡを抗マウスＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）ＨＲＰで検出するサンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いて、抗薬物抗体（ＡＤＡ）を検出した。ペルオキシダーゼ基質を使用し、結果を蛍光プレートリーダーで読み取って、結合複合体を測定した。結果を平均蛍光単位（ＦＵ）対血清希釈で表した。ＤＲＡ２３３では、おそらく３３６時間後に低レベルが開始し、５０４時間後にＡＤＡのレベルが明らかにみられたが、ＤＲＡ２３４試料ではいずれもＡＤＡであるとは思われなかった（データ不掲載）。
【０２３０】
全ＤＲＡ２３３のＰＫ時点について、５０４時間後のデータを含むものも含まないものも、平均血清中濃度対時間のプロファイルをプロットする。ＤＲＡ２３４の血清中濃度対時間のプロファイルを図１８Ｃに示す。結果を測定データのセットおよびＷｉｎＮｏｎＬｉｎ（商標）ソフトウェアで算出した予測値として表す。Ｒｓｑ値およびＲｓｑ補正値は、ＨＬ＿Ｌａｍｂｄａ  ｚの評価に用いた時点の数に対して補正した終末消失相の適合度統計量である。検出可能なレベルの抗薬物抗体がみられない時点のみを用いたときのおよその半減期は、ＤＲＡ２３３が９５時間、ＤＲＡ２３４が８４時間であった。図１８を参照されたい。
【０２３１】
ＷｉｎＮｏｎＬｉｎプログラムから得られた表形式のＰＫ評価：ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（商標）Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ（ｖ５．３）ソフトウェアを使用し、少数サンプリングおよび予めコンパイルされたモデル２０１を用いた非コンパートメント解析を均一重み付けでＩＶボーラス投与に適用して、薬物動態解析を実施した。線形／ｌｏｇ内挿計算による線形台形法を用いて、０時間から最後の測定可能な濃度（Ｔｌａｓｔ）までの血清中濃度時間曲線下面積（ＡＵＣ）を評価した。以下に挙げる薬物動態パラメータを評価した：測定血清中濃度最大値（Ｃｍａｘ）、最後の測定可能な濃度（Ｃｌａｓｔ）、測定血清中濃度最大値に達するまでの時間（Ｔｍａｘ）、見かけの終末消失相半減期（ＨＬ  ｌａｍｂｄａ  ｚ）、投与時から最後の測定可能な濃度までのＡＵＣ（ＡＵＣａｌｌ）、時間を無限大まで外挿した投与のＡＵＣ（ＡＵＣＩＮＦ＿ｏｂｓ）、血清クリアランス（Ｃ＿ｏｂｓ）、終末相に基づく分布容積（Ｖｚ＿ｏｂｓ）および平均滞留時間（ＭＲＴ）。図１９および２０を参照されたい。この実施例は、試験したｐＩ変異体が親分子ＤＲＡ１6１よりもマウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ血清半減期が長く、クリアランスが遅いことを示している。
【０２３２】
実施例５：二重特異性ホモ二量体分子−抗ＣＤ３および抗ＰＳＭＡ
標準的な技術を用いて二重特異性ＣＤ３／ＰＳＭＡ結合ホモ二量体を構築した。これらの構築物、ＴＳＣ２４９、ＴＳＣ２５０、ＴＳＣ２５１、ＴＳＣ２５２、ＴＳＣ２９５、ＴＳＣ２９６、ＴＳＣ３０１およびＴＳＣ３０２を表５に記載する。制限酵素、ＨｉｎｄＩＩＩとＸｈｏＩまたはＡｇｅＩとＸｈｏＩを用いて親鋳型およびｓｃＦｖ挿入物を消化することによりＮ末端ｓｃＦｖ結合ドメインを挿入し、所望のフラグメントを同定し、アガロースゲル精製により精製し、ライゲーションを実施した。制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩを用いて親鋳型およびｓｃＦｖ挿入物を消化することによりＣ末端ｓｃＦｖ結合ドメインを挿入し、所望のフラグメントを同定し、アガロースゲル精製により精製し、ライゲーションを実施した。
【０２３３】
【表５】
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【０２３４】
実施例６：二重特異性ホモ二量体分子−抗ＣＤ３および抗ＲＯＮ
標準的な技術を用いて、ＣＤ３結合ホモ二量体およびＲＯＮ結合ホモ二量体をともに有する二重特異性分子を構築した。これらの構築物、ＴＳＣ２７５、ＴＳＣ２７７、ＴＳＣ２７８およびＴＳＣ２７９を表６に記載する。ＴＳＣ２７５は、ＲＯＮ結合ドメインの一部であり配列番号がそれぞれ１８７および１８８であるｈｕ４Ｃ０４のＶＬ鎖およびＶＨ鎖を含む。ＴＳＣ２７７、ＴＳＣ２７８およびＴＳＣ２７９は、表６に示される変異／置換を除いてＴＳＣ２７５と同じものである。
【０２３５】
【表６】
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【０２３６】
実施例７：二重特異性ホモ二量体分子−抗ＣＤ３および抗ＣＤ１９
標準的な技術を用いて、ＣＤ３結合ホモ二量体およびＣＤ１９結合ホモ二量体をともに有する二重特異性分子を構築した。例えば、国際公開第２００７／１４６９６８号を参照されたい。これらの構築物、ＴＳＣ２３３、ＴＳＣ２３４、ＴＳＣ２３５、ＴＳＣ２４０、ＴＳＣ２４１およびＴＳＣ２４２を表７に記載する。ＴＳＣ２３３は、ＣＤ１９結合ドメインの一部であるＨＤ３７のＶＬ（配列番号１９６のアミノ酸１〜１１１）鎖とＶＨ（配列番号１９６のアミノ酸１２８〜２５１）鎖とを含む。
【０２３７】
【表７】
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【０２３８】
実施例８：二重特異性ヘテロ二量体分子−抗ＣＤ３および抗ＣＤ１９
ほぼ国際公開第２０１１／０９０７６２号に記載されている通りに、表８に示されるアミノ酸配列をコードする核酸の同時遺伝子導入を実施することにより、ＣＤ１９結合ドメインとＣＤ３結合ドメインとを含む様々なヘテロ二量体二重特異性分子を構築した。一方のポリペプチド鎖が免疫グロブリンＣＨ１ヘテロ二量体化ドメインを含み、他方のポリペプチド鎖が免疫グロブリンＣＬヘテロ二量体化ドメインを含む、２つの異なるポリペプチド鎖を同時発現させることによって、ヘテロ二量体を作製した。
【０２３９】
【表８】
2018138039.tif 000011
【０２４０】
ＴＳＣ０４９はそのアミノ末端からカルボキシル末端に向かって：ＨＤ３７（抗ＣＤ１９）ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１  ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ３およびヒトＣＨ１を含む。ＴＳＣ０９６はそのアミノ末端からカルボキシル末端に向かって：ＨＤ３７（抗ＣＤ１９）ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１  ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ３およびヒトＣＫ（ＹＡＥ）を含む。ＴＳＣ１２５はそのアミノ末端からカルボキシル末端に向かって：Ｃｒｉｓ７（抗ＣＤ３）ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１  ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ３およびヒトＣＨ１を含む。ＴＳＣ２１８はそのアミノ末端からカルボキシル末端に向かって：ＤＲＡ２２１（抗ＣＤ３）ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１  ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ３およびヒトＣＨ１を含む。ＴＳＣ２１９はそのアミノ末端からカルボキシル末端に向かって：ＤＲＡ２２２（抗ＣＤ３）ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１  ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ３およびヒトＣＨ１を含む。ＴＳＣ２２０はそのアミノ末端からカルボキシル末端に向かって：ＤＲＡ２２４（抗ＣＤ３）ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１  ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ３およびヒトＣＨ１を含む。ＴＳＣ２２１はそのアミノ末端からカルボキシル末端に向かって：ＤＲＡ２２１（抗ＣＤ３）ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１  ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ３およびヒトＣＫ（ＹＡＥ）を含む。ＴＳＣ２２２はそのアミノ末端からカルボキシル末端に向かって：ＤＲＡ２２２（抗ＣＤ３）ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１  ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ３およびヒトＣｋ（ＹＡＥ）を含む。ＴＳＣ２２３はそのアミノ末端からカルボキシル末端に向かって：ＤＲＡ２２４（抗ＣＤ３）ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１  ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ３およびヒトＣＫ（ＹＡＥ）を含む。
【０２４１】
実施例９：二重特異性ヘテロ二量体分子−抗ＣＤ３および抗ＰＳＭＡ
ほぼ国際公開第２０１１／０９０７６２号に記載されている通りに、表９に示されるアミノ酸配列をコードする核酸の同時遺伝子導入を実施することにより、ＰＳＭＡ結合ドメインとＣＤ３結合ドメインとを含む様々なヘテロ二量体二重特異性分子を構築した。一方のポリペプチド鎖が免疫グロブリンＣＨ１ヘテロ二量体化ドメインを含み、他方のポリペプチド鎖が免疫グロブリンＣＬヘテロ二量体化ドメインを含む、２つの異なるポリペプチド鎖を同時発現させることによって、ヘテロ二量体を作製した。いくつかのＰＳＭＡ結合ドメインが国際公開第２０１１／０９０７６１号に記載されている。
【０２４２】
【表９】
2018138039.tif 000012
【０２４３】
「ヒト化１０７−１Ａ４  ＶＬ−ＶＨ＃２  ｓｃＦｖ」および「ヒト化１０７−１Ａ４  ＶＬ−ＶＨ＃１  ｓｃＦｖ」は抗ヒトＰＳＭＡ１０７−１Ａ４モノクローナル抗体に基づくヒト化ｓｃＦｖであり、国際公開第２０１１／０９０７６１号にも記載されている。「ヒト化１０７−１Ａ４  ＶＬ−ＶＨ＃２  ｓｃＦｖ」および「ヒト化１０７−１Ａ４  ＶＬ−ＶＨ＃１  ｓｃＦｖ」は、それぞれ配列番号２１６および２２６のアミノ酸１〜２４３に対応する。
【０２４４】
ＴＳＣ１９２はそのアミノ末端からカルボキシル末端に向かって：ヒト化１０７−１Ａ４（抗ＰＳＭＡ）ＶＬ−ＶＨ＃２  ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１  ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ３およびヒトＣＫ（ＹＡＥ）を含む。ＴＳＣ１９５はそのアミノ末端からカルボキシル末端に向かって：ヒト化１０７−１Ａ４（抗ＰＳＭＡ）ＶＬ−ＶＨ＃２  ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１  ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ３およびヒトＣＨ１を含む。ＴＳＣ１９３はそのアミノ末端からカルボキシル末端に向かって：ヒト化１０７−１Ａ４（抗ＰＳＭＡ）ＶＬ−ＶＨ＃１  ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１  ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ３およびヒトＣＫ（ＹＡＥ）を含む。
【０２４５】
ＴＳＣ２１９はそのアミノ末端からカルボキシル末端に向かって：ＤＲＡ２２２（抗ＣＤ３）ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１  ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ３およびヒト  ＣＨ１を含む。ＴＳＣ２２２はそのアミノ末端からカルボキシル末端に向かって：ＤＲＡ２２２（抗ＣＤ３）ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１  ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ３およびヒトＣＫ（ＹＡＥ）を含む。ＴＳＣ２５４はそのアミノ末端からカルボキシル末端に向かって：ヒト化１０７−１Ａ４（抗ＰＳＭＡ）ＶＬ−ＶＨ＃１  ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１  ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ３、リンカーおよびヒトＣＨ１を含む。ＴＳＣ２５８はそのアミノ末端からカルボキシル末端に向かって：ＤＲＡ２２２（抗ＣＤ３）ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１  ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ３、リンカーおよびヒトＣＫ（ＹＡＥ）を含む。
【０２４６】
実施例１０：ＣＤ１９を標的とするポリペプチドヘテロ二量体およびホモ二量体による標的依存性のＴ細胞増殖
標的依存性Ｔ細胞活性化および増殖の誘導における異なる二重特異性ポリペプチドヘテロ二量体分子の効果を比較するため、共通の抗ＣＤ１９結合ドメイン（ＨＤ３７）および３種類の異なる抗ＣＤ３結合ドメイン（ＴＳＣ１２９ａではＣｒｉｓ７、ＴＳＣ２３３ではＤＲＡ２２１のｓｃＦｖ結合ドメイン（配列番号１０のアミノ酸１〜２４４）、ＴＳＣ２３４ではＤＲＡ２２２のｓｃＦｖ結合ドメイン（配列番号８アミノ酸１〜２４４））を有する、３種類の異なるホモ二量体二重特異性分子（ＴＳＣ１２９ａ、ＴＳＣ２３３およびＴＳＣ２３４（それぞれ配列番号２４５、１９６および１９８））を比較した。さらに、３種類の異なる抗ＣＤ３結合ドメイン（ＴＳＣ１２７ではＣｒｉｓ７、ＴＳＣ２２７ではＤＲＡ２２１のｓｃＦｖ結合ドメイン（配列番号１０のアミノ酸１〜２４４）、ＴＳＣ２２８ではＤＲＡ２２２のｓｃＦｖ結合ドメイン（配列番号８のアミノ酸１〜２４４））を有する３種類の異なるヘテロ二量体二重特異性分子（ＴＳＣ１２７、ＴＳＣ２２７、ＴＳＣ２２８）も比較した。
【０２４７】
ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）からＤａｕｄｉ  Ｂｕｒｋｉｔｔリンパ腫細胞（ＣＤ１９＋）を入手し、提供されたプロトコルに従って培養した。標準的なフィコール勾配を用いて、ヒト血液から末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を単離した。単離した細胞を緩衝食塩水で洗浄した。Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社（Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のＰａｎ  Ｔ−ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＩＩを製造業者のプロトコルを用いて使用し、このＰＢＭＣからＴ細胞をさらに単離した。
【０２４８】
単離したＴ細胞集団をカルボキシフルオセイン二酢酸サクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識することにより増殖を評価した。Ｔ細胞と腫瘍細胞の比が約３：１になるよう、ＣＦＳＥ標識Ｔ細胞をＴ細胞１００，０００個／ウェルおよび腫瘍細胞個３３，０００／ウェルでＵ底９６ウェルプレートに播いた。１ｎＭ〜５ｆＭの範囲の濃度の被験分子を、１０％ヒトまたはウシ血清、ピルビン酸ナトリウムおよび非必須アミノ酸を添加したＲＰＭＩ１６４０培地中、計２００ｕＬ／ウェルになるよう細胞混合物に添加した。プレートを加湿恒温器中、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。３日後、フローサイトメトリー解析のために細胞を抗体で標識した。移動時の細胞損失を最小限に抑えるため、元のプレートで細胞を標識して洗浄し、０．２％ウシ血清アルブミンを含有する緩衝食塩水中ですべての標識を実施した。最初に、細胞を１００ｕｇ／ｍｌヒトＩｇＧとともに室温で１５分間、プレインキュベートした。次いで、以下の色素標識抗体：ＣＤ５−ＰＥ、ＣＤ４−ＡＰＣ、ＣＤ８−Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、ＣＤ２５−ＰＥ−Ｃｙ７および７−アミノアクチノマイシンＤ（以降、７ＡＡＤ）の混合物（総体積５０ｕｌ）とともに細胞を４０分間、インキュベートした。プレートを２回洗浄し、体積８０〜１２０ｕｌで再懸濁し、直ちにＢＤ  ＬＳＲ  ＩＩフローサイトメータにかけ、各ウェルの内容物の８０％を得た。活性化した生存ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞（それぞれ７ＡＡＤ−、ＣＤ５＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋または７ＡＡＤ−ＣＤ５＋ＣＤ２５＋ＣＤ８＋）に順次ゲートをかけることにより、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いてＣＦＳＥプロファイルに従って試料ファイルを解析し、少なくとも１回の細胞分裂を経た細胞の百分率および数を算出した。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌソフトウェアを用いて平均値および標準偏差を算出した。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  ＥｘｃｅｌおよびＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍを用いてグラフをプロットした。
【０２４９】
全Ｔ細胞で処置したＤａｕｄｉ細胞由来の生存ＣＤ４＋集団およびＣＤ８＋集団の解析から、標的ＣＤ１９抗原を提示しているＤａｕｄｉ細胞の存在下での総細胞数および増殖細胞のパーセントがともに有意に増加していることが明らかになった（図２１および２２）。
【０２５０】
ホモ二量体二重特異性ポリペプチド（ＴＳＣ１２９ａ、ＴＳＣ２３３、ＴＳＣ２３４）では、ＣＤ４＋細胞とＣＤ８＋細胞との間に増殖の差はみられなかった（図２１）。ＴＳＣ１２９ａおよびＴＳＣ２３４によって誘導された増殖についてはＣＤ４＋細胞とＣＤ８＋細胞との間に差はみられず（図２１）、ｐＩ変異体のＤＲＡ２２２由来抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ結合ドメインが親Ｃｒｉｓ７結合ドメインと実質的に同等の活性を有することが示唆された。ＴＳＣ２３３によって誘導されたＴ細胞増殖のプロファイルはＴＳＣ１２９ａおよびＴＳＣ２３４とわずかに異なるものとなり、ＣＤ４＋増殖の誘導が減少し（図２１Ａ）、ＣＤ８＋増殖の誘導がわずかに増加していた（図２１Ｂ）。このことは、ｐＩ変異体のＤＲＡ２２１由来抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ結合ドメインが、活性の点で親Ｃｒｉｓ７結合ドメインと完全に同等というわけではないことを示唆するものであった。
【０２５１】
ヘテロ二量体二重特異性ポリペプチド（ＴＳＣ１２７、ＴＳＣ２２７、ＴＳＣ２２８）では、Ｄａｕｄｉ細胞の存在下でＣＤ８＋Ｔ細胞の方がＣＤ４＋Ｔ細胞よりも増殖率を示した（図２２）。ＴＳＣ１２７およびＴＳＣ２２８によって誘導された増殖についてはＣＤ４＋細胞とＣＤ８＋細胞との間に差はみられず（図２２）、ｐＩ変異体のＤＲＡ２２２由来抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ結合ドメインが親Ｃｒｉｓ７結合ドメインと実質的に同等の活性を有することが示唆された。ＴＳＣ２２７によって誘導されたＴ細胞増殖のプロファイルはＴＳＣ１２７およびＴＳＣ２２８とわずかに異なるものとなり、ＣＤ４＋増殖の誘導が減少しており、ＣＤ８＋増殖の誘導には差がみられなかった。このことは上と同様に、ｐＩ変異体のＤＲＡ２２１由来抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ結合ドメインが、活性の点で親Ｃｒｉｓ７結合ドメインと完全に同等というわけではないことを示唆するものであった。
【０２５２】
実施例１１：ＣＤ１９を標的とするポリペプチドヘテロ二量体およびホモ二量体によって再誘導されたＴ細胞細胞傷害性
標的依存性Ｔ細胞細胞傷害性の誘導における異なる二重特異性ポリペプチドヘテロ二量体分子の効果を比較するため、共通の抗ＣＤ１９結合ドメイン（ＨＤ３７）および３種類の異なる抗ＣＤ３結合ドメイン（ＴＳＣ１２９ａではＣｒｉｓ７、ＴＳＣ２３３ではＤＲＡ２２１のｓｃＦｖ結合ドメイン（配列番号１０のアミノ酸１〜２４４）、ＴＳＣ２３４ではＤＲＡ２２２のｓｃＦｖ結合ドメイン（配列番号８のアミノ酸１〜２４４）））を有する、３種類の異なるホモ二量体二重特異性分子（ＴＳＣ１２９ａ、ＴＳＣ２３３およびＴＳＣ２３４（それぞれ配列番号２４５、１９６および１９８））を比較した。さらに、３種類の異なる抗ＣＤ３結合ドメイン（ＴＳＣ１２７ではＣｒｉｓ７、ＴＳＣ２２７ではＤＲＡ２２１のｓｃＦｖ結合ドメイン（配列番号１０のアミノ酸１〜２４４）、ＴＳＣ２２８ではＤＲＡ２２２のｓｃＦｖ結合ドメイン（配列番号８のアミノ酸１〜２４４））を有する３種類の異なるヘテロ二量体二重特異性分子（ＴＳＣ１２７、ＴＳＣ２２７、ＴＳＣ２２８）も比較した。
【０２５３】
ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）からＤａｕｄｉ  Ｂｕｒｋｉｔｔリンパ腫細胞（ＣＤ１９＋）を入手し、提供されたプロトコルに従って培養した。標準的なフィコール勾配を用いて、ヒト血液から末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を単離し、緩衝食塩水で洗浄した。Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社（Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のＰａｎ  Ｔ−ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＩＩを製造業者のプロトコルを用いて使用し、ＰＢＭＣからＴ細胞をさらに単離した。
【０２５４】
５１Ｃｒ放出アッセイにより細胞傷害性を評価した。約５×１０６個のＤａｕｄｉ細胞を０．３ｍＣｉの５１Ｃｒで処理し、３７℃で７５分間インキュベートした。７５分後、細胞を培地（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ）で３回洗浄し、培地１１．５ｍＬに再懸濁した。この懸濁液から９６ウェルＵ底プレートに１ウェル当たり５０μＬを分注した（約２０，０００細胞／ウェル）。５００ｐＭ〜０．１ｐＭの範囲の濃度の二重特異性分子をＤａｕｄｉ細胞に加え、総体積を１００μＬ／ウェルにした。標的細胞を室温で１５分間インキュベートした。次いで、単離Ｔ細胞１００μＬ（約２００，０００個）を加えて、Ｔ細胞と標的細胞の比を１０：１にした。標的細胞を含む対照ウェルに０．８％ＮＰ−４０を５０μＬ加え、１５分間放置した後、培地１００μＬを加えて、全溶解対照とした。
【０２５５】
プレートを４時間インキュベートした後、１５００ｒｐｍで３分間回転させ、上清２５μＬを各ウェルから９６ウェルＬｕｍａ試料プレートの対応するウェルに移した。化学的に安全なフード内で試料プレートを１８時間、空気乾燥させた後、標準プロトコルを用いてＴｏｐｃｏｕｎｔシンチレーションカウンターで放射活性を読み取った。
【０２５６】
細胞傷害性データの解析から、Ｔ細胞および抗ＣＤ１９に対する二重特異性分子の存在下でＴ細胞がＤａｕｄｉ細胞に対して細胞傷害性を誘導することが明らかになった（図２３）。
【０２５７】
ホモ二量体二重特異性ポリペプチド（ＴＳＣ１２９ａ、ＴＳＣ２３３、ＴＳＣ２３４）では、ＴＳＣ１２９ａとＴＳＣ２３４との間に観察された細胞傷害性の差はみられず（図２３Ａ）、ＤＲＡ２２２  ｐＩ変異体が親Ｃｒｉｓ７結合ドメインと同等の活性を有することが示唆された。ＴＳＣ２３３では細胞傷害性のわずかな減少が観察され、ＤＲＡ２２１  ｐＩ変異体が親Ｃｒｉｓ７結合ドメインよりも活性が低いことが示唆された。
【０２５８】
ヘテロ二量体二重特異性ポリペプチド（ＴＳＣ１２７、ＴＳＣ２２７、ＴＳＣ２２８）では、ＴＳＣ１２７とＴＳＣ２２８との間に観察された細胞傷害性の差はみられず（図２３Ｂ）、ＤＲＡ２２２  ｓｃＦｖ結合ドメインのｐＩ変異体が親Ｃｒｉｓ７結合ドメインと同等の活性を有することが示唆された。ＴＳＣ２２７では細胞傷害性のわずかな減少が観察され、ＤＲＡ２２１  ｓｃＦｖ結合ドメインのｐＩ変異体が親Ｃｒｉｓ７結合ドメインよりも活性が低いことが示唆された。
【０２５９】
実施例１２：ＲＯＮを標的とするポリペプチドホモ二量体によって再誘導されたＴ細胞細胞傷害性
標的依存性Ｔ細胞細胞傷害性の誘導における異なる二重特異性ポリペプチドヘテロ二量体分子の効果を比較するため、共通の抗ＣＤ３結合ドメイン（ＤＲＡ２２２のｓｃＦｖ結合ドメイン（配列番号８のアミノ酸１〜２４４））および同じ抗ＲＯＮ結合ドメインの４種類の異なる変異体（ＴＳＣ２７５ではｈｕ４Ｃ０４  ｓｃＦｖ、ＴＳＣ２７７ではｈｕ４Ｃ０４  ｓｃＦｖ（Ａ４３Ｋ／Ｑ２４０Ｅ）、ＴＳＣ２７８ではｈｕ４Ｃ０４  ｓｃＦｖ（Ａ４３Ｔ）、ＴＳＣ２７９ではｈｕ４Ｃ０４  ｓｃＦｖ（Ｑ１６５Ｒ））を有する、４種類の異なるホモ二量体二重特異性分子（ＴＳＣ２７５、ＴＳＣ２７７、ＴＳＣ２７８およびＴＳＣ２７９）を比較した。
【０２６０】
ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）からＭＤＡ−ＭＢ−４５３乳癌細胞（ＲＯＮ＋）を入手し、ＡＴＣＣによって提供されたプロトコルに従って培養した。標準的なフィコール勾配を用いて、ヒト血液から末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を単離し、緩衝食塩水で洗浄した。Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社（Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のＰａｎ  Ｔ−ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＩＩを製造業者のプロトコルを用いて使用し、ＰＢＭＣからＴ細胞をさらに単離した。
【０２６１】
５１Ｃｒ放出アッセイにより細胞傷害性を評価した。約５×１０６個のＤａｕｄｉ細胞を０．３ｍＣｉの５１Ｃｒで処理し、３７℃で７５分間インキュベートした。７５分後、細胞を培地（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ）で３回洗浄し、培地１１．５ｍＬに再懸濁した。この懸濁液から９６ウェルＵ底プレートに１ウェル当たり５０μＬを分注した（約２０，０００細胞／ウェル）。１０ｎＭ〜０．００５ｆＭの範囲の濃度の二重特異性分子をＤａｕｄｉ細胞に加え、総体積を１００μＬ／ウェルにした。標的細胞を室温で１５分間インキュベートした。次いで、単離Ｔ細胞１００μＬ（約１００，０００個）を加えて、Ｔ細胞と標的細胞の比を５：１にした。標的細胞を含む対照ウェルに０．８％ＮＰ−４０を５０μＬ加え、１５分間放置した後、培地１００μＬを加えて、全溶解対照とした。
【０２６２】
プレートを２４時間インキュベートした後、１５００ｒｐｍで３分間回転させ、上清２５μＬを各ウェルから９６ウェルＬｕｍａ試料プレートの対応するウェルに移した。化学的に安全なフード内で試料プレートを１８時間、空気乾燥させた後、標準プロトコルを用いてＴｏｐｃｏｕｎｔシンチレーションカウンターで放射活性を読み取った。
【０２６３】
細胞傷害性データの解析から、Ｔ細胞および抗ＲＯＮに対する二重特異性分子の存在下でＴ細胞がＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞に対して細胞傷害性を誘導することが明らかになった（図２４）。
【０２６４】
ホモ二量体二重特異性ポリペプチド（ＴＳＣ２７５、ＴＳＣ２７７、ＴＳＣ２７８およびＴＳＣ２７９）では、観察された細胞傷害性には全般的に差がみられず（図２４）、ＯＲＮ１９６結合ドメイン内の変異が活性全体に有意な影響を及ぼさないことが示唆された。しかし、ＴＳＣ２７８では他の３種類の変異体よりも溶解の最大値がわずかに低いことが観察された（図２４）。溶解の最大値は１０ｐＭ〜１０ｎＭの濃度で観察された。
【０２６５】
実施例１３：二重特異性ポリペプチドヘテロ二量体およびホモ二量体のＴ細胞結合
Ｔ細胞との結合におけるｐＩ変異体のＣＤ３結合ドメイン（ＤＲＡ２２２にみられるｓｃＦｖ（配列番号８のアミノ酸１〜２４４））を特徴とする二重特異性ポリペプチド分子の効果を比較するため、抗ＣＤ１９×抗ＣＤ３二重特異性ポリペプチドヘテロ二量体、ＴＳＣ２２８（実施例８、表８に記載）の細胞上での結合特性と、抗ＰＳＭＡ×抗ＣＤ３二重特異性ポリペプチドホモ二量体、ＴＳＣ２４９（実施例５、表５に記載）の細胞上での結合特性とを２つの独立した実験で比較した。
【０２６６】
ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）からＪｕｒｋａｔ（ＣＤ３＋）Ｔ細胞白血病細胞を入手し、ＡＴＣＣによって提供されたプロトコルに従って培養した。５×１０５個のＪｕｒｋａｔ細胞を２５０ｎＭ〜０．１２５ｎＭ（ＴＳＣ２４９）または１２５ｎＭ〜１ｐＭ（ＴＳＣ２２８）の濃度の連続希釈した二重特異性分子、ＴＳＣ２２８またはＴＳＣ２４９とともに４℃で３０分間インキュベートすることにより、結合を評価した。細胞を３回洗浄した後、ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣ（１：２００希釈）とともに４℃でさらに３０分間インキュベートした。次いで、細胞を再び３回洗浄し、１％パラホルムアルデヒドで固定し、ＦＡＣＳ−Ｃａｌｉｂｕｒ機器で読み取った。
【０２６７】
ＦｌｏｗＪｏ  ｖ７．５（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）による  ＦＳＣが高く、ＳＳＣが高いサブセットの解析から、二重特異性分子、ＴＳＣ２２８およびＴＳＣ２４９とＪｕｒｋａｔ細胞との用量依存性の結合が明らかになった（それぞれ図２５Ａおよび２５Ｂ）。抗ＣＤ３結合ドメイン１つのみを有するＴＳＣ２２８二重特異性ポリペプチドヘテロ二量体は、抗ＣＤ３結合ドメインを２つ有するＴＳＣ２４９二重特異性ポリペプチドホモ二量体（ＥＣ５０＝１．９ｎＭ）よりも低い見かけの親和性（ＥＣ５０＝２４．５ｎＭ）で結合した。このことは、ＴＳＣ２４９二重特異性ポリペプチドヘテロ二量体がある程度の結合力で結合することを示唆している。
【０２６８】
実施例１４：ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ  ＰＳＭＡを標的とする二重特異性ポリペプチドホモ二量体による標的依存性Ｔ細胞増殖
標的依存性Ｔ細胞活性化および増殖の誘導における異なる二重特異性ポリペプチドヘテロ二量体分子の効果を判定するため、抗ＰＳＭＡ結合ドメイン（ｈｕ１０７−１Ａ４）と抗ＣＤ３結合ドメイン（ＤＲＡ２２２のｓｃＦｖ（配列番号８のアミノ酸１〜２４４））とを有するホモ二量体二重特異性分子（ＴＳＣ２４９、実施例５、表５を参照されたい）を、ＰＳＭＡを発現する前立腺癌細胞系、ＰＳＭＡを発現しない前立腺癌細胞系および標的細胞の存在しないＴ細胞で試験した。
【０２６９】
ＭＤアンダーソン癌センター（ＭＤ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ）（Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ）からＣ４−２Ｂ前立腺癌細胞（ＰＳＭＡ＋）を入手し、提供されたプロトコルに従って培養した。ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）からＤＵ−１４５前立腺癌細胞（ＰＳＭＡ）を入手し、提供されたプロトコルに従って培養した。標準的なフィコール勾配を用いて、ヒト血液から末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を単離し、さらに緩衝食塩水で洗浄した。次いで、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社（Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のＰａｎ  Ｔ−ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＩＩを製造業者のプロトコルを用いて使用し、このＰＢＭＣからＴ細胞を単離した。
【０２７０】
単離Ｔ細胞集団をカルボキシフルオセイン二酢酸サクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識することにより増殖を評価した。３つの個別の実験を同時に設定した。ＣＦＳＥ標識Ｔ細胞をＴＳＣ２４９分子のみと混合した；ＣＦＳＥ標識Ｔ細胞をＤＵ−１４５細胞およびＴＳＣ２４９分子と混合した；ＣＦＳＥ標識Ｔ細胞をＣ４−２Ｂ細胞およびＴＳＣ２４９分子と混合した。Ｕ底９６ウェルプレートにＣＦＳＥ標識Ｔ細胞を１００，０００細胞／ウェルで腫瘍細胞３３，０００個／ウェルとともに播き、Ｔ細胞と腫瘍細胞の比を約３：１にした。２０ｎＭ〜５ｆＭの範囲の濃度の被験分子を、１０％ヒトまたはウシ血清、ピルビン酸ナトリウムおよび非必須アミノ酸を添加したＲＰＭＩ１６４０培地中、計２００ｕＬ／ウェルになるよう細胞混合物に添加した。プレートを加湿恒温器中、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。３日後、フローサイトメトリー解析のために細胞を抗体で標識した。移動時の細胞損失を最小限に抑えるため、元のプレートで細胞を標識して洗浄し、０．２％ウシ血清アルブミンを含有する緩衝食塩水中ですべての標識を実施した。最初に、細胞を１００ｕｇ／ｍｌヒトＩｇＧとともに室温で１５分間、プレインキュベートした。次いで、以下の色素標識抗体：ＣＤ５−ＰＥ、ＣＤ４−ＡＰＣ、ＣＤ８−Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、ＣＤ２５−ＰＥ−Ｃｙ７および７−アミノアクチノマイシンＤ（以降、７ＡＡＤの混合物（総体積５０ｕｌ）とともに細胞を４０分間、インキュベートした。プレートを２回洗浄し、体積８０〜１２０ｕｌで再懸濁し、直ちにＢＤ  ＬＳＲ  ＩＩフローサイトメータにかけ、各ウェルの内容物の８０％を得た。活性化した生存ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞（それぞれ７ＡＡＤ−、ＣＤ５＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋または７ＡＡＤ−ＣＤ５＋ＣＤ２５＋ＣＤ８＋）に順次ゲートをかけることにより、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いてＣＦＳＥプロファイルに従って試料ファイルを解析し、少なくとも１回の細胞分裂を経た細胞の百分率および数を算出した。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌソフトウェアを用いて平均値および標準偏差を算出した。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  ＥｘｃｅｌおよびＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍを用いてグラフをプロットした。
【０２７１】
全Ｔ細胞で処置したＣ４−２Ｂ細胞由来の生存ＣＤ４＋集団およびＣＤ８＋集団の解析から、標的ＰＳＭＡ抗原を発現するＣ４−２Ｂ細胞の存在下、ＴＳＣ２４９で処置すると、総細胞数がともに有意に増加することが明らかになった（図２６Ａ）。標的ＰＳＭＡ抗原を発現しないＤＵ−１４５細胞の存在下、ＴＳＣ２４９で処置したところ、この増加はみられなかった（図２６Ｂ）。最後に、単離Ｔ細胞をＴＳＣ２４９で処置した場合にも、この増加はみられなかった（図２６Ｃ）。このことは、標的抗原を発現する腫瘍細胞の存在下でＴＳＣ２４９によって誘導されるＴ細胞増殖の標的依存性を裏付けている。
【０２７２】
実施例１５：ＣＤ３およびＰＳＭＡの二重特異性標的化のｉｎ  ｖｉｖｏ試験
ｉｎ  ｖｉｖｏの腫瘍成長阻害における抗ＣＤ３／抗ＰＳＭＡ二重特異性分子の効果を裏付けるため、以下に挙げるもののいずれか１つまたは複数を用いてＰＳＭＡに対する分子を評価することができる。
【０２７３】
皮下腫瘍の腫瘍生着の予防的処置または阻止：培養したＰＳＭＡ発現腫瘍細胞系（例えばＬＮＣａＰ、ＬＮＣａＰ  Ｃ４−２、ＬＮＣａＰ  Ｃ４−２Ｂ、ＶＣａＰ、ＣＷＲ２２Ｒｖ１、ＬＡＰＣ４、ＭＤＡ−ＰＣａ−２ｂ、ＬｕＣａＰ２３．１、ＬｕＣａＰ５８、ＬｕＣａＰ７０、ＬｕＣａＰ７７など）とヒトリンパ球（ヒト末梢血単核球または精製Ｔ細胞）とを混合し、免疫不全マウス（例えばＳＣＩＤ、ＮＯＤ／ＳＣＩＤなど）に皮下注射する。注射当日およびその後数日間、抗ＰＳＭＡ二重特異性分子を静脈内に注射する。腫瘍体積による評価で用量依存性の腫瘍成長阻害が認められれば、それぞれの分子にｉｎ  ｖｉｖｏのＰＳＭＡ発現腫瘍に対する効果があることが示される。
【０２７４】
既に確立されている皮下腫瘍の治療的処置または消退：培養したＰＳＭＡ発現腫瘍細胞系（例えばＬＮＣａＰ、ＬＮＣａＰ  Ｃ４−２、ＬＮＣａＰ  Ｃ４−２Ｂ、ＶＣａＰ、ＣＷＲ２２Ｒｖ１、ＬＡＰＣ４、ＭＤＡ−ＰＣａ−２ｂ、ＬｕＣａＰ２３．１ＡＩ、ＬｕＣａＰ５８、ＬｕＣａＰ７０およびＬｕＣａＰ７７など）を免疫不全マウス（例えばＳＣＩＤ、ＮＯＤ／ＳＣＩＤなどに皮下注射する。腫瘍成長をモニターし、腫瘍が成長確立の徴候（通常、約２００ｍｍ３の体積）を示した時点で試験を開始する。注射当日、ヒトリンパ球（ヒト末梢血単核球または精製Ｔ細胞）を抗ＰＳＭＡ二重特異性分子とともに静脈内に注射する。その後数日間、抗ＰＳＭＡ二重特異性分子を注射する。腫瘍体積による評価で用量依存性の腫瘍成長阻害が認められれば、それぞれの分子にｉｎ  ｖｉｖｏのＰＳＭＡ発現腫瘍に対する効果があることが示される。
【０２７５】
脛骨内腫瘍の腫瘍生着の予防的処置または阻止：培養したＰＳＭＡ発現腫瘍細胞系（例えばＬＮＣａＰ  Ｃ４−２、ＬＮＣａＰ  Ｃ４−２Ｂ、ＶＣａＰ、ＣＷＲ２２Ｒｖ１、ＬＡＰＣ４、ＭＤＡ−ＰＣａ−２ｂ、ＬｕＣａＰ２３．１、ＬｕＣａＰ５８、ＬｕＣａＰ７０、ＬｕＣａＰ７７など）をヒトリンパ球（ヒト末梢血単核球または精製Ｔ細胞）と混合し、免疫不全マウス（例えばＳＣＩＤ、ＮＯＤ／ＳＣＩＤなど）の脛骨内に注射する。注射当日およびその後数日間、抗ＰＳＭＡ二重特異性分子を静脈内注射する。血清バイオマーカー、放射線写真撮影、蛍光撮像、体重減少をはじめとする腫瘍体積の代用測定による評価で用量依存性の腫瘍成長阻害が認められれば、それぞれの分子にｉｎ  ｖｉｖｏのＰＳＭＡ発現腫瘍に対する効果があることが示される。
【０２７６】
既に確立されている脛骨内腫瘍の治療的処置または消退：培養したＰＳＭＡ発現腫瘍細胞系（例えばＬＮＣａＰ  Ｃ４−２、ＬＮＣａＰ  Ｃ４−２Ｂ、ＶＣａＰ、ＣＷＲ２２Ｒｖ１、ＬＡＰＣ４、ＭＤＡ−ＰＣａ−２ｂ、ＬｕＣａＰ２３．１ＡＩ、ＬｕＣａＰ５８、ＬｕＣａＰ７０およびＬｕＣａＰ７７など）を免疫不全マウス（例えばＳＣＩＤ、ＮＯＤ／ＳＣＩＤなど）の脛骨内に注射する。腫瘍成長をモニターし、腫瘍が成長確立の徴候（通常、約２００ｍｍ３の体積）を示した時点で試験を開始する。注射当日、ヒトリンパ球（ヒト末梢血単核球または精製Ｔ細胞）を抗ＰＳＭＡ二重特異性分子とともに静脈内に注射する。その後数日間、抗ＰＳＭＡ二重特異性分子を注射する。血清バイオマーカー、放射線写真撮影、蛍光撮像、体重減少をはじめとする腫瘍体積の代用測定による評価で用量依存性の腫瘍成長阻害が認められれば、それぞれの分子にｉｎ  ｖｉｖｏのＰＳＭＡ発現腫瘍に対する効果があることが示される。
【０２７７】
実施例１６：ＰＳＭＡを標的とするポリペプチドヘテロ二量体およびホモ二量体によって再誘導されたＴ細胞細胞傷害性
標的依存性Ｔ細胞細胞傷害性の誘導における異なる二重特異性ポリペプチドヘテロ二量体分子の効果を比較するため、共通の抗ＰＳＭＡ結合ドメイン（ｈｕ１０７−１Ａ４）および２種類の異なる抗ＣＤ３結合ドメイン（ＴＳＣ１９４ではＣｒｉｓ７  ｓｃＦＶ、ＴＳＣ２４９ではＤＲＡ２２２のｓｃＦｖ）を有する、２種類の異なるホモ二量体二重特異性分子（ＴＳＣ１９４、ＴＳＣ２４９）を比較した。ＴＳＣ１９４はホモ二量体二重特異性である（（ｈｕＶＬ−ＶＨ＃２  １０７−１Ａ４  ｓｃＦｖ−Ｆｃ−Ｃｒｉｓ７  ｓｃＦｖ）（配列番号２５０および２５１）。
【０２７８】
ＭＤアンダーソン（ＭＤ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ）からＣ４−２Ｂ細胞（ＰＳＭＡ＋）を入手し、公開されている培養条件に従って、１０％ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で培養した。標準的なフィコール勾配を用いて、ヒト血液から末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を単離し、緩衝食塩水で洗浄した。Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社（Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のＰａｎ  Ｔ−ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＩＩを製造業者のプロトコルを用いて使用し、ＰＢＭＣからＴ細胞をさらに単離した。
【０２７９】
５１Ｃｒ放出アッセイにより細胞傷害性を評価した。約５×１０６個のＣ４−２細胞を０．３ｍＣｉの５１Ｃｒで処理し、３７℃で７５分間インキュベートした。７５分後、細胞を培地（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ）で３回洗浄し、培地１１．５ｍＬに再懸濁した。この懸濁液から９６ウェルＵ底プレートに１ウェル当たり５０μＬを分注した（約２０，０００細胞／ウェル）。５００ｐＭ〜０．２ｐＭの範囲の濃度の二重特異性分子をＣ４−２細胞に加え、総体積を１００μＬ／ウェルにした。標的細胞を室温で１５分間インキュベートした。次いで、単離Ｔ細胞１００μＬ（約２００，０００個）を加えて、Ｔ細胞と標的細胞の比を１０：１にした。標的細胞を含む対照ウェルに０．８％ＮＰ−４０を５０μＬ加え、１５分間放置した後、培地１００μＬを加えて、全溶解対照とした。
【０２８０】
プレートを４時間インキュベートした後、１５００ｒｐｍで３分間回転させ、上清２５μＬを各ウェルから９６ウェルＬｕｍａ試料プレートの対応するウェルに移した。化学的に安全なフード内で試料プレートを１８時間、空気乾燥させた後、標準プロトコルを用いてＴｏｐｃｏｕｎｔシンチレーションカウンターで放射活性を読み取った。
【０２８１】
細胞傷害性データの解析から、Ｔ細胞および抗ＰＳＭＡに対する二重特異性分子の存在下でＴ細胞がＣ４−２細胞に対して細胞傷害性を誘導することが明らかになった（図２７）。ホモ二量体二重特異性ポリペプチド（ＴＳＣ１９４、ＴＳＣ２４９）では、ＴＳＣ１９４とＴＳＣ２４９との間に観察された細胞傷害性の差はみられず（表１０）、ＤＲＡ２２２抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ結合ドメインｐＩ変異体が親Ｃｒｉｓ７結合ドメインと同等の活性を有することが示唆された。
【０２８２】
【表１０】
2018138039.tif 000013
【０２８３】
本願は以下の発明をも含む。
（１）
配列番号４１のアミノ酸配列を有する結合ドメインと比較して等電点が低下したＣＤ３結合ドメインを含む、ＣＤ３結合ポリペプチド。
（２）
前記結合ドメインがＶＨ領域とＶＬ領域とを含み、前記ＶＨ領域および前記ＶＬ領域がフレームワーク領域を含む、（１）に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
（３）
２個以上のアミノ酸が、正荷電アミノ酸を中性アミノ酸で置換することおよび／または中性アミノ酸を負荷電アミノ酸で置換することによって、ＶＨおよび／またはＶＬのフレームワーク領域内で修飾されている、（２）に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
（４）
前記フレームワーク領域の前記修飾されたアミノ酸が、対応するヒト生殖系列ＩｇＧ配列内に含まれるアミノ酸で置換されている、（３）に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
（５）
前記ヒト生殖系列ＩｇＧ配列が配列番号４３を含む、（４）に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
（６）
前記ヒト生殖系列ＩｇＧ配列が配列番号４４を含む、（４）に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
（７）
プレヒンジ領域をさらに含む、（１）〜（３）に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
（８）
前記プレヒンジ領域が、ＲＲＴプレヒンジ領域を有するＣＤ３結合ポリペプチドと比較して低下した等電点を有する、（７）に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
（９）
フレームワーク領域と、プレヒンジ領域と、ヒンジ領域とを有するＣＤ３結合ドメインを含む、ＣＤ３結合ポリペプチドであって、
配列番号４２と比較して修飾されたアミノ酸を３個以上有し、前記修飾が、フレームワーク領域および／またはプレヒンジ領域内の正荷電アミノ酸から中性アミノ酸への置換および／または中性アミノ酸から負荷電アミノ酸への置換である、
ＣＤ３結合ポリペプチド。
（１０）
少なくとも２個以上のアミノ酸が、正荷電アミノ酸を中性アミノ酸で置換することおよび／または中性アミノ酸を負荷電アミノ酸で置換することによって、ＶＨおよび／またはＶＬのフレームワーク領域内で修飾されている、（９）に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
（１１）
少なくとも４個以上のアミノ酸が、正荷電アミノ酸を中性アミノ酸で置換することおよび／または中性アミノ酸を負荷電アミノ酸で置換することによって、ＶＨおよび／またはＶＬのフレームワーク領域内で修飾されている、（３）および（９）に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
（１２）
３〜５個のアミノ酸が、正荷電アミノ酸を中性アミノ酸で置換することおよび／または中性アミノ酸を負荷電アミノ酸で置換することによって、ＶＨおよび／またはＶＬのフレームワーク領域内で修飾されている、（３）および（９）に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
（１３）
３〜１０個のアミノ酸が、正荷電アミノ酸を中性アミノ酸で置換することおよび／または中性アミノ酸を負荷電アミノ酸で置換することによって、ＶＨおよび／またはＶＬのフレームワーク領域内で修飾されている、（３）および（９）に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
（１４）
前記ＣＤ３結合ポリペプチドプレヒンジ領域がアミノ酸配列ＳＳＳまたはＳＳＴを含む、（８）〜（９）に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
（１５）
ヒンジ領域と定常領域とをさらに含む、（１）〜（８）に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
（１６）
配列番号４のポリペプチドよりも実験的等電点が少なくとも１ｐＩ単位低い、（１）〜（１５）に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
（１７）
ヒト化抗体、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）またはＳＭＩＰである、（１）に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
（１８）
アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、前記ＣＤ３結合ドメイン、前記ヒンジ領域および前記定常領域を含む、（１５）に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
（１９）
アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、前記定常領域、前記ヒンジ領域および前記ＣＤ３結合ドメインを含む、（１５）に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
（２０）
第二の結合ドメインをさらに含む、（１５）に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
（２１）
アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、前記ＣＤ３結合ドメイン、前記ヒンジ領域、前記定常領域および前記第二の結合ドメインを含む、（２０）に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
（２２）
アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、前記第二の結合ドメイン、前記ヒンジ領域、前記定常領域および前記ＣＤ３結合ドメインを含む、（２０）に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
（２３）
ヘテロ二量体化ドメインをさらに含む、（１５）に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
（２４）
アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、前記ＣＤ３結合ドメイン、前記ヒンジ領域、前記定常領域および前記ヘテロ二量体化ドメインを含む、（２３）に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
（２５）
第二の結合ドメインをさらに含む、（１）〜（２４）に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
（２６）
前記第二の結合ドメインが標的分子と相互作用し、前記ＣＤ３結合ポリペプチドがＴ細胞細胞傷害性を誘導する、（２５に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
（２７）
前記第二の結合ドメインが腫瘍関連抗原と相互作用する、（２６）に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
（２８）
Ｔ細胞を誘導して腫瘍細胞を溶解させる、（２７）に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
（２９）
腫瘍近傍で多クローン性Ｔ細胞の活性化および拡大を誘導する、（２７）に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
（３０）
前記腫瘍関連抗原が、ＲＯＮ、ｃ−Ｍｅｔ、ＣＥＡＣＡＭ−６、ＰＳＭＡ、ＥｐＣＡＭ、ＣＥＡ、ＰＣＴＡ−１、ＳＴＥＡＰ−１、ＳＴＥＡＰ−２、ＰＳＣＡ、ＰＳＡ、ＰＡＰ、ＡＬＣＡＭ（ＣＤ１６６）、ＰＥＣＡＭ−１、ＥｐｈＡ２、ＣＤ１５１、ＣＡ−１２５／ＭＵＣ１６、ＭＵＣ−１、ＭＡＧＥ−１、ＴＲＯＰ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＴＧＦＢＲ２、ＧＨＲＨＲ、ＧＨＲ、ＩＬ−６Ｒ、ｇｐ１３０、ＴＮＦＲ２、ＯＳＭＲβ、Ｐａｔｃｈｅｄ−１、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ、Ｒｏｂｏ１、ＬＴβＲ、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ６３、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８６、ＣＤ１００、ＣＤ１５１、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ５、ＨＥＲ−２／ＥｒｂＢ１、ＨＥＲ−３／ＥｒｂＢ３、ＨＥＲ−４／ＥｒｂＢ４、ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ１、ＥＧＦＲｖＩＩＩアイソフォーム、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５ｂ、ＭＵＣ７、βｈＣＧ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、ガングリオシドＧＤ３、９−Ｏ−アセチル−ＧＤ３、ＧＭ２、Ｇｌｏｂｏ  Ｈ、フコシルＧＭ１、ポリＳＡ、ＧＤ２、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＭＮ／ＣＡ  ＩＸ）、ソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）、Ｗｕｅ−１、形質細胞抗原、（膜結合）ＩｇＥ、黒色腫コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、ＣＣＲ８、ＴＮＦ−α前駆体、メソテリン、Ａ３３抗原、Ｌｙ−６；デスモグレイン４、Ｅ−カドヘリンネオエピトープ、胎児アセチルコリン受容体、ＣＡ１９−９マーカー、ミュラー管抑制物質（ＭＩＳ）受容体ＩＩ型、ｓＴｎ（シアル化Ｔｎ抗原；ＴＡＧ−７２）、ＦＡＰ（線維芽細胞活性化抗原）、エンドシアリン、ＬＧ、ＳＡＳ、ＢＣＭＡ、ＴＷＥＡＫＲ／Ｆｎ１４、ＦＧＦＲ４、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＳＳＸ１およびＳＳＸ２からなる群より選択される、（２７）〜（２９）に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
（３１）
Ｔ細胞上のＴ細胞受容体複合体のＣＤ３εサブユニットと結合または相互作用する、（１）〜（３０）に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
（３２）
Ｔ細胞受容体複合体の内部移行を誘導する、（１）〜（３１）に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
（３３）
前記ＣＤ３結合ドメインが、マウスＣｒｉｓ−７モノクローナル抗体またはＨｕＭ２９１に由来するヒト化ＣＤ３結合ドメインである、（１）〜（３２）に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
（３４）
前記ＣＤ３結合ドメインが、マウスＣｒｉｓ−７抗体またはＨｕＭ２９１の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３とを含む、（３３）に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
（３５）
前記ＣＤ３結合ドメインが、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３８および配列番号４０からなる群より選択されるＶＨ領域配列またはＶＬ領域配列を含む、（１）に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
（３６）
前記ＣＤ３結合ドメインが、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０および配列番号３２からなる群より選択されるＶＨ領域と、配列番号３８および配列番号４０からなる群より選択されるＶＬ領域とを含む、（１）に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
（３７）
前記ＣＤ３結合ドメインが、配列番号２８、配列番号３０および配列番号３２からなる群より選択されるＶＨ領域と、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８および配列番号４０からなる群より選択されるＶＬ領域とを含む、（１）に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
（３８）
前記ＶＨ領域が配列番号２８を含み、前記ＶＬ領域が配列番号３４を含む、（２）に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
（３９）
前記ＶＨ領域が配列番号２８を含み、前記ＶＬ領域が配列番号３８を含む、（２）に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
（４０）
前記ＶＨ領域が配列番号２６を含み、前記ＶＬ領域が配列番号３８を含む、（２）に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
（４１）
前記ＶＨ領域が配列番号２６を含み、前記ＶＬ領域が配列番号３４を含む、（９）および（１４）に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
（４２）
配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８および配列番号２０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、（１）に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
（４３）
前記ＣＤ３結合ドメインが重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３とを含み、前記重鎖ＣＤＲ３が配列番号５１を含む、（１）に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
（４４）
前記重鎖ＣＤＲ１が配列番号４９を含み、前記重鎖ＣＤＲ２が配列番号５０を含み、前記重鎖ＣＤＲ３が配列番号５１を含み、前記軽鎖ＣＤＲ１が配列番号５２を含み、前記軽鎖ＣＤＲ２が配列番号５３を含み、前記軽鎖ＣＤＲ３が配列番号５４を含む、（４３）に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
（４５）
前記定常領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤもしくはその任意の組合せのＣＨ２およびＣＨ３ドメイン；ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭもしくはその任意の組合せの免疫グロブリンＣＨ３ドメイン；またはＩｇＥ、ＩｇＭもしくはその組合せの免疫グロブリンＣＨ３およびＣＨ４ドメインを含む、（１５）に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
（４６）
前記定常領域がＣＨ２とＣＨ３とを含む、（１５）に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
（４７）
前記定常領域が、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとから実質的になる、（１５）に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
（４８）
前記定常領域が、エフェクター機能が低下または消失するよう修飾されている、（４５）〜（４７）に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
（４９）
前記定常領域が、補体と結合しないよう修飾されている、（４５）〜（４７）に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
（５０）
前記定常領域が、Ｆｃγ受容体と結合しないよう修飾されている、（４５）〜（４７）に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
（５１）
前記Ｆｃγ受容体がＣＤ１６、ＣＤ３２およびＣＤ６４からなる群より選択される、（５０）に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
（５２）
前記定常領域が配列番号５５のアミノ酸配列を含む、（１５）に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
（５３）
（１）〜（５２）に記載のポリペプチドのうちのいずれか１つをコードする、核酸。
（５４）
配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２７および配列番号３７からなる群より選択される核酸を含む、単離核酸。
（５５）
（５３）または（５４）に記載の核酸を含む、発現ベクター。
（５６）
（３２）に記載の発現ベクターを含む、組換え宿主細胞。
（５７）
（１）〜（５２）のいずれかに記載のＣＤ３結合ポリペプチドと、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤とを含む、組成物。
（５８）
必要とする患者に治療有効量の（５７）に記載の組成物または（１）〜（５２）に記載のＣＤ３結合ポリペプチドを投与することを含む、癌または自己免疫障害を治療する方法。
（５９）
二量体を形成する、（１）〜（５２）に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
（６０）
前記二量体がホモ二量体またはヘテロ二量体である、（５９）に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
（６１）
ＶＬ領域のＪカッパ（Ｊｋ）領域内に、Ｃｒｉｓ−７  ＶＬ  Ｊｋ領域マウス配列ＬＱＩＴ（配列番号２５２）と比較して少なくとも１つのアミノ酸修飾が存在する、（３）に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
（６２）
前記Ｊｋ領域がアミノ酸配列ＶＥＩＫ（配列番号２５３）を含む、（６１）に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
（６３）
前記第二の結合ドメインが、配列番号２１２のアミノ酸１〜１０７および１２４〜２４３；配列番号２２６のアミノ酸１〜１０７および１２４〜２４３；配列番号２１６のアミノ酸１〜１０７および１２４〜２４３；ならびに配列番号１９６の１〜１１１および１２８〜２５１からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％一致するアミノ酸配列を含む、（２５）に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
（６４）
配列番号５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、１８６、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４または２０６と少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％一致するアミノ酸配列を含む、（１）に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
（６５）
ヘテロ二量体の一部である、（１）に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
（６６）
前記ヘテロ二量体が１対の一本鎖ポリペプチドを含み、前記一本鎖の対が、配列番号２１０と２４７、配列番号２１０と２１８、配列番号２１０と２２０、配列番号２０８と２４９、配列番号２０８と２２２または配列番号２０８と２２４、配列番号２１２と２１８、配列番号２１６と２２２、配列番号２２８と２２６または配列番号２１４と２１８から選択される対と少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％一致するアミノ酸配列を含む、（６５）に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
（６７）
前記ＣＤ３結合ドメインが配列番号４１と約９０％〜約９９％一致する、（１）に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２７】
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【配列表】
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