(57)【要約】【課題】細胞の蛍光標識方法の提供。【解決手段】  蛍光基、又は蛍光基と疎水基との結合体に親水基が結合した基質複合体と、当該基質複合体を触媒する酵素が細胞膜上に固定された細胞とを反応させ、前記酵素の触媒により親水基が除去されて膜親和性を獲得した複合体を、前記細胞の細胞膜上又は細胞膜内に拡散させるとともに細胞内に透過させることを特徴とする細胞の標識方法。【選択図】図２
2018070587.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光基、又は蛍光基と疎水基との結合体に親水基が結合した基質複合体。
【請求項２】
次式I：
【化１３】
2018070587.tif 000016
（式中、Ｒ１１は、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ２−１０アルケニル基、Ｃ２−１０アルキニル基、Ｃ３−１５シクロアルキル基、Ｃ３−１５シクロアルケニル基、Ｃ６−２０アリール基又は５〜１４員ヘテロアリール基を表し、
Ｒ１２は、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ２−１０アルケニル基、Ｃ２−１０アルキニル基、Ｃ３−１５シクロアルキル基、Ｃ３−１５シクロアルケニル基、Ｃ６−２０アリール基又は５〜１４員ヘテロアリール基を表し、
前記Ｒ１１及びＲ１２のうち、一方の基及び環は蛍光基で置換され、他方の基及び環は親水基で置換されており、
Ｒ１３及びＲ１４は、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ２−１０アルケニル基、Ｃ２−１０アルキニル基、Ｃ３−１５シクロアルキル基、Ｃ３−１５シクロアルケニル基、Ｃ６−２０アリール基、５〜１４員ヘテロアリール基、アミノ基、又はＯＲ１０１、ＣＯＲ１０２若しくはＣＯＯＲ１０３（Ｒ１０１、Ｒ１０２及びＲ１０３は、それぞれ独立して水素原子、Ｃ１−６アルキル基又はＣ２−６アルケニル基を表す。）で示される基を表し、
ｎ及びｍは、それぞれ独立して０〜20の整数を表す。）、
次式II:
【化１４】
2018070587.tif 000017
（式中、Ｒ２１は、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ２−１０アルケニル基、Ｃ２−１０アルキニル基、Ｃ３−１５シクロアルキル基、Ｃ３−１５シクロアルケニル基、Ｃ６−２０アリール基又は５〜１４員ヘテロアリール基を表し、
Ｒ２２は、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ２−１０アルケニル基、Ｃ２−１０アルキニル基、Ｃ３−１５シクロアルキル基、Ｃ３−１５シクロアルケニル基、Ｃ６−２０アリール基又は５〜１４員ヘテロアリール基を表し、
前記Ｒ２１及びＲ２２のうち、一方の基及び環は蛍光基で置換され、他方の基及び環は親水基で置換されている。）、
次式III:
【化１５】
2018070587.tif 000018
（式中、Ｒ３１は、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ２−１０アルケニル基、Ｃ２−１０アルキニル基、Ｃ３−１５シクロアルキル基、Ｃ３−１５シクロアルケニル基、Ｃ６−２０アリール基、５〜１４員ヘテロアリール基又はベンジル基を表し、
Ｒ３２は蛍光基を表し、
前記Ｒ３１は親水基で置換されており、
Ｘはヘテロ原子を表す。）、又は
次式IV:
【化１６】
2018070587.tif 000019
（式中、Ｒ４１は１〜１０個の親水基を表し、ｍ１及びｎ１は、それぞれ独立して０〜２２の整数を表し、Ｒ４２及びＲ４３は、それぞれ独立してエーテル、チオエーテル、エステル、チオエステル、アミド、アミン、ウレタン、尿素、チオ尿素又はアミノ酸を介する結合を表し、Ｒ４４は蛍光基を表す。）
で示される、請求項１に記載の基質複合体。
【請求項３】
蛍光基がフルオレセイン系蛍光基、ローダミン系蛍光基、クマリン系蛍光基、ピレン系蛍光基、シアニン系蛍光基、ヘミシアニン系蛍光基及びBODIPY系蛍光基からなる群から選ばれるいずれかの基である、請求項１又は２に記載の基質複合体。
【請求項４】
親水基がリン酸基、β-ガラクトシル基、硫酸基、β-グルコシル基、β-キシロシル基、α-グルクロン酸基及びβ-グルクロン酸基からなる群から選ばれるいずれかの基である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の基質複合体。
【請求項５】
フローサイトメトリーに使用される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の基質複合体。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の基質複合体と、当該基質複合体を触媒する酵素が細胞膜上に固定された細胞とを反応させ、前記酵素の触媒により親水基が除去されて膜親和性を獲得した複合体を、前記細胞の細胞膜上又は細胞膜内に拡散させるとともに細胞内に透過させることを特徴とする細胞の標識方法。
【請求項７】
前記酵素が、細胞表面抗原に対する抗体を介して固定されたものである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
酵素がアルカリホスファターゼである請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法により標識された細胞を検出することを特徴とする、細胞の検出方法。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の基質複合体と、当該複合体を触媒する酵素とを含む、細胞の標識又は検出用キット。
【請求項１１】
細胞表面抗原に対する抗体であって前記酵素を結合する抗体をさらに含む、請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
酵素がアルカリホスファターゼである請求項１０又は１１に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光基と疎水基との結合体に親水基が結合した複合体を用いて細胞を標識する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
フローサイトメトリーは、細胞生物学において、細胞の種類の同定と分離を行うために不可欠の技術である。その原理は、蛍光標識した抗体により、細胞上の注目する抗原タンパク質を標識して、蛍光検出を行うものである。最近、医療の現場で使用するために、各社より小型の装置が発売されはじめた。しかしながら、従来のフローサイトメトリーには感度の面で大きな問題がある。従来法では、1万コピー以上存在するタンパク質のみが検出可能であり（非特許文献４）、この感度では、プロテオームのうち、発現コピー数が上位35％までのタンパク質しか見ることができない（非特許文献５）。検出感度以下のタンパク質にも診断上、有用なものが多数存在するはずであり、フローサイトメトリーの高感度化に対するニーズは高い。
【０００３】
従来のフローサイトメトリーには感度の面で大きな問題がある。従来法では、1万コピー以上存在するタンパク質のみが検出可能であり（非特許文献４）、この感度では、プロテオームのうち、発現コピー数が上位35％までのタンパク質しか見ることができない（非特許文献５）。
高感度化させる方法として、CARD（catalyzed reporter deposition）法が存在する。これは抗体と融合させたペルオキシダーゼ（HRP）の反応を利用して、蛍光分子を細胞に共有結合固定するものである（図１）。これにより、未知のマーカーの存在が示されるなどの成果を上げた（非特許文献３）。しかしながら、CARD法はいくつかの問題がある。まず、蛍光分子が抗原タンパク質の周辺に密集して結合するため濃度消光が起こり、原理的に高感度化の上限が存在する。また、内在性の物質による妨害が起こるため（内在性のタンパク質が含有するチロシン残基がHRPの基質となる。あるいは、内在性のペルオキダーゼと基質が反応することによる蛍光分子の非特異的な吸着が起こりやすい。）、染色条件の丁寧な最適化が必要である（非特許文献４）。さらに毒性のある過酸化水素を基質とするため、細胞へのダメージがあり、ソーティングの後、細胞の培養が困難である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】David Kaplan and Dawn Smith, Cytometry 40, 81-85 (2000).
【非特許文献２】David Kaplan, Howard Meyerson, and Kristine Lewandowska, Am. J. Clin. Pathol., 116, 429-436 (2001).
【非特許文献３】David Kaplan, Dawn Smith, Howard Meyerson, Nicole Pecora, and Kristine Lewandowska, PNAS, 98, 13850-13853 (2001).
【非特許文献４】Matthew R. Clutter, Garrett C. Heffner, Peter O. Krutzik, Kacey L. Sachen, Garry P. Nolan, Cytometry A, 77A, 1020-1031 (2010).
【非特許文献５】Beck M, Schmidt A, Malmstroem J, Claassen M, Ori A, Szymborska A, Herzog F, Rinner O, Ellenberg J, Aebersold R., Mol. System. Bio. 2011, 7, 549
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、高感度に細胞を標識する方法を提供することを目的とする。
【０００６】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、蛍光基と疎水基との結合体にさらに親水基を結合させた含む複合体と、当該複合体を触媒する酵素が細胞膜表面に固定された細胞とを反応させることにより細胞を標識し得ることに成功し、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）蛍光基、又は蛍光基と疎水基との結合体に親水基が結合した基質複合体。
（２）次式I：
【化１】
2018070587.tif 000003
（式中、Ｒ１１は、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ２−１０アルケニル基、Ｃ２−１０アルキニル基、Ｃ３−１５シクロアルキル基、Ｃ３−１５シクロアルケニル基、Ｃ６−２０アリール基又は５〜１４員ヘテロアリール基を表し、
Ｒ１２は、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ２−１０アルケニル基、Ｃ２−１０アルキニル基、Ｃ３−１５シクロアルキル基、Ｃ３−１５シクロアルケニル基、Ｃ６−２０アリール基又は５〜１４員ヘテロアリール基を表し、
前記Ｒ１１及びＲ１２のうち、一方の基及び環は蛍光基で置換され、他方の基及び環は親水基で置換されており、
Ｒ１３及びＲ１４は、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ２−１０アルケニル基、Ｃ２−１０アルキニル基、Ｃ３−１５シクロアルキル基、Ｃ３−１５シクロアルケニル基、Ｃ６−２０アリール基、５〜１４員ヘテロアリール基、アミノ基、又はＯＲ１０１、ＣＯＲ１０２若しくはＣＯＯＲ１０３（Ｒ１０１、Ｒ１０２及びＲ１０３は、それぞれ独立して水素原子、Ｃ１−６アルキル基又はＣ２−６アルケニル基を表す。）で示される基を表し、
ｎ及びｍは、それぞれ独立して０〜20の整数を表す。）、
次式II:
【化２】
2018070587.tif 000004
（式中、Ｒ２１は、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ２−１０アルケニル基、Ｃ２−１０アルキニル基、Ｃ３−１５シクロアルキル基、Ｃ３−１５シクロアルケニル基、Ｃ６−２０アリール基又は５〜１４員ヘテロアリール基を表し、
Ｒ２２は、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ２−１０アルケニル基、Ｃ２−１０アルキニル基、Ｃ３−１５シクロアルキル基、Ｃ３−１５シクロアルケニル基、Ｃ６−２０アリール基又は５〜１４員ヘテロアリール基を表し、
前記Ｒ２１及びＲ２２のうち、一方の基及び環は蛍光基で置換され、他方の基及び環は親水基で置換されている。）、
次式III:
【化３】
2018070587.tif 000005
（式中、Ｒ３１は、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ２−１０アルケニル基、Ｃ２−１０アルキニル基、Ｃ３−１５シクロアルキル基、Ｃ３−１５シクロアルケニル基、Ｃ６−２０アリール基、５〜１４員ヘテロアリール基又はベンジル基を表し、
Ｒ３２は蛍光基を表し、
前記Ｒ３１は親水基で置換されており、
Ｘはヘテロ原子を表す。）、又は
次式IV：
【化４】
2018070587.tif 000006
（式中、Ｒ４１は１〜１０個の親水基を表し、ｍ１及びｎ１は、それぞれ独立して０〜２２の整数を表し、Ｒ４２及びＲ４３は、それぞれ独立してエーテル、チオエーテル、エステル、チオエステル、アミド、アミン、ウレタン、尿素、チオ尿素又はアミノ酸を介する結合を表し、Ｒ４４は蛍光基を表す。）
で示される、（１）に記載の基質複合体。
【０００８】
（３）蛍光基がフルオレセイン系蛍光基、ローダミン系蛍光基、クマリン系蛍光基、ピレン系蛍光基、シアニン系蛍光基、ヘミシアニン系蛍光基及びBODIPY系蛍光基からなる群から選ばれるいずれかの基である、（１）又は（２）に記載の基質複合体。
（４）親水基がリン酸基、β-ガラクトシル基、硫酸基、β-グルコシル基、β-キシロシル基、α-グルクロン酸基及びβ-グルクロン酸基からなる群から選ばれるいずれかの基である、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の基質複合体。
（５）フローサイトメトリーに使用される、（１）〜（４）のいずれか１項に記載の基質複合体。
（６）前記（１）〜（５）のいずれか１項に記載の基質複合体と、当該基質複合体を触媒する酵素が細胞膜上に固定された細胞とを反応させ、前記酵素の触媒により親水基が除去されて膜親和性を獲得した複合体を、前記細胞の細胞膜上又は細胞膜内に拡散させるとともに細胞内に透過させることを特徴とする細胞の標識方法。
（７）前記酵素が、細胞表面抗原に対する抗体を介して固定されたものである、（６）に記載の方法。
【０００９】
（８）酵素がアルカリホスファターゼである（６）又は（７）に記載の方法。
（９）前記（６）〜（８）のいずれか１項に記載の方法により標識された細胞を検出することを特徴とする、細胞の検出方法。
（１０）前記（１）〜（５）のいずれか１項に記載の基質複合体と、当該複合体を触媒する酵素とを含む、細胞の標識又は検出用キット。
（１１）細胞表面抗原に対する抗体であって前記酵素を結合する抗体をさらに含む、（１０）に記載のキット。
（１２）酵素がアルカリホスファターゼである（１０）又は（１１）に記載のキット。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、細胞の標識方法及び検出方法が提供される。本発明は、CARD法と異なり、抗原タンパク質に蛍光分子が密集せず、細胞内膜に広く分布するため、濃度消光が起こらない。また、過酸化水素が不要であるため、細胞へのダメージがない。アルカリフォスファターゼによる増感を用いた細胞表面のEGFRの検出に成功した。蛍光標識した抗EGFR抗体を用いる従来法に対して、本発明による検出ではおよそ100倍の蛍光増感が達成できた。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】CARD（catalyzed reporter deposition）法による細胞の蛍光標識の原理を示す図である。
【図２】本発明による細胞の蛍光標識の原理を示す図である。
【図３】膜アンカー基質の炭素鎖の長さによる標識感度を検討した結果を示す図である。
【図４】膜アンカー基質の細胞内局在を示す図である。
【図５】精製酵素CIAPによる膜アンカー基質の脱リン酸化を示す図である。
【図６】膜アンカー基質を用いてEGFRを検出した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、蛍光基、疎水基及び親水基を含む基質複合体と、当該基質複合体を触媒する酵素が細胞膜上に固定された細胞とを反応させ、前記酵素の触媒により親水基が除去されて膜親和性を獲得した複合体を、前記細胞の細胞膜上又は細胞膜内に拡散させるとともに細胞内に透過させることを特徴とする細胞の標識方法に関する。また、本発明は、前記標識方法により標識された細胞を検出することを特徴とする細胞の検出方法に関する。
まず、従来の方法である前記CARD法の原理を図１に示す。
従来のCARD法では、チラミド化した低分子（色素）をペルオキシダーゼ（図１、HRP）によってラジカル化させ、これを近傍の膜タンパク質に付着させる。しかし、この方法では、局所濃度上昇による濃度消光、膜タンパク質への色素の過剰な吸着による変性などが起こる。
【００１３】
１．概要
本発明では、上記の課題を克服するための新しい増感法を提供するものである。すなわち、濃度消光を回避することにより、従来の100倍の高感度で細胞標識及び検出を実現でき、かつダメージフリーの方法である。これは、例えば、ELISAなどの生化学分析でHRPに並びよく用いられる二つの酵素（アルカリフォスファターゼ、およびβ-ガラクトシダーゼ）および哺乳類細胞表面には存在しない酵素（スルファターゼ、β-グルコシダーゼ、β-キシロシダーゼ）等によって、増感反応を行うものである。
【００１４】
図２に示す通り、本発明において使用される基質複合体は、蛍光基、疎水基、親水基（例えばリン酸基、β-ガラクトシル基、硫酸基、β-グルコシル基、β-キシローシル基、α-グルクロン酸基又はβ-グルクロン酸基）の三成分、又は蛍光基と親水基との二成分から構成される。
アルカリフォスファターゼ、β-ガラクトシダーゼなどの酵素は、抗体を介して細胞表面に提示されている（細胞表面抗原に対する抗体を介して固定されている）。この酵素によって基質複合体中の親水基が除去されて疎水化し、膜親和性を獲得する。この複合体が細胞膜に結合・膜透過することにより、標的細胞が選択的に染色される。本発明の基質複合体を用いると、抗原タンパク質に蛍光分子が密集せず、細胞内膜に広く分布するため、濃度消光が起こらない。また、過酸化水素が不要であるため、細胞へのダメージがない。
【００１５】
２．基質複合体
本発明においては、上記基質複合体は、蛍光基に親水基が結合したもの、又は蛍光基と疎水基との結合体（蛍光基-疎水基）に親水基が結合したものである。ここで、疎水基は無くてもよく、1つ以上の疎水基が複数連結したものであってもよい。また、親水基の数は１以上である。
したがって、そのような基質複合体は下記式(1)又は(2)により表すことができる。
「蛍光基-（疎水基）ｊ１-（親水基）ｋ１」  (1)
「（親水基）ｋ２-蛍光基-（疎水基）ｊ２」  (2)
式(1)において、ｊ１は０又は１以上の整数を表し、ｋ１は１以上の整数を表す。
式(2)において、ｊ２は０又は１以上の整数を表し、ｋ２は１以上の整数を表す。
ｋ１及びｊ１、並びにｋ２及びｊ２は、例えばともに１である。
【００１６】
式(1)は、蛍光基と疎水基との結合体に親水基が結合した複合体（ｊ１が１以上）、及び蛍光基に親水基が結合した複合体（ｊ１が０）を表しており、式(2)は、蛍光基と疎水基との結合体に親水基が結合した複合体（ｊ２が１以上）、及び蛍光基に親水基が結合した複合体（ｊ２が０）を表している。
【００１７】
本発明において、基質複合体としては、例えば次式I：
【化５】
2018070587.tif 000007
（式中、Ｒ１１は、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ２−１０アルケニル基、Ｃ２−１０アルキニル基、Ｃ３−１５シクロアルキル基、Ｃ３−１５シクロアルケニル基、Ｃ６−２０アリール基又は５〜１４員ヘテロアリール基を表し、前記基及び環は、親水基で置換されており、
Ｒ１２は、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ２−１０アルケニル基、Ｃ２−１０アルキニル基、Ｃ３−１５シクロアルキル基、Ｃ３−１５シクロアルケニル基、Ｃ６−２０アリール基又は５〜１４員ヘテロアリール基を表し、前記基及び環は、蛍光基で置換されており、
Ｒ１３及びＲ１４は、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ２−１０アルケニル基、Ｃ２−１０アルキニル基、Ｃ３−１５シクロアルキル基、Ｃ３−１５シクロアルケニル基、Ｃ６−２０アリール基、５〜１４員ヘテロアリール基、アミノ基、又はＯＲ１０１、ＣＯＲ１０２若しくはＣＯＯＲ１０３（Ｒ１０１、Ｒ１０２及びＲ１０３は、それぞれ独立して水素原子、Ｃ１−６アルキル基又はＣ２−６アルケニル基を表す。）で示される基を表し、
ｎ及びｍは、それぞれ独立して0〜20の整数を表す。）
で示されるものを挙げることができる。
式Iにおいて、疎水基は、親水基及び蛍光基を除いた部分である。
【００１８】
また、本発明において、基質複合体としては、次式II:
【化６】
2018070587.tif 000008
（式中、Ｒ２１は、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ２−１０アルケニル基、Ｃ２−１０アルキニル基、Ｃ３−１５シクロアルキル基、Ｃ３−１５シクロアルケニル基、Ｃ６−２０アリール基又は５〜１４員ヘテロアリール基を表し、
Ｒ２２は、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ２−１０アルケニル基、Ｃ２−１０アルキニル基、Ｃ３−１５シクロアルキル基、Ｃ３−１５シクロアルケニル基、Ｃ６−２０アリール基又は５〜１４員ヘテロアリール基を表し、
前記Ｒ２１及びＲ２２のうち、一方の基及び環は蛍光基で置換され、他方の基及び環は親水基で置換されている。）で示されるもの、次式III:
【化７】
2018070587.tif 000009
（式中、Ｒ３１は、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ２−１０アルケニル基、Ｃ２−１０アルキニル基、Ｃ３−１５シクロアルキル基、Ｃ３−１５シクロアルケニル基、Ｃ６−２０アリール基、５〜１４員ヘテロアリール基又はベンジル基を表し、
Ｒ３２は蛍光基を表し、
前記Ｒ３１は親水基で置換されており、
Ｘはヘテロ原子を表す。）で示されるもの、又は次式IV：
【化８】
2018070587.tif 000010
（式中、Ｒ４１は１〜１０個の親水基を表し、ｍ１及びｎ１は、それぞれ独立して０〜２２の整数を表し、Ｒ４２及びＲ４３は、それぞれ独立してエーテル、チオエーテル、エステル、チオエステル、アミド、アミン、ウレタン、尿素、チオ尿素又はアミノ酸を介する結合を表し、Ｒ４４は蛍光基を表す。）
で示されるものを挙げることができる。
【００１９】
本明細書において、「Ｃ１−１０アルキル基」、「Ｃ１−６アルキル基」とは、炭素数がそれぞれ１〜１０個、１〜６個の直鎖状又は分枝鎖状の炭化水素基を意味する。このようなアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、1-プロピル基、2-プロピル基、2-メチル-1-プロピル基（i-ブチル基）、2-メチル-2-プロピル基（t-ブチル基）、1-ブチル基、2-ブチル基、1-ペンチル基、ヘキシル基、1-メチルブチル基、2-メチルブチル基、3-メチルブチル基などが挙げられ、好ましくは、メチル基、エチル基、1-プロピル基、2-プロピル基などである。他の炭素数を有するアルキル基の例も、当業者であれば上記と同様に理解することができる。また、下記の他の置換基についても同様に理解することができる。
【００２０】
「Ｃ２−１０アルケニル基」、「Ｃ２−６アルケニル基」とは、炭素数がそれぞれ２〜１０個、２〜６個の直鎖状又は分枝鎖状の炭化水素基を意味し、二重結合を１個有する。このようなアルケニル基としては、例えばエテニル基（ビニル基）、1-プロペニル基、2-プロペニル基（アリル基）、1-ブテニル基、2-ブテニル基、3-ブテニル基、ペンテニル基などが挙げられる。
「Ｃ２−１０アルキニル基」とは、炭素数が２〜10個の直鎖状又は分枝鎖状の炭化水素基を意味し、三重結合を１個有する。このようなアルキニル基としては、例えばエチニル基、1-プロピニル基、2-プロピニル基、1-ブチニル基、2-ブチニル基、3-ブチニル基、ペンチニル基などが挙げられる。
「Ｃ３−１５シクロアルキル基」とは、炭素数が３〜１５個の環状のアルキル基を意味し、例えばシクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロプロピル基、シクロブチル基等が挙げられる。
「Ｃ３−１５シクロアルケニル基」とは、炭素数が３〜１５個の環状のアルケニル基を意味し、二重結合を１個有する。例えばシクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキシニル等が挙げられる。
【００２１】
「Ｃ６−２０アリール基」とは、炭素数が６〜２０個の芳香族炭化水素基を意味し、例えばフェニル基、1-ナフチル基、2-ナフチル基、インデニル基などが挙げられ、好ましくはフェニル基である。
「５〜１４員ヘテロアリール基」とは、環を構成する原子数が５〜１４個であり、その原子中に１〜５個のヘテロ原子（窒素原子、酸素原子又は硫黄原子）を含有する芳香族基を意味する。このようなヘテロアリール基としては、例えばフリル基、チエニル基、ピロリル基、イミダゾリル基、トリアゾリル基、テトラゾリル基、チアゾリル基、ピラゾリル基、オキサゾリル基、イソオキサゾリル基、イソチアゾリル基、フラザニル基、チアジアゾリル基、オキサジアゾリル基、ピリジル基、ピラジニル基、ピリダジニル基、ピリミジニル基などが挙げられる。
「ヘテロ原子」とは、水素原子及び炭素原子以外の原子を意味するが、本発明においては例えば窒素原子、酸素原子、硫黄原子などが挙げられる。
【００２２】
本発明において、蛍光基としては、フルオレセイン系蛍光基、ローダミン系蛍光基、クマリン系蛍光基、ピレン系蛍光基及びシアニン系蛍光基からなる群から選ばれるいずれかの基が挙げられる。
【００２３】
蛍光基を例示すると以下の通りである。
フルオレセイン系：フルオレセイン、トーキョーグリーン、カルセイングリーン
【００２４】
ローダミン系蛍光基：ローダミン123、テトラメチルローダミン、ローダミンB、テキサスレッド、Alexa488
【００２５】
クマリン系蛍光基：パシフィックブルー、カルセインブルー
【００２６】
ピレン系蛍光基：ピレン
【００２７】
シアニン系蛍光基：Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7、インドシアニングリーン
【００２８】
ヘミシアニン系蛍光基：Qy:0.57
【００２９】
BODIPY系蛍光基：BODIPY FL、BODIPY R6G、BODIPY TMR、BODIPY 581/591、BODIPY TR、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665
【００３０】
その他の蛍光基：ニトロベンゾオキサジアゾール、アニリノナフタレンスルホン酸、パシフィックオレンジ、ブロモビメン、アクリジンオレンジ
【００３１】
また、本発明において使用される親水基としては、リン酸基、β-ガラクトシル基、硫酸基、β-グルコシル基、およびβ-キシロシル基、α-グルクロン酸基及びβ-グルクロン酸基からなる群から選ばれるいずれかの基が挙げられる。これらの親水基は、疎水基とのバランスを考慮して、単独、二量体、三量体、又はそれ以上とすることもできる。親疎水のバランスをとるためには、親水基があるときには細胞膜に結合せず、親水基を脱離させたときには細胞膜に結合するようにすればよく、特に限定されるものではない。本発明において、親水基の数は１以上であり、例えば１〜１０個である。
【００３２】
本発明において、式IIで示される化合物は蛍光基と親水基との結合体であり、疎水基は含まれない。親疎水のバランスが保たれる限り、疎水基を導入する必要はない。
疎水基を含まない基質化合物の構造は以下の通りである。この化合物は、疎水性の高い蛍光基に親水基を修飾したものである。
【化９】
2018070587.tif 000011
【００３３】
上記式IIにおいて、Ｒ２１は、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ２−１０アルケニル基、Ｃ２−１０アルキニル基、Ｃ３−１５シクロアルキル基、Ｃ３−１５シクロアルケニル基、Ｃ６−２０アリール基又は５〜１４員ヘテロアリール基を表す。また、Ｒ２２は、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ２−１０アルケニル基、Ｃ２−１０アルキニル基、Ｃ３−１５シクロアルキル基、Ｃ３−１５シクロアルケニル基、Ｃ６−２０アリール基又は５〜１４員ヘテロアリール基を表す。
前記Ｒ２１及びＲ２２のうち、一方の基及び環は蛍光基で置換され、他方の基及び環は親水基で置換されている。
また、式IIIで示される基質化合物としては、例えば以下の構造のものが挙げられる。
【００３４】
【化１０】
2018070587.tif 000012
【００３５】
β-ガラクトシルを二量体とすることで、親水−疎水のバランスを制御することができる。この化合物の場合は、蛍光とベンジル基が疎水基として働く。
式IVで示される化合物としては、例えば下記式で示されるものが挙げられる。
【化１１】
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この化合物も、β-ガラクトシルを二量体とすることで、親水−疎水のバランスを制御することができる。この化合物の場合は、蛍光とフェノキシ基が疎水基として働く。
【００３６】
本発明の複合体は、通常の固相合成法、液相合成法等により合成することができる。
【００３７】
３．細胞の標識方法及び検出方法
本発明の複合体を用いた細胞標識方法及び検出方法は、以下の手順で実施することができる。
細胞表面タンパク質又は抗原に対する抗体に、アビジン等を介して前記酵素を結合させる。この酵素-抗体複合体を細胞表面上の膜タンパク質又は抗原に結合させる。但し、最初に抗体を細胞と結合させた後に、抗体と酵素とを結合させることもできる。
【００３８】
次に、本発明の基質複合体を前記酵素-抗体複合体と反応させる。酵素により親水部が切断されると、複合体の疎水基が表れて膜親和性を獲得する。膜親和性を獲得した複合体は、膜上を自由に拡散することができ、また膜を透過することが可能となる。複合体には蛍光基が結合しているので、これにより、細胞表面又は細胞内が標識される。
このようにして標識された細胞を、適当な手法により検出することができる。
検出方法は、特に限定されるものではなく、目視による検出、蛍光顕微鏡による検出、フローサイトメトリーによる検出、イメージングサイトメーターによる検出などが挙げられるが、フローサイトメトリーおよびイメージングサイトメーターによる検出であることが好ましい。
【００３９】
４．キット
本発明は、前記基質複合体と、当該複合体を触媒する酵素とを含む、細胞の標識用又は検出用キットを提供する。
本発明のキットには、上記複合体及び酵素のほか、適宜、付属試薬を含めることができる、付属試薬としては、例えば、フローサイトメトリー用に細胞を標識する場合は、反応バッファー、ブロッキングバッファー等の試薬を含めることができる。但し、上記細胞や試薬は例示であり、これらの細胞及び試薬に限定されるものではない。
【００４０】
実施例
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の範囲はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例１】
【００４１】
膜アンカー基質の合成・精製
Fmoc固相合成法にて、基質の合成を行った。(n, m) = (12, 11), (6, 11)について基質（下記式の左）およびその脱リン酸化分子（下記式の右）を合成した。(n, m) = (12, 11)の基質を1、(n, m) = (6, 11)の基質を２とする。合成スケールは0.025 mmolとした。高速液体クロマトグラフィーで精製した。精製物を凍結乾燥し、メタノールに溶かしてストック溶液とした。ストック濃度は蛍光基の吸収から算出した。
【化１２】
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【００４２】
膜アンカー基質を用いた細胞染色
2.0×105個の白血病細胞株 (K562細胞) を96ウェルプレート又は1.5 mLのプラスチックチューブに入れた。遠心後上澄みを除去し、その後HEPES/mannitol溶液で2回洗浄し、50 μLのHEPES/mannitol溶液に再懸濁した。ここに、事前に膜アンカー基質10 μM, m-β-CD（マウスβシクロデキストリン）10 mMの組成で30分間平衡化した基質溶液50μLを加え、37 oCで5分-60分間静置した。
【００４３】
修飾反応後、10% FBS含有培地で2回洗浄を行い未反応の基質分子を除去した。細胞を適量の培地に再懸濁して、蛍光顕微鏡観察とイメージングサイトメトリーによる蛍光強度定量を行った。
基質1と基質2について最適化を行った。基質の脱リン酸化体を用いて細胞染色した結果を図３に示した。蛍光顕微鏡画像から、基質1の方が良く細胞を染色していることが分かる。蛍光強度を反応時間ごとに示したグラフからも、基質1が細胞を良く染色し、基質2は60分後にもほとんど細胞を染色していないことが分かる。この結果から、本基質分子は炭素鎖長が長いほど細胞を良く染色すると言える。一方、炭素鎖が長すぎると非特異的な結合が考えられるため炭素鎖はこれ以上伸ばさずに、基質1を膜アンカー基質として選択した。
【００４４】
また、Hoechst 33343による核染色と合わせることで、この基質が細胞質をほぼ均一に染色していることが分かる (図４) 。これは蛍光基が疎水性かつ正電荷を帯びていることで基質が膜透過したためだと考えられ、本基質分子は膜透過によって脱離が抑制されると期待できる。これによって、細胞染色の半減期が劇的に伸びる上に、基質が脱離して別の細胞に移ることによる色移りを抑制できると考えられる。
【００４５】
精製酵素CIAPによる膜アンカー基質の脱リン酸化
合成した基質分子がアルカリホスファターゼ (CIAP) による脱リン酸化反応を受けることを確認するために、MALDI-TOF-MSによって分子の脱リン酸化を評価した。酵素には精製酵素CIAP (タカラバイオ) を用いた。表１の組成で酵素-基質反応溶液を作製し、37 oCで5分間酵素反応を行った。酵素反応による脱リン酸化反応をMALDI-TOF-MSで評価した。
【表１】
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【００４６】
3 U (1 U : 1 μmolのp-NPPを1分間で脱リン酸化する(pH 9.5, 37 oC)) の精製酵素CIAPと5 μMの膜アンカー基質を混合し、37 oCで5分間酵素反応を行った。酵素反応による脱リン酸化反応をMALDI-TOF-MSで評価した結果を図５に示した。5分間の酵素反応によって膜アンカー基質がほぼ完全に脱リン酸化されている。膜アンカー基質はアルカリホスファターゼの基質として作用すると言える。
【００４７】
蛍光修飾抗体・ビオチン化抗体・ビオチン化CIAPの作製
抗ヒトEGFR抗体 (セツキシマブ製剤 (アービタクス)) にローダミンを修飾した。MWCO : 3 kDaの限外ろ過膜上に200μgのセツキシマブ製剤を添加した。DPBSで2度洗浄し、10 mM PB (pH 8.5) 100μL中に溶かした。1 mg/mLのNHS-ローダミン (Thermo) in DMSO溶液を準備し、セツキシマブに対して蛍光基が3等量、7等量となる条件で限外ろ過膜上に加えた。20 oC、8000G、10分で限外ろ過を繰り返した。ろ液の吸収を測定し、ローダミン由来の吸収が計測されなくなった時に精製完了とした。
抗ヒトEGFR抗体とCIAPにビオチンを修飾した。
【００４８】
膜アンカー基質による膜タンパク質検出
本検出システムの原理実証を試みた。0.35 wt%リドカインで剥離した4.0×105個のA549細胞に対して、セツキシマブ-SA複合体を添加し、4℃で30分放置した後、洗浄し、次いでビオチン化CIAPを加え (終濃度20μg/mL) 、細胞表面にCIAPを結合させた。洗浄した後、10 mMのレバミゾールを加えて、4℃で放置した。その後、5 μMの基質を加え、37 oCで30分間反応した。10% FBS含有培地で未反応の基質を洗浄し、蛍光顕微鏡および蛍光サイトメトリーで評価した。
【００４９】
一方、従来の染色法として、以下の操作を行った。ビオチン化セツキシマブとDylight 650標識ストレプトアビジン (SA) (Thermo) をモル比 1 : 3で混合し、15分間放置して、複合体を形成させた。これを終濃度5μg/mLで2.0×105個のA549細胞に添加し、4 oCで30分間放置した。未結合の複合体を洗浄・除去した後、蛍光顕微鏡および蛍光サイトメトリーで評価した。
その結果、従来法に対して、本発明で染色した場合には、細胞内部まで均一な染色が起こっていた。また、蛍光強度は、従来法の100倍以上であった。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明により、細胞標識方法が提供される。本発明の方法により、フローサイトメトリーによる細胞標識を高感度で行うことができ、本発明の方法及び複合体は、それぞれ細胞標識方法及び細胞標識用試薬として有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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