(57)【要約】      （修正有）【課題】標的遺伝子の発現を阻害するための、１２〜４９ヌクレオチドの長さの二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）コンストラクトの提供。【解決手段】（１）５’−及び３’−末端のそれぞれにおける１又は２以上のヌクレオチドが、２’−修飾リボース糖を有するセンス鎖、及び（２）５’−末端から２番目のヌクレオチドにおいて、２’−修飾リボース糖を含む、センス鎖及び標的遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズするアンチセンス鎖を含み、ここで、（ａ）ｄｓＲＮＡがダイサーによる切断に抵抗性であり、（ｂ）アンチセンス鎖がＲＩＳＣと会合し、及び（ｃ）ｄｓＲＮＡが、配列依存的な様式で標的遺伝子の発現を阻害する、二本鎖ＲＮＡコンストラクト。【選択図】図９Ａ−９Ｂ
2018007663.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的遺伝子の発現を阻害するための、１２〜４９ヌクレオチドの長さの二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）コンストラクトであって、該ｄｓＲＮＡが、
（１）５’−末端および３’−末端を有するセンス鎖、ここで該センス鎖の前記５’−および３’−末端のそれぞれにおける１または２以上のヌクレオチドが、２’−修飾リボース糖を有する、および
（２）前記センス鎖および前記標的遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズする、５’−末端および３’−末端を有するアンチセンス鎖、ここで該アンチセンス鎖が、該アンチセンス鎖の５’−末端から２番目のヌクレオチドにおいて、２’−修飾リボース糖を含む、
を含み、ここで、（ａ）前記ｄｓＲＮＡがダイサーによる切断に抵抗性であり、（ｂ）前記アンチセンス鎖がＲＩＳＣと会合し、および（ｃ）ｄｓＲＮＡが、配列依存的な様式で標的遺伝子の発現を阻害する、前記二本鎖ＲＮＡコンストラクト。
【請求項２】
標的遺伝子の発現を阻害するための、１２〜４９ヌクレオチドの長さの二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）コンストラクトであって、該ｄｓＲＮＡが、
（１）５’−末端および３’−末端を有するセンス鎖、ここで該センス鎖の前記５’−および３’−末端のそれぞれにおける１または２以上のヌクレオチドが、２’−修飾リボース糖を有する、および
（２）前記センス鎖および前記標的遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズする、５’−末端および３’−末端を有するアンチセンス鎖、ここで該アンチセンス鎖が、該アンチセンス鎖の３’−末端において、
（ｉ）非加水分解性のヌクレオチド間結合を有する少なくとも４つの連続した２’−修飾リボース糖
（ｉｉ）１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２個の２’−修飾リボース糖、好ましくは２’−Ｏ−メチル修飾リボース糖、または
（ｉｉｉ）保護基
を含む、
を含み、ここで、（ａ）前記ｄｓＲＮＡがダイサーによる切断に抵抗性であり、（ｂ）前記アンチセンス鎖がＲＩＳＣと会合し、および（ｃ）ｄｓＲＮＡが、配列依存的な様式で標的遺伝子の発現を阻害する、前記二本鎖ＲＮＡコンストラクト。
【請求項３】
標的遺伝子の発現を阻害するための、１２〜４９ヌクレオチドの長さの二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）コンストラクトであって、該ｄｓＲＮＡが、
（１）５’−末端および３’−末端を有するセンス鎖、ここで該センス鎖の前記５’−および３’−末端のそれぞれにおける１または２以上のヌクレオチドが、２’−修飾リボース糖を有し、該センス鎖が、該センス鎖の３’−末端から２番目のヌクレオチドにおいてミスマッチヌクレオチドを含む、および
（２）前記センス鎖および前記標的遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズする、５’−末端および３’−末端を有するアンチセンス鎖、
を含み、ここで、（ａ）前記ｄｓＲＮＡがダイサーによる切断に抵抗性であり、（ｂ）前記アンチセンス鎖がＲＩＳＣと会合し、および（ｃ）ｄｓＲＮＡが、配列依存的な様式で標的遺伝子の発現を阻害する、前記二本鎖ＲＮＡコンストラクト。
【請求項４】
標的遺伝子の発現を阻害するための、１２〜４９ヌクレオチドの長さの二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）コンストラクトであって、該ｄｓＲＮＡが、
（１）５’−末端および３’−末端を有するセンス鎖、ここで、該センス鎖の前記５’−および３’−末端のそれぞれに４つの連続した２’−Ｏ−メチルヌクレオチドが存在し、
（２）前記センス鎖および前記標的遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズする、５’−末端および３’−末端を有するアンチセンス鎖、ここで該アンチセンス鎖が、
（ａ）ホスホチオエート結合を有する４つの連続した２’−Ｏ−メチル修飾３’−末端ヌクレオチドを含む、または
（ｂ）５’−末端から２番目のヌクレオチドに２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含み、他の修飾ヌクレオチドを含まない、
を含み、ここで、（ａ）前記ｄｓＲＮＡがダイサーによる切断に抵抗性であり、（ｂ）前記アンチセンス鎖がＲＩＳＣと会合し、および（ｃ）ｄｓＲＮＡが、配列依存的な様式で標的遺伝子の発現を阻害する、前記二本鎖ＲＮＡコンストラクト。
【請求項５】
標的遺伝子の発現を阻害するための、１２〜４９ヌクレオチドの長さの二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）コンストラクトであって、該ｄｓＲＮＡが、
（１）５’−末端および３’−末端を有するセンス鎖、ここで、１２および１０の連続した２’−Ｏ−メチルヌクレオチドをそれぞれ５’−末端および３’−末端に含む、および、
（２）前記センス鎖および前記標的遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズする、５’−末端および３’−末端を有するアンチセンス鎖、ここで該アンチセンス鎖が、
（ａ）非修飾である、
（ｂ）ホスホチオエート結合を有する４つの連続した２’−Ｏ−メチル修飾３’−末端ヌクレオチドを含む、または
（ｃ）５’−末端から２番目のヌクレオチドに２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含み、他の修飾ヌクレオチドを含まない、
を含み、ここで、（ａ）前記ｄｓＲＮＡがダイサーによる切断に抵抗性であり、（ｂ）前記アンチセンス鎖がＲＩＳＣと会合し、および（ｃ）ｄｓＲＮＡが、配列依存的な様式で標的遺伝子の発現を阻害する、前記二本鎖ＲＮＡコンストラクト。
【請求項６】
アンチセンス鎖が、アンチセンス鎖の５’−末端から１０番目および１１番目のヌクレオチドの間の単一部位における、標的遺伝子のｍＲＮＡの一様な切断を導く、請求項１〜５のいずれか一項に記載のｄｓＤＮＡ。
【請求項７】
ｄｓＲＮＡのセンス鎖が、該センス鎖の３’−末端から１０番目および１１番目のヌクレオチドの間の単一部位において、ＲＩＳＣによって切断可能である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のｄｓＤＮＡ。
【請求項８】
ｄｓＲＮＡコンストラクトが、平滑末端である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のｄｓＤＮＡ。
【請求項９】
センス鎖の５’−末端の１２ヌクレオチドおよび３’−末端の１０ヌクレオチドが２’−修飾リボース糖である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のｄｓＤＮＡ。
【請求項１０】
センス鎖の各末端が、一続きの２’−修飾リボース糖を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のｄｓＤＮＡ。
【請求項１１】
センス鎖の各末端が、４つ一続きの２’−修飾リボース糖を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のｄｓＤＮＡ。
【請求項１２】
アンチセンス鎖が、非連続的な２’−修飾リボース糖を含み、１０番目および１１番目のアンチセンスヌクレオチドが修飾されていない、請求項１〜３のいずれか一項に記載のｄｓＤＮＡ。
【請求項１３】
アンチセンス鎖が、２’−修飾リボース糖を、２、３、４、５、６、７、８または９ヌクレオチドごとに含む、請求項１２に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項１４】
アンチセンス鎖の最も５’−末端側の２’−修飾リボース糖が、２番目のヌクレオチドである、請求項１３に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項１５】
ｄｓＲＮＡコンストラクトが、１２〜３５ヌクレオチドの長さ、２５〜３０ヌクレオチドの長さ、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチドの長さ、２２ヌクレオチドより長い長さ、２５ヌクレオチドより長い長さ、または３１〜４９ヌクレオチドの長さである、請求項１〜５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項１６】
センス鎖の各末端が、独立して、４〜１６個の２’−修飾リボース糖および／または非加水分解性ヌクレオチド間結合を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項１７】
センス鎖の各末端が、対称的なまたは非対称的な数の２’−修飾リボース糖を含む、請求項１６に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項１８】
２’−修飾リボース糖が、２’−Ｏ−アルキルヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−デオキシヌクレオチド、２’−Ｈ−（デオキシリボヌクレオチド）またはそれらの組み合わせである、請求項１６に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項１９】
２’−Ｏ−アルキルヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドである、請求項１８に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項２０】
２’−Ｏ−アルキルヌクレオチドが、２’−Ｏ−アリルヌクレオチドである、請求項１８に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項２１】
アンチセンス鎖が、アンチセンス鎖の５’−末端から２番目のヌクレオチドに２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含み、他の修飾ヌクレオチドを含まない、請求項１および３〜５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項２２】
ｄｓＲＮＡが、２’−修飾を前記の位置に含まない類似のコンストラクトと比較して、増強された標的特異性または減少したオフターゲットサイレンシングを有する、請求項２１に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項２３】
アンチセンス鎖が、ホスホチオエート結合を有する少なくとも４つの連続した２’−Ｏ−メチル修飾３’−末端ヌクレオチドを含む、請求項１および３〜５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項２４】
ｄｓＲＮＡのセンス鎖が、センス鎖の３’−末端から２番目のヌクレオチドにおいて、ミスマッチヌクレオチドを含む、請求項１、４および５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項２５】
ｄｓＲＮＡが、同一の配列を有する非修飾のｄｓＲＮＡと比較して、血清および／または脳脊髄液中での改善された安定性を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項２６】
センス鎖の３’−末端における最後から２〜８番目のヌクレオチドが、それらの対応するアンチセンス鎖ヌクレオチドとミスマッチである、請求項１〜５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項２７】
ｄｓＲＮＡが、初代細胞においてインターフェロン応答を誘導しない、請求項１〜５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項２８】
センス鎖のいずれかの末端および／またはアンチセンス鎖の３’−末端が、保護基によってブロックされている、請求項１〜５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項２９】
保護基が、反転ヌクレオチド、反転脱塩基部分、またはアミノ末端修飾ヌクレオチドである、請求項２８に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項３０】
反転ヌクレオチドが、反転デオキシヌクレオチドを含む、請求項２９に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項３１】
反転脱塩基部分が、反転デオキシ脱塩基部分を含む、請求項２９に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項３２】
反転デオキシ脱塩基部分が、３’，３’−連結または５’，５’−連結デオキシ脱塩基部分である、請求項３１に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項３３】
センスおよび／またはアンチセンス鎖の末端の交互ヌクレオチドが、２’−修飾リボース糖を含み、各２’−修飾リボース糖が、逆鎖上の非修飾のヌクレオチドと向き合う、請求項１または３に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項３４】
最初の２’−修飾アンチセンスヌクレオチドが、最も５’−末端のアンチセンスヌクレオチドであるか、またはアンチセンス鎖の５’−末端から２番目のヌクレオチドである、請求項３３に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項３５】
標的遺伝子が、ＳＯＤ１、ＰＰＩＢ、ＲＩＰ１４０、ＰＣＳＫ９、ＴＮＦα、ＡＰ２（脂肪細胞脂肪酸結合タンパク質）またはＭＡＰ４Ｋ４である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項３６】
２’−修飾リボースヌクレオチドの間のセンス鎖ヌクレオチドが、２’−Ｆ修飾である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項３７】
２’−修飾リボースヌクレオチドの間のセンス鎖ヌクレオチドが、プリンヌクレオチドであり、任意に２’−Ｆ修飾修飾および／またはホスホロチオエート結合を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項３８】
２’−修飾リボースヌクレオチドの間のセンス鎖ヌクレオチドが、１または２以上の、各１〜５ヌクレオチドのバルジを形成する、請求項１〜５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項３９】
各一続きの２’−修飾リボース糖が、末端ヌクレオチド、末端ヌクレオチドから二番目のヌクレオチド、または末端ヌクレオチドから三番目のヌクレオチドから独立して開始される、請求項１０に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項４０】
アンチセンス鎖のピリミジンヌクレオチドの５０〜１００％が、独立して２’−Ｆ修飾または２’−Ｏ−メチル修飾である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項４１】
アンチセンス鎖の５’−末端が、リン酸化されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項４２】
標的遺伝子の発現を阻害するためのＲＮＡコンストラクトであって、該コンストラクトが、センス鎖上の単一ニック以外は請求項１〜４１のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡと同一である、前記ＲＮＡコンストラクト。
【請求項４３】
ニックが、アンチセンス鎖の５’末端から約１０塩基のヌクレオチドの逆位置を占める、請求項４２に記載のＲＮＡコンストラクト。
【請求項４４】
ニックが、アンチセンス鎖の５’末端から約５〜１５塩基のヌクレオチドの逆位置を占める、請求項４２に記載のＲＮＡコンストラクト。
【請求項４５】
各二本鎖領域のΔＧが、約−１３ｋｃａｌ／モル未満である、請求項４２〜４４のいずれか一項に記載のＲＮＡコンストラクト。
【請求項４６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡの少なくとも１本の鎖を発現するベクター。
【請求項４７】
請求項４６に記載のベクターまたは請求項１〜５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡを含む細胞。
【請求項４８】
細胞が、培養哺乳類細胞である、請求項４７に記載の細胞。
【請求項４９】
細胞が、ヒト細胞である、請求項４７に記載の細胞。
【請求項５０】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ、および薬学的に許容可能な担体または希釈剤を含む組成物。
【請求項５１】
哺乳類細胞において標的遺伝子の発現を阻害する方法であって、哺乳類細胞と請求項１〜５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡコンストラクトとを接触させることを含む、前記方法。
【請求項５２】
哺乳類細胞が、培養されている、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
哺乳類細胞が、ヒト細胞である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
哺乳類細胞を、送達試薬の存在下で接触させる、請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
送達試薬が、脂質である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
脂質が、カチオン性脂質である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
送達試薬が、リポソームである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５８】
哺乳類細胞において標的遺伝子の発現を阻害する方法であって、哺乳類細胞と、請求項１〜５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡコンストラクトの鎖の少なくとも１つを発現するベクターとを接触させることを含む、前記方法。
【請求項５９】
短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の遺伝子サイレンシング効果を改善するための方法であって、ｓｉＲＮＡのセンスおよび／またはアンチセンスヌクレオチドを修飾して、請求項１〜５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡコンストラクトとすることを含む、前記方法。
【請求項６０】
ｓｉＲＮＡコンストラクトの標的部位へのin vivo送達を評価する方法であって、ｓｉＲＮＡコンストラクトとともにＰＰＩＢを標的とする請求項１〜５のいずれかに記載のｄｓＲＮＡコンストラクトを共送達し、標的部位におけるＰＰＩＢ機能の阻害をアッセイすることを含み、ここでＰＰＩＢ機能の標的部位における成功裡の阻害が、標的部位へのｓｉＲＮＡコンストラクトのin vivo送達成功の指標となる、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
背景技術
相補的なオリゴヌクレオチド配列は、有望な治療剤であり、遺伝子の機能を解明するのに有用な研究ツールである。しかしながら、従来技術のオリゴヌクレオチド分子は、それらの臨床開発を妨げ得、かかる組成物を用いた遺伝子発現（タンパク質合成を含む）の意図された効果的な阻害の達成を頻繁に難しくさせる幾つかの問題に悩まされる。
【０００２】
例えば、古典的なｓｉＲＮＡは、それらの剤がヒトの治療剤として中程度な有用性しかもたらし得ない制限および欠点を有する。具体的には、古典的なｓｉＲＮＡは二本鎖である。各分子について、二本の鎖が合成されて対にされる必要がある。古典的なｓｉＲＮＡは天然に存在するリボヌクレオチドから作製され、ヌクレアーゼおよび自発的な加水分解に脆弱である。古典的なｓｉＲＮＡ鎖は、一つの鎖の各末端におけるオーバーハングを除き、互いに対となり、およそ１９から２３ヌクレオチド長である。この構成は、化合物の多様性および活性を制限する。例えば、より長いオリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡへのより高い結合活性を有し得、これはしばしばより高い活性と相関する。古典的なｓｉＲＮＡのオーバーハングは不安定さ（なぜならば一本鎖は、大抵の場合、二本鎖よりもヌクレアーゼ抵抗性であるからである）および分解の原因となり、分子が互いにまたは他のヌクレオチドに「付着する」原因となり得る。
【０００３】
加えて、２１ｍｅｒより長い二本鎖ＲＮＡは、哺乳類細胞中のダイサーまたはダイサー様ＲＮＡｓｅＩＩＩによって切断され、その結果古典的なｓｉＲＮＡ産物となると広く信じられている。ダイサー切断産物の一本鎖は次にＲＩＳＣ複合体に取り込まれ、そして取り込まれたＲＩＳＣ複合体はＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）をもたらすように導かれる。しかしながら、ダイサーは配列特異的ではないため、非修飾の長いｄｓＲＮＡのダイサー切断産物は、２１ｍｅｒの不均質な混合物であり、各々が異なる生物学的活性および／または薬理学的性質を有し得る。加えて、各２１ｍｅｒは明確なオフターゲット効果（例として、ダイサー切断産物と標的ｍＲＮＡ間での擬似的な配列相同性に例えば起因して、意図されない標的の機能を阻害すること）を有し得る。言い換えると、活性剤（例として、２１ｍｅｒ）は、比較的予測不可能な標的特異性、生物学的活性および／または薬理学的性質を有する複数の種になり得る。また、ダイサー産物は親鎖よりも短く、低親和性のガイド鎖となる。
【０００４】
その他の問題として含まれるものは、生物システムへ適用されたときの、非特異的なヌクレアーゼ分解に対するｓｉＲＮＡの感受性である。したがって、上記の問題点のないまたは程度が軽減された改良オリゴヌクレオチドを設計することで従来技術のオリゴヌクレオチドを改良することは、非常に有益であろう。
【発明の概要】
【０００５】
本発明の１つの側面は、標的遺伝子の発現を阻害するための、１２〜４９（好ましくは１９〜４９）ヌクレオチドの長さの二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）コンストラクトであって、該ｄｓＲＮＡが、（１）５’−末端および３’−末端を有するセンス鎖、ここで該センス鎖の前記５’−および３’−末端のそれぞれにおける１または２以上のヌクレオチドが、２’−修飾リボース糖を有する、および（２）前記センス鎖および前記標的遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズする、５’−末端および３’−末端を有するアンチセンス鎖、ここで該アンチセンス鎖が、該アンチセンス鎖の５’−末端から２番目のヌクレオチドにおいて、２’−修飾リボース糖を含む、を含み、ここで（ａ）前記ｄｓＲＮＡがダイサーによる切断に抵抗性であり、（ｂ）前記アンチセンス鎖がＲＩＳＣと会合し、および（ｃ）ｄｓＲＮＡが、配列依存的な様式で標的遺伝子の発現を阻害する、前記二本鎖ＲＮＡコンストラクトに関する。
【０００６】
本発明の別の側面は、標的遺伝子の発現を阻害するための、１２〜４９（好ましくは１９〜４９）ヌクレオチドの長さの二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）コンストラクトであって、該ｄｓＲＮＡが、（１）５’−末端および３’−末端を有するセンス鎖、ここで該センス鎖の前記５’−および３’−末端のそれぞれにおける１または２以上のヌクレオチドが、２’−修飾リボース糖を有する、および（２）前記センス鎖および前記標的遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズする、５’−末端および３’−末端を有するアンチセンス鎖、ここで該アンチセンス鎖が、該アンチセンス鎖の３’−末端において、（ｉ）非加水分解性のヌクレオチド間結合を有する少なくとも４つの連続した２’−修飾リボース糖（ｉｉ）１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２個の２’−修飾リボース糖、好ましくは２’−Ｏ−メチル修飾リボース糖、または（ｉｉｉ）保護基を含む、を含み、ここで、（ａ）前記ｄｓＲＮＡがダイサーによる切断に抵抗性であり、（ｂ）前記アンチセンス鎖がＲＩＳＣと会合し、および（ｃ）ｄｓＲＮＡが、配列依存的な様式で標的遺伝子の発現を阻害する、前記二本鎖ＲＮＡコンストラクトを提供する。
【０００７】
本発明の別の側面は、標的遺伝子の発現を阻害するための、１２〜４９（好ましくは１９〜４９）ヌクレオチドの長さの二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）コンストラクトであって、該ｄｓＲＮＡが、（１）５’−末端および３’−末端を有するセンス鎖、ここで該センス鎖の前記５’−および３’−末端のそれぞれにおける１または２以上のヌクレオチドが、２’−修飾リボース糖を有し、該センス鎖が、該センス鎖の３’−末端から２番目のヌクレオチドにおいてミスマッチヌクレオチドを含む、および（２）前記センス鎖および前記標的遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズする、５’−末端および３’−末端を有するアンチセンス鎖、を含み、ここで、（ａ）前記ｄｓＲＮＡがダイサーによる切断に抵抗性であり、（ｂ）前記アンチセンス鎖がＲＩＳＣと会合し、および（ｃ）ｄｓＲＮＡが、配列依存的な様式で標的遺伝子の発現を阻害する、前記二本鎖ＲＮＡコンストラクトを提供する。
【０００８】
本発明の別の側面は、標的遺伝子の発現を阻害するための、１２〜４９（好ましくは１９〜４９）ヌクレオチドの長さの二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）コンストラクトであって、該ｄｓＲＮＡが、（１）５’−末端および３’−末端を有するセンス鎖、ここで、該センス鎖の前記５’−および３’−末端のそれぞれに４つの連続した２’−Ｏ−メチルヌクレオチドが存在し、（２）前記センス鎖および前記標的遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズする、５’−末端および３’−末端を有するアンチセンス鎖、ここで該アンチセンス鎖が、（ａ）ホスホチオエート結合を有する４つの連続した２’−Ｏ−メチル修飾３’−末端ヌクレオチドを含む、または（ｂ）５’−末端から２番目のヌクレオチドに２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含み、他の修飾ヌクレオチドを含まない、を含み、ここで、（ａ）前記ｄｓＲＮＡがダイサーによる切断に抵抗性であり、（ｂ）前記アンチセンス鎖がＲＩＳＣと会合し、および（ｃ）ｄｓＲＮＡが、配列依存的な様式で標的遺伝子の発現を阻害する、前記二本鎖ＲＮＡコンストラクトを提供する。
【０００９】
本発明の別の側面は、標的遺伝子の発現を阻害するための、１２〜４９（好ましくは１９〜４９）ヌクレオチドの長さの二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）コンストラクトであって、該ｄｓＲＮＡが、（１）５’−末端および３’−末端を有するセンス鎖、ここで、１２および１０の連続した２’−Ｏ−メチルヌクレオチドをそれぞれ５’−末端および３’−末端に含む、および、（２）前記センス鎖および前記標的遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズする、５’−末端および３’−末端を有するアンチセンス鎖、ここで該アンチセンス鎖が、（ａ）非修飾である、（ｂ）ホスホチオエート結合を有する４つの連続した２’−Ｏ−メチル修飾３’−末端ヌクレオチドを含む、または（ｃ）５’−末端から２番目のヌクレオチドに２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含み、他の修飾ヌクレオチドを含まない、を含み、ここで、（ａ）前記ｄｓＲＮＡがダイサーによる切断に抵抗性であり、（ｂ）前記アンチセンス鎖がＲＩＳＣと会合し、および（ｃ）ｄｓＲＮＡが、配列依存的な様式で標的遺伝子の発現を阻害する、前記二本鎖ＲＮＡコンストラクトを提供する。
【００１０】
ある態様において、アンチセンス鎖が、アンチセンス鎖の５’−末端から１０番目および１１番目のヌクレオチドの間の単一部位における、標的遺伝子のｍＲＮＡの一様な切断を導く。
ある態様において、ｄｓＲＮＡのセンス鎖が、該センス鎖の３’−末端から１０番目および１１番目のヌクレオチドの間の単一部位において、ＲＩＳＣによって切断可能である。
ある態様において、ｄｓＲＮＡコンストラクトが、平滑末端である。
【００１１】
ある態様において、センス鎖の５’−末端の１２ヌクレオチドおよび３’−末端の１０ヌクレオチドが２’−修飾リボース糖である。
ある態様において、センス鎖の各末端が、一続き(continuous stretch)の２’−修飾リボース糖を含む。
ある態様において、センス鎖の各末端が、４つ一続きの２’−修飾リボース糖を含む。
ある態様において、アンチセンス鎖が、非連続的な２’−修飾リボース糖を含み、１０番目および１１番目のアンチセンスヌクレオチドが修飾されていない。
ある態様において、アンチセンス鎖が、２’−修飾リボース糖を、２、３、４、５、６、７、８または９ヌクレオチドごとに含む。
【００１２】
ある態様において、アンチセンス鎖の最も５’−末端側の２’−修飾リボース糖が、２番目のヌクレオチドである。
ある態様において、ｄｓＲＮＡコンストラクトが、１２〜３５ヌクレオチドの長さ、２５〜３０ヌクレオチドの長さ、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチドの長さ、２２ヌクレオチドより長い長さ、２５ヌクレオチドより長い長さ、または３１〜４９ヌクレオチドの長さである。
ある態様において、センス鎖の各末端が、独立して、４〜１６個の２’−修飾リボース糖および／または非加水分解性ヌクレオチド間結合を含む。
【００１３】
ある態様において、センス鎖の各末端が、対称的なまたは非対称的な数の２’−修飾リボース糖を含む。
ある態様において、２’−修飾リボース糖が、２’−Ｏ−アルキルヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−デオキシヌクレオチド、２’−Ｈ−（デオキシリボヌクレオチド）またはそれらの組み合わせである。
ある態様において、２’−Ｏ−アルキルヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドである。
ある態様において、２’−Ｏ−アルキルヌクレオチドが、２’−Ｏ−アリルヌクレオチドである。
【００１４】
ある態様において、アンチセンス鎖が、アンチセンス鎖の５’−末端から２番目のヌクレオチドに２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含み、他の修飾ヌクレオチドを含まない。
ある態様において、ｄｓＲＮＡが、２’−修飾を前記の位置に含まない類似のコンストラクトと比較して、増強された標的特異性または減少したオフターゲットサイレンシングを有する。
ある態様において、アンチセンス鎖が、ホスホチオエート結合を有する少なくとも４つの連続した２’−Ｏ−メチル修飾３’−末端ヌクレオチドを含む。
ある態様において、ｄｓＲＮＡのセンス鎖が、センス鎖の３’−末端から２番目のヌクレオチドにおいて、ミスマッチヌクレオチドを含む。
【００１５】
ある態様において、ｄｓＲＮＡが、同一の配列を有する非修飾のｄｓＲＮＡと比較して、血清および／または脳脊髄液中での改善された安定性を有する。
ある態様において、センス鎖の３’−末端における最後から２〜８番目のヌクレオチドが、それらの対応するアンチセンス鎖ヌクレオチドとミスマッチである。
ある態様において、ｄｓＲＮＡが、初代細胞（primary cells）においてインターフェロン応答を誘導しない。
ある態様において、センス鎖のいずれかの末端および／またはアンチセンス鎖の３’−末端が、保護基によってブロックされている。
【００１６】
ある態様において、保護基が、反転ヌクレオチド、反転脱塩基部分、またはアミノ末端修飾ヌクレオチドである。
ある態様において、反転ヌクレオチドが、反転デオキシヌクレオチドを含む。
ある態様において、反転脱塩基部分が、反転デオキシ脱塩基部分を含む。
ある態様において、反転デオキシ脱塩基部分が、３’，３’−連結または５’，５’−連結デオキシ脱塩基部分である。
ある態様において、センスおよび／またはアンチセンス鎖の末端の交互(alternating)ヌクレオチドが、２’−修飾リボース糖を含み、各２’−修飾リボース糖が、逆鎖上の非修飾ヌクレオチドと向き合う。
【００１７】
ある態様において、最初の２’−修飾アンチセンスヌクレオチドが、最も５’−末端のアンチセンスヌクレオチドであるか、またはアンチセンス鎖の５’−末端から２番目のヌクレオチドである。
ある態様において、標的遺伝子が、ＳＯＤ１、ＰＰＩＢ、ＲＩＰ１４０、ＰＣＳＫ９、ＴＮＦα、ＡＰ２（脂肪細胞脂肪酸結合タンパク質）またはＭＡＰ４Ｋ４である。
ある態様において、２’−修飾リボースヌクレオチドの間のセンス鎖ヌクレオチドが、２’−Ｆ修飾である。
ある態様において、２’−修飾リボースヌクレオチドの間のセンス鎖ヌクレオチドが、プリンヌクレオチドであり、任意に２’−Ｆ修飾修飾および／またはホスホロチオエート結合を有する。
【００１８】
ある態様において、２’−修飾リボースヌクレオチドの間のセンス鎖ヌクレオチドが、１または２以上の、各１〜５ヌクレオチドのバルジを形成する。
ある態様において、各一続きの２’−修飾リボース糖が、末端ヌクレオチド、末端ヌクレオチドから二番目のヌクレオチド、または末端ヌクレオチドから三番目のヌクレオチドから独立して開始される。
ある態様において、アンチセンス鎖のピリミジンヌクレオチドの５０〜１００％が、独立して２’−Ｆ修飾または２’−Ｏ−メチル修飾である。
ある態様において、アンチセンス鎖の５’−末端が、リン酸化されている。
【００１９】
関連する側面において、本発明はまた、標的遺伝子の発現を阻害するためのＲＮＡコンストラクトであって、該コンストラクトが、センス鎖上の単一ニック以外は主題のｄｓＲＮＡと同一である、前記ＲＮＡコンストラクトを提供する。例えば、ニックは、アンチセンス鎖の５’末端から約１０塩基のヌクレオチドの逆位置を占めてよい。ニックはまた、アンチセンス鎖の５’末端から約５〜１５塩基のヌクレオチドの逆位置を占めてよい。ある態様において、各デュプレックス領域のΔＧが、約−１３ｋｃａｌ／モル未満である。
【００２０】
本発明の別の側面は、主題のｄｓＲＮＡの少なくとも１本の鎖（例として、非修飾のセンス鎖など）発現するベクターを提供する。
本発明の別の側面は、主題のベクターまたは主題のｄｓＲＮＡを含む細胞を提供する。
ある態様において、細胞が、培養哺乳類細胞である。
ある態様において、細胞が、ヒト細胞である。
本発明の別の側面は、主題のｄｓＲＮＡ、および薬学的に許容可能な担体または希釈剤を含む組成物を提供する。
【００２１】
本発明の別の側面は、哺乳類細胞において標的遺伝子の発現を阻害する方法であって、哺乳類細胞と主題のｄｓＲＮＡコンストラクトとを接触させることを含む、前記方法を提供する。
ある態様において、哺乳類細胞が、培養されている。
ある態様において、哺乳類細胞が、ヒト細胞である。
ある態様において、哺乳類細胞を、送達試薬の存在下で接触させる。
ある態様において、送達試薬が、脂質である。
ある態様において、脂質が、カチオン性脂質である。
ある態様において、送達試薬が、リポソームである。
【００２２】
本発明の別の側面は、哺乳類細胞において標的遺伝子の発現を阻害する方法であって、哺乳類細胞と、主題のｄｓＲＮＡコンストラクトの鎖の少なくとも１つを発現するベクターとを接触させることを含む、前記方法を提供する。
本発明の別の側面は、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の遺伝子サイレンシング効果を改善するための方法であって、ｓｉＲＮＡのセンスおよび／またはアンチセンスヌクレオチドを修飾して、主題のｄｓＲＮＡコンストラクトとすることを含む、前記方法を提供する。
本発明の別の側面は、ｓｉＲＮＡコンストラクトの標的部位へのin vivo送達を評価する方法であって、ｓｉＲＮＡコンストラクトとともにＰＰＩＢを標的とする主題のｄｓＲＮＡコンストラクトを共送達し、標的部位におけるＰＰＩＢ機能の阻害をアッセイすることを含み、ここでＰＰＩＢ機能の標的部位における阻害の成功が、標的部位へのｓｉＲＮＡコンストラクトのin vivo送達成功の指標となる、前記方法を提供する。
【００２３】
本発明の別の側面は、表中に開示されたものおよび／またはＳＯＤ１もしくは他の特定の標的遺伝子に対するものなど、本明細書に開示されたあらゆるｄｓＲＮＡに関する。
さらに、ここでおよび本明細書中のどこかで記載されたあらゆる態様は、適用可能な場合には他のあらゆる態様と組み合わせることができるものとする。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、本発明のある修飾ＲＮＡｉコンストラクト（簡潔化のために、代替ＲＮＡｉ化合物と称す）を示す。
【００２５】
【図２】図２は、Ｒ１のｓｉＲＮＡまたは代替ＲＮＡｉ化合物でトランスフェクションした２４時間後のＳＯＤ１発現を図示する。
【００２６】
【図３】図３は、ＳＯＤ１のｍＲＮＡレベルを低減させる活性のある代替ＲＮＡｉ化合物の配列を示す。
【００２７】
【図４】図４は、選択した標的部位についてのある代表的な代替ＲＮＡｉ化合物（例として、平滑末端を有し、センス鎖の各末端上に４つの２’ＯＭｅを有する２５−ｍｅｒ）がマウスおよびヒトＳＯＤ１に対して有効であることを示す。
【００２８】
【図５Ａ】図５Ａは、ＳＯＤ１の代替ＲＮＡｉ化合物についての用量反応分析および５０ｐＭ未満のＥＣ５０値を有する活性デュプレックスの同定を図示する。
【００２９】
【図５Ｂ】図５Ｂは、ヒトＨＥＫ２９３細胞中のＳＯＤ１の代替ＲＮＡｉ化合物についての用量反応分析、および約５０ｐＭのＥＣ５０値を有する活性デュプレックスの同定を示す。
【００３０】
【図５Ｃ】図５Ｃは、ネズミＮＩＨ３Ｔ３細胞中のＳＯＤ１の代替ＲＮＡｉ化合物についての用量反応分析、および約５０ｐＭのＥＣ５０値を有する活性デュプレックスの同定を示す。
【００３１】
【図６Ａ】図６Ａは、ｓｉＲＮＡまたは代替ＲＮＡｉ化合物でトランスフェクションした後の、ユビキタスタンパク質であるＰＰＩＢ（シクロフィリンＢ）の発現量を示す。
【００３２】
【図６Ｂ】図６Ｂは、ヒトＨＥＫ２９３細胞中のＰＰＩＢの代替ＲＮＡｉ化合物についての用量反応分析、ならびに２５−ｍｅｒおよび２７−ｍｅｒのＥＣ５０値がそれぞれ約２５または約７２ｐＭである活性デュプレックスの同定を示す。
【００３３】
【図６Ｃ】図６Ｃは、マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞中のＰＰＩＢの代替ＲＮＡｉ化合物についての用量反応分析、ならびに２５−ｍｅｒおよび２７−ｍｅｒのＥＣ５０値がそれぞれ約２００または約５００ｐＭである活性デュプレックスの同定を示す。
【００３４】
【図７】図７は、センス鎖修飾を有する代替ＲＮＡｉ化合物の２５−ｍｅｒがダイサー酵素によって切断されないことを実証する。
【００３５】
【図８Ａ】図８Ａは、２５−ｍｅｒのデュプレックスがＲＮＡｉサイレンシングＡｇｏ２複合体と会合することが見出されることを実証する。
【００３６】
【図８Ｂ−８Ｃ】図８Ｂは、ＳＯＤ１を標的とするＲＮＡデュプレックスのガイド鎖についてのノーザンブロットを示す。図８Ｃは、ｃ−ｍｙｃ  Ａｇｏ２を発現する２９３細胞のトランスフェクション後のＳＯＤ１発現量を示す。
【００３７】
【図９Ａ−９Ｂ】図９Ａおよび９Ｂは、ダイサープロセシングされない２１ｎｔより長いデュプレックスのための、アンチセンス鎖の５’−末端から１０ｎｔにある一律(uniform)の切断箇所を示す。合成基質を、試験されたＲＮＡデュプレックスについての標的配列を含むＳＯＤ１遺伝子の５０ｎｔ領域に相当するように、化学的に合成した。図９Ａは、合成基質ならびに予想切断箇所および産物の概略図である。図９Ｂ中では、ＳＯＤ１を標的とするＲＮＡデュプレックスを、ｃ−ｍｙｃ  Ａｇｏ２を発現する２９３細胞へと、方法欄に記載のようにトランスフェクトした。細胞を採取、溶解し、ｃ−ｍｙｃ  Ａｇｏ２を免疫沈降し、緩衝液中で再構成した。免疫沈降物を５０ｎｔの３２−Ｐ−標識化合成基質とともに３０℃で２時間、方法欄に記載のように、インキュベートした。２時間のインキュベート後、サンプルをサイズマーカー（下線で表示される）と並べて変性ポリアクリルアミドゲルにロードした。サンプルのアルファベット表記は、パネルＡの概略に示される以下のデュプレックスに相当する。Ａ＝非修飾１９−ｂｐ＋２ｎｔのｓｉＲＮＡ、Ｂ＝非修飾２５−ｂｐデュプレックス、Ｃ＝４／４  ２’ＯＭｅを有する２５−ｂｐデュプレックス、Ｄ＝４／４  ２’ＯＭｅを有する２５−ｂｐデュプレックス、Ｅ＝ルシフェラーゼ対照デュプレックス。
【００３８】
【図１０Ａ】図１０Ａは、広範な化学的修飾分析のために用いた二つの代表的な配列、ＩＤ番号１００１５および１００２３を示す。
【００３９】
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、それぞれセンス鎖についての修飾化学構造ＩＤ（００１、００２、００３等）およびアンチセンス鎖についての修飾化学構造ＩＤ（０１１、０１２、０１３等）を列挙し、設計されたおよび／または試験された全ての２５−ｍｅｒについての各ヌクレオチド位置における修飾の詳細な概要をＩＤ毎に示している。
【００４０】
【図１１】図１１は、センス鎖およびアンチセンス鎖上の修飾タイプに依存するＳＯＤ１のｍＲＮＡレベル低減の変動度合いを図示する。
【００４１】
【図１２Ａ】図１２Ａは、センス鎖のみにおける２’ＯＭｅ位置の変動の関数として、ＳＯＤ１発現の抑制についてのデュプレックスの相対活性を示す。各デュプレックスはＩＤ番号１００１５または１００２３の配列に基づく。
【００４２】
【図１２Ｂ−１２Ｃ】図１２ＢおよびＣは、センス鎖のみにおける２’ＯＭｅ位置の変動の関数として、ＳＯＤ１発現の抑制についてのデュプレックスの相対活性を示す。各デュプレックスはＩＤ番号１００１５または１００２３の配列に基づく。
【００４３】
【図１３Ａ】図１３Ａは、示される多様なアンチセンス鎖化学構造（０１１、０１３、０４２等。図１１Ｂを参照のこと）との組合せにおいて、センス鎖における２’ＯＭｅ位置の変動に応じた、ＳＯＤ１発現の抑制についてのデュプレックスの相対活性を示す。
【００４４】
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、示される多様なアンチセンス鎖化学構造（０１１、０１３、０４２等。図１１Ｂを参照のこと）との組合せにおいて、センス鎖における２’ＯＭｅ位置の変動に応じた、ＳＯＤ１発現の抑制についてのデュプレックスの相対活性を示す。
【００４５】
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、示される多様なアンチセンス鎖化学構造（０１１、０１３、０４２等。図１１Ｂを参照のこと）との組合せにおいて、センス鎖における２’ＯＭｅ位置の変動に応じた、ＳＯＤ１発現の抑制についてのデュプレックスの相対活性を示す。
【００４６】
【図１３Ｄ】図１３Ｄは、示される多様なアンチセンス鎖化学構造（０１１、０１３、０４２等。図１１Ｂを参照のこと）との組合せにおいて、センス鎖における２’ＯＭｅ位置の変動に応じた、ＳＯＤ１発現の抑制についてのデュプレックスの相対活性を示す。
【００４７】
【図１４Ａ】図１４Ａは、示されるような各デュプレックス上の修飾の結果としての、血清および／または脳脊髄液におけるデュプレックスの安定性の改善を実証する。
【００４８】
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、示されるような各デュプレックス上の修飾の結果としての、血清および／または脳脊髄液におけるデュプレックスの安定性の改善を実証する。
【００４９】
【図１５Ａ】図１５Ａは、２１−ｂｐ以上のデュプレックスでのＲＮＡｉ活性にダイサーは必要とされないことを実証する。バーは、ｂＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイによって測定されたトランスフェクション４８時間後のＳＯＤ１のｍＲＮＡレベルを表す。３つのデュプレックスについてのＳＯＤ１のｍＲＮＡ低減データが示されている；１９−ｂｐ＋２ｎｔのｓｉＲＮＡ（白いバー）、非修飾（０／０）２５−ｂｐデュプレックス（黒いバー）、および「４／４」２’ＯＭｅ２５−ｂｐデュプレックス（縞のバー）。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、本研究で用いた配列を示す。
【００５０】
【図１６Ａ】図１６Ａは、図１５Ａの観察と類似して、２７ｂｐデュプレックスでのＲＮＡｉ活性にダイサーは必要とされないことを示す。バーは、ｂＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイによって測定した、トランスフェクション４８時間後のＰＰＩＢのｍＲＮＡレベルを表す。白いバーは１９−ｂｐ＋２ｎｔのｓｉＲＮＡ、点状のバーは非修飾２５−ｂｐデュプレックス、黒いバーは２’ＯＭｅ化学構造を有する２５−ｂｐデュプレックス、そして縞のバーは２’ＯＭｅ化学構造を有する２７−ｂｐデュプレックスである。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは配列を示す。
【００５１】
【図１７Ａ−１７Ｂ】図１７ＡおよびＢは、２’−Ｏ−Ｍｅ修飾が、ｓｉＲＮＡへの２１ｎｔより大きなＲＮＡデュプレックスのダイサー酵素プロセシングを、抑制および阻害することを示す。図１７Ａは、ＳＯＤ１を標的とするＲＮＡデュプレックスへ適用した化学的修飾の概略図である。デュプレックス中の「Ｒ」は、通常のまたは２’位置修飾を有しない非修飾のＲＮＡヌクレオチドを表す。「Ｍ」は、ＲＮＡのヌクレオチドの２’位置へのＯ−メチル修飾を表す。特に記さない限り、ほとんどのヌクレオチド修飾をパッセンジャー鎖に配置する。  図１７Ｂは、本明細書中に記載のように組換ヒトダイサー酵素とともに一晩インキュベーションした後の、ＲＮＡデュプレックスのＴＢＥ−ポリアクリルアミドゲルである。レーンＭは、サイズ（上から下）が２５−ｂｐ、２１−ｂｐ、１７−ｂｐであるｓｉＲＮＡマーカーを指す。
【００５２】
【図１７Ｃ】図１７Ｃは、２’−Ｏ−Ｍｅ修飾が、ｓｉＲＮＡへの２１ｎｔ以上のＲＮＡデュプレックスのダイサー酵素プロセシングを、抑制および阻害することを示す。図１７Ｃは、「２／２」２’−Ｏ−Ｍｅ化学構造を有する２５−ｂｐＲＮＡデュプレックスのプロセシングの定量を示す。部分的にプロセシングされたバンドの密度をＬａｂＷｏｒｋｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて定量した。
【００５３】
【図１７Ｄ−１７Ｅ】図１７ＤおよびＥは、２’−Ｏ−Ｍｅ修飾が、ｓｉＲＮＡへの２１ｎｔ以上のＲＮＡデュプレックスのダイサー酵素プロセシングを、抑制および阻害することを示す。図１７Ｄは、本明細書中に記載のように組換ヒトダイサー酵素とともに一晩インキュベーションした後の、デュプレックスの各末端上に異なる組合せの（４）２’−Ｏ−Ｍｅを有するＲＮＡデュプレックスのＴＢＥ−ポリアクリルアミドゲルである。図１７Ｅは、ＳＯＤ１遺伝子中の異なる配列を標的とする２’−Ｏ−Ｍｅ修飾された２５−ｂｐデュプレックスにより得られた類似の結果を示す。
【００５４】
表１は、ＳＯＤ１およびＰＰＩＢに対する代替ＲＮＡｉ化合物の配列を提供する。全配列名を、遺伝子名−開始部位―長さ―代替ＲＮＡｉ化合物ＩＤ番号で表す。「Ｐ」は５’リン酸塩を表す一方、「ｍ」は２’Ｏ−メチル塩基修飾を表す。「Ｆ」は２’フルオロ基塩修飾を表す。「＊」はホスホチオエート骨格結合を意味する一方、「．」は通常のＲＮＡ骨格結合を表す。
【００５５】
表２は、ＳＯＤ１に対する追加の代替ＲＮＡｉ化合物の配列を提供する。表１中で用いた表記法は表２へ適用する。
【００５６】
表３は、ＲＮＡデュプレックスのリストである。一本鎖ＲＮＡまたはデュプレックスＲＮＡを化学的に合成して、方法欄に記載のようにアニールした。「Ｇ」＝グアニン、「Ｕ」＝ウラシル、「Ｃ」＝シトシン、「Ａ」＝アデニン、「ｍ」＝２’Ｏメチル塩基修飾、「．」＝通常のＲＮＡ骨格結合。方向性は、ＰＳ＝パッセンジャーまたはセンス鎖、ＧＳ＝ガイドまたはアンチセンス鎖、として表す。括弧内の数字は、デュプレックス追跡のための内部配列データベース番号に対応する。
【００５７】
表４は、上記の一部の図におけるＲＮＡデュプレックスのリストである。一本鎖ＲＮＡまたはデュプレックスＲＮＡを化学的に合成して、方法欄に記載のようにアニールした。「Ｇ」＝グアニン、「Ｕ」＝ウラシル、「Ｃ」＝シトシン、「Ａ」＝アデニン、「ｍ」＝２’Ｏメチル塩基修飾されたもの、「．」＝通常のＲＮＡ結合。方向性は、ＰＳ＝パッセンジャーまたはセンス鎖、ＧＳ＝ガイドまたはアンチセンス鎖、として表す。括弧内の数字は、デュプレックス追跡のための内部配列データベース番号に対応する。
【００５８】
表５は、ＲＮＡサイズマーカーおよび切断アッセイで用いた合成基質のリストである。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
１．概説
本発明は、あるより長いｄｓＲＮＡ（例として、２１塩基対を超える二本鎖領域を有するもの）が、センス鎖が修飾された（例として、センス鎖の両末端が例えば２’−Ｏ−メチル基によって）場合に、ダイサーまたは他のダイサー様ＲＮＡｓｅＩＩＩによって切断されず、かかるｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖が、該アンチセンス鎖の５’−末端が２１マー（すなわちダイサー切断産物）の５’末端と並んだ状態でＲＩＳＣ複合体に取り込まれ得るという驚くべき発見に部分的に基づいている。先行技術が、化合物がダイサーの基質を形成する場合、ＲＮＡｉ化合物活性は（ｓｉＲＮＡと比較して）増大すると教示しているにもかかわらず、本出願人らは実際に、ダイサーの基質ではない非常に活性なＲＮＡｉ化合物を見出した。本発明はまた、かかるより長いアンチセンス（ガイド）鎖を取り込んだＲＩＳＣ複合体が、標的ｍＲＮＡを、アンチセンス（ガイド）配列の５’−末端から１０番目および１１番目のヌクレオチドの間の位置に対応する単一位置で切断するものであるという発見に部分的に基づいている。
【００６０】
本出願人らの発見が直接的に意味することは、かかるより長いｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は単一種の活性ＲＮＡｉ試薬となり、したがってより高い標的特異性、より明確な生物学的活性および／または薬理学的特性を有したＲＮＡｉ試薬または治療薬の開発を促進することである。
さらに、より長いｄｓＲＮＡがダイサー切断に対して抵抗性であるように操作することができるという知識、およびダイサー抵抗性アンチセンス鎖が定義された場所でＲＩＳＣ複合体に取り込まれて単一種の活性ＲＮＡｉ試薬を創造することができるという知識により、人はセンスおよび／またはアンチセンス鎖に付加的な特徴または修飾を施し、ＲＮＡｉ試薬または治療薬の特性を改善することができる。特に、５’−末端に関するガイド鎖中の修飾位置を今や定義することができ、この位置がかかる修飾ＲＮＡｉ化合物の特異性および活性の定義に重要である。
【００６１】
代表的な標的遺伝子スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）を用いて、本出願人らは幾多のセンスおよびアンチセンス修飾およびその組み合わせを設計および試験して、長いｄｓＲＮＡをダイサー抵抗性にし、その上効果的な標的遺伝子サイレンシングおよび／または多くの他の付随する利益を提供する複数の特異的修飾を同定した。
【００６２】
したがって１つの側面において、本発明は、標的遺伝子の発現を阻害するための、１２〜４９（好ましくは１９〜４９）ヌクレオチドの長さの二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）コンストラクトであって、該ｄｓＲＮＡが、（１）５’−末端および３’−末端を有するセンス鎖、ここで該センス鎖の前記５’−および３’−末端のそれぞれにおける１または２以上のヌクレオチドが、２’−修飾リボース糖を有する、および（２）前記センス鎖および前記標的遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズする、５’−末端および３’−末端を有するアンチセンス鎖、ここで該アンチセンス鎖が、該アンチセンス鎖の５’−末端から２番目のヌクレオチドにおいて、２’−修飾リボース糖を含む、を含み、ここで、（ａ）前記ｄｓＲＮＡがダイサーによる切断に抵抗性であり、（ｂ）前記アンチセンス鎖がＲＩＳＣと会合し、および（ｃ）ｄｓＲＮＡが、配列依存的な様式で標的遺伝子の発現を阻害する、前記二本鎖ＲＮＡコンストラクトを提供する。
【００６３】
ある態様において、アンチセンス鎖が非修飾である。他の態様において、アンチセンス鎖が、該アンチセンス鎖の５’−末端から２番目のヌクレオチドに２’−修飾リボース糖を含む。
本明細書で用いられる場合、「２’−修飾リボース糖」は、２’−ＯＨ基を有さないリボース糖を含む。例えば、２’−修飾リボース糖は２’−Ｏ−アルキルヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−デオキシヌクレオチド、２’−Ｈ（デオキシリボヌクレオチド）、またはそれらの組み合わせであってよい。
【００６４】
ある態様において、上述のアンチセンス修飾を有する本発明のｄｓＲＮＡは、特定のアンチセンス修飾を有さない類似のコンストラクトと比較して、顕著に（例として、少なくとも約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％またはそれ以上）低い「オフターゲット」遺伝子サイレンシングを示し、したがって全体的にＲＮＡｉ試薬または治療薬の特異性を大きく改善する。
【００６５】
本明細書で用いられる場合、「オフターゲット」遺伝子サイレンシングは、例えばアンチセンス（ガイド）配列と意図しない標的ｍＲＮＡ配列との間の誤った(spurious)配列ホモロジーに起因する、意図しない遺伝子サイレンシングをいう。
【００６６】
別の側面において、本発明は、標的遺伝子の発現を阻害するための、１２〜４９（好ましくは１９〜４９）ヌクレオチドの長さの二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）コンストラクトであって、該ｄｓＲＮＡが、（１）５’−末端および３’−末端を有するセンス鎖、ここで該センス鎖の前記５’−および３’−末端のそれぞれにおける１または２以上のヌクレオチドが、２’−修飾リボース糖を有する、および（２）前記センス鎖および前記標的遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズする、５’−末端および３’−末端を有するアンチセンス鎖、ここで該アンチセンス鎖が、該アンチセンス鎖の３’−末端において、（ｉ）非加水分解性のヌクレオチド間結合を有する少なくとも４つの連続した２’−修飾リボース糖（ｉｉ）１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２個の２’−修飾リボース糖、好ましくは２’−Ｏ−メチル修飾リボース糖、または（ｉｉｉ）保護基を含む、を含み、ここで、（ａ）前記ｄｓＲＮＡがダイサーによる切断に抵抗性であり、（ｂ）前記アンチセンス鎖がＲＩＳＣと会合し、および（ｃ）ｄｓＲＮＡが、配列依存的な様式で標的遺伝子の発現を阻害する、前記二本鎖ＲＮＡコンストラクトを提供する。
【００６７】
本発明のこの側面によれば、あるアンチセンス修飾は、顕著にＲＮＡｉ活性を低減することなく（またはＲＮＡｉ活性を全く低減させずに）、さらにヌクレアーゼ安定性を増大し、および／またはインターフェロン誘導をより低める。
【００６８】
別の側面において、本発明は、標的遺伝子の発現を阻害するための、１２〜４９ヌクレオチドの長さの二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）コンストラクトであって、該ｄｓＲＮＡが、（１）５’−末端および３’−末端を有するセンス鎖、ここで該センス鎖の前記５’−および３’−末端のそれぞれにおける１または２以上のヌクレオチドが、２’−修飾リボース糖を有し、該センス鎖が、該センス鎖の３’−末端から２番目のヌクレオチドにおいてミスマッチヌクレオチドを含む、および（２）前記センス鎖および前記標的遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズする、５’−末端および３’−末端を有するアンチセンス鎖、を含み、ここで、（ａ）前記ｄｓＲＮＡがダイサーによる切断に抵抗性であり、（ｂ）前記アンチセンス鎖がＲＩＳＣと会合し、および（ｃ）ｄｓＲＮＡが、配列依存的な様式で標的遺伝子の発現を阻害する、前記二本鎖ＲＮＡコンストラクトを提供する。
【００６９】
本発明のこの側面によれば、センス鎖の３’−末端におけるあるミスマッチが、該アンチセンス鎖のＲＩＳＣ複合体へのより効果的な取り込みを可能にし、したがって、より強力なＲＮＡｉ活性を導く。好ましいかかるセンス鎖ミスマッチは、センス鎖の最後から２番目のヌクレオチド（ＲＩＳＣ複合体中のダイサー抵抗性アンチセンス鎖の２番目のヌクレオチドと塩基対を形成するもの）、およびセンス鎖の最も３’−末端側のヌクレオチドを除く最も３’−末端側の９ヌクレオチドを含む。
【００７０】
異なるセンスおよび／またはアンチセンス鎖修飾など、本発明の異なる特徴は、他に示された場合を除いて、従来のｓｉＲＮＡコンストラクトに対する複数の利点または特徴を有するＲＮＡｉコンストラクトを創造するために組み合わされてよい。
例えば、本発明の全ての適用可能な側面について、アンチセンス鎖は、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドなどの２’−修飾リボース糖を、該アンチセンス鎖の５’−末端から２番目のヌクレオチドに含んでよく、好ましくは他の修飾ヌクレオチドを含まない。かかる修飾を有するｄｓＲＮＡは、前記位置に２’−Ｏ−メチル修飾を有さない類似のコンストラクトと比較して、増強された標的特異性または減少したオフターゲットサイレンシングを有する。
【００７１】
本発明の全ての適用可能な側面について、アンチセンス鎖は少なくとも４つ一続きの、２’−Ｏ−メチル修飾などの２’−修飾リボース糖、ホスホチオエート結合などの非加水分解性ヌクレオチド間結合を有する３’−末端ヌクレオチドを含んでよい。
本発明の全ての適用可能な側面について、ｄｓＲＮＡは、センス鎖の３’−末端の１０番目と１１番目のヌクレオチドの間の単一部位において、ＲＩＳＣによって切断されてよい。
【００７２】
本発明の全ての適用可能な側面について、２５マーの５’−末端の１２ヌクレオチドおよび３’−末端の１０ヌクレオチドは２’−修飾リボース糖であってよい。修飾塩基の数は、コンストラクトの全体的な長さに依存して調整してよい。例えば、２７マーについて、５’−末端の１２〜１４ヌクレオチドおよび３’−末端の１０〜１２ヌクレオチドは２’−修飾ヌクレオチドであってもよい、などである。
【００７３】
本発明の全ての適用可能な側面について、ｄｓＲＮＡは、センス鎖の３’−末端から２番目のヌクレオチドにおいてミスマッチヌクレオチドを含んでよい。
特定のアンチセンスおよびセンス鎖修飾のある組み合わせは、標的遺伝子発現を阻害する増強された能力、増強された血清安定性、および／または増大した標的特異性などによって部分的に明らかにされたように、予測できない利点となり得る。
【００７４】
したがって、別の側面において、本発明は、標的遺伝子の発現を阻害するための、１２〜４９（好ましくは１９〜４９）ヌクレオチドの長さの二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）コンストラクトであって、該ｄｓＲＮＡが、（１）５’−末端および３’−末端を有するセンス鎖、ここで、該センス鎖の前記５’−および３’−末端に４つの連続した２’−Ｏ−メチルヌクレオチドが存在し、（２）前記センス鎖および前記標的遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズする、５’−末端および３’−末端を有するアンチセンス鎖、ここで該アンチセンス鎖が、（ａ）ホスホチオエート結合を有する４つの連続した２’−Ｏ−メチル修飾３’−末端ヌクレオチドを含む、または（ｂ）５’−末端から２番目のヌクレオチドに２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含み、他の修飾ヌクレオチドを含まない、を含み、ここで、（ａ）前記ｄｓＲＮＡがダイサーによる切断に抵抗性であり、（ｂ）前記アンチセンス鎖がＲＩＳＣと会合し、および（ｃ）ｄｓＲＮＡが、配列依存的な様式で標的遺伝子の発現を阻害する、前記二本鎖ＲＮＡコンストラクトを提供する。
【００７５】
別の側面において、本発明は、標的遺伝子の発現を阻害するための、１２〜４９（好ましくは１９〜４９）ヌクレオチドの長さの二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）コンストラクトであって、該ｄｓＲＮＡが、（１）５’−末端および３’−末端を有するセンス鎖、ここで、１２および１０の連続した２’−Ｏ−メチルヌクレオチドをそれぞれ５’−末端および３’−末端に含む、および、（２）前記センス鎖および前記標的遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズする、５’−末端および３’−末端を有するアンチセンス鎖、ここで該アンチセンス鎖が、（ａ）非修飾である、（ｂ）ホスホチオエート結合を有する４つの連続した２’−Ｏ−メチル修飾３’−末端ヌクレオチドを含む、または（ｃ）５’−末端から２番目のヌクレオチドに２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含み、他の修飾ヌクレオチドを含まない、を含み、ここで、（ａ）前記ｄｓＲＮＡがダイサーによる切断に抵抗性であり、（ｂ）前記アンチセンス鎖がＲＩＳＣと会合し、および（ｃ）ｄｓＲＮＡが、配列依存的な様式で標的遺伝子の発現を阻害する、前記二本鎖ＲＮＡコンストラクトを提供する。
【００７６】
ある態様において、主題のｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖が、アンチセンス鎖の５’−末端から１０番目および１１番目のヌクレオチドの間の単一部位における、標的遺伝子の転写産物の一様な切断を導く。
ある態様において、ｄｓＲＮＡのセンス鎖が、該センス鎖の３’−末端から１０番目および１１番目のヌクレオチドの間の単一部位において、ＲＩＳＣによって切断可能である。
【００７７】
本発明のこの態様によれば、あるセンス鎖配列は、等価なｍＲＮＡが切断される部位において、ダイサー抵抗性ガイド配列を取り込んだＲＩＳＣ複合体によって切断され得る。いかなる特定の理論にも拘束されることは望まないが、これは１つにはセンス鎖が標的ｍＲＮＡと同一のまたは類似の配列を共有することが理由である。したがって、主題のｄｓＲＮＡコンストラクトは、１０番目および１１番目の３’−末端ヌクレオチドの間で切断され得るセンス鎖を有するものを含む。
【００７８】
本発明のコンストラクトは異なる長さを有していてもよい。ある態様において、好ましい長さのコンストラクトは１２〜３５、または１２〜４９、好ましくは１９〜４９ヌクレオチドの長さである。ある態様において、コンストラクトの長さは、２２ヌクレオチドの長さより長いかまたは同じである。ある態様において、コンストラクトの長さは、２５ヌクレオチドの長さより長いかまたは同じである。ある態様において、コンストラクトの長さは、２６、２７、２８、２９、３０、または３１〜４９ヌクレオチドの長さである。長さの下限がダイサー基質にとっての最短の長さであり、上限が一般的に標的細胞においてＰＫＲ応答を惹起しない長さである限り、他の長さもまた可能である。ある態様において、修飾は、より長い長さ（５０、６０、７０、８０、９０、１００ｂｐなど）が許容され得るように、上限を変化させ得る。
【００７９】
ある態様において、ｄｓＲＮＡコンストラクトは平滑末端である。他の態様において、１〜４ヌクレオチドの５’−および／または３’−末端オーバーハングが１つのまたは両方の鎖に存在する。
２５マーコンストラクトについて、センス鎖の各末端が、独立して、４〜１６個の２’−修飾ヌクレオチドおよび／または非加水分解性結合（例として、ホスホチオエート結合）を含んでよい。修飾塩基の数はコンストラクトの全体的な長さに依存して調整されてよい。例えば２７マーについて、センス鎖の各末端が、独立して、４〜１８個の２’−修飾ヌクレオチドおよび／またはホスホチオエート結合を含んでよい、などである。
【００８０】
ある態様において、センス鎖の５’−末端の１２ヌクレオチドおよび３’−末端の１０ヌクレオチドが２’−修飾リボース糖である。
ある態様において、センス鎖の各末端は同じ数または異なる数の２’−修飾リボース糖を有してよいが、各末端が一続きの２’−修飾リボース糖を含む。
ある態様において、センス鎖の各末端が４つ一続きの２’−修飾リボース糖を含む。
【００８１】
ある態様において、アンチセンス鎖が、非連続的な２’−修飾リボース糖を含み、ここで１０番目および１１番目のアンチセンスヌクレオチドが修飾されていない。例えば、アンチセンス鎖は、各２、３、４、５、６、７、８または９ヌクレオチドの２’−修飾リボース糖を含んでよい。アンチセンス鎖上の最も５’−末端側の２’−修飾リボース糖は、２番目のヌクレオチド、または最初のヌクレオチドであってよい。
【００８２】
ある態様において、２’−修飾ヌクレオチドが、２’−Ｏ−アルキルヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−デオキシヌクレオチド、２’−Ｈ−（デオキシリボヌクレオチド）またはそれらの組み合わせである。
ある態様において、２’−修飾ヌクレオチドが、ピリミジンヌクレオチド（例として、Ｃ／Ｕ）である。
例えば、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、または２’−Ｏ−アリルヌクレオチドであってよい。
【００８３】
ある態様において、アンチセンス鎖が、該アンチセンス鎖の５’−末端の２番目に２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含み、他の修飾ヌクレオチドを含まない。
ある態様において、修飾ｄｓＲＮＡが、同一の配列を有する非修飾のｄｓＲＮＡと比較して、血清および／または脳脊髄液中での改善された安定性を有し得る。
ある態様において、ｄｓＲＮＡが、２’−修飾を前記の位置に含まない類似のコンストラクトと比較して、増強された標的特異性または減少したオフターゲットサイレンシングを有する。
【００８４】
ある態様において、アンチセンス鎖が、ホスホチオエート結合を有する少なくとも４つの連続した２’−Ｏ−メチル修飾３’−末端ヌクレオチドを含む。
ある態様において、ｄｓＲＮＡのセンス鎖が、センス鎖の３’−末端から２番目のヌクレオチドにおいて、ミスマッチヌクレオチドを含む。
ある態様において、センス鎖の３’−末端における最後から２〜８番目のヌクレオチドが、それらの対応するアンチセンス鎖ヌクレオチドとミスマッチである。
【００８５】
ある態様において、ｄｓＲＮＡが、ヒト、マウスおよび他の齧歯類、ならびに他の非ヒト哺乳類からの初代細胞を含む、哺乳類初代細胞などの初代細胞において、インターフェロン応答を誘導しない。
ある態様において、ｄｓＲＮＡが、無脊椎動物中の標的遺伝子の発現を阻害するために用いられてもよい。
ある態様において、５’−末端から１０番目および１１番目のアンチセンスヌクレオチドが修飾されていない。
【００８６】
in vivoでの主題のコンストラクトの安定性をさらに増大させるため、センス鎖のいずれかの末端および／またはアンチセンス鎖の３’−末端が、保護基によってブロックされていてよい。例えば、反転ヌクレオチド（inverted nucleotide）、反転脱塩基部分（inverted abasic moieties）、またはアミノ末端修飾ヌクレオチドなどの保護基を用いてよい。反転ヌクレオチドは、反転デオキシヌクレオチドを含んでよい。反転脱塩基部分は、３’，３’−連結または５’，５’−連結デオキシ脱塩基部分などの反転デオキシ脱塩基部分を含んでよい。
【００８７】
ある態様において、センスおよび／またはアンチセンス鎖の末端の交互ヌクレオチドが、２’−修飾リボース糖を含み、各２’−修飾リボース糖が、逆鎖上の非修飾のヌクレオチドと向き合う。ある態様において、最初の２’−修飾アンチセンスヌクレオチドが、最も５’−末端のアンチセンスヌクレオチドであるか、またはアンチセンス鎖の５’−末端から２番目のヌクレオチドである。
【００８８】
ある態様において、本明細書に記載されたあらゆる代替的ＲＮＡｉ化合物と同一のまたは類似の構造を有するが、ダイサー切断に対して抵抗性でない点で異なるＲＮＡｉコンストラクトもまた、それぞれの意図された標的（例として、ｍＲＮＡ）に対して高い活性を示す限り、望ましい。
【００８９】
ある態様において、主題の二本鎖ＲＮＡが、１または２以上の点において化学的に相互連結されていてよく、あるいは１または両方の末端においてヌクレオチドループ構造によって連結（例として、一本鎖ヘアピン構造または環状構造）されていてよい。１つの態様において、化学的な相互連結またはヘアピン構造のループが、アンチセンス鎖の３’−末端にある（例として、アンチセンス鎖の３’−末端をセンス鎖の５’−末端に連結する）。別の態様において、化学的な相互連結またはヘアピン構造のループが、アンチセンス鎖の５’−末端にある（例として、センス鎖の３’−末端をアンチセンス鎖の５’−末端に連結する）。これらの態様において、センス鎖上の５’−末端および３’−末端修飾および／またはアンチセンス鎖上の他の修飾などの、相互連結またはループしたコンストラクトの他の構造的特長は、本明細書に記載されたｄｓＲＮＡのものと本質的に同一である。
【００９０】
本発明の二本鎖および／またはデュプレックス（duplex）オリゴヌクレオチドコンストラクトは、標的遺伝子によってコードされるあらゆる標的タンパク質の合成を阻害することができる。本発明は、in vitroまたはin vivoいずれかで標的遺伝子の発現を阻害する方法を含む。標的遺伝子は、細胞に対して内因性のものでも外因性のもの（例として、ウィルスによりまたは組換えＤＮＡ技術を用いて細胞に導入される）でもあり得る。かかる方法は、標的遺伝子の発現を阻害するために十分な量の、ＲＮＡの細胞内への導入を含んでよく、ここでＲＮＡは二本鎖デュプレックスである。例示の目的で、かかるＲＮＡ分子は標的遺伝子のヌクレオチド配列に対応するリボヌクレオチド配列を有する第一の鎖、および標的遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なリボヌクレオチド配列を有する第二の鎖を有してよく、ここで、第一および第二の鎖は別々の相補的な鎖であり、デュプレックス組成物が標的遺伝子の発現を阻害するように、それらが互いにハイブリダイズして前記二本鎖分子を形成する。本発明の一般的な原則を解説するために本出願において広く用いられている代表的な（しかし限定するものではない）標的遺伝子は、ごく一部を挙げると、ＳＯＤ１、ＰＰＩＢ、ＲＩＰ１４０、ＰＣＳＫ９、ＴＮＦα、ＡＰ２（脂肪細胞脂肪酸結合タンパク質、またはＭＡＰ４Ｋ４を含む。
【００９１】
いかなる特定の理論にも拘束されることは望まないが、ＲＮＡｉの実体の「センス」鎖上の２’−Ｏ−メチルブロック領域（センス鎖の末端部分における領域など）の存在は、かかる修飾のないコンストラクトと比較して、安定性、特異性を顕著に増大し、免疫応答を最小化する。いくつかの場合において、アンチセンス鎖に対して修飾を適用することによってＲＮＡｉデュプレックスの安定性をさらに増大することは、より有益であり得る。特に、いくつかの好ましい化学修飾パターンは、含有するＣおよびＵの大部分が２’−Ｏ−メチルによって修飾されているか、または含有するＣおよびＵの大部分が２’Ｆによって修飾されているアンチセンス鎖を含んでよい。いくつかの場合において、アンチセンス鎖は数個の化学修飾の混合によって修飾されてもよい。
【００９２】
ある態様において、重度に修飾されたアンチセンス鎖は、キナーゼにとってよい基質ではない可能性がある。したがって、この問題を緩和するためにアンチセンス鎖の化学的リン酸化を用いてよい。加えて、いくつかの好ましい配列は、センス鎖の非修飾領域にプリンヌクレオチド（すなわちＡおよびＧ）のみを含んでよく、または／および２’−Ｆもしくはホスホロチオエート（ＰＳ）を含んでいてよい。いくつかの場合において、２’−Ｏ−メチルおよび２’Ｆと組み合わせたＰＳ修飾の追加の導入が好ましいだろう。
【００９３】
いくつかの場合において、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方の修飾が、コンストラクトの最大の安定性を達成するのに好ましい。重度に修飾されたデュプレックスは時としてＲＩＳＣ会合体にとって粗悪な基質であるので、いくつかの好ましい態様において、１つまたは複数のバルジ（例として、サイズにして約１〜５つのヌクレオチド）が、ＲＩＳＣ移行(entry)および効力に必要であるかまたは少なくとも有用であり得る。
【００９４】
いくつかの他の態様において、重度に修飾されたデュプレックスは、センス鎖に単一ニックを含んでよい。好ましいニック位置は、アンチセンス鎖の５’末端から１０ｂｐの逆鎖上であってよい。いくつかの態様において、ニックは上述の好ましい位置（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端から１０ｂｐの逆鎖上）から５ｂｐ以内に位置することができる。いくつかの態様において、デュプレックス安定性を提供する追加の化学的修飾が、主題のコンストラクトに適用されてよい。いくつかの態様において、配列は、例として各デュプレックス領域のΔＧが−１３ｋｃａｌ／モルとなるなどの、熱力学的特徴を有するように選択されてよい。
【００９５】
したがって、ある態様において、本発明のコンストラクトは、ある修飾をセンス／パッセンジャー鎖またはアンチセンス／ガイド鎖のいずれか、あるいは両方に含んでよく、ある利点をコンストラクトに付与してよい。
例えば、ある態様において、２’−修飾ヌクレオチドの間のセンス鎖ヌクレオチド（例として、センス鎖の中央部分または一続きの部分）が２’−Ｆ修飾である。代替的にまたはそれに加えて、センス鎖の同一の部分が、それぞれ約１〜５ヌクレオチドのバルジなど、１または２以上のバルジを形成してもよい。
【００９６】
本明細書で用いられる場合、一続きの２’−修飾リボースヌクレオチドは、かかる一続きの部分が好ましくは末端ヌクレオチドから開始されても、５’−末端または３’−末端から開始される必要はない。したがって、ある態様において、一続きの２’−修飾リボースヌクレオチドは、独立して、末端ヌクレオチド、末端ヌクレオチドから二番目のヌクレオチド、末端ヌクレオチドから三番目のヌクレオチドなどから開始される。
【００９７】
ある態様においてアンチセンス鎖の５’−末端はリン酸化されていてよい。
ある関連した態様において、本発明はまた、標的遺伝子の発現を阻害するためのＲＮＡコンストラクト、ここで該コンストラクトのセンス鎖上の単一ニック以外は上述の任意のｄｓＲＮＡと同一である、を提供する。したがって、これらの態様において、ＲＮＡコンストラクトは実際のところ、ハイブリダイゼーションによって、二本鎖構造を形成する３つのポリヌクレオチドを含む。アンチセンス鎖は一本鎖ポリヌクレオチドであり、一方で他の２つのポリヌクレオチドは両方ともアンチセンスポリヌクレオチドにハイブリダイズし、本明細書に記載された他の任意のｄｓＲＮＡコンストラクトに対応する「センス鎖」を形成する。
【００９８】
ニックの場所は、この態様において異なってよい。例えば、ニックが、アンチセンス鎖の５’末端から約１０塩基のヌクレオチドの逆位置を占めてもよい。代替的に、ニックはこの位置から５ヌクレオチド以内（例として、アンチセンス鎖の５’末端から約５〜１５塩基のヌクレオチドの逆位置を占める）であってよい。このタイプのコンストラクト中の二本鎖領域の配列は、各デュプレックス領域のΔＧが約−１３ｋｃａｌ／モル未満となるように選択されてもよい。
【００９９】
本発明はまた、主題のｄｓＲＮＡコンストラクトの少なくとも１本の鎖を発現するベクター、およびかかるベクターまたは主題のｄｓＲＮＡコンストラクトを含む細胞に関する。細胞は、ヒト細胞などの、培養哺乳類細胞であってよい。
本発明はさらに、主題のｄｓＲＮＡ、および薬学的に許容可能な担体または希釈剤を含む組成物に関する。
【０１００】
本発明の別の側面は、哺乳類細胞において標的遺伝子の発現を阻害する方法であって、哺乳類細胞と、任意の主題のｄｓＲＮＡコンストラクトとを接触させることを含む、前記方法を提供する。
本方法は、例えば培養ヒト細胞などの培養哺乳類細胞において、in vitroまたはin vivoで行われてよい。
標的細胞（例として、哺乳類細胞）は、脂質（例としてカチオン性脂質）またはリポソームなどの送達試薬の存在下で接触させてよい。
【０１０１】
本発明の別の側面は、哺乳類細胞において標的遺伝子の発現を阻害する方法であって、哺乳類細胞と主題のｄｓＲＮＡコンストラクトの少なくとも１つの鎖を発現するベクターとを接触させることを含む、前記方法を提供する。
本発明の別の側面は、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の遺伝子サイレンシング効果を改良するための方法であって、ｓｉＲＮＡのセンスおよび／またはアンチセンスヌクレオチドを修飾して、主題のｄｓＲＮＡコンストラクトとすることを含む、前記方法を提供する。
【０１０２】
本発明の別の側面は、ｓｉＲＮＡコンストラクトの標的部位へのin vivo送達を評価する方法であって、ｓｉＲＮＡコンストラクトとともに、ほとんど全ての組織において普遍的に発現するユビキタス遺伝子であるＰＰＩＢを標的とする主題のｄｓＲＮＡコンストラクトを共送達し、標的部位におけるＰＰＩＢ機能の阻害をアッセイすることを含み、ここでＰＰＩＢ機能の標的部位における成功裡の阻害が、標的部位へのｓｉＲＮＡコンストラクトのin vivo送達成功の指標となる、前記方法を提供する。
本発明のより詳細な側面は、以下のセクションにおいて記載される。
【０１０３】
ＩＩ．デュプレックス構造
デュプレックスの特徴
本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、２つの別々の相補的核酸鎖によって形成されてよい。デュプレックス形成は標的遺伝子を含む細胞の内側または外側で起こり得る。
本明細書で使用される場合、「二本鎖」という語は、少なくともヌクレオモノマーの一部が相補的であり、水素結合してデュプレックスを形成する分子の領域を含む１または２以上の核酸分子を含む。
【０１０４】
本明細書で使用される場合、「デュプレックス（duplex）」という語は、相補的配列と水素結合する二本鎖の核酸分子の領域を含む。本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、標的遺伝子に対してセンスであるヌクレオチド配列および標的遺伝子に対してアンチセンスである相補配列を含んでよい。センスおよびアンチセンスヌクレオチド配列は、標的遺伝子配列に相当し、例として、同一または標的遺伝子に対して標的遺伝子阻害をもたらすのに十分に同一（例として、少なくとも約９８％同一、９６％同一、９４％、９０％同一、８５％同一または８０％同一）である。
【０１０５】
ある態様において、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、その全長にわたって二本鎖である、すなわちオーバーハングする一本鎖配列をどちらの両端にも有さず、すなわち平滑末端である。他の態様において、個々の核酸分子が異なる長さであり得る。言い換えれば、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、その全長にわたって二本鎖ではない。例えば、二つの別々の核酸分子が用いられる場合、１つの核酸分子、例としてアンチセンス鎖を含む第一の分子、はそれにハイブリダイズする第二の分子よりも長いものであり得る（分子の一部分が一本鎖のまま）。同様に、単一の核酸分子が用いられる場合、いずれかの末端における分子の一部分が一本鎖のままであり得る。
【０１０６】
1つの態様において、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドはミスマッチおよび／またはループもしくはバルジを含むが、オリゴヌクレオチドの長さの少なくとも約７０％にわたって二本鎖となっている。別の態様において、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの長さの少なくとも約８０％にわたって二本鎖となっている。別の態様において、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの長さの少なくとも約９０％〜９５％にわたって二本鎖となっている。別の態様において、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの長さの少なくとも約９６％〜９８％にわたって二本鎖となっている。ある態様において、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、少なくともまたは最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５のミスマッチを含む。
【０１０７】
修飾
本発明のヌクレオチドは、糖部分、ホスホジエステル結合および／または塩基を含む様々な場所で修飾されていてよい。
糖部分は、例としてモノサッカライド（ペントース、例としてリボース、デオキシリボース、など）、天然の非修飾糖、修飾糖および糖アナログを含む。一般的に、ヌクレオモノマー、特に糖部分、の可能な修飾は、例えば１または２以上のヒドロキシル基のハロゲン、ヘテロ原子、脂肪族基との置き換え、またはヒドロキシル基のエーテル、アミン、チオールなどとしての官能化を含む。
【０１０８】
１つの特に有用な修飾ヌクレオモノマーのグループは、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドである。かかる２’−Ｏ−メチルヌクレオチドは、「メチル化」と呼ぶこともでき、対応するヌクレオチドは、非メチル化ヌクレオチドからアルキル化により、またはメチル化されたヌクレオチド試薬から直接作られてよい。修飾ヌクレオチドを非修飾ヌクレオチドと組み合わせて用いてもよい。例えば、本発明のオリゴヌクレオチドはメチル化および非メチル化ヌクレオモノマーを両方含んでよい。
【０１０９】
いくつかの代表的な修飾ヌクレオモノマーは、糖または主骨格修飾リボヌクレオチドを含む。修飾リボヌクレオチドは、５’−位で修飾されたウラジンまたはシチジン、例として５’−（２−アミノ）プロピルウラジンおよび５’−ブロモウラジン；８−位で修飾されたアデノシンおよびグアノシン、例として８−ブロモグアノシン；デアザヌクレオチド、例として７−デアザ−アデノシン；およびＮ−アルキル化ヌクレオチド、例としてＮ６−メチルアデノシンなどの非天然の塩基（天然塩基の代わりに）を含んでよい。また、糖修飾リボヌクレオチドは、Ｈ、アルコキシ（またはＯＲ）、Ｒまたはアルキル、ハロゲン、ＳＨ、ＳＲ、アミノ（ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２など）またはＣＮ基、ここでＲは低級アルキル、アルケニル、またはアルキニルである、で置き換えられた２’−ＯＨ基を有してよい。
【０１１０】
修飾リボヌクレオチドはまた、修飾基によって置換された隣接リボヌクレオチドと接続するリン酸エステル基、例としてホスホチオエート基、を有していてもよい。より一般的には、様々なヌクレオチド修飾が組み合わされてよい。
【０１１１】
１つの態様において、センスオリゴマーは、２’−修飾を末端に有してもよい（例として、各末端に２つ、各末端に３つ、および各末端に４つなど；同様に１つの末端に１つ、１つの末端に２つ、１つの末端に３つ、および１つの末端に４つ；ならびにさらに、１つの末端に１２個および他の末端に１０個などの、アンバランスな組み合わせ）。同様に、アンチセンス鎖は２’−修飾を末端に有してもよい（例として、各末端に２つ、各末端に３つ、および各末端に４つなど；同様に１つの末端に１つ、１つの末端に２つ、１つの末端に３つ、および１つの末端に４つ；ならびにさらに、１つの末端に１個および他の末端に２個などの、アンバランスな組み合わせ）。好ましい側面において、２’−修飾は、センスＲＮＡ鎖および／またはアンチセンス鎖における２’−Ｏ−メチル修飾である。
【０１１２】
本発明によれば、センス鎖は、中央の連結が非修飾である限り、多くの２’−修飾（２’−Ｏ−メチル修飾など）を許容し得る。本明細書で用いられる場合、「中央」は、センス鎖の幾何学的な中央点を意味するとは限定されない。むしろ、センス鎖の５’−末端部および３’−末端部の間の任意の場所を含み得る。センス鎖の５’−末端部および３’−末端部は、対称的である必要はない。
【０１１３】
したがって、ある態様において、センス鎖は完全には修飾されていない（すなわち、少なくとも１または２以上のセンス鎖ヌクレオチドが非修飾である）。ある態様において、非修飾のセンス鎖ヌクレオチドがセンス鎖の中央部にあり、または５’−末端上の一続きの修飾センス鎖ヌクレオチドおよび３’−末端上の一続きの修飾センス鎖ヌクレオチドの間にある。
【０１１４】
また本発明によれば、センス鎖の２’−修飾についての許容性は、必ずしも対称的でなくてよい。むしろ、非対称の形状は、例えば２５または２６ヌクレオチドのセンス鎖を使用する場合に望ましいことがある。２’−修飾はヌクレアーゼ安定性を付与し、およびインターフェロン誘導を低減し、および合成が容易である。したがって、本発明の教示がＲＮＡｉ活性を保存する限り、より多くのかかる２’−修飾リボース糖（特に２’−Ｏ−メチル修飾）をセンス鎖上に含むことが望ましいことがある。
【０１１５】
本発明のいくつかの態様において、最大のガイド鎖活性を可能にするために、主題の高度に修飾されたセンス鎖は、非修飾であるかまたは軽度に修飾されたアンチセンス鎖と組み合わされてよい。
エンド−およびエクソ−ヌクレアーゼ抵抗性をさらに最大化するために、２’−修飾ヌクレオモノマーを末端に使用するのに加えて、ホスホジエステル以外のヌクレオモノマー間結合を用いてよい。例えば、かかる末端ブロックは単独でまたは２’−Ｏ−メチル連結の間のホスホチオエート結合と組み合わせて用いてよい。好ましい２’−修飾ヌクレオモノマーは２’−修飾末端ヌクレオチドである。
【０１１６】
アンチセンス鎖は、標的遺伝子（または遺伝子群）の少なくとも一部と、少なくとも塩基対合特性に関して、実質的に同一であり得るけれども、例として標的遺伝子のフェノタイプの発現を阻害するのに、有用であるためには配列が完全に同一である必要はない。一般的に、高いホモロジーは、より短いアンチセンス遺伝子の利用を代償するために用いることができる。いくつかの場合において、アンチセンス鎖は一般的に、標的遺伝子と実質的に同一（アンチセンス方向ではあるけれども）であろう。
【０１１７】
本発明の組成物の１つの好ましい例は、センスオリゴヌクレオチドの両末端およびアンチセンスオリゴヌクレオチドの３’−末端のみに末端ブロックを有する。理論に束縛されるものではないが、おそらく効果的にほどけないために、２’−Ｏ−修飾センス鎖は、その非修飾版よりも良好に機能し得ない。したがって、ある態様において、ＲＩＳＣ複合体への容易な取り込みを促進するために、ミスマッチがセンス鎖（修飾された２’−Ｏ−メチルセンス鎖、または非修飾のセンス鎖であっても）の特定の位置に導入されてよい。
【０１１８】
いくつかの態様において、センス鎖の長さは、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９または１８ヌクレオチドであり得る。同様に、アンチセンス鎖の長さは、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９または１８ヌクレオチドであり得る。さらに、かかるセンスおよびアンチセンス分子から二本鎖核酸分子が形成された場合、得られるデュプレックスは、平滑末端または０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４ヌクレオチドのオーバーハングを、１つの末端または独立してそれぞれの末端に有していてよい。さらに、本発明の二本鎖核酸分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖から構成されてよく、ここでこれらの鎖は上述の長さであり、これらは同一または異なる長さであり、しかし１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０ヌクレオチドの配列相補性のみを共有する。例として、センス鎖が２０ヌクレオチドの長さであり、アンチセンスが２５ヌクレオチドの長さであり、２つの鎖が１５ヌクレオチドの配列相補性のみを共有する状況において、二本鎖核酸分子を、１０ヌクレオチドのオーバーハングを１つの末端に有し、５ヌクレオチドのオーバーハングを他方の末端に有して形成し得る。
【０１１９】
２’−Ｏ−メチルＲＮＡはまた、細胞のストレス応答を最小化することが望ましいという状況においても有益である。２’−Ｏ−メチルヌクレオモノマーを有するＲＮＡは、非修飾のＲＮＡを認識すると考えられている細胞機構に認識され得ない。２’−Ｏ−メチル化された、または部分的に２’−Ｏ−メチル化されたＲＮＡは、標的ＲＮＡ阻害を維持する一方で、二本鎖核酸に対するインターフェロン応答を回避し得る。このことは、例えば、インターフェロン応答を誘発する短鎖ＲＮＡｉ（ｓｉＲＮＡ）配列、およびインターフェロン応答を誘発し得る長鎖ＲＮＡｉ配列の両方において、インターフェロンまたは他の細胞性ストレス応答を回避するのに有用であり得る。
【０１２０】
概して、修飾糖は、Ｄ−リボース、２’−Ｏ−アルキル（２’−Ｏ−メチルおよび２’−Ｏ−エチルを含む）すなわち２’−Ｏ−アルコキシ、２’−アミノ、２’−Ｓ−アルキル、２’−ハロ（２’−フルオロを含む）、２’−メトキシエトキシ、２’−アリルオキシ（−ＯＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）、２’−プロパルギル、２’−プロピル、エチニル、エテニル、プロペニル、およびシアノなどを含んでよい。１つの態様において、糖部分はヘキソースであり得、記載されたようにオリゴヌクレオチドに組込まれ得る（Augustyns, K., et al., Nucl. Acids. Res. 18:471 1 (1992)）。代表的なヌクレオモノマーは、例としてＵＳ特許第５，８４９，９０２号に見出すことができ、本明細書に参照として組込まれる。
【０１２１】
「アルキル」という語は、直鎖アルキル基（例として、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシルなど）、分枝鎖アルキル基（イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソブチルなど）、シクロアルキル（脂環式）基（シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル）、アルキル置換シクロアルキル基、およびシクロアルキル置換アルキル基を含む飽和脂肪族基を含む。ある態様において、直鎖または分枝鎖のアルキルは、６またはそれより少ない炭素原子をその骨格に有し（例として、直鎖についてＣ１〜Ｃ６、分枝鎖についてＣ３〜Ｃ６）、より好ましくは４またはそれより少ない。同様に、好ましいシクロアルキルは、３〜８個の炭素原子をその環構造中に有し、より好ましくは５または６の炭素を環構造中に有する。Ｃ１〜Ｃ６という語は１から６個の炭素原子を含むアルキル基を含む。
【０１２２】
さらに、特別の定めのない限り、アルキルという後は、「非置換アルキル」および「置換アルキル」の両方を含み、後者は、炭化水素骨格の１または２以上の炭素原子上の水素原子を置き換えている独立して選択される置換基を有するアルキル部分をいう。かかる置換基は、例えば、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホナト、ホスフィナト、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノおよびアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェート、アルキルスルフィニル、スルホナト、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、または芳香族またはヘテロ芳香族部分を含むことができる。シクロアルキルは、例として上記の置換基でさらに置換され得る。「アルキルアリール」または「アリールアルキル」部分は、アリールで置換されたアルキル（例としてフェニルメチル（ベンジル））である。「アルキル」という語はまた、天然および非天然アミノ酸の側鎖を含む。「ｎ−アルキル」という語は、直鎖（すなわち分岐していない）非置換アルキル基を意味する。
【０１２３】
「アルケニル」という語は、長さおよび可能な置換において上記アルキルと同様であるが、少なくとも１つの二重結合を含む、不飽和の脂肪族基を含む。例えば「アルケニル」という語は、直鎖アルケニル基（例として、エチレニル、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル、ヘプテニル、オクテニル、ノネニル、デセニルなど）、分枝鎖アルケニル基、シクロアルケニル（脂環式）基（シクロプロペニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニル、シクロオクテニル）、アルキルまたはアルケニル置換シクロアルケニル基、およびシクロアルキルまたはシクロアルケニル置換アルケニル基を含む。ある態様において、直鎖または分枝鎖アルケニル基は、６またはそれより少ない炭素原子をその骨格に有する（例として、直鎖についてＣ２〜Ｃ６、分枝鎖についてＣ３〜Ｃ６）。同様に、好ましいシクロアルケニルは、３〜８個の炭素原子をその環構造中に有してよく、より好ましくは５または６の炭素を環構造中に有する。Ｃ２〜Ｃ６という語は２から６個の炭素原子を含むアルケニル基を含む。
【０１２４】
さらに、特別の定めのない限り、アルケニルという後は、「非置換アルケニル」および「置換アルケニル」の両方を含み、後者は、炭化水素骨格の１または２以上の炭素原子上の水素原子を置き換えている独立して選択される置換基を有するアルケニル部分をいう。かかる置換基は、例えば、アルキル基、アルキニル基、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホナト、ホスフィナト、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノおよびアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェート、アルキルスルフィニル、スルホナト、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、または芳香族またはヘテロ芳香族部分を含むことができる。
【０１２５】
「アルキニル」という語は、長さおよび可能な置換において上記アルキルと同様であるが、少なくとも１つの三重結合を含む、不飽和の脂肪族基を含む。例えば「アルキニル」という語は、直鎖アルキニル基（例として、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、ヘプチニル、オクチニル、ノニニル、デシニルなど）、分枝鎖アルキニル基、およびシクロアルキルまたはシクロアルケニル置換アルキニル基を含む。ある態様において、直鎖または分枝鎖アルキニル基は、６またはそれより少ない炭素原子をその骨格に有する（例として、直鎖についてＣ２〜Ｃ６、分枝鎖についてＣ３〜Ｃ６）。Ｃ２〜Ｃ６という語は２から６個の炭素原子を含むアルキニル基を含む。
【０１２６】
さらに、特別の定めのない限り、アルキニルという語は、「非置換アルキニル」および「置換アルキニル」の両方を含み、後者は、炭化水素骨格の１または２以上の炭素原子上の水素原子を置き換えている独立して選択される置換基を有するアルキニル部分をいう。かかる置換基は、例えば、アルキル基、アルケニル基、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホナト、ホスフィナト、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノおよびアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェート、アルキルスルフィニル、スルホナト、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、または芳香族またはヘテロ芳香族部分を含むことができる。
【０１２７】
炭素数が他に特別の定めのない限り、本明細書で用いられる場合「低級アルキル」は上記で定義された通りであるが１から５個の炭素原子をその主骨格構造に有するアルキル基を意味する。「低級アルケニル」および「低級アルキニル」は、例えば２〜５個の炭素原子の鎖長を有する。
【０１２８】
「アルコキシ」という語は、酸素原子に共有結合する置換および非置換のアルキル、アルケニル、およびアルキニル基を含む。アルコキシ基の例は、メトキシ、エトキシ、イソプロピルオキシ、プロポキシ、ブトキシおよびペントキシ基を含む。置換アルコキシ基の例は、ハロゲン化アルコキシ基を含む。アルコキシ基は、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホナト、ホスフィナト、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノおよびアルキルアリールアミノを含む）、 アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェート、アルキルスルフィニル、スルホナト、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、または芳香族またはヘテロ芳香族部分などの独立して選択される基で置換され得る。ハロゲン置換アルコキシ基の例は、これに限定するものではないが、フルオロメトキシ、ジフルオロメトキシ、トリフルオロメトキシ、クロロメトキシ、ジクロロメトキシ、トリクロロメトキシなどを含む。
【０１２９】
「ヘテロ原子」という語は、炭素または水素以外の任意の要素の原子を含む。好ましいヘテロ原子は窒素、酸素、硫黄およびリンである。
「ヒドロキシ」または「ヒドロキシル」という語は、−ＯＨまたは−Ｏ−（適切な対イオンを伴って）を含む。
「ハロゲン」という語は、フッ素、臭素、塩素、ヨウ素などを含む。「パーハロゲン化」は一般的に、全ての水素原子がハロゲン原子で置き換えられた基をいう。
【０１３０】
「置換（された）」という語は、部分上に置かれ得、分子が意図された機能を実行できるようにすることができる、独立して選択される置換基を含む。置換基の例は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、（ＣＲ’Ｒ’’）０〜３ＮＲ’Ｒ’’、（ＣＲ’Ｒ’’）０〜３ＣＮ、ＮＯ２、ハロゲン、（ＣＲ’Ｒ’’）０〜３Ｃ（ハロゲン）３、（ＣＲ’Ｒ’’）０〜３ＣＨ（ハロゲン）２、（ＣＲ’Ｒ’’）０〜３ＣＨ２（ハロゲン）、（ＣＲ’Ｒ’’）０〜３ＣＯＮＲ’Ｒ’’、（ＣＲ’Ｒ’’）０〜３Ｓ（Ｏ）１〜２ＮＲ’Ｒ’’、（ＣＲ’Ｒ’’）０〜３ＣＨＯ、（ＣＲ’Ｒ’’）０〜３Ｏ（ＣＲ’Ｒ’’）０〜３Ｈ、（ＣＲ’Ｒ’’）０〜３Ｓ（Ｏ）０〜２Ｒ’、（ＣＲ’Ｒ’’）０〜３Ｏ（ＣＲ’Ｒ’’）０〜３Ｈ、（ＣＲ’Ｒ’’）０〜３ＣＯＲ’、（ＣＲ’Ｒ’’）０〜３ＣＯ２Ｒ’、または（ＣＲ’Ｒ’’）０〜３ＯＲ’基、ここで各Ｒ’およびＲ’’はそれぞれ独立して水素、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、Ｃ２〜Ｃ５アルケニル、Ｃ２〜Ｃ５アルキニル、またはアリール基、あるいはＲ’およびＲ’’が一緒になってベンジリデン基または−（ＣＨ２）２Ｏ（ＣＨ２）２−基となる、を含む。
【０１３１】
「アミン」または「アミノ」という語は、窒素原子が少なくとも１つの炭素またはヘテロ原子と共有結合している化合物または部分を含む。「アルキルアミノ」という語は、窒素原子が少なくとも１つの追加のアルキル基と結合している基または化合物を含む。「ジアルキルアミノ」という語は、窒素原子が少なくとも２つの追加のアルキル基と結合している基または化合物を含む。
【０１３２】
「エーテル」という語は、２つの異なる炭素原子またはヘテロ原子と結合する酸素を含む化合物または部分を含む。例えば、この語は、別のアルキル基と共有結合している酸素原子と共有結合しているアルキル、アルケニルまたはアルキニル基をいう「アルコキシアルキル」を含む。
【０１３３】
「塩基」という語は、既知のプリンおよびピリミジン複素環塩基、デアザプリン、およびそのアナログ（複素環置換アナログ、例としてアミノエチオキシフェノキサジン、を含む）、誘導体（例として、ｌ−アルキル−、ｌ−アルケニル−、ヘテロ芳香族−およびｌ−アルキニル誘導体）、および互変異性体を含む。プリンの例は、アデニン、グアニン、イノシン、ジアミノプリンおよびキサンチン、およびそのアナログ（例として、８−オキソ−Ｎ６−メチルアデニンまたは７−ジアザキサンチン）および誘導体を含む。ピリミジンは、例えばチミン、ウラシルおよびシトシン、およびそのアナログ（例として５−メチルシトシン、５−メチルウラシル、５−（１−プロピニル）ウラシル、５−（１−プロピニル）シトシンおよび４，４−エタノシトシン）を含む。他の好適な塩基の例は、２−アミノピリジンおよびトリアジンなどの非プリニルおよび非ピリミジニル塩基を含む。
【０１３４】
好ましい態様において、本発明のオリゴヌクレオチドのヌクレオモノマーは、ＲＮＡヌクレオチドである。別の好ましい態様において、本発明のオリゴヌクレオチドのヌクレオモノマーは、修飾ＲＮＡヌクレオチドである。したがって、オリゴヌクレオチドは修飾ＲＮＡヌクレオチドを含む。
「ヌクレオシド」という語は、糖部分、好ましくはリボースまたはデオキシリボース、に共有結合している塩基を含む。好ましいヌクレオシドの例は、リボヌクレオシドおよびデオキシリボヌクレオシドを含む。ヌクレオシドはまた、遊離カルボキシル基、遊離アミノ基、または保護基を含んでもよいアミノ酸またはアミノ酸アナログに連結する塩基を含む。好適な保護基は当該技術分野において周知である（P. G. M. Wuts and T. W. Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis", 2nd Ed., Wiley-Interscience, New York, 1999参照）。
【０１３５】
「ヌクレオチド」という語は、さらにリン酸基またはリン酸アナログを含むヌクレオシドを含む。
本明細書で使用される場合、「連結（linkage）」という語は、隣接するヌクレオモノマーを共有的に結びつける、天然の、非修飾ホスホジエステル部分（−Ｏ−（ＰＯ２−）−Ｏ−）を含む。本明細書で使用される場合、「置換連結」という語は、隣接するヌクレオモノマーを共有的に結びつける、自然のホスホジエステル基の任意のアナログまたは誘導体を含む。置換連結は、ホスホジエステルアナログ、例としてホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、およびＰ−エチオキシホスホジエステル、Ｐ−エトキシホスホジエステル、Ｐ−アルキルオキシホスホトリエステル、メチルホスホネート、および非リン含有連結、例としてアセタールおよびアミド、を含む。かかる置換連結は当該技術分野において公知である（例として、Bjergarde et al., 1991, Nucleic Acids Res. 19:5843; Caruthers et al., 1991, Nucleosides Nucleotides, 10:47）。ある態様において、非加水分解性連結は、好ましくは、ホスホロチエート結合などである。
【０１３６】
ある態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、３’および５’末端を含む（環状オリゴヌクレオチドを除く）。１つの態様において、オリゴヌクレオチドの３’および５’末端は、例として３’または５’連結を修飾することにより（例として米国特許第５，８４９，９０２号およびＷＯ９８／１３５２６）、ヌクレアーゼから実質的に保護されている。例えば、「ブロッキング基」の包含により、オリゴヌクレオチドを抵抗性にすることができる。本明細書において使用する場合の「ブロッキング基」という語は、合成のための保護基としてまたはカップリング基として（例として、ＦＩＴＣ、プロピル（ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ３）、グリコール（−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）、ホスフェート（ＰＯ３２−）、亜リン酸（hydrogen phosphonate）、またはホスホロアミダイト）、オリゴヌクレオチドまたはヌクレオモノマーに取り付けることができる置換基（例としてＯＨ基以外）をいう。「ブロッキング基」はまた、オリゴヌクレオチドの５’および３’末端を保護する「末端ブロッキング基」または「エクソヌクレアーゼブロッキング基」を含み、これらは修飾ヌクレオチドおよび非ヌクレオチドエクソヌクレアーゼ抵抗性構造を含む。
【０１３７】
代表的な末端ブロッキング基は、キャップ構造（例として、７−メチルグアノシンキャップ）、反転ヌクレオモノマー、例として、３’−３’または５’−５’末端反転（例としてOrtiagao et al. 1992, Antisense Res. Dev. 2:129参照）、メチルホスホネート、ホスホロアミダイト、非ヌクレオチド基（例として非ヌクレオチドリンカー、アミノリンカー、抱合体(conjugate)）などを含む。３’末端ヌクレオモノマーは修飾糖部分を含むことができる。３’末端ヌクレオモノマーは、任意に、オリゴヌクレオチドの３’−エクソヌクレアーゼ分解を防ぐブロッキング基によって置換されることができる３’−Ｏを含む。例えば３’−ヒドロキシルは３’→３’ヌクレオチド間結合を介してヌクレオチドとエステル結合することができる。例えば、アルコキシラジカルはメトキシ、エトキシまたはイソプロポキシであることができ、好ましくはエトキシである。任意に、３’末端における３’→３’連結ヌクレオチドは、置換連結によって連結されることができる。ヌクレアーゼ分解を低減するため、最も５’側の３’→５’連結は修飾連結、例としてホスホロチオエートまたはＰ−アルキルオキシホスホトリエステル結合、であり得る。好ましくは、２つの最も５’側の３’→５’連結が修飾連結である。任意に、５’末端ヒドロキシ部分はリン含有部分、例としてリン酸、ホスホロチオエート、またはＰ−エトキシリン酸、とエステル結合していることができる。
【０１３８】
１つの態様において、オリゴヌクレオチドのセンス鎖は、ＲＮＡｉ活性が可能であるが遺伝子標的に関してセンス鎖を非活性な状態にする５’基を含む。好ましくは、かかる５’修飾基はリン酸基またはリン酸基よりも大きな基である。このタイプのオリゴヌクレオチドは、しばしばアンチセンス鎖のヌクレオチド配列に対応する細胞中の標的遺伝子についての増大した特異性を呈す。これはかかるオリゴヌクレオチド中のセンス鎖が、しばしば非特異的に結合し得る任意のヌクレオチド配列の切断を媒介できなくなり、したがって細胞中の任意の他の遺伝子を不活性化しないであろうからである。したがって、かかるオリゴヌクレオチドでトランスフェクトされた細胞中における遺伝子の発現において観察される減少は、しばしばアンチセンス鎖の直接的または間接的な効果が原因となるであろう。本明細書において用いられる場合の「標的遺伝子についての特異性」という語は、細胞におけるオリゴヌクレオチドの効果がどの程度直接的または間接的に、前記オリゴヌクレオチド中に存在するアンチセンスヌクレオチド配列による標的遺伝子発現の阻害の原因となれるかを意味する。
【０１３９】
したがって、別の態様によれば、本発明は細胞中における標的遺伝子についてのオリゴヌクレオチドの特異性を増大する方法であって、該オリゴヌクレオチドがセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、該センス鎖および該アンチセンス鎖の両方が、前記細胞中に存在した場合、対応するヌクレオチド配列が結合することができ、前記方法が、前記センス鎖が、それが非特異的に結合し得る任意のヌクレオチド配列の切断を媒介することを不可能にするために、前記オリゴヌクレオチドと前記細胞とを接触させる前に、前記センス鎖の５’末端ヒドロキシ部分を、リン酸基またはリン酸基より大きな基で修飾するステップを含み、したがって細胞中の任意の他の遺伝子を不活性化しない、前記方法を提供する。
【０１４０】
標的遺伝子特異性を増大する、またはオフターゲットサイレンシング効果を低減する別の方法は、ダイサー切断された２１マーのヌクレオチドの５’末端から２番目に対応する位置に２’−修飾（２’−Ｏメチル修飾など）を導入することである。出願人らの発見は、この２’−修飾をダイサー抵抗性ｄｓＲＮＡ中に配置することを可能にし、したがってオフターゲットサイレンシングがより少ないか全くない、より優れたｓｉＲＮＡコンストラクトを設計することができる。
【０１４１】
１つの態様において、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡである１つの核酸分子およびＲＮＡコンストラクトである一つの核酸分子を含むことができる（すなわち、デュプレックスであることができる）。本発明のアンチセンス配列は、ＲＮＡ様およびＤＮＡ様領域を含む「キメラオリゴヌクレオチド」であることができる。
【０１４２】
「ＲＮａｓｅＨ活性化領域」という言葉は、オリゴヌクレオチド、例としてキメラオリゴヌクレオチド、の領域を含み、ここで前記オリゴヌクレオチドが結合した標的ＲＮＡ鎖を切断するのにＲＮａｓｅＨを採用することができる。典型的には、ＲＮａｓｅ活性化領域は、（少なくとも約３〜５個の、典型的には約３〜１２個の間の、より典型的には約５〜１２個の間の、およびより好ましくは約５〜１０個の間の連続したヌクレオモノマーの）ＤＮＡまたはＤＮＡ様ヌクレオモノマーの最小限のコアを含む（例として、米国特許第５，８４９，９０２号参照）。好ましくは、ＲＮａｓｅＨ活性化領域は、約９個の連続したデオキシリボース含有ヌクレオモノマーを含む。
【０１４３】
「非活性化領域」という言葉は、ＲＮａｓｅＨをリクルートしないかまたは活性化しない、アンチセンス配列の領域、例としてキメラオリゴヌクレオチド、を含む。好ましくは、非活性化領域はホスホロチオエートＤＮＡを含まない。本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも1つの非活性化領域を含む。１つの態様において、非活性化領域は、ヌクレアーゼに対して安定化されることができるか、または、標的と相補的にし、オリゴヌクレオチドによって結合される標的核酸分子と水素結合を形成することにより、標的についての特異性を提供することができる。
【０１４４】
１つの態様において、連続的なポリヌクレオチドの少なくとも一部は置換連結、例としてホスホロチオエート結合、によって連結されている。
ある態様において、ほとんどまたは全てのセンス鎖ヌクレオチド（２’−修飾であるかまたはない）は、ホスホロチオエート結合によって連結されている。かかるコンストラクトは、その血清タンパク質との高い親和性に起因して、改善された薬物動態を有する傾向にある。センス鎖におけるホスホチオエート結合は一般的に、一旦ガイド鎖がＲＩＳＣに取り込まれれば、ガイド鎖活性を妨げない。
【０１４５】
本発明のアンチセンス配列は、「モルホリノオリゴヌクレオチド」を含んでよい。モルホリノオリゴヌクレオチドは非イオン性であり、ＲＮａｓｅＨ非依存性メカニズムによって機能する。モルホリノオリゴヌクレオチドの各４つの遺伝子塩基（アデニン、シトシン、グアニンおよびチミン／ウラシル）は６員モルホリン環と連結している。モルホリノオリゴヌクレオチドは、例として非イオン性ホスホロジアミデートサブユニット間結合により、４つの異なるサブユニットタイプを結びつけることにより作られる。モルホリノオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼに対する完全な抵抗性（Antisense & Nucl. Acid Drug Dev. 1996. 6:267）、予測可能なターゲティング（Biochemica Biophysica Acta. 1999. 1489:141）、細胞中での信頼できる活性（Antisense & Nucl. Acid Drug Dev. 1997. 7:63）、すばらしい配列特異性（Antisense & Nucl. Acid Drug Dev. 1996. 7:151）、最小限の非アンチセンス活性（Biochemica Biophysica Acta. 1999. 1489:141）、および単純な浸透圧性またはスクレイプ送達（osmotic or scrape delivery）（Antisense & Nucl. Acid Drug Dev. 1997. 7:291）を含む多くの利点を有する。モルホリノオリゴヌクレオチドはまた、高用量におけるその非毒性の点でも好ましい。モルホリノオリゴヌクレオチドの調製についての議論は、Antisense & Nucl. Acid Drug Dev. 1997. 7:187に見出すことができる。
【０１４６】
ＩＩＩ．合成
本発明のオリゴヌクレオチドを、当該技術分野において知られた任意の方法、例として酵素合成および／または化学合成の使用、によって合成することができる。本オリゴヌクレオチドを、in vitroで（例として、酵素合成および化学合成の使用）またはin vivoで（当該技術分野において周知の組換えＤＮＡ技術の使用）合成することができる。
【０１４７】
好ましい態様において、修飾ポリヌクレオチドについて、化学合成を用いる。直鎖オリゴヌクレオチドの化学合成は、当該技術分野において周知であり、溶液または固相技術によって達成することができる。好ましくは、合成は固相法による。オリゴヌクレオチドは、ホスホロアミダイト、亜リン酸トリエステル、Ｈ−ホスホネート、およびホスホトリエステル法を含む任意のいくつかの異なる合成手順によって、典型的には自動合成法によって作ることができる。
【０１４８】
オリゴヌクレオチド合成プロトコルは当該技術分野において周知であり、例として米国特許第５，８３０，６５３号、ＷＯ９８／１３５２６、Stec et al. 1984. J. Am. Chem. Soc. 106:6077、Stec et al. 1985. J. Org. Chem. 50:3908、Stec et al. J. Chromatog. 1985. 326:263、LaPlanche et al 1986. Nucl. Acid. Res. 1986. 14:9081、Fasman G. D., 1989. Practical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology. 1989. CRC Press, Boca Raton, FIa.、Lamone. 1993. Biochem. Soc. Trans. 21 : 1、米国特許第５，０１３，８３０号、米国特許第５，２１４，１３５号、米国特許第５，５２５，７１９号、Kawasaki et al. 1993. J. Med. Chem. 36:831、ＷＯ９２／０３５６８、米国特許第５，２７６，０１９号および米国特許第５，２６４，４２３号に見出すことができる。
【０１４９】
選択される合成方法は、所望のオリゴヌクレオチドの長さに依存し得、かかる選択は通常の当業者の能力の範囲内である。例えば、ホスホロアミダイトおよび亜リン酸トリエステル法は１７５またはそれ以上のヌクレオチドを産生することができ、一方Ｈ−ホスホネート法は１００未満のオリゴヌクレオチドについてよく動作する。修飾塩基がオリゴヌクレオチドに組み込まれる場合、および特に修飾ホスホジエステル結合が用いられる場合、合成手順は既知の手順に従って必要なように改変される。これに関し、Uhlmann et al. (1990, Chemical Reviews 90: 543-584)が、修飾塩基および修飾ホスホジエステル結合を有するオリゴヌクレオチドの作製の参照および手順のアウトラインを提供する。オリゴヌクレオチドの作製の他の代表的な方法はSonveaux. 1994. "Protecting Groups in oligonucleotide Synthesis";Agrawal. Methods in Molecular Biology 26:1に教示されている。代表的な合成方法はまた、"Oligonucleotide Synthesis - A Practical Approach" (Gait, M. J. IRL Press at Oxford University Press. 1984)に教示されている。さらに、定義された配列の直鎖オリゴヌクレオチド、修飾ヌクレオチドを有するいくつかの配列を含む、はいくつかの商業的供給源から容易に入手できる。
【０１５０】
オリゴヌクレオチドはポリアクリルアミドゲル電気泳動、または任意の多くのクロマトグラフィー法、ゲルクロマトグラフィーおよび高圧液体クロマトグラフィーを含む、によって精製されてよい。ヌクレオチド配列、特に非修飾ヌクレオチド配列、を確認するためオリゴヌクレオチドを任意の既知の手順、マクサムおよびギルバートシークエンシング、サンガーシークエンシング、キャピラリー電気泳動シークエンシング、ワンダリングスポットシークエンシング手順を含む、によってまたはハイボンドペーパーに結合したオリゴヌクレオチドの選択的化学分解によって、ＤＮＡシークエンシングにかけてもよい。短鎖オリゴヌクレオチドの配列はまた、レーザー分解質量分析または高速原子衝突によっても分析することができる（McNeal, et al., 1982, J. Am. Chem. Soc. 104:976; Viari, et al., 1987, Biomed. Environ. Mass Spectrom. 14:83; Grotjahn et al., 1982, Nuc. Acid Res. 10:4671）。シークエンシング法はＲＮＡオリゴヌクレオチドにも利用可能である。
【０１５１】
合成されたオリゴヌクレオチドの質は、例としてBergot and Egan. 1992. J. Chrom. 599:35を用いた、キャピラリー電気泳動および変性強アニオンＨＰＬＣ（ＳＡＸ−ＨＰＬＣ）によってオリゴヌクレオチドを試験することによって検証することができる。
【０１５２】
他の代表的な合成技術は当該技術分野に周知である（例として、Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual第２版 (1989); DNA Cloning, Volumes IおよびII (DN Glover Ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M J Gait Ed, 1984; Nucleic Acid Hybridisation (B D Hames and S J Higgins eds. 1984); A Practical Guide to Molecular Cloning (1984);またはMethods in Enzymologyシリーズ (Academic Press, Inc.)参照)。
【０１５３】
ある態様において、主題のＲＮＡｉコンストラクトまたは少なくともその一部分は主題のコンストラクトをコードする発現ベクターから転写される。任意の当該技術分野で認識されたベクターをこの目的に用いてよい。転写されたＲＮＡｉコンストラクトは、所望の修飾（非修飾のセンス鎖と修飾センス鎖とを置き換えるなど）がなされる前に単離および精製されてよい。
【０１５４】
ＩＶ．送達／担体
細胞によるオリゴヌクレオチドの取り込み
オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド組成物は、１または２以上の細胞または細胞溶解物に接触され（すなわち、接触に至らされる、また本明細書において投与されるまたは送達されるともいわれる）、および取り込まれる。「細胞」という語は、原核および真核細胞を含み、好ましくは脊椎動物細胞であり、およびより好ましくは哺乳類細胞である。好ましい態様において、本発明のオリゴヌクレオチド組成物は、ヒト細胞と接触される。
【０１５５】
本発明のオリゴヌクレオチド組成物in vitroで、例として試験管または培養皿内で、（および対象に導入されてもされなくてもよく）、またはin vivoで、例として哺乳類対象などの対象内で、細胞と接触させることができる。オリゴヌクレオチドはエンドサイトーシスによって低速で細胞に取り込まれるが、エンドサイトーシスされたオリゴヌクレオチドは一般的に隔離され、例として標的核酸分子へのハイブリダイゼーションには利用できない。１つの態様において、細胞への取り込みは、エレクトロポレーションまたはリン酸カルシウム沈殿によって促進することができる。しかしながら、これらの手順は、in vitroまたはex vivoの態様においてのみ有用であり、便利ではなく、およびいくつかの場合において細胞毒性を伴う。
【０１５６】
別の態様において、オリゴヌクレオチドの細胞内への送達は、リン酸カルシウム、ＤＭＳＯ、グリセロールまたはデキストラン、エレクトロポレーションを含む好適な当該技術分野に認識された方法またはトランスフェクション、例として当該技術分野において既知の、カチオン性、アニオン性または中性脂質組成物またはリポソームを用いた方法によって増強され得る（例として、WO 90/14074; WO 91/16024; WO 91/17424; U.S. Pat. No. 4,897,355; Bergan et al. 1993. Nucleic Acids Research. 21 :3567参照）。オリゴヌクレオチドの増強された送達はまた、ベクター（例として、Shi, Y. 2003. Trends Genet 2003 Jan. 19:9; Reichhart J M et al. Genesis. 2002. 34( 1 -2): 1604, Yu et al. 2002. Proc. Natl. Acad Sci. USA 99:6047; Sui et al. 2002. Proc. Natl. Acad Sci. USA 99:5515参照）、ウィルス、ポリアミンまたはポリリジン、プロタミンまたはＮｉ，Ｎ１２−ビス（エチル）スペルミンなどのポリカチオン抱合体を用いた化合物の使用によって媒介することができる（例として、Bartzatt, R. et al.1989. Biotechnol. Appl. Biochem. 1 1 :133; Wagner E. et al. 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. 88:4255参照）。
【０１５７】
オリゴヌクレオチドの取り込みについての最適なプロトコルは多数の因子に依存し、最も重要なものは用いられた細胞のタイプであろう。取り込みに重要な他の因子は、これに限定するものではないが、オリゴヌクレオチドの性質および濃度、細胞の集密度、細胞培養のタイプ（例として、懸濁培養または平板培養）および細胞が成育している培地のタイプを含む。
【０１５８】
抱合剤
抱合剤はオリゴヌクレオチドと共有的に結合している。１つの態様において、オリゴヌクレオチドは、抱合体と結合して細胞取り込みを促進するために、誘導体化するか、または化学的に修飾してもよい。例えば、コレステロール部分とオリゴヌクレオチドとの共有結合は、細胞取り込みを５〜１０倍改善することができ、そしてその結果ＤＮＡ結合を約１０倍改善することができる（Boutorin et al., 1989, FEBS Letters 254:129-132）。オクチル、ドデシルおよびオクタデシル残基の抱合は、非修飾のオリゴヌクレオチドと比較して、細胞取り込みを３、４および１０倍増強する（Valassov et al., 1994, Biochimica et Biophysica Acta 1197:95-108）。同様に、ポリ−Ｌ−リジンによるオリゴヌクレオチドの誘導体化は、細胞によるオリゴヌクレオチドの取り込みを助けることができる（Schell, 1974, Biochem. Biophys. Acta 340:323,およびLemaitre et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci USA 84:648）。
【０１５９】
あるタンパク質担体もまた、オリゴヌクレオチドの細胞取り込みを促進することができ、例えば血清アルブミン、核内へ移行するシグナルを保有する核タンパク質、および細胞膜透過可能なウィルス性または細菌性タンパク質を含む。ゆえにタンパク質担体は、オリゴヌクレオチドと会合したまたは連結した場合に有用である。したがって本発明は、炭化水素および非極性基、コレステロール、長鎖アルコール（すなわちヘキサノール）、ポリ−Ｌ−リジンおよびタンパク質、ならびにフェニルまたはナフチル基、キノリン、アントラセン、またはフェナントラセン基、脂肪酸、脂肪族アルコールおよびセスキテルペン、ジテルペンおよびステロイド類などの、類似の有用な効果を有する他のアリールまたはステロイド基およびポリカチオン、を含むオリゴヌクレオチドの細胞取り込みを促進することができる基での誘導体化を提供する。抱合体を用いることの主要な利点は、オリゴヌクレオチドのより多くの細胞内蓄積を導く、最初の膜相互作用を増大することである。
【０１６０】
他の抱合剤は、ＲＮＡｉコンストラクトを脂肪組織−ビタミンが貯蔵されている主要な場所−に特異的に送達するために用いられ得る脂溶性ビタミンなどの様々なビタミンを含む。これらのビタミンベース抱合剤は、糖尿病／肥満症などのある代謝性障害標的を標的とするのに特に有用である。ビタミンＡ、Ｄ、Ｅ、Ｋなど脂溶性ビタミンについて、ビタミンＫが、上限摂取レベルが知られていないため（高い用量は、赤血球の溶解およびおそらく肝臓病に導くものであっても）、いくつかの態様において好ましい。これに対し、ビタミンＡおよびＤは、より定義された毒性および確立された上限摂取レベルを有する。
【０１６１】
ある態様において、ガンマカルボキシグルタミン酸残基は、主題のＲＮＡｉコンストラクトに抱合され、その膜粘性を増大し、かつ／またはクリアランスを遅くし、一般的な取り込みを改善する（以下）。
【０１６２】
本発明のコンストラクトと一緒に用いられ得るある抱合剤は、Ｔａｔペプチド、WO04048545A2およびUS20040204377A1の配列番号１２の配列、ホメオボックス（ｈｏｘ）ペプチドと実質的に類似の配列、ＭＴＳ、ＶＰ２２、ＭＰＧ、少なくとも１つのデンドリマー（ＰＡＭＡＭなど）などの、WO04048545A2およびUS20040204377A1（全てその全体が本明細書に組込まれる）に記載されている。
【０１６３】
本発明のコンストラクトと一緒に用いられ得る他の抱合剤は、様々なナノトランスポーターおよび核酸分子（主題のｄｓＲＮＡコンストラクトなど）および／または他の薬剤のin vivoおよびin vitroでの送達に用いるための送達複合体を記載したWO07089607A2（本明細書に組込まれる）に記載されているものを含む。かかる送達複合体を用いて、主題のｄｓＲＮＡは、少なくとも１の機能性表面基（functional surface group）と抱合されたコアを有するナノトランスポーターと抱合したりまたは会合したりしながら、送達され得る。コアは、デンドリマー（例としてポリリジンデンドリマー）などのナノ粒子であってよい。コアはまた、単層ナノチューブまたは多層ナノチューブなどのナノチューブであってもよい。機能性表面基は、少なくとも1つの脂質、細胞タイプ特異的ターゲティング部分、蛍光分子および電荷コントロール分子である。例えば、ターゲティング部分は組織選択的ペプチドであってもよい。脂質はオレオイル脂質またはその誘導体であってよい。代表的なナノトランスポーターは、ＮＯＰ−７またはＨＢＯＬＤを含む。
【０１６４】
封入剤
封入剤は、オリゴヌクレオチドをベシクル内に閉じ込める。本発明の別の態様において、オリゴヌクレオチドは担体またはビヒクル、例としてリポソームまたはミセルであるが、当業者に十分理解されるように他の担体も用いることができる、と会合していてよい。リポソームは、生体膜と類似の構造を有する、脂質二重膜で作られるベシクルである。かかる担体は、オリゴヌクレオチドの細胞取り込みまたはターゲティングを促進するために用いられ、またはオリゴヌクレオチドの薬物動態学的または毒物学的特性を改善するために用いられる。
【０１６５】
例えば、本発明のオリゴヌクレオチドはリポソームに封入されて、活性成分が分散しているかまたは脂質層に付着した水性の同心円層からなる微粒子として様々に存在している医薬組成物として投与されてもよい。溶解性に依存して、オリゴヌクレオチドは水性相および脂質層両方に存在し得、または一般的にリポソーム性懸濁液（liposomic suspension）と言われる状態である。疎水性層は、一般的にだが排他的ではなく、レシチンおよびスフィンゴミエリンなどのリン脂質、コレステロールなどのステロイド、ジアセチルホスフェート、ステアリルアミン、またはホスファチジン酸などの多かれ少なかれイオン性の界面活性剤、または疎水性の性質である他の材料を含む。リポソームの直径は一般的に約１５ｎｍから約５ミクロンである。
【０１６６】
薬物送達ビヒクルとしてのリポソームの利用は、いくつかの利点を提示する。リポソームは細胞間安定性を増大し、取り込み効率を増大し、生物活性を改善する。リポソームは、細胞膜を形成する脂質と類似のあり方で配列される脂質で構成される中空の球状ビヒクルである。それらは水溶性化合物を閉じ込める内在性の水性空間を有し、直径で０．０５から数ミクロンのサイズの範囲である。いくつかの研究が、リポソームが核酸を細胞に送達することができることおよび核酸が依然として生物学的に活性であることを示してきた。例えば、最初は研究ツールとして設計された脂質送達ビヒクル、リポフェクタミンまたはLIPOFECTAMINETM２０００などは、完全な核酸分子を細胞に送達することができる。
【０１６７】
リポソームを用いることの具体的な利点は、以下を含む：それらは組成物中で非毒性かつ生分解性である；それらは長い循環半減期を示す；そして認識分子はすぐに組織ターゲティングのためにその表面に取り付く。最後に、液体懸濁物または凍結乾燥製品いずれでも費用効果の高い製品であるリポソームベースの医薬品は、許容可能な薬物送達システムとしてのこの技術の実行可能性を実証してきた。
【０１６８】
錯化剤(complexing agent)
錯化剤は、本発明のオリゴヌクレオチドと、強いが非共有結合性の引力（例として、静電気的、ファンデルワールス、パイスタッキングなどの相互作用）によって結合する。１つの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは錯化剤と複合し、オリゴヌクレオチドの細胞取り込みを増大する。錯化剤の例は、カチオン性脂質を含む。カチオン性脂質はオリゴヌクレオチドの細胞への送達に使用可能である。
【０１６９】
「カチオン性脂質」という語は、極性および非極性ドメインの両方を有し、生理学的ｐＨまたはその近傍において正に帯電する能力があり、核酸などのポリアニオンと結合し、核酸の細胞内への送達を促進する脂質および合成脂質を含む。一般に、カチオン性脂質は、飽和および不飽和のアルキルおよび脂環式エーテルおよびアミン、アミド、またはその誘導体のエステルを含む。カチオン性脂質の直鎖および分枝鎖アルキルおよびアルケニル基は、例として１から約２５の炭素原子を含有する。好ましい直鎖または分枝鎖アルキルまたはアルケン基は６またはそれ以上の炭素原子を有する。脂環式基はコレステロールおよび他のステロイド基を含む。カチオン性脂質は、例としてＣｌ−、Ｂｒ−、Ｉ−、Ｆ−、アセテート、トリフルオロアセテート、スルフェート、ニトライト、およびニトレートを含む様々な対イオン（アニオン）で調製することができる。
【０１７０】
カチオン性脂質の例は、ポリエチレンイミン、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）、星型デンドリマー、リポフェクチン（ＤＯＴＭＡおよびＤＯＰＥの組み合わせ）、リポフェクターゼ、LIPOFECTAMINETM（例として、LIPOFECTAMINETM２０００）、ＤＯＰＥ、サイトフェクチン（Gilead Sciences, Foster City, Calif.）、およびEufectins（JBL, San Luis Obispo, Calif.）を含む。代表的なカチオン性リポソームは、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオロキシ）−プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオロキシ）−プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルスルフェート（ＤＯＴＡＰ）、３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、２，３，−ジオレオロキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロマイド；およびジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイド（ＤＤＡＢ）から作ることができる。カチオン性脂質Ｎ−［１−（２，３−ジオレオロキシ）−プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）は、例えば、ホスホチオエートオリゴヌクレオチドのアンチセンス効果を１０００倍増大することが見出された（Vlassov et al., 1994, Biochimica et Biophysica Acta 1197:95-108）。オリゴヌクレオチドはまた、例としてポリ（Ｌ−リジン）またはアビジンと複合することができ、脂質はこの混合物中に含まれていても含まれていなくてもよく、例としてステリル−ポリ（Ｌ−リジン）である。
【０１７１】
カチオン性脂質は、当該技術分野において、オリゴヌクレオチドを細胞に送達するために使用されている（例として、米国特許５，８５５，９１０；５，８５１，５４８；５，８３０，４３０；５，７８０，０５３；５，７６７，０９９；Lewis et al. 1996. Proc. Natl. Acad. Sci USA 93:3176; Hope et al. 1998. Molecular Membrane Biology 15:1参照）。本発明のオリゴヌクレオチドの取り込みを促進するのに使用することができる他の脂質組成物は、請求された方法に関連して使用することができる。これら上記の列挙されたものに加えて、他の脂質組成物がまた当該技術分野において既知であり、例として、米国特許４，２３５，８７１；米国特許４，５０１，７２８；４，８３７，０２８；４，７３７，３２３に教示されるもの、を含む。
【０１７２】
１つの態様において、脂質組成物はさらに、オリゴヌクレオチドの脂質媒介性トランスフェクションのための剤、例としてウィルス性タンパク質を含むことができる（Kamata, et al., 1994. Nucl. Acids. Res. 22:536）。別の態様において、オリゴヌクレオチドを、例として米国特許５，７３６，３９２に教示されているように、オリゴヌクレオチド、ペプチド、および脂質を含む組成物の一部として細胞と接触させる。血清抵抗性である改良された脂質もまた開示されている（Lewis et al. 1996. Proc. Natl. Acad. Sci USA 93:3176）。カチオン性脂質および他の錯化剤は、エンドサイトーシスを介して細胞中に運ばれるオリゴヌクレオチドの数を増大するように作用する。
【０１７３】
別の態様において、オリゴヌクレオチドの取り込みの至適化のためにＮ−置換グリシンオリゴヌクレオチド（ペプトイド）を用いることができる。ペプトイドは、トランスフェクションのためのカチオン性脂質様の化合物を作出するために用いられている（Murphy, et al., 1998. Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 1517）。ペプトイドは、標準的な方法を用いて合成することができる（例として、Zuckermann, R. N., et al. 1992. J. Am. Chem. Soc. 114:10646; Zuckermann, R. N., et al. 1992. Int. J. Peptide Protein Res. 40:497）。カチオン性脂質およびペプトイド、リプトイド（liptoid）の組み合わせもまた、主題のオリゴヌクレオチドの取り込みの至適化に用いることができる（Hunag, et al., 1998. Chemistry and Biology. 5:345）。リプトイドは、ペプトイドオリゴヌクレオチドを合成し、アミノ末端サブモノマーを脂質に、そのアミノ基を介してカップリングすることによって合成できる（Hunag, et al., 1998. Chemistry and Biology. 5:345）。
【０１７４】
正に帯電したアミノ酸が高度に活性なカチオン性脂質の作出に用いることができることは、当該技術分野において既知である（Lewis et al. 1996. Proc. Natl. Acad. Sci USA 93:3176）。１つの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドを送達するための組成物は、親油性部分に連結した多くのアルギニン、リジン、ヒスチジンまたはオルニチン残基を含む（例として、米国特許第５，７７７，１５３号参照）。
【０１７５】
別の態様において、本発明のオリゴヌクレオチドを送達するための組成物は、約１から約４の間の塩基残基を有するペプチドを含む。これらの塩基残基は、例としてアミノ末端、Ｃ末端またはペプチドの内部領域に位置することができる。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例として、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例としてアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例としてグリシン（非極性と考えられることもあり得る）、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例として、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ−分枝側鎖（例として、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例として、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。塩基性アミノ酸とは別に、ペプチドの大部分または全ての他の残基は非塩基性アミノ酸、例として、リジン、アルギニン、またはヒスチジン以外のアミノ酸、から選択することができる。好ましくは、長い中性側鎖を有する中性アミノ酸が優位に用いられる。
【０１７６】
１つの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドを送達するための組成物は、ガンマカルボキシグルタミン酸残基またはγ−Ｇｌａ残基を１または２以上有する天然または合成のポリペプチドを含む。これらのガンマカルボキシグルタミン酸残基は、ポリペプチドがお互いに、および膜表面に結合することを可能にする。言い換えれば、一連のγ−Ｇｌａを有するポリペプチドは、ＲＮＡｉコンストラクトが接触したあらゆる膜に付着するのを助ける一般的な送達様式として用いられ得る。これは、ＲＮＡｉコンストラクトが血流から一掃されるのを少なくとも遅らせ得、および標的をホーミングする機会を増強し得る。
【０１７７】
ガンマカルボキシグルタミン酸残基は、天然のタンパク質中に存在し得る（例えばプロトロンビンは１０個のγ−Ｇｌａ残基を有する）。代替的に、これらは生成された、組換え技術で産生された、または化学的に合成されたポリペプチドに、例えばビタミンＫ依存性カルボキシラーゼを用いたカルボキシル化によって導入することができる。ガンマカルボキシグルタミン酸残基は連続的であっても非連続的であってもよく、ポリペプチド中のかかるガンマカルボキシグルタミン酸残基の総数および所在は、異なるレベルのポリペプチドの「粘着性」を達成するために制御／微調整することができる。
【０１７８】
１つの態様において、本発明のオリゴヌクレオチド組成物と接触する細胞は、オリゴヌクレオチドを含む混合物および脂質を含む混合物、例として上記の脂質または脂質組成物、と約１２時間から約２４時間の間接触する。別の態様において、オリゴヌクレオチド組成物と接触する細胞は、オリゴヌクレオチドを含む混合物および脂質を含む混合物、例として上記の脂質または脂質組成物、と約１日から約５日の間接触する。１つの態様において、細胞は脂質およびオリゴヌクレオチドを含む混合物と、約３日から約３０日もの間接触する。別の態様において、脂質を含む混合物と細胞とを少なくとも約５日から約２０日の間接触したままにしておく。別の態様において、脂質を含む混合物と細胞とを少なくとも約７日から約１５日の間接触したままにしておく。
【０１７９】
例えば、１つの態様において、オリゴヌクレオチド組成物と細胞とを、本明細書に記載されたような長期のインキュベーション期間のために、サイトフェクチンＣＳまたはＧＳＶ（Glen Reserch; Sterling, Vaから入手可能）、ＧＳ３８１５、ＧＳ２８８８などの脂質の存在下で接触させることができる。
【０１８０】
１つの態様において、脂質およびオリゴヌクレオチドを含む混合物と細胞との組成物のインキュベーションは、細胞のバイアビリティを低減させない。好ましくは、トランスフェクション期間の後、細胞は実質的に生存能力がある。1つの態様において、トランスフェクション後、細胞は少なくとも約７０％から少なくとも約１００％の間で生存能力がある。別の態様において、細胞は少なくとも約８０％から少なくとも約９５％の間で生存能力がある。さらに別の態様において、細胞は少なくとも約８５％から少なくとも約９０％の間で生存能力がある。
【０１８１】
１つの態様において、オリゴヌクレオチドを、本明細書において「輸送ペプチド」という、オリゴヌクレオチドを細胞内に輸送するペプチド配列を取り付けることにより修飾する。１つの態様において、組成物は、タンパク質をコードする標的核酸分子と相補的であり、輸送ペプチドを共有結合的に取り付けられているオリゴヌクレオチドを含む。
【０１８２】
「輸送ペプチド」という言葉は、オリゴヌクレオチドの細胞内への輸送を促進するアミノ酸配列を含む。それらが連結する部分の細胞内への輸送を促進する代表的なペプチドは当該技術分野において知られており、例としてＨＩＶ  ＴＡＴ転写因子、ラクトフェリン、ヘルペスＶＰ２２タンパク質、およびフィブロブラスト成長因子２（Pooga et al. 1998. Nature biotechnology. 16:857;およびDerossi et al. 1998. Trends in Cell Biology. 8:84; Elliott and O'Hare. 1997. Cell 88:223）を含む。
【０１８３】
既知の技術を用いて、オリゴヌクレオチドに輸送ペプチドを取り付けることができる（例として、Prochiantz, A. 1996. Curr. Opin. Neurobiol. 6:629; Derossi et al. 1998. Trends Cell Biol. 8:84; Troy et al. 1996. J. Neurosci. 16:253, Vives et al. 1997. J. Biol. Chem. 272:16010）。例えば、１つの態様において、活性型チオール基を有しているオリゴヌクレオチドは、そのチオール基を介して輸送タンパク質中に存在するシステインと（例として、アンテナペディアホメオドメイン、例としてDerossi et al. 1998. Trends Cell Biol. 8:84; Prochiantz. 1996. Current Opinion in Neurobiol. 6:629; Allinquant et al. 1995. J Cell Biol. 128:919に教示される、の２番目と３番目のへリックスの間のβターンに存在するシステインと）連結する。別の態様において、Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−（Ｎｐｙｓ）ＯＨ基は、輸送タンパク質と、最後のＮ−末端アミノ酸としてカップリングすることができ、ＳＨ基を有しているオリゴヌクレオチドは該ペプチドにカップリングすることができる（Troy et al. 1996. J. Neurosci. 16:253）。
【０１８４】
１つの態様において、連結基をヌクレオモノマーに取り付けることができ、輸送ペプチドをそのリンカーに共有結合的に取り付けることができる。１つの態様において、リンカーは、輸送ペプチドの取付部位として機能することができ、かつヌクレアーゼに対する安定性を提供することができる。好適なリンカーの例は、置換または非置換のＣ１〜Ｃ２０アルキル鎖、Ｃ２〜Ｃ２０アルケニル鎖、Ｃ２〜Ｃ２０アルキニル鎖、ペプチド、およびヘテロ原子（例として、Ｓ、Ｏ、ＮＨなど）を含む。他の代表的なリンカーは、スルホスクシンイミジル−４−（マレイミドフェニル）−ブチレート（ＳＭＰＢ）（例として、Smith et al. Biochem J 1991. 276:417-2参照）などの二官能性の架橋剤を含む。
【０１８５】
１つの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、遺伝子を細胞内に送達するためのレセプター媒介性エンドサイトーシスメカニズムに利用する分子抱合体として合成される（例として、Bunnell et al. 1992. Somatic Cell and Molecular Genetics. 18:559,およびこれらに参照されている文献参照）。
【０１８６】
ターゲティング剤
オリゴヌクレオチドの送達はまた、オリゴヌクレオチドを細胞のレセプターにターゲティングすることによっても改善することができる。ターゲティング部分は、オリゴヌクレオチドと抱合することができ、またはオリゴヌクレオチドに連結した担体基（すなわちポリ（Ｌ−リジン）またはリポソーム）に取り付けることができる。この方法は、特異的レセプター媒介性エンドサイトーシスを呈する細胞に良く適している。
【０１８７】
例えば、６−ホスホマンノシル化タンパク質とのオリゴヌクレオチド抱合体は、遊離オリゴヌクレオチドよりも、マンノース６−ホスフェート特異的レセプターを発現する細胞によって２０倍もより効果的に内在化される。オリゴヌクレオチドはまた、細胞性レセプターのリガンドと、生分解性リンカーを用いてカップリングされてもよい。別の例において、送達コンストラクトは、ビオチン化オリゴヌクレオチドと強い複合体を形成するマンノシル化ストレプトアビジンである。マンノシル化ストレプトアビジンはビオチン化オリゴヌクレオチドの内在化を２０倍増大させることが見出された（Vlassov et al. 1994. Biochimica et Biophysica Acta 1197:95-108）。
【０１８８】
加えて、特異的リガンドは、ポリリジンベース送達システムのポリリジンコンポーネントに抱合され得る。例えば、トランスフェリン−ポリリジン、アデノウィルス−ポリリジン、およびインフルエンザウィルスヘマグルチニンＨＡ−２  Ｎ−末端融合ペプチド−ポリリジン抱合体は、真核細胞におけるレセプター媒介性ＤＮＡ送達を大幅に増強する。肺胞マクロファージ中のポリ（Ｌ−リジン）に抱合されたマンノシル化糖タンパク質は、オリゴヌクレオチドの細胞取り込みを増強するために採用されてきた（Liang et al. 1999. Pharmazie 54:559-566）。
【０１８９】
悪性細胞は、葉酸およびトランスフェリンなどの必須栄養素の増大した必要性を有するため、これらの栄養素を癌性細胞に対するオリゴヌクレオチドの標的として使うことができる。例えば、葉酸がポリ（Ｌ−リジン）と連結した場合、オリゴヌクレオチド取り込みの増強が前骨髄性白血球（ＨＬ−６０）細胞およびヒトメラノーマ（Ｍ−１４）細胞においてみられた。Ginobbi et al. 1997. Anticancer Res. 17:29。別の例において、マレイル化ウシ血清アルブミンでコートされたリポソーム、葉酸またはプロトポルフィリンＩＸ鉄は、ネズミマクロファージ、ＫＢ細胞、および２．２．１５ヒトヘパトーマ細胞において増大したオリゴヌクレオチドの細胞取り込みを示した。Liang et al l 999. Pharmazie 54:559-566
【０１９０】
リポソームは自然に肝臓、脾臓および細網内皮細胞に蓄積する（受動的ターゲティングと呼ばれる）。リポソームと抗体やプロテインＡなどの様々なリガンドをカップリングすることにより、特定の細胞集団を能動的にターゲティングすることができる。例えば、プロテインＡを有するリポソームは、Ｌ細胞上に発現するマウス主要組織適合性複合体Ｈ−２Ｋを標的とするＨ−２Ｋ特異的抗体で前処理してよい（Vlassov et al. 1994. Biochimica et Biophysica Acta 1197:95-108）。
【０１９１】
投与
最適なオリゴヌクレオチドの投与または送達は所望の結果および／または処置される対象に依存して変化してよい。本明細書で使用される場合、「投与」は細胞とオリゴヌクレオチドとを接触させることをいい、in vitroまたはin vivoで実行され得る。オリゴヌクレオチドの用量は標的核酸分子から翻訳されるタンパク質の発現、例としてＲＮＡ安定性からの読み出しまたは治療応答から計測されるような、を過度の実験なしに最適に低減するように調整されてよい。
【０１９２】
例えば、核酸標的によってコードされるタンパク質の発現を、用量レジメンがそれにしたがって調整される必要があるか無いかを決定するために計測することができる。加えて、細胞内におけるまたは細胞によって産生されるＲＮＡまたはタンパク質レベルの増大または減少は、当該技術分野において認識されている任意の技術を用いて計測することができる。転写が減少しているかどうかを決定することにより、標的ＲＮＡの切断を誘導することにおけるオリゴヌクレオチドの有効性を決定することができる。
【０１９３】
任意の上記のオリゴヌクレオチド組成物を、単独でまたは薬学的に許容可能な担体と併せて用いることができる。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容可能な担体」は、適切な溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。薬理活性物質についてのかかる媒体および剤の使用は、当該技術分野において周知である。任意の従来の媒体または剤を、活性成分と相容れない場合を除き、治療組成物に使用することができる。補助的な活性成分もまた組成物に組込むことができる。
【０１９４】
非経口投与のために、オリゴヌクレオチドを、リポソームまたはポリエチレングリコールで修飾したまたはカチオン性脂質と混合したリポソームに組込んでよい。追加物質、例えば特定の標的細胞上に見出される膜タンパク質に対して活性な抗体、のリポソームへの組込みは、特定の細胞タイプへのオリゴヌクレオチドのターゲティングを助けることができる。
【０１９５】
さらに、本発明は主題のオリゴヌクレオチドを、例えばRataiczak et al.（1992 Proc. Natl. Acad. Sci USA 89: 11823-11827）に記載されているように、かかるオリゴヌクレオチドの連続的な注入を提供する浸透圧ポンプで投与することを提供する。かかる浸透圧ポンプは、例としてAlzet Inc. (Palo Alto, Calif.)から商業的に入手可能である。カチオン性脂質担体での局所投与および非経口投与が好ましい。
【０１９６】
in vivo投与に関し、本発明の処方物は、選択された投与の経路、例として非経口、経口、または腹腔内、に適合した様々な形態で患者に投与することができる。好ましい非経口投与は、以下の経路での投与を含む：静脈内；筋肉内；間質内；動脈内；皮下；眼球内；滑膜内；経皮を含む経上皮；吸入を介した肺内；点眼；舌下および頬側；点眼を含む局所；皮膚；眼性；直腸；およびガス吸入を介した経鼻吸入。
【０１９７】
非経口投与のための医薬製剤は、水可溶性または水可分散性の形態での活性化合物の水性溶液を含む。加えて、適切な油性注入懸濁液としての活性化合物の懸濁液が投与されてよい。好適な親油性溶媒またはビヒクルは、脂肪油、例えばごま油、または合成脂肪酸エステル、例えばオレイン酸エチルまたはトリグリセリド、を含む。水性注入懸濁液は、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランなど懸濁液の粘度を増大する物質を含んでもよく、任意に懸濁液はまた安定化剤を含んでもよい。本発明のオリゴヌクレオチドを液剤溶液として、好ましくは、ハンクス溶液またはリンガー溶液など、生理学的に相性の良い緩衝液として処方してもよい。加えて、オリゴヌクレオチドは固体形態に処方され、使用直前に再溶解または懸濁してもよい。
【０１９８】
局所投与のための医薬製剤は、経皮吸収貼付剤、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、スプレー、坐薬、液剤および粉末を含む。加えて、従来の薬学的担体、水性、粉末または油性基剤、あるいは増粘剤を、局所投与のための医薬製剤に用いてもよい。
経口投与のための医薬製剤は、粉末または顆粒、水または非水媒体中の懸濁液または溶液、カプセル、小袋または錠剤を含む。加えて、増粘剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、分散剤または結合剤を、経口投与のための医薬製剤に用いてもよい。
【０１９９】
経粘膜または経皮投与について、透過すべきバリアに対して適切な浸透剤を、処方物中に用いる。かかる浸透剤は当該技術分野において既知であり、例えば、経粘膜投与について胆汁塩、フシジン酸誘導体、およびデタージェントを含む。経粘膜投与は、鼻腔用スプレーを介してまたは坐薬を用いてなされてよい。経口投与について、オリゴヌクレオチドは、カプセル、錠剤、およびトニックなどの、従来の経口投与形態に処方される。局所投与について、本発明のオリゴヌクレオチドは、当該技術分野において既知のように、軟膏、膏薬、ゲルまたはクリームに処方される。
【０２００】
薬剤送達ビヒクルは、例としてin vitro用に、全身用にまたは局所投与用に選択できる。これらのビヒクルを、徐放性の貯留部として、またはその内容物を直接標的細胞に送達する役割を果たすように設計することができる。いくつかの直接送達薬剤ビヒクルを用いることの利点は、複数の分子が取り込み毎に送達されることである。かかるビヒクルは、そうでなければ速やかに血流から一掃されるであろう剤の循環半減期を増大することが示されてきた。このカテゴリに包含されるかかる特殊な薬剤送達ビヒクルのいくつかの例は、リポソーム、ハイドロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノカプセル、および生体接着性マイクロスフェアである。
【０２０１】
記載されたオリゴヌクレオチドは、対象に全身投与されてよい。全身吸収は、血流への剤の進入に続く体全体への分配をいう。全身吸収に導く投与経路は以下を含む：静脈内、皮下、腹腔内および鼻腔内。これらの投与経路のいずれも、オリゴヌクレオチドを到達可能な疾患細胞へと送達する。皮下投与に続いて、治療剤は局所リンパ節に流れ出し、リンパ管ネットワークを通じて血流へと進む。血流へと進入する速度は、分子量または分子サイズの機能として示されている。リポソームまたは他の剤担体の使用は、オリゴヌクレオチドをリンパ節に局在させる。オリゴヌクレオチドを細胞内へと拡散するように修飾することができ、またリポソームは修飾または非修飾いずれのオリゴヌクレオチドの細胞内への送達に直接関与することができる。
【０２０２】
選択された送達の方法は、細胞への進入をもたらす。好ましい送達方法は、リポソーム（１０〜４００ｎｍ）、ハイドロゲル、放出制御ポリマー、および他の薬学的に適用可能なビヒクルおよび、マイクロインジェクションまたはエレクトロポレーション（ex vivo処置について）を含む。
本発明の医薬製剤はエマルジョンとして調製および処方できる。エマルジョンは通常、１つの液体が別のものの中に通常直径０．１μｍを超える液滴の形状で分散した不均一系である。本発明のエマルジョンは、乳化剤、安定化剤、染料、脂肪、油脂、ワックス、脂肪酸、脂肪族アルコール、脂肪族エステル、保湿剤、親水コロイド、保存料などの賦形剤を含んでもよく、および抗酸化剤もまたエマルジョン中に必要に応じて存在してよい。これらの賦形剤は水相中、油相中またはそれら自身が別の相として、溶液として存在してよい。
【０２０３】
本発明のエマルジョン処方物に用いてよい天然の乳化剤の例は、ラノリン、蜜ろう、リン脂質、レシチンおよびアカシアを含む。微粉化した固体もまたよい乳化剤として用いられ、特に界面活性剤と組み合わせて粘性の調製物中でよい乳化剤として用いられる。乳化剤として用いてよい微粉化された固体の例は、重金属水酸化物などの極性無機固体、ベントナイト、アタパルジャイト、ヘクトライト、カオリン、モンモリロナイト、コロイド性ケイ酸アルミニウム、およびコロイド性ケイ酸アルミニウムマグネシウムなどの非膨張性粘度、顔料および炭素またはトリステアリン酸グリセリルなどの非極性固体を含む。
【０２０４】
エマルジョン処方物に用いてよい保存料の例は、メチルパラベン、プロピルパラベン、四級アンモニウム塩、ベンザルコニウムクロライド、ｐ−ヒドロキシベンゼン酸のエステル、およびホウ酸を含む。エマルジョン処方物に用いてよい抗酸化剤の例は、トコフェロール、没食子酸アルキル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、などのフリーラジカルスカベンジャー、またはアスコルビン酸およびメタ重亜硫酸ナトリウムなどの還元剤、およびクエン酸、酒石酸およびレシチンなどの抗酸化剤共力剤を含む。
【０２０５】
１つの態様において、オリゴヌクレオチドの組成物はマイクロエマルジョンとして処方される。マイクロエマルジョンは水、油および両親媒性物質の系であり、光学的に等方および熱力学的に安定な単一の液体溶液である。典型的には、マイクロエマルジョンは最初に油を水性界面活性剤溶液に分散させ、次に十分な量の第４の構成成分、一般的には透明な系を形成するための中級鎖長アルコール、を添加することで調製する。
【０２０６】
マイクロエマルジョンの調製に用いられてよい界面活性剤は、これに限定するものではないが、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、Ｂｒｉｊ９６、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリグリセロール脂肪酸エステル、テトラグリセロールモノラウレート（ＭＬ３１０）、テトラグリセロールモノオレート（ＭＯ３１０）、ヘキサグリセロールモノオレート（ＰＯ３１０）、ヘキサグリセロールペンタオレート（ＰＯ５００）、デカグリセロールモノカプレート（ＭＣＡ７５０）、デカグリセロールモノオレート（ＭＯ７５０）、デカグリセロールセキオレート（Ｓ０７５０）、デカグリセロールデカオレート（ＤＡ０７５０）、単独または共界面活性剤と組み合わせて含む。共界面活性剤、通常はエタノール、ｌ−プロパノール、およびｌ−ブタノールなどの短鎖アルコール、は界面薄膜に侵入し、その結果無秩序な薄膜を創造することにより、界面活性剤の分子の間に発生する隙間の空間のせいで、界面の流動性を増大させる。
【０２０７】
マイクロエマルジョンは、しかしながら、共界面活性剤を使用せずに調製されてもよく、アルコールフリーの自己乳化マイクロエマルジョン系は当該技術分野で既知である。水相は典型的には、これに限定するものではないが、水、薬物の水性溶液、グリセロール、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ポリグリセロール、プロピレングリコール、およびエチレングリコールの誘導体であってよい。油相は、これに限定するものではないが、Captex 300、Captex 355、Capmul MCM、脂肪酸エステル、中鎖（Ｃ８〜Ｃ１２）モノ、ジ、およびトリグリセリド、ポリオキシエチレン化グリセリル脂肪酸エステル、脂肪族アルコール、ポリグリコール化グリセリド、飽和ポリグリコール化Ｃ８〜Ｃ１０グリセリド、植物油およびシリコーン油などの材料を含んでよい。
【０２０８】
マイクロエマルジョンは、薬剤可溶化および薬剤の増強された吸収という観点から特に興味深い。脂質ベースのマイクロエマルジョン（油／水および水／油両方）は、薬物の口内バイオアベイラビリティを増強することが提案されてきた。
【０２０９】
マイクロエマルジョンは、改善された薬剤の可溶化、酵素的加水分解からの薬剤の保護、界面活性剤に誘導される膜流動性および浸透性の変化に起因する薬剤吸収の増強可能性、調製の容易さ、固体投薬形態以上の経口投与の容易さ、改善された臨床的な効能、および減少した毒性を示す（Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11:1385; Ho et al., J. Pharm. Sci., 1996, 85: 138-143）。マイクロエマルジョンはまた、化粧的および薬学的アプリケーション両方における活性構成成分の経皮吸収においても効果的である。マイクロエマルジョン組成物および本発明の処方物が、胃腸管からのオリゴヌクレオチドの増大した全身性吸収を促進するのと同様に、胃腸管内、膣内、口腔内および他の場所内の投与でのオリゴヌクレオチドの局所的細胞取り込み改善することが期待される。
【０２１０】
１つの態様において、本発明は、動物の皮膚への核酸、特にオリゴヌクレオチド、の効率的な送達に影響する様々な浸透増強剤を採用する。非親油性の薬剤であっても、横断すべき膜が浸透増強剤で処理された場合、細胞膜を横断し得る。細胞膜を横断する非親油性薬剤の拡散の増大に加えて、浸透増強剤はまた親油性薬剤の浸透性を増強するようにも作用する。
【０２１１】
本発明に用いてよい浸透増強剤の５つの分類は、界面活性剤、脂肪酸、胆汁塩、キレート剤、および非キレート非界面活性剤を含む。投与されたオリゴヌクレオチドの浸透を増強するのに用いてよい他の剤は、エチレングリコールおよびプロピレングリコールなどのグリコール、２〜１５ピロールなどのピロール、アゾン、およびリモネンおよびメントンなどのテルペンを含む。
【０２１２】
オリゴヌクレオチド、特に脂質処方物中のもの、はまた医療デバイス、例えば血管形成バルーンカテーテルなどのカテーテル、をカチオン性脂質処方物でコーティングによって投与することができる。コーティングは、例えば医療デバイスを脂質処方物または脂質処方物と好適な溶媒、例えば水性ベースの緩衝液、水性溶媒、エタノール、メチレンクロライド、クロロホルムなど、との混合物に浸漬することにより達成し得る。ある量の処方物が自然にデバイスの表面に付着し、それが続いて必要に応じて患者に投与される。代替的に、凍結乾燥された脂質処方物の混合物を、デバイスの表面に特異的に結合させてもよい。かかる結合技術は、例えばK. Ishihara et al., Journal of Biomedical Materials Research, Vol. 27, pp. 1309-1314 (1993)に記載され、この開示は参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２１３】
当業者にはすぐにわかるように、投与されるべき有用な用量および特定の投与の方式は、細胞種、またはin vivoの使用については、年齢、体重および特定の動物および処置されるべきその領域、特定のオリゴヌクレオチドおよび用いられる送達方法、意図している治療的または診断的利用、および例えば懸濁液、エマルジョン、ミセルまたはリポソームなどの処方の形態などの因子に依存して変化するだろう。典型的には、用量は低レベルで投与され、所望の効果が達成されるまで増大される。オリゴヌクレオチドの送達に脂質が用いられる場合、投与される脂質化合物の量は変化することができ、一般的には投与されるオリゴヌクレオチド剤の量に依存する。例えば、オリゴヌクレオチド剤に対する脂質化合物の重量比率は、好ましくは約１：１から約１５：１であり、重量比率で約５：１から約１０：１がより好ましい。一般的には、投与されるカチオン性脂質化合物の量は、約０．１ミリグラム（ｍｇ）から約１グラム（ｇ）の間で変化するだろう。一般的なガイダンスの目的で、典型的には、それぞれ患者の体重のキログラムあたり、約０．１ｍｇおよび約１０ｍｇの間の特定のオリゴヌクレオチド剤および約１ｍｇから約１００ｍｇの脂質組成物が投与され、それより高いおよび低い量を用いることもできる。
【０２１４】
本発明の剤を、生物学的に相性のよい薬学的投与に好適な形態で対象に投与し、または細胞と接触する。「生物学的に相性のよい投与に好適な形態」は、オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドの治療的効果があらゆる毒性効果を上回る形態で投与されることを意味する。１つの態様において、オリゴヌクレオチドを対象に投与することができる。対象の例は、哺乳類、例としてヒトおよび他の霊長類；ウシ、ブタ、ウマおよび畜産（農業）動物；イヌ、ネコ、および他の家畜化されたペット；マウス、ラットおよびトランスジェニック非ヒト動物、を含む。
【０２１５】
本発明のオリゴヌクレオチドの活性量の投与は、有効量、投与量および所望の結果を達成するのに必要な期間として定義される。例えば、オリゴヌクレオチドの活性量は、細胞種、用いられるオリゴヌクレオチド、およびin vivo使用について、疾患状態、年齢、性別、および個体の体重、および個体中で所望の応答を引き出すオリゴヌクレオチドの能力にしたがって変化してよい。細胞内でのオリゴヌクレオチドの治療的レベルの確立は、取り込みおよび流出または分解の速度に依存する。分解の程度を減少させることは、オリゴヌクレオチドの細胞内半減期を延長する。したがって、化学修飾オリゴヌクレオチド、例としてホスフェート骨格の修飾を有する、は異なる用量を必要としてよい。
【０２１６】
オリゴヌクレオチドの正確な用量および投薬の回数は、実験的におよび治験で得られたデータに依存するだろう。所望の効果、送達ビヒクル、疾患の兆候、および投与の経路などのいくつかの因子が、用量に影響するだろう。当業者はすぐに用量を決定し、主題の医薬組成物に処方することができる。好ましくは、処置時間は、少なくとも疾患の兆候の経過を通じて延長されるだろう。
【０２１７】
用量レジメンは最適な治療的応答を提供するように適合されてよい。例えば、オリゴヌクレオチドは繰り返し投与されてよく、例として毎日数回投与されてよくまたは治療的状況の緊急度によって示されるように比例的に低減されてよい。当業者は、主題のオリゴヌクレオチドの適切な用量および投与のスケジュール、オリゴヌクレオチドを細胞と対象とのどちらに投与すべきかをすぐに決定することができる。
【０２１８】
ＶＩ．オリゴヌクレオチド安定性のアッセイ
好ましくは、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは安定である、すなわちエンドヌクレアーゼおよびエクソヌクレアーゼ分解に実質的に抵抗性である。オリゴヌクレオチドは、内因性の細胞性ヌクレアーゼによる攻撃に対して少なくとも約３倍より抵抗性である場合に、ヌクレアーゼに対して実質的に抵抗性であると定義され、対応する一本鎖オリゴヌクレオチドよりも少なくとも約６倍より抵抗性である場合に、高度にヌクレアーゼ抵抗性である。このことは、当業者に既知の技術を用いて、本発明のオリゴヌクレオチドが実質的にヌクレアーゼに対して抵抗性であることを示すことにより実証することができる。
【０２１９】
実質的な安定性を実証することができる１つの方法は、本発明のオリゴヌクレオチドが細胞に送達されたときに機能する、例としてそれらが標的核酸分子の転写または翻訳を低減することを、例としてタンパク質レベルを計測することまたはｍＲＮＡの切断を計測することで、示すことである。標的ＲＮＡの安定性を計測するアッセイは、トランスフェクションの約２４時間後に実施することができる（例として、当該技術分野において既知のように、ノーザンブロット技術、ＲＮａｓｅ保護アッセイ、またはＱＣ−ＰＣＲアッセイを用いて）。代替的に、標的タンパク質のレベルを計測することができる。好ましくは、対象となるＲＮＡまたはタンパク質レベルの試験に加えて、対照、非標的遺伝子、のＲＮＡまたはタンパク質レベルが、特異性対照として計測されるだろう（例として、アクチン、または好ましくは標的と配列類似性を有する対照）。ＲＮＡまたはタンパク質計測は、技術分野に認識された任意の技術を用いて行うことができる。好ましくは、計測はトランスフェクションの約１６〜２４時間後から開始される（M. Y. Chiang, et al. 1991. J Biol Chem. 266:18162-71 ; T. Fisher, et al. 1993. Nucleic Acids Research. 21 3857）。
【０２２０】
本発明のオリゴヌクレオチド組成物の、タンパク質合成を阻害する能力は、例えば遺伝子転写またはタンパク質合成において阻害を検出するなど、当該技術分野に既知の技術を用いて計測することができる。例えば、ヌクレアーゼＳ１マッピングを行うことができる。別の例において、ノーザンブロット分析を、特定のタンパク質をコードするＲＮＡの存在を計測するために用いることができる。例えば、総ＲＮＡをセシウムクロライドクッション上で調製することができる（例としてAusebel et al., 1987. Current Protocols in Molecular Biology (Greene & Wiley, New York)参照）。そしてノーザンブロットをＲＮＡを用いて行いプローブすることができる（例として上記参照）。別の例において、例としてＰＣＲを用いて、標的タンパク質によって産生される特定のｍＲＮＡのレベルを計測することができる。さらに別の例において、ウェスタンブロットを、存在する標的タンパク質の量の計測に用いる。さらにまた別の態様において、タンパク質の量に影響されるフェノタイプを検出することができる。ウェスタンブロットを実施する技術は当該技術分野に周知であり、例としてChen et al. J. Biol. Chem. 271:8259参照。
【０２２１】
別の例において、標的遺伝子のプロモーター配列はレポーター遺伝子に連結されることができ、レポーター遺伝子転写（例として、以下に詳述されるような）を監視することができる。代替的に、プロモーターをターゲティングしないオリゴヌクレオチド組成物を、レポーター遺伝子が転写されるように標的核酸分子の一部分とレポーター遺伝子とを融合することにより、同定することができる。オリゴヌクレオチド組成物の存在下でレポーター遺伝子の発現における変化を監視することにより、レポーター遺伝子の発現阻害におけるオリゴヌクレオチド組成物の効果を決定することができる。例えば、１つの態様において、効果的なオリゴヌクレオチド組成物はレポーター遺伝子の発現を低減するだろう。
【０２２２】
「レポーター遺伝子」は、検出可能な遺伝子産物、ＲＮＡでもタンパク質でもよい、を発現する核酸である。ｍＲＮＡ発現の検出は、ノーザンブロッティングによってなされてよく、タンパク質の検出は、該タンパク質に特異的な抗体で染色することによってなされてよい。好ましいレポーター遺伝子はすぐに検出可能な産物を産生する。レポーター遺伝子は、レポーター遺伝子産物の検出が調節配列の転写活性の指標を提供するように、調節ＤＮＡ配列に操作可能に連結されていてよい。好ましい態様において、レポーター遺伝子の遺伝子産物は、この産物に関連する固有の活性によって検出される。例えば、レポーター遺伝子は、酵素活性によって、色、蛍光または発光に基づく検出可能なシグナルの上昇を与えるような遺伝子産物をコードしてよい。レポーター遺伝子の例は、これに限定するものではないが、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、およびアルカリホスファターゼをコードするものを含む。
【０２２３】
当業者はすぐに、多くのレポーター遺伝子が本発明に用いるのに好適であることを認識する。これらは、これに限定するものではないが、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）およびベータ−ガラクトシダーゼを含む。かかるレポーター遺伝子の例は、F. A. Ausubel et al.編, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, (1989)に見出すことができる。検出可能な産物、例として検出可能な酵素活性を有するまたは特異的抗体が産生される産物、をコードする任意の遺伝子が、本方法のレポーター遺伝子として用いることができる。
【０２２４】
１つのレポーター遺伝子システムは、ホタルルシフェラーゼレポーターシステムである（Gould, S. J., and Subramani, S. 1988. Anal. Biochem., 7:404-408、参照として本明細書に組込まれる）。ルシフェラーゼアッセイは、迅速かつ敏感である。このアッセイにおいて、試験細胞の溶解物を調製し、ＡＴＰおよび基質ルシフェリンと組み合わせる。コードされた酵素ルシフェラーゼは、基質の迅速な、ＡＴＰ依存性の酸化を触媒し、光放出産物を産生する。総光出力を計測し、それは広い範囲の酵素濃度にわたってルシフェラーゼの存在量に比例する。
【０２２５】
ＣＡＴは、頻繁に用いられる別のレポーター遺伝子システムであり；このシステムの主たる利点は、大規模に検証されてきており、プロモーター活性の指標として広く受け容れられていることである（Gorman C. M., Moffat, L. F., and Howard, B. H. 1982. Mol. Cell. Biol., 2:1044-1051）。このシステムにおいて、試験細胞をＣＡＴ発現ベクターでトランスフェクトし、最初のトランスフェクションから２〜３日以内に候補基質とインキュベートする。その後、細胞抽出物を調製する。抽出物をアセチルＣｏＡおよび放射性クロラムフェニコールとインキュベートする。インキュベーションに続いて、アセチル化クロラムフェニコールを非アセチル化形態から薄層クロマトグラフィーで分離する。このアッセイにおいて、アセチル化の程度が特定のプロモーターを伴うＣＡＴ遺伝子活性を反映する。
【０２２６】
別の好適なレポーター遺伝子システムは、ｈＧＨの免疫学的検出に基づいている。このシステムもまた、素早く簡便に使用できる（Selden, R., Burke-Howie, K. Rowe, M. E., Goodman, H. M., and Moore, D. D. (1986), Mol. Cell, Biol., 6:3173-3179、参照として本明細書に組込まれる）。ｈＧＨシステムは、発現されたｈＧＨポリペプチドを細胞抽出物ではなく培地内でアッセイすることに利点がある。したがって、このシステムは試験細胞の破壊を必要としない。このレポーター遺伝子システムの原理はｈＧＨに限定されず、むしろ許容可能な特異性を有する抗体が利用可能であるか調製可能である任意のポリペプチドでの使用に適用されることが認識されるだろう。
【０２２７】
１つの態様において、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ安定性が計測され、対照、例として当該技術分野で典型的に用いられるＲＮＡｉ分子（例として２５ヌクレオチド未満の長さのデュプレックスで、２ヌクレオチド塩基オーバーハングを含むもの）または平滑末端の非修飾ＲＮＡデュプレックス、と比較される。
【０２２８】
ＶＩＩ．治療的使用
遺伝子の発現を阻害することにより、本発明のオリゴヌクレオチド組成物は、遺伝子の発現を伴う任意の疾患を処置するのに用いることができる。オリゴヌクレオチド組成物により処置されることができる疾患の例は、単なる例示として、ガン、網膜症、自己免疫疾患、炎症性疾患（すなわちＩＣＡＭ−１関連疾患、乾癬、潰瘍性大腸炎、クローン病）、ウィルス性疾患（すなわち、ＨＩＶ、Ｃ型肝炎）および心臓血管疾患を含む。
【０２２９】
１つの態様において、オリゴヌクレオチドでの細胞のin vitro処置は、対象から除去した細胞のex vivo治療（例として、白血病またはウィルス感染の処置のために）または対象に由来しないが対象に投与される細胞の処置（例として、対象に移植される細胞上の移植抗原発現を排除するため）に用いることができる。加えて、細胞のin vitro処置は非治療的状況、例として遺伝子機能を評価するため、遺伝子制御およびタンパク質合成を研究するため、または遺伝子発現またはタンパク質合成を制御するために設計されたオリゴヌクレオチドになされた改良を評価するため、に用いることができる。細胞のin vivo処置は、タンパク質の発現を阻害することが望ましいある臨床的状況に有用であり得る。アンチセンス治療が好適であると報告されている多数の医学的病態があり（例として米国特許第５，８３０，６５３号）、他には呼吸器合胞体ウィルス感染（ＷＯ９５／２２，５５３）インフルエンザウィルス（ＷＯ９４／２３，０２８）および悪性腫瘍（ＷＯ９４／０８，００３）がある。アンチセンス配列の臨床的使用の他の例は、例としてGlaser. 1996. Genetic Engineering News 16:1に参照されている。オリゴヌクレオチドによって切断される代表的な標的は、例としてプロテインキナーゼＣａ、ＩＣＡＭ−１、ｃ−ｒａｆキナーゼｐ５３、ｃ−ｍｙｂ、および慢性骨髄性白血病に見出されるｂｃｒ／ａｂｌ融合遺伝子を含む。
【０２３０】
ＳＯＤ１の変異はある形態の家族性ＡＬＳ疾患の原因である。動物モデルにおいて、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＲＮＡｉによるＳＯＤ発現の阻害は、ＡＬＳ様兆候の進行を遅くすることが示されてきた。本発明の主題である高度に活性で、ヌクレアーゼ安定性でかつ特異的な化合物はＡＬＳに対する治療的投与に非常に適している。
【０２３１】
本発明の実施は、他に示されない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来の技術を採用し、それは当業者の技術の範囲内である。かかる技術は文献に十分に説明されている。例えば、Molecular Cloning A Laboratory Manual, 第２版, ed. by Sambrook, J. et al. (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)); Short Protocols in Molecular Biology, 第３版, ed. by Ausubel, F. et al. (Wiley, N.Y. (1995)); DNA Cloning, Volumes IおよびII (D. N. Glover編, 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait編(1984)); Mullis et al. ＵＳ特許番号４，６８３，１９５; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins編(1984)); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N. Y.); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker編, Academic Press, London (1987)); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell編(1986)); and Miller, J. Experiments in Molecular Genetics (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1972))参照。
【実施例】
【０２３２】
例
上記で本発明が一般的に記載され、以下の例の参照によってより容易に理解されるだろうが、これらは、単に本発明のある側面および態様を描写する目的のために含まれているのであって、本発明を制限することを意図しない。
【０２３３】
下記における多くの例は、標的遺伝子としてＳＯＤ１および／またはＰＰＩＢ遺伝子を用いているが、本発明の方法および試薬は、他のどんな遺伝子にも一般的に適用可能であり、そのように限定されるものではない。簡潔化のために、下記の例において、主題のＲＮＡｉコンストラクトはしばしば「代替ＲＮＡｉ化合物」と称される。
【０２３４】
例１：代替ＲＮＡｉ化合物は、インビトロにおいて標準的なｓｉＲＮＡと比較すると同等または優位に効果的である。
主題の修飾されたＲＮＡｉコンストラクト（「代替ＲＮＡｉ化合物」）が、標準的なｓｉＲＮＡまたは異なる化学的修飾を伴うｓｉＲＮＡと比較したときに、もし優位でなくとも、少なくとも同等に効果的であるということを実証するために、以下の対照比較実験を実施した。
【０２３５】
ＳＯＤ１を標的とする代替ＲＮＡｉ化合物（５ｎＭ）を、縣濁液中でＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥＴＭ  ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を導入剤として用いて、ＨＥＫ２９３細胞へリバーストランスフェクトした。細胞を２４時間目に溶解し、ＳＯＤ１のｍＲＮＡレベルをｂＤＮＡアッセイ（Ｐａｎｏｍｉｃｓ  ＱＵＡＮＴＩＧＥＮＥ(R)）を用いて定量した。
【０２３６】
ｂＤＮＡアッセイとは、捕獲した標的ＲＮＡからのシグナルを増幅させるためにｂＤＮＡ分子を用いる、サンドイッチ核酸ハイブリダイゼーション法である。製造者によると、ｂＤＮＡ技術は、ＨＩＶ、ＨＣＶおよびＨＢＶのウイルス負荷量のためのＦＤＡ承認の臨床診断用ＶＥＲＳＡＮＴ３．０検定の基礎を形成し、これはＳｉｅｍｅｎｓ社によって市販されており、１０年以上にわたって使用されている。ｂＤＮＡアッセイのもう一つの利点は、ＲＮＡが、ＲＮＡ精製または酵素操作を伴わずに、サンプルソースから直接に測定されることであり、それによって、これらのプロセスによってもたらされる非効率性および変動性またはこれらのプロセスに特有のエラーが回避される。
【０２３７】
この検定において、ＳＯＤ１のｍＲＮＡをシクロフィリンＢ（ＰＰＩＢ）のｍＲＮＡに対して正規化した。図２に示すように、「Ｒ１のオリジナルの化学構造」は、ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ  ＮＭ  ０００４５４中のヌクレオチド４３６を始点としてＳＯＤ１のｍＲＮＡにハイブリダイズする二本鎖２１ｍｅｒのＲＮＡｉコンストラクトを指す。センスおよびアンチセンス鎖の両方における５’−末端をリン酸化し、両鎖の末端ヌクレオチドを２’−フルオロおよび／またはホスホチオエート結合によって修飾した。図１中のＩＤ番号１０１０５として示される配列を参照のこと。
【０２３８】
Ｒ１の修飾された２’−ＯＭｅバージョンは、図１中のＩＤ番号１０１０４として示され、その中では１０１０５中の２’−Ｆヌクレオチドが２’−Ｏ−Ｍｅと置き換えられている（ＩＤ番号１０１０４）。
【０２３９】
ＩＤ番号１００２３は２５ｍｅｒの平滑末端を有する代替ＲＮＡｉ化合物であり、ヌクレオチド４３４を始点としてＳＯＤ１のｍＲＮＡにハイブリダイズする（すなわち、２１ｍｅｒのＲ１配列の各端へ２個のヌクレオチドが付加されている）。５末端の最多でも４個のヌクレオチドおよび３末端の最多でも４ヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル基により修飾される（そしてアンチセンス鎖は修飾されない）。
【０２４０】
関連する化学構造を有する「ＭＭ対照群」はｓｉＲＮＡまたは代替ＲＮＡｉ化合物に対して用られ、平均として示した。図２に示すように、２’ＯＭｅの化学構造の適用および／またはＲ１配列の長さの延長は、活性の改善につながる傾向がある。これは、２’ＯＭｅ修飾を施す費用が２’−Ｆ修飾を施すよりも低いからのみならず、２’Ｆ修飾を有するｓｉＲＮＡが動物において毒性となる結果となった一方で、２’ＯＭｅを有する代替ＲＮＡｉ化合物は、より高い投与量においてさえ毒性を示さないという理由でも有益になる可能性がある。  
【０２４１】
したがって、代替ＲＮＡｉ化合物は、インビトロにおいて従来技術の２’−Ｆ修飾されたｓｉＲＮＡと比較すると、少なくとも同等または優位に効果的である。
【０２４２】
例２：インビトロにおける代表的なＳＯＤ１の代替ＲＮＡｉ化合物の活性
本例は、標的遺伝子（この場合、ＳＯＤ１遺伝子）上のいくつかの標的領域が他よりも良い標的部位であり得ることを実証する。
【０２４３】
ＳＯＤ１を標的とする異なる２５−ｍｅｒの代替ＲＮＡｉ化合物（５ｎＭ）を、縣濁液中でＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥＴＭ  ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を導入剤として用いて、ＨＥＫ２９３細胞へリバーストランスフェクトした。細胞を２４時間目に溶解して、ＳＯＤ１のｍＲＮＡレベルをｂＤＮＡアッセイ（Ｐａｎｏｍｉｃｓ  ＱＵＡＮＴＩＧＥＮＥ(R)）を用いて定量した。ＳＯＤ１のｍＲＮＡをシクロフィリンＢ（ＰＰＩＢ）のｍＲＮＡに対して正規化した。ＭＭ−１００２５は化学構造が一致するミスマッチ対照を示す。
【０２４４】
ここで試験される全ての代替ＲＮＡｉ化合物は同じ修飾の化学構造（例として、センス鎖を各末端において２’−Ｏ−メチル基で修飾する）を有するが、他の代替ＲＮＡｉ化合物の大多数は、正規化されたＳＯＤ１レベルを６０％以上減少させた一方で、第一次スクリーニングにおける７つの代替ＲＮＡｉ化合物が、化学的に一致する対照による処理と比べると、正規化されたＳＯＤ１レベルを９０％以上減少させた。図３を参照のこと。
【０２４５】
例３：ＳＯＤ１に対する代替ＲＮＡｉ化合物
本例は、ある主題の代替ＲＮＡｉ化合物（平滑末端を有する２５−Ｍｅｒで、センス鎖の各末端に４個の２’ＯＭｅを有する）がＳＯＤ１の発現抑制のために効果的であることを証明する。
【０２４６】
ヒトＳＯＤ１を標的とする８つの代替ＲＮＡｉ化合物（５ｎＭ）を、縣濁液中でＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥＴＭ  ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を導入剤として用いて、ＨＥＫ２９３細胞へリバーストランスフェクトした。細胞を２４時間目に溶解して、ＳＯＤ１のｍＲＮＡレベルをｂＤＮＡアッセイ（ＱＵＡＮＴＩＧＥＮＥ(R)）を用いて定量した。ＳＯＤ１のｍＲＮＡレベルをシクロフィリンＢ（ＰＰＩＢ）のｍＲＮＡに対して正規化して、１００と設定された化学的に一致する対照と関連させた。ＭＭ−１０２５は、代替ＲＮＡｉ化合物の化学構造において、化学構造が一致する対照である。加えて、Ｒ１（修飾された２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡ配列および化学構造形状、例１を参照のこと）の活性を比較のために挙げる。ＭＭ−１００３２は、Ｒ１に対する化学構造が一致する対照である。
【０２４７】
図４に示すように、主題の代替ＲＮＡｉ化合物は、ＳＯＤ１標的遺伝子に対して良好な活性を有していた。活性は、２１−ｍｅｒの修飾されたデュプレックスのＲ１において改善された。これらの配列はマウスＳＯＤ１遺伝子に対する活性をも維持した。
【０２４８】
例４：ＳＯＤ１の代替ＲＮＡｉ化合物についての用量反応分析
ＳＯＤ１を標的とする代替ＲＮＡｉ化合物を、０．０１ｎＭから１０ｎＭの濃度を用いて、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。これらの実験では、標的を持たないフィラーＲＮＡデュプレックス種をトランスフェクション反応へ添加することによって、各濃度におけるデュプレックスの総濃度を２５ｎＭに保った。この方法は、製造者からの推奨に基づく、細胞のトランスフェクションを維持するやり方で、非常に低濃度の標的デュプレックスを試験することを可能とした。ヒトＳＯＤ１のｍＲＮＡを、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅのｂＤＮＡアッセイによって、トランスフェクション後４８時間目に測定した。代替ＲＮＡｉ化合物１００１４は過去の研究において複数回試験済みであり、ここではそれを比較のための対照として含めた。本研究において試験されたもう片方のデュプレックスは、単一濃度実験においてヒットとして同定し、ここにおいてＥＣ５０決定のために追跡調査した。デュプレックス１００１１、１００１４および１００９７はマウス／ヒト相同であり、マウスおよびヒト細胞培養での確認された活性を有している。デュプレックス１００８９および１００９７の活性はマウス細胞では確認されていないが、これらのデュプレックスはヒト／マウス配列相同性を有する。
【０２４９】
至適化トランスフェクション条件を用いる用量漸増研究は、デュプレックスの効力の直接比較を可能にする。特に活性なデュプレックスは、これらの研究において、元来のヒットよりも改善されたＥＣ５０値で、および５０ｐＭ以下の値で同定された（図５Ａを参照のこと）。
【０２５０】
図５Ｂは、非修飾で２５−ｂｐの平滑末端のデュプレックス（黒丸）と主題の「４／４」２’−Ｏ−Ｍｅパッセンジャー鎖修飾を有する２５−ｂｐの平滑末端のデュプレックス’（白四角）との代表的な用量漸増曲線比較を示す。ヒトＨＥＫ２９３細胞は、いずれかのコンストラクトで別々にトランスフェクトされた。両方のＲＮＡデュプレックスはＳＯＤ１遺伝子を標的としており、ヒトおよびマウス細胞の両方において相同性を有する遺伝子の領域に対して設計された。本明細書中に記載されるように、細胞をトランスフェクションの４８時間後に溶解し、ｍＲＮＡレベルをｂＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイを用いて測定した。非修飾の２５−ｂｐデュプレックスおよび「４／４」２’−Ｏ−Ｍｅ化学構造の２５−ｂｐデュプレックスのＥＣ５０値は、それぞれ０．０７２ｎＭ±２０ｎＭおよび０．０６２ｎＭ±０．０３１ｎＭだった。
【０２５１】
図５Ｃは、マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞で実施された本質的に同じ実験を示す。非修飾の２５−ｂｐデュプレックスおよび「４／４」２’−Ｏ−Ｍｅ化学構造の２５−ｂｐデュプレックスのＥＣ５０値は、それぞれ０．０７９ｎＭ±０．０４２ｎＭおよび０．０３７ｎＭ±０．０１３ｎＭだった。
【０２５２】
これらの実験は、主題の２５−ｂｐの非修飾ＲＮＡデュプレックスのサイレンシング活性がピコモル濃度の範囲内で一貫していること、および同一配列の非修飾２５−ｂｐデュプレックスのサイレンシング活性と同等であることを示す。
【０２５３】
例５：ＰＰＩＢに対して高い効力を有する代替ＲＮＡｉ化合物
ＳＯＤ１遺伝子中の他の部位または、ほとんど（全てではないにしても）の組織で発現するユビキタス遺伝子であるシクロフィリンＢ（ＰＰＩＢ）遺伝子を標的とする修飾および非修飾デュプレックスを比較したときに、強力な遺伝子サイレンシング活性もまたみられるため、例４の結果は部位特異的でも遺伝子特異的でもない。
【０２５４】
ＨＥＫ２９３細胞をｓｉＲＮＡおよび代替ＲＮＡｉ化合物でトランスフェクトし、２４時間インキュベートした。ヒトＰＰＩＢまたはＳＯＤ１に特異的なプローブを用いたｂＤＮＡアッセイ（Ｐａｎｏｍｉｃｓ）を用いて、遺伝子発現を測定した。ＰＰＩＢ発現をＳＯＤ１発現（対照遺伝子）に対して正規化することによって、分析を行った。ＰＰＩＢ抑制のパーセントを陰性対照であるルシフェラーゼのｓｉＲＮＡまたは代替ＲＮＡｉ化合物を用いて調整した。
【０２５５】
図６Ａは、ＰＰｌＢを標的とする２５−ｍｅｒの代替ＲＮＡｉ化合物ＩＤ番号１０４５７（４つの２’’ＯＭｅをセンス鎖の各末端に有する平滑末端の２５−ｍｅｒ−「４／４」）が、非修飾２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡについて実証された高い効力を維持または改善することを示す。コンストラクト１０１６７は、ＰＰＩＢを標的とする、文献からの非修飾２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡである。コンストラクト１０１６９は、１０１６７と同じ配列を有するが、そのセンス鎖上の最初の４個および最後の４個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾をも有する。
【０２５６】
図６Ｂは、１９−ｂｐ＋２ｎｔのｓｉＲＮＡ（図６Ｂ中の黒丸）；パッセンジャー鎖に２’−Ｏ−Ｍｅを有する１９−ｂｐ＋２ｎｔのｓｉＲＮＡ（図６Ｂ中の白丸）；２’−Ｏ−Ｍｅパッセンジャー鎖修飾を有する２５−ｂｐ平滑末端のデュプレックス（図６Ｂ中の白四角）；または２’−Ｏ−Ｍｅパッセンジャー鎖修飾を有する２７−ｂｐ平滑末端のデュプレックス（図６Ｂ中の白三角）、の間の代表的な用量漸増曲線比較を示す。ＲＮＡデュプレックスは、ヒトおよびマウスの両方において相同な領域中のＰＰＩＢ遺伝子を標的とする。加えて、デュプレックスは、長さに関わらず、同じｍＲＮＡ切断部位を保存するように設計された。ＥＣ５０値は以下である：１９−ｂｐ＋２ｎｔのｓｉＲＮＡ＝０．０４３ｎＭ±０．０１９ｎＭ、２’−Ｏ−Ｍｅを有する１９−ｂｐ＋２ｎｔのｓｉＲＮＡ＝０．２７６ｎＭ±０．１４４ｎＭ、２５−ｂｐデュプレックス２’−Ｏ−Ｍｅ＝０．０２５ｎＭ±０．００９ｎＭ、２７−ｂｐデュプレックス２’−Ｏ−Ｍｅ＝０．０７２ｎＭ±０．０３５ｎＭ。
【０２５７】
同じ実験をマウスＮＩＨ３Ｔ３細胞においても繰り返した（図６Ｃ）。ＥＣ５０値は以下である：非修飾１９−ｂｐ＋２ｎｔのｓｉＲＮＡ＝０．４８２ｎＭ±０．０７６ｎＭ、２’−Ｏ−Ｍｅを有する１９−ｂｐ＋２ｎｔのｓｉＲＮＡ＝１．２３５ｎＭ±０．１９４ｎＭ、２５−ｂｐデュプレックス２’−Ｏ−Ｍｅ＝０．２１９ｎＭ±０．０４４ｎＭ、２７−ｂｐデュプレックス２’−Ｏ−Ｍｅ＝０．５１８ｎＭ±０．０９９ｎＭ。
【０２５８】
例６：化学的修飾は代替ＲＮＡｉ化合物のダイサープロセシングを防止する
出願人によってなされた鍵となる知見の一つは、従来技術が「２１−ｍｅｒより長いｄｓＲＮＡはダイサーにより切断されて２１−ｍｅｒの産物になる」と説いているにもかかわらず、ある修飾二本鎖ＲＮＡはダイサー切断されないことである。加えて、出願人は、ダイサー抵抗性ｄｓＲＮＡ上のアンチセンス鎖がＲＩＳＣ複合体に取り込まれる可能性があり、ＲＮＡ干渉のためのガイド配列としての役割を果たすことを示した。このダイサー抵抗性ｄｓＲＮＡの５’−末端のヌクレオチド（３’−末端または他のヌクレオチドではなく）は、ＲＩＳＣ複合体においてダイサー切断された２１−ｍｅｒの５’−末端とぴったり合う。
【０２５９】
最初の実験では、異なる修飾化学構造（以下を参照）を有するいくつかの２５−ｍｅｒの代替ＲＮＡｉ化合物を含むいくつかのＲＮＡｉデュプレックスを組換ヒトダイサー酵素（０．５単位）（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）とともにまたは無しで、２５０ｍＭのＮａＣｌ、３０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、０．０５ｍＭのＥＤＴＡ、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２の反応緩衝液中において３７℃で８時間インキュベートした。インキュベート後、添加液を加えて液体窒素で瞬間冷凍することで反応を停止させた。各サンプルのアリコート（１５ｐｍｏｌｅｓ）を、ＴＢＥ緩衝液中で２０％の天然ポリアクリルアミドゲル上に流した。サンプルは、ゲルの上に表示されるとおりに、ダイサー酵素無しおよび有りで交互に装填した。図７に示すように、さまざまな平滑末端２５−ｍｅｒのデュプレックスへの２’−Ｏ−Ｍｅ修飾は、修飾されなかった２５−ｍｅｒの平滑デュプレックスとは対照的に、ダイサーによる切断に抵抗性を有する。
【０２６０】
このことは、代替ＲＮＡｉ化合物デュプレックスが細胞中で一律の種として機能すると予測され、活性を有するために複数の異なる２１−ｍｅｒのデュプレックスまたは他のより短い種へと切断されないことを示す。これらの発見は、活性剤は単一種であるために、臨床発達にとって重要な意味合いを有する。これは現行のモデルが、２１−ｍｅｒよりも長いデュプレックスがその長さになるようにプロセシングされることを示唆していることと対照的である。さらに、デュプレックスＲＮＡの一方の側における修飾を示す２７−ｍｅｒのデュプレックスのデータは、プロセシングを示す。例えば、Ｋｕｂｏら（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １７（４）：４４５−４６４，２００７）は、ダイサーが、同じ側に修飾を有する長いデュプレックスをプロセシングするであろうことを示した。
【０２６１】
ここで出願人は、配列のいずれかの末端における４×２’Ｏ−メチル修飾を有する平滑２５−ｍｅｒのデュプレックスなどの、より長いｄｓＲＮＡ上のあるセンスおよび／またはアンチセンス鎖の修飾はダイサー酵素によって切断されないことを実証している。本明細書に記載されている他の修飾戦略もまたダイサー切断される能力を喪失させ得ることがわかっている。修飾は一般的にセンス鎖の５’または３’末端の両方に含まれる。
【０２６２】
例７：代替ＲＮＡｉ化合物に取り込まれた免疫沈降Ａｇｏ２のノーザンブロット
本例は、本発明のダイサー抵抗性ｄｓＲＮＡがＲＩＳＣ複合体に取り込まれ、遺伝子サイレンシング活性を有することを実証する。
【０２６３】
ｍｙｃ−Ａｇｏ２を安定的に発現する２９３Ｓ細胞（Ｈａｎｎｏｎ  Ｌａｂ、ＣＳＨＬの厚意により取得）を、２５−ｍｅｒ（表４中の１０１７４）のまたは２６−ｍｅｒ（表４中の１０１７５）の代替ＲＮＡｉ化合物デュプレックスでトランスフェクトした。２４時間後に、細胞切片を収集し、抗ｃ−ｍｙｃ抗体（Ｓｉｇｍａ）を抱合したアガロースビーズを用いて免疫沈降し、ｍｙｃ−Ａｇｏ２タンパクを沈降させた。Ａｇｏ２に取り込まれたＲＮＡを沈降させ、１５％のポリアクリルアミドゲル上に装填した。２１−２６ｎｔの３２Ｐ末端標識一本鎖ＲＮＡマーカーを、サイズの決定のためにゲルに含ませた。ポリアクリルアミドゲルからのＲＮＡをナイロン膜へ転写し、膜に紫外線架橋した。その膜を、トランスフェクトされた代替ＲＮＡｉ化合物に特異的な３２Ｐ標識化ＬＮＡプローブとともに、一晩インキュベートした。洗浄後、ブロットをｐｈｏｓｐｈｏｒ  ｉｍａｇｉｎｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（ＢＡＳ−２５００、Ｆｕｊｉ）で可視化した（図８Ａ参照）。
【０２６４】
この結果は、２５−ｍｅｒまたは２６−ｍｅｒの代替ＲＮＡｉ化合物が、ＲＮＡｉプロセスの一環として、ダイサー切断されないという結論をさらに支持する。加えて、２５−ｍｅｒまたは２６−ｍｅｒのデュプレックスは、ＲＩＳＣ複合体中のＲＮＡｉサイレンシングＡｇｏ２と会合することがわかった。配列は表４に示される。
【０２６５】
類似の実験では、ｃ−ｍｙｃ  Ａｇｏ２を発現する２９３細胞を、ＳＯＤ１に対する様々なデュプレックス（例として、非修飾の２１―ｍｅｒ；非修飾の２５−ｍｅｒ；および４／４  ２’−Ｏ−Ｍｅ修飾を有する２５−ｍｅｒ）でトランスフェクトした。細胞を採取、溶解し、ｃ−ｍｙｃのＡｇｏ２を前述したように免疫沈降した。免疫沈降後、ＩＰ画分のＲＮＡを抽出および沈降した。そして本明細書中に記載したように、ＲＮＡを変性ポリアクリルアミドゲルに装填し、ナイロン膜へ転写し、トランスフェクトされたＲＮＡデュプレックスのガイド鎖に特異的なＬＮＡプローブを用いて検出した。
【０２６６】
図８ＢはデュプレックスＳＯＤ１を標的とするＲＮＡデュプレックスのガイド鎖についてのノーザンブロットを示す。一本鎖ＲＮＡを、捕獲したガイド鎖ＲＮＡの横に流した。サイズマーカーは下線が引かれており、２１から２５ｎｔ長のサイズに相当する。２１−２５ｎｔの一本鎖ＲＮＡマーカーと比較して、２つの試験された２５−ｂｐデュプレックスのＡｇｏ２：ＲＩＳＣ会合ガイド鎖は長さが２５ｎｔと特定された。これらのデータは、修飾されたガイド鎖がその完全長形態でＡｇｏ２：ＲＩＳＣと結合することを確認する。本研究では、非修飾の２５−ｂｐデュプレックスが、細胞中での効率的なダイサープロセシングによりもたらされるはずであった、より小さい想定産物へと効率的に切断されていないことにも注目されたい。これらの操作された２９３細胞株はｃ−ｍｙｃ標識Ａｇｏ２タンパクを劇的に過剰発現するので、Ａｇｏ２：ＲＩＳＣ複合体の豊富さにより、ＲＮＡデュプレックスがダイサーにプロセシングされ得る以前に取り込まれてしまう可能性がある。
【０２６７】
免疫沈降前に細胞溶解物のアリコートにおける標的ｍＲＮＡの減少を測定することによって、これらの細胞中での強力な活性が確認された。図８Ｃは、ｃ−ｍｙｃ  Ａｇｏ２を発現する２９３細胞のトランスフェクション後におけるＳＯＤ１の発現を示す。ｃ−ｍｙｃ  Ａｇｏ２の免疫沈降の前に、細胞溶解物の画分を総細胞ＲＮＡ精製のために収集した。方法欄に記載のように、ＲＮＡを精製し、ｂＤＮＡアッセイを用いて遺伝子発現を測定した。ＳＯＤ１発現のレベルをＰＰＩＢに対して正規化して、対照デュプレックスを標的とするルシフェラーゼに対して調整した。ＲＮＡデュプレックスを標的とするトランスフェクトされたＳＯＤ１の最終濃度は２５ｎＭだった。
【０２６８】
例８：精製したＲＩＳＣを用いた合成基質のｍＲＮＡ切断アッセイ
本例は、代替ＲＮＡｉ化合物中のダイサー抵抗性アンチセンス鎖（ガイド配列）の５’−末端がダイサー切断産物（２１−ｍｅｒ）の５’−末端と合致し、（標的ｍＲＮＡ上の）切断部位がガイド鎖の５’−末端から１０番目および１１番目のヌクレオチドの間であることを実証する。
【０２６９】
一つの実験では、ｍｙｃ−Ａｇｏ２を安定的に発現する２９３Ｓ細胞（Ｈａｎｎｏｎ  Ｌａｂ、ＣＳＨＬの厚意により取得）を、２１ｍｅｒの修飾ｄｓＲＮＡ１００３６（Ｒ１）のほかに、数個の代替ＲＮＡｉ化合物デュプレックスでトランスフェクトした。２４時間後に、細胞溶解物を収集し、抗ｃ−ｍｙｃ抗体（Ｓｉｇｍａ）を結合させたアガロースビーズを用いて免疫沈降した。免疫沈降（ＩＰ）サンプルを、合成の放射性標識化５０ｎｔ基質（表５）とともに、３７℃で２時間インキュベートした。サンプルを次に、１５％のポリアクリルアミドゲルに流し、ｐｈｏｓｐｈｏｒ  ｉｍａｇｅｒ（ＢＡＳ−２５００、Ｆｕｊｉ）で可視化した。
【０２７０】
Ｒｌ／１００３６と比較すると、２５−ｍｅｒの代替ＲＮＡｉ化合物１００２３が４つの追加の５’−末端ヌクレオチドを有し、それによってその予測される切断産物の長さが１００３６のそれより４ヌクレオチド分長くなるであろうことに注目されたい。Ｒｌ／１００３６と比較すると、２５−ｍｅｒの代替ＲＮＡｉ化合物１０１７４は４つの追加の３’−末端ヌクレオチドを有するが、同じ５’−末端を有するので、その予測される切断産物が１００３６のそれと同一になるだろう。
【０２７１】
標的合成基質の切断は、２１ｎｔより長いダイサープロセシングされないデュプレックスのために、アンチセンス鎖の５’−末端から１０ｎｔの一律の場所で起こる（データは示さない）。バンド群ではなく、一産物のバンドとなる単一の切断箇所が存在する。この結果は、活性なデュプレックスの設計にとって意味があり、その切断箇所の知識をもって、任意の長さのデュプレックスにおいて化学的および配列的修飾を位置決めすることを可能とする。鍵となる残基はこの結果により定義される。
【０２７２】
この結果は、ＳＯＤ１遺伝子の異なる部位における切断を導くために設計された３つの他のデュプレックス（図９Ａおよび９Ｂを参照のこと）にてさらに確認された。具体的には、合成基質を、試験されるＲＮＡデュプレックスの標的配列を含むＳＯＤ１遺伝子の５０ｎｔ領域に相当するように、化学的に合成した。図９Ａは、合成基質ならびに予想切断箇所および産物の概略図である。図９Ｂにおいて、方法欄に記載のように、ＳＯＤ１を標的とするＲＮＡデュプレックスをｃ−ｍｙｃ  Ａｇｏ２を発現する２９３細胞へとトランスフェクトした。細胞を採取、溶解し、ｃ−ｍｙｃ  Ａｇｏ２を免疫沈降し、緩衝液中で再構成した。方法欄に記載のように、免疫沈降物を５０ｎｔの３２Ｐ−標識化合成基質とともに３０℃で２時間インキュベートした。２時間のインキュベート後、サンプルをサイズマーカー（下線で表示される）と並べて変性ポリアクリルアミドゲルに装填した。サンプルのアルファベット文字は、パネルＡの概略図に示される以下のデュプレックスに相当する。Ａ＝非修飾１９−ｂｐ＋２ｎｔのｓｉＲＮＡ、Ｂ＝非修飾２５−ｂｐデュプレックス、Ｃ＝４／４  ２’ＯＭｅを有する２５−ｂｐデュプレックス、Ｄ＝４／４  ２’ＯＭｅを有する２５−ｂｐデュプレックス、Ｅ＝ルシフェラーゼ対照デュプレックス。
【０２７３】
例９：化学的修飾はダイサープロセシングを防ぐ
上記の研究は、２５−ｂｐＲＮＡデュプレックスが強力な遺伝子サイレンシングの達成、Ａｇｏ２：ＲＩＳＣへの完全な取り込み、およびガイド鎖のヌクレオチド１０の向かいにある意図する標的の切断を可能とすることを示す。過去の研究は、核酸のメチル化修飾がエンドヌクレアーゼ活性を防ぐことが可能で、それは潜在的にダイサーが２１−ｂｐ以上のデュプレックスをプロセシングする能力を阻害し得ることを示してきた。これらの化学的に修飾されたＲＮＡデュプレックスについてのダイサープロセシングを調査するために、修飾形状群（a panel of modification configuration）を、インビトロにおけるダイサー切断に対する感受性について試験した（図１７Ａ）。活性および標的特異性が、ＲＩＳＣに組み込まれたガイド鎖配列の５’位置によって定義づけられるため、切断産物の知見が少しでもあるのであれば、ＲＮＡｉ活性におけるダイサープロセシングの役割の解明の助けとなるだろう。
【０２７４】
ＳＯＤ１遺伝子を標的とする一連のデュプレックスを、パッセンジャー鎖の両末端（５’および３’）を、２’ＯＭｅヌクレオチドの数を変化させて修飾した。これらのデュプレックスを、組換ヒトダイサー酵素とともにインキュベートし、プロセシングについて分析した（図１７Ｂ）。非修飾の２５−ｂｐデュプレックスおよびパッセンジャー鎖の両末端において１つの２’ＯＭｅ修飾を有するデュプレックス（１／１）は、２１−ｂｐのｓｉＲＮＡ産物へと完全にプロセシングされる。パッセンジャー鎖の両末端において２つの２’ＯＭｅを有するデュプレックス（２／２）は、この実験において、これらの条件下（１６時間インキュベーション）では、約３０％のデュプレックスがプロセシングされずに残り、部分的なプロセシングを示した（図１７Ｃ）。しかしながら、パッセンジャー鎖の両末端において３つまたは４つの２’ＯＭｅ修飾されたヌクレオチドを有するデュプレックス（３／３または４／４）は、ダイサー酵素によってプロセシングされない。
【０２７５】
ダイサー基質の両鎖の３’末端におけるブロッキング基の存在はプロセシングをブロックする可能性があることが報告されてきた。追加の修飾形状を有する、この同一のＳＯＤ１標的デュプレックス配列のダイサープロセシングを調査した。試験された形状は、４つの２’ＯＭｅ修飾を、両５’末端、両３’末端、またはデュプレックスの各個の鎖（パッセンジャーまたはガイド鎖）の両末端（５’および３’）において含んでいた。ダイサープロセシングはこれら全ての修飾パターンによってブロックされる（図１７Ｄ）。ＳＯＤ１遺伝子上の異なる配列を標的とする２’−Ｏ−Ｍｅ修飾された２５−ｂｐデュプレックスについても類似する結果が得られる（図１７Ｅ）。具体的には、本明細書中に記載のように、ヒトＳＯＤ１配列を標的とする２５−ｂｐデュプレックス（表４を参照のこと）をダイサー酵素で１６時間インキュベートして、ＴＢＥ−ポリアクリルアミドゲル上に装填した。ゲルをＳＹＢＲグリーン染色およびＵＶトランスイルミネーターによって可視化した。示される配列は、デュプレックスの両末端において高いＣおよびＧ塩基含有量を有し、それがよりヌクレアーゼ抵抗性となるのを助けている。「Ｍ」は、本明細書中に記載の市販のｓｉＲＮＡマーカーを意味する。
【０２７６】
例１０：２’ＯＭｅを含む代替ＲＮＡｉ化合物の活性比較
本例は、主題の代替ＲＮＡｉ化合物コンストラクトの多くの可能な設計を記載し、様々な２’ＯＭｅを含む代替ＲＮＡｉ化合物の代表的な活性比較データを提供する。
【０２７７】
１００１５または１００２３配列（図１０Ａを参照のこと）に基づく多様な代替ＲＮＡｉ化合物を、図１０Ｂに示されるように、化学構造修飾物と比較した。例えば、図１０Ｂに示されるように、「０８１１」はセンス鎖の００８化学構造、およびアンチセンス鎖の０１１化学構造をいう。比較のために、０１１１、すなわち００１−０１１、は多くの以前の例において用いられた、化学構造をスクリーニングするオリジナルの代替ＲＮＡｉ化合物である。結果は、いくつかの修飾がＳＯＤ１活性レベルの低下の点でより高い活性へと導くことを示す（図１１）。
【０２７８】
代替ＲＮＡｉ化合物のセンス鎖における２’ＯＭｅ修飾の変動量の活性比較
所定のデュプレックスの活性度合いにおいてセンス鎖上の２’ＯＭｅが有する位置効果を理解するために、１００１５または１００２３のいずれかの配列に基づく多様な代替ＲＮＡｉ化合物を、センス鎖への２’ＯＭｅ修飾の量を変動させたものと比較した（図１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ）。全てのデュプレックスは非修飾アンチセンス鎖（すなわち、化学構造０１１である。図１０Ｂを参照のこと）を有する。図１２Ａは、ＰＰＩＢ（ハウスキーピング遺伝子）に対して正規化したＳＯＤ１サイレンシングの相対活性を示す。図１２Ｂおよび１２Ｃは、（アンチセンス鎖番号に関して）どの位置に２’ＯＭｅが配置され、オリジナルの００１化学構造（図１０Ｂを参照のこと）と比較されたかを示すビジュアルマップである。グラフは各デュプレックスの活性を、０１１化学構造よりも上または下の相対的パーセンテージとして図示する。０２５、０２４、００９、０３６、０２１、０１０、０３９、０３３、および００８に相当する１００１５配列（図１２Ｂ）のＩＤは、より良い活性を示し、そのいくつかをさらなる活性分析のために選択した。１００２３配列についての類似の分析もまた図１２Ｃに示される。
【０２７９】
この実験は、異なる鎖を一緒にカスタムアニーリングして、ＨＥＫ２９３細胞を５ｎＭのデュプレックスでトランスフェクトすることにより実施した。ＳＯＤ１に対するデュプレックスの活性を、トランスフェクションの２４時間後にｂＤＮＡアッセイを用いて測定し、ＰＰＩＢに対して正規化した。上述の作用メカニズムの研究は、活性および機能性を改善するための他の修飾の予測位置決めを可能とした。
【０２８０】
重複しない配列を有する２つのコンストラクト（１００１５および１００２３）からの結果は、試験された特定の修飾化学構造に関して著しく一貫している（例として、０１９化学構造によって修飾された１００１５は、０１９化学構造によって修飾された１００２３と事実上同一の結果を有する、等）。これは、（標的とする配列よりもむしろ）修飾化学構造が、ＲＮＡｉ媒介性の遺伝子サイレンシングにおいて観察された差異の主要な理由であることを示唆する。
【０２８１】
いくつかの好適なセンス鎖修飾スキームを同定したので、出願人らは以下の試験において、いくつかのセンス−アンチセンス修飾の組合せを追跡調査した。
【０２８２】
異なる２’ＯＭｅ修飾パターンの活性比較
１００１５または１００２３いずれかの配列に基づく多様な代替ＲＮＡｉ化合物を、広範なセンス鎖のみの２’ＯＭｅ分析の追跡調査として試験した。図１３Ａ（２４時間）および１３Ｂ（４８時間）は、ＰＰＩＢ（ハウスキーピング遺伝子）に対して正規化したＳＯＤ１サイレンシングの相対活性を示す。図１３Ｃおよび１３Ｄは、２’ＯＭｅの（アンチセンス鎖番号に関する）相対位置を示すビジュアルマップであり、それらをオリジナル化学構造（００１）と比較した。デュプレックス上に存在するアンチセンスの化学構造のタイプを表すためにグラフを色づけした。これらの図中に表される活性は００１−０１１（オリジナル代替ＲＮＡｉ化合物）に関連付けられている。０４２化学構造（位置２における２’ＯＭｅ）を有するアンチセンス鎖を含むデュプレックスに相当するＩＤは、この実験においてより良い活性を示した。
【０２８３】
この実験は、異なる鎖を一緒にカスタムアニーリングして、ＨＥＫ２９３細胞を５ｎＭのデュプレックスでトランスフェクトすることによって実施した。ＳＯＤ１に対するデュプレックスの活性を、トランスフェクションの２４時間後または４８時間後にｂＤＮＡアッセイを用いて測定し、ＰＰＩＢに対して正規化した。上述の作用メカニズムの研究は、活性および機能性を改善するための他の修飾の予測位置決めを可能とした。
【０２８４】
これらの結果は、センス鎖上の２’ＯＭｅ修飾を増加させることで、より良いまたは同等の活性が達成されることを確認する。さらには、活性を改善する有利な特徴を有する追加の設計が存在する。我々は驚くべきことに、５’末端上に１２個の２’ＯＭｅおよび３’末端上に１０個の２’ＯＭｅを有する２５−ｍｅｒのセンス鎖の修飾（すなわち、センス鎖化学構造０３９）が活性を増大する結果となることを見出した。このほぼ完全に修飾されたバージョンは、一つ以上のデュプレックスおよび一つ以上の実験において活性を改善した。上記の実験において活性を増大することがわかった化学構造を、以下に強調する：
・００１−０１１
・００１−０４２
・００１−０１３
・０３９−０１１
・０３９−０４２
・０３９−０１３
・ＭＭＯＯｌ−０１１
【０２８５】
さらには、図１３Ｄが示すように、アンチセンス鎖のヌクレオチド２上の修飾は増幅した活性を示した。アンチセンス鎖のヌクレオチド２上の修飾は、標的切断の特異性を増大することが報告されており、これはｍＲＮＡの低減をより排他的に標的遺伝子に制限している。
【０２８６】
加えて、５’アンチセンス配列のヌクレオチド２−８と対向するセンス鎖中のミスマッチ（化学構造ＭＭ００１）は、ＲＩＳＣ複合体へのより効率的な取り込みを可能とする。我々は、センス鎖の３’末端上のヌクレオチド２におけるミスマッチが、より強力なｍＲＮＡ低減活性を導くことを確認した。上記で実証された作用メカニズムの研究は、ダイサーによってプロセシングされていない、２１ｎｔより長いデュプレックスにおける修飾の正しい位置決めを可能とする。
【０２８７】
例１１：インビトロ安定性アッセイ
本例は、上述の利点に加えて、主題の代替ＲＮＡｉ化合物コンストラクトが血清中でより安定であり、これによってより良いｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を有すると期待されることを示す。
【０２８８】
示されるような様々な修飾を有する配列１００２３（図１４Ａ）または１００１５（図１４Ｂ）に基づくデュプレックスを、１０％ヒト血清中で、３７℃で２時間まで（パネルの下に分単位で示される）インキュベートした。サンプルをクロロホルムでクエンチして、水相を２０％のＴＢＥゲル上に流した。ゲルをＳＹＢＲグリーンで染色した。「Ｍ」はｓｉＲＮＡマーカー（２５ｍｅｒ、２１ｍｅｒ、１７ｍｅｒのデュプレックス）を表す一方、「Ｃ」は血清中でのインキュベーション無しのデュプレックスを示す。１００１５配列については、全ての修飾が、同条件下での非修飾の８１１デュプレックス（００８センス化学構造、０１１アンチセンス化学構造）と比較して、より安定なデュプレックスとなる結果となった。代替ＲＮＡｉ化合物修飾１１１、すなわち００１センス鎖、０１１アンチセンス鎖、は試験された最も安定なものの一つである。０３９化学構造のセンス鎖における修飾（３９１１）もまたデュプレックスを安定化し、増大した活性を示した。１００２３配列の修飾は、しかしながら、非修飾配列（８１１）と同条件下で安定性を変化させなかった。０３９修飾（３９１１）は、他の修飾と比べると軽度な分解阻害（主要な分解産物の強度を全長に対して比較する）を示す。
【０２８９】
例１２：ダイサーの非存在下における２１−２７ｂｐデュプレックスでのＲＮＡｉ
本例は、２１−２７ｂｐデュプレックスでＲＮＡｉをもたらすのにダイサーが必要とされないことを実証する。ここでは、ダイサー酵素が欠損したマウス胚性幹細胞株（Ｍｕｒｃｈｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）における標的遺伝子のサイレンシングを、合成の、化学的に修飾されたデュプレックスでのＲＮＡｉにおけるダイサーの役割をより直接的に試験することを可能とするために研究した。ダイサーがホモ接合のヌル（−／−）またはヘテロ接合（＋／−）の変異細胞をＲＮＡデュプレックスでトランスフェクトして、標的ｍＲＮＡの減少を定量した。
【０２９０】
酵素ダイサーについてホモ接合ヌルまたはヘテロ接合であるマウス由来のＥＳ細胞はＭｕｒｃｈｉｓｏｎおよび共同研究者によって作られ、すでに記述されたように培養された（Ｍｕｒｃｈｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）。前述の条件（Ｓｃｈａｎｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）を本明細書中に記載の９６−ウェルの用量反応法へと適用することによって、用量反応トランスフェクションを実施した。マウスＳＯＤ１と１００％相同性を有するヒトＳＯＤ１遺伝子を標的とする活性ＲＮＡデュプレックスを、２５ｎＭの最終ＲＮＡ濃度中で、０．０５ｎＭから１０ｎＭの範囲の濃度でトランスフェクトした。ＤＹ５４７標識したバージョンの非標的対照デュプレックスを用いて、トランスフェクション効率をモニターした。細胞をトランスフェクション後４８時間インキュベートして、遺伝子サイレンシング活性を、上述のようにＱｕａｎｔｉＧｅｎｅのｂＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイ（Ｐａｎｏｍｉｃｓ）を用いて測定した。
【０２９１】
図１５Ａ中のバーは、ｂＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイを用いて測定した、トランスフェクションの４８時間後のＳＯＤ１のｍＲＮＡレベルを表す。ＳＯＤ１レベルの発現をＰＰＩＢ遺伝子に対して正規化して、ルシフェラーゼ対照デュプレックスに対するパーセントとして調整した。試験された３つのデュプレックスは１９−ｂｐ＋２ｎｔのｓｉＲＮＡ（白いバー）、２５−ｂｐ平滑末端デュプレックス非修飾（黒いバー）、および「４／４」２’−Ｏ−Ｍｅ修飾を有する２５−ｂｐ平滑末端デュプレックス（縞のバー）である。本研究で使った正確な配列を図１５Ｂ中にて示す。
【０２９２】
既報のデータと矛盾せず、１９−ｂｐ＋２ｎｔのｓｉＲＮＡデュプレックスは、ダイサー非存在下で標的遺伝子を効率的にサイレンシングする（Ｍｕｒｃｈｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）。興味深いことに、（修飾および非修飾の）２５−ｂｐデュプレックスはダイサーヌル細胞中の標的遺伝子を、少なくとも同等の効率でサイレンシングする（図１５Ａ）。事実、ダイサータンパクを含む細胞中と比べると、ダイサーヌル細胞中での遺伝子サイレンシング活性の方がわずかに高かった。この所見は、ダイサーヌル細胞が、Ａｇｏ２：ＲＩＳＣの占有部分について競合する内在性ｍｉＲＮＡを有さないために、トランスフェクトされたデュプレックスがより強力になることができるという事実によって説明され得る。これらの結果は、ＲＮＡデュプレックスでの効率的なサイレンシングのためにダイサーは必要とされないことを確認するものである。
【０２９３】
この所見は、ＰＰＩＢ遺伝子に対する配列を試験することによって、最大２７−ｂｐの長さのデュプレックスにまで拡張された（図１６Ａ）。ここでは、白いバーは１９−ｂｐ＋２ｎｔのｓｉＲＮＡであり、点状のバーは非修飾２５−ｂｐデュプレックスであり、黒いバーは２’−Ｏ−Ｍｅ化学構造を有する２５−ｂｐデュプレックスであり、縞のバーは２’−Ｏ−Ｍｅ化学構造を有する２７−ｂｐデュプレックスである。サイレンシング活性は、ダイサーヌル細胞中のＳＯＤ１を標的とするデュプレックスで見られるものと類似する結果を達成した。配列は図１６Ｂに示される。
【０２９４】
方法
本明細書中の例で用いた特定の方法を、例示の目的のみのために、以下に提供する。
【０２９５】
化学的に合成されたＲＮＡ
一本鎖ＲＮＡをＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓまたはＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｄｈａｒｍａｃｏｎ製品により合成した。等モル比の一本鎖ＲＮＡを混合して、９０℃で１分間インキュベートしたあとに３７℃で１時間インキュベートすることによって、ＲＮＡデュプレックスを形成した。全ての一本鎖ＲＮＡおよびＲＮＡデュプレックスを−２０℃で保存した。ＲＮＡ配列情報については、オンラインの表３および表４を参照のこと。
【０２９６】
用量反応トランスフェクション
ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ）を１０％ウシ胎仔血清および１％ペニシリン−ストレプトマイシンとともにダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。ＮＩＨ３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ）を１０％仔ウシ血清および１％ペニシリン−ストレプトマイシンとともにＤＭＥＭ中で培養した。ＡＴＣＣ社が推奨するように、全ての細胞を１０％ＣＯ２とともに３７℃でインキュベートした。ＲＮＡデュプレックスを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）試薬を用いて、製造者が記載するようにおよび至適化条件で、用量依存的なやり方（０．００５ｎＭから５ｎＭ）でリバーストランスフェクトした。最終濃度２５ｎＭのトランスフェクトされるＲＮＡデュプレックスを作るために、ＲＮＡデュプレックスを非標的対照デュプレックスと一緒に混合した。化学構造および長さが一致する非標的対照デュプレックスはルシフェラーゼ遺伝子を標的とする。抗生物質を含まない培地入りの９６−ウェルプレートでトランスフェクションを実施して、通常の成長条件下で４８時間インキュベートした。遺伝子サイレンシングを、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ  ｂＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイ（Ｐａｎｏｍｉｃｓ）を用いて測定した。細胞を溶解し、製造者が記載するアッセイ条件下でｍＲＮＡレベルを測定した。ＳＯＤ１遺伝子およびＰＰＩＢ遺伝子について、種特異的なプローブのセット（Ｐａｎｏｍｉｃｓ）を用いて遺伝子発現を測定した。遺伝子発現値を、その発現がＳＯＤ１サイレンシングの影響を受けないためにハウスキーピング対照として用いたＰＰＩＢ遺伝子に対して正規化した。サイレンシングのパーセントおよびＥＣ５０値は、非標的対照デュプレックスの正規化ＳＯＤ１発現に基づく。ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ（Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて、その値を計算し、グラフで表した。
【０２９７】
Ａｒｇｏｎａｕｔｅ−２の免疫沈降およびＲＩＳＣからの複合ＲＮＡの抽出
ＲＮＡデュプレックスを、記載のようにアニールして、ｃ−ｍｙｃ  Ａｇｏ２を安定的に発現する２９３Ｔ細胞（Ｈａｎｎｏｎ  ｌａｂ、  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｓ）へトランスフェクトした。ｃ−ｍｙｃ  Ａｇｏ２を選択的に発現させるために、２９３細胞を前述のように０．５μｇ／ｍｌのＧ４１８の存在下で培養した。製造者が記載するように、１０ｃｍのプレートでＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ＲＮＡデュプレックスのトランスフェクションを実行した。抗生物質を含まないおよび２５ｎＭのＲＮＡデュプレックスの最終濃度を有する培地で、細胞をトランスフェクトした。採取およびｃ−ｍｙｃ  Ａｇｏ２の免疫沈降（ＩＰ）の前に、細胞を４８時間インキュベートした。細胞採取およびＩＰを前述したとおりに実施した。細胞をプレートから収集し、１×ＰＢＳで一度および２ｍｌの低張溶解緩衝液（ＨＬＢ）（１０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ７．５、１０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＤＴＴ、およびプロテアーゼ阻害剤）で一度、洗浄した。次に細胞を０．５ｍｌのＨＬＢ中で再構成して、氷上で１５分間膨潤させた。細胞溶解物の画分（５０μｌ）を採取し、続くＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ  ｂＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイ（Ｐａｎｏｍｉｃｓ）を用いた遺伝子サイレンシングアッセイのために、２００μｌのＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へと添加した。細胞溶解物を微調整用ペストル（tight pestle）付きの１ｍｌのＤｏｕｎｃｅホモジナイザーへと添加して、細胞を氷上でホモジナイズ（３０ストローク）した。細胞溶解物を遠心分離（１４，０００ｒｐｍ、４℃で３０分間）によって清澄化し、上清を新しい試験管へと移した。上清またはサイトゾル画分には、１ｍｌの緩衝液（ＬＢ６５０）（０．５％のＮＰ４０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのＣａＣｌ２、２０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ７．５、５ｍＭのＤＴＴ、６５０ｍＭのＫＣｌ、およびプロテアーゼ阻害剤）を添加した。アガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ）に結合させた抗−ｃ−ｍｙｃ抗体を各試験管へ添加し、試験管を４℃で一晩、回転させながらインキュベートした。一晩のインキュベーション後、ＩＰ反応物を３，０００ｒｐｍで２分間遠心沈降して、ビーズをＬＢ６５０緩衝液で３回洗浄した。ビーズ洗浄後、Ａｇｏ２を捕捉した抗体からＲＮＡを解離するために２００μｌのＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加した。エタノール洗浄に先立ち、製造者からの説明書に記載されるように、ＲＮＡを沈降した。ＲＮＡを２０μｌのＴＥ緩衝液中で再構成した。
【０２９８】
Ａｇｏ２免疫沈降で捕捉したＲＮＡのノーザンブロット
ＲＮＡを１５％のポリアクリルアミドＴＢＥ−Ｕｒｅａ変性ゲルに装填した。捕捉したＲＮＡのサイズを決定するために、２１から２５ｎｔの範囲内の事前に標識化した３２Ｐ−末端サイズマーカーをＩＰ反応物と並べて流した。ゲルをナイロン膜へ移して、ＲＮＡを紫外線架橋した。ＵｌｔｒａＨｙｂ−Ｏｌｉｇｏ緩衝液（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて、膜を３０分間４２℃でプレハイブリダイズ処理したあと、事前に準備した、ガイド鎖に相補的な３２Ｐ−標識化ロックド核酸プローブをハイブリダイゼーション緩衝液へ添加した。４２℃で一晩インキュベーション後、洗浄緩衝液（１×ＳＳＣ緩衝液、０．１％ＳＤＳ）中で膜を２回３０分間洗浄した。ブロットを、ＢｉｏＭＡＸオートラジオグラフフィルム（Ｋｏｄａｋ）に露光することで可視化した。自動フィルムプロセシングユニットを用いてフィルムを現像した。
【０２９９】
ｍＲＮＡの切断箇所アッセイ
ｃ−ｍｙｃ  Ａｇｏ２を発現する２９３細胞を、前述のようにＲＮＡデュプレックスでトランスフェクトした。Ａｇｏ２の免疫沈降もまた前述のように実施した。最終洗浄後、トランスフェクトしたＲＮＡを組み込んだＡｇｏ２複合体を含むアガロースビーズを１０μｌの緩衝液（１００ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、および１０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ  ７．５）中で再構成した。トランスフェクトされた２５−ｂｐデュプレックスまたは１９−ｂｐ＋２ｎｔのｓｉＲＮＡが標的とするヒトＳＯＤ１遺伝子の５０ｎｔ領域と一致する、化学的に合成された合成基質を、３２Ｐ−５’標識化およびゲル精製した。合成基質を、１９−ｂｐ＋２ｎｔのｓｉＲＮＡまたは２５−ｂｐデュプレックスのガイド鎖中の位置１０に相当する塩基２１を有するように特に設計した。標識化ＲＮＡをゲル精製してイソプロパノール中で沈殿させた。２０μｌの最終容量で切断反応を設定した。ＩＰ反応物（１０μｌ）を４μｌの標識化合成基質、１μｌのＲＮＡｓｉｎ、および５μｌの緩衝液（１００ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、および１０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ  ７．５）へ添加した。反応物を３０℃で２時間インキュベートした。インキュベーション後、反応物を１５％のポリアクリルアミドＴＢＥ−ｕｒｅａゲル上に流した。ゲルをオートラジオグラフフィルムに露光して、上述のやり方を用いて現像した。切断アッセイ反応物と並べて流した３２Ｐ−標識化サイズマーカーＲＮＡを用いて切断産物のサイズを決定した。
【０３００】
ダイサープロセシングアッセイ
製造者の推奨およびすでに記載された条件に基づいて、ＲＮＡデュプレックスを組換ヒトダイサー酵素（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ）とともにインキュベートした。ダイサー酵素とともにおよび無しで、サンプルを３７℃で一晩（〜１６時間）インキュベートした。ＴＢＥゲル添加液を加えて反応を停止させ、液体窒素中で瞬間冷凍した。停止させた反応物の画分（１６ｐｍｏｌｅｓ）を天然ＴＢＥ緩衝２０％のポリアクリルアミドゲルに流した。ｓｉＲＮＡマーカー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）をゲル上のサンプルと並べて流した。ゲルをＳＹＢＲグリーンＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて２０分間染色し、それからＵＶトランスイルミネーターおよびＣＣＤカメラを用いて可視化した。ＵＶＰ  ＢｉｏＣｈｅｍｉ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｔａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ＬａｂＷｏｒｋｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＵＶＰ）を用いて、ＵＶ撮像および相対定量分析を実施した。
【０３０１】
ダイサーヌル細胞トランスフェクション
ダイサーヌル細胞を、すでに記載されたように生成および培養した。すでに記載された条件を上記の９６−ウェル用量反応方法へと適用することによって、用量反応トランスフェクションを実施した。マウスＳＯＤ１と１００％相同性を有するヒトＳＯＤ１遺伝子を標的としたＲＮＡデュプレックスを、０．０５ｎＭから１０ｎＭの範囲の濃度でトランスフェクトした。ＤＹ５４７標識化対照デュプレックスを用いてトランスフェクション効率をモニターした。細胞をトランスフェクション後４８時間インキュベートし、それから遺伝子サイレンシング活性をＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ  ｂＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイ（Ｐａｎｏｍｉｃｓ）を用いて測定した。細胞を溶解して、前述のようにおよび製造者の推奨に基づいてアッセイを実施した。
【０３０２】
【表１−１】
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【０３０３】
【表１−２】
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【０３０４】
【表１−３】
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【０３０５】
【表２−１】
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【０３０６】
【表２−２】
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【０３０７】
【表３】
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【０３０８】
【表４−１】
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【０３０９】
【表４−２】
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【０３１０】
等価物
当業者は、本明細書中に記載の本発明の特定の態様の多数の等価物を、ルーチンの実験以上のものを用いずとも認識または確認することが可能だろう。かかる等価物は以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。本明細書中で引用する全ての特許、公開特許出願およびその他の参考文献の全内容は、その全体を参照文献として明示的に本明細書に組込まれる。
【０３１１】
【表５−１】
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【０３１２】
【表５−２】
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【０３１３】
【表５−３】
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【０３１４】
【表６−１】
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【０３１５】
【表６−２】
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【０３１６】
【表６−３】
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【０３１７】
【表６−４】
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【０３１８】
【表６−５】
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【０３１９】
【表６−６】
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【０３２０】
【表６−７】
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【０３２１】
【表６−８】
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【０３２２】
【表６−９】
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【０３２３】
【表６−１０】
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【０３２４】
【表６−１１】
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【０３２５】
【表６−１２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ−８Ｃ】
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【図９Ａ−９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ−１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ−１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ−１７Ｅ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年8月2日(2017.8.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的遺伝子の発現を阻害するための、１２〜４９ヌクレオチドの長さの二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）コンストラクトであって、該ｄｓＲＮＡが、
（１）５’−末端および３’−末端を有するセンス鎖、ここで該センス鎖の前記５’−および３’−末端のそれぞれにおける１または２以上のヌクレオチドが、２’−修飾リボース糖を有する、および
（２）前記センス鎖および前記標的遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズする、５’−末端および３’−末端を有するアンチセンス鎖、ここで該アンチセンス鎖が、該アンチセンス鎖の５’−末端から２番目のヌクレオチドにおいて、２’−修飾リボース糖を含む、
を含み、ここで、（ａ）前記ｄｓＲＮＡがダイサーによる切断に抵抗性であり、（ｂ）前記アンチセンス鎖がＲＩＳＣと会合し、および（ｃ）ｄｓＲＮＡが、配列依存的な様式で標的遺伝子の発現を阻害する、前記二本鎖ＲＮＡコンストラクト。
【外国語明細書】
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