(57)【要約】      （修正有）【課題】ＴＯＰ遺伝子に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメントと、少なくとも１つのオープンリーディングフレームと、好ましくは少なくとも１つのヒストンステムループとを含む人工核酸分子の提供。【解決手段】ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲに由来するか若しくはＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列を含むか、又は前記核酸配列からなる少なくとも１つの５’−非翻訳領域エレメント（５’ＵＴＲエレメント）と、少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と、を含む人工核酸分子。更に少なくとも１つのヒストンステムループを含む人工核酸分子。５’ＵＴＲエレメントとオープンリーディングフレームとが異種である人工核酸分子。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．  ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲに由来するか若しくはＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列を含むか、又は前記核酸配列からなる少なくとも１つの５’−非翻訳領域エレメント（５’ＵＴＲエレメント）と、
ｂ．  少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と、
を含むことを特徴とする人工核酸分子。
【請求項２】
ｃ．  少なくとも１つのヒストンステムループ
を更に含む請求項１に記載の人工核酸分子。
【請求項３】
５’ＵＴＲエレメントとオープンリーディングフレームとが、異種である請求項１から２のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項４】
５’ＵＴＲエレメントが、人工核酸分子からのタンパク質産生を増加させるのに好適である請求項１から３のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項５】
５’ＵＴＲエレメントとヒストンステムループとが、協同して、好ましくは少なくとも相加的に作用して、人工核酸分子からのタンパク質産生を増加させる請求項２から４のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項６】
５’ＵＴＲエレメントが、ＴＯＰモチーフを含まず、好ましくは、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲに由来する核酸配列、好ましくは５’ＵＴＲエレメントが、その５’末端において、ポリピリミジン領域の下流の位置１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０に位置するヌクレオチドで始まる請求項１から５のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項７】
ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲに由来する核酸配列、好ましくは５’ＵＴＲエレメントが、その３’末端において、前記５’ＵＴＲが由来する遺伝子の開始コドンの上流の位置１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０に位置するヌクレオチドで終わる請求項１から６のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項８】
５’ＵＴＲエレメントが、開始コドンもオープンリーディングフレームも含まない請求項１から７のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項９】
ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲに由来する核酸配列が、真核生物のＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲ又はその変異体、好ましくは植物又は動物のＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲ又はその変異体、より好ましくは脊索動物のＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲ又はその変異体、更により好ましくは脊椎動物のＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲ又はその変異体、最も好ましくは哺乳類のＴＯＰ遺伝子（例えば、ヒトのＴＯＰ遺伝子）の５’ＵＴＲ又はその変異体に由来する請求項１から８のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項１０】
少なくとも１つのヒストンステムループが、以下の式（Ｉ）及び（ＩＩ）のいずれかから選択される請求項２から９のいずれかに記載の人工核酸分子：
式（Ｉ）（ステム境界エレメントを含まないステムループ配列）：
【化１】
2018007682.tif 000245
式（ＩＩ）（ステム境界エレメントを含むステムループ配列）：
【化２】
2018007682.tif 000246
（式中、
ステム１又はステム２の境界エレメントＮ１−６は、１個〜６個、好ましくは２個〜６個、より好ましくは２個〜５個、更により好ましくは３個〜５個、最も好ましくは４個〜５個、又は５個のＮの連続配列であり、各Ｎは、互いに独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、及びＣから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチドアナログから選択され、
ステム１［Ｎ０−２ＧＮ３−５］は、エレメントステム２に対して逆相補的であるか又は部分的に逆相補的であり、且つ５個〜７個のヌクレオチドの連続配列であり、Ｎ０−２は、０個〜２個、好ましくは０個〜１個、より好ましくは１個のＮの連続配列であり、各Ｎは、互いに独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、及びＣから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチドアナログから選択され、Ｎ３−５は、３個〜５個、好ましくは４個〜５個、より好ましくは４個のＮの連続配列であり、各Ｎは、互いに独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、及びＣから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチドアナログから選択され、Ｇは、グアノシン又はそのアナログであり、任意でシチジン又はそのアナログによって置換されてもよいが、但し、その場合、ステム２におけるその相補的ヌクレオチドであるシチジンも、グアノシンによって置換され、
ループ配列［Ｎ０−４（Ｕ／Ｔ）Ｎ０−４］は、エレメントステム１とステム２との間に位置し、且つ３個〜５個のヌクレオチド、より好ましくは４個のヌクレオチドの連続配列であり、各Ｎ０−４は、互いに独立して、０個〜４個、好ましくは１個〜３個、より好ましくは１個〜２個のＮの連続配列であり、各Ｎは、互いに独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、及びＣから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチドアナログから選択され、Ｕ／Ｔは、ウリジン又は任意でチミジンを表し、
ステム２［Ｎ３−５ＣＮ０−２］は、エレメントステム１に対して逆相補的であるか又は部分的に逆相補的であり、且つ５個〜７個のヌクレオチドの連続配列であり、Ｎ３−５は、３個〜５個、好ましくは４個〜５個、より好ましくは４個のＮの連続配列であり、各Ｎは、互いに独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、及びＣから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチドアナログから選択され、Ｎ０−２は、０個〜２個、好ましくは０個〜１個、より好ましくは１個のＮの連続配列であり、各Ｎは、互いに独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、及びＣから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチドアナログから選択され、Ｃは、シチジン又はそのアナログであり、任意でグアノシン又はそのアナログによって置換されてもよいが、但し、その場合、ステム１におけるその相補的ヌクレオチドであるグアノシンも、シチジンによって置換され、
ステム１及びステム２は、互いに塩基対合して、ステム１とステム２との間に塩基対合が生じ得る逆相補的配列を形成することができるか、或いは、互いに塩基対合して、ステム１とステム２との間に不完全な塩基対合が生じ得る部分的に逆相補的な配列を形成することができる）。
【請求項１１】
少なくとも１つのヒストンステムループが、以下の式（Ｉａ）及び（ＩＩａ）のうちの少なくとも１つから選択される請求項２から１０のいずれかに記載の人工核酸分子：
式（Ｉａ）（ステム境界エレメントを含まないステムループ配列）：
【化３】
2018007682.tif 000247
式（ＩＩａ）（ステム境界エレメントを含むステムループ配列）：
【化４】
2018007682.tif 000248
。
【請求項１２】
ｄ．  ポリ（Ａ）配列及びポリアデニル化シグナルの少なくともいずれか
を更に含む請求項１から１１のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項１３】
ポリ（Ａ）配列が、約２５アデノシンヌクレオチド〜約４００アデノシンヌクレオチドの配列、好ましくは、約５０アデノシンヌクレオチド〜約４００アデノシンヌクレオチドの配列、より好ましくは、約５０アデノシンヌクレオチド〜約３００アデノシンヌクレオチドの配列、更により好ましくは、約５０アデノシンヌクレオチド〜約２５０アデノシンヌクレオチドの配列、最も好ましくは、約６０アデノシンヌクレオチド〜約２５０アデノシンヌクレオチドの配列を含むか又はからなる請求項１２に記載の人工核酸分子。
【請求項１４】
ポリアデニル化シグナルが、コンセンサス配列ＮＮ（Ｕ／Ｔ）ＡＮＡ（Ｎは、Ａ又はＵである）、好ましくはＡＡ（Ｕ／Ｔ）ＡＡＡ又はＡ（Ｕ／Ｔ）（Ｕ／Ｔ）ＡＡＡを含む請求項１２から１３のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項１５】
ｅ．  ポリ（Ｃ）配列
を更に含む請求項１から１４のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項１６】
ポリ（Ｃ）配列が、約１０シチジンヌクレオチド〜約２００シチジンヌクレオチド、より好ましくは約１０シチジンヌクレオチド〜約１００シチジンヌクレオチド、より好ましくは約１０シチジンヌクレオチド〜約５０シチジンヌクレオチド、更により好ましくは約２０シチジンヌクレオチド〜約４０シチジンヌクレオチドを含む、好ましくはからなる請求項１５に記載の人工核酸分子。
【請求項１７】
ｆ．  少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメント
を更に含む請求項１から１６のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項１８】
少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメントが、安定なｍＲＮＡを提供する遺伝子の３’ＵＴＲ又は安定なｍＲＮＡを提供する遺伝子の３’ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる請求項１７に記載の人工核酸分子。
【請求項１９】
少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメントと少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメントとが、少なくとも相加的に、好ましくは相乗的に作用して、人工核酸分子からのタンパク質産生を増加させる請求項１７から１８のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項２０】
５’ＵＴＲエレメントが、配列番号１〜１，３６３、配列番号１，４３５、配列番号１，４６１、及び配列番号１，４６２からなる群より選択される核酸配列；配列番号１〜１，３６３、配列番号１，４３５、配列番号１，４６１、及び配列番号１，４６２のいずれかのホモログ、又はこれらの変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる請求項１から１９のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項２１】
５’ＵＴＲエレメントが、配列番号１〜１，３６３、配列番号１，４３５、配列番号１，４６１、及び配列番号１，４６２のいずれかから選択される核酸配列、又は対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有する核酸配列を含むか又はからなる、或いは、少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメントが、配列番号１〜１，３６３、配列番号１，４３５、配列番号１，４６１、及び配列番号１，４６２のいずれかから選択される核酸配列、又は対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有する核酸配列の断片（好ましくは、５’ＴＯＰモチーフを有しない）を含むか又はからなる請求項１から２０のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項２２】
５’ＵＴＲエレメントが、リボソームタンパク質をコードしているＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲ又はリボソームタンパク質をコードしているＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの変異体、好ましくは、配列番号１７０、２３２、２４４、２５９、１，２８４、１，２８５、１，２８６、１，２８７、１，２８８、１，２８９、１，２９０、１，２９１、１，２９２、１，２９３、１，２９４、１，２９５、１，２９６、１，２９７、１，２９８、１，２９９、１，３００、１，３０１、１，３０２、１，３０３、１，３０４、１，３０５、１，３０６、１，３０７、１，３０８、１，３０９、１，３１０、１，３１１、１，３１２、１，３１３、１，３１４、１，３１５、１，３１６、１，３１７、１，３１８、１，３１９、１，３２０、１，３２１、１，３２２、１，３２３、１，３２４、１，３２５、１，３２６、１，３２７、１，３２８、１，３２９、１，３３０、１，３３１、１，３３２、１，３３３、１，３３４、１，３３５、１，３３６、１，３３７、１，３３８、１，３３９、１，３４０、１，３４１、１，３４２、１，３４３、１，３４４、１，３４６、１，３４７、１，３４８、１，３４９、１，３５０、１，３５１、１，３５２、１，３５３、１，３５４、１，３５５、１，３５６、１，３５７、１，３５８、１，３５９、及び１，３６０のいずれかに係る核酸配列の５’ＵＴＲに由来する核酸配列、対応するＲＮＡ配列、これらのホモログ、又はこれらの変異体（好ましくは、５’ＴＯＰモチーフを有しない）を含むか又はからなる請求項１から２１のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項２３】
５’ＵＴＲエレメントが、配列番号１７０、２３２、２４４、２５９、１，２８４、１，２８５、１，２８６、１，２８７、１，２８８、１，２８９、１，２９０、１，２９１、１，２９２、１，２９３、１，２９４、１，２９５、１，２９６、１，２９７、１，２９８、１，２９９、１，３００、１，３０１、１，３０２、１，３０３、１，３０４、１，３０５、１，３０６、１，３０７、１，３０８、１，３０９、１，３１０、１，３１１、１，３１２、１，３１３、１，３１４、１，３１５、１，３１６、１，３１７、１，３１８、１，３１９、１，３２０、１，３２１、１，３２２、１，３２３、１，３２４、１，３２５、１，３２６、１，３２７、１，３２８、１，３２９、１，３３０、１，３３１、１，３３２、１，３３３、１，３３４、１，３３５、１，３３６、１，３３７、１，３３８、１，３３９、１，３４０、１，３４１、１，３４２、１，３４３、１，３４４、１，３４６、１，３４７、１，３４８、１，３４９、１，３５０、１，３５１、１，３５２、１，３５３、１，３５４、１，３５５、１，３５６、１，３５７、１，３５８、１，３５９、及び１，３６０のいずれかに係る核酸配列の５’ＵＴＲ、又は対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有する核酸配列（好ましくは、５’ＴＯＰモチーフを有しない）を含むか又はからなる、或いは、少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメントが、配列番号１７０、２３２、２４４、２５９、１，２８４、１，２８５、１，２８６、１，２８７、１，２８８、１，２８９、１，２９０、１，２９１、１，２９２、１，２９３、１，２９４、１，２９５、１，２９６、１，２９７、１，２９８、１，２９９、１，３００、１，３０１、１，３０２、１，３０３、１，３０４、１，３０５、１，３０６、１，３０７、１，３０８、１，３０９、１，３１０、１，３１１、１，３１２、１，３１３、１，３１４、１，３１５、１，３１６、１，３１７、１，３１８、１，３１９、１，３２０、１，３２１、１，３２２、１，３２３、１，３２４、１，３２５、１，３２６、１，３２７、１，３２８、１，３２９、１，３３０、１，３３１、１，３３２、１，３３３、１，３３４、１，３３５、１，３３６、１，３３７、１，３３８、１，３３９、１，３４０、１，３４１、１，３４２、１，３４３、１，３４４、１，３４６、１，３４７、１，３４８、１，３４９、１，３５０、１，３５１、１，３５２、１，３５３、１，３５４、１，３５５、１，３５６、１，３５７、１，３５８、１，３５９、及び１，３６０のいずれかに係る核酸配列の５’ＵＴＲ又は対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有する核酸配列の断片（好ましくは、５’ＴＯＰモチーフを有しない）を含むか又はからなる請求項１から２２のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項２４】
５’ＵＴＲエレメントが、リボソームラージタンパク質（ＲＰＬ）をコードしているＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲ又はリボソームラージタンパク質（ＲＰＬ）をコードしているＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの変異体、好ましくは、配列番号６７、２５９、１，２８４〜１，３１８、１，３４４、１，３４６、１，３４８〜１，３５４、１，３５７、１，４６１、及び１，４６２のいずれかに係る核酸配列の５’ＵＴＲ、対応するＲＮＡ配列、これらのホモログ、又はこれらの変異体（好ましくは、５’ＴＯＰモチーフを有しない）に由来する請求項１から２３のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項２５】
５’ＵＴＲエレメントが、配列番号６７、２５９、１，２８４〜１，３１８、１，３４４、１，３４６、１，３４８〜１，３５４、１，３５７、１，４６１、及び１，４６２のいずれかに係る核酸配列の５’ＵＴＲ、又は対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有する核酸配列（好ましくは、５’ＴＯＰモチーフを有しない）を含むか又はからなる、或いは、少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメントが、配列番号６７、２５９、１，２８４〜１，３１８、１，３４４、１，３４６、１，３４８〜１，３５４、１，３５７、１，４６１、及び１，４６２のいずれかに係る核酸配列の５’ＵＴＲ又は対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有する核酸配列の断片（好ましくは、５’ＴＯＰモチーフを有しない）を含むか又はからなる請求項１から２４のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項２６】
５’ＵＴＲエレメントが、リボソームタンパク質ラージ３２遺伝子の５’ＵＴＲ又はその変異体、好ましくは脊椎動物のリボソームタンパク質ラージ３２（Ｌ３２）遺伝子の５’ＵＴＲ又はその変異体、より好ましくは哺乳類のリボソームタンパク質ラージ３２（Ｌ３２）遺伝子の５’ＵＴＲ又はその変異体、最も好ましくはヒトのリボソームタンパク質ラージ３２（Ｌ３２）遺伝子の５’ＵＴＲ又はその変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなり、好ましくは、５’ＵＴＲエレメント（好ましくは、人工核酸分子）が、前記遺伝子の５’ＴＯＰを含まない請求項１から２５のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項２７】
５’ＵＴＲエレメントが、配列番号１，３６８及び１，４５２〜１，４６０のいずれかに係る核酸配列又は対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有する核酸配列を含むか又はからなり、或いは、少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメントが、配列番号１，３６８及び１，４５２〜１，４６０のいずれかに係る核酸配列又は対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有する核酸配列の断片を含むか又はからなる請求項１から２６のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項２８】
断片が、前記断片が由来する完全長配列の少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、更により好ましくは少なくとも６０％、更により好ましくは少なくとも７０％、更により好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％を表す前記完全長配列における連続する一続きのヌクレオチドに対応する連続する一続きのヌクレオチドからなる請求項２１、２３、２５、及び２７のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項２９】
少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメントが、少なくとも約２０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約３０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約４０ヌクレオチドの長さを有する請求項１から２８のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項３０】
５’ＵＴＲエレメントが、ＲＰＳＡ、ＲＰＳ２、ＲＰＳ３、ＲＰＳ３Ａ、ＲＰＳ４、ＲＰＳ５、ＲＰＳ６、ＲＰＳ７、ＲＰＳ８、ＲＰＳ９、ＲＰＳ１０、ＲＰＳ１１、ＲＰＳ１２、ＲＰＳ１３、ＲＰＳ１４、ＲＰＳ１５、ＲＰＳ１５Ａ、ＲＰＳ１６、ＲＰＳ１７、ＲＰＳ１８、ＲＰＳ１９、ＲＰＳ２０、ＲＰＳ２１、ＲＰＳ２３、ＲＰＳ２４、ＲＰＳ２５、ＲＰＳ２６、ＲＰＳ２７、ＲＰＳ２７Ａ、ＲＰＳ２８、ＲＰＳ２９、ＲＰＳ３０、ＲＰＬ３、ＲＰＬ４、ＲＰＬ５、ＲＰＬ６、ＲＰＬ７、ＲＰＬ７Ａ、ＲＰＬ８、ＲＰＬ９、ＲＰＬ１０、ＲＰＬ１０Ａ、ＲＰＬ１１、ＲＰＬ１２、ＲＰＬ１３、ＲＰＬ１３Ａ、ＲＰＬ１４、ＲＰＬ１５、ＲＰＬ１７、ＲＰＬ１８、ＲＰＬ１８Ａ、ＲＰＬ１９、ＲＰＬ２１、ＲＰＬ２２、ＲＰＬ２３、ＲＰＬ２３Ａ、ＲＰＬ２４、ＲＰＬ２６、ＲＰＬ２７、ＲＰＬ２７Ａ、ＲＰＬ２８、ＲＰＬ２９、ＲＰＬ３０、ＲＰＬ３１、ＲＰＬ３２、ＲＰＬ３４、ＲＰＬ３５、ＲＰＬ３５Ａ、ＲＰＬ３６、ＲＰＬ３６Ａ、ＲＰＬ３７、ＲＰＬ３７Ａ、ＲＰＬ３８、ＲＰＬ３９、ＲＰＬ４０、ＲＰＬ４１、ＲＰＬＰ０、ＲＰＬＰ１、ＲＰＬＰ２、ＲＰＬＰ３、ＵＢＡ５２から選択されるＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲ、又はこれらの変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる請求項１から２９のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項３１】
少なくとも１つのヒストンステムループが、配列番号１，３９１〜１４３３からなる群より選択される核酸配列、好ましくは、配列番号１，４０３〜１，４３３からなる群より選択される核酸配列を含むか又はからなる請求項２から３０のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項３２】
ヒストンステムループが、配列番号１，４３３に係る配列又は対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有する核酸配列を含むか又はからなり、好ましくは、配列番号１，４３３に係る配列又は対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有する配列の位置６、１３、及び２０が保存されている、即ち、配列番号１，４３３の位置６、１３、及び２０におけるヌクレオチド又は対応するＲＮＡヌクレオチドと同一である請求項２から３１のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項３３】
３’ＵＴＲエレメントが、アルブミン遺伝子、α−グロビン遺伝子、β−グロビン遺伝子、チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子、リポキシゲナーゼ遺伝子、及びコラーゲンアルファ遺伝子からなる群より選択される遺伝子の３’ＵＴＲに由来する核酸配列、又はアルブミン遺伝子、α−グロビン遺伝子、β−グロビン遺伝子、チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子、リポキシゲナーゼ遺伝子、及びコラーゲンアルファ遺伝子からなる群より選択される遺伝子の３’ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる請求項１７から３２のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項３４】
少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメントが、脊椎動物のアルブミン遺伝子の３’ＵＴＲ又はその変異体、好ましくは、哺乳類のアルブミン遺伝子の３’ＵＴＲ又はその変異体、より好ましくは、ヒトのアルブミン遺伝子の３’ＵＴＲ又はその変異体、更により好ましくはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００４７７．５に係るヒトのアルブミン遺伝子の３’ＵＴＲ又はその変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる請求項１７から３３のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項３５】
少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメントが、脊椎動物のα−グロビン遺伝子の３’ＵＴＲ又はその変異体、好ましくは、哺乳類のα−グロビン遺伝子の３’ＵＴＲ又はその変異体、より好ましくは、ヒトのα−グロビン遺伝子の３’ＵＴＲ又はその変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる請求項１７から３３のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項３６】
少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメントが、配列番号１，３６９〜１，３７７及び１，４３４から選択される核酸配列又は対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有する核酸配列を含むか又はからなる、或いは、少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメントが、配列番号１，３６９〜１，３７７及び１，４３４から選択される核酸配列又は対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有する核酸配列の断片を含むか又はからなる請求項１７から３３のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項３７】
断片が、前記断片が由来する完全長配列の少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、更により好ましくは少なくとも６０％、更により好ましくは少なくとも７０％、更により好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％を表す前記完全長配列における連続する一続きのヌクレオチドに対応する連続する一続きのヌクレオチドからなる請求項３６に記載の人工核酸分子。
【請求項３８】
３’ＵＴＲエレメントが、少なくとも約４０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約５０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約７５ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１００ヌクレオチド、更により好ましくは少なくとも約１２５ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも約１５０ヌクレオチドの長さを有する請求項１７から３７のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項３９】
人工核酸分子、好ましくはオープンリーディングフレームが、少なくとも部分的にＧ／Ｃ改変されており、好ましくは、前記オープンリーディングフレームのＧ／Ｃ含量が、野生型オープンリーディングフレームに比べて増加している請求項１から３８のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項４０】
オープンリーディングフレームが、コドンが最適化されている領域を含み、好ましくは、前記オープンリーディングフレームのコドンが最適化されている請求項１から３９のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項４１】
ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡ分子である請求項１から４０のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項４２】
ａ．  ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲに由来するか又はＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列を含むか又は前記核酸配列からなる少なくとも１つの５’−非翻訳領域エレメント（５’ＵＴＲエレメント）と、
ｂ．  少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）及び少なくとも１つのクローニングサイトの少なくともいずれかと、
を含むことを特徴とするベクター。
【請求項４３】
ｃ．  少なくとも１つのヒストンステムループ
を更に含む請求項４２に記載のベクター。
【請求項４４】
５’ＵＴＲエレメントとオープンリーディングフレームとが、異種である請求項４２から４３のいずれかに記載のベクター。
【請求項４５】
５’ＵＴＲエレメントが、ベクターからのタンパク質産生を増加させるのに好適である請求項４２から４４のいずれかに記載のベクター。
【請求項４６】
５’ＵＴＲエレメントとヒストンステムループとが、協同して、好ましくは少なくとも相加的に作用して、ベクターからのタンパク質産生を増加させる請求項４３から４５のいずれかに記載のベクター。
【請求項４７】
５’ＵＴＲエレメントが、ＴＯＰモチーフを含まず、好ましくは、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲに由来する核酸配列、好ましくは５’ＵＴＲエレメントが、その５’末端において、ポリピリミジン領域の下流の位置１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０に位置するヌクレオチドで始まる請求項４２から４６のいずれかに記載のベクター。
【請求項４８】
ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲに由来する核酸配列、好ましくは５’ＵＴＲエレメントが、その３’末端において、前記５’ＵＴＲが由来する遺伝子の開始コドンの上流の位置１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０に位置するヌクレオチドで終わる請求項４２から４７のいずれかに記載のベクター。
【請求項４９】
５’ＵＴＲエレメントが、開始コドンもオープンリーディングフレームも含まない請求項４２から４８のいずれかに記載のベクター。
【請求項５０】
ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲに由来する核酸配列が、真核生物のＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲ又はその変異体、好ましくは植物又は動物のＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲ又はその変異体、より好ましくは脊索動物のＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲ又はその変異体、更により好ましくは脊椎動物のＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲ又はその変異体、最も好ましくは哺乳類のＴＯＰ遺伝子（例えば、ヒトのＴＯＰ遺伝子）の５’ＵＴＲ又はその変異体に由来する請求項４２から４９のいずれかに記載のベクター。
【請求項５１】
少なくとも１つのヒストンステムループが、以下の式（Ｉ）及び（ＩＩ）のいずれかから選択される請求項４３から５０のいずれかに記載のベクター：
式（Ｉ）（ステム境界エレメントを含まないステムループ配列）：
【化５】
2018007682.tif 000249
式（ＩＩ）（ステム境界エレメントを含むステムループ配列）：
【化６】
2018007682.tif 000250
（式中、
ステム１又はステム２の境界エレメントＮ１−６は、１個〜６個、好ましくは２個〜６個、より好ましくは２個〜５個、更により好ましくは３個〜５個、最も好ましくは４個〜５個、又は５個のＮの連続配列であり、各Ｎは、互いに独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、及びＣから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチドアナログから選択され、
ステム１［Ｎ０−２ＧＮ３−５］は、エレメントステム２に対して逆相補的であるか又は部分的に逆相補的であり、且つ５個〜７個のヌクレオチドの連続配列であり、Ｎ０−２は、０個〜２個、好ましくは０個〜１個、より好ましくは１個のＮの連続配列であり、各Ｎは、互いに独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、及びＣから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチドアナログから選択され、Ｎ３−５は、３個〜５個、好ましくは４個〜５個、より好ましくは４個のＮの連続配列であり、各Ｎは、互いに独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、及びＣから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチドアナログから選択され、Ｇは、グアノシン又はそのアナログであり、任意でシチジン又はそのアナログによって置換されてもよいが、但し、その場合、ステム２におけるその相補的ヌクレオチドであるシチジンも、グアノシンによって置換され、
ループ配列［Ｎ０−４（Ｕ／Ｔ）Ｎ０−４］は、エレメントステム１とステム２との間に位置し、且つ３個〜５個のヌクレオチド、より好ましくは４個のヌクレオチドの連続配列であり、各Ｎ０−４は、互いに独立して、０個〜４個、好ましくは１個〜３個、より好ましくは１個〜２個のＮの連続配列であり、各Ｎは、互いに独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、及びＣから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチドアナログから選択され、Ｕ／Ｔは、ウリジン又は任意でチミジンを表し、
ステム２［Ｎ３−５ＣＮ０−２］は、エレメントステム１に対して逆相補的であるか又は部分的に逆相補的であり、且つ５個〜７個のヌクレオチドの連続配列であり、Ｎ３−５は、３個〜５個、好ましくは４個〜５個、より好ましくは４個のＮの連続配列であり、各Ｎは、互いに独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、及びＣから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチドアナログから選択され、Ｎ０−２は、０個〜２個、好ましくは０個〜１個、より好ましくは１個のＮの連続配列であり、各Ｎは、互いに独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、及びＣから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチドアナログから選択され、Ｃは、シチジン又はそのアナログであり、任意でグアノシン又はそのアナログによって置換されてもよいが、但し、その場合、ステム１におけるその相補的ヌクレオチドであるグアノシンも、シチジンによって置換され、
ステム１及びステム２は、互いに塩基対合して、ステム１とステム２との間に塩基対合が生じ得る逆相補的配列を形成することができるか、或いは、互いに塩基対合して、ステム１とステム２との間に不完全な塩基対合が生じ得る部分的に逆相補的な配列を形成することができる）。
【請求項５２】
少なくとも１つのヒストンステムループが、以下の式（Ｉａ）及び（ＩＩａ）のうちの少なくとも１つから選択される請求項４３から５１のいずれかに記載のベクター：
式（Ｉａ）（ステム境界エレメントを含まないステムループ配列）：
【化７】
2018007682.tif 000251
式（ＩＩａ）（ステム境界エレメントを含むステムループ配列）：
【化８】
2018007682.tif 000252
。
【請求項５３】
ｄ．  ポリ（Ａ）配列及びポリアデニル化シグナルの少なくともいずれか
を更に含む請求項４２から５２のいずれかに記載のベクター。
【請求項５４】
ポリ（Ａ）配列が、約２５アデノシンヌクレオチド〜約４００アデノシンヌクレオチドの配列、好ましくは、約５０アデノシンヌクレオチド〜約４００アデノシンヌクレオチドの配列、より好ましくは、約５０アデノシンヌクレオチド〜約３００アデノシンヌクレオチドの配列、更により好ましくは、約５０アデノシンヌクレオチド〜約２５０アデノシンヌクレオチドの配列、最も好ましくは、約６０アデノシンヌクレオチド〜約２５０アデノシンヌクレオチドの配列を含むか又はからなる請求項５３に記載のベクター。
【請求項５５】
ポリアデニル化シグナルが、コンセンサス配列ＮＮ（Ｕ／Ｔ）ＡＮＡ（Ｎは、Ａ又はＵである）、好ましくはＡＡ（Ｕ／Ｔ）ＡＡＡ又はＡ（Ｕ／Ｔ）（Ｕ／Ｔ）ＡＡＡを含む請求項５３から５４のいずれかに記載のベクター。
【請求項５６】
ｅ．  ポリ（Ｃ）配列
を更に含む請求項４２から５５のいずれかに記載のベクター。
【請求項５７】
ポリ（Ｃ）配列が、約１０シチジンヌクレオチド〜約２００シチジンヌクレオチド、より好ましくは約１０シチジンヌクレオチド〜約１００シチジンヌクレオチド、より好ましくは約１０シチジンヌクレオチド〜約５０シチジンヌクレオチド、更により好ましくは約２０シチジンヌクレオチド〜約４０シチジンヌクレオチドを含む、好ましくはからなる請求項５６に記載のベクター。
【請求項５８】
ｆ．  少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメント
を更に含む請求項４２から５７のいずれかに記載のベクター。
【請求項５９】
少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメントが、安定なｍＲＮＡを提供する遺伝子の３’ＵＴＲ又は安定なｍＲＮＡを提供する遺伝子の３’ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる請求項５８に記載のベクター。
【請求項６０】
少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメントと少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメントとが、少なくとも相加的に、好ましくは相乗的に作用して、ベクターからのタンパク質産生を増加させる請求項５８から５９のいずれかに記載のベクター。
【請求項６１】
５’ＵＴＲエレメントが、配列番号１〜１，３６３、配列番号１，４３５、配列番号１，４６１、及び配列番号１，４６２からなる群より選択される核酸配列；配列番号１〜１，３６３、配列番号１，４３５、配列番号１，４６１、及び配列番号１，４６２のいずれかのホモログ、又はこれらの変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる請求項４２から６０のいずれかに記載のベクター。
【請求項６２】
５’ＵＴＲエレメントが、配列番号１〜１，３６３、配列番号１，４３５、配列番号１，４６１、及び配列番号１，４６２のいずれかから選択される核酸配列、又は対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有する核酸配列（好ましくは、５’ＴＯＰモチーフを有しない）を含むか又はからなる、或いは、少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメントが、配列番号１〜１，３６３、配列番号１，４３５、配列番号１，４６１、及び配列番号１，４６２のいずれかから選択される核酸配列、又は対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有する核酸配列の断片（好ましくは、５’ＴＯＰモチーフを有しない）を含むか又はからなる請求項４２から６１のいずれかに記載のベクター。
【請求項６３】
５’ＵＴＲエレメントが、リボソームタンパク質をコードしているＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲ又はリボソームタンパク質をコードしているＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの変異体、好ましくは、配列番号１７０、２３２、２４４、２５９、１，２８４、１，２８５、１，２８６、１，２８７、１，２８８、１，２８９、１，２９０、１，２９１、１，２９２、１，２９３、１，２９４、１，２９５、１，２９６、１，２９７、１，２９８、１，２９９、１，３００、１，３０１、１，３０２、１，３０３、１，３０４、１，３０５、１，３０６、１，３０７、１，３０８、１，３０９、１，３１０、１，３１１、１，３１２、１，３１３、１，３１４、１，３１５、１，３１６、１，３１７、１，３１８、１，３１９、１，３２０、１，３２１、１，３２２、１，３２３、１，３２４、１，３２５、１，３２６、１，３２７、１，３２８、１，３２９、１，３３０、１，３３１、１，３３２、１，３３３、１，３３４、１，３３５、１，３３６、１，３３７、１，３３８、１，３３９、１，３４０、１，３４１、１，３４２、１，３４３、１，３４４、１，３４６、１，３４７、１，３４８、１，３４９、１，３５０、１，３５１、１，３５２、１，３５３、１，３５４、１，３５５、１，３５６、１，３５７、１，３５８、１，３５９、及び１，３６０のいずれかに係る核酸配列の５’ＵＴＲに由来する核酸配列、対応するＲＮＡ配列、これらのホモログ、又は本明細書に記載するこれらの変異体（好ましくは、５’ＴＯＰモチーフを有しない）を含むか又はからなる請求項４２から６２のいずれかに記載のベクター。
【請求項６４】
５’ＵＴＲエレメントが、配列番号１７０、２３２、２４４、２５９、１，２８４、１，２８５、１，２８６、１，２８７、１，２８８、１，２８９、１，２９０、１，２９１、１，２９２、１，２９３、１，２９４、１，２９５、１，２９６、１，２９７、１，２９８、１，２９９、１，３００、１，３０１、１，３０２、１，３０３、１，３０４、１，３０５、１，３０６、１，３０７、１，３０８、１，３０９、１，３１０、１，３１１、１，３１２、１，３１３、１，３１４、１，３１５、１，３１６、１，３１７、１，３１８、１，３１９、１，３２０、１，３２１、１，３２２、１，３２３、１，３２４、１，３２５、１，３２６、１，３２７、１，３２８、１，３２９、１，３３０、１，３３１、１，３３２、１，３３３、１，３３４、１，３３５、１，３３６、１，３３７、１，３３８、１，３３９、１，３４０、１，３４１、１，３４２、１，３４３、１，３４４、１，３４６、１，３４７、１，３４８、１，３４９、１，３５０、１，３５１、１，３５２、１，３５３、１，３５４、１，３５５、１，３５６、１，３５７、１，３５８、１，３５９、及び１，３６０のいずれかに係る核酸配列の５’ＵＴＲ、又は対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有する核酸配列（好ましくは、５’ＴＯＰモチーフを有しない）を含むか又はからなる、或いは、少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメントが、配列番号１７０、２３２、２４４、２５９、１，２８４、１，２８５、１，２８６、１，２８７、１，２８８、１，２８９、１，２９０、１，２９１、１，２９２、１，２９３、１，２９４、１，２９５、１，２９６、１，２９７、１，２９８、１，２９９、１，３００、１，３０１、１，３０２、１，３０３、１，３０４、１，３０５、１，３０６、１，３０７、１，３０８、１，３０９、１，３１０、１，３１１、１，３１２、１，３１３、１，３１４、１，３１５、１，３１６、１，３１７、１，３１８、１，３１９、１，３２０、１，３２１、１，３２２、１，３２３、１，３２４、１，３２５、１，３２６、１，３２７、１，３２８、１，３２９、１，３３０、１，３３１、１，３３２、１，３３３、１，３３４、１，３３５、１，３３６、１，３３７、１，３３８、１，３３９、１，３４０、１，３４１、１，３４２、１，３４３、１，３４４、１，３４６、１，３４７、１，３４８、１，３４９、１，３５０、１，３５１、１，３５２、１，３５３、１，３５４、１，３５５、１，３５６、１，３５７、１，３５８、１，３５９、及び１，３６０のいずれかに係る核酸配列の５’ＵＴＲ又は対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有する核酸配列の断片（好ましくは、５’ＴＯＰモチーフを有しない）を含むか又はからなる請求項４２から６３のいずれかに記載のベクター。
【請求項６５】
５’ＵＴＲエレメントが、リボソームラージタンパク質（ＲＰＬ）をコードしているＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲ又はリボソームラージタンパク質（ＲＰＬ）をコードしているＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの変異体、好ましくは、配列番号６７、２５９、１，２８４〜１，３１８、１，３４４、１，３４６、１，３４８〜１，３５４、１，３５７、１，４６１、及び１，４６２のいずれかに係る核酸配列の５’ＵＴＲ、対応するＲＮＡ配列、これらのホモログ、又はこれらの変異体（好ましくは、５’ＴＯＰモチーフを有しない）に由来する請求項４２から６４のいずれかに記載のベクター。
【請求項６６】
５’ＵＴＲエレメントが、配列番号６７、２５９、１，２８４〜１，３１８、１，３４４、１，３４６、１，３４８〜１，３５４、１，３５７、１，４６１、及び１，４６２のいずれかに係る核酸配列の５’ＵＴＲ、又は対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有する核酸配列（好ましくは、５’ＴＯＰモチーフを有しない）を含むか又はからなる、或いは、少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメントが、配列番号６７、２５９、１，２８４〜１，３１８、１，３４４、１，３４６、１，３４８〜１，３５４、１，３５７、１，４６１、及び１，４６２のいずれかに係る核酸配列の５’ＵＴＲ又は対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有する核酸配列の断片（好ましくは、５’ＴＯＰモチーフを有しない）を含むか又はからなる請求項４２から６５のいずれかに記載のベクター。
【請求項６７】
５’ＵＴＲエレメントが、リボソームタンパク質ラージ３２遺伝子の５’ＵＴＲ、好ましくは脊椎動物のリボソームタンパク質ラージ３２（Ｌ３２）遺伝子の５’ＵＴＲ又はその変異体、より好ましくは哺乳類のリボソームタンパク質ラージ３２（Ｌ３２）遺伝子の５’ＵＴＲ又はその変異体、最も好ましくはヒトのリボソームタンパク質ラージ３２（Ｌ３２）遺伝子の５’ＵＴＲ又はその変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなり、好ましくは、５’ＵＴＲエレメントが、前記遺伝子の５’ＴＯＰを含まない請求項４２から６６のいずれかに記載のベクター。
【請求項６８】
５’ＵＴＲエレメントが、配列番号１，３６８及び１，４５２〜１，４６０のいずれかに係る核酸配列又は対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有する核酸配列を含むか又はからなり、或いは、少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメントが、配列番号１，３６８及び１，４５２〜１，４６０のいずれかに係る核酸配列又は対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有する核酸配列の断片を含むか又はからなる請求項４２から６７のいずれかに記載のベクター。
【請求項６９】
断片が、前記断片が由来する完全長配列の少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、更により好ましくは少なくとも６０％、更により好ましくは少なくとも７０％、更により好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％を表す前記完全長配列における連続する一続きのヌクレオチドに対応する連続する一続きのヌクレオチドからなる請求項６２、６４、６６、及び６８のいずれかに記載のベクター。
【請求項７０】
少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメントが、少なくとも約２０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約３０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約４０ヌクレオチドの長さを有する請求項４２から６９のいずれかに記載のベクター。
【請求項７１】
５’ＵＴＲエレメントが、ＲＰＳＡ、ＲＰＳ２、ＲＰＳ３、ＲＰＳ３Ａ、ＲＰＳ４、ＲＰＳ５、ＲＰＳ６、ＲＰＳ７、ＲＰＳ８、ＲＰＳ９、ＲＰＳ１０、ＲＰＳ１１、ＲＰＳ１２、ＲＰＳ１３、ＲＰＳ１４、ＲＰＳ１５、ＲＰＳ１５Ａ、ＲＰＳ１６、ＲＰＳ１７、ＲＰＳ１８、ＲＰＳ１９、ＲＰＳ２０、ＲＰＳ２１、ＲＰＳ２３、ＲＰＳ２４、ＲＰＳ２５、ＲＰＳ２６、ＲＰＳ２７、ＲＰＳ２７Ａ、ＲＰＳ２８、ＲＰＳ２９、ＲＰＳ３０、ＲＰＬ３、ＲＰＬ４、ＲＰＬ５、ＲＰＬ６、ＲＰＬ７、ＲＰＬ７Ａ、ＲＰＬ８、ＲＰＬ９、ＲＰＬ１０、ＲＰＬ１０Ａ、ＲＰＬ１１、ＲＰＬ１２、ＲＰＬ１３、ＲＰＬ１３Ａ、ＲＰＬ１４、ＲＰＬ１５、ＲＰＬ１７、ＲＰＬ１８、ＲＰＬ１８Ａ、ＲＰＬ１９、ＲＰＬ２１、ＲＰＬ２２、ＲＰＬ２３、ＲＰＬ２３Ａ、ＲＰＬ２４、ＲＰＬ２６、ＲＰＬ２７、ＲＰＬ２７Ａ、ＲＰＬ２８、ＲＰＬ２９、ＲＰＬ３０、ＲＰＬ３１、ＲＰＬ３２、ＲＰＬ３４、ＲＰＬ３５、ＲＰＬ３５Ａ、ＲＰＬ３６、ＲＰＬ３６Ａ、ＲＰＬ３７、ＲＰＬ３７Ａ、ＲＰＬ３８、ＲＰＬ３９、ＲＰＬ４０、ＲＰＬ４１、ＲＰＬＰ０、ＲＰＬＰ１、ＲＰＬＰ２、ＲＰＬＰ３、ＵＢＡ５２から選択されるＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲ、又はこれらの変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる請求項４２から７０のいずれかに記載のベクター。
【請求項７２】
少なくとも１つのヒストンステムループが、配列番号１，３９１〜１４３３からなる群より選択される核酸配列、好ましくは、配列番号１，４０３〜１，４３３からなる群より選択される核酸配列を含むか又はからなる請求項４３から７１のいずれかに記載のベクター。
【請求項７３】
ヒストンステムループが、配列番号１，４３３に係る配列又は対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有する核酸配列を含むか又はからなり、好ましくは、配列番号１，４３３に係る配列又は対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有する配列の位置６、１３、及び２０が保存されている、即ち、配列番号１，４３３の位置６、１３、及び２０におけるヌクレオチド又は対応するＲＮＡヌクレオチドと同一である請求項４３から７２のいずれかに記載のベクター。
【請求項７４】
３’ＵＴＲエレメントが、アルブミン遺伝子、α−グロビン遺伝子、β−グロビン遺伝子、チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子、リポキシゲナーゼ遺伝子、及びコラーゲンアルファ遺伝子からなる群より選択される遺伝子の３’ＵＴＲに由来する核酸配列、又はアルブミン遺伝子、α−グロビン遺伝子、β−グロビン遺伝子、チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子、リポキシゲナーゼ遺伝子、及びコラーゲンアルファ遺伝子からなる群より選択される遺伝子の３’ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる請求項５８から７３のいずれかに記載のベクター。
【請求項７５】
少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメントが、脊椎動物のアルブミン遺伝子の３’ＵＴＲ又はその変異体、好ましくは、哺乳類のアルブミン遺伝子の３’ＵＴＲ又はその変異体、より好ましくは、ヒトのアルブミン遺伝子の３’ＵＴＲ又はその変異体、更により好ましくはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００４７７．５に係るヒトのアルブミン遺伝子の３’ＵＴＲ又はその変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる請求項５８から７４のいずれかに記載のベクター。
【請求項７６】
少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメントが、脊椎動物のα−グロビン遺伝子の３’ＵＴＲ又はその変異体、好ましくは、哺乳類のα−グロビン遺伝子の３’ＵＴＲ又はその変異体、より好ましくは、ヒトのα−グロビン遺伝子の３’ＵＴＲ又はその変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる請求項５８から７４のいずれかに記載のベクター。
【請求項７７】
少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメントが、配列番号１，３６９〜１，３７７及び１，４３４から選択される核酸配列又は対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有する核酸配列を含むか又はからなる、或いは、少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメントが、配列番号１，３６９〜１，３７７及び１，４３４から選択される核酸配列又は対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有する核酸配列の断片を含むか又はからなる請求項５８から７４のいずれかに記載のベクター。
【請求項７８】
断片が、前記断片が由来する完全長配列の少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、更により好ましくは少なくとも６０％、更により好ましくは少なくとも７０％、更により好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％を表す前記完全長配列における連続する一続きのヌクレオチドに対応する連続する一続きのヌクレオチドからなる請求項７７に記載のベクター。
【請求項７９】
３’ＵＴＲエレメントが、少なくとも約４０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約５０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約７５ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１００ヌクレオチド、更により好ましくは少なくとも約１２５ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも約１５０ヌクレオチドの長さを有する請求項５８から７８のいずれかに記載のベクター。
【請求項８０】
ベクター、好ましくはオープンリーディングフレームが、少なくとも部分的にＧ／Ｃ改変されており、好ましくは、前記オープンリーディングフレームのＧ／Ｃ含量が、野生型オープンリーディングフレームに比べて増加している請求項４２から７９のいずれかに記載のベクター。
【請求項８１】
オープンリーディングフレームが、コドンが最適化されている領域を含み、好ましくは、前記オープンリーディングフレームのコドンが最適化されている請求項４２から８０のいずれかに記載のベクター。
【請求項８２】
ＤＮＡベクターである請求項４２から８１のいずれかに記載のベクター。
【請求項８３】
プラスミドベクター又はウイルスベクター、好ましくは、プラスミドベクターである請求項４２から８２のいずれかに記載のベクター。
【請求項８４】
請求項１から４１のいずれかに記載の人工核酸分子を含むか又はコードしている請求項４２から８３のいずれかに記載のベクター。
【請求項８５】
環状分子である請求項４２から８４のいずれかに記載のベクター。
【請求項８６】
請求項１から４１のいずれかに記載の人工核酸分子又は請求項４２から８５のいずれかに記載のベクターを含むことを特徴とする細胞。
【請求項８７】
哺乳類細胞である請求項８６に記載の細胞。
【請求項８８】
哺乳類被験体の細胞、好ましくは、哺乳類被験体（好ましくは、ヒト被験体）の単離細胞である請求項８６から８７のいずれかに記載の細胞。
【請求項８９】
請求項１から４１のいずれかに記載の人工核酸分子、請求項４２から８５のいずれかに記載のベクター、又は請求項８６から８８のいずれかに記載の細胞を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項９０】
１以上の薬学的に許容できる希釈剤、賦形剤、及び１以上のアジュバントの少なくともいずれかを更に含む請求項８９に記載の医薬組成物。
【請求項９１】
医薬として使用するための請求項１から４１のいずれかに記載の人工核酸分子、請求項４２から８５のいずれかに記載のベクター、請求項８６から８８のいずれかに記載の細胞、又は請求項８９から９０のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項９２】
ワクチンとして又は遺伝子治療において使用するための請求項１から４１のいずれかに記載の人工核酸分子、請求項４２から８５のいずれかに記載のベクター、請求項８６から８８のいずれかに記載の細胞、又は請求項８９から９０のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項９３】
請求項１から４１のいずれかに記載の人工核酸分子、請求項４２から８５のいずれかに記載のベクター、請求項８６から８８のいずれかに記載の細胞、又は請求項８９から９０のいずれかに記載の医薬組成物を、それを必要としている被験体に投与する工程を含むことを特徴とする疾患を治療又は予防する方法。
【請求項９４】
請求項１から４１のいずれかに記載の人工核酸分子又は請求項４２から８５のいずれかに記載のベクターで細胞をトランスフェクトする工程を含むことを特徴とする疾患を治療又は予防する方法。
【請求項９５】
細胞のトランスフェクトが、インビトロ／エキソビボで実施され、トランスフェクトされた細胞が、それを必要としている被験体（好ましくは、ヒト患者）に投与される請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
インビトロでトランスフェクトされる細胞が、被験体（好ましくは、ヒト患者）の単離細胞である請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
ワクチン接種方法又は遺伝子治療方法である請求項９３から９６のいずれかに記載の方法。
【請求項９８】
人工核酸分子からのタンパク質産生を増加させる方法であって、
ｉ．  ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲに由来するか又はＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる少なくとも１つの５’−非翻訳領域エレメント（５’ＵＴＲエレメント）と、
ｉｉ．  好ましくは、少なくとも１つのヒストンステムループと、
ｉｉｉ．  任意で、ポリ（Ａ）配列及びポリアデニル化シグナルの少なくともいずれかと
を含む人工核酸分子を提供する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項９９】
核酸分子からのタンパク質産生を増加させるための、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲに由来するか又はＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる５’ＵＴＲエレメントと、好ましくは少なくとも１つのヒストンステムループとの使用。
【請求項１００】
請求項１から４１のいずれかに記載の人工核酸分子、請求項４２から８５のいずれかに記載のベクター、請求項８６から８８のいずれかに記載の細胞、及び請求項８９から９０のいずれかに記載の医薬組成物の少なくともいずれかを含むことを特徴とするキット又はキットオブパーツ。
【請求項１０１】
使用説明書と、トランスフェクション用の細胞と、アジュバントと、医薬組成物の投与手段と、人工核酸分子、ベクター、又は医薬組成物を溶解又は希釈するための薬学的に許容できる担体及び薬学的に許容できる溶液の少なくともいずれかとを更に含む請求項１００に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲに由来する５’ＵＴＲエレメントと、オープンリーディングフレームと、任意で、ヒストンステムループ、３’ＵＴＲエレメント、ポリ（Ａ）配列及び／又はポリアデニル化シグナルとを含む人工核酸分子に関する。本発明は、更に、好ましくは遺伝子治療及び／又は遺伝子ワクチン接種の分野で使用するための、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲに由来する５’ＵＴＲエレメントを含むベクター、前記人工核酸分子又は前記ベクターを含む医薬組成物、並びに前記人工核酸分子、前記ベクター、及び／又は前記医薬組成物を含むキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子治療及び遺伝子ワクチン接種は、現代医学の最も有望且つ急速に発展している方法に属する。これらは、非常に広範囲に亘る疾患を治療するための非常に特異的且つ個人的な選択肢を提供することができる。具体的には、遺伝性の遺伝子疾患だけでなく、自己免疫疾患、癌性又は腫瘍関連疾患に加えて、炎症性疾患も、かかる治療アプローチの対象となり得る。また、これらアプローチによってかかる疾患の発症を（早期に）予防することも考えられる。
【０００３】
遺伝子治療の背後にある主な概念的理論は、特定の疾患の病態に関連している遺伝子発現の欠陥を適切に調節することである。遺伝子発現の病理学的変化は、重要な遺伝子産物、例えば、ホルモン等のシグナル伝達因子、ハウスキーピング因子、代謝酵素、構造タンパク質等の欠失又は過剰産生を引き起こす場合がある。遺伝子発現の変化は、転写及び／又は翻訳の誤制御によるだけではなく、特定のタンパク質をコードしているＯＲＦ内部の突然変異による場合もある。病理学的突然変異は、例えば、染色体の異常によって、又は点突然変異若しくはフレームシフト突然変異等のより特異的な突然変異によって引き起こされる場合があり、これらは全て、遺伝子産物の機能を限定したり、場合によっては、機能全てを失わせたりする。しかし、細胞の転写又は翻訳機構に関与しているタンパク質をコードしている遺伝子が突然変異によって影響を受ける場合、転写又は翻訳の誤制御が生じる場合もある。かかる突然変異は、制御機能を有する遺伝子の病理学的なアップレギュレーション又はダウンレギュレーションを導く場合がある。かかる制御機能を発揮する遺伝子産物をコードしている遺伝子は、例えば、転写因子、シグナル受容体、メッセンジャータンパク質等であり得る。しかし、かかる制御タンパク質をコードしている遺伝子の機能が失われても、特定の状況下では、欠陥のある遺伝子産物の更に下流で作用する他の因子を人工的に導入することによって復帰させることができる。また、異常のある遺伝子自体を置換することを介して、遺伝子治療によってかかる遺伝子の欠陥を補償することもできる。
【０００４】
遺伝子ワクチン接種は、選択された抗原（例えば、細菌表面、ウイルス粒子、腫瘍抗原等の特徴的な成分）に対する所望の免疫応答を誘起する。一般的に、ワクチン接種は、現代医学の重要な偉業のうちの１つである。しかし、現在有効なワクチンを利用できる疾患は非常に少数でしかない。したがって、未だ毎年数百万の人々が、ワクチン接種によって予防することができない感染症に冒されている。
【０００５】
一般的に、ワクチンは、「第１」世代、「第２」世代、及び「第３」世代のワクチンに更に分類することができる。「第１世代」のワクチンは、典型的に、全生物ワクチンである。これは、ウイルス、細菌等の生病原体及び弱毒化病原体又は殺病原体に基づく。生病原体及び弱毒化病原体のワクチンの主な問題点は、生命に危険を及ぼすような変異体に戻ってしまうリスクがあることである。したがって、かかる病原体は、たとえ弱毒化されていても、本質的に予測不可能なリスクを有している場合がある。死病原体は、特異的免疫応答を発生させるのに望ましいほど有効ではない場合がある。これらリスクを最小限に抑えるために、「第２世代」のワクチンが開発された。これは、典型的に、病原体に由来する所定の抗原又は組み換えタンパク質成分からなるサブユニットワクチンである。
【０００６】
遺伝子ワクチン、即ち、遺伝子ワクチン接種用ワクチンは、通常、「第３世代」のワクチンとして理解される。これは、典型的に、インビボで病原体又は腫瘍抗原に特徴的なペプチド又はタンパク質（抗原）の断片を発現させる遺伝的に改変された核酸分子で構成される。遺伝子ワクチンは、患者に投与され、被感染能力を有する菌によって取り込まれたときに発現する。投与された核酸が発現することにより、コードされているタンパク質が産生される。これらタンパク質が患者の免疫系によって外来タンパク質であると認識された場合、免疫応答が誘発される。
【０００７】
上記から分かる通り、遺伝子治療及び遺伝子ワクチン接種の両方法は、本質的に、核酸分子を患者に投与し、次いで、コードされている遺伝情報を転写及び／又は翻訳させることに基づいている。或いは、遺伝子ワクチン接種又は遺伝子治療は、治療を受ける患者から特定の身体細胞を単離し、次いで、かかる細胞をインビトロでトランスフェクトし、処理された細胞を前記患者に再投与することを含む方法を含んでいてもよい。
【０００８】
ＤＮＡ及びＲＮＡは、遺伝子治療又は遺伝子ワクチン接種を行う際に、投与するための核酸分子として用いることができる。ＤＮＡは、比較的安定で取り扱いが容易であることが知られている。しかし、ＤＮＡの使用には、投与されたＤＮＡ断片が患者のゲノムに不所望に挿入されて、欠陥の生じた遺伝子の機能が失われてしまう可能性があるというリスクがある。更なるリスクとして、抗ＤＮＡ抗体の不所望な産生が生じたことがある。別の問題点は、ＤＮＡを投与し、転写／翻訳させる際に得ることができる、コードされているペプチド又はタンパク質の発現レベルが限定的である点である。数ある理由の中でも、投与されるＤＮＡの発現レベルは、ＤＮＡ転写を制御する特定の転写因子の存在に依存する。かかる因子が存在しない場合、ＤＮＡ転写によって満足のいく量のＲＮＡが得られない。その結果、翻訳されるペプチド又はタンパク質のレベルが限定される。
【０００９】
遺伝子治療又は遺伝子ワクチン接種のためにＤＮＡの代わりにＲＮＡを用いることによって、不所望のゲノムへの組み込み及び抗ＤＮＡ抗体の産生のリスクが最小限に抑えられるか又はなくなる。しかし、ＲＮＡは、遍在するＲＮＡｓｅによって容易に分解され得る比較的不安定な分子種であると考えられている。
【００１０】
インビボでは、ＲＮＡの分解は、ＲＮＡの半減期の制御に寄与している。この効果により真核生物の遺伝子発現の制御が微調整されていると考えられ、立証されている（非特許文献１）。したがって、各自然界に存在するｍＲＮＡは、前記ｍＲＮＡが由来する遺伝子に依存する個々の半減期を有している。このことは、前記遺伝子の発現レベルの制御に寄与している。不安定なＲＮＡは、異なる時点で一過的に遺伝子を発現させるために重要である。しかし、寿命の長いＲＮＡは、別個のタンパク質の蓄積又は遺伝子の連続的発現に関連している場合がある。インビボでは、ｍＲＮＡの半減期は、例えば、インスリン様成長因子Ｉ、アクチン、及びアルブミンのｍＲＮＡについて示されている通り、ホルモン処理等の環境要因にも依存している場合がある（非特許文献２）。
【００１１】
遺伝子治療及び遺伝子ワクチン接種の場合、通常、安定なＲＮＡが望ましい。これは、ＲＮＡ配列によってコードされている産物がインビボで蓄積されることになっているという事実によるものである。他方、ＲＮＡは、好適な剤形に調製されたとき、保存の過程で、及び投与したときに、構造的且つ機能的に一体性を維持しなければならない。したがって、早期に分解又は崩壊するのを防ぐために、遺伝子治療又は遺伝子ワクチン接種用の安定なＲＮＡ分子の提供がかなりの注目を集めた。
【００１２】
核酸分子のＧ／Ｃ含量がその安定性に影響を及ぼす場合があることが報告されている。したがって、多量のグアニン（Ｇ）及び／又はシトシン（Ｃ）残基を含む核酸は、多量のアデニン（Ａ）及びチミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）ヌクレオチドを含有する核酸よりも機能的に安定であり得る。これに関連して、特許文献１は、翻訳領域の配列を改変することによって安定化したｍＲＮＡを含有する医薬組成物を提供している。かかる配列改変は、遺伝子コードの縮重を利用する。したがって、あまり好ましくない（ＲＮＡの安定性の観点であまり好ましくない）組み合わせのヌクレオチドを含有するコドンを、コードされているアミノ酸配列を変化させることなしに別のコドンに置換してよい。このＲＮＡの安定化方法は、所望のアミノ酸配列の余地を残してはならない各単一のＲＮＡ分子の特定のヌクレオチド配列の提供によって限定される。また、このアプローチは、ＲＮＡのコード領域に制限される。
【００１３】
ｍＲＮＡを安定化するための別の選択肢として、自然界に存在する真核生物のｍＲＮＡ分子は、特徴的な安定化エレメントを含有することが見出されている。例えば、真核生物のｍＲＮＡ分子は、５’末端（５’ＵＴＲ）及び／又は３’末端（３’ＵＴＲ）に所謂非翻訳領域（ＵＴＲ）を含み、更に５’−キャップ構造又は３’−ポリ（Ａ）テール等の他の構造的特徴を含む。５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲは、典型的に、ゲノムＤＮＡから転写されるので、未成熟ｍＲＮＡのエレメントである。５’−キャップ及び３’−ポリ（Ａ）テール（ポリ（Ａ）テール又はポリ（Ａ）配列とも呼ばれる）等の成熟ｍＲＮＡの特徴的な構造的特徴は、通常、ｍＲＮＡのプロセシング中に転写（未成熟）ｍＲＮＡに付加される。
【００１４】
３’−ポリ（Ａ）テールは、典型的に、転写ｍＲＮＡの３’末端に付加されるアデニンヌクレオチドの単調な一続きの配列である。これは、最高約４００個のアデニンヌクレオチドを含み得る。かかる３’−ポリ（Ａ）テールの長さは、個々のｍＲＮＡの安定性にとって重要な要素である可能性があることが見出されている。
【００１５】
殆ど全ての真核生物のｍＲＮＡは、遍在する切断／ポリアデニル化機構によって３’末端に付加される、かかるポリ（Ａ）配列で終結する。３’末端におけるポリ（Ａ）配列の存在は、真核生物のｍＲＮＡの最も識別しやすい特徴のうちの１つである。切断後、大部分のプレｍＲＮＡは、複製依存的ヒストン転写を除いて、ポリアデニル化テールを獲得する。これに関連して、３’末端のプロセシングは、核から細胞質へのｍＲＮＡの輸送を促進し、ｍＲＮＡの安定性及び翻訳に影響を及ぼす核の同時転写プロセスである。この３’末端の形成は、切断／ポリアデニル化機構によって指示される２段階反応で行われ、ｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）における２つの配列エレメントである、高度に保存されている６つのヌクレオチドＡＡＵＡＡＡ（ポリアデニル化シグナル）及び下流のＧ／Ｕリッチ配列の存在に依存する。第１の工程では、プレｍＲＮＡが、これら２つのエレメント間で切断される。第１の工程と緊密に関連している第２の工程では、新たに形成される３’末端が、２００個〜２５０個のアデニレートからなるポリ（Ａ）配列の付加によって伸長し、これは、後に、ｍＲＮＡのエクスポート、安定性、及び翻訳を含むｍＲＮＡ代謝の全ての局面に影響を及ぼす（非特許文献３）。
【００１６】
このルールの唯一知られている例外は、ポリ（Ａ）配列の代わりにヒストンステムループで終結する複製依存的ヒストンｍＲＮＡである。例示的なヒストンステムループ配列は、Ｌｏｐｅｚらによって記載されている（非特許文献４）。
【００１７】
ヒストンプレｍＲＮＡにおけるステムループの後には、典型的に、ヒストン下流要素（ＨＤＥ）として知られているプリンリッチ配列が続く。これらプレｍＲＮＡは、Ｕ７ｓｎＲＮＰとＨＤＥとの塩基対合を介してＵ７ｓｎＲＮＰによって触媒される、ステムループの約５ヌクレオチド下流の単一のヌクレオチド鎖切断によって核においてプロセシングされる。
【００１８】
新たに合成されるＤＮＡをクロマチンにパッケージングするための要件により、ヒストン合成は、細胞周期に呼応して制御される。Ｓ期におけるヒストンタンパク質の合成増加は、ヒストン遺伝子の転写活性化及びヒストンｍＲＮＡレベルの転写後制御によって行われる。ヒストンステムループは、ヒストン発現制御の全ての転写後工程にとって非常に重要であることが示されている。これは、効率的なプロセシング、ｍＲＮＡの細胞質へのエクスポート、ポリリボソームへのローディング、及びｍＲＮＡ安定性の制御のために必須である。
【００１９】
上記に関連して、３２ｋＤａのタンパク質が同定されており、これは、核及び細胞質の両方において、ヒストンメッセンジャーの３’末端でヒストンステムループに結合する。このステムループ結合タンパク質（ＳＬＢＰ）の発現レベルは、細胞周期によって制御され、ヒストンｍＲＮＡレベルが増加するＳ期に最も高くなる。ＳＬＢＰは、Ｕ７ｓｎＲＮＰによるヒストンプレｍＲＮＡの効率的な３’末端プロセシングに必要である。プロセシングの完了後、ＳＬＢＰは、成熟ヒストンｍＲＮＡの末端においてステムループに結合したままであり、細胞質における前記ヒストンｍＲＮＡのヒストンタンパク質への翻訳を刺激する（非特許文献３）。興味深いことに、ＳＬＢＰのＲＮＡ結合ドメインは、後生動物及び原生動物全体に亘って保存されており（非特許文献４）、そのヒストンステムループ配列への結合がステムループ構造に依存していること、及び最小結合部位が、少なくともステムループの５’の３ヌクレオチド及び３’の２ヌクレオチドを含有することが示されている（非特許文献５及び６）。
【００２０】
ヒストン遺伝子は、一般的に、ヒストンステムループで終結するｍＲＮＡが生じる「複製依存的」、又は代わりにポリ（Ａ）テールを有するｍＲＮＡが生じる「置換型」に分類されるが、幾つかの非常に稀なケースでは、３’側にヒストンステムループとポリ（Ａ）又はオリゴ（Ａ）とを両方含有するｍＲＮＡが自然界で同定されている。Ｓａｎｃｈｅｚらは、レポータータンパク質としてルシフェラーゼを用いて、アフリカツメガエルの卵形成中にヒストンｍＲＮＡのヒストンステムループの３’側に付加される自然界に存在するオリゴ（Ａ）テールの効果について研究し、前記オリゴ（Ａ）テールが、卵形成中にヒストンｍＲＮＡをサイレンシングする翻訳抑制機構の活性部分であり、且つ前記オリゴ（Ａ）テールの除去が、ヒストンｍＲＮＡの翻訳を活性化する機構の一部であることを見出した（非特許文献７）。
【００２１】
更に、プレｍＲＮＡのプロセシングのレベルにおける複製依存的ヒストンの制御の要件及びｍＲＮＡの安定性について、イントロンのないヒストン遺伝子とは対照的にグロビン遺伝子はイントロンを含むという事実を利用して、マーカータンパク質アルファグロビンをコードしている人工コンストラクトを用いて調べられている。この目的のために、アルファグロビンのコード配列に続いて、ヒストンステムループシグナル（ヒストンステムループと、それに続くヒストン下流要素）及びポリアデニル化シグナルを有するコンストラクトが作製された（非特許文献８〜１０）。
【００２２】
また、α−グロビンｍＲＮＡの３’ＵＴＲは、α−グロビンｍＲＮＡの周知の安定性にとって重要な因子であり得ることが示されている（非特許文献１１）。α−グロビンｍＲＮＡの３’ＵＴＲは、その存在がインビトロにおけるｍＲＮＡの安定性と相関している特定のリボ核タンパク質複合体（α−複合体）の形成に関与していることが明らかである（非特許文献１２）。
【００２３】
ｍＲＮＡの安定性に影響を及ぼす因子にかかわらず、投与された核酸分子が標的細胞又は組織によって有効に翻訳されることは、遺伝子治療又は遺伝子ワクチン接種用の核酸分子を用いる任意のアプローチにとって非常に重要である。安定性の制御とともに、大部分のｍＲＮＡの翻訳も、ＵＴＲ、５’−キャップ、及び３’−ポリ（Ａ）テール等の構造的特徴によって制御されている。これに関連して、ポリ（Ａ）テールの長さも同様に翻訳効率にとって重要な役割を果たしている可能性があることが報告されている。しかし、３’−エレメントの安定化は、翻訳を減少させる効果を有している可能性もある。
【００２４】
発現レベルに影響を及ぼす可能性のある更なる制御エレメントは、５’ＵＴＲに見出すことができる。例えば、特定のタンパク質、例えば、翻訳装置に属するタンパク質の合成は、転写レベルだけではなく、翻訳レベルでも制御され得ることが報告されている。例えば、所謂「ＴＯＰ遺伝子」によってコードされているタンパク質の翻訳は、翻訳抑制によってダウンレギュレートされ得る。本明細書では、用語「ＴＯＰ遺伝子」は、５’末端におけるＴＯＰ配列の存在と、殆どの場合、成長に関連する翻訳制御とを特徴とするｍＲＮＡに相当する遺伝子に関する（非特許文献１３）。これに関連して、「５’末端オリゴピリミジン領域」とも呼ばれるＴＯＰ配列は、典型的に、キャップ部位におけるＣ残基と、それに続く最高１３個又は更により多くのピリミジンの不断配列とからなる（非特許文献１４）。これらＴＯＰ配列は、翻訳機構の構成要素をコードしている多くのｍＲＮＡ中に存在し、且つ成長停止によるこれらＴＯＰ含有ｍＲＮＡの翻訳の選択的抑制の原因であることが報告されている（非特許文献１５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２５】
【特許文献１】国際公開第０２／０９８４４３号パンフレット
【非特許文献】
【００２６】
【非特許文献１】Ｆｒｉｅｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｒｅｖｅａｌｅｄ  ｂｙ  ＲＮＡ  ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００９，１−１２
【非特許文献２】Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗｌｙ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ  ＲＮＡ：Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｉｎｔａｃｔ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｒａｔｅｓ  ａｎｄ  ＲＮＡ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  Ｉ，ａｃｔｉｎ，ａｎｄ  ａｌｂｕｍｉｎ  ｉｎ  ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｖｏｌ．８８，ｐｐ．５２８７−５２９１，１９９１
【非特許文献３】Ｄｏｍｉｎｓｋｉ，Ｚ．ａｎｄ  Ｗ．Ｆ．Ｍａｒｚｌｕｆｆ（２００７），Ｇｅｎｅ  ３９６（２）：３７３−９０．
【非特許文献４】Ｄａｖｉｌａ  Ｌｏｐｅｚ，Ｍ．，＆Ｓａｍｕｅｌｓｓｏｎ，Ｔ．（２００８），ＲＮＡ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．），１４（１），１−１０．ｄｏｉ：１０．１２６１／ｒｎａ．７８２３０８．
【非特許文献５】Ｐａｎｄｅｙ，Ｎ．Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９４），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１４（３），１７０９−１７２０
【非特許文献６】Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ａ．Ｓ．，＆Ｍａｒｚｌｕｆｆ，Ｗ．Ｆ．，（１９９５），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２３（４），６５４−６６２．
【非特許文献７】Ｓａｎｃｈｅｚ，Ｒ．ａｎｄ  Ｗ．Ｆ．Ｍａｒｚｌｕｆｆ（２００４），Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２４（６）：２５１３−２５
【非特許文献８】Ｗｈｉｔｅｌａｗ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１４（１７），７０５９−７０７０
【非特許文献９】Ｐａｎｄｅｙ，Ｎ．Ｂ．，＆  Ｍａｒｚｌｕｆｆ，Ｗ．Ｆ．（１９８７）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，７（１２），４５５７−４５５９
【非特許文献１０】Ｐａｎｄｅｙ，Ｎ．Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１８（１１），３１６１−３１７０
【非特許文献１１】Ｒｏｄｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  α−ｇｌｏｂｉｎ  ｍＲＮＡ  ｄｅｃａｙ  ｉｓ  ａ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｅｖｅｎｔ  ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ３’−ｔｏ−５’  ｅｘｏｓｏｍｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｄｅｃａｐｐｉｎｇ，ＲＮＡ，８，ｐｐ．１５２６−１５３７，２００２
【非特許文献１２】Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎ  ｍＲＮＡ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｐｏｌｙ（Ａ）−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｏ  ｓｔａｂｉｌｉｚｅ  ｍＲＮＡ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ  １９，Ｎｏ．７，Ｊｕｌｙ  １９９９，ｐ．４５５２−４５６０
【非特許文献１３】Ｉａｄｅｖａｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｌｌ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｅ，ｆ，ａｎｄ  ｈ  ｓｕｂｕｎｉｔｓ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ３  ａｒｅ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｂｙ  ５’−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｏｌｉｇｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ（ＴＯＰ）ｍＲＮＡｓ；ＲＮＡ，２００８，１４：１７３０−１７３６
【非特許文献１４】Ａｖｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  ｍＲＮＡｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ５’−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ  ｔｒａｃｔ  ａｒｅ  Ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｑｕｉｅｓｃｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ：ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｃｉｓ−ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９４，ｐ．３８２２−３８３３
【非特許文献１５】Ｍｅｙｕｈａｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍＲＮＡｓ  ｉｎ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ，Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ  Ａｒｃｈｉｖｅ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６，ｐ．３６３−３８８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２７】
本発明の目的は、遺伝子治療及び／又は遺伝子ワクチン接種に応用するのに好適であり得る核酸分子を提供することにある。具体的には、本発明の目的は、ｍＲＮＡ種等の人工核酸分子であって、前記人工核酸分子からのタンパク質産生を増加させ、好ましくは、翻訳効率の上昇を示す人工核酸分子を提供することにある。本発明の別の目的は、遺伝子治療及び／又は遺伝子ワクチン接種において使用することができる優れたｍＲＮＡ種をコードする核酸分子を提供することにある。本発明の更なる目的は、遺伝子治療及び／又は遺伝子ワクチン接種において使用するための医薬組成物を提供することにある。要約すると、本発明の目的は、コスト効率が高く且つ簡単なアプローチによって関連技術の上記問題点を克服する改善された核酸種を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２８】
本発明の根底にある目的は、請求する発明主題によって解決される。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
以下の図、配列、及び実施例は、本発明を更に説明することを意図する。これらは、本発明の発明主題を限定することを意図するものではない。
【図１】図１は、後生動物及び原生動物のステムループ配列から見出したヒストンステムループのコンセンサス配列を示す（Ｄａｖｉｌａ  Ｌｏｐｅｚ，Ｍ．，＆Ｓａｍｕｅｌｓｓｏｎ，Ｔ．（２００８），ＲＮＡ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．），１４（１），１−１０．ｄｏｉ：１０．１２６１／ｒｎａ．７８２３０８に報告されている）。後生動物及び原生動物由来の４，００１個のヒストンステムループ配列をアラインメントし、ステムループ配列の全ての位置について、存在するヌクレオチドの数を示した。解析した全ての配列中に存在するヌクレオチドを表す見出されたコンセンサス配列を、ヌクレオチドの１文字表記を用いて記載する。コンセンサス配列に加えて、解析した配列のうちの少なくとも９９％、９５％、及び９０％中に存在するヌクレオチドを表す配列を示す。
【図２】図２は、原生動物のステムループ配列から見出されたヒストンステムループのコンセンサス配列を示す（Ｄａｖｉｌａ  Ｌｏｐｅｚ，Ｍ．，＆Ｓａｍｕｅｌｓｓｏｎ，Ｔ．（２００８），ＲＮＡ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．），１４（１），１−１０．ｄｏｉ：１０．１２６１／ｒｎａ．７８２３０８に報告されている）。原生動物由来の１３１個のヒストンステムループ配列をアラインメントし、ステムループ配列の全ての位置について、存在するヌクレオチドの数を示した。解析した全ての配列中に存在するヌクレオチドを表す見出されたコンセンサス配列を、ヌクレオチドの１文字表記を用いて記載する。コンセンサス配列に加えて、解析した配列のうちの少なくとも９９％、９５％、及び９０％中に存在するヌクレオチドを表す配列を示す。
【図３】図３は、後生動物のステムループ配列から見出されたヒストンステムループのコンセンサス配列を示す（Ｄａｖｉｌａ  Ｌｏｐｅｚ，Ｍ．，＆Ｓａｍｕｅｌｓｓｏｎ，Ｔ．（２００８），ＲＮＡ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．），１４（１），１−１０．ｄｏｉ：１０．１２６１／ｒｎａ．７８２３０８に報告されている）。後生動物由来の３，８７０個のヒストンステムループ配列をアラインメントし、ステムループ配列の全ての位置について、存在するヌクレオチドの数を示した。解析した全ての配列中に存在するヌクレオチドを表す見出されたコンセンサス配列を、ヌクレオチドの１文字表記を用いて記載する。コンセンサス配列に加えて、解析した配列のうちの少なくとも９９％、９５％、及び９０％中に存在するヌクレオチドを表す配列を示す。
【図４】図４は、脊椎動物のステムループ配列から見出されたヒストンステムループのコンセンサス配列を示す（Ｄａｖｉｌａ  Ｌｏｐｅｚ，Ｍ．，＆Ｓａｍｕｅｌｓｓｏｎ，Ｔ．（２００８），ＲＮＡ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．），１４（１），１−１０．ｄｏｉ：１０．１２６１／ｒｎａ．７８２３０８に報告されている）。脊椎動物由来の１，３３３個のヒストンステムループ配列をアラインメントし、ステムループ配列の全ての位置について、存在するヌクレオチドの数を示した。解析した全ての配列中に存在するヌクレオチドを表す見出されたコンセンサス配列を、ヌクレオチドの１文字表記を用いて記載する。コンセンサス配列に加えて、解析した配列のうちの少なくとも９９％、９５％、及び９０％中に存在するヌクレオチドを表す配列を示す。
【図５】図５は、ヒトのステムループ配列から見出されたヒストンステムループのコンセンサス配列を示す（Ｄａｖｉｌａ  Ｌｏｐｅｚ，Ｍ．，＆Ｓａｍｕｅｌｓｓｏｎ，Ｔ．（２００８），ＲＮＡ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．），１４（１），１−１０．ｄｏｉ：１０．１２６１／ｒｎａ．７８２３０８に報告されている）。ヒト由来の８４個のヒストンステムループ配列をアラインメントし、ステムループ配列の全ての位置について、存在するヌクレオチドの数を示した。解析した全ての配列中に存在するヌクレオチドを表す見出されたコンセンサス配列を、ヌクレオチドの１文字表記を用いて記載する。コンセンサス配列に加えて、解析した配列のうちの少なくとも９９％、９５％、及び９０％中に存在するヌクレオチドを表す配列を示す。
【図６】図６は、核酸分子ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−Ａ６４をコードしているキタアメリカホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）ルシフェラーゼのヌクレオチド配列を示す。この人工コンストラクトは、５’ＵＴＲエレメントもヒストンステムループも含まない。ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）のコード領域をイタリック体で示す。図６に記載の配列は、配列番号１，３６４に相当する。
【図７】図７は、ＲＰＬ３２−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬのヌクレオチド配列を示す。５’末端オリゴピリミジン領域を有しないヒトリボソームタンパク質ラージ３２の５’ＵＴＲをＯＲＦの５’側に挿入した。ヒストンＳＬをＡ６４ポリ（Ａ）の３’側に付加した。ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）のコード領域をイタリック体で示す。５’ＵＴＲエレメントの配列及びヒストンステムループの配列に下線を引く。図７に示す配列は、配列番号１，３６５に相当する。
【図８】図８は、ＴＯＰ遺伝子であるＲＰＬ３２の５’ＵＴＲに由来する５’ＵＴＲエレメントとヒストンステムループとの組み合わせが、ｍＲＮＡからのタンパク質産生を強く増加させることを示す。ｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発現に対する前記５’ＵＴＲエレメントとヒストンステムループとの組み合わせの効果を調べた。この目的のために、様々なｍＲＮＡをリポフェクションによってヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後にルシフェラーゼレベルを測定した。ルシフェラーゼは、５’ＵＴＲもヒストンＳＬも有しないｍＲＮＡから明らかに発現した。しかし、驚くべきことに、前記５’ＵＴＲとヒストンＳＬとの組み合わせは、ルシフェラーゼレベルを強く増加させた。同一のｍＲＮＡにおいて５’ＵＴＲとヒストンＳＬとを組み合わせたことによるルシフェラーゼレベルの増加の程度は、これらが相乗的に作用することを示す。デュープリケートのトランスフェクションについて、平均ＲＬＵ±ＳＤ（相対光単位±標準偏差）としてデータをグラフ化する。ＲＬＵを実施例５．１に要約する。
【図９】図９は、ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−Ａ６４−ヒストンＳＬのヌクレオチド配列を示す。ヒストンＳＬをＡ６４ポリ（Ａ）の３’側に付加した。ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）のコード領域をイタリック体で示す。ヒストンステムループ配列に下線を引く。図９に記載の配列は、配列番号１，４６４に相当する。
【図１０】図１０は、ｒｐｌ３２−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−Ａ６４のヌクレオチド配列を示す。５’末端オリゴピリミジン領域を有しないヒトリボソームタンパク質ラージ３２の５’ＵＴＲをＯＲＦの５’側に挿入した。ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）のコード領域をイタリック体で示す。５’ＵＴＲエレメントの配列に下線を引く。図１０に示す配列は、配列番号１，４６３に相当する。
【図１１】図１１は、ｒｐｌ３２−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−Ａ６４−ヒストンＳＬのヌクレオチド配列を示す。５’末端オリゴピリミジン領域を有しないヒトリボソームタンパク質ラージ３２の５’ＵＴＲをＯＲＦの５’側に挿入した。ヒストンＳＬをＡ６４ポリ（Ａ）の３’側に付加した。ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）のコード領域をイタリック体で示す。５’ＵＴＲエレメントの配列及びヒストンステムループの配列に下線を引く。図１１に示す配列は、配列番号１，４８０に相当する。
【図１２】図１２は、ｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発現に対するＴＯＰ遺伝子であるＲＰＬ３２の５’ＵＴＲに由来する５’ＵＴＲエレメント、ヒストンステムループ、及び５’ＵＴＲエレメントとヒストンステムループとの組み合わせの効果をグラフで示す。様々なｍＲＮＡをリポフェクションによってヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）にトランスフェクトした。トランスフェクションの８時間後、２４時間後、及び４８時間後にルシフェラーゼレベルを測定した。ヒストンステムループも５’ＵＴＲエレメントも有しないｍＲＮＡに比べて、ヒストンステムループ又は５’ＵＴＲはいずれもルシフェラーゼレベルを増加させる。驚くべきことに、５’ＵＴＲとヒストンステムループとの組み合わせは、個々のエレメントのいずれかでみられたレベルを遥かに超えてルシフェラーゼレベルを更に強く増加させるので、相乗的に作用している。トリプリケートのトランスフェクションについて、平均ＲＬＵ±ＳＤ（相対光単位±標準誤差）としてデータをグラフ化する。ＲＬＵを実施例５．２に要約する。
【図１３】図１３は、ｒｐｌ３２−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン７−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬのヌクレオチド配列を示す。アルブミン７の３’ＵＴＲエレメントで図７に示すコンストラクト（ｒｐｌ３２の５’ＵＴＲエレメントを含有する）におけるアルファグロビンの３’ＵＴＲエレメントを置き換えた。５’ＵＴＲエレメントの配列に下線を引く。図１３に示す配列は、配列番号１，４８１に相当する。
【図１４】図１４は、ｒｐｌ３５−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン７−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬのヌクレオチド配列を示す。５’末端オリゴピリミジン領域を有しないヒトリボソームタンパク質ラージ３５の５’ＵＴＲで、図１３に示すコンストラクトにおけるｒｐｌ３２の５’ＵＴＲエレメントを置き換えた。５’ＵＴＲエレメントの配列に下線を引く。図１４に示す配列は、配列番号１，４３６に相当する。
【図１５】図１５は、ｒｐｌ２１−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン７−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬのヌクレオチド配列を示す。５’末端オリゴピリミジン領域を有しないヒトリボソームタンパク質ラージ２１の５’ＵＴＲで図１３に示すコンストラクトにおけるｒｐｌ３２の５’ＵＴＲエレメントを置き換えた。５’ＵＴＲエレメントの配列に下線を引く。図１５に示す配列は、配列番号１，４３７に相当する。
【図１６】図１６は、ａｔｐ５ａ１−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン７−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬのヌクレオチド配列を示す。５’末端オリゴピリミジン領域を有しないヒトＡＴＰシンターゼ、Ｈ＋輸送、ミトコンドリアＦ１複合体アルファサブユニット１の５’ＵＴＲで、図１３に示すコンストラクトにおけるｒｐｌ３２の５’ＵＴＲエレメントを置き換えた。５’ＵＴＲエレメントの配列に下線を引く。図１６に示す配列は、配列番号１，４３８に相当する。
【図１７】図１７は、ＨＳＤ１７Ｂ４−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン７−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬのヌクレオチド配列を示す。５’末端オリゴピリミジン領域を有しないヒトヒドロキシステロイド（１７−ベータ）デヒドロゲナーゼ４の５’ＵＴＲで、図１３に示すコンストラクトにおけるｒｐｌ３２の５’ＵＴＲエレメントを置き換えた。５’ＵＴＲエレメントの配列に下線を引く。図１７に示す配列は、配列番号１，４３９に相当する。
【図１８】図１８は、ＡＩＧ１−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン７−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬのヌクレオチド配列を示す。５’末端オリゴピリミジン領域を有しないヒトアンドロゲン誘導１の５’ＵＴＲで、図１３に示すコンストラクトにおけるｒｐｌ３２の５’ＵＴＲエレメントを置き換えた。５’ＵＴＲエレメントの配列に下線を引く。図１８に示す配列は、配列番号１，４４０に相当する。
【図１９】図１９は、ＣＯＸ６Ｃ−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン７−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬのヌクレオチド配列を示す。５’末端オリゴピリミジン領域を有しないヒトシトクロームｃオキシダーゼサブユニットＶＩｃの５’ＵＴＲで、図１３に示すコンストラクトにおけるｒｐｌ３２の５’ＵＴＲエレメントを置き換えた。５’ＵＴＲエレメントの配列に下線を引く。図１９に示す配列は、配列番号１，４４１に相当する。
【図２０】図２０は、ＡＳＡＨ１−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン７−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬのヌクレオチド配列を示す。５’末端オリゴピリミジン領域を有しないヒトＮ−アシルスフィンゴシンアミドヒドロラーゼ（酸性セラミダーゼ）１の５’ＵＴＲで、図１３に示すコンストラクトにおけるｒｐｌ３２の５’ＵＴＲエレメントを置き換えた。５’ＵＴＲエレメントの配列に下線を引く。図２０に示す配列は、配列番号１，４４２に相当する。
【図２１】図２１は、ｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発現に対する、ＴＯＰ遺伝子であるＲＰＬ３２、ＲＰＬ３５、ＲＰＬ２１、ＡＴＰ５Ａ１、ＨＳＤ１７Ｂ４、ＡＩＧ１、ＣＯＸ６Ｃ、及びＡＳＡＨ１に由来する５’ＵＴＲエレメントの効果をグラフで示す。ｍＲＮＡをリポフェクションによってヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、４８時間後、及び７２時間後にルシフェラーゼレベルを測定した。５’ＵＴＲエレメントを有しないｍＲＮＡに比べて、５’ＵＴＲエレメントはルシフェラーゼレベルを強く増加させる。トリプリケートのトランスフェクションについて、平均ＲＬＵ±ＳＥＭ（相対光単位±標準誤差）としてデータをグラフ化する。ＲＬＵを実施例５．３に要約する。
【図２２】図２２は、ｒｐｌ３５−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−Ａ６４のヌクレオチド配列を示す。５’末端オリゴピリミジン領域を有しないヒトリボソームタンパク質ラージ３５の５’ＵＴＲで、図１０に示すコンストラクトにおけるｒｐｌ３２の５’ＵＴＲエレメントを置き換えた。ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）のコード領域をイタリック体で示す。５’ＵＴＲエレメントの配列に下線を引く。図２２に示す配列は、配列番号１，４６６に相当する。
【図２３】図２３は、ｒｐｌ２１−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−Ａ６４のヌクレオチド配列を示す。５’末端オリゴピリミジン領域を有しないヒトリボソームタンパク質ラージ２１の５’ＵＴＲで、図１０に示すコンストラクトにおけるｒｐｌ３２の５’ＵＴＲエレメントを置き換えた。ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）のコード領域をイタリック体で示す。５’ＵＴＲエレメントの配列に下線を引く。図２３に示す配列は、配列番号１，４６７に相当する。
【図２４】図２４は、ａｔｐ５ａ１−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−Ａ６４のヌクレオチド配列を示す。５’末端オリゴピリミジン領域を有しないヒトＡＴＰシンターゼ、Ｈ＋輸送、ミトコンドリアＦ１複合体アルファサブユニット１の５’ＵＴＲで、図１０に示すコンストラクトにおけるｒｐｌ３２の５’ＵＴＲエレメントを置き換えた。ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）のコード領域をイタリック体で示す。５’ＵＴＲエレメントの配列に下線を引く。図２４に示す配列は、配列番号１，４６８に相当する。
【図２５】図２５は、ＨＳＤ１７Ｂ４−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−Ａ６４のヌクレオチド配列を示す。５’末端オリゴピリミジン領域を有しないヒトヒドロキシステロイド（１７−ベータ）デヒドロゲナーゼ４の５’ＵＴＲで、図１０に示すコンストラクトにおけるｒｐｌ３２の５’ＵＴＲエレメントを置き換えた。ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）のコード領域をイタリック体で示す。５’ＵＴＲエレメントの配列に下線を引く。図２５に示す配列は、配列番号１，４６９に相当する。
【図２６】図２６は、ＡＩＧ１−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−Ａ６４のヌクレオチド配列を示す。５’末端オリゴピリミジン領域を有しないヒトアンドロゲン誘導１の５’ＵＴＲで、図１０に示すコンストラクトにおけるｒｐｌ３２の５’ＵＴＲエレメントを置き換えた。ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）のコード領域をイタリック体で示す。５’ＵＴＲエレメントの配列に下線を引く。図２６に示す配列は、配列番号１，４７０に相当する。
【図２７】図２７は、ＣＯＸ６Ｃ−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−Ａ６４のヌクレオチド配列を示す。５’末端オリゴピリミジン領域を有しないヒトシトクロームｃオキシダーゼサブユニットＶＩｃの５’ＵＴＲで、図１０に示すコンストラクトにおけるｒｐｌ３２の５’ＵＴＲエレメントを置き換えた。ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）のコード領域をイタリック体で示す。５’ＵＴＲエレメントの配列に下線を引く。図２７に示す配列は、配列番号１，４７１に相当する。
【図２８】図２８は、ＡＳＡＨ１−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−Ａ６４のヌクレオチド配列を示す。５’末端オリゴピリミジン領域を有しないヒトＮ−アシルスフィンゴシンアミドヒドロラーゼ（酸性セラミダーゼ）１の５’ＵＴＲで、図１０に示すコンストラクトにおけるｒｐｌ３２の５’ＵＴＲエレメントを置き換えた。ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）のコード領域をイタリック体で示す。５’ＵＴＲエレメントの配列に下線を引く。図２８に示す配列は、配列番号１，４７２に相当する。
【図２９】図２９は、ｒｐｌ３５−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−Ａ６４−ヒストンＳＬのヌクレオチド配列を示す。５’末端オリゴピリミジン領域を有しないヒトリボソームタンパク質ラージ３５の５’ＵＴＲで、図１１に示すコンストラクトにおけるｒｐｌ３２の５’ＵＴＲエレメントを置き換えた。ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）のコード領域をイタリック体で示す。５’ＵＴＲエレメント及びヒストンステムループの配列に下線を引く。図２９に示す配列は、配列番号１，４７３に相当する。
【図３０】図３０は、ｒｐｌ２１−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−Ａ６４−ヒストンＳＬのヌクレオチド配列を示す。５’末端オリゴピリミジン領域を有しないヒトリボソームタンパク質ラージ２１の５’ＵＴＲで、図１１に示すコンストラクトにおけるｒｐｌ３２の５’ＵＴＲエレメントを置き換えた。ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）のコード領域をイタリック体で示す。５’ＵＴＲエレメント及びヒストンステムループの配列に下線を引く。図３０に示す配列は、配列番号１，４７４に相当する。
【図３１】図３１は、ａｔｐ５ａ１−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−Ａ６４−ヒストンＳＬのヌクレオチド配列を示す。５’末端オリゴピリミジン領域を有しないヒトＡＴＰシンターゼ、Ｈ＋輸送、ミトコンドリアＦ１複合体アルファサブユニット１の５’ＵＴＲで、図１１に示すコンストラクトにおけるｒｐｌ３２の５’ＵＴＲエレメントを置き換えた。ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）のコード領域をイタリック体で示す。５’ＵＴＲエレメント及びヒストンステムループの配列に下線を引く。図３１に示す配列は、配列番号１，４７５に相当する。
【図３２】図３２は、ＨＳＤ１７Ｂ４−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−Ａ６４−ヒストンＳＬのヌクレオチド配列を示す。５’末端オリゴピリミジン領域を有しないヒトヒドロキシステロイド（１７−ベータ）デヒドロゲナーゼ４の５’ＵＴＲで、図１１に示すコンストラクトにおけるｒｐｌ３２の５’ＵＴＲエレメントを置き換えた。ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）のコード領域をイタリック体で示す。５’ＵＴＲエレメント及びヒストンステムループの配列に下線を引く。図３２に示す配列は、配列番号１，４７６に相当する。
【図３３】図３３は、ＡＩＧ１−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−Ａ６４−ヒストンＳＬのヌクレオチド配列を示す。５’末端オリゴピリミジン領域を有しないヒトアンドロゲン誘導１の５’ＵＴＲで、図１１に示すコンストラクトにおけるｒｐｌ３２の５’ＵＴＲエレメントを置き換えた。ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）のコード領域をイタリック体で示す。５’ＵＴＲエレメント及びヒストンステムループの配列に下線を引く。図３３に示す配列は、配列番号１，４７７に相当する。
【図３４】図３４は、ＣＯＸ６Ｃ−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−Ａ６４−ヒストンＳＬのヌクレオチド配列を示す。５’末端オリゴピリミジン領域を有しないヒトシトクロームｃオキシダーゼサブユニットＶＩｃの５’ＵＴＲで、図１１に示すコンストラクトにおけるｒｐｌ３２の５’ＵＴＲエレメントを置き換えた。ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）のコード領域をイタリック体で示す。５’ＵＴＲエレメント及びヒストンステムループの配列に下線を引く。図３４に示す配列は、配列番号１，４７８に相当する。
【図３５】図３５は、ＡＳＡＨ１−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−Ａ６４−ヒストンＳＬのヌクレオチド配列を示す。５’末端オリゴピリミジン領域を有しないヒトＮ−アシルスフィンゴシンアミドヒドロラーゼ（酸性セラミダーゼ）１の５’ＵＴＲで、図１１に示すコンストラクトにおけるｒｐｌ３２  ５’ＵＴＲエレメントを置き換えた。ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）のコード領域をイタリック体で示す。５’ＵＴＲエレメント及びヒストンステムループの配列に下線を引く。図３５に示す配列は、配列番号１，４７９に相当する。
【図３６】図３６は、ｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発現に対する、ＴＯＰ遺伝子であるＲＰＬ３５、ＲＰＬ２１、ＡＴＰ５Ａ１、ＨＳＤ１７Ｂ４、ＡＩＧ１、ＣＯＸ６Ｃ、及びＡＳＡＨ１の５’ＵＴＲに由来する５’ＵＴＲエレメント、ヒストンステムループ、並びに５’ＵＴＲエレメントとヒストンステムループとの組み合わせの効果をグラフで示す。様々なｍＲＮＡをリポフェクションによってヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）にトランスフェクトした。トランスフェクションの８時間後、２４時間後、及び４８時間後にルシフェラーゼレベルを測定した。ヒストンステムループも５’ＵＴＲエレメントも有しないｍＲＮＡに比べて、ヒストンステムループ又は５’ＵＴＲはいずれもルシフェラーゼレベルを増加させる。驚くべきことに、５’ＵＴＲとヒストンステムループとの組み合わせは、個々のエレメントのいずれかでみられたレベルを遥かに超えてルシフェラーゼレベルを更に強く増加させるので、相乗的に作用している。トリプリケートのトランスフェクションについて、平均ＲＬＵ±ＳＥＭ（相対光単位±標準誤差）としてデータをグラフ化する。５’ＵＴＲエレメントとヒストンステムループとの相乗効果を実施例５．４に要約する。
【図３７】図３７は、ｍｒｐｌ２１−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン７−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬのヌクレオチド配列を示す。５’末端オリゴピリミジン領域を有しないマウスリボソームタンパク質ラージ２１の５’ＵＴＲで、図１３に示すコンストラクトにおけるｒｐｌ３２の５’ＵＴＲエレメントを置き換えた。５’ＵＴＲエレメントの配列に下線を引く。図３６に示す配列は、配列番号１，４４３に相当する。
【図３８】図３８は、ｍｒｐｌ３５Ａ−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン７−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬのヌクレオチド配列を示す。５’末端オリゴピリミジン領域を有しないマウスリボソームタンパク質ラージ３５Ａの５’ＵＴＲで、図１３に示すコンストラクトにおけるｒｐｌ３２の５’ＵＴＲエレメントを置き換えた。５’ＵＴＲエレメントの配列に下線を引く。図３７に示す配列は、配列番号１，４４４に相当する。
【図３９】図３９は、ｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発現に対するマウスＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲに由来する５’ＵＴＲエレメントの効果をグラフで示す。マウス又はヒトの５’ＵＴＲエレメントを含有するｍＲＮＡをリポフェクションによってヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、４８時間後、及び７２時間後にルシフェラーゼレベルを測定した。ヒト５’ＵＴＲエレメントと同様に、５’ＵＴＲエレメントを有しないｍＲＮＡに比べて、マウス５’ＵＴＲエレメントはルシフェラーゼレベルを強く増加させる。トリプリケートのトランスフェクションについて、平均ＲＬＵ±ＳＥＭ（相対光単位±標準誤差）としてデータをグラフ化する。ＲＬＵを実施例５．５に要約する。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
明確に且つ読みやすくするために、以下の定義を提供する。これら定義について言及される任意の技術的特徴は、本発明の各実施形態及び全実施形態において読み取ることができる。これら実施形態に関連して更なる定義及び説明を具体的に提供する場合がある。
【００３１】
適応免疫応答：適応免疫応答は、典型的に、免疫系の抗原特異的応答であると理解される。抗原特異性により、特定の病原体又は病原体に感染している細胞に合わせた応答を生じさせることができる。これら病原体又は細胞に合わせた応答を開始させる能力は、通常、「記憶細胞」によって体内に維持されている。身体がある病原体に１回超感染した場合、これら特異的記憶細胞を用いて、前記病原体を速やかに除去する。これに関連して、適応免疫応答の第１の工程は、抗原提示細胞による抗原特異的免疫応答を誘導することができる抗原特異的なナイーブＴ細胞又は様々な免疫細胞の活性化である。これは、ナイーブＴ細胞が常に通過しているリンパ組織及び器官で生じる。抗原提示細胞として機能し得る３種の細胞は、樹状細胞、マクロファージ、及びＢ細胞である。これら細胞は、それぞれ、免疫応答の誘発において異なる機能を有する。樹状細胞は、食作用及びマクロピノサイトーシスによって抗原を取り込むことができ、また、例えば外来抗原と接触することによって刺激されて、樹状細胞が成熟樹状細胞に分化する局所リンパ組織に遊走することができる。マクロファージは、細菌等の特定の抗原を摂取し、感染因子又は他の適切な刺激によって誘導されてＭＨＣ分子を発現させる。また、受容体を介して可溶性タンパク質抗原に結合し、内部に取り込むＢ細胞の独自の能力は、Ｔ細胞の誘導にとって重要であり得る。ＭＨＣ分子は、典型的に、抗原のＴ細胞への提示を担当する。ＭＨＣ分子における抗原の提示により、Ｔ細胞が活性化されて、前記Ｔ細胞の増殖及びアームドエフェクターＴ細胞への分化が誘導される。エフェクターＴ細胞の最も重要な機能は、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞によって感染細胞を殺傷し、共に細胞媒介免疫を構成するＴｈ１細胞によってマクロファージを活性化させ、Ｔｈ２細胞及びＴｈ１細胞の両方によってＢ細胞を活性化させて様々な分類の抗体を産生させ、それによって体液性免疫応答を駆動することである。Ｔ細胞は、抗原を直接認識したり結合したりはしないが、その代わり、例えば、他の細胞の表面上のＭＨＣ分子に結合している病原体由来のタンパク質抗原の短いペプチド断片（例えば、所謂エピトープ）を認識するＴ細胞受容体によって抗原を認識する。
【００３２】
適応免疫系：適応免疫系は、本質的に、病原体の成長を停止させる又は妨げることに専念している。適応免疫系は、典型的に、特定の病原体を認識及び記憶し（免疫を生じさせ）、前記病原体に遭遇したときにより強い攻撃を開始する能力を脊椎動物の免疫系に付与することによって適応免疫応答を制御する。前記系は、体細胞超変異（体細胞の突然変異が加速されるプロセス）及びＶ（Ｄ）Ｊ組み換え（抗原受容体遺伝子セグメントの不可逆的な遺伝子組み替え）により、高度に適応可能である。この機序により、少数の遺伝子が膨大な数の様々な抗原受容体を産生することができ、前記抗原受容体は、後に、個々のリンパ球で一意的に発現する。遺伝子の再配置により各細胞のＤＮＡが不可逆的に変化するので、かかる細胞の後代（子孫）は全て、長命特異的免疫にとって重要であるメモリーＢ細胞及びメモリーＴ細胞を含む、同じ受容体特異性をコードしている遺伝子を受け継ぐ。
【００３３】
アジュバント／アジュバント成分：アジュバント又はアジュバント成分は、最も広い意味では、典型的に、薬物又はワクチン等の他の剤の効果を変化させ得る、例えば、強化し得る薬理学的及び／又は免疫学的剤である。アジュバント又はアジュバント成分は、広義で解釈すべきであり、広範囲に亘る物質を指す。典型的に、これら物質は、抗原の免疫原性を高めることができる。例えば、アジュバントは、自然免疫系によって認識され得、例えば、自然免疫応答を誘発することができる。「アジュバント」は、典型的に、適応免疫応答を誘発しない。したがって、「アジュバント」は、抗原として適切ではない。アジュバントの作用機序は、適応免疫応答を生じさせる抗原によって誘発される効果とは異なる。
【００３４】
抗原：本発明において、「抗原」は、典型的に、免疫系によって、好ましくは適応免疫系によって認識され得る物質を指し、例えば、適応免疫応答の一部として抗体及び／又は抗原特異的Ｔ細胞を形成することによって抗原特異的免疫応答を誘発することができる。典型的に、抗原は、ＭＨＣによってＴ細胞に提示され得るペプチド又はタンパク質であってもよく、前記ペプチド又はタンパク質を含んでいてもよい。
【００３５】
人工核酸分子：人工核酸分子は、典型的に、自然界には存在しない核酸分子（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）であると理解してよい。言い換えれば、人工核酸分子は、非天然核酸分子として理解してよい。かかる核酸分子は、その個々の配列（自然界には存在しない）及び／又は他の修飾（例えば、自然界には存在しないヌクレオチドの構造的修飾）から非天然であり得る。人工核酸分子は、ＤＮＡ分子であってもよく、ＲＮＡ分子であってもよく、ＤＮＡ部分とＲＮＡ部分とを含むハイブリッド分子であってもよい。典型的に、人工核酸分子は、所望の人工ヌクレオチド配列（異種配列）に相当するように遺伝子改変方法によって設計及び／又は作製することができる。これに関連して、人工配列は、通常、自然界には存在し得ない配列である、即ち、少なくとも１つのヌクレオチドが野生型配列とは異なる。用語「野生型」とは、自然界に存在する配列であると理解してよい。更に、用語「人工核酸分子」の意味は、「１つの単一分子」には限定されず、典型的に、同一分子の集合体を含むと理解される。したがって、アリコートに含有される複数の同一分子を指す場合がある。
【００３６】
２シストロン性ＲＮＡ、多シストロン性ＲＮＡ：２シストロン性又は多シストロン性のＲＮＡは、典型的に２つ（２シストロン性）又はそれ以上（多シストロン性）のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有し得るＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡである。これに関連して、オープンリーディングフレームは、ペプチド又はタンパク質に翻訳可能なコドンの配列である。
【００３７】
担体／高分子担体：本発明における担体は、典型的に、別の化合物（カーゴ）の輸送及び／又は複合体化を促進する化合物であってよい。高分子担体は、典型的に、高分子で形成される担体である。担体は、共有相互作用又は非共有相互作用によってカーゴに結合し得る。担体は、核酸（例えば、ＲＮＡ又はＤＮＡ）を標的細胞に輸送することができる。担体は、幾つかの実施形態では、カチオン性成分であってよい。
【００３８】
カチオン性成分：用語「カチオン性成分」は、典型的に、典型的に１〜９のｐＨ値、好ましくは９以下（例えば、５〜９）、８以下（例えば、５〜８）、７以下（例えば、５〜７）のｐＨ値、最も好ましくは生理学的ｐＨ（例えば、７．３〜７．４）を有する正に帯電している帯電分子（カチオン）を指す。したがって、カチオン性成分は、任意の正に帯電している化合物又はポリマーであってよく、好ましくは、生理学的条件下で、特にインビボにおける生理学的条件下で正に帯電しているカチオン性のペプチド又はタンパク質であってよい。「カチオン性のペプチド又はタンパク質」は、例えば、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、又はＯｒｎから選択される、少なくとも１つの正に帯電しているアミノ酸、又は１超の正に帯電しているアミノ酸を含有していてよい。したがって、所与の条件下で１超の正電荷を呈する「ポリカチオン性」成分も、カチオン性成分の範囲内である。
【００３９】
５’−キャップ：５’−キャップは、一般的に成熟ｍＲＮＡの５’末端を「キャップ」する実体、典型的に修飾ヌクレオチド実体である。５’−キャップは、典型的に、修飾ヌクレオチド、特に、グアニンヌクレオチドの誘導体によって形成され得る。好ましくは、５’−キャップは、５’−５’−三リン酸結合を介して５’末端に結合する。５’−キャップは、メチル化されていてもよく、例えば、ｍ７ＧｐｐｐＮ（式中、Ｎは、５’−キャップを有する核酸の５’末端のヌクレオチド、典型的に、ＲＮＡの５’末端である）である。５’−キャップ構造の更なる例としては、グリセリル、逆転デオキシ非塩基残基（部分）、４’，５’メチレンヌクレオチド、１−（ベータ−Ｄ−エリトロフラノシル）ヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド、１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド、Ｌ−ヌクレオチド、アルファ−ヌクレオチド、修飾塩基ヌクレオチド、トレオ−ペントフラノシルヌクレオチド、非環式３’，４’−セコヌクレオチド、非環式３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド、非環式３，５ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、３’−３’−逆転ヌクレオチド部分、３’−３’−逆転非塩基部分、３’−２’−逆転ヌクレオチド部分、３’−２’−逆転非塩基部分、１，４−ブタンジオールホスフェート、３’−ホスホロアミデート、ヘキシルホスフェート、アミノヘキシルホスフェート、３’−ホスフェート、３’ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、又は架橋若しくは非架橋メチルホスホネート部分が挙げられる。
【００４０】
細胞免疫／細胞免疫応答：細胞免疫は、典型的に、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球の活性化、及び抗原に応答する様々なサイトカインの放出を指す。より一般的な用語では、細胞免疫は、抗体に基づくのではなく、免疫系の細胞の活性化に基づく。典型的に、細胞免疫応答は、細胞（例えば、樹状細胞又は他の細胞等の特定の免疫細胞）においてアポトーシスを誘導することができる抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球を活性化し、その表面上に外来抗原のエピトープを提示することを特徴とし得る。かかる細胞は、ウイルスに感染していてもよく、細胞内細菌に感染していてもよく、腫瘍抗原を提示する癌細胞であってもよい。更なる特徴は、マクロファージ及びナチュラルキラー細胞を活性化して病原体を破壊させたり、細胞を刺激して適応免疫応答及び自然免疫応答に関与している他の細胞の機能に影響を及ぼす様々なサイトカインを分泌させたりすることであり得る。
【００４１】
ＤＮＡ：ＤＮＡは、デオキシリボ核酸の一般的な略称である。ＤＮＡは、核酸分子、即ち、ヌクレオチドからなるポリマーである。これらヌクレオチドは、通常、デオキシアデノシン一リン酸、デオキシチミジン一リン酸、デオキシグアノシン一リン酸、及びデオキシシチジン一リン酸のモノマーであり、これらは、単独で、糖部分（デオキシリボース）、塩基部分、及びリン酸部分で構成され、特徴的な骨格構造により重合する。前記骨格構造は、典型的に、第１のヌクレオチドの糖部分（即ち、デオキシリボース）と、隣接する第２のモノマーのリン酸部分との間のホスホジエステル結合によって形成される。モノマーの特定の順序、即ち、糖／リン酸骨格に結合している塩基の順序が、ＤＮＡ配列と呼ばれる。ＤＮＡは、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。二本鎖形態では、第１の鎖のヌクレオチドは、典型的に、例えばＡ／Ｔ塩基対合及びＧ／Ｃ塩基対合によって第２の鎖のヌクレオチドとハイブリダイズする。
【００４２】
エピトープ：エピトープ（「抗原決定基」とも呼ばれる）は、Ｔ細胞エピトープとＢ細胞エピトープとに分けることができる。本発明におけるＴ細胞エピトープ又はタンパク質の一部は、好ましくは約６アミノ酸長〜約２０アミノ酸長又はそれ以上のアミノ酸長を有する断片、例えば、好ましくは約８アミノ酸長〜約１０アミノ酸長、例えば、８アミノ酸長、９アミノ酸長、又は１０アミノ酸長（又は更には１１アミノ酸長又は１２アミノ酸長）を有するＭＨＣクラスＩ分子によって処理及び提示される断片、或いは、好ましくは約１３アミノ酸長以上、例えば、１３アミノ酸長、１４アミノ酸長、１５アミノ酸長、１６アミノ酸長、１７アミノ酸長、１８アミノ酸長、１９アミノ酸長、２０アミノ酸長、又はそれ以上のアミノ酸長を有するＭＨＣクラスＩＩ分子によって処理及び提示される断片を含んでよく、これら断片は、アミノ酸配列の任意の部分から選択してよい。これら断片は、典型的に、ペプチド断片及びＭＨＣ分子からなる複合体の形態でＴ細胞によって認識される。即ち、前記断片は、典型的に、そのネイティブな形態では認識されない。Ｂ細胞エピトープは、典型的に、好ましくは５アミノ酸〜１５アミノ酸、より好ましくは５アミノ酸〜１２アミノ酸、更により好ましくは６アミノ酸〜９アミノ酸を有する、本明細書に定義する（ネイティブな）タンパク質又はペプチド抗原の外表面上に位置する断片であり、これは、即ちそのネイティブな形態で抗体によって認識され得る。
【００４３】
更に、タンパク質又はペプチドのかかるエピトープは、かかるタンパク質又はペプチドの本明細書に記載する変異体のいずれかから選択してよい。これに関連して、抗原決定基は、本明細書に定義するタンパク質又はペプチドのアミノ酸配列において不連続であるが、三次元構造では結合する本明細書に定義するタンパク質又はペプチドのセグメントで構成される高次構造エピトープ又は不連続エピトープであってもよく、単一ポリペプチド鎖で構成される連続エピトープ又は線状エピトープであってもよい。
【００４４】
配列の断片：配列の断片は、典型的に、例えば、核酸分子又はアミノ酸の配列の完全長配列のより短い部分であってよい。したがって、断片は、典型的に、完全長配列内の相当する一続きと同一である配列からなる。本発明における好ましい配列の断片は、前記断片が由来する分子における連続する一続きの実体に相当するヌクレオチド又はアミノ酸等の連続する一続きの実体からなり、前記断片が由来する分子全体（即ち、完全長分子）の少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、更により好ましくは少なくとも６０％、更により好ましくは少なくとも７０％、最も好ましくは少なくとも８０％を表す。
【００４５】
Ｇ／Ｃ改変：Ｇ／Ｃ改変核酸は、典型的に、好ましくは野生型配列よりも多数のグアノシン／シトシンヌクレオチドを含む改変野生型配列に基づく核酸、好ましくは本明細書に定義する人工核酸分子であってよい。グアノシン又はシトシンヌクレオチドを含有するコドンでアデノシン又はチミジンヌクレオチドを含有するコドンを置換することによって、このように数を増加させることができる。ＤＮＡ又はＲＮＡのコード領域におけるＧ／Ｃ含量を増加させる場合、遺伝コードの縮重を利用する。したがって、コドン置換は、コードされているアミノ酸残基は変化させず、核酸分子のＧ／Ｃ含量のみを増加させることが好ましい。
【００４６】
遺伝子治療：遺伝子治療は、典型的に、ペプチド又はタンパク質をコードしている核酸による患者の身体又は患者の身体の単離要素（例えば、単離組織／細胞）の治療を意味すると理解してよい。遺伝子治療は、典型的に、ａ）核酸、好ましくは本明細書に定義する人工核酸分子を任意の投与経路によって患者に直接投与するか、又はインビトロで前記患者の単離細胞／組織に投与して、インビボ／エキソビボ又はインビトロで前記患者の細胞をトランスフェクトする工程；ｂ）導入された前記核酸分子を転写及び／又は翻訳させる工程；及び任意でｃ）前記核酸を前記患者に直接投与しなかった場合、トランスフェクトされた単離細胞を前記患者に再投与する工程のうちの少なくとも１つを含んでよい。
【００４７】
遺伝子ワクチン接種：遺伝子ワクチン接種は、典型的に、抗原若しくは免疫原をコードしている核酸分子又はその断片を投与することによるワクチン接種であると理解してよい。前記核酸分子は、被験体の身体又は被験体の単離細胞に投与してよい。身体の特定の細胞をトランスフェクトした際又は単離細胞をトランスフェクトした際、これら細胞は、前記抗原又は免疫原を発現し、次いで、免疫系に提示して、適応免疫応答、即ち、抗原特異的免疫応答を誘発し得る。したがって、遺伝子ワクチン接種は、典型的に、ａ）核酸、好ましくは本明細書に定義する人工核酸分子を被験体、好ましくは患者、又は被験体、好ましくは患者の単離細胞に投与して、通常、インビボ又はインビトロで前記被験体の細胞をトランスフェクトする工程；ｂ）導入された前記核酸分子を転写及び／又は翻訳させる工程；及び任意で、ｃ）前記核酸を前記患者に直接投与しなかった場合、トランスフェクトされた単離細胞を被験体、好ましくは患者に再投与する工程のうちの少なくとも１つを含む。
【００４８】
異種配列：２つの配列は、典型的に、同一の遺伝子に由来していない場合、「異種」であると理解される。即ち、異種配列は、同一の生物に由来し得たとしても、天然で（自然界で）同一の核酸分子（例えば、同一のｍＲＮＡ等）中に存在することはない。
【００４９】
体液性免疫／体液性免疫応答：体液性免疫は、典型的に、抗体産生と、任意で抗体産生に付随する付属プロセスとを指す。体液性免疫応答は、典型的に、例えば、Ｔｈ２活性化及びサイトカイン産生、胚中心の形成及びアイソタイプの切り換え、親和性成熟及び記憶細胞の産生を特徴とし得る。また、体液性免疫は、典型的に、病原体及び毒素の中和、古典的補体活性化、並びに食作用及び病原体排除のオプソニンによる促進を含む抗体のエフェクター機能を指す場合もある。
【００５０】
免疫原：本発明において、免疫原は、典型的に、免疫応答を刺激することができる化合物であると理解してよい。好ましくは、免疫原は、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質である。特に好ましい実施形態では、本発明の意味における免疫原は、提供される核酸分子、好ましくは本明細書に定義する人工核酸分子の翻訳産物である。典型的に、免疫原は、少なくとも適応免疫応答を誘発する。
【００５１】
免疫賦活組成物：本発明において、免疫賦活組成物は、典型的に、免疫応答を誘導することができるか、又は免疫応答を誘導することができる成分が由来する少なくとも１つの成分を含有する組成物であると理解してよい。かかる免疫応答は、好ましくは、自然免疫応答又は適応免疫応答と自然免疫応答との組み合わせであってよい。本発明における免疫賦活組成物は、好ましくは、少なくとも１つの人工核酸分子、より好ましくはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ分子）を含有する。ｍＲＮＡ等の免疫賦活成分は、好適な担体と複合体化し得る。したがって、免疫賦活組成物は、ｍＲＮＡ／担体複合体を含んでいてよい。更に、免疫賦活組成物は、ｍＲＮＡ等の免疫賦活成分のアジュバント及び／又は好適なビヒクルを含んでいてよい。
【００５２】
免疫応答：免疫応答は、典型的に、特定の抗原に対する適応免疫系の特異的反応（所謂、特異的又は適応免疫応答）、自然免疫系の非特異的反応（所謂、非特異的又は自然免疫応答）、又はこれらの組み合わせであってよい。
【００５３】
免疫系：免疫系は、生物を感染から保護することができる。病原体が、生物の物理的障壁の通過に成功し、この生物に侵入した場合、自然免疫系が、即座にではあるが非特異的に応答する。病原体がこの自然応答から逃れた場合、脊椎動物は、第２の保護層である適応免疫系を有している。ここで、免疫系は、感染中の応答に適応してその病原体認識を向上させる。その後、この向上した応答は、病原体が排除された後も免疫記憶の形態で保持され、この病原体に遭遇したときにはいつも適応免疫系がより速やかに且つより強力な攻撃を行うことが可能になる。これによれば、免疫系は、自然免疫系及び適応免疫系を含む。これら２つの部分はそれぞれ、典型的に、所謂体液性成分及び細胞性成分を含有する。
【００５４】
免疫賦活ＲＮＡ：本発明における免疫賦活ＲＮＡ（ｉｓＲＮＡ）は、典型的に、自然免疫応答を誘導することができるＲＮＡであってよい。これは、通常、オープンリーディングフレームを有しないので、ペプチド抗原又は免疫原を提供しないが、例えば、特定の種類のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）又は他の好適な受容体に結合することによって免疫応答を誘発する。しかし、無論、オープンリーディングフレームを有し且つペプチド／タンパク質をコードしているｍＲＮＡも自然免疫応答を誘導し得るので、免疫賦活ＲＮＡであり得る。
【００５５】
自然免疫系：非特異的免疫系としても知られている自然免疫系は、典型的に、非特異的に他の生物による感染からホストを守る細胞及び機構を含む。これは、自然免疫系の細胞は、包括的に病原体を認識し、応答することができるが、適応免疫系とは異なり、ホストに対して長期間免疫を付与することも、防御免疫を付与することもないことを意味する。自然免疫系は、例えば、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）のリガンド、リポ多糖類等の他の補助物質、ＴＮＦ−アルファ、ＣＤ４０リガンド、サイトカイン、モノカイン、リンホカイン、インターロイキン、ケモカイン、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２、ＩＬ−３３、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＬＴ−ベータ、ＴＮＦ−アルファ、成長因子及びｈＧＨ、ヒトＴｏｌｌ様受容体ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０のリガンド、マウスＴｏｌｌ様受容体ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＴＬＲ１１、ＴＬＲ１２、又はＴＬＲ１３のリガンド、ＮＯＤ様受容体のリガンド、ＲＩＧ−Ｉ様受容体のリガンド、免疫賦活核酸、免疫賦活ＲＮＡ（ｉｓＲＮＡ）、ＣｐＧ−ＤＮＡ、抗菌剤、又は抗ウイルス剤によって活性化され得る。本発明に係る医薬組成物は、１以上のかかる物質を含んでいてよい。典型的に、自然免疫系の応答は、サイトカインと呼ばれる特殊な化学メディエーターを含む化学因子の産生を介して感染部位に免疫細胞を動員し、補体カスケードを活性化し、特殊な白血球によって器官、組織、血液、及びリンパ中に存在する外来物質を同定及び除去し、適応免疫系を活性化し、及び／又は感染因子に対する物理的及び化学的な障壁として作用することを含む。
【００５６】
クローニングサイト：クローニングサイトは、典型的に、核酸配列、例えば、オープンリーディングフレームを含む核酸配列の挿入に好適である核酸分子のセグメントであると理解される。挿入は、例えば、制限酵素処理及びライゲーションによって当業者に公知の任意の分子生物学的方法によって実施してよい。クローニングサイトは、典型的に、１以上の制限酵素認識部位（制限酵素部位）を含む。これら１以上の制限酵素部位は、これら部位においてＤＮＡを切断する制限酵素によって認識され得る。１超の制限酵素部位を含むクローニングサイトは、マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）又はポリリンカーと呼ばれる場合もある。
【００５７】
核酸分子：核酸分子は、核酸成分を含む、好ましくは核酸成分からなる分子である。核酸分子という用語は、好ましくは、ＤＮＡ又はＲＮＡの分子を指す。好ましくは、用語「ポリヌクレオチド」と同義的に用いられる。好ましくは、核酸分子は、糖／リン酸骨格のホスホジエステル結合によって互いに共有結合しているヌクレオチドモノマーを含むか又はからなるポリマーである。また、用語「核酸分子」は、例えば、塩基が修飾されている、糖が修飾されている、又は骨格が修飾されているＤＮＡ又はＲＮＡの分子等の修飾核酸分子も含む。
【００５８】
オープンリーディングフレーム：本発明におけるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、典型的に、ペプチド又はタンパク質に翻訳され得る幾つかのヌクレオチドトリプレットの配列であってよい。オープンリーディングフレームは、好ましくは、開始コドン、即ち、その５’末端における通常アミノ酸メチオニンをコードしている３つの連続するヌクレオチドの組み合わせ（ＡＴＧ又はＡＵＧ）と、その後に、通常３の倍数である長さのヌクレオチドを有する領域とを含む。ＯＲＦは、好ましくは、終止コドン（例えば、ＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡ）によって終結する。典型的に、これは、オープンリーディングフレームの唯一の終止コドンである。したがって、本発明におけるオープンリーディングフレームは、好ましくは、開始コドン（例えば、ＡＴＧ又はＡＵＧ）で始まり、好ましくは、終止コドン（例えば、それぞれＴＡＡ、ＴＧＡ、若しくはＴＡＧ、又はＵＡＡ、ＵＡＧ、ＵＧＡ）で終結する、３で割り切れる多数のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列である。オープンリーディングフレームは、単離することができたり、例えば、ベクター又はｍＲＮＡにおけるより長い核酸配列に組み込むことができたりする。また、オープンリーディングフレームは、「タンパク質コード領域」と呼ばれる場合もある。
【００５９】
ペプチド：ペプチド又はポリペプチドは、典型的に、ペプチド結合によって連結されているアミノ酸モノマーのポリマーである。典型的に、５０個未満のモノマーユニットを含む。しかし、ペプチドという用語は、５０個超のモノマーユニットを有する分子を除外するものではない。また、典型的に５０個〜６００個のモノマーユニットを有する長いペプチドは、ポリペプチドとも呼ばれる。
【００６０】
薬学的に有効な量：本発明において薬学的に有効な量は、典型的に、免疫応答等の薬学的効果を誘導して、ペプチド又はタンパク質の病的レベルの発現を変化させるか又は例えば、病理学的状況の場合、欠損している遺伝子産物を置換するのに十分な量であると理解される。
【００６１】
タンパク質：タンパク質は、典型的に、１以上のペプチド又はタンパク質を含む。タンパク質は、典型的に、３次元形態に折り畳まれており、これは、タンパク質がその生物学的機能を発揮するのに必要である場合がある。
【００６２】
ポリ（Ａ）配列：ポリ（Ａ）テール又は３’−ポリ（Ａ）テールとも呼ばれるポリ（Ａ）配列は、典型的に、アデノシンヌクレオチドの配列、例えば、約４００個以下のアデノシンヌクレオチドの配列、約２０個〜約４００個のアデノシンヌクレオチドの配列、好ましくは約５０個〜約４００個のアデノシンヌクレオチドの配列、より好ましくは約５０個〜約３００個のアデノシンヌクレオチドの配列、更により好ましくは約５０個〜約２５０個のアデノシンヌクレオチドの配列、最も好ましくは約６０個〜約２５０個のアデノシンヌクレオチドの配列であると理解される。ポリ（Ａ）配列は、典型的に、ｍＲＮＡの３’末端に位置する。本発明において、ポリ（Ａ）配列は、ｍＲＮＡ内に位置してもよく、又は例えば、ベクターの転写によってＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）を作製するためのテンプレートとして機能するベクター等のベクターにおける任意の他の核酸分子内に位置してもよい。
【００６３】
ポリアデニル化：ポリアデニル化は、典型的に、ＲＮＡ分子等の核酸分子、例えば、未成熟ｍＲＮＡにポリ（Ａ）配列を付加することであると理解される。ポリアデニル化は、所謂ポリアデニル化シグナルによって誘導され得る。このシグナルは、好ましくは、ポリアデニル化される核酸分子（例えば、ＲＮＡ分子）の３’末端における一続きのヌクレオチド内に位置している。ポリアデニル化シグナルは、典型的に、アデニン及びウラシル／チミンヌクレオチドからなるヘキサマー、好ましくは、ヘキサマー配列ＡＡＵＡＡＡを含む。他の配列、好ましくはヘキサマー配列も考えられる。ポリアデニル化は、典型的に、プレｍＲＮＡ（未成熟ｍＲＮＡとも呼ばれる）のプロセシング中に生じる。典型的に、ＲＮＡの成熟（プレｍＲＮＡから成熟ｍＲＮＡへ）は、ポリアデニル化工程を含む。
【００６４】
制限酵素部位：「制限酵素認識部位」とも呼ばれる制限酵素部位は、制限酵素によって認識されるヌクレオチド配列である。制限酵素部位は、典型的に短く、好ましくは、回文構造のヌクレオチド配列、例えば、４個〜８個のヌクレオチドを含む配列である。制限酵素部位は、好ましくは、制限酵素によって特異的に認識される。制限酵素は、典型的に、この部位において制限酵素部位を含むヌクレオチド配列を切断する。二本鎖ＤＮＡ配列等の二本鎖ヌクレオチド配列では、制限酵素は、典型的に、ヌクレオチド配列の両方の鎖を切断する。
【００６５】
ＲＮＡ、ｍＲＮＡ：ＲＮＡは、リボ核酸の一般的な略称である。ＲＮＡは、核酸分子、即ち、ヌクレオチドからなるポリマーである。これらヌクレオチドは、通常、所謂骨格に沿って互いに結合しているアデノシン一リン酸、ウリジン一リン酸、グアノシン一リン酸、及びシチジン一リン酸のモノマーである。骨格は、第１のモノマーの糖（即ち、リボース）と第２の隣接するモノマーのリン酸部分との間のホスホジエステル結合によって形成される。特定の連続するモノマーをＲＮＡ配列と呼ぶ。通常、ＲＮＡは、例えば、細胞内部のＤＮＡ配列の転写によって得ることができる。真核細胞では、転写は、通常、核又はミトコンドリア内部で実施される。インビボでは、ＤＮＡの転写により、通常、所謂未成熟ＲＮＡが得られ、これは、所謂メッセンジャーＲＮＡ（通常、ｍＲＮＡと略される）にプロセシングされなければならない。例えば、真核生物における未成熟ＲＮＡのプロセシングは、スプライシング、５’−キャッピング、ポリアデニル化、核又はミトコンドリアからのエクスポート等の様々な異なる転写後修飾を含む。これらプロセス全体をＲＮＡの成熟とも呼ぶ。成熟メッセンジャーＲＮＡは、通常、特定のペプチド又はタンパク質のアミノ酸配列に翻訳され得るヌクレオチド配列を提供する。典型的に、成熟ｍＲＮＡは、５’−キャップ、５’ＵＴＲ、オープンリーディングフレーム、３’ＵＴＲ、及びポリ（Ａ）配列を含む。メッセンジャーＲＮＡは別として、転写及び／又は翻訳の制御に関与し得る幾つかの非コード型のＲＮＡが存在する。
【００６６】
核酸分子の配列：核酸分子の配列は、典型的に、そのヌクレオチドの特定の及び個々の順序、即ち、連続物であると理解される。タンパク質又はペプチドの配列は、典型的に、そのアミノ酸の順序、即ち、連続物であると理解される。
【００６７】
配列同一性：同じ長さ及び順序のヌクレオチド又はアミノ酸を有する場合、２以上の配列は同一である。同一性の割合は、典型的に、２つの配列が同一である程度について説明する。即ち、典型的に、その配列位置においてレファレンス配列の同一ヌクレオチドと一致するヌクレオチドの割合について説明するものである。同一性の程度を決定する場合、比較する配列は、同じ長さ、即ち、比較する配列のうちの最長の配列の長さを有するとみなされる。これは、８ヌクレオチドからなる第１の配列が、前記第１の配列を含む１０ヌクレオチドからなる第２の配列と８０％同一であることを意味する。言い換えれば、本発明において、配列同一性は、好ましくは、同じ長さを有する２以上の配列において配列のうちの同一位置を有するヌクレオチドの割合に関する。ギャップは、アラインメントにおけるその実際の位置にかかわらず、通常、非同一位置であるとみなされる。
【００６８】
安定化核酸分子：安定化核酸分子は、例えば、環境因子又はエキソヌクレアーゼ若しくはエンドヌクレアーゼによる分解等の酵素分解によって、修飾されていない核酸分子よりも崩壊又は分解に対して安定であるように修飾されている核酸分子、好ましくはＤＮＡ又はＲＮＡの分子である。好ましくは、本発明における安定化核酸分子は、細胞（例えば、原核細胞又は真核細胞）、好ましくは哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞）において安定化される。また、安定化効果は、例えば、安定化核酸分子を含む医薬組成物の製造過程において、細胞外、例えば、バッファ溶液中でも発揮され得る。
【００６９】
トランスフェクション：用語「トランスフェクション」は、ＤＮＡ又はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の分子等の核酸分子を細胞、好ましくは真核細胞に導入することを指す。本発明において、用語「トランスフェクション」は、核酸分子を細胞、好ましくは真核細胞、例えば哺乳類細胞に導入するための当業者に公知の任意の方法を含む。かかる方法は、例えば、エレクトロポレーション、（例えば、カチオン性脂質及び／又はリポソームに基づく）リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ナノ粒子に基づくトランスフェクション、ウイルスに基づくトランスフェクション、又はカチオン性ポリマー（例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン又はポリエチレンイミン等）に基づくトランスフェクションを含む。好ましくは、導入は、非ウイルスである。
【００７０】
ワクチン：ワクチンは、典型的に、少なくとも１つの抗原、好ましくは免疫原を提供する予防的又は治療的材料であると理解される。抗原又は免疫原は、ワクチン接種に好適な任意の材料に由来してよい。例えば、抗原又は免疫原は、病原体（例えば、細菌若しくはウイルス粒子等）又は腫瘍若しくは癌性組織に由来してよい。抗原又は免疫原は、身体の適応免疫系を刺激して、適応免疫応答を提供する。
【００７１】
ベクター：用語「ベクター」は、核酸分子、好ましくは人工核酸分子を指す。本発明におけるベクターは、オープンリーディングフレームを含む核酸配列等の所望の核酸配列を組み込む又は有するのに好適である。かかるベクターは、ストレージベクター、発現ベクター、クローニングベクター、トランスファーベクター等であってよい。ストレージベクターは、核酸分子、例えば、ｍＲＮＡ分子を便利に保管することができるベクターである。したがって、このベクターは、例えば、所望のｍＲＮＡ配列又はその一部に相当する配列（例えば、ｍＲＮＡのオープンリーディングフレーム及び３’ＵＴＲに相当する配列）を含んでいてよい。発現ベクターは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）、又はペプチド、ポリペプチド、若しくはタンパク質等の発現産物を産生するために用いることができる。例えば、発現ベクターは、プロモーター配列（例えば、ＲＮＡプロモーター配列）等のベクターの一続きの配列の転写に必要な配列を含んでいてよい。クローニングベクターは、典型的に、核酸配列をベクターに組み込むために用いることができるクローニングサイトを含むベクターである。クローニングベクターは、例えば、プラスミドベクター又はバクテリオファージベクターであってよい。トランスファーベクターは、細胞又は生物に核酸分子を移入するのに好適なベクター、例えば、ウイルスベクターであってよい。本発明におけるベクターは、例えば、ＲＮＡベクターであってもＤＮＡベクターであってもよい。好ましくは、ベクターは、ＤＮＡ分子である。好ましくは、本発明におけるベクターは、クローニングサイト、選択マーカー（例えば、抗生物質耐性因子）、及びベクターの増殖に好適な配列（例えば、複製起点）を含む。好ましくは、本願におけるベクターは、プラスミドベクターである。
【００７２】
ビヒクル：ビヒクルは、典型的に、化合物（例えば、薬学的に活性のある化合物）を保管、輸送、及び／又は投与するのに好適な材料であると理解される。例えば、薬学的に活性のある化合物を保管、輸送、及び／又は投与するのに好適な生理学的に許容可能な液体であってよい。
【００７３】
３’−非翻訳領域（３’ＵＴＲ）：３’ＵＴＲは、典型的に、ｍＲＮＡのタンパク質コード領域（即ち、オープンリーディングフレーム）とポリ（Ａ）配列との間に位置するｍＲＮＡの部分である。ｍＲＮＡの３’ＵＴＲは、アミノ酸配列に翻訳されない。３’ＵＴＲ配列は、一般的に、遺伝子発現プロセス中にそれぞれのｍＲＮＡに翻訳される遺伝子によってコードされている。ゲノム配列は、先ず、任意のイントロンを含む未成熟ｍＲＮＡに転写される。次いで、前記未成熟ｍＲＮＡは、成熟プロセスにおいて成熟ｍＲＮＡに更にプロセシングされる。この成熟プロセスは、５’キャッピング工程、未成熟ｍＲＮＡをスプライシングして、任意のイントロン及び３’末端の修飾（例えば、未成熟ｍＲＮＡの３’末端のポリアデニル化）を除去する工程、及び任意のエンドヌクレアーゼ又はエキソヌクレアーゼによる切断工程等を含む。本発明において、３’ＵＴＲは、タンパク質コード領域の終止コドンの３’側、好ましくはタンパク質コード領域の終止コドンの直ぐ３’側に位置し、且つポリ（Ａ）配列の５’側、好ましくはポリ（Ａ）配列の直ぐ５’側のヌクレオチドまで延在する成熟ｍＲＮＡの配列に相当する。用語「相当する」とは、３’ＵＴＲ配列が、３’ＵＴＲ配列を定義するために用いられるｍＲＮＡ配列等のＲＮＡ配列であってもよく、かかるＲＮＡ配列に相当するＤＮＡ配列であってもよいことを意味する。本発明において、用語「遺伝子の３’ＵＴＲ」、例えば、「アルブミン遺伝子の３’ＵＴＲ」は、この遺伝子に由来する成熟ｍＲＮＡの３’ＵＴＲに相当する配列、即ち、遺伝子の転写及び未成熟ｍＲＮＡの成熟によって得られるｍＲＮＡである。用語「遺伝子の３’ＵＴＲ」は、３’ＵＴＲのＤＮＡ配列及びＲＮＡ配列を含む。
【００７４】
５’−非翻訳領域（５’ＵＴＲ）：５’ＵＴＲは、典型的に、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の特定の部分であると理解される。これは、ｍＲＮＡのオープンリーディングフレームの５’側に位置する。典型的に、５’ＵＴＲは、転写開始点から始まり、オープンリーディングフレームの開始コドンの１つ前のヌクレオチドで終わる。５’ＵＴＲは、制御エレメントとも呼ばれる遺伝子発現を制御するエレメントを含んでいてよい。かかる制御エレメントは、例えば、リボソーム結合部位又は５’末端オリゴピリミジン領域であってよい。５’ＵＴＲは、例えば、５’−キャップの付加によって転写後修飾されてよい。本発明において、５’ＵＴＲは、５’キャップと開始コドンとの間に位置する成熟ｍＲＮＡの配列に相当する。好ましくは、５’ＵＴＲは、５’−キャップの３’側に位置するヌクレオチド、好ましくは５’キャップの直ぐ３’側に位置するヌクレオチドから、タンパク質コード領域の開始コドンの５’側に位置するヌクレオチド、好ましくはタンパク質コード領域の開始コドンの直ぐ５’側に位置するヌクレオチドまで延在する配列に相当する。成熟ｍＲＮＡの５’キャップの直ぐ３’側に位置するヌクレオチドは、典型的に、転写開始点に相当する。用語「相当する」とは、５’ＵＴＲ配列が、５’ＵＴＲ配列を定義するために用いられるｍＲＮＡ配列等のＲＮＡ配列であってもよく、かかるＲＮＡ配列に相当するＤＮＡ配列であってもよいことを意味する。本発明において、用語「遺伝子の５’ＵＴＲ」、例えば、「ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲ」は、この遺伝子に由来する成熟ｍＲＮＡの５’ＵＴＲに相当する配列、即ち、遺伝子の転写及び未成熟ｍＲＮＡの成熟によって得られるｍＲＮＡである。用語「遺伝子の５’ＵＴＲ」は、５’ＵＴＲのＤＮＡ配列及びＲＮＡ配列を含む。
【００７５】
５’末端オリゴピリミジン領域（ＴＯＰ）：５’末端オリゴピリミジン領域（ＴＯＰ）は、典型的に、特定の遺伝子の核酸分子の５’末端領域（例えば、特定のｍＲＮＡ分子の５’末端領域又は機能的実体、例えば、転写領域の５’末端領域）に位置する一続きのピリミジンヌクレオチドである。この配列は、シチジン（通常、転写開始点に相当する）で始まり、その後に、通常約３個〜約３０個の一続きのピリミジンヌクレオチドが続く。例えば、ＴＯＰは、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、又は更により多くのヌクレオチドを含んでいてよい。一続きのピリミジン、延いては５’ＴＯＰは、ＴＯＰの下流に位置する最初のプリンヌクレオチドの１ヌクレオチド５’側で終わる。５’末端オリゴピリミジン領域を含有するメッセンジャーＲＮＡは、多くの場合、５’ＴＯＰｍＲＮＡと呼ばれる。したがって、かかるメッセンジャーＲＮＡを提供する遺伝子は、ＴＯＰ遺伝子と呼ばれる。ＴＯＰ配列は、例えば、ペプチド伸長因子及びリボソームタンパク質をコードしている遺伝子及びｍＲＮＡにおいて見出されている。
【００７６】
ＴＯＰモチーフ：本発明において、ＴＯＰモチーフは、上に定義した５’ＴＯＰに相当する核酸配列である。したがって、本発明におけるＴＯＰモチーフは、好ましくは、３ヌクレオチド長〜３０ヌクレオチド長を有する一続きのピリミジンヌクレオチドである。好ましくは、ＴＯＰモチーフは、少なくとも３個のピリミジンヌクレオチド、好ましくは少なくとも４個のピリミジンヌクレオチド、好ましくは少なくとも５個のピリミジンヌクレオチド、より好ましくは少なくとも６個のピリミジンヌクレオチド、より好ましくは少なくとも７個のピリミジンヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも８個のピリミジンヌクレオチドからなり、前記一続きのピリミジンヌクレオチドは、好ましくは、その５’末端におけるシトシンヌクレオチドで始まる。ＴＯＰ遺伝子及びＴＯＰｍＲＮＡでは、ＴＯＰモチーフは、好ましくは、その５’末端における転写開始点で始まり、前記遺伝子又はｍＲＮＡにおける最初のプリン残基の１ヌクレオチド５’側で終わる。本発明におけるＴＯＰモチーフは、好ましくは、５’ＵＴＲを表す配列の５’末端、又は５’ＵＴＲをコードしている配列の５’末端に位置する。したがって、好ましくは、３個以上の一続きのピリミジンヌクレオチドは、この一続きのピリミジンヌクレオチドが、本発明に係る人工核酸分子、本発明に係る人工核酸分子の５’ＵＴＲエレメント、又は本明細書に記載するＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲに由来する核酸配列等のそれぞれの配列の５’末端に位置している場合、本発明の意味において「ＴＯＰモチーフ」と呼ばれる。言い換えれば、５’ＵＴＲ又は５’ＵＴＲエレメントの５’末端以外の５’ＵＴＲ又は５’ＵＴＲエレメント内のいずれかに位置する３個以上の一続きのピリミジンヌクレオチドは、好ましくは、「ＴＯＰモチーフ」とは呼ばない。
【００７７】
ＴＯＰ遺伝子：ＴＯＰ遺伝子は、典型的に、５’末端オリゴピリミジン領域の存在を特徴とする。更に、殆どのＴＯＰ遺伝子は、成長に関連する翻訳制御を特徴とする。しかし、組織特異的に翻訳制御するＴＯＰ遺伝子も知られている。上に定義した通り、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲは、ＴＯＰ遺伝子に由来する成熟ｍＲＮＡの５’ＵＴＲの配列に相当し、好ましくは、５’キャップの３’側に位置するヌクレオチドから開始コドンの５’側に位置するヌクレオチドまで延在する。ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲは、典型的に、開始コドンを含まず、好ましくは上流ＡＵＧ（ｕＡＵＧ）も上流オープンリーディングフレーム（ｕＯＲＦ）も含まない。本明細書では、上流ＡＵＧ及び上流オープンリーディングフレームは、典型的に、翻訳されるべきオープンリーディングフレームの開始コドン（ＡＵＧ）の５’側に存在するＡＵＧ及びオープンリーディングフレームであると理解される。ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲは、一般的に、やや短い。ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの長さは、２０ヌクレオチド〜５００ヌクレオチドで変動してよく、典型的に、約２００ヌクレオチド未満、好ましくは約１５０ヌクレオチド未満、より好ましくは約１００ヌクレオチド未満である。本発明の意味における例示的なＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲは、配列番号１〜１，３６３、１，４３５、１，４６１、及び１，４６２に係る配列における５番目の位置のヌクレオチドから開始コドン（例えば、ＡＴＧ）の直ぐ５’側に位置するヌクレオチドまで延在する核酸配列である。
【００７８】
第１の態様では、本発明は、
ａ．  ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲに由来するか又はＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる少なくとも１つの５’−非翻訳領域エレメント（５’ＵＴＲエレメント）と、
ｂ．  少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と
とを含む人工核酸分子に関する。
【００７９】
好ましくは、前記人工核酸分子は、
ｃ．  少なくとも１つのヒストンステムループ
を更に含む。
【００８０】
かかる人工核酸分子は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。人工核酸分子がＤＮＡである場合、それは、以下に更に記載する配列に相当する配列を有するＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡを提供するために用いてよい。本発明の人工核酸分子は、オープンリーディングフレームによってコードされているタンパク質のタンパク質産生を増加及び／又は延長させることができるので、遺伝子治療及び遺伝子ワクチン接種において特に有用である。
【００８１】
これに関連して、用語「５’ＵＴＲエレメント」は、好ましくは、人工ｍＲＮＡ等の人工核酸配列の５’ＵＴＲを表す核酸配列、又は人工核酸分子の５’ＵＴＲをコードしている核酸配列を指す。したがって、好ましくは、５’ＵＴＲエレメントは、ｍＲＮＡ、好ましくは人工ｍＲＮＡの５’ＵＴＲであってもよく、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲの転写テンプレートであってもよい。したがって、５’ＵＴＲエレメントは、好ましくは、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ、好ましくは人工ｍＲＮＡ（例えば、遺伝子的に改変したベクターコンストラクトの転写によって得られるｍＲＮＡ）の５’ＵＴＲに相当する核酸配列である。好ましくは、本発明の意味における５’ＵＴＲエレメントは、５’ＵＴＲとして機能するか、又は５’ＵＴＲの機能を発揮するヌクレオチド配列をコードしている。用語「５’ＵＴＲエレメント」は、更に、人工核酸配列、例えば、人工ｍＲＮＡの５’ＵＴＲの断片若しくは一部、又は人工核酸分子の５’ＵＴＲの一部若しくは断片をコードしているものを指す。これは、本発明の意味における５’ＵＴＲエレメントが、人工核酸配列（例えば、人工ｍＲＮＡ）の５’ＵＴＲに含まれていてもよく、人工核酸分子の５’ＵＴＲをコードしていてもよいことを意味する。
【００８２】
本発明によれば、５’ＵＴＲエレメントは、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲ又はＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる。
【００８３】
用語「ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲに由来する核酸配列」は、好ましくは、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲ配列又はその断片に基づく核酸配列を指す。この用語は、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲ配列全体に相当する配列、即ち、完全長５’ＵＴＲ配列と、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲ配列の断片に相当する配列とを含む。好ましくは、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの断片は、ＴＯＰ遺伝子の完全長５’ＵＴＲにおける連続する一続きのヌクレオチドに相当する連続する一続きのヌクレオチドであって、ＴＯＰ遺伝子の完全長５’ＵＴＲの少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、更により好ましくは少なくとも６０％、更により好ましくは少なくとも７０％、更により好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％を表す連続する一続きのヌクレオチドからなる。本発明の意味におけるかかる断片は、好ましくは、本明細書に記載する機能的断片である。ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの特に好ましい断片は、５’ＴＯＰモチーフを有しないＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲである。用語「ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲ」は、好ましくは、自然界に存在するＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲを指す。
【００８４】
ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲに関連して、用語「ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの変異体」及び「その変異体」は、自然界に存在するＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの変異体、好ましくは、脊椎動物のＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの変異体、好ましくは、哺乳類のＴＯＰ遺伝子の３’ＵＴＲの変異体、より好ましくは、ヒトＴＯＰ遺伝子の３’ＵＴＲの変異体を指す。かかる変異体は、ＴＯＰ遺伝子の修飾５’ＵＴＲであってもよい。例えば、変異体５’ＵＴＲは、その変異体が由来する自然界に存在する５’ＵＴＲに比べて１以上のヌクレオチドの欠失、挿入、付加、及び／又は置換を有してよい。好ましくは、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの変異体は、その変異体が由来する自然界に存在する５’ＵＴＲと少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、更により好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％同一である。好ましくは、前記変異体は、本明細書に記載する機能的変異体である。
【００８５】
用語「ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列」は、好ましくは、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲ配列の変異体又はその断片に基づく核酸配列を指す。この用語は、ＴＯＰ遺伝子の変異体５’ＵＴＲ配列全体に相当する配列（即ち、完全長変異体５’ＵＴＲ配列）と、ＴＯＰ遺伝子の変異体５’ＵＴＲ配列の断片に相当する配列とを含む。好ましくは、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの変異体の断片は、ＴＯＰ遺伝子の完全長変異体５’ＵＴＲにおける連続する一続きのヌクレオチドに相当する連続する一続きのヌクレオチドであって、ＴＯＰ遺伝子の完全長変異体５’ＵＴＲの少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、更により好ましくは少なくとも６０％、更により好ましくは少なくとも７０％、更により好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％を表す連続する一続きのヌクレオチドからなる。本発明の意味におけるかかる変異体の断片は、好ましくは、本明細書に記載する機能的断片である。
【００８６】
したがって、人工核酸分子の５’ＵＴＲエレメントは、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの断片若しくはＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの変異体の断片を含んでいてもよく、又はこれらからなっていてもよい。或いは、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲ全体を含んでいてもよく、又はそれからなっていてもよい。或いは、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの変異体を含んでいてもよく、又はそれからなっていてもよい。
【００８７】
５’ＵＴＲエレメントは、好ましくは、人工核酸分子からのタンパク質産生を増加させるのに適している。
【００８８】
好ましくは、少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメントは、ＯＲＦに機能的に連結している。これは、好ましくは、５’ＵＴＲエレメントが、ＯＲＦによってコードされているタンパク質についてのタンパク質産生増加機能又は人工核酸分子に対する安定化機能等の機能を発揮できるように、ＯＲＦと結合していることを意味する。好ましくは、５’ＵＴＲエレメントとＯＲＦとは、５’→３’方向に結合する。したがって、好ましくは、人工核酸分子は、以下の構造：５’−５’ＵＴＲエレメント−（任意の）リンカー−ＯＲＦ−３’を含む（リンカーは、存在していても存在していなくてもよい）を含む。例えば、リンカーは、例えば、１以上の制限酵素認識部位（制限酵素部位）を含むか又はからなる一続きの１個〜５０個又は１個〜２０個のヌクレオチド等の１以上のヌクレオチドであってよい。
【００８９】
好ましくは、５’ＵＴＲエレメントと少なくとも１つのオープンリーディングフレームとは、異種である。これに関連して、用語「異種」は、自然界（天然）では、オープンリーディングフレームと５’ＵＴＲエレメントとがこの組み合わせで存在しないことを意味する。好ましくは、５’ＵＴＲエレメントは、オープンリーディングフレームとは異なる遺伝子に由来する。例えば、ＯＲＦは、例えば、５’ＵＴＲエレメントとは異なる遺伝子をコードしているか又は同じタンパク質であるが異なる種のタンパク質をコードしている、５’ＵＴＲエレメントとは異なる遺伝子に由来していてよい。例えば、ＯＲＦは、５’ＵＴＲエレメントが由来する遺伝子によってコードされているタンパク質をコードしない。
【００９０】
好ましい実施形態では、５’ＵＴＲエレメント、好ましくは人工核酸分子は、完全なＴＯＰモチーフも５’ＴＯＰ配列も含まない。したがって、好ましくは、５’ＵＴＲエレメント、好ましくは人工核酸分子は、５’ＵＴＲエレメントの核酸配列が由来するＴＯＰ遺伝子の完全なＴＯＰモチーフを含まない。例えば、本発明に係る５’ＵＴＲエレメント又は人工核酸分子は、ＴＯＰモチーフ又は５’ＴＯＰのうちの１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、又はそれ以上のピリミジン残基、好ましくは、ＴＯＰモチーフ又は５’ＴＯＰの３’側に位置するＴＯＰモチーフのうちの１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個又はそれ以上のピリミジン残基を含んでいてよい。例えば、５’ＵＴＲエレメントは、その５’末端において、５’ＵＴＲエレメントの核酸配列が由来するＴＯＰ遺伝子のＴＯＰモチーフ又は５’ＴＯＰの残基２、３、４、５、６、７、８、９、１０等に相当するピリミジン残基で始まる核酸配列を含んでいてもよく、又は前記配列からなっていてもよい。
【００９１】
本発明に係る５’ＵＴＲエレメント、好ましくは人工核酸分子は、ＴＯＰモチーフも５’ＴＯＰも含まないことが特に好ましい。例えば、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲに由来する５’ＵＴＲエレメントの核酸配列は、その５’末端において、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの５’末端オリゴピリミジン領域（ＴＯＰ）の下流の位置１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０に位置するヌクレオチドで始まる。５’末端オリゴピリミジン領域（ＴＯＰ）の下流の位置１は、ＴＯＰモチーフ又は５’ＴＯＰの３’側の最初のプリン系ヌクレオチドである。したがって、５’末端オリゴピリミジン領域の下流の位置１は、５’から３’方向において５’末端オリゴピリミジン領域の３’末端に続く最初のヌクレオチドである。同様に、５’ＴＯＰの下流の位置２は、５’末端オリゴピリミジン領域の末端に続く２番目のヌクレオチドであり、位置３は、３番目のヌクレオチドである。
【００９２】
したがって、５’ＵＴＲエレメントは、好ましくは、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの転写開始点の５ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、又は５０ヌクレオチド下流で始まる。
【００９３】
幾つかの実施形態では、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲに由来する５’ＵＴＲエレメントの核酸配列は、その３’末端において、それが由来する遺伝子又はｍＲＮＡの開始コドン（例えば、Ａ（Ｕ／Ｔ）Ｇ）の上流の位置１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０に位置するヌクレオチドで終結する。したがって、５’ＵＴＲエレメントは、タンパク質コード領域を全く含まない。したがって、好ましくは、本発明の人工核酸分子の唯一のタンパク質コード領域が、オープンリーディングフレームによって提供される。しかし、オープンリーディングフレームは、好ましくは、上記の通り、５’ＵＴＲエレメントが由来する遺伝子とは異なる遺伝子に由来する。
【００９４】
５’ＵＴＲエレメントは、ヌクレオチド配列Ａ（Ｕ／Ｔ）Ｇ等の開始コドンを含まないことが特に好ましい。したがって、好ましくは、人工核酸分子は、任意の上流ＡＵＧ（又はＤＮＡ分子の場合、上流ＡＴＧ）を含まない。言い換えれば、幾つかの実施形態では、オープンリーディングフレームのＡＵＧ又はＡＴＧは、人工核酸分子の唯一の開始コドンであることが好ましい場合がある。
【００９５】
したがって、５’ＵＴＲエレメントは、オープンリーディングフレームを含まないことが好ましい。したがって、好ましくは、人工核酸分子は、上流オープンリーディングフレームを全く含まない。
【００９６】
ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲに由来する核酸配列は、真核生物のＴＯＰ遺伝子、好ましくは植物又は動物のＴＯＰ遺伝子、より好ましくは脊索動物のＴＯＰ遺伝子、更により好ましくは脊椎動物のＴＯＰ遺伝子、最も好ましくは哺乳類のＴＯＰ遺伝子、例えば、ヒト又はマウスのＴＯＰ遺伝子に由来する。
【００９７】
好ましくは、本発明に係る人工核酸分子は、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲに由来するか又はＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなり（前記ＴＯＰ遺伝子は、植物又は動物のＴＯＰ遺伝子、より好ましくは脊椎動物のＴＯＰ遺伝子、更により好ましくは脊椎動物のＴＯＰ遺伝子、最も好ましくは哺乳類のＴＯＰ遺伝子、例えば、ヒト又はマウスのＴＯＰ遺伝子である）、任意で、ヌクレオチド配列Ａ（Ｕ／Ｔ）Ｇを含まず、且つ任意でオープンリーディングフレームを含まない５’ＵＴＲエレメントと；少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と；任意で少なくとも１つのヒストンステムループとを含み、任意で、前記５’ＵＴＲエレメントは、ＴＯＰモチーフを含まず、任意で、前記５’ＵＴＲエレメントは、その５’末端において、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの５’末端オリゴピリミジン領域（ＴＯＰ）の下流の位置１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０に位置するヌクレオチドで始まり、更に任意でＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲに由来する前記５’ＵＴＲエレメントは、その３’末端において、前記遺伝子又はｍＲＮＡが由来する開始コドン（Ａ（Ｕ／Ｔ）Ｇ）の上流の位置１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０に位置するヌクレオチドで終結する。
【００９８】
例えば、５’ＵＴＲエレメントは、配列番号１〜１，３６３、配列番号１，４３５、配列番号１，４６１若しくは配列番号１，４６２；配列番号１〜１，３６３、配列番号１，４３５、配列番号１，４６１若しくは配列番号１，４６２のホモログ；及びこれらの変異体からなる群より選択される核酸配列に由来する核酸配列、又は対応するＲＮＡ配列を含むか又はからなる。「配列番号１〜１，３６３、配列番号１，４３５、配列番号１，４６１又は配列番号１，４６２のホモログ」という用語は、配列番号１〜１，３６３、配列番号１，４３５、配列番号１，４６１又は配列番号１，４６２に係る配列に対して相同性を有するＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）又はＭｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ（マウス）以外の種の配列を指す。例えば、配列番号１は、ヒトアルファ２マクログロブリン（Ａ２Ｍ）の５’ＵＴＲを含む配列に関する。本発明における配列番号１のホモログは、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）以外の種のアルファ２マクログロブリン（Ａ２Ｍ）遺伝子又はｍＲＮＡ、例えば、ヒトアルファ２マクログロブリン（Ａ２Ｍ）遺伝子以外の任意の脊椎動物、好ましくは任意の哺乳類のアルファ２マクログロブリン（Ａ２Ｍ）遺伝子、例えば、マウス、ラット、ウサギ、サル等のアルファ２マクログロブリン（Ａ２Ｍ）遺伝子に由来する任意のかかる配列である。
【００９９】
好ましい実施形態では、５’ＵＴＲエレメントは、配列番号１〜１，３６３、配列番号１，４３５、配列番号１，４６１又は配列番号１，４６２；配列番号１〜１，３６３、配列番号１，４３５、配列番号１，４６１又は配列番号１，４６２のホモログ；及びこれらの変異体から選択される核酸配列、又は対応するＲＮＡ配列の、ヌクレオチド位置５（即ち、前記配列における位置５に位置するヌクレオチド）から（前記配列の３’末端に位置する）開始コドンの直ぐ５’側のヌクレオチド位置（例えば、ＡＴＧ配列の直ぐ５’側のヌクレオチド位置）まで延在する核酸配列に由来する核酸配列を含むか又はからなる。５’ＵＴＲエレメントは、配列番号１〜１，３６３、配列番号１，４３５、配列番号１，４６１又は配列番号１，４６２；配列番号１〜１，３６３、配列番号１，４３５、配列番号１，４６１又は配列番号１，４６２のホモログ；及びこれらの変異体から選択される核酸配列、或いは対応するＲＮＡ配列の、５’−ＴＯＰの直ぐ３’側のヌクレオチド位置から（前記配列の３’末端に位置する）開始コドンの直ぐ５’側のヌクレオチド位置（例えば、ＡＴＧ配列の直ぐ５’側のヌクレオチド位置）まで延在する核酸配列に由来することが特に好ましい。
【０１００】
好ましい実施形態では、５’ＵＴＲエレメントは、配列番号１〜１，３６３、配列番号１，４３５、配列番号１，４６１又は配列番号１，４６２から選択される核酸配列、或いは対応するＲＮＡ配列のヌクレオチド位置５から（前記配列の３’末端に位置する）開始コドンの直ぐ５’側のヌクレオチド位置（例えば、ＡＴＧ配列の直ぐ５’側のヌクレオチド位置）まで延在する核酸配列に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有する核酸配列を含むか又はからなる。或いは、少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメントは、配列番号１〜１，３６３、配列番号１，４３５、配列番号１，４６１又は配列番号１，４６２から選択される核酸配列、或いは対応するＲＮＡ配列のヌクレオチド位置５から（前記配列の３’末端に位置する）開始コドンの直ぐ５’側のヌクレオチド位置（例えば、ＡＴＧ配列の直ぐ５’側のヌクレオチド位置）まで延在する核酸配列に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有する核酸配列の断片を含むか又はからなる。好ましくは、前記断片は、上記の通りである、即ち、前記断片が由来する完全長５’ＵＴＲのうちの少なくとも２０％等を表す連続する一続きのヌクレオチドである。
【０１０１】
好ましくは、５’ＵＴＲエレメントは、配列番号１〜１，３６３、配列番号１，４３５、配列番号１，４６１又は配列番号１，４６２から選択される核酸配列、或いは対応するＲＮＡ配列の、５’ＴＯＰの直ぐ３’側のヌクレオチド位置から（前記配列の３’末端に位置する）開始コドンの直ぐ５’側のヌクレオチド位置、（例えば、ＡＴＧ配列の直ぐ５’側のヌクレオチド位置）まで延在する核酸配列に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有する核酸配列を含むか又はからなる。或いは、少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメントは、配列番号１〜１，３６３、配列番号１，４３５、配列番号１，４６１又は配列番号１，４６２から選択される核酸配列、或いは対応するＲＮＡ配列の、５’ＴＯＰの直ぐ３’側のヌクレオチド位置から（前記配列の３’末端に位置する）開始コドンの直ぐ５’側のヌクレオチド位置（例えば、ＡＴＧ配列の直ぐ５’側のヌクレオチド位置）まで延在する核酸配列に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有する核酸配列の断片を含むか又はからなる。好ましくは、前記断片は、上記の通りである、即ち、前記断片が由来する完全長５’ＵＴＲのうちの少なくとも２０％等を表す連続する一続きのヌクレオチドである。
【０１０２】
好ましくは、配列番号１〜１，３６３、配列番号１，４３５、配列番号１，４６１又は配列番号１，４６２に係る配列の上に定義した断片及び変異体（例えば、少なくとも４０％の同一性を示す）は、本明細書に記載する機能的断片及び変異体である。
【０１０３】
更に、本発明に係る人工核酸分子は、１超の上記５’ＵＴＲエレメントを含んでいてよい。例えば、本発明に係る人工核酸分子は、１個、２個、３個、４個、又はそれ以上の５’ＵＴＲエレメントを含んでいてよく、個々の前記５’ＵＴＲエレメントは、同じであっても異なっていてもよい。例えば、本発明に係る人工核酸分子は、上記の通り２つの本質的に同一の５’ＵＴＲエレメントを含んでいてよく、例えば、２つの５’ＵＴＲエレメントは、配列番号１〜１，３６３、配列番号１，４３５、配列番号１，４６１又は配列番号１，４６２；配列番号１〜１，３６３、配列番号１，４３５、配列番号１，４６１又は配列番号１，４６２のホモログ；及びこれらの変異体からなる群より選択される核酸配列に由来する核酸配列、或いは対応するＲＮＡ配列、或いは上記の通りのこれらの機能的変異体、これらの機能的断片、又はこれらの機能的変異体断片を含むか又はからなる。
【０１０４】
特に好ましい実施形態では、５’ＵＴＲエレメントは、リボソームタンパク質をコードしているＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲ又はリボソームタンパク質をコードしているＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる。特に好ましい５’ＵＴＲエレメントは、ＲＰＳＡ、ＲＰＳ２、ＲＰＳ３、ＲＰＳ３Ａ、ＲＰＳ４、ＲＰＳ５、ＲＰＳ６、ＲＰＳ７、ＲＰＳ８、ＲＰＳ９、ＲＰＳ１０、ＲＰＳ１１、ＲＰＳ１２、ＲＰＳ１３、ＲＰＳ１４、ＲＰＳ１５、ＲＰＳ１５Ａ、ＲＰＳ１６、ＲＰＳ１７、ＲＰＳ１８、ＲＰＳ１９、ＲＰＳ２０、ＲＰＳ２１、ＲＰＳ２３、ＲＰＳ２４、ＲＰＳ２５、ＲＰＳ２６、ＲＰＳ２７、ＲＰＳ２７Ａ、ＲＰＳ２８、ＲＰＳ２９、ＲＰＳ３０、ＲＰＬ３、ＲＰＬ４、ＲＰＬ５、ＲＰＬ６、ＲＰＬ７、ＲＰＬ７Ａ、ＲＰＬ８、ＲＰＬ９、ＲＰＬ１０、ＲＰＬ１０Ａ、ＲＰＬ１１、ＲＰＬ１２、ＲＰＬ１３、ＲＰＬ１３Ａ、ＲＰＬ１４、ＲＰＬ１５、ＲＰＬ１７、ＲＰＬ１８、ＲＰＬ１８Ａ、ＲＰＬ１９、ＲＰＬ２１、ＲＰＬ２２、ＲＰＬ２３、ＲＰＬ２３Ａ、ＲＰＬ２４、ＲＰＬ２６、ＲＰＬ２７、ＲＰＬ２７Ａ、ＲＰＬ２８、ＲＰＬ２９、ＲＰＬ３０、ＲＰＬ３１、ＲＰＬ３２、ＲＰＬ３４、ＲＰＬ３５、ＲＰＬ３５Ａ、ＲＰＬ３６、ＲＰＬ３６Ａ、ＲＰＬ３７、ＲＰＬ３７Ａ、ＲＰＬ３８、ＲＰＬ３９、ＲＰＬ４０、ＲＰＬ４１、ＲＰＬＰ０、ＲＰＬＰ１、ＲＰＬＰ２、ＲＰＬＰ３、ＵＢＡ５２から選択されるリボソームタンパク質をコードしているＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲに由来する核酸配列を含むか又はからなる。脊椎動物のリボソームタンパク質、例えば、哺乳類のリボソームタンパク質（例えば、ヒト又はマウスのリボソームタンパク質）をコードしているＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲに由来する核酸配列が特に好ましい。
【０１０５】
例えば、５’ＵＴＲエレメントは、配列番号１７０、２３２、２４４、２５９、１，２８４、１，２８５、１，２８６、１，２８７、１，２８８、１，２８９、１，２９０、１，２９１、１，２９２、１，２９３、１，２９４、１，２９５、１，２９６、１，２９７、１，２９８、１，２９９、１，３００、１，３０１、１，３０２、１，３０３、１，３０４、１，３０５、１，３０６、１，３０７、１，３０８、１，３０９、１，３１０、１，３１１、１，３１２、１，３１３、１，３１４、１，３１５、１，３１６、１，３１７、１，３１８、１，３１９、１，３２０、１，３２１、１，３２２、１，３２３、１，３２４、１，３２５、１，３２６、１，３２７、１，３２８、１，３２９、１，３３０、１，３３１、１，３３２、１，３３３、１，３３４、１，３３５、１，３３６、１，３３７、１，３３８、１，３３９、１，３４０、１，３４１、１，３４２、１，３４３、１，３４４、１，３４６、１，３４７、１，３４８、１，３４９、１，３５０、１，３５１、１，３５２、１，３５３、１，３５４、１，３５５、１，３５６、１，３５７、１，３５８、１，３５９、若しくは１，３６０のいずれかに係る核酸配列；対応するＲＮＡ配列、これらのホモログ、又は本明細書に記載するこれらの変異体の５’ＵＴＲに由来する核酸配列（好ましくは、５’ＴＯＰモチーフを有しない）を含むか又はからなる。上記の通り、位置５から（前記配列の３’末端に位置する）ＡＴＧの直ぐ５’側のヌクレオチドまで延在する配列は、前記配列の５’ＵＴＲに相当する。
【０１０６】
好ましくは、５’ＵＴＲエレメントは、配列番号１７０、２３２、２４４、２５９、１，２８４、１，２８５、１，２８６、１，２８７、１，２８８、１，２８９、１，２９０、１，２９１、１，２９２、１，２９３、１，２９４、１，２９５、１，２９６、１，２９７、１，２９８、１，２９９、１，３００、１，３０１、１，３０２、１，３０３、１，３０４、１，３０５、１，３０６、１，３０７、１，３０８、１，３０９、１，３１０、１，３１１、１，３１２、１，３１３、１，３１４、１，３１５、１，３１６、１，３１７、１，３１８、１，３１９、１，３２０、１，３２１、１，３２２、１，３２３、１，３２４、１，３２５、１，３２６、１，３２７、１，３２８、１，３２９、１，３３０、１，３３１、１，３３２、１，３３３、１，３３４、１，３３５、１，３３６、１，３３７、１，３３８、１，３３９、１，３４０、１，３４１、１，３４２、１，３４３、１，３４４、１，３４６、１，３４７、１，３４８、１，３４９、１，３５０、１，３５１、１，３５２、１，３５３、１，３５４、１，３５５、１，３５６、１，３５７、１，３５８、１，３５９、若しくは１，３６０のいずれかに係る核酸配列の５’ＵＴＲ、又は対応するＲＮＡ配列（好ましくは、５’ＴＯＰモチーフを有しない）に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有する核酸配列を含むか又はからなる。或いは、少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメントは、配列番号１７０、２３２、２４４、２５９、１，２８４、１，２８５、１，２８６、１，２８７、１，２８８、１，２８９、１，２９０、１，２９１、１，２９２、１，２９３、１，２９４、１，２９５、１，２９６、１，２９７、１，２９８、１，２９９、１，３００、１，３０１、１，３０２、１，３０３、１，３０４、１，３０５、１，３０６、１，３０７、１，３０８、１，３０９、１，３１０、１，３１１、１，３１２、１，３１３、１，３１４、１，３１５、１，３１６、１，３１７、１，３１８、１，３１９、１，３２０、１，３２１、１，３２２、１，３２３、１，３２４、１，３２５、１，３２６、１，３２７、１，３２８、１，３２９、１，３３０、１，３３１、１，３３２、１，３３３、１，３３４、１，３３５、１，３３６、１，３３７、１，３３８、１，３３９、１，３４０、１，３４１、１，３４２、１，３４３、１，３４４、１，３４６、１，３４７、１，３４８、１，３４９、１，３５０、１，３５１、１，３５２、１，３５３、１，３５４、１，３５５、１，３５６、１，３５７、１，３５８、１，３５９、若しくは１，３６０のいずれかに係る核酸配列の５’ＵＴＲ；又は対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有する核酸配列の断片を含むか又はからなる。好ましくは、前記断片は、上記の通りである、即ち、（好ましくは５’ＴＯＰモチーフを有しない）完全長５’ＵＴＲのうちの少なくとも２０％等を表す連続する一続きのヌクレオチドである。好ましくは、前記断片は、少なくとも約２０ヌクレオチド以上、好ましくは少なくとも約３０ヌクレオチド以上、より好ましくは少なくとも約４０ヌクレオチド以上の長さを有する。好ましくは、前記断片は、本明細書に記載する機能的断片である。
【０１０７】
好ましくは、５’ＵＴＲエレメントは、リボソームラージタンパク質（ＲＰＬ）をコードしているＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲ、又はリボソームラージタンパク質（ＲＰＬ）をコードしているＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる。例えば、５’ＵＴＲエレメントは、配列番号６７、２５９、１，２８４〜１，３１８、１，３４４、１，３４６、１，３４８〜１，３５４、１，３５７、１，４６１、及び１，４６２のいずれかに係る核酸配列、対応するＲＮＡ配列、これらのホモログ、又は本明細書に記載するこれらの変異体の５’ＵＴＲに由来する核酸配列（好ましくは、５’ＴＯＰモチーフを有しない）を含むか又はからなる。
【０１０８】
好ましくは、５’ＵＴＲエレメントは、配列番号６７、２５９、１，２８４〜１，３１８、１，３４４、１，３４６、１，３４８〜１，３５４、１，３５７、及び１，３５８のいずれかに係る核酸配列の５’ＵＴＲ、又は対応するＲＮＡ配列（好ましくは、５’ＴＯＰモチーフを有しない）に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有する核酸配列を含むか又はからなる。或いは、少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメントは、配列番号６７、２５９、１，２８４〜１，３１８、１，３４４、１，３４６、１，３４８〜１，３５４、１，３５７、１，４６１、及び１，４６２のいずれかに係る核酸配列の５’ＵＴＲ、又は対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有する核酸配列の断片を含むか又はからなる。好ましくは、前記断片は、上記の通りである、即ち、好ましくは５’ＴＯＰモチーフを有しない完全長５’ＵＴＲのうちの少なくとも２０％等を表す連続する一続きのヌクレオチドである。好ましくは、前記断片は、少なくとも約２０ヌクレオチド以上、好ましくは少なくとも約３０ヌクレオチド以上、より好ましくは少なくとも約４０ヌクレオチド以上の長さを有する。好ましくは、前記断片は、本明細書に記載する機能的断片である。
【０１０９】
特に好ましい実施形態では、５’ＵＴＲエレメントは、リボソームタンパク質ラージ３２遺伝子（ＲＰＬ３２）、リボソームタンパク質ラージ３５遺伝子（ＲＰＬ３５）、リボソームタンパク質ラージ２１遺伝子（ＲＰＬ２１）、ＡＴＰシンターゼ、Ｈ＋輸送、ミトコンドリアＦ１複合体アルファサブユニット１、心筋（ＡＴＰ５Ａ１）遺伝子、ヒドロキシステロイド（１７−ベータ）デヒドロゲナーゼ４遺伝子（ＨＳＤ１７Ｂ４）、アンドロゲン誘導１遺伝子（ＡＩＧ１）、シトクロームｃオキシダーゼサブユニットＶＩｃ遺伝子（ＣＯＸ６Ｃ）、又はＮ−アシルスフィンゴシンアミドヒドロラーゼ（酸性セラミダーゼ）１遺伝子（ＡＳＡＨ１）、又はこれらの変異体；好ましくは、脊椎動物のリボソームタンパク質ラージ３２遺伝子（ＲＰＬ３２）、脊椎動物のリボソームタンパク質ラージ３５遺伝子（ＲＰＬ３５）、脊椎動物のリボソームタンパク質ラージ２１遺伝子（ＲＰＬ２１）、脊椎動物のＡＴＰシンターゼ、Ｈ＋輸送、ミトコンドリアＦ１複合体アルファサブユニット１、心筋（ＡＴＰ５Ａ１）遺伝子、脊椎動物のヒドロキシステロイド（１７−ベータ）デヒドロゲナーゼ４遺伝子（ＨＳＤ１７Ｂ４）、脊椎動物のアンドロゲン誘導１遺伝子（ＡＩＧ１）、脊椎動物のシトクロームｃオキシダーゼサブユニットＶＩｃ遺伝子（ＣＯＸ６Ｃ）、又は脊椎動物のＮ−アシルスフィンゴシンアミドヒドロラーゼ（酸性セラミダーゼ）１遺伝子（ＡＳＡＨ１）、又はこれらの変異体；より好ましくは、哺乳類のリボソームタンパク質ラージ３２遺伝子（ＲＰＬ３２）、リボソームタンパク質ラージ３５遺伝子（ＲＰＬ３５）、リボソームタンパク質ラージ２１遺伝子（ＲＰＬ２１）、哺乳類のＡＴＰシンターゼ、Ｈ＋輸送、ミトコンドリアＦ１複合体アルファサブユニット１、心筋（ＡＴＰ５Ａ１）遺伝子、哺乳類のヒドロキシステロイド（１７−ベータ）デヒドロゲナーゼ４遺伝子（ＨＳＤ１７Ｂ４）、哺乳類のアンドロゲン誘導１遺伝子（ＡＩＧ１）、哺乳類のシトクロームｃオキシダーゼサブユニットＶＩｃ遺伝子（ＣＯＸ６Ｃ）、又は哺乳類のＮ−アシルスフィンゴシンアミドヒドロラーゼ（酸性セラミダーゼ）１遺伝子（ＡＳＡＨ１）、又はこれらの変異体；最も好ましくは、ヒトのリボソームタンパク質ラージ３２遺伝子（ＲＰＬ３２）、ヒトのリボソームタンパク質ラージ３５遺伝子（ＲＰＬ３５）、ヒトのリボソームタンパク質ラージ２１遺伝子（ＲＰＬ２１）、ヒトのＡＴＰシンターゼ、Ｈ＋輸送、ミトコンドリアＦ１複合体アルファサブユニット１、心筋（ＡＴＰ５Ａ１）遺伝子、ヒトのヒドロキシステロイド（１７−ベータ）デヒドロゲナーゼ４遺伝子（ＨＳＤ１７Ｂ４）、ヒトのアンドロゲン誘導１遺伝子（ＡＩＧ１）、ヒトのシトクロームｃオキシダーゼサブユニットＶＩｃ遺伝子（ＣＯＸ６Ｃ）、又はヒトのＮ−アシルスフィンゴシンアミドヒドロラーゼ（酸性セラミダーゼ）１遺伝子（ＡＳＡＨ１）、又はこれらの変異体の５’ＵＴＲに由来する核酸配列を含むか又はからなり、好ましくは、前記５’ＵＴＲエレメントは、前記遺伝子の５’ＴＯＰを含まない。
【０１１０】
したがって、特に好ましい実施形態では、５’ＵＴＲエレメントは、配列番号１，３６８又は配列番号１，４５２〜１，４６０に係る核酸配列、又は対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有する核酸配列を含むか又はからなる。或いは、少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメントは、配列番号１，３６８又は配列番号１，４５２〜１，４６０に係る核酸配列に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有する核酸配列の断片を含むか又はからなる。好ましくは、前記断片は、上記の通りである、即ち、完全長５’ＵＴＲのうちの少なくとも２０％等を表す連続する一続きのヌクレオチドである。好ましくは、前記断片は、少なくとも約２０ヌクレオチド以上、好ましくは少なくとも約３０ヌクレオチド以上、より好ましくは少なくとも約４０ヌクレオチド以上の長さを有する。好ましくは、前記断片は、本明細書に記載する機能的断片である。
【０１１１】
好ましくは、少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメントは、少なくとも約２０ヌクレオチド以上、好ましくは少なくとも約３０ヌクレオチド以上、より好ましくは少なくとも約４０ヌクレオチド以上の長さを有する。しかし、人工核酸分子の５’ＵＴＲエレメントがやや短いことが好ましい場合がある。したがって、約２００ヌクレオチド未満、好ましくは１５０ヌクレオチド未満、より好ましくは１００ヌクレオチド未満の長さを有していてよい。例えば、５’ＵＴＲは、約２５ヌクレオチド未満、約３０ヌクレオチド未満、約３５ヌクレオチド未満、約４０ヌクレオチド未満、約４５ヌクレオチド未満、約５０ヌクレオチド未満、約５５ヌクレオチド未満、約６０ヌクレオチド未満、約６５ヌクレオチド未満、約７０ヌクレオチド未満、約８０ヌクレオチド未満、約８５ヌクレオチド未満、約９０ヌクレオチド未満、約９５ヌクレオチド未満、約１００ヌクレオチド未満、約１０５ヌクレオチド未満、約１１０ヌクレオチド未満、約１１５ヌクレオチド未満、約１２０ヌクレオチド未満、約１２５ヌクレオチド未満、約１３０ヌクレオチド未満、約１３５ヌクレオチド未満、約１４０ヌクレオチド未満、約１４５ヌクレオチド未満、約１５０ヌクレオチド未満、約１５５ヌクレオチド未満、約１６０ヌクレオチド未満、約１６５ヌクレオチド未満、約１７０ヌクレオチド未満、約１７５ヌクレオチド未満、約１８０ヌクレオチド未満、約１８５ヌクレオチド未満、約１９０ヌクレオチド未満、約１９５ヌクレオチド未満、約２００ヌクレオチド未満の長さを有していてよい。好ましくは、５’ＵＴＲエレメントは、約２０ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチド、約２６ヌクレオチド〜約３０ヌクレオチド、約３１ヌクレオチド〜約３５ヌクレオチド、約３６ヌクレオチド〜約４０ヌクレオチド、約４１ヌクレオチド〜約４５ヌクレオチド、約４６ヌクレオチド〜約５０ヌクレオチド、約５１ヌクレオチド〜約５５ヌクレオチド、約５６ヌクレオチド〜約６０ヌクレオチド、約６１ヌクレオチド〜約６５ヌクレオチド、約６６ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチド、約７１ヌクレオチド〜約８０ヌクレオチド、約８１ヌクレオチド〜約８５ヌクレオチド、約８６ヌクレオチド〜約９０ヌクレオチド、約９１ヌクレオチド〜約９５ヌクレオチド、約９６ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、約１０１ヌクレオチド〜約１０５ヌクレオチド、約１０６ヌクレオチド〜約１１０ヌクレオチド、約１１１ヌクレオチド〜約１１５ヌクレオチド、約１１６ヌクレオチド〜約１２０ヌクレオチド、約１２１ヌクレオチド〜約１２５ヌクレオチド、約１２６ヌクレオチド〜約１３０ヌクレオチド、約１３１ヌクレオチド〜約１３５ヌクレオチド、約１３６ヌクレオチド〜約１４０ヌクレオチド、約１４１ヌクレオチド〜約１４５ヌクレオチド、約１４６ヌクレオチド〜約１５０ヌクレオチド、約１５１ヌクレオチド〜約１５５ヌクレオチド、約１５６ヌクレオチド〜約１６０ヌクレオチド、約１６１ヌクレオチド〜約１６５ヌクレオチド、約１６６ヌクレオチド〜約１７０ヌクレオチド、約１７１ヌクレオチド〜約１７５ヌクレオチド、約１７６ヌクレオチド〜約１８０ヌクレオチド、約１８１ヌクレオチド〜約１８５ヌクレオチド、約１８６ヌクレオチド〜約１９０ヌクレオチド、約１９１ヌクレオチド〜約１９５ヌクレオチド、約１９６ヌクレオチド〜約２００ヌクレオチド、又はそれ以上のヌクレオチドの長さを有していてよい。例えば、５’ＵＴＲエレメントは、約２０ヌクレオチド、約２６ヌクレオチド、約３１ヌクレオチド、約３６ヌクレオチド、約４１ヌクレオチド、約４６ヌクレオチド、約５１ヌクレオチド、約５６ヌクレオチド、約６１ヌクレオチド、約６６ヌクレオチド、約７１ヌクレオチド、約８１ヌクレオチド、約８６ヌクレオチド、約９１ヌクレオチド、約９６ヌクレオチド、約１０１ヌクレオチド、約１０６ヌクレオチド、約１１１ヌクレオチド、約１１６ヌクレオチド、約１２１ヌクレオチド、約１２６ヌクレオチド、約１３１ヌクレオチド、約１３６ヌクレオチド、約１４１ヌクレオチド、約１４６ヌクレオチド、約１５１ヌクレオチド、約１５６ヌクレオチド、約１６１ヌクレオチド、約１６６ヌクレオチド、約１７１ヌクレオチド、約１７６ヌクレオチド、約１８１ヌクレオチド、約１８６ヌクレオチド、約１９１ヌクレオチド、又は約１９６ヌクレオチドの長さを有していてよい。好ましくは、５’ＵＴＲエレメントは、約２０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド、又はそれ以上から約２００ヌクレオチド未満の長さを有していてよく、より好ましくは、約２０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド、又はそれ以上から約１５０ヌクレオチド未満の長さを有していてよく、最も好ましくは、約２０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド、又はそれ以上から約１００ヌクレオチド未満の長さを有していてよい。
【０１１２】
好ましい５’ＵＴＲエレメントは、ＲＰＳＡ、ＲＰＳ２、ＲＰＳ３、ＲＰＳ３Ａ、ＲＰＳ４、ＲＰＳ５、ＲＰＳ６、ＲＰＳ７、ＲＰＳ８、ＲＰＳ９、ＲＰＳ１０、ＲＰＳ１１、ＲＰＳ１２、ＲＰＳ１３、ＲＰＳ１４、ＲＰＳ１５、ＲＰＳ１５Ａ、ＲＰＳ１６、ＲＰＳ１７、ＲＰＳ１８、ＲＰＳ１９、ＲＰＳ２０、ＲＰＳ２１、ＲＰＳ２３、ＲＰＳ２４、ＲＰＳ２５、ＲＰＳ２６、ＲＰＳ２７、ＲＰＳ２７Ａ、ＲＰＳ２８、ＲＰＳ２９、ＲＰＳ３０、ＲＰＬ３、ＲＰＬ４、ＲＰＬ５、ＲＰＬ６、ＲＰＬ７、ＲＰＬ７Ａ、ＲＰＬ８、ＲＰＬ９、ＲＰＬ１０、ＲＰＬ１０Ａ、ＲＰＬ１１、ＲＰＬ１２、ＲＰＬ１３、ＲＰＬ１３Ａ、ＲＰＬ１４、ＲＰＬ１５、ＲＰＬ１７、ＲＰＬ１８、ＲＰＬ１８Ａ、ＲＰＬ１９、ＲＰＬ２１、ＲＰＬ２２、ＲＰＬ２３、ＲＰＬ２３Ａ、ＲＰＬ２４、ＲＰＬ２６、ＲＰＬ２７、ＲＰＬ２７Ａ、ＲＰＬ２８、ＲＰＬ２９、ＲＰＬ３０、ＲＰＬ３１、ＲＰＬ３２、ＲＰＬ３４、ＲＰＬ３５、ＲＰＬ３５Ａ、ＲＰＬ３６、ＲＰＬ３６Ａ、ＲＰＬ３７、ＲＰＬ３７Ａ、ＲＰＬ３８、ＲＰＬ３９、ＲＰＬ４０、ＲＰＬ４１、ＲＰＬＰ０、ＲＰＬＰ１、ＲＰＬＰ２、ＲＰＬＰ３、ＲＰＬＰ０、ＲＰＬＰ１、ＲＰＬＰ２、ＥＥＦ１Ａ１、ＥＥＦ１Ｂ２、ＥＥＦ１Ｄ、ＥＥＦ１Ｇ、ＥＥＦ２、ＥＩＦ３Ｅ、ＥＩＦ３Ｆ、ＥＩＦ３Ｈ、ＥＩＦ２Ｓ３、ＥＩＦ３Ｃ、ＥＩＦ３Ｋ、ＥＩＦ３ＥＩＰ、ＥＩＦ４Ａ２、ＰＡＢＰＣ１、ＨＮＲＮＰＡ１、ＴＰＴ１、ＴＵＢＢ１、ＵＢＡ５２、ＮＰＭ１、ＡＴＰ５Ｇ２、ＧＮＢ２Ｌ１、ＮＭＥ２、ＵＱＣＲＢ、又はこれらの変異体から選択されるＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲに由来する。
【０１１３】
幾つかの実施形態では、人工核酸分子は、ＲＰＳＡ、ＲＰＳ２、ＲＰＳ３、ＲＰＳ３Ａ、ＲＰＳ４、ＲＰＳ５、ＲＰＳ６、ＲＰＳ７、ＲＰＳ８、ＲＰＳ９、ＲＰＳ１０、ＲＰＳ１１、ＲＰＳ１２、ＲＰＳ１３、ＲＰＳ１４、ＲＰＳ１５、ＲＰＳ１５Ａ、ＲＰＳ１６、ＲＰＳ１７、ＲＰＳ１８、ＲＰＳ１９、ＲＰＳ２０、ＲＰＳ２１、ＲＰＳ２３、ＲＰＳ２４、ＲＰＳ２５、ＲＰＳ２６、ＲＰＳ２７、ＲＰＳ２７Ａ、ＲＰＳ２８、ＲＰＳ２９、ＲＰＳ３０、ＲＰＬ３、ＲＰＬ４、ＲＰＬ５、ＲＰＬ６、ＲＰＬ７、ＲＰＬ７Ａ、ＲＰＬ８、ＲＰＬ９、ＲＰＬ１０、ＲＰＬ１０Ａ、ＲＰＬ１１、ＲＰＬ１２、ＲＰＬ１３、ＲＰＬ１３Ａ、ＲＰＬ１４、ＲＰＬ１５、ＲＰＬ１７、ＲＰＬ１８、ＲＰＬ１８Ａ、ＲＰＬ１９、ＲＰＬ２１、ＲＰＬ２２、ＲＰＬ２３、ＲＰＬ２３Ａ、ＲＰＬ２４、ＲＰＬ２６、ＲＰＬ２７、ＲＰＬ２７Ａ、ＲＰＬ２８、ＲＰＬ２９、ＲＰＬ３０、ＲＰＬ３１、ＲＰＬ３２、ＲＰＬ３４、ＲＰＬ３５、ＲＰＬ３５Ａ、ＲＰＬ３６、ＲＰＬ３６Ａ、ＲＰＬ３７、ＲＰＬ３７Ａ、ＲＰＬ３８、ＲＰＬ３９、ＲＰＬ４０、ＲＰＬ４１、ＲＰＬＰ０、ＲＰＬＰ１、ＲＰＬＰ２、ＲＰＬＰ３、ＲＰＬＰ０、ＲＰＬＰ１、ＲＰＬＰ２、ＥＥＦ１Ａ１、ＥＥＦ１Ｂ２、ＥＥＦ１Ｄ、ＥＥＦ１Ｇ、ＥＥＦ２、ＥＩＦ３Ｅ、ＥＩＦ３Ｆ、ＥＩＦ３Ｈ、ＥＩＦ２Ｓ３、ＥＩＦ３Ｃ、ＥＩＦ３Ｋ、ＥＩＦ３ＥＩＰ、ＥＩＦ４Ａ２、ＰＡＢＰＣ１、ＨＮＲＮＰＡ１、ＴＰＴ１、ＴＵＢＢ１、ＵＢＡ５２、ＮＰＭ１、ＡＴＰ５Ｇ２、ＧＮＢ２Ｌ１、ＮＭＥ２、ＵＱＣＲＢ又はこれらの変異体から選択される脊椎動物のＴＯＰ遺伝子（例えば、ヒト等の哺乳類のＴＯＰ遺伝子）の５’ＵＴＲに由来する核酸配列を含むか又はからなる５’ＵＴＲエレメントを含み、好ましくは、前記５’ＵＴＲエレメントは、前記遺伝子のＴＯＰモチーフも５’ＴＯＰも含まず、任意で、前記５’ＵＴＲエレメントは、その５’末端において、５’末端オリゴピリミジン領域（ＴＯＰ）の下流の位置１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０に位置するヌクレオチドで始まり、更に、任意で、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲに由来する前記５’ＵＴＲエレメントは、その３’末端において、それが由来する遺伝子の開始コドン（Ａ（Ｕ／Ｔ）Ｇ）の上流の位置１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０に位置するヌクレオチドで終結する。
【０１１４】
特に好ましい実施形態では、人工核酸分子は、ヒストンステムループを更に含む。
【０１１５】
したがって、本発明に係る人工核酸分子は、
ａ．  ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲに由来するか又は上記ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる少なくとも１つの５’−非翻訳領域エレメント（５’ＵＴＲエレメント）と、
ｂ．  少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と
ｃ．  少なくとも１つのヒストンステムループと
を含むことが特に好ましい。
【０１１６】
上記５’ＵＴＲエレメントとヒストンステムループとの組み合わせは、ＲＮＡ分子の翻訳を延長し、且つ強化もする可能性がある特に有益な効果を有し得る。
【０１１７】
本発明では、かかるヒストンステムループは、典型的に、ヒストン遺伝子に由来し、２つの隣接する全体的に又は部分的に逆相補的な配列が分子内塩基対合してステムループを形成したものを含む。ステムループは、一本鎖ＤＮＡ、又はより一般的にはＲＮＡにおいて形成され得る。また、その構造は、ヘアピン又はヘアピンループとして知られており、通常、連続配列内のステム及び（末端）ループからなり、前記ステムは、ステムループ構造のループを構築する一種のスペーサーとしての短い配列によって分断されている２つの隣接する全体的に又は部分的に逆相補的な配列によって形成される。前記２つの隣接する全体的に又は部分的に逆相補的な配列は、例えば、ステムループエレメント、ステム１及びステム２として定義することができる。ステムループは、これら２つの隣接する全体的に又は部分的に逆相補的な配列（例えば、ステムループエレメント、ステム１及びステム２）が互いに塩基対を形成するときに形成されて、連続配列におけるステムループエレメント、ステム１とステム２との間に位置する短い配列によって形成される不対ループを末端に含む二本鎖核酸配列をもたらす。したがって、不対ループは、典型的に、これらステムループエレメントのいずれとも塩基対合することができない核酸の領域を表す。得られるロリポップ形構造は、多くのＲＮＡ二次構造の重要な構成要素である。したがって、ステムループ構造の形成は、得られるステム及びループ領域の安定性に依存し、第１の必要条件は、典型的に、折り重ねられて対合二本鎖を形成することができる配列の存在である。対合ステムループエレメントの安定性は、対合領域の長さ、含まれているミスマッチ又はバルジの数（特に、一続きの長い二本鎖では、少数のミスマッチは典型的に許容可能である）、及び塩基組成によって決定される。本発明では、最適なループ長は、３塩基〜１０塩基、より好ましくは３塩基〜８塩基、３塩基〜７塩基、３塩基〜６塩基、又は更により好ましくは４塩基〜５塩基、最も好ましくは４塩基である。
【０１１８】
好ましくは、少なくとも１つのヒストンステムループは、ＯＲＦに機能的に結合する。これは、少なくとも１つのヒストンステムループが、好ましくは、その機能（例えば、ＯＲＦからのタンパク質産生を増加させたり人工核酸分子を安定化したりする機能）を発揮することができるように人工核酸分子内に位置することを意味する。
【０１１９】
好ましくは、ヒストンステムループは、ＯＲＦの３’側に位置する。例えば、ヒストンステムループは、ＯＲＦの３’末端に直接、又はリンカーを介して（例えば、１以上の制限酵素部位を含む一続きのヌクレオチド（例えば、２ヌクレオチド、４ヌクレオチド、６ヌクレオチド、８ヌクレオチド、１０ヌクレオチド等）を介して）連結され得る。或いは、ヒストンステムループは、３’ＵＴＲエレメント内、又はポリ（Ａ）配列とポリ（Ｃ）配列との間、又はポリ（Ａ）配列及び／若しくはポリ（Ｃ）配列の下流等、ＯＲＦの３’側に位置する他の構造内、又は前記構造の間、又は前記構造の下流に位置してもよい。或いは、ヒストンステムループは、人工核酸分子の３’末端に位置してもよい。用語「３’末端に位置する」は、ヒストンステムループに続いて、３’方向に、例えば、制限酵素で切断した後に残る数個のヌクレオチドが存在する実施形態も含む。
【０１２０】
好ましくは、５’ＵＴＲエレメント及びヒストンステムループは、人工核酸分子のＯＲＦからのタンパク質産生に対して少なくとも相加作用、好ましくは相乗作用を発揮するように選択され、配置される。好ましくは、ＯＲＦからのタンパク質産生は、５’ＵＴＲエレメント及びヒストンステムループによって少なくとも相加的に、好ましくは相乗的に増加する。したがって、ＯＲＦによってコードされているタンパク質（例えば、ルシフェラーゼ等のレポータータンパク質）のタンパク質量は、ＯＲＦの発現開始後（例えば、試験細胞株のトランスフェクション後）の特定の時点において、５’ＵＴＲエレメント及びヒストンステムループのタンパク質産生増加効果が純粋に相加的である場合に予測される量と少なくとも同じであり、好ましくは多い。相加効果、好ましくは相乗効果は、例えば、以下のアッセイによって求めることができる。例えば、ルシフェラーゼ等のレポーター遺伝子をコードしているＯＲＦを含む４つの人工核酸分子（例えば、ｍＲＮＡ）を作製する。即ち、（ｉ）５’ＵＴＲエレメント及びヒストンステムループを有しない（Ｅ０）、（ｉｉ）ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲ又はその変異体に由来する５’ＵＴＲエレメントを含有する（Ｅ１）、（ｉｉｉ）ヒストンステムループを含有する（Ｅ２）、及び（ｉｖ）５’ＵＴＲエレメント及びヒストンステムループの両方を含有する（Ｅ１Ｅ２）人工核酸分子である。前記人工核酸分子に含有されているＯＲＦの発現は、例えば、試験細胞株、例えば、哺乳類細胞株（例えば、ＨＥＬＡ細胞）又は一次細胞（例えば、ＨＤＦ細胞）をトランスフェクトすることによって開始される。発現開始後の特定の時点、例えば、６時間後、２４時間後、４８時間後、及び／又は７２時間後にサンプルを採取し、ＯＲＦによってコードされているタンパク質の種類に応じて、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ又はルシフェラーゼ試験によって、前記人工核酸分子に含有されているＯＲＦの発現によって産生するタンパク質の量を測定する。３’ＵＴＲエレメント及び５’ＵＴＲエレメントの効果が純粋に相加的である場合にコンストラクトＥ１Ｅ２によって得られる発現開始後の特定の時点におけるタンパク質の予測量（ＰＰＡ）は、以下の通り計算することができる：
ＰＰＡｘ＝（Ｅ１ｘ−Ｅ０ｘ）＋（Ｅ２ｘ−Ｅ０ｘ）＋Ｅ０ｘ
Ｅ０は、コンストラクトＥ０（５’ＵＴＲエレメント及びヒストンステムループを有しない）について得られるタンパク質の量であり、Ｅ１は、コンストラクトＥ１について得られるタンパク質の量であり、Ｅ２は、コンストラクトＥ２について得られるタンパク質の量であり、ｘは、発現開始後の時点である。Ｅ１Ｅ２ｘ＝ＰＰＡｘである場合、タンパク質産生増加効果は、相加的であり、Ｅ１Ｅ２ｘ＞ＰＰＡｘである場合、本発明における意味で相乗的である。ここで、Ｅ１Ｅ２ｘは、時点ｘにおいてコンストラクトＥ１Ｅ２から得られるタンパク質の量である。好ましくは、Ｅ１Ｅ２は、発現開始の２４時間後、４８時間後、又は７２時間後等の発現開始後の所与の時点において、ＰＰＡの少なくとも１．０倍、より好ましくは少なくとも１．１倍、より好ましくは少なくとも１．３倍、より好ましくは少なくとも１．５倍、更により好ましくは少なくとも１．７５倍である。
【０１２１】
したがって、好ましい実施形態では、本発明は、（ａ．）ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲに由来するか又は上記ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメントと；（ｂ．）少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と；（ｃ．）本明細書に記載する少なくとも１つのヒストンステムループとを含み、前記ヒストンステムループ及び前記５’ＵＴＲエレメントが、少なくとも相加的に、好ましくは相乗的に作用して、ＯＲＦからのタンパク質産生を増加させ、好ましくは、ＯＲＦの発現開始後の所与の時点、例えば、発現開始の２４時間後、好ましくは４８時間後にＥ１Ｅ２≧ＰＰＡであり、好ましくは、Ｅ１Ｅ２は、少なくともＰＰＡであり、より好ましくは、Ｅ１Ｅ２は、ＰＰＡの少なくとも１．１倍であり、より好ましくは、Ｅ１Ｅ２は、ＰＰＡの少なくとも１．３倍であり、更により好ましくは、Ｅ１Ｅ２は、ＰＰＡの少なくとも１．５倍である（Ｅ１Ｅ２及びＰＰＡは、上記の通りである）人工核酸分子を提供する。
【０１２２】
更に、少なくとも１つのヒストンステムループ及び少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメントは、特定の期間内、例えば、発現開始後２４時間以内、４８時間以内、又は７２時間以内の人工核酸分子からの全タンパク質産生に対して少なくとも相加効果、好ましくは相乗効果を有することが好ましい。相加効果、好ましくは相乗効果は、効果が相加的である場合にＥ１Ｅ２について予測される経時的なタンパク質量の曲線下面積（ＡＵＣ）をＥ１Ｅ２について測定された実際のＡＵＣと比較することを除いて、上記の通り決定することができる。
【０１２３】
本発明の好ましい実施形態では、本発明の人工核酸分子は、（ａ．）上記少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメントと；（ｂ．）少なくとも１つのオープンリーディングフレームと；（ｃ．）好ましくは以下の式（Ｉ）又は（ＩＩ）のうちの少なくとも１つに係る少なくとも１つのヒストンステムループとを含むか又はコードする：
式（Ｉ）（ステム境界エレメントを含まないステムループ配列）：
【化１】
2018007682.tif 000002
式（ＩＩ）（ステム境界エレメントを含むステムループ配列）：
【化２】
2018007682.tif 000003
（式中、
ステム１又はステム２の境界エレメントＮ１−６は、１個〜６個、好ましくは２個〜６個、より好ましくは２個〜５個、更により好ましくは３個〜５個、最も好ましくは４個〜５個、又は５個のＮの連続配列であり、各Ｎは、互いに独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、及びＣから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチドアナログから選択され、
ステム１［Ｎ０−２ＧＮ３−５］は、エレメントステム２に対して逆相補的であるか又は部分的に逆相補的であり、且つ５個〜７個のヌクレオチドの連続配列であり、Ｎ０−２は、０個〜２個、好ましくは０個〜１個、より好ましくは１個のＮの連続配列であり、各Ｎは、互いに独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、及びＣから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチドアナログから選択され、Ｎ３−５は、３個〜５個、好ましくは４個〜５個、より好ましくは４個のＮの連続配列であり、各Ｎは、互いに独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、及びＣから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチドアナログから選択され、Ｇは、グアノシン又はそのアナログであり、任意でシチジン又はそのアナログによって置換されてもよいが、但し、その場合、ステム２におけるその相補的ヌクレオチドであるシチジンも、グアノシンによって置換され、
ループ配列［Ｎ０−４（Ｕ／Ｔ）Ｎ０−４］は、エレメントステム１とステム２との間に位置し、且つ３個〜５個のヌクレオチド、より好ましくは４個のヌクレオチドの連続配列であり、各Ｎ０−４は、互いに独立して、０個〜４個、好ましくは１個〜３個、より好ましくは１個〜２個のＮの連続配列であり、各Ｎは、互いに独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、及びＣから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチドアナログから選択され、Ｕ／Ｔは、ウリジン又は任意でチミジンを表し、
ステム２［Ｎ３−５ＣＮ０−２］は、エレメントステム１に対して逆相補的であるか又は部分的に逆相補的であり、且つ５個〜７個のヌクレオチドの連続配列であり、Ｎ３−５は、３個〜５個、好ましくは４個〜５個、より好ましくは４個のＮの連続配列であり、各Ｎは、互いに独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、及びＣから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチドアナログから選択され、Ｎ０−２は、０個〜２個、好ましくは０個〜１個、より好ましくは１個のＮの連続配列であり、各Ｎは、互いに独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、及びＣから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチドアナログから選択され、Ｃは、シチジン又はそのアナログであり、任意でグアノシン又はそのアナログによって置換されてもよいが、但し、その場合、ステム１におけるその相補的ヌクレオチドであるグアノシンも、シチジンによって置換され、
ステム１及びステム２は、互いに塩基対合して逆相補的配列を形成することができる（前記塩基対合は、例えば、ヌクレオチドＡとＵ／Ｔ又はＧとＣとのワトソン−クリック塩基対合、又は非ワトソン−クリック塩基対合（例えば、ゆらぎ塩基対合、逆ワトソン−クリック塩基対合、フーグスティーン塩基対合、逆フーグスティーン塩基対合）によってステム１とステム２との間で生じ得る）か、或いは、互いに塩基対合して部分的に逆相補的な配列を形成することができる（１つのステムにおける１以上の塩基が、他のステムの逆相補的な配列に対して相補的塩基を有しないことに基づいて、ステム１とステム２との間で不完全な塩基対合が生じ得る）。
【０１２４】
上記に関連して、ゆらぎ塩基対合は、典型的に、２つのヌクレオチド間の非ワトソン−クリック塩基対合である。（用いることができる）本状況における４つの主なゆらぎ塩基対は、グアノシン−ウリジン、イオシン−ウリジン、イオシン−アデノシン、イオシン−シチジン（Ｇ−Ｕ／Ｔ、Ｉ−Ｕ／Ｔ、Ｉ−Ａ、及びＩ−Ｃ）、及びアデノシン−シチジン（Ａ−Ｃ）である。
【０１２５】
したがって、本発明では、ゆらぎ塩基は、上記の通り別の塩基とゆらぎ塩基対を形成する塩基である。したがって、非ワトソン−クリック塩基対合、例えば、ゆらぎ塩基対合は、本発明に係るヒストンステムループ構造のステムにおいて生じ得る。
【０１２６】
上記に関連して、部分的に逆相補的な配列は、ステム１及びステム２の塩基対合によって形成されるステムループ配列のステム構造においてミスマッチを最大２個、好ましくは１個のみ含む。言い換えれば、ステム１及びステム２は、好ましくは、ステム１及びステム２の全配列に亘って互いに（完全な）塩基対合（１００％可能な正確なワトソン−クリック塩基対合又は非ワトソン−クリック塩基対合）を形成して逆相補的な配列を形成することができ、ここで、各塩基は、相補的結合パートナーとして正確なワトソン−クリック塩基ペンダント又は非ワトソン−クリック塩基ペンダントを有する。或いは、ステム１及びステム２は、好ましくは、ステム１及びステム２の全配列に亘って互いに部分的に塩基対合することができ、この場合、１００％可能な正確なワトソン−クリック塩基対合又は非ワトソン−クリック塩基対合のうちの少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、又は約９５％が、前記正確なワトソン−クリック塩基対合又は非ワトソン−クリック塩基対合で占められ、最大約３０％、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％、又は約５％の残りの塩基は、不対である。
【０１２７】
本発明の好ましい実施形態によれば、本明細書に定義する本発明の核酸配列のうちの少なくとも１つのヒストンステムループ配列（ステム境界エレメントを含む）は、約１５ヌクレオチド長〜約４５ヌクレオチド長、好ましくは約１５ヌクレオチド長〜約４０ヌクレオチド長、好ましくは約１５ヌクレオチド長〜約３５ヌクレオチド長、好ましくは約１５ヌクレオチド長〜約３０ヌクレオチド長、更により好ましくは約２０ヌクレオチド長〜約３０ヌクレオチド長、最も好ましくは約２４ヌクレオチド長〜約２８ヌクレオチド長を有する。
【０１２８】
更に、本明細書に定義する本発明の人工核酸分子のうちの少なくとも１つのヒストンステムループ配列（ステム境界エレメントを含まない）は、約１０ヌクレオチド長〜約３０ヌクレオチド長、好ましくは約１０ヌクレオチド長〜約２０ヌクレオチド長、好ましくは約１２ヌクレオチド長〜約２０ヌクレオチド長、好ましくは約１４ヌクレオチド長〜約２０ヌクレオチド長、更により好ましくは約１６ヌクレオチド長〜約１７ヌクレオチド長、最も好ましくは約１６ヌクレオチド長を有し得る。
【０１２９】
好ましくは、本発明の人工核酸分子は、（ａ．）上記少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメントと；少なくとも１つのオープンリーディングフレームと；（ｃ．）以下の式（Ｉａ）又は（ＩＩａ）のうちの少なくとも１つに係る少なくとも１つのヒストンステムループとを含むか又はコードしてよい：
式（Ｉａ）（ステム境界エレメントを含まないステムループ配列）：
【化３】
2018007682.tif 000004
式（ＩＩａ）（ステム境界エレメントを含むステムループ配列）：
【化４】
2018007682.tif 000005
（式中、Ｎ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、及びＵは、上に定義した通りである）。
【０１３０】
好ましくは、本発明の人工核酸分子は、（ａ．）上記少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメントと；少なくとも１つのオープンリーディングフレームと；（ｃ．）以下の式（Ｉｂ）又は（ＩＩｂ）のうちの少なくとも１つに係る少なくとも１つのヒストンステムループとを含むか又はコードしてよい：
式（ＩＩｂ）（ステム境界エレメントを含まないステムループ配列）：
【化５】
2018007682.tif 000006
式（ＩＩｂ）（ステム境界エレメントを含むステムループ配列）：
【化６】
2018007682.tif 000007
（式中、Ｎ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、及びＵは、上に定義した通りである）。
【０１３１】
好ましくは、本発明の人工核酸分子は、（ａ．）上記少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメントと；少なくとも１つのオープンリーディングフレームと；（ｃ．）実施例１に従って作製したヒストンステムループ配列をステムループ構造で及び直鎖配列として示す以下の特定の式（Ｉｃ）〜（Ｉｈ）又は（ＩＩｃ）〜（ＩＩｈ）のうちの少なくとも１つに係る少なくとも１つのヒストンステムループとを含むか又はコードしてよい：
式（Ｉｃ）（ステム境界エレメントを含まない後生動物及び原生動物のヒストンステムループコンセンサス配列）：
【化７】
2018007682.tif 000008
式（ＩＩｃ）（ステム境界エレメントを含む後生動物及び原生動物のヒストンステムループコンセンサス配列）：
【化８】
2018007682.tif 000009
式（Ｉｄ）（ステム境界エレメントを含まない）：
【化９】
2018007682.tif 000010
式（ＩＩｄ）（ステム境界エレメントを含む）：
【化１０】
2018007682.tif 000011
式（Ｉｅ）（ステム境界エレメントを含まない原生動物のヒストンステムループコンセンサス配列）：
【化１１】
2018007682.tif 000012
式（ＩＩｅ）（ステム境界エレメントを含む原生動物のヒストンステムループコンセンサス配列）：
【化１２】
2018007682.tif 000013
式（Ｉｆ）（ステム境界エレメントを含まない後生動物のヒストンステムループコンセンサス配列）：
【化１３】
2018007682.tif 000014
式（ＩＩｆ）（ステム境界エレメントを含む後生動物のヒストンステムループコンセンサス配列）：
【化１４】
2018007682.tif 000015
式（Ｉｇ）（ステム境界エレメントを含まない脊椎動物のヒストンステムループコンセンサス配列）：
【化１５】
2018007682.tif 000016
式（ＩＩｇ）（ステム境界エレメントを含む脊椎動物のヒストンステムループコンセンサス配列）：
【化１６】
2018007682.tif 000017
式（Ｉｈ）（ステム境界エレメントを含まないヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）のヒストンステムループコンセンサス配列）：
【化１７】
2018007682.tif 000018
式（ＩＩｈ）（ステム境界エレメントを含むヒトのヒストンステムループコンセンサス配列）：
【化１８】
2018007682.tif 000019
上記式（Ｉｃ）〜（Ｉｈ）又は（ＩＩｃ）〜（ＩＩｈ）のそれぞれにおいて、Ｎ、Ｃ、Ｇ、Ａ、Ｔ、及びＵは、上に定義した通りであり、各Ｕは、Ｔで置換されてもよく、ステムエレメント１及び２における各（高度に）保存されているＧ又はＣは、その相補的ヌクレオチド塩基であるＣ又はＧで置換されてもよいが、但し、その場合、相当するステムにおける相補的ヌクレオチドも、並行してその相補的ヌクレオチドによって置換され、及び／又はＧ、Ａ、Ｔ、Ｕ、Ｃ、Ｒ、Ｙ、Ｍ、Ｋ、Ｓ、Ｗ、Ｈ、Ｂ、Ｖ、Ｄ、及びＮは、以下の表に定義するヌクレオチド塩基である：
【表１】
2018007682.tif 000020
【０１３２】
これに関連して、本発明の式（Ｉ）又は（Ｉａ）〜（Ｉｈ）又は（ＩＩ）又は（ＩＩａ）〜（ＩＩｈ）のうちの少なくとも１つに係るヒストンステムループ配列は、自然界に存在するヒストンステムループ配列から、より特に好ましくは原生動物又は後生動物のヒストンステムループ配列から、更により特に好ましくは脊椎動物のヒストンステムループ配列から、最も好ましくは哺乳類のヒストンステムループ配列から、特にヒトのヒストンステムループ配列から選択されることが特に好ましい。
【０１３３】
更に好ましくは、本発明の式（Ｉ）又は（Ｉａ）〜（Ｉｈ）又は（ＩＩ）又は（ＩＩａ）〜（ＩＩｈ）のうちの少なくとも１つに係るヒストンステムループ配列は、図１〜５に示す後生動物及び原生動物（図１）、原生動物（図２）、後生動物（図３）、脊椎動物（図４）、及びヒト（図５）における自然界に存在するヒストンステムループ配列のうちの最も頻繁に生じるヌクレオチド、又は最も頻繁に若しくは２番目に頻繁に生じるヌクレオチドを各ヌクレオチド位置に含むヒストンステムループ配列である。これに関連して、全てのヌクレオチドのうちの少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、又は最も好ましくは少なくとも９０％が、自然界に存在するヒストンステムループ配列のうちの最も頻繁に生じるヌクレオチドに相当することが特に好ましい。
【０１３４】
更に好ましくは、本発明の特定の式（Ｉ）又は（Ｉａ）〜（Ｉｈ）のうちの少なくとも１つに係るヒストンステムループ配列は、実施例１に従って作製されるヒストンステムループ配列を表す以下のヒストンステムループ配列又は対応するＲＮＡ配列（ステム境界エレメントを含まない）から選択してよい：
ＶＧＹＹＹＹＨＨＴＨＲＶＶＲＣＢ（式（Ｉｃ）に係る配列番号１，４０３）
ＳＧＹＹＹＴＴＹＴＭＡＲＲＲＣＳ（式（Ｉｃ）に係る配列番号１，４０４）
ＳＧＹＹＣＴＴＴＴＭＡＧＲＲＣＳ（式（Ｉｃ）に係る配列番号１，４０５）
ＤＧＮＮＮＢＮＮＴＨＶＮＮＮＣＨ（式（Ｉｅ）に係る配列番号１，４０６）
ＲＧＮＮＮＹＨＢＴＨＲＤＮＮＣＹ（式（Ｉｅ）に係る配列番号１，４０７）
ＲＧＮＤＢＹＨＹＴＨＲＤＨＮＣＹ（式（Ｉｅ）に係る配列番号１，４０８）
ＶＧＹＹＹＴＹＨＴＨＲＶＲＲＣＢ（式（Ｉｆ）に係る配列番号１，４０９）
ＳＧＹＹＣＴＴＹＴＭＡＧＲＲＣＳ（式（Ｉｆ）に係る配列番号１，４１０）
ＳＧＹＹＣＴＴＴＴＭＡＧＲＲＣＳ（式（Ｉｆ）に係る配列番号１，４１１）
ＧＧＹＹＣＴＴＹＴＨＡＧＲＲＣＣ（式（Ｉｇ）に係る配列番号１，４１２）
ＧＧＣＹＣＴＴＹＴＭＡＧＲＧＣＣ（式（Ｉｇ）に係る配列番号１，４１３）
ＧＧＣＴＣＴＴＴＴＭＡＧＲＧＣＣ（式（Ｉｇ）に係る配列番号１，４１４）
ＤＧＨＹＣＴＤＹＴＨＡＳＲＲＣＣ（式（Ｉｈ）に係る配列番号１，４１５）
ＧＧＣＹＣＴＴＴＴＨＡＧＲＧＣＣ（式（Ｉｈ）に係る配列番号１，４１６）
ＧＧＣＹＣＴＴＴＴＭＡＧＲＧＣＣ（式（Ｉｈ）に係る配列番号１，４１７）
【０１３５】
更に、これに関連して、特定の式（ＩＩ）又は（ＩＩａ）〜（ＩＩｈ）のうちの１つに係る実施例１に従って作製される以下のヒストンステムループ配列（ステム境界エレメントを含む）及び対応するＲＮＡ配列が特に好ましい：
Ｈ＊Ｈ＊ＨＨＶＶＧＹＹＹＹＨＨＴＨＲＶＶＲＣＢＶＨＨ＊Ｎ＊Ｎ＊（式（ＩＩｃ）に係る配列番号１，４１８）
Ｍ＊Ｈ＊ＭＨＭＳＧＹＹＹＴＴＹＴＭＡＲＲＲＣＳＭＣＨ＊Ｈ＊Ｈ＊（式（ＩＩｃ）に係る配列番号１，４１９）
Ｍ＊Ｍ＊ＭＭＭＳＧＹＹＣＴＴＴＴＭＡＧＲＲＣＳＡＣＨ＊Ｍ＊Ｈ＊（式（ＩＩｃ）に係る配列番号１，４２０）
Ｎ＊Ｎ＊ＮＮＮＤＧＮＮＮＢＮＮＴＨＶＮＮＮＣＨＮＨＮ＊Ｎ＊Ｎ＊（式（ＩＩｅ）に係る配列番号１，４２１）
Ｎ＊Ｎ＊ＨＨＮＲＧＮＮＮＹＨＢＴＨＲＤＮＮＣＹＤＨＨ＊Ｎ＊Ｎ＊（式（ＩＩｅ）に係る配列番号１，４２２）
Ｎ＊Ｈ＊ＨＨＶＲＧＮＤＢＹＨＹＴＨＲＤＨＮＣＹＲＨＨ＊Ｈ＊Ｈ＊（式（ＩＩｅ）に係る配列番号１，４２３）
Ｈ＊Ｈ＊ＭＨＭＶＧＹＹＹＴＹＨＴＨＲＶＲＲＣＢＶＭＨ＊Ｈ＊Ｎ＊（式（ＩＩｆ）に係る配列番号１，４２４）
Ｍ＊Ｍ＊ＭＭＭＳＧＹＹＣＴＴＹＴＭＡＧＲＲＣＳＭＣＨ＊Ｈ＊Ｈ＊（式（ＩＩｆ）に係る配列番号１，４２５）
Ｍ＊Ｍ＊ＭＭＭＳＧＹＹＣＴＴＴＴＭＡＧＲＲＣＳＡＣＨ＊Ｍ＊Ｈ＊（式（ＩＩｆ）に係る配列番号１，４２６）
Ｈ＊Ｈ＊ＭＡＭＧＧＹＹＣＴＴＹＴＨＡＧＲＲＣＣＶＨＮ＊Ｎ＊Ｍ＊（式（ＩＩｇ）に係る配列番号１，４２７）
Ｈ＊Ｈ＊ＡＡＭＧＧＣＹＣＴＴＹＴＭＡＧＲＧＣＣＶＣＨ＊Ｈ＊Ｍ＊（式（ＩＩｇ）に係る配列番号１，４２８）
Ｍ＊Ｍ＊ＡＡＭＧＧＣＴＣＴＴＴＴＭＡＧＲＧＣＣＭＣＹ＊Ｍ＊Ｍ＊（式（ＩＩｇ）に係る配列番号１，４２９）
Ｎ＊Ｈ＊ＡＡＨＤＧＨＹＣＴＤＹＴＨＡＳＲＲＣＣＶＨＢ＊Ｎ＊Ｈ＊（式（ＩＩｈ）に係る配列番号１，４３０）
Ｈ＊Ｈ＊ＡＡＭＧＧＣＹＣＴＴＴＴＨＡＧＲＧＣＣＶＭＹ＊Ｎ＊Ｍ＊（式（ＩＩｈ）に係る配列番号１，４３１）
Ｈ＊Ｍ＊ＡＡＡＧＧＣＹＣＴＴＴＴＭＡＧＲＧＣＣＲＭＹ＊Ｈ＊Ｍ＊（式（ＩＩｈ）に係る配列番号１，４３２）
【０１３６】
特に好ましいヒストンステムループ配列は、配列番号１，４３３（ＣＡＡＡＧＧＣＴＣＴＴＴＴＣＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡ）に係る配列又は対応するＲＮＡ配列である。
【０１３７】
したがって、特に好ましい実施形態では、本発明に係る人工核酸分子は、（ａ．）上記少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメントと；（ｂ．）少なくとも１つのオープンリーディングフレームと；（ｃ．）配列番号１，４３３に係る配列又は対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有する配列を含むか又はからなる少なくとも１つのヒストンステムループとを含み、好ましくは、配列番号１，４３３に係る配列又は対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有する配列の位置６、１３、及び２０が、保存されている、即ち、配列番号１，４３３の位置６、１３、及び２０におけるヌクレオチドと同一である。
【０１３８】
更に好ましい実施形態によれば、本発明の人工核酸分子は、特定の式（Ｉ）又は（Ｉａ）〜（Ｉｈ）又は（ＩＩ）又は（ＩＩａ）〜（ＩＩｈ）のうちの少なくとも１つに係るヒストンステムループ配列において１００％保存されている訳ではないヌクレオチド、又は自然界に存在するヒストンステムループ配列に対して少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、又は更により好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を示す少なくとも１つのヒストンステムループ配列を含むか又はコードする。
【０１３９】
更に、本発明に係る人工核酸分子は、１超の本明細書に記載するヒストンステムループを含んでいてよい。例えば、本発明に係る人工核酸分子は、１つ、２つ、３つ、４つ、又はそれ以上のヒストンステムループを含んでいてよく、ここで、個々のヒストンステムループは、同じであっても異なっていてもよい。例えば、本発明に係る人工核酸分子は、２つのヒストンステムループを含んでいてよく、ここで、各ヒストンステムループ配列は、配列番号１，３９１〜１，４３３からなる群より選択され得る。
【０１４０】
特に好ましい実施形態では、本発明は、
ａ．  ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲに由来するか又は上記ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる少なくとも１つの５’−非翻訳領域エレメント（５’ＵＴＲエレメント）と、
ｂ．  少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と、
ｃ．  少なくとも１つのヒストンステムループであって、好ましくは、前記ヒストンステムループの配列が、式（Ｉ）又は（Ｉａ）〜（Ｉｈ）又は（ＩＩ）又は（ＩＩａ）〜（ＩＩｈ）に係る配列からなる群より選択される配列、例えば、配列番号１，３９１〜１，４３３からなる群より選択される配列、好ましくは、配列番号１，４０３〜１，４３３からなる群より選択される配列であるヒストンステムループと
を含む人工核酸分子を提供する。
【０１４１】
したがって、例えば、本発明に係る人工核酸分子は、配列番号１〜１，３６３、配列番号１，４３５、配列番号１，４６１又は配列番号１，４６２からなる群より選択される配列の５’ＵＴＲ、これらのホモログ、これらの変異体、又は対応するＲＮＡ配列に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメントであって、例えば、配列番号１〜１，３６３、配列番号１，４３５、配列番号１，４６１又は配列番号１，４６２から選択される核酸配列、又は対応するＲＮＡ配列のヌクレオチド位置５から（配列の３’末端に位置する）開始コドンの直ぐ５’側のヌクレオチド位置、例えば、ＡＴＧ配列の直ぐ５’側のヌクレオチド位置まで延在する核酸配列に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有する核酸配列を含むか又はからなる５’ＵＴＲエレメントであるか、或いは配列番号１〜１，３６３、配列番号１，４３５、配列番号１，４６１又は配列番号１，４６２から選択される核酸配列、又は対応するＲＮＡ配列（好ましくは、５’ＴＯＰモチーフを有しない）のヌクレオチド位置５から（配列の３’末端に位置する）開始コドンの直ぐ５’側のヌクレオチド位置、例えば、ＡＴＧ配列の直ぐ５’側のヌクレオチド位置まで延在する核酸配列に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有する核酸配列の断片を含むか又はからなる少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメントであり、好ましくは、前記断片が、上記の通り、即ち、前記断片が由来する完全長５’ＵＴＲのうちの少なくとも２０％等を表す連続する一続きのヌクレオチドである５’ＵＴＲエレメントと；（ｂ．）少なくとも１つのオープンリーディングフレームと；（ｃ．）配列番号１，３９１〜１，４３３、好ましくは配列番号１，４０３〜１，４３３からなる群より選択される少なくとも１つのヒストンステムループ配列であって、好ましくは、配列番号１，４３３に係る配列又は対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有する配列を含むか又はからなり、好ましくは、前記配列番号１，４３３に係る配列又は対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有する配列の位置６、１３、及び２０が、保存されている、即ち、配列番号１，４３３の位置６、１３、及び２０におけるヌクレオチドと同一であるヒストンステムループ配列とを含んでよい。
【０１４２】
更に、例えば、本発明に係る人工核酸分子は、リボソームタンパク質をコードしているＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲ又はリボソームタンパク質をコードしているＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、例えば、配列番号１７０、２３２、２４４、２５９、１，２８４、１，２８５、１，２８６、１，２８７、１，２８８、１，２８９、１，２９０、１，２９１、１，２９２、１，２９３、１，２９４、１，２９５、１，２９６、１，２９７、１，２９８、１，２９９、１，３００、１，３０１、１，３０２、１，３０３、１，３０４、１，３０５、１，３０６、１，３０７、１，３０８、１，３０９、１，３１０、１，３１１、１，３１２、１，３１３、１，３１４、１，３１５、１，３１６、１，３１７、１，３１８、１，３１９、１，３２０、１，３２１、１，３２２、１，３２３、１，３２４、１，３２５、１，３２６、１，３２７、１，３２８、１，３２９、１，３３０、１，３３１、１，３３２、１，３３３、１，３３４、１，３３５、１，３３６、１，３３７、１，３３８、１，３３９、１，３４０、１，３４１、１，３４２、１，３４３、１，３４４、１，３４６、１，３４７、１，３４８、１，３４９、１，３５０、１，３５１、１，３５２、１，３５３、１，３５４、１，３５５、１，３５６、１，３５７、１，３５８、１，３５９、又は１，３６０のいずれかに係る核酸配列の５’ＵＴＲに由来する核酸配列、対応するＲＮＡ配列、これらのホモログ、又は本明細書に記載するこれらの変異体を含むか又はからなる５’ＵＴＲエレメントと；配列番号１，３９１〜１，４３３、好ましくは配列番号１，４０３〜１，４３３からなる群より選択される少なくとも１つのヒストンステムループ配列であって、好ましくは、配列番号１，４３３に係る配列、又は対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有する配列を含むか又はからなり、好ましくは、配列番号１，４３３に係る配列又は対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有する配列の位置６、１３、及び２０が、保存されている、即ち、配列番号１，４３３の位置６、１３、及び２０におけるヌクレオチドと同一であるヒストンステムループを含んでいてよい。
【０１４３】
更なる実施形態では、本発明に係る人工核酸分子は、リボソームラージタンパク質をコードしているＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲ又はリボソームラージタンパク質をコードしているＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、例えば、配列番号６７、２５９、１，２８４〜１，３１８、１，３４４、１，３４６、１，３４８〜１，３５４、１，３５７、１，４６１、及び１，４６２のいずれかに係る核酸配列の５’ＵＴＲに由来する核酸配列、対応するＲＮＡ配列、これらのホモログ、又は本明細書に記載するこれらの変異体を含むか又はからなる５’ＵＴＲエレメントと；配列番号１，３９１〜１，４３３、好ましくは配列番号１，４０３〜１，４３３からなる群より選択される少なくとも１つのヒストンステムループ配列であって、好ましくは、配列番号１，４３３に係る配列、又は対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有する配列を含むか又はからなり、好ましくは、配列番号１，４３３に係る配列又は対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有する配列の位置６、１３、及び２０が、保存されている、即ち、配列番号１，４３３の位置６、１３、及び２０におけるヌクレオチドと同一であるヒストンステムループを含んでいてよい。
【０１４４】
好ましい例として、本発明に係る人工核酸分子は、配列番号１，３６８又は１，４５２〜１，４６０に係る核酸配列に対して少なくとも約９０％、好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有する核酸配列を含むか又はからなる５’ＵＴＲエレメントと；配列番号１，４０３〜１，４３３からなる群より選択されるヒストンステムループ配列、例えば、配列番号１，４３３に係るヒストンステムループ配列であるか、或いは配列番号１，４３３に係る配列又は対応するＲＮＡ配列に対して約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有する配列を含むか又はからなり、且つ配列番号１，４３３に係る配列又は対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有する配列の位置６、１３、及び２０が、保存されている、即ち、配列番号１，４３３の位置６、１３、及び２０におけるヌクレオチドと同一であるヒストンステムループ配列とを含んでいてよい。
幾つかの実施形態では、要素（ｃ．）に係るヒストンステムループ配列は、マウスヒストン遺伝子、例えば、マウスヒストン遺伝子Ｈ２Ａ６１４には由来しない。１つの実施形態では、本発明の人工核酸分子は、マウスヒストンステムループ配列もマウスヒストン遺伝子Ｈ２Ａ６１４も含有しない。更に、１つの実施形態では、本発明の人工核酸分子は、ステムループプロセシングシグナル、より具体的には、マウスヒストンプロセシングシグナル、最も具体的には、マウスヒストンステムループプロセシングシグナルＨ２ｋＡ６１４を含有しない。また、１つの実施形態では、本発明の核酸分子は、少なくとも１つの哺乳類ヒストン遺伝子を含有していてよい。しかし、１つの実施形態では、少なくとも１つの哺乳類ヒストン遺伝子は、国際特許公開第０１／１，２８２４号パンフレットに記載の配列番号７ではない。
【０１４５】
好ましくは、本発明の人工核酸分子は、ヒストン下流要素（ＨＤＥ）を含まない。
【０１４６】
用語「ヒストン下流要素（ＨＤＥ）」は、ヒストンプレｍＲＮＡの成熟ヒストンｍＲＮＡへのプロセシングに関与するＵ７ｓｎＲＮＡの結合部位を表す、自然界に存在するヒストンステムループの３’側における約１５個〜約２０個のヌクレオチドの一続きのプリンリッチポリヌクレオチドを指す。例えばウニでは、ＨＤＥは、ＣＡＡＧＡＡＡＧＡである（Ｄｏｍｉｎｓｋｉ，Ｚ．ａｎｄ  Ｗ．Ｆ．Ｍａｒｚｌｕｆｆ（２００７），Ｇｅｎｅ３９６（２）：３７３−９０）。
【０１４７】
好ましくは、本発明に係る人工核酸分子は、ポリ（Ａ）配列又はポリ（Ａ）シグナルを更に含む。
【０１４８】
したがって、本発明の人工核酸分子は、（ａ．）上記少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメントと、（ｂ．）好ましくはペプチド又はタンパク質をコードしている少なくとも１つのオープンリーディングフレームと、（ｃ．）本明細書に記載する少なくとも１つのヒストンステムループと、（ｄ．）ポリ（Ａ）配列又はポリアデニル化シグナルとを含むか又はコードする。
【０１４９】
ポリアデニル化シグナルは、本明細書では、特定のタンパク質因子（例えば、切断及びポリアデニル化特異性因子（ＣＰＳＦ）、切断刺激因子（ＣｓｔＦ）、切断因子Ｉ及びＩＩ（ＣＦＩ及びＣＦＩＩ）、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ（ＰＡＰ））によって（転写された）ｍＲＮＡをポリアデニル化するシグナルであると定義される。
【０１５０】
好ましくは、ポリアデニル化シグナルは、コンセンサス配列ＮＮ（Ｕ／Ｔ）ＡＮＡ（Ｎは、Ａ又はＵである）、好ましくはＡＡ（Ｕ／Ｔ）ＡＡＡ又はＡ（Ｕ／Ｔ）（Ｕ／Ｔ）ＡＡＡを含む。このようなコンセンサス配列は、大部分の動物及び細菌の細胞系によって、例えば、ＣｓｔＦ、ＰＡＰ、ＰＡＢ２、ＣＦＩ及び／又はＣＦＩＩと協働する切断／ポリアデニル化特異性因子（ＣＰＳＦ）等のポリアデニル化因子によって認識され得る。ポリアデニル化シグナルは、好ましくは、上記機構が人工核酸分子のポリアデニル化に影響を及ぼすことができるように、人工核酸分子内に位置する。例えば、ポリアデニル化シグナルは、人工核酸分子の３’末端の約５０ヌクレオチド未満上流、より好ましくは約３０ヌクレオチド未満上流、最も好ましくは約２５ヌクレオチド未満上流、例えば、２１ヌクレオチド上流に位置してよい。
【０１５１】
ポリアデニル化シグナルに加えて又はポリアデニル化シグナルに代えて、幾つかの実施形態では、本発明に係る人工核酸分子は、ポリ（Ａ）配列を更に含んでいてよい。ポリ（Ａ）配列の長さは、変動してよい。例えば、ポリ（Ａ）配列は、約２０アデノシンヌクレオチド〜約４００アデノシンヌクレオチド、例えば、約２０アデノシンヌクレオチド〜約３００アデノシンヌクレオチド、好ましくは、約４０〜約２００アデノシンヌクレオチド、より好ましくは、約５０アデノシンヌクレオチド〜約１００アデノシンヌクレオチド、例えば、約６０アデノシンヌクレオチド、約７０アデノシンヌクレオチド、約８０アデノシンヌクレオチド、約９０アデノシンヌクレオチド、又は約１００アデノシンヌクレオチドの長さを有してよい。約という用語は、±１０％のぶれを指す。
【０１５２】
ポリ（Ａ）配列は、好ましくは、ＯＲＦの３’側に位置する。例えば、ポリ（Ａ）配列は、ＯＲＦの３’末端に直接、又はリンカーを介して、例えば、１以上の制限酵素部位を含む１ヌクレオチド〜５０ヌクレオチド、好ましくは１ヌクレオチド〜２０ヌクレオチドのリンカー等、２ヌクレオチド、４ヌクレオチド、６ヌクレオチド、８ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、２０ヌクレオチド等の一続きのヌクレオチドを介して連結してよい。或いは、ポリ（Ａ）配列は、ＯＲＦの３’側に位置する他の構造内、又は前記構造の間、又は前記構造の下流、例えば、３’ＵＴＲエレメントとポリ（Ｃ）配列との間、又は３’ＵＴＲエレメント及び／若しくはポリ（Ｃ）配列の下流に位置してもよい。或いは、ポリ（Ａ）配列は、人工核酸分子の３’末端に位置してもよい。用語「３’末端に位置する」は、ポリ（Ａ）配列に続いて、３’方向に、例えば、制限酵素で切断した後に残る数個のヌクレオチドが存在する実施形態も含む。
【０１５３】
本発明の人工核酸分子は、５’から３’方向に以下を含むか、又は５’から３’方向に以下をコードすることが特に好ましい：
（ａ．）本明細書に記載するＴＯＰ遺伝子に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメントと、
（ｂ．）好ましくはペプチド又はタンパク質をコードしている少なくとも１つのオープンリーディングフレームと、
（ｃ．）本明細書に記載する、任意でヒストンステムループの３’側にヒストン下流要素を含まない少なくとも１つのヒストンステムループと、
（ｄ．）ポリ（Ａ）配列及び／又はポリアデニル化シグナル。
【０１５４】
別の特に好ましい実施形態では、本発明に係る本発明の核酸分子は、５’から３’方向に以下を含むか、又は５’から３’方向に以下をコードする：
（ａ．）上記ＴＯＰ遺伝子に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメントと、
（ｂ．）好ましくはペプチド又はタンパク質をコードしている少なくとも１つのオープンリーディングフレームと、
（ｄ．）ポリ（Ａ）配列と、
（ｃ．）本明細書に記載する少なくとも１つのヒストンステムループ。
【０１５５】
したがって、本発明に係る人工核酸分子のポリ（Ａ）配列及びヒストンステムループは、５’から３’に向かって任意の所望の順序で配置してよい。特に、ポリ（Ａ）配列は、ヒストンステムループの３’と同様に５’側に位置してもよい。
【０１５６】
したがって、１つの実施形態では、本発明に係る人工核酸分子は、以下を含む：
（ａ．）ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲに由来するか又はＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる少なくとも１つの５’−非翻訳領域エレメント（５’ＵＴＲエレメント）と；
（ｂ．）少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と；
（ｃ．）ヒストンステムループと；
（ｄ．）ポリ（Ａ）配列及び／又はポリアデニル化シグナルであって、前記ポリ（Ａ）配列が、前記ヒストンステムループの５’側又は３’側に位置するポリ（Ａ）配列及び／又はポリアデニル化シグナル。
【０１５７】
更に好ましい実施形態では、本発明に係る人工核酸分子は、ポリ（Ｃ）配列を更に含む。本発明におけるポリ（Ｃ）配列は、好ましくは約１０シチジンヌクレオチド〜約２００シチジンヌクレオチド、より好ましくは約１０シチジンヌクレオチド〜約１００シチジンヌクレオチド、より好ましくは約１０シチジンヌクレオチド〜約５０シチジンヌクレオチド、更により好ましくは約２０シチジンヌクレオチド〜約４０シチジンヌクレオチド、例えば、約２０シチジンヌクレオチド、約２５シチジンヌクレオチド、約３０シチジンヌクレオチド、約３５シチジンヌクレオチド、約４０シチジンヌクレオチド、好ましくは約３０シチジンヌクレオチドからなる。ポリ（Ｃ）配列は、好ましくは、人工核酸分子のＯＲＦの３’側に位置する。例えば、ポリ（Ｃ）配列は、ＯＲＦの３’末端に直接、又は例えば、１以上の制限酵素部位を含む１ヌクレオチド〜５０ヌクレオチド、好ましくは１ヌクレオチド〜２０ヌクレオチドのリンカー等、２ヌクレオチド、４ヌクレオチド、６ヌクレオチド、８ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、２０ヌクレオチド等の一続きのヌクレオチドのリンカーを介して連結してよい。或いは、ポリ（Ｃ）配列は、ＯＲＦの３’側に位置する任意の他の構造内、又は前記構造の間、又は前記構造の下流に位置してもよい。例えば、ポリ（Ｃ）配列は、３’ＵＴＲエレメントの一部であってもよく、ポリ（Ａ）配列とヒストンステムループとの間に位置してもよい。或いは、ポリ（Ｃ）配列は、人工核酸分子の３’末端に位置してもよい。用語「３’末端に位置する」は、ポリ（Ｃ）配列に続いて、３’方向に、例えば、制限酵素で切断した後に残る数個のヌクレオチドが存在する実施形態も含む。特に好ましい実施形態では、ポリ（Ｃ）配列は、ポリ（Ａ）配列とヒストンステムループとの間に位置する。
【０１５８】
特に好ましい実施形態では、ポリ（Ｃ）配列は、ヒストンステムループの５’側に位置する。
【０１５９】
したがって、特に好ましい実施形態では、本願に係る人工核酸分子は、以下の構造：５’−［ＯＲＦ］−［任意のリンカー］−［３’ＵＴＲエレメント］−［任意のリンカー］−［ポリ（Ａ）配列］−［任意のリンカー］−［ポリ（Ｃ）配列］−［任意のリンカー］−［ヒストンステムループ］−３’（任意のリンカーは、互いに独立して、存在していても存在していなくてもよく、また、例えば、１以上の制限酵素部位を含む一続きの１ヌクレオチド〜５０ヌクレオチドであってよい）を含む。
【０１６０】
更なる実施形態では、本発明に係る人工核酸分子は、３’ＵＴＲエレメントを更に含む。したがって、幾つかの実施形態では、本発明に係る人工核酸分子は、少なくとも１つの上記５’ＵＴＲエレメントと、少なくとも１つのオープンリーディングフレームと、少なくとも１つの上記ヒストンステムループと、少なくとも１つの上記３’ＵＴＲエレメントとを含んでいてよい。更に、幾つかの実施形態では、本発明に係る人工核酸分子は、少なくとも１つの上記５’ＵＴＲエレメントと、少なくとも１つのオープンリーディングフレームと、少なくとも１つの上記ヒストンステムループと、少なくとも１つの上記３’ＵＴＲエレメントと、本明細書に記載するポリ（Ａ）配列及び／又はポリアデニル化シグナルとを含んでいてよい。幾つかの実施形態では、ヒストンステムループは、３’ＵＴＲエレメントの一部であってよい。
【０１６１】
用語「３’ＵＴＲエレメント」は、３’ＵＴＲ又は３’ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる核酸配列を指す。本発明の意味における３’ＵＴＲエレメントは、例えば、人工核酸分子がｍＲＮＡである場合、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲを表してもよく、或いは、転写されたときに転写産物（例えば、ｍＲＮＡ）の３’ＵＴＲを表す核酸コンストラクト（例えば、ベクターコンストラクト）における配列を表してもよい。したがって、本発明の意味において、好ましくは、３’ＵＴＲエレメントは、ｍＲＮＡ（好ましくは、人工ｍＲＮＡ）の３’ＵＴＲであってもよく、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲの転写テンプレートであってもよい。したがって、３’ＵＴＲエレメントは、好ましくは、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲ、好ましくは人工ｍＲＮＡ（例えば、遺伝的に改変されているベクターコンストラクトの転写によって得られるｍＲＮＡ）の３’ＵＴＲに相当する核酸配列である。好ましくは、３’ＵＴＲエレメントは、３’ＵＴＲの機能を発揮するか、又は３’ＵＴＲの機能を発揮する配列をコードしている。用語「３’ＵＴＲエレメント」は、更に、人工核酸配列（例えば、人工ｍＲＮＡ）の３’ＵＴＲの断片若しくは一部を指すか、又は人工核酸分子の３’ＵＴＲの一部若しくは断片をコードしているものを指す。これは、本発明の意味における３’ＵＴＲエレメントが、人工核酸配列（例えば、人工ｍＲＮＡ）の３’ＵＴＲ、又は人工核酸分子の３’ＵＴＲをコードしているものに含まれ得ることを意味する。
【０１６２】
本発明において、３’ＵＴＲエレメントは、遺伝子の任意の遺伝子の３’ＵＴＲ又はその変異体、例えば、本発明に係る人工核酸分子のＯＲＦに自然界で連結している３’ＵＴＲ、又は自然界に存在する遺伝子若しくはその変異体の任意の他の３’ＵＴＲに由来していてよい。
【０１６３】
好ましくは、３’ＵＴＲエレメントは、ＯＲＦに機能的に連結している。これは、好ましくは、例えば、ＯＲＦの発現に対する安定化機能又は人工核酸分子に対する安定化機能等の機能を発揮することができるように、３’ＵＴＲエレメントがＯＲＦに連結していることを意味する。好ましくは、ＯＲＦと３’ＵＴＲエレメントとは、５’→３’方向に連結する。したがって、好ましくは、人工核酸分子は、以下の構造：５’−ＯＲＦ−（任意の）リンカー−３’ＵＴＲエレメント−３’（リンカーは、存在していても存在していなくてもよい）を含む。例えば、リンカーは、例えば、１以上の制限酵素認識部位（制限酵素部位）を含むか又はからなる一続きの１ヌクレオチド〜５０ヌクレオチド又は１ヌクレオチド〜２０ヌクレオチド等、１以上のヌクレオチドであってよい。
【０１６４】
好ましくは、少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント及び少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメントは、ＯＲＦに機能的に連結している。これは、好ましくは、ＯＲＦの発現に対する安定化機能、ＯＲＦによってコードされているタンパク質のタンパク質産生増加機能、又は人工核酸分子に対する安定化機能等の機能を好ましくは相加的に、より好ましくは相乗的に発揮することができるように、５’ＵＴＲエレメント及び３’ＵＴＲエレメントがＯＲＦに連結していることを意味する。好ましくは、５’ＵＴＲエレメント、ＯＲＦ、及び３’ＵＴＲエレメントは、５’→３’方向に連結する。したがって、好ましくは、人工核酸分子は、以下の構造：５’−５’ＵＴＲエレメント−（任意の）リンカー−ＯＲＦ−（任意の）リンカー−３’ＵＴＲエレメント−３’（リンカーは、存在していても存在していなくてもよい）を含む。例えば、リンカーは、例えば、１以上の制限酵素認識部位（制限酵素部位）を含むか又はからなる一続きの１ヌクレオチド〜５０ヌクレオチド又は１ヌクレオチド〜２０ヌクレオチド等、１以上のヌクレオチドであってよい。
【０１６５】
特に好ましい実施形態では、５’ＵＴＲエレメントと３’ＵＴＲエレメントとは、異種であり、例えば、好ましくは、５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲは、同じ種の異なる遺伝子又は異なる種の異なる遺伝子に由来する。好ましくは、３’ＵＴＲは、５’ＵＴＲが由来するＴＯＰ遺伝子には由来しない。
【０１６６】
好ましい実施形態では、３’ＵＴＲエレメントは、人工核酸分子のＯＲＦからのタンパク質産生に対して５’ＵＴＲエレメントと少なくとも相加的、好ましくは相乗的に機能を発揮することができるように選択される。好ましくは、前記タンパク質産生は、３’ＵＴＲエレメント及び５’ＵＴＲエレメントによって少なくとも相加的、好ましくは相乗的に増加する。したがって、ＯＲＦによってコードされているタンパク質（例えば、ルシフェラーゼ等のレポータータンパク質）のタンパク質量は、ＯＲＦの発現開始後、例えば、試験細胞又は試験細胞株のトランスフェクション後の特定の時点において、３’ＵＴＲエレメント及び５’ＵＴＲエレメントのタンパク質産生増加効果が純粋に相加的である場合に予測される量と少なくとも同じであり、好ましくはそれよりも多い。相加効果、好ましくは相乗効果は、例えば、以下のアッセイによって求めることができる。例えば、ルシフェラーゼ等のレポーター遺伝子をコードしているＯＲＦを含む４つの人工核酸分子（例えば、ｍＲＮＡ）、即ち、（ｉ）ＵＴＲエレメントを有しない（Ｅ０）、（ｉｉ）ＴＯＰ遺伝子又はその変異体の５’ＵＴＲに由来する５’ＵＴＲエレメントを含有する（Ｅ１）、（ｉｉｉ）試験３’ＵＴＲエレメントを含有する（Ｅ２）、及び（ｉｖ）５’ＵＴＲエレメント及び試験３’ＵＴＲエレメントの両方を含有する（Ｅ１Ｅ２）人工核酸分子を作製する。人工核酸分子に含有されるＯＲＦの発現は、例えば、試験細胞株、例えば、哺乳類細胞株（例えば、ＨＥＬＡ細胞）又は一次細胞（例えば、ＨＤＦ細胞）をトランスフェクトすることによって開始される。発現開始後の特定の時点、例えば、６時間後、２４時間後、４８時間後、及び７２時間後にサンプルを採取し、ＯＲＦによってコードされているタンパク質の種類に応じて、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ又はルシフェラーゼ試験によって、人工核酸分子に含有されているＯＲＦの発現によって産生されるタンパク質の量を測定する。３’ＵＴＲエレメント及び５’ＵＴＲエレメントの効果が純粋に相加的である場合にコンストラクトＥ１Ｅ２によって得られる発現開始後の特定の時点におけるタンパク質の予測量（ＰＰＡ）は、以下の通り計算することができる：
ＰＰＡｘ＝（Ｅ１ｘ−Ｅ０ｘ）＋（Ｅ２ｘ−Ｅ０ｘ）＋Ｅ０ｘ
Ｅ０は、コンストラクトＥ０（ＵＴＲを有しない）について得られるタンパク質の量であり、Ｅ１は、コンストラクトＥ１について得られるタンパク質の量であり、Ｅ２は、コンストラクトＥ２について得られるタンパク質の量であり、ｘは、発現開始後の時点である。Ｅ１Ｅ２ｘ＝ＰＰＡｘである場合、タンパク質産生増加効果は、相加的であり、Ｅ１Ｅ２ｘ＞ＰＰＡｘである場合、本発明における意味で相乗的である。ここで、Ｅ１Ｅ２ｘは、時点ｘにおいてコンストラクトＥ１Ｅ２から得られるタンパク質の量である。好ましくは、Ｅ１Ｅ２は、発現開始の２４時間後、４８時間後、又は７２時間後等の発現開始後の所与の時点において、ＰＰＡの少なくとも１．０倍、より好ましくは少なくとも１．１倍、より好ましくは少なくとも１．３倍、より好ましくは少なくとも１．５倍、更により好ましくは少なくとも１．７５倍である。
【０１６７】
したがって、好ましい実施形態では、本発明は、（ａ．）ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲに由来するか又はＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる、少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメントと；（ｂ．）少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と；（ｃ．）少なくとも１つのヒストンステムループ及び少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメントとを含み、好ましくは、前記３’ＵＴＲエレメント及び前記５’ＵＴＲエレメントが、少なくとも相加的に、好ましくは相乗的に作用して、ＯＲＦからのタンパク質産生を増加させ、好ましくは、ＯＲＦの発現開始後の所与の時点、例えば、発現開始の２４時間後、好ましくは４８時間後にＥ１Ｅ２≧ＰＰＡであり、好ましくは、Ｅ１Ｅ２が、ＰＰＡの少なくとも１．０倍であり、より好ましくは、Ｅ１Ｅ２が、ＰＰＡの少なくとも１．１倍であり、より好ましくは、Ｅ１Ｅ２が、ＰＰＡの少なくとも１．３倍であり、更により好ましくは、Ｅ１Ｅ２が、ＰＰＡの少なくとも１．５倍である（Ｅ１Ｅ２及びＰＰＡは、上記の通りである）人工核酸分子を提供する。
【０１６８】
更に、３’ＵＴＲエレメント及び５’ＵＴＲエレメントは、特定の期間内、例えば、発現開始後２４時間以内、４８時間以内、又は７２時間以内の人工核酸分子からの全タンパク質産生に対して少なくとも相加効果、好ましくは相乗効果を有することが好ましい。相加効果又は相乗効果は、効果が相加的である場合にＥ１Ｅ２について予測される経時的なタンパク質量の曲線下面積（ＡＵＣ）をＥ１Ｅ２について測定された実際のＡＵＣと比較することを除いて、上記の通り決定することができる。
【０１６９】
好ましい実施形態では、３’ＵＴＲエレメントは、安定なｍＲＮＡの３’ＵＴＲ、又は安定なｍＲＮＡの３’ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる。したがって、好ましい実施形態では、３’ＵＴＲエレメントは、安定なｍＲＮＡを提供する遺伝子又は安定なｍＲＮＡを提供する遺伝子の３’ＵＴＲの変異体に由来する配列を含むか又はからなる。用語「安定なｍＲＮＡ」は、好ましくは、哺乳類細胞において、哺乳類細胞におけるｍＲＮＡ分子の平均半減期よりも長い半減期を示すｍＲＮＡを指す。好ましくは、本願の意味における安定なｍＲＮＡは、好ましくはアクチノマイシンＤ等の転写阻害剤を用いて測定したとき、哺乳類細胞（例えば、ＨＥＬＡ細胞等の哺乳類細胞株）又は一次細胞（例えば、ＨＤＦ細胞）において、５時間超、好ましくは８時間超の半減期を示すｍＲＮＡを指す。
【０１７０】
例えば、哺乳類細胞（例えば、ＨＥＬＡ細胞又はＨＤＦ細胞）におけるｍＲＮＡの半減期は、例えば、アクチノマイシンＤ、５，６−ジクロロ−１−β−Ｄ−リボフラノシルベンズイミダゾール（ＤＲＢ）又はα−アマニチン等の転写阻害剤の存在下で細胞を培養し、転写阻害後の様々な時点において前記細胞を回収し、例えば、定量ＲＴ−ＰＣＲ等の当業者に周知の方法によって前記細胞サンプル中に存在するｍＲＮＡの量を測定することによって求めることができる。特定のｍＲＮＡの半減期は、転写阻害後の様々な時点で測定した前記特定のｍＲＮＡの量に基づいて計算することができる。或いは、哺乳類細胞におけるｍＲＮＡの半減期を求めるために、例えば、放射活性標識されたヌクレオチドを用いるパルスチェイス法又は誘導可能なプロモーターを含むコンストラクトを用いてもよい。
【０１７１】
本発明の意味における安定なｍＲＮＡの安定性強化は、その３’ＵＴＲによって影響を受けることが特に好ましい。したがって、好ましくは、３’ＵＴＲエレメントは、好ましくはアクチノマイシンＤ等の転写阻害剤を用いて測定したとき、哺乳類細胞（例えば、ＨＥＬＡ細胞等の哺乳類細胞株）又は哺乳類一次細胞（例えば、ＨＤＦ細胞）において、５時間超、好ましくは８時間超の半減期を示す安定なｍＲＮＡの３’ＵＴＲに由来する核酸配列を含むか又はからなり、前記安定なｍＲＮＡの安定性強化は、その３’ＵＴＲによって影響を受ける。安定性を強化する３’ＵＴＲの能力は、例えば、レポーターオープンリーディングフレーム（例えば、ルシフェラーゼをコードしているオープンリーディングフレーム）を用いることによって、本明細書に記載する通り試験することができる。或いは、試験用の安定なｍＲＮＡをコードしている人工コンストラクトであって、前記安定なｍＲＮＡの３’ＵＴＲが、短命ｍＲＮＡの３’ＵＴＲ（例えば、Ｍｙｃの３’ＵＴＲ）等のレファレンス３’ＵＴＲで置換されているコンストラクトを作製してよい。野生型の安定なｍＲＮＡ及び３’ＵＴＲが改変されているｍＲＮＡの安定性は、上記の通り決定することができる。３’ＵＴＲが改変されているｍＲＮＡが、野生型の安定なｍＲＮＡよりも短い半減期を示す場合、安定なｍＲＮＡの３’ＵＴＲによって安定性強化効果が発揮されたと結論付けてよい。
【０１７２】
特に好ましい実施形態では、３’ＵＴＲエレメントは、アルブミン遺伝子、α−グロビン遺伝子、β−グロビン遺伝子、チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子、リポキシゲナーゼ遺伝子、及びコラーゲンアルファ遺伝子（例えば、コラーゲンアルファ１（Ｉ）遺伝子）からなる群より選択される遺伝子の３’ＵＴＲ、又はアルブミン遺伝子、α−グロビン遺伝子、β−グロビン遺伝子、チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子、リポキシゲナーゼ遺伝子、及びコラーゲンアルファ遺伝子（例えば、コラーゲンアルファ１（Ｉ）遺伝子）からなる群より選択される遺伝子の３’ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる。特に好ましい実施形態では、３’ＵＴＲエレメントは、アルブミン遺伝子、好ましくは脊椎動物のアルブミン遺伝子、より好ましくは哺乳類のアルブミン遺伝子、最も好ましくはヒトのアルブミン遺伝子の３’ＵＴＲに由来する核酸配列を含むか又はからなる。別の特に好ましい実施形態では、３’ＵＴＲエレメントは、α−グロビン遺伝子、好ましくは脊椎動物のα−グロビン遺伝子、より好ましくは哺乳類のα−グロビン遺伝子、最も好ましくはヒトのα−グロビン遺伝子の３’ＵＴＲに由来する核酸配列を含むか又はからなる。例えば、３’ＵＴＲエレメントは、α−グロビン遺伝子、例えば、ヒトのα−グロビン遺伝子の３’ＵＴＲの中央のα複合体結合部分を含んでいてもよく又はからなっていてもよい。
【０１７３】
好ましくは、少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメントは、脊椎動物のアルブミン遺伝子、脊椎動物のα−グロビン遺伝子、脊椎動物のβ−グロビン遺伝子、脊椎動物のチロシンヒドロキシラーゼ遺伝子、脊椎動物のリポキシゲナーゼ遺伝子、及び脊椎動物のコラーゲンアルファ遺伝子（例えば、脊椎動物のコラーゲンアルファ１（Ｉ）遺伝子）の３’ＵＴＲ、又はこれらの変異体、好ましくは、哺乳類のアルブミン遺伝子、哺乳類のα−グロビン遺伝子、哺乳類のβ−グロビン遺伝子、哺乳類のチロシンヒドロキシラーゼ遺伝子、哺乳類のリポキシゲナーゼ遺伝子、及び哺乳類のコラーゲンアルファ遺伝子（例えば、哺乳類のコラーゲンアルファ１（Ｉ）遺伝子）の３’ＵＴＲ、又はこれらの変異体、より好ましくは、ヒトのアルブミン遺伝子、ヒトのα−グロビン遺伝子、ヒトのβ−グロビン遺伝子、ヒトのチロシンヒドロキシラーゼ遺伝子、ヒトのリポキシゲナーゼ遺伝子、及びヒトのコラーゲンアルファ遺伝子（例えば、ヒトのコラーゲンアルファ１（Ｉ）遺伝子）の３’ＵＴＲ、又はこれらの変異体、更により好ましくは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００４７７．５に係るヒトのアルブミン遺伝子の３’ＵＴＲ、又はその変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる。好ましい実施形態では、３’ＵＴＲエレメントは、アフリカツメガエルのアルブミン遺伝子の３’ＵＴＲには由来しない。好ましくは、３’ＵＴＲエレメントは、アフリカツメガエルのアルブミン遺伝子由来の３’ＵＴＲのポリ（Ａ）制限要素Ｂ（ＰＬＥＢ）を含まない。好ましくは、３’ＵＴＲエレメントは、アフリカツメガエルのアルブミン遺伝子由来の３’ＵＴＲのＰＬＥＢからなるものではない。
【０１７４】
１つの実施形態では、３’ＵＴＲエレメント及び少なくとも１つのオープンリーディングフレームは、異種であり、例えば、好ましくは、３’ＵＴＲエレメント及びＯＲＦは、同じ種の異なる遺伝子又は異なる種の異なる遺伝子に由来する。好ましくは、３’ＵＴＲエレメントがα−グロビン遺伝子に由来する場合、ＯＲＦは、α−グロビンタンパク質をコードしない。好ましくは、３’ＵＴＲエレメントがβ−グロビン遺伝子に由来する場合、ＯＲＦは、β−グロビンタンパク質をコードしない。好ましくは、３’ＵＴＲエレメントがアルブミン遺伝子に由来する場合、ＯＲＦは、アルブミンタンパク質をコードしない。好ましくは、３’ＵＴＲエレメントがチロシンヒドロキシラーゼ遺伝子に由来する場合、ＯＲＦは、チロシンヒドロキシラーゼタンパク質をコードしない。好ましくは、３’ＵＴＲエレメントがリポキシゲナーゼ遺伝子に由来する場合、ＯＲＦは、リポキシゲナーゼタンパク質をコードしない。好ましくは、３’ＵＴＲエレメントがコラーゲンアルファ遺伝子に由来する場合、ＯＲＦは、コラーゲンアルファタンパク質をコードしない。
【０１７５】
１つの実施形態では、人工核酸分子は、２つの異なる遺伝子に由来する少なくとも２つの配列部分（ＴＯＰ遺伝子に由来する５’ＵＴＲエレメントと、オープンリーディングフレームと、所望のタンパク質産物をコードしている遺伝子に由来する３’ＵＴＲ）からなっていてもよい。より好ましくは、人工核酸分子は、３つの異なる遺伝子に由来する３つの配列部分（ＴＯＰ遺伝子に由来する５’ＵＴＲ、所望の遺伝子産物をコードしている遺伝子に由来するオープンリーディングフレーム、及びｍＲＮＡの半減期の延長に関連する遺伝子に由来する３’ＵＴＲエレメント（例えば、以下に定義及び記載する３’ＵＴＲエレメント））からなる。
【０１７６】
幾つかの実施形態では、３’ＵＴＲエレメントは、ヒストンステムループからなる。幾つかの実施形態では、人工核酸分子の３’ＵＴＲエレメントは、安定なｍＲＮＡを提供する遺伝子、例えば、上記の通りアルブミン遺伝子、α−グロビン遺伝子、β−グロビン遺伝子、チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子、リポキシゲナーゼ遺伝子、又はコラーゲンアルファ遺伝子（例えば、コラーゲンアルファ１（Ｉ）遺伝子）の３’ＵＴＲに由来する核酸配列に加えて、ヒストンステムループを含んでいてよい。本発明に係るかかる人工核酸分子は、例えば、５’→３’方向に、５’ＵＴＲエレメント、ＯＲＦ、３’ＵＴＲエレメント（好ましくは、ポリアデニル化シグナル、ヒストンステムループ、及び任意のポリ（Ａ）配列を含む）を含んでいてよい。また、５’→３’方向に、上記５’ＵＴＲエレメント、ＯＲＦ、３’ＵＴＲエレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル、ポリ（Ａ）配列、及びヒストンステムループを含む）を含んでいてよい。
【０１７７】
用語「［．．．］遺伝子の３’ＵＴＲに由来する核酸配列」とは、好ましくは、［．．．］遺伝子の３’ＵＴＲ配列、又はその一部、例えば、アルブミン遺伝子、α−グロビン遺伝子、β−グロビン遺伝子、チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子、リポキシゲナーゼ遺伝子、又はコラーゲンアルファ遺伝子（例えば、コラーゲンアルファ１（Ｉ）遺伝子）の３’ＵＴＲ、好ましくは、アルブミン遺伝子若しくはα−グロビン遺伝子の３’ＵＴＲ又はこれらの一部に基づく核酸配列を指す。この用語は、例えば、アルブミン遺伝子、α−グロビン遺伝子、β−グロビン遺伝子、チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子、リポキシゲナーゼ遺伝子、又はコラーゲンアルファ遺伝子（例えば、コラーゲンアルファ１（Ｉ）遺伝子）等の遺伝子、好ましくはアルブミン又はα−グロビン遺伝子の全３’ＵＴＲ配列に対応する配列（即ち、完全長３’ＵＴＲ配列）、及び３’ＵＴＲ配列の断片に対応する配列を含む。これに関連して、断片は、好ましくは、完全長３’ＵＴＲの少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、更により好ましくは少なくとも６０％、更により好ましくは少なくとも７０％、更により好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％を表す、完全長３’ＵＴＲにおける連続する一続きのヌクレオチドに対応する連続する一続きのヌクレオチドからなる。かかる断片は、本発明の意味において、好ましくは本明細書に記載する機能的断片である。用語「［．．．］遺伝子の３’ＵＴＲ」は、好ましくは、自然界に存在する遺伝子、例えば、自然界に存在するアルブミン遺伝子、α−グロビン遺伝子、β−グロビン遺伝子、チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子、リポキシゲナーゼ遺伝子、又はコラーゲンアルファ遺伝子（例えば、コラーゲンアルファ１（Ｉ）遺伝子）、好ましくは自然界に存在するアルブミン遺伝子又はα−グロビン遺伝子の３’ＵＴＲを指す。
【０１７８】
３’ＵＴＲに関連する用語「［．．．］遺伝子の３’ＵＴＲの変異体」及び「その変異体」は、自然界に存在する遺伝子、例えば、自然界に存在するアルブミン遺伝子、自然界に存在するα−グロビン遺伝子、自然界に存在するβ−グロビン遺伝子、自然界に存在するチロシンヒドロキシラーゼ遺伝子、自然界に存在するリポキシゲナーゼ遺伝子、又は自然界に存在するコラーゲンアルファ遺伝子（例えば、コラーゲンアルファ１（Ｉ）遺伝子）の３’ＵＴＲの変異体、好ましくは脊椎動物のアルブミン遺伝子、脊椎動物のα−グロビン遺伝子、脊椎動物のβ−グロビン遺伝子、脊椎動物のチロシンヒドロキシラーゼ遺伝子、脊椎動物のリポキシゲナーゼ遺伝子、及び脊椎動物のコラーゲンアルファ遺伝子（例えば、脊椎動物のコラーゲンアルファ１（Ｉ）遺伝子）の３’ＵＴＲの変異体、好ましくは、哺乳類のアルブミン遺伝子、哺乳類のα−グロビン遺伝子、哺乳類のβ−グロビン遺伝子、哺乳類のチロシンヒドロキシラーゼ遺伝子、哺乳類のリポキシゲナーゼ遺伝子、及び哺乳類のコラーゲンアルファ遺伝子（例えば、哺乳類のコラーゲンアルファ１（Ｉ）遺伝子）の３’ＵＴＲの変異体、或いはヒトのアルブミン遺伝子、ヒトのα−グロビン遺伝子、ヒトのβ−グロビン遺伝子、ヒトのチロシンヒドロキシラーゼ遺伝子、ヒトのリポキシゲナーゼ遺伝子、及びヒトのコラーゲンアルファ遺伝子（例えば、ヒトのコラーゲンアルファ１（Ｉ）遺伝子）の３’ＵＴＲの変異体を指す。かかる変異体は、遺伝子の改変３’ＵＴＲであってよい。例えば、変異体３’ＵＴＲは、その変異体が由来する自然界に存在する３’ＵＴＲに比べて、１以上のヌクレオチドの欠失、挿入、付加、及び／又は置換を示してよい。好ましくは、３’ＵＴＲの変異体は、その変異体が由来する自然界に存在する３’ＵＴＲと少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、更により好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％同一である。好ましくは、変異体は、本明細書に記載する機能的変異体である。
【０１７９】
用語「［．．．］遺伝子の３’ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列」は、好ましくは、遺伝子の３’ＵＴＲ配列の変異体、例えば、アルブミン遺伝子、α−グロビン遺伝子、β−グロビン遺伝子、チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子、リポキシゲナーゼ遺伝子、又はコラーゲンアルファ遺伝子（例えば、コラーゲンアルファ１（Ｉ）遺伝子）の３’ＵＴＲの変異体、或いは上記これらの一部に基づく核酸配列を指す。この用語は、遺伝子の３’ＵＴＲの変異体の全配列（即ち、遺伝子の完全長変異体３’ＵＴＲ配列）に対応する配列、及び遺伝子の変異体３’ＵＴＲ配列の断片に対応する配列を含む。これに関連して、断片は、好ましくは、完全長変異体３’ＵＴＲの少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、更により好ましくは少なくとも６０％、更により好ましくは少なくとも７０％、更により好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％を表す、完全長変異体３’ＵＴＲにおける連続する一続きのヌクレオチドに対応する連続する一続きのヌクレオチドからなる。かかる変異体の断片は、本発明の意味において、好ましくは、本明細書に記載する変異体の機能的断片である。
【０１８０】
本発明において、用語「機能的変異体」、「機能的断片」、及び「変異体の機能的断片」（「機能的変異体断片」とも呼ばれる）は、遺伝子の５’ＵＴＲ若しくは３’ＵＴＲの断片、５’ＵＴＲ若しくは３’ＵＴＲの変異体、又は５’ＵＴＲ若しくは３’ＵＴＲの変異体の断片が、前記変異体、前記断片、又は前記変異体の断片が由来する遺伝子の自然界に存在する５’ＵＴＲ又は３’ＵＴＲの少なくとも１つの機能、好ましくは１超の機能を発揮することを意味する。かかる機能は、例えば、好ましくは哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞）における、ｍＲＮＡの安定化、及び／又はｍＲＮＡからのタンパク質産生の安定化、及び／又はｍＲＮＡからのタンパク質産生の延長、及び／又はｍＲＮＡからのタンパク質産生の増加であってよい。本発明における変異体、断片、及び変異体の断片は、以下のうちの少なくともいずれかの機能を発揮することが特に好ましい：好ましくは哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞）において、レファレンス５’ＵＴＲを含むか又は５’ＵＴＲ及び／若しくは３’ＵＴＲを有しないｍＲＮＡに比べてｍＲＮＡを安定化させる機能；好ましくは哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞）において、レファレンス５’ＵＴＲを含むか又は５’ＵＴＲ及び／若しくは３’ＵＴＲを有しないｍＲＮＡに比べてｍＲＮＡからのタンパク質産生を安定化及び／又は延長する機能；並びに好ましくは哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞）において、レファレンス５’ＵＴＲを含むか又は５’ＵＴＲ及び／若しくは３’ＵＴＲを有しないｍＲＮＡに比べてｍＲＮＡからのタンパク質産生を増加させる機能。レファレンス５’ＵＴＲは、例えば、自然界においてＯＲＦと併存する５’ＵＴＲであってよい。更に、遺伝子の５’ＵＴＲ又は３’ＵＴＲの機能的変異体、機能的断片、又は機能的変異体断片は、その変異体が由来する野生型の５’ＵＴＲ及び／又は３’ＵＴＲに比べて、かかる５’ＵＴＲの変異体及び／又はかかる３’ＵＴＲの変異体を含むｍＲＮＡの翻訳効率を実質的に減じる効果を有しないことが好ましい。本発明において、遺伝子、例えば、アルブミン遺伝子、α−グロビン遺伝子、β−グロビン遺伝子、チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子、リポキシゲナーゼ遺伝子、又はコラーゲンアルファ遺伝子（例えば、コラーゲンアルファ１（Ｉ）遺伝子）の３’ＵＴＲの「機能的断片」、「機能的変異体」又は「変異体の機能的断片」の特に好ましい機能は、上記機能的断片、機能的変異体、又は変異体の機能的断片を有するｍＲＮＡの発現によるタンパク質産生の安定化及び／又は延長である。本発明における５’ＵＴＲの「機能的断片」、「機能的変異体」、又は「変異体の機能的断片」の特に好ましい機能は、タンパク質産生を増加させる機能である。
【０１８１】
好ましくは、機能的変異体、機能的断片、又は機能的変異体断片によって発揮される１以上の機能の効率、例えば、ｍＲＮＡ及び／又はタンパク質の産生安定化効率及び／又はタンパク質の産生増加効率は、前記変異体、前記断片、又は前記変異体断片が由来する自然界に存在する５’ＵＴＲ及び／又は３’ＵＴＲによって発揮されるｍＲＮＡ及び／又はタンパク質の産生安定化効率及び／又はタンパク質の産生増加効率の少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、更により好ましくは少なくとも７０％、更により好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％である。
【０１８２】
本発明に関連して、遺伝子、例えば、アルブミン遺伝子、α−グロビン遺伝子、β−グロビン遺伝子、チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子、リポキシゲナーゼ遺伝子、又はコラーゲンアルファ遺伝子（例えば、コラーゲンアルファ１（Ｉ）遺伝子）又はその変異体の３’ＵＴＲの断片又は一部は、好ましくは、少なくとも約４０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約５０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約７５ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１００ヌクレオチド、更により好ましくは少なくとも約１２５ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも約１５０ヌクレオチドの長さを有する。好ましくは、かかる遺伝子の３’ＵＴＲの断片又は遺伝子の３’ＵＴＲの変異体の断片は、上記機能的断片である。
【０１８３】
本発明に関連して、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲ又はその変異体の断片又は一部は、好ましくは、少なくとも約２０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約３０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約５０ヌクレオチドの長さを有する。好ましくは、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲ又はＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの変異体の断片は、上記機能的断片である。
【０１８４】
幾つかの実施形態では、本発明に係る人工核酸分子の３’ＵＴＲエレメントは、遺伝子、例えば、アルブミン遺伝子、α−グロビン遺伝子、β−グロビン遺伝子、チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子、リポキシゲナーゼ遺伝子、若しくはコラーゲンアルファ遺伝子（例えば、コラーゲンアルファ１（Ｉ）遺伝子）、又はこれらの変異体の３’ＵＴＲの「機能的断片」、「機能的変異体」、又は「変異体の機能的断片」を含むか又はからなる。
【０１８５】
幾つかの実施形態では、本発明に係る人工核酸分子の少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメントは、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの「機能的断片」、「機能的変異体」、又は「変異体の機能的断片」を含むか又はからなる。
【０１８６】
好ましくは、本発明に係る人工核酸分子の３’ＵＴＲエレメントは、３’ＵＴＲエレメントを有しないそれぞれのｍＲＮＡ（レファレンスｍＲＮＡ）と比べて人工核酸分子の安定性を上昇させる、例えば、本発明に係るｍＲＮＡの安定性を上昇させる。好ましくは、本発明に係る人工核酸分子の少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメントは、３’ＵＴＲエレメントを有しないそれぞれのｍＲＮＡと比べて、本発明に係る人工核酸分子、例えば、本発明に係るｍＲＮＡからのタンパク質産生の安定性を上昇させる。好ましくは、本発明に係る人工核酸分子の少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメントは、３’ＵＴＲエレメントを有しないそれぞれのｍＲＮＡと比べて、本発明に係る人工核酸分子、例えば、本発明に係るｍＲＮＡからのタンパク質産生を延長する。好ましくは、本発明に係る人工核酸分子の少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメントは、３’ＵＴＲエレメントを有しないそれぞれのｍＲＮＡと比べて、本発明に係る人工核酸分子、例えば、本発明に係るｍＲＮＡからのタンパク質産生を増加させる。好ましくは、本発明に係る人工核酸分子の少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメントは、３’ＵＴＲエレメントを有しないそれぞれのｍＲＮＡの翻訳効率と比べて、ｍＲＮＡの翻訳効率に悪影響を与えない。これに関連して、用語「それぞれのｍＲＮＡ」は、異なる３’ＵＴＲは別にして、レファレンスｍＲＮＡが、３’ＵＴＲエレメントを含むｍＲＮＡと類似している、好ましくは同一であることを意味する。
【０１８７】
好ましくは、本発明に係る人工核酸分子の少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメントは、５’ＵＴＲエレメントを有しないか又はレファレンス５’ＵＴＲエレメント（例えば、自然界においてＯＲＦと併存する５’ＵＴＲ）を含むそれぞれのｍＲＮＡ（レファレンスｍＲＮＡ）と比べて、人工核酸分子の安定性を上昇させる、例えば、本発明に係るｍＲＮＡの安定性を上昇させる。好ましくは、本発明に係る人工核酸分子の少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメントは、５’ＵＴＲエレメントを有しないか又はレファレンス５’ＵＴＲエレメント（例えば、自然界においてＯＲＦと併存する５’ＵＴＲ）を含むそれぞれのｍＲＮＡ（レファレンスｍＲＮＡ）と比べて、本発明に係る人工核酸分子、例えば、本発明に係るｍＲＮＡからのタンパク質産生を増加させる。これに関連して、用語「それぞれのｍＲＮＡ」は、異なる５’ＵＴＲは別にして、レファレンスｍＲＮＡが、本発明の５’ＵＴＲエレメントを含むｍＲＮＡと類似している、好ましくは同一であることを意味する。
【０１８８】
好ましくは、本発明に係る人工核酸分子のヒストンステムループは、ヒストンステムループを有しないそれぞれのｍＲＮＡ（レファレンスｍＲＮＡ）と比べて、人工核酸分子の安定性を上昇させる、例えば、本発明に係るｍＲＮＡの安定性を上昇させる。好ましくは、本発明に係る人工核酸分子のヒストンステムループは、ヒストンステムループを有しないそれぞれのｍＲＮＡと比べて、本発明に係る人工核酸分子、例えば、本発明に係るｍＲＮＡからのタンパク質産生を増加させる。これに関連して、用語「それぞれのｍＲＮＡ」は、ヒストンステムループは別にして、レファレンスｍＲＮＡが、ヒストンステムループを含むｍＲＮＡと類似する、好ましくは同一であることを意味する。
【０１８９】
好ましくは、少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント及び少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメントは、相乗的に作用して、上記の通り、本発明に係る人工核酸分子、例えば、本発明に係るｍＲＮＡからのタンパク質産生を増加させる。
【０１９０】
好ましくは、少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント及びヒストンステムループは、相乗的に作用して、上記の通り、本発明に係る人工核酸分子、例えば、本発明に係るｍＲＮＡからのタンパク質産生を増加させる。
【０１９１】
用語「ｍＲＮＡからのタンパク質産生を安定化及び／又は延長する」とは、好ましくは、例えば、３’ＵＴＲエレメントを有しないレファレンスｍＲＮＡからのタンパク質産生と比べて、ｍＲＮＡからのタンパク質産生が安定化及び／又は延長されることを意味する。
【０１９２】
これに関連して、「安定したタンパク質発現」とは、好ましくは、例えば、３’ＵＴＲエレメントを有しないレファレンス核酸分子と比べたとき、所定の期間、例えば、２４時間、より好ましくは４８時間、更により好ましくは７２時間に亘って本発明に係る人工核酸分子からより均一にタンパク質が産生されることを意味する。したがって、本発明に係る３’ＵＴＲエレメントを含む人工核酸分子、例えば、本発明に係るｍＲＮＡからの（例えば、哺乳類系における）タンパク質産生のレベルは、好ましくは、レファレンス核酸分子について観察される程度まで低下することはない。例えば、発現開始の６時間後、例えば、本発明に係る人工核酸分子を細胞（例えば、哺乳類細胞）にトランスフェクトした６時間後に観察される（ＯＲＦによってコードされている）タンパク質の量は、発現開始の４８時間後、例えば、トランスフェクションの４８時間後に観察されるタンパク質の量と同等であってよい。したがって、発現開始の４８時間後、例えば、トランスフェクションの４８時間後に観察される、例えば、レポータータンパク質（例えば、ルシフェラーゼ）等のＯＲＦによってコードされているタンパク質の量の、発現開始の６時間後、例えば、トランスフェクションの６時間後に観察されるタンパク質の量に対する比は、本発明に係る核酸分子の場合、好ましくは０．４超、好ましくは０．５超、より好ましくは０．６超、更により好ましくは０．７超、例えば、約０．４〜約４、好ましくは約０．６５〜約３、より好ましくは約０．７〜約２である。したがって、１つの実施形態では、本発明は、発現開始の４８時間後に観察される（レポーター）タンパク質の量の、発現開始の６時間後に観察される（レポーター）タンパク質の量に対する比が、好ましくは哺乳類の発現系（例えば、哺乳類細胞）において、好ましくは約０．４〜約４、好ましくは約０．６５〜約３、より好ましくは約０．７〜約２である、上記人工核酸分子を提供する。
【０１９３】
本発明において、「タンパク質発現の増加」とは、レファレンス分子と比べて発現開始後のある時点におけるタンパク質発現が増加すること又は発現開始後特定の期間内における全タンパク質産生が増加することを指してよい。したがって、本発明に係る人工核酸分子の発現開始後（例えば、トランスフェクション後）、例えば、本発明に係るｍＲＮＡのトランスフェクション後の特定の時点、例えば、トランスフェクションの２４時間後、４８時間後、又は７２時間後において観察されるタンパク質レベル、或いはある期間、例えば、２４時間、４８時間、又は７２時間の間に産生される全タンパク質は、好ましくは、レファレンス５’ＵＴＲエレメントを含むか又は５’ＵＴＲエレメント及び／若しくは３’ＵＴＲエレメント及び／若しくはヒストンステムループを有しないレファレンスｍＲＮＡ等のレファレンス核酸分子について発現開始後（例えば、トランスフェクション後）の同時点で観察されるタンパク質レベルよりも高い、又は同期間内に産生される全タンパク質よりも多い。上記の通り、５’ＵＴＲエレメント及びヒストンステムループの特に好ましい機能は、人工核酸分子からのタンパク質産生を増加させる効果である。好ましくは、発現開始後の所与の時点における、かかる５’ＵＴＲエレメント及びヒストンステムループを有しないレファレンス核酸分子と比べた５’ＵＴＲエレメント及びヒストンステムループによるタンパク質産生増加は、５’ＵＴＲエレメント及びヒストンステムループを有しないレファレンス核酸分子について観察されるタンパク質産生の少なくとも１．５倍、より好ましくは少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも３倍、より好ましくは少なくとも４倍、より好ましくは少なくとも５倍、更により好ましくは少なくとも１０倍、更により好ましくは少なくとも１５倍である。所与の期間、例えば、発現開始後２４時間、４８時間、又は７２時間の期間内に産生される全タンパク質についても当てはまることが好ましい。
【０１９４】
人工核酸分子の安定性上昇、タンパク質産生の安定性上昇、タンパク質産生の延長、及び／又はタンパク質産生の増加は、好ましくは、５’ＵＴＲエレメント及び／又は３’ＵＴＲエレメント及び／又はヒストンステムループを有しないそれぞれのレファレンス核酸分子（例えば、５’ＵＴＲエレメント及び／又は３’ＵＴＲエレメント及び／又はヒストンステムループを有しないｍＲＮＡ）、又はレファレンス５’ＵＴＲエレメント及び／又はレファレンス３’ＵＴＲエレメントを含むレファレンス核酸分子（例えば、自然界においてＯＲＦと併存する３’ＵＴＲ及び／又は５’ＵＴＲ、或いはレファレンス遺伝子の５’ＵＴＲ及び／又は３’ＵＴＲ）と比較することによって求められる。
【０１９５】
アルブミン遺伝子の３’ＵＴＲの変異体、断片、及び／又は変異体断片のｍＲＮＡ及びタンパク質の少なくともいずれかの産生安定化効果及び効率、並びに／又はタンパク質産生増加効果及び効率に加えて、本発明に係る人工核酸分子の３’ＵＴＲエレメント、少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、又はヒストンステムループのｍＲＮＡ及びタンパク質の少なくともいずれかの産生安定化効果及び効率、並びに／又はタンパク質産生増加効果及び効率は、当業者に公知であるこの目的に適した任意の方法によって求めることができる。例えば、レポータータンパク質（例えば、ルシフェラーゼ）のコード配列を含み、３’ＵＴＲ及び／又は５’ＵＴＲ及び／又はヒストンステムループを含まない人工ｍＲＮＡ分子；ＴＯＰ遺伝子由来の５’ＵＴＲ及び／又は上記遺伝子由来の３’ＵＴＲ及び／又は上記ヒストンステムループを含む人工ｍＲＮＡ分子；レファレンス遺伝子由来の５’ＵＴＲ及び／又はレファレンス遺伝子由来の３’ＵＴＲ（即ち、レファレンス３’ＵＴＲ又はレファレンス５’ＵＴＲ、例えば、自然界においてＯＲＦと併存する５’ＵＴＲ又は３’ＵＴＲ）を含む人工ｍＲＮＡ分子；３’ＵＴＲとして、上記遺伝子の３’ＵＴＲの変異体を含む人工ｍＲＮＡ分子；３’ＵＴＲとして、上記遺伝子の３’ＵＴＲの断片を含む人工ｍＲＮＡ分子；又は３’ＵＴＲとして、上記遺伝子の３’ＵＴＲの変異体の断片を含む人工ｍＲＮＡ分子；５’ＵＴＲとして、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの変異体を含む人工ｍＲＮＡ分子；５’ＵＴＲとして、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの断片を含む人工ｍＲＮＡ分子；又は５’ＵＴＲとして、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの変異体の断片を含む人工ｍＲＮＡ分子を作製してよい。かかるｍＲＮＡは、例えば、Ｔ７プロモーターとそれぞれのｍＲＮＡ配列をコードしている配列とを含むプラスミドベクター等、それぞれのベクターのインビトロ転写によって作製することができる。作製されるｍＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡをトランスフェクトするのに適した任意のトランスフェクション法によって細胞にトランスフェクトしてよい。例えば、ＨＥＬＡ細胞又はＨＤＦ細胞等の哺乳類細胞にエレクトロポレーションし、トランスフェクション後の特定の時点、例えば、トランスフェクションの６時間後、２４時間後、４８時間後、及び７２時間後にサンプルを分析してよい。前記サンプルは、当業者に周知の方法によってｍＲＮＡ量及び／又はタンパク質量について分析してよい。例えば、サンプリング時点で細胞中に存在するレポーターｍＲＮＡの量は、定量ＰＣＲ法によって求めることができる。それぞれのｍＲＮＡによってコードされているレポータータンパク質の量は、例えば、用いられるレポータータンパク質に依存して、ＥＬＩＳＡアッセイ又はレポーターアッセイ（例えば、ルシフェラーゼアッセイ）によって求めることができる。タンパク質発現の安定化及び／又はタンパク質発現の延長の効果は、例えば、トランスフェクションの４８時間後に観察されるタンパク質レベルのトランスフェクションの６時間後に観察されるタンパク質レベルに対する比を求めることによって分析することができる。前記値が１に近付くにつれて、この期間内のタンパク質発現がより安定である。また、タンパク質レベルがより後の時点においてより高い場合、前記値が１を超える場合もある。かかる測定は、無論、７２時間以上の時点で実施してもよく、タンパク質発現の安定性を求めるために、トランスフェクションの７２時間後に観察されるタンパク質レベルとトランスフェクションの６時間後に観察されるタンパク質レベルとの比を求めてもよい。
【０１９６】
好ましくは、本発明に係る人工核酸分子の３’ＵＴＲエレメントは、配列番号１，３６９〜１，３７７及び１，４３４から選択される核酸配列、並びに対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％、最も好ましくは１００％の同一性を有する核酸配列を含むか又はからなり、配列番号１，３６９〜１，３７７及び１，４３４に係る配列の変異体は、好ましくは、上記機能的変異体である。配列番号１，３６９、１，３７１、及び１，４３４、これらの変異体、並びに対応するＲＮＡ配列が、特に好ましい。
【０１９７】
また、本発明に係る人工核酸分子の３’ＵＴＲエレメントは、配列番号１，３６９〜１，３７７、及び１，４３４に係る核酸配列、並びに対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％、最も好ましくは１００％の同一性を有する核酸配列の断片を含んでいてもよく又はからなっていてもよく、前記断片は、好ましくは、上記の機能的断片又は機能的変異体断片である。好ましくは、前記断片は、上記の通りである。即ち、前記断片が由来する完全長３’ＵＴＲの少なくとも２０％等を表す連続する一続きのヌクレオチドである。かかる断片は、好ましくは、少なくとも約４０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約５０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約７５ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１００ヌクレオチド、更により好ましくは少なくとも約１２５ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも約１５０ヌクレオチドの長さを有する。
【０１９８】
例えば、かかる断片は、配列番号１，３７８〜１，３９０に係る核酸配列、例えば、
【表２】
2018007682.tif 000021
【表３】
2018007682.tif 000022
又は対応するＲＮＡ配列、又は前記核酸配列若しくは対応するＲＮＡ配列と少なくとも４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％同一である核酸配列を有し得る。したがって、本発明に係る人工核酸分子の少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメントは、上記核酸断片を含んでいてもよく又はからなっていてもよい。明らかなことであるが、配列番号１，３７８〜１，３９０に係る断片に含まれるチミジンヌクレオチドは、ウリジンヌクレオチドによって置換されてもよい。
【０１９９】
好ましくは、前記変異体、断片、又は変異体断片は、配列番号１，３６９〜１，３７７及び１，４３４に係る核酸配列の少なくとも１つの機能（例えば、本発明に係る人工核酸分子の安定化、本発明に係る人工核酸分子からのタンパク質発現の安定化及び／又は延長、タンパク質産生の増加の少なくともいずれか）を、配列番号１，３６９〜１，３７７及び１，４３４に係る核酸配列によって示される安定化効率及び／又はタンパク質産生増加効率の少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、更により好ましくは少なくとも７０％、更により好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％の効率で示す上記機能的変異体、機能的断片、又は機能的変異体断片である。好ましくは、変異体、断片、又は変異体断片は、５’ＵＴＲエレメントと相乗的に作用して人工核酸分子からのタンパク質産生を増加させる機能を示す機能的変異体、機能的断片、又は機能的変異体断片である。
【０２００】
好ましくは、本発明に係る人工核酸分子の３’ＵＴＲエレメントは、少なくとも約４０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約５０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約７５ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１００ヌクレオチド、更により好ましくは少なくとも約１２５ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも約１５０ヌクレオチドの長さを有する。例えば、３’ＵＴＲは、約５０ヌクレオチド〜約３００ヌクレオチド、好ましくは約１００ヌクレオチド〜約２５０ヌクレオチド、より好ましくは約１５０ヌクレオチド〜約２００ヌクレオチドの長さを有し得る。
【０２０１】
更に、本発明に係る人工核酸分子は、１超の上記３’ＵＴＲエレメントを含んでいてよい。例えば、本発明に係る人工核酸分子は、１、２、３、４、又はそれ以上の３’ＵＴＲエレメントを含んでいてよく、個々の３’ＵＴＲエレメントは、同一であっても異なっていてもよい。例えば、本発明に係る人工核酸分子は、２つの本質的に同一の上記３’ＵＴＲエレメント（例えば、配列番号１，３６９、１，３７１、１，３７６、又は１，４３４に係る核酸配列等、アルブミン遺伝子若しくはα−グロビン遺伝子の３’ＵＴＲ、又はアルブミン遺伝子若しくはα−グロビン遺伝子の３’ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる２つの３’ＵＴＲエレメント）、その機能的変異体、その機能的断片、又はその機能的変異体断片を含んでいてよい。
【０２０２】
好ましい実施形態では、人工核酸分子は、（ａ．）上記リボソームタンパク質（例えば、リボソームラージタンパク質）をコードしているＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲ又はその変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメントと、（ｂ．）少なくとも１つのオープンリーディングフレームと、（ｃ．）本明細書に記載する少なくとも１つのヒストンステムループ（例えば、配列番号１，３９１〜１，４３３に係る少なくとも１つのヒストンステムループ）と、任意で（ｄ．）ポリ（Ａ）配列又はポリ（Ａ）シグナルと、任意で（ｅ．）ポリ（Ｃ）配列と、任意で（ｆ．）例えば、配列番号１，３６９、１，３７１、及び１，４３４からなる群より選択される配列等のアルブミン遺伝子若しくはα−グロビン遺伝子の３’ＵＴＲ、又は本明細書に記載するその変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる、安定なｍＲＮＡを提供する遺伝子に由来することが好ましい少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメントとを含む。
【０２０３】
好ましくは、人工核酸分子のエレメントの配列は、５’から３’方向に、５’−［少なくとも１つの５’ＵＴＲ］−［ＯＲＦ］−［任意の少なくとも１つの３’ＵＴＲ］−［任意のポリ（Ａ）配列］−［任意のポリ（Ｃ）配列］−［少なくとも１つのヒストンステムループ］−３’である。
【０２０４】
特に好ましい実施形態では、人工核酸分子は、（ａ．）リボソームタンパク質ラージ３２遺伝子（ＲＰＬ３２）、リボソームタンパク質ラージ３５遺伝子（ＲＰＬ３５）、リボソームタンパク質ラージ２１遺伝子（ＲＰＬ２１）、ＡＴＰシンターゼ、Ｈ＋輸送、ミトコンドリアＦ１複合体アルファサブユニット１、心筋（ＡＴＰ５Ａ１）遺伝子、ヒドロキシステロイド（１７−ベータ）デヒドロゲナーゼ４遺伝子（ＨＳＤ１７Ｂ４）、アンドロゲン誘導１遺伝子（ＡＩＧ１）、シトクロームｃオキシダーゼサブユニットＶＩｃ遺伝子（ＣＯＸ６Ｃ）、若しくはＮ−アシルスフィンゴシンアミドヒドロラーゼ（酸性セラミダーゼ）１遺伝子（ＡＳＡＨ１）、又はこれらの変異体、好ましくは、脊椎動物のリボソームタンパク質ラージ３２遺伝子（ＲＰＬ３２）、脊椎動物のリボソームタンパク質ラージ３５遺伝子（ＲＰＬ３５）、脊椎動物のリボソームタンパク質ラージ２１遺伝子（ＲＰＬ２１）、脊椎動物のＡＴＰシンターゼ、Ｈ＋輸送、ミトコンドリアＦ１複合体アルファサブユニット１、心筋（ＡＴＰ５Ａ１）遺伝子、脊椎動物のヒドロキシステロイド（１７−ベータ）デヒドロゲナーゼ４遺伝子（ＨＳＤ１７Ｂ４）、脊椎動物のアンドロゲン誘導１遺伝子（ＡＩＧ１）、脊椎動物のシトクロームｃオキシダーゼサブユニットＶＩｃ遺伝子（ＣＯＸ６Ｃ）、若しくは脊椎動物のＮ−アシルスフィンゴシンアミドヒドロラーゼ（酸性セラミダーゼ）１遺伝子（ＡＳＡＨ１）、又はこれらの変異体、より好ましくは、哺乳類のリボソームタンパク質ラージ３２遺伝子（ＲＰＬ３２）、リボソームタンパク質ラージ３５遺伝子（ＲＰＬ３５）、リボソームタンパク質ラージ２１遺伝子（ＲＰＬ２１）、哺乳類のＡＴＰシンターゼ、Ｈ＋輸送、ミトコンドリアＦ１複合体アルファサブユニット１、心筋（ＡＴＰ５Ａ１）遺伝子、哺乳類のヒドロキシステロイド（１７−ベータ）デヒドロゲナーゼ４遺伝子（ＨＳＤ１７Ｂ４）、哺乳類のアンドロゲン誘導１遺伝子（ＡＩＧ１）、哺乳類のシトクロームｃオキシダーゼサブユニットＶＩｃ遺伝子（ＣＯＸ６Ｃ）、若しくは哺乳類のＮ−アシルスフィンゴシンアミドヒドロラーゼ（酸性セラミダーゼ）１遺伝子（ＡＳＡＨ１）、又はこれらの変異体、最も好ましくは、ヒトのリボソームタンパク質ラージ３２遺伝子（ＲＰＬ３２）、ヒトのリボソームタンパク質ラージ３５遺伝子（ＲＰＬ３５）、ヒトのリボソームタンパク質ラージ２１遺伝子（ＲＰＬ２１）、ヒトのＡＴＰシンターゼ、Ｈ＋輸送、ミトコンドリアＦ１複合体アルファサブユニット１、心筋（ＡＴＰ５Ａ１）遺伝子、ヒトのヒドロキシステロイド（１７−ベータ）デヒドロゲナーゼ４遺伝子（ＨＳＤ１７Ｂ４）、ヒトのアンドロゲン誘導１遺伝子（ＡＩＧ１）、ヒトのシトクロームｃオキシダーゼサブユニットＶＩｃ遺伝子（ＣＯＸ６Ｃ）、若しくはヒトのＮ−アシルスフィンゴシンアミドヒドロラーゼ（酸性セラミダーゼ）１遺伝子（ＡＳＡＨ１）、又はこれらの変異体の５’ＵＴＲに由来する核酸配列を含むか又はからなる少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメントであって、好ましくは、配列番号１，３６８若しくは配列番号１，４５２〜１，４６０に係る配列又はこれらの変異体等の前記遺伝子の５’ＴＯＰを含まない５’ＵＴＲエレメントと、（ｂ．）少なくとも１つのオープンリーディングフレームと、（ｃ．）少なくとも１つのヒストンステムループ（例えば、配列番号１，３９１〜１，４３３に係る少なくとも１つのヒストンステムループ）と、任意で（ｄ．）ポリ（Ａ）配列及び／又はポリ（Ａ）シグナルと、任意で（ｅ．）ポリ（Ｃ）配列と、任意で（ｆ．）例えば、配列番号１，３６９、１，３７１、及び１，４３４からなる群より選択される配列等のアルブミン遺伝子若しくはα−グロビン遺伝子、又は本明細書に記載するこれらの変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメントとを含む。
【０２０５】
特に好ましい実施形態では、本発明に係る人工核酸分子は、
（ａ．）配列番号１，３６８又は配列番号１，４５２〜１，４６０に係る核酸配列に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有する核酸配列、又は対応するＲＮＡ配列を含むか又はからなる少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメントと、
（ｂ．）少なくとも１つのオープンリーディングフレームと、
（ｃ．）本明細書に記載する少なくとも１つのヒストンステムループ（例えば、配列番号１，３９１〜１，４３３のうちのいずれか１つに係るヒストンステムループ配列、好ましくは、配列番号１，４３３に係る配列に対して少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有するヒストンステムループ配列、又は対応するＲＮＡ配列）であって、好ましくは、配列番号１，４３３に係る配列に対して少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有する配列又は対応するＲＮＡ配列の位置６、１３、及び２０が保存されている、即ち、配列番号１，４３３の位置６、１３、及び２０のヌクレオチドと同一であるヒストンステムループと、
（ｄ．）任意で、本明細書に記載するポリ（Ａ）配列又はポリ（Ａ）シグナルと、
（ｅ．）任意で、ポリ（Ｃ）配列と、
（ｆ．）任意で、３’ＵＴＲエレメント、好ましくは、安定なｍＲＮＡを提供する遺伝子に由来する３’ＵＴＲエレメント、例えば、配列番号１，３６９、１，３７１、又は１，４３４に係る核酸配列に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％、最も好ましくは１００％の同一性を有する核酸配列、又は対応するＲＮＡ配列を含むか又はからなる３’ＵＴＲエレメントと
を含む。
【０２０６】
したがって、特に好ましい実施形態では、本発明は、配列番号１，３６８又は配列番号１，４５２〜１，４６０に係る核酸配列に対して少なくとも約９０％の同一性を有する核酸配列、又は対応するＲＮＡ配列を含むか又はからなる５’ＵＴＲエレメントと、配列番号１，４３４に係る配列又は対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも約９０％の同一性を有する配列を含むヒストンステムループと、任意で、本明細書に記載するポリ（Ａ）配列及び／又はポリ（Ａ）シグナルと、任意で、ポリ（Ｃ）配列と、任意で、配列番号１，３６９、１，３７１、又は１，４３４に係る核酸配列に対して少なくとも約９０％の同一性を有する核酸配列を含むか又はからなる３’ＵＴＲエレメントとを含む人工核酸分子を提供する。
【０２０７】
好ましくは、本発明に係る人工核酸分子は、以下からなる群の構成要素のうちの１つ又は２つ又は少なくとも１つ又は１つを除く全て又は全てを含有しない：リボザイム（好ましくは、自己スプライシングリボザイム）をコードしている配列、ウイルス核酸配列、ヒストンステムループプロセシングシグナル（特に、マウスヒストンＨ２Ａ６１４遺伝子に由来するヒストンステムループプロセシング配列）、Ｎｅｏ遺伝子、不活化プロモーター配列、及び不活化エンハンサー配列。更により好ましくは、本発明に係る核酸は、リボザイム（好ましくは、自己スプライシングリボザイム）も、以下からなる群のうちの１つも含有しない：Ｎｅｏ遺伝子、不活化プロモーター配列、不活化エンハンサー配列、ヒストンステムループプロセシングシグナル（特に、マウスヒストンＨ２Ａ６１４遺伝子に由来するヒストンステムループプロセシング配列）。したがって、前記核酸は、好ましい態様では、リボザイム（好ましくは、自己スプライシングリボザイム）もＮｅｏ遺伝子も含有しなくてよく、或いは、リボザイム（好ましくは、自己スプライシングリボザイム）も任意の耐性遺伝子（例えば、通常、選択のために適用される）も含有しなくてよい。別の好ましい態様では、本発明の核酸分子は、リボザイム（好ましくは、自己スプライシングリボザイム）もヒストンステムループプロセシングシグナル（特に、マウスヒストンＨ２Ａ６１４遺伝子に由来するヒストンステムループプロセシング配列）も含有しなくてよい。
【０２０８】
更に、本発明に係る本発明の人工核酸分子は、イントロンを含まないことが好ましい。
【０２０９】
本発明に係る人工核酸分子は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）、ＤＮＡ（例えば、ＤＮＡベクター）であってよく、改変ＲＮＡ分子又は改変ＤＮＡ分子であってもよい。それは、例えば、センス鎖及びアンチセンス鎖を有する二本鎖分子として、例えば、センス鎖及びアンチセンス鎖を有するＤＮＡ分子として提供され得る。
【０２１０】
また、本発明は、５’ＵＴＲエレメントと、オープンリーディングフレームと、本明細書に記載するヒストンステムループと、任意で本明細書に記載する３’ＵＴＲエレメントと、任意でポリ（Ａ）配列とを含むｍＲＮＡ分子である人工核酸分子を提供する。
【０２１１】
本発明に係る人工核酸分子は、更に、５’−キャップを含んでいてよい。任意の５’−キャップは、好ましくは、５’ＵＴＲエレメントの５’側に付加される。
【０２１２】
本発明は、翻訳効率に関して安定化及び最適化されているＲＮＡ分子、好ましくはｍＲＮＡ分子のテンプレートとなり得る人工核酸分子を提供する。言い換えれば、人工核酸分子は、ｍＲＮＡの産生に用いることができるＤＮＡ又はＲＮＡであってよい。得ることができるｍＲＮＡは、次いで、オープンリーディングフレームによってコードされている所望のペプチド又はタンパク質を産生するために翻訳され得る。人工核酸分子がＤＮＡである場合、例えば、インビトロ又はインビボでｍＲＮＡを継続して繰り返し産生するための二本鎖保管形態として用いてよい。
【０２１３】
潜在的な転写系は、インビトロ転写系又は細胞転写系等である。したがって、本発明に係る人工核酸分子の転写、例えば、５’ＵＴＲエレメントと、オープンリーディングフレームと、ヒストンステムループと、３’ＵＴＲエレメントと、ポリアデニル化シグナルとを含む人工核酸分子の転写により、５’ＵＴＲエレメントと、オープンリーディングフレームと、ヒストンステムループと、３’ＵＴＲエレメントと、ポリ（Ａ）配列とを含むｍＲＮＡ分子を得ることができる。
【０２１４】
例えば、本発明に係る人工核酸分子は、以下のＤＮＡ配列に対応する核酸配列を含んでいてよい。
【表４】
2018007682.tif 000023
【０２１５】
かかる配列の転写により、対応するＲＮＡ配列を含む人工核酸分子を得ることができる。
【０２１６】
また、かかる人工ＲＮＡ分子は、必ずしもＤＮＡ親から転写されることなしに一般的な化学合成法によってインビトロで得ることもできる。
【０２１７】
特に好ましい実施形態では、本発明に係る人工核酸分子は、５’から３’方向に、上記５’ＵＴＲエレメントと、オープンリーディングフレームと、任意で上記３’ＵＴＲエレメントと、任意でポリ（Ａ）配列と、任意でポリ（Ｃ）配列と、本明細書に記載するヒストンステムループとを含むＲＮＡ分子、好ましくはｍＲＮＡ分子である。
【０２１８】
幾つかの実施形態では、人工核酸分子は、ＩＲＥＳモチーフ等の更なる要素を含む。配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列又はＩＲＥＳモチーフは、例えば、人工核酸分子が２以上のペプチド又はタンパク質をコードしている場合、幾つかのオープンリーディングフレームを分離することができる。ＩＲＥＳ配列は、ｍＲＮＡが２シストロン性又は多シストロン性のＲＮＡである場合、特に有用であり得る。
【０２１９】
更に、人工核酸分子は、プロモーター配列又はエンハンサー配列等の更なる５’エレメントを含んでいてよい。プロモーターは、本発明に係る人工核酸分子、例えば、本発明に係る人工ＤＮＡ分子の転写を駆動及び／又は制御することができる。
【０２２０】
好ましい実施形態では、本発明は、５’から３’方向に、以下の構造のうちの少なくとも１つを含む人工核酸分子、好ましくはｍＲＮＡ分子を提供する：
５’−キャップ−５’ＵＴＲエレメント−ＯＲＦ−３’ＵＴＲエレメント−ヒストンステムループ−ポリ（Ａ）配列
５’−キャップ−５’ＵＴＲエレメント−ＯＲＦ−３’ＵＴＲエレメント−ポリ（Ａ）配列−ヒストンステムループ
５’−キャップ−５’ＵＴＲエレメント−ＯＲＦ−ＩＲＥＳ−ＯＲＦ−３’ＵＴＲエレメント−ヒストンステムループ−ポリ（Ａ）配列
５’−キャップ−５’ＵＴＲエレメント−ＯＲＦ−ＩＲＥＳ−ＯＲＦ−３’ＵＴＲエレメント−ポリ（Ａ）配列−ヒストンステムループ
５’−キャップ−５’ＵＴＲエレメント−ＯＲＦ−３’ＵＴＲエレメント−ポリ（Ａ）配列−ポリ（Ｃ）配列−ヒストンステムループ
５’−キャップ−５’ＵＴＲエレメント−ＯＲＦ−ＩＲＥＳ−ＯＲＦ−３’ＵＴＲエレメント−ポリ（Ａ）配列−ポリ（Ｃ）配列−ヒストンステムループ
５’−キャップ−５’ＵＴＲエレメント−ＯＲＦ−ＩＲＥＳ−ＯＲＦ−３’ＵＴＲエレメント−ヒストンステムループ−ポリ（Ａ）配列−ポリ（Ｃ）配列。
【０２２１】
より好ましくは、本発明の人工核酸分子は、好ましくはコードされているタンパク質の発現レベルを上昇させるために、（ａ．）５’ＵＴＲエレメントと、（ｂ．）好ましくはペプチド又はタンパク質をコードしているオープンリーディングフレームと、（ｃ．）少なくとも１つのヒストンステムループと、任意で（ｄ．）ポリ（Ａ）配列及び／又はポリアデニル化シグナルと、（ｅ．）任意でポリ（Ｃ）配列と、（ｆ．）任意で３’ＵＴＲエレメントとを含むか又はコードしており、前記コードされているタンパク質は、好ましくは、上に定義した通り、ヒストンタンパク質、レポータータンパク質、及び／又はマーカー若しくは選択タンパク質ではない。本発明の人工核酸分子のエレメント（ｃ．）〜（ｆ．）は、本発明の人工核酸分子中に任意の順序で存在してよい。即ち、エレメント（ａ．）、（ｂ．）、（ｃ．）、（ｄ．）、（ｅ．）及び（ｆ．）は、例えば、（ａ．）、（ｂ．）、（ｃ．）、（ｄ．）、（ｅ．）及び（ｆ．）；又は（ａ．）、（ｂ．）、（ｄ．）、（ｃ．）、（ｅ．）及び（ｆ．）；又は（ａ．）、（ｂ．）、（ｃ．）、（ｄ．）、（ｆ．）及び（ｅ．）；又は（ａ．）、（ｂ．）、（ｄ．）、（ｃ．）、（ｆ．）及び（ｅ．）；又は（ａ．）、（ｂ．）、（ｅ．）、（ｄ．）、（ｃ．）及び（ｆ．）；又は（ａ．）、（ｂ．）、（ｅ．）、（ｄ．）、（ｆ．）及び（ｃ．）；又は（ａ．）、（ｂ．）、（ｃ．）、（ｆ．）、（ｅ．）及び（ｄ．）等の順序で存在してよく、例えば、５’−キャップ構造、安定化配列、ＩＲＥＳ配列等の本明細書に記載する更なるエレメントが含有されていてもよい。本発明の人工核酸分子の各エレメント（ａ．）〜（ｆ．）、特にｂ）は、２シストロン性若しくは多シストロン性のコンストラクト中に存在してよく、及び／又は各エレメント（ａ．）、（ｃ．）、及び（ｆ．）は、本発明の人工核酸分子中で少なくとも１回、好ましくは２回以上繰り返されていてもよい。一例として、本発明の人工核酸分子は、例えば以下の順序でその配列エレメント（ａ．）、（ｂ．）、（ｃ．）、及び任意で（ｄ．）を含んでいてよい。全ての場合において、人工核酸分子は、更に、本明細書に定義する１以上の任意の３’ＵＴＲエレメント及び／又はポリ（Ｃ）配列を含んでいてよい：
５’ＵＴＲ−ＯＲＦ−ヒストンステムループ−３’；又は
５’ＵＴＲ−ＯＲＦ−ＯＲＦ−ヒストンステムループ−３’；又は
５’ＵＴＲ−ＯＲＦ−ＩＲＥＳ−ＯＲＦ−ヒストンステムループ−３’；又は
５’ＵＴＲ−ＯＲＦ−ヒストンステムループ−ポリ（Ａ）配列−３’；又は
５’ＵＴＲ−ＯＲＦ−ヒストンステムループ−ポリアデニル化シグナル−３’；又は
５’ＵＴＲ−ＯＲＦ−ＯＲＦ−ヒストンステムループ−ポリアデニル化シグナル−３’；又は
５’ＵＴＲ−ＯＲＦ−ヒストンステムループ−ヒストンステムループ−３’；又は
５’ＵＴＲ−ＯＲＦ−ヒストンステムループ−ヒストンステムループ−ポリ（Ａ）配列−３’；又は
５’ＵＴＲ−ＯＲＦ−ヒストンステムループ−ヒストンステムループ−ポリアデニル化シグナル−３’；又は
５’ＵＴＲ−ＯＲＦ−ヒストンステムループ−ポリ（Ａ）配列−ヒストンステムループ−３’；又は
５’ＵＴＲ−ＯＲＦ−ポリ（Ａ）配列−ヒストンステムループ−３’；又は
５’ＵＴＲ−ＯＲＦ−ポリ（Ａ）配列−ヒストンステムループ−ヒストンステムループ−３’等。
【０２２２】
上記配列は、ポリ（Ｃ）配列を含むことが好ましい。好ましくは、このポリ（Ｃ）配列は、ヒストンステムループの５’側に位置し、好ましくは、ポリ（Ａ）配列とヒストンステムループ配列との間に位置する。
【０２２３】
これに関連して、本発明の人工核酸分子は、好ましくはコードされているタンパク質の発現レベルを増加させるためにａ）５’ＵＴＲエレメントと、ｂ）好ましくはペプチド又はタンパク質をコードしているオープンリーディングフレームと、ｃ）少なくとも１つのヒストンステムループと、ｄ）ポリ（Ａ）配列又はポリアデニル化配列とを含むか又はコードし、前記コードされているタンパク質は、好ましくは、ヒストンタンパク質、レポータータンパク質（例えば、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、β−ガラクトシダーゼ、特にＥＧＦＰ）、及び／又はマーカー若しくは選択タンパク質（例えば、α−グロビン、ガラクトキナーゼ、及びキサンチン：グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＧＰＴ））ではない。
【０２２４】
人工核酸分子のオープンリーディングフレームは、特に限定されない。例えば、オープンリーディングフレームは、疾患の治療に用いることができるタンパク質又はペプチドをコードしていてよい。タンパク質又はペプチドの具体的な選択は、治療される疾患に依存し、本発明の主題ではない。したがって、人工核酸分子は、オープンリーディングフレームによってコードされているタンパク質又はペプチドで治療可能な疾患の治療において使用するためのものであってよい。また、オープンリーディングフレームは、ワクチン接種のための抗原として用いることができるタンパク質又はペプチドをコードしていてもよい。更に、タンパク質又はペプチドの具体的な選択は、予防される疾患又は感染症に依存する。したがって、人工核酸分子は、特定の免疫応答を誘導することによって疾患の予防において使用するためのものであってよい。
【０２２５】
しかし、好ましくは、コードされているタンパク質は、ヒストンタンパク質ではない。本発明では、かかるヒストンタンパク質は、典型的に、真核生物細胞の核にみられる強アルカリ性タンパク質であり、ＤＮＡに指令を出し、ヌクレオソームと呼ばれる構造ユニットにパッケージングする。ヒストンタンパク質は、クロマチンの主なタンパク質成分であり、その周囲にＤＮＡが巻きつく糸巻きとして作用し、遺伝子制御において役割を果たす。ヒストンがないと、巻きがほどけた染色体中のＤＮＡは、非常に長くなる（ヒトＤＮＡでは、長さ対幅比が１，０００万超対１）。例えば、各ヒト細胞は、約１．８メートルのＤＮＡを有するが、ヒストンに巻きついて、約９０ミリメートルのクロマチンを形成する。クロマチンは、有糸分裂中に複製及び凝縮するときに約１２０マイクロメートルの染色体となる。より好ましくは、本発明では、かかるヒストンタンパク質は、典型的に、以下のヒストンの５つの主なクラス：Ｈ１／Ｈ５、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、及びＨ４”のうちの１つから選択され、好ましくは哺乳類ヒストンから選択され、より好ましくはヒトヒストン又はヒストンタンパク質から選択される、高度に保存されているタンパク質として定義される。かかるヒストン又はヒストンタンパク質は、典型的に、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、及びＨ４を含むコアヒストン並びにヒストンＨ１及びＨ５を含むリンカーヒストンとして定義される２つのスーパークラスに体系付けられる。
【０２２６】
これに関連して、リンカーヒストンは、係属中の発明の保護範囲から除外されることが好ましい。好ましくは哺乳類リンカーヒストン、より好ましくはヒトリンカーヒストンは、典型的に、Ｈ１Ｆを含むＨ１（具体的には、Ｈ１Ｆ０、Ｈ１ＦＮＴ、Ｈ１ＦＯＯ、Ｈ１ＦＸを含む）、及びＨ１Ｈ１（具体的には、ＨＩＳＴ１Ｈ１Ａ、ＨＩＳＴ１Ｈ１Ｂ、ＨＩＳＴ１Ｈ１Ｃ、ＨＩＳＴ１Ｈ１Ｄ、ＨＩＳＴ１Ｈ１Ｅ、ＨＩＳＴ１Ｈ１Ｔを含む）から選択される。
【０２２７】
更に、幾つかの実施形態では、好ましくは係属中の発明の保護範囲から除外されるコアヒストン、好ましくは哺乳類コアヒストン、より好ましくはヒトコアヒストンは、典型的に、Ｈ２ＡＦ（具体的には、Ｈ２ＡＦＢ１、Ｈ２ＡＦＢ２、Ｈ２ＡＦＢ３、Ｈ２ＡＦＪ、Ｈ２ＡＦＶ、Ｈ２ＡＦＸ、Ｈ２ＡＦＹ、Ｈ２ＡＦＹ２、Ｈ２ＡＦＺを含む）、及びＨ２Ａ１（具体的には、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＡ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＢ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＣ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＤ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＥ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＧ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＩ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＪ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＫ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＬ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＭを含む）、及びＨ２Ａ２（具体的には、ＨＩＳＴ２Ｈ２ＡＡ３、ＨＩＳＴ２Ｈ２ＡＣを含む）を含むＨ２Ａ；Ｈ２ＢＦ（具体的には、Ｈ２ＢＦＭ、Ｈ２ＢＦＯ、Ｈ２ＢＦＳ、Ｈ２ＢＦＷＴ）、Ｈ２Ｂ１（具体的には、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＡ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＢ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＣ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＤ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＥ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＦ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＧ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＨ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＩ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＪ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＫ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＬ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＭ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＮ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＯを含む）、及びＨ２Ｂ２（具体的には、ＨＩＳＴ２Ｈ２ＢＥを含む）を含むＨ２Ｂ；Ｈ３Ａ１（具体的には、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ａ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｂ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｃ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｄ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｅ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｆ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｇ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｈ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｉ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｊを含む）、及びＨ３Ａ２（具体的には、ＨＩＳＴ２Ｈ３Ｃを含む）、及びＨ３Ａ３（具体的には、ＨＩＳＴ３Ｈ３を含む）を含むＨ３；Ｈ４１（具体的には、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ａ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｂ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｃ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｄ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｅ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｆ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｇ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｈ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｉ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｊ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｌを含む）及びＨ４４（具体的には、ＨＩＳＴ４Ｈ４を含む）を含むＨ４；並びにＨ５から選択される。
【０２２８】
好ましくは、オープンリーディングフレームによってコードされているタンパク質は、レポータータンパク質（例えば、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、β−ガラクトシダーゼ）ではなく、且つマーカー又は選択タンパク質（例えば、アルファグロビン、ガラクトキナーゼ、及びキサンチン：グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＧＰＴ））ではない。好ましくは、本発明の人工核酸分子は、（細菌）Ｎｅｏ遺伝子配列（ネオマイシン耐性遺伝子）を含有しない。
【０２２９】
好ましくは、ＯＲＦは、アルブミンタンパク質、α−グロビンタンパク質、β−グロビンタンパク質、チロシンヒドロキシラーゼタンパク質、リポキシゲナーゼタンパク質、及びコラーゲンアルファタンパク質からなる群より選択されるタンパク質をコードしていない。
【０２３０】
好ましい実施形態では、オープンリーディングフレームは、ヒトのアルブミンをコードしないが、但し、３’ＵＴＲエレメントは、ヒトのアルブミンの３’ＵＴＲと同一である。幾つかの更なる実施形態では、オープンリーディングフレームは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００４７７．５に係るヒトのアルブミンをコードしないが、但し、３’ＵＴＲエレメントは、ヒトのアルブミンの３’ＵＴＲと同一であることが好ましい。幾つかの更なる実施形態では、オープンリーディングフレームは、ヒトのアルブミン又はその変異体をコードしないが、但し、３’ＵＴＲエレメントは、配列番号１，３６９又は対応するＲＮＡ配列と同一の配列であることが好ましい。
更に、幾つかの実施形態では、オープンリーディングフレームは、グロビンタンパク質、ルシフェラーゼタンパク質、ＧＦＰタンパク質又はその変異体、例えば、グロビンタンパク質、ルシフェラーゼタンパク質、又はＧＦＰタンパク質に対して少なくとも７０％の配列同一性を示す変異体からなる群より選択されるレポータータンパク質をコードしないことが好ましい。
【０２３１】
好ましくは、人工核酸分子、好ましくはオープンリーディングフレームは、少なくとも部分的にＧ／Ｃ改変されている。したがって、本発明の人工核酸分子は、前記分子のＧ（グアノシン）／Ｃ（シトシン）含量を改変することによって熱力学的に安定化させることができる。好ましくは遺伝コードの縮重を用いることによって、相当する野生型配列のオープンリーディングフレームのＧ／Ｃ含量と比べて本発明に係る人工核酸分子のオープンリーディングフレームのＧ／Ｃ含量を増加させてよい。したがって、核酸分子のコードされているアミノ酸配列は、好ましくは、特定の野生型配列のコードされているアミノ酸配列と比べて、Ｇ／Ｃ改変によって改変されないことが好ましい。したがって、翻訳されるアミノ酸配列を維持しながら含まれるＧ／Ｃヌクレオチドの量が増えるように、野生型コード配列と比べてコード配列又は核酸分子全体（例えば、ｍＲＮＡ）のコドンを変化させてよい。幾つかのコドンが１つの同じアミノ酸をコードしている（所謂、遺伝コードの縮重）という事実に関連して、安定性のために最も好ましいコドンを決定することができる（所謂、代替コドンの利用）。
【０２３２】
本明細書に定義する本発明の核酸分子のコード領域によってコードされているアミノ酸によっては、その野生型コード領域に対して、核酸配列、例えばコード領域を様々に改変できる可能性がある。Ｇ又はＣヌクレオチドのみを含有するコドンによってコードされているアミノ酸の場合、コドンを改変する必要はない。したがって、Ｐｒｏ（ＣＣＣ又はＣＣＧ）、Ａｒｇ（ＣＧＣ又はＣＧＧ）、Ａｌａ（ＧＣＣ又はＧＣＧ）、及びＧｌｙ（ＧＧＣ又はＧＧＧ）のコドンは、ＡもＵ／Ｔも存在しないので、改変する必要がない。
【０２３３】
対照的に、Ａ及び／又はＵ／Ｔヌクレオチドを含有するコドンは、同じアミノ酸をコードしているがＡ及び／又はＵ／Ｔを含有していない他のコドンで置換することによって改変してよい。その例は、以下の通りである：
Ｐｒｏのコドンは、ＣＣ（Ｕ／Ｔ）又はＣＣＡからＣＣＣ又はＣＣＧに改変してよい；
Ａｒｇのコドンは、ＣＧ（Ｕ／Ｔ）又はＣＧＡ又はＡＧＡ又はＡＧＧからＣＧＣ又はＣＧＧに改変してよい；
Ａｌａのコドンは、ＧＣ（Ｕ／Ｔ）又はＧＣＡからＧＣＣ又はＧＣＧに改変してよい；
Ｇｌｙのコドンは、ＧＧ（Ｕ／Ｔ）又はＧＧＡからＧＧＣ又はＧＧＧに改変してよい。
【０２３４】
他の場合、Ａ又は（Ｕ／Ｔ）ヌクレオチドをコドンからなくすことはできないが、Ａ及び／又は（Ｕ／Ｔ）ヌクレオチドの含量が低いコドンを使用することによってＡ及び（Ｕ／Ｔ）含量を減少させることができる。その例は、以下の通りである：
Ｐｈｅのコドンは、（Ｕ／Ｔ）（Ｕ／Ｔ）（Ｕ／Ｔ）から（Ｕ／Ｔ）（Ｕ／Ｔ）Ｃに改変してよい；
Ｌｅｕのコドンは、（Ｕ／Ｔ）（Ｕ／Ｔ）Ａ、（Ｕ／Ｔ）（Ｕ／Ｔ）Ｇ、Ｃ（Ｕ／Ｔ）（Ｕ／Ｔ）又はＣ（Ｕ／Ｔ）ＡからＣ（Ｕ／Ｔ）Ｃ又はＣ（Ｕ／Ｔ）Ｇに改変してよい；
Ｓｅｒのコドンは、（Ｕ／Ｔ）Ｃ（Ｕ／Ｔ）又は（Ｕ／Ｔ）ＣＡ又はＡＧ（Ｕ／Ｔ）から（Ｕ／Ｔ）ＣＣ、（Ｕ／Ｔ）ＣＧ又はＡＧＣに改変してよい；
Ｔｙｒのコドンは、（Ｕ／Ｔ）Ａ（Ｕ／Ｔ）から（Ｕ／Ｔ）ＡＣに改変してよい；
Ｃｙｓのコドンは、（Ｕ／Ｔ）Ｇ（Ｕ／Ｔ）から（Ｕ／Ｔ）ＧＣに改変してよい；
Ｈｉｓのコドンは、ＣＡ（Ｕ／Ｔ）からＣＡＣに改変してよい；
Ｇｌｎのコドンは、ＣＡＡからＣＡＧに改変してよい；
Ｉｌｅのコドンは、Ａ（Ｕ／Ｔ）（Ｕ／Ｔ）又はＡ（Ｕ／Ｔ）ＡからＡ（Ｕ／Ｔ）Ｃに改変してよい；
Ｔｈｒのコドンは、ＡＣ（Ｕ／Ｔ）又はＡＣＡからＡＣＣ又はＡＣＧに改変してよい；
Ａｓｎのコドンは、ＡＡ（Ｕ／Ｔ）からＡＡＣに改変してよい；
Ｌｙｓのコドンは、ＡＡＡからＡＡＧに改変してよい；
Ｖａｌのコドンは、Ｇ（Ｕ／Ｔ）（Ｕ／Ｔ）又はＧ（Ｕ／Ｔ）ＡからＧ（Ｕ／Ｔ）Ｃ又はＧ（Ｕ／Ｔ）Ｇに改変してよい；
Ａｓｐのコドンは、ＧＡ（Ｕ／Ｔ）からＧＡＣに改変してよい；
Ｇｌｕのコドンは、ＧＡＡからＧＡＧに改変してよい；
終止コドン（Ｕ／Ｔ）ＡＡは、（Ｕ／Ｔ）ＡＧ又は（Ｕ／Ｔ）ＧＡに改変してよい。
【０２３５】
他方、Ｍｅｔ（Ａ（Ｕ／Ｔ）Ｇ）及びＴｒｐ（（Ｕ／Ｔ）ＧＧ）のコドンの場合、コードされているアミノ酸配列を変化させることなしに配列を改変することはできない。
【０２３６】
上記置換は、その特定の野生型オープンリーディングフレーム（即ち、オリジナル配列）と比べて、本明細書に定義する本発明の核酸配列のオープンリーディングフレームのＧ／Ｃ含量を増加させるために個々に又は全ての可能な組み合わせで用いることができる。したがって、例えば、野生型配列に存在するＴｈｒの全てのコドンをＡＣＣ（又はＡＣＧ）に改変してもよい。
【０２３７】
本明細書に定義する本発明の人工核酸分子のオープンリーディングフレームのＧ／Ｃ含量は、野生型コード領域のＧ／Ｃ含量と比べて、少なくとも７％、好ましくは少なくとも１５％、特に好ましくは少なくとも２０％増加させる。特定の実施形態によれば、本発明の人工核酸分子、又はその断片、変異体、若しくは誘導体のオープンリーディングフレームにおける置換可能なコドンのうちの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、更により好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は更には１００％を置換して、前記オープンリーディングフレームのＧ／Ｃ含量を増加させる。
【０２３８】
これに関連して、本明細書に定義する本発明の核酸配列のオープンリーディングフレームのＧ／Ｃ含量を、野生型オープンリーディングフレームと比べて最大限（即ち、置換可能なコドンの１００％）増加させることが特に好ましい。
【０２３９】
更に、オープンリーディングフレームは、好ましくは、少なくとも部分的にコドンが最適化されている。コドンの最適化は、細胞内のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）の発生頻度が異なることによって翻訳効率が決定され得るという知見に基づいている。したがって、本明細書に定義する本発明の人工核酸分子のコード領域に所謂「レアコドン」が存在している場合、前記レアコドンに相当する改変核酸配列は、比較的「高頻度の」ｔＲＮＡをコードしているコドンが存在する場合よりも翻訳効率が低くなる確率が高い。
【０２４０】
したがって、本発明の核酸配列のオープンリーディングフレームは、好ましくは、細胞内で比較的レアなｔＲＮＡをコードしている野生型配列のうちの少なくとも１つのコドンが、細胞内で比較的高頻度で存在するｔＲＮＡをコードしており且つ前記比較的レアなｔＲＮＡと同じアミノ酸を運搬するコドンと交換されるように、相当する野生型コード領域に対して改変される。この改変により、本明細書に定義する本発明の人工核酸分子のオープンリーディングフレームは、高頻度で存在するｔＲＮＡを利用可能なコドンが、レアなｔＲＮＡに対応するコドンに置き換わることができるように改変される。言い換えれば、本発明によれば、この改変により、レアなｔＲＮＡをコードしている野生型オープンリーディングフレームの全てのコドンを、細胞内においてより高頻度で存在し且つ前記レアなｔＲＮＡと同じアミノ酸を運搬するコドンと交換してよい。どのｔＲＮＡが細胞内で比較的高頻度で存在するか、及び対照的にどのｔＲＮＡが比較的低頻度で存在するかは、当業者に公知である。例えば、Ａｋａｓｈｉ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．２００１，１１（６）：６６０−６６６を参照されたい。したがって、好ましくは、オープンリーディングフレームは、好ましくは本発明に係る核酸分子が発現する系に関して、好ましくは本発明に係る核酸分子が翻訳される系に関して、コドンが最適化されている。好ましくは、オープンリーディングフレームのコドン使用頻度は、哺乳類のコドン使用頻度、より好ましくはヒトのコドン使用頻度に従ってコドンが最適化されている。好ましくは、オープンリーディングフレームは、コドンが最適化されており且つＧ／Ｃ含量が改変されている。
【０２４１】
分解耐性、例えば、エキソヌクレアーゼ又はエンドヌクレアーゼによるインビボ分解に対する耐性を更に改善するために、及び／又は本発明に係る人工核酸分子からのタンパク質産生を更に改善するために、人工核酸分子は、骨格修飾、糖修飾、及び／又は塩基修飾、例えば、脂質修飾等の修飾を更に含んでいてよい。好ましくは、本発明に係る人工核酸分子の転写及び／又は翻訳は、前記修飾によって殆ど損なわれない。
【０２４２】
本発明において用いることができるヌクレオチドアナログ／修飾は、例えば、２−アミノ−６−クロロプリンリボサイド−５’−トリホスフェート、２−アミノ−アデノシン−５’−トリホスフェート、２−チオシチジン−５’−トリホスフェート、２−チオウリジン−５’−トリホスフェート、４−チオウリジン−５’−トリホスフェート、５−アミノアリルシチジン−５’−トリホスフェート、５−アミノアリルウリジン−５’−トリホスフェート、５−ブロモシチジン−５’−トリホスフェート、５−ブロモウリジン−５’−トリホスフェート、５−ヨードシチジン−５’−トリホスフェート、５−ヨードウリジン−５’−トリホスフェート、５−メチルシチジン−５’−トリホスフェート、５−メチルウリジン−５’−トリホスフェート、６−アザシチジン−５’−トリホスフェート、６−アザウリジン−５’−トリホスフェート、６−クロロプリンリボサイド−５’−トリホスフェート、７−デアザアデノシン−５’−トリホスフェート、７−デアザグアノシン−５’−トリホスフェート、８−アザアデノシン−５’−トリホスフェート、８−アジドアデノシン−５’−トリホスフェート、ベンズイミダゾール−リボサイド−５’−トリホスフェート、Ｎ１−メチルアデノシン−５’−トリホスフェート、Ｎ１−メチルグアノシン−５’−トリホスフェート、Ｎ６−メチルアデノシン−５’−トリホスフェート、Ｏ６−メチルグアノシン−５’−トリホスフェート、プソイドウリジン−５’−トリホスフェート、又はピューロマイシン−５’−トリホスフェート、キサントシン−５’−トリホスフェートから選択してよい。特に好ましくは、５−メチルシチジン−５’−トリホスフェート、７−デアザグアノシン−５’−トリホスフェート、５−ブロモシチジン−５’−トリホスフェート、及びプソイドウリジン−５’−トリホスフェートからなる塩基修飾ヌクレオチドの群から選択される塩基修飾のためのヌクレオチドである。
【０２４３】
更に、脂質修飾人工核酸分子は、典型的に、人工核酸分子と共有結合している少なくとも１つのリンカーと、このリンカーと共有結合している少なくとも１つの脂質とを含んでいてよい。或いは、脂質修飾人工核酸分子は、本明細書に定義する少なくとも１つの人工核酸分子と、好ましくはリンカーを介さずに前記人工核酸分子と共有結合している少なくとも１つの好ましくは二官能性の脂質とを含んでいてよい。第３の選択肢によれば、脂質修飾人工核酸分子は、本明細書に定義する人工核酸分子と、前記人工核酸分子と共有結合している少なくとも１つのリンカーと、このリンカーと共有結合している少なくとも１つの脂質と、更に、好ましくはリンカーを介さずに前記人工核酸分子と共有結合している少なくとも１つの好ましくは二官能性の脂質とを含んでいてよい。
【０２４４】
更なる態様では、本発明は、
（ａ．）ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲに由来するか又はＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる少なくとも１つの５’非翻訳領域エレメント（５’ＵＴＲエレメント）と、
（ｂ．）少なくとも１つのオープンリーディングフレーム及び／又は少なくとも１つのクローニングサイトと、
（ｃ．）任意で、少なくとも１つのヒストンステムループと
を含むベクターを提供する。
【０２４５】
クローニングサイトは、オープンリーディングフレームを受容するのに好適であり得る。即ち、発現するタンパク質又はペプチドをコードしているオープンリーディングフレームは、クローニングサイトを介してベクターにクローニングしてよい。
【０２４６】
少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、少なくとも１つのＯＲＦ、及び少なくとも１つの任意のヒストンステムループは、本発明に係る人工核酸分子について本明細書に記載する通りである。クローニングサイトは、オープンリーディングフレームを導入するのに好適な任意の配列又はオープンリーディングフレームを含む配列、例えば、１以上の制限酵素部位等であってよい。
【０２４７】
したがって、クローニングサイトを含むベクターは、好ましくは、オープンリーディングフレームをベクターに挿入するのに好適である。好ましくは、５’ＵＴＲエレメントとヒストンステムループ、ポリ（Ａ）配列、ポリアデニル化シグナル、及び／又は３’ＵＴＲエレメント等の望ましい３’構造との間にオープンリーディングフレームを挿入するのに好適であり得る。より好ましくは、３’構造の５’側且つ５’ＵＴＲエレメントの３’側に挿入するのに好適である。例えば、３’構造は、上記の通りヒストンステムループ、ポリ（Ａ）配列若しくはポリアデニル化シグナル、及び／又は３’ＵＴＲエレメントを含んでいてよい。それによって、ヒストンステムループ、ポリ（Ａ）配列及び／又はポリアデニル化シグナル、並びに３’ＵＴＲエレメントは、望ましい場合がある任意の順序で存在してよい。好ましくは、クローニングサイト又はＯＲＦは、好ましくは、上記の通りヒストンステムループ、ポリ（Ａ）配列、ポリアデニル化シグナル、及び／又は３’ＵＴＲエレメントの５’末端に近接して、３’ＵＴＲ構造の５’側に位置する。例えば、クローニングサイト又はＯＲＦは、ヒストンステムループ、ポリ（Ａ）配列、ポリアデニル化シグナル、及び／又は３’ＵＴＲエレメントの５’末端に直接連結してもよく、本発明に係る人工核酸分子について上記した通り一続きのヌクレオチド（例えば、一続きの２ヌクレオチド、４ヌクレオチド、６ヌクレオチド、８ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、２０ヌクレオチド等）を介して連結してもよい。好ましくは、クローニングサイト又はＯＲＦは、好ましくは、５’ＵＴＲエレメントの３’末端に近接して、５’ＵＴＲエレメントの３’側に位置する。例えば、クローニングサイト又はＯＲＦは、５’ＵＴＲエレメントの３’末端に直接連結してもよく、本発明に係る人工核酸分子について上記した通り一続きのヌクレオチド（例えば、一続きの２ヌクレオチド、４ヌクレオチド、６ヌクレオチド、８ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、２０ヌクレオチド等）を介して連結してもよい。
【０２４８】
好ましくは、本発明に係るベクターは、例えば、任意でオープンリーディングフレーム又はオープンリーディングフレームを含む配列をベクターに挿入し、前記ベクターを転写することによって、本発明に係る人工核酸分子を作製するのに、好ましくは、本発明に係る人工ｍＲＮＡを作製するのに好適である。したがって、好ましくは、ベクターは、プロモーター（例えば、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター）等の転写に必要なエレメントを含む。好ましくは、ベクターは、真核生物、原核生物、ウイルス若しくはファージの転写系（例えば、真核細胞、原核細胞等）、又は真核生物、原核生物、ウイルス、若しくはファージのインビトロ転写系を用いる転写に好適である。したがって、例えば、ベクターは、ＲＮＡポリメラーゼ等のポリメラーゼ（例えば、真核生物、原核生物、ウイルス、又はファージのＲＮＡポリメラーゼ）によって認識されるプロモーター配列を含んでいてよい。好ましい実施形態では、ベクターは、ＳＰ６又はＴ７等のファージＲＮＡポリメラーゼプロモーター、好ましくはＴ７プロモーターを含む。好ましくは、ベクターは、ファージに基づくインビトロ転写系（例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼに基づくインビトロ転写系等）を用いるインビトロ転写に好適である。
ベクターは、本発明に係る人工核酸分子について上記した通りポリ（Ａ）配列及び／又はポリアデニル化シグナル及び／又はポリ（Ｃ）配列を更に含んでいてよい。
【０２４９】
ベクターは、ＲＮＡベクターであってもよく、ＤＮＡベクターであってもよい。好ましくは、ベクターは、ＤＮＡベクターである。ベクターは、ウイルスベクター又はプラスミドベクター等の当業者に公知の任意のベクターであってよい。好ましくは、ベクターは、プラスミドベクター、好ましくはＤＮＡプラスミドベクターである。
【０２５０】
好ましい実施形態では、本発明に係るベクターは、本発明に係る人工核酸分子を含むか又はコードしている。
【０２５１】
好ましくは、本発明に係るベクターは、配列番号１〜１，３６３、配列番号１，４３５、配列番号１，４６１、配列番号１，４６２に係る配列、又は配列番号１，３６８若しくは１，４５２〜１，４６０に係る配列、上記これらの断片、又は対応するＲＮＡ配列、或いは配列番号１〜１，３６３、配列番号１，４３５、配列番号１，４６１、配列番号１，４６２のいずれか１つに係る配列、又は配列番号１，３６８若しくは１，４５２〜１，４６０に係る配列、上記これらの断片、好ましくはこれらの機能的断片、又は対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含む。
【０２５２】
好ましくは、本発明に係るベクターは、配列番号１，３６９〜１，３９０及び１，４３４のいずれか１つに係る配列、上記これらの断片、若しくは対応するＲＮＡ配列、又は配列番号１，３６９〜１，３９０及び１，４３４のいずれか１つに係る配列、若しくは上記これらの断片、好ましくはこれらの機能的断片、若しくは対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含む。
【０２５３】
好ましくは、本発明に係るベクターは、配列番号１，３９１〜１，４３３のいずれか１つに係る配列、若しくは対応するＲＮＡ配列、又は上記配列番号１，４３３に係る配列、若しくは対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約８５％、更により好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％の同一性を有する配列を含む。
【０２５４】
好ましくは、ベクターは、環状分子である。好ましくは、ベクターは、二本鎖ＤＮＡ分子等の二本鎖分子である。かかる環状の、好ましくは二本鎖のＤＮＡ分子は、本発明の人工核酸分子の保管形態として便利に用いることができる。更に、細胞、例えば培養細胞のトランスフェクションに用いることができる。また、本発明に係る人工ＲＮＡ分子を得るためのインビトロ転写に用いることができる。
【０２５５】
好ましくは、ベクター、好ましくは環状ベクターは、例えば、制限酵素で切断することによって線形にすることができる。好ましい実施形態では、ベクターは、オープンリーディングフレーム、又は（存在する場合）ヒストンステムループ、又は（存在する場合）ポリ（Ａ）配列若しくはポリアデニル化シグナル、又は（存在する場合）３’ＵＴＲエレメント、又は（存在する場合）ポリ（Ｃ）配列の直ぐ３’側に位置する制限酵素部位等の切断部位、好ましくは唯一の切断部位を含む。したがって、好ましくは、ベクターの線形化によって得られる生成物は、３’末端において、オープンリーディングフレームの３’末端、又は（存在する場合）ヒストンステムループの３’末端、又は（存在する場合）ポリ（Ａ）配列の３’末端、又はポリアデニル化シグナルの３’末端、又は（存在する場合）３’ＵＴＲエレメントの３’末端に加えて、幾つかの任意のヌクレオチド、例えば、切断後の制限酵素部位の残りで終結する。
【０２５６】
更なる態様では、本発明は、本発明に係る人工核酸分子又は本発明に係るベクターを含む細胞に関する。前記細胞は、細菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、脊椎動物細胞、例えば哺乳類細胞等の任意の細胞であってよい。前記細胞は、例えば、細菌細胞において本発明のベクターを複製するために用いることができる。更に、前記細胞は、本発明に係る人工核酸分子若しくはベクターを転写するため、及び／又は本発明に係る人工核酸分子若しくはベクターのオープンリーディングフレームを翻訳するために用いることができる。例えば、前記細胞は、組み換えタンパク質を産生するために用いることができる。
【０２５７】
本発明に係る細胞は、例えば、標準的なトランスフェクション法等の標準的な核酸移入法によって得ることができる。例えば、本発明に係る人工核酸分子又はベクターは、エレクトロポレーション、（例えば、カチオン性脂質及び／又はリポソームに基づく）リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ナノ粒子に基づくトランスフェクション、ウイルスに基づくトランスフェクション、又はカチオン性ポリマー（例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン又はポリエチレンイミン等）に基づくトランスフェクション等によって細胞に移入してよい。
【０２５８】
好ましくは、前記細胞は、哺乳類細胞、例えば、ヒト被験体、家畜、実験動物（例えば、マウス又はラット）の細胞等である。好ましくは、前記細胞は、ヒトの細胞である。前記細胞は、確立されている細胞株の細胞、例えば、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３Ｔ、ＣＯＳ−７、ＨＥＬＡ、ＨＥＫ等の細胞であってもよく、一次細胞、例えば、ＨＤＦ細胞であってもよい。好ましくは、生物から単離された細胞である。好ましい実施形態では、前記細胞は、哺乳類被験体、好ましくはヒト被験体の単離細胞である。例えば、前記細胞は、好ましくは哺乳類被験体、好ましくはヒト被験体の免疫細胞（例えば、樹状細胞）、癌細胞若しくは腫瘍細胞、又は任意の体細胞等であってよい。
【０２５９】
更なる態様では、本発明は、本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、又は本発明に係る細胞を含む医薬組成物を提供する。本発明に係る医薬組成物は、例えば、遺伝子ワクチン接種用のワクチンとして用いてよい。したがって、ＯＲＦは、ワクチン接種のために患者に投与される抗原をコードしていてよい。したがって、好ましい実施形態では、本発明に係る医薬組成物は、ワクチンである。更に、本発明に係る医薬組成物は、例えば、遺伝子治療に用いることができる。
【０２６０】
好ましくは、医薬組成物は、更に、１以上の薬学的に許容できる賦形剤、ビヒクル、充填剤、及び／又は希釈剤を含んでいてよい。本発明では、薬学的に許容できるビヒクルは、典型的に、本発明の医薬組成物用の液体又は非液体の基剤を含む。１つの実施形態では、医薬組成物は、液体形態で提供される。これに関連して、前記ビヒクルは、好ましくは、パイロジェンフリー水、等張生理食塩水又は緩衝（水）溶液、例えば、リン酸、クエン酸等のバッファ溶液等の水に基づく。バッファは、特定のレファレンス媒体に対して高張、等張、又は低張であってよい。即ち、前記バッファは、特定のレファレンス媒体に対してより高い、同一の、又はより低い塩含量を有してよく、好ましくは、浸透圧又は他の濃度効果により哺乳類細胞を損傷させない濃度の前述の塩を用いてよい。レファレンス媒体は、例えば、血液、リンパ液、サイトゾル液、又は他の体液等の「インビボ」法で用いられる液体であるか、或いは一般的なバッファ若しくは液体等の「インビトロ」法でレファレンス媒体として用いることができる液体である。かかる一般的なバッファ又は液体は、当業者に公知である。乳酸リンゲル液が、液体基剤として特に好ましい。
【０２６１】
本発明の医薬組成物のために、患者に投与するのに適している１以上の相溶性の固体又は液体の充填剤又は希釈剤、或いは封入化合物を同様に用いてもよい。用語「相溶性」とは、本明細書で使用するとき、好ましくは、典型的な使用条件下で本発明の医薬組成物の薬学的有効性を実質的に低減させる相互作用が生じないように、本発明の医薬組成物のこれら成分と本明細書に定義する本発明の核酸、ベクター、又は細胞とを混合できることを意味する。
【０２６２】
本発明に係る医薬組成物は、任意で、１以上の更なる医薬活性成分を更に含んでいてよい。これに関連して医薬活性成分とは、特定の適応症又は疾患を治癒させる、寛解させる、又は予防する治療効果を示す化合物である。前記化合物としては、限定するものではないが、ペプチド又はタンパク質、核酸、（治療的に活性のある）低分子量の有機化合物又は無機化合物（分子量：５，０００未満、好ましくは１，０００未満）、糖類、抗原又は抗体、関連技術において既に知られている治療剤、抗原細胞、抗原細胞断片、細胞画分、細胞壁成分（例えば、多糖類）、（例えば、化学的に又は放射線照射により）改変、弱毒化、又は不活化された病原体（ウイルス、細菌等）等が挙げられる。
【０２６３】
更に、本発明の医薬組成物は、人工核酸分子又はベクター用の担体を含んでいてよい。かかる担体は、医薬的に活性のある人工核酸分子又はベクターの生理学的に許容できる液体への溶解、輸送及び細胞内取り込みを媒介するのに好適であり得る。したがって、かかる担体は、本発明に係る人工核酸分子又はベクターのデポー製剤及び送達に好適であり得る成分であってよい。かかる成分は、例えば、トランスフェクション剤又は複合体化剤として機能し得るカチオン性又はポリカチオン性の担体又は化合物であってよい。
【０２６４】
これに関連して、特に好ましいトランスフェクション剤又は複合体化剤は、カチオン性又はポリカチオン性の化合物であり、例えば、プロタミン、ヌクレオリン、スペルミン若しくはスペルミジン、又は他のカチオン性のペプチド又はタンパク質（例えば、ポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ）、ポリアルギニン、塩基性ポリペプチド、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）（ＨＩＶ結合ペプチド、ＨＩＶ−１  Ｔａｔ（ＨＩＶ）、Ｔａｔ由来ペプチド、ペネトラチン、ＶＰ２２由来ペプチド又はアナログペプチドを含む）、ＨＳＶ  ＶＰ２２（単純ヘルペス）、ＭＡＰ、ＫＡＬＡ、又はタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）、ＰｐＴ６２０、プロリンリッチペプチド、アルギニンリッチペプチド、リシンリッチペプチド、ＭＰＧ−ペプチド、Ｐｅｐ−１、Ｌ−オリゴマー、カルシトニンペプチド、アンテナペディア由来ペプチド（特にショウジョウバエのアンテナペディア由来）、ｐＡｎｔｐ、ｐＩｓｌ、ＦＧＦ、ラクトフェリン、トランスポータン、ブフォリン−２、Ｂａｃ７１５−２４、ＳｙｎＢ、ＳｙｎＢ（１）、ｐＶＥＣ、ｈＣＴ由来ペプチド、ＳＡＰ、又はヒストン）が挙げられる。
【０２６５】
更に、かかるカチオン性又はポリカチオン性の化合物又は担体は、好ましくは少なくとも１つの−ＳＨ部分を含むか又は含むように更に改変されているカチオン性又はポリカチオン性のペプチド又はタンパク質であってよい。好ましくは、カチオン性又はポリカチオン性の担体は、以下の合計式（ＩＩＩ）を有するカチオン性ペプチドから選択される：
｛（Ａｒｇ）ｌ；（Ｌｙｓ）ｍ；（Ｈｉｓ）ｎ；（Ｏｒｎ）ｏ；（Ｘａａ）ｘ｝；式（ＩＩＩ）
（式中、ｌ＋ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｘは、３〜１００であり、ｌ、ｍ、ｎ、又はｏは、互いに独立して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１〜３０、３１〜４０、４１〜５０、５１〜６０、６１〜７０、７１〜８０、８１〜９０、及び９１〜１００から選択される任意の数であるが、但し、Ａｒｇ（アルギニン）、Ｌｙｓ（リジン）、Ｈｉｓ（ヒスチジン）及びＯｒｎ（オルニチン）の総含量は、オリゴペプチドの全アミノ酸の少なくとも１０％であり；Ｘａａは、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ又はＯｒｎを除くネイティブ（即ち、自然界に存在する）又は非ネイティブなアミノ酸から選択される任意のアミノ酸であり；ｘは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１〜３０、３１〜４０、４１〜５０、５１〜６０、６１〜７０、７１〜８０、８１〜９０から選択される任意の数であるが、但し、Ｘａａの総含量は、オリゴペプチドの全アミノ酸の９０％を超えない）。アミノ酸Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｏｒｎ、及びＸａａはいずれも、ペプチドの任意の位置に位置してよい。これに関連して、７アミノ酸〜３０アミノ酸のカチオン性ペプチド又はタンパク質が特に好ましい。
【０２６６】
更に、カチオン性又はポリカチオン性のペプチド又はタンパク質は、上に示す通り、式｛（Ａｒｇ）ｌ；（Ｌｙｓ）ｍ；（Ｈｉｓ）ｎ；（Ｏｒｎ）ｏ；（Ｘａａ）ｘ｝（式（ＩＩＩ））に従って定義され、少なくとも１つの−ＳＨ部分を含むか又は含むように更に改変されているとき、限定されるものではないが、部分式（ＩＩＩａ）から選択してよい：
｛（Ａｒｇ）ｌ；（Ｌｙｓ）ｍ；（Ｈｉｓ）ｎ；（Ｏｒｎ）ｏ；（Ｘａａ’）ｘ（Ｃｙｓ）ｙ｝  部分式（ＩＩＩａ）
（式中、（Ａｒｇ）ｌ；（Ｌｙｓ）ｍ；（Ｈｉｓ）ｎ；（Ｏｒｎ）ｏ；及びｘは、本明細書に定義する通りであり、Ｘａａ’は、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｏｒｎ、又はＣｙｓを除くネイティブ（即ち、自然界に存在する）又は非ネイティブなアミノ酸から選択される任意のアミノ酸であり、ｙは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１〜３０、３１〜４０、４１〜５０、５１〜６０、６１〜７０、７１〜８０、８１〜９０から選択される任意の数であるが、但し、Ａｒｇ（アルギニン）、Ｌｙｓ（リジン）、Ｈｉｓ（ヒスチジン）及びＯｒｎ（オルニチン）の総含量は、オリゴペプチドの全アミノ酸の少なくとも１０％である）。更に、カチオン性又はポリカチオン性のペプチドは、部分式（ＩＩＩｂ）から選択してよい：
Ｃｙｓ１｛（Ａｒｇ）ｌ；（Ｌｙｓ）ｍ；（Ｈｉｓ）ｎ；（Ｏｒｎ）ｏ；（Ｘａａ）ｘ｝Ｃｙｓ２  部分式（ＩＩＩｂ）
（式中、経験式｛（Ａｒｇ）ｌ；（Ｌｙｓ）ｍ；（Ｈｉｓ）ｎ；（Ｏｒｎ）ｏ；（Ｘａａ）ｘ｝（式（ＩＩＩ））は、本明細書に定義する通りであり、（半経験）式（ＩＩＩ）に係るアミノ酸配列のコアを形成し、Ｃｙｓ１及びＣｙｓ２は、（Ａｒｇ）ｌ；（Ｌｙｓ）ｍ；（Ｈｉｓ）ｎ；（Ｏｒｎ）ｏ；（Ｘａａ）ｘに近接するか又は末端に存在するシステインである）。
【０２６７】
トランスフェクション剤又は複合体化剤として用いることができる更に好ましいカチオン性又はポリカチオン性の化合物は、カチオン性多糖類（例えば、キトサン）、ポリブレン、カチオン性ポリマー（例えば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ））、カチオン性脂質（例えば、ＤＯＴＭＡ：［１−（２，３−シオレイルオキシ）プロピル）］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド、ＤＭＲＩＥ、ジ−Ｃ１４−アミジン、ＤＯＴＩＭ、ＳＡＩＮＴ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＢＧＴＣ、ＣＴＡＰ、ＤＯＰＣ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＰＥ：ジオレイルホスファチジルエタノールアミン、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＤＡＢ、ＤＯＩＣ、ＤＭＥＰＣ、ＤＯＧＳ：ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン、ＤＩＭＲＩ：ジミリスト−オキシプロピルジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド、ＤＯＴＡＰ：ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン、ＤＣ−６−１４：Ｏ，Ｏ−ジテトラデカノイル−Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）ジエタノールアミンクロリド、ＣＬＩＰ１：ｒａｃ−［（２，３−ジオクタデシルオキシプロピル）（２−ヒドロキシエチル）］−ジメチルアンモニウムクロリド、ＣＬＩＰ６：ｒａｃ−［２（２，３−ジヘキサデシルオキシプロピル−オキシメチルオキシ）エチル］トリメチルアンモニウム、ＣＬＩＰ９：ｒａｃ−［２（２，３−ジヘキサデシルオキシプロピル−オキシスクシニルオキシ）エチル］−トリメチルアンモニウム、オリゴフェクタミン、又はカチオン性若しくはポリカチオン性のポリマー（例えば、β−アミノ酸ポリマー又は逆ポリアミド等の修飾ポリアミノ酸；ＰＶＰ（ポリ（Ｎ−エチル−４−ビニルピリジニウムブロミド））等の修飾ポリエチレン；ｐＤＭＡＥＭＡ（ポリ（ジメチルアミノエチルメチルメタクリレート））等の修飾アクリレート；ｐＡＭＡＭ（ポリ（アミドアミン））等の修飾アミドアミン；ジアミン末端修飾１，４ブタンジオールジアクリレート−ｃｏ−５−アミノ−１−ペンタノールポリマー等の修飾ポリベータアミノエステル（ＰＢＡＥ）；ポリプロピルアミンデンドリマー又はｐＡＭＡＭ系デンドリマー等のデンドリマー；ＰＥＩ：ポリ（エチレンイミン）、ポリ（プロピレンイミン）等のポリイミン；ポリアリルアミン；シクロデキストリン系ポリマー、デキストラン系ポリマー、キトサン等の糖骨格系ポリマー；ＰＭＯＸＡ−ＰＤＭＳコポリマー等のシラン骨格系ポリマー）、１以上のカチオン性ブロック（例えば、上述のカチオン性ポリマーから選択される）と１以上の親水性又は疎水性のブロックとの組み合わせからなるブロックポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）等を含んでいてよい。
【０２６８】
これに関連して、本発明の人工核酸分子又は本発明のベクターは、カチオン性又はポリカチオン性の化合物、好ましくはカチオン性のタンパク質又はペプチドと少なくとも部分的に複合体化することが特に好ましい。部分的にとは、本発明の人工核酸分子又は本発明のベクターの一部のみがカチオン性又はポリカチオン性の化合物と複合体化し、本発明の人工核酸分子又は本発明のベクターの残りは、複合体化していない（「遊離」）形態であることを意味する。好ましくは、複合体化核酸の遊離核酸に対する比は、約５：１（ｗ／ｗ）〜約１：１０（ｗ／ｗ）、より好ましくは約４：１（ｗ／ｗ）〜約１：８（ｗ／ｗ）、更により好ましくは約３：１（ｗ／ｗ）〜約１：５（ｗ／ｗ）又は１：３（ｗ／ｗ）の範囲から選択され、最も好ましくは、複合体化核酸の遊離核酸に対する比は、約１：１（ｗ／ｗ）の比から選択される。
【０２６９】
本発明に係る医薬組成物は、任意で、１以上のアジュバント、例えば、自然免疫系を刺激するため又は人工核酸分子若しくはベクターの細胞内取り込みを強化するためのアジュバントを更に含んでいてよい。これに関連して、アジュバントは、自然免疫系の免疫応答、即ち、非特異的免疫応答を開始させたり増加させたりするのに好適な任意の化合物として理解してよい。言い換えれば、投与したとき、本発明の医薬組成物は、好ましくは、任意で前記医薬組成物に含有されるアジュバントにより、自然免疫応答を誘発する。好ましくは、かかるアジュバントは、哺乳類において自然免疫応答の誘導を補助するアジュバントであってよい。かかるアジュバントは、免疫賦活性核酸（即ち、例えば、Ｔｏｌｌ様受容体等に結合し得る核酸）、好ましくは、免疫賦活性ＲＮＡであってよい。
【０２７０】
かかるアジュバント、好ましくはかかる免疫賦活性核酸は、医薬組成物の人工核酸分子、好ましくはワクチンによってコードされているペプチド又はタンパク質（即ち、抗原）に対する特異的免疫応答（即ち、適応免疫応答）を補助することができる自然免疫応答（即ち、非特異的免疫応答）を誘導することができる。
【０２７１】
また、本発明の医薬組成物は、ヒトＴｏｌｌ様受容体ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０に対する（リガンドとしての）結合親和性に起因して、又はマウスＴｏｌｌ様受容体ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＴＬＲ１１、ＴＬＲ１２若しくはＴＬＲ１３に対する（リガンドとしての）結合親和性に起因して免疫賦活性であることが知られている任意の更なる化合物を更に含有していてもよい。
【０２７２】
本発明の医薬組成物に含まれ得る更なる添加剤は、例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）等の乳化剤；例えば、ラウリル硫酸ナトリウム等の湿潤剤；着色剤；風味付与剤；医薬担体；打錠剤；安定剤；酸化防止剤；保存剤である。
【０２７３】
本発明に係る医薬組成物は、好ましくは、「安全且つ有効な量」の医薬組成物の成分、特に、本明細書に定義する本発明の核酸配列、ベクター、及び／又は細胞を含む。本明細書で使用するとき、「安全且つ有効な量」とは、本明細書に定義する疾患又は疾病の好ましい変化を著しく誘導するのに十分である量を意味する。しかし、同時に、「安全且つ有効な量」は、好ましくは、重篤な副作用を避け、且つ利益とリスクとの間の道理に適った関係を可能にする。これらの限度は、典型的に、道理に適った医学的判断の範囲内で決定される。
【０２７４】
更なる態様では、本発明は、医薬として、例えば（遺伝子ワクチン接種における）ワクチンとして、又は遺伝子治療において用いるための本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物を提供する。
【０２７５】
本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物は、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質の治療作用又は効果を利用するか或いは特定のペプチド又はタンパク質の追加が必要である任意の医学的用途に特に好適である。したがって、本発明は、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質の治療作用又は効果によって治療することができるか、或いは特定のペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質の追加によって治療することができる疾患又は疾病の治療又は予防において用いるための本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物を提供する。例えば、本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物は、例えば遺伝子ワクチン接種又は遺伝子治療によって、遺伝性疾患、自己免疫疾患、癌性又は腫瘍関連疾患、感染性疾患、慢性疾患等を治療又は予防するために用いることができる。
【０２７６】
特に、５’ＵＴＲエレメントをヒストンステムループと組み合わせると本発明の核酸分子のＯＲＦからのタンパク質発現を増加させるので、治療を受ける被験体において治療用のペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質が安定的に、長期に亘り及び／又は多量に存在することから利益を得るかかる治療的処置は、本発明に関連する医学的用途に特に好適である。したがって、本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物に特に好適な医学的用途は、例えば、感染症又は腫瘍に対するワクチン接種である。したがって、本発明は、被験体、好ましくは哺乳類被験体、より好ましくはヒト被験体のワクチン接種のための本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物を提供する。好ましいワクチン接種処理は、細菌、原生動物、又はウイルスによる感染症等の感染性疾患に対するワクチン接種、及び抗腫瘍ワクチン接種である。かかるワクチン接種処理は、予防的であってもよく、治療的であってもよい。
【０２７７】
治療又は予防される疾患に応じてＯＲＦを選択してよい。例えば、オープンリーディングフレームは、遺伝性疾患に罹患している患者等、タンパク質が完全に欠失しているか又は機能が少なくとも部分的に喪失している患者に供給すべきタンパク質をコードしていてよい。更に、オープンリーディングフレームは、被験体の疾患又は症状に有益な影響を与えるペプチド又はタンパク質をコードしているＯＲＦから選択してよい。更に、オープンリーディングフレームは、天然のペプチド若しくはタンパク質の病的過剰産生をダウンレギュレートするか又は病的にタンパク質若しくはペプチドを発現する細胞を除去するペプチド又はタンパク質をコードしていてもよい。かかる欠失、機能喪失、又は過剰産生は、例えば、腫瘍及び新生物、自己免疫疾患、アレルギー、感染症、慢性疾患等に関連して生じる場合がある。更に、オープンリーディングフレームは、抗原又は免疫原（例えば、病原体又は腫瘍抗原のエピトープ）をコードしていてよい。したがって、好ましい実施形態では、本発明に係る人工核酸分子又はベクターは、抗原又は免疫原（例えば、病原体又は腫瘍関連抗原のエピトープ）と、上記５’ＵＴＲエレメントと、好ましくは本明細書に記載するヒストンステムループと、任意で本明細書に記載する３’ＵＴＲエレメント及び／又はポリ（Ａ）配列及び／又はポリ（Ｃ）配列等の更なる成分とを含むか又はからなるアミノ酸配列をコードしているＯＲＦを含む。
【０２７８】
医学的用途に関連して、特に、ワクチン接種に関連して、ＤＮＡは、抗ＤＮＡ免疫応答を誘発するリスクを有し且つゲノムＤＮＡに挿入される傾向を有するので、本発明に係る人工核酸分子は、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡであることが好ましい。しかし、幾つかの実施形態では、例えば、アデノウイルス送達ビヒクル等のウイルス送達ビヒクルを、例えば、遺伝子治療的処置において本発明に係る人工核酸分子又はベクターを送達するために用いる場合、人工核酸分子又はベクターがＤＮＡ分子であることが望ましい場合もある。
【０２７９】
本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物は、経口的に、非経口的に、吸入スプレーによって、局所的に、直腸内に、経鼻的に、口腔内に、膣内に、又は埋め込まれたレザーバを介して投与してよい。本明細書で使用するとき、非経口という用語は、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液包内、基質内、鞘内、肝臓内、病変内、頭蓋内、経皮、皮内、肺内、腹腔内、手根内、動脈内、及び舌下への注射又は注入技術を含む。
【０２８０】
好ましくは、本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物は、非経口的に、例えば非経口注射によって投与され、より好ましくは、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液包内、基質内、鞘内、肝臓内、病変内、頭蓋内、経皮、皮内、肺内、腹腔内、手根内、動脈内、及び舌下への注射又は注入技術を介して投与される。皮内及び筋肉内への注射が特に好ましい。本発明の医薬組成物の滅菌注射用形態は、水性又は油性の懸濁液であってよい。これら懸濁液は、好適な分散剤又は湿潤剤と懸濁化剤とを用いて当技術分野において公知の技術に従って製剤され得る。
【０２８１】
また、本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物は、カプセル剤、錠剤、水性懸濁剤、又は液剤が挙げられるがこれらに限定されない任意の経口的に許容できる剤形で経口投与してよい。
【０２８２】
また、本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物は、例えば、皮膚又は任意の他のアクセス可能な上皮組織の疾患を含む、局所塗布によって容易にアクセス可能な領域又は器官が治療標的に含まれる場合は特に、局所投与してもよい。これら領域又は器官のそれぞれについて、好適な局所製剤は容易に調製される。局所塗布については、本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物を、１以上の担体に懸濁又は溶解している好適な軟膏に製剤してよい。
【０２８３】
１つの実施形態では、医薬としての使用は、哺乳類細胞のトランスフェクション、好ましくは哺乳類細胞のインビトロトランスフェクション、より好ましくは前記医薬により治療される被験体の単離細胞のインビトロトランスフェクションの工程を含む。前記使用が単離細胞のインビトロトランスフェクションを含む場合、医薬としての使用は、トランスフェクトされた細胞を患者に（再）投与することを更に含んでいてよい。医薬としての本発明の人工核酸分子又はベクターの使用は、トランスフェクションに成功した単離細胞を選択する工程を更に含んでいてよい。したがって、ベクターが選択マーカーを更に含むことが有益である場合がある。また、前記医薬としての使用は、単離細胞のインビトロトランスフェクションと、前記細胞からの発現産物（即ち、コードされているペプチド又はタンパク質）の精製とを含んでいてよい。この精製ペプチド又はタンパク質は、後に、それを必要としている被験体に投与してよい。
【０２８４】
また、本発明は、上記疾患又は疾病を治療又は予防する方法であって、本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物をそれを必要としている被験体に投与することを含む方法を提供する。
【０２８５】
更に、本発明は、疾患又は疾病を治療又は予防する方法であって、本発明に係る人工核酸分子又は本発明に係るベクターで細胞をトランスフェクトすることを含む方法を提供する。トランスフェクションは、インビトロで実施してもよく、インビボで実施してもよい。好ましい実施形態では、細胞のトランスフェクションは、インビボで実施され、トランスフェクトされた細胞は、それを必要としている被験体、好ましくはヒト被験体に投与される。好ましくは、インビトロでトランスフェクトされる細胞は、被験体、好ましくはヒト患者の単離細胞である。したがって、本発明は、被験体、好ましくはヒト患者から細胞を単離する工程と、本発明に係る人工核酸分子又は本発明に係るベクターで前記単離細胞をトランスフェクトする工程と、前記トランスフェクトされた細胞を前記被験体、好ましくは前記ヒト患者に投与する工程とを含む治療方法を提供する。
【０２８６】
本発明に係る疾患を治療又は予防する方法は、好ましくは、上記ワクチン接種方法及び／又は遺伝子治療方法である。
【０２８７】
上記の通り、５’ＵＴＲエレメントと、好ましくはヒストンステムループと、任意でポリ（Ａ）配列及び／又は３’ＵＴＲエレメントとは、これらエレメント及びＯＲＦを含む人工核酸分子（例えば、ｍＲＮＡ又はベクター等）からのタンパク質産生を、好ましくは少なくとも相加的に、好ましくは相乗的に増加させることができる。したがって、更なる態様では、本発明は、人工核酸分子からのタンパク質産生を増加させる方法であって、前記人工核酸分子（好ましくは、前記人工核酸分子内に含まれるＯＲＦ）と、（ｉ）ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲに由来するか又は上記ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる少なくとも１つの５’−非翻訳領域（５’ＵＴＲエレメント）、好ましくは（ｉｉ）本明細書に記載する少なくとも１つのヒストンステムループ、及び任意で１以上の更なるエレメント（例えば、脊索動物の遺伝子、好ましくは脊椎動物の遺伝子、より好ましくは哺乳類の遺伝子、最も好ましくはヒトの遺伝子の３’ＵＴＲに由来するか、又は上記脊索動物の遺伝子、好ましくは脊椎動物の遺伝子、より好ましくは哺乳類の遺伝子、最も好ましくはヒトの遺伝子の３’ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる、ポリ（Ａ）配列及び／又はポリアデニル化シグナル及び／又はポリ（Ｃ）配列及び／又は３’ＵＴＲエレメント）とを結合させる工程を含む方法に関する。
【０２８８】
人工核酸分子又はベクターと５’ＵＴＲエレメント、及び好ましくはヒストンステムループ、及び本発明における任意の更なるエレメントとを結合させるとは、好ましくは、（例えば、ＯＲＦを含む）人工核酸分子（例えば、ｍＲＮＡ又はベクター）と、５’ＵＴＲエレメント、並びに任意でヒストンステムループ及び／又はポリ（Ａ）配列及び／又は３’ＵＴＲエレメントとを機能的に結合させるか又は機能的に組み合わせることを意味する。これは、人工核酸分子、好ましくは前記人工核酸分子内に含まれるＯＲＦと、５’ＵＴＲエレメントと、好ましくはヒストンステムループと、任意の更なるエレメント（例えば、上記ポリ（Ａ）配列及び／又は３’ＵＴＲエレメント）とを、５’ＵＴＲエレメント及びヒストンステムループ及び任意の更なるエレメントの機能（例えば、タンパク質産生を増加させる機能）が発揮されるように結合又はカップリングすることを意味する。典型的に、これは、オープンリーディングフレームが５’ＵＴＲエレメントと任意のヒストンステムループ及び任意のポリ（Ａ）配列及び／又は任意の３’ＵＴＲエレメントとの間に位置するように、５’ＵＴＲエレメントとヒストンステムループと任意でポリ（Ａ）配列及び／又は３’ＵＴＲエレメントとが人工核酸分子（好ましくは、ｍＲＮＡ分子）又はベクターに組み込まれることを意味する。
【０２８９】
前記方法の結果、好ましくは、本発明に係る人工核酸分子又は本発明に係るベクターが得られる。したがって、例えば、前記エレメント（例えば、５’ＵＴＲエレメント、ヒストンステムループ、ポリ（Ａ）配列、ポリアデニル化シグナル、ポリ（Ｃ）配列、及び３’ＵＴＲエレメント）の性質及び配列は、本発明に係る人工核酸分子又は本発明に係るベクターについて上に記載した通りである。
【０２９０】
更なる態様では、本発明は、人工核酸分子（例えば、ｍＲＮＡ）又はベクターからのタンパク質産生を増加させるための、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲに由来するか又は上記ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる少なくとも１つの５’−非翻訳領域（５’ＵＴＲエレメント）、好ましくは少なくとも１つのヒストンステムループ、任意で更なるエレメント（例えば、ポリ（Ａ）配列及び／又はポリアデニル化シグナル及び／又はポリ（Ｃ）配列、及び／又は脊索動物の遺伝子、好ましくは脊椎動物の遺伝子、より好ましくは哺乳類の遺伝子、最も好ましくはヒトの遺伝子の３’ＵＴＲに由来するか、上記脊索動物の遺伝子、好ましくは脊椎動物の遺伝子、より好ましくは哺乳類の遺伝子、最も好ましくはヒトの遺伝子の３’ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる３’ＵＴＲエレメント）の使用を提供する。
【０２９１】
本発明に係る使用は、好ましくは、上記の通り、人工核酸分子と、５’ＵＴＲエレメント、好ましくはヒストンステムループ、及び任意の更なるエレメント（例えば、ポリ（Ａ）配列又は３’ＵＴＲエレメント）とを結合させることを含む。
【０２９２】
また、本発明の医薬組成物の化合物及び成分は、互いに別々に製造及び取引してもよい。したがって、本発明は、更に、本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、及び／又は本発明に係る医薬組成物を含むキット又はキットオブパーツに関する。好ましくは、かかるキット又はキットオブパーツは、更に、使用説明書；トランスフェクション用の細胞；アジュバント；医薬組成物の投与手段；人工核酸分子、ベクター、細胞、又は医薬組成物を溶解又は希釈するための薬学的に許容できる担体及び／又は薬学的に許容できる溶液を含んでいてよい。
【０２９３】
配列番号１〜１，３６３、１，４３５、及び１，４６１〜１，４６２      ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲを含む配列
配列番号１，３６４      ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−Ａ６４（図６）
配列番号１，３６５      ＲＰＬ３２−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ（図７）
配列番号１，３６６      ヒトリボソームタンパク質ラージ３２の５’ＵＴＲの断片
配列番号１，３６７      ヒトリボソームタンパク質ラージ３２の５’ＵＴＲの断片
配列番号１，３６８      ５’末端オリゴピリミジン領域を有しないヒトリボソームタンパク質ラージ３２の５’ＵＴＲ
配列番号１，３６９      ヒトアルブミン３’ＵＴＲ
配列番号１，３７０      ヒトヘモグロビン、アルファ１（ＨＢＡ１）の３’ＵＴＲ
配列番号１，３７１      ヒトヘモグロビン、アルファ２（ＨＢＡ２）の３’ＵＴＲ
配列番号１，３７２      ヒトヘモグロビン、ベータ（ＨＢＢ）の３’ＵＴＲ
配列番号１，３７３      ヒトチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）の３’ＵＴＲ
配列番号１，３７４      ヒトアラキドン酸１５−リポキシゲナーゼ（ＡＬＯＸ１５）の３’ＵＴＲ
配列番号１，３７５      ヒトコラーゲンＩ型アルファ１（ＣＯＬ１Ａ１）の３’ＵＴＲ
配列番号１，３７６      アルブミン７の３’ＵＴＲ
配列番号１，３７７      ヒトアルブミンの３’ＵＴＲ＋ポリ（Ａ）配列
配列番号１，３７８      ヒトアルブミンの３’ＵＴＲ断片１
配列番号１，３７９      ヒトアルブミンの３’ＵＴＲ断片２
配列番号１，３８０      ヒトアルブミンの３’ＵＴＲ断片３
配列番号１，３８１      ヒトアルブミンの３’ＵＴＲ断片４
配列番号１，３８２      ヒトアルブミンの３’ＵＴＲ断片５
配列番号１，３８３      ヒトアルブミンの３’ＵＴＲ断片６
配列番号１，３８４      ヒトアルブミンの３’ＵＴＲ断片７
配列番号１，３８５      ヒトアルブミンの３’ＵＴＲ断片８
配列番号１，３８６      ヒトアルブミンの３’ＵＴＲ断片９
配列番号１，３８７      ヒトアルブミンの３’ＵＴＲ断片１０
配列番号１，３８８      ヒトアルブミンの３’ＵＴＲ断片１１
配列番号１，３８９      ヒトアルブミンの３’ＵＴＲ断片１２
配列番号１，３９０      ヒトアルブミンの３’ＵＴＲ断片１３
配列番号１，３９１      式（Ｉｃ）に係る配列
配列番号１，３９２      式（ＩＩｃ）に係る配列
配列番号１，３９３      式（Ｉｄ）に係る配列
配列番号１，３９４      式（ＩＩｄ）に係る配列
配列番号１，３９５      式（Ｉｅ）に係る配列
配列番号１，３９６      式（ＩＩｅ）に係る配列
配列番号１，３９７      式（Ｉｆ）に係る配列
配列番号１，３９８      式（ＩＩｆ）に係る配列
配列番号１，３９９      式（Ｉｇ）に係る配列
配列番号１，４００      式（ＩＩｇ）に係る配列
配列番号１，４０１      式（Ｉｈ）に係る配列
配列番号１，４０２      式（ＩＩｈ）に係る配列
配列番号１，４０３      式（Ｉｃ）に係る配列
配列番号１，４０４      式（Ｉｃ）に係る配列
配列番号１，４０５      式（Ｉｃ）に係る配列
配列番号１，４０６      式（Ｉｅ）に係る配列
配列番号１，４０７      式（Ｉｅ）に係る配列
配列番号１，４０８      式（Ｉｅ）に係る配列
配列番号１，４０９      式（Ｉｆ）に係る配列
配列番号１，４１０      式（Ｉｆ）に係る配列
配列番号１，４１１      式（Ｉｆ）に係る配列
配列番号１，４１２      式（Ｉｇ）に係る配列
配列番号１，４１３      式（Ｉｇ）に係る配列
配列番号１，４１４      式（Ｉｇ）に係る配列
配列番号１，４１５      式（Ｉｈ）に係る配列
配列番号１，４１６      式（Ｉｈ）に係る配列
配列番号１，４１７      式（Ｉｈ）に係る配列
配列番号１，４１８      式（ＩＩｃ）に係る配列
配列番号１，４１９      式（ＩＩｃ）に係る配列
配列番号１，４２０      式（ＩＩｃ）に係る配列
配列番号１，４２１      式（ＩＩｅ）に係る配列
配列番号１，４２２      式（ＩＩｅ）に係る配列
配列番号１，４２３      式（ＩＩｅ）に係る配列
配列番号１，４２４      式（ＩＩｆ）に係る配列
配列番号１，４２５      式（ＩＩｆ）に係る配列
配列番号１，４２６      式（ＩＩｆ）に係る配列
配列番号１，４２７      式（ＩＩｇ）に係る配列
配列番号１，４２８      式（ＩＩｇ）に係る配列
配列番号１，４２９      式（ＩＩｇ）に係る配列
配列番号１，４３０      式（ＩＩｈ）に係る配列
配列番号１，４３１      式（ＩＩｈ）に係る配列
配列番号１，４３２      式（ＩＩｈ）に係る配列
配列番号１，４３３      実施例のヒストンステムループ配列
配列番号１，４３４      α−グロビン遺伝子の３’ＵＴＲの中央のα−複合体結合部分
配列番号１，４３５      ＡＴＰシンターゼ脂質結合タンパク質、ミトコンドリア（ａｔｐ５ｇ２）
配列番号１，４３６      ＲＰＬ３５−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン７−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ（図１４）
配列番号１，４３７      ＲＰＬ２１−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン７−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ（図１５）
配列番号１，４３８      ＡＴＰ５Ａ１−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン７−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ（図１６）
配列番号１，４３９      ＨＳＤ１７Ｂ４−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン７−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ（図１７）
配列番号１，４４０      ＡＩＧ１−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン７−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ（図１８）
配列番号１，４４１      ＣＯＸ６Ｃ−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン７−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ（図１９）
配列番号１，４４２      ＡＳＡＨ１−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン７−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ（図２０）
配列番号１，４４３      ｍＲＰＬ２１−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン７−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ（図３７）
配列番号１，４４４      ｍＲＰＬ３５Ａ−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン７−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ（図３８）
配列番号１，４４５      ＲＰＬ３５−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ
配列番号１，４４６      ＲＰＬ２１−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ
配列番号１，４４７      ＡＴＰ５Ａ１−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ
配列番号１，４４８      ＨＳＤ１７Ｂ４−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ
配列番号１，４４９      ＡＩＧ１−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ
配列番号１，４５０      ＣＯＸ６Ｃ−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ
配列番号１，４５１      ＡＳＡＨ１−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ
配列番号１，４５２      ５’末端オリゴピリミジン領域を有しないヒトリボソームタンパク質ラージ３５（ＲＰＬ３５）の５’ＵＴＲ
配列番号１，４５３      ５’末端オリゴピリミジン領域を有しないヒトリボソームタンパク質ラージ２１（ＲＰＬ２１）の５’ＵＴＲ
配列番号１，４５４      ５’末端オリゴピリミジン領域を有しないヒトＡＴＰシンターゼ、Ｈ＋輸送、ミトコンドリアＦ１複合体アルファサブユニット１、心筋（ＡＴＰ５Ａ１）の５’ＵＴＲ
配列番号１，４５５      ５’末端オリゴピリミジン領域を有しないヒトヒドロキシステロイド（１７−ベータ）デヒドロゲナーゼ４（ＨＳＤ１７Ｂ４）の５’ＵＴＲ
配列番号１，４５６      ５’末端オリゴピリミジン領域を有しないヒトアンドロゲン誘導１（ＡＩＧ１）の５’ＵＴＲ
配列番号１，４５７      ５’末端オリゴピリミジン領域を有しないヒトシトクロームｃオキシダーゼサブユニットＶＩｃ（ＣＯＸ６Ｃ）の５’ＵＴＲ
配列番号１，４５８      ５’末端オリゴピリミジン領域を有しないヒトＮ−アシルスフィンゴシンアミドヒドロラーゼ（酸性セラミダーゼ）１（ＡＳＡＨ１）の５’ＵＴＲ
配列番号１，４５９      ５’末端オリゴピリミジン領域を有しないマウスリボソームタンパク質ラージ２１（ｍＲＰＬ２１）の５’ＵＴＲ
配列番号１，４６０      ５’末端オリゴピリミジン領域を有しないマウスリボソームタンパク質ラージ３５Ａ（ｍＲＰＬ３５Ａ）の５’ＵＴＲ
配列番号１，４６１      マウスリボソームタンパク質ラージ２１（ｍＲＰＬ２１）
配列番号１，４６２      マウスリボソームタンパク質ラージ３５Ａ（ｍＲＰＬ３５Ａ）
配列番号１，４６３      ＲＰＬ３２−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−Ａ６４（図１０）
配列番号１，４６４      ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−Ａ６４−ヒストンＳＬ（図９）
配列番号１，４６５      ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン７−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ
配列番号１，４６６      ＲＰＬ３５−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−Ａ６４（図２２）
配列番号１，４６７      ＲＰＬ２１−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−Ａ６４（図２３）
配列番号１，４６８      ａｔｐ５ａ１−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−Ａ６４（図２４）
配列番号１，４６９      ＨＳＤ１７Ｂ４−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−Ａ６４（図２５）
配列番号１，４７０      ＡＩＧ１−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−Ａ６４（図２６）
配列番号１，４７１      ＣＯＸ６Ｃ−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−Ａ６４（図２７）
配列番号１，４７２      ＡＳＡＨ１−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−Ａ６４（図２８）
配列番号１，４７３      ＲＰＬ３５−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−Ａ６４−ヒストンＳＬ（図２９）
配列番号１，４７４      ＲＰＬ２１−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−Ａ６４−ヒストンＳＬ（図３０）
配列番号１，４７５      ａｔｐ５ａ１−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−Ａ６４−ヒストンＳＬ（図３１）
配列番号１，４７６      ＨＳＤ１７Ｂ４−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−Ａ６４−ヒストンＳＬ（図３２）
配列番号１，４７７      ＡＩＧ１−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−Ａ６４−ヒストンＳＬ（図３３）
配列番号１，４７８      ＣＯＸ６Ｃ−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−Ａ６４−ヒストンＳＬ（図３４）
配列番号１，４７９      ＡＳＡＨ１−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−Ａ６４−ヒストンＳＬ（図３５）
配列番号１，４８０      ＲＰＬ３２−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−Ａ６４−ヒストンＳＬ（図１１）
配列番号１，４８１      ＲＰＬ３２−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン７−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ（図１３）
【実施例】
【０２９４】
１．  ＤＮＡテンプレートの調製
Ｔ７プロモーターに続いて、キタアメリカホタルルシフェラーゼ（ｐｐＬｕｃ（ＧＣ））をコードしているＧＣリッチ配列及びＡ６４ポリ（Ａ）配列を含むインビトロ転写用ベクターを構築した。インビトロ転写前にベクターを線形化するために用いられる制限酵素部位をポリ（Ａ）配列に続いて配置した。インビトロ転写によってこのベクターから得られたｍＲＮＡを「ｐｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−Ａ６４」と命名する。
【０２９５】
このベクターを、オープンリーディングフレームの５’側又は３’側に非翻訳領域を含むように改変した。要約すると、以下のｍＲＮＡコード配列を含むベクターを作製した：
配列番号１，３６４      ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−Ａ６４（図６）
配列番号１，３６５      ＲＰＬ３２−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ（図７）：
配列番号１，４３６      ＲＰＬ３５−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン７−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ（図１４）
配列番号１，４３７      ＲＰＬ２１−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン７−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ（図１５）
配列番号１，４３８      ＡＴＰ５Ａ１−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン７−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ（図１６）
配列番号１，４３９      ＨＳＤ１７Ｂ４−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン７−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ（図１７）
配列番号１，４４０      ＡＩＧ１−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン７−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ（図１８）
配列番号１，４４１      ＣＯＸ６Ｃ−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン７−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ（図１９）
配列番号１，４４２      ＡＳＡＨ１−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン７−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ（図２０）
配列番号１，４４３      ｍＲＰＬ２１−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン７−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ（図３７）
配列番号１，４４４      ｍＲＰＬ３５Ａ−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン７−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ（図３８）
配列番号１，４４５      ＲＰＬ３５−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ
配列番号１，４４６      ＲＰＬ２１−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ
配列番号１，４４７      ＡＴＰ５Ａ１−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ
配列番号１，４４８      ＨＳＤ１７Ｂ４−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ
配列番号１，４４９      ＡＩＧ１−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ
配列番号１，４５０      ＣＯＸ６Ｃ−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ
配列番号１，４５１      ＡＳＡＨ１−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ
配列番号１，４６３      ＲＰＬ３２−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−Ａ６４（図１０）
配列番号１，４６４      ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−Ａ６４−ヒストンＳＬ（図９）
配列番号１，４６５      ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン７−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ
配列番号１，４６６      ＲＰＬ３５−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−Ａ６４（図２２）
配列番号１，４６７      ＲＰＬ２１−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−Ａ６４（図２３）
配列番号１，４６８      ａｔｐ５ａ１−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−Ａ６４（図２４）
配列番号１，４６９      ＨＳＤ１７Ｂ４−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−Ａ６４（図２５）
配列番号１，４７０      ＡＩＧ１−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−Ａ６４（図２６）
配列番号１，４７１      ＣＯＸ６Ｃ−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−Ａ６４（図２７）
配列番号１，４７２      ＡＳＡＨ１−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−Ａ６４（図２８）
配列番号１，４７３      ＲＰＬ３５−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−Ａ６４−ヒストンＳＬ（図２９）
配列番号１，４７４      ＲＰＬ２１−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−Ａ６４−ヒストンＳＬ（図３０）
配列番号１，４７５      ａｔｐ５ａ１−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−Ａ６４−ヒストンＳＬ（図３１）
配列番号１，４７６      ＨＳＤ１７Ｂ４−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−Ａ６４−ヒストンＳＬ（図３２）
配列番号１，４７７      ＡＩＧ１−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−Ａ６４−ヒストンＳＬ（図３３）
配列番号１，４７８      ＣＯＸ６Ｃ−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−Ａ６４−ヒストンＳＬ（図３４）
配列番号１，４７９      ＡＳＡＨ１−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−Ａ６４−ヒストンＳＬ（図３５）
配列番号１，４８０      ＲＰＬ３２−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−Ａ６４−ヒストンＳＬ（図１１）
配列番号１，４８１      ＲＰＬ３２−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン７−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ（図１３）。
【０２９６】
２．  インビトロ転写
実施例１に係るＤＮＡテンプレートを線形化し、Ｔ７−ポリメラーゼを用いてインビトロで転写させた。次いで、ＤＮＡテンプレートをＤＮａｓｅ処理によって分解した。過剰のＮ７−メチル−グアノシン−５’−トリホスフェートー５’−グアノシンを転写反応物に添加することによって、５’−キャップ構造を含むｍＲＮＡ転写産物を得た。このようにして得られたｍＲＮＡを精製し、水に再懸濁させた。
【０２９７】
３．  ｍＲＮＡリポフェクションによるルシフェラーゼ発現
１ウェル当たり５×１０４個の細胞という密度になるようにヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）を２４ウェルプレートに播種した。次の日、細胞をｏｐｔｉ−ＭＥＭで洗浄し、次いで、ｏｐｔｉ−ＭＥＭ中リポフェクタミン２０００複合体化ｐｐＬｕｃコードｍＲＮＡ（１ウェル当たり５０ｎｇ）でトランスフェクトした。コントロールとして、ｐｐＬｕｃをコードしていないｍＲＮＡを別個にリポフェクトした。トランスフェクション効率を制御するために、ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ルシフェラーゼ（ＲｒＬｕｃ）をコードしているｍＲＮＡをＰｐＬｕｃ  ｍＲＮＡと共にトランスフェクトした（１ウェル当たりＲｒＬｕｃ  ｍＲＮＡ２０ｎｇ）。トランスフェクション開始の９０分間後、ｏｐｔｉ−ＭＥＭを培地に交換した。トランスフェクションの２４時間後、４８時間後、７２時間後、培地を吸引し、リシスバッファ２００μＬ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５（ＨＣｌ）、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％  グリセロール、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ）に細胞を溶解させた。ルシフェラーゼ活性を測定するまで溶解物を−２０℃で保存した。
或いは、ＨＤＦを９６ウェルプレートに播種し、１日間後〜３日間後に１ウェル当たり１０４個の細胞の密度でトランスフェクトした。リポフェクション直前に、ｏｐｔｉ−ＭＥＭで細胞を洗浄した。リポフェクタミン２０００と複合体化している１ウェル当たり２５ｎｇのＰｐＬｕｃコードｍＲＮＡで細胞をリポフェクトした。幾つかの実験では、トランスフェクション効率を制御するためにウミシイタケルシフェラーゼ（ＲｅＬｕｃ）をコードしているｍＲＮＡをＰｐＬｕｃ  ｍＲＮＡと共にトランスフェクトした（１ウェル当たりＲｒＬｕｃ  ｍＲＮＡ２．５ｎｇ）。トランスフェクション開始の９０分間後、ｏｐｔｉ−ＭＥＭを培地に交換した。トランスフェクション後の様々な時点において、培地を吸引し、リシスバッファ１００μＬ（Ｐａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ，Ｐｒｏｍｅｇａ）に細胞を溶解させた。ルシフェラーゼ活性を測定するまで溶解物を−８０℃で保存した。
【０２９８】
４．  ルシフェラーゼ測定
ＢｉｏＴｅｋ  ＳｙｎｅｒｇｙＨＴプレートリーダーによって相対光単位（ＲＬＵ）としてルシフェラーゼ活性を測定した。ＰｐＬｕｃ活性は、溶解物５０μＬ及びルシフェリンバッファ２００μＬ（７５μＭ  ルシフェリン、２５ｍＭ  グリシルグリシン、ｐＨ７．８（ＮａＯＨ）、１５ｍＭ  ＭｇＳＯ４、２ｍＭ  ＡＴＰ）を用いて、１５秒間の測定時間で測定した。ＲｒＬｕｃ活性は、溶解物５０μＬ及びセレンテラジンバッファ２００μＬ（５００ｍＭ  ＮａＣｌに調整したリン酸緩衝生理食塩水中４０μＭセレンテラジン）を用いて、１５秒間の測定時間で測定した。
或いは、Ｈｉｄｅｘ  Ｃｈａｍｅｌｅｏｎプレートリーダーによって相対光単位（ＲＬＵ）としてルシフェラーゼ活性を測定した。ＰｐＬｕｃ活性は、溶解物２０μＬ及びルシフェリンバッファ５０μＬ（Ｂｅｅｔｌｅ−Ｊｕｉｃｅ，ＰＪＫ  ＧｍｂＨ）を用いて、２秒間の測定時間で測定した。ＲｒＬｕｃ活性は、溶解物２０μＬ及びセレンテラジンバッファ５０μＬ（Ｒｅｎｉｌｌａ−Ｊｕｉｃｅ，ＰＪＫ  ＧｍｂＨ）を用いて、２秒間の測定時間で測定した。
【０２９９】
結果
５．１  ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲに由来する５’ＵＴＲエレメントとヒストンステムループとの組み合わせは、タンパク質発現を強く増加させる
ｍＲＮＡからのタンパク質産生に対するＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲに由来する５’ＵＴＲエレメントとヒストンステムループ（ヒストンＳＬ）との組み合わせの効果について調べるために、様々なＵＴＲを有するｍＲＮＡを合成した：５’ＵＴＲエレメント及びヒストンＳＬのいずれも有しないｍＲＮＡ、又は５’ＵＴＲエレメント及びヒストンＳＬを両方含むｍＲＮＡ。ルシフェラーゼをコードしているｍＲＮＡ又はコントロールｍＲＮＡをヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後にルシフェラーゼレベルを測定した（以下の表１及び図８を参照）。
【０３００】
【表５】
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【０３０１】
ルシフェラーゼは、５’ＵＴＲエレメントもヒストンＳＬも有しないｍＲＮＡから明らかに発現していた。しかし、驚くべきことに、５’ＵＴＲエレメントとヒストンＳＬとの組み合わせは、ルシフェラーゼレベルを強く増加させた。同じｍＲＮＡにおいて５’ＵＴＲエレメントとヒストンＳＬとを組み合わせたことによるルシフェラーゼレベルの増加の程度は、これらが相乗的に作用することを示す。
【０３０２】
５．２  ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲ由来の５’ＵＴＲエレメントとヒストンステムループとの組み合わせは、ｍＲＮＡからのタンパク質産生を相乗的に増加させる
ｍＲＮＡからのタンパク質発現に対するＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲに由来する５’ＵＴＲエレメントとヒストンステムループとの組み合わせの効果について調べるために、様々なＵＴＲを有するｍＲＮＡを合成した：５’ＵＴＲエレメント及びヒストンＳＬのいずれも有しないｍＲＮＡ、又は５’ＵＴＲエレメント若しくはヒストンステムループを含むｍＲＮＡ、又は５’ＵＴＲエレメント及びヒストンＳＬを両方含むｍＲＮＡ。ルシフェラーゼをコードしているｍＲＮＡをヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）にトランスフェクトした。トランスフェクションの８時間後、２４時間後、及び４８時間後にルシフェラーゼレベルを測定した（以下の表２及び図１２を参照）。
【０３０３】
【表６】
2018007682.tif 000025
【０３０４】
ルシフェラーゼは、５’ＵＴＲエレメントもヒストンステムループも有しないｍＲＮＡから明らかに発現していた。ヒストンステムループ又は５’ＵＴＲエレメントのいずれかを有するｍＲＮＡでは、これらエレメントをいずれも有しないｍＲＮＡに比べてルシフェラーゼレベルが増加した。しかし、驚くべきことに、５’ＵＴＲエレメントとヒストンステムループとの組み合わせは、個々のエレメントのいずれかでみられたレベルを遥かに超えてルシフェラーゼレベルを更に強く増加させた。同じｍＲＮＡにおいて５’ＵＴＲエレメントとヒストンステムループとを組み合わせたことによるルシフェラーゼレベルの増加の程度は、これらが相乗的に作用することを示す。
両エレメントを組み合わせたｍＲＮＡから得られたシグナルを、両エレメントを有しないｍＲＮＡから得られたシグナルと５’ＵＴＲエレメントによるシグナル増加とヒストンステムループによるシグナル増加との合計で除することによって、５’ＵＴＲエレメントとヒストンステムループとの相乗作用を定量した。この計算は、３つの時点で個別に実施し、また曲線下面積（ＡＵＣ）から計算した０時間〜４８時間に発現した全タンパク質についても実施した（以下の表３を参照）。
【０３０５】
【表７】
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【０３０６】
このようにして計算した相乗作用は、５’ＵＴＲエレメント及びヒストンステムループの効果が純粋に相加的である場合に予測されるよりも、５’ＵＴＲエレメントとヒストンステムループとを組み合わせたｍＲＮＡから得られるルシフェラーゼレベルの方がどれだけ高いかを示す。この結果は、５’ＵＴＲエレメントとヒストンステムループとの組み合わせが、タンパク質発現を著しく相乗的に増加させることを確認するものである。
【０３０７】
５．３  ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲに由来する５’ＵＴＲエレメントは、ｍＲＮＡからのタンパク質発現を増加させる
ｍＲＮＡからのタンパク質発現に対するＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲに由来する５’ＵＴＲエレメントの効果について調べるために、様々な５’ＵＴＲエレメントのうちの１つを有するｍＲＮＡを合成した。更に、ｍＲＮＡは、アルブミン７の３’ＵＴＲエレメントを含んでいた。ルシフェラーゼをコードしているｍＲＮＡをヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、４８時間後、及び７２時間後にルシフェラーゼレベルを測定した（以下の表４及び図２１を参照）。
【０３０８】
【表８】
2018007682.tif 000027
【０３０９】
ルシフェラーゼは、５’ＵＴＲエレメントを有しないｍＲＮＡから明らかに発現していた。しかし、驚くべきことに、５’ＵＴＲエレメントは、ルシフェラーゼレベルを強く増加させた。
【０３１０】
５．４  ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲに由来する５’ＵＴＲエレメントとヒストンステムループとの組み合わせは、ｍＲＮＡからのタンパク質発現を相乗的に増加させる
ｍＲＮＡからのタンパク質発現に対するＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲに由来する５’ＵＴＲエレメントとヒストンステムループとの組み合わせの効果について調べるために、様々なＵＴＲを有するｍＲＮＡを合成した：５’ＵＴＲエレメント及びヒストンステムループのいずれも有しないｍＲＮＡ、ヒストンステムループを含むｍＲＮＡ、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲに由来する様々な５’ＵＴＲエレメントのうちの１つを含むｍＲＮＡ、又は様々な５’ＵＴＲエレメントのうちの１つとヒストンステムループとの両方を含むｍＲＮＡ。更に、ｍＲＮＡは、α−グロビンの３’ＵＴＲエレメントを含んでいた。ルシフェラーゼをコードしているｍＲＮＡをヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）にトランスフェクトした。トランスフェクションの８時間後、２４時間後、及び４８時間後にルシフェラーゼレベルを測定した（図３６を参照）。ルシフェラーゼは、５’ＵＴＲエレメントもヒストンステムループも有しないｍＲＮＡから明らかに発現していた。ヒストンステムループは、ルシフェラーゼレベルを増加させた。また、全ての５’ＵＴＲエレメントが、ルシフェラーゼレベルを増加させた。しかし、驚くべきことに、５’ＵＴＲエレメントとヒストンステムループとの組み合わせは、個々のエレメントのいずれかでみられたレベルを遥かに超えてルシフェラーゼレベルを更に強く増加させた。同一のｍＲＮＡにおいて５’ＵＴＲエレメントとヒストンステムループとを組み合わせたことによるルシフェラーゼレベルの増加の程度は、これらが相乗的に作用することを示す。
【０３１１】
両エレメントを組み合わせたｍＲＮＡから得られたシグナルを、両エレメントを有しないｍＲＮＡから得られたシグナルと５’ＵＴＲエレメントによるシグナル増加とヒストンステムループによるシグナル増加との合計で除することによって、５’ＵＴＲエレメントとヒストンステムループとの相乗作用を定量した。この計算は、曲線下面積（ＡＵＣ）から計算した０時間〜４８時間に発現した全タンパク質について実施した（以下の表５を参照）。
【０３１２】
【表９】
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【０３１３】
このようにして計算した相乗作用は、５’ＵＴＲエレメント及びヒストンステムループの効果が純粋に相加的である場合に予測されるよりも、５’ＵＴＲエレメントとヒストンステムループとを組み合わせたｍＲＮＡから得られるルシフェラーゼレベルの方がどれだけ高いかを示す。５’ＵＴＲエレメントとヒストンステムループとを組み合わせたｍＲＮＡから得られるルシフェラーゼレベルは、これらの効果が純粋に相加的である場合よりも最大３倍超高かった。この結果は、５’ＵＴＲエレメントとヒストンステムループとの組み合わせが、タンパク質発現における著しく相乗的に増加させることを確認するものである。
【０３１４】
５．５  マウスＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲに由来する５’ＵＴＲエレメントは、ｍＲＮＡからのタンパク質発現を増加させる
ｍＲＮＡからのタンパク質発現に対するマウスＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲに由来するＴＯＰ５’ＵＴＲエレメントの効果について調べるために、２つの異なるマウス５’ＵＴＲエレメントを有するｍＲＮＡを合成した。更に、ｍＲＮＡは、アルブミン７の３’ＵＴＲエレメントを含んでいた。ルシフェラーゼをコードしているｍＲＮＡをヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）にトランスフェクトした。比較のために、ヒトｒｐｌ３２の５’ＵＴＲエレメントを含有するｍＲＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、４８時間後、及び７２時間後にルシフェラーゼレベルを測定した（以下の表６及び図３９を参照）。
【０３１５】
【表１０】
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【０３１６】
ルシフェラーゼは、５’ＵＴＲエレメントを有しないｍＲＮＡから明らかに発現していた。マウス５’ＵＴＲエレメントは、両方とも、ヒト５’ＵＴＲエレメントと同様にルシフェラーゼレベルを強く増加させた。
【０３１７】
配列
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年8月22日(2017.8.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．  配列番号１，３６８、１，４５２、１，４５３、１，４５４、１，４５５、１，４５６、１，４５７又は１，４５８のいずれかに係る核酸配列又は対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含むか、又は前記核酸配列からなる、或いは、配列番号１，３６８、１，４５２、１，４５３、１，４５４、１，４５５、１，４５６、１，４５７又は１，４５８のいずれかに係る核酸配列又は対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列の断片を含むか、又は前記断片からなる少なくとも１つの５’−非翻訳領域エレメント（５’ＵＴＲエレメント）と、
ｂ．  少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と、
を含むことを特徴とする人工核酸分子。
【請求項２】
ｃ．  少なくとも１つのヒストンステムループ
を更に含む請求項１に記載の人工核酸分子。
【請求項３】
５’ＵＴＲエレメントとオープンリーディングフレームとが、異種である請求項１から２のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項４】
５’ＵＴＲエレメントが、人工核酸分子からのタンパク質産生を増加させるのに好適である請求項１から３のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項５】
５’ＵＴＲエレメントが、ＴＯＰモチーフを含まない請求項１から４のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項６】
５’ＵＴＲエレメントが、その５’末端において、ポリピリミジン領域の下流の位置１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０に位置するヌクレオチドで始まる請求項１から５のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項７】
５’ＵＴＲエレメントが、その３’末端において、前記５’ＵＴＲが由来する遺伝子の開始コドンの上流の位置１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０に位置するヌクレオチドで終わる請求項１から６のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項８】
５’ＵＴＲエレメントが、開始コドンもオープンリーディングフレームも含まない請求項１から７のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項９】
少なくとも１つのヒストンステムループが、以下の式（Ｉ）及び（ＩＩ）のいずれかから選択される請求項２から８のいずれかに記載の人工核酸分子：
式（Ｉ）（ステム境界エレメントを含まないステムループ配列）：
【化１】
2018007682.tif 000292
式（ＩＩ）（ステム境界エレメントを含むステムループ配列）：
【化２】
2018007682.tif 000293
（式中、
ステム１又はステム２の境界エレメントＮ１−６は、１個〜６個のＮの連続配列であり、各Ｎは、互いに独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、及びＣから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチドアナログから選択され、
ステム１［Ｎ０−２ＧＮ３−５］は、エレメントステム２に対して逆相補的であるか又は部分的に逆相補的であり、且つ５個〜７個のヌクレオチドの連続配列であり、Ｎ０−２は、０個〜２個のＮの連続配列であり、各Ｎは、互いに独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、及びＣから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチドアナログから選択され、Ｎ３−５は、３個〜５個のＮの連続配列であり、各Ｎは、互いに独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、及びＣから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチドアナログから選択され、Ｇは、グアノシン又はそのアナログであり、シチジン又はそのアナログによって置換されてもよいが、但し、その場合、ステム２におけるその相補的ヌクレオチドであるシチジンも、グアノシンによって置換され、
ループ配列［Ｎ０−４（Ｕ／Ｔ）Ｎ０−４］は、エレメントステム１とステム２との間に位置し、且つ３個〜５個のヌクレオチドの連続配列であり、各Ｎ０−４は、互いに独立して、０個〜４個のＮの連続配列であり、各Ｎは、互いに独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、及びＣから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチドアナログから選択され、Ｕ／Ｔは、ウリジン又はチミジンを表し、
ステム２［Ｎ３−５ＣＮ０−２］は、エレメントステム１に対して逆相補的であるか又は部分的に逆相補的であり、且つ５個〜７個のヌクレオチドの連続配列であり、Ｎ３−５は、３個〜５個のＮの連続配列であり、各Ｎは、互いに独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、及びＣから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチドアナログから選択され、Ｎ０−２は、０個〜２個のＮの連続配列であり、各Ｎは、互いに独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、及びＣから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチドアナログから選択され、Ｃは、シチジン又はそのアナログであり、グアノシン又はそのアナログによって置換されてもよいが、但し、その場合、ステム１におけるその相補的ヌクレオチドであるグアノシンも、シチジンによって置換され、
ステム１及びステム２は、互いに塩基対合して、ステム１とステム２との間に塩基対合が生じ得る逆相補的配列を形成することができるか、或いは、互いに塩基対合して、ステム１とステム２との間に不完全な塩基対合が生じ得る部分的に逆相補的な配列を形成することができる）。
【請求項１０】
少なくとも１つのヒストンステムループが、以下の式（Ｉａ）及び（ＩＩａ）のうちの少なくとも１つから選択される請求項２から９のいずれかに記載の人工核酸分子：
式（Ｉａ）（ステム境界エレメントを含まないステムループ配列）：
【化３】
2018007682.tif 000294
式（ＩＩａ）（ステム境界エレメントを含むステムループ配列）：
【化４】
2018007682.tif 000295
。
【請求項１１】
ｄ．  ポリ（Ａ）配列及びポリアデニル化シグナルの少なくともいずれか
を更に含む請求項１から１０のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項１２】
ｅ．  ポリ（Ｃ）配列
を更に含む請求項１から１１のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項１３】
ｆ．  少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメント
を更に含む請求項１から１２のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項１４】
少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメントが、安定なｍＲＮＡを提供する遺伝子の３’ＵＴＲ又は安定なｍＲＮＡを提供する遺伝子の３’ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる請求項１３に記載の人工核酸分子。
【請求項１５】
少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメントと少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメントとが、少なくとも相加的に作用して、人工核酸分子からのタンパク質産生を増加させる請求項１３から１４のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項１６】
５’ＵＴＲエレメントが、配列番号１〜１，３６３、配列番号１，４３５、配列番号１，４６１、及び配列番号１，４６２からなる群より選択される核酸配列；配列番号１〜１，３６３、配列番号１，４３５、配列番号１，４６１、及び配列番号１，４６２のいずれかのホモログ、又はこれらの変異体に由来する核酸配列を含み、
前記変異体が、その変異体が由来する自然界に存在する５’ＵＴＲと少なくとも９５％同一であり、
前記ホモログが、配列番号１〜１，３６３、配列番号１，４３５、配列番号１，４６１、及び配列番号１，４６２のいずれかに係る配列に対して相同性を有する脊椎動物由来の配列であり、配列番号１〜１，３６３、配列番号１，４３５、配列番号１，４６１、及び配列番号１，４６２のいずれかに係る配列と少なくとも９５％同一である請求項１から１５のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項１７】
５’ＵＴＲエレメントが、配列番号１〜１，３６３、配列番号１，４３５、配列番号１，４６１、及び配列番号１，４６２のいずれかから選択される核酸配列、又は対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含む、或いは、少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメントが、配列番号１〜１，３６３、配列番号１，４３５、配列番号１，４６１、及び配列番号１，４６２のいずれかから選択される核酸配列、又は対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列の断片を含む請求項１から１６のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項１８】
少なくとも１つのヒストンステムループが、配列番号１，３９１〜１４３３からなる群より選択される核酸配列を含むか又はからなる請求項２から１７のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項１９】
ヒストンステムループが、配列番号１，４３３に係る配列又は対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列を含むか又はからなる請求項２から１８のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項２０】
３’ＵＴＲエレメントが、アルブミン遺伝子、α−グロビン遺伝子、β−グロビン遺伝子、チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子、リポキシゲナーゼ遺伝子、及びコラーゲンアルファ遺伝子からなる群より選択される遺伝子の３’ＵＴＲに由来する核酸配列、又はアルブミン遺伝子、α−グロビン遺伝子、β−グロビン遺伝子、チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子、リポキシゲナーゼ遺伝子、及びコラーゲンアルファ遺伝子からなる群より選択される遺伝子の３’ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる請求項１３から１９のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項２１】
少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメントが、ヒトのアルブミン遺伝子の３’ＵＴＲ又はその変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる請求項１３から２０のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項２２】
少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメントが、ヒトのα−グロビン遺伝子の３’ＵＴＲ又はその変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる請求項１３から２０のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項２３】
少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメントが、配列番号１，３６９〜１，３７７及び１，４３４から選択される核酸配列又は対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含むか又はからなる、或いは、少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメントが、配列番号１，３６９〜１，３７７及び１，４３４から選択される核酸配列又は対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列の断片を含むか又はからなる請求項１３から２２のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項２４】
人工核酸分子が、少なくとも部分的にＧ／Ｃ改変されている請求項１から２３のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項２５】
ＲＮＡである請求項１から２４のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項２６】
ａ．  配列番号１，３６８、１，４５２、１，４５３、１，４５４、１，４５５、１，４５６、１，４５７又は１，４５８のいずれかに係る核酸配列又は対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含むか又は前記核酸配列からなる、或いは、配列番号１，３６８、１，４５２、１，４５３、１，４５４、１，４５５、１，４５６、１，４５７又は１，４５８のいずれかに係る核酸配列又は対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列の断片を含むか、又は前記断片からなる少なくとも１つの５’−非翻訳領域エレメント（５’ＵＴＲエレメント）と、
ｂ．  少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）及び少なくとも１つのクローニングサイトの少なくともいずれかと、
を含むことを特徴とするベクター。
【請求項２７】
ｃ．  少なくとも１つのヒストンステムループ
を更に含む請求項２６に記載のベクター。
【請求項２８】
ＤＮＡベクターである請求項２６から２７のいずれかに記載のベクター。
【請求項２９】
請求項１から２５のいずれかに記載の人工核酸分子を含むか又はコードしている請求項２６から２８のいずれかに記載のベクター。
【請求項３０】
請求項１から２５のいずれかに記載の人工核酸分子又は請求項２６から２９のいずれかに記載のベクターを含むことを特徴とする細胞。
【請求項３１】
請求項１から２５のいずれかに記載の人工核酸分子、請求項２６から２９のいずれかに記載のベクター、又は請求項３０に記載の細胞を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項３２】
医薬として使用するための請求項１から２５のいずれかに記載の人工核酸分子、請求項２６から２９のいずれかに記載のベクター、請求項３０に記載の細胞、又は請求項３１に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
ワクチンとして又は遺伝子治療において使用するための請求項１から２５のいずれかに記載の人工核酸分子、請求項２６から２９のいずれかに記載のベクター、請求項３０に記載の細胞、又は請求項３１に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
人工核酸分子からのタンパク質産生を増加させる方法であって、
配列番号１，３６８、１，４５２、１，４５３、１，４５４、１，４５５、１，４５６、１，４５７又は１，４５８のいずれかに係る核酸配列又は対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含むか又はからなる、或いは、配列番号１，３６８、１，４５２、１，４５３、１，４５４、１，４５５、１，４５６、１，４５７又は１，４５８のいずれかに係る核酸配列又は対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列の断片を含むか、又は前記断片からなる少なくとも１つの５’−非翻訳領域エレメント（５’ＵＴＲエレメント）
を含む人工核酸分子を提供する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項３５】
前記人工核酸分子が、
少なくとも１つのヒストンステムループと、
ポリ（Ａ）配列及びポリアデニル化シグナルの少なくともいずれかと、
の少なくともいずれかを更に含む請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
核酸分子からのタンパク質産生を増加させるための、配列番号１，３６８、１，４５２、１，４５３、１，４５４、１，４５５、１，４５６、１，４５７又は１，４５８のいずれかに係る核酸配列又は対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含むか又はからなる、或いは、配列番号１，３６８、１，４５２、１，４５３、１，４５４、１，４５５、１，４５６、１，４５７又は１，４５８のいずれかに係る核酸配列又は対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列の断片を含むか、又は前記断片からなる５’ＵＴＲエレメントの使用。
【請求項３７】
請求項１から２５のいずれかに記載の人工核酸分子、請求項２６から２９のいずれかに記載のベクター、請求項３０に記載の細胞、及び請求項３１に記載の医薬組成物の少なくともいずれかを含むことを特徴とするキット又はキットオブパーツ。
【請求項３８】
使用説明書と、トランスフェクション用の細胞と、アジュバントと、医薬組成物の投与手段と、人工核酸分子、ベクター、又は医薬組成物を溶解又は希釈するための薬学的に許容できる担体及び薬学的に許容できる溶液の少なくともいずれかとを更に含む請求項３７に記載のキット。