(57)【要約】      （修正有）【課題】癌治療において有用な、リンカー−薬物およびこれを用いた抗体−薬物複合体の提供。【解決手段】式（Ｉ）：Ｃ−（Ｌ−Ｄ）ｍで表されるリンカー−薬物。式中、Ｃは結合リンカー；Ｌはリンカーユニット；Ｄは薬物ユニットであり、ｍは１から４までの整数である。結合リンカーの構造は式（ＩＩ）で表され、式中、Ｘは脱離基；Ｒ１およびＲ２は単結合または−ＮＨ−；Ｚはアリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、直鎖アルキル、シクロアルキル等；式中の波線はＬとの共有結合部位を表す。2018138538.tif 000060【選択図】図１
2018138538.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）で表されるリンカー−薬物：
Ｃ−（Ｌ−Ｄ）ｍ                    （Ｉ）
式中、Ｃは結合リンカーであり、Ｌはリンカーユニットであり、Ｄは薬物ユニットであり、ｍは１から４までの整数であり、前記結合リンカーの構造は式（ＩＩ）：
2018138538.tif 000052
により表され、式中、Ｘは脱離基であり、Ｒ１およびＲ２はいずれも単結合または−ＮＨ−であり、 Ｚはアリール、 置換アリール、 ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、 直鎖アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、 またはこれらの組み合わせであり、式（ＩＩ）の波線はＬとの共有結合部位を表す。
【請求項２】
Ｒ１およびＲ２が、互いにオルト位、メタ位、またはパラ位でＺに結合し、Ｚは式（ＩＩＩ）によって表される、請求項１に記載のリンカー−薬物：
2018138538.tif 000053
式中、Ｑは、Ｈ、ニトロ、シアノ、ヒドロキシル、アルコキシ、アミノ、アミド、エステル、スルファミド、尿素、直鎖アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリールを含む置換基であり、ｎは０から３までの整数であり、ベンゼンの１つまたは複数の−ＣＨ−は、置換されていないか、またはＮで置換されている。
【請求項３】
前記結合リンカーの構造が、式（ＩＩａ）、式（ＩＩｂ）、式（ＩＩｃ）、または式（ＩＩｄ）：
2018138538.tif 000054
によって表される、請求項１または２に記載のリンカー−薬物。
【請求項４】
前記リンカーユニットには、開裂可能な（cleavable）リンカーまたは開裂不可能な（non-cleavable）リンカーが含まれ、前記開裂可能なリンカーには、−バリン−シトルリン−（−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−）、−バリン−リジン−（−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−）、−バリン−アルギニン−（−Ｖａｌ−Ａｒｇ−）、−フェニルアラニン−シトルリン−（−Ｐｈｅ−Ｃｉｔ−）、−フェニルアラニン−リジン−（−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−）、および−フェニルアラニン−アルギニン−（−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−）からなる群より選ばれるペプチドユニット（−ＡＡ−）が含まれる、請求項１〜３のいずれか１項に記載のリンカー−薬物。
【請求項５】
−（Ｌ−Ｄ）が式（ＩＩＩａ）または（ＩＩＩｂ）により表される、請求項１〜４のいずれか１項に記載のリンカー−薬物：
2018138538.tif 000055
式中、Ｌは、直鎖アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ポリ（エチレングリコール）鎖、またはこれらの組み合わせであり、Ｄの各々は独立して細胞毒性薬、抗自己免疫疾患薬、または抗炎症薬であり、ｏは１から４までの整数であり、ｐは１から４までの整数であり、ｑは１から４までの整数である。
【請求項６】
前記薬物ユニットには、アマニチン（amanitin）、アントラサイクリン（anthracycline）、アウリスタチン（auristatin）、バッカチン（baccatin）、カリケアマイシン（calicheamicin）、カンプトテシン（camptothecin）、セマドチン（cemadotin）、コルヒチン（colchicine）、コルシミド（colcimid）、コンブレタスタチン（combretastatin）、クリプトフィシン（cryptophysin）、ディスコデルモリド（discodermolide）、ドセタキセル（docetaxel）、ドキソルビシン（doxorubicin）、デュオカルマイシン（duocarmycin）、エキノマイシン（echinomycin）、エリュテロビン（eleutherobin）、エポチロン（epothilone）、エストラムスチン（estramustine）、レキシトロプシン（lexitropsin）、メイタンシン（maytansine）、メイタンシノイド（maytansinoid）、メトトレキサート（methotrexate）、ネトロプシン（netropsin）、ピロロ−［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジ−アゼピン（pyrrolo[2,1-c][1,4]benzodi-azepine, ＰＢＤ）、ピューロマイシン（puromycin）、リゾキシン（rhizoxin）、ＳＮ−３８、タキサン（taxane）、チューブリシン（tubulysin）、またはビンカアルカロイド（vinca alkaloid）が含まれる、請求項１〜５のいずれか１項に記載のリンカー−薬物。
【請求項７】
前記脱離基が、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−Ｆ、−ＯＴｓ、−ＯＭｓ、−ＯＴｆまたは−ＯＢｓである、請求項１〜６のいずれか１項に記載のリンカー−薬物。
【請求項８】
式（ＩＶ）で表される抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）：
Ａ−Ｃ’−（Ｌ−Ｄ）ｍ                    （ＩＶ）
式中、Ａは、完全長抗体、抗体フラグメント、タンパク質、またはポリペプチドであり、Ｃ’−（Ｌ−Ｄ）ｍ  はリンカー−薬物であり、ただしＣ’は結合リンカー、Ｌはリンカーユニット、Ｄは薬物ユニットであり、ｍは１から４までの整数であり、
Ａは、Ａの２つのシステイン残基中にそれぞれ存在する２つのチオール基を介して前記リンカー−薬物と結合し、
Ａ−Ｃ’は式（Ｖ）で表される下記構造：
2018138538.tif 000056
を含み、式中、Ｒ１およびＲ２はいずれも単結合または−ＮＨ−であり、Ｚはアリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、直鎖アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、またはこれらの組み合わせであり、式（Ｖ）の破線はＬとの共有結合部位を表し、Ａ’は、Ａの２つのシステイン残基中にそれぞれ存在する２つのチオール基を介して前記リンカー−薬物と結合するＡの残りの部分を表す。
【請求項９】
Ａが、細胞表面受容体または腫瘍関連抗原を標的とする、請求項８に記載の抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）。
【請求項１０】
前記抗体が、キメラ抗体もしくは機能的に活性なそのフラグメント、ヒト化抗体もしくは機能的に活性なそのフラグメント、ヒト抗体もしくは機能的に活性なそのフラグメント、マウス抗体もしくは機能的に活性なそのフラグメント、ラット抗体もしくは機能的に活性なそのフラグメント、ヤギ抗体もしくは機能的に活性なそのフラグメント、またはウサギ抗体もしくは機能的に活性なそのフラグメントである、請求項８または９に記載の抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）。
【請求項１１】
Ｒ１およびＲ２が、互いにオルト位、メタ位、またはパラ位でＺに結合し、Ｚは式（ＩＩＩ）によって表される、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）：
2018138538.tif 000057
式中、Ｑは、Ｈ、ニトロ、シアノ、ヒドロキシル、アルコキシ、アミノ、アミド、エステル、スルファミド、尿素、直鎖アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリールを含む置換基であり、ｎは０から３までの整数であり、ベンゼンの１つまたは複数の−ＣＨ−は置換されていないか、またはＮで置換されている。
【請求項１２】
Ａ−Ｃ’が、式（Ｖａ）、式（Ｖｂ）、式（Ｖｃ）、または式（Ｖｄ）で表される下記の構造：
2018138538.tif 000058
を含む、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）。
【請求項１３】
前記リンカーユニットには、開裂可能な（cleavable）リンカーまたは開裂不可能な（non-cleavable）リンカーが含まれ、前記開裂可能なリンカーには、−バリン−シトルリン−（−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−）、−バリン−リジン−（−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−）、−バリン−アルギニン−（−Ｖａｌ−Ａｒｇ−）、−フェニルアラニン−シトルリン−（−Ｐｈｅ−Ｃｉｔ−）、−フェニルアラニン−リジン−（−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−）、および−フェニルアラニン−アルギニン−（−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−）からなる群より選ばれるペプチドユニット（−ＡＡ−）が含まれる、請求項８〜１２のいずれか１項に記載の抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）。
【請求項１４】
−（Ｌ−Ｄ）が式（ＩＩＩａ）または（ＩＩＩｂ）により表されるものである、請求項８〜１３のいずれか１項に記載の抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）：
2018138538.tif 000059
式中、Ｌは、直鎖アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ポリ（エチレングリコール）鎖、またはこれらの組み合わせであり、Ｄの各々は独立して細胞毒性薬、抗自己免疫疾患薬、または抗炎症薬であり、ｏは１から４までの整数であり、ｐは１から４までの整数であり、ｑは１から４までの整数である。
【請求項１５】
前記薬物ユニットには、アマニチン（amanitin）、アントラサイクリン（anthracycline）、アウリスタチン（auristatin）、バッカチン（baccatin）、カリケアマイシン（calicheamicin）、カンプトテシン（camptothecin）、セマドチン（cemadotin）、コルヒチン（colchicine）、コルシミド（colcimid）、コンブレタスタチン（combretastatin）、クリプトフィシン（cryptophysin）、ディスコデルモリド（discodermolide）、ドセタキセル（docetaxel）、ドキソルビシン（doxorubicin）、デュオカルマイシン（duocarmycin）、エキノマイシン（echinomycin）、エリュテロビン（eleutherobin）、エポチロン（epothilone）、エストラムスチン（estramustine）、レキシトロプシン（lexitropsin）、メイタンシン（maytansine）、メイタンシノイド（maytansinoid）、メトトレキサート（methotrexate）、ネトロプシン（netropsin）、ピロロ−［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジ−アゼピン（pyrrolo[2,1-c][1,4]benzodi-azepine, ＰＢＤ）、ピューロマイシン（puromycin）、リゾキシン（rhizoxin）、ＳＮ−３８、タキサン（taxane）、チューブリシン（tubulysin）、またはビンカアルカロイド（vinca alkaloid）が含まれる、請求項８〜１４のいずれか１項に記載の抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年１２月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／４３５２７４号の利益を主張し、その全体が参照として本明細書に援用される。
【０００２】
技術分野
本技術分野は、リンカー−薬物およびこれを用いた抗体−薬物複合体（antibody-drug conjugate , ＡＤＣ）に関する。
【背景技術】
【０００３】
癌治療において、多くの細胞毒性薬分子は、癌細胞を選択的に殺傷することができないため、癌の療法に用いることができない。故に、抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）が新規な治療剤として開発されている。一般に、ＡＤＣは３つの部分、つまり抗体、リンカーおよび薬物の３つの部分から構成されており、このうちリンカーは抗体を薬物に結合させる。ＡＤＣの作用のメカニズムについて以下に記述する。先ず、抗体が、腫瘍細胞上の特定の抗原、または腫瘍細胞上に過剰発現した抗原を認識し、その抗原に結合する。抗原に結合するとすぐ、その結合複合体は、腫瘍細胞内へ内在化し、よって結合した薬物を腫瘍細胞内に届ける。腫瘍細胞内では、抗体が消化されるか、またはリンカーが開裂し、次いで薬物が活性形態で放出されて、標的腫瘍細胞を殺傷し、選択的毒性効果が達成されることとなる。
【０００４】
ＡＤＣに用いられるリンカーは、次のような数個の要求を満たすことが要される。リンカーは、薬物が早期に放出されるのを防ぐため、ヒト血漿中を循環するときに安定である必要がある。腫瘍細胞内への内在化時に、開裂可能なリンカーは特定の条件下で開裂して薬物を放出し得るが、一方、開裂不可能（non-cleavable）なリンカーでは、薬物部分は、薬物、リンカー、およびプロテアーゼにより分解されたリガンドに由来するアミノ酸残基を含有する活性形態で放出される。
【０００５】
現在使われている臨床ＡＤＣ構造では、薬物は異なるリンカーを介しリジン残基またはヒンジ領域システイン残基に連結される（鎖間ジスルフィド結合の完全／部分的な還元の後）。最適化ＤＡＲ（薬物抗体比）は２〜４であるのが好ましい。抗体表面上の多数のリジン残基と非選択的な結合モードは、結合部位および結合される薬物の数を不確実なものとする。例えば、リジンベースの結合に属するＫａｄｃｙｌａ（登録商標）（アド-トラスツズマブエムタンシン;Roche）中には、数十個の結合部位があると考えられている。同じ様に、抗体は、ヒンジ領域に４つの還元可能な鎖間ジスルフィド結合のみを含むが、最適な平均ＤＡＲ２〜４を有するＡＤＣを得るために、部分的に還元されかつ結合されなければならない。一般に用いられる還元剤（ＤＴＴ、ＴＣＥＰなど）はヒンジ領域のジスルフィド結合を選択的に還元することができないため、得られる結合生成物（conjugation product）も均一でない。例えば、アドセトリス（Adcetris）（登録商標）（ブレンツキシマブベドチン;Seattle Genetics） は、システインベースの結合に属し、ＤＡＲが０、２、４、６および８の複合体を含む。特定のＤＡＲ値を有する部分についても、それは異なる結合部位で結合される薬物を有する複合体を含む混合物である。ＡＤＣ生成物の不均一性（heterogeneity）は最終的に、異なる部分（fraction）にそれぞれ異なる薬物動態、有効性、および毒性をもたらすことになり得る。また、ＡＤＣ生成物の不均一性は、凝集および半減期の低下にもつながる可能性がある。
【０００６】
ＡＤＣ生成物の高い不均一性という課題を克服するため、近年では部位特異的結合（site-specific conjugation）技術に注目が集まっており、それは、薬物搭載の結合部位および化学量論（stoichiometric）の両方をコントロールするものである。しかし、これら技術において、抗体またはタンパク質のほとんどが遺伝子操作されたものである。このような突然変異誘発は、さらなる薬物結合またはペグ化（pegylation）のために、実質的な作業を進行すると共に特別な注意を払って有利な変異部位を持つ抗体をスクリーニングする必要があることから、時間がかかり、かつ非費用効率的である。
【０００７】
加えて、大部分の臨床ＡＤＣでは、マレイミドが抗体の結合部位として用いられているが、マレイミドは解離し易いことから、結果として半減期が短くなってしまう。かかるケースでは、ＡＤＣが腫瘍細胞内へ内在化する前に、抗体と薬物との間のリンカーが壊れてしまい、早期に放出される薬物は標的腫瘍細胞を特異的に殺傷することができず、かつ選択的毒性効果が達成され得ない。
【０００８】
よって、ヒト血漿中における薬効および安定性を改善するための高い均一性および高い安定性を有する新規なＡＤＣが求められる。
【発明の概要】
【０００９】
１実施形態によれば、本開示は式（Ｉ）で表されるリンカー−薬物を提供する。
Ｃ−（Ｌ−Ｄ）ｍ                    （Ｉ）
【００１０】
式（Ｉ）中、Ｃは結合リンカーであり、Ｌはリンカーユニットであり、Ｄは薬物ユニットであり、ｍは１から４までの整数である。結合リンカーの構造は式（ＩＩ）により表される。
2018138538.tif 000003
【００１１】
式（ＩＩ）中、Ｘは脱離基であり、Ｒ１およびＲ２はいずれも単結合または−ＮＨ−であり、Ｚはアリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、直鎖アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、またはこれらの組み合わせである。式（ＩＩ）の波線はＬとの共有結合部位を表す。
【００１２】
別の実施形態によれば、本開示は式（ＩＶ）で表される抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）を提供する。
Ａ−Ｃ’−（Ｌ−Ｄ）ｍ                    （ＩＶ）
【００１３】
式（ＩＶ）中、Ａは完全長抗体、抗体フラグメント、タンパク質、またはポリペプチドであり、Ｃ’−（Ｌ−Ｄ）ｍはリンカー−薬物であり、ただしＣ’は結合リンカー、Ｌはリンカーユニット、Ｄは薬物ユニットであり、ｍは１から４までの整数である。Ａは、Ａの２つのシステイン残基中にそれぞれ存在する２つのチオール基を介してリンカー−薬物と結合する。
【００１４】
式（ＩＶ）中、Ａ−Ｃ’は、式（Ｖ）で表される下記構造を含む。
2018138538.tif 000004
【００１５】
式（Ｖ）中、Ｒ１およびＲ２はいずれも単結合または−ＮＨ−であり、Ｚはアリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、直鎖アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、またはこれらの組み合わせである。式（Ｖ）の破線はＬとの共有結合部位を表す。Ａ’は、Ａの２つのシステイン残基中にそれぞれ存在する２つのチオール基を介してリンカー−薬物と結合するＡの残りの部分を表す。
【００１６】
より具体的には、本発明は以下を提供する：
［１］式（Ｉ）で表されるリンカー−薬物：
Ｃ−（Ｌ−Ｄ）ｍ                    （Ｉ）
式中、Ｃは結合リンカーであり、Ｌはリンカーユニットであり、Ｄは薬物ユニットであり、ｍは１から４までの整数であり、前記結合リンカーの構造は式（ＩＩ）：
2018138538.tif 000005
により表され、式中、Ｘは脱離基であり、Ｒ１およびＲ２はいずれも単結合または−ＮＨ−であり、 Ｚはアリール、 置換アリール、 ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、 直鎖アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、 またはこれらの組み合わせであり、式（ＩＩ）の波線はＬとの共有結合部位を表す；
［２］Ｒ１およびＲ２が、互いにオルト位、メタ位、またはパラ位でＺに結合し、Ｚは式（ＩＩＩ）によって表される、［１］に記載のリンカー−薬物：
2018138538.tif 000006
式中、Ｑは、Ｈ、ニトロ、シアノ、ヒドロキシル、アルコキシ、アミノ、アミド、エステル、スルファミド、尿素、直鎖アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリールを含む置換基であり、ｎは０から３までの整数であり、ベンゼンの１つまたは複数の−ＣＨ−は、置換されていないか、またはＮで置換されている；
［３］前記結合リンカーの構造が、式（ＩＩａ）、式（ＩＩｂ）、式（ＩＩｃ）、または式（ＩＩｄ）：
2018138538.tif 000007
によって表される、［１］または［２］に記載のリンカー−薬物；
［４］前記リンカーユニットには、開裂可能な（cleavable）リンカーまたは開裂不可能な（non-cleavable）リンカーが含まれ、前記開裂可能なリンカーには、−バリン−シトルリン−（−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−）、−バリン−リジン−（−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−）、−バリン−アルギニン−（−Ｖａｌ−Ａｒｇ−）、−フェニルアラニン−シトルリン−（−Ｐｈｅ−Ｃｉｔ−）、−フェニルアラニン−リジン−（−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−）、および−フェニルアラニン−アルギニン−（−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−）からなる群より選ばれるペプチドユニット（−ＡＡ−）が含まれる、［１］〜［３］のいずれか１つに記載のリンカー−薬物；
［５］−（Ｌ−Ｄ）は式（ＩＩＩａ）または（ＩＩＩｂ）により表される、［１］〜［４］のいずれか１つに記載のリンカー−薬物：
2018138538.tif 000008
式中、Ｌは、直鎖アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ポリ（エチレングリコール）鎖、またはこれらの組み合わせであり、Ｄの各々は独立して細胞毒性薬、抗自己免疫疾患薬、または抗炎症薬であり、ｏは１から４までの整数であり、ｐは１から４までの整数であり、ｑは１から４までの整数である；
［６］前記薬物ユニットには、アマニチン（amanitin）、アントラサイクリン（anthracycline）、アウリスタチン（auristatin）、バッカチン（baccatin）、カリケアマイシン（calicheamicin）、カンプトテシン（camptothecin）、セマドチン（cemadotin）、コルヒチン（colchicine）、コルシミド（colcimid）、コンブレタスタチン（combretastatin）、クリプトフィシン（cryptophysin）、ディスコデルモリド（discodermolide）、ドセタキセル（docetaxel）、ドキソルビシン（doxorubicin）、デュオカルマイシン（duocarmycin）、エキノマイシン（echinomycin）、エリュテロビン（eleutherobin）、エポチロン（epothilone）、エストラムスチン（estramustine）、レキシトロプシン（lexitropsin）、メイタンシン（maytansine）、メイタンシノイド（maytansinoid）、メトトレキサート（methotrexate）、ネトロプシン（netropsin）、ピロロ−［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジ−アゼピン（pyrrolo[2,1-c][1,4]benzodi-azepine, ＰＢＤ）、ピューロマイシン（puromycin）、リゾキシン（rhizoxin）、ＳＮ−３８、タキサン（taxane）、チューブリシン（tubulysin）、またはビンカアルカロイド（vinca alkaloid）が含まれる、［１］〜［５］のいずれか１つに記載のリンカー−薬物；
［７］前記脱離基が、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−Ｆ、−ＯＴｓ、−ＯＭｓ、−ＯＴｆまたは−ＯＢｓである、［１］〜［６］のいずれか１つに記載のリンカー−薬物；
［８］式（ＩＶ）で表される抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）：
Ａ−Ｃ’−（Ｌ−Ｄ）ｍ                    （ＩＶ）
式中、Ａは、完全長抗体、抗体フラグメント、タンパク質、またはポリペプチドであり、Ｃ’−（Ｌ−Ｄ）ｍ  はリンカー−薬物であり、ただしＣ’は結合リンカー、Ｌはリンカーユニット、Ｄは薬物ユニットであり、ｍは１から４までの整数であり、
Ａは、Ａの２つのシステイン残基中にそれぞれ存在する２つのチオール基を介して前記リンカー−薬物と結合し、
Ａ−Ｃ’は式（Ｖ）で表される下記構造：
2018138538.tif 000009
を含み、式中、Ｒ１およびＲ２はいずれも単結合または−ＮＨ−であり、Ｚはアリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、直鎖アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、またはこれらの組み合わせであり、式（Ｖ）の破線はＬとの共有結合部位を表し、Ａ’は、Ａの２つのシステイン残基中にそれぞれ存在する２つのチオール基を介して前記リンカー−薬物と結合するＡの残りの部分を表す；
［９］Ａが、細胞表面受容体または腫瘍関連抗原を標的とする、［８］に記載の抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）；
［１０］前記抗体が、キメラ抗体もしくは機能的に活性なそのフラグメント、ヒト化抗体もしくは機能的に活性なそのフラグメント、ヒト抗体もしくは機能的に活性なそのフラグメント、マウス抗体もしくは機能的に活性なそのフラグメント、ラット抗体もしくは機能的に活性なそのフラグメント、ヤギ抗体もしくは機能的に活性なそのフラグメント、またはウサギ抗体もしくは機能的に活性なそのフラグメントである、［８］または［９］に記載の抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）；
［１１］Ｒ１およびＲ２が、互いにオルト位、メタ位、またはパラ位でＺに結合し、Ｚは式（ＩＩＩ）によって表される、［８］〜［１０］のいずれか１つに記載の抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）：
2018138538.tif 000010
式中、Ｑは、Ｈ、ニトロ、シアノ、ヒドロキシル、アルコキシ、アミノ、アミド、エステル、スルファミド、尿素、直鎖アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリールを含む置換基であり、ｎは０から３までの整数であり、ベンゼンの１つまたは複数の−ＣＨ−は置換されていないか、またはＮで置換されている；
［１２］Ａ−Ｃ’が、式（Ｖａ）、式（Ｖｂ）、式（Ｖｃ）、または式（Ｖｄ）で表される下記の構造：
2018138538.tif 000011
を含む、［８］〜［１１］のいずれか１つに記載の抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）；
［１３］前記リンカーユニットには、開裂可能な（cleavable）リンカーまたは開裂不可能な（non-cleavable）リンカーが含まれ、前記開裂可能なリンカーには、−バリン−シトルリン−（−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−）、−バリン−リジン−（−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−）、−バリン−アルギニン−（−Ｖａｌ−Ａｒｇ−）、−フェニルアラニン−シトルリン−（−Ｐｈｅ−Ｃｉｔ−）、−フェニルアラニン−リジン−（−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−）、および−フェニルアラニン−アルギニン−（−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−）からなる群より選ばれるペプチドユニット（−ＡＡ−）が含まれる、［８］〜［１２］のいずれか１つに記載の抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）；
［１４］−（Ｌ−Ｄ）が式（ＩＩＩａ）または（ＩＩＩｂ）により表されるものである、［８］〜［１３］のいずれか１つに記載の抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）：
2018138538.tif 000012
式中、Ｌは、直鎖アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ポリ（エチレングリコール）鎖、またはこれらの組み合わせであり、Ｄの各々は独立して細胞毒性薬、抗自己免疫疾患薬、または抗炎症薬であり、ｏは１から４までの整数であり、ｐは１から４までの整数であり、ｑは１から４までの整数である；
［１５］前記薬物ユニットには、アマニチン（amanitin）、アントラサイクリン（anthracycline）、アウリスタチン（auristatin）、バッカチン（baccatin）、カリケアマイシン（calicheamicin）、カンプトテシン（camptothecin）、セマドチン（cemadotin）、コルヒチン（colchicine）、コルシミド（colcimid）、コンブレタスタチン（combretastatin）、クリプトフィシン（cryptophysin）、ディスコデルモリド（discodermolide）、ドセタキセル（docetaxel）、ドキソルビシン（doxorubicin）、デュオカルマイシン（duocarmycin）、エキノマイシン（echinomycin）、エリュテロビン（eleutherobin）、エポチロン（epothilone）、エストラムスチン（estramustine）、レキシトロプシン（lexitropsin）、メイタンシン（maytansine）、メイタンシノイド（maytansinoid）、メトトレキサート（methotrexate）、ネトロプシン（netropsin）、ピロロ−［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジ−アゼピン（pyrrolo[2,1-c][1,4]benzodi-azepine, ＰＢＤ）、ピューロマイシン（puromycin）、リゾキシン（rhizoxin）、ＳＮ−３８、タキサン（taxane）、チューブリシン（tubulysin）、またはビンカアルカロイド（vinca alkaloid）が含まれる、［８］〜［１４］のいずれか１つに記載の抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）。
【００１７】
添付の図面を参照にしながら、下記の実施形態において詳細な説明を行う。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
添付の図面を参照しながら、下記の詳細な説明および実施例を読むことにより、本発明をより十分に理解することができる。
【図１】本開示の１実施形態によるハーセプチン−リンカー−薬物１のＨＩＣプロファイルを示している。
【図２】本開示の１実施形態によるハーセプチン−リンカー−薬物２のＨＩＣプロファイルを示している。
【図３】本開示の１実施形態によるハーセプチン−リンカー−薬物３のＨＩＣプロファイルを示している。
【図４】本開示の１実施形態によるハーセプチン−リンカー−薬物５のＨＩＣプロファイルを示している。
【図５】本開示の１実施形態によるハーセプチン−リンカー−薬物７のＨＩＣプロファイルを示している。
【図６】本開示の１実施形態によるハーセプチン−リンカー−薬物８のＨＩＣプロファイルを示している。
【図７】本開示の１実施形態によるハーセプチン−リンカー−薬物９のＨＩＣプロファイルを示している。
【図８】本開示の１実施形態によるハーセプチン−リンカー−薬物１１のＨＩＣプロファイルを示している。
【図９】本開示の１実施形態によるハーセプチン−リンカー−薬物１２のＨＩＣプロファイルを示している。
【図１０】本開示の１実施形態によるハーセプチン−リンカー−薬物１３のＨＩＣプロファイルを示している。
【図１１】本開示の１実施形態によるハーセプチン−リンカー−薬物１４のＨＩＣプロファイルを示している。
【図１２】本開示の１実施形態によるハーセプチン−リンカー−薬物１５のＨＩＣプロファイルを示している。
【図１３】本開示の１実施形態によるハーセプチン−リンカー−薬物１６のＨＩＣプロファイルを示している。
【図１４】本開示の１実施形態によるハーセプチン−リンカー−薬物Ｍ１のＨＩＣプロファイルを示している。
【図１５】本開示の１実施形態によるハーセプチン−リンカー−薬物７の保存試験の結果を示している。
【図１６】ＡＤＣ（ハーセプチン−リンカー−薬物３、ハーセプチン−リンカー−薬物８、ハーセプチン−リンカー−薬物９）で処理したＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞の細胞生存率を示している。
【図１７】ＡＤＣ（ハーセプチン−リンカー−薬物１４、ハーセプチン−リンカー−薬物１５、ハーセプチン−リンカー−薬物１６）で処理したＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞の細胞生存率を示している。
【図１８Ａ】ＡＤＣ（ハーセプチン−リンカー−薬物２、ハーセプチン−リンカー−薬物４、ハーセプチン−リンカー−薬物８、ハーセプチン−リンカー−薬物９）で処理したＪＩＭＴ−１細胞の細胞生存率を示している。
【図１８Ｂ】ＡＤＣ（ハーセプチン−リンカー−薬物７）で処理したＪＩＭＴ−１細胞の細胞生存率を示している。
【図１８Ｃ】ＡＤＣ（ハーセプチン−リンカー−薬物１１）で処理したＪＩＭＴ−１細胞の細胞生存率を示している。
【図１９】ＡＤＣ（ハーセプチン−リンカー−薬物１４、ハーセプチン−リンカー−薬物１５、ハーセプチン−リンカー−薬物１６）で処理したＪＩＭＴ−１細胞の細胞生存率を示している。
【図２０Ａ】ＡＤＣ（ハーセプチン−リンカー−薬物２、ハーセプチン−リンカー−薬物３、ハーセプチン−リンカー−薬物４）で処理したＢＴ−４７４細胞の細胞生存率を示している。
【図２０Ｂ】ＡＤＣ（ハーセプチン−リンカー−薬物８、ハーセプチン−リンカー−薬物９）で処理したＢＴ−４７４細胞の細胞生存率を示している。
【図２０Ｃ】ＡＤＣ（ハーセプチン−リンカー−薬物７、ハーセプチン−リンカー−薬物１１）で処理したＢＴ−４７４細胞の細胞生存率を示している。
【図２１】ＡＤＣ（ハーセプチン−リンカー−薬物１４、ハーセプチン−リンカー−薬物１５、ハーセプチン−リンカー−薬物１６）で処理したＢＴ−４７４細胞の細胞生存率を示している。
【図２２】本開示のいくつかの実施形態によるＢＴ−４７４異種移植モデル（xenograft model）におけるＡＤＣ注射マウスの腫瘍体積変化の結果を示している。
【図２３】本開示のいくつかの実施形態によるＥＣ  ＰＤＸモデルにおけるＡＤＣ注射マウスの腫瘍体積変化の結果を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
詳細な説明
以下の詳細な説明においては、説明の目的で、開示される実施形態が十分に理解されるよう多数の特定の詳細が記載される。しかし、これらの特定の詳細がなくとも、１つまたは複数の実施形態が実施可能であることは明らかであろう。また、図を簡潔とするために、既知の構造および装置は概略的に示されている。
【００２０】
本開示は、抗原の２つのシステイン残基（鎖間ジスルフィド結合の完全な／部分的な還元後）にそれぞれ存在する２つのチオール基に特異的に結合することのできる２つの結合点を有する新規な結合リンカー構造を提供する。よって、本開示により提供される当該新規な結合リンカー構造から得られる抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）は、改善された構造的安定性を備える。また、従来の抗体−薬物複合体に比して、より狭いＤＡＲ（薬物抗体比）分布も得られる。
【００２１】
上記新規な結合リンカー構造は、２つのアセトアミド基を含むように設計されている。２つのアセトアミド基は、鎖間チオール基 （鎖間ジスルフィド結合の還元後）に特異的に結合して、ジスルフィド結合に類似する構造を形成するのに用いられ、よってリンカーと抗体との間に安定な結合を提供する。一方、他の部分、例えば上記結合リンカー構造のＣ末端の官能基は、薬物ユニットまたはリンカー−薬物ユニットと結合して、抗体−薬物複合体を生じることができる。
【００２２】
よって得られた抗体−薬物複合体は、標的細胞、例えば腫瘍細胞に薬物を選択的に送達するのに用いることができる。抗体−薬物複合体は、細胞表面抗原に特異的に結合し、その結合複合体（binding complex）は即座に細胞に内在化され得る。一旦、内在化されると、薬物は特定の活性形態で放出されると共に、作用を発揮するようになる。従来のものと比較して、本開示により提供される抗体−薬物複合体は、構造的安定性が向上されただけでなく、薬理学な均一性も改善されている。
【００２３】
定義
以下の説明において、用語“抗体”には、受容体、抗原、または標的細胞と会合するその他の受容部分（receptive moiety）と結合するかまたは反応的に会合するかまたは複合化する完全長抗体または抗体フラグメントが含まれ得る。抗体は、治療的に改変されることになる細胞集団の部分と結合するか、複合化するか、または反応する任意のタンパク質、タンパク質様分子、またはペプチドであり得る。
【００２４】
いくつかの実施形態において、抗体は、キメラ抗体または機能的に活性なそのフラグメント、ヒト化抗体または機能的に活性なそのフラグメント、ヒト抗体または機能的に活性なそのフラグメントであり得る。他の実施形態では、抗体は、他の種由来の抗体、例えば、マウス抗体もしくは機能的に活性なそのフラグメント、ラット抗体もしくは機能的に活性なそのフラグメント、ヤギ抗体もしくは機能的に活性なそのフラグメント、またはウサギ抗体もしくは機能的に活性なそのフラグメントであってよい。
【００２５】
また他の実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１抗体もしくは機能的に活性なそのフラグメント、またはＩｇＧ４抗体もしくは機能的に活性なそのフラグメントであり得る。例えば抗体は、限定はされないが、ＨＬＸ−０７、ＥＧ１２０１４、抗−ＥｐＣＡＭ  ＡｂおよびＩｇＧ１、リツキシマブ（Rituximab）、イブリツモマブチウキセタン（Ibritumomab tiuxetan）、トシツモマブ（Tositumomab）、ブレンツキシマブ（Brentuximab）、アレムツズマブ（Alemtuzumab）、ＩＧＮ１０１、アデカツムマブ（Adecatumumab）、ラベツズマブ（Labetuzumab）、ｈｕＡ３３、ペムツモマブ（Pemtumomab）、オレゴボマブ（Oregovomab）、ＣＣ４９（ミンレツモマブ（minretumomab））、ｃＧ２５０、Ｊ５９１、ＭＯｖ１８、ファーレツズマブ（farletuzumab）（ＭＯＲＡｂ−００３）、３Ｆ８、ｃｈ１４．１８、ＫＷ−２８７１、ｈｕ３Ｓ１９３、ＩｇＮ３１１、ベバシズマブ（Bevacizumab）、ＩＭ−２Ｃ６、ＣＤＰ７９１、エタラシズマブ（Etaracizumab）、ボロシキシマブ（Volociximab）、セツキシマブ（Cetuximab）、パニツムマブ（Panitumumab）、ニモツズマブ（Nimotuzumab）、８０６、トラスツズマブ（Trastuzumab）、ペルツズマブ（Pertuzumab）、ＭＭ−１２１、ＡＭＧ  １０２、ＭＥＴＭＡＢ、ＳＣＨ  ９００１０５、ＡＶＥ１６４２、ＩＭＣ−Ａ１２、ＭＫ−０６４６、Ｒ１５０７、ＣＰ  ７５１８７１、ＫＢ００４、ＩＩＩＡ４、マパツムマブ（Mapatumumab）（ＨＧＳ−ＥＴＲ１）、レクサツムマブ（Lexatumumab）（ＨＧＳ−ＥＴＲ２）、ＣＳ−１００８、デノスマブ（Denosumab）、シブロツヅマブ（Sibrotuzumab）、Ｆ１９、８１Ｃ６、ヒト化抗ＨＥＲ２  ｍＡｂ、エドレコロマブ（Edrecolomab）、セツキシマブ（Cetuximab）、スマート（Smart）ＭＩ９５、リンホシド（LymphoCide）、スマート（Smart）ＩＤ１０、オンコリム（Oncolym）、アロムン（Allomune）、またはエプラツザマブ（Epratuzamab）であり得る。
【００２６】
いくつかの実施形態において、抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であってよい。いくつかの実施形態において、抗体は二重特異性抗体であってよい。いくつかの実施形態において、抗体はまた、標的抗原 （例えば、癌抗原、ウィルス抗原、微生物（microbial）抗原、または細胞もしくは基質に結合されるその他の抗体）に免疫特異的に（immuno-specifically）結合する抗体の、機能的に活性なフラグメント、誘導体または類縁体であってもよい。この点について、“機能的に活性（functionally active）”とは、フラグメント、誘導体または類縁体が、そのフラグメント、誘導体または類縁体の由来元である抗体が認識したのと同じ抗原を認識できることを意味する。他の有用な抗体には、抗体のフラグメント、例えば、限定はされないが、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’、Ｆｖフラグメント、抗体の重鎖および軽鎖二量体、またはＦｖｓもしくは一本鎖抗体（ＳＣＡ）のようなその任意の最小のフラグメントが含まれる。
【００２７】
他の実施形態では、抗体は、抗体の融合タンパク質、または機能的に活性なそのフラグメントである。例えば、抗体は、抗体ではない別のタンパク質のアミノ酸配列（またはその一部、例えばタンパク質の少なくとも１０、２０または５０個のアミノ酸部分）と共有結合（例えばペプチド結合）によりＮ末端またはＣ末端のいずれかで融合され得る。
【００２８】
いくつかの実施形態において、抗体には、修飾された、つまり任意のタイプの分子の共有結合による類縁体および誘導体も含まれる。ただし、かかる共有結合は、抗体にその抗原結合免疫特異性を保たせ得るものであることが要される。例えば、限定するつもりはないが、抗体の誘導体および類縁体には、例として、グリコシル化、アセチル化、ペグ化（pegylation）、リン酸化、アミド化、既知の保護／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解開裂（proteolytic cleavage）、細胞抗体ユニットまたはその他のタンパク質への連結などによってさらに修飾されたものも含まれる。任意の多数の化学修飾は、限定はされないが、特定の化学開裂、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシン存在下での代謝合成などを含む既知の技術により実施することができる。さらに、類縁体または誘導体は１つまたは複数の非天然アミノ酸を含んでいてよい。いくつかの実施形態において、抗体は、Fc受容体と相互作用するアミノ酸残基中に修飾（例えば、置換、欠失、または付加）を有し得る。
【００２９】
癌の治療に利用可能な抗体の例には、限定はされないが、ヒト化抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）（トラスツズマブ；Genentech）、非ホジキンリンパ腫患者の治療に用いるキメラ抗ＣＤ２０モノクローナル抗体であるＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標（リツキシマブ；Genentech）、卵巣癌の治療に用いるマウス抗体であるＯｖａＲｅｘ（AltaRex Corporation,MA）、大腸癌の治療に用いるマウスＩｇＧ２ａ抗体であるＰａｎｏｒｅｘ（Glaxo Wellcome,NC）、頭頸部癌のような上皮成長因子陽性癌（epidermal growth factor positive cancer）の治療に用いる抗−ＥＧＦＲ ＩｇＧキメラ抗体であるＣｅｔｕｘｉｍａｂ  Ｅｒｂｉｔｕｘ（Imclone Systems Inc.,NY）、肉腫の治療に用いるヒト化抗体であるＶｉｔａｘｉｎ（Medimmune,Inc.,MD）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）の治療に用いるヒト化ＩｇＧ１抗体であるＣａｍｐａｔｈ Ｉ／Ｈ（Leukosite,MA）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の治療に用いるヒト化抗ＣＤ３３ ＩｇＧ抗体であるＳｍａｒｔ  ＭＩ９５（Protein Design Labs,Inc.,CA）、非ホジキンリンパ腫の治療に用いるヒト化抗ＣＤ２２ ＩｇＧ抗体であるＬｙｍｐｈｏＣｉｄｅ（Immunomedics,Inc.,NJ）、非ホジキンリンパ腫の治療に用いるヒト化抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体であるＳｍａｒｔ ＩＤ１０（Protein Design Labs,Inc.,CA）、非ホジキンリンパ腫の治療に用いる放射標識マウス抗−ＨＬＡ−Ｄｒ１０抗体であるＯｎｃｏｌｙｍ（Techniclone, Inc.,CA）、ホジキン病または非ホジキンリンパ腫の治療に用いるヒト化抗−ＣＤ２  ｍＡｂであるＡｌｌｏｍｕｎｅ（BioTransplant,CA）、肺および大腸癌の治療に用いる抗−ＶＥＧＦヒト化抗体であるＡｖａｓｔｉｎ（Genentech,Inc.,CA）、非ホジキンリンパ腫の治療に用いる抗−ＣＤ２２抗体であるＥｐｒａｔｕｚａｍａｂ（Immunomedics,Inc.,NJ and Amgen,CA）、ならびに大腸癌の治療に用いるヒト化抗−ＣＥＡ抗体であるＣＥＡｃｉｄｅ（Immunomedics,NJ）が含まれる。
【００３０】
癌の治療に有用な他の抗体には、限定はされないが、以下の抗原（括弧内に例示の癌が示されている）:ＣＡ１２５（卵巣）、ＣＡ１５−３（癌腫（carcinoma））、ＣＡ１９−９（癌腫）、Ｌ６（癌腫）、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ（癌腫）、Ｌｅｗｉｓ  Ｘ（癌腫）、α−フェトプロテイン（癌腫）、ＣＡ  ２４２（大腸）、胎盤性アルカリフォスファターゼ（placental alkaline phosphatase）（癌腫）、前立腺特異的膜抗原（prostate specific membrane antigen ）（前立腺）、前立腺酸性フォスファターゼ（prostatic acid phosphatase）（前立腺）、上皮成長因子（癌腫）、ＭＡＧＥ−１（癌腫）、ＭＡＧＥ−２（癌腫）、ＭＡＧＥ−３（癌腫）、ＭＡＧＥ−４（癌腫）、抗トランスフェリン受容体（癌腫）、ｐ９７（メラノーマ）、ＭＵＣ１−ＫＬＨ（乳癌）、ＣＥＡ（大腸）、ｇｐ１００（メラノーマ）、ＭＡＲＴ１（メラノーマ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）（前立腺）、ＩＬ−２受容体（Ｔ細胞白血病およびリンパ種）、ＣＤ２０（非ホジキンリンパ腫）、ＣＤ５２（白血病）、ＣＤ３３（白血病）、ＣＤ２２（リンパ種）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（癌腫）、ＣＤ３８（多発性骨髄腫）、ＣＤ４０（リンパ種）、ムチン（癌腫）、Ｐ２１（癌腫）、ＭＰＧ（メラノーマ）、およびＮｅｕ癌遺伝子産物（oncogene product）（癌腫）に対する抗体が含まれる。
【００３１】
いくつかの実施形態において、抗体は、例えば、抗核抗体、抗ｄｓ  ＤＮＡ、抗ｓｓ  ＤＮＡ、抗カルジオリピン抗体ＩｇＭ・ＩｇＧ、抗リン脂質抗体ＩｇＭ・ＩｇＧ、抗ＳＭ抗体、抗ミトコンドリア抗体、甲状腺抗体、ミクロソーム抗体、サイログロブリン抗体、抗−ＳＣＬ７０、抗Ｊｏ、抗Ｕ１  ＲＮＰ、抗Ｌａ／ＳＳＢ、抗ＳＳＡ、抗ＳＳＢ、抗壁細胞（perital cell）抗体、抗ヒストン、抗ＲＮＰ、Ｃ  ＡＮＣＡ、Ｐ  ＡＮＣＡ、抗セントロメア、抗フィブリラリン（anti fibrillarin）、および抗ＧＢＭ抗体のような自己免疫疾患の治療に対し、免疫特異的なものである。１実施形態では、抗体は、自己免疫疾患に関連する活性化リンパ球に結合する。
【００３２】
ある実施形態では、抗体は、標的細胞（例えば、活性化リンパ球）上に発現する受容体または受容体複合体に結合し得る。受容体または受容体複合体には、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーメンバー、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー、インテグリン、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、主要組織適合タンパク質（major histocompatibility protein）、レクチンまたは補体制御タンパク質（complement control protein）が含まれ得る。適した免疫グロブリンスーパーファミリーメンバーの限定されない例は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２８、ＣＤ７９、ＣＤ９０、ＣＤ１５２／ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、およびＩＣＯＳである。適したＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーの限定されない例は、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＣＤ９５／Ｆａｓ、ＣＤ１３４／ＯＸ４０、ＣＤ１３７／４  １ＢＢ、ＴＮＦ  Ｒ１、ＴＮＦＲ２、ＲＡＮＫ、ＴＡＣＩ、ＢＣＭＡ、オステオプロテグリン、Ａｐｏ２／ＴＲＡＩＬ  Ｒ１、ＴＲＡＩＬ  Ｒ２、ＴＲＡＩＬ  Ｒ３、ＴＲＡＩＬ  Ｒ４、およびＡＰＯ３である。適したインテグリンの限定されない例は、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＣＤ２９、ＣＤ４１、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ１０３、およびＣＤ１０４である。適したレクチンの限定されない例は、Ｃ型、Ｓ型、およびＩ型レクチンである。
【００３３】
また抗体は、標的細胞または標的細胞集団上に存在する抗体であってもよい。例えば、膜貫通ポリペプチドおよびその他のマーカーは、１つまたは複数の正常な細胞（例えば非癌細胞）と比較して、１つまたは複数の特定のタイプの標的細胞（例えば癌細胞）の表面に特異的に発現し得る。かかるマーカーは、正常な細胞の表面上のそれらに比べ、標的細胞の表面により豊富に発現するか、またはより優れた免疫原性を示す場合が多い。かかる細胞表面抗原ポリペプチドの同定は、抗体に基づく療法（antibody-based therapy）を通して細胞を特異的に狙い破壊する能力を生みだしてきた。よって、いくつかの実施形態において、抗体には、限定はされないが、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対する抗体が含まれる。
【００３４】
用語“薬物ユニット”または“Ｄ”は、所望の生物活性および本開示の複合体（conjugate）に薬物を組み込むのに用いられ得る反応性官能基を有する任意の化合物のことをいう。いくつかの実施形態において、薬物ユニットは、癌治療に有用な細胞毒性薬；毒素、例えばアブリン、リシンＡ、緑膿菌外毒素、およびジフテリア毒素のような所望の生物活性を有するタンパク質またはポリペプチドを示し；他の適したタンパク質には、腫瘍壊死因子、αインターフェロン、βインターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノーゲンアクチベーター、および生体応答修飾物質（biological response modifier）、例えばリンホカイン、インターロイキン-1 （ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、またはその他の成長因子が含まれる。
【００３５】
１実施形態において、薬物ユニットは、アウリスタチン、例えばモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、およびアウリスタチンＦ（ＡＦ）のような微小管阻害薬であり得る。別の実施形態では薬物ユニットは、メイタンシノイド、例えばＤＭ１、ＤＭ３、およびＤＭ４のような微小管阻害薬であり得る。別の実施形態では、薬物ユニットは、カリケアミシン、デュオカルマイシン、ＳＮ−３８、およびピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジ−アゼピン（pyrrolo[2,1-c][1,4]benzodi-azepine,ＰＢＤ）のようなＤＮＡ損傷剤であり得る。また他の実施形態では、薬物ユニットは、アマニチン（amanitin）、アントラサイクリン（anthracycline）、バッカチン（baccatin）、カンプトテシン（camptothecin）、セマドチン（cemadotin）、コルヒチン（colchicine）、コルシミド（colcimid）、コンブレタスタチン（combretastatin）、クリプトフィシン（cryptophycin）、ディスコデルモリド（discodermolide）、ドセタキセル（docetaxel）、ドキソルビシン（doxorubicin）、エキノマイシン（echinomycin）、エリュテロビン（eleutherobin）、エポチロン（epothilone）、エストラムスチン（estramustine）、レキシトロプシン（lexitropsin）、メイタンシン（maytansine）、メトトレキサート（methotrexate）、ネトロプシン（netropsin）、ピューロマイシン（puromycin）、リゾキシン（rhizoxin）、タキサン（taxane）、チューブリシン（tubulysin）、またはビンカアルカロイド（vinca alkaloid）であり得る。
【００３６】
薬物は上述した範囲に限定はされず、ＡＤＣに用いることのできる全てが含まれるという点に留意すべきである。
【００３７】
本開示に記載される用語“リンカーユニット”には、開裂可能なリンカーまたは開裂不可能なリンカーが含まれる。開裂可能なリンカーは、化学的に不安定なリンカーおよび酵素的に不安定な（enzyme-labile）リンカーであり得る。高い血漿安定性ならびに優れた細胞内開裂選択性および効率のために、酵素的に不安定なリンカーがＡＤＣ中の開裂可能なリンカーの候補として広く選ばれている。いくつかの実施形態において、酵素的に不安定なリンカーには、−バリン−シトルリン−（valline-citruline）（−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−）、−バリン−リジン−（−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−）、−バリン−アルギニン−（−Ｖａｌ−Ａｒｇ−）、−フェニルアラニン−シトルリン−（−Ｐｈｅ−Ｃｉｔ−）、−フェニルアラニン−リジン−（−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−）、および−フェニルアラニン−アルギニン−（−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−）からなる群より選ばれるペプチドユニット（−ＡＡ−）が含まれ得る。代表的な酵素的に不安定なリンカーには−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−および−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−が含まれ、それはカテプシンＢによって認識され得る。いくつかの実施形態において、開裂不可能なリンカーは、得られるＡＤＣの親水性を高めることのできるリンカーであり得る。１実施形態では、開裂不可能なリンカーには、１つまたは複数のポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）が含まれ得る。他の実施形態では、開裂不可能なリンカーは、ＰＥＧ、ＰＥＧジアミン（ＮＨ２−ＰＥＧ−ＮＨ２）、アミン−ＰＥＧ−ヒドロキシル（ＮＨ２−ＰＥＧ−ＯＨ）、アミン−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ（ＮＨ２−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ）、ジエチレントリアミン、またはこれらの組み合わせであってよい。いくつかの実施形態において、ＰＥＧは下記により表されるものであり得る。
2018138538.tif 000013
式中、ｘは１から２０までの整数であってよい。
【００３８】
本開示において記載される用語“結合リンカー”または“−Ｃ”は、抗体に結合するためのリンカーとして用いられる新規な結合リンカー構造のことをいう。結合リンカーについての詳細な説明は以下の段落に述べられる。
【００３９】
１実施形態において、本開示は式（Ｉ）で表されるリンカー−薬物を提供する。
Ｃ−（Ｌ−Ｄ）ｍ                    （Ｉ）
【００４０】
式（Ｉ）中、Ｃは結合リンカーであり、Ｌはリンカーユニットであり、Ｄは薬物ユニットであり、ｍは１から４までの整数である。結合リンカー（−Ｃ）は式（ＩＩ）により表される。
2018138538.tif 000014
【００４１】
式（ＩＩ）中、Ｘは脱離基である。いくつかの実施形態において、脱離基（−Ｘ）は−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−Ｆ、−ＯＴｓ、−ＯＭｓ、−ＯＴｆまたは−ＯＢｓであり得る。式（ＩＩ）中、Ｒ１およびＲ２  はいずれも単結合または−ＮＨ−であり、Ｚはアリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、直鎖アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、またはこれらの組み合わせである。式（ＩＩ）の波線はＬとの共有結合部位を表す。
【００４２】
式（ＩＩ）中、Ｒ１およびＲ２は、互いにオルト位、メタ位、またはパラ位でＺに結合する。Ｚは式（ＩＩＩ）によって表される。
2018138538.tif 000015
【００４３】
Ｑは、Ｈ、ニトロ、シアノ、ヒドロキシル、アルコキシ、アミノ、アミド、エステル、スルファミド、尿素、直鎖アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリールを含む置換基であり、ｎは０から３までの整数である。式（ＩＩＩ）中、ベンゼンの１つまたは複数の−ＣＨ−は置換されていなくてもよいか、またはＮで置換されていてもよい。
【００４４】
いくつかの実施形態において、結合リンカーの構造（−Ｃ）は、式（ＩＩａ）、式（ＩＩｂ）、式（ＩＩｃ）、または式（ＩＩｄ）によって表される。
2018138538.tif 000016
【００４５】
しかしながら、上記構造は単に例に過ぎず、本開示の範囲が限定されることは意図されていないという点を理解すべきである。
【００４６】
いくつかの実施形態において、リンカーユニット（−Ｌ）には、開裂可能なリンカーまたは開裂不可能なリンカーが含まれ得る。いくつかの実施形態において、開裂可能なリンカーには、−バリン−シトルリン−（−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−）、−バリン−リジン−（−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−）、−バリン−アルギニン−（−Ｖａｌ−Ａｒｇ−）、−フェニルアラニン−シトルリン−（−Ｐｈｅ−Ｃｉｔ−）、−フェニルアラニン−リジン−（−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−）、および−フェニルアラニン−アルギニン−（−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−）からなる群より選ばれるペプチドユニット（−ＡＡ−）が含まれ得る。いくつかの実施形態において、ペプチドユニット（−ＡＡ−）は、１つまたは複数の酵素、例えば腫瘍関連プロテアーゼにより、酵素的に開裂されて、薬物ユニット（−Ｄ）を遊離させることができる。いくつかの実施形態において、開裂不可能なリンカーは、得られるＡＤＣの親水性を高めることのできるリンカーであり得る。１実施形態では、開裂不可能なリンカーには、１つまたは複数のポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）が含まれ得る。他の実施形態では、開裂不可能なリンカーは、ＰＥＧ、ＰＥＧジアミン（ＮＨ２−ＰＥＧ−ＮＨ２）、アミン−ＰＥＧ−ヒドロキシル（ＮＨ２−ＰＥＧ−ＯＨ）、アミン−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ（ＮＨ２−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ）、ジエチレントリアミン、またはこれらの組み合わせであり得る。いくつかの実施形態において、ＰＥＧは下式により表されるものであってよい。
2018138538.tif 000017
式中、ｘは１から２０までの整数であり得る。
【００４７】
いくつかの実施形態において、薬物ユニット（−Ｄ）は、リンカーユニット（−Ｌ）への結合部位としての−プロリン−（−Ｐｒｏ−）をさらに含む。
【００４８】
式（Ｉ）中、−（Ｌ−Ｄ）は式（ＩＩＩａ）または（ＩＩＩｂ）により表されるものであり得る。
2018138538.tif 000018
【００４９】
Ｌは、直鎖アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ポリ（エチレングリコール）鎖、またはこれらの組み合わせである。Ｄの各々は独立して細胞毒性薬、抗自己免疫疾患薬、または抗炎症薬であり、o は１から４までの整数であり、pは１から４までの整数であり、qは１から４までの整数である。−（Ｌ−Ｄ）が式（ＩＩＩｂ）で表されるものであるとき、薬物の結合数（conjugating number）は式（ＩＩＩａ）で表される−（Ｌ−Ｄ）の結合数の２倍である。設計に応じて他の−（Ｌ−Ｄ）のバリエーションがあり、より多くの薬物の結合数を有する−（Ｌ−Ｄ）を提供できる、という点を理解すべきである。
【００５０】
いくつかの実施形態において、 薬物ユニット（−Ｄｏ）は、リンカーユニット（−Ｌ）への結合部位として−プロリン−（−Ｐｒｏ−）をさらに含む。いくつかの他の実施形態では、薬物ユニット（Ｄｐ）は、Ｌへの結合部位として−プロリン−（−Ｐｒｏ−）をさらに含む。いくつかの他の実施形態では、薬物ユニット（Ｄｑ）は、Ｌへの結合部位として−プロリン−（−Ｐｒｏ−）をさらに含む。
【００５１】
式（Ｉ）において、薬物ユニットには、アマニチン（amanitin）、アントラサイクリン（anthracycline）、アウリスタチン（auristatin）、バッカチン（baccatin）、カリケアマイシン（calicheamicin）、カンプトテシン（camptothecin）、セマドチン（cemadotin）、コルヒチン（colchicine）、コルシミド（colcimid）、コンブレタスタチン（combretastatin）、クリプトフィシン（cryptophycin）、ディスコデルモリド（discodermolide）、ドセタキセル（docetaxel）、ドキソルビシン（doxorubicin）、デュオカルマイシン（duocarmycin）、エキノマイシン（echinomycin）、エリュテロビン（eleutherobin）、エポチロン（epothilone）、エストラムスチン（estramustine）、レキシトロプシン（lexitropsin）、メイタンシン（maytansine）、メイタンシノイド（maytansinoid）、メトトレキサート（methotrexate）、ネトロプシン（netropsin）、ピロロ−［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジ−アゼピン（pyrrolo[2,1-c][1,4]benzodi-azepine, ＰＢＤ）、ピューロマイシン（puromycin）、リゾキシン（rhizoxin）、ＳＮ−３８、タキサン（taxane）、チューブリシン（tubulysin）、またはビンカアルカロイド（vinca alkaloid）が含まれ得る。
【００５２】
別の実施形態において、本開示は式（ＩＶ）で表される抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）を提供する。
Ａ−Ｃ’−（Ｌ−Ｄ）ｍ                    （ＩＶ）
【００５３】
式（ＩＶ）中、Ａは、完全長抗体、抗体フラグメント、タンパク質、またはポリペプチドである。Ｃ’−（Ｌ−Ｄ）ｍはリンカー−薬物であり、ただしＣ’は結合リンカー、Ｌはリンカーユニット、Ｄは薬物ユニットであり、ｍは１から４までの整数である。Ａは、Ａの２つのシステイン残基中にそれぞれ存在する２つのチオール基を介してリンカー−薬物に結合する。
【００５４】
式（ＩＶ）中、Ａ−Ｃ’は、式（Ｖ）で表される下記の構造を含む。
2018138538.tif 000019
【００５５】
式（Ｖ）中、Ｒ１およびＲ２はいずれも単結合または−ＮＨ−である。Ｚはアリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、直鎖アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、またはこれらの組み合わせである。式（Ｖ）の波線は、Ｌとの共有結合部位を表す。Ａ’は、Ａの２つのシステイン残基中にそれぞれ存在する２つのチオール基を介してリンカー−薬物と結合するＡの残りの部分を示す。
【００５６】
式（ＩＶ）中、“Ａ”は、細胞表面受容体または腫瘍関連抗原を標的とする。いくつかの実施形態において、抗体は、キメラ抗体もしくは機能的に活性なそのフラグメント、ヒト化抗体もしくは機能的に活性なそのフラグメント、ヒト抗体もしくは機能的に活性なそのフラグメント、マウス抗体もしくは機能的に活性なそのフラグメント、ラット抗体もしくは機能的に活性なそのフラグメント、ヤギ抗体もしくは機能的に活性なそのフラグメント、またはウサギ抗体もしくは機能的に活性なそのフラグメントであり得る。
【００５７】
いくつかの実施形態において、抗体は、ＩｇＧ１抗体または機能的に活性なそのフラグメント、ＩｇＧ４抗体または機能的に活性なそのフラグメントである。
【００５８】
いくつかの実施形態において、抗体には、ＨＬＸ−０７、ＥＧ１２０１４、抗ＥｐＣＡＭ  ＡｂおよびＩｇＧ１、リツキシマブ（Rituximab）、イブリツモマブチウキセタン（Ibritumomab tiuxetan）、トシツモマブ（Tositumomab）、ブレンツキシマブ（Brentuximab）、アレムツズマブ（Alemtuzumab）、ＩＧＮ１０１、アデカツムマブ（Adecatumumab）、ラベツズマブ（Labetuzumab）、 ｈｕＡ３３、ペムツモマブ（Pemtumomab）、オレゴボマブ（Oregovomab）、ＣＣ４９（minretumomab）、ｃＧ２５０、Ｊ５９１、ＭＯｖ１８、ファーレツズマブ（farletuzumab）（ＭＯＲＡｂ−００３）、３Ｆ８、ｃｈ１４．１８、ＫＷ−２８７１、ｈｕ３Ｓ１９３、ＩｇＮ３１１、ベバシズマブ（Bevacizumab）、ＩＭ−２Ｃ６、ＣＤＰ７９１、エタラシズマブ（Etaracizumab）、ボロシキシマブ（Volociximab）、セツキシマブ（Cetuximab）、パニツムマブ（Panitumumab）、ニモツズマブ（Nimotuzumab）、８０６、トラスツズマブ、ペルツズマブ（Pertuzumab）、ＭＭ−１２１、ＡＭＧ  １０２、ＭＥＴＭＡＢ、ＳＣＨ  ９００１０５、ＡＶＥ１６４２、ＩＭＣ−Ａ１２、ＭＫ−０６４６、Ｒ１５０７、ＣＰ  ７５１８７１、ＫＢ００４、ＩＩＩＡ４、マパツムマブ（Mapatumumab）（ＨＧＳ−ＥＴＲ１）、レクサツムマブ（Lexatumumab）（ＨＧＳ−ＥＴＲ２）、ＣＳ−１００８、デノスマブ（Denosumab）、シブロツヅマブ（Sibrotuzumab）、Ｆ１９、８１Ｃ６、ヒト化抗ＨＥＲ２  ｍＡｂ、エドレコロマブ（Edrecolomab）、セツキシマブ（Cetuximab）、スマート（Smart）ＭＩ９５、リンホシド（LymphoCide）、スマート（Smart）ＩＤ１０、オンコリム（Oncolym）、アロムン（Allomune）、またはエプラツザマブ（Epratuzamab）が含まれ得る。
【００５９】
式（Ｖ）中、Ｒ１およびＲ２は互いにオルト位、メタ位、またはパラ位でＺに結合する。Ｚは式（ＩＩＩ）によって表される。
2018138538.tif 000020
【００６０】
Ｑは、Ｈ、ニトロ、シアノ、ヒドロキシル、アルコキシ、アミノ、アミド、エステル、スルファミド、尿素、直鎖アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリールが含む置換基であり、ｎは０から３までの整数である。式（ＩＩＩ）中、ベンゼンの１つまたは複数の−ＣＨ−は置換されていなくてもよいか、またはＮで置換されていてもよい。
【００６１】
式（Ｖ）中、Ａ−Ｃ’は、式（Ｖａ）、式（Ｖｂ）、式（Ｖｃ）、または式（Ｖｄ）で表される下記の構造を含む。
2018138538.tif 000021
【００６２】
しかしながら、上記構造は単に例に過ぎず、本開示の範囲が限定されることは意図されていないという点を理解すべきである。
【００６３】
いくつかの実施形態において、リンカーユニット（−Ｌ）には、開裂可能なリンカーまたは開裂不可能なリンカーが含まれ得る。いくつかの実施形態において、開裂可能なリンカーには、−バリン−シトルリン−（−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−）、−バリン−リジン−（−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−）、−バリン−アルギニン−（−Ｖａｌ−Ａｒｇ−）、−フェニルアラニン−シトルリン−（−Ｐｈｅ−Ｃｉｔ−）、−フェニルアラニン−リジン−（−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−）、および−フェニルアラニン−アルギニン−（−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−）からなる群より選ばれるペプチドユニット（−ＡＡ−）が含まれ得る。いくつかの実施形態において、開裂不可能なリンカーは、得られるＡＤＣの親水性を高めることのできるリンカーであり得る。１実施形態では、開裂不可能なリンカーには、１つまたは複数のポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）が含まれ得る。他の実施形態では、開裂不可能なリンカーは、ＰＥＧ、ＰＥＧジアミン（ＮＨ２−ＰＥＧ−ＮＨ２）、アミン−ＰＥＧ−ヒドロキシル（ＮＨ２−ＰＥＧ−ＯＨ）、アミン−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ（ＮＨ２−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ）、ジエチレントリアミン、またはこれらの組み合わせであり得る。いくつかの実施形態において、ＰＥＧは下式により表されるものであってよい。
2018138538.tif 000022
式中、ｘは１から２０までの整数であり得る。
いくつかの実施形態において、ペプチドユニット（−ＡＡ−）は、１つまたは複数の酵素、例えば腫瘍関連プロテアーゼによって酵素的に開裂されて、薬物ユニット（−Ｄ）を遊離させることができる。
【００６４】
いくつかの実施形態において、薬物ユニット（−Ｄ）は、リンカーユニット（−Ｌ）への結合部位としての−プロリン−（−Ｐｒｏ−）をさらに含む。
【００６５】
式（ＩＶ）中、−（Ｌ−Ｄ）は式（ＩＩＩａ）または（ＩＩＩｂ）により表されるものであり得る。
2018138538.tif 000023
【００６６】
Ｌは、直鎖アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ポリ（エチレングリコール）鎖、またはこれらの組み合わせである。Ｄの各々は独立して細胞毒性薬、抗自己免疫疾患薬、または抗炎症薬であり、ｏは１から４までの整数であり、ｐは１から４までの整数であり、ｑは１から４までの整数である。−（Ｌ−Ｄ）が式（ＩＩＩｂ）で表されるものであるとき、薬物の結合数（conjugating number）は式（ＩＩＩａ）で表される−（Ｌ−Ｄ）の２倍である。設計に応じて他の−（Ｌ−Ｄ）のバリエーションがあり、より多くの薬物の結合数を有する−（Ｌ−Ｄ）を提供できる、という点を理解すべきである。
【００６７】
いくつかの実施形態において、 薬物ユニット（−Ｄｏ）は、リンカーユニット（−Ｌ）への結合部位として−プロリン−（−Ｐｒｏ−）をさらに含む。いくつかの他の実施形態では、薬物ユニット（Ｄｐ）は、Ｌへの結合部位として−プロリン−（−Ｐｒｏ−）をさらに含む。いくつかの他の実施形態では、薬物ユニット（Ｄｑ）は、Ｌへの結合部位として−プロリン−（−Ｐｒｏ−）をさらに含む。
【００６８】
いくつかの実施形態において、薬物ユニットには、アマニチン（amanitin）、アントラサイクリン（anthracycline）、アウリスタチン（auristatin）、バッカチン（baccatin）、カリケアマイシン（calicheamicin）、カンプトテシン（camptothecin）、セマドチン（cemadotin）、コルヒチン（colchicine）、コルシミド（colcimid）、コンブレタスタチン（combretastatin）、クリプトフィシン（cryptophycin）、ディスコデルモリド（discodermolide）、ドセタキセル（docetaxel）、ドキソルビシン（doxorubicin）、デュオカルマイシン（duocarmycin）、エキノマイシン（echinomycin）、エリュテロビン（eleutherobin）、エポチロン（epothilone）、エストラムスチン（estramustine）、レキシトロプシン（lexitropsin）、メイタンシン（maytansine）、メイタンシノイド（maytansinoid）、メトトレキサート（methotrexate）、ネトロプシン（netropsin）、ピロロ−［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジ−アゼピン（pyrrolo[2,1-c][1,4]benzodi-azepine, ＰＢＤ）、ピューロマイシン（puromycin）、リゾキシン（rhizoxin）、ＳＮ−３８、タキサン（taxane）、チューブリシン（tubulysin）、またはビンカアルカロイド（vinca alkaloid）が含まれ得る。
【００６９】
理論上、ＤＡＲ値は、還元後の還元抗体中に備わる遊離チオールの数に対応する。例えば、抗体における４個の鎖間ジスルフィド結合が８個の遊離チオールに変換された後に、部位特異的結合リンカーは、抗原のシステイン残基中に存在する８個の遊離チオール基に特異的に結合することができる。よって、リンカーユニット（−Ｌ）が１つの薬物ユニット（−Ｄ）と結合するとき、本開示により提供された新規結合リンカー構造から得られる抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）のＤＡＲ（薬物抗体比）は約４である。別の実施形態では、リンカーユニット（−Ｌ）が２つの薬物ユニット（−Ｄ）と結合するとき、本開示により提供された新規結合リンカー構造から得られる抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）のＤＡＲ（薬物抗体比）は約８である。 
【００７０】
実施例および比較例を以下に記述して、リンカー−毒素および抗体−薬物複合体を形成する方法、ならびに抗体−薬物複合体の特性を説明する
【実施例】
【００７１】
実施例および比較例
以下の実施例により本開示を詳細に説明する。それら実施例において、ＭＭＡＥおよびＡＦはConcortis Biotherapeuticsから購入したものである。上記化合物の構造は当業者には周知であるため、簡潔とするためにここには記載しない
【００７２】
リンカー−薬物に用いる略称およびそれらの対応する化学構造を表１に列挙する。
【００７３】
【表１】
2018138538.tif 000024
2018138538.tif 000025
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【００７４】
実施例１:リンカー−薬物１の作製
ステップ１：化合物１ａの合成
下記スキームに示される手順に従ってリンカー−薬物 1を合成した。
2018138538.tif 000028
【００７５】
化合物１ａの合成は、特許文献である米国特許第９０８６４１６Ｂ２号に記載されているとおりに行った。３，４−ジアミノ安息香酸（１．５２ｇ、１０ｍｍｏｌ）およびジ−ｔｅｒｔ−ブトキシジカルボネート（di-tert-butoxy dicarbonate，（ｔ−Ｂｏｃ）２Ｏ）（６．５５ｇ、３０ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（ＮＥｔ３）（７．０ｍＬ、６０ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（２００ｍＬ）中で室温（２５℃）にて終夜（２４時間）撹拌した。得られた溶液を水で抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させて、茶色の粉末として化合物１ａ（Ｎ−Ｂｏｃ−３，４−ジアミノ安息香酸）を得た（１．３７ｇ、収率５４％）。
【００７６】
化合物１ａの化学式はＣ１７Ｈ２４Ｎ２Ｏ６である。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．０４（ｓ，１Ｈ，ＡｒＨ），７．９１−７．８９（ｄｄ，２Ｈ，ＡｒＨ），７．２３（ｓ，１Ｈ），６．６０（ｂｒｓ，２Ｈ，ＮＨ），１．５４（ｓ，１８Ｈ，ＣＨ３）。Ｍ／Ｚ（ＥＳ＋）：３５４．０（Ｍ＋Ｈ）＋，３７６．０（Ｍ＋Ｎａ）。
【００７７】
ステップ２：化合物１ｂの合成
ＤＣＭ（６ｍＬ）中の化合物１ａ（６０ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌｅ）およびペンタフルオロフェノール（３８ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）の混合溶液にＤＣＣ（４２ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌｅ）を加えた。その混合物を室温で１２時間撹拌し、その沈殿物をろ過し、真空下で濃縮した。カラムをｎ−ヘキサン／ＥｔＯＡｃ（４：１）で溶出した。目的の化合物を含有する画分を収集し、減圧下で濃縮して、化合物１ｂを生成した（７６ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌｅ、収率８０％）。
【００７８】
化合物１ｂの化学式はＣ２３Ｈ２３Ｆ５Ｎ２Ｏ６である。１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）ｄ：８．１２（ｓ；１Ｈ）；７．９７（ｓ；２Ｈ），７．２５（ｓ；１Ｈ），１．５（ｓ，１８Ｈ），ＭＳ（ＥＳＩ，ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｉｏｎ）：Ｍ／Ｚ：５１７．９（Ｍ−）。
【００７９】
ステップ３：化合物１ｃの合成
ＤＣＭ（１ｍＬ）およびＤＭＦ（２ｍＬ）中の化合物１ｂ（１１．６ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌｅ）の溶液に、Ｌ１（５５ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌｅ）、ＤＩＰＥＡ（４７．４ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌｅ）を加えた。室温下で１時間反応させた。溶媒を除去した後、化合物１ｃを分取ＨＰＬＣにより精製した（５０％ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ、ＵＶ２１０ｎｍ、Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３カラム３０×２５０ｍｍ、流量３２ｍＬ／ｍｉｎ、化合物１ｃ  ＲＴ、１４．６ｍｉｎ）。化合物１ｃを白色の固体として得た（４８ｍｇ、収率５７％）。
【００８０】
化合物１ｃの化学式はＣ２７Ｈ４４Ｎ３Ｏ１１である。ＥＳＩ−ＨＩＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｏｎ），Ｍ／Ｚ：５８６．２９７２，［Ｍ＋Ｈ］＋  ｆｏｒ  Ｃ２７Ｈ４４Ｎ３Ｏ１１，ｅｒｒ：−０．３ｐｐｍ。
【００８１】
ステップ４：化合物１ｄの合成
４ｍＬ共溶媒ＤＣＭ／ＤＭＦ（１：１）中の化合物１ｃ（２８ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌｅ）および２ｍＬ ＤＭＦ中のＭＭＡＥ（６０ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌｅ）の溶液に、ＴＢＴＵ（４４ｍｇ）およびＤＩＰＥＡ（３６ｍｇ）を加えた。４時間後に反応が完了した。減圧下で溶媒を除去した。Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３  カラム３０×２５０ｍｍ、流量３２ｍＬ／ｍｉｎ、化合物１ｄ  ＲＴ、１７ｍｉｎ。化合物１ｄを白色の固体として得た（４２ｍｇ、収率７０％）。 
【００８２】
化合物１ｄの化学式はＣ６６Ｈ１０８Ｎ８Ｏ１７である。（ＥＳＩ，ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｏｎ）：Ｍ／Ｚ：１２８６．９，（Ｍ＋１）；１３０８．８（Ｍ＋Ｎａ）。
【００８３】
ステップ５: リンカー−薬物１の合成
２ｍＬ ＤＣＭ中の化合物１ｄ（６２ｍｇ、０．０４８ｍｍｏｌｅ）の溶液に２５〜２７℃でトリフルオロ酢酸１ｍＬ（１１．５ｍｍｏｌｅ）を滴下して加えた。水浴を取り除き、４時間撹拌を続けた。減圧下で溶媒を除去し、残留物に５ｍＬメタノールを加え、５分攪拌してから、溶媒を除去した。最小量のＤＩＷ（１．５ｍＬ）を加え、凍結乾燥して、ＴＦＡ塩としての粗生成物化合物１ｄ−ｄｅＢｏｃを得た（４９ｍｇ）。
【００８４】
次いで、ＤＣＭ（１．５ｍＬ）溶液中のＴＦＡ塩（４９ｍｇ、０．０４８ｍｍｏｌｅ）の溶液に、０〜５℃で撹拌しながら、トリメチルアミン（４５μＬ、０．６１３ｍｍｏｌｅ）、次いでＤＣＭ（０．３ｍＬ）中のクロロアセチルクロリド（４３ｍｇ、０．３７７ｍｍｏｌｅ）の溶液を加えた。撹拌後、トリメチルアミンの第２の部分（４５μｌ、０．６１３ｍｍｏｌｅ）を加えた。２時間後に冷却浴を取り除き、撹拌を１５時間続けた。ＨＰＬＣにより反応が完了したかをチェックすると共に、その混合物を蒸発させ乾燥させた。精製をＲＰ−ＨＰＬＣにより行った（残留物は３ｍＬ Ｍ．Ｐ．溶媒で希釈、Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３カラム３０×２５０ｍｍ、１０μｍ、流量３１ｍＬ／ｍｉｎ、Ｍ．Ｐ．４３％から５５％（グラジエント）ＡｃＮ／Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ、ＵＶ２２０ｎｍ）。生成物を含有した画分（Ｒｔ  １６．１ｍｉｎ）を凍結乾燥して化合物１、つまりリンカー−薬物１を得た（４３ｍｇ、６８．３％収率）。
【００８５】
リンカー−薬物１の化学式はＣ８０Ｈ９４Ｃｌ２Ｎ８Ｏ５である。（ＥＳＩ，ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｏｎ）：Ｍ／Ｚ：［Ｍ＋Ｈ］＋＝１２３８．７，［Ｍ＋Ｎａ］＋＝１２６０．７。
【００８６】
実施例２：リンカー−薬物２の作製
下記スキームに示される手順に従ってリンカー−薬物２を合成した。
2018138538.tif 000029
【００８７】
ステップ１〜４：化合物２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄの合成
実施例１に記載したステップ１〜４と同じ合成法により化合物２ａ、２ｂ、２ｃ、および２ｄを合成した。
【００８８】
ステップ５：リンカー−薬物２の合成
１ｍＬ ＤＣＭ中の化合物２ｄ（４０ｍｇ、０．０３１ｍｍｏｌｅ）の溶液に、２０〜２３℃の水浴で、トリフルオロ酢酸（０．８ｍＬ、９．１２ｍｍｏｌｅ）を滴下して加えた。水浴を取り除き、撹拌を２時間続けた。減圧下で溶媒を除去し、残留物に２ｍＬメタノールを加え、５分攪拌してから、溶媒を除去した。最小量のＤＩＷ（２ｍＬ）を加え、凍結乾燥し、ＴＦＡ塩として粗生成物化合物２ｄ−ｄｅＢｏｃを得た（２７ｍｇ）。
【００８９】
次いで、ＤＣＭ（１ｍＬ）溶液中のＴＦＡ塩（２７ｍｇ、０．０３１ｍｍｏｌｅ）の溶液に、０〜５℃で撹拌しながら、ＤＣＭ（０．３ｍＬ）中のトリメチルアミン（２０μＬ、０．１３６ｍｍｏｌｅ）、次いでＤＣＭ（０．３ｍＬ）中のブロモアセチルブロミド（４２ｍｇ、０．２０８ｍｍｏｌｅ）の溶液を加えた。２時間後に冷却浴を取り除き、１５時間撹拌を続けた。ＨＰＬＣにより反応が完了したかをチェックすると共に、その混合物を蒸発させ乾燥させた。精製をＲＰ−ＨＰＬＣにより行い（残留物は４ｍＬ  Ｍ．Ｐ．溶媒で希釈、Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３カラム３０×２５０ｍｍ、１０μｍ、流量３１ｍＬ／ｍｉｎ、Ｍ．Ｐ．４３％から６２％（グラジエント）ＡｃＮ／Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ、ＵＶ２２０ｎｍ）、生成物を含有した画分（Ｒｔ  １７〜１９ｍｉｎ）を凍結乾燥して、化合物２、つまりリンカー−薬物２を得た（２．６ｍｇ、収率６．８％）。
【００９０】
リンカー−薬物２の化学式はＣ６０Ｈ８４Ｂｒ２Ｎ８Ｏ１５である。（ＥＳＩ，ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｏｎ）：Ｍ／Ｚ：［Ｍ＋Ｈ］＋＝１３２６．８。
【００９１】
実施例３：リンカー−薬物３の作製
下記スキームに示される手順に従ってリンカー−薬物３を合成した。
2018138538.tif 000030
【００９２】
ステップ１：化合物３ａ（Ｎ−Ｂｏｃ−３，６−ジオキサオクタン−１，８−ジアミン）の合成
文献に記載されている方法（Bioorganic）に従って化合物ＤＡＢ−２を作製した。ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）中の二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（（Ｂｏｃ）２Ｏ）（０．７ｇ、３．２１ｍｍｏｌ）の溶液を、ｔｒｉｓ（エチレングリコール）−１，８−ジアミン（５．０ｇ，２７８ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（１０ｍＬ、５７ｍｍｏｌ）の混合物に、室温で２時間にわたって滴下して加えた。その反応混合物を６時間撹拌し、その後、真空下で濃縮した。フラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製を行い（ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ、１０／１、ｖ／ｖ）、Ｎ−Ｂｏｃ−３，６−ジオキサオクタン−１，８−ジアミンを得た（０．６ｇ、７５．６％）。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ３．６１（ｓ，４Ｈ），３．５５−３．５３（ｔ，２Ｈ），３．５２−３．４９（ｔ，２Ｈ），３．３１−３．３０（ｔ，２Ｈ），２．８８−２．８５（ｔ，２Ｈ），１．４３（ｓ，９Ｈ）。
【００９３】
ステップ２：化合物３ｂ（Ｂｏｃ−ＰＥＧ−ＡＦ）の合成
ＤＣＭ（２ｍＬ）およびＤＭＦ（２ｍＬ）中のアウリスタチンＦ（２００ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌｅ）の溶液に、化合物３ａ（７５ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌｅ）、ＤＩＰＥＡ（１８０ｍｇ、１．３９ｍｍｏｌｅ）、ＴＢＴＵ（２２０ｍｇ、０．６８ｍｍｏｌｅ）を加えた。室温で１時間２４時間反応させた。溶媒を除去した後、化合物３ｂを分取ＨＰＬＣにより精製した（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３  カラム３０×２５０ｍｍ、移動相４３％ＡｃＮ／Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ、流量３２ｍＬ／ｍｉｎ、Ｂｏｃ−ＰＥＧ−ＡＦ  ＲＴ  ９．３ｍｉｎ）。上掲の化合物３ｂを白色の固体として得た（２０３ｍｇ、８９％）。ＥＳＩ，ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｏｎ：Ｍ／Ｚ：９７７．５（Ｍ＋１）；９９３．２（Ｍ＋Ｎａ）。
【００９４】
ステップ３：化合物３ｃの合成
ＤＣＭ（４ｍＬ）中の化合物３ｂ（２０３ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＦＡ（２ｍＬ）を加えた。その反応混合物を室温で１時間撹拌し、その後、真空下で溶媒を除去した。その粗生成物を、さらなる精製をせずに用いた。ＥＳＩ，ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｏｎ：Ｍ／Ｚ：８７７．４（Ｍ＋１）；８９９．４（Ｍ＋Ｎａ）。
【００９５】
ステップ４：化合物３の合成
４ｍＬ共溶媒ＤＣＭ／ＤＭＦ（１：１）中の化合物３ｃ（１８０ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌｅ）および２ｍＬ  ＤＭＦ中の化合物３，４−ｂｉｓ（２−クロロアセトアミド）安息香酸（６２ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌｅ）の溶液に、ＴＢＴＵ（１９１ｍｇ）およびＤＩＰＥＡ（１５４ｍｇ）を加えた。４時間後に反応が完了した。減圧下で溶媒を除去した。ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製し（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３  カラム３０×２５０ｍｍ、流量３２ｍＬ／ｍｉｎ、化合物３  ＲＴ  １７ｍｉｎ）、上掲の化合物３、つまりリンカー−薬物３を白色の固体として得た（１６７ｍｇ、７０％）。
【００９６】
リンカー−薬物３の化学式はＣ５７Ｈ８９Ｃｌ２Ｎ９Ｏ１２である。ＥＳＩ，ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｏｎ：Ｍ／Ｚ：１１６３．５（Ｍ＋１）；１１８５．３（Ｍ＋Ｎａ）。ＥＳＩ−ＨＩＭＳ，ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｏｎ：Ｍ／Ｚ：１１６２．６０８２，［Ｍ＋Ｈ］＋ｆｏｒ  Ｃ５７Ｈ９０Ｃｌ２Ｎ９Ｏ１２，ｅｒｒ：−０．１ｐｐｍ。
【００９７】
実施例４：リンカー−薬物４の作製
下記スキームに示される手順に従ってリンカー−薬物４を合成した。
2018138538.tif 000031
【００９８】
ステップ１〜３：化合物４ａ、４ｂ、４ｃの合成
実施例３に記載したステップ１〜３と同じ合成法により化合物４ａ、４ｂおよび４ｃを合成した。
【００９９】
ステップ４：リンカー−薬物４の合成
４ｍＬ  ＤＣＭ中の化合物４ｂ（９０ｍｇ、０．０７４ｍｍｏｌｅ）の溶液に、２０〜２３℃の水浴中で、トリフルオロ酢酸（２ｍＬ、１０．４ｍｍｏｌｅ）を滴下して加えた。水浴を取り除き、撹拌を２時間続けた。減圧下でその溶媒を除去し、その残留物に２ｍＬメタノールを加え、５分間攪拌してから、溶媒を除去した。最小量のＤＩＷ（２ｍＬ）を加え、凍結乾燥し、ＴＦＡ塩として化合物４ｃの粗生成物を得た（９０ｍｇ）。
【０１００】
ＤＣＭ（１．５ｍＬ）溶液中のＴＦＡ塩（９０ｍｇ、０．０７４ｍｍｏｌｅ）の溶液に、０〜５℃で撹拌しながら、トリメチルアミン（２６μＬ、０．１８ｍｍｏｌｅ）、次いでＤＣＭ（０．３ｍＬ）中のブロモアセチルブロミド（６４ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌｅ）の溶液を加えた。５分撹拌した後、トリメチルアミンの第２の部分（５２μＬ、０．３６ｍｍｏｌｅ）を加えた。２時間後に冷却浴を取り除き、１５時間撹拌を続けた。ＨＰＬＣにより反応が完了したかをチェックし、その混合物を蒸発させ乾燥させた。ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製を行い（残留物は３ｍＬ  Ｍ．Ｐ．溶媒で希釈、Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３  カラム３０×２５０ｍｍ、１０ｕｍ、流量３１ｍＬ／ｍｉｎ、Ｍ．Ｐ．４３％ＡｃＮ／Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ、ＵＶ２２０ｎｍ）、生成物を含有した画分（Ｒｔ＝７．６６ｍｉｎ）を凍結乾燥して、化合物４、つまりリンカー−薬物４を得た（８５ｍｇ、収率９２％）。
【０１０１】
リンカー−薬物４の化学式はＣ５７Ｈ８９Ｂｒ２Ｎ９Ｏ１２である。（ＥＳＩ，ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｏｎ）：Ｍ／Ｚ：Ｍ＋Ｈ＝１２５１．６。
【０１０２】
実施例５：リンカー−薬物５の作製
下記スキームに示される手順に従ってリンカー−薬物５を合成した。
2018138538.tif 000032
【０１０３】
ステップ１：化合物５ａの合成
化合物５ａは、ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（イミノジエタン−２，１−ジイル）ビスカルバメート（di-tert-butyl（iminodiethane-2,1-diyl） biscarbamate ,ＤＥＴＡ−３）と称されることもある。文献に記載されている方法（Org. Lett. 2000, 2, 2117-2120）により化合物５ａを作製した。
【０１０４】
先ず、下記の方法によりＤＥＴＡ−２を合成した。ジエチレントリアミン（０．８２ｇ、６．２ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（２．６ｍＬ、８．６ｍｍｏｌ、３ｅｑ．）をテトラヒドロフラン（４０ｍＬ）中に溶解し、氷浴中で冷却した。次いで、テトラヒドロフラン（２０ｍＬ）中のＢｏｃ２Ｏ（３．１ｇ、１２．４ｍｍｏｌ、２ｅｑ．）の溶液を２．５時間かけて滴下して加えた。その反応混合物を、一晩かけて周囲温度に到達させる前に、０℃でさらに１時間撹拌した。次いで、その反応混合物を真空下で濃縮した。その残留物をジクロロメタン中に溶解し、１Ｍ  ａｑ．ＮａＯＨで洗浄した。Ｎａ２ＳＯ４により有機相を乾燥し、真空下で濃縮した。その粗物質をフラッシュクロマトグラフィーで精製し、ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（イミノジエタン−２，−ジイル）ビスカルバメート（ＤＥＴＡ−２、Ｍ／Ｚ（ＥＳ−）、３０２．９（Ｍ−Ｈ）−．）およびＤＥＴＡ−２−１（Ｍ／Ｚ（ＥＳ−）、４０３．０（Ｍ−Ｈ）−．）の混合物を黄色の粘性油として得た。ＤＣＭ（２０ｍＬ）中の化合物ＤＥＴＡ−２およびＤＥＴＡ−２−１（０．８６ｇ）の溶液に、無水コハク酸（０．３ｇ、３ｍｍｏｌ）を加えた。その反応混合物を室温で１６時間撹拌した。真空下で溶媒を除去し、その残留物をカラムクロマトグラフィーにより精製して（シリカゲル、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ  ２０／１）、白色の固体を得た（０．４３ｇ）。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ５．２１（ｂｒ，１Ｈ），４．９８（ｂｒ，１Ｈ），３．３２（ｂｒ，６Ｈ），３．２４（ｂｓ，６Ｈ），１．４５（ｓ，９Ｈ，ＣＨ３），１．４６（ｓ，９Ｈ，ＣＨ３），１．４２（ｓ，９Ｈ，ＣＨ３）；Ｍ／Ｚ（ＥＳ＋），４０４．９（Ｍ＋Ｈ），４２６．７（Ｍ＋Ｎａ）。
【０１０５】
次いで、ＤＣＭ（２０ｍＬ）中の化合物ＤＥＴＡ−２（０．８６ｇ、２．８４ｍｍｏｌ）の溶液に無水コハク酸（０．３ｇ、３ｍｍｏｌ）を加えた。その反応混合物を室温で１６時間撹拌した。真空下で溶媒を除去し、その残留物をカラムクロマトグラフィーにより精製し（シリカゲル、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ  ２０／１）、化合物５ａを白色の固体として得た（０．４３ｇ）。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ５．２１（ｂｒ，１Ｈ），４．９８（ｂｒ，１Ｈ），３．６８−３．７１（ｍ，４Ｈ），３．４６−３．４８（ｍ，４Ｈ），２．６２−２．６９（ｍ，４Ｈ），１．４５（ｓ，１８Ｈ，ＣＨ３）ＭＳ：（ＥＳＩ＋）Ｍ／Ｚ，４０４．９（Ｍ＋Ｈ）＋．４２６．２（Ｍ＋Ｎａ）。 
【０１０６】
ステップ２：化合物５ｂの合成
ＤＣＭ（６ｍＬ）中の化合物５ａ（１７０ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌｅ）およびペンタフルオロフェノール（９３ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）の混合溶液にＤＣＣ（１０４ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌｅ）を加えた。その混合物を室温で１２時間撹拌し、その沈殿物をろ過し、真空下で濃縮した。カラムをｎ−ヘキサン／ＥｔＯＡｃ（４：１）で溶出した。目的の化合物を含有する画分を収集し、減圧下で濃縮して、化合物５ｂを生成した（１６８ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌｅ、収率７０％）。ＭＳ（ＥＳＩ，ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｉｏｎ）：Ｍ／Ｚ：５７０．９（Ｍ＋１）＋，５９２．８（Ｍ＋Ｎａ）＋。
【０１０７】
ステップ３：化合物５ｃの合成
ＤＣＭ（２ｍＬ）およびＤＭＦ（２ｍＬ）中の化合物５ｂ（１６８ｍｇ、0．２９ｍｍｏｌｅ）の溶液に、ＣＪ３５−５（１１１ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌｅ）、ＤＩＰＥＡ（９５ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌｅ）を加えた。室温で２時間反応させた。溶媒を除去した後、化合物５ｃを分取ＨＰＬＣにより精製した（５０％ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ、ＵＶ２２０ｎｍ、Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３  カラム３０×２５０ｍｍ、流量３１ｍＬ／ｍｉｎ、化合物５ｃ、ＲＴ６．９ｍｉｎ）。上掲の化合物５ｃを白色の固体として得た（１２５ｍｇ、６７％）。ＭＳ（ＥＳＩ，ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｉｏｎ）：Ｍ／Ｚ：６３５．７（Ｍ−Ｈ）＋。
【０１０８】
ステップ４：化合物５ｄの合成
４ｍＬ共溶媒ＤＣＭ／ＤＭＦ（１：１）中の化合物５ｃ（１２５ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌｅ）および２ｍＬ  ＤＭＦ中の化合物ＭＭＡＥ（１４１ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌｅ）の溶液に、ＴＢＴＵ（１８３ｍｇ）およびＤＩＰＥＡ（１４７ｍｇ）を加えた。４時間後に反応が完了した。減圧下で溶媒を除去した。Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３  カラム３０×２５０ｍｍ、移動相：１％から５０％のグラジエントのＡｃＮ／Ｈ２Ｏ４、流量３２ｍＬ／ｍｉｎ、化合物５ｄ  ＲＴ  ２３．７ｍｉｎ。上掲の化合物５ｄを白色の固体として得た（１８６ｍｇ、７１％）。ＥＳＩ−ＭＳ（ＥＳＩ，ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｏｎ）：Ｍ／Ｚ：１３３８．０（Ｍ＋Ｈ）＋，１３５９．９（Ｍ＋Ｎａ）＋。
【０１０９】
ステップ５：リンカー−薬物５の合成
１ｍＬ ＤＣＭ中の化合物５ｄ（９２ｍｇ、０．０６８ｍｍｏｌｅ）の溶液に５〜８℃でトリフルオロ酢酸（０．８ｍＬ、１０．４ｍｍｏｌｅ）を滴下して加えた。冷却浴を取り除き、撹拌を４時間続けた。減圧下で溶媒を除去し、その残留物に２ｍＬメタノールを加え、５分間攪拌してから、溶媒を除去した。最小量のＤＩＷ（３ｍＬ）を加え、凍結乾燥して、ＴＦＡ塩として化合物５−ｄｅＢｏｃの粗生成物を得た（６２ｍｇ）。
【０１１０】
１．７ｍＬ  ＤＣＭ中のＴＦＡ塩（６２ｍｇ、０．０５４ｍｍｏｌｅ）の溶液に、０〜５℃で撹拌しながら、トリメチルアミン（４０μＬ、０．２７２ｍｍｏｌｅ）、次いでＤＣＭ（０．３ｍＬ）中のブロモアセチルブロミド（６０ｍｇ、０．２９７ｍｍｏｌｅ）の溶液を加えた。２時間後に冷却浴を取り除き、１５時間撹拌を続けた。ＨＰＬＣにより反応が完了したかをチェックし、その混合物を蒸発させ乾燥させた。ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製を行った（残留物は４ｍＬ移動相溶媒で希釈、Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３  カラム３０×２５０ｍｍ、流量３１ｍＬ／ｍｉｎ、移動相４０％から６０％のグラジエントのＡｃＮ／Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ、化合物５、つまりリンカー−薬物５  ＲＴ  １１．０８ｍｉｎ  ＵＶ２１５ｎｍ）。生成物を含有した画分を凍結乾燥して、リンカー−薬物５を得た（１５ｍｇ）。
【０１１１】
リンカー−薬物５の化学式はＣ６１Ｈ１０３Ｂｒ２Ｎ９Ｏ１６である。（ＥＳＩ，ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｏｎ）：Ｍ／Ｚ：［Ｍ＋Ｈ］＋＝１３７７．６。
【０１１２】
実施例６：リンカー−薬物６の作製
下記スキームに示される手順に従ってリンカー−薬物６を合成した。
2018138538.tif 000033
【０１１３】
ステップ１〜４：化合物６ａ、６ｂ、６ｃ、６ｄの合成
実施例５に記載したステップ１〜４と同じ合成法により化合物６ａ、６ｂ、６ｃおよび６ｄを合成した。
【０１１４】
ステップ５：リンカー−薬物６の合成
アセトニトリル（２ｍＬ）中の化合物５（７．９ｍｇ、５．７μｍｏｌ）およびヨウ化ナトリウム（８．６ｇ、５７．３μｍｏｌ）の混合物を室温で８時間撹拌し、真空下で溶媒を蒸発させた。化合物６を分取ＨＰＬＣで精製した（４３％ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ、ＵＶ２２０ｎｍ；Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３カラム２０×２５０ｍｍ、流量１９ｍＬ／ｍｉｎ、化合物６、つまりリンカー−薬物６、ＲＴ  ２３．２ｍｉｎ）。上掲の化合物、リンカー−薬物６を白色の固体として得た（６．７ｍｇ、４．５μｍｏｌ，収率８０％）。
【０１１５】
リンカー−薬物６の化学式はＣ６１Ｈ１０３Ｉ２Ｎ９Ｏ１である。ＥＳＩ−ＨＩＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｏｎ）Ｍ／Ｚ：１４７３．６，（Ｍ＋Ｈ）＋１４９５．５（Ｍ＋Ｎａ）＋。
【０１１６】
実施例７：リンカー−薬物７の作製
下記スキームに示される手順に従ってリンカー−薬物７を合成した。
2018138538.tif 000034
【０１１７】
ステップ１：化合物７ａの合成
クロロホルム（ＣＨＣｌ３、２００ｍＬ）中の３，４−ジアミノ安息香酸（１．５２ｇ、１０ｍｍｏｌ）およびジ−ｔｅｒｔ−ブトキシジカーボネート（di-tert-butoxy dicarbonate，（ｔ−Ｂｏｃ）２Ｏ）（６．５５ｇ、３０ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（ＮＥｔ３；７．０ｍＬ、６０ｍｍｏｌ）を室温（２５℃）で終夜（２４時間）撹拌した。得られた溶液を水で抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させて、茶色の粉末として化合物７ａ（Ｎ−Ｂｏｃ−３，４−ジアミノ安息香酸）を得た（２．０ｇ、収率７９％）。
【０１１８】
化合物７ａの化学式はＣ１７Ｈ２４Ｎ２Ｏ６である。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ｄ−ＭｅＯＨ）δ７．９６（ｓ，１Ｈ），７．７５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４，１．９Ｈｚ），７．６０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４，１．９Ｈｚ），４．８０（ｂｒｓ，２Ｈ，ＮＨ），１．５２（ｓ，１８Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，ｄ−ＭｅＯＨ）δ１７３．２，１５６．４，１５５．５，１３５．７，１３３．６，１３０．３，１２７．９，１２７．８，１２３．６，８１．７，８１．６，２８．８，２８．７。化合物７ａの質量を測定した（Ｃ１７Ｈ２４Ｎ２Ｏ６；３５２．４Ｄａ）。
【０１１９】
ステップ２：化合物７ｂの合成
ＤＣＭ（８ｍＬ）中の化合物７ａ（５００ｍｇ、１．４２ｍｍｏｌｅ）およびペンタフルオロフェノール（３１３ｍｇ、１．７０ｍｍｏｌ）の混合溶液に、ＤＣＣ（３５１ｍｇ、１．７０ｍｍｏｌｅ）を加えた。その混合物を室温で１２時間撹拌し、その沈殿物をろ過し、真空下で濃縮した。ＤＣＭ（１ｍＬ）およびＤＭＦ（２ｍＬ）中のＰＦＰエステルの溶液に、Ｌ１（５３４．８ｍｇ、２．１２ｍｍｏｌｅ）、ＤＩＰＥＡ（４５７．８ｍｇ、３．５４ｍｍｏｌｅ）を加えた。室温で２時間反応させた。溶媒を除去した後、化合物７ｂを分取ＨＰＬＣで精製した（５０％ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ；ＵＶ２１０ｎｍ、Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３  カラム３０×２５０ｍｍ、流量３２ｍＬ／ｍｉｎ、化合物７ｂ  ＲＴ、１４．６ｍｉｎ）。化合物７ｂを白色の固体として得た（５５７ｍｇ、収率６７％）。
【０１２０】
化合物７ｂの化学式はＣ２７Ｈ４４Ｎ３Ｏ１１である。ＥＳＩ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｏｎ）Ｍ／Ｚ：５８６．２９７２  ｆｏｒ  Ｃ２７Ｈ４４Ｎ３Ｏ１１，ｅｒｒ  −０．３ｐｐｍ。
【０１２１】
ステップ３：化合物７ｃの合成
４ｍＬ共溶媒ＤＣＭ／ＤＭＦ（１：１）中の化合物７ｂ（４０ｍｇ、６８．３ｍｍｏｌｅ）および２ｍＬ  ＤＭＦ中のＶａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦ（９５ｍｇ、８５．４ｍｍｏｌｅ）の溶液に、ＴＢＴＵ（６８ｍｇ）およびＤＩＰＥＡ（５２ｍｇ）を加えた。３時間後に反応が完了した。減圧下で溶媒を除去した。化合物７ｃを分取ＨＰＬＣで精製した。生成物を含有した画分を凍結乾燥し、化合物７ｃを白色の固体として得た（６３．５ｍｇ、収率５５％）。
【０１２２】
化合物７ｃの化学式はＣ８６Ｈ１３８Ｎ１４Ｏ２０である。ＥＳＩ，ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｏｎ：Ｍ／Ｚ：１６８９．２（Ｍ＋１），１７１１．２（Ｍ＋Ｎａ）。
【０１２３】
ステップ４:リンカー−薬物７の合成 
１．５ｍＬ  ＤＣＭ中の化合物７ｃ（２０．１ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌｅ）の溶液に、２５〜２７℃でトリフルオロ酢酸（０．８ｍＬ、１０．４ｍｍｏｌｅ）を滴下して加えた。水浴を取り除き、撹拌を４時間続けた。減圧下で溶媒を除去し、その残留物に２ｍＬメタノールを加え、５分攪拌してから、溶媒を除去した。最小量のＤＩＷ（２ｍＬ）を加え、凍結乾燥して、ＴＦＡ塩として粗生成物化合物７ｃ−ｄｅＢｏｃを得た（２３ｍｇ）。
【０１２４】
化合物７ｃ−ｄｅＢｏｃの化学式はＣ７６Ｈ１２２Ｎ１４Ｏ１６である。ＥＳＩ，ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｏｎ：Ｍ／Ｚ：１４８９．０（Ｍ＋１），１５１１．０（Ｍ＋Ｎａ），  ＥＳＩ，ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｉｏｎ：Ｍ／Ｚ：１４８７．２（Ｍ−１）。
【０１２５】
次いで、ＤＣＭ／ＤＭＦ（１／０．３ｍＬ）溶液中のＴＦＡ塩（２２ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌｅ）の溶液に、０〜５℃で撹拌しながら、トリメチルアミン（８μＬ、０．０５７ｍｍｏｌｅ）、続いてＤＣＭ（０．３ｍＬ）中のクロロアセチルクロリド（２２ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌｅ）の溶液を加えた。５分撹拌した後、トリメチルアミンの第２の部分（８μＬ、０．０５７ｍｍｏｌｅ）を加えた。２時間後に冷却浴を取り除き、撹拌を１５時間続けた。ＨＰＬＣにより反応が完了したかをチェックし、その混合物を蒸発させ乾燥させた。ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製を行い（残留物は２ｍＬ  Ｍ．Ｐ．溶媒で希釈、Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３カラム  ２０×２５０ｍｍ、５μｍ、流量１７．５ｍＬ／ｍｉｎ、Ｍ．Ｐ．４３％  ＡｃＮ／Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ、ＵＶ２１５ｎｍ）、生成物を含有した画分（Ｒｔ＝６．５ｍｉｎ）を凍結乾燥して、化合物７、つまりリンカー−薬物７を得た（１６ｍｇ、８４％収率）。
【０１２６】
リンカー−薬物７の化学式はＣ８０Ｈ１２４Ｃｌ２Ｎ１４Ｏ１８である。（ＥＳＩ，ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｏｎ）：Ｍ／Ｚ：Ｍ＋Ｈ＝１６４１．０。
【０１２７】
実施例８：リンカー−薬物８の作製
下記スキームに示される手順に従ってリンカー−薬物８を合成した。
2018138538.tif 000035
【０１２８】
ステップ１〜３：化合物８ａ、８ｂ、８ｃの合成
実施例７に記載したステップ１〜４と同じ合成法により化合物８ａ、８ｂ、および８ｃを合成した。
【０１２９】
ステップ４：リンカー−薬物８の合成
１．５ｍＬ  ＤＣＭ中の化合物８ｃ（２０ｍｇ、０．０３１ｍｍｏｌｅ）の溶液に、８〜１０℃でトリフルオロ酢酸（１ｍＬ、１３ｍｍｏｌｅ）を滴下して加えた。氷水浴を取り除き、撹拌を４時間続けた。減圧下で溶媒を除去し、その残留物に２ｍＬメタノールを加え、５分間攪拌してから、溶媒を除去した。最小量のＤＩＷ（２ｍＬ）を加え、凍結乾燥し、ＴＦＡ塩として化合物８ｃ−ｄｅＢｏｃの粗生成物を得た（１８ｍｇ）。
【０１３０】
１ｍＬ  ＤＣＭ中のＴＦＡ塩の溶液に、０〜５℃で撹拌しながら、トリメチルアミン（１３μＬ、０．０９３ｍｍｏｌｅ）、次いでＤＣＭ（０．３ｍＬ）中のブロモアセチルブロミド（１３ｍｇ、０．０６４ｍｍｏｌｅ）の溶液を加えた。１５分撹拌した後、トリメチルアミンの第２の部分（１３μＬ、０．０９４ｍｍｏｌｅ）を加えた。２時間後に冷却浴を取り除き、撹拌を４時間続けた。ＨＰＬＣにより反応が完了したかをチェックし、その混合物を蒸発させ乾燥させた。ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製を行った（残留物は３ｍＬ  Ｍ．Ｐ．溶媒で希釈、Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３  カラム３０×２５０ｍｍ、流量３１ｍＬ／ｍｉｎ、４４％ＡｃＮ／Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ、ＵＶ２２０ｎｍ）。生成物を含有した画分（Ｒｔ＝７．１ｍｉｎ）を凍結乾燥し、化合物８、つまりリンカー−薬物８を得た（１２．４ｍｇ）。
【０１３１】
リンカー−薬物８の化学式はＣ８０Ｈ１２４Ｂｒ２Ｎ１４Ｏ１８である。（ＥＳＩ，ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｏｎ）：Ｍ／Ｚ：Ｍ＋Ｈ＝１７２８．３。
【０１３２】
実施例９：リンカー−薬物９の作製
下記スキームに示される手順に従ってリンカー−薬物９を合成した。
2018138538.tif 000036
【０１３３】
ステップ１：化合物９ａの合成
文献（Synthesis, 1986, 48.）に記載されているとおりに化合物９ａの合成を行った。３，５−ジアミノ安息香酸（０．４５ｇ、２．９６ｍｍｏｌ）およびジ−ｔｅｒｔ−ブトキシジカーボネート（（ｔ−Ｂｏｃ）２Ｏ）（０．５７ｇ、８．９ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（ＮＥｔ３；２．１ｍＬ、１０．６ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（６０ｍＬ）中で室温（２５℃）にて終夜（２４時間）撹拌した。得られた溶液を水で抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させて、化合物９ａ（Ｎ−Ｂｏｃ−３，５−ジアミノ安息香酸）を茶色の粉末として得た（０．８７ｇ、収率８３％）。
【０１３４】
化合物９ａの化学式はＣ１７Ｈ２４Ｎ２Ｏ６である。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．８７（ｓ，１Ｈ，ＡｒＨ），７．７０（ｓ，２Ｈ，ＡｒＨ），６．９０  （ｂｓ，２Ｈ，ＮＨ），１．５２（ｓ，１８Ｈ，ＣＨ３）。
【０１３５】
ステップ２：化合物９ｂの合成
ＤＣＭ（６ｍＬ）中の化合物９ａ（７４．６ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌｅ）およびペンタフルオロフェノール（４６ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）の混合溶液にＤＣＣ（４２ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌｅ）を加えた。その混合物を室温で１２時間撹拌し、その沈殿物をろ過し、真空下で濃縮した。ＤＣＭ（１ｍＬ）およびＤＭＦ（２ｍＬ）中の化合物９ａの溶液に、Ｌ１（８０ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌｅ）、ＤＩＰＥＡ（６８ｍｇ、０．５３ｍｍｏｌｅ）を加えた。室温で２時間反応させた。溶媒を除去した後、化合物９ｂを分取ＨＰＬＣで精製した（５０％ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ、ＵＶ２１０ｎｍ、Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３  カラム３０×２５０ｍｍ、流量３２ｍＬ／ｍｉｎ、化合物９ｂ  ＲＴ，１４．６ｍｉｎ）。化合物９ｂを白色の固体として得た（２５ｍｇ）。
【０１３６】
化合物９ｂの化学式はＣ２７Ｈ４３Ｎ３Ｏ１１である。ＥＳＩ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｏｎ）Ｍ／Ｚ：５８６．９，６０８．８。収率９９％。
【０１３７】
ステップ３：化合物９ｃの合成
４ｍＬ共溶媒ＤＣＭ／ＤＭＦ（１：１）中の化合物９ｂ（２５ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌｅ）および２ｍＬ  ＤＭＦ中のＶａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦ（４８ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌｅ）の溶液に、ＴＢＴＵ（４４ｍｇ）およびＤＩＰＥＡ（３６ｍｇ）を加えた。４時間後に反応が完了した。減圧下で溶媒を除去した。５０％ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ、ＵＶ２１０ｎｍ、Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３  カラム３０×２５０ｍｍ、流量３２ｍＬ／ｍｉｎ、化合物９ｂ  ＲＴ、１４．６ｍｉｎ。化合物９ｃを白色の固体として得た（５２ｍｇ、収率７０％）。
【０１３８】
化合物９ｃの化学式はＣ８６Ｈ１３８Ｎ１４ＮａＯ１０である。（ＥＳＩ，ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｏｎ）：Ｍ／Ｚ：１６８９．９（Ｍ＋１）。ＥＳＩ−ＨＩＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｏｎ）Ｍ／Ｚ：１７１０．０２１４［Ｍ＋Ｎａ］＋  ｆｏｒ  Ｃ８６Ｈ１３８Ｎ１４ＮａＯ１０，ｅｒｒ：６．４ｐｐｍ。
【０１３９】
ステップ４：リンカー−薬物９の合成
１．５ｍＬ  ＤＣＭ中の化合物９ｃ（５２ｍｇ、０．０３１ｍｍｏｌｅ）の溶液に、８〜１０℃でトリフルオロ酢酸（０．８ｍＬ、１０．４ｍｍｏｌｅ）を滴下して加えた。氷水浴を取り除き、撹拌を４時間続けた。減圧下で溶媒を除去し、その残留物に２ｍＬメタノールを加え、５分間攪拌してから、溶媒を除去した。最小量のＤＩＷ（２ｍＬ）を加え、凍結乾燥して化合物９ｃ−ｄｅＢｏｃの粗生成物をＴＦＡ塩として得た（３５ｍｇ）。
【０１４０】
１ｍＬ  ＤＣＭ中のＴＦＡ塩（３５ｍｇ、０．０２１ｍｍｏｌｅ）の溶液に、０〜５℃で撹拌しながら、トリメチルアミン（１３μＬ、０．０９３ｍｍｏｌｅ）、次いでＤＣＭ（０．３ｍＬ）中のブロモアセチルブロミド（１９ｍｇ、０．０９４ｍｍｏｌｅ）の溶液を加えた。１５分撹拌した後、トリメチルアミンの第２の部分（１３μＬ、０．０９４ｍｍｏｌｅ）を加えた。２時間後に冷却浴を取り除き、１５時間撹拌を続けた。ＨＰＬＣにより反応が完了したかをチェックし、その混合物を蒸発させ乾燥させた。ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製を行った（残留物は３ｍＬ  Ｍ．Ｐ．溶媒で希釈、Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３  カラム３０×２５０ｍｍ、流量３２ｍＬ／ｍｉｎ、４３％ＡｃＮ／Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ、ＵＶ２２０ｎｍ）。生成物を含有した画分（Ｒｔ＝７．６ｍｉｎ）を凍結乾燥し、化合物９、つまりリンカー−薬物９を得た（１３．３ｍｇ）。
【０１４１】
リンカー−薬物９の化学式はＣ８０Ｈ１２４Ｂｒ２Ｎ１４Ｏ１８である。（ＥＳＩ，ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｏｎ）：Ｍ／Ｚ：Ｍ＋Ｈ＝１７２８．５，ＥＳＩ−ＨＩＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｏｎ）Ｍ／Ｚ：１７２７．７６８２，［Ｍ＋Ｈ］＋  ｆｏｒ  Ｃ６０Ｈ９４Ｂｒ２Ｎ８  ＮａＯ１５，１７２７．７６５８  ｅｒｒ：１．４ｐｐｍ。
【０１４２】
Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦの合成
実施例９のステップ３において、下記スキームに示される手順に従って化合物Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦを合成した。
2018138538.tif 000037
【０１４３】
ステップ３−１：Ｚ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−Ｂｏｃの合成
Ｚ−Ｌ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＯＨ（４．０ｇ、９．７９ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（２５０ｍＬ）およびイソプロパノール（５０ｍＬ）の混合物に入れた。次いで、ｔｅｒｔ−ブチル４−アミノフェネチルカルバメート（２．９５ｇ、１２．５ｍｍｏｌ）およびＥＥＤＱ（４．９５ｇ、２０ｍｍｏｌ）をその混合物に加えた。その混合物を室温（２５℃）で３６時間撹拌した。減圧下４０℃で溶媒を除去してから、残留物にエーテル（３００ｍＬ）を加えた。その混合物を１時間遠心分離機にかけた。澄んだ（clear）エーテル溶液を除去した。固体生成物をエーテル（３００ｍＬ）中に再懸濁し、１０分間超音波処理した。その混合物を再び１時間遠心分離機にかけた。次いで、固体生成物を上述のように収集した。このプロセスを再度繰り返した。最後に、収集した固体生成物を真空下で乾燥し、目的の生成物（４．５ｇ）を純度約９０％で得た。（ＨＰＬＣ、２１０ｎｍ）収率は６５．５％であった。
【０１４４】
ステップ３−２：Ｚ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦの合成
ＤＣＭ（４ｍＬ）中のＺ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−Ｂｏｃ（１６９ｍｇ、０．６４２ｍｍｏｌ）の溶液にＴＦＡ（２ｍＬ）を加えた。その混合物を室温で１時間撹拌し、その後、溶媒を真空下で除去した。その粗生成物を、さらなる精製を行わずに用いた。ＤｅＢｏｃ粗化合物Ｚ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ（１８４ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌｅ）を１０ｍＬ混合溶媒（ＤＣＭ：ＤＭＦ＝１：０．１）およびＡＦ（３００ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌｅ）、ＴＢＴＵ（２００ｍｇ）、ならびにＤＩＰＥＡ（１６２ｍｇ、０．３５３ｍｍｏｌｅ）中に溶解した。その反応混合物を室温で１７時間撹拌した。溶媒を真空下で蒸発させ、分取カラムを用いてＨＰＬＣにより精製した（５０％ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ、ＵＶ２１０ｎｍ；Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３  カラム３０×２５０ｍｍ、流量３２ｍＬ／ｍｉｎ、Ｚ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦ  ＲＴ  １４．６ｍｉｎ、２２３ｍｇ、収率６２％）。
【０１４５】
Ｚ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦの化学式はＣ６７Ｈ１０３Ｎ１１Ｏ１２である。ＥＳＩ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｏｎ）Ｍ／Ｚ：１２５６．１。
【０１４６】
ステップ３−３：Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦの合成
エタノール（１０ｍＬ）中のＺ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦ（９０ｍｇ、０．０７１７ｍｍｏｌ）の溶液に、１０％ Ｐｄ／Ｃ（９ｍｇ）を加えた。得られた混合物をＨ２の雰囲気下で４時間撹拌し、その後、その混合物をセライトパッドでろ過した。そのセライトパッドをＥｔＯＡｃで洗浄し、ろ液を真空下で濃縮して、生成物Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦを得た。収率は９９％であった。
【０１４７】
Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦの化学式はＣ５９Ｈ９７Ｎ１１Ｏ１０である。ＥＳＩ−ＨＩＭＳ（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｉｏｎ）Ｍ／Ｚ：１１４２．７３１６［Ｍ＋Ｎａ］＋  ｆｏｒ  Ｃ５９Ｈ９７Ｎ１１ＮａＯ１０，ｅｒｒ：−０．３ｐｐｍ。
【０１４８】
実施例１０：リンカー−薬物１０の作製
下記スキームに示される手順に従ってリンカー−薬物１０を合成した。
2018138538.tif 000038
【０１４９】
ステップ１：化合物１０ａの合成
ＤＣＭ溶液（１０ｍＬ／ｍｍｏｌ）中のジアミン（１当量）をＢｏｃ２Ｏ（０．１５当量）で５時間室温にて処理した。未反応のジアミンが全て抽出されるまで、有機相を水で洗浄した。乾燥（ＭｇＳＯ４）および真空下での濃縮の後、Ｂｏｃ保護（Boc-protected）化合物１０ａを定量的に回収した。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣ１３，５００ＭＨｚ）３．７４（ｍ，１Ｈ），３．７０（ｍ，１Ｈ），３．６２（ｍ，８Ｈ），３．５４（ｍ，４Ｈ），３．３１（ｍ，２Ｈ），１．４４（ｓ，９Ｈ），ＥＳＩ，ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｏｎ：Ｍ／Ｚ：２９３．７（Ｍ＋１），３１６．７（Ｍ＋Ｎａ）。
【０１５０】
ステップ２：化合物１０ｂの合成
４ｍＬ共溶媒ＤＣＭ／ＤＭＦ（１：１）中のアウリスタチンＦ（２００ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌｅ）および２ｍＬ  ＤＭＦ中の化合物１０ａ（７５ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌｅ）の溶液に、ＴＢＴＵ（２２０ｍｇ、０．６８ｍｍｏｌｅ）およびＤＩＰＥＡ（１８０ｍｇ、１．３９ｍｍｏｌｅ）を加えた。反応は２時間後に完了した。減圧下で溶媒を除去した。Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３  カラム３０×２５０ｍｍ、１０μｍ、アセトニトリル４３％、流量３２ｍＬ／ｍｉｎ、ＵＶ２２０、ＲＴ  ９．３ｍｉｎ。上掲の化合物１０ｂを白色の固体として得た（１５１ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌｅ、６４％）。ＥＳＩ，ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｏｎ：Ｍ／Ｚ：１０２１．７（Ｍ＋１），１０４３．７（Ｍ＋Ｎａ）。
【０１５１】
ステップ３：化合物１０ｃの合成
ＤＣＭ（４ｍＬ）中の化合物１０ｂ（１５１ｍｇ）の溶液にＴＦＡ（２ｍＬ）を加えた。その混合物を室温で１時間撹拌し、その後、溶媒を真空下で除去した。化合物１０ｃの粗生成物を、さらなる精製を行わずに用いた。
【０１５２】
ステップ４：化合物１０ｄの合成
ＤＣＭ（６ｍＬ）中のＮ−Ｂｏｃ−３，４−ジアミノ安息香酸（６０ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌｅ）およびペンタフルオロフェノール（４７ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）の混合溶液にＤＣＣ（５１．５ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌｅ）を加えた。その混合物を室温で１２時間撹拌し、その沈殿物をろ過し、真空下で濃縮した。ＰＦＰエステルの溶液に化合物１０ｃ（２３５ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌｅ）およびＤＩＰＥＡ（５５ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌｅ）を加えた。室温で１時間反応させた。溶媒を除去した後、化合物１０ｄを分取ＨＰＬＣで精製した（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３  カラム３０×２５０ｍｍ、５μｍ、アセトニトリル４２％（０−５ｍｉｎ）から５０％（５−１３ｍｉｎ）から５５％（１３−２５ｍｉｎ）、流量３１ｍＬ／ｍｉｎ、ＵＶ２２０、Ｔ３１−３、ＲＴ  １３．８ｍｉｎ）。上掲の化合物１０ｄを白色の固体として得た（１７３ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌｅ、８１％）。ＥＳＩ，ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｏｎ：Ｍ／Ｚ：１２５５．３，１２７７３（Ｍ＋Ｎａ）。
【０１５３】
ステップ５：化合物１０の合成
４ｍＬ  ＤＣＭ中の化合物１０ｄ（２０ｍｇ、０．０１６ｍｍｏｌｅ）の溶液に、２０〜２３℃の水浴で、トリフルオロ酢酸（２ｍＬ、１０．４ｍｍｏｌｅ）を滴下して加えた。その水浴を取り除き、撹拌を２時間続けた。減圧下で溶媒を除去し、その残留物に２ｍＬメタノールを加え、５分間攪拌してから、溶媒を除去した。最小量のＤＩＷ（２ｍＬ）を加え、凍結乾燥して、ＴＦＡ塩として粗生成物化合物１０ｄ−ｄｅＢｏｃを得た（２３ｍｇ）。
【０１５４】
ＤＣＭ／ＤＭＦ（１／０．５ｍＬ）溶液中のＴＦＡ塩（２３ｍｇ、０．０１６ｍｍｏｌｅ）の溶液に、０〜５℃で撹拌しながら、トリメチルアミン（１０μＬ、０．０７２ｍｍｏｌｅ）、次いでＤＣＭ（０．３ｍＬ）中のブロモアセチルブロミド（２４ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌｅ）の溶液を加えた。５分撹拌した後、トリメチルアミンの第２の部分（１０μＬ、０．０７２ｍｍｏｌｅ）を加えた。２時間後に冷却浴を取り除き、１５時間撹拌を続けた。ＨＰＬＣにより反応が完了したかをチェックし、その混合物を蒸発させ乾燥させた。ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製を行い（残留物は２ｍＬ  Ｍ．Ｐ．溶媒で希釈、Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３カラム２０×２５０ｍｍ、５μｍ、流量１７．５ｍＬ／ｍｉｎ、Ｍ．Ｐ．４２％ＡｃＮ／Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ、ＵＶ２１５ｎｍ）、生成物を含有した画分（ＲＴ＝７．４７ｍｉｎ）を凍結乾燥して、化合物１０、つまりリンカー−薬物１０を得た（１２ｍｇ、収率５８％）。
【０１５５】
リンカー−薬物１０の化学式はＣ５９Ｈ９３Ｂｒ２Ｎ９Ｏ１３である。（ＥＳＩ，ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｏｎ）：Ｍ／Ｚ：Ｍ＋Ｈ＝１２９７．５。
【０１５６】
実施例１１：リンカー−薬物１１の作製
下記スキームに示される手順に従ってリンカー−薬物１１を合成した。
2018138538.tif 000039
【０１５７】
ステップ１：化合物１１ａの合成
Ｌ１（０．７９ｇ、３．１４ｍｍｏｌ）およびＫ２ＣＯ３（１．０４ｇ、７．５０ｍｍｏｌ）を水５．８ｍＬ中に溶解し、室温で１５分撹拌した後、Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）スクシンイミド（N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl) succinimide，Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）（１．２８ｇ、３．７９ｍｍｏｌ）を加え、反応の進行をＴＬＣ（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＡｃＯＨ，５：１：０．０６）でモニタリングしながら、その混合物を２４時間撹拌した。塩をろ過し、そのろ物をＥｔ２Ｏで洗浄し、３Ｎ  ＨＣｌで酸性化してｐＨ１とし、そしてＤＣＭで所望の化合物を抽出した。真空下で溶媒を除去した後、ＲＰ−ＨＰＬＣで精製し、生成物を含有した画分を凍結乾燥して、化合物１１ａを得た（１．０８ｇ、収率７３％）。
【０１５８】
化合物１１ａの化学式はＣ２５Ｈ３１ＮＯ８である。ｒｅｑｕｉｒｅｄ［Ｍ＋Ｈ］＋＝４７４．２，ｆｏｕｎｄ［Ｍ＋Ｈ］＋＝４７４．９，［Ｍ＋Ｎａ］＋＝４９６．９。
【０１５９】
ステップ２：化合物１１ｂの合成
イミダゾール（０．７８ｇ、１１．５ｍｍｏｌ）を室温で１０ｍＬ  ＤＣＭ中に懸濁させた。二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（Ｂｏｃ２Ｏ）（２．６２ｇ、１２ｍｍｏｌ）を数回に分けて（portion wise）加えた。その反応混合物を室温で１時間撹拌した。その反応混合物を水で洗浄し、Ｎａ２Ｓ０４で乾燥し、ろ過し、揮発性物質を減圧下で除去した。その残留物を４ｍＬトルエン中に溶解し、ジエチレントリアミン（０．５９５ｍＬ、５．５ｍｍｏｌ）を加えた。その反応混合物を６０℃で２時間撹拌した。１０ｍＬ  ＤＣＭを加え、有機相を水で洗浄した。その有機相をＮａ２Ｓ０４で乾燥し、ろ過し、減圧下で還元した。トリエチルアミンを含むＤＣＭ中のメタノール（ＭｅＯＨ）のグラジエントを用いたシリカフラッシュカラムにより、タイトルの化合物を無色の固体として得た（化合物１１ｂ、１．０２ｇ、収率６１％）。
【０１６０】
化合物１１ｂの化学式はＣ１４Ｈ２９Ｎ３Ｏ４である。１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：１．４１（ｓ，１８Ｈ），１．５８（ｂｓ，１Ｈ），２．６６−２．７７  （ｍ，４Ｈ），３．１３−３．２６（ｍ，４Ｈ），４．９６（ｂｓ，２Ｈ）。
【０１６１】
ステップ３：化合物１１ｃの合成
４ｍＬ  ＤＣＭ中の化合物１１ａ（６４５．２ｍｇ、１．３６ｍｍｏｌｅ）および２ｍＬ  ＤＭＦ中の化合物１１ｂ（４１３ｍｇ、１．３６ｍｍｏｌｅ）の溶液に、ＴＢＴＵ（１１０ｍｇ）およびＤＩＰＥＡ（８４４ｍｇ）を加えた。反応は２時間後に完了した。減圧下で溶媒を除去した。Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３  カラム３０×２５０ｍｍ、流量３２ｍＬ／ｍｉｎ、化合物１１ｃ  ＲＴ、１７ｍｉｎ。化合物１１ｃを白色の固体として得た（７３８ｍｇ、収率７６％）。
【０１６２】
化合物１１ｃの化学式はＣ３９Ｈ５８Ｎ４Ｏ１１Ｎａである。（ＥＳＩ，  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｏｎ）：Ｍ／Ｚ：７６０．４（Ｍ＋１）；７８２．４（Ｍ＋Ｎａ）。ＨＲＭＳ  ｆｏｕｎｄ  ７８１．４００５  ｆｏｒ  Ｃ３９Ｈ５８Ｎ４Ｏ１１Ｎａ，ｅｒｒ：１．３ｐｐｍ。
【０１６３】
ステップ４：化合物１１ｄの合成
４ｍＬ  ＤＣＭ中の化合物１１ｃ（２１８．６ｍｇ、０．２８８ｍｍｏｌｅ）の溶液に０℃でトリフルオロ酢酸２ｍＬを滴下して加えた。冷却浴を除去し、３時間撹拌を続けた。減圧下で溶媒を除去した。その残留物に２ｍＬメタノールを加えて５分撹拌し、次いで溶媒を除去した。最小量のＤＩＷ（２ｍＬ）を加え、凍結乾燥して、ＴＦＡ塩として粗生成物化合物１１ｃ−ｄｅＢｏｃを得た（２７ｍｇ）。
【０１６４】
化合物１１ｃ−ｄｅＢｏｃの化学式はＣ２９Ｈ４２Ｎ４Ｏ７である。（ＥＳＩ，ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｏｎ）：Ｍ／Ｚ：５５８．４（Ｍ＋１）；５８０．３（Ｍ＋Ｎａ）。
【０１６５】
次いで、４ｍＬ  ＤＣＭ中のＴＦＡ塩（２５０ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌｅ）および２ｍＬ  ＤＭＦ中の化合物Ｎ−Ｂｏｃ−Ｌ１（６２８ｍｇ、１．７６ｍｍｏｌｅ）の溶液に、ＴＢＴＵ（８３１．６ｍｇ）およびＤＩＰＥＡ（５５２ｍｇ）を加えた。反応は３時間後に完了した。減圧下で溶媒を除去した。化合物１１ｄを分取ＨＰＬＣで精製した。生成物を含有した画分を凍結乾燥して、化合物１１ｄを白色の固体として得た（３５６ｍｇ、収率６５％）。
【０１６６】
化合物１１ｄの化学式はＣ５９Ｈ９６Ｎ６Ｏ２１である。ＥＳＩ，ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｏｎ：Ｍ／Ｚ：１２２６．７（Ｍ＋１），１２４８．８（Ｍ＋Ｎａ）。
【０１６７】
ステップ５：化合物１１ｅの合成
４ｍＬ  ＤＣＭ中の化合物１１ｄ（３００ｍｇ、０．２８８ｍｍｏｌｅ）の溶液に、０℃でトリフルオロ酢酸２ｍＬを滴下して加えた。冷却浴を除去し、３時間撹拌を続けた。減圧下で溶媒を除去した。その残留物に２ｍＬメタノールを加え、５分撹拌してから、溶媒を除去した。最小量のＤＩＷ（２ｍＬ）を加え、凍結乾燥して、粗生成物化合物１１ｄ−ｄｅＢｏｃをＴＦＡ塩として得た。
【０１６８】
化合物１１ｄ−ｄｅＢｏｃの化学式はＣ４９Ｈ８０Ｎ６Ｏ１７である。Ｒｅｑｕｉｒｅｄ［ＭＨ＋］１０２４．５６，ｆｏｕｎｄ＿［Ｍ＋Ｈ］＋１０２６．７。［Ｍ＋Ｎａ］＋１０４８．７。
【０１６９】
次いで、２ｍＬ  ＤＣＭ中のＴＦＡ塩（１３０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌｅ）および２ｍＬ  ＤＭＦ中のアウリスタチンＦ（２７２ｍｇ、０．３ｍｍｏｌｅ）の溶液に、ＴＢＴＵ（２３５ｍｇ、０．７３ｍｍｏｌｅ）およびＤＩＰＥＡ（１７３ｍｇ、１．３４ｍｍｏｌｅ）を加えた。反応は１時間後に完了した。減圧下で溶媒を除去した。Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３  カラム３０×２５０ｍｍ、流量３２ｍＬ／ｍｉｎ、化合物１１ｅ  ＲＴ、１７ｍｉｎ。化合物１１ｅを白色の固体として得た（２６１ｍｇ、収率８３％）。  
【０１７０】
化合物１１ｅの化学式はＣ１２９Ｈ２１０Ｎ１６Ｏ３１である。（ＥＳＩ，ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｏｎ）：Ｍ／Ｚ：１２４２．３（Ｍ＋２Ｈ）２＋；８２９．０（Ｍ＋３Ｈ）３＋。
【０１７１】
ステップ６：化合物１１ｆの合成
２ｍＬ  ＤＣＭ中の化合物１１ｅ（２０．８ｍｇ、０．２８８ｍｍｏｌｅ）の溶液に０℃でジエチルアミン１ｍＬを滴下して加えた。冷却浴を除去し、撹拌を４時間続けた。減圧下で溶媒を除去した。その残留物に２ｍＬメタノールを加え、５分撹拌してから、溶媒を除去した。最小量のＤＩＷ（２ｍＬ）を加え、凍結乾燥して、粗生成物化合物１１ｅ−ｄｅＦｍｏｃをＴＦＡ塩として得た。
【０１７２】
化合物１１ｅ−ｄｅＦｍｏｃの化学式はＣ１１４Ｈ２００Ｎ１６Ｏ２９である。ＥＳＩ，ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｏｎ：２２５９．５（Ｍ＋１），２２８１．５（Ｍ＋Ｎａ）。
【０１７３】
次いで、４ｍＬ共溶媒ＤＣＭ（６ｍＬ）中のＣＪ２４−１（６４ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌｅ）および２ｍＬ  ＤＭＦ中の化合物１１ｅ−ｄｅＦｍｏｃ（１２３．５ｍｇ、０．０５４ｍｍｏｌｅ）の溶液に、ＥＤＣ（２６ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌｅ）およびＤＩＰＥＡ（１４ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌｅ）を加えた。反応は１２時間後に完了した。減圧下で溶媒を除去した。化合物１１ｆを分取ＨＰＬＣで精製した。生成物を含有した画分を凍結乾燥して、化合物１１ｆを白色の固体として得た（１６９．８ｍｇ、収率５５％）。
【０１７４】
化合物１１ｆの化学式はＣ１２５Ｈ２１１Ｎ１９Ｏ３３である。ＥＳＩ，ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｏｎ：１４１５（Ｍ＋２Ｈ）２＋
【０１７５】
ステップ７：リンカー−薬物１１の合成
４ｍＬ  ＤＣＭ中の化合物１１ｆ（２６．３ｍｇ、０．００９２ｍｍｏｌｅ）の溶液に、２０〜２３℃の水浴で、トリフルオロ酢酸（２ｍＬ、１０．４ｍｍｏｌｅ）を滴下して加えた。水浴を取り除き、撹拌を２時間続けた。減圧下で溶媒を除去し、その残留物に２ｍＬメタノールを加え、５分間攪拌してから、溶媒を除去した。最小量のＤＩＷ（２ｍＬ）を加え、凍結乾燥して、ＴＦＡ塩として粗生成物化合物１１ｆ−ｄｅＢｏｃを得た（２６ｍｇ）。
【０１７６】
次に、ＤＣＭ／ＤＭＡｃ（１／０．５ｍＬ）溶液中のＴＦＡ塩（２６ｍｇ、０．００９２ｍｍｏｌｅ）の溶液に、０〜５℃で撹拌しながら、ＤＣＭ（０．２ｍＬ）中のトリメチルアミン（４０μＬ、０．２８８ｍｍｏｌｅ）、次いでＤＣＭ（０．３ｍＬ）中のブロモアセチルブロミド（３０ｍｇ、０．１４８ｍｍｏｌｅ）の溶液を加えた。２時間後に冷却浴を取り除き、１５時間撹拌を続けた。ＨＰＬＣにより反応が完了したかをチェックし、その混合物を蒸発させ乾燥させた。ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製を行い（残留物は３．５ｍＬ  Ｍ．Ｐ．溶媒で希釈、Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３  カラム３０×２５０ｍｍ、１０μｍ、流量３１ｍＬ／ｍｉｎ、Ｍ．Ｐ．３５％（０−６．５ｍｉｎ）から４３％（６．５−２０ｍｉｎ）ＡｃＮ／Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ、ＵＶ２２０ｎｍ）、生成物を含有した画分（Ｒｔ＝１１．７１ｍｉｎ）を凍結乾燥して、化合物１１、つまりリンカー−薬物１１を得た（１２ｍｇ、収率４６％）。
【０１７７】
リンカー−薬物１１の化学式はＣ１３５Ｈ２２７Ｂｒ２Ｎ１９Ｏ３７である。（ＥＳＩ，ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｏｎ）：Ｍ／Ｚ：［Ｍ＋Ｈ］＋２＝１４３５．９。
【０１７８】
実施例１２：リンカー−薬物１２の作製
下記スキームに示される手順に従ってリンカー−薬物１２を合成した。
2018138538.tif 000040
【０１７９】
ステップ１：化合物１２ａの合成
アセトニトリル中の二炭酸ジ−ｔ−ブチル（５．２ｇ、２３．８ｍｍ）の溶液を、（ｓ）−５−（アミノメチル）ピロリジン−２−オン（(s)-5-(aminomethyl)pyrrolidin-2-one,ＥＤＡ−４）（１．２９ｇ、１１．３ｍｍｏｌ）の撹拌溶液（stirred solution）にゆっくりと加え、次いでＤＭＡＰ（１８０ｍｇ、１．５ｍｍｏｌｅ）を加えた。反応は６時間以内に完了した（ＴＬＣでモニター ）。その溶液を濃縮し、固体をフラッシュカラムクロマトグラフィー(ヘキサン／ＥｔｏＡＣ（１：５））で精製して、ｄｉ−ｂｏｃ保護（di-boc-protected）中間体ＥＤＡ−５を固体として得た（１．８２ｇ、５１％）。水（１２ｍＬ）中のＬｉＯＨ×Ｈ２Ｏ（０．３６ｇ、１９ｍｍｏｌ）の溶液を、１０ｍＬ  ＴＨＦ中のＥＤＡ−５（１．０３ｇ、３．２８ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に加えた。その混合物を終夜撹拌し、次いで１Ｎ  ＨＣｌで酸性化した。その溶液を濃縮し、その混合物をＥｔＯＡｃで抽出し、塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、そして濃縮した。その固体をフラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘキサン（１／４））で精製し、タイトルの化合物１２ａを固体として得た（０．８１ｇ、７５％）。Ｍ／Ｚ＝３３３．９［Ｍ＋Ｈ］＋，Ｍ／Ｚ＝３３１．８［Ｍ−１］−；．１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）１．４１（ｓ，９Ｈ）；１．４３（ｓ，９Ｈ）；１．６１−１．８４（ｍ，２Ｈ），２．４２−２．４５（ｍ，２Ｈ），３．１７−３．２２（ｔ，２Ｈ），３．６７（ｓ，１Ｈ），４．９５（ｂｓ，２Ｈ）。
【０１８０】
ステップ２：化合物１２ｂの合成
ＤＣＭ（６ｍＬ）中の化合物１２ａ（１３３ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌｅ）およびペンタフルオロフェノール（１１０ｍｇ、０．６０ｍｍｏｌ）の混合溶液に、ＤＣＣ（１２３ｍｇ、０．６０ｍｍｏｌｅ）を加えた。その混合物を室温で１２時間撹拌し、化合物１２ｂの粗生成物を得た。
【０１８１】
ステップ３：化合物１２ｃの合成
ＣＪ３５−５（１５１ｍｇ、０．６０ｍｍｏｌｅ）およびＤＩＰＥＡ（１３０ｍｇ、１．００ｍｍｏｌｅ）を加えた。室温で２時間反応させた。溶媒を除去した後、化合物１２ｃを分取ＨＰＬＣで精製した（５０％ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ、ＵＶ２２０ｎｍ、Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３  カラム３０×２５０ｍｍ、流量３１ｍＬ／ｍｉｎ、化合物１２ｃ、ＲＴ  ６．９ｍｉｎ）。上掲の化合物１２ｃを白色の固体として得た（１６０ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌｅ、７０％）。ＭＳ（ＥＳＩ，ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｉｏｎ）：Ｍ／Ｚ：５６４．８（Ｍ−Ｈ）＋。
【０１８２】
ステップ４：化合物１２ｄの合成
４ｍＬ  共溶媒ＤＣＭ／ＤＭＦ（２：２）中の化合物１２ｃ（６０ｍｇ、０．１０６ｍｍｏｌｅ）および２ｍＬ  ＤＭＦ中の化合物Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦ（１１８．８ｍｇ、０．１０６ｍｍｏｌｅ）の溶液に、ＴＢＴＵ（１１３ｍｇ、０．２９７ｍｍｏｌｅ）およびＤＩＰＥＡ（７９．５ｍｇ、０．６１６ｍｍｏｌｅ）を加えた。４時間後に反応が完了した。減圧下で溶媒を除去した。Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３  カラム３０×２５０ｍｍ、１０μｍ、アセトニトリル４３％、流量３２ｍＬ／ｍｉｎ、ＵＶ２２０、化合物１２ｄ、ＲＴ  ９．３ｍｉｎ。上掲の化合物１２ｄを白色の固体として得た（１１３．８ｍｇ、０．０６８ｍｍｏｌｅ、収率６４．２％）。ＥＳＩ，ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｏｎ：Ｍ／Ｚ：１６７１．７（Ｍ＋１），１６９３．７（Ｍ＋Ｎａ）。
【０１８３】
ステップ５：リンカー−薬物１２の合成 
１．５ｍＬ  ＤＣＭ中の化合物１２ｄ（２４ｍｇ、０．０１４ｍｍｏｌｅ）の溶液に、８〜１０℃でトリフルオロ酢酸（１ｍＬ、１３ｍｍｏｌｅ）を滴下して加えた。氷水浴を取り除き、撹拌を４時間続けた。減圧下で溶媒を除去し、その残留物に２ｍＬメタノールを加え、５分間攪拌してから、溶媒を除去した。最小量のＤＩＷ（２ｍＬ）を加え、凍結乾燥して粗生成物化合物１２ｄ−ｄｅＢｏｃをＴＦＡ塩として得た（１９ｍｇ）。  
【０１８４】
１ｍＬ  ＤＣＭ中のＴＦＡ塩の溶液に、０〜５℃で撹拌しながら、トリメチルアミン（１３μＬ、０．０９３ｍｍｏｌｅ）、次いでＤＣＭ（０．３ｍＬ）中のブロモアセチルブロミド２２ｍｇ（０．１１９ｍｍｏｌｅ）の溶液を加えた。１５分撹拌した後、トリメチルアミンの第２の部分（１３μＬ、０．０９４ｍｍｏｌｅ）を加えた。２時間後に冷却浴を取り除き、１５時間撹拌を続けた。ＨＰＬＣにより反応が完了したかをチェックし、その混合物を蒸発させ乾燥させた。ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製を行い（残留物は３ｍＬ  Ｍ．Ｐ．溶媒で希釈、Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３  カラム３０×２５０ｍｍ、流量３１ｍＬ／ｍｉｎ、４４％（０−１５ｍｉｎ）、５０％（１５−２５ｍｉｎ）のＡｃＮ／Ｈ２Ｏ、化合物１２、つまりリンカー−薬物１２、１８．３ｍｉｎ、ＵＶ２２０ｎｍ）、生成物を含有した画分（保持時間＝１８．３ｍｉｎ）を凍結乾燥して、リンカー−薬物１２を得た（１．４ｍｇ）（ＥＳＩ，ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｏｎ）：Ｍ／Ｚ：Ｍ＋Ｈ＝１７１１．８（Ｂｒ７９，Ｍ＋１），１７１３．９（Ｂｒ８１，Ｍ＋１）。
【０１８５】
実施例１３：リンカー−薬物１３の作製
下記スキームに示される手順に従ってリンカー−薬物１３を合成した。
2018138538.tif 000041
【０１８６】
ステップ１：化合物１３ａ（１．３−ｄｉ（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）プロパン−２−オール(1.3-di(tert-butyloxycarbonylamino)propan-2-ol) )の合成
文献に記載されている方法(Chem. Eur. J. 2004, 10, 1215-1226)に従って化合物１３ａを作製した。
【０１８７】
ＣＨ２Ｃｌ２（４ｍＬ）中の二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（４．８０ｇ、２２ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ／ＭｅＯＨ（１：５、１０ｍＬ）中の１，３−ジアミノ−プロパノール（９０１ｍｇ、１０．０ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（１６４ｍＬ、１．１８ｍｍｏｌ）の撹拌溶液にゆっくり加えた。反応は２時間以内に完了した（ＴＬＣでモニター）。その溶液を濃縮し、油性残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ（１：４））で精製し、Ｂｏｃ保護中間体化合物１３ａを無色の固体として得た（１．５９ｇ、５５％）；１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝５．１６（ｂｓ，２Ｈ），３．７３（ｍ，１Ｈ），３．２２−３．１６（ｍ，４Ｈ），１．４３（ｓ，１８Ｈ）ｐｐｍ；Ｍ／Ｚ（ＥＳ＋），２９１．７（Ｍ＋Ｈ），３１３．７（Ｍ＋Ｎａ）。
【０１８８】
ステップ２：化合物１３ｂ（Ｎ−（３−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−２−（エトキシカルボニルメチル−オキシ）−プロパ−１イル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル）（(N-(3-(tert-Butoxycarbonylamino)-2-(ethoxycarbonylmethyl-oxy)- prop-1yl) carbamic acid tert-butyl ester)）の合成
ブロモ酢酸ｔｅｒｔ−ブチル（２．０７ｇ、１０．７ｍｍｏｌ）を、乾燥ＴＨＦ  （２ｍＬ）中の化合物１３ａ（１．２３ｇ、４．２３ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に室温で加えた。水素化ナトリウム（０．４７ｇ、４．５モル当量）を１時間かけてゆっくり添加した。さらに５時間経過した後、その反応混合物をセライトで濾過し、蒸発させた。その残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製し（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ（８：２））、化合物１３ｂを透明の油として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：＝４．２１（ｑ，Ｊ＝７Ｈｚ，２Ｈ），４．１５（ｓ，２Ｈ），３．４５（ｍ，１Ｈ），  ３．４８−３．０６（ｍ，４Ｈ），１．４２（ｓ，１８Ｈ），１．２７（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，３Ｈ）；ＭＳｍ／ｚ（ＥＳ−），３４８．２（Ｍ−ｔ−ＢｕＯ）。
【０１８９】
ステップ３：化合物１３ｃ（Ｎ−（３−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−２−（エトキシカルボニルメチル−オキシ）−プロパ−１イル）カルバミン酸（(N-(3-(tert-Butoxycarbonylamino)-2-(ethoxycarbonylmethyl-oxy)- prop-1yl) carbamic acid）) の合成
化合物１３ｂ（３０ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１００ｍＬ）およびＭｅＯＨ（１００ｍＬ）中に溶解し、６Ｎ  ＮａＯＨ（１５０ｍＬ）を加え、その反応混合物を室温で１時間撹拌した。真空下で溶媒を除去し、０℃で６Ｎ  ＨＣｌ（１５５ｍＬ）を加えた。ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した後、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、乾燥剤をろ過すると共に、溶媒を留去して、粗生成物を得、それをカラムクロマトグラフィーにより精製し（シリカゲル、ヘキサン／酢酸エチル３／１から１／３）、白色の固体を得た（３．９ｇ、７４．５％）。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ５．２１（ｂｒ，１Ｈ），４．７２（ｂｒ，１Ｈ），４．６２（ｂｒ，１Ｈ），３．９２（ｓ，２Ｈ），３．７１−３．６８（ｔ，１Ｈ），３．４４−３．２９（ｍ，４Ｈ），１．３９（ｓ，１８Ｈ，ＣＨ３）；ＭＳ  ｍ／ｚ（ＥＳ−），３４７．７（Ｍ−１），２７３．６（Ｍ−ｔ−ＢｕＯ）。
【０１９０】
ステップ４：化合物１３ｄの合成
ＤＣＭ（６ｍＬ）中のＤＥＴＡ−４（５８ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌｅ）およびペンタフルオロフェノール（３６．８ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）の混合溶液に、ＤＣＣ（４１．２ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌｅ）を加えた。その混合物を室温で１２時間撹拌した。ＣＪ３５−５（６２．７ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌｅ）、ＤＩＰＥＡ（５４ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌｅ）を加えた。室温で３時間反応させた。溶媒を除去した後、化合物１３ｄを分取ＨＰＬＣで精製した（５０％から３５％ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ、ＵＶ２２０ｎｍ、Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３  カラム３０×２５０ｍｍ、流量３１ｍＬ／ｍｉｎ、化合物１３ｄ）。上掲の化合物１３ｄを白色の固体として得た（７３ｍｇ、７６％）。ＭＳ（ＥＳＩ，ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｉｏｎ）：Ｍ／Ｚ：５８１．１（Ｍ−Ｈ）＋。
【０１９１】
ステップ５：化合物１３ｅの合成
４ｍＬ共溶媒ＤＣＭ／ＤＭＦ（１：１）中の化合物１３ｄ（５７．５ｍｇ、０．０９８ｍｍｏｌｅ）および２ｍＬ  ＤＭＦ中の化合物ＭＭＡＥ（７０．５ｍｇ、０．０９８ｍｍｏｌｅ）の溶液に、ＴＢＴＵ（４７．６ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌｅ）およびＤＩＰＥＡ（３１．８ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌｅ）を加えた。４時間後に反応が完了した。減圧下で溶媒を除去した。Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３カラム３０×２５０ｍｍ、１０μｍ、アセトニトリル５０−３５％、流量３２ｍＬ／ｍｉｎ、ＵＶ２２０、化合物１３ｅ。上掲の化合物１３ｅを白色の固体として得た（１０１．６ｍｇ、収率８０．２％）。ＥＳＩ，ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｏｎ：Ｍ／Ｚ：１２８６．９（Ｍ＋１），１３０４．９（Ｍ＋Ｎａ）。
【０１９２】
ステップ６：リンカー−薬物１３の合成
１ｍＬ  ＤＣＭ中の化合物１３ｅ（１２ｍｇ、０．００９ｍｍｏｌｅ）の溶液に８〜１０℃でトリフルオロ酢酸（０．８ｍＬ、１０．４ｍｍｏｌｅ）を滴下して加えた。１時間後に氷水浴を取り除き、室温で４時間撹拌を続けた。減圧下で溶媒を除去し、その残留物に２ｍＬメタノールを加え、５分間攪拌してから、溶媒を除去した。最小量のＤＩＷ（２ｍＬ）を加え、凍結乾燥して、ＴＦＡ塩として粗生成物化合物１３ｅ−ｄｅＢｏｃを得た（１１ｍｇ）。
【０１９３】
１ｍＬ  ＤＣＭ中のＴＦＡ塩の溶液に、０〜３℃で撹拌しながら、トリメチルアミン（２０μＬ、０．１３６ｍｍｏｌｅ）、次いでＤＣＭ（０．２５ｍＬ）中のブロモアセチルブロミド１５ｍｇ（０．０７４ｍｍｏｌｅ）の溶液を加えた。１５分撹拌した後、トリメチルアミンの第２の部分（１０μＬ、０．０６８ｍｍｏｌｅ）を加えた。２時間後に冷却浴を取り除き、１５時間撹拌を続けた。ＨＰＬＣにより反応が完了したかをチェックし、その混合物を蒸発させ乾燥させた。ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製を行い（残留物は３ｍＬ  Ｍ．Ｐ．溶媒で希釈、Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３  カラム３０×２５０ｍｍ  １０μｍ、アセトニトリル４３％（０−９ｍｉｎ） ５０％（９−１５ｍｉｎ） ６０％（１５−２５ｍｉｎ）  流量３１ｍＬ／ｍｉｎ、ＵＶ２２０ｎｍ）、生成物を含有した画分（保持時間＝１４．１ｍｉｎ）を凍結乾燥して、化合物１３、つまりリンカー−薬物１３を得た（３．５ｍｇ）。（ＥＳＩ，ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｏｎ）：Ｍ／Ｚ：Ｍ＋Ｈ＝１３２２．７（Ｂｒ７９，Ｍ＋１）１３２４．７（Ｂｒ８１，Ｍ＋１）。
【０１９４】
実施例１４：リンカー−薬物１４の作製
下記スキームに示される手順に従ってリンカー−薬物１４を合成した。
2018138538.tif 000042
【０１９５】
ステップ１：化合物１４ａの合成
ＤＣＭ溶液（１００ｍＬ）中の２，２’−（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）（2,2’-(Ethylenedioxy)bis(ethylamine)）（１０ｇ）をＢｏｃ２Ｏ（２．２５ｇ、０．０１ｍｏｌｅ）で０℃５時間、および室温１８時間処理した。その有機相を、未反応のジアミンが全て抽出されるまで水１００ｍＬで洗浄した。乾燥（ＭｇＳＯ４）および真空下での濃縮の後、Ｂｏｃ保護化合物を定量的に回収した（２．５３ｇ、０．０１ｍｏｌｅ）。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：ｄ  １．４２（ｓ，９Ｈ），１．６３（ｂｒ  ｍ，２Ｈ，ＮＨ２），２．８６（ｔ，２Ｈ，Ｊ  ＝５．５Ｈｚ），３．３０（ｍ，２Ｈ），３．５０（ｍ，４Ｈ），３．４９−３．６１（ｍ，８Ｈ），５．３０（ｂｒ  ｓ，１Ｈ，ＮＨＣＯ２）。
【０１９６】
ステップ２：プロリン−ＡＦの合成
１２ｍＬ  ＤＣＭ中のアウリスタチンＦ（５００ｍｇ、０．５８ｍｍｏｌｅ）の溶液およびプロリン−ｔ−ブチルエステル（１１０ｍｇ、０．６４ｍｍｏｌｅ）に、ＨＡＴＵ（３３０ｍｇ、０．８６ｍｍｏｌｅ）およびＤＩＰＥＡ（１８８ｍｇ、１．４５ｍｍｏｌｅ）を加えた。反応は３〜４時間後に完了した。減圧下で溶媒を除去した。ＤＣＭ（６ｍＬ）中の上記溶液にＴＦＡ（２ｍＬ）を加えた。その混合物を室温で５時間撹拌し、その後、溶媒を真空下で除去した。Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３  カラム３０×２５０ｍｍ、流量３１ｍＬ／ｍｉｎ、移動相ＡｃＮ３５％（０−７ｍｉｎ）  ４３％（７−１６ｍｉｎ）  ４３％（７−１６ｍｉｎ）、１００％（１６ｍｉｎ−）、水＋０．１％ＴＦＡ  ＵＶ２２０ｎｍ、プロリン−ＡＦ、保持時間９．１ｍｉｎ。上掲の化合物、プロリン−ＡＦを白色の固体として得た（４４１．２ｍｇ、９０％）。ＥＳＩ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｏｎ），８４４．１［Ｍ＋Ｈ］＋，８６６．６［Ｍ＋Ｎａ］＋。
【０１９７】
ステップ３：化合物１４ｂの合成
４ｍＬ共溶媒ＤＣＭ／ＤＭＦ（１：１）中のプロリン−ＡＦ（５０４．３ｍｇ、０．５９ｍｍｏｌｅ）および２ｍＬ  ＤＭＦ中の化合物Ｎ−Ｂｏｃ−ＰＥＧ−アミン（Ｎ−Ｂｏｃ−２，２’−（エチレンジオキシ）ジエチルアミン）（１６３ｍｇ、０．１０６ｍｍｏｌｅ）の溶液に、ＨＡＴＵ（３４０ｍｇ、０．８９ｍｍｏｌｅ）およびＤＩＰＥＡ（１９３ｍｇ、１．４９ｍｍｏｌｅ）を加えた。反応は２時間後に完了した。減圧下で溶媒を除去した。Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３  カラム３０×２５０ｍｍ、１０μｍ、ＡｃＮ４３％（０−１５ｍｉｎ）  １００％（１５ｍｉｎ−）、流量３２ｍＬ／ｍｉｎ、ＵＶ２２０、化合物１４ｂ、ＲＴ  １１．５ｍｉｎ。上掲の化合物１４ｂを白色の固体として得た（５３０ｍｇ、収率８２．８％）。ＥＳＩ，ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｏｎ：Ｍ／Ｚ：１０７４．６［Ｍ＋Ｈ］＋，１０９６．９［Ｍ＋Ｎａ］＋。
【０１９８】
ステップ４：化合物１４ｃの合成
ＤＣＭ（４ｍＬ）中の化合物１４ｂ（５３０ｍｇ）の溶液にＴＦＡ（２ｍＬ）を加えた。その混合物を０℃で１．６時間撹拌し、その後、溶媒を真空下で除去した。その化合物１４ｃの粗生成物（ＴＦＡ塩）を、さらに精製することなく用いた。ＥＳＩ，ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｏｎ：Ｍ／Ｚ：９７４．８［Ｍ＋Ｈ］＋，９９６．９［Ｍ＋Ｎａ］＋。
【０１９９】
ステップ５：化合物１４ｄの合成
ＤＣＭ（１８ｍＬ）中のＮ−Ｂｏｃ−３，４−ジアミノ安息香酸（１ｇ、２．８４ｍｍｏｌｅ）およびペンタフルオロフェノール（７８４ｍｇ、４．２６ｍｍｏｌ）の混合溶液にＤＣＣ（８８０ｍｇ、４．２７ｍｍｏｌｅ）を加えた。その混合物を室温で１２時間撹拌し、その沈殿物をろ過し、真空下で濃縮した。カラムをｎ−ヘキサン／ＥｔＯＡｃ（４：１）で溶出した。目的の化合物を含有する画分を収集し、減圧下で濃縮して、Ｎ−Ｂｏｃ−３，４−ジアミノ安息香酸ＰＦＰエステル（１１−１、１．４７ｇ、２．８４ｍｍｏｌｅ、収率８０％）を生成した；１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）ｄ：８．１２（ｓ；１  Ｈ）；７．９７（ｓ；２Ｈ），７．２５（ｓ；１Ｈ），１．５（ｓ，１８Ｈ），ＥＳＩ，  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｉｏｎ）：Ｍ／Ｚ：５１７．９（Ｍ−）。
【０２００】
４ｍＬ共溶媒ＤＣＭ／ＤＭＦ（１：１）中のＮ−Ｂｏｃ−３，４−ジアミノ安息香酸ＰＦＰエステル（２５５ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌｅ）および２ｍＬ  ＤＭＦ中の化合物１４ｃ（４８０．６ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌｅ）の溶液に、ＤＩＰＥＡ（３１７．５ｍｇ、２．４６ｍｍｏｌｅ）を加えた。反応は５時間後に完了した。減圧下で溶媒を除去した。Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３  カラム３０×２５０ｍｍ、１０μｍ、ＡｃＮ３５％（０−５ｍｉｎ）  ４３％（５−１１ｍｉｎ）  ５０％（１１−２０ｍｉｎ）  ５５％（２０−２５ｍｉｎ）  ６５％（２５−３０ｍｉｎ）  １００％（３０ｍｉｎ−）、流量３２ｍＬ／ｍｉｎ、ＵＶ２２０、化合物１４ｄ、保持時間１８．１ｍｉｎ。上掲の化合物１４ｄを白色の固体として得た（４５０ｍｇ、０．３４４ｍｍｏｌｅ、収率７０％）。ＥＳＩ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｏｎ）：１３０９．０［Ｍ＋Ｈ］＋，１３３１．０［Ｍ＋Ｎａ］＋。
【０２０１】
ステップ６：リンカー−薬物１４の合成
４ｍＬ  ＤＣＭ中の化合物１４ｄ（２５ｍｇ、１９μｍｏｌｅ）の溶液に、２０〜２３℃の水浴で、トリフルオロ酢酸２ｍＬ（１０．４ｍｍｏｌｅ）を滴下して加えた。その水浴を取り除き、撹拌を２時間続けた。減圧下で溶媒を除去し、その残留物に２ｍＬメタノールを加え、５分間攪拌してから、溶媒を除去した。最小量のＤＩＷ（２ｍＬ）を加え、凍結乾燥して、粗生成物化合物１４ｄ−ｄｅＢｏｃをＴＦＡ塩として得た。ＥＳＩ（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｏｎ）：１１０８．９［Ｍ＋Ｈ］＋，１１３０．９［Ｍ＋Ｎａ］＋。
【０２０２】
ＤＣＭ／ＤＭＦ（１．２／０．５ｍＬ）溶液中のＴＦＡ塩（２４ｍｇ、１９μｍｏｌｅ）の溶液に、０〜５℃で撹拌しながら、ＤＣＭ（０．２ｍＬ）中のトリメチルアミン（４０μＬ、０．２８８ｍｍｏｌｅ）、次いでＤＣＭ（０．３ｍＬ）中のクロロアセチルクロリド（２１ｍｇ、０．１８５ｍｍｏｌｅ）の溶液を加えた。２時間後に冷却浴を取り除き、室温で１５時間撹拌を続けた。ＨＰＬＣにより反応が完了したかをチェックし、その混合物を蒸発させ乾燥させた。ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製を行い（残留物は３．５ｍＬ  Ｍ．Ｐ．溶媒で希釈、Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３  カラム３０×２５０ｍｍ、１０μｍ、流量３１ｍＬ／ｍｉｎ、Ｍ．Ｐ．３５％（０−５．５ｍｉｎ）  ４３％（５．５−１６ｍｉｎ）  １００％（１６ｍｉｎ−）ＡｃＮ＋０．１％ＴＦＡ、ＵＶ２２０ｎｍ）、生成物を含有した画分（保持時間１０．８１ｍｉｎ）を凍結乾燥して、化合物１４、つまりリンカー−薬物１４を得た（２０ｍｇ、８３％収率）。ＥＳＩ，ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｏｎ：Ｍ／Ｚ：１２６０．８［Ｍ＋Ｈ］＋，１２８２．９［Ｍ＋Ｎａ］＋  ＝１２８２．９。
【０２０３】
実施例１５：リンカー−薬物１５の作製
下記スキームに示される手順に従ってリンカー−薬物１５を合成した。
2018138538.tif 000043
【０２０４】
ステップ１：化合物１５ａの合成
ＤＣＭ  ６ｍＬ中のプロリン−ＡＦ（５１．３ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌｅ）および２ｍＬ  ＤＣＭ中の化合物Ｎ−Ｂｏｃ−１，６−ヘキサンジアミン（ＣＡＳ：１９４９２０−６２−２）（２２．４ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌｅ）の溶液に、ＨＡＴＵ  （３４．２ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌｅ）およびＤＩＰＥＡ（１９．３ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌｅ）を加えた。４時間後に反応が完了した。減圧下で溶媒を除去した。  分取ＨＰＬＣにより精製を行った（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３  カラム３０×２５０ｍｍ、流量３１ｍＬ／ｍｉｎ、移動相３５％（０−５ｍｉｎ）  ４３％（５−２１ｍｉｎ）  １００％（２１ｍｉｎ−）ＡｃＮ＋０．１％ＴＦＡ、ＵＶ２２０ｎｍ、化合物１５ａ、ＲＴ  １３．６ｍｉｎ）。上掲の化合物１５ａを白色の固体として得た（５２ｍｇ、収率７４．６％）。ＥＳＩ，ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｏｎ：Ｍ／Ｚ：１１４６．７［Ｍ＋１］＋，１１６９．０［Ｍ＋Ｎａ］＋。
【０２０５】
ステップ２：化合物１５ｂの合成
ＤＣＭ（４ｍＬ）中の化合物１５ａ（５２ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌｅ）の溶液にＴＦＡ（２ｍＬ）を加えた。その混合物を室温で１時間撹拌し、その後、溶媒を真空下で除去した。化合物１５ｂ粗生成物をさらに精製することなく用いた。ＥＳＩ，ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｏｎ：Ｍ／Ｚ：１０４６．９［Ｍ＋１］＋，１０６９．０［Ｍ＋Ｎａ］＋。
【０２０６】
ステップ３：化合物１５ｃの合成
ＤＣＭ（１８ｍＬ）中のＮ−Ｂｏｃ−３，４−ジアミノ安息香酸（１６ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌｅ）およびペンタフルオロフェノール（１２．５ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）の混合溶液にＤＣＣ（１２．３ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌｅ）を加えた。その混合物を室温で１２時間撹拌し、その沈殿物をろ過し、真空下で濃縮した。カラムをｎ−ヘキサン／ＥｔＯＡｃ（４：１）で溶出した。目的の化合物を含有する画分を収集し、減圧下で濃縮して、Ｎ−Ｂｏｃ−３，４−ジアミノ安息香酸ＰＦＰエステルを生成した。
【０２０７】
Ｎ−Ｂｏｃ−３，４−ジアミノ安息香酸ＰＦＰエステルの溶液に、２ｍＬ  ＤＭＦ中の化合物１５ｂ（４７．４ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌｅ）およびＤＩＰＥＡ（２９．３ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌｅ）を加えた。反応は２時間後に完了した。減圧下で溶媒を除去した。Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３  カラム３０×２５０ｍｍ、１０μｍ、ＡｃＮ４３％（０−５ｍｉｎ）  ５０％（５−１０ｍｉｎ）  ５５％（１０−１５ｍｉｎ）  ６５％（１５−２０ｍｉｎ）  １００％（２０ｍｉｎ−）、流量３２ｍＬ／ｍｉｎ、ＵＶ２２０、Ｔ６９−３、ＲＴ  １３．９ｍｉｎ。上掲の化合物１５ｃを白色の固体として得た（２８．９ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌｅ、収率５０％）。ＥＳＩ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｏｎ）：１３８０．９［Ｍ＋１］＋，１４０３．２［Ｍ＋Ｎａ］＋。
【０２０８】
ステップ４：リンカー−薬物１５の合成
４ｍＬ  ＤＣＭ中の化合物１５ｃ（８．６ｍｇ、６μｍｏｌｅ）の溶液に、２０〜２３℃でトリフルオロ酢酸２ｍＬ（１０．４ｍｍｏｌｅ）を滴下して加えた。水浴を取り除き、撹拌を２時間続けた。減圧下で溶媒を除去した。その残留物に２ｍＬメタノールを加え、５分撹拌してから、溶媒を除去した。最小量のＤＩＷ（２ｍＬ）を加え、凍結乾燥して、ＴＦＡ塩として化合物１５ｃ−ｄｅＢｏｃの粗生成物を得た（８．１ｍｇ）。ＥＳＩ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｏｎ）：１２７７．０［Ｍ＋１］＋，１２９８．９［Ｍ＋Ｎａ］＋。
【０２０９】
ＤＣＭ／ＤＭＦ（１．２／０．５ｍＬ）溶液中のＴＦＡ塩（８．１ｍｇ、６μｍｏｌｅ）の溶液に、０〜５℃で撹拌しながら、ＤＣＭ（０．２ｍＬ）中のトリメチルアミン（４５μＬ、０．３２４ｍｏｌｅ）、次いでＤＣＭ（０．３ｍＬ）中のクロロアセチルクロリド（２１ｍｇ、０．１８５ｍｍｏｌｅ）の溶液を加えた。２時間後に冷却浴を取り除き、室温で１５時間撹拌を続けた。ＨＰＬＣにより反応が完了したかをチェックし、その混合物を蒸発させ乾燥させた。ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製を行い（残留物は４ｍＬ  Ｍ．Ｐ．溶媒により希釈、Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３  カラム３０×２５０ｍｍ、１０μｍ、流量３１ｍＬ／ｍｉｎ、Ｍ．Ｐ．３５％（０−５ｍｉｎ）  ４３％（５−１５ｍｉｎ）  １００％（１５ｍｉｎ−）ＡｃＮ＋０．１％ＴＦＡ、ＵＶ２２０ｎｍ）、生成物を含有した画分（保持時間＝１１．４５ｍｉｎ）を凍結乾燥して、化合物１５、つまりリンカー−薬物１５を得た（６ｍｇ、４．５μｍｏｌｅ、７５％収率）。ＥＳＩ，ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｏｎ：Ｍ／Ｚ：１３３３．０  ［Ｍ＋Ｈ］＋，１３５５．０［Ｍ＋Ｎａ］＋。
【０２１０】
実施例１６：リンカー−薬物１６の作製
下記スキームに示される手順に従ってリンカー−薬物１６を合成した。
2018138538.tif 000044
【０２１１】
ステップ１：化合物１６ａの合成
８ｍＬ  ＤＣＭ中のプロリン−アウリスタチンＦ（１１７ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌｅ）およびＮ−Ｂｏｃ−１，６−ヘキサンジアミン（４５ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌｅ）の溶液に、ＨＡＴＵ（８０ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌｅ）およびＤＩＰＥＡ（４５ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌｅ）を加えた。反応は１時間後に完了した。減圧下で溶媒を除去した。分取ＨＰＬＣにより精製を行った（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３  カラム３０×２５０ｍｍ、流量３１ｍＬ／ｍｉｎ、移動相４３％（０−１０ｍｉｎ）  ５０％（１０−１７ｍｉｎ）  １００％（１７ｍｉｎ−）ＡｃＮ＋０．１％ＴＦＡ、ＵＶ２２０ｎｍ、化合物１６ａ、ＲＴ  １４．４ｍｉｎ。上掲の化合物１６ａを白色の固体として得た（１３７．８ｍｇ、収率９５％）。ＥＳＩ，ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｏｎ：  Ｍ／Ｚ：１０４２．４［Ｍ＋Ｈ］＋，１０６４．９［Ｍ＋Ｎａ］＋。
【０２１２】
ステップ２：化合物１６ｂの合成
ＤＣＭ（４ｍＬ）中の化合物１６ａ（１３７．８ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌｅ）の溶液にＴＦＡ（２ｍＬ）を加えた。その混合物を室温で１時間撹拌し、その後、真空下で溶媒を除去した。化合物１６ｂの粗生成物をさらに精製することなく用いた。ＥＳＩ，ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｏｎ：Ｍ／Ｚ：９４２．６［Ｍ＋Ｈ］＋，９６４．８［Ｍ＋Ｎａ］＋。
【０２１３】
ステップ３：化合物１６ｃの合成
ＤＣＭ（６ｍＬ）中のＮ−Ｂｏｃ−３，４−ジアミノ安息香酸（１２．７ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌｅ）およびペンタフルオロフェノール（１０ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）の混合溶液にＤＣＣ（１１．１ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌｅ）を加えた。その混合物を室温で１２時間撹拌し、その沈殿物をろ過し、真空下で濃縮した。ＰＦＰエステルの溶液に化合物１６ｂ（３３．９ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌｅ）およびＤＩＰＥＡ（２７．３ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌｅ）を加えた。室温で１時間反応させた。溶媒を除去した後、化合物１６ｃを分取ＨＰＬＣで精製した（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３カラム、サイズ３０×２５０ｍｍ、流量３１ｍＬ／ｍｉｎ、移動相：４３％（０−５ｍｉｎ）、５０％（５−１０ｍｉｎ）、５５％（１０−２０ｍｉｎ）、１００％（２０ｍｉｎ−）ＡｃＮ／水＋０．１％ＴＦＡ、ＵＶ２２０ｎｍ、化合物１６ｃ、  ＲＴ  １５．２ｍｉｎ。上掲の化合物１６ｃを白色の固体として得た（３２ｍｇ、７０％）。ＥＳＩ，ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｏｎ：Ｍ／Ｚ：１２７７．０［Ｍ＋Ｈ］＋，１２９９．０［Ｍ＋Ｎａ］＋。
【０２１４】
ステップ４：リンカー−薬物１６の合成
４ｍＬ  ＤＣＭ中の化合物１６ｃ（７．５ｍｇ、５．８μｍｏｌｅ）の溶液に２０〜２３℃の水浴でトリフルオロ酢酸２ｍＬ（１０．４ｍｍｏｌｅ）を滴下して加えた。水浴を取り除き、撹拌を２時間続けた。減圧下で溶媒を除去し、その残留物に２ｍＬメタノールを加え、５分撹拌してから、溶媒を除去した。最小量の水（２ｍＬ）を加え、凍結乾燥して、粗生成物化合物１６ｃ−ｄｅＢｏｃをＴＦＡ塩として得た。ＥＳＩ  ｆｏｒ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｏｎ，Ｍ／Ｚ：１０７７．０［Ｍ＋Ｈ］＋，１０９８．９［Ｍ＋Ｎａ］＋。
【０２１５】
ＤＣＭ／ＤＭＦ（１．０／０．５ｍＬ）溶液中のＴＦＡ塩（７ｍｇ、５．８μｍｏｌｅ）の溶液に、０〜５℃で撹拌しながら、ＤＣＭ（０．２ｍＬ）中のトリメチルアミン（４０μＬ、０．２８８ｍｍｏｌｅ）、次いでＤＣＭ（０．３ｍＬ）中のクロロアセチルクロリド（１８ｍｇ、０．１５９ｍｍｏｌｅ）の溶液を加えた。２時間後に冷却浴を取り除き、室温で１５時間撹拌を続けた。ＨＰＬＣにより反応が完了したかをチェックし、その混合物を蒸発させ乾燥させた。ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製を行い（残留物は３．５ｍＬ  Ｍ．Ｐ．溶媒で希釈、Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３  カラム３０×２５０ｍｍ、１０μｍ、流量３１ｍＬ／ｍｉｎ、Ｍ．Ｐ．３５％から４３％（グラジエント）ＡｃＮ／Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ、ＵＶ２２０ｎｍ）、生成物を含有した画分（保持時間１２．２７ｍｉｎ）を凍結乾燥して、化合物１６、つまりリンカー−薬物１６を得た（５ｍｇ、４．１μｍｏｌｅ、収率７０％）。ＥＳＩ，ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｏｎ：Ｍ／Ｚ：［Ｍ＋Ｈ］＋＝１２２８．９，１２５０．９［Ｍ＋Ｎａ］＋。
【０２１６】
＜抗体の還元＞
ハーセプチンを２．０〜５．５モル当量のＴＣＥＰで３７℃２時間処理し、還元した。脱塩した後、ハーセプチンのチオール濃度をＤＴＮＢにより測定し、かつタンパク質濃度をＵＶ２８０ｎｍで測定して、ＳＨの数／ＩｇＧを算出した。還元ハーセプチンのバンドプロファイルをＣＥにより得た。４対の鎖間ジスルフィド結合が４．５〜５．０モル当量のＴＣＥＰにより還元され、８個の遊離チオールが得られたことが確認された。
【０２１７】
＜抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）＞
キャピラリー電気泳動（ＣＥ）および疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を用い、架橋度および平均薬物抗体比（ＤＡＲ）をそれぞれ測定した。
【０２１８】
ＨＩＣ（疎水性相互作用クロマトグラフィー）分析
Ｂｕｔｙｌ  ＮＰＲ（４．６×３５ｍｍ）ＴＯＳＯＨカラムを有するＡｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣを用い、薬物抗体比（ＤＡＲ）プロファイルを分析した。移動相Ａは２５ｍＭリン酸ナトリウム、１．５Ｍ硫酸アンモニウムからなり、ｐＨは６．９５、移動相Ｂは２５ｍＭリン酸ナトリウム、２５％イソプロパノールからなり、ｐＨは６．９５であった。１０μＬの試料を流量０．８ｍＬ／ｍｉｎでカラムに注入した。グラジエントモード下、２０分で分離した（表２）。吸光度を２８０ｎｍで測定した。
【０２１９】
【表２】
2018138538.tif 000045
【０２２０】
実施例１７：ハーセプチン−リンカー−薬物１
抗体ハーセプチン（Ｒｏｃｈｅより購入）の凍結された結晶をＤＩＷ中に溶解した（初期濃度：１１．３６ｍｇ／ｍＬ）。抗体溶液４０μＬをＴＣＥＰ０．７７μＬ（５モル当量）で処理し、３７℃で２時間撹拌した。脱塩カラムを用いて還元ハーセプチン中の余分なＴＣＥＰを除去し、緩衝液をホウ酸塩緩衝液に変えた。ＤＭＳＯ中で調製した２０ｍＭのリンカー−薬物１（２．６１８μＬ、１７モル当量）を抗体溶液に２５〜４０℃で２時間かけて加え（混合溶液中の有機溶媒の最終濃度は約４．９％）、抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）を得た。脱塩カラム (ThermoFisher Scientific, ＭＷＣＯ：４０Ｋ）を用い、生成物ＡＤＣであるハーセプチン−リンカー−薬物１を精製した。溶出時、緩衝液をＰＢＳ緩衝液（２．６７ｍＭ  ＫＣｌ、１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１３７．９３ｍＭ  ＮａＣｌ、８．０６ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４−７Ｈ２Ｏ）に変えた。
【０２２１】
図１は、ハーセプチン−リンカー−薬物１の平均ＤＡＲが約３．９であり、Ｄ４の比率が約６５％であることを示している。 
【０２２２】
実施例１８：ハーセプチン−リンカー−薬物２
抗体ハーセプチン（Ｒｏｃｈｅより購入）の凍結された結晶をＤＩＷ中に溶解した（初期濃度：１１．３６ｍｇ／ｍＬ）。抗体溶液４０μＬをＴＣＥＰ３．０７μＬ（５モル当量）で処理し、３７℃で２時間撹拌した。脱塩カラムを用いて還元ハーセプチン中の余分なＴＣＥＰを除去し、緩衝液をホウ酸塩緩衝液に変えた。ＤＭＳＯ２．８μＬを加え、均一に混合した。次いで、ＤＭＳＯ中で調製した２０ｍＭのリンカー−薬物２（１．３８６μＬ、９モル当量）を抗体溶液に０〜４℃で２４時間かけて加え（混合溶液中の有機溶媒の最終濃度は約７．６％）、抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）を得た。脱塩カラム (ThermoFisher Scientific, ＭＷＣＯ：４０Ｋ）を用い、生成物ＡＤＣであるハーセプチン−リンカー−薬物２を精製した。溶出時、緩衝液をＰＢＳ緩衝液（２．６７ｍＭ  ＫＣｌ、１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１３７．９３ｍＭ  ＮａＣｌ、８．０６ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４−７Ｈ２Ｏ）に変えた。
【０２２３】
図２は、ハーセプチン−リンカー−薬物２の平均ＤＡＲが約４．３であり、Ｄ４の比率が約６０%であることを示している。
【０２２４】
実施例１９：ハーセプチン−リンカー−薬物３
抗体ハーセプチン（Ｒｏｃｈｅより購入）の凍結された結晶をＤＩＷ中に溶解した（初期濃度：１１．３６ｍｇ／ｍＬ）。抗体溶液４０μＬをＴＣＥＰ３．０７μＬ（５モル当量）で処理し、３７℃で２時間撹拌した。脱塩カラムを用いて還元ハーセプチン中の余分なＴＣＥＰを除去し、緩衝液をホウ酸塩緩衝液に変えた。ＤＭＳＯ中で調製した２０ｍＭのリンカー−薬物３（３．２３４μＬ、２１モル当量）を抗体溶液に０〜４℃で２４時間かけて加え（混合溶液中の有機溶媒の最終濃度は約５．９％）、抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）を得た。脱塩カラム (ThermoFisher Scientific, ＭＷＣＯ：４０Ｋ）を用い、生成物ＡＤＣであるハーセプチン−リンカー−薬物３を精製した。溶出時、緩衝液をＰＢＳ緩衝液（２．６７ｍＭ  ＫＣｌ、１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１３７．９３ｍＭ  ＮａＣｌ、８．０６ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４−７Ｈ２Ｏ）に変えた。
【０２２５】
図３は、ハーセプチン−リンカー−薬物３の平均ＤＡＲが約３．６であり、Ｄ４の比率が約３１%であることを示している。
【０２２６】
実施例２０：ハーセプチン−リンカー−薬物５
抗体ハーセプチン（Ｒｏｃｈｅより購入）の凍結された結晶をＤＩＷ中に溶解した（初期濃度：１１．３６ｍｇ／ｍＬ）。抗体溶液４０μＬをＴＣＥＰ３．０７μＬ（５モル当量）で処理し、３７℃で２時間撹拌した。脱塩カラムを用いて還元ハーセプチン中の余分なＴＣＥＰを除去し、緩衝液をホウ酸塩緩衝液に変えた。ＤＭＳＯ中で調製した２０ｍＭのリンカー−薬物５（１．３８６μＬ、９モル当量）を抗体溶液に０〜４℃で２４時間かけて加え（混合溶液中の有機溶媒の最終濃度は約２．７％）、抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）を得た。脱塩カラム (ThermoFisher Scientific, ＭＷＣＯ：４０Ｋ）を用い、生成物ＡＤＣであるハーセプチン−リンカー−薬物５を精製した。溶出時、緩衝液をＰＢＳ緩衝液（２．６７ｍＭ  ＫＣｌ、１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１３７．９３ｍＭ  ＮａＣｌ、８．０６ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４−７Ｈ２Ｏ）に変えた。
【０２２７】
図４は、ハーセプチン−リンカー−薬物５の平均ＤＡＲが約４．０であり、Ｄ４の比率が約５４％であることを示している。
【０２２８】
実施例２１：ハーセプチン−リンカー−薬物７
抗体ハーセプチン（Ｒｏｃｈｅより購入）の凍結された結晶をＤＩＷ中に溶解した（初期濃度：１１．３６ｍｇ／ｍＬ）。抗体溶液４０μＬをＴＣＥＰ３．０７μＬ（５モル当量）で処理し、３７℃で２時間撹拌した。脱塩カラムを用いて還元ハーセプチン中の余分なＴＣＥＰを除去し、緩衝液をホウ酸塩緩衝液に変えた。ＤＭＳＯ９．９μＬを加え、均一に混合した。次いで、ＤＭＳＯ中で調製した２０ｍＭのリンカー−薬物７（１．６９４μＬ、１１モル当量）を抗体溶液に０〜４℃で２４時間かけて加え（混合溶液中の有機溶媒の最終濃度は約１８．３％）、抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）を得た。脱塩カラム (ThermoFisher Scientific, ＭＷＣＯ：４０Ｋ)を用い、生成物ＡＤＣであるハーセプチン−リンカー−薬物７を精製した。溶出時、緩衝液をＰＢＳ緩衝液（２．６７ｍＭ  ＫＣｌ、１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１３７．９３ｍＭ  ＮａＣｌ、８．０６ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４−７Ｈ２Ｏ）に変えた。
【０２２９】
図５は、ハーセプチン−リンカー−薬物７の平均ＤＡＲが約３．９であり、Ｄ４の比率が約７７％であることを示している。
【０２３０】
実施例２２：ハーセプチン−リンカー−薬物８
抗体ハーセプチン（Ｒｏｃｈｅより購入）の凍結された結晶をＤＩＷ中に溶解した（初期濃度：１１．３６ｍｇ／ｍＬ）。抗体溶液４４０μＬをＴＣＥＰ３３．７８μＬ（５モル当量）で処理し、３７℃で２時間撹拌した。脱塩カラムを用いて還元ハーセプチン中の余分なＴＣＥＰを除去し、緩衝液をホウ酸塩緩衝液に変えた。ＤＭＳＯ７６．１μＬを加え、均一に混合した。次いで、ＤＭＳＯ中で調製した２０ｍＭのリンカー−薬物８（１５．２５μＬ、９モル当量）を抗体溶液に２５〜４０℃で２時間かけて加え（混合溶液中の有機溶媒の最終濃度は約１２．８％）、抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）を得た。脱塩カラム (ThermoFisher Scientific, ＭＷＣＯ：４０Ｋ)を用い、生成物ＡＤＣであるハーセプチン−リンカー−薬物８を精製した。溶出時、緩衝液をＰＢＳ緩衝液（２．６７ｍＭ  ＫＣｌ、１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１３７．９３ｍＭ  ＮａＣｌ、８．０６ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４−７Ｈ２Ｏ）に変えた。
【０２３１】
図６は、ハーセプチン−リンカー−薬物８の平均ＤＡＲが約４．２であり、Ｄ４の比率が約６５％であることを示している。
【０２３２】
実施例２３：ハーセプチン−リンカー−薬物９
抗体ハーセプチン（Ｒｏｃｈｅより購入）の凍結された結晶をＤＩＷ中に溶解した（初期濃度：１１．３６ｍｇ／ｍＬ）。抗体溶液４０μＬをＴＣＥＰ３．０７μＬ（５モル当量）で処理し、３７℃で２時間撹拌した。脱塩カラムを用いて還元ハーセプチン中の余分なＴＣＥＰを除去し、緩衝液をホウ酸塩緩衝液に変えた。ＤＭＳＯ１２．５μＬを加え、均一に混合した。次いで、ＤＭＳＯ中で調製した２０ｍＭのリンカー−薬物９（０．９２４μＬ、６モル当量）を抗体溶液に２５〜４０℃で２時間かけて加え（混合溶液中の有機溶媒の最終濃度は約２８．９％）、抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）を得た。脱塩カラム (ThermoFisher Scientific, ＭＷＣＯ：４０Ｋ)を用い、生成物ＡＤＣであるハーセプチン−リンカー−薬物９を精製した。溶出時、緩衝液をＰＢＳ緩衝液（２．６７ｍＭ  ＫＣｌ、１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１３７．９３ｍＭ  ＮａＣｌ、８．０６ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４−７Ｈ２Ｏ）に変えた。
【０２３３】
図７は、ハーセプチン−リンカー−薬物９の平均ＤＡＲが約４．０であり、Ｄ４の比率が約７０％であることを示している。
【０２３４】
実施例２４：ハーセプチン−リンカー−薬物１１
抗体ハーセプチン（Ｒｏｃｈｅより購入）の凍結された結晶をＤＩＷ中に溶解した（初期濃度：１１．３６ｍｇ／ｍＬ）。抗体溶液４０μＬをＴＣＥＰ３．０７μＬ（５モル当量）で処理し、３７℃で２時間撹拌した。脱塩カラムを用いて還元ハーセプチン中の余分なＴＣＥＰを除去し、緩衝液をホウ酸塩緩衝液に変えた。ＤＭＳＯ中で調製した２０ｍＭのリンカー−薬物１１（１．０７８μＬ、７モル当量）を抗体溶液に０〜４℃で２時間かけて加え（混合溶液中の有機溶媒の最終濃度は約２．１％）、抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）を得た。脱塩カラム (ThermoFisher Scientific, ＭＷＣＯ：４０Ｋ)を用い、生成物ＡＤＣであるハーセプチン−リンカー−薬物１１を精製した。溶出時、緩衝液をＰＢＳ緩衝液（２．６７ｍＭ  ＫＣｌ、１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１３７．９３ｍＭ  ＮａＣｌ、８．０６ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４−７Ｈ２Ｏ）に変えた。
【０２３５】
図８は、ハーセプチン−リンカー−薬物１１の平均ＤＡＲが約８．０であり、Ｄ８の比率が約５３％であることを示している。ハーセプチン−リンカー−薬物１１のリンカーユニットは２つの薬物単位と結合する。よって、ハーセプチン−リンカー−薬物１１の平均ＤＡＲは、他のＡＤＣの２倍である。
【０２３６】
実施例２５：ハーセプチン−リンカー−薬物１２
抗体ハーセプチン（Ｒｏｃｈｅより購入）の凍結された結晶をＤＩＷ中に溶解した（初期濃度：１１．３６ｍｇ／ｍＬ）。抗体溶液４０μＬをＴＣＥＰ３．０７μＬ（５モル当量）で処理し、３７℃で２時間撹拌した。脱塩カラムを用いて還元ハーセプチン中の余分なＴＣＥＰを除去し、緩衝液をホウ酸塩緩衝液に変えた。ＤＭＳＯ中で調製した２０ｍＭのリンカー−薬物１２（２．６１５μＬ、１７モル当量）を抗体溶液に２５〜４０℃で２時間かけて加え（混合溶液中の有機溶媒の最終濃度は約４．９％）、抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）を得た。脱塩カラム (ThermoFisher Scientific, ＭＷＣＯ：４０Ｋ)を用い、生成物ＡＤＣであるハーセプチン−リンカー−薬物１２を精製した。溶出時、緩衝液をＰＢＳ緩衝液（２．６７ｍＭ  ＫＣｌ、１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１３７．９３ｍＭ  ＮａＣｌ、８．０６ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４−７Ｈ２Ｏ）に変えた。
【０２３７】
図９は、ハーセプチン−リンカー−薬物１２の平均ＤＡＲが約３．２であり、Ｄ４の比率が約３８％であることを示している。
【０２３８】
実施例２６：ハーセプチン−リンカー−薬物１３
抗体ハーセプチン（Ｒｏｃｈｅより購入）の凍結された結晶をＤＩＷ中に溶解した（初期濃度：１１．３６ｍｇ／ｍＬ）。抗体溶液４０μＬをＴＣＥＰ３．０７μＬ（５モル当量）で処理し、３７℃で２時間撹拌した。脱塩カラムを用いて還元ハーセプチン中の余分なＴＣＥＰを除去し、緩衝液をホウ酸塩緩衝液に変えた。ＤＭＳＯ中で調製した２０ｍＭのリンカー−薬物１３（０．９２４μＬ、６モル当量）を抗体溶液に２５〜４０℃で２時間かけて加え（混合溶液中の有機溶媒の最終濃度は約１．８％）、抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）を得た。脱塩カラム (ThermoFisher Scientific, ＭＷＣＯ：４０Ｋ)を用い、生成物ＡＤＣであるハーセプチン−リンカー−薬物１３を精製した。溶出時、緩衝液をＰＢＳ緩衝液（２．６７ｍＭ  ＫＣｌ、１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１３７．９３ｍＭ  ＮａＣｌ、８．０６ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４−７Ｈ２Ｏ）に変えた。
【０２３９】
図１０は、ハーセプチン−リンカー−薬物１３の平均ＤＡＲが約３．９であり、Ｄ４の比率が約５８％であることを示している。
【０２４０】
実施例２７：ハーセプチン−リンカー−薬物１４
抗体ハーセプチン（Ｒｏｃｈｅより購入）の凍結された結晶をＤＩＷ中に溶解した（初期濃度：１１．３６ｍｇ／ｍＬ）。抗体溶液４０μＬをＴＣＥＰ０．７７μＬ（５モル当量）で処理し、３７℃で２時間撹拌した。脱塩カラムを用いて還元ハーセプチン中の余分なＴＣＥＰを除去し、緩衝液をホウ酸塩緩衝液に変えた。ＤＭＳＯ中で調製した２０ｍＭのリンカー−薬物１４（２．００２μＬ、１３モル当量）を抗体溶液に０〜４℃で２４時間かけて加え（混合溶液中の有機溶媒の最終濃度は約３．８％）、抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）を得た。脱塩カラム (ThermoFisher Scientific,  ＭＷＣＯ：４０Ｋ)を用い、生成物ＡＤＣであるハーセプチン−リンカー−薬物１４を精製した。溶出時、緩衝液をＰＢＳ緩衝液（２．６７ｍＭ  ＫＣｌ、１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１３７．９３ｍＭ  ＮａＣｌ、８．０６ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４−７Ｈ２Ｏ）に変えた。
【０２４１】
図１１は、ハーセプチン−リンカー−薬物１４の平均ＤＡＲが約４．０であり、Ｄ４の比率が約８７％であることを示している。
【０２４２】
実施例２８：ハーセプチン−リンカー−薬物１５
抗体ハーセプチン（Ｒｏｃｈｅより購入）の凍結された結晶をＤＩＷ中に溶解した（初期濃度：１１．３６ｍｇ／ｍＬ）。抗体溶液４０μＬをＴＣＥＰ０．７７μＬ（５モル当量）で処理し、３７℃で２時間撹拌した。脱塩カラムを用いて還元ハーセプチン中の余分なＴＣＥＰを除去し、緩衝液をホウ酸塩緩衝液に変えた。ＤＭＳＯ中で調製した２０ｍＭのリンカー−薬物１５（２．００２μＬ、１３モル当量）を抗体溶液に０〜４℃で２４時間かけて加え（混合溶液中の有機溶媒の最終濃度は約３．８％）、抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）を得た。脱塩カラム (ThermoFisher Scientific, ＭＷＣＯ：４０Ｋ)を用い、生成物ＡＤＣであるハーセプチン−リンカー−薬物１５を精製した。溶出時、緩衝液をＰＢＳ緩衝液（２．６７ｍＭ  ＫＣｌ、１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１３７．９３ｍＭ  ＮａＣｌ、８．０６ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４−７Ｈ２Ｏ）に変えた。
【０２４３】
図１２は、ハーセプチン−リンカー−薬物１５の平均ＤＡＲが約４．０であり、Ｄ４の比率が約８２%であることを示している。
【０２４４】
実施例２９：ハーセプチン−リンカー−薬物１６
抗体ハーセプチン（Ｒｏｃｈｅより購入）の凍結された結晶をＤＩＷ中に溶解した（初期濃度：１１．３６ｍｇ／ｍＬ）。抗体溶液４０μＬをＴＣＥＰ３．０７μＬ（５モル当量）で処理し、３７℃で２時間撹拌した。脱塩カラムを用いて還元ハーセプチン中の余分なＴＣＥＰを除去し、緩衝液をホウ酸塩緩衝液に変えた。ＤＭＳＯ１６．０μＬを加え、均一に混合した。次いで、ＤＭＳＯ中で調製した２０ｍＭのリンカー−薬物１６（２．００２μＬ、１３モル当量）を抗体溶液に０〜４℃で２４時間かけて加え（混合溶液中の有機溶媒の最終濃度は約２６．４％）、抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）を得た。脱塩カラム (ThermoFisher Scientific, ＭＷＣＯ：４０Ｋ)を用い、生成物ＡＤＣであるハーセプチン−リンカー−薬物１６を精製した。溶出時、緩衝液をＰＢＳ緩衝液（２．６７ｍＭ  ＫＣｌ、１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１３７．９３ｍＭ  ＮａＣｌ、８．０６ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４−７Ｈ２Ｏ）に変えた。
【０２４５】
図１３は、ハーセプチン−リンカー−薬物１６の平均ＤＡＲが約４．０であり、Ｄ４の比率が約８１％であることを示している。
【０２４６】
＜保存試験（Storage Test）＞
２０ｍＭリンカー−薬物７をＤＭＳＯ中に−２０℃で０日間、２１日間、９２日間および９９日間保管した。ＬＣ−ＭＳを用い、リンカー−薬物７の純度を分析した。ＬＣ−ＭＳ分析の条件は以下のとおりとした。
カラム：４．６ｍｍ×２０ｍｍ  ＸＢｒｉｄｇｅ  Ｃ１８  ｃｏｌｕｍｎ(Waters, Milford USA)  
流量：７００μｌ／ｍｉｎ  
線形グラジエント：５から７０％  溶媒Ｂ（１００％アセトニトリルと０．１％ギ酸）
溶媒Ａ（ｄｄＨ２Ｏ中、０．１％ギ酸）
溶媒Ｂ（１００％アセトニトリルと０．１％ギ酸）
【０２４７】
図１５に示されるように、異なる保管条件におけるリンカー−薬物７のＬＣ−ＭＳ分析の結果から、ＤＭＳＯ中に溶解したときにリンカー−薬物７は安定であったということがわかる。
【０２４８】
＜力価試験＞
ＨＥＲ２陰性細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、抗ハーセプチン（登録商標）薬物耐性を有するＨＥＲ２中程度発現（moderate-expressing）乳癌細胞株ＪＩＭＴ−１、およびＨＥＲ２高発現乳癌細胞株ＢＴ−４７４をＡＤＣで処理し、これら細胞におけるＡＤＣの選択毒性を分析した。
【０２４９】
細胞をＣｏｒｎｉｎｇ  ＣｅｌｌＢＩＮＤ  ９６−ウェルプレートに密度６×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種した。３７℃で終夜、５％ＣＯ２のインキュベーターで培養した後、段階希釈により異なる濃度のＡＤＣを細胞に加えた。次いで、細胞を７２〜１２０時間、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで培養した。７２〜１２０時間後、古い培地を除去し、細胞を１度リンスし、１０倍希釈ＣＣＫ−８試薬で３７℃４時間処理した。その９６ウェルプレートをＥＬＩＳＡリーダーに入れ、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。細胞生存率を次の式：細胞生存率（％）＝（試料の強度／対照群の強度）×１００％により算出した。ＡＤＣ試料のＩＣ５０値をＳｉｇｍａＰｌｏｔソフトウェアを用いて算出した。
【０２５０】
表３および図１６によると、ＨＥＲ２陰性細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４６８におけるハーセプチン−リンカー−薬物３、ハーセプチン−リンカー−薬物８、およびハーセプチン−リンカー−薬物９の毒性は、市販のＫａｄｃｙｌａに比べて著しく低い。
【０２５１】
表４および図１７によると、ＨＥＲ２陰性細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４６８におけるハーセプチン−リンカー−薬物１４、ハーセプチン−リンカー−薬物１５、およびハーセプチン−リンカー−薬物１６の毒性は、市販のＫａｄｃｙｌａに比べて著しく低い。
【０２５２】
また、表３、および図１８Ａ〜１８Ｃは、ＨＥＲ２中程度発現乳癌細胞株ＪＩＭＴ−１におけるハーセプチン−リンカー−薬物４、ハーセプチン−リンカー−薬物７、ハーセプチン−リンカー−薬物８、ハーセプチン−リンカー−薬物９、およびハーセプチン−リンカー−薬物１１のＩＣ５０値が０．５ｎＭ未満であることを示している。ＪＩＭＴ−１細胞におけるこれらＡＤＣの力価は、市販のＫａｄｃｙｌａに比べ良好である。特に、図１８Ｃはハーセプチン−リンカー−薬物１１の細胞毒性を示しており、それは高ＤＡＲ値を有し（ＤＡＲ約８）、他のＡＤＣの細胞毒性よりも優れている。
【０２５３】
表４および図１９は、ＨＥＲ２中程度発現乳癌細胞株ＪＩＭＴ−１におけるハーセプチン−リンカー−薬物１４、ハーセプチン−リンカー−薬物１５、およびハーセプチン−リンカー−薬物１６のＩＣ５０値が０．５ｎＭ未満であることを示している。ＪＩＭＴ−１細胞におけるこれらＡＤＣの力価は、市販のＫａｄｃｙｌａに比べ良好である。
【０２５４】
また、表３および図２０Ａ〜２０Ｃは、ＨＥＲ２高発現乳癌細胞株ＢＴ−４７４におけるハーセプチン−リンカー−薬物２、ハーセプチン−リンカー−薬物３、ハーセプチン−リンカー−薬物４、ハーセプチン−リンカー−薬物７、ハーセプチン−リンカー−薬物８、ハーセプチン−リンカー−薬物９、およびハーセプチン−リンカー−薬物１１のＩＣ５０値が０．５ｎＭ未満であることを示している。ＢＴ−４７４細胞におけるこれらＡＤＣの力価は、市販のＫａｄｃｙｌａに比べて良好である。
【０２５５】
表４および図２１は、ＨＥＲ２高発現乳癌細胞株ＢＴ−４７４におけるハーセプチン−リンカー−薬物１４、ハーセプチン−リンカー−薬物１５、およびハーセプチン−リンカー−薬物１６のＩＣ５０値が０．１ｎＭ未満であることを示している。ＢＴ−４７４細胞におけるこれらＡＤＣの力価は、市販のＫａｄｃｙｌａに比べ良好である。
【０２５６】
結果から、表３中の部位特異的ＡＤＣは、ＨＥＲ２中程度発現乳癌細胞株ＪＩＭＴ−１およびＨＥＲ２高発現乳癌細胞株ＢＴ−４７４において良好な選択毒性を備えることがわかる。
【０２５７】
【表３】
2018138538.tif 000046
【０２５８】
【表４】
2018138538.tif 000047
【０２５９】
＜腫瘍増殖抑制試験：ＢＴ−４７４異種移植モデル＞
１×１０７個の乳癌細胞株ＢＴ−４７４をＮＯＤＳＣＩＤマウスに皮下注射し、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＡＤＣの薬効について試験した。
【０２６０】
先ず、雌マウスにエストラジオール試薬ペレット（０．３６ｍｇ／ペレット；９０ｄａｙｓ  ｒｅｌｅａｓｅ，Innovative Research of America)を注入した。次いで、ＢＴ−４７４細胞をマウスに皮下注射し、腫瘍増殖を待った。腫瘍の長さおよび幅を測り、腫瘍のサイズを（長さ×幅×幅×１／２）（ｍｍ３）で計算し、記録した。平均腫瘍サイズが約３５９ｍｍ３になったとき、ビヒクル（ＤＰＢＳ）、Ｋａｄｃｙｌａ（Ｒｏｃｈｅより購入）（１０ｍｇ／ｋｇ）、ハーセプチン−リンカー−薬物５（５ｍｇ／ｋｇ）、ハーセプチン−リンカー−薬物５（２．５ｍｇ／ｋｇ）、ハーセプチン−リンカー−薬８（５ｍｇ／ｋｇ）、ハーセプチン−リンカー−薬８（２．５ｍｇ／ｋｇ）を、０日目および２１日目に２回静脈内注射し(注入量1０ｍＬ／ｋｇ  Ｂ．Ｗ．）、薬力学的実験を行った。
【０２６１】
腫瘍増殖およびマウスの体重を６０日目まで観察した。腫瘍増殖抑制（ＴＧＩ）の計算式は、ＴＧＩ（％）＝［１―（△薬物処理群の腫瘍体積／△ビヒクル群の腫瘍体積）］×１００（％）である。実験期間中、腫瘍がマウス体重の１０％を上回るか、腫瘍体積が１５００ｍｍ３より大きくなるか、または他の副作用が同時に起こったら、人道的配慮からＣＯ２を用いてマウスを犠牲死させた。 
【０２６２】
ＡＤＣで６０日処理した後、ハーセプチン−リンカー−薬物５（５ｍｇ／ｋｇ）、ハーセプチン−リンカー−薬物８（５ｍｇ／ｋｇ）、およびハーセプチン−リンカー−薬物８（２．５ｍｇ／ｋｇ）処理群の腫瘍増殖は、大幅に抑制された。６０日目に、ハーセプチン−リンカー−薬物５（５ｍｇ／ｋｇ）、ハーセプチン−リンカー−薬物８（５ｍｇ／ｋｇ）、およびハーセプチン−リンカー−薬物８（２．５ｍｇ／ｋｇ）処理群のＴＧＩは、それぞれ１３３．８±９．４％、１４１．７±１４％、および１４２．２±６．７％であり、一方、Ｋａｄｃｙｌａ（１０ｍｇ／ｋｇ）処理群のＴＧＩは約６４％であった（表５および図２２参照）。
【０２６３】
結果（表６参照）から、ＡＤＣ投与後に、体重減少または他の顕著な異常臨床症状が生じなかったことがわかった。
【０２６４】
【表５】
2018138538.tif 000048
【０２６５】
【表６】
2018138538.tif 000049
【０２６６】
＜腫瘍増殖抑制試験：ＥＣ  ＰＤＸモデル＞
国立台湾大学（National Taiwan University）より入手した子宮内膜癌腫瘍組織がＨＥＲ２陽性（＋１）であることを確認した。腫瘍（直径２〜３ｍｍ）をＮＯＤＳＣＩＤマウスに皮下移植し、ｉｎ  ｖｉｖｏでＡＤＣの薬効を試験した。
【０２６７】
平均腫瘍サイズが約１００ｍｍ３になったとき、マウスをグループ分けし、ＡＤＣを静脈注射した（注入量１０ｍＬ／ｋｇ  Ｂ．Ｗ．）。１２日間ＡＤＣで処理した後、ハーセプチン−リンカー−薬物７（１０ｍｇ／ｋｇ）、ハーセプチン−リンカー−薬物７（５ｍｇ／ｋｇ）、ハーセプチン−リンカー−薬物１１（１０ｍｇ／ｋｇ）、およびハーセプチン−リンカー−薬物１１（５ｍｇ／ｋｇ）処理群の腫瘍増殖は大幅に抑制された。１２日目に、ハーセプチン−リンカー−薬物７（１０ｍｇ／ｋｇ）、ハーセプチン−リンカー−薬物７（５ｍｇ／ｋｇ）、ハーセプチン−リンカー−薬物１１（１０ｍｇ／ｋｇ）、およびハーセプチン−リンカー−薬物１１（５ｍｇ／ｋｇ）処理群のＴＧＩはそれぞれ９５．６±２．３％、６６．９±４．６％、１０１．７±０．５％、および９５．０±３．２％であり、一方、Ｋａｄｃｙｌａ（１０ｍｇ／ｋｇ）処理群のＴＧＩは  ２６．５±１０．１％であった（表７および図２３参照）。
【０２６８】
結果（表８参照）から、ビヒクル、Ｋａｄｃｙｌａ（１０ｍｇ／ｋｇ）、ハーセプチン−リンカー−薬物７（１０ｍｇ／ｋｇ）、およびハーセプチン−リンカー−薬物７（５ｍｇ／ｋｇ）投与後に、体重減少または他の顕著な異常臨床症状が生じなかったことがわかる。ハーセプチン−リンカー−薬物１１（１０ｍｇ／ｋｇ）およびハーセプチン−リンカー−薬物１１（５ｍｇ／ｋｇ）投与後に著しい体重減少は生じたが、異常臨床症状は１週間後に回復した。
【０２６９】
【表７】
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【０２７０】
【表８】
2018138538.tif 000051
【０２７１】
当業者には、開示された実施形態に様々な修飾および変更を加え得ることは明かであろう。明細書および実施例は単に例とみなされることが意図されており、本開示の真の範囲は、以下の特許請求の範囲およびそれらの均等物によって示されるものである。
【図１】
2018138538.tif 000061
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2018138538.tif 000070
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
2018138538.tif 000074
【図１５】
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【図１６】
2018138538.tif 000076
【図１７】
2018138538.tif 000077
【図１８Ａ】
2018138538.tif 000078
【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
2018138538.tif 000080
【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
2018138538.tif 000084
【図２１】
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【図２２】
2018138538.tif 000086
【図２３】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年4月13日(2018.4.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９３】
ステップ２：化合物３ｂ（Ｂｏｃ−ＰＥＧ−ＡＦ）の合成
ＤＣＭ（２ｍＬ）およびＤＭＦ（２ｍＬ）中のアウリスタチンＦ（２００ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌｅ）の溶液に、化合物３ａ（７５ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌｅ）、ＤＩＰＥＡ（１８０ｍｇ、１．３９ｍｍｏｌｅ）、ＴＢＴＵ（２２０ｍｇ、０．６８ｍｍｏｌｅ）を加えた。反応溶液を室温で１時間攪拌した。溶媒を除去した後、化合物３ｂを分取ＨＰＬＣにより精製した（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３  カラム３０×２５０ｍｍ、移動相４３％ＡｃＮ／Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ、流量３２ｍＬ／ｍｉｎ、Ｂｏｃ−ＰＥＧ−ＡＦ  ＲＴ  ９．３ｍｉｎ）。上掲の化合物３ｂを白色の固体として得た（２０３ｍｇ、８９％）。ＥＳＩ，ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｏｎ：Ｍ／Ｚ：９７７．５（Ｍ＋１）；９９３．２（Ｍ＋Ｎａ）。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９６】
リンカー−薬物３の化学式はＣ５７Ｈ８９Ｃｌ２Ｎ９Ｏ１２である。ＥＳＩ，ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｏｎ：Ｍ／Ｚ：１１６３．５（Ｍ＋１）；１１８５．３（Ｍ＋Ｎａ）。ＥＳＩ−ＨＩＭＳ，ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｏｎ：Ｍ／Ｚ：１１６２．６０８２，［Ｍ＋Ｈ］＋ｆｏｒ  Ｃ５７Ｈ９０Ｃｌ２Ｎ９Ｏ１２，ｅｒｒ：−０．１ｐｐｍ。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５２】
ステップ４：化合物１０ｄの合成
ＤＣＭ（６ｍＬ）中のＮ−Ｂｏｃ−３，４−ジアミノ安息香酸（６０ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌｅ）およびペンタフルオロフェノール（４７ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）の混合溶液にＤＣＣ（５１．５ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌｅ）を加えた。その混合物を室温で１２時間撹拌し、その沈殿物をろ過し、真空下で濃縮した。ＰＦＰエステルの溶液に化合物１０ｃ（２３５ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌｅ）およびＤＩＰＥＡ（５５ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌｅ）を加えた。室温で１時間反応させた。溶媒を除去した後、化合物１０ｄを分取ＨＰＬＣで精製した（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３  カラム３０×２５０ｍｍ、５μｍ、アセトニトリル４２％（０−５ｍｉｎ）から５０％（５−１３ｍｉｎ）から５５％（１３−２５ｍｉｎ）、流量３１ｍＬ／ｍｉｎ、ＵＶ２２０、ＲＴ  １３．８ｍｉｎ）。上掲の化合物１０ｄを白色の固体として得た（１７３ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌｅ、８１％）。ＥＳＩ，ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｏｎ：Ｍ／Ｚ：１２５５．３，１２７７３（Ｍ＋Ｎａ）。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７３】
次いで、４ｍＬ共溶媒ＤＣＭ中のＣＪ２４−１（６４ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌｅ）および２ｍＬ  ＤＭＦ中の化合物１１ｅ−ｄｅＦｍｏｃ（１２３．５ｍｇ、０．０５４ｍｍｏｌｅ）の溶液に、ＥＤＣ（２６ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌｅ）およびＤＩＰＥＡ（１４ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌｅ）を加えた。反応は１２時間後に完了した。減圧下で溶媒を除去した。化合物１１ｆを分取ＨＰＬＣで精製した。生成物を含有した画分を凍結乾燥して、化合物１１ｆを白色の固体として得た（１６９．８ｍｇ、収率５５％）。
【外国語明細書】
2018138538000001.pdf