(57)【要約】【課題】アスコルビン酸の即時測定を、精度よく、低コストで簡便に行うこと。【解決手段】電極と、該電極と接触し、アスコルビン酸からの電子授受を行う非触媒の電子アクセプターを含む検知層とを含み、該検知層において前記電子アクセプターと前記電極間で還元反応が行われることを特徴とする、アスコルビン酸応答電極。【選択図】図４
2018013385.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
電極と、
該電極と接触し、アスコルビン酸からの電子授受を行う非触媒の電子アクセプターを含む検知層とを含み、
該検知層において前記電子アクセプターと前記電極間で還元反応が行われることを特徴とする、アスコルビン酸応答電極。
【請求項２】
前記電子アクセプターは、プルシアンブルーである、請求項１に記載のアスコルビン酸応答電極。
【請求項３】
プルシアンブルーは酸化体である、請求項２に記載のアスコルビン酸応答電極。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のアスコルビン酸応答電極を含むバイオセンサ。
【請求項５】
請求項４に記載のバイオセンサにアスコルビン酸含有試料を反応させ、前記アスコルビン酸応答電極に還元電位を印加して応答電流を測定し、該応答電流に基づいてアスコルビン酸濃度を算出することを特徴とする、アスコルビン酸濃度の測定方法。
【請求項６】
請求項４に記載のバイオセンサと、
バイオセンサへの電圧印加を制御する、制御部と、
バイオセンサへの電圧印加により得られる、アスコルビン酸応答電流を検出する、検出部と、
前記電流値からアスコルビン酸の濃度を算出する、演算部と、
前記算出されたアスコルビン酸の濃度を出力する出力部とから構成される測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中のアスコルビン酸濃度を測定するための電極およびバイオセンサに関する。
【背景技術】
【０００２】
アスコルビン酸（ビタミンC）は食事により摂取され、小腸より吸収され体内の臓器および組織へ広く分布する。生化学的にはコラーゲンの合成、カルニチンの合成、副腎皮質ホルモンの合成、カテコールアミンの合成、過酸化脂質の分解、活性酸素の分解などに関与しており、生体内で重要な役割を果たしている。近年では、ビタミンCの強い還元性による、抗がん作用、免疫力増強、そして、美肌、美白効果が着目され、高濃度ビタミンC点滴療法などに応用されている。
【０００３】
アスコルビン酸の測定においては、アスコルビン酸欠乏症診断のための測定や食品中のアスコルビン酸の測定が挙げられる。また、高濃度ビタミンC点滴療法においては、血中のビタミンC濃度の即時モニタリングが必須であり、また、糖尿病における自己血糖測定においては、血中のアスコルビン酸がグルコース測定値に影響を及ぼすため、アスコルビン酸濃度の測定値によるグルコース値の補正の必要性が挙がっている。
【０００４】
特許文献１には、食品中の微量栄養素として、アスコルビン酸を高速液体クロマトグラフィー（HPLC）法で測定する方法が開示されている。
特許文献２には、アスコルビン酸測定の一例として、アスコルビン酸オキシダーゼおよびフェリシアン化合物等の電子メディエーターを含む検知層を構成要素とした電極を有するバイオセンサが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表2005-517926
【特許文献２】特開平09-243591
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
先行文献１の高速液体クロマトグラフィー（HPLC）法でのアスコルビン酸測定に関しては、装置が高価になることからコスト面の問題がある。また、上記装置は、大型の医療施設や検査センターに設置されていることが多く、装置を設置していない施設においては、検査を外注分析に出すため、リアルタイムの測定が出来ないが、特に高濃度ビタミンC点滴療法においては、ビタミンCの代謝や排出の影響を考慮し、リアルタイムな測定が望まれており、問題となっている。
先行文献２では、バイオセンサにより、簡便で即時（リアルタイム）測定が可能であるが、アスコルビン酸オキシダーゼ等の酵素触媒を用いていることにより、非特異的な触媒反応による測定精度の悪化の問題があった。また、酵素の変性に起因しセンサの保存安定性が悪いため、酵素の処方量を増加する必要があり、コストが高くなるという課題があった。
上記に鑑み、本発明は、アスコルビン酸の即時測定を、精度よく、低コストで簡便に行うことを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明者は上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、従来のようなHPLCやアスコル
ビン酸オキシダーゼのような酵素触媒を用いることなくアスコルビン酸を簡便に測定することのできるアスコルビン酸応答電極を見出した。すなわち、本発明は、電極と、該電極と接触し、アスコルビン酸からの電子授受を行う非触媒の電子アクセプターを含む検知層を含み、前記検知層における前記電子アクセプターと前記電極間で還元反応が行われることを特徴とする、アスコルビン酸応答電極を提供する。
本発明はまた、前記アスコルビン酸応答電極を含むバイオセンサを提供する。
本発明はまた、該バイオセンサにアスコルビン酸含有試料を反応させ、前記アスコルビン酸応答電極に還元電位を印加して応答電流を測定し、該応答電流に基づいてアスコルビン酸濃度を算出することを特徴とする、アスコルビン酸濃度の測定方法、を提供する。
本発明はまた、前記バイオセンサと、バイオセンサへの電圧印加を制御する、制御部と、バイオセンサへの電圧印加により得られる、アスコルビン酸応答電流を検出する、検出部と、前記電流値からアスコルビン酸の濃度を算出する、演算部と、前記算出されたアスコルビン酸の濃度を出力する出力部とから構成される測定装置、を提供する。
前記「電子アクセプター」は、電子を供与できる電子ドナーの機能を持った化合物からの電子を授受できる化合物である。前記「非触媒」とは、酵素やオルガネラ等、化学反応を触媒する生体触媒の機能を持っていないか、もしくは、生体触媒の機能が小さいことを意味する。アスコルビン酸は、還元性物質として強い電子ドナーの機能を持っている。この特性を利用し、アスコルビン酸からの電子を電子アクセプターへ電子授受させて、還元体の電子アクセプターを生成させることを実現した。その後、電極に負の電位を印加することで、未反応の酸化体の電子アクセプターと、電極との間で、電子授受が行われ、還元電流が流れる。この還元電流は、前記電子ドナーと負に相関することを見出した。これらの種々の機能により本発明を完成させた。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のアスコルビン酸応答電極は酵素を使用しないため、非特異的な触媒反応による測定精度の悪化を抑えた精度の高いアスコルビン酸の測定が可能である。また、酵素タンパク質の変性に起因する保存安定性の問題がないため、コストを抑えることが可能である。また、オスミウム錯体、ルテニウム錯体等の血糖センサを中心としたバイオセンサに主に使われているメディエーターの酸化電位より低い-500mVでの測定が可能であるため、グルコース測定セルと同一の系で測定を行ってもグルコース測定に影響しない。以上より、本発明により、アスコルビン酸の即時測定を、精度よく、低コストで簡便に行うことが可能になった。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、本発明の一実施形態にかかるバイオセンサの製造方法の一例を示す工程図であり、（Ａ）〜（Ｅ）は、各工程でのバイオセンサの模式図を示す。
【図２】図２は、本発明の測定装置の一態様を示す模式図である。
【図３】図３は、本発明の測定装置を用いた測定プログラムの一態様を示すフローチャート図である。
【図４】図４は、様々な濃度のアスコルビン酸を含む試料を本発明のバイオセンサに反応させて電圧（−５００ｍＶ）を印加してから５秒間の応答電流を示すグラフである。
【図５】図５は、電圧（−５００ｍＶ）印加２または４秒後において、アスコルビン酸濃度と、アスコルビン酸濃度0mg/dLの応答電流値に対する各濃度の応答電流値のバイアス（%）をプロットした結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
（電極の構成）
本発明のアスコルビン酸応答電極は、電極と、
該電極と接触し、アスコルビン酸からの電子授受を行う非触媒の電子アクセプターを含む検知層を含み、
該検知層において前記電子アクセプターと前記電極間で還元反応が行われることを特徴とする。
なお、検知層が酵素及び電子アクセプターを含む従来の酵素電極とは異なり、本発明のアスコルビン酸応答電極では、検知層は電子アクセプターを含むが、酵素は含まない。
【００１１】
（電極）
電極は、導電性のある素材であれば特に制限されないが、例えば、金（Au）、白金（Pt）、銀（Ag）及びパラジウム（Pd）のような金属材料、或いはグラファイト、カーボンナノチューブ、グラフェン、メソポーラスカーボンなどのカーボンに代表される炭素材料を用いて形成される。電極は、例えば、絶縁性基板上に形成される。絶縁性基板は、ポリエーテルイミド（ＰＥＩ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエチレン（ＰＥ）のような熱可塑性樹脂、ポリイミド樹脂、エポキシ樹脂のような各種の樹脂（プラスチック）、ガラス、セラミック、紙のような絶縁性材料で形成される。電極及び絶縁性基板の大きさ、厚さは適宜設定可能である。
【００１２】
（電子アクセプター）
電子アクセプターとしては、アスコルビン酸から電子を受け取って還元される一方で、電極でも還元されうる、触媒作用のない化合物であればよいが、例えば、プルシアンブルーが挙げられ、これらは単独で使用してもよいし、２種以上で併用してもよい。
この中では、酸化体のプルシアンブルーがより好ましい。ただし、酸化体と還元体の混合物でもよい。
【００１３】
プルシアンブルーとは、フェロシアン化鉄のことであり、ヘキサシアノ鉄（II）酸鉄（III）とも呼ばれる。Ｆｅ4［Ｆｅ（ＣＮ）6］3で表され、また、鉄以外の陽イオンをさらに含み、M+Fe3+ [Fe2+(CN)6]・yH2O y=1-5（ｘおよびｙは任意の数、Ｍはカリウムイオン、アンモニウムイオン等の陽イオン）で表されてもよい。
プルシアンブルーの酸化体と還元体はそれぞれ下記の式で表される。
［酸化体］Fe2+4[Fe3+(CN)6]3-3
［還元体］Fe3+4[Fe2+(CN)6]4-3
【００１４】
検知層における電子アクセプターの含有量は、測定試料の種類等によって適宜決定できるが、例えば、検知層の表面積１ｃｍ2当たり、１０ｍｍｏｌ〜１００ｍｏｌが好ましく、より好ましくは１０ｍｍｏｌ〜５０ｍｍｏｌ、特に好ましくは１５ｍｍｏｌ〜２０ｍｍｏｌである。
【００１５】
また、検知層は、上記電子アクセプターに加えてバインダーを含有することができる。電極製造工程において、検知層調製液として、電子アクセプター、バインダーおよび溶媒または分散媒を含有したスクリーン印刷対応インクとして調製することができ、スクリーン印刷手法にて樹脂等の基材にパターンニング印刷を行い電極を形成することにより、電極作製効率を向上することができ、センサ間差を小さくすることが可能になる。
【００１６】
検知層に使用することのできるバインダーとしては、例えば、ブチラール樹脂系、ポリエステル樹脂系などの樹脂バインダーを使用してもよいが、再表2005/043146に開示された層状無機化合物を使用することが好ましい。層状無機化合物とは、例えば、無機物の多面体が平面状に連なってシート構造を形成し、このシート構造がさらに層状に重なって結晶構造を形成したものが挙げられる。前記多面体の形状としては、例えば、四面体シート、八面体シート等があり、具体的には、例えば、Ｓｉ四面体、Ａｌ八面体等が挙げられる。このような層状無機化合物としては、例えば、層状粘土鉱物、ハイドロタルサイト、ベントナイト、スメクタイト、バーミキュライト、ハロイサイト、カオリン鉱物、雲母等が含まれる。このような層状無機化合物としては、例えば、市販品が使用でき、コープケミカ
ル（株）製の商品名ルーセンタイトＳＷＮ、商品名ルーセンタイトＳＷＦ（合成ヘクトライト）、商品名ＭＥ（フッ素雲母）、クニミネ工業（株）製の商品名スメクトンＳＡ（合成サポナイト）、協和化学工業（株）製の商品名チキソピーＷ（合成ヘクトライト）、商品名キョーワード５００（合成ハイドロタルサイト）、ラポー社製の商品名ラポナイト（合成ヘクトライト）、（株）ナカライテスク社製の天然ベントナイト、（株）豊順鉱業社製の商品名マルチゲル（ベントナイト）等が使用できる。検知層におけるバインダーの含有量は、例えば、検知層の面積１ｃｍ2当たり、０．００３〜３０ｍｇの範囲である。
【００１７】
また、検知層は、緩衝剤や界面活性剤などの添加剤を追加的に含んでもよく、これらの含有量は適宜設定できる。
緩衝剤としては、アミン系緩衝剤が好ましく、例えば、Ｔｒｉｓ、ＡＣＥＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＣＡＰＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＴＡＰＳＯ、ＴＥＳ、ＴｒｉｃｉｎｅおよびＡＤＡ等が挙げられ、好ましくはＡＣＥＳ、Ｔｒｉｓであり、より好ましくはＡＣＥＳである。これらの物質は、１種類でもよいし２種類以上を併用してもよい。また、前記緩衝剤としては、カルボキシル基を有する緩衝剤も好ましく、例えば、酢酸−酢酸Ｎａ緩衝剤、リンゴ酸−酢酸Ｎａ緩衝剤、マロン酸−酢酸Ｎａ緩衝剤、コハク酸−酢酸Ｎａ緩衝剤等が挙げられ、この中でもコハク酸−酢酸Ｎａ緩衝剤が好ましい。
界面活性剤としては、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ドデシル硫酸ナトリウム、ペルフルオロオクタンスルホン酸またはステアリン酸ナトリウムが含まれてもよい。アルキルアミノカルボン酸（またはその塩）、カルボキシベタイン、スルホベタインおよびホスホベタイン等が挙げられる。
【００１８】
（電極の作製方法）
本発明のアスコルビン酸応答電極は、例えば、以下のようにして作製される。すなわち、絶縁性基板の片面に、電極として機能する金属層を形成する。例えば、所定の厚さ（例えば１００μｍ程度）のフィルム状の絶縁性基板の片面に、金属材料をスクリーン印刷、物理蒸着（ＰＶＤ、例えばスパッタリング）、或いは化学蒸着（ＣＶＤ）によって成膜することによって、所望の厚さ（例えば３０ｎｍ程度）を有する金属層が形成される。金属層の代わりに、炭素材料で形成された電極層を形成することもできる。次に、電極上に電子アクセプターを含む検知層調製液をコートし、乾燥させることで検知層を電極上に配置することができる。
【００１９】
本発明のアスコルビン酸応答電極は、試料中に含まれるアスコルビン酸の濃度を測定するためのバイオセンサに使用することができる。なお、試料は測定対象物質を含む試料であれば特に制限されないが、生体試料が好ましく、血液、尿などが挙げられる。
【００２０】
（バイオセンサ）
アスコルビン酸センサとしてのバイオセンサは、本発明のアスコルビン酸応答電極（作用極）とともに対極となる電極を含む。対極としては、バイオセンサの対極として一般的に使用できるものであればよいが、例えば、スクリーン印刷により製膜したカーボン電極や、物理蒸着（ＰＶＤ、例えばスパッタリング）、或いは化学蒸着（ＣＶＤ）によって成膜した金属電極や、スクリーン印刷により製膜した銀／塩化銀電極を用いることができる。また、銀/塩化銀電極やスクリーン印刷により製膜したカーボン電極や、物理蒸着、或いは化学蒸着によって成膜した金属電極を参照極とした３電極系を用いてもよい。
【００２１】
本発明のアスコルビン酸応答電極表面（作用極）にアスコルビン酸を含む試料を接触させると、アスコルビン酸の電子が電子アクセプター（酸化体）に受け渡され、電子アクセプターは還元される。すなわち、試料中のアスコルビン酸の量に応じて酸化体電子アクセプターの量は減少する。そして、作用極に還元電位を印加することで、作用極表面で未反応の酸化体電子アクセプターが還元され、これによって電流が発生する。この還元電流はア
スコルビン酸濃度と負に相関するが、この電流値に基づいて試料中のアスコルビン酸濃度を測定することができる。
【００２２】
以下、本発明のバイオセンサの一例について、図１に基づいて説明する。図１（Ａ）〜（Ｅ）は、バイオセンサを製造する一連の工程を示した斜視図である。なお、本発明のバイオセンサは以下の態様には限定されない。
【００２３】
図１（Ｅ）に示すように、このバイオセンサＡは、基板１１、リード部１２ａを有する作用極１２とリード部１３ａを有する対極１３とから構成された電極系、絶縁層１４、電子アクセプターとバインダーと緩衝液とを含む検知層１６、開口部を有するスペーサー１８および貫通孔２０を有するカバー１９を備えている。図１（Ｂ）に示すように、基板１１上には、検出部１５が設けられており、検出部１５には、作用極１２と対極１３とが、基板１１の幅方向に並行して配置されている。前記両電極の一端は、それぞれリード部１２ａ、１３ａとなり、これらと、検出部１５における他端とが、垂直となるように配置されている（図１（Ａ））。また、作用極１２と対極１３との間は、絶縁部となっている。このような電極系を備えた基板１１の上には、図１（Ｂ）に示すように、リード部１２ａ、１３ａおよび検出部１５を除いて、絶縁層１４が積層されており、絶縁層１４が積層されていない前記検出部１５上には、検知層１６が積層されている。そして、絶縁層１４の上には、図１（Ｄ）に示すように、検出部１５に対応する箇所が開口部になっているスペーサー１８が配置されている。さらにスペーサー１８の上には、前記開口部に対応する一部に貫通孔２０を有するカバー１９が配置されている（図１（Ｅ））。このバイオセンサＡにおいて、前記開口部の空間部分であり、かつ、前記検知層１６および絶縁層１４とカバー１９とに挟まれた空間部分が、キャピラリー構造の試料供給部１７となる。そして、前記貫通孔２０が、試料を毛管現象により吸入するための空気孔となる。
【００２４】
このようなバイオセンサは、例えば、以下のようにして作製できる。
【００２５】
まず、図１（Ａ）に示すように、基板１１上にリード部１２ａを有する作用極１２およびリード部１３ａを有する対極１３からなる電極系を形成する。
【００２６】
続いて、図１（Ｂ）に示すように、前記電極系１２、１３を形成した基板１１上に絶縁層１４を形成する。この絶縁層は、電極のリード部１２ａ、１３ａと、電子アクセプター等を形成する検出部１５を除いた基板１１上に形成する。前記絶縁層１４は、例えば、絶縁性樹脂を溶媒に溶解した絶縁ペーストを前記基板１１上に印刷し、これを加熱処理または紫外線処理して形成することができる。絶縁性樹脂としては、例えば、ポリエステル、ブチラール樹脂、フェノール樹脂等が挙げられ、前記溶媒としては、例えば、カルビトールアセテート、二塩基酸エステル系混合溶剤（ＤＢＥソルベント）等が挙げられる。
【００２７】
次に、図１（Ｃ）に示すように、絶縁層１４が形成されていない検出部１５において、基板１１および電極１２、１３上に、検知層１６を形成する。検知層１６は、例えば、電子アクセプター、緩衝剤およびバインダーが分散された分散液を調製し、これを前記検出部１５に分注して、乾燥することによって形成できる。前記分散液の調製に使用する溶媒としては、例えば、水、緩衝液アルコール、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等が使用できる。
【００２８】
つぎに、図１（Ｄ）に示すように、絶縁層１４上にスペーサー１８を配置する。図示のように、スペーサー１８は、前記検知層１６に対応する箇所が開口部となっている。スペーサー１８の材料としては、例えば、樹脂製フィルムやテープ等が使用できる。また、両面テープであれば、前記絶縁膜１４との接着だけでなく、後述するカバー１９も容易に接着できる。この他にも、例えば、レジスト印刷等の手段によりスペーサーを形成してもよい
。
【００２９】
次に、図１（Ｅ）に示すように、前記スペーサー１８上にカバー１９を配置する。前記カバー１９の材料としては、特に制限されないが、例えば、各種プラスチック等が使用でき、好ましくは、ＰＥＴ等の透明樹脂が挙げられる。
【００３０】
このバイオセンサＡの使用方法について、試料が全血、測定対象物がアスコルビン酸、電子アクセプターが酸化体プルシアンブルーである例を挙げて説明する。
【００３１】
まず、全血試料をバイオセンサＡの開口部１７の一端に接触させる。この開口部１７は、前述のようにキャピラリー構造となっており、その他端に対応するカバー１９には空気孔２０が設けられているため、毛管現象によって前記試料が内部に吸引される。吸引された前記試料は、検出部１５上に設けられた検知層１６表面に達する。そして、表面に達した試料中のアスコルビン酸と、検知層１６中の酸化体プルシアンブルーとが反応する。具体的には、測定対象物であるアスコルビン酸の電子によって、酸化体プルシアンブルーが還元される。そして、電極に負の電位を印加することで、検知層１６中に存在する未反応の酸化体プルシアンブルーと、検知層１６の下に位置する電極との間で、電子授受が行われ、電流が流れる。これに基づいてアスコルビン酸濃度が測定できる。
【００３２】
具体的には、全血試料の供給から一定時間経過後、前記電圧を加える手段により対極１３と作用極１２との間に電圧を印加して、電極と接触している検知層中の未反応の酸化体プルシアンブルーを電気化学的に還元し、その際の還元電流を、作用極１２のリード部１２ａを介して前記電気信号を測定する手段等によって検出する。この還元電流の値は、試料中のアスコルビン酸濃度に負に相関するため、これを前記演算手段によりアスコルビン酸濃度に演算すれば、試料中のアスコルビン酸濃度を求めることができる。
作用極１２に印加する電圧としては、対極に対して負の電圧であればよいが、−１００〜−８００ｍＶ、−２００〜−７００ｍＶ、又は−２５０〜−７００ｍＶが好ましい。
試料を接触させた後、所定の時間非印加の状態で保持した後、電極系に電圧を印加してもよいし、前記試料との接触と同時に電極系に電圧を印加してもよい。非印加の状態で保持する時間としては、例えば、３０秒以下、又は１０秒以下である。
【００３３】
（装置）
次に、図面を用いて、本発明の測定装置について説明する。ここでは、アスコルビン酸測定装置の一態様について例示したが、本発明の測定装置は以下の態様には限定されない。図２は、測定装置Ｂ内に収容された主な電子部品の構成例を示す。制御コンピュータ２８、ポテンショスタット２９、電力供給装置３１が、筐体内に収容された基板３０上に設けられている。
制御コンピュータ２８は、ハードウェア的には、ＣＰＵ（中央演算処理装置）のようなプロセッサと、メモリ（ＲＡＭ（Random Access Memory）、ＲＯＭ（Read Only Memory））のような記録媒体と、通信ユニットを含んでおり、プロセッサが記録媒体（例えばＲＯＭ）に記憶されたプログラムをＲＡＭにロードして実行することによって、出力部２１、制御部２２、演算部２３及び検出部２４を備えた装置として機能する。なお、制御コンピュータ２８は、半導体メモリ（ＥＥＰＲＯＭ、フラッシュメモリ）やハードディスクのような、補助記憶装置を含んでいてもよい。
【００３４】
制御部２２は、電圧印加のタイミング、印加電圧値などを制御する。
電力供給装置３１は、バッテリ２６を有しており、制御コンピュータ２８やポテンショスタット２９に動作用の電力を供給する。なお、電力供給装置３１は、筐体の外部に置くこともできる。
ポテンショスタット２９は、作用極の電位を参照電極に対して一定にする装置であり、制
御部２２によって制御され、端子ＣＲ、Ｗを用いて、アスコルビン酸センサ２７の対極と作用極との間に所定の電圧を印加し、端子Ｗで得られる作用極の応答電流を測定し、応答電流の測定結果を検出部２４に送る。
【００３５】
演算部２３は検出された電流値から測定対象物質の濃度の演算を行い、記憶する。出力部２１は、表示ユニット２５との間でデータ通信を行い、演算部２３による測定対象物質の濃度の演算結果を表示ユニット２５に送信する。表示ユニット２５は、例えば、測定装置Ｂから受信されたアスコルビン酸濃度の演算結果を所定のフォーマットで表示画面に表示することができる。
【００３６】
図３は、制御コンピュータ２８によるアスコルビン酸濃度測定処理の例を示すフローチャートである。制御コンピュータ２８のＣＰＵ（制御部２２）は、アスコルビン酸濃度測定の開始指示を受け付けると、制御部２２は、ポテンショスタット２９を制御して、作用極への所定の電圧を印加し、作用極からの応答電流の測定を開始する（ステップＳ０１）。なお、測定装置へのセンサの装着の検知を、濃度測定開始指示としてもよい。
【００３７】
次に、ポテンショスタット２９は、電圧印加によって得られる応答電流、すなわち、試料内の測定対象物質（アスコルビン酸）に由来する電子の電極への移動に基づく電荷移動律速電流、例えば、電圧印加から１〜２０秒後の定常電流を測定し、検出部２４へ送る（ステップＳ０２）。
【００３８】
演算部２３は、電流値に基づいて演算処理を行い、アスコルビン酸濃度を算出する（ステップＳ０３）。例えば、制御コンピュータ２８の演算部２３は、アスコルビン酸濃度の計算式またはアスコルビン酸濃度の検量線データを予め保持しており、これらの計算式または検量線を用いてアスコルビン酸濃度を算出する。
【００３９】
出力部２１は、アスコルビン酸濃度の算出結果を、表示ユニット２５との間に形成された通信リンクを通じて表示ユニット２５へ送信する（ステップＳ０４）。その後、制御部２２は、測定エラーの有無を検知し（ステップＳ０５）、エラーがなければ測定を終了し、アスコルビン酸濃度を表示部に表示する。エラーがあればエラー表示をした後に、図３のフローによる処理を終了する。また、算出結果を演算部２３に保存し、後から算出結果を呼び出して、表示部に表示し確認することも可能である。なお、ここでは、算出結果の表示ユニット２５への送信（ステップＳ０４）後に、制御部２２による測定エラー検知（ステップＳ０５）を行っているが、これらのステップの順番を入れ替えることも可能である。
【実施例】
【００４０】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の態様には限定されない。
【００４１】
前記バイオセンサは、図１に示すように、以下の手順で作製した。まず、図１（Ａ）に示すように、アスコルビン酸センサの絶縁性基板１１として、ＰＥＴ製基板（長さ５０ｍｍ、幅６ｍｍ、厚み２５０μｍ）を準備し、その一方の表面に、スクリーン印刷により、リード部をそれぞれ有する作用極１２および対極１３からなるカーボン電極系を形成した。
【００４２】
つぎに、図１（Ｂ）に示すように、前記電極上に絶縁層１４を形成した。まず、絶縁性樹脂ポリエステルを、７５％（ｗｔ）となるように溶媒カルビトールアセテートに溶解させて絶縁性ペーストを調製し、これを前記電極上にスクリーン印刷した。印刷条件は、３００メッシュスクリーン、スキージ圧４０ｋｇであり、印刷する量は、電極面積１ｃｍ2あたり０．００２ｍＬとした。なお、検出部１５上と、リード部１２ａ、１３ａ上には、ス
クリーン印刷を行わなかった。そして、１５５℃で２０分間、加熱処理し、絶縁層１４を形成した。
【００４３】
さらに、図１（Ｃ）に示すように、絶縁層１４を形成しなかった検出部１５に、プルシアンブルー層１６を形成した。まず、０．３％（ｗｔ）の合成スメクタイト（商品名「ルーセンタイトＳＷＮ」、コープケミカル社製）、酢酸ナトリウム、およびコハク酸を含むプルシアンブルー液（ｐＨ７．５）を調製した。１．０μＬのプルシアンブルー液を、検出部１５に分注した。なお、検出部１５の表面積は約０．６ｃｍ2であり、前記検出部１５における電極１２、１３の表面積は約０．１２ｃｍ2であった。そして、これを、３０℃で乾燥させて、プルシアンブルー層１６を形成した。
【００４４】
図１（Ｄ）に示すように、開口部を有するスペーサー１８を絶縁層１４上に配置した。さらに、図１（Ｅ）に示すように、スペーサー１８上に空気孔となる貫通孔２０を有するカバー１９を配置してバイオセンサを作製した。前記カバー１９と絶縁層１４とに挟まれたスペーサー１８の開口部の空間が、キャピラリー構造となるため、これを試料供給部１７とした。
【００４５】
（２）目的成分の測定
次に、所定濃度（０、３、６、１００、３００、または６００ｍｇ／ｄＬ）となるようにアスコルビン酸（ASA）を含む、ヘマトクリット（Ｈｔ）値４２％のアスコルビン酸の全血試料１を調製した。
【００４６】
そして、各アスコルビン酸試料について、前記バイオセンサおよび電気化学測定器を用い、−５００ｍVまたは２００ｍＶの電圧を５秒間印加し、電流値を計測した。また、電圧印加時を基準として、２、４秒における電流値をサンプリングし、アスコルビン酸（ASA）濃度依存性を確認した。
【００４７】
（３）結果「アスコルビン酸の応答特性」
図４にアスコルビン酸の電気化学測定における、電流と電圧（−５００ｍＶ）印加時間の関係を示す。アスコルビン酸の濃度の増加に伴って、−５００ｍＶ印加では応答電流が減少した電流プロファイルが得られることが確認できた。なお、２００ｍＶ印加では濃度依存性がなかった。
また、図５のアスコルビン酸濃度と応答電流値のプロットにおいては、各サンプリング時間において、良好なアスコルビン酸濃度依存性が確認できた。本アスコルビン酸の濃度依存性は、負に相関している。これは、アスコルビン酸と未反応のセンサ中の酸化体のプルシアンブルーの還元反応を検出していることに起因する。また、上記アスコルビン酸の測定は、全血を用いているが、全血中には、尿酸、グルタチオン等の還元性物質が存在する。本発明では、上記還元性物質の存在化においても、アスコルビン酸の測定が、広い濃度域で出来ており、本測定条件において、測定の特異性があることが確認できている。
【符号の説明】
【００４８】
Ａ・・・バイオセンサ
１１・・・基板
１２・・・作用極
１２ａ・・・リード部
１３・・・対極
１３ａ・・・リード部
１４・・・絶縁層
１５・・・検出部
１６・・・検知層
１７・・・開口部
１８・・・スペーサー
１９・・・カバー
２０・・・空気孔
Ｂ・・・測定装置
２１・・・出力部
２２・・・制御部
２３・・・演算部
２４・・・検出部
２５・・・表示部ユニット
２６・・・バッテリ
２７・・・アスコルビン酸センサ
２８・・・制御コンピュータ
２９・・・ポテンショスタット
３０・・・基板
３１・・・電力供給装置
ＣＲ、Ｗ・・・端子
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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