(57)【要約】      （修正有）【課題】本発明は、生物学的試料(例えば組織塊、癌生検、及び全血)の細胞形態を固定及び保存する技術を提供することを課題とする。【解決手段】生体分子の分解を阻害する深共晶溶媒（deep eutectic solvent）の使用であって、生体分子が試料又は組織中に存在するＤＮＡまたはタンパク質であり、深共晶溶媒がN+基、モノフルオロアルキル基、ジフルオロアルキル基又はトリフルオロアルキル基、トリフルオロアセトアミド基、トリフルオロチオアセトアミド基、又はＮ−メチルトリフルオロアセトアミド基、臭化コリン基、等を含む化合物。本発明はまた、細胞、組織、血液、エキソソーム、及び他の生物学的試料の固定及び安定化にも関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体分子の分解を阻害する深共晶溶媒（deep eutectic solvent）の使用であって、
生体分子が、ＤＮＡまたはタンパク質であり、
深共晶溶媒が第一成分及び第二成分を含み、第一成分が式Ｉの化合物であり、
【化１】
2018113982.tif 000053
Ｒ6がＨ又はＯＨであり、
Ｒ7がＨ、ＣＨ3、Ｃｌ、Ｂｒ、カルボニル酸素及び
【化２】
2018113982.tif 000054
から選択され;
Ｚが−ＣＨ2−、Ｏ及びＳから選択され、
Ｒ8がＲ11又はＯＨであり、
第二成分が式ＩＩの化合物またはその塩を含み、
【化３】
2018113982.tif 000055
ＡはＯ、Ｓ及びＮＨから選択され、
Ｒ1はＲ9、及び−Ｃ（Ｒ3）（Ｒ4）（Ｒ5）から選択され、
Ｒ2はＨ及び１〜３の炭素原子を有する直鎖アルキル基から選択され、
Ｒ3は置換されていない５員又は６員の脂肪族環又は芳香族環であるか、或いは置換されている５員又は６員の脂肪族環又は芳香族環であり、置換基はＲ10であり、
Ｒ4及びＲ5はＦであり、
Ｒ9がモノ−、ジ−又はトリフルオロメチル基であるか、モノ−、ジ−又はトリフルオロエチル基であり、
Ｒ10及びＲ11は、それぞれ独立して、１〜３の炭素原子を有するアルキル基、１〜３の炭素原子を有するモノクロロアルキル基、及び１〜３の炭素原子を有するモノフルオロアルキル基、ジフルオロアルキル基又はトリフルオロアルキル基から選択される、使用。
【請求項２】
生体分子がタンパク質であり、タンパク質がリンタンパク質である請求項１に記載の使用。
【請求項３】
生体分子が試料又は組織中に存在する請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
試料又は組織が固体組織、血漿、血清又は全血を含む請求項３に記載の使用。
【請求項５】
ＡがＯ又はＳである請求項１〜４のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
Ｒ2がＨである請求項１〜５のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
Ｒ9がモノ−、ジ−又はトリフルオロメチル基である請求項１〜６のいずれかに記載の使用。
【請求項８】
第二成分がトリフルオロアセトアミド、トリフルオロチオアセトアミド、又はＮ−メチルトリフルオロアセトアミドである請求項７に記載の使用。
【請求項９】
Ｒ9がモノ−、ジ−又はトリフルオロエチル基である請求項１〜６のいずれかに記載の使用。
【請求項１０】
第二成分が２，２−ジフルオロプロパンアミド、又は３，３，３−トリフルオロプロパンアミドである請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
Ｒ1がＣ（Ｒ3）（Ｒ4）（Ｒ5）である請求項１〜６のいずれかに記載の使用。
【請求項１２】
Ｒ3が置換されていない６員の芳香族環であるか、置換されている６員の芳香族環であり、置換基がＲ10である請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
Ｒ3が置換されていないフェニル基であるか、又は置換されているフェニル基であり、置換基がＲ10である請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
第二成分が２，２−ジフルオロ−２−フェニルアセトアミドである請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
Ｒ3が置換されているフェニル基であり、置換基がモノ−、ジ−又はトリフルオロメチル基である請求項１３に記載の使用。
【請求項１６】
置換基がフェニル基の２位にある請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
第二成分が２−（トリフルオロメチル）フェニルアセトアミドである請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
第一成分がコリン、臭化コリン、又はＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルグリシンを含む請求項１〜１７のいずれかに記載の使用。
【請求項１９】
Ｒ7が
【化４】
2018113982.tif 000056
である請求項１〜１７のいずれかに記載の使用。
【請求項２０】
第一成分がアセチルコリン、アセチルチオコリン、ブチリルコリン、又はカルニチンを含む請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
第一成分が、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルグリシンであり、第二成分が、トリフルオロアセトアミドである請求項１〜４のいずれかに記載の使用。
【請求項２２】
第二成分に対する第一成分のモル比が１：１．５〜１：２．５の範囲である請求項１〜２１のいずれかに記載の使用。
【請求項２３】
深共晶溶媒が、硫酸亜鉛、塩化亜鉛、亜鉛ＥＤＴＡ、硫酸アンモニウム、トシレートアンモニウム、ソルビトール、１−ベンジルイミダゾール及びテトラメチル尿素から選択される少なくとも１つの添加剤をさらに含む請求項１〜２２のいずれかに記載の使用。
【請求項２４】
深共晶溶媒が、４０体積％〜６０体積％のシリカゲルをさらに含む請求項１〜２３のいずれかに記載の使用。
【請求項２５】
深共晶溶媒が、Ｎ−アルキルピロリドンをさらに含み、Ｎ−アルキル基が１〜５の炭素原子を有する請求項１〜２４のいずれかに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体分子（特にＲＮＡ）の安定化、例えばＲＮＡ安定化方法、ＲＮＡ安定化用組成物及びキット、及び安定化ＲＮＡ含有組成物に関する。本発明はまた、細胞、組織、血液、エキソソーム、及び他の生物学的試料の固定及び安定化に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物学的試料からの生体分子の抽出は、多くの実験及び臨床診断手順の本質的な部分である。核酸、タンパク質、炭水化物及び脂質等の生体分子の不安定性は、周知であり、完全性は、元の環境から取り出す前の試料の生理学的条件、試料の供給源からの迅速な取り出し、試料の冷却速度、試料の保存温度及び生体分子精製方法等の多数のパラメータに依存する。生体分子精製以前の生物学的試料の処理は、試料分析物の完全性における非常に重要な変化をもたらす場合があることは周知である。例えば、ＲＮＡは、特に正しく取り扱われない場合、数分以内に完全かつ不可逆的にダメージを受け、極端に不安定な分子であることは周知である。ＲＮＡはおそらく不安定な生体分子の一つであるが、翻訳後修飾を含むタンパク質、脂質、代謝分析に不可欠な２０００ダルトン未満の低分子、及びＤＮＡは実質的に分解過程に供され得る。
【０００３】
内在性の細胞酵素は、大半の分解過程に重要であるが、分析物は常に保存又は処理中に自発的に加水分解する傾向がある。この過程は、温度、水分量、ｐＨ、光、安定性、分析物分子の分子量などの保存条件に主に依存するが、使用される試薬の質にも依存する場合がある。
【０００４】
最も一般的で単純な保存アプローチの一つは、生物学的試料の温度を下げることである。一般的に、試料は、室温（２０〜２４℃）以下の温度で保存され、タンパク質溶液は、４℃又は−２０℃で保存され、核酸は、−２０℃又は−８０℃の冷凍庫、ドライアイス又は液体窒素で保存される。アジ化ナトリウム等の抗菌剤が、細菌の成長を制御する為に添加されてもよい。
【０００５】
ＲＮＡは、酵素、自発性加水分解、二価金属カチオン触媒加水分解、ＦＦＰＥ（ホルマリン固定パラフィン包埋）試料のアルカリ感受性及び架橋による分解に特に感受性が高いことが周知である。鉛、マグネシウム、マンガン等の多くの金属溶液は、ＲＮＡを分解するが、リボザイムだけではなくＤＮアーゼＩ、緑豆ヌクレアーゼ及びＳ１ヌクレアーゼ等のヌクレアーゼ活性に不可欠である。鉄（２+）は、Ｆｅｎｔｏｎ反応の一部として核酸塩基の酸化、例えばグアニンの８−オキソ−グアニンへの転換に関与し、翻訳で壊れたｒＲＮＡ及びｍＲＮＡをもたらす(非特許文献１)。ホスホジエステル結合の酵素切断及び非酵素切断における金属イオンの他の触媒役割が概説されている(非特許文献２)。ＥＤＴＡ及びＥＧＴＡ等のキレート剤は、金属イオン除去によるＲＮＡ分解低減を目的としてＲＮＡ又はＲＮＡ溶解溶液にしばしば添加される。リボヌクレアーゼ（「ＲＮアーゼ」）は、微生物、ヒト皮膚、塵、細胞及び組織の内容物を含む多くの供給源と関連する偏在酵素の大きな群である。これらはまた、解凍中に細胞内小胞から容易に放出される。膵臓等の特定組織では、ＲＮアーゼＡが特に豊富に存在することが公知である。ＲＮアーゼＡは、最も安定な酵素の一つであり、例えばカオトロピック塩変性後に酵素活性を容易に得て、破壊することが非常に困難となる。高濃度のカオトロープ（例えばグアニジン）（４〜６Ｍ）は、ＲＮアーゼ活性を破壊する為に必要である(非特許文献３)。
【０００６】
ＲＮアーゼ活性を阻害するいくつかの方法は、（ｉ）リボヌクレアーゼペプチドインヒビター（「ＲＮａｓｉｎ」）（少量でしか入手できずＲＮアーゼＡ、Ｂ及びＣに特異的な高価な試薬）、（ｉｉ）ジチオスレイトール及びβ−メルカプトエタノール等の還元剤（ＲＮアーゼ酵素のジスルフィド結合を破壊するが、効果は制限され、一時的であり、毒性があり、揮発性である）、（ｉｉｉ）プロテアーゼ（例えばＲＮアーゼを消化するプロテナーゼＫ）（キットにおけるプロテナーゼの輸送及び一般的に緩やかな作用により生体分子を分解する）、（ｉｖ）酵素活性温度以下への温度低減（通常組織及び細胞試料は、−８０℃又は液体窒素で保存される）、（ｖ）抗ＲＮアーゼ抗体、（ｖｉ）溶媒（例えばアセトン）又はコスモトロピック塩（例えば硫酸アンモニウム）を用いたＲＮアーゼ等のタンパク質、ＤＮＡ及びＲＮＡの沈殿（硫酸アンモニウムの市販調製物はＲＮＡｌａｔｅｒTM(Sigma-Aldrich, USA; LifeTechnologies, USA; Qiagen, Germany)として公知である）、（ｖｉｉ）PAXgeneTMDNA及びRNA抽出キット(PreAnalytix, Germany)に見られるもの等の全血の核酸を安定化する試薬、（ｖｉｉｉ）カオトロピック塩、（ｉｘ）PAXgeneTM 組織安定化試薬(PreAnalytix, Germany)に見られるもの等のアルコール等である。カオトロピック混合物の範囲は、非特許文献４に記載されている。
【０００７】
試料保存の主要な目標は、分析前の手順及び試料精製の結果として導入され得る分析物の生体分子に対する変化を最小限にすることであり、分析結果は、生体分子の元々のｉｎ  ｖｉｖｏ複雑性及び多様性に出来るだけ近づけ、アッセイ精度、感度、及び特異性を改善する。分析前の変化の低減に利用できる様々な方法及び物質が存在するが、全てにおいて、様々な欠点があり、その使用は問題となるか最適下限となる。一種の生体分子の安定化に有効な手順は、他の物の安定化には有効ではなく、技術者は、各生体分子分析物に特化された試薬及び手順を選択せざるを得ない。例えばPAXgeneTMシステム(PreAnalytix) (特許文献１及び特許文献２)は、タンパク質を除く核酸に使用することができ、多数の洗
浄バッファを用いた長期の精製工程を必要とし、一方でプロテアーゼインヒビターカクテルは、核酸を除くタンパク質を分解から保護するのに役立つ。PAXgeneTM組織安定化キットは、組織の別々の２つの処理を必要とし、毒性及び可燃性物質を含む。組織のRNAlaterTM処理は、免疫組織学、組織学の有用性を低減し、ＲＮＡを十分保護せずに組織の硬さを高めるものの、ＲＮＡ保存の至適基準として採用されている。
【０００８】
試料（例えば病院の手術室からの生検又は診察室からの血液試料）を抽出する時間又は場所によりＲＮＡ精製は常に可能とは限らない。これらの場合において、試料は、ＲＮＡの抽出前に非常に注意深く保存する必要があり、ＲＮＡ抽出は３０分以内に行われ得るが、病院の病理室で処理した後、数時間又は数日後に行われてもよい。分析工程前の時間及び温度は殆ど記録されず、試料の品質の知見は不明である。結果として、各種の組織及びＲＮＡの使用のための個別の試料保存条件を開発する必要がある。既に述べた様に、これには、通常ＲＮＡｌａｔｅｒ又はＰＡＸｇｅｎｅ等の専用の安定化溶液又は液体窒素中の試料の即時凍結の使用を伴う。少なくとも、ＰＡＸｇｅｎｅ安定化試薬の場合において、安定剤の不完全な除去により、精製中にＲＮＡ収率に悪影響を与える(非特許文献５)。
【０００９】
組織保存は、固定剤を用いた組織固定により影響を受ける場合がある。「固定」は、機械的強度の増大、硬化、処理した生物学的試料（例えば新しい細胞、生検又は組織）の保存及び安定性の増大のことをいい、ｉｎ  ｓｉｔｕでの試料の状態を、できるだけ天然に近い試料の状態に維持することをいう。固定は、病理学、組織学、組織化学、細胞化学、解剖学研究及び細胞研究で一般的に使用され、保存、包埋、染色、免疫組織化学及び／又は免疫細胞化学等の更なる工程を経る。理想的に、固定処理は、ヌクレアーゼ及びプロテアーゼなどの酵素を阻害し、試料の微生物増殖を停止し、ゴルジ体、核、細胞内小胞、ミトコンドリア、リソソーム及び細胞膜等の組織形態及び細胞微細構造の両方を維持する。一例として、正確な細胞形態の保存は、病理学者が患者の癌の存在、種類及び等級を診断する為に重要であるが、これを正しく行う為に、試料は、正しく染色できるか免疫組織化学の抗体で標識できる必要がある。一般的に、試料は、タンパク質及び他の細胞成分を架橋し、組織切片化、ヘマトキシリン及びエオシン染色（Ｈ＆Ｅ）を行う為、ホルマリン（ホルムアルデヒド）、パラホルムアルデヒド又はグルタルアルデヒドの１〜５％緩衝水溶液を用いて室温で１〜２４時間処理される。グルタルアルデヒドも使用できるが、組織への浸透率は、ホルムアルデヒドよりも緩やかである（１８〜２０容量が組織体積に対して添加される場合１時間当たり約１ｍｍで浸透する）。ＲＮＡがこの方法で保存される場合、一般には、ＲＮＡはホルマリン固定の以後で非常に分解され、遺伝子発現分析が問題となり、人為的結果となる。一つの特異的な問題は、ＲＮＡ分析物がタンパク質等の他の生体分子と架橋し、分析前に架橋をほどく必要がある点にあり、当該方法は著しいＲＮＡ分解をもたらす長期の高い温度を要する為、非常に厳しい。
固定の別の問題は、細胞のＲＮＡ及びタンパク質等の可溶性分析物を維持する事であり、例えばｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション又は免疫組織学により一本化することができる。ホルマリン固定を用いた別の問題は、タンパク質の共有結合修飾により抗原性免疫認識が損なわれ、免疫組織化学技術が抗体に応じて困難又は不可能となる。更なる一例として、ホルマリン固定組織は、通常、パラフィンワックスに包埋され、組織塊を薄片に切断し、顕微鏡で観察する（ＦＦＰＥ）。他の組織固定法は、メタノール、エタノール又はアセトンの使用を含み、架橋よりもタンパク質沈殿となる。組織を固定し、良好なＲＮＡ品質を維持しつつ、免疫組織化学染色を可能とする方法が特に必要とされる。通常使用される固定剤（例えばホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド及びメタノール）は、非常に毒性のある発がん物質であり、一方でエタノール及びアセトンは非常に可燃性であることが周知である。理想的な固定剤は、神経、リンパ及び脂肪等の広範な組織に機能し、大きな組織片を保存し、免疫組織化学、組織化学及びｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション及び他の専門的技術と両立するべきである。当該方法は、自動化組織固定手順と両立すべきである。詳細なプロトコールを含む概説が、非特許文献６及び非特許文献７に公開されており、固定及び染色組織の代表例が非特許文献８に見出すことができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第6,602,718号
【特許文献２】米国特許第6,617,170号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Honda et al., (2005) J. Biol. Chem. 280, 20978-20986
【非特許文献２】Yarus, M. (1993) FASEB J. 7, 31-39
【非特許文献３】Thompson. J. and Gillespie. D. Anal Biochem. (1987) 163:281-91
【非特許文献４】RNA Isolation and Analysis, Jones編(1994) Chapter 2
【非特許文献５】PAXgene Blood RNA Kit Handbook, June 2005
【非特許文献６】Bancroft (2008) ‘Theory and Practice of Histological Techniques
【非特許文献７】Stanta (2011) ‘Guidelines for Molecular Analysis in ArchiveTissues
【非特許文献８】Ross and Pawlina (2011)‘Histology A Text and Atlas
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、生物学的試料(例えば組織塊、癌生検、及び全血)の細胞形態を固定及び保存する技術を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の要旨は以下の通りである：
［１］  生体分子の分解を阻害する深共晶溶媒（deep eutectic solvent）の使用であって、
生体分子が、ＤＮＡまたはタンパク質であり、
深共晶溶媒が第一成分及び第二成分を含み、第一成分が式Ｉの化合物であり、
【００１４】
【化１】
2018113982.tif 000002
【００１５】
Ｒ6がＨ又はＯＨであり、
Ｒ7がＨ、ＣＨ3、Ｃｌ、Ｂｒ、カルボニル酸素及び
【００１６】
【化２】
2018113982.tif 000003
【００１７】
から選択され;
Ｚが−ＣＨ2−、Ｏ及びＳから選択され、
Ｒ8がＲ11又はＯＨであり、
第二成分が式ＩＩの化合物またはその塩を含み、
【００１８】
【化３】
2018113982.tif 000004
【００１９】
ＡはＯ、Ｓ及びＮＨから選択され、
Ｒ1はＲ9、及び−Ｃ（Ｒ3）（Ｒ4）（Ｒ5）から選択され、
Ｒ2はＨ及び１〜３の炭素原子を有する直鎖アルキル基から選択され、
Ｒ3は置換されていない５員又は６員の脂肪族環又は芳香族環であるか、或いは置換されている５員又は６員の脂肪族環又は芳香族環であり、置換基はＲ10であり、
Ｒ4及びＲ5はＦであり、
Ｒ9がモノ−、ジ−又はトリフルオロメチル基であるか、モノ−、ジ−又はトリフルオロエチル基であり、
Ｒ10及びＲ11は、それぞれ独立して、１〜３の炭素原子を有するアルキル基、１〜３の炭素原子を有するモノクロロアルキル基、及び１〜３の炭素原子を有するモノフルオロアルキル基、ジフルオロアルキル基又はトリフルオロアルキル基から選択される、使用。
［２］  生体分子がタンパク質であり、タンパク質がリンタンパク質である［１］に記載の使用。
［３］  生体分子が試料又は組織中に存在する［１］又は［２］に記載の使用。
［４］  試料又は組織が固体組織、血漿、血清又は全血を含む［３］に記載の使用。
［５］  ＡがＯ又はＳである［１］〜［４］のいずれかに記載の使用。
［６］  Ｒ2がＨである［１］〜［５］のいずれかに記載の使用。
［７］  Ｒ9がモノ−、ジ−又はトリフルオロメチル基である［１］〜［６］のいずれかに記載の使用。
［８］  第二成分がトリフルオロアセトアミド、トリフルオロチオアセトアミド、又はＮ−メチルトリフルオロアセトアミドである［７］に記載の使用。
［９］  Ｒ9がモノ−、ジ−又はトリフルオロエチル基である［１］〜［６］のいずれかに記載の使用。
［１０］  第二成分が２，２−ジフルオロプロパンアミド、又は３，３，３−トリフルオロプロパンアミドである［９］に記載の使用。
［１１］  Ｒ1がＣ（Ｒ3）（Ｒ4）（Ｒ5）である［１］〜［６］のいずれかに記載の使用。
［１２］  Ｒ3が置換されていない６員の芳香族環であるか、置換されている６員の芳香族環であり、置換基がＲ10である［１１］に記載の使用。
［１３］  Ｒ3が置換されていないフェニル基であるか、又は置換されているフェニル基であり、置換基がＲ10である［１２］に記載の使用。
［１４］  第二成分が２，２−ジフルオロ−２−フェニルアセトアミドである［１３］に記載の使用。
［１５］  Ｒ3が置換されているフェニル基であり、置換基がモノ−、ジ−又はトリフルオロメチル基である［１３］に記載の使用。
［１６］  置換基がフェニル基の２位にある［１５］に記載の使用。
［１７］  第二成分が２−（トリフルオロメチル）フェニルアセトアミドである［１６］に記載の使用。
［１８］  第一成分がコリン、臭化コリン、又はＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルグリシンを含む［１］〜［１７］のいずれかに記載の使用。
［１９］  Ｒ7が
【００２０】
【化４】
2018113982.tif 000005
【００２１】
である［１］〜［１７］のいずれかに記載の使用。
［２０］  第一成分がアセチルコリン、アセチルチオコリン、ブチリルコリン、又はカルニチンを含む［１９］に記載の使用。
［２１］  第一成分が、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルグリシンであり、第二成分が、トリフルオロアセトアミドである［１］〜［４］のいずれかに記載の使用。
［２２］  第二成分に対する第一成分のモル比が１：１．５〜１：２．５の範囲である［１］〜［２１］のいずれかに記載の使用。
［２３］  深共晶溶媒が、硫酸亜鉛、塩化亜鉛、亜鉛ＥＤＴＡ、硫酸アンモニウム、トシレートアンモニウム、ソルビトール、１−ベンジルイミダゾール及びテトラメチル尿素から選択される少なくとも１つの添加剤をさらに含む［１］〜［２２］のいずれかに記載の使用。
［２４］  深共晶溶媒が、４０体積％〜６０体積％のシリカゲルをさらに含む［１］〜［２３］のいずれかに記載の使用。
［２５］  深共晶溶媒が、Ｎ−アルキルピロリドンをさらに含み、Ｎ−アルキル基が１〜５の炭素原子を有する［１］〜［２４］のいずれかに記載の使用。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、生物学的試料（例えば細胞、組織、生検及び血液）中の生体分子（例えばＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質）を固定及び安定化できる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１Ａ−Ｃは、ＤＥＳ混合物がキャップされたバイアルに入っている本発明の装置を示す。
【図２】図２は、本発明と先行技術の抽出されたＲＮＡ試料のアガロースゲル電気泳動の結果を示す。
【図３】図３は、特定の温度範囲での本発明のＤＥＳで安定化したＲＮＡのアガロースゲル電気泳動の結果を示す。
【図４】図４は、本発明又は先行技術の組織に保存されたＲＮＡのアガロースゲル電気泳動の結果を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、本発明及び先行技術のＤＥＳを用いてマウス組織試料中で安定化されたＲＮＡのアガロースゲル電気泳動の結果を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、本発明及び先行技術のＤＥＳを用いてマウス組織試料中で安定化されたＲＮＡのアガロースゲル電気泳動の結果を示す。
【図６】図６は、本発明及び先行技術の異なる組織量で保存されたＲＮＡのアガロースゲル電気泳動の結果を示す。
【図７】図７は、ＨｅＬａ細胞を添加したＤＥＳ安定化全血から精製したＲＮＡのアガロースゲル電気泳動の結果を示す。
【図８】図８は、抽出前に１８時間ＨｅＬａ細胞を添加した全血中で安定化されたＲＮＡのアガロースゲル電気泳動の結果を示す。
【図９】図９は、グアニジン又は塩化コリン：トリフルオロアセトアミドを用いて全血中で安定化されたＲＮＡを示す。
【図１０】図１０は、本発明の塩化コリン：トリフルオロアセトアミドで固定されたＨｅＬａ細胞の光学顕微鏡画像を示す。
【図１１】図１１は、安定化剤なしの組織試料で分解したＲＮＡのアガロースゲル電気泳動の結果を示す。
【図１２】図１２は、本発明又は先行技術のＨｅＬａ細胞中で安定化されたゲノムＤＮＡのアガロースゲル電気泳動の結果を示す。
【図１３】図１３は、本発明又は先行技術による安定化されたマウス肝臓からのタンパク質のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す。
【図１４】図１４は、安定化され、任意に精製前の処理工程に供されたＨｅＬａ細胞からのＤＮＡ及びＲＮＡのアガロースゲル電気泳動の結果を示す。
【図１５】図１５は、本発明又は先行技術による完全性が固定後に測定されたＲＮＡ及びＤＮＡのアガロースゲル電気泳動の結果を示す。
【図１６】図１６は、本発明又は先行技術により処理されたショウジョウバエ胚からのＲＮＡのアガロースゲル電気泳動の結果を示す。
【図１７】図１７は、本発明又は先行技術により安定化されたタマネギ芽からのＲＮＡのアガロースゲル電気泳動の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
一態様において、本発明は、生体分子の分解を阻害する深共晶溶媒の使用を提供する。
【００２５】
生物学的試料中の生体分子（例えばＲＮＡ、ＤＮＡ及びタンパク質）を深共晶溶媒（ＤＥＳ）で安定化することができることを驚くべき事に発見した。ＤＥＳ混合物は、組織塊、癌検体及び全血等の生物学的試料中の細胞形態を固定及び保存する為に使用できることも発見した。本発明は、ＤＥＳ混合物を用いて生体分子、全ての細胞、組織及び生物学的試料を安定化及び保存する方法を記載する。試料又は組織は、固形組織又は非固形組織を含んでいてもよい。
【００２６】
驚くべき事に、多くのＤＥＳ混合物は、ＲＮＡ、タンパク質、ＤＮＡ等の他の生体分子、細胞及び組織構造を安定化及び保存できることを見出した。塩化コリン（６Ｍ）又は尿素（５Ｍ）等の水溶液中で個々のＤＥＳ成分を単独で使用すると、ＲＮＡ安定化又は細胞固定はできず、塩化コリン：尿素などのＤＥＳ中で成分を組み合わせた場合にのみ、保存及び安定化できる（表１）。例えば、塩化コリンとトリフルオロアセトアミドの混合物は細胞形態を維持しつつ細胞のＲＮＡを安定化する点で特に有効である事を見出した。また、塩化コリンとソルビトールの混合物は、組織全体のＲＮＡを安定化する点で特に有効である事を見出した。しかしながら、非常に多数の他の組み合わせ及びＤＥＳ成分の比率は本発明を行うために有用である。
【００２７】
通常のイオン液体及び通常のＤＥＳの混合物の成分が別々に報告されているが（ＷＯ２０１１／１５５８２９）、生体分子又は細胞の安定化に対するＤＥＳの効果は、報告されていない。実際、ＵＳ２００９／０１１７６２８Ａ１では、酵素反応がＤＥＳ中で行われてもよく、＜様々な酵素反応は種々のＤＥＳと作用し＞、ヌクレアーゼ、プロテアーゼ及び他の代謝酵素がそれぞれ活性である事が示されている。驚くべき事に、ＲＮＡ及び他の生体分子はＤＥＳ混合物中で安定化され、細胞形態が固定され細胞骨格も安定化される事を見出した。
【００２８】
ＤＥＳは、２つ以上の成分の混合物であり、組み合わせると凝固点又は氷点（Ｆｐ）の共融点を有する。組み合わせた成分の共融点は、一般的に個々の成分又は如何なる混合比率よりも低く、凝固に関して個々の成分に分かれることなく単一の温度で生じる。ＤＥＳの特性は、A.P. Abbott, G. Capper, D.L. Davies, R.K. Rasheed, V. Tambyrajah, Chem. Commun. 7 (2003) 70-71., A.P. Abbott, D. Boothby, G. Capper, D.L. Davies, R.K.Rasheed, J. Am. Chem. Soc.126 (2004) 9142-9147., [7] G. Imperato, E. Eibler, J.Niedermaier, B. Konig, Chem. Commun. 9 (2005) 1170-1172., S. Gore, S. Baskaran,B. Koenig, Green Chem. 13 (2011) 1009-1013., J.T. Gorke, F. Srienc, R.J. Kazlauskas, Chem. Commun. 10 (2008) 1235-1237., A.P. Abbott, J. Collins, I. Dalrymple,R.C. Harris, R. Mistry, F. Qiu, J. Scheirer, W.R. Wise, Aust. J. Chem. 62 (2009) 341-347., Y.H. Choi, J. van Spronsen, Y. Dai, M. Verberne, F. Hollmann, I.W.C.E. Arends, G.J. Witkamp, R. Verpoorte, Plant Physiol. 156 (2011) 1701-1705に記載されており、Zhang Q, De Oliveira Vigier K, Royer S, Jerome F. Chem Soc Rev. 2012 Nov 7;41(21):7108-46に概説されている。
【００２９】
ＤＥＳは、工業的に電気化学めっき、鉱業用途及びドリル潤滑油(US2009/0247432)、工業用酵素用途(US2009/0117628A1)、無機化合物の製造(D. Freudenmann, S. Wolf, M. Wolff and C. Feldmann, Angew. Chem., Int. Ed., (2011), 50, 11050-11060)又は有機化合物 (S. Gore, S. Baskaran and B. Koenig, Green Chem., (2011), 13, 1009-1013)、生物学的抽出 (WO 2011/155829)、色素増感太陽電池用電解質としての電気化学及び金属電解研磨(H.-R. Jhong, D. Shan-Hill, C.-C. Wan, Y.-Y. Wang and T.-C. Wei, Electrochem. Commun., (2009)、電着塗装(E. Gomez, P. Cojocaru, L. Magagnin and E. Valles, J. Electroanalytical Chem., (2011), 658, 18-24)、バイオディーゼル精製(K. Shahbaz, F. S. Mjalli, M. A. Hashim and I. M. AlNashef, Energy Fuels, (2011), 25, 2671-2678)、薬物可溶化(H. G. Morrison, C. C. Sun and S. Neervannan, Int. J. Pharm., (2009), 378, 136-139)、金属酸化物可溶化(A. P. Abbott, D. Boothby, G. Capper, D. L. Davies and R. K. Rasheed, J. Am. Chem. Soc., (2004), 126, 9142-9147)及びＣＯ2可溶化(X. Li, M. Hou, B. Han, X. Wang and L. Zou, J. Chem. Eng. Data, (2008), 53, 548-550)に使用されている。Van Spronsenらは、WO2011/155829において抽出のためのアミノ酸、糖及びカルボン酸の様々な組み合わせ等の天然ＤＥＳの使用を説明しているが、細胞及び組織の固定又は安定化についての使用は言及されていない。ＤＥＳは、安定化及び固定よりも抽出目的の為に記載されている。
【００３０】
ＤＥＳは、（ｉ）全体的にイオン性物質から構成されておらず、（ｉｉ）非イオン性物質から得ることができ、（ｉｉｉ）混合物であり、化合物ではない為、イオン性液体であるとはみなされない。従来のイオン性液体と比較して、例えば塩化コリンに由来するＤＥＳは、（１）低コスト、（２）水に対して化学的に不活性、（３）２つ以上の成分を単純に混合することが容易、（４）ほとんど生物分解性及び非毒性、（５）加熱時でも低揮発性、（６）非可燃性等の幾つかの利点を有する。全てのＤＥＳは１５０℃以下で液体であり、多くは室温〜７０℃で液体であり、いくつかは０℃以下で液体である注目すべき例もある。
【００３１】
ＤＥＳは、しばしばハロゲン化第四級アンモニウム塩と、第四級アンモニウム塩のハロゲン化アニオンと複合体を形成する能力を有する金属塩（例えばＺｎＣｌ2）又は水素結合供与体（例えば尿素）と混合して得られる。しかしながら、ベタイン：トリフルオロアセトアミドの様にＤＥＳにハロゲン化アニオンが存在しない場合等の例外も存在することを見出した。本明細書で使用される場合、用語「ベタイン」は、特定されていない限り、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルグリシンを意味する。
【００３２】
本明細書に記載される深共晶溶媒は、第四級アンモニウム基を有する成分を含んでいてもよい。
【００３３】
第四級アンモニウム基を有する成分は、カルボキシレート基をさらに含む両性イオン成分であってもよい。好ましい両性イオン成分は、ベタイン（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルグリシン）である。
【００３４】
また、第四級アンモニウム基を含む成分は、適切な対イオンと共に塩の形態で存在してもよい。
対イオンは、適切にはハロゲン化物であり、好ましくは塩素、臭素、又はヨウ素であり、最も好ましくは塩素である。他の適切な対イオンは、硝酸塩、テトラフルオロホウ酸塩等を含む。当該成分が塩の形態で存在する場合、対イオンは、好ましくはカルボン酸エステル基を含まない。
【００３５】
更なる態様において、本発明は、試料をＤＥＳ含有混合物と接触させて安定化ＲＮＡ含有組成物を形成する工程を含む、ＲＮＡ含有試料におけるＲＮＡの安定化方法を提供する。
【００３６】
更なる態様において、本発明は、試料をＤＥＳ含有混合物と接触させて安定化ＤＮＡ含有組成物を形成する工程を含む、ＤＮＡ含有試料におけるＤＮＡの安定化方法を提供する。
【００３７】
更なる態様において、本発明は、試料をＤＥＳ含有混合物と接触させて安定化タンパク質含有組成物を形成する工程を含む、ペプチド含有試料におけるリンタンパク質を含むタンパク質の安定化方法を提供する。
【００３８】
更なる態様において、本発明は、細菌、真菌、動物又は植物試料、例えば大腸菌、酵母、線虫、ショウジョウバエ、ゼブラフィッシュ、マウス、ラット、シロイヌナズナ、米、小麦、トウモロコシ、タバコ及び／又はジャガイモにおいて、細胞の形態を固定し、ＲＮＡ、ＤＮＡ、及び／又はタンパク質を安定化する方法を提供する。
【００３９】
更なる態様において、本発明は、細胞含有試料（例えば臓器、組織、生検、循環性腫瘍細胞（ＣＴＣ）、血液、血漿、血清、組織培養細胞、唾液、尿、脳脊髄液、医療用試料、卵、胚、若しくは成体組織、又はＦＦＰＥ試料）の細胞形態の固定及び安定化方法であって、細胞含有試料をＤＥＳ含有混合物と接触させ、細胞構造及び形態の固定物及び安定化物を形成する工程を含み、細胞数計測、ＣＴＣ検出、免疫組織化学、組織化学、染色及び発色、フローサイトメトリー、質量分析、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、レーザー捕捉マイクロダイセクション、及びＲＮＡ、ＤＮＡ及び／又はタンパク質の分子分析に対応できる方法を提供する。
【００４０】
更なる態様において、本発明は、細胞含有試料中の細胞の形態を固定及び安定化する方法であって、細胞含有試料をＤＥＳ含有混合物と接触させ、細胞構造及び形態の固定物または安定化物を形成し、同時に又は続いて試料を着色剤、抗体又はアプタマーと接触させる工程を含む方法を提供する。当該方法により、タンパク質含有量及びタンパク質の細胞局在が着色剤、抗体又はアプタマーを使用して決定することができる。
【００４１】
更なる態様において、本発明は、細胞含有試料中の細胞の形態を固定及び安定化する方法であって、細胞含有試料をＤＥＳ含有混合物と接触させ、細胞構造及び形態の固定物及び安定化物を形成し、同時に又は続いて当該試料を分子分析の天然又は合成ハイブリダイゼーション配列を接触させる工程を含む方法を提供する。当該方法により、標識又は未標識プローブ（例えばオリゴヌクレオチド、プライマー、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ＤＮＡ、ｂＤＮＡ、又はＲＮＡ配列、天然又は合成相補性核酸配列）を使用してＲＮＡ含有量及びその細胞局在を決定することができる。
【００４２】
更なる態様において、本発明は、ＤＥＳ混合物を含む少なくとも１つの容器を含む、生物学的試料中のＲＮＡ、ＤＮＡ、及び／又はタンパク質を安定化するキットを提供する。当該キットは、試料をＤＥＳ混合物と接触させる指示書をさらに含み、生物学的試料中のＲＮＡ、ＤＮＡ、及び／又はタンパク質を分解に対して安定化させる。
【００４３】
更なる態様において、本発明は、ＤＥＳ混合物を含む少なくとも１つの容器を含む、生物学的試料中の細胞構造を安定化するキットを提供する。当該キットは、試料をＤＥＳ混合物と接触させる指示書をさらに含み、ＤＥＳ混合物は、顕微鏡及び／又は組織学（例えば染色及び呈色、ＩＳＨ及び／又はＩＨＣ）のための、細胞構造の固定剤及び／又は安定化剤として機能する。
【００４４】
更なる態様において、本発明は、生物学的試料中の細胞、組織構造及び形態を固定するためのキットであって、ＤＥＳ固定及び／又は安定化混合物を含む少なくとも一つの容器を含み、任意に容器は透過性であり、試料を浸漬、固定及び／又は安定化する最大１０ｍｍの高さを有するキットを提供する。透過性容器の壁は、ふるい又は格子であってもよく、細胞又は組織試料に対するＤＥＳ混合物の通過及び接触、及び／又は液体パラフィンとの接触を可能にするスリットが付与されていてもよい。
【００４５】
更なる態様において、本発明は、ＤＥＳ混合物と添加剤の組み合わせの使用であって、ＲＮＡ、ＤＮＡ、及び／又はタンパク質を含む生体分子の固定剤及び安定化剤として機能する使用を提供する。
【００４６】
更なる態様において、本発明は、ＲＮＡ及びＤＥＳ混合物を含む安定化ＲＮＡ含有組成物を提供する。
【００４７】
更なる態様において、本発明は、ＤＮＡ及びＤＥＳ混合物を含む安定化ＤＮＡ含有組成物を提供する。
【００４８】
更なる態様において、本発明は、タンパク質及びＤＥＳ混合物を含む安定化タンパク質含有組成物を提供する。
【００４９】
更なる態様において、本発明は、細胞及び／又は組織及び／又は形態の安定化剤、並びにＲＮＡ、ＤＮＡ及び／又はタンパク質の安定化剤としてのＤＥＳ混合物の使用を提供する。
【００５０】
更なる態様において、本発明は、パラフィン包埋、ミクロトーム切片、任意に染色、insituハイブリダイゼーション及び／又は免疫組織化学のための、細胞構造及び／又は組織及び／又は形態の安定化剤としてのＤＥＳ混合物の使用を提供する。
【００５１】
更なる態様において、本発明は、凍結クライオスタット切片、任意に染色、in situハイブリダイゼーション及び／又は免疫組織化学のための、細胞構造及び／又は組織及び／又は形態の安定化剤としてのＤＥＳ混合物の使用を提供する。
【００５２】
更なる態様において、本発明は、レーザー捕捉マイクロダイセクション（ＬＣＭ）、任意にタンパク質、ＤＮＡ及びＲＮＡ回収のための、細胞構造及び／又は組織及び／又は形態の安定化剤としてのＤＥＳ混合物の使用を提供する。
【００５３】
更なる態様において、本発明は、循環性腫瘍細胞及び／又は白血球及び／又は全血等の細胞捕捉、計測及び／又はタイピング、染色及び／又は呈色、質量分析、in situハイブリダイゼーション及び／又は免疫組織化学を含む診断分析のための、血漿、血清及び血液中の生体分子及び／又は細胞の安定化剤としてのＤＥＳ混合物の使用を提供する。任意に、タンパク質、ＤＮＡ、及びＲＮＡの回収を行うことができる。
【００５４】
更なる態様において、本発明は、エキソソーム、他の種類の小胞、微小小胞、ミセル、リポソーム、エンドソーム、細胞残屑、細胞膜、細胞核等の細胞内の物質及び粒子、細胞内区画、ゴルジ、小胞体及び／又はミトコンドリア等の細胞質成分の固定剤としてのＤＥＳ混合物の使用を提供する。
本発明は更に、診断試験（例えばエキソソーム又は他の細胞外微小胞内に含まれるｍｉＲＮＡ又はｍＲＮＡの抽出、分析及び／又は同定）について保存、輸送及び取り扱いのための、血液、血清、血漿、尿、脳脊髄液及び他の体液に由来するエキソソームに含まれるＲＮＡ、ＤＮＡ及び／又はタンパク質の安定化に関する。
【００５５】
更なる態様において、本発明は、ウイルス粒子、バクテリオファージ、ＲＮＡ、ＤＮＡ、酵素、タンパク質（例えば抗体、脂質、脂肪及び／又は炭水化物）等の精製前の粒子及び分子の安定化剤としてのＤＥＳ混合物の使用を提供する。精製前は、本明細書において、８０％以上の目的の粒子又は分子からなる試料として定義される。
【００５６】
更なる態様において、本発明は、細菌及び／又はウイルス診断を含む病原体診断分析のための、血漿、血清、バフィーコート及び／又は血液中の生体分子、細菌、真菌、及び／又は他の病原体（例えばリーシュマニア、トリパノソーマ、及び／又はマラリア原虫）の安定化剤としてのＤＥＳ混合物の使用を提供する。
【００５７】
更なる態様において、本発明は、ウイルス診断分析のための、生物学的試料（例えば唾液、スワッブ、血漿、血清、バフィコート及び／又は血液）中の、インフルエンザ、ＨＰＶ、ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、手足口病、ＳＡＲＳ及び／又はウエストナイル病等のウイルス、ウイルス粒子、ウイルス核酸及び／又はタンパク質の安定化剤としてのＤＥＳ混合物の使用を提供する。
【００５８】
更なる態様において、本発明は、細胞又は組織固定用及び／又は生体分子分解阻害用装置であって、第一深共晶溶媒から形成される第一深共晶溶媒層及び生体分子を含む試料を受ける第一深共晶溶媒中の凹部を含み、第一深共晶溶媒が固体又はゲルである装置を提供する。当該装置は、第二深共晶溶媒から形成される第二深共晶溶媒層をさらに含んでいてもよく、第二深共晶溶媒層が凹部を取り囲み、第二深共晶溶媒層は固体又はゲルである。
【００５９】
第一深共晶溶媒及び／又は第二深共晶溶媒は、本明細書に定義される深共晶溶媒であってもよく、好ましくは３，３，３−トリフルオロプロパンアミド、２，２−ジフルオロ−２−フェニルアセトアミド、尿素及びチオ尿素から選択される成分を含む。
【００６０】
第一深共晶溶媒及び／又は第二深共晶溶媒は、塩化コリン、ブチリルコリンヨージド、及びＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルグリシンから選択される成分を含んでいてもよい。
【００６１】
本発明の細胞又は組織固定用及び／又は生体分子分解阻害用装置は、第一深共晶溶媒から形成される第一深共晶溶媒を含む。第一深共晶溶媒は、固体又はゲルである。適切には、深共晶溶媒の成分は、望ましい使用条件下、例えば約２５℃の温度及び約１ａｔｍの圧力で固体である様に選択される。或いは、深共晶溶媒は、望ましい使用条件下で固体又はゲルであるマトリックス材料と混合されてもよい。
【００６２】
特に好ましくは、第一深共晶溶媒として使用される深共晶溶媒としては、任意に約１：２のモル比の塩化コリン：３，３，３−トリフルオロプロパンアミド；任意に約１：１のモル比の塩化コリン：２，２−ジフルオロ−２−フェニルアセトアミド；任意に約１：１のモル比の塩化コリン：トレハロース；任意に約１：２のモル比のブチリルコリンヨージド：尿素が挙げられる。
【００６３】
装置が第二深共晶溶媒を含む場合、第一深共晶溶媒及び第二深共晶溶媒は、同じでもよく、異なっていてもよい。好ましくは、第二深共晶溶媒は、任意に約１：２のモル比の塩化コリン：３，３，３−トルフルオロプロパンアミド；任意の約１：１のモル比の塩化コリン：２，２−ジフルオロ−２−フェニルアセトアミド；任意に約１：１のモル比の塩化コリン：トレハロース；任意に約１：２のモル比のブチリルコリンヨージド：尿素から選択される。
【００６４】
更なる態様において、本発明は、深共晶溶媒が本明細書に定義される深共晶溶媒であるキットを提供する。
【００６５】
本発明は、１種類の生体分子の安定化に特に限定されず、ＲＮＡの質及び完全性の改善は、ＲＮＡの長さ及び環境侵襲に対する薬剤感受性の為、細胞で最も壊れやすい分子の一つであることから、注目に値する。大体一般的に、ｒＲＮＡ分子が完全の状態である場合、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、脂質、炭水化物、及び低分子代謝物も完全な状態であると考えることができる。しかし、ｒＲＮＡが分解している場合、他の生体分子は各生体分子の特定の薬剤感受性に依存して分解されたり、分解されない場合がある。組織又は細胞で、特定の種類の生体分子の分解又は修飾をもたらす特定の酵素（例えばＲＮアーゼ、ＤＮアーゼ、エステラーゼ、プロテアーゼ又はホスファターゼ）を多く含む場合の幾つかの例外がある。
【００６６】
ＲＮＡは、試料（例えばウイルス、細胞、循環性腫瘍細胞、脳脊髄液、気管支肺胞洗浄物、血清、血漿、血液、エキソソーム、他の微小小胞）、保存試料（例えばＦＦＰＥ塊又は切片、生検、固体又は液体組織）又は他の生物学的試料に見出されてもよく、これらに由来してもよく、これらに関連してもよい。生体分子は、ｃＡＭＰ、ＡＴＰ、ＧＴＰ等のヌクレオシド又はヌクレオチド含有分子、デオキシヌクレオチド及びリボヌクレオチドのモノマー、ダイマー、オリゴマー、プラスミドＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｐｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ウイロイド、環状ＲＮＡ、環状ｓｓ又はｄｓ、非コーディングＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ、５Ｓ、５．８Ｓ、１６Ｓ、１８Ｓ，２３Ｓ、及び２８Ｓ  ｒＲＮＡ等のｒＲＮＡ、例えばＨＣＶ、ウエストナイル病ウイルス、足口病ウイルス、インフルエンザ、ＳＡＲＳ、又はＨＩＶ  ＲＮＡ、及び／又は細胞外ＲＮＡ（ｅｘＲＮＡ）等のＲＮＡであってもよい。
【００６７】
生体分子はまた、合成有機手順（例えばオリゴ合成器）に由来する分子、ＲＮＡ及びＤＮＡの混合物、ＲＮＡ及びＤＮＡのキメラ、酵素反応生成物（例えばin vitroＲＮＡ転写物）、増幅ＲＮＡ（ａＲＮＡ）、リボザイム、アプタマー、ＰＣＲ増幅物、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）又はリガーゼ鎖反応（ＬＣＲ）、内部対照標準又は対照ＲＮＡであってもよい。
【００６８】
本発明で有用なＲＮＡ分析方法としては、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏでのｍＲＮＡ鋳型のタンパク質翻訳、ＲＮＡ依存性ＲＮＡ重合、ＤＮＡ依存性ＲＮＡ重合、ＲＮＡスプライス分析、ＲＮＡフォールディング分析、アプタマー及びリボザイム生成、光学密度（ＯＤ）測定、ＲＮＡ：タンパク質相互反応研究、分子量標準を含むＲＮＡ電気泳動及び沈降、ＲＮＡバイオコンジュゲート、ＲＮＡライゲーション、ＲＮＡフォールディング研究、ＲＮＡフットプリンティング、ＲＮＡ  ＮＭＲ構造研究、ＲＮＡオリゴヌクレオチド合成、ＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕ、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、ＲＮＡ配列決定、逆転写（ＲＴ）、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＴ−ｑＰＣＲ、ヌクレアーゼ保護アッセイ、ハイブリダイゼーション技術、例えばノーザンブロット、ｂＤＮＡ、マイクロアレイ（プローブ、蛍光核酸標識の調製を含む）、ＮＡＳＢＡ、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡ技術（例えば抽出及び定量）、ＲＮＡ品質制御及び／又は定性若しくは定量測定を要する方法が挙げられる。
【００６９】
不安定性とは、分子量の変化又はＲＮＡ分子の化学構造の変化のことをいい、係る不安定性は、分析物分子の取り扱い、保存、輸送及び／又は実際の分析と関連する。生体分子の不安定性はしばしば、天然の代謝酵素、特にＲＮＡの分子量を実質的に変更するか元々の分析物分子の分子量を小さくするＲＮアーゼの活性に依存する。当該ＲＮアーゼは、生物学的試料自体に由来し、ＲＮアーゼは、例えば解凍される場合に組織の不十分な取り扱いの結果として次第に放出されるか大規模に放出され、非常に高い割合で分析物分解をもたらすプロテアーゼ及びヌクレアーゼを含む細胞内小胞が破壊され、細胞質に流出する。或いは、分解酵素は、試料の微生物汚染又は腐敗などの試料環境の外部汚染に起因することがある。分析物の不安定性は、分析物がタンパク質、核酸、炭水化物、脂質、又は代謝物であろうと、一般的に分析手順の感度又は性能の低下と関連している。
【００７０】
「分解」とは、生体分子及び／又は分析物の不安定性の結果として生じる物理的又は化学的変化のことをいう。核酸に関連する分解の例として、分解は、核酸塩基の脱アミノ化（例えばシトシンからウラシルへの転換）、核酸塩基の酸化（例えばグアニン）、メチル−シトシンからのメチル基の損失、一つ以上の核酸塩基の損失（例えば脱プリン化で生じる等）、鎖切断をもたらすリン酸ジエステル結合の切断、及び核酸分子から一つ以上のヌクレオチド損失のことをいう。分解は、分子の二次的又は三次的構造の変化のことを意味しない。
【００７１】
「完全性」は、分子の完全性を意味し、分解の反対である。
【００７２】
「実質的な分解」は、少なくとも半分の分析物分子で分子量が５％以上低減された試料を意味する。分解を決定する方法は、周知であり、分析物分子に依存する (Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Ed.) Cold Spring Harbor University Press, NY参照)。分子量の決定及び核酸の分解は変性又は未変性ゲル電気泳動を用いて一般的に行われ、標識ハイブリダイゼーションプローブを用いたサザン又はノザンブロットが含まれてもよい。ＲＮＡ定量は、ＲＮＡチップ及びAgilent Bioanalyser 2100TM systemを用いて「ＲＮＡ完全性値」(ＲＩＮ)を算出する分析が含まれてもよい。核酸分解は、例えばLightcyclerTM(Roche)及び適切な増幅プローブを用いたＤＮＡ用Ｑ−ＰＣＲ及びＲＮＡ用ＲＴ−ｑＰＣＲにより定量することができる。
オリゴｄＴプライマーを用いた逆転写後のｍＲＮＡ、しばしばβ−アクチンの３’／５’末端のＲＴ−ｑＰＣＲ増幅比の算出は、ＲＮＡ分解を評価する為に一般的に使用される。他の方法には、細胞又は組織の全ｍＲＮＡ含有量のＲＮＡ配列分析、又はAffymetrix（登録商標）GeneChips（登録商標）を用いた分析後のｍＲＮＡの３’〜５’部位を示すオリゴヌクレオチドの相対ハイブリダイゼーションシグナルの比較が含まれる。１００ヌクレオチド長未満の一本鎖又は二本鎖核酸（例えばオリゴヌクレオチド及びｍｉＲＮＡ）は、MALDI-TOF MS等の質量分析により殆ど正確に定量され、当該技術は、核酸塩基の脱プリン化又は脱アミノ化などの分析物の分子量を有意に変更しない分解を決定できる更なる利点を有する。殆どのｍｉＲＮＡ分析は専用のＲＴ−ｑＰＣＲにより行われる。ＲＮＡ分解の程度を決定する方法の複雑性にも関わらず、特定のｍＲＮＡ配列は分解に対して非常に感受性が高くなく、１８Ｓ及び２８Ｓ  ｒＲＮＡは比較的分解に安定である為、ｍＲＮＡ分解のための代用マーカーである。ｍＲＮＡ分解の正確な分析は、上記で説明した通り、ＲＴ−ｑＰＣＴを用いて現在最も行われている。ＲＮＡ精製の結果としてＲＮＡ分解を評価する方法の詳細な記載についてはMuyal et al., (2009) Diag. Path. 4:9が参照される。
【００７３】
ＲＮＡ又はＤＮＡの「純粋試料」は、ＯＤ２６０／２８０比が１．７以上である、水中の核酸溶液を意味する。
【００７４】
一般的に不安定性及び分解は、検討中の分子（分析物）の分子量の減少と相関している。逆に、例えば保存中に漸進的に凝集する複合体の分子量の増大に関連することもある。後者の一つの例は、組織全体の保存中の核酸へのタンパク質の複合体化或いは凝集、又は試料（ホルマリン固定パラフィン包埋組織（ＦＦＰＥ）等）の処理中の分子の化学架橋である。
【００７５】
「安定化」は、対照に比べて分析物分子の分解量の低下となる条件を意味する。当該対照は、本発明を使用しない使用条件、例えば安定剤なしでの保存（図１１）であり、ＲＮＡ分解の割合は、一般的に有用な比較となるほど非常に高く、良好な対照は製造業者の指示によって使用される市販のＲＮＡｌａｔｅｒである(Cat. No. 76106, Qiagen, Germany)。対照は、生検、血液又は血清試料等の組織切片又は組織片でもよく、ＲＮＡｌａｔｅｒで例えば４、２０又は３７℃で１〜１６時間又は１〜４５日間保存される。
【００７６】
組織破壊は、カオトロープ溶液の添加で溶解する程小さい粒子まで大きな組織試料を破壊するプロセスを意味する。ＲＮＡ抽出及び精製の為、分析物の十分な放出を可能にする程小さい断片にまで試料が破壊される。
【００７７】
「ＲＮアーゼ不活性化」工程は、ＲＮアーゼを十分不活性化するために行われてもよく、ＲＮＡが著しく分解せずにＤＥＳ混合物を用いて安定化される。ＲＮアーゼを不活性化する多くの方法が、当該技術分野で公知であり、プロテアーゼ（トリプシン、キモトリプシン、パパイン、又はプロテアーゼＫ等）を用いた酵素分解、β−メルカプトエタノールを用いたジスルフィド結合の減少(Chirgwin, et al., "Isolation of Biologically Active Ribonucleic Acid from Sources Enriched in Ribonuclease," Biochemistry, 18:5294-5299, 1979.)、ジチオトレイトール、ジチオエリスリトール、グルタチオン又はＴＣＥＰ、ＲＮａｓｉｎタンパク質の添加(Life Technologies, USA)、RNAsecureTM(Life Technologies, USA)、カオトロープ（例えばグアニジン、ＨＣｌ、グアニジンチオシアネート）を用いた処理(Chomczynski and Sacchi, "Single Step Method of RNA Isolation by Acid Guanidine Isothiocyanate-Phenol-Chloroform Extraction," Anal. Biochem., 162:156-159, 1987; Sambrook, et al., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual," pp. 7.16-7.52, 1989.)、尿素、ホルムアミド、ホルムアルデヒド、又はヨードアセテートナトリウム、界面活性剤（Tween-20、Triton X-100、NP-40、SLS、SDS等）を用いた処理、又はEDTA、EGTA、クエン酸ナトリウム、熱又は酸変性、バナジルリボヌクレオシド複合体を用いた阻害(Berger and Birkenmeier, 1979)又はグルタルアルデヒドを用いた架橋がある。組織試料は、一実施例で記載する通り、ＤＥＳ混合物処理前に、ＲＮアーゼ活性が未処理活性の少なくとも５０％、７５％、好ましくは１００％減少するように処理される。処理前のＲＮアーゼ活性は、RNaseAlertTM kit (Life Technologies, USA)を用いてモニターすることができる。組織のＲＮアーゼを不活性化する方法は、米国特許第6,777,210号及び米国特許出願第2009/0286304号に記載されている。
【００７８】
限定されないが、一例として、ＤＥＳは、一つ以上の成分を混合、又は混合及び加熱して作製される。当該成分は、硝酸コリン、テトラフルオロボレートコリン、水酸化コリン、酒石酸水素コリン、クエン酸二水素コリン、ｐ−トルエンスルホン酸コリン、重炭酸コリン、塩化コリン、臭化コリン、ヨウ化コリン、フッ化コリン、塩化クロロコリン、臭化ブロモコリン、ヨウ化ヨードコリン、水酸化アセチルコリン、酒石酸水素アセチルコリン、クエン酸二水素アセチルコリン、ｐ−トルエンスルホン酸アセチルコリン、重炭酸アセチルコリン、塩化アセチルコリン、臭化アセチルコリン、ヨウ化アセチルコリン、フッ化アセチルコリン、塩化クロロアセチルコリン、臭化ブロモアセチルコリン、ヨウ化ヨードアセチルコリン、水酸化ブチリルコリン、酒石酸水素ブチリルコリン、クエン酸二水素ブチリルコリン、ｐ−トルエンスルホン酸ブチリルコリン、重炭酸ブチリルコリン、塩化ブチリルコリン、臭化ブチリルコリン、ヨウ化ブチリルコリン、フッ化ブチリルコリン、塩化クロロブチリルコリン、臭化ブロモブチリルコリン、ヨウ化ヨードブチリルコリン、塩化アセチルチオコリン、Ｌ−カルニチン、Ｄ−カルニチン、ベタイン、サルコシン、トリメチルアミンＮオキシド、ベタインＨＣｌ、セチルベタイン、フッ化セチルトリメチルアンモニウム、塩化セチルトリメチルアンモニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、ラウリルベタイン、塩化Ｎ，Ｎ−ジメチレンエタノールアンモニウム、塩化Ｎ，Ｎ−ジエチルエタノールアンモニウム、塩化βメチルコリン、塩化ホスホコリン、クエン酸コリン、塩化ベンゾイルコリン、ラウリルスルホベタイン、塩化ベンジルトリメチルアンモニウム、塩化メチルトリフェニルホスホニウム、臭化メチルトリフェニルホスホニウム、ヨウ化メチルトリフェニルホスホニウム、フッ化メチルトリフェニルホスホニウム、塩化Ｎ，Ｎ−ジエチレンエタノールアンモニウム、塩化エチルアンモニウム、塩化テトラメチルアンモニウム、臭化テトラメチルアンモニウム、ヨウ化テトラメチルアンモニウム、フッ化テトラメチルアンモニウム、塩化テトラエチルアンモニウム、臭化テトラエチルアンモニウム、ヨウ化テトラエチルアンモニウム、フッ化テトラエチルアンモニウム、塩化テトラブチルアンモニウム、臭化テトラブチルアンモニウム、ヨウ化テトラブチルアンモニウム、フッ化テトラブチルアンモニウム、塩化（２−クロロエチル）トリメチルアンモニウム、塩化テルビウム（ＩＩＩ）、塩化亜鉛（ＩＩ）、臭化亜鉛（ＩＩ）、塩化ジルコニウム（ＩＩＩ）、塩化鉄（ＩＩＩ）、塩化スズ（ＩＩ）、塩化銅（ＩＩ）、塩化マグネシウム（ＩＩ）の群から選択されてもよい。
ＤＥＳを形成できる一つ以上の他の成分としては、限定されないが、尿素、ホルムアミド、チオ尿素、１−メチル尿素、１，１−ジメチル尿素、１，３−ジメチル尿素、カルボヒドラジド、テトラメチル尿素、１，３−ビス（ヒドロキシメチル）尿素、ベンズアミド、ジラール試薬Ｔ、ラクトアミド、アセトアミド、フルオロアセトアミド、ジフルオロアセトアミド、トリフルオロアセトアミド、クロロフルオロアセトアミド、クロロジフルオロアセトアミド、クロロアセトアミド、ジクロロアセトアミド、ジクロロフルオロアセトアミド、トリクロロアセトアミド、ブロモアセトアミド、ジブロモアセトアミド、トリブロモアセトアミド、ブロモフルオロアセトアミド、ブロモジフルオロアセトアミド、ブロモクロロフルオロアセトアミド、ヨードアセトアミド、ジヨードアセトアミド、トリヨードアセトアミド、２−メチル−２，２−ジフルオロアセトアミド、２−メチル−２−フルオロアセトアミド、２，２−ジメチル−２−フルオロアセトアミド、２−エチル−２，２−ジフルオロアセトアミド、２−エチル−２−フルオロアセトアミド、２，２−ジエチル−２−フルオロアセトアミド、２−プロピル−２，２−ジフルオロアセトアミド、２−プロピル−２−フルオロアセトアミド、２，２−プロピル−２−フルオロアセトアミド、２−フルオロプロピオンアミド、３−フルオロプロピオンアミド、２，２−ジフルオロプロピオンアミド、２，３−ジフルオロプロピオンアミド、３，３−ジフルオロプロピオンアミド、３，３，３−トリフルオロプロピオンアミド、２−フルオロ−３，３，３−トリフルオロプロピオンアミド、２−クロロ−３，３，３−トリフルオロプロピオンアミド、２，２−クロロ−３，３，３−トリフルオロプロピオンアミド、２−ブロモ−３，３，３−トリフルオロプロピオンアミド、２，２−ブロモ−３，３，３−トリフルオロプロピオンアミド、ペンタフルオロプロピオンアミド、ヘプタフルオロブチルアミド、トリメチルアセトアミド、１−（トリフルオロアセチル）イミダゾール、Ｎ，Ｏ−ビス（トリフルオロアセチル）ヒドロキシアミン、ビストリフルオロアセトアミド、Ｎ−メチル−フルオロアセトアミド、Ｎ−メチル−ジフルオロアセトアミド、Ｎ−メチル−トリフルオロアセトアミド、Ｎ−メチル−クロロフルオロアセトアミド、Ｎ−メチル−クロロジフルオロアセトアミド、Ｎ−メチル−クロロアセトアミド、Ｎ−メチル−ジクロロアセトアミド、Ｎ−メチル−ジクロロフルオロアセトアミド、Ｎ−メチル−トリクロロアセトアミド、Ｎ−メチル−ブロモアセトアミド、Ｎ−メチル−ジブロモアセトアミド、Ｎ−メチル−トリブロモアセトアミド、Ｎ−メチル−ブロモフルオロアセトアミド、Ｎ−メチル−ブロモジフルオロアセトアミド、Ｎ−メチル−ブロモクロロフルオロアセトアミド、Ｎ−メチル−ヨードアセトアミド、Ｎ−メチル−ジヨードアセトアミド、Ｎ−メチル−トリヨードアセトアミド、Ｎ−メチル−２−メチル−２，２−ジフルオロアセトアミド、Ｎ−メチル−２−メチル−２−フルオロアセトアミド、Ｎ−メチル−２，２−ジメチル−２−フルオロアセトアミド、Ｎ−メチル−２−エチル−２，２−ジフルオロアセトアミド、Ｎ−メチル−２−エチル−２−フルオロアセトアミド、Ｎ−メチル−２，２−ジエチル−２−フルオロアセトアミド、Ｎ−メチル−２−プロピル−２，２−ジフルオロアセトアミド、Ｎ−メチル−２−プロピル−２−フルオロアセトアミド、Ｎ−メチル−２，２−プロピル−２−フルオロアセトアミド、Ｎ−メチル−２−フルオロプロピオンアミド、Ｎ−メチル−３−フルオロプロピオンアミド、Ｎ−メチル−２，２−ジフルオロプロピオンアミド、Ｎ−メチル−２，３−ジフルオロプロピオンアミド、Ｎ−メチル−３，３−ジフルオロプロピオンアミド、Ｎ−メチル−３，３，３−トリフルオロプロピオンアミド、Ｎ−メチル−２−フルオロ−３，３，３−トリフルオロプロピオンアミド、Ｎ−メチル−２−クロロ−３，３，３−トリフルオロプロピオンアミド、Ｎ−メチル−２，２−クロロ−３，３，３−トリフルオロプロピオンアミド、Ｎ−メチル−２−ブロモ−３，３，３−トリフルオロプロピオンアミド、Ｎ−メチル−２，２−ブロモ−３，３，３−トリフルオロプロピオンアミド、Ｎ−メチル−ペンタフルオロプロピオンアミド、Ｎ−メチルヘプタフルオロブチルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，２，２−トリフルオロアセトアミド、Ｎ−エチル−２，２，２−トリフルオロアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチル−２，２，２−トリフルオロアセトアミド、Ｎ−（ヒドロキシメチル）トリフルオロアセトアミド、エチルトリフルオロアセテート、ジチオトレイトール、ジチオエリスリトール、β−メルカプトエタノール、ペニシラミン、チオプロニン、アクリルアミド、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、タウリン、アコニット酸、アジピン酸、安息香酸、クエン酸、マロン酸、リンゴ酸、ＤＬ−マレイン酸、シュウ酸、フェニル酢酸、フェニルプロピオン酸、コハク酸、レブリン酸、酒石酸、没食子酸、ｐ−トルエンスルホン酸、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、メチオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、アルギニン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、プロリン、エチレングリコール、トリエチレングリコール、グリセロール、レゾルシノール、フェノール、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、１，４−ブタンジオール、１，５−ペンタンジオール、１，６−ヘキサンジオール、１，８−オクタンジオール、１，１２−ドデカンジオール、ｍ−クレゾール、イミダゾール、１−メチルイミダゾール、４−メチルイミダゾール、Ｎ−メチルピロリドン、Ｎ−エチルピロリドン、Ｎ−ベンジルピロリドン、２−イミダゾリンドン、テトラヒドロ−２−ピリミジオン、グアニジン、グアニジンＨＣｌ、グアニジンイソチオシアネート、グアニジンスルフェート、アンモニウムアセテート、酒石酸水素アンモニウム、塩化アンモニウム、クエン酸二水素アンモニウム、アンモニウムホルメート、アンモニウムヨーダイド、アンモニウムニトレート、アンモニウムホスフェート、アンモニウムホスフェート二塩基性、アンモニウムスルファメート、アンモニウムスルフェート、アンモニウム酒石酸二塩基性、アンモニウムイソチオシアネート、アンモニ���ムベンゾエート、アンモニウムブロミド、アンモニウムフルオリド、アンモニウムハイドロジェンスルフェート、アンモニウムトリフルオロアセテート、アンモニウムチオスルフェート、アドニトール、リビトール、ラムノース、トレハロース、Ｄ−ソルビトール、Ｌ−ソルビトール、ソルボース、キシリトール、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、マンノース、マンニトール、アラビノース、ガラクトース、ラフィノース、イノシトール、エリスリトール又はキシロースの群から選択される一つ以上の化合物が挙げられる。
【００７９】
本明細書に開示されるいくつかの化合物は、イオン化可能であってもよく、すなわち、いくつかの化合物は、弱酸、弱塩基、又は両性電解質であってもよい。イオン化可能な化合物の遊離形態の代表例は、対応するイオン化形態を包含することが意図される。例えば、カルボン酸基の代表例は、対応するカルボン酸エステル基を包含する。
【００８０】
塩化亜鉛等の特定の成分は、塩化コリンだけではなく尿素と共にＤＥＳを形成することができ（塩化コリンと塩化亜鉛は上記の同一成分基であると思われる）、特定のＤＥＳ混合物が同一基の化合物から調製することができる。
【００８１】
上記リストは、完全に網羅されておらず、ＤＥＳ成分は、ＤＥＳ成分間の水素結合が多く絶対に必要ではない事以外は、如何なる種類の分子又は特性に限定されない。
【００８２】
本発明で使用される深共晶溶媒は、好ましくは実質的に有機酸を含まない。特に、本発明で使用される深共晶溶媒は、好ましくはリンゴ酸、マレイン酸、クエン酸、乳酸、ピルビン酸、フマル酸、コハク酸、酢酸、アコニット酸、酒石酸、アスコルビン酸、マロン酸、シュウ酸、グルクロン酸、ノイラミン酸、シアル酸から選択される有機酸を実質的に含まない。或いは、式ＩＩ及びＩＩＩに示されるＲ6、Ｒ7、Ｒ8は、得られる化合物がカルボン酸基を含まないように選択される。好ましい取り決めにおいて、Ｒ6がＯＨである場合、Ｒ7はカルボニルではない。別の好ましい取決めにおいて、Ｒ7が−Ｚ−Ｃ（Ｏ）Ｒ8である場合、Ｒ8はＯＨではない。
【００８３】
本発明で使用される深共晶溶媒は、好ましくは実質的に金属塩を含まない。一つの取り決めにおいて、深共晶溶媒は、亜鉛又はジルコニウムの塩以外の金属塩を実質的に含まない。深共晶溶媒は、好ましくはＮａＨ2ＰＯ4、Ｎａ2ＨＰＯ4、ＮａＨＳＯ3、Ｎａ2ＳＯ4、ＭｇＣｌ2、ＣａＣｌ2、ＫＣｌ、ＮａＣｌ及びＫＩを実質的に含まない。深共晶溶媒が糖又は糖アルコールを含む場合、深共晶溶媒は、特に好ましくは金属塩を含まない。
【００８４】
本発明で使用される深共晶溶媒は、好ましくはスクロース、グルコース、フルクトース、ラクトース、マルトース、セロビオース、アラビノース、リボース、リブロース、ガラクトース、ラムノース、ラフィノース、キシロース、マンノース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、キシリトール、リビトール、ガラクチトール、エリスリトール、及びアドニトールから選択される糖又は糖アルコールを実質的に含まない。深共晶溶媒が金属塩を含む場合、深共晶溶媒は、特に好ましくは糖又は糖アルコールを含まない。
【００８５】
ＤＥＳ混合物においてＤＥＳ成分の最大数は特段なく、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の成分を混合してＤＥＳ混合物を作製できる。必要に応じて例えば２成分ＤＥＳ混合物の整数モル比において、成分１及び成分２は、以下の比：１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０（モル：モル）で混合することができる。例えば３成分ＤＥＳ混合物において、成分１、成分２及び成分３は、１０：１：１、９：１：１、８：１：２、７：１：３、６：１：４、５：１：５、４：１：６、３：１：７、２：１：８、１：１：９、１：２：８、１：３：７、１：４：６、１：５：５、１：６：４、１：７：３、１：８：２、１：９：１、１：１０：１（モル：モル：モル）で混合することができる。
【００８６】
当業者は、成分の混合比率、例えば２０：１又は１：３０（モル：モル）が可能である事、共融点をもたらす特定のモル比が、ＲＮＡの安定化及び／又は細胞形態の固定に最適又は所望のモル比ではない事を理解する。ＤＥＳの安定化活性は、ＤＥＳ混合物の水素結合特性と関連する場合がある。特定の用途に有用なＤＥＳ混合物を作製する成分の数又は混合比率には特段制限はない。ＤＥＳの物性、例えば粘度又は密度は、更なる成分の添加、又は以下に示す「添加剤」の添加によって変更することができる。いくつかのＤＥＳ混合物は、端数のモル比を用いて調製でき、例えばＺｎＣｌ2：尿素は１：３．５（モル：モル）で調製できる。成分１及び成分２又は成分１、成分２及び成分３等のモル比に特段制限はなく、細胞固定等の用途に使用されるＤＥＳ混合物を含む成分の最適比は経験上殆ど正確に決定できる。例示のみとして、塩化コリン／トリフルオロアセトアミドは２：１、１．７５：１、１．５：１、１．２５：１、１：１、１：１．２５、１：１．５、１：１．７５、又は１：２のモル：モル比で混合でき、個別に試験して最適なＲＮＡ安定化及び／又は細胞固定特性を有するモル比を決定できる。
【００８７】
当業者は、費用又は毒性等の他の要因により特定の成分の比率を削減し、安い代替物に部分的に置き換える場合がある。例えば、塩化アセチルコリン：尿素（１：２  モル：モル）ＤＥＳ混合物は、特定の用途で、塩化アセチルコリン：塩化コリン：尿素（１：１：４  モル：モル：モル）の様に安い塩化コリンに部分的に置き換えることができる。
【００８８】
例えば、ＤＥＳの作製に使用される成分中の夾雑物（例えば水）、酸化、ＣＯ2の吸収が存在する為、合成中の副生成物又は一成分の分解生成物が生じる事は当業者に明らかである。例えば１：１（モル：モル）混合物の所望の正確な比率は、成分１又は成分２の正確な量において、実際に±１０％、好ましくは５％、より好ましくは１％の差異であってもよい。例示として、５％誤差は、最終モル比率：０．９５：１、１：０．９５、１．０５：０．９５又は０．９５：１．０５（モル：モル）となることがあり、当該誤差の影響、例えば実施例１に示す通り、ＲＮＡの質に対する影響が経験的に決定できる。一般的に、水等の夾雑物を除去する為に、エタノール中の再結晶の周知手順が行われ、真空乾燥及び／又は化学乾燥が行われる。当該方法は、‘Purification of Laboratory Chemicals’
Butterworth-Heinemann (2012)に説明されている。
【００８９】
典型的に、ＤＥＳは、以下の種類の化合物：（ｉ）第一級、第二級、第三級、又は第四級窒素等の正電荷カチオンを有する窒素塩（窒素塩の一例は、塩化コリン等のハロゲン化物を有するものである）、（ｉｉ）金属塩、例えば一つの遷移金属塩ハロゲン化物からの水素結合供与体と、（ｉｉｉ）アミン、（ｉｖ）ヒドロキシ、（ｖ）アルデヒド、（ｖｉ）アミド又は（ｖｉｉ）カルボン酸を含んでいてもよい水素結合受容体とを混合することにより調製される。糖、カルボン酸、トリフルオロアセトアミド等の尿素、及びアルコール等の水素結合供与体が含まれる。
【００９０】
一つの取り決めにおいて、深共晶溶媒は、ＩＩＩ型深共晶溶媒又はＩＶ型深共晶溶媒であり、１０ｍｇのラット肝臓試料から抽出され、４００ｍｇの深共晶溶媒を用いて２４℃で２０日間インキュベートされたＲＮＡは、Agilent Bioanalyser 2100を用いて測定される、少なくとも４．０のＲＮＡ完全性値（ＲＩＮ）を有する。
【００９１】
ＲＮＡ完全性値は、RNA 6000 Nano total RNA Kit (Cat. No. 5067-1511, Agilent Technologies, USA)及びBioanalyser 2100 instrument (Cat. No. G2939AA, Agilent Technologies, USA)を用いて測定されてもよい。
【００９２】
本明細書で使用される場合、用語「ＩＩＩ型深共晶溶媒」は、少なくとも第一成分及び第二成分を有する深共晶溶媒であって、第一成分は塩化コリン又はＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルグリシン（ベタイン）等の第四級アンモニウム又はホスホニウム化合物であり、第二成分は尿素又はトリフルオロアセトアミドなどの水素結合供与体である事を意味する。ＩＶ型深共晶溶媒は、少なくとも第一成分及び第二成分を有する深共晶溶媒であって、第一成分は塩化亜鉛等の金属塩であり、第二成分は尿素等の水素結合供与体である。
【００９３】
当業者は、組織試料からＲＮＡを抽出する方法に精通している。適切には、ＲＮＡは製造業者の指示に従ってRNeasy Mini kit(Cat. No. 74106, Qiagen, Germany)を用いて抽出されてもよく、他の方法を使用してもよい。
【００９４】
本発明は、固定したウイルス、細胞又は組織を作製するための、ウイルス、細胞又は組織の固定剤としての深共晶溶媒の使用を提供する。好ましくは基質上で培養され、深共晶溶媒を用いて２４℃で１時間インキュベートされたＨｅＬａ細胞の少なくとも７５％は、深共晶溶媒を水で置換し、２４℃で１時間インキュベーションされた後に結合したままである。
【００９５】
当業者は、基質に結合した状態の細胞数を決定する方法に精通している。例えば、約２０００個のＨｅＬａ細胞がカバーガラス等の最適な基質上で成長できる。最適なカバーガラスの一例は、２５ｍｍの直径を有するCellatticeTM: Micro-Ruled Cell Culture SurfaceMicro-ruled cell culture coverslip surface, Cat. No. CLS5-25D-050 Nexcelom Bioscience, USAである。基質は、組織培養プレートに置かれ、適切なバッファ、例えば２ｍｌのＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳで一晩培養する。所定面積の基質に結合する細胞数は、１０倍の対物顕微鏡レンズを用いて手作業で数えることができる。組織培養培地は、例えば吸引ピペットを用いて除去でき、４００ｍｇの深共晶溶媒で置き換える。組織培養は、室温で１時間インキュベートし、細胞を固定し、深共晶溶媒を除去し、２ｍｌの蒸留水で置換し、室温で１時間インキュベートし、グリッドの所定面積の細胞数を手作業で数える。元の数と比較して所定の面積に結合したままの細胞の割合を算出してもよい。
【００９６】
特に好ましい取り決めにおいて、１０ｍｇのラット肝臓試料から抽出され、４００ｍｇの深共晶溶媒を用いて２４℃で２０日間インキュベートされたＲＮＡは、Agilent Bioanalyser 2100を用いて測定される、少なくとも４．０のＲＮＡ完全性値（ＲＩＮ）を有し、基質上で培養され、深共晶溶媒を用いて２４℃で１時間インキュベートされたＨｅＬａ細胞の少なくとも７５％は、深共晶溶媒を水と置換し、２４℃で１時間インキュベーションした後に基質に結合したままである。
【００９７】
任意に、本発明で使用される深共晶溶媒は、ＩＩＩ型深共晶溶媒であり、当該深共晶溶媒は、トリフルオロメチル基を含む化合物を含む。トリフルオロメチル基を含む化合物は、深共晶溶媒の少なくとも５重量％の量で深共晶溶媒に存在してもよい。
【００９８】
一つの取り決めにおいて、深共晶溶媒は、第一成分及び第二成分を含み、第一成分は、式Ｉの化合物であり、
【００９９】
【化５】
2018113982.tif 000006
【０１００】
Ｒ6がＨ又はＯＨであり、
Ｒ7がＨ、ＣＨ3、Ｃｌ、Ｂｒ、カルボニル酸素及び
【０１０１】
【化６】
2018113982.tif 000007
から選択され;
Ｚは−ＣＨ2−、Ｏ、及びＳから選択され、
Ｒ8はＲ11又はＯＨであり、
第二成分は、式ＩＩの化合物またはその塩を含み、
【０１０２】
【化７】
2018113982.tif 000008
ＡはＯ、Ｓ及びＮＨから選択され、
Ｒ1はＨ、１〜６の炭素原子を有するアルケン基、Ｒ9、−ＮＨ2、−ＮＨ−（ＣＨ2）aＣＨ3、及び−Ｃ（Ｒ3）（Ｒ4）（Ｒ5）から選択され、
ａは０又は１〜５の整数であり、
Ｒ2はＨ及び１〜３の炭素原子を有する直鎖アルキル基から選択され、
Ｒ3は任意に置換される５員又は６員の脂肪族環又は芳香族環であり、置換基はＲ10であり、
Ｒ4及びＲ5はそれぞれ独立してＨ又はＦであり、
Ｒ9、Ｒ10、及びＲ11は、それぞれ独立して１〜３の炭素原子を有するアルキル基、１〜３の炭素原子を有するモノクロロアルキル基、及び１〜３の炭素原子を有するモノフルオロアルキル基、ジフルオロアルキル基又はトリフルオロアルキル基から選択される。
【０１０３】
好ましくは、当該取り決めにおいて、Ａは、Ｏ、Ｓ及びＮＨから選択され、Ｒ1は、Ｈ、−ＣＨ＝ＣＨ2、Ｒ9、−ＮＨ2、−ＮＨＣＨ3、及び−Ｃ（Ｒ3）（Ｒ4）（Ｒ5）から選択され、Ｒ2はＨ及び−ＣＨ3から選択され、Ｒ3は任意に置換される５員又は６員の脂肪族環又は芳香族環であり、置換基はＲ10であり、Ｒ4及びＲ5はそれぞれ独立してＨ又はＦであり、Ｒ9、Ｒ10、及びＲ11は、それぞれ独立して１〜３の炭素原子を有するアルキル基、１〜３の炭素原子を有するモノクロロアルキル基、及び１〜３炭素原子を有するモノフルオロアルキル基、ジフルオロアルキル基又はトリフルオロアルキル基から選択される。任意にＲ7は、Ｈ、Ｂｒ、カルボニル酸素及び
【０１０４】
【化８】
2018113982.tif 000009
から選択される。
Ａは、Ｏ又はＳであってもよい。
Ｒ2はＨであってもよい。
Ｒ1は、Ｈ、Ｒ9、−ＣＨ＝ＣＨ2、及び−Ｃ（Ｒ3）（Ｒ4）（Ｒ5）から選択されてもよい。当該取り決めにおいて、Ｒ1は、Ｒ9であり、Ｒ9は好ましくは１つの炭素原子を有することが好ましい。
【０１０５】
好ましくは第二成分がアセトアミド、又は２−クロロアセトアミドである。
【０１０６】
別の取り決めにおいて、Ｒ9は、モノ−、ジ−又はトリ−フルオロメチル基である。
【０１０７】
第二成分は、好ましくはトリフルオロアセトアミド、トリフルオロチオアセトアミド又はＮ−メチルトリフルオロアセトアミドである。
【０１０８】
別の取り決めにおいて、Ｒ9は、２つの炭素原子を有し、Ｒ9は、好ましくはモノ−、ジ−、又はトリ−フルオロエチル基である。
【０１０９】
第二成分は、２，２−ジフルオロプロパンアミド又は３，３，３−トリフルオロプロパンアミドであることが好ましい。別の取り決めにおいて、第二成分は、ホルムアミド又はアクリルアミドである。
【０１１０】
更なる取り決めにおいて、Ｒ1は、Ｃ（Ｒ3）（Ｒ4）（Ｒ5）であり、Ｒ4及びＲ5は、好ましくはＦである。
【０１１１】
Ｒ3は、任意に置換されるフェニル基等の任意に置換される６員芳香族環であってもよい。好ましくは、第一成分は、２，２−ジフルオロ−２−フェニルアセトアミドである。あるいは、Ｒ3は、置換基を含み、好ましくはフェニル基の２位に置換基を含む。
【０１１２】
置換基は、好ましくはモノ−、ジ−又はトリ−フルオロメチル基である。よって、一つの取り決めにおいて、第二成分は、２−（トリフルオロメチル）フェニルアセトアミドである。
【０１１３】
更なる取り決めにおいて、Ｒ1は、−ＮＨ2及び−ＮＨＣＨ3から選択される。好ましくは、第二成分は尿素、チオ尿素又は１，３−ジメチル尿素である。
【０１１４】
更なる取り決めにおいて、ＡはＮＨである。この取り決めにおいて、第二成分は、グアニジンであってもよく、任意にグアニジンはヒドロイソチオシアネート塩の形態で存在してもよい。
【０１１５】
更なる取り決めにおいて、Ｒ7はＨである。この取り決めにおいて、第一成分は、好ましくはコリンを含む。
【０１１６】
別の取り決めにおいて、第一成分は、臭化コリンを含む。
【０１１７】
別の取り決めにおいて、第一成分は、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルグリシンであり、任意に第二成分は、トリフルオロアセトアミド及び尿素から選択される。
【０１１８】
別の取り決めにおいて、Ｒ7は、
【０１１９】
【化９】
2018113982.tif 000010
である。
【０１２０】
当該取り決めにおいて、ＺはＯまたはＳであってもよく、Ｒ8は、Ｒ11であってもよく、Ｒ11は、好ましくは一つの炭素原子を有する。
【０１２１】
当該取り決めにおいて、第一成分は好ましくはアセチルコリン又はアセチルチオコリンを含む。
【０１２２】
或いは、Ｒ11は、３つの炭素原子を有していてもよく、第一成分は好ましくはブチリルコリンを含む。
【０１２３】
更なる取り決めにおいて、ＺはＣＨ2であってもよい。当該取り決めにおいて、Ｒ8は、ＯＨであってもよい。当該取り決めにおいて、第二成分は好ましくはカルニチンである。
【０１２４】
第一成分は、対イオンを含んでいてもよく、典型的にはハロゲン化物アニオンであるが硝酸（ＮＯ3-）又はテトラフルオロボレート（ＢＦ4-）等の別のアニオンであってもよい。ハロゲン化物アニオンは、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素から選択されてもよく、好ましくは塩素である。この取り決めにおいて、第一成分は塩化コリンであり、任意に第二成分はトリフルオロアセトアミド、トリフルオロチオアセトアミド、３，３，３−トリフルオロプロパンアミド、２，２−ジフルオロ−２−フェニルアセトアミド、チオ尿素及び尿素から選択され、好ましくはトリフルオロアセトアミドである。
【０１２５】
第二成分に対する第一成分のモル比は、１：３〜２：１の範囲であり、好ましくは１：１．５〜１：２．５の範囲であり、より好ましくは１：２である。
【０１２６】
更なる取り決めにおいて、深共晶溶媒は、第一成分及び第二成分を含み、第一成分はコリンのハロゲン化塩であり、第二成分は任意に置換されるイミダゾールであり、置換基は、１〜３の炭素原子を有するアルキル基である。当該取り決めにおいて、第二成分に対する第一成分のモル比は、好ましくは２．８：１〜２：１の範囲である。
【０１２７】
コリンのハロゲン化塩は、好ましくは塩化コリンであり、置換イミダゾールは、好ましくはメチルイミダゾールであり、例えばＮ−メチルイミダゾール又は４−メチルイミダゾールである。１−ベンジルイミダゾール等のベンジル置換イミダゾールの使用も含まれる。或いは、イミダゾールは、置換されていない。
【０１２８】
更なる取り決めにおいて、深共晶溶媒は、第一成分及び第二成分を含み、第一成分は、式ＩＩＩの化合物を含み、
【０１２９】
【化１０】
2018113982.tif 000011
Ｒ6はＨ又はＯＨであり、Ｒ7はＨ、ＣＨ3、Ｃｌ、Ｂｒ、カルボニル酸素及び
【０１３０】
【化１１】
2018113982.tif 000012
から選択され、
Ｚは−ＣＨ2−、Ｏ及びＳから選択され、
Ｒ8はＯＨ、１〜３の炭素原子を有するアルキル基、１〜３の炭素原子を有するモノクロロアルキル基、及び１〜３の炭素原子を有するモノフルオロアルキル基、ジフルオロアルキル基又はトリフルオロアルキル基から選択され、
第二成分は糖又は少なくとも３つの炭素原子を有する糖アルコールである。
【０１３１】
Ｒ7は任意にＨ、Ｂｒ、カルボニル酸素及び
【０１３２】
【化１２】
2018113982.tif 000013
から選択される。
【０１３３】
糖アルコールは、グリセロール、トレイトール、キシリトール、ソルビトール及びボレミトールから選択されてもよく、好ましくはグリセロール、キシリトール及びソルビトールから選択され、最も好ましくはソルビトールである。或いは、糖は、トレハロースであってもよい。
【０１３４】
当該取り決めにおいて、第二成分は、コリン、例えば塩化コリンを含んでいてもよい。第二成分に対する第一成分のモル比は、１：２〜２：１の範囲であってもよく、好ましくは１：０．８〜１：１．２の範囲である。
【０１３５】
更なる取り決めにおいて、深共晶溶媒は、第一成分及び第二成分を含み、第一成分はハロゲン化亜鉛（ＩＩ）又はハロゲン化ジルコニウム（ＩＶ）であり、第二成分は式ＩＶの化合物である。
【０１３６】
【化１３】
2018113982.tif 000014
ＡはＯ、Ｓ及びＮＨから選択され、
Ｒ1はＨ、１〜６の炭素原子を有するアルケン基、Ｒ9、−ＮＨ2、−ＮＨ（ＣＨ2）ｎＣＨ3、及び−Ｃ（Ｒ3）（Ｒ4）（Ｒ5）から選択され、
ｎは０又は１〜５の整数であり、
Ｒ2はＨ及び１〜３の炭素原子を有する直鎖アルキル基から選択され、
Ｒ3は任意に置換される５員又は６員の脂肪族環又は芳香族環であり、置換基はＲ10であり、
Ｒ4及びＲ5はそれぞれ独立してＨ又はＦであり、
Ｒ9は、それぞれ独立して１〜３の炭素原子を有するアルキル基、１〜３の炭素原子を有するモノクロロアルキル基、及び１〜３の炭素原子を有するモノフルオロアルキル基、ジフルオロアルキル基又はトリフルオロアルキル基から選択される。
【０１３７】
好ましいハロゲン化亜鉛（ＩＩ）はＺｎＣｌ2である。好ましいハロゲン化ジルコニウム（ＩＶ）はＺｒＣｌ4である。第二成分は、好ましくは尿素である。第二成分に対する第一成分のモル比は、１：３〜１：４の範囲であってもよい。
【０１３８】
第二成分は、好ましくは尿素である。
【０１３９】
更なる取り決めにおいて、深共晶溶媒は、第一成分及び第二成分を含み、第一成分は、式Ｖの化合物であり、
【０１４０】
【化１４】
2018113982.tif 000015
Ｙ-はＣｌ-またはＢｒ-であり、
ＸはＮ又はＰであり、
Ｒ12、Ｒ13、Ｒ14及びＲ15はそれぞれ独立して１〜１６の炭素原子を有する直鎖アルキル基、１〜１６の炭素原子を有する直鎖アルコール基、ベンジル基、またはフェニル基であり、
第二成分は、式Ｉの化合物またはその塩であり、
【０１４１】
【化１５】
2018113982.tif 000016
ＡはＯ、Ｓ及びＮＨから選択され、
Ｒ1はＨ、−ＣＨ＝ＣＨ2、Ｒ9、−ＮＨ2、−ＮＨＣＨ3、及び−Ｃ（Ｒ3）（Ｒ4）（Ｒ5）から選択され、
Ｒ2はＨ及び−ＣＨ3から選択され、
Ｒ3は任意に置換される５員又は６員の脂肪族環又は芳香族環であり、置換基はＲ10であり、
Ｒ4及びＲ5はそれぞれ独立してＨ又はＦであり、
Ｒ9及びＲ10は、それぞれ独立して１〜３の炭素原子を有するアルキル基、１〜３の炭素原子を有するモノクロロアルキル基、及び１〜３の炭素原子を有するモノフルオロアルキル基、ジフルオロアルキル基又はトリフルオロアルキル基から選択される。
【０１４２】
Ｙ-はＣｌ-であってもよい。別の取り決めにおいて、Ｙ-は任意の適切な対イオン、例えばハロゲン、硝酸、又はテトラフルオロボレートであってもよい。
【０１４３】
ＸはＮであってもよく、この取り決めにおいて、式Ｖの化合物は、第四級アンモニウム塩である。
【０１４４】
任意にＲ12、Ｒ13、Ｒ14及びＲ15はそれぞれ独立して１〜１６の炭素原子を有する直鎖アルキル基、ベンジル基、又はフェニル基である。
【０１４５】
Ｒ12、Ｒ13、Ｒ14及びＲ15はそれぞれ独立して１〜４の炭素原子を有する直鎖アルキル基から選択されてもよく、好ましくはそれぞれメチル基である。この取り決めにおいて、第一成分は、好ましくは塩化テトラメチルアンモニウムである。
【０１４６】
或いは、Ｒ12、Ｒ13、Ｒ14及びＲ15はそれぞれエチル基である。この取り決めにおいて、第一成分は、好ましくは塩化テトラエチルアンモニウムである。
【０１４７】
或いは、Ｒ12、Ｒ13、Ｒ14及びＲ15はそれぞれブチル基である。この取り決めにおいて、第二成分は、塩化テトラブチルアンモニウム又は臭化テトラブチルアンモニウムである。
【０１４８】
或いは、第一成分は、
【０１４９】
【化１６】
2018113982.tif 000017
を含む。
【０１５０】
或いは、第一成分は、
【０１５１】
【化１７】
2018113982.tif 000018
を含む。
【０１５２】
別の取り決めにおいて、ＸはＰであってもよい。
【０１５３】
Ｒ12、Ｒ13、Ｒ14及びＲ15の少なくとも１つはフェニル基であってもよい。当該取り決めにおいて、第一成分は、好ましくはメチルトリフェニルホスホニウムを含み、臭化メチルトリフェニルホスホニウムであってもよい。
【０１５４】
別の取り決めにおいて、ＡはＯ又はＳであってもよい。
【０１５５】
Ｒ1は、−ＮＨ2及び−ＮＨＣＨ3から選択されてもよく、第二成分は、好ましくは尿素である。或いは、第二成分は、トリフルオロチオアセトアミドであってもよい。或いは、第二成分は、トリフルオロアセトアミドであってもよい。
【０１５６】
第二成分に対する第一成分のモル比は、１：１．５〜１：２．５であってもよく、好ましくは１：１．８〜１：２．２である。
【０１５７】
更なる取り決めにおいて、深共晶溶媒は、第一成分及び第二成分を含み、第一成分は、コリンを含み、第二成分は、５〜７の炭素原子を有するアルカンジオールである。アルカンジオールは、好ましくはヘキサンジオールである。
【０１５８】
更なる取り決めにおいて、深共晶溶媒は、第一成分及び第二成分を含み、第一成分はコリンを含み、第二成分はＮ−アルキルピロリドンを含み、Ｎ−アルキル基が１〜５の炭素原子を有する。好ましくは、Ｎ−アルキルピロリドンは、Ｎ−メチルピロリドンである。好ましくは、コリンは、塩化コリンである。当該取り決めにおいて、第二成分に対する第一成分のモル比は、１：２であってもよい。
【０１５９】
別の取り決めにおいて、深共晶溶媒は、第一成分及び第二成分を含み、第一成分はコリンを含み、第二成分は、βメルカプトエタノールを含む。当該取り決めにおいて、コリンは塩化コリンであってもよく、第二成分に対する第一成分のモル比は、約１：２であってもよい。
【０１６０】
別の取り決めにおいて、深共晶溶媒は、第一成分及び第二成分を含み、第一成分はコリンを含み、第二成分は、ジチオトレイトールを含む。コリンは塩化コリンであってもよい。第二成分に対する第一成分のモル比は、約１：２であってもよい。
【０１６１】
ＤＥＳ混合物は、Ａｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ（フランス）、ＴＣｌ（ベルギー）、Ｆｌｕｋａ（フランス）等の化学試薬会社から入手できる市販の化学物質から殆ど単純に調製される。各成分の正しい量は、ポリプロピレンチューブ内に共に添加され、手短にボルテックスし、標準手段で１００℃に加熱し、必要ならば成分又は添加物を溶解することが困難である場合、最も有効な混合方法として超音波処理される。吸湿性の塩化コリン等の成分は注意すべきであり、真空下又は再結晶によりストックの乾燥が必要となる場合がある。ＤＥＳ混合物のストックは、真空下又はシリカゲル等の乾燥剤により乾燥することができる。保存は、一般的に密封チューブで室温である。
【０１６２】
また、ＤＥＳ混合物（例えば塩化コリン：トルフルオロアセトアミド（１：２モル：モル））を用いた植物及び動物組織の処理は、未処理試料又はＲＮＡｌａｔｅｒ、Ｆｏｒｍｏｌ又は凍結処理されたものと比較して酸化が低減されることにより、葉、花、血液及び組織の色を保存する事が見出された。色保存は、種及び／又は種の成分の正しい同定に有用であってもよい。
【０１６３】
塩化コリンと揮発性／臭気性化合物（例えばジチオスレイトール、ジチオエリスリトール、β−メルカプトエタノール又はフェノール）との間でのＤＥＳ混合物の調製は、揮発性を低減し、係る化合物を呼気する不快又は危険性を低減する事を見出した。この作用は、恐らく揮発性化合物及び塩化コリンとの間での水素結合の結果である。成分間の水素結合を必要とする以外に、ＤＥＳ混合物の揮発性化合物の組み合わせに特段制限はない。このことは、低分子量アルコール等の他の揮発性成分、ＤＭＳＯ及びホルムアミド等の溶媒等の他の有機化合物の損失を低減することを意味する。従って、本発明には、開放環境での保存または使用のための成分の蒸発及び／又は揮発を低減する手段が含まれる。利点として良好な衛生及び安全性、高価な試薬の蒸発による損失低減、燃焼性低減及び単純な廃棄が挙げられる。
【０１６４】
２つ以上の成分のＤＥＳ混合物の共融点は、他の成分に対する成分１の割合が最も低い融点をもたらす。例えば塩化コリン：尿素（１：２モル：モル）ＤＥＳ混合物の共融点は、１２℃の氷点（Ｆｐ）であると報告されている。実際の観点から、この事は、ＤＥＳが室温で液体として取り扱われるが、冷蔵庫で緩やかに固体化することを意味する。他のＤＥＳ混合物、特に塩化コリンとグリセロール、エチレングリコール、トリフルオロアセトアミド又はフェニル酢酸を混合したものは、低いＦｐを有し、０℃又は−２０℃以下で液体である。液体での取り扱いによって、正確な体積の測定及び混合の容易性等の特定の利点があるが、本発明は、特定の温度のうち室温で液体であるＤＥＳ混合物に限定されるものではない。ＤＥＳ成分の加熱及び混合は、個々の原子及び分子が他の原子と分子との水素結合又は相互作用を確立する手段をもたらす。これらが生じると、ＤＥＳ混合物は、液体、ゲル又は固体であろうと、組織試料のＲＮＡを安定化する性能は必ずしも変化しない。組織試料とＤＥＳ混合物の接触は、ＤＥＳが室温で固体である場合でも生じ、急速な安定化が生じる。ＲＮＡ安定化試薬はRNAlater, AllProtect, PAXgene Tissue又はホルマリン等の液体であるが、本発明は、ＲＮＡ安定化及び／又は細胞固定のために、液体、ゲル又は固体のＤＥＳを利用することができる。実際、固体のＤＥＳを使用すると、組織試料を取り扱う場合に利点があり、ＤＥＳの固体は、共融点以上でＤＥＳ固体を加熱し、溶融し、適切な容器に注入し、冷却及び固体化して形成でき、特定の容器に合わせて成形又は切断して形成でき、ＤＥＳ固体表面に組織試料を置いて安定化させる。ウェル、凹部又溝を固体ＤＥＳ表面に作製して、各試料の特定の保存場所として機能させ、一つのウェルが一つの試料を受けることができる。ウェルを使用すると、固体ＤＥＳと試料の接触する表面積が増大し（図１Ａ）、一方でウェルに位置する試料上のＤＥＳ固体又は液体の別層が、利用できるＤＥＳ全量及び試料と接触する表面積を増やす（図１Ｂ）。ＤＥＳ液体を含み、シリンジ針又は血液回収キット(PreAnalytix)により血液侵入用突き刺しキャップを
備える血液回収チューブを図１Ｃに示す。例示のみとして、室温で固体又は液体であるＤＥＳ混合物を表１に示す。
【０１６５】
本発明は、ＤＥＳ混合物と組み合わせる添加剤の使用を含む。添加剤の目的は、ＤＥＳ混合物の特性、例えばＲＮＡ、ＤＮＡ及び／又はタンパク質の安定化及び／又は細胞及び組織固定等を改善することである。細胞形態に対する様々な添加剤の効果を表６に示す。添加剤の目的は、特定の用途の為ＤＥＳ混合物の特性、ＲＮＡの安定化、保存、輸送、及び／又は細胞又は組織固定を促進することである。例示のみとして、添加剤は、（ｉ）組織の取り扱い、染色又は処理を補助する着色剤又は色素（Ｈ＆Ｅ染色、クーマシーブルー、メチレンブルー、キシレンシアノール、クリスタルバイオレット、フクシン、アクリジンオレンジ、ＤＡＰＩ、カルミン、エオシン、エチジウムブロミド、ビスマルクブラウン、ヘキスト、マラカイトグリーン、メチルグリーン、ニュートラルブルー、ナイルブルー、四酸化オスミウム、ローダミン又はサフラニン）、（ｉｉ）ＤＥＳ混合物を用いて細胞膜の浸透を改善する界面活性剤、第四級アンモニウム塩、又はサポニン（例えばＳＤＳ、ソジウムラウリルスルフェート（ＳＬＳ）、セチルテトラブチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、テトラブチルアンモニウムブロミド（ＴＢＡＢ）、デオキシコレートナトリウム、Brij-35、Brij-58、NP-40、Triton X-100、Triton X-114、Tween-20、Tween-80、オクチルベータグルコシド、CHAPS、ソラニン、（ｉｉｉ）抗菌剤（例えば抗生物質又は防腐剤、例えばカノマイシン、ストレプトマイシン又はペニシリン、硝酸ナトリウム、亜硝酸ナトリウム又は安息香酸ナトリウム）、（ｉｖ）タンパク質沈殿剤、例えばトリクロロ酢酸、硫酸アンモニウム、スルホサリチル酸、亜鉛塩（ＺｎＣｌ2又はＺｎＳＯ4）、（ｖ）ＤＥＳ混合物から過剰の水を除く乾燥剤、例えばモレキュラーシーブス４Ａ、シリカゲル、ＣａＣｌ2又はＬｉＣｌ、（ｖｉ）プローブ、ハイブリダイズ相補核酸、ペプチド、核酸又は標識分子、内部対照、ブロッキング配列又は担体核酸、例えば（ａ）ｓｓ又はｄｓＲＮＡ又はＤＮＡ配列、（ｂ）ペプチド、酵素又は他のタンパク質、例えば抗体、（ｃ）分析物検出用分子、例えばビオチン、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アビジン、ストレプトアビジン、蛍光標識分子、例えばフルオレセイン、テキサスレッド、Alexa FluorTM標識LNA、（ｄ）Molecular BeaconTM、Scorpion probeTM、（ｖｉｉ）試料から酸素を除去し、ＲＮＡ又はＤＮＡ核酸塩基の保存中の酸化を低減する抗酸化剤、例えばビタミンＣ又はグルタチオニン、（ｖｉｉｉ）リボヌクレアーゼインヒビター、例えばＲＮａｓｉｎ、SUPERaseINTM, RNaseOUTTM、プロテアーゼインヒビター、例えばフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、ジイソプロピルフルオロホスフェート（ＤＦＰ）、アプロチニン又はPefabloc SCTM、（ｉｘ）０．５〜２０ｍＭで使用されるｐＨ５〜８、好ましくはｐＨ６〜７を安定化するバッファー、例えばTris-HCl、PIPES、MES、HEPES、MOPS、MOPSO、CAPS、CAPSO、BIPES、リン酸、イミダゾール、（ｘ）二価金属カチオンを除去し０．５〜２０ｍＭで使用されるキレート剤、例えばBAPTA、EDTA、EGTA、クエン酸、D-ペニシルアミン、（ｘｉ）溶解酸素（最終濃度２〜２０％）、及び／又はＣＯ2（最終濃度０．０１〜５％）、非反応性ガス（（例えばアルゴン）（最終濃度１〜２０％））、バッフ��、細胞、組織、生体生存性を高める栄養物（例えばグルコース及びアミノ酸）、及び／又は（ｘｉｉ）ＤＥＳ粘度を低減する１〜２０％（ｗｔ：ｗｔ）のアルコール、例えばｔｅｒｔ−ブタノールであってもよい。
【０１６６】
「添加剤」は本明細書で、特定のＤＥＳ混合物に溶解され得る任意の物質として定義され、ＤＥＳ混合物の全量よりも多い、これと等しい又はこれよりも少ない量（重量：重量）で存在することができる。例示のみとして、塩化コリン：尿素：塩化亜鉛（１：２：０．５モル：モル：モル）ではＺｎＣｌ2が添加剤であり、或いは塩化コリン：トリフルオロアセトアミド：尿素（１：２．０：０．１モル：モル：モル）では尿素が添加剤である。添加剤は、必ずしもＤＥＳ混合物の氷点に如何なる影響を与えず、ＤＥＳ成分のいずれとも水素結合を形成しないが、ＤＥＳ混合物に特有の性質を与える。
【０１６７】
ＤＥＳ混合物に対する添加物の網羅的ではないリストは、以下の通りである：ｐ−トルエンスルホン酸アンモニウム、ｐ−トルエンスルホン酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、チオ硫酸アンモニウム、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、安息香酸ナトリウム、水酸化ドデシルジメチル（３−スルホプロピル）アンモニウム、ジメチルベンゼンスルホン酸、コンゴレッド、ギムザ、ＤＡＰＩ、エチジウムブロミド、マロリー染色、オルセイン、アルデヒドフクシン、四酸化オスミウム、三酸化クロミウム、クロム酸、フォイルゲン、重クロム酸、塩化水銀、ヘマトキシリン及びエオシン染色（Ｈ＆Ｅ）、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、アセトン、エタノール、メタノール、臭化メチルトリフェニルホスホニウム、臭化セチルテトラブチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、臭化テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＢ）、デオキシコレートナトリウム、Brij-35、Brij-58、NP-40、Triton X-100、Triton X-114、Tween-20、Tween-80、オクチルベータグルコシド、CHAPS、ソラニン、カノマイシン、ストレプトマイシン又はペニシリン、硝酸ナトリウム、亜硝酸ナトリウム、又は安息香酸ナトリウム、ｓｓ又はｄｓＲＮＡ又はＤＮＡ配列、ｓｓ又はｄｓＲＮＡ又はＤＮＡ標識配列、アプタマー、ペプチド、酵素、抗体、ビオチン、ビオチン標識分子、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アビジン、ストレプトアビジン、ＧＦＰ又はその変異体、ルシフェラーゼ、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、Alexa FluorTM、LNA、標識LNA、Molecular BeaconTM、 Scorpion probeTM、ＦＩＳＨプローブ、ｂＤＮＡ、ＰＣＲプライマー、オリゴ（ｄＴ）、ＰＮＡ、抗酸化剤、ＲＮａｓｉｎ、SUPERaseINTM、RNaseOUTTM、フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、ジイソプロピルフルオロホスフェート（ＤＦＰ）、アプロチニン又はPefabloc SCTM、Tris-HCl、PIPES、MES、HEPES、MOPS、MOPSO、CAPS、CAPSO、BIPES、リン酸、イミダゾール、BAPTA、EDTA、EGTA、クエン酸、Ｄ−ペニシルアミン、Ｏ2、ＣＯ2、Ｎ2、アルゴン、プロパノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、トリクロロ酢酸、スルホサリチル酸、水、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、テトラメチル尿素、イミダゾール、１−メチルイミダゾール、１−エチルイミダゾール、１−ベンジルイミダゾール、４−メチルイミダゾール、Ｎ−メチルピロリドン、Ｎ−エチルピロリドン、Ｎ−ベンジルピロリドン、グアニジン、グアニジンＨＣｌ、グアニジンイソチアシアネート、リビトール、ラムノース、トレハロース、Ｄ−ソルビトール、Ｌ−ソルビトール、ソルボース、キシリトール、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、マンノース、マンニトール、アラビノース、ガラクトース、ラフィノース、イノシトール、エリスリトール、キシロース、酢酸亜鉛、ＥＤＴＡ亜鉛、リン酸亜鉛、トリフルオロ酢酸亜鉛、クエン酸亜鉛、ＰＴＳＡ亜鉛、グルコン酸亜鉛、塩化亜鉛及び／又は硫酸亜鉛。ＤＥＳ混合物に溶解できない添加剤としては限定されないが、パラフィン、シリカゲル、硫酸ナトリウム、又はMolecular SievesTM、ポリアクリルアミド、エアロゲル、ポリアクリル酸及び／又はQuantum Dotが挙げられる。
【０１６８】
エタノール又は他のアルコール（例えばメタノール及びイソプロパノール）の塩化コリン：トリフルオロアセトアミド（１：２  モル：モル）への添加は、ＲＮＡ安定性に対して強い負の影響がある事を見出した（表２参照）。エタノールが特にＲＮＡ安定性に対してこの様な負の影響があるのか分からないが、トリフルオロアセトアミドと塩化コリンとの水素結合の変化が部分的な説明となるかもしれない。いずれにせよ、成分１（塩化コリン）と比べて０．１超のモル比でエタノールを使用することを回避することが好ましい。しかしながら、エタノール又は別のアルコールでのＤＥＳ混合物で処理された組織試料を処理又は保存することが望ましい場合、過剰ＤＥＳ混合物は、吸収性紙を用いて組織試料から除去でき、長期組織を静置する前に１００％エタノールで２回洗浄して、ＲＮＡ安定化の負の影響を止める。或いは、同じ方法を使用して第一ＤＥＳ混合物を第二ＤＥＳ混合物と置換できる。例えば、塩化コリン：トリフルオロアセトアミド（１：２  モル：モル）混合物は、塩化コリン：尿素（１：２  モル：モル）又はＲＮＡ安定化を伴う特定の用途に好ましい別のＤＥＳ混合物と置換できる。或いは、ＤＥＳ混合物から除去されると、生物学的試料は、モレキュラーシーブ、ドライエライト、乾燥糖（例えばトレハロース、キシリトール、またはソルビトール）、RNAstable（登録商標）(Biomatrica, USA)、又は保存用塩化カルシウムを含む密封容器中等の乾燥環境に置くことができる。別の代替法は、アルコール（例えばメタノール、エタノール、プロパノール、又はブタノール）、RNALater (Life Technologies, USA)、AllProtect (Qiagen, Germany)、PAXgene tissue、PAXgene Blood(PreAnalytix, Germany)、GenTegra RNA (Integenx, USA)、Cell-Free RNA BCT（登録商標） (Streck, USA)又はCellSave Preservative (Veridex, USA)等の液体保存媒体中に処理した生物学的試料を置くことである。別の代替法として、ＤＥＳ混合物で処理した試料は、１０倍体積の４％ホルムアルデヒド又はグルタルアルデヒド溶液等の架橋固定剤溶液に移し、１５分〜２４時間等の適切な時間インキュベートすることができる。架橋剤での試料の処理は、ＲＮＡ、ＤＮＡ及びタンパク質の品質に負の影響を与えるが、処理は、スライド調製の試料の硬さ及びホルマリン処理タンパク質エピトープに特異的な抗体を使用する免疫組織化学等の特定のアッセイの性能を改善してもよい。別の代替法は、１０倍体積の４％ホルムアルデヒド又はグルタルアルデヒド溶液で試料を前処理し、１５分〜２４時間等の適切な時間インキュベートし、試料を除去する前に、１０倍体積のＤＥＳ混合物（例えば塩化コリン：トリフルオロアセトアミド（１：２  モル：モル））に添加して１５分〜２４時間保持する事である。
【０１６９】
好ましくは、水の使用又は存在は、分析物の加水分解、特にＲＮＡ、ＤＮＡ及びタンパク質の加水分解のリスクを低減する為に回避される。ＤＥＳ混合物は、ＲＮＡ、ＤＮＡ又はタンパク質の安定化の為、好ましくは５０％以下、より好ましくは４０％以下、さらにより好ましくは３０％以下、さらにより好ましくは２０％以下、さらにより好ましくは１０％以下、さらにより好ましくは５％以下、最も好ましくは２％以下の水（重量％）を含む。細胞構造及び形態及び組織固定の為、ＤＥＳ混合物は、好ましくは５０％以下、より好ましくは４０％以下、さらに好ましくは３０％以下、さらにより好ましくは２０％以下、さらにより好ましくは１０％以下、最も好ましくは１０％〜５％（重量％）の水を含んでいてもよい。
【０１７０】
最適なＲＮＡ安定化として、塩化コリン：トリフルオロアセトアミド（１：２  モル：モル）混合物に対する乾燥剤の添加が好ましいことを見出した。適切な乾燥剤としては、シリカゲル、ポリアクリルアミド、硫酸ナトリウム、DrieriteTM及びモレキュラーシーブスが挙げられる。ＲＮＡ安定化の好ましい乾燥剤は、ＤＥＳ混合物、好ましくは塩化コリン：トリフルオロアセトアミド（１：２  モル：モル）混合物を用いて５〜５０％重量で使用されるモレキュラーシーブス４Ａ型（粉末又はペレット形態、例えば４〜１２メッシュ）である。更なる利点は、モレキュラーシーブスが塩化コリン：トリフルオロアセトアミド（１：２モル：モル）混合物で生じる結晶化を低減するところにある。
【０１７１】
作製できるＤＥＳ混合物には多くの種類があり、試料のＲＮＡを保存する目的で特定のＤＥＳの選択は、以下のＤＥＳの好ましい特徴の一つ以上により決定される：（１）ＲＮＡとの混合、試料と混合する場合好ましくはｐＨ４．５〜８．５、より好ましくはｐＨ５〜８、さらに好ましくはｐＨ５．５〜７．５、最も好ましくはｐＨ６〜７である。（２）ＲＮＡ精製試薬及びプロトコールとの適合性、例えばＲＮＡとシリカスピンカラム（例えばRNeasy (RNeasy Mini Kit, Cat. No. 74106, Qiagen, Germany)）との結合を阻害しない又はフェノール含有試薬（例えばTRIzol (Cat. No. 15596018 Life Technologies, USA)）中でＲＮＡの分配を変更しない。（３）リボヌクレアーゼの活性及び／又はＲＮＡの加水分解に対する可能性を実質的に改変するほど十分迅速に組織試料のＲＮＡを安定化する。或いは保存せずに同じ種類の組織試料から抽出されたＲＮＡと比較して室温でＤＥＳ混合物を用いて１８〜２４時間保存中に、ＲＮＡ完全性（ＲＩＮ）が好ましくは２ＲＩＮ単位より小さく、より好ましくは１ＲＩＮ単位以下、さらに好ましくは０．５ＲＩＮ単位以下、最も好ましくは０．１ＲＩＮ単位以下低減しないほど十分迅速に組織でＲＮＡを安定化する。（４）組織がＤＥＳ混合物の重量の少なくとも１０％、好ましくは２０％、より好ましくは少なくとも５０％を示す場合にＲＮＡを安定化する能力を有する。（５）新しい組織と比べて２０％以上ＲＮＡ収率を低減しない。（６）ＤＮＡ、タンパク質、及びホスホタンパク質のリン酸基の安定化を提供する。（７）化学的に安定であり、非燃焼性、使用者及び環境に毒性がなく、生物分解性であり、ＲＮＡ精製中に使用される漂白剤又は試薬と反応し毒性化合物を形成しない。（８）室温で少なくとも６ヶ月の保存期間を有する。（９）ＲＮＡ及び他の生体分子を安定化しつつ、抗体エピトープ及び細胞より小さい構成物、小器官等の細胞形態及び組織学を固定及び安定化する。（１０）抗体及び染色（例えばヘキスト又はＨ＆Ｅ染色）を用いた組織学及び免疫組織化学を可能にする方法で細胞を固定及び安定化する。（１１）５０℃以上の温度でホルマリン架橋を保護及び促進するためにＦＦＰＥ試料でＲＮＡを安定化し、溶融し、固定試料からパラフィンが容易に除去される。（１２）全血の循環性腫瘍細胞を固定及び安定化し、精製、検出及び分子分析を可能にする。
【０１７２】
試料中のＲＮＡの安定化は、ＤＥＳ処理、ＤＥＳ処理と別の物理的処理の組み合わせの結果であり、例えば、水分子の置換、又は溶解したＤＥＳの組織の細胞構造への浸透及びＲＮＡ安定化の結果としてリボヌクレアーゼの不活性化、タンパク質及び核酸の沈殿又はこれらの組み合わせの結果である。ＤＥＳによる細胞及びＲＮＡ周辺の水素結合の変化は本発明で述べる生体分子及び細胞安定化の重要な要因であるが、ＤＥＳ混合物が安定化する正確なメカニズムは、未だに知られていない。
【０１７３】
分析物を含む試料又は組織は、（ｉ）血液、血漿、血清、脳脊髄液（ＣＳＦ）、唾液、精液、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）、羊水、乳及び尿等の液体、（ｉｉ）体組織（例えば肝臓、脾臓、脳、筋肉、心臓、食道、精巣、卵巣、胸腺、腎臓、皮膚、腸、膵臓、副腎、肺、骨及び骨髄）等の固形物、（ｉｉｉ）医学的検査（例えば前立腺、乳房又は癌試料、腫瘍又は生検、例えばＦＦＰＥ試料、循環性腫瘍細胞、血液検査、臨床スワッブ、乾燥血液、エキソソーム、微小小胞）の臨床、（ｉｖ）生体医療研究又は基礎生物学に由来する動物組織（サル、ラット、マウス、ゼブラフィッシュ、アフリカツメガエル、ショウジョウバエ、線虫、酵母）及び様々な発生段階（卵、胚、幼生、成体）に由来する動物組織、（ｖ）薬物開発目的に使用される組織及び組織培養細胞、（ｖｉ）病原性及び非病原性微生物（例えば菌類、古細菌、グラム陽性細菌及びグラム陰性細菌、例えば大腸菌、スタフィロコッカス、ストレプトコッカス、マイコバクテリウム、シュードモナス及び赤痢、ジフテリア、破傷風、梅毒、クラミジア、レジオネラ、リステリア及びハンセン病を引き起こす細菌）、（ｖｉｉ）病原性及び非病原性ビロイド、バクテリオファージ又はウイルス（細菌、植物、血液、ヒト組織、動物血液、血清、血漿及び組織並びに臨床試料等の様々な生物学的試料に見られる）、（ｖｉｉｉ）植物（例えば米、トウモロコシ、モロコシ、ヤシ、ブドウ、トマト、小麦、大麦、タバコ、サトウキビ、シロイヌナズナの葉、花、花粉、種、茎及び根）、（ｉｘ）固定組織（例えば、高品質核酸を抽出するために特別なプロトコールをしばしば必要とするＦＦＰＥ組織及び生検）、（ｘ）バイオテロと関連する病原性物質（例えば発見場所から試験設備に輸送される必要があるかもしれないし、必要がないかもしれない炭疽菌）、（ｘｉ）極端に小さな試料（例えばレーザー捕捉微小切除試料（ＬＣＭ）に由来するもの）、（ｘｉｉ）食物媒介病を含んでいてもよい食物、（ｘｉｉｉ）土壌試料であってもよい。試料は、生物学的試料だけではなく、化学的又は酵素的合成物（例えば核酸ベース複製分子又は増幅産物、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡ及びＰＣＲ産物、オリゴデオキシリボヌクレオチド及びオリゴリボヌクレオチド、ＰＮＡ及びＬＮＡ）にも由来してもよい。本発明で使用できる試料の種類に制限はない。
【０１７４】
本発明はまた、ＲＮＡ、ＤＮＡ、及びタンパク質の内部対照（ＩＣ）及びAmplicorTM(Roche Molecular Diagnostics)等のＨＩＶ又はＨＣＶ診断キットに含まれるもの等の標準物の安定化、又はかかる診断キットに含まれ得る担体ＲＮＡに有用である。当該使用のために、ＲＮＡ  ＩＣは、室温または４℃で、他のキット成分と共に輸送及び保存されるが、分解する場合がある。ＲＮＡ  ＩＣ又は担体ＲＮＡ成分の安定化は、キット性能を改善し、輸送及び保存中の物質の完全性を維持する。
【０１７５】
本発明は、一本鎖及び／又は二本鎖ＲＮＡウイルス、例えば動物ＲＮＡウイルス、例えばノルウォーク、ロタウイルス、ポリオウイルス、エボラウイルス、マルブルグウイルス、ラッサウイルス、ハンタウイルス、狂犬病、インフルエンザ、黄熱ウイルス、コロナウイルス、ＳＡＲＳ、ウエストナイルウイルス、Ａ型肝炎、Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）、Ｅ型肝炎、デング熱ウイルス、トーガ（例えば風疹）、ラブド（例えば狂犬病及びＶＳＶ）、ピコルナ（ポリオ及びリノウイルス）、ミクソ（例えばインフルエンザ）、レトロ（例えばＨＩＶ、ＨＴＬＶ）、ブンヤ、コロナ及びヒトの健康に影響を及ぼすレオウイルス（例えばビロイド様ウイルス、例えばＤ型肝炎ウイルス、植物ＲＮＡウイルス、ビロイド、例えばトンブス−、ルテオ−、トバモ−、ポテックス−、トブラ−、コモ−、ネポ−、アルモ−、ククモ−、ブロモ−、アイラ−ウイルス、ココナッツカダン−カダンビロイド及び農業生産に影響があるジャガイモやせいもビロイドを保存するために使用することができるが、診断検出目的の抽出前後で、分解されやすい。本発明は、一本鎖ＲＮＡバクテリオファージ、例えばレニウイルス属（例えばエンテロバクテリアファージＭＳ２）及びアロレビウイルス属（例えばエンテロバクテリアファージＱβ）、又は二本鎖ＲＮＡバクテリオファージ（例えばシストウイルス（例えばシュードモナスファージΦ６）又は他の種類のファージ（例えば診断用途の内部ＲＮＡ対照として使用されるもの（例えばArmored RNA（登録商標）(Ambion)に使用されるもの）の安定化に使用することができる。本発明は、ＤＥＳと純粋な核酸を混合することにより、診断キットで使用される内部対照（ＩＣ）ＲＮＡ又はＤＮＡ配列の安定化に使用することができる。
【０１７６】
本発明は、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、及び他の天然の低分子ＲＮＡ、例えばｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、及びｒａｓｉＲＮＡの分析用試料を安定化することもできる。本発明はまた、ＲＮＡｉ型の合成ＲＮＡを含む研究、診断及び治療のために使用することができる。
【０１７７】
本発明は、グアニジン及び血液、血漿、血清、細胞及び／又は他の医学的に重要な試料（例えば細胞及び組織）の混合物において、ウイルスＲＮＡ（例えばレトロウイルス、例えばＨＩＶ、ロタウイルス、ＨＣＶ、及びウエストナイルウイルス）を保存するために有効に使用することができる。
【０１７８】
特定のＤＥＳ混合物である塩化コリン；トリフルオロアセトアミド（１：２モル：モル）は、強い抗菌作用を有し（実施例３４）、試料の作業や輸送を安定なものとする。他の用途には、ＲＮＡ、ＤＮＡ、及び／又はタンパク質の輸送及び実験室分析のための毒素、ウイルス、バクテリア、及び／又は菌類で故意に汚染されてもよい土壌及び／又は他の環境試料の安定化及び固定が含まれる。
【０１７９】
従って、本発明は、分解からＲＮＡを保護するため、ＲＮＡ安定性を高めるため、結果として分析感度及びアッセイ品質を改善するため、貯蔵、保存、アーカイブ及び輸送の改善方法に関する。
【０１８０】
様々なＤＥＳが、実施例１に示す通り、少なくとも１０：１（ｗｔ：ｗｔ）の比率で試料に添加されて本発明での最適性について試験することができる。相対ＲＮＡ安定化は、製造業者の指示(Cat. No. 76106, Qiagen, Germany)により使用されるRNAlater (10:1 (vol:wt))の対照溶液を使用して比較できる。３７℃で一日以上インキュベートして、ＲＮＡは標準プロトコール（例えばRNeasy (RNeasy Mini Kit, Cat. No. 74106, Qiagen, Germany)）により抽出され、ゲル電気泳動又はRNA 6000 Nano total RNA Kit (Cat. No. 5067-1511, Agilent Technologies, USA)及びBioanalyser 2100又は他の適切な方法（例えばＲＴ−ｑＰＣＴ）により完全性を分析する。ＲＮＡ収率は、OD260nm ｕｖ分光測定により決定でき、純度は、OD260/230及びOD260/280比により決定できる。Nanodrop ND2000 (ThermoScientific Inc., USA)は、かかる測定に適切な分光測定器の一例である。最適なＤＥＳ混合物が特定されると、最適量、純度、汚染水の量及び使用をさらなる試験により決定できる。
【０１８１】
一般的に、最適化に最も重要な単一要因は、ＤＥＳ混合物の個々の成分の相対モル比である。第一に、ＤＥＳ混合物のうち２成分の混合は、おおよそ最も単純な同定手段であり、上記の経験的な手段により、ＲＴ−ＰＣＲ又はハイブリダイゼーションなどの下流適用のために、ＲＮＡ安定化、収率、純度及び最適性等の所望の効果となる成分を混合する。しかし、２成分よりも多い混合が所望されてもよく、ＤＥＳ混合物に対する新規な特性を更に促進してもよく、付与されてもよい。ＤＥＳ混合物をもたらす多数の成分の混合物が明らかに存在し、一例において、ＤＥＳ混合物の単純な化学量論的モル比（例えば例示のみとして塩化コリン及び尿素２：１、１：１、１：２モル比（モル：モル））の調製で開始することが最も容易である。２成分ＤＥＳ混合物の氷点の低下は、少なくとも一部では利用可能な水素結合ドナー（例えば塩化コリン）とアクセプター（例えば尿素）との間の水素結合により示される。しかし、ＤＥＳ混合物の好ましい成分及びＲＮＡ保存又は細胞固定などの特定の用途のための最適混合比は観察される氷点低下に必ずしも関連しない。ある用途に最適なＤＥＳ混合物の同定は、経験的に決定する必要があり、試行錯誤を伴うかもしれない。２成分よりも多いＤＥＳ混合物の特定の目的のための最良の混合の同定には、かなりの努力を伴うかもしれない。従って、第一の例で、成分の適切なモル比を迅速に特定する目的で、化学量論的比率が上記の通りに使用されてもよい。およそのモル比が同定されると、一成分のモル量を固定して他の２つ以上を変化させつつ、さらに改善することができる。様々なＤＥＳ成分のモル濃度は変化し、個々の成分の密度、モル比、分子量に依存する。例示のみとして、塩化コリン：トリフルオロアセトアミド（１：２）混合物における３．６Ｍの塩化コリンと７．２Ｍのトリフルオロアセトアミドと比較して、塩化コリン：尿素（１：２）混合物の塩化コリン濃度は、およそ５Ｍであり、尿素濃度はおよそ１０Ｍである。
【０１８２】
タンパク質及びリンタンパク質の完全性は、Proteome Characterization and Proteomics (2003) Timothy D. Veenstra, Richard D. Smith編に記載される様に、準備又は分析２−Ｄ  ＰＡＧＥ、質量分析、適切な抗リン酸抗体及びＥＬＩＳＡにより決定することができる。
【０１８３】
粘度の高いＤＥＳ液体混合物から試料を回収する方法は、ワイヤ、ピン、ブラシ、棒、メッシュ、挿入物等の後つかみ部に試料を固定又は結合させる方法、効率のよいＤＥＳ安定化及び／又は固定を可能にする十分なＤＥＳを含む２つの透過膜又はポリマーパッド間に試料を挟む方法、又は処理中に試料を掴むことができる成形プラスチックホルダーを使用する方法を含む。好ましくは、ＤＥＳ混合物と組織試料の持ち越しがＲＮＡ溶解溶液（例えばRLT(RNeasy Mini Kit, Cat. No. 74106, Qiagen, Germany)）に容易に溶解する。
好ましくは持ち越しがＲＮＡ収率に影響を及ぼさないか又はＲＮＡ収率を高めて、溶液から試料は沈殿しない。ＲＮＡ試料の持ち込みがある場合、下流アプリケーションに影響を及ぼさず、そうでない場合にはＲＴ−ｑＰＣＲ等の感度の高い下流アプリケーションを促進する。ＲＮＡ収率及び品質の変化を測定する方法は、周知であり、分光光度方法、Agilent Bioanalyser 2100 quantification及び／又はRT-qPCRと共にRNA 6000 Nano total RNA Kit (Cat. No. 5067-1511, Agilent Technologies, USA) が挙げられる。
【０１８４】
ヌクレアーゼが非常に広範な要件で活性を有することは周知であり、例えばリボヌクレアーゼＡはｐＨ４〜１０、＋４〜６０℃などの種々の温度、０〜３Ｍのナトリウム濃度、４００ｍＭまでのグアニジンカオトロピック濃度で活性である強力なヌクレアーゼであり、数分間の煮沸で生存する為(Raines (1998) Chem. Rev. 98:1045-1065)、ＤＥＳ混合物を用いて本発明で示される結果は、特に驚くべきものである。かかる酵素を不活性化することが非常に困難であるにも関わらず、多くの異なるＤＥＳ混合物を用いた処理は、ヌクレアーゼ活性と共にＲＮＡ品質の改善に大きな影響を与える。一例として、ＤＥＳ成分がヌクレアーゼ、特にリボヌクレアーゼなどの酵素と水素結合を形成し、酵素周辺の水分子が置換され、変性及び不活性化され、ＲＮＡがリボソームなどの変性ＤＥＳ処理リボヌクレオタンパク質複合体内で保護されることが挙げられる。
【０１８５】
生体分子保存用ＤＥＳの有効性試験は、多数の方法で行うことができることは当業者に明らかである。第一に、公知量のＤＥＳは、予め秤量した所定量の組織、例えば２０ｍｇの凍結解凍ラット肝臓に添加し、様々な時間、例えば５時間、１０時間、２０時間、４０時間及び６０時間３７℃でインキュベートし、インキュベーション後に組織を回収し、ＲＮＡ又は他の生体分子を精製により回収し、完全性を分析することができる。ＲＮＡの質は、例えばRT-qPCR又はBioanalyser 2100 (Agilent, USA) RIN analysisにより決定することができる。
【０１８６】
好ましくは、ＤＥＳ混合物は、安定性が雰囲気温度で少なくとも６ヶ月以上の保存で有意に変化しないという調製後の適切な保存期間を有する。
【０１８７】
ＤＥＳ混合物と組織試料の撹拌、混合及び温度は、最適なＲＮＡ安定化にとって重要な要因である。組織試料とＤＥＳ混合物の穏やかな撹拌は、試料の安定性の割合を高めるのに役立つ。混合又は撹拌の手段としては、Thermomixer (Eppendorf, Germany)の混合機能、LabRoller (LabNet, USA)等の回転ホイール又はプラットフォームの使用が挙げられる。ＤＥＳ混合物を使用して観察されるＲＮＡ分解量は制限されるが、不可避の分解は、試料を動物の正常な環境から除去する時からＤＥＳ混合物がリボヌクレアーゼ活性の低減又は完全な阻害を開始できる時までの時間差で生じる。本発明に関し、重要な工程は、試料へのＤＥＳ混合物の添加とリボヌクレアーゼ不活性化との間での時間差であり、リボヌクレアーゼは４〜１６℃より２５〜３７℃の温度で活性である。ＤＥＳ及び溶液の予備冷却及びＤＥＳ処理工程中の低い温度の維持が好ましいが、ラット膵臓などの高いレベルのリボヌクレアーゼを含む組織と比較して、ラット肝臓などのリボヌクレアーゼの平均的レベルを有する組織には必須ではない。ＲＮＡの質は、低い温度、例えば４℃のＤＥＳ混合物、容器及び環境を使用して高いリボヌクレアーゼ活性を有する組織で改善されてもよい。
【０１８８】
生物学的試料のＲＮＡの保存のためのＤＥＳ混合物の適切な選択は、多数の物理学的及び化学的特性に依存する。理想的には、ＤＥＳ混合物は、（１）生体分子（例えば生物学的試料中のＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、翻訳後修飾タンパク質（例えばホスホタンパク質）、炭水化物、脂質、代謝物）の迅速及び効率的な安定化、（２）好ましくは２０：１（重量：重量）比、より好ましくは１５：１、さらに好ましくは１０：１、さらにより好ましくは８：１、さらにより好ましくは６：１、さらにより好ましくは４：１、さらにより好ましくは３：１、さらにより好ましくは２：１、最も好ましくは１：１で生物学的試料に添加する場合、ＲＮＡ等の生体分子を最適に安定化する機能、（３）好ましくは１２０℃以下、より好ましくは１００℃以下、さらに好ましくは８０℃以下、さらにより好ましくは６０℃以下、最も好ましくは室温で液体、（４）作業及び固体試料からの除去が特段困難である程粘度が高くなく、２５℃で好ましくは１０００００ｃＰ未満、より好ましくは７５０００ｃＰ以下、さらに好ましくは５００００ｃＰ以下、さらにより好ましくは２５０００ｃＰ以下、さらにより好ましくは１００００ｃＰ以下、さらにより好ましくは５０００ｃＰ以下、さらにより好ましくは２５００ｃＰ以下、さらにより好ましくは１０００ｃＰ以下、さらにより好ましくは７５０ｃＰ以下、さらにより好ましくは５００ｃＰ以下、さらにより好ましくは２５０ｃＰ以下、さらにより好ましくは１００ｃＰ以下、さらにより好ましくは７５ｃＰ以下、さらにより好ましくは５０ｃＰ以下、さらにより好ましくは２５ｃＰ以下、さらにより好ましくは１０ｃＰ以下、最も好ましくは５ｃＰ以下の粘度、（５）ＲＮＡ及びＲＮＡ精製試薬との混合、例えばグアニジンＨＣｌ、グアニジンチオシアネート、Lysis buffer RLT (RNeasy Mini Kit, Cat. No. 74106, Qiagen, Germany)、シリカスピンカラム、磁性シリカビーズ（例えばMagNA Pure（登録商標）(Roche Applied Science, UK)）、TRIzol（登録商標）(Life Technologies, USA)、（６）シリカカラム（例えばRNeasy (Qiagen, Germany)）に結合するＲＮＡが２０％以上低減しない事及び標準精製と比較してOD260/280nm分光測定比が０．２以上減少しない事、（７）ＲＮＡ精製試薬と組み合わせてもユーザーに毒性がなく非可燃性である事、（８）生物分解性、及び（９）非揮発性を可能にするべきである。
【０１８９】
ＦＦＰＥ試料からのＲＮＡ抽出のためのＤＥＳの使用の一例として、ホルマリン固定が、ＲＮＡとタンパク質の多数の架橋をもたらすが、ＲＮＡ抽出が問題となりＲＮＡの質が下がることは周知である。ＦＦＰＥ試料のＲＮＡから架橋を除去する標準プロトコールは、８０℃で１５〜６０分加熱する事であるが、これはＲＮＡ分解を生じる(RNeasy FFPE Kit, Cat. No. 73504, Qiagen, Germany)。ＲＮＡは、架橋の除去に必要な試薬とＤＥＳを組み合わせて、必須の加熱工程で保護することができ、良好な質のＲＮＡ試料がもたらされる。適切なＤＥＳの一例として、塩化コリン：トリフルオロアセトアミド（１：２）を用いて、ＦＦＰＥ試料を８０℃で処理し、パラフィンを除去し、ＲＮＡから架橋を除去してもよい。
【０１９０】
医療分野でＤＥＳを使用する別の例は、循環性腫瘍細胞（ＣＴＣ）を安定化するため、全血の処理である。腫瘍に由来し、血流に入るこれらの細胞は、診断、予後及び治療目的のため、化学治療薬物の多くの臨床の終了点として徐々に使用されている。しかしながら、全血のこれら細胞の安定化は問題があり、患者血液の輸送はＣＴＣの正しい同定及び／又は分子診断分析の実施における損失又は困難性をもたらす場合がある。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで全血のＣＴＣを安定化するＤＥＳを用い、現在のＣＴＣ保存技術に対して多くの欠点が克服される。例示のみとして、全血のＣＴＣは、細胞を固定し、ＲＮＡを保存するため、少なくとも６倍容量の塩化コリン：トリフルオロアセトアミド（１：２モル：モル）で処理されてもよい。ＣＴＣは、多数の異なる方法のいずれか（例えばCellSieveTM (MD, USA)）を用いて次に回収及び精製することができる。
【０１９１】
例示としてのみ、以下の実施例及び図面を参照して本発明を更に詳細に説明する。
【実施例】
【０１９２】
１．動物組織試料におけるＲＮＡの安定化
標準１．５ｍｌポリプロピレン微小遠心管中の４００μｌの塩化コリン：尿素（１：２モル：モル）に、２〜２５ｍｇのラット肝臓試料を加え、室温で２０分間プレインキュベートして、安定化および／または固定化させ、次いで、鉗子での組織試料の回収と、その後の以下に記載するＲＮＡ精製の前に、試料をＤＥＳ混合物中で−８０℃、−２０℃、４℃、２０℃または３７℃、４２℃または５５℃で１時間から数週間にわたってインキュベートすることができる。
【０１９３】
いくつかの高濃度組織、空気で満たされた組織および／または問題がある組織についての固定化速度を、固定化中に、Ｎａｌｇｅｎｅ手持ち式真空ポンプ（カタログ番号６１３２−００２０、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＫ）などの真空系を用いて、改善することができる。
【０１９４】
次いで、試料を、３５０μＬの溶解緩衝液ＲＬＴ、製造業者の説明書に従ってホモジナイズされた組織（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ、カタログ番号７４１０６、Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）を含有する新しい管に加える。次いで、製造業者の説明書に従い、３００μｌの溶解物を直ちに精製し、２０〜５０μｌの水に溶出させた。次いで、ＯＤ  ２６０／２８０ｎｍによってＲＮＡの収率および純度を比較し、オリゴｄＴ  ｃＤＮＡプライミングおよびβ−アクチンＰＣＲプライマー（ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ、カタログ番号２０４１４１、Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）およびＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、フランス）を用いたＲＴ−ｑＰＣＲによって、またはＲＮＡ  ６０００  Ｎａｎｏ全ＲＮＡキット（カタログ番号５０６７−１５１１、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）およびＢｉｏａｎａｌｙｓｅｒ  ２１００機器（カタログ番号Ｇ２９３９ＡＡ、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）を用いてＲＮＡ完全性値（ＲＩＮ）を得ることによって、ＲＮＡの完全性を決定した。
【０１９５】
他の種類の市販のＲＮＡ精製キットは、該ＲＮｅａｓｙキットに取って代わることができ、用いられるキットの種類に特に制限はない。
【０１９６】
肝臓試料を、肝臓、脾臓、脳、筋肉、心臓、食道、精巣、卵巣、胸腺、腎臓、皮膚、腸、膵臓、副腎、肺、骨髄などの他の種類の組織および細胞、またはＣＯＳ−７、ＮＩＨ／３Ｔ３、ＨｅＬａ、２９３、およびＣＨＯ細胞などの細胞、または血清、血漿または血液などの液体試料と置き換えることができる。
【０１９７】
図２：ＲＮｅａｓｙキットを用いて１５ｍｇのラット肝臓から抽出した３００ｎｇのＲＮＡ試料：レーン１〜５  塩化コリン：尿素（１：２  モル：モル）またはレーン６〜１０  ＲＮＡｌａｔｅｒ（カタログ番号７６１０６、Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）、５分間（レーン１＋６）、１日間（レーン２＋７）、３日間（レーン３＋８）、７日間（レーン４＋９）または２１日間（レーン５＋１０）保存後の１％アガロース−ＥｔＢｒゲル電気泳動画像。３７℃での保存の後、７日後の比較によって、ＲＮＡｌａｔｅｒと比較して塩化コリン：尿素安定化試料でのＲＮＡ安定性が改善されており、塩化コリン：尿素試料のＲＮＡ完全性値はＲＩＮ＝８であるが、他方、ＲＮＡｌａｔｅｒ安定化試料のＲＮＡ完全性値はＲＩＮ＝５．１０であった。
【０１９８】
２．他の塩化コリンベースのＤＥＳ混合物を用いた動物組織試料中でのＲＮＡ安定化
標準１．５ｍｌポリプロピレン微小遠心管中の４００μｌの塩化コリン：トリフルオロアセトアミド（１：２  モル：モル）または塩化コリン：ソルビトール（１：１  モル：モル）に、２〜２５ｍｇのラット肝臓試料を加え、室温で２０分間プレインキュベートして、安定化および／または固定化させ、次いで、鉗子での組織試料の回収と、その後の以下の実施例に記載するＲＮＡ精製の前に、試料を−８０℃、−２０℃、４℃、２０℃または３７℃、４２℃または５５℃で１時間から数週間にわたってインキュベートすることができる。
【０１９９】
次いで、試料を、３５０μｌの溶解緩衝液ＲＬＴ、製造業者の説明書に従ってホモジナイズされた組織（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ、カタログ番号７４１０６、Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）を含有する新しい管に加える。次いで、溶解物の３００μｌの部分を製造業者の説明書に従って直ちに精製し、２０〜５０μｌの水に溶出させた。ＲＮＡの収率および品質を実施例１および表１に記載したように決定したところ、両方のＤＥＳ混合物について、ＲＮＡ完全性はＲＮＡｌａｔｅｒと比べて優れていた。
【０２００】
塩化コリンの適切な供給源は、カタログ番号１１０２９５０００、Ａｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ、フランスであり、ソルビトールはカタログ番号Ｓ００６５、ＴＣＩ、ベルギーであり、トリフルオロアセトアミドはカタログ番号Ｔ０５９８、ＴＣＩ、ベルギーである。
【０２０１】
３．他のＤＥＳ混合物を用いた動物組織試料におけるＲＮＡ安定化
２ｍｌのポリプロピレン管中の４００μｌの以下のＤＥＳ混合物に、５〜１５ｍｇのラット組織（凍結させた組織ストック）を加え、２０分間の固定化工程後に、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｃｒｏキット（カタログ番号７４００４、Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）を用いたＲＮＡ抽出／精製前に、試料を３７℃で１８時間インキュベートした。ＤＥＳ混合物が室温において固体であるか液体であるかに拘わらず、抽出後のＲＮＡ収率および１〜１０の尺度でのＲＮＡの品質（ラット肝臓組織試料から直ちに抽出したＲＮＡのＲＮＡ品質＝１０と比較して、０は安定化なしを示し、１０は分解なしを示す）。結果を以下の表１に示す（ｎｄ＝決定せず、「飽和」溶液はＤＥＳでない）。
【０２０２】
表１  二成分ＤＥＳ混合物を用いた動物組織におけるＲＮＡ安定化
【０２０３】
【表１】
2018113982.tif 000019
【０２０４】
2018113982.tif 000020
【０２０５】
2018113982.tif 000021
【０２０６】
2018113982.tif 000022
【０２０７】
2018113982.tif 000023
【０２０８】
定性的なＲＮＡの品質基準は以下の通りである；０（高度に分解）から１０（最高の品質）。表１および２のＲＮＡ分析を以下のように行った；臭化エチジウム染色、１％アガロース０．５×ＴＡＥゲル電気泳動、１８Ｓおよび２８Ｓ  ｒＲＮＡバンドの完全性の、紫外光下で撮影された写真の視覚分析。８以上のＲＮＡ品質スコアを持つＲＮＡ試料は、１８Ｓ対２８Ｓ  ｒＲＮＡ臭化エチジウム染色比が１：２であり、他方、ＲＮＡ品質スコアが５であるＲＮＡ試料は、１８Ｓ対２８Ｓ  ｒＲＮＡ染色比がほぼ１：１である。
【０２０９】
表２  二成分ＤＥＳ混合物＋添加物
【０２１０】
【表２】
2018113982.tif 000024
【０２１１】
2018113982.tif 000025
【０２１２】
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【０２１３】
2018113982.tif 000027
【０２１４】
定性的なＲＮＡの品質基準は以下の通りである；０（高度に分解）から１０（最高の品質）。表１および２中のＲＮＡ分析を以下のように行った；臭化エチジウム染色、１％アガロース０．５×ＴＡＥゲル電気泳動、１８Ｓおよび２８Ｓ  ｒＲＮＡバンドの完全性の、紫外光下で撮影された写真の視覚分析。８以上のＲＮＡ品質スコアを持つＲＮＡ試料は、１８Ｓ対２８Ｓ  ｒＲＮＡ臭化エチジウム染色比が１：２であり、他方、ＲＮＡ品質スコアが５であるＲＮＡ試料は、１８Ｓ対２８Ｓ  ｒＲＮＡ染色比がほぼ１：１である。
【０２１５】
４．ＤＥＳと支持マトリックスとの混合組成物
組織またはバイオプシーなどの保存試料のＤＥＳ液体混合物の物理的分離を改善するために、ＤＥＳを種々の支持マトリックスと混合した。マトリックス材料は特に限定されるものではないが、ＤＥＳと混合した場合であっても構造的強度を保持すべきであり、従って、溶解または反応すべきでない。好ましくは、支持マトリックスを、プリンターまたはインクペンによって、例えば、バーコードまたは保存寿命の期日について直接標識することができる。
【０２１６】
３．２ｇのＰＥＧ（ＭＷ８０００）、アガロース、ポリアクリレートまたは３ＭＭセルロース繊維（Ｗｈａｔｍａｎｎ、ＵＫ）に１０ｍｌの塩化コリン：トリフルオロアセトアミド（１：１モル：モル）を加え、撹拌しながら１００℃で３０分間加熱して、混合物をホモジナイズし、次いで、これを適切な容器中に注いで、冷却させた。
【０２１７】
当該複合混合物は、液状ＤＥＳ混合物よりも取扱いが容易であり、ＤＥＳの持越しを抽出工程、例えばＲＮＡ精製まで低減させる利点を有する。該複合物を９６、２４または６ウェルプレート、１．５ｍｌの微小遠心管、５、１５または５０ｍｌの管などの任意の数の容器中に注ぎ、成形、形状化、切断、層化、または形成を行ってもよい。
【０２１８】
５．様々な温度における全組織のＲＮＡの安定化
標準２ｍｌポリプロピレン微小遠心管中の４００μｌの塩化コリン：尿素（１：２  モル：モル）またはＲＮＡｌａｔｅｒのいずれかに、１０ｍｇのラット肝臓試料を加え、室温で２０分間プレインキュベートして、安定化および／または固定化させ、次いで、組織試料の回収および以下の実施例に記載するＲＮＡ精製前に、試料をＤＥＳ混合物中で−２０℃、４℃、３７℃、５０℃または６５℃で１８時間インキュベートした。
【０２１９】
次いで、試料を、３５０μｌの溶解緩衝液ＲＬＴ、および製造業者の説明書に従ってグアニジンでホモジナイズされた組織（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ、カタログ番号７４１０６、Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）から抽出したＲＮＡを含有する新たな管に加えた。次いで、３００μｌのグアニジン溶解物を用いて、製造業者の説明書に従ってＲＮＡを直ちに精製し、２０〜５０μｌの水中に溶出させた。ＲＮＡの収率および品質を実施例１に記載したように決定したところ、ＤＥＳ安定化混合物について、ＲＮＡ完全性は、ＲＮＡｌａｔｅｒと比べて、３７℃よりも高い全ての温度において優れており、−２０℃および４℃で等しかった。結果を図３に示す。レーン１、３、５、７、９塩化コリン：尿素（１：２）、レーン２、４、６、８、１０ＲＮＡｌａｔｅｒ。
【０２２０】
塩化コリン：尿素は、塩化コリン：トリフルオロアセトアミド（１：２  モル：モル）などの他のＤＥＳ混合物と置き換えることができることが、当業者には明らかである。
【０２２１】
６．２４℃における全組織のＲＮＡの長期間安定化
標準２ｍｌポリプロピレン微小遠心管中の４００μｌの塩化コリン：尿素（１：２  モル：モル）またはＲＮＡｌａｔｅｒのいずれかに１０ｍｇのラット肝臓試料を加え、室温で２０分間プレインキュベートして、安定化および／または固定化させ、次いで、組織試料の回収および以下の実施例に記載するＲＮＡ精製前に、２４℃で０〜１９日の間、塩化コリン：尿素（１：２モル：モル）中で試料をインキュベートした。
【０２２２】
試料を、３５０μｌの溶解緩衝液ＲＬＴ、および製造業者の説明書に従ってグアニジンでホモジナイズされた組織（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ、カタログ番号７４１０６、Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）から抽出したＲＮＡを含有する新たな管に加えた。次いで、３００μｌのグアニジン溶解物を用いて、製造業者の説明書に従ってＲＮＡを直ちに精製し、２０μｌの水中に溶出させた。ＲＮＡの収率および品質を、実施例１に記載したように決定したところ、ＤＥＳ安定化混合物について、ＲＮＡ完全性は全ての時点においてＲＮＡｌａｔｅｒと同等であるか、またはそれよりも優れていた。結果を図４に示す。レーン１、３、５塩化コリン：尿素（１：２）、レーン２、４、６ＲＮＡｌａｔｅｒ処理試料。
【０２２３】
７．異なる組織の精製
標準２ｍｌポリプロピレン微小遠心管中の４００μｌの塩化コリン：尿素（１：２  モル：モル）またはＲＮＡｌａｔｅｒのいずれかに、凍結させた１０ｍｇのマウス脳（レーン３および４）または腎臓試料（レーン１、２、５、６）を加え、室温で２０分間プレインキュベートして、安定化および／または固定化させ、次いで、組織試料の回収および以下に記載するＲＮＡ精製前に、塩化コリン：尿素（１：２  モル：モル）中で３７℃で１〜７日間、試料をインキュベートした（図５Ａ  レーン１、３、５；塩化コリン：尿素（１：２）での安定化、レーン２、４、６；２４時間（レーン１〜４）または７日間（レーン５および６）のいずれかにわたるＲＮＡｌａｔｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ、フランス）での安定化）。
【０２２４】
別法として、先に凍結させた１０ｍｇのマウス組織を４００μｌの塩化コリン：トリフルオロアセトアミドに加え、ＲＮＡ精製前に３７℃で１８時間インキュベートした（図５Ｂ  レーン１、３、５、７、９、１１、１３、１５；塩化コリン：トリフルオロアセトアミド（１：２）での安定化、レーン２、４、６、８、９、１０、１２、１４、１６；ＲＮＡｌａｔｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）での安定化）。
【０２２５】
試料を、３５０μｌの溶解緩衝液ＲＬＴ、および製造業者の説明書に従ってグアニジンでホモジナイズされた組織（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ、カタログ番号７４１０６、Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）から抽出したＲＮＡを含有する新たな管に加えた。次いで、３００μｌのグアニジン溶解物を用いて、製造業者の説明書に従ってＲＮＡを直ちに精製し、２０μｌの水中に溶出させた。ＲＮＡの収率および品質を実施例１に記載したように決定したところ、ＤＥＳ安定化混合物について、ＲＮＡ完全性はＲＮＡｌａｔｅｒと同等であるか、またはそれよりも優れていた。
【０２２６】
８．異なる量の組織の精製
標準２ｍｌポリプロピレン微小遠心管中の４００μｌの塩化コリン：尿素（１：２  モル：モル）またはＲＮＡｌａｔｅｒのいずれかに、１５ｍｇ（レーン１および２）または２５ｍｇのラット肝臓（レーン３および４）のいずれかを加え、室温で２０分間プレインキュベートして安定化および／または固定化させ、次いで、組織試料の回収および以下に記載するＲＮＡ精製前に、塩化コリン：尿素中で３７℃で１８時間、試料をインキュベートした。
【０２２７】
試料を、３５０μｌの溶解緩衝液ＲＬＴおよび製造業者の説明書に従ってグアニジンでホモジナイズされた組織（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ、カタログ番号７４１０６、Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）から抽出したＲＮＡを含有する新たな管に加えた。次いで、３００μｌのグアニジン溶解物を用いて、製造業者の説明書に従ってＲＮＡを直ちに精製し、２０μｌの水中に溶出させた。
【０２２８】
ＲＮＡの収率および品質を実施例１に記載したように決定したところ、ＤＥＳ安定化混合物について、ＲＮＡ完全性は全ての時点においてＲＮＡｌａｔｅｒと同等であるか、またはそれよりも優れていた。結果を図６に示す。レーン１および３、塩化コリン：尿素（１：２）、レーン２および４、ＲＮＡｌａｔｅｒ処理試料。
【０２２９】
塩化コリン：トリフルオロアセトアミド（１：２  モル：モル）を含有するＤＥＳ混合物は、塩化コリン：尿素（１：２  モル：モル）よりも、新鮮な組織中のＲＮＡを安定化させる際に有意により効果的であることが判明した。しかしながら、組織を−２０℃または−８０℃でまず凍結した場合、塩化コリン：尿素は塩化コリン：トリフルオロアセトアミドと同等の効果を有する。塩化コリン：尿素が新鮮な組織においてＲＮＡを安定化させる際にあまり効果的でない理由はわかっていないが、３３ｍＭのＺｎＣｌ２またはＺｎＳＯ４の塩化コリン：尿素（２：１  モル：モル）への添加は、新鮮な組織を用いた場合に起こるＲＮＡ分解の量を有意に低下させることが判明した。
【０２３０】
通常、塩化コリン：トリフルオロアセトアミド（１：２  モル：モル）などのＤＥＳで少なくとも１時間処理し、次いで−８０℃で凍結させた肝臓、腎臓および筋肉などの組織は、非処理組織よりも有意に柔軟であり、バイオプシーの針の侵入を可能にする。これは、試料を完全に解凍すべきではなく、一部のみをさらなる分析のために取り出すべき場合に特に有用である。塩化コリン：トリフルオロアセトアミドで処理された組織の色、注目すべきことには血液の色は、有意に変化または退色しないが、処理していないまたはホルマリン処理した試料は、凍結をするしないに関係なくその色強度を迅速に失う。かかる色の保持は、バイオプシー検体およびバイオプシー検体における細胞型を正しく分析するための重要な利点であり得る。
【０２３１】
９．ＨｅＬａ細胞を添加したＤＥＳ安定化全血のＲＮＡの精製
４００μｌの塩化コリン：トリフルオロアセトアミド（１：２  モル：モル）に、５０μｌの１５０，０００個のＨｅＬａ細胞を添加した５０μｌのヒト全血を加え、丁寧なピペッティングによって混合し、ＲＮＡ抽出前に、試料を放置して室温で２０分間安定化させた。５０μｌ（レーン１）または１００μｌ（レーン２）のいずれかの安定化ＤＥＳ−血液／細胞混合物を３００μｌの溶解緩衝液ＲＬＴ（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ、カタログ番号７４１０６、Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）と混合して細胞を溶解し、ＲＮＡを抽出し、精製を以下のように行った。
【０２３２】
グアニジン血液溶解物を１４，０００ｇで６０秒間遠心し、上清を３００μｌの７０％エタノールを含有する新たな管に移し、ピペッティングによって混合し、次いで、ＭｉｎＥｌｕｔｅスピンカラム（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ、カタログ番号７４００４、Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）に移した。製造業者の説明書に従って、ＭｉｎＥｌｕｔｅカラムを７００μｌの緩衝液ＲＷ１で１回、次いで、５００μｌの緩衝液ＲＰＥで２回洗浄し、６０秒間遠心して、２０μｌの水での溶出前にカラムを乾燥させた。Ｎａｎｏｄｒｏｐ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）を用いてＯＤ２６０ｎｍ吸光度によってＲＮＡ収率を決定し、１％アガロース、０．５×ＴＡＥゲルに負荷し、分析した。
【０２３３】
表３  ＨｅＬａ細胞を添加した血液試料に由来するＲＮＡの収率
【０２３４】
【表３】
2018113982.tif 000028
【０２３５】
結果を図７に示す。グアニジン血液溶解物の通過後のシリカＭｉｎＥｌｕｔｅスピンカラムは、ヘムで視覚的に汚染されていなかった。従って、塩化コリン：トリフルオロアセトアミド−グアニジン混合物は、非特異的な汚染からシリカ膜を保護する。
【０２３６】
１０．塩化コリン：トリフルオロアセトアミドを用いたＨｅＬａ細胞を添加した全血におけるＲＮＡの安定化
１０００μｌの塩化コリン：トリフルオロアセトアミド（１：２  モル：モル）に、５０μｌの１，０００，０００個のＨｅＬａ細胞を添加した２００μｌのヒト全血を加え、丁寧なピペッティングによって混合し、ＲＮＡ抽出前に、試料を室温で１８時間インキュベートした。１００μｌ（図８；レーン１）、１５０μｌ（レーン２）、２００μｌ（レーン３）または２５０μｌ（レーン４）のいずれかの安定化ＤＥＳ−血液／細胞混合物を２５０μｌの溶解緩衝液ＲＬＴ（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ、カタログ番号７４１０６、Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）と混合して、細胞を溶解し、ＲＮＡを抽出し、精製を以下のように行った。
【０２３７】
グアニジン血液溶解物を１４，０００ｇで６０秒間遠心し、上清を３００μｌの７０％エタノールを含有する新たな管に移し、ピペッティングによって混合し、次いで、ＭｉｎＥｌｕｔｅスピンカラム（ＲＮｅａｓｙ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ、カタログ番号７４２０４、Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）に移した。製造業者の説明書に従って、ＭｉｎＥｌｕｔｅカラムを７００μｌの緩衝液ＲＷ１で１回、次いで、５００μｌの緩衝液ＲＰＥで２回洗浄し、６０秒間遠心して、２０μｌの水での溶出前にカラムを乾燥させた。Ｎａｎｏｄｒｏｐ（Ａｇｉｌｅｎｔ、ＵＳＡ）を用いてＲＮＡ収率を決定し、１％アガロース、０．５×ＴＡＥゲルに負荷し、分析した。ＯＤ２６０／２８０ｎｍデータは、ＲＮＡが汚染タンパク質を実質的に含まないことを実証し、他方、ＲＮＡ収率は、ＭｉｎＥｌｕｔｅカラムがＲＮＡで飽和しており、ＭｉｎＥｌｕｔｅカラム（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ、カタログ番号７４１０６、Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）がさらに良好な収率を提供することを示唆する。
【０２３８】
表４  １８時間の血液試料の保存後のＲＮＡの収率および品質
【０２３９】
【表４】
2018113982.tif 000029
【０２４０】
全血の一晩のＲＮＡの安定化もまた以下のように実証された。５０，０００個のＨｅＬａ細胞を５０μｌの新鮮なヒト全血と混合し、次いで、細胞および血液を、４００μｌの緩衝液ＲＬＴ（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）または４００μｌの塩化コリン：トリフルオロアセトアミド（１：２  モル：モル）のいずれかに加え、２４℃で一晩インキュベートし、次いで、製造業者の説明書（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ、Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）に従って、ＲＮＡを精製した。ＲＮＡは、全血において塩化コリン：トリフルオロアセトアミド（１：２  モル：モル）による分解から有意に保護されたが、緩衝液ＲＬＴ中で一晩保存した場合には分解した。白血球細胞または循環性腫瘍細胞などの細胞形態、エキソソームまたは他の微小小胞などの細胞レベル下の形態、またはウイルス粒子のいずれかでの全血中のＲＮＡの保存を、好ましくは１：８、より好ましくは１：１０で全血を塩化コリン：トリフルオロアセトアミド（１：２  モル：モル）に加えることによって行うことができる。別法として、２０％ｗｔ：ｗｔモレキュラーシーブ４Ａを含む、または含まない１０ｍＭ  ＺｎＣｌ２またはＺｎＳＯ４を塩化コリン：トリフルオロアセトアミドに加えて、ＲＮＡの安定性をさらに改善することができる。
【０２４１】
図９は、グアニジンまたは塩化コリン：トリフルオロアセトアミド（１：２  モル：モル）のいずれかでの全血中のＲＮＡの安定化を示す。緩衝液ＲＬＴ（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）（レーン１）または４００μｌの塩化コリン：トリフルオロアセトアミド（１：２  モル：モル）（レーン２）のいずれかにおける２４℃での一晩の試料の保存において、全ＲＮＡはグアニジン中で有意に分解するが、塩化コリン：トリフルオロアセトアミド中では有意に分解しない。
【０２４２】
１１．真空血液吸引管を用いた全血の安定化
１０ｍｌのポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）採血管に、７ｍｌの滅菌塩化コリン：トリフルオロアセトアミド（１：２  モル：モル）を加え、該管をＨｅｍｏｇａｒｄＴＭ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ＵＳＡ）または他の適切な閉塞具で閉じ、空気を部分的に除去して、真空を作り出した。別法として、採血管は、７ｍｌの塩化コリン：トリフルオロアセトアミド（１：２  モル：モル）に加えて、ＺｎＳＯ４を含有して、１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、３３ｍＭ、１００ｍＭまたは２００ｍＭのいずれかの希釈された血液試料中の最終濃度とした。血液吸引管デバイスの例としては、図１Ｃ参照。採血セット（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉｘ、ドイツ）を用いて、または標準的なルアーロックシリンジおよび針を充填することによって、ほぼ２ｍｌの全静脈血を管に吸引し、内容物の２ｍｌを採血管に移した。血液の添加後に、管を１０回倒立させて成分を混合し、次いで、室温で２０分間インキュベートして、Ｔリンパ球およびＢリンパ球、単球、マクロファージ（例えば、ＰＢＭＣ）、好中球、好塩基球および好酸球（多形核球）、血小板、ＨＰＶ、ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶ、インフルエンザおよびＳＡＲＳに関与するコロナウイルスを含む本明細書に記載したようなあらゆる細菌またはウイルスなどの白血球細胞中のＲＮＡを安定化させた。一般に、赤血球は、この混合物中で完全なままではない。ＣＴＣのより良好な捕捉、分析および保存を可能にするこの方法を用いて、循環性腫瘍細胞などの他の細胞を安定化させ、固定化することもできる。
【０２４３】
例えば、３７℃で２４時間、室温で３日間、４℃で１週間、または−２０℃で３カ月までの採血管での保存後に、ＲＮＡを、以下のように、塩化コリン：トリフルオロアセトアミド安定化血液から抽出することができる：キット製造業者の説明書に従って、採血管を開け、１ｍｌの安定化試料を取り出し、３ｍｌの溶解緩衝液ＲＬＴと混合し、１４，０００ｇで６０秒間遠心し、上清を除去し、ＲＮｅａｓｙ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ、カタログ番号７４１０６、Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）またはＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｄｉスピンカラム（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ、カタログ番号７５１４２、Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）のいずれかへの負荷前に、同量の７０％エタノールに加え、次いで、スピンカラムを緩衝液ＲＷＩおよびＲＰＥで洗浄し、ＲＮＡを溶出させた。
【０２４４】
１２．ＤＥＳ混合物の細胞固定化特性の測定
１２ウェル組織培養プレートの各ウェルに、１ｍｌのＤＭＥＭ／５％ＦＢＳ中の２０，０００個のトリプシン処理したＨｅＬａ細胞を加え、次いで、適切な組織培養インキュベーター中で３７℃で少なくとも６時間インキュベートすることによって、細胞をプレート表面に付着させた。次いで、真空ピペットを用いて、組織培養培地を除去し、４００μｌのＤＥＳ混合物を各ウェルに加え、他方、２０×光学顕微鏡下でリアルタイムに細胞のあらゆる形態学的変化を調べた。次いで、さらなる顕微鏡検査前に、組織培養プレートを９０分間にわたって３７℃のインキュベーターに戻した。ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）を非毒性対照として用い、結果を以下の表に示す。細胞の生存率を、標準トリパンブルー染色によって確認した。
【０２４５】
表５  細胞形態に対する種々の固定剤および添加剤の効果
【０２４６】
【表５】
2018113982.tif 000030
【０２４７】
表６  細胞形態に対する添加剤を含むまたは含まない種々のＤＥＳ混合物の効果
【０２４８】
【表６】
2018113982.tif 000031
【０２４９】
2018113982.tif 000032
【０２５０】
2018113982.tif 000033
【０２５１】
2018113982.tif 000034
【０２５２】
ＨｅＬａ細胞形態に対する効果、尺度＋（最低）から＋＋＋＋＋（最良）。
【０２５３】
１３．ＤＥＳ混合物を含有するトリフルオロアセトアミドを用いた細胞の固定化
２４ウェル組織培養プレートの標準組織培養条件下で、ＨｅＬａ組織培養細胞をコンフルエンスまで成長させ、１ｍｌのＤＭＥＭ／ＦＢＳ培地を除去し、０．２〜１．０ｍｌの（Ａ）ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）または（Ｂ）塩化コリン：トリフルオロアセトアミド（１：２  モル：モル）と置き換え、細胞を５０×標準光学顕微鏡下で画像化した。細胞の代表的な視野を図１０に示し、細胞形態に対する実質的な変化は、ＤＰＢＳまたは塩化コリン：トリフルオロアセトアミド処理細胞の間で見られなかった。ＤＥＳ処理細胞が固定化されたことを実証する１つの試験として、ＤＰＢＳまたは塩化コリン：トリフルオロアセトアミドを除去し、細胞を２ｍｌの水道水で洗浄したところ、室温で１時間後に、ＤＰＢＳ処理細胞のみが膨潤し、次いで、水の浸透圧効果から破壊された。塩化コリン：トリフルオロアセトアミド処理細胞は、室温で１カ月水に沈めた後でさえ、この処理によってほとんど変化がなかったことが判明し、この事は、当該細胞が実際に固定化されたことを示す。さらに、細胞の固定化の証拠として、細胞を１ｍＬの０．０５％トリプシンを用いて室温で１時間処理したところ、ＤＰＢＳ処理細胞とは異なり、効果または細胞の目に見えるプロテアーゼ分解はなく、細胞は完全な状態のままであったことが判明した。
【０２５４】
塩化コリン：トリフルオロアセトアミド（１：２  モル：モル）は、塩化コリン：トリフルオロアセトアミド１：１、１：１．５、１：１．７５、１：２．２５、１：２．５、１：２．７５または１．３（モル：モル）と置き換えることができる。別法として、塩化コリン：トリフルオロアセトアミドは、ベタイン：トリフルオロアセトアミド（１：２  モル：モル）または塩化アセチルコリン：トリフルオロアセトアミド（１：２  モル：モル）と置き換えることができる。細胞固定化のためのＤＥＳ混合物に特に制限はないが、トリフルオロアセトアミド含有混合物は、細胞の固定化およびＲＮＡの安定化に特に有用である（表１参照）。
【０２５５】
組織培養細胞および組織は、細胞が溶解したり変形したりすることなく、様々な温度で塩化コリン：トリフルオロアセトアミド（１：２  モル：モル）で固定化することができる。４００μｌの塩化コリン：トリフルオロアセトアミドを３７℃、１００℃または１２０℃で予熱し、予熱されたピペットの先端で２４ウェルプレート中のＨｅＬａ細胞に加えた。高温の塩化コリン：トリフルオロアセトアミドの添加の直後に細胞を顕微鏡観察したところ、注目すべきことに、細胞が室温で固定化された細胞と非常に似ている形態を有することが示された。高温の塩化コリン：トリフルオロアセトアミドの粘度は、室温における粘度よりもかなり低い。
【０２５６】
具体的には、深共晶溶媒の細胞固定化特性を以下のように決定し、定量した：ほぼ２，０００個のＨｅＬａ細胞を、２４ウェル組織培養プレートに入れた２５ｍｍのＣｅｌｌａｔｔｉｃｅTM：Ｍｉｃｒｏ−Ｒｕｌｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｓｕｒｆａｃｅ（微細罫線付き細胞培養カバーガラス表面、カタログ番号ＣＬＳ５−２５Ｄ−０５０  Ｎｅｘｃｅｌｏｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＳＡ）上で成長させ、２ｍｌのＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ中で一晩成長させ、格子の規定された面積内の付着した細胞の数を、１０×顕微鏡対物レンズを用いて手動で数え、次いで、吸引ピペットを用いて組織培養培地を取り出し、４００ｍｇの深共晶溶媒と置き換え、室温で１時間インキュベートして、細胞を固定化させ、次いで、吸引ピペットで深共晶溶媒を除去し、２ｍｌの蒸留水と置き換え、室温で１時間インキュベートし、格子の同じ規定された面積内の細胞の数を、処理前と同様に手動で数えた。元の数と比較した格子に残存する付着した細胞のパーセンテージを計算したところ、細胞の少なくとも７５％が、塩化コリン：トリフルオロアセトアミド（１：２  モル：モル）での処理の後に付着していたことが判明した。多数の緩く付着した死滅しつつある細胞が、容易に剥離し、従って、細胞の計数の誤りを引き起こすので、細胞をコンフルエンスまで成長させるべきでない。他の深共晶溶媒の細胞固定化特性も、この方法を用いて決定することができることが当業者には明らかである。
【０２５７】
１４．塩混合物の塩化コリン：尿素への溶解性
注目すべきことには、塩化亜鉛（ＺｎＣｌ２）は塩化コリン：尿素（１：２）に溶解して、１：２：２（モル：モル：モル）の塩化コリン：尿素：ＺｎＣｌ2のＤＥＳ混合物を調製でき、イソチオシアン酸グアニジンは塩化コリン：尿素に溶解して、１：２：５（モル：モル：モル）の塩化コリン：尿素：イソチオシアン酸グアニジンのＤＥＳ混合物を調製でき、酢酸アンモニウムは塩化コリン：尿素（１：２）に溶解して、１：２：３（モル：モル：モル）の塩化コリン：尿素：酢酸アンモニウムのＤＥＳ混合物を調製できることが判明した。
【０２５８】
１５．安定化剤の非存在下におけるＲＮＡ分解
ＤＥＳ混合物または他の安定化剤の非存在下におけるＲＮＡ分解の速度を決定するために、５０ｍｇのラット肝臓片を、実施例１のＲＮＡ精製前に、２０℃で（レーン１）０分間、（レーン２）１分間、（レーン３）２分間、（レーン４）５分間、または（レーン５）２０分間インキュベートした。結果を図１０に示す。
【０２５９】
ＲＮＡは、室温で５分後に著しく分解し、２０分後にかなり分解したことが判明した。これは、組織ＲＮＡが分解を開始する前に完全な状態である最大時間、およびＤＥＳ固定剤を比較できる迅速性および有効性を見積もるための方法を提供する。例えば、筋肉などのＲＮＡ分解が比較的遅い組織の試料重量は、より速度の速い膵臓などの組織の重量よりも大きい場合がある。
【０２６０】
１６．動物組織試料におけるＤＮＡ安定化
標準１．５ｍｌポリプロピレン微小遠心管中の４００μｌの塩化コリン：トリフルオロアセトアミド（１：２  モル：モル）に２〜２５ｍｇのラット肝臓試料を加え、室温で２０分間プレインキュベートして、安定化および／または固定化させ、鉗子での組織試料の回収と、以下に記載するような、ＲＮＡおよびＤＮＡ精製の前に、−８０℃、−２０℃、４℃、２０℃または３７℃、４２℃または５５℃で１時間から数週間インキュベートすることができる。
【０２６１】
簡単に述べれば、試料を４００μｌの溶解緩衝液ＲＬＴに機械的に溶解し、製造業者の説明書（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ、カタログ番号７４１０６、Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）に従って、少なくとも４０μｌの水中にＲＮＡを溶出させ、次いで、シリカ膜を１００μｌの水で洗浄し、１０，０００×ｇで６０秒間遠心し、フロースルーを捨て、次いで、１００μｌの１０ｍＭのＮａＯＨを加え、７０℃で１５分間インキュベートして、残存するＲＮＡを破壊し、次いで、１０，０００×ｇで６０秒間遠心し、ＤＮＡを含有するフロースルーを回収し、１％アガロースゲルを用いて分析した。
【０２６２】
ＰｕｒｅＬｉｎｋ（登録商標）（カタログ番号１２１８３０１８Ａ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）およびＤＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＤＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ、カタログ番号６９５０４、Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）などの市販のＤＮＡ精製キットを用いることもでき、ＤＮＡ精製に用いることができるキットの種類または組織の種類に特に制限はない。
【０２６３】
肝臓試料を、肝臓、脾臓、脳、筋肉、心臓、食道、精巣、卵巣、胸腺、腎臓、皮膚、腸、膵臓、副腎、肺、骨髄などの他の組織および細胞型、またはＣＯＳ−７、ＮＩＨ／３Ｔ３、ＨｅＬａ、２９３、およびＣＨＯ細胞などの細胞、または血清、血漿または血液などの液体試料とも置き換えることができる。
【０２６４】
室温で４００μｌのＲＮＡｌａｔｅｒと比較して、４００μｌの塩化コリン：トリフルオロアセトアミド（１：２）で固定化され、安定化されたラット肝臓試料から抽出したＤＮＡは、有意に多くの完全なＤＮＡを有していたことが判明し、ＤＮＡならびにＲＮＡを保存するために奨励されてきた製品であるＲＮＡｌａｔｅｒと比較して、ＤＥＳ混合物の優れた安定化が実証される。１〜３３ｍＭのＺｎＳＯ４もまたＤＮＡ安定化を改善するために加えることができる。
【０２６５】
結果を図１２に示す。ＨｅＬａ細胞ペレットを、２４℃で、９日間（レーン１および２）または１５日間（レーン３および４）のいずれかにわたって、塩化コリン：トリフルオロアセトアミド（１：２  モル：モル）（レーン１および３）、ＲＮＡｌａｔｅｒ（レーン２および３）で安定化させた。ＲＮＡｌａｔｅｒ安定化細胞のＤＮＡは、塩化コリン：トリフルオロアセトアミドの場合よりも有意に大きく分解する。
【０２６６】
１７．動物組織試料におけるタンパク質の安定化
標準１．５ｍｌポリプロピレン微小遠心管中の４００μｌの塩化コリン：トリフルオロアセトアミド（１：２  モル：モル）、１０ｍＭのＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏおよび４０ｍｇのモレキュラーシーブ４Ａに、１０ｍｇの凍結解凍したマウス肝臓を加え、２４℃で４、７または１８日間のいずれかにわたってインキュベートした。タンパク質抽出前に、対照マウス肝臓試料を、４００μｌのＰＢＳ中で２４℃で０分間、３６時間、６日間、または１３日間のいずれかにわたってインキュベートした。
【０２６７】
１０容量の１×試料緩衝液（１２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ  ｐＨ６．８、２％ＳＤＳ、１０％グリセロール、５％β−メルカプトエタノール、０．００１％ブロモフェノールブルー）を肝臓試料に加え、ペレット乳棒で３０秒間粉砕し、次いで、試料を７０℃で１０分間直ちに加熱し、管を５分間氷の上に置き、次いで、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、フランス）によって、タンパク質計量前に、１０，０００×ｇで５分間遠心することによって、タンパク質を抽出した。３０μｇの各タンパク質をＬａｅｍｌｌｉ緩衝液と混合し、標準ＳＤＳ−７．５％アクリルアミドゲルに負荷し、１１０Ｖで３時間電気泳動した。次いで、タンパク質をウェスタンブロッティングＰＶＤＦ／ＥＣＬ＋膜に移し、一次抗体抗α−アクチンの１：５００希釈物と共に、４℃でＴＢＳ（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）、５％粉ミルク中で一晩インキュベートし、膜をＴＢＳ（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、５％粉ミルク）で３回洗浄し、ＨＲＰ標識マウス抗ＩｇＧ二次抗体の１：１００希釈物と共に２４℃で６０分間インキュベートし、洗浄し、Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  ｐｉｃｏ化学発光キット（Ｐｉｅｒｃｅ、フランス）で発色させた。
【０２６８】
結果を図１３に示す。ＰＢＳ（レーン２〜４）または塩化コリン：トリフルオロアセトアミド（１：２  モル：モル）（レーン５〜７）中で、２４℃で、マウス肝臓を０分間（レーン１）、３６時間（レーン２）、６日間（レーン３）、１３日間（レーン４）、４日間（レーン５）、７日間（レーン６）または１８日間（レーン７）のいずれかにわたって安定化させた。ＰＢＳ保存試料中のＩｇＧおよびアクチンタンパク質は、塩化コリン：トリフルオロアセトアミドの場合よりも有意に大きく分解する。
【０２６９】
１８．免疫組織化学（ＩＨＣ）のための塩化コリン：トリフルオロアセトアミド（１：２モル：モル）を用いた細胞固定化
ＨｅＬａ細胞を、２４ウェル組織培養プレート中で、１３ｍｍカバーガラス上で２０％の細胞密度まで成長させ、ＤＭＥＭ成長培地を真空ピペットで除去し、ティッシュで端を軽く押さえてカバーガラスを１２ウェルプレートに移し、６００μｌの塩化コリン：トリフルオロアセトアミド（１：２  モル：モル）をカバーガラス上に直接加え、室温で、揺動プラットフォーム上で６０分間放置して固定化させた。次いで、カバーガラスおよび細胞を固定剤から取り出し、過剰の固定剤を真空ピペットおよびティッシュで押さえることによって除去し、２ｍｌのＰＢＳで４×５分間洗浄した。細胞を揺動プラットフォーム上で２ｍｌのＰＢＳ／１％ＢＳＡでブロックし、次いで、１：１００の一次抗体などの適切な希釈物を加え、４℃で一晩放置した。次いで、細胞を３×２ｍｌのＰＢＳ／１％ＢＳＡ中で、各々５分間洗浄し、標識された二次抗体の１：１０００のＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８ヤギ抗マウスＩｇＧ１（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＫ）などの適切な希釈物を加え、暗所にて、室温で３０分間インキュベートした。細胞を３×２ｍｌのＰＢＳ／１％ＢＳＡ、次いで、３×２ｍｌのＰＢＳで洗浄し、次いで、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ／ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ、ＵＫ）のマウントおよび適切な顕微鏡での観察前に、水中で軽くすすいだ。
【０２７０】
別法として、塩化コリン：トリフルオロアセトアミド（１：２  モル：モル）中への１０ｍＭのＺｎＳＯ4、ＺｎＣｌ2、５％（ｖｏｌ：ｖｏｌ）のＮ−エチルピロリドン、５〜１０％の水、ＰＢＳまたはＤＭＥＭなどの水溶液、２．５％（ｖｏｌ：ｖｏｌ）の１−ベンジルイミダゾールまたは１％（ｖｏｌ：ｖｏｌ）のテトラメチル尿素の添加を、細胞固定化前に行って、免疫組織化学の結果を改善することができる。
【０２７１】
１９．染色または免疫組織化学（ＩＨＣ）のための塩化コリン：トリフルオロアセトアミド（１：２  モル：モル）を用いた哺乳動物組織の固定化
肝臓、腎臓、肺、脳、平滑筋、骨格筋または心筋、脾臓、胸腺、唾液腺、子宮、精巣、皮膚、目、舌、食道、胃、腸、膵臓、副腎、胆嚢などの新たに解剖したマウスの組織片を１０容量の塩化コリン：トリフルオロアセトアミド（１：２  モル：モル）に加え、４℃または室温の間で少なくとも１時間インキュベートして、浸透および組織固定化を行った。１時間よりも長いインキュベーション時間、例えば、４、８、１５、２４または７２時間可能である。組織試料を凍結し、必要になるまで塩化コリン：トリフルオロアセトアミド（１：２  モル：モル）混合物中で保存することもできる。組織固定化に必要な時間は、組織の種類、サイズ、密度、脂肪含有量、形状、表面積および固定剤の種類を含む多数の因子によって決まる。特定の組織のための固定化に必要な最短時間の決定は、最も簡単には、組織を異なる時間でインキュベートし、次いで、ミクロトーム切断の間に組織が振る舞う様子を観察することによって行うことができ、不十分な固定化時間は、ミクロトームブレードを通過する間に組織が引き裂かれることによって検知される。十分な固定化時間は、ミクロトーム切断だけでなくＲＮＡ安定化に対して頑強な試料をもたらす。
【０２７２】
塩化コリン：トリフルオロアセトアミド（１：２  モル：モル）を用いた固定化後に、６５℃および１００℃における、各々１時間のパラフィン（融点５６〜５８℃）中への包埋前に、７０％エタノール４５分間、８０％エタノール４５分間、１００％エタノール３０分間２回、トルエン３０分間２回の脱水前に、組織を１０容量のＰＢＳで軽く１回すすぐ。ホルムアルデヒド固定化組織に用いられるものと同一の標準的なプロトコルに従い、ミクロトーム処理前に、固定化された組織を含有するパラフィンブロックを室温まで放冷する。詳細な方法は、Ａｌ−ＭｕｌｌａおよびＧｏｈｌｍａｎｎ（２０１１）Ｆｏｒｍａｌｉｎ−Ｆｉｘｅｄ  Ｐａｒａｆｆｉｎ−Ｅｍｂｅｄｄｅｄ  Ｔｉｓｓｕｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）に記載されている。必要であれば、トルエンをキシレンまたはヒストゾルと置き換えることができる。
【０２７３】
塩化コリン：トリフルオロアセトアミドへの１〜３３ｍＭ、好ましくは１０〜３３ｍＭの塩化亜鉛、硫酸亜鉛またはクエン酸亜鉛などの亜鉛塩の添加は、固定剤による組織の浸透および固定化速度を改善するが、さらにモレキュラーシーブタイプ４Ａが存在することによって、試料中のＲＮＡの安定化が改善される。
【０２７４】
ヘマトキシリンおよびエオシンでの組織片染色は、標準的で周知の方法に従った。
【０２７５】
２０．パラフィン包埋後の塩化コリン：トリフルオロアセトアミドでのＨｅＬａ細胞のＲＮＡおよびＤＮＡの安定化
ＨｅＬａ細胞ペレット（１００万個細胞）を、１０ｍＭのＺｎＣｌ２を含有する４００ｍｇの塩化コリン：トリフルオロアセトアミド（１：２  モル：モル）に加え、室温で６０分間固定化した。固定化された細胞を直ちに処理するか、または標準パラフィン包埋プロトコルを続けた；（ｉ）１ｍｌ１００％エタノール３０分間浸漬、（ｉｉ）１ｍｌトルエン１５分間、次いで、５５℃における１ｍｌパラフィン（ｉｉｉ）１５分間または（ｉｖ）６０分間の浸透。引き続いて、ＲＮＡおよびＤＮＡを精製し（ＲＮｅａｓｙ、Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）、ＲＩＮを決定した（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｓｅｒ  ２１００）。ＨｅＬａ細胞ＲＮＡのＲＩＮは、固定化なしで９．６（レーン１、陽性対照）から、固定化、脱水およびパラフィン包埋後の８．６（レーン６）まで減少し、このことは、確かにＲＮＡ分解が処理中に起こったが、総量は非常に満足できるものであったことを示す。塩化コリン：トリフルオロアセトアミド固定化の結果、ホルムアルデヒド処理試料（データは示さず）を用いた場合よりもＲＮＡ分解はかなり少なくなったことも判明した。ＤＮＡ試料の完全性は、視覚的に変化せず、固定化中にＤＮＡが安定化されることを示す。結果を図１４に示す。
【０２７６】
２１．パラフィン包埋後の塩化コリン：トリフルオロアセトアミドを用いたマウス肝臓および腎臓組織のＲＮＡおよびＤＮＡ安定化
１０ｍｇのマウス肝臓または腎臓片を、１０ｍＭのＺｎＳＯ4およびモレキュラーシーブ４Ａ（３％（ｗｔ：ｗｔ））の両方を含有する４００μｌの塩化コリン：トリフルオロアセトアミド（１：２  モル：モル）、または４００μｌのＰＢＳのいずれかに加え、４℃または２４℃のいずれかで６４時間インキュベートした。次いで、組織試料を以下のように処理した；７０％エタノール６０分間、８０％エタノール６０分間、９５％エタノール６０分間、１００％エタノール３０分間２回、１００％エタノール６０分間、トルエン３０分間２回、１００％トルエン６０分間、５５℃パラフィン２時間、５５℃パラフィン５時間。次いで、パラフィンに包埋した試料を、−８０℃でほぼ２週間凍結した。引き続いて、まず解剖用メスを用いてパラフィンブロックから包埋された組織を除去し、次いでＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）を用いた４００μｌの緩衝液ＲＬＴへの直接的溶解によって、ＲＮＡおよびＤＮＡを精製し、ＲＮＡ  ６０００  Ｎａｎｏ全ＲＮＡキット（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｓｅｒ  ２１００、ＵＳＡ）を用いてＲＩＮを決定した。
【０２７７】
結果を図１５に示す。肝臓（レーン１〜４）および腎臓（レーン５〜８）試料の両方について、ＲＮＡの完全性は、ＰＢＳ（レーン３、４、７、８）と比較して、塩化コリン：トリフルオロアセトアミド、ＺｎＳＯ4およびモレキュラーシーブ処理（レーン１、２、５、６）後に有意により良好であったことが判明した。例として、ＲＩＮ値を図１４に示し、２４℃で、塩化コリン：トリフルオロアセトアミド、ＺｎＳＯ4およびモレキュラーシーブ（レーン１）をＰＢＳ（レーン３）と比較して、７．５から２．４に減少することが判明し、ＤＮＡの品質も、塩化コリン：トリフルオロアセトアミド、ＺｎＳＯ4およびモレキュラーシーブ処理後に有意により良好であることも判明した。
【０２７８】
２２．塩化コリン：トリフルオロアセトアミド、硫酸亜鉛およびモレキュラーシーブを用いたＨｅＬａ細胞のＲＮＡ安定化
水添加又は水非添加の保存された生物学的試料中の塩化コリン：トリフルオロアセトアミド（１：２  モル：モル）に、種々の亜鉛塩およびモレキュラーシーブを加えてＲＮＡ安定化効果の比較を行った。１００万個のＨｅＬａ細胞を遠心したペレットをＲＮＡの供給源として用い、４００μｌの塩化コリン：トリフルオロアセトアミド（１：２  モル：モル）を各ペレットに加え、次いで、１０％または１５％（ｖｏｌ：ｖｏｌ）のいずれかの最終濃度の水を、表に記載した３３ｍＭの硫酸亜鉛および３３％（ｗｔ：ｗｔ）のモレキュラーシーブタイプ４Ａの存在下または非存在下で加えた。製造業者の説明書に従って、シリカスピンカラム（Ｉｎｖｉｔｅｋ、ドイツ）を用いたＲＮＡ精製、およびＡｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｓｅｒ２１００を用いたＲＮＡ完全性値（ＲＩＮ）決定前に、試料を３７℃で１８時間保存した。水をＨｅＬａ細胞ペレット／塩化コリン：トリフルオロアセトアミドに添加することによって、ＲＮＡの完全性は顕著に低下するが、硫酸亜鉛、より好ましくは硫酸亜鉛およびモレキュラーシーブタイプ４Ａの添加は、ＲＩＮ値の増加によって示されるように、水が存在する場合、ＲＮＡ分解の量を実質的に低下させることができる。これは、より大きな組織試料、血液、血清、血漿または植物材料について、かなりの量の水（例えば、安定化溶液中の１０％よりも大きな最終濃度）が存在する場合、試料である分析物の品質を改善するために特に有用な手段である。長期間の試料の保存が必要な場合、１０％未満の水を含有する試料でも、幾分の改善が得られ得る。
【０２７９】
１〜３３ｍＭ、好ましくは１０ｍＭ（最終濃度）の硫酸亜鉛は、塩化亜鉛またはＥＤＴＡ亜鉛よりもＲＮＡ分解の低減にわずかに効果的であるが、グルコン酸亜鉛、酢酸亜鉛またはｐ−トルエンスルホン酸亜鉛よりも格段に効果的であることが判明した（表２）。
【０２８０】
表７．ＨｅＬａ細胞ペレットから抽出したＲＮＡについてのＲＩＮスコア
【０２８１】
【表７】
2018113982.tif 000035
【０２８２】
２３．有機添加剤を含む塩化コリン：トリフルオロアセトアミドを用いたＨｅＬａ細胞のＲＮＡ安定化
水添加または水非添加の保存された生物学的試料において、塩化コリン：トリフルオロアセトアミド（１：２  モル：モル）に、Ｎ−エチルピロリドンまたはテトラメチル尿素を加えて、ＲＮＡ安定化効果の比較を行った。１００万個のＨｅＬａ細胞を遠心したペレットをＲＮＡの供給源として用い、表に記載したように、２．５％、５％、１０％または２０％（ｖｏｌ：ｖｏｌ）のＮ−エチルピロリドン、５％または２０％（ｖｏｌ：ｖｏｌ）のテトラメチル尿素の存在下または非存在下で、４００μｌの塩化コリン：トリフルオロアセトアミド（１：２  モル：モル）を各ペレットに加えた。製造業者の説明書に従い、シリカスピンカラム（ＩｎｖｉＴｒａｐ  Ｓｐｉｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ  カタログ番号１０６０１００２００  Ｓｔｒａｔｅｃ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ、ドイツ）を用いたＲＮＡ精製、およびＡｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｓｅｒ２１００を用いたＲＮＡ完全性値（ＲＩＮ）決定前に、試料を２４℃で２０日間保存した。Ｎ−エチルピロリドンおよびテトラメチル尿素の両方が、塩化コリン：トリフルオロアセトアミド単独と比較して、長期間の保存後にＨｅＬａ細胞ペレットにおけるＲＮＡの品質を改善したことが判明した。
【０２８３】
表８：Ｎ−エチルピロリドンおよびテトラメチル尿素を用いたＲＮＡの収率および品質
【０２８４】
【表８】
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【０２８５】
定性的なＲＮＡの品質基準は以下の通りである；０（高度に分解）から１０（最高の品質）。表１および２におけるＲＮＡ分析を以下のように行った；臭化エチジウム染色、１％アガロース０．５×ＴＡＥゲル電気泳動、１８Ｓおよび２８Ｓ  ｒＲＮＡバンドの完全性の、紫外光下で撮影された写真の視覚分析。８以上のＲＮＡ品質スコアを持つＲＮＡ試料は、１８Ｓ対２８Ｓ  ｒＲＮＡ臭化エチジウム染色比が１：２であり、他方、ＲＮＡ品質スコアが５であるＲＮＡ試料は、１８Ｓ対２８Ｓ  ｒＲＮＡ染色比がほぼ１：１である。
【０２８６】
２４．種々の第四級アンモニウム塩および水素結合供与体の使用
室温（２４℃）のＤＥＳ液体は、１：２  モル：モルの割合で、塩化コリンをプロリン、オキサミド、ピバルアミド、１−エチル−２−ピロール、４−ホルミルモルホリン、アセトニルアセトン、炭酸エチレン、テトラメチル尿素、Ｎ−エチルイミダゾール、１−ベンジルイミダゾールおよび／または１，３−ジメチル−２−イミダゾリドンのいずれかと混合しても調製できなかった。以下のアンモニウム塩もまた室温のＤＥＳ液体を形成することができなかった；硫酸アンモニウムおよび酢酸アンモニウム。硫酸アンモニウムおよび塩化アンモニウムの両方は、イソチオシアン酸グアニジン、ソルビトールおよび／またはキシリトールとの１：２  モル：モル比の液体を、部分的には１００℃で形成できたが、２４℃では形成できなかった。
【０２８７】
表９：異なる第四級アンモニウム塩を用いた二成分混合物
【０２８８】
【表９】
2018113982.tif 000037
【０２８９】
２５．キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）胚ＲＮＡの安定化
１０ｍｇのＤ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ胚（０〜２４時間）を、４００μＬの塩化コリン：トリフルオロアセトアミド（１：２  モル：モル）（レーン１〜３）またはＲＮＡｌａｔｅｒ（レーン４〜６）のいずれかと混合し、ＲＮＡ精製（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ、カタログ番号７４１０６、Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）前に、３７℃で１２時間（レーン１、４）、２日間（レーン２、５）または４５日間（レーン３、６）のいずれかにわたってインキュベートした。ＲＮＡの品質を図１６に示し、塩化コリン：トリフルオロアセトアミド安定化ＲＮＡは、ＲＮＡｌａｔｅｒの品質よりも有意に良好であった。
【０２９０】
２６．タマネギ（Ａｌｌｉｕｍ  ｃｅｐａ）葉シュートにおけるＲＮＡの安定化
１０ｍｇのＡ．ｃｅｐａ葉シュートを４００μｌの塩化コリン：トリフルオロアセトアミド（１：２モル：モル）（レーン１〜３）またはＲＮＡｌａｔｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）（レーン４〜６）のいずれかと混合し、ＲＮＡ精製（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ、カタログ番号７４１０６、ドイツ）前に、２２℃で、１８時間（レーン１、４）、３日間（レーン２、５）または９日間（レーン３、６）のいずれかにわたってインキュベートした。ＲＮＡの品質を図１７に示し、塩化コリン：トリフルオロアセトアミド安定化ＲＮＡは、ＲＮＡｌａｔｅｒの品質よりも有意に良好であった。
【０２９１】
２７．ＤＥＳ安定化後のin situハイブリダイゼーション適用
組織試料を調製し、塩化コリン：トリフルオロアセトアミド（１：２  モル：モル）および１０ｍＭ  ＺｎＳＯ4を用いて、４℃で、１〜２４時間の固定化時間で、実施例２１に記載するようにパラフィン包埋した。次いで、組織試料を以下のように処理した；７０％エタノール６０分間、８０％エタノール６０分間、９５％エタノール６０分間、１００％エタノール３０分間２回、１００％エタノール６０分間、トルエン３０分間２回、１００％トルエン６０分間、５５℃パラフィン２時間、次いで、５５℃パラフィン５時間。パラフィン組織スライス（３〜１２μｍの厚み）のミクロトーム調製に続き、キシレンを用いてパラフィンを室温で１０分間除去し、組織スライスを、１００％エタノール、７０％エタノール、５０％エタノール、２５％エタノール、次いで、水中で各々５分間インキュベートすることによって水和させた。次いで、ＰＢＳ洗浄、および５００μｌの超純粋５０％ホルムアミド、２５０μｌの２０×ＳＳＣ、５０μｌの１０μｇ／μｌの酵母ｔ−ＲＮＡおよび２０μｌの５０×デンハルト溶液を含有する１ｍｌの緩衝液中でのプレハイブリダイゼーションと、それに続く適切な色原体または蛍光標識プローブでのハイブリダイゼーション前に、組織片を室温で５分間プロテイナーゼＫ（１０μｇ／ｍｌ）処理することができる。in situハイブリダイゼーションについてのプロトコルは周知であり、Ｊ．Ｍ．ＢｒｉｄｇｅｒおよびＫ  Ｍｏｒｒｉｓ（２０１０）によってＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＦＩＳＨ）：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉоｎｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）およびＳｕｍｍｅｒｓｇｉｌｌら、（２００７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃ．３：２２０−２３４に記載されている。
【０２９２】
２８．フローサイトメトリーのための細胞の調製
ＨｅＬａ、ＭＣＦ−７、ＮＣＩ６０、ＰＣ３、Ｖｅｒｏ、ＧＨ３、ＭＣ３Ｔ３、ＺＦ４またはＩＭＲ−９０などのほぼ５００，０００個の組織培養細胞を、固体表面で成長する場合、まず、軽くトリプシン処理して剥離させ、１０ｍｌのＥＭＥＭ／１０％ＦＢＳと混合し、９００×ｇ（２４℃）で、１５ｍｌの管中で１０分間遠心した。次いで、細胞ペレットを１００μｌのＤＰＢＳ緩衝液に再懸濁し、１ｍｌの塩化コリン：トリフルオロアセトアミド（１：２  モル：モル）と直ちに混合し、１０ｍｌピペットで丁寧にピペット処理して、完全に混合した。細胞を４℃または２４℃のいずれかで１〜２４時間放置して固定化させ、次いで、１４ｍｌのＤＰＢＳを加え、丁寧な倒立によって管内容物を混合し、９００×ｇで１０分間遠心し、細胞ペレットを１００μｌのＤＰＢＳ中に丁寧に再懸濁し、染色緩衝液（１００ｍＭのトリス、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＣａＣｌ2、０．５ｍＭのＭｇＣｌ2、０．１％ノニデットＰ−４０）中に１ｍｌのＤＡＰＩ（３μＭ）を加えることによって、核を１５分間染色した（２４℃）。次いで、染色し固定化した細胞をフローサイトメトリーに用いることができる。塩化コリン：トリフルオロアセトアミド固定化細胞は単分散しており、それらの蛍光に従って、細胞周期の種々の段階に分類することができた。
【０２９３】
２９．生物学的試料の２工程処理
１０ｍｇのマウス組織片を、１０ｍＭのＺｎＳＯ4およびモレキュラーシーブ４Ａ（３％（ｗｔ：ｗｔ））の両方を含有する４００μｌの塩化コリン：トリフルオロアセトアミド（１：２  モル：モル）に加え、２４℃で１時間インキュベートし、次いで、組織を取り出し、例えば、４００μｌの塩化コリン：トリフルオロアセトアミド（１：２  モル：モル）、塩化コリン：尿素（１：２  モル：モル）、塩化コリン：ソルビトール（１：２  モル：モル）、塩化ベタイン：トリフルオロアセトアミド（１：２  モル：モル）または４％パラホルムアルデヒドのいずれかへの浸漬前に、ペーパータオルを軽く押し付けて過剰の安定化剤を除去し、次いでインキュベートして、少なくとも１時間、好ましくは一晩保存した。別法として、本出願において記載した多数のＤＥＳ混合物のいずれか１つは、最初の安定化または固定化溶液として作用することができ、続いて、第二の安定化または固定化溶液として作用することができる。また別の例として、組織固定化を、まず、例えば、４％パラホルムアルデヒドで室温で１時間行うことができ、次いで、組織を１０ｍＭのＺｎＳＯ4およびモレキュラーシーブ４Ａ（３％（ｗｔ：ｗｔ））の両方を含有する４００μｌの塩化コリン：トリフルオロアセトアミド（１：２  モル：モル）に移すことができる。この２工程手法は、例えば、細胞形態のための最適な安定化剤を、ＲＮＡ、ＤＮＡおよびタンパク質のための最適な安定化剤と組み合わせることができる手段を提供する。この手法は、生物学的試料に由来する含水量を、元の安定化混合物を変更することによって低下させることができる手段も提供する。多くの第一混合物と第二混合物との組合せがあり、最も適切な選択は、少なくとも部分的には、Ｈ＆Ｅ染色組織片の品質およびＲＮＡの品質などの経験的手段によって決定しなければならない。用いる安定化および固定化混合物は、液体であっても固体であってもよい。
【０２９４】
３０．ＤＥＳ混合物のグアニジンおよびフェノール精製試薬との適合性
有利なことには、塩化コリン：トリフルオロアセトアミド（１：２  モル：モル）は完全に可溶性であって、以下のＲＮＡ精製キット；ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）、ＰｕｒｅＬｉｎｋTM（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）、ＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ  ＬＣ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＩＩＩ、Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＲＮＡ  Ｔｉｓｓｕｅ  ＫｉｔおよびＲＮＡ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ  Ａｍｐｌｉｃｏｒ  ＨＣＶ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＳＡ）、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｍｕｌｔｉ−８  Ｖｉｒｕｓ  ＲＡＶ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ  Ｎａｇｅｌ、ドイツ）、ＴＥＭＰＵＳTM  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡ  Ｔｕｂｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）、ＳＶ  ＲＮＡ  ＫｉｔおよびＰｕｒｅＹｉｅｌｄTM  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）、ＴｏＴＡＬＬＹ  ＲＮＡTM  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ、ＵＳＡ）、ＧｅｎＥｌｕｔｅTＭ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）、ＰＡＸｇｅｎｅTM  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡ  Ｋｉｔ（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉｘ、ドイツ）に見出されるものなどのチオシアン酸グアニジンまたはＨＣｌベースのウイルス、細胞および組織溶解緩衝液と、塩化コリン：トリフルオロアセトアミドから試料を分離することなくグアニジンまたはフェノール精製試薬との直接的な塩化コリン：トリフルオロアセトアミド（１：２  モル：モル）安定化試料との混合を可能にするＴＲＩｚｏｌ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）などのフェノールベースの精製試薬と混合できる。これは、例えば、固定剤が浸透した組織試料を分離することが現実的でない場合、または組織培養細胞、血液またはＣＴＣなどの個々の細胞が、それよりもずっと多量の固定剤と混合され、遠心によって分離することが困難または不可能であり得る場合に有利であり得る。参考として、ＲＮＡｌａｔｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）中の哺乳動物細胞は遠心によってペレット化することができず、またはＲＮＡの収率が劇的に低下するため、細胞＋ＲＮＡｌａｔｅｒをグアニジン溶解緩衝液と混合することによってＲＮＡを精製することができない。
【０２９５】
一例として、６％（試料５、表１０）、またはそれ未満の少量の緩衝液ＲＬＴを塩化コリン：トリフルオロアセトアミド（１：２  モル：モル）中に含有するＲＮＡ含有試料を、１容量の７０％エタノールと混合する際に、表１０に記載したように優れた収率および純度でＲＮＡをシリカスピンカラム膜（ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ、Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）に効果的に結合させるために用いることができることが判明した。マウス肝臓溶解物を、１００ｍｇの肝臓を１ｍｌの緩衝液ＲＬＴに溶解することによって調製し、次いで、表１０に示すように７０％エタノールとの混合、およびＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉスピンカラムへの結合前に、２０μｌの溶解物を緩衝液ＲＬＴ、次いで、塩化コリン：トリフルオロアセトアミドに加えた。次いで、５０μｌの水の溶出容量で、製造業者の説明書（ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ、Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）に従ってＲＮＡを精製した。ＲＮＡの収率および純度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ＮＤ−１０００を用いて決定した。塩化コリン：トリフルオロアセトアミドがグアニジンのカオトロピック活性を機能させて試料を溶解させただけでなく、収率に影響が及ぼされないかまたはわずかに増加するように、シリカスピンカラム膜へのＲＮＡ結合に影響を及ぼさなかったことも驚くべきことに見出した。
【０２９６】
さらに、塩化コリン：トリフルオロアセトアミドは、グアニジン溶解物（２０μｌ）に加えられる場合に、標準的な製造業者のプロトコル（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ、Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）により必須のＲＮＡ結合機能となる７０％エタノールに置き換えることができ、表１１に示すように、ＲＮＡをシリカ膜に結合させるために１容量の７０％エタノールの溶解物への添加を必要とする。７０％エタノールを溶解物に加えない場合、ＲＮＡはシリカ膜に結合することができないが、試料が塩化コリン：トリフルオロアセトアミドを含有する場合、ＲＮＡは、エタノールの非存在下においても結合することができ、このことは、工程の数を減少させ、可燃性液体を用いる必要がなく、例えば、ＲＮｅａｓｙキットのＲＮＡ精製手法を改善する手段を提供する。緩衝液ＲＬＴ（１：１ｗｔ：ｗｔ）に溶解した塩化コリンも塩化コリン：尿素もこの特性を有しないが、緩衝液ＲＬＴ（１：１ｗｔ：ｗｔ）に溶解したトリフルオロアセトアミド単独は、緩衝液ＲＬＴ（１：１ｗｔ：ｗｔ）に溶解した塩化コリン：トリフルオロアセトアミドと比較して、たった１５％のＲＮＡ収率をもたらすことに注目すべきである。緩衝液ＲＬＴ：塩化コリン：トリフルオロアセトアミド（１：２  モル：モル）の１：１混合物は、非常に良好なＨｅＬａ細胞溶解性活性を有し、７０％エタノールの非存在下で、独立した溶解およびシリカ膜結合緩衝液として用いることができ、この新規な混合物でのＲＮＡ収率は、緩衝液ＲＬＴ単独よりも有意に良好であったことも判明した。
【０２９７】
驚くべきことに、緩衝液ＲＬＴ：塩化コリン：トリフルオロアセトアミド（１：２  モル：モル）の１：１混合物２００μｌ中で調製されたＨｅＬａ細胞溶解物は、製造業者の説明書に従って、６５℃で１０分間加熱し、続いて、１容量の７０％エタノールを加え、シリカスピンカラム（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ、Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）に結合させると、結果として、小さなＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡおよび５ＳのｒＲＮＡ）の排他的な精製をもたらすことが判明した。加熱工程を省略した場合、１８Ｓおよび２８Ｓ  ｒＲＮＡを含む全ＲＮＡが精製され、従って、加熱は、小さなＲＮＡを細胞溶解物から選択的に精製する方法を提供する。溶解混合物中のトリフルオロアセトアミドと尿素での置換えと加熱の結果、極端なＲＮＡ分解がもたらされた。塩化コリン：トリフルオロアセトアミドの非存在下で溶解物を加熱した場合も同様であった。
【０２９８】
表１０  グアニジン／塩化コリン：トリフルオロアセトアミド混合物のＲＮＡ収率
【０２９９】
【表１０】
2018113982.tif 000038
【０３００】
表１１．結合用エタノールの非存在下におけるグアニジン／塩化コリン：トリフルオロアセトアミド混合物のＲＮＡ収率
【０３０１】
【表１１】
2018113982.tif 000039
【０３０２】
３１．細菌における全ＲＮＡの安定化
３００μｌの塩化コリン：トリフルオロアセトアミド（１：２  モル：モル）を、Ｅｓｃｈｅｒｉｓｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５αの１０ｍｇペレットに加え、２２℃で１８時間インキュベートし、次いで、ＤＥＳ液体を除去して、４００μｌの緩衝液ＲＬＴを該ペレットに加えるか、または４００μｌの緩衝液ＲＬＴを直接的に該ペレットおよびＤＥＳ液体に加え、管を２０秒間ボルテックスし、次いで軽く超音波処理して細胞を破壊し、製造業者の説明書（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）に従って、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを用いてＲＮＡ精製を続けた。１６Ｓおよび２３Ｓ  ｒＲＮＡの完全性は、新鮮な細菌ペレットから抽出したＲＮＡと比較して不変であった。別法として、ＺｎＳＯ4を塩化コリン：トリフルオロアセトアミド（１：２  モル：モル）に加えて、１〜３３ｍＭ、好ましくは３３ｍＭの最終濃度とし、１０％（ｗｔ：ｗｔ）のモレキュラーシーブを所望により加えて、安定化を改善することもできる。
【０３０３】
３２．多成分ＤＥＳ混合物
ＲＮＡ安定化ＤＥＳ混合物は、ベタイン：トリフルオロアセトアミド（１：２  モル：モル）または塩化コリン：トリフルオロアセトアミド（１：２  モル：モル）のいずれかの代わりに、ベタイン：塩化コリン：トリフルオロアセトアミド（０．５：０．５：２  モル：モル：モル）などの２つを超える成分を混合することによって簡単に調製することができることが判明した。別法として、新規なＤＥＳ混合物は、例えば、塩化コリン：尿素：トリフルオロアセトアミド（１：１：１  モル：モル：モル）またはベタイン：尿素：トリフルオロアセトアミド（１：１：１  モル：モル：モル）またはベタイン：塩化コリン：尿素：トリフルオロアセトアミド（０．５：０．５：１：１  モル：モル：モル：モル）からも作製することができる。３成分以上のＤＥＳ混合物は、単一のＤＥＳ混合物中の全ての成分を合わせたものの相互作用および特性に基づいて、低下した粘度、改善された保存寿命、改善された核酸安定性または細胞固定化特性などの興味深い新規な特性を有し得る。
【０３０４】
一例として、ＨｅＬａペレット（５００，０００個の細胞）に、各々が１０ｍＭのＺｎＳＯ4を含有する、４００ｍｇの塩化コリン：トリフルオロアセトアミド（１：２  モル：モル）、ベタイン：塩化コリン：トリフルオロアセトアミド（０．５：０．５：２  モル：モル：モル）またはベタイン：トリフルオロアセトアミド（１：２  モル：モル）のいずれかを加え、３７℃で一晩インキュベートし、続いて、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）を用いたＤＮＡ精製、およびＲＩＮ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｓｅｒ  ２１００、ＵＳＡ）の決定を行った。
【０３０５】
多くのＤＥＳ混合物は、成分やモル濃度が変更されても調製可能であり、この適用に最も適した混合物を経験的に決定する必要があることは、当業者に明らかである。
【０３０６】
表１２  ３７℃で一晩インキュベートされたＨｅＬａ細胞に関する３つの異なるＤＥＳ混合物のＲＮＡ、ＤＮＡ収率およびＲＮＡ完全性値（ＲＩＮ）の比較
【０３０７】
【表１２】
2018113982.tif 000040
【０３０８】
３３．細胞固定化のためのＤＥＳの水性混合物
塩化コリン：トリフルオロアセトアミド（１：２  モル：モル）の水性希釈物は、組織培養細胞および組織を固定化できることが判明した。ＤＭＥＭ組織培養培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、フランス）を塩化コリン：トリフルオロアセトアミドの溶液に加えて、０％、６％、１２％、２１％または５０％のＤＭＥＭの最終濃度とし、次いで、４００μｌの混合物を２４ウェルプレート中のＨｅＬａ組織培養細胞に加えて、顕微鏡で観察した。全ての混合物は、細胞に対する低張または高張効果なしに細胞を固定化できた一方で、６％ＤＭＥＭを含有する塩化コリン：トリフルオロアセトアミドは、純粋な塩化コリン：トリフルオロアセトアミドよりもさらに優れた、最良の品質の細胞形態をもたらしたことが見出された。１５％を超える水を含む塩化コリン：トリフルオロアセトアミドの希釈物により、細胞膜が微小な液滴を形成し、次いで、完全な状態のままである細胞質が細胞から消失され得る。ＤＥＳの水性希釈物は、粘度およびコストを低下させ、細胞固定化特性を潜在的に改善する簡単な手段を提供するが、水の存在はＲＮＡ安定性に対して有害となる。水、ＰＢＳ、ＤＰＢＳ、糖溶液、または様々なＤＥＳを含むＤＭＥＭなどの多数の異なる水溶液を混合できること、細胞固定化および生体分子安定性に対する影響を経験的に試験しなければならないことは当業者に明らかである。
【０３０９】
３４．ＤＥＳ混合物の抗細菌活性
１×１０9のＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５ａ細胞のペレットを塩化コリン：トリフルオロアセトアミド（１：２  モル：モル）の９０μｌの水性希釈物で室温２５分間処理して、９０％、９％または０．９％のいずれかの最終濃度とし、次いで、寒天プレート上で平板培養し、３７℃で一晩インキュベートしてコロニーを成長させた。９０％の塩化コリン：トリフルオロアセトアミドは、全ての細菌の成長およびコロニーの形成を停止させたが、９％または０．９％希釈物は停止させなかったことが判明した。従って、塩化コリン：トリフルオロアセトアミドは、強力な抗菌活性を有するように思われ、より長い処理期間または様々なＤＥＳ混合物は、一層強い抗菌作用をもたらし得ることは当業者に明らかである。有利なことには、細菌の成長は、変質を止める塩化コリン：トリフルオロアセトアミドに保存された組織試料において阻害されることが予測される。
【０３１０】
３５．ＤＥＳ液体のその場での調製
固定化および安定化のための使用前にＤＥＳ混合物を調製することが通常は好都合であるが、代替法は、ＤＥＳの２つ以上の成分を一緒に固形物として、かつ試料と同時に加えることである。例えば、単一管において、１．２８ｇの塩化コリン固体を２ｇのトリフルオロアセトアミド固体に加え、次いで、５０〜１００μｌの全血または２５ｍｇの組織試料を加え、固形物を混合し、生物学的試料の存在下で（１：２  モル：モル）の共晶混合物を形成した。別法として、２つの固形物を、採血管などの適切な容器中に２つの予め負荷された層として加えることができるが、試料との接触後に破壊されるか溶解する膜によって分離され、成分を混合し、試料の存在下においてのみＤＥＳ液体を形成することができる。別の可能性は、頂部が適切に閉じられた容器中に２つの開放区画を有することであり、各区画は適切な量の、例えば塩化コリンおよびトリフルオロアセトアミドで予め負荷されている。振盪または倒立させると、２つの成分が混合され、必要であれば、試料の存在下でＤＥＳ液体を形成することができる。
【０３１１】
３６．接着性組織培養細胞でのＲＮＡの安定化
２４ウェル組織培養プレート中で、ヒト胚線維芽細胞（ＨＥＦ）を８０％コンフルエンス（ほぼ２００，０００個の細胞）まで成長させ、成長培地を取り除き、４００μｌの塩化コリン：トリフルオロアセトアミド（１：２  モル：モル）またはＲＮＡｌａｔｅｒのいずれかと置き換え、ＲＮＡ精製およびＲＩＮ分析（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｓｅｒ）前に、３７℃で、０時間、３２時間または９日間インキュベートした。表１３は、塩化コリン：トリフルオロアセトアミド（１：２  モル：モル）のいずれかを用いて、接着性組織培養細胞のＲＮＡを非常によく保存できることを示す。
【０３１２】
表１３  ３７℃で保存されたヒト胚線維芽細胞（ＨＥＦ）接着性細胞から抽出したＲＮＡについてのＲＩＮスコア
【０３１３】
【表１３】
2018113982.tif 000041
【０３１４】
[１]  生体分子の分解を阻害する深共晶溶媒（deep eutectic solvent）の使用。
[２]  生体分子が、ＲＮＡ、ＤＮＡ及びタンパク質から選択される[１]に記載の使用。
[３]  生体分子がＲＮＡである[２]に記載の使用。
[４]  生体分子が試料又は組織中に存在する[１]〜[３]のいずれかに記載の使用。
[５]  試料又は組織が固体組織を含む[４]に記載の使用。
[６]  試料又は組織が血漿、血清又は全血を含む[４]に記載の使用。
[７]  全血が循環性腫瘍細胞を含む[６]に記載の使用。
[８]  固定したウイルス、細胞又は組織を作製するための、ウイルス、細胞又は組織の固定剤としての深共晶溶媒の使用。
[９]  組織が全血である[８]に記載の使用。
[１０]  組織が固体組織である[８]に記載の使用。
[１１]  全血が循環性腫瘍細胞を含む[９]に記載の使用。
[１２]  固定した細胞又は組織を処理する工程をさらに含み、処理工程は包埋、切片、染色、顕微鏡、in situハイブリダイゼーション、フローサイトメトリー、免疫組織化学法
、及び免疫細胞化学法から選択される１つ以上の方法を含む[８]〜[１１]のいずれかに記載の使用。
[１３]  深共晶溶媒がＩＩＩ型又はＩＶ型深共晶溶媒であり、１０ｍｇラット肝臓試料から抽出され、４００ｍｇの深共晶溶媒を用いて２４℃で２０日間インキュベートされたＲＮＡが、Agilent Bioanalyser 2100を用いて測定される、少なくとも４．０のＲＮＡ完全性値を有する[１]〜[１２]のいずれかに記載の使用。
[１４]  基質上で培養され、深共晶溶媒を用い２４℃で１時間インキュベートされたＨｅＬａ細胞の少なくとも７５％が、深共晶溶媒と水で置換され、２４℃で１時間インキュベートされた後に基質に結合したままでである[１]〜[１３]のいずれかに記載の使用。
[１５]  深共晶溶媒が、ＩＩＩ型深共晶溶媒であり、トリフルオロメチル基を含む化合物を含む[１]〜[１４]のいずれかに記載の使用。
[１６]  深共晶溶媒が第一成分及び第二成分を含み、第一成分が式Ｉの化合物であり、
【０３１５】
【化１８】
2018113982.tif 000042
Ｒ6がＨ又はＯＨであり、
Ｒ7がＨ、ＣＨ3、Ｃｌ、Ｂｒ、カルボニル酸素及び
【０３１６】
【化１９】
2018113982.tif 000043
から選択され;
Ｚが−ＣＨ2−、Ｏ及びＳから選択され、
Ｒ8がＲ11又はＯＨであり、
第二成分が式ＩＩの化合物またはその塩を含み、
【０３１７】
【化２０】
2018113982.tif 000044
ＡはＯ、Ｓ及びＮＨから選択され、
Ｒ1はＨ、１〜６の炭素原子を有するアルケン基、Ｒ9、−ＮＨ2、−ＮＨ−（ＣＨ2）ｎＣＨ3、及び−Ｃ（Ｒ3）（Ｒ4）（Ｒ5）から選択され、
ｎは０又は１〜５の整数であり、
Ｒ2はＨ及び１〜３の炭素原子を有する直鎖アルキル基から選択され、
Ｒ3は任意に置換される５員又は６員の脂肪族環又は芳香族環であり、置換基はＲ10であり、
Ｒ4及びＲ5はそれぞれ独立してＨ又はＦであり、
Ｒ9、Ｒ10、及びＲ11は、それぞれ独立して１〜３の炭素原子を有するアルキル基、１〜３の炭素原子を有するモノクロロアルキル基、及び１〜３の炭素原子を有するモノフルオロアルキル基、ジフルオロアルキル基又はトリフルオロアルキル基から選択される[１]〜[１５]のいずれかに記載の使用。
[１７]  ＡはＯ、Ｓ及びＮＨから選択され、
Ｒ1はＨ、−ＣＨ＝ＣＨ2、Ｒ9、−ＮＨ2、−ＮＨＣＨ3、及び−Ｃ（Ｒ3）（Ｒ4）（Ｒ5）から選択され、
Ｒ2はＨ及び−ＣＨ3から選択され、
Ｒ3は任意に置換される５員又は６員の脂肪族環又は芳香族環であり、置換基はＲ10であり、
Ｒ4及びＲ5はそれぞれ独立してＨ又はＦであり、
Ｒ9、Ｒ10、及びＲ11は、それぞれ独立して１〜３の炭素原子を有するアルキル基、１〜３の炭素原子を有するモノクロロアルキル基、及び１〜３炭素原子を有するモノフルオロアルキル基、ジフルオロアルキル基又はトリフルオロアルキル基から選択される[１６]に記載の使用。
[１８]  ＡがＯ又はＳである[１６]又は[１７]に記載の使用。
[１９]  Ｒ2がＨである[１６]〜[１８]のいずれかに記載の使用。
[２０]  Ｒ1がＨ、Ｒ9、−ＣＨ＝ＣＨ2、及びＣ（Ｒ3)（Ｒ4)（Ｒ5)から選択される[１６]〜[１９]のいずれかに記載の使用。
[２１]  Ｒ1がＲ9である[２０]に記載の使用。
[２２]  Ｒ9が一つの炭素原子を有する[２１]に記載の使用。
[２３]  第二成分がアセトアミドである[２２]に記載の使用。
[２４]  第二成分が２−クロロアセトアミドである[２２]に記載の使用。
[２５]  Ｒ9がモノ−、ジ−又はトリフルオロメチル基である[２２]に記載の使用。
[２６]  第二成分がトリフルオロアセトアミドである[２５]に記載の使用。
[２７]  第二成分がトリフルオロチオアセトアミドである[２５]に記載の使用。
[２８]  第二成分がＮ−メチルトリフルオロアセトアミドである[２５]に記載の使用。
[２９]  Ｒ9が２つの炭素原子を有する[２１]に記載の使用。
[３０]  Ｒ9がモノ−、ジ−又はトリフルオロエチル基である[２９]に記載の使用。
[３１]  第二成分が２，２−ジフルオロプロパンアミドである[３０]に記載の使用。
[３２]  第二成分が３，３，３−トリフルオロプロパンアミドである[３０]に記載の使用。
[３３]  第二成分がホルムアミドである[２０]に記載の使用。
[３４]  第二成分がアクリルアミドである[２０]に記載の使用。
[３５]  Ｒ1がＣ（Ｒ3）（Ｒ4）（Ｒ5）である[２０]に記載の使用。
[３６]  Ｒ4及びＲ5がＦである[３５]に記載の使用。
[３７]  Ｒ3が任意に置換された６員芳香族環である[３５]又は[３６]に記載の使用。
[３８]  Ｒ3が任意に置換されたフェニル基である[３７]に記載の使用。
[３９]  第二成分が２，２−ジフルオロ−２−フェニルアセトアミドである[３８]に記載の使用。
[４０]  Ｒ3が置換基を含む[３８]に記載の使用。
[４１]  置換基がフェニル基の２位にある[４０]に記載の使用。
[４２]  置換基がモノ−、ジ−又はトリフルオロメチル基である[４０]又は[４１]に記載の使用。
[４３]  第二成分が２−（トリフルオロメチル）フェニルアセトアミドである[４２]に記載の使用。
[４４]  Ｒ1が−ＮＨ2及び−ＮＨＣＨ3から選択される[１６]〜[１９]のいずれかに記載の使用。
[４５]  第二成分が尿素である[４４]に記載の使用。
[４６]  第二成分がチオ尿素である[４４]に記載の使用。
[４７]  第二成分が１，３−ジメチル尿素である[４４]に記載の使用。
[４８]  ＡがＮＨである[１６]又は[１７]に記載の使用。
[４９]  第二成分がグアニジンである[４８]に記載の使用。
[５０]  グアニジンがハイドロイソチオシアネート塩の形態で存在する[４９]に記載の使用。
[５１]  Ｒ7がＨである[１６]〜[５０]のいずれかに記載の使用。
[５２]  第一成分がコリンを含む[５１]に記載の使用。
[５３]  第一成分が臭化コリンを含む[１６]〜[５０]のいずれかに記載の使用。
[５４]  第一成分がＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルグリシンである[１６]〜[５０]のいずれかに記載の使用。
[５５]  Ｒ7が
【０３１８】
【化２１】
2018113982.tif 000045
である[１６]〜[５０]のいずれかに記載の使用。
[５６]  ＺがＯ又はＳである[５５]に記載の使用。
[５７]  Ｒ8がＲ11である[５５]又は[５６]に記載の使用。
[５８]  Ｒ11が一つの炭素原子を有する[５７]に記載の使用。
[５９]  第一成分がアセチルコリンを含む[５８]に記載の使用。
[６０]  第一成分がアセチルチオコリンを含む[５８]に記載の使用。
[６１]  Ｒ11が３つの炭素原子を有する[５７]に記載の使用。
[６２]  第一成分がブチリルコリンを含む[６１]に記載の使用。
[６３]  ＺがＣＨ2である[５５]に記載の使用。
[６４]  Ｒ8がＯＨである[６３]に記載の使用。
[６５]  第一成分がカルニチンである[６４]に記載の使用。
[６６]  第一成分がハロゲン化物アニオンである対イオンを含む[１６]〜[６５]のいずれかに記載の使用。
[６７]  ハロゲン化物アニオンが塩素、臭素、及びヨウ素から選択される[６６]に記載の使用。
[６８]  ハロゲン化物アニオンが塩素である[６７]に記載の使用。
[６９]  第一成分が塩化コリンである[６８]に記載の使用。
[７０]  第二成分が、トリフルオロチオアセトアミド、３，３，３−トリフルオロプロパンアミド、２，２−ジフルオロ−２−フェニルアセトアミド、チオ尿素、及び尿素から選択される[６９]に記載の使用。
[７１]  第二成分がトルフルオロチオアセトアミドである[７０]に記載の使用。
[７２]  第二成分がトリフルオロアセトアミド及び尿素から選択される[５４]に記載の使用。
[７３]  第二成分に対する第一成分のモル比が１：３〜２：１の範囲である[１６]〜[７２の]いずれかに記載の使用。
[７４]  第二成分に対する第一成分のモル比が１：１．５〜１：２．５の範囲である[７３]に記載の使用。
[７５]  第二成分に対する第一成分のモル比が１：２である[７４]に記載の使用。
[７６]  深共晶溶媒が第一成分及び第二成分を含み、第一成分がコリンのハロゲン化塩であり、第二成分が任意に置換されたイミダゾールであり、各置換基が１〜３の炭素原子を有するアルキル基である[１]〜[１５]のいずれかに記載の使用。
[７７]  コリンのハロゲン化塩が塩化コリンである[７６]に記載の使用。
[７８]  置換イミダゾールがメチルイミダゾールである[７６]又は[７７]に記載の使用。[７９]  メチルイミダゾールがＮ−メチルイミダゾールである[７８]に記載の使用。
[８０]  メチルイミダゾールが４−メチルイミダゾールである[７８]に記載の使用。
[８１]  イミダゾールが置換されていない[７６]又は[７７]に記載の使用。
[８２]  第二成分に対する第一成分のモル比が２．８：１〜２：１の範囲である[７６]〜[８１]のいずれかに記載の使用。
[８３]  深共晶溶媒が第一成分及び第二成分を含み、第一成分が式ＩＩＩの化合物を含み、
【０３１９】
【化２２】
2018113982.tif 000046
Ｒ6がＨ又はＯＨであり、
Ｒ7がＨ、ＣＨ3、Ｃｌ、Ｂｒ、カルボニル酸素及び
【０３２０】
【化２３】
2018113982.tif 000047
から選択され;
Ｚが−ＣＨ2−、Ｏ及びＳから選択され、
Ｒ8がＯＨ、１〜３の炭素原子を有するアルキル基、１〜３の炭素原子を有するモノクロロアルキル基、及び１〜３の炭素原子を有するモノフルオロアルキル基、ジフルオロアルキル基又はトリフルオロアルキル基から選択され、
第二成分が糖又は少なくとも３つの炭素原子を有する糖アルコールである[１]〜[１４]のいずれかに記載の使用。
[８４]  糖アルコールがグリセロール、キシリトール及びソルビトールから選択される[８３]に記載の使用。
[８５]  糖アルコールがソルビトールである[８４]に記載の使用。
[８６]  糖がトレハロースである[８３]に記載の使用。
[８７]  第一成分がコリンを含む[８３]〜[８６]のいずれかに記載の使用。
[８８]  第一成分が塩化コリンである[８３]に記載の使用。
[８９]  第二成分に対する第一成分のモル比が１：２〜２：１の範囲である[８３]〜[８８]のいずれかに記載の使用。
[９０]  第二成分に対する第一成分のモル比が１：０．８〜１：１．２の範囲である[８９]に記載の使用。
[９１]  深共晶溶媒が第一成分及び第二成分を含み、第一成分がハロゲン化亜鉛（ＩＩ）又はハロゲン化ジルコニウム（ＩＶ）であり、第二成分が式ＩＶの化合物であり、
【０３２１】
【化２４】
2018113982.tif 000048
ＡはＯ、Ｓ及びＮＨから選択され、
Ｒ1はＨ、１〜６の炭素原子を有するアルケン基、Ｒ9、−ＮＨ2、−ＮＨ（ＣＨ2）ｎＣＨ3、及び−Ｃ（Ｒ3）（Ｒ4）（Ｒ5）から選択され、
ｎは０又は１〜５の整数であり、
Ｒ2はＨ及び１〜３の炭素原子を有する直鎖アルキル基から選択され、
Ｒ3は任意に置換される５員又は６員の脂肪族環又は芳香族環であり、置換基はＲ10であり、
Ｒ4及びＲ5はそれぞれ独立してＨ又はＦであり、
Ｒ9は、１〜３の炭素原子を有するアルキル基、１〜３の炭素原子を有するモノクロロアルキル基、及び１〜３の炭素原子を有するモノフルオロアルキル基、ジフルオロアルキル基又はトリフルオロアルキル基から選択される[１]〜[１４]のいずれかに記載の使用。[９２]  第一成分が尿素である[９１]に記載の使用。
[９３]  第二成分に対する第一成分のモル比が１：３〜１：４である[９１]又は[９２]に記載の使用。
[９４]  第一成分がハロゲン化亜鉛（ＩＩ）であり、ハロゲン化亜鉛（ＩＩ）がＺｎＣｌ2である[９１]〜[９３]のいずれかに記載の使用。
[９５]  第一成分がハロゲン化ジルコニウム（ＩＶ）であり、ハロゲン化ジルコニウム（ＩＶ）がＺｒＣｌ4である[９１]〜[９３]のいずれかに記載の使用。
[９６]  深共晶溶媒が第一成分及び第二成分を含み、第一成分が式Ｖの化合物であり、
【０３２２】
【化２５】
2018113982.tif 000049
Ｙ-はＣｌ-またはＢｒ-であり、
ＸはＮ又はＰであり、
Ｒ12、Ｒ13、Ｒ14及びＲ15はそれぞれ独立して１〜１６の炭素原子を有する直鎖アルキル基、１〜１６の炭素原子を有する直鎖アルコール基、ベンジル基、またはフェニル基であり、
第二成分は、式Ｉの化合物またはその塩であり、
【０３２３】
【化２６】
2018113982.tif 000050
ＡはＯ、Ｓ及びＮＨから選択され、
Ｒ1はＨ、−ＣＨ＝ＣＨ2、Ｒ9、−ＮＨ2、−ＮＨＣＨ3、及び−Ｃ（Ｒ3）（Ｒ4）（Ｒ5）から選択され、
Ｒ2はＨ及び−ＣＨ3から選択され、
Ｒ3は任意に置換される５員又は６員の脂肪族環又は芳香族環であり、置換基はＲ10であり、
Ｒ4及びＲ5はそれぞれ独立してＨ又はＦであり、
Ｒ9、Ｒ10は、それぞれ独立して１〜３の炭素原子を有するアルキル基、１〜３の炭素原子を有するモノクロロアルキル基、及び１〜３の炭素原子を有するモノフルオロアルキル基、ジフルオロアルキル基又はトリフルオロアルキル基から選択される[１]〜[１４]のいずれかに記載の使用。
[９７]  Ｙ-がＣｌ-である[９６]に記載の使用。
[９８]  式Ｖの化合物が第四級アンモニウム塩である[９６]又は[９７]に記載の使用。
[９９]  Ｒ12、Ｒ13、Ｒ14、及びＲ15はそれぞれ独立して１〜４の炭素原子を有する直鎖アルキル基から選択される[９６]〜[９８]のいずれかに記載の使用。
[１００]  Ｒ12、Ｒ13、Ｒ14、及びＲ15はそれぞれメチル基である[９９]に記載の使用。
[１０１]  第一成分が塩化テトラメチルアンモニウムである[１００]に記載の使用。
[１０２]  Ｒ12、Ｒ13、Ｒ14及びＲ15がそれぞれエチル基である[９９]に記載の使用。
[１０３]  第一成分が塩化テトラエチルアンモニウムである[１０２]に記載の使用。
[１０４]  Ｒ12、Ｒ13、Ｒ14及びＲ15がそれぞれブチル基である[９９]に記載の使用。
[１０５]  第一成分が塩化テトラブチルアンモニウムである[１０４]に記載の使用。
[１０６]  第一成分が臭化テトラブチルアンモニウムである[１０４]に記載の使用。
[１０７]  第一成分が
【０３２４】
【化２７】
2018113982.tif 000051
を含む[９６]に記載の使用。
[１０８]  第一成分が
【０３２５】
【化２８】
2018113982.tif 000052
を含む[９６]に記載の使用。
[１０９]  ＸがＰである[９６]又は[９７]に記載の使用。
[１１０]  Ｒ12、Ｒ13、Ｒ14及びＲ15の少なくとも１つがフェニル基である[１０９]に記載の使用。
[１１１]  第一成分がメチルトリフェニルホスホニウムを含む[１１０]に記載の使用。
[１１２]  第一成分が臭化メチルトリフェニルホスホニウムである[１１１]に記載の使用。
[１１３]  ＡがＯ又はＳである[９６]〜[１１２]のいずれかに記載の使用。
[１１４]  Ｒ1が−ＮＨ2及び−ＮＨＣＨ3から選択される[９６]〜[１１３]のいずれかに記載の使用。
[１１５]  第一成分が尿素である[１１４]に記載の使用。
[１１６]  第一成分がトリフルオロチオアセトアミドである[１１３]に記載の使用。
[１１７]  第一成分がトリフルオロアセトアミドである[１１３]に記載の使用。
[１１８]  第二成分に対する第一成分のモル比が１：１．５〜１：２．５である[９６]〜[１１７]のいずれかに記載の使用。
[１１９]  第二成分に対する第一成分のモル比が１：１．８〜１：２．２である[１１８]に記載の使用。
[１２０]  深共晶溶媒が第一成分及び第二成分を含み、第一成分がコリンを含み、第二成分が５〜７の炭素原子を有するアルカンジオールである[１]〜[１４]のいずれかに記載の使用。
[１２１]  アルカンジオールがヘキサンジオールである[１２０]に記載の使用。
[１２２]  深共晶溶媒が第一成分及び第二成分を含み、第一成分がコリンを含み、第二成分がＮ−アルキルピロリドンを含み、Ｎ−アルキル基が１〜５の炭素原子を有する[１]〜[１４]のいずれかに記載の使用。
[１２３]  Ｎ−アルキルピロリドンがＮ−メチルピロリドンである[１２２]に記載の使用。
[１２４]  深共晶溶媒が第一成分及び第二成分を含み、第一成分がコリンを含み、第二成分がβ−メルカプトエタノールを含む[１]〜[１４]のいずれかに記載の使用。
[１２５]  深共晶溶媒が第一成分及び第二成分を含み、第一成分がコリンを含み、第二成分がジチオスレイトールを含む[１]〜[１４]のいずれかに記載の使用。
[１２６]  深共晶溶媒がｐＨ５〜７．５を有する[１]〜[１２５]のいずれかに記載の使用。
[１２７]  深共晶溶媒がｐＨ６〜７を有する[１２６]に記載の使用。
[１２８]  深共晶溶媒が、着色剤、色素、界面活性剤、第四級アンモニウム塩、サポニン、抗菌剤、防湿剤、プローブ、内部対照、抗酸化剤、リボヌクレアーゼインヒビター、緩衝液、キレート剤、溶解ガス、アルコール、及びタンパク質沈殿剤から選択される少なくとも１つの添加剤をさらに含む[１３]〜[１２７]のいずれかに記載の使用。
[１２９]  少なくとも１つの添加剤が、硫酸亜鉛、塩化亜鉛、亜鉛EDTA、硫酸アンモニウム、トシレートアンモニウム、及びソルビトールから選択される[１２８]の記載の使用。[１３０]  少なくとも１つの添加剤が硫酸亜鉛である[１２９]に記載の使用。
[１３１]  少なくとも１つの添加剤が、深共晶溶媒の０．０１重量％〜１重量％で深共晶溶媒に存在する[１２８]〜[１３０]のいずれかに記載の使用。
[１３２]  少なくとも１つの添加剤が、深共晶溶媒の０．０１重量％〜０．２重量％で深共晶溶媒に存在する[１３１]に記載の使用。
[１３３]  少なくとも１つの添加剤が、深共晶溶媒の０．５重量％〜１．５重量％で深共晶溶媒に存在する[１２８]〜[１３２]のいずれかに記載の使用。
[１３４]  少なくとも１つの添加剤が、深共晶溶媒の０．８重量％〜１．２重量％で深共晶溶媒に存在する[１３３]に記載の使用。
[１３５]  少なくとも１つの添加剤が塩化亜鉛である[１３３]又は[１３４]に記載の使用。
[１３６]  深共晶溶媒が、４０体積％〜６０体積％のシリカゲルをさらに含む[１３]〜[１３５]のいずれかに記載の使用。
[１３７]  深共晶溶媒が、深共晶溶媒の２．５重量％〜１２．５重量％でソルビトールをさらに含む[１２９]〜[１３６]のいずれかに記載の使用。
[１３８]  深共晶溶媒が、Ｎ−アルキルピロリドンをさらに含み、Ｎ−アルキル基が１〜５の炭素原子を有する[１３]〜[１３７]のいずれかに記載の使用。
[１３９]  Ｎ−アルキルピロリドンがＮ−メチルピロリドンである[１３８]に記載の使用。
[１４０]  Ｎ−アルキルピロリドンがＮ−エチルピロリドンである[１３９]に記載の使用。
[１４１]  Ｎ−アルキルピロリドンが、深共晶溶媒の２重量％〜２０重量％で深共晶溶媒に存在する[１３８]〜[１４０]のいずれかに記載の使用。
[１４２]  深共晶溶媒が１−ベンジルイミダゾールをさらに含む[１３]〜[１４１]のいずれかに記載の使用。
[１４３]  深共晶溶媒がテトラメチル尿素をさらに含む[１３]〜[１４２]のいずれかに記載の使用。
[１４４]  深共晶溶媒が、深共晶溶媒の５０重量％までの水を含む[１３]〜[１４３]のいずれかに記載の使用。
[１４５]  深共晶溶媒が、深共晶溶媒の５重量％〜１０重量％で水を含む[１４４]に記載の使用。
[１４６]  第一成分が塩化コリンである[１２８]〜[１４５]のいずれかに記載の使用。
[１４７]  第二成分が尿素である[１４６]の記載の使用。
[１４８]  第二成分がトリフルオロアセトアミドである[１４０]に記載の使用。
[１４９]  第二成分に対する第一成分のモル比が０．８：２〜１．２：２の範囲である[１４６]〜[１４８]のいずれかに記載の使用。
[１５０]  細胞又は組織固定用及び／又は生体分子の分解阻害用装置であって、第一深共晶溶媒から形成される第一深共晶溶媒層、及び生体分子を含む試料を受ける第一深共晶溶媒層における凹部を含み、第一深共晶溶媒が固体又はゲルであることを特徴とする装置。[１５１]  第二深共晶溶媒から形成される第二深共晶溶媒層をさらに含み、第二深共晶溶媒層が凹部を取り囲み、第二深共晶溶媒が固体又はゲルである[１５０]に記載の装置。
[１５２]  第一深共晶溶媒及び／又は第二深共晶溶媒が、[１３]〜[１４９]のいずれかに記載の深共晶溶媒である[１５０]又は[１５１]に記載の装置。
[１５３]  第一深共晶溶媒及び／又は第二深共晶溶媒が、３，３，３−トリフルオロプロパンアミド、２，２−ジフルオロ−２−フェニルアセトアミド、尿素及びチオ尿素から選択される成分を含む[１５２]に記載の装置。
[１５４]  第一深共晶溶媒及び／又は第二深共晶溶媒が塩化コリン、ブチリルコリンヨージド、及びＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルグリシンから選択される成分を含む[１５２]又は[１５３]に記載の装置。
[１５５]  ワイヤ、ピン、ブラシ、棒、メッシュ、透過性膜、ポリマーパッド、及びプラスチックホルダーから選択される後つかみ部をさらに含み、該後つかみ部は取り外しできるように試料と結合できる[１５１]〜[１５４]のいずれかに記載の装置。
[１５６]  第一深共晶溶媒及び／又は第二深共晶溶媒が、ポリエチレングリコール、アガロース、ポリアクリレート、及びセルロースから選択される支持性マトリックスを含む[１５１]〜[１５５]のいずれかに記載の装置。
[１５７]  深共晶溶媒を含む容器、及びキャップを含み、キャップが深共晶溶媒を含む容器を密封するように変更可能であり、かつ突き刺し可能である事を特徴とする生物学的試料固定装置。
[１５８]  深共晶溶媒が[１３]〜[１４９]のいずれかに記載の深共晶溶媒である[１５７]に記載の使用。
[１５９]  キャップが自己シール性である[１５７]又は[１５８]に記載の装置。
【図１】
2018113982.tif 000057
【図２】
2018113982.tif 000058
【図３】
2018113982.tif 000059
【図４】
2018113982.tif 000060
【図５Ａ】
2018113982.tif 000061
【図５Ｂ】
2018113982.tif 000062
【図６】
2018113982.tif 000063
【図７】
2018113982.tif 000064
【図８】
2018113982.tif 000065
【図９】
2018113982.tif 000066
【図１０】
2018113982.tif 000067
【図１１】
2018113982.tif 000068
【図１２】
2018113982.tif 000069
【図１３】
2018113982.tif 000070
【図１４】
2018113982.tif 000071
【図１５】
2018113982.tif 000072
【図１６】
2018113982.tif 000073
【図１７】
2018113982.tif 000074
【手続補正書】
【提出日】平成30年4月27日(2018.4.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体分子の分解を阻害する深共晶溶媒（deep eutectic solvent）の使用であって、
生体分子が、ＤＮＡまたはタンパク質であり、
深共晶溶媒が第一成分及び第二成分を含み、第一成分が式Ｉの化合物であり、
【化１】
2018113982.tif 000075
Ｒ6がＨ又はＯＨであり、
Ｒ7がＨ、ＣＨ3、Ｃｌ、Ｂｒ、カルボニル酸素及び
【化２】
2018113982.tif 000076
から選択され;
Ｚが−ＣＨ2−、Ｏ及びＳから選択され、
Ｒ8がＲ11又はＯＨであり、
第二成分が式ＩＩの化合物またはその塩を含み、
【化３】
2018113982.tif 000077
ＡはＯ、Ｓ及びＮＨから選択され、
Ｒ1はＲ9、及び−Ｃ（Ｒ3）（Ｒ4）（Ｒ5）から選択され、
Ｒ2はＨ及び１〜３の炭素原子を有する直鎖アルキル基から選択され、
Ｒ3は置換されていない５員又は６員の脂肪族環又は芳香族環であるか、或いは置換されている５員又は６員の脂肪族環又は芳香族環であり、置換基はＲ10であり、
Ｒ4及びＲ5はＦであり、
Ｒ9がモノ−、ジ−又はトリフルオロメチル基であるか、モノ−、ジ−又はトリフルオロエチル基であり、
Ｒ10及びＲ11は、それぞれ独立して、１〜３の炭素原子を有するアルキル基、１〜３の炭素原子を有するモノクロロアルキル基、及び１〜３の炭素原子を有するモノフルオロアルキル基、ジフルオロアルキル基又はトリフルオロアルキル基から選択される、使用。
【請求項２】
生体分子がタンパク質であり、タンパク質がリンタンパク質である請求項１に記載の使用。
【請求項３】
生体分子が試料又は組織中に存在する請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
Ｒ9がモノ−、ジ−又はトリフルオロメチル基である請求項１又は２に記載の使用。
【請求項５】
第二成分がトリフルオロアセトアミド、トリフルオロチオアセトアミド、又はＮ−メチルトリフルオロアセトアミドである請求項４に記載の使用。
【請求項６】
第一成分がコリン、臭化コリン、又はＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルグリシンを含む請求項１〜５のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
第一成分が、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルグリシンであり、第二成分が、トリフルオロアセトアミドである請求項１〜３のいずれかに記載の使用。
【請求項８】
第二成分に対する第一成分のモル比が１：１．５〜１：２．５の範囲である請求項１〜７のいずれかに記載の使用。