(57)【要約】【課題】抗がん活性に優れ、経口投与が可能な新規錯体、及びそれを有効成分とする抗がん剤を提供することを目的とする。【解決手段】下記式［２］2018135297.tif 000023で表される金属錯体又はその塩を有効成分とする抗がん剤である。【選択図】図１７
2018135297.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式［１］
【化１】
2018135297.tif 000020
（式中、Ｍは、Ｐｔ又はＰｄであり、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素数１〜３の直鎖状もしくは分枝状アルキル基であるか、又はＲ１及びＲ２は一緒になって、炭素数５もしくは６の環状の飽和炭化水素を形成し、
Ｒ３〜Ｒ１１は、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１〜３０のアルキル基、炭素数３〜３０のシクロアルキル基、炭素数２〜３０のアルケニル基、炭素数３〜３０のシクロアルケニル基、炭素数２〜３０のアルキニル基、炭素数７〜３０のアラルキル基、炭素数７〜３０のアラルケニル基、炭素数７〜３０のアラルキニル基、炭素数６〜３０のアリール基、ハロゲン原子、炭素数１〜３０のハロアルキル基、炭素数２〜３０のハロアルケニル基、炭素数２〜３０のハロアルキニル基、炭素数６〜３０のハロアリール基、炭素数１〜３０のアルコキシ基、炭素数６〜３０のアリールオキシ基、ヒドロキシ基、アミノ基、炭素数１〜３０のアルキルアミノ基、炭素数６〜３０のアリールアミノ基、シアノ基又はニトロ基である。）
で表される金属錯体又はその塩。
【請求項２】
Ｍが、Ｐｔである請求項１に記載の金属錯体又はその塩。
【請求項３】
Ｒ３〜Ｒ１１が、水素原子である請求項１又は２に記載の金属錯体又はその塩。
【請求項４】
下記式［２］
【化２】
2018135297.tif 000021
で表される金属錯体又はその塩。
【請求項５】
下記式［３］
【化３】
2018135297.tif 000022
で表される金属錯体又はその塩。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の金属錯体又はその塩を有効成分として含有する抗がん剤。
【請求項７】
経口投与用である請求項６に記載の抗がん剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、金属錯体、及びそれを有効成分とする抗がん剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在臨床で用いられている白金製剤として、シスプラチンやオキサリプラチン等の白金−ジアミン骨格を有する白金（ＩＩ）錯体があり、現在では分子標的薬と組み合わせた研究等、その広がりは多岐に及んでいる。
【０００３】
しかし一方で、シスプラチンには腎毒性、オキサリプラチンには末梢神経障害といったそれぞれ重大な副作用があり、患者に長時間の点滴や安静等を強いることになる上、副作用の程度が治療の続行に影響する場合もある。また、これらの製剤は点滴静注が必要となるが、オキサリプラチンを末梢静脈から投与する場合には血管痛が生じるため、その点ではやや使いにくい面がある。患者のＱＯＬを改善するため、既存の白金製剤と同等の効果が得られる経口製剤の開発が望まれる。
【０００４】
シスプラチン後の白金抗がん剤として、（特許文献１）には、Ｐｔ（ＩＶ）錯体化によって脂溶性・安定性を向上させた医薬が開示されている。しかし、この白金（ＩＶ）錯体は、経口投与可能な白金製剤としての評価が行われたが、効果が小さく、また、吐き気を伴う等の副作用もあった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１６／２０８４８１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで本発明は、抗がん活性に優れ、経口投与が可能な新規錯体、及びそれを有効成分とする抗がん剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、特定構造のジアミンに対してアントラセン環を結合させた９−アントラセニルジアミンを合成し、これをシスプラチン、オキサリプラチンと結合させてプロドラッグ化したところ、腫瘍細胞への取り込み増大と抗がん活性の増強が確認され、また、酸で分解されず経口投与が可能であることを見い出し、発明を完成した。すなわち、本発明の要旨は次のとおりである。
【０００８】
（１）下記式［１］
【化１】
2018135297.tif 000003
（式中、Ｍは、Ｐｔ又はＰｄであり、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素数１〜３の直鎖状もしくは分枝状アルキル基であるか、又はＲ１及びＲ２は一緒になって、炭素数５もしくは６の環状の飽和炭化水素を形成し、
Ｒ３〜Ｒ１１は、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１〜３０のアルキル基、炭素数３〜３０のシクロアルキル基、炭素数２〜３０のアルケニル基、炭素数３〜３０のシクロアルケニル基、炭素数２〜３０のアルキニル基、炭素数７〜３０のアラルキル基、炭素数７〜３０のアラルケニル基、炭素数７〜３０のアラルキニル基、炭素数６〜３０のアリール基、ハロゲン原子、炭素数１〜３０のハロアルキル基、炭素数２〜３０のハロアルケニル基、炭素数２〜３０のハロアルキニル基、炭素数６〜３０のハロアリール基、炭素数１〜３０のアルコキシ基、炭素数６〜３０のアリールオキシ基、ヒドロキシ基、アミノ基、炭素数１〜３０のアルキルアミノ基、炭素数６〜３０のアリールアミノ基、シアノ基又はニトロ基である。）
で表される金属錯体又はその塩。
（２）Ｍが、Ｐｔである上記（１）に記載の金属錯体又はその塩。
（３）Ｒ３〜Ｒ１１が、水素原子である上記（１）又は（２）に記載の金属錯体又はその塩。
（４）下記式［２］
【化２】
2018135297.tif 000004
で表される金属錯体又はその塩。
（５）下記式［３］
【化３】
2018135297.tif 000005
で表される金属錯体又はその塩。
（６）上記（１）〜（５）のいずれかに記載の金属錯体又はその塩を有効成分として含有する抗がん剤。
（７）経口投与用である上記（６）に記載の抗がん剤。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の金属錯体又はその塩は、細胞内に取り込まれ易く、抗がん活性にも優れている。また、強酸条件下でも安定であるため、胃酸で分解されずに腸管へ到達し、吸収されることを期待して、経口投与用のプロドラッグとして用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ＡｔＣ２・ＨＣｌ、Ｐｔ（ＮＨ３）２（ＡｔＣ２）Ｃｌ２、及びＰｔ（ｄａｃｈ）（ＡｔＣ２）Ｃｌ２の蛍光スペクトルを示す図である。
【図２】ＡｔＣ３・ＨＣｌ、Ｐｔ（ＮＨ３）２（ＡｔＣ３）Ｃｌ２、及びＰｔ（ｄａｃｈ）（ＡｔＣ３）Ｃｌ２の蛍光スペクトルを示す図である。
【図３】強酸下におけるＰｔ（ＮＨ３）２（ＡｔＣ２）Ｃｌ２の２４時間後の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図４】強酸下におけるＰｔ（ＮＨ３）２（ＡｔＣ２）Ｃｌ２の７日後の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図５】強酸下におけるＰｔ（ＮＨ３）２（ＡｔＣ３）Ｃｌ２の２４時間後の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図６】強酸下におけるＰｔ（ＮＨ３）２（ＡｔＣ３）Ｃｌ２の７日後の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図７】強酸下におけるＰｔ（ｄａｃｈ）（ＡｔＣ２）Ｃｌ２の２４時間後の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図８】強酸下におけるＰｔ（ｄａｃｈ）（ＡｔＣ２）Ｃｌ２の７日後の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図９】強酸下におけるＰｔ（ｄａｃｈ）（ＡｔＣ３）Ｃｌ２の２４時間後の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図１０】強酸下におけるＰｔ（ｄａｃｈ）（ＡｔＣ３）Ｃｌ２の７日後の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図１１】オキサリプラチン及びＰｔ（ｄａｃｈ）（ＡｔＣ３）に曝露後、２時間及び２４時間経過後の細胞に取り込まれたＰｔ量を示すグラフである。
【図１２】Ｐｔ（ｄａｃｈ）（ＡｔＣ３）入メディウムに暴露したヒト結腸腺癌細胞ＬＳ１８０の２４時間経過後の蛍光顕微鏡像（２０倍）である。左側が励起光露光像、右側が明視野像と励起光露光像を重ねた像である。
【図１３】Ｐｔ（ｄａｃｈ）（ＡｔＣ３）入メディウムにヒト結腸腺癌細胞ＬＳ１８０を２４時間暴露し、核染色を行った後の蛍光顕微鏡像（１００倍）である。左側が、明視野像・青色励起光露光像を重ねた像、右側が明視野像・赤色励起光露光像を重ねた像である。
【図１４】Ｐｔ（ｄａｃｈ）（ＡｔＣ３）を静脈内投与後２、５、２４及び４８時間の各臓器における分布を示すグラフである。
【図１５】オキサリプラチンを静脈内投与後２、５、２４及び４８時間の各臓器における分布を示すグラフである。
【図１６】Ｐｔ（ｄａｃｈ）（ＡｔＣ３）を経口投与後３、５、２４及び４８時間の各臓器における分布を示すグラフである。
【図１７】がん移植マウスにＰｔ（ｄａｃｈ）（ＡｔＣ３）を経口投与したときの腫瘍サイズの変化を示すグラフである。
【図１８】がん移植マウスにＰｔ（ｄａｃｈ）（ＡｔＣ３）を経口投与したときの体重の変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、実施の形態に基づき本発明を詳細に説明する。
本実施形態に係る金属錯体は、下記式［１］で表される。
【化４】
2018135297.tif 000006
【００１２】
式［１］において、Ｍは、Ｐｔ又はＰｄである。本実施形態の金属錯体（又はその塩）は、貴金属である白金（Ｐｔ）又はパラジウム（Ｐｄ）を含有することにより、優れた抗がん効果を発揮する。体内においてタンパク質等の生体物質と置換反応を受けにくく、副作用が少ないという観点から、Ｍは好ましくはＰｔである。
【００１３】
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素数１〜３の直鎖状もしくは分枝状アルキル基であるか、又はＲ１及びＲ２は一緒になって、炭素数５もしくは６の環状の飽和炭化水素を形成している。
【００１４】
炭素数１〜３の直鎖状もしくは分枝状アルキル基の例としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基等が挙げられる。
【００１５】
また、Ｒ３〜Ｒ１１は、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１〜３０のアルキル基、炭素数３〜３０のシクロアルキル基、炭素数２〜３０のアルケニル基、炭素数３〜３０のシクロアルケニル基、炭素数２〜３０のアルキニル基、炭素数７〜３０のアラルキル基、炭素数７〜３０のアラルケニル基、炭素数７〜３０のアラルキニル基、炭素数６〜３０のアリール基、ハロゲン原子、炭素数１〜３０のハロアルキル基、炭素数２〜３０のハロアルケニル基、炭素数２〜３０のハロアルキニル基、炭素数６〜３０のハロアリール基、炭素数１〜３０のアルコキシ基、炭素数６〜３０のアリールオキシ基、ヒドロキシ基、アミノ基、炭素数１〜３０のアルキルアミノ基、炭素数６〜３０のアリールアミノ基、シアノ基又はニトロ基である。
【００１６】
炭素数１〜３０のアルキル基の例としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、１，２−ジメチルプロピル基、ｎ−ヘキシル基、１，３−ジメチルブチル基、１−イソプロピルプロピル基、１，２−ジメチルブチル基、ｎ−ヘプチル基、１，４−ジメチルペンチル基、２−メチル−１−イソプロピルプロピル基、１−エチル−３−メチルブチル基、ｎ−オクチル基、２−エチルヘキシル基、３−メチル−１−イソプロピルブチル基、２−メチル−１−イソプロピル基、１−ｔ−ブチル−２−メチルプロピル基、ｎ−ノニル基、３，５，５−トリメチルヘキシル基等が挙げられる。
【００１７】
炭素数３〜３０のシクロアルキル基の例としては、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基等が挙げられる。
【００１８】
炭素数２〜３０のアルケニル基の例としては、ビニル基、アリル基、プロペニル基、イソプロペニル基、２−メチル−１−プロペニル基、２−メチルアリル基、２−ブテニル基等が挙げられる。
【００１９】
炭素数３〜３０のシクロアルケニル基の例としては、シクロプロペニル基、シクロブテニル基、２−シクロペンテン−１−イル基、２−シクロヘキセン−１−イル基、３−シクロヘキセン−１−イル基等が挙げられる。
【００２０】
炭素数２〜３０のアルキニル基の例としては、エチニル基、２−プロピニル基、２−ブチニル基等が挙げられる。
【００２１】
炭素数７〜３０のアラルキル基の例としては、ベンジル基、フェネチル基、ジフェニルメチル基等が挙げられる。
【００２２】
炭素数７〜３０のアラルケニル基の例としては、スチリル基、２−フェニル−１−プロペニル基、３−フェニル−２−ブテニル基、２−ナフチルエテニル基等が挙げられる。
【００２３】
炭素数７〜３０のアラルキニル基の例としては、２−フェニルエチニル基、２−ナフチルエチニル基等が挙げられる。
【００２４】
炭素数６〜３０のアリール基の例としては、フェニル基、トリル基、キシリル基、エチルフェニル基、ナフチル基、アントラニル基等が挙げられる。
【００２５】
ハロゲン原子は、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素である。
【００２６】
炭素数１〜３０のハロアルキル基の例としては、トリフルオロメチル基、ジフルオロメチル基、トリクロロメチル基、ジクロロメチル基、フルオロメチル基、クロロメチル基、ヨードメチル基、ブロモメチル基、ペンタフルオロエチル基、ペンタクロロエチル基等が挙げられる。
【００２７】
炭素数２〜３０のハロアルケニル基の例としては、２，２−ジフルオロエテニル基、２，２−ジクロロエテニル基、３−クロロ−２−アリル基、３，３−ジクロロ−２−アリル基、２，３−ジブロモ−２−アリル基等が挙げられる。
【００２８】
炭素数２〜３０のハロアルキニル基の例としては、３−クロロ−２−プロピニル基、１，３−ジクロロ−２−プロピニル基、１，３−ジブロモ−２−プロピニル基等が挙げられる。
【００２９】
炭素数６〜３０のハロアリール基の例としては、クロロフェニル基（例えば、４−クロロフェニル基）、ブロモフェニル基、フルオロフェニル基等が挙げられる。
【００３０】
炭素数１〜３０のアルコキシ基の例としては、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ブトキシ基、ヘキシルオキシ基、オクチルオキシ基、２−エチルヘキシルオキシ基等が挙げられる。
【００３１】
炭素数６〜３０のアリールオキシ基の例としては、フェニルオキシ基、ナフチルオキシ基、ビフェニルオキシ基等が挙げられる。
【００３２】
炭素数１〜３０のアルキルアミノ基の例としては、メチルアミノ基、エチルアミノ基、ヘキシルアミノ基、ドデシルアミノ基等が挙げられる。
【００３３】
炭素数６〜３０のアリールアミノ基の例としては、フェニルアミノ基、ナフチルアミノ基、ベンジルアミノ基、インダニルアミノ基、インデニルアミノ基等が挙げられる。
【００３４】
好ましくは、アントラセン環は非置換であり、すなわち、Ｒ３〜Ｒ１１は水素原子である。また、好ましくは、Ｒ１及びＲ２が水素原子であるか、Ｒ１及びＲ２は一緒になって、炭素数６の環状の飽和炭化水素を形成している。つまり、本実施形態の金属錯体の好ましい具体例は、下記式［２］又は式［３］で表される。式［２］及び式［３］の金属錯体は、それぞれ、シスプラチン及びオキサリプラチンをプロドラッグ化した化合物に相当する。
【００３５】
【化５】
2018135297.tif 000007
【化６】
2018135297.tif 000008
【００３６】
なお、上述した式［１］で表される金属錯体においては、中心金属Ｍに対するリガンドの配位の向きによって、幾何異性体が存在し得る。式［１］において一部の配位結合を波線（〜〜〜）によって表現しているのはこのためである。
【００３７】
幾何異性体が存在し得る金属錯体を製造する際には、選択的に製造するのでない限り、生成物が２種の幾何異性体の当量混合物として得られるのが通常である。この場合、得られた幾何異性体の混合物から一方のみを精製する手段としては、例えば、結晶化法，クロマトグラフィー法等が挙げられる。本発明においては、このような精製処理が施されていない混合物の形態であっても、また、精製処理が施された後の一方の異性体のみの形態であっても、いずれも請求項に記載された発明の技術的範囲に包含されるものとする。
【００３８】
本実施形態に係る金属錯体は塩の形態であっても良い。金属錯体が塩の形態である場合における対アニオンの種類については特に限定されるものではない。このような対アニオンとしては、例えば、塩化物イオン、フッ化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオン等のハロゲン化物イオン、硝酸イオン、硫酸イオン、リン酸イオン、酢酸イオン、炭酸イオン、過塩素酸イオン等が挙げられる。
【００３９】
本発明の金属錯体又はその塩の製造方法については特に制限はなく、本願の出願時における技術常識を参酌することにより、製造が可能である。
【００４０】
本実施形態に係る金属錯体の製造方法の一例としては、テトラクロリド白金酸カリウムＫ２ＰｔＣｌ４等の塩化白金酸塩や塩化パラジウム酸塩等の貴金属錯体を原料として、シスプラチン等の白金又はパラジウムの錯体を形成した後、得られた錯体を下記の「ＡｔＣ３」で表されるアントラセン環を有するジアミン誘導体と反応させて目的の金属錯体を得る方法が例示される。ここでＡｔＣ３は、置換又は非置換の９−アントラセンカルボキシアルデヒドとジアミノプロパンを反応させることにより得ることができる。
【００４１】
【化７】
2018135297.tif 000009
【００４２】
上記反応の際、ＡｔＣ３の種類をＲ３〜Ｒ１１の置換基に応じて適宜選択することにより、所望の置換基を有する金属錯体を製造することができる。また、用いる貴金属錯体の有する貴金属原子（Ｐｔ又はＰｄ）を選択することによって、得られる金属錯体に対して所望の貴金属原子を導入することができる。なお、上記の方法では原料としての貴金属錯体がリガンドとして塩素原子を有しているが、この形態には限られず、後段の反応においてＡｔＣ３と置換され得るリガンドであれば、特に制限されることなく用いることができる。
【００４３】
なお、得られた金属錯体は、従来公知の精製手段によって、適宜精製され得る。これは、後述する他の化合物についても、同様である。
【００４４】
反応条件についても特に制限はなく、適宜設定され得る。一例を挙げると、シスプラチン等の白金又はパラジウムの錯体とＡｔＣ３とを反応させる際の温度は、通常は室温〜８０℃であり、好ましくは室温〜６０℃である。また、反応時間は、通常は２時間〜１週間であり、好ましくは数時間〜数日である。
【００４５】
本実施形態に係る金属錯体又はその塩は、後述するように高い抗がん活性を有することから、抗がん剤として用いられ得る。すなわち、上述した金属錯体又はその塩を有効成分とする抗がん剤が提供されるのである。
【００４６】
本実施形態の抗がん剤が適用されるがんの種類は、特に限定されず、例えば、白血病、悪性黒色腫、悪性リンパ腫、消化器がん、肺がん、食道がん、胃がん、大腸がん、直腸がん、結腸がん、尿管腫瘍、胆嚢がん、胆管がん、胆道がん、乳がん、肝臓がん、膵臓がん、睾丸腫瘍、上顎がん、舌がん、口唇がん、口腔がん、咽頭がん、喉頭がん、卵巣がん、子宮がん、前立腺がん、甲状腺がん、脳腫瘍、カポジ肉腫、血管腫、真性多血症、神経芽腫、網膜芽腫、骨髄腫、膀胱腫、肉腫、骨肉腫、筋肉腫、皮膚がん、基底細胞がん、皮膚付属器がん、皮膚転移がん、皮膚黒色腫等が挙げられる。また、悪性腫瘍のみならず、良性腫瘍への適用も可能である。また、本実施形態に係る抗がん剤は、がん転移を抑制するために使用することができ、特に、術後のがん転移抑制剤としても有用である。
【００４７】
本実施形態に係る抗がん剤を使用するに当たっては、種々の形態でヒト又は動物（特に好ましくはヒト）に投与することができる。投与形態としては、経口投与でも良いし、静脈内、筋肉内、皮下又は皮内等への注射、直腸内投与、経粘膜投与等の非経口投与でも良い。経口投与に適する製剤形態としては、例えば、錠剤、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤等が挙げられる。また、非経口投与に適する医薬組成物としては、例えば、注射剤、点滴剤、点鼻剤、噴霧剤、吸入剤、坐剤等の外用固形剤、又は、軟膏、クリーム、粉状塗布剤、液状塗布剤、貼付剤等の経皮吸収剤等が挙げられる。さらに、本実施形態に係る抗がん剤の製剤形態として、埋め込み用ペレットや公知の技術により調製される持続性製剤が挙げられる。
【００４８】
好ましい投与形態や製剤形態等は、患者の年齢、性別、体質、症状、処置時期等に応じて、医師によって適宜選択される。
【００４９】
特に、本実施形態に係る抗がん剤は、胃酸で分解されずに腸管へ到達して吸収され、腫瘍細胞への取り込みが大きく、細胞内で分解されて抗がん活性を発揮するプロドラッグとして機能し得る。そのため、経口投与用の抗がん剤として有用である。
【００５０】
抗がん剤が、錠剤、丸剤、散剤、粉剤、顆粒剤等の固形製剤である場合、これらの固形製剤は、本実施形態に係る金属錯体又はその塩を、常法に従って適当な添加剤、例えば、乳糖、ショ糖、Ｄ−マンニトール、トウモロコシデンプン、合成もしくは天然ガム、結晶セルロース等の賦形剤、デンプン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アラビアゴム、ゼラチン、ポリビニルピロリドン等の結合剤、カルボシキメチルセルロースカルシウム、カルボシキメチルセルロースナトリウム、デンプン、コーンスターチ、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸カルシウム等の滑沢剤、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸ナトリウム等の充填剤又は希釈剤等と適宜混合することにより製造することができる。錠剤等には、必要に応じて、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、白糖、ポリエチレングリコール、酸化チタン等のコーティング剤を用いて、糖衣、ゼラチン、腸溶被覆、フイルムコーティング等が施されても良い。
【００５１】
抗がん剤が、注射剤、点眼剤、点鼻剤、吸入剤、噴霧剤、ローション剤、シロップ剤、液剤、懸濁剤、乳剤等の液状製剤である場合、これらの液状製剤は、本実施形態に係る金属錯体又はその塩に、精製水、リン酸緩衝液等の適当な緩衝液、生理的食塩水、リンゲル溶液、ロック溶液等の生理的塩類溶液、カカオバター、ゴマ油、オリーブ油等の植物油、鉱油、高級アルコール、高級脂肪酸、エタノール等の有機溶媒等に溶解して、必要に応じてコレステロール等の乳化剤、アラビアゴム等の懸濁剤、分散助剤、浸潤剤、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油系、ポリエチレングリコール系等の界面活性剤、リン酸ナトリウム等の溶解補助剤、糖、糖アルコール、アルブミン等の安定化剤、パラベン等の保存剤、塩化ナトリウム、ブドウ糖、グリセリン等の等張化剤、緩衝剤、無痛化剤、吸着防止剤、保湿剤、酸化防止剤、着色剤、甘味料、フレーバー、芳香物質等を適宜添加することにより、滅菌された水溶液、非水溶液、懸濁液、リポソーム又はエマルジョン等として調製することができる。この際、注射剤は、生理学的なｐＨを有することが好ましく、６〜８の範囲内のｐＨを有することが特に好ましい。
【００５２】
抗がん剤が、ローション剤、クリーム剤、軟膏等の半固形製剤の場合、これらの半固形製剤は、本実施形態に係る金属錯体又はその塩を脂肪、脂肪油、ラノリン、ワセリン、パラフィン、蝋、硬膏剤、樹脂、プラスチック、グリコール類、高級アルコール、グリセリン、水、乳化剤、懸濁化剤等と適宜混和することによって製造することができる。
【００５３】
抗がん剤における、本実施形態に係る金属錯体又はその塩の含有量は、投与形態、重篤度や所望の投与量等に応じて変動し得るが、一般的には、抗がん剤の全質量に対して、０．００１〜８０質量％、好ましくは０．１〜５０質量％である。
【００５４】
抗がん剤の投与量は、例えば患者の年齢、性別、体重、症状、及び投与経路等の条件に応じて、医師により適宜決定され得る。一般的には、成人一日当たりの有効成分の量として１μｇ／ｋｇから１，０００ｍｇ／ｋｇ程度の範囲であり、好ましくは１０μｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇ程度の範囲である。このような投与量の抗がん剤は、一日一回投与されても良いし、一日数回（例えば、２〜４回程度）に分けて投与されても良い。
【００５５】
抗がん剤を使用するに当たっては、既知の化学療法、外科的治療法、放射線療法、温熱療法や免疫療法等と併用しても良い。
【００５６】
本実施形態に係る抗がん剤は、極めて高い抗がん活性を示す。また、重篤な副作用（腎毒性、吐き気等）が問題となっている従来の白金製剤と比較して、顕著に副作用が低減されている。したがって、既存の白金製剤に代替し得る可能性を秘めたものであり、非常に有望な新規薬剤となり得る。
【実施例】
【００５７】
以下、実施例及び比較例に基づき本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００５８】
１．合成
下記の方法により、金属錯体の合成を行った。合成した化合物は、１Ｈ−ＮＭＲ、元素分析によって同定した。
（１）ｃｉｓ−Ｐｔ（ＮＨ３）２Ｉ２の合成
Ｋ２ＰｔＣｌ４  ２．０ｇ（４．８ｍｍｏｌ）をＨ２Ｏ  ２０ｍｌに溶解し、ＫＩ  ３．３ｇ（１９．８ｍｍｏｌ）を加えて５０℃の湯浴で５分間撹拌した。２８％アンモニア水  １ｍＬ（５２．９ｍｍｏｌ）にこの溶液を加え、２分間撹拌した。３時間静置後、黄色粉末をろ取した。熱水、エタノール、ジエチルエーテルの順で洗浄後、真空乾燥した。
収量：  ２．１１ｇ
収率：  ９１．１％
元素分析：  H6N2I2Pt1 (M=482.88)
【化８】
2018135297.tif 000010
【００５９】
（２）ｃｉｓ−Ｐｔ（ＮＨ３）２Ｃｌ２の合成
ＡｇＮＯ３  ０．６８ｇ（４．０ｍｍｏｌ）をＨ２Ｏ  ８０ｍｌに溶解し、ｃｉｓ−Ｐｔ（ＮＨ３）２Ｉ２  ０．９６ｇ（２．０ｍｍｏｌ）を溶解した１０ｍｌのジメチルアセトアミド溶液を加えて、遮光し一晩撹拌した。溶液を濾過してＡｇＩを除去し１Ｍ  ＮａＣｌ  ２ｍＬを加え、６０℃で一晩撹拌した。生成した黄色粉末をろ取し、大量の冷水で洗浄した。
収量：  ０．３７４ｇ
収率：  ６１．７％
元素分析：  H6N2PtCl2 (M=300.08)
calcd. C:0.00% H:2.00% N:9.33%
obsd. C:0.00% H:1.84% N:9.44%
【化９】
2018135297.tif 000011
【００６０】
（３）Ｐｔ（ｄａｃｈ）Ｃｌ２の合成
Ｈ２Ｏ  ２０ｍｌにＫ２ＰｔＣｌ４  ２．０ｇ（４．８ｍｍｏｌ）を加え１Ｒ，２Ｒ−シクロヘキサンジアミン（ｄａｃｈ）０．５７ｇ（５．０ｍｍｏｌ）をＨ２Ｏ  ２０ｍｌに溶かした。これを６０℃で５時間加熱撹拌した。生成した黄色い粉末をろ取し、Ｈ２Ｏで洗浄後、乾燥した。
収量：  １．３１ｇ
収率：  ７１．８％
元素分析：  C6H14N2PtCl2 (M=380.08)
calcd. C:18.95% H:3.68% N:7.37%
obsd. C:18.64% H:3.60% N:7.12%
【化１０】
2018135297.tif 000012
【００６１】
（４）ＡｔＣ２の合成
ＣＨＣｌ３  ４０ｍＬとＭｅＯＨ  １０ｍＬを混ぜた溶液にエチレンジアミン５ｍｌ（７４．９ｍｍｏｌ）と９−アントラセンカルボキシアルデヒド２．０６ｇ（１０ｍｍｏｌ）を加え、一晩撹拌した。その後ＮａＢＨ４  １．１３ｇ（３０ｍｍｏｌ）を少しずつ加え、一晩撹拌した。エバポレートすることで溶媒をとばし、３５％ＨＣｌを加えて酸性とし、１０Ｎ  ＮａＯＨを加えてアルカリ性とした。
ＣＨＣｌ３  ５０ｍｌで抽出し、１％Ｎａ２ＣＯ３  ５０ｍｌで３回洗った後、有機層を分離した。
無水ＭｇＳＯ４で脱水した後、エバポレートし、残渣を２０ｍｌのＥｔＯＨに溶かし、一晩撹拌し、３５％ＨＣｌを加えて撹拌することで化合物を得た。
収量：  １．４９ｇ
収率：  ４６．１％
元素分析：  C17H18N2・2HCl (0H2O M=252 2HCl M'=323)
calcd. C:63.16% H:6.19% N:8.67%
obsd. C:63.28% H:6.16% N:8.74%
NMR (D2O,TSP基準)
δ1(s):8.662 δ2(d):8.271 δ3(d):8.154 δ4(dd):7.737 δ5(dd):7.635 C2 δ1(s):5.267 δ2(dd):3.136 δ3(dd):3.397
【化１１】
2018135297.tif 000013
【００６２】
（５）ＡｔＣ３の合成
ＣＨＣｌ３  ４０ｍＬとＭｅＯＨ  １０ｍＬを混ぜた溶液に１，３−ジアミノプロパン５ｍｌ（５９．９ｍｍｏｌ）と９−アントラセンカルボキシアルデヒド２．０６ｇ（１０ｍｍｏｌ）を加え、一晩撹拌した。その後ＮａＢＨ４  １．１３ｇ（３０ｍｍｏｌ）を少しずつ加え、一晩撹拌した。エバポレートすることで溶媒をとばし３５％ＨＣｌを加えて酸性とし、１０Ｎ  ＮａＯＨを加えてアルカリ性とした。
ＣＨＣｌ３  ５０ｍｌで抽出し、１％Ｎａ２ＣＯ３  ５０ｍｌで３回洗った後、有機層を分離した。
無水ＭｇＳＯ４で脱水した後、エバポレートし、残渣を２０ｍｌのＥｔＯＨに溶かし、一晩撹拌し、３５％ＨＣｌを加えて撹拌することで化合物を得た。
収量：  １．８１ｇ
収率：  ５３．７％
元素分析：  C18H20N2・2HCl (0H2O M=266 2HCl M'=337)
calcd. C:64.09% H:6.52% N:8.31%
obsd. C:63.90% H:6.89% N:7.98%
NMR (D2O,TSP基準)
δ1(d):8.630 δ2(dd):8.232 δ3(dd):8.140 δ4(t):7.732 δ5(t):7.634 C2 δ1(s):5.875 δ2(t):3.361 δ3(t):3.092 δ4(m):2.182,2.102
【化１２】
2018135297.tif 000014
【００６３】
（６）Ｐｔ（ＮＨ３）２（ＡｔＣ２）Ｃｌ２の合成
ＡｔＣ２・２ＨＣｌ  ０．４２ｇ（１．３ｍｍｏｌ）をＨ２Ｏ  １０ｍｌに溶かし、ＮａＯＨ  ０．２０ｇ（５ｍｍｏｌ）を加えた。ＣＨＣｌ３  ２０ｍＬを加えてＡｔＣ３を抽出し、エバポレートしＥｔＯＨ  １０ｍＬに溶解した。これにＰｔ（ＮＨ３）２Ｃｌ２  ０．１５ｇ（０．５ｍｍｏｌ）の５ｍｌ  Ｈ２Ｏ溶液を加え、６０℃で２４時間撹拌し、ろ液が１〜２ｍｌになるまでエバポレートし、アセトンで再沈澱し、黄色粉末を吸引ろ過でろ取し、洗浄した後乾燥した。
収量：  ０．２１２ｇ
収率：  ７１．３％
元素分析：  C17H24N4PtCl2・2.5H2O (0H2O M=550.08 2.5H2O M'=595.08)
calcd. C:34.28% H:4.87% N:9.41%
obsd. C:34.05% H:4.82% N:9.64%
NMR (D2O,TSP基準)
アントラセン環 δ1(d):8.740 δ2(d):8.206 δ3(t):7.801 δ4(t):7.667 C2 δ1(d):5.218 δ2(m):3.400,3.325 δ3(m):3.173,3.074 δ4(m):2.959.2.921
【化１３】
2018135297.tif 000015
【００６４】
（７）Ｐｔ（ＮＨ３）２（ＡｔＣ３）Ｃｌ２の合成
ＡｔＣ３・２ＨＣｌ  ０．４４ｇ（１．３ｍｍｏｌ）をＨ２Ｏ  １０ｍｌに溶かし、ＮａＯＨ  ０．２０ｇ（５ｍｍｏｌ）を加えた。ＣＨＣｌ３  ２０ｍＬを加えてＡｔＣ３を抽出し、エバポレートしＥｔＯＨ  １０ｍＬに溶解した。これにＰｔ（ＮＨ３）２Ｃｌ２  ０．１５ｇ（０．５ｍｍｏｌ）の５ｍｌ  Ｈ２Ｏ溶液を加え、６０℃で２４時間撹拌し、ろ液が１〜２ｍｌになるまでエバポレートし、アセトンで再沈澱し、橙色粉末を吸引ろ過でろ取し、洗浄した後乾燥した。
収量：  ０．１０９ｇ
収率：  ３５．９％
元素分析：  C18H26N4PtCl2・3.5H2O (0H2O M=564.08 3.5H2O M'=627.08)
calcd. C:34.45% H:5.26% N:8.93%
obsd. C:34.65% H:5.37% N:8.63%
NMR (D2O,TSP基準)
アントラセン環 δ1(d):8.740 δ2(d):8.140 δ3(m):8.000,7.858 δ4(s):7.637 C3 δ1(br):5.12 δ2(br):4.52 δ3(m):3.51 δ4(m):3.27 δ5(m):3.11 δ6(m):2.25 δ7(m):1.93
【化１４】
2018135297.tif 000016
【００６５】
（８）Ｐｔ（ｄａｃｈ）（ＡｔＣ２）Ｃｌ２の合成
ＡｔＣ２・２ＨＣｌ  ０．４２ｇ（１．３ｍｍｏｌ）をＨ２Ｏ  １０ｍｌに溶かし、ＮａＯＨ  ０．２０ｇ（５ｍｍｏｌ）を加えた。ＣＨＣｌ３  ２０ｍＬを加えてＡｔＣ２を抽出し、エバポレートしＥｔＯＨ  １０ｍＬに溶解した。これにＰｔ（ｄａｃｈ）Ｃｌ２  ０．１５ｇ（０．５ｍｍｏｌ）の５ｍｌ  Ｈ２Ｏ溶液を加え、８０℃で３時間撹拌し、ろ液が１〜２ｍｌになるまでエバポレートし、アセトンで再沈澱し、黄色粉末を吸引ろ過でろ取し、洗浄した後乾燥した。
収量：  ０．５７０ｇ
収率：  ８６．４％
元素分析：  C23H32N4PtCl2・2H2O (0H2O M=630.08 2H2O M'=666.08)
calcd. C:41.44% H:5.41% N:8.41%
obsd. C:41.15% H:5.55% N:8.19%
NMR (D2O,TSP基準)
アントラセン環 δ1(br):8.72 δ2(br):8.17 δ3(br):7.80 δ4(br):7.67 dach, C2 δ1(br):5.06 δ2(m):3.13 δ3(m):1.83 δ4(m):1.71 δ5(m):1.34 δ6(m):0.87 δ7(m):0.55 δ8(m):0.11
【化１５】
2018135297.tif 000017
【００６６】
（９）Ｐｔ（ｄａｃｈ）（ＡｔＣ３）Ｃｌ２の合成
ＡｔＣ３・２ＨＣｌ  ０．４４ｇ（１．３ｍｍｏｌ）をＨ２Ｏ  １０ｍｌに溶かし、ＮａＯＨ  ０．２０ｇ（５ｍｍｏｌ）を加えた。ＣＨＣｌ３  ２０ｍＬを加えてＡｔＣ３を抽出し、エバポレートしＥｔＯＨ  １０ｍＬに溶解した。これにＰｔ（ｄａｃｈ）Ｃｌ２  ０．１５ｇ（０．５ｍｍｏｌ）の５ｍｌ  Ｈ２Ｏ溶液を加え、８０℃で３時間撹拌し、ろ液が１〜２ｍｌになるまでエバポレートし、アセトンで再沈澱し、橙色粉末を吸引ろ過でろ取し、洗浄した後乾燥した。
収量：  ０．３２９ｇ
収率：  ４５．３％
元素分析：  C24H34N4PtCl2・3.5H2O (0H2O M=644.08 3.5H2O M'=707.08)
calcd. C:40.74% H:5.80% N:7.92%
obsd. C:40.36% H:5.44% N:7.86%
NMR (D2O,TSP基準)
アントラセン環 δ1(s):8.66   δ2(d):8.153 δ3(br):7.84 δ4(s):7.669 dach, C3 δ1(m):2.24 δ2(m):1.90 δ3(m):1.76 δ4(br):1.39 δ5(br):1.31 δ6(m):1.21 δ7(m):0.76
【化１６】
2018135297.tif 000018
【００６７】
２．安定性試験
次に、合成したポリアミン含有白金(ＩＩ)錯体の安定性について検討した。
まず、水中での安定性を確認する実験に必要な濃度を決めるため、ＵＶ測定を行い、その結果をもとに、リガンドと錯体での蛍光強度の比較実験を行った。
さらに、経口投与において最初の関門となる胃内の強い酸性条件下で錯体が分解するか否かの検討を１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの比較により行った。
【００６８】
（１）蛍光強度測定
アントラセン環には、励起光の照射により蛍光を発する性質がある。しかし、Ｐｔ錯体中のアントラセン環は励起光のエネルギーをＰｔに奪われるため、蛍光がほとんど検出されない。これを踏まえ、錯体とそのリガンドであるＡｔＣ２及びＡｔＣ３で蛍光強度を比較し、錯体の安定性を検討した。
【００６９】
（実験）
ＡｔＣ２及びＡｔＣ３とポリアミン含有白金（ＩＩ）錯体を水に１μＭの濃度で溶かし、２４ｈ経過後、蛍光分光計（ＦＰ−６５００  ＪＡＳＣＯ）を用いて、リガンド・錯体ともに吸光度が極大を示す３６７ｎｍに励起波長を固定し、蛍光スペクトルを測定した。
錯体とリガンドでの蛍光スペクトル比較を図１及び図２に示す。
【００７０】
（結果）
図１及び図２に示すように、リガンドのみと錯体間で蛍光強度を比較するとリガンドの蛍光強度と比較して錯体の蛍光は圧倒的に弱く、ほとんど分解していないことが分かった。したがって、これらの錯体は水中で安定と考えられた。
【００７１】
（２）酸条件下での安定性比較
経口投与を想定した場合、胃内の強酸性下で容易に分解してしまう場合にはプロドラッグとしての役割が失われてしまう。抗がん作用のあるプロドラッグとしての働きが期待され錯体としては、胃内と同様の酸性条件下で分解せず吸収される必要がある。そこで、リガンドのスペクトルと強酸性下での錯体のスペクトルを比較し、分解が起こっているか検討した。
【００７２】
（実験）
３５％ＨＣｌをＤ２Ｏで希釈し、０．０２Ｍ  ＨＣｌ／Ｄ２Ｏを作製し、合成した錯体を加えたサンプルを調製後２４時間、７日後に１Ｈ−ＮＭＲ測定を行った。その結果を図３〜１０に示す。
【００７３】
（結果）
もし錯体が分解していれば、ＡｔＣ２やＡｔＣ３といったリガンドのピークが見られるはずだが、図３〜１０に示すように、リガンドのものと思われるピークは見られなかったことから、いずれの錯体も胃酸条件下で分解しにくいことが明らかとなった。
【００７４】
３．ＭＴＴアッセイによるin vitro細胞増殖抑制評価
合成したＰｔ錯体と原料の細胞毒性を比較するため、ヒト結腸腺癌ＬＳ１８０を用いてＭＴＴアッセイを行った。
【００７５】
（実験）
・培地の作製
８４０ｍｌのミリＱにイーグル最小必須培地９．６ｇを加え撹拌した。そこにＮａＨＣＯ３  ２．２ｇとＦＢＳを１００ｍｌ加えて撹拌し、全量が１０００ｍｌになるようにミリＱを加えた。その後、クリーンベンチ内でオートクレーブ済みのメディウム瓶に滅菌ろ過し、以下の培養実験の培地として使用した（以下「ＭＥＭ」とする。）。
【００７６】
・細胞培養と継代
サンプル容器に凍結保存していたＬＳ１８０を３７℃で急速に溶解し、クリーンベンチ内で、２０ｍｌの培地を入れたディッシュに移した。
２日後、培地を除去し、５ｍｌのＰＢＳで洗浄後５倍希釈した０．５％−トリプシン／５．３ｍＭ−ＥＤＴＡ溶液５ｍｌを加え、３７℃で１０分間インキュベートした。細胞が全て剥がれたのを確認後、メディウム５ｍｌを加え、継代を行った。この継代実験を３回行った。
【００７７】
・薬剤の調製
表１に示す各薬剤を１０ｍＭの水溶液とし、ＭＥＭで希釈し１００μＭとした。これを段階希釈し、１０００、５００、１００、１０、１、０．５、０．２５、０．１、０．０５、０．０１及び０．００１μＭに調製した。
【００７８】
・ＭＴＴアッセイ
培養し、細胞数を計測したＬＳ１８０に５．０×１０３細胞／１００μＬとなるようにＭＥＭを加え、９６穴ウェルに１穴１００μＬずつ細胞を撒き、３７℃で一晩インキュベートした。メディウムを吸い、ＰＢＳで１回洗浄後に各濃度の薬剤入りメディウムを加え（各濃度ｎ＝３）、２４時間インキュベートした。メディウムを吸い、ＰＢＳで２回洗浄後に０．５ｍｇ／ｍＬ  ＭＴＴ入りのメディウムを１００μＬ加え、３時間インキュベートした。メディウムを吸い、ＤＭＳＯを１００μＬ加え、５７０ｎｍの吸光度を測定した。薬剤暴露後２４時間と７２時間におけるＩＣ５０の変化を比較した。結果を表１に示す。
【００７９】
【表１】
2018135297.tif 000019
【００８０】
（結果）
Ｐｔ（ＮＨ３）２（ＡｔＣ２）とＰｔ（ｄａｃｈ）（ＡｔＣ２）は暴露後２４時間、７２時間でＩＣ５０の変化がほとんどないのに対し、Ｐｔ（ＮＨ３）２（ＡｔＣ３）、Ｐｔ（ｄａｃｈ）（ＡｔＣ３）では暴露後２４時間に比べて７２時間でのＩＣ５０が低下した。特に、Ｐｔ（ｄａｃｈ）（ＡｔＣ３）ではＩＣ５０が１／１００ほどになり、毒性が強くなったことが分かった。この結果より、Ｐｔ（ＮＨ３）２（ＡｔＣ３）及びＰｔ（ｄａｃｈ）（ＡｔＣ３）は錯体として存在している間は毒性が小さく、細胞内に入って分解されるにつれ、毒性が強くなることが明らかとなった。
【００８１】
Ｐｔ（ｄａｃｈ）（ＡｔＣ３）はオキサリプラチンと比較してＩＣ５０が高かったが、Ｐｔ（ｄａｃｈ）（ＡｔＣ３）の暴露後２４時間から７２時間にかけてのＩＣ５０の低下を考慮すると、副作用の少ないプロドラッグとして使用できる可能性が示唆された。
【００８２】
４．細胞取り込み実験
Ｐｔ（ｄａｃｈ）（ＡｔＣ３）の細胞内への取り込み量をオキサリプラチンと比較するため、以下の実験を行った。
【００８３】
（実験）
１．６×１０６細胞を滅菌浅型シャーレ（９０φ×１５ｍｍ）に播き、２４時間インキュベートした。Ｐｔ（ｄａｃｈ）（ＡｔＣ３）入メディウム（２０μＭ）に暴露し２時間、２４時間（ｎ＝４）経過後、ＰＢＳで洗浄した。ＰＢＳをよく吸引した後、６０％硝酸を１ｍＬ加えて６０℃で２４時間加熱し、細胞を完全に溶解した。さらに蒸留水５ｍＬを加えてサンプル溶液とし、ＩＣＰ−ＡＥＳでＰｔ濃度を定量し、ディッシュ中の細胞に含まれたＰｔ量を算出した。同じ実験をオキサリプラチン入メディウムを用いて行った。結果を図１１に示す。
【００８４】
（結果）
Ｐｔ（ｄａｃｈ）（ＡｔＣ３）入メディウム暴露群では、オキサリプラチン暴露群に比べて２時間経過後、２４時間経過後のいずれにおいてもＰｔ取り込み量が高かった。アントラセン−ポリアミン構造を結合させたことで細胞内への取り込み量が向上したことが示された。
【００８５】
５．蛍光顕微鏡による観察
細胞中での錯体の挙動について検討するため、ＨＳオールインワン蛍光顕微鏡（ＫＥＹＥＮＣＥ、ＢＺ−９０００）を用いて、Ｐｔ（ｄａｃｈ）（ＡｔＣ３）入メディウムに暴露した細胞を経時的に観察した。また、Ｐｔ（ｄａｃｈ）（ＡｔＣ３）の分解後の細胞内局在を調べるために、薬剤に暴露した細胞の核染色を行った。
【００８６】
（１）蛍光顕微鏡観察
（実験）
ヒト結腸腺癌細胞ＬＳ１８０をガラスベースディッシュに播き、一晩インキュベートした。Ｐｔ（ｄａｃｈ）（ＡｔＣ３）入メディウム（１０μＭ）に暴露し２４時間経過後、蛍光顕微鏡で観察・撮像した。図１２に、暴露２４時間後に２０倍で撮像した画像を示す。励起光露光像を左側、明視野像と励起光露光像を重ねた像を右側に示す。
【００８７】
（結果）
暴露２４時間経過後では、大多数の細胞が蛍光を発していたため、ほとんどの細胞でＰｔ（ｄａｃｈ）（ＡｔＣ３）の分解が起こっていることが示唆された。
【００８８】
（２）核染色後の蛍光顕微鏡観察
（実験）
核染色は以下の手順で行った。
Ｐｔ（ｄａｃｈ）（ＡｔＣ３）入メディウム（１０μＭ）に２４時間暴露した後、蛍光顕微鏡で青色蛍光が鮮明に見られることを確認した。これをＰＢＳで洗浄後ＲＮａｓｅ  １６μｇ／ｍＬ（／ＭＥＭ）に３０分間ＣＯ２インキュベーターで暴露後、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）１５μＭ（／ＭＥＭ）に３０分間冷蔵庫内で遮光し暴露した。
図１３に、１００倍で撮像し、明視野像・青色励起光露光像を重ねた像を左側に、明視野像・赤色励起光露光像を重ねた像を右側に示す。
【００８９】
（結果）
核内に赤色蛍光と青色蛍光が共存していることが分かった。一細胞内の同じ部位で赤色蛍光と青色蛍光が確認されたことから、錯体分解後に生じたＡｔＣ３が核内に存在することが示唆された。
【００９０】
６．分布実験
Ｐｔ（ｄａｃｈ）（ＡｔＣ３）の生体内での臓器への蓄積性や特定の臓器への集積の有無を確認するため、ｄｄＹ雄マウス（７週齢）を用いて各臓器への分布を調べた。
【００９１】
（実験）
・投与量と投与方法
実験は静脈内投与、経口投与のそれぞれについて行った。静脈内投与ではＰｔ（ｄａｃｈ）（ＡｔＣ３）及びオキサリプラチンを蒸留水に溶かし８．２５μｍｏｌ／ｋｇで尾静脈より投与後、２、５、２４及び４８時間後にと殺、解剖し各臓器を得た。静脈内投与によるＰｔ（ｄａｃｈ）（ＡｔＣ３）の分布を図１４、オキサリプラチンの分布を図１５に示す。経口投与ではＰｔ（ｄａｃｈ）（ＡｔＣ３）を蒸留水に溶かし１６５μｍｏｌ／ｋｇで投与後、３、５、２４及び４８時間後にと殺、解剖し各臓器を得た。経口投与によるＰｔ（ｄａｃｈ）（ＡｔＣ３）の分布を図１６に示す。
【００９２】
・測定サンプルの作製とＰｔ濃度測定
臓器１００ｍｇに対して２５％水酸化テトラアンモニウム（ＴＭＡＨ）５００μＬを加え（骨に対してはＴＭＡＨの代わりに６０％ＨＮＯ３を加えた）、６０℃で一晩加熱し、臓器を溶解した。次に、臓器溶解液５００μＬ当たりトリトンＸ−１００を入れた０．１Ｍ  ＨＮＯ３を５ｍＬ加えて溶液を酸性にした後、シリンジフィルター（ナイロン：孔径０．４５μｍ、直径３２ｍｍ）でろ過した。既知濃度の白金溶液で検量線を作成し、調製した臓器溶解液の白金濃度をＩＣＰ−ＡＥＳにて測定した。
【００９３】
（結果）
図１４に示すように、Ｐｔ（ｄａｃｈ）（ＡｔＣ３）は静脈内投与の２時間後にほとんどが肝臓に集まっており、血中に入った後速やかに肝臓に移行していることが分かった。オキサリプラチンが腎排泄であるのに対してＰｔ（ｄａｃｈ）（ＡｔＣ３）は肝代謝を受けると考えられる。時間の経過とともに消失し、臓器への滞留はほとんど見られなかった。臓器への蓄積性が少ないことから、臓器傷害性は少ないと考えられる。
【００９４】
一方、図１５に示すように、オキサリプラチンは投与から２時間以内に速やかに体内から消失した。オキサリプラチンは血中半減期が１０分〜２５分とされており、臓器に分布後も速やかに消失すると考えられる。図１４との比較から、Ｐｔ（ｄａｃｈ）（ＡｔＣ３）はＡｔＣ３により体内での滞留性が上昇したことが示唆される。
【００９５】
さらに、図１６に示すように、経口投与によって錯体が吸収されたことが確認された。投与３時間後では、胃と小腸におけるＰｔ濃度が高く、錯体が吸収過程にあると考えられる。投与後５時間後にかけて消化管でのＰｔ濃度が低下し、血中濃度が上昇するため、３〜５時間にかけては錯体が腸管からゆっくりと吸収されていることが示唆された。腎臓・肝臓でＰｔ濃度が頭打ちになっていることから、吸収された錯体は速やかに腎臓・肝臓に移行するが、５時間前後で飽和する可能性が示唆された。
【００９６】
７．がん移植マウスを用いたin vivo抗がん実験
ＢＡＬＢ／ｃ  Ｓｌｃを用いてＰｔ（ｄａｃｈ）（ＡｔＣ３）のin vivoにおける抗がん活性効果について検討した。
【００９７】
（実験）
・マウス大腸癌細胞Ｃｏｌｏｎ２６の継代実験
マウス大腸癌細胞Ｃｏｌｏｎ２６を用いて担がんマウスを作製し、in vivoにおけるＰｔ（ｄａｃｈ）（ＡｔＣ３）の抗がん活性の評価を行うためにＣｏｌｏｎ２６の培養実験を行った。下記に継代実験の操作手順を示す。
【００９８】
・ＣＯ２インキュベーターの準備
ＣＯ２ボンベをインキュベータ−に接続し、５％、３７℃に調節した。インキュベーター内部には滅菌水を入れたバットを設置した。
【００９９】
・クリーンベンチの用意
クリーンベンチの殺菌灯を消し、７０％エタノールを手に吹き付け、クリーンベンチ内をエタノールを染み込ませたキムワイプで拭き、殺菌した。
【０１００】
・培地の作製
５００ｍＬ  ＲＰＭＩ−１６４０にペニシリン−ストレプトマイシン混合溶液をペニシリン１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ、ストレプトマイシン１００ｍｇ／μＬになるように加えた。さらに、ＦＢＳ  ５０ｍｌを加えた。
【０１０１】
・ＰＢＳの作製
ミリＱ  １０００ｍｌにダルベッコリン酸緩衝生理食塩水９．６ｇを加えて撹拌し、溶解後、１２１℃、２０分でオートクレーブで滅菌処理した。
【０１０２】
・細胞培養と継代
ディープフリーザーで凍結保存していたマウス大腸癌細胞Ｃｏｌｏｎ２６を３７℃で急速に溶解し、クリーンベンチ内で２０ｍｌの培地を入れたディッシュに移した。１日後、培地を除去し、５ｍｌのＰＢＳで洗浄後、５倍希釈した０．５％−トリプシン／５．３ｍＭ−ＥＤＴＡ溶液５ｍｌを加え、３７℃で５分間インキュベートした。細胞がすべてはがれたのを確認後、メディウム５ｍｌを加え、継代を行った。３日間同様の操作を行った。
【０１０３】
・細胞数の計測
計数板にとりパンブルーで染色した細胞浮遊液をのせ、上からカバーガラスをかけた。光学顕微鏡で計数板の計８か所のカウンター部に存在する細胞数を数え、１か所に存在する平均細胞数を算出し、希釈前の細胞浮遊液中の細胞数を計算した。
【０１０４】
・細胞浮遊液の調整とインジェクション
メディウム１００μｌ当たり１×１０６個の細胞数になるように細胞浮遊液を調製した。調整済みの細胞浮遊液を１匹あたり１００μｌ×２、マウスの両肩付近の皮下にインジェクションした。
【０１０５】
・サンプル投与と腫瘍径の測定
マウスに腫瘍をインジェクションした日を０日目とし、１４日間２４時間毎に治療群（ｎ＝５）にＰｔ（ｄａｃｈ）（ＡｔＣ３）を２００μｍｏｌ／ｋｇ（１．４１ｍｇ／０．１ｍＬ  Ｈ２Ｏ／１０ｇ）で経口投与した。対照群は０．１ｍＬ  Ｈ２Ｏ／１０ｇ無処置とした。また、７日目、１４日目、２１日目に体重、腫瘍径を測定した。腫瘍サイズは（長さ×幅２×０．５２）として計算し、相対評価で示した。それぞれの群はｎ＝５とした。測定した腫瘍サイズ、体重をそれぞれ図１７及び図１８に示す。
【０１０６】
（結果）
図１７に示すように、Ｐｔ（ｄａｃｈ）（ＡｔＣ３）は２００μｍｏｌ／ｋｇの投与で腫瘍の成長を抑制した。また、図１８に示すように、投与直後は体重減少が見られ、食欲低下をもたらしたものと考えられた。しかし、日数の経過とともに体重が回復していることから、食欲低下は徐々におさまったものと考えられた。毎日経口投与を行う中で、吐瀉物や下痢等の異常便等は見られず、マウスの様子に異常は見られなかったことから、この投与量ではマウスへの急激な毒性は現れないものと考えられた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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