(57)【要約】【課題】新規なクルクミン誘導体を提供する。【解決手段】下式（１）により表される化合物。2018138528.tif 000053  式中、  R1が、炭素数１〜５のアルキル基、炭素数２〜５のアルケニル基又は炭素数２〜５のアルキニル基を表し、  R2が、炭素数１〜５のアルキル基、炭素数２〜５のアルケニル基又は炭素数２〜５のアルキニル基を表し、  n1が、１〜４の整数を表し、n1が２以上のとき、R1はそれぞれ同じでも異なっていてもよく、  n2が、１〜４の整数を表し、n2が２以上のとき、R2はそれぞれ同じでも異なっていてもよい。【選択図】図１
2018138528.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下式（１）により表される化合物。
2018138528.tif 000047
式中、
R1が、炭素数１〜５のアルキル基、炭素数２〜５のアルケニル基又は炭素数２〜５のアルキニル基を表し、
R2が、炭素数１〜５のアルキル基、炭素数２〜５のアルケニル基又は炭素数２〜５のアルキニル基を表し、
n1が、１〜４の整数を表し、n1が２以上のとき、R1はそれぞれ同じでも異なっていてもよく、
n2が、１〜４の整数を表し、n2が２以上のとき、R2はそれぞれ同じでも異なっていてもよい。
【請求項２】
R1が炭素数１〜５のアルキル基であり、かつR2が炭素数１〜５のアルキル基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
n1が２又は３である、請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項４】
前記式（１）中の下式（２）：
2018138528.tif 000048
で表される基が、
2018138528.tif 000049
である、請求項１〜３のいずれか１項記載の化合物。
【請求項５】
R1がメチル基である、請求項１〜４のいずれか１項記載の化合物。
【請求項６】
R2がメチル基である、請求項１〜５のいずれか１項記載の化合物。
【請求項７】
以下の化合物から選択される、請求項１〜６のいずれか１項記載の化合物。
2018138528.tif 000050
2018138528.tif 000051
及び
2018138528.tif 000052
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項記載の化合物を含む、アミロイドβタンパク質検出剤。
【請求項９】
アミロイドβタンパク質を検出する方法であって、
請求項１〜７のいずれか１項記載の化合物をアミロイドβタンパク質の凝集体と接触させ、複合体を形成する工程、及び
前記形成された複合体に由来する蛍光を検出する工程
を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なクルクミン誘導体に関する。また、本発明は、新規なクルクミン誘導体を含むアミロイドβタンパク質検出剤、及び新規なクルクミン誘導体を用いてアミロイドβタンパク質を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病の原因物質として考えられているアミロイドβタンパク質（以下、本明細書において、「アミロイドβ」又は「Ａβ」ということがある。）は、アミノ酸残基４０〜４２の凝集性の高いペプチドである。Ａβが高度に凝集したものが老人斑を構成し、これが脳の機能低下を招くと考えられている。よって、Ａβの凝集阻害剤はアルツハイマー病の根本治療薬として期待されているが、未だ臨床では用いられていない。また、その診断薬も開発されていない。
ウコンの主成分であるクルクミンには、Ａβ凝集阻害活性があることが報告されている（非特許文献１）。また、クルクミンについて、抗酸化作用、抗炎症作用など様々な効果が報告されているが、これらの効果を臨床研究では証明することができず、更に、分子レベルで解析した報告例は皆無である。その理由の一つとして、クルクミンの難水溶性が挙げられることから、水溶性クルクミン誘導体（親水性クルクミン誘導体）の創成研究が行われており、その中で、水溶性クルクミン誘導体（親水性クルクミン誘導体）がＡβ凝集阻害活性を有することが報告されている（非特許文献２及び３）。
しかしながら、Ａβの凝集体と相互作用して十分な強度の蛍光を発するクルクミン誘導体は今まで知られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ono, K. et al., Neurosci. Res., 2004, 75, 742-750
【非特許文献２】Konno, H. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2014, 24, 865-870
【非特許文献３】Endo, H. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2014, 24, 5621-5626
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、新規なクルクミン誘導体を提供することを目的とする。特には、本発明は、アミロイドβタンパク質の検出に利用し得るクルクミン誘導体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の一実施態様によれば、下式（１）により表される化合物（以下、本明細書において、「本発明の化合物」ということがある。）が提供される。
2018138528.tif 000003
（式中、
R1が、炭素数１〜５のアルキル基、炭素数２〜５のアルケニル基又は炭素数２〜５のアルキニル基を表し、
R2が、炭素数１〜５のアルキル基、炭素数２〜５のアルケニル基又は炭素数２〜５のアルキニル基を表し、
n1が、１〜４の整数を表し、n1が２以上のとき、R1はそれぞれ同じでも異なっていてもよく、
n2が、１〜４の整数を表し、n2が２以上のとき、R2はそれぞれ同じでも異なっていてもよい。）
【０００６】
本発明の一実施態様において、式（１）中、R1は炭素数１〜５のアルキル基であり、かつR2は炭素数１〜５のアルキル基である。
本発明の一実施態様において、式（１）中、n1は２又は３である。
本発明の一実施態様において、式（１）中の下式（２）：
2018138528.tif 000004
で表される基は、
2018138528.tif 000005
である。
本発明の一実施態様において、式（１）中、R1はメチル基である。
本発明の一実施態様において、式（１）中、R2はメチル基である。
【０００７】
本発明の一実施態様において、式（１）により表される化合物は、以下のものから選択される。
2018138528.tif 000006
2018138528.tif 000007
及び
2018138528.tif 000008
【０００８】
本発明の一実施態様によれば、式（１）により表される前記化合物を含む、アミロイドβタンパク質検出剤が提供される。
【０００９】
本発明の一実施態様によれば、アミロイドβタンパク質を検出する方法であって、
式（１）により表される前記化合物をアミロイドβタンパク質の凝集体と接触させ、複合体を形成する工程、及び
前記形成された複合体に由来する蛍光を検出する工程
を含む方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の化合物とアミロイドβ凝集体（アミロイド線維）を含む試料について、透過型電子顕微鏡（TEM）により観察した画像である。
【図２】本発明の化合物とアミロイドβ凝集体（アミロイド線維）を含む試料について、蛍光顕微鏡により観察した画像である。
【図３】アミロイドβタンパク質に対し、本発明の化合物（1a, 2a, 3a, 4a, 5a, 8a, 9a, 11a, 12a, 13a）、比較化合物（3c, 4c, 5c, 8c, 9c）又はチオフラビンＴ（ThT）を用いた場合に検出された蛍光量を示すグラフである。チオフラビンＴを用いた場合に検出された蛍光量を100 a.u.として換算して示している。
【図４】アミロイドβタンパク質に対し、チオフラビンＴのみを用いた場合、チオフラビンＴと水溶性クルクミン誘導体（親水性クルクミン誘導体）を用いた場合、及びチオフラビンＴと本発明の化合物を用いた場合に検出された蛍光量を示すグラフである。
【図５】リゾチームに対し、本発明の化合物（1a, 2a, 3a, 4a, 5a, 8a, 9a, 11a, 12a, 13a）又はチオフラビンＴ（ThT）を用いた場合に検出された蛍光量を示すグラフである。チオフラビンＴを用いた場合に検出された蛍光量を100 a.u.として換算して示している。
【図６】BSAに対し、本発明の化合物（1a, 2a, 3a, 4a, 5a, 8a, 9a, 11a, 12a, 13a）又はチオフラビンＴ（ThT）を用いた場合に検出された蛍光量を示すグラフである。チオフラビンＴを用いた場合に検出された蛍光量を100 a.u.として換算して示している。
【図７】ポリグルタミンに対し、本発明の化合物（1a, 2a, 3a, 4a, 5a, 8a, 9a, 11a, 12a, 13a）又はチオフラビンＴ（ThT）を用いた場合に検出された蛍光量を示すグラフである。チオフラビンＴを用いた場合に検出された蛍光量を100 a.u.として換算して示している。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明について詳述する。
本発明の化合物は、以下の式（１）で表される。
2018138528.tif 000009
（式中、
R1が、炭素数１〜５のアルキル基、炭素数２〜５のアルケニル基又は炭素数２〜５のアルキニル基を表し、
R2が、炭素数１〜５のアルキル基、炭素数２〜５のアルケニル基又は炭素数２〜５のアルキニル基を表し、
n1が、１〜４の整数を表し、n1が２以上のとき、R1はそれぞれ同じでも異なっていてもよく、
n2が、１〜４の整数を表し、n2が２以上のとき、R2はそれぞれ同じでも異なっていてもよい。）
【００１２】
式（１）中、R1は、好ましくは炭素数１〜５のアルキル基であり、より好ましくは炭素数１〜３のアルキル基であり、更に好ましくはメチル基である。炭素数１〜５のアルキル基としては、具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ-ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、ｎ-ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、1-メチルブチル基、1-エチルプロピル基、1,1-ジメチルプロピル基等が挙げられる。
式（１）中のR1において、炭素数２〜５のアルケニル基としては、好ましくは炭素数２〜３のアルケニル基である。
式（１）中のR1において、炭素数２〜５のアルキニル基としては、好ましくは炭素数２〜３のアルキニル基である。
【００１３】
式（１）中、R2は、好ましくは炭素数１〜５のアルキル基であり、より好ましくは炭素数１〜３のアルキル基であり、更に好ましくはメチル基である。R2の具体例としては、R1の具体例として挙げたものがそのまま当てはまる。
式（１）中のR2において、炭素数２〜５のアルケニル基としては、好ましくは炭素数２〜３のアルケニル基である。
式（１）中のR2において、炭素数２〜５のアルキニル基としては、好ましくは炭素数２〜３のアルキニル基である。
本発明の化合物において、特に好ましくは、式（１）中、R1とR2の両方がメチル基である。
【００１４】
式（１）中、n1は、好ましくは１〜３の整数であり、より好ましくは２〜３の整数であり、更に好ましくは２である。
式（１）中、n2は、好ましくは１〜３の整数であり、一実施態様において、n2は１であるか、２であるか、又は３である。
【００１５】
式（１）中、下式（２）：
2018138528.tif 000010
で表される基として、n1が１である場合には、例えば、以下のものが挙げられる。
2018138528.tif 000011
【００１６】
上記式（２ａ）〜（２ｄ）で表される基において、例えば、R1がメチル基（本明細書において、「Me」と表されることがある。）である場合、各々以下の化学構造式で示される。
2018138528.tif 000012
【００１７】
上記式（２ａ'）で示される基は、２−メトキシフェニル基と称される。
上記式（２ｂ'）で示される基は、３−メトキシフェニル基と称される。
上記式（２ｃ'）で示される基は、４−メトキシフェニル基と称される。
上記式（２ｄ'）で示される基は、５−メトキシフェニル基と称される。
本明細書において、R1Oが複数存在する場合にも、R1がメチル基以外の基である場合にも、このような置換基R1Oの位置に関するフェニル基（式（２）で表される基）上の番号付けはいずれも同様である。
一実施態様において、本発明の化合物は、例えば、置換基R1Oを有するフェニル基（式（２）で表される基）に関して、３位及び４位のうちの少なくとも１つの位置において置換基R1Oを有する。
一実施態様において、本発明の化合物は、例えば、置換基R1Oを有するフェニル基（式（２）で表される基）に関して、少なくとも３位の位置において置換基R1Oを有する。
一実施態様において、本発明の化合物は、例えば、置換基R1Oを有するフェニル基（式（２）で表される基）に関して、少なくとも４位の位置において置換基R1Oを有する。
【００１８】
式（１）中、下式（２）：
2018138528.tif 000013
で表される基として、n1が２である場合には、例えば、以下のものが挙げられる。
2018138528.tif 000014
【００１９】
これらの基において、例えば、R1がメチル基である場合、各々以下の化学構造式で示される。
2018138528.tif 000015
【００２０】
一実施態様において、本発明の化合物は、例えば、置換基R1Oを有するフェニル基（式（２）で表される基）に関して、少なくとも３位及び４位の両方の位置において置換基R1Oを有する。
一実施態様において、本発明の化合物は、好ましくは、置換基R1Oを有するフェニル基（式（２）で表される基）に関して、３位及び４位の両方の位置においてのみ置換基R1Oを有する。より好ましくは、本発明の化合物は、置換基R1Oを有するフェニル基（式（２）で表される基）に関して、３位及び４位の両方の位置においてのみ置換基MeOを有し、これは以下の化学構造式で示される。
2018138528.tif 000016
【００２１】
式（１）中、下式（２）：
2018138528.tif 000017
で表される基として、n1が３である場合には、例えば、以下のものが挙げられる。
2018138528.tif 000018
【００２２】
これらの基において、例えば、R1がメチル基である場合、各々以下の化学構造式で示される。
2018138528.tif 000019
【００２３】
一実施態様において、本発明の化合物は、例えば、置換基R1Oを有するフェニル基（式（２）で表される基）に関して、３位、４位及び５位の位置において置換基R1Oを有する。
【００２４】
式（１）中、下式（３）：
2018138528.tif 000020
で表される基として、n2が１である場合には、例えば、以下のものが挙げられる。
2018138528.tif 000021
【００２５】
上記式（３ａ）〜（３ｄ）で表される基において、例えば、R2がメチル基である場合、各々以下の化学構造式で示される。
2018138528.tif 000022
【００２６】
上記式（３ａ'）で示される基は、２−メトキシフェニル基と称される。
上記式（３ｂ'）で示される基は、３−メトキシフェニル基と称される。
上記式（３ｃ'）で示される基は、４−メトキシフェニル基と称される。
上記式（３ｄ'）で示される基は、５−メトキシフェニル基と称される。
本明細書において、R2Oが複数存在する場合にも、R2がメチル基以外の基である場合にも、このような置換基R2Oの位置に関するフェニル基（式（３）で表される基）上の番号付けはいずれも同様である。
一実施態様において、本発明の化合物は、例えば、置換基R2Oを有するフェニル基（式（３）で表される基）に関して、少なくとも２位の位置において置換基R2Oを有する。
一実施態様において、本発明の化合物は、例えば、置換基R2Oを有するフェニル基（式（３）で表される基）に関して、少なくとも３位の位置において置換基R2Oを有する。
一実施態様において、本発明の化合物は、例えば、置換基R2Oを有するフェニル基（式（３）で表される基）に関して、少なくとも４位の位置において置換基R2Oを有する。
一実施態様において、本発明の化合物は、例えば、置換基R2Oを有するフェニル基（式（３）で表される基）に関して、少なくとも５位の位置において置換基R2Oを有する。
【００２７】
式（１）中、下式（３）：
2018138528.tif 000023
で表される基として、n2が２である場合には、例えば、以下のものが挙げられる。
2018138528.tif 000024
【００２８】
これらの基において、例えば、R2がメチル基である場合、各々以下の化学構造式で示される。
2018138528.tif 000025
【００２９】
一実施態様において、本発明の化合物は、例えば、置換基R2Oを有するフェニル基（式（３）で表される基）に関して、少なくとも３位及び４位の両方の位置において置換基R2Oを有する。
一実施態様において、本発明の化合物は、例えば、置換基R2Oを有するフェニル基（式（３）で表される基）に関して、少なくとも２位及び５位の両方の位置において置換基R2Oを有する。
【００３０】
式（１）中、下式（３）：
2018138528.tif 000026
で表される基として、n2が３である場合には、例えば、以下のものが挙げられる。
2018138528.tif 000027
【００３１】
これらの基において、例えば、R2がメチル基である場合、各々以下の化学構造式で示される。
2018138528.tif 000028
【００３２】
一実施態様において、本発明の化合物は、好ましくは、置換基R2Oを有するフェニル基（式（３）で表される基）に関して、２位の位置においてのみ置換基R2Oを有する。
一実施態様において、本発明の化合物は、好ましくは、置換基R2Oを有するフェニル基（式（３）で表される基）に関して、３位及び４位の両方の位置においてのみ置換基R2Oを有する。
一実施態様において、本発明の化合物は、好ましくは、置換基R2Oを有するフェニル基（式（３）で表される基）に関して、２位及び５位の両方の位置においてのみ置換基R2Oを有する。
より好ましくは、置換基R2Oを有するフェニル基（式（３）で表される基）は、以下の化学構造式で示されるものから選択される。
2018138528.tif 000029
【００３３】
本発明の一実施態様において、特に好ましくは、本発明の化合物は、以下のものから選択される。
2018138528.tif 000030
2018138528.tif 000031
及び
2018138528.tif 000032
【００３４】
式（１）で表される化合物は、下式（１a）で表される互変異生体を包含するものである。
2018138528.tif 000033
従って、式（１）で表される本発明の化合物には、実質的に上記化合物式（１a）で表される互変異生体が包含されていてもよいものと解される。
【００３５】
本発明の化合物は、以下のスキーム１に示される製造方法により合成することができるが、これに限定されるわけではない。
スキーム１
2018138528.tif 000034
【００３６】
化合物(i)は、n1個のヒドロキシ基を有するベンズアルデヒド誘導体であり、公知の方法に従って製造してもよいし、市販品を用いてもよい。
化合物(ii)中、Ｘはハロゲン原子（例えば、F、Cl、Br、Ｉ）を表し、化合物(ii)は、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アルケニル又はハロゲン化アルキニルである。化合物(ii)は、公知の方法に従って製造してもよいし、市販品を用いてもよい。
化合物(iii)は、化合物(i)のヒドロキシ基をR1Oに置換したものであり、化合物(i)と化合物(ii)との反応により得られる。化合物(i)と化合物(ii)との反応には、当業者の技術常識に基づいて種々の試薬を用いることができる。例えば、この化合物(i)と化合物(ii)との反応は、触媒として、炭酸カリウム、水素化ナトリウム等を用いて行うことができ、好ましくは、炭酸カリウムが用いられる。化合物(i)と化合物(ii)との反応に用いられる溶媒としては、ジメチルホルムアミド（DMF）、テトラヒドロフラン（THF）等の有機溶媒を用いて行うことができ、好ましくは、DMFが用いられる。
例えば、化合物(i)と化合物(ii)との反応は、有機溶媒中に化合物(i)、化合物(ii)及び触媒を添加して得た混合物を、約80〜95℃の温度で約1〜2時間撹拌することにより行われる。用いる試薬等について、その配合割合は特に限定されるものではないが、例えば、化合物(i)：化合物(ii)＝1：3〜5（モル比）、特には、約1：4（モル比）で使用されてもよく、触媒の種類に応じても異なるが、化合物(i)：触媒＝1：3〜7（モル比）、特には、約1：5（モル比）で使用されてもよい。
なお、化合物(iii)は、上記のとおり製造し得るが、市販品を用いてもよい。
【００３７】
化合物(iv)は、アセチルアセトンであり、公知の方法に従って製造してもよいし、市販品を用いてもよい。
化合物(v)は、化合物(iii)と化合物(iv)との反応（アルドール縮合）により得られる。化合物(iii)と化合物(iv)との反応には、当業者の技術常識に基づいて種々の試薬を用いることができるが、例えば、立体選択性や目的物の収率の観点から、以下のような手順で行うことが好ましい。
酢酸エチル、1,4-ジオキサン等の有機溶媒中に、化合物(iv)と酸化ホウ素を添加して混合し、約70〜85℃の温度で約30〜90分間撹拌した後、この混合物中に、化合物(iii)とホウ酸トリエチルを添加して混合し、約70〜85℃の温度で約30〜90分間撹拌する。その後、得られた混合物にｎ-ブチルアミン等のアミンを加え、温度を一定に保ちながら約1〜3時間撹拌し、約50〜60℃まで温度が下がったところで塩酸等の酸を加え、得られた反応溶液をクロマトグラフィー等で精製し、化合物(v)を得ることができる。
化合物(iii)と化合物(iv)との反応において、溶媒として、好ましくは酢酸エチルが用いられる。
用いる試薬等について、その配合割合は特に限定されるものではないが、例えば、化合物(iii)：化合物(iv)＝1：3〜5（モル比）、特には、約1：4（モル比）で使用されてもよく、化合物(iii)：酸化ホウ素＝1：2〜5（モル比）、特には、約1：3（モル比）で使用されてもよく、化合物(iii)：ホウ酸トリエチル＝1：0.3〜1.2（モル比）、特には、約1：0.6（モル比）で使用されてもよい。
【００３８】
式（１）により表される本発明の化合物は、化合物(v)と化合物(vi)との反応（アルドール縮合）により得られる。化合物(v)と化合物(vi)との反応には、当業者の技術常識に基づいて種々の試薬を用いることができるが、例えば、立体選択性や目的物の収率の観点から、以下のような手順で行うことが好ましい。
酢酸エチル、1,4-ジオキサン等の有機溶媒中に、化合物(v)と酸化ホウ素を添加して混合し、約75〜85℃の温度で約30〜90分間撹拌した後、この混合物中に、化合物(vi)とホウ酸トリエチルを添加して混合し、約75〜85℃の温度で約30〜120分間撹拌する。その後、得られた混合物にピペリジン等のアミンを加え、温度を一定に保ちながら約1〜3時間撹拌し、約50〜60℃まで温度が下がったところで塩酸等の酸を加え、得られた反応溶液をクロマトグラフィー等で精製し、本発明の化合物を得ることができる。
化合物(v)と化合物(vi)との反応において、溶媒として、好ましくは酢酸エチルが用いられる。
なお、化合物(vi)は、化合物(iii)と同じように上記のとおり製造し得るが、市販品を用いてもよい。
用いる試薬等について、その配合割合は特に限定されるものではないが、例えば、化合物(v)：化合物(vi)＝1：0.6〜1.5（モル比）、特には、約1：1（モル比）で使用されてもよく、化合物(v)：酸化ホウ素＝1：2〜5（モル比）、特には、約1：4（モル比）で使用されてもよく、化合物(v)：ホウ酸トリエチル＝1：0.6〜3、特には、約1：2.5（モル比）で使用されてもよい。
本発明の化合物の合成において、抽出や乾燥、精製等の一般的な操作は、公知の技術を用いて行うことができる。
【００３９】
具体的な例として、本発明の化合物は、以下のスキーム２に示されるとおり合成することができる。
スキーム２
2018138528.tif 000035
【００４０】
一実施態様において、本発明の化合物は、アミロイドβタンパク質（Ａβ）検出剤として使用することができる。本発明の化合物は、Ａβ、具体的には、Ａβ凝集体と相互作用して複合体を形成することにより、十分な強度の蛍光を発し得る。Ａβ凝集体とは、凝集性の高いペプチドであるＡβが凝集して形成される集合体であり、一般にアミロイド線維と呼ばれるものであり得る。
一方で、以前報告された水溶性クルクミン誘導体（親水性クルクミン誘導体）は、Ａβ凝集阻害活性を有しており、Ａβ凝集体を分解させるため、本発明の化合物のように蛍光を発することはできない。このことからも、本発明の化合物がＡβ凝集体と相互作用して複合体を形成することにより十分な強度の蛍光を発し得ることは予想外のことであり、驚くべきことである。
【００４１】
一実施態様において、本発明の化合物を含むアミロイドβタンパク質（Ａβ）検出剤が提供される。Ａβ検出剤は、本発明の化合物のみからなるものであってもよいし、本発明の化合物以外に他の成分を含んでもよい。他の成分としては、水、0.1%アンモニア水、1%食塩水等の溶媒や、通常使用され得る緩衝剤等が挙げられるが、これらに限定されるものではなく、当業者の技術常識に基づいて適宜選択され得る。
一実施態様において、本発明の化合物を含むＡβ凝集体検出剤が提供される。Ａβ凝集体検出剤は、本発明の化合物のみからなるものであってもよいし、本発明の化合物以外に他の成分を含んでもよい。他の成分としては、水、0.1%アンモニア水、1%食塩水等の溶媒や、通常使用され得る緩衝剤等が挙げられるが、これらに限定されるものではなく、当業者の技術常識に基づいて適宜選択され得る。
【００４２】
一実施態様において、本発明の化合物を用いてアミロイドβタンパク質（Ａβ）を検出する方法が提供される。
該方法においては、本発明の化合物をＡβ凝集体と接触させ、本発明の化合物とＡβ凝集体の複合体を形成する工程が含まれる。本発明の化合物とＡβ凝集体を接触させるとは、例えば、適当な溶媒中に本発明の化合物とＡβ又はＡβ凝集体を添加し、混合することにより行われ、Ａβを添加する場合には、ＡβがＡβ凝集体を形成する条件下で行われる。溶媒としては、水、ジメチルスルホキシド、リン酸緩衝液等が挙げられるが、これらに限定されるものではなく、当業者の技術常識に基づいて適宜選択され得る。用いられる本発明の化合物とＡβの割合は特に限定されるものではないが、例えば、本発明の化合物：Ａβ＝1：3（モル比）で使用され得る。
該方法においては、形成された複合体に由来する蛍光を検出する工程が含まれる。蛍光の検出には、市販の通常使用され得る測定機器を用いることができる。検出において用いられる励起波長は、例えば、420〜440の範囲内であり、測定蛍光波長は、例えば、470〜490の範囲内であるが、これらに限定されるものではない。
【００４３】
一実施態様において、本発明の化合物を用いてアミロイドβタンパク質（Ａβ）凝集体を検出する方法又はＡβ凝集体の量を測定する方法が提供される。
該方法においては、本発明の化合物をＡβ凝集体と接触させ、本発明の化合物とＡ凝集体βの複合体を形成する工程が含まれる。本発明の化合物とＡβ凝集体を接触させるとは、例えば、適当な溶媒中に本発明の化合物とＡβ又はＡβ凝集体を添加し、混合することにより行われ、Ａβを添加する場合には、ＡβがＡβ凝集体を形成する条件下で行われる。溶媒としては、水、ジメチルスルホキシド、リン酸緩衝液等が挙げられるが、これらに限定されるものではなく、当業者の技術常識に基づいて適宜選択され得る。用いられる本発明の化合物とＡβの割合は特に限定されるものではないが、例えば、本発明の化合物：Ａβ＝1：3（モル比）で使用され得る。
該方法においては、形成された複合体に由来する蛍光を検出する工程が含まれる。蛍光の検出には、市販の通常使用され得る測定機器を用いることができる。検出において用いられる励起波長は、例えば、420〜440の範囲内であり、測定蛍光波長は、例えば、470〜490の範囲内であるが、これらに限定されるものではない。
Ａβ凝集体の量を測定する方法の場合には、検出された蛍光に基づいて、Ａβ凝集体の量を測定する工程が含まれる。Ａβ凝集体の量の測定は、検量線法等、当業者の技術常識に基づいて適宜行えばよい。
【００４４】
アミロイドβタンパク質（Ａβ）の検出試薬としては、チオフラビンＴが広く用いられている。しかしながら、チオフラビンＴは、Ａβ以外のタンパク質に対しても反応して蛍光を発してしまい、また、測定上の理由により、チオフラビンＴの蛍光領域が阻害される場合がある。
一実施態様において、本発明の化合物は、チオフラビンＴよりも強い強度の蛍光を発することができ、また、一実施態様において、本発明の化合物は、チオフラビンＴと同等かチオフラビンＴよりも優れたＡβ特異性を有し得るため、チオフラビンＴよりも優れたＡβ検出剤となる可能性を秘めている。
更には、本発明の化合物をチオフラビンＴと併用することで、チオフラビンＴのみを用いて検出される蛍光強度と比べて、蛍光強度を増加させることができる。また、本発明の化合物の蛍光領域は、チオフラビンＴの蛍光領域と比べて長波長側にシフトしており、チオフラビンＴの蛍光領域が阻害される場合などにおいて、本発明の化合物がより有用である。
【実施例】
【００４５】
以下において、本発明について、具体的な製造例及び実施例を参照しながら更に詳細に説明するが、本発明の範囲は、これらの製造例及び実施例によって何ら限定されるものではない。
【００４６】
＜製造例＞
１．本発明の化合物の調製
（１）5-ヒドロキシ-1-（3,4-ジメトキシフェニル）-1,4-ヘキサジエン-3-オンの調製
2018138528.tif 000036
3,4-ジヒドロキシベンズアルデヒド（1.0 g）に対しヨードメタン（4.5 mL）、炭酸カリウム（5 g）を用いて、3,4-ジヒドロキシベンズアルデヒドの水酸基をメトキシ基に変換したベンズアルデヒド誘導体を93%の収率で得た。次に、アセチルアセトン（1.5 g）と酸化ホウ素（1.0 g）を酢酸エチル中で混合して70℃で0.5時間撹拌した後に、当該混合物に、ホウ酸トリエチル（0.4 g）と前記得られたベンズアルデヒド誘導体（0.8 g）を添加して76℃で0.5時間撹拌した。その後、温度を一定に保ちながら、ｎ-ブチルアミン（0.3 g）を加え1.0時間撹拌し、反応溶液の温度が50℃まで下がったところで1M塩酸（20 ml）を加えた。反応溶液をカラムクロマトグラフィーで精製し、標題の化合物を29%の収率で得た。
【００４７】
（２）5-ヒドロキシ-1-（3,4-ジメトキシフェニル）-7-（2-メトキシフェニル）-1,4,6-ヘプタトリエン-3-オン（5a）の調製
2018138528.tif 000037
5-ヒドロキシ-1-（3,4-ジメトキシフェニル）-1,4-ヘキサジエン-3-オン（0.20 g, 0.806 mmol）を酢酸エチルに溶解し、酸化ホウ素（0.14 g, 2.011 mmol）を加え70℃で加熱撹拌した。1時間後、2-メトキシベンズアルデヒド（0.136 g, 1.00 mmol）とホウ酸トリエチル（0.342 ml, 2.014 mmol）を加え、80℃で2時間撹拌した。その後、ピペリジン（0.080 ml, 0.810 mmol）をゆっくり滴下し、同温で2.5時間撹拌した。反応溶液の温度を50℃まで下げ1M塩酸（8 ml）と、酢酸エチルとを加えさらに1時間撹拌した。室温に戻し、飽和食塩水を加え酢酸エチルで抽出し、得られた有機層を飽和食塩水で3回洗浄した。硫酸マグネシウムで乾燥し、エバポレーターで濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン/ 酢酸エチル, 4:1）で精製し、標題の化合物5a(0.061 g, 21%)を橙色油状物として得た。
【００４８】
下記表１に示されるとおりの置換基に対応するよう、ベンズアルデヒド誘導体上の置換基を変更した以外は、上記（１）及び（２）に記載の方法に準じて、本発明の化合物を更に調製した（1a-4a及び6a-14a）。
【００４９】
表１
2018138528.tif 000038
2018138528.tif 000039
2018138528.tif 000040
【００５０】
上記のとおり調製した化合物1a-14aについて、以下のとおり物性値を測定した。
5-ヒドロキシ-1,7-ビス（4-メトキシフェニル）-1,4,6-ヘプタトリエン-3-オン（1a）
1H NMR (400 MHz, CDCl3):δ= 3.82 (s, 6H), 5.76 (s, 1H), 6.50 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 6.90 (d, J = 4.2 Hz, 4H), 7.48 (d, J = 4.2 Hz, 4H), 7.57 (s, 1H), 7.61 (s, 1H).
IR (film) νmax cm-1:3583, 3019, 2399, 1685, 1509, 1216, 929, 769, 667, 423, 408.
ESIMS [M+H]+ C21H20O4 に対する計算値：336.14, 実測値：336.31.
【００５１】
5-ヒドロキシ-1,7-ビス（2-メトキシフェニル）-1,4,6-ヘプタトリエン-3-オン（2a）
mp = 121-126℃.
1H NMR (400 MHz, CDCl3):δ= 3.91 (s, 6H), 5.88 (s, 1H), 6.73 (d, 2H, J = 16.0 Hz), 6.91-6.99 (m, 4H), 7.32-7.36 (m, 2H), 7.55(d, 2H, J = 7.6 Hz), 7.91 (d, 1H, J = 16.0 Hz).
13C NMR (400 MHz, CDCl3):δ= 55.6, 101.6, 111.3, 120.8, 124.1, 124.9, 128.7, 131.4, 135.8, 158.5, 183.9.
IR (film) νmax cm-1: 3583, 3435, 2939, 2837, 2359, 1630, 1458, 1317, 1246, 1138, 1026, 962.
ESIHRMS [M+Na]+ C21H20NaO4に対する計算値：359.1259, 実測値:359.1275. 
【００５２】
5-ヒドロキシ-1,7-ビス（2,3-ジメトキシフェニル）-1,4,6-ヘプタトリエン-3-オン（3a）
1H NMR (400 MHz, CDCl3):δ= 3.77-3.85 (m, 12H), 5.86 (s, 1H), 6.66 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 6.91 (dd, J = 4.0, 0.4 Hz, 2H), 7.04 (t, J = 5.3 Hz, 2H), 7.16-7.17 (m, 2H), 7.93 (d, J = 6.0 Hz, 2H).
IR (film) νmax cm-1: 3583, 2937, 2838, 1710, 1660, 1621, 1577, 1478, 1427, 1378, 1268, 1224, 1175, 1074, 1003, 789, 749, 665, 423, 407.
ESIMS [M+Na]+ C23H24O6に対する計算値：396.16, 実測値：397.14.
【００５３】
5-ヒドロキシ-1-（2,3-ジメトキシフェニル）-7-（2,5-ジメトキシフェニル）-1,4,6-ヘプタトリエン-3-オン（4a）
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ= 3.90 (s, 3H), 3.92 (s, 3H) 3.93 (s, 3H) 5.85 (s, 1H), 6.49 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 6.69 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 6.87 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.91 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.95 (t, 1H), 7.08 (s, 1H), 7.13 (d, 1H), 7.32 (t, 1H), 7.51 (d, 1H), 7.59 (d, 1H), 7.96 (d, 1H).
13C NMR (400 MHz, CDCl3): δ= 3.75-3,83 (m, 12H), 5.87 (s, 1H), 6.65 (dd, J = 8.2, 2.0 Hz 2H), 6.82-6.92 (m, 4H), 7.05-7.07 (m, 2H), 7.14 (dd, J = 4.0, 0.6 Hz 1H), 7.94 (d, J = 8.0 Hz, 2H).
IR (film) νmax cm-1: 3583, 2932, 1622, 1577, 1495, 1478, 1426, 1267, 1219, 1178, 1138, 1070, 1046, 979, 772, 665, 455, 439, 425, 409.
ESIMS [M+Na]+ C23H24O6に対する計算値： 396.16, 実測値：397.12.
【００５４】
5-ヒドロキシ-1-（3,4-ジメトキシフェニル）-7-（2-メトキシフェニル）-1,4,6-ヘプタトリエン-3-オン（5a）
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ= 3.90 (s, 3H), 3.92 (s, 3H) 3.93 (s, 3H) 5.85 (s, 1H), 6.49 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 6.69 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 6.87 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.91 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.95 (t, 1H), 7.08 (s, 1H), 7.13 (d, 1H), 7.32 (t, 1H), 7.51 (d, 1H), 7.59 (d, 1H), 7.96 (d, 1H).
13C NMR (400 MHz, CDCl3): δ= 55.6, 56.0, 60.4, 101.4, 110.0, 111.3, 111.4, 120.8, 122.3, 122.7, 124.2, 124.8, 128.2, 128.7, 131.3, 135.8, 140.4, 149.4, 151.2, 158.5, 183.5, 183.7.
IR (film) νmax cm-1: 2961, 2936, 2837, 1621, 1512, 1338, 1262, 1106, 1024.
ESIMS [M+H]+ C22H22O5に対する計算値：367.4150, 実測値：367.1610.
【００５５】
5-ヒドロキシ-1-（3,4-ジメトキシフェニル）-7-（4-メトキシフェニル）-1,4,6-ヘプタトリエン-3-オン（6a）
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ= 3.72-3.77 (m, 12H), 5.68 (s, 1H), 6.37 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.52 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.01-6.91 (m, 3H), 7.12-7.20 (m, 1H), 7.34-7.45 (m, 2H), 7.84 (d, J = 8.0 Hz, 1H).
13C NMR (400 MHz, CDCl3): δ= 27.0, 30.8, 55.7, 61.1, 101.6, 113.6, 123.9, 124.3, 129.0134.2, 129.0, 148.2, 153.1, 176.9, 198.2.
IR (film) νmax cm-1: 3583, 2936, 2836, 1621, 1583, 1510, 1485, 1463, 1303, 1264, 1160, 1135, 1024, 966, 846, 807, 752, 665, 405.
【００５６】
5-ヒドロキシ-1-（3,4-ジメトキシフェニル）-7-（2,3-ジメトキシフェニル）-1,4,6-ヘプタトリエン-3-オン（7a）
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ= 3.83(d, J = 1.2 Hz 6H), 3.88 (d, J = 4.4 Hz, 6H), 5.80 (s, 1H), 6.45 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.65(d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.83 (d, J = 4.4 Hz, 1H), 6.89(q, J = 0.6 Hz, 1H) 7.00-7.03 (m, 2H), 7.10 (q, J = 0.6 Hz, 1H), 7.15(d, J = 0.6 Hz, 1H), 7.56 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.93 (d, J = 8.0 Hz, 1H).
13C NMR (400 MHz, CDCl3): δ= 40.0, 55.9, 61.4, 101.7, 109.7, 111.1, 119.3, 122.0, 122.9, 124.3, 125.4, 128.0, 129.2, 134.8, 148.4, 149.2, 151.1, 153.2, 182.8, 184.1.
IR (film) νmax cm-1: 3583, 2936, 2835, 1624, 1580, 1511, 1478, 1462, 1425, 1266, 1221, 1136, 1070, 1024, 970, 771, 665, 421, 406.
ESIMS [M+Na]+ C23H24NaO6に対する計算値： 419.1471, 実測値：419.1332.
【００５７】
5-ヒドロキシ-1-（3,4-ジメトキシフェニル）-7-（2,5-ジメトキシフェニル）-1,4,6-ヘプタトリエン-3-オン（8a）
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ= 3.62 (d, J = 1.0 Hz, 6H), 3.73 (d, J = 3.0 Hz, 6H), 5.68 (s, 1H), 6.53 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.01-6.91 (m, 3H), 7.12-7.20 (m, 1H), 7.34-7.45 (m, 2H), 7.84 (d, J = 8.0 Hz, 1H).
13C NMR (400 MHz, CDCl3): δ= 31.0, 55.7, 55.9, 56.0, 110.0, 111.1, 122.1, 122.8, 124.5, 124.7, 128.0, 135.4, 140.5, 149.2, 151.0, 152.9, 153.0, 153.1, 153.5, 183.1, 183.9.
IR (film) νmax cm-1: 3538, 2937, 2834, 1622, 1581, 1967, 1510, 1495, 1463, 1263, 1220, 1136, 1044, 1024, 969, 848, 805, 754, 665, 439, 423, 406.
ESIMS [M+Na]+ C21H20NaO4に対する計算値： 359.1259, 実測値：397.1485.
【００５８】
5-ヒドロキシ-1,7-ビス（3,4-ジメトキシフェニル）-1,4,6-ヘプタトリエン-3-オン（9a）
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ= 3.86 (d, J = 2.2 Hz, 12 H), 5.78 (s, 1H), 6.44 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 6.84 (d, J = 4.4 Hz), 7.04 (s, 2H), 7.01 (m, 2H), 7.57 (d, J = 8.0 Hz, 2H).
13C NMR (400 MHz, CDCl3): δ= 26.6, 31.2, 32.0, 56.1, 16.2, 101.6, 109.8, 111.2, 112.2, 122.2, 122.9, 124.5, 128.2, 149.3, 151.2, 183.5.
IR (film) νmax cm-1: 3583, 3032, 2821, 1623, 1580, 1509, 1459, 1420, 1261, 1136, 1022, 968, 842, 803, 770, 665, 440, 424, 409.
ESIMS [M+H]+ C23H24O6に対する計算値： 396.16, 実測値：397.15.
【００５９】
5-ヒドロキシ-1,7-ビス（2,5-ジメトキシフェニル）-1,4,6-ヘプタトリエン-3-オン（10a）
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ= 3.86 (s, 12H), 5.87 (s, 1H), 6.67 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 6.92 (d, J = 4.2 Hz, 2H), 7.07(t, J = 5.3 Hz, 2H), 7.18 (d, J = 4.2 Hz, 2H), 7.96 (d, J = 8.0 Hz, 2H).
13C NMR (400 MHz, CDCl3): δ= 55.8, 56.1, 101.7, 112.4, 113.0, 116.9, 124.6, 125.0, 135.0, 153.6, 153.0, 153.6, 183.7.
IR (film) νmax cm-1: 3583, 3000, 2941, 2834, 1621, 1575, 1494, 1464, 1428, 1289, 1263, 1220, 1179, 1161, 1137, 1046, 1024, 977, 862, 804, 754, 712, 665, 422.
ESIMS [M+Na]+ C23H24NaO6に対する計算値：419.1471, 実測値：419.1332.
【００６０】
5-ヒドロキシ-1-（3,4,5-トリメトキシフェニル）-7-（2-メトキシフェニル）-1,4,6-ヘプタトリエン-3-オン（11a）
mp = 56-63℃.
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ= 3.92 (s, 12H), 5.86 (s, 1H), 6.53 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 6.70 (d, J = 16.4 Hz, 1H), 6.77 (s, 2H), 6.94 (dt, J = 7.2 Hz, 14.8 Hz, 2H), 7.33 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 7.55 (d, J = 15.6 Hz, 2H), 7.98 (d, J = 16.0Hz, 2H).
13C NMR (400 MHz, CD3OD): δ= 54.8, 55.3, 59.9, 101.2, 105.3, 111.1, 120.5, 123.4, 123.7, 124.1, 128.0, 130.0, 131.5, 135.6, 140.4, 153.5, 158.5, 182.9.
IR (film) νmax cm-1: 2962, 2833, 2360, 1624, 1583, 1464, 1248, 1128, 1025.
ESIHRMS [M+H]+ C23H25O6に対する計算値：397.1651, 実測値：397.1606.
【００６１】
5-ヒドロキシ-1,7-ビス（3,4,5-トリメトキシフェニル）-1,4,6-ヘプタトリエン-3-オン（12a）
mp = 184-190℃.
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ= 3.91 (s, 18H), 5.86 (s, 1H), 6.52 (d, 2H, J = 15.6 Hz), 6.78 (s, 4H), 7.58 (d, 2H, J = 15.6 Hz).
13C NMR(400MHz, CD3OD): δ= 56.6, 60.7, 101.5, 106.5, 124.2, 130.8, 140.1, 141.1, 153.7, 183.7.
IR (film) νmax cm-1: 3365, 3262, 2939, 2829, 1633, 1504, 1417, 1340, 1126, 1001, 822.
ESIHRMS [M+H]+ C25H29O8に対する計算値：457.1867, 実測値：457.1867.
【００６２】
5-ヒドロキシ-1,7-ビス（3,4-ジエトキシフェニル）-1,4,6-ヘプタトリエン-3-オン（13a）
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ= 1.41-1.57 (m, 12H), 4.07-4.10 (m, 8H), 5.74 (s, 1H), 6.44 (d, J = 4.0 Hz, 2H), 6.80 (d, J = 12.4 Hz, 2H), 6.99-7.06 (m, 4H), 7.51 (d, J = 16.2 Hz, 2H).
IR (film) νmax cm-1: 3583, 2939, 2838, 1627, 1582, 1504, 1455, 1417, 1339, 1266, 1241, 1186, 1128, 1002, 966, 828, 752, 665, 439, 425, 409.
ESIMS [M+H]+ C27H32O6に対する計算値：452.2199, 実測値：453.2187.
【００６３】
5-ヒドロキシ-1,7-ビス（3,4-ジイソプロポキシフェニル）-1,4,6-ヘプタトリエン-3-オン（14a）
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ= 1.29-1.31 (m, 24 H), 4.34-4.53 (m, 4H), 5.77 (s, 1H), 6.43 (d, J = 7.8 Hz), 6.84 (d, J = 4 Hz, 2H), 7.07-7.14 (m, 4H), 7.51 (d, J = 8 Hz, 2H).
IR (film) νmax cm-1: 3583, 2976, 5546, 1687, 1625, 1580, 1504, 1428, 1383, 1264, 1130, 1106, 948, 809, 773, 665, 421, 405.
ESIMS [M+H]+ C31H40O6に対する計算値：508.28, 実測値：509.27.
【００６４】
２．比較化合物の調製
（１）ダウンサイジング化合物
以下のとおり、C5 モノケトン5cを調製した。
2018138528.tif 000041
3,4-ヒドロキシベンズアルデヒド（１等量）をDMFに溶解させ、ヨードメタン（４等量）および炭酸カリウム（５等量）を加え、80−95℃で加熱することにより、3,4-ジメトキシベンズアルデヒドとした。続いて3,4-ジメトキシベンズアルデヒド（１等量）をジメチルスルホキシドに溶解させ、Ｌ−プロリン（０．５等量）および過剰のアセトンを加え室温で24時間攪拌した。反応残渣を水、酢酸エチルで洗浄し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝２：１）で3,4-ジメトキシシンナモイル誘導体を得た（上記反応式参照）。
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3,4-ジメトキシシンナモイル誘導体（１等量）および2-メトキシベンズアルデヒド（１等量）をメタノールに溶解させ、28％ナトリウムメトキシドメタノール溶液（2等量）を加え室温で２４時間攪拌した。反応残渣を水、酢酸エチルで洗浄し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝２：１）で目的物5cを得た（上記反応式参照）。
【００６５】
下記表２に示されるとおりの置換基に対応するよう、ベンズアルデヒド誘導体上の置換基を変更した以外は、上記（１）に記載の方法に準じて、比較化合物を更に調製した（3c, 4c, 8c及び9c）。
【００６６】
表２
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2018138528.tif 000044
2018138528.tif 000045
【００６７】
（２）水溶性クルクミン誘導体（親水性クルクミン誘導体）の調製
下式で表される化合物を、Konno, H. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2014, 24, 865-870又はEndo, H. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2014, 24, 5621-5626に記載の方法に準じて調製した。
2018138528.tif 000046
【００６８】
＜実施例＞
１．試験溶液の調製
本発明の化合物: 5 μM（5 % DMSO水溶液）に用時調整した。
チオフラビンＴ(ThT)：5 μM（50 mM Glycine-NaOH buffer pH 8.5）に用時調整した。
ダウンサイジング化合物：5 μM（0.05% DMSO）に用時調整した。
水溶性クルクミン誘導体（親水性クルクミン誘導体）：10 μM（0.05% DMSO）に用時調整した。
【００６９】
２．凝集体試料の調製
（１）アミロイドβタンパク質（Ａβ）
Ａβ（1-42）を25 μM（0.1％ NH3 aq）に調整したのち、PCRチューブに2.5 μlずつ分注し、全量25 μlとなるように50 mM PBS（pH 7.5）および 100 mM NaCl aq をそれぞれ2.5 μl、純水を17.5 μlずつ分注した。その後、37℃で0, 2, 4, 6, 8, 10又は20時間インキュベーションした。
【００７０】
（２）リゾチーム
Lysozyme, Egg White（6X Crystallized）を70 μM（50 mM pH 7.5 リン酸緩衝溶液）に用時調整した後、エッペンチューブに1 mLずつ分注し、ヒートブロック (90 ℃)で10分間加熱し、氷冷却することで変性を止めた。
【００７１】
（３）牛血清アルブミン（BSA）
Albumin, Bovine, F-V, pH 5.2を25 μM（50 mM pH 7.5 リン酸緩衝溶液）に用時調整した後、エッペンチューブに1 mLずつ分注し、ヒートブロック (90 ℃)で10分間加熱し、氷冷却することで変性を止めた。
【００７２】
（４）ポリグルタミン
Fmoc 固相合成法により合成されたポリグルタミンQ10（結合次数＝10）を100 μM (50 mM Glycine-NaOH buffer pH 7.5) に調整した。
【００７３】
３．蛍光強度測定
（１）Ａβ凝集体と、本発明の化合物、比較化合物又はチオフラビンＴとを用いた測定
前記調製した凝集体試料（20時間インキュベーションしたもの）を25 μlずつPCRチューブに分注し、各チューブに１種類の前記調製した試験溶液を80 μl添加した後、得られた混合物を96well-plateに播いた。続いてマイクロプレートリーダー（Infinite 200 PRO, TECAN）を用い、励起光波長:430 nmを照射することにより蛍光波長:485 nmでの蛍光強度を測定した。
Ａβ凝集体に本発明の化合物を添加したものについて、透過型電子顕微鏡（TEM）及び蛍光顕微鏡により観察を行った（図１及び２）。
Ａβ凝集体に、本発明の化合物（1a, 2a, 3a, 4a, 5a, 8a, 9a, 11a, 12a, 13a）、比較化合物（3c, 4c, 5c, 8c, 9c）又はチオフラビンＴを添加したものにおいて検出された蛍光量をグラフに示す（図３）。本発明の化合物は、いずれも、構造が類似する比較化合物に比べて強い蛍光を示した。特に、5a、8a及び9aの化合物は、チオフラビンＴよりも強い蛍光を示した。
なお、この実験では、用いた励起波長及び測定蛍光波長を、チオフラビンＴを用いるアッセイにおいて用いられる波長と同じ値に合わせて測定している。本発明の化合物の蛍光領域は、チオフラビンＴの蛍光領域と比べて長波長側にシフトしているため、測定条件によって、チオフラビンＴよりも更に強い蛍光を示すと考えられる。
【００７４】
（２）Ａβ凝集体と、チオフラビンＴのみ、チオフラビンＴ及び水溶性クルクミン誘導体（親水性クルクミン誘導体）、又はチオフラビンＴ及び本発明の化合物とを用いた測定
前記調製した凝集体試料（37℃で0, 2, 4, 6, 8, 10又は20時間インキュベーションしたもの各々）を25 μlずつPCRチューブに分注し、各チューブに、前記調製したチオフラビンＴの試験溶液を80 μl、前記調製したチオフラビンＴの試験溶液と水溶性クルクミン誘導体（親水性クルクミン誘導体）の試験溶液を80 μlずつ、又は前記調製したチオフラビンＴの試験溶液と本発明の化合物（5a）の試験溶液を80 μlずつ添加した後、得られた混合物を96well-plateに播いた。続いてマイクロプレートリーダーを用い、励起光波長:430 nmを照射することにより蛍光波長:480 nmでの蛍光強度を測定した。
Ａβ凝集体に、チオフラビンＴのみを用いた場合、チオフラビンＴと水溶性クルクミン誘導体（親水性クルクミン誘導体）を用いた場合、及びチオフラビンＴと本発明の化合物を用いた場合に検出された蛍光量の比較をグラフに示す（図４）。本発明の化合物をチオフラビンＴと併用することで、チオフラビンＴのみを用いる場合と比べて、蛍光量の増大を示した。一方で、水溶性クルクミン誘導体（親水性クルクミン誘導体）をチオフラビンＴと併用した場合には、チオフラビンＴのみを用いた場合に検出される蛍光を消光させる結果となった。
【００７５】
（３）リゾチーム、BSA又はポリグルタミンと、本発明の化合物又はチオフラビンＴとを用いた測定
前記調製した凝集体試料を25 μlずつPCRチューブに分注し、各チューブに１種類の前記調製した試験溶液を80 μl添加した後、得られた混合物を96well-plateに播いた。続いてマイクロプレートリーダーを用い励起光波長:430 nmを照射することにより蛍光波長:480 nmでの蛍光強度を測定した。
リゾチームに、本発明の化合物（1a, 2a, 3a, 4a, 5a, 8a, 9a, 11a, 12a, 13a）又はチオフラビンＴを添加したものにおいて検出された蛍光量をグラフに示す（図５）。BSAに、本発明の化合物（1a, 2a, 3a, 4a, 5a, 8a, 9a, 11a, 12a, 13a）又はチオフラビンＴを添加したものにおいて検出された蛍光量をグラフに示す（図６）。ポリグルタミンに、本発明の化合物（1a, 2a, 3a, 4a, 5a, 8a, 9a, 11a, 12a, 13a）又はチオフラビンＴを添加したものにおいて検出された蛍光量をグラフに示す（図７）。用いた凝集体（タンパク質）の種類によって、本発明の化合物は、チオフラビンＴよりも強い蛍光、同等の蛍光、弱い蛍光を示すものがあり、全体的に見れば、本発明の化合物は、チオフラビンＴと同等かチオフラビンＴよりも優れたＡβ特異性を有し得ると言える。特に、Ａβに対してチオフラビンＴよりも強い蛍光を示した5aの化合物は、チオフラビンＴと同等かチオフラビンＴよりも優れたＡβ特異性を有していることが明らかとなり、5aの化合物は特に有用であると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
一実施態様によれば、本発明の化合物は、アルツハイマー病の原因物質として考えられているＡβ（又はその凝集体）の検出に利用し得る。また、一実施態様によれば、本発明の化合物を、Ａβの検出試薬として用いられているチオフラビンＴと併用することで、蛍光強度をより高めることもできるのみならず、本発明の化合物単体で、チオフラビンＴを上回る検出感度を達成することも可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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