(57)【要約】      （修正有）【課題】硫砒銅鉱と黄銅鉱の分離を行うために、黄銅鉱への結合能を有する新規ペプチド及びその応用技術の提供。【解決手段】（ａ）特定のアミノ酸配列を含むペプチド、（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、黄銅鉱への結合能を有するペプチド、及び、（ｃ）特定のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、黄銅鉱への結合能を有するペプチド、から選択されるペプチド。前記ペプチドをコードする核酸、前記核酸を含むベクター、前記ベクターを導入された形質転換体が好ましい。前記ペプチドを表面に提示した微生物又は前記ペプチドを固定した担体を黄銅鉱を含む鉱物粒子を分散した液に添加する、黄銅鉱の選別方法。前記固定した担体を含むカラムに前記分散した液を通す、黄銅鉱の選別方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）〜（ｃ）から選択されるいずれか１種のペプチド。
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチド。
（ｂ）配列番号１において１個若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、黄銅鉱への結合能を有するペプチド。
（ｃ）配列番号１のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、黄銅鉱への結合能を有するペプチド。
【請求項２】
下記（ｄ）〜（ｆ）から選択されるいずれか１種のペプチド。
（ｄ）配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｅ）配列番号１において１個若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、黄銅鉱への結合能を有するペプチド。
（ｆ）配列番号１のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ、黄銅鉱への結合能を有するペプチド。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のペプチドをコードする核酸。
【請求項４】
請求項３に記載の核酸を含むベクター。
【請求項５】
請求項４に記載のベクターが導入された形質転換体。
【請求項６】
請求項１又は２に記載のペプチドを表面に提示した微生物。
【請求項７】
請求項１又は２に記載のペプチドが固定された担体。
【請求項８】
請求項７に記載の担体を含む精製カラム。
【請求項９】
請求項１又は２に記載のペプチドを黄銅鉱に接触させる工程を含む黄銅鉱の選別方法。
【請求項１０】
黄銅鉱を含む鉱物粒子が分散した液に請求項６に記載の微生物を添加する工程を含む請求項９に記載の黄銅鉱の選別方法。
【請求項１１】
黄銅鉱を含む鉱物粒子が分散した液に請求項７に記載の担体を添加する工程を含む請求項９に記載の黄銅鉱の選別方法。
【請求項１２】
黄銅鉱を含む鉱物粒子が分散した液を請求項８に記載の精製カラムに通過させる工程を含む請求項９に記載の黄銅鉱の選別方法。
【請求項１３】
請求項１又は２に記載のペプチドを黄銅鉱に接触させて浮遊選鉱を行う請求項９に記載の黄銅鉱の選別方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規ペプチド及びその応用に関する。より詳細には、黄銅鉱への結合能を有する新規ペプチド及びその応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
銅鉱山で産出される銅鉱石は、主に硫化鉱である。この硫化鉱には、輝銅鉱（Ｃｕ２Ｓ）、銅藍（ＣｕＳ）等を主体とする比較的高銅品位の二次硫化銅鉱と、黄銅鉱（ＣｕＦｅＳ２）を主体とする比較的低銅品位の初生硫化鉱とが含まれる。また、硫化鉱には、硫砒銅鉱（Ｃｕ３ＡｓＳ４）等の砒素鉱物も含まれる。
【０００３】
砒素は環境に有害な元素であるため、精錬を行う前に硫砒銅鉱等の砒素鉱物を除去することが好ましい。しかし、硫砒銅鉱と黄銅鉱とは浮遊特性が近いため、浮遊選鉱によって硫砒銅鉱と黄銅鉱とを分離することは一般に困難である。
【０００４】
そこで、特許文献１では、銅鉱石、銅精鉱等の砒素を含有する含銅物から浮遊選鉱により砒素鉱物を分離する際に、チオ硫酸ナトリウムを抑制剤として用いる方法が提案されている。
また、特許文献２では、銅鉱石、銅精鉱等の砒素を含有する含銅物から浮遊選鉱により砒素鉱物を分離する際に、ポリエチレンアミン類等のキレート剤を抑制剤として用いる方法が提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１０−１３３００４号公報
【特許文献２】特開２０１１−１５６５２１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、特許文献１、２の方法によっても硫砒銅鉱と黄銅鉱との分離性能が不十分であり、実用化された例はない。このため、硫砒銅鉱と黄銅鉱とを分離することが可能な新たな技術が望まれていた。
【０００７】
本発明は上記に鑑みてなされたものであり、黄銅鉱への結合能を有する新規ペプチド及びその応用技術を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、特定のペプチドが黄銅鉱への結合能を有することを見出し、本発明を完成するに至った。より具体的には、本発明は以下のとおりである。
【０００９】
＜１＞  下記（ａ）〜（ｃ）から選択されるいずれか１種のペプチド。
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチド。
（ｂ）配列番号１において１個若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、黄銅鉱への結合能を有するペプチド。
（ｃ）配列番号１のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、黄銅鉱への結合能を有するペプチド。
＜２＞  下記（ｄ）〜（ｆ）から選択されるいずれか１種のペプチド。
（ｄ）配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｅ）配列番号１において１個若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、黄銅鉱への結合能を有するペプチド。
（ｆ）配列番号１のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ、黄銅鉱への結合能を有するペプチド。
＜３＞  ＜１＞又は＜２＞に記載のペプチドをコードする核酸。
＜４＞  ＜３＞に記載の核酸を含むベクター。
＜５＞  ＜４＞に記載のベクターが導入された形質転換体。
＜６＞  ＜１＞又は＜２＞に記載のペプチドを表面に提示した微生物。
＜７＞  ＜１＞又は＜２＞に記載のペプチドが固定された担体。
＜８＞  ＜７＞に記載の担体を含む精製カラム。
＜９＞  ＜１＞又は＜２＞に記載のペプチドを黄銅鉱に接触させる工程を含む黄銅鉱の選別方法。
＜１０＞  黄銅鉱を含む鉱物粒子が分散した液に＜６＞に記載の微生物を添加する工程を含む＜９＞に記載の黄銅鉱の選別方法。
＜１１＞  黄銅鉱を含む鉱物粒子が分散した液に＜７＞に記載の担体を添加する工程を含む＜９＞に記載の黄銅鉱の選別方法。
＜１２＞  黄銅鉱を含む鉱物粒子が分散した液を＜８＞に記載の精製カラムに通過させる工程を含む＜９＞に記載の黄銅鉱の選別方法。
＜１３＞  ＜１＞又は＜２＞に記載のペプチドを黄銅鉱に接触させて浮遊選鉱を行う＜９＞に記載の黄銅鉱の選別方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、黄銅鉱への結合能を有する新規ペプチド及びその応用技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】黄銅鉱への結合能を有するペプチドを提示したファージ（Ｃ３４ファージ）又はペプチドを提示していないファージ（ｎｕｌｌファージ）を黄銅鉱粒子、硫砒銅鉱粒子、又は黄鉄鉱粒子に接触させたときの粒子の凝集状態を示す図である。
【図２】黄銅鉱への結合能を有するペプチド（Ｃ３４ペプチド）を黄銅鉱粒子又は硫砒銅鉱粒子に接触させたときの粒子の凝集状態を、可視光又は蛍光フィルタを用いて顕微鏡観察した結果を示す図であり、（Ａ）は黄銅鉱粒子の顕微鏡観察結果を示し、（Ｂ）は硫砒銅鉱粒子の顕微鏡観察結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の実施形態について説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
アミノ酸配列の記載は左側がＮ末端側であり、アミノ酸残基は当分野で周知の一文字表記（例えば、グリシン残基であれば「Ｇ」）又は三文字表記（例えば、グリシン残基であれば「Ｇｌｙ」）を用いて表記する。
【００１３】
＜ペプチド＞
本開示のペプチドの一態様は、下記（ａ）〜（ｃ）から選択されるいずれか１種である。
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチド。
（ｂ）配列番号１において１個若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、黄銅鉱への結合能を有するペプチド。
（ｃ）配列番号１のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、黄銅鉱への結合能を有するペプチド。
【００１４】
本開示のペプチドの他の態様は、下記（ｄ）〜（ｆ）から選択されるいずれか１種である。
（ｄ）配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｅ）配列番号１において１個若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、黄銅鉱への結合能を有するペプチド。
（ｆ）配列番号１のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ、黄銅鉱への結合能を有するペプチド。
【００１５】
本開示のペプチドは、黄銅鉱への結合能が高く、硫砒銅鉱等の他の鉱物への結合能が低いという性質を有する。このため、本開示のペプチドを用いることにより、例えば、黄銅鉱と他の鉱物との混合物から黄銅鉱を選別することができる。また、本開示のペプチドに蛍光色素等の識別マーカーを結合させることにより、黄銅鉱を検出することもできる。
【００１６】
上記（ｄ）のペプチドは、詳細には以下のアミノ酸配列からなるペプチドである（アミノ酸配列は一文字表記で示す）。
ＬＬＶＬＲＩＩＧＷＶＭＧ（配列番号１）
【００１７】
上記（ａ）のペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドである。上記（ａ）のペプチドとしては、例えば、上記（ｄ）のペプチドのＮ末端側及びＣ末端側の少なくとも一方に、任意の数のアミノ酸残基が付加されたものが挙げられる。アミノ酸残基が付加される位置は、Ｎ末端側及びＣ末端側のいずれであってもよく、Ｎ末端側であることが好ましい。また、上記（ｄ）のペプチドの片側（Ｎ末端側又はＣ末端側）に付加されるアミノ酸残基の数は、例えば、１〜２０個であってもよく、１〜１０個であってもよい。
【００１８】
上記（ｅ）のペプチドは、配列番号１において１個若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、黄銅鉱への結合能を有するペプチドである。置換、欠失、又は付加されるアミノ酸残基の数は、黄銅鉱への結合能が維持される限り特に制限されない。置換、欠失、又は付加されるアミノ酸残基の数は、例えば、１〜３個であってもよく、１個又は２個であってもよく、１個であってもよい。
【００１９】
任意のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換する場合、通常、置換前後でアミノ酸側鎖の性質が保存されていることが好ましい。アミノ酸側鎖の性質によってアミノ酸を分類する場合、例えば、親水性アミノ酸（Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ）；疎水性アミノ酸（Ａ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｍ、Ｃ、Ｐ）；酸性アミノ酸（Ｄ、Ｅ）；塩基性アミノ酸（Ｋ、Ｒ、Ｈ）；脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ａ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ）；芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｆ、Ｙ、Ｗ）；硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｍ、Ｃ）；等に分類することができる（括弧内のアルファベットはアミノ酸の一文字表記を示す）。
【００２０】
アミノ酸残基が置換、欠失、又は付加される位置は、黄銅鉱への結合能が維持される限り特に制限されない。例えば、配列番号１のＮ末端側の２個のアミノ酸残基のうち１個又は２個を他のアミノ酸残基に置換してもよく、配列番号１のＮ末端側の２個のアミノ酸残基のうち１個又は２個を欠失させてもよく、配列番号１のＮ末端側に１個又は２個のアミノ酸残基を付加してもよい。
【００２１】
上記（ｅ）のペプチドの具体例としては、以下の配列番号２又は３のアミノ酸配列からなるものが挙げられる（アミノ酸配列は一文字表記で示す）。ただし、上記（ｅ）のペプチドがこれらの例に限定されないことは勿論である。
ＬＱＶＬＲＩＩＧＷＶＭＧ（配列番号２）
ＨＬＶＬＲＩＩＧＷＶＭＧ（配列番号３）
【００２２】
上記（ｂ）のペプチドは、配列番号１において１個若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、黄銅鉱への結合能を有するペプチドである。上記（ｂ）のペプチドとしては、例えば、上記（ｅ）のペプチドのＮ末端側及びＣ末端側の少なくとも一方に、任意の数のアミノ酸残基が付加されたものが挙げられる。アミノ酸残基が付加される位置は、Ｎ末端側及びＣ末端側のいずれであってもよく、Ｎ末端側であることが好ましい。また、上記（ｅ）のペプチドの片側（Ｎ末端側又はＣ末端側）に付加されるアミノ酸残基の数は、例えば、１〜２０個であってもよく、１〜１０個であってもよい。
【００２３】
上記（ｆ）のペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ、黄銅鉱への結合能を有するペプチドである。配列番号１のアミノ酸配列との配列同一性は、９２％以上であることが好ましく、９５％以上であることがより好ましく、９８％以上であることがさらに好ましい。
【００２４】
なお、配列番号１のアミノ酸配列との配列同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴプログラム（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ／ｃｇｉ）を使用して算出することができる。
【００２５】
上記（ｆ）のペプチドの具体例としては、上記の配列番号２又は３のアミノ酸配列からなるものが挙げられる。ただし、上記（ｆ）のペプチドがこれらの例に限定されないことは勿論である。
【００２６】
上記（ｃ）のペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、黄銅鉱への結合能を有するペプチドである。上記（ｃ）のペプチドとしては、例えば、上記（ｆ）のペプチドのＮ末端側及びＣ末端側の少なくとも一方に、任意の数のアミノ酸残基が付加されたものが挙げられる。アミノ酸残基が付加される位置は、Ｎ末端側及びＣ末端側のいずれであってもよく、Ｎ末端側であることが好ましい。また、上記（ｆ）のペプチドの片側（Ｎ末端側又はＣ末端側）に付加されるアミノ酸残基の数は、例えば、１〜２０個であってもよく、１〜１０個であってもよい。
【００２７】
本開示のペプチドの作製手法は、遺伝子工学的手法及び有機合成化学的手法のいずれであってもよい。遺伝子工学的手法の場合、後述する本開示の形質転換体を利用することができる。
【００２８】
＜核酸＞
本開示の核酸は、本開示のペプチドをコードするものである。本開示の核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラのいずれであってもよい。また、本開示の核酸は、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。一本鎖の場合、本開示のペプチドをコードするセンス鎖であってもよく、センス鎖に対して相補的な配列を有するアンチセンス鎖であってもよい。二本鎖の場合、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ及びＲＮＡハイブリッドのいずれであってもよい。
【００２９】
＜ベクター＞
本開示のベクターは、本開示の核酸を含むものである。本開示のベクターは、本開示の核酸をベクター中のプロモーターの下流に機能的に連結することにより作製することができる。
【００３０】
ベクターの種類としては、プラスミドベクター、ウイルスベクター等があり、用いる宿主に応じて適宜選択することができる。プラスミドベクターとしては、大腸菌由来のプラスミドベクター、枯草菌由来のプラスミドベクター、酵母由来のプラスミドベクター等が挙げられる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、パピローマウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ＳＶ４０ベクター等が挙げられる。
【００３１】
プロモーターとしては、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーター等があり、用いる宿主に応じて適宜選択することができる。
【００３２】
本開示のベクターは、必要に応じて、エンハンサー、スプライシングシグナル、選択マーカー等を、それぞれ機能可能な態様で含んでいてもよい。
【００３３】
＜形質転換体＞
本開示の形質転換体は、本開示のベクターが導入されたものである。
ベクターが導入される宿主としては、細菌、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞等がある。細菌としては、エシェリヒア属菌、バチルス属菌等が挙げられる。哺乳動物細胞としては、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＶ−１細胞等が挙げられる。
宿主にベクターを導入する方法としては、リポフェクション法、リン酸カルシウム法、マイクロインジェクション法、プロトプラスト融合法、エレクトロポレーション法、ＤＥＡＥデキストラン法、遺伝子銃法等が挙げられる。
【００３４】
なお、本開示のベクターとして発現ベクターを用い、この発現ベクターを適切な宿主に導入した場合、得られる形質転換体は本開示のペプチドを発現し得る。したがって、形質転換体を宿主の種類に応じた方法で培養し、培養物から本開示のペプチドを単離することにより、本開示のペプチドを製造することができる。本開示のペプチドを単離又は精製するには、例えば、菌体溶解液又は培養上清をクロマトグラフィー（逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等）に供すればよい。
【００３５】
＜微生物＞
本開示の微生物は、本開示のペプチドを表面に提示したものである。ここで、「微生物」は、ウイルスを含む概念として定義される。本開示の微生物としては、本開示のペプチドを表面に提示できるものであれば特に制限されず、例えば、バクテリオファージ（以下、単に「ファージ」ともいう。）が挙げられる。
【００３６】
＜担体＞
本開示の担体は、本開示のペプチドが固定化されたものである。担体の表面に本開示のペプチドを固定化する手法としては、当分野で公知の手法を用いることができる。
【００３７】
担体としては、本開示のペプチドを固定化できるものである限り特に制限されない。担体としては、例えば、磁気ビーズ、ガラスビーズ、高分子ビーズ等の微粒子が挙げられる。
【００３８】
＜精製カラム＞
本開示の精製カラムは、本開示の担体を有するものである。本開示の精製カラムは、例えば、後述する黄銅鉱の選別方法に用いることができる。
【００３９】
＜黄銅鉱の選別方法＞
本開示の黄銅鉱の選別方法は、本開示のペプチドを黄銅鉱に接触させる工程を含むものである。上述したとおり、本開示のペプチドは黄銅鉱への結合能を有するため、本開示のペプチドを黄銅鉱に接触させることにより、黄銅鉱を選別することができる。
【００４０】
本開示の黄銅鉱の選別方法は、黄銅鉱を含む鉱物粒子（例えば、銅鉱石、銅精鉱等の粒子）が分散した液に本開示の微生物を添加する工程を含むものであってもよい。本開示の微生物の表面のペプチドが鉱物粒子の黄銅鉱と結合すると、鉱物粒子が凝集して沈降し得る。この沈降した鉱物粒子を回収することにより、黄銅鉱を選別することができる。
【００４１】
微生物の添加量は、微生物の種類、鉱物量等の諸条件を考慮して適宜決定することができる。例えば、本開示の微生物がファージである場合、ファージ量（ｐｆｕ／ｍＬ）／鉱物量（ｇ／Ｌ）の比率を０．１３×１０８〜５×１０８とすることが好ましく、０．３３×１０８〜１×１０８とすることがより好ましい。
【００４２】
また、本開示の黄銅鉱の選別方法は、黄銅鉱を含む鉱物粒子が分散した液に本開示の担体を添加する工程を含むものであってもよい。本開示の担体の表面のペプチドが鉱物粒子の黄銅鉱と結合すると、鉱物粒子が凝集して沈降し得る。この沈降した鉱物粒子を回収することにより、黄銅鉱を選別することができる。また、本開示の担体として磁気ビーズを用いている場合には、沈降を待つことなく、磁力により鉱物粒子を回収することもできる。
【００４３】
また、本開示の黄銅鉱の選別方法は、黄銅鉱を含む鉱物粒子が分散した液を本開示の精製カラムに通過させる工程を含むものであってもよい。黄銅鉱を含む鉱物粒子が分散した液を本開示の精製カラムに通過させると、黄銅鉱を含む鉱物粒子の流出が遅れる傾向にある。この傾向を利用することで、黄銅鉱を選別することができる。
【００４４】
また、本開示の黄銅鉱の選別方法は、本開示のペプチドを黄銅鉱に接触させて浮遊選鉱を行うものであってもよい。例えば、黄銅鉱を含む鉱物粒子に本開示のペプチドが結合すると、気泡にトラップされ難くなる傾向にある。この傾向を利用することで、黄銅鉱を選別することができる。
【００４５】
なお、浮遊選鉱に際しては、捕収剤、抑制剤、起泡剤等の浮選剤などを適宜用いることができる。
【実施例】
【００４６】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載によって何ら限定して解釈されるものではない。
【００４７】
＜実施例１：ファージディスプレイ法による黄銅鉱結合ファージの選択＞
黄銅鉱に結合するペプチドの選択には、１２個のアミノ酸残基がランダムに結合したＭ１３バクテリオファージライブラリーを用いた。具体的には、Ｍ１３バクテリオファージライブラリーを粒子径７５μｍ以下に粉砕した黄銅鉱に接触させ、黄銅鉱に結合したファージのみを回収した。そして、回収したファージを大腸菌に感染させて増殖させた後、再び黄銅鉱に接触させ、黄銅鉱に結合したファージのみを回収した。この結合・回収操作（パニング）を４回繰り返し、黄銅鉱への結合能が高いファージを単離した。
【００４８】
単離したファージのＤＮＡ配列を解析した結果、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドが提示されていることが確認された。以下、配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドを提示したファージをＣ３４ファージとも称する。
【００４９】
＜実施例２：黄銅鉱結合ペプチドの化学合成＞
配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端側に３個のグリシン残基を付加したペプチドをＦｍｏｃ固相合成法により化学合成し、Ｎ末端を蛍光色素で修飾した。以下、この合成したペプチドをＣ３４ペプチドとも称する。
【００５０】
＜実施例３：黄銅鉱結合ファージ（Ｃ３４ファージ）による黄銅鉱粒子の凝集解析＞
粒子径７５μｍ以下の黄銅鉱粒子、硫砒銅鉱粒子、及び黄鉄鉱粒子を１０ｇ／Ｌとなるようにそれぞれ純水に懸濁し、水酸化ナトリウムを用いてｐＨを７．０に調整した。得られた懸濁液に、Ｃ３４ファージを１×１０１２ｐｆｕ／Ｌとなるように添加した。なお、Ｃ３４ファージの代わりにペプチドを提示していないファージ（ｎｕｌｌファージ）を用いたものをコントロールとした。
【００５１】
粒子の凝集を光学顕微鏡により観察した結果を図１に示す。図１に示すとおり、Ｃ３４ファージを黄銅鉱粒子に接触させた場合には凝集が確認されたが、硫砒銅鉱粒子又は黄鉄鉱粒子に接触させた場合には凝集が確認されなかった。一方、ｎｕｌｌファージを黄銅鉱粒子、硫砒銅鉱粒子、又は黄鉄鉱粒子に接触させた場合には、いずれも凝集が確認されなかった。この結果から、Ｃ３４ファージを黄銅鉱に接触させることにより、黄銅鉱を選別できることが示唆された。
【００５２】
＜実施例４：黄銅鉱結合ペプチド（Ｃ３４ペプチド）による黄銅鉱粒子の凝集解析＞
粒子径７５μｍ以下の黄銅鉱粒子及び硫砒銅鉱粒子を１０ｇ／Ｌとなるようにそれぞれ純水に懸濁し、水酸化ナトリウムを用いてｐＨを７．０に調整した。得られた懸濁液に、Ｃ３４ペプチドを１００ｎｇ／Ｌとなるように添加し、５分間静置した。その後、粒子の凝集状態を可視光で顕微鏡観察し、さらに、蛍光フィルタ（励起波長：４５０〜４９０ｎｍ、観察波長：５１０ｎｍ）を用いて顕微鏡観察した。
【００５３】
黄銅鉱粒子及び硫砒銅鉱粒子の顕微鏡観察結果をそれぞれ図２（Ａ）、（Ｂ）に示す。図２（Ａ）に示すとおり、Ｃ３４ペプチドを黄銅鉱粒子に接触させた場合には凝集が確認され、その凝集箇所は蛍光が観察された箇所と一致していた。一方、図２（Ｂ）に示すとおり、Ｃ３４ペプチドを硫砒銅鉱粒子に接触させた場合には凝集が確認されなかった。この結果から、Ｃ３４ペプチドが黄銅鉱粒子に特異的に結合することが示された。
【００５４】
＜実施例５：黄銅鉱結合ファージ（Ｃ３４ファージ）を用いたバブルピックアップ試験＞
粒子径７５〜１００μｍに篩い分けした黄銅鉱粒子及び硫砒銅鉱粒子を１００ｇ／Ｌとなるようにそれぞれ純水に懸濁し、水酸化ナトリウムを用いてｐＨを７．０に調整した。得られた懸濁液に、Ｃ３４ファージを１×１０１３ｐｆｕ／Ｌとなるように添加した。ボルテックスミキサーを使用して１分間撹拌した後、懸濁液中の粒子が全て沈降するまで５分間静置した。なお、Ｃ３４ファージを添加していないものをコントロールとした。
【００５５】
次いで、マイクロピペットを使用してマイクロチップの先に２０μＬの気泡を形成した。気泡を沈降している粒子に２秒間接触させた後、粒子から離し、気泡に粒子が付着しているか否かを観察した。観察後に気泡を壊し、新たな気泡を形成し再度同様の操作を合計３０回繰り返した。粒子が泡に付着する確率を付着確率とし、下記式に従って付着確率を算出した。結果を下記表１に示す。
付着確率（％）＝（気泡に粒子が付着した回数÷３０）×１００
【００５６】
また、捕収剤による影響を確認するため、Ｃ３４ファージの添加後に捕収剤を添加するほかは上記と同様にして、付着確率を算出した。より具体的には、Ｃ３４ファージを添加して撹拌し、５分間静置した後、捕収剤（アミルキサントゲン酸カリウム）を終濃度４０ｇ／ｔ（粒子質量）となるように添加した。再度ボルテックスミキサーを使用して１分間撹拌し、懸濁液中の粒子が全て沈降するまで２０分間静置した。その後、マイクロチップの先に２０μＬの気泡を形成し、上記と同様にして付着確率を算出した。結果を下記表１に示す。
【００５７】
【表１】
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【００５８】
表１に示すとおり、黄銅鉱粒子にＣ３４ファージを接触させた場合には、気泡への付着確率が２０％へと大きく低下し、捕収剤を添加しても３６％までしか増加しなかった。一方、硫砒銅鉱粒子にＣ３４ファージを接触させた場合には、気泡への付着確率が１６％へと大きく低下したが、捕収剤を添加すると８６％へと大きく増加した。この結果から、Ｃ３４ファージを黄銅鉱に接触させて浮遊選鉱を行うことにより、黄銅鉱を選別できることが示唆された。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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