(57)【要約】【課題】本発明の課題は、ＣＤ１ｄリガンドを含むＰＥＧ修飾中性リポソームの新たな用途を提供することである。【解決手段】ＣＤ１ｄリガンドとがん抗原を含むＰＥＧ修飾中性リポソームを用いることにより、ＣＴＬの産生誘導が起こるが、Ｔｒｅｇは誘導されない。そのため、ＣＤ１ｄリガンドとがん抗原を含むＰＥＧ修飾中性リポソームを用いて、ＣＴＬに影響の少ない抗がん剤を併用することにより、腫瘍の顕著な縮退を達成することができた。この結果、本発明のＰＥＧ修飾中性リポソームは、他の抗がん剤と併用可能で、相乗効果の期待できる抗がん剤組成物になることが示された。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の組成のＰＥＧ修飾中性リポソームを有効成分とするＣＴＬ誘導促進剤であって、
ａ）ＰＥＧ修飾中性リポソームが、中性脂質、ＰＥＧ化されたリン脂質、ＣＤ１ｄリガンドとがん抗原を含有し、
ｂ）Ｔｒｅｇ誘導が抑制されている
ことを特徴とする、ＣＴＬ誘導促進剤。
【請求項２】
中性脂質が、コレステロールであることを特徴とする、請求項１に記載のＣＴＬ誘導促進剤。
【請求項３】
ＰＥＧ化されたリン脂質が、ジステアロイル−Ｎ−モノメトキシ‐ポリエチレングリコール−スクシニル−フォスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）であることを特徴とする、請求項１又は２に記載のＣＴＬ誘導促進剤。
【請求項４】
ＰＥＧ化されたリン脂質を１モルとすると、ＣＤ１ｄリガンドが０．０５〜０．２モル含有されることを特徴とする、請求項１又は２に記載のＣＴＬ誘導促進剤。
【請求項５】
ＰＥＧ化されたリン脂質を１モルとすると、がん抗原が０．００１〜０．００２モル含有されることを特徴とする、請求項１又は２に記載のＣＴＬ誘導促進剤。
【請求項６】
ＰＥＧ化されたリン脂質を１モルとすると、中性脂質が６〜１５モル含有されることを特徴とする、請求項１又は２に記載のＣＴＬ誘導促進剤。
【請求項７】
ＣＤ１ｄリガンドがα−ＧａｌＣｅｒであることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載のＣＴＬ誘導促進剤。
【請求項８】
中性リン脂質が更に添加されていることを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載のＣＴＬ誘導促進剤。
【請求項９】
中性リン脂質が水素添加ホスファチジルコリンであることを特徴とする、請求項８に記載のＣＴＬ誘導促進剤。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載のＣＴＬ誘導促進剤を含有する、がんワクチン。
【請求項１１】
請求項１０のがんワクチンとＣＴＬに傷害の少ない抗がん剤を併用することを特徴とする、抗がん剤組成物。
【請求項１２】
ＣＴＬに傷害の少ない抗がん剤が、リポソーム化された化学療法剤、分子標的薬であることを特徴とする、請求項１１に記載の抗がん剤組成物。
【請求項１３】
リポソーム化された化学療法剤が、ドキソルビシン封入リポソーム（Ｄｏｘｉｌ（商標））、オキサリプラチン封入リポソームであることを特徴とする、請求項１２に記載の抗がん剤組成物。
【請求項１４】
リポソーム化された化学療法剤の投与後、同時又は一両日以内にがんワクチンを投与することを特徴とする、請求項１１〜１３のいずれかに記載の抗がん剤組成物。
【請求項１５】
がんワクチンとして静脈注射可能であることを特徴とする、請求項１０に記載のがんワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、ＣＤ１ｄリガンドを含有するＰＥＧ修飾リポソームを有効成分とするがんワクチンに関するものである。特に、ＰＥＧ修飾の中性リポソームを用いることにより、制御性Ｔ細胞が誘導されず、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の誘導が増強されるがんワクチンに関するものである。
【背景技術】
【０００２】  近年、ＣＤ１ｄリガンドとアレルゲンを含有する免疫制御リポソームに関する研究が進み、免疫疾患の新たな治療方法となることが期待されている（特許文献１、非特許文献１）。上記免疫制御リポソームの免疫制御メカニズムは、ＣＤ１ｄリガンド（α−ＧａｌＣｅｒ）を含有したリポソームが脾臓の辺縁帯Ｂ細胞（ＭＺ−Ｂ）に取り込まれ、ＭＺ−ＢがナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞と会合してＩＬ−１０を産生し、次いでＩＬ−１０受容体を発現して、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の誘導能を持つＣＤ１１ｃｌｏｗＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈｔ細胞が増殖することであるとされている。この結果、ＣＤ１ｄリガンド（α−ＧａｌＣｅｒ）を含有したリポソームとアレルゲンの組合せにより、生体内でＴｒｅｇを誘導し、ＩｇＥ抗体産生が抑制できると報告されている（非特許文献２、特許文献２）。【０００３】  一方、リポソーム製剤ではなく、α−ＧａｌＣｅｒ等のＣＤ１ｄリガンドは、腫瘍抗原やマラリア抗原などと共にワクチンとして使用すると、抗体応答反応を著しく増強するだけでなく、抗原に対して特異的なＢ細胞記憶プールの増大を誘導することが知られている（特許文献３）。更に、α−ＧａｌＣｅｒと腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を組み合わせて使用すると、黒色腫、肺がん又はリンパ腫のようながんの治療において、相乗効果が見られている。そのメカニズムとして、α−ＧａｌＣｅｒの単回投与により、ＮＫＴ細胞が特異的に活性化され、ＴＮＦの抗腫瘍効果を選択的に増強したことが示されている（特許文献４）。【０００４】  ＣＤ１ｄリガンド（α−ＧａｌＣｅｒ）は、リポソームに含有されるか否かで、上記のように、免疫抑制に働く場合と免疫賦活に働く場合が分かれてくることが知られている。
しかしながら、免疫の多彩な機能の中から選択的に免疫抑制機能を増強させる方法や、免疫賦活機能を増強させる方法は、未だ開発されていない状況である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】再表２００７−０８０９７７号公報
【特許文献２】再表２００５−１２０５７４号公報
【特許文献３】特開２０１５−１３１８５２号公報
【特許文献４】特表２０１０−５１９２７４号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】石井保之、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３１（５）３９２−３９８（２００８）
【非特許文献２】石井保之、生化学第８１巻第３号、２０９−２１７頁（２００９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】  本発明の目的は、抗がん剤の活性を増強させるために、ＣＴＬを誘導できる新たな作用機序のがんワクチンを提供することである。特にＣＤ１ｄリガンドとがん抗原を含有するＰＥＧ修飾の中性リポソームを用いて、ＣＴＬの誘導を行うと共に、Ｔｒｅｇの誘導を抑えて、抗がん剤（化学療法剤等）の活性を向上できるがんワクチンを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】  本発明者らは、これまでのがんワクチン検討の結果、ＣＤ１ｄリガンドとがん抗原を含むＰＥＧ修飾リポソームを使用すると、ＣＴＬの誘導が増強され、腫瘍細胞の増殖を抑制することを見出した。更に、本発明者らは検討を進めて、従来、細胞や腫瘍への取り込みが高いことから汎用されるカチオン性リポソームではなく、荷電を持たない中性のリポソームを使用すると、取り込まれる細胞の選択性が向上することを見出した。その結果、中性リポソームを用いたがんワクチンを作製すると、Ｔｒｅｇの誘導が抑えられ、しかも、中性リポソームに包含されるがん抗原により、抗原特有のＣＴＬが誘導され、より有効な抗腫瘍効果を示すことが見出された。
本発明のＰＥＧ修飾中性リポソームのがんワクチンは、Ｔｒｅｇの誘導が抑制されていることから、単剤のみでも有効であるが、ＣＴＬに対する影響が少ないリポソーム化された化学療法剤を併用すれば、その相乗効果により、顕著に腫瘍が縮退し、腫瘍が消失することを見出した。
以上のように、本発明者らは、がん細胞に取り込まれ難いことから使用されていない中性リポソームを使用してがんワクチンを作製すると、免疫系の細胞への取込みの選択性が高まり、主として脾臓のＭＺ−Ｂ細胞に取り込まれて、ＣＴＬの誘導が増加し、しかもＴｒｅｇの誘導が抑制できると言う予想外の知見を得た。この知見を利用することによって、ＣＴＬに影響が少ない抗がん剤（例えばリポソーム化された抗がん剤）を併用することにより、更に、本発明のＰＥＧ修飾中性リポソームのがんワクチンの抗腫瘍効果を発揮できることを見出し、本発明を完成した。【０００９】  本発明の要旨は以下の通りである。
（１）以下の組成のＰＥＧ修飾中性リポソームを有効成分とするＣＴＬ誘導促進剤であって、
ａ）ＰＥＧ修飾中性リポソームが、中性脂質、ＰＥＧ化されたリン脂質、ＣＤ１ｄリガンドとがん抗原を含有し、
ｂ）Ｔｒｅｇ誘導が抑制されている
ことを特徴とする、ＣＴＬ誘導促進剤。
（２）中性脂質が、コレステロールであることを特徴とする、上記（１）に記載のＣＴＬ誘導促進剤。
（３）ＰＥＧ化されたリン脂質が、ジステアロイル−Ｎ−モノメトキシ‐ポリエチレングリコール−スクシニル−フォスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）であることを特徴とする、上記（１）又は（２）に記載のＣＴＬ誘導促進剤。
（４）ＰＥＧ化されたリン脂質を１モルとすると、ＣＤ１ｄリガンドが０．０５〜０．２モル含有されることを特徴とする、上記（１）又は（２）に記載のＣＴＬ誘導促進剤。
（５）ＰＥＧ化されたリン脂質を１モルとすると、がん抗原が０．００１〜０．００２モル含有されることを特徴とする、上記（１）又は（２）に記載のＣＴＬ誘導促進剤。
（６）ＰＥＧ化されたリン脂質を１モルとすると、中性脂質が６〜１５モル含有されることを特徴とする、上記（１）又は（２）に記載のＣＴＬ誘導促進剤。
（７）ＣＤ１ｄリガンドがα−ＧａｌＣｅｒであることを特徴とする、上記（１）〜（６）のいずれかに記載のＣＴＬ誘導促進剤。
（８）中性リン脂質が更に添加されていることを特徴とする、上記（１）〜（７）のいずれかに記載のＣＴＬ誘導促進剤。
（９）中性リン脂質が水素添加ホスファチジルコリンであることを特徴とする、上記（８）に記載のＣＴＬ誘導促進剤。【００１０】（１０）上記（１）〜（９）のいずれかのＣＴＬ誘導促進剤を含有する、がんワクチン。
（１１）上記（１０）のがんワクチンとＣＴＬに傷害の少ない抗がん剤を併用することを特徴とする、抗がん剤組成物。
（１２）ＣＴＬに傷害の少ない抗がん剤が、リポソーム化された化学療法剤、分子標的薬であることを特徴とする、上記（１１）に記載の抗がん剤組成物。
（１３）リポソーム化された化学療法剤が、ドキソルビシン封入リポソーム（Ｄｏｘｉｌ（商標））、オキサリプラチン封入リポソーム（ｌ−ＯＨＰ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ（商標））であることを特徴とする、上記（１２）に記載の抗がん剤組成物。
（１４）リポソーム化された化学療法剤の投与後、同時又は１両日以内にがんワクチンを投与することを特徴とする、上記（１１）〜（１３）のいずれかに記載の抗がん剤組成物。
（１５）がんワクチンとして静脈注射可能であることを特徴とする、上記（１０）に記載のがんワクチン。
【発明の効果】
【００１１】  本発明のＣＤ１ｄリガンドとがん抗原を含むＰＥＧ修飾中性リポソームは、ＣＴＬの産生を誘導し、特許文献１と２に示されるような免疫抑制効果を起こすことなく、免疫賦活効果を示し、ＣＴＬの誘導を行うものである。
このように、本発明のＰＥＧ修飾中性リポソームは、これまでのＴｒｅｇを誘導するようなＣＤ１ｄリガンドを含有するカチオン性リポソームとは、効果が異なっている。
本発明のＰＥＧ修飾中性リポソームはがんワクチンとして使用され、ＣＴＬの産生を促進し、抗がん剤（特にＣＴＬへの影響が少ない抗がん剤）との併用により相乗効果を発揮し、腫瘍の顕著な縮退が生じることが明らかとなっている。例えば、ＣＴＬへの影響が少ない抗がん剤として、リポソーム化された化学療法剤を使用すると、このリポソーム製剤は静脈内投与後に高い血中滞留性を示し、かつ化学療法剤をリポソーム内に安定に保持するため、がん組織に蓄積しやすくなっている。更に、本発明のリポソームは静脈注射が可能であり、併用することにより、ＣＴＬが誘導され易くなっている。その結果、ＣＴＬを殺傷しない化学療法剤の抗腫瘍効果と、本発明のリポソームによるＣＴＬ誘導作用の相乗効果により、がん細胞の顕著な縮退が可能になっている。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明のＰＥＧ修飾リポソームとリポソーム化された抗がん剤ドキソルビシン（Ｄｏｘｉｌ：登録商標）の併用療法（単回投与）による、ＯＶＡ発現マウス胸腺腫に対する抗腫瘍効果の評価プロトコールを表した図である。
【図２】本発明のＰＥＧ修飾リポソームとリポソーム化された抗がん剤オキサリプラチン（ｌ−ＯＨＰ−ＰＬ）の併用療法（単回投与）による、ＯＶＡ発現マウス胸腺腫に対する抗腫瘍効果の評価プロトコールを表した図である。
【図３】図１のプロトコールに基づいて評価された、本発明のＰＥＧ修飾リポソームとリポソーム化された抗がん剤ドキソルビシンの併用療法（単回投与）の結果を示した図である。
【図４】図２のプロトコールに基づいて評価された、本発明のＰＥＧ修飾リポソームとリポソーム化された抗がん剤オキサリプラチンの併用療法（単回投与）の結果を示した図である。
【図５】リポソームに封入された抗がん剤（ドキソルビシン、オキサリプラチン）を使用するのではなく、抗がん剤をそのまま使用して図１と図２の方法に従い、まず、抗がん剤の投与を先に行った場合の抗腫瘍効果を表した図である。
【図６】リポソームに封入された抗がん剤（Ｄｏｘｉｌ：商標）が本発明のがんワクチンが誘導するＣＴＬに対して傷害を与えないことを示した図である。
【図７】リポソームに封入された抗がん剤（ｌ−ＯＨＰ−ＰＬ）が本発明のがんワクチンが誘導するＣＴＬに対して傷害を与えないことを示した図である。
【図８】本発明のがんワクチンを投与しても、Ｔｒｅｇの誘導が起こらないことを示した図である。
【図９】本発明のがんワクチンを投与すると、ＣＴＬ誘導が生じることを示した図である。
【図１０】本発明のがんワクチンを投与すると、抗原特異的抗体が誘導されることを示した図である。
【図１１】本発明のがんワクチンを投与すると、ＮＫＴ細胞が誘導されることを示した図である。
【図１２】本発明のがんワクチンを投与すると、サイトカインが誘導されることを示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】  本発明の「ＰＥＧ修飾中性リポソーム」とは、中性脂質を使用したリポソームのことである。カチオン性リポソームとして、ＤＣ−コレステロール（ＤＣ−ＣＨＯＬ）、ＤＭＴＡＰ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＡＢ、ＤＯＤＡＰがカチオン性脂質と使用されるが、中性リポソームでは使用されることはない。中性脂質として好ましいものは、コレステロールを挙げることができる。更に、中性リン脂質を添加することができる。中性リン脂質としては、特に限定されるものではないが、好ましいものとして水素添加ホスファチジルコリンを挙げることができる。
本発明で使用される「ＰＥＧ化されたリン脂質」とは、ＰＥＧ化されたリン脂質のことであり、例えばジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）等のリン脂質、スフィンゴ等脂質、グリセロ糖脂質等にポリエチレングリコール等の水溶性高分子が脂質に結合した化合物である。本発明では、これらを単独または二種以上、あるいは中性リン脂質およびコレステロール等の中性脂質と組み合わせてリポソームの作製に使用される。
【００１４】  リポソームは、公知の方法に従って調製することができる。例えば、Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．  １，２ｎｄｅｄｉｔｉｏｎ（ｂｙ  Ｇｒｅｇｏｒｙ  Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｔｏｋｙｏ）、Ｃｈａｐｔｅｒ  ４，ｐｐ６７−８０，Ｃｈａｐｔｅｒ  １０，ｐｐ１６７−１８４  ａｎｄ  Ｃｈａｐｔｅｒ  １７，ｐｐ２６１−２７６（１９９３））に記載された方法を用いることができる。より具体的には、超音波処理法、エタノール注入法、フレンチプレス法、エーテル注入法、コール酸法、カルシウム融合法、凍結融解法、逆相蒸発法等が挙げられるが、これに限られるものではない。本発明のリポソームのサイズは、特に制限されないが、通常は平均１００〜２００ｎｍが好ましく、１００〜１５０ｎｍがより好ましい。リポソームの構造も特に限定されず、ユニラメラ、マルチラメラなどいかなるリポソームであってもよい。リポソームの内部に内包される溶液としては、水のほか、緩衝液、生理食塩水などを用いることができる。これらに水溶性有機溶媒（例えばグリセリンなど）を適宜の量加えて用いることも可能である。
【００１５】  なお、本発明の医薬に用いられるリポソームは、標的部位にターゲッティングするために、リポソーム表面が修飾されたものであってもよい。標的部位としては、例えば、肝臓、脾臓、リンパ節、骨髄、肺、眼、皮膚、眼、鼻などが挙げられる。
リポソーム表面を修飾する物質としては、低分子化合物、高分子化合物、核酸、ペプチド、タンパク質、糖鎖などが挙げられる。高分子化合物としては、ポリエチレングリコールなどが挙げられる（例えば、特許第２９４８２４６号参照）。核酸としては、例えば、標的細胞のＴｏｌｌ様受容体のＴＬＲ−７やＴＬＲ−９を認識するｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ＲＮＡやｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡおよびそれら核酸の誘導体などが挙げられる。タンパク質としては、例えば、抗原提示細胞である樹状細胞（ＤＣ）またはその前駆細胞などの標的細胞表面に特異的に発現する分子を認識する抗体やレセプターなどが挙げられる。糖鎖による修飾としては、ＤＣ細胞表面に発現するマンノース受容体に結合しうる、マンノース結合脂質による修飾等が挙げられる（例えば、Ｃｏｐｌａｎｄ、Ｍ．Ｊ．、ｅｔ  ａｌ．、（２００３）Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ、Ｖａｃｃｉｎｅ、２１：８８３−８９０、参照）。
リポソームへのリガンドの封入は通常の方法により行うことができる。例えば、実施例に示すように、リポソームの成分及びリガンドをそれぞれ有機溶媒に溶解し、これらを混合して、水を加えることによって本発明のＣＤ１ｄリガンドを含むリポソームを得ることができる。ただし、ＣＤ１ｄリガンドを含むリポソームの製造法は上記のものに限定されない。
【００１６】  本発明の「がん抗原」とは、腫瘍抗原は、上皮性及び非上皮性腫瘍を含む固形腫瘍、造血組織における腫瘍の抗原である。固形腫瘍抗原としては特に限定されないが、例えば、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、Ｍａｇｅ−１、Ｍａｇｅ−３、ｇｐ１００、チロシナーゼ，ＣＥＡ、ＰＳＡ、ＣＡ−１２５、ｅｒｂ−２、Ｍｕｃ−１、Ｍｕｃ−２、ＴＡＧ−７２、ＡＥＳ、ＦＢＰ、Ｃ−レクチン、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ｇａｌｅｃｔｉｎ−４／ＮＹ−ＣＯ−２７、Ｐｅｃ６０、ＨＥＲ−２／ｅｒｂＢ−２／ｎｅｕ、テロメラーゼ、Ｇ２５０、Ｈｓｐ１０５、点変異ｒａｓ癌遺伝子、点変異ｐ５３癌遺伝子、癌胎児性抗原が挙げられる（例えば、特開２００５−１３９１１８号公報、特開２００４−１４７６４９号公報、特開２００２−１１２７８０号公報、特開２００４−２２２７２６号公報を参照）。造血組織における腫瘍（例、白血病）の抗原としては特に限定されないが、例えば、ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ３、ＷＴ−１、ｈＴＥＲＴ、ＰＲＡＭＥ、ＰＭＬ／ＲＡＲ−ａ、ＤＥＫ／ＣＡＮ、シクロフィリンＢ、ＴＥＬ−ＭＡＬ１、ＢＣＲ−ＡＢＬ、ＯＦＡ−ｉＬＲＰ、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ｉｄｉｏｔｙｐｅ、Ｓｐｅｒｍ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １７，ＳＰＡＮ−Ｘｂ、ＣＴ−２７、ＭＵＣ１が挙げられる。
【００１７】  本発明の「ＣＤ１ｄリガンド」とは、ＣＤ１ｄ発現抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に提示され、それによってＮＫＴ細胞を活性化し得る物質のことをいう。例えば、α−ＧａｌＣｅｒ（α−ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ）、α−Ｃ−ＧａｌＣｅｒ（α−Ｃ−ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ）、ｉＧＢ３（ｉｓｏｇｌｏｂｏｔｒｉｈｅｘｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ）、ＧＤ３（ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ  ３）、ＧＳＬ−１（α−ｌｉｎｋｅｄ  ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ＧＳＬ−１’ＳＡ（ｇａｌａｃｔｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）が挙げられるが、α−ＧａｌＣｅｒ、α−Ｃ−ＧａｌＣｅｒが好ましい。
本発明における中性脂質、ＰＥＧ化されたリン脂質、ＣＤ１ｄリガンドとがん抗原の比率は、目的に応じて適宜調整可能であり、例えば、ＰＥＧ化されたリン脂質を１モルとすると、ＣＤ１ｄリガンドが０．０５〜０．２モルであり、がん抗原が０．００１〜０．００２モルであり、中性脂質が６〜１５モルであることが好ましい。
【００１８】  本発明の「がんワクチン」とは、がん抗原を用いて皮下注を行いワクチネーションするだけでなく、本発明のがんワクチンは静脈注射により、ＣＴＬを誘導できるものである。従って、一般的な皮下注のがんワクチンとは大きく異なるものである。
本発明の「ＣＴＬに傷害の少ない抗がん剤」とは、リポソームに封入されているがんの化学療法剤、又は分子標的薬のことを言う。本発明では、本発明のＰＥＧ修飾中性リポソームで誘導されるＣＴＬに傷害を与えない抗がん剤であれば特に限定されるものではない。
本発明の「化学療法剤」とは、特に限定されるものではないが、例えばドキソルビシン等のアンスラサイクリン系化合物、オキサリプラチン、シスプラチン、カルボプラチン等の白金化合物等を挙げることができる。
本発明の「抗がん剤組成物」とは、血管内皮機能の改善のために、その目的に応じて医薬品として用いる組成物のことを言う。本発明の組成物は非経口で使用され、適宜、製剤上通常用いられる賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、潤滑剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤、等張化剤等を適宜選択し、常法により製造することができる。
【実施例】
【００１９】  次に実施例を挙げて本発明を更に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００２０】（実施例１）がんワクチンの作製
（１）試剤
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾リポソーム（ＰＬ）を形成するための脂質として、水素添加卵黄ホスファチジルコリン、コレステロール、ＰＥＧ修飾ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンを使用した。組成比は１．８５：１：０．１５（モル比）である。
アジュバントのα‐ガラクトシルセラミド（ＧＣ）は、上記総脂質量に対して０．５％添加された。
抗原としては卵白アルブミン（ＯＶＡ）を用いた（封入量：１μｍｏｌの総脂質あたり２０−３０μｇのＯＶＡを封入）。
（２）ワクチン作製方法
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾リポソーム（ＰＬ）は薄膜法により調製した。アジュバントのα‐ガラクトシルセラミド（ＧＣ）をＰＬの総脂質量に対して０．５％になるように添加した。抗原の卵白アルブミン（ＯＶＡ）は、凍結融解法によりＰＬに封入した。未封入のＯＶＡはゲル濾過によって取り除き、ＯＶＡとＧＣを封入したＰＬ（ＯＶＡ−ＧＣ−ＰＬ）をがんワクチンとして用いた。【００２１】（参考例１）抗がん剤（化学療法剤）を含有したリポソーム製剤の作製
（１）ドキソルビシン封入のリポソーム
ドキソルビシン封入のリポソームとしては、Ｄｏｘｉｌ（商標）を用いた。
（２）オキサリプラチン（ｌ−ＯＨＰ）封入のリポソーム
ｌ−ＯＨＰ封入のリポソームは逆相蒸発法により調製し、脂質組成は水素添加大豆ホスファチジルコリン：コレステロール：ＰＥＧ修飾ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン＝２：１：０．２（モル比）とした。未封入のｌ−ＯＨＰは透析によって除去し、ｌ−ＯＨＰ封入ＰＬ（１−ＯＨＰ−ＰＬ）を調製した。【００２２】（試験例１）がんワクチンと抗がん剤（化学療法剤）を含有したリポソーム製剤との併用効果
（１）細胞培養とがんモデルマウス作製
ＯＶＡ発現Ｔリンパ腫細胞（ＥＧ７−ＯＶＡ）は、１０％ウシ胎児血清、０．０５ｍＭの２−メルカプトエタノールを補充したＲＰＭＩ培地で培養した。細胞を回収した後、細胞数を測定し、１０６細胞をＣ５７ＢＬ／６Ｎマウスの皮下に移植した。
（２）併用投与試験
腫瘍サイズがおよそ１００ｍｍ３に到達したとき、治療を開始した。図１と図２に示すように、がんワクチンであるＯＶＡ−ＧＣ−ＰＬを、ＯＶＡ量として０．５ｍｇ／ｋｇを単回静脈内投与した。抗がん剤封入リポソーム製剤であるＤｏｘｉｌおよびｌ−ＯＨＰ−ＰＬは、それぞれ０．５ｍｇ／ｋｇ、４．２ｍｇ／ｋｇを単回静脈内投与した。検討を行った群は以下の通りである。（１）無処置群、（２）抗がん剤封入リポソーム単独治療群、（３）がんワクチン単独治療群、（４）抗がん剤含有のリポソーム製剤の投与後にがんワクチンを投与を行う群（投与間隔：１日）、（５）がんワクチン治療後に抗がん剤含有のリポソーム製剤を行う群（投与間隔：１日）。腫瘍サイズはノギスを用いて経時的に測定した。
（３）評価結果
図３と図４に示すように、がんワクチンと抗がん剤（化学療法剤）含有のリポソーム製剤を併用した場合には、継続的な抗腫瘍効果が見られ、がんの再発は認められなかった。特に、抗がん剤を先に投与した場合においては、劇的に腫瘍が縮退した。【００２３】（試験例２）がんワクチンと抗がん剤（化学療法剤）との併用効果
（１）併用投与試験
試験例１と同様に行い、抗がん剤封入リポソーム製剤ではなく、抗がん剤そのもの（ドキソルビシンとオキサリプラチン）を投与した。投与方法は、まず抗がん剤を投与することから開始した。
（２）評価結果
図５に示すように、ドキソルビシンの場合、本発明のがんワクチン（ＯＶＡ−ＧＣ−ＰＬ）単剤の投与によるがんの縮退効果は、ドキソルビシンを併用すると悪化する。また、オキサリプラチンを併用すると、相加的ながんの縮退効果しかなく、図１の左図と図２の左図に見られるような、相乗効果は見出せなかった。
これらのことから、ドキソルビシンやオキサリプラチンがＣＴＬを攻撃して殺傷するため、本発明のがんワクチンを投与してＣＴＬを誘導し産生を促進させても効果がなくなっていることを示している。【００２４】（試験例３）抗がん剤（化学療法剤）封入のリポソームによるＣＴＬへの影響評価
（１）評価方法
試験例１のがん治療を終えたマウスから脾臓を摘出し、抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞を測定するため、脾臓細胞懸濁液を調製した。Ｔ−Ｓｅｌｅｃｔ  Ｈ−２Ｋｂ  ＯＶＡ  Ｔｅｔｒａｍｅｒ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ−ＰＥ、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ８抗体（ＭＢＬ社）を用いてＯＶＡ特異的細胞傷害性Ｔ細胞を染色し、フローサイトメトリー解析を行った。
（２）評価結果
図６と図７に示すように、ＤｏｘｉｌによるＣＴＬの大幅な減少は見られなかった。また、Ｉ−ＯＨＰリポソームによるＣＴＬの大幅な減少も見られなかった。
以上のことから、ＤｏｘｉｌとＩ−ＯＨＰリポソームは、実施例１のがんワクチンによって誘導されるＣＴＬを傷害しないことが示された。【００２５】（試験例４）がんワクチンによる制御性Ｔ細胞の誘導抑制の評価試験
実施例１のがんワクチン（ＯＶＡ−ＧＣ−ＰＬ）をＣ５７ＢＬ／６Ｎマウスに静脈内投与した。３４日後に脾臓を回収し、制御性Ｔ細胞を抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ２５抗体を用いて染色し、フローサイトメトリー解析した。
その結果、図８に示されるように、ＯＶＡ−ＧＣ−ＰＬ投与によって制御性Ｔ細胞が誘導されていないことを確認した。【００２６】（試験例５）がんワクチンの細胞傷害性Ｔ細胞の誘導作用
実施例１のがんワクチン（ＯＶＡ−ＧＣ−ＰＬ）をＣ５７ＢＬ／６Ｎマウスに静脈内投与した。１４日後に脾臓を回収し、エフェクター細胞として用いた。ターゲット細胞としてＥＧ７−ＯＶＡを用い、マイトマイシンＣによる不活化、ＣＦＳＥによる蛍光標識を行った。エフェクター細胞とターゲット細胞を各種割合で混合して１２時間培養した後、７−ＡＡＤを用いてアポトーシス細胞を染色し、ターゲット細胞のアポトーシスをフローサイトメトリー解析した。
その結果、図９に示されるように、ＥＧ７−ＯＶＡのアポトーシス誘導が観察され、免疫によってＯＶＡ特異的細胞傷害性Ｔ細胞が誘導されていることが確認された。【００２７】（試験例５）がんワクチンによる抗原特異的抗体の誘導作用
実施例１のがんワクチン（ＯＶＡ−ＧＣ−ＰＬ）をＢＡＬＢ／ｃマウスに静脈内投与した。１４日後に血清を回収し、血清中の抗ＯＶＡ抗体量を測定した。
その結果、図１０に示されるように、本発明のがんワクチンは抗ＯＶＡＩｇＧを誘導することを確認した。【００２８】（試験例６）がんワクチンによるＮＫＴ細胞の誘導作用
実施例１のがんワクチン（ＯＶＡ−ＧＣ−ＰＬ）をＣ５７ＢＬ／６Ｎマウスに静脈内投与した。投与直後、２日後、３日後、６日後に脾臓を回収し、抗ＣＤ３抗体とＣＤ１ｄテトラマーを用いてＮＫＴを染色し、フローサイトメトリー解析した。
その結果、図１１に示されるようにＮＫＴが誘導されることを確認した。【００２９】（試験例７）がんワクチンによるサイトカインの誘導
Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス由来の脾臓細胞に実施例１のがんワクチン（ＯＶＡ−ＧＣ−ＰＬ）を添加して３日間培養し、分泌されたサイトカイン量をＢｉｏ−ｐｌｅｘを用いて測定した。
その結果、図１２に示されるように、Ｔｈ１サイトカインであるＩＦＮ−ｙやＩＬ−１２、Ｔｈ２サイトカインであるＩＬ−４やＩＬ−１０の分泌が確認された。
【産業上の利用可能性】
【００３０】  本発明のＣＤ１ｄリガンドとがん抗原を含むＰＥＧ修飾中性リポソームは、ＣＴＬの産生誘導を行うが、Ｔｒｅｇの誘導は行われない。そのため、本発明のＰＥＧ修飾中性リポソームを用いて、ＣＴＬに影響の少ない抗がん剤を併用することにより、腫瘍の顕著な縮退を達成することができている。このように、本発明のＰＥＧ修飾中性リポソームは、他の抗がん剤と併用可能で、相乗効果が顕著な抗がん剤組成物になることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１１】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年3月24日(2017.3.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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