(57)【要約】      （修正有）【課題】ＤＮＡ断片５’末端へのリン酸基付加が不要で、ＮＧＳライブラリー構築の低収率を改善した、断片化された二本鎖ＤＮＡ分子の末端へのアダプターとのライゲーション効率を増強させる方法の提供。【解決手段】ＤＮＡの物理的断片化の結果として損傷を受けた５’末端塩基を除去し、損傷を受けた塩基の除去により、５’リン酸を伴うライゲーション適合性塩基を露出させる方法を含む、第１のオリゴヌクレオチド、第２のオリゴヌクレオチド、及び二本鎖部分を含むアダプターポリヌクレオチドであり、第１のオリゴヌクレオチドが５’リン酸を含み、第２のオリゴヌクレオチドが、分解を受けやすい塩基とその３’末端に遮断基を含む、アダプターポリヌクレオチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１のオリゴヌクレオチド、第２のオリゴヌクレオチド、及び二本鎖部分を含むアダプターポリヌクレオチドであって、
前記二本鎖部分が、前記第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした前記第２のオリゴヌクレオチドを含み、
前記第１のオリゴヌクレオチドが、５’リン酸を含み、
前記第２のオリゴヌクレオチドが、分解を受けやすい塩基とその３’末端に遮断基を含み、
前記分解を受けやすい塩基が、デオキシウリジン、リボヌクレオチド、デオキシイノシン、及びイノシンからなる群から選択され、
前記遮断基が、３’−デオキシチミジン、３’−デオキシアデニン、３−’デオキシグアニン、３’−デオキシシトシン及び２’３’−ジデオキシヌクレオチドからなる群から選択される、前記アダプターポリヌクレオチド。
【請求項２】
第１のオリゴヌクレオチドの第１の切片が、一本鎖部分を形成する、請求項１に記載のアダプターポリヌクレオチド。
【請求項３】
第１の切片が、第１のオリゴヌクレオチドの第２の切片の３’側であり、
前記第２の切片が、第２のオリゴヌクレオチドと二本鎖部分を形成する、請求項２に記載のアダプターポリヌクレオチド。
【請求項４】
遮断基が、３’−デオキシチミジンである、請求項１に記載のアダプターポリヌクレオチド。
【請求項５】
分解を受けやすい塩基が、デオキシウリジンである、請求項１に記載のアダプターポリヌクレオチド。
【請求項６】
第１のオリゴヌクレオチド、第２のオリゴヌクレオチド、及び二本鎖部分を含む３’アダプターポリヌクレオチドであって、
前記二本鎖部分が、前記第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした前記第２のオリゴヌクレオチドを含み、
前記第１のオリゴヌクレオチドが、５’リン酸を含み、
前記第２のオリゴヌクレオチドが、その３’末端に遮断基を含み、
前記遮断基が、３’−デオキシチミジン、３’−デオキシアデニン、３’−デオキシグアニン、３’−デオキシシトシン及び２’３’−ジデオキシヌクレオチドからなる群から選択される、前記３’アダプターポリヌクレオチド；と、
基質核酸分子の５’末端からリン酸を除去するためのホスファターゼと、
前記基質核酸分子の３’陥凹末端の充填及び３’突出の切除のための、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ；と、
少なくとも１つの２’−デオキシヌクレオシド５’三リン酸（ｄＮＴＰ）と、
前記３’アダプターポリヌクレオチドを前記基質核酸分子の３’末端にライゲーションするための第１のリガーゼ；と
を含む、次世代シークエンシングアダプター系。
【請求項７】
第２のオリゴヌクレオチドが、分解を受けやすい塩基を含み、前記分解を受けやすい塩基が、デオキシウリジン、リボヌクレオチド、デオキシイノシン、及びイノシンからなる群から選択される、請求項６に記載の次世代シークエンシングアダプター系。
【請求項８】
分解を受けやすい塩基を認識するエンドヌクレアーゼをさらに含む、請求項７に記載の次世代シークエンシングアダプター系。
【請求項９】
エンドヌクレアーゼが、ＵＤＧプラスエンドヌクレアーゼVIII、ＲＮアーゼ  ＨＩ、ＲＮアーゼ  Ｈ２、及びエンドヌクレアーゼＶからなる群から選択される、請求項８に記載の次世代シークエンシングアダプター系。
【請求項１０】
３’アダプターポリヌクレオチドの第１のオリゴヌクレオチドの切片に部分的又は完全に相補的な第１の配列を含む５’アダプターポリヌクレオチド；
前記５’アダプターポリヌクレオチドを基質核酸分子の５’末端にライゲーションするための第２のリガーゼ；及び
ニックトランスレーション活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、
をさらに含む、請求項６に記載の次世代シークエンシングアダプター系。
【請求項１１】
第２のオリゴヌクレオチドが、分解を受けやすい塩基を含み、前記分解を受けやすい塩基が、デオキシウリジン、リボヌクレオチド、デオキシイノシン、イノシン、及びその組み合わせからなる群から選択される、請求項１０に記載の次世代シークエンシングアダプター系。
【請求項１２】
分解を受けやすい塩基を認識するエンドヌクレアーゼをさらに含む、請求項１１に記載の次世代シークエンシングアダプター系。
【請求項１３】
エンドヌクレアーゼが、ＵＤＧプラスエンドヌクレアーゼVIII、ＲＮアーゼ  ＨＩ、ＲＮアーゼ  Ｈ２、及びエンドヌクレアーゼＶからなる群から選択される、請求項１２に記載の次世代シークエンシングアダプター系。
【請求項１４】
第１のリガーゼが、大腸菌ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ３リガーゼ、及びＴ７リガーゼからなる群から選択される、請求項１０に記載の次世代シークエンシングアダプター系。
【請求項１５】
第２のリガーゼが、大腸菌ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ３リガーゼ、Ｔ７リガーゼ、Ｔａｑリガーゼ、及びＡｍｐリガーゼからなる群から選択される、請求項１０に記載の次世代シークエンシングアダプター系。
【請求項１６】
５’アダプターポリヌクレオチドが、一本鎖である、請求項１０に記載の次世代シークエンシングアダプター系。
【請求項１７】
第２のリガーゼが、第１のリガーゼと同一である、請求項１０に記載の次世代シークエンシングアダプター系。
【請求項１８】
以下のステップを含む、加工された基質核酸分子を産生する方法。
(ｉ) ホスファターゼ酵素を、基質核酸分子を含む試料に適用するステップであって、前記基質核酸分子が、二本鎖である、ステップ；
（ii）前記ホスファターゼ酵素が、前記基質核酸分子の５’末端からリン酸を除去することを可能にするのに十分な条件下で前記試料をインキュベートするステップ；
（iii）３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ及びｄＮＴＰを前記試料に適用するステップ；
（iv）前記３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼが、前記基質核酸分子の平滑末端化を可能にするのに十分な条件下で前記試料をインキュベートするステップ；
（ｖ）３’アダプターポリヌクレオチド及び第１のリガーゼを前記試料に適用するステップであって、前記３’アダプターポリヌクレオチドが、第１のオリゴヌクレオチド、第２のオリゴヌクレオチド、及び二本鎖部分を含み、前記二本鎖部分が、前記第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした第２のオリゴヌクレオチドを含み、
前記第１のオリゴヌクレオチドが、５’リン酸を含み、
前記第２のオリゴヌクレオチドが、その３’末端に遮断基を含み、
前記遮断基が、３’−デオキシチミジン、３’−デオキシアデニン、３’−デオキシグアニン、３’−デオキシシトシン及び２’３’−ジデオキシヌクレオチドからなる群から選択される、ステップ；及び
（vi）前記第１のオリゴヌクレオチドの前記基質核酸分子の３’末端へのライゲーションを可能にするのに十分な条件下で前記試料をインキュベートし、第１の加工された基質核酸分子を産出するステップ；
【請求項１９】
ホスファターゼ酵素が、仔ウシ腸ホスファターゼ又はエビホスファターゼである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
（iv-a）鋳型非依存性ポリメラーゼを試料に適用し、基質分子の３’末端をアデニル化するステップをさらに含み、ステップ（iv-a）が、ステップ（iv）の後かつステップ（ｖ）の前に行われる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
基質核酸分子が、ゲノムＤＮＡであり、ステップ（ｉ）の前に、前記基質核酸分子を、せん断、エンドヌクレアーゼによる切断、超音波処理、加熱、化学的切断、又はその組み合わせからなる群から選択される処理によって断片化するステップを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
基質核酸分子が、ゲノムＤＮＡであるか、又は前記基質核酸分子が、合成であり、かつ、ｃＤＮＡ、全ゲノム増幅により産生されるＤＮＡ、少なくとも１つの二本鎖末端を含むプライマー伸長産物、及びＰＣＲアンプリコンからなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
基質核酸分子が、循環無細胞ＤＮＡである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
第１のリガーゼが、大腸菌ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ３リガーゼ、及びＴ７リガーゼからなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
第２のオリゴヌクレオチドが、分解を受けやすい塩基を含み、前記分解を受けやすい塩基が、デオキシウリジン、リボヌクレオチド、デオキシイノシン、及びイノシンからなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
以下のステップをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
（vii）エンドヌクレアーゼを試料に適用するステップあって、前記エンドヌクレアーゼが、分解を受けやすい塩基を認識するステップ；
（viii）前記エンドヌクレアーゼが、前記分解を受けやすい塩基の分解を可能にするのに十分な条件下で前記試料をインキュベートするステップ；
【請求項２７】
エンドヌクレアーゼが、ＵＤＧプラスエンドヌクレアーゼVIII、ＲＮアーゼ  ＨＩ、ＲＮアーゼ  Ｈ２、及びエンドヌクレアーゼＶからなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ステップ（vii）が、５’アダプターポリヌクレオチド、第２のリガーゼ、少なくとも１つのｄＮＴＰ、及びニックトランスレーション活性を有するＤＮＡポリメラーゼを試料に適用するステップをさらに含み、前記５’アダプターポリヌクレオチドが、３’アダプターポリヌクレオチドの第１オリゴヌクレオチドの切片に部分的又は完全に相補的である第１の配列を含み、
ステップ（viii）において、条件は、
(a) 前記５’アダプターポリヌクレオチドの３’アダプターの第１のオリゴヌクレオチドへのアニーリングを促進すること、
（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼによるニックトランスレーションを可能にすること、及び
（ｃ）前記５’アダプターポリヌクレオチドの基質分子の５’末端へのライゲーションを可能にすること
のために十分であり、
ステップ（viii）の完了後、第１の加工された基質核酸分子が、前記核酸分子の両鎖のそれぞれ３’末端及び５’末端にライゲーションされた前記３’アダプターポリヌクレオチド及び前記５’アダプターポリヌクレオチドを含む、第２の加工された基質核酸分子である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
第２のリガーゼが、大腸菌ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ３リガーゼ、Ｔ７リガーゼ、Ａｍｐリガーゼ、及びＴａｑリガーゼからなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
以下のステップをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
（vii）５’アダプターポリヌクレオチド、第２のリガーゼ、少なくとも１つのｄＮＴＰ、及びニックトランスレーション活性を有するＤＮＡポリメラーゼを試料に適用するステップであって、前記５’アダプターポリヌクレオチドが、前記３’アダプターポリヌクレオチドの第１のオリゴヌクレオチドの切片に部分的又は完全に相補的である第１の配列を含むステップ；
（viii）(a)前記５’アダプターポリヌクレオチドの３’アダプターの第１のオリゴヌクレオチドへのアニーリングを促進すること、
（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼによるニックトランスレーションを可能にすること、及び
（ｃ）前記５’アダプターポリヌクレオチドの基質分子の５’末端へのライゲーションを可能にすること
のために十分な条件下で前記試料をインキュベートするステップであって、
ステップ（viii）の完了後、第１の加工された基質核酸分子が、前記基質核酸分子の両鎖のそれぞれ３’末端及び５’末端にライゲーションされた前記３’アダプターポリヌクレオチド及び前記５’アダプターポリヌクレオチドを含む、第２の加工された基質核酸分子である、ステップ；
【請求項３１】
５’アダプターポリヌクレオチドが、一本鎖である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
第２の加工された基質核酸分子を精製することをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
ステップ（viii）のために十分な条件が、４０℃で少なくとも１０分のインキュベーションを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
ステップ（ii）のために十分な条件が、３７℃で少なくとも１０分のインキュベーションを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項３５】
ステップ（iv）のために十分な条件が、２０℃で少なくとも１０分のインキュベーションを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項３６】
ステップ（vi）のために十分な条件が、２５℃で１５分以上のインキュベーションを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項３７】
第１のオリゴヌクレオチド、第２のオリゴヌクレオチド、及び二本鎖部分を含む３’アダプターポリヌクレオチドであって、前記二本鎖部分が、前記第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした前記第２のオリゴヌクレオチドを含み、
前記第１のオリゴヌクレオチドが、５’リン酸を含み、
前記第２のオリゴヌクレオチドが、その３’末端に遮断基を含み、
前記遮断基が、３’−デオキシチミジン、３’−デオキシアデニン、３−デオキシグアニン、３’−デオキシシトシン及び２’３’−ジデオキシヌクレオチドからなる群から選択される、前記３’アダプターポリヌクレオチド；と、
前記３’アダプターポリヌクレオチドの前記第１のオリゴヌクレオチドの切片と部分的又は完全に相補的である第１の配列を含む５’アダプターポリヌクレオチド；と、
前記３’アダプターポリヌクレオチドを、基質核酸分子の３’末端にライゲーションするための第１のリガーゼ；と、
前記５’アダプターポリヌクレオチドを、前記基質核酸分子の５’末端にライゲーションするための第２のリガーゼと
を含む、次世代シークエンシングアダプター系。
【請求項３８】
以下のステップを含む、加工された基質核酸分子を産生する方法。
（ｉ）３’アダプターポリヌクレオチド及び第１のリガーゼを、基質核酸分子を含む試料に適用するステップであって、
前記基質核酸分子が、二本鎖であり、
前記３’アダプターポリヌクレオチドが、第１のオリゴヌクレオチド、第２のオリゴヌクレオチド、及び二本鎖部分を含み、
前記二本鎖部分が、前記第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした前記第２のオリゴヌクレオチドを含み、
前記第１のオリゴヌクレオチドが、５’リン酸を含み、
前記第２のオリゴヌクレオチドが、その３’末端に遮断基を含み、
前記遮断基が、３’−デオキシチミジン、３’−デオキシアデニン、３’−デオキシグアニン、３’−デオキシシトシン及び２’３’−ジデオキシヌクレオチドからなる群から選択される、ステップ；
（ii）前記第１のオリゴヌクレオチドの、前記基質核酸分子の３’末端へのライゲーションを可能にするのに十分な条件下で前記試料をインキュベートし、第１の加工された基質核酸分子を産出するステップ；
（iii）５’アダプターポリヌクレオチド、第２のリガーゼ、少なくとも１つのｄＮＴＰ、及びニックトランスレーション活性を有するＤＮＡポリメラーゼを、前記試料に適用するステップであって、前記５’アダプターポリヌクレオチドが、前記３’アダプターポリヌクレオチドの前記第１のオリゴヌクレオチドの切片に部分的又は完全に相補的である第１の配列を含む、ステップ；並びに
（iv）(a)前記５’アダプターポリヌクレオチドの前記３’アダプターの第１のオリゴヌクレオチドへのアニーリングを促進すること、
（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼによるニックトランスレーションを可能にすること、及び
（ｃ）前記５’アダプターポリヌクレオチドの前記基質分子の５’末端へのライゲーションを可能にすること
のために十分な条件下で前記試料をインキュベートするステップであって、
ステップ（iv）の完了後、第１の加工された基質核酸分子が、前記基質核酸分子の両鎖のそれぞれ３’末端及び５’末端にライゲーションされた前記３’アダプターポリヌクレオチド及び前記５’アダプターポリヌクレオチドを含む、第２の加工された基質核酸分子である、ステップ；
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下で、２０１４年１月３１日に出願された米国特許仮出願第６１／９３４，５１５号、及び２０１４年１１月１１日に出願された米国特許仮出願第６２／０７８，３０９号の優先権の利益を主張するものであり、それらの開示は各々、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
電子的に提出された素材の、参照による組み込み
本出願は、開示の別個の部分として、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、コンピュータ読取り型の配列表（ファイル名：47999A_Seqlisting.txt；２０１５年１月
２９日作成；４７，０３５バイト）を含有する。
【背景技術】
【０００３】
序説
全ての市販の次世代シークエンシング（ＮＧＳ：next-generation sequencing）技術は、計器によるシークエンシングを可能とするために、特異的アダプター配列の対を、ＤＮＡ断片の末端へとライゲーションする、ライブラリーの調製を要求する。大半のＮＧＳアダプターは、３つの機能的ドメイン：（１）ライブラリー及びクローン増幅のための、固有のＰＣＲプライマーアニーリング配列、（２）固有のシークエンシングプライマーアニーリング配列、並びに（３）固有の試料インデックス化配列を含む。現在のところ、大半のプラットフォームでは、クローン増幅を活用して、各個別のＤＮＡライブラリー分子の数百のコピーを作製する。これは、各ライブラリー分子の配列検出の特定の方式のために発生させるシグナル（例えば、蛍光又はｐＨ）を増幅することを目的とする架橋増幅又はエマルジョンＰＣＲにより達成する。合成によるシークエンシングのためには、シークエンシングプライマーのためのアニーリングドメインを、アダプター−インサート接合部と並置する（ペアドエンドシークエンシングを可能とするために、各アダプターは、プライマーアニーリングのための固有の配列を保有する）。試料インデックス配列は、典型的には６〜８塩基の、短い固有の配列であって、シークエンシングされると、特定の配列リードの試料供給源を同定し、試料のマルチプレックス化又は共シークエンシングを可能とする配列を含む。既存の単一分子シークエンシング技術及び新進の単一分子シークエンシング技術であって、シグナル検出のためのクローン増幅には依拠しないが、両方の鎖の、単一の分子としてのシークエンシングを可能とする、末端のヘアピンループの、ＤＮＡ二重鎖への付加、又はナノポアに通すためのリーダー配列の導入など、他の目的で、アダプター配列の、それらの末端への結合をなおも要求する技術が存在する。
【０００４】
ターゲティング型次世代シークエンシングは、２つの主導的技術：アンプリコンシークエンシング、及び全ゲノムライブラリーに由来する標的の、ハイブリダイゼーション捕捉による濃縮により包接されている。アンプリコンシークエンシングとは、ステップ数の低減を踏まえた迅速な所要時間、全エクソームより著明に小規模な標的遺伝子座のパネルを所望する場合、並びに調製用試薬及びシークエンシング深度の両方における著明な総費用の節減のためのえり抜きの方法である。アンプリコンシークエンシングは、様々な利用可能な技法により表される。これらの例は、１．プライマー二量体を消失させる分解性標的特異的プライマーを使用するマルチプレックスＰＣＲに続く、ポリッシング及びＮＧＳアダプターのライゲーションであり、この場合、重複標的が、別個のチューブに分けられる（Ion Torrent社製AmpliSeq）；２．各標的特異的オリゴヌクレオチド対の末端にＮＧＳアダプターを組み込むマルチプレックス伸長−ライゲーション反応に続く、ＮＧＳアダプター媒介型ＰＣＲ増幅であり、これは、マルチプレックスＰＣＲの全体を回避するが、ライゲーション媒介型ＰＣＲは、インプットＤＮＡ量の増大を要求する（Illumina社製TSCA）；３．プライマー対を分離して、プライマー二量体の形成を回避し、標的遺伝子座の重複を可能とする、マイクロ流体セル上のマルチプレックスＰＣＲであるが、別個の反応は、インプットＤＮＡ量の増大を要求する（Fluidigm社製access array）；４．これもまた、プライマー対を分離して、プライマー二量体の形成を回避し、標的遺伝子座の重複を可能とする、デジタル液滴ＰＣＲによるマルチプレックスＰＣＲであるが、これもまた、インプットＤＮＡ量の増大を要件とする（Raindance社）技法を含む。各技術は、これらのアーチファクトが、結果として得られるＮＧＳアンプリコンライブラリーに大きく影響することを回避するよう、プライマー二量体を消失させるか、又はマルチプレックス化増幅工程におけるそれらの形成を回避するように設計されている。既存の方法の欠点は、Ａ．マイクロ流体計器又はデジタル液滴は、高価であり、消耗品であること、Ｂ．高インプットの要件；及びＣ．重複カバレッジ又は連続カバレッジが所望される場合、別個のマルチプレックス反応が必要となるため、さらなるインプット増大の要件が生じることである。連続カバレッジが所望される場合の、これらの選択肢に対する代替法は、ロングレンジＰＣＲを実施することである。しかし、ロングレンジＰＣＲは、マルチプレックス化することが困難であり、大半のシークエンシングプラットフォームに要求される後続の断片化に続く、別個のＮＧＳライブラリーの調製はいずれも、時間及び費用を要する。当技術分野で必要とされることは、ＤＮＡ約１０ナノグラム（ｎｇ：nanogram）の低インプットを可能とし、サーモサイクラー以外の計器を要求せず、連続カバレッジが要求される場合に、標的が別個のホットスポット遺伝子座であるのか、ゲノムの重複領域であるのかに依存しない、簡単なアンプリコン作製法である。本明細書で開示される組成物及び方法は、この必要に対する解決法を提供する。
【０００５】
ＮＧＳ  ＤＮＡライブラリーの調製は、５つのステップ：（１）ＤＮＡの断片化、（２）ポリッシング、（３）アダプターのライゲーション、（４）サイズの選択、及び（５）ライブラリーの増幅を伴う（図１及び２を参照されたい）ことが典型的である。
【０００６】
（１）断片化：ＤＮＡの断片化は、酵素による消化、又は超音波処理、噴霧化、若しくは流体力学的せん断などの物理的方法を介して達成することができる。各断片化法は、その利点及び限界を有する。酵素による消化は、効率的にポリッシングし、アダプター配列へとライゲーションされうるＤＮＡ末端を産生する。しかし、酵素反応を制御し、予測される長さの断片を産生することは困難である。加えて、酵素による断片化はしばしば、塩基特異的であり、このため、配列解析に表示バイアスを導入する。ＤＮＡを断片化する物理的方法は、それほどランダムでなく、ＤＮＡのサイズ分布は、より容易に制御しうるが、物理的断片化により産生されるＤＮＡ末端は、損傷を受けており、従来型のポリッシング反応では、十分なライゲーション適合端を作製するのに不十分である。
【０００７】
（２）ポリッシング：典型的なポリッシング混合物は、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ：polynucleotide kinase）を含有する。Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼの５’−３’ポリメラーゼ活性及び３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は、３’突出を切除し、３’陥凹末端を充填し、これにより、損傷を受けた３’塩基の切除のほか、ポリッシングＤＮＡ末端（平滑ＤＮＡ末端の創出）も結果としてもたらす。ポリッシングミックス中のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼは、リン酸を、これを欠いている可能性があるＤＮＡ断片の５’末端へと付加し、したがって、それらを、ＮＧＳアダプターに対してライゲーション適合性とする。
【０００８】
当技術分野で依然として知られていなかったことは、物理的断片化により産生される、著明数の５’末端が、同定されない形で損傷を受けており、ＰＮＫによりリン酸化されないことである。従来型のポリッシングミックス中には、損傷を受けた５’末端塩基をトリミングしうる酵素が存在しない。結果として、調製物中のＤＮＡ断片の実質的な画分は、それらの５’末端において、ＮＧＳアダプターに対してライゲーション不適合性のままであるため、ＮＧＳライブラリー分子へと転換されない。当技術分野では、アダプターのライゲーションが非効率なことは公知であるが、ライゲーションは、両方の鎖で同時になされることが典型的であるので、どちらの鎖が律速的であるのかは依然として知られていなかった。本発明者らは、反応を、鎖特異的ライゲーションへと分離して、それぞれを、各々の効率について調べた。この解析により、本発明者らは、全工程内の律速段階を、ＤＮＡ断片の著明な画分に対して、ＰＮＫの基質として良好でなく、結果として、アダプターのライゲーションの基質としても良好でない、５’末端に特定することができた。
【０００９】
（３）アダプターのライゲーション：５’リン酸基の欠如以外で、ＮＧＳライブラリー収率の低さに寄与する別の因子は、ライゲーション反応自体である。ライゲーションの前に、キメラ形成及びアダプター間（二量体）ライゲーション産物を最小化するために、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠くＤＮＡポリメラーゼを使用して修復されたＤＮＡのアデニル化を実施することが多い。これらの方法では、単一の３’Ａ突出ＤＮＡ断片を、単一の５’Ｔ突出アダプターへとライゲーションするほか、Ａ突出断片及びＴ突出アダプターは、自己ライゲーションに不適合性の粘着末端を有する。しかし、アデニル化反応は、不完全であり、非特異的副産物をもたらすことから、ライゲーションに利用可能な分子の数はさらに低減し、これにより、ライブラリー収率も低減する。本明細書では、コンカテマー形成を最小化する、より効率的な代替法が提示される。
【００１０】
（４）サイズの選択：サイズ選択工程もまた、ライブラリー収率に影響を及ぼす。サイズの選択時には、所望されるシークエンシングリード長に応じて、ライブラリーインサートサイズを最適化するために、ゲルベースの選択又はビーズベースの選択を使用して、所望されないサイズの断片をライブラリーから除去する。これは、短いＤＮＡライブラリーインサートから生じる、ペアドエンドシークエンシングの重複を最小化することにより、配列データのアウトプットを最大化する。インプットが極めて限定された試料の場合、このステップは省略することができ、ペアドエンド重複の程度が高くなる代わりに、より希少な断片がシークエンシングされる。
【００１１】
（５）増幅：低ライブラリー収率の問題により、ＮＧＳ解析の前に、ＰＣＲによりライブラリーを増幅する必要性が結果として生じ、これは、ライブラリーの複雑性の喪失と、塩基組成バイアスの招来とをもたらす。この問題を回避する、現行の唯一の解決法は、ライブラリー調製物のためのインプットＤＮＡ量の増大であるが、ＮＧＳ解析にかけられる臨床試料のうちの最大２０％では、ＤＮＡ量として不十分であるので、代わりに、さらなるＰＣＲサイクルを適用して、ＤＮＡインプットの不十分さを克服する。これは、許容されない比率のＰＣＲ複製物の存在に由来する配列データの低減を結果としてもたらす。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
ＮＧＳライブラリーの構築の低収率を引き起こす、上記で記載した既存の問題のうちの一部に取り組むため、増強されたアダプターのライゲーション法が提供される。この新規の方法は、リン酸基をＤＮＡ断片の５’末端へと付加する必要性（これは、従来型のアダプターのライゲーションに要求される；図１及び２を参照されたい）を克服する。その代わりに、ＤＮＡの物理的断片化の結果として損傷を受けた５’末端塩基を除去する。損傷を受けた塩基の除去により、５’リン酸を伴うライゲーション適合性塩基を露出させ、アダプターのライゲーション効率を回復させ、ライブラリー収率の著明な増大と、低減したインプットＤＮＡ量からライブラリーを構築する能力とをもたらす。加えて、キメラライブラリーインサート（ライゲーション時におけるコンカテマー形成）及びアダプター二量体ライゲーション産物の形成を防止するための、アデニル化／ＴＡライゲーションに対する代替法であって、ライブラリーの高調製収率にもまた寄与する代替法を導入する。本明細書で記載される方法の任意の実施形態では、処理するステップ（processing）は、基質分子の５’末端及び／又は３’末端を、ライゲーション適合性である末端へと転換することを含む。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
この方法は、その例示的形態において、処理された基質分子を作製するのに、４つの個別のインキュベーション（図３、４及び５を参照されたい）を含む。第１のインキュベーションでは、二本鎖断片化ＤＮＡを、ホスファターゼ酵素と組み合わせ、適切な反応条件下で、酵素により、リン酸基をＤＮＡ断片の末端から除去する。これは、後続のライゲーション反応における、ＤＮＡ断片によるコンカテマー形成を防止することにより、キメラライブラリーインサートの作製を防止する。
【００１４】
第２のインキュベーションでは、脱リン酸化されたＤＮＡ断片を、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を保有するポリメラーゼ又はポリメラーゼのカクテルと組み合わせる。適切な反応条件下及びｄＮＴＰの存在下では、損傷を受けた３’塩基をトリミングし、二本鎖ＤＮＡ断片のポリッシングを、物理的断片化時に発生した３’突出の切除及び３’陥凹末端の充填により達成する。このステップが完了すると、ＤＮＡ断片は、リン酸基を欠く、ライゲーション適合性３’末端及び５’末端を伴う平滑末端を保有するので、ＤＮＡ断片は、自己ライゲーションが不可能となる。
【００１５】
第３のインキュベーションでは、平滑末端の二本鎖ＤＮＡ断片を、ＤＮＡリガーゼ及び５’リン酸を含み、ＤＮＡ断片の３’末端へのライゲーションが可能な（図３を参照されたい）二本鎖平滑末端の第１のＮＧＳアダプター（３’アダプター）と組み合わせる。この３’アダプターの特異的な特徴は、ＤＮＡ断片の５’末端へと同時にライゲーションされることが典型的なアダプターＤＮＡ鎖が、ライゲーションを防止する３’末端修飾を施されており、これにより、５’リン酸の存在下であってもなお、ライゲーション反応後において、各ＤＮＡ断片の５’末端と、３’アダプターの３’末端との接合部に、ニックが残存することである。ＤＮＡ断片の５’末端へのライゲーションを防止する、同じ３’修飾はまた、アダプター間のライゲーション産物であって、これらは、機能的なアダプター二量体（機能的な二量体は、両方のアダプターを含む）とはならない、単一のアダプター配列も含むが、このようなライゲーション産物の形成も防止する。このステップの産物は、単一のＮＧＳアダプターを、ただ１つの鎖の両方の３’末端へとライゲーションした、二本鎖ＤＮＡ断片である。
【００１６】
第４のインキュベーションでは、ＤＮＡ断片へとライゲーションされずに残存する（３’修飾のために）３’アダプターの鎖はまた、オリゴ合成時における分解性塩基の組み込みのために、置換又は分解もなされる。第４のインキュベーション時には、任意の適切な酵素の存在下で、３’アダプター鎖は、これもまた反応物中に存在する、第２のＮＧＳアダプター配列を含む、新たな一本鎖アダプター（５’アダプター、図３を参照されたい）により分解又は置換されるが、アダプター−インサート接合部における、３’アダプターに対する相補性配列を介して、一本鎖５’アダプターは、二本鎖ＤＮＡ断片の３’末端へとライゲーションされた３’アダプターの相補性部分とアニールする結果として、ニック又はギャップを元に戻す。加えて、反応物中には、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を保有するＤＮＡポリメラーゼも存在し、ｄＮＴＰ、リガーゼ及び適切な反応条件の存在下では、５’アダプターとＤＮＡ断片の５’末端との接合部に存在するニック又はギャップにおいて、ニックトランスレーションが誘発される。ニックトランスレーションは、損傷を受けた５’末端塩基（及び５’末端に対して内部にある、さらなる１又は２以上の塩基）の置き換えを結果としてもたらし、ライゲーション適合性である５’末端のリン酸基を露出させる。続いて、リガーゼが、１又は２以上の塩基にわたりトランスレーションされたニックをシールすると、５’アダプターの、ＤＮＡ基質分子への効率的ライゲーションが生じる（図４を参照されたい）。この新規のアダプターのライゲーション工程の完了時には、各二本鎖ＤＮＡ断片の両方の末端を、２つの異なる一本鎖ＮＧＳアダプターであって、アダプター−インサート接合部において、短い相補性アダプター配列を共有する、ＮＧＳアダプターが挟んでいる。
【００１７】
代替的に、５’末端塩基の除去と、５’アダプターのライゲーションとは、重合化を伴わずに、一本鎖５’アダプターを、１又は２以上のさらなるランダム塩基と、基質分子の損傷を受けた５’塩基と重複するその３’末端においてアニールさせることにより達成することができ、ｄＮＴＰの非存在下で、ＤＮＡ基質分子の５’末端において置換された塩基の、５’ｆｌａｐ特異的ヌクレアーゼによる切断が、置換後になされ、この結果として、切断されたＤＮＡ基質分子の末端上において、第２のＮＧＳアダプターの、露出させた５’リン酸への効率的ライゲーションがもたらされる（図５を参照されたい）。
【００１８】
別の代替法では、５’末端塩基の除去と、５’アダプターのライゲーションとは、３’アダプターの分解性鎖又は置換性鎖からの単一のジデオキシ塩基の伸長に続く、ポリメラーゼの５’ｆｌａｐエンドヌクレアーゼ活性による、ＤＮＡ断片の５’末端塩基の切断により達成することもできる。次いで、鎖を、５’アダプターにより分解又は置換し、リガーゼの存在下で、５’アダプターを、ＤＮＡ断片の露出させた５’リン酸へと効率的にライゲーションする。このステップ及び前出のステップの代替的な実施形態を、下記に提示する。
【００１９】
したがって、一態様では、本開示は、処理された基質分子を産生する方法であって、（ｉ）第１のポリヌクレオチドを、少なくとも部分的に二本鎖である基質分子の３’末端へとライゲーションするステップと；（ii）アニーリングを促進する条件下で、第２のポリヌクレオチドを、第１のポリヌクレオチドとアニールさせるステップと；（iii）少なくとも１つのヌクレオチドを、基質分子の５’末端から切除するステップと；次いで、（iv）第２のポリヌクレオチドを、二本鎖基質分子の５’末端へとライゲーションして、処理された基質分子を産生するステップとを含む方法を提供する。一実施形態では、方法は、ステップ（ｉ）の前に、基質分子を、ホスファターゼ酵素と接触させるステップをさらに含む。別の実施形態では、方法は、基質分子を、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を保有するポリメラーゼ酵素と接触させることにより、平滑末端化された基質分子を作製するステップをさらに含む。さらに別の実施形態では、方法は、基質分子を、鋳型非依存性ポリメラーゼと接触させて、基質分子の３’末端をアデニル化するステップをさらに含む。
【００２０】
本明細書で開示される方法のうちのいずれかでは、基質分子は、天然に存在するか、又は基質分子は、合成であることが想定される。一実施形態では、基質分子は、天然に存在する。別の実施形態では、基質分子は、ゲノムＤＮＡであり、さらなる実施形態では、ゲノムＤＮＡは、真核生物ゲノムＤＮＡ又は原核生物ゲノムＤＮＡである。基質分子が、ゲノムＤＮＡである実施形態では、本開示は、ゲノムＤＮＡを、インビトロ又はインビボで断片化することを想定する。一部の実施形態では、インビトロにおける断片化を、せん断（shearing）、エンドヌクレアーゼによる切断、超音波処理、加熱、アルファ線源、ベータ線源、又はガンマ線源を使用する照射、金属イオンの存在下における化学的切断、ラジカルによる切断、及びこれらの組合せからなる群から選択される工程により実施する。一部の実施形態では、インビボにおける断片化を、アポトーシス、放射線、及びアスベストへの曝露からなる群から選択される工程により行う。
【００２１】
本開示はまた、基質分子が、合成であり、ｃＤＮＡ、全ゲノム増幅により産生されるＤＮＡ、少なくとも１つの二本鎖末端を含むプライマー伸長産物、及びＰＣＲアンプリコンからなる群から選択される実施形態も想定する。
【００２２】
本開示の態様又は実施形態のうちのいずれかでは、第１のポリヌクレオチドは、少なくとも部分的に二本鎖であり、オリゴヌクレオチド１及びオリゴヌクレオチド２を含むことが想定される。一部の実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド１とアニールし、さらなる実施形態では、アニーリングは、ニック、ギャップ、又は第２のポリヌクレオチドと基質分子との重複塩基を結果としてもたらす。一部の実施形態では、アニーリングは、オリゴヌクレオチド１とオリゴヌクレオチド２とのデハイブリダイゼーションを結果としてもたらす。
【００２３】
多様な実施形態では、第２のポリヌクレオチドを、ポリメラーゼと接触させ、その結果、オリゴヌクレオチド２の分解をもたらす。
【００２４】
本開示ではまた、オリゴヌクレオチド２が、分解を受けやすい塩基を含む実施形態も想定され、本開示はまた、オリゴヌクレオチド２が、ライゲーションを防止する、その３’末端における遮断基を含む実施形態も提示する。一部の実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、修飾塩基を含む。
【００２５】
さらなる実施形態では、本開示の方法は、（ｉ）第３のポリヌクレオチドを、少なくとも部分的に二本鎖である、さらなる基質分子の３’末端へとライゲーションするステップと；（ii）アニーリングを促進する条件下で、第４のポリヌクレオチドを、第３のポリヌクレオチドへとアニールさせるステップと；（iii）少なくとも１つのヌクレオチドを、さらなる基質分子の５’末端から切除するステップと；次いで、（iv）第４のポリヌクレオチドを、二本鎖のさらなる基質分子の５’末端へとライゲーションして、処理された、さらなる基質分子を産生するステップとをさらに含む。一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチドと第３のポリヌクレオチドとは、同じである。一部の実施形態では、第２のポリヌクレオチドと第４のポリヌクレオチドとは、同じである。
【００２６】
ターゲティング型アンプリコンによるＮＧＳライブラリーの構築法は、２つの個別のステップ：マルチプレックスＰＣＲ標的の濃縮に続く、ＮＧＳアダプターのライゲーションステップを含む（図３９を参照されたい）。２つの個別のワークフローオプション：２ステップのＰＣＲに続くアダプターのライゲーション又は１ステップのＰＣＲに続くライゲーションが可能である。
【００２７】
いずれかの方法を使用するマルチプレックスＰＣＲステップでは、所望される標的遺伝子座に対する標的特異的プライマー対が設計され、それらの５’末端において、ユニバーサルの短縮ＮＧＳアダプター配列を含む（図４０及び４１、表２を参照されたい）。第１のＰＣＲサイクルは、それらの各々が低濃度である、それらの標的配列から、ユニバーサルＮＧＳアダプターでタグ付けされたアンプリコンを創出する、複雑性の大きなプライマー対を可能とするように、サイクリング時間が延長されている。これらのプライマーは、個別のアンプリコンを同定する固有の縮重配列タグ（ＵＩ＝unique identifier：固有の識別子）であって、各ＵＩが、各プライマーの５’末端におけるユニバーサルＮＧＳアダプター配列と、各プライマーの３’末端における標的特異的部分との間に配置される（及び、ＮＮＮＮ塩基の連なりとして表示される；図４０、４１）ＵＩを任意に保有する。ＵＩ配列を使用する場合、延長されるマルチプレックスＰＣＲサイクルは、既に作製されたアンプリコンのコピーへの、さらなるＵＩ配列の組み込みを回避するために、２回に限定され；ＵＩ配列を使用しない場合は、延長されるマルチプレックスＰＣＲサイクルは、３サイクル以上にわたり実施することができる。実施される標的特異的サイクルの数が限定されるほど、蓄積されるプライマー二量体産物は少なくなるので、試料インプットに対して妥当な、最小数のマルチプレックス化サイクルを実施すべきである。マルチプレックスサイクル（２又は３以上）の後、各標的アンプリコンを挟むユニバーサルの短縮ＮＧＳアダプターに対応する、単一のユニバーサルプライマーを使用する増幅の第２相では、伸長時間をより短くして、ＰＣＲを継続する。ユニバーサルプライマーは、標的特異的プライマーと比較して比較的高濃度で使用するが、この場合、サイクルの総数は、所望されるライブラリー収率により決定される。標的特異的プライマーの濃度は、標的を増幅するのに十分ではないので、自己相互作用しえないユニバーサルプライマーが、さらなるプライマー二量体の形成を伴わずに、増幅反応を引き継ぐ。加えて、限定的なマルチプレックス化サイクルにおいて蓄積されるプライマー二量体は、所望されるアンプリコンより長さが短く、安定的な二次構造下に置かれ、この結果として、単一のユニバーサルプライマーによる増幅の効率は低下する。ＵＩ配列を使用する場合、ユニバーサルプライマーの付加の前に、さらなるＵＩ配列が、既に作製されたアンプリコンのその後のコピーを標識することを防止するために、マルチプレックスプライマーの精製ステップ又はマルチプレックスプライマーのエキソヌクレアーゼＩによる消化が要求される。ＵＩ配列を使用しない場合は、マルチプレックスプライマーによる反応の開始時にユニバーサルプライマーを添加することができ、これらは、ユニバーサルアダプターでタグ付けされたアンプリコンが作製されたら、機能的となるであろう。
【００２８】
ユニバーサルプライマーのさらなる特徴は、それが、下流におけるアダプターのライゲーションを可能とする切断性塩基を任意に含むことである。限定せずに述べると、切断性塩基は、デオキシウリジン、ＲＮＡ又はデオキシイノシンを含みうる。代替的に、ユニバーサルプライマーは、切断性塩基を含まないが、この配列は、アダプターのライゲーションを可能とするように、５’エキソヌクレアーゼを使用して、後で切除する（図４２を参照されたい）。加えて、標的特異的プライマー及びユニバーサルプライマーのいずれも、それらの３’末端に、ヌクレアーゼ耐性修飾を任意に含むが、これらは、ホスホロチオエート連結、２’Ｏ−メチル修飾又はメチルホスホネート修飾を含む。これらは、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を保有するプルーフリーディングポリメラーゼを使用する場合、より特異的で効率的なプライミングを可能とする。ヌクレアーゼ耐性修飾はまた、アダプターのライゲーションの前に、この酵素を使用して、ユニバーサルアダプター配列をアンプリコンから除去する場合、５’エキソヌクレアーゼ消化も制限する。ＰＣＲの後では、使用されなかった試薬及びポリメラーゼを除去する精製ステップが要求される。
【００２９】
アダプターライゲーションの最終ステップ（図４２を参照されたい）では、プライマーへの分解性塩基の組み込み及び修飾特異的エンドヌクレアーゼの使用のために、各アンプリコンのうちの、ユニバーサルプライマーに由来する部分を消化する。代替的に、それらの３’末端にヌクレアーゼ耐性塩基を含有するプライマーでは、５’エキソヌクレアーゼ消化により、各アンプリコンの５’部分をトリミングすることができる。この場合、アンプリコンの５’末端のエキソヌクレアーゼ消化は、ヌクレアーゼ耐性塩基の位置で終結するであろう。プライマー消化反応は、各アンプリコンの両方の末端において、一本鎖３’突出を創出する。反応物中にはまた、第２のＮＧＳアダプター配列を含む、全長一本鎖アダプターＢも存在し、アダプター−標的の接合部における、ユニバーサルアダプターと相補的な配列を介して、一本鎖である第２のアダプターＢは、各アンプリコンの３’突出に配置された、ユニバーサルアダプターの相補性部分とアニールし、この場合、アダプターのアニーリングの結果として、ニック又はギャップが形成される。加えて、反応物中には、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を保有するＤＮＡポリメラーゼも存在し、ｄＮＴＰ、リガーゼ及び適切な反応条件の存在下では、アダプターＢとアンプリコンの５’末端との接合部に存在するニック又はギャップにおいて、ニックトランスレーションが誘発される。ニックトランスレーションは、５’末端に対して内部にある１又は２以上の塩基の置き換えを結果としてもたらし、ライゲーション適合性である５’末端のリン酸基を露出させる。続いて、リガーゼが、１又は２以上の塩基にわたりトランスレーションされたニックをシールすると、アダプターＢの、ＤＮＡ基質アンプリコンへの効率的ライゲーションが生じる。代替的に、アダプターＢのライゲーションは、ポリメラーゼを、ｆｌａｐエンドヌクレアーゼ活性と共に使用し、加えて、リガーゼと共に使用する置換−切断反応によっても達成される。この場合、ｄＮＴＰは要求されず、各アンプリコンにおいて残存する、アダプターＢの３’末端と、アダプターのユニバーサル部分の５’末端との、複数の塩基重複だけが要求される。アダプターのライゲーション工程を完了するには、リンカー媒介型ライゲーションを同時に実施して、各アンプリコンの３’末端に残存するユニバーサルアダプター配列において、第１のアダプター（Ａ）を完了させる。リンカーオリゴヌクレオチドは、各アンプリコンにおいて残存するユニバーサルアダプターの３’末端と相補的であり、第１のアダプターの残余部分を含むオリゴヌクレオチドとも相補的である。両方の配列に対するその相補性を介して、リンカーオリゴヌクレオチドは、第１のアダプターの３’残余部分、及び各アンプリコンに存在する残存するユニバーサルアダプターの両方とハイブリダイズし、ライゲーションが生じることを可能とする。この新規のアダプターのライゲーション工程の完了時には、各アンプリコンの両方の末端を、アダプター−標的接合部において、短い相補性アダプター配列を共有する、２つの異なる一本鎖ＮＧＳアダプター（Ａ及びＢ）が挟んでいる。次いで、ライブラリーの定量化及びシークエンシングの前の最終精製ステップを実施する。
【００３０】
開示される方法のさらなる特徴は、マルチプレックス化ＰＣＲ増幅反応において使用されるＤＮＡポリメラーゼの選択である。高いフィデリティーのPfu DNA polymerase、Phusion DNA polymerase、KAPA HiFi DNA polymerase、Q5 DNA polymerase、又はこれらの誘導体及びアナログを使用する場合は、増幅時におけるエラー率を改善することができる。加えて、増幅反応の第２相で使用されるユニバーサルプライマーが、切断性塩基を任意に含むことを踏まえると、ウラシル塩基、ＲＮＡ塩基又はイノシン塩基に寛容性がある高いフィデリティーのＤＮＡポリメラーゼもまた、所望される。これは、全てがウラシル含有基質を寛容するように操作されている、KAPA HiFi U+ polymerase、Themo Fisher社製Phusion U polymerase及びEnzymatics社製VeraSeq ULtra polymeraseを含むがこれらに限定されない。３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を保有する高いフィデリティーの酵素の、増幅反応における使用を踏まえると、全ての標的特異的プライマー並びにユニバーサルプライマーは、プライマー伸長のフィデリティー及び効率を増大させるように、それらの３’末端にヌクレアーゼ耐性連結を含む。これは、ホスホロチオエート連結又は他のヌクレアーゼ耐性部分を含むがこれらに限定されない。
【００３１】
加えて、既に言及したとおり、単一チューブフォーマットにおける連続カバレッジのために重複標的を増幅することが可能な、ターゲティング型ＮＧＳライブラリーのためのマルチプレックス化ＰＣＲ法が所望される。本明細書で開示される方法は、この効果を達成することが可能である（図４３及び４４）。重複する標的領域を有する２つのプライマー対の場合、４つの可能なアンプリコン：２つの遠位プライマーの増幅から生じるマキシアンプリコン及び２つの近位プライマーの増幅から生じるミニアンプリコンという２つのプライマー対の各々に特異的なアンプリコンを作製することができる。ミニアンプリコンが、マルチプレックス化ＰＣＲ反応に大きく影響すること（ミニアンプリコンなどの短いアンプリコン及びプライマー二量体は、それらの長さが短く、増幅が容易であるために、増幅反応に大きく影響することが多い）を回避するために、大半の方法では、重複するプライマー対を、２つのチューブへと分離するが、これは、有効ではあるが、作業負荷及び要求されるＤＮＡインプット量を倍増させる。各末端におけるユニバーサル配列の存在に起因して、短いミニアンプリコンは、安定的な二次構造下に置かれ、この結果として、単一のユニバーサルプライマーによる増幅の効率は低下するため、本明細書で開示される方法は、重複アンプリコンを、単一のチューブ内で創出することを可能とする。したがって、初期の標的特異的ＰＣＲサイクルにおいて、ミニアンプリコンが産生される場合であってもなお、これが効率的に増幅されることはなかろう。結果として、本明細書で開示される方法を使用すると、高品質で高分子量のＤＮＡインプットから、各プライマー対に特異的なアンプリコン及びマキシアンプリコンだけが産生される。架橋ＦＦＰＥ  ＤＮＡ又は断片化ＤＮＡ（特に、１６５ｂｐの範囲にある循環無細胞ＤＮＡ）を使用する場合は、鋳型の長さ又は不規則性が、このサイズのアンプリコンに不利であるので、マキシアンプリコンの形成が抑制され、各プライマー対に特異的なアンプリコンだけが産生される。
【００３２】
本明細書で開示される方法のうちのいずれかでは、試料ＤＮＡインプットは、天然に存在するＤＮＡであることが想定される。一実施形態では、インプットＤＮＡは、無傷の高分子量ＤＮＡ又は断片化された循環無細胞ＤＮＡである、ゲノムＤＮＡであり、さらなる実施形態では、ゲノムＤＮＡは、真核生物由来のＤＮＡ、原核生物由来のＤＮＡ、微生物由来のＤＮＡ又はウイルス由来のＤＮＡである。他の実施形態では、インプットＤＮＡは、一本鎖ＤＮＡ若しくは二本鎖ＤＮＡであるか、又は合成ＤＮＡであり、過去における全ゲノム増幅の結果であるか、又はランダムプライミングによるＲＮＡの逆転写若しくは他の形でプライミングされたＲＮＡの逆転写の結果である。
【００３３】
本開示のさらなる態様では、リガーゼと、少なくとも部分的に二本鎖であり、オリゴヌクレオチド１及びオリゴヌクレオチド２を含む、第１のポリヌクレオチドとを含む組成物であって；オリゴヌクレオチド１が、５’リン酸と、その３’末端の遮断基とを含み；オリゴヌクレオチド２が、（ｉ）分解を受けやすい塩基を含み、及び／又は（ii）非変性加熱条件により置換される可能性があり、その３’末端に遮断基をさらに含み、前記遮断基が、３’末端のライゲーションは防止するが、オリゴヌクレオチド１の５’末端のライゲーションは可能とする組成物が提供される。
【００３４】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド２の３’遮断基は、３’デオキシチミジン、３’デオキシアデニン、３’デオキシグアニン、３’デオキシシトシン又はジデオキシヌクレオチドである。さらなる実施形態では、分解を受けやすい塩基は、デオキシウリジン、リボヌクレオチド、デオキシイノシン、又はイノシンである。非変性加熱条件は、多様な実施形態では、約５０℃〜約８５℃である。
【００３５】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド２は、オリゴヌクレオチド２の結合安定性を低減する塩基修飾を含み、塩基修飾は、デオキシイノシン、イノシン又はユニバーサル塩基である。
【００３６】
一部の態様では、本開示はまた、二本鎖基質の、本開示の組成物とのインキュベーションから生じるライゲーション産物と；リガーゼ、ニックトランスレーション活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、分解を受けやすい塩基を認識するエンドヌクレアーゼと；一本鎖であり、ポリヌクレオチド１のオリゴヌクレオチド２が、分解又は置換されると、ポリヌクレオチド２のオリゴヌクレオチド１の５’部分と、適切な条件下でアニールする程度に十分に相補的な３’ドメインを含む、第２のポリヌクレオチドとを含む組成物も提示する。
【００３７】
一部の実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、第１のポリヌクレオチドのオリゴヌクレオチド２を置換するのに十分な長さであるか、又は第２のポリヌクレオチドは、その結合安定性を増大させる塩基修飾を含む。さらなる実施形態では、エンドヌクレアーゼは、ＵＤＧプラスエンドヌクレアーゼVIII、ＲＮアーゼ  ＨＩ、ＲＮアーゼ  Ｈ２及びエンドヌクレアーゼＶからなる群から選択される。なおさらなる実施形態では、リガーゼは、大腸菌（E. coli）ＤＮＡリガーゼ又はＴ４  ＤＮＡリガーゼである。その結合安定性を増大させる塩基修飾は、多様な実施形態では、ロックト核酸（ＬＮＡ：locked nucleic acid）である。
【００３８】
本開示のさらなる態様では、二本鎖基質の、本開示の組成物とのインキュベーションから生じるライゲーション産物と；リガーゼと；ｆｌａｐエンドヌクレアーゼと；分解を受けやすい塩基を認識するエンドヌクレアーゼと；ポリヌクレオチド１のオリゴヌクレオチド２が、分解又は置換されると、ポリヌクレオチド２のオリゴヌクレオチド１の５’部分と、適切な条件下でアニールする程度に十分に相補的な３’ドメインを含む一本鎖オリゴヌクレオチドを含む第２のポリヌクレオチドとを含む組成物であって、第２のポリヌクレオチドが、第１のポリヌクレオチドのオリゴヌクレオチド２を置換するのに十分な長さであるか、又は第２のポリヌクレオチドが、その結合安定性を増大させる塩基修飾を含み、第２のポリヌクレオチドが、３’末端の縮重塩基をさらに含む組成物が提供される。
【００３９】
別の態様では、本開示は、処理された基質分子を産生する方法であって、（ｉ）第１のポリヌクレオチドを、少なくとも部分的に二本鎖である基質分子の３’末端へとライゲーションするステップと；（ii）アニーリングを促進する条件下で、第２のポリヌクレオチドを、第１のポリヌクレオチドとアニールさせるステップと；（iii）少なくとも１つのヌクレオチドを、基質分子の５’末端から切除するステップと；次いで、（iv）第２のポリヌクレオチドを、二本鎖基質分子の５’末端へとライゲーションして、処理された基質分子を産生するステップとを含む方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、ステップ（ｉ）の前に、基質分子を、ホスファターゼ酵素と接触させるステップをさらに含む。
【００４０】
一部の実施形態では、ホスファターゼ酵素は、仔ウシ腸ホスファターゼ又はエビホスファターゼである。
【００４１】
さらなる実施形態では、方法は、基質分子を、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を保有するポリメラーゼ酵素と接触させることにより、平滑末端化された基質分子を作製するステップをさらに含む。
【００４２】
一部の実施形態では、ポリメラーゼ酵素は、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、クレノウ断片、Ｔ７ポリメラーゼ、及びこれらの組合せからなる群から選択される。なおさらなる実施形態では、方法は、基質分子を、鋳型非依存性ポリメラーゼと接触させて、基質分子の３’末端をアデニル化するステップをさらに含む。
【００４３】
多様な実施形態では、基質分子は、天然に存在するか、又は基質分子は、合成である。したがって、一部の実施形態では、基質分子は、天然に存在する。さらなる実施形態では、基質分子は、ゲノムＤＮＡである。なおさらなる実施形態では、ゲノムＤＮＡは、真核生物ゲノムＤＮＡ又は原核生物ゲノムＤＮＡであり、なおさらなる実施形態では、ゲノムＤＮＡを、インビトロ又はインビボで断片化する。一部の実施形態では、基質分子は、循環無細胞ＤＮＡである。
【００４４】
一部の実施形態では、方法は、ステップ（ｉ）の前に、温度を約５０℃〜約８５℃の間へと調整するステップをさらに含む。一部の実施形態では、温度は、６５℃である。
【００４５】
さらなる実施形態では、インビトロにおける断片化を、せん断、エンドヌクレアーゼによる切断、超音波処理、加熱、アルファ線源、ベータ線源、又はガンマ線源を使用する照射、金属イオンの存在下における化学的切断、ラジカルによる切断、及びこれらの組合せからなる群から選択される工程により実施する。さらなる実施形態では、インビボにおける断片化を、アポトーシス、放射線、及びアスベストへの曝露からなる群から選択される工程により行う。
【００４６】
さらなる実施形態では、基質分子は、合成であり、ｃＤＮＡ、全ゲノム増幅により産生されるＤＮＡ、少なくとも１つの二本鎖末端を含むプライマー伸長産物、及びＰＣＲアンプリコンからなる群から選択される。
【００４７】
一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、少なくとも部分的に二本鎖であり、オリゴヌクレオチド１及びオリゴヌクレオチド２を含む。多様な実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド１とアニールする。一部の実施形態では、アニーリングは、ニック、ギャップ、又は第２のポリヌクレオチドと基質分子との重複塩基を結果としてもたらす。
【００４８】
多様な実施形態では、第２のポリヌクレオチドを、ポリメラーゼと接触させ、その結果、オリゴヌクレオチド２の分解をもたらす。
【００４９】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド２は、分解を受けやすい塩基を含む。さらなる実施形態では、分解を受けやすい塩基は、デオキシウリジン、ＲＮＡ、デオキシイノシン、及びイノシンからなる群から選択される。なおさらなる実施形態では、オリゴヌクレオチド２は、ライゲーションを防止する、その３’末端における遮断基を含む。多様な実施形態では、遮断基は、３’デオキシヌクレオチド又はジデオキシヌクレオチドである。
【００５０】
一部の実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、修飾塩基を含む。
【００５１】
さらなる実施形態では、アニーリングは、オリゴヌクレオチド１とオリゴヌクレオチド２とのデハイブリダイゼーションを結果としてもたらす。
【００５２】
なおさらなる実施形態では、方法は、（ｉ）第３のポリヌクレオチドを、少なくとも部分的に二本鎖である、さらなる基質分子の３’末端へとライゲーションするステップと；（ii）アニーリングを促進する条件下で、第４のポリヌクレオチドを、第３のポリヌクレオチドへとアニールさせるステップと；（iii）少なくとも１つのヌクレオチドを、さらなる基質分子の５’末端から切除するステップと；次いで、（iv）第４のポリヌクレオチドを、二本鎖のさらなる基質分子の５’末端へとライゲーションして、処理された、さらなる基質分子を産生するステップとをさらに含む。
【００５３】
一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチドと第３のポリヌクレオチドとは、同じである。さらなる実施形態では、第２のポリヌクレオチドと第４のポリヌクレオチドとは、同じである。
【００５４】
さらなる態様では、本開示は、ユニバーサルプライマー及び複数の標的特異的オリゴヌクレオチドプライマー対であって、複数のプライマー対の各標的特異的プライマーが、標的特異的配列と、標的基質分子と相補的ではない５’末端配列とを含み；ユニバーサルプライマーが、５’末端配列と、切断性塩基又はヌクレアーゼ耐性修飾とを含み；複数のプライマー対の各標的特異的プライマー及びユニバーサルプライマーの各々が、それらの３’末端にヌクレアーゼ耐性修飾を含む、ユニバーサルプライマー及び複数の標的特異的オリゴヌクレオチドプライマー対と；ユニバーサルプライマーへと組み込まれた切断性塩基に寛容性がある高いフィデリティーのポリメラーゼとを含む組成物であって、標的特異的プライマー対及びユニバーサルプライマーが、同じ温度で、それらの標的基質分子へとアニールし；標的特異的プライマーの、ユニバーサルプライマーに対するモル比が、少なくとも約１：１００である組成物を提供する。
【００５５】
一部の実施形態では、切断性塩基は、デオキシウリジン、ＲＮＡ、デオキシイノシン、又はイノシンである。さらなる実施形態では、ヌクレアーゼ耐性修飾は、ホスホロチオエート修飾である。
【００５６】
さらなる実施形態では、少なくとも１つの標的特異的プライマーは、標的特異的配列と５’末端配列との間の分子同定タグをさらに含む。
【００５７】
本開示の多様な実施形態では、標的特異的プライマーの、ユニバーサルプライマーに対するモル比は、少なくとも約１：２００、若しくは少なくとも約１：３００、若しくは少なくとも約１：４００、若しくは少なくとも約１：５００、若しくは少なくとも約１：１０００、若しくは少なくとも約１：２０００、若しくは少なくとも約１：３０００、若しくは少なくとも約１：５０００、若しくは少なくとも約１：１０，０００以上である。
【００５８】
多様な実施形態では、組成物は、基質分子をさらに含む。
【００５９】
一部の態様では、ユニバーサルプライマーにより作製される、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：polymerase chain reaction）産物であって、ユニバーサルプライマーを介して組み込まれる少なくとも１つの切断性塩基を含む産物と；切断性塩基を切断しうるエンドヌクレアーゼと；（ｉ）少なくとも１つのヌクレオチド及びニックトランスレーション活性を保有するＤＮＡポリメラーゼ、又は（ii）ｆｌａｐエンドヌクレアーゼ活性を保有する酵素と；ＤＮＡリガーゼと；（ｉ）ユニバーサルプライマーのエンドヌクレアーゼ切断により露出される、ユニバーサルプライマーの逆相補体の５’部分と相補的な３’配列と、（ii）ユニバーサルプライマーの逆相補体と相補的ではない５’部分とを含む５’アダプターとを含み、ユニバーサルプライマーの逆相補体の３’部分が、部分的に二本鎖の短縮３’アダプターとアニールする組成物が提供される。
【００６０】
一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、ＵＤＧ＋エンドヌクレアーゼVIII、ＲＮアーゼ  ＨＩ、ＲＮアーゼ  Ｈ２、及びエンドヌクレアーゼＶからなる群から選択される。さらなる実施形態では、ＤＮＡリガーゼは、大腸菌ＤＮＡリガーゼ又はＴ４  ＤＮＡリガーゼである。
【００６１】
さらなる態様では、本開示は、ユニバーサルプライマーにより作製される、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物であって、ユニバーサルプライマーを介して組み込まれる少なくとも１つのヌクレアーゼ耐性修飾を含む産物と；ヌクレアーゼ耐性修飾を越えてＰＣＲ産物を消化することが不可能な５’エキソヌクレアーゼと；（ｉ）少なくとも１つのヌクレオチド及びニックトランスレーション活性を保有するＤＮＡポリメラーゼ、又は（ii）ｆｌａｐエンドヌクレアーゼ活性を保有する酵素と；ＤＮＡリガーゼと；（ｉ）ユニバーサルプライマーのエンドヌクレアーゼ切断により露出される、ユニバーサルプライマーの逆相補体の５’部分と相補的な３’配列と、（ii）ユニバーサルプライマーの逆相補体と相補的ではない５’部分とを含む５’アダプターとを含み、ユニバーサルプライマーの逆相補体の３’部分が、部分的に二本鎖の短縮３’アダプター分子とアニールする組成物を提供する。
【００６２】
なおさらなる態様では、基質分子を、（ｉ）各プライマーが、基質分子と相補的ではない５’配列を含み、結果として得られるアンプリコンの末端に単一のユニバーサルアダプターを組み込む、標的特異的プライマー対；及び（ii）単一のユニバーサルアダプター配列を含み、切断性塩基又はヌクレアーゼ耐性修飾をさらに含む、単一のプライマーと接触させるステップを含み、各標的特異的プライマーのユニバーサルプライマーに対するモル比が少なくとも約１：１００である、高いフィデリティーのＤＮＡポリメラーゼ及びヌクレオチドの存在下でＰＣＲの各サイクルに一定のアニーリング温度を使用するがアニーリング時間は変化させる適切な反応条件下において、アニーリング時間が５分間以上、最初の２又は３以上のＰＣＲサイクルの間に標的特異的アンプリコンを作製し、その後、各々が１分間又はこれ未満のアニーリング時間を含む残りのＰＣＲサイクルの間に結果として得られるアンプリコンの増幅を行い、高濃度の単一のユニバーサルプライマーによる標的特異的アンプリコンの増幅を達成する、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法が提供される。
【００６３】
さらなる態様では、基質分子を、（ｉ）各プライマーが、基質と相補的ではない５’配列を含み、結果として得られるアンプリコンの末端に単一のユニバーサルアダプターを組み込む、複数の標的特異的プライマー対；及び（ii）単一のユニバーサルアダプター配列を含み、切断性塩基又はヌクレアーゼ耐性修飾をさらに含む、単一のプライマーと接触させるステップを含み、各標的特異的プライマーのユニバーサルプライマーに対するモル比が少なくとも約１：１００である、高いフィデリティーのＤＮＡポリメラーゼ及びヌクレオチドの存在下で各ＰＣＲサイクルに一定のアニーリング温度を使用するがアニーリング時間は変化させる適切な反応条件下において、アニーリング時間が５分間以上、最初の２又は３以上のＰＣＲサイクルの間に、標的特異的アンプリコンを作製し、その後、各々が１分間又はこれ未満のアニーリング時間を含む残りのＰＣＲサイクルの間に結果として得られるアンプリコンの増幅を行い、高濃度の単一のユニバーサルプライマーによる標的特異的アンプリコンのマルチプレックス化増幅を達成する、マルチプレックス化ＰＣＲ法が提供される。
【００６４】
一部の態様では、各末端に単一のユニバーサルアダプター配列を含むポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物を、各末端に非対称性の５’アダプター及び３’アダプターを含む産物へと転換する方法であって、（ａ）切断性塩基又はヌクレアーゼ耐性修飾を導入したＰＣＲ産物の５’末端を消化するステップ、その後（ｂ）消化により露出させたユニバーサルアダプターの逆相補体の５’部分と相補的な５’アダプターのアニーリング及び（ｉ）ニックトランスレーションライゲーション又は（ii）ｆｌａｐエンドヌクレアーゼ切断によるライゲーションを行うステップを含み、（ｃ）部分的に二本鎖の短縮３’アダプターを、ユニバーサルアダプターの逆相補体の３’部分とアニールさせ、ライゲーションし、これにより、ＰＣＲ産物を、各末端に非対称性のアダプターを含む産物へと転換する方法が提供される。
【００６５】
一部の実施形態では、ＰＣＲ産物は、全ゲノム増幅（ＷＧＡ：whole genome amplification）産物である。
【００６６】
本明細書で開示される方法のうちのいずれかでは、マルチプレックス化増幅のために選択される標的遺伝子座は、がん特異的標的、薬物耐性特異的標的、遺伝性疾患についての標的、感染性病原体に由来する標的、病原体宿主についての標的、種特異的標的、及び任意の臨床で適用可能な標的を含むがこれらに限定されない、様々な適用のうちのいずれかに対応することが想定される。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】現行のＮＧＳアダプターを示す図である。  ・３’ヒドロキシル及び５’ヒドロキシルを伴うフィルインアダプター（平滑末端化されているか、又はＴ突出を伴う）  ・３’ヒドロキシル及び５’リン酸を伴うＹアダプター（Ｔ突出を伴う）  ・３’ヒドロキシル及び５’ヒドロキシル又は５’リン酸を伴うステムループアダプター（平滑末端化されているか、又はＴ突出を伴う）
【図２Ａ−２Ｂ】従来型アダプターのライゲーション化学反応を示す図である。
【図３】３’アダプター特徴及び５’アダプター特徴を示す図である。
【図４】ニックトランスレーションによる５’アダプターのライゲーションを示す図である。  ステップは、  ・基質分子の脱リン酸化  ・基質分子のポリッシング／平滑末端の作製  ・３’アダプターのライゲーション  ・３’アダプターの部分的分解及び５’アダプターのアニーリング  ・ニックトランスレーションを介する、ポリメラーゼによる５’アダプターの伸長  ・伸長させた５’アダプターの、ＤＮＡ基質の露出させた５’リン酸へのライゲーションを含む。
【図５】置換−切断による５’アダプターのライゲーションを示す図である。  ステップは、  ・１．基質分子の脱リン酸化  ・２．基質分子末端のポリッシング／平滑末端の作製  ・３．３’アダプターのライゲーション  ・４．３’アダプターの部分的分解及び５’アダプターのアニーリング  ・５．ＤＮＡ断片の５’塩基の置換及び５’アダプターの３’塩基のアニーリング  ・６．ＤＮＡの置換された５’塩基の、５’−ｆｌａｐエンドヌクレアーゼによる切断  ・７．５’アダプターの３’末端の、ＤＮＡ基質の露出させた５’リン酸へのライゲーションを含む。
【図６】アダプターのライゲーションを、２つのインキュベーションにより達成することを示す図である。  ・アニーリング−ニックトランスレーション−ライゲーションのカップリングによる５’アダプターの結合は、第１のインキュベーションが、３’アダプターの結合であり、第２のインキュベーションが、逐次的に施される３つの反応：（１）５’アダプターのアニーリング、（２）ニックトランスレーション活性を伴うＤＮＡポリメラーゼによる５’アダプターの伸長（基質ＤＮＡの損傷を受けた５’末端の切除）、及び（３）５’アダプターの、ＤＮＡ基質の露出させた５’リン酸へのライゲーションを組み合わせる、２つのインキュベーションにおいて達成する。  ・アニーリング−塩基切除−ライゲーションのカップリングによる５’アダプターの結合は、第１のインキュベーションが、３’アダプターの結合であり、第２のインキュベーションが、逐次的に施される３つの反応：（１）５’アダプターの、３’末端における１又は複数のランダム塩基とのアニーリング、及び基質ＤＮＡの１又は複数の末端５’塩基の置換、（２）置換された５’塩基の、５’−ｆｌａｐエンドヌクレアーゼによる切断（基質ＤＮＡの損傷を受けた５’末端の切除）、並びに（３）５’アダプターの、ＤＮＡ基質の露出させた５’リン酸へのライゲーションを組み合わせる、２つのインキュベーションにおいて達成する。
【図７】一本鎖３’突出の作製を示す図である。  ・３’アダプターの突出配列は、少なくとも４つの異なる方法により：    ○Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを使用する従来型のライゲーションにより    ○一本鎖ＤＮＡ（ＲＮＡ）リガーゼにより    ○末端トランスフェラーゼを伴う従来型のホモポリマーによるテール形成により    ○末端トランスフェラーゼ、ＤＮＡリガーゼ及びアテニュエーター−アダプター分子を使用する制御型テール形成及び同時的なアダプターのライゲーション（参照によりその全体が組み込まれる、２０１３年３月１３日に出願された、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１３／３１１０４号明細書を参照されたい）により酵素的に付加することができる。  ・代替的に、ＤＮＡの断片化又は他の処理により、５’アダプターのアニーリングに十分な３’突出を伴う既存のＤＮＡ末端を結果としてもたらすこともできる。
【図８Ａ−Ｂ】５’アダプターをアニールさせる方法を示す図である。図８Ａは、ステップ（ｉ）〜（iii）：  ｉ）３’アダプターへとあらかじめアニールさせた第２のオリゴヌクレオチドの分解後における結合を介するステップ  ii）３’アダプターへとあらかじめアニールさせた第２のオリゴヌクレオチドに対する競合的置換を介するステップ  iii）３’アダプターの上流領域への結合（これに続く、３’アダプターへとあらかじめアニールさせた第２のオリゴヌクレオチドの限定的ニックトランスレーション及び分解）を介するステップについて描示する図であり；図８Ｂは、ステップ（iv）〜（v）：  iv）５’アダプターを、３’アダプターの上流領域へとあらかじめアニールさせていること（これに続く、３’アダプターへとあらかじめアニールさせた第２のオリゴヌクレオチドの限定的ニックトランスレーション及び分解）を介するステップ  v）第２のオリゴヌクレオチドの代わりに、３’遮断された５’アダプターであって、切断により活性化する５’アダプターを有することを介するステップについて描示する図である。
【図９Ａ−９Ｄ】単一塩基の伸長を使用する、５’アダプターのライゲーションを示す図である。
【図１０ａ−ｂ】Illumina社製ＮＧＳライブラリーＩの合成を示す図である。  ライブラリーＩの合成は、５つ又は６つのステップ：  図１０ａ：  ・１．基質分子の脱リン酸化及びポリッシング  ・２．Illumina社製の配列Ｐ７（ａ）若しくはＰ５’（ｂ）を伴う３’アダプターのライゲーション  ・３．３’アダプターの部分的分解及びIllumina社製の配列Ｐ５（ａ）若しくはＰ７’（ｂ）を伴う相補性５’アダプターのアニーリング  ・４．ニックトランスレーションを介する、ポリメラーゼによる５’アダプターの伸長、並びに  ・５．５’アダプターの３’末端の、ＤＮＡ基質の露出させた５’リン酸へのライゲーション  ・又は、代替的に、図１０ｂでは：  ・４．ＤＮＡ基質の５’塩基の置換及び５’アダプターの３’塩基のアニーリング  ・５．ＤＮＡ基質の置換された５’塩基の、５’−ｆｌａｐエンドヌクレアーゼによる切断、並びに  ・６．５’アダプターの３’末端の、ＤＮＡ基質の露出させた５’リン酸へのライゲーションにおいて行う。ライブラリーは、プライマーＰ５及びプライマーＰ７’を使用するＰＣＲにより増幅する。
【図１１】Illumina社製ＮＧＳライブラリーIIの合成を示す図である。  ライブラリーIIの合成は、４つのステップ：  ・１．図６で記載した２つの方法のうちの１つによる、短縮アダプターＰ７を伴うＮＧＳライブラリーの合成ステップ  ・２．短縮分解性プライマーＰ７＊又は全長分解性プライマーＰ７＊によるライブラリーの増幅ステップ  ・３．組み込まれたＰ７＊プライマーの分解に続く、５’アダプターＰ５のアニーリング及びライゲーションステップ  ・４．ステップ２で、短縮分解性プライマーＰ７＊を使用した場合に、Ｐ７＊’’アダプターの、短縮アダプターＰ７＊’への架橋ライゲーションを実施して、全長アダプターＰ７を完成させるステップにおいて行う。
【図１２Ａ−１２Ｂ】Ion Torrent社製ライブラリーの合成を示す図である。  ライブラリーの合成は、  ・１．ＤＮＡ基質の脱リン酸化及びポリッシング  ・２．配列Ａ１’−Ｐ１’（ａ）又はＡ’（ｂ）を伴う３’アダプターのライゲーション  ・３．配列Ａ（ａ）又は配列Ｐ１−Ａ１（ｂ）を伴う５’アダプターの３’末端の、トリミングされたＤＮＡの５’末端への、ニックトランスレーションライゲーション又は塩基の切断によるライゲーション  ・４．プライマーＡ及びＰ１を使用するＰＣＲによるライブラリーの増幅により実施する。
【図１３】２０のアダプター配列だけを使用する、９６のコンビナトリアルバーコード配列を伴う、Ion Torrent社製ライブラリーの合成を示す図である。  ライブラリーの合成ステップ：  ・１．ＤＮＡ末端の脱リン酸化及びポリッシング（図示しない）  ・２．配列Ｔ’ｎ−Ｌ’−Ｐ１’を伴う（平滑）３’アダプターＰ１ｎ及び５’リン酸基及び配列Ｐ１ｔｒ−Ｌ−Ｔｎを伴う３’遮断相補性オリゴヌクレオチドのライゲーション  ・３．３’遮断相補性オリゴヌクレオチドＰ１ｔｒ−Ｌ−Ｔｎの分解  ・４．配列Ａ−ｔｍ−Ｌを伴う５’アダプターＡｍの、リンカー領域Ｌ’とのアニーリング  ・５．ニックトランスレーションによる重合化を介する５’アダプターＡｍの伸長及び伸長させた５’アダプターＡｍの３’末端の、ＤＮＡの５’末端へのライゲーション  ・６．プライマーＡ及びＰ１を使用するＰＣＲによるライブラリーの増幅  コンビナトリアルバーコードを伴うアダプターは、バーコード配列Ｔ１、Ｔ２、・・・、Ｔ８を含有する８つのアダプターＰ１ｎと、バーコード配列ｔ１、ｔ２、・・・、ｔ１２を含有する１２のアダプターＡｍとを含む。  創出されたライブラリーは、バーコードの組合せが最大９６に及ぶ、コンビナトリアルバーコード配列ｔｍ−Ｌ−Ｔｎを有する。
【図１４】選択された制限断片の、５’アダプターのライゲーションによる濃縮を示す図である。  制限ＤＮＡ断片は、５’アダプターのライゲーションに続く、ＰＣＲ増幅により選択する。選択は、制限断片の５’末端配列と同一な配列ａ及びｂを含有する、２つの５’アダプターセレクターＡ及びＢにより行う。濃縮法は、  １．制限エンドヌクレアーゼによるＤＮＡの消化；  ２．３’アダプターのライゲーション；  ３．３’アダプターの部分的分解及び５’アダプターセレクターのアニーリング；  ４．５’アダプターセレクターの、制限断片の末端配列ａ及びｂへの侵入；  ５．置換された末端配列ａ及びｂの、５’−ｆｌａｐエンドヌクレアーゼによる切断；  ６．５’アダプターセレクターの、制限断片の末端へのライゲーション；  ７．選択された制限断片の、ＰＣＲによる増幅を伴う。  ステップ１、２に加えてまた、ステップ３〜６も、単一のインキュベーション反応へと組み合わせることができる。
【図１５ａ−ｂ】プライマー伸長による標的の濃縮を示す図である。  濃縮は、５’アダプターの結合により実施し、この場合、３’突出は、アダプターＡ及びアダプターＢを伴うライブラリー上の標的ＤＮＡ領域と相補的なプライマーの伸長、並びにアダプターＡの５’ドメインの部分的消化により創出する。ビオチニル化５’アダプターを、アダプターＡの３’突出へとアニールさせ、次いで、限定的ニックトランスレーション（ａ）又は侵入−切断反応（ｂ）によるトリミングの後で、アダプターＡの５’末端へとライゲーションする。次いで、標的ＤＮＡ領域を含有するライブラリー断片を、ストレプトアビジン磁気ビーズを使用するアフィニティー捕捉により単離し、ＰＣＲにより増幅し、シークエンシングにより解析する。
【図１６】代替的なライブラリー構築Ｉを示す図である。  ライブラリー構築は、６つ又は７つのステップ：  １．基質分子の脱リン酸化ステップ  ２．基質分子末端のポリッシング／平滑末端の作製ステップ  ３．配列Ａ’を伴う３’アダプターのライゲーションステップ  ４．３’アダプターの部分的分解及び配列Ａを伴う相補性５’アダプターのアニーリングステップ  ５．ニックトランスレーションを介する、ポリメラーゼによる５’アダプターの伸長ステップ、並びに  ６．５’アダプターの３’末端の、ＤＮＡ基質の露出させた５’リン酸へのライゲーションステップ又は、代替的に、  ５．ＤＮＡの５’塩基の置換及び５’アダプターの３’塩基のアニーリングを介するステップ  ６．ＤＮＡの置換された５’塩基の、５’−ｆｌａｐエンドヌクレアーゼによる切断を介するステップ、並びに  ７．５’アダプターの３’末端の、ＤＮＡ基質の露出させた５’リン酸へのライゲーションを介するステップにおいて、単一のアダプターを使用して実施することができる。  ライブラリーは、単一のプライマーＡを使用するＰＣＲにより増幅することができる。
【図１７】代替的なライブラリー構築IIを示す図である。  アダプターの結合により、３’ＤＮＡ末端と５’ＤＮＡ末端とを共有結合的に連結した、二本鎖ＤＮＡ断片のライブラリーを創出することができる。ライブラリー構築は、  １．基質分子の脱リン酸化（図示しない）  ２．基質分子末端のポリッシング／平滑末端の作製（図示しない）  ３．５’末端をリン酸化し、３’末端を遮断した（任意に）、ヘアピン平滑アダプターのライゲーション  ４．伸長性３’末端を創出する、ヘアピンアダプターの部分的分解  ５．ヘアピンアダプターの３’末端のニックトランスレーション及びその、ＤＮＡ基質の露出させた５’リン酸へのライゲーションにより実施する。
【図１８】代替的なライブラリー構築IIIを示す図である。  環状化ＮＧＳライブラリーは、以下のステップ：  １．基質分子の脱リン酸化（図示しない）  ２．基質分子末端のポリッシング／平滑末端の作製（図示しない）  ３．５’末端をリン酸化し、３’末端を遮断し（任意に）、配列Ｘと配列Ｘ’とが相互に相補的なアダプターのライゲーション  ４．一本鎖３’突出を創出する、ライゲーションされなかったアダプター鎖の分解  ５．末端配列Ｘ及びＸ’のアニーリングによる、ＤＮＡの非共有結合的環状化（低ＤＮＡ濃度で実施する）  ６．ニックトランスレーションライゲーション反応を介する、ＤＮＡの共有結合的環状化を使用して構築することができる。
【図１９】ＦＡＭ標識オリゴヌクレオチド基質を使用する、従来型のアダプターのライゲーションの、３’アダプターのライゲーションとの比較（実施例１）を示す図である。
【図２０】せん断され、サイズ選択された、ゲノムＤＮＡ基質を使用する、従来型のアダプターのライゲーションの、３’アダプターのライゲーションとの比較（実施例２）を示す図である。
【図２１Ａ−２１Ｂ】ＦＡＭ標識オリゴヌクレオチド基質を使用する、５’アダプターのライゲーションのための温度最適化（実施例３）を示す図である。
【図２２】ｄＮＴＰ組成の、５’アダプターのライゲーションに対する効果についての解析（実施例４）を示す図である。
【図２３Ａ−２３Ｂ】熱安定性酵素を伴う、ニックトランスレーション−ライゲーション反応のカップリング（実施例５）を示す図である。
【図２４】置換−切断−ライゲーション反応のカップリング（実施例６）を示す図である。
【図２５】「Ｎ」ユニバーサル／縮重５’アダプター３’突出又は「Ｔ」基質特異的５’アダプター３’突出を伴う、置換−切断−ライゲーション反応のカップリング（実施例７）を示す図である。
【図２６】ＤＮＡポリメラーゼＩを使用する、ニックトランスレーション−ライゲーション反応のカップリング（実施例８）を示す図である。
【図２７】ポリッシングは、物理的にせん断されたＤＮＡの平滑ライゲーションに要求され、脱リン酸化は、キメラライゲーション産物の形成を防止すること（実施例９）を示す図である。
【図２８Ａ−２８Ｂ】アダプターのライゲーション反応とカップリングさせた５’塩基のトリミングを使用して調製されると、ＮＧＳライブラリーは、収率を増大させたこと（実施例１０）を示す図である。
【図２９Ａ−２９Ｃ】アダプターのライゲーションとカップリングさせた５’塩基のトリミングを使用して調製されたＮＧＳライブラリーについての配列解析（実施例１１）を示す図である。
【図３０】実施例１において記載される、アダプターの構造、モデル基質及びオリゴヌクレオチド構築物について描示する図である。
【図３１】ＦＡＭ基質分子（実施例１を参照されたい）について描示する図である。
【図３２】実施例２において記載される、アダプターの構造について描示する図である。
【図３３】実施例３、４、５、及び８において記載される、オリゴヌクレオチド構築物系について描示する図である。
【図３４】実施例６において記載される、オリゴヌクレオチド構築物系について描示する図である。
【図３５】実施例７において記載される、オリゴヌクレオチド構築物系について描示する図である。
【図３６】実施例７において記載される、オリゴヌクレオチド構築物系について描示する図である。
【図３７】実施例１０において記載される、Ｐ７アダプター及びＰ５アダプターの構造について描示する図である。
【図３８】実施例１１において記載される、Ｐ７アダプター及びＰ５アダプターの構造について描示する図である。
【図３９】アンプリコンＮＧＳライブラリーの構築法のための２つのワークフローについて描示する図である。
【図４０】マルチプレックス化ＰＣＲを、精製ステップで分ける、第１のワークフローについて描示する図である。
【図４１】マルチプレックス化ＰＣＲを、単一のステップとして実施する、第２のワークフローについて描示する図である。
【図４２】アダプターＡ及びアダプターＢの、各アンプリコンへの同時的なライゲーションによる最終ステップについて描示する図である。
【図４３】単一チューブワークフローを、２チューブワークフローと対比して比較する図である。
【図４４Ａ−４４Ｂ】重複するプライマー対の標的領域から作製されるアンプリコン産物について描示する図である。
【図４５】実施例１：ＴＰ５３をコードするエクソンにわたるアンプリコンカバレッジプロットを示す図である。
【図４６】実施例１：ＴＰ５３のエクソン８内の体細胞変異の同定を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００６８】
一態様では、本発明は、断片化された二本鎖ＤＮＡ分子の末端へとアダプターをライゲーションする、高度に効率的な方法について記載する。本明細書では、このようなＤＮＡ分子を、「基質分子」と称する。一態様では、方法は、（１）５’アダプターの、基質分子上の既存の３’突出、好ましくは、３’アダプターとのアニーリングと、（２）損傷を受けた塩基の、基質分子の５’末端からの除去と、これにより可能となる、（３）５’アダプターの、基質分子の露出させた５’リン酸への効率的ライゲーションとを含む、単一のインキュベーションを含む。別の態様では、方法は、上記で記載したとおり、第１のインキュベーションでは、３’アダプターを、基質分子へとライゲーションし、第２のインキュベーションでは、５’アダプターを、基質分子へとライゲーションする、２つのインキュベーション（図６を参照されたい）を含む。多様な実施形態では、本開示は、１つ又は２つのライゲーションステップの前に施されるさらなるステップであって、（ｉ）脱リン酸化反応と、（ii）損傷を受けた３’末端を切除し、平滑末端を作製するポリッシング反応と、（iii）アデニル化反応とを含むステップを含む方法をさらに提示するが、本開示では、ステップの多様な組合せが想定されており、下記で詳細に論じられる。
【００６９】
別の態様では、開示は、マルチプレックスアンプリコンＮＧＳライブラリーの、高度に効率的な調製法について記載する。一態様では、方法は、複数の重複アンプリコンの、単一のチューブ内の合成及び増幅を可能とする。別の態様では、開示は、キメラアンプリコン及びアダプター二量体を含有しない、ＰＣＲアンプリコンの末端への、アダプターライゲーションの、新規の、高度に効率的な方法について記載する。一態様では、方法は、個別のアンプリコンを同定する固有の縮重配列タグの組み込みを可能とする。別の態様では、方法は、アンプリコンの５’末端の分解に続く、第２のアダプターＢの同時的なライゲーションと、第１のアダプターの残余部分Ａの、基質アンプリコンへの、リンカー媒介型ライゲーションとを含む、単一のインキュベーションを含む。多様な実施形態では、本開示は、ライゲーションステップの前に施されるさらなるステップであって、（ｉ）マルチプレックス化ＰＣＲ反応、（ii）精製ステップ、及び（iii）ユニバーサル単一プライマーによる増幅ステップを含むステップを含む方法をさらに提示する。代替的に、ライゲーションステップの前に施されるさらなるステップは、（ｉ）ユニバーサル単一プライマーによる増幅と組み合わされたマルチプレックスＰＣＲ反応に続く、（ii）精製ステップを含む。本開示では、ステップの多様な組合せが想定されており、下記で詳細に論じられる。
【００７０】
本明細書で使用される「反応条件」又は「標準的な反応条件」という用語は、製造元の指示書に従う条件を意味する。本明細書で開示される全ての酵素は、そうでないことが指し示されない限りにおいて、標準的な反応条件下で使用することが理解される。本明細書で使用される「第１のポリヌクレオチド」という用語は、「３’アダプター」、「第１のアダプター」、又は「アダプターＡ」と互換的に使用され、本明細書で使用される「第２のポリヌクレオチド」という用語は、「５’アダプター」、「第２のアダプター」又は「アダプターＢ」と互換的に使用される。アダプターＡを、IonTorrent（商標）技術に言及しながら使用する、ある特定の場合、例えば、図１２〜１３の場合、アダプターＡとは、製造元により提供される、IonTorrent（商標）法のためのアダプターＡを指すものであり、本明細書で規定される「アダプターＡ」を指すものではない。
【００７１】
本明細書で使用される「３’アダプター」は、基質分子の３’末端へとライゲーションされ、「５’アダプター」は、基質分子の５’末端へとライゲーションされる。
【００７２】
本明細書で使用される「損傷を受けた」５’末端とは、５’リン酸を欠く５’末端である。
【００７３】
本明細書で使用される「処理された」基質分子とは、５’アダプターを結合させた基質分子である。
【００７４】
本明細書で使用される「高いフィデリティーのポリメラーゼ」とは、３’−５’エキソヌクレアーゼ（すなわち、プルーフリーディング）活性を保有するポリメラーゼである。
【００７５】
本明細書で使用される「寛容性」という用語は、切断性塩基（例えば、ウラシル、イノシン、及びＲＮＡ）を含有する鋳型を介して伸長させうる、ポリメラーゼの特性を指す。
【００７６】
本明細書で使用される「非対称性の」という用語は、両方の末端に単一のアダプターではなく、両方の末端に両方のアダプターを伴う二本鎖分子を指す。したがって、非対称性は、両方のアダプターが大部分、互いと非相補的であり、一本鎖部分を有するという事実から生じる。
【００７７】
本明細書で使用される「ユニバーサルプライマー」とは、ユニバーサルアダプター配列を組み込む増幅反応において使用されるオリゴヌクレオチドである。本明細書で使用される「ユニバーサルアダプター」とは、ユニバーサルプライマー配列に対応する増幅産物の部分及びその逆相補体である。
【００７８】
２つの核酸の結合安定性を減少させる修飾は、ヌクレオチドのミスマッチ、デオキシイノシン塩基、イノシン塩基又はユニバーサル塩基を含むがこれらに限定されないことが理解されるであろう。
【００７９】
また、２つの核酸の結合安定性を増大させる修飾は、ロックト核酸（ＬＮＡ）、スペルミン及びスペルミジン又は他のポリアミン、並びにシトシンのメチル化を含むがこれらに限定されないことも理解されるであろう。
【００８０】
本明細書で使用される「ユニバーサル塩基」という用語は、水素結合を伴わずに、４つの天然に存在する塩基全てと塩基対を形成しうる塩基であり、ミスマッチより不安定ではなく、５’ニトロインドールを含みうるがこれらに限定されない。
【００８１】
本明細書で使用される「分子同定タグ」は、４〜１６塩基の間のいずれかの長さであり、この場合、最適の長さは、８〜１２塩基の間の縮重Ｎ塩基である。
【００８２】
基質分子
基質分子は、天然に存在する供給源から得られるか、又は合成でありうることが想定される。天然に存在する供給源は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、全ゲノム増幅により産生されるＤＮＡ、少なくとも１つの二本鎖末端を含むプライマー伸長産物、及びＰＣＲアンプリコンを含むがこれらに限定されない。多様な実施形態では、天然に存在する供給源は、原核生物供給源又は真核生物供給源である。例えば、限定せずに述べると、供給源は、ヒト、マウス、ウイルス、植物若しくは細菌又は複数のゲノムを含む混合物でありうる。
【００８３】
本明細書で使用される「アンプリコン」とは、増幅法を使用して合成されたポリヌクレオチドの部分を意味することが理解される。
【００８４】
基質分子の供給源が、ゲノムＤＮＡである場合、一部の実施形態では、ゲノムＤＮＡを断片化することが想定される。ゲノムＤＮＡの断片化は、当業者に公知の一般的な手順であり、例えば、限定せずに述べると、インビトロにおいて、ＤＮＡのせん断（噴霧化すること）、エンドヌクレアーゼによるＤＮＡの切断、ＤＮＡの超音波処理を介して、ＤＮＡの加熱を介して、アルファ線源、ベータ線源、ガンマ線源又は他の放射線源を使用するＤＮＡの照射を介して、光を介して、金属イオンの存在下におけるＤＮＡの化学的切断を介して、ラジカルによる切断を介して、及びこれらの組合せを介して実施される。ゲノムＤＮＡの断片化はまた、インビボでも行うことができ、例えば、限定せずに述べると、アポトーシスのために、放射線及び／又はアスベストへの曝露を行うことができる。本明細書で提供される方法に従うと、基質分子の集団は、一様なサイズであることが要求されない。したがって、本開示の方法は、サイズの異なる基質ポリヌクレオチド断片の集団を伴う使用にも有効である。
【００８５】
本明細書で開示される基質分子は、少なくとも部分的に二本鎖であり、３’突出（図７ａを参照されたい）、平滑末端、３’陥凹末端、又は遊離３’ヒドロキシル基を含む。基質ポリヌクレオチドの突出又は陥凹末端の長さは、変化させることができる。多様な態様では、基質分子の突出又は陥凹末端の長さは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０ヌクレオチド又は２１ヌクレオチド以上の長さである。さらなる実施形態では、基質分子の突出又は陥凹末端の長さは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９又は少なくとも２０ヌクレオチドの長さである。なおさらなる実施形態では、基質分子の突出又は陥凹末端の長さは、約１〜約５、又は約１〜約１０、又は約１〜約１５、又は約１〜約２０ヌクレオチドの長さである。多様な態様では、基質分子の集団は、上記で言及された基質分子の種類のうちの２つ以上が、単一の反応物中に存在する集団を含む。本開示はまた、基質分子が、少なくとも部分的に一本鎖であることも想定する。基質分子が一本鎖である本開示の態様は、一本鎖リガーゼ酵素の使用を伴う。
【００８６】
本発明の一部の適用は、アダプター配列の、元の二本鎖ＤＮＡ基質分子又は天然の二本鎖ＤＮＡ基質分子への結合を伴わずに、プライマーの伸長による合成を介して産生される二本鎖ＤＮＡへの結合を伴う。このような適用の一例は、（ａ）プライマー結合性配列を含むオリゴヌクレオチドの、一本鎖ＤＮＡ又は二本鎖ＤＮＡの３’末端への結合であって、プライマーの伸長を可能とする結合、（ｂ）オリゴヌクレオチドとアニールさせたプライマーの伸長、及び（ｃ）３’アダプター及び５’アダプターの、プライマー伸長により産生された二本鎖ＤＮＡ末端への結合により産生されるＤＮＡライブラリーである。
【００８７】
基質分子の二本鎖部分又は一本鎖部分の長さは、３〜約１×１０６ヌクレオチドの間であることが想定される。一部の態様では、基質分子の長さは、約１０〜約３０００ヌクレオチドの間、又は約４０〜約２０００ヌクレオチドの間、又は約５０〜約１０００ヌクレオチドの間、又は約１００〜約５００ヌクレオチドの間、又は約１０００〜約５０００ヌクレオチドの間、又は約１０，０００〜約５０，０００ヌクレオチドの間、又は約１００，０００〜１×１０６ヌクレオチドの間である。さらなる態様では、基質分子の長さは、少なくとも３ヌクレオチドであり、最大で約５０、１００若しくは１０００ヌクレオチドであるか；又は少なくとも１０ヌクレオチドであり、最大で約５０、１００若しくは１０００ヌクレオチドであるか；又は少なくとも１００ヌクレオチドであり、最大で約１０００、５０００若しくは１００００ヌクレオチドであるか；又は少なくとも１０００ヌクレオチドであり、最大で約１００００、２００００及び５００００ヌクレオチドであるか；又は少なくとも１００００ヌクレオチドであり、最大で約２００００、５００００及び１００，０００ヌクレオチドであるか；又は少なくとも２００００ヌクレオチドであり、最大で約１００，０００、２００，０００若しくは５００，０００ヌクレオチドであるかであるか；又は少なくとも２００，０００ヌクレオチドであり、最大で約５００，０００、７００，０００若しくは１，０００，０００ヌクレオチドである。多様な態様では、基質分子の長さは、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、約５０、約５１、約５２、約５３、約５４、約５５、約５６、約５７、約５８、約５９、約６０、約６１、約６２、約６３、約６４、約６５、約６６、約６７、約６８、約６９、約７０、約７１、約７２、約７３、約７４、約７５、約７６、約７７、約７８、約７９、約８０、約８１、約８２、約８３、約８４、約８５、約８６、約８７、約８８、約８９、約９０、約９１、約９２、約９３、約９４、約９５、約９６、約９７、約９８、約９９、約１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、約１６０、約１７０、約１８０、約１９０、約２００、約２１０、約２２０、約２３０、約２４０、約２５０、約２６０、約２７０、約２８０、約２９０、約３００、約３１０、約３２０、約３３０、約３４０、約３５０、約３６０、約３７０、約３８０、約３９０、約４００、約４１０、約４２０、約４３０、約４４０、約４５０、約４６０、約４７０、約４８０、約４９０、約５００、約５１０、約５２０、約５３０、約５４０、約５５０、約５６０、約５７０、約５８０、約５９０、約６００、約６１０、約６２０、約６３０、約６４０、約６５０、約６６０、約６７０、約６８０、約６９０、約７００、約７１０、約７２０、約７３０、約７４０、約７５０、約７６０、約７７０、約７８０、約７��０、約８００、約８１０、約８２０、約８３０、約８４０、約８５０、約８６０、約８７０、約８８０、約８９０、約９００、約９１０、約９２０、約９３０、約９４０、約９５０、約９６０、約９７０、約９８０、約９９０、約１０００、約１１００、約１２００、約１３００、約１４００、約１５００、約１６００、約１７００、約１８００、約１９００、約２０００、約２１００、約２２００、約２３００、約２４００、約２５００、約２６００、約２７００、約２８００、約２９００、約３０００、約３１００、約３２００、約３３００、約３４００、約３５００、約３６００、約３７００、約３８００、約３９００、約４０００、約４１００、約４２００、約４３００、約４４００、約４５００、約４６００、約４７００、約４８００、約４９００、約５０００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、１５０，０００、２００，０００、２５０，０００、３００，０００、３５０，０００、４００，０００、４５０，０００、５００，０００、５５０，０００、６００，０００、６５０，０００、７００，０００、７５０，０００、８００，０００、８５０，０００、９００，０００、９５０，０００、又は１，０００，０００以上のヌクレオチドである。
【００８８】
アンプリコン分子
本明細書で使用される「アンプリコン」とは、増幅法を使用して合成されたポリヌクレオチドの部分を意味することが理解される。
【００８９】
アンプリコンの長さは、約１０ｂｐ〜１７５ｂｐの間であることが想定され、この場合、所望されるアンプリコンサイズは、循環無細胞ＤＮＡ断片（約１６５ｂｐ）より著明に短く、保存試料に由来するホルマリン誘導型架橋ＤＮＡに及ばない程度の、十分に小さなサイズであり、理想的には、１５０ｂｐ未満の長さである。アンプリコンは、１５ｂｐ、２０ｂｐ、２５ｂｐ、３０ｂｐ、３５ｂｐ、４０ｂｐ、４５ｂｐ、５０ｂｐ、５１ｂｐ、５２ｂｐ、５３ｂｐ、５４ｂｐ、５５ｂｐ、５６ｂｐ、５７ｂｐ、５８ｂｐ、５９ｂｐ、６０ｂｐ、６１ｂｐ、６２ｂｐ、６３ｂｐ、６４ｂｐ、６５ｂｐ、６６ｂｐ、６７ｂｐ、６８ｂｐ、６９ｂｐ、７０ｂｐ、７１ｂｐ、７２ｂｐ、７３ｂｐ、７４ｂｐ、７５ｂｐ、７６ｂｐ、７７ｂｐ、７８ｂｐ、７９ｂｐ、８０ｂｐ、８１ｂｐ、８２ｂｐ、８３ｂｐ、８４ｂｐ、８５ｂｐ、８６ｂｐ、８７ｂｐ、８８ｂｐ、８９ｂｐ、９０ｂｐ、９１ｂｐ、９２ｂｐ、９３ｂｐ、９４ｂｐ、９５ｂｐ、９６ｂｐ、９７ｂｐ、９８ｂｐ、９９ｂｐ、１００ｂｐ、１０１ｂｐ、１０２ｂｐ、１０３ｂｐ、１０４ｂｐ、１０５ｂｐ、１０６ｂｐ、１０７ｂｐ、１０８ｂｐ、１０９ｂｐ、１１０ｂｐ、１１１ｂｐ、１１２ｂｐ、１１３ｂｐ、１１４ｂｐ、１１５ｂｐ、１１６ｂｐ、１１７ｂｐ、１１８ｂｐ、１１９ｂｐ、１２０ｂｐ、１２１ｂｐ、１２２ｂｐ、１２３ｂｐ、１２４ｂｐ、１２５ｂｐ、１２６ｂｐ、１２７ｂｐ、１２８ｂｐ、１２９ｂｐ、１３０ｂｐ、１３１ｂｐ、１３２ｂｐ、１３３ｂｐ、１３４ｂｐ、１３５ｂｐ、１３６ｂｐ、１３７ｂｐ、１３８ｂｐ、１３９ｂｐ、１４０ｂｐ、１４１ｂｐ、１４２ｂｐ、１４３ｂｐ、１４４ｂｐ、１４５ｂｐ、１４６ｂｐ、１４７ｂｐ、１４８ｂｐ、１４９ｂｐ、１５０ｂｐ、１５１ｂｐ、１５２ｂｐ、１５３ｂｐ、１５４ｂｐ、１５５ｂｐ、１５６ｂｐ、１５７ｂｐ、１５８ｂｐ、１５９ｂｐ、１６０ｂｐ、１６１ｂｐ、１６２ｂｐ、１６３ｂｐ、１６４ｂｐ、１６５ｂｐ、１６６ｂｐ、１６７ｂｐ、１６８ｂｐ、１６９ｂｐ、１７０ｂｐ、１７１ｂｐ、１７２ｂｐ、１７３ｂｐ、１７４ｂｐ、１７５ｂｐ又は１７６ｂｐ以上の長さでありうることが想定される。
【００９０】
代替的に、より長いリード、特に、複数キロ塩基のリードを提供することが可能な長鎖リード配列技術であって、ハプロタイプ解析の情報を提供するか、又は反復配列若しくは他の困難な配列に及ぶ技術（PacBio）では、高分子量ＤＮＡを、増幅反応のためのインプットＤＮＡとして活用する場合、アンプリコンの長さは、１５０ｂｐ〜１５０，０００ｂｐの間以上の長さであることも想定される。アンプリコンは、１５０ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１，０００ｂｐ、２，０００ｂｐ、３，０００ｂｐ、４，０００ｂｐ、５，０００ｂｐ、６，０００ｂｐ、７，０００ｂｐ、８，０００ｂｐ、９，０００ｂｐ、１０，０００ｂｐ、１１，０００ｂｐ、１２，０００ｂｐ、１３，０００ｂｐ、１４，０００ｂｐ、１５，０００ｂｐ、１６，０００ｂｐ、１７，０００ｂｐ、１８，０００ｂｐ、１９，０００ｂｐ、２０，０００ｂｐ、３０，０００ｂｐ、４０，０００ｂｐ、５０，０００ｂｐ、１００，０００ｂｐ、又は１５０，０００ｂｐ以上の長さでありうることが想定される。
【００９１】
本明細書で開示される方法のうちのいずれかでは、マルチプレックス化増幅のために選択される標的遺伝子座は、がん特異的標的、薬物耐性特異的標的、薬物代謝標的及び薬物吸収標的（例えば、ＣＹＰ２Ｄ６）、遺伝性疾患についての標的（例えば、嚢胞性線維症のＣＦＴＲ遺伝子、リンチ症候群のＭＬＨ１遺伝子、ＭＳＨ２遺伝子、ＭＳＨ６遺伝子、ＰＭＳ２遺伝子及びＥＰＣＡＭ遺伝子）、感染性病原体に由来する標的、病原体宿主の遺伝子座についての標的、種特異的標的、及び任意の臨床で適用可能な標的を含むがこれらに限定されない、様々な適用のうちのいずれかに対応することが想定される。一態様では、標的遺伝子座は、ＢＲＡＦ、ＫＲＡＳ、ＥＧＦＲ、ＫＩＴ、ＨＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＭＥＴ、ＲＥＴ、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＮＯＴＣＨ１、ＡＬＫ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＪＡＫ２、ＡＫＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＩＤＨ２、ＥＲＢＢ２及びＴＰ５３を含むがこれらに限定されない、がん標的のセットから選択される。別の態様では、がん標的は、以下の遺伝子のサブセット：ＡＣＵＲＬ１、ＡＫＴ１、ＡＰＣ、ＡＰＥＸ１、ＡＲ、ＡＴＭ、ＡＴＰ１１Ｂ、ＢＡＰ１、ＢＣＬ２Ｌ１、ＢＣＬ９、ＢＩＲＣ２、ＢＩＲＣ３、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＥ１、ＣＤ２７４、ＣＤ４４、ＣＤＨ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＳＮＫ２Ａ１、ＤＣＯＮ１Ｄ１、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＦＢＸＷ７、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＦＬＴ３、ＧＡＳ６、ＧＡＴＡ３、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＬ６、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＭＣＬ１、ＭＤＭ２、ＭＥＴ、ＭＳＨ２、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ、ＭＹＣＮ、ＭＹＯ１８Ａ、ＮＦ１、ＮＦ２、ＮＫＸ２−１、ＮＫＸ２−８、ＮＯＴＣＨ１、ＰＤＣＤ１ＬＧ２、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＮＰ、ＰＰＡＲＧ、ＰＴＣＨ１、ＰＴＥＮ、ＲＢ１、ＲＰＳ６ＫＢ１、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＲＣＢ１、ＳＯＸ２、ＳＴＫ１１、ＴＥＲＴ、ＴＥＴ２、ＴＩＡＦ１、ＴＰ５３、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＶＨＬ、ＷＴ１及びＺＮＦ２１７を含むがこれらに限定されない、４００〜６００の遺伝子を含む。さらなる実施形態では、標的遺伝子座は、ＡＢＩ１、ＡＢＬ１、ＡＢＬ２、ＡＣＳＬ３、ＡＦ１５Ｑ１４、ＡＦ１Ｑ、ＡＦ３ｐ２１、ＡＦ５ｑ３１、ＡＫＡＰ９、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＬＤＨ２、ＡＬＫ、ＡＬＯ１７、ＡＭＥＲ１、ＡＰＣ、ＡＲＨＧＥＦ１２、ＡＲＨＨ、ＡＲＩＤ１Ａ、ＡＲＩＤ２、ＡＲＮＴ、ＡＳＰＳＣＲ１、ＡＳＸＬ１、ＡＴＦ１、ＡＴＩＣ、ＡＴＭ、ＡＴＰ１Ａ１、ＡＴＰ２Ｂ３、ＡＴＲＸ、ＡＸＩＮ１、ＢＡＰ１、ＢＣＬ１０、ＢＣＬ１１Ａ、ＢＣＬ１１Ｂ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ３、ＢＣＬ５、ＢＣＬ６、ＢＣＬ７Ａ、ＢＣＬ９、ＢＣＯＲ、ＢＣＲ、ＢＨＤ、ＢＩＲＣ３、ＢＬＭ、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＲＡＦ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４、ＢＲＩＰ１、ＢＴＧ１、ＢＵＢ１Ｂ、Ｃ１２ｏｒｆ９、Ｃ１５ｏｒｆ２１、Ｃ１５ｏｒｆ５５、Ｃ１６ｏｒｆ７５、Ｃ２ｏｒｆ４４、ＣＡＣＮＡ１Ｄ、ＣＡＬＲ、ＣＡＭＴＡ１、ＣＡＮＴ１、ＣＡＲＤ１１、ＣＡＲＳ、ＣＡＳＰ８、ＣＢＦＡ２Ｔ１、ＣＢＦＡ２Ｔ３、ＣＢＦＢ、ＣＢＬ、ＣＢＬＢ、ＣＢＬＣ、ＣＣＤＣ６、ＣＣＮＢ１ＩＰ１、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＣＣＮＤ３、ＣＣＮＥ１、ＣＤ２７３、ＣＤ２７４、ＣＤ７４、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤＣ７３、ＣＤＨ１、ＣＤＨ１１、ＣＤＫ１２、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＣＤＫＮ２ａ（ｐ１４）、ＣＤＸ２、ＣＥＢＰＡ、ＣＥＰ１、ＣＥＰ８９、ＣＨＣＨＤ７、ＣＨＥＫ２、ＣＨＩＣ２、ＣＨＮ１、ＣＩＣ、ＣＩＩＴＡ、ＣＬＩＰ１、ＣＬＴＣ、ＣＬＴＣＬ１、ＣＭＫＯＲ１、ＣＮＯＴ３、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ２Ａ１、ＣＯＰＥＢ、ＣＯＸ６Ｃ、ＣＲＥＢ１、ＣＲＥＢ３Ｌ１、ＣＲＥＢ３Ｌ２、ＣＲＥＢＢＰ、ＣＲＬＦ２、ＣＲＴＣ３、ＣＳＦ３Ｒ、ＣＴＮＮＢ１、ＣＵＸ１、ＣＹＬＤ、Ｄ１０Ｓ１７０、ＤＡＸＸ、ＤＣＴＮ１、ＤＤＢ２、ＤＤＩＴ３、ＤＤＸ１０、ＤＤＸ５、ＤＤＸ６、ＤＥＫ、ＤＩＣＥＲ１、ＤＮＭ２、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＵＸ４、ＥＢＦ１、ＥＣＴ２Ｌ、ＥＧＦＲ、ＥＩＦ３Ｅ、ＥＩＦ４Ａ２、ＥＬＦ４、ＥＬＫ４、ＥＬＫＳ、ＥＬＬ、ＥＬＮ、ＥＭＬ４、ＥＰ３００、ＥＰＳ１５、ＥＲＢＢ２、ＥＲＣ１、ＥＲＣＣ２、ＥＲＣＣ３、ＥＲＣＣ４、ＥＲＣＣ５、ＥＲＧ、ＥＴＶ１、ＥＴＶ４、ＥＴＶ５、ＥＴＶ６、ＥＶＩ１、ＥＷＳＲ１、ＥＸＴ１、ＥＸＴ２、ＥＺＨ２、ＥＺＲ、ＦＡＣＬ６、ＦＡＭ４６Ｃ、ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＤ２、ＦＡＮＣＥ、ＦＡＮＣＦ、ＦＡＮＣＧ、ＦＡＳ、ＦＢＸＯ１１、ＦＢＸＷ７、ＦＣＧＲ２Ｂ、ＦＥＶ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ１ＯＰ、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＨ、ＦＨＩＴ、ＦＩＰ１Ｌ１、ＦＬＩ１、ＦＬＪ２７３５２、ＦＬＴ３、ＦＮＢＰ１、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＬ２、ＦＯＸＯ１Ａ、ＦＯＸＯ３Ａ、ＦＯＸＯ４、ＦＯＸＰ１、ＦＳＴＬ３、ＦＵＢＰ１、ＦＵＳ、ＦＶＴ１、ＧＡＳ７、ＧＡＴＡ１、ＧＡＴＡ２、ＧＡＴＡ３、ＧＭＰＳ、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＧＮＡＳ、ＧＯＬＧＡ５、ＧＯＰＣ、ＧＰＣ３、ＧＰＨＮ、ＧＲＡＦ、Ｈ３Ｆ３Ａ、Ｈ３Ｆ３Ｂ、ＨＣＭＯＧＴ−１、ＨＥＡＢ、ＨＥＲＰＵＤ１、ＨＥＹ１、ＨＩＰ１、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｂ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｉ、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＦ、ＨＬＸＢ９、ＨＭＧＡ１、ＨＭＧＡ２、ＨＮＲＮＰＡ２Ｂ１、ＨＯＯＫ３、ＨＯＸＡ１１、ＨＯＸＡ１３、ＨＯＸＡ９、ＨＯＸＣ１１、ＨＯＸＣ１３、ＨＯＸＤ１１、ＨＯＸＤ１３、ＨＲＡＳ、ＨＳＰＣＡ、ＨＳＰＣＢ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＩＧＨ￥、ＩＧＫ、ＩＧＬ、ＩＫＺＦ１、ＩＬ２、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ６ＳＴ、ＩＬ７Ｒ、ＩＲＦ４、ＩＲＴＡ１、ＩＴＫ、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＪＡＺＦ１、ＪＵＮ、ＫＣＮＪ５、ＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ６Ａ、ＫＤＲ、ＫＩＡＡ１５４９、ＫＩＡＡ１５９８、ＫＩＦ５Ｂ、ＫＩＴ、ＫＬＦ４、ＫＬＫ２、ＫＭＴ２Ｄ、ＫＲＡＳ、ＫＴＮ１、ＬＡＦ４、ＬＡＳＰ１、ＬＣＫ、ＬＣＰ１、ＬＣＸ、ＬＨＦＰ、ＬＩＦＲ、ＬＭＮＡ、ＬＭＯ１、ＬＭＯ２、ＬＰＰ、ＬＲＩＧ３、ＬＳＭ１４Ａ、ＬＹＬ１、ＭＡＦ、ＭＡＦＢ、ＭＡＬＡＴ１、ＭＡＬＴ１、ＭＡＭＬ２、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＰ２Ｋ２、ＭＡＰ２Ｋ４、ＭＡＸ、ＭＤＭ２、ＭＤＭ４、ＭＤＳ１、ＭＤＳ２、ＭＥＣＴ１、ＭＥＤ１２、ＭＥＮ１、ＭＥＴ、ＭＩＴＦ、ＭＫＬ１、ＭＬＦ１、ＭＬＨ１、ＭＬＬ、ＭＬＬ３、ＭＬＬＴ１、ＭＬＬＴ１０、ＭＬＬＴ２、ＭＬＬＴ３、ＭＬＬＴ４、ＭＬＬＴ６、ＭＬＬＴ７、ＭＮ１、ＭＰＬ、ＭＳＦ、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＭＳＩ２、ＭＳＮ、ＭＴＣＰ１、ＭＵＣ１、ＭＵＴＹＨ、ＭＹＢ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＣＮ、ＭＹＤ８８、ＭＹＨ１１、ＭＹＨ９、ＭＹＯ５Ａ、ＭＹＳＴ４、ＮＡＢ２、ＮＡＣＡ、ＮＢＳ１、ＮＣＯＡ１、ＮＣＯＡ２、ＮＣＯＡ４、ＮＤＲＧ１、ＮＦ１、ＮＦ２、ＮＦＡＴＣ２、ＮＦＥ２Ｌ２、ＮＦＩＢ、ＮＦＫＢ２、ＮＩＮ、ＮＫＸ２−１、ＮＯＮＯ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＰＭ１、ＮＲ４Ａ３、ＮＲＡＳ、ＮＲＧ１、ＮＳＤ１、ＮＴ５Ｃ２、ＮＴＲＫ１、ＮＴＲＫ３、ＮＵＭＡ１、ＮＵＰ２１４、ＮＵＰ９８、ＮＵＴＭ２Ａ、ＮＵＴＭ２Ｂ、ＯＬＩＧ２、ＯＭＤ、Ｐ２ＲＹ８、ＰＡＦＡＨ１Ｂ２、ＰＡＬＢ２、ＰＡＸ３、ＰＡＸ５、ＰＡＸ７、ＰＡＸ８、ＰＢＲＭ１、ＰＢＸ１、ＰＣＭ１、ＰＣＳＫ７、ＰＤＥ４ＤＩＰ、ＰＤＧＦＢ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＰＥＲ１、ＰＨＦ６、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＰＩＣＡＬＭ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＩＭ１、ＰＬＡＧ１、ＰＬＣＧ１、ＰＭＬ、ＰＭＳ１、ＰＭＳ２、ＰＭＸ１、ＰＮＵＴＬ１、ＰＯＴ１、ＰＯＵ２ＡＦ１、ＰＯＵ５Ｆ１、ＰＰＡＲＧ、ＰＰＦＩＢＰ１、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＰＲＣＣ、ＰＲＤＭ１、ＰＲＤＭ１６、ＰＲＦ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＳＩＰ１、ＰＴＣＨ１、ＰＴＥＮ、ＰＴＰＮ１１、ＰＴＰＲＢ、ＰＴＰＲＣ、ＰＴＰＲＫ、ＰＷＷＰ２Ａ、ＲＡＢ５ＥＰ、ＲＡＣ１、ＲＡＤ２１、ＲＡＤ５１Ｌ１、ＲＡＦ１、ＲＡＬＧＤＳ、ＲＡＮＢＰ１７、ＲＡＰ１ＧＤＳ１、ＲＡＲＡ、ＲＢ１、ＲＢＭ１５、ＲＥＣＱＬ４、ＲＥＬ、ＲＥＴ、ＲＮＦ４３、ＲＯＳ１、ＲＰＬ１０、ＲＰＬ２２、ＲＰＬ５、ＲＰＮ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、ＲＵＮＤＣ２Ａ、ＲＵＮＸ１、ＲＵＮＸＢＰ２、ＳＢＤＳ、ＳＤＣ４、ＳＤＨ５、ＳＤＨＢ、ＳＤＨＣ、ＳＤＨＤ、４２２５３、ＳＥＴ、ＳＥＴＢＰ１、ＳＥＴＤ２、ＳＦ３Ｂ１、ＳＦＰＱ、ＳＦＲＳ３、ＳＨ２Ｂ３、ＳＨ３ＧＬ１、ＳＩＬ、ＳＬＣ３４Ａ２、ＳＬＣ４５Ａ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＲＣＡ４、ＳＭＡＲＣＢ１、ＳＭＡＲＣＥ１、ＳＭＯ、ＳＯＣＳ１、ＳＯＸ２、ＳＲＧＡＰ３、ＳＲＳＦ２、ＳＳ１８、ＳＳ１８Ｌ１、ＳＳＸ１、ＳＳＸ２、ＳＳＸ４、ＳＴＡＧ２、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＳＴＡＴ６、ＳＴＫ１１、ＳＴＬ、ＳＵＦＵ、ＳＵＺ１２、ＳＹＫ、ＴＡＦ１５、ＴＡＬ１、ＴＡＬ２、ＴＢＬ１ＸＲ１、ＴＣＥＡ１、ＴＣＦ１、ＴＣＦ１２、ＴＣＦ３、ＴＣＦ７Ｌ２、ＴＣＬ１Ａ、ＴＣＬ６、ＴＥＲＴ、ＴＥＴ２、ＴＦＥ３、ＴＦＥＢ、ＴＦＧ、ＴＦＰＴ、ＴＦＲＣ、ＴＨＲＡＰ３、ＴＩＦ１、ＴＬＸ１、ＴＬＸ３、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＮＦＲＳＦ１４、ＴＮＦＲＳＦ１７、ＴＯＰ１、ＴＰ５３、ＴＰＭ３、ＴＰＭ４、ＴＰＲ、ＴＲＡ、ＴＲＡＦ７、ＴＲＢ、ＴＲＤ、ＴＲＩＭ２７、ＴＲＩＭ３３、ＴＲＩＰ１１、ＴＲＲＡＰ、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＴＳＨＲ、ＴＴＬ、Ｕ２ＡＦ１、ＵＢＲ５、ＵＳＰ６、ＶＨＬ、ＶＴＩ１Ａ、ＷＡＳ、ＷＨＳＣ１、ＷＨＳＣ１Ｌ１、ＷＩＦ１、ＷＲＮ、ＷＴ１、ＷＷＴＲ１、ＸＰＡ、ＸＰＣ、ＸＰＯ１、ＹＷＨＡＥ、ＺＣＣＨＣ８、ＺＮＦ１４５、ＺＮＦ１９８、ＺＮＦ２７８、ＺＮＦ３３１、ＺＮＦ３８４、ＺＮＦ５２１、ＺＮＦ９及びＺＲＳＲ２を含むがこれらに限定されない、がんにおいて臨床的関連性を有することが公知である遺伝子のサブセットから選択される。
【００９２】
別の態様では、標的は、ターゲティング型抗がん剤として使用されるチロシンキナーゼ阻害剤に対する耐性を付与する遺伝子座、ターゲティング型抗がん剤と関連する他のターゲティングされる遺伝子座、抗生剤耐性の遺伝子座、及び抗ウイルス耐性の遺伝子座を含む、薬物耐性遺伝子座に特異的である。
【００９３】
別の態様では、細菌、真菌、酵母、ウイルス、又は原虫を含む、腸内病原体、血液感染性病原体、ＣＮＳ病原体、呼吸器病原体、性感染性病原体、及び尿路病原体の検出を実施することができる。また、耳、皮膚、又は眼の感染を引き起こす病原体も、検出しうるであろう。細菌病原型又はウイルス病原型の間の鑑別のほか、抗生剤耐性を促進する遺伝子又は毒素をコードする遺伝子の間の鑑別も行いうるであろう。
【００９４】
結果として得られるアンプリコンの配列解析から検出されうる遺伝子病変の種類は、ＳＮＶ（一塩基バリアント：single nucleotide variant）、点変異、転移、トランスバージョン、ナンセンス変異、ミスセンス変異、一塩基挿入及び一塩基欠失、プライマー対の間にマッピングされる、大規模な挿入及び欠失、転座、遺伝子融合、欠失、挿入など、公知の染色体再配列を含み、このような公知の再配列；増幅イベントを含むコピー数の変化、欠失、ヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ：loss of heterozygosity）、異数性、片親性ダイソミー、及び他の遺伝性又は後天性の染色体異常の切断点を挟むように、プライマー対を設計する。加えて、マルチプレックス化ＰＣＲの前に、亜硫酸水素転換を実施し、亜硫酸水素転換されたＤＮＡに従ってプライマーを設計し、プライマーが任意に、多様な修飾配列状態を結果としてもたらすことから、プライマーの設計をより困難としうる、ＣｐＧジヌクレオチドと重複しない場合はまた、開示される方法を使用して、メチル化による変化も検出することができる。
【００９５】
標的遺伝子座を増幅する場合、プライマーの３’標的特異的部分の最適の長さは、１５〜３０塩基の間であるが、この範囲に限定されず、この場合、プライマーの標的特異的部分は、５〜５０塩基若しくは１０〜４０塩基又はこれらの間の任意の長さである。２．５ｍＭのＭｇ２＋、５０ｍＭのＮａＣｌ及び０．２５μＭのオリゴヌクレオチドで規定される所望のＴｍは、６３℃であり、この場合、一定の反応条件下における均一の増幅を確保するように、マルチプレックス化プライマー間のＴｍの変化は、±２．５℃以下とする。プライマーの標的特異的部分の所望されるＧＣ含量は、理想的には、５０％であるが、３０〜７０％の間で変化しうる。標的特異的プライマーは、多様な遺伝子バックグラウンドに由来するＤＮＡ試料からの、特異的でバイアスのかからない増幅を確保するために、アッセイされる状態について、反復を伴う重複、非固有の配列又は共通のＳＮＰ多型又は公知の変異を回避するように設計する。加えて、標的特異的プライマー及び標的相補性プライマーの設計は、効能を低減する二次構造の形成下に置かないものとする。
【００９６】
ユニバーサルプライマーは、デオキシウリジン、デオキシイノシン又はＲＮＡを含むがこれらに限定されない切断性塩基を含み、１、２、３、４、５又は６以上の切断性塩基を含有しうる。加えて、標的特異的プライマー及びユニバーサルプライマーは、それらの３’末端に、１、２、３、４又は５以上のヌクレアーゼ耐性部分を含む。
【００９７】
アダプター分子
本開示は、５’アダプター及び３’アダプターの使用を想定する（図３を参照されたい）。本開示に従い、３’アダプターは任意に、「オリゴヌクレオチド１」及び「オリゴヌクレオチド２」を含む二本鎖である。このような二本鎖基質分子には、２つのオリゴヌクレオチドが、標準的な反応条件下で、互いとアニーリングすることが可能である限りにおいて、任意の長さのオリゴヌクレオチド１及びオリゴヌクレオチド２が想定される。したがって、オリゴヌクレオチド１とオリゴヌクレオチド２との間の相補性は、それらが、互いとアニールしうるような相補性である。多様な実施形態では、相補性は、約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５〜約１００％、又は約７０％、７５％、８０％、８５％、９０〜約９５％、又は約７０％、７５％、８０％、８５〜約９０％である。具体的な実施形態では、オリゴヌクレオチド１とオリゴヌクレオチド２との間の相補性の程度は、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％である。さらなる実施形態では、オリゴヌクレオチド２は、非塩基性ヌクレオチド又は非塩基性リボヌクレオチドなど、分解／除去を受けやすいヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチド１とオリゴヌクレオチド２とは、異なる長さであり、オリゴヌクレオチド１は、オリゴヌクレオチド２の長さに沿った任意の位置でハイブリダイズする。
【００９８】
さらなる実施形態では、５’アダプターは、一本鎖である。５’アダプターが、３’アダプターのオリゴヌクレオチド１とハイブリダイズする実施形態において、このようなアニーリングは、ニック、ギャップ又は５’アダプターと基質分子との重複塩基を結果としてもたらすことが、さらなる実施形態では、想定される（図８を参照されたい）。多様な実施形態では、ギャップ又は重複塩基は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５又は１００塩基の長さである。５’アダプターの、３’アダプターへのアニーリング後において、３’アダプターが二本鎖である、別の実施形態では、ニックトランスレーションを介して、オリゴヌクレオチド２を除去する、５’アダプターの「チューイングフォワード」を触媒するように、酵素を添加する。一部の実施形態では、５’アダプターは加えて、オリゴヌクレオチド１と相補的でなく、その５’塩基が置換されれば、基質分子の第１の塩基とアニールする、ランダムな、単一、２連又は３連以上のＮ塩基を、その３’末端に含む。他の実施形態では、５’アダプターは、修飾ポリヌクレオチドである。使用のために想定される修飾オリゴヌクレオチドは、参照によりその全体が組み込まれる、米国特許出願公開第２０１１／０１２９８３２号パンフレットにおいて開示されている。具体的な実施形態では、５’アダプターは、ロックト核酸（ＬＮＡ）及びペプチド核酸（ＰＮＡ：peptide nucleic acid）からなる群から選択される塩基修飾を含む。ある特定の実施形態では、５’アダプターのオリゴヌクレオチドを、３’アダプターへとあらかじめアニールさせる（図８を参照されたい）。
【００９９】
本開示はまた、ＰＣＲにより組み込まれるユニバーサルアダプター、一本鎖５’アダプター及び部分的に処理されたアンプリコン基質上のユニバーサルアダプターの１つの鎖へとライゲーションされる３’アダプターの残余部分の使用も想定する。本開示に従い、３’アダプターの残余部分のライゲーションは、リンカーにより媒介される。３つのオリゴヌクレオチドが、標準的な反応条件下で、互いとアニーリングすることが可能である限りにおいて、リンカー分子には、ユニバーサルアダプター及び３’アダプターの残余部分と相補的な任意の長さが想定される。したがって、相補性は、それらが、互いとアニールしうるような相補性である。多様な実施形態では、相補性は、約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５〜約１００％、又は約７０％、７５％、８０％、８５％、９０〜約９５％、又は約７０％、７５％、８０％、８５〜約９０％である。
【０１００】
さらなる実施形態では、５’アダプターは、一本鎖である。５’アダプターが、アンプリコン末端上のユニバーサルアダプターの３’突出とハイブリダイズする実施形態では、このようなアニーリングは、５’アダプターとアンプリコン基質との間のニック又はギャップを結果としてもたらすことが、さらなる実施形態では、想定される。多様な実施形態では、ギャップは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５又は１００塩基の長さである。
【０１０１】
ユニバーサルアダプター、５’アダプターＢ又は３’アダプターの残余部分Ａの長さは、約５〜約２００ヌクレオチドの間であることが想定される。一部の態様では、ユニバーサルアダプター、５’アダプター又は３’アダプターの長さは、約５〜約２００ヌクレオチドの間、又は約５〜約１５０ヌクレオチドの間、又は約５〜約１００ヌクレオチドの間、又は約５〜約５０ヌクレオチドの間、又は約５〜約２５ヌクレオチドの間、又は約１０〜２００ヌクレオチドの間、又は約１０〜１００ヌクレオチドの間である。さらなる態様では、５’アダプター又は３’アダプターの長さは、少なくとも５ヌクレオチドであり、最大で約５０、１００若しくは２００ヌクレオチド；又は少なくとも１０ヌクレオチドであり、最大で約５０、１００若しくは２００ヌクレオチドであるか；又は少なくとも１５ヌクレオチドであり、最大で約５０、１００、若しくは２００ヌクレオチドであるか；又は少なくとも２０ヌクレオチドであり、最大で約５０、１００若しくは２００ヌクレオチドであるか；又は少なくとも３０ヌクレオチドであり、最大で約５０、１００若しくは２００ヌクレオチドであるか；又は少なくとも４０ヌクレオチドであり、最大で約５０、１００若しくは２００ヌクレオチドである。多様な態様では、基質分子の長さは、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、約５０、約５１、約５２、約５３、約５４、約５５、約５６、約５７、約５８、約５９、約６０、約６１、約６２、約６３、約６４、約６５、約６６、約６７、約６８、約６９、約７０、約７１、約７２、約７３、約７４、約７５、約７６、約７７、約７８、約７９、約８０、約８１、約８２、約８３、約８４、約８５、約８６、約８７、約８８、約８９、約９０、約９１、約９２、約９３、約９４、約９５、約９６、約９７、約９８、約９９、約１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、約１６０、約１７０、約１８０、約１９０、約２００、約３００、約４００、約５００、約６００、約７００、約８００、約９００、約１０００、約１１００、約１２００、約１３００、約１４００、約１５００、約１６００、約１７００、約１８００、約１９００、約２０００、約２１００、約２２００、約２３００、約２４００、約２５００、約２６００、約２７００、約２８００、約２９００、約３０００、約３１００、約３２００、約３３００、約３４００、約３５００、約３６００、約３７００、約３８００、約３９００、約４０００、約４１００、約４２００、約４３００、約４４００、約４５００、約４６００、約４７００、約４８００、約４９００、約５０００、約５１００、約５２００、約５３００、約５４００、約５５００、約５６００、約５７００、約５８００、約５９００、約６０００、約６１００、約６２００、約６３００、約６４００、約６５００、約６６００、約６７００、約６８００、約６９００、約７０００、約７１００、約７２００、約７３００、約７４００、約７５００、約７６００、約７７００、約７８００、約７９００、約８０００、約８１００、約８２００、約８３００、約８４００、約８５００、約８６００、約８７００、約８８００、約８９００、約９０００、約９１００、約９２００、約９３００、約９４００、約９５００、約９６００、約９７００、約９８００、約９９００、約１００００、約１０５００、約１１０００、約１１５００、約１２０００、約１２５００、約１３０００、約１３５００、約１４０００、約１４５００、約１５０００、約１５５００、約１６０００、約１６５００、約１７０００、約１７５００、約１８０００、約１８５００、約１９０００、約１９５００、約２００００、約２０５００、約２１０００、約２１５００、約２２０００、約２２５００、約２３０００、約２３５００、約２４０００、約２４５００、約２５０００、約２５５００、約２６０００、約２６５００、約２７０００、約２７５００、約２８０００、約２８５００、約２９０００、約２９５００、約３００００、約３０５００、約３１０００、約３１５００、約３２０００、約３２５００、約３３０００、約３３５００、約３４０００、約３４５００、約３５０００、約３５５００、約３６０００、約３６５００、約３７０００、約３７５００、約３８０００、約３８５００、約３９０００、約３９５００、約４００００、約４０５００、約４１０００、約４１５００、約４２０００、約４２５００、約４３０００、約４３５００、約４４０００、約４４５００、約４５０００、約４５５００、約４６０００、約４６５００、約４７０００、約４７５００、約４８０００、約４８５００、約４９０００、約４９５００、約５００００、約６００００、約７００００、約８００００、約９００００、又は約１０００００以上のヌクレオチドの長さである。
【０１０２】
ＮＧＳアダプターのライゲーションを完了するには、ユニバーサルアダプターのプライマーは加えて、酵素的、化学的又は物理的に破壊されうる修飾塩基及び／又は修飾連結も含む。修飾は、ｄＵ塩基、デオキシイノシン及びＲＮＡ塩基を含むがこれらに限定されない。一本鎖５’アダプターの、アンプリコンの３’突出へのアニーリングは、切断性塩基を伴う、組み込まれたユニバーサルプライマーに対応する、ユニバーサルアダプターの１つの鎖の分解の結果として生じる。一部の実施形態では、分解を、酵素的に、より具体的には、オリゴヌクレオチドが、デオキシウラシル塩基を含有する場合は、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）、若しくはＵＤＧと非プリン性／非ピリミジン性エンドヌクレアーゼとの組合せを使用することにより、又はオリゴヌクレオチドが、デオキシイノシン塩基を含有する場合は、エンドヌクレアーゼＶにより達成する。分解はまた、組み込まれたプライマーが、ＲＮＡ塩基を含有する場合は、ＲＮアーゼ  Ｈ１又はＲＮアーゼ  Ｈ２を伴うインキュベーションによっても実施することができる。一部の適用では、組み込まれたプライマーの分解は、化学的又は物理的に、例えば、光により実施することができる。代替的に、アンプリコンの３’突出は、アンプリコンの５’末端の限定的なエキソヌクレアーゼ消化により産生することもできる。このような限定的な消化は、酵素的に、より具体的には、プライマーオリゴヌクレオチドが、３’末端に、ヌクレアーゼ耐性塩基、具体的には、ホスホロチオエート連結を伴う塩基を含有する場合は、Ｔ７第６遺伝子エキソヌクレアーゼ又はラムダ５’→３’エキソヌクレアーゼを使用することにより達成することができる。この場合、エキソヌクレアーゼ反応は、修飾塩基で停止され、３’突出を産生する。
【０１０３】
方法−ステップ
方法のうちの最初の３つのインキュベーションは、プレライゲーションステップであり、（ｉ）脱リン酸化、（ii）ポリッシング及び（iii）任意のアデニル化を含む。方法のうちの残りの２つのインキュベーションは、（１）３’アダプターのライゲーションと、（２）５’アダプターのライゲーションとを含み、（２）は、（ａ）５’アダプターのアニーリングと、（ｂ）５’塩基の基質分子からの除去と、（ｃ）５’アダプターのライゲーションとを含む（図４〜６を参照されたい）。この態様では、方法は、最大で３つのプレライゲーションステップと、２つのライゲーションステップとを有する。別の態様では、基質分子が、好ましくは、３’アダプターとして用いられる、既存の３’突出を含む場合、方法は、５’アダプターの単一のライゲーションステップを有する（図７ａを参照されたい）。
【０１０４】
増幅反応内では、マルチプレックス化サイクルの数を、最小の２サイクルへと限定するか、又は、非マルチプレックス化ユニバーサルアダプターによる単一のプライマー増幅へと切り替える前に、３サイクル、４サイクル、５サイクル若しくは６サイクル以上の最大Ｎサイクルとして実施することができる。ユニバーサルサイクルの数は、ＤＮＡインプット量及び所望されるライブラリー収率に応じて、１〜４０サイクル以上で変化させることができる。マルチプレックスＰＣＲ増幅の後、精製ステップを実施し、次いで、同時的なアダプターのライゲーションステップを実施する。
【０１０５】
プレライゲーションステップ：
（ｉ）脱リン酸化
アダプターのライゲーションの前に、ＤＮＡ末端を任意に処理して、アダプターのライゲーション反応の効率を改善する。既存の方法におけるＤＮＡ末端の処理では、２つの酵素反応：（ａ）３’突出を除去し、３’陥凹末端を充填することによりＤＮＡ末端をポリッシングする、プルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼを伴うインキュベーション、及び（ｂ）リン酸基を５’末端へと付加する、ポリヌクレオチドキナーゼを伴うインキュベーションを使用することが典型的である。ＤＮＡ末端を処理する場合、一部の方法はまた、３’末端において、ポリッシングされたＤＮＡの、非プルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼとのインキュベーションにより、平滑末端化されたＤＮＡもアデニル化する。アデニル化は、ＤＮＡの自己ライゲーション及びキメラ産物の形成を防止する一助となる。アデニル化はまた、対応するアダプターの３’末端におけるｄＴの存在のために、アダプター二量体の形成も最小化する。本発明では、これらの問題に、全く異なる方式で取り組む。ＤＮＡ断片の５’末端へとリン酸基を付加するのではなく、本発明の方法では、ＤＮＡ断片の５’末端からのリン酸基の完全な除去を任意で実装する。ＤＮＡ末端の脱リン酸化は、ＤＮＡ断片の、ＤＮＡ末端からリン酸を除去することが可能な酵素とのインキュベーションにより達成する。本開示の方法で、５’リン酸又は３’リン酸を除去するのに有用な酵素の例は、各々が標準的な条件に従い使用される、仔ウシ腸アルカリホスファターゼ、細菌性アルカリホスファターゼ、エビアルカリホスファターゼ、アンタークティックホスファターゼ、及び胎盤アルカリホスファターゼなど、任意のホスファターゼ酵素を含むがこれらに限定されない。
【０１０６】
（ii）ポリッシング
アルカリホスファターゼの除去又は熱によるその不活化の後で、ＤＮＡ基質分子を、任意に、ｄＮＴＰの存在下で、プルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼを伴うインキュベーションにかけて、平滑末端を創出する。反応は、標準的な条件に従い実施する。脱リン酸化及びポリッシングされたＤＮＡ断片は、３’アダプターの結合には基質として良好であるが、ＤＮＡ断片のコンカテマーライゲーション及びキメラ形成には基質として良好でない。脱リン酸化及びポリッシングされたＤＮＡ断片はまた、従来型のアダプターのライゲーションにも基質として良好でない。
【０１０７】
本発明の一部の適用では、ホスファターゼ酵素による５’末端の脱リン酸化を省略しうるが、この場合は、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼなどの酵素の、ＤＮＡポリッシングミックスへの添加が、ＤＮＡのポリッシングの前に、リン酸基の３’末端からの除去を確保するのに好ましい。代替的に、上記で記載した、最初の２つのプレライゲーション反応である、脱リン酸化及びポリッシングは、任意の順序で実行することができ、それらの末端の５’リン酸基を欠く、平滑末端化された二本鎖ＤＮＡを結果としてもたらす。
【０１０８】
（iii）アデニル化
本発明はまた、ＤＮＡポリメラーゼＩの（エキソ）クレノウ断片、及びＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを含むがこれらに限定されない、非鋳型ポリメラーゼ活性を伴うＤＮＡポリメラーゼを使用する、平滑末端ＤＮＡ断片の３’末端のアデニル化の使用も想定する。アルカリホスファターゼ処理及びアデニル化のいずれも、ＤＮＡ断片の自己ライゲーション及びキメラライブラリー分子の形成の傾向を低減する。アデニル化ステップを含む場合、後続のステップで使用される３’アダプターは、単一のＴ突出を要求するであろう。
【０１０９】
ライゲーションステップ：
（１）３’アダプターのライゲーション又はＤＮＡ基質上の一本鎖３’突出の作製
オプションは、図７に描示する。
【０１１０】
オプション１ａ：二本鎖３’アダプターの部分としての、３’遮断されたオリゴヌクレオチド２（図７ａ）
既存のＮＧＳライブラリーの調製プロトコールは、アダプターの３’ＯＨ基と、ＤＮＡ断片の末端における５’リン酸基とのライゲーションに依拠する。この理由で、従来型の方法で使用されるアダプターは、３’ヒドロキシル基及び任意の５’リン酸基を伴う、１つの官能性の二本鎖末端を有することが典型的である（図１及び２を参照されたい）。これに対し、本発明では、３’アダプターの５’リン酸基とＤＮＡ断片の３’ＯＨ基とのライゲーション反応を使用するが、３’アダプターの３’末端とＤＮＡ断片の５’末端との間にニックを残す（図３を参照されたい）。３’アダプターは、５’リン酸基を伴う官能性の二本鎖末端と、このオプションでは、ライゲーションに適さない３’ヌクレオチド（例えば、２’，３’ジデオキシ塩基又は３’デオキシ塩基など、糖修飾された塩基アナログを含む）とを有する。３’アダプターは、２つのオリゴヌクレオチド：５’末端におけるリン酸基及び３’末端における遮断基（Ｃ３スペーサーなど）を有する、オリゴヌクレオチド１と、５’末端におけるリン酸基を欠き、３’末端における非ライゲーション性の塩基を含む、オリゴヌクレオチド２とのアニーリングにより形成する。オリゴヌクレオチド２は加えて、酵素的、化学的又は物理的に破壊されうる修飾塩基及び／又は修飾連結も含む。大半の適用において、基質分子とのライゲーションに関与する３’アダプターの末端は、平滑末端である。ＤＮＡ断片のアデニル化を伴う適用では、３’アダプターのライゲーション性末端は、２’，３’ジデオキシチミジン塩基又は３’デオキシチミジン塩基（又はチミン塩基に対する他の修飾であって、隣接する塩基との共有結合的連結を形成するその能力を遮断する修飾）を含有する３’突出を有する。他の適用では、３’アダプターの官能性末端は、複数の塩基を含有する、３’突出又は５’突出を有しうるであろう。ＤＮＡリガーゼを伴うインキュベーション時には、３’アダプターの５’リン酸を、ＤＮＡ基質分子の３’末端へとライゲーションする一方で、３’アダプターの３’末端とＤＮＡ基質分子の５’末端との間にはニックを残す。反応が完了した後で、ライゲーションされたＤＮＡを、スピンカラムによる精製又はＳＰＲＩビーズベースの精製にかけて、過剰なアダプター及びライゲーション反応の他の成分を除去する。
【０１１１】
オプション１ｂ：二本鎖３’アダプターの部分としての、３’ヒドロキシルオリゴヌクレオチド２（図７ａ）
代替法では、オリゴヌクレオチド２の３’末端における、遮断された、非ライゲーション性塩基を欠く３’アダプターを使用することができる。非遮断オリゴヌクレオチド２の、基質分子へのライゲーションは、やはり、脱リン酸化反応の結果としての、基質分子上の５’リン酸の欠如により防止されるであろう。非遮断オリゴヌクレオチド２を使用する利点は、オリゴヌクレオチド２の３’末端は、ジデオキシヌクレオチドミックスと、ニックトランスレーションによるＤＮＡ合成が可能なＤＮＡポリメラーゼとを使用して一塩基伸長させることができることである。これは、基質分子からの５’塩基の切除を実施する代替法（下記で記載される後続のステップを参照されたい）を可能とする。非遮断３’アダプターを使用する短所は、ライゲーション反応時におけるアダプター二量体の創出であり、これは、アダプター濃度を低減し、結果として、アダプターのライゲーション効率を低下させる可能性がある。このオプションではまた、オリゴヌクレオチド２は加えて、酵素的、化学的又は物理的に破壊されうる修飾塩基及び／又は修飾連結も含む。
【０１１２】
オプション２：一本鎖３’アダプター（図７ａ）
一本鎖アダプターを、二本鎖（又は一本鎖）基質分子へと、共有結合的に結合させることが可能なリガーゼ（ＤＮＡ又はＲＮＡ）の存在下では、オリゴヌクレオチド２を反応から除外することができる。
【０１１３】
オプション３：ホモポリマーの３’アダプター（図７ａ）
末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ：terminal deoxynucleotidyl transferase）などの鋳型非依存性ポリメラーゼ、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ、ポリ（Ｕ）ポリメラーゼ又は３’−エキソヌクレアーゼプルーフリーディング活性を欠くＤＮＡポリメラーゼの存在下で、ヌクレオチドを含むときは、３’アダプター配列として用いられうる、ホモポリマーテール又は他のテールを、基質分子の３’末端に組み込むことができる。
【０１１４】
オプション４：制御されたテール形成及び同時的な３’アダプターのライゲーション（図７ａ）
ＴｄＴなどの鋳型非依存性ポリメラーゼ、ヌクレオチドの存在下で、リガーゼ及びアテニュエーター−アダプター分子をさらに含むときは、合成テールと、規定された３’アダプター配列とを、基質分子の３’末端に組み込むことができる（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１３年３月１３日に出願された、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１３／３１１０４号明細書を参照されたい）。
【０１１５】
オプション５：３’アダプターのライゲーションステップを省略する（図７ｂ）
天然に存在するか、又は先行する酵素的処理又は他の処理から生じる既存の３’突出を、規定された配列又はランダム配列として含む基質分子の場合、別個の３’アダプターのライゲーションステップは、要求されず、省略することができ、この場合、既存の３’突出は、３’アダプターとして用いられうる。
【０１１６】
代替的な実施形態では、亜鉛及び他の反応成分を伴うホスファターゼ酵素を、その完了時において、３’アダプターのライゲーション反応へと添加することができる。３’アダプターのライゲーション後においてホスファターゼ反応を実施することは、ライゲーションされなかった３’アダプター分子に、後続のライゲーションを不可能とする手段であり、これにより、５’アダプターが存在する場合に、後続のステップにおけるアダプター二量体の形成が防止される。
【０１１７】
（２）単一のインキュベーションにおいて施される３つのステップを含む、５’アダプターのライゲーション
（Ｉ）５’アダプターのアニーリング
一本鎖３’アダプターのライゲーション（オプション２）、ホモポリマーの付加（オプション３）又は既存の３’突出の３’アダプターとしての使用（オプション５）の場合は、分解させるか又は置換するオリゴヌクレオチド２が存在しないので、５’アダプターのアニーリングを、他の事項を検討せずに、直接実施することができる。
【０１１８】
二本鎖３’アダプターのライゲーションを使用して、二本鎖ＤＮＡの末端において一本鎖３’突出を創出する場合（上記のオプション１ａ、１ｂ及び４）、それらの各々が、下記で論じられ、図８で描示される、５つの異なるオプション：
ｉ）３’アダプターとアニールさせたオリゴヌクレオチド２の分解後におけるオプション
ii）３’アダプターとアニールさせたオリゴヌクレオチド２に対する競合的置換を介するオプション
iii）５’アダプターを、オリゴヌクレオチド１上の、オリゴヌクレオチド２のアニーリング部位と比べてさらに３’側でアニールさせた後における、ニックトランスレーション及びオリゴヌクレオチド２の分解を介するオプション
iv）５’アダプターを、３’アダプターのオリゴヌクレオチド１の３’領域とあらかじめアニールさせた後における、ニックトランスレーション及びオリゴヌクレオチド２の分解を介するオプション
v）３’遮断基を伴う５’アダプターを、３’アダプターのオリゴヌクレオチド１（オリゴヌクレオチド２の代わりに）の５’領域とあらかじめアニールさせた後における、３’遮断基の酵素的切除を介するオプション
のうちのいずれかを使用して、５’アダプターを、３’アダプターへとアニールさせることができる。
【０１１９】
オプションｉ：
３’アダプターのオリゴヌクレオチド２は加えて、酵素的、化学的又は物理的に破壊されうる修飾塩基及び／又は修飾連結も含む。修飾は、ｄＵ塩基、デオキシイノシン及びＲＮＡ塩基を含むがこれらに限定されない。一本鎖５’アダプターの、３’アダプターのオリゴヌクレオチド１の５’部分とのアニーリングは、３’アダプター、具体的には、オリゴヌクレオチド２の部分的分解の結果としてなされる。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド２の分解を、酵素的に、より具体的には、第２のオリゴヌクレオチドが、デオキシウラシル塩基を含有する場合は、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）、若しくはＵＤＧと非プリン性／非ピリミジン性エンドヌクレアーゼとの組合せを使用することにより、又は第２のオリゴヌクレオチドが、デオキシイノシン塩基を含有する場合は、エンドヌクレアーゼＶにより達成する。オリゴヌクレオチド２の分解はまた、第２のオリゴヌクレオチドがＲＮＡ塩基を含有する場合は、ＲＮアーゼ  Ｈ１又はＲＮアーゼ  Ｈ２を伴うインキュベーションによっても実施することができる。一部の適用では、第２のオリゴヌクレオチドの分解は、化学的又は物理的に、例えば、光によりなされうる。
【０１２０】
オプションii：
一部の適用では、５’アダプターの、３’アダプターのオリゴヌクレオチド１とのアニーリングは、オリゴヌクレオチド２の分解を伴わずに行う。この場合、オリゴヌクレオチド２の、一本鎖５’アダプターによる置き換えは、５’アダプターの、オリゴヌクレオチド２のアフィニティーを上回る高アフィニティーであって、オリゴヌクレオチド１と５’アダプター配列との相補性の増大に起因するか、又はその溶融温度を増大させる５’アダプター内の塩基修飾（例えば、ＬＮＡ塩基）に起因する高アフィニティーにより容易とすることができる。５’アダプターの設計に応じて、３’アダプターのオリゴヌクレオチド１とのアニーリングは、５’アダプターの３’末端とＤＮＡ基質分子の５’末端との間のニック若しくはギャップ、又は５’アダプター及びＤＮＡ基質分子のそれぞれの、３’塩基と５’塩基との重複を結果としてもたらす。
【０１２１】
オプションiii：
この場合は、オリゴヌクレオチド２の分解性修飾も、競合的置換も使用しない。そうではなく、５’アダプターは、オリゴヌクレオチド１上の、オリゴヌクレオチド２のアニーリング部位と比べてさらに３’側で、３’アダプターとアニールした後における、限定的ニックトランスレーションによる「チューイングフォワード」により、オリゴヌクレオチド２を置き換え、この結果として、オリゴヌクレオチド２の分解又は部分的分解をもたらす。
【０１２２】
オプションiv及びｖ：
これらの場合、５’アダプターは、３’アダプターの部分を構成し、３’アダプターの、ＤＮＡ基質へのライゲーション時に存在する。オプションivでは、５’アダプターは、オリゴヌクレオチド１上の、オリゴヌクレオチド２のアニーリング部位と比べてさらに３’側で、あらかじめ３’アダプターとアニールさせる（オプションiiiと同様）。オプションｖでは、５’アダプターを、３’末端に遮断基を有し、オリゴヌクレオチド２の代わりに、３’アダプターとあらかじめアニールさせる。３’アダプターのライゲーションの後で、５’アダプターの３’末端における遮断基を酵素的に除去して、ＤＮＡポリメラーゼによるその伸長を可能とする。
【０１２３】
（II）５’リン酸の露出を結果としてもたらす、基質分子からの５’塩基の除去
このステップでは、ライゲーション適合性である５’末端のリン酸基の、基質分子上における創出は、ＤＮＡポリメラーゼ及びヌクレオチドを使用する、５’アダプターのオリゴヌクレオチドのニックトランスレーション（オプションｉ）を介するか、ヌクレオチドの非存在下において、５’アダプター及び５’−ｆｌａｐエンドヌクレアーゼを使用する置換−切断反応（オプションii）を介するか、又はオリゴヌクレオチド２からの単一のジデオキシ塩基の伸長に続く、ヌクレオチドの非存在下において、５’−ｆｌａｐエンドヌクレアーゼを使用する、置換−切断（オプションiii）を介する、ＤＮＡ基質分子の損傷を受けた５’末端塩基の除去により達成する。第３のオプションでは、５’アダプターの代わりにアニールさせたオリゴヌクレオチド２を使用して実施するため、基質分子の５’塩基の切除は、５’アダプターのアニーリングの前に行うが、方法についての記載を単純化するために、本節に組み入れる（図９を参照されたい）。
【０１２４】
オプションｉ：
ニックトランスレーションによるＤＮＡ合成は、５’アダプターの３’末端オリゴヌクレオチドと、ＤＮＡ基質分子の５’末端との間のニック又はギャップにおいて開始され、ライゲーション反応によりニックがシールされたときに停止される（図４及び６ａを参照されたい）。ニックトランスレーション反応は、ＤＮＡポリメラーゼＩ（ホロ酵素）、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、及びＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（ホロ酵素）などのＤＮＡポリメラーゼによるがこれらに限定されないＤＮＡポリメラーゼにより実施することができる。使用のために想定されるさらなる酵素は、限定なしに述べると、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を伴うＤＮＡポリメラーゼ、５’ｆｌａｐエンドヌクレアーゼ、及び鎖置換ポリメラーゼと５’ｆｌａｐエンドヌクレアーゼとの組合せを含む。
【０１２５】
このステップに想定される反応条件は、（ｉ）内因性５’エキソヌクレアーゼ活性を伴うポリメラーゼ及びリガーゼの両方が活性であるか；（ii）鎖置換ポリメラーゼ及びｆｌａｐエンドヌクレアーゼ及びリガーゼが活性であるか；（iii）ｆｌａｐエンドヌクレアーゼ及びリガーゼが活性であるか、（iv）熱安定性酵素及び熱不安定性酵素の両方の同時的な活性が生じるか；又は（v）熱安定性酵素だけ又は熱不安定性酵素だけの活性が生じうる反応条件を含む。一部の実施形態では、条件（ｉ）及び（ii）は各々、ニックトランスレーションのためのｄＮＴＰを伴って実施する。具体的な実施形態では、Ｔａｑポリメラーゼ及び大腸菌リガーゼを、４０℃の反応温度で使用する。しかし、多様な実施形態では、１０℃〜７５℃の反応温度の範囲が想定される。
【０１２６】
ニックトランスレーション反応は、５’アダプターの伸長産物とＤＮＡ基質分子との間でなされるライゲーション反応の前における、ＤＮＡ基質分子の５’末端からの、１、２又は３以上の塩基の除去を結果としてもたらす。ニックトランスレーションによる合成は、４つのヌクレオチドであるｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＡＴＰの全て、又はこれらの限定的な組合せの存在下で行うことができる。限定的な組合せは、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＡＴＰ、若しくはｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ、若しくはｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ及びｄＴＴＰ、若しくはｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ及びｄＴＴＰなど、３ヌクレオチドの組合せ、ｄＧＴＰ及びｄＣＴＰ、若しくはｄＧＴＰ及びｄＡＴＰ、若しくはｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ、若しくはｄＣＴＰ及びｄＡＴＰ、若しくはｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ、若しくはｄＡＴＰ及びｄＴＴＰなど、２ヌクレオチドの組合せ、又はｄＧＴＰ、若しくはｄＣＴＰ、若しくはｄＡＴＰ、若しくはｄＴＴＰなど、ただ１つのヌクレオチドを含むがこれらに限定されない。
【０１２７】
オプションii：
置換−切断反応は、ｄＮＴＰを要求しないが、５’アダプター配列が、基質分子との重複を創出するように、３’末端に、１、２又は３以上のランダム塩基を含むことを要求し、反応物中に、複数の５’アダプターを含む（図５及び６ｂを参照されたい）。置換−切断反応は、５’アダプターのアニーリング、５’アダプターの３’塩基と重複する、ＤＮＡ基質分子の５’ＤＮＡ塩基の置換、置換された塩基の５’−ｆｌａｐエンドヌクレアーゼによる切断により誘発される。一部の実施形態では、５’アダプターは、３’末端に、１つのランダム塩基ｄＮを有する。この場合、重複は、１つの塩基を伴い、ＤＮＡ基質分子の５’末端から単一の５’塩基だけを除去し、５’アダプター配列に由来する類似の塩基で置き換える。置換−切断反応の効率は、その末端の３’塩基が、ＤＮＡ基質分子の５’塩基とミスマッチする場合、５’アダプターを解離させ、再アニールさせるように、反応のサイクリング温度を４０℃〜６５℃の間とすることにより増大させる。
【０１２８】
オプションiii：
基質分子の５’塩基の切除に関与する５’アダプターに対する代替的実施形態は、代わりに、先行するステップで、３’アダプターのオリゴヌクレオチド２を、基質分子の５’塩基の切除に関与させる（図９を参照されたい）。
【０１２９】
１つの手法（図９ａ及びｃ）では、３’アダプターのオリゴヌクレオチド２は、伸長性３’末端を含み、適切な条件下にある、ジデオキシヌクレオチド混合物及びポリメラーゼの存在下で、単一のジデオキシ塩基付加を行い、これにより、基質分子の５’末端との一塩基重複をもたらし、これにより、適切なｆｌａｐエンドヌクレアーゼ又は５’ｆｌａｐエンドヌクレアーゼ活性を保有するポリメラーゼを介する、単一の塩基の置換−切断を誘導する。続いて、その３’末端にランダムｄＮ塩基を伴う５’アダプターを使用する（図９ａ）が、この場合、二本鎖ＤＮＡの末端へと結合させた３’アダプターへの結合の後で、ニックが形成される。ニックは、ＤＮＡリガーゼによりシールすることができ、この結果として、５’アダプターの、ＤＮＡ基質分子の５’末端への共有結合的結合がもたらされる。
【０１３０】
代替的に、その３’末端におけるランダムｄＮ塩基を欠く、５’アダプターのオリゴヌクレオチドであって、二本鎖ＤＮＡ基質分子の末端へと結合させた３’アダプターへの結合の後で、一塩基ギャップを形成する、５’アダプターのオリゴヌクレオチドも使用することができる。（図９ｃ）。ギャップは、鎖置換活性を欠くＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ又はＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ）により充填して、ニックを創出することができ、ニックは、ＤＮＡリガーゼによりシールすることができ、この結果として、５’アダプターの、ＤＮＡ基質分子の５’末端への共有結合的結合がもたらされる。
【０１３１】
別の代替法では（図９ｂ及びｄを参照されたい）、遮断３’末端を含むオリゴヌクレオチド２は、５’ｆｌａｐエンドヌクレアーゼ活性を伴うＤＮＡポリメラーゼを介して、単一のジデオキシ塩基により伸長するプライマーオリゴヌクレオチドにより部分的に分解又は置換され、その結果として、ＤＮＡの５’末端からの一塩基の切除がもたらされる。プライマーオリゴヌクレオチドは、その３’末端にランダムｄＮ塩基を伴う５’アダプターにより分解又は置換されて、ニックを創出し、ニックは、ＤＮＡリガーゼによりシールすることができる。
【０１３２】
（III）５’アダプターのライゲーション
５’アダプターの、基質分子への共有結合的結合は、５’アダプター又はその伸長産物と、基質分子の露出させた５’リン酸とのライゲーションを伴う。ＤＮＡ基質分子の５’塩基の切除を、ニックトランスレーション反応により達成する場合は、ライゲーション反応により、ポリメラーゼにより伸長させる５’アダプターと、切除されるＤＮＡ基質分子の５’末端との間のニックをシールする。ＤＮＡ基質分子の５’塩基の切除を、置換−切断反応を介して達成する場合は、ライゲーションを、元の５’アダプターのオリゴヌクレオチドと、切除されるＤＮＡ基質分子の５’末端との間で行う。多様な実施形態では、このステップにおけるライゲーション反応に関する標準的な条件は、ＤＮＡ内のニック又はギャップをシールすることが可能な、任意のＤＮＡリガーゼの使用を含む。一実施形態では、リガーゼは、大腸菌ＤＮＡリガーゼであり、反応は、１０℃〜５０℃の間の温度間隔で行う。一部の実施形態では、リガーゼは、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ、又はAmplリガーゼなどの熱安定性ＤＮＡリガーゼであり、反応は、３０℃〜７５℃の間の温度間隔で行う。
【０１３３】
本発明の多様な態様では、５’アダプターのライゲーションステップのうちの３つのステップである、（Ｉ）、（II）及び（III）は、単一のインキュベーションにおいて、３’アダプター処理された基質ＤＮＡを、（ｉ）任意の分解用エンドヌクレアーゼ（例えば、ＵＤＧ、エンドヌクレアーゼＶ、ＲＮアーゼ  Ｈ、又はこれらの組合せ）；（ii）ニックトランスレーション用ＤＮＡポリメラーゼ又は５’−ｆｌａｐエンドヌクレアーゼ；及び（iii）ＤＮＡリガーゼと混合し、インキュベートすることにより、同時に実施する（図６を参照されたい）。インキュベーションは、一定の温度で、又は１０℃〜７５℃の間隔の温度サイクリング条件を使用して実行する。他の適用では、３’アダプターの部分的分解を、下流における反応とは別個に実施する。
【０１３４】
ＮＧＳライブラリーの構築
Illumina社製ＮＧＳライブラリーの合成は、開示される方法を使用して実施することができる。図１０で示されるとおり、Illumina社製ライブラリーは、ニックトランスレーションライゲーション法（左側）又は置換−切断ライゲーション法（右側）を使用して構築することができる。２つのIllumina社製アダプターの結合の順序は、柔軟であり、図１０ａでは、Illumina社製アダプターＰ７が、３’アダプターであり、Illumina社製アダプターＰ５が、５’アダプターであるのに対し、図１０ｂでは、Illumina社製アダプターＰ５は、３’アダプターであり、Illumina社製アダプターＰ７は、５’アダプターである。図１０で描示されるライブラリーは、ＰＣＲを伴わずに構築することもでき、インプット基質ＤＮＡの量に応じて、ＰＣＲ増幅することもできる。代替的に、Illumina社製ＮＧＳライブラリーの合成は、開示される方法であって、短縮アダプター配列を使用するため、ＰＣＲ増幅を要求する方法を使用して実施することもできる（図１１を参照されたい）。この場合は、Ｐ５又はＰ７を、短縮アダプターとして導入する（Ｐ７だけを示す）が、全長アダプター配列を導入するほか、その５’末端に分解性塩基も含む、ＰＣＲプライマーを使用する増幅の後であり、結果として得られるアンプリコンの５’部分の分解後において、アニーリング及びライゲーションにより、Ｐ７又はＰ５を導入することができる。代替的に、短縮分解性プライマーをＰＣＲ増幅に使用する場合は、アダプターの残余部分の架橋ライゲーションを実施して、全長配列を完成させることができる。
【０１３５】
開示される方法を使用して、様々なシークエンシングプラットフォームのためのＮＧＳライブラリーを構築することができるが、別の例を、Ion Torrent社製ライブラリーの構築が描示される、図１２及び１３に提示する。図１２で示されるとおり、Ｐ１アダプター上のアダプター配列Ａの部分的複製をインサート接合部位に導入することにより、３’アダプターのライゲーション後における、後続の５’アダプターのアニーリングを行うことができる。ライゲーションの順序は柔軟であり、アダプターＡの部分的複製を伴うアダプターＰ１を、３’アダプターとして導入した後で、ニックトランスレーション又は置換−切断を使用して、５’アダプターとしてのアダプターＡのライゲーションを行うことができる（図１２ａ）。代替的に、アダプターＡを、３’アダプターとして導入し、アダプターＡの部分的複製を伴うアダプターＰ１を、５’アダプターとすることもできる（図１２ｂ）。Ion Torrent社製のシークエンシングは、Ｐ１アダプター上のアダプターＡの部分的複製の長さのために、アダプターＡからの単一のリードとして実施されるので、シークエンシングプライマーのアニーリング又は他のアダプター機能には干渉しない。
【０１３６】
代替的に、図１３では、開示される方法を使用して、コンビナトリアルバーコード処理を、Ion Torrent社製ライブラリーへと導入することができる。３’アダプターのライゲーションステップでは、二重コンビナトリアルバーコードのうちの第１の部分を、２０のバーコード全てに共通なリンカー領域Ｌに隣接して導入する。ＤＮＡ基質へとライゲーションされない３’遮断鎖の分解後に、５’アダプターを、共通のリンカー領域Ｌとアニールさせ、これにより、二重バーコードの第２の部分を、リンカー領域Ｌの５’側に隣接して組み込む。ニックトランスレーションライゲーションの後、結果として得られるライブラリーは、標準的なIon Torrent社製ＰＣＲプライマーにより増幅することができ、ライブラリー分子を、アダプターＡ側からシークエンシングする場合、各Ionスフェアによる試料の同定は、リードの開始部分において読み取られ、９６の可能な組合せを達成することができる。
【０１３７】
標的を選択したＮＧＳライブラリーのための適用
開示される方法を使用して、全ゲノムシークエンシングと比べて、複雑性及びシークエンシング要件を低減する方策として、特異的標的を選択及び濃縮しうる、ＮＧＳライブラリーを構築することができる。このような適用の例は、３’アダプター及び５’アダプターの、ランダムに断片化し、変性させ、プライマーにより伸長させたＤＮＡ基質への結合であって、１又は複数のプライマーを、公知のターゲティングされるＤＮＡ領域とアニールさせる結合であろう。この場合、ターゲティングされる遺伝子座だけが二本鎖末端を含み、選択されない遺伝子座は一本鎖のままであり、それらの末端におけるアダプターのライゲーションは生じないであろう。
【０１３８】
他の適用では、本発明の５’アダプターを使用して、末端配列が公知であるＤＮＡ断片の小画分を選択及び濃縮することができる。あらかじめ選択されたＤＮＡ配列は、１、２、３又は４以上の末端ＤＮＡ塩基を含有するであろう。このような選択を達成するには、５’アダプター配列が、選択された侵入塩基又は３’末端における塩基の組合せを含有するものとする。結果として、選択された末端配列を伴うＤＮＡ断片だけを、５’アダプターへとライゲーションし、増幅する。図１４で示されるとおり、３’末端が、選択された制限断片の末端配列と相補的な、５’アダプターを使用して、制限断片標的を複数の制限断片から選択することができる。別の実施形態では、ＣｐＧジヌクレオチドを含む３’末端を伴う５’アダプターの使用により、ＣｐＧアイランドに由来する断片について濃縮する。
【０１３９】
代替的に、標的の選択は、本明細書で開示される方法を使用するライブラリー構築の後で実施することもできる（図１５を参照されたい）。１つのアダプターが、その５’末端に分解性塩基を含む、このようなライブラリーを構築する場合、標的特異的プライマーの伸長及びアダプターの分解性部分の部分的消化の後で、ビオチニル化５’アダプターを、結果として得られる３’突出とアニールさせることができ、ニックトランスレーションライゲーション（図１５ａ）又は置換−切断ライゲーション（図１５ｂ）を使用して、ビオチニル化５’アダプターを、ターゲティングされるＤＮＡ基質だけと共有結合的に結合させ、その後、ストレプトアビジン磁気ビーズを使用して捕捉し、次いで、ＰＣＲ増幅して、シークエンシングのために十分な材料を作製することができる。
【０１４０】
代替的なアダプターの設計及び適用
また、開示される方法を使用する、複数の代替的なアダプターの設計及びライゲーション法も提示される。図１６では、アダプター配列対の代わりに、単一のアダプター配列を使用して、ライブラリーを構築する。この例では、ライゲーションの前の基質の処理、並びに３’アダプターのライゲーション及び５’アダプターのニックトランスレーションライゲーション又は置換−切断ライゲーションの両方のために、同じステップを使用し、結果として得られるライブラリーを、単一のプライマーを使用してＰＣＲ増幅することができる。
【０１４１】
図１７では、単一のオリゴヌクレオチドによるヘアピンアダプターのライゲーションのための方法であって、ヘアピンアダプターの５’末端を使用して、３’アダプターの、基質分子へのライゲーションを実施し、ヘアピンアダプターの遮断３’末端の分解後において、ヘアピンアダプターの短縮３’末端を、基質分子の露出させた５’リン酸へのニックトランスレーションライゲーションのために使用する方法を提示する。
【０１４２】
場合によって、メイトペアＮＧＳライブラリーの構築のための中間体構造など、環状ＤＮＡライブラリーを作製することも有用である。図１８で示されるとおり、本開示の方法を使用して、このようなライブラリーを構築することができる。第１のステップでは、３’アダプターのライゲーションを、相互に相補的なアダプターであるＸとＸ’とを使用して実施する。ライゲーションされなかった鎖の分解の後、各基質分子上の３’突出であるＸとＸ’との相補性により、ＤＮＡの非共有結合的環状化を行うことができる。単一分子のアニーリングに好適とし、コンカテマー形成を低減するため、このアニーリング反応は、適切な程度の低ＤＮＡ濃度で実施する。３’突出のアニーリング後、ニックトランスレーションライゲーションを実施することができる。
【０１４３】
酵素
本開示の方法を実施するのに、標準的な反応条件に従い使用されうるリガーゼは、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ、Ｔ３  ＤＮＡリガーゼ又はＴ７  ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ、Ａｍｐリガーゼ、大腸菌ＤＮＡリガーゼ及び大腸菌ＲＮＡリガーゼを含むがこれらに限定されない。多様な実施形態では、本開示は、平滑末端又は粘着（「スティッキー」）末端のライゲーションに適切な反応条件を想定する。一部の実施形態では、粘着末端は、５’突出又は３’突出を含む。
【０１４４】
本開示の方法で、５’リン酸又は３’リン酸を除去するのに有用な酵素の例は、各々が標準的な条件に従い使用される、仔ウシ腸アルカリホスファターゼ、細菌性アルカリホスファターゼ、エビアルカリホスファターゼ、アンタークティックホスファターゼ、及び胎盤アルカリホスファターゼなど、任意のホスファターゼ酵素を含むがこれらに限定されない。加えて、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼのホスファターゼ活性を使用して、３’リン酸基を除去することができる。
【０１４５】
本発明の実施において有用なポリメラーゼ酵素は、ＤＮＡポリメラーゼ（熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを含みうる）、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩ及び逆転写酵素を含むがこれらに限定されない。本発明を実施するのに使用されうる酵素の非限定的な例は、KAPA HiFi及びKAPA HiFi Uracil+、VeraSeq Ultra DNA Polymerase、VeraSeq 2.0 High Fidelity DNA Polymerase、タカラバイオ株式会社製PrimeSTAR DNA Polymerase、Agilent社製Pfu Turbo CX Polymerase、Phusion U DNA Polymerase、Deep VentR（商標）DNA Polymerase、LongAmp（商標）Taq DNA Polymerase、Phusion（商標）High-Fidelity DNA Polymerase、Phusion（商標）Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase、Kapa High-Fidelity DNA Polymerase、Q5 High-Fidelity DNA Polymerase、Platinum Pfx High-Fidelity Polymerase、Pfu High-Fidelity DNA Polymerase、Pfu Ultra High-Fidelity DNA Polymerase、KOD High-Fidelity DNA Polymerase、iProof High-Fidelity Polymerase、High-Fidelity 2 DNA Polymerase、Velocity High-Fidelity DNA Polymerase、ProofStart High-Fidelity DNA Polymerase、Tigo High-Fidelity DNA Polymerase、Accuzyme High-Fidelity DNA Polymerase、VentR（登録商標）DNA Polymerase、DyNAzyme（商標）II Hot Start DNA Polymerase、Phire（商標）Hot Start DNA Polymerase、Phusion（商標）Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase、Crimson LongAmp（商標）Taq DNA Polymerase、DyNAzyme（商標）EXT DNA Polymerase、LongAmp（商標）Taq DNA Polymerase、Phusion（商標）High-Fidelity DNA Polymerase、Taq DNA Polymerase with Standard Taq（Mg-free）Buffer、Taq DNA Polymerase with Standard Taq Buffer、Taq DNA Polymerase with ThermoPol II（Mg-free）Buffer、Taq DNA Polymerase with ThermoPol Buffer、Crimson Taq（商標）DNA Polymerase、Crimson Taq（商標）DNA Polymerase with（Mg-free）Buffer、Phire（商標）Hot Start DNA Polymerase、VentR（登録商標）(exo) DNA Polymerase、Hemo KlenTaq（商標）、Deep VentR（商標）(exo) DNA Polymerase、Deep VentR（商標）DNA Polymerase、DyNAzyme（商標）EXT DNA Polymerase、Hemo KlenTaq（商標）、LongAmp（商標）Taq DNA Polymerase、ProtoScript（登録商標）AMV First Strand cDNA Synthesis Kit、ProtoScript（登録商標）M-MuLV First Strand cDNA Synthesis Kit、Bst DNA Polymerase, Full Length、Bst DNA Polymerase, Large Fragment、9°Nm DNA Polymerase、DyNAzyme（商標）II Hot Start DNA Polymerase、Hemo KlenTaq（商標）、Sulfolobus DNA Polymerase IV、Therminator（商標）γ DNA Polymerase、Therminator（商標）DNA Polymerase、Therminator（商標）II DNA Polymerase、Therminator（商標）III DNA Polymerase、Bsu DNA Polymerase, Large Fragment、DNA Polymerase I (E. coli)、DNA Polymerase I, Large (Klenow) Fragment、Klenow Fragment (3’→5’ exo)、phi29 DNA Polymerase、T4 DNA Polymerase、T7 DNA Polymerase (unmodified)、Terminal Transferase、Reverse Transcriptase及びRNA Polymerase、E. coli Poly(A) Polymerase、AMV Reverse Transcriptase、M-MuLV Reverse Transcriptase、phi6 RNA Polymerase (RdRP)、Poly(U) Polymerase、SP6 RNA Polymerase、並びにT7 RNA Polymeraseを含むがこれらに限定されない。
【０１４６】
本開示において有用な、ｆｌａｐエンドヌクレアーゼ活性を保有する酵素は、ｆｌａｐエンドヌクレアーゼ１（ＦＥＮ１：flap endonuclease 1）、Ｔ５エキソヌクレアーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩ及びこれらの誘導体を含むがこれらに限定されない。
［実施例］
【実施例１】
【０１４７】
ＦＡＭ標識オリゴヌクレオチドを伴う、従来型のアダプターのライゲーションの、３’アダプターのライゲーションとの比較
根拠：ＦＡＭ標識オリゴヌクレオチド系を使用して、フィルインアダプター（図２Ａ）又は３’アダプター（図３）を使用する平滑ライゲーションについて、基質の、アダプターに対する、異なるモル比で調べて、ライゲーション効率及びキメラ形成に対する効果について検討した。
【０１４８】
材料：
・オリゴヌクレオチド１２−９００及び１３−４２６（表１）を含有するフィルインアダプター
・３’アダプター；第１のオリゴヌクレオチド１３−３４０（表１）
・３’アダプター；第２のオリゴヌクレオチドオプション１（３’末端に３’デオキシチミジン遮断塩基を伴う）１３−５５９（表１）
・３’アダプター；第２のオリゴヌクレオチドオプション２（３’末端にリン酸基を伴う）１３−５５８（表１）
・ＦＡＭ基が基質の５’リン酸へのライゲーションを標識する、オリゴヌクレオチド１３−５６２及び１３−５６３から構成されるＦＡＭ基質Ａ（表１）
・ＦＡＭ基が基質の３’ＯＨへのライゲーションを標識し、基質の対応する５’末端がリン酸を有する、オリゴヌクレオチド１３−５６１及び１３−５６４から構成されるＦＡＭ基質Ｂ（表１）
・ＦＡＭ基が基質の３’ＯＨへのライゲーションを標識し、基質の対応する５’末端がリン酸を欠く、オリゴヌクレオチド１３−５６０及び１３−５６４から構成されるＦＡＭ基質Ｃ（表１）
・T4 DNA Ligase (Rapid)（Enzymatics社製；型番L6030-HC-L）
・１０倍濃度のT4 DNA Ligase Buffer（Enzymatics社製；型番B6030）
【０１４９】
方法：
従来型アダプターのライゲーション反応物を、１倍濃度のＴ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液、１０ピコモルのＦＡＭ基質Ａ、２０若しくは２００ピコモルのフィルインアダプター、６００ｕｎｉｔのT4 DNA Ligase (Rapid)を含むか、又はリガーゼを含まない、１０μｌの総容量中に集成した。
【０１５０】
３’アダプターのライゲーション反応物を、１倍濃度のＴ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液、１０ピコモルのＦＡＭ基質Ｂ又は１０ピコモルのＦＡＭ基質Ｃ、２０若しくは２００ピコモルの３’アダプターオプション１又は２０若しくは２００ピコモルの３’アダプターオプション２及び６００ｕｎｉｔのT4 DNA Ligase (Rapid)を含有するか、又はＴ４  ＤＮＡリガーゼを含有しない、１０μｌの総容量中に集成した。
【０１５１】
全てのライゲーション反応は、２５℃で３０分間にわたり実施した。ライゲーション反応物の総容量（１０μｌ）を、２倍濃度のホルムアミドローディングバッファー（９７％のホルムアミド、１０ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１％のブロモフェノールブルー及び０．０１％のキシレンシアノール）１０μｌと混合し、９５℃で５分間にわたり加熱し、その後、６５℃のオーブン内の、ＴＢＥ−尿素プレキャスト１５％ポリアクリルアミドゲル（Invitrogen社製；型番S11494）上で泳動させ、Dark readerライトボックス（Clare Chemical Research社製）上で可視化させ、デジタルカメラを使用して撮影した。その後、ゲルを、SYBR（登録商標）Gold核酸ゲル染色色素（Invitrogen社製；型番S11494）で染色した（図示しない）。
【０１５２】
結果：
ＦＡＭ基質Ａは、フィルインアダプター及びＴ４  ＤＮＡリガーゼの存在下で、ライゲーション産物へと転換された（図１９、レーン１〜２）。この従来型のアダプターのライゲーションは、使用するアダプターの、基質に対する比が２：１に過ぎない場合（図１９、レーン１）、比を２０：１とする場合（レーン２）と比較して、ある程度のＦＡＭ基質Ａによるキメラ形成を示した。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼの非存在下では、ライゲーション産物が観察されなかった（図１９、レーン３）。
【０１５３】
３’アダプターのライゲーションの異なる状況について、レーン４〜１２において調べた（図１９）。レーン４及び５は、ＦＡＭ基質Ｂと、３’アダプターオプション１とのライゲーション反応を示す。アダプターの、基質に対する比を、２：１（レーン４）又は２０：１（レーン５）としたところ、３’アダプターを伴う場合もあり、伴わない場合もある、高分子量のキメラ産物が形成された。しかし、ライゲーション産物は、アダプターの、基質に対する比を、２０：１としたときにより豊富であり、その形成に好適であった（レーン５）。レーン６及び７は、ＦＡＭ基質Ｃと、３’アダプターオプション１とのライゲーション反応を示す。反応には、アダプターの、基質に対する比を、２０：１としたときが好適であり（レーン７）、キメラ産物は観察されなかった。レーン８及び９は、ＦＡＭ基質Ｂと、３’アダプターオプション２とのライゲーション反応を示す。ライゲーション産物は、観察されなかったが、キメラ産物は検出された。レーン１０及び１１は、ＦＡＭ基質Ｃと、３’アダプターオプション２とのライゲーション反応を示す。ライゲーション産物は、観察されなかった。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼの非存在下では、ライゲーション産物が観察されなかった（レーン１２）。
【０１５４】
結論：
従来型アダプターのライゲーションは、ＦＡＭ基質上の５’リン酸を要求し、これは、フィルインアダプターが過剰に存在しない場合、キメラの形成をもたらした。ＦＡＭ基質が、５’ヒドロキシ基を有し、３’アダプターの３’デオキシチミジン塩基が遮断されている場合（オプション１）であって、アダプター分子間のライゲーションが防止され、基質とアダプターとの間のライゲーションに好適である場合、３’アダプターのライゲーションは、より効率的であり、キメラも少なかった。いずれの場合にも、アダプターの、基質に対する、２０：１の比は、ライゲーション産物の形成に好適であった。
【実施例２】
【０１５５】
せん断され、サイズ選択された、ゲノムＤＮＡを伴う、従来型のアダプターのライゲーションの、３’アダプターのライゲーションとの比較
根拠
この実験は、物理的にせん断されたゲノムＤＮＡのポリッシングの、従来型のアダプターのライゲーション又は３’アダプターのライゲーションの効率に対する効果について調べるのに実施した。
【０１５６】
材料：
・オリゴヌクレオチド１３−４８９及び１３−４２６（表１）を含有するフィルインアダプター
・３’アダプター；第１のオリゴヌクレオチド１３−３４０（表１）及び第２のオリゴヌクレオチドオプション１（３’末端に３’デオキシチミジン遮断塩基を含有する）１３−５５９（表１）
・NEBuffer 2（New England Biolabs社製；型番B7002S）
・ＰＣＲグレードの１００ｍＭ  ２’デオキシヌクレオシド５’三リン酸（ｄＮＴＰ：2'-deoxynucleoside 5'-triphosphate）セット（Invitrogen（Life technologies）社製；型番10297-018）
・アデノシン５’三リン酸（ＡＴＰ：Adenosine 5'-Triphosphate）（New England Biolabs社製；型番P0756S）
・DNA Polymerase I, Large (Klenow) Fragment（New England Biolabs社製；型番M0210S）
・Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ（New England Biolabs社製；型番M0203S）
・Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（New England Biolabs社製；型番M0201S）
・エキソヌクレアーゼIII（大腸菌）（New England Biolabs社製；型番M0293S）
・アンタークティックホスファターゼ（New England Biolabs社製；型番M0289S）
・アンタークティックホスファターゼ反応緩衝液（New England Biolabs社製；型番B0289S）
・T4 DNA Ligase (Rapid)（Enzymatics社製；型番L6030-HC-L）
・１０倍濃度のT4 DNA Ligase Buffer（Enzymatics社製；型番B6030）
・大腸菌ゲノムＤＮＡ  ＡＴＣＣ  １１３０３株（Affymetrix社製；型番14380）
・M220 Focused-ultrasonicator（Covaris社製；型番PN 500295）
・Pippin Prep（Sage Science社製）
・CDF2010 2% agarose, dye free w/ internal standards（Sage Science社製）
・DNA Clean & Concentrator-5（Zymo research社製；型番D4004）
・２５ｂｐラダーＤＮＡサイズマーカー（Invitrogen（Life technologies）社製；型
番10488-022）
【０１５７】
方法：
大腸菌ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ：genomic DNA）を、ＤＮＡ懸濁緩衝液（Teknova社製；型番T0227）中に、１００ｎｇ／ｕｌの濃度で再懸濁させた。ＤＮＡを、M220 Focused-ultrasonicatorにより、１５０塩基対の平均サイズへと断片化した。その後、Pippin Prepを使用して、約１５０ｂｐ〜約１８５ｂｐの緊密なサイズ分布の断片化ＤＮＡを、２％のアガロースゲル上で単離した。
【０１５８】
２００ｎｇのサイズ選択されたＤＮＡを、異なる酵素の活性下に置いた。反応物を、１倍濃度のNEBuffer 2、１００μＭずつの各ｄＮＴＰ、３ｕｎｉｔのＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ又は５ｕｎｉｔのDNA Polymerase I, Large (Klenow) Fragment又は３ｕｎｉｔのＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ及び５ｕｎｉｔのDNA Polymerase I, Large (Klenow) Fragment又は３ｕｎｉｔのＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ及び５ｕｎｉｔのDNA Polymerase I, Large (Klenow) Fragment及び１ｕｎｉｔのエキソヌクレアーゼIIIの最終濃度を含む、３０μｌの総容量中に集成した。別の反応物を、１倍濃度のNEBuffer 2、１ｍＭのＡＴＰ、１０ｕｎｉｔのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼの最終濃度を含む、３０μｌの総容量中に集成した。別の反応物を、１倍濃度のアンタークティックホスファターゼ反応緩衝液及び５ｕｎｉｔのアンタークティックホスファターゼの最終濃度を含む、３０μｌの総容量中に集成した。対照反応物を、１倍濃度のNEBuffer 2を伴う、２００ｎｇのサイズ選択されたＤＮＡと共に集成した。全ての反応物を、３７℃で３０分間にわたりインキュベートし、DNA Clean & Concentrator-5カラムを使用して、ＤＮＡを精製した。ＤＮＡを、３０μｌのＤＮＡ懸濁緩衝液中に溶出させ、後続の従来型のアダプターのライゲーション又は３’アダプターのライゲーションのための、１５μｌずつの２つのチューブへと分けた。従来型のアダプターのライゲーション反応物を、１倍濃度のＴ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液、オリゴヌクレオチド１３−４８９（２２０ピコモル）及び１３−４２６（４４０ピコモル）を含有するフィルインアダプター、及び１２００ｕｎｉｔのT4 DNA Ligase (Rapid)を含む、３０μｌの総容量中に集成した。３’アダプターのライゲーション反応物を、１倍濃度のＴ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液、２２０ピコモルの３’アダプターの第１のオリゴヌクレオチド、４４０ピコモルの３’アダプターの第２のオリゴヌクレオチド及び１２００ｕｎｉｔのT4 DNA Ligase (Rapid)を含有する、３０μｌの総容量中に集成した。全ての反応物を、DNA Clean & Concentrator-5カラムを使用して精製した。ＤＮＡを、１０μｌのＤＮＡ懸濁緩衝液中に再懸濁させ、２倍濃度のホルムアミドローディングバッファー（９７％のホルムアミド、１０ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１％のブロモフェノールブルー及び０．０１％のキシレンシアノール）１０μｌと混合し、９５℃で５分間にわたり加熱し、６５℃のオーブン内の、ＴＢＥ−尿素プレキャスト６％ポリアクリルアミドゲル（Invitrogen社製；型番S11494）上で泳動させた。ゲルを、SYBR（登録商標）Gold核酸ゲル染色色素（Invitrogen社製；型番S11494）で染色し、Dark readerライトボックス（Clare Chemical Research社製）上で可視化させ、デジタルカメラを使用して撮影した。
【０１５９】
結果：
せん断されたＤＮＡ基質上の５’リン酸を要求する、従来型のアダプターのライゲーション反応（図２０、上パネル）は、これを要求しない３’アダプターのライゲーション（図２０、下パネル）より低い効率を示した。ライゲーション反応は、両方いずれの種類のライゲーションについても、ＤＮＡを、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ単独（レーン３）又はクレノウと組み合わせたＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ（レーン７）又はクレノウプラスエキソヌクレアーゼIIIと組み合わせたＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ（レーン８）で処理した後において、より効率的であった。クレノウ、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ又はアンタークティックホスファターゼ単独（それぞれ、レーン４、５及び６）による処理は、平滑ライゲーションを、非処理ＤＮＡ（レーン２）と比較して、中程度に増強するに過ぎなかった。レーン９には、緊密な範囲分布の断片化ＤＮＡをロードした。
【０１６０】
結論：
平滑アダプターの、せん断されたＤＮＡへのライゲーションは、このＤＮＡのポリッシングに高度に依存する。強力な５’−３’エキソヌクレアーゼ活性及び５’−３’ポリメラーゼ活性を提示する、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼなどのＤＮＡポリメラーゼは、この目的によく適する。従来型のアダプターのライゲーション反応は、基質の平滑末端上の無傷の５’リン酸の存在に依存する。しかし、３’アダプターのライゲーションは、ライゲーションが、断片化ＤＮＡの３’ヒドロキシル末端で生じるので、これに依存しない。せん断されたＤＮＡの５’末端は、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼの酵素基質ではないので、これにより、なぜ、３’アダプターが、フィルインアダプター（レーン３）よりライゲーションに成功するのかが説明される。Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼプラスクレノウ及びエキソヌクレアーゼIIIの組合せは、平滑ライゲーションを著明に増強した。エキソヌクレアーゼIII活性は、ＤＮＡの３’末端において損傷を受けた可能性がある３’ヒドロキシル末端を除去することにより、平滑アダプターのライゲーションに要求される平滑末端を産生した。エキソヌクレアーゼIIIはまた、３’ホスファターゼ活性も保有し、これは、３’末端を、ＤＮＡポリメラーゼによるポリッシング活性に対してアクセス可能とする。
【実施例３】
【０１６１】
ＦＡＭ標識オリゴヌクレオチド基質を使用する、５’アダプターのライゲーションのための温度最適化
根拠：この実験では、ニックトランスレーションにより媒介される５’アダプターのライゲーションの温度依存性及びｄＮＴＰ組成を評価した。
【０１６２】
材料：
・ニックトランスレーションのための５’アダプターのオリゴヌクレオチド（１３−１４４）（表１）
・ＦＡＭオリゴヌクレオチド基質（１３−５８１）（表１）
・オリゴヌクレオチド鋳型（１３−５８２）（表１）
・ＰＣＲグレード１００ｍＭ  ２’デオキシヌクレオシド５’三リン酸（ｄＮＴＰ）セット（Invitrogen（Life technologies）社製；型番10297-018）
・E. coli DNA Ligase（New England Biolabs社製；型番M0205S）
・１０倍濃度のE. coli DNA Ligase Reaction Buffer（New England BioLabs社製）
・２５Ｕ／ｕｌに濃縮されたＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Genscript社製；型番E00012）
・２５ｂｐラダーＤＮＡサイズマーカー（Invitrogen（Life technologies）社製；型番10488-022）
【０１６３】
方法：
ニックトランスレーション反応物の第１のセットを、１倍濃度の大腸菌ＤＮＡリガーゼ緩衝液、３０ピコモルのＦＡＭオリゴヌクレオチド基質、４５ピコモルのニックトランスレーションのための５’アダプターのオリゴヌクレオチド及び４５ピコモルのオリゴヌクレオチド鋳型、２００μＭのｄＴＴＰ又はｄＴＴＰ／ｄＧＴＰの各々２００ｕＭずつ若しくはｄＡＴＰ／ｄＴＴＰ／ｄＧＴＰの各々２００ｕＭずつのミックス並びに２．５ｕｎｉｔのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの最終濃度を含むか、又はＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを含まない、３０μｌの総容量中に集成した。反応物を、３０℃、４０℃又は５０℃で３０分間にわたりインキュベートした。
【０１６４】
ニックトランスレーション反応に続くライゲーション反応の反応物の第２のセットを、１倍濃度の大腸菌ＤＮＡリガーゼ緩衝液、３０ピコモルのＦＡＭオリゴヌクレオチド基質、４５ピコモルのニックトランスレーションのための５’アダプターのオリゴヌクレオチド及び４５ピコモルのオリゴヌクレオチド鋳型、ｄＡＴＰ／ｄＴＴＰ／ｄＧＴＰの各々２００ｕＭずつ、並びに２．５ｕｎｉｔのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの最終濃度を含む、３０μｌの総容量中に集成した。反応物を、５０℃、５３℃、５６℃又は６０℃で３０分間にわたりインキュベートした。これらの反応物１０μｌを、ゲル解析のために取り置いた。１０ｕｎｉｔの大腸菌リガーゼを、残りの２０μｌへと添加し、２５℃で１５分間にわたりインキュベートした。さらなる対照反応物を、１倍濃度の大腸菌ＤＮＡリガーゼ緩衝液、及び３０ピコモルのＦＡＭオリゴヌクレオチド基質の最終濃度を含む、３０μｌ中に集成した。これらの反応物１０μｌを、２倍濃度のホルムアミドローディングバッファー（９７％のホルムアミド、１０ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１％のブロモフェノールブルー及び０．０１％のキシレンシアノール）１０μｌと混合し、９５℃で５分間にわたり加熱し、その後、６５℃のオーブン内の、ＴＢＥ−尿素プレキャスト１５％ポリアクリルアミドゲル（Invitrogen社製；型番S11494）上で泳動させ、Dark readerライトボックス（Clare Chemical Research社製）上で可視化させ、デジタルカメラを使用して撮影した。
【０１６５】
結果：
図２１、パネルＡにおいて示されるとおり、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは、その５’ｆｌａｐエンドヌクレアーゼ活性により、ＦＡＭオリゴヌクレオチド基質上のヌクレオチドを除去しながら、ニックトランスレーションのための５’アダプターのオリゴヌクレオチドの３’ヒドロキシル末端を伸長させた。ｄＴＴＰだけ（図２１、レーン２、５、８、パネルＡ）の添加は、ニックトランスレーションのための５’アダプターのオリゴヌクレオチドの３’末端における、１塩基だけの付加を可能とし、ｄＴＴＰ／ｄＧＴＰ（図２１、レーン３、６、９、パネルＡ）の添加は、３塩基の付加を可能とし、ｄＴＴＰ／ｄＧＴＰ／ｄＡＴＰ（図２１、レーン４、７、１０、パネルＡ）の添加は、４塩基の付加を可能としたが、これらは、ＦＡＭオリゴヌクレオチド基質から切断される塩基の数（図２１、パネルＡ）に比例した。また、ＦＡＭオリゴヌクレオチド基質から切断される塩基の数は、反応が生じる温度にも依存した。５０℃（図２１、レーン２〜４、パネルＡ）では、ＦＡＭオリゴヌクレオチド基質から切断される塩基の量は、４０℃又は３０℃で切断される量より大きかった。また、ニックトランスレーションの効率及び切断されるＦＡＭオリゴヌクレオチド基質の量も、反応の温度に高度に依存した。４０℃又は３０℃では、ｄＴＴＰだけの添加（図２１、レーン５、８、パネルＡ）は、５０℃で観察されるＦＡＭオリゴヌクレオチド基質の切断（図２１、レーン２、パネルＡ）を可能としなかった。ｄＴＴＰ／ｄＧＴＰ又はｄＴＴＰ／ｄＧＴＰ／ｄＡＴＰの添加は、４０℃でもある程度の切断を可能とした（レーン６及び７）又は３０℃（レーン９及び１０）が、有効性は、５０℃の場合（レーン３及び４）より小さかった。レーン１（図２１、パネルＡ）は、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの非存在下におけるＦＡＭオリゴヌクレオチド基質を示す。
【０１６６】
ニックトランスレーションの効率及び切断されるＦＡＭオリゴヌクレオチド基質の量は、反応の温度に高度に依存した。６０℃では、ＦＡＭオリゴヌクレオチド基質は、ほぼ完全に小型の分子種へと処理された（図２１、レーン４、パネルＢ）。ＦＡＭオリゴヌクレオチド基質の切断産物のサイズはまた、反応の温度が上昇するにつれて減少もした（図２１、レーン１〜４、パネルＢ）。レーン５（図２１、パネルＢ）は、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの非存在下におけるＦＡＭオリゴヌクレオチド基質を示す。ニックトランスレーション反応時に、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは、ＦＡＭオリゴヌクレオチド基質の５’末端を切断し、大腸菌リガーゼが、５’アダプターのオリゴヌクレオチドの３’末端を、ＦＡＭオリゴヌクレオチド基質の５’末端へと共有結合的に結合させるのに不可欠な、末端の５’リン酸を作製する。また、ライゲーション効率も、反応が生じる温度に依存した。ライゲーション産物は、５０℃では豊富（レーン６）であり、６０℃ではほぼ非存在（レーン９）であり、５３℃及び５６℃では、中程度量のライゲーション産物が作製された。
【０１６７】
結論：
ニックトランスレーション時に、ＦＡＭオリゴヌクレオチド基質から切断される塩基の数は、反応物中に導入される相補性ｄＮＴＰと、反応が生じる温度とに依存した。ニックトランスレーション反応時に、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは、ＦＡＭオリゴヌクレオチド基質の５’末端を切断し、大腸菌リガーゼが２つの断片をライゲーションするのに不可欠な、末端の５’リン酸を作製する。高温でニックトランスレーションにより切断されるＦＡＭオリゴヌクレオチド基質は、５’アダプターのオリゴヌクレオチドの３’末端と、ＦＡＭオリゴヌクレオチド基質の５’末端との間に形成される潜在的なギャップのために、大腸菌リガーゼによるライゲーションのための基質として良好でなかった。
【実施例４】
【０１６８】
ｄＮＴＰ組成の、５’アダプターのライゲーションに対する効果についての解析 
根拠：この実験は、変化させるｄＮＴＰ組成の存在下で生じるニックトランスレーションの程度及びこれとカップリングさせたライゲーション反応に対する効果を評価するのに実施した。
【０１６９】
材料：
・ニックトランスレーションのための５’アダプターのオリゴヌクレオチド（１３−１４４）（表１）
・ＦＡＭオリゴヌクレオチド基質（１３−５８１）（表１）
・オリゴヌクレオチド鋳型（１３−５８２）（表１）
・ＰＣＲグレード１００ｍＭ  ２’デオキシヌクレオシド５’三リン酸（ｄＮＴＰ）セット（Invitrogen（Life technologies）社製；型番10297-018）
・２５ｂｐラダーＤＮＡサイズマーカー（Invitrogen（Life technologies）社製；型番10488-022）
・E. coli DNA Ligase（Enzymatics社製；型番L6090L）
・１０倍濃度のE. coli DNA Ligase Buffer（Enzymatics社製；型番B6090）
・Ｔａｑ−Ｂ  ＤＮＡポリメラーゼ（Enzymatics社製；型番P7250L）
【０１７０】
方法：
反応物を、１倍濃度の大腸菌ＤＮＡリガーゼ緩衝液、３０ピコモルのＦＡＭオリゴヌクレオチド基質、４５ピコモルのニックトランスレーションのための５’アダプターのオリゴヌクレオチド及び４５ピコモルのオリゴヌクレオチド鋳型、各々２００μＭずつである４つのｄＮＴＰ又は各々２００μＭずつである、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ；若しくはｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ；若しくはｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ；若しくはｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰのミックス（又はｄＮＴＰを含まない）、１０ｕｎｉｔの大腸菌リガーゼ及び１０ｕｎｉｔのＴａｑ−Ｂ  ＤＮＡポリメラーゼの最終濃度を含む、３０μｌの総容量中に集成した。全ての反応物を、４０℃で３０分間にわたりインキュベートした。これらの反応物１０μｌを、２倍濃度のホルムアミドローディングバッファー（９７％のホルムアミド、１０ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１％のブロモフェノールブルー及び０．０１％のキシレンシアノール）１０μｌと混合し、９５℃で５分間にわたり加熱し、その後、６５℃のオーブン内の、ＴＢＥ−尿素プレキャスト１５％ポリアクリルアミドゲル（Invitrogen社製；型番S11494）上で泳動させ、Dark readerライトボックス（Clare Chemical Research社製）上で可視化させ、デジタルカメラを使用して撮影した（下パネル）。その後、ゲルを、SYBR（登録商標）Gold核酸ゲル染色色素（Invitrogen社製；型番S11494）で染色し、Dark readerライトボックス（Clare Chemical Research社製）上で可視化させ、デジタルカメラを使用して撮影した（上パネル）。
【０１７１】
結果：
図２２の最初の２つのレーンは、対照オリゴヌクレオチドを示す。ＦＡＭ基質は、５’リン酸修飾を欠くため、Ｔａｑ−Ｂ  ＤＮＡポリメラーゼの非存在下における、大腸菌リガーゼ単独では、５’アダプターのオリゴヌクレオチドを、ＦＡＭオリゴヌクレオチド基質へとライゲーションすることができない（図２２、レーン３）。Ｔａｑ−Ｂ  ＤＮＡポリメラーゼ及び４つのｄＮＴＰの存在下では、５’アダプターのオリゴヌクレオチドは伸長し、５８塩基の新たな産物を形成し、ＦＡＭオリゴヌクレオチド基質は、置換され、Ｔａｑ−Ｂ  ＤＮＡポリメラーゼの５’ｆｌａｐエンドヌクレアーゼ活性により分解された（図２２、レーン４）。大腸菌リガーゼ、Ｔａｑ−Ｂ  ＤＮＡポリメラーゼ及びｄＡＴＰ／ｄＴＴＰ／ｄＧＴＰ（図２２、レーン７）又はｄＣＴＰ／ｄＴＴＰ／ｄＧＴＰ（図２２、レーン６）又はｄＡＴＰ／ｄＴＴＰ／ｄＣＴＰ（図２２、レーン９）の存在下では、ニックトランスレーションは、それぞれ、４、３又は１塩基の付加に限定された。５’アダプターの伸長に伴い、ＦＡＭオリゴヌクレオチド基質の５’末端に、ｆｌａｐが形成された。このｆｌａｐは、ライゲーションに要求される５’リン酸を創出するＴａｑ−Ｂ  ５’ｆｌａｐエンドヌクレアーゼ活性のための基質となる。５’アダプターは、ＦＡＭオリゴヌクレオチド基質へとライゲーションされ、６９塩基の産物を形成した。３又は４塩基のｆｌａｐ（図２２、レーン６及び７）は、１塩基のｆｌａｐ（図２２、レーン９）より効率的にライゲーションを支援した。大腸菌リガーゼ、Ｔａｑ−Ｂ  ＤＮＡポリメラーゼ及びｄＡＴＰ／ｄＣＴＰ／ｄＧＴＰ（図２２、レーン８）の存在下では、ライゲーション産物に対応する弱いバンドが観察された。ライゲーション活性の弱さは、「非マッチ」塩基（Ｔの代わりにＣ又はＧ）の組み込みに由来するが、これは、一部のＦＡＭオリゴヌクレオチド基質上では、ｆｌａｐの形成をもたらす。大腸菌リガーゼ、Ｔａｑ−Ｂ  ＤＮＡポリメラーゼの存在下であっても、ｄＮＴＰの非存在下では、ライゲーション産物は、観察されなかった。大腸菌リガーゼ、Ｔａｑ−Ｂ  ＤＮＡポリメラーゼ及び４つのｄＮＴＰの存在下では、５’アダプターは、ＦＡＭオリゴヌクレオチド基質へとライゲーションされ、６９塩基の産物を形成した（図２２、レーン５）。５’アダプター及びオリゴヌクレオチド鋳型は、ＦＡＭオリゴヌクレオチド基質と比較して過剰に存在したので、ニックトランスレーション産物はまた、５８塩基においても観察された（図２２、レーン５、上パネル）。しかし、観察されたライゲーション産物の量は、同じであった。レーンＭには、２５ｂｐラダーＤＮＡサイズマーカーをロードした。
【０１７２】
結論：
ライゲーションには、ＦＡＭオリゴヌクレオチド基質の５’末端のリン酸化が要求される。ｄＮＴＰの存在下では、５’アダプターの伸長を実施するのに、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性が要求され、これにより、ＦＡＭオリゴヌクレオチド基質の５’末端には、ｆｌａｐが創出される。このｆｌａｐは、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの５’ｆｌａｐエンドヌクレアーゼ活性の基質として良好であり、大腸菌リガーゼによるライゲーションのための完全な５’リン酸基質を作製する。ｆｌａｐが１つの塩基だけにより形成される場合であってもなおライゲーションは生じる。ライゲーションはまた、４つのｄＮＴＰ全てが存在する場合にも生じ、ｆｌａｐの長さ又はニックトランスレーションの程度を制限しないことから、ライゲーションは、ＦＡＭオリゴヌクレオチド基質の５’末端において、５’リン酸が創出された直後に生じることが示唆される。
【実施例５】
【０１７３】
熱安定性酵素を伴う、ニックトランスレーション−ライゲーション反応のカップリング
根拠：この実験は、反応温度及びカップリング反応内のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ酵素のｕｎｉｔ数の効果を評価するのに実施した。
【０１７４】
材料：
・ニックトランスレーションのための５’アダプターのオリゴヌクレオチド（１３−１４４）（表１）
・ＦＡＭオリゴヌクレオチド基質（１３−５８１）（表１）
・オリゴヌクレオチド鋳型（１３−５８２）（表１）
・ＰＣＲグレード１００ｍＭ  ２’デオキシヌクレオシド５’三リン酸（ｄＮＴＰ）セット（Invitrogen（Life technologies）社製；型番10297-018）
・Taq DNA Ligase（New England Biolabs社製；型番M0208S）
・１０倍濃度のTaq DNA ligase Reaction Buffer（New England BioLabs社製）
・２５Ｕ／ｕｌに濃縮されたＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Genscript社製；型番E00012）
【０１７５】
方法：
反応物を、１倍濃度のＴａｑ  ＤＮＡリガーゼ反応緩衝液、３０ピコモルのＦＡＭオリゴヌクレオチド基質、４５ピコモルのニックトランスレーションのための５’アダプターのオリゴヌクレオチド及び４５ピコモルのオリゴヌクレオチド鋳型、各々２００μＭずつのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ又はｄＴＴＰ、４０ｕｎｉｔのＴａｑ  ＤＮＡリガーゼ、又は８０ｕｎｉｔのＴａｑ  ＤＮＡリガーゼ、又は１２０ｕｎｉｔのＴａｑ  ＤＮＡリガーゼ並びに１０ｕｎｉｔのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの最終濃度を含む、３０μｌの総容量中に集成した。反応物を、４５℃、５０℃、５５℃、又は６０℃で３０分間にわたりインキュベートした。これらの反応物１０μｌを、２倍濃度のホルムアミドローディングバッファー（９７％のホルムアミド、１０ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１％のブロモフェノールブルー及び０．０１％のキシレンシアノール）１０μｌと混合し、９５℃で５分間にわたり加熱し、その後、６５℃のオーブン内の、ＴＢＥ−尿素プレキャスト１５％ポリアクリルアミドゲル（Invitrogen社製；型番S11494）上で泳動させ、Dark readerライトボックス（Clare Chemical Research社製）上で可視化させ、デジタルカメラを使用して撮影した。
【０１７６】
結果：
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは、その５’ｆｌａｐエンドヌクレアーゼ活性により、ＦＡＭオリゴヌクレオチド基質上のヌクレオチドを除去しながら、５’アダプターのオリゴヌクレオチドの３’ヒドロキシル末端を伸長させた。ｄＴＴＰ／ｄＧＴＰ／ｄＡＴＰ（図２３、レーン２〜５、パネルＡ）又はｄＴＴＰ（図２３、レーン６〜９、パネルＡ）の添加は、それぞれ、５’アダプターのオリゴヌクレオチドの３’末端における、４及び１塩基の付加、及び後続のＦＡＭオリゴヌクレオチド基質の５’末端の切断を可能とした。６０℃では、ライゲーションが損われた（図２３、レーン５及び９、パネルＡ）。ライゲーションの効率は、ｄＴＴＰ／ｄＧＴＰ／ｄＡＴＰ（図２３、レーン２〜５、パネルＡ）又はｄＴＴＰ（図２３、レーン６〜９、パネルＡ）を添加することの影響を受けなかった。ライゲーション効率は、反応物中に存在するＴａｑ  ＤＮＡリガーゼの量に依存した。ライゲーション産物は、１２０ｕｎｉｔのＴａｑ  ＤＮＡリガーゼ（図２３、レーン４、パネルＢ）を、反応物へと添加する場合に、４０又は８０ｕｎｉｔのＴａｑ  ＤＮＡリガーゼ（それぞれ、図２３、レーン２及び３、パネルＢ）場合と比較して、より豊富であった。レーン１、パネルＡ及びレーン１、パネルＢは、酵素を伴わない対照オリゴヌクレオチドを示す。
【０１７７】
結論：
ニックトランスレーション反応時に、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは、ＦＡＭオリゴヌクレオチド基質の５’末端を切断し、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼが、４５℃〜６０℃の間で、ライゲーションを実施するのに不可欠な５’リン酸の末端を作製する。６０℃では、ライゲーションが低減した。反応物中のＴａｑ  ＤＮＡリガーゼの濃度はまた、ライゲーションの効率にも影響を及ぼした。１２０Ｕの酵素の存在下では、８０Ｕ及び４０Ｕの場合と比較して、多くの産物が観察された。
【実施例６】
【０１７８】
置換−切断−ライゲーション反応のカップリング
根拠：この実験は、置換−切断−ライゲーション反応のカップリングにおいて、熱安定性Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ又は熱不安定性大腸菌リガーゼを、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼと組み合わせうることを実証するのに実施した。
【０１７９】
材料：
・置換−切断のための５’アダプターのオリゴヌクレオチド（１３−１５６）（表１）
・ＦＡＭオリゴヌクレオチド基質（１３−５８１）（表１）
・オリゴヌクレオチド鋳型（１３−５８２）（表１）
・Taq DNA Ligase（New England Biolabs社製；型番M0208S）
・１０倍濃度のTaq DNA ligase Reaction Buffer（New England BioLabs社製）
・２５Ｕ／ｕｌに濃縮されたＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Genscript社製；型番E00012）
・E. coli DNA Ligase（New England Biolabs社製；型番M0205S）
・１０倍濃度のE. coli DNA Ligase Reaction Buffer（New England BioLabs社製）
【０１８０】
方法：
反応物を、１倍濃度の大腸菌ＤＮＡリガーゼ反応緩衝液又は１倍濃度のＴａｑ  ＤＮＡリガーゼ反応緩衝液、３０ピコモルのＦＡＭオリゴヌクレオチド基質、４５ピコモルの置換−切断のための５’アダプターのオリゴヌクレオチド及び４５ピコモルのオリゴヌクレオチド鋳型、１０ｕｎｉｔの大腸菌ＤＮＡリガーゼ又は４０ｕｎｉｔのＴａｑ  ＤＮＡリガーゼ、並びに１０ｕｎｉｔのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの最終濃度を含む、３０μｌの総容量中に集成した。反応物を、４０℃又は４５℃で３０分間にわたりインキュベートした。これらの反応物１０μｌを、２倍濃度のホルムアミドローディングバッファー（９７％のホルムアミド、１０ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１％のブロモフェノールブルー及び０．０１％のキシレンシアノール）１０μｌと混合し、９５℃で５分間にわたり加熱し、その後、６５℃のオーブン内の、ＴＢＥ−尿素プレキャスト１５％ポリアクリルアミドゲル（Invitrogen社製；型番S11494）上で泳動させ、Dark readerライトボックス（Clare Chemical Research社製）上で可視化させ、デジタルカメラを使用して撮影した。
【０１８１】
結果：
置換−切断のための５’アダプターのオリゴヌクレオチドは、追加のマッチング塩基「Ｔ」を、ＦＡＭオリゴヌクレオチド基質の５’末端と重複する、その３’末端に有する。５’アダプターのオリゴヌクレオチドの３’末端が、ＦＡＭオリゴヌクレオチド基質の５’末端を置換すると、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの５’ｆｌａｐエンドヌクレアーゼ活性は、ＦＡＭオリゴヌクレオチド基質の５’末端を切断して、大腸菌リガーゼ（図２４、レーン２、パネルＡ）又はＴａｑ  ＤＮＡリガーゼ（図２４、レーン２、パネルＢ）によるライゲーションに不可欠な５’リン酸を創出する。パネルＡ及びＢのレーン１は、酵素を伴わないオリゴヌクレオチド対照を示す。
【０１８２】
結論：
ｄＮＴＰの非存在下では、５’アダプターの伸長は、生じなかった。しかし、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは、ＦＡＭオリゴヌクレオチド基質の５’末端を切断し、大腸菌ＤＮＡリガーゼ又はＴａｑ  ＤＮＡリガーゼがライゲーションを実施するのに不可欠な末端の５’リン酸を作製しうる。
【実施例７】
【０１８３】
「Ｎ」ユニバーサル／縮重５’アダプター３’突出又は「Ｔ」基質特異的５’アダプター３’突出を伴う、置換−切断−ライゲーション反応のカップリング
根拠：この実験では、ｆｌａｐエンドヌクレアーゼを使用する、５’アダプターのライゲーションは、５’アダプターの３’末端の突出が、配列特異的なマッチであるか、又はこれが、縮重した非配列特異的な「Ｎ」から構成される場合に実施しうることを実証する。
【０１８４】
材料：
・置換−切断のための５’アダプターのオリゴヌクレオチド「Ｔ」（１３−６０７）（表１）
・置換−切断のための５’アダプターのオリゴヌクレオチド「Ｎ」（１３−５９６）（表１）
・ＦＡＭオリゴヌクレオチド基質（１３−５８１）（表１）
・オリゴヌクレオチド鋳型（１３−５８２）（表１）
・Taq DNA Ligase（New England Biolabs社製；型番M0208S）
・１０倍濃度のTaq DNA ligase Reaction Buffer（New England BioLabs社製）
・２５Ｕ／ｕｌに濃縮されたＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Genscript社製；型番E00012）
・E. coli DNA Ligase（New England Biolabs社製；型番M0205S）
・１０倍濃度のE. coli DNA Ligase Reaction Buffer（New England BioLabs社製）
【０１８５】
方法：
反応物を、１倍濃度のＴａｑ  ＤＮＡリガーゼ反応緩衝液、３０ピコモルのＦＡＭオリゴヌクレオチド基質、４５ピコモルの５’アダプターのオリゴヌクレオチド「Ｔ」又は４５ピコモルの５’アダプターのオリゴヌクレオチド「Ｎ」１又は１８０ピコモルの５’アダプターのオリゴヌクレオチド「Ｎ」又は４５０ピコモルの５’アダプターのオリゴヌクレオチド「Ｎ」及び４５ピコモルのオリゴヌクレオチド鋳型、４０ｕｎｉｔのＴａｑ  ＤＮＡリガーゼ、並びに１０ｕｎｉｔのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの最終濃度を含む、３０μｌの総容量中に集成した。反応物を、４５℃若しくは５０℃若しくは５５℃で３０分間にわたり、又は４５℃で３分間、６５℃で１５秒間のサイクル８回にわたりインキュベートした。これらの反応物１０μｌを、２倍濃度のホルムアミドローディングバッファー（９７％のホルムアミド、１０ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１％のブロモフェノールブルー及び０．０１％のキシレンシアノール）１０μｌと混合し、９５℃で５分間にわたり加熱し、その後、６５℃のオーブン内の、ＴＢＥ−尿素プレキャスト１５％ポリアクリルアミドゲル（Invitrogen社製；型番S11494）上で泳動させ、Dark readerライトボックス（Clare Chemical Research社製）上で可視化させ、デジタルカメラを使用して撮影した。
【０１８６】
結果：
置換−切断のための５’アダプターのオリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチド鋳型にマッチするその３’末端に、「Ｔ」を有する（図２５、レーン３、５、７、パネルＡ）、（ＦＡＭオリゴヌクレオチド基質の５’末端と重複する）場合、ライゲーションは、５’アダプターのオリゴヌクレオチドが、縮重した「Ｎ」塩基を有し、オリゴ合成時に、全ての４つのヌクレオチドがこの位置に存在した（図２５、レーン２、４、６、パネルＡ）場合であって、オリゴヌクレオチド鋳型に対して完全なマッチとなるのは、４分の１の確率であるに過ぎない場合より、高速で生じた。異なる反応温度（４５℃、５０℃及び５５℃）について調べたが、５’アダプターのオリゴヌクレオチド「Ｎ」を使用するライゲーションは改善されなかった（図２５、レーン２、４、６、パネルＡ）。また、異なる量の５’アダプターのオリゴヌクレオチド「Ｎ」（４５ピコモル、１８０ピコモル及び４５０ピコモル）についても調べたが、ライゲーション反応は改善されなかった（図２５、レーン３〜５、パネルＢ）。しかし、４５℃〜６５℃の間における、反応の温度サイクリングは、ライゲーションが、５’アダプターのオリゴヌクレオチドの「Ｔ」マッチング塩基の場合と同等の最高速度で生じることを可能とした（図２５、レーン６、パネルＢ）。パネルＡ及びＢのレーン１は、酵素を伴わないオリゴヌクレオチド対照を示す。
【０１８７】
結論：
５’アダプターのオリゴヌクレオチド「Ｎ」を使用して、置換−切断カップリングさせた、効率的な５’アダプターのライゲーションを可能とするには、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼを作動させるための第１の温度と、オリゴヌクレオチド鋳型と５’アダプターのオリゴヌクレオチド「Ｎ」との間の二重鎖を解離させうる第２の温度との間のサイクリングが極めて重要であった。サイクリング条件は、５’アダプターのオリゴヌクレオチド「Ｎ」とオリゴヌクレオチド鋳型との間の複数の会合を可能としたが、置換−切断反応が生じたのは、５’アダプターのオリゴヌクレオチドの３’末端塩基が、鋳型との完全なマッチであり、ＦＡＭオリゴヌクレオチド基質の５’末端を置換しうる場合に限られた。
【実施例８】
【０１８８】
ＤＮＡポリメラーゼＩを使用する、ニックトランスレーション−ライゲーション反応のカップリング
根拠：この実験では、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を保有するＤＮＡポリメラーゼＩはまた、ニックトランスレーションとカップリングさせたアダプターのライゲーション法にも関与しうることを実証する。
【０１８９】
材料：
・ニックトランスレーションのための５’アダプターのオリゴヌクレオチド（１３−１４４）（表１）
・ＦＡＭオリゴヌクレオチド基質（１３−５８１）（表１）
・オリゴヌクレオチド鋳型（１３−５８２）（表１）
・ＰＣＲグレード１００ｍＭ  ２’デオキシヌクレオシド５’三リン酸（ｄＮＴＰ）セット（Invitrogen（Life technologies）社製；型番10297-018）
・２５ｂｐラダーＤＮＡサイズマーカー（Invitrogen（Life technologies）社製；型番10488-022）
・E. coli DNA Ligase（Enzymatics社製；型番L6090L）
・１０倍濃度のE. coli DNA Ligase Buffer（Enzymatics社製；型番B6090）
・Ｔａｑ−Ｂ  ＤＮＡポリメラーゼ（Enzymatics社製；型番P7250L）
・ＤＮＡポリメラーゼＩ（New England Biolabs社製；型番M0209S）
【０１９０】
方法：
反応物を、１倍濃度の大腸菌ＤＮＡリガーゼ緩衝液、３０ピコモルのＦＡＭオリゴヌクレオチド基質、４５ピコモルのニックトランスレーションのための５’アダプターのオリゴヌクレオチド及び４５ピコモルのオリゴヌクレオチド鋳型、各々２００μＭずつである４つのｄＮＴＰ、１０ｕｎｉｔの大腸菌リガーゼ並びに１０ｕｎｉｔのＴａｑ−Ｂ  ＤＮＡポリメラーゼ又は５ｕｎｉｔのＤＮＡポリメラーゼＩ又は１ｕｎｉｔのＤＮＡポリメラーゼＩの最終濃度を含む、３０μｌの総容量中に集成した。反応物を、４０℃、１８℃、１６℃又は１４℃で３０分間にわたりインキュベートした。１０μｌの各反応物を、２倍濃度のホルムアミドローディングバッファー（９７％のホルムアミド、１０ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１％のブロモフェノールブルー及び０．０１％のキシレンシアノール）１０μｌと混合し、９５℃で５分間にわたり加熱し、その後、６５℃のオーブン内の、ＴＢＥ−尿素プレキャスト１５％ポリアクリルアミドゲル（Invitrogen社製；型番S11494）上で泳動させ、SYBR goldを伴うか又は伴わずに（それぞれ、上パネル及び下パネル）、Dark readerライトボックス（Clare Chemical Research社製）上で可視化させ、デジタルカメラを使用して撮影した。
【０１９１】
結果：
図２６の第１のレーンは、酵素による制御が存在しないことを示す。Ｔａｑ−Ｂ  ＤＮＡポリメラーゼ及び大腸菌リガーゼ（図２６、レーン２）の存在下では、５’アダプターのオリゴヌクレオチドは、ＦＡＭオリゴヌクレオチド基質へとライゲーションされ、６９塩基の産物を産生する（図２６、レーン２、上パネル及び下パネル）か、又は完全に伸長し、５８塩基の新たな産物を形成した（図２６、レーン２、上パネル）。６９塩基の産物は、Ｔａｑ−Ｂ  ＤＮＡポリメラーゼによる伸長及びＦＡＭオリゴヌクレオチド基質の５’末端におけるｆｌａｐの形成に由来した。Ｔａｑ−Ｂ  ５’ｆｌａｐエンドヌクレアーゼ活性は、ｆｌａｐを切除し、大腸菌リガーゼにより使用される５’リン酸を作製して、ライゲーションを完成させた。５８塩基の産物は、ＦＡＭオリゴヌクレオチド基質が、伸長の間に完全に置換され、Ｔａｑ−Ｂ  ＤＮＡポリメラーゼの５’ｆｌａｐエンドヌクレアーゼ活性により分解される場合に得られた。これらの２つの種類の産物はまた、Ｔａｑ−Ｂ  ＤＮＡポリメラーゼを、成長しつつあるＤＮＡ鎖の前方のヌクレオチドを１つずつ除去し、ニックトランスレーションが生じることを可能とする、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼＩにより置き換えた場合（図２６、レーン３〜８）にも形成された。反応は、５ｕｎｉｔのＤＮＡポリメラーゼＩ（図２６、レーン３〜５）又は１ｕｎｉｔのＤＮＡポリメラーゼＩ（図２６、レーン６〜８）により実施した。好熱性のＴａｑ−Ｂ  ＤＮＡポリメラーゼによる反応は、４０℃（図２６、レーン２）で実施したが、中温性のＤＮＡポリメラーゼＩによる反応は、１８℃（図２６、レーン３及び６）、１６℃（図２６、レーン４及び７）又は１４℃（図２６、レーン５及び８）で実施した。６９塩基のライゲーション産物は、全ての場合に得られたが、１ｕｎｉｔのＤＮＡポリメラーゼＩ（図２６、レーン６〜８）だけの添加が、５ｕｎｉｔ（図２６、レーン３〜５）の場合より効率的であった。これは、それがライゲーションされうる前に、ＦＡＭオリゴヌクレオチド基質の迅速な部分的分解を引き起こす、ＤＮＡポリメラーゼの極めて強力な５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により説明される。分解産物は、下パネルの下方で観察された（図２６、レーン３〜５）。レーンＭには、２５ｂｐラダーＤＮＡサイズマーカーをロードした。
【０１９２】
結論：
Ｔａｑ−Ｂ  ＤＮＡポリメラーゼ（好熱性のポリメラーゼ）及びＤＮＡポリメラーゼＩ（中温性のポリメラーゼ）のいずれも、ニックトランスレーションに媒介されるライゲーションを実施するのに使用しうるが、完全に活性となるには、異なる条件を要求する。これらはいずれも、６９塩基の産物を作製し、これは、５’末端の切除に続くライゲーションの結果であったが、異なる機構が使用されている。Ｔａｑ−Ｂが、大腸菌リガーゼによるライゲーションに要求される５’リン酸化末端を産生するのに切除されるｆｌａｐを創出するのに対し、ＤＮＡポリメラーゼＩは、成長しつつある鎖の前方のヌクレオチドを１つずつ除去し、５’リン酸化されたヌクレオチドを作製し、これは、２つの断片を接合する大腸菌リガーゼの完全な基質となった。ＤＮＡポリメラーゼＩを使用して、ニックトランスレーションに媒介される５’アダプターのライゲーションを実施することができる。
【実施例９】
【０１９３】
ポリッシングは、物理的にせん断されたＤＮＡの平滑ライゲーションに要求され、脱リン酸化は、キメラライゲーション産物の形成を防止する
根拠：この実験では、アダプターの、物理的にせん断されたＤＮＡ基質への平滑ライゲーションに対する、末端のポリッシング及び脱リン酸化の重要性を実証する。
【０１９４】
材料：
・Blue Buffer（Enzymatics社製；型番B0110）
・T4 DNA Ligase (Rapid)（Enzymatics社製；型番L6030-HC-L）
・１０倍濃度のT4 DNA Ligase Buffer（Enzymatics社製；型番B6030）
・ＰＣＲグレード１００ｍＭ  ２’デオキシヌクレオシド５’三リン酸（ｄＮＴＰ）セット（Invitrogen（Life technologies）社製；型番10297-018）
・アデノシン５’三リン酸（ＡＴＰ）（New England Biolabs社製；型番P0756S）
・DNA Polymerase I, Large (Klenow) Fragment（New England Biolabs社製；型番M0210S）
・Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ（New England Biolabs社製；型番M0203S）
・Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（New England Biolabs社製；型番M0201S）
・エビアルカリホスファターゼ（Affymetrix社製；型番78390）
・T4 DNA Ligase (Rapid)（Enzymatics社製；型番L6030-HC-L）
・１０倍濃度のT4 DNA Ligase Buffer（Enzymatics社製；型番B6030）
・大腸菌ゲノムＤＮＡ  ＡＴＣＣ  １１３０３株（Affymetrix社製；型番14380）
・M220 Focused-ultrasonicator（Covaris社製；型番PN 500295）
・Pippin Prep（Sage Science社製）
・DNA Clean & Concentrator-5（Zymo research社製；型番D4004）
・CDF2010 2% agarose, dye free w/ internal stds（Sage Science社製）
【０１９５】
方法
大腸菌ｇＤＮＡを、ＤＮＡ懸濁緩衝液（Teknova社製；型番T0227）中に、１００ｎｇ／ｕｌの濃度で再懸濁させた。ＤＮＡを、M220 Focused-ultrasonicatorにより、１５０塩基対の平均サイズへと断片化した。その後、Pippin Prepを使用して、約１５０ｂｐ〜約１８５ｂｐの緊密なサイズ分布の断片化ＤＮＡを、２％のアガロースゲル上でサイズ選択した。
【０１９６】
反応物Ａのセットでは、１００ｎｇ又は５００ｎｇのサイズ選択されたＤＮＡを、ポリッシング酵素の活性下に置いた。反応物を、１倍濃度のBlue Buffer、１００μＭずつの各ｄＮＴＰ、３ｕｎｉｔのT4 DNA Polymerase、５ｕｎｉｔのDNA Polymerase I, Large (Klenow) Fragment、１ｍＭのＡＴＰ、１０ｕｎｉｔのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼの最終濃度を含む、３０μｌの総容量中に集成した。反応物を、３０℃で２０分間にわたりインキュベートした。ＤＮＡを、DNA Clean & Concentrator-5カラムを使用して精製した。ＤＮＡを、１５μｌのＤＮＡ懸濁緩衝液中に溶出させ、後続の脱リン酸化反応Ｂに続いてアダプターのライゲーションを行うか、又は脱リン酸化を伴わずに、直接ライゲーション反応にかけた。脱リン酸化反応物を、処理されたＤＮＡ、１倍濃度のBlue Buffer、及び１ｕｎｉｔのエビアルカリホスファターゼを含む、３０μｌの最終容量中に集成した。反応物を、３７℃で１０分間にわたりインキュベートした。ＤＮＡを、DNA Clean & Concentrator-5カラムを使用して精製し、１５μｌのＤＮＡ懸濁緩衝液中に溶出させた。
【０１９７】
反応物Ｃのセットでは、１００ｎｇのサイズ選択されたＤＮＡを、脱リン酸化に続くポリッシングにかけるか、又は反応物Ｄのセット内で直接ポリッシングにかけた。脱リン酸化反応物を、処理されたＤＮＡ、１倍濃度のBlue Buffer、及び１ｕｎｉｔのエビアルカリホスファターゼを含む、３０μｌの最終容量中に集成した。反応物を、３７℃で１０分間にわたりインキュベートした。ＤＮＡを、DNA Clean & Concentrator-5カラムを使用して精製し、１５μｌのＤＮＡ懸濁緩衝液中に溶出させた。ポリッシング反応物Ｄを、１倍濃度のBlue Buffer、１００μＭずつの各ｄＮＴＰ、３ｕｎｉｔのＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ、５ｕｎｉｔのDNA Polymerase I, Large (Klenow) Fragment、（レーン６〜７）の最終濃度を含む、３０μｌの総容量中に集成した。ＤＮＡを、DNA Clean & Concentrator-5カラムを使用して精製し、１５μｌのＤＮＡ懸濁緩衝液中に溶出させた。
【０１９８】
精製の後で、全ての先行する反応物を、ライゲーション反応にかけた。反応物を、処理されたＤＮＡ、１倍濃度のＴ４  ＤＮＡリガーゼ反応緩衝液及び１２００ｕｎｉｔのＴ４  ＤＮＡリガーゼを含む、３０μｌの最終容量中に集成した。反応物を、２５℃で１５分間にわたりインキュベートした。各ライゲーション反応からの３３ｎｇずつのＤＮＡを、２倍濃度のホルムアミドローディングバッファー（９７％のホルムアミド、１０ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１％のブロモフェノールブルー及び０．０１％のキシレンシアノール）と混合し、９５℃で５分間にわたり加熱し、その後、６５℃のオーブン内の、ＴＢＥ−尿素プレキャスト１５％ポリアクリルアミドゲル（Invitrogen社製；型番S11494）上で泳動させ、SYBR Goldで染色し、Dark readerライトボックス（Clare Chemical Research社製）上で可視化させ、デジタルカメラを使用して撮影した。
【０１９９】
結果：
ポリッシング前には、物理的にせん断されたＤＮＡは、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼによる平滑末端アダプターへのライゲーションに適する基質ではなかった（図２７、レーン１）。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ及びクレノウ断片によるポリッシング後に、ＤＮＡ末端は平滑化され、一部の５’末端はリン酸化され、分子は、互いに連鎖又はライゲーションされうるほか、平滑アダプターへも連鎖又はライゲーションされうる（図２７、レーン２及び４）。約３２５塩基、約５００塩基及び５００塩基超における分子種は、それぞれ、約１７５塩基ずつを、２分子、３分子及び４分子として併せたライゲーションに対応する（図２７、レーン２及び４）。ＤＮＡの濃度は、ライゲーション産物の形成に影響を及ぼした。高ＤＮＡ濃度では、高分子量のキメラライゲーション種が、より豊富であった（図２７、レーン４）。ポリッシングステップ後における、ＤＮＡの、エビアルカリホスファターゼによる処理は、ＤＮＡ分子間のコンカテマー形成を損った（図２７、レーン３及び５）。エビアルカリホスファターゼによる処理はまた、断片化ＤＮＡのポリッシングの前に実施した場合にも、コンカテマー形成を防止した（図２７、レーン６）。Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ及びクレノウ断片によるポリッシング後に観察されるライゲーション産物（図２７、レーン７）は、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼによるポリッシングの場合と比較して豊富ではなかった（図２７、レーン２）。
【０２００】
結論：
物理的にせん断されたＤＮＡの平滑ライゲーション効率は、ＤＮＡポリメラーゼによる末端のポリッシングに依存した。ライゲーションはまた、ＤＮＡ断片の５’末端をリン酸化し、３’末端を脱リン酸化する、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼの添加によっても改善された。ＤＮＡの濃度はまた、ライゲーション及びキメラ産物の形成の量にも影響を及ぼした。高濃度では、ＤＮＡは、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼの存在下で、キメラ産物を形成する可能性が高かった。アルカリホスファターゼは、５’リン酸（ライゲーションに要求される）を除去し、キメラライゲーション産物（コンカテマー）の形成を防止する。
【実施例１０】
【０２０１】
アダプターのライゲーション反応とカップリングさせた５’塩基のトリミングを使用して調製されると、ＮＧＳライブラリーは、収率を増大させた
根拠：この実験では、ＮＧＳライブラリーの構築へのそれらの例示的適用において提示される反応の有用性、特に、５’アダプターのライゲーションとカップリングさせた５’塩基のトリミングを組み入れることから生じるライブラリー収率の増大を実証する。ライブラリーは、せん断されたＤＮＡのサイズ選択から構築したので、ライブラリー産物は、ゲル電気泳動により容易に可視化することができた。
【０２０２】
材料：
・Blue Buffer（Enzymatics社製；型番B0110）
・T4 DNA Ligase (Rapid)（Enzymatics社製；型番L6030-HC-L）
・１０倍濃度のT4 DNA Ligase Buffer（Enzymatics社製；型番B6030）
・ＰＣＲグレード１００ｍＭ  ２’デオキシヌクレオシド５’三リン酸（ｄＮＴＰ）セット（Invitrogen（Life technologies）社製；型番10297-018）
・アデノシン５’三リン酸（ＡＴＰ）（New England Biolabs社製；型番P0756S）
・クレノウ断片（Enzymatics社製；型番P7060L）
・Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ（Enzymatics社製；型番P7080L）
・Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Enzymatics社製；型番Y904L）
・エビアルカリホスファターゼ（Affymetrix社製；型番78390）
・T4 DNA Ligase (Rapid)（Enzymatics社製；型番L6030-HC-L）
・１０倍濃度のT4 DNA Ligase Buffer（Enzymatics社製；型番B6030）
・３’アダプター；第１のオリゴヌクレオチド１３−５０１（表１）
・３’アダプター；第２のオリゴヌクレオチド１３−７１２（表１）
・大腸菌ゲノムＤＮＡ  ＡＴＣＣ  １１３０３株（Affymetrix社製；型番14380）
・M220 Focused-ultrasonicator（Covaris社製；型番PN 500295）
・E. coli DNA Ligase（Enzymatics社製；型番L6090L）
・E. coli DNA Ligase Buffer（Enzymatics社製；型番B6090）
・ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（Enzymatics社製；型番G5010L）
・Ｔａｑ−Ｂ  ＤＮＡポリメラーゼ（Enzymatics社製；型番P7250L）
・ニックトランスレーションのための５’アダプターのオリゴヌクレオチド（１３−４８９）（表１）
・置換−切断のための５’アダプターのオリゴヌクレオチド（１３−５９５）（表１）
・Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ（Enzymatics社製；型番L6060L）
・SPRIselect（Beckman coulter社製；型番B23419）
【０２０３】
方法：
大腸菌ゲノムＤＮＡを、ＤＮＡ懸濁緩衝液（Teknova社製；型番T0227）中に、１００ｎｇ／μｌの濃度で再懸濁させた。ＤＮＡを、M220 Focused-ultrasonicatorにより、１５０塩基対の平均サイズへと断片化した。その後、Pippin Prepを使用して、約１５０ｂｐ〜約１８５ｂｐの緊密な分布の断片化ＤＮＡを、２％のアガロースゲル上でサイズ選択した。
【０２０４】
１００ｎｇのサイズ選択された大腸菌ゲノムＤＮＡを、増強されたアダプターのライゲーション法によりライブラリーを調製するのに使用した。ポリッシング反応物を、１倍濃度のBlue Buffer、各々１００μＭずつのｄＮＴＰ、３ｕｎｉｔのＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ、５ｕｎｉｔのDNA Polymerase I, Large (Klenow) Fragment、１０ｕｎｉｔのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼの最終濃度を含む、３０μｌ中に集成した。反応物を、３７℃で２０分間にわたりインキュベートした。DNA Clean & Concentrator-5を使用して、ＤＮＡを精製し、ＤＮＡ懸濁緩衝液を伴う１５μｌ中に溶出させた。３’アダプターのライゲーション反応物を、１倍濃度のＴ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液、２２０ピコモルの３’アダプターの第１のオリゴヌクレオチド、４４０ピコモルの３’アダプターの第２のオリゴヌクレオチド、１５μｌの精製ＤＮＡ及び１２００ｕｎｉｔのＴ４  ＤＮＡリガーゼを含む、３０μｌ中に集成した。反応物を、２５℃で１５分間にわたりインキュベートした。ＤＮＡを、５０μｌの容量とし、７０μｌのSPRIselectビーズ（１．４倍の比）を使用して、精製及びサイズ選択した。ＤＮＡを、１５μｌのＤＮＡ再懸濁緩衝液中に溶出させた。３’アダプターの部分的分解、５’アダプターのアニーリング、５’末端のトリミング及び５’アダプターのライゲーションの全ては、次の反応物であって、１倍濃度の大腸菌ＤＮＡリガーゼ緩衝液又は１倍濃度のＴａｑ  ＤＮＡリガーゼ緩衝液、各々２００μＭずつのｄＮＴＰ又は各々２００μＭずつのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ（又はｄＮＴＰを含まない）、２００ピコモルのニックトランスレーションのための５’アダプターのオリゴヌクレオチド又は置換−切断のための５’アダプターのオリゴヌクレオチド、１０ｕｎｉｔの大腸菌リガーゼ又は４０ｕｎｉｔのＴａｑ  ＤＮＡリガーゼ、２ｕｎｉｔのウラシルＤＮＡグリコシラーゼ、１０ｕｎｉｔのＴａｑ−Ｂ  ＤＮＡポリメラーゼ及び３’アダプターのライゲーション反応後において精製された１５μｌのＤＮＡを含有する、３０μｌの最終容量中に集成された反応物中で行った。反応物を、４０℃又は４５℃で１０分間にわたり、又は（４５℃で４５秒間〜６５℃で５秒間にわたる）の３０サイクルでインキュベートした（ライブラリー５）。ＤＮＡを、５０μｌの容量とし、４０μｌのSPRIselectビーズ（０．８倍の比）を使用して、精製及びサイズ選択した。ＤＮＡを、２０μｌ中に溶出させ、Kapa Library Quantification Kit - Illumina/Universal（型番KK4824）を使用するｑＰＣＲにより定量化した。
【０２０５】
結果：
ライブラリー濃度は、プロット（図２８、パネルＡ）上で報告し、ライブラリーは、６％のポリアクリルアミドゲル上で、変性条件下における電気泳動により可視化した（図２８、パネルＢ）。インプットＤＮＡは、約１５０塩基〜約１８５塩基の間を移動した（図２８、レーンＩ、パネルＢ）。３’アダプターのライゲーションステップ後にアリコートを採取し、ゲル上にロードした。この産物は、６４塩基の３’アダプターの付加に対応する、約２２５〜約２５０塩基の間を移動した（図２８、レーンＬ、パネルＢ）。５’アダプターのライゲーションの前の、ＤＮＡの５’末端における、１又は２以上の塩基の除去及び５’リン酸基の露出における、Ｔａｑ−Ｂ  ＤＮＡポリメラーゼの寄与を、ライブラリー２と対比したライブラリー１において実証した（図２８、レーン１及び２、パネルＡ及びＢ）。Ｔａｑ−Ｂを伴わずに作製されたライブラリー１の濃度（２．６ｎＭ）は、Ｔａｑ−Ｂ  ＤＮＡポリメラーゼを伴って作製されたライブラリー２の濃度（７．９ｎＭ）の３分の１である。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによる処理の後であってもなお、断片化ＤＮＡのうちの７５％は、ライゲーション適合性とするために、それらの５’末端の処理を要求した。完成したライブラリーもまた、ゲル上にロードした（図２８、レーン１及び２、パネルＢ）。これらのライブラリーは、５８塩基のニックトランスレーションのための５’アダプターのオリゴヌクレオチド又は置換−切断のための５’アダプターのオリゴヌクレオチド及び６４塩基の３’アダプターの付加に対応する、約２７５塩基〜約３００塩基の間を移動した。ライブラリー１の産物が提示されるときの強度は、ライブラリー２のバンドより小さかった（図２８、パネルＢ）。ライブラリー３及び４は、それぞれ、３’アダプターの部分的分解ステップ、５’アダプターのアニーリングステップ、５’末端のトリミングステップ及び５’アダプターのライゲーションステップにおいて、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ及び大腸菌リガーゼ又はＴａｑ  ＤＮＡリガーゼにより作製された。ライブラリー３の濃度（４．８ｎＭ）は、ライブラリー２の濃度（７．９ｎＭ）の約６０％であった。この収率の３０％の喪失は、大腸菌ゲノム内のシトシン「Ｃ」の比率（２５％）と関連する。ＤＮＡ基質の５’末端がシトシンであるたびに、Ｔａｑにより、ニックトランスレーションのための５’アダプターのオリゴヌクレオチドを伸長することができず、５’末端をトリミングすることもできない。また、ＤＮＡ基質の５’末端において、２及び３の連続シトシンを有するさらなる確率も、それぞれ、６．２５％及び１．５％存在する。Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼによる、４５℃におけるライゲーション（ライブラリー４）も、４０℃における大腸菌リガーゼ（５．２ｎＭ）（ライブラリー３）と比較して、同様の収率（４．８ｎＭ）をもたらした。置換−切断のための５’アダプターのオリゴヌクレオチドにより作製されたライブラリー５（４．２ｎＭ）は、ニックトランスレーションのための５’アダプターのオリゴヌクレオチドにより作製されたライブラリー２（７．９ｎＭ）ほど効率的ではなかった。
【０２０６】
結論：
開示されるアダプターのライゲーション法によるライブラリーの作製は成功した。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼによる５’末端ＤＮＡのトリミングは、５’末端の処理ステップを有さないライブラリーと比較した場合、５’アダプターのライゲーション産物の収率の３倍の増大を可能とする（ライブラリー２と対比したライブラリー１）。Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ（ライブラリー４）及び大腸菌リガーゼ（ライブラリー３）のいずれも、ニックトランスレーションの後で、５’アダプターを効率的にライゲーションした。Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼはまた、置換−切断の後でも、５’アダプターをライゲーションした（ライブラリー５）。ニックトランスレーション時に、３つのｄＮＴＰ（ライブラリー３及び４）の代わりに、４つのｄＮＴＰ（ライブラリー２）を使用することにより、より多くのＤＮＡ基質の、５’アダプターへのライゲーションを可能とすることができる。
【実施例１１】
【０２０７】
アダプターのライゲーションとカップリングさせた５’塩基のトリミングを使用して調製されたＮＧＳライブラリーについての配列解析
根拠：この実験では、ＮＧＳライブラリーの構築へのそれらの例示的適用において提示される反応の有用性を実証する。ライブラリーは、せん断された大腸菌ＤＮＡから構築し、次いで、ゲノムの広範な塩基組成にわたり得られるカバレッジの優れた均一性を実証するために、シークエンシングした。
【０２０８】
材料：
・Blue Buffer（Enzymatics社製；型番B0110）
・T4 DNA Ligase (Rapid)（Enzymatics社製；型番L6030-HC-L）
・１０倍濃度のT4 DNA Ligase Buffer（Enzymatics社製；型番B6030）
・ＰＣＲグレード１００ｍＭ  ２’デオキシヌクレオシド５’三リン酸（ｄＮＴＰ）セット（Invitrogen（Life technologies）社製；型番10297-018）
・アデノシン５’三リン酸（ＡＴＰ）（New England Biolabs社製；型番P0756S）
・クレノウ断片（Enzymatics社製；型番P7060L）
・Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ（Enzymatics社製；型番P7080L）
・Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Enzymatics社製；型番Y904L）
・エビアルカリホスファターゼ（Affymetrix社製；型番78390）
・T4 DNA Ligase (Rapid)（Enzymatics社製；型番L6030-HC-L）
・１０倍濃度のT4 DNA Ligase Buffer（Enzymatics社製；型番B6030）
・３’アダプター；第１のオリゴヌクレオチド１３−５１０（表１）
・３’アダプター；第２のオリゴヌクレオチド１３−７１２（表１）
・大腸菌ゲノムＤＮＡ  ＡＴＣＣ  １１３０３株（Affymetrix社製；型番14380）
・M220 Focused-ultrasonicator（Covaris社製；型番PN 500295）
・E. coli DNA Ligase（Enzymatics社製；型番L6090L）
・E. coli DNA Ligase Buffer（Enzymatics社製；型番B6090）
・ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（Enzymatics社製；型番G5010L）
・Ｔａｑ−Ｂ  ＤＮＡポリメラーゼ（Enzymatics社製；型番P7250L）
・ニックトランスレーションのための５’アダプターのオリゴヌクレオチド（１３−４８９）
・SPRIselect（Beckman coulter社製；型番B23419）
【０２０９】
方法：
大腸菌ゲノムＤＮＡを、ＤＮＡ懸濁緩衝液（Teknova社製；型番T0227）中に、１００ｎｇ／μｌの濃度で再懸濁させた。ＤＮＡを、M220 Focused-ultrasonicatorにより、１５０塩基対の平均サイズへと断片化した。１００ｎｇの大腸菌covaris社ゲノムＤＮＡを使用して、ライブラリーを調製した。第１の脱リン酸化反応物を、１倍濃度のBlue Buffer、１００ｎｇの断片化された大腸菌ゲノムＤＮＡ及び１ｕｎｉｔのエビアルカリホスファターゼの最終濃度を含む、１５μｌの総容量中に集成した。反応物を、３７℃で１０分間にわたりインキュベートした。エビアルカリホスファターゼは、６５℃で５分間にわたり不活化させた。ポリッシング反応物を、１倍濃度のBlue Buffer、各々１００μＭずつのｄＮＴＰ、３ｕｎｉｔのＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ、５ｕｎｉｔのDNA Polymerase I, Large (Klenow) Fragment及び１５μｌの脱リン酸化反応物の最終濃度を含む、３０μｌ中に集成した。反応物を、２０℃で３０分間にわたりインキュベートした。DNA Clean & Concentrator-5を使用して、ＤＮＡを精製した。ＤＮＡを、ＤＮＡ懸濁緩衝液を伴う１５μｌ中に溶出させた。３’アダプターのライゲーション反応物を、１倍濃度のＴ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液、２２０ピコモルの３’アダプターの第１のオリゴヌクレオチド、４４０ピコモルの３’アダプターの第２のオリゴヌクレオチド、ポリッシング後において精製された１５μｌのＤＮＡ及び１２００ｕｎｉｔのＴ４  ＤＮＡリガーゼを含む、３０μｌ中に集成した。反応物を、２５℃で１５分間にわたりインキュベートした。容量を５０μｌへと調整した後で、４５μｌのSPRIselectビーズ（０．９倍の比）を使用して、ＤＮＡを精製及びサイズ選択した。ＤＮＡを、１５μｌのＤＮＡ再懸濁緩衝液中に溶出させた。３’アダプターの部分的分解、５’アダプターのアニーリング、５’末端のＤＮＡトリミング及び５’アダプターのライゲーションの全ては、次の反応物であって、１倍濃度の大腸菌ＤＮＡリガーゼ、各々２００μＭずつのｄＮＴＰ、２００ピコモルのニックトランスレーションのための５’アダプターのオリゴヌクレオチド、１０ｕｎｉｔの大腸菌リガーゼ、２ｕｎｉｔのウラシルＤＮＡグリコシラーゼ、１０ｕｎｉｔのＴａｑ−Ｂ  ＤＮＡポリメラーゼ及び３’アダプターのライゲーション反応後において精製された１５μｌのＤＮＡを含有する、３０μｌの最終容量中に集成された反応物中で行った。反応物を、４０℃で１０分間にわたりインキュベートした。容量を５０μｌへと調整した後で、７０μｌのSPRIselectビーズ（１．４倍の比）を使用して、ＤＮＡを精製した。ＤＮＡを、２０μｌ中に溶出させ、Kapa Library Quantification Kit - Illumina/Universal（型番KK4824）を使用するｑＰＣＲにより定量化した。ＤＮＡを、最終濃度を０．１ｍＭとする水酸化ナトリウムで５分間にわたり変性させ、６００μｌの１０ｐＭのライブラリーを、MiSeq（Illumina社製）上にロードした。
【０２１０】
結果：
ｑＰＣＲにより定量化されたライブラリー濃度は、２．８ｎＭであった。７６塩基のペアエンドリードは、Illumina社製MiSeqのｖ２化学反応により作製した。９２８Ｋ／ｍｍ２のクラスターが作製され、スコアＱ３０は、第１のリード及び第２のリードについて、それぞれ、９７．８％及び９６．９％であった。配列データの品質は、FastQC報告書（Babraham Bioinformatics社製）を使用して評価した。解析の概要は、緑色のチェックマーク９つ、黄色のエクスクラメーションマーク（警告）２つを示したが、赤色の×マーク（不合格）は、観察されなかった（図２９、パネルＡ）。全配列中の全塩基の全体的なＧＣ％は、大腸菌ゲノムについて予測されるとおり、５０％であった（緑色のチェックマーク、図２９、パネルＢ）。配列の品質は、解析された７６塩基を通して、あらゆるリードにおいて優良であった（緑色のチェックマーク、図２９、パネルＣ）。各塩基の比率を、パネルＤにプロットした。Ｇ／Ｃ量とＡ／Ｔ量との差違は、任意のリードにおいて、１０％未満であった（緑色のチェックマーク、図２９、パネルＤ）。ＧＣ含量は、解析された７６塩基を通して、同様であった（緑色のチェックマーク、図２９、パネルＥ）。各配列の全長にわたるリードごとのＧＣ含量を、理論的分布と比較した（黄色のエクスクラメーションマーク、図２９、パネルＦ）。警告は、１５％を超えるリードにおいて、正規分布からの偏差和が見出されたために発せられた（黄色のエクスクラメーションマーク、図２９、パネルＦ）。「塩基ごとのＮ含量」又は「配列長の分布」については、警告が発せられなかった（「概要」、図２９、パネルＡ）。「配列の複製レベル」は、３５．８５％であった（図２９、パネルＧ）。黄色の警告は、１３５倍という高レベルのカバレッジで、非固有の配列が、全体のうちの２０％超を占めるために発せられた（黄色のエクスクラメーションマーク、図２９、パネルＧ）。過剰表示配列又はｋマーは、報告されなかった（「概要」、図２９、パネルＡ）。事実上、アダプター二量体は、観察されなかった（０．０２％、データは図示しない）。また、ＧＣバイアスも、Picard CollectGcBiasMetricsを使用して査定した。カバレッジの均一性は、広範にわたる塩基組成を通じて保存された。カバレッジの偏差が観察されるのは、ＧＣ含量が、１０％未満であるか又は８０％を超える場合に限られた。塩基品質は、塩基コールにおける９９．８％の確度に対応する、Ｑ２５を上回った。ここでもまた、低品質が観察されるのは、ＧＣ含量が極度に低値の場合と極度に高値の場合に限られた。
【０２１１】
結論：
断片化された大腸菌ゲノムＤＮＡを使用するライブラリーの作製に成功した。シークエンシングは、ＧＣ含量の範囲を通じて、データ品質が高く、カバレッジにバイアスが見られないことを実証した。
【実施例１２】
【０２１２】
ＴＰ５３遺伝子の包括的カバレッジと組み合わされた、がんホットスポットパネル
根拠：合計５１のアンプリコンを、ＴＰ５３遺伝子の全コード領域のほか、がんの臨床で適用可能な変異を表す、３０のホットスポット遺伝子座もカバーするように設計した。
【０２１３】
根拠：このアンプリコンパネルは、開示される方法についての概念実証であって、５１のアンプリコンが、反応に大きく影響するミニアンプリコンの非存在のほか、限定的なマルチプレックスサイクル数を使用して達成しうる、アンプリコン間のカバレッジの均一性も実証するように著明な重複を有する概念実証を提供する。加えて、シークエンシングされたライブラリー内に、プライマー二量体、及び非特異的な、オフターゲットの増幅産物が現れないため、高比率の標的リードが、プライミングの特異性を実証する。
【０２１４】
材料：
・ヒトＨａｐＭａｐゲノムＤＮＡ（Coriell Institute、NA12878）
・KAPA HiFi HotStart Uracil+ ReadyMix（KAPA Biosystems社製；型番KK2802）
・１０２の標的特異的プライマー（表２）
・３’アダプターのオリゴヌクレオチドの短縮配列及び切断性塩基を含有するユニバーサルプライマー１４−８８２（表２）
・E. coli DNA Ligase Buffer（Enzymatics社製；型番B6090）
・アダプターのライゲーションステップのための、５’アダプターのオリゴヌクレオチド（１４−５７１）
・アダプターのライゲーションステップのための、３’アダプターのオリゴヌクレオチドの５’部分（１４−８７７）
・アダプターのライゲーションステップのための、リンカーオリゴヌクレオチド１４−３８２（表２）
・E. coli DNA Ligase（Enzymatics社製；型番L6090L）
・ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（Enzymatics社製；型番G5010L）
・エンドヌクレアーゼVIII（Enzymatics社製；型番Y9080L）
・Ｔａｑ−Ｂ  ＤＮＡポリメラーゼ（Enzymatics社製；型番P7250L）
・SPRIselect（Beckman coulter社製；型番B23419）
・精製ステップのための、２０％のPEG-8000／２．５ＭのＮａＣｌ溶液
【０２１５】
方法：
ヒトゲノムＤＮＡを、ＤＮＡ懸濁緩衝液（Teknova社製；型番T0227）中に、２ｎｇ／μｌの濃度で希釈した。２分間にわたりボルテックスすることにより、ＤＮＡを軽くせん断した。この１０ｎｇのせん断されたゲノムＤＮＡを使用して、ライブラリーを調製した。増幅の第１の反応物を、１倍濃度のKAPA HiFi HotStart Uracil+ ReadyMix、１０ｎｇのせん断されたヒトゲノムＤＮＡ、３００ピコモルのユニバーサルプライマー及び最終濃度を０．８５ｕＭとされ、異なる比で存在する、１０２の標的特異的プライマーのミックスの最終濃度を含む、３０μｌの総容量中に集成した。この反応物を、以下のサイクリングプログラム：９５℃で３分間に続いて、９８℃で２０秒間、６３℃で５分間及び７２℃で１分間の４サイクルにかけて、標的特異的アンプリコンを作製し、９８℃で２０秒間及び６４℃で１分間の２３サイクルにより終結させて、標的特異的アンプリコンの複数のコピーを産生した。容量を５０μｌへと調整した後で、６０μｌのSPRIselectビーズ（１．２倍の比）を使用して、ＤＮＡ産物を精製した。ビーズを、１倍濃度の大腸菌リガーゼ緩衝液、１００ピコモルのリンカーオリゴヌクレオチド、１０ｕｎｉｔの大腸菌リガーゼ、１０ｕｎｉｔのエンドヌクレアーゼVIII、２ｕｎｉｔのウラシルＤＮＡグリコシラーゼ、２０ｕｎｉｔのＴａｑ−Ｂ  ＤＮＡポリメラーゼ、１００ピコモルの５’アダプターのオリゴヌクレオチド及び１００ピコモルの３’アダプターのオリゴヌクレオチドの５’部分を含有する１倍濃度の反応物ミックス５０μｌ中に再懸濁させた。反応物を、３７℃で１０分間にわたりインキュベートし、次いで、４２．５μｌの２０％のPEG-8000／２．５ＭのＮａＣｌ溶液（０．８５倍の比）を添加することにより精製した。ＤＮＡを、２０μｌ中に溶出させ、Kapa Library Quantification Kit - Illumina/Universal（型番KK4824）を使用するｑＰＣＲにより定量化した。ＤＮＡを、最終濃度を０．１ｍＭとする水酸化ナトリウムで５分間にわたり変性させ、６００μｌの１０ｐＭのライブラリーを、MiSeq（Illumina社製）上にロードした。
【０２１６】
結果：
ｑＰＣＲにより定量化されたライブラリー濃度は、１９．１ｎＭであった。１０１塩基のペアドエンドリードは、Illumina社製MiSeqのｖ２化学反応により作製した。データ解析の前に、Cutadaptプログラムを使用して合成プライマー配列を除去するように、リード１及びリード２の両方の５’末端からの配列特異的トリミングを実施した。BWA-MEMツールを使用して、ヒトゲノム及びターゲティングされる領域へと対合させたリードのアライメントは、例外的な高品質データを示し、９８％が、ターゲティングされる領域へと配列決定された。また、BEDtoolsを使用して、カバレッジデータも得た。カバレッジの均質性は、１００％であったが、これは、５１のアンプリコンの各々が、最終的なライブラリー内で表示されることを意味する。また、各アンプリコン内の各個別の塩基のカバレッジも計算したところ、塩基ごとの平均カバレッジより２０％大きかったが、これは、５１のアンプリコンのうちのいずれも、最終産物内で過小表示されないことを意味する。図４５は、ＴＰ５３遺伝子のコードエクソンをカバーする重複アンプリコンについて得られたカバレッジについて描示する。図４６は、VarScan及びSAMtoolsを使用する配列解析により得られた、頻度１８％のバリアントのコールについて描示する。
【０２１７】
結論：
ターゲティング型アンプリコンライブラリーは、ヒトゲノムＤＮＡを使用する作製に成功した。シークエンシングは、高品質データを実証した。
【０２１８】
【表１】
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【０２１９】
【表２】
2018138052.tif 000003
2018138052.tif 000004
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【０２２０】
前出の開示を、以下の番号付けされた項において提供される、本開示の多様な態様及び実施形態についての以下の記載により補足する。
１．処理された基質分子を産生する方法であって、
（ｉ）第１のポリヌクレオチドを、少なくとも部分的に二本鎖である基質分子の３’末端へとライゲーションするステップと；
（ii）アニーリングを促進する条件下で、第２のポリヌクレオチドを、第１のポリヌクレオチドとアニールさせるステップと；
（iii）少なくとも１つのヌクレオチドを、基質分子の５’末端から切除するステップと；次いで、
（iv）第２のポリヌクレオチドを、二本鎖基質分子の５’末端へとライゲーションして、処理された基質分子を産生するステップと
を含む方法。
２．ステップ（ｉ）の前に、基質分子を、ホスファターゼ酵素と接触させるステップをさらに含む、項１の方法。
３．基質分子を、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を保有するポリメラーゼ酵素と接触させることにより、平滑末端化された基質分子を作製するステップをさらに含む、項２の方法。
４．基質分子を、鋳型非依存性ポリメラーゼと接触させて、基質分子の３’末端をアデニル化するステップをさらに含む、項３の方法。
５．基質分子が、天然に存在するか、又は基質分子が、合成である、項１〜４のいずれかの方法。
６．基質分子が、天然に存在する、項５の方法。
７．基質分子が、ゲノムＤＮＡである、項６の方法。
８．ゲノムＤＮＡが、真核生物ゲノムＤＮＡ又は原核生物ゲノムＤＮＡである、項７の方法。
９．ゲノムＤＮＡを、インビトロ又はインビボで断片化する、項７又は８の方法。
１０．インビトロにおける断片化を、せん断、エンドヌクレアーゼによる切断、超音波処理、加熱、アルファ線源、ベータ線源、又はガンマ線源を使用する照射、金属イオンの存在下における化学的切断、ラジカルによる切断、及びこれらの組合せからなる群から選択される工程により実施する、項９の方法。
１１．インビボにおける断片化を、アポトーシス、放射線、及びアスベストへの曝露からなる群から選択される工程により行う、項９の方法。
１２．基質分子が、合成であり、ｃＤＮＡ、全ゲノム増幅により産生されるＤＮＡ、少なくとも１つの二本鎖末端を含むプライマー伸長産物、及びＰＣＲアンプリコンからなる群から選択される、項５の方法。
１３．第１のポリヌクレオチドが、少なくとも部分的に二本鎖であり、オリゴヌクレオチド１及びオリゴヌクレオチド２を含む、項１〜１２のいずれかの方法。
１４．第２のポリヌクレオチドが、オリゴヌクレオチド１とアニールする、項１３の方法。
１５．アニーリングが、ニック、ギャップ、又は第２のポリヌクレオチドと基質分子との重複塩基を結果としてもたらす、項１４の方法。
１６．第２のポリヌクレオチドを、ポリメラーゼと接触させ、その結果、オリゴヌクレオチド２の分解をもたらす、項１４又は１５の方法。
１５．オリゴヌクレオチド２が、分解を受けやすい塩基を含む、項１３〜１６のいずれかの方法。
１６．オリゴヌクレオチド２が、ライゲーションを防止する、その３’末端における遮断基を含む、項１３〜１７のいずれかの方法。
１７．第２のポリヌクレオチドが、修飾塩基を含む、項１〜１６のいずれかの方法。
１８．アニーリングが、オリゴヌクレオチド１とオリゴヌクレオチド２とのデハイブリダイゼーションを結果としてもたらす、項１４の方法。
１９．（ｉ）第３のポリヌクレオチドを、少なくとも部分的に二本鎖である、さらなる基質分子の３’末端へとライゲーションするステップと；
（ii）アニーリングを促進する条件下で、第４のポリヌクレオチドを、第３のポリヌクレオチドへとアニールさせるステップと；
（iii）少なくとも１つのヌクレオチドを、さらなる基質分子の５’末端から切除するステップと；次いで、
（iv）第４のポリヌクレオチドを、二本鎖のさらなる基質分子の５’末端へとライゲーションして、処理された、さらなる基質分子を産生するステップと
をさらに含む、項１〜１８のいずれかの方法。
２０．第１のポリヌクレオチドと第３のポリヌクレオチドとが、同じである、項１９の方法。
２１．第２のポリヌクレオチドと第４のポリヌクレオチドとが、同じである、項１９又は２０の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
2018138052.tif 000019
【図９Ｂ】
2018138052.tif 000020
【図９Ｃ】
2018138052.tif 000021
【図９Ｄ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
2018138052.tif 000025
【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
2018138052.tif 000029
【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
2018138052.tif 000039
【図２２】
2018138052.tif 000040
【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
2018138052.tif 000042
【図２４】
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【図２５】
2018138052.tif 000044
【図２６】
2018138052.tif 000045
【図２７】
2018138052.tif 000046
【図２８Ａ】
2018138052.tif 000047
【図２８Ｂ】
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【図２９Ａ−１】
2018138052.tif 000049
【図２９Ａ−２】
2018138052.tif 000050
【図２９Ｂ−１】
2018138052.tif 000051
【図２９Ｂ−２】
2018138052.tif 000052
【図２９Ｂ−３】
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【図２９Ｂ−４】
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【図２９Ｃ】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４Ａ】
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【図４４Ｂ】
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【図４５】
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【図４６】
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【配列表】
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