(57)【要約】【課題】  ホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼＡ１濃度を測定することにより、甲状腺疾患を検出する方法ならびに甲状腺疾患治療効果を判定する方法および試薬を提供する。【解決手段】  ヒト検体中のホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼＡ１を測定し、甲状腺疾患を検出する。また、甲状腺疾患患者の治療効果を判定するための情報を提供する方法であって、前記患者由来の検体中のホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼＡ１を測定すること、及びその測定値と前記患者の治療効果との関連付けを行う。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト検体中のホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼＡ１を測定することを特徴とする、甲状腺疾患の検出方法。
【請求項２】
甲状腺疾患患者の治療効果を判定するための情報を提供する方法であって、
前記患者由来の検体中のホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼＡ１を測定すること、及び
その測定値と前記患者の治療効果との関連付けをすること、
を含む方法。
【請求項３】
甲状腺疾患が甲状腺機能亢進症又は甲状腺炎である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
甲状腺機能亢進症がバセドウ病である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼＡ１を、ホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼＡ１を認識する抗体を用いた免疫化学的方法により測定する、請求項１〜４いずれかに記載の方法。
【請求項６】
ホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼＡ１を認識する抗体を含有することを特徴とする、請求項１〜５いずれかに記載の方法により、前記疾患を検出又は治療効果を判定するための情報を提供するための試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はヒト検体中のホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼＡ１濃度を測定することによる甲状腺疾患の検出方法、治療効果を判定するための情報を提供する方法とその試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
甲状腺機能亢進症の診断ならびに管理は、甲状腺ホルモン、甲状腺ホルモンによりネガティブフィードバックを受ける甲状腺刺激ホルモンが使われている。甲状腺ホルモンは個々の患者により至適甲状腺ホルモン値が異なり、わずかに基準範囲を超えていたとしても問題ないことや、また逆に基準範囲内に収まっていたとしても甲状腺ホルモンが該当患者にとって至適でない場合もあり、甲状腺ホルモンの一般的値を基準にした場合、症状の判断が困難な場合がある。甲状腺ホルモンによりネガティブフィードバックを受ける甲状腺刺激ホルモンも同時に測定することが多いが、甲状腺刺激ホルモンの変動は、甲状腺ホルモンの作用から２週間から長い場合数ヶ月ほどのタイムラグがあるため甲状腺機能をリアルタイムに反映しないという問題がある。また、バセドウ病の原因物質の１つである抗甲状腺刺激ホルモン抗体（以下、ＴＲＡｂと記載する場合もある）もバセドウ病の診断弁別には有効であるが、治療介入後の変動は甲状腺ホルモン、甲状腺刺激ホルモンよりさらにタイムラグがあるため、甲状腺機能のリアルタイムでの状態把握には向かない。そのため甲状腺機能の補助的検査項目として、甲状腺ホルモンの状態を反映するアルカリ性ホスファターゼや総コレステロールが利用されることがあるが、これらの検査項目は甲状腺疾患を疑う際の指標にされているが、甲状腺疾患に限らず生活習慣など他の要因により大きく変動するため甲状腺機能の指標としては限界がある。
【０００３】
臨床現場において甲状腺ホルモンは、脂質異常症、低脂血症、動悸、ふるえなどありふれた健診結果異常、患者からの訴えにより検査する項目であり、健常人でも基準範囲から逸脱する例は多く典型的症状を示さない場合も多くあり、その場合、追加の血液検査、放射性ヨウ素取込みによる画像診断、超音波検査、生検検査等の追加検査により甲状腺疾患を確定させる。そのためバセドウ病に代表される甲状腺機能亢進症と基準範囲を逸脱している健常者とを弁別診断を可能とする簡便な検査法が切望されている。
【０００４】
さらに、バセドウ病においては抗甲状腺薬による治療介入が代表的であるが、投薬により甲状腺ホルモンの正常化を目安に投薬が継続され、甲状腺ホルモンの正常化後の甲状腺刺激ホルモンの正常化を待つ。この際、投薬量を減量しながら治療を進めるが、甲状腺ホルモン正常化から、甲状腺刺激ホルモン正常化までの数週間から数ヶ月の間、投薬量をコントロールする指標がないため、過剰投薬による甲状腺機能の過剰低下に陥るケースもあるため甲状腺機能をリアルタイムに反映するマーカーも要望されている。
【０００５】
ホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼＡ１は１９９７年同定されたリパーゼファミリーに属する蛋白質であり、極性頭部にセリン残基を有するセリンリン脂質であるホスファチジルセリンを特異的基質としてｓｎ−１位のアシル基を加水分解する酵素である（非特許文献１）。本酵素は活性化血小板やマクロファージより主に産生され、肥満細胞活性化による炎症反応への関与は古くから知られているが、最近になりリゾホスファチジルセリン受容体が同定されたことからリゾホスファチジルセリンとその受容体を介した様々な細胞機能調節等に関与していることが想定されている。また、血小板細胞表面に露出するホスファチジルセリンの除去による凝固系の制御や、アポトーシス細胞表面におけるホスファチジルセリンの除去等の死細胞処理の制御に関与していることも示唆されるが、未だ不明な点も多い。
【０００６】
血清中のホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼＡ１濃度が変動する疾患の報告は少なく、全身性エリテマトーデスでの濃度上昇（特許文献１）、癲癇での上昇、白血病での低値化、また動物モデルとして敗血症モデルマウスでの血清濃度上昇ならびに虚血性脳疾患モデルラット脳組織での発現上昇（特許文献２）の報告があるが、甲状腺疾患との関連性を示す報告はない。
【０００７】
ホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼＡ１の測定自体は、例えば非特許文献２又は特許文献２に記載の方法により可能である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許第５６２５１５５号公報
【特許文献２】特許第５２８８７１２号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９７；２１９２?２１９８
【非特許文献２】Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  ２０１０；４１１：１０９０?１０９４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
これまでにホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼＡ１の血液中の濃度がいくつかの疾患で変動することが報告されているが、甲状腺疾患との関連性に関しては報告がなかった。本発明はホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼＡ１濃度を測定することにより、甲状腺疾患を検出する方法、ならびに甲状腺疾患に対する治療介入時の治療効果を判定するための情報を提供する方法、またその判定により投薬量をコントロールする方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、様々な内分泌疾患患者の血液中のホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼＡ１濃度を測定し、鋭意検討を重ねた結果、甲状腺疾患において血液中のホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼＡ１濃度が上昇し、治療介入による病状改善に伴い濃度が低減することを見いだし、本発明に到達した。
【００１２】
即ち本発明は下記の発明を包含する：
（１）ヒト検体中のホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼＡ１を測定することを特徴とする、甲状腺疾患の検出方法。
（２）甲状腺疾患患者の治療効果を判定するための情報を提供する方法であって、
前記患者由来の検体中のホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼＡ１を測定すること、及び、
その測定値と前記患者の治療効果との関連付けをすること、
を含む方法。
（３）甲状腺疾患が甲状腺機能亢進症又は甲状腺炎である、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）甲状腺機能亢進症がバセドウ病である、（３）に記載の方法。
（５）ホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼＡ１を、ホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼＡ１を認識する抗体を用いた免疫化学的方法により測定する、（１）〜（４）いずれかに記載の方法。
（６）ホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼＡ１を認識する抗体を含有することを特徴とする、（１）〜（５）いずれかに記載の方法により、前記疾患を検出又は治療効果を判定するための情報を提供するための試薬。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、ヒト検体中のホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼＡ１を測定することにより甲状腺疾患を検出することが可能であり、治療介入後の効果判定も可能である。特許文献２等に記載の免疫学的定量試薬を用い測定を実施すれば、短時間でヒトホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼＡ１を定量可能であり、小規模医療施設においても簡便、低コストで検査可能な試薬を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】健常者ならびに未治療バセドウ病患者検体のホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼＡ１測定値の分布を示す図である。箱ひげ図の表示は典型的表記であり、具体的には中央の箱は２５−７５パーセンタイルと中央値を示しており、上限下限の各棒線は７５および２５パーセンタイル値の１．５倍以上のデータを除く最大値、最小値を示している。
【図２】未治療バセドウ病ならびに治療介入バセドウ病患者検体のホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼＡ１測定値の分布を示す図である。
【図３】治療介入バセドウ病検体をＦＴ４、ＦＴ３いずれかが陽性である群をプラス記号で、ＴＲＡｂが陽性である群をプラス記号で示し、４群に分類し、健常者を含めたホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼＡ１測定値の分布を示す図である。
【図４】健常者ならびに未治療甲状腺炎患者検体のホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼＡ１測定値の分布を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明において用いられる検体には特に限定はないが、血液成分等をあげることができ、その中でも全血、血球、血漿などが好ましく、血清、血漿が更に好ましい。
【００１６】
本発明において、甲状腺疾患としては特に限定されるものではないが、例えば甲状腺機能亢進症であるバセドウ病、あるいは甲状腺炎があげられる。
【００１７】
本発明においてホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼＡ１を測定する方法には特に限定はないが、例えばホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼＡ１を認識する抗体を用いた免疫化学的方法があげられる。より具体的には、ホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼＡ１を認識する抗体を含有する免疫学的測定試薬を用いて行うことができる。このとき、例えば測定対象のホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼＡ１を認識する固相化抗体と、それとは異なる部位で測定対象のホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼＡ１を認識する酵素等の標識化抗体とを含む試薬を用いて、サンドイッチ法により行うことができる。例えば非特許文献２、特許文献２に記載の試薬をあげることができる。
【００１８】
本発明は、ヒト検体中のホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼＡ１を測定することにより、甲状腺疾患の検出を可能とするものである。具体的には、ヒト検体中のホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼＡ１の測定値が、健常人の測定値より高い場合は、甲状腺疾患を有する、即ち甲状腺疾患を検出することができるものである。
【００１９】
また本発明は、甲状腺疾患患者の治療効果を判定するための情報を提供する方法であって、前記患者由来の検体中のホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼＡ１を測定すること、及びその測定値と前記患者の治療効果との関連付けをすること、を含む方法である。この際、甲状腺疾患の治療介入の前後または治療介入後に複数回測定を行い、ホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼＡ１の濃度が以前の測定時よりも低減した場合には、治療効果を有するとすることができる。なお、医師は、本発明により提供された情報等を参照して、治療効果を判定する。即ち、本発明の方法自体は、治療効果を判定する最終的な判断行為は含まず、医師に判断材料を提供する段階までを含むものである。
【実施例】
【００２０】
以下に実施例を示すが、本発明は実施例に記載された例に限られるものではない。以下の実験を行うに当たっては、各施設の研究倫理委員会での承認のもと実施した。ホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼＡ１（以下、ＰＳＰＬＡ１とする）濃度測定は、特許文献２と同様にしてサンドイッチ法による免疫学的測定試薬を作製し、自動免疫測定装置ＡＩＡシリーズ（東ソー社製）を用い実施した。
【００２１】
実施例１：ＰＳＰＬＡ１濃度の測定対象者の患者数、検体数ならびに年齢を表１に示す。バセドウ病患者（未治療血清５０検体、治療介入後血清６３検体）ならびに甲状腺炎において患者数と検体数の相違は同一患者で治療介入前後の測定を実施している対象者がいるため患者数に対し検体数が上回っている。対象者の血清中ＰＳＰＬＡ１の測定濃度一覧を表２に示す。また、本測定による健常者５２例のＰＳＰＬＡ１濃度の９５パーセンタイル上限値は２７．７μｇ／Ｌであった。
【００２２】
【表１】
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【００２３】
【表２】
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実施例２：健常者ならびにバセドウ病のＰＳＰＬＡ１濃度比較
実施例１で測定した健常者血清５２検体と未治療バセドウ病患者血清５０検体に分け、ＰＳＰＬＡ１測定値を比較した結果を図１に示す。また、未治療バセドウ患者血清５０検体と治療介入されたバセドウ患者血清６３検体のＰＳＰＬＡ１測定値を比較した結果を図２に示す。
【００２４】
健常者群と未治療バセドウ病群間、ならびに未治療バセドウ病群と治療介入バセドウ病群間において、表３に示す通り有意差が確認された。さらに健常者群と未治療バセドウ病群間、ならびに未治療バセドウ病群と治療介入バセドウ病群間の弁別能をＲＯＣ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）解析によりＡＵＣ（曲線下面積）、感度、特異度を算出した結果を表４に示す。健常者群と未治療バセドウ病群間のＡＵＣ、感度、特異度は高い数値を示しており、優れた弁別能を有していることが示された。未治療バセドウ病群と治療介入バセドウ病群間のＡＵＣ、感度、特異度に関しても十分な弁別能を有していることが示された。
【００２５】
【表３】
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【００２６】
【表４】
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実施例３：治療介入バセドウ病における治療効果に伴うＰＳＰＬＡ１濃度変動
実施例１で測定した治療介入したバセドウ病患者検体において、同時に測定したＦＴ４及びＦＴ３ならびにＴＲＡｂより４群に分類し、ＰＳＰＬＡ１濃度を検証した。ＦＴ４は１．６３ｎｇ／ｄＬ以下を陰性、ＦＴ３は３．８０ｐｇ／ｍＬ以下を陰性、ＴＲＡｂは２．０ＩＵ／Ｌ以下を陰性とし、その値を超えるものを陽性とし、ＦＴ４あるいはＦＴ３いずれかが陽性ならばＦＴ４／ＦＴ３は陽性群とした。
その濃度分布を図３に示す。ＦＴ４／ＦＴ３ならびにＴＲＡｂの陰性化に伴いＰＳＰＬＡ１濃度が低値を示す結果であった。
【００２７】
実施例４：健常者ならびに甲状腺炎のＰＳＰＬＡ１濃度比較
実施例１で測定した健常者血清５２検体と未治療甲状腺炎血清７検体に分けＰＳＰＬＡ１測定値を比較した結果を図４に示す。健常者群と未治療甲状腺炎群間において、表５に示す通り有意差が確認された。さらに健常者群と未治療甲状腺炎群間の弁別能をＲＯＣ解析によりＡＵＣ、感度、特異度を算出した結果を表６に示す。健常者群と未治療甲状腺炎群間のＡＵＣ、感度、特異度は高い数値を示しており、優れた弁別能を有していることが示された。
【００２８】
【表５】
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【００２９】
【表６】
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実施例５：ＰＳＰＬＡ１濃度と各種パラメーターとの相関性の検証
実施例１のバセドウ病患者におけるＰＳＰＬＡ１測定値と、甲状腺疾患に関連する各種パラメーターとの、相関性を検証した結果を表７に示す。一部、欠損値があるため使用した測定例数を表中に示している。その結果、ＦＴ３ならびにＦＴ４に対して比較的良い相関性が認められるものの、他のパラメーターとの相関性は非常に弱いものであった。
【００３０】
【表７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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