(57)【要約】      （修正有）【課題】質量分析法を使用して、生物学的試料から調製されたタンパク質消化物中の細胞膜結合Ｈｅｒ２タンパク質の切断バージョンの度合いを検出する診断的アッセイ法を提供する。【解決手段】腫瘍組織から得られた細胞膜結合Ｈｅｒ２タンパク質の酵素消化物中の特定の配列を有する１０個のペプチドと、ホルマリン固定パラフィン包埋組織に由来の細胞中の完全長Ｈｅｒ２タンパク質を質量分析法により測定し、完全長Ｈｅｒ２タンパク質の切断バージョンのレベルを計算する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的試料から調製されたタンパク質消化物中の、Ｈｅｒ２タンパク質の存在を検出し、Ｈｅｒ２タンパク質のレベル及びＨｅｒ２タンパク質の切断バージョンの度合いを測定する方法であって、質量分析法を使用して、前記生物学的試料から調製されたタンパク質消化物中の前記Ｈｅｒ２タンパク質から特定のペプチドを検出することと、前記試料中の前記Ｈｅｒ２タンパク質のこれら２つのバージョンのレベルを計算すること、とを含んでなり、前記レベルが、前記Ｈｅｒ２タンパク質の双方のバージョンの絶対レベルである、方法。
【請求項２】
前記ペプチドを検出することに先立って、前記タンパク質消化物を分画する工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記分画の工程が、ゲル電気泳動、液体クロマトグラフィー、毛管電気泳動、ナノ逆相液体クロマトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィー、又は逆相高性能液体クロマトグラフィーからなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記生物学的試料の前記タンパク質消化物が、前記液体組織プロトコルによって調製される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記タンパク質消化物が、プロテアーゼ消化物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記タンパク質消化物が、トリプシン消化物を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
質量分析法が、直列型質量分析法、イオントラップ質量分析法、トリプル四重極質量分析法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法、ＭＡＬＤＩ質量分析法、及び／又は飛行時間型質量分析法を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記使用される質量分析法のモードが、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）、及び／又は多重選択反応モニタリング（ｍＳＲＭ）である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｈｅｒ２断片ペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、及び配列番号９に記載される前記アミノ酸配列を含む、請求項１及び８に記載の方法。
【請求項１０】
前記生物学的試料が、血液試料、尿試料、血清試料、腹水試料、唾液試料、細胞、又は固形組織である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記組織がホルマリン固定組織である、実施例１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記組織がパラフィン包埋組織である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記組織が腫瘍から得られる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記腫瘍が一次腫瘍である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記腫瘍が二次腫瘍である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
１０個（１０）全てのＨｅｒ２断片ペプチドを検出及び定量化することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記１０個のＨｅｒ２断片ペプチドを定量化することが、１つの生物学的試料中の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０に示されるＨｅｒ２の約８個〜約４５個のアミノ酸残基のアミノ酸配列に対応するそれぞれのＨｅｒ２断片ペプチドの量を、異なる別個の生物学的試料中の同一のＨｅｒ２断片ペプチドの前記量と比較することを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記Ｈｅｒ２断片ペプチドを定量化することが、既知の量のスパイクされた内部標準ペプチドと比較することによって、生物学的試料中の前記１０個のＨｅｒ２断片ペプチドのうちの１つ以上の前記量を決定することを含み、前記生物学的試料中の天然ペプチドと前記内部標準ペプチドの双方が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０に示されるＨｅｒ２の約８個〜約４５個のアミノ酸残基の前記同一のアミノ酸配列に対応する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記内部標準ペプチドが、同位元素によりラベルされたペプチドである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記同位元素によりラベルされた内部標準ペプチドが、１８Ｏ、１７Ｏ、３４Ｓ、１５Ｎ、１３Ｃ、２Ｈ又はこれらの組み合わせから選択される１つ以上の重安定同位体元素を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
被験体から前記生物学的試料を得ることを更に含み、前記タンパク質消化物中の前記１０個の非修飾Ｈｅｒ２断片ペプチドのうちの１つ以上を検出かつ定量化することが、前記完全長Ｈｅｒ２タンパク質の存在、前記完全長Ｈｅｒ２タンパク質の切断バージョン（複数可）の存在、並びに／又はこれら双方の前記存在及び前記被験体における癌の関連の組み合わせを示唆する、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記Ｈｅｒ２断片ペプチドの検出されかつ定量化された量を、前記癌の前記診断的ステージ／グレード／進行状況に相関させることを更に含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記タンパク質消化物中の前記１０個のＨｅｒ２断片ペプチドのうちの１つ以上の前記存在、不在、又はその定量されたレベルに基づいて前記被験体のための治療を選択することを更に含む、請求項１６〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記Ｈｅｒ２タンパク質を特異的に標的化する治療薬の治療的有効量を投与することを更に含み、どの薬剤がどれほどの量で治療に使用されるかについての前記治療決定が、前記生物学的試料中の前記完全長Ｈｅｒ２タンパク質又は前記Ｈｅｒ２タンパク質の切断バージョンの特定のレベルに基づく、請求項１６〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
治療薬が、前記完全長Ｈｅｒ２タンパク質又は前記Ｈｅｒ２タンパク質の切断バージョンのいずれか若しくはその生物学的活性に特異的に結合しかつそれを阻害するよう設計されたものを含み、例えば、ハーセプチン、トラスツズマブ、及びラパチニブが挙げられるが、前記薬剤に限定されない、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記Ｈｅｒ２タンパク質の前記完全長又は前記完全長の切断バージョンを検出かつ定量化することが、他のタンパク質からの他のペプチドを検出及び定量化することと多重的に組み合わされることが可能であることで、どの薬剤がどれほどの量で治療に使用されるかについての前記治療決定が、前記生物学的試料中の他のペプチド／タンパク質と組み合わせて前記Ｈｅｒ２断片ペプチドの特定のレベルに基づく、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記生物学的試料が、前記液体組織プロトコル及び試薬による前記修飾された又は非修飾のＨｅｒ２断片ペプチドの定量分析用に処理加工されたホルマリン固定腫瘍組織である、請求項１０及び２１に記載の方法。
【請求項２８】
２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、又は９つ以上の配列番号１〜１０の単離したペプチドを含む、組成物。
【請求項２９】
（ｉ）１つ以上、２つ以上、３つ以上、又は４つ以上のＨｅｒ２細胞内ペプチドと、
（ｉｉ）１つ以上、２つ以上、３つ以上、又は４つ以上のＨｅｒ２細胞外ペプチドと、を含む組成物であって、前記細胞内ペプチドと細胞外ペプチドが、配列番号１〜１０の前記配列を有するペプチドから選択される、組成物。
【請求項３０】
前記組成物が、前記Ｈｅｒ２に由来の他のペプチドを含まない又は実質的に含まない、請求項２８又は２９に記載の組成物。
【請求項３１】
前記ペプチドが、１８Ｏ、１７Ｏ、３４Ｓ、１５Ｎ、１３Ｃ、２Ｈ又はこれらの組み合わせから選択される１つ以上、２つ以上、又は３つ以上の重安定同位体元素を含む同位体元素でラベルされた内部標準ペプチドである、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
前記組成物が、実質的に純粋であるか、又は他の細胞構成成分を含まない、請求項２８又は２９に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
本出願は、その内容が、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるものとする、２０１０年１２月８日に出願された、出願番号第６１／４２１，２０６号への優先権を主張するものである。
【発明の概要】
【０００２】
完全長Ｈｅｒ２タンパク質（Ｎｅｕプロトオンコジン、ｃ−ＥｒｂＢ−２、チロシンキナーゼ型細胞表面受容体ＨＥＲ２、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、又はＣＤ３４０としても既知）のサブ配列に由来の特定のペプチドが提供される。このペプチド配列及び各ペプチドに関する断片化／遷移イオンは、質量分析法に基づく選択反応モニタリング（ＳＲＭ）アッセイで特に有用であり、これは多重反応モニタリング（ＭＲＭ）アッセイとも呼ぶこともでき、以降ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイと称する。
【０００３】
このＳＲＭ／ＭＲＭアッセイは、完全長Ｈｅｒ２タンパク質の存在を検出しかつその量を定量的に測定し、これと同時に生物学的試料中の完全長Ｈｅｒ２タンパク質の切断バージョンの量を検出しかつ定量的に測定するように使用することができる。このアッセイは、癌細胞中のＨｅｒ２タンパク質が完全長であるか又は切断型であるかを決定するために有用であり、これは、例えばホルマリン固定された癌組織などの癌患者組織から獲得された細胞において直接的に実行することができる。このＳＲＭ／ＭＲＭアッセイは、個々の癌患者に非常に重要であり、これは、異なる治療薬剤及び治療戦略を、１）Ｈｅｒ２タンパク質のどちらの型（完全長又は切断型）が、患者の特定の癌において発現されているか、及び２）患者の癌細胞中に存在するそれぞれの型の絶対量及び相対量（切断型に対する完全長Ｈｅｒ２の比）に基づいて、特定の癌患者の疾患を治療するよう使用することができるためである。したがって、このＳＲＭ／ＭＲＭアッセイが患者の癌細胞に提供する知識に基づいて、個々の癌患者について最適な治療法の決定がなされることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
【図１】図１は、ホルマリン固定され、液体組織溶解物が調製された細胞系からの液体組織溶解物で実施されたＳＲＭ／ＭＲＭアッセイからの結果を示す。
【発明の具体的説明】
【０００５】
１０個の特定のペプチドが、細胞膜結合Ｈｅｒ２タンパク質から提供され、このペプチドの具体的特徴が記載される。更に提供されるものは、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織に由来の細胞中の完全長Ｈｅｒ２タンパク質の切断バージョンの存在及び量（完全長Ｈｅｒ２の量と比較して）を決定するために有用な診断的アッセイ法である。
複数のペプチドは、完全長Ｈｅｒ２タンパク質の細胞内ドメイン（ＩＣＤ）に由来し、一方他の複数のペプチドは、完全長Ｈｅｒ２タンパク質の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に由来する。このペプチドは、表１に示される。
【０００６】
【表１】
2018013492.tif 000002
【０００７】
これらのペプチドは、質量分析法によるタンパク質の分析用、及びＳＲＭ／ＭＲＭ質量分析法に基づくアッセイでの使用のために最適化されるよう有利に決定された。より具体的には、このＳＲＭ／ＭＲＭアッセイは、ホルマリン固定された癌患者組織などの患者の組織試料から獲得された細胞から調製された複合タンパク質溶解物試料中で直接的に、これらのペプチドの１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上又は９つ以上の任意の組み合わせを測定することが可能である。一実施形態では、少なくとも１つの細胞内ペプチドと少なくとも１つの細胞外ペプチドが測定される。別の実施形態では、１つ以上、２つ以上、３つ以上、又は４つ以上の細胞内ペプチドと、１つ以上、２つ以上、３つ以上、又は４つ以上の細胞外ペプチドとの任意の組み合わせが測定される。少なくとも１つ以上の細胞内ペプチドと１つ以上の細胞外ペプチドとを測定することによって、ＨＥＲ２受容体の様々な型の量又は比を決定することができる。
【０００８】
ホルマリン固定組織からタンパク質試料を調製する方法は、その内容が、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，４７３，５３２号に記載されている。
米国特許第７，４７３，５３２号に記載される方法は、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手可能な液体組織試薬（Ｌｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｒｅａｇｅｎｔｓ）及びプロトコルを使用して好都合に実行されてもよい。
【０００９】
原理的には、例えば、既知の特殊性を有するプロテアーゼ（例えば、トリプシン）で消化させることによって調製された、Ｈｅｒ２タンパク質に由来の任意の予測されたペプチドを、代用レポーターとして使用して、質量分析法に基づくＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを使用して、試料中のＨｅｒ２タンパク質の存在度を決定することができる。同様に、Ｈｅｒ２タンパク質において潜在的に修飾されることが知られている部位でアミノ酸残基を含有する任意の予測されたペプチド配列がまた、潜在的に試料中のＨｅｒ２タンパク質の修飾の範囲をアッセイするよう使用されてもよい。しかしながら、驚くべきことに、Ｈｅｒ２タンパク質からの非常に多数の潜在的なペプチド配列が、質量分析法に基づくＳＲＭ／ＭＲＭアッセイ法における使用では不適切又は無効であることが見出されている。これらのペプチドは、例えば、質量分析法によって検出することが困難であるか、又は親タンパク質からペプチドを得るために使用される条件下では適切であるかである。このことは、米国特許第７，４７３，５３２号に提供される液体組織プロトコルを使用するホルマリン固定組織から調製されたタンパク質溶解物から情報を得るような場合に特に認められる。液体組織プロトコル及び試薬は、以下の実験工程を組織に実施することによって、質量分析用にホルマリン固定パラフィン包埋組織からペプチドを調製することが可能である。先ず初めに、組織を、緩衝液を含有する試験管に配置し、ここで組織が、高い温度で長時間、緩衝液中で加熱される。この緩衝液は、中性の緩衝液、すなわちトリス系緩衝液であるか、又は洗浄剤を含有する緩衝液であり、質量分析を妨害しない緩衝液であることが好都合である。次に、この組織が、トリプシン、キモトリプシン、及び／又はペプシンが挙げられるが、これらに限定されない１つ以上のプロテアーゼで処置される。予期せぬことに、Ｈｅｒ２タンパク質のために信頼性がありかつ正確なＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを開発するために、実際の液体組織溶解物中の候補の修飾された及び非修飾のペプチドを実験的に同定することが必要であることを見出した。特に、Ｈｅｒ２タンパク質からの多くのトリプシンペプチドが、ホルマリン固定パラフィン包埋組織からの液体組織溶解物では有効に又は全く検出されない可能性があることを見出した。したがって、ホルマリン固定組織試料から調製された液体組織溶解物中で検出することができるＨｅｒ２タンパク質からのこれらペプチドは、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを生物学的試料中でＨｅｒ２タンパク質の完全長又は切断バージョンを決定するよう開発することができる目的のペプチドである。
【００１０】
癌患者組織からの最も広範にかつ好都合に利用可能な組織の形態は、ホルマリン固定パラフィン包埋組織である。外科的に切除された組織のホルムアルデヒド／ホルマリン固定は、癌組織を保存するための世界的な規模での依然として最も一般的な方法であり、標準病理学的実施基準において承認された慣習である。ホルムアルデヒドの水溶液はホルマリンと呼ばれる。「１００％」のホルマリンは、酸化及び重合化の程度を制限するための少量の安定化剤（通常はメタノール）を伴う、水中のホルムアルデヒドの飽和溶液（これは約４０体積％又は３７質量％である）からなる。そこで組織が保存される最も一般的な方法は、全組織を、水性ホルムアルデヒド（一般的には１０％中性緩衝ホルマリンと呼ばれる）中に長時間（８時間〜４８時間）浸漬し、続いて室温での長期保存のために、固定された全組織をパラフィンワックス中に埋め込むことである。したがって、ホルマリン固定された癌組織を分析するための分子分析法は、癌患者組織の分析のために、最も受け入れられかつ頻繁に利用されている方法であろう。
【００１１】
ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイからの結果は、そこから組織が採取され保存された患者の特定の癌内における完全長Ｈｅｒ２タンパク質と完全長Ｈｅｒ２タンパク質の切断型の存在との双方の正確かつ精密な定量レベルを相関させるように使用することができる。これは、癌についての診断的情報を提供するのみならず、医師又は他の医療専門家が患者のために適切な治療を決定することも可能にする。病変した組織又は他の患者の試料におけるタンパク質発現のレベルについての診断的かつ治療的に重要な情報を提供するこのようなアッセイは、コンパニオン診断アッセイと呼ばれる。例えば、このようなアッセイは、癌のステージ又は程度を診断し、患者が最も応答する可能性が高い治療薬剤を決定するよう設計することができる。切断型Ｈｅｒ２タンパク質の特定の形態を同定することは、このアッセイにとって重要なことではない。Ｈｅｒ２の切断は、Ｈｅｒ２タンパク質活性を阻害する薬剤に対する耐性の原因であるという事実があり、切断の程度を検出かつ定量化する能力は、癌がＨｅｒ２拮抗剤に耐性があるかどうかの正確な予測を可能にする。
【００１２】
本発明に記載される方法は、選択反応モニタリング質量分析法によって実施することができる。この方法では、表１のリストからの２つ又はそれ以上のペプチドの検出が、ＦＦＰＥ組織から獲得された細胞中の完全長Ｈｅｒ２タンパク質の存在を示し、このペプチドは、ＦＦＰＥ組織から調製された液体組織溶解物のＭＲＭ／ＳＲＭ分析におけるＩＣＤ及びＥＣＤの双方ともに同定する。逆に、ＥＣＤに特異的に由来する表１中のリストからの１つ以上のペプチドの不在は、ＩＣＤからの１つ以上のペプチドの同時検出とともに、Ｈｅｒ２タンパク質が切断型で存在することを示す。加えて、ＩＣＤペプチド（複数可）のＭＲＭ／ＳＲＭシグナルと比較してのＥＣＤペプチド（複数可）のペプチドＭＲＭ／ＳＲＭシグナルの定量的量での減少（比）は、少なくともＨｅｒ２タンパク質の切断バージョン又はバージョン（複数）の存在を示唆し、ＩＣＤペプチドシグナルに対するＥＣＤペプチドシグナルの比は、完全長Ｈｅｒ２タンパク質に対する切断型Ｈｅｒ２タンパク質の比を示唆する。この方法は、患者の癌組織から得られた癌細胞に直接的に実施され、組織顕微解剖の方法によるものが最も好ましく、更にこの方法は、異なる治療試薬が、完全長のＨｅｒ２タンパク質とその切断型のそれぞれに相互作用しかつそれを不活性化するために、癌治療に重要である。したがって、患者の癌細胞においてＨｅｒ２タンパク質が完全長型で存在するか及び／又は切断型で存在するかを決定することによって、患者の体内に残存する癌細胞を殺傷するために、患者に投与する１つ以上の適切な治療薬の選択を可能にする。
【００１３】
ペプチドの検出並びにこれらＨｅｒ２ペプチドの定量的レベルの決定は、ＳＲＭ／ＭＲＭ方法論によって質量分析的に決定され、これによって、それぞれのペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭ識別特性クロマトグラフィーピーク面積値が、液体組織溶解物中に存在する複合体ペプチド混合物内で決定される。次いで、Ｈｅｒ２タンパク質の定量的レベルが、ＳＲＭ／ＭＲＭ方法論によって決定され、これによって、１つの生物学的試料中のＨｅｒ２タンパク質からのそれぞれの個々のペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭ識別特性クロマトグラフィーピーク面積値が、それぞれの個々のペプチドに関する「スパイクされた」内部標準の既知量のＳＲＭ／ＭＲＭ識別特性クロマトグラフィーピーク面積値と比較される。一実施形態では、この内部標準は、１つ以上の重同位体元素でラベルされた１つ以上のアミノ酸残基を含有する正確に同じであるＨｅｒ２ペプチドの合成品である。内部標準でラベルされたこのような同位体元素は、マススペクトル分析が、未変性のＨｅｒ２ペプチドのクロマトグラフィー識別特性ピークとは異なりかつ明確に区別される、予測可能でかつ一貫したＳＲＭ／ＭＲＭ識別特性クロマトグラフィーピークを発生するように、並びにこれが比較ピークとして使用することができるように合成される。したがって、内部標準が既知量で、生物学的試料からのタンパク質又はペプチド調製物にスパイクされ、質量分析法によって分析される場合、未変性のペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭ識別特性クロマトグラフィーピーク面積が、内部標準のＳＲＭ／ＭＲＭ識別特性クロマトグラフィーピーク面積と比較され、そしてこの数値比較は、生物学的試料からの元のタンパク質調製物中に存在する天然ペプチドの絶対モル濃度及び／又は絶対重量のいずれかを表示する。断片ペプチドに関する定量的データは、試料当たりの分析されたタンパク質の量に従って、表示される。
【００１４】
Ｈｅｒ２タンパク質に由来の各々のペプチドに関するＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを開発するためには、単純なペプチド配列を超える追加的情報が、質量分析計によって利用される必要がある。この追加的情報は、質量分析計（例えば、トリプル四重極質量分析計）が特異的に標的化されたペプチドの正確かつ収束された分析を実施するよう方向付けかつ指示することにおいて重要である。ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを実行する場合の重要な留意点は、このようなアッセイは、トリプル四重極質量分析計で有効に実施されてもよいことである。このタイプの質量分析計は、細胞内に含まれた全てのタンパク質からの１０万〜数百万の個々のペプチドからなる非常に複雑なタンパク質溶解物内の単一の単離された標的ペプチドを分析するために、最も好適な機器であると考えられる場合がある。この追加的情報は、トリプル四重極マススペクトル計に正確な指示を提供し、細胞内に封入された全てのタンパク質からの１０万〜数百万の個々のペプチドからなる非常に複雑なタンパク質溶解物内の単一の単離された標的ペプチドの分析を可能にする。ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイは、ＭＡＬＤＩ、イオントラップ、又はトリプル四重極を含む任意のタイプの質量分析計で開発しかつ実施することができるが、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイに関する現在最も有利な機器プラットフォームは、トリプル四重極機器プラットフォームであると考えらえる場合が多い。広くは標的ペプチドについての、並びに３つの特定のＨｅｒ２ペプチドについての追加的情報としては、各々のペプチドの１つ以上の単一同位体質量、その前駆体の電荷状態、前駆体のｍ／ｚ値、ｍ／ｚ遷移イオン、及びそれぞれの遷移イオンのイオン型を挙げてもよい。１０個のＨｅｒ２ペプチドに関して記載されたような必要な追加的情報は、表２に例として示されるが、これは表１に含まれる他のペプチドにも必要であり、そしてこの情報は、表２中の３つのペプチドからの例を通して、表１に列挙された他のペプチドのそれぞれについて暗示されている。
【００１５】
【表２】
2018013492.tif 000003
【００１６】
図１は、ホルマリン固定され、液体組織溶解物が調製された細胞系からの液体組織溶解物で実施されたＳＲＭ／ＭＲＭアッセイからの結果を示す。結果は、完全長Ｈｅｒ２の細胞外ドメインからの２つのペプチドを検出かつ定量化する能力と、完全長Ｈｅｒ２タンパク質の細胞内ドメインからの１つのペプチドを検出かつ定量化するための能力を示す。このアッセイからのデータは、ホルマリン固定化細胞系から調製された液体組織試料中の３つのペプチドのそれぞれのための内部標準と内因性ペプチドの双方に関する一意的なＳＲＭ／ＭＲＭ識別特性クロマトグラフィーピークの存在を示す。このＳＲＭ／ＭＲＭアッセイは、表１及び２で特定化された情報を使用しての、トリプル四重極質量分析計でのＨｅｒ２タンパク質の定量化及びＨｅｒ２タンパク質の切断バージョンの存在の決定のために開発された。
【００１７】
特定の実施形態
１．生物学的試料から調製されたタンパク質消化物中のＨｅｒ２タンパク質の存在を検出し、かつＨｅｒ２タンパク質のレベル及びＨｅｒ２タンパク質の切断バージョンの度合いを検出する方法であって、この方法は、質量分析法を使用して、前記生物学的試料から調製されたタンパク質消化物中のＨｅｒ２タンパク質から特定のペプチドを検出することと、このＨｅｒ２タンパク質の前記試料中のこれら２つのバージョンのレベルを計算すること、とを含んでなり、前記レベルが、Ｈｅｒ２タンパク質の双方のバージョンの絶対レベルである、方法。
２．実施形態１に記載の方法であって、前記ペプチドを検出することに先立って、前記タンパク質消化物を分画する工程を更に含む、方法。
３．実施形態２に記載の方法であって、前記分画の工程が、ゲル電気泳動、液体クロマトグラフィー、毛管電気泳動、ナノ逆相液体クロマトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィー、又は逆相高性能液体クロマトグラフィーからなる群から選択される、方法。
４．実施形態１に記載の方法であって、前記生物学的試料の前記タンパク質消化物が、液体組織プロトコルによって調製される、方法。
５．実施形態１に記載の方法であって、前記タンパク質消化物が、プロテアーゼ消化物を含む、方法。
６．実施形態５に記載の方法であって、前記タンパク質消化物が、トリプシン消化物を含む、方法。
７．実施形態１に記載の方法であって、質量分析法が、直列型質量分析法、イオントラップ質量分析法、トリプル四重極質量分析法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法、ＭＡＬＤＩ質量分析法、及び／又は飛行時間型質量分析法を含む、方法。
８．実施形態７に記載の方法であって、使用される質量分析法のモードが、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）、及び／又は多重選択反応モニタリング（ｍＳＲＭ）である、方法。
９．実施形態１及び８に記載の方法であって、Ｈｅｒ２断片ペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、及び配列番号９に記載されるアミノ酸配列を含む、方法。
１０．実施形態１に記載の方法であって、生物学的試料が、血液試料、尿試料、血清試料、腹水試料、唾液試料、細胞、又は固形組織である、方法。
１１．実施形態１０に記載の方法であって、組織がホルマリン固定組織である、方法。
１２．実施形態１０に記載の方法であって、組織がパラフィン包埋組織である、方法。
１３．実施形態１０に記載の方法であって、組織が腫瘍から得られる、方法。
１４．実施形態１３に記載の方法であって、腫瘍が一次腫瘍である、方法。
１５．実施形態１３に記載の方法であって、腫瘍が二次腫瘍である、方法。
１６．実施形態１に記載の方法にであって、１０個（１０）全てのＨｅｒ２断片ペプチドを検出しかつ定量化することを更に含む、方法。
１７．実施形態１６に記載の方法であって、１０個のＨｅｒ２断片ペプチドを定量化することが、１つの生物学的試料中の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０に示されるＨｅｒ２の約８個〜約４５個のアミノ酸残基のアミノ酸配列に対応するそれぞれのＨｅｒ２断片ペプチドの量を、異なる別個の生物学的試料中の同一のＨｅｒ２断片ペプチドの量と比較することを含む、方法。
１８．実施形態１６に記載の方法であって、Ｈｅｒ２断片ペプチドを定量化することが、既知の量のスパイクされた内部標準ペプチドと比較することによって、生物学的試料中の１０個のＨｅｒ２断片ペプチドの１つ以上の量を決定することを含み、生物学的試料中の天然ペプチドと内部標準ペプチドの双方が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０に示されるＨｅｒ２の約８個〜約４５個のアミノ酸残基の同一のアミノ酸配列に対応することを特徴とする、方法。
１９．実施形態１８に記載の方法であって、内部標準ペプチドが、同位元素によりラベルされたペプチドである、方法。
２０．実施形態１９に記載の方法であって、同位元素によりラベルされた内部標準ペプチドが、１８Ｏ、１７Ｏ、３４Ｓ、１５Ｎ、１３Ｃ、２Ｈ又はこれらの組み合わせから選択される１つ以上の重安定同位体元素を含む、方法。
２１．実施形態１に記載の方法であって、被験体から生物学的試料を得ることを更に含み、タンパク質消化物中の１０個の非修飾Ｈｅｒ２断片ペプチドの１つ以上を検出及び定量化することが、完全長Ｈｅｒ２タンパク質の存在、完全長Ｈｅｒ２タンパク質の切断バージョン又はバージョン（複数）の存在、及び／又はこれら双方の存在と被験体における癌に関連するものの存在との組み合わせを示す、方法。
２２．実施形態２１に記載の方法であって、Ｈｅｒ２断片ペプチドの検出され定量化された量を、癌の診断的ステージ／グレード／進行状況に対応させることを更に含む、方法。
２３．実施形態１６〜２２のいずれか１つに記載の方法であって、タンパク質消化物中の１０個のＨｅｒ２断片ペプチドの１つ以上の存在、不在、又はその定量されたレベルに基づいて被験体のための治療を選択することを更に含む、方法。
２４．実施形態１６〜２３のいずれか１つに記載の方法であって、Ｈｅｒ２タンパク質を特異的に標的化する治療薬の治療的有効量を投与することを更に含み、どの薬剤がどれほどの量で治療に使用されるかについての治療決定が、生物学的試料中の完全長Ｈｅｒ２タンパク質又はＨｅｒ２タンパク質の切断バージョンの特定のレベルに基づく、方法。
２５．実施形態２３及び２４に記載の方法であって、治療薬が、完全長Ｈｅｒ２タンパク質又はＨｅｒ２タンパク質の切断バージョン及びその生物学的活性のいずれかに特異的に結合しかつこれらを阻害するよう設計されたものであって、例えば、ハーセプチン、トラスツズマブ、及びラパチニブが挙げられるが、これらに限定されないもの、を含む、方法。
２６．実施形態２４及び２５に記載の方法であって、Ｈｅｒ２タンパク質の完全長又は完全長の切断バージョンを検出かつ定量化することが、他のタンパク質からの他のペプチドを検出かつ定量化することと多重的に組み合わされることが可能であることで、どの薬剤がどれほどの量で治療に使用されるかについての治療決定が、生物学的試料中の他のペプチド／タンパク質と組み合わせてＨｅｒ２断片ペプチドの特定のレベルに基づく、方法。
２７．実施形態１０及び２１に記載の方法であって、生物学的試料が、液体組織プロトコル及び試薬による修飾された又は非修飾のＨｅｒ２断片ペプチドの定量分析用に処理加工されたホルマリン固定腫瘍組織である、方法。
２８．２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、又は９つ以上の配列番号１〜１０の単離したペプチドを含む、組成物。
２９．（ｉ）１つ以上、２つ以上、３つ以上、又は４つ以上のＨｅｒ２内細胞ペプチドと、
（ｉｉ）１つ以上、２つ以上、３つ以上、又は４つ以上のＨｅｒ２外細胞ペプチドと、を含む組成物であって、前記細胞内ペプチドと細胞外ペプチドが、配列番号１〜１０の配列を有するペプチドから選択される、組成物。
３０．実施形態２８又は２９に記載の組成物であって、前記組成物が、Ｈｅｒ２に由来の他のペプチドを含まない又は実質的に含まないことを特徴とする、組成物。
３１．実施形態３０に記載の組成物であって、前記ペプチドが、１８Ｏ、１７Ｏ、３４Ｓ、１５Ｎ、１３Ｃ、２Ｈ又はこれらの組み合わせから選択される１つ以上、２つ以上、又は３つ以上の重安定同位体元素を含む同位体元素でラベルされた内部標準ペプチドである、組成物。
３２．実施形態２８又は２９に記載の組成物であって、前記組成物が、実質的に純粋であるか、又は他のタンパク質、膜脂質及び核酸の任意の組み合わせから選択される他の細胞構成成分を含まない、組成物。
３３．実施形態３２に記載の組成物であって、前記ペプチドが、１８Ｏ、１７Ｏ、３４Ｓ、１５Ｎ、１３Ｃ、２Ｈ又はこれらの組み合わせから選択される１つ以上、２つ以上、又は３つ以上の重安定同位体元素を含む同位体元素でラベルされた内部標準ペプチドである、組成物。
【００１８】
上記説明及び方法の例示的実施形態並びに組成物は、本開示の範囲の例示である。しかしながら、当業者には明白であろう変形のために、本開示は上記記載の特定の実施形態に限定されることを意図しない。
【図１】
2018013492.tif 000004
【配列表】
2018013492000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成29年10月12日(2017.10.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホルマリン固定組織のヒト生物学的試料中の、切断されたおよび完全長のＨｅｒ２タンパク質の量を測定する方法であって、質量分析法を使用して、前記生物学的試料から調製されたタンパク質消化物中の前記Ｈｅｒ２タンパク質の細胞内ドメインからの第１の断片ペプチドの量、ならびに前記Ｈｅｒ２タンパク質の細胞外ドメインからの第２の断片ペプチドの量を検出および定量することと、前記試料中の前記第１および第２の断片ペプチドのレベルを計算すること、とを含んでなり、ここで、第１の断片ペプチドが配列番号７の配列のペプチドであり、第２の断片ペプチドが配列番号１〜５の配列のペプチドからなる群より選択されるものである、方法。
【請求項２】
前記ペプチドを検出することに先立って、前記タンパク質消化物を分画する工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記分画の工程が、液体クロマトグラフィー、ナノ逆相液体クロマトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィー、又は逆相高性能液体クロマトグラフィーからなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記タンパク質消化物が、プロテアーゼ消化物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記質量分析法が、直列型質量分析法、イオントラップ質量分析法、トリプル四重極質量分析法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法、ＭＡＬＤＩ質量分析法、及び／又は飛行時間型質量分析法を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記組織がパラフィン包埋組織である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記組織が腫瘍から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
第１および第２のＨｅｒ２断片ペプチドを定量化することが、１つの生物学的試料中の第１および第２のＨｅｒ２断片ペプチドの量を、異なる別個の生物学的試料中の同一のＨｅｒ２断片ペプチドの量と比較することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記第１および第２のＨｅｒ２断片ペプチドを定量化することが、既知の量のスパイクされた内部標準ペプチドと比較することによって、生物学的試料中の前記Ｈｅｒ２断片ペプチドの量を決定することを含み、前記生物学的試料中の天然ペプチドと対応する内部標準ペプチドの双方が、同一のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
それぞれの内部標準ペプチドが、同位元素によりラベルされたペプチドである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
同位元素によりラベルされたそれぞれの内部標準ペプチドが、１８Ｏ、１７Ｏ、３４Ｓ、１５Ｎ、１３Ｃ、２Ｈ又はこれらの組み合わせから選択される１つ以上の重安定同位体元素を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
被験体から前記生物学的試料を得ることを更に含み、前記タンパク質消化物中の前記第１および第２のＨｅｒ２断片ペプチドを検出かつ定量化することが、前記完全長Ｈｅｒ２タンパク質の存在、前記完全長Ｈｅｒ２タンパク質の切断バージョン（複数可）の存在、並びに／又はこれら双方の前記存在及び前記被験体における癌の関連の組み合わせを示唆する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記Ｈｅｒ２断片ペプチドの検出されかつ定量化された量を、前記癌の前記診断的ステージ／グレード／進行状況に相関させることを更に含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記タンパク質消化物中の前記Ｈｅｒ２断片ペプチドの前記存在、不在、又はその定量されたレベルに基づいて前記被験体のための治療を選択することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記Ｈｅｒ２タンパク質を特異的に標的化する治療薬の治療的有効量を選択することを更に含み、どの薬剤がどれほどの量で治療に使用されるかについての前記治療決定が、前記生物学的試料中の前記完全長Ｈｅｒ２タンパク質又は前記Ｈｅｒ２タンパク質の切断バージョンの特定のレベルに基づく、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記治療薬が、ハーセプチン、トラスツズマブ、及びラパチニブからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記Ｈｅｒ２タンパク質の前記完全長および前記完全長の切断バージョンを検出かつ定量化することが、他のタンパク質からの他のペプチドを検出及び定量化することと多重的に組み合わされることが可能であることで、どの薬剤がどれほどの量で治療に使用されるかについての前記治療決定が、前記生物学的試料中の他のペプチド／タンパク質と組み合わせて前記Ｈｅｒ２断片ペプチドの特定のレベルに基づく、請求項１５に記載の方法。
【外国語明細書】
2018013492000001.pdf