(57)【要約】      （修正有）【課題】簡易的且つ迅速に活性エステルを検査する方法及びその検査キットを提供する。【解決手段】活性エステルの検査方法において、（ａ）加水分解により基材表面で活性エステルを分解する工程、（ｂ）鉄含有溶液と分解した前記活性エステルを接触させて呈色反応させる工程、を含むことを特徴とし、前記活性エステルが、窒素を有する環を含み且つ前記窒素にヒドロキシル基が結合した化合物を含み、前記活性エステルは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾールからなる群から選ばれる１種以上の化合物を含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）加水分解により基材表面で活性エステルを分解する工程、
（ｂ）鉄含有溶液と分解した前記活性エステルを接触させて呈色反応させる工程、
を含む、活性エステルの検査方法。
【請求項２】
前記活性エステルが、窒素を有する環を含み且つ前記窒素にヒドロキシル基が結合した化合物を含む、請求項１に記載の検査方法。
【請求項３】
前記活性エステルが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、 Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、 及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾールからなる群から選ばれる１種以上の化合物を含む、請求項１又は２に記載の検査方法。
【請求項４】
前記鉄含有溶液が、塩化鉄、硝酸鉄、クエン酸鉄からなる群から選ばれる１種以上である、請求項１〜３のいずれかに記載の検査方法。
【請求項５】
前記分解する工程が１００ｍｍｏｌ／Ｌ未満の濃度の塩基性溶液を用いる、請求項１〜４のいずれかに記載の検査方法。
【請求項６】
鉄含有溶液を封入した第一容器を含む、ＤＮＡチップ用基材表面における活性エステルの検査キット。
【請求項７】
塩基性溶液を封入した第二容器をさらに含む、請求項６に記載の検査キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、基材表面における活性エステルの検査方法、及び、その検査キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ＤＮＡチップと呼ばれる担体を使用した食品検査や環境検査、遺伝子検査等が行われている。このようなＤＮＡチップは、一般的に、数ミリ〜数センチ四方程度の大きさの基板上に、ターゲットを結合させるためのプローブが高密度に配置され固定化されている。
プローブとしては例えばＤＮＡまたはＲＮＡ等の核酸配列が挙げられ、ターゲットとしては例えば上記プローブに実質的に相補的な核酸配列、又は上記プローブに特異的に結合するタンパク質等が挙げられる。
【０００３】
基材にプローブを固定化させる前処理として以下のような表面処理を行う。
【０００４】
シリコン材料や樹脂材料からなる基材上にアミノ基を導入するため、アミノアルキルシラン層を形成する。アミノアルキルシラン層の形成は、例えば、基材をシランカップリング剤溶液中に所定の時間浸漬すること等により行われる。
次に、カルボキシル基を導入するため、例えば前記アミノアルキルシラン層のアミノ基にポリアクリル酸を吸着させる。そして前記カルボキシル基に活性エステルを導入する。
【０００５】
活性エステルは、エステルのアルコール側に酸性度の高い電子求引性基を有して求核反応を活性化し、ターゲットとの反応活性を高くするため、活性エステルの導入量がＤＮＡチップの品質や性能に影響する。
【０００６】
従来の活性エステルの検査方法は、以下の様な方法で行われている。
特許文献１には、プローブを固定化する前に、処理担体上に結合された固定化物質の量を、赤外線分光光度計等により測定する方法、特許文献２には、ＤＮＡチップ上に蛍光染料を標識した核酸を含む試薬をスポットし、ハイブリダイゼーション反応を実行した後、現われる蛍光シグナルを蛍光スキャナで分析することにより、活性エステルがどの程度導入されているかを検査する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００７−３３１７３号公報
【特許文献２】特表２００３−５３６０５４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、従来の検査方法は、大掛かりな測定環境を準備する必要があり、多くの検査工程を要するため、十分に満足できるものではなかった。
【０００９】
本発明の目的は、簡易的且つ迅速に活性エステルを検査する方法及びその検査キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の検査方法においては、
（ａ）加水分解により基材表面で活性エステルを分解する工程、（ｂ）鉄含有溶液と分解した前記活性エステルを接触させて呈色反応させる工程、を含む、活性エステルの検査方法が提供される。
また、本発明の検査キットにおいては、鉄含有溶液を封入した第一容器を含む、ＤＮＡチップ用基材表面における活性エステルの検査キットが提供される。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、簡易的且つ迅速に基材上の活性エステルの検査方法及びその検査キットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の実施形態における検査方法を示す模式図である。
【図２】本発明の実施形態における検査方法を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の検査方法を以下の実施形態によりさらに説明する。なお、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
【００１４】
［検査方法］
本実施形態における基材表面における活性エステルの検査方法は、（ａ）加水分解により基材表面で活性エステルを分解する工程、（ｂ）鉄含有溶液と分解した前記活性エステルを接触させる工程を含むことを特徴とする。
【００１５】
本実施形態における基材の素材としては、公知の素材を使用することができる。例えば、白金やパラジウム等の金属材料、グラファイトやカーボンファイバー等の炭素材料、単結晶シリコンやアモルファスシリコン等のシリコン材料、ガラスやセラミクス等の無機材料、あるいは、ポリエステルやアクリル樹脂、ポリカーボネート等の有機材料等を挙げることができる。
基材の形状も特に制限はなく、平板状の他、膜状、チップ状、アレイ状、ビーズ状等の形状であっても構わない。
基材の大きさについても特に制限はなく、例えば基材が平板状の場合には、通常、１〜７５ｍｍ四方のものが使用される。
【００１６】
本実施形態における基材は、その表面に表面処理層を有するものが好ましく使用される。表面処理層としては例えば、カーボン層と化学修飾基を含む。
基材としてポリカーボネート等の樹脂を使用し、表面にカーボン層と化学修飾基とを有していてもよいし、基材自体をカーボンファイバー等の炭素材料としてその表面に化学修飾基を有していてもよい。あるいは、基材をガラスやシリコンとしてその表面にダイヤモンドライクカーボン等の軟ダイヤモンド層を形成し、その表面に化学修飾基を導入してもよい。
前記カーボン層の形成は、公知の方法、例えば高周波プラズマＣＶＤ法、直流スパッタリング法、イオン化蒸着法、アーク式蒸着法等により行うことができる。
【００１７】
また、化学修飾基としては、アミノ基、カルボキシル基、エポキシ基、ホルミル基、ヒドロキシル基等を挙げることができる。
各種化学修飾基の導入手法について、カーボン層をアンモニアガス中で紫外線照射することによりアミノ基を導入することができる。
カルボキシル基の導入は、アミノ化したカーボン層に、カルボキシル基を有する適当な化合物（ハロカルボン酸やジカルボン酸等）を反応させることによりカルボキシル基の導入することができる。また、各々の基を有する適当な化合物を、上記のようにアミノ化したカーボン層に反応させることによりエポキシ基、ホルミル基、ヒドロキシル基の導入することができる。
【００１８】
活性エステルの導入は、上記のようにして表面処理層中に導入したカルボキシル基を、カルボジイミド（例えば、１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド）などの脱水縮合剤と、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドなどの化合物で活性エステル化することができる。
【００１９】
ここで活性エステルとは、エステルのアルコール側に酸性度の高い電子求引性基を有するものを言う。
上記活性エステルは、アミノ基、チオール基、水酸基等に対する強い反応性を有するため、ＤＮＡチップを製造するにあたってプローブを強固に固定化することができる。
上記活性エステルとしては、窒素を有する環を含み且つ前記窒素にヒドロキシル基が結合した化合物を含むものであればよい。例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、ｐ−ニトロフェニル、コハク酸イミド、フタル酸イミド、５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド、等が挙げられる。このうち特に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、又は１−ヒドロキシベンゾトリアゾールの１種以上が活性エステルとして基材上に導入されていることが好ましい。
【００２０】
以下に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、又は１−ヒドロキシベンゾトリアゾールの構造をそれぞれ示す。
【００２１】
【化１】
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【００２２】
【化２】
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【００２３】
【化３】
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【００２４】
本実施形態の検査方法は、活性エステルが窒素を有する環を含み且つ前記窒素にヒドロキシル基が結合し得るものであれば、活性エステルが有する前記ヒドロキシル基と鉄含有溶液の鉄イオンが錯体を形成し、鉄含有溶液中で呈色反応を示すと想定される。
【００２５】
本実施形態の検査方法において使用される鉄含有溶液としては、鉄を金属イオンとして含むものであればよい。例えば水溶性の観点より、塩化鉄溶液、硝酸鉄溶液、クエン酸鉄溶液、硫酸鉄溶液、乳酸鉄溶液、臭化鉄溶液、あるいはグルコン酸鉄溶液のいずれかが使用されることが好ましい。特に、溶解度、溶液加熱時の安定性、操作性の観点より塩化鉄溶液、クエン酸鉄溶液、硝酸鉄溶液のいずれかが使用されることがより好ましい。また、上記鉄含有溶液は１種又は２種以上組み合わせて使用できる。
本実施形態の検査方法において使用される鉄含有溶液の鉄濃度としては、０．１〜５０重量％、特に１〜１０重量％であることが好ましい。
【００２６】
この鉄含有溶液の溶媒は、純水であってもよいし、酸性液体や、エタノール等の有機溶媒であってもよい。溶媒としての酸性液体としては、塩酸、硫酸、硝酸が好ましく使用できる。また、塩酸や硫酸を鉄含有溶液の溶媒として使用する際の濃度は、０．１〜１．０ｍｏｌ／Ｌであることが好ましい。
【００２７】
次いで本実施形態における検査方法の内容について説明する。
図１に示すように、鉄含有溶液が表面処理済みの基材（１０）上の活性エステル（４）と接触した場合、鉄含有溶液の酸性により加水分解が生じ、活性エステルのエステル結合が分解し、基材上から分離する。さらに、分解・分離した活性エステルは鉄含有溶液中の鉄イオンと錯体を形成することが想定され、溶液は呈色する。（図１に示す方法を、以下「一段階法」とも称する。）
【００２８】
本実施形態における検査方法の検査環境、条件等については以下のとおりであることが好ましい。すなわち、基材表面と鉄含有溶液を接触させる際の溶液温度及び加熱時間は特に制限されるものではないが、反応の進行速度や検査に要する時間等の観点から、例えば３０〜９０℃で５〜３０分加熱することが好ましい。
【００２９】
また、上記の温度で所定時間加熱した後に、さらに呈色反応を確認しやすくするため、室温に約５〜１５分程度静置することが好ましい。
なお、本実施形態における検査方法において、基材表面と鉄含有溶液を接触させた後の溶液のｐＨは、鉄化合物が析出せず、さらに基材が溶出しないｐＨ１．２〜７．０であることが好ましい。これは、基材からの溶出等により、意図しない呈色反応が起こることを回避するためである。
【００３０】
次に、本実施形態において、呈色反応の確認方法としては、目視、或いは測定機器を用いた呈色確認であってもよい。
さらには、超微量分光光度計で測定することにより、被測定溶液が極少量であっても高感度で測定できる。測定は、後述する吸光スペクトルピーク波長での吸光度により確認することができ、基準との吸光度差が０．０１０以上、特に０．０５０以上であることが好ましい。
【００３１】
本実施形態の一つの検査方法を示す。図２（ａ）に示すように、前記鉄含有溶液を活性エステルと接触させる前段階として、予め塩基性溶液を活性エステルに接触させてもよい。（以下、図２に示す方法を「二段階法」とも称する。）
【００３２】
この場合、塩基性溶液に接触した活性エステルのエステル結合は加水分解により基材表面で分解し、分離する（図２（ｂ）（１））。その後鉄含有溶液を添加することにより、分解・分離した活性エステルと鉄イオンが錯体を形成する（図２（ｂ）（２））と推定される。この呈色反応を上記と同様にして確認することにより、本実施形態の検査方法が実現するのである。
【００３３】
何らかの理由において検査溶液の分量が少ない場合や、基材上の活性エステルの存在量が少ないと予想される場合等には、検査結果において十分な吸光度差が得られないことが危惧される。しかしながらそのような場合でも、あらかじめ活性エステルを分解する工程を設けることにより、測定機器で測定できるだけの呈色反応が期待できるようになる。また、基材が酸性溶液に適さない場合は、活性エステルを分解した後、チューブ２０から基材を取り出すことで、基材と鉄含有溶液が直接接触することを回避することができる。
【００３４】
なお、本実施形態の検査方法は、基材上に存在する活性エステルを分解したものと鉄イオンとから形成される錯体の呈色反応を確認するものであるが、基材からの溶出物等により意図しない呈色反応が起こらないように注意すべきである。
【００３５】
例えば、上記塩基性溶液を用いるときは、次の理由により所定の濃度範囲に調整を要する。基材がポリカーボネート等の樹脂製であった場合には、ビスフェノールＡが溶出する。ビスフェノールＡなどのフェノール類は、鉄含有溶液により呈色反応を示すため、分解した活性エステルと鉄イオンとの錯体の呈色反応を阻害するからである。
【００３６】
そのため、基材としてポリカーボネート等の樹脂を選択して二段階法で本実施形態の検査方法を実施する場合には、塩基性溶液の濃度及び接触させる際の温度を、基材が溶出しない条件に設定する必要がある。具体的には、塩基性溶液の濃度を１００ｍｍｏｌ／Ｌ以下、特に、０．００１〜１０ｍｍｏｌ／Ｌ以下とすることが好ましい。且つ、塩基性溶液と基材との接触時間を３０分未満、とすることが好ましい。
塩基性溶液の濃度が上記範囲よりも低い場合、活性エステルを基材表面から分解させるのに時間がかかるため好ましくない。一方で、上記範囲の濃度より高い場合、溶液が懸濁して目視或いは測定器による確認ができなくなってしまうため好ましくない。
【００３７】
なお、上述した二段階法により本実施形態を実施する場合には、塩基性溶液の種類としては特に制限されるものではなく、公知の塩基性溶液を使用することができる。例えば、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液が、取り扱いのし易さ等の観点から好適に使用される。
【００３８】
［検査キット］
本実施形態の検査キットは、ＤＮＡチップ用基材表面における活性エステルを確認するために用いられるものであり、鉄含有溶液ｐを封入した第一容器Ｐを含むことを特徴とする。
【００３９】
本実施形態における検査キットを使用して本実施形態の検査方法を実施する場合には、まず、検査を行う表面処理済み基材を製造工程より抜き取って、必要に応じてピンセット等で表面処理済み基材の一部を剥がし、鉄含有溶液ｐを封入した第一容器Ｐに入れる。その後に、第一容器Ｐを所定の温度で所定時間加熱し、室温にて静置する。続いて、前記第一容器Ｐ中の溶液を分取し、目視あるいは測定機器により呈色反応を確認する。
【００４０】
また、必要に応じて表面処理済み基材の一部を、まずは塩基性溶液ｑを封入した第二容器Ｑに入れてもよい。この場合、塩基性溶液ｑにより表面処理済み基材の表面に存在する活性エステルが分解される。その後、前記第二容器Ｑの内容物を一部あるいはすべて第一容器Ｐに入れて、上記と同様にして呈色反応を確認することも可能である。
【００４１】
第一容器Ｐ及び第二容器Ｑの素材としては、ガラス試験管や樹脂製チューブ等を使用することが可能である。また、第一容器Ｐ及び第二容器Ｑの容量としても特に制限されるものではなく、本実施形態の検査方法が実施できるだけの容量（例えば０．１〜５．０ｍｌ）があればよい。
【実施例】
【００４２】
本発明を次の実施例にて説明する。
【００４３】
［基材の表面処理（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル）］
ガラス基材（武藤化学株式会社、カバーガラス2432）、黒色ポリカーボネート基材（白石工業株式会社、カーボンブラック含有ポリカーボネート基材）、黒色ポリプロピレン基材（透明ポリプロピレン基材（株式会社プライムポリマー、ポリプロピレンJ108）にカーボンブラック（越谷化成工業株式会社）を混合し、射出成型したもの）を準備した。各基材を５重量％の３−アミノプロピルトリエトキシシラン水溶液に２時間浸漬した後、取り出し、純水で洗浄後、７０℃で２時間乾燥した。
次に、乾燥済の各基材を、１％ポリアクリル酸水溶液に１０分間浸漬した後、取り出し、純水で洗浄した。
続いて、０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）２００ｍＬに０．１ｍｏｌ／ＬのＮ−ヒドロキシスクシンイミドを溶解した活性化液中に、各基材を１０分間浸漬し、各基材を活性化した。その後各基材を取り出し、純水で洗浄後、１２０℃で２時間乾燥した。
このようにして、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステルを表面に有する表面処理済みの各基材を得た。
【００４４】
［基材の表面処理（Ｎ−ヒドロキシフタルイミド活性エステル）］
ガラス基材、長さ２４ｍｍ×幅３２ｍｍに切断した黒色ポリカーボネート基材及び黒色ポリプロピレン基材を準備した。各基材に１重量％Ｎ−ヒドロキシフタルイミド／エタノール溶液をそれぞれ５０μＬ滴下し、溶液を表面に塗布し、１００℃で３０分乾燥した。
次に乾燥済の各基材を、純水で洗浄後、１２０℃で２時間乾燥した。
このようにして、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド活性エステルを表面に有する表面処理済みの各基材を得た。
【００４５】
［基材の表面処理（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール活性エステル）］
各基材に１重量％１−ヒドロキシベンゾトリアゾール／エタノール溶液を滴下した以外は、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド活性エステルを表面に有する表面処理済みの基材と同様に表面処理を行い、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール活性エステルを表面に有する表面処理済みの各基材を得た。
【００４６】
［吸光スペクトルピーク波長の確認］
鉄含有溶液中におけるＮ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、１−ヒドロキシベンゾトリアゾールの各化合物の吸光スペクトルピーク波長の確認を行った。
【００４７】
［活性エステルの存在有無の評価方法］
活性エステルの存在有無は、表面処理未実施の基材と表面処理実施の基材における上記吸光スペクトルピーク波長での吸光度を比較することで評価した。なお、評価基準として、溶液に懸濁が未発生、且つ吸光度差が０．０１０以上の場合を○とし、溶液に懸濁が発生、または吸光度差が０．０１０未満の場合を×とした。
【００４８】
［実施例１］
１．５ｍＬチューブ２本を準備し、１本にはＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステルを表面に有する表面処理済みのガラス基材を長さ６ｍｍ×幅３ｍｍに切断したものを４つ入れた。別の１本には表面処理を行っていないガラス基材を長さ６ｍｍ×幅３ｍｍに切断したものを４つ入れた。各チューブに１重量％塩化鉄（III）水溶液を１００μＬ添加し、６０℃１０分加熱した。その後試験管ミキサーで１０秒間攪拌し、室温で６０分静置し、遠心機でスピンダウンを行った。次に各チューブから８０μＬを分取してキュベットに入れ、吸光光度計にて本溶液での測定対象物のピーク波長である４９０ｎｍの吸光度を測定した。
表面処理済みのガラス基材における吸光度から表面処理を行っていないガラス基材の吸光度を差し引いた値（吸光度差）を表１に示す。
【００４９】
［実施例２〜９］
表１に示す基材、鉄含有溶液、吸光度の測定波長に変更した以外は実施例１と同様にして吸光度差を求めた。結果を表１に示す。
【００５０】
［実施例１０］
１．５ｍＬチューブ２本を準備し、１本にはＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステルを表面に有する表面処理済みのガラス基材を長さ６ｍｍ×幅３ｍｍに切断したものを４つ入れた。別の１本には表面処理を行っていないガラス基材を長さ６ｍｍ×幅３ｍｍに切断したものを４つ入れた。各チューブに１０ｍｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）溶液９０μＬを添加し、６０℃１０分加熱した。その後、試験管ミキサーで１０秒間攪拌し、室温で５分静置し、遠心機でスピンダウンを行った。次に各チューブに１０重量％塩化鉄（III）水溶液を１０μＬ添加し、試験管ミキサーで１０秒間攪拌し、遠心機でスピンダウンを行った後、室温で５分静置した。続いて、各チューブから８０μＬを分取してキュベットに入れ、吸光光度計にて４９０ｎｍの吸光度を測定した。
表面処理済みのガラス基材における吸光度から表面処理を行っていないガラス基材の吸光度を差し引いた値（吸光度差）を表１に示す。
【００５１】
［実施例１１〜３６］
表１に示す基材、鉄含有溶液、吸光度の測定波長に変更した以外は実施例１０と同様にして吸光度差を求めた。結果を表１に示す。
【００５２】
［参考例１］
ＮａＯＨ濃度を１００ｍｍｏｌ／Ｌに変更した点以外は、実施例１０と同様に行い、キュベットに入れた際に溶液の懸濁を確認した。結果を表１に示す。
【００５３】
［参考例２］
基材を黒色ＰＣ基材とした点以外は、参考例１と同様に行い、キュベットに入れた際に溶液の懸濁を確認した。結果を表１に示す。
【００５４】
［参考例３］
基材を黒色ＰＰ基材とした点以外は、参考例１と同様に行い、キュベットに入れた際に溶液の懸濁を確認した。結果を表１に示す。
【００５５】
【表１】
2018189490.tif 000006
【００５６】
表１の実施例１〜９に示すとおり、基材種類や鉄含有溶液の組成に依存せず、一段階法にて基材上の活性エステルの存在有無を確認できることがわかる。
また、表１の参考例１〜３で示すように、二段階法にて塩基濃度が高い場合に溶液の懸濁を観察された。これは塩基濃度が高い場合、鉄含有溶液を混合した時でも溶液が塩基性となっており、溶液中の鉄が水酸化鉄を形成していることが理由として推察される。そのため、表１の実施例１０〜３６で示すように、溶液に懸濁が観察されなければ、基材種類、活性エステル種類、鉄含有溶液の組成に依存せず、二段階法にて基材上の活性エステルの存在有無を確認できることがわかる
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明の検査方法によれば、簡易的且つ迅速に基材上の活性エステルを確認することができる。
本発明の検査方法はＤＮＡチップの製造工程における品質検査以外の用途にも適用できる。例えばペプチド（有機化合物）合成における反応条件の性能評価等に広範囲に適用することが可能である。
【符号の説明】
【００５８】
４・・・活性エステル
１０・・・表面処理済みの基材
２０・・・マイクロチューブ
【図１】
2018189490.tif 000007
【図２】
2018189490.tif 000008