(57)【要約】【課題】細胞スフェロイドを短時間で作製することのできる細胞スフェロイドの形成方法を提供することを課題とする。【解決手段】ゼラチン溶液を用いた細胞スフェロイドの作製方法による。より具体的には、以下の（Ａ）〜（Ｃ）の工程を含む、細胞スフェロイドの作製方法による。（Ａ）ゼラチン溶液と細胞とを接触させる工程。（Ｂ）冷却してゼラチンをゲル化する工程。（Ｃ）細胞をインキュベートする工程。  本発明の作製方法によれば、細胞スフェロイドを短時間で形成可能であり、また様々な形態の細胞スフェロイドを作製可能である。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（Ａ）〜（Ｃ）の工程を含む、細胞スフェロイドの作製方法；
（Ａ）ゼラチン溶液と細胞とを接触させる工程；
（Ｂ）冷却してゼラチンをゲル化する工程；
（Ｃ）細胞をインキュベートする工程。
【請求項２】
細胞スフェロイドが、以下の１）〜３）のいずれかに示す順序で作製される、請求項１に記載の作製方法：
１）（Ｂ）、（Ａ）、（Ｃ）；
２）（Ｃ）、（Ａ）、（Ｂ）；
３）（Ａ）、（Ｃ）、（Ｂ）。
【請求項３】
１）又は２）の順序で細胞スフェロイドが作製され、工程（Ａ）において、細胞非接着表面を含む表面により区切られた空間内で、ゼラチン溶液と細胞とを接触させることを特徴とする、請求項２に記載の作製方法。
【請求項４】
１）の順序で細胞スフェロイドが作製され、工程（Ｂ）が以下の工程（ｂ１）及び（ｂ２）を含み、工程（Ａ）が以下の工程（ａ１）を含む、請求項３に記載の作製方法：
（ｂ１）底面が細胞非接着表面の区切られた空間内で、ゼラチン溶液を冷却してゲル化する工程；
（ｂ２）得られたゼラチンゲルを凍結乾燥してゼラチンスポンジを作製する工程；
（ａ１）ゼラチンスポンジの空孔に、細胞懸濁液を添加する工程。
【請求項５】
１）の順で細胞スフェロイドが作製され、工程（Ｂ）が以下の工程（ｂ３）を含み、工程（Ａ）が以下の工程（ａ２）を含む、請求項３に記載の作製方法：
（ｂ３）底面が細胞非接着表面の区切られた空間内で、ゼラチン溶液を冷却してゲル化し、凹部を設けたゼラチンゲルを作製する工程；
（ａ２）ゼラチンゲルの凹部に、細胞懸濁液を添加する工程。
【請求項６】
細胞スフェロイドの形状が球状である、請求項３〜５のいずれかに記載の作製方法。
【請求項７】
２）の順で細胞スフェロイドが作製され、工程（Ｃ）は以下の工程（ｃ２）を含む、請求項３に記載の作製方法：
（ｃ２）細胞接着表面上で細胞をコンフルエントになるまで培養する工程。
【請求項８】
工程（Ａ）が以下の工程（ａ３）及び（ａ４）を含み、工程（Ｂ）が以下の工程（ｂ４）を含む、請求項７に記載の作製方法：
（ａ３）中空部材の断面が細胞に面する向きで、中空部材を細胞上に置く工程；
（ａ４）中空部材の空洞部分にゼラチン溶液を含める工程；
（ｂ４）中空部材の空洞部分のゼラチン溶液を冷却してゼラチンをゲル化する工程。
【請求項９】
工程（Ｃ）、（Ａ）、および（Ｂ）を２回以上繰り返すことを含む、請求項７又は８に記載の作製方法。
【請求項１０】
細胞スフェロイドの形状が、単層又は積層されたシート状である、請求項７〜９のいずれかに記載の作製方法。
【請求項１１】
３）の順序で細胞スフェロイドが作製され、工程（Ａ）が以下の工程（ａ５）を含む、請求項３に記載の作製方法：
（ａ５）細胞非接着表面で区切られた空間内に、細胞とゼラチンを含む懸濁液を添加する工程。
【請求項１２】
細胞スフェロイドの形状が、紐状、板状、又は筒状である、請求項１１に記載の作製方法。
【請求項１３】
懸濁液において、細胞の密度が1×102細胞/μL以上である、請求項４，５，１１のいずれかに記載の作製方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれかに記載の作製方法により作製された細胞スフェロイド。
【請求項１５】
請求項１４に記載の細胞スフェロイドを用いて、以下のいずれかについて分析する方法：
（１）薬剤のスクリーニング；
（２）薬剤の毒性の確認。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ゼラチン溶液を用いて細胞スフェロイドを形成する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
最近、細胞を３次元培養し、様々な形態の細胞スフェロイドを形成することに注目が集まっている。３次元培養した細胞スフェロイドでは、平面培養した細胞とは異なる機能を発揮することが知られている。細胞スフェロイドは、生体により近い細胞環境にあり、生体内の細胞機能を発揮できると考えられていることから、細胞スフェロイドを用いた解析や、細胞スフェロイドの応用技術について活発に研究が行われている。
【０００３】
細胞スフェロイドの形成は、ハンギングドロップ法や、細胞が接着しないような培養基材に微細な接着領域を作製した細胞培養プレートなどを用いた培養等により行われる。ハンギングドロップ法は、シャーレなどのデバイスの天井から液滴をぶら下げ、その中で細胞を培養する方法である。本方法は培養を行う個人の技量が大きく影響するため、多数のサンプルをスクリーニングするなどの目的には不向きである。また微細な接着領域のある細胞培養プレートは、細胞の接着表面を微細加工する技術が必要であることから、一般的に高価である。
【０００４】
細胞培養の足場として利用可能なゼラチンスポンジ（商品名：MedGel(R) Scaffold、株式会社メドジェル）が市販されている（非特許文献１）。かかるゼラチンスポンジは、ゼラチンを架橋して水不溶化させたものであり、生体親和性が高い。間葉系幹細胞（MSC）や、HepG2細胞などを当該ゼラチンスポンジに培養することにより、細胞の増殖が促進することが確認されている（非特許文献２）。また、キトサンとゼラチンの混合フィルム上で、ヒト脂肪細胞由来幹細胞がスフェロイドを形成すること、キトサンを含まないゼラチンフィルム上では、スフェロイドの形成がなされないことが報告されている（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】http://www.medgel.jp/products/scaffold/index.html
【非特許文献２】Takahashi Y, Yamamoto M, Tabata Y. Biomaterials. 2005 Jun; 26 (17):3587-96.
【非特許文献３】Cheng NC et al. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 2012 Jul;100(5):1369-77.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、細胞スフェロイドを短時間で作製することのできる細胞スフェロイドの形成方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、冷却してゼラチンをゲル化する工程とゼラチン溶液と細胞とを接触させる工程を組み合わせることにより、細胞スフェロイドを短時間で形成可能であり、また様々な形態の細胞スフェロイドを作製できることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は以下よりなる。
１．以下の（Ａ）〜（Ｃ）の工程を含む、細胞スフェロイドの作製方法；
（Ａ）ゼラチン溶液と細胞とを接触させる工程；
（Ｂ）冷却してゼラチンをゲル化する工程；
（Ｃ）細胞をインキュベートする工程。
２．細胞スフェロイドが、以下の１）〜３）のいずれかに示す順序で作製される、前項１に記載の作製方法：
１）（Ｂ）、（Ａ）、（Ｃ）；
２）（Ｃ）、（Ａ）、（Ｂ）；
３）（Ａ）、（Ｃ）、（Ｂ）。
３．１）又は２）の順序で細胞スフェロイドが作製され、工程（Ａ）において、細胞非接着表面を含む表面により区切られた空間内で、ゼラチン溶液と細胞とを接触させることを特徴とする、前項２に記載の作製方法。
４．１）の順序で細胞スフェロイドが作製され、工程（Ｂ）が以下の工程（ｂ１）及び（ｂ２）を含み、工程（Ａ）が以下の工程（ａ１）を含む、前項３に記載の作製方法：
（ｂ１）底面が細胞非接着表面の区切られた空間内で、ゼラチン溶液を冷却してゲル化する工程；
（ｂ２）得られたゼラチンゲルを凍結乾燥してゼラチンスポンジを作製する工程；
（ａ１）ゼラチンスポンジの空孔に、細胞懸濁液を添加する工程。
５．１）の順で細胞スフェロイドが作製され、工程（Ｂ）が以下の工程（ｂ３）を含み、工程（Ａ）が以下の工程（ａ２）を含む、前項３に記載の作製方法：
（ｂ３）底面が細胞非接着表面の区切られた空間内で、ゼラチン溶液を冷却してゲル化し、凹部を設けたゼラチンゲルを作製する工程；
（ａ２）ゼラチンゲルの凹部に、細胞懸濁液を添加する工程。
６．細胞スフェロイドの形状が球状である、前項３〜５のいずれかに記載の作製方法。
７．２）の順で細胞スフェロイドが作製され、工程（Ｃ）は以下の工程（ｃ２）を含む、前項３に記載の作製方法：
（ｃ２）細胞接着表面上で細胞をコンフルエントになるまで培養する工程。
８．工程（Ａ）が以下の工程（ａ３）及び（ａ４）を含み、工程（Ｂ）が以下の工程（ｂ４）を含む、前項７に記載の作製方法：
（ａ３）中空部材の断面が細胞に面する向きで、中空部材を細胞上に置く工程；
（ａ４）中空部材の空洞部分にゼラチン溶液を含める工程；
（ｂ４）中空部材の空洞部分のゼラチン溶液を冷却してゼラチンをゲル化する工程。
９．工程（Ｃ）、（Ａ）、および（Ｂ）を２回以上繰り返すことを含む、前項７又は８に記載の作製方法。
１０．細胞スフェロイドの形状が、単層又は積層されたシート状である、前項７〜９のいずれかに記載の作製方法。
１１．３）の順序で細胞スフェロイドが作製され、工程（Ａ）が以下の工程（ａ５）を含む、前項３に記載の作製方法：
（ａ５）細胞非接着表面で区切られた空間内に、細胞とゼラチンを含む懸濁液を添加する工程。
１２．細胞スフェロイドの形状が、紐状、板状、又は筒状である、前項１１に記載の作製方法。
１３．懸濁液において、細胞の密度が1×102細胞/μL以上である、前項４，５，１１のいずれかに記載の作製方法。
１４．前項１〜１３のいずれかに記載の作製方法により作製された細胞スフェロイド。
１５．前項１４に記載の細胞スフェロイドを用いて、以下のいずれかについて分析する方法：
（１）薬剤のスクリーニング；
（２）薬剤の毒性の確認。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、従来の方法では細胞スフェロイドを形成しないような、E-カドヘリン等の接着因子を細胞表面に持たない細胞であっても、短時間のインキュベートで細胞スフェロイドを形成させることができる。また本発明は、特殊な技術を必要とすることなく、安価なゼラチンを用いて、容易かつ短時間で細胞スフェロイドを作製することができる。よって、細胞を大量に培養して、多数の細胞スフェロイドを作製することができる。また同質のスフェロイドを大量に再現性良く作製可能であり、作製した細胞スフェロイドを用いて薬剤等のスクリーニングや毒性評価を行ったり、当該スフェロイドを用いた有用タンパク質の生産が可能となる。またゼラチンは生体吸収性を持つ安全な素材であることから、本発明で作製される細胞スフェロイドを再生医療用材料の作製に用いることも可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】球状細胞スフェロイドの作製方法について、ゼラチンスポンジを用いた実施態様を説明した図である。（実施例１）
【図２】ゼラチンスポンジを用いた実施態様により作製された、球状細胞スフェロイドを確認した結果を示す写真図である。（実施例１）
【図３】球状細胞スフェロイドの作製方法について、ゼラチンゲルを用いた実施態様を説明した図である。（実施例２）
【図４】ゼラチンゲルを用いた実施態様により作製された、球状細胞スフェロイドを確認した結果を示す写真図である。（実施例２）
【図５】シート状細胞スフェロイドの作製方法について説明した図である。（実施例３、４）
【図６】シート状細胞スフェロイドを確認した結果を示す写真図である。（実施例３）
【図７】シート状細胞スフェロイドを確認した結果を示す写真図である。（実施例４）
【図８】紐状細胞スフェロイドの作製方法について説明した図である。（実施例５）
【図９】紐状細胞スフェロイドを確認した結果を示す写真図である。（実施例５）
【図１０】円筒状細胞スフェロイドを確認した結果を示す写真図である。（実施例６）
【図１１】円筒状細胞スフェロイドを確認した結果を示す写真図である。（実施例６）
【図１２】球状細胞スフェロイドの脂肪細胞への分化度について、脂肪滴をOil Red O染色を用いて染色することにより検証した結果を示す写真図である。（実験例１）
【図１３】球状細胞スフェロイドの脂肪細胞への分化度について、脂肪細胞分化マーカーのアディポネクチン  mRNAの発現量を確認することにより検証した結果を示す写真図である。（実験例１）
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、ゼラチン溶液（ゼラチンゾル）を細胞と接触させて培養することにより、細胞スフェロイドを形成させる、細胞スフェロイドの作製方法に関する。本明細書における「細胞スフェロイド」は、細胞同士が集合・凝集化した細胞集合体である。細胞スフェロイドの形態は特に限定されず、球状、紐状、円筒状、シートを積層したもの等の三次元のものであってもよいし、単層のシートのような二次元のものであってもよい。
【００１２】
本発明は、具体的には、以下の（Ａ）〜（Ｃ）の工程を含む、細胞スフェロイドの作製方法に関する。
（Ａ）ゼラチン溶液と細胞とを接触させる工程。
（Ｂ）冷却してゼラチンをゲル化する工程。
（Ｃ）細胞をインキュベートする工程。
また所望により、本発明は（Ｄ）ゼラチンゲルを溶解する工程をさらに含む。
【００１３】
本発明の形成方法においては、工程（Ａ）においてゼラチン溶液（すなわち、ゼラチンゾル）を細胞と接触させることが必要である。ゼラチン溶液が細胞と接触することにより、ゼラチン分子が細胞間に入り込み、細胞と結合する。細胞の密度が高くなると細胞同士の間隔が狭くなり、ゼラチン分子が複数の細胞と結合し、細胞スフェロイドを形成すると考えられる。
【００１４】
また本発明の形成方法においては、（Ｂ）ゼラチン溶液を冷却してゲル化する必要がある。工程（Ｂ）は工程（Ａ）の前であっても、後であってもよく、特に限定されない。ゼラチンは冷却と加熱により、ゾルとゲルの状態を可逆的に移行する。ゾルの状態では、ゼラチン分子がランダムに分散しているが、ゲルの状態ではゼラチン分子同士が部分的にトリプルヘリックスを形成しており、加熱することによりトリプルヘリックスが解けると考えられている。工程（Ｂ）のゲル化を経ることにより、細胞間に入り込んだゼラチンはトリプルへリックスの形態をとり、加熱をしたとしても、トリプルヘリックスが維持され、細胞スフェロイドを維持することができるものと考えられる。
【００１５】
本発明の形成方法において、（Ｃ）細胞をインキュベートする工程では、細胞スフェロイドを所望の形状とする。工程（Ｃ）においては、細胞が増殖しても増殖しなくてもいずれであってもよい。細胞が増殖することにより、細胞スフェロイドが所望の形状を形成してもよいし、所望の形状の鋳型内や平面上で細胞をインキュベートしたり、遠心処理をしたりすることも含まれる。
また本発明の形成方法においては、（Ｄ）ゼラチンゲルを溶解することにより、形成された細胞スフェロイドを回収することができる。
【００１６】
本発明においては、工程（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）の順番は特に限定されないが、好ましくは以下のいずれかの順番で細胞スフェロイドが作製される。
１）（Ｂ）、（Ａ）、（Ｃ）；
２）（Ｃ）、（Ａ）、（Ｂ）；
３）（Ａ）、（Ｃ）、（Ｂ）。
【００１７】
細胞スフェロイドを形成する細胞の種類は特に限定されない。従来の方法ではE-カドヘリン等の接着因子を細胞表面に持つ細胞が、細胞スフェロイドを形成しやすいと考えられていた。しかしながら、本発明の形成方法によれば、接着因子を細胞表面に持たないような細胞であっても、短時間で細胞スフェロイドを作製することができる。細胞としては、肝細胞、神経細胞、甲状腺由来細胞、胸腺由来細胞、腎臓細胞、消化管由来細胞、幹細胞（ES細胞、iPS細胞等）、抗体産生細胞（ハイブリドーマ等）、間葉細胞、間質細胞、脂肪組織由来の前駆細胞、インシュリン産生細胞、B細胞、ホルモン産生細胞、肥満細胞、免疫系細胞、遺伝子組み換え細胞が挙げられる。好ましくは、肝細胞、腎臓細胞、幹細胞、抗体産生細胞等である。細胞の由来は特に限定されず、哺乳動物由来の細胞、好ましくはヒト由来の細胞である。本発明においては、１種の細胞を用いても良いし、複数種の細胞を用いても良い。また、細胞はスフェロイドの形態のものを用いても良い。
【００１８】
〔球状細胞スフェロイドの作製〕
球状細胞スフェロイドを作製する場合は、細胞非接着表面上で、ゼラチン溶液と細胞とを接触させることが好ましい。また、ゼラチン溶液と細胞との接触は、区切られた空間内で行うことが好ましい。さらに上記工程は（Ｂ）、（Ａ）、（Ｃ）の順で行われ、球状細胞スフェロイドを作製することができる。以下に、より具体的な方法を記載する。
【００１９】
一つの実施態様として、ゼラチンスポンジを用いることにより、均一な球状細胞スフェロイドを作製する方法がある。本方法によれば、均一な球状細胞スフェロイドを一度に大量に作製することができる。
【００２０】
本実施態様の工程（Ｂ）は以下の工程（ｂ１）と工程（ｂ２）を含む。
（ｂ１）底面が細胞非接着表面の区切られた空間内で、ゼラチン溶液を冷却してゲル化する工程。
（ｂ２）得られたゼラチンゲルを凍結乾燥してゼラチンスポンジを作製する工程。
【００２１】
本工程にて用いられるゼラチンは、ゼラチンスポンジとなった後に水分を含むことにより膨潤し得るものであればいかなるものであってもよく、修飾されたものであっても、無修飾ものであってもよい。ゼラチン溶液の濃度は、1%(w/v)〜20%(w/v)、好ましくは2%(w/v)〜10%(w/v)である。
【００２２】
底面が細胞非接着表面である区切られた空間とは、ゼラチン溶液を添加可能な空間内であればよい。例えば、シャーレの中や、マイクロプレート（マイクロタイタープレート）の各反応ウェル内を意味する。細胞非接着表面は、いかなるものであってもよいが、例えばキチンゲルやキチンフィルムが挙げられる。1 %(w/v)〜5 %(w/v)のキトサン溶液とアセチル化剤とを混合して作製することによりキチンゲルを作製することができる。キチンフィルムは、当該キチンゲルを乾燥させることにより作製することができる。アセチル化剤は好ましくは、無水酢酸である。
【００２３】
前記空間にゼラチン溶液を添加した後、0〜25℃で冷却することによりゲル化する。ゲル化のための冷却時間は、ゼラチン溶液の濃度、量にもよるが、1分間〜3時間程度、好ましくは5分間〜1時間程度である。また、本発明におけるゼラチンのゲル化は、架橋剤を用いないことを特徴とする。架橋剤を用いてゲル化を行った場合は、加熱をしたとしても再度ゼラチンゾルに戻ることはなく、可逆性を有さないゼラチンゲルとなってしまうため、好ましくない。
【００２４】
ゲル化した後のゼラチンゲルの凍結乾燥は、凍結処理と減圧乾燥処理により行われる。凍結処理は工程（ｂ１）にて得られたゼラチンゲルを、0〜-196℃の温度から選択される所望の温度で凍結させる。凍結時間は、温度やゼラチンゲルの量にもより適宜設定可能である。ゼラチンゲルを凍結後、緩やかに温度を上昇させながら減圧乾燥処理を行うことにより、ゼラチンをスポンジ状にして、複数の空孔を有するゼラチンスポンジを得ることができる。ゼラチンゲルの凍結温度を変動させることにより、ゼラチンスポンジの空孔の大きさ（直径）を調節することができる。例えば、-25℃といった高い温度で凍結を行った場合は、ゼラチンスポンジの空孔は150 μm程度と比較的大きくなり、-80℃といった低い温度で凍結を行った場合は、ゼラチンスポンジの空孔は50 μm程度と比較的小さくなる。なお得られたゼラチンスポンジは使用前に滅菌処理することが好ましく、滅菌処理は水を使わずに行うものであればよい。具体的には、オゾン滅菌、ガンマ線照射等が例示される。
【００２５】
本実施態様の工程（Ａ）は、以下の工程（ａ１）を含む。
（ａ１）ゼラチンスポンジの空孔に、細胞懸濁液を添加する工程。
【００２６】
細胞懸濁液中の細胞密度は、1×102〜1×1010細胞/μL、好ましくは1×103〜1×106細胞/μLであることが好ましい。1×102細胞/μL以上であることにより、ゼラチンと細胞とが良好に結合すると考えられる。また細胞懸濁液の溶媒は、いかなるものであっても良いが、好ましくは細胞に適した液体培地である。液体培地には水分が含まれることから、ゼラチンスポンジに添加することにより、ゼラチンスポンジが膨潤して、ゼラチン溶液と細胞とが接触することができると考えられる。細胞懸濁液を添加した後、さらに0〜25℃で10分間〜3時間インキュベートを行うことが好ましい。0〜25℃でインキュベートを行うことにより、膨潤したゼラチンを再度ゲル化することができる。
【００２７】
本実施態様の工程（Ｃ）は、以下の工程（ｃ１）を含む。
（ｃ１）細胞を、30〜37℃で1分間〜3時間インキュベートをする工程。
【００２８】
インキュベートを行うことにより、ゼラチンゲルが溶解するとともに、各空孔内で、各空孔の大きさ（直径）に応じた球状の細胞スフェロイドが形成される。工程（Ｃ）のインキュベートでは球状細胞スフェロイドが形成されさえすればよく、細胞が増殖していても細胞が増殖していなくてもよい。インキュベートの前には、空孔内に液体培地を添加してもよい。
【００２９】
別の実施態様として、ゼラチンゲルを用いて球状細胞スフェロイドを作製する方法がある。
【００３０】
本実施態様の工程（Ｂ）は以下の工程（ｂ３）を含む。
（ｂ３）底面が細胞非接着表面の区切られた空間内で、ゼラチン溶液を冷却してゲル化し、凹部を設けたゼラチンゲルを作製する工程。
【００３１】
本実施態様の工程（ｂ３）にて用いられるゼラチンは、ゲル化した後でも加温することにより溶解し、可逆的にゼラチン溶液となるものであれば、いかなるものであってもよく、修飾されたものであっても、無修飾ものであってもよい。ゼラチン溶液の濃度は、1%(w/v)〜20%(w/v)、好ましくは2%(w/v)〜10%(w/v)である。ゼラチン溶液の冷却温度、冷却時間、ゲル化に架橋剤を用いない点は、上述の実施態様と同様であるゼラチン溶液は、培地を含んでいてもよい。
【００３２】
底面が細胞非接着表面である空間とは、ゼラチン溶液を添加可能な空間内であればよい。例えば、シャーレの中や、マイクロプレート（マイクロタイタープレート）の各反応ウェル内を意味する。細胞非接着表面は、上述の実施態様と同様にいかなるものであってもよく、キチンゲルやキチンフィルムが例示される。
【００３３】
本実施態様においては、ゼラチンゲルに凹部を設けることが好ましい。凹部はゼラチンゲルの表面に設けられたゼラチンゲルの欠落した部分である。凹部は、例えばゼラチン溶液に型枠を含めた状態でゲル化を行い、ゲル化後に型枠を除去することにより設けることができる。型枠はPCRチューブ等や粒状物質が例示される。粒状物質は、塩、スクロース、アルギン酸カルシウムの粒などが例示される。
【００３４】
本実施態様の工程（Ａ）は、以下の工程（ａ２）を含む。
（ａ２）ゼラチンゲルの凹部に、細胞懸濁液を添加する工程。
【００３５】
細胞懸濁液中の細胞密度は、1×102〜1×1010細胞/μL、好ましくは1×103〜1×106細胞/μLであることが好ましい。1×102細胞/μL以上であることにより、ゼラチンと細胞とが良好に結合を形成すると考えられる。また細胞懸濁液の溶媒は、いかなるものであっても良いが、好ましくは細胞に適した液体培地である。工程（ａ２）では、細胞懸濁液を凹部に添加した後、細胞密度を濃縮してもよい。例えば、0〜25℃で5分間〜30分間インキュベートを行い、細胞を凹部内で沈降させ、上清の懸濁液を吸い取る等して除去することにより、細胞密度を濃縮することができる。その後凹部にゼラチン溶液を添加してもよい。ゼラチン溶液を添加した後はゼラチンをゲル化させることが好ましい。ゼラチンのゲル化は、例えば、0〜25℃で5分間〜2時間インキュベートを行えばよい。
【００３６】
本実施態様の工程（Ｃ）では、上述の実施態様と同様に、以下の工程（ｃ１）を含む。
（ｃ１）細胞を、30〜37℃で1分間〜3時間インキュベートをする工程。
【００３７】
インキュベートを行うことにより、ゼラチンゲルが溶解するとともに、凹部内で球状の細胞スフェロイドが形成される。工程（Ｃ）のインキュベートでは球状細胞スフェロイドが形成されさえすればよく、細胞が増殖していても細胞が増殖していなくてもよい。
【００３８】
〔シート状細胞スフェロイドの作製〕
シート状細胞スフェロイドを作製する場合は、細胞接着表面上で細胞をコンフルエントになるまで培養することが好ましく、空洞部分を有する中空部材（例えば、チューブやリング）を用いることが好ましい。さらに上記工程は（Ｃ）、（Ａ）、（Ｂ）の順でシート状細胞スフェロイドを作製することができる。好ましくは、工程（Ｄ）を含む。以下に、より具体的な方法を記載する。
【００３９】
本発明の作製方法には、単層のシート状スフェロイドを作製する方法、２層以上の複数の層の重なったシート状スフェロイドを作製する方法が含まれる。
【００４０】
まず、単層のシート状スフェロイドを作製する方法の実施態様を説明する。本実施態様の工程（Ｃ）は以下の工程（ｃ２）を含む。
（ｃ２）細胞接着表面上で細胞をコンフルエントになるまで培養する工程。
【００４１】
細胞接着表面上への細胞の播種密度は特に限定されない。培養温度や培養時間等の培養条件は、細胞の種類、細胞接着表面の広さ等により適宜設定可能である。工程（ｃ２）の培養は、細胞を増殖させることにより細胞接着表面上でコンフルエントにするものである。培養に使用する培地は、液体培地が好ましい。細胞接着表面はいかなるものであってもよく、一般的に接着培養で用いられているものを用いればよい。
【００４２】
工程（ｃ２）では、細胞をコンフルエントになるまで培養した後、細胞の種類によっては、細胞接着表面と細胞とを剥離する処理をしてもよい。細胞接着表面と細胞との剥離は、細胞剥離剤を用いることができる。細胞剥離剤はいかなるものであってよいが、例えばトリプシン溶液が例示される。細胞をコンフルエントになるまで培養した後、培地を除去しPBS等を用いて細胞を洗浄して、細胞剥離剤を添加し、反応させることが好ましい。細胞剥離剤の処理時間は短い方が好ましく、細胞剥離剤を除去することにより、反応を停止させることができる。
【００４３】
本実施態様の工程（Ａ）は、以下の工程（ａ３）、（ａ４）を含む。
（ａ３）中空部材の断面が細胞に面する向きで、中空部材を細胞上に置く工程。
（ａ４）中空部材の空洞部分にゼラチン溶液を含める工程。
【００４４】
中空部材は、空洞部分を有する管状の部材である。中空部材の断面には空洞部分が露出している。中空部材の空洞部分の表面は細胞非接着表面であることが好ましい。例えばステンレスやシリコン等の材料で作られた中空部材を用いることができる。中空部材の大きさは特に限定されない。
【００４５】
ゼラチンの種類は、球状細胞スフェロイドの作製と同様である。ゼラチン溶液の濃度は、1%(w/v)〜20%(w/v)、好ましくは2%(w/v)〜10%(w/v)である。ゼラチン溶液は、培地を含んでいてもよい。
【００４６】
工程（ａ３）において、細胞上に置かれる中空部材は、空洞部分にゼラチンを含んでいても良いし、含んでいなくてもよい。ゼラチンを含んでいない場合は、工程（ａ４）において空洞部分にゼラチン溶液を添加することにより、ゼラチン溶液を空洞部分に含めることができる。工程（ａ３）において空洞部分にゼラチンを含んでいる場合は、工程（ａ４）において、空洞部分に含まれるゼラチンを溶解することにより、空洞部分にゼラチン溶液を含めることができる。ゼラチンは、30〜40℃（好ましくは37℃）で、5分間以上インキュベートすることにより溶解することができる。また工程（ａ３）において空洞部分にゼラチンが含まれる場合、ゼラチンは溶液状態であってもよいし、ゲル化されていてもいずれであってもよい。工程（ａ４）において、空洞部分にゼラチン溶液が含まれることにより、空洞部分の底面にある細胞とゼラチン溶液とが接触する。なお「空洞部分にゼラチン溶液を含める」とは、細胞とゼラチン溶液とが接触する程度の量のゼラチン溶液が、空洞部分に含められていればよく、空洞部分の最上面までゼラチン溶液が満たされていることを意味するのではない。
【００４７】
本実施態様の工程（Ｂ）は、以下の工程（ｂ４）を含む。
（ｂ４）中空部材の空洞部分のゼラチン溶液を冷却してゼラチンをゲル化する工程。
【００４８】
ゼラチン溶液の冷却温度、冷却時間は球状細胞スフェロイドの作製と同様であり、架橋剤を用いないことも同様である。本工程（ｂ４）により、細胞間に入り込んだゼラチン分子が、トリプルへリックスを形成し、細胞間の結合を補強すると考えられる。
【００４９】
本実施態様の工程（Ｄ）は、以下の工程（ｄ１）及び（ｄ２）を含む。
（ｄ１）中空部材を別の空間に移動させる工程。
（ｄ２）ゼラチンゲルを溶解して、シート状細胞スフェロイドを得る工程。
【００５０】
工程（ｄ１）により、シート状細胞スフェロイドが細胞接着表面から取り除かれ、ゼラチンゲルに貼りついた状態のシート状細胞スフェロイドが得られる。工程（ｄ２）では、30〜40℃（好ましくは37℃）で、5分間以上インキュベートすることにより、ゼラチンを溶解することが好ましい。ゼラチンが溶解した後も、シート状細胞スフェロイドの形状は損なわれずに維持される。
【００５１】
別の実施態様として、２層以上の複数の層の重なったシート状スフェロイドを作製する方法がある。本実施態様では、（Ｃ）、（Ａ）、（Ｂ）を繰り返すことによりシート状細胞スフェロイドが作製される。
【００５２】
１度目の工程（Ｃ）は上述の実施態様と同様に、工程（ｃ２）を含む。工程の詳細についても、上述の実施態様と同様である。
【００５３】
１度目の工程（Ａ）は上述の実施態様と同様に、工程（ａ３）及び（ａ４）を含む。各工程の詳細については、上述の実施態様と同様である。
【００５４】
１度目の工程（Ｂ）は上述の実施態様と同様に、工程（ｂ４）を含む。工程の詳細についても、上述の実施態様と同様である。
【００５５】
１度目の工程（Ｄ）は、以下の工程（ｄ１）を含む。
（ｄ１）中空部材を別の空間に移動させる工程。
工程（ｄ１）により、シート状細胞スフェロイドが細胞接着表面から取り除かれ、ゼラチンゲルに貼りついた状態のシート状細胞スフェロイドが得られる。
【００５６】
２度目以後の工程（Ｃ）も、上述と同様に工程（ｃ２）を含む。上記１度目の工程（ｃ２）とは別に工程（ｃ２）を行い、別途新たにコンフルエントになった細胞を準備する。
【００５７】
２度目以後の工程（Ａ）は、上記１度目の工程（ｄ１）の後に、以下の工程（ａ３’）、（ａ４）を含む。
（ａ３’）中空部材のシート状スフェロイドが張り付いた断面が細胞に面する向きで、工程（ｄ１）の中空部材を、新たな細胞上に置く工程。
（ａ４）中空部材の空洞部分にゼラチン溶液を含める工程。
【００５８】
工程（ａ３）において、中空部材の断面の一方には、シート状細胞スフェロイドが貼りついており、空洞部分にはゼラチンゲルが含まれる。本実施態様における工程（ａ３）では、シート状細胞スフェロイド側がコンフルエントな細胞に接するように、中空部材を細胞上に置く。
【００５９】
２度目以後の工程（Ｂ）は、上述の実施態様と同様に、工程（ｂ４）を含む。工程の詳細についても、上述の実施態様と同様である。
【００６０】
２度目以後の工程（Ｄ）は、さらにシート状細胞スフェロイドを積層させる場合は、工程（ｄ１）のみを含む。所望のシート数のシート状細胞スフェロイドを回収する場合には、工程（ｂ４）の後に、以下の工程（ｄ１）及び（ｄ２）を行う。
（ｄ１）中空部材を別の空間に移動させる工程。
（ｄ２）ゼラチンゲルを溶解して、シート状細胞スフェロイドを得る工程。
【００６１】
最後の工程（ｄ２）を行う前まで（すなわち（ｃ１）、（ａ３’）、（ａ４）、（ｂ４）、（ｄ１））を複数回繰り返した後、最後に工程（ｄ２）を行うことにより、２層以上のシート状細胞スフェロイドを作製することができる。
【００６２】
〔各種形状の細胞スフェロイドの作製〕
各種形状、例えば紐状、筒状、板状細胞スフェロイドを作製することができる。本作製方法では、細胞非接着表面により区切られた空間内でゼラチン溶液と細胞とを接触させることが好ましい。より具体的には、細胞非接着表面により区切られた空間を有する所望の鋳型（例えば紐状の場合はチューブ等）を利用することができる。さらに上記工程は（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）の順で、細胞スフェロイドの作製が行われる。また工程（Ｄ）を含むことが好ましい。以下に、より具体的な方法を記載する。
【００６３】
本実施態様の工程（Ａ）は、以下の工程（ａ５）を含む。
（ａ５）細胞非接着表面で区切られた空間内に、細胞とゼラチンを含む懸濁液を添加する工程。
【００６４】
細胞非接着表面で区切られた空間である鋳型としては、例えば、シリコン、パラフィルム、ガラス等の材料でできたものであったり、表面をゼラチンコートや、ワセリンコートした鋳型を用いることができる。
【００６５】
ゼラチンの種類は、球状細胞スフェロイドの作製と同様である。ゼラチン溶液の濃度は、1%(w/v)〜20%(w/v)、好ましくは2%(w/v)〜10%(w/v)である。ゼラチン溶液の冷却温度、冷却時間は球状細胞スフェロイドの作製と同様と同様であり、架橋剤を用いないことも同様である。
【００６６】
懸濁液中の細胞密度は、1×102〜1×1010細胞/μL、好ましくは1×103〜1×106細胞/μLであることが好ましい。1×102細胞/μL以上であることにより、ゼラチンと細胞とが良好に結合を形成すると考えられる。また懸濁液の溶媒は、いかなるものであっても良いが、好ましくは細胞に適した液体培地である。
【００６７】
本実施態様の工程（Ｃ）は、以下の工程（ｃ３）を含む。
（ｃ３）空間内の懸濁液の細胞密度を濃縮する工程。
工程（ｃ３）では、懸濁液を空間内に添加した後、細胞密度を濃縮することにより、細胞スフェロイドを所望の形状にすることができる。例えば、鋳型ごと遠心処理を行うことにより、細胞密度を濃縮することができる。
【００６８】
本実施態様の工程（Ｂ）は、以下の工程（ｂ５）を含む。
（ｂ５）ゼラチン溶液を冷却してゲル化を行う工程。
ゼラチン溶液の冷却温度、冷却時間は上述の実施態様と同様であり、架橋剤を用いないことも同様である。
【００６９】
本実施態様の工程（Ｄ）では、以下の工程（ｄ３）及び工程（ｄ４）を含む。
（ｄ３）ゼラチンゲルを溶解する工程。
（ｄ４）鋳型から細胞スフェロイドを取り外す工程。
工程（ｄ３）では、30〜37℃、5分〜1時間でゼラチンを溶解することが好ましい。また、鋳型から細胞スフェロイドを取り外す前に、ゼラチンゲルを溶解してもよいし、鋳型から細胞スフェロイドを取り外した後に、ゼラチンゲルを溶解してもよい。ゼラチンゲルを溶解した後でも、細胞スフェロイドの形状は維持される。
【００７０】
本発明は、本発明の作製方法により得られた細胞スフェロイドも包含する。本発明の細胞スフェロイドにおいては、ゼラチンが細胞同士を接着していると考えられる。ゼラチンは、ランダムコイル状ではなく、トリプルヘリックスとなり、細胞と結合していると考えられ、細胞間を接着する働きを有している。また本発明の細胞スフェロイドは、
１週間程度、細胞スフェロイドの形態を維持できる。本発明の作製方法により作製された細胞スフェロイドは短時間で形成されるため、外気に接触していない細胞スフェロイドの内部の細胞が細胞死に至っていないという利点もある。
【００７１】
本発明はさらに、細胞スフェロイドを用いて、様々な解析を行うことを含む。具体的には、薬剤のスクリーニングや、薬剤の毒性の確認等を行うことを含む。
【実施例】
【００７２】
以下、本発明の内容を実施例に示して具体的に本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００７３】
（実施例１）  ゼラチンスポンジを用いた球状細胞スフェロイドの作製
ゼラチンスポンジを作製し、均一な球状細胞スフェロイドを作製した（図１）。以下に具体的な手法を示す。
（１）キトサン（和光純薬、キトサン10、http://www.siyaku.com/uh/Shs.do?dspCode=W01W0103-2292）に無水酢酸を添加して3分間振盪することにより混合し、2％キトサン溶液を作製した。24穴プレートの各ウェルに100 μLキトサン溶液を添加してキチンゲルを作製し、ドラフト内で、室温で、一晩放置することでキチンフィルムを作製した。
（２）各ウェルのキチンフィルム上に、10％ゼラチン溶液（新田ゼラチンより入手）を300 μLを添加し、4℃で30分間インキュベートしてゲル化させた。
（３）ゼラチンゲルを-25℃又は-80℃で、1時間静置して、凍結させた。その後、-80℃のディープフリーザーに移して、1時間さらに冷却してゼラチンゲルを凍結させた。
（４）その後、減圧乾燥を行い、ゼラチンをスポンジ状にしてゼラチンスポンジを作製した。得られたゼラチンスポンジを、クールクレーブを用いてオゾン滅菌した。
（５）マウス胎児性癌細胞由来癌幹細胞P19CL6株の細胞懸濁液300 μL（1 x 105 細胞/300μL）を各ウェルに添加し、25℃で2時間放置して、ゼラチンスポンジを膨潤させ、ゼラチンをゲル化した。
（６）各ウェルに、1 mL  DMEM培地を添加して37℃でインキュベートし、ゼラチンゲルを溶解し、細胞スフェロイドを形成させた。
【００７４】
上記（６）のインキュベート開始から1時間後には、複数の細胞が寄り集まった状態のものが複数観察された。さらに一晩インキュベートした結果を、図２にて示す（１日後と示したもの）。図２では、1 mL  DMEMを添加した直後のものを、イニシャルとして示す。一晩インキュベートしたものでは、直径100 μｍ程度のスフェロイドが多量に得られた。
【００７５】
（実施例２）  ゼラチンゲルを用いた球状細胞スフェロイドの作製
ゼラチンゲルを用いて、球状細胞スフェロイドを作製した（図３）。以下に具体的な手法を示す。
（１）キトサンに無水酢酸を添加して3分間振盪することにより混合し、2％キトサン溶液を作製した。24穴プレートの各ウェルに300 μLキトサン溶液を添加してキチンゲルを作製した。
（２）各ウェルのキチンゲル上に、DMEM含有10%ゼラチン溶液2 mLを添加した。
（３）型枠として、PCRチューブをゼラチン溶液中に差し込み、4℃、1時間冷却して、ゼラチンをゲル化し、型枠を取り外した。
（４）型枠を取り外してできた凹部に、20 μLの細胞懸濁液（2 x 106 cells /20 μL）を注入した。用いた細胞は、マウス褐色脂肪細胞HB2株、マウス線維芽細胞L929株、ヒト肝がん細胞HepG2株、ヒト乳腺癌細胞MDA-MB-231株、ヒト子宮頚癌細胞HeLa細胞である。
（５）25℃で10分間インキュベートして、細胞を沈降させ、その後細胞を吸わないように上清を取り除き、凹部に10%ゼラチン溶液100 μLをさらに添加した。
（６）25℃で30分間インキュベートして、ゼラチンをゲル化させた。
（７）37℃で1時間インキュベートして、ゼラチンゲルを溶解し、細胞スフェロイドを形成させた。
【００７６】
上記（７）で1時間インキュベートした結果、目に見える巨大な球状の細胞スフェロイドが形成された（図４）。L929株とMDA-MB-231株はE-カドヘリンの発現がないか、もしくは少ないため、通常は細胞スフェロイドを形成することはできないが、本実施例では1時間程度で巨大な球状細胞スフェロイドを形成することができた。
【００７７】
（実施例３）  シート状細胞スフェロイドの作製
ゼラチン溶液を用いてシート状細胞スフェロイドを作製した（図５）。以下に具体的な手法を示す。単層のシート状細胞スフェロイドと、２層のシート状細胞スフェロイドを作製した。
【００７８】
（単層のシート状細胞スフェロイドの作製）
（１）マウス胎児性癌細胞由来癌幹細胞P19CL6株を、12穴プレートの各ウェルに播種し、37℃でコンフルエントになるまで培養した。
（２）ウェル内の培地を吸い取って除去し、各ウェルに200 μL  PBSを添加して洗浄後、200 μLトリプシン溶液を入れ、１分間静置し、トリプシン溶液をウェルから除去した。
（３）ステンレスリング（内径1 cm）の断面が細胞に接するように、各ウェル内の細胞上にステンレスリングを置いた。
（４）各ステンレスリング内にDMEM含有10%ゼラチン溶液を100 μL添加した。
（５）冷蔵庫（4℃）で20分間冷却して、ゼラチンをゲル化した。
（６）ステンレスリングをウェルから取り外した。
（７）次にステンレスリング内のゼラチンゲルを取り出した。ゼラチンゲルを新たな12穴プレートに置き、DMEM培地1 mLを添加して、37℃で1時間インキュベートし、ゼラチンゲルを溶解した。
【００７９】
上記（７）において、37℃でインキュベートすることにより、ゼラチンゲルが溶解し、単層のシート状細胞スフェロイドが得られた。
癌幹細胞P19CL6株は、DMSOを添加して培養することにより心筋細胞に分化することが知られている。本実施例にて得られた単層シート状細胞スフェロイドを、DMSOを添加した培地を用いて37℃で１日間培養したところ、細胞が集合し分化しつつあることが確認された（図６、矢印の箇所）。
【００８０】
（２層のシート状細胞スフェロイドの作製）
上記（１）〜（６）を行った。
（８）上記（１）と同様にして、マウス胎児性癌細胞由来癌幹細胞P19CL6株を、新たな12穴プレートの各ウェルに播種し、37℃でコンフルエントになるまで培養した。
（９）ウェル内の培地を吸い取って除去し、各ウェルに200 μL  PBSを添加して洗浄後、200 μLトリプシン溶液を入れ、1分間静置し、トリプシン溶液をウェルから除去した。
（１０）上記（６）にて取り外したステンレスリングを、ゼラチンゲルごと、ステンレスリングに貼り付いた細胞スフェロイドがウェル内の細胞に接するように、各ウェル内の細胞上に置いた。
（１１）37℃で1時間インキュベートして、ゼラチンを溶解した。
（１２）冷蔵庫（4℃）で20分間冷却して、ゼラチンをゲル化した。
（１３）ステンレスリングをウェルから取り外した。
（１４）次にステンレスリング内のゼラチンゲルを取り出した。ゼラチンゲルを新たな12穴プレートに置き、DMEM培地1 mLを添加して、37℃で1時間インキュベートし、ゼラチンゲルを溶解した。
【００８１】
上記（１４）において、37℃でインキュベートすることにより、ゼラチンゲルが溶解し、２層のシート状細胞スフェロイドが得られた。
【００８２】
（実施例４）  シート状細胞スフェロイドの作製２
ゼラチン溶液を用いてシート状細胞スフェロイドを作製した。
（１）マウス結合組織由来細胞L929株を、12穴プレートの各ウェルに播種し、37℃でコンフルエントになるまで培養した。
（２）ウェル内の培地を吸い取って除去し、各ウェルに200 μL  PBSを添加して洗浄後、200 μLトリプシン溶液を入れ、１分間静置し、トリプシン溶液をウェルから除去した。（３）シリコンチューブ（内径1 mm）に、DMEM含有10%ゼラチン溶液を注入し、冷蔵庫（4℃）で冷却して、ゼラチンをゲル化した。
（４）シリコンチューブの断面のゼラチンゲルが細胞に接触するようにして、シリコンチューブを各ウェル内の細胞上に置いた。
（５）37℃で15分間インキュベートして、ゼラチンを溶解した。
（６）冷蔵庫（4℃）で15分間冷却して、ゼラチンをゲル化した。
（７）シリコンチューブをウェルから取り外した。
（８）シリコンチューブを新たな12穴プレートに置き、DMEM培地を添加して、37℃でインキュベートしてゼラチンを溶解し、シリコンチューブを取り除いた。
【００８３】
上記（８）において、37℃でインキュベートすることにより、ゼラチンゲルが溶解し、シート状細胞スフェロイドを作製することができた（図７）。本実施例により、コンフルエントな状態の細胞から、一部分をシート状細胞スフェロイドとして剥離できることがわかった。
【００８４】
（実施例５）  紐状細胞スフェロイドの作製
紐状細胞スフェロイドを作製した（図８）。以下に具体的な手法を示す。
（１）シリコンチューブ（内径0.1 mm、0.35 mm、0.5 mm、1.0 mm）を、長さ3 cm程度に切断し、片側に白チップ（10μLチップ）を装着させた。
（２）マウス胎児性癌細胞由来癌幹細胞P19CL6株を、DMEM含有10%ゼラチン溶液で懸濁し、細胞懸濁液を調製した。
（３）シリコンチューブの白チップを介して、20 μLの細胞懸濁液（2 x 106 細胞/20 μL）を注入し、シリコンチューブの反対側をクリップで留めた。
（４）シリコンチューブを金属製パイプに挿入して、さらに50ｍLチューブに入れて、37℃で30分インキュベートし、ゼラチン溶解した。なお、シリコンチューブを金属製パイプに挿入した理由は、以下の遠心時にシリコンチューブが曲がることを防ぐためである。
（５）シリコンチューブを1000G×3分間遠心し、細胞密度を濃縮した。
（６）4℃で1時間冷却して、ゼラチンをゲル化した。
（７）3cm ディッシュにチューブを静置し、DMEM培地2 mLを注ぎ、37℃で1時間インキュベートし、ゼラチンを溶解した。
（７）ピベッティングにより細胞スフェロイドをシリコンチューブから押し出した。
【００８５】
その結果、シリコンチューブの内径に応じて、直径が100μm、350μm、500μm、1000μmの紐状の細胞スフェロイドを作製することができた。図９には、直径が500μmの紐状細胞スフェロイドの写真を示した。
【００８６】
（実施例６）  円筒状細胞スフェロイドの作製
（１）シリコンチューブ（内径  0.5 mm）を、長さ3 cm程度に切断し、片側から注射針を突き刺した。
（２）マウス胎児性癌細胞由来癌幹細胞P19CL6株を、DMEM含有10%ゼラチン溶液で懸濁し、細胞懸濁液を調製した。
（３）シリコンチューブと注射針との間隙に、20 μLの細胞懸濁液（2 x 106 細胞/20 μL）を注入し、シリコンチューブの反対側をクリップで留めた。
（４）シリコンチューブを金属製パイプに挿入して、さらに50ｍLチューブに入れて、37℃で30分インキュベートし、ゼラチンを溶解した。なお、シリコンチューブを金属製パイプに挿入した理由は、実施例４と同様である。
（５）シリコンチューブを1000G×3分間遠心し、細胞密度を濃縮した。
（６）4℃で1時間冷却して、ゼラチンをゲル化した。
（７）3cm ディッシュにチューブを静置し、DMEM培地2 mLを注ぎ、37℃で1時間インキュベートし、ゼラチンを溶解した。
（８）注射針を抜き、ピベッティングにより細胞スフェロイドをシリコンチューブから押し出した。
【００８７】
その結果、円筒状細胞スフェロイドを作製することができた（図１０、図１１）。図１１は、円筒状細胞スフェロイドをゼラチンに包埋して固め、ゼラチンごとスフェロイドを切断し、肉眼及び顕微鏡で観察した写真である。図１０及び図１１から、円筒状細胞スフェロイドに中空の領域があり、円筒状であることが確認できた。
【００８８】
（実験例１）
マウス白色脂肪前駆細胞（HW株）を用いて、平面培養、キチンゲルシート上で培養、キチンゲルシート上のゼラチンスポンジを用いた培養を行い、HW細胞の脂肪細胞への分化に対する影響を確認した。
【００８９】
（１）脂肪滴の染色
マウス白色脂肪前駆細胞が、脂肪細胞に分化すると、細胞内に脂肪滴が形成される。培養後の細脂肪滴を、定法であるOil Red O染色を行い、その分化度を検証した。
【００９０】
平面培養は、一般的なマイクロプレートを用いて接着培養することにより行った。上記の各培養において、マウス白色脂肪前駆細胞は20万細胞/mLの密度の懸濁液を準備し、10万細胞/500 μLをマイクロプレートの各ウェルに播種した。マウス白色脂肪前駆細胞を播種して、各ウェルに培地500μLを加えて、1日間、37℃で培養した。1日後、培地を分化誘導培地（D-MEM、10％FBS、0.5 mM IBMX、1 μM dexamethasone）に交換し、その2日後に、培地を分化培地（D-MEM、10％FBS、10 μg/mL insulin、50 nM T3）に交換した。さらに2日後に分化培地を交換し、1日後にOil Red O染色を行った。
【００９１】
従来のスフェロイド作製方法として、キチンフィルム上での培養はキチンフィルムを作製し、その上に細胞を播種した以外は、平面培養と同様にして、培養を行った。キチンフィルムは細胞非接着表面であり、自発的に１日程度で細胞スフェロイドが形成される。形成した細胞スフェロイドはそのままキチンフィルム上で培養した。培養後、Oil Red O染色を行った。
【００９２】
ゼラチンスポンジを用いた培養は、実施例１と同様の方法にて、キチンフィルム上にゼラチンスポンジを形成させ、スポンジの穴に細胞を播種することにより行った。細胞の播種密度は、平面培養と同様である。細胞を播種後、2時間室温で放置することにより、細胞スフェロイドを形成させた。その後、培地500μLを加え、37℃で培養してゼラチンスポンジを溶解させ、形成した細胞スフェロイドは、そのままキチンフィルム上で培養した。以後は平面培養と同様にして、分化誘導培地、分化培地を用いて培養を行い、Oil Red O染色を行った。
【００９３】
結果を図１２に示す。平面培養では、スフェロイドが形成されておらず、まばらに染色されていた。またキチンフィルムを用いた培養（いわゆる通常のスフェロイド培養）では、スフェロイド全体が赤黒く染色されており、細胞が分化誘導されていることがわかった。脂肪細胞は硬い固定面に接着すると分化しにくく、柔らかい面に接着、あるいはスフェロイドのように接着していない場合に、分化が促進されることがわかっている。本発明のゼラチンスポンジで作製したスフェロイドも、従来のスフェロイド作製方法で（細胞が自発的に集合した）スフェロイドと同様に、赤黒く染色され、全体に分化していることがわかった。ゼラチンスポンジで作製したスフェロイドも、従来のスフェロイド作製方法で作製したスフェロイドと同様に分化誘導されることがわかった。
【００９４】
（２）脂肪細胞の分化マーカーの確認
上記（１）と同様にして、マウス白色脂肪前駆細胞（HW株）を平面培養した細胞、キチンシート上で培養したスフェロイド、及び、ゼラチンスポンジを用いて培養したスフェロイドについて、脂肪細胞分化マーカーであるアディポネクチン（adiponectin）mRNAの発現をリアルタイムPCRで測定した。細胞の分化誘導は、2日間分化誘導培地を用いて培養し、以後分化培地に交換して培養することにより行った。分化誘導のDay0（誘導前）、Day2、Day4に、細胞の全RNAを抽出し、逆転写によりcDNAを作製、リアルタイムPCRを行なった。内部標準として、βアクチンを用い、補正を行なった。各細胞の発現量は、平面培養のDay0（分化誘導前）の値を１とした時の相対値で表した。
【００９５】
結果を、図１３に示す。ゼラチンスポンジを用いて作製したスフェロイドでは、分化誘導2日目から早くも分化マーカーであるアディポネクチンの発現が見られ、4日目では強く発現していることがわかった。また、従来のスフェロイド作製方法であるキチンゲルシートを用いて作製したスフェロイドより、アディポネクチンが強く誘導されていることがわかった。ゼラチンスポンジで作製したスフェロイドは、従来の作製方法によるスフェロイドに比べて、分化誘導が早く進行していると考えられた。ゼラチンスポンジの場合、約2時間という短時間でスフェロイドが形成できることにより、分化誘導の進行が早いものと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００９６】
本発明によれば、従来の方法では細胞スフェロイドを形成しないような、E-カドヘリン等の接着因子を細胞表面に持たない細胞であっても、短時間のインキュベートで細胞スフェロイドを形成させることができる。短時間で形成されることから、内部の細胞も活性を維持した状態の細胞スフェロイドを作製することができる。また得られた細胞スフェロイドは１週間程度、そのまま形状を維持することができる。本発明によれば、また同質のスフェロイドを大量に再現性良く作製可能であり、作製した細胞スフェロイドを用いて薬剤等のスクリーニングや毒性評価を行うことができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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