(57)【要約】【課題】Thermococcus spp.から分離された新規な水素化酵素、これを暗号化する遺伝子及びその遺伝子を有する微生物を用いて水素を産生する方法を提供すること。【解決手段】本発明は、Thermococcus属に属する高好熱性新菌株から分離した新規な水素化酵素、これを暗号化する遺伝子及びこれを用いて水素を産生する方法に関する。本発明の水素の産生方法によれば、前記菌株を特定の培養条件下で培養するだけで多量の水素を産生することができることから、既存の水素の産生方法に比べて経済的で且つ効率的であり、しかも、高温下でも水素を産生することができるというメリットがある。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホルム酸から水素を産生するための 配列番号 61ないし 配列番号 80の塩基配列を含 Hyg4-III遺伝子。
【請求項２】
水素産生のための組換えベクターであって、 請求項1に記載の遺伝子が作動可能に連結される、組換えベクター。
【請求項３】
水素産生のための、請求項2に記載の組換えベクターで形質転換された原核細胞。
【請求項４】
請求項3に記載の形質転換体を使用して水素を産生する方法であって、
培養容器に培地を生成するステップと、
前記培養容器の気体相中にホルム酸塩を供給するステップと、
前記培養容器において前記形質転換体を培養するステップと、
前記培養容器から水素を抽出するステップと
を含む、方法。
【請求項５】
配列番号 61ないし 配列番号 80の タンパク質を含 水素産生の酵素システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はThermococcus属に属する新菌株から発見した新規な水素化酵素、これを暗号化する遺伝子、及びこれらを用いて水素を産生する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
水素エネルギーは重量当たりの発熱量が石油よりも３倍以上高いつつも、二酸化炭素、ＮＯｘ、ＳＯｘなど環境に悪影響を及ぼしうる物質を排出しないことから、今後化石エネルギーに替えうるエネルギーとして脚光を浴びている。
【０００３】
従来より用いられてきている水素の産生方法には、水の電気分解、天然ガスやナフサの熱分解または水蒸気改質法などがある。しかしながら、これらの方法はさらに化石燃料を用いて高温・高圧の条件を造成しなければならないという不都合があり、一酸化炭素を含む混合ガスを発生するため、そのようなガスから一酸化炭素を除去しなければならないという難点を発生する。
【０００４】
これに対し、微生物を用いた生物学的な水素の産生方法は、別途のエネルギーを投入して高温・高圧の条件を造成する必要がなく、生成されたガスに一酸化炭素を含んでいないというメリットがある。このような生物学的な水素の産生方法は、大きく光合成微生物を利用する方法と、非光合成微生物（主として、嫌気性微生物）を利用する方法と、に大別できる。前者に属する例として、例えば、下記の特許文献１の「高い塩分濃度における、水素生成能に優れた光合成細菌ロドシュードモナス・スフェロイデス（Rhodobacter sphaeroides）菌株を用いた水素の産生方法」などがある。
【０００５】
しかしながら、光をエネルギー源として用いる光合成細菌の高濃度培養技術が未だ十分に開発されておらず、従来の光合成細菌は高い分圧の基質がある場合に基質阻害が深刻であるという欠点がある。なお、これらは光が存在する場合にしか水素生成能を持続することができないといった不都合がある。
【０００６】
このため、有機炭素を用いて水素を産生可能な微生物を用いて水素を産生しようとする試みが絶えずなされてきており、その例として、例えば、下記の特許文献２の「シトロバクター属菌株Ｙ１９及びこれによる水素産生」、例えば、下記の特許文献３の「ロドシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris」Ｐ４及びこれによる水素産生」などがある。
【０００７】
本発明者らは高好熱性新菌株Thermococcus onnurineus NA1（寄託番号：ＫＣＴＣ １０８５９ＢＰ）の新規なタンパク質及びこれを暗号化する遺伝子について２００８年９月５日付けにて特許出願を行った（例えば、下記の特許文献４参照）。本発明は、これらの特許出願されたタンパク質及び遺伝子のうち特に水素生成と関連するものに関する。本発明者らは、前記菌株の水素生成能力と関連する実験を行った結果、前記菌株が高温の環境下でも多量の水素を生成することを見出し、特に、一酸化炭素（ＣＯ）またはホルム酸塩を添加した培養条件下で多量発現する新規な水素化酵素を見出し、本発明を完成するに至った。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】大韓民国登録特許第１０−０６８０６２４号公報
【特許文献２】大韓民国登録特許第１０−０３１５６６３号公報
【特許文献３】大韓民国登録特許第１０−０３１５６６２号公報
【特許文献４】大韓民国特許出願第１０−２００８−００８７７９４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、高温の環境下でも水素を産生可能な高好熱性Thermococcus spp.の水素化酵素及びこれを暗号化する遺伝子を提供し、これを用いて効率よく水素を産生する方法を提供するところにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記目的を達成するための手段として、本発明は、嫌気的培養条件下で水素を産生可能な高好熱性Thermococcus spp.菌株が有している水素化酵素及びこれを暗号化する遺伝子を提供する。なお、本発明は、前記菌株を培養して水素を産生する方法及び前記遺伝子を用いて水素を産生する方法を提供する。
【００１１】
第１態様として、本発明は、高好熱性新菌株Thermococcus onnurineus NA1（寄託番号：ＫＣＴＣ １０８５９ＢＰ）が産生する水素化酵素を提供する。T. onnurineus NA1は８種類の新規な水素化酵素遺伝子クラスターを有しており、ここに属する水素化酵素に対するアミノ酸配列は配列番号１乃至配列番号８の通りである。
【００１２】
第２態様として、本発明は、前記アミノ酸を暗号化する遺伝子を提供する。これに制限されるものではないが、好ましくは、前記遺伝子は、配列番号１２乃至配列番号１９である（前記配列番号１乃至配列番号８のアミノ酸がそれぞれ配列番号１２乃至１９の遺伝子に対応する）。
【００１３】
第３態様として、本発明は、Thermococcus spp.を培養して水素を産生する方法を提供する。前記方法は、１）培養容器に培地を生成するステップと、２）Thermococcus spp.を前記培養容器において培養するステップと、３）前記培養容器から水素を抽出するステップと、を含むことを特徴とする。前記Thermococcus spp.は、好ましくは、Thermococcus onnurineus NA1（寄託番号：ＫＣＴＣ １０８５９ＢＰ）である。
【００１４】
さらに、前記培地は、一酸化炭素、ホルム酸塩及び澱粉よりなる群から選ばれるいずれか一種以上の物質が添加された培地であってもよい。また、前記培養は、８０℃の高温下で行われてもよく、嫌気的条件下で行われてもよい。
【００１５】
第４態様として、本発明は、配列番号９乃至配列番号１１よりなる群から選ばれるいずれか一種以上のアミノ酸配列からなる脱水素化酵素を提供する。
【００１６】
第５態様として、本発明は、前記脱水素化酵素を暗号化する遺伝子を提供し、好ましくは、これは、配列番号２０乃至配列番号２２である（前記配列番号９乃至１１のアミノ酸がそれぞれ配列番号２０乃至２２に対応する）。
【００１７】
第６態様として、本発明は、T. onnurineus NA1のＣＯＤＨ−ＭＣＨ−ＭＮＨ３水素化酵素クラスターを構成する遺伝子がいずれも作動可能に連結された組換えベクターを提供する。好ましくは、これに制限されるものではないが、前記遺伝子は、配列番号２１（ＣＯＤＨ脱水素化酵素）及び配列番号１６（ＭＣＨ水素化酵素）の遺伝子を含む。加えて、本発明は、前記組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。
【００１８】
また、本発明は、培養容器に培地を生成するステップと、前記培養容器のガス層に一酸化炭素を供給するステップと、前記形質転換体を前記培養容器において培養するステップと、前記培養容器から水素を抽出するステップと、を含むことを特徴とする前記形質転換体を用いて水素を産生する方法を提供する。
【００１９】
第７態様として、本発明は、T. onnurineus NA1のＦＤＨ２−ＭＦＨ２−ＭＮＨ２水素化酵素クラスターを構成する遺伝子がいずれも作動可能に連結された組換えベクターを提供する。好ましくは、これに制限されるものではないが、前記遺伝子は、配列番号２２（ＦＤＨ２脱水素化酵素）及び配列番号１８（ＭＦＨ２水素化酵素）の遺伝子を含む。加えて、本発明は、前記組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。
【００２０】
さらに、本発明は、培養容器にホルム酸塩を含む培地を生成するステップと、前記形質転換体を前記培養容器において培養するステップと、前記培養容器から水素を抽出するステップと、を含むことを特徴とする前記形質転換体を用いて水素を産生する方法を提供する。
【００２１】
第８態様として、本発明は、T. onnurineus NA1のＦＤＨ１−ＭＦＨ１−ＭＮＨ１水素化酵素クラスターを構成する遺伝子がいずれも作動可能に連結された組換えベクターを提供する。好ましくは、これに制限されるものではないが、前記遺伝子は、配列番号２０（ＦＤＨ１脱水素化酵素）及び配列番号１３（ＭＦＨ１水素化酵素）の遺伝子を含む。加えて、本発明は、前記組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。
【００２２】
さらに、本発明は、培養容器に澱粉を含む培地を生成するステップと、前記形質転換体を前記培養容器において培養するステップと、前記培養容器から水素を抽出するステップと、を含むことを特徴とする前記形質転換体を用いて水素を産生する方法を提供する。
【発明の効果】
【００２３】
本発明に係る水素の産生方法は、従来の化学的な産生方法とは異なり、高温・高圧の条件を必要とせず、且つ、常温・常圧の条件下で水素を発生することができ、有害な副産物を発生しないというメリットがある。なお、微生物を用いて水素を産生する従来の技術と比較しても、高純度の水素を高効率にて産生することができ、高温条件下でも水素を産生することができるというメリットがある。
【００２４】
このため、石油精製工程などにおいて排出される高温の一酸化炭素を別途の冷却過程なしに直ちに捕獲して水素生成に活用することができるという経済的な利点があり、空気浄化の側面からも有効に利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】Thermococcales strains、T. onnurineus NA1 (NA1)、T. kodakaraensis、P. furiosus及びP. abyssi.のプロテオームの共通領域及び特異領域を示すベン図である。前記菌株に対するタンパク質組はＮＣＢＩのRefSeq collectionから求めた。
【図２】図２Ａは、T. onnurineus NA1の８個の水素化酵素遺伝子クラスターの代表図である。Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ；膜内水素化酵素及び細胞質内ＮｉＦｅ−水素化酵素。Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３；T. onnurineus NA1.遺伝子に特異的な水素化酵素をＣＯＧ機能カテゴリによって彩色した。ＴＯＮ＿００５１−００５５は配列番号１から５、ＴＯＮ＿０４８６−０４９８は配列番号３５から４７、ＴＯＮ＿０５３３−０５４４は配列番号４８から５９、ＴＯＮ＿１５８３−１５９５は配列番号１００から１１２、ＴＯＮ＿０２６１−０２８９は配列番号６から３４、ＴＯＮ＿１０１６−１０３１は配列番号６０から７５、ＴＯＮ＿１５５９−１５８２は配列番号７６から９９を示す。図２ＢはT. onnurineus NA1のゲノム上において３−モジュール遺伝子クラスターを有する３個の水素化酵素遺伝子クラスター（ｆｄｈ１−ｍｆｈ１−ｍｎｈ１、ｆｄｈ２−ｍｆｈ２−ｍｎｈ２及びｃｏｄｈ−ｍｃｈ−ｍｎｈ）の遺伝子構成を示すものである。同じサブクラスターに属する遺伝子は同じ色にて表示した。
【図３】３１個の古細菌遺伝体の水素化酵素遺伝子クラスターの分布及び保存パターンを示す。青色のクロチェット（下から１番目、３番目、５番目のクロチェット）にて表示した部分は３１個の古細菌遺伝体のＣＤＳに対して低い（＜２５％）類似度を示すＣＤＳを示す。黒色にて表示した部分はP. abyssiの水素化酵素４に類似するＣＤＳを示す。１番から３１番に相当する古細菌遺伝子は、以下の表１の通りである。
【図４】ＣＯＤＨとＦ４２０水素化酵素タンパク質のアルファサブユニットを比較したものである。図４はＣＯＤＨの系統樹である。系統樹上、それぞれのタンパク質の同族体はＮＣＢＩ ｎｒデータベースから得た。
【図５】ＣＯＤＨとＦ４２０水素化酵素タンパク質のアルファサブユニットを比較したものである。図５はＦ４２０水素化酵素アルファサブユニットの系統樹である。系統樹上、それぞれのタンパク質の同族体はＮＣＢＩ ｎｒデータベースから得た。
【図６】ＣＯに依存するT. onnurineus NA1の成長分析表である。T. onnurineus NA1をＣＯ（２、正三角形）、硫黄（３、四角形）または両者とも（４、逆三角形）添加された培地１において生長させた。対照群として、添加物なし培地（１、円）とＹＰＳ培地（Ｃ）において培養したものを表示した。フィルター上のＤＡＰＩ染色された細胞を蛍光顕微鏡により直接的に計数した。ａ.様々な酵母抽出物（yeast extract、ＹＥ）濃度の培地組成による効果。ｂ.他の補充物が添加された培地１におけるT. onnurineus NA1の成長曲線。ｃ.ＣＯＤＨ遺伝子の転写分析。
【図７】ＹＰＳ（Ａ）またはＣＯ含有培地（Ｂ）におけるT. onnurineus NA1の成長及び水素生成を示す。開円は成長を示し、閉円は水素生成を示す。
【図８】ＹＰＳ（Ａ）またはＣＯ含有培地（Ｂ）におけるT. onnurineus NA1の水素化酵素遺伝子クラスターの発現をマイクロアレイ（Ａ）及びＲＴ−ＰＣＲ（Ｂ）により分析したものである。（Ａ）はT. onnurineus NA1の８反復の水素化酵素遺伝子クラスターのマイクロアレイ分析である。ＣＯにおけるｍＲＮＡ変化の階層的クラスターリングと、対照区としてＹＰＳ成長条件におけるものとを比較した。上向き調節及び下向き調節はそれぞれ赤色と緑色にて表示した。成長条件はクラスターリングの上端に表示した。クラスターリングの右側に、ｃｏｄｈ−ｍｃｈ−ｍｎｈ３、ｆｄｈ１−ｍｆｈ１−ｍｎｈ１またはｆｄｈ２−ｍｆｈ２−ｍｎｈ２それぞれのＯＲＦを棒にて表示した。ＹＥ：酵母抽出物。（Ｂ）はｍｂｈ（ＴＯＮ＿１５９３）、ｍｂｘ（ＴＯＮ０４８９）、ｆｒｈ（ＴＯＮ＿１５６０）、ｓｕｌｆＩ（ＴＯＮ＿０５３４）、ｍｃｈ（ＴＯＮ＿１０２３）、ｍｆｈ２（ＴＯＮ＿１５６９）、またはｍｆｈ１（ＴＯＮ＿０２７６）水素化酵素の大きなサブユニットそれぞれのＣＯまたはＹＰＳ条件における定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析結果である。T. onnurineus NA1のｃｈａ（シャペロニン−暗号化遺伝子）が対照区であって、発現レベルを標準化する上で用いられた。
【図９】ｍｃｈ（ＴＯＮ＿１０２３）及びｍｆｈ２（ＴＯＮ＿１５６９）水素化酵素それぞれの大きなサブユニットの標的遺伝子破壊を示す。（Ａ）はT. onnurineus NA1のｃｏｄｈ−ｍｃｈ−ｍｎｈ３及びｆｄｈ２−ｍｆｈ２−ｍｎｈ２クラスターそれぞれの遺伝子構成である。Ｐｇｄｈ、T. kodakaraensis KOD1のグルタメート脱水素化酵素遺伝子の５’−上流地域のプロモータ；ｈｍｇＰｆｕ、Pyrococcus furiosusの３−ヒドロキシ−メチルグルタリルコエンザイムＡ還元酵素遺伝子。（Ｂ）はＰＣＲによる遺伝子欠損の確認を示す。左パネルは過発現カセット（Ｐｇｄｈ−ｈｍｇＰｆｕ）領域に対するプライマーを用いたＰＣＲ増幅を示す。右パネルはｍｃｈＴＮＡ１またはｍｆｈ２ＴＮＡ１水素化酵素それぞれの大きなサブユニット領域に対するプライマーを用いたＰＣＲ増幅を示す。Ｍ；サイズマーカー（1kb ladder）、Ｗ；野生型、レーン１−２；それぞれの突然変異菌株。
【図１０】ＹＰＳまたはＣＯ含有培地における△ｍｃｈＴＮＡ１または△ｍｆｈ２ＴＮＡ１突然変異菌株の成長及び水素生成を示す。開円；成長、閉円；水素生成。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
【表１】
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【００２７】
第１態様として、本発明は、嫌気性条件下で水素を産生する高好熱性新菌株Thermococcus onnurineus NA1（寄託番号：ＫＣＴＣ １０８５９ＢＰ）が産生する水素化酵素を提供する。前記菌株は、イースト・マヌス・バシン（East Manus Basin）にあるパークマヌス地域の深海熱水噴出口から分離したものであり、大韓民国生命工学研究院生物資源センター（ＫＣＴＣ）に２００５年１０月７日付けにて寄託して、２００５年１０月２０日付けにてＫＣＴＣ １０８５９ＢＰの寄託番号を付与された。前記菌株の特徴及び培養方法などについては、本出願の基礎出願である大韓民国特許出願第１０−２００７−０１２７２５５号公報に記載されている。
T. onnurineus NA1は８種類の新規な水素化酵素遺伝子クラスターを有している。前記水素化酵素は水素分子（Ｈ２）の代謝に関連する核心的酵素であって、２Ｈ＋＋２ｅ−⇔Ｈ２の可逆的反応に触媒作用をする。好ましくは、前記クラスターに属する水素化酵素は配列番号１乃至配列番号８よりなる群から選ばれるいずれか一種以上のアミノ酸配列を含むタンパク質及びこの機能的な同等物を提供する。「機能的同等物」には前記タンパク質においてその一部または全部が置換されたり、アミノ酸の一部が欠失または付加されたアミノ酸配列変形体が含まれる。アミノ酸の置換は、好ましくは、保存的置換である。天然に存在するアミノ酸の保存的置換の例は、下記の通りである；脂肪族アミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｒｏ）、疎水性アミノ酸（Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ）、芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）、酸性アミノ酸（Ａｓｐ、Ｇｌｕ）、塩基性アミノ酸（Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ）及び硫黄含有アミノ酸（Ｃｙｓ、Ｍｅｔ）。アミノ酸の欠失は、好ましくは、水素化酵素の活性に直接的に関与しない部分に位置する。
【００２８】
第２態様として、本発明は、前記アミノ酸を暗号化する遺伝子を提供する。これに制限されるものではないが、好ましくは、前記遺伝子は、配列番号１２乃至配列番号１９である（前記配列番号１乃至配列番号８のアミノ酸がそれぞれ配列番号１２乃至１９の遺伝子に対応する）。
【００２９】
第３態様として、本発明は、Thermococcus spp.を培養して水素を産生する方法を提供する。前記方法は、１）培養容器に培地を生成するステップと、２）Thermococcus spp.を前記培養容器において培養するステップと、３）前記培養容器から水素を抽出するステップと、を含むことを特徴とする。前記Thermococcus spp.は、好ましくは、Thermococcus onnurineus NA1（寄託番号：ＫＣＴＣ １０８５９ＢＰ）である。
【００３０】
加えて、前記培地は、一酸化炭素、ホルム酸塩及び澱粉よりなる群から選ばれるいずれか一種以上の物質が添加された培地であってもよい。なお、前記培養は８０℃の高温において行われてもよく、嫌気的な条件下で行われてもよい。
【００３１】
第４態様として、本発明は、配列番号９乃至配列番号１１よりなる群から選ばれるいずれか一種のアミノ酸配列からなる脱水素化酵素を提供する。
【００３２】
第５態様として、本発明は、前記脱水素化酵素を暗号化する遺伝子を提供し、好ましくは、これは、配列番号２０乃至配列番号２２である（前記配列番号９乃至１１のアミノ酸がそれぞれ配列番号２０乃至２２に対応する）。
【００３３】
第６態様として、本発明は、T. onnurineus NA1のＣＯＤＨ−ＭＣＨ−ＭＮＨ３水素化酵素クラスターを構成する遺伝子がいずれも作動可能に連結された組換えベクターを提供する。好ましくは、これに制限されるものではないが、前記遺伝子は、配列番号２１（ＣＯＤＨ脱水素化酵素）及び配列番号１６（ＭＣＨ水素化酵素）の遺伝子を含む。前記「ベクター」とは、他の核酸をそこに結合して移送可能な核酸分子を意味する。前記ベクターにより運ばれる各組換え型遺伝子により暗号化されるタンパク質を合成可能な「発現ベクター」としてプラスミド、コスミドまたはファージなどを利用することができる。好適なベクターは、それが結合された核酸を自己複製及び発現可能なベクターである。
【００３４】
加えて、本発明は、前記組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。前記組換えベクターは、原核生物、カビ、植物、動物細胞などの細胞を形質転換させて高い効率にて水素を産生可能な形質転換細胞を製造するのに利用可能である。「形質転換」という用語は、外来ＤＮＡまたはＲＮＡが細胞に吸収されて細胞の遺伝型が変化されることを言う。
【００３５】
また、本発明は、培養容器に培地を生成するステップと、前記培養容器のガス層に一酸化炭素を供給するステップと、前記形質転換体を前記培養容器において培養するステップと、前記培養容器から水素を抽出するステップと、を含むことを特徴とする前記形質転換体を用いて水素を産生する方法を提供する。
【００３６】
第７態様として、本発明は、T. onnurineus NA1のＦＤＨ２−ＭＦＨ２−ＭＮＨ２水素化酵素クラスターを構成する遺伝子がいずれも作動可能に連結された組換えベクターを提供する。好ましくは、これに制限されるものではないが、前記遺伝子は、配列番号２２（ＦＤＨ２脱水素化酵素）及び配列番号１８（ＭＦＨ２水素化酵素）の遺伝子を含む。加えて、本発明は、前記組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。
【００３７】
前記「ベクター」、「形質転換」及び「宿主細胞」に関する事項は、前記第６態様に記述されている通りである。
【００３８】
さらに、本発明は、培養容器にホルム酸塩を含む培地を生成するステップと、前記形質転換体を前記培養容器において培養するステップと、前記培養容器から水素を抽出するステップと、を含むことを特徴とする前記形質転換体を用いて水素を産生する方法を提供する。
【００３９】
第８態様として、本発明は、T. onnurineus NA1のＦＤＨ１−ＭＦＨ１−ＭＮＨ１水素化酵素クラスターを構成する遺伝子がいずれも作動可能に連結された組換えベクターを提供する。好ましくは、これに制限されるものではないが、前記遺伝子は、配列番号２０（ＦＤＨ１脱水素化酵素）及び配列番号１３（ＭＦＨ１水素化酵素）の遺伝子を含む。加えて、本発明は、前記組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。
【００４０】
前記「ベクター」、「形質転換」及び「宿主細胞」に関する事項は、前記第６態様に記述されている通りである。
【００４１】
さらに、本発明は、培養容器に澱粉を含む培地を生成するステップと、前記形質転換体を前記培養容器において培養するステップと、前記培養容器から水素を抽出するステップと、を含むことを特徴とする前記形質転換体を用いて水素を産生する方法を提供する。
【００４２】
以下、本発明を実施例によって一層詳述する。但し、下記の実施例は本発明を例示するものであり、本発明の内容が実施例により限定されることはない。
【実施例】
【００４３】
１.Thermococcus onnurineus NA1菌株の水素化酵素遺伝子分析
（１）実験方法
１）培養条件
一般的な培養条件として、８０℃の嫌気性環境においてＹＰＳ（yeast extract-peptone-sulfur）培地に細胞を培養させた（Holden et al. 2001）。生理的特性に対する試験は、１.０ｍｌ微量元素混合物、１ｍｌビタミン溶液（Balch, W. E., G. E. Fox, L. J. Magrum, C. R. Woese, and R. S. Wolfe. 1979. Methanogens: reevaluation of a unique biological group. Microbiol. Rev. 43:260-296.）、ＮａＣｌ（３０ｇｌ−１）及び酵母抽出物（０．５ｇｌ−１）を追加した変形培地１（Sokolova, T. G., C. Jeanthon, N. A Kostrikina, N. A. Chernyh, A. V. Lebedinsky, E. Stackebrandt, and E. A. Bonch-Osmolovskaya. 2004. The first evidence of anaerobic CO oxidation coupled with H2 production by a hyperthermophilic archaeon isolated from a deep-sea hydrothermal vent. Extremophiles 8:317-323.）を用いて行った。ｐＨはＮａＯＨを用いて８．０に調整した。嫌気的条件下で製造した培地を２５ｍｌ血清瓶に入れ、残りのガス層（１５ｍｌ）をＮ２／ＣＯ２（８０：２０、１bar）または１００％ＣＯにより満たした。ホルム酸塩や澱粉により培養する場合には、加圧滅菌する前にそれぞれ１０ｇＬ−１のホルム酸塩ナトリウム（Sigma社製）や５ｇＬ−１の可溶性澱粉（Sigma社製）を培地に添加した。生理的な試験のための培養はいずれも８０℃において２日間行った。
【００４４】
２）遺伝子配列分析
T. onnurineus NA1の遺伝体配列は全ゲノムショットガンシークエンス法及びパイロシークエンス法を用いて決定した。キャピラリーシークエンスのために、２−から３−ｋｂサイズの挿入ライブラリ（１１,０２８クローン）、４０−ｋｂの挿入ライブラリ（１,８７０クローン）、及び３５−ｋｂの挿入ライブラリ（２８８クローン）を製作し、ＡＢＩ ３７３０ＸＬシーケンサー（Applied Biosystems社製）を用いて配列分析した。パイロシークエンスのために、ＧＳ−２０シーケンサー（４５４ Life Sciences）を用いて５８１,９９０個のＤＮＡ断片に対して配列分析を行った。両配列分析機により生成されたコンティグを組み合わせ、クローンワーキング及びＰＣＲシークエンスによりシークエンス間隔を埋めた。タンパク質を暗号化するＯＲＦ及びＲＮＡ遺伝子はGlimmer 3.0（University of Maryland）、GSFinder及びRBSFinderの組み合わせとmanual ORF fitting processを通じて予測した。全てのＯＲＦを決定した後に、ＮＣＢＩ ｎｒタンパク質データベース、ＫＥＧＧ（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）及びＣＯＧｓ（Clusters of Orthologous Groups of proteins）データベースに対してＢＬＡＳＴｐ検索（Tatusova, R. L., D. A. Natale, I. V. Garkavtsev, T. A. Tatusova, U. T. Shankavaram, B. S. Rao, B. Kiryutin, M. Y. Galperin, N. D. Fedorova, and E. V. Koonin. 2001. The COG database: new developments in phylogenetic classification of proteins from complete genomes. Nucleic Acids Res. 29:22-28.）を用いてタンパク質配列をさらに分析した。ｔＲＮＡ−暗号化部位はｔＲＮＡ scan−ＳＥを用いて予測した（Lowe, T. M., and S. R. Eddy. 1997. tRNAscan-SE: a program for improved detection of transfer RNA genes in genomic sequence. Nucleic Acids Res. 25:955-964.）。
【００４５】
３）タンパク質分析
T. onnurineus NA1細胞を４％ＳＤＳ及び４ｍＭ ＥＤＴＡが含まれている１００ｍＭ Tris−ＨＣｌバッファ（ｐＨ６．８）に浮遊させ、１０分間沸騰した後、２２,０００ｇにて２０分間遠心分離した。１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて細胞溶解物を分離し、分子サイズに基づいて３０個の分画を得た。その後、トリプシン（Promega, USA）を用いてそれをイン−ゲル分解させ（Kim, Y. H., K. Cho, S. H. Yun, J. Y. Kim, K. H. Kwon, J. S. Yoo, and S. I. Kim. 2006. Analysis of aromatic catabolic pathways in Pseudomonas putida KT 2440 by combined proteomic approach: 2-DE/MS and cleavable ICAT analysis. Proteomics 6:1301-1318.）、質量分析計（Thermo Finnigan LTQ IT）により分析するためにトリプシンにより分解した物質を０．５％トリフルオロ酢酸溶液に溶かした。ペプチド同定はシーケストプログラム（Thermo Finnigan, San Jose, CA）を用いて行った。
【００４６】
４）総ＲＮＡ分離及びＲＴ−ＰＣＲ分析
５０ｍｌのT. onnurineus NA1培養液をＮ２／ＣＯ２（８０：２０, 1bar）または１００％ＣＯ気体相において様々な濃度の酵母抽出物を添加した変形培地１において半指数成長段階まで生長した。６,０００ｘｇにて３０分間遠心分離して細胞を得た。５００μｌのトリゾール試薬（Invitrogen, Carlsbad, CA）を添加した５０μｌの５０ｍＭ Tris−ＨＣｌバッファ（ｐＨ７．５）にペレットを再懸濁させた。その細胞を冷凍と解凍過程を通じて溶解させ、２００μｌのクロロホルムを用いて試料を抽出した。総ＲＮＡを含む水溶液相はエタノール沈殿を通じてさらに処理した後、蒸留水に再懸濁させた。ＲＮＡの濃度及び完全性は０．８％アガロースゲル分析と２６０及び２８０ｎｍにおける吸光度測定を通じて決定した。製品使用説明書による方法によりSuperScriptTM ＩＩ逆転写酵素（Invitrogen）を用いて逆転写及びＰＣＲ増幅を行った。対照群として、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＣＯＤＨ：carbon monooxide dehydrogenase）及びＨｓｐ６０（chaperonine）の増幅のために下記の２組のプライマーを使用した。
【００４７】
ＣＯＤＨ gene（順方向、５’−ＧＧＡＣＣＡＴＧＴＡＧＡＡＴＣＧＡＹＣＣＧＴＴＹ−３’（配列番号２３）及び逆方向、５’−ＴＴＣＲＴＴＴＣＣＧＧＴＡＣＡＧＣＡ−３’（配列番号２４））
Ｈｓｐ６０ gene（順方向、５’−ＡＴＧＧＣＡＣＡＧＣＴＴＡＧＴＧＧＡＣＡＧ−３’（配列番号２５）及び逆方向、５’−ＣＡＡＧＧＡＴＴＴＣＣＴＧＧＧＣＴＴＴＣＴＣ−３’（配列番号２６））。
【００４８】
５）コンピュータ分析
アミノ酸配列の相同性検索はＮＣＢＩの非冗長なタンパク質データベースに対してＢＬＡＳＴプログラムを用いて行った。グループ４水素化酵素のＬ１信号（Ｃ［ＧＳ］［ＩＬＶ］Ｃ［ＡＧＮＳ］ｘｘＨ、ｘはあるアミノ酸を表示）を持つタンパク質のためのモチーフ検索は、ＮＣＢＩの非冗長なタンパク質データベースに対してProteinFinderプログラム（Ensoltek, Korea）を用いて行った。タンパク質に対する多重配列整列はClustalWプログラム（Thompson, J.D., Higgins, D.G. and Gibson, T.J. (1994) CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 22, 4673-4680.）を用いて行い、系統学的ツリーはMolecular Evolutionary Genetics Analysis (Mega 4.1) ソフトウェア（Tamura, K., Dudley, J., Nei, M. and Kumar, S. (2007) MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Mol. Biol. Evol. 24, 1596-1599.）を用いて構築した。１６Ｓ ｒＲＮＡ配列の系統学ツリーはRibosomalデータベースサイト（http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp）から得たプレアライン配列を用いて製造した。
【００４９】
６）配列ロゴの生成
ロゴ表示は、関連配列により共有される与えられたモチーフそれぞれの位置と関連する情報を視覚化するために用いられた。グラフィック表示において、それぞれの位置の全体的な高さはその位置（ビットにて表示）における保存度と関連があるのに対し、ある位置内のシンボルの相対的なサイズはそれらの相対的な頻度を示す。ロゴ分析は、Berkeley Structural Genomics Center (http://weblogo.berkeley.edu/)において行われた。
【００５０】
（２）分析結果
１）T. onnurineus NA1遺伝子の一般的特徴
熱水噴出孔地域においてThermococcus spp.が成功的な優占種になった理由を明らかにするために、T. onnurineus NA1の遺伝体配列を任意的な全ゲノムショットガンシークエンス法及びパイロシークエンスを組み合わせて決定した。その結果、T. onnurineus NA1は別途の染色体外構成要素がなく、一つの環状染色体（１,８４７,６０７ｂｐ）を有していることを明らかにし、合計１,９７６個の暗号化ＤＮＡ配列（coding DNA sequences, CDSs）を同定した（表１及び図１）。１１０４個のＣＤＳ（５５．８％）は相同性及びドメイン検索を通じてアノテーションすることができるが、残りの８７２個のＣＤＳの機能は１次構造から予測することができなかった。遺伝体スケールにてタンパク質類似度を検索したとき、T. onnurineus NA1タンパク質の８２．７％がThermococcalesのものと類似性を示した。
【００５１】
【表２】
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【００５２】
２）水素化酵素クラスター
T. onnurineus NA1の遺伝体において水素化酵素及びそれと関連するタンパク質の割合が高いことを見出し（５．５％）、これは、ＣＯ脱水素酵素及びホルム酸塩脱水素酵素を含む酸化還元酵素と関連する還元力の保存または再循環の増加を示す。
【００５３】
水素化酵素はそれらの触媒金属中心に基づいて［ＮｉＦｅ］−水素化酵素、［ＦｅＦｅ］−水素化酵素及び［Ｆｅ］−水素化酵素に分類することができる。前記それぞれの水素化酵素群内に保存された特徴的な機能性中心に基づくとき、一つの水素化酵素を除くT. onnurineus NA1内の全ての水素化酵素は［ＮｉＦｅ］−水素化酵素に属すると認められる。Vignais et al.の分類体系によれば、T. onnurineus NA1の［ＮｉＦｅ］−水素化酵素はグループ３（一つのＦ４２０還元及び２つのＮＡＤＰ還元水素化酵素）またはグループ４（４個の膜関連水素化酵素）に属する（Silva, P.J., van den Ban, E.C., Wassink, H., Haaker, H., de Castro, B., Robb, F.T. and Hagen, W.R. (2000) Enzymes of hydrogen metabolism in Pyrococcus furiosus. Eur. J. Biochem. 267, 6541-6551）。グループ４に属する水素化酵素はエネルギー転換水素化酵素（energy-converting hydrogenases, Ech）と命名され、バクテリア及び古細菌の間に広く分布されている。
【００５４】
水素化酵素代謝の分子的基礎を理解するために、水素化酵素遺伝子クラスターを比較分析した。前記水素化酵素の系統学的分析結果、グループ４水素化酵素を２つのサブグループの４ａ及び４ｂに分類することができ、グループ４ｂの全ての配列に共通する１対のモチーフパターンを発見することができた。
【００５５】
図２に示すように、Pyrococcus spp.及びT. kodakaraensis KOD1において報告された２つの膜内水素化酵素であるＭｂｈ（ＴＯＮ＿１５９０−１５９５、配列番号８）、Ｍｂｘ（ＴＯＮ＿０４８９−０４８６、配列番号３）及び２つの細胞質内ＮｉＦｅ−水素化酵素であるＳｕｌｆ−Ｉ（ＴＯＮ＿０５３３−０５４４、配列番号４）、Ｓｕｌｆ−ＩＩ（ＴＯＮ＿００５１−００５５、配列番号１）と一緒にT. onnurineus NA1遺伝体において３個のさらなる水素化酵素クラスターＦＤＨ１−ＭＦＨ１−ＭＮＨ１（Ｈｙｇ４−Ｉ、Ｓ１：ＴＯＮ＿０２７９−０２７４、ＭＦＨ１：配列番号２）、ＣＯＤＨ−ＭＣＨ−ＭＮＨ３（Ｈｙｇ４−ＩＩ、Ｓ２：ＴＯＮ＿１０２１−１０２４、ＭＣＨ：配列番号５）、ＦＤＨ２−ＭＦＨ２−ＭＮＨ２（Ｈｙｇ４−III、Ｓ３：ＴＯＮ＿１５６５−１５７１、ＭＦＨ２：配列番号７）とＦｒｈ（ＴＯＮ＿１５５９−１５６２、配列番号６）水素化酵素を発見した。３１個の古細菌遺伝体のＣＤＳにより水素化酵素の遺伝子クラスター分析をした結果、ＦＤＨ１−ＭＦＨ１−ＭＮＨ１（Ｈｙｇ４−Ｉ）、ＣＯＤＨ−ＭＣＨ−ＭＮＨ３（Ｈｙｇ４−ＩＩ）及びＦＤＨ２−ＭＦＨ２−ＭＮＨ２（Ｈｙｇ４−III）は一次配列が特異的であり、これは、P. abyssi及びR. rubrumの水素化酵素−４の構成要素との類似度が低いことを示す（図３）。さらなる水素化酵素と同様に、ＦＤＨ２−ＭＦＨ２−ＭＮＨ２（Ｈｙｇ４−ＩＩＩ）クラスター（ＴＯＮ＿１５５９−１５８２、配列番号７６から９９）は遺伝体においてＦ４２０水素化酵素（ＴＯＮ＿１５５９−１５６１、配列番号７６から７８）のａ／β／γサブユニットを含んでいた。Ｆ４２０水素化酵素のａ／β／γサブユニットは特異的な一次配列を有し、これは、Methanococcus maripaludisの補酵素Ｆ４２０還元ヒドロゲナーゼ（ＹＰ＿００１０９７１７６）（３３％）及びMethanococcus maripaludis S2の補酵素Ｆ４２０還元ヒドロゲナーゼ（ＮＰ＿９８７９４０）（３３％）との類似性を示す（図３及び図５）。ThermococcalesのＦ４２０ヒドロゲナーゼに相同性を示すものは未だ報告されていない。
【００５６】
３）３モジュール遺伝子クラスターの構成
［ＮｉＦｅ］−水素化酵素のグループ４に属する前記３個のＥｃｈ水素化酵素（ＭＦＨ１、ＭＦＨ２、ＭＣＨ）それぞれは、ＴＯＮ＿２６６−ＴＯＮ＿２８２、ＴＯＮ＿１５６３−ＴＯＮ＿１５８０及びＴＯＮ＿１０１６−ＴＯＮ＿１０３１ＯＲＦｓ（オープン・リーディング・フレーム）よりなる大きな１７−または１８−遺伝子クラスター（ｆｄｈ１−ｍｆｈ１−ｍｎｈ１、ｆｄｈ２−ｍｆｈ２−ｍｎｈ２及びｃｏｄｈ−ｍｃｈ−ｍｎｈ３）の一部であることが判明された（図２のＢ）。クラスター内のＯＲＦは３個のサブクラスターに分けられる。１番目の部分は、ホルム酸塩脱水素化酵素（Ｆｄｈ１（配列番号９）またはＦｄｈ２（配列番号１１））または一酸化炭素脱水素化酵素（Ｃｏｄｈ（配列番号１０））などの酸化還元酵素を暗号化している。２番目の部分は、５個から７個のサブユニットを有する多重膜−結合水素化酵素（ＭＦＨ１、ＭＦＨ２またはＭＣＨ）を暗号化する。最後の部分は、Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーターなどの陽イオン／水素イオンアンチポーターを暗号化する。このような３モジュール遺伝子クラスターは未だ報告されていない。
【００５７】
実施例２．ガス組成の分析
（１）分析方法
水素ガスはＨＰ−ＰＬＯＴ Molesieve column (Agilent)及びＴＣＤ検出器を備えたgas chromatograph HP 5890 series ＩＩ (Hewlett Packard)を用いて測定した。アルゴンをガス運搬体として用いた。水素ガスを定量化するために窒素にそれぞれの成分（ＣＯ、ＣＯ２、Ｈ２、ＣＨ４及びＯ２）１％（ｗ／ｗ）が含まれているGas calibration standard (Supleco)を使用した。
【００５８】
（２）様々な物質を用いた水素生成
反復された多数の水素化酵素が様々な環境下においてT. onnurineus NA1に水素を効率的に産生せしめるかどうかを調べるために、様々なエネルギー源を用いて水素生成率を分析した（表２）。その結果、ＮＡ１菌株は硫黄無し条件下でも澱粉、ＣＯ、及びホルム酸塩を用いて水素を生成することができた。特に、ＣＯ及びホルム酸塩は水素を効率的に産生する上で極めて優れたエネルギー源であった。
【００５９】
【表３】
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【００６０】
回分式培養におけるＮＡ１菌株の水素産生性は、T. kodakaraensis KOD1及びPyrococcus furiosusの連続式培養におけるそれとほとんど同様である。高好熱性古細菌は低い体積産生性にも拘わらず、中温性細菌の発酵や光合成原核生物による水素生成に比べて高い特異的産生率を示し、高純度の水素産生など種々のメリットを有している。この明細書に記載されている高い水素生成率は、培養条件及び処理過程設計の最適化または代謝工学により一層向上する余地が高い。
【００６１】
実施例３．Thermococcus onnurineus NA1によるＣＯ−依存的Ｈ２生成：ＣＯ−反応水素化酵素の同定
（１）ＣＯＤＨ遺伝子クラスター及び一酸化炭素栄養成長
上述したように、T. onnurineus NA1は特異的な遺伝子クラスターを有していることを見出し（ＣＯＤＨ−ＭＣＨ−ＭＮＨ３）、この遺伝子クラスターは水素化酵素（ｍｃｈ、ＴＯＮ＿１０２１−１０２４、配列番号５）と一緒に暫定的な転写調節因子（ＴＯＮ＿１０１６）、ＣＯＤＨ付属タンパク質（ＣｏｏＣ、ＴＯＮ＿１０１９）、ＣＯＤＨ触媒サブユニット（ＣｏｏＳ、ＴＯＮ＿１０１８）、及び電子伝達タンパク質（ＣｏｏＦ、ＴＯＮ＿１０１７）を暗号化する塩基配列から構成されている（図２Ｂ）。微生物の一酸化炭素（ＣＯ）代謝の中心酵素であるＣｏｏＳ（ＴＯＮ＿１０１８）は、Methanosarcina acetivorans C2AのＣＯＤＨ（ＡＡＭ０６６５２）（６０％）及びMethanosarcina mazei Go1のＣＯＤＨ（ＡＡＭ２９８１７）（５９％）などのＣＯ−酸化メタン生成古細菌のＣＯＤＨとかなり高い類似度を示している（図３及び図４）。これは、両機能を有するＣＯＤＨ／ＡＣＳ酵素のアセチル−ＣｏＡ合成／切断活性がない単一機能のＣＯＤＨ（Bonam, D., L. Lehman, G. P. Roberts, and P. W. Ludden. 1989. Regulation of carbon monoxide dehydrogenase and hydrogenase in Rhodospirillum rubrum: effects of CO and oxygen on synthesis and activity. J. Bacteriol. 171:3102-3107.およびWu, M. Q. Ren, A. S. Durkin, S. C. Daugherty, L. M Brinkac, R. J. Dodson, R. Madupu, S. A. Sullivan, J. F. Kolonay, W. C. Nelson, L. J. Tallon, K. M. Jones, L. E. Ulrich, J. M. Gonzalez, I. B. Zhulin, F. T. Robb, and J. A. Eisen. 2005. Life in hot carbon monoxide: the complete genome sequence of Carboxydothermus hydrogenoformans Z-2901. PLoS Genet. 1:e65.）であると認められる。Fox et al. (Fox, J. D., R. L. Kerby, G. P. Roberts, and P. W. Ludden. 1996. Characterization of the CO-induced, CO-tolerant hydrogenase from Rhodospirillum rubrum and the gene encoding the large subunit of the enzyme. J. Bacteriol. 178:1515-1524.)によれば、Rhodospirillum rubrumの単一機能ＣＯＤＨ／水素化酵素複合体は、細胞膜を横切って発生する水素イオン濃度勾配にてエネルギーが保存されるＣＯ−誘発陽性子呼吸に関与する。この観点から、ＣＯＤＨクラスターがＣＯを酸化させることによりエネルギー保存に類似する役割を果たすことができるという点を説明するために、本発明者らは、T. onnurineus NA1がＣＯを利用することができるかどうかを試験した。その結果、前記菌株は、実際に、ＹＰＳ培地よりはやや成長率が落ちるとしても（図６ａ）、基本培地よりも培地１において硫黄があるかないＣＯ気体環境において一層上手く成長するということを見出した（図６ａ、ｂ）。ＣＯ気体環境における成長はＣｏｏＳ遺伝子の転写と関連されており、その遺伝子はＣＯの存在により誘導可能である（図６ｃ）。硫黄の添加はＣｏｏＳ遺伝子の転写を減少させるという点に注目する必要がある。これらの結果は、T. onnurineus NA1がＣＯからエネルギーを発生するという仮説を裏付ける。以下、前記仮説を検証するための具体的な実験方法及び結果をさらに述べる。
【００６２】
（２）実験方法
１）培養条件
ＹＰＳ（yeast extract-peptone-sulfur）培地において８０℃の嫌気性条件下でT. onnurineus NA1を培養した。突然変異菌株の生長特性を調べるために、基本培地として３０．０ｇ／ＬのＮａＣｌを添加した変形培地１を使用した（Uffen, R. L. 1976. Anaerobic growth of a Rhodopseudomonas species in the dark with carbon monoxide as sole carbon and energy substrate. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73:3298-3302）。前記培地を加圧滅菌した後、嫌気性チャンバーにおいて１．０ｍｌ／Ｌのビタミン溶液（Balch, W. E., G. E. Fox, L. J. Magrum, C. R. Woese, and R. S. Wolfe. 1979. Methanogens: reevaluation of a unique biological group. Microbiol. Rev. 43:260-296）及び０．５ｇ／Ｌの酵母抽出物を変形培地１に添加した。前記基本培地に１Ｎ ＮａＯＨを添加してｐＨを８．０に調整した。準備された培地３０ｍｌを１５０ｍｌ培養瓶に分配し、ガス層（１２０ｍｌ）は１００％ＣＯ（１０５Ｐａ）に交換した。生理学的実験のためのすべての培養は８０℃の嫌気性条件下で２４時間行われ、前記実験は重複して行った。
【００６３】
２）ＲＮＡ抽出及びマイクロアレイ設計
培養物を４℃において３,５００×ｇにて１０分間遠心分離し、生産者のプロトコール（Invitrogen, Carlsbad, California）に従ってＴＲＩＺＯＬ試薬により総ＲＮＡを抽出した。総ＲＮＡ試料はNanoDrop分光器（ＮＤ−１０００, Thermo Scientific）及び電気泳動により定量及び定性分析した。この実験に供されたマイクロアレイは、Roche NimbleGenマイクロアレイであった。簡略に、総３１,９９４個の独立した６０merオリゴヌクレオチドを設計し、光脱分解を用いて、インサイチュにて合成した。それぞれの独立したオリゴヌクレオチドはアレイ上において２回反復された（総〜７２,０００features）。
【００６４】
３）ｃＤＮＡ合成及び混成化条件
マイクロアレイ実験は生産者のプロトコールに従って実施した。それぞれの総ＲＮＡ試料（５μｇ）は逆転写酵素、SuperScrip ＩＩ (Invitrogen, Carlsbad, California)を用いた逆転写反応によりシアニン（Ｃｙ５）結合ｄＣＴＰ（Amersharm, Piscataway, NJ）にて標識された。その後、前記標識されたｃＤＮＡ混合物をエタノール沈殿法を用いて濃縮させた。濃縮されたＣｙ５標識ｃＤＮＡｓを３０μｌの混成化溶液（GenoCheck, Korea）に懸濁させた。標識されたｃＤＮＡをマイクロアレイに位置させた後、MAUI Mixer X4 hybridization chamber mixers (BioMicro systems, Salt Lake City, UT)により覆った。前記スライドをＭＡＵＩ １２−bay systems (BioMicro systems, Salt Lake City, UT）により４２℃において１２時間混成化させた。前記混成化されたスライドを室温において２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおいて２分、１ＸＳＳＣにおいて３分、その後、０．２ＸＳＳＣにおいて２分間洗浄した。前記スライドを乾燥するために、１, ０００ｘｇにて２０秒間遠心分離した。
【００６５】
４）スライドスキャニング、標準化、及びデータ分析
アレイはGenePix 4000B scanner (Molecular Devices Corporation, Union City, CA)を用いてスキャンし、データはNimbleScan 2.4ソフトウェアを用いて抽出した。アレイ標準化はメディアンポリッシュ及びクォンタイル標準化方法を用いて行った（Amaratunga, D., and J. Cabrera. 2001. Statistical analysis of viral microchip data. J. Am. Stat. Assoc. 96:1161-1170）。個別的なプローブに対する標準化された発現値は、Irizarry et al. (Karl, D. M. 1995. The microbiology of deep-sea hydrothermal vents. CRC Press, Boca Raton, FL)に記述されたＲＭＡ(robust multi-array average)方法を用いて、与えられたＯＲＦに対する発現値を得るのに用いられた。最後に、試料から特定の遺伝子のために得たＲＭＡ処理された発現値（ＲＭＡ calls）を用いてｎ倍変化率（Ｒ）を計算した。データ分析は、GeneSpring GX 7.3.1 (Agilent technologies, CA)を用いて行った。フォールド変化フィルターは上向き調節される遺伝子に対しては少なくとも対照区の２００％、下向き調節される遺伝子に対しては対照区の５０％以下で現れるべきであるという条件を含めた。データは、GeneSpring GX 7.3.1 (Agilent technologies, CA)を用いた実験において類似に行動する遺伝子グループ内にクラスターさせた。類似するパターンの遺伝子を分離するためにユークリッド距離及び平均結合法に基づくアルゴリズムを用いた。
【００６６】
５）定量的ＲＴ−ＰＣＲ
T. onnurineus NA1（Genbank accession number,ＣＰ０００８５５）の遺伝体配列から遺伝子特異的プライマーを設計した。プライマー配列は、下記表３に記載されている。
【００６７】
ｃＤＮＡは逆転写酵素、SuperScrip ＩＩ (Invitrogen, Carlsbad, California)を用いて生産者のプロトコールに従って３５０ｎｇの総ＲＮＡから合成した。ＰＣＲ反応はＴ１ thermocycler (Biometra)を用いてｒＴａｑ（Takara）ＤＮＡ重合酵素により行った。前記反応は、１次鎖反応ｃＤＮＡ、１０pmolのプライマー、２５０μＭ ｄＮＴＰｓ及び生産者のバッファを含む５０μｌ混合物において行われた。９４℃において２分間の変性段階後に、変性（３０秒、９４℃）、アニーリング（３０秒、５６℃）及び伸張反応（１分、７２℃）が２５サイクル行われた。ＰＣＲ産物は０．８％アガロースゲル電気泳動を用いて分析した。発現レベルは,GelPro32.EXE v4.6 (Media Cybernetics, Inc.)を用いて測定した。ｃｈａと命名されたシャペロニン−暗号化遺伝子を発現レベルを標準化するための対照区として用いた。
【００６８】
【表４Ａ】
2018138060.tif 000006
【表４Ｂ】
2018138060.tif 000007
【００６９】
６）標的遺伝子除去
T. onnurineus NA1の生体内における水素化酵素の機能を分析するために、高好熱性古細菌であるT. kodakaraensis KOD1に用いられた遺伝子除去システムを用いて（Sapra, R., K. Bagramyan, and M. W. W. Adams. 2003. A simple energy-conserving system: Proton reduction coupled to proton translocation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:7545-7550）、ｍｃｈまたはｍｆｈ２水素化酵素の大きなサブユニットの挿入不活性突然変異を製作した。具体的に、ｍｃｈ及びｍｆｈ２水素化酵素それぞれの大きなサブユニット（ＴＯＮ＿０２３及びＴＯＮ＿１５６９）の隣接地域を含むＤＮＡ断片をＦｌｋ−ｍｃｈまたはＦｌｋ−ｍｆｈ２に対するプライマー組（表３）を用いてT. onnurineus NA1のゲノムＤＮＡから増幅させた。それぞれの増幅された断片はＨｉｎｃＩＩで切断されたｐＵＣ１１８に接合させた。その後、鋳型（Ｆｌｋ−ｍｃｈ＿ｐＵＣ１１８またはＦｌｋ−ｍｆｈ２＿ｐＵＣ１１８組換えプラスミド）からプライマー組（Ｉｖｓ−ｍｃｈまたはＩｖｓ−ｍｆｈ２）（表３）を用いて逆ＰＣＲを行い、次いで、Ｐｇｄｈ−ｈｍｇＰｆｕカセットに接合させた（Sapra, R., K. Bagramyan, and M. W. W. Adams. 2003. A simple energy-conserving system: Proton reduction coupled to proton translocation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:7545-7550）。その後、前記接合された結果物をEscherichia coli ＤＨ５ａ細胞に形質転換させた。組換えプラスミド（ｍｃｈ：：Ｐｇｄｈ−ｈｍｇＰｆｕ及びｍｆｈ２：：Ｐｇｄｈ−ｈｍｇＰｆｕ）はプラスミドミニキット（Qiagen, Hilden, Germany）により準備した。最後に、前記プラスミドをSato et al.(Sato, T., T. Fukui, H. Atomi, and T. Imanaka. 2003. Targeted gene disruption by homologous recombination in the hyperthermophilic archaeon Thermococcus kodakaraensis KOD1. J. Bacteriol. 185:210-220., Sato, T., T. Fukui, H. Atomi, and T. Imanaka. 2005. Improved and versatile transformation system allowing multiple genetic manipulations of the hyperthermophilic archaeon Thermococcus kodakaraensis. Appl. Environ. Microbiol. 71:3889-3899）の僅かな変形された方法によりT. onnurineus NA1に形質転換させた。形質転換体は１０μＭシンバスタチンの存在下でＡＳＷ−ＹＴ−Ｓ培地によりスクリーニングされ（Matsumi, R., K. Manabe, T. Fukui, H. Atomi, T. Imanaka. 2007. Disruption of a sugar transporter gene cluster in a hyperthermophilic archaeon using a host-marker system based on antibiotic resistance. J. Bacteriol. 189:2683-2691）、標的遺伝子が除去されたと思われる候補群はＰＣＲ増幅を通じて標的地域内Ｐｇｄｈ−ｈｍｇＰｆｕカセットの存在有無により除去有無を確認することができた。
【００７０】
７）成長及び水素生成に関する動力学的分析
成長は目視確認した。試料を海塩（３０．０ｇ／Ｌ）、ホルマリン（２．５％）、及び４’−６’−ジアミジノ−２−フェニルインドール（０．０１％）を含む滅菌水に希釈させ（Sato, T., T. Fukui, H. Atomi, and T. Imanaka. 2005. Improved and versatile transformation system allowing multiple genetic manipulations of the hyperthermophilic archaeon Thermococcus kodakaraensis. Appl. Environ. Microbiol. 71:3889-3899）、ブラックポリカーボネート膜フィルターによりろ過した後（孔径；０．２μｍ, Whatman）、位相差顕微鏡（Zeiss Axioplan）により計数した。水素ガスはＨＰ−ＰＬＯＴ Molesieve column (Agilent)及びＴＣＤ検出器を備えたガスクロマトグラフＨＰ５８９０series ＩＩ(Hewlett Packard)を用いて測定した。アルゴンがガス運搬体として用いられた。オーブンの温度は４０℃であった。分析のための１０μｌのガス試料は培養瓶のブチルゴムを通じてガスタイトシリンジにより取り出した。検出された水素ガスの測定はピーク面積を、窒素に４０％水素を含む標準ガスを用いた回帰分析により行われた補正曲線と比較することにより計算された。
【００７１】
（３）実験結果
１）T. onnurineus NA1水素化酵素のイン・シリコ分析
先のT. onnurineus NA1の遺伝体分析は８反復の水素化酵素遺伝子クラスターの存在を示し（Porter, K. G. and Y. S. Feig. 1980. The use of DAPI for identifying and counting microflora. Limnol. Oceanogr. 25:943-948）、５個の膜結合［ＮｉＦｅ］−水素化酵素（Ｍｂｈ,ＴＯＮ＿１５８３−１５９５；Ｍｂｘ,ＴＯＮ＿０４８６−０４９８；Ｍｆｈ１,ＴＯＮ＿０２７３−０２７８；Ｍｆｈ２,ＴＯＮ＿１５６６−１５７３；Ｍｃｈ,ＴＯＮ＿１０２１−１０２４）、及び３個の細胞質内［ＮｉＦｅ］−水素化酵素（Ｆｒｕ,ＴＯＮ＿１５５９−１５６２；ＳｕｌｆＩ,ＴＯＮ＿０５３３−０５４４；ＳｕｌｆＩＩ,ＴＯＮ＿００５１−００５５）を含む。ゲノムシークエンスが完了したThermococcales菌株との水素化酵素遺伝子クラスターの比較分析結果をみるとき、Ｍｆｈ１、Ｍｆｈ２、またはＭｃｈクラスターに相同性があるクラスターは極めて稀であると考えられ、T. barophilus ＭＰ（Ｍｆｈ１、Ｍｃｈ相同遺伝子）、Thermococcus sp. ＡＭ４（Ｍｆｈ１、Ｍｃｈ相同遺伝子）（Unfinished sequence, GenBank accession number, ＡＢＸＮ００００００００）、及びT. gammatolerans（Ｍｆｈ１及びＭｆｈ２相同性）（GenBank accession number、ＣＰ００１３９８）のように最近にゲノム配列が決定されたThermococcales菌株から発見される。T. onnurineus NA1のｆｄｈ１−ｍｆｈ１−ｍｎｈ１（Lee, H. S., S. G. Kang, S. S. Bae, J. K. Lim, Y. Cho, Y. J. Kim, J. H. Jeon, S.-S. Cha, K. K. Kwon, H.-T. Kim, C.-J. Park, H.-W. Lee, S. I. Kim, J. Chun, R. R. Colwell, S.-J. Kim,及びJ.-H. Lee. 2008. The complete genome sequence of Thermococcus onnurineus NA1 reveals a mixed heterotrophic and carboxydotrophic metabolism. J. Bacteriol. 190:7491-7499.の論文においてＨｙｇ４−Ｉと命名される。）、ｆｄｈ２−ｍｆｈ２−ｍｎｈ２（Ｈｙｇ４−ＩＩＩ）、及びｃｏｄｈ−ｍｃｈ−ｍｎｈ３（Ｈｙｇ４−ＩＩ）クラスターの配列分析は前記クラスターがそれぞれホルム酸塩脱水素化酵素（ＦＤＨ）及びＣＯ脱水素化酵素（Ｃｏｄｈ）などの酸化還元酵素を含むということを示す。特に、ＣＯ条件における成長により現れる一酸化炭素栄養代謝はＣＯを酸化させることにより水素生成経路においてエネルギーを提供するＣｏｄｈ−Ｍｃｈ−Ｍｎｈ３の機能的役割を示唆する。
【００７２】
２）ＣＯ−誘導成長条件下における水素化酵素遺伝子の発現
T. onnurineus NA1がＣＯ条件下で成長しながら水素を産生することができるかどうかを調べてみた。図７に示すように、ＹＰＳ培地においては水素産生を探知することができなかったが、ＣＯが添加された培地１においては培養時間が長くなるにつれて総水素ガスと細胞数が増大した。
【００７３】
その後、いかなる水素化酵素が一酸化炭素栄養成長中に水素生成に関与するかを調べるために、ＣＯ含有成長条件または複合培地（ＹＰＳ）における水素化酵素遺伝子の発現レベルを分析した。下記表４、表５及び図８Ａに示すように、ｃｏｄｈ−ｍｃｈ−ｍｎｈ３クラスターの一部ＯＲＦ（１６個のうち１０個のＯＲＦ）の発現レベルはＣＯを含む生長条件下でＹＰＳに比べて２倍以上上向き調節された。加えて、ｆｄｈ２−ｍｆｈ２−ｍｎｈ２クラスター内の複数のＯＲＦ（ＴＯＮ＿１５６３、ＴＯＮ＿１５６９−１５７１）の発現レベルもまた１ｇの酵母抽出物を含むＣＯ条件下で上向き調節された。ｃｏｄｈ−ｍｃｈ−ｍｎｈ３クラスター内のＯＲＦの発現レベルもまた酵母抽出物の量に応じて様々であるということに注目する必要があり、これは、ＣＯ−誘導代謝作用における異化作用の抑制または活性への関連性を示唆する（表４及び表５）。これに対し、他の水素化酵素遺伝子クラスターの発現は大きな変化がないのに対し、ｆｄｈ１−ｍｆｈ１−ｍｎｈ１クラスターの遺伝子（２９個のＯＲＦのうち２０個の遺伝子）は下向き調節を示した。水素化酵素それぞれの大きなサブユニットに対する定量的ＲＴ−ＰＣＲデータもまたマイクロアレイデータと一致した。ｍｃｈ及びｍｆｈ２水素化酵素の大きなサブユニット（ＴＯＮ＿１０２３及びＴＯＮ＿１５６９）の発現は２倍以上増大したのに対し（図８Ｂ）、ｍｆｈ１水素化酵素の大きなサブユニット（ＴＯＮ＿０２７６）の発現は抑制され、他の大きなサブユニット（ｍｂｈ、ｍｂｘ、ｆｒｈ、及びｓｕｌｆI）は両方条件下でいずれも一定に維持された。これらの結果は、ｃｏｄｈ−ｍｃｈ−ｍｎｈ３またはｆｄｈ２−ｍｆｈ２−ｍｎｈ２クラスターがＣＯにより誘導可能であり、一酸化炭素栄養代謝と関連する水素生成過程に関連する可能性があるという点を示唆する。
【００７４】
【表５Ａ】
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【表５Ｂ】
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【表５Ｃ】
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【００７５】
【表６Ａ】
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【表６Ｂ】
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【表６Ｃ】
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【００７６】
３）遺伝子破壊及び突然変異の形質分析
転写体分析は、ｃｏｄｈと近くにクラスターされたｍｃｈ水素化酵素が（図９Ａ）T. onnurineus NA1において一酸化炭素栄養水素の生成過程に重要な役割を果しうるということを示唆する。しかしながら、ｆｄｈ２−ｍｆｈ２−ｍｎｈ２クラスターの上向き調節及び他の水素化酵素ｍＲＮＡの多くの反復数はｃｏｄｈ−ｍｃｈ−ｍｎｈ３が単独にて前記過程に関与するものであるか、それとも、他の水素化酵素が脱水素化酵素と複合体を形成したり脱水素化酵素と連合してＦＡＤＨ２やＮＡＤＨなどの電子運搬体を再活用することによりｍｃｈに対して代替的経路になりうるかに関して疑問を引き起こす。このため、本発明者らは、ｍｃｈまたはｍｆｈ２水素化酵素それぞれの大きなサブユニットの欠損突然変異を製造した（Matsumi, R., K. Manabe, T. Fukui, H. Atomi, T. Imanaka. 2007. Disruption of a sugar transporter gene cluster in a hyperthermophilic archaeon using a host-marker system based on antibiotic resistance. J. Bacteriol. 189:2683-2691）。製作方法は、図９Ａに示してある。標的領域における相同組換えによるＰｇｄｈ−ｈｍｇＰｆｕカセットの挿入不活性化及びそれによるｈｍｇ−ＣｏＡ遺伝子の過発現によりＭｃｈまたはＭｆｈ２水素化酵素遺伝子クラスターそれぞれの大きなサブユニットが破壊される。標的遺伝子破壊は、１０μＭシンバスタチンが添加されたＹＰＳ培地における生存により候補群を選別した後、ＰＣＲ増幅を通じてのＰｇｄｈ−ｈｍｇＰｆｕカセットの存在により確認された（図９Ｂ）。破壊候補群（△ｍｃｈＴＮＡ１及び△ｍｆｈ２ＴＮＡ１）においてＰｇｄｈ−ｈｍｇＰｆｕが増幅可能であるのに対し、ｍｃｈまたはｍｆｈ２の大きなサブユニットの増幅には失敗した。これらの結果は、T. kodakaraensis KOD1（Sapra, R., K. Bagramyan, and M. W. W. Adams. 2003. A simple energy-conserving system: Proton reduction coupled to proton translocation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:7545-7550）に報告された遺伝子破壊システムがT. onnurinues ＮＡ１にも適用可能であることを示す。
【００７７】
ＹＰＳ培地において欠損突然変異ΔｍｃｈＴＮＡ１及びΔｍｆｈ２ＴＮＡ１を得ることができたため、ＭｃｈまたはＭｆｈ２がＹＰＳ培地の代謝消費に必須ではないということが分かる。図１０から明らかなように、突然変異菌株ΔｍｃｈＴＮＡ１及びΔｍｆｈ２ＴＮＡ１の成長及び形態変化は、ＹＰＳ培地上において前記遺伝子が必ずしも必須ではないということを確認させる。加えて、ＣＯ成長条件下でΔｍｆｈ２ＴＮＡ１菌株は野生型菌株と類似するレベルに成長して水素を生成した（図７及び１０）。これに対し、ΔｍｃｈＴＮＡ１突然変異はＣＯ成長条件下で成長することができず、水素も産生することができなかった（図１０）。これは、Ｍｃｈ大きなサブユニットの不在がＣＯ下においてT. onnurineus NA1の一酸化炭素栄養の生存能力を完全に破壊するということを示す。この結果をも考慮すると、ＣＯが基質に供給された場合にＭｃｈ水素化酵素だけが成長及び水素の生成に関与すると認められる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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