(57)【要約】      （修正有）【課題】高コレステロール血症および関連障害に対して、細胞内のプロタンパク質転換酵素サブチリシン/ケキシン9型（PCSK9）PCSK9 mRNAを標的とし、PCSK9の発現の低下をもたらす、オリゴマー化合物およびそれらのコンジュゲートの提供。【解決手段】a．対応する長さの、特定なヌクレオチドの配列からなるヌクレオチド配列に相補的である10〜16ヌクレオチドの連続配列を含む12〜22ヌクレオチド長のアンチセンスオリゴマー（A）と、b．オリゴマー（A）に共有結合で付着した、少なくとも1種のアシアロ糖タンパク質受容体を標的とするコンジュゲート部分（C）とを含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
a．対応する長さのSEQ ID NO 30または31または32または33または34または45に相補的である10〜16ヌクレオチドの連続配列を含む12〜22ヌクレオチド長のアンチセンスオリゴマー（A）と、
b．オリゴマー（A）に共有結合で付着した、少なくとも1種のアシアロ糖タンパク質受容体を標的とするコンジュゲート部分（C）と
を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
【請求項２】
アンチセンスオリゴマーが、SEQ ID NO 25、26、27、28、29、および44からなる群より選択される連続配列を含む、請求項0記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
【請求項３】
アンチセンスオリゴマーがPCSK9を標的とする、請求項0または2のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
【請求項４】
アンチセンスオリゴマーが、SEQ ID NO 1、2、3、4、5、6、7、および8からなる群より選択される連続配列を含む、請求項0〜3のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
【請求項５】
コンジュゲート部分（C）が、1価、2価、3価、または4価のGalNAcのようなN-アセチルガラクトサミン（GalNAc）を含む、請求項0〜4のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
【請求項６】
コンジュゲート部分（C）が、肝細胞への送達および／または取り込みを増強する、請求項0〜5のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
【請求項７】
コンジュゲート部分（C）が、3価GalNAc、例えば、コンジュゲート1、2、3、もしくは4、または1a、2a、3a、もしくは4aとして示されたものを含む、請求項0〜6のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
【請求項８】
3個のGalNAc部分、例えば、コンジュゲート1、2、1a、または2aとして示されたものが、PEGスペーサーを介してジリジン分岐点基に付着している、請求項7記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
【請求項９】
コンジュゲート部分（C）がコンジュゲート2aを含む、請求項7または7記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
【請求項１０】
SEQ ID NO 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、および24からなる群より選択される、請求項0〜9のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
【請求項１１】
アンチセンスオリゴマー（A）が、オリゴマーの連続配列とコンジュゲート部分との間に位置付けられたリンカー領域（Bおよび／またはY）を介して、コンジュゲート部分（C）にコンジュゲートされている、請求項0〜10のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
【請求項１２】
リンカーが、C6〜C12アミノアルキル基より選択される、請求項11記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
【請求項１３】
リンカーが、1〜6個のヌクレオチドを含む生物切断性（biocleavable）ホスフェートヌクレオチドリンカーである、請求項11記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
【請求項１４】
a．対応する長さのSEQ ID NO 31に相補的である16ヌクレオチドの連続配列、または
b．対応する長さのSEQ ID NO 33もしくは34もしくは45に相補的である10〜16ヌクレオチドの連続配列
のいずれかを含む、12〜22ヌクレオチド長のオリゴマー。
【請求項１５】
SEQ ID NO 26、27、28、29、および44からなる群より選択される連続配列を含む、請求項14記載のオリゴマー。
【請求項１６】
PCSK9を標的とする、請求項14または15のいずれか一項記載のオリゴマー。
【請求項１７】
連続配列が、親和性増強ヌクレオチド類似体を含む、請求項14〜16のいずれか一項記載のオリゴマー。
【請求項１８】
ギャップマーである、請求項14〜17のいずれか一項記載のオリゴマー。
【請求項１９】
13、14、15、または16ヌクレオチドの連続配列を含む、請求項14〜18のいずれか一項記載のオリゴマー。
【請求項２０】
ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、およびボラノホスフェートからなる群より選択される1個以上のヌクレオシド連結を含む、請求項14〜19のいずれか一項記載のオリゴマー。
【請求項２１】
SEQ ID NO 2、3、4、5、6、7、および8からなる群より選択される連続配列を含む、請求項14〜20のいずれか一項記載のオリゴマー。
【請求項２２】
請求項0〜21のいずれか一項記載のオリゴマーまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートと、薬学的に許容される希釈剤、担体、塩、またはアジュバントとを含む薬学的組成物。
【請求項２３】
高コレステロール血症または関連障害、例えば、アテローム性動脈硬化症、高脂血症、高コレステロール血症、家族性高コレステロール血症、例えば、PCSK9の機能獲得型変異、HDL/LDLコレステロール不均衡、脂質異常症、例えば、家族性高脂血症（FCHL）もしくは家族性高コレステロール血症（FHC）、後天性高脂血症、スタチン抵抗性高コレステロール血症、冠動脈疾患（CAD）、および冠動脈性心疾患（CHD）からなる群より選択される障害の処置等のための医薬として使用するための、請求項0〜22のいずれか一項記載のオリゴマーまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは薬学的組成物。
【請求項２４】
高コレステロール血症または関連障害、例えば、アテローム性動脈硬化症、高脂血症、高コレステロール血症、家族性高コレステロール血症、例えば、PCSK9の機能獲得型変異、HDL/LDLコレステロール不均衡、脂質異常症、例えば、家族性高脂血症（FCHL）もしくは家族性高コレステロール血症（FHC）、後天性高脂血症、スタチン抵抗性高コレステロール血症、冠動脈疾患（CAD）、および冠動脈性心疾患（CHD）からなる群より選択される障害の処置のための医薬の製造のための、請求項0〜22のいずれか一項記載のオリゴマーまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは薬学的組成物の使用。
【請求項２５】
有効量の請求項0〜22のいずれか一項記載のオリゴマーまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは薬学的組成物を高コレステロール血症または関連障害に罹患しているかまたは罹患する可能性が高い患者へ投与する工程を含む、高コレステロール血症または関連障害、例えば、アテローム性動脈硬化症、高脂血症、高コレステロール血症、家族性高コレステロール血症、例えば、PCSK9の機能獲得型変異、HDL/LDLコレステロール不均衡、脂質異常症、例えば家族性高コレステロール血症（FHC）、後天性高脂血症、スタチン抵抗性高コレステロール血症、冠動脈疾患（CAD）、および冠動脈性心疾患（CHD）からなる群より選択される障害を処置する方法。
【請求項２６】
請求項0〜22のいずれか一項記載のオリゴマーまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは薬学的組成物をPCSK9を発現している細胞へ投与する工程を含む、該細胞におけるPCSK9の阻害のためのインビボまたはインビトロの方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、細胞内のプロタンパク質転換酵素サブチリシン/ケキシン9型（PCSK9）mRNAを標的とし、PCSK9の発現の低下をもたらすオリゴマー化合物およびそれらのコンジュゲートに関する。PCSK9発現の低下は、高コレステロール血症および関連障害のようなある範囲の医学的障害のために有益である。
【背景技術】
【０００２】
背景
プロタンパク質転換酵素サブチリシン/ケキシン9型（PCSK9）は、低密度リポタンパク質コレステロール（LDL-C）の低下のための治療的な標的として出現した。PCSK9は、LDL受容体の分解を増加させ、高いPCSK9活性を有する個体において高いLDL-Cをもたらす。
【０００３】
Lindholm et al.,Molecular Therapy(2012);20 2,376-381（非特許文献1）は、負荷用量（20mg/kg）および4回の毎週の維持用量（5mg/kg）の後に非ヒト霊長類においてLDL-Cの持続的な低下を生ずる、PCSK9を標的とする2種のLNAアンチセンスオリゴヌクレオチドについて報告している。使用された化合物は、14塩基長SPC5001（SEQ ID NO 1）および13塩基長SPC4061であった。SPC5001は、WO2011/009697（特許文献1）にも同様に開示されている。これらのPCSK9阻害剤の効力は、短い長さによるものとされている（Krieg et al.,Molecular Therapy Nucleic Acids(2012)1,e6（非特許文献2））。
【０００４】
WO2007/146511（特許文献2）は、より長い化合物より明白に強力であって、低毒性である、短い二環式（LNA）ギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチドについて報告している。例示された化合物は、14nt長であると考えられる。
【０００５】
van Poelgeestら（American Journal of Kidney Disease,2013 Oct;62(4):796-800（非特許文献3））によると、ヒト臨床試験におけるLNAアンチセンスオリゴヌクレオチドSPC5001の投与は、急性腎損傷をもたらす場合がある。
【０００６】
EP 1 984 381B1（特許文献3）、Seth et al.,Nucleic Acids Symposium Series 2008 No.52 553-554（非特許文献4）、およびSwayze et al.,Nucleic Acid Research 2007,vol35,pp687-700（非特許文献5）によると、LNAオリゴヌクレオチドは、動物において重大な肝毒性を引き起こす。WO2007/146511（特許文献2）によると、LNAオリゴヌクレオチドの毒性は、12〜14ヌクレオチド長という短いLNAギャップマーを使用することによって回避され得る。EP 1 984 381B1（特許文献3）は、LNAオリゴヌクレオチドの肝毒性の可能性を減少させるため、6'置換型二環式ヌクレオチドを使用することを推奨している。Hagedorn et al.,Nucleic Acid Therapeutics 2013（非特許文献6）によると、アンチセンスオリゴヌクレオチドの肝毒性の可能性は、配列および修飾パターンから予測され得る。
【０００７】
オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、siRNAにおいて使用するために広範囲に評価され、十分なインビボ効力を入手するために不可欠であると見なされている。例えば、RNA干渉経路を介して遺伝子発現を調節する修飾型オリゴマー化合物に言及しているWO2004/044141（特許文献4）を参照すること。オリゴマー化合物は、付着したオリゴマー化合物の薬物動態学的特性および薬力学的特性を修飾するかまたは増強することができる1種以上のコンジュゲート部分を含む。
【０００８】
WO2012/083046（特許文献5）は、siRNAのためのガラクトースクラスタ-薬物動態モジュレーターターゲティング部分を報告している。
【０００９】
対照的に、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、典型的には、コンジュゲーションまたは製剤化なしに治療的に投与される。アンチセンスオリゴヌクレオチドの主な標的組織は、肝臓および腎臓であるが、リンパ節、脾臓、および骨髄を含む広範囲のその他の組織も、アンチセンスモダリティによって到達可能である。
【００１０】
WO2005/086775（特許文献6）は、治療用化学部分、切断可能リンカー、および標識ドメインを使用した、特定の器官への治療剤の標的特異的な送達に言及している。切断可能リンカーは、例えば、ジスルフィド基、ペプチド、または制限酵素によって切断可能なオリゴヌクレオチドドメインであり得る。
【００１１】
WO2011/126937（特許文献7）は、低分子リガンドとのコンジュゲーションを介した、オリゴヌクレオチドの標的特異的な細胞内送達に言及している。
【００１２】
WO2009/025669（特許文献8）は、ピリジルジスルフィド部分を含有しているポリマー（ポリエチレングリコール）リンカーに言及している。Zhao et al.,Bioconjugate Chem.2005 16 758-766（非特許文献7）も参照すること。
【００１３】
Chaltin et al.,Bioconjugate Chem.2005 16 827-836（非特許文献8）は、デンドリマー送達系を作製するため、アンチセンスオリゴヌクレオチドをカチオン性リポソームへ組み入れるために使用された、コレステロールによって修飾されたモノマー型、ダイマー型、およびテトラマー型のオリゴヌクレオチドについて報告している。コレステロールは、リジンリンカーを介して、オリゴヌクレオチドにコンジュゲートされる。
【００１４】
他の非切断可能コレステロールコンジュゲートは、siRNAおよびアンタゴmir（antagomir）を肝臓へターゲティングするために使用されている。例えば、Soutscheck et al.,Nature 2004 vol.432 173-178（非特許文献9）およびKrutzfeldt et al.,Nature 2005 vol 438,685-689（非特許文献10）を参照すること。部分的にホスホロチオエート化されたsiRNAおよびアンタゴmirのための、肝臓ターゲティングエンティティとしてのコレステロールの使用は、インビボ活性にとって不可欠であることが見出された。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】WO2011/009697
【特許文献２】WO2007/146511
【特許文献３】EP 1 984 381B1
【特許文献４】WO2004/044141
【特許文献５】WO2012/083046
【特許文献６】WO2005/086775
【特許文献７】WO2011/126937
【特許文献８】WO2009/025669
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Lindholm et al.,Molecular Therapy(2012);20 2,376-381
【非特許文献２】Krieg et al.,Molecular Therapy Nucleic Acids(2012)1,e6
【非特許文献３】American Journal of Kidney Disease,2013 Oct;62(4):796-800
【非特許文献４】Seth et al.,Nucleic Acids Symposium Series 2008 No.52 553-554
【非特許文献５】Swayze et al.,Nucleic Acid Research 2007,vol35,pp687-700
【非特許文献６】Hagedorn et al.,Nucleic Acid Therapeutics 2013
【非特許文献７】Zhao et al.,Bioconjugate Chem.2005 16 758-766
【非特許文献８】Chaltin et al.,Bioconjugate Chem.2005 16 827-836
【非特許文献９】Soutscheck et al.,Nature 2004 vol.432 173-178
【非特許文献１０】Krutzfeldt et al.,Nature 2005 vol 438,685-689
【発明の概要】
【００１７】
発明の目的
従って、SPC5001と同等に有効であるが、低下した毒性リスク、具体的には、低下した腎毒性を有している、PCSK9を標的とするアンチセンス化合物が必要とされている。
【００１８】
本発明によると、アンチセンスアプローチを使用して標的とするために特に効果的である新しいヒトPCSK9配列（SEQ ID NO 33およびSEQ ID NO 34）、ならびに毒性問題なしにSPC5001の著しい効力を保持しているかまたはそれよりも改善されているSPC5001配列のより長いバリアントの同定によって、これが達成された。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、LNAアンチセンスオリゴヌクレオチドの治療指数を大きく増強することが見出されたコンジュゲートを使用することによって、さらに改善され得る。
【００１９】
本発明の化合物は、高コレステロール血症および関連障害の処置において有用な、PCSK9の強力な非毒性の阻害剤である。
【００２０】
発明の概要
本発明のオリゴマーは、（a）対応する長さのSEQ ID NO 33または34または45に相補的である10〜16ヌクレオチドの連続配列、または（b）対応する長さのSEQ ID NO 31に相補的である16ヌクレオチドの連続配列のいずれかを含む、10〜22ヌクレオチド長、例えば、12〜18ヌクレオチド長を含み得る。
【００２１】
本発明は、本発明によるオリゴマーと、オリゴマーに共有結合で付着した少なくとも1種の非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分とを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートを提供する。
【００２２】
本発明は、本発明によるオリゴマー（A）と、任意で、オリゴマーの連続配列とコンジュゲート部分との間に位置付けられたリンカー領域（Bおよび／またはY）を介して、オリゴマーに共有結合で付着した少なくとも1種の非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分（C）とを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートも提供する。
【００２３】
いくつかの態様において、本発明は、（a）対応する長さのSEQ ID NO 33もしくは34もしくは45に相補的である10〜16ヌクレオチドの連続配列、または（b）対応する長さのSEQ ID NO 31に相補的である16ヌクレオチドの連続配列を含む、10〜22ヌクレオチド長、例えば、12〜18ヌクレオチド長のオリゴマーを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートも提供する。
【００２４】
本発明は、SEQ ID NO 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、17、16、18、19、20、21、22、23、および24からなる群より選択される化合物も提供する。
【００２５】
本発明は、本発明によるオリゴマーまたはコンジュゲートと、薬学的に許容される希釈剤、担体、塩、またはアジュバントとを含む薬学的組成物を提供する。
【００２６】
本発明は、高コレステロール血症または関連障害、例えば、アテローム性動脈硬化症、高脂血症、高コレステロール血症、家族性高コレステロール血症、例えば、PCSK9の機能獲得型変異、HDL/LDLコレステロール不均衡、脂質異常症、例えば、家族性高脂血症（FCHL）もしくは家族性高コレステロール血症（FHC）、後天性高脂血症、スタチン抵抗性高コレステロール血症、冠動脈疾患（CAD）、および冠動脈性心疾患（CHD）からなる群より選択される障害の処置等のための医薬として使用するための、本発明によるオリゴマーまたはコンジュゲートまたは薬学的組成物を提供する。
【００２７】
本発明は、高コレステロール血症または関連障害、例えば、アテローム性動脈硬化症、高脂血症、高コレステロール血症、家族性高コレステロール血症、例えば、PCSK9の機能獲得型変異、HDL/LDLコレステロール不均衡、脂質異常症、例えば、家族性高脂血症（FCHL）もしくは家族性高コレステロール血症（FHC）、後天性高脂血症、スタチン抵抗性高コレステロール血症、冠動脈疾患（CAD）、および冠動脈性心疾患（CHD）からなる群より選択される障害の処置のための医薬の製造のための、本発明のオリゴマーまたはコンジュゲートまたは薬学的組成物の使用を提供する。
【００２８】
本発明は、有効量の本発明によるオリゴマーまたはコンジュゲートまたは薬学的組成物を高コレステロール血症または関連障害に罹患しているかまたは罹患する可能性が高い患者へ投与する工程を含む、高コレステロール血症または関連障害、例えば、アテローム性動脈硬化症、高脂血症、高コレステロール血症、家族性高コレステロール血症、例えば、PCSK9の機能獲得型変異、HDL/LDLコレステロール不均衡、脂質異常症、例えば、家族性高脂血症（FCHL）もしくは家族性高コレステロール血症（FHC）、後天性高脂血症、スタチン抵抗性高コレステロール血症、冠動脈疾患（CAD）、および冠動脈性心疾患（CHD）からなる群より選択される障害を処置する方法を提供する。
【００２９】
本発明は、細胞内のPCSK9を阻害するため、本発明によるオリゴマーまたはコンジュゲートまたは薬学的組成物をPCSK9を発現している細胞へ投与する工程を含む、該細胞におけるPCSK9の阻害のためのインビボまたはインビトロの方法を提供する。
【００３０】
本発明は、10〜22個、例えば、12〜18個、例えば、13個、14個、15個、16個、または17個のホスホロチオエートによって連結されたヌクレオシドの連続領域（即ち、典型的には、SEQ ID NO 46のような標的配列の対応する領域に相補的である領域A）を含み、LNAオリゴマーと連続している1〜6個のDNAヌクレオシドをさらに含む、本発明によるオリゴマー、例えば、LNAオリゴマーも提供する。DNA間のかつ／またはDNAヌクレオシドに隣接したヌクレオシド間連結は、生理学的に不安定なものであり、例えば、ホスホジエステル連結である。そのようなLNAオリゴマーは、本明細書に記載されるコンジュゲートの形態をとっていてもよいし、または、例えば、その後のコンジュゲーション工程において使用される中間体であってもよい。コンジュゲートされる時、コンジュゲートは、例えば、ステロール、例えば、コレステロールもしくはトコフェロールであるかもしくはそれを含んでいてもよいし、または（非ヌクレオチド）炭水化物、例えば、GalNAcコンジュゲートもしくは本明細書に記載される他のコンジュゲートであるかもしくはそれを含んでいてもよい。
【００３１】
本発明は、ヒトPCSK9を標的とする（即ち、その対応する部分に相補的である配列を有する）10〜22ヌクレオチド長、例えば、12〜18ヌクレオチド長、例えば、13ヌクレオチド長、14ヌクレオチド長、15ヌクレオチド長、16ヌクレオチド長、または17ヌクレオチド長の少なくとも1種のcETヌクレオチド、例えば、(S)-cETヌクレオチドを含むギャップマーオリゴマーも提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１−１】使用され得るトリGalNAcコンジュゲートの例。コンジュゲート1〜4は、4種の適当なGalNAcコンジュゲート部分を例示し、コンジュゲート1a〜4aとは、コンジュゲートをオリゴマー（領域A、または領域Bのような生物切断性（biocleavable）リンカー）に連結するために使用される付加的なリンカー部分（Y）を含む同一のコンジュゲートをさす。波線は、オリゴマーとの共有結合性の連結を表す。
【図１−２】使用され得るトリGalNAcコンジュゲートの例。コンジュゲート1〜4は、4種の適当なGalNAcコンジュゲート部分を例示し、コンジュゲート1a〜4aとは、コンジュゲートをオリゴマー（領域A、または領域Bのような生物切断性（biocleavable）リンカー）に連結するために使用される付加的なリンカー部分（Y）を含む同一のコンジュゲートをさす。波線は、オリゴマーとの共有結合性の連結を表す。
【図１−３】使用され得るトリGalNAcコンジュゲートの例。コンジュゲート1〜4は、4種の適当なGalNAcコンジュゲート部分を例示し、コンジュゲート1a〜4aとは、コンジュゲートをオリゴマー（領域A、または領域Bのような生物切断性（biocleavable）リンカー）に連結するために使用される付加的なリンカー部分（Y）を含む同一のコンジュゲートをさす。波線は、オリゴマーとの共有結合性の連結を表す。
【図２】コレステロールコンジュゲート部分およびトコフェロールコンジュゲート部分の例。コンジュゲート5aおよび6aとは、コンジュゲートをオリゴマー（領域A、または領域Bのような生物切断性リンカー）に連結するために使用される付加的なリンカー部分（Y）を含む同一のコンジュゲートをさす。波線は、オリゴマーとの共有結合性の連結を表す。
【図３】具体的なLNA化合物。β-D-オキシLNAは、文字の後の上付きのLによって同定され、下付きのsはホスホロチオエート連結を表し、大文字のCの前の上付きのMeは5-メチルシトシンLNAを表し、非LNAヌクレオチドはDNAヌクレオチド（上付きのLなし）である。
【図４】LNA化合物のコレステロールコンジュゲートの例。β-D-オキシLNAは、文字の後の上付きのLによって同定され、下付きのsはホスホロチオエート連結を表し、下付きのOはホスホジエステル連結を表し、大文字のCの前の上付きのMeは5-メチルシトシンLNAを表し、非LNAヌクレオチドはDNAヌクレオチド（上付きのLなし）である。
【図５】LNA化合物のGalNAcコンジュゲートの例。コンジュゲートは、波線がLNAオリゴマーによって置換されている図中のコンジュゲート2aに本質的に相当する。β-D-オキシLNAは、文字の後の上付きのLによって同定され、下付きのsはホスホロチオエート連結を表し、大文字のCの前の上付きのMeは5-メチルシトシンLNAを表し、非LNAヌクレオチドはDNAヌクレオチド（上付きのLなし）である。
【図５Ａ】SEQ ID NO 18の詳細な構造。
【図５Ｂ】SEQ ID NO 19の詳細な構造。
【図６】FAMコンジュゲート基の例。
【図７】切断可能なホスホジエステル連結を含むLNA-FAMコンジュゲートおよび含まないLNA-FAMコンジュゲート。β-D-オキシLNAは、文字の後の上付きのLによって同定され、下付きのsはホスホロチオエート連結を表し、下付きのOはホスホジエステル連結を表し、大文字のCの前の上付きのMeは5-メチルシトシンLNAを表し、非LNAヌクレオチドはDNAヌクレオチド（上付きのLなし）である。
【図８】インビトロの効力によってランク付けされた抗PCSK9ギャップマー。
【図９】インビトロの効力によってランク付けされた選択された抗PCSK9ギャップマー。
【図１０】選択された抗PCSK9化合物のインビトロの効力およびIC50計算。
【図１１】選択された抗PCSK9コンジュゲートについてのインビボALTデータ。
【図１２】本発明の化合物の非限定的な例示。ヌクレオシド間連結Lは、例えば、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ボラノホスフェート、またはメチルホスホネート、例えば、ホスホジエステルであり得る。POはホスホジエステル結合である。化合物（a）は、単一のDNA（またはRNA）を含む領域Bを有しており、第2領域と第1領域との間の連結はPOである。化合物（b）は、ホスホジエステル結合によって連結された2個のDNA/RNA（例えば、DNA）ヌクレオシドを有する。化合物（c）は、ホスホジエステル結合によって連結された3個のDNA/RNA（例えば、DNA）ヌクレオシドを有する。いくつかの態様において、領域Bは、さらなるホスホジエステルDNA/RNA（例えば、DNAヌクレオシド）によってさらに延長されてもよい。コンジュゲート基（本明細書中、X、または領域Cと表される）は、各化合物の左側に例示され（例えば、コレステロール、GalNAc、コンジュゲート1〜4、1a〜4a、および5または6）、任意で、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ボラノホスフェート、もしくはメチルホスホネートのようなリンヌクレオシド連結基を介して、領域Bの末端ヌクレオシドに共有結合で付着していてもよいし、または代替的な連結、例えば、トリアゾール連結（化合物（d）、（e）、および（f）のLを参照すること）を介して連結されていてもよい。
【図１３】第3（コンジュゲート）領域（X）と第2領域（領域B）との間にオプションのリンカー（Y）を含む本発明の化合物の非限定的な例示。図12と同一の命名法。適当なリンカーは、本明細書に開示され、例えば、アルキルリンカー、例えば、C6リンカーを含む。化合物（a）、（b）、および（c）において、Xと領域Bとの間のリンカーは、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ボラノホスフェート、もしくはメチルホスホネートのようなリンヌクレオシド連結基を介して領域Bに付着していてもよいし、または代替的な連結、例えば、トリアゾール連結（Li）を介して連結されていてもよい。これらの化合物において、Liiは、第1領域（A）と第2領域（B）との間のヌクレオシド間連結を表す。化合物（d）、（e）、および（f）は、領域Bとコンジュゲート基との間にリンカー（Y）をさらに含み、領域Yは、例えば、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ボラノホスフェート、もしくはメチルホスホネートのようなリンヌクレオシド連結基、またはいくつかの態様において、トリアゾール連結を介して、領域Bに連結されていてもよい。付加的にまたは代替的に、Xは、活性化基または反応基であってもよい。Xは、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ボラノホスフェート、もしくはメチルホスホネートのようなリンヌクレオシド連結基を介して、領域Bに共有結合で付着していてもよいし、または代替的な連結、例えば、トリアゾール連結を介して連結されていてもよい。
【図１４】インビボのコレステロールコンジュゲートによるPCSK9 mRNAのサイレンシング。10mg/kgの非コンジュゲートLNAアンチセンスオリゴヌクレオチド（＃40）または異なるリンカーによってコレステロールにコンジュゲートされた等モル量のLNAアンチセンスオリゴヌクレオチドを、マウスに単回注射し、投薬後1日目、3日目、7日目、および10日目に屠殺した。RNAを肝臓および腎臓から単離し、PCSK9特異的なRT-qPCRに供した。A. BACTに対して標準化され、等価な生理食塩水対照の平均に対する百分率として示された肝臓試料からのPCSK9 mRNAの定量化。B. BACTに対して標準化され、等価な生理食塩水対照の平均に対する百分率として示された腎臓試料からのPCSK9 mRNAの定量化。
【図１５】ラット安全性研究からのKim-1発現（実施例5を参照すること）。
【図１６】0.5mg/kg/週または1.5mg/kg/週のSEQ ID 2および18を4回（週1回）注射されたカニクイザルに由来する試料における血清中のPCSK9およびLDLコレステロール。
【図１７】0.5mg/kg/週または1.5mg/kg/週のSEQ ID 3および19を4回（週1回）注射されたカニクイザルに由来する試料における血清中のPCSK9およびLDLコレステロール。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
発明の詳細な説明
以下、本発明の異なる要素を、別々の標題の下で説明する。（例えば、図12および13に例示されるような）本発明の化合物に到達するため、ある要素からの態様を、他の要素からの態様と組み合わせてもよいことが理解される。
【００３４】
オリゴマー（領域A）
本発明に関して「オリゴマー」または「オリゴヌクレオチド」という用語は、2個以上のヌクレオチドの共有結合性の連結によって形成された分子（即ち、オリゴヌクレオチド）をさす。本明細書において、単一のヌクレオチド（単位）を、モノマーまたは単位と呼ぶ場合もある。いくつかの態様において、「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」、「単位」、および「モノマー」という用語は、交換可能に使用される。ヌクレオチドまたはモノマーの配列に言及する時、言及されるのは、A、T、G、C、またはUのような塩基の配列であることが認識されるであろう。
【００３５】
本発明のオリゴマーは、10〜22ヌクレオチド長、例えば、12〜22ヌクレオチド長、例えば、12〜18ヌクレオチド長を含み得る。オリゴマーは、（a）対応する長さのSEQ ID NO 33もしくは34もしくは45に相補的である10〜16ヌクレオチドの連続配列、または（b）対応する長さのSEQ ID NO 31に相補的である16ヌクレオチドの連続配列のいずれかを含む。
【００３６】
いくつかの態様において、本発明のオリゴマーは、SEQ ID NO 26、27、28、29、および44からなる群より選択される連続配列を含む。
【００３７】
本発明の化合物（例えば、オリゴマーまたはコンジュゲート）は、PCSK9を標的とし、従って、PCSK9、例えば、ヒトまたはPCSK9を発現する細胞におけるPCSK9の発現をダウンレギュレートするかまたは阻害することができる。
【００３８】
いくつかの態様において、対応する長さのSEQ ID NO 33または34または45に相補的である10〜16ヌクレオチドの連続配列のヌクレオシド間連結は、ホスホロチオエート連結であり得る。
【００３９】
いくつかの態様において、本発明のオリゴマーは、SEQ ID NO 2、3、4、5、6、7、8、および40からなる群より選択される連続配列を含むかまたはそれからなる。一つの態様において、オリゴマーは、（a）SEQ ID NO 2もしくは3、または（b）SEQ ID NO 4、5、もしくは6、または（c）SEQ ID NO 7もしくは8、または（d）SEQ ID NO 40より選択される配列を含むかまたはそれからなる。
【００４０】
いくつかの態様において、オリゴマーは、10〜16個のホスホロチオレート（phosporothiolate）によって連結されたヌクレオシドを含む。
【００４１】
いくつかの態様において、本発明のオリゴマーは、ヌクレオチド類似体を含む、対応する長さのSEQ ID NO 33もしくは34もしくは45に相補的である少なくとも10〜16ヌクレオチドの連続配列、または対応する長さのSEQ ID NO 31に相補的である16ヌクレオチドの連続配列を含む。好ましくは、ヌクレオチド類似体は、親和性増強ヌクレオチド類似体である。
【００４２】
いくつかの態様において、ヌクレオチド類似体は、糖修飾型ヌクレオチド、例えば、ロックド核酸（LNA）単位；2'-O-アルキル-RNA単位、2'-OMe-RNA単位、2'-アミノ-DNA単位、および2'-フルオロ-DNA単位からなる群より独立にまたは非独立に選択される糖修飾型ヌクレオチドである。
【００４３】
いくつかの態様において、ヌクレオチド類似体は、ロックド核酸（LNA）単位を含むか、またはロックド核酸（LNA）単位である。
【００４４】
いくつかの態様において、本発明のオリゴマーは、ギャップマー、例えば、LNAギャップマーオリゴヌクレオチドであるかまたはそれを含む。
【００４５】
いくつかの態様において、ギャップマーは、2-4ヌクレオチド類似体、好ましくは、LNA類似体の各側（5'および3'）にウィング（wing）を含む。
【００４６】
いくつかの態様において、本発明のオリゴマーは、対応する長さのSEQ ID NO 33もしくは34もしくは45に相補的である少なくとも13ヌクレオチド、14ヌクレオチド、15ヌクレオチド、もしくは16ヌクレオチドの連続配列、または対応する長さのSEQ ID NO 31に相補的である16ヌクレオチドの連続配列を含み、任意で、生物切断性ヌクレオチド領域、例えば、ホスフェートヌクレオチドリンカーを形成するかまたはそれを含む1〜6個のヌクレオチドをさらに含む。適切に、生物切断性ヌクレオチド領域は、生理学的に不安定であるヌクレオチドの短いストレッチ（例えば、1、2、3、4、5、または6）から形成される。これは、DNA/RNAヌクレオシドを含むホスホジエステル連結を使用することによって達成されてもよいし、または、生理学的不安定性が維持され得る場合には、他のヌクレオシドが使用されてもよい。実施例6において例証されるように、生理学的不安定性は肝臓抽出物を使用して測定され得る。
【００４７】
従って、本発明のオリゴマーは、対応する長さのSEQ ID NO 33もしくは34もしくは45に相補的である10〜16nt長の連続ヌクレオチド配列、または対応する長さのSEQ ID NO 31に相補的である16ヌクレオチドの連続配列（第1領域または領域A）を含み得る。本発明のオリゴマーは、さらなるヌクレオチド領域を含んでいてもよい。いくつかの態様において、さらなるヌクレオチド領域には、領域Aを、非ヌクレオチド部分、例えば、コンジュゲート基（第3領域または領域C）に共有結合で連結することができる、生物切断性ヌクレオチド領域、例えば、ホスフェートヌクレオチド配列（第2領域、領域B）が含まれる。いくつかの態様において、本発明のオリゴマーの連続ヌクレオチド配列（領域A）は、直接、領域Cに共有結合で連結される。いくつかの態様において、領域Cは生物切断性である。
【００４８】
オリゴマーは、12〜22ヌクレオチド長、例えば、13ヌクレオチド長、14ヌクレオチド長、15ヌクレオチド長、16ヌクレオチド長、17ヌクレオチド長、18ヌクレオチド長、19ヌクレオチド長、20ヌクレオチド長、21ヌクレオチド長、例えば、14〜16ヌクレオチド長、例えば、15ヌクレオチド長または16ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列からなるかまたはそれを含む。従って、オリゴマーとは、領域Aおよび領域B、例えば、領域A（10〜16nt）および領域B（1〜6nt）の長さを組み合わせたものをさす場合もある。
【００４９】
様々な態様において、本発明の化合物は、RNA（単位）を含まない。いくつかの態様において、本発明による化合物、第1領域、または（例えば、単一の連続配列として）第1領域および第2領域を合わせたものは、直鎖状分子であるか、または直鎖状分子として合成される。従って、オリゴマーは、一本鎖分子であり得る。いくつかの態様において、オリゴマーは、同一オリゴマー内の等価な領域に相補的である短い領域、例えば、少なくとも3連続ヌクレオチド、4連続ヌクレオチド、または5連続ヌクレオチドの領域（即ち、二重鎖）を含まない。オリゴマーは、いくつかの態様において、（本質的に）二本鎖でない。いくつかの態様において、オリゴマーは、本質的に二本鎖でなく、例えば、siRNAでない。
【００５０】
オリゴマー配列
以下の表は、本発明のオリゴマーおよびオリゴマーコンジュゲートならびに本発明のPCSK9標的配列を提供する。
【００５１】
（表１）
2018064575.tif 000002
2018064575.tif 000003
【００５２】
SEQ ID NO 25〜29および44は、核酸塩基配列モチーフである。
【００５３】
SEQ ID NO 30〜34および45は、ヒトPCSK9 mRNAに存在するRNA標的配列である。
【００５４】
SEQ ID NO 1は、SPC5001である。
【００５５】
SEQ ID NO 1〜24および40〜43は、ヌクレオチド類似体を含むオリゴマー、例えば、LNAギャップマーオリゴマーである。小文字がDNA単位（ヌクレオシド／ヌクレオチド）であり、大文字がLNA単位である。
【００５６】
いくつかの態様において、全てのLNA Cが5-メチルシトシンである。いくつかの態様において、全てのLNA単位がβ-D-オキシLNAである。いくつかの態様において、SEQ ID NO 1〜24および40〜43のヌクレオシド間のヌクレオシド間連結は全てホスホロチオエート連結である。
【００５７】
SEQ ID NO 9〜16および41〜43は、（SEQ IDによって示される）オリゴマーのみならず、任意で、生物切断性リンカー、例えば、ホスフェートヌクレオシドリンカーを介して、オリゴマーの5'末端または3'末端に共有結合で連結されていてもよいコレステロールコンジュゲートも含む。いくつかの態様において、コレステロールコンジュゲートはオリゴマーの5'末端に連結されている。
【００５８】
SEQ ID NO 17〜24は、（SEQ IDによって示される）オリゴマーのみならず、任意で,生物切断性リンカー、例えば、ホスフェートヌクレオシドリンカーまたは切断可能なペプチドリンカーを介して、オリゴマーの5'末端または3'末端に共有結合で連結されていてもよいGalNAcコンジュゲートも含む。いくつかの態様において、GalNAcコンジュゲートはオリゴマーの5'末端に連結されている。
【００５９】
本明細書において使用される具体的なオリゴマーおよびコンジュゲートは、図3（オリゴマー）、図4（コレステロールコンジュゲート）、図5（GalNAcコンジュゲート）に例示される。本発明のオリゴマーと共に使用され得るコンジュゲートの他の例は、図1および2に例示され、GalNAcコンジュゲート部分というセクションに記載される。
【００６０】
表2は、オリゴマーおよびコンジュゲートの具体的な組み合わせを提供する。
【００６１】
（表２）オリゴマー／コンジュゲート組み合わせ
2018064575.tif 000004
【００６２】
これらの組み合わせは、全て、図1または2の波線をオリゴマーの配列に置換することによって視覚化され得る。図5は、コンジュゲート2aと、上に示されたSEQ ID NOとの組み合わせを示す。図5Aおよび5Bは、図5中の化合物の2種の詳細な例である。コンジュゲート部分（C）とオリゴマー（A）との間に、生物切断性リンカー（B）が存在してもよいし、または存在しなくてもよいことに注意すること。コンジュゲート1〜4および1a〜4aについて、GalNAcコンジュゲート自体が、GalNAcクラスタ内のペプチドリンカーを利用して生物切断性であり、従って、さらなる生物切断性リンカー（B）が、使用されてもよいしまたは使用されなくてもよい。しかしながら、予備データは、本明細書に開示された生物切断性リンカー（B）、例えば、ホスフェートヌクレオチドリンカーの包含が、そのようなGalNAcクラスタオリゴマーコンジュゲートの活性を増強し得ることを示している。図4は、ホスホジエステル連結によって連結された2個のDNAモノマーCおよびAから構成された生物切断性リンカー（B）を伴う、コンジュゲート5aと、上に示されたSEQ ID NOとの組み合わせを示す。コンジュゲート5およびコンジュゲート6を含む使用について、生物切断性リンカーの使用は、化合物の活性を大きく増強し、本明細書に開示された生物切断性リンカー（B）、例えば、ホスフェートヌクレオチドリンカーの包含が、推奨される。
【００６３】
「対応する」という用語は、オリゴマーのヌクレオチド配列（即ち、核酸塩基もしくは塩基配列）または連続ヌクレオチド配列（第1領域/領域A）と、核酸標的またはそれらの部分領域（例えば、SEQ ID NO 31、32 33、34、もしくは45）の逆相補鎖との間の比較をさす。ヌクレオチド類似体は、等価なまたは対応するヌクレオチドと直接比較される。好ましい態様において、オリゴマー（またはその第1領域）は、標的領域またはそれらの部分領域（例えば、SEQ ID NO 31、32、33、34、もしくは45）に相補的、例えば、完全に相補的である。
【００６４】
「逆相補鎖」、「逆相補的」、および「逆相補性」という用語は、本明細書において使用されるように、「相補鎖」、「相補的」、および「相補性」という用語と交換可能である。
【００６５】
「相補的」という用語は、各配列の3'末端が他方の配列の5'末端に結合するような逆平行方向で、一方の配列が他方の配列に結合することができ、一方の配列のA、T（U）、G、およびCが、各々、それぞれ、他方の配列のT（U）、A、C、およびGと整列する時、それらの2種の配列が相補的であることを意味する。通常、オリゴヌクレオチドの相補配列は、定義された配列との少なくとも90％、好ましくは、95％、最も好ましくは、100％の相補性を有する。
【００６６】
「対応するヌクレオチド類似体」および「対応するヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチド類似体および天然に存在するヌクレオチドのヌクレオチドが同一であることを示すものとする。例えば、ヌクレオチドの2-デオキシリボース単位がアデニンに連結されている時、「対応するヌクレオチド類似体」は、アデニンに連結された（2-デオキシリボースとは異なる）ペントース単位を含有している。
【００６７】
「核酸塩基」という用語は、ヌクレオチドの塩基部分をさし、天然に存在するバリアントおよび天然には存在しないバリアントの両方をカバーする。従って、「核酸塩基」は、公知のプリン複素環およびピリミジン複素環のみならず、それらの複素環式類似体および互変異性体もカバーする。領域BのDNAヌクレオシドまたはRNAヌクレオシドは、天然に存在する核酸塩基および／または天然には存在しない核酸塩基を有し得ることが認識されるであろう。
【００６８】
核酸塩基の例には、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチン、ヒポキサンチン、5-メチルシトシン、イソシトシン、プソイドイソシトシン、5-ブロモウラシル、5-プロピニルウラシル、6-アミノプリン、2-アミノプリン、イノシン、ジアミノプリン、および2-クロロ-6-アミノプリンが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、核酸塩基は、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、5-メチルシトシンからなる群より独立に選択され得る。いくつかの態様において、核酸塩基は、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、および5-メチルシトシンからなる群より独立に選択され得る。
【００６９】
いくつかの態様において、オリゴマーに存在する核酸塩基のうちの少なくとも1種は、5-メチルシトシン、イソシトシン、プソイドイソシトシン、5-ブロモウラシル、5-プロピニルウラシル、6-アミノプリン、2-アミノプリン、イノシン、ジアミノプリン、および2-クロロ-6-アミノプリンからなる群より選択される修飾型核酸塩基である。
【００７０】
標的
適当に、本発明のオリゴマーは、PCSK9遺伝子の発現を調節することができる。好ましくは、オリゴマーは、PCSK9遺伝子の発現をダウンレギュレートすることができる。これに関して、本発明のオリゴマーは、PCSK9の発現、典型的には、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞、例えば、肝細胞におけるPCSK9の発現に影響を与えることができる。いくつかの態様において、本発明のオリゴマーは標的核酸に結合し、発現に対する効果は、正常発現レベル（例えば、生理食塩水によって処置された動物細胞またはヒト細胞の発現レベル）と比較された少なくとも10％または20％の低下、より好ましくは、正常発現レベルと比較された少なくとも30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、または95％の阻害である。いくつかの態様において、そのようなモジュレーションは、本発明の化合物の0.04〜25nM、例えば、0.8〜20nMの濃度を使用した時に見られる。いくつかの態様において、そのようなモジュレーションは、本発明の化合物の0.01〜15mg/kg、例えば、0.05〜10mg/kg、例えば、0.1〜7.5mg/kg、例えば、0.25〜5mg/kg、例えば、0.5〜2.5mg/kgの濃度を使用した時に見られる。同一のまたは異なる態様において、発現の阻害は、100％未満、例えば、98％未満の阻害、95％未満の阻害、90％未満の阻害、80％未満の阻害、例えば、70％未満の阻害である。発現レベルのモジュレーションは、例えば、SDS-PAGE後の標的タンパク質に対する適当な抗体を使用したウエスタンブロッティングのような方法によって、タンパク質レベルを測定することによって決定され得る。あるいは、発現レベルのモジュレーションは、例えば、ノーザンブロッティングまたは定量的RT-PCRによって、mRNAのレベルを測定することによって決定され得る。mRNAレベルを介して測定する時、適切な投薬量、例えば、0.04〜25nM、例えば、0.8〜20nMの濃度を使用した時のダウンレギュレーションのレベルは、いくつかの態様において、典型的には、本発明の化合物の非存在下での正常レベルの10〜20％のレベルとなる。
【００７１】
従って、本発明は、細胞におけるPCSK9タンパク質および／またはmRNAの発現をダウンレギュレートするかまたは阻害するため、本発明によるオリゴマーまたはコンジュゲートをPCSK9タンパク質および／またはmRNAを発現している細胞へ投与する工程を含む、該細胞におけるPCSK9タンパク質および／またはmRNAの発現をダウンレギュレートするかまたは阻害する方法を提供する。適切には、細胞は、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞である。投与は、いくつかの態様において、インビトロで行われ得る。投与は、いくつかの態様において、インビボで行われ得る。
【００７２】
「標的核酸」という用語は、本明細書において使用されるように、哺乳動物PCSK9ポリペプチド、例えば、ヒトPCSK9をコードするDNAまたはRNA、例えば、NCBIアクセッション番号NM_174936 SEQ ID NO:46をさす。PCSK9をコードする核酸またはその天然に存在するバリアントおよびそれらに由来するRNA核酸は、好ましくは、mRNA、例えば、プレmRNA、好ましくは、成熟mRNAである。いくつかの態様において、例えば、研究または診断において使用される時、「標的核酸」は、上記のDNA核酸標的またはRNA核酸標的に由来するcDNAまたは合成オリゴヌクレオチドであり得る。本発明によるオリゴマーは、好ましくは、標的核酸にハイブリダイズすることができる。SEQ ID NO:46はcDNA配列であり、従って、成熟mRNA標的配列に対応するが、cDNA配列においては、ウラシルがチミジンに置換されていることが認識されるであろう。
【００７３】
「その天然に存在するバリアント」という用語は、定義された分類学的な群、例えば、哺乳動物、例えば、マウス、サル、好ましくは、ヒトに天然に存在する核酸配列のPCSK9ポリペプチドのバリアントをさす。典型的には、ポリヌクレオチドの「天然に存在するバリアント」に言及する時、その用語には、4番染色体、4 C7に見出されるPCSK9をコードするゲノムDNAの染色体転座または重複による対立遺伝子バリアント、およびそれらに由来するRNA、例えば、mRNAも包含され得る。「天然に存在するバリアント」には、PCSK9 mRNAのオルタナティブスプライシングに由来するバリアントも含まれ得る。従って、例えば、特定のポリペプチド配列を参照する時、その用語には、例えば、翻訳時修飾または翻訳後修飾、例えば、シグナルペプチド切断、タンパク質分解切断、グリコシル化等によるプロセシングを受けていてもよいタンパク質の天然に存在する形態も含まれる。
【００７４】
いくつかの態様において、オリゴマー（またはその連続ヌクレオチド部分）は、SEQ ID NO:28もしくは29もしくは44からなる群より選択される配列または少なくとも10連続ヌクレオチドのそれらの部分配列から選択されるかまたはそれらのうちの一つを含み、任意で、その配列と比較した時、1個、2個、または3個のミスマッチを含んでいてもよい。
【００７５】
いくつかの態様において、標的配列は、SEQ ID NO 31、32、33、34、もしくは45からなる群より選択される配列またはSEQ ID NO:33、34、もしくは45の少なくとも10連続ヌクレオチドの部分配列から選択されるか、それらのうちの一つを含むか、またはそれらのうちの一つからなる。
【００７６】
いくつかの態様において、部分配列は、11個、12個、13個、14個、15個、または16個の連続ヌクレオチド、例えば、12〜16個のヌクレオチドからなり得る。適宜、いくつかの態様において、部分配列は、（任意で、領域Bが標的に相補的でない時には、領域Bを除外した）本発明のオリゴマーの連続ヌクレオチド配列と同一の長さを有する。
【００７７】
しかしながら、いくつかの態様において、オリゴマーのヌクレオチド配列は、付加的な5'ヌクレオチドまたは3'ヌクレオチドを含んでいてもよく、例えば、独立に、標的配列に相補的でない1個、2個、3個、4個、5個、または6個の付加的なヌクレオチドを5'および／または3'に含んでいてもよいことが認識される。そのような非相補的なオリゴヌクレオチドは、領域Bを形成していてもよい。この点に関して、本発明のオリゴマーは、いくつかの態様において、付加的なヌクレオチドが5'およびまたは3'に隣接している連続ヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの態様において、付加的な5'ヌクレオチドまたは3'ヌクレオチドは、天然に存在するヌクレオチド、例えば、DNAまたはRNAである。いくつかの態様において、付加的な5'ヌクレオチドまたは3'ヌクレオチドは、本明細書においてギャップマーオリゴマーに関して言及されるような領域Dを表すことができる。
【００７８】
いくつかの態様において、本発明によるオリゴマーは、SEQ ID NO:27によるヌクレオチド配列または少なくとも10核酸塩基もしくは12核酸塩基のその部分配列からなるかまたはそれを含む。
【００７９】
いくつかの態様において、本発明によるオリゴマーは、SEQ ID NO:28によるヌクレオチド配列または少なくとも10核酸塩基もしくは12核酸塩基のその部分配列からなるかまたはそれを含む。好ましい態様において、本発明によるオリゴマーは、SEQ ID NO:5または6によるヌクレオチド配列からなるかまたはそれを含む。もう一つの好ましい態様において、本発明によるオリゴマーコンジュゲートは、SEQ ID NO:13または14または21または22によるヌクレオチド配列からなるかまたはそれを含む。
【００８０】
いくつかの態様において、本発明によるオリゴマーは、SEQ ID NO:29によるヌクレオチド配列または少なくとも10核酸塩基もしくは12核酸塩基のその部分配列からなるかまたはそれを含む。好ましい態様において、本発明によるオリゴマーは、SEQ ID NO:7または8によるヌクレオチド配列からなるかまたはそれを含む。もう一つの好ましい態様において、本発明によるオリゴマーコンジュゲートは、SEQ ID NO:15または16または23または24によるヌクレオチド配列からなるかまたはそれを含む。
【００８１】
いくつかの態様において、本発明によるオリゴマーは、SEQ ID NO:44によるヌクレオチド配列または少なくとも10核酸塩基もしくは12核酸塩基のその部分配列からなるかまたはそれを含む。好ましい態様において、本発明によるオリゴマーは、SEQ ID NO:40によるヌクレオチド配列からなるかまたはそれを含む。もう一つの好ましい態様において、本発明によるオリゴマーコンジュゲートは、SEQ ID NO:41、42、または43によるヌクレオチド配列からなるかまたはそれを含む。
【００８２】
いくつかの態様において、本発明によるオリゴマーは、SEQ ID NO:26によるヌクレオチド配列からなるかまたはそれを含む。好ましい態様において、本発明によるオリゴマーは、SEQ ID NO:2または3によるヌクレオチド配列からなるかまたはそれを含む。もう一つの好ましい態様において、本発明によるオリゴマーコンジュゲートは、SEQ ID NO:10または11または18または19によるヌクレオチド配列からなるかまたはそれを含む。
【００８３】
長さ
オリゴマーは、全部で10連、11連、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、または22連続ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなり得る。長さは、例えば、領域Aまたは領域AおよびBを含み得る。
【００８４】
いくつかの態様において、オリゴマーは、全部で10〜22連続ヌクレオチド長、例えば、12〜18連続ヌクレオチド長、例えば、13〜17連続ヌクレオチド長または12〜16連続ヌクレオチド長、例えば、13、14、15、16連続ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなる。好ましくは、領域Aのオリゴマーは、14連続ヌクレオチド長、より好ましくは、15連続ヌクレオチド長、最も好ましくは、16連続ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなる。
【００８５】
いくつかの態様において、本発明によるオリゴマーは、22個以下のヌクレオチド、例えば、20個以下のヌクレオチド、例えば、18個以下のヌクレオチド、例えば、15個、16個、または17個のヌクレオチドからなる。いくつかの態様において、本発明のオリゴマーは、20個未満のヌクレオチドを含む。
【００８６】
ヌクレオチド類似体
「ヌクレオチド」という用語は、本明細書において使用されるように、糖部分と、塩基部分と、共有結合で連結された基、例えば、ホスフェート型またはホスホロチオエート型のヌクレオチド間連結基とを含む配糖体をさし、天然に存在するヌクレオチド、例えば、DNAまたはRNA、ならびに、本明細書において「ヌクレオチド類似体」とも呼ばれる、修飾型の糖および／または塩基部分を含む天然には存在しないヌクレオチドの両方をカバーする。本明細書において、単一のヌクレオチド（単位）を、モノマーまたは核酸単位と呼ぶ場合もある。
【００８７】
生化学の領域において、「ヌクレオシド」という用語は、糖部分と塩基部分とを含む配糖体をさすために一般的に使用される。2個のヌクレオシドの間の共有結合性の連結は、ヌクレオシド間連結と呼ばれ得る。あるいは、ヌクレオチド間連結という用語は、オリゴマーのヌクレオチドの間の連結を特徴決定するために使用され得る。
【００８８】
オリゴヌクレオチドの5'ヌクレオチドは、5'ヌクレオチド間連結基を含まないが、リンカー（BまたはYまたはコンジュゲート部分）をコンジュゲートするために適当な5'末端基、例えば、ホスホジエステルまたはホスホロチオエートを含んでいてもよいしまたは含んでいなくてもよいことを、当業者は認識するであろう。
【００８９】
天然には存在しないヌクレオチドには、修飾型糖部分を有するヌクレオチド、例えば、二環式ヌクレオチド、または2'修飾型ヌクレオチド、例えば、2'置換型ヌクレオチドが含まれる。
【００９０】
「ヌクレオチド類似体」とは、糖および／または塩基部分の修飾による、天然ヌクレオチド、例えば、DNAヌクレオチドまたはRNAヌクレオチドのバリアントである。類似体は、原則として、「サイレント」であるに過ぎないか、またはオリゴヌクレオチドに関して、天然ヌクレオチドと「等価」であり、即ち、標的遺伝子発現を阻害するためにオリゴヌクレオチドが機能する方式に対して機能的な効果を及ぼさないものであり得る。しかしながら、そのような「等価な」類似体は、例えば、製造がより容易であるかもしくはより安価であるか、または保管もしくは製造の条件に対してより安定しているか、またはタグもしくは標識を表す場合、有用であり得る。しかしながら、好ましくは、類似体は、例えば、標的に対する結合親和性を増加させ（親和性増強）、かつ／または細胞内ヌクレアーゼに対する抵抗性を増加させ、かつ／または細胞への輸送の容易さを増加させることによって、発現を阻害するためにオリゴマーが機能する方式に対して機能的な効果を及ぼすであろう。ヌクレオシド類似体の具体例は、例えば、Freier & Altmann;Nucl.Acid Res.,1997,25,4429-4443およびUhlmann;Curr.Opinion in Drug Development,2000,3(2),293-213によって記載されており、スキーム1に記載される。
2018064575.tif 000005
【００９１】
従って、オリゴマーは、天然に存在するヌクレオチド、好ましくは、（本明細書において「DNA」と一般に呼ばれる）2'-デオキシヌクレオチドの単純な配列を含むかまたはそれからなっていてよいが、（本明細書において「RNA」と一般に呼ばれる）リボヌクレオチド、またはそのような天然に存在するヌクレオチドと1個以上の天然には存在しないヌクレオチド、即ち、ヌクレオチド類似体との組み合わせを含むかまたはそれからなることも可能である。そのようなヌクレオチド類似体は、適当に、標的配列に対するオリゴマーの親和性を増強し得る。適当な好ましいヌクレオチド類似体の例は、WO2007/031091によって提供されるか、またはその中で参照されている。
【００９２】
親和性増強ヌクレオチド類似体、例えば、LNAまたは2'置換型糖のオリゴマーへの組み入れは、特異的に結合するオリゴマーのサイズの低下を可能にすることができ、非特異的なまたは異常な結合が起こる前のオリゴマーのサイズへ上限を低下させることもできる。
【００９３】
いくつかの態様において、オリゴマーは、少なくとも2個のヌクレオチド類似体を含む。いくつかの態様において、オリゴマーは、3〜8個のヌクレオチド類似体、例えば、6個または7個のヌクレオチド類似体を含む。
【００９４】
ヌクレオチド類似体の例には、2'-置換基を提供するか、または結合親和性を増強し、増加したヌクレアーゼ抵抗性も提供し得る二環構造を作製するための糖部分の修飾が含まれる。
【００９５】
いくつかの態様において、本発明のアンチセンスオリゴマー（例えば、「ギャップマー設計」というセクションにおいて言及される領域X'およびY'）内に存在するヌクレオチド類似体は、例えば、2'-O-アルキル-RNA単位、2'-OMe-RNA単位、2'-O-アルキル-DNA単位、2'-アミノ-DNA単位、2'-フルオロ-DNA単位、LNA単位、アラビノ核酸（ANA）単位、2'-フルオロ-ANA単位、HNA単位、INA単位（インターカレーティング核酸 − 参照によって本明細書に組み入れられるChristensen,2002.Nucl.Acids.Res.2002 30:4918-4925）、および2'MOE単位より独立に選択される。
【００９６】
いくつかの態様において、ヌクレオチド類似体は、2'-O-メトキシエチル-RNA（2'MOE）、2'-フルオロ-DNAモノマー、またはLNAヌクレオチド類似体であり、従って、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、これらの三つの種類の類似体より独立に選択されるヌクレオチド類似体を含んでいてもよいし、または三つの種類より選択される一つの種類の類似体のみを含んでいてもよい。いくつかの態様において、ヌクレオチド類似体のうちの少なくとも1個は、2'-MOE-RNAであり、例えば、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、または10個が、2'-MOE-RNAヌクレオチド単位である。いくつかの態様において、ヌクレオチド類似体のうちの少なくとも1個は、2'-フルオロDNAであり、例えば、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、または10個が、2'-フルオロ-DNAヌクレオチド単位である。
【００９７】
好ましいヌクレオチド類似体は、LNA、例えば、オキシ-LNA（例えば、β-D-オキシ-LNAおよびα-L-オキシ-LNA）ならびに／またはアミノ-LNA（例えば、β-D-アミノ-LNAおよびα-L-アミノ-LNA）ならびに／またはチオ-LNA（例えば、β-D-チオ-LNAおよびα-L-チオ-LNA）ならびに／またはENA（例えば、β-D-ENAおよびα-L-ENA）である。最も好ましいのは、β-D-オキシ-LNAである。
【００９８】
いくつかの態様において、ヌクレオチド類似体の上記の種類のうちの一つのみが、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列に存在する。
【００９９】
いくつかの態様において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも1個のロックド核酸（LNA）単位、例えば、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、または8個のLNA単位、例えば、3〜7個または4〜8個のLNA単位を含む。最も好ましい態様においてヌクレオチド類似体のうちの少なくとも1個がロックド核酸（LNA）であり；例えば、ヌクレオチド類似体のうちの少なくとも3個または少なくとも4個または少なくとも5個または少なくとも6個または少なくとも7個または8個がLNAであり得る。いくつかの態様において、全てのヌクレオチド類似体がLNAであり得る。
【０１００】
いくつかの態様において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド類似体（好ましくは、LNA）およびDNA単位の両方を含み得る。好ましくは、ヌクレオチド類似体（好ましくは、LNA）およびDNA単位の合計は、10〜25、例えば、10〜24、好ましくは、10〜20、例えば、10〜18、さらに好ましくは、12〜16である。いくつかの態様において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列、例えば、連続ヌクレオチド配列は、少なくとも1個のヌクレオチド類似体（好ましくは、LNA）からなり、残りのヌクレオチド単位はDNA単位である。いくつかの態様において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、LNAヌクレオチド類似体、および天然に存在するヌクレオチド（例えば、RNAヌクレオチドまたはDNAヌクレオチド、最も好ましくは、DNAヌクレオチド）のみを、任意で、修飾型ヌクレオチド間連結、例えば、ホスホロチオエートと共に含む。
【０１０１】
ヌクレオチドのみからなる好ましいヌクレオチド配列モチーフまたはヌクレオチド配列に言及する場合、その配列によって定義される本発明のオリゴマーは、該配列に存在するヌクレオチドのうちの1個以上の代わりに、対応するヌクレオチド類似体、例えば、オリゴマー／標的二重鎖の二重鎖安定性／Tmを上昇させるLNA単位またはその他のヌクレオチド類似体（即ち、親和性増強ヌクレオチド類似体）を含んでいてもよいことが認識されるであろう。
【０１０２】
Tmアッセイ：
オリゴヌクレオチド：
オリゴヌクレオチドとRNA標的（PO）との二重鎖を、500mlのRNase不含水で3mMに希釈し、500mlの2×Tm緩衝液（200mM NaCl、0.2mM EDTA、20mMリン酸Na、pH7.0）と混合する。その溶液を3分間95℃に加熱し、次いで、30分間室温でアニールさせる。二重鎖融解温度（Tm）を、PE Templabソフトウェア（Perkin Elmer）を使用して、Peltier温度プログラマPTP6が装備されたLambda 40 UV/VIS分光光度計で測定する。温度を20℃から95℃まで上昇させ、次いで、25℃まで降下させ、260nmでの吸光を記録する。融解およびアニーリングの両方の一次導関数および極大を、二重鎖Tmを査定するために使用する。
【０１０３】
いくつかの態様において、オリゴマーのヌクレオチド配列と標的配列との間のミスマッチは、好ましくは、親和性増強ヌクレオチド類似体の外側の領域、例えば、「ギャップマー設計」というセクションにおいて言及される領域Y'、および／またはオリゴヌクレオチド内の非修飾ヌクレオチド、例えば、DNAヌクレオチドを含む位置、および／または連続ヌクレオチド配列の5'もしくは3'の領域に見出される。
【０１０４】
LNA
「LNA」という用語は、リボース環の2'位と4'位との間にブリッジを含む二環式ヌクレオシド類似体（2'-4'二環式ヌクレオシド類似体）をさし、「ロックド核酸」として公知である。LNAは、文献中、BNA（ブリッジド（bridged）核酸または二環式核酸）と呼ばれる場合もあり、これらの二つの用語は交換可能に使用され得る。LNAという用語は、LNAモノマーをさす場合もあるし、または「LNAオリゴヌクレオチド」に関して使用された場合、LNAとは、1個以上のそのような二環式ヌクレオチド類似体を含有しているオリゴヌクレオチドをさす。いくつかの局面において、二環式ヌクレオシド類似体は、LNAヌクレオチドであり、従って、これらの用語は、交換可能に使用され得、そのような態様において、いずれも、リボース糖環のC2'とC4'との間のリンカー基（例えば、ブリッジ）の存在を特徴とする。
【０１０５】
いくつかの態様において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、β-D-オキシ-LNAと、以下のLNA単位のうちの1種以上との両方を含み得る：β-D配置もしくはα-L配置のいずれかまたはそれらの組み合わせにあるチオ-LNA、アミノ-LNA、オキシ-LNA、5'-メチル-LNA、および／またはENA。いくつかの態様において、全てのLNAシトシン単位が、5'-メチル-シトシンである。いくつかの態様において、第1領域（X'）に存在する少なくとも1個のヌクレオシド類似体が、二環式ヌクレオチド類似体であり、例えば、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個（領域Y'のDNAヌクレオシドおよびまたはRNAヌクレオシドを除く）が、糖修飾型ヌクレオシド類似体、例えば、二環式ヌクレオシド類似体、例えば、LNA、例えば、β-D-X-LNAもしくはα-L-X-LNA（Xはオキシ、アミノ、もしくはチオである）または本明細書に開示されたその他のLNA、例えば、以下に限定されないが、(R/S)cET、cMOE、もしくは5'-Me-LNAである。
【０１０６】
いくつかの態様において、本発明のオリゴヌクレオチド化合物において使用されるLNAは、好ましくは、一般式IIの構造を有する：
2018064575.tif 000006
式中、Yは、-O-、-CH2O-、-S-、-NH-、N(Re)、および／または-CH2-からなる群より選択され；
ZおよびZ*は、ヌクレオチド間連結、RH、末端基、または保護基の中から独立に選択され；Bは、天然または非天然のヌクレオチド塩基部分（核酸塩基）を構成し、RHは、水素およびC1-4-アルキルより選択され；Ra、Rb、Rc、Rd、およびReは、任意で独立に、水素、置換されていてもよいC1-12-アルキル、置換されていてもよいC2-12-アルケニル、置換されていてもよいC2-12-アルキニル、ヒドロキシ、C1-12-アルコキシ、C2-12-アルコキシアルキル、C2-12-アルケニルオキシ、カルボキシ、C1-12-アルコキシカルボニル、C1-12-アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ-カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ-カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノ-およびジ(C1-6-アルキル)アミノ、カルバモイル、モノ-およびジ(C1-6-アルキル)-アミノ-カルボニル、アミノ-C1-6-アルキル-アミノカルボニル、モノ-およびジ(C1-6-アルキル)アミノ-C1-6-アルキル-アミノカルボニル、C1-6-アルキル-カルボニルアミノ、カルバミド、C1-6-アルカノイルオキシ、スルホノ（sulphono）、C1-6-アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、C1-6-アルキルチオ、ハロゲン、DNAインターカレーター、光化学的活性を有する基、熱化学的活性を有する基、キレート基、レポーター基、ならびにリガンドからなる群より選択され、ここで、アリールおよびヘテロアリールは、置換されていてもよく、2個のジェミナル置換基RaおよびRbは、共に、置換されていてもよいメチレン（=CH2）を表し得；RHは、水素およびC1-4-アルキルより選択される。いくつかの態様において、Ra、Rb、Rc、Rd、およびReは、任意で独立に、水素およびC1-6アルキル、例えば、メチルからなる群より選択される。全ての不斉中心について、非対称基はR方向またはS方向のいずれかで見出され得、例えば、2種の例示的な立体化学的異性体には、以下のように図示され得るβ-Dアイソフォームおよびα-Lアイソフォームが含まれる。
2018064575.tif 000007
【０１０７】
具体的な例示的なLNA単位は以下に示される。
2018064575.tif 000008
【０１０８】
「チオ-LNA」という用語には、上記一般式中のYがSまたは-CH2-S-より選択される、ロックドヌクレオチドが含まれる。チオ-LNAは、β-D配置およびα-L配置の両方であり得る。
【０１０９】
「アミノ-LNA」という用語には、上記一般式中のYが-N(H)-、N(R)-、CH2-N(H)-、および-CH2-N(R)-（式中、Rは水素およびC1-4-アルキルより選択される）より選択される、ロックドヌクレオチドが含まれる。アミノ-LNAは、β-D配置およびα-L配置の両方であり得る。
【０１１０】
「オキシ-LNA」という用語には、上記一般式中のYが-O-を表す、ロックドヌクレオチドが含まれる。オキシ-LNAは、β-D配置およびα-L配置の両方であり得る。
【０１１１】
「ENA」という用語には、上記一般式中のYが-CH2-O-（式中、-CH2-O-の酸素原子は塩基Bに対して2'位に付着している）である、ロックドヌクレオチドが含まれる。Reは水素またはメチルである。
【０１１２】
いくつかの例示的な態様において、LNAは、β-D-オキシ-LNA、α-L-オキシ-LNA、β-D-アミノ-LNA、およびβ-D-チオ-LNAより選択され、具体的には、β-D-オキシ-LNAである。
【０１１３】
本明細書において使用される、「二環式ヌクレオシド」とは、二環式糖部分を含む修飾型ヌクレオシドをさす。二環式ヌクレオシドの例には、非限定的に、4'リボシル環原子と2'リボシル環原子との間に架橋を含むヌクレオシドが含まれる。いくつかの態様において、本明細書に提供される化合物には、架橋が4'〜2'二環式ヌクレオシドを含む、1種以上の二環式ヌクレオシドが含まれる。そのような4'〜2'二環式ヌクレオシドの例には、次の式のうちのいずれかが含まれるが、これらに限定されない：4'-(CH2)-O-2'（LNA）；4'-(CH2)-S-2'；4'-(CH2)2-O-2'（ENA）；4'-CH(CH3)-O-2'、および4'-CH(CH2OCH3)-O-2*、ならびにそれらの類似体（2008年7月15日に発行された米国特許第7,399,845号を参照）；4'-C(CH3)(CH3)-O-2'およびその類似体（2009年1月8日に公開された公開されたPCT国際出願WO2009/006478を参照）；4'-CH2-N(OCH3)-2'およびその類似体（2008年12月11日に公開された、公開されたPCT国際出願WO2008/150729を参照）；4'-CH2-O-N(CH3)-2'（2004年9月2日に公開された、公開された米国特許出願US2004/0171570を参照）；4'-CH2-N(R)-O-2'［Rは、H、C1-C10アルキル、または保護基である］（2008年9月23日に発行された米国特許第7,427,672号を参照）；4'-CH2-C(H)(CH3)-2'（Chattopadhyaya,et al,J.Org.Chem.,2009,74,118-134を参照）；ならびに4'-CH2-C(=CH2)-2'およびその類似体（2008年12月8日に公開された、公開されたPCT国際出願WO2008/154401を参照）。例えば、Singh et al.,Chem.Commun.,1998,4,455-456；Koshkin et al.,Tetrahedron,1998,54,3607-3630；Wahlestedt et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2000,97,5633-5638；Kumar et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.,1998,8,2219-2222；Singh et al.,J.Org.Chem.,1998,63,10035-10039；Srivastava et al.,J.Am.Chem.Soc,129(26)8362-8379(Jul.4,2007)；Elayadi et al.,Curr.Opinion Invens.Drugs,2001,2,558-561；Braasch et al.,Chem.Biol,2001,8,1-7；Oram et al,Curr.Opinion Mol.Ther.,2001,3,239-243；米国特許第6,670,461号、第7,053,207号、第6,268,490号、第6,770,748号、第6,794,499号、第7,034,133号、第6,525,191号、第7,399,845号；公開されたPCT国際出願WO2004/106356、WO94/14226、WO2005/021570、およびWO2007/134181；米国特許公開番号US2004/0171570、US2007/0287831、およびUS2008/0039618；ならびに米国特許出願番号12/129,154、60/989,574、61/026,995、61/026,998、61/056,564、61/086,231、61/097,787、および61/099,844；ならびにPCT国際出願番号PCT/US2008/064591、PCT/US2008/066154、およびPCT/US2008/068922も参照。上記二環式ヌクレオシドの各々は、1種以上の立体化学的糖配置、例えば、a-L-リボフラノースおよびβ-D-リボフラノースを有して、調製され得る（1999年3月25日にWO99/14226として公開されたPCT国際出願PCT DK98/00393を参照）。
【０１１４】
いくつかの態様において、LNAヌクレオシドの二環式糖部分には、ペントフラノシル糖部分の4'位と2'位との間に少なくとも1個の架橋を有する化合物が含まれるが、これらに限定されない。そのような架橋は、独立に、-[CiRaXRb)],,-、-C(Ra)=C(Rb)-、-C(Ra)=N-、-C(=NRa)-、-C(=O)-、-C(=S)-、-O-、-Si(Ra)2-、-S(=O)x-、および-N(Ra)-［式中、xは、0、1、または2であり；nは、1、2、3、または4であり；RaおよびRbは、各々独立に、H、保護基、ヒドロキシル、C1-C12アルキル、置換型C1-C12アルキル、C2-Ci2アルケニル、置換型C2-C12アルケニル、C2-Ci2アルキニル、置換型C2-C12アルキニル、C5-C20アリール、置換型C5-C20アリール、複素環ラジカル、置換型複素環ラジカル、ヘテロアリール、置換型ヘテロアリール、C5-C7脂環式ラジカル、置換型C5-C7脂環式ラジカル、ハロゲン、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、COOJ1、アシル（C(=O)-H）、置換型アシル、CN、スルホニル（S(=O)2-J1）、またはスルホキシル（S(=O)-J1）であり；J1およびJ2は、各々独立に、H、C1-C6アルキル、置換型C1-C12アルキル、C2-C12アルケニル、置換型C2-C12アルケニル、C2-C12アルキニル、置換型C2-C12アルキニル、C5-C20アリール、置換型C5-C20アリール、アシル（C(=O)-H）、置換型アシル、複素環ラジカル、置換型複素環ラジカル、C1-C12アミノアルキル、置換型C1-C12アミノアルキル、または保護基である］より独立に選択される1個または2〜4個の連結された基を含む。
【０１１５】
いくつかの態様において、二環式糖部分の架橋は、-[C(Ra)(Rb)]n-、-[C(Ra)(Rb)]n-O-、-C(RaRb)-N(R)-O-、または-C(RaRb)-O-N(R)-である。いくつかの態様において、架橋は、4'-CH2-2'、4'-(CH2)2-2'、4'-(CH2)3-2'、4'-CH2-O-2'、4*-(CH2)2-O-2'、4'-CH2-O-N(R)-2'、および4'-CH2-N(R)-O-2'-［式中、Rは、各々独立に、H、保護基、またはC1-C12アルキルである］である。
【０１１６】
いくつかの態様において、二環式ヌクレオシドは、異性体配置によってさらに定義される。例えば、4'-2'メチレン-オキシ架橋を含むヌクレオシドは、a-L配置またはβ-D配置にあり得る。以前に、アンチセンス活性を示したアンチセンスオリゴヌクレオチドへ、a-L-メチレンオキシ（4'-CH2-O-2'）BNAが組み入れられた（Frieden et al,Nucleic Acids Research,2003,21,6365-6372）。
【０１１７】
いくつかの態様において、二環式ヌクレオシドには、以下に図示されるような、（A）a-L-メチレンオキシ（4'-CH2-O-2'）BNA、（B）β-D-メチレンオキシ（4'-CH2-O-2'）BNA、（C）エチレンオキシ（4'-(CH2)2-O-2'）BNA、（D）アミノオキシ（4'-CH2-O-N(R)-2'）BNA、（E）オキシアミノ（4'-CH2-N(R)-O-2'）BNA、（F）メチル(メチレンオキシ)（4'-CH(CH3)-O-2'）BNA、（G）メチレン-チオ（4'-CH2-S-2'）BNA、（H）メチレン-アミノ（4'-CH2-N(R)-2'）BNA、（I）メチル炭素環式（4'-CH2-CH(CH3)-2'）BNA、および（J）プロピレン炭素環式（4'-(CH2)3-2'）BNAが含まれるが、これらに限定されない。
2018064575.tif 000009
式中、Bxは、塩基部分であり、Rは、独立に、H、保護基、またはC1-C2アルキルである。
【０１１８】
いくつかの態様において、二環式ヌクレオシドは、式Iにより定義される：
2018064575.tif 000010
式中、Bxは、複素環式塩基部分であり；
-Qa-Qb-Qc-は、-CH2-N(Rc)-CH2-、-C(=O)-N(Rc)-CH2-、-CH2-O-N(Rc)-、-CH2-N(Rc)-O-、または-N(Rc)-O-CH2であり；
Rcは、C1-C12アルキルまたはアミノ保護基であり；かつ
TaおよびTbは、各々独立に、H、ヒドロキシル保護基、コンジュゲート基、反応性リン基、リン部分、または支持媒体への共有結合性の付着である。
【０１１９】
いくつかの態様において、二環式ヌクレオシドは、式IIにより定義される：
2018064575.tif 000011
式中、Bxは、複素環式塩基部分であり；
TaおよびTbは、各々独立に、H、ヒドロキシル保護基、コンジュゲート基、反応性リン基、リン部分、または支持媒体への共有結合性の付着であり；Zaは、C1-C6アルキル、C2-C6アルケニル、C2-C6アルキニル、置換型C1-C6アルキル、置換型C2-C6アルケニル、置換型C2-C6アルキニル、アシル、置換型アシル、置換型アミド、チオール、または置換型チオである。
【０１２０】
いくつかの態様において、置換型の基は、各々独立に、ハロゲン、オキソ、ヒドロキシル、OJc、NJd、SJc、N3、OC(=X)Jc、およびNJeC(=X)NJcJdより独立に選択される置換基によって一置換または多置換されている。Jc、Jd、およびJeは、各々独立に、H、C1-C6アルキル、または置換型C1-C6アルキルであり、Xは、OまたはNJCである。
【０１２１】
いくつかの態様において、二環式ヌクレオシドは、式IIIにより定義される：
2018064575.tif 000012
式中、Bxは、複素環式塩基部分であり；
TaおよびTbは、各々独立に、H、ヒドロキシル保護基、コンジュゲート基、反応性リン基、リン部分、または支持媒体への共有結合性の付着であり；
Rdは、C1-C6アルキル、C2-C6アルケニル、C2-C6アルキニル、置換型C1-C6アルキル、置換型C2-C6アルケニル、置換型C2-C6アルキニル、または置換型アシル（C(=O)-）である。
【０１２２】
いくつかの態様において、二環式ヌクレオシドは、式IVにより定義される：
2018064575.tif 000013
式中、Bxは、複素環式塩基部分であり；
TaおよびTbは、各々独立に、H、ヒドロキシル保護基、コンジュゲート基、反応性リン基、リン部分、または支持媒体への共有結合性の付着であり；
Rdは、C1-C6アルキル、置換型C1-C6アルキル、C2-C6アルケニル、置換型C2-C6アルケニル、C2-C6アルキニル、置換型C2-C6アルキニルであり；qb、qc、およびqdは、各々独立に、H、ハロゲン、C1-C6アルキル、置換型C1-C6アルキル、C2-Ceアルケニル、置換型C2-C6アルケニル、C2-C6アルキニル、または置換型C2-C6アルキニル、C1-C6アルコキシル、置換型Q-C6アルコキシル、アシル、置換型アシル、C1-C6アミノアルキル、または置換型C1-C6アミノアルキルである。
【０１２３】
いくつかの態様において、二環式ヌクレオシドは、式Vにより定義される：
2018064575.tif 000014
式中、Bxは、複素環式塩基部分であり；
TaおよびTbは、各々独立に、H、ヒドロキシル保護基、コンジュゲート基、反応性リン基、リン部分、または支持媒体への共有結合性の付着であり；qa、qb、qc、およびqfは、各々独立に、水素、ハロゲン、C1-C12アルキル、置換型C1-C12アルキル、C2-C12アルケニル、置換型C2-C12アルケニル、C2-C12アルキニル、置換型C2-C12アルキニル、C1-C12アルコキシ、置換型C1-C12アルコキシ、OJj、SJj、SOJj、SO2Jj、NJjJk、N3、CN、C(=O)OJj、C(=O)NJjJk、C(=O)Jj、O-C(=O)NJjJk、N(H)C(=NH)NJjJk、N(H)C(=O)NJjJk、もしくはN(H)C(=S)NJjJkであるか；またはqeおよびqfは、共に、=C(qg)(qh)であり；qgおよびqhは、各々独立に、H、ハロゲン、C1-C12アルキル、または置換型C1-C12アルキルである。
【０１２４】
メチレンオキシ（4'-CH2-O-2'）BNAモノマー、アデニン、シトシン、グアニン、5-メチル-シトシン、チミン、およびウラシルの合成および調製は、それらのオリゴマー化および核酸認識特性と共に記載されている（例えば、Koshkin et al.,Tetrahedron,1998,54,3607-3630を参照）。BNAおよびその調製は、WO98/39352およびWO99/4226にも記載されている。
【０１２５】
メチレンオキシ（4'-CH2-O-2'）BNA、メチレンオキシ（4'-CH2-O-2'）BNA、および2'-チオ-BNAの類似体も、調製されている（例えば、Kumar et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.,1998,8,2219-2222を参照）。核酸ポリメラーゼの基質としてのロックドヌクレオシド類似体を含むオリゴデオキシリボヌクレオチド二重鎖の調製も記載されている（例えば、Wengel et al.,WO99/14226を参照）。さらに、新規の立体構造的に制限された高親和性オリゴヌクレオチド類似体である2'-アミノ-BNAの合成が、当技術分野において記載されている（例えば、Singh et al.,J.Org.Chem.,1998,63,10035-10039を参照）。さらに、2'-アミノ-BNAおよび2'-メチルアミノ-BNAが調製されており、相補的なRNA鎖およびDNA鎖とのそれらの二重鎖の熱安定性が以前に報告されている。
【０１２６】
いくつかの態様において、二環式ヌクレオシドは、式VIにより定義される：
2018064575.tif 000015
式中、Bxは、複素環式塩基部分であり；
TaおよびTbは、各々独立に、H、ヒドロキシル保護基、コンジュゲート基、反応性リン基、リン部分、または支持媒体へ共有結合性の付着であり；qj、qj、qk、およびqlは、各々独立に、H、ハロゲン、C1-C12アルキル、置換型C1-C12アルキル、C2-C12アルケニル、置換型C2-C12アルケニル、C2-C12アルキニル、置換型C2-C12アルキニル、C1-C12アルコキシル、置換型C2-C12アルコキシル、OJj、SJj、SOJj、SO2Jj、NJjJk、N3、CN、C(=O)OJj、C(=O)NJjJk、C(=O)Jj、O-C(=O)NJjJk、N(H)C(=NH)NJjJk、N(H)C(=O)NJjJk、または(H)C(=S)NJjJkであり；かつqiおよびqjまたはqlおよびqkは、共に、=C(qg)(qh)［式中、qgおよびqhは、各々独立に、H、ハロゲン、C1-C12アルキル、または置換型C1-C6アルキルである］である。
【０１２７】
4'-(CH2)3-2'架橋およびアルケニル類似体、架橋4'-CH=CH-CH2-2'を有する炭素環式二環式ヌクレオシドが、記載されている（例えば、Freier et al,Nucleic Acids Research,1997,25(22),4429-4443およびAlbaek et al,J.Org.Chem.,2006,71,7731-77'40を参照）。炭素環式二環式ヌクレオシドの合成および調製も、それらのオリゴマー化および生化学的研究と共に記載されている（例えば、Srivastava et al,J.Am.Chem.Soc.2007,129(26),8362-8379を参照）。
【０１２８】
本明細書において使用される、「4'〜2'（4'-2'）二環式ヌクレオシド」または「4'〜2'（4' to 2'）二環式ヌクレオシド」とは、2'炭素原子と4'炭素原子とを接続する架橋を含むフラノース環を含む二環式ヌクレオシドをさす。
【０１２９】
本明細書において使用される、「単環式ヌクレオシド」とは、二環式糖部分でない修飾型糖部分を含むヌクレオシドをさす。いくつかの態様において、ヌクレオシドの糖部分または糖部分類似体は、任意の位置で修飾または置換されていてよい。
【０１３０】
本明細書において使用される、「2'修飾型糖」とは、2'位において修飾されたフラノシル糖を意味する。いくつかの態様において、そのような修飾には、以下のものより選択される置換基が含まれる：ハロゲン化物、例えば、以下に限定されないが、置換型および非置換型のアルコキシ、置換型および非置換型のチオアルキル、置換型および非置換型のアミノアルキル、置換型および非置換型のアルキル、置換型および非置換型のアリル、ならびに置換型および非置換型のアルキニル。いくつかの態様において、2'修飾は、O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2),,NH2、O(CH2),,CH3、O(CH2),,ONH2、OCH2C(=O)N(H)CH3、およびO(CH2)nON[(CH2)nCH3]2（式中、nおよびmは、1〜約10である）を含むが、これらに限定されない置換基より選択される。その他の2'置換基も、以下のものより選択され得る：C1-C12アルキル；置換型アルキル；アルケニル；アルキニル；アルカリル；アラルキル；O-アルカリルまたはO-アラルキル；SH；SCH3；OCN；Cl；Br；CN；CF3；OCF3；SOCH3；SO2CH3；ONO2；NO2；N3；NH2；ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリル；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ；置換型シリル；R；切断基；レポーター基；インターカレーター；薬物動態学的特性を改善するための基；およびアンチセンス化合物の薬力学的特性を改善するための基、ならびに類似の特性を有するその他の置換基。いくつかの態様において、修飾型ヌクレオシドは、2'-MOE側鎖を含む（例えば、Baker et al.,J.Biol.Chem.,1997,272,1 1944-12000を参照）。そのような2'-MOE置換は、未修飾ヌクレオシド、ならびに2'-O-メチル、O-プロピル、およびO-アミノプロピルのようなその他の修飾型ヌクレオシドと比較して改善された結合親和性を有することが記載されている。2-MOE置換基を有するオリゴヌクレオチドは、インビボで使用するための有望な特色を有する遺伝子発現のアンチセンス阻害剤であることも示されている（例えば、Martin,P.,He/v.Chim.Acta,1995,78,486-504；Altmann et al.,Chimia,1996,50,168-176；Altmann et al.,Biochem.Soc.Trans.,1996,24,630-637；およびAltmann et al.,Nucleosides Nucleotides,1997,16,917-926を参照）。
【０１３１】
本明細書において使用される、「修飾型テトラヒドロピランヌクレオシド」または「修飾型THPヌクレオシド」とは、通常のヌクレオシドにおけるペントフラノシル残基が6員テトラヒドロピラン「糖」（糖代替物）に置換されているヌクレオシドを意味する。修飾された?THPヌクレオシドには、ヘキシトール核酸（HNA）、アニトール核酸（ANA）、マニトール（manitol）核酸（MNA）（Leumann,CJ.Bioorg.and Med.Chem.(2002)10:841-854を参照）、フルオロHNA（F-HNA）と当技術分野において呼ばれているもの、または式Xにより定義される化合物が含まれるが、これらに限定されない：
式X
2018064575.tif 000016
式中、式Xの少なくとも1つの前記テトラヒドロピランヌクレオシド類似体のそれぞれについて独立に、
Bxは、複素環式塩基部分であり；
T3およびT4は、各々独立に、テトラヒドロピランヌクレオシド類似体をアンチセンス化合物と連結しているヌクレオシド間連結基であるか、またはT3およびT4の一方が、テトラヒドロピランヌクレオシド類似体をアンチセンス化合物と連結しているヌクレオシド間連結基であり、かつT3およびT4の他方が、H、ヒドロキシル保護基、連結されたコンジュゲート基、または5'末端もしくは3'末端の基であり；q1、q2、q3、q4、q5、q6、およびq7は、各々独立に、H、C1-C6アルキル、置換型C1-C6アルキル、C2-C6アルケニル、置換型C2-C6アルケニル、C2-C6アルキニル、または置換型C2-C6アルキニルであり；かつR1およびR2の一方は、水素であり、かつ他方は、ハロゲン、置換型または非置換型のアルコキシ、NJ、J2、SJ、N3、OC(=X)J1、OC(=X)NJ1J2、NJ3C(=X)NJ1J2、およびCN［式中、Xは、O、S、またはNJ1であり、J1、J2、およびJ3は、各々独立に、HまたはC1-C6アルキルである］より選択される。
【０１３２】
いくつかの態様において、qm、qn、qp、qr、qs、qt、およびquが各々Hである、式Xの修飾型THPヌクレオシドが提供される。いくつかの態様において、qm、qn、qp、qr、qs、qt、およびquのうちの少なくとも1個は、H以外である。いくつかの態様において、qm、qn、qp、qr、qs、qt、およびquのうちの少なくとも1個は、メチルである。いくつかの態様において、R1およびR2のうちの一方がFである、式XのTHPヌクレオシドが提供される。いくつかの態様において、R1がフルオロであり、かつR2がHであり、R1がメトキシであり、かつR2がHであり、R1がメトキシエトキシであり、かつR2がHである。
【０１３３】
本明細書において使用される、「2'修飾型」または「2'置換型」とは、HまたはOH以外の置換基を2'位に含む糖を含むヌクレオシドをさす。2'修飾型ヌクレオシドには、非架橋2'置換基、例えば、アリル、アミノ、アジド、チオ、O-アリルおよびO-C1-C10アルキル、-OCF3、O-(CH2)2-O-CH3、2'-O(CH2)2SCH3、O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)、またはO-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn)［式中、RmおよびR,,は、各々独立に、Hまたは置換型もしくは非置換型のC1-C10アルキルである］を有するヌクレオシドが含まれるが、これらに限定されない。2'修飾型ヌクレオシドは、例えば、糖の他の位置および／または核酸塩基に、他の修飾をさらに含んでいてもよい。
【０１３４】
本明細書において使用される、「2'-F」とは2'位にフルオロ基を含む糖をさす。
【０１３５】
本明細書において使用される、「2'-OMe」または「2'-OCH3」または「2'-O-メチル」とは、各々、糖環の2'位に-OCH3基を含む糖を含むヌクレオシドをさす。
【０１３６】
本明細書において使用される、「オリゴヌクレオチド」とは、多数の連結されたヌクレオシドを含む化合物をさす。
【０１３７】
いくつかの態様において、多数のヌクレオシドのうちの1個以上が修飾型である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、1個以上のリボヌクレオシド（RNA）および／またはデオキシリボヌクレオシド（DNA）を含む。
【０１３８】
アンチセンス化合物へ組み入れるためのヌクレオシドを修飾するために使用され得るその他の多くのビシクロ糖代替環系およびトリシクロ糖代替環系も、当技術分野において公知である（例えば、概説論文：Leumann,J.C,Bioorganic and Medicinal Chemistry,2002,10,841-854を参照）。そのような環系は、活性を増強するために様々な付加的な置換を受けることができる。修飾型糖の調製の方法は、当業者に周知である。修飾型糖部分を有するヌクレオチドにおいて、核酸塩基部分（天然、修飾型、またはそれらの組み合わせ）は、適切な核酸標的とのハイブリダイゼーションのため、維持される。
【０１３９】
いくつかの態様において、アンチセンス化合物は、修飾型糖部分を有するヌクレオチドを1個以上含む。いくつかの態様において、修飾型糖部分は2'-MOEである。いくつかの態様において、2'-MOE修飾型ヌクレオチドは、ギャップマーモチーフに配置される。いくつかの態様において、修飾型糖部分は、cEtである。いくつかの態様において、cEt修飾型ヌクレオチドは、ギャップマーモチーフのウィング全体に配置される。
【０１４０】
いくつかの態様において、LNAにおいて、R4*およびR2*は、共に、R配置またはS配置のいずれかにあるビラジカル-O-CH(CH2OCH3)-を表す（2'O-メトキシエチル二環式核酸 - Seth at al.,2010,J.Org.Chem）。
【０１４１】
いくつかの態様において、LNAにおいて、R4*およびR2*は、共に、R配置またはS配置のいずれかにあるビラジカル-O-CH-(CH2CH3)-を表す（2'O-エチル二環式核酸 - Seth at al.,2010,J.Org.Chem）。
【０１４２】
いくつかの態様において、LNAにおいて、R4*およびR2*は、共に、R配置またはS配置のいずれかにあるビラジカル-O-CH-(CH3)-を表す。いくつかの態様において、R4*およびR2*は、共に、ビラジカル-O-CH2-O-CH2-を表す（Seth at al.,2010,J.Org.Chem）。
【０１４３】
いくつかの態様において、LNAにおいて、R4*およびR2*は、共に、ビラジカル-O-NR-CH3-を表す（Seth at al.,2010,J.Org.Chem）。
【０１４４】
いくつかの態様において、LNA単位は、以下の群より選択される構造を有する。
2018064575.tif 000017
【０１４５】
親和性増強ヌクレオチド類似体、例えば、LNAまたは2'置換型糖のオリゴマーへの組み入れは、特異的に結合するオリゴマーのサイズの低下を可能にすることができ、非特異的なまたは異常な結合が起こる前にオリゴマーのサイズに対する上限を低下させることもできる。
【０１４６】
本発明者らは、cET化合物（その配列を有する(S)-cETを使用（WO2009/12495の化合物ID 6/411847））および比較のためのβ-D-オキシLNA化合物（WO2009/12495の6/392063）の腎毒性を評価し、cET化合物が、β-D-オキシLNA対照と比較して驚くほど高い腎毒性を誘発することを見出した。本研究は、単回投与の研究であり、屠殺は3日後であった（本発明者らはNMRIマウスを使用したが、方法論についてはEP1984381の実施例41を参照すること）。腎毒性は組織学的分析によって確認された。顕著に、血清ALTが認められるものより低いcET化合物の投薬量において、腎毒性の兆候が見られ、このことは、cET化合物について、腎毒性が具体的な問題となり得ることを示している。従って、本発明のコンジュゲート、例えば、3価GalNAcコンジュゲートの使用は、LNA化合物、例えば、cET化合物の腎毒性の低下において高度に有用である。
【０１４７】
いくつかの態様において、オリゴマーは、少なくとも1個のヌクレオシド類似体を含む。いくつかの態様において、オリゴマーは、少なくとも2個のヌクレオチド類似体を含む。いくつかの態様において、オリゴマーは、3〜8個のヌクレオチド類似体、例えば、6個または7個のヌクレオチド類似体を含む。現在最も好ましい態様において、該ヌクレオチド類似体のうちの少なくとも1個はロックド核酸（LNA）であり；例えば、ヌクレオチド類似体のうちの少なくとも3個または少なくとも4個または少なくとも5個または少なくとも6個または少なくとも7個または8個がLNAであり得る。いくつかの態様において、全てのヌクレオチド類似体がLNAであり得る。
【０１４８】
ヌクレオチドのみからなる好ましいヌクレオチド配列モチーフまたはヌクレオチド配列に言及する際、その配列によって定義される本発明のオリゴマーは、該配列に存在するヌクレオチドのうちの1個以上の代わりに、対応するヌクレオチド類似体、例えば、オリゴマー／標的二重鎖の二重鎖安定性／Tmを上昇させるLNA単位またはその他のヌクレオチド類似体（即ち、親和性増強ヌクレオチド類似体）を含んでいてもよいことが認識されるであろう。
【０１４９】
好ましいヌクレオチド類似体は、LNA、例えば、オキシ-LNA（例えば、β-D-オキシ-LNAおよびα-L-オキシ-LNA）ならびに／またはアミノ-LNA（例えば、β-D-アミノ-LNAおよびα-L-アミノ-LNA）ならびに／またはチオ-LNA（例えば、β-D-チオ-LNAおよびα-L-チオ-LNA）ならびに／またはENA（例えば、β-D-ENAおよびα-L-ENA）である。
【０１５０】
いくつかの態様において、本発明のオリゴマー、例えば領域Aは、LNA単位および他のヌクレオチド類似体を含み得る。さらに、本発明のオリゴマー内に存在するヌクレオチド類似体は、例えば、2'-O-アルキル-RNA単位、2'-アミノ-DNA単位、2'-フルオロ-DNA単位、LNA単位、アラビノ核酸（ANA）単位、2'-フルオロ-ANA単位、HNA単位、INA単位（インターカレーティング核酸 - 参照によって本明細書に組み入れられるChristensen,2002.Nucl.Acids.Res.2002 30:4918-4925）、および2'MOE単位：より独立に選択される。いくつかの態様において、ヌクレオチド類似体の上記のタイプのうちの一つのみが、本発明のオリゴマー、例えば、その第1領域または連続ヌクレオチド配列に存在する。
【０１５１】
したがって、いくつかの態様において、本発明によるオリゴマー（領域A）は、少なくとも1個のロックド核酸（LNA）単位、例えば、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、もしくは8個のLNA単位、例えば、3〜7個もしくは4〜8個のLNA単位、または3個、4個、5個、6個、もしくは7個のLNA単位を含み得る。いくつかの態様において、全てのヌクレオチド類似体が、LNAである。いくつかの態様において、オリゴマーは、β-D-オキシ-LNA、および以下のLNA単位のうちの1種以上の両方を含み得る：β-D配置もしくはα-L配置のいずれかまたはそれらの組み合わせにあるチオ-LNA、アミノ-LNA、オキシ-LNA、および／またはENA。いくつかの態様において、全てのLNAシトシン単位が、5'-メチル-シトシンである。本発明のいくつかの態様において、オリゴマー（例えば、第1領域、任意で第2領域）は、LNA単位およびDNA単位の両方を含み得る。いくつかの態様において、LNA単位およびDNA単位の合計は、10〜25、例えば、10〜24、好ましくは、10〜20、例えば、10〜18、例えば、12〜16である。本発明のいくつかの態様において、オリゴマーまたはその第1領域のヌクレオチド配列、例えば、連続ヌクレオチド配列は、少なくとも1個のLNAからなり、残りのヌクレオチド単位はDNA単位である。いくつかの態様において、オリゴマーまたはその第1領域は、LNA、ヌクレオチド類似体、および天然に存在するヌクレオチド（例えば、RNAヌクレオチドまたはDNAヌクレオチド、最も好ましくは、DNAヌクレオチド）のみを、任意で、修飾型ヌクレオチド間結合、例えば、ホスホロチオエートと共に含む。
【０１５２】
RNAseリクルートメント
オリゴマー化合物は、非RNase媒介型の標的mRNAの分解を介して、例えば、翻訳の立体的な障害またはその他の方法によって機能し得ることが認識される。いくつかの態様において、本発明のオリゴマーは、エンドリボヌクレアーゼ（RNase）、例えば、RNaseHをリクルートすることができる。
【０１５３】
そのようなオリゴマー、例えば、領域Aまたは連続ヌクレオチド配列は、少なくとも4連続ヌクレオチド単位、例えば少なくとも5連続ヌクレオチド単位、例えば少なくとも6連続ヌクレオチド単位、例えば少なくとも7連続ヌクレオチド単位、例えば少なくとも8または少なくとも9連続ヌクレオチド単位（残基）の領域を含むことが好ましく、7、8、9、10、11、12、13、14、15、または16連続ヌクレオチドを含み、相補的な標的RNAとの二重鎖を形成した時に、RNase（例えばDNA単位）をリクルートすることができる。RNAseをリクルートすることができる連続配列は、本明細書に記載されるギャップマーに関して言及される領域Y'であり得る。いくつかの態様において、RNAseをリクルートすることができる連続配列、例えば、領域Y'のサイズは、より大きく、例えば、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20ヌクレオチド単位であってもよい。
【０１５４】
EP 1 222 309は、RNaseHをリクルートする能力を決定するために使用され得る、RNaseH活性を決定するためのインビトロの方法を提供する。相補的なRNA標的と共に準備された時に、EP 1 222 309の実施例91〜95によって提供された方法論を使用して、同一の塩基配列を有するが、DNAモノマーのみを含有しており、2'置換を有しておらず、オリゴヌクレオチド内の全てのモノマーの間にホスホロチオエート連結基を有するDNAのみのオリゴヌクレオチドを使用して決定された初速度の少なくとも1％、例えば、少なくとも5％、例えば、少なくとも10％、または20％を超える、pmol/l/分で測定される初速度を有している場合、そのオリゴマーは、RNaseHをリクルートすることができると見なされる。
【０１５５】
いくつかの態様において、相補的なRNA標的およびRNaseHと共に準備された時に、EP 1 222 309の実施例91〜95によって提供される方法論を使用して、pmol/l/分で測定されるRNaseH初速度が、2'置換を有しておらず、オリゴヌクレオチド内の全てのヌクレオチドの間にホスホロチオエート連結基を有する等価なDNAのみのオリゴヌクレオチドを使用して決定された初速度の1％未満、例えば、5％未満、例えば、10％未満、または20％未満である場合、そのオリゴマーはRNaseHをリクルートすることが本質的にできないと見なされる。
【０１５６】
他の態様において、相補的なRNA標的およびRNaseHと共に準備された時に、EP 1 222 309の実施例91〜95によって提供される方法論を使用して、pmol/l/分で測定されるRNaseH初速度が、2'置換を有しておらず、オリゴヌクレオチド内の全てのヌクレオチドの間にホスホロチオエート連結基を有する等価なDNAのみのオリゴヌクレオチドを使用して決定された初速度の少なくとも20％、例えば、少なくとも40％、例えば、少なくとも60％、例えば、少なくとも80％である場合、そのオリゴマーはRNaseHをリクルートすることができると見なされる。
【０１５７】
典型的には、相補的な標的RNAとの二重鎖を形成した時にRNaseをリクルートすることができる連続ヌクレオチド単位を形成するオリゴマーの領域は、RNA標的と共にDNA/RNA様二重鎖を形成するヌクレオチド単位からなる。本発明のオリゴマー、例えば、第1領域は、ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体の両方を含むヌクレオチド配列を含んでいてよく、例えば、ギャップマーの形態にあり得る。
【０１５８】
ギャップマー設計
いくつかの態様において、本発明のオリゴマー、例えば、第1領域は、ギャップマーを含むかまたはギャップマーである。ギャップマーオリゴマーは、RNAse、例えば、RNAseHをリクルートすることができるヌクレオチドの連続ストレッチ、例えば、本明細書において領域Y'（Y'）と呼ばれる、少なくとも6 DNAヌクレオチドまたは7 DNAヌクレオチドの領域を含むオリゴマーであり、領域Y'の5'および3'の両方に、親和性増強ヌクレオチド類似体の領域が隣接している。例えば、RNAseをリクルートすることができるヌクレオチドの連続ストレッチの5'および3'に、1〜6個のヌクレオチド類似体が隣接している。これらの領域は、それぞれ領域X'（X'）および領域Z'（Z'）と呼ばれる。X'およびZ'領域ギャップマーの例は、WO2004/046160、WO2008/113832、およびWO2007/146511に開示されている。
【０１５９】
いくつかの態様において、RNAseをリクルートすることができるモノマーは、DNAモノマー、α-L-LNAモノマー、C4'アルキル化DNAモノマー（参照によって本明細書に組み入れられるPCT/EP2009/050349およびVester et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.18(2008)2296-2300を参照）、ならびにUNA（アンリンクト核酸）ヌクレオチド（参照によって本明細書に組み入れられるFluiter et al.,Mol.Biosyst.,2009,10,1039を参照）からなる群より選択される。UNAは、典型的には、リボースのC2-C3 C-C結合が除去され、ロックされていない「糖」残基が形成されている、ロックされていない核酸である。好ましくは、ギャップマーは、式（5'〜3'）X'-Y'-Z'の（ポリ）ヌクレオチド配列を含み；領域X'（X'）（5'領域）は、少なくとも1個のヌクレオチド類似体、例えば少なくとも1個のLNA単位、例えば、1〜6個のヌクレオチド類似体、例えばLNA単位からなるかまたはそれを含み；領域Y'（Y'）は、（相補的なRNA分子、例えば、mRNA標的との二重鎖を形成した時に）RNAseをリクルートすることができる少なくとも4個または少なくとも5個の連続ヌクレオチド、例えば、DNAヌクレオチドからなるかまたはそれを含み、かつ；領域Z'（Z'）（3'領域）は、少なくとも1個のヌクレオチド類似体、例えば少なくとも1個のLNA単位、例えば、1〜6個のヌクレオチド類似体、例えばLNA単位からなるかまたはそれを含む。
【０１６０】
いくつかの態様において、領域X'は、1個、2個、3個、4個、5個、もしくは6個のヌクレオチド類似体、例えばLNA単位、例えば、2〜5個のヌクレオチド類似体、例えば2〜5個のLNA単位、例えば、3個もしくは4個のヌクレオチド類似体、例えば3個もしくは4個のLNA単位からなり；かつ／または領域Zは、1個、2個、3個、4個、5個、もしくは6個のヌクレオチド類似体、例えばLNA単位、例えば、2〜5個のヌクレオチド類似体、例えば2〜5個のLNA単位、例えば、3個もしくは4個のヌクレオチド類似体、例えば3個もしくは4個のLNA単位からなる。
【０１６１】
いくつかの態様において、Y'は、RNAseをリクルートすることができる4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、もしくは12個の連続ヌクレオチド、またはRNAseをリクルートすることができる4〜12個もしくは6〜10個もしくは7〜9個、例えば、8個の連続ヌクレオチドからなるかまたはそれを含む。いくつかの態様において、領域Y'は、少なくとも1個のDNAヌクレオチド単位、例えば1〜12個のDNA単位、好ましくは、4〜12個のDNA単位、より好ましくは、6〜10個のDNA単位、例えば、7〜10個のDNA単位、最も好ましくは、8個、9個、または10個のDNA単位からなるかまたはそれを含む。
【０１６２】
いくつかの態様において、領域X'は、3個または4個のヌクレオチド類似体、例えばLNAからなり、領域X'は、7個、8個、9個、または10個のDNA単位からなり、かつ領域Z'は、3個または4個のヌクレオチド類似体、例えばLNAからなる。そのような設計には、（X'-Y'-Z'）3-10-3、3-10-4、4-10-3、3-9-3、3-9-4、4-9-3、3-8-3、3-8-4、4-8-3、3-7-3、3-7-4、4-7-3が含まれる。好ましい態様において、ギャップマーは3-9-4ギャップマーであり、さらに好ましくは、これは3-10-3ギャップマーである。
【０１６３】
さらなるギャップマー設計は、参照によって本明細書に組み入れられるWO2004/046160に開示されている。参照によって本明細書に組み入れられる米国仮出願第60/977,409号に基づく優先権を主張するWO2008/113832は、「ショートマー（shortmer）」ギャップマーオリゴマーに言及している。いくつかの態様において、本明細書に提示されたオリゴマーは、そのようなショートマーギャップマーであってもよい。
【０１６４】
いくつかの態様において、オリゴマー、例えば、領域X'は、式（5'〜3'）X'-Y'-Z'を含むかまたは該式である、全部で10ヌクレオチド単位、11ヌクレオチド単位、12ヌクレオチド単位、13ヌクレオチド単位、または14ヌクレオチド単位の連続ヌクレオチド配列からなっている。X'は、1個、2個、または3個のヌクレオチド類似体単位、例えばLNA単位からなり；Y'は、相補的なRNA分子（例えば、mRNA標的）との二重鎖を形成した時にRNAseをリクルートすることができる7個、8個、または9個の連続ヌクレオチド単位からなり；かつZ'は、1個、2個、または3個のヌクレオチド類似体単位、例えばLNA単位からなる。
【０１６５】
いくつかの態様において、X'は、1個のLNA単位からなる。いくつかの態様において、X'は、2個のLNA単位からなる。いくつかの態様において、X'は、3個のLNA単位からなる。いくつかの態様において、Z'は、1個のLNA単位からなる。いくつかの態様において、Z'は、2個のLNA単位からなる。いくつかの態様において、Z'は、3個のLNA単位からなる。いくつかの態様において、Y'は、7個のヌクレオチド単位からなる。いくつかの態様において、Y'は、8個のヌクレオチド単位からなる。いくつかの態様において、Y'は、9個のヌクレオチド単位からなる。ある特定の態様において、領域Y'は、10個のヌクレオシドモノマーからなる。ある特定の態様において、領域Y'は、1〜10個のDNAモノマーからなるかまたはそれを含む。いくつかの態様において、Y'は、1〜9個のDNA単位、例えば、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、または9個のDNA単位を含む。いくつかの態様において、Y'は、DNA単位からなる。いくつかの態様において、Y'は、α-L配置にある少なくとも1個のLNA単位、例えば、α-L配置にある2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、または9個のLNA単位を含む。いくつかの態様において、Y'は、少なくとも1個のα-L-オキシLNA単位を含むか、またはα-L配置の全てのLNA単位がα-L-オキシLNA単位である。いくつかの態様において、X'-Y'-Z'内に存在するヌクレオチドの数は、次からなる群より選択される（ヌクレオチド類似体単位-領域Y'-ヌクレオチド類似体単位）：1-8-1、1-8-2、2-8-1、2-8-2、3-8-3、2-8-3、3-8-2、4-8-1、4-8-2、1-8-4、2-8-4、または；1-9-1、1-9-2、2-9-1、2-9-2、2-9-3、3-9-2、1-9-3、3-9-1、4-9-1、1-9-4、または；1-10-1、1-10-2、2-10-1、2-10-2、1-10-3、3-10-1、2-10-3、3-10-2。いくつかの態様において、X'-Y'-Z'内のヌクレオチドの数は、2-7-1、1-7-2、2-7-2、3-7-3、2-7-3、3-7-2、3-7-4、および4-7-3からなる群より選択される。ある特定の態様において、領域X'およびY'の各々は、3個のLNAモノマーからなり、領域Y'は、8個または9個または10個のヌクレオシドモノマー、好ましくは、DNAモノマーからなる。いくつかの態様において、X'およびZ'の両方が、各々2個のLNA単位からなり、Y'は、8個または9個のヌクレオチド単位、好ましくは、DNA単位からなる。様々な態様において、その他のギャップマー設計には、領域X'および／またはZ'が、3個、4個、5個、または6個のヌクレオシド類似体、例えば、2'-O-メトキシエチル-リボース糖（2'-MOE）を含有しているモノマーまたは2'-フルオロ-デオキシリボース糖を含有しているモノマー）からなり、領域Y'が、8個、9個、10個、11個、または12個のヌクレオシド、例えば、DNAモノマーからなり、ここで、領域X'-Y'-Z'が、3-9-3、3-10-3、5-10-5、または4-12-4のモノマーを有しているものが含まれる。さらなるギャップマー設計は、参照によって本明細書に組み入れられるWO2007/146511A2に開示されている。
【０１６６】
LNAギャップマー：
LNAギャップマーは、少なくとも1個のLNAヌクレオチドを含むギャップマーオリゴマー（領域A）である。SEQ ID NO 1、2、3、4、5、6、7、8、および40はLNAギャップマーオリゴマーである。対応する長さのSEQ ID NO 33または34または45に相補的な、10〜16ヌクレオチドの連続配列を有するオリゴマーは、ギャップマーオリゴマー、例えばLNAオリゴマーでもあり得る。
【０１６７】
ヌクレオチド間連結
本明細書に記載されたオリゴマー（例えば、第1領域および第2領域）のヌクレオシドモノマーは、ヌクレオシド間連結基を介して、共に結合されている。適宜、各モノマーは、連結基を介して、3'隣接モノマーに連結されている。
【０１６８】
本発明に関して、オリゴマーの末端の5'モノマーは、5'末端基、またはコンジュゲーションのための連結基を含んでいてもよいしまたは含んでいなくてもよいが、5'連結基を含まないことを、当業者は理解するであろう。
【０１６９】
「連結基」または「ヌクレオチド間連結」という用語は、2個のヌクレオチドを共有結合で共に結合することができる基を意味するものである。具体的な好ましい例には、ホスフェート基およびホスホロチオエート基が含まれる。ヌクレオシド間連結は、ヌクレオチド間連結と交換可能に使用され得る。
【０１７０】
本発明のオリゴマーのヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列は、連結基を介して、共に結合されている。適宜、各ヌクレオチドは、連結基を介して、3'隣接ヌクレオチドに連結されている。
【０１７１】
適したヌクレオチド間連結には、WO2007/031091にリストされたもの、例えば、（参照によって本明細書に組み入れられる）WO2007/031091の34頁の第1段落にリストされたヌクレオチド間連結が含まれる。これは、いくつかの態様において、領域Bのホスホジエステル連結（存在する場合）以外は、ヌクレオチド間連結をその通常のホスホジエステルからヌクレアーゼによる攻撃に対してより抵抗性のもの、例えば、ホスホロチオエートまたはボラノホスフェートへ改変することが好ましい。これらの2種は、RNaseHによって切断可能であり、標的遺伝子の発現の低下におけるアンチセンス阻害の経路も可能にする。
【０１７２】
いくつかの態様において、本発明のオリゴマーは、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、およびボラノホスフェートからなる群より選択される1個または複数のヌクレオシド連結を含む。
【０１７３】
本明細書に提供される適切な硫黄（S）含有ヌクレオチド間連結、例えば、ホスホロチオエートまたはホスホジチオエートが、好ましい場合がある。ホスホロチオエートヌクレオチド間連結は、特に、第1領域のため、例えば、ギャップマー、ミックスマー、抗mir、スプライススイッチングオリゴマー、およびトータルマーにおいても好ましい。
【０１７４】
「ミックスマー」という用語は、天然に存在するヌクレオチドおよび天然には存在しないヌクレオチドの両方を含むオリゴマーを指し、ギャップマー、テールマー、およびヘッドマーとは対照的に、5個を超える、およびいくつかの態様において、4個以下の連続的な、例えば、3個以下の連続的な天然に存在するヌクレオチド、例えば、DNA単位である連続配列が存在しない。
【０１７５】
「トータルマー」という用語は、天然には存在しないヌクレオシド、例えば、糖修飾型ヌクレオシド類似体のみを含む一本鎖オリゴマーをさす。
【０１７６】
ギャップマーについて、オリゴマー内のヌクレオチド間連結は、例えば、標的とされたRNAのRNaseHによる切断を可能にするため、ホスホロチオエートまたはボラノホスフェートであり得る。ホスホロチオエートは、改善されたヌクレアーゼ抵抗性およびその他の理由、例えば、製造の容易さのため、好ましい。
【０１７７】
一つの局面において、第1領域と第2領域との間のホスホジエステル連結を除き、および任意で、領域B内のホスホジエステル連結を除き、本発明のオリゴマーの残りのヌクレオシド間連結、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチド類似体は、ホスホロチオエート基によって相互に連結されている。いくつかの態様において、第1領域内のヌクレオシド間の少なくとも50％、例えば、少なくとも70％、例えば、少なくとも80％、例えば、少なくとも90％、例えば、全てのヌクレオシド間連結が、ホスホジエステル（ホスフェート）以外であり、例えば、ホスホロチオエート、ホスホジチオエート、またはボラノホスフェートからなる群より選択される。いくつかの態様において、第1領域内のヌクレオシド間の少なくとも50％、例えば、少なくとも70％、例えば、少なくとも80％、例えば、少なくとも90％、例えば、全てのヌクレオシド間連結が、ホスホロチオエートである。
【０１７８】
WO09124238は、中性ヌクレオシド間連結によって3'末端または5'末端に付着した少なくとも1個の二環式ヌクレオシドを有するオリゴマー化合物に言及している。従って、本発明のオリゴマーは、中性ヌクレオシド間連結、例えば、1個以上のホスホトリエステル、メチルホスホネート、MMI、アミド-3、ホルムアセタール（formacetal）、またはチオホルムアセタールによって3'末端または5'末端に付着した少なくとも1個の二環式ヌクレオシドを有し得る。残りの結合は、ホスホロチオエートであり得る。
【０１７９】
オリゴマーコンジュゲート（領域C）
本発明のさらなる局面は、本発明のオリゴマーと、任意でオリゴマーの連続配列およびコンジュゲート部分の間に位置するリンカー領域（Bおよび／またはY）を介してオリゴマー（A）に共有結合で付着した少なくとも1個の非ヌクレオチド部分または非ポリヌクレオチド部分（C）とを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートである。
【０１８０】
オリゴヌクレオチドと共に使用されている代表的なコンジュゲート部分は、ステロイド分子；タンパク質（例えば、抗体、酵素、血清タンパク質）；ペプチド；ビタミン（水溶性または脂溶性）；ポリマー（水溶性または脂溶性）；薬物、毒素、レポーター分子、および受容体リガンドを含む小分子；炭水化物複合体；核酸切断複合体；金属キレート剤（例えば、ポルフィリン、テキサフィリン、クラウンエーテル等）；ハイブリッドフォトヌクレアーゼ（photonuclease）／インターカレーターを含むインターカレーター；架橋剤（例えば、光活性、酸化還元活性）、ならびにこれらの組み合わせおよび誘導体を含む親油性分子（芳香性および非芳香性）を含むことができる。多数の適当なコンジュゲート部分、それらの調製およびオリゴマー化合物との連結は、例えば、各々参照によってその全体が本明細書に組み入れられるWO93/07883および米国特許第6,395,492号に提供されている。オリゴヌクレオチドコンジュゲートおよびそれらの合成は、各々参照によってその全体が本明細書に組み入れられるManoharan in Antisense Drug Technology,Principles,Strategies,and Applications,S.T.Crooke,ed.,Ch.16,Marcel Dekker,Inc.,2001、およびManoharan,Antisense and Nucleic Acid Drug Development,2002,12,103による包括的な概説においても報告されている。
【０１８１】
いくつかの態様において、本発明のオリゴマーは、肝臓へターゲティングされる。即ち全身投与の後、化合物は（ヘパトサイトのような）肝細胞に蓄積する。肝臓へのターゲティングは、コンジュゲート部分（C）の付加によって大きく増強され得る。しかしながら、オリゴマーの効力を最大限にするため、生物切断性リンカー（B）、例えば、ヌクレオチドホスフェートリンカーを介して、コンジュゲート（またはターゲティング部分）がオリゴマーに連結されることが多くの場合望ましい。従って、ヘパトサイトにおける取り込みおよび活性を増強するコンジュゲート部分を使用することが望ましい。活性の増強は、取り込みの増強によるものであってもよいし、またはヘパトサイトにおける化合物の効力の増強によるものであってもよい。
【０１８２】
いくつかの態様において、オリゴマー化合物は、アンチセンスオリゴマーと、任意で生物切断性リンカー、例えば領域Bと、炭水化物コンジュゲート（領域Cと呼ばれ得る）とを含む、LNAオリゴマー、例えばギャップマー、または例えば、LNAアンチセンスオリゴマー（本明細書において領域Aと呼ばれ得る）である。LNAアンチセンスオリゴマーは、7〜30ヌクレオシド長、例えば、8〜26ヌクレオシド長であり得、少なくとも1個のLNA単位（ヌクレオシド）を含む。
【０１８３】
いくつかの態様において、コンジュゲートは、炭水化物であるかもしくは炭水化物を含んでいてもよく、または炭水化物基を含む。いくつかの態様において、炭水化物は、ガラクトース、ラクトース、n-アセチルガラクトサミン、マンノース、およびマンノース-6-リン酸からなる群より選択される。いくつかの態様において、コンジュゲート基は、マンノースもしくはマンノース-6-リン酸であるかまたはそれを含んでいてもよい。炭水化物コンジュゲートは、ある範囲の組織、例えば、肝臓および／または筋肉における送達または活性を増強するために使用され得る。例えば、EP1495769、WO99/65925、Yang et al.,Bioconjug Chem(2009)20(2):213-21、Zatsepin & Oretskaya Chem Biodivers.(2004)1(10):1401-17を参照されたい。
【０１８４】
いくつかの態様において、炭水化物部分は直鎖状の炭水化物ポリマーではない。いくつかの態様において、オリゴマー化合物は、アンチセンスオリゴマーと、本明細書において定義される領域Bと、アシアロ糖タンパク質受容体ターゲティング部分コンジュゲート部分、例えば、GalNAc部分（領域Cと呼ばれ得る）とを含む、LNAオリゴマー、例えば、LNAアンチセンスオリゴマー（本明細書において領域Aと呼ばれ得る）である。炭水化物部分は、多価、例えば、2価、3価、4価であってもよいし、または4個の同一のもしくは非同一の炭水化物部分が、任意で（領域Yのような）リンカーを介して、オリゴマーに共有結合で接合されていてもよい。
【０１８５】
GalNAcコンジュゲート部分
いくつかの態様において、炭水化物部分は、直鎖状の炭水化物ポリマーではない。しかしながら、炭水化物部分は、多価、例えば、2価、3価、4価であってもよいし、または4個の同一のもしくは同一でない炭水化物部分が、任意でリンカーを介して、オリゴマーに共有結合で接合されていてもよい。いくつかの態様において、本発明は、本発明のオリゴマーと炭水化物コンジュゲート部分とを含むコンジュゲートを提供する。いくつかの態様において、本発明は、本発明のオリゴマーと、さらなる領域（領域Cと呼ばれる）の一部を形成し得るアシアロ糖タンパク質受容体ターゲティング部分コンジュゲート部分、例えば、GalNAc部分とを含むコンジュゲートを提供する。
【０１８６】
本発明は、アシアロ糖タンパク質受容体ターゲティング部分にコンジュゲートされたLNAアンチセンスオリゴヌクレオチドも提供する。いくつかの態様において、コンジュゲート部分（例えば、第3領域または領域C）は、アシアロ糖タンパク質受容体ターゲティング部分、例えば、ガラクトース、ガラクトサミン、N-ホルミル-ガラクトサミン、Nアセチルガラクトサミン、N-プロピオニル-ガラクトサミン、N-n-ブタノイル-ガラクトサミン、およびN-イソブタノイルガラクトサミンを含む。いくつかの態様において、コンジュゲートは、ガラクトースクラスタ、例えば、N-アセチルガラクトサミン三量体を含む。いくつかの態様において、コンジュゲート部分は、GalNAc（N-アセチルガラクトサミン）、例えば、一価、二価、三価、または四価のGalNAcを含む。3価GalNAcコンジュゲートは、化合物を肝臓へ標的指向化するために使用され得る。GalNAcコンジュゲートは、メチルホスホネートおよびPNAアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、US 5,994517およびHangeland et al.,Bioconjug Chem.1995 Nov-Dec;6(6):695-701）ならびにsiRNA（例えば、WO2009/126933、WO2012/089352＆WO2012/083046）と共に使用されている。GalNAcの参照およびそこで使用された具体的なコンジュゲートは、参照によって本明細書に組み入れられる。WO2012/083046は、本発明において使用するために適当である切断可能な薬物動態モジュレーターを含むGalNAcコンジュゲート部分を有するsiRNAを開示しており、好ましい薬物動態モジュレーターは、C16疎水基、例えば、パルミトイル、ヘキサデカ-8-エノイル、オレイル、(9E,12E)-オクタデカ-9,12-ジエノイル、ジオクタノイル、およびC16-C20アシルである。'046号の切断可能な薬物動態モジュレーターは、コレステロールでもあり得る。
【０１８７】
ターゲティング部分（コンジュゲート部分）は、ガラクトース、ガラクトサミン、N-ホルミル-ガラクトサミン、N-アセチルガラクトサミン、Nプロピオニル-ガラクトサミン、N-n-ブタノイル-ガラクトサミン、N-イソ-ブタノイルガラクトサミン、ガラクトースクラスタ、およびN-アセチルガラクトサミン三量体からなる群より選択され得、16個以上の炭素原子を有する疎水基、16〜20個の炭素原子を有する疎水基、パルミトイル、ヘキサデカ-8-エノイル、オレイル、(9E,12E)-オクタデカ-9,12-ジエノイル、ジオクタノイル、およびC16-C20アシル、およびコレステロールからなる群より選択される薬物動態モジュレーターを有し得る。'046号に開示されたある特定のGalNacクラスタには、(E)-ヘキサデカ-8-エノイル（C16）、オレイル（C18）、(9,E,12E)-オクタデカ-9,12-ジエノイル（C18）、オクタノイル（C8）、ドデカノイル（C12）、C-20アシル、C24アシル、ジオクタノイル（2×C8）が含まれる。ターゲティング部分-薬物動態モジュレーターターゲティング部分は、生理学的に不安定な結合、または、例えば、ジスルフィド結合、またはPEGリンカーを介して、ポリヌクレオチドに連結され得る。本発明は、オリゴマーとコンジュゲート基との間のホスホジエステルリンカーの使用にも関する（これらは本明細書において領域Bと呼ばれ、適宜、LNAオリゴマーと炭水化物コンジュゲート基との間に位置する）。
【０１８８】
肝臓のヘパトサイトを標的とするため、好ましいターゲティングリガンドは、ガラクトースクラスタである。
【０１８９】
ガラクトースクラスタには、2〜4個の末端ガラクトース誘導体を有する、例えば、それを含む、分子が含まれる。本明細書において使用される、ガラクトース誘導体という用語には、ガラクトース、およびガラクトースと同等以上のアシアロ糖タンパク質受容体に対する親和性を有するガラクトースの誘導体の両方が含まれる。末端ガラクトース誘導体は、そのC-l炭素を通して分子に付着する。アシアロ糖タンパク質受容体（ASGPr）は、主にヘパトサイト上で発現し、枝分かれした末端にガラクトースを有する糖タンパク質に結合する。好ましいガラクトースクラスタは、各々アシアロ糖タンパク質受容体に対する親和性を有するガラクトサミンまたはガラクトサミン誘導体を、3個、末端に有する。より好ましいガラクトースクラスタは、3個のN-アセチルガラクトサミンを末端に有する。当技術分野において一般的な他の用語には、三分岐型ガラクトース、三価ガラクトース、およびガラクトース三量体が含まれる。三分岐型ガラクトース誘導体クラスタは、二分岐型または単分岐型のガラクトース誘導体構造より大きい親和性で、ASGPrに結合することが公知である（Baenziger and Fiete,1980,Cell,22,611-620；Connolly et al.,1982,1.Biol.Chern.,257,939-945）。nMレベルの親和性を達成するためには多価が必要とされる。WO2012/083046によると、アシアロ糖タンパク質受容体に対する親和性を有する単一のガラクトース誘導体の付着は、送達ポリマーと共に同時投与された時、インビボでRNAiポリヌクレオチドのヘパトサイトへの機能的送達を可能にしない。
【０１９０】
ガラクトースクラスタは、各々中心分岐点に連結された2個、または好ましくは3個のガラクトース誘導体を含み得る。ガラクトース誘導体は、糖類のC-l炭素を通して中心分岐点に付着する。ガラクトース誘導体は、好ましくは、リンカーまたはスペーサーを介して分岐点に連結される。好ましいスペーサーは、フレキシブル親水性スペーサー（米国特許第5885968号；Biessen et al.J.Med.Chern.1995 Vol.39 p.1538-1546）である。好ましいフレキシブル親水性スペーサーは、PEGスペーサーである。好ましいPEGスペーサーは、PEG3スペーサーである。分岐点は、3個のガラクトース誘導体の付着を可能にし、さらにオリゴマーへの分岐点の付着を可能にする任意の小分子であり得る。例示的な分岐点基はジリジンである。ジリジン分子は、3個のガラクトース誘導体が付着し得る3個のアミン基、およびジリジンがオリゴマーに付着し得るカルボキシル反応基を含有している。分岐点のオリゴマーへの付着は、リンカーまたはスペーサーを通して起こり得る。好ましいスペーサーは、フレキシブル親水性スペーサーである。好ましいフレキシブル親水性スペーサーは、PEGスペーサーである。好ましいPEGスペーサーは、PEG3スペーサー（3個のエチレン単位）である。ガラクトースクラスタは、当技術分野において公知の方法を使用して、オリゴマーの3'末端または5'末端に付着させられ得る。
【０１９１】
好ましいガラクトース誘導体は、N-アセチル-ガラクトサミン（GalNAc）である。アシアロ糖タンパク質受容体に対する親和性を有するその他の糖類は、ガラクトサミン、N-n-ブタノイルガラクトサミン、およびN-イソ-ブタノイルガラクトサミンを含むリストより選択され得る。アシアロ糖タンパク質受容体に対する多数のガラクトース誘導体の親和性が研究されており（例えば、Jobst,S.T.and Drickamer,K.JB.C.1996,271,6686を参照）、または当技術分野において典型的な方法を使用して、容易に決定される。
2018064575.tif 000018
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【０１９２】
本発明のコンジュゲートのさらなる例は、以下に図示される。
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2018064575.tif 000021
【０１９３】
ここで、上記GalNacクラスタコンジュゲート内の疎水性または親油性の部分（またはさらなるコンジュゲート部分）（即ち、薬物動態モジュレーター）は、LNAオリゴマー、例えば、LNAアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用する時には、任意である。
【０１９４】
本研究において使用された具体的なGalNacクラスタ、コンジュゲート1、2、3、4、ならびにコンジュゲート1a、2a、3a、および4a（GalNacクラスタをオリゴマーに接合する任意でのC6リンカーと共に示されている）については、図面を参照されたい。
【０１９５】
本発明の好ましい態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートのコンジュゲート部分は、コンジュゲート1、2、3、4、ならびにコンジュゲート1a、2a、3a、および4aを含むかまたはそれからなる。最も好ましくは、コンジュゲート部分は、コンジュゲート2aを含むかまたはそれからなる。
【０１９６】
もう一つの好ましい態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、SEQ ID NO 17、18、19、20、21、22、23、および24からなる群より選択される。
【０１９７】
従って、GalNacクラスタの各炭水化物部分（例えば、GalNAc）は、スペーサー、例えば、(ポリ)エチレングリコールリンカー（PEG）、例えば、ジエチレングリコールリンカー、トリエチレングリコールリンカー、テトラエチレングリコールリンカー、ペンタエチレングリコールリンカー、ヘキサエチレングリコールリンカーを介して、オリゴマーに接合され得る。上に示されるように、PEG部分は、ガラクトース糖部分とペプチド（トリリジンが示されている）リンカーとの間のスペーサーを形成する。
【０１９８】
いくつかの態様において、GalNAcクラスタは、ビラジカルリンカーを介してオリゴマー（または領域Yもしくは領域B）に付着したペプチドリンカー、例えば、Tyr-Asp(Asp)トリペプチドまたはAsp(Asp)ジペプチドを含み、例えば、GalNAcクラスタは、以下のビラジカルリンカーを含み得る：
2018064575.tif 000022
R1は、-C2H4-、-C3H6-、-C4H8-、-C5H10-、-C6H12-、1,4-シクロヘキシル（-C6H10-）、1,4-フェニル（-C6H4-）、-C2H4OC2H4-、-C2H4(OC2H4)2-、または-C2H4(OC2H4)3-、C(O)CH2-、-C(O)C2H4-、-C(O)C3H6-、-C(O)C4H8-、-C(O)C5H10-、-C(O)C6H12-、1,4-シクロヘキシル（-C(O)C6H10-）、1,4-フェニル（-C(O)C6H4-）、-C(O)C2H4OC2H4-、-C(O)C2H4(OC2H4)2-、または-C(O)C2H4(OC2H4)3-より好ましくは選択されるビラジカルである。
【０１９９】
いくつかの態様において、R1は、-C2H4-、-C3H6-、-C4H8-、-C5H10-、-C6H12-、1,4-シクロヘキシル（-C6H10-）、1,4-フェニル（-C6H4-）、-C2H4OC2H4-、-C2H4(OC2H4)2-、または-C2H4(OC2H4)3-より好ましくは選択されるビラジカルである。
【０２００】
炭水化物コンジュゲート（例えば、GalNAc）または炭水化物-リンカー部分（例えば、炭水化物-PEG部分）は、分岐点基、例えば、アミノ酸または適宜2個以上（例えば、3個、4個、または5個）のアミノ基を含むペプチド、例えば、リジン、ジリジンまたはトリリジンまたはテトラリジンを介して、オリゴマーに共有結合で接合（連結）され得る。トリリジン分子は、3個の炭水化物コンジュゲート基、例えば、ガラクトース＆誘導体（例えば、GalNAc）およびさらなるコンジュゲート部分／基、例えば、疎水性または親油性の部分／基が付着させられ得る4個のアミン基、ならびにトリリジンがオリゴマーに付着させられ得るカルボキシル反応基を含有している。さらなるコンジュゲート部分、例えば、親油性／疎水性部分は、オリゴマーに付着しているリジン残基に付着させられ得る。
【０２０１】
驚くべきことに、本発明者らは、LNAオリゴマーと共に使用するためのGalNacコンジュゲートが、薬物動態モジュレーター（以下に記載）を必要としないことを見出し、従って、いくつかの態様において、GalNacコンジュゲートは、親油性または疎水性の部分、例えば、本明細書に記載されたものに共有結合で連結されていない、例えば、C8-C36脂肪酸またはステロールを含まない。従って、本発明は、親油性または疎水性の薬物動態モジュレーターまたはコンジュゲート部分／基を含まないLNAオリゴマーGalNacコンジュゲートも提供する。
【０２０２】
薬物動態モジュレーター
本発明の化合物は、1個以上の付加的なコンジュゲート部分をさらに含むことができ、その中で、例えば、コンジュゲート基が炭水化物部分である場合、親油性または疎水性の部分が特に関心対象である。そのような親油性または疎水性の部分は、薬物動態モジュレーターとして作用することができ、任意で、リンカー、例えば、生物切断性リンカーを介して、炭水化物コンジュゲート、炭水化物コンジュゲートをオリゴマーに連結するリンカー、または複数の炭水化物コンジュゲート（多価コンジュゲート）をオリゴマーに連結するリンカーに、共有結合で連結され得る。
【０２０３】
従って、オリゴマーまたはコンジュゲート部分は、薬物動態モジュレーター、例えば、親油性または疎水性の部分を含み得る。そのような部分は、WO2012/082046においてsiRNAコンジュゲートに関して開示されている。疎水性部分には、飽和または不飽和であり得るC8〜C36脂肪酸が含まれ得る。いくつかの態様において、C10、C12、C14、C16、C18、C20、C22、C24、C26、C28、C30、C32、およびC34脂肪酸が使用され得る。疎水基は、16個以上の炭素原子を有し得る。例示的な適当な疎水基は、ステロール、コレステロール、パルミトイル、ヘキサデカ-8-エノイル、オレイル、(9E,12E)-オクタデカ-9,12-ジエノイル、ジオクタノイル、およびC16〜C20アシルからなる群より選択され得る。WO'346号によると、16個未満の炭素原子を有する疎水基は、ポリヌクレオチドのターゲティングを増強する効果が劣っているが、複数コピー（例えば、2×、例えば、2×C8、C10、C12、C14）で使用して、効力が増強され得る。ポリヌクレオチドターゲティング部分として有用な薬物動態モジュレーターは、コレステロール、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アラルキル基、アラルケニル基、およびアラルキニル基からなる群より選択され得、それらは、各々、直鎖状、分岐状、または環状であり得る。薬物動態モジュレーターは、好ましくは、炭素原子および水素原子のみを含有している炭化水素である。しかしながら、疎水性を維持する置換またはヘテロ原子、例えば、フッ素は、許容され得る。
【０２０４】
親油性コンジュゲート
いくつかの態様において、コンジュゲート基は、親油性部分、例えば、ステロール（例えば、コレステロール、コレステリル、コレスタノール、スチグマステロール、コラン酸、およびエルゴステロール）であるかまたはそれを含み得る。いくつかの態様において、コンジュゲートは、トコフェロール（図2において、コンジュゲート6およびコンジュゲート6aとして例示）であるかまたはそれを含む。いくつかの態様において、コンジュゲートは、コレステロール（図2において、コンジュゲート5およびコンジュゲート5aとして例示）であるかまたはそれを含み得る。
【０２０５】
いくつかの態様において、コンジュゲートは、脂質、リン脂質、または親油性アルコール、例えば、カチオン性脂質、中性脂質、スフィンゴ脂質、ならびに脂肪酸、例えば、ステアリン酸、オレイン酸、エライジン酸、リノール酸、リノールエライジン酸、リノレン酸、およびミリスチン酸であるかまたはそれを含み得る。いくつかの態様において、脂肪酸には、飽和または不飽和のC4〜C30アルキル鎖が含まれる。アルキル鎖は、直鎖状であってもよいしまたは分岐状であってもよい。
【０２０６】
親油性コンジュゲート部分は、例えば、オリゴマー化合物の親水性に対抗し、細胞侵入を増強するため、使用され得る。
【０２０７】
親油性部分には、例えば、ステロール  スタノール、およびステロイドならびに関連化合物、例えば、コレステロール（米国特許第4,958,013号およびLetsinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989,86,6553）、チオコレステロール（Oberhauser et al,Nucl Acids Res.,1992,20,533）、ラノステロール、コプロスタノール、スチグマステロール、エルゴステロール、カルシフェロール、コール酸、デオキシコール酸、エストロン、エストラジオール、エストラトリオール、プロゲステロン、スチルベストロール、テストステロン、アンドロステロン、デオキシコルチコステロン、コルチゾン、17-ヒドロキシコルチコステロン、それらの誘導体等が含まれる。いくつかの態様において、コンジュゲートは、コレステロール、チオコレステロール、ラノステロール、コプロスタノール、スチグマステロール、エルゴステロール、カルシフェロール、コール酸、デオキシコール酸、エストロン、エストラジオール、エストラトリオール、プロゲステロン、スチルベストロール、テストステロン、アンドロステロン、デオキシコルチコステロン、コルチゾン、および17-ヒドロキシコルチコステロンからなる群より選択され得る。その他の親油性コンジュゲート部分には、脂肪族基、例えば、直鎖状、分岐状、および環状のアルキル、アルケニル、およびアルキニルが含まれる。脂肪族基は、例えば、5〜約50個、6〜約50個、8〜約50個、または10〜約50個の炭素原子を有し得る。脂肪族基の例には、ウンデシル、ドデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、ノナデシル、テルペン、ボルニル、アダマンチル、それらの誘導体等が含まれる。いくつかの態様において、脂肪族基内の1個以上の炭素原子が、ヘテロ原子、例えば、O、S、またはNに置換されていてもよい（例えば、ゲラニルオキシヘキシル）。さらなる適当な親油性コンジュゲート部分には、グリセロールの脂肪族誘導体、例えば、アルキルグリセロール、ビス(アルキル)グリセロール、トリス(アルキル)グリセロール、モノグリセリド、ジグリセリド、およびトリグリセリドが含まれる。いくつかの態様において、親油性コンジュゲートは、ジ-ヘキシルデシル-rac-グリセロールもしくは1,2-ジ-O-ヘキシルデシル-rac-グリセロール（Manoharan et al.,Tetrahedron Lett.,1995,36,3651；Shea,et al.,Nuc.Acids Res.,1990,18,3777）、またはそれらのホスホネートである。飽和および不飽和の脂肪族官能性、例えば、脂肪酸、脂肪族アルコール、脂肪酸エステル、および脂肪族アミンも、親油性コンジュゲート部分として役立ち得る。いくつかの態様において、脂肪族官能性は、約6〜約30個または約8〜約22個の炭素を含有し得る。脂肪酸の例には、カプリン酸、カプリル酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、エイコサン酸等が含まれる。
【０２０８】
さらなる態様において、親油性コンジュゲート基は、6〜約50個、10〜約50個、または14〜約40個の炭素原子を有する多環芳香族基であり得る。多環芳香族基の例には、ピレン、プリン、アクリジン、キサンテン、フルオレン、フェナントレン、アントラセン、キノリン、イソキノリン、ナフタレン、それらの誘導体等が含まれる。その他の適当な親油性コンジュゲート部分には、メントール、トリチル（例えば、ジメトキシトリチル（DMT））、フェノキサジン、リポ酸、リン脂質、エーテル、チオエーテル（例えば、ヘキシル-S-トリチルチオール）、それらの誘導体等が含まれる。オリゴマー化合物の親油性コンジュゲートの調製は、当技術分野において、例えば、Saison-Behmoaras et al,EMBO J.,1991,10,1111；Kabanov et al.,FEBSLett.,1990,259,327；Svinarchuk et al,Biochimie,1993,75,49；Mishra et al.,Biochim.Biophys.Acta,1995,1264,229、およびManoharan et al.,Tetrahedron Lett.,1995,36,3651に十分に記載されている。
【０２０９】
低密度リポタンパク質（LDL）に対する親和性を有するコンジュゲート部分を含有しているオリゴマー化合物は、効果的な標的特異的送達系の提供を支援することができる。腫瘍細胞上における、LDLの受容体の高い発現レベルから、LDLは、これらの細胞に対する薬物の選択的送達のための、魅力的な担体である（Rump,et al.,Bioconjugate Chem.,1998,9,341；Firestone,Bioconjugate Chem.,1994,5,105；Mishra,et al.,Biochim.Biophys.Acta,1995,1264,229）。LDLに対する親和性を有する部分には、多くの親油基、例えば、ステロイド（例えば、コレステロール）、脂肪酸、それらの誘導体、およびそれらの組み合わせが含まれる。いくつかの態様において、LDL親和性を有するコンジュゲート部分は、コール酸、例えば、ケノデオキシコール酸およびリトコール酸のジオレイルエステルであり得る。
【０２１０】
いくつかの態様において、親油性コンジュゲートは、グリセリドもしくはグリセリドエステルであってもよいしまたはグリセリドもしくはグリセリドエステルを含んでいてもよい。
【０２１１】
親油性コンジュゲート、例えばステロール、スタノール、およびステイン、例えば、コレステロールまたは本明細書に開示されるものは、オリゴヌクレオチドの、例えば、肝臓（典型的には、ヘパトサイト）への送達を増強するために使用され得る。
【０２１２】
本発明の好ましい態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートのコンジュゲート部分は、コンジュゲート5、5a、6、または6aを含むかまたはそれからなる。最も好ましくは、コンジュゲート部分は、コンジュゲート5aを含むかまたはそれからなる。
【０２１３】
もう一つの好ましい態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、SEQ ID NO 9、10、11、12、13、14、15、16、41、42、および43からなる群より選択される。
【０２１４】
以下の参照も、親油性コンジュゲートの使用に言及している：Kobylanska et al.,Acta Biochim Pol.(1999);46(3):679-91。Felber et al,.Biomaterials(2012)33(25):599-65；Grijalvo et al.,J Org Chem(2010)75(20):6806-13。Koufaki et al.,Curr Med Chem(2009)16(35):4728-42。Godeau et al J.Med.Chem.(2008)51(15):4374-6。
【０２１５】
リンカー（例えば領域BまたはY）
連結またはリンカーは、1個以上の共有結合を介して、ある関心対象の化学基またはセグメントを、もう一つの関心対象の化学基またはセグメントに連結する、2個の原子の間の接続である。コンジュゲート部分（またはターゲティング部分またはブロッキング部分）は、直接、または連結部分（リンカーもしくはテザー）を通して、オリゴマー化合物に付着し得る。リンカーは、第3領域、例えば、コンジュゲート部分を、オリゴマー化合物（例えば、領域A）に、共有結合で接続するために役立つ二官能性部分である。いくつかの態様において、リンカーは、反復単位、例えば、エチレングリコール単位またはアミノ酸単位の鎖構造またはオリゴマーを含む。リンカーは、少なくとも2種類の官能性を有することができ、一つは、オリゴマー化合物に対する付着のためのものであり、他方は、コンジュゲート部分に対する付着のためのものである。リンカーの官能性の例は、オリゴマー上もしくはコンジュゲート部分上の求核基と反応するため求電子性であるか、または求電子基と反応するため求核性であり得る。いくつかの態様において、リンカーの官能性には、アミノ、ヒドロキシル、カルボン酸、チオール、ホスホルアミダート、ホスホロチオエート、ホスフェート、ホスファイト、不飽和（例えば、二重結合または三重結合）等が含まれる。リンカーのいくつかの例には、8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸（ADO）、サクシニミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-l-カルボキシレート（SMCC）、6-アミノヘキサン酸（AHEXまたはAHA）、6-アミノヘキシルオキシ、4-アミノ酪酸、4-アミノシクロヘキシルカルボン酸、サクシニミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-l-カルボキシ-(6-アミド-カプロエート)（LCSMCC）、サクシニミジルm-マレイミド-ベンゾイレート（MBS）、サクシニミジルN-e-マレイミド-カプロイレート（EMCS）、サクシニミジル6-(β-マレイミド-プロピオンアミド)ヘキサノエート（SMPH）、サクシニミジルN-(a-マレイミドアセテート)（AMAS）、サクシニミジル4-(p-マレイミドフェニル)ブチレート（SMPB）、β-アラニン（β-ALA）、フェニルグリシン（PHG）、4-アミノシクロヘキサン酸（ACHC）、β-(シクロプロピル)アラニン（β-CYPR）、アミノドデカン酸（ADC）、アルキレンジオール、ポリエチレングリコール、アミノ酸等が含まれる。
【０２１６】
コンジュゲート部分のオリゴマー化合物への付着において有用であり得る多様なさらなるリンカー基が、当技術分野において公知である。有用なリンカー基の多くの概説が、例えば、Antisense Research and Applications,S.T.Crooke and B.Lebleu,Eds.,CRC Press,Boca Raton,Fla.,1993,p.303-350に見出され得る。ジスルフィド連結は、オリゴヌクレオチドの3'末端を、ペプチドに連結するために使用されている（Corey,et al.,Science 1987,238,1401；Zuckermann,et al,J Am.Chem.Soc.1988,110,1614；およびCorey,et al.,J Am.Chem.Soc.1989,111,8524）。Nelson,et al.,Nuc.Acids Res.1989,17,7187は、オリゴヌクレオチドの3'末端にビオチンを付着させるための連結試薬を記載している。この試薬、N-Fmoc-O-DMT-3-アミノ-1,2-プロパンジオールは、3'-Amineの名称でClontech Laboratories（Palo Alto,Calif.）から市販されている。それは、Glen Research Corporation（Sterling,Va.）からも3'-Amino-Modifier試薬の名称で市販されている。この試薬は、Judy,et al.,Tetrahedron Letters 1991,32,879によって報告されたように、ペプチドをオリゴヌクレオチドに連結するためにも利用された。オリゴヌクレオチドの5'末端に連結するための類似の市販の試薬は、5'-Amino-Modifier C6である。これらの試薬は、Glen Research Corporation（Sterling,Va.）から入手可能である。これらの化合物または類似のものは、フルオレセインをオリゴヌクレオチドの5'末端に連結するため、Krieg,et al,Antisense Research and Development 1991,1,161によって利用された。他の化合物、例えば、アクリジンは、ポリメチレン連結を介して、オリゴヌクレオチドの3'末端ホスフェート基に付着させられた（Asseline,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1984,81,3297）。上記の基のいずれかは、単一のリンカーとして、または1種以上のさらなるリンカーと組み合わせて使用され得る。
【０２１７】
リンカー、およびオリゴマー化合物のコンジュゲートの調製におけるそれらの使用は、当技術分野において、例えば、各々参照によってその全体が組み入れられる、WO96/11205およびWO98/52614ならびに米国特許第4,948,882号；第5,525,465号；第5,541,313号；第5,545,730号；第5,552,538号；第5,580,731号；第5,486,603号；第5,608,046号；第4,587,044号；第4,667,025号；第5,254,469号；第5,245,022号；第5,112,963号；第5,391,723号；第5,510475号；第5,512,667号；第5,574,142号；第5,684,142号；第5,770,716号；第6,096,875号；第6,335,432号；および第6,335,437号、WO2012/083046に提供されている。
【０２１８】
本明細書において使用される、生理学的に不安定な結合とは、哺乳動物体内に通常見られる条件またはそれに類似している条件の下で切断可能である不安定結合である（切断可能リンカーとも呼ばれ、図12および13において領域Bとして例示される）。生理学的に不安定な連結基は、ある特定の生理学的条件に存在する時に化学的変換（例えば、切断）を受けるよう選択される。哺乳動物の細胞内の条件には、哺乳動物細胞内に見出される化学的条件、例えば、pH、温度、酸化条件もしくは還元条件、酸化剤もしくは還元剤、および塩濃度、またはそれらに類似している条件が含まれる。哺乳動物の細胞内の条件には、哺乳動物細胞に通常存在する、例えば、タンパク質分解酵素または加水分解酵素からの酵素活性の存在も含まれる。いくつかの態様において、切断可能リンカーは、例えば、標的細胞において発現され得るヌクレアーゼに対して感受性であり、従って、本明細書に詳述されるように、リンカーは、例えば、1〜10個のホスホジエステルによって連結されたヌクレオシド、例えば、DNAヌクレオシドの短い領域であり得る。
【０２１９】
化学的変形（不安定結合の切断）は、薬学的に許容される薬剤の細胞への添加によって開始し得るか、または不安定結合を含有している分子が、適切な細胞内および／もしくは細胞外の環境に到達した時に自然に起こり得る。例えば、pH不安定結合は、分子が酸性化されたエンドソームに進入する時に切断され得る。従って、pH不安定結合は、エンドソーム切断可能結合であると見なされ得る。酵素切断可能結合は、酵素、例えば、エンドソームもしくはリソソームまたは細胞質に存在するものに曝された時に切断され得る。ジスルフィド結合は、細胞質のより還元性の環境に分子が進入する時に切断され得る。従って、ジスルフィドは、細胞質切断可能結合であると見なされ得る。本明細書において使用される、pH不安定結合とは、酸性条件（pH＜7）下で選択的に分解される不安定結合である。細胞エンドソームおよびリソソームは7未満のpHを有するため、そのような結合は、エンドソーム不安定結合とも名付けられ得る。
【０２２０】
オリゴマーと連結された生物切断性コンジュゲート
オリゴマー化合物は、任意で、オリゴマー（領域Aと呼ばれる）とコンジュゲート（領域Cと呼ばれる）との間に位置する第2領域（領域B）を含み得る（図12および13の図示を参照）。領域Bは、リンカー、例えば、切断可能なリンカー（生理学的に不安定な連結とも呼ばれる）であり得る。ヌクレアーゼ感受性の生理学的に不安定な連結：いくつかの態様において、本発明のオリゴマー（オリゴマー化合物とも呼ばれる）、（またはコンジュゲート）は、以下の3種の領域を含む：
（i）10〜18個の連続ヌクレオチドを含む第1領域（領域A）；
（ii）生物切断性リンカーを含む第2領域（領域B）
（iii）コンジュゲート部分、ターゲティング部分、活性化部分を含み、第2領域に共有結合で連結されている、第3領域（C）。
【０２２１】
いくつかの態様において、領域Bは、ホスフェートヌクレオチドリンカーであり得る。例えば、そのようなリンカーは、コンジュゲートが、親油性コンジュゲート、例えば、脂質、脂肪酸、ステロール、例えば、コレステロールまたはトコフェロールである時、使用され得る。ホスフェートヌクレオチドリンカーは、他のコンジュゲート、例えば、炭水化物コンジュゲート、例えば、GalNacのためにも使用され得る。
【０２２２】
ペプチドリンカー
いくつかの態様において、生物切断性リンカー（領域B）は、ポリGalNacコンジュゲート、例えば、トリGalNacコンジュゲートにおいて使用され得るペプチド、例えば、トリリジンペプチドリンカーである。本明細書において言及されるペプチドビラジカルも参照されたい。
【０２２３】
使用され得る当技術分野において公知の他のリンカーは、ジスルフィドリンカーを含む。
【０２２４】
ホスフェートヌクレオチドリンカー
いくつかの態様において、領域Bは、例えば、ヌクレオシド間連結基、例えば、ホスホジエステル連結を介して、第1領域の5'ヌクレオチドまたは3'ヌクレオチドに共有結合で連結された1〜6個のヌクレオチドを含み、ここで、
a．第1領域と第2領域との間のヌクレオシド間連結は、ホスホジエステル連結であり、第1領域に［例えば、直接］隣接している第2領域のヌクレオシドは、DNAもしくはRNAのいずれかであり；かつ／または
b．第2領域の少なくとも1個のヌクレオシドは、ホスホジエステルによって連結されたDNAヌクレオシドもしくはRNAヌクレオシドである。
【０２２５】
いくつかの態様において、領域Aおよび領域Bは、12〜22ヌクレオチド長の単一の連続ヌクレオチド配列を形成する。
【０２２６】
いくつかの局面において、第1領域と第2領域との間のヌクレオシド間連結は、第2領域の一部と見なされ得る。
【０２２７】
いくつかの態様において、第2領域と第3領域との間にリン含有連結基が存在する。リン連結基は、例えば、ホスフェート（ホスホジエステル）基、ホスホロチオエート基、ホスホロジチオエート基、またはボラノホスフェート基であり得る。いくつかの態様において、このリン含有連結基は、第2領域と、第3領域に付着しているリンカー領域との間に位置する。いくつかの態様において、ホスフェート基はホスホジエステルである。
【０２２８】
従って、いくつかの局面において、オリゴマー化合物は、少なくとも2個のホスホジエステル基を含み、少なくとも1個は、本発明の上記の通りであり、その他は、第2領域と第3領域との間、任意で、リンカー基と第2領域との間に位置する。
【０２２９】
いくつかの態様において、第3領域は、活性化基、例えばコンジュゲーションにおいて使用するための活性化基である。この点で、本発明は、領域Aおよび領域Bならびに活性化基を含む活性化されたオリゴマー、例えば、その後の第3領域との連結に適した、例えばコンジュゲーションに適した中間体も提供する。
【０２３０】
いくつかの態様において、第3領域は、反応基、例えばコンジュゲーションにおいて使用するための反応基である。この点で、本発明は、領域Aおよび領域Bならびに反応基を含むオリゴマー、例えば、その後の第3領域との連結に適した、例えばコンジュゲーションに適した中間体も提供する。反応基は、いくつかの態様において、アミン基またはアルコール基、例えば、アミン基を含み得る。
【０２３１】
いくつかの態様において、領域Aは、ホスホジエステル以外のヌクレオシド間連結、例えば、（任意で独立に）ホスホロチオエート、ホスホジチオエート、およびボラノホスフェート、およびメチルホスホネートからなる群より選択されるヌクレオシド間連結、例えば、ホスホロチオエートを、少なくとも1個、例えば、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、または21個、含む。いくつかの態様において、領域Aは、少なくとも1個のホスホロチオエート連結を含む。いくつかの態様において、ヌクレオシド間連結の少なくとも50％、例えば少なくとも75％、例えば少なくとも90％、例えば、領域A内の全てのヌクレオシド間連結が、ホスホジエステル以外であり、例えば、ホスホロチオエート連結である。いくつかの態様において、領域A内の全てのヌクレオシド間連結が、ホスホジエステル以外である。
【０２３２】
いくつかの態様において、オリゴマー化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートを含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、第1領域、任意で、第1領域および第2領域であってもよいしまたはそれを含んでいてもよい。この点で、いくつかの態様において、領域Bは、（核酸）標的に相補的な連続核酸塩基配列の一部を形成し得る。他の態様において、領域Bは、標的との相補性を欠いていてもよい。
【０２３３】
換言すると、いくつかの態様において、本発明は、ホスホジエステル連結を介してオリゴヌクレオチドの隣接ヌクレオシドに連結された少なくとも1個の末端（5'および／または3'）のDNAヌクレオシドまたはRNAヌクレオシドを有する、非ホスホジエステルによって連結された、例えば、ホスホロチオエートによって連結されたオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）を提供する。末端のDNAヌクレオシドまたはRNAヌクレオシドは、任意でリンカー部分を介して、コンジュゲート部分、ターゲティング部分、またはブロッキング部分にさらに共有結合で連結されている。
【０２３４】
いくつかの態様において、オリゴマー化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートを含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、第1領域であってもよいしまたはそれを含んでいてもよい、任意で、第2領域を含んでいてもよい。この点で、いくつかの態様において、領域Bは、（核酸）標的に相補的な連続核酸塩基配列の一部を形成し得る。他の態様において、領域Bは、標的との相補性を欠いていてもよい。
【０２３５】
いくつかの態様において、第2領域の少なくとも2個の連続ヌクレオシドは、DNAヌクレオシド（例えば、少なくとも3個または4個または5個の連続DNAヌクレオシド）である。  
【０２３６】
そのような態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、以下の式によって説明され得る：
5'-A-PO-B[Y]X-3'  または  3'-A-PO-B[Y]X-5'
式中、Aは、領域Aであり、POは、ホスホジエステル連結であり、Bは、領域Bであり、Yは、任意の連結基であり、Xは、コンジュゲート基、ターゲティング基、ブロッキング基、または反応基もしくは活性化基である。
【０２３７】
いくつかの態様において、領域Bは、3'〜5'または5'〜3'に：（i）領域Aの5'または3'ヌクレオシドとのホスホジエステル連結、（ii）DNAヌクレオシドまたはRNAヌクレオシド、例えば、DNAヌクレオシド、および（iii）さらなるホスホジエステル連結を含む。
5'-A-PO-B-PO-3'  または  3'-A-PO-B-PO-5'
【０２３８】
さらなるホスホジエステル連結は、領域Bのヌクレオシドを、1個以上のさらなるヌクレオシド、例えば、1個以上のDNAヌクレオシドもしくはRNAヌクレオシドに連結するか、または、任意で連結基（Y）を介して、X（コンジュゲート基、ターゲティング基、もしくはブロッキング基、もしくは反応基もしくは活性化基）に連結することができる。
【０２３９】
いくつかの態様において、領域Bは、3'〜5'または5'〜3'に：（i）領域Aの5'または3'ヌクレオシドとのホスホジエステル連結、（ii）2〜10個の、ホスホジエステルによって連結されたDNAまたはRNAヌクレオシド、例えば、DNAヌクレオシド、および任意で（iii）さらなるホスホジエステル連結を含む：
5'-A-[PO-B]n-[Y]-X 3'  または  3'-A-[PO-B]n-[Y]-X 5'
5'-A-[PO-B]n-PO-[Y]-X 3'  または  3'-A-[PO-B]n-PO-[Y]-X 5'
式中、Aは、領域Aを表し、[PO-B]nは、領域Bを表し、nは、1〜10、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10であり、POは、領域BとX（または存在する場合、Y）との間の任意でのホスホジエステル連結基である。
【０２４０】
いくつかの態様において、本発明は、以下の式のうちの一つによる（またはそれを含む）化合物を提供する。
5' [領域A]-PO-[領域B] 3'-Y-X
5' [領域A]-PO-[領域B]-PO 3'-Y-X
5' [領域A]-PO-[領域B] 3'-X
5' [領域A]-PO-[領域B]-PO 3'-X
3' [領域A]-PO-[領域B] 5'-Y-X
3' [領域A]-PO-[領域B]-PO 5'-Y-X
3' [領域A]-PO-[領域B] 5'-X
3' [領域A]-PO-[領域B]-PO 5'-X
【０２４１】
領域Bは、例えば、以下のものを含むかまたはそれからなる。
5' DNA 3'
3' DNA 5'
5' DNA-PO-DNA-3'
3' DNA-PO-DNA-5'
5' DNA-PO-DNA-PO-DNA 3'
3' DNA-PO-DNA-PO-DNA 5'
5' DNA-PO-DNA-PO-DNA-PO-DNA 3'
3' DNA-PO-DNA-PO-DNA-PO-DNA 5'
5' DNA-PO-DNA-PO-DNA-PO-DNA-PO-DNA 3'
3' DNA-PO-DNA-PO-DNA-PO-DNA-PO-DNA 5'
【０２４２】
ホスフェート連結生物切断性リンカーはDNAおよびRNA以外のヌクレオシドを利用し得ることが認識されるべきである。生物切断性ヌクレオチドリンカーは、実施例6におけるアッセイを使用して同定することができる。
【０２４３】
いくつかの態様において、本発明の化合物は、オリゴマー（または連続ヌクレオチド配列または領域A）をコンジュゲート部分（または領域C）に接合する、生物切断性リンカー（生理学的に不安定なリンカー、ヌクレアーゼ感受性の生理学的に不安定な連結、またはヌクレアーゼ感受性リンカーとも呼ばれる）、例えば、ホスフェートヌクレオチドリンカー（例えば、領域B）またはペプチドリンカーを含む。
【０２４４】
実施例6に示されるアッセイにおける切断に対する感受性は、リンカーが生物切断性であるかまたは生理学的に不安定であるかどうかを決定するために使用することができる。
【０２４５】
本発明による生物切断性リンカーとは、標的組織、例えば、肝臓および／または腎臓において、切断に対して感受性（即ち、生理学的に不安定）であるリンカーをさす。標的組織において見られる切断速度は、血清において見られるものより大きいことが好ましい。組織（例えば、肝臓または腎臓）および血清における切断のレベル（％）を決定するための適当な方法は、実施例6に見出される。いくつかの態様において、本発明の化合物における生物切断性リンカー（生理学的に不安定なリンカーまたはヌクレアーゼ感受性リンカーとも呼ばれる）、例えば、領域Bは、実施例6の肝臓または腎臓のホモジネートアッセイにおいて、少なくとも約20％切断され、例えば、少なくとも約30％切断され、例えば、少なくとも約40％切断され、例えば、少なくとも約50％切断され、例えば、少なくとも約60％切断され、例えば、少なくとも約70％切断され、例えば、少なくとも約75％切断される。いくつかの態様において、実施例6におけるアッセイにおいて使用される血清における切断（％）は、約30%未満、約20％未満、例えば、約10％未満、例えば、5％未満、例えば、約1％未満である。
【０２４６】
同一であってもよいしまたは異なっていてもよいいくつかの態様において、本発明の化合物における生物切断性リンカー（生理学的に不安定なリンカーまたはヌクレアーゼ感受性リンカーとも呼ばれる）、例えば、領域Bは、S1ヌクレアーゼ切断に対して感受性である。S1切断に対する感受性は、実施例6において示されるS1ヌクレアーゼアッセイを使用して評価され得る。いくつかの態様において、本発明の化合物における生物切断性リンカー（生理学的に不安定なリンカーまたはヌクレアーゼ感受性リンカーとも呼ばれる）、例えば、領域Bは、実施例6において使用されるアッセイによるS1ヌクレアーゼとの120分のインキュベーションの後に、少なくとも約30％切断され、例えば、少なくとも約40％切断され、例えば、少なくとも約50％切断され、例えば、少なくとも約60％切断され、例えば、少なくとも約70％切断され、例えば、少なくとも約80％切断され、例えば、少なくとも約90％切断され、例えば、少なくとも95％切断される。
【０２４７】
第2領域における配列選択：
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチド領域AおよびBを、相補的な標的配列と整列させた時、領域Bは相補的な配列を形成しない。
【０２４８】
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチド領域AおよびBを、相補的な標的配列と整列させた時、領域Bは相補的な配列を形成する。この点で、領域Aおよび領域Bは、共に、標的配列に相補的である単一の連続配列を形成し得る。
【０２４９】
いくつかの態様において、領域B内の塩基の配列は、標的の組織または細胞または細胞内コンパートメントに存在する優勢なエンドヌクレアーゼ切断酵素に基づき、最適のエンドヌクレアーゼ切断部位を提供するよう選択される。この点で、標的組織および非標的組織から細胞抽出物を単離することによって、非標的細胞（例えば、腎臓）と比較して、所望の標的細胞（例えば、肝臓／ヘパトサイト）において優先的な切断活性に基づき、領域Bにおいて使用するためのエンドヌクレアーゼ切断配列が、選択され得る。この点で、標的ダウンレギュレーションのための化合物の効力は、所望の組織／細胞のために最適化され得る。
【０２５０】
いくつかの態様において、領域Bは、配列AA、AT、AC、AG、TA、TT、TC、TG、CA、CT、CC、CG、GA、GT、GC、またはGG（Cは5-メチルシトシンであってもよくかつ／またはTはUに交換されてもよい）のジヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、領域Bは、配列
2018064575.tif 000023
（Cは5-メチルシトシンであってもよくかつ／またはTはUに交換されてもよい）のトリヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、領域Bは、配列
2018064575.tif 000024
（Xは、A、T、U、G、C、およびそれらの類似体からなる群より選択され得、Cは5-メチルシトシンであってもよく、かつ／またはTはUに交換されてもよい）のトリヌクレオチドを含む。（天然に存在する）核酸塩基A、T、U、G、Cに言及する時、これらは、等価な天然核酸塩基として機能する（例えば、相補的なヌクレオシドと塩基対形成する）核酸塩基類似体に置換されてもよいことが認識されるであろう。いくつかの態様において、領域BはTもUも含まない。
【０２５１】
アミノアルキル中間体
本発明は、アミノアルキルリンカー、例えば、C2〜C36アミノアルキル基、例えば、C6〜C12アミノアルキル基、例えば、C6アミノアルキル基およびC12アミノアルキル基を（例えば、5'末端または3'末端に）含むアンチセンスLNAオリゴマーを含むLNAオリゴマー中間体をさらに提供する。アミノアルキル基は、例えば、（例えば、保護された）アミノアルキルホスホラミダイトを使用した標準的なオリゴヌクレオチド合成の一部としてLNAオリゴマーに付加され得る。アミノアルキルとLNAオリゴマーとの間の連結基は、例えば、ホスホロチオエートもしくはホスホジエステル、または、例えば、本明細書において言及されたその他のヌクレオシド連結基のうちの1種であり得る。アミノアルキル基は、例えば、ヌクレオシド連結基、例えば、ホスホロチオエート連結またはホスホジエステル連結によって、例えば、LNAオリゴマーの5'または3'に共有結合で連結され得る。
【０２５２】
本発明は、例えば、オリゴヌクレオチド合成の最初または最後のラウンドにおいて、アミノアルキル基をオリゴマーに付加する工程を含む、LNAオリゴマーの逐次合成、例えば、固相オリゴヌクレオチド合成を含む、LNAオリゴマーの合成の方法も提供する。合成の方法は、コンジュゲートをアミノアルキル-LNAオリゴマーと反応させる工程（コンジュゲーション工程）をさらに含み得る。コンジュゲートは、適当なリンカーおよび／または分岐点基を含んでいてよく、本明細書に記載されるさらなるコンジュゲート基、例えば、疎水基または親油基を任意で含んでいてもよい。コンジュゲーション工程は、オリゴマーが固体支持体に結合している間（例えば、オリゴヌクレオチド合成の後、固体支持体からのオリゴマーの溶出の前）に実施されてもよいし、またはその後（即ち、溶出の後）に実施されてもよい。本発明は、本発明のオリゴマーの合成におけるアミノアルキルリンカーの使用を提供する。
【０２５３】
製造／合成の方法
本発明は、オリゴマー化合物、例えば、本発明のオリゴマー化合物の合成（または製造）方法を提供し、本法は、
（a）以下のうちの一つ［第3領域］：
（i）リンカー基（-Y-）、
（ii）コンジュゲート、ターゲティング基、ブロッキング基、反応基［例えば、アミンもしくはアルコール］、または活性化基からなる群より選択される基（X-）、
（iii）-Y-X基
が付着している［固相］オリゴヌクレオチド合成支持体を準備する工程、ならびに
（b）領域B、続いて、領域Aの［逐次］オリゴヌクレオチド合成の工程、ならびに／または
（c）第1領域（A）および第2領域（B）の［逐次］オリゴヌクレオチド合成の工程を含み、合成工程に続いて、
（d）第3領域［ホスホラミダイトを含む］である、
（i）リンカー基（-Y-）、
（ii）コンジュゲート、ターゲティング基、ブロッキング基、反応基［例えば、アミンもしくはアルコール］、または活性化基からなる群より選択される基（X-）、
（iii）-Y-X基
を付加する工程、それに続いて、
（e）［固相］支持体からオリゴマー化合物を切断する工程
を含み、任意で、
（f）第3の基が活性化基であり、反応基を生成するため活性化基を活性化し、続いて、任意でリンカー基（Y）を介して、コンジュゲート基、ブロッキング基、またはターゲティング基を反応基に付加する工程；
（g）第3領域が反応基であり、任意でリンカー基（Y）を介して、コンジュゲート基、ブロッキング基、またはターゲティング基を反応基に付加する工程、
（h）第3領域がリンカー基（Y）であり、コンジュゲート基、ブロッキング基、またはターゲティング基をリンカー基（Y）に付加する工程
より選択されるさらなる工程
をさらに含み、
工程（f）、（g）、または（h）は、オリゴヌクレオチド合成支持体からのオリゴマー化合物の切断の前または後のいずれかに実施される。いくつかの態様において、本法は、標準的なホスホラミダイト化学を使用して実施され得、従って、領域Xおよび／または領域Xまたは領域XおよびYは、ホスホラミダイトとして、オリゴマーへの組み入れの前に準備され得る。本発明の方法の非限定的な局面を例示する図5〜10を参照されたい。
【０２５４】
本発明は、オリゴマー化合物、例えば、本発明のオリゴマー化合物の合成（または製造）方法を提供し、本法は、
第1領域（A）および第2領域（B）の逐次オリゴヌクレオチド合成の工程
を含み、この合成工程の後に、第3領域［ホスホラミダイトを含む］である領域X（領域Cとも呼ばれる）、もしくはY、例えば、コンジュゲート、ターゲティング基、ブロッキング基、官能基、反応基（例えば、アミンもしくはアルコール）、もしくは活性化基（X）からなる群より選択される基を含む領域、または-Y-X基を付加する工程、それに続く、［固相］支持体からオリゴマー化合物を切断する工程を含む。
【０２５５】
しかしながら、領域XまたはX-Yは、固体支持体からの切断の後に付加されてもよいことが認識される。あるいは、合成の方法は、第1領域（A）、および任意で第2領域（B）を合成する工程、続いて、支持体からオリゴマーを切断する工程、ならびに第3領域、例えば、X基またはX-Y基をオリゴマーへ付加するその後の工程を含み得る。第3領域の付加は、例えば、（支持体上の）オリゴマー合成の最終工程においてアミノホスホラミダイト単位を添加することによって達成され得る。それは、支持体からの切断の後に、任意でX基上またはY基（存在する場合）上の活性化基を介して、X基またはX-Y基と接合するために使用され得る。切断可能リンカーがヌクレオチド領域でない態様において、領域Bは、領域X（領域Cとも呼ばれる）の一部を形成するかまたは領域Y（もしくはその一部）であり得る非ヌクレオチド切断可能リンカー、例えば、ペプチドリンカーであり得る。
【０２５６】
方法のいくつかの態様において、領域X（例えば、C）または（X-Y）、例えばコンジュゲート（例えば、GalNAcコンジュゲート）は、活性化基（活性化された官能基）を含み、合成の方法において、活性化されたコンジュゲート（または領域xまたはX-Y）が、第1領域および第2領域、例えば、アミノによって連結されたオリゴマーに付加される。アミノ基は、標準的なホスホラミダイト化学によって、例えば、（典型的には、オリゴマーの5'末端にアミノ基をもたらす）オリゴマー合成の最終工程として、オリゴマーに付加され得る。例えば、オリゴヌクレオチド合成の最終工程において、保護されたアミノ-アルキルホスホラミダイト、例えば、TFA-アミノC6ホスホラミダイト（6-(トリフルオロアセチルアミノ)-ヘキシル-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)-ホスホラミダイト）が使用される。
【０２５７】
領域X（または本明細書において言及される領域C）、例えばコンジュゲート（例えば、GalNacコンジュゲート）は、NHSエステル法を介して活性化され得、次いで、アミノによって連結されたオリゴマーが付加される。例えば、N-ヒドロキシサクシニミド（NHS）が、領域X（または領域C）、例えばコンジュゲート、例えばGalNacコンジュゲート部分のための活性化基として使用され得る。
【０２５８】
本発明は、本発明の方法によって調製されたオリゴマーを提供する。
【０２５９】
いくつかの態様において、領域Xおよび／または領域Xまたは領域XおよびYは、ホスホジエステルもしくはホスホロチオエートを含むホスフェートヌクレオシド連結、例えば、本明細書に記載されたものを介して、または代替的な基、例えば、トリアゾール基を介して、領域Bに共有結合で接合（連結）され得る。
【０２６０】
いくつかの態様において、第1領域と第2領域との間のヌクレオシド間連結は、第2領域の最初の（または唯一の）DNAヌクレオシドまたはRNAヌクレオシドに連結されたホスホジエステルであるか、または領域Bが、少なくとも1個のホスホジエステルによって連結されたDNAヌクレオシドまたはRNAヌクレオシドを含む。
【０２６１】
第2領域は、いくつかの態様において、ホスホジエステルによって連結され得るさらなるDNAヌクレオシドまたはRNAヌクレオシドを含み得る。第2領域は、例えば、コンジュゲート、ターゲティング基、反応基、および／またはブロッキング基であり得る第3領域に、さらに共有結合で連結されている。
【０２６２】
いくつかの局面において、本発明は、第1領域、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドと、コンジュゲート基または官能基、例えば、ターゲティング基またはブロッキング基とを連結する、不安定領域である第2領域の提供に基づく。不安定領域は、少なくとも1個のホスホジエステルによって連結されたヌクレオシド、例えば、DNAヌクレオシドまたはRNAヌクレオシド、例えば1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、または10個のホスホジエステルによって連結されたヌクレオシド、例えばDNAまたはRNAを含む。いくつかの態様において、オリゴマー化合物は、切断可能（不安定）リンカーを含む。この点で、切断可能リンカーは、好ましくは、領域B内（または、いくつかの態様において、領域Aと領域Bとの間）に存在する。
【０２６３】
換言すると、いくつかの態様において、本発明は、ホスホジエステル連結を介してオリゴヌクレオチドの隣接ヌクレオシドに連結された少なくとも1個の末端（5'および／または3'）のDNAヌクレオシドまたはRNAヌクレオシドを有する、非ホスホジエステルによって連結された、例えば、ホスホロチオエートによって連結されたオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）を提供する。末端のDNAヌクレオシドまたはRNAヌクレオシドは、任意でリンカー部分を介して、コンジュゲート部分、ターゲティング部分、またはブロッキング部分にさらに共有結合で連結されている。
【０２６４】
組成物
本発明のオリゴマーまたはオリゴマーコンジュゲートは、薬学的な製剤および組成物において使用され得る。適宜、そのような組成物は、薬学的に許容される希釈剤、担体、塩、またはアジュバントを含む。WO2007/031091は、適当な好ましい薬学的に許容される希釈剤、担体、およびアジュバントを提供しており、それらは、参照によって本明細書に組み入れられる。適当な投薬量、製剤、投与経路、組成物、剤形、他の治療剤との組み合わせ、プロドラッグ製剤も、WO2007/031091に提供されており、それらも、参照によって本明細書に組み入れられる。
【０２６５】
用途
本発明のオリゴマーまたはオリゴマーコンジュゲートは、例えば、診断、治療、および予防のための研究試薬として利用され得る。
【０２６６】
研究において、そのようなオリゴマーは、細胞および実験動物において（典型的には、mRNAを分解するかまたは阻害し、それによって、タンパク質形成を防止することによって）PCSK9タンパク質の合成を特異的に阻害し、それによって、標的の機能的分析、または治療的介入のための標的としての有用性の評価を容易にするために使用され得る。
【０２６７】
診断法においては、本オリゴマーは、ノーザンブロッティング、インサイチューハイブリダイゼーション、または類似の技術による細胞および組織におけるPCSK9発現の検出および定量化のために使用され得る。
【０２６８】
治療に関しては、PCSK9の発現を調節することによって処置され得る疾患または障害を有すると推測される動物またはヒトが、本発明によるオリゴマー化合物を投与することによって処置される。本発明のオリゴマーまたは組成物のうちの1種以上を、治療的にまたは予防的に有効な量で投与することによって、哺乳動物を処置する方法、例えば、PCSK9の発現に関連した疾患または状態を有するかまたはその素因を有すると推測されるヒトを処置する方法が、さらに提供される。本発明によるオリゴマー、コンジュゲート、または薬学的組成物は、典型的には、有効量で投与される。
【０２６９】
本発明は、本明細書において言及される障害の処置のための医薬の製造のための、または本明細書において言及される障害の処置の方法のための、記載される本発明の化合物またはコンジュゲートの使用も提供する。
【０２７０】
本発明は、本明細書に記載される本発明による化合物、および／または本発明によるコンジュゲート、および／または本発明による薬学的組成物を、その必要のある患者へ投与する工程を含む、本明細書において言及される障害を処置する方法も提供する。
【０２７１】
医学的適応症
本発明によるオリゴマー、オリゴマーコンジュゲート、およびその他の組成物は、PCSK9の過剰発現または変異型発現に関連した状態の処置のために使用され得る。
【０２７２】
本発明は、本明細書において言及される疾患、障害、または状態の処置のための医薬の製造における本発明の化合物の使用をさらに提供する。
【０２７３】
大まかに述べると、本発明の一つの局面は、1個以上のLNA単位を含む、PCSK9を標的とする治療的に有効な量のオリゴマーまたはオリゴマーコンジュゲートを哺乳動物へ投与する工程を含む、PCSK9の異常なレベルおよび／または活性に関連した状態に罹患しているかまたは罹患し易い哺乳動物を処置する方法に関する。本発明によるオリゴマー、コンジュゲート、または薬学的組成物は、典型的には、有効量、投与される。
【０２７４】
本明細書において言及される疾患または障害は、いくつかの態様において、PCSK9遺伝子、またはPCSK9に関連しているかもしくはPCSK9と相互作用するタンパク質産物の遺伝子における変異に関連している。従って、いくつかの態様において、標的mRNAは、PCSK9配列の変異した形態である。
【０２７５】
本発明の重要な局面は、本明細書において言及される疾患、障害、または状態の処置のための医薬の調製のための、本明細書において定義されるオリゴマー（化合物）または本明細書において定義されるコンジュゲートの使用に関する。
【０２７６】
本発明の方法は、好ましくは、PCSK9の異常なレベルおよび／または活性によって引き起こされた疾患に対する処置または予防のために利用される。
【０２７７】
換言すると、いくつかの態様において、本発明は、本発明のオリゴマーまたは本発明のコンジュゲートまたは本発明の薬学的組成物を、その必要のある患者へ投与する工程を含む、PCSK9の異常なレベルおよび／または活性を処置する方法にさらに関する。
【０２７８】
本発明は、医薬として使用するための、本明細書において定義されるオリゴマー、組成物、またはコンジュゲートにも関する。
【０２７９】
本発明は、PCSK9の異常なレベルおよび／もしくは活性またはPCSK9の変異体形態（例えば、対立遺伝子バリアント、例えば、本明細書において言及された疾患のうちの一つに関連したもの）の発現の処置のための医薬の製造のための、本明細書において定義される化合物、組成物、またはコンジュゲートの使用にさらに関する。
【０２８０】
さらに、本発明は、疾患または状態、例えば、本明細書において言及されたものに罹患している対象を処置する方法に関する。
【０２８１】
処置を必要とする患者は、疾患もしくは障害に罹患しているかまたは罹患する可能性が高い患者である。
【０２８２】
いくつかの態様において、「処置」という用語は、本明細書において使用されるように、既存の疾患（例えば、本明細書において言及される疾患もしくは障害）の処置、または疾患の防止、即ち、予防の両方をさす。従って、本明細書において言及される処置とは、いくつかの態様において、予防的であり得ることが認識されるであろう。
【０２８３】
一つの態様において、本発明は、高コレステロール血症および関連障害の処置のための化合物もしくは化合物を含む組成物、または高コレステロール血症および関連障害を処置するためのそのような化合物もしくは組成物を使用した処置の方法に関する。高コレステロール血症に言及する場合、「関連障害」という用語は、以下のものからなる群より選択される状態のうちの一つ以上をさす：アテローム性動脈硬化症、高脂血症、高コレステロール血症、家族性高コレステロール血症、例えば、PCSK9の機能獲得型変異、HDL/LDLコレステロール不均衡、脂質異常症、例えば、家族性高脂血症（FCHL）もしくは家族性高コレステロール血症（FHC）、後天性高脂血症、スタチン抵抗性高コレステロール血症、冠動脈疾患（CAD）、および冠動脈性心疾患（CHD）。
【０２８４】
併用療法
いくつかの態様において、本発明の化合物は、他の治療剤との併用療法において使用するためのものである。例えば、HMG CoA還元酵素の阻害剤、例えば、スタチンが、代謝疾患の処置において広く使用されている（併用療法の例については、参照によって本明細書に組み入れられるWO2009/043354を参照すること）。併用療法は、その他のコレステロール低下化合物、例えば、胆汁酸塩捕捉樹脂（例えば、コレスチラミン、コレスチポール、およびコレセベラム塩酸塩）、HMGCoA還元酵素阻害剤（例えば、ロバスタチン、セリバスタチン、プラバスタチン、アトルバスタチン、シンバスタチン、ロスバスタチン、およびフルバスタチン）、ニコチン酸、フィブリン酸誘導体（例えば、クロフィブラート、ゲムフィブロジル、フェノフィブラート、ベザフィブラート、およびシプロフィブラート）、プロブコール、ネオマイシン、デキストロチロキシン、植物スタノールエステル、コレステロール吸収阻害剤（例えば、エゼチミブ）、インプリタピド（implitapide）、胆汁酸輸送体（頂端側ナトリウム依存性胆汁酸輸送体）の阻害剤、肝CYP7aの制御因子、エストロゲン補充治療薬（例えば、タモキシフェン）、ならびに抗炎症薬（例えば、グルココルチコイド）からなる群より選択される化合物であり得る。スタチンとの併用が、特に好ましいものであり得る。
【０２８５】
発明の具体的な態様
1. a．対応する長さのSEQ ID NO 30または31または32または33または34または45に相補的である10〜16ヌクレオチドの連続配列を含む12〜22ヌクレオチド長のアンチセンスオリゴマー（A）と、
b．オリゴマー（A）に共有結合で付着した、少なくとも1種の非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチドコンジュゲート部分（C）と
を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
2. アンチセンスオリゴマーが、SEQ ID NO 25、26、27、28、29、および44からなる群より選択される連続配列を含む、態様1のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
3. アンチセンスオリゴマーがPCSK9を標的とする、態様1または2のいずれか1つのオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
4. アンチセンスオリゴマーが親和性増強ヌクレオチド類似体を含む、態様1〜3のいずれか1つのオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
5. ヌクレオチド類似体が、糖修飾型ヌクレオチド、例えば、ロックド核酸（LNA）単位；2'-O-アルキル-RNA単位、2'-OMe-RNA単位、2'-アミノ-DNA単位、および2'-フルオロ-DNA単位からなる群より独立にまたは非独立に選択される糖修飾型ヌクレオチドである、態様4のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
6. ヌクレオチド類似体が、ロックド核酸（LNA）単位であるかまたはそれを含む、態様4または5のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
7. アンチセンスオリゴマーがギャップマーである、態様1〜6のいずれか1つのオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
8. ギャップマーが、2-4ヌクレオチド類似体、好ましくは、LNA類似体の各側（5'および3'）にウィングを含む、態様7のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
9. ギャップマー設計が、2-8-2、3-8-3、2-8-3、3-8-2、4-8-2、2-8-4、2-9-2、2-9-3、3-9-2、3-9-3、3-9-4、4-9-3、2-10-2、2-10-3、3-10-2、3-10-3、3-10-4、4-10-3、2-11-2、2-11-3、3-11-2、3-11-3、3-11-4、4-11-3、および4-11-4からなる群より選択される、態様7または8のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
10. ギャップマー設計が、2-8-3、3-8-3、3-9-4、3-10-3、2-11-2、2-11-3、および3-11-2からなる群より選択される、態様7〜9のいずれか1つのオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
11. オリゴマーが、13、14、15、または16ヌクレオチドの連続配列を含む、態様1〜10のいずれか1つのオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
12. オリゴマーが、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、およびボラノホスフェートからなる群より選択される1個以上のヌクレオシド連結を含む、態様1〜11のいずれか1つのオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
13. オリゴマーが、ホスホロチオエートヌクレオシド連結を含むかまたはそれからなる、態様1〜12のいずれか1つのオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
14. オリゴマーが、SEQ ID NO 1、2、3、4、5、6、7、および8からなる群より選択される連続配列を含む、態様1〜12のいずれか1つのオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
15. コンジュゲート部分（C）が、炭水化物、例えば、GalNAcもしくはGalNAcクラスタ；親油基、例えば、脂質、脂肪酸；ステロール、例えば、コレステロールもしくはトコフェロール；またはスタチンからなる群より選択される、態様1〜14のいずれか1つのオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
16. コンジュゲート部分（C）が、肝細胞への送達および／または取り込みを増強する、態様1〜15のいずれか1つのアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
17. コンジュゲート部分（C）が、ステロール、例えば、トコフェロール、コレステロール、例えば、コンジュゲート5、コンジュゲート5、コンジュゲート6、またはコンジュゲート6aとして示されたものを含む、態様1〜16のいずれか1つのアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
18. コンジュゲート部分（C）が、炭水化物、例えば、GalNAcまたは3価GalNAc、例えば、コンジュゲート1、2、3、もしくは4、または1a、2a、3a、もしくは4aとして示されたものを含む、態様1〜16のいずれか1つのアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
19. コンジュゲート部分（C）が、コンジュゲート2aを含む、態様18のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
20. SEQ ID NO 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、および24からなる群より選択される、態様1〜19のいずれか1つのアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
21. アンチセンスオリゴマー（A）が、オリゴマーの連続配列とコンジュゲート部分との間に位置付けられたリンカー領域（Bおよび／またはY）を介して、コンジュゲート部分（C）にコンジュゲートされている、態様1〜20のいずれか1つのアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
22. リンカーが、アミノアルキルリンカー、ホスフェートヌクレオチドリンカー、およびペプチドリンカーからなる群より選択される、態様21のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
23. リンカーが、C6〜C12アミノアルキル基より選択される、態様21または22のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
24. リンカーが、1〜6個のヌクレオチドを含む生物切断性ホスフェートヌクレオチドリンカーである、態様21または22のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
25. リンカー（B）が、オリゴマーの連続配列の5'末端または3'末端と連続しており、かつPCSK9標的配列と相補的な塩基対を形成していてもよいしまたは形成していなくてもよい、1個以上の連続DNAホスホジエステルヌクレオチド、例えば、1個、2個、3個、4個、5個、または6個のDNAホスホジエステルヌクレオチドを含むホスホジエステルヌクレオチド連結である、態様21〜24のいずれか1つのアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
26. ホスホジエステルヌクレオチド連結（または生物切断性リンカー）が、1個、2個、または3個のDNAホスホジエステルヌクレオチド、例えば、2個のDNAホスホジエステルヌクレオチド、例えば、5'CA3'ジヌクレオチドを含む、態様24または25のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
27. a．対応する長さのSEQ ID NO 31に相補的である16ヌクレオチドの連続配列、または
b．対応する長さのSEQ ID NO 33もしくは34もしくは45に相補的である10〜16ヌクレオチドの連続配列
のいずれかを含む、12〜22ヌクレオチド長のオリゴマー。
28. SEQ ID NO 26、27、28、29、および44からなる群より選択される連続配列を含む、態様27のオリゴマー。
29. PCSK9を標的とする、態様27または28のいずれか1つのオリゴマー。
30. 連続配列が、親和性増強ヌクレオチド類似体を含む、態様27〜29のいずれか1つのオリゴマー。
31. ヌクレオチド類似体が、糖修飾型ヌクレオチド、例えば、ロックド核酸（LNA）単位；2'-O-アルキル-RNA単位、2'-OMe-RNA単位、2'-アミノ-DNA単位、および2'-フルオロ-DNA単位からなる群より独立にまたは非独立に選択される糖修飾型ヌクレオチドである、態様30のオリゴマー。
32. ヌクレオチド類似体が、ロックド核酸（LNA）単位であるかまたはそれを含む、態様30または31のオリゴマー。
33. ギャップマー、例えば、ロックド核酸ギャップマーオリゴヌクレオチドである、態様27〜32のいずれか1つのオリゴマー。
34. ギャップマーが、2-4ヌクレオチド類似体、好ましくは、LNA類似体の各側（5'および3'）にウィングを含む、態様33のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
35. ギャップマー設計が、2-8-2、3-8-3、2-8-3、3-8-2、4-8-2、2-8-4、2-9-2、2-9-3、3-9-2、3-9-3、3-9-4、4-9-3、2-10-2、2-10-3、3-10-2、3-10-3、3-10-4、4-10-3、2-11-2、2-11-3、3-11-2、3-11-3、3-11-4、4-11-3、および4-11-4からなる群より選択される、態様33または34のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
36. ギャップマー設計が、2-8-3、3-8-3、3-9-4、3-10-3、2-11-2、2-11-3、および3-11-2からなる群より選択される、態様33〜35のいずれか1つのオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
37. 13、14、15、または16ヌクレオチドの連続配列を含む、態様27〜36のいずれか1つのオリゴマー。
38. ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、およびボラノホスフェートからなる群より選択される1個以上のヌクレオシド連結を含む、態様27〜37のいずれか1つのオリゴマー。
39. ホスホロチオエートヌクレオシド連結を含むかまたはそれからなる、態様27〜38のいずれか1つのオリゴマー。
40. SEQ ID NO 2、3、4、5、6、7、および8からなる群より選択される連続配列を含む、態様27〜38のいずれか1つのオリゴマー。
41. 態様1〜40のいずれか1つのオリゴマーまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートと、薬学的に許容される希釈剤、担体、塩、またはアジュバントとを含む薬学的組成物。
42.高コレステロール血症または関連障害、例えば、アテローム性動脈硬化症、高脂血症、高コレステロール血症、家族性高コレステロール血症、例えば、PCSK9の機能獲得型変異、HDL/LDLコレステロール不均衡、脂質異常症、例えば、家族性高脂血症（FCHL）もしくは家族性高コレステロール血症（FHC）、後天性高脂血症、スタチン抵抗性高コレステロール血症、冠動脈疾患（CAD）、および冠動脈性心疾患（CHD）からなる群より選択される障害の処置等のための医薬として使用するための、態様1〜41のいずれか1つのオリゴマーまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは薬学的組成物。
43. 高コレステロール血症または関連障害、例えば、アテローム性動脈硬化症、高脂血症、高コレステロール血症、家族性高コレステロール血症、例えば、PCSK9の機能獲得型変異、HDL/LDLコレステロール不均衡、脂質異常症、例えば、家族性高脂血症（FCHL）もしくは家族性高コレステロール血症（FHC）、後天性高脂血症、スタチン抵抗性高コレステロール血症、冠動脈疾患（CAD）、および冠動脈性心疾患（CHD）からなる群より選択される障害の処置のための医薬の製造のための、態様1〜41のいずれか1つのオリゴマーまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは薬学的組成物の使用。
44.有効量の態様1〜41のいずれか1つのオリゴマーまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは薬学的組成物を高コレステロール血症または関連障害に罹患しているかまたは罹患する可能性が高い患者へ投与する工程を含む、高コレステロール血症または関連障害、例えば、アテローム性動脈硬化症、高脂血症、高コレステロール血症、家族性高コレステロール血症、例えば、PCSK9の機能獲得型変異、HDL/LDLコレステロール不均衡、脂質異常症、例えば、家族性高コレステロール血症（FHC）、後天性高脂血症、スタチン抵抗性高コレステロール血症、冠動脈疾患（CAD）、および冠動脈性心疾患（CHD）からなる群より選択される障害を処置する方法。 
45. PCSK9を発現している細胞におけるPCSK9を阻害するため、態様1〜41のいずれか1つのオリゴマーまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは薬学的組成物を該細胞へ投与する工程を含む、該細胞におけるPCSK9の阻害のためのインビボまたはインビトロの方法。
【実施例】
【０２８６】
それぞれ、4μmolまたは1μmolのスケールで、Expedite 8900/MOSS合成装置（多重オリゴヌクレオチド合成系）またはOligomaker 48で、ホスホラミダイトアプローチを使用して、ウリジンユニバーサルサポート（uridine universal supports）において、オリゴヌクレオチドを合成した。合成の完了後、60℃で5〜16時間アンモニア水を使用して固体支持体からオリゴヌクレオチドを切断した。オリゴヌクレオチドを、逆相HPLC（RP-HPLC）または固相抽出によって精製し、UPLCによって特徴決定し、分子量をESI-MSによってさらに確認した。さらなる詳細については、下記を参照すること。
【０２８７】
オリゴヌクレオチドの伸長
β-シアノエチル-ホスホラミダイト（DNA-A（Bz）、DNA-G（ibu）、DNA-C（Bz）、DNA-T、LNA-5-メチル-C（Bz）、LNA-A（Bz）、LNA-G（dmf）、LNA-T、またはC6-S-S-C6リンカー）のカップリングを、アセトニトリル中の0.1Mの5'-O-DMT-保護アミダイトおよびアセトニトリル中のDCI（4,5-ジシアノイミダゾール）（0.25M）の溶液を活性化剤として使用することによって実施する。最終サイクルのため、市販のC6連結コレステロールホスホラミダイトを、DCM中0.1Mで使用した。ホスホロチオエート連結の導入のためのチオール化を、キサンタンヒドリド（アセトニトリル／ピリジン9:1中0.01M）を使用することによって実施する。ホスホジエステル連結を、THF／ピリジン／水7:2:1中の0.02Mヨウ素を使用して導入する。試薬の残りは、オリゴヌクレオチド合成のために典型的に使用されるものである。固相合成後のコンジュゲーションのため、市販のC6アミノリンカーホスホラミダイトを、固相合成の最後のサイクルにおいて使用し、脱保護および固体支持体からの切断の後、アミノ連結脱保護オリゴヌクレオチドを単離した。コンジュゲートを、標準的な合成法を使用して、官能基の活性化を介して導入した。
【０２８８】
RP-HPLCによる精製：
粗化合物を、Phenomenex Jupiter C18 10μ 150×10mmカラムでの調製用RP-HPLCによって精製した。0.1M酢酸アンモニウム（pH8）およびアセトニトリルを、5mL/分の流速で、緩衝液として使用した。収集された画分を凍結乾燥させ、典型的には、白色固体として精製された化合物を得た。
【０２８９】
略語：
DCI：4,5-ジシアノイミダゾール
DCM：ジクロロメタン
DMF：ジメチルホルムアミド
DMT：4,4'-ジメトキシトリチル
THF：テトラヒドロフラン
Bz：ベンゾイル
Ibu：イソブチリル
RP-HPLC：逆相高速液体クロマトグラフィ
【０２９０】
合成された化合物は表1に示され、図面にも例示される。
【０２９１】
実施例1  新たなPCSK9標的モチーフの発見 
ヒトおよび霊長類のPCSK9に特異的な521の抗PCSK9アンチセンスオリゴヌクレオチド（全て、10個のDNAに隣接する3個のロックド核酸を有し、即ち、16塩基長LNAギャップマー設計を有する）を設計し合成した。ヒト細胞株15PC3を、モック、または濃度0.3μMのヒトPCSK9を標的とするロックド核酸修飾型オリゴヌクレオチドのいずれかと共に3日間インキュベートした。各抗PCSK9オリゴヌクレオチドを、3回の独立した実験において試験した。PCSK9 mRNAレベルを、記載されたようなリアルタイムPCRを使用して、抽出されたRNAから定量化し、βアクチンmRNAに対して標準化し、12個のモックによって処理された試料における平均レベルに対して相対的に、図8に提示した。図9には、最も強力な分子のサブセットのクローズアップが示される。
【０２９２】
実施例2  インビトロmRNAノックダウン
ヒト細胞株15PC3を、モック、または濃度0.0012μM、0.06μM、0.3μM、および1.5μMのヒトPCSK9を標的とするSEQ ID 1〜8を有するロックド核酸修飾型オリゴヌクレオチドのいずれかと共に3日間インキュベートした。PCSK9 mRNAレベルを、記載されたようなリアルタイムPCRを使用して、抽出されたRNAから定量化し、4個のモックによって処理された試料における平均レベルに対して相対的に、図10に提示した。各オリゴヌクレオチドについて、最大有効濃度の半分（EC50）として定量化された効力を、EC50＝推定値±標準偏差として、下限を0％、上限を100％に設定した2パラメータロジスティックフォームのヒルの式の最小二乗法フィッティングによって決定した。
【０２９３】
実施例3 - インビボALTレベル
到着時体重およそ20gの4週齢雌NMRIマウス（Taconic,Denmark）に、生理食塩水、または用量7.5mg/kgおよび15mg/kgのヒトPCSK9を標的とするSEQ ID 9〜16を有するロックド核酸修飾型コレステロールコンジュゲートオリゴヌクレオチドのいずれかを単回静脈注射した。投与の7日後にマウスを屠殺し、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）の血清レベルを酵素アッセイ（Horiba ABX Diagnostics）を使用して決定した。5匹のマウスの各処置群について、平均値および標準偏差を計算し、生理食塩水によって処置されたマウスにおける平均レベルに対して相対的に、図11に提示した。ALT上昇は、全てではないが、いくつかのコレステロールコンジュゲート分子について両方の濃度において認められた。化合物のうちのいくつか、例えば、SEQ ID NO 9および10は、肝臓への化合物の取り込みを増強するためにコレステロールをコンジュゲートとして使用した時ですら、臨床的に有意にマウスにおけるALTを増強しなかった。
【０２９４】
実施例4：非ヒト霊長類での研究
この研究の主目的は、抗PCSK9 LNA化合物のカニクイザルへの単回低速ボーラス注射の後、7週間にわたり、選択された脂質マーカーを調査し、サルにおける化合物の可能性のある毒性を査定することであった。この研究において使用された化合物は、0.625mg/mlおよび2.5mg/mlの初期濃度で無菌生理食塩水（0.9％）において調製されたSEQ ID NO 10 13、18、19、20、および21であった。
【０２９５】
少なくとも24ヶ月齢の雄サルを使用し、水道水を自由に摂取させ、1匹当たり180gのMWM(E)SQC SHORT expanded diet（Dietex France,SDS,Saint Gratien,France）を毎日給餌した。各ケージに給餌される食物の総量は、当日のケージ内の動物の数によって計算されるであろう。さらに、果物または野菜を、各動物に毎日与えた。処置期間を開始する前に、少なくとも14日間、動物を研究条件に順応させた。この期間に、処置前調査を実施した。動物に、0.25mg/kg、1.0mg/kg、もしくは2.5mg/kg（SEQ ID NO 10、13、18、および21）の単一用量、または1.0mg/kgもしくは2.5mg/kg（SEQ ID NO 19および20）の単一用量で、静脈内注射で投薬した。用量体積は0.4mL/kgであった。1群当たり2匹の動物を使用した。
【０２９６】
用量製剤を、1日目に単回投与した。動物を、処置後7週間にわたり観察し、51日目に研究から解放した。1日目は処置期間の初日に相当する。臨床的観察および体重および摂食量（1群当たり）を、調査前および調査中に記録する。
【０２９７】
以下の時点で、血液を試料採取し、分析を実施した：
2018064575.tif 000025
RCP 0 ルーチン臨床病理学、LSB＝肝安全性生化学、PK＝薬物動態、OA＝その他の分析、L＝脂質。
【０２９８】
以下に示された時点で、全ての生存している動物について、以下のパラメータを決定した：
・完全な生化学パネル（下記の完全なリスト）- −8日目、15日目、および50日目、
・肝安全性（ASAT、ALP、ALAT、TBIL、およびGGTのみ）- 4日目、8日目、22日目、および36日目、
・脂質プロファイル（総コレステロール、HDL-C、LDL-C、およびトリグリセリド）ならびにアポBのみ- −1日目、4日目、8日目、22日目、29日目、36日目、および43日目。
【０２９９】
血液（およそ1.0 mL）を、（ADVIA 1650血液生化学分析装置を使用して）リチウムヘパリンチューブへ採取した：アポB、ナトリウム、カリウム、塩化物、カルシウム、無機リン、グルコース、HDL-C、LDL-C、尿素、クレアチニン、総ビリルビン（TBIL）、総コレステロール、トリグリセリド、アルカリホスファターゼ（ALP）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALAT）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ASAT）、クレアチンキナーゼ、γグルタミルトランスフェラーゼ（GGT）、乳酸脱水素酵素、総タンパク質、アルブミン、アルブミン/グロブリン比。
【０３００】
血中PCSK9の分析：PCSK9分析のための血液試料を、−8日目、−1日目、4日目、8日目、15日目、22日目、29日目、36日目、43日目、および50日目に収集した。静脈血（およそ2mL）を各動物の適切な静脈からSerum Separating Tube（SST）へ収集し、室温で少なくとも60±30分間凝固させた。血液を（＋4℃を維持するよう設定された）冷蔵条件下で10分間1000gで遠心分離した。血清を3本の個々のチューブへ移し、ELISA方法（カニクイザル由来の試料についてバリデートされている、Circulex Human PCSK9 ELISAキット、CY-8079）を使用して、CitoxLAB Franceにおいて分析されるまで、−80℃で保管する。
【０３０１】
その他の分析：WO2011009697は、以下の分析のための方法を提供する：qPCR、PCSK9 mRNA分析。その他の分析には、PCSK9タンパク質ELISA、ELISA（Mercodia 10-1106-01番）による血清Lp(a)分析、組織および血漿のオリゴヌクレオチド分析（薬物含量）、試料、標準物試料、およびQC試料の抽出、ELISAによるオリゴヌクレオチド含量決定が含まれる。
【０３０２】
PCSK9を標的とする化合物についてのデータを以下の表に示す：
2018064575.tif 000026
【０３０３】
PCSK9を標的とする化合物による肝毒性または腎毒性の徴候は、存在しなかった。顕著に、PCSK9-GalNAc化合物は、PCSK9の急速かつ高度に効果的なダウンレギュレーションを与え、それは、長期（研究の全期間）にわたり維持された。このことは、GalNAcコンジュゲート化合物が、迅速な初期ノックダウンに関しても、長期的にも、より有効であることを例証しており、非コンジュゲート親化合物と比較しても、代替コンジュゲーションテクノロジー、例えば、コレステロールコンジュゲーションを使用した化合物と比較しても、比較的低い頻度で、より低い投薬量で投薬され得ることを示している。SEQ ID NO 18は、研究の期間を通じてPCSK9およびLDL-Cの迅速で一貫したダウンレギュレーションを与えた（2.5mg/kg用量で34日目に見られ、顕著なPCSK9ダウンレギュレーションは、2.5mg/kg用量の単回投与の48日後に見られ、その時、血漿中PCSK9タンパク質レベルは投薬前の71％であった）。
【０３０４】
実施例5: ラットにおける肝臓および腎臓毒性評価
本発明の化合物は、マウスまたはラットでのような、げっ歯類でのその毒性プロファイルについて評価することができる。以下のプロトコルが用いられうる: Wistar Han Crl:WI(Han)をおよそ8週齢の年齢で用いた。この年齢で、雄はおよそ250 gの重さであった。全ての動物がSSNIFF R/M-Hペレット維持食(SSNIFF Spezialdiaten GmbH, Soest, Germany)を、およびボトルに含有された水道水(0.22 μmのフィルタでろ過された)を自由に利用できた。10および40 mg/kg/用量の用量レベルを用い(皮下投与)、1日目および8日目に投与した。動物を15日目に安楽死させる。尿および血液サンプルを7日目および14日目に集めた。臨床病理学評価を14日目に行った。体重を試験の前に、投与の初日に、および剖検の1週間前に判定する。1群あたりの飼料消費を毎日評価した。血液サンプルを絶食6時間後に尾静脈から採取した。以下の血清分析を行った: 赤血球数、平均細胞容積 血中血球容積、ヘモグロビン、平均細胞ヘモグロビン濃度、血小板数、白血球数、細胞形態とともに白血球分画、網状赤血球数、ナトリウム、カリウム、塩化物、カルシウム、無機リン、グルコース、尿素、クレアチニン、総ビリルビン、総コレステロール、トリグリセリド、アルカリホスファターゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、総タンパク質、アルブミン、アルブミン/グロブリン比。α-GST、β-2ミクログロブリン、カルビンジン、クラステリン、シスタチンC、KIM-1、オステオポンチン、TIMP-1、VEGF、およびNGALについて検尿を行った。7つの被分析物(カルビンジン、クラステリン、GST-α、KIM-1、オステオポンチン、TIMP-1、VEGF)は、パネル1 (MILLIPLEX(登録商標) MAP Rat Kidney Toxicity Magnetic Bead Panel 1, RKTX1 MAG-37K)の下で定量化した。3つの被分析物(β-2ミクログロブリン、シスタチンC、リポカリン-2/NGAL)は、パネル2 (MILLIPLEX(登録商標) MAP Rat Kidney Toxicity Magnetic Bead Panel 2, RKTX2MAG-37K)の下で定量化した。ラット尿中のこれらのバイオマーカーの濃度の判定のためのアッセイ法は、Luminex xMAP(登録商標)技術に基づいた。抗α-GST/β-2ミクログロブリン/カルビンジン/クラステリン/シスタチンC/KIM-1/オステオポンチン/TIMP-1/VEGF/NGAL抗体でコーティングされたミクロスフェアを2種類の異なる蛍光色素で色分けした。以下のパラメータを判定した(尿 ADVIA 1650を用いて): 尿中タンパク質、尿中クレアチニン。定量的パラメータ: 容積、pH (10-Multistix SG試験ストリップ/Clinitek 500尿分析器を用いて)、比重(屈折計を用いて)。半定量的パラメータ(10-Multistix SG試験ストリップ/Clinitek 500尿分析器を用いて): タンパク質、グルコース、ケトン、ビリルビン、亜硝酸塩、血液、ウロビリノーゲン、沈降細胞診断(顕微鏡検査による)。定性的パラメータ: 外観、色。殺処理後、体重ならびに腎臓、肝臓および脾臓の重量を測定し、臓器の対体重比を算出する。腎臓および肝臓サンプルを採取し、凍結させるかまたはホルマリン中で貯蔵した。顕微鏡による分析を実施した。Kim-1発現についてのデータは、図15に示され、SEQ ID NO 4以外の全ての分子が、SEQ ID NO 1より低い尿中kim-1シグナルを有することが証明されており、このことは、最初の以前に特徴決定された非コンジュゲート分子と比較して改善された腎安全性を証明している。
【０３０５】
実施例6  切断可能リンカーの分析
異なるDNA/POリンカーを有するFAM標識アンチセンスオリゴマー（ASO）を、S1ヌクレアーゼ抽出物（下記表）、肝臓もしくは腎臓のホモジネート、または血清のいずれかにおけるインビトロ切断に供した。
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【０３０６】
大文字は、LNAヌクレオシド（例えば、β-D-オキシLNA）であり、小文字は、DNAヌクレオシドである。添字sは、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結を表す。LNAシトシンは、任意で、5-メチルシトシンである。FAMコンジュゲート部分は図6に示され、分子は図7に示される。
【０３０７】
異なるDNA/POリンカーを有するFAM標識ASO（100μM）を、ヌクレアーゼ緩衝液中のS1ヌクレアーゼ（100μL当たり60U）によるインビトロ切断に20分間および120分間供した（A）。緩衝溶液にEDTAを添加することによって酵素活性を停止させた。次いで、溶液を、Dionex DNApac p-100カラムおよび10mM〜1M過塩素酸ナトリウム（pH7.5）の範囲の勾配を使用したDionex Ultimate 3000におけるAIE HPLC分析に供した。切断されたオリゴヌクレオチドおよび未切断のオリゴヌクレオチドの含量を、615nmでの蛍光検出器および260nmでのuv検出器の両方を使用して、標準物に対して決定した。
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【０３０８】
結論：POリンカー（または本明細書において言及される領域B）は、コンジュゲート（または基C）の切断をもたらし、リンカーの長さおよび／または配列組成の両方が、領域Bの核酸分解切断に対する感受性を調節するために使用され得る。DNA/POリンカーの配列は、ヌクレアーゼS1抽出物において20分後に見られる切断率を調節することができる。従って、血清および標的組織の細胞における切断のレベルを調節するためにも、領域B（例えば、DNA/POリンカー）のための配列選択を使用することができる。
【０３０９】
肝臓および腎臓のホモジネートならびに血清に、200μg/g組織の濃度で化合物SEQ ID NO 35を添加した。NMRIマウスから収集された肝臓および腎臓の試料を、均質化緩衝液（0.5％Igepal CA-630、25mMトリスpH8.0、100mM NaCl、pH8.0（1N NaOHによって調整））において均質化した。ホモジネートを37℃で24時間インキュベートし、その後、ホモジネートをフェノール-クロロホルムによって抽出した。肝臓および腎臓からの抽出物ならびに血清において切断されたオリゴおよび未切断のオリゴの含量を、上記HPLC法を使用して、標準物に対して決定した。
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【０３１０】
結論：POリンカー（または本明細書において言及される領域B）は、肝臓または腎臓のホモジネートにおいては、コンジュゲート（または基C）の切断除去をもたらすが、血清においてはもたらさない。実施例6において示されたアッセイにおける切断に対する感受性は、リンカーが生物切断性であるかまたは生理学的に不安定であるか否かを決定するために使用され得る。上記アッセイにおける切断とは、切断可能リンカーの切断をさし、オリゴマーまたは領域Aは、機能的に完全なままでなければならないことに注意すること。
【０３１１】
実施例7：インビボのコレステロールコンジュゲートによるPCSK9 mRNAのノックダウン
PCSK9-マウス特異的化合物
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【０３１２】
表5に従って、NMRIマウスに、生理食塩水、または10mg/kgの非コンジュゲートLNAアンチセンスオリゴヌクレオチド（SEQ ID 40）、または異なるリンカーによってコレステロールにコンジュゲートされた等モル量のLNAアンチセンスオリゴヌクレオチドを、単回注射し、1〜10日目に屠殺した。
【０３１３】
肝臓および腎臓からRNAを単離し、PCSK9 mRNAノックダウンについて分析するため、PCSK9に特異的なプライマーおよびプローブを用いたqPCRに供した。結果は図14に示される。
【０３１４】
結論：ホスホジエステル骨格を有する2種のDNA（SEQ ID NO 42およびSEQ ID NO 43）から構成されたリンカーによってPCSK9 LNAアンチセンスオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされたコレステロールは、非コンジュゲート化合物（SEQ ID NO 40）と比較しても、安定リンカーを含むコレステロールコンジュゲート（SEQ ID NO 41）と比較しても、増強されたPCSK9の肝臓ノックダウンを示した（図14）。
【０３１５】
材料および方法：
実験設計：
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【０３１６】
用量投与
上記表に従って、到着時およそ20gのNMRI雌動物に、生理食塩水で製剤化された化合物または生理食塩水単独を、（0日目の体重によって）BW 1kg当たり10ml、静脈内注射で投薬した。
【０３１７】
肝組織および腎組織の組織採取
70％CO2-30％O2によって動物を麻酔下に置き、表4に従って、頚部脱臼によって屠殺した。肝臓の右葉の半分および1個の腎臓を刻み、RNAlaterに浸した。
【０３１８】
製造業者の説明に従って、MagNa Pure 96 Cellular RNA Large Volume Kit（Rocheカタログ番号5467535001）を使用して、MagNA Pure LC RNA Isolation Tissue buffer（Rocheカタログ番号03 604 721 001）の存在下でビーズ粉砕によって均質化された最大10mgの組織から、全RNAを抽出した。製造業者の説明に従って、Ambionからの逆転写酵素試薬を使用して、第一鎖合成を実施した。
【０３１９】
各試料について、0.5μgの全RNAをRNase不含H2Oで（10.8μl）に調整し、2μlのランダムデカマー（50μM）および4μlのdNTPミックス（2.5mM各dNTP）と混合し、3分間70℃に加熱した後、試料を氷上で急速に冷却した。2μlの10×Buffer RT、1μlのMMLV逆転写酵素（100U/μl）、および0.25μlのRNase阻害剤（10U/μl）を、各試料に添加し、続いて、60分間42℃でインキュベートし、10分間95℃で酵素を熱不活化し、次いで、試料を4℃に冷却した。cDNA試料を1:5希釈し、製造業者のプロトコルに従って、Taqman Fast Universal PCR Master Mix 2×（Applied Biosystemsカタログ番号4364103）を使用したRT-QPCRならびにTaqman遺伝子発現アッセイ（mPCSK9、Mn00463738_m1およびmアクチン＃4352341E）に供し、ファーストモードでApplied Biosystems RT-qPCR装置（7500/7900またはViiA7）で処理した。
【０３２０】
実施例8：非ヒト霊長類での研究；複数回皮下注射
この非ヒト霊長類研究の目的は、化合物が皮下注射（s.c.）によって投与された時の反復投与環境における抗PCSK9化合物の効力および安全性を査定することであった。この研究において使用された化合物は、0.625mg/mlおよび2.5mg/mlの初期濃度で無菌生理食塩水（0.9％）において調製されたSEQ ID NO 2、3、18、および19であった。
【０３２１】
少なくとも24ヶ月齢の雌カニクイザルを使用し、水道水を自由に摂取させ、1匹当たり180gのOWM(E)SQC SHORT expanded diet（Dietex France,SDS,Saint Gratien,France）を毎日給餌した。さらに、果物または野菜を、各動物に毎日与えた。処置期間を開始する前に、少なくとも14日間、動物を研究条件に順応させた。この期間に、処置前調査を実施した。動物に、4週間にわたる全部で4回の注射により、0.5mg/kg（SEQ ID NO 2、3、18、および19）または1.5mg/kg/注射（SEQ ID NO 18および19）の用量で週1回4週間皮下投薬した。用量体積は0.4 mL/kg/回であった。1群当たり6匹の動物を使用した。4回目かつ最後の投与の後、動物を1週間観察し、その後、肝アポB転写物制御、脂質パラメータ、肝臓および腎臓の組織学、ならびに肝臓および腎臓の組織分布を研究するため、半分の動物を屠殺した。1日目は処置期間の初日に相当する。臨床的観察および体重および摂食量（1群当たり）を、調査前および調査中に記録した。
【０３２２】
血液および組織を試料採取し、以下の時点で分析した：
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RCP：ルーチン臨床病理学、LSB：肝安全性生化学、PK：薬物動態、OA：その他の分析、L：脂質。
【０３２３】
ナトリウム、カリウム、塩化物、カルシウム、無機リン、グルコース、HDL-C、LDL-C、尿素、クレアチニン、総ビリルビン（TBIL）、総コレステロール、トリグリセリド、アルカリホスファターゼ（ALP）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALAT）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ASAT）、クレアチンキナーゼ、γグルタミルトランスフェラーゼ（GGT）、乳酸脱水素酵素、総タンパク質、アルブミン、アルブミン/グロブリン比を分析するため、血液（およそ1.0mL）を（ADVIA 1650血液生化学分析装置を使用して）リチウムヘパリンチューブへ採取した。
【０３２４】
血液の分析：
アポB分析のための血液試料を、−8日目、−1日目、4日目、8日目、15日目、22日目、29日目、36日目、43日目、および50日目に、群1〜16の動物（即ち、抗アポB化合物によって処置された動物）のみから収集した。静脈血（およそ2mL）を、各動物の適切な静脈からSerum Separating Tube（SST）へ収集し、室温で少なくとも60±30分間凝固させた。血液を（＋4℃を維持するよう設定された）冷蔵条件下で10分間1000gで遠心分離した。血清を3本の個々のチューブへ移し、ELISAによるアポBタンパク質の分析まで、−80℃で保管した。
【０３２５】
その他の分析：
WO2010142805は、以下の分析のための方法を提供する：qPCR、アポB mRNA分析。その他の分析には、ELISA（Mercodia 10-1106-01番）による血清Lp(a)分析、組織および血漿のオリゴヌクレオチド分析（薬物含量）、試料、標準物試料、およびQC試料の抽出、ELISAによるオリゴヌクレオチド含量決定が含まれる。
【０３２６】
抗PCSK9オリゴヌクレオチドについて意図された薬理は、循環血中のPCSK9タンパク質（「血清中のPCSK9」）の低下によるLDLコレステロールの低下である。GalNAcコンジュゲート分子は、血清中のPCSK9およびLDLコレステロールの両方を研究した際、非コンジュゲート分子と比較して、増強された効力を示した（図16および図17）。図16は、0.5mg/kg/回の非コンジュゲートSEQ ID NO 2の4回の毎週の注射が、血清中のPCSK9およびLDLコレステロールに対して軽微な効果しか及ぼさず、同一のLNAギャップマーのGalNAcコンジュゲート（SEQ ID 18）は、血清中のPCSK9およびLDLコレステロールの両方に対して強力な低下効果を及ぼしたことを例証している。SEQ ID NO 3およびSEQ ID NO 19（図17）の複数回注射についてのデータを比較した場合、次の同一の関係が認められた: 非コンジュゲート分子のほんの軽微な効果および対応するGalNAcコンジュゲート（SEQ ID NO 19）による血清中のPCSK9およびLDLコレステロールの強力なダウンレギュレーション。血清中のPCSK9およびLDLコレステロールに対するSEQ ID 18および19の効果が、用量依存性であり、長い作用の持続期間を有し、血清中のPCSK9およびLDLコレステロールが、最後の注射の後、少なくとも7週間、平均基線レベルより低かったことに注意するべきである（最後の注射は22日目、71日目までの回復期間について例証されたデータ）。
【０３２７】
肝臓および腎臓のオリゴヌクレオチド含量を、最後の注射の1週間後、即ち、研究の29日目に分析した。（コンジュゲートされた）SEQ ID NO 18を標準曲線の調製のために使用した場合に結果の変化が存在しないことを確かめた後、SEQ ID NO 2およびSEQ ID NO 18によって処置された動物に由来する試料についての標準曲線を調製するためにSEQ ID NO 2を使用して、ハイブリダイゼーションELISA（本質的に、Lindholm et al,Mol Ther.2012 Feb;20(2):376-81に記載されたものと同様）を使用してオリゴヌクレオチド含量を分析した。同様に、SEQ ID NO 19を試料のELISA分析についての標準曲線の調製のために使用した場合に結果の違いが存在しないことを確かめた後、SEQ ID NO 3およびSEQ ID NO 19についての標準曲線の調製のためにSEQ ID NO 3を使用した。
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【０３２８】
上記表に例証されるように、SEQ ID NO 2およびSEQ ID NO 3のコンジュゲーションは、動物に4週間のあいだ週1回皮下注射された場合、最後の注射の1週間後に、対応する非コンジュゲート分子よりコンジュゲート分子（SEQ ID NO 18およびSEQ ID 19）について高い肝/腎比をもたらした。他の非コンジュゲート抗PCSK9分子（図15に例証されるように、例えば、SEQ ID NO 1）による尿細管毒性の徴候が示されたため、そして肝臓が抗PCSK9処置の標的器官であるため、より高い肝/腎比へのシフトは、コンジュゲートされていないSEQ ID NO 2および3と比較して、コンジュゲートされたSEQ ID NO 18および19の安全性の増加をもたらすと予想される。
【０３２９】
図16および図18に例証されるように、SEQ ID NO 18および19は、薬物学的に関連するレベルで投薬された。処置期間および回復期の間の同一の動物の臨床化学プロファイルは、肝臓または腎臓の安全性パラメータの臨床的に関連する増加を示さなかった。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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