(57)【要約】      （修正有）【課題】酵素を誘導する方法、並びに前記酵素を用いてセルロース及びリグノセルロース系バイオマスを処理するための方法の提供。【解決手段】リグノセルロース材料を電子線により処理する工程と、前記処理されたリグノセルロース材料を粉砕する工程と、前記粉砕された材料を酵素により糖化する工程と、前記糖化された材料とトリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）とを組み合わせて酵素複合体の産生を誘導する工程と、を包含する方法であって、前記酵素複合体は１つ以上のセルラーゼを含む方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
リグノセルロース材料を電子線により処理する工程と、
前記処理されたリグノセルロース材料を粉砕する工程と、
前記粉砕された材料を酵素により糖化する工程と、
前記糖化された材料とトリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）とを組み合わせて酵素複合体の産生を誘導する工程と、
を包含する方法であって、
前記酵素複合体は１つ以上のセルラーゼを含む、方法。
【請求項２】
前記リグノセルロース材料が、以下の：音波処理、酸化、熱分解、水蒸気爆発、化学的処理、機械的処理、凍結粉砕からなる群から選択される処理方法により難分解性を低減するために処理される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記粉砕が乾式粉砕を包含する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記粉砕が湿式粉砕を包含する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記リグノセルロース材料が、３０〜２００μｍの粒子サイズを有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記リグノセルロース材料が、３０〜１００μｍの粒子サイズを有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記リグノセルロース材料が、３０〜５０μｍの粒子サイズを有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記リグノセルロース材料が、木材、草および農業残渣からなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記リグノセルロース材料が、以下の：紙、紙製品、紙廃棄物、紙パルプ、着色紙、上塗り紙、被覆紙、充填紙、雑誌、印刷物、印刷用紙、ポリコーティング紙、硬い厚紙、ボール紙、板紙、綿、木材、パーティクルボード、林業系廃棄物、おがくず、アスペン材、木材チップ、草、スイッチグラス、ススキ、ミクリ、クサヨシ、穀粒残渣、コメ籾殻、オートムギ籾殻、コムギ籾殻、オオムギ籾殻、農業廃棄物、貯蔵牧草、キャノーラ藁、コムギ藁、オオムギ藁、オートムギ藁、コメ藁、ジュート、麻、亜麻、竹、サイザルアサ、マニラ麻、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ飼葉、ダイズ飼葉、トウモロコシ繊維、アルファルファ、干し草、ココヤシ表面毛、糖加工残渣、バガス、ビートパルプ、リュウゼツランバガス、藻類、海藻、堆肥、下水汚物、腐肉、農業または工業廃棄物、アラカチャ、ソバ、バナナ、オオムギ、キャッサバ、葛、アンデスカタバミ、サゴヤシ、モロコシ、ジャガイモ、サツマイモ、タロイモ、ヤムイモ、ダイズ、ソラマメ、レンズマメ、エンドウおよびこれらのいずれかの混合物からなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記リグノセルロース材料が、発酵工程の残渣を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）菌株が、以下の：ＲＵＴ‐ＮＧ１４、ＰＣ３‐７、ＱＭ９４１４および/またはＲＵＴ‐Ｃ３０からなる群から選択される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）菌株が、ＲＵＴ‐Ｃ３０である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記リグノセルロース材料が、前記トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）が誘導期にある場合に、前記トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）と組み合わされる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
液体媒質と、
電子線により処理され、粉砕され、糖化されたリグノセルロース材料と、
トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）と、
前記トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）により産生された１つ以上のセルラーゼと、
を包含する組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許仮出願第６１／５７９，５５０号および第６１／５７９，５６２号（ともに２０１１年１２月２２日出願）の利益を主張する。上記出願の全開示内容は、参照により本明細書中で援用される。
【０００２】
本発明の分野
本発明は、バイオマス材料の加工に有用な酵素の調製に関する。例えば、本発明は、セルラーゼ酵素または他の酵素型に関する。
【背景技術】
【０００３】
石油に対する需要が増大するのと同じように、バイオ燃料および生化学物質を製造するための再生可能原料が関心を集めている。このような製造工程のための供給原料としてのリグノセルロース系バイオマスの使用は、１９７０年代以来研究されてきた。リグノセルロース系バイオマスは、豊富で、再生可能で、自国で製造されるため、そして食品産業用途と競合しないため、魅力的である。
【０００４】
多数の潜在的リグノセルロース原料、例えば少数の例を挙げると、農業残渣、木材バイオマス、地方自治体廃棄物、脂肪種子／固形採油残渣および海藻が、今日利用可能である。目下、これらの材料は、動物飼料、バイオ堆肥材料として用いられるか、あるいは熱電併給施設で焼却されるかまたは埋め立てられる。
【０００５】
リグノセルロース系バイオマスは、植物細胞壁が剛性で且つ緊密な構造を有するので、難分解性である。当該構造は、リグニンに取り囲まれた半セルロースマトリクス中に埋め込まれた結晶セルロース繊維を含む。この緊密なマトリクスは、酵素または他の化学的、生化学的および生物学的工程により査定するのが難しい。セルロース性バイオマス材料（例えば、実質的にすべてのリグニンが除去されたバイオマス材料）は、酵素またはその他の転嫁工程により接近することが可能になるが、しかしそういう場合でも、天然セルロース物質は、加水分解酵素と接触されると、しばしば低収量（理論的収量に比して）を有する。リグノセルロース系バイオマスは、酵素攻撃に対してさらに難分解性である。さらに、各型のリグノセルロース系バイオマスは、セルロース、半セルロースおよびリグニンのその自身の特異的組成物を有する。
【０００６】
リグノセルロース系バイオマスから構造性炭水化物を抽出するために多数の方法が試みられてきたが、それらは高価すぎるか、収量が低すぎるか、結果的に生じる物質中に望ましくない化学物質を残しているか、あるいは簡単に糖を分解する。
【０００７】
再生可能バイオマス供給源からのサッカリドは、石油およびその他の化石供給原料に取って代わり、補足し、または置換することにより化学および燃料産業の基礎になる。しかしながら、これらの単糖を、大量に、そして許容可能な純度および価格で利用可能にする技術が開発される必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
誘導因子の使用による、微生物により１つ以上の酵素の産生を誘導する方法が、本明細書中で提供される。
【０００９】
一態様において、その難分解性を低減するために処理されたセルロースまたはリグノセルロース系バイオマスを、微生物と組み合わせて、微生物による酵素（単数または複数）の産生を可能にする条件下で、微生物‐バイオマスの組合せを保持することにより、微生物による１つ以上の酵素（単数または複数）の産生を誘導することを包含する方法が提供される。いくつかの実行において、酵素（単数または複数）は、次に、セルロースまたはリグノセルロース系バイオマスを糖化するために用いられる。
【００１０】
微生物による酵素の産生を誘導するための方法であって、以下の：第一セルロースまたはリグノセルロース系バイオマスを提供すること；第一バイオマスを、その難分解性を低減するための処理方法で処理し、それにより第一処理バイオマスを提供すること；微生物を提供すること；液体培地を提供すること；第一処理バイオマス、微生物および液体培地を組み合わせて、それにより微生物による酵素の産生を可能にする条件下で微生物‐バイオマスの組合せを保持し、それにより誘導因子‐酵素組合せを生成すること；それにより微生物による酵素の産生を誘導することを包含する方法も、本明細書中で提供される。
【００１１】
液体培地、その難分解性を低減するよう処理されたセルロースまたはリグノセルロース系バイオマス、微生物、および微生物により作られる１つ以上の酵素を含む組成物も、本明細書中で提供される。
【００１２】
本明細書中で提供される方法または組成物のいずれかにおいて、バイオマス材料（単数または複数）の難分解性を低減するための処理は、以下のうちのいずれかであり得る：電子による衝撃、音波処理、酸化、熱分解、水蒸気爆発、化学的処理、機械的処理および凍結粉砕。好ましくは、処理方法は、電子による衝撃である。
【００１３】
当該方法および組成物は、第一または第二のセルロースまたはリグノセルロース系バイオマスを、その嵩密度を低減するか、および／またはその表面積を増大するために機械的に処理することも包含し得る。バイオマス材料（単数または複数）は、微生物および液体培地と組み合わされる前に、細砕され得る。細砕は、乾式粉砕または湿式粉砕であり得る。バイオマス材料は、約３０〜１４００μｍの粒子サイズを有し得る。
【００１４】
本明細書中に記載される方法および組成物のいずれかにおいて、セルロースまたはリグノセルロース系バイオマスは、以下のものであり得る：紙、紙製品、紙廃棄物、紙パルプ、着色紙、上塗り紙、被覆紙、充填紙、雑誌、印刷物、印刷用紙、ポリコーティング紙、硬い厚紙、ボール紙、板紙、綿、木材、パーティクルボード、林業系廃棄物、おがくず、アスペン材、木材チップ、草、スイッチグラス、ススキ、ミクリ、クサヨシ、穀粒残渣、コメ籾殻、オートムギ籾殻、コムギ籾殻、オオムギ籾殻、農業廃棄物、貯蔵牧草、キャノーラ藁、コムギ藁、オオムギ藁、オートムギ藁、コメ藁、ジュート、麻、亜麻、竹、サイザルアサ、マニラ麻、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ飼葉、ダイズ飼葉、トウモロコシ繊維、アルファルファ、干し草、ココヤシ表面毛、糖加工残渣、バガス、ビートパルプ、リュウゼツランバガス、藻類、海藻、堆肥、下水汚物、腐肉、農業または工業廃棄物、アラカチャ、ソバ、バナナ、オオムギ、キャッサバ、葛、アンデスカタバミ、サゴヤシ、モロコシ、ジャガイモ、サツマイモ、タロイモ、ヤムイモ、ダイズ、ソラマメ、レンズマメ、エンドウおよびこれらのいずれかの混合物。代替的には、セルロースまたはリグノセルロース系バイオマスは、前のセルロースまたはリグノセルロース系バイオマスが微生物の酵素により一生成物にあらかじめ転化された後に残存していた材料を包含し得る。
【００１５】
これらの方法および組成物において、微生物は、真菌、細菌または酵母のいずれかであり得る。微生物は、実際には、異なる微生物の一集団であり得る。微生物は、高レベルのセルラーゼを産生する菌株であり得るし、および/またはそれは遺伝子工学処理され得る。微生物は、例えばトリコデルマ・リーセイであり得るし、またはそれはクロストリジウム・テルモセルムであり得る。微生物は、Ｔ．リーセイ菌株、例えばＲＵＴ‐ＮＧ１４、ＰＣ３‐７、ＱＭ９４１４またはＲＵＴ‐Ｃ３０であり得る。
【００１６】
これらの方法および組成物のいずれかにおいて、セルロースまたはリグノセルロース系バイオマスは、微生物が誘導期にある時期に、微生物と組み合わされ得る。
【００１７】
当該方法および組成物は、酵素抽出物を生成するために、微生物‐誘導因子‐酵素の組合せから液体の全部または一部分を除去することも包含し得る。当該方法および組成物は、酵素のうちの１つ以上を濃縮すること、および/または酵素のうちの１つ以上を単離することも包含し得る。
【００１８】
当該方法および組成物は、１つ以上の糖が生成されるよう、第二セルロースまたはリグノセルロース系バイオマスの糖化を起こさせることも包含し得る。１つ以上の糖は、単離され、および/または濃縮され得る。
【００１９】
本発明はこの概要に開示された実施形態に限定されるものではなく、本発明は、特許請求の範囲により定義されるように、本発明の精神および範囲内である修正を包含するよう意図される、と理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
添付の図面（同一参照数字は、異なる図面全体を通して同一部分を指す）に示されているように、本発明の実施形態例についての以下のさらに特定的説明から、上記の説明は明らかになる。図は、必ずしも同一縮尺ではなく、代わりに、本発明の実施形態を例証する時に強調される。
【図１】グルコースへのセルロースの酵素的加水分解を示す図である。セルロース基質（Ａ）は、エンドセルラーゼ（ｉ）によりセルロース（Ｂ）に転化され、これは、エキソセルラーゼ（ｉｉ）によりセルロビオース（Ｃ）に転化され、これは、セロビアーゼ（ベータグルコシダーゼ）（ｉｉｉ）によりグルコース（Ｄ）に転化される。
【図２】１つ以上の生成物へのバイオマス供給原料の転化を示す流れ図である。供給原料は、物理的に前処理され（例えば、そのサイズを低減するために）（２００）、任意に、その難分解性を低減するよう処理され（２１０）、糖化されて糖溶液を形成し（２２０）、その溶液は、製造プラントに運搬され（２３０）（例えば、パイプライン、鉄道車輛により）（あるいは糖化が途中で実施される場合、供給原料、酵素および水が運搬される）、糖化供給原料は、バイオ加工処理されて、所望の生成物（例えば、アルコール）（２４０）を生成し、そして生成物は、例えば蒸留によりさらに加工処理されて、最終生成物を生じ得る（２５０）。難分解性のための処理は、リグニン含量を測定すること（２０１）、そして工程パラメーターを設定するかまたは調整すること（２０５）により、改変され得る。供給原料（２２０）を糖化することは、供給原料を培地および酵素（２２１）と混合することにより改変され得る。
【図３】第一バイオマス（３００）の処理、セルラーゼ産生生物（３１０）の付加、第二バイオマス（３２０）の付加、およびその結果生じる糖を加工して、生成物（例えば、アルコール（単数または複数）、純糖）（３３０）を作ることを示す流れ図である。第一処理バイオマスは、任意に分割され、一部分が第二バイオマス付加される（Ａ）。
【図４】酵素の生成を示す流れ図である。セルラーゼ産生生物は増殖培地（４００）に付加され、処理済み第一バイオマス（４０５）が付加されて（Ａ）、混合物（４１０）を製造し、第二バイオマスが付加され（４２０）、その結果生じる糖が加工処理されて、生成物（例えば、アルコール（単数または複数）、純糖）を製造する（４３０）。第一バイオマス（４０５）の部分は、さらにまた、第二バイオマス（４２０）に付加される（Ｂ）。
【図５】ＳＤＳ  ＰＡＧＥを用いるタンパク質解析の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
詳細な説明
誘導因子の使用による、微生物により１つ以上の酵素の産生を誘導する方法が、本明細書中で提供される。誘導因子は、その難分解性を低減するよう処理されたバイオマス（セルロースまたはリグノセルロース系）から作られる。処理方法は、バイオマスを、電子による衝撃、音波処理、酸化、熱分解、水蒸気爆発、化学的処理、機械的処理または凍結粉砕に付すことを包含し得る。本明細書中で開示されるように、このような方法で処理されたバイオマスは、培地（例えば、液体培地）中で微生物と組み合わされて、１つ以上の酵素を産生するよう微生物を誘導し得る。
【００２２】
一態様において、本発明は、リグノセルロース材料を含む誘導物質を微生物と接触させて、酵素を生成することを包含する方法を特徴づける。
【００２３】
具体的には、本明細書中に記載される工程は、以下でさらに詳細に考察されるように、トリコデルマ・リーセイ真菌により産生された酵素を用いてセルロースまたはリグノセルロース系材料を糖化することを包含する。
【００２４】
概して、本発明は、バイオマス材料（例えば、バイオマス材料またはバイオマス由来材料）を加工して、中間体および生成物、例えば燃料および/またはその他の生成物を生成するに際しての改良に関する。例えば、当該工程は、糖、アルコール（例えば、エタノール、イソブタノールまたはｎ‐ブタノール）、糖アルコール（例えば、エリトリトール）または有機酸を生成するために用いられ得る。
【００２５】
本発明は、バイオマス材料の加工に有用な酵素の調製にも関する。例えば、本発明は、セルラーゼ酵素または他の酵素型の生成に関する。
【００２６】
典型的バイオマス供給源は、セルロース、ヘミセルロースおよびリグニン＋少量のタンパク質、抽出可能物質および無機物を含有する。セルロースおよびヘミセルロース分画中に含有される複合炭水化物は、糖化により、糖、例えば発酵可能な糖に転化され、糖は次に、最終生成物または中間体として用いられ得るし、あるいはさらなる加工処理、例えば発酵または水素添加により、種々の生成物、例えばアルコールまたは有機酸に転化され得る。得られる生成物は、利用される方法または微生物、ならびにバイオプロセシングが起こる条件によって決まる。
【００２７】
一実施形態では、例えば本発明は、酵素の生成を誘導する方法を包含する。セルロースまたはリグノセルロース系バイオマスが提供され、その難分解性を低減するよう処理され、次いで、液体培地中で微生物と組み合わされる。その結果生じる微生物‐バイオマス組合せは、次に、生物体の増殖、そしてバイオマスを分解し得る酵素の生成を可能にする条件下で、保持される。処理済みバイオマスは、誘導因子として作用して、微生物に酵素を産生させる。当該方法は、誘導因子‐酵素組合せを生成する。
【００２８】
いかなる理論にも縛られずに考えると、バイオマスの難分解性を低減するために用いられる処理は、酵素誘導において重要である。低レベルの処理は、低レベルの酵素誘導を生じるか、または非常に長い誘導期を生じる、ということを本発明人等は見出したが、これはおそらくは、処理済みバイオマス材料から微生物が糖を抽出することが難しいためである。同様に、非常に高レベルの処理も、微生物に低レベルの酵素を産生させるが、これは、処理済みバイオマスからの糖の相対的に容易な抽出が、大量の酵素を微生物が産生する必要性を下げているためであろうと思われる。
【００２９】
関連物質に関して、難分解性処理は、材料を滅菌するためにも役立つ。バイオマス材料は、その性質により、しばしば材料それ自体の中に深く埋められる夾雑微生物を含有する。本明細書中に開示されるような酵素誘導、長い発酵時間（１週間まで、またはそれ以上）になりがちで、滅菌が重要である。したがって、それを滅菌するために、できるだけ厳密に材料を処理するのが有益である。しかしながら、高レベルの処理は微生物による酵素産生を低下させるため、このような高レベルの処理は逆効果であると思われる。
【００３０】
したがって、本明細書中で開示されるように、微生物が大量の酵素を産生できないよう、材料を滅菌して、材料を過剰処理しないために、処理のレベルを注意深くつりあわせることにより得られる利益は大きい。
【００３１】
「誘導因子」という用語は、本明細書中で用いる場合、生物体が酵素を産生するのを助長するセルロースまたはリグノセルロース系バイオマスを意味する。一例は、その難分解性を低減するよう処理されたバイオマスである。処理済みバイオマスは、次に、液体培地中で１つ以上の微生物と組み合わせられ、次いで、１つ以上の酵素を微生物に産生させる条件下で保持されることにより、酵素誘導因子として用いられる。
【００３２】
誘導因子‐酵素組合せは、次に、別のバイオマスと組み合わされて。それを糖化するために用いられる。
【００３３】
意外にも、微生物を摂取する前にバイオマスを処理すると、増大量の酵素が微生物により産生される、ということが判明した。さらに、非処理バイオマスの使用に比して、処理済みバイオマスでは異なる酵素が産生される。
【００３４】
本明細書中に記載されるように、セルロースまたはリグノセルロース系バイオマスは、広範な種々の材料から供給され得る。一実施形態では、バイオマスはリグニン殻であり得る。「リグニン殻」とは、本明細書中で用いる場合、バイオマスが糖化された後に残存している材料を意味する。
【００３５】
ある実施形態では、本発明は、真菌により、例えばセルロース分解性糸状菌トリコデルマ・リーセイの菌株により産生された酵素を用いて、セルロースまたはリグノセルロース系材料を糖化するための工程に関する。いくつかの実行において、トリコデルマ・リーセイの高収量性セルラーゼ突然変異体、例えばＲＵＴ‐ＮＧ１４、ＰＣ３‐７、ＱＭ９４１４および／またはＲＵＴ‐Ｃ３０が用いられる。このような菌株は、例えば“Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｉｇｈ  Ｙｉｅｌｄｉｎｇ  Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ  Ｍｕｔａｎｔｓ  ｏｆ  Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ，”Ｍｏｎｔｅｎｅｃｏｕｒｔ，Ｂ．Ｓ．  ａｎｄ  Ｅｖｅｒｌｅｉｇｈ，Ｄ．Ｅ．Ａｄｖ．Ｃｈｅｍ．Ｓｅｒ．１８１，２８９−３０１（１９７９）に記載されている。これらの突然変異体は、高産生性で、異化代謝産物抑制耐性であって、セルラーゼの高収量を達成させる。
【００３６】
好ましい実施形態では、酵素産生は、糖化されるべきリグノセルロース系材料の一部分の存在下で実行される。リグノセルロース系材料は、酵素産生工程において、セルラーゼ合成のための誘導物質として作用して、特定のリグノセルロース系材料に仕立てられる活性を有するセルラーゼ複合体を産生し得る。いくつかの実行において、リグノセルロース系材料の難分解性は、誘導物質としてそれを用いる前に低減される。これは、リグノセルロース系材料内のセルロースを真菌がより容易に利用できるようにする、と考えられる。リグノセルロース系材料の難分解性の提言は、糖化も助長する。
【００３７】
いくつかの場合、リグノセルロース系材料の難分解性を低減することは、物理的処理でリグノセルロース系材料を処理することを包含する。物理的処理は、例えば、放射線、例えば電子衝撃、音波処理、熱分解、酸化、水蒸気爆発、化学的処理、またはこれらの処理のいずれかの組合せであり得る。処理は、単独でまたは任意の所望の組合せで適用され、そして１回または多数回適用される本明細書中に記載される処理のうちのいずれか１つまたはそれ以上も包含し得る。
【００３８】
バイオマス、例えばバイオマスのセルロースおよび／またはリグニン部分を分解する酵素およびバイオマス破壊生物は、種々のセルロース分解酵素（セルラーゼ）、リグニナーゼまたは種々の小分子バイオマス破壊代謝産物を含有するかまたは製造する。これらの酵素は、バイオマスの結晶セルロースまたはリグニン部分を分解するために相乗的に作用する酵素の複合体であり得る。セルロース分解酵素の例としては、以下のものが挙げられる：エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼおよびセロビアーゼ（ベータ・グルコシダーゼ）。
【００３９】
図１に示したように、例えば糖化中、セルロース基質（Ａ）は、最初に、無作為位置でエンドグルカナーゼ（ｉ）により加水分解されて、オリゴマー中間体（例えばセルロース）を生じる（Ｂ）。これらの中間体は、その場合、グルカナーゼ（ｉｉ）、例えばセロビオヒドロラーゼを外分解して、セルロースポリマーの末端からセロビオースを生成するための基質である。セロビオースは、グルコースの水溶性１，４‐連結二量体である。最後に、セロビアーゼ（ｉｉｉ）はセロビオースを切断して（Ｃ）、グルコースを生じる（Ｄ）。したがって、エンドグルカナーゼは、セルロースの結晶部分を攻撃するのに、そしてエキソセルラーゼの有効性を増大してセロビオースを生成し、これは次に、グルコースを生成するためにセロビオースの特異性を要する。したがって、セルロース基質の性質および構造によって、３つの異なる酵素の量および種類が改質される必要があり得る、ということは明白である。
【００４０】
本明細書中に記載される工程で産生され、用いられる酵素は、真菌により、例えば真菌トリコデルマ・リーセイの１つ以上の菌株により産生され得る。好ましい実行において、トリコデルマ・リーセイの高収量セルラーゼ突然変異体、例えばＲＵＴ‐ＮＧ１４、ＰＣ３‐７、ＱＭ９４１４および／またはＲＵＴ‐Ｃ３０が用いられる。
【００４１】
酵素産生は、糖化されるであろう供給原料の一部分の存在下で実行され、それにより特定の供給原料に仕立てられるセルラーゼ複合体を生成する、というのが好ましい。例えば、供給原料中のセルロースを真菌がより容易に利用できるようにするために、本明細書中に記載される難分解性低減工程のうちの１つ以上を用いて、供給原料は、その難分解性を低減するためのこのような使用の前に処理され得る。
【００４２】
好ましい実施形態では、酵素誘導バイオマスは、電子衝撃により処理され得る。バイオマスは、例えば、約１Ｍｒａｄ未満、約２Ｍｒａｄ、約５、約１０、約２０、約５０、約１００または約１５０Ｍｒａｄ未満の総線量での電子衝撃により、処理され得る。好ましくは、酵素誘導バイオマスは、約０．１Ｍｒａｄ〜約１５０Ｍｒａｄ、約１〜約１００Ｍｒａｄ、好ましくは約２〜約５０Ｍｒａｄ、または約５〜約４０Ｍｒａｄの総線量で処理される。
【００４３】
以下でさらに考察されるように、一旦酵素が生成されると、それは、酵素を生成するために用いられていない残りの供給原料を糖化するために用いられる。所望の生成物または中間体に供給原料を転化するための工程は、一般的に、この糖化ステップのほかに、他のステップを包含する。
【００４４】
例えば、図２に言及すると、アルコールを製造するための工程は、例えば、この処理の前および／または後に、そのサイズを低減するために、供給原料を任意に機械的に処理すること（２００）、任意に、その難分解性をさらに低減するために別の物理的処理で供給原料を処理すること（２１０）、次いで、酵素複合体を用いて、供給原料を糖化して、糖溶液を形成すること（２２０）を包含し得る。任意に、当該方法は、例えばパイプライン、鉄道車輛、トラックまたは平底荷船により、溶液（または糖化が途中で実施される場合、供給原料、酵素および水）を製造プラントに運搬すること（２３０）も包含し得る。いくつかの場合、糖化供給原料は、さらにバイオ加工処理（発酵）されて、所望の生成物、例えば、アルコールを生成する（２４０）。この結果的に生じる生成物は、いくつかの実行において、例えば蒸留によりさらに加工処理されて（２５０）、最終生成物を生じ得る。供給原料の難分解性を低減するための一方法は、供給原料の電子衝撃による。所望により、供給原料のリグニン含量を測定するステップ（２０１）、そしてこの測定値に基づいて工程パラメーターを設定するかまたは調整すること（２０５）ステップは、米国特許出願公告２０１０／０２０３４９５  Ａ１（ＭｅｄｏｆｆおよびＭａｓｔｅｒｍａｎ；２０１０年８月１２日公開；この記載内容は参照により本明細書中で援用される）に記載されるように、工程の種々の段階で実施され得る。供給原料を糖化すること（２２０）は、供給原料を培地および酵素（２２１）と混合することにより改変され得る。
【００４５】
酵素複合体の製造は、ここで、先ず記載され、その後、図２を参照しながら上記の方法ステップ、ならびに当該工程で用いられる材料について記載する。
【００４６】
多数の異なる条件が試験された。結果を以下に示す。一実施形態では、酵素誘導バイオマスは、トウモロコシ穂軸である。この実施形態では、バイオマスは、３５Ｍｒａｄ電子線を用いた電子衝撃により処理される。好ましくは、バイオマスは、１０〜１４００ｕｍ、さらに好ましくは２００ｕｍ未満、最も好ましくは５０ｕｍ未満の粒子サイズに細砕される。処理済みバイオマス（湿潤または乾燥形態）は、約２５〜約１３３ｇ／接種培地１Ｌ、さらに好ましくは１００ｇ／Ｌの総量で付加される。誘導因子バイオマスは、接種後３日目を過ぎて微生物の増殖における任意の時点で付加され得るが、しかし好ましくは、接種後１〜３日に付加される。誘導因子として付加されるべきバイオマスの量は、すべて一度に、あるいはアリコートで、例えば２部に分けて、または５部に分けて、付加され得る。好ましくは、トウモロコシ穂軸バイオマスは、すべて一度に付加される。
【００４７】
酵素誘導バイオマスは、固体として、またはスラリーとして、微生物に提示され得る。好ましくは、それはスラリーとして付加される。
酵素産生
【００４８】
セルラーゼを産生する糸状菌または細菌は、典型的にはセルラーゼの産生のための炭素源および誘導物質を必要とする。いかなる理論にも縛られずに考えると、この開示の酵素は、その産生を誘導するために用いられる基質の糖化のために特に適している。
【００４９】
リグノセルロース材料は、セルロース、ヘミセルロースおよびリグニンの異なる組合せを含む。セルロースは、グルコースの線状ポリマーで、有意のらせん化を伴わないわずかに堅い線状構造を形成する。この構造および水素結合し得るヒドロキシル基の配置のため、セルロースは、結晶および非結晶部分を含有する。結晶部分はさらにまた、鎖間の水素結合の位置によって、例えばＩ（アルファ）およびＩ（ベータ）として表される異なる型を有し得る。ポリマー長それ自体は、変化して、セルロースの形態により多くの変種を加える。ヘミセルロースは、いくつかのヘテロポリマーのいずれか、例えばキシラン、グルクロノキシラン、アラビノキシランおよびキシログルカンである。存在する主な糖単量体はキシロースであるが、しかし他の単量体、例えばマンノース、ガラクトース、ラムノース、アラビノースおよびグルコースが存在する。典型的には、ヘミセルロースは、セルロースより低い分子量を有する分枝鎖構造を形成する。したがって、ヘミセルロースは、一般的に酵素的加水分解に感受性の非晶質材料である。リグニンは、一般的に複雑な高分子量ヘテロポリマーである。すべてのリグニンがその組成に変異を示すが、しかしそれらは、フェニルプロペン単位の非晶質樹上網目構造ポリマーとして記載されている。特定の生体材料中のセルロース、ヘミセルロースおよびリグニンの量は、生体材料の供給源によって決まる。例えば、木材由来の生体材料は、型によって、セルロース約３８〜４９％、ヘミセルロース７〜２６％、およびリグニン２３〜３４％であり得る。草は、典型的には、セルロース約３３〜３８％、ヘミセルロース２４〜３２％、およびリグニン１７〜２２％である。明らかに、リグノセルロース性バイオマスは、大クラスの基質を構成する。
【００５０】
バイオマス材料の多様性は、前処理により、例えばポリマーの結晶性および分子量を変えることにより、さらに増大され得る。
【００５１】
セルラーゼ産生生物は、バイオマスと接触されると、生物の成長に有益な分子、例えばグルコースを放出する酵素を産生する傾向がある。これは、上記のような酵素誘導の現象により実行される。特定の生体材料中には種々の基質が存在するため、種々のセルラーゼが、例えば上記のエンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼおよびセロビアーゼが存在する。誘導物質として特定のリグノセルロース材料を選択することにより、これらの酵素の相対濃度および/または活性は調整され、したがってその結果生じる酵素複合体は、誘導物質または同様の材料として用いられるリグノセルロース材料において効率的に働く。例えば、結晶セルロースの割合の高い生体材料ほど、結晶セルロースをほとんど有さない生体材料より有効なまたは多量のエンドグルカナーゼを誘導し得る。」
【００５２】
したがって、セルラーゼの最適生成および使用のための多数の方法がある。これらの工程のいくつかの詳細を、図面を参照しながら記載する。
【００５３】
例えば、図３に言及すると、第一バイオマスは、例えばその難分解性を低減するために、任意に前処理され（３００）、次いで、水性培地およびセルラーゼ産生生物と混合される（３１０）。細胞が所望の段階に増殖し、十分な酵素が産生されるために適切な時間が経過した後、第二バイオマスが付加される（３２０）。第二および任意の残りの第一バイオマスに及ぼす酵素の作用が糖の混合物を生成し、これがさらに有用な生成物（例えば、アルコール、純糖）に加工される（３３０）。第一および第二バイオマスは、同一バイオマス供給源材料の部分であり得る。例えばバイオマスの一部分は、セルラーゼ産生生物と組み合わされて、次に、酵素のいくつかが一旦産生されると、別の部分が後の段階で付加される（Ａ）。任意に、第一および第二バイオマスは、ともに、難分解性を低減するよう前処理され得る。水性培地は、以下で考察される。
【００５４】
ここで、図４に言及すると、セルラーゼ産生生物（４００）は、特定の増殖期に達する時間の間、増殖培地中で増殖され得る。例えばこの増殖期は、数日または数週間にわたって延長し得る。前処理済み第一バイオマス（４０５）は、次に、酵素産生細胞（４１０）と接触され（Ａ）、したがって、一定時間後、酵素が産生される。酵素産生は、長期間ン位亘って起きることもある。酵素含有溶液は、次に、第二バイオマス（４２０）と組み合わされる。第二および残りの第一バイオマスに及ぼす酵素の作用は、混合糖を生じ、これはさらに、有用な生成物に加工処理される（４３０）。第一および第二バイオマスは、同一バイオマスの部分であり得るし、あるいは類似するが、しかし同一ではない（例えば前処理済みおよび非前処理済み）材料であり得る（Ｂ）。
【００５５】
図４で上記した方法のほかに、セルラーゼ産生生物（４００）は、任意に、第一前処理済みバイオマス（４１０）と組み合わされる前に、収穫され得る。収穫は、溶媒および増殖培地構成成分の部分的またはほぼ完全な除去を包含し得る。例えば、細胞は、遠心分離により収集され、次いで、水または別の溶液で洗浄され得る。
【００５６】
別の実施形態では、酵素（単数または複数）が産生された後（４１０）、それは濃縮され得る（例えば、図４のステップ４１０と４２０の間）。濃縮は、任意の有用な方法、例えばクロマトグラフィー、遠心分離、濾過、透析、抽出、溶媒の蒸発、噴霧乾燥、および固体支持体上への吸着による。濃縮酵素は、一定時間保存され、次いで、第二バイオマス（４２０）の付加、および有用生成物（４３０）の産生により用いられ得る。
【００５７】
上記方法で用いられる水性培地は、付加酵母抽出物、トウモロコシ浸出液、ペプトン、アミノ酸、アンモニウム塩、リン酸塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩、亜鉛塩およびコバルト塩を含有し得る。これらの構成成分のほかに、増殖培地は、典型的には、０〜１０％グルコース（例えば、１〜５％グルコース）を炭素源として含有する。付加的には、誘導物質培地は、前記のバイオマスのほかに、他の誘導物質を含有し得る。例えば、いくつかの既知の誘導物質は、ラクトース、純セルロースおよびソフォロースである。有用な生成物の所望の産生を最適化するための加工処理中に、種々の構成成分が付加され、除去され得る。
【００５８】
酵素産生を誘導するために典型的に用いられるバイオマスの濃度は、０．１重量％以上、および５０重量％以下、０．５重量％以上および２５重量％以下、１重量％以上および１５重量％以下、または１重量％以上および１０重量％以下である。
【００５９】
上記の工程のいずれかは、バッチ、流加バッチまたは連続工程として実施され得る。工程は、工業規模の生産のために有用であり、例えば、少なくとも５０リットル、少なくとも１００リットル、さらに好ましくは少なくとも５００リットル、さらに好ましくは少なくとも１，０００リットル、特に、少なくとも５，０００リットル、１００，０００リットルまたは５００，０００リットルの培地を有する。当該工程は、好気的にまたは嫌気的に実行され得る。いくつかの酵素は、液中培養により、あるものは表面培養により産生される。
【００６０】
上記の工程のいずれかにおいて、酵素は製造され、保存され、次いで、後日に、および／または異なる場所で、糖化するために用いられる。
【００６１】
上記の工程のいずれかは、撹拌を用いて実行され得る。いくつかの場合、撹拌は、米国特許出願公告２０１０／０２９７７０５  Ａ１（ＭｅｄｏｆｆおよびＭａｓｔｅｒｍａｎ；２０１０年１１月２５日公開）、米国特許出願公告２０１２／００９１０３５  Ａ１（ＭｅｄｏｆｆおよびＭａｓｔｅｒｍａｎ；２０１２年４月１９日公開）および米国特許出願公告２０１２／０１００５７２  Ａ１（ＭｅｄｏｆｆおよびＭａｓｔｅｒｍａｎ；２０１２年４月２６日公開）（これらの記載内容は、参照により本明細書中で援用される）に記載されたように、ジェットミキシングを用いて実行され得る。
【００６２】
酵素産生生物の増殖のための温度は、生物体増殖を増強するために選択される。例えば、トリコデルマ・リーセイに関しては、最適温度は、一般的に２０〜４０℃（例えば、３０℃）である。酵素産生のための温度は、当該工程のその部分のために最適化される。例えば、トリコデルマ・リーセイに関しては、酵素産生のための最適温度は、２０〜４０℃（例えば、２７℃）である。
供給原料、バイオマス材料、および／または誘導物質
【００６３】
酵素産生のための誘導物質であり得る供給原料は、好ましくはリグノセルロース材料であるが、しかし本明細書中に記載される工程は、セルロース材料、例えば紙、紙製品、紙パルプ、綿およびこれらのいずれかの混合物、そして他の型のバイオマスとともに用いられ得る。本明細書中に記載される工程は、リグノセルロース材料を用いて特に有用であるが、それは、これらの工程が、リグノセルロース材料の難分解性を低減し、このような材料が経済的に実行可能な方法で生成物および中間体に加工処理させるのに特に有効であるためである。
【００６４】
本明細書中で用いる場合、「バイオマス材料」という用語は、リグノセルロース系、セルロース系、デンプン系および微生物系材料を包含する。
【００６５】
好ましくは、酵素誘導バイオマス材料は、農業廃棄物、例えばトウモロコシ穂軸、さらに好ましくはトウモロコシ飼葉である。もっとも好ましくは、酵素誘導バイオマス材料は草を含む。
【００６６】
リグノセルロース材料としては、木材、パーティクルボード、林業系廃棄物（例えば、おがくず、アスペン材、木材チップ）、草（例えば、スイッチグラス、ススキ、ミクリ、クサヨシ）、穀粒残渣（例えば、コメ籾殻、オートムギ籾殻、コムギ籾殻、オオムギ籾殻）、農業廃棄物（例えば、貯蔵牧草、キャノーラ藁、コムギ藁、オオムギ藁、オートムギ藁、コメ藁、ジュート、麻、亜麻、竹、サイザルアサ、マニラ麻、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ飼葉、ダイズ飼葉、トウモロコシ繊維、アルファルファ、干し草、ココヤシ表面毛）、糖加工残渣（例えば、バガス、ビートパルプ、リュウゼツランバガス）、藻類、海藻、堆肥、下水汚物、およびこれらのいずれかの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６７】
いくつかの場合、リグノセルロース材料はトウモロコシ穂軸を包含する。粉砕または破砕トウモロコシ穂軸は、照射のために相対的に均一な厚みで広げられ、照射後、さらなる加工処理のために媒質中に分散するのが容易になる。収穫および収集を助長するために、いくつかの場合には、トウモロコシ植物全体、例えばトウモロコシ茎、トウモロコシ穀粒、そしていくつかの場合には、植物体の根系でも用いられ得る。
【００６８】
トウモロコシ穂軸、あるいは有意量のトウモロコシ穂軸を含有するセルロースまたはリグノセルロース材料の発酵中は、付加的栄養成分（窒素源、例えば尿素またはアンモニア以外）を必要としない、というのが有益である。
【００６９】
トウモロコシ穂軸は、細砕の前および後に、搬送および分散するのも容易であり、他のセルロースまたはリグノセルロース材料、例えば干し草および草より空気中で爆発性混合物を生じ難い。
【００７０】
セルロース材料としては、例えば紙、紙製品、紙廃棄物、紙パルプ、着色紙、上塗り紙、被覆紙、充填紙、雑誌、印刷物（例えば、書物、カタログ、マニュアル、ラベル、カレンダー、挨拶状、小冊子、内容見本、新聞印刷用紙）、印刷用紙、ポリコーティング紙、硬い厚紙、ボール紙、板紙、高アルファ‐セルロース含量を有する材料、例えば綿、ならびにこれらのいずれかの混合物が挙げられる。例えば、米国特許出願１３／３９６，３６５（“Ｍａｇａｚｉｎｅ  Ｆｅｅｄｓｔｏｃｋｓ”；Ｍｅｄｏｆｆ等；２０１２年２月１４日出願；この記載内容は参照により本明細書中で援用される）に記載されたような紙製品。
【００７１】
セルロース材料は、脱リグニン化されたリグノセルロース材料も含み得る。
【００７２】
デンプン材料としては、デンプンそれ自体、例えばコーンスターチ、コムギデンプン、ジャガイモデンプンまたはコメデンプン、デンプンの誘導体、あるいは食料品または穀物のようなデンプンを含む材料が挙げられる。例えば、デンプン材料は、アラカチャ、ソバ、バナナ、オオムギ、キャッサバ、葛、アンデスカタバミ、サゴヤシ、モロコシ、普通の家庭用ジャガイモ、サツマイモ、タロイモ、ヤムイモ、あるいは１つ以上の豆類、例えばソラマメ、レンズマメまたはエンドウであり得る。任意の２つ以上のデンプン材料の配合物も、デンプン材料である。デンプン、セルロースおよび／またはリグノセルロース材料の混合物も、用いられ得る。例えばバイオマスは、全植物、植物の一部分、または植物の異なる部分、例えばコムギ植物体、綿植物体、トウモロコシ植物体、コメ植物体または樹木であり得る。デンプン材料は、本明細書中に記載される方法のいずれかにより処理され得る。
【００７３】
微生物材料としては、任意の天然または遺伝子修飾微生物、または炭水化物（例えばセルロース）の供給源を含有するかまたは提供し得る生物体、例えば原生生物、例えば動物原生生物（例えば、鞭毛虫類、アメーバ類、繊毛虫類および胞子虫類のような原生動物）および植物原生生物（例えば、藻類、例えばアルベオラータ類、クロロラクニオン藻類、クリプトモナド類、ミドリムシ類、灰色藻類、ハプト藻類、紅藻類、黄金色藻類および緑藻類）が挙げられるが、これらに限定されない。その他の例としては、海藻、プランクトン（例えば、マクロプランクトン、メソプランクトン、ミクロプランクトン、ナノプランクトン、ピコプランクトンおよびフェムトプランクトン）、植物プランクトン、細菌（例えば、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌および好極限性細菌）、酵母および／またはこれらの混合物が挙げられる。いくつかの場合には、微生物バイオマスは、天然供給源から、例えば海、湖、水本体、例えば塩水または真水から、あるいは陸上で得られる。代替的にはまたはさらに、微生物バイオマスは、培養系、例えば大規模乾燥および湿潤培養および発酵系から得られる。
【００７４】
バイオマス材料は、腐肉および同様の材料供給源も包含し得る。
【００７５】
他の実施形態では、バイオマス材料、例えばセルロース、デンプンおよびリグノセルロース供給材料は、野生型変種に関して修飾されたトランスジェニック微生物および植物から獲得され得る。このような修飾は、例えば、植物における所望の形質を得るための選択および育種の反復ステップによるものであり得る。さらに、植物は、野生型変種に関して除去され、修飾され、サイレンス化され、および／または付加される遺伝物質を有し得た。例えば遺伝子修飾植物は、組換えＤＮＡ法（この場合、遺伝子修飾は、親変種からの特定遺伝子を導入するかまたは修飾することを包含する）により、あるいは例えば、トランスジェニック育種（この場合、単数または複数の特定遺伝子が異なる種の植物および／または細菌からある植物に導入される）を用いることにより、産生され得る。遺伝子変異を作成するための別の方法は、突然変異育種による（この場合、新規対立遺伝子は、内因性遺伝子から人工的に作成される）。人工遺伝子は、種々の方法により、例えば化学的突然変異誘発因子（例えば、アルキル化剤、エポキシ度、アルカロイド、過酸化物、ホルムアルデヒドを使用する）、照射（例えば、Ｘ線、ガンマ線、中性子、ベータ粒子、アルファ粒子、陽子、重水素、ＵＶ線）および温度ショックまたはその他の外的ストレス、ならびにその後の選択技法により、作成され得る。修飾遺伝子を提供するその他の方法は、エラープローンＰＣＲおよびＤＮＡシャッフリングとその後の所望の修飾ＤＮＡの所望の植物または種子への挿入による。種子または植物における所望の遺伝子変異を導入する方法としては、例えば、細菌キャリア、微粒子銃、リン酸カルシウム沈降、電気穿孔、遺伝子スプライシング、遺伝子サイレンシング、リポフェクション、マイクロインジェクションおよびウィルスキャリアが挙げられる。付加的遺伝子修飾材料は、米国特許出願１３／３９６，３６９（２０１２年２月１４日出願；この記載内容は参照により本明細書中で援用される）に記載されている。
【００７６】
本明細書中に記載される方法のいずれかが、本明細書中に記載される任意のバイオマス材料の混合物で実行され得る。
バイオマス  ‐  機械的調製
【００７７】
供給原料の機械的処理としては、例えば切断、粉砕、例えばハンマー式粉砕、湿式粉砕、磨り潰し、圧縮、剪断または切り刻みが挙げられ得る。最初の機械的処理ステップは、いくつかの実行では、供給原料のサイズを低減することを包含し得る。いくつかの場合、切断、剪断および／または細断により、目の粗い供給原料（例えば、リサイクル紙またはスイッチグラス）が最初に調製される。
【００７８】
加工処理中の最初および／または後期に実施され得るこのサイズ低減のほかに、機械的処理は、供給原料材料を「開口し」、「圧迫し」、分断するかまたは打ち砕き、当該材料のセルロースを、構造的改変処理中の鎖切断および／または結晶構造の崩壊に対してより感受性にするためにも、有益である。
【００７９】
供給原料を機械的に処理する方法としては、例えば粉砕または磨り潰しが挙げられる。粉砕は、例えばハンマーミル、ボールミル、コロイドミル、コニカルまたはコーンミル、ディスクミル、エッジミル、ウィリーミルまたはグリストミルを用いて実施され得る。磨り潰しは、例えば切断／衝撃型グラインダーを用いて実施され得る。グラインダーの具体例としては、石材用グラインダー、ピングラインダー、コーヒーグラインダーおよびブーア（ｂｕｒｒ）グラインダーが挙げられる。磨り潰しまたは粉砕は、例えば、ピンミルの場合のように、往復運動ピンまたは他の要素により、提供され得る。その他の機械的処理方法としては、機械的切り裂きまたは引き裂き、繊維に圧力を適用する他の方法、および空気磨滅粉砕が挙げられる。適切な機械的処理はさらに、以前の加工処理ステップにより開始された材料の内部構造の崩壊を継続する任意の他の技法を包含する。
【００８０】
用いられ得る機械的処理、ならびに機械的処理済み供給原料の特質は、米国特許１３／２７６，１９２（２０１１年１０月１８日出願、そして米国特許出願公告２０１２／０１００５７７  Ａ１として２０１２年４月２６日公開；この記載内容は参照により本明細書中で援用される）にさらに詳細に記載されている。
バイオマス処理  ‐  電子衝撃
【００８１】
いくつかの場合、供給原料は、電子衝撃で処理されて、その構造を改変し、それによりその難分解性を低減し得る。このような処理は、例えば、供給原料の平均分子量を低減し、供給原料の結晶構造を変え、および／または供給原料の表面積および／または多孔度を増大する。
【００８２】
電子線による電子衝撃が一般的に好ましいが、それは、非常に高い処理量を提供するためであり、そして相対的低電圧／高出力電子線装置は、「セルフシールド」され、安全で効率的工程を提供するので、このような装置の使用が高価なコンクリート製丸天井型遮蔽の必要性を排除するためである。「セルフシールド」装置は遮蔽（例えば金属板遮蔽）を包含するが、それらは、コンクリート製丸天井の構築を必要とせず、資本支出を大きく低減し、そしてしばしば、高価な修正なしに現存製造設備の使用を可能にする。電子線加速器は、例えばＩＢＡ（Ｉｏｎ  Ｂｅａｍ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｌｏｕｖａｉｎ−ｌａ−Ｎｅｕｖｅ，  Ｂｅｌｇｉｕｍ）、Ｔｉｔａｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，  ＵＳＡ）およびＮＨＶ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｎｉｐｐｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｖｏｌｔａｇｅ，  Ｊａｐａｎ）から入手可能である。
【００８３】
電子衝撃は、１０ＭｅＶ未満、例えば７ＭｅＶ未満、５ＭｅＶ未満または２ＭｅＶ未満、例えば約０．５〜１．５ＭｅＶ、約０．８〜１．８ＭｅＶ、約０．７〜１ＭｅＶまたは約１〜３ＭｅＶの公称エネルギーを有する電子線装置を用いて実施され得る。いくつかの実行において、公称エネルギーは約５００〜８００ｋｅＶである。
【００８４】
電子線は、相対的に高い総ビーム出力（全加速ヘッドの併合ビーム出力、または多重加速器が用いられる場合、全加速器および全ヘッドの併合ビーム出力）、例えば少なくとも２５ｋＷ、例えば少なくとも３０、４０、５０、６０、６５、７０、８０、１００、１２５または１５０ｋＷを有し得る。いくつかの場合、出力は、５００ｋＷ、７５０ｋＷまたは１０００ｋＷ以上という高さでさえある。いくつかの場合、電子線は、１２００ｋＷ以上のビーム出力を有する。
【００８５】
この高い総ビーム出力は、通常は、多重加速ヘッドを利用することにより達成される。例えば電子線装置は、２、４またはそれより多い加速ヘッドを包含し得る。その各々が相対的低ビーム出力を有する多重ヘッドの使用は、当該材料中の過剰温度上昇を防止し、それにより当該材料の燃焼を防止し、さらにまた、材料の層の厚みを通して線量の均一性を増大する。
【００８６】
いくつかの実行においては、電子衝撃中に材料を冷却することが望ましい。例えば、当該材料は、例えば単軸押出機またはその他の搬送装置により搬送されている間、冷却され得る。
【００８７】
難分解性低減工程により必要とされるエネルギーを低減するために、できるだけ迅速に材料を処理することが望ましい。概して、処理は約０．２５Ｍｒａｄ／秒より大きい、例えば約０．５、０．７５、１、１．５、２、５、７、１０、１２、１５より大きく、あるいは約２０Ｍｒａｄ／秒より大きいことさえあり、例えば約０．２５〜２Ｍｒａｄ／秒の線量率で実施される、ということが好ましい。材料の熱分解を回避するためには、線量率が高いほど、一般的に高ライン速度を要する。一実行において、加速器は、３ＭｅＶ、５０ｍＡｍｐビーム流に設定され、約２０ｍｍの試料厚に関してはライン速度は２４フィート／分である（例えば、０．５ｇ／ｃｍ３の嵩密度を有する細砕トウモロコシ穂軸材料）。
【００８８】
いくつかの実施形態では、電子衝撃は、材料が少なくとも０．５Ｍｒａｄ、例えば少なくとも５、１０、２０、３０または少なくとも４０Ｍｒａｄの総線量を受けるまで実施される。いくつかの実施形態では、処理は、約０．５Ｍｒａｄ〜約１５０Ｍｒａｄ、約１Ｍｒａｄ〜約１００Ｍｒａｄ、約２Ｍｒａｄ〜約７５Ｍｒａｄ、１０Ｍｒａｄ〜約５０Ｍｒａｄ、例えば約５Ｍｒａｄ〜約５０Ｍｒａｄ、約２０Ｍｒａｄ〜約４０Ｍｒａｄ、約１０Ｍｒａｄ〜約３５Ｍｒａｄまたは約２５Ｍｒａｄ〜３０Ｍｒａｄの線量を材料が受けるまで実施される。いくつかの実行において、２５〜３５Ｍｒａｄの総線量が選択され、理想的には２〜３秒間、例えば５Ｍｒａｄ／通過（pass）で適用され、各通過（pass）は、約１秒間適用される。７〜８Ｍｒａｄ／通過（pass）より多い線量の適用は、いくつかの場合、供給原料の熱分解を引き起こす。
【００８９】
上記のような多重ヘッドを用いて、当該物質は、多重通過（pass）で、例えば２通過（pass）を、１０〜２０Ｍｒａｄ／通過（pass）で、例えば１２〜１８Ｍｒａｄ／通過（pass）で、２〜３秒のクールダウンを挟んで、あるいは３通過（pass）を、７〜１２Ｍｒａｄ／通過（pass）、例えば９〜１１Ｍｒａｄ／通過（pass）で、処理され得る。上記のように、１つの高線量でというよりむしろ、いくつかの相対的に低い線量での材料の処理は、材料の過熱を防止し、さらにまた材料の厚み全体を通しての線量均一性を増大する傾向がある。いくつかの実行において、材料は各通過（pass）の最中または後に撹拌されるか、そうでなければ混合されて、次に、再び均一層にならした後、次の通過（pass）に進んで、処理均一性をさらに増強する。
【００９０】
いくつかの実施形態では、電子は、例えば光の速度の７５％より速い速度に、例えば光の速度の８５、９０、９５または９９％より速い速度に加速される。
【００９１】
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載される任意の加工処理は、獲得された場合の乾燥を保持する、または、例えば熱および／または減圧を用いて乾燥されたリグノセルロース材料において生じる。例えば、いくつかの実施形態では、セルロースおよび／またはリグノセルロース材料は、２５℃で５０％の相対湿度で測定して、約５重量％未満の保持水分量を有する。
【００９２】
電子衝撃は、セルロースおよび／またはリグノセルロース材料が空気、酸素濃化空気に、または酸素それ自体にも曝露されるか、あるいは不活性ガス、例えば窒素、アルゴンまたはヘリウムにより覆われる間、適用され得る。最大酸化が所望される場合、酸化環境、例えば空気または酸素が利用され、ビーム源からの距離が最適化されて、反応性ガス生成、例えばオゾンおよび／または窒素の酸化物を最大にする。
バイオマス処理  ‐  音波処理、熱分解、酸化、水蒸気爆発
【００９３】
所望により、供給原料の難分解性を低減するために、電子衝撃のほかに、１つ以上の音波処理、熱分解、酸化または水蒸気爆発工程が用いられ得る。
処理済みバイオマス材料の使用
【００９４】
バイオマス材料（例えば、植物バイオマス、動物バイオマス、紙および地方自治体廃棄物バイオマス）は、供給原料として用いられて、有用な中間物質および生成物、例えば有機酸、有機酸の塩、無水物、有機酸のエステルおよび燃料、例えば内燃エンジンのための燃料または燃料電池のための供給原料を生成し得る。容易に入手可能であるが、しかししばしば加工処理するのが困難であり得るセルロースおよび／またはリグノセルロース材料、例えば地方自治体廃棄物ストリームおよび廃棄物紙ストリーム、例えば新聞、クラフト紙、段ボール紙またはこれらの混合物を含むストリームを供給原料として用い得るシステムおよび工程が、本明細書中で記載される。
【００９５】
容易に加工処理され得る形態に供給原料を転換するために、供給原料中のグルカン‐またはキシラン‐含有セルロースは、糖化剤、例えば酵素または酸により、低分子量炭水化物、例えば糖に加水分解され得る（糖化と呼ばれる工程）。次に、低分子量炭水化物は、例えば現存製造プラントにおいて、例えば単一細胞タンパク質プラント、酵素製造プラント、または燃料プラント、例えばエタノール製造施設において、用いられ得る。
【００９６】
供給原料は、酵素を用いて、例えば溶媒中で、例えば水溶液中で、材料および酵素を併合することにより、加水分解され得る。酵素は、本明細書中に記載される方法にしたがって、製造され／誘導され得る。
【００９７】
具体的には、酵素は、バイオマス（例えばバイオマスのセルロースおよび／またはリグニン部分）を分解し得る、あるいは種々のセルロース分解酵素（セルラーゼ）、リグニナーゼまたは種々の小分子バイオマス分解代謝物質を含有するかまたは製造する生物体により供給され得る。これらの酵素は、結晶セルロースまたはバイオマスのリグニン部分を分解するために相乗的に作用する酵素の複合体であり得る。セルロース分解酵素の例としては、以下のものが挙げられる：エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼおよびセロビアーゼ（ベータ・グルコシダーゼ）。
【００９８】
糖化中、セルロース基質は、最初は、無作為位置でエンドグルカナーゼにより加水分解されて、オリゴマー中間体を生成し得る。これらの中間体は、その場合、セルロースポリマーの末端からセロビオースを生成するためのセロビオヒドロラーゼのような外分割グルカナーゼのための基質である。セロビオースは、グルコースの水溶性１，４‐結合二量体である。最後に、セロビアーゼは、セロビオースを切断して、グルコースを産生する。この工程の効率（例えば、加水分解するための時間および／または加水分解の終始）は、セルロース性物質の難分解性によって決まる。
中間体および生成物
【００９９】
本明細書中で記載される工程を用いて、バイオマスは、１つ以上の生成物、例えばエネルギー、燃料、食物および材料に転化され得る。生成物の具体的例としては、水素、糖(例えば、グルコース、キシロース、アラビノース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、二糖、オリゴ糖および多糖)、アルコール(例えば、一価アルコールまたは二価アルコール、例えばエタノール、ｎ‐プロパノール、イソブタノール、ｓｅｃ‐ブタノール、ｔｅｒｔ‐ブタノールまたはｎ‐ブタノール)、水和または水性アルコール(例えば、１０％、２０％、３０％より多い、または４０％より多いことさえある水を含有)、バイオディーゼル、有機酸、炭化水素(例えば、メタン、エタン、プロパン、イソブテン、ペンタン、ｎ‐ヘキサン、バイオディーゼル、バイオガソリンおよびその混合物)、共生成物(例えば、タンパク質、例えばセルロース分解タンパク質(酵素)または単一細胞タンパク質)、ならびに任意の組合せまたは相対濃度での、ならびに任意に、任意の添加物（例えば、燃料添加物）と組合せたこれらのいずれかの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。その他の例としては、カルボン酸、カルボン酸の塩、カルボン酸とカルボン酸の塩およびカルボン酸のエステルの混合物(例えば、メチル、エチルおよびｎ‐プロピルエステル)、ケトン(例えば、アセトン)、アルデヒド(例えば、アセトアルデヒド)、アルファおよびベータ不飽和酸(例えば、アクリル酸)およびオレフィン(例えば、エチレン)が挙げられる。その他のアルコールおよびアルコール誘導体としては、プロパノール、プロピレングリコール、１，４−ブタンジオール、１，３−プロパンジオール、糖アルコールおよびポリオール(例えば、グリコール、グリセロール、エリトリトール、トレイトール、アラビトール、キシリトール、リビトール、マンニトール、ソルビトール、ガラクチトール、イジトール、イノシトール、ボレミトール、イソマルト、マルチトール、ラクチトール、マルトトリイトール、マルトテトライトールおよびポリグリシトール、ならびにその他のポリオール)、ならびにこれらのアルコールのメチルまたはエチルエステルが挙げられる。その他の生成物としては、メチルアクリレート、メチルメタクリレート、乳酸、クエン酸、蟻酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、コハク酸、吉草酸、カプロン酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、シュウ酸、マロン酸、グルタル酸、オレイン酸、リノール酸、グリコール酸、ガンマ-酪酸、およびその混合物、これらの酸のいずれかの塩、酸の混合物およびそれらのそれぞれの塩のいずれかの混合物が挙げられる。
【０１００】
上記の生成物と互いとのおよび/または上記生成物と他の生成物（他の生成物は、本明細書中に記載される工程により、または他の方法で製造され得る）との任意の組合せは、一緒に包装され、製品として販売され得る。当該生成物は、併合され、例えば混合され、配合され、または共溶解され得るし、あるいは単に一緒に包装され、販売され得る。
【０１０１】
本明細書中に記載される生成物または生成物の組合せのいずれかは、製品販売の前に、例えば精製または単離後、あるいは包装後でも、生成物（単数または複数）中に存在し得る１つ以上の潜在的に望ましくない夾雑物を中和するために、衛生的にされるかまたは滅菌され得る。このような衛生処理は、電子衝撃で実行され、例えば約２０Ｍｒａｄ未満、例えば約０．１〜１５Ｍｒａｄ、約０．５〜７Ｍｒａｄ、または約１〜３Ｍｒａｄの投与量であり得る。
【０１０２】
本明細書中に記載される工程は、プラントの他の部分で用いられるべき、あるいは公開市場で販売されるべき水蒸気および電気（共発生）を生成するために有用な種々の副産物ストリームを産生し得る。例えば、燃焼副産物ストリームから生成される水蒸気は、蒸留工程に用いられ得る。別の例として、燃焼副産物ストリームから生成される電気は、前処理に用いられる発電機を作動するために用いられ得る。
【０１０３】
水蒸気および電気を生成するために用いられる副産物は、工程全体を通して多数の供給源から得られる。例えば廃水の嫌気性消化は、メタン濃度が高いバイオガスと、少量の廃棄物バイオマス（スラッジ）を生じ得る。別の例として、糖化後および/または蒸留後固体（例えば、前処理および一次工程から残存する非転化リグニン、セルロースおよびヘミセルロース）が用いられ、例えば燃料として燃焼され得る。
【０１０４】
得られる生成物の多くは、例えばエタノールまたはｎ‐ブタノールは、車、トラック、トラクター、船または汽車を動かすための燃料として、例えば内燃燃料として、または燃料電池供給原料として、利用され得る。得られる生成物の多くは、航空機、例えばジェットエンジンを有する飛行機またはヘリコプターを動かすためにも利用され得る。さらに、本明細書中に記載される生成物は、発電のために、例えば慣用的水蒸気生成プラントで、または燃料電池プラントで利用され得る。
【０１０５】
その他の中間体および生成物、例えば食品および薬学的製品は、米国特許出願公告２０１０/０１２４５８３  Ａ１（Ｍｅｄｏｆｆ；２０１０年５月２０日公開；この記載内容は参照により本明細書中で援用される）に記載されている。
糖化
【０１０６】
低減化難分解性供給原料は、一般的に、流体媒質中、例えば水溶液中で当該材料と酵素を組み合わせることにより、上記酵素で処理される。いくつかの場合、米国特許出願公告２０１２／０１００５７７  Ａ１（ＭｅｄｏｆｆおよびＭａｓｔｅｒｍａｎ；２０１２年４月２６日公開）（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）に記載されているように、供給原料は、糖化前に熱水中で煮沸され、浸され、または煮られる。
【０１０７】
糖化工程は、製造プラントにおいてタンク（例えば、少なくとも４０００、４０，０００または５００，０００Ｌの容積を有するタンク）中で部分的にまたは完全に実施され得るし、および/または輸送中に、例えば鉄道車輛、タンカートラックにおいて、またはスーパータンカーまたは船の船倉で、部分的にまたは完全に実施され得る。完全糖化に要する時間は、工程条件、ならびに用いられるバイオマス材料および酵素によって決まる。糖化が制御条件下で製造プラントにおいて実施される場合、セルロースは、約１２〜９６時間で、実質的に完全に、糖、例えばグルコースに転化され得る。糖化が輸送中に部分的にまたは完全に実施される場合、糖化はより長い時間を要し得る。
【０１０８】
例えば、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３５３３１（２０１０年５月１８日出願；ＷＯ  ２０１０／１３５３８０として英語で公開され、米国を指定；この記載内容は参照により本明細書中で援用される）に記載されたようなジェットミキシングを用いて、糖化中にタンク内容物が混合される、というのが一般的に好ましい。
【０１０９】
界面活性剤の付加は、糖化の速度を増強し得る。界面活性剤の例としては、非イオン性界面活性剤、例えばトゥイーン（登録商標）２０またはトゥイーン（登録商標）８０ポリエチレングリコール界面活性剤、イオン性界面活性剤または両イオン性界面活性剤が挙げられる。
【０１１０】
糖化に起因する糖溶液の濃度は、相対的に高く、例えば４０重量％より高く、あるいは５０、６０、７０、８０、９０より高く、あるいは９５重量％より高いことさえある、というのが一般的に好ましい。水は、例えば蒸発により除去されて、糖溶液の濃度を増大し得る。これは、出荷されるべき容積を低減し、溶液中での微生物増殖も抑制する。
【０１１１】
代替的には、低濃度の糖溶液が用いられ得るが、この場合、抗菌性添加物、例えば広範囲抗生物質を、低濃度で、例えば５０〜１５０ｐｐｍで付加するのが望ましい。その他の適切な抗生物質としては、アンフォテリシンＢ、アンピシリン、クロラムフェニコール、シプロフロキサシン、ゲンタマイシン、ヒグロマイシンＢ、カナマイシン、ネオマイシン、ペニシリン、プロマイシン、ストレプトマイシンが挙げられる。抗生物質は、運搬および貯蔵中の微生物の増殖を抑制し、適切な濃度で、例えば１５〜１０００重量ｐｐｍ、例えば２５〜５００ｐｐｍまたは５０〜１５０ｐｐｍで用いられ得る。所望により、抗生物質は、糖濃度が相対的に高い場合でも、含まれ得る。代替的には、防腐特性を有する抗菌性のその他の添加物が用いられ得る。好ましくは、抗菌性添加物（単数または複数）は、食品等級である。
【０１１２】
酵素を有するバイオマス材料に付加される水の量を限定することにより、相対的に高濃度の溶液が得られる。濃度は、例えば糖化が起きる程度を制御することにより、制御され得る。例えば、濃度は、溶液により多くのバイオマス材料を付加することにより、増大され得る。溶液中に生成されている糖を保持するために、界面活性剤、例えば上記の界面活性剤の１つが付加され得る。溶液の温度を増大することにより、溶解度も増大される。例えば、溶液は、４０〜５０℃、６０〜８０℃、またはそれより高く保持され得る。
糖化剤
【０１１３】
適切なセルロース分解酵素としては、以下の属の種からのセルラーゼが挙げられる：バシラス属、ヒトヨタケ属、ミセリオフィトラ属、セファロスポリウム属、シタリジウム属、ペニシリウム属、アスペルギルス属、シュードモナス属、フミコラ属、フザリウム属、チエラビア属、アクレモニウム属、クリソスポリウム属およびトリコデルマ属、特にアスペルギルス種(例えば、欧州特許公開番号０  ４５８  １６２参照)、フミコラ・インソレンス(シタリジウム・テルモフィルムとして再分類；例えば、米国特許第４，４３５，３０７号参照)、コプリヌス・シエレウス、フザリウム・オキシスポルム、ミセリオフィトラ・テルモフィラ、メリピルス・ギガンテウス、チエラビア・テレストリス、アクレモニウム種(例えば、Ａ．ペルシシヌム、Ａ．アクレモニウム、Ａ．ブラキペニウム、Ａ．ジクロモスポルム、Ａ．オブクラバツム、Ａ．ピンケルトニエ、Ａ．ロゼオグリセウム、Ａ．インコロラツムおよびＡ．フラツム（これらに限定されない））。好ましい菌株としては、フミコラ・インソレンス  ＤＳＭ１８００、フザリウム・オキシスポルム  ＤＳＭ２６７２、ミセリオフィトラ・テルモフィラ  ＣＢＳ１１７．６５、セファロスポリウム種  ＲＹＭ−２０２、アクレモニウム種  ＣＢＳ４７８．９４、アクレモニウム種  ＣＢＳ２６５．９５、アクレモニウム・ペルシシヌム  ＣＢＳ１６９．６５、アクレモニウム・アクレモニウム  ＡＨＵ９５１９、セファロスポリウム種  ＣＢＳ５３５．７１、アクレモニウム・ブラキペニウム  ＣＢＳ８６６．７３、アクレモニウム・ジクロモスポルム  ＣＢＳ６８３．７３、アクレモニウム・オブクラバツム  ＣＢＳ３１１．７４、アクレモニウム・ピンケルトニエ  ＣＢＳ１５７．７０、アクレモニウム・ロゼオグリセウム  ＣＢＳ１３４．５６、アクレモニウム・インコロラツム  ＣＢＳ１４６．６２およびアクレモニウム・フラツム  ＣＢＳ２９９．７０Ｈが挙げられる。セルロース分解酵素は、クリソスポリウム属、好ましくはクリソスポリウム・ルクノウエンスの菌株からも得られる。用いられ得る付加的菌株としては、トリコデルマ属（特に、Ｔ．ビリデ、Ｔ．リーセイおよびＴ．コニンギー）、好アルカリ性バシラス属（例えば米国特許第３，８４４，８９０号および欧州特許公開番号０  ４５８  １６２参照）、ならびにストレプトミセス属（例えば、欧州特許公開番号０  ４５８  １６２参照）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１４】
バイオマス材料を糖化し、糖を生成するために用いられ得る多数の微生物はさらにまた、糖を有用な生成物に発酵し、転化するために用いられ得る。
糖
【０１１５】
本明細書中に記載される工程において、例えば糖化後、糖（例えば、グルコースおよびキシロース）が単離され得る。例えば糖は、沈降、結晶化、クロマトグラフィー（例えば、擬似移動床クロマトグラフィー、高圧クロマトグラフィー）、遠心分離、抽出、当該技術分野で既知の任意の他の単離方法、およびその組合せにより単離され得る。
水素添加およびその他の化学的変換
【０１１６】
本明細書中に記載される工程は、水素添加を包含し得る。例えば、グルコースおよびキシロースは、それぞれソルビトールおよびキシリトールに水素添加され得る。水素添加は、高圧（例えば、１０〜１２０００ｐｓｉ）下で、Ｈ２と組合せて、触媒（例えば、Ｐｔ/ガンマ‐Ａｌ２Ｏ３、Ｒｕ/Ｃ、ラネーニッケル、または当該技術分野で既知のその他の触媒）の使用により成し遂げられ得る。本明細書中に記載される工程からの生成物の他の型の化学的変換、例えば有機糖由来生成物（例えば、フルフラルおよびフルフラル由来生成物）の生成が、用いられ得る。糖由来生成物の化学的変換は、米国特許仮出願第６１/６６７，４８１号（２０１２年７月３日出願；この記載内容は参照により本明細書中で援用される）に記載されている。
発酵
【０１１７】
糖化により生成される糖は、最終生成物として単離され得るし、あるいは発酵されて、他の生成物、例えばアルコール、糖アルコール、例えばエリトリトール、または有機酸、例えば乳酸、グルタミン酸またはクエン酸あるいはアミノ酸を生成し得る。
【０１１８】
例えば、酵母およびザイモモナス属細菌は、アルコール（単数または複数）への糖（単数または複数）の発酵または転化のために用いられ得る。他の微生物は、以下で考察される。発酵のための最適ｐＨは、約ｐＨ４〜７である。例えば、酵母のための最適ｐＨは約ｐＨ４内ｓ５であるが、一方、ザイモモナス属のためのｐＨは約５〜６である。典型的発酵時間は、約２４〜１６８時間（例えば２４〜９６時間）で、温度は２０℃〜４０℃（例えば、２６℃〜４０℃）の範囲であるが、しかしながら好熱性微生物はより高温を選択する。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、例えば嫌気性生物が用いられる場合、発酵の少なくとも一部分は、酸素の非存在下で、例えば不活性ガス、例えばＮ２、Ａｒ、Ｈｅ、ＣＯ２またはその混合物のブランケット下で、実行される。付加的には、混合物は、発酵の一部または全部の間、タンクを通して流れる不活性ガスの不断のパージを有し得る。いくつかの場合、嫌気性条件は、発酵中の二酸化炭素生成により達成されるかまたは保持され、付加的不活性ガスは必要でない。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、発酵工程の全部または一部は、低分子量糖が完全に生成物（例えば、エタノール）に転化される前に、遮断され得る。中間発酵産物としては、高濃度での糖および炭水化物が挙げられる。糖および炭水化物は、当該技術分野で既知の任意の手段により単離され得る。これらの中間発酵産物は、ヒトまたは動物消費のための食物の調製に用いられ得る。付加的には、または代替的には、中間発酵産物は、ステンレススチール製の実験室ミルで微細粒子サイズに磨り潰されて、小麦粉様物質を生じる。
【０１２１】
ジェットミキシングは、発酵中に用いられ、いくつかの場合、糖化および発酵は、同一タンク中で実施される。
【０１２２】
微生物のための栄養素は、糖化および/または発酵中に付加され、例えば食物ベースの栄養素パッケージは、米国特許出願公告２０１２/００５２５３６（２０１１年７月１５日出願；この記載内容は参照により本明細書中で援用される）に記載されている。
【０１２３】
「発酵」は、米国特許仮出願６１/５７９，５５９（２０１２年１２月２２日出願）および米国特許仮出願６１/５７９，５７６（２０１２年１２月２２日出願）（これらの記載内容はともに、参照により本明細書中で援用される）に開示されている方法および生成物を包含する。
【０１２４】
国際出願ＰＣＴ/ＵＳ２００７/０７４０２８（２００７年７月２０日出願；ＷＯ２００８/０１１５９８として英語で公開され、米国を指定）（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）に記載されているように、可動性発酵槽が利用され得る。同様に、糖化設備は、可動性であり得る。さらに、糖化および/または発酵は、輸送中に、一部または完全に実施され得る。
発酵剤
【０１２５】
発酵に用いられる微生物（単数または複数）は、天然微生物および/または工学処理微生物であり得る。例えば、微生物は、細菌（例えば、セルロース分解性細菌（これに限定されない））、真菌（例えば酵母（これに限定されない））、植物、原生生物、例えば原生動物または真菌様原生生物（例えば、粘菌（これに限定されない））、または藻類であり得る。生物体が適合性である場合、生物体の混合物が利用され得る。
【０１２６】
適切な発酵微生物は、炭水化物、例えばグルコース、フルクトース、キシロース、アラビノース、マンノース、ガラクトース、オリゴ糖または多糖を発酵産物に転化する能力を有する。発酵微生物としては、以下の属の菌株が挙げられる：作家路ミセス種（例えば出芽酵母（パン酵母）、Ｓ．ディスタチクス、Ｓ．ウバルム（これらに限定されない）)、ｌクルイベロミセス属(例えば、Ｋ．マルキシアヌス、Ｋ．フラギリス（これらに限定されない）)、カンジダ属（例えば、Ｃ.シュードトロピカリスおよびＣ．ブラッシケ（これらに限定されない））、ピキア・スチピチス（カンジダ・シェハテの共通系統）、クラビスポラ属（例えば、Ｃ．ルシタニエおよびＣ．オプンチエ（これらに限定されない））、パチソレン属（例えば、Ｐ．タンノフィルス（これに限定されない））、ブレタンノミセス属（例えば、Ｂ．クラウセニイ（Ｐｈｉｌｉｐｐｉｄｉｓ，  Ｇ．  Ｐ．，  １９９６，  Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ｉｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｎ  Ｂｉｏｅｔｈａｎｏｌ：  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ，  Ｗｙｍａｎ，  Ｃ．Ｅ．，  ｅｄ．，  Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  ＤＣ，  １７９−２１２））。その他の適切な微生物としては、例えば、ザイモモナス・モビリス、クロストリジウム種（例えば、Ｃ．テルモセルム（Ｐｈｉｌｉｐｐｉｄｉｓ，  １９９６，上記）、Ｃ．サッカロブチラセトニクム、Ｃ．サッカロブチリクム、Ｃ．プニセウム、Ｃ．ベイジェルンキイおよびＣ．アセトブチリクム（これらに限定されない））、モニリエラ・ポリニス、モニリエラ・メガチリエンシス、ラクトバシルス種、ヤロウィア・リポリチカ、アウレオバシジウム種、トリコスポロノイデス種、トリゴノプシス・バリアビリス、トリコスポロン種、モニリエラアセトアブタンス種、チフラ・バリアビリス、カンジダ・マグノリエ、ウスチラギノミセテス種、シュードザイマ・ツクバエンシス、ジゴサッカロミセス属、デバリオミセス属、ハンセヌラ属およびピキア属の酵母種、ならびにトルラ属類皮の真菌が挙げられる。
【０１２７】
例えば、クロストリジウム種は、エタノール、ブタノール、酪酸、酢酸およびアセトンを生成するために用いられ得る。ラクトバシルス種は、乳酸を生成するために用いられ得る。
【０１２８】
多数のこのような微生物菌株は、商業的に、あるいは例えばＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，  Ｍａｎａｓｓａｓ，  Ｖｉｒｇｉｎｉａ，  ＵＳＡ）、ＮＲＲＬ（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｖｉｃｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，  Ｐｅｏｒｉａ，  Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，  ＵＳＡ）またはＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ，  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）のような保管所を通して、公的に入手可能である。
【０１２９】
市販の酵母としては、例えばレッドスター（Ｒｅｄ  Ｓｔａｒ）（登録商標）／レサッフレ・エタノールレッド（Ｌｅｓａｆｆｒｅ  Ｅｔｈａｎｏｌ  Ｒｅｄ）（Ｒｅｄ  Ｓｔａｒ／Ｌｅｓａｆｆｒｅ，ＵＳＡから入手可能）、ＦＡＬＩ（登録商標）（Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ’ｓ  Ｙｅａｓｔ，  ａ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｕｒｎｓ  Ｐｈｉｌｉｐ  Ｆｏｏｄ  Ｉｎｃ．，  ＵＳＡから入手可能）、スーパースタート（ＳＵＰＥＲＳＴＡＲＴ）（登録商標）（Ａｌｌｔｅｃｈ、現在はＬａｌｅｍａｎｄから入手可能）、ＧＥＲＴ  ＳＴＲＡＮＤ（登録商標）（Ｇｅｒｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ＡＢ，Ｓｗｅｄｅｎから入手可能）およびＦＥＲＭＯＬ（登録商標）（ＤＳＭ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓから入手可能）が挙げられる。
【０１３０】
バイオマス材料を糖化し、糖を生成するために用いられ得る多数の微生物は、それらを発行し、有用な生成物に転化するためにも用いられ得る。
蒸留
【０１３１】
発酵後、その結果生じた流体は、例えば「ビールカラム」を用いて蒸留されて、大多数の水および残留固体からエタノールおよびその他のアルコールを分離し得る。ビールカラムを出る蒸気は、例えば、３５重量％エタノールであり、精留塔に供給され得る。精留塔からのほぼ共沸混合性（９２．５％）のエタノールおよび水の混合物は、蒸気相分子篩を用いて、純（９９．５％）エタノールに精製され得る。ビールカラム底は、三重効用蒸発器の第一効用に送られ得る。精留塔還流冷却器は、この第一効用のために熱を提供する。第一効用後、個体は、遠心分離器を用いて分離されて、回転乾燥機中で乾燥される。遠心分離流出液の一部分（２５％）は、発酵に再循環され、残りは第二および第三蒸発器効用に送られる。蒸発器凝縮物のほとんどが、かなり透明な凝縮物として当該工程に戻され、小部分が、廃水処理に分けられて、低沸点化合物の増加を防止する。
【０１３２】
本明細書中の実施例における以外に、または別記しない限り、本明細書および添付の特許請求の範囲の以下の部分における、数的範囲、量、値およびパーセンテージ、例えば材料、元素含量、反応の時間および温度、量の比率等はすべて、「約」という用語が値、量または範囲を伴って明らかに出現し得ない場合でも、「約」という語が前置きされているかのように理解され得る。したがって、そうでないことが示されない限り、以下の明細書および添付の特許請求の範囲において記述される数的パラメーターは、本発明により得られることが求められる所望の特性によって変わり得る概数である。非常に少なくではあるが、そして本発明の範囲と糖化の見解の適用を限定するものではなく、各数的パラメーターは、少なくとも、報告された有意の数字の数にかんがみて、そして普通の丸め技法を適用することにより、解釈されるべきである。
【０１３３】
本発明の広範囲を記述する数的範囲およびパラメーターが概数であるにもかかわらず、具体例に記述される数値は、できるだけ精確に報告される。しかしながら、任意の数値は、その基礎をなすそれぞれの試験測定値に見出される標準偏差に必然的に起因する誤差を固有に含有する。さらに、数的範囲が本明細書中で記述される場合、これらの範囲は、列挙範囲終点（すなわち、終点が用いられ得る）を含む。重量パーセンテージが本明細書中で用いられる場合、報告される数値は、総重量に対する割合である。
【０１３４】
さらにまた、本明細書中で列挙される任意の数的範囲は、そこに組み込まれたすべての亜範囲を包含するよう意図される、と理解されるべきである。例えば、「１〜１０」の範囲は、１という記載最小値と１０という記載最大値との間の（含めた）すべての亜範囲を包含する、すなわち、１または１より大きい最小値、および１０以下の最大値を有するよう意図される。「１つの（ｏｎｅ）」、「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」という用語は、本明細書中で用いる場合、別記しない限り、「少なくとも１つ」または「１つ以上」を包含するよう意図される。
実施例
材料および方法
【０１３５】
以下の手順および材料を、以下の実施例で用いた。
【０１３６】
細胞バンキング：  以下のトリコデルマ・リーセイ菌株を寄託した：ＡＴＣＣ  ６６５８９、ＰＣ３−７；ＡＴＣＣ  ５６７６５、ＲＵＴ−Ｃ３０；ＡＴＣＣ  ５６７６７、ＮＧ−１４；ＡＴＣＣ  ２６９２１、ＱＭ  ９４１４。
【０１３７】
各細胞を再水和して、ジャガイモデキストロース（ＰＤ）培地中で２５℃で増殖させた。
【０１３８】
主細胞バンクの生成のために、各菌株を、０．５ｍｌ滅菌水中で一晩、再水和させた。細胞を増殖するために、４０ｕｌの再水和化細胞を用いて、ジャガイモデキストロース寒天（ＰＤＡ）固形培地に接種した。再水和化細胞を、５０ｍｌのＰＤ液体培地中にも接種し、２５℃および２００ｒｐｍでインキュベートした。ＰＤＡ培地中で２週間培養後、胞子を滅菌ＮａＣｌ（９ｇ／Ｌ）、２０％グリセロール溶液中に再懸濁し、細胞バンクとして用いるために−８０℃冷凍庫中に保存した。
【０１３９】
タンパク質測定およびセルラーゼ検定：  標準としてウシ血清アルブミンを用いて、ブラッドフォード法により、タンパク質濃度を測定した。
【０１４０】
ＩＵＰＡＣ法（Ｔ．Ｋ．  Ｇｈｏｓｅ，  Ｐｕｒｅ  Ａｐｐｌ．  Ｃｈｅｍ．  ５９：２５７−６８，１９８７）を用いて、濾紙検定（ＦＰＵ）、セロビアーゼ活性およびＣＭＣ活性を実行した。
【０１４１】
反応生成物（グルコース）を、ＹＳＩ  ７１００多重パラメーター生体検定系（ＹＳＩ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｙｅｌｌｏｗ  Ｓｐｒｉｎｇｓ，  Ｏｈｉｏ，  ＵＳＡ）またはＨＰＬＣで分析した。
【０１４２】
培地：  培地は、トウモロコシ浸出物（２ｇ／Ｌ）、硫酸アンモニウム（１．４ｇ／Ｌ）、水酸化カリウム（０．８ｇ／Ｌ）、リン酸（８５％，４ｍＬ／Ｌ）、フタル酸二カリウム塩（５ｇ／Ｌ）、硫酸マグネシウム・七水和物（０．３ｇ／Ｌ）、塩化カルシウム（０．３ｇ／Ｌ）、硫酸第一鉄・七水和物（５ｍｇ／Ｌ）、硫酸マンガン・一水和物（１．６ｍｇ／Ｌ）、硫酸亜鉛・七水和物（５ｍｇ／Ｌ）および塩化コバルト・六水和物（２ｍｇ／Ｌ）を含んだ。培地は、Ｈｅｒｐｏｅｌ−Ｇｉｍｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｆｕｅｌｓ，  ２００８，  １：１８に記載されている。
【０１４３】
バイオリアクター：  細胞バンキングからの冷凍庫ストックを用いて、上記の培地に２．５％グルコースを付加したものを用いた種培地を作製した。種培地は、典型的には、３０℃、２００ｒｐｍで７２時間に設定されたインキュベーターを用いて、フラスコ中に作製した。種培地ブロス（５０ｍＬ）を、３Ｌ発酵器中の１Ｌ出発培地における接種物として用いた。増殖相で、３５ｇ／Ｌのラクトースを培地に付加した。培養条件は、以下の通りであった：２７°Ｃ、ｐＨ４．８（６Ｍアンモニア使用）、空気流  ０．５ＶＶＭ、撹拌  ５００ｒｐｍ、そして溶解酸素（ＤＯ）を、酸素飽和率４０％超に保持した。誘導相では、所望の誘導物質（下記）を付加した。発酵中、泡が発酵器上部に達したら、アンチフォーム（Ａｎｔｉｆｏｒｍ）２０４（Ｓｉｇｍａ）を培地中に注入した。
【０１４４】
振盪フラスコ：  上記の培地のほかに、フラスコ培養のために、トリス緩衝液（１２．１ｇ／Ｌ）、マレイン酸（１１．０６ｇ／Ｌ）および水酸化ナトリウム（２．０８ｇ／Ｌ）を付加した。付加グルコースを有する培地中で、スターター培養を調製した。３日増殖後、細胞塊を遠心分離により収穫した。細胞塊を、所望の誘導物質を有する培地５０ｍｌ中に再懸濁した。撹拌速度２００ｒｐｍおよび温度３０°Ｃに設定した振盪インキュベーター中に、フラスコを入れた。
実施例１．  紙、処理済みトウモロコシ穂軸および非処理トウモロコシ穂軸に関するセルラーゼ性能試験
【０１４５】
種々の誘導物質（処理済みバイオマス（ＴＢＭ）、非処理バイオマス（ＵＢＭ）、紙（Ｐ）およびカルボキシルメチルセルロース（ＣＭＣ，Ａｌｄｒｉｃｈ））を用いて、酵素を生成した。バイオマス（ＴＢＭおよびＵＢＭ）は、１５〜４０のメッシュサイズで収集した粉砕トウモロコシ穂軸であった。ＴＢＭを生成するためのバイオマス（ＵＢＭ）の処理は、総線量３５Ｍｒａｄまでの電子線を用いた電子衝撃を包含した。紙を細断し、０．１６インチより小さい公称粒子サイズを有するようスクリーニングした。振盪フラスコならびにＰＣ３−７およびＲＵＴ−Ｃ３０染色を用いて、誘導物質実験を実行した。増殖培養の３日後、収穫細胞塊を、各々が５０ｍｌの培地および１重量％の誘導物質の１つを含有する一連の振盪フラスコに付加した。
【０１４６】
誘導実験を１１日間進行させた。次いで、１４，５００ｒｐｍで５分間の遠心分離により培養上清を収穫し、４℃で保存した。
【０１４７】
培養上清のタンパク質濃度：  振盪フラスコ中で増殖させた、ＰＣ３‐７由来の細胞培養を用いて、１１日後のタンパク質濃度は、ＴＢＭ、ＵＢＭ、ＰおよびＣＭＣに関してそれぞれ１．３９、１．１８、１．０６および０．２６ｍｇ／ｍｌであった。ＲＵＴ‐Ｃ３０に関しては、タンパク質濃度は、ＴＢＭ、Ｐ、ＵＢＭおよびＣＭＣに関してそれぞれ１．２６、１．２６、１．００および０．２６ｍｇ／ｍｌであった。
【０１４８】
セルラーゼ活性：  セルラーゼ活性を査定した。結果を以下の表に列挙する。
【表１】
2018007665.tif 000003
【０１４９】
これらの結果は、処理済みバイオマスが、非処理バイオマスより大きい割合で酵素産生を誘導するのに役立つ、ということを示す。
実施例２．  異なる濃度のＴＢＭ誘導物質における酵素産生
【０１５０】
この実施例を、バイオリアクターを用いて実行した。２．５％グルコースを有する培地中で、細胞株ＲＵＴ‐Ｃ３０を増殖させた。３日増殖後、培養を遠心分離して、１、３、５、７および９重量％ＴＢＭを有する培地５０ｍｌ中に細胞を再懸濁した。２７℃および２００ｒｐｍでのインキュベーションの１１日後のタンパク質濃度および活性を、以下の表に示す。
【表２】
2018007665.tif 000004
【０１５１】
これらの結果は、処理済みバイオマス（ＴＢＭ）を５％の割合で付加した場合、高レベルの酵素が産生された、ということを示す。
【０１５２】
酵素を用いたバイオマスの糖化：  ２、５および７重量％の処理済みバイオマス誘導物質（ＴＢＭ）対市販の酵素（Ｄｕｅｔ（商標）アクセレラーゼ（Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ），  Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）の付加により産生される酵素を用いるバイオマス（ＴＢＭ）の糖化を実行した。バイオマス、１０重量％ＴＢＭを、０．２５ｍｌ／ｇの酵素培養ブロスまたは市販の酵素と組み合わせた。振盪インキュベーター中で、５０℃および２００ｒｐｍで、糖化を実行した。２４時間後、ＹＳＩにより生成グルコース量を測定した。溶液１Ｌおよびタンパク質１ｍｇあたりで産生されたグルコースの量を、以下の表に示す。
【表３】
2018007665.tif 000005
実施例３．  処理済みバイオマスを用いて生成される酵素のＳＤＳ‐ＰＡＧＥ
【０１５３】
上記の方法を用いてバイオリアクター培養を調製したが、但し、混合は、５００ｒｐｍでなく、５０ｒｐｍで実行した。タンパク質検定は、３．４ｇ／Ｌタンパク質を生成することを示した。
【０１５４】
ＳＤＳ  ＰＡＧＥを用いたタンパク質の分析を、図５に示す。レーン１および５は分子量マーカーであり、レーン２は３０ｕｌタンパク質負荷、レーン３は４０ｕｌタンパク質負荷であり、レーン４はＤｕｅｔ（商標）アクセレラーゼ酵素複合体（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）である。
実施例４．  試験条件範囲
【表４】
2018007665.tif 000006
【０１５５】
参照により本明細書中で援用されると言われる任意の特許、出版物、またはその他の開示は、全体でまたは一部は、組み入れられた試料がこの開示に記述される現存する定義、記述またはその他の開示と矛盾しない程度に本明細書中で援用される。このようなものとして、そして必要な程度に、本明細書中に明白に記述されるような開示は、参照により本明細書中に組み入れられた任意の相反する資料に取って代わる。本明細書中に参照により組み入れられるといわれる、しかし本明細書中に記述される現行の定義、記述またはその他の開示資料と相反する任意の資料またはその部分は、組み入れられた資料と現行開示資料との間に相反が生じない程度に援用されるに過ぎない。
【０１５６】
本発明を特定的に示しその好ましい実施形態に関して説明してきたが、添付の特許請求の範囲に包含される本発明の範囲を逸脱しない限り、形態および詳細における変更がなされ得る、当業者は理解する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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