(57)【要約】【課題】ヒト腫瘍がＥＲＢＢ３インヒビター（例えば、抗ＥＲＢＢ３抗体）での処置に感受性であるかもしくは耐性であるか否かを定量的に推定するための診断法を提供すること。【解決手段】上記方法は、上記腫瘍に由来する組織サンプル中のＲＮＡレベルもしくはタンパク質レベルでのＮＲＧ１発現の測定に基づく。抗ＥＲＢＢ３抗体での処置に感受性である可能性が高いかもしくは耐性である可能性が高いかに関して腫瘍を同定するための方法であって、該方法は（ａ）該腫瘍に由来する組織サンプル中のＮＲＧ１遺伝子発現を測定し、それによって、ＮＲＧ１スコアを決定する工程；および（ｂ）該ＮＲＧ１スコアを、閾値決定分析によって規定される閾値スコアに対して比較する工程であって、ここで該閾値スコアに等しいかもしくはそれより高いＮＲＧ１スコアは、該腫瘍が抗ＥＲＢＢ３抗体での処置に対して応答性である可能性が高いことを示す、工程、を包含する、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願図面に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の引用
本願は、２０１２年４月２０日に出願された米国仮出願第６１／６３６，１８３号および２０１１年１０月６日に出願した米国仮出願第６１／５４４，２０６号の利益およびそれらの出願の優先権を主張する。各出願の内容全体は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明の分野は、分子生物学、腫瘍学、および臨床診断である。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
大部分の癌薬物は、ある患者には有効であるが、他の患者には有効ではない。このことは、腫瘍間の遺伝的バリエーションから生じ、同じ患者内の腫瘍間ですら認められ得る。変わることができる患者応答は、標的治療に関して特に判断がなされる。従って、上記標的治療の完全な潜在能力は、どの患者がどの薬物から利益を得るかを決定するための適切な試験なくしては、実現できない。国立衛生研究所（ＮＩＨ）によれば、用語「バイオマーカー」は、「通常の生物学的もしくは病的プロセスまたは治療的介入への薬理学的応答のインジケーターとして、客観的に測定かつ評価される特徴」として定義される（非特許文献１（Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎｓ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ，  ２００１，  Ｃｌｉｎ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  ６９：８９−９５））。
【０００４】
バイオマーカーの発見に基づく改善された診断の開発は、所定の薬物に対する臨床応答を示す可能性が最も高い患者を予め同定することによって、新薬開発を加速する潜在的可能性がある。これは、臨床試験のサイズ、長さおよびコストを顕著に低下させる。ゲノミクス、プロテオミクスおよび分子画像化のような技術は、現在、特定の遺伝子変異、特定の遺伝子の発現レベル、および他の分子バイオマーカーの迅速で、感度が高く、信頼性の高い検出を可能にしている。腫瘍の分子的特徴付けのために種々の技術が利用可能であるにも拘わらず、癌バイオマーカーの臨床利用は、大部分は実現されていないままである。なぜなら、癌バイオマーカーがほとんど発見されていないからである。例えば、最近の総説記事は、以下のように述べている：
癌の診断および処置を改善するためのバイオマーカーおよびそれらの使用の迅速な開発が決定的に必要である（非特許文献２（Ｃｈｏ，  ２００７，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｎｃｅｒ  ６：２５））。
癌バイオマーカーに関する別の最近の総説記事は、以下のコメントを含む：
癌バイオマーカーを発見することは難題である。いくつかの腫瘍タイプ（例えば、慢性骨髄性白血病、消化管間質腫瘍、肺癌および多形性膠芽腫）の分子的に規定されたサブセットを、分子標的化薬剤を使用して標的とするにあたって臨床的な成功があったものの、より広い状況においてこのような成功を応用できる能力は、患者において標的化薬剤を評価するための効率的ストラテジーがないことによって厳しく制限されている。問題は主に、臨床試験のために分子的に規定された癌を有する患者を選択して、これら刺激に満ちた新薬を評価するということができない、ということにある。その解決策には、特定の薬剤から利益を得る可能性が最も高い患者を信頼性高く同定するバイオマーカーが必要である（非特許文献３（Ｓａｗｙｅｒｓ，  ２００８，  Ｎａｔｕｒｅ  ４５２：５４８−５５２）の５４８頁））。
前述のようなコメントは、臨床的に有用なバイオマーカーおよびこのようなバイオマーカーに基づく診断法の発見が必要であるという認識を例示する。
【０００５】
癌バイオマーカーには、３つの別のタイプがある：（１）予後（ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ）バイオマーカー、（２）推定バイオマーカー、および（３）薬物動態的（ＰＤ）バイオマーカー。予後バイオマーカーは、攻撃性（すなわち、増殖および／もしくは転移の速度）、ならびに処置への反応性（ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅｎｅｓｓ）に従って、癌（例えば、固形腫瘍）を分類するために使用される。これは、ときおり、「良好な転帰」の腫瘍を、「不良な転帰」の腫瘍から区別することといわれる。推定バイオマーカーは、特定の患者が特定の薬物での処置から利益を受ける確率を評価するために使用される。例えば、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）遺伝子が増幅される乳癌を有する患者は、トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））での処置から利益を受ける可能性が高いのに対して、ＥＲＢＢ２遺伝子増幅がない患者は、トラスツズマブでの処置から利益を受ける可能性が低い。ＰＤバイオマーカーは、上記患者が上記薬物を摂取している間のその分子標的に対する薬物の影響の指標（ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎ）である。よって、ＰＤバイオマーカーはしばしば、新薬の臨床開発の早期段階の間に、投与量レベルおよび投与頻度をガイドするために使用される。癌バイオマーカーの考察については、例えば、非特許文献３（Ｓａｗｙｅｒｓ，  ２００８，  Ｎａｔｕｒｅ  ４５２：５４８−５５２）を参照のこと。
【０００６】
ＥＧＦＲもしくはＨＥＲ２によって駆動される腫瘍はしばしば、ＥＧＦＲもしくはＨＥＲ２のインヒビターでの処置に応答するが、これら腫瘍は、これらインヒビターに対する耐性を常に発生させる。抗ＥＧＦＲもしくは抗ＨＥＲ２処置に対する獲得耐性に関する少なくとも１つの機構は、ＥＲＢＢ３（ＨＥＲ３としても公知）シグナル伝達の活性化である。例えば、非特許文献４（Ｅｎｇｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６，  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １２：４３７２）；非特許文献５（Ｒｉｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７，  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １３：４９０９）；非特許文献６（Ｓｅｒｇｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７，  Ｎａｔｕｒｅ  ４４５：４３７）を参照のこと。ＨＥＲ２−ＥＲＢＢ３ヘテロダイマーのＮＲＧ１誘導性活性化はまた、ＥＧＦＲインヒビターに対する耐性と関連づけられた（非特許文献７（Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  １０：３９））。従って、ＥＲＢＢ３は、薬物耐性の発生において重要な役割を果たし、そしてＥＧＦＲおよびＨＥＲ２とのそのヘテロダイマー化を介して、腫瘍の始まりおよび維持への関与する。結論として、ＥＲＢＢ３は、キナーゼ活性を欠いているので、ＥＲＢＢ３インヒビター（特に、抗ＥＲＢＢ３抗体）の開発が重要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎｓ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ，  ２００１，  Ｃｌｉｎ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  ６９：８９−９５
【非特許文献２】Ｃｈｏ，  ２００７，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｎｃｅｒ  ６：２５
【非特許文献３】Ｓａｗｙｅｒｓ，  ２００８，  Ｎａｔｕｒｅ  ４５２：５４８−５５２
【非特許文献４】Ｅｎｇｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６，  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １２：４３７２
【非特許文献５】Ｒｉｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７，  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １３：４９０９
【非特許文献６】Ｓｅｒｇｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７，  Ｎａｔｕｒｅ  ４４５：４３７
【非特許文献７】Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  １０：３９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
標的化治療の他のタイプと同様に、いくらかの（しかし全てではない）腫瘍は、抗ＥＲＢＢ３治療に応答する。従って、ＥＲＢＢ３インヒビター（例えば、抗ＥＲＢＢ３抗体）での処置に応答する可能性が高い（もしくはその可能性が低い）腫瘍を有する患者を同定するために使用され得る推定バイオマーカーに基づいた診断法が、必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（要旨）
本発明は、一部、哺乳動物腫瘍（例えば、ヒト腫瘍）に由来する組織サンプル中のニューレグリン−１（ＮＲＧ１）発現が、ＥＲＢＢ３インヒビター（例えば、抗ＥＲＢＢ３抗体）での処置に対する上記腫瘍の感受性と相関するという知見に基づく。驚くべきことに、ＮＲＧ１発現単独の測定は、ＥＲＢＢ３インヒビターでの処置に感受性であるかもしくは耐性であるかの腫瘍の有用な分類のために十分であるために相関が十分に強いことが見出された。よって、本発明は、ＥＲＢＢ３インヒビターでの処置に対して感受性である腫瘍を同定する方法を提供する。上記方法は、以下を包含する：（ａ）上記腫瘍に由来する組織サンプル中のＮＲＧ１遺伝子発現を測定し、それによって、ＮＲＧ１スコアを決定する工程；および（ｂ）上記ＮＲＧ１スコアを、閾値決定分析によって規定される閾値スコアに対して比較する工程。上記閾値スコアに等しいかもしくはそれより高いＮＲＧ１スコアは、上記腫瘍がＥＲＢＢ３インヒビター（例えば、抗ＥＲＢＢ３抗体）での処置に感受性である可能性が高いことを示す。あるいは、上記閾値を下回るＮＲＧ１スコアは、上記腫瘍が、ＥＲＢＢ３インヒビター（例えば、抗ＥＲＢＢ３抗体）での処置に耐性である可能性が高いことを示す。特定の実施形態において、上記方法は、ＮＲＧ１以外のいかなる遺伝子の発現にも基づかない。
【００１０】
ＮＲＧ１発現の測定は、タンパク質レベルにおいて、例えば、抗ＮＲＧ１抗体に結合体化した発色団もしくは発蛍光団を伴う免疫組織化学（ＩＨＣ）によるものであり得る。あるいは、ＮＲＧ１発現の測定は、ＲＮＡレベルにおいて、例えば、ＮＲＧ１をコードするｍＲＮＡのレベルを、例えば、定量的ＰＣＲもしくはマイクロアレイによって測定することによるものであり得る。上記閾値決定分析は、受信者動作特性曲線分析を含み得る。本発明の方法は、腫瘍の種々のタイプ（例えば、固形腫瘍（例えば、乳房腫瘍、肺腫瘍、腎臓腫瘍、結腸直腸腫瘍、頭頸部腫瘍、食道腫瘍、卵巣腫瘍、および膵臓腫瘍が挙げられる））を試験するために有用である。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
抗ＥＲＢＢ３抗体での処置に感受性である可能性が高いかもしくは耐性である可能性が高いかに関して腫瘍を同定する方法であって、該方法は、
（ａ）該腫瘍に由来する組織サンプル中のＮＲＧ１遺伝子発現を測定し、それによって、ＮＲＧ１スコアを決定する工程；および
（ｂ）該ＮＲＧ１スコアを、閾値決定分析によって規定される閾値スコアに対して比較する工程であって、ここで該閾値スコアに等しいかもしくはそれより高いＮＲＧ１スコアは、該腫瘍が抗ＥＲＢＢ３抗体での処置に対して応答性である可能性が高いことを示す、工程、
を包含する、方法。
（項目２）
前記抗ＥＲＢＢ３抗体は、ＥＲＢＢ３へのＮＲＧ１の結合を阻害するかもしくは妨げる、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記抗ＥＲＢＢ３抗体は、ＥＲＢＢ３へのＮＲＧ１の結合を阻害することなく、ＥＲＢＢ３のダイマー化を阻害するかもしくは妨げる、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記抗ＥＲＢＢ３抗体は、以下：
（ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、および配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む、免疫グロブリン重鎖可変領域；ならびに
（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、および配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む、免疫グロブリン軽鎖可変領域；
（ｂ）（ｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、および配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む、免疫グロブリン重鎖可変領域；ならびに
（ｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、および配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む、免疫グロブリン軽鎖可変領域；
（ｃ）（ｉ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、および配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む、免疫グロブリン重鎖可変領域；ならびに
（ｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、および配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む、免疫グロブリン軽鎖可変領域；
（ｄ）（ｉ）配列番号４７のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、および配列番号４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む、免疫グロブリン重鎖可変領域；ならびに
（ｉｉ）配列番号５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、および配列番号５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む、免疫グロブリン軽鎖可変領域；ならびに
（ｅ）（ｉ）配列番号５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、および配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む、免疫グロブリン重鎖可変領域；ならびに
（ｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、および配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む、免疫グロブリン軽鎖可変領域；
（ｆ）配列番号７のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、および配列番号８のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域；
（ｇ）配列番号９のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖、および配列番号１０のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖；
（ｈ）配列番号１７のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、および配列番号１８のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域；
（ｉ）配列番号４３のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、および配列番号４４のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域；
（ｊ）配列番号５３のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、および配列番号５４のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域；ならびに
（ｋ）配列番号５９のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、および配列番号６０のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域、
からなる群より選択される、項目２に記載の方法。
（項目５）
前記抗ＥＲＢＢ３抗体は、以下：
（ａ）（ｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、および配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む、免疫グロブリン重鎖可変領域；ならびに
（ｉｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、および配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む、免疫グロブリン軽鎖可変領域；
（ｂ）（ｉ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、および配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む、免疫グロブリン重鎖可変領域；ならびに
（ｉｉ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、および配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む、免疫グロブリン軽鎖可変領域；
（ｃ）配列番号２７のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、および配列番号２８のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域；ならびに
（ｄ）配列番号３６のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、ならびに配列番号３７のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域、
からなる群より選択される、項目３に記載の方法。
（項目６）
前記抗ＥＲＢＢ３抗体は、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、および配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む、免疫グロブリン重鎖可変領域；ならびに（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、および配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３、を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域、を含む、項目２に記載の方法。
（項目７）
前記抗ＥＲＢＢ３抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、および配列番号８のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む、項目２に記載の方法。
（項目８）
前記抗ＥＲＢＢ３抗体は、配列番号９のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖、および配列番号１０のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖を含む、項目２に記載の方法。
（項目９）
前記ＮＲＧ１遺伝子発現を測定する工程は、ＮＲＧ１タンパク質のレベルを測定することによって行われる、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記ＮＲＧ１遺伝子発現を測定する工程は、ＮＲＧ１タンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルを測定することによって行われる、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記閾値決定分析は、受信者動作特性曲線分析を含む、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記腫瘍は、固形腫瘍である、項目１に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、ＡＶ−２０３、０４Ｄ０１、０９Ｄ０３、１１Ｇ０１、１２Ａ０７、１８Ｈ０２および２２Ａ０２（これらは図２においてボックスで囲まれた領域に対応する）として示される上記抗ＥＲＢＢ３抗体に関する免疫グロブリン重鎖可変領域配列のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３の配列（Ｋａｂａｔ定義）を示す模式図である。
【００１２】
【図２】図２は、ＡＶ−２０３、０４Ｄ０１、０９Ｄ０３、１１Ｇ０１、１２Ａ０７、１８Ｈ０２および２２Ａ０２として示される抗ＥＲＢＢ３抗体に関する完全な免疫グロブリン重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す模式図である。各抗体に関するアミノ酸配列は、互いに対して整列され、相補性決定配列（ＣＤＲ）（Ｋａｂａｔ定義）、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３は、ボックスで囲まれて同定される。ボックスで囲まれていない配列は、フレームワーク（ＦＲ）配列を表す。
【００１３】
【図３】図３は、ＡＶ−２０３、０４Ｄ０１、０９Ｄ０３、１１Ｇ０１、１２Ａ０７、１８Ｈ０２および２２Ａ０２（これらは図４においてボックスで囲まれた領域に対応する）として示される上記抗ＥＲＢＢ３抗体に関する免疫グロブリン軽鎖可変領域配列のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３の配列（Ｋａｂａｔ定義）を示す模式図である。
【００１４】
【図４】図４は、ＡＶ−２０３、０４Ｄ０１、０９Ｄ０３、１１Ｇ０１、１２Ａ０７、１８Ｈ０２および２２Ａ０２として示される上記抗ＥＲＢＢ３抗体に関する完全な免疫グロブリン軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す模式図である。各抗体に関するアミノ酸配列は、互いに対して整列され、相補性決定配列（ＣＤＲ）（Ｋａｂａｔ定義）、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３は、ボックスで囲まれて同定される。ボックスで囲まれていない配列は、フレームワーク（ＦＲ）配列を表す。
【００１５】
【図５】図５は、（Ａ）全長ＡＶ−２０３免疫グロブリン重鎖および（Ｂ）全長ＡＶ−２０３免疫グロブリン軽鎖を規定するアミノ酸配列を提供する。
【００１６】
【図６】図６は、（Ａ）全長０４Ｄ０１免疫グロブリン重鎖および（Ｂ）全長０４Ｄ０１免疫グロブリン軽鎖を規定するアミノ酸配列を提供する。
【００１７】
【図７】図７は、（Ａ）全長０９Ｄ０３免疫グロブリン重鎖および（Ｂ）全長０９Ｄ０３免疫グロブリン軽鎖を規定するアミノ酸配列を提供する。
【００１８】
【図８】図８は、（Ａ）全長１１Ｇ０１免疫グロブリン重鎖および（Ｂ）全長１１Ｇ０１免疫グロブリン軽鎖を規定するアミノ酸配列を提供する。
【００１９】
【図９】図９は、（Ａ）全長１２Ａ０７免疫グロブリン重鎖および（Ｂ）全長１２Ａ０７免疫グロブリン軽鎖を規定するアミノ酸配列を提供する。
【００２０】
【図１０】図１０は、（Ａ）全長１８Ｈ０２免疫グロブリン重鎖および（Ｂ）全長１８Ｈ０２免疫グロブリン軽鎖を規定するアミノ酸配列を提供する。
【００２１】
【図１１】図１１は、（Ａ）全長２２Ａ０２免疫グロブリン重鎖および（Ｂ）全長２２Ａ０２免疫グロブリン軽鎖を規定するアミノ酸配列を提供する。
【００２２】
【図１２】図１２は、２５の異種移植片モデルにおけるＡＶ−２０３のインビボ効力（腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）パーセンテージとして表される）と、定量的ＲＴ−ＰＣＲによって測定されたとおりの、Ｃｔ値によって表されるＮＲＧ１  ＲＮＡ発現との間の関係を示す線形回帰トレンド線（ｌｉｎｅａｒ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｔｒｅｎｄ  ｌｉｎｅ）を伴う散布図である。上記２５のデータ点は、黒四角によって表される。線形回帰は、実線によって示され、９５％信頼区間は、破線によって示される。試験した２５の腫瘍では、Ｒｈｏ値は、−０．６０１であり、ｐ＝０．００１５（スピアマン相関）であった。
【００２３】
【図１３】図１３は、２５の異種移植片モデルにおけるＡＶ−２０３のインビボ効力（ＴＧＩパーセンテージとして表される）と、Ｃｔ値によって表される定量的ＲＴ−ＰＣＲによって測定されたとおりの、ＥＲＢＢ３  ＲＮＡ発現との間の関係を示す線形回帰トレンド線を伴う散布図である。２５のデータ点は、黒四角によって表される。上記線形回帰は、実線によって示され、９５％信頼区間は、破線によって示される。
【００２４】
【図１４】図１４は、至適閾値ＰＧＳスコアを決定するための、図１３のデータに基づく受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線である。このＲＯＣ曲線は、偽陽性率０．１３および偽陰性率０．２を生じる、上記至適閾値がＣｔ＝２２．９であることを示す。
【００２５】
【図１５】図１５は、高ＮＲＧ１発現腫瘍（Ｃｔ＝＜２２．９）および低ＮＲＧ１発現腫瘍（Ｃｔ＞２２．９）によって分けられる異種移植片モデルでのＡＶ−２０３のインビボでの効力をまとめる箱ひげ図である。
【００２６】
【図１６】図１６は、ＮＣＲヌードマウスにおいて２０ｍｇ／ｋｇで投与された、ＰＢＳビヒクルコントロール（黒菱形）および上記抗ＥＲＢＢ３抗体ＡＶ−２０３（黒丸）の、ＬＵ−１０ヒト原発性肺腫瘍異種移植片に対する効力のデータをまとめるグラフである。
【００２７】
【図１７】図１７は、ＮＣＲヌードマウスにおいて２０ｍｇ／ｋｇで投与された、ＰＢＳビヒクルコントロール（黒菱形）、ヒトＩｇＧコントロール（黒四角）および上記抗ＥＲＢＢ３抗体ＡＶ−２０３（黒丸）の、ＬＵ−５８ヒト原発性肺腫瘍異種移植片に対する効力のデータをまとめるグラフである。
【００２８】
【図１８】図１８は、ＮＣＲヌードマウスにおいて２０ｍｇ／ｋｇで投与された、ＰＢＳビヒクルコントロール（黒菱形）、ヒトＩｇＧコントロール（黒四角）および上記抗ＥＲＢＢ３抗体ＡＶ−２０３（黒丸）の、ＬＵ−０８ヒト原発性肺腫瘍異種移植片に対する効力のデータをまとめるグラフである。
【００２９】
【図１９】図１９は、ＮＣＲヌードマウスにおいて２０ｍｇ／ｋｇで投与された、ＰＢＳビヒクルコントロール（黒菱形）、ヒトＩｇＧコントロール（黒四角）および上記抗ＥＲＢＢ３抗体ＡＶ−２０３（黒丸）の、ＬＵ−４４ヒト原発性肺腫瘍異種移植片に対する効力のデータをまとめるグラフである。
【００３０】
【図２０】図２０は、ＣＢ１７−ＳＣＩＤマウスにおいて２０ｍｇ／ｋｇで投与された、ＰＢＳビヒクルコントロール（黒菱形）および上記抗ＥＲＢＢ３抗体ＡＶ−２０３（黒丸）の、ＣＡＬ−２７ヒト頭頸部癌異種移植片に対する効力のデータをまとめるグラフである。
【００３１】
【図２１】図２１は、ＮＣＲヌードマウスにおいて２０ｍｇ／ｋｇで投与された、ＰＢＳビヒクルコントロール（黒菱形）、ヒトＩｇＧコントロール（黒四角）および上記抗ＥＲＢＢ３抗体ＡＶ−２０３（黒丸）の、ＫＹＳＥ−１５０ヒト食道癌異種移植片に対する効力のデータをまとめるグラフである。
【００３２】
【図２２】図２２は、ＮＣＲヌードマウスにおいて２０ｍｇ／ｋｇで投与された、ＰＢＳビヒクルコントロール（黒菱形）、ヒトＩｇＧコントロール（黒四角）および上記抗ＥＲＢＢ３抗体ＡＶ−２０３（黒丸）の、Ｈ５２０ヒト非小細胞肺癌異種移植片に対する効力のデータをまとめるグラフである。
【００３３】
【図２３】図２３は、ＣＢ．１７  ＳＣＩＤマウスにおいて２０ｍｇ／ｋｇで投与された、ＰＢＳビヒクルコントロール（黒菱形）、ヒトＩｇＧコントロール（黒四角）および上記抗ＥＲＢＢ３抗体１１Ｇ０１（白四角）の、ＢｘＰＣ３膵臓腫瘍異種移植片に対する効力のデータをまとめるグラフである。
【００３４】
【図２４】図２４は、ＣＢ．１７  ＳＣＩＤマウスにおいて２０ｍｇ／ｋｇで投与された、ＰＢＳビヒクルコントロール（黒菱形）および上記抗ＥＲＢＢ３抗体１１Ｇ０１（黒丸）の、ＤＵ１４５前立腺腫瘍異種移植片に対する効力のデータをまとめるグラフである。
【００３５】
【図２５】図２５は、ＮＣＲヌードマウスにおいて２０ｍｇ／ｋｇで投与された、ＰＢＳビヒクルコントロール（黒四角）、ヒトＩｇＧコントロール（−−−）および上記抗ＥＲＢＢ３抗体１１Ｇ０１（黒丸）の、Ｈ３２２肺腫瘍異種移植片に対する効力データをまとめるグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
（発明の詳細な説明）
（定義）
本明細書で使用される場合、「ＡＶ−２０３」とは、全長重鎖アミノ酸配列が配列番号９であり、かつ全長軽鎖アミノ酸配列が配列番号１０であるヒト化抗ヒトＥＲＢＢ３モノクローナル抗体を意味する。
【００３７】
本明細書で使用される場合、「ＥＲＢＢ３」（ＨＥＲ３としても公知）は、Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ  Ｎｏ．  ２０６５によって同定される遺伝子、およびその対立遺伝子改変体によってコードされるヒトタンパク質を意味する。
【００３８】
本明細書で使用される場合、「ＥＲＢＢ３インヒビター」とは、ＥＲＢＢ３に結合し、かつ腫瘍細胞におけるＥＲＢＢ３の生物学的活性を阻害、中和、妨害もしくは除去する分子（低分子もしくは高分子、例えば、抗体もしくはその抗原結合フラグメント）を意味する。
【００３９】
本明細書で使用される場合、「ＮＲＧ１」（ニューレグリン−１、ヒレグリン、ＨＲＧおよびＨＲＧ１としても公知）は、Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ  Ｎｏ．  ３０８４によって同定される遺伝子、およびその対立遺伝子改変体によってコードされるヒトタンパク質を意味する。
【００４０】
本明細書で使用される場合、「至適閾値スコア」は、分類子（ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ）が偽陰性コール（ｃａｌｌｓ）のコストと偽陽性コールのコストとの間の最も望ましいバランスを与える閾値スコアを意味する。
【００４１】
本明細書で使用される場合、「受信者動作特性」（ＲＯＣ）曲線とは、２成分分類子システム（ｂｉｎａｒｙ  ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ）の偽陽性率（感受性）  対  真陽性率（特異性）のプロットを意味する。ＲＯＣ曲線の構築において、以下の定義が適用される：
偽陰性率：  ＦＮＲ＝１−ＴＰＲ
真陽性率：  ＴＰＲ＝真陽性／（真陽性＋偽陰性）
偽陽性率：  ＦＰＲ＝偽陽性／（偽陽性＋真陰性）
【００４２】
本明細書で使用される場合、処置に対して「応答する」もしくは「応答」とは、処置された腫瘍に関して、上記腫瘍が：（ａ）増殖を遅らせる、（ｂ）増殖を停止させる、または（ｃ）退縮することを意味する。
【００４３】
本明細書で使用される場合、「ＮＲＧ１スコア」は、腫瘍におけるＮＲＧ１発現のレベルを表す数値である。上記ＮＲＧ１スコアは、ＲＮＡレベルもしくはタンパク質レベルにおけるＮＲＧ１遺伝子発現に基づき得る。例えば、ＮＲＧ１スコアは、（１）ｑＲＴ−ＰＣＲアッセイのＣｔ値、または（２）ＩＨＣアッセイにおける染色強度として表され得る。Ｃｔ値およびＮＲＧ１発現は、逆に関連する。従って、より低いＣｔ値は、より高いＮＲＧ１スコアに解釈される。上記ＮＲＧ１スコアは、閾値決定分析において、例えば、ＲＯＣ曲線分析を使用して、経験的に決定され得る閾値スコアに関して解釈され得る。
【００４４】
本明細書で使用される場合、「閾値決定分析」は、所定の腫瘍タイプ、例えば、ヒト腎細胞癌についての閾値スコアを決定するために、その所定の腫瘍タイプを表すデータセットの分析を意味する。所定の腫瘍タイプを表すデータセットは、このような腫瘍の集団からの各腫瘍に関して：（ａ）実際の腫瘍応答データ（抗ＥＲＢＢ３抗体のようなＥＲＢＢ３インヒビターに対する応答および非応答）、および（ｂ）ＮＲＧ１発現レベルを含む。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「閾値スコア」とは、スコアであって、これを上回ると、ＥＲＢＢ３インヒビターでの処置に感受性であると腫瘍が分類されるものを意味する。
【００４６】
（ＥＲＢＢ３抗体）
本明細書で開示される方法は、ＥＲＢＢ３インヒビター（例えば、抗ＥＲＢＢ３抗体、または抗ＥＲＢＢ３抗体の抗原結合フラグメント）での処置に対する腫瘍応答を推定するために使用され得る。いくつかの実施形態において、腫瘍は、ＮＲＧ１（例えば、ＮＲＧ１−β１）のＥＲＢＢ３への結合を阻害するかもしくはＮＲＧ１がＥＲＢＢ３に結合しないようにし、それによって、ＥＲＢＢ３のリガンド誘導性ダイマー化を間接的に阻害するかもしくは妨げるＥＲＢＢ３抗体（もしくはその抗原結合フラグメント）（例えば、抗ＥＲＢＢ３抗体ＡＶ−２０３、０４Ｄ０１、１２Ａ０７、１８Ｈ０２および２２Ａ０２）に対して感受性もしくは耐性であると分類される。他の実施形態において、腫瘍は、ＥＲＢＢ３へのＮＲＧ１の結合を妨げることなしに、ＥＲＢＢ３ダイマー化を阻害するかもしくは妨げる抗体（もしくはその抗原結合フラグメント）（例えば、抗ＥＲＢＢ３抗体０９Ｄ０３および１１Ｇ０１）に対して感受性もしくは耐性であると分類される。
【００４７】
例示的実施形態において、上記ＥＲＢＢ３インヒビターは、以下の抗体のうちの１つである：ＡＶ−２０３、０４Ｄ０１、１２Ａ０７、１８Ｈ０２、２２Ａ０２、１１Ｇ０１、および０９Ｄ０３。
【００４８】
抗ＥＲＢＢ３抗体ＡＶ−２０３（もとは、抗体２４Ｃ０５と称されていた）は、図１に示されるとおりの、配列番号１からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、および配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域；ならびに図３に示されるとおりの、配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、および配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。例示的実施形態において、抗体ＡＶ−２０３は、図２に示されるとおりの配列番号７のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、および図４に示されるとおりの配列番号８のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。別の例示的実施形態において、抗体ＡＶ−２０３は、図５に示されるとおりの、配列番号９の免疫グロブリン重鎖アミノ酸配列および配列番号１０の免疫グロブリン軽鎖アミノ酸配列を含む。
【００４９】
抗ＥＲＢＢ３抗体０４Ｄ０１は、図１に示されるとおりの配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、および配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域；ならびに図３に示されるとおりの配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、および配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。例示的実施形態において、抗体０４Ｄ０１は、図２に示されるとおりの配列番号１７のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、および図４に示されるとおりの配列番号１８のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。別の例示的実施形態において、抗体０４Ｄ０１は、図６に示されるとおりの、配列番号１９の免疫グロブリン重鎖アミノ酸配列および配列番号２０の免疫グロブリン軽鎖アミノ酸配列を含む。
【００５０】
抗ＥＲＢＢ３抗体０９Ｄ０３は、図１に示されるとおりの配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、および配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域；ならびに図３に示されるとおりの配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、および配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。例示的実施形態において、抗体０９Ｄ０３は、図２に示されるとおりの配列番号２７のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、および図４に示されるとおりの配列番号２８のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。別の例示的実施形態において、抗体０９Ｄ０３は、図７に示されるとおりの、配列番号２９の免疫グロブリン重鎖アミノ酸配列および配列番号３０の免疫グロブリン軽鎖アミノ酸配列を含む。
【００５１】
抗ＥＲＢＢ３抗体１１Ｇ０１は、図１に示されるとおりの配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、および配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域；ならびに図３に示されるとおりの配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、および配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。例示的実施形態において、抗体１１Ｇ０１は、図２に示されるとおりの配列番号３６のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、および図４に示されるとおりの配列番号３７のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。別の例示的実施形態において、抗体１１Ｇ０１は、図８に示されるように、配列番号３８の免疫グロブリン重鎖アミノ酸配列および配列番号３９の免疫グロブリン軽鎖アミノ酸配列を含む。
【００５２】
抗ＥＲＢＢ３抗体１２Ａ０７は、図１に示されるとおりの配列番号４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、および配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域；ならびに図３に示されるとおりの配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、および配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。例示的実施形態において、抗体１２Ａ０７は、図２に示されるとおりの配列番号４３のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、および図４に示されるとおりの配列番号４４のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。別の例示的実施形態において、抗体１２Ａ０７は、図９に示されるとおりの、配列番号４５の免疫グロブリン重鎖アミノ酸配列および配列番号４６の免疫グロブリン軽鎖アミノ酸配列を含む。
【００５３】
抗ＥＲＢＢ３抗体１８Ｈ０２は、図１に示されるとおりの配列番号４７のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、および配列番号４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域；ならびに図３に示されるとおりの配列番号５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、および配列番号５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。例示的実施形態において、抗体１８Ｈ０２は、図２に示されるとおりの配列番号５３のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、および図４に示されるとおりの配列番号５４のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。別の例示的実施形態において、抗体１８Ｈ０２は、図１０に示されるとおりの、配列番号５５の免疫グロブリン重鎖アミノ酸配列および配列番号５６の免疫グロブリン軽鎖アミノ酸配列を含む。
【００５４】
抗ＥＲＢＢ３抗体２２Ａ０２は、図１に示されるとおりの配列番号５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、および配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域；ならびに図３に示されるとおりの配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、ならびに配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。例示的実施形態において、抗体２２Ａ０２は、図２に示されるとおりの配列番号５９のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、および図４に示されるとおりの配列番号６０のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。別の例示的実施形態において、抗体２２Ａ０２は、図１１に示されるように、配列番号６１の免疫グロブリン重鎖アミノ酸配列および配列番号６２の免疫グロブリン軽鎖アミノ酸配列を含む。
【００５５】
当業者は、完全な重鎖もしくはカッパ鎖の抗体配列が、上記に記載されるとおりの可変領域をそれぞれの定常領域配列に連結して、活性な全長免疫グロブリン重鎖および軽鎖を生成することによって作られ得ることを理解している、ということが企図される。例えば、完全な重鎖は、重鎖可変配列、続いて、マウスもしくはヒトのＩｇＧ１もしくはＩｇＧ２ｂの重鎖定常配列（これらは、当該分野で公知である）を含み、完全なκ鎖は、κ可変配列、続いて、マウスもしくはヒトのκ軽鎖定常配列（これらは、当該分野で公知である）を含む。免疫グロブリン重鎖および軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の配列が、ヒト免疫グロブリンフレームワーク領域もしくはヒト化免疫グロブリンフレームワーク領域間に挿入され得ることは、さらに企図される。
【００５６】
（組織サンプル）
ヒト患者における腫瘍からの組織サンプル（例えば、ヒト患者（例えば、ＥＲＢＢ３インヒビターでの処置が考慮されているヒト患者）から得られた腫瘍からの組織サンプル）は、上記サンプル中のＮＲＧ１のレベルが、開示される方法を実施するにあたって決定され得るように、ＲＮＡ供給源、タンパク質供給源、もしくは免疫組織化学（ＩＨＣ）のための薄切片の供給源として使用され得る。上記組織サンプルは、従来の腫瘍生検機器および手順を使用することによって得られ得る。内視鏡下生検、切除による生検（ｅｘｃｉｓｉｏｎａｌ  ｂｉｏｐｓｙ）、切開による生検（ｉｎｃｉｓｉｏｎａｌ  ｂｉｏｐｓｙ）、細針生検、パンチ生検、薄片生検および皮膚生検は、腫瘍サンプルを得るために当業者によって使用され得る認識された医学的手順の例である。上記腫瘍組織サンプルは、ＮＲＧ１およびＥＲＢＢ３遺伝子発現を測定するために十分なＲＮＡ、タンパク質、もしくは薄片を提供するために十分大きいべきである。
【００５７】
上記腫瘍組織サンプルは、ＮＲＧ１およびＥＲＢＢ３の発現もしくは含量の測定を可能にする任意の形態にあり得る。言い換えると、上記組織サンプルは、ＲＮＡ抽出、タンパク質抽出、もしくは薄片の調製のために十分でなければならない。よって、上記組織サンプルは、新鮮であり得るか、適切な低温技術を介して保存され得るか、または非低温技術を介して保存され得る。臨床生検標本を取り扱うための標準的プロセスは、上記組織サンプルをホルマリン中で固定し、次いで、これをパラフィン中に包埋することである。この形態にあるサンプルは、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織として一般に公知である。その後の分析のための組織調製に適した技術は、当業者に周知である。
【００５８】
（ＮＲＧ１遺伝子発現）
本明細書中で記載される場合、腫瘍からの組織サンプル中のＮＲＧ１遺伝子発現のレベルを決定もしくは測定することは、任意の適切な方法によって行われ得る。いくつかのこのような方法は、当該分野で公知である。例えば、ＮＲＧ１遺伝子発現を決定することは、サンプル中で、ＮＲＧ１タンパク質のレベルもしくは量を測定するか、またはＮＲＧ１
ＲＮＡのレベルもしくは量を測定することによって、行われ得る。
【００５９】
ニューレグリン１は、ＮＲＧ１遺伝子の発現に際して多くのアイソフォームにおいて生成される。上記種々のアイソフォームの相対量は、組織タイプおよび／もしくは発生段階のような要因に依存して変動するようである。ニューレグリン１のＥＧＦ様ドメインは、ＥＲＢＢ３に結合するのに必須である。それは、β改変体（ＮＲＧ１β）もしくはα改変体（ＮＲＧ１α）として、上記種々のＮＲＧ１アイソフォームのうちの全てにおいて見いだされる。従って、本明細書に記載されるようにＮＲＧ１遺伝子発現のレベルを決定する場合、上記ＮＲＧ１アッセイは、好ましくは、存在するＮＲＧ１アイソフォームの大部分（全てではなくても）を検出するために、ＮＲＧ１の少なくともＥＧＦ様ドメインを検出するように設計される。よって、いくつかの実施形態において、ＰＣＲプライマーは、上記ＥＧＦ様ドメインの一部を増幅するように設計される。同様に、いくつかの実施形態において、マイクロアレイプローブは、上記ＥＧＦ様ドメインにおける配列もしくは複数の改変体にわたって保存された配列とハイブリダイズするように設計される。抗ＮＲＧ１抗体がＮＲＧ１タンパク質を検出するために使用される場合、上記抗体は、好ましくは、上記ＥＧＦ様ドメインを認識する。
【００６０】
いくつかの実施形態において、ＥＲＢＢ３インヒビターでの処置に感受性もしくは耐性としての腫瘍の分類は、上記腫瘍からの組織サンプル中のＮＲＧ１の発現にのみ基づく。他の実施形態において、１種もしくはそれより多くの他の遺伝子の発現は、ＮＲＧ１発現に加えて、ＥＲＢＢ３インヒビターでの処置に感受性もしくは耐性として腫瘍を分類するために測定される。１種もしくはそれより多くの他の遺伝子の発現がＮＲＧ１に加えて測定される場合の実施形態において、上記１種もしくはそれより多くの他の遺伝子は、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、およびＥｒｂＢ３（例えば、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２およびＥｒｂＢ３のうちのいずれかのモノマー、ヘテロダイマーおよび／もしくはホモダイマー、ならびに／またはモノマー形態もしくはダイマー形態のいずれかにあるリン酸化されたＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２およびＥｒｂＢ３）を含まないことは、本明細書で企図される。他の実施形態において、ＮＲＧ１の発現は、β−セルリン（ＢＣＴ）分泌と組み合わせて測定されない。ＮＲＧ１に加えて測定される１種もしくはそれより多くの他の遺伝子の発現は、例えば、データ正規化のために、コントロールもしくは標準として働く遺伝子を含み得ることは、本明細書でさらに企図される。
【００６１】
（ＲＮＡ分析）
従来のマイクロアレイ分析および定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、ｍＲＮＡレベルにおいてＮＲＧ１遺伝子発現のレベルを決定するための方法の例である。いくつかの実施形態において、ＲＮＡは、標準的プロトコルを使用して、目的の細胞、腫瘍もしくは組織から抽出される。他の実施形態において、ＲＮＡ分析は、ＲＮＡ単離を要しない技術を使用して行われる。
【００６２】
組織サンプルからの真核生物ｍＲＮＡ、すなわち、ポリ（ａ）  ＲＮＡの迅速かつ効率的な抽出のための方法は、十分に確立されており、当業者に公知である。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓを参照のこと。上記組織サンプルは、新鮮であり得るか、凍結され得るか、もしくは固定したパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）サンプル（例えば、臨床研究腫瘍標本）であり得る。一般に、新鮮なもしくは凍結した組織サンプルから単離されたＲＮＡは、ＦＦＰＥサンプルからのＲＮＡよりフラグメント化が少ない傾向にある。しかし、腫瘍材料のＦＦＰＥサンプルは、より容易に入手可能であり、ＦＦＰＥサンプルは、本発明の方法における使用のためのＲＮＡの適切な供給源である。ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現プロファイリングのためのＲＮＡの供給源としてのＦＦＰＥサンプルの考察に関しては、例えば、Ｃｌａｒｋ−Ｌａｎｇｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７，  ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ８：２７９を参照のこと。Ｄｅ  Ａｎｄｒｅ’ｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １８：４２０４４；およびＢａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  米国特許出願公開番号２００５／００９５６３４もまた参照のこと。ＲＮＡの抽出および調製のための販売者の説明書とともに市販されているキットの使用は、広く行き渡っておりかつ一般的である。種々のＲＮＡ単離製品および完全なキットの商業的販売者としては、Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，  ＣＡ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）、Ａｍｂｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ，  ＴＸ）およびＥｘｉｑｏｎ（Ｗｏｂｕｒｎ，  ＭＡ）が挙げられる。
【００６３】
一般に、ＲＮＡ単離は、組織／細胞破壊とともに始まる。組織／細胞破壊の間に、ＲＮａｓｅによるＲＮＡ分解を最小限にすることが望ましい。上記ＲＮＡ単離プロセスの間にＲＮａｓｅ活性を制限する１つのアプローチは、細胞を破壊したら可能な限り速やかに変性剤と細胞内容物とを接触した状態にすることを確実にすることである。別の一般的実践は、ＲＮＡ単離プロセスに１種もしくはそれより多くのプロテアーゼを含めることである。必要に応じて、新鮮な組織サンプルは、上記サンプルが集められたら可能な限り速やかに、室温においてＲＮＡ安定化溶液中に浸漬される。上記安定化溶液は、上記細胞に迅速に浸透し、その後の単離のために、４℃の貯蔵の間、ＲＮＡを安定化する。１つのこのような安定化溶液は、ＲＮＡｌａｔｅｒ（登録商標）（Ａｍｂｉｏｎ，  Ａｕｓｔｉｎ，  ＴＸ）として市販されている。
【００６４】
いくつかのプロトコルにおいて、全ＲＮＡは、塩化セシウム密度勾配遠心分離によって、破壊された腫瘍材料から単離される。一般に、ｍＲＮＡは、全細胞ＲＮＡのうちの約１％〜５％を構成する。固定化オリゴ（ｄＴ）、例えば、オリゴ（ｄＴ）セルロースは、リボソームＲＮＡおよびトランスファーＲＮＡからｍＲＮＡを分離するために一般に使用される。単離後に貯蔵される場合、ＲＮＡは、ＲＮａｓｅ非含有条件下で貯蔵されなければならない。単離されたＲＮＡの安定な貯蔵のための方法は、当該分野で公知である。ＲＮＡの安定な貯蔵のための種々の市販の製品が、利用可能である。
【００６５】
（マイクロアレイ）
ＮＲＧ１のｍＲＮＡ発現レベルは、従来のＤＮＡマイクロアレイ発現プロファイリング技術を使用して測定され得る。ＤＮＡマイクロアレイは、固体表面もしくは基材（例えば、ガラス、プラスチックもしくはシリコン）に付着させられ、各特定のＤＮＡセグメントが上記アレイ中の既知の位置を占めている、特定のＤＮＡセグメントもしくはプローブの集まりである。標識されたＲＮＡのサンプルとの、通常は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でのハイブリダイゼーションは、上記アレイ中の各プローブに対応するＲＮＡ分子の検出および定量を可能にする。非特異的に結合したサンプル材料を除去するためのストリンジェントな洗浄の後に、上記マイクロアレイは、共焦点レーザー顕微鏡法もしくは他の適切な検出法によってスキャンされる。現代の市販のＤＮＡマイクロアレイ（しばしば、ＤＮＡチップとして公知）は、代表的には、何万個ものプローブを含み、従って、何万種もの遺伝子の発現を同時に測定し得る。このようなマイクロアレイは、本発明を実施するにあたって使用され得る。あるいは、ＮＲＧ１を測定するために必要なプローブと同程度に少ないプローブと、必要なコントロールもしくは標準を（例えば、データ正規化のために）含むカスタムチップは、開示される方法を実施するにあたって使用され得る。
【００６６】
データ正規化を容易にするために、２色マイクロアレイリーダーが使用され得る。２色（２チャネル）システムにおいて、サンプルは、第１の波長で発光する第１の発蛍光団で標識される一方で、ＲＮＡもしくはｃＤＮＡ標準は、異なる波長で発光する第２の発蛍光団で標識される。例えば、Ｃｙ３（５７０ｎｍ）およびＣｙ５（６７０ｎｍ）はしばしば、２色マイクロアレイシステムにおいて一緒に使用される。
【００６７】
ＤＮＡマイクロアレイ技術は、十分に開発されており、市販されており、広く使用されている。従って、開示される方法を行うにあたって、当業者は、マイクロアレイ技術を使用して、バイオマーカータンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを、過度な実験なくして測定し得る。ＤＮＡマイクロアレイチップ、試薬（例えば、ＲＮＡもしくはｃＤＮＡ調製、ＲＮＡもしくはｃＤＮＡ標識、ハイブリダイゼーションおよび洗浄溶液のためのもの）、機器（例えば、マイクロアレイリーダー）およびプロトコルは、当該分野で周知であり、種々の市販の供給源から入手可能である。マイクロアレイシステムの商業的販売者としては、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，  ＣＡ）およびＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，  ＣＡ）が挙げられるが、他のＰＣＲシステムも使用され得る。
【００６８】
（定量的ＰＣＲ）
ＮＲＧ１をコードするｍＲＮＡのレベルは、従来の定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）技術を使用して測定され得る。ｑＲＴ−ＰＣＲの利点としては、感度、融通性、定量的正確性、および密接に関連したｍＲＮＡ間を識別できることが挙げられる。定量的ＰＣＲのための組織サンプルの処理に関するガイダンスは、種々の供給源（ｑＲＴ−ＰＣＲのための市販の機器および試薬の製造業者および販売者（例えば、Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，  ＣＡ）およびＡｍｂｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ，  ＴＸ））が挙げられる）から入手可能である。ｑＲＴ−ＰＣＲの自動化された実施のための機器およびシステムは、市販されており、多くの研究室において慣用的に使用されている。周知の市販のシステムの例は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７９００ＨＴ  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）である。
【００６９】
ｍＲＮＡが一旦単離されたら、ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現測定の第１工程は、ｍＲＮＡテンプレートを逆転写してｃＤＮＡにすることである。次いで、このｃＤＮＡは、ＰＣＲ反応において指数関数的に増幅される。２種の一般に使用される逆転写酵素が、トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（ＡＭＶ−ＲＴ）およびモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ−ＲＴ）である。上記逆転写反応は、代表的には、特異的プライマー、ランダムヘキサマー、もしくはオリゴ（ｄＴ）プライマーでプライミングされる。適切なプライマーは、市販されている（例えば、ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）  ＲＮＡ  ＰＣＲキット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，  Ｗａｌｔｈａｍ，  ＭＡ））。得られたｃＤＮＡ生成物は、その後のポリメラーゼ連鎖反応においてテンプレートとして使用され得る。
【００７０】
上記ＰＣＲ工程は、熱安定性ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用して行われる。ＰＣＲシステムにおいて最も一般に使用されるポリメラーゼは、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ポリメラーゼである。ＰＣＲの選択性は、増幅の標的とされるＤＮＡ領域（すなわち、目的のタンパク質をコードする遺伝子から逆転写されるｃＤＮＡの領域）に相補的なプライマーの使用から生じる。従って、ｑＲＴ−ＰＣＲが本発明において使用される場合、各マーカー遺伝子に特異的なプライマーは、上記遺伝子のｃＤＮＡ配列に基づく。ＳＹＢＲ（登録商標）グリーンもしくはＴａｑＭａｎ（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）のような商業的な技術は、上記販売者の指示書に従って使用され得る。メッセンジャーＲＮＡレベルは、ハウスキーピング遺伝子（例えば、β−アクチンもしくはＧＡＰＤＨ）のレベルを比較することによって、サンプル間での負荷量（ｌｏａｄｉｎｇ）の差異について正規化され得る。ｍＲＮＡ発現のレベルは、任意の単一のコントロールサンプル（例えば、正常な、非腫瘍組織もしくはサンプルからのｍＲＮＡ）と比較して表され得る。あるいは、それは、腫瘍サンプルのプール、もしくは腫瘍細胞株、またはコントロールｍＲＮＡの市販のセットからのｍＲＮＡと比較して表され得る。
【００７１】
遺伝子ＮＲＧ１もしくはＥＲＢＢ３の発現のＰＣＲ分析の適切なプライマーセットは、過度の実験なくして、当業者によって設計および合成され得る。あるいは、本発明を実施するためのＰＣＲプライマーセットは、市販の供給源（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）から購入され得る。ＰＣＲプライマーは、好ましくは、約１７〜２５ヌクレオチド長である。プライマーは、融解温度（Ｔｍ）予測のための従来のアルゴリズムを使用して、特定のＴｍを有するように設計され得る。プライマー設計およびＴｍ予測のためのソフトウェアは、市販されており（例えば、Ｐｒｉｍｅｒ  ＥｘｐｒｅｓｓＴＭ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、インターネット上からも利用可能である（例えば、Ｐｒｉｍｅｒ３（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））。ＰＣＲプライマー設計の確立された原則を適用することによって、多数の異なるプライマーが、ＮＲＧ１およびＥＲＢＢ３を含め、任意の所定の遺伝子の発現レベルを測定するために使用され得る。
【００７２】
（ｑＮＰＡＴＭ）
いくつかの実施形態において、ＲＮＡ分析は、ＲＮＡ抽出も単離も要さない技術を使用して行われる。１つのこのような技術は、定量的ヌクレアーゼ保護アッセイであり、このアッセイは、名称ｑＮＰＡＴＭ（Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｔｕｃｓｏｎ，  ＡＺ）の下で市販されている。この技術は、上記分析される腫瘍組織サンプルがＦＦＰＥ材料の形態にある場合に、有利であり得る。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７，  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ８７：９７９−９９７を参照のこと。
【００７３】
（タンパク質分析）
他の実施形態において、ＮＲＧ１およびＥＲＢＢ３の遺伝子発現は、タンパク質レベルにおいて検出され得る。ＮＲＧ１もしくはＥＲＢＢ３の遺伝子発現のレベルをタンパク質レベルにおいて測定するための方法の例としては、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）およびＩＨＣ分析が挙げられる。
【００７４】
（ＥＬＩＳＡ）
ＮＲＧ１  ＥＬＩＳＡの実施は、ＮＲＧ１に対する少なくとも１種の抗体（すなわち、検出抗体）を必要とする。分析されるサンプルからのＮＲＧ１タンパク質は、固体支持体（例えば、ポリスチレンマイクロタイタープレート）上に固定化される。この固定化は、非特異的結合によるもの（すなわち、その表面への吸着を介する）であり得る。あるいは、固定化は、「サンドイッチ」ＥＬＩＳＡにおいて、特異的結合によるもの、すなわち、捕捉抗体（上記検出抗体とは異なる抗ＮＲＧ１抗体）による上記サンプルからのＮＲＧ１の結合を介するものであり得る。上記ＮＲＧ１が固定化された後、上記検出抗体が添加され、上記検出抗体は、上記結合したＮＲＧ１と複合体を形成する。上記検出抗体は、酵素に、直接的もしくは間接的のいずれかで、例えば、上記検出抗体を特異的に認識する二次抗体を介して連結される。代表的には、各工程の間に、ＮＲＧ１が結合している上記プレートは、温和な界面活性剤溶液で洗浄される。代表的なＥＬＩＳＡプロトコルはまた、１回もしくはそれより多くのブロッキング工程を含み、これら工程は、上記プレートへのタンパク質試薬の望ましくない非特異的結合をブロックするために非特異的結合タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン）の使用を伴う。最終の洗浄工程の後に、上記プレートは、上記サンプル中のＮＲＧ１の量を示す目に見えるシグナルを生じるように、適切な酵素基質の添加によって発色させられる。上記基質は、例えば、色素生成基質もしくは蛍光生成基質であり得る。ＥＬＩＳＡ法、試薬および装置は、当該分野で周知であり、市販されている。
【００７５】
（免疫組織化学（ＩＨＣ））
腫瘍組織サンプルもしくは臨床標本におけるＮＲＧ１の存在およびレベルは、免疫組織化学（ＩＨＣ）もしくは免疫蛍光（ＩＦ）によって決定（例えば、可視化）され得る。臨床標本はしばしば、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）ブロックとして保存されるので、ＩＨＣおよびＩＦは、臨床標本中のＮＲＧ１タンパク質を測定するために特に有用である。ＩＨＣもしくはＩＦによるＮＲＧ１のアッセイは、ＮＲＧ１に対する少なくとも１種の抗体を要する。ＩＨＣおよびＩＦに適した抗ＮＲＧ１抗体は、市販されている。例えば、適切な抗体は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，  ＭＮ）、ａｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＭＡ）、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｉｎｃ．（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，  ＣＡ）、もしくはＮｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ，  ＣＯ）から購入され得る。標準的技術を使用すると、上記抗ＮＲＧ１抗体は、腫瘍（ＦＦＰＥ切片および凍結腫瘍切片を含む）から得られた薄片（例えば、５ミクロン切片）中のＮＲＧ１タンパク質の存在を検出するために使用され得る。代表的には、上記腫瘍切片は、上記腫瘍材料を集めて保存する最初のプロセスにおいて固定されたタンパク質の抗原性構造を回復させるような方法において最初に処理される。次いで、スライドは、上記抗ＮＲＧ１検出抗体による非特異的結合を妨げるためにブロックされる。次いで、ＮＲＧ１タンパク質の存在は、上記ＮＲＧ１タンパク質への上記抗ＮＲＧ１抗体（一次抗体）の結合によって検出される。上記一次抗体を認識しかつ結合する検出抗体（二次抗体）は、検出可能な酵素もしくは発蛍光団に結合される。代表的には、上記腫瘍切片は、工程の間に洗浄され、非特異的タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン）でブロックされる。上記検出抗体が検出可能な酵素に連結される場合、上記スライドは、目に見えるシグナルを生じるように、適切な酵素基質を使用して発色させられる。上記検出抗体が発蛍光団に連結される場合、上記スライドは、蛍光顕微鏡を使用して調べられる。上記サンプルは、ヘマトキシリンで対比染色され得る。
【００７６】
（データ解釈）
腫瘍に関するＮＲＧ１スコアは、閾値スコアに関連して解釈され得る。上記閾値スコアに等しいかもしくはそれより高いＮＲＧ１スコアは、上記腫瘍がＥＲＢＢ３インヒビター（例えば、ＥＲＢＢ３抗体）での処置に対して感受性（応答性）であるという予測と解釈され得る。あるいは、上記閾値スコアに等しいかもしくはそれより低いＮＲＧ１スコアは、腫瘍がＥＲＢＢ３インヒビターでの処置に耐性（非応答性）であるという予測と解釈され得る。
【００７７】
至適閾値ＮＲＧ１スコアは、閾値決定分析を行うことによって経験的に決定（もしくは少なくとも概算）され得る。好ましくは、閾値決定分析は、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線分析を含む。ＲＯＣ曲線分析は、確立された統計技術であり、その適用は、当該分野の通常の技術範囲内である。ＲＯＣ曲線分析の考察については、一般に、Ｚｗｅｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３，  「Ｒｅｃｅｉｖｅｒ  ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ  （ＲＯＣ）  ｐｌｏｔｓ：  ａ  ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｔｏｏｌ  ｉｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ」，  Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  ３９：５６１−５７７；およびＰｅｐｅ，  ２００３，  Ｔｈｅ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｔｅｓｔｓ  ｆｏｒ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと。
【００７８】
ＮＲＧ１スコアおよび至適閾値ＮＲＧ１スコアは、腫瘍タイプ間で変動し得る。従って、閾値決定分析は、好ましくは、本発明を使用して試験される任意の所定の腫瘍タイプを表す１つ以上のデータセットに対して行われる。閾値決定分析のために使用されるデータセットとしては、以下が挙げられる：（ａ）実際の応答データ（応答もしくは非応答）、および（ｂ）腫瘍の群からの各腫瘍サンプルのＮＲＧ１スコア。ＮＲＧ１スコア閾値が所定の腫瘍タイプに関連して一旦決定されたら、その閾値は、その腫瘍タイプの腫瘍からのＮＲＧ１スコアを解釈するために適用され得る。特定の実施形態において、閾値スコアは、抗ＥＲＢＢ３インヒビターで以前に処置されかつ上記抗ＥＲＢＢ３インヒビターに対して感受性であると示されたヒト患者および抗ＥＲＢＢ３インヒビターで以前に処置されかつ抗ＥＲＢＢ３インヒビターに耐性であると示されたヒト患者から得られた腫瘍の組織サンプル中のＮＲＧ１発現を測定することによって、決定される。
【００７９】
上記ＲＯＣ曲線分析は、以下のように行われ得る。上記閾値より高いかもしくはそれに等しいＮＲＧ１スコアを有する任意のサンプルは、応答者（感受性）と同定される。あるいは、上記閾値未満のＮＲＧ１スコアを有する任意のサンプルは、非応答者（耐性）と同定される。サンプルの試験されたセットからのあらゆるＮＲＧ１スコアに関して、「応答者」および「非応答者」（仮定コール）が、上記閾値としてそのスコアを使用して分類される。このプロセスは、上記データセットについての実際の応答データに対する仮定コールの比較を介して、各潜在的閾値についてＴＰＲ（ｙベクトル）およびＦＰＲ（ｘベクトル）の計算を可能にする。次いで、ＲＯＣ曲線は、上記ＴＰＲベクトル、およびＦＰＲベクトルを使用して、ドットプロットを作成することによって構築される。上記ＲＯＣ曲線が、（０，０）点から（１．０，  ０．５）点までの対角線より上にある場合、それは、上記ＮＲＧ１試験結果がランダムよりも良好な試験結果であることを示す。
【００８０】
上記ＲＯＣ曲線は、最良の動作点（ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  ｐｏｉｎｔ）、もしくは至適閾値を同定するために使用され得る。上記最良の動作点は、偽陰性のコストに対して重み付けされた偽陽性のコスト間での最良のバランスを生じるものである。これらコストは、等しい必要はない。ＲＯＣ空間における点ｘ，ｙでの分類の平均期待コスト（Ｃ）は、以下の式によって決定される。
Ｃ＝（１−ｐ）α×ｘ  ＋  ｐ×β（１−ｙ）
ここで：
α＝偽陽性のコスト、
β＝陽性をみのがす（偽陰性）コスト、および
ｐ＝陽性の症例の割合。
【００８１】
偽陽性および偽陰性は、αおよびβに関して異なる値を割り当てることによって、異なって重み付けされ得る。例えば、非応答者であるより多くの患者を処置するというコストにおいて、応答者群により多くの患者を含めることを決定する場合、αに対してより多くの重みを付け得る。この場合、偽陽性および偽陰性のコストは同じ（α＝β）であると想定される。従って、上記ＲＯＣ空間における点ｘ，ｙでの分類の平均期待コストは、以下である：
Ｃ’＝（１−ｐ）×ｘ  ＋  ｐ×（１−ｙ）。
最小のＣ’は、偽陽性および偽陰性（ｘ，ｙ）の全ての対を使用した後に計算され得る。至適スコア閾値は、Ｃ’における（ｘ，ｙ）のスコアとして計算される。
【００８２】
腫瘍がＥＲＢＢ３インヒビターでの処置に感受性であるかまたは耐性であるかを推定すること、すなわち、２項分類に加えて、ＮＲＧ１スコアは、腫瘍がどの程度の可能性で感受性であるか耐性であるかという、およそではあるが、有用な指標を提供する。一般に、上記ＮＲＧ１スコアが高いほど、腫瘍がＥＲＢＢ３インヒビターに対して感受性である可能性が高く、上記ＮＲＧ１スコアが低いほど、腫瘍がＥＲＢＢ３インヒビターに対して耐性である可能性が高い。
【００８３】
（試験キット）
本発明の方法を行うための特定の成分を含む診断試験キットもまた、開示される。診断試験キットは、診断アッセイの実施において便宜性、速度および再現性を高める。例えば、例示的ｑＲＴ−ＰＣＲベースの実施形態において、基本的な診断試験キットは、ＮＲＧ１の発現を分析するためのＰＣＲプライマーを含む。他の実施形態において、より精巧な試験キットは、ＰＣＲプライマーのみならず、ＰＣＲ技術を使用してＮＲＧ１発現レベルを測定するための緩衝液、試薬および詳細な指示書をも含む。いくつかの実施形態において、上記キットは、ＲＮＡサンプル以外の、上記試験に必要とされる試験プロトコルおよび消費され得る構成要素全てを含む。
【００８４】
例示的なＤＮＡマイクロアレイベースの実施形態において、試験キットは、特定の機器での使用のために設計された微小流体カード（アレイ）を含む。必要に応じて、上記微小流体カードは、ＮＲＧ１の測定のために特に設計されたカスタムメイドのデバイスである。このようなカスタム微小流体カードは、市販されている。例えば、ＴａｑＭａｎ  Ａｒｒａｙは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７９００ＨＴ  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ
Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）での使用のために設計された３８４ウェル微小流体カード（アレイ）である。１種もしくはそれより多くのさらなる遺伝子の発現を測定するために、さらなるプローブが流体カード上に必要に応じて含められ得ることは、理解される。このようなさらなる遺伝子は、コントロールもしくは標準として、例えば、データ正規化のために働くように含められてもよいし、または他の点で有益であってもよい。
【００８５】
いくつかの実施形態において、上記試験キットは、ＩＨＣによるＮＲＧ１含量の決定のための材料を含む。ＩＨＣキットは、例えば、ＮＲＧ１に対する一次抗体、およびレポーター酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）に結合体化された二次抗体を含み得る。いくつかの実施形態において、上記二次抗体は、上記一次抗体を特異的に認識する結合体化ポリマーで置換される。
【実施例】
【００８６】
本発明は、以下の実施例によってさらに例示される。実施例は、例示目的のみで提供されるのであって、本発明の範囲もしくは内容を限定するとは如何様にも解釈されるべきではない。
【００８７】
（実施例１：ＡＶ−２０３に対する異種移植片腫瘍応答）
ＡＶ−２０３に対する腫瘍応答の評価を、以下のように行った。異種移植片腫瘍を確立するために、最初に腫瘍細胞を、３７℃において、５％  ＣＯ２を含む雰囲気中、１０％
ウシ胎仔血清を含む培地を使用して培養で増殖させた。細胞を、８週齢の雌性ＮＣＲヌードマウスもしくはＣＢ．１７  ＳＣＩＤマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｌａｂｓ）の側腹部へと、５０％  マトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｃａｔ  Ｎｏ．  ３５６２３７）中２〜１０×１０６細胞／マウスで皮下接種した。腫瘍測定を、ノギスを使用して１週間に２回行った。腫瘍体積を、以下の式を使用して計算した：幅×幅×長さ／２。腫瘍が約２００ｍｍ３に達したとき、上記マウスを各１０匹のマウスの２群（ＰＢＳビヒクルコントロールもしくは１週間に２回２０ｍｇ／ｋｇでＡＶ−２０３腹腔内（ＩＰ）投与）へとランダム化した。いくつかの研究において、第２のコントロール群を使用し、この群には、１週間に２回２０ｍｇ／ｋｇ  ＩＰで投与されるヒトＩｇＧを与えた。
【００８８】
合計して、２５個の異種移植片腫瘍を、ＡＶ−２０３で処置した。ＡＶ−２０３に対する応答は、−１０％腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）から腫瘍退縮までの範囲に及んで、変動した。「腫瘍退縮」は、処置前の評価期間の開始時の腫瘍のサイズと比較して、評価期間の最後に腫瘍がより小さいことを意味する。達成された腫瘍増殖阻害に基づいて、応答者（ＴＧＩ＞６０％を有するものと定義される）および非応答者（ＴＧＩ＜６０％を有するものと定義される）を同定した。評価した２５の腫瘍のうち、１０は、応答者であることが分かり（例えば、ｈＮＲＧ１  Ｃｔ値は、２２．９に等しいかもしくはそれ未満）、１５は、非応答者であることが分かった（表１）。これら群は、ＡＶ−２０３応答性についての分子マーカーの同定を可能にした。
【表１−１】
2018113987.tif 000002
【表１−２】
2018113987.tif 000003
【００８９】
（実施例２：ＡＶ−２０３応答とＮＲＧ１レベルとの間の関係性）
評価した上記２５の腫瘍に関して、ＲＮＡを、未処置の元気な腫瘍（ｕｎｔｒｅａｔｅｄ  ｈｅａｌｔｈｙ  ｔｕｍｏｒ）から調製した。瞬間凍結腫瘍サンプルを、Ｃｏｖａｒｉｓ  ＣｒｙｏＰｒｅｐＴＭシステム（Ｃｏｖａｒｉｓ  Ｉｎｃ．  Ｍｏｄｅｌ  ＣＰ−０２）を使用して粉砕した。粉砕した腫瘍材料のうちの約３０ｍｇを、２ｍＬ  ＳａｆｅＬｏｃｋＴＭチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，カタログ番号０２２３６６５２）へと移した。１ｍＬのＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号１５５９６−０２６）および１（５ｍｍ）ステンレス鋼シェイカービーズ（Ｑｉａｇｅｎ，カタログ番号６９９８９）を、各チューブに添加した。次いで、上記チューブを、細胞溶解のためにＴｉｓｓｕｅ  Ｌｙｓｅｒ  ＩＩＴＭ（Ｑｉａｇｅｎ，カタログ番号８５３００）中で、ラックに置いた。上記サンプルを、２回の３０秒間サイクルにわたって振盪した。次いで、上記ラックを回転し、さらに２回のサイクルにわたって再び振盪した。
【００９０】
全ＲＮＡ（水相）を、上記細胞溶解物から、各サンプルに２００μＬ  クロロホルムを添加することによって抽出した。上記サンプルを、１５秒間にわたって激しく振盪し、１２，０００ｒｐｍにおいて１５分間にわたって４℃で遠心分離にかけた。上側の上清（３５０μＬ）を、新しい２ｍＬ  ＳａｆｅＬｏｃｋＴＭチューブに移し、ＲＮｅａｓｙＴＭ  Ｍｉｎｉ  ＱＩＡｃｕｂｅ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，カタログ番号７４１１６）での自動化ＲＮＡ単離のために、ＱＩＡｃｕｂｅＴＭ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ，  Ｃａｔ．  Ｎｏ．９００１２９２）に配置した。ＤＮａｓｅ  Ｉ処理工程は、上記ＲＮＡ単離に含めた。単離した全ＲＮＡ濃度を、ＮａｎｏＤｒｏｐＴＭ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｍｏｄｅｌ  １０００）で測定し、ＲＮＡ完全性を、１８Ｓバンドの位置および任意のＲＮＡ分解の検出を確認するために、電気泳動によって決定した。上記ＲＮＡを２つの１．７ｍＬ  マイクロチューブ（Ａｘｙｇｅｎカタログ番号ＭＣＴ−１７５−Ｃ）の中にアリコートに分け、−８０℃で貯蔵した。
【００９１】
ヒトＮＲＧ１、ＥＲＢＢ３およびβ−アクチンの発現レベルを、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用して決定した。全腫瘍ＲＮＡ発現を、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔＴＭ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＲＴ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ  Ｃａｔ．  Ｎｏ．２０４２４５）を使用してアッセイし、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ，  Ｍｏｄｅｌ  ７９００ＨＴ  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｃａｔ．Ｎｏ．４３２９００１）で実施した。各ＲＮＡ腫瘍サンプルを、２０μＬの反応系において四連でアッセイした。各反応系は、５０ｎｇの全腫瘍ＲＮＡ、１０μＬの２×ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔＴＭ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、０．２μＬ  ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＲＴ  Ｍｉｘならびに終濃度９００ｎＭの正方向および逆方向の遺伝子特異的プライマー（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎによって合成された）を含んだ。反応を、３８４ウェルプレートにおけるＱｉａｇｅｎ  ＢｉｏＲｏｂｏｔ  Ｒａｐｉｄｐｌａｔｅ液体取り扱いシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，カタログ番号４３０９８４９）を使用し、ＭｉｃｒｏＡｍｐ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ａｄｈｅｓｉｖｅ  Ｆｉｌｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，カタログ番号４３１１９７１）でシールして設定した。上記リアルタイムプレートを、以下のプログラムでアッセイした：５０℃において３０分間、９５℃において１５分間、続いて、９５℃において１５秒間、５４℃において３０秒間、７２℃において３０秒間を４０サイクル。次いで、サイクル閾値（Ｃｔ）の値平均を、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌで計算した。Ｃｔ値は、ｌｏｇベース蛍光の閾値レベルにおけるサイクル数として規定される。低Ｃｔ値は、高い特異的ＲＮＡレベルを反映する（すなわち、低Ｃｔ値は、ＮＲＧ１の高発現を反映する）。
【００９２】
次いで、これら２５の腫瘍におけるＡＶ−２０３腫瘍増殖阻害を、各腫瘍内のＮＲＧ１発現レベル（Ｃｔ値として表される）に対してプロットした。図１２に示されるように、腫瘍増殖阻害とＮＲＧ１発現との間で陽性相関が認められた。より具体的には、ＡＶ−２０３での処置後の増大した腫瘍増殖阻害は、増大したＮＲＧ１発現（より低いＣｔ値）と相関した。この相関は、統計的に非常に有意であることが分かった（表２）。
【表２】
2018113987.tif 000004
【００９３】
（実施例３：ＡＶ−２０３応答とＥＲＢＢ３レベルとの間の関係性）
ＮＲＧ１に関して記載されるように、ＥＲＢＢ３レベルもまた、これら２５の腫瘍モデルからの定量的ＲＴ−ＰＣＲによって決定した。次いで、これら２５の腫瘍におけるＡＶ−２０３腫瘍増殖阻害を、各腫瘍に関するＥＲＢＢ３発現レベル（Ｃｔ値として表される）に対してプロットした。図１３に示されるように、ＥＲＢＢ３がＡＶ−２０３の標的であるとしても、腫瘍増殖阻害は増大したＥＲＢＢ３発現と相関しなかった。
【００９４】
（実施例４：ＮＲＧ１閾値決定）
上記ＡＶ−２０３応答（感受性）および非応答（耐性）異種移植片腫瘍モデルに由来するＮＲＧ１のＣｔ値を使用して、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を作成して、ＡＶ−２０３腫瘍応答を推定するために有用なＮＲＧ１発現閾値を決定した（図１４）。一般に、ＲＯＣ曲線は、試験結果（例えば、ＮＲＧ１バイオマーカー試験結果）がランダム事象とは有意に異なるか否かを決定するために、および至適閾値スコア（例えば、至適閾値ＮＲＧ１スコア）を決定するために使用される。例えば、上記試験結果がランダムである場合、対角線は、ＲＯＣ空間を分割する。この実施例において、上記ＲＯＣ曲線が対角線より上にあることは、応答者と非応答者との間での高い程度の分離を上記試験が達成していることを示す（図１４）。図１４に示されるように、上記至適閾値は、Ｃｔ＝２２．９であり、これは、偽陽性率  ０．１３、および偽陰性率  ０．２を生じる。上記ＲＯＣ分析の結果は、ＡＶ−２０３腫瘍応答が、Ｃｔ値  ２２．９におけるカットオフを使用して高ＮＲＧ１発現レベルによって推定され得ることを示す。表１に列挙された異種移植片腫瘍モデルを使用したところ、上記Ｃｔ値カットオフ  ２２．９（例えば、２２．９に等しいかもしくはそれ未満）から、統計的有意性のあるＡＶ−２０３応答が推定された（図１５）。図１５に示されるように、増大したＴＧＩは、低Ｃｔ値（これは、高ＮＲＧ１発現および高ＮＲＧ１スコアを示す）を有する腫瘍におけるＡＶ−２０３での処置の後に観察された。
【００９５】
（実施例５：原発性ヒト腫瘍モデル応答）
ＡＶ−２０３に対する応答に関するこの推定法を確認するために、原発性ヒト腫瘍モデルを、上記原発性ヒト腫瘍のマイクロアレイ分析に基づいて、高ＮＲＧ１発現もしくは低ＮＲＧ１発現を有すると分類した。次いで、これらモデルを、ＡＶ−２０３処置に対する応答に関して試験した。
【００９６】
ＡＶ−２０３に対するヒト原発性腫瘍応答の評価を、以下のように行った。原発性ヒト腫瘍を、手術による切除物から集めた。腫瘍サンプルを、１０％  ＦＢＳを含む培地中で、一晩かけて氷（ｗｅｔ  ｉｃｅ）上に置いて輸送した。到着したら、腫瘍サンプルを２ｍｍ×２ｍｍの断片へと切って、１０ゲージトロカールニードルを使用して５匹のＮＣＲヌードマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ）へと皮下移植した。効力研究のために使用されるべき異種移植片腫瘍材料を確立するために、腫瘍を５００ｍｍ３において集め、２０の部位へとさらに増殖させた。これら腫瘍が５００ｍｍ３のサイズに一旦達したら、それらをさらなる増殖、効力研究、および分子特徴付けのために集めた。効力研究に関しては、腫瘍断片を８週齢の雌性ＮＣＲヌードマウスへと皮下移植した。ノギスを使用して、１週間に２回腫瘍測定を行った。腫瘍体積を、以下の式を使用して計算した：幅×幅×長さ／２。腫瘍が約２００ｍｍ３に達したら、上記マウスを、各１０匹のマウスの２群（ＰＢＳビヒクルコントロールもしくはＡＶ−２０３を１週間に２回２０ｍｇ／ｋｇで腹腔内（ＩＰ）投与）へとランダム化した。いくつかの研究において、第２のコントロール群を使用し、この群には、１週間に２回２０ｍｇ／ｋｇで投与されるヒトＩｇＧを与えた。
【００９７】
合計で、４種の原発性ヒト肺腫瘍の異種移植片を、ＡＶ−２０３で処置した。上記マイクロアレイデータのＮＲＧ１発現ランキングに基づくと、２つは、応答すると推定され、２つは、応答しないと推定された。ＡＶ−２０３処置に応答すると推測された上記２つのＮＲＧ１高ヒト原発性腫瘍は応答し、有意な腫瘍増殖阻害を示した。これら感受性腫瘍のデータを、図１６および図１７にまとめる。応答しないと推測された上記２つのＮＲＧ１低ヒト原発性腫瘍は、ＡＶ−２０３処置に応答しなかった。上記耐性腫瘍のデータを、図１８および図１９にまとめる。これらデータから、ＡＶ−２０３での処置に対するヒト原発性腫瘍感受性は、上記腫瘍における高ＮＲＧ１発現に基づいて推定され得ることが実証された。
【００９８】
（実施例６：抗ＥＲＢＢ３抗体ＡＶ−２０３に対する異種移植片腫瘍モデル応答）
２つのさらなる異種移植片腫瘍（すなわち、ＣＡＬ−２７頭頸部腫瘍異種移植片およびＫＹＳＥ  １５０食道腫瘍異種移植片）を、実施例４に概説されたＣｔ値カットオフ  ２２．９（例えば、２２．９に等しいかもしくはそれ未満）に基づいて高ＮＲＧ１発現について選択し、従って、ＡＶ−２０３に応答すると推定された。さらに、Ｈ５２０非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）異種移植片腫瘍を、実施例４に概説された同じＣｔ値カットオフ  ２２．９に基づいて、低ＮＲＧ１発現について選択し、従って、ＡＶ−２０３に応答しないと推定された。３つ全ての腫瘍モデルを、２０ｍｇ／ｋｇの抗体ＡＶ−２０３で処置した。抗体ＡＶ−２０３に対する応答は、上記感受性腫瘍（すなわち、ＣＡＬ−２７およびＫＹＳＥ  １５０）に関して７５．２〜７９．９％腫瘍増殖阻害の範囲であり（ＴＧＩ，表３および図２０〜２１を参照のこと）、上記耐性腫瘍（すなわち、Ｈ５２０）に関して−８．０％  ＴＧＩであった（表３および図２２を参照のこと）。
【表３】
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【００９９】
これらデータから、ＡＶ−２０３での処置に対する固形腫瘍の応答は、ＮＲＧ１発現を測定することによって推定され得ることが実証される。
【０１００】
（実施例７：抗ＥＲＢＢ３抗体１１Ｇ０１に対する異種移植片腫瘍モデル応答）
他の抗ＥＲＢＢ３抗体に対する応答に関する推定法を検証するために、高ＮＲＧ１レベルを発現する腫瘍モデルを、ＡＶ−２０３とは異なる作用機構を有する抗ＥＲＢＢ３抗体で処置した。上記で考察されるように、ＡＶ−２０３は、ＥＲＢＢ３へのＮＲＧ１の結合を阻害するので、以下の実験を、ＥＲＢＢ３へのＮＲＧ１の結合を阻害することなしにＥＲＢＢ３のダイマー化をブロックする抗体（すなわち、抗体１１Ｇ０１）を使用して行った。抗体１１Ｇ０１に対する腫瘍応答の評価を、実施例１に記載されるように行った。
【０１０１】
３つの異種移植片腫瘍（すなわち、ＢｘＰＣ３膵臓腫瘍異種移植片、ＤＵ１４５前立腺腫瘍異種移植片およびＨ３２２肺腫瘍異種移植片）を、実施例４に概説された上記Ｃｔ値カットオフ  ２２．９（例えば、２２．９に等しいかもしくはそれ未満）に基づいて、高ＮＲＧ１発現について選択し、従って、抗ＥＲＢＢ３抗体に応答すると推定された。３つ全ての腫瘍モデルを、２０ｍｇ／ｋｇの抗体１１Ｇ０１で処置した。抗体１１Ｇ０１に対する応答は、６０〜７２％  腫瘍増殖阻害の範囲に及んだ（ＴＧＩ，  表４および図２３〜２５を参照のこと）。
【表４】
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【０１０２】
実施例１および実施例４に記載されるとおりの応答の同じカットオフ（すなわち、ｈＮＲＧ１  Ｃｔ値は２２．９に等しいかもしくはそれ未満）を使用したところ、３つの腫瘍全てが、抗体１１Ｇ０１に応答すると考えられた。これらデータから、中和抗体（例えば、ＡＶ−２０３）およびダイマー化阻害抗体（例えば、抗体１１Ｇ０１）を含む抗ＥＲＢＢ３抗体での処置に対する固形腫瘍の応答が、高ｈＮＲＧ１発現を測定することによって推定され得ることが実証される。
【０１０３】
（援用の表示）
本明細書中で引用される特許文書および科学論文の各々の開示全体は、全ての目的で参考として援用される。
【０１０４】
（等価物）
本発明は、その本質的特徴から離れた他の具体的形態において具現化され得る。従って、前述の実施形態は、本明細書に記載される発明の限定ではなく、例示であるとみなされるべきである。本発明の範囲は、前述の説明によってではなく、添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の等価物の意味およびその範囲内に入る全ての変更が、そこに包含されると解釈される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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