(57)【要約】【課題】セルロース及びヘミセルロースを効率的に糖化でき、高収率なリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造方法及び製造装置を提供する。【解決手段】本発明のリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造方法は、リグノセルロース系バイオマス由来の糖化液を発酵させた後に得られる糖化酵素が吸着した発酵残渣に水を添加し、前記糖化酵素が糖化反応可能な温度に保ちながら撹拌する撹拌工程と、  前記撹拌工程で生成された発酵残渣溶液を、糖化工程において、前処理済みリグノセルロース系バイオマスと糖化酵素とともに混合し、糖化に再利用し循環させる循環工程と、を備える。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リグノセルロース系バイオマス由来の糖化液を発酵させた後に得られる糖化酵素が吸着した発酵残渣に水を添加し、前記糖化酵素が糖化反応可能な温度に保ちながら撹拌する撹拌工程と、
前記撹拌工程で生成された発酵残渣溶液を、糖化工程において、前処理済みリグノセルロース系バイオマスと糖化酵素とともに混合し、糖化に再利用し循環させる循環工程と、
を備えることを特徴とするリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造方法。
【請求項２】
前記撹拌工程において、アルカリを添加し、前記発酵残渣溶液のｐＨが５以上７以下となるように調節する請求項１に記載のリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造方法。
【請求項３】
前記糖化反応可能な温度が２５℃以上６０℃以下である請求項１又は２に記載のリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造方法。
【請求項４】
前記循環工程において、前記前処理済みリグノセルロース系バイオマスと前記糖化酵素とによる糖化反応開始前に、前記発酵残渣溶液を添加し、前記前処理済みリグノセルロース系バイオマスと前記糖化酵素と混合する請求項１〜３のいずれか一項に記載のリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造方法。
【請求項５】
前記撹拌工程において、前記発酵残渣溶液の固形分濃度が５％以上１５％以下である請求項１〜４のいずれか一項に記載のリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造方法。
【請求項６】
前記撹拌工程において、使用する水は、リグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造に必要とされる全水量からの分配水である請求項１〜５のいずれか一項に記載のリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造方法。
【請求項７】
前処理済みリグノセルロース系バイオマスと糖化酵素とを含む糖化装置と、
前記糖化装置で生成された糖化液及び前記糖化酵素が吸着した糖化残渣と微生物とを含む発酵槽と、
前記発酵槽で生成された発酵液と前記糖化酵素が吸着した発酵残渣とを分離するための固液分離装置と、
前記固液分離装置で分離された前記糖化酵素が吸着した発酵残渣と水とを含む撹拌槽と、
前記撹拌槽で生成された発酵残渣溶液を前記糖化装置へ送液するための配管と、
を備えることを特徴とするリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造装置。
【請求項８】
さらに、前記撹拌槽は前記撹拌槽内の前記発酵残渣溶液のｐＨを測定するためのｐＨ測定器と、前記発酵残渣溶液のｐＨが５以上７以下となるようにアルカリ供給量を調整するためのアルカリ供給装置と、を備える請求項７に記載のリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造装置。
【請求項９】
さらに、前記撹拌槽は温度調整装置を備え、前記撹拌槽に含まれる前記発酵残渣溶液の温度が２５℃以上６０℃以下である請求項７又は８に記載のリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造装置。
【請求項１０】
さらに、前記撹拌槽は前記撹拌槽内の前記発酵残渣溶液の固形分濃度が５％以上１５％以下となるように糖化装置及び撹拌槽に送液される水の量、並びに糖化装置に送液される発酵残渣溶液の量を制御するための制御装置を備える請求項７〜９のいずれか一項に記載のリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造装置。
【請求項１１】
さらに、前記撹拌槽の後に、糖化装置に送液されなかった前記発酵残渣溶液に含まれる残渣を分離し排出するための固液分離装置と、
前記固形分離装置により分離された溶液を糖化装置に送液するための配管と、
を備える請求項７〜１０のいずれか一項に記載のリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造装置。
【請求項１２】
さらに、リグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造に必要とされる全水量から前記糖化装置及び前記撹拌槽において使用する水量を調節し、分配する水量調節装置を備える請求項７〜１１のいずれか一項に記載のリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造方法及び製造装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、地球温暖化対策や、廃棄物の有効活用の観点から、植物資源を原料とするバイオマスの利用が注目されている。一般に、バイオマスからエタノール等の化合物を製造するための原料としては、サトウキビ等の糖質やトウモロコシ等のデンプン質が多く用いられている。しかしながら、これらの原料はもともと食料又は飼料として用いられており、長期的に工業用利用資源として活用することは、食料又は飼料用途との競合を引き起こし、原料価格の高騰を招く危険性がある。
【０００３】
従って、非食用バイオマスをエネルギー資源として活用する技術開発が進められている。非食用バイオマスとしては、地球上に最も多く存在するセルロースがあげられるが、その大部分は芳香族ポリマーのリグニンやヘミセルロースとの複合体であるリグノセルロースとして存在する。
【０００４】
リグノセルロース系バイオマスを利用したエタノール生産では、一般に、前処理や糖化酵素による糖化処理によって獲得された糖を酵母等の微生物に嫌気発酵を行わせることでエタノールに変換させる。糖化酵素を用いた糖化処理では、糖化反応により生成された糖（主に、グルコース）濃度が高くなると未糖化の多糖類（例えば、セルロース、ヘミセルロース等）が含まれていても、糖化酵素による糖化反応が進まなくなる（以下、この状態を「グルコース生成阻害」又は「糖化酵素反応阻害」と称する場合がある。）。
【０００５】
さらに、続く酵母等の微生物による発酵では、前記微生物による発酵が進み、糖（主に、グルコース）濃度が低下するが、発酵の至適温度は約３２℃付近であるため、糖化反応の至適温度である約５０℃付近よりも温度が低い。そのため、発酵と同時に糖化液又は糖化残渣に含まれる糖化酵素による糖化反応が行われるが、反応速度が遅い。よって、セルロースの約３割が未糖化のまま発酵残渣中に残る。
【０００６】
リグノセルロース系バイオマスに含まれるセルロース及びヘミセルロースを効率的に糖化する方法としては、例えば、糖化槽を３つに分けて固形分及び液体を相互に交換処理することで、糖化槽内の糖（主に、グルコース）濃度を低く保ち、糖（主に、グルコース）による糖化酵素反応阻害を抑制する方法（例えば、特許文献１参照。）等が挙げられる。
その他の効率的な糖化方法としては、例えば、糖化発酵工程後の発酵液を減圧蒸留し、発酵組成物と糖化酵素を含む蒸留濃縮液に分離し、前記蒸留濃縮液を固液分離して得られる残渣に酢酸ナトリウム及び／又は塩化ナトリウムからなる水溶性塩類を含む水溶液を添加し、残渣から糖化酵素を遊離させる。次いで、遊離した糖化酵素を含む溶液を循環し、糖化発酵工程に再利用する方法（例えば、特許文献２参照。）等が挙げられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１１−０１９４８３号公報
【特許文献２】特許第５９１０３６７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
特許文献１に記載の方法では、糖化槽及び固液分離装置が３組必要となり、設備規模が大きくなる。さらに、原料であるリグノセルロース系バイオマスの組成はばらつきが大きく、糖化残渣の組成及び糖化液に残存する酵素活性をリアルタイムで測定することが困難であるため、最適な操業ポイントを選定及び維持することが難しい。その結果、酵素を補充することが必要となり、経済的ではない。
また、特許文献２に記載の方法では、添加した塩を循環濃縮することによる糖化酵素及び微生物への悪影響が懸念される。さらに、新しく系外の水が必要であり、設備規模が大きくなる。
【０００９】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、セルロース及びヘミセルロースを効率的に糖化でき、高収率なリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造方法及び製造装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
［１］リグノセルロース系バイオマス由来の糖化液を発酵させた後に得られる糖化酵素が吸着した発酵残渣に水を添加し、前記糖化酵素が糖化反応可能な温度に保ちながら撹拌する撹拌工程と、前記撹拌工程で生成された発酵残渣溶液を、糖化工程において、前処理済みリグノセルロース系バイオマスと糖化酵素とともに混合し、糖化に再利用し循環させる循環工程と、を備えることを特徴とするリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造方法。
［２］前記撹拌工程において、アルカリを添加し、前記発酵残渣溶液のｐＨが５以上７以下となるように調節する［１］に記載のリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造方法。
［３］前記糖化反応可能な温度が２５℃以上６０℃以下である［１］又は［２］に記載のリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造方法。
［４］前記循環工程において、前記前処理済みリグノセルロース系バイオマスと前記糖化酵素とによる糖化反応開始前に、前記発酵残渣溶液を添加し、前記前処理済みリグノセルロース系バイオマスと前記糖化酵素と混合する［１］〜［３］のいずれか一つに記載のリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造方法。
［５］前記撹拌工程において、前記発酵残渣溶液の固形分濃度が５％以上１５％以下である［１］〜［４］のいずれか一つに記載のリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造方法。
［６］前記撹拌工程において、使用する水は、リグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造に必要とされる全水量からの分配水である［１］〜［５］のいずれか一つに記載のリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造方法。
【００１１】
［７］前処理済みリグノセルロース系バイオマスと糖化酵素とを含む糖化装置と、前記糖化装置で生成された糖化液及び前記糖化酵素が吸着した糖化残渣と微生物とを含む発酵槽と、前記発酵槽で生成された発酵液と前記糖化酵素が吸着した発酵残渣とを分離するための固液分離装置と、前記固液分離装置で分離された前記糖化酵素が吸着した発酵残渣と水とを含む撹拌槽と、前記撹拌槽で生成された発酵残渣溶液を前記糖化装置へ送液するための配管と、を備えることを特徴とするリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造装置。
［８］さらに、前記撹拌槽は前記撹拌槽内の前記発酵残渣溶液のｐＨを測定するためのｐＨ測定器と、前記発酵残渣溶液のｐＨが５以上７以下となるようにアルカリ供給量を調整するためのアルカリ供給装置と、を備える［７］に記載のリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造装置。
［９］さらに、前記撹拌槽は温度調整装置を備え、前記撹拌槽に含まれる前記発酵残渣溶液の温度が２５℃以上６０℃以下である［７］又は［８］に記載のリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造装置。
［１０］さらに、前記撹拌槽は前記撹拌槽内の前記発酵残渣溶液の固形分濃度が５％以上１５％以下となるように糖化装置及び撹拌槽に送液される水の量、並びに糖化装置に送液される発酵残渣溶液の量を制御するための制御装置を備える［７］〜［９］のいずれか一つに記載のリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造装置。
［１１］さらに、前記撹拌槽の後に、糖化装置に送液されなかった前記発酵残渣溶液に含まれる残渣を分離し排出するための固液分離装置と、前記固形分離装置により分離された溶液を糖化装置に送液するための配管と、を備える［７］〜［１０］のいずれか一つに記載のリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造装置。
［１２］さらに、リグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造に必要とされる全水量から前記糖化装置及び前記撹拌槽において使用する水量を調節し、分配する水量調節装置を備える［７］〜［１１］のいずれか一つに記載のリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造装置。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、セルロース及びヘミセルロースを効率的に糖化でき、高収率なリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造方法及び製造装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明のリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造装置の一実施形態を模式的に示す概略構成図である。
【図２】本発明のリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造装置の他の実施形態を模式的に示す概略構成図である。
【図３】実施例１における撹拌工程にて固形分濃度が５％、７．５％、１０％、又は１５％であって、系外水を用いたもの、又はエタノール製造に用いる水全量からの分配水を用いたものでの２回目の糖化工程にて得られた糖化液のＣ５糖化率（％）、Ｃ６糖化率（％）、及び発酵工程にて得られたサトウキビバガス乾燥重量１ｔあたりのエタノール収量（Ｌ）を示すグラフである。
【図４】実施例２における撹拌工程にて発酵残渣溶液のｐＨについて、ｐＨ調整なし、ｐＨ６．０、又はｐＨ７．０に調整し、５０℃又は６０℃で行ったサンプルでの発酵残渣１ｇ乾燥重量あたりのグルコース生成率（ｇ／ｇ−ｄｒｙ）を示すグラフである。
【図５】実施例２における撹拌工程にて発酵残渣溶液のｐＨについて、ｐＨ調整なし、ｐＨ６．０、又はｐＨ７．０に調整し、５０℃又は６０℃で行ったサンプルでの２回目の糖化工程にて得られた糖化液のＣ５糖化率（％）、Ｃ６糖化率（％）、及び発酵工程にて得られたサトウキビバガス乾燥重量１ｔあたりのエタノール収量（Ｌ）示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本明細書において、「リグノセルロース系バイオマス」としては、主に、セルロース、ヘミセルロース及びリグニンを含有するものであり、例えば針葉樹、広葉樹、建築廃材、林地残材、剪定廃材、稲藁、籾殻、麦藁、木材チップ、木材繊維、化学パルプ、古紙、合板等の農林産物資源、サトウキビバガス、サトウキビ茎葉、コーンストーバー等の農林産物廃棄物、農林産物加工品及び大型藻類、微細藻類等の植物組織等が挙げられ、これらに限定されない。これらのリグノセルロース系バイオマスは単独であってもよく、混合物であってもよい。
【００１５】
本明細書において、「ヘミセルロース」には、キシロースなどの５つの炭素を構成単位とする五炭糖とよばれるものやマンノース、アラビノース、ガラクツロン酸などの６つの炭素を構成単位とする六炭糖とよばれるもの、さらにグルコマンナンやグルクロノキシランなどのような複合多糖等が含まれる。よって、ヘミセルロースは加水分解を受けると、炭素５つからなる五炭糖の単糖やその単糖が複数個連結された五炭糖のオリゴ糖、炭素６つからなる六炭糖の単糖やその単糖が複数個連結された六炭糖のオリゴ糖、五炭糖の単糖と六炭糖の単糖が複数個連結されたオリゴ糖を生ずる。
「セルロース」には、６つの炭素を構成単位とする六炭糖が含まれる。よって、セルロースは加水分解を受けると、炭素６つからなる六炭糖の単糖（例えば、グルコース等）やその単糖が複数個連結された六炭糖のオリゴ糖（例えば、セロビオース等）を生ずる。
一般に、ヘミセルロース又はセルロースから生ずる単糖又はオリゴ糖の構成比率や生成量は、前処理方法や原料として用いた農林産物資源、農林産物廃棄物、農林産物加工品及び大型藻類、微細藻類等の植物組織等の種類によって異なる。
【００１６】
本明細書において、「前処理済みリグノセルロース系バイオマス」とは、糖化反応を効率的に行うために事前処理を行ったリグノセルロース系バイオマスを意味する。前処理方法としては、例えば、蒸気のみでの蒸煮法、イオン液体を用いる方法、ミルを用いる粉砕法などが挙げられる。また、前処理において、必要に応じて、適宜酸又はアルカリを混合させてもよい。酸としては、硫酸、塩酸、硝酸、リン酸等の中から選ばれ、これらを単独で又は組み合わせて用いてもよい。中でも工業利用には安価で手に入りやすい硫酸が特に好ましい。アルカリとしては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアの中から選ばれ、これらを単独で又は組み合わせて用いてもよい。
【００１７】
本明細書において、「リグノセルロース系バイオマス由来化合物」とは、リグノセルロース系バイオマスを分解して得られた単糖及びオリゴ糖を、酵母が摂取することにより生成された化合物を意味する。例えば、エタノール、ブタノール、１，３−プロパンジオール、１，４−ブタンジオール、グリセロール等のアルコール、ピルビン酸、コハク酸、リンゴ酸、イタコン酸、クエン酸、乳酸等の有機酸、イノシン、グアノシン等のヌクレオシド、イノシン酸、グアニル酸等のヌクレオチド、カダベリン等のジアミン化合物等が挙げられる。発酵によって得られた化合物が乳酸等のモノマーである場合は、重合によりポリマーに変換することもある。
【００１８】
以下、図面を参照しながら、本発明の実施形態について詳細に説明する。なお、各図において、説明に関連しない部分は図示を省略する場合がある。
【００１９】
＜＜リグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造方法＞＞
一実施形態において、本発明は、リグノセルロース系バイオマス由来の糖化液を発酵させた後に得られる糖化酵素が吸着した発酵残渣に水を添加し、前記糖化酵素が糖化反応可能な温度に保ちながら撹拌する撹拌工程と、前記撹拌工程で生成された発酵残渣溶液を、糖化工程において、前処理済みリグノセルロース系バイオマスと糖化酵素とともに混合し、糖化に再利用し循環させる循環工程と、を備えるリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造方法を提供する。
【００２０】
本実施形態の製造方法によれば、セルロース及びヘミセルロースを効率的に糖化でき、高収率でリグノセルロース系バイオマス由来化合物を得ることができる。
従来のリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造方法において、糖化残渣を糖化反応に再利用する方法はあった。
これに対し、本実施形態の製造方法では、発酵残渣を糖化工程に再利用している。さらに、本実施形態の製造方法において発酵残渣は、糖化工程の他に、発酵工程、撹拌工程及び循環工程を経て、発酵残渣に含まれる基質（例えば、セルロース、ヘミセルロース等）、及び糖化酵素を糖化工程に再利用しているため、合計での糖化酵素が基質（例えば、セルロース、ヘミセルロース等）に接している時間、すなわち糖化時間が長くなる。一般に、糖化時間が長ければ長いほど糖化が進むため、本実施形態の製造方法によれば、効率的に糖化を行うことができる。
本実施形態の製造方法における各工程について、以下に詳細に説明する。
【００２１】
［糖化工程］
糖化工程は、続く発酵工程において、発酵を効率的に行うために、前処理済みリグノセルロース系バイオマスを基質として、糖化酵素を用いて、糖化反応を行う工程である。糖化工程は従来技術に基づき適宜行えばよく、例えば、糖化温度は、４５℃以上７０℃以下が好ましく、４５℃以上５５℃以下より好ましく、５０℃が特に好ましい。また、糖化時間は１２時間以上１２０時間以下が好ましく、２４時間以上９６時間以下がより好ましく、２４時間以上７２時間以下がさらに好ましい。
また、糖化工程における前処理済みリグノセルロース系バイオマス由来の固形分濃度は、撹拌性、及び糖化酵素による糖化反応の効率性から、５％以上１５％以下であることが好ましい。
【００２２】
本明細書において、糖化酵素とは、リグノセルロース系バイオマスを単糖又はオリゴ糖単位に分解する酵素を意味し、リグノセルロース系バイオマスを単糖又はオリゴ糖にまで分解するものであればよく、主に、セルラーゼ及びヘミセルラーゼの各活性を持つものであればよい。
セルラーゼは、セルロースをグルコース等の単糖又はオリゴ糖に分解するものであればよく、エンドグルカナーゼ（ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅ；ＥＧ）、セロビオハイドロラーゼ（ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ；ＣＢＨ）、及びβ−グルコシダーゼ（β−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ；ＢＧＬ）の各活性の少なくとも１つの活性を有するものを挙げることができ、これらの各活性を有する酵素混合物であることが、酵素活性の観点から好ましい。
同じくヘミセルラーゼは、ヘミセルロースをキシロース等の単糖又はオリゴ糖に分解するものであればよく、キシラナーゼ、キシロシダーゼ、マンナナーゼ、ペクチナーゼ、ガラクトシダーゼ、グルクロニダーゼ、及びアラビノフラノシダーゼの各活性の少なくとも１つの活性を有するものを挙げることができ、これらの各活性を有する酵素混合物であることが、酵素活性の観点から好ましい。
これらセルラーゼ及びヘミセルラーゼ等の糖化酵素の由来は限定されることはなく、例えば、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ）属、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎｕｓ）属、イルペックス（Ｉｒｐｅｘ）属、スポロトリクム（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ）属、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属等の糸状菌、担子菌、細菌類等の糖化酵素生産菌由来のセルラーゼ及びヘミセルラーゼ等の糖化酵素を用いることができる。
【００２３】
一般的に、糖化反応において、リグニンに糖化酵素が非特異的に吸着する現象がしばしば起きる。また、セルラーゼのうち、ＥＧ及びＣＢＨは、セルロース結合モジュール（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｄｕｌｅ；ＣＢＭ）を有し、基質であるセルロースに特異的に吸着する。一方、ＢＧＬはＣＢＭを有しないため、リグニンへの非特異的吸着のみである。
また、ＢＧＬはリグニンに吸着した状態であっても、活性部位が残っており、液中のセロビオースに対して糖化能力が維持されている。
よって、糖化工程を経た糖化残渣に含まれるリグニンにはＢＧＬが吸着しており、また、糖化工程を経た糖化残渣に含まれる未糖化のセルロースにはＥＧ及びＣＢＨが特異的に吸着している。このため、本実施形態の製造方法において、続く発酵工程において糖化液のみならず、糖化残渣も一緒に使用することで、基質（例えば、セルロース、ヘミセルロース等）、並びに糖化酵素であるＥＧ、ＣＢＨ及びＢＧＬを含むため、発酵と同時に糖化反応を行うことができ、効率的に糖化することができる。
【００２４】
本明細書において、「固形分濃度」とは、ある重量の固液混合物（Ａ）を、絶対乾燥状態（材料を１００〜１１０℃の温度で定質量となるまで乾燥し、材料内部に蒸発する水が存在しなくなるまで乾燥した状態）にした時に残る固形分重量（Ｂ）の割合を意味し、下記式［１］で表される。
（固形分濃度）［％］＝（Ｂ）／（Ａ）×１００    ［１］
【００２５】
［発酵工程］
次いで、前記糖化工程において得られた糖化液及び糖化酵素が吸着した糖化残渣と微生物とを添加し、撹拌しながら発酵を行う。発酵工程において、前記糖化工程において得られた糖化液及び糖化残渣両方を用いることで、糖化残渣には未糖化のセルロース、ヘミセルロース等の多糖類、並びに糖化残渣に吸着した状態の糖化酵素が含まれるため、発酵工程においても糖化反応を同時に行い、微生物による発酵における基質となる単糖及びオリゴ糖を生成することができる。
発酵工程は従来技術に基づき適宜行えばよく、例えば、発酵温度は、２５℃以上５０℃以下が好ましく、２８℃以上３５℃以下がより好ましく、３２℃が特に好ましい。また、発酵時間は、２４時間以上１２０時間以下が好ましく、２４時間以上９６時間以下がより好ましく、２４時間以上７２時間以下がさらに好ましい。
【００２６】
使用する微生物としては、目的のリグノセルロース系バイオマス由来化合物を生成できるものであれば、特別な限定はない。具体的には、酵母や細菌等が挙げられ、遺伝子組換え微生物も好ましく用いられる。遺伝子組換え微生物とは、アルコール等の目的のリグノセルロース系バイオマス由来化合物への変換に必要な酵素遺伝子を有していない微生物に、遺伝子工学技術によりこれら遺伝子を導入し、アルコール等の目的のリグノセルロース系バイオマス由来化合物の生成を可能にしたものである。遺伝子組換え微生物としては、例えば、アルコール発酵性を有する遺伝子組換え大腸菌等が挙げられる。
また、微生物は微生物を含む培養液をそのまま使用してもよく、又は、微生物を含む培養液を遠心分離により濃縮したもの、乾燥状態のもの等を適宜使用してよい。
使用する微生物の量は、微生物の増殖速度、発酵槽の大きさ、及び発酵に用いる糖化液の量等を元に算出すればよい。
【００２７】
［固液分離工程］
次いで、前記発酵工程の後に、発酵液と発酵残渣とに固液分離する。発酵液には、主に、リグノセルロース系バイオマス由来化合物が溶解しているため、必要に応じて、後述の精製工程を行い、リグノセルロース系バイオマス由来化合物を精製する。
一方、発酵残渣には、未糖化のセルロース、ヘミセルロース等の多糖類、並びに発酵残渣に吸着した状態の糖化酵素が含まれるため、続く撹拌工程を経て、糖化工程に循環することにより、効率的にセルロース、ヘミセルロース等の多糖類、並びに糖化酵素を再利用することができる。
【００２８】
固液分離する方法としては、発酵工程後の溶液に含まれる固形分の３０％以上を回収可能な公知の方法を用いればよく、例えば、フィルター、振動篩等によりろ過する方法、遠心分離法、スクリュープレスを用いた分離法等が挙げられ、これらに限定されない。
【００２９】
［撹拌工程］
次いで、固形分離工程において分離された糖化酵素が吸着した発酵残渣に水を添加し、前記糖化酵素が糖化可能な温度に保ちながら、撹拌する。
前記糖化酵素が糖化可能な温度とは、糖化酵素が糖化を行うことができる温度を意味し、具体的には、２５℃以上６０℃以下が好ましく、５０℃が特に好ましい。
温度が上記下限値以上であることにより、糖化酵素が活発に糖化反応を行うことができる。また、温度が上記上限値以下であることにより、糖化酵素の３次元構造が変性し、失活して触媒機能を喪失することを防ぐことができる。
また、撹拌時間は、２４時間以上７２時間以下であることが好ましく、２４時間以上４８時間以下であることがより好ましい。
【００３０】
また、撹拌工程において、アルカリを添加し、前記発酵残渣溶液のｐＨが５以上７以下（特に好ましくは、ｐＨ７）となるように調節することが好ましい。ｐＨを上記範囲に調節することにより、発酵残渣溶液中における糖化酵素及び発酵残渣の表面がマイナスの電荷を帯び、両者間に静電気反発力が生じることで発酵残渣に付着した糖化酵素を遊離させることができる。
前記アルカリとしては、上述の「前処理済みリグノセルロース系バイオマス」の定義において例示されたものと同様のものが挙げられる。
【００３１】
また、撹拌工程における発酵残渣溶液の固形分濃度は、５％以上１５％以下であることが好ましく、１０％であることが特に好ましい。
固形分濃度が上記下限値以上であることにより、過剰に水を使用することを防ぐことができる。また、固形分濃度が上記上限値以下であることにより、撹拌性（発酵残渣溶液の流動性）が優れ、発酵残渣から糖化酵素を遊離させて、撹拌工程において効率的に糖化反応を行うことができる。
【００３２】
また、撹拌工程において使用する水は、リグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造に必要とされる全水量からの分配水であることが好ましい。これにより、系外水を新たに必要とせず、設備コストの増加を最低限に抑え且つリグノセルロース系バイオマス由来化合物の収量を向上させることができる。
【００３３】
［循環工程］
次いで、撹拌工程で生成された発酵残渣溶液を、前記糖化工程において、前処理済みリグノセルロース系バイオマスと糖化酵素とともに混合し、糖化に再利用し循環させる。
前処理済みリグノセルロース系バイオマス由来の固形分（乾燥状態での重量）に対する発酵残渣溶液由来の固形分（乾燥状態での重量）の割合は、０．１５倍以上０．３倍以下であることが好ましい。
割合が上記範囲内であることにより、効率的に糖化反応を行うことができる。
【００３４】
また、発酵残渣溶液を糖化工程において投入するタイミングとしては、前処理済みリグノセルロース系バイオマスと糖化酵素とによる糖化反応開始前であってもよく、糖化反応途中であってもよい。中でも、発酵残渣溶液に含まれる糖化酵素及び未糖化の基質（例えば、セルロース、ヘミセルロース等）の糖化時間を長くすることができることから、投入するタイミングは糖化反応開始前であることが好ましい。
また、発酵残渣溶液を糖化工程において糖化反応途中に投入する場合、なるべく糖化時間を長くするために、糖化工程における糖化時間のちょうど半分にあたる時間まで（例えば、糖化時間が４８時間である場合は、糖化開始から２４時間後まで）に発酵残渣溶液を投入すればよい。
【００３５】
また、循環工程に伴い、糖化工程に再利用されなかった発酵残渣溶液が蓄積するが、撹拌工程後に糖化工程に循環されなかった発酵残渣溶液を固液分離し、分離された残渣は適宜排出されるため、系内に循環する発酵残渣の量を一定に保つことができる。一方、撹拌工程後に糖化工程に循環されなかった発酵残渣溶液を固液分離し、分離された溶液は遊離された糖化酵素、未糖化であって可溶化された基質（例えば、セロビオース等のオリゴ糖等）、及び単糖（例えば、グルコース、キシロース等）を含むため、糖化工程において再利用してもよい。
【００３６】
本実施形態において、糖化工程の前にリグノセルロース系バイオマスを糖化酵素による糖化反応を行いやすくするために前処理を行う前処理工程を備えていてもよい。
【００３７】
［前処理工程］
前処理工程は、続く糖化工程において、糖化反応を効率的に行うためにリグノセルロース系バイオマスを前処理する工程である。
前処理方法としては、例えば、蒸気のみでの蒸煮法、イオン液体を用いる方法、ミルを用いる粉砕法などが挙げられる。また、前処理工程において、必要に応じて、適宜酸又はアルカリを混合させてもよい。前記酸及び前記アルカリとしては、上述の「前処理済みリグノセルロース系バイオマス」の定義の際に例示されたものと同様のものが挙げられる。
【００３８】
本実施形態において、固液分離工程の後に得られた溶液に含まれるリグノセルロース系バイオマス由来化合物の純度を上げるために精製を行う精製工程を備えていてもよい。
【００３９】
［精製工程］
精製工程は、固液分離工程の後に得られた溶液に含まれるリグノセルロース系バイオマス化合物を精製するための工程である。
精製方法としては、リグノセルロース系バイオマス化合物がアルコール類である場合は、例えば、前記発酵液を蒸留する方法等が挙げられる。また、リグノセルロース系バイオマス化合物がアミノ酸類である場合は、例えば、イオン交換法、活性炭を用いた異物の吸着除去法等が挙げられる。
【００４０】
＜＜リグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造装置＞＞
＜第一実施形態＞
図１は、本発明のリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造装置の一実施形態を模式的に示す概略構成図である。
なお、以下の説明で用いる図は、本発明の特徴を分かり易くするために、便宜上、要部となる部分を拡大して示している場合があり、各構成要素の寸法比率等が実際と同じであるとは限らない。
本実施形態の製造装置１０は、糖化装置１１と発酵槽１２と固液分離装置１３と撹拌槽１４とが、配管１５、１６、１７ａ、及び１８を介して、循環するように配設されている。また、固体分離装置１３には、発酵残渣を移送するための配管１７ａの他に、発酵液を送液するための配管１７ｂが配設されている。
【００４１】
糖化装置１１は、糖化酵素と前処理済みリグノセルロース系バイオマスとを含み、単糖を生成する糖化反応を行うための装置であり、特別な制限はない。例えば、撹拌型、通気撹拌型、気泡塔型、流動層型、充填層型などを挙げられ、これらに限定されない。
糖化装置１１内の温度を一定に保つために、糖化装置１１の外側に温水循環式のジャケットなど温度調整装置を備えていてもよい。
【００４２】
発酵槽１２は、糖化装置１１で得られた糖化液及び糖化酵素が吸着した糖化残渣に、微生物を植菌し、発酵するための槽であって、特別な限定はない。前記発酵槽１２としては、例えば、撹拌型、通気撹拌型、気泡塔型、流動層型、充填層型等を挙げられ、これらに限定されない。
また、発酵槽１２内の温度を一定に保つために、発酵槽１２の外側に温水循環式のジャケットなど温度調整装置を備えていてもよい。
【００４３】
固液分離装置１３は、発酵液と糖化酵素が吸着した発酵残渣とを分離するための装置であって、特別な限定はない。
前記固液分離装置としては、固液の分離強度を調節できる装置であればよく、例えば、加わる圧力を調節することで分離強度を調節することができる装置や、篩目やフィルターの網目の大きさを変更することで分離強度を調節することができる装置、固液分離装置の運転条件は変更せずに固液分離後の固形分の一部を排出することで分離強度を下げることができる装置等が挙げられる。前記固液分離装置として具体的には、例えば、フィルタープレス、スクリュープレスや、１００μｍ以上２３６０μｍ以下の網目である振動篩、遠心分離機等が挙げられる。
【００４４】
撹拌槽１４は、糖化酵素が吸着した発酵残渣と水とを混合し、撹拌することで、発酵残渣から糖化酵素を遊離させ、同時に発酵残渣に含まれる基質（例えば、セルロース、ヘミセルロース等）を用いて前記糖化酵素による糖化反応を行うための槽であって、特別な限定はない。
撹拌槽１４は撹拌翼等の撹拌機構を有することが好ましい。
撹拌槽１４に含まれる発酵残渣溶液の温度は、糖化酵素が糖化反応を行うことができる温度であればよく、具体的には、２５℃以上６０℃以下であることが好ましく、５０℃であることが特に好ましい。
温度が上記下限値以上であることにより、糖化酵素が活発に糖化反応を行うことができる。また、温度が上記上限値以下であることにより、糖化酵素の３次元構造が変性し、失活して触媒機能を喪失することを防ぐことができる。
撹拌槽１４内の温度を上記範囲内に保つために、撹拌槽１４の外側に温水循環式のジャケットなど温度調整装置を備えていてもよい。
【００４５】
撹拌槽１４はさらにアルカリ供給装置及びｐＨ測定器を備えていてもよい（図示せず）。前記ｐＨ測定器を用いて、撹拌槽１４内の発酵残渣溶液のｐＨを測定し、前記アルカリ供給装置からのアルカリ供給量を適宜調整することにより、撹拌槽１４に含まれる発酵残渣溶液のｐＨが、好ましくは５以上７以下（特に好ましくは、ｐＨ７）となるように管理する。
ｐＨが上記範囲であることにより、発酵残渣溶液中における糖化酵素及び発酵残渣の表面がマイナスの電荷を帯び、両者間に静電気反発力が生じることで発酵残渣に付着した糖化酵素を遊離させることができる。
前記アルカリとしては、上述の「前処理済みリグノセルロース系バイオマス」の定義において例示されたものと同様のものが挙げられる。
【００４６】
また、撹拌槽１４に含まれる発酵残渣溶液の固形分濃度は５％以上１５%以下であることが好ましい。
固形分濃度が上記下限値以上であることにより、過剰に水を使用することを防ぐことができる。また、固形分濃度が上記上限値以下であることにより、撹拌性（発酵残渣溶液の流動性）が優れ、発酵残渣から糖化酵素を遊離させて、撹拌槽１４において効率的に糖化反応を行うことができる。
【００４７】
配管１５は、糖化装置１１から得られた糖化液及び糖化残渣を発酵槽１２に送液するための配管であって、特別な限定はない。
配管１６は、発酵槽１２から得られた発酵液及び発酵残渣を固液分離装置１３に送液するための配管であって、特別な限定はない。
配管１７ａは、固液分離装置１３から得られた発酵残渣を撹拌槽１４に移送するための配管であって、特別な限定はない。
配管１７ｂは、固液分離装置１３から得られた発酵液を精製装置等に送液するための配管であって、特別な限定はない。
配管１８は、撹拌槽１４から得られた発酵残渣溶液を糖化装置１１に送液し、系内に循環させるための配管であって、特別な限定はない。
配管１５、１６、１７ａ、１７ｂ、及び１８の途中には、それぞれ送液又は移送する流量を調整するためのポンプ（図示せず）が配設されていてもよい。
【００４８】
図１に示す本実施形態のリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造装置を用いて、リグノセルロース系バイオマス由来化合物を製造する方法を以下に説明する。
まず、前処理装置を用いて、リグノセルロース系バイオマスを物理的又は化学的な処理を施し、形状を微細化する、又はオリゴ糖に分解する等して糖化酵素処理しやすい状態にする。次いで、前処理済みリグノセルロース系バイオマスを糖化装置１１へ移送し、糖化酵素と混合し、糖化反応を行うことでグルコースやキシロース等の単糖又はオリゴ糖に分解させて、糖化液を生産させる。次いで、配管１５を介して糖化装置１１から発酵槽１２へ糖化液及び糖化残渣を送液し、微生物を添加し、撹拌しながら発酵を行う。このとき、糖化残渣には糖化酵素が吸着しており、さらに基質となる未糖化のセルロース及び未糖化のヘミセルロース等が含まれているため、発酵と同時に糖化も行われる。次いで、配管１６を介して発酵槽１２内の溶液を固液分離装置１３に送液し、発酵液と発酵残渣とに分離する。次いで、発酵液に含まれる所望のリグノセルロース系バイオマス由来化合物を分離又は精製するために、必要に応じて、発酵液は配管１７ｂを介して蒸留塔等の精製装置へ送液される。一方、発酵残渣は配管１７ａを介して固液分離装置１３から撹拌槽１４へ送液される。送液された発酵残渣は水と、必要に応じてアルカリとを添加し、撹拌することで、発酵残渣に吸着している糖化酵素が遊離され、同時に発酵残渣に含まれる基質（例えば、セルロース、ヘミセルロース等）を用いて前記糖化酵素による糖化反応を行う。次いで、発酵残渣溶液は配管１８を介して撹拌槽１４から糖化装置１１へ送液されて、前処理済みリグノセルロース系バイオマスと糖化酵素とともに混合し、発酵残渣溶液に含まれる糖化酵素及び基質（例えば、セルロース、ヘミセルロース等）は糖化反応において再利用される。
また、撹拌槽１４に含まれる発酵残渣溶液のうち、糖化装置１１に送液されず残った発酵残渣溶液が一定量蓄積した場合、残った発酵残渣溶液を固液分離して得られる分離残渣を適宜排出することで、系内に循環する発酵残渣の量を一定に保てばよい。
【００４９】
＜第二実施形態＞
図２は、本発明のリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造装置の他の実施形態を模式的に示す概略構成図である。
本実施形態の製造装置２０は、制御装置２１が糖化装置１１、撹拌槽１４、ポンプ２３ａ、ポンプ２３ｂ、及びポンプ２３ｃに接続しており、貯水槽２２が配管２４ａを介して糖化装置１１に、配管２４ｂを介して撹拌槽１４に配設されている点で、図１に示すリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造装置１０と相違し、その他の構成はリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造装置１０と同じである。
なお、以下の図２において、図１に示す構成要素と同一のものについては同じ符号を用いている。
【００５０】
制御装置２１は、糖化装置１１又は撹拌槽１４に含まれる溶液の重量、前処理済みリグノセルロース系バイオマス又は発酵残渣における固形分濃度、及び発酵残渣溶液における固形分濃度から、必要な水の量を算出し、固形分濃度が５％以上１５％以下となるようにモニタリングしながら、ポンプ２３ａ、２３ｂ、及び２３ｃを制御することにより、糖化装置１１及び撹拌槽１４に送液される水の量、並びに糖化装置１１に送液される発酵残渣溶液の量を制御するためのものである。
制御装置２１は、例えば、図２に示すように、制御用コンピュータ及びコントローラーから構成されるもの等が挙げられる。
【００５１】
貯水槽２２は、リグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造に使用するための水を保管するための槽であって、特別な限定はない。
また、貯水槽２２内の水の温度を必要に応じて変更するために、貯水槽２２の外側に温水循環式のジャケットなど温度調整装置を備えていてもよい。
【００５２】
ポンプ２３ａは、貯水槽２２から糖化装置１１に水を送液するためのポンプであって、特別な限定はない。
ポンプ２３ｂは、貯水槽２２から撹拌槽１４に水を送液するためのポンプであって、特別な限定はない。
ポンプ２３ｃは、撹拌槽１４から糖化装置１１に発酵残渣溶液を送液するためのポンプであって、特別な限定はない。
【００５３】
配管２４ａは、貯水槽２２から糖化装置１１に水を送液するための配管であって、特別な限定はない。
配管２４ｂは、貯水槽２２から撹拌槽１４に水を送液するための配管であって、特別な限定はない。
【００５４】
図２に示すリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造装置２０を用いて、リグノセルロース系バイオマス由来化合物を製造する方法を以下に説明する。
まず、制御装置２１は、前処理済みリグノセルロース系バイオマスにおける固形分濃度及び糖化装置１１に移送された前処理済みリグノセルロース系バイオマスの重量から、必要な水の量を算出する。次いで、制御装置２１は、ポンプ２３ａを制御し、貯水槽２２から配管２４ａを介して、糖化装置１１に水を送液する。次いで、図１に示すリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造装置１０と同様の方法により、糖化装置１１、発酵槽１２、及び固形分離装置１３を経て、発酵液及び発酵残渣を固液分離する。次いで、撹拌槽１４に移送された発酵残渣における固形分濃度及び撹拌槽１４に移送された発酵残渣の重量から、必要な水量を算出する。次いで、制御装置２１は、ポンプ２３ｂを制御し、貯水槽２２から配管２４ｂを介して、撹拌槽１４に水を送液する。次いで、撹拌槽１４において、必要に応じてアルカリを添加し、撹拌することで、発酵残渣に吸着している糖化酵素が遊離され、同時に発酵残渣に含まれる基質（例えば、セルロース、ヘミセルロース等）を用いて前記糖化酵素による糖化反応を行う。次いで、制御装置２１は、前処理済みリグノセルロース系バイオマスにおける固形分濃度及び糖化装置１１に移送された前処理済みリグノセルロース系バイオマスの重量から、必要な水の量を算出する。さらに、糖化装置１１に移送された前処理済みリグノセルロース系バイオマスの重量から、上述の＜＜リグノセルロース系バイオマスの製造方法＞＞の［循環工程］において示した前処理済みリグノセルロース系バイオマス由来の固形分（乾燥状態での重量）に対する発酵残渣溶液由来の固形分（乾燥状態での重量）の割合となるように、糖化装置１１に移送する発酵残渣溶液の量を算出する。次いで、制御装置２１は、ポンプ２３ａを制御し、貯水槽２２から配管２４ａを介して、糖化装置１１に水を送液する。さらに、制御装置２１は、ポンプ２３ｃを制御し、撹拌槽１４から配管１８を介して、糖化装置１１に発酵残渣溶液を送液する。これにより、前処理済みリグノセルロース系バイオマスと糖化酵素とともに混合し、発酵残渣溶液に含まれる糖化酵素及び基質（例えば、セルロース、ヘミセルロース等）は糖化反応において再利用される。
【００５５】
本発明のリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造装置は、図１及び図２に示すものに限定されず、本発明の効果を損なわない範囲内において、図１及び図２に示すものの一部の構成が変更又は削除されたものや、これまでに説明したものにさらに他の構成が追加されたものであってもよい。
例えば、図１及び図２に示すリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造装置においては、糖化装置１１の前に、前処理装置が配設されていてもよい。
また、例えば、図１及び図２に示すリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造装置においては、固液分離装置１３の後に配管１７ｂを介して精製装置が配設させていてもよい。
前記精製装置としては、発酵液の用途に応じて、適宜選択することができる。前記精製装置として具体的には、例えば、蒸留塔、分離ろ過膜、遠心分離機等の精製装置が配設されていてもよい。
また、例えば、図１及び図２に示すリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造装置においては、撹拌槽１４の後に、糖化装置１１へ送液されず撹拌槽１４に蓄積し再利用されなかった発酵残渣溶液に含まれる残渣を分離し排出するための固液分離装置と、前記固形分離装置により分離された溶液を糖化装置１１に送液するための配管と、が配設されていてもよい。
前記固液分離装置としては、上述の＜第一実施形態＞において例示されたものと同様のものが挙げられる。
【実施例】
【００５６】
以下、具体的実施例により、本発明についてより詳細に説明する。ただし、本発明は以下に示す実施例に何ら限定されるものではない。
【００５７】
［参考例１］
（１）基質溶液の調製
１本の１００ｍＬ容量の三角フラスコに、希硫酸を用いて前処理を行ったサトウキビバガス（乾燥重量１０ｇ）を加え、固形分濃度１０％となるように水を添加した。なお、溶液のｐＨが５．５となるようにアルカリにて調整した。
【００５８】
（２）糖化工程
次いで、糖化酵素溶液を添加し、５０℃で４８時間振盪しながら糖化反応を行った。少量のサンプルを採取し、ＨＰＬＣ（島津製作所製、検出器：ＦＬＤ、カラムオーブン：ＣＴＯ−２０Ａ）を用いて、糖化液に含まれる糖（グルコース及びキシロース）の量を算出したところ、４．９ｇであった。
【００５９】
（３）発酵工程
次いで、酵母（サッカロミセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ．Ｃｅｒｅｖｉｖｉａｅ））溶液を２０ｍＬ加え、合計１２０ｍＬの溶液とした。発酵前の固形分濃度は３．５％であった。次いで、３２℃で４８時間振盪しながら発酵を行った。
【００６０】
（４）エタノール生産量の測定
次いで、０，４５ｍｍのふるいを用いて固液分離を行ったところ、乾燥重量２ｇの発酵残渣と、１１２ｇのろ液を得た。発酵後の固形分濃度は３．４％であった。
また、ＨＰＬＣ（島津製作所製、検出器：ＲＩＤ−１０Ａ、カラムオーブン：ＣＴＯ−２０Ａ）を用いて、ろ液中に含まれるエタノールを検出したところ、生成したエタノール量は２．５３ｇであった。また、乾燥サトウキビバガス１ｔ当たりのエタノール収量を算出したところ、３０５Ｌであった。
理論生成エタノール重量は、糖化工程後の糖化液中の糖の量の０．５１１倍で算出できることから、２．５０ｇであった。
実際の生成エタノール重量（２．５３ｇ）を理論生成エタノール重量（２．５０ｇ）で割って、発酵率を算出したところ、１０１．２％であった。
【００６１】
発酵前後で固形分濃度が３．５％から３．４％に減少したことから、発酵においても糖化反応が進み、不溶成分であるセルロースが糖化により可溶成分であるセロビオース、又はグルコースに分解されたと推察された。
また、発酵率が１０１．２％であったことから、発酵工程においても糖化反応が進むことで発酵工程において生成された糖もエタノールの生産に使用されたため、エタノール収量が理論値よりも多くなったと推察された。
以上のことから、発酵中においても糖化反応が進むため、糖化残渣を発酵工程においても使用し、糖化工程及び発酵工程の時間を長くとることは有用であることが確かめられた。
【００６２】
［実施例１］撹拌工程における発酵残渣溶液の固形分濃度の検討
（１）糖化工程
３００ｍＬ三角フラスコに、希硫酸を用いて前処理を行ったサトウキビバガス（乾燥重量１２ｇ）を加え、固形分濃度１０％となるように水を添加し、全量で１２０ｇの基質溶液を調製した。なお、基質溶液のｐＨが５．５となるようにアルカリにて調整した。
次いで、酵素を加え、５０℃で４８時間振盪しながら糖化反応を行った。少量の糖化前後のサンプルを採取し、ＨＰＬＣ（島津製作所製、検出器：ＦＬＤ、カラムオーブン：ＣＴＯ−２０Ａ）を用いて、糖化前の基質溶液の糖組成と、糖化液に含まれるＣ５糖（例えば、キシロース、アラビノース等）及びＣ６糖（例えば、グルコース、マンノース、ガラクトース）の量とを測定した。原料であるサトウキビバガスの組成及び糖化液に含まれる単糖（Ｃ５糖（キシロース）及びＣ６糖（グルコース））量との関係から、Ｃ５糖及びＣ６糖の酵素糖化率を算出した。結果を図３に示す。
【００６３】
（２）発酵工程
次いで、（１）の糖化工程後の３００ｍＬ三角フラスコに酵母溶液２４ｇ添加して、３２℃で４８時間振盪しながら発酵を行った。
【００６４】
（３）固液分離工程
次いで、開き目０．４５ｍｍのふるいを用いて固液分離を行い、発酵液と発酵残渣（乾燥重量約２．４ｇ）とに分離した。
【００６５】
（４）撹拌工程
次いで、発酵残渣（乾燥重量約２．４ｇ）を撹拌用フラスコに投入し、水を加えて、固形分濃度が５％、７．５％、１０％、又は１５％となるように調節して、５０℃で４８時間振盪しながら保持して発酵残渣溶液を調製した。このとき、固形分濃度１０％であって、系外水を用いたもの（水バランス×）と、エタノール製造に用いる水全量からの分配水を用いたもの（水バランス○）とを準備して行った。
【００６６】
（５）循環工程
次いで、（１）と同様に３００ｍＬ三角フラスコに希硫酸を用いて前処理を行ったサトウキビバガス（乾燥重量１２ｇ）を加え、固形分濃度１０％となるように水を添加した。この際、水バランス○の条件における添加水は、（４）に用いた水量を差し引いた量とした。次いで、（４）で得られた発酵残渣溶液をそれぞれ全量添加した。なお、基質溶液のｐＨが５．５となるようにアルカリにて調整した。
次いで、上述の（１）糖化工程、及び（２）発酵工程に記載の方法と同様に行った。
なお、２回目の糖化工程の開始前後の糖化液についても、ＨＰＬＣ（島津製作所製、検出器：ＦＬＤ、カラムオーブン：ＣＴＯ−２０Ａ）を用いて、糖化前の基質溶液の糖組成と、糖化液に含まれるＣ５糖及びＣ６糖の量とを測定した。原料であるサトウキビバガスの組成及び糖化液に含まれる単糖（Ｃ５糖（キシロース）及びＣ６糖（グルコース））量との関係から、Ｃ５糖及びＣ６糖の酵素糖化率を算出した。結果を図３に示す。
【００６７】
（６）エタノール生産量の測定
次いで、ＨＰＬＣ（島津製作所製、検出器：ＲＩＤ−１０Ａ、カラムオーブン：ＣＴＯ−２０Ａ）を用いて、エタノールを測定し、サトウキビバガス乾燥重量１ｔあたりのエタノール収量（Ｌ）を算出した。結果を図３に示す。
図３において、「水バラ×」とは撹拌工程において系外水を用いたものを意味し、「水バラ○」とは撹拌工程においてエタノール製造に用いる水全量からの分配水を用いたものを意味する。また、図３において、点線で示され、「循環なし」と記載されたＣ５糖化率、Ｃ６糖化率、及びエタノール収量は、１回目の糖化工程において得られた糖化液、及び１回目の発酵工程において得られた発酵液から算出したＣ５糖化率、Ｃ６糖化率、及びサトウキビバガス乾燥重量１ｔあたりのエタノール収量（Ｌ）を意味する。
【００６８】
図３から、いずれの条件のサンプルにおいても、撹拌工程及び循環工程を行わなかったサンプル（循環なし）よりも、撹拌工程及び循環工程を行ったサンプルの方が、エタノール収量が多かった。
また、固形分濃度１０％に調製した発酵残渣溶液において、系外水を用いたもの（水バランス×）よりも、エタノール製造に用いる水全量からの分配水を用いたもの（水バランス○）のほうが、エタノール収量が多かった。
以上のことから、固形分濃度５％以上１５％以下に調製した発酵残渣溶液を用いて、撹拌工程及び循環工程を行うことにより、高収率でエタノールを製造できることが確かめられた。
【００６９】
［実施例２］撹拌工程における発酵残渣溶液のｐＨ及び温度の検討
（１）糖化工程
実施例１の（１）と同様の方法を用いて、糖化反応を行った。また、少量の糖化前後のサンプルを採取し、ＨＰＬＣ（島津製作所製、検出器：ＦＬＤ、カラムオーブン：ＣＴＯ−２０Ａ）を用いて、糖化前の基質溶液の糖組成と、糖化液に含まれるＣ５糖（例えば、キシロース、アラビノース等）及びＣ６糖（例えば、グルコース、マンノース、ガラクトース）の量とを測定した。Ｃ５糖及びＣ６糖の量を下記表１に示す。また、原料であるサトウキビバガスの組成及び糖化液に含まれる単糖（Ｃ５糖（キシロース）及びＣ６糖（グルコース））量との関係から、Ｃ５糖及びＣ６糖の酵素糖化率を算出した。結果を図５に示す。
【００７０】
（２）発酵工程
次いで、実施例１の（２）と同様の方法を用いて、発酵を行った。
【００７１】
（３）固液分離工程
次いで、実施例１の（３）と同様の方法を用いて、発酵液と発酵残渣（乾燥重量約２．４ｇ）とを分離した。
【００７２】
（４）撹拌工程
次いで、発酵残渣（乾燥重量約２．４ｇ）を撹拌用フラスコに投入し、水を加えて、固形分濃度が１０％となるように調節した。さらに発酵残渣溶液のｐＨについて、ｐＨ調整なし、ｐＨ６．０又はｐＨ７．０に調節し、５０℃又は６０℃で４８時間振盪しながら保持して発酵残渣溶液を調製した。使用した水は、エタノール製造に用いる水全量からの分配水である。撹拌工程開始前と終了後とに、少量のサンプルを採取し、ＨＰＬＣ（島津製作所製、検出器：ＦＬＤ、カラムオーブン：ＣＴＯ−２０Ａ）を用いて、発酵残渣溶液に含まれるキシロース及びグルコースの量とを測定した。発酵残渣溶液に含まれるキシロース及びグルコースの量を下記表１に示す。また、測定値から、発酵残渣乾燥重量１ｇ当たりのキシロース又はグルコースの生成率（ｇ／ｇ−ｄｒｙ）を算出した。結果を図４に示す。図４において、「ｐＨｎｏｎ」とはｐＨ調整をしていないサンプルを意味する。
【００７３】
図４から、５０℃でｐＨ５．０及び６．０で撹拌工程を行ったサンプルにおいて、グルコース生成率が高くなることが確かめられた。これは、ｐＨを中性付近とすることで、糖化酵素及び発酵残渣ともに負に帯電するため、静電気力で反発しあい、発酵残渣に吸着していた糖化酵素が遊離するためであると推察された。また、６０℃以上の高温では糖化酵素の熱変性による失活及び発酵残渣への吸着が促進されたため、糖化反応に用いられる糖化酵素量が少なくグルコース生成率が低くなったと推察された。
【００７４】
（５）循環工程
次いで、実施例１の（５）と同様の方法を用いて、（１）糖化工程、及び（２）発酵工程を行った。
なお、２回目の糖化工程の開始前後の糖化液についても、ＨＰＬＣ（島津製作所製、検出器：ＦＬＤ、カラムオーブン：ＣＴＯ−２０Ａ）を用いて、糖化前の基質溶液の糖組成と、糖化液に含まれるＣ５糖及びＣ６糖の量とを測定した。Ｃ５糖及びＣ６糖の量を下記表１に示す。また、原料であるサトウキビバガスの組成及び糖化液に含まれる単糖（Ｃ５糖（キシロース）及びＣ６糖（グルコース））量との関係から、Ｃ５糖及びＣ６糖の酵素糖化率を算出した。結果を図５に示す。
【００７５】
（６）エタノール生産量の測定
次いで、ＨＰＬＣ（島津製作所製、検出器：ＲＩＤ−１０Ａ、カラムオーブン：ＣＴＯ−２０Ａ）を用いて、エタノールを測定し、サトウキビバガス乾燥重量１ｔあたりのエタノール収量（Ｌ）を算出した。結果を図５に示す。
図５において、「ｐＨｎｏｎ」とはｐＨ調整をしていないサンプルを意味する。また、図５において、点線で示され、「循環なし」と記載されたＣ５糖化率、Ｃ６糖化率、及びエタノール収量は、１回目の糖化工程において得られた糖化液、及び１回目の発酵工程において得られた発酵液から算出したＣ５糖化率、Ｃ６糖化率、及びサトウキビバガス乾燥重量１ｔあたりのエタノール収量（Ｌ）を意味する。
【００７６】
【表１】
2018064515.tif 000002
【００７７】
図５から、いずれの条件のサンプルにおいても、撹拌工程及び循環工程を行わなかったサンプル（循環なし）よりも、撹拌工程及び循環工程を行ったサンプルの方が、エタノール収量が多かった。
また、図５及び表１から、発酵残渣溶液のｐＨが７．０であって、５０℃の条件で撹拌工程を行ったサンプルにおいて、発酵残渣の再糖化による効果（糖化率及びエタノール収量）が最も高くなることが明らかとなった。
【００７８】
以上のことから、発酵残渣溶液のｐＨが６．０以上７．０以下であって、５０℃以下の条件で撹拌工程を行うことにより、高収率でエタノールを製造できることが確かめられた。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明によれば、セルロース及びヘミセルロースを効率的に糖化でき、高収率なリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造方法及び製造装置を提供することができる。
【符号の説明】
【００８０】
１０、２０…リグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造装置、１１…糖化装置、１２…発酵槽、１３…固液分離装置、１４…撹拌槽、１５，１６，１７ａ，１７ｂ、１８，２４ａ，２４ｂ…配管、２１…制御装置、２２…貯水槽、２３ａ，２３ｂ，２３ｃ…ポンプ。
【図１】
2018064515.tif 000003
【図２】
2018064515.tif 000004
【図３】
2018064515.tif 000005
【図４】
2018064515.tif 000006
【図５】
2018064515.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】平成28年12月22日(2016.12.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
前処理済みリグノセルロース系バイオマス及び糖化酵素を用いて、糖化反応を行う糖化工程と、
前記糖化工程において得られた糖化液及び前記糖化酵素が吸着した糖化残渣と微生物とを添加し、撹拌しながら発酵を行う発酵工程と、
前記発酵工程の後に、発酵液と前記糖化酵素が吸着した発酵残渣とに固液分離する固液分離工程と、
前記固液分離工程で得られた前記糖化酵素が吸着した発酵残渣に水を添加し、前記糖化酵素が糖化反応可能な温度に保ちながら撹拌する撹拌工程と、
前記撹拌工程で生成された発酵残渣溶液を、前記糖化工程に循環させる循環工程と、を備えることを特徴とするリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造方法。
【請求項２】
前記撹拌工程において、アルカリを添加し、前記発酵残渣溶液のｐＨが５以上７以下となるように調節する請求項１に記載のリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造方法。
【請求項３】
前記糖化反応可能な温度が２５℃以上６０℃以下である請求項１又は２に記載のリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造方法。
【請求項４】
前記循環工程において、前記前処理済みリグノセルロース系バイオマスと前記糖化酵素とによる糖化反応開始前に、前記発酵残渣溶液を添加し、前記前処理済みリグノセルロース系バイオマスと前記糖化酵素と混合する請求項１〜３のいずれか一項に記載のリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造方法。
【請求項５】
前記撹拌工程において、前記発酵残渣溶液の固形分濃度が５％以上１５％以下である請求項１〜４のいずれか一項に記載のリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造方法。
【請求項６】
前記撹拌工程において、使用する水は、リグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造に必要とされる全水量からの分配水である請求項１〜５のいずれか一項に記載のリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造方法。
【請求項７】
前処理済みリグノセルロース系バイオマスと発酵残渣溶液と糖化酵素とを含む糖化装置と、
前記糖化装置で生成された糖化液及び前記糖化酵素が吸着した糖化残渣と微生物とを含む発酵槽と、
前記発酵槽で生成された発酵液と前記糖化酵素が吸着した発酵残渣とを分離するための固液分離装置と、
前記固液分離装置で分離された前記糖化酵素が吸着した発酵残渣と水とを含む撹拌槽と、
前記撹拌槽で生成された前記発酵残渣溶液を前記糖化装置へ送液するための配管と、
を備えることを特徴とするリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造装置。
【請求項８】
さらに、前記撹拌槽は前記撹拌槽内の前記発酵残渣溶液のｐＨを測定するためのｐＨ測定器と、
前記発酵残渣溶液のｐＨが５以上７以下となるようにアルカリ供給量を調整するためのアルカリ供給装置と、を備える請求項７に記載のリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造装置。
【請求項９】
さらに、前記撹拌槽は温度調整装置を備え、前記撹拌槽に含まれる前記発酵残渣溶液の温度が２５℃以上６０℃以下である請求項７又は８に記載のリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造装置。
【請求項１０】
さらに、前記撹拌槽は前記撹拌槽内の前記発酵残渣溶液の固形分濃度が５％以上１５％以下となるように糖化装置及び撹拌槽に送液される水の量、並びに糖化装置に送液される発酵残渣溶液の量を制御するための制御装置を備える請求項７〜９のいずれか一項に記載のリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造装置。
【請求項１１】
さらに、前記撹拌槽の後に、糖化装置に送液されなかった前記発酵残渣溶液に含まれる残渣を分離し排出するための固液分離装置と、
前記固形分離装置により分離された溶液を糖化装置に送液するための配管と、
を備える請求項７〜１０のいずれか一項に記載のリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造装置。
【請求項１２】
さらに、リグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造に必要とされる全水量から前記糖化装置及び前記撹拌槽において使用する水量を調節し、分配する水量調節装置を備える請求項７〜１１のいずれか一項に記載のリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造装置。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
［１］前処理済みリグノセルロース系バイオマス及び糖化酵素を用いて、糖化反応を行う糖化工程と、前記糖化工程において得られた糖化液及び前記糖化酵素が吸着した糖化残渣と微生物とを添加し、撹拌しながら発酵を行う発酵工程と、前記発酵工程の後に、発酵液と前記糖化酵素が吸着した発酵残渣とに固液分離する固液分離工程と、前記固液分離工程で得られた前記糖化酵素が吸着した発酵残渣に水を添加し、前記糖化酵素が糖化反応可能な温度に保ちながら撹拌する撹拌工程と、前記撹拌工程で生成された発酵残渣溶液を、前記糖化工程に循環させる循環工程と、を備えることを特徴とするリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造方法。
［２］前記撹拌工程において、アルカリを添加し、前記発酵残渣溶液のｐＨが５以上７以下となるように調節する［１］に記載のリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造方法。
［３］前記糖化反応可能な温度が２５℃以上６０℃以下である［１］又は［２］に記載のリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造方法。
［４］前記循環工程において、前記前処理済みリグノセルロース系バイオマスと前記糖化酵素とによる糖化反応開始前に、前記発酵残渣溶液を添加し、前記前処理済みリグノセルロース系バイオマスと前記糖化酵素と混合する［１］〜［３］のいずれか一つに記載のリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造方法。
［５］前記撹拌工程において、前記発酵残渣溶液の固形分濃度が５％以上１５％以下である［１］〜［４］のいずれか一つに記載のリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造方法。
［６］前記撹拌工程において、使用する水は、リグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造に必要とされる全水量からの分配水である［１］〜［５］のいずれか一つに記載のリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
［７］前処理済みリグノセルロース系バイオマスと発酵残渣溶液と糖化酵素とを含む糖化装置と、前記糖化装置で生成された糖化液及び前記糖化酵素が吸着した糖化残渣と微生物とを含む発酵槽と、前記発酵槽で生成された発酵液と前記糖化酵素が吸着した発酵残渣とを分離するための固液分離装置と、前記固液分離装置で分離された前記糖化酵素が吸着した発酵残渣と水とを含む撹拌槽と、前記撹拌槽で生成された前記発酵残渣溶液を前記糖化装置へ送液するための配管と、を備えることを特徴とするリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造装置。
［８］さらに、前記撹拌槽は前記撹拌槽内の前記発酵残渣溶液のｐＨを測定するためのｐＨ測定器と、前記発酵残渣溶液のｐＨが５以上７以下となるようにアルカリ供給量を調整するためのアルカリ供給装置と、を備える［７］に記載のリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造装置。
［９］さらに、前記撹拌槽は温度調整装置を備え、前記撹拌槽に含まれる前記発酵残渣溶液の温度が２５℃以上６０℃以下である［７］又は［８］に記載のリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造装置。
［１０］さらに、前記撹拌槽は前記撹拌槽内の前記発酵残渣溶液の固形分濃度が５％以上１５％以下となるように糖化装置及び撹拌槽に送液される水の量、並びに糖化装置に送液される発酵残渣溶液の量を制御するための制御装置を備える［７］〜［９］のいずれか一つに記載のリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造装置。
［１１］さらに、前記撹拌槽の後に、糖化装置に送液されなかった前記発酵残渣溶液に含まれる残渣を分離し排出するための固液分離装置と、前記固形分離装置により分離された溶液を糖化装置に送液するための配管と、を備える［７］〜［１０］のいずれか一つに記載のリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造装置。
［１２］さらに、リグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造に必要とされる全水量から前記糖化装置及び前記撹拌槽において使用する水量を調節し、分配する水量調節装置を備える［７］〜［１１］のいずれか一つに記載のリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造装置。