(57)【要約】      （修正有）【課題】病理学的に規定可能な単離循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）の提供。【解決手段】癌様核又は細胞分裂中の核、線維状パターンを有するサイトケラチン８、１８及び１９のうちの１つ又は複数の発現、及び（ｃ）ＣＤ４５陰性表現型を有する単離循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）。さらに、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）を発現する、ＣＴＣ。前立腺癌ＣＴＣ、乳癌ＣＴＣ、膵臓癌ＣＴＣ、肺癌ＣＴＣ又は大腸癌ＣＴＣである、ＣＴＣ。ステージＩ、ステージＩＩ、ステージＩＩＩ又はステージＩＶの癌を有する患者から単離された、ＣＴＣ。【選択図】図１０
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌に関して対象をスクリーニングする方法であって、対象由来の生物学的試料中で循環癌関連マクロファージ様細胞（ＣＡＭＬ）を検出するステップを含む方法。
【請求項２】
ＣＡＭＬが前記生物学的試料中で検出される場合、前記対象が、癌腫又は固形腫瘍を潜在的に有すると特定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＣＡＭＬが前記生物学的試料中で検出される場合、前記対象が、癌腫又は固形腫瘍を有すると特定される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記生物学的試料中で循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を検出するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
対象において癌を診断する方法であって、対象由来の生物学的試料中でＣＡＭＬを検出するステップを含み、ＣＡＭＬが前記生物学的試料中で検出される場合、前記対象が癌であると診断される方法。
【請求項６】
前記生物学的試料中でＣＴＣを検出するステップをさらに含み、ＣＡＭＬ及びＣＴＣが前記生物学的試料中で検出される場合、前記対象が癌であると診断される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
対象において癌の再発を検出する方法であって、癌に関してすでに治療した対象由来の生物学的試料中でＣＡＭＬを検出するステップを含み、ＣＡＭＬが前記生物学的試料中で検出される場合、癌の再発が検出される方法。
【請求項８】
前記生物学的試料中でＣＴＣを検出するステップをさらに含み、ＣＡＭＬ及びＣＴＣが前記生物学的試料中で検出される場合、癌の再発が検出される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
対象において癌の診断を確認する方法であって、癌であると診断された対象由来の生物学的試料中でＣＡＭＬを検出するステップを含み、ＣＡＭＬが前記生物学的試料中で検出される場合、癌の診断が前記対象において確認される方法。
【請求項１０】
前記生物学的試料中でＣＴＣを検出するステップをさらに含み、ＣＡＭＬ及びＣＴＣが前記生物学的試料中で検出される場合、癌の診断が前記対象において確認される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
初期の癌診断が、マンモグラフィー、ＰＳＡ試験又はＣＡ１２５の存在によるものであった、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記対象が、癌を有する疑いがある対象である、請求項１又は５に記載の方法。
【請求項１３】
ＣＡＭＬが、サイズ排除方法、赤血球溶解、ＦＩＣＯＬＬ、マイクロ流体チップ、及びフローサイトメトリー、又はそれらの組合せからなる群から選択される１つ又は複数の手段を使用して検出される、請求項１、５、７又は９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記サイズ排除方法が、約７〜８ミクロンの孔サイズを有するマイクロフィルターの使用を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記マイクロフィルターが、精密孔配置及び均一な孔分布を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ＣＡＭＬ及びＣＴＣが、約７〜８ミクロンの孔サイズを有するマイクロフィルターを使用して同時に検出される、請求項４、６、８又は１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記マイクロフィルターが、精密孔配置及び均一な孔分布を有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＣＡＭＬが、物理的サイズベースの選別、流体力学的サイズベースの選別、グループ分け、捕捉、免疫捕獲、大細胞の濃縮、又はサイズに基づく小細胞の排除に基づいて、マイクロ流体チップを使用して検出される、請求項１、５、７又は９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
ＣＡＭＬが、セルシーブ（商標）低圧精密濾過アッセイを使用して検出される、請求項１、５、７又は９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記生物学的試料が、末梢血、血液、リンパ節、骨髄、脳脊髄液、組織及び尿からなる群から選択される１つ又は複数である、請求項１、５、７又は９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記生物学的試料が末梢血である、請求項１、５、７又は９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記癌が固形腫瘍である、請求項１、５、７又は９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記癌が、ステージＩ、ステージＩＩ、ステージＩＩＩ又はステージＩＶの癌である、請求項１、５、７又は９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記癌が上皮細胞癌である、請求項１、５、７又は９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記癌が、乳癌、前立腺癌、肺癌、膵臓癌又は大腸癌である、請求項１、５、７又は９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
癌治療の効力をモニタリングする方法であって、（ａ）癌治療前に、対象由来の生物学的試料中でＣＡＭＬの数を決定するステップと、（ｂ）（ａ）で決定したＣＡＭＬの前記数を、治療後の１つ又は複数の時点で同じ対象由来の類似する生物学的試料から決定したＣＡＭＬの数と比較するステップとを含む方法。
【請求項２７】
ＣＡＭＬの前記数における変化が、治療効力の指標である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記変化が増加である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記変化が減少である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記癌治療が、化学療法又は放射線療法である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
（ｃ）（ａ）の前記生物学的試料中でＣＴＣの数を決定するステップと、（ｄ）（ｃ）で決定したＣＴＣの前記数を（ｂ）の前記生物学的試料から決定したＣＴＣの数と比較するステップとをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
ＣＡＭＬの前記数が、サイズ排除方法、赤血球溶解、ＦＩＣＯＬＬ、マイクロ流体チップ、及びフローサイトメトリー、又はそれらの組合せからなる群から選択される１つ又は複数の手段を使用して決定される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３３】
前記サイズ排除方法が、約７〜８ミクロンの孔サイズを有するマイクロフィルターの使用を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記マイクロフィルターが、精密孔配置及び均一な孔分布を有する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ＣＡＭＬ及びＣＴＣの前記数が、約７〜８ミクロンの孔サイズを有するマイクロフィルターを使用して同時に決定される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
前記マイクロフィルターが、精密孔配置及び均一な孔分布を有する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
ＣＡＭＬの前記数が、物理的サイズベースの選別、流体力学的サイズベースの選別、グループ分け、捕捉、免疫捕獲、大細胞の濃縮、又はサイズに基づく小細胞の排除に基づいて、マイクロ流体チップを使用して決定される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３８】
ＣＡＭＬの前記数が、セルシーブ（商標）低圧精密濾過アッセイを使用して決定される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３９】
前記生物学的試料が、末梢血、血液、リンパ節、骨髄、脳脊髄液、組織及び尿からなる群から選択される１つ又は複数である、請求項２６に記載の方法。
【請求項４０】
前記生物学的試料が末梢血である、請求項２６に記載の方法。
【請求項４１】
前記癌が固形腫瘍である、請求項２６に記載の方法。
【請求項４２】
前記癌が、ステージＩ、ステージＩＩ、ステージＩＩＩ又はステージＩＶの癌である、請求項２６に記載の方法。
【請求項４３】
前記癌が上皮細胞癌である、請求項２６に記載の方法。
【請求項４４】
前記癌が、乳癌、前立腺癌、肺癌、膵臓癌又は大腸癌である、請求項２６に記載の方法。
【請求項４５】
以下の特徴：
（ａ）約１４〜６４μｍのサイズを有する大異型核、
（ｂ）拡散し、又は空胞及び／若しくは摂取材料に付随するサイトケラチン８、１８及び１９のうちの１つ又は複数の発現、
（ｃ）約２０ミクロン〜約３００ミクロンの範囲の細胞サイズ、
（ｄ）紡錘形、オタマジャクシ形、円形、楕円形及び無定形からなる群から選択される形態学的形状、及び
（ｅ）ＣＤ４５陽性表現型
を有する単離循環癌関連マクロファージ様細胞（ＣＡＭＬ）。
【請求項４６】
以下のさらなる特徴：
（ｆ）ほぼ均一な分布を有する拡散性ＥｐＣＡＭの発現、
（ｇ）原発性腫瘍の１つ又は複数のマーカーの発現、
（ｈ）単球ＣＤ１１Ｃ及びＣＤ１４マーカーの発現、及び
（ｉ）内皮ＣＤ１４６、ＣＤ２０２ｂ及びＣＤ３１マーカーの発現
のうちの１つ又は複数を有する、請求項４５に記載の単離細胞。
【請求項４７】
前記さらなる特徴のそれぞれを有する、請求項４６に記載の単離細胞。
【請求項４８】
以下の特徴：
（ａ）癌様核、
（ｂ）線維状パターンを有するサイトケラチン８、１８及び１９のうちの１つ又は複数の発現、及び
（ｃ）ＣＤ４５陰性表現型
のうちの１つ又は複数を有する病理学的に規定可能な単離循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）。
【請求項４９】
以下の特徴：
（ａ）癌様核、
（ｂ）スポットの形態で断片化されているサイトケラチン８、１８及び１９のうちの１つ又は複数の発現、及び
（ｃ）ＣＤ４５陰性表現型
のうちの１つ又は複数を有する単離アポトーシス循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
［０００１］本出願は、２０１２年６月１日に出願された米国特許仮出願第６１／６５４，６３６号、２０１３年３月５日に出願された米国特許仮出願第６１／７７３０２６号、及び２０１３年３月１５日に出願された米国特許仮出願第６１／７８７８６３号の利益を主張するものであり、これらのそれぞれの内容は、その全体が参照により本明細書に援用される。
【０００２】
［背景］
［発明の分野］
［０００２］本発明は、一般的には、固形腫瘍の検出、並びに化学療法及び放射線療法の治療の効力のモニタリングに使用することができる、血液及び他の体液中のバイオマーカーの特定に関する。本発明はまた、循環腫瘍細胞、遊離血漿及び血清ＤＮＡ癌マーカー、癌関連タンパク質マーカー及び他のバイオマーカーと組み合わせたバイオマーカーの使用に関する。
【０００３】
［関連技術］
［０００３］腫瘍細胞が原発性固形腫瘍から離脱すると、腫瘍細胞は、血液又はリンパ管循環へと浸透して、最終的には血流を離れて、他の臓器又は組織に入り、転移を形成する。癌関連死の９０％が、転移プロセスにより引き起こされる。最も一般的な転移部位は、肺、肝臓、骨及び脳である。循環中に見出される腫瘍細胞は、循環腫瘍細胞（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ，  ＣＴＣ）と呼ばれる。多くの研究出版物及び臨床試験により、ＣＴＣは（ｉ）血流中の細胞の数を計数することにより予後生存及び癌再発情報を提供することによって、及び（ｉｉ）ＣＴＣにおけるタンパク質発現、遺伝子突然変異及び転座を調べることにより治療情報を提供することによって、臨床的有用性を有することが示されている。しかしながら、ステージＩＶの患者でさえ、ＣＴＣを一貫して見出すことはできない。
【０００４】
［０００４］幾つかの病状は、体液中でのある特定のタイプの細胞の存在を検出することにより診断され得る。特に、ある特定の病状の兆候となる、又はある特定の病状に特徴的な細胞は、ある特定の体液中で見出される他の細胞よりも大きい、及び／又は柔軟性が低い場合がある。したがって、体液の液体サンプルから、かかるより大きい、及び／又はより柔軟性が低い細胞を収集することにより、収集された細胞に基づいて病状を診断することが可能であり得る。
【０００５】
［概要］
［０００５］本発明は、癌患者の血液中で見出される特殊な特徴を有する細胞の型に関し、それを開示する。「循環癌関連マクロファージ様細胞」（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−Ｌｉｋｅ  ｃｅｌｌ，  ＣＡＭＬ）と称される細胞型が本明細書中に記載されており、患者における固形腫瘍の存在と関連付けられると示されている。この細胞型は、本明細書中に提示されるデータにより、それが様々な医学的用途のためのバイオマーカーとして使用することができるという点で臨床的有用性を有すると示されている。この細胞型は、精密マイクロフィルターを使用した精密濾過により上皮性起源のステージＩ〜ステージＩＶの癌の末梢血中で一貫して見出されている。
【０００６】
［０００６］ＣＡＭＬは、癌の診断、特に癌の早期検出、癌再発の早期検出及び癌突然変異の決定を提供するためのバイオマーカーとして使用することができる。ＣＡＭＬはまた、適切な療法コースを決定する際にバイオマーカーとして使用することができ、特に細胞は、化学療法及び放射線療法の治療応答の有効性の迅速な決定で使用され得る。
【０００７】
［０００７］ＣＡＭＬＳは、癌マーカーとして独立して使用されてもよく、ＣＡＭＬＳは、患者の疾患のより完全な理解を提供するために、体液中でＣＴＣ、遊離ＤＮＡ、タンパク質及び他のバイオマーカーと一緒に使用することができる。
【０００８】
［０００８］より詳細には、第１の実施形態では、本発明は、癌に関して対象をスクリーニングする方法であって、対象由来の生物学的試料中で循環癌関連マクロファージ様細胞（ＣＡＭＬ）を検出するステップを含む方法に関する。特定の態様では、ＣＡＭＬが生物学的試料中で検出される場合、対象が、癌腫又は固形腫瘍を潜在的に有すると特定される。他の態様では、ＣＡＭＬが生物学的試料中で検出される場合、対象が、癌腫又は固形腫瘍を有すると特定される。ある特定の態様では、この実施形態により包含される方法はまた、生物学的試料中で循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を検出するステップも含む。この第１の実施形態の特定の態様では、対象は、癌を有する疑いがある対象である。
【０００９】
［０００９］第２の実施形態では、本発明は、対象において癌を診断する方法であって、対象由来の生物学的試料中でＣＡＭＬを検出するステップを含み、ＣＡＭＬが生物学的試料中で検出される場合、対象が癌であると診断される方法に関する。ある特定の態様では、この実施形態に包含される方法はまた、生物学的試料中でＣＴＣを検出するステップも含み、ここでＣＡＭＬ及びＣＴＣが生物学的試料中で検出される場合、対象が癌であると診断される。
【００１０】
［００１０］第３の実施形態では、本発明は、対象において癌の再発を検出する方法であって、癌に関して以前に治療した対象由来の生物学的試料中でＣＡＭＬを検出するステップを含み、ＣＡＭＬが生物学的試料中で検出される場合、癌の再発が検出される方法に関する。ある特定の態様では、この実施形態により包含される方法はまた、生物学的試料中でＣＴＣを検出するステップも含み、ここでＣＡＭＬ及びＣＴＣが生物学的試料中で検出される場合、癌の再発が検出される。
【００１１】
［００１１］第４の実施形態では、本発明は、対象において癌の診断を確認する方法であって、癌であると診断された対象由来の生物学的試料中でＣＡＭＬを検出するステップを含み、ＣＡＭＬが生物学的試料中で検出される場合、癌の診断が対象において確認される方法に関する。ある特定の態様では、この実施形態により包含される方法はまた、生物学的試料中でＣＴＣを検出するステップも含み、ここでＣＡＭＬ及びＣＴＣが生物学的試料中で検出される場合、癌の診断が対象において確認される。特定の態様では、初期の癌診断が、マンモグラフィー、ＰＳＡ試験又はＣＡ１２５の存在によるものである。特定の態様では、対象が、癌を有する疑いがある。
【００１２】
［００１２］第１〜第４の実施形態の態様では、ＣＡＭＬが、サイズ排除方法、赤血球溶解、ＦＩＣＯＬＬ、マイクロ流体チップ、及びフローサイトメトリー、又はそれらの組合せからなる群から選択される１つ又は複数の手段を使用して検出される。特定の態様では、サイズ排除方法が、マイクロフィルターの使用を含む。適切なマイクロフィルターは、様々な孔サイズ及び形状を有することができる。サイズが約７〜８ミクロンの孔を有するマイクロフィルターが許容可能であり、円形及び長方形の孔形状を包含する。高分子マイクロフィルターが使用される場合、サイズが約７〜８ミクロンの円形の孔を有するマイクロフィルターが特に最適である。好ましい態様では、マイクロフィルターが、精密孔配置及び均一な孔分布を有する。
【００１３】
［００１３］第１〜第４の実施形態のある特定の態様では、ＣＡＭＬ及びＣＴＣが、マイクロフィルターを使用して同時に検出される。適切なマイクロフィルターは、様々な孔サイズ及び形状を有することができる。サイズが約７〜８ミクロンの孔を有するマイクロフィルターが許容可能であり、円形及び長方形の孔形状を包含する。高分子マイクロフィルターが使用される場合、サイズが約７〜８ミクロンの円形の孔を有するマイクロフィルターが特に最適である。好ましい態様では、マイクロフィルターが、精密孔配置及び均一な孔分布を有する。
【００１４】
［００１４］第１〜第４の実施形態のある特定の態様では、ＣＡＭＬが、物理的サイズベースの選別、流体力学的サイズベースの選別、グループ分け、捕捉、免疫捕獲、大細胞の濃縮、又はサイズに基づく小細胞の排除に基づいてマイクロ流体チップを使用して検出される。
【００１５】
［００１５］第１〜第４の実施形態でのある特定の態様では、ＣＡＭＬが、セルシーブ（ＣｅｌｌＳｉｅｖｅ）（商標）低圧精密濾過アッセイを使用して検出される。
【００１６】
［００１６］第１〜第４の実施形態の態様では、生物学的試料が、末梢血、血液、リンパ節、骨髄、脳脊髄液、組織及び尿からなる群から選択される１つ又は複数である。好ましい態様では、生物学的試料が末梢血である。他の態様では、血液は、肘正中静脈血液、下大静脈血液又は頸静脈血液である。
【００１７】
［００１７］第１〜第４の実施形態の態様では、癌が、固形腫瘍、ステージＩの癌、ステージＩＩの癌、ステージＩＩＩの癌、ステージＩＶの癌、上皮細胞癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、膵臓癌及び大腸癌のうちの１つ又は複数である。
【００１８】
［００１８］第５の実施形態では、本発明は、癌治療の効力をモニタリングする方法であって、（ａ）癌治療前に、対象由来の生物学的試料中でＣＡＭＬの数を決定するステップと、（ｂ）（ａ）で決定したＣＡＭＬの数を、治療後の１つ又は複数の時点で同じ対象由来の類似した生物学的試料から決定したＣＡＭＬの数と比較するステップとを含む方法に関する。ある特定の態様では、その方法は、（ｃ）（ａ）の生物学的試料中のＣＴＣの数を決定するステップと、（ｄ）（ｃ）で決定したＣＴＣの数を、（ｂ）の生物学的試料から決定したＣＴＣの数と比較するステップとをさらに含む。
【００１９】
［００１９］第５の実施形態の態様では、ＣＡＭＬの数における変化が、治療効力の指標であり、ここで変化は、ＣＡＭＬの数における増加又は減少である。
【００２０】
［００２０］第５の実施形態の態様では、癌治療が、化学療法又は放射線療法である。
【００２１】
［００２１］第５の実施形態の態様では、ＣＡＭＬの数が、サイズ排除方法、赤血球溶解、ＦＩＣＯＬＬ、マイクロ流体チップ、及びフローサイトメトリー、又はそれらの組合せからなる群から選択される１つ又は複数の手段を使用して決定される。特定の態様では、サイズ排除方法が、マイクロフィルターの使用を含む。適切なマイクロフィルターは、様々な孔サイズ及び形状を有することができる。サイズが約７〜８ミクロンの孔を有するマイクロフィルターが許容可能であり、円形及び長方形の孔形状を包含する。高分子マイクロフィルターが使用される場合、サイズが約７〜８ミクロンの円形の孔を有するマイクロフィルターが特に最適である。好ましい態様では、マイクロフィルターが、精密孔配置及び均一な孔分布を有する。特定の態様では、ＣＡＭＬの数が、物理的サイズベースの選別、流体力学的サイズベースの選別、グループ分け、捕捉、免疫捕獲、大細胞の濃縮、又はサイズに基づく小細胞の排除に基づいてマイクロ流体チップを使用して決定される。特定の態様では、ＣＡＭＬの数が、セルシーブ（商標）低圧精密濾過アッセイを使用して決定される。
【００２２】
［００２２］第５の実施形態のある特定の態様では、ＣＡＭＬ及びＣＴＣの数が、マイクロフィルターを使用して同時に決定される。適切なマイクロフィルターは、様々な孔サイズ及び形状を有することができる。サイズが約７〜８ミクロンの孔を有するマイクロフィルターが許容可能であり、円形及び長方形の孔形状を包含する。高分子マイクロフィルターが使用される場合、サイズが約７〜８ミクロンの円形の孔を有するマイクロフィルターが特に最適である。好ましい態様では、マイクロフィルターが、精密孔配置及び均一な孔分布を有する。
【００２３】
［００２３］第５の実施形態の態様では、生物学的試料が、末梢血、血液、リンパ節、骨髄、脳脊髄液、組織及び尿からなる群から選択される１つ又は複数である。好ましい態様では、生物学的試料が末梢血である。他の態様では、血液は、肘正中静脈血液、下大静脈血液又は頸静脈血液である。
【００２４】
［００２４］第５の実施形態の態様では、癌が、固形腫瘍、ステージＩの癌、ステージＩＩの癌、ステージＩＩＩの癌、ステージＩＶの癌、上皮細胞癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、膵臓癌又は大腸癌のうちの１つ又は複数である。
【００２５】
［００２５］第６の実施形態では、本発明は、以下の特徴：（ａ）約１４〜６４μｍのサイズを有する大異型核、（ｂ）拡散し、又は空胞及び／又は摂取材料に付随するサイトケラチン８、１８及び１９のうちの１つ又は複数の発現、（ｃ）約２０ミクロン〜約３００ミクロンの範囲の細胞サイズ、（ｄ）紡錘形、オタマジャクシ形、円形、楕円形（ｏｂｌｏｎｇ）及び無定形からなる群から選択される形態学的形状、及び（ｅ）ＣＤ４５陽性表現型を有する単離循環癌関連マクロファージ様細胞（ＣＡＭＬ）に関する。この実施形態の１つの態様では、細胞が、以下のさらなる特徴：（ｆ）ほぼ均一な分布を有する拡散性ＥｐＣＡＭの発現、（ｇ）原発性腫瘍の１つ又は複数のマーカーの発現、（ｈ）単球ＣＤ１１Ｃ及びＣＤ１４マーカーの発現、及び（ｉ）内皮ＣＤ１４６、ＣＤ２０２ｂ及びＣＤ３１マーカーの発現のうちの１つ又は複数を有する。特定の態様では、細胞は、さらなる特徴（ｆ）〜（ｉ）のそれぞれを有する。
【００２６】
［００２６］第７の実施形態では、本発明は、以下の特徴：（ａ）癌様核、（ｂ）線維状パターンを有するサイトケラチン８、１８及び１９のうちの１つ又は複数の発現、及び（ｃ）ＣＤ４５陰性表現型のうちの１つ又は複数を有する病理学的に規定可能な単離循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）に関する。
【００２７】
［００２７］第８の実施形態では、本発明は、以下の特徴：（ａ）癌様核、（ｂ）スポットの形態で断片化されているサイトケラチン８、１８及び１９のうちの１つ又は複数の発現、及び（ｃ）ＣＤ４５陰性表現型のうちの１つ又は複数を有する単離アポトーシス循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）に関する。
【００２８】
［００２８］本発明及びその付随する利点の多くのより完全な理解は、添付の図面に関連して考察すると、以下の詳細な説明に対する参照により良好に理解されるため容易に得られる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１Ａ〜１Ｄは、癌患者の血液中に見出される循環腫瘍細胞を示す図である。合成したカラー画像は、ＤＡＰＩ（青色）、ＣＫ８、１８及び１９（緑色）、ＥｐＣＡＭ（赤色）及びＣＤ４５（紫色）により作成される。
【図２】図２Ａ〜２Ｄは、癌患者の血液中に見出されるアポトーシス循環腫瘍細胞を示す図である。合成したカラー画像は、ＤＡＰＩ（青色）、ＣＫ８、１８及び１９（緑色）、ＥｐＣＡＭ（赤色）及びＣＤ４５（紫色）により作成される。
【図３】図３は、癌患者の血液中に見出される循環癌関連マクロファージ様細胞（ＣＡＭＬ）を示す図である。この合成したカラー画像は、ＤＡＰＩ（青色）、ＣＫ８、１８及び１９（緑色）、ＥｐＣＡＭ（赤色）及びＣＤ４５（紫色）により作成される。
【図４】図４は、癌患者の血液中に見出される循環癌関連マクロファージ様細胞を示す図である。この合成したカラー画像は、ＤＡＰＩ（青色）、ＣＫ８、１８及び１９（緑色）、ＥｐＣＡＭ（赤色）及びＣＤ４５（紫色）により作成される。
【図５】図５は、癌患者の血液中に見出される循環癌関連マクロファージ様細胞を示す図である。この合成したカラー画像は、ＤＡＰＩ（青色）、ＣＫ８、１８及び１９（緑色）、ＥｐＣＡＭ（赤色）及びＣＤ４５（紫色）により作成される。
【図６】図６は、癌患者の血液中に見出される循環癌関連マクロファージ様細胞を示す図である。この合成したカラー画像は、ＤＡＰＩ（青色）、ＣＫ８、１８及び１９（緑色）、ＥｐＣＡＭ（赤色）及びＣＤ４５（紫色）により作成される。
【図７】図７Ａ〜７Ｉは、癌患者の血液中に見出される循環癌関連マクロファージ様細胞の集まりを示す図である。合成したカラー画像は、ＤＡＰＩ（青色）、ＣＫ８、１８及び１９（緑色）、ＥｐＣＡＭ（赤色）及びＣＤ４５（紫色）により作成される。
【図８−１】図８Ａ〜８Ｉは、別個のＣＫ８、１８、１９、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ４５の発現、並びに核、及び図７における細胞それぞれの合成したカラー画像である。図８Ｂ、図８Ｃ及び図８Ｄは、乳癌患者由来である。図８Ａ、図８Ｆ及び図８Ｇは、膵臓癌患者由来である。図８Ｅ、図８Ｈ及び図８Ｉは、前立腺癌患者由来である。合成したカラー画像は、ＤＡＰＩ（青色）、ＣＫ８、１８及び１９（緑色）、ＥｐＣＡＭ（赤色）及びＣＤ４５（紫色）により作成される。
【図８−２】図８Ａ〜８Ｉは、別個のＣＫ８、１８、１９、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ４５の発現、並びに核、及び図７における細胞それぞれの合成したカラー画像である。図８Ｂ、図８Ｃ及び図８Ｄは、乳癌患者由来である。図８Ａ、図８Ｆ及び図８Ｇは、膵臓癌患者由来である。図８Ｅ、図８Ｈ及び図８Ｉは、前立腺癌患者由来である。合成したカラー画像は、ＤＡＰＩ（青色）、ＣＫ８、１８及び１９（緑色）、ＥｐＣＡＭ（赤色）及びＣＤ４５（紫色）により作成される。
【図８−３】図８Ａ〜８Ｉは、別個のＣＫ８、１８、１９、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ４５の発現、並びに核、及び図７における細胞それぞれの合成したカラー画像である。図８Ｂ、図８Ｃ及び図８Ｄは、乳癌患者由来である。図８Ａ、図８Ｆ及び図８Ｇは、膵臓癌患者由来である。図８Ｅ、図８Ｈ及び図８Ｉは、前立腺癌患者由来である。合成したカラー画像は、ＤＡＰＩ（青色）、ＣＫ８、１８及び１９（緑色）、ＥｐＣＡＭ（赤色）及びＣＤ４５（紫色）により作成される。
【図９】図９は、白血球（ＷＢＣ）、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）及び循環癌関連マクロファージ様細胞（ＣＡＭＬ）の細胞質径のウィスカープロットである。
【図１０】図１０は、セルサーチ（ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ）（登録商標）により捕獲された循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）並びにセルシーブ（商標）精密濾過により単離された病理学的に規定可能なＣＴＣ及びセルシーブ（商標）精密濾過により同時に単離された循環癌関連マクロファージ様細胞（ＣＡＭＬ）の存在の比較を示す図である。
【図１１】図１１は、異なるステージの癌における乳癌、前立腺癌及び膵臓癌患者の循環中に見出される循環癌関連マクロファージ様細胞（ＣＡＭＬ）の数のプロットである。
【図１２】図１２は、前立腺癌患者試料中に見出されるＣＡＭＬ及びＣＴＣの数のプロットである。
【図１３】図１３は、膵臓癌患者試料中に見出されるＣＡＭＬ及びＣＴＣの数のプロットである。
【図１４】図１４は、乳癌患者試料中に見出されるＣＡＭＬ及びＣＴＣの数のプロットである。
【図１５】図１５は、異なるステージの癌における乳癌、前立腺癌、膵臓癌及び肺癌患者の循環中に見出される循環癌関連マクロファージ様細胞（ＣＡＭＬ）の数のプロットである。
【図１６】図１６Ａ及び１６Ｂは、それぞれ、前立腺癌患者試料中に見出されるＣＡＭＬ及びＣＴＣの数のプロットである。
【図１７】図１７Ａ及び１７Ｂは、それぞれ、膵臓癌患者試料中に見出されるＣＡＭＬ及びＣＴＣの数のプロットである。
【図１８】図１８Ａ及び１８Ｂは、それぞれ、乳癌患者試料中に見出されるＣＡＭＬ及びＣＴＣの数のプロットである。
【図１９】図１９は、肺癌患者で見出されるＣＡＭＬ及びＣＴＣの数のプロットである。
【図２０】図２０は、大腸癌患者で見出されるＣＡＭＬ及びＣＴＣの数のプロットである。
【図２１】図２１は、ＰＤＸ−１に関しても染色された膵臓癌患者由来のＣＡＭＬの例である。
【図２２】図２２は、ＰＳＭＡに関しても染色された前立腺癌患者由来のＣＡＭＬの例である。
【図２３】図２３Ａ〜Ｂは、ＣＡＭＬのＨ＆Ｅ染色を示す図である。２つの代表的なＣＡＭＬ細胞（Ａ）及び（Ｂ）を光学顕微鏡下で示す。黒矢印は、ＣＡＭＬの細胞質内に位置する円形空胞である。白矢印は、ＣＡＭＬの個々の核、及び続いて多核性を示す。
【図２４】図２４Ａは、治療を伴わない乳癌患者、並びにホルモン治療を伴う乳癌患者又は化学療法及び放射線療法を伴う乳癌患者における循環癌関連マクロファージ様細胞（ＣＡＭＬ）の数のプロットである。  図２４Ｂは、治療を伴わない膵臓癌患者、並びに化学療法及び放射線療法を伴う膵臓癌患者における循環癌関連マクロファージ様細胞（ＣＡＭＬ）の数のプロットである。
【図２５】図２５Ａは、ＣＡＭＬに付随するＣＴＣを示す図である。  図２５Ｂは、ＣＡＭＬに結合したＣＴＣを示す図である。  図２５Ｃは、膜融合を伴ってＣＡＭＬに結合したＣＴＣを示す図である。  図２５Ｄは、ＣＫ陽性細胞を飲み込んだＣＡＭＬを示す図である。
【図２６】図２６Ａは、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４及びＴＩＥ−２に関して染色した乳癌患者由来のＣＡＭＬの例を示す図である。  図２６Ｂは、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４及びＴＩＥ−２に関して染色した膵臓癌患者由来のＣＡＭＬの例を示す図である。  図２６Ｃは、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４及びＣＤ１４６に関して染色した乳癌患者由来のＣＡＭＬの例を示す図である。  図２６Ｄは、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４及びＣＤ１４６に関して染色した膵臓癌患者由来のＣＡＭＬの例を示す図である。
【００３０】
［詳細な説明］
［００６２］詳細な構築及び要素のような説明で定義される事項は、本発明の包括的な理解を助けるために提供されるものに過ぎない。したがって、本明細書中に記載される実施形態の各種変更及び修正が、本発明の範囲及び精神を逸脱することなく成され得ることが、当業者に理解されよう。
【００３１】
［００６３］癌は、世界中で最も恐れられている疾病であり、全ての国において全ての人口及び民族に影響を及ぼしている。米国単独では、１千万人を上回る癌患者が見られ、１年につき１５０万人の新たな癌の症例、及びほぼ６０万人の死亡を伴う。世界中の癌の死亡は、毎年約８００万人であると推定され、そのうちの３百万人が、患者が利用可能な治療を有する先進国で発生している。
【００３２】
［００６４］理想的には、（ｉ）全ての癌腫の、特に喫煙者のような潜在的に危険な群に対して肺癌の、早期検出を提供することができ、（ｉｉ）前立腺癌に関して高いＰＳＡのような、癌の他の指標を裏付けることができ、及び／又は（ｉｉｉ）癌の再発の早期検出を提供することができるバイオマーカーが存在する。
【００３３】
［００６５］腫瘍専門医は、新たに診断された癌患者を治療する最良の方法を知る必要がある。現在の試験規格は、組織バイオプシーであり、治療薬が特定のサブタイプに対してのみ有効である場合が多いため、組織バイオプシーは、癌のサブタイプを決定するのに使用される。バイオプシー法は、位置によって異なるが、侵襲的であり、危険を伴い得る。
【００３４】
［００６６］治療をモニタリングするために、腫瘍専門医は、薬物が患者に対してどの程度良好に機能しているか、用量を調節すべきであるかどうか、及び疾患が広がっているか、それとも寛解期にあるかどうかを知る必要がある。これらの疑問に答える一般的な方法は、Ｘ線断層撮影（ＣＴ）スキャン及び磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）であり、これらはともに高価である。さらに、これらの方法は、腫瘍サイズが知覚可能に変化してやっと、必要な情報を提供することができる。
【００３５】
［００６７］癌患者の９０パーセントが、原発性腫瘍ではなく、転移で死亡している。転移プロセスは、原発性癌腫（上皮細胞の固形腫瘍）から抜け出して、血流に入る腫瘍細胞を包含する。これらの離脱した癌細胞は、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）として知られている。ＣＴＣは、療法を決定して、治療をモニタリングして、再発を決定して、生存の予後情報を提供するためのツールとして有用である可能性を有する。しかしながら、ＣＴＣは、ステージＩＩＩ及びＩＶの癌でさえ、血液から一貫して収集することができない。
【００３６】
［００６８］この開示では、ステージＩ〜ＩＶ由来の癌腫患者の血液中で一貫して見出される細胞タイプが提示される。これらの細胞は、原発性腫瘍として同じ腫瘍マーカーを含有するマクロファージ様細胞であり、それらは、本明細書中では循環癌関連マクロファージ様細胞（ＣＡＭＬ）と称する。
【００３７】
［００６９］ＣＴＣ及びＣＡＭＬは、精密濾過法によるようなサイズ排除法により、同時に同じ患者試料から見出され得る。マイクロフィルターは、全ての赤血球及び白血球の大部分を通過させ、ＣＴＣ及びＣＡＭＬのようなより大きな細胞を保持するのに十分な大きさの孔を有するように形成され得る。サイズ排除法はまた、マイクロ流体チップによっても実行されている。
【００３８】
［００７０］ＣＡＭＬは、単独で使用される場合に多くの臨床的有用性を有する。さらに、ＣＡＭＬは、ＣＴＣ、血液中の遊離ＤＮＡ及び血液中の遊離タンパク質のような他のマーカーと組み合わせて、診断の感度及び特異性をさらに改善することができる。このことは、ＣＡＭＬ及びＣＴＣが同時に単離及び特定され得るため、ＣＡＭＬ及びＣＴＣに関して特に当てはまる。
【００３９】
循環腫瘍細胞
［００７１］ＣＴＣは、多数のサイトケラチン（ＣＫ）を発現する。ＣＫ８、１８及び１９が、診断で最も一般的に使用されるが、調査はこれらの３つに限定される必要はない。固形腫瘍ＣＴＣの表面は通常、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）を発現する。しかしながら、この発現は均一でもなく、一貫性もない。ＣＤ４５は白血球マーカーであるため、ＣＴＣは、いずれのＣＤ４５も発現すべきでない。ＣＴＣ及びＣＡＭＬのような腫瘍関連細胞を特定するためのアッセイでは、ＣＫ８、１８若しくは１９に対する抗体、又はＣＤ４５若しくはＤＡＰＩに対する抗体を使用することで十分である。染色の存在を形態学と組み合わせて、病理学的に規定可能なＣＴＣ、アポトーシスＣＴＣ及びＣＡＭＬを特定することができる。
【００４０】
［００７２］図１Ａ〜図１Ｄは、病理学的に規定可能なＣＴＣの４つの例を示す。病理学的に規定可能なＣＴＣは、以下の特徴により特定される：
それらは、ＤＡＰＩにより染色される「癌様（ｃａｎｃｅｒ−ｌｉｋｅ）」核を有する。但し、細胞が分裂中である場合は除く；核は凝縮されている。
それらは、少なくともＣＫ８、１８及び１９を発現する。サイトケラチンは、線維状パターンを有する。
それらは、ＣＤ４５発現を欠如する。低発現性ＣＤ４５細胞を見逃すのを回避するために、画像収集中に長い曝露が使用される。
【００４１】
［００７３］したがって、本発明の病理学的に規定可能なＣＴＣは、以下の特徴：（ａ）癌様核、（ｂ）線維状パターンを有するサイトケラチン８、１８及び１９のうちの１つ又は複数の発現、及び（ｃ）ＣＤ４５陰性表現型、のうちの１つ、２つ又は３つを有するＣＴＣを包含する。
【００４２】
［００７４］図１Ａは、十分規定されたＥｐＣＡＭを発現する病理学的に規定可能な前立腺癌ＣＴＣを示し、図１Ｂは、非常に低いＥｐＣＡＭを発現するか又はＥｐＣＡＭを発現しない、病理学的に規定可能な前立腺癌ＣＴＣを示す。図１Ｃは、十分規定されたＥｐＣＡＭを発現する病理学的に規定可能な乳癌ＣＴＣを示し、図１Ｄは、非常に低いＥｐＣＡＭを発現するか又はＥｐＣＡＭを発現しない、病理学的に規定可能な乳癌ＣＴＣを示す。
【００４３】
［００７５］図２Ａ〜図２Ｄは、アポトーシスＣＴＣの例を示す。アポトーシスＣＴＣは、以下の特徴により特定される：
それらは、癌性核（ｃａｎｃｅｒｏｕｓ  ｎｕｃｌｅｕｓ）を有する。
それらは、少なくともＣＫ８、１８及び１９を発現する。サイトケラチンは、線維状でないが、スポットの形態で断片化されているようである。
それらは、ＣＤ４５を発現しない。
【００４４】
［００７６］したがって、本発明のアポトーシスＣＴＣは、以下の特徴：（ａ）癌様核、（ｂ）スポットの形態で断片化されているサイトケラチン８、１８及び１９のうちの１つ又は複数の発現、及び（ｃ）ＣＤ４５陰性表現型、のうちの１つ、２つ又は３つを有するＣＴＣを包含する。
【００４５】
［００７７］図２Ａ及び図２Ｂは、それぞれ、アポトーシスの初期及び中期段階で、非常に低いＥｐＣＡＭを発現するか、又はＥｐＣＡＭを発現しないアポトーシス乳癌ＣＴＣを示す。図２Ｃ及び図２Ｄは、それぞれ、アポトーシスの中期段階で、高いＥｐＣＡＭ及び低いＥｐＣＡＭを発現する前立腺癌ＣＴＣを示す。
【００４６】
循環癌関連マクロファージ様細胞（ＣＡＭＬ）
［００７８］同じ患者試料で、別のタイプの細胞が特定された。この細胞型を、ＣＡＭＬと称した。ＣＡＭＬは、以下の特徴を有する：
ＣＡＭＬは、大異型核を有する。複数の個々の核がＣＡＭＬ中に見出され得るが、およそ１４μｍ〜およそ６５μｍの拡大した融合核小体が一般的である。
ＣＡＭＬは、少なくともＣＫ８、１８又は１９を発現してもよく、ＣＫは拡散し、又は空胞及び／又は摂取材料に付随する。ＣＫは、細胞全体にわたってほぼ均一である。
ＣＡＭＬは、ほとんどの場合がＣＤ４５陽性である。
ＣＡＭＬは大きく、サイズが約２０ミクロン〜約３００ミクロンである。
ＣＡＭＬは、５つの異なる形態学的形状（紡錘形、オタマジャクシ形、円形、楕円形又は無定形）で出現する。
ＣＡＭＬのさらなる分析により、ＣＡＭＬが以下の特徴も有することが示される：
ＣＡＭＬがＥｐＣＡＭを発現する場合、ＥｐＣＡＭは拡散し、或は、空胞及び／又は摂取材料に付随し、細胞全体にわたってほぼ均一であるが、腫瘍によっては非常に低いＥｐＣＡＭを発現するか、又はＥｐＣＡＭを発現しないため、全てのＣＡＭＬがＥｐＣＡＭを発現するとは限らない。
ＣＡＭＬは、腫瘍起源のマーカーと関連するマーカーを発現する。例えば、腫瘍が前立腺癌起源であり、ＰＳＭＡを発現する場合、この患者由来のＣＡＭＬもまた、ＰＳＭＡを発現する。別の例では、原発性腫瘍が膵臓起源であり、ＰＤＸ−１を発現する場合、この患者由来のＣＡＭＬもまた、ＰＤＸ−１を発現する。
ＣＡＭＬは単球マーカー（例えば、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４）及び内皮マーカー（例えば、ＣＤ１４６、ＣＤ２０２ｂ、ＣＤ３１）を発現する。ＣＡＭＬはまた、Ｆｃフラグメントを結合する能力を有する。
【００４７】
［００７９］したがって、本発明のＣＡＭＬは、以下の特徴：（ａ）約１４〜６４μｍのサイズを有する大異型核、（ｂ）拡散し、或いは、空胞及び／又は摂取材料に付随する、サイトケラチン８、１８及び１９のうちの１つ又は複数の発現、（ｃ）約２０ミクロン〜約３００ミクロンの範囲の細胞サイズ、（ｄ）紡錘形、オタマジャクシ形、円形、楕円形及び無定形からなる群から選択される形態学的形状、及び（ｅ）ＣＤ４５陽性表現型、のうちの１つ、２つ、３つ、４つ又は５つを有するＣＡＭＬを包含する。本発明のＣＡＭＬはまた、以下のさらなる特徴：（ｆ）ほぼ均一な分布を有する拡散性ＥｐＣＡＭの発現、（ｇ）原発性腫瘍の１つ又は複数のマーカーの発現、（ｈ）単球ＣＤ１１Ｃ及びＣＤ１４マーカーの発現、及び（ｉ）内皮ＣＤ１４６、ＣＤ２０２ｂ及びＣＤ３１マーカーの発現、のうちの１つ、２つ、３つ又は４つを有するＣＡＭＬを包含する。特定の態様では、本発明のＣＡＭＬは、さらなる特徴（ｆ）〜（ｉ）のそれぞれを有する。
【００４８】
［００８０］乳癌患者由来のＣＡＭＬの画像は、図３〜図５に示され、前立腺癌患者由来のＣＡＭＬは、図６に示される。図７は、別個の前立腺、乳及び膵臓患者試料由来の５つの異なるＣＡＭＬ形態及びシグナル変動を示すＣＡＭＬのコラージュを含有する：（７Ａ）膵臓、（７Ｂ）乳房、（７Ｃ）乳房、（７Ｄ）乳房、（７Ｅ）前立腺、（７Ｆ）膵臓、（７Ｇ）膵臓、（７Ｈ）前立腺及び（７Ｉ）前立腺。形態変異体の例は下記の通りである：無定形（７Ａ）、楕円形（７Ｂ及び７Ｇ）、紡錘形（３、５、６、７Ｃ、７Ｆ及び７Ｉ）、円形（７Ｄ）及びオタマジャクシ形（４、７Ｅ及び７Ｈ）。色の差異は、ＥｐＣＡＭ、サイトケラチン及びＣＤ４５に対する抗体反応由来のタンパク質発現の様々な度合いから生じる。図７Ａ〜ＩにおけるＣＡＭＬそれぞれのマーカーの発現は、図８Ａ〜Ｉにおいて詳細に示される。
【００４９】
［００８１］図９は、白血球（ＷＢＣ）、ＣＴＣ及びＣＡＭＬの細胞質径のウィスカープロットを示す。前立腺、乳房及び膵臓からマイクロフィルター上で捕獲されたＷＢＣと、ＣＴＣと、ＣＡＭＬとの間のメジアンサイズの差異並びに範囲（白血球ｎ＝２５、ＣＡＭＬ  ｎ＝２５及びＣＴＣ  ｎ＝２５）。径は、Ｚｅｎ  ２０１１測定ソフトウェアを使用して、細胞上の２つの最長点間の距離を使用して測定した。白血球のメジアン値は１２．４μｍであり、ＣＴＣは、１８．８μｍであり、ＣＡＭＬは、４３．５μｍであった。
【００５０】
ＣＡＭＬ及びＣＴＣを使用した診断方法
［００８２］上記で示唆したように、本明細書中に記載されるＣＡＭＬ及びＣＴＣの特有の特徴は、それらを、癌のような疾患のスクリーニング及び診断の方法を含む臨床的方法論、及び疾患進行のモニタリングにおける使用に十分適したものにしている。
【００５１】
［００８３］したがって、本発明は、第１の実施形態では、癌に関して対象をスクリーニングする方法であって、対象由来の生物学的試料中で循環癌関連マクロファージ様細胞（ＣＡＭＬ）を検出するステップを含む方法に関する。特定の態様では、ＣＡＭＬが生物学的試料中で検出される場合、対象が、癌腫又は固形腫瘍を潜在的に有すると特定される。他の態様では、ＣＡＭＬが生物学的試料中で検出される場合、対象が、癌腫又は固形腫瘍を有すると特定される。ある特定の態様では、この実施形態により包含される方法はまた、生物学的試料中で循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を検出するステップも含む。この第１の実施形態の特定の態様では、対象は、癌を有する疑いがある対象である。
【００５２】
［００８４］第２の実施形態では、本発明は、対象において癌を診断する方法であって、対象由来の生物学的試料中でＣＡＭＬを検出するステップを含み、ＣＡＭＬが生物学的試料中で検出される場合、対象が癌であると診断される方法に関する。ある特定の態様では、この実施形態に包含される方法はまた、生物学的試料中でＣＴＣを検出するステップも含み、ここでＣＡＭＬ及びＣＴＣが生物学的試料中で検出される場合、対象が癌であると診断される。
【００５３】
［００８５］第３の実施形態では、本発明は、対象において癌の再発を検出する方法であって、癌に関してすでに治療した対象由来の生物学的試料中でＣＡＭＬを検出するステップを含み、ＣＡＭＬが生物学的試料中で検出される場合、癌の再発が検出される方法に関する。ある特定の態様では、この実施形態により包含される方法はまた、生物学的試料中でＣＴＣを検出するステップも含み、ここでＣＡＭＬ及びＣＴＣが生物学的試料中で検出される場合、癌の再発が検出される。
【００５４】
［００８６］第４の実施形態では、本発明は、対象において癌の診断を確認する方法であって、癌と診断された対象由来の生物学的試料中でＣＡＭＬを検出するステップを含み、ＣＡＭＬが生物学的試料中で検出される場合、癌の診断が対象において確認される方法に関する。ある特定の態様では、この実施形態により包含される方法はまた、生物学的試料中でＣＴＣを検出するステップも含み、ここでＣＡＭＬ及びＣＴＣが生物学的試料中で検出される場合、癌の診断が対象において確認される。特定の態様では、初期の癌診断が、マンモグラフィー、ＰＳＡ試験又はＣＡ１２５の存在によるものである。特定の態様では、対象が、癌を有する疑いがある。
【００５５】
［００８７］これらの実施形態それぞれでは、ＣＡＭＬが、サイズ排除方法、赤血球溶解、ＦＩＣＯＬＬ、マイクロ流体チップ、及びフローサイトメトリー、又はそれらの組合せ、のうちの１つ又は複数が挙げられるが、これらに限定されない適切な手段を使用して検出される。サイズ排除方法が利用される場合、それは、マイクロフィルターの使用を含み得る。適切なマイクロフィルターは、様々な孔サイズ及び形状を有することができる。サイズが約７〜８ミクロンの孔を有するマイクロフィルターが許容可能であり、円形及び長方形の孔形状を包含する。高分子マイクロフィルターが使用される場合、サイズが約７〜８ミクロンの円形の孔を有するマイクロフィルターが特に最適である。好ましい態様では、マイクロフィルターが、精密孔配置及び均一な孔分布を有する。
【００５６】
［００８８］或いは、ＣＡＭＬが、物理的サイズベースの選別、流体力学的サイズベースの選別、グループ分け、捕捉、免疫捕獲、大細胞の濃縮、又はサイズに基づく小細胞の排除を含むが、これらに限定されない手段に基づいて、マイクロ流体チップを使用して検出され得る。
【００５７】
［００８９］これらの実施形態それぞれでは、ＣＴＣはまた、ＣＡＭＬと一緒に検出されてもよい。かかる検出は、同時又は順次検出であってもよく、同じ手段又は異なる手段を利用することができる。例えば、両方の細胞型に関して選定する孔サイズを有するマイクロフィルターを使用した同時検出を使用してもよい。適切なマイクロフィルターは、様々な孔サイズ及び形状を有することができる。サイズが約７〜８ミクロンの孔を有するマイクロフィルターが許容可能であり、円形及び長方形の孔形状を包含する。高分子マイクロフィルターが使用される場合、サイズが約７〜８ミクロンの円形の孔を有するマイクロフィルターが特に最適である。好ましい態様では、マイクロフィルターが、精密孔配置及び均一な孔分布を有する。
【００５８】
［００９０］これらの実施形態で提供される方法は、ＣＴＣ及び／又はＣＡＭＬを含有する疑いがある任意の生物学的試料を使用して実施され得る。適切な生物学的試料として、末梢血、血液、リンパ節、骨髄、脳脊髄液、組織及び尿からなる群から選択される１つ又は複数が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい態様では、生物学的試料が末梢血である。他の態様では、血液は、肘正中静脈血液、下大静脈血液又は頸静脈血液である。
【００５９】
［００９１］これらの実施形態で提供される方法が癌の特定の形態又はタイプに限定されないこと、及びそれらが、多種多様な癌と関連して実施され得ることは、当業者に理解されよう。例示的な癌としては、固形腫瘍、ステージＩの癌、ステージＩＩの癌、ステージＩＩＩの癌、ステージＩＶの癌、上皮細胞癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、膵臓癌及び大腸癌が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６０】
ＣＡＭＬ及びＣＴＣを使用した治療効力のモニタリング
［００９２］上記で示唆されたように、本明細書中に記載されるＣＡＭＬ及びＣＴＣの特有の特徴はまた、それらを、疾患治療の有効性をモニタリングする際の使用に十分適したものにしている。
【００６１】
［００９３］したがって、本発明は、第５の実施形態では、癌治療の効力をモニタリングする方法であって、
（ａ）癌治療前に、対象由来の生物学的試料中でＣＡＭＬの数を決定するステップと、
（ｂ）（ａ）で決定したＣＡＭＬの数を、治療後の１つ又は複数の時点で同じ対象由来の類似した生物学的試料から決定したＣＡＭＬの数と比較するステップと
を含む方法に関する。
【００６２】
［００９４］ＣＴＣと関連した予後可能性を考えると、この実施形態の方法は、以下のさらなるステップ：
（ｃ）（ａ）の生物学的試料中でＣＴＣの数を決定するステップと、
（ｄ）（ｃ）で決定したＣＴＣの数を、（ｂ）の生物学的試料から決定したＣＴＣの数と比較するステップと
をさらに含んでもよい。
【００６３】
［００９５］ＣＡＭＬ及び／又はＣＴＣの数における変化が、治療効力の指標であり、ここで変化が、ＣＡＭＬ及び／又はＣＴＣの数における増加又は減少であり得ることが、当業者に理解されよう。
【００６４】
［００９６］特定の癌治療は、この方法に限定されないが、化学療法及び／又は放射線療法を一般的に含む。
【００６５】
［００９７］これらの方法は、サイズ排除方法、赤血球溶解、ＦＩＣＯＬＬ、マイクロ流体チップ、及びフローサイトメトリー、又はそれらの組合せからなる群から選択される１つ又は複数の手段を使用してＣＡＭＬの数を決定することにより実施され得る。サイズ排除方法が使用される場合、それは、マイクロフィルターの使用を含み得る。適切なマイクロフィルターは、様々な孔サイズ及び形状を有することができる。サイズが約７〜８ミクロンの孔を有するマイクロフィルターが許容可能であり、円形及び長方形の孔形状を包含する。高分子マイクロフィルターが使用される場合、サイズが約７〜８ミクロンの円形の孔を有するマイクロフィルターが特に最適である。好ましい態様では、マイクロフィルターが、精密孔配置及び均一な孔分布を有する。特定の態様では、ＣＡＭＬの数が、物理的サイズベースの選別、流体力学的サイズベースの選別、グループ分け、捕捉、免疫捕獲、大細胞の濃縮、又はサイズに基づく小細胞の排除が挙げられるが、これらに限定されない手段に基づいて、マイクロ流体チップを使用して決定される。別の特定の態様では、ＣＡＭＬの数が、セルシーブ（商標）低圧精密濾過アッセイを使用して決定される。
【００６６】
［００９８］両方がモニタリングされる場合、ＣＡＭＬ及びＣＴＣの数が、同じ手段又は異なる手段を使用して、順次又は同時に決定され得る。例えば、両方の細胞型に関して選定する孔サイズを有するマイクロフィルターを使用した同時検出を使用してもよい。適切なマイクロフィルターは、様々な孔サイズ及び形状を有することができる。サイズが約７〜８ミクロンの孔を有するマイクロフィルターが許容可能であり、円形及び長方形の孔形状を包含する。高分子マイクロフィルターが使用される場合、サイズが約７〜８ミクロンの円形の孔を有するマイクロフィルターが特に最適である。好ましい態様では、マイクロフィルターが、精密孔配置及び均一な孔分布を有する。
【００６７】
［００９９］これらの実施形態で提供される方法は、ＣＴＣ及び／又はＣＡＭＬを含有する疑いがある任意の生物学的試料を使用して実施され得る。適切な生物学的試料として、末梢血、血液、リンパ節、骨髄、脳脊髄液、組織及び尿からなる群から選択される１つ又は複数が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい態様では、生物学的試料が末梢血である。他の態様では、血液は、肘正中静脈血液、下大静脈血液又は頸静脈血液である。
【００６８】
［００１００］これらの実施形態で提供される方法が癌の特定の形態又はタイプに限定されないこと、及びそれらが、多種多様な癌と関連して実施され得ることは、当業者に理解されよう。例示的な癌としては、固形腫瘍、ステージＩの癌、ステージＩＩの癌、ステージＩＩＩの癌、ステージＩＶの癌、上皮細胞癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、膵臓癌及び大腸癌が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６９】
ＣＡＭＬの生物学及び臨床結果の考察
［００１０１］腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）は、ほとんどの腫瘍内に見出される特殊分化マクロファージであり、それらは、腫瘍侵襲性又は腫瘍抑制のいずれかの予後指標として使用することができる。循環単球から支質へ動員されるＴＡＭは、腫瘍細胞血管内侵入（ｉｎｔｒａｖａｓａｔｉｏｎ）、遊走、溢出（ｅｘｔｒａｖａｓａｔｉｏｎ）及び血管新生に必要とされる。腫瘍は、化学走化性因子（ＭＣＰ−１、ＣＣＬ−２）を介して単球を引き寄せる。続いて、ＴＡＭは、サイトカイン、ケモカイン及び成長因子（例えば、ＭＭＰ−１、ＣＸＣＬ１２）を分泌して、それらが、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）になる能力を有する腫瘍細胞を刺激する。次に、ＴＡＭ及び腫瘍細胞は、リンパ系を介して遊走するか、又は腫瘍内毛細管関門を横切って、末梢循環へと血管内侵入する。
【００７０】
［００１０２］転移カスケードを介してＣＴＣの初期散在ステップを詳述する病理学的証拠は、依然として不確定のままである。通常、癌細胞散在カスケードは、３つのステップを要する：腫瘍からのＣＴＣ分離、親となる塊から離れた移動、及び循環系への遊走。様々な理論がこのカスケードの選り抜きの態様（内皮前駆細胞、癌間葉幹細胞、ハイブリッド癌細胞等）を説明するが、３つのプロセス全てを完全に説明できるものはない。近年、ｉｎ  ｖｉｖｏ研究により、循環単球細胞が腫瘍細胞侵襲性、運動性及び転移能力に複雑に関与することが示されている。骨髄系譜細胞と、腫瘍細胞との相互作用が患者で確認されており、マウスではモデリングされており、血管内侵入に関して経路を示唆しているが、最終的な散在ステップに関するメカニズムは、未だに確立されていない。
【００７１】
［００１０３］ここでは、本発明者等は、乳癌、前立腺癌及び膵臓癌患者の末梢血から単離した高度分化巨循環（マクロファージ様）細胞の存在について記載しており、それらは散在したＴＡＭ（ＤＴＡＭ）であり得ると、本発明者等は仮定する。本発明者等は、精密孔寸法及び均一な分布を有するセルシーブ（商標）マイクロフィルター（Ｃｒｅａｔｖ  ＭｉｃｒｏＴｅｃｈ）を使用して、この細胞タイプを単離した。全末梢血７．５ｍｌのセルシーブ（商標）精密濾過は、低圧下で、細胞を損失することなく実施されて、細胞形態の組織学的特定を可能にする。巨細胞がＣＤ１４＋発現、取り込まれた材料の空胞を示し、また専ら癌患者で見出されるため、本発明者等は、この巨細胞を循環癌関連マクロファージ様細胞（ＣＡＭＬ）と定義する（図３〜図７、及び表１）。本発明者等は、健常な個体では見出されないこの細胞集団が、癌の攻撃性に対して予め定義されていない自然免疫応答の頑強な細胞バイオマーカーとして役立ち得ること、並びに化学療法及び放射線療法誘導性応答をモニタリングし得ることを提唱している。循環中にＣＴＣと相互作用するこれらの巨細胞の観察は、患者の自然免疫応答が、ＣＴＣの遊走に対して観察可能な効果を有するという証拠を支持する。これらのマクロファージにより発現されるＴＩＥ−２陽性マーカーは、腫瘍転移内の新血管形成の細胞開始剤としてのＣＡＭＬの役割を示唆する。本発明者等は、ＣＡＭＬが、循環中にＣＴＣの遊走において関連する役割を果たし得るということを支持するｉｎ  ｖｉｖｏでの証拠を明らかにした。
【００７２】
［００１０４］巨融合マクロファージは、多数の組織で見出されるよく理解されていない細胞である。巨融合マクロファージは、外来及び壊死組織の食作用、組織再吸収及び炎症を含む多数の生理学的プロセス及び病理学的プロセスに関与する骨髄系譜に由来する多核細胞のハイブリッドである。ＣＡＭＬは、拡大した核を呈する巨細胞（ＣＤ４５＋）であり、上皮細胞に特徴的である拡散した細胞質染色：サイトケラチン８、１８及び１９、並びに上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）を示すことを、本発明者等は見出している（図３〜図８）。複数の個々の核をＣＡＭＬで見出すことができるが、大きな融合核小体（直径１４〜６４μｍ）が一般的である（図３〜図８）。サイトケラチン境界により規定されるＣＡＭＬ細胞質は、長さが２１〜３００μｍの範囲であり、フィルター上では５つの異なる形態額的表現型で見出される（紡錘形、オヤマジャクシ形、円形、楕円形又は無定形）（図３〜図８）。
【００７３】
［００１０５］これらの細胞の特定は、それらの極度の大きさ、大きな核プロフィール及び細胞質シグナチャーに起因して容易であるが、それらは、非常に不均一な表現型を有する。サイトケラチン、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ４５の発現は全て、発現の欠如から、非常に強烈な発現まで多様である（図８Ａ〜図８Ｈ）。この不均一さは、５つの細胞構造、サイズ範囲及び各種核プロフィールでさらに示される（図８Ａ〜図８Ｈ）。高いマーカー発現の不均一さは、ＣＡＭＬが分化の経路に沿って異なる段階を表すか、又は様々な細胞型を有する非特異的な細胞の飲み込みの産物であることを含意する。このことは、マクロファージが多数の細胞表現型へ分化することが可能な非常に柔軟な細胞型であるため驚くべきことではない。
【００７４】
［００１０６］ＣＡＭＬがＣＴＣ列挙に類似して、癌進行の独立した予後指標として機能し得るということを認識して、本発明者等は、セルシーブ（商標）低圧精密濾過アッセイ（Ｃｒｅａｔｖ  ＭｉｃｒｏＴｅｃｈ，Ｉｎｃ）及びセルサーチ（登録商標）循環腫瘍細胞試験（Ｖｅｒｉｄｅｘ，ＬＬＣ）を使用して、ＣＡＭＬ及びＣＴＣの数を比較した。ＣＴＣは、転移疾患を伴う癌患者において、それらの希少さ及び限られた出現（１０〜５０％）に起因して単離するべき課題となっている。ＴＡＭ列挙及び表現型検査は、予後の利用性を有し得るが、多数の侵襲性腫瘍バイオプシーを必要とするため、現在のところ原発性から転移性への進行を追跡する逐次実験を欠いている。セルサーチ（登録商標）及びセルシーブ（商標）系により富化されるＣＴＣの列挙を、２９名の癌患者由来の血液を使用してセルシーブ（商標）により単離されるＣＡＭＬの列挙と直接比較した（図１０）。セルサーチ（登録商標）がＣＴＣを富化するのにＥｐＣＡＭ抗体を使用する一方で、セルシーブ（商標）はサイズ排除を使用する。両方の技術が、抗サイトケラチン８、１８及び１９の抗体パネル、ＤＡＰＩ核染色及び抗ＣＤ４５の非存在を利用して、ＣＴＣを表現型的に特定する。１以上のＣＴＣ計数を用いると、セルシーブ（商標）系の感度は７２％（２９名の患者のうちの２１名、乳房＝１５／２１（７１％）、前立腺＝６／８（７５％））であった一方で、セルサーチ（登録商標）系の感度は、５８％（２９名の患者のうちの１５名、乳房＝９／２１（４３％）、前立腺＝６／８（７５％））であった。ＣＡＭＬ捕獲は、試験した試料の９７％（２９名のうちの２８名）で陽性であった（図１０）。興味深いことに、唯一のＣＡＭＬ陰性試料が、融合細胞で構成される骨の巨大骨髄系細胞である破骨細胞の形成を阻害する薬物の一種であるビスホスホネートで処理している乳癌患者であった。したがって、ＣＡＭＬの特異性が、試験した試料に関して１００％である場合、ＣＡＭＬの存在は、広範囲の癌患者に関する転移性疾患の予後指標としての使用のための非侵襲性逐次実験に関する方法を提供し得る。
【００７５】
［００１０７］転移性疾患の予後指標としての適用可能性に関してＣＡＭＬの感度及び特異性を評価するために、本発明者等は、早期〜後期癌患者及び健常対象由来の試料を検査した。７６名の患者由来の試料をセルシーブ（商標）マイクロフィルター上で実行した。ステージ分布として、３つの癌：乳癌（ｎ＝２９）、膵臓癌（ｎ＝２７）及び前立腺癌（ｎ＝２０）にわたってステージＩ（ｎ＝８）、ステージＩＩ（ｎ＝９）、ステージＩＩＩ（ｎ＝１３）、ステージＩＶ（ｎ＝２４）、未知のステージ（ｎ＝２２）が挙げられた（表Ｓ１）。本発明者等は、新たに診断されて未治療の患者（ｎ＝３６）、並びに非外科的療法を受けた患者（ｎ＝４０）を包含した（表１）。研究には、良性疾患を有する２名（線維腺腫が１名及び基底細胞癌腫が１名）を含む健常対象（ｎ＝３０）が包含された。ＣＡＭＬは、この対照群では見出されなかった（表１）。ＣＡＭＬは、ステージＩＩＩ／ＩＶ癌を有する癌患者の９７％（３７名のうち３６名）、ステージＩ／ＩＩのうちの７７％（１７名のうち１３名）、及び癌タイプに関わらず全ての患者の９３％（７６名のうち７１名）で見出された（図１１）。ＣＡＭＬは、患者の８５％（前立腺）（図１２）、９３％（膵臓）（図１３）及び９７％（乳房）（図１４）で見出された。前立腺癌試料におけるＣＡＭＬは、２０名の前立腺患者のうちの６名がステージＩであったという事実におそらく起因して、数がわずかに少なかった。マイクロフィルター上のＣＴＣ分析が、試験した患者全てにわたって５４％の全体的な陽性を提供したが、ＣＡＭＬは、同じコホートにわたって９３％感度を提供した（図１２〜図１４及び表１）。様々な疾病を有する患者のさらなる研究が評価されなくてはならないが、これらの見解により、ＣＭＡＬの存在が癌状態の頑強で広く適用可能な評価を提供することができることが実証される。
【００７６】
［００１０８］
表１．健常対象、並びに、ステージ、癌タイプ及び療法タイプにより分離されるＣＡＭＬ患者データ及びＣＴＣ患者データの概要。ＣＴＣは、ステージＩ及びＩＩ患者の少ないパーセントで見出される一方で、ＣＡＭＬは、多くのステージＩ〜ＩＶ患者で見出される。患者間のＣＴＣ数は、３００％を上回る標準偏差（ＳＤ）を伴って非常に可変的である。ＣＡＭＬは、はるかに低いＳＤ、１１０％を有し、その数は、ステージ及び治療と相関するようである。
【表１】
2018138042.tif 000003
【００７７】
［００１０９］より多くの試料が収集されると、さらなるＣＡＭＬデータが得られた。図１５は、乳癌、膵臓癌、前立腺癌及び非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）に関してステージ分類情報をともに１２２名の患者に関するＣＡＭＬ計数を提示する。ステージＩに関して、１名の膵臓癌患者、及び６名の前立腺癌患者は、いかなるＣＡＭＬも有さなかった。ステージＩＩに関しては、１名の膵臓癌患者、及び１名の前立腺癌患者が、いかなるＣＡＭＬも有さなかった。ステージＩＶに関して、１名の乳癌患者、１名の肺癌患者及び３名の膵臓癌患者は、いかなるＣＡＭＬも有さなかった。
【００７８】
［００１１０］図１６Ａ及び図１６Ｂは、それぞれ、今日まで得られた前立腺癌患者データからのＣＡＭＬ及びＣＴＣの数を提示する。ステージ分類情報は、全ての患者に関してはわからなかった。ＣＡＭＬを有する前立腺癌患者のパーセントは、８１％（３０／３７）であり（図１６Ａ）、ここで１３名がステージＩであるとわかっている。病理学的に規定可能なＣＴＣを有する前立腺癌患者のパーセントは３２％（１２／３７）であった（図１６Ｂ）。
【００７９】
［００１１１］図１７Ａ及び図１７Ｂは、それぞれ、今日まで得られた膵臓癌患者データからのＣＡＭＬ及びＣＴＣの数を提示する。ステージ分類情報は、全ての患者に関してはわからなかった。ＣＡＭＬを有する膵臓癌患者のパーセントは、９３％（７１／７６）であり（図１７Ａ）、ここで１１名がステージＩであるとわかっていた。２つの試料が、８０よりも大きな病理学的に規定可能なＣＴＣを有した。試料番号１３及び５３は、それぞれ８３及び５４１個の病理学的に規定可能なＣＴＣを有していた。病理学的に規定可能なＣＴＣを有する前立腺癌患者のパーセントは２３％（１８／７６）であった（図１７Ｂ）。
【００８０】
［００１１２］図１８Ａ及び図１８Ｂは、それぞれ、今日まで得られた乳癌患者データからのＣＡＭＬ及びＣＴＣの数を提示する。ステージ分類情報は、全ての患者に関してはわからなかった。ＣＡＭＬを有する乳癌患者のパーセントは、９７％（３６／３７）であり（図１８Ａ）、ここで唯一１名がステージＩであるとわかっていた。１名のステージＩＶ患者は、彼女がビスホスホネートを摂取していたため、いかなるＣＡＭＬも有さなかった。４つの試料が、１１０よりも大きな病理学的に規定可能なＣＴＣを有した。試料番号１７、２７及び３０は、それぞれ９７８、６８２及び７０７の病理学的に規定可能なＣＴＣを有していた。病理学的に規定可能なＣＴＣを有する乳癌患者のパーセントは、８４％（３１／３７）（図１８Ｂ）であった。
【００８１】
［００１１３］図１９は、今日まで得られたＮＳＣＬＣ患者データからのＣＡＭＬ及びＣＴＣの数を提示する。ステージ分類情報は、全ての患者に関してはわからなかった。ＣＡＭＬを有する大腸癌患者のパーセントは、この小試料サイズに関して１００％（４／４）であった。病理学的に規定可能なＣＴＣを有する大腸癌患者のパーセントは、２５％（１／４）であった。
【００８２】
［００１１４］図２０は、今日まで得られた大腸癌患者データからのＣＡＭＬ及びＣＴＣの数を提示する。全ての患者がステージＩＶであった。ＣＡＭＬを有するＮＳＣＬＣ患者のパーセントは、８８％（７／８）であった。病理学的に規定可能なＣＴＣを有するＮＳＣＬＣ患者のパーセントは、３８％（３／８）であった。
【００８３】
［００１１５］全てのこれらのデータにおいて、ＣＡＭＬは、ＣＴＣよりもはるかに大きい数の患者で見出された。
【００８４】
［００１１６］様々な疾病を有する患者のさらなる研究が評価されなくてはならないが、これらの見解により、ＣＭＡＬの存在が癌腫に関する癌状態の頑強で広く適用可能な評価を提供することが実証される。
【００８５】
［００１１７］本発明者等は、ＣＡＭＬが腫瘍の部位に始まって、循環へと散在する特殊ＴＡＭを表すことを提唱する。このことは、原発性腫瘍部位でＴＡＭを特徴付けるこれまでの出版物、並びにＣＡＭＬがＣＤ１４＋のように見えて、飲み込まれた上皮組織を有し、専ら癌患者で生じるという観察と一致している。ＣＡＭＬの起源を理解するために、本発明者等は、それらが、循環単球から又は直接ＤＴＡＭから生じるかどうかを検討した。ＴＡＭ及び単球はともに、類似したタンパク質マーカーを呈するため、本発明者等は、飲み込まれた臓器特異的マーカー、膵臓患者に関しては膵臓十二指腸ホメオボックス−１（ＰＤＸ−１）又は前立腺患者に関しては前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）の存在を評価した。ＰＤＸ−１は、成体内分泌臓器、即ち膵臓細胞で見出される分化及び発生マーカーである。ＰＳＭＡは、膜糖タンパク質であり、これは、前立腺細胞で高度に発現される。ＣＡＭＬを単離及び列挙した後、本発明者等は、予め特定したＣＡＭＬサンプルをＰＳＭＡ又はＰＤＸ−１で再染色した。ＰＤＸ−１陽性反応は、膵臓サンプル由来の全てのＣＡＭＬで見られた（図２１）一方で、ＰＳＭＡは、前立腺試料由来の全てのＣＡＭＬで見出された（図２２）。細胞融合又は細片の摂取は、腫瘍部位から離れて行われた可能性がある一方で、循環中の腫瘍細片の不足に加えて高濃度のマーカーにより、これが起きる可能性は低くなっている。代わって、本発明者等は、ＣＡＭＬがＤＴＡＭのサブタイプであること、また染色が貪食壊死細片又は腫瘍部位由来の飲み込まれた腫瘍性細胞から起きるという証拠として、この一連のバイオマーカー染色を解釈する。
【００８６】
［００１１８］
表２．ＣＡＭＬを分析するのに使用される細胞マーカー。（＋）細胞型の大部分において陽性；（−）細胞型の大部分において陰性；（＋／−）このマーカーに関して不均一である細胞集団で、陽性であっても又は陰性であってもよい；（＊（星印））膵臓癌患者由来の細胞においてのみ見出される；（‡（ダブルダガー））前立腺癌患者由来の細胞においてのみ見出される；（◆（黒菱形））単球上の小サブセット集団がこのマーカーに関して陽性である；（○（白丸））単球が白血球の亜集団であり、これらのマーカーを発現する。
【表２】
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【００８７】
［００１１９］図２３は、ＣＡＭＬのＨ＆Ｅ染色を示す。乳癌患者由来の試料は、蛍光ＤＡＰＩ及びサイトケラチン染色により特定された。続いて、フィルターをヘマトキシリンにより、及びエオシンＹにより再染色した。２つの代表的なＣＡＭＬ細胞を光学顕微鏡下で示す。黒矢印は、ＣＡＭＬの細胞質内に位置する円形空胞である。白矢印は、ＣＡＭＬの個々の核、及び続く多核性を示す。（Ａ）３つの目に見える核及び空胞を有する楕円形状のＣＡＭＬ（Ｂ）５つの目に見える核を有する円形形状のＣＡＭＬ。
【００８８】
［００１２０］ＣＡＭＬがＤＴＡＭサブタイプであるかどうかをさらに試験するために、本発明者等は、癌進行及び安定性に関連して、療法レジメンとＣＡＭＬの数の一時的な変化を比較した。ＣＡＭＬが腫瘍部位での細胞障害性に起因した細胞細片の食作用に関連する、即ちＴＡＭに由来する場合には、化学応答性でない患者、又はホルモン療法のみを受けている患者は、さらなる細胞細片を産生せず、したがってＣＡＭＬ数に変化がないと本発明者等は仮定した。逆に、化学療法に応答している患者は、ＣＡＭＬにおいて増加が見られる。治療上のレジメンの分析により、化学療法のみが、乳癌患者（図２４Ａ）及び膵臓癌患者（図２４Ｂ）においてＣＡＭＬレベルの増加に関連して、ホルモン療法も非療法も関連しないことが示された。膵臓癌患者に関して、平均的な化学療法に関するＣＡＭＬは、１６．４個のＣＡＭＬであり、療法なしに関しては、４．１個である。腫瘍サイズにおいてあまり変化を示さないはずである非治療患者及びホルモン治療患者は、０．４〜０．６個未満／血液１ｍＬの少ない数のＣＡＭＬを有することを、本発明者等は見出している（図２４Ａ〜図２４Ｂ）。逆に、化学療法レジメンが使用されていた場合、ＣＡＭＬ数は３．９／ｍＬに増加した。これらのデータにより、ＣＡＭＬは、化学療法により引き起こされる細胞細片の程度に対して細胞特異的な免疫応答を定量化できる腫瘍部位での食作用の高感度表示を提供し得ると示唆される。
【００８９】
［００１２１］ＣＴＣは、腫瘍部位で始まり、末梢血中を循環して、転移部位を播種する能力を有する。しかしながら、ＣＴＣ剥離及び循環系への侵入に関する経路は、複雑なプロセスである。本発明者等は、ＣＴＣ／ＣＡＭＬ相互作用の証拠に関して、患者試料から単離したＣＡＭＬを分析した。ＣＴＣは、７２名の患者のうちの３名において、転移性疾患においては全てでＣＡＭＬに結合していることが見出された（図２５Ａ〜図２５Ｃ）。さらに、ＣＡＭＬの３つの事例が、腫瘍性／ＣＴＣ表現型を有するようである飲み込まれた細胞で見出された（図２５Ｄ）。患者の７％を代表して、二重ペアＣＴＣ及びＣＡＭＬの観察される相互作用は、２つの可能性を示している。まず、これらの細胞は循環中に付着し、ＣＡＭＬが血液中の癌細胞に対して活性な免疫応答であることを含意している。次に、これらの細胞は原発性腫瘍で結合し、循環中に一緒に散在し、血管内侵入の類似の経路を含意する。いずれの場合でも、細胞のこのペア形成により、ＣＡＭＬが、癌患者の末梢血中で癌細胞遊走に対する免疫応答において役割を果たし得ることが示唆される。
【００９０】
［００１２２］循環単球は、リンパ節、骨髄、ほとんどの臓器を含む身体の任意の組織区画に、さらには血液脳関門を横切って入る能力を有する。新生血管潜在性を有する血管新生内皮前駆細胞（ＥＰＣ）は、マクロファージに由来することが可能であり、ＴＩＥ−２＋（ＣＤ２０２ｂ）マクロファージは、腫瘍血管化に複雑に関与する。最近のｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験及びマウスｉｎ  ｖｉｖｏ実験により、ＣＤ１４＋／ＣＤ１１ｃ＋単球に由来するＥＰＣは、血管新生促進活性が可能なＣＤ１４６＋／ＴＩＥ−２＋内皮細胞へ分化することがわかっている。ＣＡＭＬがＥＰＣ様紡錘形表現型を呈するため、本発明者等は、この経路の証拠に関してＣＡＭＬを分析した。ＣＡＭＬ陽性試料を特定した後、本発明者等は、単球マーカーであるＣＤ１１ｃ及びＣＤ１４、並びに血管新生内皮マーカーであるＣＤ１４６又はＴＩＥ−２のパネルでＣＡＭＬを染色した（図２６Ａ〜図２６Ｄ）。本発明者等は、単球マーカー及び内皮マーカーの両方に関して陽性であるＣＡＭＬを観察した。単球マーカーＣＤ１１ｃは、最も反応性が高く、染色した全てのＣＡＭＬで見出された一方で、二次単球マーカーＣＤ１４は、最も反応性が低く、時折陰性であった。血管新生促進マーカー（ＴＩＥ−２）及び内皮マーカー（ＣＤ１４６）は、ＣＡＭＬで陽性に染色したが、染色強度は断続的であった。内皮／単球重複の見解は、循環単球が高い形態学的及びマーカー不均一性を有するため、驚くべきことではない。今日でさえ、内皮細胞、骨髄由来細胞及び単球細胞が重複マーカーを発現し、類似の発生経路を有するため、分類に関して単核性食細胞系について激論されている。それにも関わらず、ＣＤ１４陽性細胞上のＣＤ１４６又はＴＩＥ−２の存在は、新生血管潜在性が可能な特殊血管新生促進マクロファージを示している。
【００９１】
［００１２３］多くの研究がＣＴＣの散在に焦点を当ててきたが、ＴＡＭは、転移の播種、増殖及び新血管形成に関与し得る。これまでの研究は、マクロファージの補助を介した腫瘍細胞の血管浸潤に関する証拠を提供する一方で、本発明者等の結果はまたここで、循環中の腫瘍細胞とのマクロファージ相互作用の証拠を供給する。本発明者等は、原発性腫瘍に由来するＣＡＭＬが循環中に散在すると仮定する。本発明者等はまた、ＣＡＭＬが、ＣＴＣに結合し、ＣＴＣに付着した状態で循環を介して遊走し、おそらく連動して散在することを示す。最終的に、本発明者等は、血管新生促進ＴＩＥ−２／ＣＤ１４６発現ＣＡＭＬについて記載しており、転移性微小環境を新血管形成する能力を示している。これらのデータにより、血管新生促進細胞がＣＴＣに結合した状態で遊走するという臨床的証拠が提供され、ＣＴＣの血管内侵入と、遊走と、溢出との間の関連性を示唆する。
【００９２】
ＣＡＭＬ及びＣＴＣの捕獲
［００１２４］体液中に存在する他の細胞よりも大きい、及び／又は柔軟性が低い細胞は、体液を濾過することにより収集され得る。例えば、状態を示す標的とされる細胞は、標的細胞が通過するには小さすぎるが、他の細胞が通過するのには十分大きな開口部を有するフィルターに体液を通すことにより収集され得る。いったん収集されると、標的細胞の任意数の分析が実施され得る。かかる分析としては、例えば、特定すること、計数すること、マーカーの発現を特徴付けること、分子分析を得ること、及び／又は収集した細胞を培養することが挙げられ得る。
【００９３】
［００１２５］ＣＡＭＬ、病理学的に規定可能なＣＴＣ及びアポトーシスＣＴＣは、赤血球及びほとんどの白血球よりも大きい。精密孔サイズ及び孔分布を有する精密マイクロフィルターを使用することにより、高い捕獲効率及び低い標準偏差を提供することが示されている。セルシーブ（商標）マイクロフィルター（Ｃｒｅａｔｖ  ＭｉｃｒｏＴｅｃｈ）は、精密マイクロフィルターの一例である。セルシーブ（商標）マイクロフィルターは、透明及び非蛍光であり、それらを顕微鏡画像分析にとって理想的なものにしている。７〜８ミクロンの孔サイズは、全ての赤血球及び白血球の９９．９９％を排除した。均一な孔サイズ及び分布を生じるマイクロフィルターを製造する方法は、国際公開第２０１１／１３９４４５号パンフレット及び国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１２／６６３９０に記載されており、それらはともに、その全体が参照により本明細書に援用される。トラックエッチ法により作製されるマイクロフィルターは、重複することができるランダムに位置する孔を有し、効果的に大きな孔をもたらす。それらは、幾らかＣＡＭＬ及びＣＴＣを損失し得る。
【００９４】
［００１２６］多くの他の方法が、ＣＴＣの捕獲に関して存在する。また、ＣＡＭＬを捕獲するのに採択することができるものもある。それらは一般的に、以下のカテゴリーに分類される：
ＣＡＭＬは、血液細胞の大部分と比較して大きいため、任意のサイズベースの方法が、ＣＡＭＬを捕獲するのに適している。マイクロフィルターは、ＣＡＭＬ及びＣＴＣの捕獲にとって理想的である。サイズにより大きな細胞を選別して、選択して、グループ分けして、捕捉して、濃縮するか、又は小さな細胞を排除するマイクロ流体チップ技術もまた適切である。
免疫捕獲は、ＣＡＭＬの選択又は他の細胞の排除のための抗体でコーティングされた強磁性流体、磁気ビーズ、マイクロ流体チップ等を使用する。
赤血球溶解はまた、ＣＡＭＬを収集するのにも使用することができる。得られた試料容積は、多重スライドガラス上でのプレーティングを必要とする。
ＦＩＣＯＬＬ
フローサイトメトリー
様々な生物学的及び物理学的原理を利用する様々なマイクロ流体チップ。
【００９５】
臨床的実用性の概要
［００１２７］これらの結果は、ＣＡＭＬが癌の存在の頑強な指標を提供するという発想を支持する。
【００９６】
［００１２８］ＣＡＭＬの実用性の感度及び特異性は、ＣＴＣの同時検出と組み合わせて、さらに改善させることができる。
【００９７】
［００１２９］癌スクリーニングは、徴候又は症状を有さず、前症候性又は未認識症候性疾患を有する個体において、未認識疾患を特定するのに集団で使用される戦略である。したがって、スクリーニング試験は、それらが一見良好な健康の個人に対して実施されるという点で幾らか特有である。スクリーニング試験は、診断試験ではない。診断試験は、疾患を有することが疑わしい個体において、疾患の存在を確認又は決定するように実施される手順である。
【００９８】
［００１３０］ＣＡＭＬは、マンモグラフィー、ＰＳＡ及びＣＡ１２５のような他のスクリーニング技法を確認するためのさらなる非侵襲的診断法を提供するために癌診断法として使用され得る。
【００９９】
［００１３１］ＣＡＭＬは、ステージＩ及びＩＩの癌で見出すことができるため、ＣＡＭＬは、肺、膵臓、大腸及び早期検出方法を有さない他の癌に関して、特に高い危険性の患者についての上皮起源の癌腫の早期検出に関するスクリーニングとして使用され得る。癌のタイプの特異性は、様々な癌部位特異的マーカーに関して染色することにより決定することができる。幾つかの例は、（ｉ）前立腺癌を特異的に特定するためのＰＳＭＡに対する抗体の使用、（ｉｉ）肺癌を特異的に特定するためのＰＤＸ−１に対する抗体の使用、（ｉｉｉ）卵巣癌に関するＣＡ１２５に対する抗体、及び（ｉｖ）神経膠腫を特定するためのクロロトキシンである。
【０１００】
［００１３２］同様に、ＣＡＭＬを使用して、癌が寛解した場合に癌の早期再発を確認することができる。現在は、ＣＴ及びＭＲＩを使用して、患者の腫瘍をモニタリングして、腫瘍が、差異に気がつくように実質的にそのサイズを変化させることを必要とする。したがって、ほんのわずかなサイズ変化が起きる場合に、患者は、治療を開始する際に貴重な時間を損失し得る。ＣＡＭＬは、単独で又はＣＴＣと組み合わせて、癌の再発の早期検出を提供することができる。ＣＡＭＬ及びＣＴＣの非侵襲性血液試験は、ＣＴ及びＭＲＩよりも費用がはるかに安い。
【０１０１】
［００１３３］ＣＡＭＬを追跡する能力は、壊死及び化学療法又は放射線療法応答を日常的にモニタリングするための新規機会を提供する。化学療法が作動していない場合、ＣＡＭＬ数は増加しない。これは、ＣＴＣ検出と並行して使用することができる。治療が作動している場合、病理学的に規定可能なＣＴＣの数が減少し、アポトーシスＣＴＣの数が増加する。しかしながら、ＣＴＣは、必ずしも検出することができるとは限らない。ＣＴＣがＣＡＭＬと同時に検出される場合、感度及び特異性を改善することができる。多くの癌に関して、多数の化学療法剤が存在する。患者が化学療法剤の１つのタイプに応答していない場合、患者は迅速に別のタイプに切り替えることができる。
【０１０２】
［００１３４］ＣＡＭＬはまた、癌のサブタイピング又は遺伝子突然変異、転座又は増幅を確定するのに潜在的に使用され得る。各ＣＡＭＬにおいて多数の癌性核が存在する。したがって、遺伝子突然変異、遺伝子欠陥、遺伝子転座に関する核の分子分析は、治療を決定するための情報を提供することができる。ある特定の遺伝子突然変異、転座又は増幅を具体的に標的とする薬物が存在する。ＣＡＭＬは、ＣＴＣと一緒に又は並行して、分子分析に使用することができる。
【０１０３】
［００１３５］循環単球は、リンパ節、骨髄、ほとんどの臓器を含む身体の任意の組織区画に、さらには血液脳関門を横切って入る能力を有する。ＣＡＭＬの検出は血液に限定されず、リンパ節、骨髄、脳脊髄液、ほとんどの臓器及び尿で見出すことができる。
【０１０４】
［００１３６］ＣＴＣの検出に通常使用される血液の容量は、７．５ｍＬである。より大きな容量の血液は、より高い感度及び一貫性を提供するが、３．５ｍＬのようなより小さな容量で十分であり得る。多くのＣＴＣ検出方法に関して、より大きな容量の血液は、様々な理由で実用的ではない。しかしながら、ＣＴＣ及び／又はＣＡＭＬを捕獲するための血液の精密濾過により、より柔軟に試料サイズを増加させることが可能となる。５０ｍＬの血液容量は、１６０，０００個の孔を有するセルシーブ（商標）マイクロフィルターを使用して首尾よくスクリーニングされることが示されている。ＣＡＭＬを捕獲するための血液の推奨容量は、７．５ｍｌ又はそれ以上である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年4月19日(2018.4.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の特徴：
（ａ）癌様核又は細胞分裂中の核
（ｂ）線維状パターンを有するサイトケラチン８、１８及び１９のうちの１つ又は複数の発現、及び
（ｃ）ＣＤ４５陰性表現型
を有する病理学的に規定可能な単離循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）。
【請求項２】
さらに、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）を発現する、請求項１に記載のＣＴＣ。
【請求項３】
前立腺癌ＣＴＣ、乳癌ＣＴＣ、膵臓癌ＣＴＣ、肺癌ＣＴＣ又は大腸癌ＣＴＣである、請求項１に記載のＣＴＣ。
【請求項４】
ステージＩ、ステージＩＩ、ステージＩＩＩ又はステージＩＶの癌を有する患者から単離された、請求項１に記載のＣＴＣ。
【請求項５】
以下の特徴：
（ａ）癌様核、
（ｂ）スポットの形態で断片化されているサイトケラチン８、１８及び１９のうちの１つ又は複数の発現、及び
（ｃ）ＣＤ４５陰性表現型
のうちの２つ以上を有する、単離アポトーシス循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）。
【請求項６】
特徴（ｂ）及び（ｃ）を有する、請求項５に記載のＣＴＣ。
【請求項７】
特徴（ａ）〜（ｃ）のそれぞれを有する、請求項５に記載のＣＴＣ。
【請求項８】
さらに、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）を発現する、請求項５〜７のいずれか一項に記載のＣＴＣ。
【請求項９】
前立腺癌ＣＴＣ、乳癌ＣＴＣ又は膵臓癌ＣＴＣである、請求項５に記載のＣＴＣ。
【請求項１０】
ステージＩ、ステージＩＩ、ステージＩＩＩ又はステージＩＶの癌を有する患者から単離された、請求項５に記載のＣＴＣ。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８１】
［００１１３］図１９は、今日まで得られたＮＳＣＬＣ患者データからのＣＡＭＬ及びＣＴＣの数を提示する。ステージ分類情報は、全ての患者に関してはわからなかった。ＣＡＭＬを有するＮＳＣＬＣ患者のパーセントは、８８％（７／８）であった。病理学的に規定可能なＣＴＣを有するＮＳＣＬＣ患者のパーセントは、３８％（３／８）であった。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８２】
［００１１４］図２０は、今日まで得られた大腸癌患者データからのＣＡＭＬ及びＣＴＣの数を提示する。全ての患者がステージＩＶであった。ＣＡＭＬを有する大腸癌患者のパーセントは、この小試料サイズに関して１００％（４／４）であった。病理学的に規定可能なＣＴＣを有する大腸癌患者のパーセントは、２５％（１／４）であった。
【外国語明細書】
2018138042000001.pdf