(57)【要約】  【課題】不安定な脂質由来のラジカルを捕捉し、それらのラジカルの構造を解析する方法の提供。  【解決手段】蛍光ニトロキシド (NBD-Pen)を作用させることにより、脂質ラジカルまたはその断片ラジカルを捕捉し、蛍光検出液体クロマトグラフィー（LC/FL）および質量分析（MS）を組み合わせて、脂質抽出物に含まれる脂質由来ラジカルを同定する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中に存在する脂質由来のラジカル体を検出する方法であって、
サンプルに、以下の化合物（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）：
【化１】
2018189446.tif 000013
よりなる群から選択されるニトロキシド誘導体またはそれらの混合物を添加して、ニトロキシド誘導体混合物を得る工程；および
得られたニトロキシド混合物を蛍光検出液体クロマトグラフィーで分析して、脂質由来のラジカル体がニトロキシド誘導体に付加した付加体を分画し、画分の各々につき質量分析して構造を解析する工程
を含む、検出方法。
【請求項２】
前記サンプルが、生体から摘出した肝臓から脂肪抽出して得られた脂肪抽出物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ニトロキシド誘導体またはそれらの混合物が化合物（Ｃ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
サンプルに、リポキシゲナーゼ、2, 2’-アゾビス（2-メチルプロピオンアミジン）ジヒドロクロリド、2,2’-アゾビス（4-メトキシ-2,4’-ジメチルバレロニトリルのいずれかのラジカル誘発剤を添加して、ラジカルを誘発する工程
をさらに含み、
ラジカル誘発されたサンプルに、ニトロキシド誘導体またはそれらの混合物を添加する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
下記の化合物（Ａ’）、（Ｂ’）および（Ｃ’）：
【化２】
2018189446.tif 000014
よりなる群から選択される化合物。
【請求項６】
式中、Rは、CH3, C2H5, C3H7, C4H9,C6H13, C7H13, C7H13O, C8H15O, C9H15, C9H15O2, C9H13O3, C10H17O, C11H19O2, およびC12H21O2よりなる群から選択され、ここに、LAはリノール酸を意味する、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
式中、Rは、AA-O2, CH3, C2H5, C3H7, C4H9, C6H13, C6H9O3, C7H13, C7H13O, C8H13O2, C8H15O, C9H17, C9H15O2, C9H13O3, C10H17O, C11H19, C11H17O, C11H19O, C11H19O2, C12H19O, C12H19O2, C13H19O2, C14H21O, C14H23O, およびC15H23Oよりなる群から選択され、ここに、AAはアラキドン酸を意味する、請求項５に記載の化合物
【請求項８】
式中、Rは、ALA-O2, CH3, C5H9O, C6H9O, C6H11O, C7H11O, C8H13, C8H11O, C8H11O3, C8H13O, C9H13O, C9H13O2, C10H15O, C11H17, C11H15O, C11H17O, C11H15O3, C15H21O2, およびC15H21O3よりなる群から選択され、ここに、ALAはα−リノレン酸を意味する、請求項５に記載の化合物。
【請求項９】
式中、Rは、EPA-O2, CH3, C5H9O, C6H9O, C6H11O, C7H11O, C8H13, C8H11O, C8H11O3, C8H13O, C9H13O, C9H13O2, C10H15O, C11H17, C11H15O, C11H17O, C11H15O3, C12H17O, C12H17O2, C14H21O, C14H19O, C15H21O, C15H21O2, C15H21O3, C17H23O, およびC18H25Oよりなる群から選択され、ここに、EPAはエイコサペンタエン酸を意味する、請求項５に記載の化合物。
【請求項１０】
式中、Rは、DHA-O2, CH3, C5H9O, C6H9O, C6H11O, C7H11O, C8H13, C8H11O, C8H11O3, C8H13O,C9H13O, C9H13O2, C10H15O, C11H17, C11H15O, C11H17O, C11H15O3, C12H17O, C12H17O2, C14H21O, C14H19O, C15H21O, C15H21O2, C15H21O3, C17H23O, C18H25O, およびC21H31O4よりなる群から選択され、ここに、DHAはドコサヘキサエン酸を意味する、請求項５に記載の化合物。
【請求項１１】
化合物（Ｃ’）：
【化３】
2018189446.tif 000015
である、請求項６〜１０のいずれか一項に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂質ラジカルの構造を解析するための方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
ゲノムや遺伝子の機能を対象とするゲノム解析や、タンパク質の構造及び機能を対象とするプロテオーム解析が盛んに行われ、得られた情報をデータベース化することで、疾患を含む生体内での様々な現象の解明に貢献している。
【０００３】
一方、脂質の機能や構造を対象とするリピドーム解析の重要性も着目され始めているが、脂質は遺伝子コードがされていないこと、水に溶けにくいことなどの理由から検出技術が不足しているため、脂質の研究は発展途上にある。しかしながら、インドメタシンやスタチンなど脂質をターゲットとした医薬品が多数開発されており、脂質についてのデータベースが作成されれば、創薬研究が加速することが期待される。
【０００４】
近年、スーパーオキシドアニオンラジカル、ヒドロキシラジカル、過酸化水素及び一重項酸素などの活性酸素種（ROS）が生体内の様々な現象に影響し、なかでも、ヒドロキシラジカルは極めて反応性が高く、様々な疾患をもたらすことが明らかとなり、盛んに研究が進められている。このようなヒドロキシラジカルは脂質に作用して脂質ラジカルを生成することが知られている。
【０００５】
脂質ラジカルは反応性が高く不安定なため、脂質ラジカルが生成すると連鎖的脂質過酸化反応が起こり、脂質過酸化物が発生し、さらに代謝産物として求電子性の化合物が生成される。脂質は不飽和脂肪酸を多く含み、その活性メチレン部分の水素原子が引き抜かれるためフリーラジカルによる攻撃を受け易く、反応式（ａ）〜（ｃ）に示す過程から構成される脂質過酸化連鎖反応が誘発される（図１）。
【０００６】
【数１】
2018189446.tif 000002
【０００７】
フリーラジカル（R・）が不飽和脂肪酸（LH）から水素元素を引き抜き、連鎖反応が開始され（ａ）；生成した脂質ラジカル（L・）と酸素分子との反応により脂質ペルオキシルラジカル（LOO・）が生成し（ｂ）；そして、脂質ペルオキシルラジカルが周囲の不飽和脂肪酸から水素原子を引き抜き、脂質ペルオキシド（LOOH）と脂質ラジカル（L・）が生成する（ｃ）。再生された脂質ラジカル（L・）により次の連鎖反応サイクルが開始される。
【０００８】
脂質ペルオキシド（LOOH）は、その代謝産物として、マロンジアルデヒド、４−ヒドロキシ−２−ノネナール、アクロレイン、プロパナール、グリオキサールをはじめとする数百種類以上の求電子性化合物に転換される。
これらの代謝産物は、単独で、またはタンパク質との複合体を形成して、それぞれが、細胞毒性、炎症、変異原性を有することが分かっている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
非特許文献１  ：Hollyfield JG. et al., Nat. Med., 14:194, 2008
非特許文献２  ：Schutt F. et al. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 44:3663, 2003
非特許文献３  ：Verna L, et al., Pharmacol. Ther., 71:57, 1996 
非特許文献４  ：Park JE, et al., Cell, 140:197, 2010
非特許文献５  ：Maeda S, et al., Cell, 121:977, 2005
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
例えば、網膜には不飽和脂肪酸が多く、かつ、目は常に太陽光を浴びていることからROSが大量に発生している。その結果、網膜では脂肪酸の過酸化反応が恒常的に生じている。実際、網膜内から、脂質過酸化物およびその代謝産物として、マロンジアルデヒド、４−ヒドロキシ−２−ノネナール、アクロレイン、プロパナール、グリオキサールなどが検出されている。さらに、これらの化合物とタンパク質との複合体が加齢性黄斑変性（age-related macular degeneration; AMD）の原因物質となることが報告されている［非特許文献１］。このような複合体の種類は膨大であり、実際に、AMD患者の網膜では極めて多数の分子が修飾されていることが分かった［非特許文献２］。
【００１１】
このように、AMDを例としただけでも、予防または治療するためにはひとつひとつの原因物質を阻害していかなければならず、根幹的な対応とは言えない。そこで、本発明者らが、初めて、AMD発症・進展経路を推定し、体系的かつ網羅的にまとめた（図２）。
すると、本発明者らは、個別に脂質過酸化物の代謝産物を標的とするのではなく、脂質過酸化物を生成する前駆体である脂質ラジカルを標的とすれば、一連の反応で生じる化合物に起因する疾患を網羅的に予防または治療できることを明らかにした。
【００１２】
マロンジアルデヒド、４−ヒドロキシ−２−ノネナール、アクロレイン、プロパナール、グリオキサールなどの代謝産物は安定な化合物であるので、その構造解析や機能研究は比較的容易であるが、脂質ラジカルは本質的に不安定な物質であり、発生したらすぐさま、連鎖反応により、脂質ペルオキシルラジカル、脂質過酸化物、代謝産物へと転換されるため、脂質ラジカルを同定することは実質的に不可能であった。
【００１３】
そこで、本発明者らは、脂質ラジカル誘発性の各種の疾患を予防または治療するために、不安定な脂質由来のラジカルを捕捉し、それらのラジカルの構造を解析する方法を提供することを課題とした。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、酸化ストレスを受けた生体に構造式（１）： 
【００１５】
【化１】
2018189446.tif 000003
で示される蛍光ニトロキシド2,2,6-trimethyl-4-(4-nitrobenzo[1,2,5]oxadiazol-7-ylamino)-6-pentylpiperadine-1-oxyl (NBD-Pen)を作用させることにより、生体から抽出した脂質抽出物を分析すれば、脂質ラジカルまたは断片化した脂質のラジカル（断片ラジカル）を捕捉することができ、蛍光検出液体クロマトグラフィー（LC/FL）および質量分析（MS）を組み合わせて、脂質抽出物に含まれる脂質由来ラジカルを同定できることを見出した。
【発明の効果】
【００１６】
蛍光ニトロキシドを用いるLC/FL/MSを組み合わせることにより、生体内で誘発される脂質ラジカルまたはその断片ラジカルを捕捉し、それらの構造を解析することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】脂質過酸化反応を説明する概略図。
【図２】本発明者による加齢黄斑変性（AMD）発症・進展経路。
【図３】NBD-ニトロキシドの活性酸素種および脂質ラジカルとの反応性を示すグラフ。
【図４】NBD-Penの活性酸素種および脂質ラジカルとの反応性を示すグラフ。
【図５】ニトロキシドによる脂質ラジカルの刺激抑制を示すグラフ。
【図６】ニトロキシドによる脂質ラジカルの肝細胞がん誘発抑制を示す概略図（ａ）および腫瘍数のグラフ（ｂ）。
【図７】本発明による脂質ラジカルの蛍光検出の概念図。
【図８】本発明のひとつの具体例のLC/FL/MSシステムの概略図。
【図９】AAPH刺激によるアラキドン酸（AA）由来のラジカル体の検出結果。
【図１０】AAPH刺激によるドコサヘキサエン酸（DHA）由来のラジカル体の検出結果。
【図１１】NBD-Penによる肝細胞がんモデルマウス内で誘発されたラジカル体の検出結果。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
参考例１：蛍光ニトロキシドの開発
本発明者らは、構造式（２）：
【００１９】
【化２】
2018189446.tif 000004
で示されるTEMPO系ニトロキシド2,2,6,6-tetramethylpiperadine-N-oxylの2,6位置換体の新規合成法を開発し、ラジカル周辺にアルキル鎖を導入すれば、脂質親和性と脂質過酸化抑制能が上昇し、効率的に脂質ラジカルを捕捉できることを見出した。
【００２０】
また、ニトロキシド（NO・）は、常磁性を有する安定なラジカルであり、電荷分離状態を伴う光誘起電子移動や電子−スピン交換による項間交差によって蛍光を減弱させる性質を有する。ニトロキシドに蛍光発色団が共有結合した蛍光性ニトロキシドは、分子内消光状態にある。ところが、ニトロキシドがフリーラジカルと反応して常磁性を喪失すれば、蛍光発光状態となることが確認された。すなわち、蛍光性ニトロキシドは、蛍光観測により、脂質ラジカルの捕捉を検出するプローブとして有用である。
【００２１】
本発明者らは、TEMPO系ニトロキシドの4位カルボニル基をアミノ基に変換し、構造式（３）：
【００２２】
【化３】
2018189446.tif 000005
で示される蛍光発色団7-ニトロソベンゾフラザン（7-nitrobenzofurazan; NBD）を共有結合させて、TEMPO系ニトロキシドのラジカル部位との近接性を持たせるようにした。
【００２３】
検出対象とする脂質分子の大部分は生体膜内に存在し、疎水性環境を形成している。そのため、親水的環境では蛍光が減弱しているが、疎水的な環境において選択的に高い蛍光を発する環境応答性の蛍光発色団が最適である。そのため、本発明者らは、蛍光発色団として生体膜の相転移や膜融合、あるいは細胞内脂質代謝など、脂質分野で広く用いられているNBDを選択した。
【００２４】
NBD誘導体の励起波長はおよそ470 nmであり、アルゴンレーザー励起 (488 nm)に適しているため、蛍光顕微鏡を用いたイメージングへと展開できるため、非常に有利である。さらに、発光極大が約530 nmであり、生体内物質による自家蛍光を軽減できる観点からもNBD誘導体を使用することは有利である。
【００２５】
本発明者らは、TEMPO系ニトロキシドのラジカル部位の近傍に鎖状アルキル基を導入することにより、化合物の脂質親和性や立体障害が変化し、結果として脂質ラジカルを効率よく捕捉できることを見出した。例えば、ニトロキシドの2位（または6位）のアルキル鎖を伸ばせば、脂質過酸化抑制能が上昇した。
【００２６】
本発明者らは、脂質反応性が高いNBD-ニトロキシドとして、2,6位をそれぞれ２つのメチル基またはエチル基で置換した化合物Ａ（NBD-Me）および化合物Ｂ（NBD-Et）、ならびに、2位を２つのメチル基で、6位をメチル基とペンチル基で置換した化合物Ｃ（NBD-Pen）を合成した。
【００２７】
【化４】
2018189446.tif 000006
【００２８】
2位（または6位）に結合する２つのアルキル基のうち一方のアルキル基を伸長すると、脂質ラジカルとの反応性が高くなり、ニトロキシド誘導体と脂質との複合体が熱的に安定であることが分かった。すなわち、化合物ＡからＣの中では、化合物ＣのNBD-Penが優位であった。
【００２９】
参考例２：NBD-ニトロキシドの脂質ラジカルの検出感度
（１）NBD-ニトロキシドの活性酸素種および脂質ラジカルとの反応性
上記３種類のNBD-ニトロキシド（NBD-Me、NBD-EtおよびNBD-Pen）の反応選択性を検討するために、種々のROSと脂質ラジカルとの反応性を蛍光にて評価した。
過酸化水素、次亜塩素酸、スーパーオキシドアニオンラジカル、ヒドロキシラジカルあるいは一酸化窒素に、各NBD-ニトロキシドを反応させた場合、いずれのニトロキシドでも蛍光はあまり増加しなかった。また、これらの化合物との反応において、各ニトロキシド間で蛍光強度に大きな差は認められず、2,6位-置換基による違いはなかった。一方、リノール酸（LA）、α−リノレン酸（ALA）、アラキドン酸（AA）につきリポキシゲナーゼ（lipoxygenase; LOX）を用いて発生させた脂質ラジカルに、各NBD-ニトロキシドを反応させると、その蛍光強度は著しく上昇し、脂質ラジカルを選択的にかつ高感度に検出できることが分かった。特に、NBD-Penを用いたとき、蛍光強度は脂質ラジカルとの反応により約１０〜２６倍上昇することがわかった（図３）。
【００３０】
（２）NBD-Penの活性酸素種および脂質ラジカルとの反応性
脂質ラジカルの蛍光検出につき、最も感度が高いNBD-Penの反応性について、さらに調べた。
過酸化水素、次亜塩素酸、スーパーオキシドアニオンラジカルあるいはヒドロキシラジカルにNBD-Penを反応させた場合、上記と同じ結果が再現され、蛍光はあまり増加しなかった。一方、LA、ALA、AAにつき、それぞれ、リポキシゲナーゼ（lipoxygenase; LOX）、2, 2’-アゾビス（2-メチルプロピオンアミジン）ジヒドロクロリド（2, 2’-azobis(2-methylpropion amidine) dihydrochoride; AAPH）、2,2’-アゾビス（4-メトキシ-2,4’-ジメチルバレロニトリル（2,2’-azobis(4-methoxy-2,4’-dimethylvaleronitorile; MeO-AMVN)のいずれかのラジカル誘発剤で活性化して誘発した脂質ラジカルに、NBD-Penを反応させると、蛍光強度は著しく上昇した（図４）。
【００３１】
参考例３：NBD-ニトロキシドの細胞毒性
ヒト臍帯静脈内皮細胞（human umbilical vein endothelial cell; HUVEC）を用いて、NBD-ニトロキシドの細胞毒性評価を行った。HUVECに各濃度の化合物を添加し、24 時間インキュベート後の生細胞数を測定したところ、いずれのNBD-ニトロキシドでも10 μMまで細胞毒性は認められなかった。
【００３２】
参考例３：脂質ラジカルの肝細胞がん誘発の可能性
また、ジエチルニトロソアミン（diethylnitrosamine; DEN）は、シトクロムP450により代謝的に活性化されて炭素中心ラジカルを生じる。このラジカルがDNAをアルキル化して、肝細胞がんを誘発することが知られている［非特許文献３］。
【００３３】
【化５】
2018189446.tif 000007
【００３４】
DENを用いて肝細胞がんモデルマウスを作製する研究において、肥満マウスの発がん率が高いこと［非特許文献４］、肝細胞がんモデルマウスの体内にROSが多量に蓄積されること［非特許文献５］がすでに知られている。
本発明者らは、上記の２つの知見から、ROSが脂質を活性化して脂質ラジカルを生じ、このような脂質ラジカルも肝細胞がんを誘発すると推測した。
【００３５】
本発明者らは、ラットにDENを投与して１時間後には脂質ラジカルが発生することを確認していたが、脂質ラジカルが肝細胞がんを誘発するか否かを不明であった。
【００３６】
そこで、脂質ラジカル発生の阻害が肝細胞がん発生に影響するかを調べた。本発明者らは、まず、ニトロキシド化合物Ｄ（4-hydroxy-2,2,6-trimethyl-6-pentylpiperidine-1-oxyl; OH-Pen）とニトロキシド化合物Ｄのニトロキシドの部分にメチル基を修飾して脂質ラジカル捕捉能を欠如したピペリジン化合物Ｅ（4-hydroxy-1-methoxy-2,2,6-trimethyl-6-pentylpiperidine-1-oxyl; OH-Pen-NOMe）を合成した。OH-PenはNBD-Penの蛍光発色団が未結合の化合物である。
【００３７】
【化６】
2018189446.tif 000008
【００３８】
６週齢の雄ラット（F344）を４群に分け、対照として、第１群のラットに対して、腹腔内注射により、生理食塩水（PBS）を投与した。第２〜４群のラットに対して、腹腔内注射により100 mg/kgにてDENを投与した。
【００３９】
DEN投与の１時間後に、腹腔内注射により、第２群のラットに対して生理食塩水を投与し、第３群のラットに対して、4 ml/kgにて500 μMのOH-Pen溶液を投与し、第４群のラットに対して、4 ml/kgにて500 μMのOH-Pen-NOMe溶液を投与した。
【００４０】
DEN投与の２４時間後に、各群のラットから肝臓を摘出し、脂質抽出を行った。抽出物につき、脂質過酸化物マーカーとしてマロンジアルデヒド; MDA、肝障害マーカーとしてアラニントランスアミナーゼ（グルタミン酸ピルビン酸転移酵素; ALT(GPT)）、炎症マーカーとしてインターロイキン−6; IL-6の量を測定した。結果を図５に示す。
【００４１】
上記結果から明らかなように、対照（第１群）と比較して、DEN投与により各マーカー値は上昇するが（第２群）、脂質ラジカル捕捉能を有するOH-Penを投与すると、各マーカー値は顕著に低下した（第３群）。一方、脂質ラジカル捕捉能を欠如するOH-Pen-NOMeを投与した場合、各マーカー値の低下はほぼなかった（第４群）。
【００４２】
DEN投与の３か月後に、各群のラットに3種混合麻酔をかけ、犠牲にして、速やかに肝臓を取り出した。各群のラットから取り出した肝臓の写真を図６ａに示し、腫瘍巣数を計測した結果を図６ｂに示す。
【００４３】
上記結果から明らかなように、DEN投与により肝細胞がんが誘発されるが（第２群）、脂質ラジカル捕捉能を有するOH-Penを投与すると、肝細胞がん発生が抑制された（第３群）。一方、脂質ラジカル捕捉能を欠如するOH-Pen-NOMeを投与した場合、肝細胞がん発生は全く抑制されなかった（第４群）。
【００４４】
実施例１
（１）実験の目的
上記の参考例で、NBD-Penは、脂質ラジカル捕捉能、脂質ラジカルを捕捉した際の蛍光感度および、10 μM以下の濃度にて細胞毒性がないことが確認された。
本発明者らは、脂質ラジカル捕捉能を有するNBD-ニトロキシドを用いれば、生体内で誘発された脂肪ラジカルを捕捉して構造解析ができると予測した。
上記のように、生体内の脂質が脂質ラジカルとなり、連鎖反応により脂質過酸化物、さらには、代謝産物などが疾患に関連することが分かったが、今まで観測することができなかった脂肪ラジカルの構造解析が可能になれば、生体内に存在する脂質およびその誘導体と疾患との関連性を網羅的に解析することが可能になる。
【００４５】
（２）NBD-Penによる脂質ラジカルのイン・ビトロ捕捉
本発明者らは、NBD-Penが脂質ラジカル（L・）を捕捉して、ラジカル付加体NBD-Pen-Lが形成されれば、蛍光クロマトグラムおよび質量分析を組み合わせて、捕捉された脂質（LH）の構造解析ができると考えた。
例えば、サンプル中に、それぞれ、R1, R2およびR3基を有する３種類のラジカル種が含まれていると場合、NBD-Penを作用させたサンプルの液体クロマトグラムを蛍光で観察し、各カラム保持時間にて得られた画分を質量分析すれば、R1, R2およびR3の構造を解析することができる。本発明によるこのような脂質ラジカルの蛍光検出の概念図を図７に示す。
【００４６】
この実施例においては、2, 2’-アゾビス（2-メチルプロピオンアミジン）ジヒドロクロリド（AAPH）で、オメガ−６脂肪酸として、リノール酸（linoleic acid; LA）およびアラキドン酸（arachidonic acid; AA）、ならびに、オメガ−３脂肪酸として、α−リノレン酸（alpha-linolenic acid; ALA）、エイコサペンタエン酸（eicosapentaenoic acid; EPA）、ドコサヘキサエン酸（docosahexanoic acid; DHA）を活性化して脂質ラジカルを誘発した。
各脂肪酸100 mMのエタノール溶液を調製し、これにリン酸緩衝液を添加して最終濃度 (500 μM)まで希釈した。これらの脂肪酸溶液に、リン酸緩衝液中50 mMのAAPH溶液を添加した。
【００４７】
【化７】
2018189446.tif 000009
【００４８】
脂質ラジカルを誘発した溶液にNBD-Penを反応させ、反応溶液から脂質抽出した。抽出物につき、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）に蛍光（FL）および質量分析器（MS）を統合したLC/FL/MSシステムを用いて解析した。
本発明のひとつの具体例のLC/FL/MSシステムの概略図を図８に示す。LC/FL/MSシステム１は、ポンプ１１、バルブ１２、ＨＰＬＣカラム１３、蛍光検出器１４、バルブ１５、質量分析用イオン源１６およびイオン検出器１７ならびに、バルブ１２を経由してカラム１３にサンプルを供給するサンプラー１８を含む。また、蛍光検出器から流れ出るサンプル溶液は、質量分析を行わない場合、バルブ１５を経由して廃棄することができる。
【００４９】
本発明において限定されることなく適宜選択することができるが、この実施例において、40℃にて0.4 ml／分の速度にて移動相（Ａ：H2O中5.0 mM 酢酸アンモニウム、Ｂ：ACN:H2O (95:5)中5.0 mM 酢酸アンモニウム）で溶出するGL Science社製InertSusteain C18分析カラム（粒子径3 μm ＥＳシリカ充填、2.0 x 150 mm）に、10 μLのサンプル液を注入して、HPLC分析を行う。移動相溶出の時間プログラムは、Ｂ％：０〜２２分；６０％、２２〜６０分；８０％、６０〜７０分；１００％とした。
【００５０】
溶出してきた各画分につき、蛍光検出器（株式会社 島津製作所製 RF-20A xs）にて、励起波長（470 nm）および発光波長（530 nm）でNBD-Pen由来の蛍光観測を行った。
また、得られた各画分を、エレクトロスプレーイオン化（ESI）により、イオン検出器（Thermo Fisher Scientific社製Q ExactiveTM Hibrid Quadrupole-OrbitrapTM MS）に導入して質量分析を行った。
LC/FL部位において観測された蛍光ピークと、そのカラム保持時間における精密質量分析結果とを照合することで、ラジカル付加体の構造を解析した。
【００５１】
すると、驚くべきことに、オメガ−６脂肪酸としてアラキドン酸（AA）の溶液からは、NBD-Penにアラキドン酸ラジカルが付加した付加体（NBD-Pen-AA）、そこに酸素１分子が結合した付加体（NBD-Pen-AA-O1）および酸素２分子が結合した付加体（NBD-Pen-AA-O2）の３種類の新たな付加体のみならず、NBD-Penに・C5H11,・C8H15,・C7H13Oが付加した付加体を含む２５種類の付加体が得られ、そのうちの２３種類は新たな付加体であった（図９）。
また、オメガ−３脂肪酸としてドコサヘキサエン酸（DHA）の溶液からは、NBD-Penにドコサヘキサエン酸ラジカルが付加した付加体（NBD-Pen-DHA）およびそこに酸素１分子が結合した付加体（NBD-Pen-DHA-O1）ならびに酸素２分子が結合した新たな付加体（NBD-Pen-AA-O2）の３種類の付加体のみならず、NBD-Penに・C5H9,・C4H7O,・C7H11Oが付加した付加体を含む３７種類の付加体が得られ、そのうちの３５種類は新たな付加体であった（図１０）。
表１に、本発明の方法により取得された、LA (18:2n-6), AA (20:4n-6), ALA (18:3n-3), EPA (20:5n-3)およびDHA (22:6n-3)の各脂質由来のラジカル付加体を構成するラジカル体をまとめた。
【００５２】
この明細書において、「ラジカル体」とは、脂質自体のラジカル（脂質ラジカル）および断片化した脂質のラジカル（脂質断片ラジカル）を意味する。また、NBD-ニトロキシド（NBD-Me, NBD-Et, NBD-Pen）にラジカル体が付加した付加体：
【００５３】
【化８】
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を、総括的に「NBD-ニトロキシド-R（NBD-Me-R, NBD-Et-R, NBD-Pen-R）」と表記し、例えば、NBD-Penに脂質ラジカルが付加した付加体を「NBD-Pen-L」と表記することがある。
【００５４】
【表１】
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【００５５】
AAPHでラジカル誘発したリノール酸（LA）をNBD-Penを用いるLC/FL/MS解析を行ったところ、新たに、NBD-Pen-R（式中、Rは、CH3, C2H5, C3H7, C4H9,C6H13, C7H13, C7H13O, C8H15O, C9H15, C9H15O2, C9H13O3, C10H17O, C11H19O2, およびC12H21O2よりなる群から選択される。）で示される化合物を得た。
【００５６】
AAPHでラジカル誘発したアラキドン酸（AA）をNBD-Penを用いるLC/FL/MS解析を行ったところ、新たに、NBD-Pen-R（式中、Rは、AA-O2, CH3, C2H5, C3H7, C4H9, C6H13, C6H9O3, C7H13, C7H13O, C8H13O2, C8H15O, C9H17, C9H15O2, C9H13O3, C10H17O, C11H19, C11H17O, C11H19O, C11H19O2, C12H19O, C12H19O2, C13H19O2, C14H21O, C14H23O, およびC15H23Oよりなる群から選択される。）で示される化合物を得た。
【００５７】
AAPHでラジカル誘発したα−リノレン酸（ALA）をNBD-Penを用いるLC/FL/MS解析を行ったところ、新たに、NBD-Pen-R（式中、Rは、ALA-O2, CH3, C5H9O, C6H9O, C6H11O, C7H11O, C8H13, C8H11O, C8H11O3, C8H13O, C9H13O, C9H13O2, C10H15O, C11H17, C11H15O, C11H17O, C11H15O3, C15H21O2, およびC15H21O3よりなる群から選択される。）で示される化合物を得た。
【００５８】
AAPHでラジカル誘発したエイコサペンタエン酸（EPA）をNBD-Penを用いるLC/FL/MS解析を行ったところ、新たに、NBD-Pen-R（式中、Rは、EPA-O2, CH3, C5H9O, C6H9O, C6H11O, C7H11O, C8H13, C8H11O, C8H11O3, C8H13O, C9H13O, C9H13O2, C10H15O, C11H17, C11H15O, C11H17O, C11H15O3, C12H17O, C12H17O2, C14H21O, C14H19O, C15H21O, C15H21O2, C15H21O3, C17H23O, およびC18H25Oよりなる群から選択される。）で示される化合物を得た。
【００５９】
AAPHでラジカル誘発したドコサヘキサエン酸（DHA）をNBD-Penを用いるLC/FL/MS解析を行ったところ、新たに、NBD-Pen-R（式中、Rは、DHA-O2, CH3, C5H9O, C6H9O, C6H11O, C7H11O, C8H13, C8H11O, C8H11O3, C8H13O,C9H13O, C9H13O2, C10H15O, C11H17, C11H15O, C11H17O, C11H15O3, C12H17O, C12H17O2, C14H21O, C14H19O, C15H21O, C15H21O2, C15H21O3, C17H23O, C18H25O, およびC21H31O4よりなる群から選択される。）で示される化合物を得た。
【００６０】
さらなる解析によって、オメガ−３脂肪酸につき構造特定された化合物のＲとして、少なくともC5H9, C5H9O, C6H9O, C6H11O, C7H11O, C8H13, C8H11O, C8H11O3, C10H15O, C11H17, C11H15O, C11H17Oが共通し、オメガ−６脂肪酸につき構造特定された化合物のＲとして、少なくともC5H11, C6H13, C7H13, C7H13O, C8H15, C8H15O, C9H15,C10H17Oが共通し、かつ、オメガ−３脂肪酸に対する共通構造とオメガ−６脂肪酸に対する共通構造とは相違することが分かった。
【００６１】
また、オメガ−６脂肪酸のなかでも、アラキドン酸（AA）につき構造特定された化合物のＲとして、少なくともC8H15, C8H15O, C11H19, C11H17O, C11H19O, C11H19O2, C12H19O, C12H19O2, C12H19O2, C13H19O2, C14H21O, C14H23O, C15H23Oは、リノール酸（LA）につき構造特定された化合物とは相違することが分かった。
【００６２】
実施例２
（１）実験の目的
実施例１により、NBD-Penを用いるLC/FL/MS解析によれば、得られたラジカル体の組合せにより、未知のサンプルに含まれる脂肪酸を識別することができる可能性が示唆された。
そこで、NBD-Penを用いるLC/FL/MS解析により、マウスの生体内で産生されたラジカル体を検出する。
【００６３】
（２）NBD-Penによる肝細胞がんモデルマウス内で誘発された脂質ラジカルの捕捉
８週齢の雄マウス（C57BL/6J）を２群に分け、対照として、第１群のマウスに対して、腹腔内注射により、生理食塩水（PBS）を投与した。第２群のマウスに対して、腹腔内注射により１００ｍｇ／ｋｇにてDENを投与した。
【００６４】
DEN投与の４時間後に、腹腔内注射により、第１および２群のマウスに対して、4 ml/kgにて500 μMのNBD-Pen溶液を投与した。
NBD-Pen投与の１５分間後に、各群のマウスから肝臓を摘出し、脂質抽出を行った。抽出物につき、実施例１と同様の条件でLC/FL/MS解析を行った。LC/FL部位において観測された蛍光ピークと、そのカラム保持時間における精密質量分析結果とを照合することで、ラジカル付加体の構造を解析した。結果を表２および図１１に記載する。
【００６５】
【表２】
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【００６６】
表２からわかるように、オメガ−６脂肪酸の識別マーカーであるNBD-Pen- C5H11が検出され、さらに、NBD-Pen- C8H15が検出されたことから、アラキドン酸（AA）の生成が確認された。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明の蛍光性ニトロキシドを用いれば、生体内において活性酸素種（ROS）により誘発される脂質由来のラジカルを捕捉し、それらのラジカル構造を解析することが可能となった。この手法によって、加齢性黄斑変性、肝細胞がんなど脂質ラジカルに起因する疾患との関連性を解明することができる。
【符号の説明】
【００６８】
１    LC/FL/MSシステム
１１  ポンプ
１２  バルブ
１３  液体クロマトグラフィー用カラム
１４  蛍光検出器
１５  バルブ
１６  質量分析用イオン源
１７  質量分析用イオン検出器
１８  サンプラー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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