(57)【要約】【課題】液体培地と含フッ素溶媒とを用いる細胞培養によってサイトカインを効率良く製造する方法を提供する。【解決手段】含フッ素アルカン、含フッ素オレフィン、含フッ素アルキルエーテル及び含フッ素アルキルアミンからなる群から選択される少なくとも１種の含フッ素溶媒と、液体培地との界面で細胞を培養することを含むサイトカインの製造方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
含フッ素アルカン、含フッ素オレフィン、含フッ素アルキルエーテル及び含フッ素アルキルアミンからなる群から選択される少なくとも１種の含フッ素溶媒と、液体培地との界面で細胞を培養することを含むサイトカインの製造方法。
【請求項２】
前記含フッ素溶媒の２５℃における水への溶解度が５０ｇ／Ｌ以下である請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記細胞が、付着性細胞である請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記細胞が、幹細胞である請求項１から３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項５】
前記サイトカインが、インターロイキン、インターフェロン、造血因子、細胞増殖因子、細胞傷害因子、アディポカイン及び神経栄養因子からなる群から選択される少なくとも１種を含む請求項１から４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
前記含フッ素溶媒に気体を供給することを含む請求項１から５のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項７】
前記気体が酸素、一酸化窒素、二酸化窒素、窒素、一酸化炭素、二酸化炭素、水素および硫化水素からなる群から選択される少なくとも１種を含む請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
前記サイトカインを回収することを含む請求項１から７のいずれか１項に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サイトカインの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
液体培地と特定の含フッ素アルキルアルコールとの界面でマウスメラノーマ細胞株を培養すると、細胞伸展を起こさずに、細胞の球状化または細胞シートの形成が起きることが知られている（例えば、非特許文献１及び２参照）。また含フッ素溶媒の酸素溶解性を利用して、培地と含フッ素溶媒との存在下で細胞を懸濁培養する技術が知られている（例えば、特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開平１１−１８７８６８号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】J. Fluorine Chem., 132(2011), 978-981.
【非特許文献２】J. Fluorine Chem., 163(2014), 46-49.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、液体培地と含フッ素溶媒とを用いる細胞培養によってサイトカインを効率良く製造する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するための具体的手段は以下の通りである。
第一の態様は、含フッ素アルカン、含フッ素オレフィン、含フッ素アルキルエーテル及び含フッ素アルキルアミンからなる群から選択される少なくとも１種の含フッ素溶媒と、液体培地との界面で細胞を培養することを含むサイトカインの製造方法である。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、液体培地と含フッ素溶媒とを用いる細胞培養によってサイトカインを効率良く製造する方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】含フッ素溶媒の細胞毒性評価の結果を示すグラフである。
【図２】２相系培養における細胞（ｈＭＳＣ）への影響を示すグラフである。
【図３】２相系培養でマウス脂肪由来幹細胞から産生されたＰＧＥ２量を示すグラフである。
【図４】２相系培養でマウス脂肪由来幹細胞から産生されたＶＥＧＦ量を示すグラフである。
【図５】２相系培養でマウス脂肪由来幹細胞から産生されたＩＬ−６量を示すグラフである。
【図６】２相系培養でマウス脂肪由来幹細胞から産生されたＴＧＦ−β１量を示すグラフである。
【図７】２相系培養でマウス脂肪由来幹細胞から産生されたＩＬ−１０量を示すグラフである。
【図８】界面活性剤が添加された２相系培養でマウス脂肪由来幹細胞から産生されたＰＧＥ２量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
［サイトカインの製造方法］
本発明のサイトカインの製造方法は、含フッ素アルカン、含フッ素オレフィン、含フッ素アルキルエーテル及び含フッ素アルキルアミンからなる群から選択される少なくとも１種の含フッ素溶媒と、液体培地との界面で細胞を培養することを含む製造方法である。細胞を特定の含フッ素溶媒と液体培地との界面で、細胞が含フッ素溶媒に接触した状態で培養することで、細胞からサイトカインが産生され、これを回収することで効率よく所望のサイトカインを製造することができる。
【００１０】
含フッ素溶媒と液体培地との混合物は、液体培地を構成する水に対する含フッ素溶媒の溶解性が小さく、またその密度が水よりも大きいため、含フッ素溶媒を下層とする２相に分離して、含フッ素溶媒と液体培地との間に界面が形成される。この２相系の界面に細胞を配置して培養すると、細胞増殖において付着依存性を示す細胞であっても細胞が増殖し、場合により細胞凝集塊を形成して、細胞本来の機能が充分に発現されると考えられる。また、含フッ素溶媒の流動性、官能基、表面張力等により通常のポリスチレン製細胞培養皿とは異なる細胞形態をとり、細胞機能が変化していると考えられる。これらにより効率的にサイトカインが産生されると考えられる。
【００１１】
（含フッ素溶媒）
含フッ素溶媒は、含フッ素アルカン、含フッ素オレフィン、含フッ素アルキルエーテル及び含フッ素アルキルアミンからなる群から選択される少なくとも１種からなる。特定構造の含フッ素溶媒を用いて２相系培養を行うことで、通常のポリスチレン製細胞培養皿とは異なる細胞形態で細胞が培養され、サイトカインの製造効率がより向上する傾向がある。含フッ素溶媒は１種からなっていてもよく、２種以上の混合物であってもよい。
【００１２】
含フッ素溶媒は、液体培地との相分離の観点から、分子量中のフッ素原子の総含有率であるフッ素含量が、５０質量％以上が好ましく、６０質量％以上がより好ましい。またフッ素含量は、例えば８５質量％以下であり、８０質量％以下が好ましい。
【００１３】
含フッ素溶媒の２５℃における水に対する溶解度は、液体培地との相分離の観点から、５０ｇ／Ｌ以下が好ましく、１０ｇ／Ｌ以下がより好ましく、５ｇ／Ｌ以下が特に好ましい。水に対する溶解度の下限値は、例えば０ｇ／Ｌである。
【００１４】
含フッ素溶媒の沸点は、細胞培養条件で液体である限り特に限定されない。含フッ素溶媒の沸点は、例えば４℃以上であり、４０℃以上が好ましい。また含フッ素溶媒の沸点は、例えば３００℃以下であり、２００℃以下が好ましい。
【００１５】
含フッ素溶媒の粘度は特に限定されない。含フッ素溶媒の粘度は、例えば２５℃において、０．４ｍＰａ・ｓ以上であり、０．４４ｍＰａ・ｓ以上が好ましい。また含フッ素溶媒の粘度は、例えば２０００ｍＰａ・ｓ以下であり、５０ｍＰａ・ｓ以下が好ましい。
【００１６】
含フッ素溶媒の密度は特に限定されない。含フッ素溶媒の密度は、例えば２５℃において、１．０ｇ／ｍＬ超であり、１．１ｇ／ｍＬ以上が好ましく、細胞より十分に重い事が好ましいことから特に好ましくは１．２ｇ／ｍＬである。また含フッ素溶媒の密度は、例えば３．０ｇ／ｍＬ以下であり、２．０ｇ／ｍＬ以下が好ましい。
【００１７】
含フッ素溶媒の表面張力は特に限定されない。含フッ素溶媒の表面張力は、例えば２５℃において、１０ｍＮ／ｍ以上であり、１３ｍＮ／ｍ以上が好ましい。また含フッ素溶媒の表面張力は、例えば８０ｍＮ／ｍ以下であり、１００ｍＮ／ｍ以下が好ましい。 
【００１８】
含フッ素溶媒としての含フッ素アルカンは、直鎖状、分岐鎖状及び環状のいずれであってもよい。含フッ素アルカンの炭素数は、例えば５〜２０であり、６〜１０が好ましい。含フッ素アルカンはアルカンの水素原子のすべてがフッ素原子に置き換わったペルフルオロアルカンでもよいし、水素原子の一部がフッ素原子に置き換わったハイドロフルオロアルカンでもよい。
含フッ素アルカンとして具体的には、ペルフルオロヘキサン、ペルフルオロヘプタン、ペルフルオロオクタン、ペルフルオロノナン、ペルフルオロデカン、ペルフルオロメチルシクロヘキサン、ペルフルオロ（１，３−ジメチルシクロヘキサン）、ペルフルオロデカリン、１，１，１，２，２，３，３，４，４，５，５，６，６−トリデカフルオロオクタン、１，１，１，２，２，３，３，４，４，５，５，６，６−トリデカフルオロヘキサン、１，１，１，２，２，３，３，４，４−ノナフルオロヘキサン、１，１，１，２，２，３，４，５，５，５−デカフルオロペンタン、１，１，２，２，３，３，４−ヘプタフルオロシクロペンタン、３Ｍ社製のＦＣ−８７、ＦＣ−８４、ＦＣ−７７、ペルフルオロケロセン等が挙げられ、これからなる群から選択される少なくとも１種が好ましい。
【００１９】
含フッ素オレフィンは、直鎖状、分岐鎖状及び環状のいずれであってもよいが、直鎖状又は分岐鎖状が好ましい。含フッ素オレフィンの炭素数は、例えば５〜２０であり、６〜１０が好ましい。含フッ素オレフィンに含まれる不飽和結合数は、例えば１〜１０であり、１〜５が好ましい。含フッ素オレフィンはオレフィンの水素原子のすべてがフッ素原子に置き換わったペルフルオロオレフィンでもよいし、水素原子の一部がフッ素原子に置き換わったハイドロフルオロオレフィンでもよい。
含フッ素オレフィンとして具体的には、ペルフルオロシクロペンテン、ペルフルオロシクロヘキセン、ペルフルオロシクロヘプテン、ペルフルオロシクロオクテン、ペルフルオロシクロノネン、ペルフルオロシクロデセン、１−クロロ−３，３，３−トリフルオロプロペン、１−クロロ−２，３，３−トリフルオロプロペン、１，１，１，２，２，３，５，５，６，６，７，７，７−トリデカフルオロ−４−メトキシ−３−ヘプテン等が挙げられ、これからなる群から選択される少なくとも１種が好ましい。
【００２０】
含フッ素アルキルエーテルは、酸素原子に結合する２つのアルキル基のうち少なくとも一方にフッ素原子が１以上置換していればよい。含フッ素アルキルエーテルを構成するフッ素原子で置換されていてもよいアルキル基部分は、直鎖状、分岐鎖状及び環状のいずれであってもよいが、直鎖状又は分岐鎖状が好ましい。含フッ素アルキルエーテルに含まれるアルキル基部分の炭素数は、例えば５〜２０であり、６〜１０が好ましい。含フッ素アルキルエーテルに含まれるフッ素原子で置換されていてもよいアルキル基部分は同一であっても、異なっていてもよい。含フッ素アルキルエーテルはアルキルエーテルの水素原子のすべてがフッ素原子に置き換わったペルフルオロアルキルエーテルでもよいし、水素原子の一部がフッ素原子に置き換わったハイドロフルオロアルキルエーテルでもよい。
含フッ素アルキルエーテルとして具体的には、１，１，２，２−テトラフルオロエチル−２，２，２−トリフルオロエチルエーテル、１−メトキシ−１，１，２，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン、１−エトキシ−１，１，２，２，３，３，４，４，４−ノナフルオロブタン、３−メトキシ−１，１，１，２，２，３，４，４，５，５，６，６，６−トリデカフルオロヘキサン、１−メトキシ−１，１，２，２，３，３，４，４，５，５，６，６，６−トリデカフルオロヘキサン、メチルノナフルオロイソブチルエーテル、エチルノナフルオロブチルエーテル、エチルノナフルオロイソブチルエーテル、１、１、１、２、２、３、４、５、５、５−デカフルオロ−３−メトキシ−４−(トリフルオロメチル)ペンタン、ＳＯＬＶＥＹ社製のＧＡＬＤＥＮ  ＨＴ５５、ＧＡＬＤＥＮ  ＨＴ７０、ＧＡＬＤＥＮ  ＨＴ９０、ＧＡＬＤＥＮ  ＺＴ１５０、ＧＡＬＤＥＮ  ＨＴ１７０、ＧＡＬＤＥＮ  ＺＴ１８０、ＧＡＬＤＥＮ  ＨＴ２００、ＦＯＭＢＬＩＮＥ  Ｙ等が挙げられ、これからなる群から選択される少なくとも１種が好ましい。
【００２１】
含フッ素アルキルアミンは、一級アミン、二級アミン及び三級アミンのいずれでもよく、なかでも三級アミンが好ましく用いられる。含フッ素アルキルアミンは、窒素原子に結合するアルキル基のうちの少なくとも１つにフッ素原子が１以上置換していればよい。含フッ素アルキルアミンを構成するフッ素原子で置換されていてもよいアルキル基部分は、直鎖状、分岐鎖状及び環状のいずれであってもよいが、直鎖状又は分岐鎖状が好ましい。含フッ素アルキルアミンに含まれる１つのアルキル基部分の炭素数は、例えば３〜５０であり、９〜３０が好ましい。含フッ素アルキルアミンに含まれるフッ素原子で置換されていてもよいアルキル基部分が２以上ある場合、それらは同一であっても、異なっていてもよい。含フッ素アルキルアミンはアルキルアミンの水素原子のすべてがフッ素原子に置き換わったペルフルオロアルキルアミンでもよいし、水素原子の一部がフッ素原子に置き換わったハイドロフルオロアルキルアミンでもよい。
含フッ素アルキルアミンとして具体的には、ペルフルオロトリプロピルアミン、ペルフルオロトリブチルアミン、ペルフルオロトリペンチルアミン、ペルフルオロトリヘキシルアミン、ペルフルオロトリヘプチルアミン、ペルフルオロトリオクチルアミン、ペルフルオロトリノニルアミン、ペルフルオロトリデシルアミン等が挙げられ、これからなる群から選択される少なくとも１種が好ましい。
【００２２】
（液体培地）
液体培地は、通常用いられる細胞培養培地から、培養する細胞、目的等に応じて適宜選択することができる。通常の細胞培養培地としては、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＭＥＭ−α、ＲＰＭＩ１６４０等を挙げることができる。またこれらの培地に対しては、必要に応じて、血清、各種ビタミン、各種抗生物質等、通常の細胞培養に適用可能な各種添加剤を添加してもよい。これらの添加剤の濃度は通常用いられる濃度であればよく、例えば、血清は培地量の５〜１０容量％とすることができる。
【００２３】
本発明の製造方法においては、含フッ素溶媒に界面活性剤、含フッ素アルコール等の含フッ素溶媒又は液体培地の表面張力を変化させ得る添加剤を添加して細胞培養を行ってもよい。界面活性剤としては、サーフロンＳ−２１１、Ｓ−２２１、Ｓ−２３１、Ｓ−２４１、Ｓ−２４２、Ｓ−２４３、Ｓ−４２０、Ｓ−６１１、Ｓ−６５１、Ｓ−３８６、Ｓ−２３２、Ｓ−２３３（以上、旭硝子社製）、プルロニックＦ６８、Ｆ１２８（以上、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、Ｔｗｅｅｎ２０（東京化成社製）等を挙げることができる。また、含フッ素アルコールとしては、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール、４，４，５，５，５−ペンタフルオロペンタノール、２，２，３，３，４，４，５，５−オクタフルオロ−１−ペンタノール、３，３，４，４，５，５，６，６，６−ノナフルオロ−１−ヘキサノール、２，２，３，３，４，４，５，５，６，６，６−ウンデカフルオロ−１−ヘキサノール、２，２，３，３，４，４，５，５，６，６，７，７−ドデカフルオロヘプタノール、アサヒガード（旭硝子社製）等を挙げることができる。界面活性剤、含フッ素アルコール等の添加剤の添加量は含フッ素溶媒に対して体積基準で、例えば０．０１％〜１０％であり、０．１％〜１．０％が好ましい。
添加剤添加後の含フッ素溶媒の表面張力は、例えば２５℃において、１ｍＮ／ｍ以上であり、５ｍＮ／ｍ以上が好ましい。また添加剤添加後の含フッ素溶媒の表面張力は、例えば５０ｍＮ／ｍ以下であり、３０ｍＮ／ｍ以下が好ましい。
【００２４】
細胞培養における液体培地と含フッ素溶媒の使用比率は、細胞培養に供される界面が形成される限り特に制限されない。液体培地と含フッ素溶媒の使用比率は、体積基準で例えば１：９〜９：１であり、４：６〜６：４が好ましい。
【００２５】
（細胞）
培養される細胞の種類は、目的等に応じて適宜選択することができる。細胞が含フッ素溶媒と液体培地の界面に配置されて培養されることから、細胞は付着性細胞であることが好ましい。ここで付着性細胞とは、非浮遊性の細胞であり、細胞増殖に際して培養器面に対する接着依存性を示す細胞である。詳細なメカニズムは不明であるが、特定の種類の含フッ素溶媒と液体培地との界面に配置された付着性細胞は、界面の含フッ素溶媒側に付着するようにして増殖することが可能となる。これにより付着性細胞を用いて所望のサイトカインを、より効率的に製造することができる。
【００２６】
培養される細胞は、サイトカインの生産性の観点から、幹細胞の一種であることが好ましい。幹細胞の由来は特に制限されず、例えば、間葉系幹細胞、脂肪由来幹細胞、臍帯血由来幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、歯髄由来幹細胞、皮膚幹細胞等を挙げることができ、これらからなる群から選択される少なくとも１種が好ましく、間葉系幹細胞、脂肪由来幹細胞及び臍帯血由来幹細胞からなる群から選択される少なくとも１種がより好ましい。また幹細胞は、目的等に応じてヒト由来であっても、マウス等の非ヒト哺乳動物由来であってもよい。
また、培養される細胞は、株化細胞であってもよい。株化細胞を用いることでより安定的にサイトカインを製造することができる。
【００２７】
（培養条件）
細胞の培養条件は、細胞の種類、目的等に応じて適宜選択することができる。培養条件は例えば、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃とすることができる。また培養は培養器を静置しておこなってもよく、含フッ素溶媒又は液体培地を界面が維持される程度に撹拌しながら行ってもよい。
【００２８】
本発明の製造方法においては、含フッ素溶媒に気体を供給して細胞培養を行ってもよい。供給される気体は、目的等に応じて適宜選択することができ、例えば、酸素、窒素、一酸化窒素、二酸化窒素、一酸化炭素、二酸化炭素、水素、硫化水素等を挙げることができ、これらからなる群から選択される少なくとも１種を含むことが好ましく、一酸化窒素、二酸化窒素、一酸化炭素、二酸化炭素、水素及び硫化水素からなる群から選択される少なくとも１種を含むことがより好ましい。
【００２９】
含フッ素溶媒に気体を供給する場合、その供給量は特に制限されず目的等に応じて適宜選択することができる。気体の供給量は例えば、その気体の含フッ素溶媒に対する飽和濃度とすることができる。
含フッ素溶媒への気体の供給方法は、例えばシリンジ針等の気体供給部材を用いて常法により行うことができる。
含フッ素溶媒への気体の供給は細胞培養を開始する前に行ってもよく、気体の供給と細胞培養とを時間的に重複させて行ってもよい。
【００３０】
（サイトカイン）
製造されるサイトカインとしては、インターロイキン、インターフェロン、造血因子、細胞増殖因子、細胞傷害因子、アディポカイン、神経栄養因子、炎症性メディエーター等が挙げられ、これらからなる群から選択される少なくとも１種が好ましく、インターロイキン、インターフェロン、造血因子、細胞増殖因子、細胞傷害因子、アディポカイン及び神経栄養因子からなる群から選択される少なくとも１種がより好ましい。
【００３１】
これらのサイトカインのうち、造血因子としては、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、顆粒系コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）等が挙げられる。細胞増殖因子としては、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）等が挙げられる。細胞傷害因子としては、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）、リンフォトキシン（ＴＮＦ−β）等のＴＮＦスーパーファミリーが挙げられる。アディポカインとしては、レプチン、ＴＮＦ−α等が挙げられる。神経栄養因子としては、神経成長因子（ＮＧＦ）等が挙げられる。炎症性メディエーターとしてはプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）等が挙げられる。
【００３２】
本発明の製造方法は、細胞培養で産生されたサイトカインを回収することを含んでいてもよい。産生されるサイトカインは、例えば液体培地中に放出されることから、細胞培養後の培養上清を、サイトカインを含む組成物として回収してもよい。
【００３３】
本発明の製造方法で製造されるサイトカインは、その種類に応じて所望の目的に用いることができる。サイトカインは例えば、単一、あるいは複数のサイトカインの混合物として炎症のコントロールによる臓器再生の治療薬として用いることができる。
【実施例】
【００３４】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３５】
（含フッ素溶媒の細胞毒性評価）
含フッ素溶媒の細胞毒性を、培養後培地の乳酸脱水素酵素活性（ＬＤＨ）を測定することで評価した。ＬＤＨは細胞膜の内側に存在する酵素であり、細胞膜の損傷に伴って培地中に流出してくるため、培養上清のＬＤＨ活性を測定することで含フッ素溶媒の細胞毒性を評価することができる。
【００３６】
含フッ素溶媒として、Ｐ１０（１，１，２，２−テトラフルオロエチル−２，２，２−トリフルオロエチルエーテル）、Ｐ１２（１，１，１，２，２，３，３，４，４，５，５，６，６−トリデカフルオロヘキサン）、Ｐ１４（１−メトキシ−１，１，２，２，３，３，４，４，５，５，６，６，６−トリデカフルオロヘキサン）、Ｐ１５（ペルフルオロトリブチルアミン）、Ｐ１６（１，１，１，２，２，３，３，４，４，５，５，６，６−トリデカフルオロオクタン）、Ｐ２０（１−エトキシ−１，１，２，２，３，３，４，４，４−ノナフルオロブタン：Ｎｏｖｅｃ７１００、３Ｍ社製）、Ｐ２１（３−メトキシ−１，１，１，２，２，３，４，４，５，５，６，６，６−トリデカフルオロヘキサン：Ｎｏｖｅｃ７２００、３Ｍ社製）、Ｐ２２（１，１，１，２，２，３，４，５，５，５−デカフルオロペンタン：バートレルＸＦ、三井・デュポン・フロロケミカル社製）を準備した。また対照サンプルとしてポリスチレン基板（ＰＳ）を準備した。
【００３７】
４８穴プレートを用い、ＰＴＦＥの滅菌用フィルターを通した含フッ素溶媒を５００μＬ／ｗｅｌｌで添加し、その上から等量の液体培地を添加して２相系培地を作製した。液体培地としては、ＭＥＭ−α培地（１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン）を用いた。ヒト間葉系幹細胞株（ｈＭＳＣ）を５０，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、５％ＣＯ２、３７℃で、１日間、細胞培養を行い、培養上清を回収してＬＤＨ試験を行った。
ＬＤＨ試験には、LDH-Cytotoxic Test Wako（Code No. 299-50601、和光純薬工業社製）を用い、キットに添付のプロトコールに従って回収した培養上清に対して試験を行った。結果を図１に示す。図１中、Blankは液体培地のみを用いたことを示す。
【００３８】
図１から、評価した含フッ素溶媒は、対照サンプルのポリスチレン基板と比較して、顕著な細胞毒性を示さなかったことが分かる。
【００３９】
（実施例１）
２相系培養における細胞への影響を、培養上清中のプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）含有量を定量することで評価した。ＰＧＥ２は炎症性メディエーターの１種であり、本発明におけるサイトカインの１種である。
【００４０】
上記の細胞毒性評価と同様にして、ｈＭＳＣを４日間培養した。培養中は１日毎に細胞形態を観察した。培養上清を回収し、ＰＧＥ２  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い、キットに添付のプロトコールに従って、培養上清中のＰＧＥ２含有量を定量して評価した。また併せて、以下のようにして気体を添加した含フッ素溶媒を準備し、これを用いて、含フッ素溶媒への気体供給の影響を同様にして評価した。
【００４１】
ガラスバイアルとゴム栓をオートクレーブ滅菌した。ガラスバイアルに滅菌済みの含フッ素溶媒を入れ、ゴム栓でフタをした。ゴム栓に２本のシリンジ針を刺し、一方のシリンジ針を含フッ素溶媒中に挿入し、滅菌用フィルターを介して気体（一酸化炭素）をバブリングして気体が添加された含フッ素溶媒を準備した。
【００４２】
評価結果を図２に示す。図２から、含フッ素溶媒の種類に応じてＰＧＥ２の産生量が変化することが分かる。また、含フッ素溶媒に一酸化炭素を添加することでＰＧＥ２産生量が上昇する傾向があった。
下表に含フッ素溶媒の物性値と細胞応答性（細胞形態）の結果をまとめた。なお、親フッ素パラメータについては、２０１１年高分子分析討論会講演要旨集「親フッ素−親油−親水バランス評価に基づいたフッ素系ポリマーのＬＣ分析法開発」ｐ１０９−１１０を参照することができる。
【００４３】
【表１】
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【００４４】
（実施例２）
４８穴プレートを用い、ＰＴＦＥの滅菌用フィルターを通した含フッ素溶媒を５００μＬ／ｗｅｌｌで添加し、その上から等量の液体培地を添加して２相系培地を作製した。液体培地としては、高グルコースＤＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン）を用いた。マウス脂肪由来幹細胞（ｍＡＤＳＣ）を５０，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、５％ＣＯ２、３７℃で、４日間、１日毎に細胞形態を観察しながら細胞培養を行った。培養上清を回収し、ＰＧＥ２  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ及びＶＥＧＦ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（共にＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い、キットに添付のプロトコールに従って、培養上清中のＰＧＥ２含有量及びＶＥＧＦ含有量をそれぞれ定量した。結果を図３及び図４に示す。
【００４５】
マウス脂肪由来幹細胞はｈＭＳＣと比較して、含フッ素溶媒上で細胞凝集塊を形成しやすく、Ｐ１２、Ｐ１４、Ｐ１５及びＰ１６上で大きな細胞凝集塊を形成した。ＶＥＧＦの産生量に関しては、いずれの含フッ素溶媒においても、コントロールであるポリスチレン基板よりも高い数値を示した。
【００４６】
（実施例３）
実施例２と同様にして細胞培養を行った後、培養上清を回収し、ｍｏｕｓｅ  ＩＬ−６  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い、キットに添付のプロトコールに従って、培養上清中のＩＬ−６含有量をそれぞれ定量した。結果を図５に示す。
【００４７】
ポリスチレンシャーレ上で培養した場合と比較して、Ｐ１０、Ｐ１２、Ｐ１４、Ｐ１５、Ｐ１６及びＰ２０では、ＩＬ−６の分泌が増加する傾向があった。また、Ｐ２２ではＩＬ−６の分泌が顕著に抑制された。
【００４８】
（実施例４）
実施例２と同様にして細胞培養を行った後、培養上清を回収し、ｍｏｕｓｅ／ｒａｔ／ｐｒｏｃｉｎｅ  ＴＧＦ−β１  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い、キットに添付のプロトコールに従って、培養上清中のＴＧＦ−β１含有量をそれぞれ定量した。結果を図６に示す。
【００４９】
ポリスチレンシャーレ上で培養した場合と比較して、Ｐ１０、Ｐ１２、Ｐ１４、Ｐ１５、Ｐ１６及びＰ２０では、ＴＧＦ−β１の分泌が増加する傾向があった。また、Ｐ２２ではＴＧＦ−β１の分泌が抑制された。
【００５０】
（実施例５）
実施例２と同様にして細胞培養を行った後、培養上清を回収し、ｍｏｕｓｅＩＬ−１０  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い、キットに添付のプロトコールに従って、培養上清中のＩＬ−１０含有量をそれぞれ定量した。結果を図７に示す。
【００５１】
Ｐ２０を用いた場合、僅かではあるがＩＬ−１０の分泌が見られた。ＩＬ−１０は通常Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ（ＬＰＳ）等で刺激を行うことで発現が誘導されるが、含フッ素溶媒を用いて２相系で培養することによっても分泌を誘導できることが示唆された。
【００５２】
（実施例６）
含フッ素溶媒として、Ｐ１５、Ｐ２３（Ｐ１５に、サーフロンＳ−６１１を０．０１体積％添加したもの）、Ｐ２４（Ｐ１５に、サーフロンＳ−６１１を０．０５体積％添加したもの）、Ｐ２５（Ｐ１５に、サーフロンＳ−６１１を０．１体積％添加したもの）、及びＰ２６（Ｐ１５に、サーフロンＳ−６１１を１体積％添加したもの）を準備した。
【００５３】
【表２】
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＊：溶け残りがあったため測定せず。
【００５４】
なお、上記表中の表面張力は、協和界面科学社製  ＦＡＣＥ  ＣＢＶＰ−Ｚを用いて、２５℃で測定した。
【００５５】
含フッ素溶媒としてＰ１５、Ｐ２３〜Ｐ２６を用いたこと以外は実施例１と同様にして細胞培養を行った後、培養上清を回収し、ＰＧＥ２  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い、キットに添付のプロトコールに従って、培養上清中のＰＧＥ２含有量を定量した。結果を図８に示す。
【００５６】
サーフロンＳ−６１１を添加することで細胞が凝集し易くなり、ＰＧＥ２の分泌が増加する傾向が見られた。表面張力を高めることで細胞が凝集し易くなると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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