(57)【要約】      （修正有）【課題】生体内でのレプチンの分泌を促進することができるレプチン分泌促進剤の提供。【解決手段】エピテアフラガリン類を有効成分とするレプチン分泌促進剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
エピテアフラガリン類を有効成分とするレプチン分泌促進剤。
【請求項２】
エピテアフラガリン類の含有量が０．５質量％超３０質量％以下である、請求項１に記載のレプチン分泌促進剤。
【請求項３】
胃におけるレプチンの分泌促進に使用される、請求項1又は２に記載のレプチン分泌促進剤。
【請求項４】
レプチン分泌促進用飲食品である、請求項１〜３のいずれかに記載のレプチン分泌促進剤。
【請求項５】
レプチン分泌促進用医薬品である、請求項１〜３のいずれかに記載のレプチン分泌促進剤。
【請求項６】
エピテアフラガリン類を有効成分とする抗肥満剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レプチンの分泌を促進することができる薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、脂質や糖質の過剰摂取や運動不足等による、肥満の増加が大きな社会問題となっている。肥満は、体内に脂肪が過剰に蓄積された状態であり、糖尿病、心臓病、脳梗塞、高血圧等の生活習慣病を引き起こす原因の一つとされる。そのため、肥満を予防・改善することは、これらの生活習慣病の予防・改善にもつながる。
【０００３】
これまでの研究により、抗肥満効果がある成分としていくつか知られている。例えば、エピガロカテキンやエピガロカテキンガレート等のカテキン類や、カテキン類が酸化・重合した橙赤色のテアフラビン類を含む茶ポリフェノールは、脂肪の合成を抑制し、抗肥満効果があることが報告されている（非特許文献１〜４）。例えば、非特許文献５には、テアフラビン類の紅茶ポリフェノールが、脂質や糖の消化、吸収及び摂取を阻害したり、脂質代謝を促進したり、肥満の病理プロセスを妨害したりことが開示されている。
【０００４】
ところで、レプチンは、脂肪細胞が分泌するホルモンであり、主に視床下部の受容体を介して摂食抑制やエネルギー消費亢進をもたらし、その作用が不十分であると、肥満症を引き起こすと考えられている。そのため、レプチンの産生・分泌を調整することにより、肥満の予防・改善を期待することができる。
【０００５】
レプチンの産生又は分泌を調整する成分としては、これまでに種々知られている。例えば、特許文献１には、カプサンチンを有効成分とするレプチン産生促進剤が開示されている。また、例えば、特許文献２には、ガンマ−リノレン酸（γ−リノレン酸）を有効成分として含有するレプチン分泌促進剤が開示されている。
【０００６】
しかしながら、エピテアフラガリン類とレプチンの産生・分泌との関連については、これまで十分には検討されていない。また、エピテアフラガリン類と抗肥満作用について知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１１−５１９１２号公報
【特許文献２】特開２０１５−２０５８４６号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｊｅｎ−Ｋｕｎ  Ｌｉｎら、Ｍｏｌ．  Ｎｕｔｒ．  Ｆｏｏｄ  Ｒｅｓ．，  ２００６，  ｖｏｌ．５０，  ｐｐ２１１−２１７
【非特許文献２】Ｎａｖａｍａｙｏｏｒａｎ  Ｔｈａｖａｎｅｓａｎ，  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，  （２０１１），  １０６，  １２９７−１３０９
【非特許文献３】Ｔｉａ  Ｍ．Ｒａｉｎｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２２（２０１１）１−７
【非特許文献４】Ｔａｋｕｊｉ  Ｓｕｚｕｋｉら、Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２０１６，２１，１３０５
【非特許文献５】Ｈａｉｂｏ  Ｐａｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，  ２０１６，  ２１，  １６５９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、このような技術背景に鑑みて、簡便に、生体内でのレプチンの分泌を促進することができるレプチン分泌促進剤を提供することを課題とする。また、新たな抗肥満剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、前記課題を解決するために鋭意研究を行ったところ、エピテアフラガリン類が、レプチンの分泌を促進しうることを見出した。本発明は、これらの知見に基づいて更に検討を重ねることにより完成したものである。
【００１１】
即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１．  エピテアフラガリン類を有効成分とするレプチン分泌促進剤。
項２．  エピテアフラガリン類の含有量が０．５質量％超３０質量％以下である、項１に記載のレプチン分泌促進剤。
項３．  胃におけるレプチンの分泌促進に使用される、項1又は２に記載のレプチン分泌促進剤。
項４．  レプチン分泌促進用飲食品である、項１〜３のいずれかに記載のレプチン分泌促進剤。
項５．  レプチン分泌促進用医薬品である、項１〜３のいずれかに記載のレプチン分泌促進剤。
項６．  エピテアフラガリン類を有効成分とする抗肥満剤。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、簡便に生体内でのレプチンの分泌を促進することができる、レプチン分泌促進剤を提供することができる。本発明のレプチン分泌促進剤は、経口投与、飲食品の形態で投与又は摂取できるので、非侵襲的で患者への負担が少なく、容易に生体内でのレプチン分泌を促進することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実験例１の実験結果を表すグラフである。
【図２】実験例２の実験結果を表すグラフである。
【図３】実験例３の実験結果を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、エピテアフラガリン類を有効成分とするレプチン分泌促進剤である。以下、本発明のレプチン分泌促進剤について詳述する。
【００１５】
１．レプチン分泌促進剤
本発明のレプチン分泌促進剤は、エピテアフラガリン類を有効成分とすることを特徴とする。
【００１６】
エピテアフラガリン類
本発明において、エピテアフラガリン類とは、下記の化学式（１）で表される化合物及び当該化合物と同じ骨格を有する類縁体である。本発明においてエピテアフラガリン類としては、具体的には、下記の化学式（１）で表されるエピテアフラガリン、下記の化学式（２）で表されるエピテアフラガリン３−Ｏ−ガレートが挙げられる。本発明におけるエピテアフラガリン類としては、これらの化合物のうち１種を含むものであってもよいし、２種を含むものであってもよい。
【００１７】
【化１】
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【００１８】
本発明におけるエピテアフラガリン類としては、特に制限はなく、化学合成したものであってもよいし、茶等の天然物由来の材料から抽出や精製等したもの又はそれらの酵素反応物であってもよい。また、エピテアフラガリン類は、商業的に入手可能であり、市販品を使用してもよい。
【００１９】
本発明におけるエピテアフラガリン類としては、茶カテキン類の酵素反応物であってもよい。例えば、茶カテキン類を没食子酸の存在下でポリフェノールオキシダーゼで酸化させることによりエピテアフラガリン類を得ることができる。具体的には、例えば、エピガロカテキンをエピテアフラガリンに変換することができ、エピガロカテキンガレートをエピテアフラガリン３−Ｏ−ガレートに変換することができる。ポリフェノールオキシダーゼとしては、エピガロカテキンをエピテアフラガリンに変換することができ、エピガロカテキンガレートをエピテアフラガリン３−Ｏ−ガレートに変換することができる酵素であれば特に制限されないが、具体的には、例えば、ラッカーゼ、チロシナーゼ等が挙げられる。
【００２０】
茶カテキン類は、茶抽出物であってもよい。茶としては、緑茶、発酵茶が挙げられる。緑茶としては、Ｃａｍｅｌｌｉａ属、例えば、Ｃ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ（チャノキ）、Ｃ．ａｓｓａｍｉｃａ（アッサムチャ）及びそれらの雑種から選択される茶葉から製茶された緑茶、又は緑茶を発酵したウーロン茶、紅茶の茶葉が挙げられる。茶抽出物は、茶（茶葉）から熱水、エタノール等の水溶性有機溶媒、又は水溶性有機溶媒と水との混合物を用いて、ニーダー抽出、カラム抽出、ドリップ抽出等の公知の抽出手段により得ることができる。得られた茶抽出物は必要に応じて、公知の方法により濃縮又は精製を行ってもよい。
【００２１】
本発明のレプチン分泌促進剤におけるエピテアフラガリン類の含有量としては、特に限定されず、用途、剤型、投与形態等に応じて適宜調整することができるが、一般に０．５質量％超３０質量％以下、好ましくは１〜３０質量％、より好ましくは３〜３０質量％、更に好ましくは５〜３０質量％が挙げられる。
【００２２】
添加成分
本発明のレプチン分泌促進剤は、前述したエピテアフラガリン類以外に、本発明の効果を損なわない範囲で、剤型に応じて、他の添加成分を含有していてもよい。本発明のレプチン分泌促進剤に含有され得る添加成分としては、例えば、水、油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、高級アルコール類、エステル類、植物抽出エキス類、水溶性高分子、界面活性剤、金属石鹸、アルコール、多価アルコール、ｐＨ調整剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、防腐剤、香料、粉体、増粘剤、色素、キレート剤等が挙げられる。これらの添加成分は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。また、これらの添加成分の含有量については、使用する添加成分の種類や本発明のレプチン分泌促進剤の剤型等に応じて適宜設定される。
【００２３】
剤型・製剤形態・用途
本発明のレプチン分泌促進剤の剤型については、特に限定されず、固体状、半固体状、又は液体状のいずれであってもよく、レプチン分泌促進剤の種類や用途に応じて適宜設定すればよい。
【００２４】
本発明のレプチン分泌促進剤の投与方法としては、特に限定されず、適用する疾患の種類に応じて適宜選択すればよく、全身投与であっても、局所投与であってもよい。具体的には、経口、経血管内（動脈内又は静脈内）、経皮、経腸、経肺、経鼻投与等が挙げられる。経血管内投与には、血管内注射、持続点滴も含まれる。なかでも、投与が容易な点で、経口投与が好ましい。
【００２５】
本発明のレプチン分泌促進剤の製剤形態については、特に限定されず、投与方法に適した製剤形態に適宜設定することができ、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、注射剤、点滴剤、坐剤等の任意の製剤形態を挙げることができる。例えば、本発明のレプチン分泌促進剤の投与形態が経口投与である場合は、経口投与が可能であることを限度として特に制限されないが、具体的には、飲食品及び内服用医薬品が挙げられる。また、本発明の分泌促進剤は液体に溶解した形態が好ましい。
【００２６】
本発明のレプチン分泌促進剤を飲食品の製剤形態にする場合、本発明のレプチン分泌促進剤を、そのまま又は他の食品素材や添加成分と組み合わせて所望の形態に調製すればよい。このような飲食品としては、一般の飲食品の他、特定保健用食品、栄養補助食品、機能性食品、病者用食品等が挙げられる。これらの飲食品の形態として、特に制限されないが、具体的にはカプセル剤（ソフトカプセル剤、ハードカプセル剤）、錠剤、顆粒剤、粉剤、ゼリー剤、リポソーム製剤等のサプリメント；栄養ドリンク、果汁飲料、炭酸飲料、乳酸飲料等の飲料；団子、アイス、シャーベット、グミ、キャンディー等の嗜好品；等が例示される。これらの飲食品の中でも、好ましくは飲料、サプリメント、より好ましくは飲料、カプセル剤、更に好ましくは飲料、ソフトカプセル剤、特に好ましくは飲料が挙げられる。
【００２７】
本発明のレプチン分泌促進剤を内服用医薬品の製剤形態にする場合、本発明のレプチン分泌促進剤を、そのまま又は他の添加成分と組み合わせて所望の形態に調製すればよい。このような内服用医薬品としては、具体的には、ドリンク剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤、ハードカプセル剤）、錠剤、顆粒剤、粉剤、ゼリー剤、シロップ剤、リポソーム製剤等が挙げられる。これらの内服用の医薬品の中でも、好ましくは有効成分が液体に溶解した形態が挙げられ、より好ましくはドリンク剤、ソフトカプセル剤、シロップ剤、更に好ましくはドリンク剤が挙げられる。
【００２８】
本発明のレプチン分泌促進剤が飲食品又は内服用医薬品の製剤形態である場合、有効成分であるエピテアフラガリン類としては、レプチンの分泌が促進される限り特に制限されず、製剤形態に応じて適宜設定すればよいが、例えば、０．５質量％超３０質量％以下が挙げられ、好ましくは１〜３０質量％、より好ましくは３〜３０質量％、より好ましくは５〜３０質量％が挙げられる。
【００２９】
本発明のレプチン分泌促進剤は、レプチンの分泌促進に基づいて、症状が軽減又は改善させる疾患に対して適用することができる。例えば、レプチンは、主に視床下部の受容体を介して摂食抑制やエネルギー消費亢進をもたらすので、レプチンの分泌を促進すると、過剰摂食や消費エネルギー不足で起こる肥満を予防又は治療することができると考えられる。そのため、本発明のレプチン分泌促進剤は、肥満の予防又は治療用途に適用することができる。
【００３０】
レプチンは、食欲抑制、体重減少（肥満抑制）、血液中の脂質量の減少、酸素消費量や活動性の増進、血糖値やインスリン分泌の低下、脂肪組織重量や肝臓重量の減少、動脈血栓の防止、高血圧の低下、胆石の防止等の作用を有する。そのため、本発明のレプチン分泌促進剤は、それらの作用が促進されることで症状が軽減又は改善される疾患に対して適用することができる。それらの作用が促進されることにより症状が軽減又は改善される疾患としては、前記の肥満以外に、例えば、高血圧症、糖尿病、高脂血症、脳卒中、心筋梗塞、脳梗塞、脂肪肝、変形性膝関節症、胆石症、脂肪委縮症等が挙げられる。
【００３１】
本発明のレプチン分泌促進剤は、脂肪組織が分泌するレプチンの分泌を促進するのであれば、特に制限されないが、なかでも胃におけるレプチンの分泌促進に使用されるのが好ましい。
【００３２】
本発明のレプチン分泌促進剤の摂取量については、特に制限されず、製品形態、用法等に応じて適宜設定するとよい。
【００３３】
以上のように、エピテアフラガリン類を含む本発明のレプチン分泌促進剤は、体内でのレプチンの分泌を促進することができる。本発明のレプチン分泌促進剤は、レプチンの分泌を促進することにより、症状が改善させる疾患の治療又は予防用途に使用することができる。具体的には、本発明のレプチン分泌促進剤は、肥満、高血圧、糖尿病、高脂血症、脳卒中、心筋梗塞、脳梗塞、脂肪肝、変形性膝関節症、胆石症、脂肪委縮症等の予防又は治療用途に使用することができる。
【００３４】
２．抗肥満剤
本発明の抗肥満剤は、エピテアフラガリン類を有効成分とすることを特徴とする。エピテアフラガリン類は、「１．レプチン分泌促進剤」の欄に記載のように、レプチンの分泌を促進することができる。そのため、本発明の抗肥満剤は、優れた抗肥満作用を有する。
有効成分であるエピテアフラガリン類、本発明の抗肥満剤に適用可能なその他の成分、製剤形態、投与形態、用法については、「１．レプチン分泌促進剤」の欄の記載と同様のものが挙げられる。
【実施例】
【００３５】
次に、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明は、これらの例によってなんら限定されるものではない。
【００３６】
実験例１
＜細胞の処理方法＞
４８ウェル細胞培養プレートに、正常ラット胃粘膜上皮細胞株ＲＧＭ１細胞(理化学研究所バイオリソースセンター)を１０％ＦＢＳ  ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２培地（以下、「培地」と表記する。）で培養し、細胞が８０〜９０％コンフルエントになったところで、培地をＦＢＳ−ｆｒｅｅ  ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２培地（以下、「無血清培地」と表記する。）に交換し、一晩培養した。一晩培養後に無血清培地を除去し、さらに２００μＬの無血清培地を添加した。
エピテアフラガリン類と無血清培地を混合して、エピテアフラガリン類の濃度が１０μＭの混合溶液を調製した。培養プレート中の培地をアスピレーターで除去し、速やかに前記混合溶液２００μＬを培養プレートに添加し、３０分間ＣＯ2インキュベーター内（３７℃）で培養した。また、前記混合溶液２００μＬを、細胞を播種していない培養プレートに添加し、３０分間、ＣＯ2インキュベーター内（３７℃）でインキュベートした。培地を１８０μＬエッペンに回収し、２００×ｇで３分間遠心分離を行い、上清をサンプルとした。なお、回収後はエッペンを氷上で保管した。
エピテアフラガリン類としては、エピテアフラガリン（ＥＴＦＧ）、エピテアフラガリン３−Ｏ−ガレート（ＥＴＦＧｇ）を使用した。
【００３７】
上記で処理したＲＧＭ１細胞について、下記に示すＥＬＩＳＡ法により、レプチンの分泌量を測定した。
【００３８】
＜ＥＬＩＳＡ法＞
測定の前日に、１００μｇ／ｍＬのＣａｐｔｕｒｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙをＰＢＳで１００倍希釈し、ＥＬＩＳＡプレート（３８０１−０９６、ＩＷＡＫＩ）の各ウェルに１００μＬ加えた。そして、プレートをラップで梱包して４℃、遮光条件下で一晩インキュベートした。溶液を除去し、Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒを各ウェル３００μＬずつ添加して洗浄を行った（４回）。最後の洗浄が終わったら、キムタオル（商品名、日本製紙クレシア株式会社）にＥＬＩＳＡプレートを軽く叩きつけて液をよく切った。各ウェルにＢｌｏｃｋ  ｂｕｆｆｅｒを３００μＬ加え４℃で少なくとも１時間インキュベートし、洗浄を４回行い、液をよく切った。サンプルとレプチンスタンダード（ｌｅｐｔｉｎを無血清培地で０から２．０ｎｇ／ｍＬとなるように希釈）を各ウェルに１００μＬ加え、４℃で少なくとも２時間インキュベートした。洗浄を４回行い、液をよく切った。１００μｇ／ｍＬのＤｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙをＤｉｌｕｅｎｔで１００倍希釈し、各ウェルに１００μＬ加え、４℃で少なくとも２時間インキュベートした。洗浄を４回行い、液をよく切った。１１ｍＬのＤｉｌｕｅｎｔにＡｖｉｄｉｎ−ＨＲＰを５．５μＬ（１：２，０００）加え希釈し、各ウェルに１００μＬ加え４℃で３０分インキュベートした。洗浄を４回行い、液をよく切った。そして、ＥＬＩＳＡ  ＰＯＤ基質ＴＭＢキットの発色試薬と基質溶液を等量ずつ混合し、各ウェルに１００μＬ添加し観察した。十分発色したら各ウェルに反応停止薬として１ＭのＨ2ＳＯ4を５０μＬ添加し、４５０ｎｍの吸光度を、マイクロプレートリーダー（サンライズリモート、ＴＥＣＡＮ社製）を使用して測定した。
【００３９】
なお、上記で使用した試薬は、具体的には下記のとおりである。
Ｃａｐｔｕｒｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｌｅｐｔｉｎ、Ａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ（Ｌｅｐｔｉｎ，  Ｍｕｒｉｎｅ  ＥＬＩＳＡ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｋｉｔ  （９００−Ｋ７６）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ））
発色試薬、基質溶液（ＥＬＩＳＡ  ＰＯＤ基質ＴＭＢキット（Ｐｏｐｕｌａｒ）（ナカライテスク））
Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ  （０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０  ｉｎ  ＰＢＳ）
Ｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｆｒｅｅ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ  （ｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｆｒｅｅ  ＢＳＡ）（ＥＩＡ／ＲＩＡ  ｇｒａｄｅ）（ナカライテスク）
Ｂｌｏｃｋ  ｂｕｆｆｅｒ  （１％  ｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｆｒｅｅ  ＢＳＡ  ｉｎ  ＰＢＳ）
Ｄｉｌｕｅｎｔ  （０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０，  ０．１％ｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｆｒｅｅ  ＢＳＡ  ｉｎ  ＰＢＳ）
ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ  １２培地  （ナカライテスク）
ペニシリン−ストレプトマイシン混合溶液（ペニシリン  １０，０００  ｕ／ｍＬ、ストレプトマイシン  １０，０００μｇ／ｍＬ含有）  （ナカライテスク）
Ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  （ＦＢＳ）  （Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）
【００４０】
結果を図１に示す。図１は、エピテアフラガリン（ＥＴＦＧ）、エピテアフラガリン３−Ｏ−ガレート（ＥＴＦＧｇ）をそれぞれ１０μＭの濃度で細胞を３０分間処理した場合の細胞のレプチン分泌量を示す。図１から、ＥＴＦＧ、ＥＴＦＧｇを添加した場合、ＲＧＭ細胞においてレプチンの分泌が認められた。
【００４１】
実験例２
Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ＬＤＨ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ−ＷＳＴ（株式会社同仁化学研究所）を使用し、そのプロトコルに従って、エピテアフラガリン類による細胞の膜傷害（膜透過性）を評価した。細胞として、前記ＲＧＭ１細胞を使用した。培地として、前記ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２培地（ナカライテスク）を使用した。具体的には、上記キットのプロトコルに従って、細胞数の最適化を行い、細胞膜傷害試験を行った。
【００４２】
細胞膜傷害試験は、具体的には、下記のとおりに行った。すなわち、平底９６ウェル細胞培養プレートに、正常ラット胃粘膜上皮細胞株ＲＧＭ１細胞(理化学研究所バイオリソースセンター)を１０％ＦＢＳ  ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２培地（以下、「培地」と表記する。）で培養し、細胞が８０〜９０％コンフルエントになったところで、培地をＦＢＳ−ｆｒｅｅ  ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２培地（以下、「無血清培地」と表記する。）に交換し、一晩培養した。一晩培養後に無血清培地を除去し、さらに１００μＬの無血清培地を添加した。無血清培地で０、５、１０又は２５μＭの濃度に調整したエピテアフラガリン類溶液１００μＬを前記細胞懸濁液に添加し、３７℃で６０分間、ＣＯ2インキュベーション内でインキュベーションした。次いで、高コントロールウェルに無血清培地９０μＬとＬｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ  １０μＬを加え、３７℃、３０分間ＣＯ2インキュベーター内でインキュベーションした。各ウェルにＷｏｒｋｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  １００μＬ加え、遮光下、室温で３０分間呈色反応を行った。そして、全てのウェルにＳｔｏｐ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ５０μＬを加え、プレートリーダーを用いて４９０ｎｍの吸光度を測定した。上記キットのプロトコルに従って、エピテアフラガリン類と各コントロールの吸光度からバックグランドコントロールの吸光度を引いた値を用いて細胞傷害性（％）を算出した（３重測定の平均値）。Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒを添加した高コントロールウェルの値を１００％とした。
【００４３】
結果を図２に示す。図２は、エピテアフラガリン類の濃度の違いによる細胞傷害率を示すグラフである。図２から、エピテアフラガリン類は細胞傷害性が低く、５〜２５μＭの濃度範囲では、Ｖｅｈｉｃｌｅ（ＤＭＳＯ）処理と比較して同等またはそれ以下の細胞傷害性であった。図２よりエピテアフラガリン類が刺激するＲＧＭ１細胞からのレプチンの分泌は、細胞膜傷害に起因しないことが確認された。
【００４４】
実験例３
Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ＳＦ（ナカライテスク）のキットを使用して、そのプロトコルに従って、エピテアフラガリン類による細胞毒性を評価した。細胞として、前記ＲＧＭ１細胞を使用した。培地として、前記ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２培地（ナカライテスク）を使用した。具体的には、上記キットのプロトコルに従って、細胞増殖アッセイを行い、細胞毒性試験を行った。
【００４５】
細胞毒性試験は、具体的には、下記のとおりに行った。すなわち、対数増殖期にある細胞を５０００ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌの濃度になるよう計数し、平底９６ウェル細胞培養プレートの各ウェルに１００μＬずつ播いた。これをＣＯ2インキュベーター内で２４時間前培養した。次いで、０、５、１０又は２５μＭの濃度となるようＦＢＳ−ｆｒｅｅ  ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２培地で調整したエピテアフラガリン類を各ウェルに１０μＬずつ添加し、ＣＯ2インキュベーターで１時間培養した。培地を１０％ＦＢＳ  ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２培地に交換後にＣＯ2インキュベーター内で２４時間前培養した。そして、上記キットの試薬を各ウェルに１０μＬずつ添加し、ＣＯ2インキュベーター内で１〜４時間呈色反応を行った後、マイクロプレートリーダー（製品名サンライズリモート、ＴＥＣＡＮ社製）を用い、４５０ｎｍの吸光度を測定し、細胞生存率（％）を測定した（５重測定の平均値）。得られたデータについて、Ｄｕｎｎｅｔｔ検定を行った。
【００４６】
結果を図３に示す。図３は、エピテアフラガリン類の濃度の違いによる細胞生存率（％）を示すグラフである。図３から、いずれのエピテアフラガリン類についても、５〜２５μＭの濃度範囲において有意な細胞毒性は認められなかった。
【図１】
2018138530.tif 000003
【図２】
2018138530.tif 000004
【図３】
2018138530.tif 000005