(57)【要約】【課題】多能性幹細胞由来の細胞が特定細胞系統に分化する過程に、相対的に低分化度の段階と高分化度の段階とが存在する場合において、低分化度の細胞の分化を促進させる工程を含む、高分化度の多能性幹細胞由来細胞の製造方法を提供する。【解決手段】多能性幹細胞由来細胞が特定細胞系統に分化する過程に、相対的に低分化度の段階と相対的に高分化度の段階とが存在する場合において、特定細胞系統への分化段階が低分化度である多能性幹細胞由来細胞と、同一細胞系統への分化段階が高分化度である多能性幹細胞由来細胞とを共培養することで、低分化度の多能性幹細胞由来細胞を高分化度の多能性幹細胞由来細胞に分化させる工程を含む、高分化度の多能性幹細胞由来細胞の製造方法。【選択図】図９
2018113962.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞由来細胞が特定細胞系統に分化する過程に、相対的に低分化度の段階と相対的に高分化度の段階とが存在する場合において、
特定細胞系統への分化段階が低分化度である多能性幹細胞由来細胞と、同一細胞系統への分化段階が高分化度である多能性幹細胞由来細胞とを共培養することで、低分化度の多能性幹細胞由来細胞を高分化度の多能性幹細胞由来細胞に分化させる工程を含む、高分化度の多能性幹細胞由来細胞の製造方法。
【請求項２】
共培養する高分化度の多能性幹細胞由来細胞が、当該細胞系統への分化段階が低分化度の多能性幹細胞由来細胞の培養系から、当該細胞系統への分化度の指標に基づいて高分化度の細胞を分離して得たものである、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
共培養する高分化度の多能性幹細胞由来細胞が、当該細胞系統への分化段階が低分化度の多能性幹細胞由来細胞の培養上清中に存在していた細胞である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項４】
特定細胞系統への分化がメラノサイトへの分化であり、低分化度の多能性幹細胞由来細胞が着色のないメラノサイトであり、高分化度の多能性幹細胞由来細胞が着色のあるメラノサイトである、請求項１から３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
共培養工程が、表皮誘導を刺激する成分、ケラチノサイトへの最終分化を刺激する成分、および増殖因子もしくは培養剤を含む培地中で行われる、請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
表皮誘導を刺激する成分が、ＳＣＦ、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７、Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ５、Ｓｍａｄ７、ＧＤＦ−６、ＥＧＦ、Ｗｎｔ３ａ、およびｂＦＧＦからなる群から選択される一つ以上の成分である、請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
ケラチノサイトへの最終分化を刺激する成分が、アスコルビン酸および／または活性型ビタミンＤ３である、請求項５または６に記載の製造方法。
【請求項８】
増殖因子もしくは培養剤がＣａ塩、ＫＧＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＨＧＦ、α−ＭＳＨ、ＤＢｃＡＭＰ、Ｌ−チロシン、およびトランスフェリンからなる群から選択される一つ以上の成分である、請求項５から７のいずれかに記載の製造方法。
【請求項９】
共培養工程が、ＳＣＦ、Ｗｎｔ３ａ、ＢＭＰ４、アスコルビン酸、活性型ビタミンＤ３、αＭＳＨ、 ＤＢｃＡＭＰ、Ｌ−チロシン、トランスフェリン、ＫＧＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＨＧＦ、ｂＦＧＦ、ハイドロコーチゾン、およびエンドセリン１を含有する培地中で行われる、請求項４に記載の製造方法。
【請求項１０】
多能性幹細胞がヒト多能性幹細胞である、請求項１から９のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１１】
ヒト多能性幹細胞がヒトｉＰＳ細胞である、請求項１０に記載の製造方法。
【請求項１２】
共培養工程が、他の細胞も他の細胞の培養上清も用いない工程である、請求項１から１１のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１３】
ＳＣＦ、Ｗｎｔ３ａ、ＢＭＰ−４、アスコルビン酸、活性型ビタミンＤ３、αＭＳＨ、
ＤＢｃＡＭＰ、Ｌ−チロシン、トランスフェリン、ＫＧＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＨＧＦ、ｂＦＧＦ、ハイドロコーチゾン、およびエンドセリン１を含有する動物細胞培養用培地。
【請求項１４】
請求項１３に記載の培地を用いた動物細胞の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多能性幹細胞由来細胞の分化誘導技術に関する。さらに詳細には、多能性幹細胞由来の細胞が特定細胞系統に分化する過程に、相対的に低分化度の段階と高分化度の段階とが存在する場合において、低分化度の細胞の分化を促進させる工程を含む、高分化度の多能性幹細胞由来細胞の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）や胚性幹細胞を含む多能性幹細胞は、体を構成するすべての細胞、組織、臓器に分化誘導できる潜在性をもつとともに、制限のない増殖の可能性があり、再生医療を含むさまざまな臨床応用が期待されている。
そうした応用分野の一つとして、皮膚色素が関係する疾患が挙げられる。
色素細胞障害の発症にはヒト表皮性メラノサイト（色素細胞）が関与している。白斑や遺伝性対側性色素異常症のような皮膚色素の疾患では、病変部位におけるメラノサイトの喪失に至るが、その機序は未だ明確にはされていない。
こうした疾患に対しては、脱色性皮膚病変部位への通常の表皮性メラノサイトの自家移植による治療がしばしばなされるが、脱色部位における効果が常に認められるわけではない（非特許文献１）。
【０００３】
白斑はメラノサイトの喪失によって生ずると考えられているが、ヒト表皮性メラノサイトについては、増殖や分化の制御に重要な役割を果たす因子がいくつか同定されている。
ヒト表皮性メラノサイトの増殖や分化の制御においては、幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｗｎｔ３ａ、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ−４）、アスコルビン酸、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（活性型ビタミンＤ３）、αヒトメラノサイト刺激ホルモン（αＭＳＨ）、Ｎ６，２’−Ｏ−ジブチリルアデノシン  ３’，５’−環状一リン酸ナトリウム塩（ＤＢｃＡＭＰ）、Ｌ−チロシン、トランスフェリン、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、ハイドロコーチゾン、およびエンドセリン１が重要であることがわかっている（非特許文献２−７、特許文献１）。本明細書では、これらの因子につき、括弧内の表記も用いる。
すでに、ヒトｉＰＳ細胞からメラノサイトへ分化させた報告はあるが（非特許文献８、９）、いずれも表皮性メラノサイトを大量培養できる技術ではない。
【０００４】
また、特許文献２には、幹細胞からメラノサイトへの分化を誘導し、細胞増殖を刺激する増殖因子に関する記載があり、特許文献３には特定の薬剤のほか、特定のフィーダー細胞を用いて多能性幹細胞からメラノサイトの集団を得る方法が記載されている。
しかし、広範囲の白斑や脱色素斑病変に対するメラノサイト移植治療では、より容易にメラノサイトを大量産生できる製造方法が求められている。
これを実現するためには、多能性幹細胞由来の細胞が特定細胞系統に分化する過程に、相対的に低分化度の段階と高分化度の段階とが存在する場合において、低分化度の細胞の分化を促進させる技術が求められる。
【０００５】
特許文献４には、膵前駆細胞から内分泌前駆細胞までのいずれかの段階の細胞をフィーダー細胞とし、その上で、内分泌前駆細胞まで分化させた細胞を単一細胞に分散させてから培養したところ、生体内の膵島と同様の三次元構造を有する細胞塊が得られることが記載されている。これは、分化段階の低い細胞と分化段階の高い細胞とを共培養することで、分化段階の高い細胞の分化段階をさらに進めるものである。しかし、この技術は分化段階の低い細胞の分化を進めて分化段階の高い細胞のそれに追いつかせるものではない。
【０００６】
また、特許文献５には、ヒト由来の多能性幹細胞を、ヒト由来の多能性幹細胞から樹立した間葉系幹細胞との共培養下で分化誘導する方法が記載されているが、この間葉系幹細胞はフィーダー細胞として機能するのみで、それ自体の分化段階が進行するわけではない。
特許文献６にも、血管内皮細胞や間葉系細胞とともに、臓器細胞を培養することで器官芽を作製する技術が開示されているが、これも分化段階の低い細胞の分化を進めて分化段階の高い細胞のそれに追いつかせる技術ではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１５−１４６８０３号公報
【特許文献２】特表２０１４−５３４８１５号公報
【特許文献３】特表２０１３−５２０１６３号公報
【特許文献４】特開２０１４−１６１２５７号公報
【特許文献５】国際公開ＷＯ２０１２／０４３８１４
【特許文献６】国際公開ＷＯ２０１３／０４７６３９
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】J Dermatol. 2013 Sep;40(9):771-2
【非特許文献２】J Dermatol Sci. 2015 Dec; 80(3):203-11
【非特許文献３】J Dermatol Sci. 2014 Aug; 75(2):100-8
【非特許文献４】J Dermatol Sci. 2013 Jul; 71(1):45-57
【非特許文献５】Pigment Cell Melanoma Res. 2011 Jun; 24(3):462-78
【非特許文献６】J Invest Dermatol. 2008 May; 128(5):1220-6
【非特許文献７】J Dermatol Sci. 2014 Oct; 76(1):72-4
【非特許文献８】PLoS One. 2011; 6(1): e16182
【非特許文献９】Proc Natl Acad Sci U S A. 2011; 108(36): 14861-6
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、多能性幹細胞由来の細胞が特定細胞系統に分化する過程に、相対的に低分化度の段階と高分化度の段階とが存在する場合において、低分化度の細胞の分化を促進させる工程を含む、高分化度の多能性幹細胞由来細胞の製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、多能性幹細胞由来細胞が特定細胞系統に分化する過程に、相対的に低分化度の段階と相対的に高分化度の段階とが存在する場合において、特定細胞系統への分化段階が低分化度である多能性幹細胞由来細胞と、同一細胞系統への分化段階が高分化度である多能性幹細胞由来細胞とを共培養することで、低分化度の多能性幹細胞由来細胞を高分化度の多能性幹細胞由来細胞に分化させる工程を含む、高分化度の多能性幹細胞由来細胞の製造方法である。
【００１１】
本発明はまた、ＳＣＦ、Ｗｎｔ３ａ、ＢＭＰ−４、アスコルビン酸、活性型ビタミンＤ３、αＭＳＨ、ＤＢｃＡＭＰ、Ｌ−チロシン、トランスフェリン、ＫＧＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＨＧＦ、ｂＦＧＦ、ハイドロコーチゾン、およびエンドセリン１を含有する動物細胞培養用培地である。
さらに、本発明はかかる動物細胞培養用培地を用いた動物細胞の培養方法である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、多能性幹細胞由来の細胞から、効率よく、短期間に、および／またはフィーダー細胞を用いることなく、目的とする細胞系統に分化した高分化度の多能性幹細胞由来細胞を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】マトリゲル（商標）でゲル状に被覆した培養皿上のヒトｉＰＳ細胞由来の表皮性メラノサイトを示す図。黒点または黒みがかった領域として認識できる。
【図２】ｉＰＳ細胞巣の境界にみられる高密度のヒトｉＰＳ細胞由来の表皮性メラノサイトを示す図。
【図３】細胞質中に多数のメラニン顆粒が認められるヒトｉＰＳ細胞由来のメラノサイトを示す図。
【図４】左から順にヒトｉＰＳ細胞、ヒトｉＰＳ細胞由来のメラノサイト、ＨＥＭａ−ＬＰ細胞（正常ヒト成人の表皮性メラノサイト、以下同じ。）における多能化遺伝子であるＮＡＮＯＧのｍＲＮＡ発現量をＲＴ−ＰＣＲ法により比較した図。縦軸は４０５ｎｍにおける吸光度を示す。
【図５】左から順にヒトｉＰＳ細胞、ヒトｉＰＳ細胞由来のメラノサイト、ＨＥＭａ−ＬＰ細胞におけるメラノサイト特有のＭＩＴＦのｍＲＮＡ発現量をＲＴ−ＰＣＲ法により比較した図。縦軸は４０５ｎｍにおける吸光度を示す。
【図６】左から順にヒトｉＰＳ細胞、ヒトｉＰＳ細胞由来のメラノサイト、ＨＥＭａ−ＬＰ細胞におけるメラノサイト特有のＴＲＰ１のｍＲＮＡ発現量をＲＴ−ＰＣＲ法により比較した図。縦軸は４０５ｎｍにおける吸光度を示す。
【図７】左から順にヒトｉＰＳ細胞、ヒトｉＰＳ細胞由来のメラノサイト、ＨＥＭａ−ＬＰ細胞におけるメラノサイト特有のチロシナーゼのｍＲＮＡ発現量をＲＴ−ＰＣＲ法により比較した図。縦軸は４０５ｎｍにおける吸光度を示す。
【図８】マトリゲルでゲル状に被覆した培養皿上での８週間の培養によりコンフルエントに達したヒトｉＰＳ細胞由来の表皮性メラノサイトを示す図。
【図９】コンフルエントに達したプレートからの二つの黒いコロニーが、ヒトｉＰＳ細胞由来メラノサイトのマトリゲル上の新たな培養系で生着し、増殖している状況を示す図。図中には、二つのコロニーの部分拡大図も示されている。
【図１０】ヒトｉＰＳ細胞由来メラノサイトの培養液から取得した着色細胞が、ヒトｉＰＳ細胞由来メラノサイトのマトリゲル上の新たな培養系で、黒みがかった部分として生着し、増殖している状況を示す図（左）、ならびにピペットで取得したコロニー細胞や、培地から取得した細胞により、マトリゲルでゲル状に被覆した培養皿上、新たなヒトｉＰＳ細胞由来のメラノサイトの誘導、増殖がもたらされたことを示す図（右）。図中には、着色細胞の部分拡大図も示されている。
【図１１】マトリゲルでゲル状に被覆した培養皿上、培養後１２日でみられた多数のヒトｉＰＳ細胞由来メラノサイトを示す図。
【図１２】遠心操作により遠沈管の底に集まった黒色のヒトｉＰＳ細胞由来メラノサイト塊（左）およびその黒色の溶液（右）を示す図。
【図１３】ヌードマウス背部の注射部位の皮膚に青色ないし黒色の着色が認められたことを示す図。
【図１４】ヌードマウス背部の注射部位の皮膚に青色ないし黒色の着色が認められたことを示す図。
【図１５】ヌードマウス背部の注射部位に黒い塊が認められたことを示す解剖図。
【図１６】ヌードマウス背部の注射部位に黒い塊が認められたことを示す解剖図。
【図１７】着色部位切片のフォンタナ・マッソン染色によりメラノサイトの細胞塊であることが示された１００倍の拡大図。
【図１８】着色部位切片のフォンタナ・マッソン染色によりメラノサイトの細胞塊であることが示された４００倍の拡大図。
【図１９】ヌードマウス背部の注射部位の真皮におけるメラノサイトの細胞塊が、抗Melan-Ａ抗体を用いた免疫染色で陽性であったことを示す、４００倍の拡大図。
【図２０】ヌードマウス背部の注射部位の真皮におけるメラノサイトの細胞塊が、抗Melan-Ａ抗体を用いた免疫染色で陽性であったことを示す、１０００倍の拡大図。
【図２１】本発明の製造方法および特許文献１に記載の製造方法により取得したヒトｉＰＳ細胞由来メラノサイトの培養物における黒色部分の面積の割合を比較した図。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、多能性幹細胞由来細胞が特定細胞系統に分化する過程に、相対的に低分化度の段階と相対的に高分化度の段階とが存在する場合において、特定細胞系統への分化段階が低分化度である多能性幹細胞由来細胞と、同一細胞系統への分化段階が高分化度である多能性幹細胞由来細胞とを共培養することで、低分化度の多能性幹細胞由来細胞を高分化度の多能性幹細胞由来細胞に分化させる工程を含む、高分化度の多能性幹細胞由来細胞の製造方法である。
【００１５】
かかる、共培養に用いる同一細胞系統への分化段階が高分化度である多能性幹細胞由来細胞としては、当該細胞系統への分化段階が低分化度の多能性幹細胞由来細胞の培養系から、当該細胞系統への分化度の指標に基づいて高分化度の細胞を分離して得た細胞を用いることが好ましい。
【００１６】
また、共培養に用いる同一細胞系統への分化段階が高分化度である多能性幹細胞由来細胞としては、当該細胞系統への分化段階が低分化度の多能性幹細胞由来細胞の培養上清中に存在している細胞も用いられる。
例えば、特定細胞系統への分化がメラノサイトへの分化である場合、低分化度の多能性幹細胞由来細胞が着色のないメラノサイトであり、高分化度の多能性幹細胞由来細胞が着色のあるメラノサイトであるとして、高分化度の多能性幹細胞由来のメラノサイトを製造することができる。
この場合のメラノサイト系統への分化度の指標は着色の有無である。
【００１７】
また、この場合の低分化度の多能性幹細胞由来細胞の培養系から、当該細胞系統への分化度の指標に基づいて高分化度の細胞を分離して得た細胞として、例えばｉＰＳ細胞由来メラノサイトがコンフルエントになった状態（通常、５−６週以降）で認められる黒色細胞塊を用いることができる。
あるいは、当該細胞系統への分化段階が低分化度の多能性幹細胞由来細胞の培養上清中に存在している細胞として、例えばｉＰＳ細胞由来メラノサイトの細胞培養３−４週程度、ほぼ毎日培養液を交換しながら培養する際に、培養液を回収し、それを遠沈して得た細胞を用いることもできる。
こうした細胞と共培養することで、新しい培養系のｉＰＳ細胞も刺激を受け、メラノサイト色素細胞への分化が加速される。
【００１８】
また、本発明の製造方法における共培養工程は、表皮誘導を刺激する成分、ケラチノサイトへの最終分化を刺激する成分、および／または増殖因子もしくは培養剤を含む培地中で行うことが好ましい。
かかる表皮誘導を刺激する成分としては、ＳＣＦ、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７、Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ５、Ｓｍａｄ７、ＧＤＦ−６、ＥＧＦ、Ｗｎｔ３ａ、およびｂＦＧＦからなる群から選択される一つ以上の成分であることが好ましい。
【００１９】
また、かかるケラチノサイトへの最終分化を刺激する成分としては、アスコルビン酸および／または活性型ビタミンＤ３を用いることが好ましい。
また、かかる増殖因子もしくは培養剤としては、Ｃａ塩、ＫＧＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＨＧＦ、α−ＭＳＨ、ＤＢｃＡＭＰ、Ｌ−チロシン、およびトランスフェリンからなる群から選択される一つ以上の成分を用いることが好ましい。
【００２０】
本発明の製造方法における共培養工程では、ＳＣＦ、Ｗｎｔ３ａ、ＢＭＰ−４、アスコルビン酸、活性型ビタミンＤ３、αＭＳＨ、ＤＢｃＡＭＰ、Ｌ−チロシン、トランスフェリン、ＫＧＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＨＧＦ、ｂＦＧＦ、ハイドロコーチゾン、およびエンドセリン１を含有する培地を用いることが特に好ましい。
なお、かかる培地は本発明の製造方法以外の動物細胞培養に用いることもできる。
【００２１】
本発明の製造方法で用いられる多能性幹細胞としては、ヒト多能性幹細胞を用いることが好ましく、特にヒトｉＰＳ細胞を用いることが好ましい。
また、本発明の製造方法における共培養工程は、他の細胞も他の細胞の培養上清も用いない工程であることが好ましい。
【実施例】
【００２２】
１．ヒトｉＰＳ細胞の生成と解析
４０歳の健常人である日本人男性の血液から増殖させたＴ細胞をセンダイウイルスベクター（ＳｅＶｄｐ）により、４つの初期化因子ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ｃＭＹＣ、 Ｋ
ＬＦ４を発現させて初期化した（感染の多重度＝２、３７℃、２時間）。J Biol Chem. 2011 Feb 11; 286(6):4760-71参照。ＳｅＶｄｐは国立研究開発法人 産業技術総合研究所 幹細胞工学研究センターの中西真人博士から譲り受けた。
この形質転換細胞を、ヒトＴ細胞培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Thermo Fisher Scientific社、ウォルサム、マサチューセッツ）、インターロイキン２（PeproTech社、ロッキー・ヒル、ニュージャージー）
）中、Ｘ線を照射したマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）上に播種した。
【００２３】
２日後、培地を霊長類ＥＳ細胞培養用培地（ReproCELL社、横浜）にｂＦＧＦ（５ｎｇ
／ｍｌ、R&D Systems社、ミネアポリス、ミネソタ）を加えたものに交換し、コロニーが
みられるまで培養した。ｉＰＳ細胞のコロニーを機械的に吸い上げ、増殖と解析のため、Ｘ線を照射したＭＥＦ上においた。確立されたｉＰＳ細胞のセルライン、ＷＴ−ｉＰＳＣ１は、ヒトｉＰＳ細胞用培地（ｈｉＰＳＣＭ）中で維持した。この培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Sigma-Aldrich社、セントルイス、ミズーリ）に２０％KnockOut（商標）血清サプ
リメント（Invitrogen社）、１％非必須アミノ酸（Thermo Fisher Scientific社）、０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１％ ペニシリン−ストレプトマイシン、および５ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦを加えたものである。
【００２４】
ＳｅＶｄｐを完全に除去すべく、ｓｉＲＮＡ混合物（５００μｌのOptiMEM（登録商標
）中、４０ｎＭ Ｌ５２７ｓｉＲＮＡ−１および２．５μl ＲＮＡｉＭＡＸ（Thermo Fisher Scientific社））を何回か培地に加えた。
Ｌ５２７ｓｉＲＮＡ−１： 5’-GGUUCAGCAUCAAAUAUGAAG-3’（配列番号１）
Ｌ５２７ｓｉＲＮＡ−２： 5’-UCAUAUUUGAUGCUGAACCAU-3’（配列番号２）
そしてこのｉＰＳ細胞セルラインの真正性を公知文献に従って確認した。Stem Cell Research, Volume 17, Issue 1, July 2016, Pages 22-24、Stem Cell Research, Volume 17, Issue 1, July 2016, Pages 16-18、およびStem Cell Research, 16 (3) (2016), pp.
611-613参照。
【００２５】
２．ヒトｉＰＳセルライン、ＷＴ−ｉＰＳＣ１の確立
このヒトｉＰＳ細胞は、ｈｉＰＳＣＭ中、マイトマイシンＣで処理したＭＥＦ上に播種した。アポトーシスの有効な阻害およびヒトｉＰＳ細胞の生残率を高めるため、ｐ１６０−Ｒｈｏ結合キナーゼ（ＲＯＣＫ）の選択的阻害剤であるＹ−２７６３２を培地に加えた。
腸細胞への分化が始まる前に、ヒトｉＰＳ細胞をディスパーゼ（Sigma-Aldrich社）を用いて細胞塊として分散させ、増殖因子を減らしたマトリゲル基底膜マトリックス（BD Biosciences社、レキシントン、ケンタッキー）上におき、ＭＥＦの馴化培地で２ないし３日間培養した。
【００２６】
３．細胞培養
正常ヒト成人表皮メラノサイト（ＨＥＭａ−ＬＰ細胞）はInvitrogen Gibco社（カールスバッド、カリフォルニア）から購入した。このメラノサイトは、Gibco社のメラノサイト培地２５４ＣＦ中、ヒトメラノサイト成長サプリメント（ＨＭＧＳ−２）および０．２ｍＭの塩化カルシウムを加えて維持した。ＨＭＧＳ−２には３ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、０．１８μｇ／ｍｌのハイドロコーチゾン、および１０ｎＭのエンドセリン１が含まれる。
また、本発明の製造方法における培地としては、例えば次の組成のもの（「ヒトｉＰＳ細胞由来メラノサイト培地」とも表記する。）が用いられるが、添加される因子の種類については、当業者であればこれを参考に適宜取捨選択が可能であり、またそれらの因子の濃度についても適宜最適化ができるであろう。
【００２７】
メラノサイト培地２５４ＣＦ（Gibco社）、ＨＭＧＳ−２（Gibco社）、０．２ｍＭ塩化カルシウム、５０ｎｇ／ｍｌ ＳＣＦ（R&D Systems社）、５０ｎｇ／ｍｌ Ｗｎｔ３ａ（R&D Systems社）、２０ｎＭヒト組み換えＢＭＰ−４（R&D Systems社）、０．３ｍＭ アスコルビン酸（Sigma-Aldrich社）、１０−７Ｍ １，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（Enzo Life Sciences社、プリマスミーティング、ペンシルベニア）、１００μＭ αＭＳＨ（Sigma-Aldrich社）、０．２ｍＭ ＤＢｃＡＭＰ（Sigma-Aldrich社）、０．１ｍＭ Ｌ−チロシン（Sigma-Aldrich社）、１００μｇ／ｍｌ トランスフェリン（Sigma-Aldrich社）、１０ｎｇ／ｍｌ ＫＧＦ（Sigma-Aldrich社）、０．１ｎｇ／ｍｌ ＧＭ−ＣＳＦ（Sigma-Aldrich社）、０．１ｎｇ／ｍｌ ＨＧＦ（Sigma-Aldrich社）。
【００２８】
４．ヌードマウス
５週齢オスのＫＳＮ／ＳｌｃヌードマウスをＳＬＣ社（名古屋）から購入した。これらのマウスは、すべて日本実験動物ケア評価認証協会の施設で飼われ、摂餌させた。ヒトｉＰＳ細胞由来のメラノサイトをこれらのマウスに皮内注射した。
【００２９】
５．統計的分析
すべてのデータは平均値±標準偏差で表した。０．０５未満のｐ値は統計学的に有意とした。母集団間の定量的パラメータ差は、マン・ホイットニーのＵ検定で評価した。
【００３０】
［参考例１］ヒトｉＰＳ細胞からメラノサイトへの分化
ヒトｉＰＳ細胞をメラノサイトに分化誘導すべく、ＤＭＥＭ／Ｆ１２中、マトリゲル（BD Biosciences社）でゲル状に被覆した６０ｍｍ培養皿においた。
ヒトｉＰＳ細胞をＭＥＦの馴化培地中、マトリゲル上で１日間、継代培養した後、これらの細胞を、前記した培地である、ＨＭＧＳ−２、０．２ｍＭ塩化カルシウム、５０ｎｇ／ｍｌ ＳＣＦ、５０ｎｇ／ｍｌ Ｗｎｔ３ａ、２０ｎＭヒト組み換えＢＭＰ−４、０．３ｍＭ アスコルビン酸、１０−７Ｍ １，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３、１００μｇ／ｍｌ αＭＳＨ、０．２ｍＭ ＤＢｃＡＭＰ、０．１ｍＭ Ｌ−チロシン、１００μｇ／ｍ
ｌ トランスフェリン、１０ｎｇ／ｍｌ ＫＧＦ、０．１ｎｇ／ｍｌ ＧＭ−ＣＳＦ、０．
１ｎｇ／ｍｌ ＨＧＦを含むメラノサイト培地２５４ＣＦ中で培養した。
【００３１】
［参考例２］ヒトｉＰＳ細胞から分化したメラノサイトのＲＴ−ＰＣＲ分析
RNeasyミニキット（Qiagen社、ヒルデン、ドイツ）を用いて細胞からＲＮＡを抽出し、そのうち２μｇのＲＮＡから、SuperScript（商標） III逆転写酵素およびオリゴ−ｄＴ
プライマー（Thermo Fisher Scientific社）を製造業者の使用説明書に従って用いてｃＤＮＡを合成し、PowerSYBR（商標） Green PCR Master Mix（Applied Biosystis社、フォスターシティ、カリフォルニア）およびStepOne（商標） Real-Time PCR System（Applied Biosystis社）を用いたリアルタイムＰＣＲにより、その定量分析を行った。
用いたＰＣＲプライマーは次の通りである。
ＮＡＮＯＧ: 5'-CAAAGGCAAACAACCCACTT-3'（配列番号３）
および5'-TCTGCTGGAGGCTGAGGTAT-3'（配列番号４）
ＰＡＸ３: 5'-CTGGAACATTTGCCCAGACT -3'（配列番号５）
および5'-GCTGTCGGTTCCTAGTCCAG-3'（配列番号６）
microphthalmia-associated transcription factor (MITF): 5'-CCGGGTGCAGAATTGTAACT-3'（配列番号７）
および5'-GGACAATTTTGGCATTTTGG-3'（配列番号８）
tyrosinase-related protein 1 (TRP1): 5'-AGCAGTAGTTGGCGCTTTGT-3'（配列番号９）
および5'-TCAGTGAGGAGAGGCTGGTT-3'（配列番号１０）、ならびに
tyrosinase: 5'-TTGTACTGCCTGCTGTGGAG-3'（配列番号１１）
および5'-CAGGAACCTCTGCCTGAAAG-3'（配列番号１２）
【００３２】
［参考例３］ヒトｉＰＳ細胞由来メラノサイトのヌードマウスへの皮内注射
すべての実験手順は、聖マリアンナ医科大学の動物実験委員会の承認を得ている。
プレート上のヒトｉＰＳ細胞由来のメラノサイトをStemPro（登録商標） Accutase（登録商標）（Gibco社）を用いて剥離し、洗浄し、遠心して細胞塊とした。このメラノサイトを等張の塩化ナトリウム溶液中、３×１０６細胞／ｍｌの密度で懸濁した。
ヌードマウス（ｎ＝５）をジエチルエーテルで麻酔し、１ｍｌの細胞懸濁液をマウス背部側面に皮内注射した。そのヌードマウスの皮膚標本を４％のホルムアルデヒドを含むＰＢＳで固定し、パラフィンに包埋した。
【００３３】
［参考例４］メラノサイト関連の染色
このホルマリンで固定し、パラフィンに包埋した組織標本を４μｍの切片とした。これをフォンタナ・マッソン染色のため、フォンタナのアンモニア銀溶液中、製造業者の使用説明書に従って１０時間、室温放置した。また、形態学的分析のため、この組織標本のヘマトキシリン染色およびエオジン染色も行った。さらに、このホルマリン固定、パラフィン包埋組織標本を、抗Melan-Ａモノクローナル抗体（Dako社、サンタクララ、カリフォルニア）の５０倍希釈液中、４℃で終夜放置した。次に、この組織切片スライドをビオチン化二次抗体およびペルオキシダーゼ標識アビジン（Dako社）、ならびに発色基質であるジアミノベンジジンで処理した。一次抗体の代わりにトリス緩衝食塩水を用いたものを陰性対照とした。
【００３４】
［実施例１］本発明方法による低分化度ヒトｉＰＳ細胞由来メラノサイトの分化誘導
ヒトｉＰＳ細胞由来メラノサイトをＳＣＦ、Ｗｎｔ３ａ、ＢＭＰ−４、アスコルビン酸、活性型ビタミンＤ３、αＭＳＨ、ＤＢｃＡＭＰ、Ｌ−チロシン、トランスフェリン、ＫＧＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＨＧＦ、ｂＦＧＦ、ハイドロコーチゾン、およびエンドセリン１を含む培地で２０日間培養すると、マトリゲルでゲル状に被覆した培養皿上、ヒトｉＰＳ細胞巣の縁に、黒い顆粒をもつ多数の着色細胞の生成が認められた（図１−３）。
【００３５】
そのヒトｉＰＳ細胞由来の着色細胞のＮＡＮＯＧ、ＭＩＴＦ、ＴＲＰ−１、およびチロシナーゼの発現をＲＴ−ＰＣＲ法で調べた（図４−７）。これらの着色細胞における多能化能のマーカーであるＮＡＮＯＧのｍＲＮＡ発現は、ヒトｉＰＳ細胞のものより顕著に低かった（ｐ＜０．００１）。一方、これらの着色細胞におけるメラノサイト特異的なマーカーであるＭＩＴＦ、ＴＲＰ−１、およびチロシナーゼのｍＲＮＡ発現は、ヒトｉＰＳ細胞のものより顕著に高かった（ｐ＜０．００１）。そして、これらの着色細胞におけるＮＡＮＯＧ、ＭＩＴＦ、ＴＲＰ−１、およびチロシナーゼのｍＲＮＡ発現は、正常ヒトメラノサイトであるＨＥＭａ−ＬＰ細胞のものと同等であった。こうした事実から、これらの着色細胞はヒトｉＰＳ細胞由来のメラノサイトであるといえる。
【００３６】
およそ５−６週後、ヒトｉＰＳ細胞由来メラノサイトはマトリゲルでゲル状に被覆した培養皿上、コンフルエントに達した（図８）。培養皿中での緩やかなピペッティングにより、ヒトｉＰＳ細胞由来メラノサイトのコロニーを吸い上げ上げた。マトリゲルでゲル状に被覆した培養皿上、ヒトｉＰＳ細胞由来メラノサイト培地中で２日間培養した新たなヒトｉＰＳ細胞由来メラノサイトの培養系に、このコロニーを直接加えた。３日後、これらのメラノサイトのコロニーはマトリゲル上に生着し、他のヒトｉＰＳ細胞由来メラノサイトとともに分化、増殖していた（図９）。
【００３７】
一方、ピペッティングによる細胞取得とは別の操作も行った。すなわち、ヒトｉＰＳ細胞由来細胞の培養開始から３週後、その培地を回収して遠心し、遠沈管の底に認められた黒い細胞塊を新たなヒトｉＰＳ細胞由来メラノサイト培地に直接加え、緩やかに攪拌した。マトリゲルでゲル状に被覆した培養皿上、ヒトｉＰＳ細胞由来メラノサイト培地中で２日間培養した新たなヒトｉＰＳ細胞由来メラノサイトの培養系に、この細胞を含む培地を直接加えた。数日後、これらのメラノサイトは少数の黒い小粒子を含み、マトリゲル上に生着し、他のヒトｉＰＳ細胞由来メラノサイトとともに分化、増殖していた（図１０）。
【００３８】
このように、「ピペッティングにより吸い上げたコロニー」や「培地から回収したヒトｉＰＳ細胞由来メラノサイト」の存在は、マトリゲルでゲル状に被覆した培養皿上、新たなヒトｉＰＳ細胞由来メラノサイトの分化、増殖を誘起した。１２日後、マトリゲルでゲル状に被覆した培養皿上、これら二つの手法により、多数の良質なヒトｉＰＳ細胞由来メラノサイトを取得した（図１１）。なお、従来の技術では、分化誘導から８週間でやっとメラノサイトが確認できる程度である。
【００３９】
［実施例２］ヒトｉＰＳ細胞由来メラノサイトのヌードマウスの皮膚組織への浸潤
ヒトｉＰＳ細胞由来メラノサイトを遠心すると、その遠心ペレットもその上清も黒色であった（図１２）。その細胞をヌードマウスの背部に皮内注射した。注射後３日で、マウス背部の注射部位において、青ないし黒に着色した皮膚の病斑が認められた（図１３、１４）。そして７日目に剖検したところ、注射したヌードマウスの背部に黒い塊が認められた（図１５、１６）。着色した病変部位切片をフォンタナ・マッソン組織化学染色したものを顕微鏡観察すると、陽性の黒色が認められ、メラノサイトであることが確認された（図１７、１８）。抗Melan-Ａモノクローナル抗体を用いた免疫組織学的染色を行ったところ、陰性対照の染色切片と比較して、注射部位に対応し、細胞質が茶色ないし黒色の細胞が認められた（図１９、２０）。ヒトｉＰＳ細胞由来メラノサイトを注射したヌードマウス４頭すべてで、移植したメラノサイトは、主に真皮から皮下筋膜間に存在したが、一部は上皮にも存在した。
【００４０】
［実施例３］ヒトｉＰＳ細胞由来メラノサイトのＳＣＩＤマウスへの移植後の長期観察
本発明の製造方法により取得したヒトｉＰＳ細胞由来メラノサイトの培養細胞をＳＣＩＤマウスに皮下注射した。投与後１２ヶ月間観察を行った結果、がん化は認められなかった。これにより、本発明の製造方法により取得したヒトｉＰＳ細胞由来メラノサイトは、生体へ移植後もがん化のリスクがなく、安全性が高いことが証明された。
【００４１】
［実施例４］本発明の製造方法と特許文献１に記載の製造方法の比較
メラノサイトからは黒色のメラニンが産生されるため、メラノサイトを細胞培養皿内で培養した際に生じる黒色部分の面積の割合を計測すれば、それがメラノサイトの分化度の指標となる。
【００４２】
そこで、本発明の製造方法によるヒトｉＰＳ細胞由来メラノサイト、および特許文献１に記載の製造方法によるヒトｉＰＳ細胞由来メラノサイトを培養し、直径60ｍｍの細胞培養皿内における黒色部分の面積の割合を画像処理ソフトウェアＩｍａｇｅＪを用いて計測した。その結果は図２１に示すように、本発明の製造方法によるヒトｉＰＳ細胞由来メラノサイトの黒色部分の面積の割合は、２１日目において２.３％であるのに対し、特許文献１に記載の製造方法によるヒトｉＰＳ細胞由来メラノサイトの黒色部分の面積の割合は０.１％であった。したがって、本発明の製造方法によれば、高分化度のメラノサイトが得られることが明らかとなった（ｐ＜０．０１）。
【００４３】
本発明の製造方法をメラノサイトへの分化に適用したところ、分化度の低いヒトｉＰＳ細胞由来メラノサイトから、分化度の高い良質のメラノサイトを多量に調製することが可能になった。また、こうしたメラノサイト用いてヌードマウスの皮膚に色素沈着させることができた。こうして得たメラノサイトは、例えば白斑や脱色素斑疾患など、皮膚色素細胞が欠乏した疾患の治療に用いられる。
【００４４】
また、入れ墨をした患者がＭＲＩ診断を行うと、入れ墨顔料中にある強磁性の金属化合物に起因する皮膚火傷の問題があるほか、ＭＲＩ像を歪めるおそれがあるが、金属化合物に代えてヒトｉＰＳ細胞由来のメラノサイトを用いれば、こうした問題や懸念もなくなる。
さらに、乳房切除術後の乳房再建術においては乳輪の再建が重要であるが、ヒトｉＰＳ細胞由来メラノサイトによる皮内注入は安全な乳輪再建術となろう。
他にも、白髪の黒毛化や、悪性黒色腫治療への応用も想定される。
【００４５】
本発明の製造方法は、細胞医薬として自家移植に用いうる高分化度の多能性幹細胞由来細胞の効率的な製造を可能とするものであり、多様な生活の質の改善に資するものである。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明の高分化度の多能性幹細胞由来細胞の製造方法によれば、意図した方向に高度に分化した多能性幹細胞由細胞を調製できるので、例えば細胞医薬の製造業で利用される。
【図１】
2018113962.tif 000003
【図２】
2018113962.tif 000004
【図３】
2018113962.tif 000005
【図４】
2018113962.tif 000006
【図５】
2018113962.tif 000007
【図６】
2018113962.tif 000008
【図７】
2018113962.tif 000009
【図８】
2018113962.tif 000010
【図９】
2018113962.tif 000011
【図１０】
2018113962.tif 000012
【図１１】
2018113962.tif 000013
【図１２】
2018113962.tif 000014
【図１３】
2018113962.tif 000015
【図１４】
2018113962.tif 000016
【図１５】
2018113962.tif 000017
【図１６】
2018113962.tif 000018
【図１７】
2018113962.tif 000019
【図１８】
2018113962.tif 000020
【図１９】
2018113962.tif 000021
【図２０】
2018113962.tif 000022
【図２１】
2018113962.tif 000023
【配列表】
2018113962000001.app