(57)【要約】      （修正有）【課題】高温の利益を組み込むことができるペプチド合成スキームを提供する。【解決手段】アミノ酸をカップリングしてペプチド又はペプチドミメティックを製造する方法において、改良が、活性化添加剤の存在下に、３０℃を超える温度で活性化及びカップリングを同じ容器内で実施し、アミノ酸に対して１当量を超える量のカルボジイミドを配合することを含む固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）方法。活性化された酸が、固相樹脂に連結された少なくとも一つの他のアミノ酸とカップリングしてよい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸をカップリングしてペプチド又はペプチドミメティックを製造する方法において、改良が、
活性化添加剤の存在下；及び
３０℃を超える温度で
活性化及びカップリングを同じ容器内で実施し；
アミノ酸に対して１当量を超える量のカルボジイミドを配合する
ことを含む方法。
【請求項２】
活性化された酸が、固相樹脂に連結された少なくとも一つの他のアミノ酸とカップリングされる、請求項１に記載の固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）法。
【請求項３】
付け加えられる酸の少なくとも一つが最初にＦｍｏｃ保護されている、請求項２に記載の固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）法。
【請求項４】
カルボジイミドがアミノ酸に対して１．５〜４当量の量で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
７０℃を超える温度で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
１０分未満の総カップリング時間に制限される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
１５分未満の総カップリング時間に制限される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
活性化添加剤がアミノ酸に対して１〜１．５当量の量で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
カルボジイミドがアミノ酸に対して１．５〜４当量の量で存在する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
アミノ酸をカップリングしてペプチド又はペプチドミメティックを製造するための組成物であって、
アミノ酸と；
有機溶媒と；
前記アミノ酸に対して１当量を超える量のカルボジイミドと；そして
活性化添加剤と
を含む組成物。
【請求項１１】
前記組成物がさらに、前記アミノ酸に対して１〜１．５当量の前記活性化添加剤を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記組成物がさらに、前記アミノ酸に対して１．５〜４当量の前記カルボジイミドを含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
前記アミノ酸が最初にＦｍｏｃ保護されたアミノ酸である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１４】
前記アミノ酸と前記カルボジイミドのＯ−アシルイソ尿素中間体をさらに含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１５】
ＤＩＣ又はＯｘｙｍａ活性化剤をさらに含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記アミノ酸と前記カルボジイミドの前記Ｏ−アシルイソ尿素のエステルをさらに含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
固相樹脂に連結された少なくとも一つのアミノ酸を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１８】
固相ペプチド合成樹脂に連結されたペプチド鎖をさらに含む、請求項１０に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0001]本発明はペプチド合成に関し、特に固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）に関する。
【背景技術】
【０００２】
[0002]本明細書及び特許請求の範囲を通じて、幾つかの頭字語が使用されている。それらは当業者には一般的に周知である。本明細書において、それらは下記の意味を有する。
[0003]ＥｔＯＨ：エタノール
[0004]ＨＢＴＵ：２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
[0005]ＨＡＴＵ：１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−１Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジニウム  ３−オキシドヘキサフルオロホスフェート
[0006]ＨＣＴＵ：１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−５−クロロベンゾトリアゾリウム  ３−オキシドヘキサフルオロホスフェート
[0007]ＰｙＢＯＰ：ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
[0008]ＰｙＡＯＰ：７−アザベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
[0009]ＤＩＥＡ：ジイソプロピルエチルアミン
[0010]ＮＭＭ：Ｎ−メチルモルホリン
[0011]Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）：システイン（トリチル）
[0012]ＤＭＡＰ：４−ジメチルアミノピリジン
[0013]ＮＭＰ：Ｎ−メチル−２−ピロリドン
[0014]ＴＩＳ：トリイソプロピルシラン
[0015]ＤＯＤｔ：３，６−ジオキサ−１，８−オクタン−ジチオール
[0016]ＭＢＨＡ：（４−メチルベンズヒドリルアミン）
[0017]おそらく、ペプチド合成のために最も一般的に使用され研究されている活性化法は、カルボジイミドを利用する方法であろう。ペプチド合成におけるそれらの使用は、アミド結合の形成を促進するためにＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）が使用された１９５５年に遡る。カルボジイミドは、２個のわずかに塩基性の窒素原子を含有し、これが、図１に示されているように、アミノ酸誘導体のカルボン酸と反応して、高反応性のＯ−アシルイソ尿素化合物を形成する。形成されたＯ−アシルイソ尿素は、次いで直ちにアミンと反応し、ペプチド結合を形成できるか又は他の反応性種に変換されうる。
【０００３】
[0018]Ｏ−アシルイソ尿素の高い反応性は、これも図1に示されているように、ペプチド結合形成に至ることも至らないこともある幾つかのその他の望ましくない経路も促進する。非反応性のＮ−アシル尿素への変換は、カップリングを妨げる一方、オキサゾロン形成を通じて活性化キラルアミノ酸のエピマー化を起こしうる。カルボジイミドに比して過剰のアミノ酸を使用することにより、高反応性の対称性無水物を形成することができる。しかしながら、この手法は追加のアミノ酸当量を消費するので望ましくない。
【０００４】
[0019]１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）をカルボジイミド活性化中に添加剤として配合すると、カルボジイミド活性化法に顕著な改良が見られた。ＨＯＢｔはＯ−アシルイソ尿素を高反応性のＯＢｔエステルに迅速に変換するので、望ましくないＮ−アシルイソ尿素及びオキサゾロンの形成が回避される。後に、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）が、７位の窒素の隣接基効果のために、ＨＯＢｔの有益な代替であることが示された［１６１］。ＨＯＢｔ及びＨＯＡｔの代わりに他の多くの添加剤が使用できる。いくつかの一般的な例を挙げると、６−クロロ−１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（６−Ｃｌ−ＨＯＢｔ）、エチル  ２−シアノ−２−（ヒドロキシイミノ）アセテート（Ｏｘｙｍａ、ＯｘｙｍａＰｕｒｅ、ＥＣＨＡ）、及び１−ヒドロキシ−２，５−ピロリジンジオン（ＮＨＳ）などである。
【０００５】
[0020]典型的には、アミノ酸及びカルボジイミドに対して１当量の添加剤が添加される。しかしながら、最近の研究で、添加剤を１当量未満に低減することが有用でありうることが示唆された（Ｓ．Ｎｏｚａｋｉ，“過剰の添加剤が引き起こすカップリングの遅延(Delay of coupling caused by excess additives）”，Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ．，ｖｏｌ．１２，ｐｐ．１４７−１５３，２００６）。著者らは、アシル化反応がアミンと添加剤との間の塩形成によって妨害されうることを見出した。しかしながら、著者らは、添加剤を１当量未満に低減すると、活性化速度が落ち、セグメントカップリングにおけるエピマー化もわずかに増大することも見出した。
【０００６】
【化１】
2018070590.tif 000002
【０００７】
[0021]図１  カルボジイミドに基づく活性化
[0022]Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド(ＤＩＣ)が、ペプチド活性化のための好適なカルボジイミドとして、ＤＣＣに大きく取って代わっている。ＤＣＣは、望ましくないことに、ＴＦＡにしか溶解しない尿素を生成するので、このことがＦｍｏｃ化学でのその使用を困難にしている。さらに、ＤＣＣは、取扱いが困難となりうるワックス状固体であるほか、アレルギー反応を引き起こすことも報告されている。これに代わり、ＤＩＣは、その生成尿素の有機溶媒中での改良された溶解性、アレルギー反応報告の低発生率、及びＤＣＣと同じくらい低コストであることのために有益である。今日なお使用されている最も人気の高いカップリング法の一つは、日常的に効果的なカップリングを提供しながらもそのコスト及び副反応の低さから、ＤＩＣ／ＨＯＢｔを基にしたものである。
【０００８】
[0023]ＨＯＢｔ、ＨＯＡｔ、及び６−Ｃｌ−ＨＯＢｔなどのベンゾトリアゾール系添加剤の最近の分析により、それらはクラス１爆発物と再分類されることとなった。ベンゾトリアゾール添加剤のこの望ましくない特徴のため、ベンゾトリアゾール添加剤に代わる適切な代替品の開発に関心が高まっている。そのような代替品の一つはＯｘｙｍａ（エチル  ２−シアノ−２−（ヒドロキシイミノ）アセテート）で、１９７３年に最初に報告された（Ｍ．Ｉｔｏｈ，“ペプチド．ＩＶ．エチル−２−ヒドロキシイミノ−２−シアノアセテート及びそのアミドの使用によるラセミ化の抑制(Peptides. IV. Racemization Suppression by the Use of Ethyl-2-Hydroximino-2-cyanoacetate and Its Amide)，”Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，ｖｏｌ．４６，ｐｐ．２２１９−２２２１，１９７３参照）。最近になって、Ｏｘｙｍａの爆発性が示差走査熱量測定(ＤＳＣ)のほか、加速速度熱量測定（ＡＲＣ，accelerating rate calorimetry）でも試験され、ＨＯＢｔに比べて好ましい結果が得られた（Ｒ．Ｓｕｂｉｒｏｓ−Ｆｕｎｏｓａｓ，“Ｏｘｙｍａ:ベンゾトリアゾール系ＨＯＢｔ及びＨＯＡｔに代わるペプチド合成のための爆発危険性の低い効率的な添加剤(An Efficient Additive for Peptide Synthesis to Replace the Benzotriazole-Based HOBt and HOAt with a Lower Risk of Explosion)，”Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．１５，ｐｐ．９３９４−９４０３，２００９）。
【０００９】
[0024]それでも、カルボジイミドを利用した活性化法の室温合成条件下での使用は、比較的遅い活性化法であることと、より酸性のカップリング環境であることのために、高レベルの欠失をもたらしうる。このため、より最近ではより迅速なオニウム塩を利用した活性化法の開発が行われるようになった。しかしながら、オニウム塩を利用した活性化は塩基の使用を必要とする。塩基は、カルボン酸をまず脱プロトン化してカルボキシレートアニオンを生成させ、これがオニウム塩活性化剤と反応する。室温条件下で、カルボジイミドに基づく活性化と比べて、多くのオニウム塩（中でも、ＨＢＴＵ、ＨＡＴＵ、ＰｙＢＯＰ、ＰｙＡＯＰ、ＨＣＴＵ）で改良されたカップリングが示されている。
【００１０】
[0025]図２  オニウム塩に基づく活性化
【００１１】
【化２】
2018070590.tif 000003
【００１２】
[0026]２０００年代初期から、アミノ酸カップリングを改良するための方法として、ＳＰＰＳ中の加熱の使用が広く適用されている。ペプチド合成における加熱は、マイクロ波照射又はその他の公知慣用加熱法によって達成でき、標準的なカルボジイミドカップリング法でもオニウム塩カップリング法でも使用されている。それでも、カップリング工程中の高温は、ペプチド合成にいくつかの課題を提示する。オニウム塩に基づく活性化法を使用すると、塩基（典型的にはＤＩＥＡ、ＮＭＭ）の存在に起因して、システイン誘導体のエピマー化が高温で実質的に増大する。さらに、活性化中にアルギニンのδ−ラクタム形成の増大が観察され、ある配列では主なアルギニン欠失がもたらされる。
【００１３】
[0027]最近、Ｃｏｌｌｉｎｓらは、非常に迅速で効率的なカップリングが、９０℃で何の塩基の存在もなしに現場でのカルボジイミドに基づくカップリングにより実施できることを示した（Ｊ．Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｋ．Ｐｏｒｔｅｒ，Ｓ．Ｓｉｎｇｈ及びＧ．Ｖａｎｉｅｒ，“高効率固相ペプチド合成(High-Efficiency Solid Phase Peptide Synthesis)（ＨＥ−ＳＰＰＳ），”Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．，ｖｏｌ．１６，ｐｐ．９４０−９４３，２０１４）。このことは、マイクロ波照射が、遅い活性化過程もその後のアシル化工程も、例えば９０℃、２分間で促進できることを示している。Ｃｏｌｌｉｎｓらのカップリング法では塩基が存在しないことが、ＣａｒｐｉｎｏらやＢｅｙｅｒｍａｎｎらが述べた妨害活性化(hindered activation)を都合よく回避し、エピマー化からより安全なカップリング環境を提供した。実際、Ｃｏｌｌｉｎｓらは、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨが、室温法と比べてエピマー化の増大なしに９０℃でカップリングできることを示した。 (Ｌ．Ｃａｒｐｉｎｏ，“ジイソプロピルカルボジイミド／１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール系：セグメントカップリング及び逐次ペプチドアセンブリ(The Diisopropylcarbodiimide/1-Hydroxy-7-azabenzotriazole System: Segment Coupling and Stepwise Peptide Assembly)”，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，ｖｏｌ．５５，ｐｐ．６８１３−６８３０，１９９９；Ｍ．Ｂｅｙｅｒｍａｎｎ，“カルボジイミド媒介ペプチド合成に及ぼす第三級アミンの影響(Effect of tertiary amine on the carbodiimide-mediated peptide synthesis)”，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．３７，ｐｐ．２５２−２５６，１９９１）。
【００１４】
[0028]それでも、（オニウム塩と比べて）低反応性のカルボジイミドの活性化を推進するために必要なより高温でより酸性の環境は、超酸感受性リンカー（例えば２−クロロトリチル）に結合されたペプチドの早期切断を招くことになろう。これは、樹脂からのペプチドの全体的損失をもたらすと共に、このクラスのリンカーに適用できる温度を著しく制限しうる。超酸感受性リンカーの使用は、より大きいペプチド配列の構築を可能にするペプチドフラグメントの縮合を可能にするので、ある種のペプチド合成においては重要である。超酸リンカーは、ジケトピペラジン形成などの副反応の回避、樹脂ローディング中のＤＭＡＰの回避、及び酸リンカーに連結されたｃ−末端システイン残基のベータ脱離の回避のためにも重要である。
【００１５】
[0029]このように、ペプチド化学者は、カルボジイミドに基づく活性化法でも又はオニウム塩に基づく活性化法でも、ペプチド合成においてカップリング工程に高温を適用する場合、制約に直面することになる。
【００１６】
[0030]過剰のカルボジイミドはアミノ基と反応し、ペプチド結合の形成に望ましくないことが示唆されているため、過剰のカルボジイミドの使用は回避されるようになった。しかしながら、稀ではあるが、過剰のカルボジイミドの使用も検討されている。一つの報告では、アミノ酸に対して過剰のＤＩＣ／ＨＯＢｔを使用したところ、Ｎ−アシル尿素ペプチド形成が観察されたことから、過剰のカルボジイミドによるアミノ基の望ましくないキャッピングが報告された（Ｂ．Ｊ．Ｅｇｎｅｒ，Ｇ．Ｊ．Ｌａｎｇｌｅｙ及びＭ．Ｂｒａｄｌｅｙ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．６０，ｎｏ．９，ｐｐ．２６５２−２６５３，１９９５）。
【００１７】
[0031]過剰のカルボジイミドの使用は、カップリング後に形成されるアシル尿素の困難な溶媒和性の点からも望ましくないと見られていた。これはＤＣＣでは特に問題である。というのも、その尿素は多くの溶媒に不溶であるため、ジクロロメタン(ＤＣＭ)の使用を必要とするからである。これが大きな要因となって、ＤＣＣはＤＩＣ（その尿素はＤＭＦにより可溶である）に取って代わられている。
【００１８】
[0032]ごく最近、ＳＰＰＳの改良カップリング法がＵＳ１４／９６９，００４に提示された。それは、高温での標準的なカルボジイミド及びオニウム塩に基づくいずれの方法にも優るカップリングの改良を示していた。この方法は、塩基の使用を特徴とする変形カルボジイミド活性化戦略である。アミノ酸に対して１当量未満で添加された強塩基、カルボジイミド、及び活性化添加剤が、全活性化及びカップリング過程の最中に存在できながら全体的カップリング反応も増強でき、可能性ある副反応も回避できることが見出された。限定的な量の塩基の使用により、エピマー化もごくわずかな増大しか観察されなかった。
【００１９】
[0033]従って、これらの様々な不利益を回避しながら、高温の利益を組み込むことができるペプチド合成スキームが求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２０】
【非特許文献１】Ｓ．Ｎｏｚａｋｉ，Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ．，ｖｏｌ．１２，ｐｐ．１４７−１５３，２００６
【非特許文献２】Ｍ．Ｉｔｏｈ，Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，ｖｏｌ．４６，ｐｐ．２２１９−２２２１，１９７３
【非特許文献３】Ｒ．Ｓｕｂｉｒｏｓ−Ｆｕｎｏｓａｓ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．１５，ｐｐ．９３９４−９４０３，２００９
【非特許文献４】Ｊ．Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｋ．Ｐｏｒｔｅｒ，Ｓ．Ｓｉｎｇｈ及びＧ．Ｖａｎｉｅｒ，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．，ｖｏｌ．１６，ｐｐ．９４０−９４３，２０１４
【非特許文献５】Ｌ．Ｃａｒｐｉｎｏ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，ｖｏｌ．５５，ｐｐ．６８１３−６８３０，１９９９
【非特許文献６】Ｍ．Ｂｅｙｅｒｍａｎｎ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．３７，ｐｐ．２５２−２５６，１９９１
【非特許文献７】Ｂ．Ｊ．Ｅｇｎｅｒ，Ｇ．Ｊ．Ｌａｎｇｌｅｙ及びＭ．Ｂｒａｄｌｅｙ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．６０，ｎｏ．９，ｐｐ．２６５２−２６５３，１９９５
【発明の概要】
【００２１】
[0034]アミノ酸をカップリングしてペプチド又はペプチドミメティックを製造するための改良された方法であって、活性化及びカップリングが、同じ容器内にて、アミノ酸に対して１当量を超える量のカルボジイミドの存在下、活性化添加剤の存在下、及び３０℃を超える温度で実施される方法を開示する。
【００２２】
[0035]一部の態様において、カルボジイミドは、アミノ酸に対して１．５当量を超える量で存在する。
[0036]一部の態様において、方法は１０分未満の総カップリング時間に制限される。
【００２３】
[0037]一部の態様において、カルボジイミドは、アミノ酸に対して１．５当量を超える量で存在する。
[0038]一部の態様において、方法は１０分未満の総カップリング時間に限定され、３０℃を超える温度で実施される。
【００２４】
[0039]一部の態様において、方法は、存在するカルボジイミドの量をアミノ酸に対して約１．５〜４当量に制限することを含む。
[0040]一部の態様において、方法は１０分未満の総カップリング時間に限定され、７０℃を超える温度で実施される。
【００２５】
[0041]一部の態様において、方法は固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）法である。
[0042]一部の態様において、付け加えられる酸の少なくとも一つは最初にＦｍｏｃ保護される。
【００２６】
[0043]本発明の上記及びその他の目的及び利点、ならびに本発明が達成される様式は、以下の詳細な説明を基にすることにより、より明白になるであろう。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
[0044]強塩基の使用を避けながら同時にカップリング効率を増大する高温での改良されたカルボジイミドカップリング法を示す。本方法は、アミノ酸に対して増大された量のカルボジイミド（１当量を超える）を使用することにより、カップリングに予期せぬ改良が見られたことに基づく。この組合せは、ｏ−アシルイソ尿素中間体のより迅速な形成、予期されるＮ−アシル尿素ペプチド形成及び／又は末端アミノ基のキャッピングの回避、及びカルボジイミドカップリングで塩基を使用した場合と比べてエピマー化の低減を通じ、カップリング効率を独自に改良したことが見出された。本方法の効率は、表１〜３に示されているように、様々な条件下で３種類の異なるペプチド配列を合成することにより、確認された。
【００２８】
[0045]本発明はまた、ペプチドミメティック、すなわちペプチドを模倣するために設計された小タンパク質様鎖(small protein-like chains)の合成にも適用される。本明細書において記載されるカップリング反応は、ペプチドとペプチドミメティックの間で大部分が同一なので、本発明ではペプチドに関して記載することにする。当業者には、当然ながら、このことは完全に理解されるであろう。
【００２９】
[0046]同様に、当業者であれば、“アミノ酸”という用語は、本明細書においては、アミンとカルボン酸官能基の両方を、通常は側鎖と共に、含有する有機化合物のことを言うのにその最も広い意味で使用されていることも理解されるであろう。当業者は、ポリペプチドに天然に組み込まれ、タンパク質構成(proteinogenic)又は天然アミノ酸と呼ばれる２２種類のアミノ酸のことは周知であり、精通している。繰り返すが、基本的なカップリング反応はこれらの特定分子に限定されないので、当業者であれば、本発明の利益は、非タンパク質構成アミノ酸（“非天然アミノ酸”としても知られる）（このうちの４０種類は確立された合成工程を用いてタンパク質に付加されている）にも適用されることは分かるであろう。本明細書中に記載された結果は、合成ペプチドにおいて良く確立されたアミノ酸の１文字表記を使用している。
【００３０】
[0047]固相ペプチド化学の基礎は、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄの先駆者的研究を端緒として良く確立されている（Ｒ．Ｂ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３）“固相ペプチド合成Ｉ、テトラペプチドの合成(Solid Phase Peptide Synthesis I, The Synthesis of a Tetrapeptide)”，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５ （１４），２１４９−２１５４）。しばしば使用されるＦｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）保護基法は、当業者が容易に利用できる文献に良く説明されている（例えば、Ｃｈａｎ及びＷｈｉｔｅ，“Ｆｍｏｃ固相ペプチド合成、実践的手法(Fmoc solid phase peptide synthesis, a practical approach)，オックスフォード大学出版局（２０００））。
【００３１】
[0048]実験のところで言及されているＬＩＢＥＲＴＹ  ＢＬＵＥＴＭ装置は、ノースカロライナ州マシューズのＣＥＭ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社より入手できる。高温での固相ペプチド合成の主題を扱い、マイクロ波照射を使用している関連米国特許は以下の通りであるが、必ずしもこれらに限定されない。米国特許第７３９３９２０号；７５５０５６０号；７５６３８６５号；７９３９６２８号；７９０２４８８号；７５８２７２８号；８１５３７６１号；８０５８３９３号；８４２６５６０号；８８４６８６２号；９２１１５２２号。これらの内容は引用によって全て本明細書に援用される。
【実施例】
【００３２】
[0049]表１  様々な量のカルボジイミドを用いたチモシンの合成
【００３３】
【表１】
2018070590.tif 000004
【００３４】
[0050]実験条件：
[0051]ペプチド配列（チモシン）＝ＳＤＡＡＶＤＴＳＳＥＩＴＴＫＤＬＫＥＫＫＥＶＶＥＥＡＥＮ−ＮＨ２
[0052]合成規模＝０．１ｍｍｏｌ
[0053]樹脂＝Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ  ＭＢＨＡ  ポリスチレン樹脂（０．３８ｍｍｏｌ／ｇ）
[0054]装置＝Ｌｉｂｅｒｔｙ  Ｂｌｕｅ  マイクロ波ペプチド合成機（ＣＥＭ  Ｃｏｒｐ．社製、ノースカロライナ州マシューズ）
[0055]脱保護＝ＥｔＯＨ：ＮＭＰ（１：９）中１０％（ｗ／ｖ）ピペラジン３ｍＬ
[0056]マイクロ波脱保護法＝９０℃で１分間
[0057]洗浄＝脱保護後（２ｍＬ、２ｍＬ、３ｍＬ−ＤＭＦ）；カップリング後＝なし
[0058]カップリング＝４ｍＬ溶液中５倍過剰のＡＡ／ＤＩＣ／Ｏｘｙｍａ
[0059]切断（切り出し）＝Ａｃｃｅｎｔ  ＭＷ  切断装置（ＣＥＭ  Ｃｏｒｐ．社製、ノースカロライナ州マシューズ）中３８℃で３０分間、５ｍＬのＴＦＡ／ＴＩＳ／Ｈ２Ｏ／ＤＯＤｔ（９２．５：２．５：２．５：２．５）
[0060]分析＝ペプチドは、３１００シングル四重極ＭＳを備えたＷａｔｅｒｓ社製ＵＰＬＣ  ＡＣＱＵＩＴＹ  Ｈ−Ｃｌａｓｓにて、溶媒系として０．１％ＴＦＡ入りアセトニトリル／水を用い、Ｃ１８カラム（１．７ｍｍ、２．１×１００ｍｍ）で分析された
[0061]表２  様々な量のカルボジイミドを用いたＧＲＰの合成
【００３５】
【表２】
2018070590.tif 000005
【００３６】
[0062]実験条件：
[0063]ペプチド配列（ＧＲＰ）＝ＶＰＬＰＡＧＧＧＴＶＬＴＫＭＹＰＲＧＮＨＷＡＶＧＨＬＭ−ＮＨ２
[0064]合成規模＝０．１ｍｍｏｌ
[0065]樹脂＝Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ  ＭＢＨＡ  ポリスチレン樹脂（０．３５ｍｍｏｌ／ｇ）
[0066]装置＝Ｌｉｂｅｒｔｙ  Ｂｌｕｅ  マイクロ波ペプチド合成機（ＣＥＭ  Ｃｏｒｐ．社製、ノースカロライナ州マシューズ）
[0067]脱保護＝ＥｔＯＨ：ＮＭＰ（１：９）中１０％（ｗ／ｖ）ピペラジン３ｍＬ
[0068]マイクロ波脱保護法＝９０℃で１分間
[0069]洗浄＝脱保護後（２ｍＬ、２ｍＬ、３ｍＬ−ＤＭＦ）；カップリング後＝なし
[0070]カップリング＝４ｍＬ溶液中５倍過剰のＡＡ／ＤＩＣ／Ｏｘｙｍａ
[0071]切断（切り出し）＝Ａｃｃｅｎｔ  ＭＷ  切断装置（ＣＥＭ  Ｃｏｒｐ．社製、ノースカロライナ州マシューズ）中３８℃で３０分間、５ｍＬのＴＦＡ／ＴＩＳ／Ｈ２Ｏ／ＤＯＤｔ（９２．５：２．５：２．５：２．５）
[0072]分析＝ペプチドは、３１００シングル四重極ＭＳを備えたＷａｔｅｒｓ社製ＵＰＬＣ  ＡＣＱＵＩＴＹ  Ｈ−Ｃｌａｓｓにて、溶媒系として０．１％ＴＦＡ入りアセトニトリル／水を用い、Ｃ１８カラム（１．７ｍｍ、２．１×１００ｍｍ）で分析された
[0073]表３  様々な量のカルボジイミドを用いたユビキチンの合成
【００３７】
【表３】
2018070590.tif 000006
【００３８】
[0074]実験条件：
[0075]ペプチド配列（ユビキチン）＝ＭＱＩＦＶＫＴＬＴＧＫＴＩＴＬＥＶＥＰＳＤＴＩＥＮＶＫＡＫＩＱＤＫＥＧＩＰＰＤＱＱＲＬＩＦＡＧＫＱＬＥＤＧＲＴＬＳＤＹＮＩＱＫＥＳＴＬＨＬＶＬＲＬＲＧＧ−ＮＨ２
[0076]合成規模＝０．１ｍｍｏｌ
[0077]樹脂＝Ｆｍｏｃ−ＰＡＬ−ＰＥＧ−ＰＳ樹脂（０．２０ｍｍｏｌ／ｇ）
[0078]装置＝Ｌｉｂｅｒｔｙ  Ｂｌｕｅ  マイクロ波ペプチド合成機（ＣＥＭ  Ｃｏｒｐ．社製、ノースカロライナ州マシューズ）
[0079]脱保護＝ＥｔＯＨ：ＮＭＰ（１：９）中１０％（ｗ／ｖ）ピペラジン４ｍＬ＋０．１Ｍ  ＨＯＢｔ
[0080]マイクロ波脱保護法＝９０℃で１分間
[0081]洗浄＝脱保護後（４×４ｍＬ  ＤＭＦ）；カップリング後＝なし
[0082]カップリング＝４ｍＬ溶液中５倍過剰のＡＡ／ＤＩＣ／Ｏｘｙｍａ
[0083]切断（切り出し）＝Ａｃｃｅｎｔ  ＭＷ  切断装置（ＣＥＭ  Ｃｏｒｐ．社製、ノースカロライナ州マシューズ）中３８℃で３０分間、５ｍＬのＴＦＡ／ＴＩＳ／Ｈ２Ｏ／ＤＯＤｔ（９２．５：２．５：２．５：２．５）
[0084]分析＝ペプチドは、３１００シングル四重極ＭＳを備えたＷａｔｅｒｓ社製ＵＰＬＣ  ＡＣＱＵＩＴＹ  Ｈ−Ｃｌａｓｓにて、溶媒系として０．１％ＴＦＡ入りアセトニトリル／水を用い、Ｃ１８カラム（１．７ｍｍ、２．１×１００ｍｍ）で分析された
[0085]表１に示されているように、カルボジイミドをアミノ酸に対して過剰に増加させることにより、純度の顕著な増大が観察された（７５％対６３％）。同様の改良は、表２及び３に示されているように合成された他のペプチドからも観察された。これらの結果を合わせると、カップリング効率が増大したのみならず、カルボジイミド由来のキャッピングの可能性も回避されたことを示している。これはおそらくキャッピングと比べてアシル化の反応速度(kinetics)が増大したことにより、この可能性ある副反応が回避されるためであろう。さらに、カップリング反応の温度増大も、カルボジイミドから形成された尿素が完全に溶解し、その後の排液(draining)及び洗浄工程中に除去されることを確実にするために役立つ。従って、高温は、１当量を超えるカルボジイミドの使用を通じて生成する多量の尿素に由来する潜在的溶解性の問題に対する保護策を提供する。
【００３９】
[0086]次に、各アミノ酸のエピマー化を、加水分解、その後の誘導体化、及びガスクロマトグラフィーによる分析（ＣＡＴ  ＧｍｂＨ）によって調べた。我々は、過剰カルボジイミド法を用いて、極めて低レベルのエピマー化しか観察しなかった。これはおそらくカップリング反応が最速で完了し（活性化種の短い寿命）、外部塩基が存在しないためであろう。従って、本方法は、高温でのカップリングに関してこれまでに記載されたいずれの従来法にも優る利益を提供する。
【００４０】
[0087]表４  ２当量のカルボジイミドを用いたチモシン合成のエピマー化分析
【００４１】
【表４】
2018070590.tif 000007
【００４２】
[0088]カップリング法の最中に塩基を使用するのは、望ましくない副反応を招きうるので理想的ではない。Ｃｏｌｌｉｎｓらは、何の塩基も存在しないと、カルボジイミドに基づくカップリング法の下、９０℃でシステインのエピマー化が如何に最小限になるかを示した（Ｊ．Ｃｏｌｌｉｎｓら，“高効率固相ペプチド合成（ＨＥ−ＳＰＰＳ），”Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．，ｖｏｌ．１６，ｐｐ．９４０−９４３，２０１４）。Ｐａｌａｓｅｋらは、ＤＩＥＡ及びＮＭＭが２当量で存在するオニウム塩活性化法の下では如何に顕著なシステインのエピマー化が起こりうるかを示した（Ｓ．Ｐａｌａｓｅｋ，Ｚ．Ｃｏｘら，“マイクロ波増強Ｆｍｏｃ固相ペプチド合成におけるラセミ化及びアスパルチミド形成の制限(Limiting racemization and aspartimide formation in microwave-enhanced Fmoc solid phase peptide synthesis)”,Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ．，ｖｏｌ．１３，ｐｐ．１４３−１４８，２００７）。Ｆｍｏｃ保護基はＤＩＥＡに対して徐々に不安定になることも知られている。これは高温で増大しかねないため、分離が困難となり得る望ましくない挿入配列をもたらす。
【００４３】
【表５】
2018070590.tif 000008
【００４４】
[0089]表５  高温でのペプチドカップリングに関するカルボジイミド活性化戦略とオニウム塩活性化戦略の比較
【００４５】
【表６】
2018070590.tif 000009
【００４６】
[0090]表６  高温でのペプチドカップリングに関するカルボジイミド活性化戦略の比較
[0091]本明細書において、本発明の好適な態様を示し、そして特定の用語を使用してきたが、それらは一般的及び説明的意味でのみ使用されたものであり、制限を目的としたものではない。本発明の範囲は特許請求の範囲において定義されている。
【手続補正書】
【提出日】平成30年1月15日(2018.1.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸をカップリングしてペプチド又はペプチドミメティックを製造する方法において、改良が、
活性化添加剤の存在下；及び
３０℃を超える温度で
活性化及びカップリングを同じ容器内で実施し；
アミノ酸に対して１当量を超える量のカルボジイミドを配合する
ことを含む方法。
【請求項２】
請求項１に記載の固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）法。
【請求項３】
アミノ酸の少なくとも一つが最初にＦｍｏｃ保護されている、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
カルボジイミドがアミノ酸に対して１．５〜４当量の量で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
７０℃を超える温度で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
１０分未満の総カップリング時間に制限される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
１５分未満の総カップリング時間に制限される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
活性化添加剤がアミノ酸に対して１〜１．５当量の量で存在する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
活性化添加剤がアミノ酸に対して１〜１．５当量の量で存在し、カップリング工程が１０分未満に制限される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
活性化添加剤がアミノ酸に対して１〜１．５当量の量で存在し、カップリング工程が１５分未満に制限される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
アミノ酸をカップリングしてペプチド又はペプチドミメティックを製造するための組成物であって、
アミノ酸と；
有機溶媒と；
前記アミノ酸に対して１当量を超える量のカルボジイミドと；そして
活性化添加剤と
を含む組成物。
【請求項１２】
前記組成物がさらに、１〜１．５当量の前記活性化添加剤を含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記組成物がさらに、１．５〜４当量の前記カルボジイミドを含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記アミノ酸がＦｍｏｃ保護されたアミノ酸である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記アミノ酸と前記カルボジイミドのＯ−アシルイソ尿素中間体をさらに含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１６】
ＤＩＣ又はＯｘｙｍａ活性化剤をさらに含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記アミノ酸と前記カルボジイミドの前記Ｏ−アシルイソ尿素のエステルをさらに含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
固相樹脂に連結された少なくとも一つのアミノ酸を含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１９】
固相ペプチド合成樹脂に連結されたペプチド鎖をさらに含む、請求項１１に記載の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
本発明の態様
態様１  アミノ酸をカップリングしてペプチド又はペプチドミメティックを製造する方法において、改良が、
活性化添加剤の存在下；及び
３０℃を超える温度で
活性化及びカップリングを同じ容器内で実施し；
アミノ酸に対して１当量を超える量のカルボジイミドを配合する
ことを含む方法。
態様２  活性化された酸が、固相樹脂に連結された少なくとも一つの他のアミノ酸とカップリングされる、態様１に記載の固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）法。
態様３  付け加えられる酸の少なくとも一つが最初にＦｍｏｃ保護されている、態様２に記載の固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）法。
態様４  カルボジイミドがアミノ酸に対して１．５〜４当量の量で存在する、態様１に記載の方法。
態様５  ７０℃を超える温度で実施される、態様１に記載の方法。
態様６  １０分未満の総カップリング時間に制限される、態様１に記載の方法。
態様７  １５分未満の総カップリング時間に制限される、態様１に記載の方法。
態様８  活性化添加剤がアミノ酸に対して１〜１．５当量の量で存在する、態様１に記載の方法。
態様９  カルボジイミドがアミノ酸に対して１．５〜４当量の量で存在する、態様８に記載の方法。
態様１０  アミノ酸をカップリングしてペプチド又はペプチドミメティックを製造するための組成物であって、
アミノ酸と；
有機溶媒と；
前記アミノ酸に対して１当量を超える量のカルボジイミドと；そして
活性化添加剤と
を含む組成物。
態様１１  前記組成物がさらに、前記アミノ酸に対して１〜１．５当量の前記活性化添加剤を含む、態様１０に記載の組成物。
態様１２  前記組成物がさらに、前記アミノ酸に対して１．５〜４当量の前記カルボジイミドを含む、態様１０に記載の組成物。
態様１３  前記アミノ酸が最初にＦｍｏｃ保護されたアミノ酸である、態様１０に記載の組成物。
態様１４  前記アミノ酸と前記カルボジイミドのＯ−アシルイソ尿素中間体をさらに含む、態様１０に記載の組成物。
態様１５  ＤＩＣ又はＯｘｙｍａ活性化剤をさらに含む、態様１４に記載の組成物。
態様１６  前記アミノ酸と前記カルボジイミドの前記Ｏ−アシルイソ尿素のエステルをさらに含む、態様１５に記載の組成物。
態様１７  固相樹脂に連結された少なくとも一つのアミノ酸を含む、態様１０に記載の組成物。
態様１８  固相ペプチド合成樹脂に連結されたペプチド鎖をさらに含む、態様１０に記載の組成物。
[0090]表６  高温でのペプチドカップリングに関するカルボジイミド活性化戦略の比較
[0091]本明細書において、本発明の好適な態様を示し、そして特定の用語を使用してきたが、それらは一般的及び説明的意味でのみ使用されたものであり、制限を目的としたものではない。本発明の範囲は特許請求の範囲において定義されている。
【外国語明細書】
2018070590000001.pdf