(57)【要約】      （修正有）【課題】肺動脈性高血圧症（ＰＡＨ）の新規治療方法の提供。【解決手段】肺動脈性高血圧症（ＰＡＨ）を処置するための方法であって、単離された内皮前駆細胞（ＥＰＣ）を提供する工程；前記ＥＰＣをプロスタサイクリンにより処理する工程であって、前記処理されたＥＰＣが、向上した血管新生活性を有する過剰増殖性の表現型を示す工程；及び、前記処理されたＥＰＣを含む組成物を、ＰＡＨを患う対象に投与する工程を含む、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
肺動脈性高血圧症（ＰＡＨ）を処置するための方法であって、
単離された内皮前駆細胞（ＥＰＣ）を提供する工程；
前記ＥＰＣをプロスタサイクリンにより処理する工程であって、前記処理されたＥＰＣ
が、向上した血管新生活性を有する過剰増殖性の表現型を示す工程；および、
前記処理されたＥＰＣを含む組成物を、ＰＡＨを患う対象に投与する工程を含む、
方法。
【請求項２】
前記プロスタサイクリンが、エポプロステノールナトリウム、トレプロスチニル、イル
プロストおよびＰＧＩ２受容体作動剤からなる群から選択される、請求項１に記載の方法
。
【請求項３】
前記対象が、ヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＥＰＣが、自家である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＥＰＣが、ＰＡＨを患う前記対象の血液から単離される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＥＰＣが、内皮コロニー形成細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＥＰＣが、遺伝子組み換えされている、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記組成物が、少なくとも１つの薬学的に許容され得るキャリアをさらに含む薬学的組
成物である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記組成物が、さらに、ＥＰＣを除く少なくとも１つの治療剤を含む、請求項１に記載
の方法。
【請求項１０】
前記組成物が、肺血管の修復を促進する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＥＰＣが、少なくとも１つの増殖因子と共に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記増殖因子が、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＢＭＰ−４およびＴＧＦ−ベ
ータからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＥＰＣが、間葉系幹細胞または、間葉系幹細胞と接触しており、その１つまたはそ
れ以上の成分を含む培養培地と共に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＥＰＣが、プロスタサイクリンと共に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記対象が、前記ＥＰＣの単離前に、プロスタサイクリンにより前処置される、請求項
５に記載の方法。
【請求項１６】
ＥＰＣの増殖を促進するための方法であって、
単離されたＥＰＣを提供する工程；
前記ＥＰＣをプロスタサイクリンにより処理する工程を含み、
前記プロスタサイクリンが、前記ＥＰＣの増殖を向上させる、
方法。
【請求項１７】
前記ＥＰＣが、ヒトから単離される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＥＰＣが、組織または細胞培養物から単離される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記プロスタサイクリンが、トレプロスチニルである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記処理されたＥＰＣが、向上した血管新生特性を有する過剰増殖性の表現型を示す、
請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
ＰＡＨを処置するための方法であって、
単離されたＥＰＣを提供する工程；および、
プロスタサイクリンと前記ＥＰＣとを、ＰＡＨを患う対象に共に投与する工程を含む、
方法。
【請求項２２】
ＰＡＨを処置するための方法であって、
単離されたＥＰＣを提供する工程；
前記ＥＰＣを、ＰＡＨを患う対象に投与する工程；および、
プロスタサイクリンを、前記対象に投与する工程を含む、
方法。
【請求項２３】
ＰＡＨを処置するための方法であって、
単離されたＥＰＣを提供する工程；
プロスタサイクリンを、ＰＡＨを患う対象に投与する工程；および、
前記ＥＰＣを、前記対象に投与する工程を含む、
方法。
【請求項２４】
前記ＥＰＣが、間葉系幹細胞または、間葉系幹細胞と接触しており、その１つまたはそ
れ以上の成分を含む培養培地と共に投与される、請求項２１−２３のいずれかに記載の方
法。
【請求項２５】
前記プロスタサイクリンが、間葉系幹細胞または、間葉系幹細胞と接触しており、その
１つまたはそれ以上の成分を含む培養培地と共に投与される、請求項２１−２３のいずれ
かに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年８月１日に出願された米国仮出願番号第６１／６７８，２０８号
および２０１３年１月９日に出願された米国仮出願番号第６１／７５０，４５８号の利益
を請求する。それらの内容は、それらの全体が参照により組み込まれる。
【０００２】
本出願は、肺動脈性高血圧症（ＰＡＨ）および他の種類の肺高血圧症の処置における内
皮前駆細胞（ＥＰＣ）の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
肺動脈性高血圧症は、進行性の肺傷害であり、未処置の場合、診断された後、平均２．
８年以内に死に至る。肺循環の進行する狭窄が、右心の向上したストレスをもたらし、右
心不全に発展し得る。定義によれば、慢性の肺高血圧症の症例における平均肺動脈圧（ｍ
ＰＡＰ）は、安静時に２５ｍｍＨｇより大きく、労作中に３０ｍｍＨｇより大きい（正常
値は、２０ｍｍＨｇ未満である）。肺動脈性高血圧症の病態生理学は、血管収縮および肺
血管の組織修復により特徴付けられる。慢性ＰＡＨでは、最初に筋肥大していない肺血管
の筋肥大新生が存在し、既に筋肥大した血管の血管筋は、外周で増加する。肺循環のこの
進行する閉塞は、右心における進行性のストレスをもたらす。前記ストレスは、右心から
の低下した出力をもたらし、最終的に、右心不全をもたらす（M. Humbert et al., J. Am
. Coll. Cardiol. 2004, 43, 13S-24S）。ＰＡＨは、１００万人あたりに１−２人の有病
率である、極端に稀な障害である。患者の平均年齢は、３６歳であると推定されており、
患者の１０％のみが、６０歳を超えていた。明確に、男性より女性が罹患する（G. E. D'
Alonzo et al., Ann. Intern. Med. 1991, 115, 343-349）。
【０００４】
上市されている標準的な治療（例えば、プロスタサイクリン類似体、エンドセリン受容
体拮抗剤、ホスホジエステラーゼ阻害剤）は、患者の生活の質、運動耐性および予後を改
善することが可能である。これらの治療の原理は、主に、血管緊張に影響を及ぼすが、病
原性の組織修復プロセスにおける直接的な影響を有しない血流力学的である。さらに、こ
れらの薬剤を使用する可能性は、場合により、深刻な副作用および／または混合型の投与
により制限される。患者の臨床状態が特定の単剤療法により改善または安定化され得る期
間は限定的である。最終的には、前記治療は段階的に拡大するため、混合療法が適用され
る。この場合、複数の薬剤が、同時に提供されなければならない。肺動脈性高血圧症の治
療における全ての利点に関わらず、この深刻な障害の治癒の見通しは未だに存在しない。
【０００５】
内皮前駆細胞は、成体の骨髄ならびに末梢血およびヒトの臍帯血において特定されてき
ており、成熟した内皮細胞を増殖させ、同内皮細胞に分化させるその活性を維持するのが
示されてきた（Ashara et al., Science 275:964 (1997)；Murohara et al., J. Clin. I
nvest. 105(11):1527-36(2000)）。胚形成中での新たな血管の伸長である脈管形成は、内
皮前駆細胞（ＥＰＣ）および造血幹細胞を含む血島の形成により開始する（Risau, Natur
e 386(6626):671-4 (1997)；Risau, FASEB J. 9(10):926-33 (1995)；Risau et al., Dev
elopment 102(3):471-8 (1988)；Flamme et al., Development 116(2):435-9 (1992)；Ha
tzopoulos et al., Development 125(8):1457-68 (1998)；Doyle et al., Endothelium 1
3(6):403-10 (2006)；Ribatti, Leuk Res. (4):439-44 (2007)）。
【０００６】
ＥＰＣは、出生後の血管新生に関与することが示されてきた（Takahashi et al., Nat 
Med. 5(4):434-8 (1999)；Isner and Asahara, J Clin Invest. 103(9):1231-6 (1999)）
。さらに、ＥＰＣは、血管形成、血管修復および血管保護に関与することが見出された（
Doyle et al., Endothelium 13(6):403-10 (2006)）。
【０００７】
ここで、プロスタサイクリン処理されたＥＰＣが、ＰＡＨを処置するのに有用であるこ
とが、驚くべきことに見出されてきた。
【発明の概要】
【０００８】
本発明の一実施形態は、肺動脈性高血圧症（ＰＡＨ）を処置するための方法であって、
単離された内皮前駆細胞（ＥＰＣ）を提供する工程；前記ＥＰＣをプロスタサイクリンに
より処理する工程であって、前記処理されたＥＰＣが、向上した血管新生活性を有する過
剰増殖性の表現型を示す工程；および、前記処理されたＥＰＣを含む組成物を、ＰＡＨを
患う対象に投与する工程を含む方法である。別の実施形態では、前記プロスタサイクリン
は、エポプロステノールナトリウム、トレプロスチニル、イルプロストおよびＰＧＩ２受
容体作動剤からなる群から選択され得る。別の実施形態では、前記対象は、ヒトである。
別の実施形態では、前記ＥＰＣは、自家であり、ＰＡＨを患う前記対象の血液から単離さ
れ、内皮コロニー形成細胞であり、遺伝子組み換えされており、少なくとも１つの増殖因
子と共に投与され、間葉系幹細胞または、間葉系幹細胞と接触しており、その１つまたは
それ以上の成分を含む培養培地と共に投与され、および／または、プロスタサイクリンと
共に投与される。別の実施形態では、前記ＥＰＣは、プロスタサイクリンと、間葉系幹細
胞または、間葉系幹細胞と接触しており、その１つまたはそれ以上の成分を含む培養培地
との両方を共に投与される。別の実施形態では、前記増殖因子は、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ−Ａ
、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＢＭＰ−４およびＴＧＦ−ベータからなる群から選択される。別の実施
形態では、前記組成物は、ＥＰＣ以外に、少なくとも１つの薬学的に許容され得るキャリ
アまたは少なくとも１つの治療剤をさらに含む薬学的組成物である。別の実施形態では、
前記組成物は、肺動脈の修復を促進する。別の実施形態では、前記対象は、前記ＥＰＣの
単離前に、プロスタサイクリンにより前処置される。
【０００９】
本発明の別の実施形態は、ＥＰＣの増殖を促進するための方法であって、単離されたＥ
ＰＣを提供する工程；前記ＥＰＣをプロスタサイクリンにより処理する工程を含み、前記
プロスタサイクリンが、前記ＥＰＣの増殖を向上させる方法である。前記ＥＰＣは、ヒト
または組織もしくは細胞培養物から単離され得る。さらに、前記処理されたＥＰＣは、向
上した血管新生特性を有する過剰増殖性の表現型を示し得る。別の実施形態では、前記プ
ロスタサイクリンは、トレプロスチニルである。
【００１０】
本発明の別の実施形態は、ＰＡＨを処置するための方法であって、単離されたＥＰＣを
提供する工程；および、プロスタサイクリンと前記ＥＰＣとを、ＰＡＨを患う対象に共に
投与する工程を含む方法である。
【００１１】
本発明の別の実施形態は、ＰＡＨを処置するための方法であって、単離されたＥＰＣを
提供する工程；前記ＥＰＣを、ＰＡＨを患う対象に投与する工程；および、プロスタサイ
クリンを、前記対象に投与する工程を含む方法である。
【００１２】
本発明の別の実施形態は、ＰＡＨを処置するための方法であって、単離されたＥＰＣを
提供する工程；プロスタサイクリンを、ＰＡＨを患う対象に投与する工程；および、前記
ＥＰＣを、前記対象に投与する工程を含む方法である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
特に断らない限り、「ａ」または「ａｎ」は、「１つまたはそれ以上（one or more）
」を意味する。
【００１４】
特に他に規定しない限り、本願明細書において使用される全ての技術的および科学的用
語は、（例えば、幹細胞の生物学、細胞培養、分子遺伝学、免疫学、免疫組織化学、タン
パク質化学および生化学における）当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有す
るであろう。
【００１５】
特に断らない限り、本発明において使用される組換えタンパク質、細胞培養および免疫
技術は、当業者に周知の標準的な手法である。このような技術は、例えば、J. Perbal, A
Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984)、J. Sambrook e
t al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Pr
ess (1989)、T. A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Appro
ach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991)、D. M. Glover and B. D. Hames (editors), 
DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 and 1996)およびF
. M. Ausubel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pu
b. Associates and Wiley-Interscience（1988、現在までの全てのアップデートを含む）
、Ed Harlow and David Lane (editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Sprin
g Harbour Laboratory, (1988)ならびにJ. E. Coligan et al. (editors) Current Proto
cols in Immunology, John Wiley & Sons（現在までの全てのアップデートを含む）の出
典における文献全体を通して記載され、説明される。これらの文献は、参照により本願明
細書に組み込まれる。
【００１６】
本願明細書で使用する時、「対象」（本願明細書では、「患者」とも呼ばれる）の用語
は、温血動物、好ましくは哺乳類、例えば、ヒトを含む。好ましい実施形態では、前記対
象は、霊長類である。さらにより好ましい実施形態では、前記対象は、ヒトである。
【００１７】
本願明細書で使用する時、「処置すること（treating）」、「処置する（treat）」ま
たは「処置（treatment）」の用語は、肺動脈性高血圧症の少なくとも１つの兆候を低減
または除去するのに十分な治療的に有効量の本願明細書に規定された細胞を投与すること
を含む。
【００１８】
本願明細書で使用する時、「予防すること（preventing）、「予防する（prevent）ま
たは「予防（prevention）」の用語は、肺動脈性高血圧症の少なくとも１つの兆候の進行
を停止または防止するのに十分な治療的に有効量の本願明細書に規定された細胞を投与す
ることを含む。
【００１９】
本願明細書で使用する時、「幹細胞」の用語は、表現型的および遺伝子型的に同一の娘
および少なくとも１つの他の最終的な細胞種（例えば、最終的に分化した細胞）を生じさ
せ得る自己再生細胞を意味する。前記「幹細胞」の用語は、全能性、多能性および多分化
能の細胞ならびにそれらの分化由来の前駆細胞および／または前駆体を含む。
【００２０】
本願明細書で使用する時、前記「全能性細胞（totipotent cell）」または「全能性細
胞（totipotential cell）」の用語は、完全な胚（例えば、胞胚）を形成可能な細胞を意
味する。
【００２１】
本願明細書で使用する時、前記「多能性細胞（pluripotent cell）」または「多能性細
胞（pluripotential cell）」の用語は、完全に分化した万能性、すなわち、哺乳類の身
体のおおよそ２６０の細胞種のいずれかに成長する能力を有する細胞を意味する。多能性
細胞は、自己再生することができ、組織内で休止または静止したままであることができる
。
【００２２】
「多分化能細胞（multipotential cell）」または「多分化能細胞（multipotent cell
）」は、複数の成熟細胞種を生じ得る細胞を意味する。本願明細書で使用する時、この表
現は、成体性または胚性の幹細胞および前駆細胞ならびにこれらの細胞の多分化能子孫を
包含する。多能性細胞と違って、多分化性細胞は、前記細胞種の全てを形成する能力を有
していない。
【００２３】
本願明細書で使用する時、前記「前駆細胞」の用語は、特定種の細胞に分化するか、ま
たは、特定種の組織を形成するのを関連付けられた細胞を意味する。
【００２４】
内皮前駆細胞
本発明は、ＥＰＣを提供する。ＥＰＣは、増殖するのに誘導され得る未分化細胞である
。ＥＰＣは、各細胞分割に関して、少なくとも１つの娘細胞もＥＰＣ細胞であろうように
、自己維持可能である。ＥＰＣは、１００、２５０、５００、１０００、２０００、３０
００、４０００、５０００倍またはそれ以上に発展され得る。
【００２５】
ＥＰＣの表現型は、これらの細胞が、関連する造血マーカーＣＤ４５を発現することを
証明する。さらに、ＥＰＣは、ＶＥＧＦＲ−２および／またはＴｉｅ−２について免疫反
応性であり得る。場合により、前記ＥＰＣは、ＣＤ１４について免疫反応性である。前記
ＥＰＣは、多分化能の前駆細胞である。
【００２６】
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、胚の血管新生および造血に必須であるシグナルを伝
達する、ＶＥＧＦＲ−１（ｆｌｔ−１）およびＶＥＧＦＲ−２（ｆｌｋ−１／ＫＤＲ）な
らびにＶＥＧＦＲ−３／Ｆｌｔ−４を含む、特定のチロシンキナーゼ受容体を介して作用
する。ＶＥＧＦは、３つ全ての受容体に結合するが、ほとんどの生体機能は、ＶＥＧＦＲ
−２により媒介される。ＶＥＧＦＲ−１の役割は、現在未知である。ＶＥＧＦＲ３／Ｆｌ
ｔ４のシグナル伝達は、リンパ性内皮細胞の発達に重要であることが公知であり、ＶＥＧ
ＦＲ３のシグナル伝達は、内皮細胞に対して、リンパ性内皮様表現型を付与し得る。ＶＥ
ＧＦＲは、血管増殖、血管弛緩、血管透過の誘導、内皮細胞の遊走、増殖および生存の刺
激に必須のプロセスについてのシグナルを中継する。内皮細胞は、全ての種々のＶＥＧＦ
−Ｒを発現する。胚形成中に、１つの前駆細胞である血管芽細胞が造血系および血管系の
両方に対して生じ得ることが報告されてきた。
【００２７】
Ｔｉｅ−２は、内皮特異的受容体チロシンキナーゼおよびアンジオポイエチン１につい
ての受容体である。それは、活発に増殖している血管の内皮において優先的に発現され、
最も初期の哺乳類の内皮細胞系統マーカーを表し得るＩ型膜タンパク質である。Ｔｉｅ−
２は、内皮細胞の増殖および分化の調節におそらく関与し、血管の形成中に内皮細胞の特
定の方向に方向付け得る。
【００２８】
ＣＤ１４抗原は、リポポリ多糖類（ＬＰＳ）とＬＰＳ結合タンパク質（ＬＢＰ）との複
合体についての高親和性受容体である。前記ＣＤ１４抗原は、ＣＤ１４、ＴＬＲ４および
ＭＤ−２から構成された機能性ヘテロマーＬＰＳ受容体複合体の一部である。ＣＤ１４は
、末梢血、他の体液ならびに種々の組織、例えば、リンパ節および脾臓における大部分の
ヒト単球およびマクロファージにおいて強力に発現される。ＣＤ１４は、ヒト好中球およ
び骨髄樹状細胞の亜集団において弱く発現される。
【００２９】
ＣＤ４５抗原は、白血球共通抗原（ＬＣＡ）としても公知のチロシンホスファターゼで
ある。ＣＤ４５は、赤血球系細胞、血小板およびその前駆細胞を除く、造血性由来の全て
のヒト細胞に存在する。前記ＣＤ４５分子は、Ｔ細胞およびＢ細胞の活性化に必要とされ
、前記細胞の活性化状態に応じて、少なくとも５つのアイソフォームにおいて発現される
。
【００３０】
ＶＥＧＦＲ−１＋、ＶＥＧＦＲ−２＋およびＴｉｅ−２＋の細胞は、血液における単核
細胞の全集合の、それぞれ、おおよそ３．０＋−０．２％、０．８＋−０．５％、２．０
＋−０．３％を構成した。ＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２＋の細胞は、単球の全集合のおお
よそ２．０＋−０．５％を構成し、血液における単核細胞の０．０８＋−０．０４％を構
成した。
【００３１】
ＥＰＣは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける長期培養において維持され得る。前記ＥＰＣは、
２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２回またはそれ以上の培養において継
代され得る。
【００３２】
ＥＰＣは、典型的には、１−３週間の細胞培養後に発展された、内皮コロニー形成細胞
を含む。内皮コロニー形成細胞は、内皮系統に関連付けられる前駆細胞の特徴を有し、Sm
ardja et al., Angiogenesis 14(1):17-27 (2011)に基づいて、新生血管内に混合可能で
ある。
【００３３】
ＥＰＣの単離および培養
ＥＰＣの単離、精製、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける培養および特徴決定は、Hill et al, N.
Engl. J. Med. 348:593-600 (2003)、Assmus et al., Circulation 106:3009-16 (2002)
、Wang et al., J. Am. Coll. Cardiol. 49:1566-71 (2007)および、Kalka et al., P.N.
A.S. 97:3422-7 (2000)に記載されており、その内容は、その全体が参照により取り込ま
れる。さらに、内皮コロニー形成細胞の単離、精製、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける培養および
特徴決定は、Yoder et al., Blood 109:1801-1809 (2007)、Ingram et al., Blood 104:2
752-2760 (2004)および、Smardja et al., Angiogenesis 14(1):17-27 (2011)に記載され
ており、その内容は、その全体が参照により取り込まれる。
【００３４】
例えば、前記細胞集合は、ポジティブ選択により、または、いずれかの順序におけるポ
ジティブおよびネガティブ選択の両方の組み合わせにより単離される。前駆細胞の集合は
精製される。ＥＰＣの精製された集合は、前記細胞から単離された細胞の粗集合より顕著
に高い割合のＥＰＣを含む。
【００３５】
例えば、精製手法は、総集合に対するＥＰＣにおける、少なくとも５倍の向上、好まし
くは少なくとも１０倍の向上、より好ましくは少なくとも１５倍の向上、最も好ましくは
少なくとも２０倍の向上、および最適に少なくとも２５倍の向上をもたらすべきである。
前記精製されたＥＰＣの集合は、少なくとも１５％、好ましくは少なくとも２０％、より
好ましくは少なくとも２５％、最も好ましくは少なくとも３５％、および最適に少なくと
も５０％のＥＰＣを含むべきである。
【００３６】
本願明細書に記載された方法は、７５％まで、好ましくは８０％まで、より好ましくは
８５％まで、最も好ましくは９０％まで、および最適に９５％までの幹細胞を含む混合物
をもたらし得る。このような方法は、９９％、９９．９０％およびさらに１００％のＥＰ
Ｃを含む混合物を製造可能である。したがって、精製された本発明の集合は、上記された
ように、天然に存在するより顕著に高いレベルのＥＰＣを含む。
【００３７】
前記精製されたＥＰＣの集合は、前記ＥＰＣの抗原特性を発現する幹細胞の集合を含む
細胞の粗製混合物を、前記抗原の細胞外部分に特異的に結合する分子と接触させることに
より単離され得る。このような技術は、ポジティブ選択として公知である。前記分子に対
する前記ＥＰＣの結合は、前記ＥＰＣが、前記抗原を発現しない汚染細胞から十分に区別
されるのを可能にして、前記汚染細胞から前記幹細胞を単離するのを可能にする。前記抗
原は、好ましくはＶＥＧＦＲであり、より好ましくはＶＥＧＦＲ−２である。
【００３８】
前記汚染細胞から前駆細胞を分離するのに使用される分子は、前記ＥＰＣを特徴付ける
抗原に特異的に結合する任意の分子であり得る。前記分子は、例えば、モノクローナル抗
体、モノクローナル抗体のフラグメントであることができ、または、受容体である抗原の
場合には、その受容体のリガンドであることができる。例えば、ＶＥＧＦ受容体、例えば
、ＦＬＫ−１の場合には、前記リガンドは、ＶＥＧＦである。
【００３９】
本発明の固有の単離された細胞は、そのＣＤ４５＋状態および血管内皮増殖因子受容体
（ＶＥＧＦＲ）、例えば、ＶＥＧＦＲ−２を有することにより、他の細胞から分離され得
る。前記細胞は、細胞を分離するための従来技術、例えば、Ｃｉｖｉｎの米国特許第４，
７１４，６８０号明細書、同第４，９６５，２０４号明細書、同第５，０３５，９９４号
明細書および同第５，１３０，１４４号明細書、Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌの米国
特許第５，７５０，３９７号明細書ならびにＬｏｋｅｎ  ｅｔ  ａｌの米国特許第５，１
３７，８０９号明細書に記載されたものにより単離され得る。前記文献はそれぞれ、その
全体が参照により組み込まれる。このため、例えば、ＣＤ４５特異的モノクローナル抗体
またはＶＥＧＦＲ特異的抗体は、固体支持体、例えば、ニトロセルロース、アガロースビ
ーズ、ポリスチレンビーズ、中空の繊維膜、磁性ビーズおよびプラスチックペトリ皿上に
固定され得る。ついで、細胞集合全体が、前記固体支持体を通過されるか、または、前記
ビーズに添加される。
【００４０】
前記結合分子に結合された細胞は、残った細胞懸濁液から前記固体支持体を物理的に分
離することにより、細胞懸濁液から除去され得る。例えば、未結合の細胞は、前記固体支
持体に前記幹細胞を十分な時間結合させた後に、生理学的バッファーにより溶出または洗
浄され得る。
【００４１】
結合した細胞は、主に、前記固相および前記結合分子の性質に応じて、前記固相から任
意の適切な方法により分離され得る。例えば、結合した分子は、激しい振とうにより、プ
ラスチックのペトリ皿から溶出され得る。または、結合した細胞は、酵素的に「ニッキン
グ」するか、または、前記固相と抗体との間の酵素感受性の「スペーサ」配列を消化する
ことにより溶出され得る。アガロースビーズに結合した適切なスペーサ配列は、例えば、
Ｐｈａｒｍａｃｉａから市販されている。
【００４２】
ついで、前記溶出され、濃縮された細胞画分は、遠心分離によりバッファーで洗浄され
、後の使用のために、従来技術に基づいて、生きた状態で低温において保存され得る。前
記細胞は、例えば、レシピエントの静脈内に注入されることにより、直ちに使用されても
よい。
【００４３】
前記固体支持体に付着したままのものは、使用された抗体により認識されるマーカーを
含むそれらの細胞である。例えば、抗−ＣＤ４５抗体が使用される場合、ついで、得られ
た集合は、ＣＤ４５＋細胞にかなり濃縮されているであろう。使用される前記抗体がＶＦ
ＧＦＲである場合、ついで、得られた集合は、ＶＥＧＦＲ＋細胞にかなり濃縮されている
であろう。ついで、その集合は、他のマーカーに対する抗体に付着されたそれを有する固
体支持体を使用して、前記工程を繰り返すことにより、他のマーカーにおいて濃縮され得
る。
【００４４】
ＣＤ４５＋ＶＥＧＦＲ＋細胞を分取する別の方法は、フローサイトメトリー、最も好ま
しくは、蛍光活性化セルソータ（ＦＡＣＳ）、例えば、名称ＦＡＣＳｃａｎまたはＦＡＣ
ＳＣａｌｉｂｕｒでＢｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎにより製造されたものによる。こ
の技術により、ＣＤ４５マーカーをその上に有する細胞は、このような染料にコンジュゲ
ートされている抗−ＣＤ４５抗体による特定の蛍光染料によりタグ付けされる。同様に、
前記細胞のＶＥＧＦＲマーカーは、他の染料にコンジュゲートされた抗−ＶＥＧＦＲ抗体
による異なる蛍光染料によりタグ付けされる。染色された細胞が機器上にある場合、細胞
流が、光を発する蛍光色素を励起するアルゴンレーザビームにより方向付けられる。この
発光は、光学フィルタのセットによる前記蛍光色素の発光波長に特異的な光電子増倍管（
ＰＭＴ）により検出される。前記ＰＭＴにより検出されたシグナルは、それ自体のチャネ
ルにおいて増幅され、各種の方式、例えば、ヒストグラム、ドット表示または対比表示に
おいて、コンピュータにより表示される。例えば、１つの波長を発する蛍光細胞は、特異
的な蛍光色素標識試薬と反応性である分子を発現する。一方、非蛍光細胞または異なる波
長において発光する蛍光細胞は、この分子を発現しないが、他の波長で蛍光する前記蛍光
色素標識試薬と反応性である分子を発現し得る。前記フローサイトメトリーは、前記細胞
により発せられた蛍光の量（蛍光強度）を表示する点で、半定量的でもある。これは、相
対的な意味で、前記細胞により発現された分子の数に相関する。
【００４５】
フローサイトメーターは、細胞がレーザビームを通過する際に、非蛍光パラメータ、例
えば、細胞容量または前記細胞により散乱された光を測定するのにも準備され得る。細胞
容積は、通常、直接測定である。前記光散乱ＰＭＴは、前方角（前方散乱；ＦＳＣ）また
は直角（側方散乱；ＳＳＣ）のいずれかにおける、前記細胞により散乱された光を検出す
る。ＦＳＣは、通常、サイズの指標である。一方、ＳＳＣは、細胞の複雑性の指標である
が、両方のパラメータは、他の要因により影響を受け得る。
【００４６】
好ましくは、前記フローサイトメーターは、１つを超えるＰＭＴ発光検出器を備える。
さらなるＰＭＴは、他の発光波長を検出し、個々の分離したチャネルそれぞれにおいて、
１つを超える蛍光色素の同時検出を可能にする。コンピュータは、各チャネルの分析また
は別のものとの各パラメータの相関を可能にする。ＦＡＣＳマシンと共に典型的に使用さ
れる蛍光色素としては、５２５ｎｍ（緑色）での発光ピークを有するフルオレセインイソ
チオシアネート（ＦＩＴＣ）、５７５ｎｍ（オレンジ色−赤色）での発光ピークを有する
Ｒ−フィコエリスリン（ＰＥ）、６２０ｎｍ（赤色）での発光ピークを有するヨウ化プロ
ピジウム（ＰＩ）、６６０ｎｍ（赤色）での発光ピークを有する７−アミノアクチノマイ
シンＤ（７−ＡＡＤ）、６７０ｎｍ（赤色）での発光ピークを有するＲ−フィコエリスリ
ンＣｙ５（ＲＰＥ−Ｃｙ５）および６５５−７５０ｎｍ（紅色）での発光ピークを有する
アロフィコシアニン（ＡＰＣ）があげられる。
【００４７】
これらおよび他の種類のＦＡＣＳマシンは、種々の特性の細胞を種々の容器に向かわせ
ることにより、種々の画分を物理的に分離するためのさらなる能力を有し得る。
【００４８】
開始材料、例えば、骨髄、末梢血または臍帯血のＣＤ４５＋ＶＥＧＦＲ＋集合を単離す
るための任意の他の方法も、本発明に基づいて使用され得る。本発明の種々の亜集合（例
えば、ＣＤ１４＋、Ｔｉｅ２＋、ＣＤ１４４−）は、類似する方法において単離され得る
。
【００４９】
前記粗製細胞集合が上記されたように精製される前後のいずれかに、前記前駆細胞の集
合は、さらに、当分野において公知の方法により濃縮され得る。例えば、前記前駆細胞は
、ＥＰＣの１つまたはそれ以上の抗原特性についてのポジティブ選択により濃縮され得る
。このような抗原としては、例えば、ＣＤ１４またはＴｉｅ−２があげられる。
【００５０】
一実施形態では、血液は、ドナーの循環抹消血から直接回収される。前記血液は、ＥＰ
Ｃを捕捉するための結合分子、例えば、抗体であるＶＥＧＦＲ−２を結合した固相を含む
カラムを通して連続的にろ過される。前駆細胞枯渇血液は、当分野において公知の方法、
例えば、血漿交換により、ドナーの循環系に直ちに戻される。前記血液は、十分な数の前
駆細胞が前記カラムに結合するまで、この方法で処理される。ついで、前記幹細胞が、当
分野において公知の方法により、前記カラムから単離される。この方法は、骨髄を収集す
る費用および痛み、ならびに、麻酔、痛覚消失症、輸血および感染の関連するリスクをド
ナーがなしで済ませて、稀な末梢血前駆細胞が、非常に多量の血液から収集されるのを可
能にする。
【００５１】
ＥＰＣは、本願明細書に記載された方法を使用して、培養および増殖をされる。細胞は
、密度勾配遠心により末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離することにより末梢血から取得
される。
【００５２】
細胞懸濁液は、細胞を維持可能な任意の容器、特に培養フラスコ、培養プレートまたは
ローラーボトル、およびより具体的には、小さな培養フラスコ、例えば、２５ｃｍ２の培
養フラスコに播種される。懸濁液において培養された細胞は、おおよそ５×１０４から２
×１０５個／ｍｌ（例えば、１×１０５個／ｍｌ）で再懸濁される。固定された基材に播
種される細胞は、おおよそ２−３×１０３個／ｃｍ２で播種される。場合により、前記培
養プレートは、マトリクスタンパク質、例えば、コラーゲンによりコートされる。前記細
胞は、細胞増殖を補助可能な任意の公知の培養培地、例えば、細胞の代謝に必要とされる
添加物、例えば、グルタミンおよび他のアミノ酸、ビタミン、ミネラルならびにタンパク
質、例えば、トランスフェリン等を含む、ＨＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ、Ｆ−１２等に入
れられ得る。前記培養培地は、酵母、細菌および糸状菌による汚染を予防する抗生物質、
例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン等も含み得る。前記培養培地
は、ウシ、ウマ、ニワトリ等由来の血清を含み得る。
【００５３】
培養のための条件は、生理的条件に近くあるべきである。前記培養培地のｐＨは、生理
的ｐＨ（例えば、ｐＨ６−８の間、約ｐＨ７から７．８の間またはｐＨ７．４）に近くあ
るべきである。生理的温度は、約３０℃から４０℃の間の範囲である。ＥＰＣは、約３２
℃から約３８℃の間（例えば、約３５℃から約３７℃の間）の温度で培養される。
【００５４】
場合により、前記培養培地は、少なくとも１つの増殖誘引（「分裂促進」）増殖因子を
添加される。「増殖因子」は、タンパク質、ペプチドまたは、ＥＰＣにおける増殖、増殖
誘引、分化誘引もしくは栄養作用を有する他の分子である。「増殖誘引増殖因子」は、Ｅ
ＰＣを増殖するのを可能にする栄養因子、例えば、前記細胞の表面上の受容体に結合して
、前記細胞上において栄養または増殖誘引作用を果たす、任意の分子である。増殖誘引増
殖因子としては、ＥＧＦ、アンフィレグリン、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦまたは
ＦＧＦ−１）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦまたはＦＧＦ−２）、形質転換増殖
因子アルファ（ＴＧＦα）、ＶＥＧＦおよびそれらの組み合わせがあげられる。増殖因子
は、通常、前記培養培地に、約１ｆｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍｌの間の範囲の濃度で添加さ
れる。約１から１００ｎｇ／ｍｌの間の濃度で、通常十分である。単純な滴定アッセイが
、特定の増殖因子の最適な濃度を決定するのに、容易に行われ得る。
【００５５】
増殖因子および栄養因子の生物学的効果は、一般的には、細胞表面の受容体に結合する
ことにより媒介される。数多くのこれらの因子についての受容体が特定されてきており、
特定の受容体についての抗体および分子プローブが利用可能である。ＥＰＣは、分化の全
ての段階における増殖因子受容体の存在について分析され得る。多くの場合、特定の受容
体の特定は、外因性の増殖因子または栄養因子の添加による特定の発展経路に沿って、前
記細胞をさらに分化させるのに使用するための戦略についてのガイダンスを提供する。
【００５６】
一般的には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて約３−１０日後、前記ＥＰＣの培養培地は、前
記培地を吸引し、前記培養フラスコに新鮮な培地を添加することにより補給される。場合
により、前記吸引された培地は、回収、ろ過され、後にＥＰＣを継代するための順化培地
として使用される。例えば、１０％、２０％、３０％、４０％またはそれ以上の順化培地
が使用される。
【００５７】
前記ＥＰＣ細胞培養物は、増殖を再開するために容易に継代され得る。例えば、ｉｎ  
ｖｉｔｒｏにおける３−７日後、前記培養フラスコは、十分振とうされ、ついで、ＥＰＣ
は、５０ｍｌの遠沈管に移され、低速で遠心分離される。前記培地は吸引される。前記Ｅ
ＰＣは、少量の培養培地に再懸濁される。ついで、前記細胞は計測され、増殖を再開する
ために、所望の密度で再度播種される。この手順は、毎週繰り返されて、各継代での生き
た細胞の数における対数増加をもたらし得る。前記手順は、所望の数のＥＰＣが取得され
るまで継続される。
【００５８】
ＥＰＣおよびＥＰＣの子孫は、それらが必要とされるまで、当分野における任意の公知
の方法により凍結保存され得る（例えば、米国特許第５，０７１，７４１号明細書、国際
公開第９３／１４１９１号パンフレット、同第９５／０７６１１号パンフレット、同第９
６／２７２８７号パンフレット、同第９６／２９８６２号パンフレットおよび同第９８／
１４０５８号パンフレット、Karlsson et al., 65 Biophysical J. 2524-2536 (1993)を
参照のこと）。前記ＥＰＣは、等張性溶液、好ましくは、特定の凍結保存剤を含む細胞培
養培地に懸濁され得る。このような凍結保存剤としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳ
Ｏ）、グリセロール等があげられる。これらの凍結保存剤は、５−１５％（例えば、８−
１０％）の濃度で使用される。細胞は、−１０℃から−１５０℃（例えば、−２０℃から
−１００℃または−７０℃から−８０℃）の温度に徐々に凍結される。
【００５９】
プロスタサイクリンによるＥＰＣの処理
本発明の一態様に基づいて、プロスタサイクリンは、単離されたＥＰＣを処理するのに
使用される。本願明細書で使用される「プロスタサイクリン」の用語は、任意のプロスタ
グランジンＩ２（ＰＧＩ２）、任意のプロスタサイクリン類似体および任意のＰＧＩ２受
容体作動剤を明確に含む。例としては、エポプロステノールナトリウム（例えば、Ｆｌｏ
ｌａｎ（登録商標））、トレプロスチニル（例えば、ＴＹＶＡＳＯ（登録商標）、レモジ
ュリン（登録商標））、イルプロスト（例えば、Ｖｅｎｔａｖｉｓ（登録商標））および
ＰＧＩ２受容体作動剤（例えば、Ｓｅｌｅｘｉｐａｇ）があげられる。
【００６０】
プロスタサイクリンにより処理されたＥＰＣは、向上した血管新生特性を有する過剰増
殖性の表現型を示す。前記表現型は、未処理のＥＰＣと比較して、ＰＡＨを処置するのに
有利である。
【００６１】
ＥＰＣは、種々の方法において、プロスタサイクリンにより処理され得る。例えば、プ
ロスタサイクリンは、ＥＰＣの発展中に、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて、ＥＰＣを処理するの
に使用され得る。プロスタサイクリンは、レシピエントに対して、ＥＰＣと共に投与され
得る。プロスタサイクリンは、移植後に、ＥＰＣを処理するのにも使用され得る。本発明
の一実施形態に基づいて、ＥＰＣは、レシピエント自身の血液または骨髄から調製される
。その場合、プロスタサイクリンは、ＥＰＣがレシピエントから単離される前に、ＥＰＣ
を処理するのにも使用され得る。
【００６２】
ＥＰＣの投与
ＥＰＣを投与／移植することによりＰＡＨを処置することは、Wang et al., J. Am. Co
ll. Cardiol. 49:1566-71 (2007)、Zhao et al. Circ. Res. 96:442-450 (2005)および、
Nagaya et al., Circulation 108:889-895(2003)に記載されている。それらの内容は、そ
の全体が参照により組み込まれる。
【００６３】
傷ついた血管内へのＥＰＣの投与／移植は、傷ついた血管組織、例えば、静脈、動脈、
毛細血管を修復する可能性を有することにより、血管機能を回復させる。ただし、移植目
的に適切な細胞の不存在は、この手法の完全な可能性が合致するのを妨げてきた。「適切
な」細胞は、１つまたはそれ以上の下記評価基準に合致する細胞である。（１）大量の取
得され得る；（２）必要であれば、遺伝子材料の挿入を可能にするためにｉｎ  ｖｉｔｒ
ｏで増殖され得る；（３）無期限に生存可能であり、移植において血管修復を容易にする
、および（４）非免疫原性である、好ましくは、患者自身の組織または適切なドナーから
取得される。適切なＥＰＣは、自家、同種または異種であり得る。
【００６４】
前記ＥＰＣは、異常な脈管構造または冠動脈不全の兆候を有する対象に投与され得る。
前記ＥＰＣは、レシピエント自身の血液または骨髄から調製され得る。このような例では
、前記ＥＰＣは、分離された組織から産生され、上記された方法を使用してｉｎ  ｖｉｔ
ｒｏにおいて増殖され得る。細胞数の適切な発展に基づいて、前記ＥＰＣは、収集され、
必要に応じて遺伝子組み換えされ、レシピエントの脈管構造内への直接注入用に準備され
得る。
【００６５】
前記ＥＰＣは、宿主に対して異種であるドナー組織から調製され得る。成功した異種移
植片について、移植組織への免疫応答を低下または除去するいくつかの方法が、通常使用
される。例えば、ＥＰＣレシピエントは、免疫抑制剤、例えば、シクロスポリンの使用、
または、局所適用された免疫抑制剤を使用する局所免疫抑制戦略のいずれかにより、免疫
抑制され得る。局所免疫抑制は、Gruber, 54 Transplantation 1-11 (1992)により開示さ
れている。米国特許第５，０２６，３６５号明細書には、局所免疫抑制に適した封入法が
開示されている。
【００６６】
免疫抑制技術を使用する代替手段として、Smithies et al., 317 Nature 230-234 (198
5)により教示され、細胞系統における遺伝子置換またはノックアウトに拡大された（Zhen
g et al., 88 Proc. Natl. Acad. Sci. 8067-8071 (1991)）、胚性幹細胞における相同組
換えを使用する遺伝子置換またはノックアウトの方法が、主要組織適合性遺伝子複合体（
ＭＨＣ）遺伝子の切除について、ＥＰＣに適用され得る。ＭＨＣ発現を欠くＥＰＣは、濃
縮された内皮細胞集合の移植について、レシピエントを免疫抑制する必要なしに、同種、
おそらくさらに異種の組織適合性障壁を通過する。ドナー細胞の免疫原性を低下させる組
換え法の使用についての全体的なレビューおよび引用は、Gruber, 54 Transplantation 1
-11 (1992)によっても開示されている。表面修飾による移植の免疫原性低下に対する例示
となるアプローチは、国際公開第９２／０４０３３号パンフレットおよび同第９９／２４
６３０号パンフレットにより開示されている。または、移植片の免疫原性は、ＭＨＣ抗原
を変異または欠失されているトランスジェニック動物からＥＰＣを調製することにより低
下され得る。
【００６７】
前記ＥＰＣは、公知の封入技術、例えば、マイクロ封入（例えば、米国特許第４，３５
２，８８３号明細書；同第４，３５３，８８８号明細書および同第５，０８４，３５０号
明細書を参照のこと。同文献は、参照により本願明細書に組み込まれる）および、マクロ
封入（例えば、米国特許第５，２８４，７６１、５号明細書，同第１５８，８８１号明細
書、同第４，９７６，８５９号明細書および同第４，９６８，７３３号明細書ならびに国
際公開第９２／１９１９５号パンフレットおよび同第９５／０５４５２号パンフレットを
参照のこと。それぞれは、参照により本願明細書に組み込まれる）に基づいて、宿主に因
子を送達するために、封入され、使用され得る。マクロ封入は、米国特許第５，２８４，
７６１号明細書；同第５，１５８，８８１号明細書；同第４，９７６，８５９号明細書；
同第４，９６８，７３３号明細書；同第５，８００，８２８号明細書および国際公開第９
５／０５４５２号パンフレットに記載されている。それぞれは、参照により本願明細書に
組み込まれる。複数のマクロ封入装置が、前記宿主に埋め込まれ得る。
【００６８】
レシピエントのそれに対して同種である組織から調製されたＥＰＣは、レシピエントの
組織適合性型を密接にマッチさせるための、組織タイピングの周知の方法により使用する
ために試験され得る。
【００６９】
脈管構造に投与されたＥＰＣは、前記細胞が隣の血管細胞と正常な結合を形成し、移植
された内皮細胞または既存の内皮細胞との接触を維持するように、血管グラフトを形成し
得る。例えば、前記移植されたＥＰＣは、疾患および加齢により傷害されている血管組織
を再確立し得る。
【００７０】
宿主の血管組織内への移植片の機能的な一体化は、種々の機能の回復における移植片の
有効性を試験することにより評価され得る。
【００７１】
本発明の一実施形態に基づいて、ＥＰＣは、レシピエントに、少なくとも１つの増殖因
子、例えば、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＢＭＰ−４、ＴＧＦ−ベータ等と共
に投与され得る。ＥＰＣは、レシピエントに、間葉系幹細胞またはその培養培地および／
またはプロスタサイクリン（例えば、トレプロスチニル）と共にも投与され得る。
【００７２】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、骨髄、血液、歯髄細胞、脂肪組織、皮膚、脾臓、膵臓、脳
、腎臓、肝臓、心臓、網膜、脳、毛嚢、腸、肺、リンパ節、胸腺、骨、靭帯、腱、骨格筋
、真皮および骨膜において見出された細胞であり、種々の生殖細胞系統、例えば、中胚葉
、内胚葉および外胚葉に分化可能である。例えば、ＭＳＣは、数多くの細胞種、例えば、
制限されず、脂肪組織、骨組織、軟骨組織、弾性組織、筋肉組織および線維性結合組織に
分化可能である。特定の分化系列決定およびこれらの細胞が入る分化経路は、機械的影響
および／または内在的生体活性因子、例えば、増殖因子、サイトカインおよび／または宿
主組織により確立された局所微小環境条件からの種々の影響により決まる。例えば、ＭＳ
Ｃは、表現型細胞を生じさせるのに不可逆的に分化するであろうタイミングで、幹細胞ま
たは前駆細胞のいずれかである娘細胞を生じさせるのに分割される非造血前駆細胞である
。ＭＳＣの例としては、間葉系前駆細胞（ＭＰＣ）があげられる。
【００７３】
ＭＳＣは、増殖または分化中に細胞外環境内に放出され得る化合物によりその活性を行
い得ることが見出される。一部の態様では、このような化合物としては、エクソソームと
呼ばれる微小小胞があげられる。前記微小小胞は、直径が約３０ｎｍと約２００ｎｍとの
間である。エクソソームは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、宿主細胞により内部移行され得る
。
【００７４】
エクソソームは、微小小胞的な身体分取経路由来の小胞である。最近の研究は、エクソ
ソームが、細胞内伝達および免疫調節プロセスの容易化に有用な生体活性小胞であること
を示している。ＭＳＣエクソソームは、２０Ｓプロテアソームおよび数多くのＲＮＡ（メ
ッセンジャＲＮＡ、非コードＲＮＡ、マイクロＲＮＡ）を含む。
【００７５】
エクソソームに加えて、ＭＳＣは、本開示の目的に有用な他の生体活性分子／小胞も放
出する。このような分子および小胞としては、制限されず、ミトコンドリアおよび増殖因
子があげられる。ＭＳＣから放出されたこのような分子および小胞を含む培養培地を調製
する方法ならびに特定の分子および小胞をさらに単離する方法は、当分野において公知で
ある。例えば、Hu et al., Frontiers in Genetics, 2:56, 1-9 (2012)を参照のこと。
【００７６】
一部の実施形態では、患者へのＭＳＣまたはＭＳＣ順化培養培地とＥＰＣおよび／また
はプロスタサイクリンとの共投与前に、前記ＭＳＣまたはＭＳＣ順化培養培地は、場合に
より、プロスタサイクリンにより前処理され得る。したがって、一実施形態では、ｉｎ  
ｖｉｖｏ送達用の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）またはＭＳＣ順化培養培地を調製するための方
法であって、前記ＭＳＣまたはＭＳＣ順化培養培地をプロスタサイクリンと接触させる工
程を含む方法が提供される。さらに別の実施形態は、このような方法により取得可能な、
処理されたＭＳＣまたはＭＳＣ順化培養培地を提供する。
【００７７】
化合物による細胞または培地の前処理は、公知の技術を包含する。一態様では、前記プ
ロスタサイクリンは、ＭＳＣを含む培養培地と共に添加され、インキュベートされ得る。
ただし、場合により、このような共インキュベーションは、さらに、増殖因子（例えば、
ＶＥＧＦおよびアンジオポイエチン−１または−２、血小板由来の増殖因子）の添加およ
び／または低酸素を含み得る。
【００７８】
ＭＳＣまたはＭＳＣ順化培養培地は、種々の方法において、プロスタサイクリンにより
処理され得る。例えば、プロスタサイクリンは、ＭＳＣの進展中に、ｅｘ  ｖｉｖｏにお
いてＭＳＣを処理するのに使用されることができ、プロスタサイクリンは、投与後に、Ｍ
ＳＣを処理するのに使用されることもできる。本開示の一実施形態に基づいて、ＭＳＣは
、レシピエント自身の血液または骨髄から調製され得る。その場合、プロスタサイクリン
は、ＭＳＣがレシピエントから単離される前に、ＭＳＣを処理するのにも使用され得る。
【００７９】
薬学的組成物
典型的には、前記細胞は、少なくとも１つの薬学的に許容され得るキャリアを含む薬学
的組成物において投与される。前記「薬学的に許容され得る」の表現は、正常な医療判断
の範囲内であり、合理的な利益／リスク比と釣り合った、過剰の毒性、刺激、アレルギー
反応または他の問題または合併症なしに、ヒトおよび動物の組織と接触させるのに適した
、それらの化合物、材料、組成物および／または剤形を意味する。本願明細書で使用する
時、前記「薬学的に許容され得るキャリア」の表現は、薬学的に許容され得る材料、組成
または媒体、例えば、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤または溶媒封入材料を意
味する。
【００８０】
薬学的に許容され得るキャリアとしては、生理食塩水、バッファー水溶液、溶媒および
／または分散媒体があげられる。このようなキャリアの使用は、当分野において周知であ
る。前記溶液は、好ましくは、無菌であり、容易シリンジ性が存在する内容物に対して流
動性である。好ましくは、前記溶液は、製造および保存条件下において安定であり、例え
ば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等の使用
により、微生物、例えば、細菌および糸状菌の汚染作用に対して保存される。
【００８１】
薬学的に許容され得るキャリアとして機能し得る材料および溶液のいくつかの例として
は、（１）、糖類、例えば、ラクトース、グルコースおよびスクロース；（２）デンプン
、例えば、トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプン；（３）セルロースおよびそ
の誘導体、例えば、セルロースカルボキシメチルナトリウム、エチルセルロースおよびセ
ルロースアセテート；（４）粉末状のトラガント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）
タルク；（８）賦形剤、例えば、ココアバターおよび坐剤ワックス；（９）油、例えば、
ピーナッツ油、綿実油、ひまわり油、ゴマ油、オリーブ油、とうもろこし油および大豆油
；（１０）グリコール、例えば、プロピレングリコール；（１１）ポリオール、例えば、
グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール；（１２）エス
テル、例えば、エチルオレエートおよびエチルラウレート；（１３）アガー；（１４）緩
衝剤、例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム；（１５）アルギン酸；（
１６）発熱物質を含まない水；（１７）等張性生理食塩水；（１８）リンゲル液；（１９
）エチルアルコール；（２０）ｐＨ緩衝液；（２１）ポリエステル、ポリカーボネートお
よび／またはポリ酸無水物；ならびに（２２）薬学的配合物に使用される他の非毒性の適
合性物質があげられる。
【００８２】
本発明の方法に有用な薬学的組成物は、ポリマー性キャリアまたは細胞外マトリクスを
含み得る。
【００８３】
各種の生物学的または合成の固体マトリクス材料（すなわち、固体支持体マトリクス、
生物学的接着剤またはドレッシング材および生物学的／医療足場）は、この発明における
使用に適している。前記マトリクス材料は、好ましくは、ｉｎ  ｖｉｖｏ用途に使用する
のに医療的に許容され得る。このような医療的に許容され得るおよび／または生物学的に
もしくは生理学的に許容され得るまたは適合性の材料の非限定的な例としては、制限され
ず、吸収性および／または非吸収性の固体マトリクス材料、例えば、小腸粘膜下組織（Ｓ
ＩＳ）、例えば、ブタ由来（および他のＳＩＳ供給源）；架橋または非架橋のアルギン酸
、親水コロイド、フォーム、コラーゲンゲル、コラーゲンスポンジ、ポリグリコール酸（
ＰＧＡ）メッシュ、ポリグラクチン（ＰＧＬ）メッシュ、フリース、フォームドレッシン
グ材、生体接着剤（例えば、フィブリンのりおよびフィブリンゲル）および、１つまたは
それ以上の層における死んだ非表皮化皮膚相当物があげられる。
【００８４】
適切なポリマー性キャリアとしては、合成もしくは天然のポリマーから形成された多孔
質のメッシュもしくはスポンジ、ならびに、ポリマー溶液があげられる。マトリクスの一
形態は、ポリマー性のメッシュまたはスポンジであり、他のものは、ポリマー性ヒドロゲ
ルである。使用され得る天然ポリマーとしては、タンパク質、例えば、コラーゲン、アル
ブミンおよびフィブリン；ならびに、多糖類、例えば、アルギン酸塩およびヒアルロン酸
のポリマーがあげられる。合成ポリマーとしては、生分解性および非生分解性のポリマー
があげられる。生分解性ポリマーの例としては、ヒドロキシ酸、例えば、ポリ乳酸（ＰＬ
Ａ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）およびポリ乳酸−グリコール酸（ＰＬＧＡ）、ポリオ
ルトエステル、ポリ酸無水物、ポリホスファゼンおよびそれらの組み合わせがあげられる
。非生分解性ポリマーとしては、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、エチレンビニ
ルアセテートおよびポリビニルアルコールがあげられる。
【００８５】
展性のある、イオン性または共有的架橋性のヒドロゲルを形成し得るポリマーが、細胞
を封入するのに使用される。ヒドロゲルは、有機ポリマー（天然または合成）が、共有結
合、イオン結合または水素結合を介して架橋されて、水分子を捕捉してゲルを形成する三
次元的開格子構造を形成する際に形成される物質である。ヒドロゲルを形成するのに使用
され得る材料の例としては、イオン的に架橋される多糖類、例えば、アルギン酸塩、ポリ
ホスファジンおよびポリアクリレート、または、温度またはｐＨそれぞれにより架橋され
る、ブロックコポリマー、例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ．ＴＭ．もしくはＴｅｔｒｏｎｉ
ｃｓ．ＴＭ．、ポリエチレンオキシド−ポリプロピレングリコールブロックコポリマーが
あげられる。他の材料としては、タンパク質、例えば、フィブリン、ポリマー、例えば、
ポリビニルピロリドン、ヒアルロン酸およびコラーゲンがあげられる。
【００８６】
一般的には、これらのポリマーは、水溶液、例えば、水、緩衝化された塩溶液またはア
ルコール水溶液において、少なくとも部分的に可溶性である。前記ポリマーは、荷電した
側鎖またはその一価のイオン性塩を有する。カチオンと反応し得る酸性側鎖を有するポリ
マーの例は、ポリ（ホスファゼン）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、アク
リル酸とメタクリル酸とのコポリマー、ポリ（ビニルアセテート）およびスルホン酸化ポ
リマー、例えば、スルホン酸化ポリスチレンである。アクリル酸またはメタクリル酸とビ
ニルエーテルモノマーまたはポリマーとの反応により形成された酸性側鎖を有するコポリ
マーも使用され得る。酸性基の例は、カルボン酸基、スルホン酸基、ハロゲン化（好まし
くは、フッ化）アルコール基、フェノール性ＯＨ基および酸性ＯＨ基である。アニオンと
反応し得る塩基性側鎖を有するポリマーの例は、ポリ（ビニルアミン）、ポリ（ビニルピ
リジン）、ポリ（ビニルイミダゾール）および一部のイミノ置換されているポリホスファ
ゼンである。前記ポリマーのアンモニウムまたは四級塩も、骨格窒素またはペンダント性
イミノ基から形成され得る。塩基性側鎖の例は、アミノ基およびイミノ基である。
【００８７】
さらに、本発明の方法に使用される組成物は、少なくとも１つの治療剤を含んでもよい
。例えば、前記組成物は、炎症もしくは疼痛を処置するのに役立つ鎮痛剤、または、前記
組成物により処置された部位の感染を予防する抗感染症剤を含んでもよい。より具体的に
は、有用な治療剤の非限定的な例としては、下記治療剤：鎮痛剤、例えば、非ステロイド
抗炎症薬、オピエート作動剤およびサリチル酸塩；抗感染症剤、例えば、駆虫剤、抗嫌気
性菌、抗生物質、アミノグリコシド抗生物質、抗真菌抗生物質、セファロスポリン系抗生
物質、マクロライド系抗生物質、種々のベータ−ラクタム系抗生物質、ペニシリン系抗生
物質、キノロン系抗生物質、スルホンアミド系抗生物質、テトラサイクリン系抗生物質、
抗マイコバクテリア、抗結核抗マイコバクテリア、抗原虫、抗マラリア性抗原虫剤、抗ウ
イルス剤、抗レトロウイルス剤、殺疥癬虫薬、抗炎症剤、副腎皮質ステロイド抗炎症剤、
鎮痒剤／局所麻酔剤、局所抗感染症剤、抗真菌性局所抗感染症剤、抗ウイルス性抗感染症
剤；電解質および腎臓作用剤、例えば、酸性化剤、アルカリ性化剤、利尿剤、炭酸脱水酵
素阻害性利尿剤、ループ利尿剤、浸透圧利尿剤、カリウム保持性利尿剤、チアジド利尿剤
、電解質置換および尿酸排泄剤；酵素、例えば、膵酵素および血栓溶解酵素；胃腸薬、例
えば、止瀉薬、胃腸性抗炎症剤、胃腸性抗炎症剤、制酸性抗潰瘍剤、胃酸ポンプ阻害性抗
潰瘍剤、胃粘膜性抗潰瘍剤、Ｈ２ブロッカ抗潰瘍剤、胆石溶解性剤、消化薬、催吐剤、緩
下剤、便軟化剤および消化管運動改善薬；全身麻酔剤、例えば、吸入麻酔、ハロゲン化吸
入麻酔、静脈内麻酔、バルビツール酸静脈内麻酔、ベンゾジアゼピン静脈内麻酔およびオ
ピエート作動性静脈内麻酔；ホルモンおよびホルモン修飾因子、例えば、堕胎剤、副腎性
剤、副腎皮質ステロイド副腎性剤、アンドロゲン、抗アンドロゲン、免疫生物学剤、例え
ば、免疫グロブリン、免疫抑制剤、トキソイドおよびワクチン；局所麻酔、例えば、アミ
ド局所麻酔およびエステル局所麻酔；筋骨格剤、例えば、抗痛風性抗炎症剤、副腎皮質ス
テロイド抗炎症剤、金化合物抗炎症剤、免疫抑制抗炎症剤、非ステロイド抗炎症剤（ＮＳ
ＡＩＤ）、サリチル酸塩抗炎症剤、ミネラル；ならびに、ビタミン、例えば、ビタミンＡ
、ビタミンＢ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥおよびビタミンＫがあげられる。
【００８８】
本発明の方法に有用な組成物は、細胞培養成分、例えば、アミノ酸、金属、補酵素因子
を含む培養培地および少数の他の細胞、例えば、前記幹細胞のその後の分化により生じ得
るいくつかのものを含み得る。
【００８９】
本発明の方法に有用な組成物は、例えば、対象となる細胞を、前記培養培地から沈降さ
せ、それらを所望の溶液または材料中に再懸濁させることにより調製され得る。前記細胞
は、例えば、遠心、ろ過、限外ろ過等により、前記培養培地から沈降および／または変更
され得る。
【００９０】
当業者は、本発明の方法において投与するために、組成物中の細胞および任意のキャリ
アの量を容易に決定し得る。実施形態において、（前記活性な細胞に加えて）任意の添加
剤が、リン酸緩衝生理食塩水中に、０．００１から５０％（重量）の量の溶液で存在する
。活性成分は、マイクログラムからミリグラムの単位、例えば、約０．０００１から約５
ｗｔ％、好ましくは約０．０００１から約１ｗｔ％、さらにより好ましくは約０．０００
１から約０．０５ｗｔ％または約０．００１から約２０ｗｔ％、好ましくは約０．０１か
ら約１０ｗｔ％、およびさらにより好ましくは、約０．０５から約５ｗｔ％で存在する。
当然、動物またはヒトに投与される任意の組成物について、および、任意の具体的な投与
方法について、したがって、例えば、致死量（ＬＤ）および適切な動物モデル、例えば、
げっ歯類、例えば、マウスにおけるＬＤ５０を決定することによる毒性、適切な応答を引
き出す、前記組成物の用量、その中での成分濃度、および、前記組成物を投与するタイミ
ングを決定するのが好ましい。このような決定は、当業者の知識、この開示および本願明
細書に引用された文献から、過度の試行錯誤を必要としない。そして、連続的な投与のタ
イミングは、過度の試行錯誤をすることなく確定され得る。
【００９１】
本発明の方法に有用な組成物は、特に、局所注入、例えば、カテーテル投与、全身性注
入、局所注入、静脈内注入、子宮内注入または末梢投与により投与され得る。本願明細書
に記載された治療組成物（例えば、薬学的組成物）を投与する際、それは、一般的には、
ユニットドーズの注入剤型（溶液、懸濁液、エマルジョン）に製剤化されるであろう。
【００９２】
ＥＰＣの遺伝子組換え
一実施形態では、本発明の方法に使用される細胞は、遺伝子組み換えされる。好ましく
は、前記細胞は、異種タンパク質を産生するように遺伝子組み換えされる。典型的には、
前記細胞は、前記異種タンパク質が前記細胞から分泌されるように遺伝子組み換えされる
であろう。ただし、実施形態において、前記細胞は、機能性の非タンパク質コードポリヌ
クレオチド、例えば、ｄｓＲＮＡ（典型的には、ＲＮＡサイレンシング用）、アンチセン
スオリゴヌクレオチドまたは触媒性核酸（例えば、リボザイムもしくはＤＮＡザイム）を
発現するように修飾され得る。一実施形態では、前記ＥＰＣは、内皮一酸化窒素合成酵素
（ｅＮＯＳ）、ヘムオキシゲナーゼ（ＨＭＯＸ１）およびプロスタサイクリン合成酵素（
ＰＴＧＩＳ）からなる群から選択されるタンパク質の発現または過剰発現をするように遺
伝子組み換えされる。
【００９３】
遺伝子組み換えされた細胞は、前記修飾された細胞の増殖を補助するのに十分な量での
、少なくとも１つのサイトカインの存在において培養され得る。このため、前記取得され
た遺伝子組換え細胞は、（例えば、移植において）直ちに使用され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏに
おいて培養および発展され、または、後の使用のために保存され得る。前記修飾された細
胞は、当分野において周知の方法、例えば、液体窒素における凍結により保存され得る。
【００９４】
本願明細書で使用する時、遺伝子組換えは、本願明細書に記載された細胞への外因性ま
たは外来性のポリヌクレオチドの導入、または、前記細胞内の内在性遺伝子の修飾を含む
、任意の遺伝子組換え法を包含する。遺伝子組換えとしては、制限されず、形質導入（ｉ
ｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかでの、宿主またはドナーからレシピエン
トへの宿主ＤＮＡのウイルス媒介性転移）、トランスフェクション（単離されたウイルス
ＤＮＡゲノムによる細胞の形質転換）、リポソーム媒介性転移、エレクトロポレーション
、リン酸カルシウムトランスフェクションまたは共沈等があげられる。形質導入法として
は、細胞と産生細胞との直接共培養または、適切な増殖因子およびポリカチオンの有無に
よるウイルス上清との培養があげられる。
【００９５】
前述は、特定の好ましい実施形態を意味するが、本開示は、そのように限定されないこ
とが理解されるであろう。種々の修飾が開示された実施形態になされ得ること、および、
このような修飾が本開示の範囲内であることを意図することが、当業者に明らかとなるで
あろう。
【００９６】
この明細書において引用された刊行物、特許出願および特許は全て、その全体が参照に
より本願明細書に組み込まれる。
【外国語明細書】
2018135352000001.pdf