(57)【要約】【課題】癌に対する補助的機能診断テストを提供すること。【解決手段】本発明は、種々のがんに関連し、ＢＨ３プロファイリング診断方法に対する改善を含む診断方法に関する。一つの実施形態において、患者のためのがん処置を決定するための方法であって、該患者の腫瘍試料またはがん細胞試料についてのＢＨ３プロフィールを決定する工程；該患者の一つまたは複数の臨床因子を決定する工程；および該患者を、一つまたは複数のがん処置に対する臨床応答の可能性について分類する工程；を含み、該一つまたは複数の臨床因子が、臨床応答との関連についての該ＢＨ３プロフィールの特異度および／または感度を増大させるように選択される、方法が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願はアメリカ合衆国仮出願Ｎｏ．６１／６４５，２５３（出願日２０１２年５月１０日）とアメリカ合衆国仮出願Ｎｏ．６１／７８０，２５２（出願日２０１３年３月１３日）の利益を特許請求するものであり、これらの出願は、それぞれその全体が本明細書中に参考として援用される。
発明の領域
【０００２】
本発明は人体から採取された試料中に存在する腫瘍の評価を行うのに有用な方法に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
背景
標的とするがん治療と対をなす予防および予後予見が可能なバイオマーカーの使用は薬剤の開発に要する時間の低減、薬効の改善また、臨床意思決定に非常に重要な役割を果たすであろう。近年のがん処置法の進歩にもかかわらず、  化学療法は依然として多くの症例であまり効率的でなくあまり有効でない。この化学療法に余り効果が認められない理由の一つは処置が患者個人個人の疾患に適した選択がなされていないことが多いということである。正確な診断と治療を組み合わせた医療のアプローチがこの問題は解決できる。
【０００４】
現在臨床腫瘍医療領域で使用されているほんの一握りのバイオマーカーしか有用性を認められていない。これは部分的ではあるが感知マーカーがしばしば薬剤の作用機序に相関的であるだけで病因的には関係しない事によっている。もしその「バイオマーカー」がコンパニオン治療の薬理学的作用と生物学的に一致したとしても薬剤が患者にどのように作用するかを予測するのは非常に難しいことである。それ以上に、臨床開発への道には検査の値を理解し、かつそれが患者に利益をもたらすことを考える医師−科学者の関与が必須である。
【０００５】
ＢＨ３プロファイリングはがん細胞の化学療法に対する反応性にとって重要な原因因子の機能を測定するものである。具体的には、ＢＨ３プロファイリングはミトコンドリアの表面にあってアポトーシスを調節するタンパク質の機能を測定するものである。多くの化学療法でアポトーシスのメカニズムを利用しているものは効果がある。このテストからはＢＨ３のみを持つ前アポトーシスタンパク質のＢＨ３ドメインに対するミトコンドリアの反応性を提供する。ＢＨ３プロファイリングは化学療法に対する感受性または反応性について一般的意味を提供することは公知ではあるが、このプロファイリングに寄ってある特定の薬剤およびがんの種類に対する医師の意思決定を支持するための予測能力はこれまでにはない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明のサマリー
従って、一つの側面として、この発明は患者個人のがん処置を選択する方法を提供する、それは患者の腫瘍或はがん細胞の検体を用いてＢＨ３プロファイルを決定する；一つ或はそれ以上の患者の臨床因子の決定と一つ或はそれ以上のがん処置に対する臨床的反応性をもって患者を区分する、つまり、一つ或はそれ以上の臨床因子が選択されそれによって臨床的反応性に関連してＢＨ３プロファイルの特異性および／または感度を上昇させる。
【０００７】
ある実施形態において、ここに示すように、様々な臨床的因子は、それがアポトーシスと関わっていなくてもアポトーシスと関係ある事が知られていないとに関わらず、ＢＨ３プロファイリングの予測検出力を高め、このテストを予測的であってしかしただ単に予後的ではないテストに変換する。
【０００８】
ある実施形態において、本明細書の記載された方法は細胞遺伝子学的プロファイルもしくは状態をおよび／または特定の年齢のそれを合わせた白血病患者に対するシタラビン、またはシタラビンに基づく化学療法、および／或はアザシチジンに対する反応を予測できる診断学的なテストを提供する。ある実施形態において、ＢＨ３プロファイリングを含む診断学的なテストはＢＭＩに反応するミトコンドリア膜電位の変化を測定することを包含する。
【０００９】
他の側面として、この発明は患者にふさわしいがん処置を決める方法を提供する。この方法は透過性を上げた患者がん細胞を、一つ以上のＢＨ３ドメインペプチドと接触させてプライミングの程度を決定すること、患者のがん細胞の一つ以上の臨床因子の存在または非存在を免疫組織化学、および／または蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）をもちいて決定すること、および１つ以上のがん処置に対する臨床的反応の可能性について患者をクラス分けする事を包含する。
【００１０】
他の側面として、この発明は急性骨髄性白血病の患者がシタラビンおよび／またはアザシチジンに対して反応するかを決定する為の方法を提供する、それは以下を包含する：ＢＨ３プロファイルを患者のＡＭＬ癌細胞検体で決定すること；１つ以上の臨床因子を患者ごとに決定すること（ここで、１つ以上の臨床因子は年齢プロファイルおよび／または細胞遺伝学的状況から選択される）；および１つ以上のがん処置に対する臨床的反応の可能性について患者をクラス分けすること。
【００１１】
この発明の詳しい内容は下記に記す通りである。本明細書で記載する方法や材料と類似のまたは同等の方法および材料はこの発明を実施或は試験に使用することができるが、例示の方法と材料についてはここで記述する。他にこの発明の他の特徴、目的、および利点は以下の記述および特許請求の範囲から明らかである。特許明細書及び、添付の特許請求の範囲では、内容が明らかに他を示さない限り単数形は複数形も含まれる。他が定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的科学的な用語はこの発明が属する技術における当業者によって普通に理解される意味と同じである。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
患者のためのがん処置を決定する方法であって、
該患者の腫瘍試料またはがん細胞試料についてのＢＨ３プロファイルを決定する工程；
該患者の一つまたは複数の臨床因子を決定する工程；および
該患者を、一つまたは複数のがん処置に対する臨床応答の可能性について分類する工程；
を含み、該一つまたは複数の臨床因子が、臨床応答との関連について該ＢＨ３プロファイルの特異度および／または感度を増大させるように選択される、方法。
（項目２）
前記がんが、血液がんである、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記血液がんが、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、多発性骨髄腫、濾胞性リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病、および非ホジキンリンパ腫から選択される、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記非ホジキンリンパ腫が、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫から選択される、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記がんが固形腫瘍である、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記固形腫瘍が、非小細胞性肺癌（ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、卵巣がん、および黒色腫から選択される、項目５に記載の方法。
（項目７）
がん処置が、抗がん薬剤、化学療法、外科手術、アジュバント療法、およびネオアジュバント療法のうちの一つまたは複数である、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記がん処置が、ＢＨ３ミメティック、エピジェネティック修飾剤、トポイソメラーゼ阻害剤、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、およびキネシンスピンドルタンパク質安定剤のうちの一つまたは複数である、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記がん処置が、プロテアソーム阻害剤である、項目７に記載の方法。
（項目１０）
前記がん処置が、細胞周期制御の調節剤である、項目７に記載の方法。
（項目１１）
細胞周期制御の前記調節剤が、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤である、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
がん処置が、細胞のエピジェネティック機構の調節剤である、項目７に記載の方法。
（項目１３）
エピジェネティック機構の前記調節剤が、ボリノスタットまたはエンチノスタットのうちの一つまたは複数を含む、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）の阻害剤である、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
エピジェネティック機構の前記調節剤が、アザシチジンである、項目１２に記載の方法。
（項目１５）
エピジェネティック機構の前記調節剤が、デシタビンである、項目１２に記載の方法。（項目１６）
がん処置が、アントラサイクリンまたはアントラセンジオンである、項目７に記載の方法。
（項目１７）
前記アントラサイクリンまたはアントラセンジオンが、エピルビシン、ドキソルビシン、ミトキサントロン、ダウノルビシン、イダルビシンのうちの一つまたは複数である、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
がん処置が、プラチナベースの治療剤である、項目７に記載の方法。
（項目１９）
前記プラチナベースの治療剤が、カルボプラチン、シスプラチン、およびオキサリプラチンのうちの一つまたは複数である、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
がん処置が、シタラビンまたはシタラビンベースの化学療法である、項目７に記載の方法。
（項目２１）
がん処置が、ＢＨ３ミメティックである、項目７に記載の方法。
（項目２２）
前記ＢＨ３ミメティックが、ＢＣＬ２、ＢＣＬＸＬ、およびＭＣＬ１のうちの一つまたは複数である、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
がん処置が、ＭＣＬ１の阻害剤である、項目７に記載の方法。
（項目２４）
前記ＢＨ３プロファイリングが、
前記患者のがん細胞を透過処理する工程、
該透過処理した細胞と一つまたは複数のＢＨ３ドメインペプチドとの接触の際に、ミトコンドリア膜電位の変化を決定する工程；および
ミトコンドリア膜電位の低下を、該細胞のアポトーシス誘導性化学療法剤への化学療法感受性と相関付ける工程
を含む、項目１に記載の方法。
（項目２５）
前記ＢＨ３プロファイリングが、ペプチドの使用を含み、該ペプチドが、ＢＩＭ、ＢＩＭ２Ａ、ＢＡＤ、ＢＩＤ、ＨＲＫ、ＰＵＭＡ、ＮＯＸＡ、ＢＭＦ、ＢＩＫ、およびＰＵＭＡ２Ａのうちの一つまたは複数である、項目１に記載の方法。
（項目２６）
前記ペプチドが、０．１μＭ〜２００μＭの濃度で使用される、項目２４に記載の方法。
（項目２７）
前記試料が、凍結腫瘍組織試料、培養細胞、循環腫瘍細胞、およびホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍組織試料から選択されるバイオプシーである、項目１に記載の方法。
（項目２８）
前記試料が、ヒト腫瘍由来の細胞株である、項目１に記載の方法。
（項目２９）
前記試料が、がん幹細胞である、項目１に記載の方法。
（項目３０）
前記試料が、固形腫瘍のバイオプシーに由来する、項目１に記載の方法。
（項目３１）
前記試料が、直腸結腸、胸部、前立腺、肺、膵臓、腎臓、または卵巣の原発腫瘍のバイオプシーに由来する、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記試料が、上皮起源の試料である、項目１に記載の方法。
（項目３３）
前記上皮試料が、抗上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、または固体マトリクスもしくはビーズに結合した他の上皮細胞結合抗体を用いた、バイオプシーサンプルからの選択により濃縮される、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記試料が、間葉起源の試料である、項目１に記載の方法。
（項目３５）
前記間葉試料が、神経細胞接着分子（Ｎ−ＣＡＭ）、もしくはニューロピリン、または固体マトリクスもしくはビーズに結合した他の間葉細胞結合抗体を用いた、バイオプシーサンプルからの選択により濃縮される、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記試料が、非固形腫瘍のバイオプシー由来する、項目１に記載の方法。
（項目３７）
前記試料が、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、および非ホジキンリンパ腫を有する患者のバイオプシー由来する、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記試料が、固体マトリクスもしくはビーズに結合した抗ＣＤ１３８抗体を用いた、バイオプシーサンプルからの選択により濃縮された多発性骨髄腫細胞である、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記がん細胞が、ＣＤ４５に対する抗体への結合により濃縮された急性骨髄性白血病である、項目３７に記載の方法。
（項目４０）
前記がん細胞が、非Ｂ細胞の枯渇により濃縮された慢性リンパ性白血病またはびまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫である、項目３７に記載の方法。
（項目４１）
前記試料が、循環腫瘍細胞由来する、項目１に記載の方法。
（項目４２）
前記臨床因子が、年齢、細胞遺伝学的状態、パフォーマンス（ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ）、組織学的サブクラス（ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｕｂｃｌａｓｓ）、性別、および疾患の状態のうちの一つまたは複数である、項目１に記載の方法。
（項目４３）
変異の状態、一塩基多型、定常状態のタンパク質レベル、および動的なタンパク質レベル、から選択されるさらなるバイオマーカーの測定をさらに含む、項目１に記載の方法。（項目４４）
前記患者における臨床応答を予測する工程をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目４５）
前記臨床応答が、少なくとも約１年、約２年、約３年、または約５年の無増悪生存／無再発生存である、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
臨床応答の前記可能性が、以下の式：
【数１】
2018013498.tif 000002
により定義され、
式中：
該ＡＵＣは、曲線下面積またはシグナル強度のいずれかを含み；
該ＤＭＳＯは、ベースラインのネガティブコントロールを含み；
該ＣＣＣＰ（カルボニルシアニドｍ−クロロフェニルヒドラゾン）は、ミトコンドリア内の電子伝達鎖における電子担体の正常な活性が、ベースラインのポジティブコントロールを含む間に確立されたプロトン勾配の脱共役剤として機能することによる、タンパク質合成のエフェクターを含む、
項目１に記載の方法。
（項目４７）
前記曲線下面積は、均質な時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）により確立される、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記時間が、約０分〜約３００分から約０分〜約３０分のウィンドウの間に生じる、項目４６に記載の方法。
（項目４９）
前記曲線下面積は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）により確立される、項目４６に記載の方法。
（項目５０）
前記シグナル強度が、約５分〜約３００分の間に生じる単一時点の測定点である、項目４６に記載の方法。
（項目５１）
ＢＨ３プロファイル、ならびに細胞表面マーカーＣＤ３３、細胞表面マーカーＣＤ３４、ＦＬＴ３変異状態、ｐ５３変異状態、ＭＥＫ−１キナーゼのリン酸化状態、およびＢｃｌ−２の位置７０におけるセリンのリン酸化のうちの一つまたは複数を決定する工程；ならびに
シタラビンまたはシタラビンベースの化学療法および／またはアザシチジンによるＡＭＬ患者の処置の有効性を相関付ける工程
を含む、項目１に記載の方法。
（項目５２）
ＢＨ３プロファイル、ならびに細胞表面マーカーＣＤ３３、細胞表面マーカーＣＤ３４、ＦＬＴ３変異状態、ｐ５３変異状態、ＭＥＫ−１キナーゼのリン酸化状態、およびＢｃｌ−２の位置７０におけるセリンのリン酸化のうちの一つまたは複数を決定する工程；ならびに
化学療法によるＭＭ患者の処置の有効性を相関付ける工程
を含む、項目１に記載の方法。
（項目５３）
前記がんが、ＡＭＬおよび／またはＭＭであり、前記臨床因子が、年齢プロファイルおよび／または細胞遺伝学的状態である、項目１に記載の方法。
（項目５４）
前記がんが、ＡＭＬおよび／またはＭＭであり、前記がん処置が、シタラビンまたはシタラビンベースの化学療法および／またはアザシチジンである、項目１に記載の方法。
（項目５５）
前記がん処置が、シタラビンまたはシタラビンベースの化学療法および／またはアザシチジンであり、前記臨床因子が、年齢プロファイルおよび／または細胞遺伝学的状態である、項目１に記載の方法。
（項目５６）
前記がん処置が、シタラビンまたはシタラビンベースの化学療法および／またはアザシチジンであり；前記がんが、ＡＭＬおよび／またはＭＭであり；かつ前記臨床因子が、年齢プロファイルおよび／または細胞遺伝学的状態である、項目１に記載の方法。
（項目５７）
患者のためのがん処置を決定する方法であって、
該患者の透過処理されたがん細胞を、一つまたは複数のＢＨ３ドメインペプチドと接触させる工程；
該患者のがん細胞の一つまたは複数の臨床因子の存在または非存在を、免疫組織化学、および／または蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）によって決定する工程；ならびに
該患者を、一つまたは複数のがん処置に対する臨床応答の可能性について分類する工程を含む、方法。
（項目５８）
シタラビンおよび／またはアザシチジンに対するＡＭＬ患者の応答を決定する方法であって、
該患者のＡＭＬがん細胞試料についてのＢＨ３プロファイルを決定する工程；
該患者の一つまたは複数の臨床因子を決定する工程であって、該一つまたは複数の臨床因子が年齢プロファイルおよび／または細胞遺伝学的状態から選択される工程；ならびに
該患者を、一つまたは複数のがん処置に対する臨床応答の可能性について分類する工程を含む、方法。
（項目５９）
ＢＨ３プロファイルを決定する工程が、前記患者のＡＭＬがん細胞試料をＢＩＭと接触させる工程を含む、項目５８に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１−１】図１は、代表的なＢＨ３プロファイリングデータを示す。この図は、高いプライミング細胞株対低いプライミング細胞株のパターンの違いを示す。ＭＲＬ−１４は、ＭＲＬ−１１と比較して、ＢＩＭ  ０．３、ＰＵＭＡ  ０．３、およびＮＯＸＡについて高度にプライミングされる（ＭＴＳアッセイによる治療阻害剤活性と相関する）。
【図１−２】図１は、代表的なＢＨ３プロファイリングデータを示す。この図は、高いプライミング細胞株対低いプライミング細胞株のパターンの違いを示す。ＭＲＬ−１４は、ＭＲＬ−１１と比較して、ＢＩＭ  ０．３、ＰＵＭＡ  ０．３、およびＮＯＸＡについて高度にプライミングされる（ＭＴＳアッセイによる治療阻害剤活性と相関する）。
【図１−３】図１は、代表的なＢＨ３プロファイリングデータを示す。この図は、高いプライミング細胞株対低いプライミング細胞株のパターンの違いを示す。ＭＲＬ−１４は、ＭＲＬ−１１と比較して、ＢＩＭ  ０．３、ＰＵＭＡ  ０．３、およびＮＯＸＡについて高度にプライミングされる（ＭＴＳアッセイによる治療阻害剤活性と相関する）。
【図１−４】図１は、代表的なＢＨ３プロファイリングデータを示す。この図は、高いプライミング細胞株対低いプライミング細胞株のパターンの違いを示す。ＭＲＬ−１４は、ＭＲＬ−１１と比較して、ＢＩＭ  ０．３、ＰＵＭＡ  ０．３、およびＮＯＸＡについて高度にプライミングされる（ＭＴＳアッセイによる治療阻害剤活性と相関する）。
【００１３】
【図２】図２は治療阻害剤活性対従来の増殖阻害ＥＣ５０  ＭＴＳアッセイの代表的なデータを示す。
【００１４】
【図３−１】図３は８つの接着細胞株でのＢＨ３  プロファイルを示す。各々のペプチドと細胞株の４−６の反復（ＲＥＰＬＩＣＡＴＥＳ）での限定的標準偏差
【図３−２】図３は８つの接着細胞株でのＢＨ３  プロファイルを示す。各々のペプチドと細胞株の４−６の反復（ＲＥＰＬＩＣＡＴＥＳ）での限定的標準偏差
【図３−３】図３は８つの接着細胞株でのＢＨ３  プロファイルを示す。各々のペプチドと細胞株の４−６の反復（ＲＥＰＬＩＣＡＴＥＳ）での限定的標準偏差
【図３−４】図３は８つの接着細胞株でのＢＨ３  プロファイルを示す。各々のペプチドと細胞株の４−６の反復（ＲＥＰＬＩＣＡＴＥＳでの限定的標準偏差
【００１５】
【図４−１】図４は９つの浮遊細胞株でのＢＨ３  プロファイルを示す。各々のペプチドと細胞株の４−６の反復（ＲＥＰＬＩＣＡＴＥＳでの限定的標準偏差
【図４−２】図４は９つの浮遊細胞株でのＢＨ３  プロファイルを示す。各々のペプチドと細胞株の４−６の反復（ＲＥＰＬＩＣＡＴＥＳでの限定的標準偏差
【図４−３】図４は９つの浮遊細胞株でのＢＨ３  プロファイルを示す。各々のペプチドと細胞株の４−６の反復（ＲＥＰＬＩＣＡＴＥＳでの限定的標準偏差
【図４−４】図４は９つの浮遊細胞株でのＢＨ３  プロファイルを示す。各々のペプチドと細胞株の４−６の反復（ＲＥＰＬＩＣＡＴＥＳでの限定的標準偏差
【図４−５】図４は９つの浮遊細胞株でのＢＨ３  プロファイルを示す。各々のペプチドと細胞株の４−６の反復（ＲＥＰＬＩＣＡＴＥＳでの限定的標準偏差
【００１６】
【図５】図５は浮遊細胞株でのＢＨ３プロファイリングを示す。ＢＩＭ、  ＢＩＭ＿ＰＵＭＡモデルはＣＤＫ阻害活性を識別する。
【００１７】
【図６−１】図６は  接着細胞株でのＢＨ３  プロファイリングを示す。  ＢＩＭ、ＰＵＭＡおよびＮＯＸＡでのモデルはＣＤＫ阻害活性を識別する。
【図６−２】図６は  接着細胞株でのＢＨ３  プロファイリングを示す。  ＢＩＭ、ＰＵＭＡおよびＮＯＸＡでのモデルはＣＤＫ阻害活性を識別する。
【図６−３】図６は  接着細胞株でのＢＨ３  プロファイリングを示す。  ＢＩＭ、ＰＵＭＡおよびＮＯＸＡでのモデルはＣＤＫ阻害活性を識別する。
【図６−４】図６は  接着細胞株でのＢＨ３  プロファイリングを示す。  ＢＩＭ、ＰＵＭＡおよびＮＯＸＡでのモデルはＣＤＫ阻害活性を識別する。
【００１８】
【図７−１】図７はＭＣＬ１阻害剤のＥＣ５０対浮遊細胞株の個々のペプチドについてのプライミングを表している。
【図７−２】図７はＭＣＬ１阻害剤のＥＣ５０対浮遊細胞株の個々のペプチドについてのプライミングを表している。
【図７−３】図７はＭＣＬ１阻害剤のＥＣ５０対浮遊細胞株の個々のペプチドについてのプライミングを表している。
【００１９】
【図８−１】図８はＭＣＬ１阻害剤のＥＣ５０対浮遊細胞株の複数のペプチド由来のアルゴリズムについてのプライミングのパーセンテージを表している。
【図８−２】図８はＭＣＬ１阻害剤のＥＣ５０対浮遊細胞株の複数のペプチド由来のアルゴリズムについてのプライミングのパーセンテージを表している。
【図８−３】図８はＭＣＬ１阻害剤のＥＣ５０対浮遊細胞株の複数のペプチド由来のアルゴリズムについてのプライミングのパーセンテージを表している。
【００２０】
【図９−１】図９はＭＣＬ１阻害剤のＥＣ５０対接着細胞株の個々のペプチドについてのプライミングのパーセンテージを表している。
【図９−２】図９はＭＣＬ１阻害剤のＥＣ５０対接着細胞株の個々のペプチドについてのプライミングのパーセンテージを表している。
【図９−３】図９はＭＣＬ１阻害剤のＥＣ５０対接着細胞株の個々のペプチドについてのプライミングのパーセンテージを表しているド。
【００２１】
【図１０−１】図１０はＭＣＬ１阻害剤対浮遊細胞株の複数のペプチド由来のアルゴリズムについてのプライミングのパーセンテージを表している。
【図１０−２】図１０はＭＣＬ１阻害剤対浮遊細胞株の複数のペプチド由来のアルゴリズムについてのプライミングのパーセンテージを表している。
【図１０−３】図１０はＭＣＬ１阻害剤対浮遊細胞株の複数のペプチド由来のアルゴリズムについてのプライミングのパーセンテージを表している。
【００２２】
【図１１−１】図１１はキネシンスピンドルタンパク質阻害剤（ＫＳＰ  ＩＮＨ）、多発性骨髄腫、白血病細胞株を示す。
【図１１−２】図１１はキネシンスピンドルタンパク質阻害剤（ＫＳＰ  ＩＮＨ）、多発性骨髄腫、白血病細胞株を示す。
【００２３】
【図１２−１】図１２Ａ−ＤはＢＨ３プロファイイングの代表的な患者データを示す。
【図１２−２】図１２Ａ−ＤはＢＨ３プロファイイングの代表的な患者データを示す。
【００２４】
【図１３】図１３Ａ−Ｂはシタラビン処置後の急性骨髄性白血病患者の、ＢＩＭ患者反応について描写するドットプロットとＲＯＣプロットを表す。
【００２５】
【図１４−１】図１４はシタラビン処置後の反応なし（ＮＲ）と著効（ＣＲ）の急性骨髄性白血病患者におけるＢＨ３ペプチドのＢＨ３プロファイリングを示す。
【図１４−２】図１４はシタラビン処置後の反応なし（ＮＲ）と著効（ＣＲ）の急性骨髄性白血病患者におけるＢＨ３ペプチドのＢＨ３プロファイリングを示す。
【図１４−３】図１４はシタラビン処置後の反応なし（ＮＲ）と著効（ＣＲ）の急性骨髄性白血病患者におけるＢＨ３ペプチドのＢＨ３プロファイリングを示す。
【図１４−４】図１４はシタラビン処置後の反応なし（ＮＲ）と著効（ＣＲ）の急性骨髄性白血病患者におけるＢＨ３ペプチドのＢＨ３プロファイリングを示す。
【００２６】
【図１５】図１５はシタラビン処置後の急性骨髄性白血病患者の多変数解析ＲＯＣカーブ
【００２７】
【図１６−１】図１６Ａ−ＨはＢＨ３ペプチド反応の予測を細胞遺伝学的状態によって階層化したものを示す。
【図１６−２】図１６Ａ−ＨはＢＨ３ペプチド反応の予測を細胞遺伝学的状態によって階層化したものを示す。
【図１６−３】図１６Ａ−ＨはＢＨ３ペプチド反応の予測を細胞遺伝学的状態によって階層化したものを示す。
【図１６−４】図１６Ａ−ＨはＢＨ３ペプチド反応の予測を細胞遺伝学的状態によって階層化したものを示す。
【００２８】
【図１７−１】図１７Ａ−Ｅはシタラビン処置後の急性骨髄性白血病患者のＢＩＭ（０．１）プライミングおよびＢＩＭ（ＢＣＬ２Ｌ１１）タンパク質レベルの反応予測との相関を示す。
【図１７−２】図１７Ａ−Ｅはシタラビン処置後の急性骨髄性白血病患者のＢＩＭ（０．１）プライミングおよびＢＩＭ（ＢＣＬ２Ｌ１１）タンパク質レベルの反応予測との相関を示す。
【００２９】
【図１８】図１８は全生存期間（ＯＳ）および無再発生存（ＥＦＳ  無疾患生存）対  ＢＩＭ（０．１）のパーセントプライミングによってサブグループ分けされた急性骨髄性白血病患者の三分位値（ｔｅｒｔｉｌｅ）を示す。
【００３０】
【図１９−１】図１９はＢＨ３プロファイリング測定の分配解析であって、個々のＢＨ３ペプチドモデルについてのものを示す。
【図１９−２】図１９はＢＨ３プロファイリング測定の分配解析であって、個々のＢＨ３ペプチドモデルについてのものを示す。
【図１９−３】図１９はＢＨ３プロファイリング測定の分配解析であって、個々のＢＨ３ペプチドモデルについてのものを示す。
【００３１】
【図２０】図２０はＢＨ３プロファイリング測定の分配解析であって、組み合わせたＢＨ３ペプチドモデル（２つのペプチド）についてのものを示す。
【００３２】
【図２１−１】図２１はＢＨ３プロファイリング測定の分配解析であって、組み合わせたＢＨ３ペプチドモデル（３／４つのペプチド）についてのものを示す。
【図２１−２】図２１はＢＨ３プロファイリング測定の分配解析であって、組み合わせたＢＨ３ペプチドモデル（３／４つのペプチド）についてのものを示す。
【００３３】
【図２２−１】図２２はＢＨ３プロファイリング測定の連続的変数解析であって、個々のＢＨ３ペプチドモデルについてのものを示す。
【図２２−２】図２２はＢＨ３プロファイリング測定の連続的変数解析であって、個々のＢＨ３ペプチドモデルについてのものを示す。
【００３４】
【図２３】図２３はＢＨ３プロファイリング測定の連続的変数解析であって、組み合わせたＢＨ３ペプチドモデル（２つのペプチド）についてのものを示す。
【００３５】
【図２４−１】図２４はＢＨ３プロファイリング測定の連続的変数解析であって、組み合わせたＢＨ３ペプチドモデル（３／４ペプチド）についてのものを示す。
【図２４−２】図２４はＢＨ３プロファイリング測定の連続的変数解析であって、組み合わせたＢＨ３ペプチドモデル（３／４ペプチド）についてのものを示す。
【００３６】
【図２５】図２５はアザシチジン処置のコホートから代表的な急性骨髄性白血病患者のＢＨ３プロファイリングを示し、それはプライミング値のｆｕｌｌ治療的スケールが使われた事を示す。
【００３７】
【図２６−１】図２６は急性骨髄性白血病患者のアザシチジン反応のＢＩＭ＋ＮＯＸＡ区別はＢＩＭあるいはＮＯＸＡ単独よりも良い（ｓｕｐｅｒｉｏｒ）ことを示す。
【図２６−２】図２６は急性骨髄性白血病患者のアザシチジン反応のＢＩＭ＋ＮＯＸＡ区別はＢＩＭあるいはＮＯＸＡ単独よりも良い（ｓｕｐｅｒｉｏｒ）ことを示す。
【図２６−３】図２６は急性骨髄性白血病患者のアザシチジン反応のＢＩＭ＋ＮＯＸＡ区別はＢＩＭあるいはＮＯＸＡ単独よりも良い（ｓｕｐｅｒｉｏｒ）ことを示す。
【図２６−４】図２６は急性骨髄性白血病患者のアザシチジン反応のＢＩＭ＋ＮＯＸＡ区別はＢＩＭあるいはＮＯＸＡ単独よりも良い（ｓｕｐｅｒｉｏｒ）ことを示す。
【００３８】
【図２６−５】表１は細胞株による治療阻害剤反応とＢＨ３プロファイリングの収集（ｃｏｍｐｉｌａｔｉｏｎ）を表す。
【図２６−６】表１は細胞株による治療阻害剤反応とＢＨ３プロファイリングの収集（ｃｏｍｐｉｌａｔｉｏｎ）を表す。
【００３９】
【図２６−７】表２はＭＣＬ−１阻害剤のサポートデータのまとめである。
【００４０】
【図２６−８】表３はシタラビン処置後の急性骨髄性白血病患者の患者コホートの為の臨床病理的な変数を表す。
【００４１】
【図２６−９】表４はシタラビン処置後急性骨髄性白血病患者を示す。ＢＨ３プロファイリングバイオマーカーが解析され、反応の識別において有意であった。
【００４２】
【図２６−１０】表５は細胞株でのアザシチジン効果のまとめであって、分配および連続的変数モデルについて示すものである。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
詳しい記載
この発明の基礎になっているのは、一部であっても、ＢＨ３プロファイリング測定値の感度および／または特異性がある特定の臨床因子との関係において有意に改善され得ると言う発見である。本明細書に記載する診断的手法はひとそろいのＢＨ３の反応および臨床的な指標の解析を可能とし、それには、ヒトの悪性腫瘍における治療の効果を予想する為の、アポトーシスとは直接関係ないようなものが含まれる。例えば、この発明者らは白血病の患者におけるシタラビンやアザシチジンを基にした化学療法レジメに対する反応がＢＨ３プロファイリングと年齢プロファイル、および細胞遺伝学的状況によって予想できる事を発見した。
【００４４】
ある側面として、この発明は患者のがん処置を決定する方法を提供する。それには、患者の腫瘍またはがん細胞の検体のＢＨ３プロファイルを決定し、一つ以上の患者の臨床因子の決定、および一つ以上のがん処置に対する臨床的反応の可能性について患者を分類することが含まれ、臨床的反応に関係するＢＨ３プロファイルの高い特異性および感度を持つように一つ以上の臨床因子を選択する。
【００４５】
他の側面として、この発明は患者のがん処置を決定するための方法を提供する。それには、患者由来の透過性を上げたがん細胞を、一つ以上のＢＨ３ドメインペプチドと接触させてプライミングの程度決定すること、免疫組織化学および／または蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を用いて患者の癌細胞の一つ以上の臨床因子の有無を決定すること、および一つ以上のがん治療に対する臨床的反応の可能性について患者を分類することが包含される。
【００４６】
他の側面としてこの発明はシタラビンおよび／またはアザシチジンに対して反応する急性骨髄性白血病の患者を決定するための方法であって、ＢＨ３プロファイリングを患者の白血病細胞検体について決定すること、患者の一つ以上の臨床因子を決定すること（ここで、一つ以上の臨床因子を年齢プロファイルおよび／または細胞遺伝学的状態から選ぶ）、および１つ以上のがん処置に対する臨床的反応の可能性について患者を分類することを含む、方法を提供する。
【００４７】
他の側面の特定の実施形態として、がんは血球系の癌であって、それには、例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、多発性骨髄腫、濾胞性リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病、および非ホジキンリンパ腫（例えば、マントル細胞リンパ腫、および、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫）が挙げられる。いくつかの実施形態では、がんは、固形腫瘍、例えば非小細胞肺癌、卵巣がん、悪性黒色腫が挙げられる。
【００４８】
ある実施形態において、この発明はがん処置に対する有効性を予想する。がん処置として、一つ以上の抗がん剤、化学療法、外科手術、（例えば、外科手術の前の）アジュバント治療および、（例えば、外科手術後の）ネオアジュバント治療を挙げることができる。別の実施形態において、がん処置は一つ以上のＢＨ３ミメティック（ｍｉｍｅｔｉｃｓ）、エピジェネティク修飾薬剤、トポイソメラーゼ阻害剤、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、およびキネシンスピンドルタンパク質安定剤を含む。さらに別の実施形態において、がん処置として、以下のものが含まれる：プロテアソーム阻害剤、および／または細胞周期制御の調節剤（これらの例に限るわけでないが、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤）；および／または細胞のエピジェネティクな機構の調節剤（これらの例に限らないが、一つ以上のヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）（例えばボリナスタット、エンチノスタットのうちの１つ以上）アザシチジン、デシタビン）  および／またはアントラサイクリン、またはアントラセネジオン（非限定的例として、エピルビシン、ドキソルビシン、ミトキサントロン、ダウノルビシン、イダルビシン）および／またはプラチナベースの治療剤（非限定的例として、カルボプラチン、シスプラチン、オキザリプラチンのうちの１つ以上）、シタラビンまたはシタラビンベースの化学療法、ＢＨ３ミメティック（これらの例に限る訳でないが、ＢＣＬ２、ＢＣＬＸＬまたはＭＣＬ１のうちの１つ以上）およびＭＣＬ１阻害剤。
【００４９】
ある実施形態において、ＢＨ３プロファイリングは患者のがん細胞の透過性を上げること、透過性を上げた細胞を１つ以上のＢＨ３ドメインペプチドと接触させる事によるミトコンドリアの膜ポテンシャルの変化を決定或は定量化することが含まれる。この測定値は本明細書に記載の臨床因子と合わせる事で各種の治療に対する患者の反応および患者を区分することを助ける。
【００５０】
これら又は他の実施形態において、ＢＨ３プロファイイングはＢＩＭ、ＢＩＭ２Ａ、ＢＡＤ、ＢＩＤ、ＨＲＫ、ＰＵＭＡ、ＮＯＸＡ、ＢＭＦ、ＢＩＫ、ＰＵＭＡ２Ａのうちの１つ以上のペプチドの使用を含む。一つの実施形態において、使用するペプチド濃度は０．１μＭから２００μＭの範囲で又その中の様々な濃度で用いる。一つの実施形態において、ＢＨ３プロファイリングは、検体の透過性をあげる事でミトコンドリアへの接近を可能にすることを含む。これら又は他の実施形態において、ＢＨ３プロファイリングは急性骨髄性白血病のがん細胞検体をＢＩＭと接触させることを含むＢＨ３プロファイルを決定することが含まれる
【００５１】
ある実施形態において、患者の検体は凍結腫瘍組織検体、培養した細胞、血中に循環している腫瘍細胞、およびホルマリン固定パラフィン包埋の腫瘍組織検体（例えば、抗体を用いたＢＨ３プロファイリング）から選択される生検である。他の実施形態において、検体はヒトの腫瘍由来の細胞株である。ほかの実施形態において、検体はがん幹細胞である。検体は固形腫瘍の生検（これらの例に限定するものではないが、例えば、結腸直腸、乳、前立腺、肺、膵臓、腎臓、卵巣原発腫瘍の１つ以上）に由来する。他の実施形態において、検体は上皮由来の検体であって、それには、例えば、生検試料から、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）に対する抗体または他の上皮細胞結合抗体を固体マトリックスまたはビーズに結合させたものを使用して選択することにより濃縮される上皮細胞が含まれる。他の実施形態では、検体は中胚葉由来のものであり、それには、例えば中胚葉性の検体であって、生検試料から、神経細胞接着分子（Ｎ−ＣＡＭ）、またはニューロフィリンまたは他の中胚葉性細胞結合抗体を固体マトリックスまたはビーズに結合させたものを使用して選択することにより濃縮される中胚葉性の検体が含まれる。他の実施形態において、検体は非固形腫瘍の生検に由来する。他の実施形態において、検体は多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、マントル細胞リンパ腫、びまん性細胞型Ｂ細胞リンパ腫、および非ホジキンリンパ腫を有する患者の生検に由来する。他の実施形態において、検体は多発性骨髄腫細胞であり、それは生検試料から、固体マトリックスまたはビーズに結合させた抗ＣＤ１３８抗体を用いて選択により濃縮したものである。他の実施形態において、がん細胞は、急性骨髄性白血病細胞であり、それはＣＤ４５に対する抗体に結合させることにより濃縮したものである。またその上他の実施形態において、がん細胞は、慢性リンパ球性白血病細胞またはびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫であり、それは非Ｂ細胞を除去して濃縮されたものである。他の実施形態において、検体は、血中循環腫瘍細胞に由来する。
【００５２】
様々な実施形態において、臨床因子として、年齢、細胞遺伝学的状態、パフォーマンス、組織学的サブクラス、性別、および疾患ステージの１つ以上である。他の実施形態において、方法は、変異の状況、一塩基多型、定常状態のタンパク質レベル及び動的タンパク質レベルから選択される追加のバイオマーカーの測定を含み、それにより、テストの特異性および／または感度をあげることができる。他の実施形態において、方法は、患者の臨床的な反応を推測することをさらに含む。他の実施形態において、臨床的な反応は、少なくとも約１年、約２年、約３年または約５年の無進行／無症候性生存である。
【００５３】
ある実施形態においてプライミングは以下の数式で定義される。
【化１】
2018013498.tif 000003
式中、ＡＵＣは、曲線下面積或はシグナル強度を含む；ＤＭＳＯはベースラインの陰性対照を含む；ＣＣＣＰ（カルボニルシアニドｍ−クロロフェニルヒドラゾン）はミトコンドリアの電子伝達鎖における電子担体の正常な活性の間に確立されたプロトン勾配の脱共役薬として働くことによるタンパク質合成のエフェクターを含み、それはベースラインの陽性対照を含む。ある実施形態において、曲線下面積は均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）によって確立される。ある実施形態において、時間は約０から約３００分、から、約０から３０分のあいだのウインドウにわたって生じる。ある実施形態において曲線下面積は蛍光活性化細胞識別（ＦＡＣＳ）によって確立される。ある実施形態において、シグナル強度は約５分および約３００分の間で生じる単一時間点の測定値（ｓｉｎｇｌｅ  ｔｉｍｅ  ｐｏｉｎｔ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）である。
【００５４】
他の実施形態において、方法は、ＢＨ３プロファイリングアッセイを実施すること、および細胞表面マーカーＣＤ３３、細胞表面マーカーＣＤ３４、ＦＬＴ３変異状態、ｐ５３変異状態、ＭＥＫ１キナーゼのリン酸化状態、およびＢｃｌ−２の７０番目のセリンのリン酸化の１つ以上を、シタラビンもしくはシタラビン系の化学療法および／またはアザシチジンによる急性骨髄性白血病の患者処置効果に相関させることを含む。
【００５５】
他の実施形態において、方法は、ＢＨ３プロファイリングを実施すること、および一つ又はそれ以上の細胞表面マーカーＣＤ３３、細胞表面マーカーＣＤ３４、ＦＬＴ３変異状態、ｐ５３変異状態、ＭＥＫ１キナーゼのリン酸化状態、およびＢｃｌ−２の７０番目のセリンのリン酸化を、多発性骨髄腫の患者の化学療法処置に対する効果と相関させることを含む。
【００５６】
ある実施形態において、がんは急性骨髄性白血病および／または多発性骨髄腫であり、そして臨床因子は年齢プロファイルおよび／または細胞遺伝学的状態であり；又はがんは急性骨髄性白血病および／または多発性骨髄腫であり、がん処置はシタラビンもしくはシタラビン系化学療法および／またはアザシチジンであるか、又はがん処置はシタラビンもしくはシタラビン系化学療法および／またはアザシチジンであり、また臨床因子として年齢プロファイルおよび／または細胞遺伝学的状態であるか、又はがん処置はシタラビンもしくはシタラビン系化学療法および／またはアザシチジンであり；がんは急性骨髄性白血病および／または多発性骨髄腫であり；臨床因子は年齢プロファイルおよび／または細胞遺伝学的状態である。
【００５７】
典型的な臨床決定
ある実施形態において、ここで記載する方法は患者の評価をするのに有用である。例えば、診断、予後、および処置に対する反応を評価する上で有用である。様々な態様では、この発明は腫瘍または血液がんを評価することを含む。様々な実施形態では、評価は診断、予後、および処置に対する反応から選ばれうる。
【００５８】
診断とは、例えばがんなどの病気あるいは障害の可能性を決定或は同定する為の試みの過程を指す。予後は、例えばがんなどの病気或は障害によってもたらされる可能性のある結果を予測することを指す。完全な予後はしばしば予想される期間、機能、病気の経過の記述、例えば進行性の機能低下や間欠的に起きる危機的状況または予測できないが突然の危機的な状況を含む。処置に対する反応は患者が処置を受けたときにその患者に起こりうる医学的な予測である。処置に対する反応は、この例だけにとどまらないが、例えば病理学的著効、生存、およびがん進展が見られない生存、がんが進行するまでの時間、再発の可能性であり得る。
【００５９】
さまざまな実施形態において、本発明の方法を用いると臨床的に患者が特定の処置を受けるかどうかの判断が出来る。一つの実施形態において、この方法はネオアジュバントおよび／またはアジュバント化学療法に陽性の反応であるか、またはネオアジュバントおよび／またはアジュバント化学療法に反応しないかを予測する。一つの実施形態において、本発明の方法は以下の薬剤に対する陽性の反応を予測する：アポトーシス促進薬剤、またはアポトーシスを介して働く薬剤、および／またはアポトーシスを介して働かないかアポトーシスのエフェクター薬剤に無反応の薬剤および／またはアポトーシスを介して働かない薬剤。様々な実施形態においてこの発明はがん患者の処置を導く、それには、例えばどのようなタイプの処置をするべきか止めるのかを含む。
【００６０】
一つの実施形態において、この方法は、患者が一次の主なまたは最初の処置を始めた後にアジュバント治療、限定されないが、単一単独アジュバント治療も含めて、受けるべきかといった臨床的決定を導く。アジュバント治療はアジュバントケアともいわれ主な中心的なまたは最初の処置に加えて行われる処置である。これらの例に限らないが、アジュバント治療は通常全ての検出可能な疾患が除去されたが、不顕性疾患のため再発の統計的リスクが依然として存在する外科手術の後で行われる追加処置であり得る。
【００６１】
ある実施形態において、この方法は患者の処置、アジュバント治療も含めて、を導く。例えば、患者がある特定の処置に対して反応性を有すると評価された場合、その患者は、その処置をアジュバント治療として受ける。さらに、この方法は、非限定的な例として、アポトーシス促進的方法で、誘導するおよび／もしくは働く処置として、または、そうではない処置として、アジュバント治療の正体（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を導き得る。一つの実施形態においてこの方法はある患者が特定の処置に対して反応するもしくは反応がが少ない事を示すことができ、それゆえ、そのような患者はそのような処置をアジュバント治療として受けなくてよい。従って、ある実施形態において、この方法は、起こり得る患者の反応に従い、アジュバント治療を与えるのか与えないのかを提供する。このように、患者の生活の質の改善と治療コストを抑制することができる。
【００６２】
様々な実施形態において、この方法は、患者がネオアジュバント治療、例えば、外科手術前に腫瘍を縮小させる、および／または悪性度を下げる治療を受けるべきかと言う臨床決定を導く。ある実施形態において、ネオアジュバント治療はがん患者に外科手術の前に投与される化学療法を意味する。ある実施形態において、ネオアジュバント治療は、がん患者に外科手術の前に投与される、本明細書に記載の薬剤を含む薬剤を意味する。ネオアジュバント化学療法一般に考慮されるがんの種類については例えば乳がん、結腸直腸がん、卵巣がん、子宮頸がん、膀胱がんと肺がんである。
【００６３】
ある実施形態においてこの方法はネオアジュバント治療を含む患者の処置を導く。例えば、ある特定の処置に対して反応すると評価される患者は、そのような処置がネオアジュバント治療として受けることができる。さらに、この方法は、非限定的例として、アポトーシス促進的方法で、誘導および／もしくは働く処置として、またはそうではない処置として、ネオアジュバント治療の正体（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を導き得る。一つの実施形態において、この方法は患者が特定の処置に対する反応がないもしくは反応が少ない事を示し得、従ってそのような患者は、ネオアジュバント治療としてそのような治療を受けなくてよい。従って、ある実施形態では、この方法は、起こり得る患者の反応に従ってネオアジュバント治療を与えるのか与えないのかを提供する。このように、患者の生活の質の改善と治療コストを抑制できる。
【００６４】
ある実施形態においてこの方法は、患者がある特定の種類の処置を受けるかに関する臨床的決定を導く。従って、ある実施形態において、この方法は患者の処置の為の手引きの試験である。
【００６５】
ある実施形態において、この方法は、患者がある特定の処置を受けるべきである、起こり得る反応についての情報を提供するものである。ある実施形態において、この方法は、反応が高い可能性を提供し、積極的処置を含む処置を導くことができる。ある実施形態において、この方法は、反応が低い可能性を提供し、積極的処置を含む処置の停止を導き得、より良い生活の質を求めて効果の少ない化学療法から来る必要の無い毒性を避けるための、緩和ケアの使用を導き得る。
【００６６】
典型的な実施形態において、この方法はある特定の処置に対する反応の可能性を示す。例えば、ある実施形態においてこの方法はアポトーシス促進剤および／またはアポトーシスを介して作用する薬剤および／またはタンパク質を直接調節することによって駆動されるアポトーシスを介する薬剤に対する反応が高いか低いかの可能性を示す。様々な実施形態において典型的なアポトーシス促進剤および／またはアポトーシスを介して作用する薬剤および／または直接タンパク質を調節することによって駆動されるアポトーシスを介して作用する薬剤としては、ＡＢＴ２６３（ノビトクラックス）やオバトクラックス、ＷＥＰ、ボルテゾミブ、およびカルフィルゾミブが挙げられる。ある実施形態において、この方法は、アポトーシスを介して作用しない薬剤、および／または直接タンパク質を調節することによって駆動されるアポトーシスを介して作用しない薬剤に対する反応が高いか低いかの可能性を示す。様々な実施形態では、アポトーシスを介して作用しない例示的薬剤として、例えばキネシンスピンドルタンパク質阻害剤、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、三酸化ヒ素剤（ＴＲＩＳＥＮＯＸ）、ＭＥＫ阻害剤、ポモリドミド、アザシチジン、デシチビン、ボリノスタット、エンチノスタット、ジナシクリブ、ゲムツズマブ、ＢＴＫ阻害剤、ＰＩ３キナーゼデルタ阻害剤、レノリジミド、アントラサイクリン、シタラビン、メルファラン、Ａｋｙ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤が挙げられる。
【００６７】
典型的な実施形態において、この方法は患者がアポトーシス促進薬或はアポトーシスを介して作用する薬剤でがん処置されるべきかどうかを示す。  別の典型的な実施形態においてに、本方法は、患者がアポトーシスを介して作用しない薬剤を投与されるべきかを示す。
【００６８】
特殊な実施形態において、この方法はここに記載した任意の処置（薬剤を含む）に対するがん患者の反応を推定するのに有用である。典型的な実施形態において、この発明は、シタラビンおよびアザシチヂンに対する急性骨髄性白血病の患者の反応の可能性を予測し、かつ、患者のＢＨ３プロファイル、年齢プロファイル、および細胞遺伝学的因子を評価する事を含む。
【００６９】
様々な実施形態において、ここで記載した方法に基づき、がん処置を施行するのかまたは与えない。例示的な処置は、外科的な除去、放射線療法（ここで記載した化合物の使用、或は放射線増感剤との併用を含む）化学療法、薬力学的治療、標的療法、免疫療法、および補助的療法（例えば、鎮痛剤、利尿剤、抗利尿剤、抗ウイルス剤、抗生物質、栄養サプリメント、貧血治療、血液凝固治療、骨治療、精神医学及び心理学的治療）を含む。
【００７０】
典型的な実施形態において、この発明で処置薬剤が選択される。そのような薬剤の例としては、ここで示す例に限らないが、例えば、抗がん剤、化学療法、外科手術、アジュバント療法およびネオアジュバント療法の１つ以上が挙げられる。ひとつの実施形態においてがん処置はＢＨ３ミメティック、エピジェネティク修飾薬、トポイソメラーゼ阻害剤、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、およびキネシンスピンドルタンパク質安定化剤の１つ以上である。別の実施形態において、がん処置は、プロテアソーム阻害剤、および／または細胞周期制御の調節剤（ここで挙げる例に限らないが、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤）；および／または細胞エピジェネティック機構の調節剤（この例に限らないがヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）（たとえばヴォリノスタット、またはエンチノスタット）、アザシチジン、デシタビン）；および／またはアントラサイクリン、またはアントラセネジオン（この例に限らないが、エピルビシン、ドキソルビシン、ミトキサントロン、ダウノルビシン、イダルビシンの１つ以上）；および／またはプラチナベースの治療剤（この例に限らないが、カルボプラチン、シスプラチン、およびオキザリプラチンの１つ以上）；シタラビン、もしくはシタラビン系化学療法剤、ＢＨ３ミメティック（この例に限らないが、ＢＣＬ２、ＢＬＣＸＬ、またはＭＣＬ１）；およびＭＣＬ１阻害剤である。
【００７１】
様々な実施形態において、この発明は、がん処置に付属するものであり、ここで挙げる例に限らず例えば米国特許公開番号ＵＳ２０１２−０２２５８５１および国際特許公開番号ＷＯ２０１２／１２２３７０（それらの内容は、その全体がここに参考文献として組み込まれている）に記載されているものが挙げられる。
【００７２】
様々な実施形態において、この発明は、がん処置に付属するものであり、ここで挙げる例に限らず例えば、アルキル化剤、例えばチオテパ、およびサイトキサン（シクロフォスファミド）、アルキルスルホン酸塩、例えばブスルファン、インプロスルファン、およびピポスルファン；アジリジン例えばベンゾドパ、カルボコン、メツレドパ、およびウレドパ；エチレンイミンおよび、メチラメラミン、例えばアルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド、およびトロメチルオロメラミン、アセトゲニン（例えば、ブラタシン、およびブラタシノン）；カンプトテシン（合成類似剤トポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリー（ｃａｌｌｙ）  スタチン；ＣＣ−１０６５（アドゼレシン、カルゼレシン、およびビゼレシン合成類似薬を含む）；クリプトフィシン（クリプトフィシン１、およびクリプトフィシン８など）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似薬ＫＷ２１８９、およびＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エレウテロビン；パンクラチスタチン；サルコディクチン；スポンギスタチン；ナイトロジェンマスタード  例としてクロラムブチル、クロルナファジン、コロフォスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、酸化メクロレタミン塩酸塩、メルファラン、ノベムビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド、ウラシルマスタード、ニトロソウレア例としてカルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチン；抗生物質例えばエンジイン抗生物質（例えば、カリケアミシン、特にカリケアミシンガンマＩＩとカリケマミシンオメガＩＩ（参照：例えば、Ａｇｎｅｗ，  Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，  ３３：１８３−１８６  （１９９４））；ディネミシン、ディネミシンＡを含む；ビスホスホネート例えばクロドロネート；エスペラミシン；ならびにネオカルジノスタチン  クロモフォア及び関連したクロモタンパク質エンジイン抗生物質クロモフォア）アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オートラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、アドリアマイシン、ドキソルビシン（モルフォリノ−ドキソルビシン、シアノモルフォリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン、およびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン  （マイトマイシンＣ等）、ミコフェノール酸、ノガラミシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラミシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、チュベルシジン、ウベニメックス、ジノスタチン、ゾルビシン；抗代謝薬例えばメトトレキセートと５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸類似体（例えば、デノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセート）；プリン類似体（例えば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン）；���リミジン類似体（例えば、アンシタビン（ａｎｃｉｔａｂｉｎｅ）、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン；アンドロゲン（例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎剤（ａｎｔｉ−ａｄｒｅｎａｌ）（例えば、アミノグルテチミド（ｍｉｎｏｇｌｕｔｅｔｈｉｍｉｄｅ）、ミトタン、トリロスタン）；葉酸補給物、例えばフロリン酸；アセグラトン；アルドフォスファミド  グリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキセート；デメコルシン；ジアジコン；エルフォルミチン；エリプチニウムアセテート；エポチロン；エトグルシド；ガリウムニトレート；ハイドロキシウレア；レンチナン；ロニダイニン；メイタンシノイド  例えばメイタンシンとアンサミトシン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモル；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ多糖複合体（ＪＨＳナチュラルプロダクト、ユージン、オレゴン）ラゾキサン；リゾキシン；シゾフラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（例Ｔ−２毒素、ベラキュリンＡ、ロリジンＡ、およびアングイディン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「アラ−Ｃ」）；シクロフォスファミド；チオテパ；タキソイド、例えばタキソール  パクリタキセル（ブリストルマイヤーズ  スクイブ  オンコロジー、プリンストン、ニュージャージー）、アブラキサン  クレモフォール−フリー、アルブミン加工ナノ粒子型のパクリタキセル製剤（アメリカン  ファーマシューティカル  パートナーズ、シャウンバーグ、１１１）、およびタキソテール  ドキセタキセル（ローヌ  プーラン  ローラー、アントニー、フランス；クロランブシル；ゲムザール  ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；プラチナ類似体、例えばシスプラチン、オキザリプラチン、およびカルボプラチン；ビンブラスチン；プラチナ；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ナベルビン；ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；イリノテカン（カンプトサー、ＣＰＴ−１１）（イリノテカンと５ＦＵ、およびロイコボリンとの処置レジメを含む）；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイド、例えばレチノイン酸；カペシタビン；コンブレタスタチン；ロイコボリン（ＬＶ）；オキサリプラチン、オキサリプラチン処置レジメを含む（ＦＯＬＦＯＸ）；ラパチニブ（Ｔｙｋｅｒｂ）；ＰＫＣ−ａ、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ、ＥＧＦＲの阻害剤（例えば、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ））および細胞増殖を低減するＶＥＧＦ−Ａ、ダコゲン、���ルケード、および薬学的に受容可能な塩、酸、或は上記の薬剤の誘導体のうちの１つ以上を含む。
【００７３】
典型的な検出方法
さまざまな実施形態において、この方法はタンパク質および／または核酸の有無またはレベルを評価することを含む。さまざまな実施形態において、この方法は、ＢＨ３  プロファイリングの特異性および／または感度を高めることができるタンパク質および／またはの有無またはレベルを評価することを含む。ある実施形態において、評価は患者の反応についてのマーカーの評価である。ある実施形態において、この方法は免疫組織染色法、ウエスタンブロット法、細胞ウエスタンブロット、免疫蛍光染色、ＥＬＩＳＡ、および蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）、またはここに記載されている、或は当該仔術で公知の任意の他の方法の１つ以上を用いる測定を含む。
その方法は、腫瘍の検体（例えば、生検、またはがん組織、または体液）に抗体を接触させて組織または体液に特異的なエピトープを同定することを含み得、そしてそれがんの状況の指標になる。
【００７４】
一般的に、直接法と間接法という二つの方法を用いて体液或は組織における抗原上のエピトープを検出する。直接法は一段階の染色を含み、体液または組織試料中の抗原に直接反応する標識抗体（例えば、ＦＩＴＣをコンジュゲートした抗血清）が関与し得る。間接法は体液または組織抗原反応する非標識の一次抗体および一次抗体と反応する標識二次抗体を含む。標識は放射性標識、蛍光標識、ハプテン標識、例えばビオチン、または酵素、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼを含み得る。これらのアッセイを実施する方法は当該技術分野で広く知られている。例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．  （Ａｎｔｉｂｏｄｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  ＮＹ  １９９８），  Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．  （  Ｕｓｉｎｇ
Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  ＮＹ  １９９９），  Ｖｉｒｅｌｌａ  （Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｉｎｆｏｒｍａ  ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ２００７），  およびＤｉａｍａｎｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９６）を参照。  これらのアッセイをするキットは、例えばクロンテックラボラトリーズ社（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，  ＣＡ）から市販されている。
【００７５】
さまざまな実施形態において、抗体は、抗体全体、および／または任意の抗原結合フラグメント（例えば、抗原結合部分）、および／またはこれらの一本鎖（例えば、ジスルフィド結合で相互に接続された少なくとも２本の重（Ｈ）鎖と２本の軽（Ｌ）鎖を含む抗体、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価フラグメントであるＦａｂフラグメント；ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結した２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントであるＦ（ａｂ）２フラグメント；ＶＨおよびＣＨ１ドメインでできているＦｄフラグメント；抗体のシングルアームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメントなど）。様々な実施形態において、ポリクローナルとモノクローナル抗体は、ヒトまたはヒト化抗体、またはその機能的なフラグメントが単離されるので、有用である。
【００７６】
様々な種の標的に向けた抗体の結合能を評価する標準的なアッセイは、例えばＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、ＲＩＡを含め当該技術で公知である。抗体の結合キネティクス（例えば、結合親和性）は、ビアコア解析等による当該技術分野で公知の標準的アッセイによって評価することができる。
【００７７】
別の実施形態において、測定は、核酸の存在、非存在、またはレベルを評価することを含む。当業者であれば適切なマーカーのＤＮＡ／ＲＮＡレベルを検出或は定量するのに使用できる幾多の方法を理解する。
【００７８】
遺伝子の発現は、例えば、低から中プレックスの技術、この例に限らないが、リポータージーンアッセイ、ノーザンブロット、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）および逆転写ＰＣＴ（ＲＴ−ＰＣＲ）を含めた、技術を用いて測定することができる。遺伝子の発現も、例えば高プレックス技術、この例に限らないが、遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）、ＤＮＡマイクロアレイ、タイリングアレイ、ＲＮＡシークエンス／全トランスクリプトームショットガンシークエンシング（ＷＴＳＳ）、ハイスループットシークエンシング、マルチプレックスＰＣＲ、マルチプレックスライゲーション依存性プローブ増幅（ＭＬＰＡ）、ライゲーションによるＤＮＡシークエンシング、およびルミネックス／ＸＭＡＰ。バイオマーカーに使われるＲＮＡの発現レベルを検出或は測定、マイクロアレー、ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＰＣＲを含む）ヌクレアーゼプロテクションアッセイ、ノーザンブロットを含む技術を用いて測定することができる。
典型的ながんと患者
【００７９】
ある実施形態において、この発明は、がん処置を決定するための方法を提供し、かつ、患者の腫瘍またはがん細胞の検体を含む。がん或は腫瘍は制御不能な細胞増殖、および／または細胞生存の異常な上昇、および／または体の器官やシステムの正常な機能を損なうアポトーシスの阻害を指す。がんまたは腫瘍を有する被験体は客観的に測定できるレベルのがん細胞が被験体の体内に存在する被験体である。この発明には良性および悪性のがん、ならびに休止状態の腫瘍または微細転移も含まれる。がんが原発巣から移動して重要な臓器に播種すると影響を受けた臓器の機能悪化によって最終的には被験体に死をもたらす。
【００８０】
様々な実施形態において、この発明は転移前のがんでも転移がんにも適応できる。転移はがんがその原発巣から体の他の場所に広がる事である。がん細胞は原発腫瘍から遊離しリンパ管や血管に浸潤し、血流によって循環し、身体の他の場所の正常組織の遠隔巣で成長する（転移する）。転移は局所或は遠位に起きる。転移は、、原発腫瘍から腫瘍細胞が偶発的に遊離する事、続いて血流よって移動して、遠隔部位で留まる  連続的過程である。その新しい場所で細胞が血液供給を確立し、成長して生命を脅かす固まりを作るようになる。腫瘍細胞内の刺激的および阻害的分子経路が転移の過程を制御している、また、腫瘍細胞と遠隔部位の宿主細胞の間の相互作用も重要である。転移の検出には多くの場合、特有の症状のモニタリングの他、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）のスキャン、コンピュタートモグラフィー（ＣＴ）のスキャン、血液血小板数、肝機能検査、胸部Ｘ線検査、骨スキャンの単独または組み合わせを用いて行われる。
【００８１】
ここで記載した方法は、がんの予後、がんの診断、がんの処置、および／または、細胞生存の増加またはアポトーシスの阻害と関連する悪性腫瘍および増殖性障害の診断、予後、処置、予防、または、成長、進行および／もしくは転移の改善に向けられる。ある実施形態において、がんは血液のがんであり、それには、この例に留まらないが例えば急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、多発性骨髄腫、濾胞性リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病、および非ホジキンリンパ腫（例えば限定されないがマントル細胞リンパ腫、およびびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫が含まれる）が含まれる。ある実施形態において、がんは固形腫瘍であり、例えばこの例に留まらないが、非小細胞肺癌、卵巣がん、および悪性黒色腫が含まれる。
【００８２】
ある実施形態において、この発明は以下に示すがんの１つ以上に関係する：急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連がん、肛門がん、虫垂がん、星状細胞腫（例えば、小児の小脳または大脳）、基底細胞癌、胆管がん、膀胱がん、骨腫瘍（例えば、骨肉腫、悪性線維性組織球腫）脳幹部グリア腫、脳がん、脳腫瘍（例えば、小脳アストロサイトーマ、大脳アストロサイトーマ／悪性グリア腫、上衣腫、髄芽腫、テント上未分化型神経外胚葉性腫瘍、
視路及び視床下部グリオーマ）、乳がん、気管支腺腫／カルチノイド、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、中枢神経系リンパ腫、小脳アストロサイトーマ、子宮頸がん、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、
慢性骨髄増殖性疾患、結腸がん、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、
子宮体がん、上衣腫、食道がん、ユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管がん、眼球腫瘍、胆嚢がん、胃（胃）がん、胃腸系間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、杯腫瘍（例えば、頭蓋外、性腺外、卵巣）妊娠性トロフォブラスト腫瘍、グリア腫瘍（例えば、脳幹部、大脳星状細胞腫、視路および視床下部）、胃カルチノイド、頭頸部腫瘍、心臓がん、肝細胞（肝臓）がん、下咽頭がん、視床下部と視路グリア腫瘍、眼内黒色腫、膵島細胞癌（内分泌膵臓）、腎臓がん（腎細胞がん）、喉頭がん、白血病（例えば、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、有毛細胞）、口唇および口腔がん、脂肪肉腫、肝がん、肺がん(例えば、非小細胞肺がん、小
細胞肺がん)、リンパ腫（例えば、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、バーキットリンパ腫、皮膚Ｔ
細胞ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、中枢神経系原発リンパ腫）、髄芽腫、黒色腫、メルケル細胞癌、中皮腫、転移性頸部扁平上皮がん、口腔がん、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性疾患、骨髄性白血病、骨髄性白血病、骨髄性白血病、骨髄増殖性疾患、慢性鼻腔及び副鼻腔がん、鼻咽頭癌、神経芽腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺がん、口腔がん、口腔咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、膵臓がん、副鼻腔及び鼻腔がん、副甲状腺がん、陰茎がん、喉頭がん、褐色細胞腫、松果体星状細胞腫、および／または胚細胞腫、松果体芽細胞腫およびテント上未分化型神経外胚葉性腫瘍、脳下垂体腺腫、プラスマ細胞腫瘍／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、中枢神経系原発リンパ腫、前立腺がん、腎がん、腎細胞癌（腎臓がん）、腎盂及び尿管がん、網膜芽腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫（例えば、ユーイングファミリー、カポジ、軟部組織、子宮）、セザリー症候群、皮膚がん（例えば、非黒色腫、黒色腫、メルケル細胞）、小細胞肺がん、小腸がん、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、頸部扁平上皮がん、胃がん、テント上未分化型神経外胚葉性腫瘍、Ｔ細胞性リンパ腫、睾丸がん、咽喉がん、胸腺腫及び胸腺癌、甲状腺がん、栄養膜腫瘍、尿管及び腎盂がん、尿道がん、子宮がん、子宮肉腫、膣がん、視路及び視床下部グリア腫瘍、外陰がん、ワルデンストロームマクログロブリン血症、およびウイルムス腫瘍。
【００８３】
一つの実施形態において、がんは急性骨髄性白血病である。  急性骨髄性白血病は２番目に多い一般的な白血病であり、アメリカ合衆国では年間に約１万３千人の新規に診断された症例と死者は９千人である。承認済み治療が有るが、多くの白血病患者において予後は悪く良好な処置経過を来すものは少ない。現在行われているＡＭＬに対する標準的な治療はシトシンアラビノシド（ａｒａ−Ｃ）にアントラサイクリン剤（例えばダウノルビシン、イダルビシンまたはミトキサントロンなど）を組み合わせたものである。この治療レジメでは普通高用量のシタラビンおよび／または幹細胞移植がその後に行われる。これらの処置は若い患者に良好な治療結果をもたらした。急性前骨髄球性白血病の処置においても進歩が見られ、オールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）または三酸化ヒ素を用いる標的化治療で非常に良い生存率がえられた。しかし、ＡＭＬ症例のほとんどを代表する６０歳以上の患者集団では治療が不可解なままである。６５−８５％の患者は最初に既存の処置に反応するが、その応答者の６５％は再発を経験し、多くの患者は病気に倒れる。少なくともこれらの理由及び前述の処置は非常に強い副作用を伴い得る事から、治療反応を予測できるテストは、これらの訴訟を緩和する処置の使用を手引きする事が出来る。ある実施形態では、本発明は、我々の発明が患者と処置の適合性を合わせる事で成功する処置の可能性を改善する。さらに、現在急性骨髄性白血病の患者の処置に対する反応性を推測する試験はない。
【００８４】
本明細書で使用される用語被験体は、特別に定義されない限り、哺乳動物、例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、犬、猫、馬、牛、ヤギ、豚、または非ヒト霊長類、例えば猿、チンパンジー、またはバブーンである。用語「被験体」および「患者」は交換可能に使用される。
典型的な検体
【００８５】
ある実施形態において、この発明は腫瘍検体（生検または外科検体の試料を含む）の測定を含む。ある実施形態において、検体は凍結腫瘍組織検体、培養細胞、循環腫瘍細胞、およびホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍組織検体（例えば、抗体ベースのＢＨ３プロファイリング）から選択される。ある実施形態において、生検はヒト生検である。様々な実施形態において、生検材料は凍結腫瘍組織検体、培養細胞、循環腫瘍細胞、およびホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍組織検体（例えば、抗体ベースのＢＨ３  プロファイリング）である。
【００８６】
ある実施形態において、腫瘍検体は生検試料、例えば、凍結腫瘍組織（凍結切片）検体である。当技術分野で公知のように凍結切片には低温槽（冷凍器内にミクロトームを含む）を使用することができる。外科検体は金属の組織ディスク上に置き、次にチャック（ｃｈｕｃｋ）内に固定して約-２０℃〜約-３０℃まで急速凍結する。検体は例えばポリエチレングリコールおよびポリビニルアルコールからなるゲル様の媒体に包埋する。凍結組織はクライオスタットのミクロトーム部分で凍結切断し、切片を必要に応じてガラススライドに載せた後染色する。
【００８７】
ある実施形態において、腫瘍検体は生検試料、例えば、培養細胞である。これらの細胞は当該技術分野で公知である通常の細胞培養の技術を用いて処理され得る。これらの細胞は循環腫瘍細胞でありうる。
【００８８】
ある実施形態において、腫瘍検体は生検試料、例えばホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）の腫瘍組織検体であり得る。当該技術分野で公知のように、生検検体はホルマリン（水およびホルムアルデヒドの混合物）或は他の流体を含む容器に入れ、それを保存することができる。組織試料は熱せられたパラフィンろうを含む型に入れることができる。このろうが冷やされると組織を保護する固体ブロックが形成される。包埋組織を含むパラフィンろうはミクロトームの上に置かれ、非常に薄い組織切片が作製される。
【００８９】
特定の実施形態において、組織検体（または生検）は１００ミリグラム未満の組織を含有し、または、特定の実施形態において、約５０ミリグラム以下の組織を含有する。腫瘍検体（または生検）は約２０ミリグラムから５０ミリグラムの組織、例えば約３５ミリグラムの組織を含有し得る。
【００９０】
組織は例えば一つ以上の（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ）針生検（例えば、１４ゲージの針或は他の適当なサイズの針を用いて）として得ることができる。ある実施形態において、生検はカッティングチップを有する長い針をコア針生検の間に使用して、疑わしい領域から柱状の組織を取り出す、コア針生検である。ある実施形態において、生検は、吸引デバイスが、針を介して抜き取られる流体および細胞の量を増加させる、真空支援生検である。ある実施形態において、生検は、針生検を画像化手順、例えば、Ｘ線、コンピューター断層撮影（ＣＴ）、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）または超音波などと組み合わせた画像誘導生検である。他の実施形態において、マンモトーム（登録商標）生検システムのようなデバイス（乳房生検のための、レーザー誘導、真空支援の生検システムである）を介して得ることができる。
【００９１】
特定の実施形態において、検体はヒト腫瘍由来の細胞株である。特定の実施形態において、検体はがん幹細胞である。他の実施形態において、検体は固形腫瘍の生検、例として、結腸直腸原発腫瘍、乳腺原発腫瘍、前立腺原発腫瘍、肺原発腫瘍、膵臓原発腫瘍、腎臓原発腫瘍、または卵巣原発腫瘍などに由来する。
【００９２】
特定の実施形態において、検体は上皮由来である。ある実施形態において、上皮検体は、固体マトリックスまたはビーズに結合させた抗上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）または他の上皮細胞結合抗体を用いて生検試料からの選択によって濃縮する。
【００９３】
特定の実施形態において、検体は、間葉起源の検体である。特定の実施形態において、間葉の検体は、神経細胞接着分子（Ｎ−ＣＡＭ）またはニューロピリン、または他の間葉細胞結合抗体を用いて生検試料からの選択によって濃縮される。
【００９４】
特定の実施形態において、検体は、非固形腫瘍の生検、例えば本明細書に記載したがんのいずれかなどに由来する。具体的な実施形態において、検体が多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、急性リンパ球性白血病、慢性リンパ性白血病、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、および非ホジキンリンパ腫を有する患者の生検に由来する。具体的な実施形態において、検体は、固体マトリックスまたはビーズに結合させた抗ＣＤ１３８抗体ビーズを用いて生検試料からの選択により濃縮される多発性骨髄腫細胞である。具体的な実施形態において、検体は、の試料をＣＤ４５に向けた抗体に結合させることによって濃縮する急性骨髄性白血病細胞である。具体的な実施形態において、検体は、非Ｂ細胞の除去のより濃縮される慢性リンパ性白血病または、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫である。
【００９５】
ある実施形態において、検体は循環腫瘍細胞に由来する。
ＢＨ３プロファイリング
【００９６】
様々な実施形態において、この発明はＢＨ３プロファイリングを含む。様々な実施形態において、本発明は、少なくとも２種、または３種、または４種、または５種、または６種、または７種、または８種、または９種、または１０種のＢＨ３ペプチドを一度に評価する、ＢＨ３プロファイリングを含む。ある実施形態において、本発明の方法は、単一のＢＨ３ペプチドの評価とは対照的に、マルチペプチド解析を含む。ある実施形態において、ＢＨ３  ペプチドのパネルを単一患者検体に対してスクリーニングする。
【００９７】
ある実施形態において、ＢＨ３プロファイリングはペプチドの使用を含み、ここで、該ペプチドは、ＢＩＭ、ＢＩＭ２Ａ、ＢＡＤ、ＢＩＤ、ＨＲＫ、ＰＵＭＡ、ＮＯＸＡ、ＢＭＦ、ＢＩＫ、およびＰＵＭＡ２Ａのうちの１つ以上である。ある実施形態において、ＢＨ３プロファイリングは、ＢＩＭ、ＢＩＭ２Ａ、ＢＡＤ、ＢＩＤ、ＨＲＫ、ＰＵＭＡ、ＮＯＸＡ、ＢＭＦ、ＢＩＫ、およびＰＵＭＡ２Ａの１つ以上に対する抗体、ならびに２つのＢｃｌ−２タンパク質、例えば、第１のＢｃｌ−２タンパク質（例えば、Ｂｉｍ、Ｂｉｄ、Ｂａｄ、Ｐｕｍａ、Ｎｏｘａ、Ｂａｋ、Ｈｒｋ、ＢａｘまたはＭｕｌｅ）および第２のＢｃｌ−２タンパク質（例えば、Ｍｃｌ−１、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｂｆｌ−１、またはＢｃｌ−ｗ）の間に形成される天然に存在するヘテロダイマーの使用を含み、これは米国特許第８１６８７５５号に記載されているとおりであり、該特許の全内容が、ここに参考文献として援用される。ある実施形態において、ＢＨ３プロファイリングは張り合わせペプチド  （ＳＴＡＰＬＥＤ  ＰＥＰＴＩＤＥ）（例えば、タンパク質をより強固にし細胞に浸透できるようにするための、３Ｄアルファヘリックスタンパク質部分を、炭化水素結合を用いて合成的強化することにより生成したペプチド）（たとえば、ベルジン等執筆「細胞内薬剤標的の為の張り合わせペプチド」ＭＥＴＨＯＤ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＯＧＹ，  ＶＯＬＵＭＥ  ５０３  （Ｃｈａｐ．１），（その内容は全てが参考文献によりここに援用される））の使用を含む。
【００９８】
１つの実施形態において、ペプチドは約０．１〜２００μＭの濃度で使用する。ある実施形態において、約０．１〜約１５０、または約０．１〜約１００、または約０．１〜約５０、または約０．１〜約１０、または約０．１〜約５、約１〜約１５０、または約１〜約１００、約１〜約５０、約１〜約１０、約１〜約５μＭ、または約１０〜約１００μＭのペプチドが使用される。ある実施形態において、約０．１、または約０．５、または約１．０、または約５、または約１０、または約５０、または約１００、または約１５０、または約２００μＭのペプチドの濃度を使用する。１つの実施形態において、ＢＨ３プロファイリングは検体を透過処理することを含む。
【００９９】
ＢＨ３プロファイリングとかかる方法に有用な試薬については米国特許第７８６８１３３号、同第８２２１９６６号、および同第８１６８７５５号、ならびに米国特許公開第２１１／０１３０３０９号（その内容が、全体としてここに参考文献として援用される）に記載される。
【０１００】
簡潔には、理論に拘束されるものではないが、異常な表現型の結果として、がん細胞は、アポトーシス経路におけるブロックを発達させる。これらのブロックにより、がん細胞をある種の療法に対して耐性にし、かつ、驚いた事に、他の療法に対して一部のがん細胞を感受性にする。「癌遺伝子中毒」という概念は、がん細胞が生存のためにある種のタンパク質に対する依存性、または、それへの嗜好をを獲得する現象を記載する。ＢＨ３プロファイリングは、所与のがん細胞に特定のアポトーシス制御タンパク質へのかかる依存性が生じるかを決定し、そしてその依存性タンパク質を同定する。がん細胞は、何時もそうである訳ではないが、アポトーシスを受けるようにあらかじめ設定されている可能性があり、また、これは、これらの細胞が、別段の偶然の生存のため、抗アポトーシスのＢｃｌ−２ファミリータンパク質のいずれかまたは全てに依存性であるという機能である。この事でがん細胞が処置に対して反応の可能性の予測を提供する。
【０１０１】
がん細胞は、理論に拘束されるものではないが、ＤＮＡ損傷、遺伝的不安定性、増殖因子異常シグナル伝達、および異常か欠損したマトリックスの相互作用（これらのいずれかは、典型的には内因性（ミトコンドリア性）のアポトーシス経路を介してアポトーシスを誘導するはずである）などの異常を示す。しかしこれらのアポトーシスシグナルに反応するよりはむしろ、がん細胞は生存する。そうすることで、しばしば、これらの細胞は慢性的なアポトーシスシグナルに対する選択的ブロックに高度に依存するようになる。この適応はがん細胞に生存の仕組みを与えるが、しかし、このような適応は特定のアポトーシス誘導治療法に対してがん細胞を感受性にもし得る。細胞を内因性アポトーシスによる死へ付す極めて重要な事象は、ミトコンドリア外膜の透過性（ＭＯＭＰ）およびエフェクターであるカスパーゼを活性化する分子の放出である。多くの例で、ＭＯＭＰは内因性アポトーシス経路における戻りのない小領域である。Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質はＭＯＭＰの重要な制御分子であり、それらの活性は、リンパ系のがんや幾つかの固形腫瘍のがんと関連しており、多くのがんでは、化学治療に対する耐性を司る重要な媒介物質であると考えられている。
【０１０２】
Ｂｃｌ−２タンパク質は生存促進（抗アポトーシス）メンバーおよびアポトーシス促進メンバーの間の識別可能なタンパク質-タンパク質相互作用によって制御されている。こ
れらの相互作用は、主にＢＨ３（Ｂｃｌ−２ホモロジードメイン−３）媒介性結合を介して起こる。アポトーシス開始のシグナル伝達は大部分の場合はミトコンドリアの上流で起こり、短いＢＨ３のみを有するＢｃｌ−２ファミリーメンバーがミトコンドリアに移動して、そこでＭＯＭＰを活性化する、またはそれを感受性にする。活性型ＢＨ３のみを有するタンパク質、Ｂｉｍ、およびＢｉｄはエフェクターであるアポトーシス促進タンパク質、ＢａｘおよびＢａｋと結合し直接活性化する、そして又抗アポトーシスＢｃｌ−２ファミリータンパク質、Ｂｃｌ−２、Ｍｃｌ−１  Ｂｆｌ−１、Ｂｃｌ−ｗ、およびＢｃｌ−ｘＬに結合してそれをを阻害する。感受性増強型ＢＨ３タンパク質であるＢａｄ、Ｂｉｋ、  Ｎｏｘａ、  Ｈｒｋ、Ｂｍｆ、およびＰｕｍａは抗アポトーシス型のＢｃｌ−２ファミリータンパク質、Ｂｃｌ−２、  Ｍｃｌ−１  Ｂｆｌ−１、  Ｂｃｌ−ｗ、およびＢｃｌ−ｘＬ、とだけ結合し、それらの抗アポトーシス機能をブロックする。  理論に拘束されるものではないが、各感受性増強型タンパク質はユニークな特異性プロファイルを持つ。例えばＮｏｘａ（ＡおよびＢ）はＭｃｌ−１と高い親和性をもって結合し、ＢａｄはＢｃｌ−ｘＬとＢｃｌ−２とは結合するがＭｃｌ−１とは非常に弱くしか結合せず、Ｐｕｍａはこれら３つの標的全てに良く結合する。これらのタンパク質の抗アポトーシス機能は活性型ＢＨ３タンパク質ＢｉｍおよびＢｉｄの分離である。これらの活性型ＢＨ３タンパク質を感受性増強型のペプチドによって置き換えるとＢａｘ／Ｂａｋ媒介性のアポトーシスの決定がもたらされる。これらの相互作用は様々な結果を有し得、例えばこの例に限らないが、恒常性、細胞死、アポトーシスに対する感受性の増加、およびアポトーシスの妨害が挙げられる。
【０１０３】
アポトーシスのシグナル伝達がブロックされるがん細胞の性状を定義すると、ミトコンドリア表面でＢＨ３のみを有する活性型タンパク質の蓄積であり、抗アポトーシスタンパク質によってこれらのタンパク質は分離される結果となる。それらのエフェクター標的にたいする蓄積と近接は、「ＢＨ３を活性化した」状況においてＢｃｌ−２ファミリータンパク質のアンタゴニスト作用に対して感受性を増加する原因となる。
【０１０４】
ある実施形態において、細胞がＮｏｘａ（ＡまたはＢ）に対する高いアポトーシスの反応を持つ場合はＭｃｌ−１が活性化されており、一方Ｂａｄペプチドに対する高い反応はＢｃｌ−ｘＬまたはＢｃｌ−２がアポトーシスブロックをする事を示唆する。ある実施形態において、Ｐｕｍａは全Ｂｃｌ−２ファミリープライミングを反映する。このように、Ｍｃｌ−１又はＢｃｌ−ｘＬのいずれかに、その両方のタンパク質に、或は数種のＢｃｌ−２ファミリーメンバーに依存している細胞は容易に区別でき、それで適切な処置が結果的に適合するようにし得る。ミトコンドリアのこれらのペプチドに対する反応の違いは、Ｍｃｌ−１またはＢｃｌ−ｘＬによって影響された内因性シグナル伝達経路に送り込む経路を介して働くと知られている所の治療の使用を手引きする。Ｂｃｌ−２阻害或はＭｃｌ−１阻害化合物の使用はこのような場合に示され得る。  ある実施形態において、本発明のこの方法はまたＭｃｌ−１又はＢｃｌ−ｘＬの上流の実体を標的とするような治療を示すか又は禁忌とする。
【０１０５】
ＢＨ３プロファイリングアッセイはがん細胞がプライミングの状態にある、ならびにプライミングが起こっている構造にあるときを識別し、これは予測値を有する。
典型的な臨床因子と追加的バイオマーカー
【０１０６】
ある実施形態において、この発明は臨床因子の評価を含む。ある実施形態において、この発明は、ＢＨ３プロファイリングおよび／または患者の反応を評価するための臨床因子の評価を含む。ある実施形態において、ＢＨ３プロファイリング研究と患者の反応に関する情報を提供する臨床因子との組み合わせはアポトーシスに関連しないかもしれない。ある実施形態において、臨床因子はアポトーシス以外に影響を与える。
【０１０７】
一つの実施形態において、臨床因子は表３に示される。
【０１０８】
一つの実施形態において、臨床因子は年齢、細胞遺伝学的状態、パフォーマンス、組織学的サブクラス、性別、および病期のうちの１つ以上である。
【０１０９】
一つの実施形態において臨床因子は年齢である。一つの実施形態において患者の年齢プロファイルは約１０歳以上、または約２０歳以上、または約３０歳以上、または約４０歳以上、または約５０歳以上、または約６０歳以上，または約７０歳以上，または約８０歳以上で分類される。
【０１１０】
一つの実施形態において臨床因子は細胞遺伝学的状態である。ある種のがん、例えばウイルムス腫瘍と網膜芽細胞腫では、例えば、遺伝子欠失、または遺伝子不活性化は、がんの進行が始まる事に重要である、つまり腫瘍抑制に関連している染色体領域には普通欠失或は変異があるからである。例えば、欠失、逆位、および転位はグリア腫瘍、非小細胞肺がん、白血病、および黒色腫において普通染色体９ｐ２１領域で検出される。理論に拘束されるものではないが，これらの染色体変化は腫瘍サプレッサーのサイクリン依存性キナーゼ阻害２Ａを不活性化する。特定の遺伝子におけるこれらの欠失とともに、大きな染色体領域の欠損が認められることもある。例えば、染色体１ｐおよび１６ｑは固形腫瘍細胞において一般に失われている。遺伝子重複や遺伝子コピー数の増加もがんに寄与し得、また転写解析或はコピー数変動アレイで検出できる。例えば，染色体領域１２ｑ１３−ｑ１４は多くの肉腫において増幅されている。この染色体領域はｐ５３と呼ばれる腫瘍サプレッサーに結合することが公知のＭＤＭ２と呼ばれる結合タンパク質をコードする。ＭＤＭ２が増幅されるとＰ５３による細胞増殖の制御を抑制する事で腫瘍が形成され得る。さらに、ある腫の乳がんはヒト表皮増殖因子受容体２の過発現およびヒト表皮増殖因子受容体２をコードするＥＲＢＢ２遺伝子のコピー数の増加と関連している。そのほか、染色体数の増加、例えば染色体１ｑおよび３ｑはまたがんの危険性の増加と関係している。
【０１１１】
細胞遺伝学的状態は当該技術分野で公知の様々な方法で測定することができる。例えば、ＦＩＳＨ、典型的な核型分析および仮想核型分析（例えば、比較ゲノムハイブリダイゼーションアレイ（ＣＧＨ）と一塩基多型アレイ）が用いられ得る。例えば，ＦＩＳＨは特定の遺伝子座における染色体再構成を調べるのに使われ得、またこれらの現象は疾患のリスク状態に関連している。ある実施形態において、細胞遺伝学的状態は好ましい、好ましくない、どちらとも言えないである。
【０１１２】
一つの実施形態において臨床因子はパフォーマンスである。パフォーマンスステータスは色々なシステムを用いて定量でき、患者のパフォーマンスステータスをスコア化するための方法は当該技術分野で公知である。この測定はしばしば患者が化学療法を受けることができるのかどうか、用量調節の調節，また緩和ケアの強度について決定するために使用される。色々な点数化の方法があり、それらとしては、カルノフスキースコアとズブロッドスコアが挙げられる。パラレルスコアリングシステムは全身機能の全体的評価（ＧＡＦ）スコア（これは精神科においては診断と統計学的指針（ＤＳＭ）の５番目の軸として組み込まれている）が挙げられる。高度パフォーマンスステータス（例えば、カルノフスキースコアを用いて少なくとも８０又は少なくとも７０％）は、疾患状態の進行を防止するための、および、化学療法および／または放射線処置を受ける患者の能力を増強するための処置を示し得る。例えば、これらの実施形態において、患者は外来であり自己管理できる。他の実施形態において、評価が、患者が低いパフォーマンスステータス（例えば、カルノフスキースコアリングシステムを用いて５０％未満、３０％未満、または２０％未満）であることを示し、従来の放射線療法および／または化学療法に耐性を可能にすべき事を示す。これらの実施形態において、患者はほとんど寝たきりか車いす生活で自己管理できない。
【０１１３】
カルノフスキースコアは１００から０に及び、１００が「完全な」健康で０は死である。スコアは１０の間隔で付けられ得る、つまり１００％は正常、合併症が無く、病気の徴候が無い。９０％は正常の活動が可能だが幾つか病気の症状または徴候がある。８０％は正常な活動であるが幾つかの困難を伴い幾つかの症状または徴候がある。７０％は、自己管理は出来るが正常の活動や仕事ができない。６０％は介助が少し必要であり大多数の個人的要件は自己管理できる。５０％は介助がしばしば必要であり頻繁な医療介護が必要である。４０％は障害を持ち、特別な介護が必要である。３０％は高度の障害を持ち入院が示唆されるが死の危険性は無い。２０％は非常に病状が悪化した状態で緊急の入院が必要で支持処置（ｓｕｐｐｏｒｔｉｖｅ  ｍｅａｓｕｒｅ）または処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）が必要である。１０％は瀕死の急激に進行する致死的疾患過程である。
【０１１４】
パフォーマンスステータスについてのズブロッドスコアリングシステムは以下を包含する：０  完全に活動的、  制限なしにすべての前病パフォーマンスを実行できる。１身体的に激しい活動に制限があるが歩行可能で軽い或は座って行う性質の仕事、例えば、軽度の家での仕事、オフィスワークが出来る。２、歩行可能ですべての自己管理が出来るが覚醒時間の約５０％以上であらゆる仕事活動ができない。３、限定された自己管理しか可能でなく、覚醒時間の５０％超をベッド或はイスで過ごす。４、完全に障害のある状態で、自己管理が全く出来ず、寝たきり又は何時も座っている。５、死。
【０１１５】
一つの実施形態において臨床因子は組織学的サブクラスである。ある実施形態において、腫瘍の組織試料はＥｌｓｔｏｎ＆Ｅｌｌｉｓ，  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １９９１，  １９：４０３−１０（その内容はその全体として本明細書に参考として組み込まれる）に従ってグレード付けする。
【０１１６】
一つの実施形態において臨床因子は性別である。一つの実施形態において、性別は男性である。他の実施形態において性別は女性である。
【０１１７】
一つの実施形態において臨床因子は病期である。非限定的例として、ステージグループ分けを使用すると、ステージＩ  がんは体内の一カ所に局在している。ステージＩＩとＩＩＩ  がんは局所的に進行している。がんがステージＩＩとしてまたはステージＩＩＩとして指定されるかは、がんの特定の種類に依存する。一つの非限定的な例として、ホジキン病ではステージＩＩは横隔膜の上か下の一側のみのリンパ節が影響を受け、一方、ステージＩＩＩは上および下のリンパ節が影響を受けたことを示す。ステージＩＩおよびＩＩＩについての特別の診断基準は、それゆえ診断によって異なる。ステージＩＶ  がんは多くの場合転移が認められ、他の臓器へのまたは全身へ拡散している。
【０１１８】
ある実施形態において臨床因子は血液病に対するフランス−米国−英国（ＦＡＢ）分類システム（例えば、骨髄発生不全の存在ならびに骨髄芽球および赤血芽球の定量を示す）である。一つの実施形態において、急性リンパ芽球性白血病の為のＦＡＢはＬ１−Ｌ３であるか、又は急性骨髄性白血病についてはＭ０−Ｍ７である。
【０１１９】
別の実施形態においてこの方法は変異状態、一塩基多型、定常状態のタンパク質レベル、および動的タンパク質レベルから選択される追加的なバイオマーカーの測定をさらに含む。別の実施形態において、この方法は患者の臨床的反応を予測することをさらに含む。別の実施形態において、臨床反応は約１、約２、約３、または約５年に渡る進行／発症が無い状態での生存である。
【０１２０】
各種の臨床因子、例えば年齢プロファイルおよびパフォーマンスステータスが同定されている。いくつかの診断の統計学的な測定法も使用されており、それらとしては、例えば細胞遺伝学および分子事象（これらの例に限らないが、遺伝子ＭＬＬ、ＡＭＬ／ＥＴＯ、Ｆｌｔ３−ＩＴＤ、ＮＰＭ１（ＮＰＭｃ＋）、ＣＥＢＰａ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＲＵＮＸ１、ｒａｓ、およびＷＴ１の変異、およびエピジェネティク修飾遺伝子ＴＥＴ２およびＡＳＸＬにおける変異、ならびに細胞シグナリングタンパク質プロファイルが挙げられる）が挙げられる。
【０１２１】
ある実施形態において本明細書に記載された方法により手引きされるとおり、本予防的手法は、がんによって苦しめられている可能性のある患者に対し処置をほどこすことを含む。ある実施形態において、被験体ががんに対してハイリスク、がんの遺伝的素因（例えば遺伝の危険因子）、がんの既往歴（例えば、新規がんおよび／または再発）、がんの家族歴、がん誘発剤に対する暴露（例えば、環境物質）および薬理遺伝学的情報（遺伝型の薬物動態、薬力学に対する効果、または治療薬の効果プロファイル）のうちの１つ以上の特徴を示す場合、被験体はがんを罹患している可能性がある。
【０１２２】
ある実施形態において被験体はがんに対してハイリスクを特徴とする場合、被験体はがんに苦しめられる可能性がある。ある実施形態において被験体はもしがんに対する遺伝的素因の特徴を示すならば、がんに苦しめられる可能性がある。ある実施形態においてがんに対する遺伝的素因は、当該技術分野で公知なように、遺伝的臨床因子である。このような臨床因子は、例として、少なくとも結腸がん、子宮がん、小腸がん、胃がん、尿路がんについてのＨＮＰＣＣ、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＰＭＳ１、ＰＭＳ２を含み得る。ある実施形態において、被験体が以前のがんの発症によって特徴づけられる場合、被験体はがんによって苦しめられる可能性がある。ある実施形態において、被験体は１、または２、または３、または４、または５、または６回のがんの以前の発症に苦しめられていた。ある実施形態において被験体ががんの家族歴によって特徴づけられる場合、被験体ががんに苦しめられる可能性がある。ある実施形態において、および／または祖父母および／または同胞および／または叔母／叔父および／または大叔父／大叔母、および／または従兄弟従姉妹が今まで又は現在がんに苦しめられている。ある実施形態において、被験体はもしがん誘発物質（例えば、環境物質）に暴露されることを特徴とする場合、がんに苦しめられる可能性がある。例えば皮膚の強力な日光への暴露は皮膚癌の臨床因子である。例として、喫煙は肺、口、喉頭、膀胱、腎臓、およびいくつかの他の臓器のがんの臨床因子である。
【０１２３】
さらに、ある実施形態において次の臨床因子の任意の１つはここで述べる方法で有用であり得る：性別，遺伝的危険因子、家族歴、個人歴、人種、民族性、特定の組織の性質、様々な良性状態（例えば、非増殖性病変）；以前に受けた胸部Ｘ線、発癌物質への暴露など。
【０１２４】
さらに，ある実施形態において以下の臨床因子の任意の１つは本明細書に記載する方法において有用であり得る：細胞表面抗原マーカーＣＤ３３，細胞表面マーカーＣＤ３４，ＦＬＴ３変異状態、ｐ５３変異状態、ＭＥＫ１  キナーゼのリン酸化状態、およびＢｃｌ−２の７０位のセリンのリン酸化のうちの１つ以上。
【０１２５】
ある実施形態において臨床因子はサイトカインの発現レベルであり、これらの例に限らないがインターロイキン−６を含む。ある実施形態において、インターロイキン−６レベルは多発性骨髄腫の患者の反応の可能性に関連しており、それらとしては、患者の不良な予後または患者の良好な予後を含む。
【０１２６】
特定の実施形態において、反応の可能性はプライミングのパーセントで決定される。特定の実施形態においてプライミングは以下の数式で定義される。
【化２】
2018013498.tif 000004
式中、ＡＵＣは曲線下面積或はシグナル強度のいずれかを含む；ＤＭＳＯはベースラインの陰性対照を含む；ＣＣＣＰ（カルボニルシアニドｍ−クロロフェニルヒドラゾン）はミトコンドリアの電子伝達鎖における電子担体の正常な活性（ｎｏｒｍａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）の間に確立されたプロトン勾配の脱共役薬として働くことによるタンパク質合成エフェクターを含み、それはベースラインの陽性対照を含む。ある実施形態において、曲線下面積は均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）によって確立される。ある実施形態において、時間は約０から約３００分、から，約０から３０分の間のウインドウにわたって生じる。ある実施形態において曲線下面積は蛍光活性化細胞識別（ＦＡＣＳ）によって確立される。ある実施形態において、シグナル強度は約５分および約３００分の間で生じる単一時間点の測定値である。
【０１２７】
別の実施形態において本方法は、ＢＨ３プロファイリングアッセイおよび細胞表面マーカーＣＤ３３、細胞表面マーカーＣＤ３４、ＦＬＴ３変異状態、ｐ５３変異状態、ＭＥＫ１キナーゼのリン酸化状態，およびＢｃｌ−２の７０番目のセリンのリン酸化の１つ以上を測定すること、ならびにシタラビン又はシタラビン系の化学療法および／もしくはアザシチジンによる急性骨髄性白血病の患者の処置効果に相関させることを含む。
【０１２８】
別の実施形態において、本方法は、ＢＨ３プロファイリングアッセイおよび細胞表面マーカーＣＤ３３、細胞表面マーカーＣＤ３４、ＦＬＴ３変異状態、ｐ５３変異状態、ＭＥＫ１キナーゼのリン酸化状態，およびＢｃｌ−２の７０番目のセリンのリン酸化の１つ以上を測定すること、ならびに化学療法による多発性骨髄腫の患者処置の効果に相関させることを含む。
【０１２９】
さらに他の実施形態においてがんは急性骨髄性白血病および／または多発性骨髄腫であり、臨床因子は年齢プロファイルおよび／または細胞遺伝学的状態であるか、またはがんは急性骨髄性白血病および／または多発性骨髄腫であり、がん処置はシタラビンもしくはシタラビン系化学療法および／またはアザシチジンであるか、またはがん処置はシタラビンもしくはシタラビン系化学療法および／またはアザシチジンであり、臨床因子は年齢プロファイルおよび／または細胞遺伝学的状態であるか、または、がん処置はシタラビンもしくはシタラビン系化学療法および／またはアザシチジンであり、がんは急性骨髄性白血病および／または多発性骨髄腫であり、臨床因子は年齢プロファイルおよび／または細胞遺伝学的状態である。
【０１３０】
この発明はまた腫瘍またはがん細胞検体の評価を簡便化できるキットを提供する。本発明の典型的なキットは様々な試薬、例えばＢＨ３ペプチドを検出する１つ以上の剤を含む。キットはまた様々な検出方法で有用な試薬、例えば抗体などをふくむ、検出のための１つ以上の試薬を含み得る。そのキットはウエルのあるプレート、シリンジなどを含む、評価に必要な材料をさらに含み得る。そのキットはラベルまたは記載の試薬の使用方法が記載された印刷された説明書をさらに含み得る。そのキットは試験されるべき処置をさらに含み得る。
【０１３１】
用語の「約（ａｂｏｕｔ）」は参照される数の表示と関係して使用される場合、参照される数の表示にその参照される数の表示の最大１０％を加算または減算したものを意味する。例えば「約５０」という言語は４５から５５の範囲を網羅する。
【０１３２】
本明細書で使用される場合、用語「含む」およびその変形は、一覧における項目の言及が、本技術の材料、組成物、デバイス、および方法においてまた有用であり得る他の同様の項目の除外に対するものではないように、非限定的であることが意図される。同様に、用語「できる（ｃａｎ）」および「し得る（ｍａｙ）」、およびそれらの変形は、ある実施形態が特定の要素または特徴を含むことができるかまたは含み得るという記載が、これらの要素または特徴を含まない本技術の他の実施形態を除外しないように、非限定的であることが意図される。含む、含有する、または有するなどの用語と同語である、オープンエンド型の用語「含む」は、本発明、本発明の技術またはその実施形態を記載および特許請求するために本明細書で使用されるが、より限定的な用語（例えば、引用された成分「からなる」または「から本質的になる」）を用いて代替的に記載され得る。
【０１３３】
定義付けされない限り、すべての技術的、および科学的用語は、本明細書では、本発明が属する当業者によって一般的に理解される用語と同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の、任意の方法および材料は、この発明の実施或は試験で使用することができるが、好ましい方法および材料は本明細書に記載されている。ここで引用されたすべての出版物、特許および特許公開は、全ての目的のため、その全体が引用文献として本明細書に記載されている。
【０１３４】
この発明は次の非限定的実施例でさらに例示する。
【実施例】
【０１３５】
実施例１：治療開発での細胞ベースの研究
方法：試験細胞については、一ウェルあたり７．５×１０３細胞を、反応緩衝液（３００ｍＭトレハロース，  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  ｐＨ７．４，  ８０ｍＭ  ＫＣｌ，  １ｍＭ  ＥＧＴＡ，  １ｍＭ  ＥＤＴＡ，  ０．１％  ＢＳＡ，および５ｍＭ  コハク酸塩）に懸濁させた。細胞を、ジギトニンで透過処理し、陽イオン性色素ＪＣ−１及びβ−メルカプトエタノールで負荷した。次に、細胞を３８４ウェルプレートのウェルに等分し、ＢＨ３ドメインペプチド：Ｂｉｍ、Ｂｉｄ、Ｂａｄ、ＮｏｘａＡ、Ｂｉｍ２Ａ、Ｐｕｍａ、Ｂｍｆ、ＨｒｋおよびＢｉｋのうちの１つとともにインキュベートした。このアッセイに使用するペプチドは合成されたものでＨＰＬＣによって決定された場合９５％を超えて純粋であった。ペプチドの本質は質量分析で確認された。ＤＭＳＯビヒクルコントロールをネガティブコントロールとして含んだ。完全なミトコンドリア膜脱分極を、この細胞を１ｍＭ  ＦＣＣＰ（ｐ−トリフルオロメトキシカルボニルシアニドフェニルヒドラゾン）で処理することによって測定し、この試料をアッセイの標準およびポジティブコントロールとして役立てた。ペプチド（とＦＣＣＰ）を加えると、適切にプライムされた細胞において膜電位が下がり、これはＴｅｃａｎ  Ｇｅｎｉｏｓ  プレートリーダーで励起５４５ｎｍ  発光５９０ｎｍを用いＪＣ−１蛍光の減少で測定される。この過程のキネティクスはそれぞれのペプチドで違っており、またエンドポイントは、１８０分の時間経過にわたるキネティクストレースから達成し、記録した。それぞれのペプチドでの蛍光減少はＦＣＣＰ反応に対して正規化され、膜電位の損失パーセント（％ＤＹｍ）として記録した。各実験は、それぞれの細胞株について三連で実行した。
【０１３６】
サイクリン依存性キナーゼ阻害剤開発：治療阻害剤活性によってビンに入れられた細胞株とのＢＨ３プロファイリングの相関は、アポトーシス促進性ペプチド識別が、細胞周期に影響を及ぼす開発中の治療薬に対する応答を識別するために細胞株に対して利用されてきたことを示す。このような細胞株からの代表的ＢＨ３プロファイリングデータは図１に示され、この細胞株に対する細胞周期調節剤の治療効果は図２に示されている。固形腫瘍悪性疾患に由来する８つの接着細胞株のパネルの完全なＢＨ３プロファイルは、図３に示され、一方、非固形腫瘍に由来する浮遊細胞株で試験したすべてのペプチドについてのＢＨ３プロファイルは図４に示される。接着及び浮遊細胞株の両方でのサイクリン依存性キナーゼ阻害剤についての治療効果ならびに定量化したＢＨ３プロファイリング測定基準は表１にまとめている。特に低濃度ＢＩＭペプチドに対するパーセント反応は浮遊細胞株と接着細胞株両方において治療活性と相関する（図５，６）。ＮＯＸＡぺプチドおよびＰＵＭＡペプチドに対するパーセント反応は、特にＢＩＭと併用（ＮＯＸＡ＋ＢＩＭ接着細胞；ＰＵＭＡ＋ＢＩＭ浮遊細胞）した場合、識別に向かった傾向を有した。
【０１３７】
細胞周期調節剤は、細胞周期を乱し、それゆえ主として細胞増殖阻害剤として働くように固有に設計されている。他方、ＢＨ３プロファイリングは、アポトーシス促進性の指示を引き起こす細胞の傾向を測定するようにデザインされている。したがって、この実施例に記載されているデータは、とりわけ，アポトーシス促進性の指示と機構的に関連しない薬剤の治療効果を予想する為のこのＢＨ３プロファイリングアプローチの予期しない診断的使用を表している。
【０１３８】
ＢＨ３ミメティック（ＭＣＬ−１阻害剤開発）：治療阻害剤活性によってビンに入れられた細胞株とのＢＨ３プロファイリングの相関は、アポトーシス促進性ペプチドが浮遊細胞（図７）と接着細胞（図９）両方における効果（ｅｆｆｉｃａｃｙ）を識別することを示す。特に、低ＢＩＭ、ＰＵＭＡ、ＮＯＸＡ、ＢＡＤおよびＨＲＫペプチドに対するパーセント反応はすべて個々に浮遊細胞株における治療活性に相関している。浮遊細胞株における治療効果に相関する多元的マーカーアルゴリズムはＢＩＭ＋ＰＵＭＡ、ＢＩＭ＋ＮＯＸＡ、ＰＵＭＡ＋ＮＯＸＡ、ＢＩＭ＋ＰＵＭＡ＋ＮＯＸＡ、ＢＩＭ＋ＰＵＭＡ＋ＮＯＸＡ＋ＨＲＫおよびＢＩＭ＋ＰＵＭＡ＋ＮＯＸＡ＋ＨＲＫ＋ＢＡＤを含む（図８）。固形腫瘍由来の接着細胞株において、ＢＩＭ、ＰＵＭＡおよびＮＯＸＡはそれぞれ個々にＭＣＬ−１阻害剤効果と相関がある、一方相関性を示す多元マーカーアルゴリズムは、浮遊細胞株での相関性について上に述べたものと同一である（ＢＩＭ＋ＰＵＭＡ、ＢＩＭ＋ＮＯＸＡ、ＰＵＭＡ＋ＮＯＸＡ、ＢＩＭ＋ＰＵＭＡ＋ＮＯＸＡ、ＢＩＭ＋ＰＵＭＡ＋ＮＯＸＡ＋ＨＲＫおよびＢＩＭ＋ＰＵＭＡ＋ＮＯＸＡ＋ＨＲＫ＋ＢＡＤ）（図１０）。
【０１３９】
このデータは、とりわけ、多元的マーカーアプローチが治療効果を予想する上で個々のマーカーよりも情報を加えるであろうことを示す。この知見は、ＭＣＬ−１が、主に、Ｎｏｘａによって特異的に、そしてＰＵＭＡ（ＢＣＬ２およびＢＣＬ−ｘＬにも結合する）によって非特異的に調節されることを鑑みると予想されないものである。これらのアプローチのなかで多数のマーカーを含有する事によって付与される重み付けは、ＭＣＬ−１阻害剤個々より治療効果に相関している。治療効果とＢＨ３プロファイリングの個々のマーカーアルゴリズムおよび多元的マーカーアルゴリズムについてのデータは表２に提供される。
【０１４０】
キネシンスピンドルタンパク質（ＫＳＰ）阻害剤開発：ＫＳＰ阻害剤は８つの多発性骨髄腫／白血病由来のヒト細胞株に対する抗増殖アッセイでテストされた。ＢＨ３プロファイリングは同時にこれらの細胞株に対して行われた。データは、化合物の抗増殖特性とＢＨ３プロファイリング読み出し（個々にＰＵＭＡおよびＢＡＤに対する％プライミング）との間に強力な相関を与える（図１１）。
【０１４１】
ＫＳＰ阻害剤活性の相関性は、ＭＣＬ１タンパク質のレベルによって調節され得る。もしこれが単一機構であるならば、ＭＣＬ１の調節因子としてのＮｏｘａが効果の適切な予想因子になるであろうことを予想し得る。実際、ＰＵＭＡ（ＭＣＬ１、ＢＣＬ２およびＢＣＬｘｌの調節）とＢＡＤ（ＢＣＬ２およびＢＣＬｘｌのエフェクター）が独立してこれらの細胞株における治療効果を識別できるという予期しない結果が得られた。
【０１４２】
キネシンスピンドルタンパク質阻害剤は、微小管構造と相互作用し、それを再構築する事によって抗がん活性を調節する。このような作用機構は、これらの薬剤の作用がミトコンドリアの反応、そしてそれに続くアポトーシスのシグナル伝達によって予想され得ることを驚くべきものにする。
実施例２：腫瘍学患者ベースのコホートを用いた研究
【０１４３】
ＡＭＬ（シタラビンベースの処置［標準的処置］）方法：ＡＭＬ患者コホート：新たに診断されたＡＭＬ患者試料は、１９９９年９月から２００７年３月の間に導入補助化学療法施与前の末梢血採血又は骨髄穿刺液（ＢＭ）の収集によって得られた３９。検体は、研究審査委員会によって承認された規制とプロトコール（ラボ０１−４７３）に従って慣例的診断評価のなかで得られた。インフォームドコンセントはヘルシンキ宣言に従って得られた。フィコール精製の後、ＣＤ３／ＣＤ１９細胞枯渇により、混入しているＴ細胞およびＢ細胞を除去した。細胞の個々のアリコートを、遠心分離し、９０％ＦＢＳ／１０％  ＤＭＳＯに再懸濁し、液体窒素中で凍結保存した。病理学的分類，細胞遺伝学分析および変異状態が得られた；臨床指標は、補助表及び図に示す。
【０１４４】
患者処置：患者を、標準的診断基準により反応について分類した。６２人の患者のうち４８人はシタラビンとアントラサイクリンで処置された、７人の患者はシタラビンとアントラサイクリン以外の薬剤、８人の患者はシタラビンとフルダラビン（このうち一人はシタラビンとアントラサイクリン以外の薬剤、次に、その後のサイクルでシタラビンとフルダラビンで処置された「どちらのサイクルでも反応なし」）。ＣＲ＝骨髄形態が正常、絶対好中球数が１０００超、血小板数が１０万超、高ヘモグロビン。原発性不応性＝２サイクルの導入補助化学療法（同じか違うレジメであり得る）後の残存白血病。再発は、以前ＣＲであった患者において、骨髄中の５％より多くの芽球、或は末梢血中の芽球である。
【０１４５】
細胞遺伝学的リスク状態の決定：細胞遺伝学的リスクの決定はＣＬＩＡ認定された細胞遺伝学ラボによって実行された。簡単に記載すると、患者は標準的なグループ分けで分類された：好ましい＝ｉｎｖ１６，  ｔ（８：２１），  Ｔ（１５；１７）  中間＝二倍体，  −ｙ，  不十分な細胞分裂中期，  好ましくない＝他すべて，  −５，  −７，  ＋８，  ｔ（６；９），  １１ｑ，  ＰＨ１＋，  ｍｉｓｃ。
【０１４６】
ＢＨ３プロファイリング：フィコール精製され、生存可能に凍結された、前処置ＡＭＬ検体を解凍し、ＦＣＲブロッキング試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，  Ａｕｂｕｒｎ  ＣＡ）を含むＦＡＣＳバッファー（１％ＦＢＳ，  ２ｍＭ  ＥＤＴＡ，  ＰＢＳ）中に１０分間、氷上で再懸濁し、その後抗体ＣＤ４５−Ｖ４５０（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ  ＣＡ）、ＣＤ３−ビオチン（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ  ＣＡ）およびＣＤ２０−ビオチン（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）を用いて２０分間氷上で染色した。試料を、二次抗体ストレプトアビジン−ＡＰＣ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，
ＣＡ）を含むＦＡＣｓバッファー中に２０分間氷上で再懸濁した。染色後、ＡＭＬ検体を、ジギトニン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）で透過処理し、室温においてニューマイヤーバッファー（８０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、４０μＭ  ＥＤＴＡ、４０μＭ  ＥＧＴＡ、５ｍＭ  コハク酸塩、３００ｍＭ  トレハロース、０．１％  ＢＳＡ、ｐＨ７．４）中、チューブあたり２×１０５細胞で、ペプチド（ＢＩＭ  １００μＭ、ＢＩＭ  ０．１μＭ、ＰＵＭＡ  １００μＭ、ＰＵＭＡ  １０μＭ、ＮＯＸＡ  １００μＭ、ＢＡＤ  １００μＭ、ＢＭＦ  １００μＭ、ＨＲＫ  １００μＭまたはＰＵＭＡ２Ａ  １００μＭ）とともにか、あるいはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ[１％]）またはカルボニルシアニドｍ−クロロフェニルヒドラゾン（ＣＣＣＰ[１０μＭ]）とともに１８０分間インキュベートした。試料は充分量の生存可能な細胞が利用可能でないとき以外は二連で試行した。電位差ＪＣ−１ミトコンドリア色素（Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ  ＮＹ）を解析の４５分前に加えた。
【０１４７】
試料はＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩ  （ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ  ＣＡ）でＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｄｉｖａソフトウエアを用いて解析した。芽球集団を、ＣＤ４５  ｄｉｍ，  ＳＳＣ低、ＣＤ３およびＣＤ２０ネガティブとして同定した。以前にも述べたが、成熟リンパ球を示す強く染色されたＣＤ４５細胞は、この解析から除外した。脱共役試薬コントロールと比較したミトコンドリア脱分極を誘導するアポトーシス促進性ペプチドの定量化できる傾向を、パーセントプライミングという。芽球集団では、これはＤＭＳＯをバックグラウンド（ネガティブコントロール）として、およびＣＣＣＰを１００％プライミング（ポジティブコントロール）として正規化されたＰＥチャンネルのメジアンシグナル強度を用いる事で計算した。
【０１４８】
統計学的解析：ＢＨ３プロファイリングバイオマーカーの予期値を、バイオマーカー状態（％プライミング）と患者が反応者または非反応者と特徴付けられるかとの間の関連を試験することによって研究した。単変量比較を、マン−ホイットニー検定を用いて行い、全ての報告されたｐ値は、両側のものである。統計学的解析は、擬陽性の結果の危険性を限定するためにｐ＜０．０１の有意性についての閾値で計画する（０．０１＜ｐ値＜０．０５は、有意な境界とみなされた）。マーカーの予測能力は、曲線下面積（ＡＵＣ）統計量を用いて評価された。生存エンドポイントはコックス比例ハザード回帰を用いて解析した。多変量解析は、ロジスティック回帰を用いて実行し、上記の診断基準を用いた患者の臨床病理的な情報から重要である調節変数を用いた。ＯＳおよびＥＦＳは、傾向についてのログランクテストによってパーセントプライミングとの有意な相関について試験された。解析はＳＡＳソフトウエア  バージョン９．２（ＳＡＳ  ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＩＮＣ．，  Ｃａｒｙ，  ＮＣ）、Ｒバージョン２．１４．２（Ｒ  Ｃｏｒｅ  Ｔｅａｍ；  Ｖｉｅｎｎａ，  Ａｕｓｔｒｉａ）および／またはＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン５．０４（ＬａＪｏｌｌａ，  ＣＡ）を使用して行った。
【０１４９】
Ｒ患者コホート特徴：ＡＭＬ患者は臨床病理学的変数と比較してシタラビンベースのレジメの反応状態によって階層化された（表３）。マンーホイットニー解析は臨床変数と化学療法の反応の非ランダム関連性をテストする為に行われた。テストされた変数のうち、患者の年齢プロファイルおよび細胞遺伝的リスク階層化のみが、反応に対する非ランダム関連性を示した（各々Ｐ＝０．００８およびＰ＝０．００６）。これら２つの非ランダム変数は、次にＢＨ３プロファイリングバイオマーカーについて以下に記載された多変量解析で利用された。
【０１５０】
患者検体のＢＨ３プロファイリング：この研究の一部としてＢＨ３プロファイリングされた生存可能に保存された６２個のＡＭＬ患者検体のうち、６１個が解析可能なデータを提供した。統計学的解析前に考察から除外された一試料は、トリパンブルー排除によって同定された生細胞が解析を継続するのに十分ではないプロファイルを生じた。６２の患者検体のうち６１をＢＨ３プロファイリングによってアッセイできたことは、全体で９８．４％の技術的な成功を示す。さらに、本発明者らがこの検体に関係した技術的失敗は、明らかに凍結障害と合致する。なぜなら、乏しい細胞生存率が、解凍直後に記述されたからである。
【０１５１】
すべてのペプチドは、以前のＡＭＬ検体を用いたこれらの研究が始まる前に、ダイナミックレンジの％プライミング値を与えるように、経験的に最適化された。もっとも特記すべきことは、１００μＭのＢＩＭは、大多数のＡＭＬ患者の検体では飽和（又は飽和に近い）ことが見出されたことである。それゆえ、１００μＭのＢＩＭに加えて、ＢＩＭは、ダイナミックレンジの％プライミング値を提供すると決定された濃度である０．１μＭでもアッセイされた。２人のＮＲ患者と２人のＣＲ患者の代表的なデータは図１２で示されている。個々の患者からの反復試料についての全体の変動係数（ＣＶ）は一般的に３〜５％であり、試行間の変動性が限定された技術的に強固なアッセイを示すことに留意すること。
【０１５２】
アッセイされたバイオマーカーペプチドの中で、より高いＢＩＭ（０．１）パーセントプライミングスコアは、高い程度の統計学的有意性（ｐ＝０．０００００１８）で反応と相関していた（図１３）。アッセイされたそのほかのＢＨ３プロファイリングバイオマーカー解析は表４に示す。ＢＩＭ（０．１）によって得られた統計学的有意性に加えて、ＰＵＭＡ（１０）は反応に対して有意な関連性を示した（ｐ＝０．００６４）（図１４）。
【０１５３】
個々の患者のＢＩＭ（０．１）プライミングスコアが反応者群と非反応者群とに分離されたとき（図２）、明らかな傾向が現れた。シタラビンベースの療法への反応を示す可能性が高いＡＭＬ患者は、反応しない可能性が高い患者（パーセントプライミング＝１３．２±１３．４［ＳＤ］）よりも、ＢＨ３プロファイリングプライミングが高い傾向がある（パーセントプライミング＝３６．８±２１．２［ＳＤ］）。可能性が高い反応者を正確に同定する一方、同時に非反応者を正確に分離することにおいてこのバイオマーカーの感度と特異性を確立するには、受信者動作特性（ＲＯＣ）のプロット図が０．８３のＡＵＣ（個々の検体を正確に識別するバイオマーカーの能力の優れた指標）を示している［９５％ＣＩ：０．７３、０．９４］（図１４）。興味深い事に、これらの数の中で、単一のバイオマーカーは、８９．７％の反応者の同定、一方で同時に、反応しない可能性が高い患者のうち５９．１％の同定を達成できる。所望される感度カットオフが９２．３％より少し高いと、特異性は、可能性の低い反応者の５４．６％を依然として達成する。
【０１５４】
年齢および細胞遺伝学は、このデータセットにおいてもＡＭＬの予後因子であることが示された（表３）。もしＢＩＭ（０．１）％プライミングバイオマーカーの追加が、年齢プロファイルと細胞遺伝学の情報を超えた予後情報を加えたかどうかを決定するために、年齢プロファイルと細胞遺伝学を、ＢＩＭ（０．１）％プライミング多変量解析に順次加えられた。ＢＩＭ（０．１）に患者の年齢プロファイルを加えると、以前のＢＩＭ（０．１）ＡＵＣ＝０．８３単独から、ＡＵＣを０．８９に増大させる（図１５）。さらにＢＩＭ（０．１）が、患者の年齢プロファイルと細胞遺伝学的リスクに対して調節されると、ＡＵＣは０．９１にさらに増加する。後者の調節で、可能性が高い非反応者の７０％超の分離と同時の同定において、９０％超の感度が達成される（図１５）。
【０１５５】
患者は細胞遺伝学的リスク状態によって階層化され、そしてこれらのサブグループは、反応者と非反応者との同定における有意性についてマン−ホイットニーで解析された。中程度のリスク（ｎ＝３３）サブグループでは、ＢＩＭ（０．１）は、反応をさらに識別することと非常に有意に関連し（ｐ＝０．０００１７）そして好ましくないグループ（ｎ＝２３）では、ＢＩＭ（０．１）は依然として有意であった（ｐ＝０．０２３）（図１６）。ここでｐ値は組み合わせたコホートのＢＩＭ（０．１）解析に比べて幾分減少している一方、これは、一般的に患者のサブグループ化した数の為に統計学的検出力が減少する現象である。興味深い事に、ＢＡＤおよびＨＲＫ両方の解析が、反応識別に興味深い有意なｐ値を生じた（それぞれ、ｐ＝０．００１７およびｐ＝０．００５５）。しかしこの事は、中程度のリスクグループでのみ観察された（図１６）。反応識別におけるこれらバイオマーカーのＲＯＣ解析による感度と特異性の評価は、中程度グループではＢＩＭ（０．１）には０．８７５のＡＵＣ、ＢＡＤには０．８７５のＡＵＣ、ＨＲＫには０．８２３のＡＵＣ、そして好ましくないグループではＢＩＭ（０．１）には０．７９０のＡＵＣを与える（図１６）。留意するべき点は、これらのＡＵＣが、独立したサブグループにおいて、反応者対非反応者について幾分不均衡なサブグループ分けから利益を受け得ることである（中程度のものについて８ＮＲ、２５ＣＲ、そして好ましくないものについて１５ＮＲ、９ＣＲ）。５人の好ましい患者についてのデータしかないので、このグループについて、統計学的な解析をすることはできなかった。
【０１５６】
ＢＩＭ（０．１）ＢＨ３プロファイリングパーセントプライミングとＢＩＭ（ＢＣＬ２Ｌ１１）タンパク質レベルの比較：ＢＩＭ  ＢＨ３プロファイリングの予測検出力が、ＢＩＭタンパク質レベルを単に要約しているかどうか評価する為に、本研究内でのＡＭＬ患者検体に、相関または相関の欠如が存在するか否かの評価を行った。ＢＩＭタンパク質レベルとパーセントプライミングには何ら相関性が無いことが解り（図１７）、ここでは、Ｒ２＝０．０３９６を得た。
【０１５７】
ＢＩＭ（０．１）のＢＨ３プロファイリングは、ＢＨ３プロファイリングとＲＰＰＡデータの両方が全患者コホートに存在する小集団において有意なｐ値（ｐ＝０．００４８）を維持する（図１７）。試料サイズがｎ＝６２からｎ＝４３に減少し、またＲＰＰＡデータがない多くの試料の多くが最も高いスコアを出したＢＨ３プロファイリング検体の中にあったので、この解析の検出力が、本発明者らの以前の解析と比べて減少することにここで留意のこと。ＢＣＬ２Ｌ１１のタンパク質レベルに関して検体のこの同じ小集団についての反応識別に対するｐ値は、ｐ＝０．３３である（図１７）。これらのデータは、ＢＨ３プロファイリングが全体のタンパク質レベルとは相関しておらず、またＢＨ３プロファイリングがＡＭＬ患者のシタラビン反応性を予測する新しい理論的枠組みを提供し得ることの強力な証拠を提供する。
実施例３：二次的臨床エンドポイント：全生存期間及び無再発生存
【０１５８】
ＢＨ３プロファイリングバイオマーカーをまた、二次的臨床エンドポイントである全生存期間（ＯＳ）および無再発生存（ＥＦＳ）への相関について解析した。コックス比例解析を用いた連続変数モデルは、ＢＩＭ（０．１）が、ＥＦＳ（ｐ＝０．１４）にもＯＳ（ｐ＝０．０５７）にも有意ではなかったことを示した。ＮＯＸＡパーセントプライミングとＥＦＳとの間のコックス比例ハザード解析も有意ではなかった（ｐ＝０．０８９）。試験したすべての他のペプチドは、ＯＳ或はＥＦＳのいずれかとパーセントプライミングとの間に有意な相関も傾向も生じなかった（すべて  ｐ＞０．１０）。さらに、患者の年齢プロファイルと細胞遺伝学的リスク状態の調節変数を用いた多変量解析は、ＢＨ３プロファイリングバイオマーカーおよびＯＳ臨床エンドポイントおよびＥＦＳ臨床エンドポイントの間に有意な相関は生じなかった。
【０１５９】
興味深い事に、分配モデル解析において、患者コホートがＢＩＭパーセントプライミングによって三分位数に分割されたときに（高プライミング、中プライミングおよび低プライミング）、対応するＯＳは、それぞれ２５０．７週間、１６８．２週間および３２．７週間のメジアン（ｐ＝０．０２９、傾向についてログランクテスト）を得た（図１８）。これらの三分位数の同じ解析をＥＦＳについて実行したとき、メジアンＥＦＳは、低プライミング三分位数、中プライミング三分位数、高プライミング三分位数についてそれぞれ２６．１週間、７１．３週間および１６０．７週間（ｐ＝０．０４４、傾向についてログランクテスト）であった（図１８）。
【０１６０】
ＡＭＬとアザシチジン：１３のヒトＡＭＬ由来細胞株をＢＨ３プロファイリングし、またインビトロアザシチジン反応性についての相関的解析を行った。ＢＨ３測定基準を使った分配モデルは、個々のペプチド由来のモデル（図１９）ならびに２つのペプチドモデル（図２０）および３つ或はそれより多いペプチドを含むモデル（図２１）を使用して、より感受性のあるＡＭＬ由来細胞株（ＩＣ５０＜２μＭ）とより感受性が乏しいＡＭＬ由来細胞株（ＩＣ５０＞２μＭ）との間で、統計学的有意性（ｐ＜０．０１）をもってアザシチジン反応性を識別した。連続変数解析を用いて、Ｐｕｍａ（汎プライミング指標）を用いる場合、［ｌｏｇ］ＩＣ５０に対する個々のペプチド由来アルゴリズム（図２２）ならびに２つのペプチド（図２３）および３つまたはそれより多いペプチド（図２４）を含む組み合わせたＢＨ３ペプチドモデルについて、Ｒ２＞０．７。統計学的に有意なｐ値（ｐ＜０．０１）は、たいていＰｕｍａを含むモデルに付随する。結果は表５にまとめられている。
【０１６１】
アザシチジンはエピゲネティックな修飾剤として知られる抗がん剤のクラスに属するので、アポトーシスの直接的な調節およびミトコンドリアの生物学に対する効果は疑わしい。従って、アザシチジン治療の効果がアポトーシスの内因性経路やミトコンドリアの生物学を調査するために設計された測定基準によって予測され得ることは驚くべきことである。例えば、Ｖｏ  ｅｔ  ａｌ  （Ｃｅｌｌ．  ２０１２；１５１（２）：３４４−３５５）を参照のこと、ここでは、アザシチジンの効果はＢＨ３由来の測定基準では予測されないと報告された。
【０１６２】
データは、アザシチジンの結果をモデル化する為のＢＨ３プロファイリングの目的のために、原発性ＡＭＬ患者検体の試験を進めるよう強く促した。
【０１６３】
アザシチジンで処置されたＡＭＬ患者のＢＨ３測定基準由来のアルゴリズムの為のサポートデータが作成された。Ｎ＝２８の組み合わせたコホート（１３（９安定／ＣＲ；４治療抵抗性／ＮＲ）検体と１５（すべてＮＲ／治療抵抗性））を含む研究。１検体は評価できなかった。すべてにおいて、２７検体を、反応性に対して解析した（１９  ＮＲ、８  Ｒ）。このコホートの報告されたスコアの範囲は図２５に示され、またスコアの範囲が、反応および他の臨床エンドポイント（例えば、全生存期間（ＯＳ）と無再発生存（ＥＦＳ）を測定し得る治療ウインドウを提供することを例示する。
【０１６４】
個々のマーカーについては、ＢＩＭとＮＯＸＡだけが、反応との境界線での有意な関係を生じた（それぞれ、ｐ＝０．０５およびｐ＝０．０２）。すべての他のバイオマーカーはｐ値＞０．１。しかし、ＢＩＭとＮＯＸＡがここで記載されたアプローチによって組み合わせた場合、反応との相関は高度に有意であった（ｐ＝０．００１）。さらに、感度と特異性のＲＯＣは０．９１であった。これは、単変量解析のみであり、また臨床的調節変数（例えば、年齢、細胞遺伝学的状態など）を重みづけする場合、統計学的により強力になり得る（図２６）。
等価物
【０１６５】
当業者は、本明細書に具体的に記載された特定の実施形態に対する多くの等価物を認識し、たんに慣例的な実験を使用してそれらを確かめることができる。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲内に包含されることが意図される。
参照による引用
【０１６６】
本明細書で引用されたすべての特許及び刊行物は、それらの全体が参考として本明細書で援用される。
【０１６７】
本明細書で議論されている刊行物は、本出願の出願日前におけるそれらの開示についてのみ提供される。本発明が先の発明という理由でこのような刊行物に先行する資格がないことの承認とみなされるものは、本願明細書には存在しない。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図４−５】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１４−４】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１６−４】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図１９−３】
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【図２０】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２３】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２５】
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【図２６−１】
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【図２６−２】
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【図２６−３】
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【図２６−４】
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【図２６−５】
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【図２６−６】
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【図２６−７】
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【図２６−８】
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【図２６−９】
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【図２６−１０】
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【外国語明細書】
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