(57)【要約】      （修正有）【課題】環境因子、中間形質又は疾患と関連性のあるＣｐＧ部位の候補となるＣｐＧ部位を特定する方法の提供。【解決手段】複数の個体の細胞からゲノムＤＮＡを抽出する工程と、前記ゲノムのＣｐＧ部位を検知する工程と、前記ＣｐＧ部位のシトシンのメチル化レベルを調べる工程と、メチル化レベルの個人的変動が所定値より大きいＣｐＧ部位を特定する工程と、を含む環境因子、中間形質または疾患と関連性のあるＣｐＧ部位の候補となるＣｐＧ部位を特定する方法。前記個体がヒトであり、前記細胞が単球又はＣＤ４＋Ｔ細胞である方法【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
環境因子、中間形質または疾患と関連性のあるＣｐＧ部位の候補となるＣｐＧ部位を特定する方法であって、
メチル化レベルの個人的変動の大きいＣｐＧ部位を特定する工程を含む方法。
【請求項２】
複数の個体の細胞からゲノムＤＮＡを抽出する工程と、
前記ゲノムＤＮＡのＣｐＧ部位を検知する工程と、
前記ＣｐＧ部位のシトシンのメチル化レベルを調べる工程と、
前記メチル化レベルの個人的変動が所定値より大きいＣｐＧ部位を特定する工程と、
を含む方法によって、メチル化レベルの個人的変動の大きいＣｐＧ部位が特定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記個体がヒトである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞が、単球またはＣＤ４＋Ｔ細胞である、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記ゲノムＤＮＡのシトシンのメチル化状態が全ゲノムバイサルファイトシーケンシング（ＷＧＢＳ）によって調べられる、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記メチル化レベルが、ＣｐＧ部位中の全塩基数またはシトシン数に対するメチル化シトシンの割合として計算される、請求項２〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
全個体の前記メチル化レベルの９５パーセンタイルと５パーセンタイルの差が計算され、
前記メチル化レベルの個人的変動が所定値より大きいＣｐＧ部位として、前記差が所定値より大きいＣｐＧ部位が特定される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法で特定されたＣｐＧ部位について、メチル化レベルを測定する測定方法。
【請求項９】
環境因子、中間形質または疾患と関連性のあるＣｐＧ部位を同定する方法であって、
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法で特定されたＣｐＧ部位について、環境因子、中間形質または疾患との関連性を調べる方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法で、環境因子、中間形質または疾患との関連性ありと同定されたＣｐＧ部位について、メチル化レベルを測定する測定方法。
【請求項１１】
ＤＮＡアレイを用いてメチル化レベルが測定される、請求項１０に記載の測定方法。
【請求項１２】
請求項９に記載の方法で、環境因子、中間形質または疾患との関連性ありと同定されたＣｐＧ部位を有するＤＮＡを搭載したＤＮＡアレイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、環境因子、中間形質または疾患と関連性のあるＣｐＧ部位の候補となるＣｐＧ部位を特定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
環境因子、中間形質または疾患と関連性のあるエピジェネティックサインとして、ＤＮＡメチル化部位の探索が行われてきた。ある個体において、特定されたＤＮＡメチル化部位を調べることにより、その個体の環境因子、中間形質または疾患と関連性、例えば環境因子に対する虚弱性や疾患の罹患・発症可能性などを調べることが可能になる（例えば、特許文献１〜２参照）。それによって、疾患の罹患予防や発症予防を対策することも可能になる。
【０００３】
網羅的な探索のため、ヒトゲノム全体にあるすべてのＣｐＧアイランドにおけるメチル化レベルを計測し、環境因子、中間形質または疾患との関連性を調べることが好ましい。しかしながら、コストの面で、すべてのＣｐＧアイランドが実際的には不可能であり、そのため、環境因子、中間形質または疾患と関連性のあるＣｐＧアイランドを効率的に特定することが試みられてきた。そのうちの一つが、遺伝子の制御領域中のＣｐＧアイランドをターゲットするものであった（例えば、非特許文献１〜３）。そして、特定された
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２０１５-５３６６３９
【特許文献２】ＷＯ２００５／０８０５６５
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Bibikova, M. et al. Genomics 98, 288-295 (2011).
【非特許文献２】Bibikova, M. et al. Epigenomics 1, 177-200 (2009).
【非特許文献３】Dedeurwaerder, S. et al. Epigenomics 3, 771-784 (2011).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、環境因子、中間形質または疾患と関連性のあるＣｐＧ部位の候補となるＣｐＧ部位を特定する新規な方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、環境因子、中間形質または疾患と関連性のあるＣｐＧ部位を特定する際に、メチル化レベルの個人的変動の大きいＣｐＧ部位を特定することによって、関連性のあるＣｐＧ部位を効率よく特定できることを見出し、本発明の完成に至った。
【０００８】
本発明にかかる一実施態様は、環境因子、中間形質または疾患と関連性のあるＣｐＧ部位の候補となるＣｐＧ部位を特定する方法であって、メチル化レベルの個人的変動の大きいＣｐＧ部位を特定する工程を含む方法である。複数の個体の細胞からゲノムＤＮＡを抽出する工程と、前記ゲノムＤＮＡのＣｐＧ部位を検知する工程と、前記ＣｐＧ部位のシトシンのメチル化レベルを調べる工程と、前記メチル化レベルの個人的変動が所定値より大きいＣｐＧ部位を特定する工程と、を含む方法によって、メチル化レベルの個人的変動の大きいＣｐＧ部位が特定されてもよい。前記個体がヒトであってもよい。前記細胞が、単球またはＣＤ４＋Ｔ細胞であってもよい。前記ゲノムＤＮＡのシトシンのメチル化状態が全ゲノムバイサルファイトシーケンシング（ＷＧＢＳ）によって調べられてもよい。前記メチル化レベルが、ＣｐＧ部位中の全塩基数またはシトシン数に対するメチル化シトシンの割合として計算されてもよい。全個体の前記メチル化レベルの９５パーセンタイルと５パーセンタイルの差が計算され、前記メチル化レベルの個人的変動が所定値より大きいＣｐＧ部位として、前記差が所定値より大きいＣｐＧ部位が特定されてもよい。
【０００９】
本発明にかかる他の実施態様は、上記いずれかの方法で特定されたＣｐＧ部位について、メチル化レベルを測定する測定方法である。
【００１０】
本発明にかかるさらなる実施態様は、環境因子、中間形質または疾患と関連性のあるＣｐＧ部位を同定する方法であって、上記いずれかの方法で特定されたＣｐＧ部位について、環境因子、中間形質または疾患との関連性を調べる方法である。この方法で、環境因子、中間形質または疾患との関連性ありと同定されたＣｐＧ部位について、メチル化レベルを測定する測定方法は、本発明にかかるさらなる実施態様となる。メチル化レベルはＤＮＡアレイを用いて測定されてもよい。また、この方法で、環境因子、中間形質または疾患との関連性ありと同定されたＣｐＧ部位を有するＤＮＡを搭載したＤＮＡアレイも、本発明にかかるさらなる実施態様となる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によって、環境因子、中間形質または疾患と関連性のあるＣｐＧ部位の候補となるＣｐＧ部位を特定する新規な方法を提供することができるようになった。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明に係る一実施例における被験者の特性を示す表である。
【図２】本発明に係る一実施例における、ゲノム全体の各ＣｐＧ部位におけるReference Interval（ＲＩ）の分布を示したグラフ（Ａ及びＣ）と、ＲＩをＨＭ４５０に含まれるメチル化サイトと既存のメチル化部位との間で比較した時のＲＩとオッズ比の関係を示すグラフである。Ａ及びＢ：ＣＤ１４＋＋／ＣＤ１６-単球、Ｃ及びＤ：ＣＤ４＋Ｔ細胞
【図３】本発明に係る一実施例において、特定の領域での各ＣｐＧ部位におけるＲＩの分布を示したグラフである。
【図４Ａ】本発明に係る一実施例において、単球における喫煙習慣と相関性のあるＣｐＧ部位の解析を示す図である。いずれのグラフにおいても、x軸はAHRR座位のcg05575921を０とした時の相対的位置を示す。上から１つ目のグラフでは、y軸は、-ｌｏｇ１０（Ｐ）（式中、ＰはＤＮＡのメチル化レベルと喫煙（すなわち、喫煙者か非喫煙者か）の相関に対するp値を表す）である。基準点となるcg05575921とのＤＮＡのメチル化レベルの相関値Ｒ２の大きさで各点が分類されている。折れ線グラフは、ＤＮＡのメチル化レベルと遺伝子発現レベルの相関に対するp値を表す。点線は、p＝０．０５を示す。上から２つ目のグラフでは、y軸は、ＤＮＡのメチル化レベルである。各折れ線グラフは、喫煙者と非喫煙者の平均ＤＮＡのメチル化レベルを示す。標準偏差は影で示されている。上から３つ目のグラフでは、y軸は、ＲＩである。点線は、ＲＩが３０％であることを示す。上から４つ目のグラフでは、転写因子（ＰＵ．１及びＰＡＸ５）結合部位（ＴＦＢＳ）、ＣＧＩ及びＣｐＧアイランドショア（ｓｈｏｒｅ）、ＤＨＳの位置を示す。
【図４Ｂ】本発明に係る一実施例において、単球における喫煙習慣と相関性のあるＣｐＧ部位の解析を示す図である。いずれのグラフにおいても、x軸はF2RL3座位のcg03636183を０とした時の相対的位置を示す。上から１つ目のグラフでは、y軸は、-ｌｏｇ１０（Ｐ）（式中、ＰはＤＮＡのメチル化レベルと喫煙（すなわち、喫煙者か非喫煙者か）の相関に対するp値を表す）である。基準点となるcg03636183とのＤＮＡのメチル化レベルの相関値Ｒ２の大きさで各点が分類されている。折れ線グラフは、ＤＮＡのメチル化レベルと遺伝子発現レベルの相関に対するp値を表す。点線は、p＝０．０５を示す。上から２つ目のグラフでは、y軸は、ＤＮＡのメチル化レベルである。各折れ線グラフは、喫煙者と非喫煙者の平均ＤＮＡのメチル化レベルを示す。標準偏差は影で示されている。上から３つ目のグラフでは、y軸は、ＲＩである。点線は、ＲＩが３０％であることを示す。上から４つ目のグラフでは、転写因子（ＰＵ．１及びＰＡＸ５）結合部位（ＴＦＢＳ）、ＣＧＩ及びＣｐＧアイランドショア（ｓｈｏｒｅ）、ＤＨＳの位置を示す。
【図５】本発明に係る一実施例において、本発明の方法を従来法と比較した時のオッズ比を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的に実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００１４】
＝＝環境因子、中間形質または疾患と関連性のあるＣｐＧ部位の候補となるＣｐＧ部位を特定する方法＝＝
本発明の方法は、環境因子、中間形質または疾患と関連性のあるＣｐＧ部位の候補となるＣｐＧ部位を特定する方法であって、メチル化レベルの個人的変動の大きいＣｐＧ部位を特定する工程を含む方法である。ここで、環境因子とは、有害物質、居住区、運動、飲酒、喫煙、食事、輸血、献血、投薬、治療、家族や友人とのつながり、ストレス、女性の健康に関わるもの（例えば、月経、妊娠、出産、母乳）、職業、勤務時間、休暇など、中間形質とは、身長、体重、腹囲、BMI(Body mass index)、収縮期血圧、拡張期血圧、血中成分（例えば、ヘモグロビン、ヘマトクリット、LDLコレステロール、HDLコレステロール、中性脂肪、AST、ALT、γ-GTP、血糖、HbA1c、尿糖、尿蛋白、血算（例えば、赤血球数、白血球数、血小板数）、末梢血液像、総コレステロール、尿酸、尿素窒素、クレアチニン、グリコアルブミンなど）の量または測定値、眼底状態、心電図、ヘリコバクターピロリ、ペプシノーゲン、NT-pro BNP、シスタチンC、高感度心筋トロポニンT、アレルギー、尿成分（例えば、尿中ナトリウム、尿中カリウム、尿中アルブミン、尿中クレアチニンなど）の量または測定値、握力、眼科検査結果（例えば、眼圧、眼底、網膜断層写真、眼軸長）、脈波伝搬速度（ABI、PWV）、血管内皮機能、IMT、内臓脂肪、呼吸機能など、疾患とは、高血圧、脂質異常症、糖尿病、肥満などの生活習慣病、癌や腫瘍（例えば、肺がん、食道がん、胃がん、大腸・直腸がん、肝がん、膵がん、胆嚢・胆管がん、前立腺がん、乳がん、子宮頸がん、子宮体がん、卵巣がん、造血器腫瘍、胃がん）などの新生物（neoplasm）、自己免疫疾患（例えば、バセドウ病、関節リウマチ膠原病）、脳梗塞、脳動脈瘤・くも膜下出血、てんかん、ぜんそく、結核、肺気腫（COPD）、間質性肺炎・肺線維症、心筋梗塞、安定狭心症、不安定狭心症、不整脈、心不全、閉塞性動脈硬化症（ASO）、慢性肝疾患、Ｂ型慢性肝炎、Ｃ型慢性肝炎、肝硬変、ネフローゼ症候群、尿路結石、骨粗しょう症、糖尿病、高脂血症、花粉症、過敏性症候群（薬疹）、アトピー性皮膚炎、ケロイド、子宮筋腫、子宮内膜症、熱性けいれん、緑内障、白内障、歯周病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）などをいう。そして、環境因子と関連性があるというのは、その環境因子に影響されていること（例えば、有害物質に暴露されたこと）、中間形質と関連性があるというのは、その中間形質を有していること、そして疾患と関連性があるというのは、その疾患に罹患していること、または現在罹患していなくても、将来罹患する可能性が高いこと、などと特定のＣｐＧ部位におけるメチル化が相関していることをいう。  
【００１５】
同時に複数のＣｐＧ部位の候補を特定することによって、環境因子、中間形質または疾患と関連性のあるＣｐＧ部位を高い割合で含むＣｐＧセットを作製することができる。
【００１６】
＝＝メチル化レベルの個人的変動の大きいＣｐＧ部位を特定するための方法＝＝
メチル化レベルの個人的変動の大きいＣｐＧ部位を特定するための方法は特に限定されないが、例えば、以下の方法が考えられる。
【００１７】
まず、複数の個体の細胞からゲノムＤＮＡを抽出する。ここで、個体の種は特に限定されないが、哺乳類であることが好ましく、ヒトであることがより好ましい。中でも、人種、国籍、民族などについて均一な集団から個体を選択するのが好ましい。個体数は特に限定されないが、多い方が好ましく、例えば１０人以上であることが好ましく、３０人以上であることがより好ましく、１００人以上であることがさらに好ましく、３００人以上であることがさらに好ましく、１０００人以上であることがさらに好ましい。細胞のタイプも特に限定されず、生体から得た細胞であっても、培養細胞であってもよい。生体から得た細胞の場合、血液細胞が好ましく、単球（特にＣＤ１４＋＋/ＣＤ１６-単球やＣＤ４＋Ｔ細胞）が特に好ましい。培養細胞の場合、生体から得た細胞を培養したものが好ましいが、初代培養細胞であっても、継代された培養細胞であってもよい。細胞タイプの純度は高いほうがよく、８５％以上が好ましく、９０％以上がより好ましく、９５％以上がさらに好ましい。
【００１８】
次に、各個体のゲノムＤＮＡのＣｐＧ部位を検知し、そのシトシンのメチル化レベルを調べる。その方法は特に限定されないが、全ゲノムバイサルファイトシーケンシング（ＷＧＢＳ）法やPost-bisulfite adaptor-tagging（ＰＢＡＴ）法を用いるのが好ましい。これらの方法によって、ゲノムＤＮＡのＣｐＧ部位内のメチル化シトシンの位置が特定できる。そして、各ＣｐＧ部位中で、全塩基に対するメチル化シトシンの割合、または全シトシンに対するメチル化シトシンの割合をシトシンのメチル化レベルとして算出する。
【００１９】
最後に、メチル化レベルの個人的変動が所定値より大きいＣｐＧ部位を特定する。メチル化レベルの個人的変動の算出方法は特に限定されないが、例えば、８０以上、好ましくは８５以上、より好ましくは９０以上、さらに好ましくは９５以上の数のパーセンタイルの個人のメチル化レベルと、２０以下、好ましくは、１５以下、より好ましくは１０以下、さらに好ましくは５以下の数のパーセンタイルの個人のメチル化レベルとの差を求め、その差が所定値より大きいＣｐＧ部位を特定してもよい。所定値は、細胞によっても異なるが、通常、２０％以上であることが好ましく、３０％以上であることがより好ましい。
【００２０】
＝＝特定したＣｐＧセットの利用方法＝＝
こうして特定されたＣｐＧセットには、環境因子、中間形質または疾患との関連性があるＣｐＧが高い割合で含まれているため、そのＣｐＧセットに含まれるＣｐＧについて環境因子、中間形質または疾患との関連性を調べることによって、実際に環境因子、中間形質または疾患との関連性があるＣｐＧマーカーを同定することができる。
【００２１】
ある生物個体において、こうして同定したＣｐＧ部位のメチル化レベルを調べることによって、その個体が影響を受けている環境因子、中間形質または疾患を判断することができる。そのための方法は特に限定されないが、効率的な具体的方法として、例えばＤＮＡアレイ（例えば、ＤＮＡマイクロアレイ、ＤＮＡチップ、又はバイオチップ等の別称があるが、本明細書ではこれらを総称してＤＮＡアレイと称する）を用いる方法（例えば、特開２００３―３８１８３号公報、ＷＯ２００５／０８０５６５参照）が、当業者には公知である。
【実施例】
【００２２】
［実施例１］
本実施例では、環境因子、中間形質または疾患との関連性のあるＣｐＧ部位では、メチル化レベルの個人的変動が大きいことを示す。
【００２３】
（１）ＣｐＧ部位の特定
東北大学東北メディカル・メガバンク機構（ＴｏＭＭｏ）及びいわて東北メディカル・メガバンク機構（ＩＭＭ）によって実施されているＴｏｈｏｋｕ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｅｇａｂａｎｋ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ-Ｂａｓｅｄ  Ｃｏｈｏｒｔ  Ｓｔｕｄｙ  （ＴＭＭ  ＣｏｍｍＣｏｈｏｒｔ  ｓｔｕｄｙ）に参加している日本国岩手県居住の健常者（１０２名、３４〜７４歳）より血液を採取し、以下の解析に用いた。各人の特性を図１に示す。
【００２４】
採取された血液から、遠心分離（１，７００ｘｇ、２０分、Ｓｏｒｖａｌｌ  Ｌｅｇｅｎｄ  ＸＦＲ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）によって単球を回収した。この単球を、ＣＤ１４-ＦＩＴＣ抗体、ＣＤ１６-ＰＥ抗体、ＣＤ３-ＰＥ／Ｃｙ７抗体、ＣＤ４-ＡＰＣ抗体（細胞溶液５００μｌに対し、抗体５μｌ；ソニー・バイオテクノロジー社）と、４℃で２０分間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄後、セルソーター（ＳＨ８００、ソニー・バイオテクノロジー社）を用いてＣＤ１４＋＋／ＣＤ１６-単球及びＣＤ４＋Ｔ細胞を単離した。これらの細胞から、AllPrep DNA/RNA Micro Kit（Qiagen社）を用いて、ゲノムＤＮＡ及びＲＮＡを単離した。EZ DNA Methylation-Gold Kit（Zymo Research Corp.社）及びTruSeq DNA Methylation Kit（Illumina社）を用い、５０または７５μgのゲノムＤＮＡを用いてバイサルファイトシーケンシングのためのＷＧＢＳライブラリーを作製した。HiSeq SBS Kit ver.4及びIllumina HiSeq2500（Illumina社）を用いて、このＷＧＢＳライブラリーのシーケンシングを行った。６回未満または３００回超の繰り返しを有するものは除外し、かつ被検者の５０％以上で保持されているＣｐＧ部位を算定したところ、ＣＤ１４＋＋／ＣＤ１６-単球では常染色体上に２３９０万個、ＣＤ４＋Ｔ細胞では常染色体上に２３００万個のＣｐＧ部位が特定された。
【００２５】
（２）メチル化レベルの算出
２３００万個または２３９０万個のＣｐＧ部位で、変換されたシトシン及び変換されなかったシトシンを被験者全員についてNovoMethy v.3.02.08（http//www.novocraft.com/）で計測し、シトシンのメチル化レベルを、全シトシン数に対するメチル化シトシン数として算出した。そして、環境因子、中間形質または疾患との関連性を示す指標として、各ＣｐＧ部位について、被験者内での５パーセンタイルと９５パーセンタイルのメチル化レベルの差（本明細書では、Reference Interval、またはＲＩと称する）を算出し、その分布（確率密度）をグラフ化した。なおコントロールとして、ＨＭ４５０（HumanMethylation450）に含まれる４５万個以上のメチル化サイト、およびblood-based EWASで報告されていた環境因子、中間形質または疾患との関連性のある既知のメチル化部位におけるＲＩを算出し、同様にグラフ化した。なお、既知のメチル化部位とは、従来の１１の研究より明らかになった、喫煙習慣、肥満、タイプ２糖尿病、脂質レベル、精神分裂病と関連性のある２６９のＣｐＧ部位である。図２Ａ（ＣＤ１４＋＋／ＣＤ１６-単球）及び図２Ｃ（ＣＤ４＋Ｔ細胞）に示すように、blood-based EWASで報告されていたメチル化部位でのＲＩは、他の二つに比べ、そのグラフはＲＩが大きい方に偏位している。
【００２６】
同様の解析を、遺伝子のプロモーター部位、エクソン、イントロン、ＣｐＧアイランド（ＣＧＩ）、ＣｐＧアイランドショア（ＣＧＩショア）、転写因子結合部位（ＴＦＢＳ）、転写因子結合部位隣接領域（ＴＦＢＳｆｌａｎｋｉｎｇ）、ＤＮａｓｅＩ−ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ部位（ＤＨＳ）、ヒストンＨ３アセチルＬｙｓＬｙｓ２７（Ｈ３Ｋ２７ａｃ）、ヒストンＨ３モノメチルＬｙｓ４（Ｈ３Ｋ４ｍｅ１）、ヒストンＨ３トリメチルＬｙｓ４（Ｈ３Ｋ４ｍｅ３）、繰り返し配列（Ｒｅｐｅａｔ）において行った。なお、（１）で特定したＣｐＧ部位のデータをＢａｃｋｇｒｏｕｎｄとして記載した。図３（ａ〜ｆ、ＣＤ１４＋＋／ＣＤ１６-単球；ｇ〜ｌ、ＣＤ４＋Ｔ細胞）に示すように、全ての場合において、小さいＲＩが多く、Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄと同様の形状のグラフになった。
【００２７】
このように、環境因子、中間形質または疾患との関連性のある領域では、ＲＩの分布は値が大きい方へ偏位する。
【００２８】
なお、ＲＩをその大きさによって１０のグループに分け、ＨＭ４５０に含まれるメチル化サイトと既存のメチル化部位との間でＲＩを比較したところ、オッズ比は、図２Ｂ（ＣＤ１４＋＋／ＣＤ１６-単球）及び図２Ｄ（ＣＤ４＋Ｔ細胞）のようになり、明らかに、ＲＩの大きい方が、関連性が既知のメチル化部位との相関があった。
【００２９】
これらの結果は、環境因子、中間形質または疾患との関連性のあるＣｐＧ部位では、メチル化レベルの個人的変動が大きいことを示している。
【００３０】
（３）環境因子、中間形質または疾患との関連性のあるＣｐＧ部位を特定するためのＲＩ値
このように、環境因子、中間形質または疾患との関連性のある領域では、ＲＩの分布は値が大きい方へ偏位するため、例えば、ＲＩが所定値以上のＣｐＧ部位であれば、当該関連性が高いＣｐＧ部位が得られる。（１）で特定したＣｐＧ部位やＨＭ４５０に含まれるＣｐＧ部位のＲＩについては、中央値が約１１−約１３％となり、その範囲より大きいと、含まれる個体数が急激に減少し、約２０％からは緩やかに減少する。従って、当該関連性が高いＣｐＧ部位を特定するとき、例えば、所定値を２０％以上にするのが好ましく、３０％以上にするのがより好ましい。
【００３１】
［実施例２］喫煙習慣と相関性のあるＣｐＧ部位の解析
本実施例では、従来喫煙習慣と相関性のあることが知られているＣｐＧ部位である、ＡＨＲＲ遺伝子内のcg05575921領域と、Ｆ２ＲＬ３遺伝子内のcg03636183領域について、ＣＤ１４＋＋／ＣＤ１６-単球を用いてメチル化の解析を行った。これらの領域では、喫煙をしたことがない非喫煙者に比べて喫煙者ではメチル化が減少していることが知られており、またこれらの領域のメチル化は、喫煙状況について補正したとしても、肺がんのリスクとも相関していることが知られている。
【００３２】
図４に示すように、cg05575921領域はＣＧＩショアに位置する。cg05575921領域におけるＲＩは、実施例１と同様に算出すると、２０％未満だったが、その周辺領域のＣｐＧ部位も考慮して算出すると、３０％以上となり、実施例１に記載の方法を用いることによって喫煙習慣との相関があると判断できる。
【００３３】
cg03636183領域もＣＧＩショアに位置する。cg03636183領域の場合も、その周辺領域のＣｐＧ部位も考慮して算出すると、３０％以上となり、実施例１に記載の方法を用いることによって喫煙習慣との相関があると判断できる
このように、喫煙習慣と相関性のあることが知られている特定のＣｐＧ部位についても、ＲＩが３０％以上と算出でき、実施例１の方法を用いても、関連性があると判断できる。
【００３４】
［実施例３］従来法との比較
本実施例では、本発明の方法を従来法と比較した。
【００３５】
まず、ＣＤ１４＋＋／ＣＤ１６-単球及びＣＤ４＋Ｔ細胞において、繰り返し配列を含まず、ＲＩが３０％以上になるＣｐＧ部位を、それぞれ２００万個及び３００万個含むＣｐＧセット（CMV-Mono及びCMV-CD4T）を作製した。一方、対照のセットとして、マイクロアレイ（HM450、EPIC）、メチル化キャプチャーシーケンシング（SuperSelect、CpGiant）、ＲＲＢＳ（RRBS(Rep1)、RRBS(Rep2)）からのＣｐＧセットを用いた。なお、ＣｐＧ部位のデータは、各製造メーカーのウエブサイトより入手した。
【００３６】
実施例１で特定した、環境因子、中間形質または疾患との関連性のある２６９個のＣｐＧ部位が各セットに入る入りやすさの指標としてとしてオッズ比を求めたところ、図５Ａに示すように、CMV-Mono及びCMV-CD4Tだけが、他と比べて有意に高いオッズ比を示した。
【００３７】
さらに、従来関連性が知られていたＣｐＧ部位は、症例対照研究から特定されたもの（２２５例）と、集団をベースにした研究から特定されたもの（４７例）に大別できる（３例は共通）。そこで、上記の各ＣｐＧセットに対し、これらのＣｐＧ部位の入りやすさの指標としてオッズ比を求めたところ、図５Ｂ（集団をベースにした研究から特定されたもの）及び図５Ｃ（症例対照研究から特定されたもの）の両方において、CMV-Mono及びCMV-CD4Tだけが、他と比べて有意に高いオッズ比を示した。
【００３８】
このように、ＲＩが３０％以上になるＣｐＧ部位を含むＣｐＧセットは、従来の方法で得られたＣｐＧセットより、環境因子、中間形質または疾患との関連性のあるＣｐＧ部位を特定しやすい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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