(57)【要約】      （修正有）【課題】抗体の使用が有利である任意の疾患又は病的状態、及び任意の他の用途に対する治療薬の提供。【解決手段】異なる結合特性を有する抗体など、１つ、２つ又は３つのテザーを用いて構築された改変ヘテロ多量体タンパク質複合体、並びにこのような複合体を作製、使用、及び精製する方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の成分、すなわち、
（ａ）第１のＶＨ（ＶＨ１）ドメイン及び第２のＶＨ（ＶＨ２）ドメインと、
（ｂ）ＨＤテザーと、
（ｃ）一又は複数の重鎖定常ドメインと
を含み、
前記一又は複数の重鎖定常ドメインが、第１のＣＨ２（ＣＨ２１）ドメイン、第１のＣＨ３（ＣＨ３１）ドメイン、第２のＣＨ２（ＣＨ２２）ドメイン、及び第２のＣＨ３（ＣＨ３２）ドメインから選択され、
前記成分が、ＶＨ１−任意選択のＣＨ２１−任意選択のＣＨ３１−ＨＤテザー−ＶＨ２−任意選択のＣＨ２２−任意選択のＣＨ３２の通りに、Ｎ末端からＣ末端の方向に互いに相対的に配置される、
単一ポリペプチドを含む単鎖抗体。
【請求項２】
前記一又は複数の重鎖定常ドメインの少なくとも一つが、別の重鎖定常ドメインと対合される、請求項１に記載の単鎖抗体。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、
（ａ）前記ＶＨ１とＣＨ２１ドメインの間に配置された第１のヒンジ（ヒンジ１）ドメイン、
（ｂ）前記ＶＨ２とＣＨ２２ドメインの間に配置された第２のヒンジ（ヒンジ２）ドメイン、又は
（ｃ）第１のヒンジ（ヒンジ１）ドメイン及び第２のヒンジ（ヒンジ２）ドメインの両方
を更に含み、
前記ドメインが、ＶＨ１−任意選択のヒンジ１−任意選択のＣＨ２１−任意選択のＣＨ３１−ＨＤテザー−ＶＨ２−任意選択のヒンジ２−任意選択のＣＨ２２−任意選択のＣＨ３２の通り、Ｎ末端からＣ末端の方向に互いに相対的に配置される、請求項１又は２に記載の単鎖抗体。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、第１のＣＨ１（ＣＨ１１）ドメイン又は第２のＣＨ１（ＣＨ１２）ドメインあるいは両方を含む、請求項１から３の何れか一項に記載の単鎖抗体。
【請求項５】
前記ポリペプチドが、ＶＨ１−任意選択のＣＨ１１−任意選択のヒンジ１−任意選択のＣＨ２１−任意選択のＣＨ３１−ＨＤテザー−ＶＨ２−任意選択のＣＨ１２−任意選択のヒンジ２−任意選択のＣＨ２２−任意選択のＣＨ３２の通り、Ｎ末端からＣ末端の方向に互いに相対的に配置されたドメインを含む、請求項４に記載の単鎖抗体。
【請求項６】
前記ポリペプチドが、第１のＶＬ（ＶＬ１）ドメイン又は第２のＶＬ（ＶＬ２）ドメイン又は両方を更に含む、請求項１から５の何れか一項に記載の単鎖抗体。
【請求項７】
前記ポリペプチドがＶＬ１ドメイン及びＶＬ２ドメインを含み、前記ＶＬ１ドメインが第１のテザー（ＣＬＨテザー１）により前記ＶＨ１ドメインに連結され、前記ＶＬ２ドメインが第２のテザー（ＣＬＨテザー２）により前記ＶＨ２ドメインに連結され、前記ドメインが、次の通り：ＶＬ１−ＣＬＨテザー１−ＶＨ１−任意選択のＣＨ１１−任意選択のヒンジ１−ＣＨ２１−ＣＨ３１−ＨＤテザー−ＶＬ２−ＣＬＨテザー２−ＶＨ２−任意選択のＣＨ１２−任意選択のヒンジ２−ＣＨ２２−ＣＨ３２、Ｎ末端からＣ末端の方向に互いに相対的に配置される、請求項６に記載の単鎖抗体。
【請求項８】
前記ポリペプチドが、第１のＣＬ（ＣＬ１）ドメイン又は第２のＣＬ（ＣＬ２）ドメイン又は両方を含む、請求項７に記載の単鎖抗体。
【請求項９】
前記ポリペプチドが、ＶＬ１−任意選択のＣＬ１−ＣＬＨテザー１−ＶＨ１−任意選択のＣＨ１１−任意選択のヒンジ１−任意選択のＣＨ２１−任意選択のＣＨ３１−ＨＤテザー−ＶＬ２−任意選択のＣＬ２−ＣＬＨテザー２−ＶＨ２−任意選択のＣＨ１２−任意選択のヒンジ２−任意選択のＣＨ２２−任意選択のＣＨ３２の通り、Ｎ末端からＣ末端の方向に互いに相対的に配置されるＣＬ１ドメイン又はＣＬ２ドメインを含む、請求項８に記載の単鎖抗体。
【請求項１０】
Ｎ末端からＣ末端の方向に互いに相対的に配置された以下のドメイン、すなわち、ＶＬ１−ＣＬ１−ＣＬＨテザー１−ＶＨ１−ＣＨ１１−ヒンジ１−ＣＨ２１−ＣＨ３１−ＨＤテザー−ＶＬ２−ＣＬ２−ＣＬＨテザー２−ＶＨ２−ＣＨ１２−ヒンジ２−ＣＨ２２−ＣＨ３２を含む単一ポリペプチドを含む単鎖抗体。
【請求項１１】
前記ＨＤテザーが１５〜１００アミノ酸長である、請求項１から１０に記載の単鎖抗体。
【請求項１２】
前記ＨＤテザーが３０〜３９アミノ酸長である、請求項１１に記載の単鎖抗体。
【請求項１３】
前記ＨＤテザーがグリシン（Ｇ）及びセリン（Ｓ）残基を含む、請求項１から１２の何れか一項に記載の単鎖抗体。
【請求項１４】
前記ＨＤテザーがＧＧＳリピートを含む、請求項１３に記載の単鎖抗体。
【請求項１５】
前記ＨＤテザーが８から９個のＧＧＳリピート（配列番号１９）を含む、請求項１４に記載の単鎖抗体。
【請求項１６】
前記ＨＤテザーが、エンドペプチダーゼにより切断可能なアミノ酸配列を含む、請求項１から１５の何れか一項に記載の単鎖抗体。
【請求項１７】
前記アミノ酸配列が、前記エンドペプチダーゼによりインサイチュで切断される、請求項１６に記載の単鎖抗体。
【請求項１８】
前記アミノ酸配列が、精製後に前記エンドペプチダーゼを添加すると切断される、請求項１６に記載の単鎖抗体。
【請求項１９】
前記ＨＤテザーが、前記ＨＤテザーのＮ末端及びＣ末端に位置するエンドペプチダーゼにより切断可能な２つのアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の単鎖抗体。
【請求項２０】
前記エンドペプチダーゼが、フューリン、ウロキナーゼ、トロンビン、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰａ）、ゲネナーゼ、Ｌｙｓ−Ｃ、Ａｒｇ−Ｃ、Ａｓｐ−Ｎ、Ｇｌｕ−Ｃ、第Ｘａ因子、タバコエッチウイルスプロテアーゼ（ＴＥＶ）、エンテロキナーゼ、ヒトライノウイルスＣ３プロテアーゼ（ＨＲＶ  Ｃ３）、及びキニノゲナーゼからなる群から選択される、請求項１６から１９の何れか一項に記載の単鎖抗体。
【請求項２１】
前記エンドペプチダーゼがフューリンである、請求項２０に記載の単鎖抗体。
【請求項２２】
前記ＨＤテザーが、前記ＨＤテザーのＮ末端及びＣ末端に位置する２つのエンドペプチダーゼ切断部位を含み、前記エンドペプチダーゼ切断部位の１つがフューリン切断部位である、請求項２１に記載の単鎖抗体。
【請求項２３】
フューリンにより切断可能なアミノ酸配列が、アミノ酸配列ＲＫＲＫＲＲ（配列番号９）を含む、請求項２１又は２２に記載の単鎖抗体。
【請求項２４】
フューリンにより切断可能なアミノ酸配列が、アミノ酸配列ＲＨＲＱＰＲ（配列番号１０）を含む、請求項２１又は２２に記載の単鎖抗体。
【請求項２５】
前記エンドペプチダーゼ切断部位の１つがＬｙｓ−Ｃ切断部位である、請求項２２に記載の単鎖抗体。
【請求項２６】
前記ＣＬＨテザー１又は前記ＣＬＨテザー２がグリシン（Ｇ）及びセリン（Ｓ）残基を含む、請求項７から２５の何れか一項に記載の単鎖抗体。
【請求項２７】
前記ＣＬＨテザー１又は前記ＣＬＨテザー２がＧＧＳリピートを含む、請求項２６に記載の単鎖抗体。
【請求項２８】
前記ＣＬＨテザー１及び前記ＣＬＨテザー２がグリシン（Ｇ）及びセリン（Ｓ）残基を含む、請求項２６に記載の単鎖抗体。
【請求項２９】
前記ＣＬＨテザー１及び前記ＣＬＨテザー２がＧＧＳリピートを含む、請求項２７に記載の単鎖抗体。
【請求項３０】
前記ＣＬＨテザー１及び前記ＣＬＨテザー２がそれぞれ１０〜８０アミノ酸長である、請求項２６から２９に記載の単鎖抗体。
【請求項３１】
前記ＣＬＨテザー１及び前記ＣＬＨテザー２がそれぞれ２０〜４０アミノ酸長である、請求項３０に記載の単鎖抗体。
【請求項３２】
前記ＣＬＨテザー１又は前記ＣＬＨテザー２が、エンドペプチダーゼにより切断可能なアミノ酸配列を含む、請求項７から３１の何れか一項に記載の単鎖抗体。
【請求項３３】
前記アミノ酸配列が、前記エンドペプチダーゼによりインサイチュで切断される、請求項３２に記載の単鎖抗体。
【請求項３４】
前記アミノ酸配列が、精製後に前記エンドペプチダーゼを添加すると切断される、請求項３２に記載の単鎖抗体。
【請求項３５】
前記ＣＬＨテザー１及び前記ＣＬＨテザー２が、エンドペプチダーゼにより切断可能なアミノ酸配列を含む、請求項３２に記載の単鎖抗体。
【請求項３６】
前記エンドペプチダーゼが、フューリン、ウロキナーゼ、トロンビン、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰａ）、ゲネナーゼ、Ｌｙｓ−Ｃ、Ａｒｇ−Ｃ、Ａｓｐ−Ｎ、Ｇｌｕ−Ｃ、第Ｘａ因子、タバコエッチウイルスプロテアーゼ（ＴＥＶ）、エンテロキナーゼ、ヒトライノウイルスＣ３プロテアーゼ（ＨＲＶ  Ｃ３）、及びキニノゲナーゼからなる群から選択される、請求項３２から３４の何れか一項に記載の単鎖抗体。
【請求項３７】
前記エンドペプチダーゼがフューリンである、請求項３６に記載の単鎖抗体。
【請求項３８】
前記ＣＬＨテザー１又は前記ＣＬＨテザー２が、前記ＣＬＨテザー１又は前記ＣＬＨテザー２のＮ末端及びＣ末端に位置する２つのエンドペプチダーゼ切断部位を含み、前記エンドペプチダーゼ切断部位が両方ともフューリン切断部位である、請求項３７に記載の単鎖抗体。
【請求項３９】
前記ＣＬＨテザー１及び前記ＣＬＨテザー２が、前記ＣＬＨテザー１及び前記ＣＬＨテザー２のＮ末端及びＣ末端に位置する２つのエンドペプチダーゼ切断部位をそれぞれ含み、前記エンドペプチダーゼ切断部位がフューリン切断部位である、請求項３８に記載の単鎖抗体。
【請求項４０】
フューリンにより切断可能なアミノ酸配列が、アミノ酸配列ＲＫＲＫＲＲ（配列番号９）を含む、請求項３７から３９の何れか一項に記載の単鎖抗体。
【請求項４１】
フューリンにより切断可能なアミノ酸配列が、アミノ酸配列ＲＨＲＱＰＲ（配列番号１０）を含む、請求項３７から３９の何れか一項に記載の単鎖抗体。
【請求項４２】
前記第１のヒンジドメイン又は前記第２のヒンジドメインが、ヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２１６からＰｒｏ２３０を含む、請求項３から４１に記載の単鎖抗体。
【請求項４３】
前記第１のヒンジドメイン又は前記第２のヒンジドメインが、Ｌｙｓ−Ｃエンドペプチダーゼ切断部位を含む、請求項４２に記載の単鎖抗体。
【請求項４４】
前記Ｌｙｓ−Ｃエンドペプチダーゼ切断部位が不活性化変異を含む、請求項４３に記載の単鎖抗体。
【請求項４５】
前記不活性化変異がＫ２２２Ａ置換（ＥＵナンバリングシステム）である、請求項４４に記載の単鎖抗体。
【請求項４６】
前記単鎖抗体が単一特異性単鎖抗体である、請求項１から４５の何れか一項に記載の単鎖抗体。
【請求項４７】
前記単鎖抗体が二重特異性又は多重特異性単鎖抗体である、請求項１から４５の何れか一項に記載の単鎖抗体。
【請求項４８】
前記単鎖抗体が少なくとも２つの抗原に結合することができる、請求項４７に記載の単鎖抗体。
【請求項４９】
前記単鎖抗体が、同じ抗原上の少なくとも２つのエピトープを結合することができる、請求項４７に記載の単鎖抗体。
【請求項５０】
前記単鎖抗体が、少なくとも一つのＦｃ成分における機能性部分にコンジュゲートされた定常領域を含む、請求項１から４９の何れか一項に記載の単鎖抗体。
【請求項５１】
前記単鎖抗体が、一又は複数の前記ＨＤ又はＣＬＨテザーの切断後にエキソペプチダーゼに対する一又は複数の切断部位を含む、請求項１から５０の何れか一項に記載の単鎖抗体。
【請求項５２】
前記一又は複数の切断部位が、前記エキソペプチダーゼによりインサイチュで切断される、請求項５１に記載の単鎖抗体。
【請求項５３】
前記一又は複数の切断部位が、精製後に前記エキソペプチダーゼを添加すると切断される、請求項５１に記載の単鎖抗体。
【請求項５４】
前記エキソペプチダーゼが、カルボキシペプチダーゼＡ、カルボキシペプチダーゼＢ、血漿カルボキシペプチダーゼＢ、カルボキシペプチダーゼＤ、カルボキシペプチダーゼＥ、カルボキシペプチダーゼＭ、カルボキシペプチダーゼＮ、及びカルボキシペプチダーゼＺからなる群から選択される、請求項５１から５３の何れか一項に記載の単鎖抗体。
【請求項５５】
前記エキソペプチダーゼが塩基性残基で切断する、請求項５４に記載の単鎖抗体。
【請求項５６】
前記エキソペプチダーゼがカルボキシペプチダーゼＢである、請求項５５に記載の単鎖抗体。
【請求項５７】
前記ＣＨ３１及びＣＨ３２ドメインがそれぞれ突起又はキャビティを含み、前記ＣＨ３１ドメイン中の前記突起又はキャビティが、それぞれ前記ＣＨ３２ドメイン中の前記キャビティ又は突起に配置可能である、請求項１から５６の何れか一項に記載の単鎖抗体。
【請求項５８】
前記ＣＨ３１及びＣＨ３２ドメインが前記突起とキャビティの間の界面で会合する、請求項５７に記載の単鎖抗体。
【請求項５９】
前記ポリペプチドが、
（ａ）前記ＣＨ１１ドメイン又は前記ＣＨ１２ドメイン又は両方に突起又はキャビティと、
（ｂ）前記ＣＬ１ドメイン又は前記ＣＬ２ドメイン又は両方に突起又はキャビティと
を更に含み、
（ｃ）前記ＣＨ１１ドメイン中の前記突起もしくはキャビティが、それぞれ前記ＣＬ１ドメイン中の前記キャビティもしくは突起に配置可能であり、
（ｄ）前記ＣＨ１２ドメイン中の前記突起もしくはキャビティが、それぞれ前記ＣＬ２ドメイン中の前記キャビティもしくは突起に配置可能であり、又は
（ｅ）（ｃ）及び（ｄ）の両方である、請求項８から５８の何れか一項に記載の単鎖抗体。
【請求項６０】
前記ＣＨ１１及びＣＬ１ドメイン、前記ＣＨ１２及びＣＬ２ドメイン、又は全ての４つの前記ドメインが、前記突起とキャビティの間の界面で会合する、請求項５９に記載の単鎖抗体。
【請求項６１】
前記ＣＨ２１又はＣＨ２２ドメインの一又は複数が、抗体エフェクター機能に影響を与えるＣＨ２ドメイン変異を含む、請求項１から６０の何れか一項に記載の単鎖抗体。
【請求項６２】
抗体エフェクター機能に影響を与える前記ＣＨ２ドメイン変異がＮ２９７変異である、請求項６１に記載の単鎖抗体。
【請求項６３】
請求項１から６２の何れか一項に記載の単鎖抗体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項６４】
請求項６３に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項６５】
請求項６４に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項６６】
前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項６５に記載の宿主細胞。
【請求項６７】
前記哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞である、請求項６６に記載の宿主細胞。
【請求項６８】
前記宿主細胞が原核生物細胞である、請求項６５に記載の宿主細胞。
【請求項６９】
前記原核生物細胞が大腸菌（ｅ．ｃｏｌｉ）細胞である、請求項６８に記載の宿主細胞。
【請求項７０】
請求項１から６２の何れか一項に記載の単鎖抗体を作製する方法であって、請求項６４のベクターを含む宿主細胞を培養培地で培養することを含む方法。
【請求項７１】
前記宿主細胞又は前記培養培地から前記単鎖抗体を回収することを更に含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
以下の成分、すなわち、
（ａ）それぞれＶＬドメイン及びＣＬドメインを含む第１及び第２の同一ポリペプチドと、
（ｂ）（ｉ）第１のＶＨ（ＶＨ１）及び第２のＶＨ（ＶＨ２）ドメイン、
（ｉｉ）ＨＤテザー、
（ｉｉｉ）第１のヒンジ（ヒンジ１）ドメイン又は第２のヒンジ（ヒンジ２）ドメイン又は両方、及び
（ｉｖ）一又は複数の重鎖定常ドメイン
を含む第３のポリペプチドと
を含み、
前記一又は複数の重鎖定常ドメインが、第１のＣＨ１（ＣＨ１１）ドメイン、第１のＣＨ２（ＣＨ２１）ドメイン、第１のＣＨ３（ＣＨ３１）ドメイン、第２のＣＨ１（ＣＨ１２）ドメイン、第２のＣＨ２（ＣＨ２２）ドメイン、及び第２のＣＨ３（ＣＨ３２）ドメインから選択され、
前記第３のポリペプチドの前記成分が、ＶＨ１−任意選択のＣＨ１１−任意選択のヒンジ１−任意選択のＣＨ２１−任意選択のＣＨ３１−ＨＤテザー−ＶＨ２−任意選択のＣＨ１２−任意選択のヒンジ２−任意選択のＣＨ２２−任意選択のＣＨ３２の通り、Ｎ末端からＣ末端の方向に互いに相対的に配置される、抗体。
【請求項７３】
前記第１のポリペプチドの前記ＶＬ及びＣＬドメインが、それぞれ前記ＶＨ１及びＣＨ１１ドメインと結合し、前記第２のポリペプチドの前記ＶＬ及びＣＬドメインが、それぞれ前記ＶＨ２及びＣＨ１２ドメインと結合する、請求項７２に記載の抗体。
【請求項７４】
以下の成分、すなわち、
（ａ）第１のＶＬ（ＶＬ１）ドメイン及び第１のＣＬ（ＣＬ１）ドメインを含む第１のポリペプチドと、
（ｂ）（ｉ）第１のＶＨ（ＶＨ１）及び第２のＶＨ（ＶＨ２）ドメイン、
（ｉｉ）ＨＤテザー、
（ｉｉｉ）第２のＶＬ（ＶＬ２）及び第２のＣＬ（ＣＬ２）ドメイン、
（ｉｖ）ＣＬＨテザー、
（ｖ）第１のヒンジ（ヒンジ１）ドメイン又は第２のヒンジ（ヒンジ２）ドメイン又は両方、及び
（ｖｉ）一又は複数の重鎖定常ドメイン
を含む第２のポリペプチドと
を含み、
前記一又は複数の重鎖定常ドメインが、第１のＣＨ１（ＣＨ１１）ドメイン、第１のＣＨ２（ＣＨ２１）ドメイン、第１のＣＨ３（ＣＨ３１）ドメイン、第２のＣＨ１（ＣＨ１２）ドメイン、第２のＣＨ２（ＣＨ２２）ドメイン、及び第２のＣＨ３（ＣＨ３２）ドメインから選択され、
前記第２のポリペプチドの前記成分が、ＶＨ１−任意選択のＣＨ１１−任意選択のヒンジ１−任意選択のＣＨ２１−任意選択のＣＨ３１−ＨＤテザー−ＶＬ２−ＣＬ２−ＣＬＨテザー−ＶＨ２−任意選択のＣＨ１２−任意選択のヒンジ２−任意選択のＣＨ２２−任意選択のＣＨ３２の通り、Ｎ末端からＣ末端の方向に互いに相対的に配置される、抗体。
【請求項７５】
以下の成分、すなわち、
（ａ）（ｉ）第１のＶＬ（ＶＬ１）ドメイン及び第１のＣＬ（ＣＬ１）ドメインと、
（ｉｉ）ＣＬＨテザー、
（ｉｉｉ）第１のＶＨ（ＶＨ１）及び第２のＶＨ（ＶＨ２）ドメイン、
（ｉｖ）ＨＤテザー、
（ｖ）第１のヒンジ（ヒンジ１）ドメイン又は第２のヒンジ（ヒンジ２）ドメイン又は両方、及び
（ｖｉ）一又は複数の重鎖定常ドメイン
を含む第１のポリペプチドと、
（ｂ）第２のＶＬ（ＶＬ２）ドメイン及び第２のＣＬ（ＣＬ２）ドメインを含む第２のポリペプチドと
を含み、
前記第１のポリペプチドの前記一又は複数の重鎖定常ドメインが、第１のＣＨ１（ＣＨ１１）ドメイン、第１のＣＨ２（ＣＨ２１）ドメイン、第１のＣＨ３（ＣＨ３１）ドメイン、第２のＣＨ１（ＣＨ１２）ドメイン、第２のＣＨ２（ＣＨ２２）ドメイン、及び第２のＣＨ３（ＣＨ３２）ドメインから選択され、
前記第１のポリペプチドの前記成分が、ＶＬ１−ＣＬ１−ＣＬＨテザー−ＶＨ１−任意選択のＣＨ１１−任意選択のヒンジ１−任意選択のＣＨ２１−任意選択のＣＨ３１−ＨＤテザー−ＶＨ２−任意選択のＣＨ１２−任意選択のヒンジ２−任意選択のＣＨ２２−任意選択のＣＨ３２の通り、Ｎ末端からＣ末端の方向に互いに相対的に配置される、抗体。
【請求項７６】
前記一又は複数の重鎖定常ドメインの少なくとも一つが、別の重鎖定常ドメインと対合される、請求項７２から７５の何れか一項に記載の抗体。
【請求項７７】
前記ＨＤテザーが１５〜１００アミノ酸長である、請求項７２から７５の何れか一項に記載の抗体。
【請求項７８】
前記ＨＤテザーが３０〜３９アミノ酸長である、請求項７７に記載の抗体。
【請求項７９】
前記ＨＤテザーがグリシン（Ｇ）及びセリン（Ｓ）残基を含む、請求項７２から７８の何れか一項に記載の抗体。
【請求項８０】
前記ＨＤテザーがＧＧＳリピートを含む、請求項７９に記載の抗体。
【請求項８１】
前記ＨＤテザーが８から９個のＧＧＳリピート（配列番号１９）を含む、請求項８０に記載の抗体。
【請求項８２】
前記ＨＤテザーが、エンドペプチダーゼにより切断可能なアミノ酸配列を含む、請求項７２から８１の何れか一項に記載の抗体。
【請求項８３】
前記アミノ酸配列が、前記エンドペプチダーゼによりインサイチュで切断される、請求項８２に記載の抗体。
【請求項８４】
前記アミノ酸配列が、精製後に前記エンドペプチダーゼを添加すると切断される、請求項８２に記載の抗体。
【請求項８５】
前記ＨＤテザーが、前記ＨＤテザーのＮ末端及びＣ末端に位置するエンドペプチダーゼにより切断可能な２つのアミノ酸配列を含む、請求項８２に記載の抗体。
【請求項８６】
前記エンドペプチダーゼが、フューリン、ウロキナーゼ、トロンビン、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰａ）、ゲネナーゼ、Ｌｙｓ−Ｃ、Ａｒｇ−Ｃ、Ａｓｐ−Ｎ、Ｇｌｕ−Ｃ、第Ｘａ因子、タバコエッチウイルスプロテアーゼ（ＴＥＶ）、エンテロキナーゼ、ヒトライノウイルスＣ３プロテアーゼ（ＨＲＶ  Ｃ３）、及びキニノゲナーゼからなる群から選択される、請求項８２から８５の何れか一項に記載の抗体。
【請求項８７】
前記エンドペプチダーゼがフューリンである、請求項８６に記載の抗体。
【請求項８８】
前記ＨＤテザーが、前記ＨＤテザーのＮ末端及びＣ末端に位置する２つのエンドペプチダーゼ切断部位を含み、前記エンドペプチダーゼ切断部位の１つがフューリン切断部位である、請求項８７に記載の抗体。
【請求項８９】
フューリンにより切断可能なアミノ酸配列が、アミノ酸配列ＲＫＲＫＲＲ（配列番号９）を含む、請求項８６から８８の何れか一項に記載の抗体。
【請求項９０】
フューリンにより切断可能なアミノ酸配列が、アミノ酸配列ＲＨＲＱＰＲ（配列番号１０）を含む、請求項８６から８８の何れか一項に記載の抗体。
【請求項９１】
前記エンドペプチダーゼ切断部位の１つがＬｙｓ−Ｃ切断部位である、請求項９０に記載の抗体。
【請求項９２】
前記ＣＬＨテザーがグリシン（Ｇ）及びセリン（Ｓ）残基を含む、請求項７４から９１の何れか一項に記載の抗体。
【請求項９３】
前記ＣＬＨテザーがＧＧＳリピートを含む、請求項９２に記載の抗体。
【請求項９４】
前記ＣＬＨテザーが１０〜８０アミノ酸長である、請求項９２又は９３に記載の抗体。
【請求項９５】
前記ＣＬＨテザーが２０〜４０アミノ酸長である、請求項９４に記載の抗体。
【請求項９６】
前記ＣＬＨテザーが、エンドペプチダーゼにより切断可能なアミノ酸配列を含む、請求項７４から９５の何れか一項に記載の抗体。
【請求項９７】
前記アミノ酸配列が、前記エンドペプチダーゼによりインサイチュで切断される、請求項９６に記載の抗体。
【請求項９８】
前記アミノ酸配列が、精製後に前記エンドペプチダーゼを添加すると切断される、請求項９６に記載の抗体。
【請求項９９】
前記エンドペプチダーゼが、フューリン、ウロキナーゼ、トロンビン、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰａ）、ゲネナーゼ、Ｌｙｓ−Ｃ、Ａｒｇ−Ｃ、Ａｓｐ−Ｎ、Ｇｌｕ−Ｃ、第Ｘａ因子、タバコエッチウイルスプロテアーゼ（ＴＥＶ）、エンテロキナーゼ、ヒトライノウイルスＣ３プロテアーゼ（ＨＲＶ  Ｃ３）、及びキニノゲナーゼからなる群から選択される、請求項９６から９８の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１００】
前記エンドペプチダーゼがフューリンである、請求項９９の抗体。
【請求項１０１】
前記ＣＬＨテザーが、前記ＣＬＨテザーのＮ末端及びＣ末端に位置する２つのエンドペプチダーゼ切断部位を含み、前記エンドペプチダーゼ切断部位が両方ともフューリン切断部位である、請求項１００に記載の抗体。
【請求項１０２】
フューリンにより切断可能なアミノ酸配列が、アミノ酸配列ＲＫＲＫＲＲ（配列番号９）を含む、請求項９９から１０１の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１０３】
フューリンにより切断可能なアミノ酸配列が、アミノ酸配列ＲＨＲＱＰＲ（配列番号１０）を含む、請求項９９から１０１の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１０４】
前記第１のヒンジドメイン又は前記第２のヒンジドメインが、ヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２１６からＰｒｏ２３０を含む、請求項７２から１０３の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１０５】
前記第１のヒンジドメイン又は前記第２のヒンジドメインが、Ｌｙｓ−Ｃエンドペプチダーゼ切断部位を含む、請求項１０４に記載の抗体。
【請求項１０６】
前記Ｌｙｓ−Ｃエンドペプチダーゼ切断部位が不活性化変異を含む、請求項１０５に記載の抗体。
【請求項１０７】
前記不活性化変異がＫ２２２Ａ置換（ＥＵナンバリングシステム）である、請求項１０６に記載の抗体。
【請求項１０８】
前記抗体が単一特異性抗体である、請求項７２から１０７の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１０９】
前記抗体が二重特異性又は多重特異性抗体である、請求項７２から１０７の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１１０】
前記抗体が少なくとも２つの抗原に結合することができる、請求項１０９に記載の抗体。
【請求項１１１】
前記抗体が、同じ抗原上の少なくとも２つのエピトープを結合することができる、請求項１１０に記載の抗体。
【請求項１１２】
前記抗体が細胞傷害性剤にコンジュゲートされた定常領域を含む、請求項７２から１１１の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１１３】
前記抗体が、前記ＨＤテザーの切断後にエキソペプチダーゼに対する一又は複数の切断部位を含む、請求項７２から１１２の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１１４】
前記抗体が、前記ＣＬＨテザーの切断後にエキソペプチダーゼに対する一又は複数の切断部位を含む、請求項７４から１１３の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１１５】
前記一又は複数の切断部位が、前記エキソペプチダーゼによりインサイチュで切断される、請求項１１３又は１１４に記載の抗体。
【請求項１１６】
前記一又は複数の切断部位が、精製後に前記エキソペプチダーゼを添加すると切断される、請求項１１３又は１１４に記載の抗体。
【請求項１１７】
前記エキソペプチダーゼが、カルボキシペプチダーゼＡ、カルボキシペプチダーゼＢ、血漿カルボキシペプチダーゼＢ、カルボキシペプチダーゼＤ、カルボキシペプチダーゼＥ、カルボキシペプチダーゼＭ、カルボキシペプチダーゼＮ、及びカルボキシペプチダーゼＺからなる群から選択される、請求項１１３から１１６の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１１８】
前記エキソペプチダーゼが塩基性残基で切断する、請求項１１７に記載の抗体。
【請求項１１９】
前記エキソペプチダーゼがカルボキシペプチダーゼＢである、請求項１１８に記載の抗体。
【請求項１２０】
前記ＣＨ３１及びＣＨ３２ドメインがそれぞれ突起又はキャビティを含み、前記ＣＨ３１ドメイン中の前記突起又はキャビティが、それぞれ前記ＣＨ３２ドメイン中の前記キャビティ又は突起に配置可能である、請求項７２から１１９の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１２１】
前記ＣＨ３１及びＣＨ３２ドメインが前記突起とキャビティの間の界面で会合する、請求項１２０に記載の抗体。
【請求項１２２】
前記ポリペプチドが、
（ａ）前記ＣＨ１１ドメイン又は前記ＣＨ１２ドメイン又は両方に突起又はキャビティと、
（ｂ）前記ＣＬ１ドメイン又は前記ＣＬ２ドメイン又は両方に突起又はキャビティと
を更に含み、
（ｃ）前記ＣＨ１１ドメイン中の前記突起もしくはキャビティが、それぞれ前記ＣＬ１ドメイン中の前記キャビティもしくは突起に配置可能であり、
（ｄ）前記ＣＨ１２ドメイン中の前記突起もしくはキャビティが、それぞれ前記ＣＬ２ドメイン中の前記キャビティもしくは突起に配置可能であり、又は
（ｅ）（ｃ）及び（ｄ）の両方である、請求項７２から１２１の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１２３】
前記ＣＨ１１及びＣＬ１ドメイン、前記ＣＨ１２及びＣＬ２ドメイン、又は全ての４つの前記ドメインが、前記突起とキャビティの間の界面で会合する、請求項１２２に記載の抗体。
【請求項１２４】
前記ＣＨ２１又はＣＨ２２ドメインの一又は複数が、抗体エフェクター機能に影響を与えるＣＨ２ドメイン変異を含む、請求項７２から１２３の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１２５】
前記抗体エフェクター機能に影響を与える前記ＣＨ２ドメイン変異がＮ２９７変異である、請求項１２４に記載の抗体。
【請求項１２６】
請求項７２から１２５の何れか一項に記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１２７】
請求項１２６に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１２８】
請求項１２７に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１２９】
前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項１２８に記載の宿主細胞。
【請求項１３０】
前記哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞である、請求項１２９に記載の宿主細胞。
【請求項１３１】
前記宿主細胞が原核生物細胞である、請求項１２８に記載の宿主細胞。
【請求項１３２】
原核生物細胞が大腸菌である、請求項１３１に記載の宿主細胞。
【請求項１３３】
請求項７２から１２５の何れか一項に記載の抗体を作製する方法であって、請求項１２７のベクターを含む宿主細胞を培養培地で培養することを含む方法。
【請求項１３４】
前記宿主細胞又は前記培養培地から前記抗体を回収することを更に含む、請求項１３３に記載の方法。
【請求項１３５】
以下の成分、すなわち、
（ａ）アドヘシンと、
（ｂ）第１のＣＨ２（ＣＨ２１）ドメイン又は第１のＣＨ３（ＣＨ３１）ドメイン又は両方と、
（ｃ）ＨＤテザーと、
（ｄ）ＶＨドメインと、
（ｅ）ＣＨ１ドメイン、第２のＣＨ２（ＣＨ２２）ドメイン、又は第２のＣＨ３（ＣＨ３２）ドメインから選択される一又は複数の重鎖定常ドメインと
を含み、
ヘテロ多量体の前記成分が、アドヘシン−任意選択のＣＨ２１−任意選択のＣＨ３１−ＨＤテザー−ＶＨ−任意選択のＣＨ１−任意選択のＣＨ２２−任意選択のＣＨ３２の通り、Ｎ末端からＣ末端の方向に互いに相対的に配置される、ヘテロ多量体。
【請求項１３６】
前記ヘテロ多量体が、ＶＬドメイン及びＣＬドメインを含む第２のポリペプチドを更に含み、前記ＶＬドメインが前記ＶＨドメインと結合する、請求項１３５に記載のヘテロ多量体。
【請求項１３７】
前記ヘテロ多量体が、以下の成分、すなわち、
（ａ）ＶＬドメインと、
（ｂ）ＣＬドメインと、
（ｄ）ＣＬＨテザーと
を更に含み、
前記ヘテロ多量体の前記成分が、アドヘシン−任意選択のＣＨ２１−任意選択のＣＨ３１−ＨＤテザー−ＶＬ−ＣＬ−ＣＬＨテザー−ＶＨ−任意選択のＣＨ１−任意選択のＣＨ２２−任意選択のＣＨ３２の通り、Ｎ末端からＣ末端の方向に互いに相対的に配置される、請求項１３５に記載のヘテロ多量体。
【請求項１３８】
アミノ酸スペーサーが前記アドへシンとＣＨ２１ドメインの間に配置される、請求項１３５から１３７の何れか一項のヘテロ多量体。
【請求項１３９】
前記アミノ酸スペーサーがグリシン（Ｇ）及びセリン（Ｓ）残基を含む、請求項１３８に記載のヘテロ多量体。
【請求項１４０】
前記アミノ酸スペーサーがＧＧＳリピートを含む、請求項１３９に記載のヘテロ多量体。
【請求項１４１】
前記アミノ酸スペーサーが１０〜８０アミノ酸長である、請求項１３８から１４０の何れか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項１４２】
前記アミノ酸スペーサーが２０〜４０アミノ酸長である、請求項１４１に記載のヘテロ多量体。
【請求項１４３】
前記ＣＨ２１又はＣＨ３１ドメインが、それぞれ前記ＣＨ２２又はＣＨ３２ドメインと対合される、請求項１３５から１４２の何れか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項１４４】
前記ＣＨ２１及びＣＨ３１ドメインが、それぞれ前記ＣＨ２２及びＣＨ３２ドメインと対合される、請求項１４３に記載のヘテロ多量体。
【請求項１４５】
前記ヘテロ多量体が、前記ＣＨ１とＣＨ２２ドメインの間に配置されたヒンジドメインを更に含む、請求項１３５から１４４の何れか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項１４６】
前記ＨＤテザーが１５〜１００アミノ酸長である、請求項１３５から１４５の何れか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項１４７】
前記ＨＤテザーが３０〜３９アミノ酸長である、請求項１４６に記載のヘテロ多量体。
【請求項１４８】
前記ＨＤテザーがグリシン（Ｇ）及びセリン（Ｓ）残基を含む、請求項１３５から１４７の何れか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項１４９】
前記ＨＤテザーがＧＧＳリピートを含む、請求項１４８に記載のヘテロ多量体。
【請求項１５０】
前記ＨＤテザーが８から９個のＧＧＳリピート（配列番号１９）を含む、請求項１４９に記載のヘテロ多量体。
【請求項１５１】
前記ＨＤテザーが、エンドペプチダーゼにより切断可能なアミノ酸配列を含む、請求項１３５から１５０の何れか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項１５２】
前記アミノ酸配列が、前記エンドペプチダーゼによりインサイチュで切断される、請求項１５１に記載のヘテロ多量体。
【請求項１５３】
前記アミノ酸配列が、精製後に前記エンドペプチダーゼを添加すると切断される、請求項１５１に記載のヘテロ多量体。
【請求項１５４】
前記ＨＤテザーが、前記ＨＤテザーのＮ末端及びＣ末端に位置するエンドペプチダーゼにより切断可能な２つのアミノ酸配列を含む、請求項１５１に記載のヘテロ多量体。
【請求項１５５】
前記エンドペプチダーゼが、フューリン、ウロキナーゼ、トロンビン、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰａ）、ゲネナーゼ、Ｌｙｓ−Ｃ、Ａｒｇ−Ｃ、Ａｓｐ−Ｎ、Ｇｌｕ−Ｃ、第Ｘａ因子、タバコエッチウイルスプロテアーゼ（ＴＥＶ）、エンテロキナーゼ、ヒトライノウイルスＣ３プロテアーゼ（ＨＲＶ  Ｃ３）、及びキニノゲナーゼからなる群から選択される、請求項１５１から１５４の何れか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項１５６】
前記エンドペプチダーゼがフューリンである、請求項１５５に記載のヘテロ多量体。
【請求項１５７】
前記ＨＤテザーが、前記ＨＤテザーのＮ末端及びＣ末端に位置する２つのエンドペプチダーゼ切断部位を含み、前記エンドペプチダーゼ切断部位の１つがフューリン切断部位である、請求項１５６に記載のヘテロ多量体。
【請求項１５８】
フューリンにより切断可能なアミノ酸配列が、アミノ酸配列ＲＫＲＫＲＲ（配列番号９）を含む、請求項１５５から１５７の何れか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項１５９】
フューリンにより切断可能なアミノ酸配列が、アミノ酸配列ＲＨＲＱＰＲ（配列番号１０）を含む、請求項１５５から１５７の何れか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項１６０】
前記エンドペプチダーゼ切断部位の１つがＬｙｓ−Ｃ切断部位である、請求項１５９に記載のヘテロ多量体。
【請求項１６１】
前記ＣＬＨテザーがグリシン（Ｇ）及びセリン（Ｓ）残基を含む、請求項１３７から１６０の何れか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項１６２】
前記ＣＬＨテザーがＧＧＳリピートを含む、請求項１６１に記載のヘテロ多量体。
【請求項１６３】
前記ＣＬＨテザーが１０〜８０アミノ酸長である、請求項１６１又は１６２に記載のヘテロ多量体。
【請求項１６４】
前記ＣＬＨテザーが２０〜４０アミノ酸長である、請求項１６３に記載のヘテロ多量体。
【請求項１６５】
前記ＣＬＨテザーが、エンドペプチダーゼにより切断可能なアミノ酸配列を含む、請求項１３７から１６４の何れか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項１６６】
前記アミノ酸配列が、前記エンドペプチダーゼによりインサイチュで切断される、請求項１６５に記載のヘテロ多量体。
【請求項１６７】
前記アミノ酸配列が、精製後に前記エンドペプチダーゼを添加すると切断される、請求項１６５に記載のヘテロ多量体。
【請求項１６８】
前記エンドペプチダーゼが、フューリン、ウロキナーゼ、トロンビン、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰａ）、ゲネナーゼ、Ｌｙｓ−Ｃ、Ａｒｇ−Ｃ、Ａｓｐ−Ｎ、Ｇｌｕ−Ｃ、第Ｘａ因子、タバコエッチウイルスプロテアーゼ（ＴＥＶ）、エンテロキナーゼ、ヒトライノウイルスＣ３プロテアーゼ（ＨＲＶ  Ｃ３）、及びキニノゲナーゼからなる群から選択される、請求項１６５から１６７の何れか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項１６９】
前記エンドペプチダーゼがフューリンである、請求項１６８に記載のヘテロ多量体。
【請求項１７０】
前記ＣＬＨテザーが、前記ＣＬＨテザーのＮ末端及びＣ末端に位置する２つのエンドペプチダーゼ切断部位を含み、前記エンドペプチダーゼ切断部位が両方ともフューリン切断部位である、請求項１６９に記載のヘテロ多量体。
【請求項１７１】
フューリンにより切断可能なアミノ酸配列が、アミノ酸配列ＲＫＲＫＲＲ（配列番号９）を含む、請求項１６８から１７０の何れか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項１７２】
フューリンにより切断可能なアミノ酸配列が、アミノ酸配列ＲＨＲＱＰＲ（配列番号１０）を含む、請求項１６８から１７０の何れか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項１７３】
前記ヒンジドメインがヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２１６からＰｒｏ２３０を含む、請求項１４５から１７２の何れか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項１７４】
前記ヒンジドメインがＬｙｓ−Ｃエンドペプチダーゼ切断部位を含む、請求項１７３に記載のヘテロ多量体。
【請求項１７５】
前記Ｌｙｓ−Ｃエンドペプチダーゼ切断部位が不活性化変異を含む、請求項１７４に記載のヘテロ多量体。
【請求項１７６】
前記不活性化変異がＫ２２２Ａ置換（ＥＵナンバリングシステム）である、請求項１７５に記載のヘテロ多量体。
【請求項１７７】
前記ヘテロ多量体が単一特異性ヘテロ多量体である、請求項１３５から１７６の何れか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項１７８】
前記ヘテロ多量体が二重特異性又は多重特異性ヘテロ多量体である、請求項１３５から１７６の何れか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項１７９】
前記ヘテロ多量体が少なくとも２つの抗原に結合することができる、請求項１７８に記載のヘテロ多量体。
【請求項１８０】
前記ヘテロ多量体が、同じ抗原上の少なくとも２つのエピトープを結合することができる、請求項１７９に記載のヘテロ多量体。
【請求項１８１】
前記ヘテロ多量体が細胞傷害性剤にコンジュゲートされた定常領域を含む、請求項１３５から１８０の何れか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項１８２】
前記ヘテロ多量体が、前記ＣＬＨテザーの切断後にエキソペプチダーゼに対する一又は複数の切断部位を含む、請求項１３７から１８１の何れか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項１８３】
前記一又は複数の切断部位が、前記エキソペプチダーゼによりインサイチュで切断される、請求項１８２に記載のヘテロ多量体。
【請求項１８４】
前記一又は複数の切断部位が、精製後に前記エキソペプチダーゼを添加すると切断される、請求項１８３に記載のヘテロ多量体。
【請求項１８５】
前記エキソペプチダーゼが、カルボキシペプチダーゼＡ、カルボキシペプチダーゼＢ、血漿カルボキシペプチダーゼＢ、カルボキシペプチダーゼＤ、カルボキシペプチダーゼＥ、カルボキシペプチダーゼＭ、カルボキシペプチダーゼＮ、及びカルボキシペプチダーゼＺからなる群から選択される、請求項１８２から１８４の何れか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項１８６】
前記エキソペプチダーゼが塩基性残基で切断する、請求項１８５に記載のヘテロ多量体。
【請求項１８７】
前記エキソペプチダーゼがカルボキシペプチダーゼＢである、請求項１８６に記載のヘテロ多量体。
【請求項１８８】
前記ＣＨ３１及びＣＨ３２ドメインがそれぞれ突起又はキャビティを含み、前記ＣＨ３１ドメイン中の前記突起又はキャビティが、それぞれ前記ＣＨ３２ドメイン中の前記キャビティ又は突起に配置可能である、請求項１３５から１８７の何れか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項１８９】
前記ＣＨ３１及びＣＨ３２ドメインが前記突起とキャビティの間の界面で会合する、請求項１８８に記載のヘテロ多量体。
【請求項１９０】
前記ＣＨ１及びＣＬドメインがそれぞれ突起又はキャビティを含み、前記ＣＨ１ドメイン中の前記突起又はキャビティが、それぞれ前記ＣＬドメイン中の前記キャビティ又は突起に配置可能である、請求項１３６から１８９の何れか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項１９１】
前記ＣＨ１及びＣＬドメインが前記突起とキャビティの間の界面で会合する、請求項１９０に記載のヘテロ多量体。
【請求項１９２】
前記ＣＨ２１又はＣＨ２２ドメインの一又は複数が、免疫グロブリン定常ドメイン成分のエフェクター機能に影響を与えるＣＨ２ドメイン変異を含む、請求項１３５から１９１の何れか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項１９３】
免疫グロブリン定常ドメイン成分のエフェクター機能に影響を与える前記ＣＨ２ドメイン変異がＮ２９７変異である、請求項１９２に記載のヘテロ多量体。
【請求項１９４】
請求項１３５から１９３の何れか一項に記載のヘテロ多量体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１９５】
請求項１９４に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１９６】
請求項１９５に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１９７】
前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項１９６に記載の宿主細胞。
【請求項１９８】
前記哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞である、請求項１９７に記載の宿主細胞。
【請求項１９９】
前記宿主細胞が原核生物細胞である、請求項１９６に記載の宿主細胞。
【請求項２００】
前記原核生物細胞が大腸菌である、請求項１９９に記載の宿主細胞。
【請求項２０１】
請求項１３５から１９３の何れか一項に記載のヘテロ多量体を作製する方法であって、請求項１９５のベクターを含む宿主細胞を培養培地で培養することを含む方法。
【請求項２０２】
前記宿主細胞又は前記培養培地から前記ヘテロ多量体を回収することを更に含む、請求項２０１に記載の方法。
【請求項２０３】
Ｎ末端からＣ末端の方向に互いに相対的に配置された以下のドメイン、すなわち、ＶＬ１−ＣＬ１−ＣＬＨテザー１−ＶＨ１−ＣＨ１１−ヒンジ１−ＣＨ２１−ＣＨ３１−ＨＤテザー−ＶＬ２−ＣＬ２−ＣＬＨテザー２−ＶＨ２−ＣＨ１２−ヒンジ２−ＣＨ２２−ＣＨ３２を含む単一ポリペプチドを含み、ＣＬＨテザー１、ＣＬＨテザー２及びＨＤテザーが、それぞれフューリンエンドペプチダーゼにより切断可能なアミノ酸配列を含む、単鎖抗体。
【請求項２０４】
フューリン切断可能配列がアミノ酸配列ＲＫＲＫＲＲ（配列番号９）を含む、請求項２０３に記載の単鎖抗体。
【請求項２０５】
フューリン切断可能配列がアミノ酸配列ＲＨＲＱＰＲ（配列番号１０）を含む、請求項２０３に記載の単鎖抗体。
【請求項２０６】
請求項２０３又は２０５の何れか一項に記載の単鎖抗体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２０７】
請求項２０６に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２０８】
請求項２０７に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２０９】
前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項２０８に記載の宿主細胞。
【請求項２１０】
前記哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞である、請求項２０９に記載の宿主細胞。
【請求項２１１】
前記宿主細胞が原核生物細胞である、請求項２０８に記載の宿主細胞。
【請求項２１２】
前記原核生物細胞が大腸菌である、請求項２１１に記載の宿主細胞。
【請求項２１３】
請求項２０３から２０５の何れか一項に記載の単鎖抗体を作製する方法であって、請求項２０７のベクターを含む宿主細胞を培養培地で培養することを含む方法。
【請求項２１４】
前記宿主細胞又は前記培養培地から前記単鎖抗体を回収することを更に含む、請求項２１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１２年２月１０日に出願された米国仮出願第６１／５９７，４８６号に関連し、その優先権の利益を主張するものであり、該出願の開示はその全体を出典明示によりここに援用する。
【０００２】
配列表
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂ経由でＡＳＣＩＩ形式で提出された、その全体が出典明示によりここに援用される配列表を含む。２０１３年１月２８日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、名称Ｐ４７３３Ｒ１ＷＯ＿ＰＣＴＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔであり、サイズ７，５０１バイトである。
【０００３】
発明の分野
本発明は、単一特異性又は多重特異性を有するヘテロ多量体（例えば、単鎖抗体、多重鎖抗体、及びイムノアドヘシン−抗体複合体）を含む新規の改変タンパク質及びタンパク質複合体、これらの構築及び作製方法に関する。本発明はまた、単一特異性又は多重特異性ヘテロ多量体を得るうえで有用な技術の新たな適用にも関する。本明細書に提供された方法により生成されたヘテロ多量体は、抗体の使用が有利である任意の疾患又は病的状態、及び任意の他の用途に対する治療薬として有用である。
【背景技術】
【０００４】
商業及び治療目的に有用で測定可能な、異なる結合特性を有する（例えば、単一特異性又は多重特異性）抗体又は他のヘテロ多量体の作製技術の開発は、とらえどころがない。多くの方法が試みられているが、ほとんど全てが、数ある問題の中でも特に、哺乳動物細胞において発現できないか難溶性であること、低いヘテロ二量体形成収量を示すこと、製造するのが技術的に難しいかもしくは免疫原性であること、短いインビボ半減期を示すこと、あるいは不安定であることなどの重大な欠点を有している（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら、（１９９３）ＰＮＡＳ  ９０：６４４４〜６４４８頁；ＵＳ５，９３２，４４８；ＵＳ６，８３３，４４１；ＵＳ５，５９１，８２８；ＵＳ７，１２９，３３０；ＵＳ７，５０７，７９６；Ｆｉｓｃｈｅｒら、（２００７）Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ  ７４：３〜１４頁；Ｂｏｏｙ（２００６）Ａｒｃｈ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  Ｅｘｐ．  ５４：８５〜１０１頁；Ｃａｏら、（２００３）５５：１７１〜１９７頁；及びＭａｒｖｉｎら、（２００６）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ９（２）：１８４〜１９３頁）。故に、異なる結合特性を有する抗体又は他のヘテロ多量体を作製するための改善された技術及びプロセスが必要である。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、ヘテロ多量体（例えば、新規の単鎖抗体（ｓｃＡｂ）、多重鎖抗体（ｍｃＡｂ）、及びイムノアドヘシン−抗体複合体）並びに該ヘテロ多量体の作製、製造、及び使用の方法を提供する。一態様では、本発明は、第１の重鎖可変（ＶＨ）ドメインを第２のＶＨドメインに連結するヘテロ二量体化（ＨｅｔｅｒｏＤｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）（ＨＤ）テザーを含むヘテロ多量体単鎖抗体を特徴とし、該ヘテロ多量体は、重鎖定常（ＣＨ）ドメインは、第１のＣＨ２ドメイン、第１のＣＨ３ドメイン、第２のＣＨ２ドメイン、及び第２のＣＨ３ドメインから選択される一又は複数の重鎖定常（ＣＨ）ドメインを含む。一実施態様では、ヘテロ多量体は、少なくとも１対の重鎖定常ドメインを含む。別の実施態様では、ヘテロ多量体は、一方又は両方の重鎖上のＶＨとＣＨ２ドメインの間に配置されるヒンジドメインを含み得る。別の実施態様では、ヘテロ多量体は、第１及び／又は第２のＣＨ１ドメインを含む。一又は二のＣＨ１ドメインは、一方もしくは両方のＶＨドメインのＣ末端、及び一方もしくは両方のヒンジドメインのＮ末端、又はヒンジドメインの非存在下では一方もしくは両方のＣＨ２ドメインのＮ末端に配置される。特定の実施態様では、ヘテロ多量体は、一又は二のＣＬＨテザー（Ｃｏｇｎａｔｅ  ＬＣ−ＨＣ  ｔｅｔｈｅｒ（同種ＬＣ−ＨＣテザー））により第１及び／又は第２のＶＨドメインのＮ末端に連結される、一又は二の軽鎖可変（ＶＬ）ドメインも含み得る。幾つかの実施態様では、ヘテロ多量体は、それぞれ一方又は両方のＶＬドメインのＣ末端、及び一方又は両方のＣＬＨテザーのＮ末端のすぐ隣りに配置される、一又は二の軽鎖定常（ＣＬ）ドメインを更に含む。
【０００６】
別の態様では、本発明は、次の通り：ＶＬ１−ＣＬ１−ＣＬＨテザー１−ＶＨ１−ＣＨ１１−ヒンジ１−ＣＨ２１−ＣＨ３１−ＨＤテザー−ＶＬ２−ＣＬ２−ＣＬＨテザー２−ＶＨ２−ＣＨ１２−ヒンジ２−ＣＨ２２−ＣＨ３２、Ｎ末端からＣ末端の方向に互いに相対的に配置されたドメインを有する単一ポリペプチドを含むヘテロ多量体単鎖抗体を特徴とする。
【０００７】
別の態様では、本発明は、３つのポリペプチド鎖を含む多重鎖抗体ヘテロ多量体を特徴とし、第１及び第２のポリペプチド鎖は同一であり、並びに各々が軽鎖（ＬＣ）を形成し、第３のポリペプチド鎖は第１の重鎖（ＨＣ）及び第２のＨＣを形成する。第１及び第２のポリペプチド鎖は、それぞれＶＬ及びＣＬドメインを含む。第３のポリペプチド鎖は、２つのＶＨドメイン、ＨＤテザー、一又は二のヒンジドメイン、並びに第１のＣＨ１ドメイン、第１のＣＨ２ドメイン、第１のＣＨ３ドメイン、第２のＣＨ１ドメイン、第２のＣＨ２ドメイン、及び第２のＣＨ３ドメインから選択される一又は複数の重鎖定常ドメインを含み、第２のポリペプチド鎖の成分は、次の通り：ＶＨ１−任意選択のＣＨ１１−任意選択のヒンジ１−任意選択のＣＨ２１−任意選択のＣＨ３１−ＨＤテザー−ＶＨ２−任意選択のＣＨ１２−任意選択のヒンジ２−任意選択のＣＨ２２−任意選択のＣＨ３２、Ｎ末端からＣ末端の方向に互いに相対的に配置される。
【０００８】
別の態様では、本発明は、２つのポリペプチド鎖を含む多重鎖抗体ヘテロ多量体を特徴とし、第１のポリペプチド鎖は第１の軽鎖（ＬＣ）を形成し、第２のポリペプチド鎖は、第１の重鎖（ＨＣ）、第２のＬＣ、及び第２のＨＣを形成する。第１のポリペプチド鎖は、第１のＶＬ及びＣＬドメインを含む。第２のポリペプチド鎖は、２つのＶＨドメイン、ＨＤテザー、第２のＶＬドメイン、第２のＣＬドメイン、ＣＬＨテザー、一又は二のヒンジドメイン、並びに第１のＣＨ１ドメイン、第１のＣＨ２ドメイン、第１のＣＨ３ドメイン、第２のＣＨ１ドメイン、第２のＣＨ２ドメイン、及び第２のＣＨ３ドメインから選択される一又は複数の重鎖定常ドメインを含み、第２のポリペプチド鎖の成分は、次の通り：ＶＨ１−任意選択のＣＨ１１−任意選択のヒンジ１−任意選択のＣＨ２１−任意選択のＣＨ３１−ＨＤテザー−ＶＬ２−ＣＬ２−ＣＬＨテザー−ＶＨ２−任意選択のＣＨ１２−任意選択のヒンジ２−任意選択のＣＨ２２−任意選択のＣＨ３２、Ｎ末端からＣ末端の方向に互いに相対的に配置される。
【０００９】
別の態様では、本発明は、２つのポリペプチド鎖を含む多重鎖抗体ヘテロ多量体を特徴とし、第１のポリペプチド鎖は第１のＬＣ、第１のＨＣ、及び第２のＨＣを形成し、第２のポリペプチド鎖は第２のＬＣを形成する。第１のポリペプチド鎖は、２つのＶＨドメイン、ＨＤテザー、第１のＶＬドメイン、第１のＣＬドメイン、ＣＬＨテザー、一又は二のヒンジドメイン、並びに第１のＣＨ１ドメイン、第１のＣＨ２ドメイン、第１のＣＨ３ドメイン、第２のＣＨ１ドメイン、第２のＣＨ２ドメイン、及び第２のＣＨ３ドメインから選択される一又は複数の重鎖定常ドメインを含み、第２のポリペプチド鎖の成分は、次の通り：ＶＬ１−ＣＬ１−ＣＬＨテザー−ＶＨ１−任意選択のＣＨ１１−任意選択のヒンジ１−任意選択のＣＨ２１−任意選択のＣＨ３１−ＨＤテザー−ＶＨ２−任意選択のＣＨ１２−任意選択のヒンジ２−任意選択のＣＨ２２−任意選択のＣＨ３２、Ｎ末端からＣ末端の方向に互いに相対的に配置される。第２のポリペプチド鎖は、第２のＶＬ及びＣＬドメインを含む。
【００１０】
別の態様では、本発明は、２つのポリペプチド鎖を含むヘテロ多量体を特徴とし、第１のポリペプチドは、アドヘシン及び一又は複数の重鎖定常ドメイン（例えば、ＣＨ２１及び／又はＣＨ３１）を含むイムノアドヘシンを含み、第２のポリペプチドは、ＶＨドメイン及び一又は複数の重鎖定常ドメイン（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２２、及び／又はＣＨ３２）を含む半抗体を形成し、並びに第１及び第２のポリペプチド鎖は、ＨＤテザーにより互いに連結されて単一ポリペプチド鎖を形成する。ヘテロ多量体の成分は、次の通り：アドヘシン−任意選択のＣＨ２１−任意選択のＣＨ３１−ＨＤテザー−ＶＨ−任意選択のＣＨ１−任意選択のＣＨ２２−任意選択のＣＨ３２、Ｎ末端からＣ末端の方向に互いに相対的に配置される。ＨＤテザーは、イムノアドヘシンの一又は複数の定常ドメインと半抗体の間の相互作用を促進する。一実施態様では、ＣＬＨテザーは、半抗体の軽鎖成分と重鎖成分の間の相互作用を促進して、次の通り：アドヘシン−任意選択のＣＨ２１−任意選択のＣＨ３１−ＨＤテザー−ＶＬ−ＣＬ−ＣＬＨテザー−ＶＨ−任意選択のＣＨ１−任意選択のＣＨ２２−任意選択のＣＨ３２、Ｎ末端からＣ末端の方向に互いに相対的に配置された成分を有するヘテロ多量体をもたらす。別の実施態様では、半抗体の軽鎖のＶＬ及びＣＬドメインは、第１のポリペプチド鎖の半抗体の重鎖と結合して軽鎖−重鎖同種対を形成する第２のポリペプチドにより提供される。別の実施態様では、ヘテロ多量体のイムノアドヘシン部分は、アドヘシンと重鎖定常ドメイン成分の間にアミノ酸スペーサーを含んでもよい。スペーサーは、一実施態様では、グリシン（Ｇ）及びセリン（Ｓ）残基、例えばＧＧＳリピートを含む。別の実施態様では、スペーサーは、１０〜８０アミノ酸長、例えば２０〜４０残基長である。
【００１１】
本発明のヘテロ多量体は、１５〜１００アミノ酸長のＨＤテザーを含み得る。特定の実施態様では、ＨＤテザーは、３０〜３９アミノ酸長、例えば、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、又は３９アミノ酸長である。該テザーは、一実施態様では、グリシン（Ｇ）及びセリン（Ｓ）残基を含む。別の実施態様では、テザーはＧＧＳリピートを含む。好ましい実施態様では、該テザーは８〜９個のＧＧＳリピート（配列番号１９）を含む。
【００１２】
本発明のヘテロ多量体はまた、一又は複数のＣＬＨテザーも含み得る。一実施態様では、一又は複数のＣＬＨテザーは、それぞれ１０〜８０アミノ酸長である。特定の実施態様では、一又は複数のＣＬＨテザーは、それぞれ２０〜４０アミノ酸長である。該テザーは、一実施態様では、グリシン（Ｇ）及びセリン（Ｓ）残基を含む。別の実施態様では、該テザーはＧＧＳリピートを含む。
【００１３】
別の実施態様では、一又は複数の本発明のＨＤ及びＣＬＨテザーは、一又は複数の以下のエンドペプチダーゼにより切断される：フューリン、ウロキナーゼ、トロンビン、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰａ）、ゲネナーゼ（ｇｅｎｅｎａｓｅ）、Ｌｙｓ−Ｃ、Ａｒｇ−Ｃ、Ａｓｐ−Ｎ、Ｇｌｕ−Ｃ、第Ｘａ因子、タバコエッチウイルスプロテアーゼ（ＴＥＶ）、エンテロキナーゼ、ヒトライノウイルスＣ３プロテアーゼ（ＨＲＶ  Ｃ３）、又はキニノゲナーゼ。好ましい実施態様では、テザーの少なくとも一つはフューリンにより切断可能である。別の実施態様では、一又は複数の本発明のテザーの少なくとも一つは、テザーのＮ及びＣ末端の、又はこの近くの２つの部位で切断可能である。好ましくはＨＤテザーに対して、２つの切断部位の１つはフューリン切断部位であり、及び他方の切断部位はＬｙｓ−Ｃ切断部位である。好ましくはＣＬＨテザーに対して、一又は複数のＣＬＨテザーのＮ及びＣ末端切断部位は両方とも、フューリンにより切断可能である。特定の実施態様では、フューリン切断部位は、アミノ酸配列ＲＫＲＫＲＲ（配列番号９）を含む。特定の他の実施態様では、フューリン切断部位は、アミノ酸配列ＲＨＲＱＰＲ（配列番号１０）を含む。一実施態様では、エンドペプチダーゼ切断はインサイチュで生じる。特定の実施態様では、エンドペプチダーゼは、宿主細胞において組換え発現される。別の実施態様では、エンドペプチダーゼ切断は、精製後、エンドペプチダーゼを添加した時点で生じる。
【００１４】
本発明のヘテロ多量体は、一又は複数の（例えば、２つの）ＣＬＨテザーを有してもよく、各々は、一又は複数の以下の特定のエキソペプチダーゼに対する一又は複数の切断部位を含む：カルボキシペプチダーゼＡ、カルボキシペプチダーゼＢ、血漿カルボキシペプチダーゼＢ（カルボキシペプチダーゼＵ又はトロンビン活性化線溶阻害因子（ＴＡＦＩ）としても知られている）、カルボキシペプチダーゼＤ、カルボキシペプチダーゼＥ（エンケファリン転換酵素又はカルボキシペプチダーゼＨとしても知られている）、カルボキシペプチダーゼＭ、カルボキシペプチダーゼＮ、又はカルボキシペプチダーゼＺ。好ましい実施態様では、本発明のヘテロ多量体は、カルボキシペプチダーゼＢエキソペプチダーゼにより切断可能である。一実施態様では、エキソペプチダーゼ切断はインサイチュで生じる。特定の実施態様では、エキソペプチダーゼは、宿主細胞において組換え発現される。別の実施態様では、エキソペプチダーゼ切断は、精製後、エキソペプチダーゼを添加した時点で生じる。本明細書で使用されるとき、カルボキシペプチダーゼＢは、カルボキシペプチダーゼのクラス又は特定のカルボキシペプチダーゼを指し得る。クラスとして、カルボキシペプチダーゼＢは、カルボキシペプチダーゼＡを除く全ての特定のカルボキシペプチダーゼを含む。特定のカルボキシペプチダーゼとして、カルボキシペプチダーゼＢは、カルボキシペプチダーゼＵ又はＴＡＦＩとしても知られている。当業者は、該用語が使用される文脈に応じて、クラスとしてのカルボキシペプチダーゼＢと特定のエキソペプチダーゼとしてのカルボキシペプチダーゼＢの違いを容易に識別することができる。
【００１５】
更に別の実施態様では、本発明のヘテロ多量体は、ヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２１６からＰｒｏ２３０を含むヒンジドメインを含むがこれらに限定されない、一又は複数のヒンジドメインを含んでもよい。幾つかの実施態様では、一方又は両方のヒンジドメインは、Ｌｙｓ−Ｃエンドペプチダーゼ切断部位を除去する変異を含む。１つの例において、Ｌｙｓ−Ｃエンドペプチダーゼ切断部位を除去する変異はＫ２２２Ａ置換（ＥＵナンバリングシステム）である。
【００１６】
本発明のヘテロ多量体は、単一特異性であってもよい。一実施態様では、本発明の単一特異性ヘテロ多量体は、同じエピトープ標的を結合するが異なる親和性で結合し得る２つの半抗体を含む。別の実施態様では、本発明の単一特異性ヘテロ多量体は、各々が同じ結合パートナー又はエピトープに特異的なイムノアドヘシンと結合された半抗体を含む。
【００１７】
本発明のヘテロ多量体は、二重特異性又は多重特異性であってもよい。一実施態様では、ヘテロ多量体は、少なくとも２つの抗原に結合することができる、別の実施態様では、ヘテロ多量体は、同じ抗原上の少なくとも２つのエピトープを結合することができる。更に別の実施態様では、本発明の二重特異性又は多重特異性ヘテロ多量体は、各々が異なる結合パートナー又はエピトープに特異的なイムノアドヘシンと結合された半抗体を含む。
【００１８】
別の実施態様では、本発明のヘテロ多量体は、細胞傷害性剤にコンジュゲートされた定常領域を含む。
【００１９】
別の実施態様では、ヘテロ多量体は、突起又はキャビティを有する２つの重鎖定常ドメイン（例えば、２つのＣＨ３ドメイン）を含んでもよく、１つの重鎖定常ドメイン（例えば、ＣＨ３１ドメイン）の突起又はキャビティは、それぞれ第２の重鎖定常ドメイン（例えば、ＣＨ３２ドメイン）のキャビティ又は突起に配置可能である。好ましくは、２つの定常ドメインは、突起とキャビティとを含む界面で会合する。更に別の実施態様では、ヘテロ多量体は、少なくとも一つの軽鎖定常ドメイン及び１つの重鎖定常ドメイン界面（例えば、ＣＬ／ＣＨ１界面）を含んでもよく、軽鎖定常ドメイン（例えば、ＣＬドメイン）及び重鎖定常ドメイン（例えば、ＣＨ１ドメイン）は、少なくとも一部は突起−キャビティ相互作用により相互作用する。
【００２０】
別の実施態様では、本発明のヘテロ多量体は、エフェクター機能が変化した抗体をもたらす、ＣＨ２１又はＣＨ２２のどちらかでのＣＨ２ドメイン変異を含む。好ましい実施態様では、ＣＨ２ドメイン変異はＮ２９７変異である。特定の実施態様では、Ｎ２９７変異はＮ２９７Ａ変異である。特定の他の実施態様では、ＣＨ２ドメインはＤ２５６Ａ変異を更に含む。
【００２１】
更なる態様では、本発明は、ヘテロ多量体を作製する方法を特徴とする。別の態様では、本発明は、本発明のヘテロ多量体をコードするポリヌクレオチドを特徴とする。更なる態様では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、及びベクターを含む宿主細胞を特徴とする。一実施態様では、宿主細胞は哺乳動物細胞である。好ましい実施態様では、哺乳動物細胞はＣＨＯ細胞である。別の実施態様では、宿主細胞は原核生物細胞である。更なる実施態様では、原核生物細胞は大腸菌細胞である。更なる態様では、本発明は、ヘテロ多量体をコードするポリヌクレオチドを有するベクターを含む宿主細胞を培養培地で培養することを含む、ヘテロ多量体を作製する方法を特徴とする。好ましくは、ヘテロ多量体は、宿主細胞又は宿主細胞の培養培地から回収される。
【００２２】
更なる態様では、本発明は、Ｎ末端からＣ末端の方向に互いに相対的に配置された以下のドメイン、すなわち、ＶＬ１−ＣＬ１−ＣＬＨテザー１−ＶＨ１−ＣＨ１１−ヒンジ１−ＣＨ２１−ＣＨ３１−ＨＤテザー−ＶＬ２−ＣＬ２−ＣＬＨテザー２−ＶＨ２−ＣＨ１２−ヒンジ２−ＣＨ２２−ＣＨ３２を含む単一ポリペプチドを含み、ＣＬＨテザー１、ＣＬＨテザー２及びＨＤテザーが、それぞれフューリンエンドペプチダーゼにより切断可能なアミノ酸配列を含む単鎖抗体を提供する。本態様の特定の実施態様では、フューリン切断可能配列は、アミノ酸配列ＲＫＲＫＲＲ（配列番号９）を含むが、他の実施態様では、フューリン切断可能配列は、アミノ酸配列ＲＨＲＱＰＲ（配列番号１０）を含む。関連する態様では、本発明は、本発明の単鎖抗体をコードするポリヌクレオチド分子、該ポリヌクレオチドを含むベクター、及び該ベクターを含む宿主細胞を提供する。特定の実施態様では、宿主細胞は、ＣＨＯ細胞を含むがこれに限定されない哺乳動物細胞である。特定の他の実施態様では、宿主細胞は、大腸菌細胞を含むがこれに限定されない原核生物細胞である。更なる関連する態様では、本発明は、該ベクターを含む該宿主細胞を培養培地で培養することを含む該単鎖抗体を作製する方法を提供する。特定の実施態様では、該方法は、前記宿主細胞又は前記培養培地から前記単鎖抗体を回収する工程を更に含む。
【００２３】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の発明を実施するための形態、図面、及び特許請求の範囲から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】３つの切断可能なテザーを含む例示的なヘテロ多量体単鎖抗体の構造を示す模式図である。エンドペプチダーゼ切断部位は三角形で示されている。任意選択のＫ２２２Ａ変異も示されている。
【図２】例示的なヘテロ多量体単鎖抗体のＬＣ、ＨＣ、テザー、及び切断部位の配置を示す模式図である。切断部位は、ＲＫＲＫＲＲＧ（ＧＧＳ）６ＧＲＳＲＫＲＲ（配列番号１４）及び（ＧＧＳ）（８〜１０）ＲＳＲＫＲＲ（配列番号１５〜１７）により例示されている。フューリン認識部位は、ＲＸＲＸＲＲ（配列番号８）として図示されている。
【図３Ａ】フューリン切断後のヘテロ多量体単鎖抗体の例を示す図である。括弧内の残基（ＲＫＲＫＲＲ（配列番号９）、及びＲＫＲＫＲ（配列番号１８））は、プロテインＡカラム上で精製前に内因性エキソペプチダーゼにより除去され得、ラグド型（ｒａｇｇｅｄ）Ｃ末端をもたらす残基を指す。任意選択のＫ２２２Ａ変異も示されている。
【図３Ｂ】フューリン、Ｌｙｓ−Ｃ、及びエキソペプチダーゼ（例えばカルボキシペプチダーゼＢ）処理後のヘテロ多量体単鎖抗体の例を示す図である。任意選択のＫ２２２Ａ変異も示されている。
【図４】テザーを除去する切断前の例示的なコンジュゲートヘテロ多量体単鎖抗体を示す図である。任意選択のコンジュゲート部分、例えば、毒素、抗生物質等、及び任意のＫ２２２Ａ変異も示されている。
【図５Ａ】１つの切断可能なテザーを含有する例示的なヘテロ多量体多重鎖抗体の構造を示す模式図である。２つのつながれていないＬＣがテザー含有ポリペプチドとは独立に表され得る。つながれていないＬＣは、連結された重鎖と同じ細胞又は異なる細胞において発現され得る。つながれていないＬＣは、同じ又は異なるプラスミドで発現され得る。任意選択のコンジュゲート部分、例えば、毒素、抗生物質等、及び任意のＫ２２２Ａ変異も示されている。
【図５Ｂ】２つの切断可能なテザーを含有する例示的なヘテロ多量体多重鎖抗体の構造を示す模式図である。ＨＤテザーは、つながれているＬＣにより間接的に第１のＨＣを第２のＨＣに連結する。つながれていないＬＣは、テザー含有ポリペプチドとは独立に発現され得る。つながれていないＬＣは、連結された重鎖と同じ細胞又は異なる細胞において発現され得る。つながれていないＬＣは、同じ又は異なるプラスミドで発現され得る。任意選択のＫ２２２Ａ変異も示されている。
【図５Ｃ】２つの切断可能なテザーを含有する例示的なヘテロ多量体多重鎖抗体の構造を示す模式図である。ＨＤテザーは第１のＨＣを第２のＨＣに直接連結する。つながれていないＬＣは、テザー含有ポリペプチドとは独立に発現され得る。つながれていないＬＣは、連結された重鎖と同じ細胞又は異なる細胞において発現され得る。つながれていないＬＣは、同じ又は異なるプラスミドで発現され得る。任意選択のＫ２２２Ａ変異も示されている。
【図６Ａ】オクテット分析からの結果を示すグラフである。Ｂ〜Ｄに示された図をまとめたもの。
【図６Ｂ】オクテット分析からの結果を示すグラフである。例示的なヘテロ多量体単鎖抗体は、抗原１及び抗原２の両方を同時に結合する。
【図６Ｃ】オクテット分析からの結果を示すグラフである。抗体１及び抗体２は互いの抗原と交差反応しないが、それぞれの抗原に結合する。ｘ軸は秒での時間である。ｙ軸は相対的吸光度である。実施例３を参照のこと。
【図６Ｄ】オクテット分析からの結果を示すグラフである。抗体１及び抗体２は互いの抗原と交差反応しないが、それぞれの抗原に結合する。ｘ軸は秒での時間である。ｙ軸は相対的吸光度である。実施例３を参照のこと。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
単一特異性もしくは多重特異性（例えば二重特異性）抗体、又は複数のポリペプチド鎖を含む異なる結合特性を有する他のヘテロ多量体を生成する場合、望まれない重鎖ホモ二量体化が典型的には生じる。本発明者らは、この一般的な問題が、一又は複数のテザーにより構築が指示される単鎖単一特異性又は多重特異性ヘテロ多量体を生成することにより回避できることを発見した。理論に拘束されることなく、本発明者らは、ＨＤテザーが、高度の精度及び効率で異なるＦｃ重鎖成分を結合すること、同じ又は異なる結合親和性で同じ標的又は異なる標的を結合する２つの半分子（例えば、２つの半抗体）を含む機能性ヘテロ多量体を産生することを可能にすると考える。連結された重鎖成分を有するヘテロ多量体は、異なる軽鎖成分を更に含み得、重鎖及び軽鎖の完全な補体を有する、機能性単鎖単一特異性又は多重特異性ヘテロ多量体（例えば、抗体）を産生することができる。本発明による追加のテザーは、ヘテロ多量体の軽鎖及び重鎖を連結することができ、これにより各軽鎖のこの同種重鎖への適切な結合に役立つように使用することができる。
【００２６】
本明細書に記載されたヘテロ多量体の作製方法の使用は、単一又は複数のポリペプチド配列から生成された単一特異性又は多重特異性ヘテロ多量体の実質的に均一な集団の作製を可能にする。本明細書に記載された方法により生成されたヘテロ多量体は、病原経路における１つを超える標的の認識、又は特定の標的（例えば、腫瘍細胞）及び該標的に対する作用物質（例えば、Ｔ細胞）の共局在化に有用であり得る。更に、本明細書に記載されたヘテロ多量体は、２つの抗原を標的にする併用療法の必要性、及び２つ以上の治療薬を対象に提供することに伴うリスクを排除することから、有利である。
【００２７】
Ｉ．定義
本明細書において用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、２本の重鎖及び２本の軽鎖を含む任意の免疫グロブリン（Ｉｇ）分子、並びに所望の生物学的活性（例えばエピトープ結合活性）を示す限り、任意のその断片、変異体、バリアント又は派生物を指す。抗体の例には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、及び抗体断片が含まれる。
【００２８】
Ｋａｂａｔナンバリングシステムは、一般的に、可変ドメイン中の残基（軽鎖の約１〜１０７残基及び重鎖の約１〜１１３残基）に言及する場合に使用される（例えば、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．  第５版  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１））。「ＥＵナンバリングシステム」又は「ＥＵインデックス」は、一般的に、免疫グロブリン重鎖定常領域中の残基に言及する場合に使用される（例えば、上記に報告されたＥＵインデックス）。「ＫａｂａｔにおけるＥＵインデックス」は、ヒトＩｇＧ１  ＥＵ抗体の残基ナンバリングを指す。本明細書において特に記載のない限り、抗体の可変ドメインにおける残基番号に対する言及は、Ｋａｂａｔナンバリングシステムによる残基ナンバリングを意味する。本明細書において特に記載のない限り、抗体の重鎖定常ドメインにおける残基番号に対する言及は、ＥＵナンバリングシステムによる残基ナンバリングを意味する。
【００２９】
自然発生の基本的な４鎖抗体ユニットは、２つの同一の軽鎖（ＬＣ）及び２つの同一の重鎖（ＨＣ）から構成されたヘテロ四量体糖タンパク質である（ＩｇＭ抗体は、Ｊ鎖と呼ばれる更なるポリペプチドと共に５つの基本的ヘテロ四量体ユニットから成り、したがって１０個の抗原結合部位を含有するが、分泌ＩｇＡ抗体は重合して、Ｊ鎖と共に２〜５つの基本的な４鎖ユニットを含む多価集合体を形成し得る）。ＩｇＧの場合、４鎖ユニットは、一般的に約１５０，０００ダルトンである。各ＬＣは、１つの共有ジスルフィド結合によりＨＣに連結されるが、２つのＨＣは、ＨＣアイソタイプに応じて一又は複数のジスルフィド結合により互いに連結される。各ＨＣ及びＬＣはまた、規則的間隔で並んだ鎖内ジスルフィド結合も有する。各ＨＣはＮ末端に可変ドメイン（ＶＨ）と、これに続いて、α及びγ鎖の各々については３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）、μ及びεアイソタイプについては４つのＣｊドメインを有する。各ＬＣはＮ末端に可変ドメイン（ＶＬ）と、これに続いて、他端に定常ドメイン（ＣＬ）を有する。ＶＬはＶＨと整列し、ＣＬは重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）と整列している。ＣＨ１は、ヒンジ領域により重鎖の第２の定常ドメイン（ＣＨ２）に接続され得る。特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインの間の界面を形成すると考えられる。ＶＨ及びＶＬは一緒に対合して単一の抗原結合部位を形成する。異なるクラスの抗体の構造及び特性については、例えば、Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第８版、Ｄａｎｉｅｌ  Ｐ．  Ｓｔｉｔｅｓ、Ａｂｂａ  Ｉ．  Ｔｅｒｒ  ａｎｄ  Ｔｒｉｓｔｒａｍ  Ｇ．  Ｐａｒｓｌｏｗ（編）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ、１９９４、７１頁及び第６章を参照のこと。
【００３０】
「ヒンジ領域」は一般的に、ヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２１６からＰｒｏ２３０までの伸長として定義される（Ｂｕｒｔｏｎ、Ｍｏｌｅｃ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２２：１６１〜２０６頁（１９８５））。他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域は、重鎖間Ｓ−Ｓ結合を形成する最初及び最後のシステイン残基を同じ位置に置くことにより、ＩｇＧ１配列と整列され得る。
【００３１】
Ｆｃ領域の「下部ヒンジ領域」は通常、Ｃ末端のすぐ側からヒンジ領域までの残基、すなわち、Ｆｃ領域の２３３から２３９残基までの伸長として定義される。本発明の前は、ＦｃガンマＲ結合は一般的に、ＩｇＧ  Ｆｃ領域の下部ヒンジ領域中のアミノ酸残基に起因すると考えられた。
【００３２】
ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」は通常、ＩｇＧの約２３１から約３４０残基まで伸びている。ＣＨ２ドメインは、別のドメインと密接に対合しないという点で独特である。それどころか、２つのＮ結合型分岐炭水化物鎖が、インタクトな天然ＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメイン間に挟まっている。該炭水化物は、ドメイン−ドメイン対合の代わりとなり得、ＣＨ２ドメインの安定化に役立ち得ると推測されている。Ｂｕｒｔｏｎ、Ｍｏｌｅｃ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：１６１〜２０６頁（１９８５）。
【００３３】
「ＣＨ３ドメイン」は、Ｆｃ領域中のＣ末端からＣＨ２ドメインまでの残基（すなわち、ＩｇＧの約３４１アミノ酸残基から約４４７アミノ酸残基まで）の伸長を含む。
【００３４】
任意の脊椎動物種由来の軽鎖（ＬＣ）は、この定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ及びラムダと呼ばれる２つの明白に異なるタイプの１つに割り当てることができる。この重鎖（ＣＨ）の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは、異なるクラス又はアイソタイプに割り当てることができる。５つのクラスの免疫グロブリン、すなわち、それぞれα、δ、γ、ε、及びμと名付けられた重鎖を有するＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがある。γ及びαクラスは更に、ＣＨ配列及び機能における比較的わずかな違いに基づきサブクラスに分けられ、例えば、ヒトは、以下のサブクラス、すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２を発現する。
【００３５】
用語「可変」は、可変ドメインの特定のセグメントは、抗体の間で配列が広範囲に異なるという事実を指す。Ｖドメインは、抗原結合を媒介し、特定の抗体のこの特定の抗原に対する特異性を規定する。しかし、可変性は、可変ドメインの１１０アミノ酸スパンにわたって均一には分布されない。代わりに、Ｖ領域は、各々９〜１２アミノ酸長である「超可変領域」と呼ばれる極度に可変なより短い領域により分離された、１５〜３０アミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる比較的不変のストレッチからなる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは各々、３つの超可変領域により接続された、大部分はベータシート立体配置をとる４つのＦＲを含み、超可変領域はループ接続を形成し、幾つかの場合においてベータシート構造の一部を形成する。各鎖における超可変領域は、ＦＲにより近接で結び付けられ、他方の鎖からの超可変領域と共に、抗体の抗原−結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、１９９１を参照のこと）。定常ドメインは、抗原への抗体の結合に直接関与しないが、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）における抗体の関与などの様々なエフェクター機能を示す。
【００３６】
用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」は本明細書で使用されるとき、配列において超可変であり及び／又は構造的に明確なループ（「超可変ループ」）を形成する、抗体可変ドメインの各領域を指す。一般的に天然の４鎖抗体は、６つのＨＶＲ、すなわち、ＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、ＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）を含む。ＨＶＲは一般的に、超可変ループからのアミノ酸残基及び／又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）からのアミノ酸残基を含み、後者は最も高い配列可変性であり、及び／又は抗原認識に関与する。ＨＶＲは本明細書で使用されるとき、２４〜３６位（Ｌ１について）、４６〜５６位（Ｌ２について）、８９〜９７位（Ｌ３について）、２６〜３５Ｂ（Ｈ１について）、４７〜６５位（Ｈ２について）、及び９３〜１０２位（Ｈ３について）内に位置する任意の数の残基を含む。したがって、ＨＶＲは、以前に記載された（Ａ）、（Ｂ）、及び（Ｃ）の位置に残基を含む：（Ａ）２４〜３４位（Ｌ１）、５０〜５２位（Ｌ２）、９１〜９６位（Ｌ３）、２６〜３２位（Ｈ１）、５３〜５５位（Ｈ２）、及び９６〜１０１位（Ｈ３）（Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９６：９０１〜９１７頁（１９８７）；（Ｂ）Ｌ１の２４〜３４位、Ｌ２の５０〜５６位、Ｌ３の８９〜９７位、Ｈ１の３１〜３５Ｂ位、Ｈ２の５０〜６５位、及びＨ３の９５〜１０２位（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１））；（Ｃ）３０〜３６位（Ｌ１）、４６〜５５位（Ｌ２）、８９〜９６位（Ｌ３）、３０〜３５位（Ｈ１）、４７〜５８位（Ｈ２）、９３〜１００ａ〜ｊ（Ｈ３）（ＭａｃＣａｌｌｕｍら  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２６２：７３２〜７４５頁（１９９６））。特に指示のない限り、ＨＶＲ残基及び可変ドメイン中の他の残基（例えばＦＲ残基）は、Ｋａｂａｔら、上記に従って本明細書において番号付けされる。
【００３７】
多くのＨＶＲ説明が使用されており、本明細書に包含される。Ｋａｂａｔ相補性決定領域（ＣＤＲ）は配列可変性に基づいており、最も一般的に使用される（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、１９９１）。Ｃｈｏｔｈｉａは代わりに、構造的ループの位置に言及している（Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９６：９０１〜９１７頁（１９８７））。ＡｂＭ  ＨＶＲは、Ｋａｂａｔ  ＨＶＲとＣｈｏｔｈｉａ構造的ループの妥協を表し、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ’ｓ  ＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアにより使用される。「接触」ＨＶＲは、利用可能な複合体結晶構造の分析に基づく。これらの各ＨＶＲからの残基が以下に示される。
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【００３８】
ＨＶＲは、次の通り「拡大ＨＶＲ」を含むことがある：ＶＬにおける２４〜３６又は２４〜３４（Ｌ１）、４６〜５６又は５０〜５６（Ｌ２）及び８９〜９７又は８９〜９６（Ｌ３）、並びにＶＨにおける２６〜３５（Ｈ１）、５０〜６５又は４９〜６５（Ｈ２）及び９３〜１０２、９４〜１０２、又は９５〜１０２（Ｈ３）。可変ドメイン残基は、これらの定義の各々に対しＫａｂａｔら（上記）に従って番号付けされる。
【００３９】
「フレームワーク領域」（ＦＲ）は、ＣＤＲ残基以外の可変ドメイン残基である。各可変ドメインは、典型的には、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４として同定された４つのＦＲを有する。ＣＤＲがＫａｂａｔに従って定義される場合、軽鎖ＦＲ残基は約１〜２３（ＬＣＦＲ１）、３５〜４９（ＬＣＦＲ２）、５７〜８８（ＬＣＦＲ３）、及び９８〜１０７（ＬＣＦＲ４）残基に位置し、重鎖ＦＲ残基は、重鎖残基中の約１〜３０（ＨＣＦＲ１）、３６〜４９（ＨＣＦＲ２）、６６〜９４（ＨＣＦＲ３）、及び１０３〜１１３（ＨＣＦＲ４）残基に位置する。ＣＤＲが超可変ループからのアミノ酸残基を含む場合、軽鎖ＦＲ残基は、軽鎖における約１〜２５（ＬＣＦＲ１）、３３〜４９（ＬＣＦＲ２）、５３〜９０（ＬＣＦＲ３）、及び９７〜１０７（ＬＣＦＲ４）残基に位置し、重鎖ＦＲ残基は、重鎖残基における約１〜２５（ＨＣＦＲ１）、３３〜５２（ＨＣＦＲ２）、５６〜９５（ＨＣＦＲ３）、及び１０２〜１１３（ＨＣＦＲ４）残基に位置する。幾つかの例において、ＣＤＲがＫａｂａｔにより定義されたＣＤＲ及び超可変ループのアミノ酸の両方からのアミノ酸を含む場合、ＦＲ残基はこれに応じて調整される。例えば、ＣＤＲＨ１がアミノ酸Ｈ２６〜Ｈ３５を含む場合、重鎖ＦＲ１残基は１〜２５位であり、ＦＲ２残基は３６〜４９位である。
【００４０】
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選択において、最も共通して生じるアミノ酸残基となるフレームワークである。一般的に、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからである。一般的に、配列のサブグループはＫａｂａｔと同様のサブグループである。一実施態様では、ＶＬに関してサブグループは、Ｋａｂａｔと同様のサブグループカッパＩである。一実施態様では、ＶＨに関してサブグループは、Ｋａｂａｔと同様のサブグループＩＩＩである。
【００４１】
「インタクトな」抗体の１つの例は、抗原結合部位、並びにＣＬ及び重鎖定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３を含むものである。定常ドメインは、天然配列定常ドメイン（例えば、ヒト天然配列定常ドメイン）又はこのアミノ酸配列バリアントであってもよい。
【００４２】
「抗体断片」は、インタクトな抗体の一部、好ましくはインタクトな抗体の抗原結合領域又は可変領域を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；ダイアボディ（Ｄｂ）；タンデムダイアボディ（ｔａＤｂ）、直鎖抗体（例えば、米国特許第５，６４１，８７０号、実施例２；Ｚａｐａｔａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  ８（１０）：１０５７〜１０６２頁（１９９５））；一アーム抗体、単一可変ドメイン抗体、ミニボディ、単鎖抗体分子；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体（例えば、Ｄｂ−Ｆｃ、ｔａＤｂ−Ｆｃ、ｔａＤｂ−ＣＨ３及び（ｓｃＦＶ）４−Ｆｃを含むが、これらに限定されない）が含まれる。
【００４３】
「Ｆａｂ」断片は、抗体のパパイン消化により生成される抗原結合断片であり、Ｌ鎖全体とＨ鎖の可変領域ドメイン（ＶＨ）、及び１本の重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）からなる。抗体のパパイン消化は、２つの同一のＦａｂ断片を産生する。抗体のペプシン処理は単一の大きなＦ（ａｂ’）２断片をもたらし、該断片は、二価の抗原結合活性を有する２つのジスルフィド結合されたＦａｂ断片にほぼ相当し、依然として抗原を架橋することができる。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含むＣＨ１ドメインのカルボキシ末端の更なる数残基を有することにより、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を有するＦａｂ’の本明細書における名称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片はもともと、Ｆａｂ’断片間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として作製された。抗体断片の他の化学結合も知られている。
【００４４】
「Ｆｃ」断片は、パパイン消化により生成される残りの抗体断片であり、容易に結晶化する該断片の能力を反映する名称である。Ｆｃ断片は、ジスルフィドにより共に保持された両方のＨ鎖のカルボキシ末端部分を含む。抗体のエフェクター機能はＦｃ領域中の配列により決定され、この領域は、特定のタイプの細胞上に見出されるＦｃ受容体（ＦｃＲ）により認識される部分でもある。
【００４５】
用語「Ｆｃ領域」は本明細書において、天然配列Ｆｃ領域及びバリアントＦｃ領域を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するのに使用される。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変わる可能性があるが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は通常、Ｃｙｓ２２６位又はＰｒｏ２３０位のアミノ酸残基からこのカルボキシ末端まで伸びると定義される。Ｆｃ領域のＣ末端リシン（ＥＵナンバリングシステムによる残基４４７）は、例えば、抗体の作製もしくは精製中に、又は抗体の重鎖をコードする核酸を組換え改変して除去することができる。したがって、インタクトな抗体の組成物は、全てのＫ４４７残基が除去されている抗体集団、Ｋ４４７残基が除去されていない抗体集団、並びにＫ４４７残基を含む抗体及びＫ４４７残基を含まない抗体の混合物を有する抗体集団を含み得る。
【００４６】
「機能的Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域の「エフェクター機能」を有する。例示的な「エフェクター機能」には、Ｃ１ｑ結合；ＣＤＣ；Ｆｃ受容体結合；ＡＤＣＣ；食作用；細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体；ＢＣＲ）のダウンレギュレーション等が含まれる。このようなエフェクター機能は、一般的に、結合ドメイン（例えば抗体可変ドメイン）と結合されるのにＦｃ領域を必要とし、例えば本明細書の定義において開示されているような様々なアッセイを用いて評価することができる。
【００４７】
「天然配列Ｆｃ領域」は、天然に見出されるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。天然配列ヒトＦｃ領域には、天然配列ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域（非Ａ及びＡアロタイプ）；天然配列ヒトＩｇＧ２  Ｆｃ領域；天然配列ヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域；及び天然配列ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域のほか、この自然発生バリアントが含まれる。
【００４８】
「バリアントＦｃ領域」は、少なくとも１個のアミノ酸修飾、好ましくは１個又は複数のアミノ酸置換によって、天然配列Ｆｃ領域のものとは異なるアミノ酸配列を含む。好ましくは、バリアントＦｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域又は親ポリペプチドのＦｃ領域と比べて少なくとも１個のアミノ酸置換、例えば、天然配列Ｆｃ領域又は親ポリペプチドのＦｃ領域中に約１個から約１０個のアミノ酸置換、及び好ましくは約１個から約５個のアミノ酸置換を有する。バリアントＦｃ領域は本明細書において、好ましくは、天然配列Ｆｃ領域及び／又は親ポリペプチドのＦｃ領域と少なくとも約８０％相同性、並びに最も好ましくはこれと少なくとも約９０％相同性、より好ましくはこれと少なくとも約９５％相同性を有する。
【００４９】
「Ｆｃ複合体」は本明細書で使用されるとき、一緒に作用するＦｃ領域の２つのＣＨ２ドメイン及び／又は一緒に作用するＦｃ領域の２つのＣＨ３ドメインを指し、ＣＨ２ドメイン及び／又はＣＨ３ドメインは、ペプチド結合ではない結合及び／又は力（例えば、ファンデルワールス力、疎水性力、親水性力）を通じて相互作用する。
【００５０】
「Ｆｃ成分」は本明細書で使用されるとき、Ｆｃ領域のヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン又はＣＨ３ドメインを指す。
【００５１】
「Ｆｃ  ＣＨ成分」又は「ＦｃＣＨ」は本明細書で使用されるとき、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、又はＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含むポリペプチドを指す。
【００５２】
「Ｆｖ」は、緊密な非共有結合的会合での１つの重鎖可変領域ドメイン及び１つの軽鎖可変領域ドメインの二量体からなる。抗原結合にアミノ酸残基を提供し、抗体に抗原結合特異性を付与する６つの超可変ループ（Ｈ鎖及びＬ鎖から３ループずつ）が、これらの２つのドメインの折り畳みから生じる。しかし、結合部位全体より低い親和性であることが多いものの、単一可変ドメイン（又は抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でも、抗原を認識し結合する能力を有する。
【００５３】
本明細書で使用されるとき、用語「イムノアドヘシン」は、異種タンパク質（「アドヘシン」）の結合特異性を免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能と組み合わせる分子を意味する。構造的に、イムノアドヘシンは、アミノ酸配列が抗体の抗原認識部位及び抗原結合部位以外である（すなわち、抗体の定常領域と比べて「異種である」）所望の結合特異性を有するアミノ酸配列、並びに免疫グロブリン定常ドメイン配列（例えば、ＩｇＧのＣＨ２及び／又はＣＨ３配列）の融合を含む。アドヘシン及び免疫グロブリン定常ドメインは、場合によりアミノ酸スペーサーにより分離することができる。例示的なアドヘシン配列には、目的とするタンパク質に結合する受容体又はリガンドの一部を含む連続アミノ酸配列が含まれる。アドヘシン配列はまた、目的とするタンパク質を結合するが、受容体又はリガンド配列ではない配列であってもよい（例えば、ペプチボディにおけるアドヘシン配列）。このようなポリペプチド配列は、ファージディスプレイ法及びハイスループット選別方法を含む様々な方法により選択又は同定することができる。イムノアドヘシンにおける免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ１及びＩｇＡ２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ、又はＩｇＭなどの任意の免疫グロブリンから得ることができる。
【００５４】
アミノ酸「スペーサー」は本明細書で使用されるとき、例えば自己切断、酵素的又は化学的切断により切断することができない、２つ以上のアミノ酸長のアミノ酸配列を意味する。スペーサーは、中性、極性、又は非極性アミノ酸から成り得る。アミノ酸スペーサーは、１０〜８０アミノ酸長又は２０〜４０アミノ酸長などの例えば２から１００アミノ酸長、例えば３、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、又は４０アミノ酸長であってもよい。幾つかの実施態様では、アミノ酸スペーサーは、グリシン（Ｇ）及びセリン（Ｓ）残基を含んでもよい（例えば、ＧＧＳリピートとして）。幾つかの実施態様では、アミノ酸スペーサーは、スレオニン（Ｔ）及びヒスチジン（Ｈ）残基を含んでもよい。例示的なスペーサーは、ＴＨＴ（配列番号１）、ＧＧＧＳＴＨＴ（配列番号２）、及びＧＧＧＳＧＧＧＳＴＨＴ（配列番号３）である。
【００５５】
「ｓＦｖ」又は「ｓｃＦｖ」とも略される「単鎖Ｆｖ」は、単一のポリペプチド鎖に接続されたＶＨ及びＶＬ抗体ドメインを含む抗体断片である。好ましくは、ｓＦｖポリペプチドは、更に、ＶＨとＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーを含み、ｓＦｖが抗原結合に対して所望の構造を形成できるようにする。ｓＦｖの概説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、第１１３巻、Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２６９〜３１５頁（１９９４）；Ｍａｌｍｂｏｒｇら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８３：７〜１３頁、１９９５を参照のこと。
【００５６】
用語「ダイアボディ」は、Ｖドメインの鎖内ではなく鎖間対合が得られ、二価の断片、すなわち２つの抗原結合部位を有する断片をもたらすように、ＶＨとＶＬドメインの間に短いリンカー（約５〜１０残基）を有するｓＦｖ断片（前段落を参照のこと）を構築して調製される小さな抗体断片を指す。二重特異性ダイアボディは、２つの抗体のＶＨ及びＶＬドメインが異なるポリペプチド鎖上に存在する、２つの「交差」ｓＦｖ断片のヘテロ二量体である。ダイアボディは、例えば、ＥＰ  ４０４，０９７；ＷＯ  ９３／１１１６１；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：６４４４〜６４４８頁（１９９３）においてより十分に記載されている。
【００５７】
表現「単一ドメイン抗体」（ｓｄＡｂ）又は「単一可変ドメイン（ＳＶＤ）抗体」は、一般的に、単一可変ドメイン（ＶＨ又はＶＬ）が抗原結合をもたらすことができる抗体を指す。換言すると、単一可変ドメインは、標的抗原を認識するために別の可変ドメインと相互作用する必要がない。単一ドメイン抗体の例には、ラクダ科（ラマ及びラクダ）及び軟骨魚類（例えばナースシャーク）に由来するもの、並びにヒト及びマウス抗体からの組換え方法に由来するものが含まれる（Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４１：５４４〜５４６頁；Ｄｅｖ  Ｃｏｍｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００６）３０：４３〜５６頁；Ｔｒｅｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ（２００１）２６：２３０〜２３５頁；Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２００３）２１：４８４〜４９０頁；ＷＯ  ２００５／０３５５７２；ＷＯ  ０３／０３５６９４；Ｆｅｂｓ  Ｌｅｔｔ（１９９４）３３９：２８５〜２９０頁；ＷＯ００／２９００４；ＷＯ  ０２／０５１８７０）。
【００５８】
用語「半抗体」は本明細書で使用されるとき、抗体の１本のアームを指し、少なくとも一つのＶＨドメイン及び１つのＣＨドメインを含む。幾つかの実施態様では、半抗体は、イムノアドヘシンと結合して本発明のヘテロ多量体を形成することができる。他の実施態様では、第１の半抗体は、同一の又は異なるアミノ酸配列（例えば、少なくとも一つのアミノ酸残基が異なる）の第２の半抗体と結合して、それぞれ対称又は非対称なヘテロ多量体を形成することができる。
【００５９】
用語「単鎖抗体」は、本明細書において最も広い意味で使用され、具体的には、初めは単一の連続ポリペプチド鎖として生成される単一特異性又は多重特異性（例えば二重特異性）を有する抗体を対象にする。このような単鎖抗体には、２つの連結されたＨＣ（互いに異なっても又は同一でもよく、２つの異なる又は同一のＶＨドメインを含む）を有する抗体、２つのＨＣを連結するＨＤテザー、並びに２つの異なる又は同一のＣＨ２ドメイン及び２つの異なる又は同一のＣＨ３ドメインから選択される少なくとも一つの重鎖定常ドメインが含まれるが、これらに限定されない。単鎖抗体は、一又は二の、異なる又は同一のＣＨ１ドメインを更に含んでもよい。幾つかの実施態様では、単鎖抗体は、１つのＨＣドメイン（例えば、ＶＨ又はＣＨ１）を第２の隣接して位置するドメイン（例えばＣＨ２）と連結する一又は二のヒンジドメインを含む。他の実施態様では、単鎖抗体は、互いに異なり得又は同一であり得る一又は二の連結されたＬＣを含んでもよく、該ＬＣはそれぞれ、２つの異なる又は同一のＶＬ及びＣＬドメインを含み得、それぞれＣＬＨテザーにより特定のＨＣに連結され得る。本明細書に記載されている通り、単鎖抗体は更に、ノブ−イントゥ−ホール（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）技術を使用してＨＣ／ＨＣ又はＨＣ／ＬＣヘテロ二量体化を支持することができ、切断可能なテザーを含むことができる。単鎖抗体は、本発明のヘテロ多量体である。
【００６０】
本明細書で使用されるとき、用語「多重鎖抗体」は、２つのＨＣが単一ポリペプチドとして発現され、少なくとも一つのＬＣが別個のポリペプチドとして発現される、２つのＬＣ及び２つのＨＣからなる抗体を指す。独立して発現されるＬＣは、この同種ＨＣと結合して２つの機能的アームを有する抗体を形成する。多重鎖抗体は、単一特異性又は多重特異性であってもよい。多重鎖抗体は更に、ノブ−イントゥ−ホール技術を使用してＨＣ／ＨＣ又はＨＣ／ＬＣヘテロ二量体化を支持することができ、切断可能なテザーを含むことができる。
【００６１】
用語「ノブ−イントゥ−ホール」又は「ＫｎＨ」技術は本明細書において言及されるとき、突起（ノブ）を１つのポリペプチドに、キャビティ（ホール）を他のポリペプチドに、これらが相互作用する界面で導入して、インビトロ又はインビボで２つのポリペプチドを共に対合させるのを導く技術を指す。例えば、ＫｎＨは、抗体のＦｃ：Ｆｃ結合界面、ＣＬ：ＣＨ１界面又はＶＨ／ＶＬ界面（例えば、ＵＳ２００７／０１７８５５２、ＷＯ  ９６／０２７０１１、ＷＯ  ９８／０５０４３１及びＺｈｕら（１９９７）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ６：７８１〜７８８頁）に導入されている。これは、多重特異性抗体の製造中に、２つの異なる重鎖を共に対合させるのを駆動するうえで特に有用である。例えば、Ｆｃ領域にＫｎＨを有する多重特異性抗体は、各Ｆｃ領域に連結された単一可変ドメインを更に含むことができ、又は類似のもしくは異なる軽鎖可変ドメインと対合する異なる重鎖可変ドメインを更に含むことができる。ＫｎＨ技術はまた、２つの異なる受容体細胞外ドメインを共に対合させる、又は異なる標的認識配列を含む任意の他のポリペプチド配列を対合させるのに使用することもできる。
【００６２】
用語「多重特異性抗体」は、最も広い意味で使用され、具体的には、ポリエピトープ特異性を有する抗体を対象にする。このような多重特異性抗体には、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨ／ＶＬユニットがポリエピトープ特異性を有する抗体、各ＶＨ／ＶＬユニットが異なるエピトープに結合している２つ以上のＶＬ及びＶＨドメインを有する抗体、各単一可変ドメインが異なるエピトープに結合している２つ以上単一可変ドメインを有する抗体、完全長抗体、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、二重特異性ダイアボディ及びトリアボディなどの抗体断片、共有又は非共有結合された抗体断片が含まれるが、これらに限定されない。「ポリエピトープ特異性」は、同じ又は異なる標的上の２つ以上の異なるエピトープに特異的に結合する能力を指す。「単一特異性」は、１つの抗原のみを結合する能力を指す。一実施態様では、単一特異性ヘテロ多量体は、同じ標的／抗原上の２つの異なるエピトープを結合する。一実施態様によれば、多重特異性抗体は、５μＭから０．００１ｐＭ、３μＭから０．００１ｐＭ、１μＭから０．００１ｐＭ、０．５μＭから０．００１ｐＭ、又は０．１μＭから０．００１ｐＭの親和性で各エピトープに結合するＩｇＧ抗体である。
【００６３】
本発明の抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種に由来する抗体、又は特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一又は相同であるが、該鎖の残りは、別の種に由来する抗体、又は別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体、及びこのような抗体の断片における対応する配列と同一又は相同である「キメラ」抗体であってもよい（ただし、これらが所望の生物学的活性を示すことを条件として）（米国特許第４，８１６，５６７号；及びＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８１：６８５１〜６８５５頁（１９８４））。本明細書において目的とするキメラ抗体には、非ヒト霊長類（例えば、旧世界ザル、類人猿等）に由来する可変ドメイン抗原結合配列及びヒト定常領域配列を含む、霊長類化抗体が含まれる。
【００６４】
非ヒト（例えば齧歯類）抗体の「ヒト化」型は、非ヒト抗体に由来する最小配列を含有するキメラ抗体である。概してヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域由来の残基が、所望の抗体特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域由来の残基により置換されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。幾つかの例において、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基により置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体又はドナー抗体において見出されない残基を含むことができる。これらの修飾は、抗体性能を更に改良するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、超可変ループの全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、及びＦＲの全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のＦＲである、実質的に全ての又は少なくとも一つ、典型的には２つの可変ドメインを含む。ヒト化抗体は場合により、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンのＦｃの少なくとも一部も含む。更なる詳細については、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２〜５２５頁（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３〜３２９頁（１９８８）；及びＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  ２：５９３〜５９６頁（１９９２）を参照のこと。
【００６５】
「複合体」又は「複合体化された」は本明細書で使用されるとき、ペプチド結合ではない結合及び／又は力（例えば、ファンデルワールス力、疎水性力、親水性力）を通じて互いと相互作用する、２つ以上の分子の結合を指す。一実施態様では、複合体はヘテロ多量体性である。用語「タンパク質複合体」又は「ポリペプチド複合体」には、本明細書で使用されるとき、タンパク質複合体中のタンパク質にコンジュゲートされた非タンパク質実体（例えば、毒素又は検出剤などの化学分子を含むが、これらに限定されない）を有する複合体が含まれると理解されるべきである。
【００６６】
用語「ヘテロ多量体」又は「ヘテロ多量体（性の）」は本明細書で使用されるとき、非ペプチド共有結合（例えばジスルフィド結合）及び／又は非共有相互作用（例えば、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、又は疎水性相互作用）により互いに相互作用する、異なる配列の２つ以上のポリペプチドを記載する。またこの定義に含まれるのは、初めに連結された形態での多量体ポリペプチドである（例えば、単一の連続ポリペプチド鎖の形態で作製されるような）。本明細書で使用されるとき、ヘテロ多量体には、例えば、単鎖抗体及び多重鎖抗体、並びに一又は複数のイムノアドヘシンと結合された一又は複数の半抗体を有する多量体が含まれる。ヘテロ多量体には、ＨＤテザーが存在する又は欠如するポリペプチド及び／又はポリペプチド複合体が含まれる。
【００６７】
目的とする抗原を「結合する」本発明の抗体は、該抗体が、抗原を発現するタンパク質又は細胞又は組織を標的にするのに診断剤及び／又は治療剤として有用であり、他のタンパク質と著しく交差反応しないように、十分な親和性で抗原に結合するものである。このような実施態様では、「非標的」タンパク質への該抗体の結合の程度は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析又は放射性免疫沈降（ＲＩＡ）又はＥＬＩＳＡにより決定されるとき、特定の標的タンパク質への該抗体の結合の約１０％未満であろう。標的分子への抗体の結合に関して、特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド標的上のエピトープに「特異的結合（specific binding）」又は「特異的に結合する（specifically binds to）」又は「特異的な（specific for）」という用語は、非特異的相互作用とは測定可能な程度に異なる結合を意味する（例えば、非特異的相互作用は、ウシ血清アルブミン又はカゼインに結合することができる）。特異的結合は、例えば、対照分子の結合と比べて分子の結合を決定することにより測定することができる。例えば、特異的結合は、標的に類似した対照分子、例えば過剰な非標識標的との競合により決定することができる。この場合、特異的結合は、プローブへの標識された標的の結合が、過剰な非標識標的により競合的に阻害される場合に示される。特定のポリペプチド標的又は特定のポリペプチド上のエピトープに「特異的結合」又は「特異的に結合する」又は「特異的な」という用語は、本明細書で使用されるとき、例えば、約１μＭから約１ｆＭ、あるいは約２００ｎＭから約１ｆＭ、あるいは約２００ｎＭから約１ｐＭ、あるいは約１５０ｎＭから約１ｆＭ、あるいは約１５０ｎＭから約１ｐＭ、あるいは約１００ｎＭから約１ｆＭ、あるいは約１００ｎＭから約１ｐＭ、あるいは約６０ｎＭから約１ｆＭ、あるいは約６０ｎＭから約１ｐＭ、あるいは約５０ｎＭから約１ｆＭ、あるいは約５０ｎＭから約１ｐＭ、あるいは約３０ｎＭから約１ｆＭ、あるいは約３０ｎＭから約１ｐＭ、あるいは約２０ｎＭから約１ｆＭ、あるいは約２０ｎＭから約１ｐＭ、あるいは約１０ｎＭから約１ｆＭ、あるいは約１０ｎＭから約１ｐＭ、あるいは約８ｎＭから約１ｆＭ、あるいは約８ｎＭから約１ｐＭ、あるいは約６ｎＭから約１ｆＭ、あるいは約６ｎＭから約１ｐＭ、あるいは約４ｎＭから約１ｆＭ、あるいは約４ｎＭから約１ｐＭ、あるいは約２ｎＭから約１ｆＭ、あるいは約２ｎＭから約１ｐＭ、あるいは約１ｎＭから約１ｆＭ、あるいは約１ｎＭから約１ｐＭの標的に対するＫｄを有する分子により示され得る。一実施態様では、用語「特異的結合」は、分子が、任意の他のポリペプチド又はポリペプチドエピトープに実質的に結合することなく、特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド上のエピトープに結合する結合を指す。
【００６８】
「結合親和性」は一般的に、分子（例えば抗体）の単一結合部位とこの結合パートナー（例えば抗原）の間の非共有相互作用の総計の強度を指す。特に指示のない限り、本明細書で使用されるとき、「結合親和性」は、結合対のメンバー（例えば抗体と抗原）間の１：１相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのこのパートナーＹに対する親和性は、一般的に解離定数（Ｋｄ）により表すことができる。例えば、Ｋｄは、約２００ｎＭ、１５０ｎＭ、１００ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、８ｎＭ、６ｎＭ、４ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ又はより強い場合があり得る。親和性は、本明細書に記載されたものを含む、当技術分野で公知の一般的な方法により測定することができる。低親和性抗体は一般的に、抗原をゆっくり結合し、すぐに解離する傾向があるのに対し、高親和性抗体は一般的に、抗原をより速く結合し、より長く結合したままである傾向がある。結合親和性を測定する様々な方法は当技術分野で公知であり、いずれも本発明の目的のために使用することができる。
【００６９】
一実施態様では、本発明による「Ｋｄ」又は「Ｋｄ値」は、およそ１０応答単位（ＲＵ）の固定化抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃でＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−２０００又はＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、ピスカタウェイ、ＮＪ）による表面プラズモン共鳴アッセイを用いて測定される。本発明の抗体は、約１μＭから約１ｆＭ、あるいは約２００ｎＭから約１ｆＭ、あるいは約２００ｎＭから約１ｐＭ、あるいは約１５０ｎＭから約１ｆＭ、あるいは約１５０ｎＭから約１ｐＭ、あるいは約１００ｎＭから約１ｆＭ、あるいは約１００ｎＭから約１ｐＭ、あるいは約６０ｎＭから約１ｆＭ、あるいは約６０ｎＭから約１ｐＭ、あるいは約５０ｎＭから約１ｆＭ、あるいは約５０ｎＭから約１ｐＭ、あるいは約３０ｎＭから約１ｆＭ、あるいは約３０ｎＭから約１ｐＭ、あるいは約２０ｎＭから約１ｆＭ、あるいは約２０ｎＭから約１ｐＭ、あるいは約１０ｎＭから約１ｆＭ、あるいは約１０ｎＭから約１ｐＭ、あるいは約８ｎＭから約１ｆＭ、あるいは約８ｎＭから約１ｐＭ、あるいは約６ｎＭから約１ｆＭ、あるいは約６ｎＭから約１ｐＭ、あるいは約４ｎＭから約１ｆＭ、あるいは約４ｎＭから約１ｐＭ、あるいは約２ｎＭから約１ｆＭ、あるいは約２ｎＭから約１ｐＭ、あるいは約１ｎＭから約１ｆＭ、あるいは約１ｎＭから約１ｐＭのＫｄ値で標的に対する親和性を有し得る。表面プラズモン共鳴アッセイを用いてＫｄ値を測定するには、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭＳ、ＢＩＡｃｏｒｅ，  Ｉｎｃ．）が、供給者の指示に従ってＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）により活性化される。約１０応答単位（ＲＵ）の結合タンパク質を得るには、抗原が１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８で５μｇ／ｍｌ（およそ０．２μＭ）に希釈された後、５μｌ／分の流速で注入される。抗原の注入後、未反応基をブロックするために１Ｍエタノールアミンが注入される。反応速度測定のために、Ｆａｂの２倍連続希釈物（例えば、０．７８ｎＭから５００ｎＭ）が約２５μｌ／分の流速で、２５℃、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳに注入される。結合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）は、結合及び解離センサーグラムを同時にフィットさせて単純な１対１ラングミュア結合モデル（ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン３．２）を用いて計算される。平衡解離定数（Ｋｄ）は、比ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして計算される。例えば、Ｃｈｅｎら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２９３：８６５〜８８１頁（１９９９）を参照のこと。結合速度が、上記の表面プラズモン共鳴アッセイによる１０６Ｍ−１Ｓ−１を上回る場合、結合速度は、ストップフローを備えた分光光度計（Ａｖｉｖ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）又は撹拌レッドキュベットを備える８０００シリーズＳＬＭ−Ａｍｉｎｃｏ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）などの分光計において測定された漸増濃度の抗原の存在下、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中２５℃で、２０ｎＭ抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の蛍光発光強度（励起＝２９５ｎｍ；発光��３４０ｎｍ、１６ｎｍ帯域通過）における増加又は減少を測定する蛍光消光法を用いて決定することができる。
【００７０】
本発明による「結合速度（on-rate）」又は「結合速度（rate of association）」又は「結合速度（association rate）」又は「ｋｏｎ」は、およそ１０応答単位（ＲＵ）の固定化抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃でＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−２０００又はＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、ピスカタウェイ、ＮＪ）により、上記された同じ表面プラズモン共鳴法を用いて決定することもできる。簡単には、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡｃｏｒｅ，  Ｉｎｃ．）は、供給者の指示に従ってＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）により活性化される。約１０応答単位（ＲＵ）の結合タンパク質を得るには、抗原が１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８で５μｇ／ｍｌ（およそ０．２μＭ）に希釈された後、５μｌ／分の流速で注入される。抗原の注入後、未反応基をブロックするために１Ｍエタノールアミンが注入される。反応速度測定のために、Ｆａｂの２倍連続希釈物（例えば、０．７８ｎＭから５００ｎＭ）が約２５μｌ／分の流速で、２５℃、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳに注入される。結合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）は、結合及び解離センサーグラムを同時にフィットさせて単純な１対１ラングミュア結合モデル（ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン３．２）を用いて計算される。平衡解離定数（Ｋｄ）は、比ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして計算される。例えば、Ｃｈｅｎら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２９３：８６５〜８８１頁（１９９９）を参照のこと。しかし、結合速度が、上記の表面プラズモン共鳴アッセイによる１０６Ｍ−１Ｓ−１を上回る場合、結合速度は好ましくは、ストップフローを備えた分光光度計（Ａｖｉｖ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）又は撹拌キュベットを備える８０００シリーズＳＬＭ−Ａｍｉｎｃｏ  分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）などの分光計において測定された漸増濃度の抗原の存在下、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中２５℃で、２０ｎＭ抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の蛍光発光強度（励起＝２９５ｎｍ；発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍ帯域通過）における増加又は減少を測定する蛍光消光法を用いて決定される。
【００７１】
抗体、断片、又はこの誘導体などの本発明のポリペプチドに関して「生物学的に活性な」及び「生物学的活性」及び「生物学的特徴」は、特に明記されない限り、生物学的分子に結合する能力を有することを意味する。
【００７２】
本発明のヘテロ多量体は、一般的に実質的均一にまで精製される。語句「実質的に均一な（substantially homogeneous）」「実質的に均一な形態（substantially homogeneous form）」及び「実質的均一（substantial homogeneity）」は、生成物が、望ましくないポリペプチド組み合わせから生じる副生成物が実質的にないことを示すのに使用される。
【００７３】
純度に関して表された実質的均一は、副生成物の量が１０重量％、９重量％、８重量％、７重量％、６重量％、４重量％、３重量％、２重量％もしくは１重量％を超えない、又は１重量％未満であることを意味する。一実施態様では、副生成物は５％より低い。
【００７４】
「生物学的分子」は、核酸、タンパク質、炭水化物、脂質、及びこれらの組み合わせを指す。一実施態様では、生物学的分子は天然に存在する。
【００７５】
「単離された」は、本明細書に開示された様々なヘテロ多量体を記載するのに使用される場合、発現された細胞又は細胞培養物から同定され、分離され、及び／又は回収されたヘテロ多量体を意味する。この自然環境の汚染成分は、該ポリペプチドの診断的又は治療的使用を典型的には妨げるであろう材料であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質を含み得る。好ましい実施態様では、ヘテロ多量体は、（１）スピニングカップシークエネーターを用いてＮ末端配列もしくは内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度に、又は（２）クーマシーブルーもしくは、好ましくは銀染色を用いて非還元又は還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより均一にまで精製されるであろう。該ポリペプチドの自然環境の少なくとも一つの成分は存在しないため、単離されたヘテロ多量体は、組換え細胞内にインサイチュで抗体を含む。しかし、通常は、単離されたポリペプチドは、少なくとも一つの精製工程により調製される。
【００７６】
本明細書で使用されるとき、「連結された」又は「連結する」により、第１と第２のアミノ酸配列の間の直接ペプチド結合連結、又は第１及び第２のアミノ酸配列に結合され、第１と第２のアミノ酸配列の間のペプチドである第３のアミノ酸配列を必要とする連結のいずれかが意味される。例えば、アミノ酸リンカーは、１つのアミノ酸配列のＣ末端及び他のアミノ酸配列のＮ末端に結合される。
【００７７】
本明細書で使用されるとき、「リンカー」により、２以上のアミノ酸長のアミノ酸配列が意味される。リンカーは、天然の極性又は非極性アミノ酸から成り得る。リンカーは、２から５０アミノ酸長、例えば、３、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０アミノ酸長などの、例えば２〜１００アミノ酸長であってもよい。リンカーは、例えば自己切断、又は酵素的もしくは化学的切断により「切断可能」であり得る。アミノ酸配列中の切断部位並びにこのような部位で切断する酵素及び化学物質は、当技術分野で十分に公知であり、また本明細書にも記載されている。
【００７８】
「ＨＤテザー」又は「ヘテロ二量体化テザー（ＨｅｔｅｒｏＤｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｔｅｔｈｅｒ）」は本明細書で使用されるとき、２つの異なる重鎖定常（ＣＨ）ドメイン含有ポリペプチドをつなぎ合わせるアミノ酸リンカーを意味する。一般的に、２つのＣＨドメイン含有ポリペプチドは、第１のポリペプチドのＣＨ２又はＣＨ３ドメインを、自身は第２のＣＨ含有ポリペプチドの成分であるＶＬドメインに連結させてつなぎ合わされる。幾つかの実施態様では、ＨＤテザーは、第１のポリペプチドのＣＨ３ドメインを第２のＣＨドメイン含有ポリペプチドのＶＨドメインに直接連結させる。２０〜４０個のアミノ酸、２５〜４０個のアミノ酸、及び３０〜４０個のアミノ酸のＨＤテザーが有効であるように、一般に１５〜１００個のアミノ酸のＨＤテザーが有効である。特定の実施態様では、ＨＤテザーは、３０から３９アミノ酸長（例えば、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、又は３９アミノ酸長）である。ＨＤテザーは、例えば、当技術分野で標準的な方法及び試薬を用いて、自己切断、又は酵素的もしくは化学的切断により「切断可能」であり得る。
【００７９】
本明細書で使用されるとき、「ＣＬＨテザー」又は「同種ＬＣ−ＨＣテザー（Ｃｏｇｎａｔｅ  ＬＣ−ＨＣ  ｔｅｔｈｅｒ）」により、軽鎖をこの同種重鎖とつなぐアミノ酸リンカーが意味される。ＣＬＨテザーは、一般的に、軽鎖のＣＬドメインを重鎖のＶＨドメインに連結させるアミノ酸を指す。幾つかの実施態様では、ＣＬＨテザーは、軽鎖のＶＬドメインを重鎖のＶＨドメインに直接連結させる。２０〜４０個のアミノ酸、２５〜４０個のアミノ酸、３０〜４０個のアミノ酸、及び３０〜３５個のアミノ酸（例えば、３０、３１、３２、３３、３４、又は３５個のアミノ酸）のＣＬＨテザーが有効であるように、一般に１０〜８０個のアミノ酸のＣＬＨテザーが有効である。本発明の単鎖抗体は、配列及び／又は長さにおいて異なり得る又は異なり得ない複数のＣＬＨテザーを有することができる。好ましい実施態様では、単鎖抗体は、それぞれ軽鎖をこの同種重鎖につなぐ２つのテザー（ＣＬＨテザー１及びＣＬＨテザー２）を有する。ＣＬＨテザーは、当技術分野で標準的な方法及び試薬を用いて、例えば、自己切断、又は酵素的もしくは化学的切断により「切断可能」であり得る。
【００８０】
「リンカー」又は「テザー」の酵素的切断は、例えば、ウロキナーゼ、Ｌｙｓ−Ｃ、Ａｓｐ−Ｎ、Ａｒｇ−Ｃ、Ｖ８、Ｇｌｕ−Ｃ、キモトリプシン、トリプシン、ペプシン、パパイン、トロンビン、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰａ）、ゲネナーゼ、第Ｘａ因子、ＴＥＶ（タバコエッチウイルスシステインプロテアーゼ）、エンテロキナーゼ、ＨＲＶ  Ｃ３（ヒトライノウイルスＣ３プロテアーゼ）、キニノゲナーゼ、及びスブチリシン様プロタンパク質転換酵素（例えば、フューリン（ＰＣ１）、ＰＣ２、又はＰＣ３）又はＮ−アルギニン二塩基転換酵素などのエンドペプチダーゼの使用を必要とし得る。望ましい実施態様では、酵素的切断は、エンドペプチダーゼフューリンを必要とする。化学的切断は、例えば、ヒドロキシルアミン、Ｎ−クロロスクシンイミド、Ｎ−ブロモスクシンイミド、又は臭化シアンの使用も必要とし得る。
【００８１】
「フューリンエンドペプチダーゼ切断部位」は本明細書で使用されるとき、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−アルギニンアミノ酸配列（配列番号６）であり、Ｘ１は塩基性アミノ酸残基（天然又は非天然、修飾又は非修飾）であり、Ｘ２及びＸ３は、それぞれ、フューリンエンドペプチダーゼによりＣ末端側で切断され得る任意のアミノ酸残基（天然又は非天然、修飾又は非修飾）であってもよい。フューリンエンドペプチダーゼは、アルギニン残基のＣ末端側で切断する。特定の実施態様では、フューリン切断部位はアミノ酸配列ＲＸＲＸＹＲを含み（ＹはＫ又はＲであり、Ｘは任意のアミノ酸残基（配列番号７）である）、より具体的にはＲＸＲＸＲＲ（配列番号８）である。特定の実施態様では、フューリン切断部位は、アミノ酸配列ＲＫＲＫＲＲ（配列番号９）を含む。特定の他の実施態様では、フューリン切断部位は、ＲＨＲＱＰＲ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含む。更に他の実施態様では、フューリン切断部位は、アミノ酸配列ＲＳＲＫＲＲ（配列番号１１）を含む。
【００８２】
「Ｌｙｓ−Ｃエンドペプチダーゼ切断部位」は本明細書で使用されるとき、Ｌｙｓ−ＣエンドペプチダーゼによりＣ末端側で切断され得るアミノ酸配列中のリシン残基である。Ｌｙｓ−Ｃエンドペプチダーゼは、リシン残基のＣ末端側で切断する。
【００８３】
「リンカー」又は「テザー」の酵素的切断は、エンドペプチダーゼ切断後の残存エンドペプチダーゼ認識配列を除去するために、例えば、カルボキシペプチダーゼＡ、カルボキシペプチダーゼＢ、カルボキシペプチダーゼＤ、カルボキシペプチダーゼＥ（カルボキシペプチダーゼＨとも呼ばれる）、カルボキシペプチダーゼＭ、カルボキシペプチダーゼＮ、又はカルボキシペプチダーゼＺなどのエキソペプチダーゼの使用も必要とし得る。
【００８４】
抗体「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域（天然配列Ｆｃ領域又はアミノ酸配列バリアントＦｃ領域）に起因する生物学的活性を指し、抗体アイソタイプによって異なる。抗体エフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）のダウンレギュレーション；並びにＢ細胞活性化が含まれる。
【００８５】
「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」又は「ＡＤＣＣ」は、特定の細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合した分泌Ｉｇが、これらの細胞傷害性エフェクター細胞が抗原担持標的細胞に特異的に結合すること、及びこの後、細胞傷害性剤により標的細胞を死滅させることを可能にする、細胞傷害性の形態を指す。抗体は細胞傷害性細胞を「備えて」おり、このような死滅には絶対に必要である。ＡＤＣＣを媒介する主要な細胞、ＮＫ細胞がＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対し、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞でのＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ９：４５７〜９２頁（１９９１）の４６４頁の表３にまとめられている。目的とする分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５，５００，３６２号又は第５，８２１，３３７号に記載されているものなどのインビトロＡＤＣＣアッセイが行われ得る。このようなアッセイのための有用なエフェクター細胞には、抹消血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは、又は更に、目的とする分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５：６５２〜６５６頁（１９９８）に開示されているものなどの動物モデルにおいて評価することができる。
【００８６】
「Ｆｃ受容体」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を記載する。好ましいＦｃＲは、天然配列ヒトＦｃＲである。更に、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマ受容体）を結合するものであり、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体（これらの受容体の対立遺伝子バリアント及び選択的スプライシング型を含む）が含まれる。ＦｃγＲＩＩ受容体には、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「抑制性受容体」）が含まれ、細胞質ドメインが主に異なる類似のアミノ酸配列を有する。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、細胞質ドメインに免疫受容体活性化チロシンモチーフ（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｍｏｔｉｆ）（ＩＴＡＭ）を含有する。抑制性受容体ＦｃγＲＩＩＢは、細胞質ドメインに免疫受容体抑制性チロシンモチーフ（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｍｏｔｉｆ）（ＩＴＩＭ）を含有する（概説Ｍ．  ｉｎ  Ｄａｅｒｏｎ、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５：２０３〜２３４頁（１９９７）を参照のこと）。ＦｃＲは、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ９：４５７〜４９２頁（１９９１）；Ｃａｐｅｌら、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２５〜３４頁（１９９４）；及びｄｅ  Ｈａａｓら、Ｊ．  Ｌａｂ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｅｄ．  １２６：３３０〜４１頁（１９９５）に概説されている。今後同定されるものを含む他のＦｃＲは、本明細書において用語「ＦｃＲ」により包含される。該用語はまた、母系ＩｇＧの胎児への移動に関与する新生児型受容体、ＦｃＲｎも含む（Ｇｕｙｅｒら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １１７：５８７頁（１９７６）及びＫｉｍら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２４：２４９頁（１９９４））。
【００８７】
「ヒトエフェクター細胞」は、一又は複数のＦｃＲを発現する白血球であり、エフェクター機能を果たす。好ましくは、該細胞は、少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を果たす。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例には、抹消血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞、及び好中球が含まれ、ＰＢＭＣ及びＮＫ細胞が好ましい。エフェクター細胞は、天然の供給源、例えば血液から単離することができる。
【００８８】
「補体依存性細胞傷害」又は「ＣＤＣ」は、補体の存在下での標的細胞の溶解を指す。古典的補体経路の活性化は、同種抗原に結合された（適切なサブクラスの）抗体に補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）が結合することにより開始される。補体活性化を評価するために、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２：１６３頁（１９９６）に記載されているＣＤＣアッセイが行われ得る。
【００８９】
「治療的有効量」は、対象における疾患又は障害を治療するためのヘテロ多量体、抗体、抗体断片、又は誘導体の量を指す。腫瘍（例えば、癌性腫瘍）の場合、ヘテロ多量体、抗体、又は抗体断片（例えば、多重特異性抗体又は抗体断片）の治療的有効量は、癌細胞の数を低減し得；原発腫瘍サイズを低減し得；末梢器官への癌細胞浸潤を阻害し得（すなわち、ある程度遅らせ得、及び好ましくは阻止し得る）；腫瘍転移を阻害し得（すなわち、ある程度遅らせ得、及び好ましくは阻止し得る）；腫瘍増殖をある程度阻害し得；及び／又は該障害に伴う１つもしくは複数の症状をある程度軽減し得る。ヘテロ多量体、抗体、又は抗体断片が、増殖を防ぎ得及び／又は既存の癌細胞を死滅させ得る限りにおいて、これは細胞増殖抑制性及び／又は細胞傷害性であり得る。癌治療に関して、インビボでの有効性は、例えば、生存期間、疾患無増悪期間（ＴＴＰ）、奏効率（ＲＲ）、奏効期間、及び／又は生活の質を評価して測定することができる。
【００９０】
「低減又は阻害する」により、好ましくは２０％以上、より好ましくは５０％以上、及び最も好ましくは７５％、８５％、９０％、９５％、又はこれ以上の全体的減少をもたらす能力を意味する。低減又は阻害するは、治療される障害の症状、転移の存在もしくはサイズ、原発腫瘍のサイズ、又は血管新生障害における血管のサイズもしくは数を指し得る。
【００９１】
用語「細胞傷害性剤」は本明細書で使用されるとき、細胞の機能を阻害しもしくは妨げ、及び／又は細胞の破壊を引き起こす物質を指す。該用語は、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｒａ２２３、Ｐ３２、及びＬｕの放射性同位体）、化学療法剤、例えば、メトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン又は他の挿入剤、核酸分解酵素などの酵素及びこの断片、抗生物質、並びに細菌、真菌、植物又は動物起源の低分子毒素又は酵素的に活性な毒素などの毒素（これらの断片及び／又はバリアントを含む）、並びに本明細書に開示される様々な抗腫瘍剤、抗癌剤、及び化学療法剤を含むことが意図される。他の細胞傷害性剤は、本明細書に記載されている。殺腫瘍剤は、腫瘍細胞の破壊を引き起こす。
【００９２】
「化学療法剤」は、癌の治療において有用な化学化合物である。化学療法剤の例には、チオテパ及びＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）シクロホスファミドなどのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンなどのスルホン酸アルキル；ベンゾドーパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、及びウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）などのアジリシン；アルトレートアミン（ａｌｔｒｅｔａｍｉｎｅ）、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド及びトリメチロールメラミンを含むエチレンイミン及びメチラメラミン；アセトゲニン（特にブラタシン及びブラタシノン）；デルタ−９−テトラヒドロカナビノール（ドロナビノール、ＭＡＲＴＮＯＬ（登録商標））；ベータ−ラパコン；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カプトテシン（合成類似体トポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標）を含む）、ＣＰＴ−１１（イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標））、アセチルカンプトテシン、スコポレクチン（ｓｃｏｐｏｌｅｃｔｉｎ）、及び９−アミノカンプトテシン）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（このアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成類似体を含む）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸；テニポシド；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体、ＫＷ−２１８９及びＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エロイテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンギスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、及びラニムスチンなどのニトロソウレア；エンジイン抗生物質（例えばカリケアマイシン、特にカリケアマイシンガンマ１（例えばＡｇｎｅｗ、Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔｌ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｌ．  ３３：１８３〜１８６頁（１９９４）を参照のこと）などの抗生物質；ダイネマイシンＡを含むダイネマイシン；エスペラマイシン；並びにネオカルチノスタチンクロモフォア及び関連色素タンパク質エンジイン抗生物質クロモフォア）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）ドキソルビシン（モルホリノドキソルビシン、シアノモルホリノドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン、ミコフェ���ール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、ケラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；メトトレキサート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの代謝拮抗薬；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸類似体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリシン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリシン、ドキシフルリシン、エノシタビン、フロキシウリシンなどのピリミジン類似体；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎薬（ａｎｔｉ−ａｄｒｅｎａｌ）；フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）などの葉酸リプレニッシャー；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキセート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルシン；ジアジコン；エルフォルニチン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；メイタンシン及びアンサマイトシンなどのメイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）；ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖複合体（ＪＨＳ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、ユージーン、ＯＲ）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ−２毒素、ベラキュリン（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ）Ａ、ロリシンＡ及びアングイジン）；ウレタン；ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；チオテパ；タキソイド、例えば、ＴＡＸＯＬ（登録商標）パクリタキセル（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、プリンストン、ＮＪ）、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）パクリタキセルのクレモフォール不含、アルブミン改変ナノ粒子製剤（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ、シャンバーグ、ＥＬ）、及びＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）ドキセタキセル（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ、アントニー、Ｆｒａｎｃｅ）；クロランブシル；ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチン及びカルボプラチンなどのプラチナ類似体；ビンブラスチン（ＶＥＬＢＡＮ（登録商標））；プラチナ；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））；オキサリプラチン；ロイコボリン；ビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））；ノバントロン；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロネート；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ  ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸などのレチノイド；カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））；上記のいずれかの薬学的に許容可能な塩、酸又は誘導体；並びにＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及びプレドニゾロンの併用療法の略称）、及びＦＯＬＦＯＸ、（５−ＦＵ及びロイコボリンと併用されるオキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ（商標））を用いた治療レジメンの略称）などの上記の２つ以上の併用が含まれる。
【００９３】
またこの定義に含まれるのは、癌の増殖を促進し得るホルモンの影響を調節、低減、ブロック、又は阻害するように作用し、多くの場合、全身（systemic）、すなわち全身（whole body）治療の形態である抗ホルモン剤である。これらは、ホルモン自体であってもよい。例には、例えば、タモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）タモキシフェンを含む）、ＥＶＩＳＴＡ（登録商標）ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、及びＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標）トレミフェンを含む、抗エストロゲン及び選択的エストロゲン受容体調節剤（ＳＥＲＭ）；抗プロゲステロン；エストロゲン受容体ダウンレギュレーター（ＥＲＤ）；卵巣を抑制又は停止させるように機能する薬剤、例えば、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）アゴニスト（ＬＵＰＲＯＮ（登録商標）及びＥＬＩＧＡＲＤ（登録商標）ロイプロリドアセテート、ゴセレリンアセテート、ブセレリンアセテート及びトリプトレリンなどの）；フルタミド、ニルタミド及びビカルタミドなどの他の抗アンドロゲン；並びに、例えば、４（５）−イミダゾール、アミノアミノグルテチミド、ＭＥＧＡＳＥ（登録商標）メゲストロールアセテート、ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標）エキセメスタン、フォルメスタン、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標）ボロゾール、ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）レトロゾール、及びＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標）アナストロゾールなどの、副腎におけるエストロゲン産生を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤が含まれる。更に、化学療法剤のこのような定義には、クロドロネート（例えば、ＢＯＮＥＦＯＳ（登録商標）又はＯＳＴＡＣ（登録商標））、ＤＩＤＲＯＣＡＬ（登録商標）エチドロネート、ＮＥ−５８０９５、ＺＯＭＥＴＡ（登録商標）ゾレドロン酸／ゾレドロネート、ＦＯＳＡＭＡＸ（登録商標）アレンドロネート、ＡＲＥＤＩＡ（登録商標）パミドロネート、ＳＫＥＬＩＤ（登録商標）チルドロネート、又はＡＣＴＯＮＥＬ（登録商標）レセドロネートなどのビスホスホネート；及びトロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に異常な細胞増殖に関与するシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの（例えば、ＰＫＣ−アルファ、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ、及び上皮増殖因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）などの）；ＴＨＥＲＡＴＯＰＥ（登録商標）ワクチン及び遺伝子療法ワクチン（例えば、ＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、及びＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチン）などのワクチン；ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）トポイソメラーゼ１阻害剤；ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）ＧｎＲアンタゴニスト；トシル酸ラパチニブ（ＥｒｂＢ−２及びＧＷ５７２０１６としても知られるＥＧＦＲ二重チロシンキナーゼ低分子阻害剤）；並びに上記のいずれかの薬学的に許容可能な塩、酸又は誘導体が含まれる。
【００９４】
本明細書において使用される場合、「増殖阻害剤」は、細胞の増殖をインビトロ又はインビボのいずれかで阻害する化合物又は組成物を指す。故に、増殖阻害剤は、Ｓ期の細胞のパーセンテージを著しく低減するものであり得る。増殖阻害剤に例には、Ｇ１停止及びＭ期停止を誘導する薬剤などの細胞周期進行を（Ｓ期以外の所で）ブロックする薬剤が含まれる。古典的なＭ期ブロッカーには、ビンカス（例えば、ビンクリスチン及びビンブラスチン）、タキサン、並びにドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンなどのトポイソメラーゼＩＩ阻害剤が含まれる。Ｇ１を停止させる薬剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、及びアラ−ＣなどのＤＮＡアルキル化剤は、Ｓ期停止にも波及する。更なる情報は、Ｍｕｒａｋａｍｉらによる「Ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ、ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ，  ａｎｄ  ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ」と題されたＴｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ、Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ  ａｎｄ  Ｉｓｒａｅｌ編、第１章（ＷＢ  Ｓａｕｎｄｅｒｓ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、１９９５）、特に１３頁に見出すことができる。タキサン（パクリタキセル及びドセタキセル）は、両方ともイチイに由来する抗癌剤である。ヨーロッパイチイに由来するドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ）は、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）の半合成類似体である。パクリタキセル及びドセタキセルは、チューブリン二量体からの微小管の集合を促進し、脱重合を防いで微小管を安定化させ、これが細胞における有糸分裂の阻害をもたらす。
【００９５】
「抗癌療法」は本明細書で使用されるとき、対象における癌を低減又は阻害する治療を指す。抗癌療法の例には、細胞傷害性放射線療法のほか、対象への細胞傷害性剤、化学療法剤、増殖阻害剤、癌ワクチン、血管新生阻害剤、プロドラッグ、サイトカイン、サイトカインアンタゴニスト、コルチコステロイド、免疫抑制剤、制吐薬、抗体もしくは抗体断片、又は鎮痛剤の治療的有効量の投与が含まれる。
【００９６】
「標的分子」は、（好ましくはスキャッチャード分析による１μＭ  Ｋｄより高い親和性で）本発明のタンパク質複合体に結合することができる分子を指す。標的分子の例には、サイトカイン及びサイトカイン受容体などの血清可溶性タンパク質及びこの受容体、アドヘシン、増殖因子及びこの受容体、ホルモン、ウイルス粒子（例えば、ＲＳＶＦタンパク質、ＣＭＶ、ＳｔａｐｈＡ、インフルエンザ、Ｃ型肝炎ウイルス）、微生物（例えば、細菌細胞タンパク質、真菌細胞）、ＣＤタンパク質及びこの受容体が含まれるが、これらに限定されない。
【００９７】
「対象」は、哺乳動物、例えばヒトなどの脊椎動物である。哺乳動物には、家畜（ウシなどの）、スポーツ用動物、ペット（ネコ、イヌ及びウマなどの）、霊長類、マウス、及びラットが含まれるが、これらに限定されない。
【００９８】
実施例において言及されている市販の試薬は、特に指示のない限り製造者の指示に従って使用された。以下の実施例において及び本明細書を通じて、ＡＴＣＣアクセッション番号により特定された細胞の供給源は、アメリカンタイプカルチャーコレクション、マナッサス、ＶＡである。特に断りのない限り、本発明は、上文及び以下の教科書：Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記参照；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＹ、１９８９）；Ｉｎｎｉｓら、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、ＮＹ、１９９０）；Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、１９８８）；Ｇａｉｔ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９８４）；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ、１９８７；Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９１に記載されたものなどの組換ＤＮＡ技術の標準的な手順を使用する。
【００９９】
本明細書及び特許請求の範囲を通じて、語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形形態は、記載された整数又は整数群の包含を意味するが、任意の他の整数又は整数群の除外を意味するものではないと理解される。
【０１００】
用語「プロドラッグ」は本出願において使用されるとき、親薬物と比べて腫瘍細胞に対する細胞傷害性が場合により低い可能性があり、酵素的に活性化又はより活性な親形態に変換することができる薬学的に活性な物質の前駆体又は誘導体型を指す。例えば、Ｗｉｌｍａｎ、「Ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ、１４、３７５〜３８２頁、６１５ｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｂｅｌｆａｓｔ（１９８６）、及びＳｔｅｌｌａら、「Ｐｒｏｄｒｕｇｓ：Ａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、Ｂｏｒｃｈａｒｄｔら（編）、２４７〜２６７頁、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（１９８５）を参照のこと。プロドラッグには、より活性な細胞傷害性遊離薬物に変換することができる、リン酸塩含有プロドラッグ、チオリン酸塩含有プロドラッグ、硫酸塩含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ−アミノ酸修飾プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、ベータ−ラクタム含有プロドラッグ、場合により置換されたフェノキシアセトアミド含有プロドラッグ、又は場合により置換されたフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、５−フルオロシトシン及び他の５−フルオロウリシンプロドラッグが含まれるが、これらに限定されない。本発明において使用するためのプロドラッグ形態に誘導体化され得る細胞傷害性薬物の例には、上記の化学療法剤が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０１】
用語「サイトカイン」は、細胞間メディエーターとして別の細胞で作用する、１つの細胞集団により放出されるタンパク質に対する総称である。このようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、及び伝統的なポリペプチドホルモンである。サイトカインに含まれるのは、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）などの成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロシン；インスリン；プロインスリン；レラキシン；プロレラキシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、及び黄体形成ホルモン（ＬＨ）などの糖タンパク質ホルモン；上皮成長因子（ＥＧＦ）；肝臓増殖因子；線維芽成長因子（ＦＧＦ）；プロラクチン；胎盤性ラクトゲン；腫瘍壊死因子−アルファ及び−ベータ；ミュラー管抑制因子；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ−αなどの神経増殖因子；血小板成長因子；ＴＧＦ−アルファ及びＴＧＦ−βなどの形質転換増殖因子（ＴＧＦ）；インスリン様成長因子−Ｉ及び−ＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロン−アルファ、−ベータ及び−ガンマなどのインターフェロン；マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）などのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）及び顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）；ＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８などのインターロイキン（ＩＬ）；ＴＮＦ−α又はＴＮＦ−βなどの腫瘍壊死因子；並びにＬＩＦ及びキットリガンド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子である。本明細書で使用されるとき、用語サイトカインには、天然の供給源又は組換え細胞培養物由来のタンパク質、及び天然配列サイトカインの生物学的に活性な同等物が含まれる。
【０１０２】
「サイトカインアンタゴニスト」により、少なくとも一つのサイトカインの生物学的活性を部分的又は完全にブロック、阻害、又は中和する分子を意味する。例えば、サイトカインアンタゴニストは、サイトカイン発現及び／又は分泌を阻害すること、サイトカインもしくはサイトカイン受容体に結合することによりサイトカイン活性を阻害することができる。サイトカインアンタゴニストには、抗体、ヘテロ多量体、合成又は天然配列ペプチド、イムノアドヘシン、及びサイトカイン又はサイトカイン受容体に結合する低分子アンタゴニストが含まれる。サイトカインアンタゴニストは、場合により細胞傷害性剤とコンジュゲート又は融合される。
【０１０３】
用語「免疫抑制剤」は本明細書で使用されるとき、治療される対象の免疫系を抑制又は隠蔽するように作用する物質を指す。これには、サイトカイン産生を抑制し、自己抗原発現をダウンレギュレートもしくは抑制し、又はＭＨＣ抗原を隠蔽する物質が含まれる。免疫抑制剤の例には、２−アミノ−６−アリール−５−置換ピリミジン（米国特許第４，６６５，０７７号を参照のこと）；ＣＥＬＬＣＥＰＴ（登録商標）などのミコフェノール酸モフェチル；アザチオプリン（ＩＭＵＲＡＮ（登録商標）、ＡＺＡＳＡＮ（登録商標）／６−メルカプトプリン；ブロモクリプチン；ダナゾール；ダプソン；グルタルアルデヒド（米国特許第４，１２０，６４９号に記載の通りＭＨＣ抗原を隠蔽する）；ＭＨＣ抗原及びＭＨＣ断片に対する抗イディオタイプ抗体；シクロスポリンＡ；コルチコステロイド及びグルココルチコステロイドなどのステロイド、例えば、プレドニゾン、プレドニゾロン（ＰＥＤＩＡＰＲＥＤ（登録商標）（プレドニゾロンリン酸ナトリウム）又はＯＲＡＰＲＥＤ（登録商標）（プレドニゾロンリン酸ナトリウム経口溶液）、メチルプレドニゾロンなどの）、及びデキサメタゾン；メトトレキサート（経口又は皮下）（ＲＨＥＵＭＡＴＲＥＸ（登録商標）、ＴＲＥＸＡＬＬＴＭ（商標））；ヒドロキシクロロキン（ｈｙｄｒｏｘｙｃｌｏｒｏｑｕｉｎｅ）／クロロキン；スルファサラジン；レフルノミド；抗インターフェロン−γ、−β、又は−α抗体、抗腫瘍壊死因子−α抗体（インフリキシマブ又はアダリムマブ）、抗ＴＮＦαイムノアドヘシン（ＥＮＢＲＥＬ（登録商標）、エタネルセプト）、抗腫瘍壊死因子−β抗体、抗インターロイキン−２抗体及び抗ＩＬ−２受容体抗体を含むサイトカイン又はサイトカイン受容体アンタゴニスト；抗ＣＤ１１ａ及び抗ＣＤ１８抗体を含む抗ＬＦＡ−１抗体；抗Ｌ３Ｔ４抗体；異種抗リンパ球グロブリン；ポリクローナルもしくは汎Ｔ抗体、又はモノクローナル抗ＣＤ３もしくは抗ＣＤ４／ＣＤ４ａ抗体；ＬＦＡ−３結合ドメインを含有する可溶性ペプチド（ＷＯ  ９０／０８１８７）；ストレプトキナーゼ；ＴＧＦ−β；ストレプトドルナーゼ；宿主由来のＲＮＡ又はＤＮＡ；ＦＫ５０６；ＲＳ−６１４４３；デオキシスペルグアリン；ラパマイシン；Ｔ細胞受容体（Ｃｏｈｅｎら、米国特許第５，１１４，７２１号）；Ｔ細胞受容体断片（Ｏｆｆｎｅｒら  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：４３０〜４３２頁（１９９１）；ＷＯ  ９０／１１２９４；Ｉａｎｅｗａｙ、Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：４８２頁（１９８９）；及びＷＯ  ９１／０１１３３）；Ｔ１０Ｂ９などのＴ細胞受容体抗体（ＥＰ  ３４０，１０９）；シクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標））；ダプソン；ペニシラミン（ＣＵＰＲＩＭＩＮＥ（登録商標））；血漿交換；又は静注用免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）が含まれる。これらは、単独で又は互いに併用して、特にステロイド及び別の免疫抑制剤の併用で、又はこのような併用とこれに続く、ステロイドの必要性を低減するための非ステロイド剤による維持量で使用することができる。
【０１０４】
「鎮痛剤」は、対象における疼痛を阻害又は抑制するように作用する薬物を指す。例示的な鎮痛剤にはイブプロフェン（ＭＯＴＲＩＮ（登録商標））、ナプロキセン（ＮＡＰＲＯＳＹＮ（登録商標））、アセチルサリチル酸、インドメタシン、スリンダク、及びトルメチンを含む非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）（これらの塩及び誘導体を含む）、並びに抗痙攣薬（ガバペンチン、フェニトイン、カルバマゼピン）又は三環系抗うつ薬を含む、生じ得る刺痛を低減するのに使用される様々な他の薬物が含まれる。具体例には、アセトアミノフェン、アスピリン、アミトリプチリン（ＥＬＡＶＩＬ（登録商標））、カルバマゼピン（ＴＥＧＲＥＴＯＬ（登録商標））、フェニトイン（ＤＩＬＡＮＴＩＮ（登録商標））、ガバペンチン（ＮＥＵＲＯＮＴＩＮ（登録商標））、（Ｅ）−Ｎ−バニリル−８−メチル−６−ノネンアミド（ＣＡＰＳＡＩＣＩＮ（登録商標））、又は神経遮断薬が含まれる。
【０１０５】
「コルチコステロイド」は、自然発生コルチコステロイドの効果を模倣又は増大する、ステロイドの一般的化学構造を有する幾つかの合成又は自然発生物質のいずれか１つを指す。合成コルチコステロイドの例には、プレドニゾン、プレドニゾロン（メチルプレドニゾロンを含む）、デキサメタゾン、トリアムシノロン、及びベタメタゾンが含まれる。
【０１０６】
「癌ワクチン」は本明細書で使用されるとき、対象において癌に対する免疫応答を刺激する組成物である。癌ワクチンは典型的には、抗原に対する免疫応答を更に刺激及び追加刺激する他の成分（例えばアジュバント）と共に、対象にとって自家（自己由来）又は同種異系（他者由来）であり得る癌関連物質又は細胞（抗原）の供給源からなる。癌ワクチンは、１つもしくは幾つかの特異的抗原に対する抗体を産生し、及び／又はこれらの抗原を有する癌細胞を攻撃するキラーＴ細胞を産生するように対象の免疫系の刺激をもたらすことができる。
【０１０７】
「制吐薬」は、対象における悪心を低減又は予防する化合物である。制吐化合物には、例えば、ニューロキニン−１受容体アンタゴニスト、５ＨＴ３受容体アンタゴニスト（オンダンセトロン、グラニセトロン、トロピセトロン、及びザチセトロン（ｚａｔｉｓｅｔｒｏｎ）などの）、バクロフェンなどのＧＡＢＡＢ受容体アゴニスト、デキサメタゾン、ＫＥＮＡＬＯＧ（登録商標）、ＡＲＩＳＴＯＣＯＲＴ（登録商標）、又はＮＡＳＡＬＩＤＥ（登録商標）などのコルチコステロイド、抗ドーパミン作用性のフェノチアジン（例えばプロクロルペラジン、フルフェナジン、チオリダジン及びメソリダジン）、ドロナビノール、メトクロプラミド、ドンペリドン、ハロペリドール、シクリシン、ロラゼパム、ロクロルペラジン、及びレボメプロマジンが含まれる。
【０１０８】
ＩＩ．単鎖及び多重鎖テザー抗体及び他のヘテロ多量体の構築
本明細書に記載された単一特異性及び多重特異性（例えば二重特異性）抗体を含むヘテロ多量体は、一又は複数のテザーを用いて構築することができる。
【０１０９】
テザーの使用は、単一のヘテロ多量体内に異なる重鎖及び／又は軽鎖を有するヘテロ多量体の比較的純粋な集団の構築を可能にする。特に、上記の通り、抗体は典型的には２つの同一の重鎖を含み、この各々が２つの同一の軽鎖の１つと対合する。本発明のテザー技術の使用は、単一ポリペプチド鎖により形成された単一のヘテロ多量体抗体の形成において、異なる抗体重鎖が互いと二量体化できるようにする。テザーは、典型的には第１の重鎖のＣＨ３ドメインを軽鎖のＶＬドメインに連結させて、第１の重鎖を第２の重鎖に接続することができ、軽鎖自体は、第２のテザーにより第２の重鎖に連結される。ヘテロ多量体単鎖抗体において、第３のテザーは、第２の軽鎖を第１の重鎖に直接連結させることができ、故に、各々がこの同種軽鎖と対合し得る２つの異なる重鎖を含むヘテロ多量体をもたらす。他の実施態様では、テザーは、第１の重鎖定常ドメインのＣ末端を第２の重鎖可変ドメインのＮ末端と接続して、第１の重鎖を第２の重鎖に直接接続することができる。このようなヘテロ多量体内の重鎖及び軽鎖の各対は、異なる重鎖及び軽鎖同種対の存在により、異なる結合特異性を有することができ、故に該ヘテロ多量体は多重特異性抗体と見なすことができる。本発明のテザー技術の使用はまた、３つのポリペプチド鎖の結合を含み得るヘテロ多量体（例えば多重鎖抗体）の形成も可能にし、１つのポリペプチド鎖は、上記のようなＨＤテザーにより直接つなぎ合わされた２つのＨＣを含み、他の２つのポリペプチド鎖は同一であり、及びＬＣを形成し、該ＬＣは２つのＨＣと結合して２つの機能的ＨＣ／ＬＣ同種対を形成する。他の実施態様では、ＨＤ及びＣＬＨテザーの使用は、２つのポリペプチド鎖による多重特異性抗体の形成を可能にし、一方のポリペプチド鎖は第１のＬＣを形成し、他方のポリペプチド鎖は２つのＨＣ及び第２のＬＣを含み、該ＬＣはＨＤテザーを介して第１のＨＣと、ＣＬＨテザーを介して第２のＨＣと結合する。他の実施態様では、ＨＤ及びＣＬＨテザーの使用は、２つのポリペプチド鎖を有する多重特異性抗体の形成を可能にし、第１のポリペプチド鎖は第１のＬＣ及び２つのＨＣを含み（１つのＨＣは、ＣＬＨテザーを介して第１のＬＣと直接相互作用し、ＨＤテザーを介して第２のＨＣと直接相互作用する）、第２のポリペプチドは、第１のＬＣに連結されないＨＣと結合する第２のＬＣを形成する。他の実施態様では、本発明のテザー技術の使用は、イムノアドヘシンがＨＤテザーを介して半抗体と結合するヘテロ多量体の形成を可能にする。該テザー技術は、本発明のヘテロ多量体を改変すために、単独で又はノブ−イントゥ−ホール（「ＫｎＨ」）技術と併用して利用することができる。ＫｎＨ技術を用いる又は用いない、テザーを含むヘテロ多量体、及び組換えヘテロ多量体作製は、以下に詳細に記載されている。
【０１１０】
Ａ．ヘテロ多量体テザー
本発明は、テザーを用いて構築されたヘテロ多量体を提供する。例えば、ヘテロ多量体は、免疫グロブリン重鎖定常ドメインのＣ末端を免疫グロブリン重鎖可変ドメインのＮ末端と連結させるテザーを有することができる。他の実施態様では、ヘテロ多量体は、重鎖とこの同種軽鎖との適切な結合（すなわち、重鎖とこれにつながれた軽鎖との結合）に役立つ、一又は複数（例えば、２つ）の追加のテザーを更に含む。このようなヘテロ多量体は、ＫｎＨ技術により作られたものなど、追加のヘテロ二量体化ドメインを含んで又は含まずに構築することができる。
【０１１１】
図１の模式図に示されている通り、例示的なヘテロ多量体は、２つの異なる重鎖（ＨＣ１及びＨＣ２）及び２つの異なる軽鎖（ＬＣ１及びＬＣ２）を含有する多重特異性単鎖抗体であり、ＨＣ１及びＬＣ１は第１の同種対を形成し、ＨＣ２及びＬＣ２は第２の同種対を形成する。例示的なヘテロ多量体には、３つのテザーが存在する。第１のテザー（ＨＤテザー）はＨＣ１をＬＣ２と連結させ、第２のテザー（ＣＬＨテザー１）及び第３のテザー（ＣＬＨテザー２）は、それぞれＬＣ１をＨＣ１と、ＬＣ２をＨＣ２と連結させる。該テザーは、２つの異なる重鎖及びこれらの同種軽鎖を一緒に結び付け、これにより多重特異性を有するヘテロ多量体単鎖抗体を生成するのに役立つ。
【０１１２】
特定の実施態様では、ＨＤテザーは、第１及び第２の重鎖の適切な結合を可能にする構築されたヘテロ多量体（図１）におけるＨＣ１のＣ末端とＬＣ２（又は、ＬＣ２の非存在下ではＨＣ２）のＮ末端の間の距離にまたがるほど長いが、ＨＣ１及び／又はＨＣ２の分子間ホモ二量体化を防ぐほど短い。ＨＣ１のＣ末端とＬＣ２（又は、ＬＣ２の非存在下ではＨＣ２）のＮ末端の間の距離は、構築されたヘテロ多量体間で異なり得、故にＨＤテザーの長さもヘテロ多量体間で異なり得る。２０〜４０個のアミノ酸、２５〜４０個のアミノ酸、及び３０〜４０個のアミノ酸のＨＤテザーが有効であるように、一般に１５〜１００個のアミノ酸のＨＤテザーが有効である。特定の実施態様では、ＨＤテザーは、３６から３９アミノ酸長（例えば、３６、３７、３８、又は３９アミノ酸長）である。
【０１１３】
特定の実施態様では、ＣＬＨテザーはそれぞれ、適切な軽鎖／重鎖結合を可能にする構築されたヘテロ多量体（図１）における重鎖のＮ末端と同種軽鎖のＣ末端の間の距離にまたがるほど長いが、望まれない鎖内結合（すなわち、軽鎖とこれが直接つながれていない非同種重鎖との結合）を防ぐほど短い。重鎖のＮ末端とこの同種軽鎖のＣ末端の間の距離は、抗体間で又は抗体自体の中でさえ異なり得る（すなわち、第１同種対の重鎖のＮ末端と同種軽鎖のＣ末端の間の距離は、第２同種対のものとは異なる）。したがって、ＨＤテザーの長さは、本発明のヘテロ多量体間で異なる可能性があり、ＣＬＨテザー１の長さは、同じヘテロ多量体内のＣＬＨテザー２の長さに等しくない可能性がある。２０〜４０個のアミノ酸、２５〜４０個のアミノ酸、３０〜４０個のアミノ酸、及び３０〜３５個のアミノ酸（例えば、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、又は３５個のアミノ酸）のＣＬＨテザーが有効であるように、一般に１０〜８０個のアミノ酸のＣＬＨテザーが有効である。本発明のヘテロ多量体は、第１の軽鎖を第１の重鎖と、第２の軽鎖を第２の重鎖とつなぐ２つのテザー（ＣＬＨテザー１及びＣＬＨテザー２）を有することができる。
【０１１４】
ＨＤ又はＣＬＨテザーは、柔軟なままであり得、２次構造を形成し得ず、このためグリシン（Ｇ）及びセリン（Ｓ）残基を含有するテザーが使用され得る。テザーは、Ｇ及びＳ残基のみから成ってもよいが、上記の鎖内結合を可能にするようにテザーが柔軟なままである限り、他の残基を含んでもよい。特定の実施態様では、ＨＤ又はＣＬＨテザーはＧＧＳリピートを含有する（図２）。幾つかの実施態様では、ＨＤテザーは少なくとも１個のＧＧＳリピートを含有する。本明細書に記載された例示的なＨＤテザーは、このＮ末端及びＣ末端に８〜９個のＧＧＳリピート（配列番号１９）及びエンドペプチダーゼ切断部位（例えば、フューリン及びＬｙｓ−Ｃ切断部位）を含有する（図２）。別の実施態様では、ＣＬＨテザーは少なくとも１個のＧＧＳリピートを含有する。本明細書に記載された例示的なＣＬＨテザーは、このＮ末端及びＣ末端に６個のＧＧＳリピート（配列番号２０）及びエンドペプチダーゼ切断部位（例えばフューリン切断部位）を含有する（図２）。
【０１１５】
Ｂ．ヘテロ多量体テザーの切断
本発明のヘテロ多量体がひとたび構築されると、テザーはもはや必要とされ得ず、幾つかの実施態様においてヘテロ多量体から切断され得る。テザー中に又はテザーに直接隣接して見出されるが、テザー以外のヘテロ多量体成分配列中には存在しない、又は使用される条件下で切断に利用できない切断部位が、テザーを除去するのに使用され得る。
【０１１６】
図２は、例示的なヘテロ多量体単鎖抗体内に存在し得る３つのテザーにおける例示的な切断部位の位置を図示している。一般に、テザー中の切断部位は、テザー配列のＣ末端及びＮ末端もしくはこの近く、又は抗体及びテザーがつながれる部位もしくこの近くの抗体配列内に位置する。一又は複数のテザーが、（例えば、定常重鎖のＣ末端のリシン残基で）Ｌｙｓ−Ｃエンドペプチダーゼを用いて切断される場合、Ｌｙｓ−Ｃエンドペプチダーゼ切断部位を除去するためにヘテロ多量体の配列が修飾される必要はない可能性がある。このような修飾の例は、アラニンへのヒンジ領域中のリシンの変異である（本明細書に記載された例示的なヘテロ多量体では、例えば、Ｋ２２２Ａ、Ｋａｂａｔナンバリングシステム；Ｋ２２２Ａ、ＥＵナンバリングシステム）。異なる切断剤が本発明において使用するために選択される場合、他の切断部位の修飾が必要とされる可能性があり、類似の方法で行われ得る。
【０１１７】
特定の部位でのアミノ酸配列の切断は、当技術分野で一般的であり、酵素的切断、化学的切断、又は自己処理を必要とし得る。例えば、テザーは、エンドペプチダーゼを用いてタンパク質から切断することができる。例示的なエンドペプチダーゼには、フューリン、ウロキナーゼ、Ｌｙｓ−Ｃ、Ａｓｐ−Ｎ、Ａｒｇ−Ｃ、Ｖ８、Ｇｌｕ−Ｃ、トロンビン、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰａ）、ゲネナーゼ（スブチリシンＢＰＮ’プロテアーゼのバリアント）、第Ｘａ因子、ＴＥＶ（タバコエッチウイルスシステインプロテアーゼ）、エンテロキナーゼ、ＨＲＶ  Ｃ３（ヒトライノウイルスＣ３プロテアーゼ）、キニノゲナーゼ、キモトリプシン、トリプシン、ペプシン、及びパパインが含まれるがこれらに限定されず、これらの全ては市販されている（例えば、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、又はＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから）。フューリン（ＰＣ１）、ＰＣ２、及びＰＣ３などのスブチリシン様プロタンパク質転換酵素（Ｓｔｅｉｎｅｒ（１９９１）ｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ（Ｆｒｉｃｋｅｒ編）１〜１６頁、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、ＦＬ；Ｍｕｌｌｅｒら、ＪＢＣ  ２７５：３９２１３〜３９２２２頁、（２０００））及びＮ−アルギニン二塩基転換酵素（Ｃｈｏｗら、ＪＢＣ  ２７５：１９５４５〜１９５５１頁（２０００））は、二塩基性部位で切断する。Ｌｙｓ−Ｃはリシン残基のカルボキシル側で切断し、Ｖ８及びＧｌｕ−Ｃはグルタミン酸残基のカルボキシル側で切断し、Ａｒｇ−Ｃはアルギニン残基のカルボキシル側で切断し、Ａｓｐ−Ｎはアスパラギン酸残基のアミノ側で切断し、キモトリプシンはチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びロイシン残基のカルボキシル側で切断し、並びにトリプシンはアルギニン及びリシン残基のカルボキシル側で切断する。ＴＥＶは、「Ｇｌｎ」と「Ｇｌｙ」残基の間のアミノ酸配列ＧｌｕＡｓｎＬｅｕＴｙｒＰｈｅＧｌｎＧｌｙ（配列番号４）を切断する。このような酵素の使用は当技術分野で一般的であり、プロトコルは製造者から入手可能である。図３Ａは、フューリンによる切断後の例示的なヘテロ多量体単鎖抗体を示している。
【０１１８】
あるいは、テザーは、ヒドロキシルアミンなどの化学物質を用いてタンパク質から切断することができる。ヒドロキシルアミンは、アスパラギン−グリシンペプチド結合を切断する。ヒドロキシルアミンがテザーをタンパク質から切断するのに使用される場合、タンパク質中の幾つかのグリシン又はアスパラギン残基は、タンパク質の断片化を避けるために変異される必要があり得る。
【０１１９】
ペプチド結合を切断する多数の他の化学物質が、当技術分野で知られている。例えば、Ｎ−クロロスクシンイミドは、トリプトファン残基のＣ末端側で切断する（Ｓｈｅｃｈｔｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １５：５０７１〜５０７５頁（１９７６））。Ｎ−ブロモスクシンイミド及び臭化シアンも、トリプトファン残基のＣ末端側で切断する。更に、２−ニトロチオシアノ安息香酸又は有機ホスフィンは、システイン残基のＮ末端側でタンパク質を切断するのに使用することができる（例えば、ＥＰ  ０３３９２１７を参照のこと）。
【０１２０】
タンパク質が自己処理することも知られている。例えば、ヘッジホッグタンパク質は、該タンパク質内のタンパク質分解活性によりＧｌｙＡｓｐＴｒｐＡｓｎＡｌａＡｒｇＴｒｐＣｙｓＰｈｅ切断部位（配列番号５）で処理される。自己タンパク質分解切断部位も、リンカー又はテザー配列に含まれ得る。
【０１２１】
エンドペプチダーゼ切断後、本発明のヘテロ多量体は、ヘテロ多量体の精製前又は後に一又は複数のエキソペプチダーゼにより更に処理することができる。図３Ｂは、精製並びにフューリン、Ｌｙｓ−Ｃ、及びエキソペプチダーゼ（例えば、カルボキシペプチダーゼＢ）処理後のヘテロ多量体単鎖抗体を示している。フューリン処理後、ヘテロ多量体のＣＨ３１ドメインに依然として付加されたＨＤテザーは、Ｌｙｓ−Ｃ処理により除去される。ＣＬ１及びＣＬ２ドメインに付加された残存フューリン認識配列は、エキソペプチダーゼ（例えば、カルボキシペプチダーゼＢ）による処理により除去される。
【０１２２】
Ｃ．ノブ−イントゥ−ホール技術
本発明のヘテロ多量体は、２つの異なる抗体重鎖間の界面を改変してこれらの結合を促進するノブ−イントゥ−ホール（ＫｎＨ）技術（例えば、その全体を出典明示によりここに援用する米国特許第５，７３１，１６８号を参照のこと）を用いて、ヘテロ二量体化ドメインを更に含むことができる。一般に、該方法は、重鎖のヘテロ二量体化を更に促進するよう突起がキャビティに位置し得るように、「突起」を第１の重鎖の界面に、対応する「キャビティ」を第２の重鎖の界面に導入することを必要とする。
【０１２３】
第１の好ましい界面は、第１の重鎖のＣＨ３ドメイン（ＣＨ３１）定常ドメインの少なくとも一部、及び第２の重鎖のＣＨ３ドメイン（ＣＨ３２）定常ドメインの少なくとも一部を含む。突起は、第１のドメイン（例えば、ＣＨ３１）の界面からの小さいアミノ酸側鎖をより大きい側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）と置換して構築することができる。突起と同一又は類似のサイズの補完的キャビティは、場合により、大きいアミノ酸側鎖をより小さいもの（例えば、アラニン又はスレオニン）と置換して、第２のドメイン（例えばＣＨ３２）の界面に作られる。第２の好ましい界面は、軽鎖のＣＬドメインの少なくとも一部、及び突起−キャビティ相互作用が上記の通り構築され得る重鎖のＣＨ１ドメインを含む。適切に位置し及び適切な大きさをした突起又はキャビティが、第１又は第２のドメインのいずれかの界面に存在する場合、それぞれ対応するキャビティ又は突起を、隣接する界面で改変しさえすればよい。
【０１２４】
Ｄ．異なる結合特性を有する単一特異性又は多重特異性ヘテロ多量体
このようなヘテロ多量体の可変ドメインは、幾つかの方法から得ることができると理解されるべきである。例えば、本発明のヘテロ多量体の可変ドメインは、当技術分野で公知の既存の抗体と同じであってもよい。
【０１２５】
上記の通り、本発明のＨＤテザーは、異なる結合特性を有するヘテロ多量体を生成するのに使用することができる。幾つかの実施態様では、本発明は、同じ標的エピトープに対する結合親和性が異なる２つの半抗体を含む単鎖単一特異性抗体を生成するのに使用することができる。別の実施態様では、本発明は、単鎖多重特異性抗体（少なくとも２つの抗原又は同じ抗原上の少なくとも２つのエピトープに結合する抗体）を生成するのに使用することができる。典型的には、自然発生のＩｇＧ抗体において、抗体中の重鎖及び軽鎖の各対の可変領域は同一である。本発明によるテザーの使用は、抗体内の２つの重鎖が異なることを可能にし、結合特異性が異なる抗原結合ドメイン（例えばエピトープ標的）、又は結合特異性は同じだが結合親和性が異なる抗原結合ドメインを有する抗体をもたらす。幾つかの実施態様では、ＨＤテザーは、単一ポリペプチド鎖内にコードされた２つの異なる重鎖間の結合を促進して重鎖のみの単鎖抗体を産生する。他の実施態様では、ＣＬＨテザーは、重鎖とこの同種軽鎖の間の結合を促進する。幾つかの実施態様では、重鎖の１つとこの同種軽鎖の間の結合は、本発明のヘテロ多量体を生成するのにＣＬＨテザーなしで確立される。場合により、一又は複数のテザーは、エンドペプチダーゼ切断部位（例えば、フューリン及びＬｙｓ−Ｃ切断部位）を含み、該部位は、一又は複数のテザーが構築後にヘテロ多量体から除去されるように切断することができる。場合により、本発明のヘテロ多量体は更に、ＫｎＨ技術を用いて生成された一又は複数の突起−キャビティ界面を含む。
【０１２６】
図１に示されている通り、上記された例示的な二重特異性ヘテロ多量体（この場合、二重特異性抗体）は、ＨＤテザー及び２つのＣＬＨテザーを含有し、それぞれこのＮ末端及びＣ末端に２つのフューリン切断部位を含み得る。場合により、例示的なヘテロ多量体は、ＨＣ１及びＨＣ２の結合を更に促進するのにＫｎＨ技術を使用することができる。
【０１２７】
テザーの切断が見込まれるヘテロ多量体は、この配列内にテザーを切断するのに使用されるエンドペプチダーゼの切断部位を含有するべきではなく、又は、ヘテロ多量体のテザー以外の配列内に切断部位がある場合、ヘテロ多量体の切断も意図されていない限り、該切断部位は、使用される条件下で切断されるべきではない。ヘテロ多量体の重鎖又は軽鎖配列中に、テザーを除去した際のヘテロ多量体自体の切断を避けるために除去される必要があるいずれかの切断部位（例えば、フューリン又はＬｙｓ−Ｃエンドペプチダーゼ切断部位）があるかどうかを決定するのに、ヘテロ多量体の配列がスキャンされ得る。
【０１２８】
単鎖単一特異性又は多重特異性ヘテロ多量体（例えば抗体）は、本明細書に記載された方法を用いて構築することができ、ヘテロ多量体の２つの異なる重鎖がＨＤテザーにより互いに直接接続される。一実施態様では、重鎖のみの単鎖単一特異性又は多重特異性ヘテロ多量体は、ＣＨ１ドメインを更に欠くことができる（ＶＨドメインは、場合によりヒンジにより少なくとも一つのＣＨドメインに直接接続される）。別の実施態様では、単鎖単一特異性又は多重特異性ヘテロ多量体重鎖はＣＨ１ドメインを欠くが、ＣＬＨテザーを介して、ＣＬドメインを欠く対応する軽鎖と結合する。このようなヘテロ多量体は、２つの異なる抗原を結び付け、又はＢ細胞とＴ細胞を結合させるのに使用することができる。更に別の実施態様では、テザーは、半抗体をイムノアドヘシンと結合させるのに利用することができる。
【０１２９】
更に、本発明は、単一特異性又は多重特異性を有するヘテロ多量体を含む。一実施態様では、ＣＬＨテザーにより同種軽鎖に連結された第１の重鎖は、同種軽鎖がテザーと関係なく結合する第２の重鎖と結合する。
【０１３０】
Ｅ．異なるエフェクター機能を有するヘテロ多量体
幾つかの実施態様では、本明細書に記載された方法を用いて構築された本発明のヘテロ多量体（例えば、単鎖もしくは多重鎖抗体、又は抗体−イムノアドヘシン複合体）は、エフェクター機能の変化を可能にするＣＨ２ドメイン変異を含んでもよい。典型的には、ＣＨ２ドメイン変異は、グリコシル化状態が変化したヘテロ多量体をもたらし得るＮ２９７の変異である。特定の実施態様では、Ｎ２９７変異はＮ２９７Ａ置換である。エフェクター機能の変化には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害、食作用、細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体）のダウンレギュレーション、並びにＢ細胞活性化が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３１】
Ｆ．コンジュゲートタンパク質複合体
以下に詳細に記載されている通り、本発明のＨＤテザーは、定常領域が細胞傷害性剤へのコンジュゲーションにより修飾されたヘテロ多量体（例えば、単一特異性、二重特異性、多重特異性、単鎖又は多重鎖抗体）などのタンパク質複合体を生成するのに使用することもできる。例えば、ＨＤテザーは、重鎖定常領域の１つ（ＨＣ１又はＨＣ２）が細胞傷害性剤へのコンジュゲーションを可能にする修飾を含有するが、他方の重鎖定常領域は含有しないヘテロ多量体の構築を可能にする。１つの例において、ＨＣ１は細胞傷害性剤にコンジュゲートされるが、ＨＣ２はコンジュゲートされない。本発明のコンジュゲートされたヘテロ多量体の例を図示する模式図が、図４に示されている。例示的なヘテロ多量体単鎖抗体は、２つの完全長重鎖及び同種軽鎖、並びに上記されたＨＤ及びＣＬＨテザーを含む。図４に示されている通り、重鎖の１つは、細胞傷害性剤（例えば、毒素又は抗生物質）にコンジュゲートされている。同様に、代わりのヘテロ多量体コンストラクトにおいて、軽鎖定常領域の１つは細胞傷害性剤にコンジュゲートされ得るが、他方の軽鎖定常領域はコンジュゲートされない（例えば、ＬＣ１は細胞傷害性剤にコンジュゲートされ、ＬＣ２はコンジュゲートされない）。図５Ａに示されている通り、コンジュゲートタンパク質複合体は、本発明の多重鎖抗体であってもよい。細胞傷害性剤のコンジュゲーションは、図５Ａに示された特定の多重鎖抗体に限定されない。図５Ｂ及び図５Ｃに示されたものなどの多重鎖抗体のほか、イムノアドヘシン抗体ヘテロ多量体も定常領域でコンジュゲートされ得る。
【０１３２】
１つの特定の例において、ヘテロ多量体の定常領域は、細胞傷害性剤をヘテロ多量体にコンジュゲートするのに使用されるリンカー試薬上、又は細胞傷害性剤自体上の求核置換基と反応することができる求電子性部分を導入するように修飾されてもよい。グリコシル化抗体の糖は、例えば過ヨウ素酸酸化試薬を用いて酸化されて、リンカー試薬又は細胞傷害性剤のアミン基と反応することができるアルデヒド基又はケトン基を形成し得る。得られたイミンシッフ塩基群は、安定な結合を形成することができ、又は、例えばホウ化水素試薬により還元されて安定なアミン結合を形成し得る。細胞傷害性剤上の求核基には、抗体領域及びリンカー試薬上の求電子基（（ｉ）ＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロホルメート、及び酸ハロゲン化物などの活性エステル；（ｉｉ）ハロアセトアミドなどのハロゲン化アルキル及びハロゲン化ベンジル；並びに（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシル、及びマレイミド基を含む）と反応して共有結合を形成することができるアミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、及びアリールヒドラジド基が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３３】
Ｇ．他のタンパク質特性
本発明によるヘテロ多量体は、ヒト又はマウス源又はこの組み合わせを含む、任意の供給源由来の配列を含んでもよい。タンパク質の特定の部分（例えば超可変領域）の配列はまた、ランダム配列を含むライブラリー（例えば、ファージディスプレイライブラリー）をスクリーニングして同定された配列などの人工的配列であってもよい。
【０１３４】
異なる供給源由来の配列を含むヘテロ多量体の場合、ヘテロ多量体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種に由来する抗体、又は特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一又は相同であるが、該鎖の残りは、別の種に由来する抗体、又は別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体、及びこのような抗体の断片における対応する配列と同一又は相同である「キメラ」ヘテロ多量体であってもよい（ただし、これらが所望の生物学的活性を示すことを条件として）（米国特許第４，８１６，５６７号；及びＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８１：６８５１〜６８５５頁（１９８４））。このようなキメラヘテロ多量体は、例えば、マウス可変領域（又はこの部分）及びヒト定常領域を含むことができる。
【０１３５】
キメラ単鎖ヘテロ多量体は、場合により、非ヒト抗体に由来する最小配列を含有する「ヒト化」単鎖ヘテロ多量体（例えば、単鎖抗体）であってもよい。ヒト化ヘテロ多量体は典型的には、レシピエントの超可変領域由来の残基が、所望の特異性、親和性、及び能力を有する、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域由来の残基により置き換えられるヒト抗体（レシピエント抗体）に由来する。幾つかの例において、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基である。更に、ヒト化ヘテロ多量体は、レシピエント抗体又はドナー抗体に見出されない残基を含むことができる。これらの修飾は、ヘテロ多量体の性能を更に改良するために行われる。一般に、ヒト化ヘテロ多量体は、少なくとも一つ、及び典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、全て又は実質的に全ての超可変ループは非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全て又は実質的に全てのＦＲはヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化ヘテロ多量体はまた、場合により、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンの少なくとも一部も含む。更なる詳細については、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２〜５２５頁（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３〜３２９頁（１９８８）；及びＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  ２：５９３〜５９６頁（１９９２）を参照のこと。
【０１３６】
より詳細には、ヒト化ヘテロ多量体は、ヒト以外である供給源からこれに導入された一又は複数のアミノ酸残基を有し得る。これらの非ヒトアミノ酸残基は、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と呼ばれることが多い。ヒト化は基本的に、ヒト抗体の対応する配列を齧歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列に置換することにより、Ｗｉｎｔｅｒ及び共同研究者らの方法（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２〜５２５頁（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３〜３２７頁（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４〜１５３６頁（１９８８））に従って行うことができる。したがって、このような「ヒト化」ヘテロ多量体は、インタクトなヒト可変ドメインより実質的に少ないドメインが、非ヒト種由来の対応する配列により置換されたキメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）である。実際に、ヒト化ヘテロ多量体は典型的には、幾つかのＣＤＲ残基及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似部位由来の残基により置換されているヒト抗体である。
【０１３７】
ヒト化ヘテロ多量体の作製に使用される軽鎖及び重鎖両方のヒト可変ドメインの選択が、抗原性を低減するのに極めて重要である。いわゆる「ベストフィット（best-fit）」方法に従って、齧歯類抗体の可変ドメインの配列が公知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングされる。齧歯類の配列に最も近いヒト配列が、次いでヒト化ヘテロ多量体のヒトフレームワーク（ＦＲ）として認められる（Ｓｉｍｓら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５１：２２９６頁（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９６：９０１頁（１９８７））。別の方法は、軽鎖又は重鎖の特定のサブグループの全てのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークを使用する。該同じフレームワークは、幾つかの異なるヒト化ヘテロ多量体に使用することができる（Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：４２８５頁（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａら、Ｊ．  Ｉｍｍｎｏｌ．  １５１：２６２３頁（１９９３））。
【０１３８】
ヘテロ多量体は、一又は複数の標的抗原に対する高い親和性及び他の好ましい生物学的特性を保持した状態でヒト化されることが更に重要である。この目標を達成するために、例示的な方法に従って、ヒト化ヘテロ多量体は、親配列及びヒト化配列の三次元モデルを用いて、親配列及び様々な概念的ヒト化産物を分析する過程により調製される。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に利用可能であり、当業者に十分に公知である。選択された候補免疫グロブリン配列の可能性が高い三次元コンフォメーション構造を図示し、表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示を検証することは、候補免疫グロブリン配列の機能において果たす可能性のある残基の役割の分析、すなわち、抗原に結合する候補免疫グロブリンの能力に影響を与える残基の分析を可能にする。このようにして、ＦＲ残基は、標的抗原に対する増加した親和性などの所望のヘテロ多量体特性が得られるように、レシピエント配列及び移入配列から選択され得、組み合わされ得る。一般に、ＣＤＲ残基は、抗原結合への影響に直接及び最も実質的に関与する。
【０１３９】
ＩＩＩ．ベクター、宿主細胞、及び組換え方法
本発明のヘテロ多量体を組換え産生するには、これをコードする核酸が単離され、更なるクローニング（ＤＮＡの増幅）又は発現のために複製可能なベクターに挿入される。ヘテロ多量体をコードするＤＮＡは容易に単離され、従来の手順を用いて（例えば、ヘテロ多量体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いて）配列決定される。多くのベクターが利用可能である。ベクターの選択は、使用される宿主細胞に一部依存する。一般的に、好ましい宿主細胞は、原核生物又は真核生物（一般的に哺乳動物であるが、真菌（例えば、酵母）、昆虫、植物、及び他の多細胞生物由来の有核細胞も含む）起源のどちらかである。ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥ定常領域を含む任意のアイソタイプの定常領域がこの目的のために使用され得ること、並びにこのような定常領域は、任意のヒト又は動物種から得られ得ることが理解されよう。
【０１４０】
Ａ．原核生物宿主細胞を用いたヘテロ多量体の生成
ｉ．ベクター構築
本発明のヘテロ多量体のポリペプチド成分をコードするポリヌクレオチド配列は、標準的な組換え手法を用いて得ることができる。所望のポリヌクレオチド配列は、ハイブリドーマ細胞などの抗体産生細胞から単離及び配列決定されてもよい。あるいは、ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド合成装置又はＰＣＲ法を用いて合成されてもよい。得られたら、該ポリペプチドをコードする配列は、異種ポリヌクレオチドを原核生物宿主において複製及び発現することができる組換えベクターに挿入される。利用可能であり当技術分野で公知の多くのベクターが、本発明の目的のために使用することができる。適切なベクターの選択は、ベクターに挿入される核酸のサイズ、及びベクターにより形質転換される特定の宿主細胞に主として依存する。各ベクターは、この機能（異種ポリヌクレオチドの増幅もしくは発現、又は両方）及びこれが存在する特定の宿主細胞との適合性に応じて、様々な成分を含有する。ベクター成分は一般的に、複製起源、選択マーカー遺伝子、プロモーター、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、シグナル配列、異種核酸インサート及び転写終結配列を含むが、これらに限定されない。
【０１４１】
一般に、宿主細胞と適合可能な種に由来するレプリコン及び制御配列を含有するプラスミドベクターが、これらの宿主と関連して使用される。ベクターは通常、複製部位のほか、形質転換された細胞において表現型選択を与えることができるマーキング配列を担持する。例えば、大腸菌は典型的には、大腸菌種に由来するプラスミド、ｐＢＲ３２２を用いて形質転換される。ｐＢＲ３２２は、アンピシリン（Ａｍｐ）及びテトラサイクリン（Ｔｅｔ）耐性をコードする遺伝子を含有し、故に形質転換細胞を同定するための容易な手段を提供する。ｐＢＲ３２２、この誘導体、又は他の微生物プラスミドもしくはバクテリオファージはまた、内因性タンパク質を発現する微生物起源により使用され得るプロモーターを含有してもよく、又は含有するように修飾されてもよい。特定のヘテロ多量体抗体の発現に使用されるｐＢＲ３２２誘導体の例は、Ｃａｒｔｅｒら、米国特許第５，６４８，２３７号に詳細に記載されている。
【０１４２】
更に、宿主微生物と適合可能なレプリコン及び制御配列を含有するファージベクターが、これらの宿主と関連した形質転換ベクターとして使用されてもよい。例えば、λＧＥＭ−１１（商標）などのバクテリオファージが、大腸菌ＬＥ３９２などの感受性宿主細胞を形質転換するのに使用できる組換えベクターの作製に利用されてもよい。
【０１４３】
本発明の発現ベクターは、各ポリペプチド成分をコードする２つ以上のプロモーター−シストロン対を含むことができる。プロモーターは、この発現を調節するシストロンの上流（５’）に位置する非翻訳制御配列である。原核生物プロモーターは典型的には、誘導性及び構成性の２つのクラスに分類される。誘導性プロモーターは、培養条件の変化（例えば、栄養素の有無又は温度の変化）に応答して、この制御下のシストロンの転写レベルの上昇を開始するプロモーターである。
【０１４４】
様々な潜在的宿主細胞により認識される多数のプロモーターは、十分に公知である。選択されたプロモーターは、制限酵素消化により供給源ＤＮＡからプロモーターを除去すること、及び単離されたプロモーター配列を本発明のベクターに挿入することにより、軽鎖又は重鎖をコードするシストロンＤＮＡに操作可能に連結することができる。天然プロモーター配列及び多くの異種プロモーターは両方とも、標的遺伝子の増幅及び／又は発現を指示するのに使用することができる。幾つかの実施態様では、異種プロモーターは一般的に、天然の標的ポリペプチドプロモーターと比べて、発現された標的遺伝子のより高い転写及びより高い収量を可能にするため、異種プロモーターが利用される。
【０１４５】
原核生物宿主との使用に適したプロモーターには、ＰｈｏＡプロモーター、β−ガラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、並びにｔａｃ又はｔｒｃプロモーターなどのハイブリッドプロモーターが含まれる。しかし、細菌において機能する他のプロモーター（他の公知の細菌プロモーター又はファージプロモーターなど）も同様に適している。これらのヌクレオチド配列は公表されており、これにより当業者が、リンカー又は任意の必要とされる制限部位を供給するアダプターを用いて、標的軽鎖及び重鎖をコードするシストロンに該配列をライゲートできるようになる（Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔら、（１９８０）Ｃｅｌｌ  ２０：２６９頁）。
【０１４６】
本発明の一態様では、組換えベクター内の各シストロンは、膜を横断する発現ポリペプチドの移動を指示する分泌シグナル配列成分を含む。一般に、シグナル配列は、ベクターの成分であってもよく、又はベクターに挿入される標的ポリペプチドＤＮＡの一部であってもよい。本発明の目的のために選択されるシグナル配列は、宿主細胞により認識及び処理される（すなわち、シグナルペプチダーゼにより切断される）ものであるべきである。異種ポリペプチドに対して天然なシグナル配列を認識及び処理しない原核生物宿主細胞について、該シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ｉｐｐ、又は熱安定性エンテロトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）リーダー、ＬａｍＢ、ＰｈｏＥ、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ、及びＭＢＰからなる群から選択される原核生物シグナル配列により置換される。本発明の一実施態様では、発現系の両方のシストロンで使用されるシグナル配列は、ＳＴＩＩシグナル配列又はこのバリアントである。
【０１４７】
別の態様では、本発明によるヘテロ多量体の産生は宿主細胞の細胞質で生じる得、したがって各シストロン内に分泌シグナル配列の存在を必要としない。この点において、ヘテロ多量体軽鎖及び重鎖は、細胞質内で機能性ヘテロ多量体を形成するように発現され、折り畳まれ、及び構築される。特定の宿主株（例えば、大腸菌ｔｒｘＢ株）は、ジスルフィド結合形成に好ましい細胞質条件を提供し、これにより、発現されたタンパク質サブユニットの適切な折り畳み及び構築を可能にする（Ｐｒｏｂａ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｇｅｎｅ、１５９：２０３頁（１９９５））。
【０１４８】
本発明のヘテロ多量体を発現するのに適した原核生物宿主細胞には、グラム陰性又はグラム陽性生物などの古細菌及び真正細菌が含まれる。有用な細菌の例には、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）（例えば、大腸菌）、桿菌（Ｂａｃｉｌｌｉ）（例えば、枯草菌（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ））、腸内細菌、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種（例えば、緑膿菌（Ｐ．  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ））、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、霊菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、根粒菌（Ｒｈｉｚｏｂｉａ）、ビトレオシラ（Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ）、又はパラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）が含まれる。一実施態様では、グラム陰性細胞が使用される。一実施態様では、大腸菌細胞が本発明の宿主として使用される。大腸菌株の例には、株Ｗ３１１０（Ｂａｃｈｍａｎｎ、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２巻（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１９８７）、１１９０〜１２１９頁；ＡＴＣＣ寄託番号２７，３２５）及び、遺伝子型Ｗ３１１０  ΔｆｈｕＡ（ΔｔｏｎＡ）ｐｔｒ３  ｌａｃ  Ｉｑ  ｌａｃＬ８  ΔｏｍｐＴΔ（ｎｍｐｃ−ｆｅｐＥ）ｄｅｇＰ４１  ｋａｎＲ（米国特許第５，６３９，６３５号）を有する株３３Ｄ３を含むこの誘導体が含まれる。大腸菌２９４（ＡＴＣＣ  ３１，４４６）、大腸菌Ｂ、大腸菌λ  １７７６（ＡＴＣＣ  ３１，５３７）及び大腸菌ＲＶ３０８（ＡＴＣＣ  ３１，６０８）などの他の株及びこの誘導体もまた適している。これらの例は、限定というよりむしろ実例である。確定した遺伝子型を有するいずれかの上述された細菌の誘導体を構築する方法は、当技術分野で公知であり、例えば、Ｂａｓｓら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ８：３０９〜３１４頁（１９９０）に記載されている。細菌の細胞中のレプリコンの複製可能性を考慮して適切な細菌を選択することが一般的に必要である。例えば、大腸菌、セラチア、又はサルモネラ種は、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７、又はｐＫＮ４１０などの十分に公知のプラスミドがレプリコンを供給するのに使用される場合、宿主として適切に使用することができる。典型的には宿主細胞は、最小量のタンパク質分解酵素を分泌するべきであり、追加のプロテアーゼ阻害剤が、望ましくは細胞培養物に組み込まれ得る。
【０１４９】
ｉｉ．ヘテロ多量体産生
宿主細胞は、上記された発現ベクターで形質転換され、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、又は所望の配列をコードする遺伝子の増幅に適切なように修飾された従来の栄養培地で培養される。
【０１５０】
形質転換は、染色体外エレメント又は染色体組込み体のどちらかとしてＤＮＡが複製可能であるように、原核生物宿主にＤＮＡを導入することを意味する。使用される宿主細胞に応じて、形質転換は、このような細胞に対して適切な標準的手法を用いて行われる。塩化カルシウムを使用するカルシウム処理は、実質的な細胞壁バリアを含有する細菌細胞に一般的に使用される。形質転換のための別の方法は、ポリエチレングリコール／ＤＭＳＯを使用する。使用される更に別の手法は、エレクトロポレーションである。
【０１５１】
本発明のヘテロ多量体を作製するのに使用される原核生物細胞は、当技術分野で公知の及び選択された宿主細胞の培養に適した培地で増殖される。適切な培地の例には、ルリアブロス（ＬＢ）プラス必要な栄養素補給が含まれる。幾つかの実施態様では、培地は、発現ベクターを含有する原核生物細胞の増殖を選択的に可能にする、発現ベクターの構築に基づき選択された選択剤も含有する。例えば、アンピシリンは、アンピシリン耐性遺伝子を発現する細胞を増殖させる培地に添加される。
【０１５２】
炭素、窒素、及び無機リン酸源以外の任意の必要なサプリメントも、単独で、又は複合体窒素源などの別のサプリメントもしくは培地との混合物として導入され、適切な濃度で含まれてもよい。場合により培養培地は、グルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコール酸、ジチオエリトリトール、及びジチオトレイトールからなる群から選択される一又は複数の還元剤を含有してもよい。
【０１５３】
原核生物宿主細胞は、適切な温度で培養される。例えば大腸菌増殖にとって、好ましい温度は、約２０℃から約３９℃、より好ましくは約２５℃から約３７℃、更により好ましくは約３０℃の範囲である。培地のｐＨは、主として宿主生物に応じて、約５から約９の範囲の任意のｐＨであってもよい。大腸菌にとって、ｐＨは、好ましくは約６．８から約７．４、より好ましくは約７．０である。
【０１５４】
誘導性プロモーターが本発明の発現ベクターにおいて使用される場合、タンパク質発現は、該プロモーターの活性化に適した条件下で誘導される。本発明の一態様では、ＰｈｏＡプロモーターが、ポリペプチドの転写を制御するのに使用される。したがって、形質転換宿主細胞は、誘導のためにリン酸制限培地で培養される。好ましくは、リン酸制限培地はＣ．Ｒ．Ａ．Ｐ培地である（例えば、Ｓｉｍｍｏｎｓら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００２）、２６３：１３３〜１４７頁を参照のこと）。当技術分野で公知の通り、使用されるベクターコンストラクトに従って様々な他のインデューサーが用いられ得る。
【０１５５】
一実施態様では、本発明の発現されたヘテロ多量体は、宿主細胞のペリプラズムに分泌され、ペリプラズムから回収される。タンパク質回収は典型的には、一般的に浸透圧ショック、超音波処理又は溶解のような手段による微生物の破壊を必要とする。細胞が破壊されると、細胞残屑又は細胞全体は、遠心分離又は濾過により除去することができる。ヘテロ多量体は、例えばアフィニティー樹脂クロマトグラフィーにより更に精製することができる。あるいは、タンパク質は、培養培地に移され得、ここで単離され得る。細胞は、培養物から除去され得、培養上清が、産生されたタンパク質の更なる精製のために濾過及び濃縮され得る。発現されたポリペプチドは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）及びウエスタンブロットアッセイなどの一般に公知の方法を用いて、更に単離及び同定され得る。
【０１５６】
本発明の一態様では、ヘテロ多量体産生は、発酵プロセスにより大量に行われる。様々な大規模流加発酵手順が、組換えタンパク質の産生に利用可能である。大規模発酵は、少なくとも１０００リットルの容量、好ましくは約１，０００から１００，０００リットルの容量を有する。これらの発酵槽は、撹拌インペラを用いて酸素及び栄養素、特にグルコース（好ましい炭素／エネルギー源）を分配する。小規模発酵は一般的に、容積が約１００リットルにすぎず、約１リットルから約１００リットルの範囲であり得る発酵槽における発酵を指す。
【０１５７】
発酵プロセスにおいて、タンパク質発現の誘導は、典型的には、細胞が適切な条件下で所望の密度、例えば、約１８０〜２２０のＯＤ５５０（細胞が初期静止期にある段階）まで増殖した後に開始される。当技術分野で公知の及び上記の通り、様々なインデューサーが、使用されるベクターコンストラクトに従って用いられ得る。細胞は、誘導の前により短期間で増殖することができる。細胞は通常、約１２〜５０時間誘導されるが、より長い又は短い誘導時間が用いられてもよい。
【０１５８】
本発明のヘテロ多量体の産生収量及び質を改善するために、様々な発酵条件が変更され得る。例えば、分泌されたヘテロ多量体の適切な構築及び折り畳みを改善するために、Ｄｓｂタンパク質（ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、ＤｓｂＤ、及び／又はＤｓｂＧ）又はＦｋｐＡ（シャペロン活性を有するペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼ）などのシャペロンタンパク質を過剰発現する追加のベクターが、宿主原核生物細胞を共形質転換するのに使用されてもよい。シャペロンタンパク質は、細菌宿主細胞において産生された異種タンパク質の適切な折り畳み及び可溶性を促進することが示されている（Ｃｈｅｎら、（１９９９）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７４：１９６０１〜１９６０５頁；Ｇｅｏｒｇｉｏｕら、米国特許第６，０８３，７１５号；Ｇｅｏｒｇｉｏｕら、米国特許第６，０２７，８８８号；Ｂｏｔｈｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（２０００）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７５：１７１００〜１７１０５頁；Ｒａｍｍ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、（２０００）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７５：１７１０６〜１７１１３頁；Ａｒｉｅら、（２００１）Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ３９：１９９〜２１０頁）。
【０１５９】
発現された異種タンパク質（特にタンパク質分解感受性であるもの）のタンパク質分解を最小限にするために、タンパク質分解酵素を欠損する特定の宿主株が本発明に使用されてもよい。例えば、宿主細胞株は、プロテアーゼＩＩＩ、ＯｍｐＴ、ＤｅｇＰ、Ｔｓｐ、プロテアーゼＩ、プロテアーゼＭｉ、プロテアーゼＶ、プロテアーゼＶＩ、及びこれらの組み合わせなどの公知の細菌性プロテアーゼをコードする遺伝子に遺伝子変異をもたらすように修飾されてもよい。幾つかの大腸菌プロテアーゼ欠損株が利用可能であり、例えば、Ｊｏｌｙら、（１９９８）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５：２７７３〜２７７７頁；Ｇｅｏｒｇｉｏｕら、米国特許第５，２６４，３６５号；Ｇｅｏｒｇｉｏｕら、米国特許第５，５０８，１９２号；Ｈａｒａら、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ、２：６３〜７２頁（１９９６）に記載されている。
【０１６０】
一実施態様では、タンパク質分解酵素を欠損し、及び一又は複数のシャペロンタンパク質を過剰発現するプラスミドにより形質転換された大腸菌株が、本発明の発現系において宿主細胞として使用される。
【０１６１】
別の実施態様では、大腸菌細胞は、精製前に目的とするヘテロ多量体の一又は複数のテザーを切断するためのエンドペプチダーゼ（例えば、フューリン）を更に発現する。更に別の実施態様では、真核生物宿主細胞は、エンドペプチダーゼ（例えば、フューリン）及びエキソペプチダーゼ（例えば、カルボキシペプチダーゼＢ）を発現することができ、エンドペプチダーゼは、ヘテロ多量体の一又は複数のテザーを切断し、エキソペプチダーゼは、精製前に残存エンドペプチダーゼ切断部位を分解する。
【０１６２】
ｉｉｉ．ヘテロ多量体精製
当技術分野で公知の標準的タンパク質精製方法が使用され得る。以下の手順は、適切な精製手順、すなわち、免疫親和性又はイオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上又はＤＥＡＥなどの陽イオン交換樹脂上のクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、疎水性相互作用カラム（ＨＩＣ）、硫酸アンモニウム沈殿、及び例えばＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−７５を用いたゲル濾過の例示である。
【０１６３】
一態様では、固相に固定化されたプロテインＡが、本発明の完全長ヘテロ多量体生成物の免疫親和性精製に使用される。プロテインＡは、抗体のＦｃ領域に高い親和性で結合する、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）由来の４１ｋＤ細胞壁タンパク質である。Ｌｉｎｄｍａｒｋら、（１９８３）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈ．  ６２：１〜１３頁。プロテインＡが固定化される固相は、好ましくはガラス又はシリカ表面を含むカラム、より好ましくは制御多孔質ガラスカラム又はケイ酸カラムである。幾つかの適用において、カラムは、汚染物質の非特異的付着を防ぐためにグリセロールなどの試薬でコーティングされている。
【０１６４】
精製の第１工程として、上記のような細胞培養物に由来する調製物をプロテインＡ固定化固相に適用して、プロテインＡへの目的とするヘテロ多量体の特異的結合を可能にする。次いで、固相を洗浄して、固相に非特異的に結合した汚染物質を除去する。目的とするヘテロ多量体は、カオトロピック剤又は中性洗剤を含有する溶液への溶出により固相から回収することができる。例示的なカオトロピック剤には、尿素、グアニジンＨＣｌ、過塩素酸リチウム、ヒスチジン、及びアルギニンが含まれるが、これらに限定されない。例示的な中性洗剤には、Ｔｗｅｅｎ（例えば、Ｔｗｅｅｎ−２０）、トリトン（例えば、トリトンＸ−１００）、ＮＰ−４０（ノニルフェノキシルポリエトキシルエタノール）（ｎｏｎｙｌｐｈｅｎｏｘｙｌｐｏｌｙｅｔｈｏｘｙｌｅｔｈａｎｏｌ）、ノニデットＰ−４０（オクチルフェノキシルポリエトキシルエタノール）（ｏｃｔｙｌ  ｐｈｅｎｏｘｙｌｐｏｌｙｅｔｈｏｘｙｌｅｔｈａｎｏｌ）、及びドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が含まれるが、これらに限定されない。カラム（例えば、ｍＡｂＳｕｒｅカラム）からの溶出後、カオトロピック剤又は中性洗剤を含有する溶液にヘテロ多量体を希釈することは、溶出後のヘテロ多量体の安定性を維持する。幾つかの実施態様では、本発明のエンドペプチダーゼ処理されたヘテロ多量体の一又は複数の残存エンドペプチダーゼ切断部位は、エキソペプチダーゼ（例えば、カルボキシペプチダーゼＢ）の添加により精製後に処理され分解され得る。他の実施態様では、本発明のヘテロ多量体の一又は複数のテザーは、精製前の代わりに精製後に、エンドペプチダーゼ（例えば、フューリン）及びエキソペプチダーゼ（例えば、カルボキシペプチダーゼＢ）により切断及び処理することができる。
【０１６５】
Ｂ．真核生物宿主細胞を用いたヘテロ多量体の生成
ベクター成分には一般的に、一又は複数の以下のもの、すなわち、シグナル配列、複製起点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列が含まれるが、これらに限定されない。
【０１６６】
ｉ．シグナル配列成分
真核生物宿主細胞において使用するためのベクターは、シグナル配列又は、成熟タンパク質もしくは目的とするポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドを含有することができる。選択される異種シグナル配列は、宿主細胞により認識及び処理される（すなわち、シグナルペプチダーゼにより切断される）ものであってもよい。哺乳動物細胞発現において、哺乳動物シグナル配列及びウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスｇＤシグナルが利用可能である。このような前駆体領域のＤＮＡは、抗体をコードするＤＮＡにリーディングフレームでライゲートされる。
【０１６７】
ｉｉ．複製起点
一般的に、複製起点成分は、哺乳動物発現ベクターには必要でない。例えば、ＳＶ４０起点が典型的には使用され得るが、ただこれが初期プロモーターを含有するためだからである。
【０１６８】
ｉｉｉ．選択遺伝子成分
発現及びクローニングベクターは、選択可能マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含有することができる。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質もしくは他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、もしくはテトラサイクリンに対する耐性を付与し、（ｂ）該当する場合、栄養要求性欠損を補完し、又は（ｃ）複合培地からは利用できない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
【０１６９】
選択スキームの１つの例は、宿主細胞の増殖を停止する薬物を利用する。異種遺伝子で成功裏に形質転換される細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を産生し、故に選択レジメンを生き延びる。このような優性選択の例は、薬物ネオマイシン、ミコフェノール酸、及びハイグロマイシンを使用する。
【０１７０】
哺乳動物細胞に適した選択可能マーカーの別の例は、ＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネイン−Ｉ及び−ＩＩ、好ましくは霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ等など、ヘテロ多量体核酸を取り込む能力がある細胞の同定を可能にするものである。
【０１７１】
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子で形質転換された細胞は、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニスト、メトトレキサート（Ｍｔｘ）を含有する培養培地で全ての形質転換体を培養することにより、最初に同定される。野生型ＤＨＦＲが使用される場合の適切な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性が欠損したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系（例えば、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９０９６）である。
【０１７２】
あるいは、ヘテロ多量体、野生型ＤＨＦＲタンパク質、及び別の選択可能マーカー（アミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）などの）をコードするＤＮＡ配列で形質転換又は共形質転換された宿主細胞（特に内因性ＤＨＦＲを含有する野生型宿主）は、アミノグリコシド系抗生物質、例えば、カナマイシン、ネオマイシン、又はＧ４１８などの選択可能マーカーに対する選択剤を含有する培地での細胞増殖により選択することができる。例えば、米国特許第４，９６５，１９９号を参照のこと。
【０１７３】
ｉｖ．プロモーター成分
発現及びクローニングベクターは通常、宿主生物により認識され、ヘテロ多量体をコードする核酸配列に操作可能に連結されるプロモーターを含有する。プロモーター配列は、真核生物について知られている。事実上全ての真核生物遺伝子は、転写が開始される部位から約２５から３０塩基上流に位置するＡＴリッチ領域を有する。多くの遺伝子の転写の開始から７０から８０塩基上流に見出される別の配列は、ＣＮＣＡＡＴ領域（配列番号１２）であり、Ｎは任意のヌクレオチドであってもよい。ほとんどの真核生物遺伝子の３’末端は、コード配列の３’末端にポリＡ尾部を付加するシグナルであり得るＡＡＴＡＡＡ配列（配列番号１３）である。これらの配列の全ては、真核生物発現ベクターに適切に挿入される。
【０１７４】
哺乳動物宿主細胞におけるヘテロ多量体をコードするベクターからの転写は、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２などの）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、及びシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから得られたプロモーターにより、異種哺乳動物プロモーター（例えば、アクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター）から、又は熱ショックプロモーターから、このようなプロモーターが宿主細胞系と適合可能であることを条件として、例えば制御される。
【０１７５】
ＳＶ４０ウイルスの初期及び後期プロモーターは、好都合には、ＳＶ４０ウイルス複製起点も含有するＳＶ４０制限断片として得られる。ヒトサイトメガロウイルスの前初期プロモーターは、好都合には、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｅ制限断片として得られる。ウシパピローマウイルスをベクターとして用いて哺乳動物宿主においてＤＮＡを発現する系は、米国特許第４，４１９，４４６号に開示されている。この系の修飾は、米国特許第４，６０１，９７８号に開示されている。あるいは、ラウス肉腫ウイルス長末端リピートがプロモーターとして使用されてもよい。
【０１７６】
ｖ．エンハンサーエレメント成分
ヘテロ多量体ポリペプチドをコードするＤＮＡの高等真核生物による転写は、エンハンサー配列をベクターに挿入して高めることができる。多くのエンハンサー配列が、現在、哺乳動物遺伝子（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、及びインスリン遺伝子）から知られている。同様に、真核生物細胞ウイルス由来のエンハンサーを使用してもよい。例には、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００〜２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウイルスエンハンサーが含まれる。真核生物プロモーターの活性化を増強するエレメントの記載については、Ｙａｎｉｖ、Ｎａｔｕｒｅ  ２９７：１７〜１８頁（１９８２）も参照のこと。エンハンサーは、増強が達成されるという条件で、ヘテロ多量体ポリペプチドをコードする配列の５’又は３’位でベクターにスプライスされてもよいが、一般的にプロモーターからの５’位に位置する。
【０１７７】
ｖｉ．転写終結成分
真核生物宿主細胞に使用される発現ベクターは、典型的には、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含有する。このような配列は、真核生物もしくはウイルスＤＮＡ又はｃＤＮＡの５’及び、時として３’非翻訳領域から一般に利用可能である。これらの領域は、ヘテロ多量体をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分におけるポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含有する。１つの有用な転写終結成分は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。ＷＯ  ９４／１１０２６及びこの中に開示された発現ベクターを参照のこと。
【０１７８】
ｖｉｉ．宿主細胞の選択及び形質転換
本明細書においてベクター中でＤＮＡをクローニング又は発現するのに適した宿主細胞には、脊椎動物宿主細胞を含む本明細書に記載された高等真核生物細胞が含まれる。培養（組織培養）での脊椎動物細胞の増殖は、日常的な手順になっている。有用な哺乳動物宿主細胞系の例は、ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト胎児腎臓細胞系（２９３又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  ３６：５９頁（１９７７））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７７：４２１６頁（１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｐｒｏｄ．  ２３：２４３〜２５１頁（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ３８３：４４〜６８頁（１９８２））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝癌系（Ｈｅｐ  Ｇ２）である。
【０１７９】
宿主細胞は、ヘテロ多量体産生のための上記された発現又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために必要に応じて修飾された従来の栄養培地で培養される。
【０１８０】
ｖｉｉｉ．宿主細胞の培養
本発明のヘテロ多量体を産生するのに使用される宿主細胞は、様々な培地で培養することができる。ハムＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ））、及びダルベッコ改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）などの市販の培地が、該宿主細胞を培養するのに適している。更に、Ｈａｍら、Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚ．  ５８：４４頁（１９７９）、Ｂａｒｎｅｓら、Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １０２：２５５頁（１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号；第４，６５７，８６６号；第４，９２７，７６２号；第４，５６０，６５５号；もしくは第５，１２２，４６９号；ＷＯ  ９０／０３４３０；ＷＯ  ８７／００１９５；又は米国特許再発行第３０，９８５号に記載された培地のいずれも、宿主細胞用の培養培地として使用することができる。これらの培地のいずれも、ホルモン及び／又は他の増殖因子（インスリン、トランスフェリン、又は上皮増殖因子などの）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びリン酸塩などの）、緩衝液（ＨＥＰＥＳなどの）、ヌクレオチド（アデノシン及びチミジンなどの）、抗生物質（ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標）薬などの）、微量元素（通常、マイクロモル範囲の最終濃度で存在する無機化合物として定義された）、並びにグルコース又は同等のエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要なサプリメントも、当業者に公知であろう適切な濃度で含まれてもよい。温度、ｐＨ等などの培養条件は、発現用に選択された宿主細胞で以前に使用されたものであり、当業者に明らかである。
【０１８１】
ｉｘ．ヘテロ多量体の精製
組換え手法を用いる場合、ヘテロ多量体は細胞内に産生され得、又は培地に直接分泌され得る。ヘテロ多量体が細胞内に産生される場合、第１の工程として、宿主細胞又は溶解断片のどちらであっても、粒子状の残屑が例えば遠心分離又は限外濾過により除去される。ヘテロ多量体が培地に分泌される場合、このような発現系からの上清が、市販のタンパク質濃度フィルター、例えば、Ａｍｉｃｏｎ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを用いて一般的に最初に濃縮される。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤が、タンパク質分解を阻害するために前述の工程のいずれかに含まれてもよく、抗生物質が外来性の汚染物質の増殖を防ぐために含まれてもよい。
【０１８２】
細胞から調製されたヘテロ多量体組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及び親和性クロマトグラフィーを用いて精製することができ、親和性クロマトグラフィーが好ましい精製手法である。親和性リガンドとしてのプロテインＡの適合性は、ヘテロ多量体に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、又はγ４重鎖に基づくヘテロ多量体を精製するのに使用することができる（Ｌｉｎｄｍａｒｋら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈ．  ６２：１〜１３頁（１９８３））。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に推奨される（Ｇｕｓｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ．  ５：１５６７１５７５頁（１９８６））。親和性リガンドが結合されるマトリックスはほとんどの場合アガロースであるが、他のマトリックスが利用可能である。制御多孔質ガラス又はポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定なマトリックスは、アガロースで達成され得るより速い流速及び短い処理時間を可能にする。ヘテロ多量体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．  Ｔ．  Ｂａｋｅｒ、フィリップスバーグ、ＮＪ）が精製に有用である。イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上のクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）上のクロマトグラフィー、陰イオン又は陽イオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラムなどの）上のクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿などのタンパク質精製の他の手法もまた、回収される抗体に応じて利用可能である。
【０１８３】
一実施態様では、真核生物宿主細胞は、精製前（例えば、トランスゴルジ輸送の間）に目的とするヘテロ多量体の一又は複数のテザーを切断するためのエンドペプチダーゼ（例えば、フューリン）を更に発現する。別の実施態様では、真核生物宿主細胞は、エンドペプチダーゼ（例えば、フューリン又はＬｙｓ−Ｃ）及びエキソペプチダーゼ（例えば、カルボキシペプチダーゼＢ）を発現することができ、エンドペプチダーゼは、ヘテロ多量体の一又は複数のテザーを切断し、エキソペプチダーゼは、精製前に残存エンドペプチダーゼ切断部位を分解する。
【０１８４】
目的とするヘテロ多量体は、カオトロピック剤又は中性洗剤を含有する溶液への溶出によりカラムの固相から回収される。「カオトロピック剤」により、分子内相互作用（例えば、水素結合、ファンデルワールス力、又は疎水性作用）の安定化を妨げてタンパク質（例えば、抗体）の三次元構造を破壊する水溶性物質が意味される。例示的なカオトロピック剤には、尿素、グアニジン−ＨＣｌ、過塩素酸リチウム、ヒスチジン、及びアルギニンが含まれるが、これらに限定されない。「中性洗剤」により、分子内相互作用（例えば、水素結合、ファンデルワールス力、又は疎水性作用）の安定化を妨げて、タンパク質又はタンパク質複合体（例えば、ヘテロ多量体）の三次元構造を破壊するが、生物学的活性の喪失を引き起こすようにタンパク質構造を永続的には破壊しない（すなわち、タンパク質を変性しない）水溶性物質が意味される。例示的な中性洗剤には、Ｔｗｅｅｎ（例えば、Ｔｗｅｅｎ−２０）、トリトン（例えば、トリトンＸ−１００）、ＮＰ−４０（ノニルフェノキシルポリエトキシルエタノール）、ノニデットＰ−４０（オクチルフェノキシルポリエトキシルエタノール）、及びドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１８５】
任意の予備精製工程後、目的とするヘテロ多量体及び汚染物質を含む混合物は、ｐＨ約２．５〜４．５の溶出緩衝液を用いた、好ましくは低塩濃度（例えば約０〜０．２５Ｍ塩）で行われる、低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーに供されてもよい。
【０１８６】
幾つかの実施態様では、エンドペプチダーゼ処理された本発明のヘテロ多量体の一又は複数の残存エンドペプチダーゼ切断部位は、エキソペプチダーゼ（例えば、カルボキシペプチダーゼＢ）により精製後に処理及び分解することができる。他の実施態様では、本発明のヘテロ多量体の一又は複数のテザーは、精製前の代わりに精製後に、エンドペプチダーゼ（例えば、フューリン）及びエキソペプチダーゼ（例えば、カルボキシペプチダーゼＢ）により切断及び処理することができる。
【０１８７】
ｘ．バキュロウイルスを用いたヘテロ多量体産生
組換えバキュロウイルスは、ヘテロ多量体又はヘテロ多量体断片及びＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ（商標）ウイルスＤＮＡ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）をコードするプラスミドを、例えばリポフェクチン（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬから市販）を用いてスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞（例えば、Ｓｆ９細胞；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １７１１）又はキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）Ｓ２細胞などの昆虫細胞に共トランスフェクトして生成することができる。特定の例において、ヘテロ多量体配列は、バキュロウイルス発現ベクター内に含有されたエピトープタグの上流で融合される。このようなエピトープタグにはポリＨｉｓタグが含まれる。ｐＶＬ１３９３（Ｎｏｖａｇｅｎ）又はｐＡｃＧＰ６７Ｂ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）などの市販のプラスミドに由来するプラスミドを含む様々なプラスミドが使われ得る。簡単には、抗体ヘテロ多量体又はこの断片をコードする配列は、５’及び３’領域に相補的なプライマーを用いたＰＣＲにより増幅することができる。５’プライマーは、フランキング（選択）制限酵素部位を組み込むことができる。生成物は次いで選択制限酵素で消化され得、発現ベクターにサブクローン化され得る。
【０１８８】
発現ベクターによるトランスフェクション後、宿主細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）は、２８℃で４〜５日間インキュベートされ、放出されたウイルスが回収され、更なる増幅に使用される。ウイルス感染及びタンパク質発現は、例えばＯ’Ｒｅｉｌｌｅｙら（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．  Ｏｘｆｏｒｄ：  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９４））により記載されている通りに行うことができる。
【０１８９】
発現されたポリＨｉｓタグ化ヘテロ多量体は次いで、例えばＮｉ２＋キレート親和性クロマトグラフィーにより次の通り精製することができる。抽出物は、Ｒｕｐｅｒｔら（Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：１７５〜１７９頁（１９９３））により記載されている通り組換えウイルス感染Ｓｆ９細胞から調製することができる。簡単には、Ｓｆ９細胞は、洗浄され、超音波処理緩衝液（２５ｍＬ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．９；１２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２；０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ；１０％グリセロール；０．１％  ＮＰ−４０；０．４Ｍ  ＫＣｌ）に再懸濁され、氷上で２０秒間、２回超音波処理される。超音波処理物が遠心分離により取り除かれ、上清がローディング緩衝液（５０ｍＭリン酸塩；３００ｍＭ  ＮａＣｌ；１０％グリセロール  ｐＨ７．８）に５０倍に希釈され、０．４５μｍフィルターを通して濾過される。Ｎｉ２＋−ＮＴＡアガロースカラム（Ｑｉａｇｅｎから市販）は、５ｍＬのベッドボリュームで調製され、２５ｍＬの水で洗浄され、２５ｍＬのローディング緩衝液で平衡化される。濾過された細胞抽出物は、１分当たり０．５ｍＬでカラムに添加される。カラムは、ローディング緩衝液でベースラインＡ２８０まで洗浄され、この時点で分画回収が開始される。次に、カラムは、二次洗浄緩衝液（５０ｍＭリン酸塩；３００ｍＭ  ＮａＣｌ；１０％グリセロール  ｐＨ６．０）で洗浄され、非特異的に結合したタンパク質を溶出する。Ａ２８０ベースラインに再び達した後、カラムは、二次洗浄緩衝液中で０〜５００ｍＭイミダゾール勾配により展開される。１ｍＬ分画が回収され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色、又はアルカリホスファターゼ（Ｑｉａｇｅｎ）にコンジュゲートされたＮｉ２＋−ＮＴＡ−を用いたウエスタンブロットにより分析される。溶出されたＨｉｓ１０タグ化（配列番号２１）ヘテロ多量体を含有する分画がプールされ、ローディング緩衝液に対して透析される。
【０１９０】
ヘテロ多量体の精製は、例えばプロテインＡ又はプロテインＧカラムクロマトグラフィーを含む公知のクロマトグラフィー法を用いて行うこともできる。目的とするヘテロ多量体は、カオトロピック剤又は中性洗剤を含有する溶液への溶出によりカラムの固相から回収することができる。例示的なカオトロピック剤及び中性洗剤には、グアニジン−ＨＣｌ、尿素、過塩素酸リチウム、アルギニン、ヒスチジン、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、Ｔｗｅｅｎ、トリトン、及びＮＰ−４０が含まれるがこれらに限定されず、これらの全ては市販されている。上記の通り、ヘテロ多量体の一又は複数のテザーは、エンドペプチダーゼ（例えば、フューリン又はＬｙｓ−Ｃ）及びエキソペプチダーゼ（例えば、カルボキシペプチダーゼＢ）の添加により、精製後に切断及び処理することができる。
【０１９１】
Ｃ．精製手法
ＨＤテザー含有ヘテロ多量体に使用することができる１つの特定の精製アプローチが、以下に示される。
テザー化ヘテロ多量体を４℃でプロテインＡ（例えば、ｍＡｂＳｕｒｅ）カラムに添加
↓
カラムをＫＰＯ４、次いでＰＢＳ＋０．１％トリトンＸ１１４で洗浄
↓
試料をＴｒｉｓ  ｐＨ８．０（２００ｍＭ）に溶出
↓
試料ｐＨを８．０に調整し、３７℃、１．５時間、Ｌｙｓ−Ｃで切断
↓
試料をＭａｂＳＵＲＥカラムで再精製
↓
試料ｐＨを８．０に調整し、３７℃、４時間、カルボキシペプチダーゼＢで切断
↓
試料導電性を調整し、イオン交換カラムに添加
↓
分画を回収し、プールし、ＰＢＳに透析
【０１９２】
アルギニンに加えて、最初のプロテインＡカラム工程後に、上記の精製プロトコルにおいて使用することができる他のカオトロピック剤又は中性洗剤には、グアニジン−ＨＣｌ、尿素、過塩素酸リチウム、ヒスチジン、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、Ｔｗｅｅｎ、トリトン、及びＮＰ−４０が含まれるがこれらに限定されず、これらの全ては市販されている。幾つかの実施態様では、本発明のエンドペプチダーゼ処理されたヘテロ多量体の一又は複数の残存エンドペプチダーゼ切断部位は、エキソペプチダーゼ（例えば、カルボキシペプチダーゼＢ）により、精製後に処理及び分解することができる。他の実施態様では、本発明のヘテロ多量体の一又は複数のテザーは、精製前の代わりに精製後に、エンドペプチダーゼ（例えば、フューリン又はＬｙｓ−Ｃ）及びエキソペプチダーゼ（例えば、カルボキシペプチダーゼＢ）により切断及び処理することができる。
【０１９３】
ＩＶ．コンジュゲートタンパク質
本発明は、軽鎖又は重鎖の定常領域の１つが、色素又は細胞傷害性剤（化学療法剤などの）、薬物、増殖阻害剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素的に活性な毒素、又はこの断片）、又は放射性同位体（すなわち放射性コンジュゲート）などの化学分子にコンジュゲートされる、本明細書に記載されたヘテロ多量体（例えば、ＨＤテザー含有単鎖単一特異性又は多重特異性抗体、ＨＤテザー含有多重鎖単一特異性又は多重特異性ヘテロ多量体）のいずれかを含むコンジュゲートヘテロ多量体又は免疫コンジュゲート（例えば、「抗体−薬物コンジュゲート」又は「ＡＤＣ」）などのコンジュゲートタンパク質も提供する。特に、本明細書に記載されている通り、ＨＤテザーの使用は、２つの異なる重鎖（ＨＣ１及びＨＣ２）及び２つの異なる軽鎖（ＬＣ１及びＬＣ２）を含有するヘテロ多量体の構築を可能にする。本明細書に記載された方法を用いて構築された免疫コンジュゲートは、重鎖（ＨＣ１又はＨＣ２）の一方のみ又は軽鎖（ＬＣ１又はＬＣ２）の一方のみの定常領域にコンジュゲートされた細胞傷害性剤を含有することができる。また、免疫コンジュゲートは、重鎖又は軽鎖の一方のみに付加された細胞傷害性剤を有することができるため、重鎖又は軽鎖の両方に付加された細胞傷害性剤を有するヘテロ多量体の投与と比べて、対象に投与される細胞傷害性剤の量は低減される。対象に投与される細胞傷害性剤の量の低減は、細胞傷害性剤に伴う有害な副作用を制限する。
【０１９４】
細胞傷害性又は細胞増殖抑制性剤、すなわち、癌の治療において腫瘍細胞を死滅又は阻害する薬物を局所送達するための抗体−薬物コンジュゲートの使用（Ｓｙｒｉｇｏｓ  ａｎｄ  Ｅｐｅｎｅｔｏｓ、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９：６０５〜６１４頁（１９９９）；Ｎｉｃｕｌｅｓｃｕ−Ｄｕｖａｚ  ａｎｄ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ａｄｖ．  Ｄｒｇ．  Ｄｅｌ．  Ｒｅｖ．  ２６：１５１〜１７２頁（１９９７）；米国特許第４，９７５，２７８号）は、腫瘍への薬物部分の標的送達、及びこの中での細胞内蓄積を可能にし、これらのコンジュゲートされていない薬剤の全身投与が、取り除こうとする腫瘍細胞だけでなく正常細胞に対する許容できないレベルの毒性をもたらす可能性がある（Ｂａｌｄｗｉｎら、Ｌａｎｃｅｔ（Ｍａｒ．  １５、１９８６）：６０３〜６０５頁（１９８６）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ‘８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ａ．  Ｐｉｎｃｈｅｒａら（編）、４７５〜５０６頁のＴｈｏｒｐｅ、（１９８５）「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ」）。最小限の毒性で最大限の有効性が、これにより求められている。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体は両方とも、有用なこれらの戦略において有用であると報告されている（Ｒｏｗｌａｎｄら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．  ２１：１８３〜１８７頁（１９８６））。これらの方法において使用される薬物には、ダウノマイシン、ドキソルビシン、メトトレキサート、及びビンデシンが含まれる（Ｒｏｗｌａｎｄら、（１９８６）上記参照）。ヘテロ多量体−毒素コンジュゲートにおいて使用される毒素には、ジフテリア毒素などの細菌毒素、リシンなどの植物毒素、ゲルダナマイシンなどの低分子毒素（Ｍａｎｄｌｅｒら、Ｊｏｕｒ．  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．  ９２（１９）：１５７３〜１５８１頁（２０００）；Ｍａｎｄｌｅｒら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １０：１０２５〜１０２８頁（２０００）；Ｍａｎｄｌｅｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  １３：７８６〜７９１頁（２００２））、メイタンシノイド（ＥＰ  １３９１２１３；Ｌｉｕら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９３：８６１８〜８６２３頁（１９９６））、及びカリケアマイシン（Ｌｏｄｅら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５８：２９２８頁（１９９８）；Ｈｉｎｍａｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５３：３３３６〜３３４２頁（１９９３））が含まれる。毒素は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合、又はトポイソメラーゼ阻害を含む機構により、毒素の細胞傷害性及び細胞増殖抑制性作用に影響を与え得る。幾つかの細胞傷害性薬物は、大きなヘテロ多量体抗体又はタンパク質受容体リガンドにコンジュゲートされる場合、不活性又は活性低下の傾向がある。
【０１９５】
免疫コンジュゲートの生成において有用な化学療法剤は本明細書に記載されている（例えば、上記）。使用され得る酵素的に活性な毒素及びこの断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（緑膿菌由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、サポンソウ（ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、及びトリコテセンが含まれ得る。例えば、１９９３年１０月２８日に公開されたＷＯ  ９３／２１２３２を参照のこと。様々な放射性核種が、放射性コンジュゲート抗体の作製に利用可能である。例には、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、及び１８６Ｒｅが含まれる。抗体及び細胞傷害性剤のコンジュゲートは、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミデート塩酸塩などの）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベレートなどの）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなどの）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなどの）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなどの）、ジイソシアネート（トルエン２，６−ジイソシアネートなどの）、及びビス−活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなどの）などの様々な二官能性タンパク質カップリング剤を用いて作製される。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：１０９８頁（１９８７）に記載されている通りに調製することができる。炭素−１４−標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、抗体に放射性ヌクレオチドをコンジュゲーションするための例示的なキレート剤である。例えば、ＷＯ９４／１１０２６を参照のこと。
【０１９６】
カリケアマイシン、メイタンシノイド、ドラスタチン、オーリスタチン、トリコテセン、ＣＣ１０６５、及び毒素活性を有するこれらの毒素の誘導体などのヘテロ多量体及び一又は複数の低分子毒素のコンジュゲートもまた、本明細書において企図される。
【０１９７】
Ａ．メイタンシン及びメイタンシノイド
幾つかの実施態様では、免疫コンジュゲートは、一又は複数のメイタンシノイド分子にコンジュゲートされた本発明のヘテロ多量体を含む。
【０１９８】
メイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害することにより作用する有糸分裂阻害剤である。メイタンシンは、東アフリカの灌木メイテナス・セラタ（Ｍａｙｔｅｎｕｓ  ｓｅｒｒａｔａ）から最初に単離された（米国特許第３，８９６，１１１号）。この後、特定の微生物も、メイタンシノール及びＣ−３メイタンシノールエステル（米国特許第４，１５１，０４２号）などのメイタンシノイドを産生することが発見された。合成メイタンシノール並びにこの誘導体及び類似体は、例えば、米国特許第４，１３７，２３０号；第４，２４８，８７０号；第４，２５６，７４６号；第４，２６０，６０８号；第４，２６５，８１４号；第４，２９４，７５７号；第４，３０７，０１６号；第４，３０８，２６８号；第４，３０８，２６９号；第４，３０９，４２８号；第４，３１３，９４６号；第４，３１５，９２９号；第４，３１７，８２１号；第４，３２２，３４８号；第４，３３１，５９８号；第４，３６１，６５０号；第４，３６４，８６６号；第４，４２４，２１９号；第４，４５０，２５４号；第４，３６２，６６３号；及び第４，３７１，５３３号に開示されている。
【０１９９】
メイタンシノイド薬物部分は、（ｉ）発酵又は化学修飾、発酵産物の誘導体化により調製するのに比較的利用しやすい、（ｉｉ）非ジスルフィドリンカーを通じた抗体へのコンジュゲーションに適した官能基による誘導体化に適している、（ｉｉｉ）血漿中で安定している、及び（ｉｖ）様々な腫瘍細胞系に対して有効であるため、これらは、ヘテロ多量体の抗体薬物コンジュゲートにおける魅力的な薬物部分である。
【０２００】
メイタンシノイドを含有する免疫コンジュゲート、この作製方法、及びこの治療的使用は、例えば、米国特許第５，２０８，０２０号、第５，４１６，０６４号及び欧州特許第ＥＰ  ０  ４２５  ２３５  Ｂ１号に開示されており、これらの開示は、参照により本明細書に明示的に組み込まれている。Ｌｉｕら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９３：８６１８〜８６２３頁（１９９６）は、ヒト結腸直腸癌に対するモノクローナル抗体Ｃ２４２に連結されたＤＭ１と名付けられたメイタンシノイドを含む免疫コンジュゲートを記載している。該コンジュゲートは、培養結腸癌細胞に対して高い細胞傷害性であることが見出され、インビボ腫瘍増殖アッセイにおいて抗腫瘍活性を示した。Ｃｈａｒｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：１２７〜１３１頁（１９９２）は、ヒト結腸癌細胞系での抗原に結合するマウス抗体Ａ７、又はＨＥＲ−２／ｎｅｕ発癌遺伝子を結合する別のマウスモノクローナル抗体に、ジスルフィドリンカーを介してメイタンシノイドがコンジュゲートされた免疫コンジュゲートを記載している。ＴＡ．１−メイタンシノイドコンジュゲートの細胞傷害性は、細胞当たり３×１０５ＨＥＲ−２表面抗原を発現するヒト乳癌細胞系ＳＫ−ＢＲ−３においてインビトロでテストされた。該薬物コンジュゲートは、遊離メイタンシノイド薬物に類似した細胞傷害性の程度を達成し、該程度は抗体分子当たりのメイタンシノイド分子数を増加させることにより向上する可能性がある。Ａ７−メイタンシノイドコンジュゲートは、マウスにおいて低い全身性細胞傷害性を示した。
【０２０１】
メイタンシノイドコンジュゲートは、ヘテロ多量体又はメイタンシノイド分子のどちらの生物学的活性も著しく減らすことなく、メイタンシノイド 分子にヘテロ多量体を化学的に連結させて調製される。例えば、米国特許第５，２０８，０２０号（この開示は、参照により本明細書に明示的に組み込まれている）を参照のこと。ヘテロ多量体抗体分子当たり平均３〜４個のコンジュゲートされたメイタンシノイド分子は、抗体の機能又は可溶性に負の影響を与えることなく標的細胞の細胞傷害性を増強する上で有効性を示したが、毒素／抗体の１分子でさえ、裸の抗体の使用を上回る細胞傷害性の増強が期待される。メイタンシノイドは、当技術分野で十分に公知であり、公知の手法により合成することができ、又は天然の供給源から単離することができる。適切なメイタンシノイドは、例えば、米国特許第５，２０８，０２０号並びに上記に言及された他の特許及び非特許刊行物に開示されている。好ましいメイタンシノイドは、メイタンシノール及び、様々なメイタンシノールエステルなどの、メイタンシノール分子の芳香環又は他の位置で修飾されたメイタンシノール類似体である。
【０２０２】
例えば、米国特許第５，２０８，０２０号又はＥＰ特許第０  ４２５  ２３５  Ｂ１号、Ｃｈａｒｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：１２７〜１３１頁（１９９２）、及び米国特許出願公開第２００５／０１６９９３３号（これらの開示は参照により本明細書に明示的に組み込まれている）に開示されたものを含む、メイタンシノイドコンジュゲートを作製するための当技術分野で公知の多くの連結基がある。リンカー成分ＳＭＣＣを含むメイタンシノイドコンジュゲートは、米国特許出願公開第２００５／０１６９９３３号に開示されている通りに調製することができる。連結基には、上記に特定された特許に開示されているようなジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光解離性基、ペプチダーゼ不安定性基、又はエステラーゼ不安定性基が含まれ、ジスルフィド基及びチオエーテル基が好ましい。更なる連結基が本明細書において記載され、例示される。
【０２０３】
ヘテロ多量体及びメイタンシノイドのコンジュゲートは、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミデート塩酸塩などの）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベレートなどの）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなどの）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなどの）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなどの）、ジイソシアネート（トルエン２，６−ジイソシアネートなどの）、及びビス−活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなどの）などの様々な二官能性タンパク質カップリング剤を用いて作製することができる。特に好ましいカップリング剤には、ジスルフィド結合を提供するＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）（Ｃａｒｌｓｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  １７３：７２３〜７３７頁（１９７８））及びＮ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）が含まれる。
【０２０４】
リンカーは、連結のタイプに応じて様々な位置でメイタンシノイド分子に付加することができる。例えば、エステル結合は、従来のカップリング手法を用いて水酸基との反応により形成することができる。反応は水酸基を有するＣ−３位、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ−１４位、水酸基で修飾されたＣ−１５位、及び水酸基を有するＣ−２０位で生じ得る。好ましい実施態様では、該結合は、メイタンシノール又はメイタンシノール類似体のＣ−３位で形成される。
【０２０５】
Ｂ．オーリスタチン及びドラスタチン
幾つかの実施態様では、免疫コンジュゲートは、ドラスタチン又はドラスタチンペプチド類似体及び誘導体にコンジュゲートされた本発明のヘテロ多量体、オーリスタチン（米国特許第５，６３５，４８３号及び第５，７８０，５８８号）を含む。ドラスタチン及びオーリスタチンは、微小管動態、ＧＴＰ加水分解、並びに核及び細胞分裂（Ｗｏｙｋｅら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  ４５（１２）：３５８０〜３５８４頁（２００１））を妨げ、抗癌（米国特許第５，６６３，１４９号）及び抗真菌活性（Ｐｅｔｔｉｔら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  ４２：２９６１〜２９６５頁（１９９８））を有することが示されている。ドラスタチン又はオーリスタチン薬物部分は、該ペプチド薬物部分のＮ−（アミノ）末端又はＣ−（カルボキシル）末端を通じてヘテロ多量体に付加することができる（ＷＯ  ０２／０８８１７２）。
【０２０６】
例示的なオーリスタチン実施態様には、「Ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌｖａｌｉｎｅ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  Ｃａｐａｂｌｅ  ｏｆ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｌｉｇａｎｄｓ」、米国出願公開第２００５／０２３８６４９号（この開示は参照によりその全体が本明細書に明示的に組み込まれている）に開示された、Ｎ末端連結モノメチルオーリスタチン薬物部分ＤＥ及びＤＦが含まれる。
【０２０７】
典型的には、ペプチドベースの薬物部分は、２つ以上アミノ酸及び／又はペプチド断片間でペプチド結合を形成して調製することができる。このようなペプチド結合は、例えば、ペプチド化学の分野で十分に公知の液相合成方法（Ｅ．  Ｓｃｈｒｏｄｅｒ及びＫ．  Ｌｕｂｋｅ、「Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」、第１巻、７６〜１３６頁、１９６５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと）に従って調製することができる。オーリスタチン／ドラスタチン薬物部分は、米国特許第５，６３５，４８３号及び第５，７８０，５８８号；Ｐｅｔｔｉｔら、Ｊ．  Ｎａｔ．  Ｐｒｏｄ．  ４４：４８２〜４８５頁（１９８１）；Ｐｅｔｔｉｔら、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  １３：４７〜６６頁（１９９８）；Ｐｏｎｃｅｔ、Ｃｕｒｒ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｄｅｓ．  ５：１３９〜１６２頁（１９９９）；及びＰｅｔｔｉｔ、Ｆｏｒｔｓｃｈｒ．  Ｃｈｅｍ．  Ｏｒｇ．  Ｎａｔｕｒｓｔ．  ７０：１〜７９頁（１９９７）の方法に従って調製されてもよい。Ｄｏｒｏｎｉｎａ、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２１（７）：７７８〜７８４頁（２００３）；及び参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、「Ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌｖａｌｉｎｅ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  Ｃａｐａｂｌｅ  ｏｆ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｌｉｇａｎｄｓ」、米国出願公開第２００５／０２３８６４９号（例えば、リンカー並びにリンカーにコンジュゲートされたＭＭＡＥ及びＭＭＡＦなどのモノメチルバリン化合物を調製する方法を開示する）も参照のこと。
【０２０８】
Ｃ．カリケアマイシン
他の実施態様では、免疫コンジュゲートは、一又は複数のカリケアマイシン分子にコンジュゲートされた本発明のヘテロ多量体を含む。抗生物質のカリケアマイシンファミリーは、ピコモル以下の濃度で二本鎖ＤＮＡ切断を生じさせることができる。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、米国特許第５，７１２，３７４号、第５，７１４，５８６号、第５，７３９，１１６号、第５，７６７，２８５号、第５，７７０，７０１号、第５，７７０，７１０号、第５，７７３，００１号、及び第５，８７７，２９６号（全てＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｙａｎａｍｉｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ社に対する）を参照のこと。使用され得るカリケアマイシンの構造類似体には、γ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ−アセチル−γ１Ｉ、ＰＳＡＧ及びθＩ１（Ｈｉｎｍａｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：３３３６〜３３４２頁（１９９３）、Ｌｏｄｅら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５８：２９２５〜２９２８頁（１９９８）及び前述のＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｙａｎａｍｉｄに対する米国特許）が含まれるが、これらに限定されない。抗体がコンジュゲートされ得る別の抗腫瘍薬物は、抗葉酸剤ＱＦＡである。カリケアマイシン及びＱＦＡは両方とも、細胞内作用部位を有し、原形質膜を容易に横断しない。したがって、抗体媒介内在化を通じたこれらの薬剤の細胞取り込みは、細胞傷害性効果を大幅に増強する。
【０２０９】
Ｄ．他の細胞傷害性剤
本発明のヘテロ多量体にコンジュゲートされ、又は本明細書に記載された方法に従って作製され得る他の抗腫瘍剤には、ＢＣＮＵ、ストレプトゾシン、ビンクリスチン及び５−フルオロウラシル、米国特許第５，０５３，３９４号及び第５，７７０，７１０号に記載されたＬＬ−Ｅ３３２８８複合体として集合的に知られている薬剤のファミリー、並びにエスペラミシン（米国特許第５，８７７，２９６号）が含まれる。
【０２１０】
使用され得る酵素的に活性な毒素及びこの断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（緑膿菌由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ阻害剤、クルシン、クロチン、サポンソウ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、及びトリコテセンが含まれる（例えば、１９９３年１０月２８日に公開されたＷＯ  ９３／２１２３２を参照のこと）。
【０２１１】
本発明は、ヘテロ多量体と、核酸分解活性（例えば、リボヌクレアーゼ又はデオキシリボヌクレアーゼ；ＤＮａｓｅなどのＤＮＡエンドヌクレアーゼ）を有する化合物の間で形成される免疫コンジュゲートを更に企図する。
【０２１２】
腫瘍を選択的に破壊するために、ヘテロ多量体は、高放射性原子を含むことができる。様々な放射性同位体が、放射性コンジュゲートヘテロ多量体の作製に利用可能である。例には、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体が含まれる。該コンジュゲートが検出に使用される場合、該コンジュゲートは、シンチグラフィー試験のための放射性原子（例えばＴｃ９９ｍ又はＩ１２３）、又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像（磁気共鳴画像、ｍｒｉとしても知られる）のためのスピン標識（再びヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄などの）を含み得る。
【０２１３】
放射性標識又は他の標識は、公知の方法でコンジュゲートに組み込むことができる。例えば、ペプチドは、生合成されてもよく、又は例えば水素の代わりにフッ素−１９を含む適切なアミノ酸前駆体を用いた化学アミノ酸合成により合成されてもよい。ｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８及びＩｎ１１１などの標識は、システイン残基を介してペプチドに付加することができる。イットリウム−９０は、リシン残基を介して付加することができる。ＩＯＤＯＧＥＮ方法（Ｆｒａｋｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ８０：４９〜５７頁（１９７８））は、ヨウ素−１２３を組み込むのに使用することができる。「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｙ」（Ｃｈａｔａｌ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９）は他の方法を詳細に記載している。
【０２１４】
ヘテロ多量体及び細胞傷害性剤のコンジュゲートは、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミデート塩酸塩などの）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベレートなどの）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなどの）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなどの）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなどの）、ジイソシアネート（トルエン２，６−ジイソシアネートなどの）、及びビス−活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなどの）などの様々な二官能性タンパク質カップリング剤を用いて作製することができる。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：１０９８頁（１９８７）に記載されている通りに調製することができる。炭素−１４−標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、ヘテロ多量体に放射性ヌクレオチドをコンジュゲーションするための例示的なキレート剤である。例えば、ＷＯ９４／１１０２６を参照のこと。リンカーは、細胞への細胞傷害性薬物の放出を促進する「切断可能なリンカー」であってもよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ−感受性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：１２７〜１３１頁（１９９２）；米国特許第５，２０８，０２０号）が使用されてもよい。
【０２１５】
本発明の化合物は、市販されている（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．、ロックフォード、ＩＬ．、Ｕ．Ｓ．Ａから）架橋剤試薬、すなわち、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、及びスルホ−ＳＭＰＢ、及びＳＶＳＢ（スクシンイミジル−（４−ビニルスルホン）ベンゾエート）で調製されたＡＤＣを明示的に企図するが、これらに限定されない。４６７〜４９８頁、２００３〜２００４  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ａｎｄ  Ｃａｔａｌｏｇを参照のこと。
【０２１６】
Ｅ．コンジュゲートヘテロ多量体の調製
本発明のコンジュゲートヘテロ多量体において、ヘテロ多量体は、場合によりリンカーを通じて、一又は複数の部分（例えば薬物部分）、例えば１抗体当たり約１〜約２０部分にコンジュゲートされる。コンジュゲートヘテロ多量体は、（１）抗体ヘテロ多量体の求核基と二価のリンカー試薬との共有結合を介した反応と、これに続く目的とする部分との反応；及び（２）ある部分の求核基と二価のリンカー試薬との共有結合を介した反応と、これに続抗体ヘテロ多量体の求核基との反応を含む、当業者に公知の有機化学反応、条件、及び試薬を用いて幾つかの手段により調製することができる。コンジュゲートヘテロ多量体を調製する更なる方法は、本明細書に記載されている。
【０２１７】
リンカー試薬は、一又は複数のリンカー成分から構成され得る。例示的なリンカー成分には、６−マレイミドカプロイル（「ＭＣ」）、マレイミドプロパノイル（「ＭＰ」）、バリン−シトルリン（「ｖａｌ−ｃｉｔ」）、アラニン−フェニルアラニン（「ａｌａ−ｐｈｅ」）、ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（「ＰＡＢ」）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルチオ）ペンタノエート（「ＳＰＰ」）、Ｎ−スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１カルボキシレート（「ＳＭＣＣ」）、及びＮ−スクシンイミジル（４−ヨード−アセチル）アミノベンゾエート（「ＳＩＡＢ」）が含まれる。更なるリンカー成分は当技術分野で公知であり、幾つかが本明細書に記載されている。「Ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌｖａｌｉｎｅ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  Ｃａｐａｂｌｅ  ｏｆ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｌｉｇａｎｄｓ」、米国出願公開第２００５／０２３８６４９号（この内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれている）も参照のこと。
【０２１８】
幾つかの実施態様では、リンカーはアミノ酸残基を含んでもよい。例示的なアミノ酸リンカー成分には、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド又はペンタペプチドが含まれる。例示的なジペプチドには、バリン−シトルリン（ｖｃ又はｖａｌ−ｃｉｔ）、アラニン−フェニルアラニン（ａｆ又はａｌａ−ｐｈｅ）が含まれる。例示的なトリペプチドには、グリシン−バリン−シトルリン（ｇｌｙ−ｖａｌ−ｃｉｔ）及びグリシン−グリシン−グリシン（ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ）が含まれる。アミノ酸リンカー成分を含むアミノ酸残基には、自然発生のもの、並びに微量アミノ酸及びシトルリンなどの非自然発生のアミノ酸類似体が含まれる。アミノ酸リンカー成分は設計することができ、特定の酵素、例えば、腫瘍関連プロテアーゼ（カテプシンＢ、Ｃ及びＤ）又はプラスミンプロテアーゼによる酵素的切断に対する選択性において最適化することができる。
【０２１９】
本発明のヘテロ多量体上の求核基には、（ｉ）Ｎ末端アミン基、（ｉｉ）側鎖アミン基、例えばリシン、（ｉｉｉ）側鎖チオール基、例えばシステイン、及び（ｉｖ）ヘテロ多量体がグリコシル化される糖水酸基又は糖アミノ基が含まれるが、これらに限定されない。アミン、チオール、及び水酸基は求核性であり、リンカー部分及びリンカー試薬上の求電子基（（ｉ）ＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロホルメート、及び酸ハロゲン化物などの活性エステル；（ｉｉ）ハロアセトアミドなどのハロゲン化アルキル及びハロゲン化ベンジル；（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシル、及びマレイミド基を含む）と反応して共有結合を形成することができる。特定のヘテロ多量体は、還元可能な鎖間ジスルフィド、すなわち、システイン架橋を有する。本発明のヘテロ多量体は、ＤＴＴ（ジチオトレイトール）などの還元剤を用いた処理により、リンカー試薬とのコンジュゲーションに対して反応性にすることができる。各システイン架橋は故に、理論的には２つの反応性チオール求核基を形成する。追加の求核基は、チオールへのアミンの変換をもたらすリシンと２−イミノチオラン（トラウト試薬）との反応を通じて、抗体に導入することができる。反応性チオール基は、１つ、２つ、３つ、４つ、又はこれ以上のシステイン残基を導入して（例えば、一又は複数の非天然システインアミノ酸残基を含む変異体ヘテロ多量体を調製して）、ヘテロ多量体（又はこの断片）に導入されてもよい。
【０２２０】
本発明のコンジュゲートヘテロ多量体はまた、リンカー試薬もしくは薬物又は他の部分上の求核置換基と反応することができる求電子性部分を導入するようにヘテロ多量体を修飾して作製することもできる。本発明のグリコシル化ヘテロ多量体の糖は、例えば過ヨウ素酸酸化試薬を用いて酸化されて、リンカー試薬もしくは薬物又は他の部分のアミン基と反応することができるアルデヒド基又はケトン基を形成し得る。得られたイミンシッフ塩基群は、安定な結合を形成することができ、又は、例えばホウ化水素試薬により還元されて安定なアミン結合を形成し得る。一実施態様では、グリコシル化抗体の炭水化物部分とガラクトースオキシダーゼ又はメタ過ヨウ素酸ナトリウムのどちらかとの反応は、薬物又は他の部分上の適切な基と反応することができるタンパク質中のカルボニル（アルデヒド及びケトン）基をもたらし得る（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）。別の実施態様では、Ｎ末端セリン又はスレオニン残基を含有するタンパク質は、メタ過ヨウ素酸ナトリウムと反応し得、第１アミノ酸の代わりにアルデヒドの産生をもたらし得る（Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ及びＳｔｒｏｈ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  ３：１３８〜１４６頁（１９９２）；米国特許第５，３６２，８５２号）。このようなアルデヒドは、薬物部分又はリンカー求核基と反応することができる。
【０２２１】
同様に、ある部分（薬物部分などの）上の求核基には、リンカー部分及びリンカー試薬上の求電子基（（ｉ）ＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロホルメート、及び酸ハロゲン化物などの活性エステル；（ｉｉ）ハロアセトアミドなどのハロゲン化アルキル及びハロゲン化ベンジル；並びに（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシル、及びマレイミド基を含む）と反応して共有結合を結合することができるアミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、及びアリールヒドラジド基が含まれるが、これらに限定されない。
【０２２２】
あるいは、ヘテロ多量体及び細胞傷害性剤を含む融合タンパク質は、例えば、組換え手法又はペプチド合成により作製されてもよい。ＤＮＡの長さは、互いに隣接した、又はコンジュゲートの所望の特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域により分離された、コンジュゲートの２つの部分をコードするそれぞれの領域を含み得る。更に別の実施態様では、ヘテロ多量体は、腫瘍プレターゲティングにおいて利用するために「受容体」（ストレプトアビジンのような）にコンジュゲートされてもよく、腫瘍プレターゲティングでは、ヘテロ多量体−受容体コンジュゲートが個体に投与され、この後に透明化剤を用いて非結合コンジュゲートが循環から除去され、次いで細胞傷害性剤（例えば放射性ヌクレオチド）にコンジュゲートされた「リガンド」（例えばアビジン）が投与される。
【０２２３】
Ｖ．治療的使用
本明細書に記載されたヘテロ多量体（例えば、ＨＤテザー含有単鎖単一特異性又は多重特異性抗体、ＨＤテザー含有単一特異性又は多重特異性抗体、イムノアドヘシン−抗体複合体）は、治療的用途に使用されてもよい。このようなヘテロ多量体は、増殖性疾患、癌、血管新生障害、炎症性障害、自己免疫疾患、及び免疫障害を含む、ヘテロ多量体生成に適した候補標的がある任意の疾患の治療に使用することができる。
【０２２４】
治療的使用に加えて、本発明のヘテロ多量体は、上記の疾患又は状態などの抗体生成に適した候補標的がある任意の疾患又は状態に対する診断方法などの診断方法を含む、他の目的に使用することができる。
【０２２５】
ＶＩ．投与量、製剤、及び期間
本発明のヘテロ多量体は、医療実施基準（good medical practice）と一致するやり方で処方され、用量決定され、投与される。この文脈で考慮する要因には、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の対象の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、及び医師に公知の他の要因が含まれる。投与されるタンパク質の「治療的有効量」は、このような考慮事項により管理され、特定の障害（例えば、増殖性疾患、癌、血管新生障害、炎症性障害、自己免疫疾患、又は免疫障害）を予防、改善、治療するために必要な最小量である。該タンパク質は、障害を予防又は治療するのに現在使用される一又は複数の薬剤と共に製剤化される必要はないが、場合により製剤化される。このような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在するタンパク質の量、障害又は治療のタイプ、及び上で論じられた他の要因に依存する。これらは一般的に、上記で使用されたのと同じ投与量及び投与経路で、又はこれまで使用された投与量の約１から９９％で使用される。
【０２２６】
一実施態様では、本発明は、ヘテロ多量体生成に適した候補標的がある特定の障害に罹りやすい、又は該障害と診断されたヒト対象の生存期間を増加させるのに使用することができる。生存期間は、薬物の最初の投与から死亡までの期間として定義される。生存期間は、治療中の対象の死亡リスクを表す治療群対対照群の層別化ハザード比（ＨＲ）により測定することもできる。
【０２２７】
更に別の実施態様では、本発明の方法は、ある障害に罹りやすい、又は該障害と診断された、及び該障害に対する１つもしくは複数の療法で治療中のヒト対象群における奏効率を著しく上昇させる。奏効率は、治療に応答した治療された対象のパーセンテージとして定義される。一態様では、本発明のタンパク質及び外科手術又は別の療法形態（例えば、放射線療法又は化学療法剤）を用いた本発明の併用治療は、外科手術又は別の療法形態単独で治療された群と比べて、治療された対象群における奏効率を著しく上昇させ、該上昇は０．００５未満のカイ二乗ｐ値を有する。癌の治療における治療有効性の更なる測定法は、米国特許出願公開第２００５０１８６２０８号に記載されている。
【０２２８】
治療製剤は、所望の純度を有する活性成分を任意の生理学的に許容可能な担体、賦形剤又は安定剤と混合して、当技術分野で公知の標準的方法を用いて調製される（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第２０版）、Ａ．  Ｇｅｎｎａｒｏ編、２０００、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）。許容可能な担体には、生理食塩水、もしくはリン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンもしくはリシンなどのアミノ酸；単糖、二糖、及びグルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトール又はソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；並びに／又はＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、もしくはＰＥＧなどの非イオン性界面活性剤が含まれる。
【０２２９】
場合により、しかし好ましくは、製剤は薬学的に許容可能な塩、好ましくは塩化ナトリウムを、好ましくはほぼ生理的濃度で含有する。場合により、本発明の製剤は、薬学的に許容可能な防腐剤を含有してもよい。幾つかの実施態様において防腐剤濃度は、０．１から２．０％（典型的にはｖ／ｖ）の範囲である。適切な防腐剤には、製薬技術分野で公知のものが含まれる。ベンジルアルコール、フェノール、ｍ−クレゾール、メチルパラベン、及びプロピルパラベンが好ましい防腐剤である。場合により、本発明の製剤は、薬学的に許容可能な界面活性剤を０．００５から０．０２％の濃度で含んでもよい。
【０２３０】
製剤は本明細書において、治療される特定の適応症に対する１つを超える活性な化合物、好ましくは、互いに悪影響を与えない相補的活性を有するものを必要に応じて含有することもできる。このような分子は、意図される目的に対して有効な量で組み合わせて適切に存在する。
【０２３１】
活性成分はまた、例えばコアセルベーション法又は界面重合により調製されたマイクロカプセル（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセル又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ−（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル）、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロエマルジョンに封入することもできる。このような手法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（上記参照）に開示されている。
【０２３２】
徐放性製剤が調製されてもよい。徐放性製剤の適切な例には、ヘテロ多量体を含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが含まれ、該マトリックスは、成形物、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、又はポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸及びγエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドから構成される注射可能なミクロスフェア）などの分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が含まれる。エチレン−酢酸ビニル及び乳酸−グリコール酸などのポリマーは、１００日間にわたって分子の放出を可能にするが、特定のヒドロゲルは、タンパク質をより短い期間放出する。カプセル化された本発明のヘテロ多量体が体内に長時間留まる場合、３７℃で水分に曝露した結果、該多量体は変性及び凝集し、生物学的活性の喪失及び免疫原性における起こり得る変化をもたらす。関与する機構に応じた安定化のために、合理的な戦略が考えられ得る。例えば、凝集機構が、チオ−ジスルフィド交換を通じた分子間Ｓ−Ｓ結合形成であることが発見された場合、安定化は、スルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含量の制御、適切な添加剤の使用、及び特異的ポリマーマトリックス組成物の開発により達成することができる。
【０２３３】
本明細書に記載されたタンパク質（例えば、ＨＤテザー含有単鎖単一特異性又は多重特異性抗体、ＨＤテザー含有多重鎖単一特異性又は多重特異性ヘテロ多量体、イムノアドヘシン−抗体複合体）は、ボーラスとしての又は一定期間にわたる持続注入による静脈内投与などの公知の方法に従って、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液内、髄腔内、経口、局所、又は吸入経路によりヒト対象に投与される。広範な副作用又は毒性が、タンパク質により認識される標的分子に対する拮抗作用と関連する場合、局所投与が特に望ましいことがある。エクスビボ戦略もまた治療的用途に使用することができる。エクスビボ戦略は、本発明のヘテロ多量体をコードするポリヌクレオチドで対象由来の細胞をトランスフェクト又は形質導入することを必要とする。トランスフェクト又は形質導入された細胞は、次いで対象に戻される。細胞は、造血細胞（例えば、骨髄細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、Ｔ細胞、又はＢ細胞）、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、ケラチン生成細胞、又は筋肉細胞を含むがこれらに限定されない、広範なタイプのいずれかであり得る。
【０２３４】
１つの例において、本発明のヘテロ多量体は、腫瘍の障害又は位置が許す場合、例えば直接注射により局所的に投与され、注射は定期的に反復され得る。該タンパク質複合体は、局所再発又は転移を予防又は低減するために、対象又は直接腫瘍細胞（例えば腫瘍の外科的切除後の腫瘍又は腫瘍床）に全身的に送達することもできる。
【０２３５】
ＶＩＩ．製品
本発明の別の実施態様は、本明細書に記載された一又は複数のヘテロ多量体、及びヘテロ多量体生成に適した標的がある任意の障害を治療又は診断するのに有用な材料を含有する製品である。製品は、容器、及び容器上の又は容器に付随するラベル又は添付文書を含む。適切な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ等が含まれる。容器は、ガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。容器は、状態を治療するのに有効な組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有してもよい（例えば、容器は、静脈内溶液バッグ、又は皮下注射針により突き刺し可能なストッパーを有するバイアルであってもよい）。組成物中の少なくとも一つの活性剤は、本発明のヘテロ多量体である。ラベル又は添付文書は、組成物が特定の状態を治療するのに使用されることを示す。ラベル又は添付文書は更に、ヘテロ多量体組成物を対象に投与するための説明も含む。本明細書に記載された併用療法を含む製品及びキットもまた企図される。
【０２３６】
添付文書は、治療製品の商業的包装に慣習的に含まれる説明書を指し、このような治療製品の使用に関する適応症、用法、用量、投与、禁忌及び／又は警告についての情報を含む。
【０２３７】
更に、製品は、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸塩緩衝生理食塩水、リンゲル液及びデキストロース溶液などの薬学的に許容可能な緩衝液を含む第２の容器を更に含んでもよい。製品は、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業的及び利用者の観点から考えられた他の材料を更に含んでもよい。
【０２３８】
様々な目的、例えば、細胞からの抗原の精製又は免疫沈殿に有用であるキットもまた提供される。抗原の単離及び精製のために、キットは、ビーズ（例えば、セファロースビーズ）に結合されたヘテロ多量体を含んでもよい。インビトロで、例えばＥＬＩＳＡ又はウエスタンブロットで抗原を検出及び定量するために、ヘテロ多量体を含有するキットが提供されてもよい。製品と同様に、キットは、容器、及び容器上の又は容器に付随するラベル又は添付文書を含む。容器は、本発明の少なくとも一つのヘテロ多量体を含む組成物を保持する。例えば希釈剤及び緩衝液を含有する、又はヘテロ多量体を制御する追加の容器が含まれてもよい。ラベル又は添付文書は、組成物の記載のほか、インビトロで意図される用途又は診断的用途に関する説明を提供することができる。
【０２３９】
ＶＩＩＩ．標的分子
本発明のヘテロ多量体（例えば、単鎖もしくは多重鎖抗体、又はイムノアドヘシン−抗体複合体）により標的にされ得る分子の例には、可溶性血清タンパク質、受容体タンパク質、膜結合タンパク質（例えば、アドヘシン）、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、及びホルモンが含まれるが、これらに限定されない。
【０２４０】
場合により他の分子にコンジュゲートされる可溶性抗原又はこの断片は、ヘテロ多量体を生成するための免疫原として使用することができる。受容体などの膜貫通分子に対して、これらの断片（例えば、受容体の細胞外ドメイン）が免疫原として使用され得る。あるいは、膜貫通分子を発現する細胞が免疫原として使用され得る。このような細胞は、天然の供給源（例えば癌細胞系）から得られてもよく、又は膜貫通分子を発現するように組換え手法により形質転換された細胞であってもよい。ヘテロ多量体を調製するのに有用な他の抗原及びこの形態は、当業者に明らかである。
【０２４１】
前述の記載は、当業者が本発明を実施できるようにするのに十分であると考えられる。以下の例は、例示目的のみで提供され、本発明の範囲を限定するものでは決してない。実際、本明細書に示され、記載されたものに加えて本発明の様々な変更は、前述の記載から当業者に明らかとなり、添付の特許請求の範囲内である。実施例に示された記載は、本発明の一部として一般的に見なされることが意図される。
【実施例】
【０２４２】
実施例１．ＨＤテザー含有ヘテロ多量体を発現するためのベクターの構築
全てのＨＤテザー含有ヘテロ多量体単鎖抗体コンストラクトは、社内で既に利用可能な既存のＩｇＧ１モノクローナル抗体コンストラクトから作製した。ＰＣＲを用いて、ＬＣの３’プライマーがＬＣ  Ｃ末端を超えて伸び、ＣＬＨ−テザーのＮ末端部分をコードし、ＢａｍＨＩ部位で終結するＬＣを調製した。５’ＬＣプライマーはＣｌａＩ部位で終結した。ＰＣＲ断片を次いで消化し、同様に消化し脱リン酸化したｐＲＫベクター（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，  Ｉｎｃ．；Ｅａｔｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５：８３４３〜８３４７頁（１９８６））にクローン化した。ＰＣＲを用いて、５’プライマーがＨＣ  Ｎ末端（マイナスシグナル配列）を超えて伸び、ＣＬＨ−テザーのＣ末端部分をコードし、ＢａｍＨＩ部位で終結する同種ＨＣを次いで調製した。３’ＨＣプライマーはＸｂａＩ部位で終結した。ＨＣ  ＰＣＲ断片を消化し、上記の同種ＬＣを含み、よってテザー化半抗体を形成する同様にして調製したプラスミドにクローン化した。ＢａｍＨＩ部位は、アミノ酸残基「ＧＳ」をコードし、テザーのＧＧＳリピートの完全性を維持するように配置した。次に、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＱｕｉｋｃｈａｎｇｅ  ＩＩ  ＸＬ部位特異的変異誘発キットを用いて、Ｋ２２２位（Ｋａｂａｔナンバリングスキーム）のリシン残基をアラニン残基に変異させた。
【０２４３】
単鎖抗体のＮ末端に向かう半抗体を、上記で使用した同じ５’ＬＣプライマーと、ＨＣのＣ末端を超えて伸び、ＨＤテザーのＮ末端をコードし、ＢｓｐＥＩ部位で終結する３’プライマーを用いて増幅する別のラウンドのＰＣＲを介して、上記のＣＬＨ−テザー化半抗体の２つを次いでつなぎ合わせた。ＰＣＲ断片を消化し、同様に消化し脱リン酸化したｐＲＫベクターにクローン化した。半抗体の構築に使用した同じ３’ＨＣプライマーと、ＬＣ  Ｎ末端（マイナスシグナル配列）を超えて伸び、ＨＤテザーのＣ末端部分をコードし、ＢｓｐＥＩ部位で終結する５’プライマーを用いて、ヘテロ多量体単鎖抗体のＣ末端に向かう半抗体を増幅した。ＰＣＲ産物を消化し、同様に消化し脱リン酸化したＮ末端コンストラクトベクターにクローン化した。ＢａｍＨＩと同様に、ＢｓｐＥＩはテザーのＧＧＳリピートの完全性を維持するように配置することができる。
【０２４４】
ＨＤテザー含有ヘテロ多量体多重鎖抗体の構築は同様であり、Ｎ末端「半抗体」がＨＣシグナル配列で始まる点、及びこの同種ＬＣが第２ｐＲＫプラスミドとは別に発現される点でのみ異なった。
【０２４５】
実施例２．ＨＤテザー含有ヘテロ多量体の切断及び精製
本発明のヘテロ多量体を精製するのに使用することができる例示的なスキームを以下に示す。
ヘテロ多量体を４℃でプロテインＡ（例えば、ｍＡｂＳｕｒｅ）カラムに添加
↓
カラムをＫＰＯ４、次いでＰＢＳ＋０．１％トリトンＸ１１４で洗浄
↓
試料を１００ｍＭ酢酸（ｐＨ２．９）で溶出
↓
試料ｐＨを１Ｍ  Ｔｒｉｓを用いてｐＨ８．０に調整し、３７℃で１．５時間、１：５００（ｗｔ：ｗｔ）Ｌｙｓ−Ｃで切断
↓
試料をｍＡｂＳｕｒｅ樹脂上で精製してＬｙｓ−Ｃを除去
↓
試料を１００ｍＭ酢酸（ｐＨ２．９）で溶出し、１Ｍ  Ｔｒｉｓを用いてｐＨ８に中和
↓
試料を３７℃、２．５時間、カルボキシペプチダーゼＢ  １：５（ｗｔ：ｗｔ）で切断
↓
試料ｐＨを調整し、２０ｍＭ酢酸ナトリウム＋１Ｍ  ＮａＣｌの勾配で、２０ｍＭ酢酸ナトリウム  ｐＨ５．０中で陽イオン交換カラムに添加
↓
分画を回収し、プールし、ＰＢＳに透析
【０２４６】
特に、ヘテロ多量体は、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（スウェーデン）製のｍＡｂＳｕｒｅ  Ｓｅｌｅｃｔ樹脂を用いて、一晩、４℃で馴化培地から精製した。カラムを、２つのカラム容積（ＣＶ）のＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）と、これに続く１０ＣＶのＰＢＳ＋０．１％トリトンＸ１１４洗剤と、これに続く１０ＣＶリン酸カリウム緩衝液で洗浄した。カラムを１００ｍＭ酢酸（ｐＨ２．９）で溶出し、トリス（２００ｍＭ最終濃度）、ｐＨ８．０を用いてｐＨ８．０に直ちに調整した。ＨＤテザーを１：５００（ｗｔ：ｗｔ）比のＬｙｓ−Ｃエンドペプチダーゼ（Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて３７℃で１〜５時間処理してヘテロ多量体から除去した。試料を次いでカラムに添加して酵素を除去した。残存フューリン認識部位は、この後、１：５（ｗｔ：ｗｔ）ブタカルボキシペプチダーゼＢ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号１０１０３２３３００１）を用いて１〜５時間除去する。切断した試料を、陽イオン交換カラムに添加して酵素を除去した。ピーク分画をプールし、質量スペクトル分析の前に一晩、ＰＢＳに対して透析して完全性及び純度を確保した。
【０２４７】
実施例３．改変ヘテロ多量体の特徴付け
本発明のＨＤテザーヘテロ二量体化技術を用いて構築した例示的なヘテロ多量体が、これらの配列が由来する抗体又はアドヘシンの結合特性を保持しているかを決定するために、結合アッセイを実施した（図６Ａ〜６Ｄ）。これらの結合アッセイは、ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｏｃｔｅｔシステムで反応速度ウィザードプログラムを用いて行った。全ての試験試料は、濃度２５μｇ／ｍｌ（反復実験において種々の試料の中で抗ヒトＩｇＧプローブの飽和を示す濃度）であった。プローブに第１試料を１０分間添加し、ＰＢＳ中で３０秒間洗浄した。第２及び第３試料に関する全ての結合は１５分間実施し、結合と結合の間に３０秒間ＰＢＳ洗浄した。
【０２４８】
他の実施態様
本明細書において引用又は言及された全ての特許、特許出願、特許出願公開公報、及び他の刊行物は、それぞれ独立した特許、特許出願、特許出願公開公報又は刊行物が、出典明示により援用されると具体的及び個別に示される場合と同じ程度に、出典明示により明細書に援用される。
【図１】
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【図２】
2018070634.tif 000005
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
2018070634.tif 000012
【図６Ｂ】
2018070634.tif 000013
【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【配列表】
2018070634000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成29年12月28日(2017.12.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【外国語明細書】
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