(57)【要約】【課題】普遍的且つ簡易な虚血再灌流障害抑制剤の評価方法を提供する。【解決手段】本発明の虚血再灌流障害抑制剤の評価方法は、空気を不活性ガスに置換し、ミトコンドリアを含む細胞抽出液を嫌気状態下に置く工程１と、前記工程１の後、前記細胞抽出液を好気条件下に置く工程２と、前記工程２の後、前記細胞抽出液に呼吸鎖複合体の基質を添加し、前記細胞抽出液の酸素消費速度を測定する工程３を備え、前記工程１又は前記工程２において、虚血再灌流障害抑制剤候補物質を注入する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
空気を不活性ガスに置換し、ミトコンドリアを含む細胞抽出液を嫌気状態下に置く工程１と、
前記工程１の後、前記細胞抽出液を好気条件下に置く工程２と、
前記工程２の後、前記細胞抽出液に呼吸鎖複合体の基質を添加し、前記細胞抽出液の酸素消費速度を測定する工程３を備え、
前記工程１又は前記工程２において、虚血再灌流障害抑制剤候補物質を注入することを特徴とする虚血再灌流障害抑制剤の評価方法。
【請求項２】
さらに、前記工程３の後、前記工程１において、虚血再灌流障害抑制剤候補物質を注入した場合の前記細胞抽出液の酸素消費速度と、前記工程２において、虚血再灌流障害抑制剤候補物質を注入した場合の前記細胞抽出液の酸素消費速度と、を比較する工程４を備える請求項１に記載の虚血再灌流障害抑制剤の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、虚血再灌流障害抑制剤の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
心筋梗塞、脳梗塞、腸間管膜血栓症等の梗塞性疾患では、梗塞部を機械的に拡張するか、血栓を溶解することにより、血流が途絶えていた虚血状態の組織に対して血流を再開させる虚血再灌流治療が行われることがある。また、臓器移植後の移植臓器においても、同様に血流が途絶えていた組織に血流が再開される。この血流の再開時に、虚血状態の組織に対して急に酸素が付加されるため、活性酸素やフリーラジカルの産生、好中球の浸潤、血小板活性化をはじめとするさまざまな生理反応が起こり、それが原因となって臓器障害、例えば、心筋障害（例、心筋梗塞）を増悪させることが知られており、虚血再灌流障害又は単に再灌流障害と呼ばれている。
【０００３】
近年、還元剤である水素（Ｈ２）が反応性の高い活性酸素種（ヒドロキシラジカル＜・ＯＨ＞やペルオキシナイトライト＜ＯＮＯＯ−＞）と選択的に反応し、これらを還元して消去することが示された。水素ガスを肺から吸入投与すると、血液を介して水素が全身に行き渡り、活性酸素に関連した病変を抑え、細胞障害を引き起こす酸化力の強いフリーラジカルを還元して消去することができることが知られており、マウスの脳梗塞の虚血再灌流モデル、肝臓の虚血再灌流モデルにおいて、虚血再灌流時の臓器及び組織障害を水素により低減できることが報告されている（例えば、非特許文献１、２等参照。）。
また、麻酔ガス、又は不活性ガス（例えば、キセノンガス、アルゴンガス等）がミトコンドリアに作用して虚血再灌流障害を抑制すると報告されている（例えば、非特許文献３〜５等参照。）。
しかしながら、虚血再灌流障害抑制剤となり得るこれらのガスの虚血再灌流障害に対する詳細な作用機序は未だ不明な点が多く、その作用機序を解明するための評価方法が求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ohsawa I., et al., “Hydrogen acts as a therapeutic antioxidant by selectively reducing cytotoxic oxygen radicals”, Nature Medicine, vol.13, no.6, p688-694, 2007.
【非特許文献２】Fukuda K., et al., “Inhalation of hydrogen gas suppresses hepatic injury caused by ischemia/reperfusion through reducing oxidative stress”, Biochemical and Biophysical Research Communications, vol.361, Issue 3, p670-674, 2007.
【非特許文献３】Mio Y., et al., “Xenon preconditioning: the role of prosurvival signaling, mitochondrial permeability transition and bioenergetics in rats”, Anesthesia&Analgesia, vol.108, no.3, p858-866, 2009.
【非特許文献４】Pagel PS., et al., “Noble gases without anesthetic properties protect myocardium against infarction by activating prosurvival signaling kinases and inhibiting mitochondrial permeability transition in vivo”, Anesthesia&Analgesia, vol.105, no.3, p562-569, 2007.
【非特許文献５】Hirata N., et al., “Isoflurane differentially modulates mitochondrial reactive oxygen species production via forward versus reverse electron transport flow: implications for preconditioning”, Anesthesiology, vol.115, no.3, p531-540, 2011.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
非特許文献１、２に記載のマウスの虚血再灌流モデル等、従来の虚血再灌流障害抑制剤の評価方法では、動物を用いた試験法であり、実験条件（例えば、虚血部位（組織）、動物種、虚血に至る条件等）に依存するため、普遍的且つ簡易な評価方法が求められていた。
【０００６】
従って、本発明は上記事情を鑑みてなされたものであり、普遍的且つ簡易な虚血再灌流障害抑制剤の評価方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、ミトコンドリアを含む細胞抽出液を窒素雰囲気下におくことにより、虚血状態に似せた状態を構築できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の態様を含む。
［１］空気を不活性ガスに置換し、ミトコンドリアを含む細胞抽出液を嫌気状態下に置く工程１と、前記工程１の後、前記細胞抽出液を好気条件下に置く工程２と、前記工程２の後、前記細胞抽出液に呼吸鎖複合体の基質を添加し、前記細胞抽出液の酸素消費速度を測定する工程３を備え、前記工程１又は前記工程２において、虚血再灌流障害抑制剤候補物質を注入することを特徴とする虚血再灌流障害抑制剤の評価方法。
［２］さらに、前記工程３の後、前記工程１において、虚血再灌流障害抑制剤候補物質を注入した場合の前記細胞抽出液の酸素消費速度と、前記工程２において、虚血再灌流障害抑制剤候補物質を注入した場合の前記細胞抽出液の酸素消費速度と、を比較する工程４を備える請求項１に記載の虚血再灌流障害抑制剤の評価方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、普遍的且つ簡易な虚血再灌流障害抑制剤の評価方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実施例１におけるミトコンドリア酸素消費速度測定の流れを示すグラフである。
【図２】実施例１における各群の各測定地点でのミトコンドリア酸素消費速度を示すグラフである。
【図３】実施例２における各群の各測定地点でのミトコンドリア酸素消費速度を示すグラフである。
【図４】（Ａ）〜（Ｄ）比較例１における濃度及び含有量が異なる亜硫酸ナトリウムを含む細胞抽出液のチャンバ閉鎖状態及び開放状態（酸素再添加状態）でのチャンバ内の酸素濃度の変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
＜虚血再灌流障害抑制剤の評価方法＞
一実施形態において、本発明は、空気を不活性ガスに置換し、ミトコンドリアを含む細胞抽出液を嫌気状態下に置く工程１と、前記工程１の後、前記細胞抽出液を好気条件下に置く工程２と、前記工程２の後、前記細胞抽出液に呼吸鎖複合体の基質を添加し、前記細胞抽出液の酸素消費速度を測定する工程３を備え、前記工程１又は前記工程２において、虚血再灌流障害抑制剤候補物質を注入する虚血再灌流障害抑制剤の評価方法を提供する。
【００１２】
本実施形態の評価方法によれば、実験条件（例えば、虚血部位（組織）、動物種、虚血に至る条件等）に依存せず、虚血再灌流障害抑制剤を普遍的且つ簡易に評価することができる。
なお、一般に、「虚血再灌流障害」とは、虚血状態にある臓器又は組織に血液再灌流が起きた際に、その臓器又は組織内の微小循環において種々の毒性物質の産生が惹起され引きおこされる障害を意味する。虚血の時間と程度、臓器の種類等により障害の程度は異なる。例えば、心筋梗塞、脳梗塞、腸間膜血管閉塞症等に対する再灌流療法後や臓器移植後にみられることが多い。障害を引きおこす機序としては、スーパーオキサイド（Ｏ２−）やヒドロキシルラジカル（・ＯＨ）等の活性酸素や一酸化窒素（ＮＯ）等のフリーラジカル産生による障害；各種サイトカイン、エンドセリン、アラキドン酸等の各種ケミカルメディエータ産生による障害；活性化好中球と血管内皮細胞との相互作用に基づく障害等の機序が考えられている。
また、本明細書において、「虚血再灌流障害抑制」とは、上記虚血再灌流障害における種々の毒性物質の産生を抑制する、又は虚血状態から再灌流状態となった際の細胞内のミトコンドリアにおける呼吸障害（酸素消費の阻害）を抑制することを意味する。
以下、本実施形態の評価方法の各工程について、詳細に説明する。
【００１３】
［工程１］
まず、ミトコンドリアを含む細胞抽出液を嫌気状態下に置く。具体的には、例えば、密封可能な容器に前記細胞抽出液を加え、さらに不活性ガスを注入して空気と置換し、その後密封状態で静置すればよい。嫌気状態下におく際の温度としては、例えば４℃以上４０℃以下であればよい。
また、嫌気状態下におく時間としては、特別な限定はなく、例えば２０分以上９０分以下であればよく、例えば３０分以上６０分以下であればよい。
前記不活性ガスとしては、例えば、窒素ガス；アルゴンガス、ヘリウムガス、ネオンガス等の希ガス等が挙げられる。中でも、コスト面、ミトコンドリア機能への影響の少なさから窒素ガスを用いることが好ましい。
後述の実施例において示すとおり、亜硫酸ナトリウムを用いて細胞抽出液中の溶存酸素を取り除く方法では、充分に酸素を取り除くのに２時間以上時間かかり、また、高濃度の亜硫酸ナトリウムを用いた場合、嫌気状態後に、再度酸素を注入しても、酸素濃度が上がりにくいという弊害が生じていた。
これに対し、窒素等のガスを用いる場合では、短時間で前記細胞抽出液を嫌気状態におくことができ、さらに、再度酸素雰囲気下に置いても、前記細胞抽出液における酸素濃度を好気状態下の細胞抽出液における酸素濃度と同等の濃度まで問題なく回復させることができるため、生体内における虚血再灌流を再現するために有用である。
【００１４】
また、使用する細胞抽出液の量としては、０．０５ｍＬ以上１０ｍＬ以下であることが好ましく、０．１ｍＬ以上５ｍＬ以下であることがより好ましく、０．２ｍＬ以上３ｍＬ以下であることがさらに好ましい。
前記細胞抽出液の由来となる細胞の種類及び動物種を適宜選択することによって、所望の組織及び動物種における虚血状態を再現し、評価することができる。
【００１５】
本実施形態の評価方法において用いられる細胞抽出液の由来となる細胞としては、特別な限定はなく、例えば、生体を構成する体細胞、生体から分離され不死化能を獲得して体外で安定して維持される細胞（細胞株）、生体から分離され人為的に遺伝子改変された細胞、生体から分離され人為的に核が交換された細胞等が挙げられるが、これらに限定されない。
生体を構成する体細胞としては、例えば、皮膚、腎臓、脾臓、副腎、肝臓、肺、卵巣、膵臓、子宮、胃、結腸、小腸、大腸、膀胱、前立腺、精巣、胸腺、筋肉、結合組織、骨、軟骨、血管組織、血液、心臓、眼、脳、神経組織等の任意の組織から採取される細胞等が挙げられるが、これらに限定されない。
体細胞として、より具体的には、例えば、線維芽細胞（例えば、大動脈外膜線維芽細胞、心臓線維芽細胞等）、骨髄細胞、免疫細胞（例えば、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、好中球、マクロファージ、単球、等）、赤血球、血小板、骨細胞、骨髄細胞、周皮細胞、樹状細胞、表皮角化細胞（ケラチノサイト）、脂肪細胞、間葉細胞、上皮細胞（例えば、肺胞上皮細胞、気管支上皮細胞、腎臓近位尿細管上皮細胞等）、表皮細胞、内皮細胞、血管内皮細胞（例えば、肺小血管内皮細胞、微小血管内皮細胞等）、リンパ管内皮細胞、肝細胞、膵島細胞（例えば、α細胞、β細胞、δ細胞、ε細胞、ＰＰ細胞等）、軟骨細胞、卵丘細胞、グリア細胞、神経細胞（ニューロン）、オリゴデンドロサイト、マイクログリア、星状膠細胞、心筋細胞、食道細胞、筋肉細胞（例えば、平滑筋細胞（例えば、気管支平滑筋細胞、メサンギウム細胞等）、骨格筋細胞等）、メラニン細胞、単核細胞等が挙げられるが、これらに限定されない。
中でも、虚血再灌流障害において、特に脳、肺、心臓、肝臓、腎臓等が標的臓器となることから、腎臓、副腎、肝臓、肺、心臓、脳、神経組織から採取される細胞であることが好ましく、大動脈外膜線維芽細胞、心臓線維芽細胞、肝細胞、肺胞上皮細胞、気管支上皮細胞、腎臓近位尿細管上皮細胞、肺小血管内皮細胞、微小血管内皮細胞、神経細胞、心筋細胞、気管支平滑筋細胞、メサンギウム細胞であることがより好ましい。
【００１６】
また、前記細胞の由来となる動物種としては、特別な限定はなく、例えば、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウシ、マウス、ラット等が挙げられるが、これらに限定されない。また、由来となる動物類は、目的等により任意に選択することができる。
中でも、由来となる動物種としては、ヒトであることが好ましい。由来となる動物がヒトであることにより、ヒトに適用可能な新薬開発等へ応用することができる。
【００１７】
前記細胞抽出液は、特別な限定はなく、公知の方法を用いて調製すればよい。例えば、乳鉢中で乳棒を用いてすり潰す方法、ダウンスホモジナイザーを用いる方法、ガラスビーズを用いる方法等が挙げられる。
【００１８】
また、前記細胞抽出液は、プロテアーゼインヒビターを含有していてもよい。プロテアーゼインヒビターを含有することで、細胞抽出液に含有されるプロテアーゼの活性が阻害され、当該プロテアーゼによる抽出物中の活性タンパクの不所望な分解を防止できる。
前記プロテアーゼインヒビターとしては、プロテアーゼの活性を阻害し得るものであれば、特別な限定はなく、例えば、フェニルメタンスルホニルフルオリド（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ；ＰＭＳＦ）、アプロチニン、ベスタチン、ロイペプチン、ペプスタチンＡ、Ｅ−６４（Ｌ−ｔｒａｎｓ−エポキシスクシニルロイシルアミド−４−グアニジノブタン）、エチレンジアミン四酢酸、ホスホラミドン等が挙げられる。また、使用するプロテインインヒビターは１種類であってもよく、２種類以上の混合物（プロテアーゼインヒビターカクテル）であってもよい。
前記細胞抽出用液中におけるプロテアーゼインヒビターの含有量に特別な限定はなく、例えば１μＭ以上５０ｍＭ以下であればよく、０．０１ｍＭ以上５ｍＭ以下であればさらによい。プロテアーゼインヒビターが１μＭ以上であることによりプロテアーゼの分解活性を充分抑えることができ、またプロテアーゼインヒビターが５０ｍＭ以下であることにより、細胞抽出液中におけるタンパク質合成反応の阻害を抑制することができる。
【００１９】
また、前記細胞抽出液は、さらに、カリウム塩、マグネシウム塩、ジチオトレイトール、及び緩衝剤を含有していてもよい。
【００２０】
前記カリウム塩としては、ミトコンドリアにおける呼吸を阻害するようなものでなければ特別な限定はなく、例えば酢酸カリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、塩化カリウム、リン酸水素二カリウム、クエン酸水素二カリウム、硫酸カリウム、リン酸二水素カリウム、ヨウ化カリウム、フタル酸カリウム等が挙げられる。
前記細胞抽出用液中におけるカリウム塩の含有量に特別な限定はなく、保存安定性の観点から、例えば酢酸カリウム等、１価のカリウム塩である場合、１０ｍＭ以上５００ｍＭ以下であればよく、２０ｍＭ以上３００ｍＭ以下であればさらによい。カリウム塩の含有量が上記範囲であることにより、細胞抽出液中の成分が不安定になることを防ぐことができる。
【００２１】
前記マグネシウム塩としては、ミトコンドリアにおける呼吸を阻害するようなものでなければ特別な限定はなく、例えば酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、クエン酸マグネシウム、リン酸水素マグネシウム、ヨウ化マグネシウム、乳酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、シュウ酸マグネシウム等が挙げられる。
前記細胞抽出用液中におけるマグネシウム塩の含有量に特別な限定はなく、保存安定性の観点から、例えば酢酸マグネシウム等、２価の塩である場合、０．１ｍＭ以上１０ｍＭ以下であればよく、０．５ｍＭ以上５ｍＭ以下であればさらによい。マグネシウム塩の含有量が上記範囲であることにより、細胞抽出液中の成分が不安定になることを防ぐことができる。
【００２２】
前記ジチオトレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ；ＤＴＴ）は、酸化防止の目的で配合されるものである。
前記細胞抽出用液中におけるＤＴＴの含有量に特別な限定はなく、保存安定性の観点から、例えば０．１ｍＭ以上１０ｍＭ以下であればよく、０．５ｍＭ以上５ｍＭ以下であればさらによい。ＤＴＴの含有量が上記範囲であることにより、細胞抽出液中の成分が不安定になることを防ぐことができる。
【００２３】
前記緩衝剤は、緩衝能を付与し、抽出用液による抽出により調製された抽出液（＝抽出用液＋抽出物）において、例えば酸性又は塩基性物質の添加等によって起こるｐＨの急激な変化による抽出物の変性を防止する目的で配合される。このような緩衝剤としては、特別な限定はなく、例えば、ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸−酢酸ナトリウム、クエン酸−クエン酸ナトリウム、リン酸、ホウ酸、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ等が挙げられる。
【００２４】
緩衝剤は、得られた細胞抽出液のｐＨが４以上１０以下に保持されるようなものを使用することが好ましく、ｐＨが６以上８．５以下に保持されるようなものを使用するのがより好ましい。細胞抽出液のｐＨが４以上１０以下であることにより、細胞抽出液中の成分が変性することを防ぐことができる。
【００２５】
前記細胞抽出用液中における緩衝剤の含有量に特別な限定はなく、好適な緩衝能を保持する観点から、例えば５ｍＭ以上２００ｍＭ以下であればよく、１０ｍＭ以上１００ｍＭ以下であればさらによい。緩衝剤を５ｍＭ以上含有することにより、酸性又は塩基性物質の添加によりｐＨの急激な変動を引き起こすことを防ぎ、調製した細胞抽出液において抽出物が変性することを防ぐことができる。また、緩衝剤を２００ｍＭ以下含有することにより、塩濃度が高くなり過ぎず、細胞抽出液中の成分が不安定になることを防ぐことができる。
【００２６】
前記細胞抽出液は、さらに、カルシウム塩等を含んでいてもよい。
前記カルシウム塩としては、ミトコンドリアにおける呼吸を阻害するようなものでなければ特別な限定はなく、例えば、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、硫酸カルシウム、クエン酸カルシウム、ヨウ化カルシウム、乳酸カルシウム、硝酸カルシウム、シュウ酸カルシウム等が挙げられる。
前記細胞抽出用液中におけるカルシウム塩の含有量に特別な限定はなく、例えば、塩化カルシウム等、２価のカルシウム塩である場合、０．１ｍＭ以上１０ｍＭ以下であればよく、０．５ｍＭ以上５ｍＭ以下であればさらによい。
【００２７】
前記細胞抽出液は、抽出物をタンパク質濃度で、例えば１ｍｇ／ｍＬ以上２００ｍｇ／ｍＬ以下含有すればよく、１０ｍｇ／ｍＬ以上１００ｍｇ／ｍＬ以下含有すればさらによい。抽出物の含有量がタンパク質濃度で１ｍｇ／ｍＬ以上であることにより、ミトコンドリアにおける呼吸を充分に測定することができ、また抽出物の含有量がタンパク質濃度で２００ｍｇ／ｍＬ以下であることにより、抽出液の粘性が高くなり、操作しづらくなることを防ぐことができる。
【００２８】
細胞抽出液中の抽出物の含有量は、タンパク質濃度を測定することで決定され、例えば、ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ Ｋｉｔ等を使用し、タンパク質濃度を測定することによって決定される。具体的には、反応試薬２ｍＬに対してサンプルを０．１ｍＬ加え、３７℃で３０分間反応させ、分光光度計を用いて、５６２ｎｍにおける吸光度を測定する。コントロールとしては、通常、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を使用し、検量線を作成する。このような手法により測定することができる。
【００２９】
前記細胞抽出液を入れる密封容器としては、開閉可能なものが好ましく、特別な限定はない。密封容器としては、例えば、スクリューキャップ付のコニカルチューブ、スクリューキャップ付の細胞培養用フラスコ等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３０】
［工程２］
次いで、嫌気状態にした細胞抽出液を好気条件下に置き、再灌流状態を再現する。具体的には、細胞抽出液を含む密封容器内の窒素ガスを、約２１％程度の酸素ガスを含む空気に置換し、好気状態にすればよい。容器内の酸素濃度が安定後、直ちに、続く工程３に移ればよい。
【００３１】
また、工程１又は工程２において、虚血再灌流障害抑制剤候補物質を注入すればよい。虚血再灌流障害抑制剤候補物質としては、特別な限定はなく、固体、液体、気体のうちいずれの形態であってもよい。
前記虚血再灌流障害抑制剤候補物質が固体である場合は、適当な溶媒（例えば、水、又は生理食塩水等）に溶解して溶液として、細胞抽出液と混合させればよい。また、前記虚血再灌流障害抑制剤候補物質が気体である場合、工程１においては窒素ガスに、又は工程２においては酸素ガスに混合し、密封容器内に注入すればよい。
【００３２】
［工程３］
次いで、容器内の酸素濃度が安定後、直ちに、細胞抽出液に呼吸鎖複合体の基質を添加し、細胞抽出液の酸素消費速度を測定すればよい。
【００３３】
前記基質は、呼吸鎖複合体の基質として必要となる順番に従い、添加すればよい。例えば、後述の実施例に示すとおり、まず、ピルビン酸、リンゴ酸、グルタミン酸を出来るだけ間隔を開けずに加え、酸素消費速度が安定した後に、ＡＤＰ＋Ｍｇ２+、シトクロムｃ、コハク酸を酸素消費速度が安定したら一つずつ順番に加えればよい（図１参照）。
さらに、酸素消費速度の測定を終了するために、コハク酸を添加し酸素消費速度安定後、呼吸鎖複合体の阻害剤を添加してもよい。前記阻害剤としては、例えば、ＣＮ−、ＣＯ、Ｓ２−、Ｎ３−等のシトクロムａ阻害剤、アンチマイシンＡ、ナフトキノン誘導体（シトクロムｂ−シトクロムｃ間の阻害剤）アミタール、ロテノン等の電子伝達阻害剤；２，４−ジニトロフェノール（２，４−Ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ；２，４−ＤＮＰ）、ペンタクロロフェノール（Ｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌ；ＰＣＰ）、ジクマロール、不飽和脂肪酸、グラミシジン、Ｃａ２＋、ヒ酸塩、バリノマイシン、カルボニルシアニド−ｐ−トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン（Ｃａｒｂｏｎｙｌ  ｃｙａｎｉｄｅ−ｐ−ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌｈｙｄｒａｚｏｎｅ；ＦＣＣＰ）等の脱共役剤、オリゴマイシン、アトラクチレート、ｐ−クロロメルクリベンゾエート（ｐ−ｃｈｌｏｒｏｍｅｒｃｕｒｉｂｅｎｚｏａｔｅ；ＰＣＭＢ）、トリアルキルチン等のエネルギー転移系伝達阻害剤等が挙げられる。
【００３４】
酸素消費速度の測定方法としては、例えば、後述の実施例に示すとおり、ミトコンドリア酵素活性／細胞代謝エネルギー分析装置を使用した測定方法等が挙げられるが、これに限定されない。
得られた酸素消費速度の測定結果において、虚血再灌流条件下においた細胞抽出液において、虚血再灌流障害抑制剤候補物質を添加したものにおける酸素消費速度が、虚血再灌流障害抑制剤候補物質を添加していないものにおける酸素消費速度よりも大きい場合、前記候補物質が虚血再灌流障害抑制剤として有効であると判断することができる。
さらに、虚血再灌流条件下におき、虚血再灌流障害抑制剤候補物質を添加したものにおける酸素消費速度が、虚血再灌流条件下におかない、すなわち正常な状態の細胞抽出液における酸素消費速度と等しい、又はよりも大きい場合、前記候補物質が虚血再灌流障害抑制剤として極めて有効であると判断することができる。
一方、虚血再灌流条件下においた細胞抽出液において、虚血再灌流障害抑制剤候補物質を添加したものにおける酸素消費速度が、虚血再灌流障害抑制剤候補物質を添加していないものにおける酸素消費速度と等しい、又はよりも小さい場合、前記候補物質が虚血再灌流障害抑制剤として有効ではないと判断することができる。
【００３５】
［工程４］
さらに、上記工程３の後に、以下に示す工程４を備えていてもよい。
工程４においては、上記工程１において虚血再灌流障害抑制剤候補物質を注入した場合の酸素消費速度と、上記工程２において虚血再灌流障害抑制剤候補物質を注入した場合の酸素消費速度とを比較する。これにより、虚血再灌流障害抑制剤候補物質の投与するタイミングが、虚血状態に投与することが好ましいか、それとも再灌流状態に投与することが好ましいかを判断することができる。
例えば、後述の実施例に示すとおり、水素ガスについては、工程１において注入した場合、虚血再灌流障害抑制効果を示すが、工程２において注入した場合、虚血再灌流障害抑制効果を示さない。このことから、水素ガスは、虚血状態において投与することが好ましく、例えば、臓器移植において、血流が途絶えていた組織に水素ガスを注入し、その後、血流が再開されることで、虚血再灌流障害が起こることを防ぐことができる。
【実施例】
【００３６】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３７】
［実施例１］
（１）試薬の調製
（１−１）単離バッファーの調製
以下の表１に示す最終濃度となるように各化合物を水に加えて、単離バッファー（ＢＩＯＰＳ）を調製した。常に氷上（０℃）で撹拌しながら調製した。また、単離バッファーのｐＨが７．１となるように５Ｎ  ＫＯＨを用いて調整した。使用するまで、−２０℃で保存した。
【００３８】
【表１】
2018064541.tif 000002
【００３９】
（１−２）呼吸バッファーの調製
以下の表２に示す最終濃度となるようにＫ−ｌａｃｔｏｂｉｏｎａｔｅ  ｓｔｏｃｋ及びＢＳＡ以外の各化合物を８００ｍＬの水に常に撹拌しながら加えた。
【００４０】
【表２】
2018064541.tif 000003
【００４１】
次いで、Ｋ−ｌａｃｔｏｂｉｏｎａｔｅ  ｓｔｏｃｋを１２０ｍＬ加えた。５Ｎ  ＫＯＨを用いてｐＨを約７．１となるように調整した。次いで、ゆっくり撹拌しながら、１ｇのＢＳＡを加え、さらに１Ｌとなるまで水を加えた。次いで、５Ｎ  ＫＯＨを用いてｐＨを約７．１となるように調整した。使用するまで、−２０℃で保存した。
【００４２】
（２）細胞抽出液の調製
北里大学医学部実験動物センターにおいて、ブタを安楽死後、直ちに心臓を摘出し、使用するまで、−８０℃にて冷凍保存した。なお、心臓摘出から冷凍までは、約１〜１．５時間程度要した。
次いで、ピンセット及びハサミを用いて、心臓から２２〜２６ｍｇの切片を採取し、シャーレに移した。次いで、切片が完全に浸るように（１）で調製した単離バッファーを加え、氷上にて３０分間静置した。次いで、シュレッダーチューブ（予め−２０℃で保存）のキャップ側を、キャップツールを用いて閉め、氷上にて３０分間静置した切片をラムサイドから切片をチューブ内に移動させた。次いで、（１）で調製した呼吸バッファーを加え、キャップツールを用いてラムサイドも閉じた。
次いで、シュレッダーベース（予め−２０℃で保存）にチューブを固定させ、ＳＧ３  Ｄｒｉｖｅｒを所定の位置にセッティングしＰｏｓｉｔｉｏｎ １で１０秒間、Ｐｏｓｉｔｉｏｎ  ２で１０秒間ホモジネートした。また、この時間はストップウォッチを用いて正確に測定した。
次いで、ラムサイドを開けて、１５ｍＬ遠沈管に懸濁液を移動させた。さらに、（１）で調製した呼吸バッファー１ｍＬを用いて、チューブ内をリンスして、同様にして遠沈管に移動させた。得られた細胞抽出液は使用するまで、氷冷した。
【００４３】
（３）嫌気状態でのインキュベーション
次いで、（２）で得られた細胞抽出液１．５ｍＬを、ガス置換しない環境下（以下、「Ｃｏｎｔｒｏｌ群」と称する場合がある。）、又は窒素ガスのみ（以下、「ａｎｏｘｉａ群」と称する場合がある。）、若しくは窒素ガス＋１．３％Ｈ２ガス（以下、「Ｈ２群」と称する場合がある。）雰囲気下で５０分間インキュベートした。
【００４４】
（４）酸素消費速度の測定
（４−１）基質及び阻害剤の調製
以下の表３に示す最終濃度となるように基質及び阻害剤を調製した。
【００４５】
【表３】
2018064541.tif 000004
【００４６】
上記の基質及び阻害剤の作用は以下のとおりである。
Ｐｙｒｕｖｉｃ  ａｃｉｄ（Ｐ）：解糖系において解糖系中間代謝物より生成される。その後ミトコンドリアのマトリックスに入りアセチルＣｏＡとなる。Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｉの中間体として作用する。
Ｍａｌｉｃ  ａｃｉｄ（Ｍ）：リンゴ酸。クエン酸回路の中間物質である。
Ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ（Ｇ）：クエン酸回路の中間物質として作用する。リンゴ酸と共にＣｏｍｐｌｅｘ  Ｉに関係した基質でもある。
ＡＤＰ＋Ｍｇ２＋（Ｄ）：ＡＴＰの前駆物質で酸化的リン酸化における中心代謝物である。ＡＤＰが加えられることで酸化的リン酸化の活動段階は上がるように誘発される。また、細胞内においてＡＴＰ分解酵素や他の酵素系はＭｇ２+（ｆｒｅｅ  Ｍｇ）濃度に依存的に働く。生理的なＭｇ２+濃度は１−３ｍＭである。
Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃ（ｃ）：電子伝達系の構成要素の一つで、Ｃｏｍｐｌｅｘ  ＩＩＩからＩＶへ電子を運ぶ。また、細胞質への放出はアポトーシスと関係がある。
Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ（Ｓ）：ＴＣＡサイクル（クエン酸回路）において生成され、Ｃｏｍｐｌｅｘ  ＩＩの基質である。Ｃｏｍｐｌｅｘ  ＩＩの活性剤として作用する。
Ｒｏｔｅｎｏｎｅ（Ｒｏｔ）：Ｃｏｍｐｌｅｘ  ＩにおけるＮＡＤＨの酸化を阻害する。Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｉの阻害剤として作用する。
Ａｎｔｉｍｙｃｉｎ  Ａ（Ａｍａ）：Ｃｏｍｐｌｅｘ  ＩＩＩにおける電子の移動を阻害することで、ミトコンドリア内の電子の流れが止まる。Ｃｏｍｐｌｅｘ  ＩＩＩの阻害剤として作用する。
【００４７】
（４−２）ミトコンドリア呼吸測定
次いで、インキュベート後の各サンプルをＯＲＯＢＯＲＯＳ  Ｏｘｙｇｒａｐｈ−２ｋ（ミトコンドリア酵素活性／細胞代謝エネルギー分析装置）を用いて、ミトコンドリア酸素消費速度測定を行なった。この装置は高分解能呼吸測定装置であり、専用の分析ソフト（ＤａｔＬａｂ４）を用いることでミトコンドリア呼吸の酸素濃度及び酸素消費速度をオンラインで測定した。
ａｎｏｘｉａ群及びＨ２群では、蓋を閉めて定常待ちを行った後、操作を開始した。
Ｃｏｎｔｒｏｌ群では、呼吸バッファーをチャンバに２．０ｍＬ入れ、キャップをしてスターラを回転させ、続けてミトコンドリア懸濁液をよく撹拌してから０．５ｍＬ加えた。測定する酸素消費速度の基線が安定するまで定常待ちを行った後、操作を開始した。
いずれの群も酸素濃度、酸素消費速度が安定したら、ピルビン酸、リンゴ酸、グルタミン酸を出来るだけ間隔を開けずに加え、その後ＡＤＰ＋Ｍｇ２+、シトクロムｃ、コハク酸、ロテノンを酸素消費速度が安定したら一つずつ順番に加えていき、最後にアンチマイシンＡを加えて定常待ちを行い酸素消費速度の測定を終了した。
図１は、ミトコンドリア酸素消費速度測定の流れを示すグラフである。図１において、「Ｂａｓｅｌｉｎｅ」とはピルビン酸、リンゴ酸、グルタミン酸添加前の定常状態である測定地点を示し、「ＣＩ」とはＡＤＰ＋Ｍｇ２＋添加後の測定地点を示し、「ＣＩ’」とはシトクロムｃ添加後の測定地点を示し、「ＣＩ’＋ＩＩ」とはコハク酸添加後の測定地点を示し、「ＣＩＩ」とはロテノン添加後の測定地点を示し、「ＲＯＸ」とはアンチマイシンＡ添加後の測定地点を示す。また、図１において、実線は酸素消費速度を示し、点線は酸素濃度を示す。
各群の上記各測定地点での酸素消費速度を図２に示す。図１において、「ｃｏｎｔｒｏｌ」は、何もガスを添加していない条件下でインキュベートしたサンプルを示し、「ａｎｏｘｉａ」とは、窒素（Ｎ２）ガスのみ雰囲気下でインキュベートしたサンプルを示し、「Ｈ２」とは、窒素ガス＋１．３％Ｈ２ガス雰囲気下でインキュベートしたサンプルを示す。
【００４８】
図２から、ＣＩ’＋ＩＩにおいて、ｃｏｎｔｒｏｌ群では約１７５ｐｍｏｌ／（ｓ  ｍＬ）であるのに対し、ａｎｏｘｉａ群では約５０ｐｍｏｌ／（ｓ  ｍＬ）と酸素消費速度が著しく低下しており、虚血状態に似せた嫌気状態が再現されていることが確かめられた。
さらに、ＣＩ’＋ＩＩにおいて、ａｎｏｘｉａ群では約５０ｐｍｏｌ／（ｓ  ｍＬ）であるのに対し、Ｈ２群では約１００ｐｍｏｌ／（ｓ  ｍＬ）と酸素消費速度が顕著に増加していた。
このことから、Ｈ２を虚血状態において添加することで、ミトコンドリアにおける呼吸鎖複合体ＩＩの機能低下が抑制されたと推察された。
【００４９】
［実施例２］
（１）試薬の調製
実施例１の（１）と同様の方法を用いて、試薬を調製した。
【００５０】
（２）細胞抽出液の調製
実施例１の（２）と同様の方法を用いて、細胞抽出液を調製した。
【００５１】
（３）嫌気状態でのインキュベーション
次いで、（２）で得られた細胞抽出液１．５ｍＬを、窒素（Ｎ２）ガス雰囲気下で５０分間インキュベートした。
【００５２】
（４）酸素消費速度の測定
（４−１）基質及び阻害剤の調製
実施例１の（４−１）と同様の方法を用いて、基質及び阻害剤を調製した。
【００５３】
（４−２）ミトコンドリア呼吸測定
次いで、インキュベート後のサンプルについて、２１％酸素ガス（以下、「ａｎｏｘｉａ」群と称する場合がある。）、又は２１％酸素ガス＋１．３％Ｈ２（以下、「Ｈ２群」と称する場合がある。）雰囲気下で、ＯＲＯＢＯＲＯＳ  Ｏｘｙｇｒａｐｈ−２ｋを用いて、ミトコンドリア酸素消費速度測定を行なった。測定の流れは実施例１の（４−２）と同様である。結果を図３に示す。図３において、「ａｎｏｘｉａ」とは、窒素（Ｎ２）ガス雰囲気下でインキュベート後、２１％酸素ガスした雰囲気下で測定を行ったサンプルを示し、「Ｈ２」とは、窒素（Ｎ２）ガス雰囲気下でインキュベート後、２１％酸素ガス＋１．３％Ｈ２雰囲気下で測定を行ったサンプルを示す。
また、図３において、「Ｂａｓｅｌｉｎｅ」とはピルビン酸、リンゴ酸、グルタミン酸添加前の定常状態である測定地点を示し、「ＣＩ」とはＡＤＰ＋Ｍｇ２+添加後の測定地点を示し、「ＣＩ’」とはシトクロムｃ添加後の測定地点を示し、「ＣＩ’＋ＩＩ」とはコハク酸添加後の測定地点を示し、「ＣＩＩ」とはロテノン添加後の測定地点を示し、「ＲＯＸ」とはアンチマイシンＡ添加後の測定地点を示す。
【００５４】
図３から、Ｈ２群及びａｎｏｘｉａ群では、いずれの測定地点においても１００ｐｍｏｌ／（ｓ  ｍＬ）を超えることなく、酸素消費速度が低かった。
このことから、虚血状態後の再灌流状態においてＨ２を添加しても、ミトコンドリアにおける呼吸鎖複合体の機能を回復することはできないと推察された。
【００５５】
［比較例１］
虚血再灌流障害抑制剤の評価系を構築するために、Ｎ２ガスを用いる代わりに、亜硫酸ナトリウムを用いた嫌気状態及び再灌流状態の構築を検討した。
【００５６】
（１）試薬の調製
実施例１の（１）と同様の方法を用いて、試薬を調製した。
【００５７】
（２）細胞抽出液の調製
実施例１の（２）と同様の方法を用いて、細胞抽出液を調製した。
【００５８】
（３）嫌気状態でのインキュベーション
次いで、（２）で得られた細胞抽出液を、亜硫酸ナトリウムの濃度及び含有量をふって（１．２６g／ｍＬの亜硫酸ナトリウムを２５μＬ、０．３１５g／ｍＬの亜硫酸ナトリウムを５０μＬ、０．３１５g／ｍLの亜硫酸ナトリウムを４０μＬ、及び０．３１５g／ｍLの亜硫酸ナトリウムを２５μＬ）、チャンバ閉鎖状態及び開放状態（酸素再添加状態）でのチャンバ内の酸素濃度の変化を、ＯＲＯＢＯＲＯＳ  Ｏｘｙｇｒａｐｈ−２ｋを用いて測定した。結果を図４（Ａ）〜（Ｄ）に示す。
【００５９】
図４（Ａ）から、亜硫酸ナトリウムの濃度が１．２６ｇ／ｍＬでは、閉鎖状態において１０分で酸素濃度が０になったが、開放状態（酸素再添加状態）において酸素濃度の増加が少なく、さらに閉鎖状態にすると、酸素濃度が低下した。
一方、図４（Ｂ）及び（Ｃ）から、亜硫酸ナトリウムの濃度を０．３１５g／ｍＬとして、含有量が５０μＬ、及び４０μＬでは、閉鎖状態において酸素濃度が０になるために、３〜４時間と時間がかかり、開放状態（酸素再添加状態）において酸素濃度が著しく増加したが、さらに閉鎖状態にすると、酸素濃度が低下した。
また、図４（Ｄ）から、亜硫酸ナトリウムの濃度を０．３１５g／ｍＬとして、含有量が２５μＬでは、開放状態（酸素再添加状態）において酸素濃度が著しく増加し、さらに閉鎖状態にしても酸素濃度の低下が見られなかったが、閉鎖状態において酸素濃度が０になるために、１０時間と時間がかかった。
【００６０】
以上のことから、本実施形態の虚血再灌流障害抑制剤の評価方法では、短時間で簡便に疑似的な虚血状態を構築できることが確かめられた。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明によれば、普遍的且つ簡易な虚血再灌流障害抑制剤の評価方法を提供することができる。また、前記虚血再灌流障害抑制剤の評価方法を用いて、多くの虚血再灌流障害抑制剤候補物質から虚血再灌流障害に対する有効な治療薬を簡便にスクリーニングすることができる。
【図１】
2018064541.tif 000005
【図２】
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【図３】
2018064541.tif 000007
【図４】
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