(57)【要約】【課題】多層構造をなす細胞の培養が可能な灌流培養装置を提供すること。【解決手段】培養液である培地が通過できる状態で細胞を播種するシート状の担体である膜１１５と、膜１１５の表裏両面に培地が接する状態で膜１１５を保持する容器１０Ａと、膜１１５の表裏両面のうちの少なくとも一方の面に接する側の培地に外部から圧力を作用することで他方の面に接する側の培地との間に圧力差を形成する気室１１９と、を備える灌流培養装置１では、圧力差に応じて培地が膜１１５を通過する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養液である培地が通過できるシート状の担体に細胞を保持すると共に、該シート状の担体の表裏両面のうちの少なくともいずれかの面に培地が接する状態で当該担体を保持し、
前記シート状の担体の表裏両面のうちの少なくとも一方の面の側に外部から圧力を作用することで当該シート状の担体の両側に圧力差を設け、この圧力差により培地が前記シート状の担体を通過することを特徴とする灌流培養方法。
【請求項２】
請求項１において、前記外部から作用する圧力の大きさを周期的に変化させることで前記圧力差を周期的に変動させる灌流培養方法。
【請求項３】
請求項１又は２において、前記シート状の担体の表裏両面に異なる成分の培地が接していると共に、前記シート状の担体を貫く方向における圧力の勾配の向きを交互に切り換える灌流培養方法。
【請求項４】
培養液である培地が通過できる状態で細胞を保持するシート状の担体と、
表裏両面のうちの少なくともいずれかの面に培地が接する状態で当該シート状の担体を保持する容器と、
前記シート状の担体の表裏両面のうちの少なくとも一方の面の側に外部から圧力を作用することで当該シート状の担体の両側に圧力差を形成する圧力手段と、を備え、当該圧力差に応じて培地が前記シート状の担体を通過するように構成されている灌流培養装置。
【請求項５】
請求項４において、前記容器は、前記シート状の担体が外周面の少なくとも一部をなす培養容器と、該培養容器を収容可能な収納容器と、を含み、前記圧力手段は、前記収納容器及び前記培養容器のうちの少なくともいずれかの容器の内側に外部から圧力を作用することで前記圧力差を形成するように構成されていることを特徴とする灌流培養装置。
【請求項６】
請求項５において、前記培養容器及び前記収納容器のうちの少なくともいずれか一方の容器には、貯える培地の液面高さを検出する液面高さ検出手段が設けられていることを特徴とする灌流培養装置。
【請求項７】
請求項４〜６のいずれか１項において、前記圧力手段は、ガスを充填可能であって、充填されたガスの圧力を培地に作用するように構成された気室を含む手段であることを特徴とする灌流培養装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞及び生体組織の培養などを含む細胞培養に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞などの実用化に向けた研究が推進されている。この研究の目的のひとつは、細胞を培養し、その培養物を人に移植する再生医療の実現にある。このような再生医療の成否を分けるポイントは、細胞等の培養の確実性や精度にある。培養液である培地を満たした培養容器に細胞を播種して行われる培養中では、培地を適切に交換することで培養の精度を向上できる。
【０００３】
例えば下記の特許文献１では、培養容器内の培地を自動的に入れ替える培養装置が提案されている。この培養装置は、気密構造の培養容器の培地をポンプで排出しつつ新鮮な培地を供給することで培地の入れ替えを可能としている。この培養装置によれば、培養容器内の培地を自動的に入れ替えでき、培地交換の作業負担を軽減できる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００８−８６２６４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、前記従来の培養装置では、次のような問題がある。すなわち、細胞が底面に貼り付いて播種された培養容器を採用しているため、細胞の表面側には比較的十分に培地を供給できる一方、培地交換が適切であっても細胞の内側に培地を十分に供給できないおそれがあり、それ故、細胞が多層構造をなすような組織の培養には適さないという問題がある。
【０００６】
本発明は、前記従来の問題点に鑑みてなされたものであり、多層構造をなす細胞の培養が可能な灌流培養装置及び灌流培養方法を提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一態様は、培養液である培地が通過できるシート状の担体に細胞を保持すると共に、該シート状の担体の表裏両面のうちの少なくともいずれかの面に培地が接する状態で当該担体を保持し、
前記シート状の担体の表裏両面のうちの少なくとも一方の面の側に外部から圧力を作用することで当該シート状の担体の両側に圧力差を設け、この圧力差により培地が前記シート状の担体を通過することを特徴とする灌流培養方法にある（請求項１）。
【０００８】
本発明の一態様は、培養液である培地が通過できる状態で細胞を保持するシート状の担体と、
表裏両面のうちの少なくともいずれかの面に培地が接する状態で当該シート状の担体を保持する容器と、
前記シート状の担体の表裏両面のうちの少なくとも一方の面の側に外部から圧力を作用することで当該シート状の担体の両側に圧力差を形成する圧力手段と、を備え、当該圧力差に応じて培地が前記シート状の担体を通過するように構成されている灌流培養装置にある（請求項４）。
【発明の効果】
【０００９】
本発明に係る灌流培養方法、及び灌流培養装置では、前記シート状の担体の両側に圧力差を設け、この圧力差に応じて培地が前記シート状の担体を通過する。この灌流培養方法等では、前記シート状の担体に保持された細胞を透過する方向に培地を供給できる。それ故、例えば多層構造の細胞を培養する場合には、下層や中間層の細胞に対して確実性高く培地を供給できる。
【００１０】
このように本発明に係る灌流培養方法、及び灌流培養装置は、多層構造をなす細胞の培養が可能な優れた特性の培養装置である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】灌流培養装置を示す斜視図。
【図２】灌流培養方法を説明する図。
【図３】灌流培養装置の電気的な構成を示すブロック図。
【図４】他の灌流培養装置の構成の一部を示す説明図。
【図５】他の灌流培養装置の構成の一部を示す説明図。
【図６】他の灌流培養装置の構成の一部を示す説明図。
【図７】培養容器の培地とウェルの培地との水頭差を説明する図。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明において、前記シート状の担体に細胞を保持することの意味には、当該シート状の担体が直接、細胞を保持する態様のほか、コラーゲンや寒天など細胞を直接、保持する足場材を前記シート状の担体が保持することにより足場材など他の部材を介在して前記シート状の担体が間接的に細胞を保持する態様も含まれる。
【００１３】
前記シート状の担体の表裏両面のうちの少なくとも一方の面の側に外部から圧力を作用する方法としては、当該一方の面に接している培地に対して外部から圧力を作用する方法や、当該一方の面に接しているガスの圧力により外部から圧力を作用する方法等がある。
【００１４】
本発明において、前記シート状の担体の表裏両面のうちのいずれかの一の面のみに培地が接することも良く、表裏両面に培地が接することも良い。いずれか一の面のみに培地が接する場合には、この一の面に接する培地に外部から圧力を作用すると良い。例えば細胞を保持するコラーゲンや寒天などの足場材を利用し、前記シート状の担体がこの足場材を保持する構成を採用する場合には、前記シート状の担体の表裏両面のうちのいずれかの一の面のみに培地が接する構成を採用できる。この構成を採用する場合の培養では、前記シート状の担体の培地が接していない側の面から培地が滴下する態様となる。さらに、前記シート状の担体の表裏両面のうちのいずれかの一の面のみに培地が接する構成を採用した場合、例えば、培地が接していない他の面の側に負圧を作用することで前記圧力差を形成することも良い。
【００１５】
本発明に係る灌流培養方法では、前記外部から作用する圧力の大きさを周期的に変化させることで前記圧力差を周期的に変動させることも良い（請求項２）。例えば心臓の鼓動に近い周期で前記圧力差を変動させれば、より生体に近づけた環境下の培養が可能になる。
【００１６】
前記シート状の担体の表裏両面に異なる成分の培地が接していると共に、、前記シート状の担体を貫く方向における圧力の勾配の向きを交互に切り換えることも良い（請求項３）。この方法は、例えば一方の側が血液に面し、他方の側が尿に面する腎臓などの細胞や組織の培養に好適である。例えば細胞が増殖・分化する際に協力して働くフィーダー細胞をいずれか一方の培地に含めることも良い。この場合には、前記シート状の担体の両側で特性の異なる細胞を効率良く培養できる。
【００１７】
本発明に係る灌流培養装置における容器は、前記シート状の担体が外周面の少なくとも一部をなす培養容器と、該培養容器を収容可能な収納容器と、を含み、前記圧力手段は、前記収納容器及び前記培養容器のうちの少なくともいずれかの容器の内側に外部から圧力を作用することで前記圧力差を形成することも良い（請求項５）。この場合には、培養容器を収納容器が収容するという比較的シンプルな構成により、前記シート状の担体を通過する培地により細胞を培養する灌流培養装置を構成できる。
【００１８】
前記培養容器及び前記収納容器のうちの少なくともいずれか一方の容器には、貯える培地の液面高さを検出する液面高さ検出手段が設けられていることも良い（請求項６）。この場合には、容器が貯える培地の液面高さの管理が容易となる。液面高さ検出手段としては、液面高さが所定高さに到達しているか否かを検出する手段であっても良く、液面までの距離を計測することで液面高さを検出する手段であっても良い。
【００１９】
前記シート状の担体の表裏両面に培地が接しており、
前記培養容器が貯える培地の液面高さと、前記収納容器が貯える培地の液面高さと、の違いである水頭差を制御するための手段を備えることも良い。この水頭差を制御すれば、水頭差に由来して前記シート状の担体に作用する液圧の成分を制御できるようになる。例えばこの水頭差をゼロにすれば、水頭差に由来して前記シート状の担体に作用する液圧の成分をゼロに近くできる。そして、この場合には、前記シート状の担体に作用する液圧の１００％近くが、培地に外部から作用する圧力に由来するものとなり、前記シート状の担体に作用する液圧の調整等が容易になる。
【００２０】
前記収納容器及び前記培養容器のうちの一方の培地に外部から圧力を作用する一方、他方の培地に正の水頭差を設定することも良い。この場合には、前記圧力差が正値のとき、当該一方の培地側から前記他方の培地に向かう液圧を前記シート状の担体に作用できる。前記圧力差がゼロであるときには、前記水頭差に応じて、前記他方の培地側から前記一方の培地に向かう液圧を前記シート状の担体に作用できる。このように前記水頭差を設ければ、前記圧力差の正負を反転させなくても、前記シート状の担体に作用する液圧の向きを反転できる。
【００２１】
前記圧力手段は、ガスを充填可能であって、充填されたガスの圧力を培地に作用するように構成された気室を含む手段であっても良い（請求項７）。気体を介して圧力を作用する場合には、培地に対して均等に近く圧力を作用できる。培地に作用する圧力が均等に近ければ、培地に急激な流れが発生する状況を未然に回避でき、細胞を過度に刺激するおそれを抑制できる。細胞に対する過度な刺激を抑制すれば、培養の確実性や精度を向上できる。なお、前記気室は、気密構造の気室であっても良く、流入口と流出口とを有すると共にガスが流れる際の圧力損失によって前記圧力を発生させる気室であっても良い。
【実施例】
【００２２】
本発明の実施の形態につき、以下の実施例を用いて具体的に説明する。
（実施例１）
本例は、培養対象の細胞を透過する方向に培地の流れを発生できる灌流培養装置１、及びこの灌流培養装置１による細胞の培養方法に関する例である。この内容について、図１〜図７を用いて説明する。
【００２３】
灌流培養装置１は、図１に示すように、培養容器１１を収容する６箇所のウェル（収納容器）１０、新鮮な培地（培養液）を貯えるプール２１１、使用済みの培地を回収するプール２１３、培地に外部から圧力を作用するためのガスを貯えるボンベ２４、等がコンパクトにセットされた一体型の装置である。
【００２４】
この灌流培養装置１には、プール２１１の培地を培養容器１１に供給するポンプ２２１や、ウェル１０の培地をプール２１３に回収するポンプ２２３や、ボンベ２４のガスを制御するバルブ２５１〜２５３（図２）やレギュレータ２５０（図２）等が装備され、さらに、全体動作を制御する制御ユニット１００（図３）が組み込まれている。
【００２５】
灌流培養装置１は、予め組み込まれた動作プログラム等による単体での動作が可能である。例えば、灌流培養装置１は、温度、湿度、炭酸ガス濃度などが管理された図示しないインキュベータ内に収めた状態で使用でき、細胞の培養を実施できる。
【００２６】
灌流培養装置１は、ウェル１０やプール２１をなす凹みやボンベ２４の収容スペース等を設けたケース１４に対して、トッププレート１３を組み合わせた装置である。トッププレート１３は、ポンプ２２の上部を貫通配置するための孔を有しているほか、ウェル１０やプール２１等を密閉するための気密パッキン１３０、１３１、１３５を備えている。また、トッププレート１３には、ウェル１０とポンプ２２とを結ぶ図示しない配管、ポンプ２２とプール２１とを結ぶ図示しない配管、ボンベ２４からウェル１０に至る図示しない配管等が敷設あるいは形成されている。
【００２７】
ケース１４に対してトッププレート１３をネジ締め等により取り付けると、ウェル１０、培養容器１１、プール２１等を気密パッキン１３０、１３１、１３５で密閉できる。さらに、ケース１４に対してトッププレート１３を組み合わせることで、ケース１４側の配管とトッププレート１３側の配管とを接続でき、これにより灌流培養装置１の動作に必要な培地やガスの経路（図２中の符号１８、１７。）を確保できる。なお、例えば天板プレートと中間プレートとの２枚重ね構造のトッププレート１３を採用することも良い。例えば配管を形成する溝が表面に穿設された中間プレートに対して天板プレートを積層することで、溝を利用して培地やガスの配管等の経路を形成できる。
【００２８】
ウェル１０は、図１及び図２のごとく、カップ状の培養容器１１を収容する外側容器である。ウェル１０は、培養容器１１の下側に間隙を設けた状態で培養容器１１を固定可能である。トッププレート１３をケース１４に組み合わせた際、気密パッキン１３０、１３１により培養容器１１及びウェル１０のそれぞれを同時に密閉できるよう、それぞれの開口部が同じ高さになるように高さ方向の寸法等が設定されている。
【００２９】
培養容器１１は、細胞を播種（保持）するシート状の担体の一例をなす多孔質の膜１１５を底面に設けたカップ形状の容器である。膜１１５は、例えば、直径約０．３〜０．５μｍの微細孔を多数有するメンプレンフィルターなどから形成されている。細胞は、膜１１５の目詰まりを防止できるよう、ゲルと混合された細胞懸濁液の層１１７として膜１１５に播種されて保持される。なお、膜１１５は、孔径１〜１０μｍ、あるいはこれよりも大きい１００μｍ程度の穴を多数設けて穴自体が流路抵抗にならないように設計することも良い。この場合には、細胞を播種するための足場材としてコラーゲンや寒天などを採用し、これらの足場材が穴の内部に入り込むようにすると良い。
【００３０】
培養容器１１は、図１及び図２のごとく、培地を貯える状態で、同様に培地を貯えるウェル１０に収容される。本例の灌流培養装置１では、培養容器１１とウェル１０との組合せにより、細胞を播種する膜１１５の表裏両面に培地が接する状態で膜１１５を保持する容器１０Ａが構成されている。この容器１０Ａでは、培養容器１１の培地は底面の膜１１５を通過してウェル１０に流入する。培養容器１１の底面をなす膜１１５は、ウェル１０の底面に対して間隙を空けて位置し、これにより、膜１１５を通過した培地の流路が確保されている。
【００３１】
ウェル１０及び培養容器１１には、図２のごとく、液面高さを光学的に検知する液面センサ（液面高さ検出手段）１５１、１５２が設けられている。液面センサ１５１、１５２は、受光位置に応じた強度の電気信号を出力する１次元のＰＳＤ（Position Sensitive Detector）素子と、赤外光を発光する発光ダイオードと、を組み合わせた測距センサである。発光ダイオードは、ＰＳＤ素子の上記の１次元の方向にずらして配置されている。この液面センサ１５１、１５２によれば、発光ダイオードが発光したときのＰＳＤ素子が出力する電気信号の強度等に応じて培地の液面高さを計測できる。
【００３２】
培養容器１１では、液面センサ１５２による計測値を利用して培地の液面高さが規定の高さに制御され、これにより培地とトッププレート１３との間に気室１１９が形成されている。この気室１１９には、充填するガスの圧力を計測する圧力センサ１５３、ガス中の酸素濃度を計測するＯ２センサ１５４など、制御に利用される各種のセンサが設けられている。なお、気室１１９と同様にウェル１０内には気室１１８が形成され、この気室１１８には、図示しない経路により滅菌済みの大気圧の空気が導入される。
【００３３】
灌流培養装置１では、図２のごとく、プール２１１の新鮮な培地を培養容器１１に供給しウェル１０を経由して使用済みの培地をプール２１３に回収する培地の経路１８と、ボンベ２４から培養容器１１（気室１１９）を経由して大気に開放されるガス（気体）の経路１７と、が形成されている。
【００３４】
培地の経路１８は、膜１１５に播種された細胞に対して新鮮な培地を灌流するための経路である。ガスの経路１７は、培養容器１１の培地に圧力を作用するためのガスを気室１１９に充填する経路である。
【００３５】
培地の経路１８は、プール２１１の新鮮な培地を培養容器１１に供給する供給経路１８１と、ウェル１０内の使用済みの培地をプール２１３に回収する回収経路１８３と、を含めて形成されている。供給経路１８１には、プール２１１の培地を吸い上げる供給用のポンプ２２１が介設されている。回収経路１８３には、ウェル１０内の培地を吸い上げる回収用のポンプ２２３が介設されている。なお、各ウェル１０及び各培養容器１１には、それぞれ独立した経路によって培地が供給あるいは回収され、液面高さ等の個別調整が可能となっている。
【００３６】
ガスの経路１７は、ガスが充填されたボンベ２４を起点として培養容器１１内の気室１１９に至る送気経路１７１と、気室１１９から大気開放に至る排気経路１７３と、により形成されている。ボンベ２４としては、酸素ボンベ２４１、二酸化炭素ボンベ２４２、窒素ボンベ２４３が備えられ、混合されたガスが気室１１９に供給される。なお、各気室１１９には、それぞれ独立した経路によって培地が供給あるいは回収され、圧力の個別調整が可能となっている。
【００３７】
送気経路１７１の途中には、ボンベ２４１〜２４３毎に設けられたバルブ２５１〜２５３、各ボンベ２４１〜２４３のガスを混合した高圧のガスを気室１１９に減圧して供給するためのレギュレータ２５０、図示しないエアフローメータなど、が設けられている。各ボンベ２４１〜２４３のガスは、バルブ２５１〜２５３の制御により所定割合で混合されて混合ガスとなり、レギュレータ２５０で減圧されて気室１１９に充填される。なお、混合ガスのうち、酸素と二酸化炭素は細胞の生存に必要な成分である。また、二酸化炭素は、培地の酸化を抑制する効果を有し、その濃度は通常５％が適切である。
【００３８】
本例では、レギュレータ２５０として、減圧する圧力を外部からの制御により調節可能なレギュレータを採用している。各ボンベ２４１〜２４３の混合ガスは、このレギュレータ２５０により所望の圧力に減圧されて気室１１９に供給される。なお、気室１１９に供給するガスの圧力を適宜変更できるよう、レギュレータ２５０に代えて、あるいは加えて圧縮ポンプを配置することも良い。
【００３９】
排気経路１７３には、培養容器１１の気室１１９内のガスを大気開放するか否かを切り換える開放バルブ２５８が設けられている。開放バルブ２５８は、気室１１９内のガスを入れ替える際や、気室１１９の内圧を調整する際などに適宜、開状態に制御される。ガスの入れ替え時には、開状態に開放バルブを切り換える一方、圧力の調整の際は、例えば開状態と閉状態とを周期的に繰り返すデューティー制御を開放バルブ２５８に適用することも良い。デューティー制御によれば、１周期中の開状態の占有割合を変更することで開放バルブ２５８のバルブ開度を変更して圧力損失の大きさを調整でき、これにより、気室１１９の内圧の制御等が可能になる。このように本例の灌流培養装置１では、気室１１９や、気室１１９にガスを供給するボンベ２４等により、培地に外部から圧力を作用する圧力手段が形成されている。
【００４０】
灌流培養装置１は、図３のごとく、制御ユニット１００を中心として電気的に構成されている。制御ユニット１００には、装置の動作状態を把握するための各種のセンサが接続されていると共に、制御対象であるポンプやバルブ等が接続されている。センサとしては、上記の液面センサ１５１、１５２のほか、気室１１９の圧力を計測する圧力センサ１５３、気室１１９の酸素濃度を計測するＯ２センサ１５４などがある。ポンプとしては、培地の経路１８に介設された上記の供給用のポンプ２２１や回収用のポンプ２２３、ガスの経路１７に介設された上記のレギュレータ２５０等がある。バルブとしては、ガスの経路１７に介設された上記のバルブ２５１〜２５３や、上記の開放バルブ２５８などがある。
【００４１】
次に、上記のように構成された灌流培養装置１を利用した細胞の培養方法について、（１）準備作業、（２）運転、に分けて説明する。
（１）準備作業
細胞の培養を行うに当っては、まず、各ウェル１０の培養容器１１の底面をなす膜１１５に、培養する細胞を播種する。このとき、培養する細胞は懸濁液とし、さらにゲルと混合して培養容器１１の底面をなす膜１１５に播種すると良い。このように細胞の懸濁液をゲルと混合すれば、膜１１５の目詰まりを未然に防止できる。
【００４２】
各ウェル１０及び各培養容器１１に新鮮な培地を充填すると共に、供給用のプール２１１に入替用の新鮮な培地を充填した後、トッププレート１３をケース１４に取り付ける。トッププレート１３を取り付ければ、上記の通り、プール２１、ウェル１０、培養容器１１等を密閉できると共に、トッププレート１３側の配管等とケース１４側の配管等とを接続でき、培地の経路１８及びガスの経路１７を確保できる。
【００４３】
以上のような準備作業を済ませた灌流培養装置１は、温度、湿度、炭酸ガス濃度などが管理された図示しないインキュベータに収容すると良い。インキュベータ内の安定した環境下であれば、細胞の培養を確実性高く高精度に実行できる。
【００４４】
（２）運転
灌流培養装置１に電源を投入し、図示しない起動ボタン等により動作を開始させる。動作開始に応じて制御ユニット１００は、まず、培養容器１１の気室１１９を大気開放するために開放バルブ２５８を開状態に切り換えると共に、送気経路１７１のバルブ２５１〜２５３等を制御して培養容器１１の気室１１９にガスを供給する。
【００４５】
排気経路１７３の開放バルブ２５８を開いた状態でガスを供給すれば、気室１１９内の空気を押し出してガスを充填できる。なお、制御ユニット１００は、３つのバルブ２５１〜２５３の開度をそれぞれ制御することで所定の成分割合の混合ガスを生成し、レギュレータ２５０によりこの混合ガスを所定圧に減圧して気室１１９に供給する。
【００４６】
制御ユニット１００は、気室１１９内の空気の押し出しに必要な量のガスを供給した後、開放バルブ２５８を圧力制御モードに切り換え、培養容器１１内のガスの圧力が規定圧になるように開放バルブ２５８を制御する。なお、細胞の培養中では、時間当たり所定量のガスが気室１１９に供給されるようにバルブ２５１〜２５３やレギュレータ２５０が制御されると共に、培養容器１１のガスの圧力が規定圧になるようにレギュレータ２５０や開放バルブ２５８等が制御される。ガスの圧力は、培養容器１１に貯えられた培地の液面に作用して加圧し、細胞を播種した膜１１５に液圧を作用する。なお、本例では、気室１１９内のガスの規定圧を５ｋＰａとしている。
【００４７】
制御ユニット１００は、培養中において、例えば４８時間等、予め設定された所定時間毎に供給用のポンプ２２１及び回収用のポンプ２２３を動作させて一定量の培地の入れ替えを実行する。培地の入れ替えでは、供給用のポンプ２２１の作動により新鮮な培地が培養容器１１に供給されると共に、回収用のポンプ２２３の作動によりほぼ等しい量の使用済みの培地がウェル１０からプール２１３に回収される。このように灌流培養装置１では、使用済みの古い培地を新鮮な培地に入れ替えながら確実性高く細胞を培養できる。なお、所定時間毎の培地の入れ替えに代えて、細胞に刺激を与えない程度の低流量で連続的に培地の入れ替えを行うことも良い。
【００４８】
制御ユニット１００は、培養容器１１の培地の液面高さが規定高さとなるように供給用のポンプ２２１を駆動すると共に、ウェル１０の培地の液面高さが培養容器１１と同じになるように回収用のポンプ２２３を駆動する。このように培養容器１１とウェル１０とで液面高さを同じにすれば、培地の水頭差を解消できる。水頭差を解消すれば、膜１１５に作用する培地の液圧のうち、気室１１９のガスの圧力に由来する成分をゼロに近づけることができ液圧の管理が容易となる。
【００４９】
以上のように、本例の灌流培養装置１の運転により細胞を培養すれば、膜１１５に播種された細胞に対して培地を適切に供給でき、培養を精度高く実施できる。
この灌流培養装置１では、培養容器１１の培地をガスで加圧することにより、培養容器１１の底面の膜１１５に播種された細胞に対して培地の液圧を作用できる。このように膜１１５を貫通する方向に培地の液圧を作用すれば、膜１１５に播種された細胞を透過する培地の流れを形成できる。例えば多層階層の細胞の中間層あるいは下層の細胞に対しても確実性高く培地を供給できるようになり、内側層の細胞の壊死などを回避できる。
【００５０】
このように本例の灌流培養装置１及び灌流培養方法は、細胞が多層構造をなす組織の培養に好適な装置あるいは培養方法である。
例えばシャーレ等の容器の底面に細胞を静置して培養する従来の一般的な培養方法において、培地の上清のみ継続的に交換するだけの灌流培養方式では、組織や細胞塊の深部まで培地を充分に供給できない可能性が高い。それ故、この培養方法では、細胞を維持できる期間を十分に確保できない可能性が高い。また、細胞は底面に沿って広がる性質があるため、この培養方法では、細胞を透過する方向に培地の流れを発生させることが難しく、細胞が多層構造をなす組織の培養等には不向きである。
【００５１】
一方、本例の灌流培養装置１による培養方法では、底面に穴の空いた「ザル」のような膜１１５を細胞の播種に利用し、この膜１１５の貫通方向に圧力差を設けることで細胞を透過する方向に培地の流れを発生できる。細胞を透過する方向に培地の流れを発生すれば、細胞や組織の深部まで培地を供給することが可能となり、長期に亘る細胞の安定維持が可能となる。
【００５２】
例えば、肝臓細胞の代謝においては、星細胞、類洞内皮細胞、肝実質細胞の順番で積層した３種類の細胞に対し、この順に培地を流さないと正常に胆汁を生成できない可能性がある。このように細胞を透過する方向の流れを実現すれば、より生体（in vivo）に近づけた環境下での培養を可能にできる。
【００５３】
また、播種する細胞に圧力を加えることにより、厚みのある血管付き組織でも組織深部まで培地を供給する灌流を発生でき、より生体に近い条件での培養を実現できる。作用する圧力を制御すれば、血管付き組織を透過する培地の液量の調整が可能となる。これにより、最適条件下での培養が可能になる。
このように本例の灌流培養装置１は、肝臓細胞による階層組織の構築や、血管を有するがん細胞の構築や、皮膚組織、ｉＰＳ細胞等多能性幹細胞への応用等が可能な有用な装置である。
【００５４】
灌流培養装置１では、細胞を播種する膜１１５の表裏両面側の圧力差を調整することで、細胞を透過する培地の液圧や流量を調整できる。培地の液圧や流量をきめ細かく調整すれば、培養の精度を高めて確実性を向上できる。特に、灌流培養装置１では、比較的大きな液圧を細胞に作用できるため、例えば１ｍｍ程度で比較的厚く透過抵抗の大きな組織に対しても培地を供給できる。
【００５５】
細胞を播種するための足場材としてコラーゲンや寒天等を利用することもある。透過抵抗の高い寒天を足場材に利用した場合には、培地が透過し難くなる。一方、本例の灌流培養装置１によれば、培地を外部から加圧することで比較的高い液圧を実現でき、寒天など透過抵抗の高い足場材を採用した場合であっても培地が透過できる。
【００５６】
灌流培養装置１では、培養容器１１の気室１１９の圧力を調整することで、細胞を播種する膜１１５側に作用する液圧の制御が可能である。例えば気室１１９の圧力を周期的に昇降すれば、脈動をもたせて心臓の拍動、血圧の脈動を模した液圧の制御も可能である。血圧の脈動を模擬した圧力変動を生じさせる制御を行えば、血圧の脈動の影響下の細胞を精度高く培養できる。
【００５７】
灌流培養装置１では、ウェル１０側の気室１１８に大気圧を導入している。例えば培養容器１１側の気室１１９を負圧にすれば、膜１１５に作用する液圧の向き（圧力勾配の向き）を反転できる。培養容器１１側の気室１１９と同様、気室１１８の気密性を高め、ガスを充填することも良い。気室１１８と気室１１９とでどちらの圧力を高くするかにより、膜１１５に作用する液圧の向き（圧力勾配の向き）を容易に変更できるようになる。
【００５８】
なお、図２の培地の経路１８に代えて、図４に示す培地の経路１８を採用することも良い。この培地の経路１８では、供給経路１８１を経由してウェル１０の培地が培養容器１１に還流される。例えばｐＨセンサ１５５によりウェル１０内の培地のｐＨ低下が検出されたときには、経路１８３を介して新鮮な培地がプール２１５からウェル１０に供給され、等しい量の培地が経路１８５を介してプール２１５に回収される。
【００５９】
このようにｐＨの低下に応じて随時、培地を新鮮なものに交換すれば、ウェル１０内の培地の酸性化を回避でき、培養容器１１に還流する培地の性状をある程度の範囲で維持できる。ウェル１０の培地を培養容器１１に還流する構成を採用すれば、高価な消耗品である培地の消費量を低減でき、培養コストを抑制できる。
【００６０】
図５に示すように、細胞を播種する膜１１５の表裏両面側に性状が異なる培地を配置すると共に、一方の培地に正圧あるいは負圧を作用できる灌流培養装置であっても良い。この装置では、密閉可能な容器１０Ａの中間的な高さに仕切りとなる膜１１５が設けられていると共に、膜１１５の上側及び下側にそれぞれ培地の供給ポート及び回収ポートが設けられている。例えば容器１０Ａの底面には、特定の成分を培地中に拡散するフィーダー細胞１１０が静置され、これにより、膜１１５の上下両側で培地の性状が変更されている。
【００６１】
膜１１５の下側の空間は、培地が膜１１５に接するように隙間なく培地が満たされている一方、膜１１５の上側の空間では培地の液面が規定高さに調節され、密閉された容器１０Ａ内に気室１１９が形成されている。そして、この気室１１９には、ガスの経路１７が接続されている。気室１１９のガスの圧力を調整することで、培地に作用する圧力の調節が可能となっている。
【００６２】
上側の培地に作用する気室１１９の圧力は、正圧であっても良く、負圧としても良い。正圧にすれば、膜１１５に播種された細胞に上側の培地を供給できる一方、負圧にすれば、下側の培地を細胞に供給できる。このような装置は、例えば一方の側が血液に面し他方の側が尿に面する腎臓の組織など、表裏の両側が異なる体液等に面する細胞の培養に好適である。気室１１９の圧力については、正負が時間的に交互に変動するように制御することも良い。
【００６３】
図６のように左右を分割する仕切り１１１を有する容器１０Ａについて、仕切り１１１の孔１１２に配設された膜１１５の両側にそれぞれ気室１１９を設けることも良い。各気室１１９の圧力を制御しても良いし、いずれか一方の気室１１９の圧力を制御することも良い。両方の気室１１９の圧力を制御する場合には、例えば図中左側の気室１１９を正圧にし右側を大気圧にすれば、左から右に向けて圧力が低下する圧力勾配を形成できる。反対に、右側の気室１１９を正圧にすれば反対方向に向かって圧力が低下する圧力勾配を形成できる。左右の気室１１９の圧力をそれぞれ制御すれば、負圧を利用することなく圧力勾配の方向を反転できる。
【００６４】
灌流培養装置１は、培養容器１１及びウェル１０の液面高さを計測する液面センサ１５１、１５２を備えている。液面センサ１５１、１５２は、供給用及び回収用のポンプ２２１、２２３との組み合わせにより、培養容器１１が貯える培地の液面高さと、ウェル１０が貯える培地の液面高さと、の違いである図７に例示の水頭差を制御するための手段を構成している。なお、同図では、水頭差を明示できるよう液面高さに違いを設けてある。液面センサ１５１、１５２を含む水頭差の制御手段については、本発明における必須の構成ではない。例えば、準備作業において、培養容器１１及びウェル１０を適切に調整した後、培養容器１１への培地の供給量と、ウェル１０からの培地の回収量と、が同じになるように供給用及び回収用のポンプ２２１、２２３を制御すれば、培養中において培養容器１１及びウェル１０の液面高さを適切に維持できる。また、本例では、培養容器１１の培地とウェル１０の培地との水頭差をゼロに制御しているが、水頭差をゼロにすることは必須の構成ではなく、培養中にある程度、水頭差が生じたり、変動しても良いし、水頭差が所定量となるように制御することも良い。
なお、液面センサ１５１、１５２については、水頭差の制御手段としての利用のほか、
培養容器１１あるいはウェル１０から培地が溢れるトラブルを未然に回避するための手段として有用である。
【００６５】
以上、実施例のごとく本発明の具体例を詳細に説明したが、これらの具体例は、特許請求の範囲に包含される技術の一例を開示しているにすぎない。言うまでもなく、具体例の構成や数値等によって、特許請求の範囲が限定的に解釈されるべきではない。特許請求の範囲は、公知技術や当業者の知識等を利用して前記具体例を多様に変形、変更あるいは適宜組み合わせた技術を包含している。
【符号の説明】
【００６６】
１  灌流培養装置
１０  ウェル（収納容器）
１０Ａ  容器
１００  制御ユニット
１１  培養容器
１１５  膜（シート状の担体）
１１９  気室
１４  ケース
１５１、１５２  液面センサ（液面高さ検出手段）
２１、２１１、２１３  プール
２２、２２１、２２３  ポンプ
２５１〜２５３  バルブ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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