(57)【要約】      （修正有）【課題】高い親和力・大きな結合活性で新生児Ｆｃ受容体に結合する変異型Ｆｃポリペプチドとその単離・作製・使用法の提供。【解決手段】変異型Ｆｃ断片は挿入を含み特定の配列の間にあり、又は特定の配列が欠失し、１０〜２０アミノ酸の前記挿入は更に特定配列の間にあり、最初の４挿入されたアミノ酸の間と最後の４挿入されたアミノ酸の間に、其々少なくとも１つシステインを含み、前記変異型Ｆｃポリペプチドは挿入を含まないことを除いて、同じアミノ酸配列の対照Ｆｃポリペプチドよりも高い結合活性でヒト新生児Ｆｃ受容体（ｈＦｃＲｎ）に結合し、並びに前記変異型Ｆｃポリペプチドは、ｈＦｃＲｎ結合の結合活性がほとんど又は全く無く、検出される残留結合応答が前記対照Ｆｃポリペプチドを用いた検出よりも、０．１ナノメーター以下大きいヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４変異型Ｆｃ断片を含む前記変異型Ｆｃポリペプチド。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４変異型Ｆｃ断片を含む変異型Ｆｃポリペプチドであって、
前記変異型Ｆｃ断片は、前記変異型Ｆｃ断片のループ５、８および／もしくは１０の内にまたは隣接して、３〜２０アミノ酸の挿入を含み、
前記変異型Ｆｃポリペプチドは、前記ループ５、８および／もしくは１０の内のまたは隣接する挿入を含まないことを除いて、前記変異型Ｆｃポリペプチドと同じアミノ酸配列を有する対照Ｆｃポリペプチドよりも高い結合活性で、ｐＨ６．０で、ヒト新生児Ｆｃ受容体（ｈＦｃＲｎ）に結合し、ならびに
前記変異型Ｆｃポリペプチドは、ｐＨ７．４でのｎＦｃＲｎ結合の結合活性が、ほとんどまたは全く無く、およびｐＨ７．４で検出される残留結合応答が、対照Ｆｃポリペプチドを用いた検出よりも、０．１ナノメーター以下大きいだけである、変異型Ｆｃポリペプチド。
【請求項２】
前記変異型Ｆｃ断片のループ５、８および／もしくは１０の内にある、または隣接する前記挿入が、少なくとも６アミノ酸の長さである、請求項１に記載の変異型Ｆｃポリペプチド。
【請求項３】
前記変異型Ｆｃ断片のループ５、８および／もしくは１０の内にある、または隣接する前記挿入が、６〜１６アミノ酸の長さである、請求項２に記載の変異型Ｆｃポリペプチド。
【請求項４】
前記変異型Ｆｃ断片のループ５、８および／もしくは１０の内にある、または隣接する前記挿入が、少なくとも１２アミノ酸の長さである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の変異型Ｆｃポリペプチド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の変異型Ｆｃポリペプチドであって、
前記変異型Ｆｃ断片のループ５、８および／もしくは１０の内にあるまたは隣接する前記挿入が、最初の４挿入アミノ酸の間に少なくとも１つのシステインを含み、および最後の４挿入アミノ酸の間に少なくとも１つのシステインを含む、変異型Ｆｃポリペプチド。
【請求項６】
前記挿入が、前記変異型Ｆｃ断片のループ１０の内にある、または隣接する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の変異型Ｆｃポリペプチド。
【請求項７】
前記挿入が、表１に示すＥＵ付番方式を使用して、アミノ酸３８３〜３８７の内にある、請求項６に記載の変異型Ｆｃポリペプチド。
【請求項８】
請求項７に記載の変異型Ｆｃポリペプチドであって、
前記変異型ヒトＦｃ断片の前記挿入が、表１に示すＥＵ付番方式を使用して、前記変異型Ｆｃ断片のアミノ酸３８２と３８３、アミノ酸３８３と３８４、アミノ酸３８４と３８５、アミノ酸３８５と３８６、アミノ酸３８６と３８７、またはアミノ酸３８７と３８８の間にあるか、または
前記ＥＵ付番方式を使用して、アミノ酸３８４〜３８６が欠失し、および前記挿入がアミノ酸３８３と３８７の間にある、変異型Ｆｃポリペプチド。
【請求項９】
請求項８に記載の変異型Ｆｃポリペプチドであって、
前記変異型ヒトＦｃ断片の前記挿入が、前記ＥＵ付番方式を使用して、前記変異型Ｆｃ断片のアミノ酸３８２と３８３、アミノ酸３８３と３８４、アミノ酸３８４と３８５またはアミノ酸３８５と３８６の間にあるか、または、
前記ＥＵ付番方式を使用して、アミノ酸３８４〜３８６が欠失し、および前記挿入がアミノ酸３８３と３８７の間にある、変異型Ｆｃポリペプチド。
【請求項１０】
前記変異型ヒトＦｃ断片が、変異型ＩｇＧ１  Ｆｃ断片である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の変異型Ｆｃポリペプチド。
【請求項１１】
前記変異型ヒトＦｃ断片が、変異型ＩｇＧ２  Ｆｃ断片である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の変異型Ｆｃポリペプチド。
【請求項１２】
前記変異型Ｆｃ断片の前記挿入が、配列番号１３〜２４の内のいずれか１つのアミノ酸配列を有する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の変異型Ｆｃポリペプチド。
【請求項１３】
前記変異型Ｆｃ断片の前記挿入が、配列番号４１〜６７、９０〜３５６、３５９〜３６７、３６９、３７２、３７３および３７５〜３７９の内のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の変異型Ｆｃポリペプチド。
【請求項１４】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の変異型Ｆｃポリペプチドであって、
前記変異型Ｆｃ断片の前記挿入が、
（ａ）配列番号２１６のアミノ酸４〜８、
（ｂ）配列番号４１〜５３、６７、９０〜１６３、１６５〜２１５および２１７〜２４７および３５９〜３７８の内の１つ、ならびに、配列番号４１〜５３、６７、９０〜１６３、１６５〜２１５および２１７〜２４７および３５９〜３７８のアミノ酸４〜９、
（ｃ）配列番号１６４のアミノ酸４〜１０、
（ｄ）配列番号２４８〜２８８、２９０〜３０６および３４２の内のいずれか１つのアミノ酸４〜１１、
（ｅ）配列番号２８９または３０７のアミノ酸４−１２、ならびに
（ｆ）配列番号３０８〜３４１および３４３〜３５６の内のいずれか１つのアミノ酸４〜１３、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、変異型Ｆｃポリペプチド。
【請求項１５】
ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４変異型Ｆｃ断片を含む変異型Ｆｃポリペプチドであって、
前記変異型Ｆｃ断片は、ループ１０の内にまたは隣接して、３〜２０アミノ酸の挿入を含み、
ｐＨ６．０での、前記変異型ＦｃポリペプチドのｈＦｃＲｎへの結合活性が、ループ１０の内にあるまたは隣接する挿入を含まない点以外は前記変異型Ｆｃポリペプチドと同一である、対照Ｆｃポリペプチドの結合活性よりも高く、ならびに
前記変異型Ｆｃポリペプチドは、ｐＨ７．４でのｎＦｃＲｎ結合の結合活性が、ほとんどまたは全く無く、およびｐＨ７．４で検出される残留結合応答が、対照Ｆｃポリペプチドを用いた検出よりも、０．１ナノメーター以下大きいだけである、変異型Ｆｃポリペプチド。
【請求項１６】
前記挿入が、少なくとも６アミノ酸の長さである、請求項１５に記載の変異型Ｆｃポリペプチド。
【請求項１７】
請求項１５または１６のいずれか１項に記載の変異型Ｆｃポリペプチドであって、
前記挿入が、前記挿入の最初の４アミノ酸の間に少なくとも１つのシステインを含有し、および前記挿入の最後の４アミノ酸の間に少なくとも１つのシステインを含有する、変異型Ｆｃポリペプチド。
【請求項１８】
前記挿入が、６〜１６アミノ酸の長さである、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の変異型Ｆｃポリペプチド。
【請求項１９】
前記挿入が、少なくとも１２アミノ酸の長さである、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の変異型Ｆｃポリペプチド。
【請求項２０】
前記挿入が、表１に示す前記ＥＵ付番方式を使用して、アミノ酸３８３〜３８７の内にある、請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の変異型Ｆｃポリペプチド。
【請求項２１】
請求項２０に記載の変異型Ｆｃポリペプチドであって、
前記変異型ヒトＦｃ断片の前記挿入が、表１に示す前記ＥＵ付番方式を使用して、前記変異型Ｆｃ断片のアミノ酸３８２と３８３、アミノ酸３８３と３８４、アミノ酸３８４と３８５、アミノ酸３８５と３８６、アミノ酸３８６と３８７または、アミノ酸３８７と３８８の間にあるか、または
前記ＥＵ付番方式を使用して、アミノ酸３８４〜３８６が欠失し、および前記挿入がアミノ酸３８３と３８７の間にある、変異型Ｆｃポリペプチド。
【請求項２２】
前記変異型Ｆｃ断片の前記挿入が、表１に示す前記ＥＵ付番方式を使用して、アミノ酸３８４と３８５の間にある、請求項２１に記載の変異型Ｆｃポリペプチド。
【請求項２３】
請求項１５〜２２のいずれか１項に記載の変異型Ｆｃポリペプチドであって、前記変異型Ｆｃ断片の前記挿入が、配列番号１３〜２４の内のいずれか１つのアミノ酸配列を有する、変異型Ｆｃポリペプチド。
【請求項２４】
請求項２３に記載の変異型Ｆｃポリペプチドであって、前記変異型Ｆｃ断片の前記挿入が、配列番号４１、４２、４３、４４、４５、５０、９７、１８０および２１６の内のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、変異型Ｆｃポリペプチド。
【請求項２５】
前記変異型Ｆｃ断片の前記挿入が、配列番号５４、５５、５６、５７または５８のアミノ酸配列を含む、請求項１５〜２２のいずれか１項に記載の変異型Ｆｃポリペプチド。
【請求項２６】
ヒトＩｇＧ１変異型Ｆｃ断片を含む、請求項１５〜２５のいずれか１項に記載の変異型Ｆｃポリペプチド。
【請求項２７】
ヒトＩｇＧ２変異型Ｆｃ断片を含む、請求項１５〜２５のいずれか１項に記載の変異型Ｆｃポリペプチド。
【請求項２８】
ヒトＩｇＧ４変異型Ｆｃ断片を含む、請求項１５〜２５のいずれか１項に記載の変異型Ｆｃポリペプチド。
【請求項２９】
非抗体ポリペプチドを含む、変異型Ｆｃ融合タンパク質である、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の変異型Ｆｃポリペプチド。
【請求項３０】
前記変異型Ｆｃ融合タンパク質に対する対照Ｆｃ融合タンパク質が、アレファセプト、リロナセプト、アフリバーセプト、エタネルセプト、ロミプロスチムまたはアバタセプトである、請求項２９に記載の変異型Ｆｃポリペプチド。
【請求項３１】
抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）および／または、軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の変異型Ｆｃポリペプチド。
【請求項３２】
第一の重鎖定常領域（ＣＨ１）および軽鎖定常領域（ＣＬ）をさらに含む、請求項３１に記載の変異型Ｆｃポリペプチド。
【請求項３３】
ＶＨ領域およびＶＬ領域を含む、請求項３１または３２に記載の変異型Ｆｃポリペプチド。
【請求項３４】
請求項３９〜４１のいずれか１項に記載の変異型Ｆｃポリペプチドであって、
（ａ）ＶＨ領域、第一の重鎖定常領域（ＣＨ１）、ヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域を含む重鎖、ならびに
（ｂ）ＶＬ領域および軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む軽鎖
を含む、変異型Ｆｃポリペプチド。
【請求項３５】
一価である、請求項３１〜３４のいずれか１項に記載の変異型Ｆｃポリペプチド。
【請求項３６】
二量体である、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の変異型Ｆｃポリペプチド。
【請求項３７】
四量体である、請求項３１〜３４のいずれか１項に記載の変異型Ｆｃポリペプチド。
【請求項３８】
請求項１〜３７のいずれか１項に記載の前記変異型Ｆｃポリペプチドをコードする核酸。
【請求項３９】
請求項３８に記載の前記核酸を含有する宿主細胞。
【請求項４０】
変異型Ｆｃポリペプチドを作製する方法であって、
前記変異型Ｆｃポリペプチドをコードする核酸を宿主細胞へと導入すること、
前記核酸を含む前記宿主細胞を、前記核酸が発現するような条件下で培養すること、
培養培地または細胞集団から、発現された変異型Ｆｃポリペプチドを回収すること
を含み、
ここで、前記変異型Ｆｃポリペプチドは、前記変異型Ｆｃ断片のループ５、８および／もしくは１０の内にあるまたは隣接する３〜２０のアミノ酸の挿入を含む変異型Ｆｃ断片を含有し、
前記変異型Ｆｃポリペプチドは、ｐＨ６．０で、対照Ｆｃポリペプチドよりも、ｈＦｃＲｎへの結合に対する結合活性が高く、ならびに
前記変異型Ｆｃポリペプチドは、ｐＨ７．４で、結合活性がほとんどまたは全く無く、およびｐＨ７．４で検出される残留結合応答が、対照Ｆｃポリペプチドを用いた検出よりも、０．１ナノメーター以下大きいだけである、方法。
【請求項４１】
前記核酸は、請求項３８に記載の核酸である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
ヒトＩｇＧ  Ｆｃ断片を含むＦｃポリペプチドの半減期を延長させる方法であって、
挿入のために、ループ５、８および／または１０の内にある部位または隣接する部位を選択するステップ；ならびに
前記選択された部位に、ペプチドを挿入するステップ、
を含み、前記ペプチドは、
（ａ）配列番号４１〜６７、９０〜３５６、３５９〜３６７、３６９、３７２、３７３および３７５〜３７９、
（ｂ）配列番号２１６のアミノ酸４〜８、
（ｃ）配列番号４１〜５３、６７、９０〜１６３、１６５〜２１５および２１７〜２４７および３５９〜３７８の内の１つのアミノ酸４〜９、
（ｄ）配列番号１６４のアミノ酸４−１０、
（ｅ）配列番号２４８−２８８、２９０−３０６および３４２の内のいずれか１つのアミノ酸４〜１１、
（ｆ）配列番号２８９または３０７のアミノ酸４〜１２、ならびに
（ｇ）配列番号３０８〜３４１および３４３〜３５６の内のいずれか１つのアミノ酸４〜１３、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、方法。
【請求項４３】
前記部位が、ループ１０の内にある、または隣接する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記挿入部位が、ＥＵ付番方式に従い付番した、アミノ酸３８３〜３８７の内にある、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
請求項４４に記載の方法であって、
前記挿入が、前記ＥＵ付番方式を使用して、前記変異型Ｆｃ断片のアミノ酸３８２と３８３、アミノ酸３８３と３８４、アミノ酸３８４と３８５、またはアミノ酸３８５と３８６の間にあるか、または、
アミノ酸３８４〜３８６が欠失し、および前記挿入が、前記ＥＵ付番方式を使用して、アミノ酸３８３と３８７の間にある、方法。
【請求項４６】
対照Ｆｃポリペプチドと比較して、前記変異型Ｆｃ断片を含む変異型Ｆｃポリペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を延長させる、ヒトＩｇＧ変異型Ｆｃ断片を同定する方法であって、
（ａ）ループ１０の内に、または隣接して、４〜２０のランダム化アミノ酸を含む挿入を含有する、Ｆｃ断片をコードする核酸のライブラリを作製するステップ、
（ｂ）前記ライブラリによりコードされるＦｃ断片をスクリーニングして、（ｉ）ｐＨ６で、対照Ｆｃ断片よりも高い結合活性でｈＦｃＲｎに結合する、（ｉｉ）ｐＨ７．４で、ｈＦｃＲｎへの結合に対する結合活性がほとんどまたは全く無い、変異型Ｆｃ断片を特定するステップ、
（ｃ）（ｂ）で特定された変異型Ｆｃ断片を含む変異型Ｆｃポリペプチドをコードする核酸を構築するステップであって、ここで、前記変異型Ｆｃ断片ではなく対照Ｆｃ断片を含む対照Ｆｃポリペプチドの濃度が、動物にｉｎ  ｖｉｖｏで投与すると、徐々に直線的に減少することが知られているステップ、
（ｄ）宿主細胞に（ｃ）の前記核酸を導入し、および前記核酸によりコードされる前記変異型Ｆｃポリペプチドが発現できるような条件下で前記宿主細胞を培養するステップ、
（ｅ）前記細胞集団または細胞培養培地から、前記変異型Ｆｃポリペプチドを回収するステップ、
（ｆ）前記変異型Ｆｃポリペプチドを動物に投与し、および対照Ｆｃポリペプチドを別の動物に投与するステップ、ならびに
（ｇ）投与後、末梢血中の前記変異型Ｆｃポリペプチドおよび対照Ｆｃポリペプチドの濃度を経時的にモニターし、それにより、変異型Ｆｃポリペプチドにｉｎ  ｖｉｖｏ半減期の延長と、曝露の増加をもたらす変異型Ｆｃ断片を特定するステップ
を含む方法。
【請求項４７】
ステップ（ａ）の前記挿入が、表１に示す前記ＥＵ付番方式を使用して、３８４位および３８５位の間にある、方法。
【請求項４８】
請求項１〜３７のいずれか１項に記載の変異型Ｆｃポリペプチドを、それを必要とする患者に投与することを含む、慢性疾患の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権
本出願は、２０１１年１２月２１日に出願された米国仮特許出願第６１／５７８，７８０号、２０１２年１月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／５８５，９９３号および、２０１２年１１月２１日に出願された米国仮特許出願第６１／７２９，０５０号の優先権を主張し、それらは各々、その全体が本出願に援用される。
【０００２】
分野
本発明は、対照のＦｃ断片と比較して、高い親和力および／または大きな結合活性で新生児Ｆｃ受容体に結合する変異型Ｆｃ断片を含むポリペプチドに関する。本発明はさらに、そのようなポリペプチドを単離する方法、作製する方法、および使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
治療用モノクローナル抗体は、様々な疾患に対する治療剤として成功裏に使用されている。ｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗体の比較的長い半減期は、少なくとも部分的に新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）と抗体のＦｃ領域との相互作用により仲介される。たとえば、Ghetie  et  al.(１９９６),Eur.J.Immunol.２６:６９０-９６を参照のこと。ＦｃＲｎは、６．０以下のｐＨではナノモルの親和力（ＫＤ≒１００ｎＭ）でＩｇＧ抗体のＦｃ領域と結合するが、血液のｐＨ（すなわち、約ｐＨ７．４）では結合しない。Tesar  and  Bjorkman  (２００１),  Curr.  Opin.  Struct.  Biol.  ２０(２):  ２２６-２３３。たとえばピノサイトーシス等により抗体が細胞内に移行すると、ＩｇＧは、エンドソームの酸性環境下でＦｃＲｎにより結合することができる（同書）。エンドソーム内でＦｃＲｎにより結合されると、ＩｇＧは、エンドソーム内の既定の異化経路に入ることとは反対に、細胞表面へと戻っていく（同書）。通常の細胞表面上の生理学的ｐＨ環境下では、ＩｇＧはＦｃＲｎから解離して、再度、血液循環へと戻ることができる。このプロセスにより、細胞のエンドソーム内で分解されることとは反対に、細胞内移行の後、抗体が血液循環へと戻ることができるのである。
【０００４】
投与量および／または投与頻度を減少させるため、ｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期を延長させた治療抗体に対するニーズが当分野には存在する。そのような抗体は、患者の利便性の増加という利点があり、また、それゆえに患者のコンプライアンスが増加し、および／または、コストが減少するという可能性がある。近年のコスト意識の高いヘルスケア状況においては、コストは、治療用製品の実用性の決定因子となりうる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ghetie  et  al.(１９９６),Eur.J.Immunol.２６:６９０-９６
【非特許文献２】Tesar  and  Bjorkman  (２００１),  Curr.  Opin.  Struct.  Biol.  ２０(２):  ２２６-２３３
【発明の概要】
【０００６】
やや酸性のｐＨでは、対照のＦｃ断片よりも高い親和力および／または高い結合活性でＦｃＲｎへ結合し、生理ｐＨでは、対照のＦｃ断片とほぼ同じであるか、より低い親和力（すなわち、結合活性がわずかしか無いか、または結合活性がない）でＦｃＲｎへ結合する変異型Ｆｃ断片が提供される。また、変異型Ｆｃ断片ならびに標的分子に結合する結合領域を含有する変異型Ｆｃポリペプチドが提供される。本明細書において、上述の結合特性を有する変異型Ｆｃ断片を含有する変異型Ｆｃポリペプチドが、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、対照のＦｃポリペプチドよりも長い半減期をも有することを示す。さらに、これらのＦｃ断片およびＦｃポリペプチドをコードする核酸、ならびに、これらの核酸を用いた、これらのタンパク質の製造方法が提供される。また、Ｆｃポリペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏにおける半減期を延長させる方法が含まれ、および、対照のＦｃ断片と比較して、ｐＨ５〜６では高い親和力でＦｃＲｎに結合し、生理ｐＨでは同等か、または低い親和力でＦｃＲｎに結合する変異型Ｆｃ断片の特定方法が含まれる。
【０００７】
本明細書において、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４変異型Ｆｃ断片を含む変異型Ｆｃポリペプチドが提供され、ここで、当該変異型Ｆｃ断片は、変異型Ｆｃ断片のループ５、８および／もしくは１０の内に、または隣接して、３〜２０、１０〜２０、２０〜４０、４０〜６０または６０〜８０アミノ酸の挿入を含み、ここで、当該変異型Ｆｃポリペプチドは、ループ５、８および／もしくは１０の内の、または隣接した挿入を含有していないことを除けば当該変異型Ｆｃポリペプチドと同じアミノ酸配列を有する対照Ｆｃポリペプチドよりも、約ｐＨ５．０〜約ｐＨ６．０の間（および／または、約５．０、５．２、５．５、５．７または６．０のｐＨ）では、高い親和力および／または高い結合活性でヒト新生児Ｆｃ受容体（ｈＦｃＲｎ）に結合し、および、ここで、当該変異型Ｆｃポリペプチドは、生理ｐＨ（および／または、約７．４、７．５、または７．６のｐＨ）では、対照Ｆｃポリペプチドと比較してほぼ同じか、もしくはより低い親和力または結合活性（すなわち、結合活性がわずかしかないか、または結合活性が無い）で、ヒト新生児Ｆｃ受容体（ｈＦｃＲｎ）に結合する。変異型Ｆｃ断片の内に、または隣接した挿入は、少なくとも６アミノ酸の長さであり得、２５アミノ酸の長さを超えないものであり得、６〜１６の間のアミノ酸の長さであり得、および／または、少なくとも１２アミノ酸の長さであり得る。いくつかの実施形態において、当該挿入は、メチオニンおよび／またはトリプトファン残基を含有しない。変異型Ｆｃ断片の内、または隣接した挿入は、最初の４つの挿入されたアミノ酸の間に、少なくとも１つのシステインを含み得、および、最後の４つの挿入されたアミノ酸の間に、少なくとも１つのシステインを含み得る。任意選択的に、当該挿入は、最初または最後の４つの挿入アミノ酸に存在するいずれかのシステイン残基以外の、システイン残基を欠損し得る。いくつかの実施形態において、当該挿入は、変異型Ｆｃ断片のループ１０の内、または隣接しており、任意選択的に、変異型Ｆｃ断片のアミノ酸３８４と３８５（表１に示すＥＵ付番方式を使用）の間にある。当該挿入は、アミノ酸３８３〜３８７（ＥＵ付番方式を使用）の内にあり得る。いくつかの実施形態において、変異体ヒトＦｃ断片の当該挿入は、アミノ酸３８２と３８３、３８３と３８４、３８５と３８６、３８６と３８７、３８７と３８８、３８８と３８９、３８９と３９０、または３９０と３９１（表１に示すＥＵ付番方式を使用）の間であり得る。あるいは、アミノ酸３８４〜３８６を欠損し得、当該挿入は、アミノ酸３８３と３８７の間であり得る（表１に示すＥＵ付番方式を使用）。変異型Ｆｃ断片の当該挿入は、配列番号１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、９０〜３５６および３５９〜３７９のうちの任意の１つのアミノ酸配列を含み得る。さらに、変異型Ｆｃ断片の当該挿入は、以下のうちの任意の１つのアミノ酸配列を含み得る：配列番号４１〜６７；配列番号９０〜２４６；配列番号２４７〜３５６；配列番号３６７、３６９、３７２、３７３および３７５〜３７９；配列番号４１〜５３、６７、９０〜１６２、９０〜１６３、１６５〜２１５、１６４〜２１４、２１７〜２４７、２１６〜２４６、３５９〜３７９および３９２〜３９９、４０１〜４０９、４１１〜４２６、４２８〜４３９、４４１〜４４７、４４９〜４５３、４５６、４５９、４６１、４６４および４７０、４７５、４７７〜４８９、４９１〜４９６のうちの任意の１つのアミノ酸４〜９；配列番号１６４、２５２および４９０のアミノ酸４〜１０、ならびに、配列番号２１５または２１６のアミノ酸４〜８、；配列番号２４８〜２８８、２９０〜３０６、３４２、４００、４１０、４２７、４４０、４４８、４５４、４５５、４５７、４５８、４６０、４６５〜４６９、４７１〜４７４、および４７６のうちの任意の１つのアミノ酸４〜１１；配列番号２８９または３０７のアミノ酸４〜１２；配列番号３０８〜３４１および３４３〜３５６の内の任意の１つのアミノ酸４〜１３。
【０００８】
さらに本明細書において、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４変異型Ｆｃ断片を含む変異型Ｆｃポリペプチドを記載し、ここで、当該変異型Ｆｃ断片は、ループ１０の内にある、または隣接している３〜２０、１０〜２０、２０〜４０、４０〜６０、または６０〜８０のアミノ酸の挿入を含有し、ここで、当該変異型Ｆｃポリペプチドは、約５．０〜約６．０の範囲にあるｐＨでは、および／または、約５．０、５．２、５．５、５．７または６．０のｐＨでは、対照Ｆｃポリペプチド（ループ１０の内にある、または隣接する挿入を含有しない点を除き、変異型Ｆｃポリペプチドと同一である）よりも高い親和力および／または、高い結合活性でｈＦｃＲｎに結合し、および、ここで、当該変異型Ｆｃポリペプチドは、生理ｐＨ、および／または、約７．４、７．５、または７．６のｐＨでは、対照Ｆｃポリペプチドと比較してほぼ同じか、または低い親和力（すなわち、結合活性がわずかしかないか、または結合活性が無い）で、ｈＦｃＲｎに結合する。当該挿入は、少なくとも６アミノ酸の長さであり得、２５アミノ酸を超えない長さであり得、６〜１６アミノ酸の長さであり得、少なくとも１２アミノ酸の長さであり得、ならびに／または、挿入された最初の４つのアミノ酸の間に、少なくとも１つのシステインを含有し、および、挿入された最後の４つのアミノ酸の間に少なくとも１つのシステインを含有し得る。当該挿入は、当該挿入内の他の位置でシステイン残基を欠損し得る。当該挿入は、メチオニンおよび／またはトリプトファン残基を欠損し得る。変異型Ｆｃ断片の挿入は、アミノ酸３８３−３８７（ＥＵ付番方式に従う）の内であり得る。変異型Ｆｃ断片の挿入は、アミノ酸３８２と３８３、３８３と３８４、３８４と３８５、３８５と３８６、３８６と３８７、３８７と３８８、３８８と３８９、３８９と３９０、または３９０と３９１（表１に示すＥＵ付番方式を使用）の間であり得る。あるいは、アミノ酸３８４〜３８６を欠損し得、当該挿入は、アミノ酸３８３と３８７の間であり得る（ＥＵ付番方式を使用）。変異型Ｆｃ断片の当該挿入は、配列番号１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、９０〜３５６、３５９〜３７９および３９２〜４９６のうちの任意の１つのアミノ酸配列を含み得る。さらに、変異型Ｆｃ断片の当該挿入は、以下のうちの任意の１つのアミノ酸配列を含み得る：配列番号４１〜６７；配列番号９０〜２４６；配列番号２４７〜３５６；配列番号３６７、３６９、３７２、３７３および３７５〜３７９；配列番号４１〜５３、６７、９０〜１６２、９０〜１６３、１６５〜２１５、１６４〜２１４、２１７〜２４７、２１６〜２４６、３５９〜３７９および３９２〜３９９、４０１〜４０９、４１１〜４２６、４２８〜４３９、４４１〜４４７、４４９〜４５３、４５６、４５９、４６１、４６４および４７０、４７５、４７７〜４８９、４９１〜４９６のうちの任意の１つのアミノ酸４〜９；配列番号１６４、２５２および４９０のアミノ酸４〜１０、ならびに、配列番号２１５または２１６のアミノ酸４〜８、；配列番号２４８〜２８８、２９０〜３０６、３４２、４００、４１０、４２７、４４０、４４８、４５４、４５５、４５７、４５８、４６０、４６５〜４６９、４７１〜４７４、および４７６のうちの任意の１つのアミノ酸４〜１１；配列番号２８９または３０７のアミノ酸４〜１２；配列番号３０８〜３４１および３４３〜３５６のうちの任意の１つのアミノ酸４〜１３。変異型Ｆｃポリペプチドは、非抗体ポリペプチドを含む変異型Ｆｃ融合タンパク質であり得る。特定の実施形態において、変異型Ｆｃ融合タンパク質に対する対照Ｆｃ融合タンパク質は、アレファセプト、リロナセプト、アフリバーセプト、エタネルセプト、ロミプロスチム、またはアバタセプトであり得る。他の実施形態において、変異型Ｆｃポリペプチドは、任意の抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）および／または軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むことができ、また、第一の重鎖定常領域（ＣＨ１）および軽鎖定常領域（ＣＬ）を含み得る。いくつかの実施形態において、変異型Ｆｃポリペプチドは、（ａ）ＶＨ領域、第一の重鎖定常領域（ＣＨ１）、ヒンジ領域、ＣＨＨ２領域およびＣＨ３領域を含む重鎖、ならびに、（ｂ）ＶＬ領域および軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む軽鎖、を含むことができる。変異型Ｆｃポリペプチドは、一価であり得る。変異型Ｆｃポリペプチドは、二量体であり得、または四量体であり得る。
【０００９】
さらなる実施形態において、本明細書は、本明細書に記述される変異型Ｆｃポリペプチドまたは変異型Ｆｃ断片をコードする核酸、ならびに、変異型Ｆｃ断片のループの内にある、または隣接する挿入をコードする核酸を開示する。また、そのような核酸を含有する宿主細胞を記載する。また、（ａ）変異型Ｆｃポリペプチドまたは変異型Ｆｃ断片をコードする核酸を宿主細胞に導入すること、（ｂ）当該核酸が発現されるような条件下で当該核酸を含む宿主細胞を培養すること、および、（ｃ）発現された変異型ＦｃポリペプチドまたはＦｃ断片を培養培地または細胞集団から回収すること、を含む変異型Ｆｃポリペプチドまたは変異型Ｆｃ断片を作製する方法を企図し、ここで、当該変異型Ｆｃ断片または、変異型Ｆｃ断片を含有する変異型Ｆｃポリペプチドは、当該変異型Ｆｃ断片のループ５、８および／または１０の内にある、または隣接する３〜２０、１０〜２０、２０〜４０、４０〜６０、または６０〜８０アミノ酸の挿入を含み、および、当該変異型ＦｃポリペプチドまたはＦｃ断片は、対照ＦｃポリペプチドまたはＦｃ断片よりも、約５．０〜約６．０の範囲にあるｐＨで、および／または、約５．０、５．２、５．５、５．７もしくは６．０のｐＨで、より高い親和力および／またはより高い結合活性で、ｈＦｃＲｎへ結合し、および、当該変異型ＦｃポリペプチドまたはＦｃ断片は、生理ｐＨおよび／または約７．４、７．５もしくは７．６のｐＨで、対照Ｆｃポリペプチドまたは対照Ｆｃ断片と比較して、ほぼ同じか、もしくはより低い親和力または結合活性で（すなわち、結合活性がわずかしかないか、結合活性が無い）、ヒト新生児Ｆｃ受容体（ｈＦｃＲｎ）へと結合する。
【００１０】
また、（ａ）変異型ＦｃポリペプチドまたはＦｃ断片をコードする核酸を宿主細胞に導入すること、（ｂ）当該核酸が発現されるような条件下で核酸を含む宿主細胞を培養すること、および、（ｃ）発現された変異型ＦｃポリペプチドまたはＦｃ断片を培養培地または細胞集団から回収すること、を含む、本明細書に記述される任意の変異型Ｆｃ断片またはＦｃポリペプチドを作製する方法が記載される。
【００１１】
さらなる実施形態において、以下のステップを含む、ヒトＩｇＧ  Ｆｃ断片を含むＦｃポリペプチドの半減期を延長させる方法を開示する：ループ５、８および／または１０の内に、または隣接する位置に、挿入のための部位を選択すること；そして、選択された部位にペプチドを挿入することであって、当該ペプチドは、配列番号４１〜６７；配列番号９０〜２４６；配列番号２４７〜３５６；配列番号３６７、３６９、３７２、３７３および３７５〜３７９；配列番号４１〜５３、６７、９０〜１６２、９０〜１６３、１６５〜２１５、１６４〜２１４、２１７〜２４７、２１６〜２４６、３５９〜３７９および３９２〜３９９、４０１〜４０９、４１１〜４２６、４２８〜４３９、４４１〜４４７、４４９〜４５３、４５６、４５９、４６１、４６４および４７０、４７５、４７７〜４８９、４９１〜４９６のうちの任意の１つのアミノ酸４−９；配列番号１６４、２５２および４９０のアミノ酸４−１０、ならびに、配列番号２１５または２１６のアミノ酸４−８、；配列番号２４８〜２８８、２９０〜３０６、３４２、４００、４１０、４２７、４４０、４４８、４５４、４５５、４５７、４５８、４６０、４６５〜４６９、４７１〜４７４、および４７６のうちの任意の１つのアミノ酸４−１１；配列番号２８９または３０７のアミノ酸４−１２；ならびに、配列番号３０８〜３４１および３４３〜３５６のうちの任意の１つのアミノ酸４−１３、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。選択された部位は、ループ１０の内にあるか、または隣接し得、および、当該挿入部位は、アミノ酸３８４と３８５（ＥＵ付番方式に従う番号付け）の間にあり得る。挿入部位は、アミノ酸３８３〜３８７（ＥＵ付番方式を使用）の内にあり得る。変異型Ｆｃ断片の挿入は、アミノ酸３８２と３８３、３８３と３８４、３８４と３８５、３８５と３８６、３８６と３８７、３８７と３８８、３８８と３８９、３８９と３９０、または３９０と３９１（表１に示すＥＵ付番方式を使用）の間であり得る。あるいは、アミノ酸３８４−３８６を欠損し得、当該挿入は、アミノ酸３８３と３８７（ＥＵ付番方式を使用）の間に存在し得る。
【００１２】
さらに、対照Ｆｃポリペプチドと比較して、変異型Ｆｃ断片を含む変異型Ｆｃポリペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を延長させるヒトＩｇＧ変異型Ｆｃ断片を特定する方法であって、以下のステップを含む方法が提供される：（ａ）ループ１０の内に、または隣接して、４〜２０、１０〜２０、２０〜４０、４０〜６０または６０〜８０のランダム化アミノ酸を含む挿入を含有するＦｃ断片をコードする核酸のライブラリを作製すること；（ｂ）ライブラリによりコードされたＦｃ断片をスクリーニングし、（ｉ）ヒトＦｃＲｎに、ｐＨ５．５および／または約５〜６のｐＨで、対照Ｆｃ断片と比較して高い親和力および／または高い結合活性で結合する、（ｉｉ）ヒトＦｃＲｎに、生理ｐＨで、および／または７．４、７．５、または７．６のｐＨで、対照のＦｃ断片と比較して同じか、もしくはより低い親和力または結合活性で（すなわち、結合活性がわずかしかないか、または結合活性が無い）、結合する、変異型Ｆｃ断片を特定すること；（ｃ）（ｂ）で特定された変異型Ｆｃ断片を含む変異型Ｆｃポリペプチドをコードする核酸を構築することであって、対照Ｆｃポリペプチドの濃度（変異型Ｆｃ断片ではなく、対照Ｆｃ断片を含む）は、ｉｎ  ｖｉｖｏで動物に投与された際に、徐々に直線的に減少することが知られている；（ｄ）（ｃ）の核酸を宿主細胞に導入し、当該核酸によりコードされる変異型Ｆｃポリペプチドが発現できるような条件下で当該宿主細胞を培養すること；（ｅ）細胞集団または細胞培養培地から変異型Ｆｃポリペプチドを回収すること；（ｆ）変異型Ｆｃポリペプチドを動物に投与し、他の動物に対照Ｆｃポリペプチドを投与すること；および、（ｇ）投与の後、変異型および対照Ｆｃポリペプチドの末梢血中の濃度を経時的にモニターし、それにより変異型Ｆｃポリペプチドにｉｎ  ｖｉｖｏ半減期の延長をもたらす変異型Ｆｃ断片を特定すること。ステップ（ａ）の挿入は、３８４位および３８５位（表１に解説されるＥＵ付番方式を使用）の間であり得る。挿入部位は、アミノ酸３８３〜３８７（ＥＵ付番方式を使用）の内にあり得る。変異型Ｆｃ断片の挿入は、アミノ酸３８２と３８３、３８３と３８４、３８４と３８５、３８５と３８６、３８６と３８７、３８７と３８８、３８８と３８９、３８９と３９０、または３９０と３９１（表１に示すＥＵ付番方式を使用）の間であり得る。あるいは、アミノ酸３８４〜３８６を欠損していてもよく、そして当該挿入は、アミノ酸３８３および３８７（ＥＵ付番方式を使用）の間に存在し得る。
【００１３】
他の態様において、本明細書に記述される変異型Ｆｃポリペプチドを、それを必要とする患者に投与することを含む、慢性疾患を治療する方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ヒトＦｃＲｎ（ｈＦｃＲｎ）およびヒトＩｇＧ１  Ｆｃ断片の、ＦｃＲｎのＦｃ断片への結合で、最も近くで接触する部分の、予測される３次元部分構造のリボンダイヤグラム。上は、ｈＦｃＲｎの三次構造部分のリボンダイヤグラムである。下は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ断片の、ＦｃＲｎが結合する際に、ＦｃＲｎが最も近く接触する部分のリボンダイヤグラムである。ループは紐として示され、αフェリックスおよびβシートは、リボンとして示される。挿入が為される６つの部位は、以下に記述されるように構築された８つのライブラリの名称（すなわち、Ｌ１、Ｌ２Ａ、Ｌ２Ｂ、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６ＡおよびＬ６Ｂ）で示されている。
【図２】挿入ライブラリの形式。ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ断片（配列番号１）の配列が上に示されている。挿入がなされるループの内にあるアミノ酸、または隣接するアミノ酸は、下線および太字で示される。ライブラリの名称（すなわちＬ１、Ｌ２Ａ等）は、特定のライブラリに対して作製され、挿入される領域の上に表される。挿入の形式は、以下に示される。左端は、ライブラリの名称（すなわちＬ１、Ｌ２Ａ等）である。ライブラリの名称の右は、任意のアミノ酸が挿入される前の、挿入部位の周辺の元々の配列である。イタリック体は、挿入の前に欠損されるアミノ酸を示す。垂直の破線は、アミノ酸が欠損しないライブラリの挿入部位を示す。右端は、挿入が適所にある挿入部位周辺の配列である。「（１９Ｒ）５」または、「（１９Ｒ）６」は、それぞれ５つまたは６つのランダム化アミノ酸を意味し、それらはシステイン以外の任意の１９アミノ酸であることができる。「（２０Ｒ）８」は、８つのランダム化アミノ酸を意味し、それらは２０アミノ酸のいずれかであることができる。
【図３】ライブラリＬ５由来の変異型Ｆｃ断片の、それぞれｐＨ６およびｐＨ７．４での結合曲線および解離曲線である。左の曲線は、実施例４で解説されるように、ＦｏｒｔｅＢｉｏＯｃｔｅｔ（登録商標）システムを用いて検出された応答を示し、中心の垂直線の左までの曲線部分は、ｐＨ６での様々なＦｃ断片のＦｃＲｎに対する結合の相対量を示し、中心の垂直線の右の曲線部分は、ｐＨ７．４でのＦｃＲｎ由来のＦｃ断片の解離を示す。右の表は、各変異型および野生型Ｆｃ断片（ＦｃＷＴ）のそれぞれに対する、ｐＨ６で検出された最大結合応答を提示する。
【図４】カニクイザルへの注射後の時間関数としての、変異型および対照Ｆｃ断片を含有する平均抗体濃度。ｘ軸は、注射後の時間（時）を示し、ｙ軸は、抗体を注射されたカニクイザルの末梢血中の抗体濃度（ナノグラム／ミリリットル（ｎｇ／ｍＬ））を示す。
【図５】ループ１０変異型の配列。ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ断片のループの野生型または変異型のアミノ酸配列、および、各サイドの３つの隣接アミノ酸を示す。示されたアミノ酸配列は、アミノ酸残基１６６〜１７８（図２の付番スキーム）またはアミノ酸３８１〜３９３（表１およびこの図に示されるＥＵ付番に従う（配列番号５６３））由来である。変化していない、野生型のループ領域配列は、「野生型配列」と示されている。Ｆｃ変異型５−１のこのループ領域の配列（ライブラリＬ５からの単離株によりコードされている）は、「５−１」（配列番号５６４）と示されている。挿入されたアミノ酸配列は、下線の太字で示される。様々な５−１変異型（このループの内に、または隣接した異なる位置に同じ挿入ペプチドを有し、いくつかの例においては、いくつかのループアミノ酸が欠損されている）由来の、これと同じループ領域の配列を、下記に示す。
【図６】ループ１０の異なる位置で同じ挿入を有する、変異型Ｆｃ断片の、それぞれｐＨ６およびｐＨ７．４での結合曲線および解離曲線。左は、様々な変異型のＦｃ断片および野生型Ｆｃ断片（ＦｃＷＴ）の、ｐＨ６での結合曲線（中心の垂直線の左まで）、およびｐＨ７．４での解離曲線（中心の垂直線の右）を示す。右に、ｐＨ６で各変異型に対して検出された最大結合応答を、表の形式で示す。
【図７】酵母でスクリーニングされたライブラリＬ５由来の変異型Ｆｃ断片の、ｐＨ６およびｐＨ７．４での結合曲線および解離曲線。様々な変異型Ｆｃ断片および野生型Ｆｃ断片（ＦｃＷＴ）の、ｐＨ６での結合曲線（中心の垂直線の左まで）と、ｐＨ７．４での解離曲線（中心の垂直線の右）を、左に示す。右に、各変異型の、ｐＨ６で検出された最大結合応答を表の形式で示す。
【図８】酵母でスクリーニングされたライブラリＬ−８およびＬ−１０由来の変異型Ｆｃ断片の、ｐＨ６およびｐＨ７．４での結合曲線および解離曲線。様々な変異型Ｆｃ断片および野生型Ｆｃ断片（ＦｃＷＴ）の、ｐＨ６での結合曲線（中心の垂直線の左まで）と、ｐＨ７．４での解離曲線（中心の垂直線の右）を、左に示す。右に、各変異型の、ｐＨ６で検出された最大結合応答を表の形式で示す。
【図９】カニクイザルでの注射後の時間関数としての、変異型および対照Ｆｃ断片を含有する平均抗体濃度。ｘ軸は、注射後の時間（時）を示し、ｙ軸は、抗体を注射されたカニクイザルの末梢血中の抗体濃度（ナノグラム／ミリリットル（ｎｇ／ｍＬ））を示す。
【図１０】カニクイザルでの注射後の時間関数としての、変異型および対照Ｆｃ断片を含有する平均抗体濃度。ｘ軸は、注射後の時間（時）を示し、ｙ軸は、抗体を注射されたカニクイザルの末梢血中の抗体濃度（ナノグラム／ミリリットル（ｎｇ／ｍＬ））を示す。示されるように、黒丸は、Ｙ−５−１１２を注射されたカニクイザルに対する個々のデータポイントを表し、実線は、これらのデータの平均を示す。同様に、△は、抗体Ｙを注射されたカニクイザルに対する個々のデータポイントを表し、破線は、これらのデータの平均を表す。
【００１５】
【表１】
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【発明を実施するための形態】
【００１６】
治療用タンパク質における、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を延長させる改変は、そのようなタンパク質は投与量を減らし、および／または投与頻度を減らすことができるという点で、有用でありうる。本発明により、やや酸性のｐＨ（たとえば、ｐＨ５．０〜６．０等）では、ＦｃＲｎに高い親和力および／または結合活性で結合し、生理ｐＨ（約７．２〜７．６）ではＦｃＲｎにはあまり結合しない変異型Ｆｃ断片を含むＦｃポリペプチドを提供する。本明細書で示されるように、変異型Ｆｃ断片を含有するそのような変異型Ｆｃポリペプチドは、対照のＦｃポリペプチドと比較して、半減期が延長されうる。ループの内にある、または隣接する挿入を少なくとも１つ含有し、約５〜６のｐＨでは、対照のＦｃポリペプチド（挿入（複数含む）を含有しないという点でのみ、異なっている）と比較して、高い親和力および／または結合活性でＦｃＲｎに結合する変異型ヒトＦｃ断片を提供する。また、そのような変異型Ｆｃ断片および変異型Ｆｃポリペプチドを含有するタンパク質をコードする核酸、そのような核酸を含有する宿主細胞、ならびに、変異型Ｆｃポリペプチドおよび変異型Ｆｃ断片を作製する方法を提供する。さらに、Ｆｃポリペプチドの半減期を延長させる方法を提供し、また、対照のＦｃ断片と比較して、生理ｐＨでは低いもしくは同等な親和力および／または結合活性でＦｃＲｎに結合し、ｐＨ５〜６では高い親和力および／または結合活性でＦｃＲｎに結合する変異型Ｆｃ断片を特定する方法を提供する。
【００１７】
本明細書に記述される変異型Ｆｃ断片は、ループ中の選択された部位に、短い挿入を含有する。ＦｃＲｎは、Ｆｃ断片と相互作用する。たとえばＣＨ２またはＣＨ３ドメイン等のイムノグロブリンドメインは、ループと交互になっているβシート部分を含む、たる型の構造を有している。Hunkapiller  and  Hood  (１９８９),  Adv.  Immunol.  ４４:  １-６３；  Williams  and  Barclay  (１９８８),  Ann.  Rev.  Immunol.  ６:  ３８１-４０５。Ｆｃ断片の挿入部位は、Ｆｃ断片に結合する際、比較的近接してＦｃＲｎと接触した状態になる領域の部分であるループ、またはこれらの領域に隣接するループの中で選択された。図１に、ＦｃＲｎ部分のリボンダイヤグラム（上）およびＦｃ断片のリボンダイヤグラム（下）を示し、挿入のために選択された部位のＦｃ断片における位置を示す。
【００１８】
以下に示すように、ライブラリＬ５における多くの挿入は、ｐＨ５〜６でＦｃＲｎへの結合が増強され、生理ｐＨではＦｃＲｎにわずかしか、または結合しないという所望の特性を有している。ライブラリＬ１、Ｌ２Ｂ、Ｌ３およびＬ４を含む他のライブラリ（図１および図２を参照のこと）からは、ほぼ同数の変異型をスクリーニングしたにもかかわらず、所望の特性を有する挿入が得られなかった。ライブラリＬ２Ａ、Ｌ６Ａ、およびＬ６Ｂからは、所望の特性を有するいくつかの挿入が得られたが、ライブラリＬ５から得られた数よりも、非常に少ない数であった。驚くべきことに、所望の特性を有する最も多くの挿入を生み出したライブラリ（すなわち、ライブラリＬ５）は、ＦｃＲｎと最も近接して接触する状態となる領域の部分ではないループ領域中にあった。図１。
【００１９】
定義
「親和力」という用語は、本明細書において、実施例３に解説されるように、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００（または類似の機器）を用いて測定されるＥＣ５０として測定される結合親和力を指す。対照Ｆｃポリペプチド（対照Ｆｃ断片を含有）と比較した、変異型Ｆｃポリペプチド（変異型Ｆｃ断片を含有）のＦｃＲｎに対する「高い親和力」とは、その変異型Ｆｃポリペプチドが、対照ＦｃポリペプチドのＥＣ５０の５０％を超えないＥＣ５０を有することを意味する。同様に、対照Ｆｃポリペプチドと比較した、変異型Ｆｃポリペプチドの「低い親和力」とは、その変異型Ｆｃポリペプチドが、対照ＦｃポリペプチドのＥＣ５０の１５０％を超えるＥＣ５０を有することを意味する。もし変異型ＦｃポリペプチドのＥＣ５０が、対照ＦｃポリペプチドのＥＣ５０の５０〜１５０％である場合、変異型Ｆｃポリペプチドの親和力は、対照Ｆｃポリペプチドの親和力と「実質的に同じである」とみなされる。
【００２０】
「結合活性」という用語は、本明細書において、実施例４に記述されるＯｃｔｅｔ  Ｒｅｄ（登録商標）システムにおいて、ビオチニル化ヒトＦｃＲｎ（ｈＦｃＲｎ）でコートされたストレプトアビジンバイオセンサーを用いて測定される、ＦｃポリペプチドのＦｃＲｎへの結合活性を指し、ｐＨ６で結合が発生し、ｐＨ７．４で解離が発生する。もし観察される最大応答が、対照Ｆｃポリペプチドで観察される最大応答の少なくとも１．５、１．７５または２．０倍である場合、ｐＨ６での変異型Ｆｃポリペプチドの結合活性は、対照Ｆｃポリペプチドのそれより、「より高い」とみなされる。非常に少量の残留結合応答、すなわち、ｐＨ７．４で、野生型Ｆｃ断片を含む対照Ｆｃポリペプチドを用いて観察される、ｈＦｃＲｎからほとんどのタンパク質が解離した後に残る結合応答は、「結合活性がわずかしか無いまたは結合活性が無い」とみなされる。また、もし、ｐＨ７．４でタンパク質の一部またはほとんどが解離した後で、実施例４に記述されるＦｏｒｔｅＢｉｏシステムを用いて検出される残留結合応答が、対照Ｆｃポリペプチドを用いて検出されるそれよりも、０．２または０．１ナノメーターを超えないものである場合、変異型Ｆｃポリペプチドは、ｐＨ７．４で、「結合活性がわずかしか無い、または結合活性が無い」とみなされる。
【００２１】
「アミノ酸」とは、本明細書において、ヒトタンパク質において通常見出される、２０のＬ−アミノ酸のうちの任意の１つを指し、以下のものである：アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリン。
【００２２】
「抗体」とは、本明細書において、重鎖イムノグロブリン可変領域または軽鎖イムノグロブリン可変領域を少なくとも１つ含有するタンパク質である。たとえば、ｓｃＦｖ、２以上のｓｃＦｖを含む分子、および基本的に単一のイムノグロブリン可変領域からなるドメイン抗体（たとえば、米国特許７，５６３，４４３号に記述されている）は、本明細書において「抗体」である。多くの場合において、抗体には重鎖可変領域および軽鎖可変領域と、ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域が含まれる。ゆえに、「抗体」という用語には、２つの全長重鎖および２つの全長軽鎖を含有する全長抗体（たとえば、哺乳類において見出される天然型ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＤまたはＩｇＭ抗体等）が包含される。Carayannopoulos  and  Capra,  Ch.  ９  in  FUNDAMENTAL  IMMUNOLOGY,  ３rd  ed.,  Paul,  ed.,  Raven  Press,  New  York,  １９９３,  pp.  ２８４-２８６；この参考文献の抗体について記述する部分は、参照により本明細書に援用される。例となる抗体としては、特に、アダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ（登録商標）、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、インフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標）、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ  Ｏｒｔｈｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．）、ウステキヌマブ（ＳＴＥＬＬＡＲＡ（登録商標）、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）、ゴリムマブ（ＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ  Ｏｒｔｈｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、カナキヌマブ（ＩＬＡＲＩＳ（登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｐｈａｒｍｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、オファツムマブ（ＡＲＺＥＲＲＡ（登録商標）、Ｇｌａｘｏ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｔｄ．）、トシリズマブ（ＡＣＴＥＭＲＡ（登録商標）、Ｃｈｕｇａｉ  Ｓｅｉｙａｋｕ  Ｋａｂｕｓｈｉｋｉ  Ｃｏｒｐ．，  Ｊａｐａｎ）、ベリムマブ（ＢＥＮＬＹＳＴＡ（登録商標）、ＬＹＭＰＨＯＳＴＡＴ−Ｂ（登録商標）、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｉｎｃ．）、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、セツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）、ＩｍＣｌｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）、エファングマブ（ｅｆｕｎｇｕｍａｂ）（ＭＹＣＯＧＲＡＢ（登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ  ＡＢ  Ｃｏｒｐ．）、エファリズマブ（ＲＡＰＴＩＶＡ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．）、エタラシズマブ（ＡＢＥＧＲＩＮ（登録商標）、Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ  ＬＬＣ）、ゲムツズマブ  オゾガマイシン（ＭＹＬＯＴＡＲＧ（登録商標）、Ｗｙｅｔｈ）、ギレンツキシマブ（ｇｉｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ）（ＲＥＮＣＡＲＥＸ（登録商標）、Ｗｉｌｅｘ  ＡＧ  Ｃｏｒｐ．，  Ｇｅｒｍａｎｙ）、ナタリズマブ（ＴＹＳＡＢＲＩ（登録商標）、Ｅｌａｎ  Ｐｈａｒｍｃｅｕｔｉｃａｌｓ，  Ｉｎｃ．）、オマリズマブ（ＸＯＬＡＩＲ（登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ  ＡＧ  Ｃｏｒｐ．，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、オレゴボマブ（ＯＶＡＲＥＸ（登録商標）、ＡｌｔａＲｅｘ  Ｃｏｒｐ．，  Ｃａｎａｄａ）、パリビズマブ（ＳＹＮＡＧＩＳ（登録商標）、ＡＢＢＯＳＹＮＡＧＩＳ（登録商標）、Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ  Ｉｎｃ．）、パニツムマブ（ＶＥＣＴＩＢＩＸ（登録商標）、Ａｍｇｅｎ  Ｉｎｃ．）、ラニビズマブ（ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標）、Ｇｅｎｅ���ｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．）、リツキシマブ（ＭＡＢＴＨＥＲＡ（登録商標）、ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）、Ｉｄｅｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｃｏｒｐ．）、テフィバズマブ（ＡＵＲＥＸＩＳ（登録商標）、Ｉｎｈｉｂｉｔｅｘ  Ｃｏｒｐ．）、トシツモマブ（ＢＥＸＸＡＲ（登録商標）、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ  Ｃｏｒｐ．）、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．）、およびデノスマブ（ＰＲＯＬＩＡ（登録商標）、またはＸＧＥＶＡ（登録商標）、Ａｍｇｅｎ  Ｉｎｃ．）が挙げられる。そのようなＩｇＧ抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４アイソタイプのものであり得、キメラ抗体、ヒト抗体またはヒト化抗体であり得る。さらに、「抗体」という用語には、２つの重鎖を含有するが軽鎖は含有しない（たとえばラクダや他のヒトコブラクダ種、およびサメに見いだされる天然型抗体等）二量体抗体が含まれる（たとえば、Muyldermans  et  al.,  ２００１,  J.  Biotechnol.  ７４:２７７-３０２；Desmyter  et  al,  ２００１  ,  J.  Biol.  Chem.  ２７６:２６２８５-９０；  Streltsov  et  al.  (２００５),  Protein  Science  １４:  ２９０１-２９０９を参照のこと）。抗体は、単一特異性（すなわち、ただ一種類の抗原にのみ結合する）または多特異性（すなわち、１つより多い種類の抗原に結合する）であり得る。いくつかの実施形態において、抗体は、二重特異性（すなわち、２つの異なる種類の抗原に結合する）であり得る。さらに、抗体は、一価、二価または多価であり得、それの意味するところは、一度で１つまたは２つ以上の抗原分子に結合することができるということである。とりわけ、そのような抗体の可能性のあるいくつかの形式としては、結合する分子を阻害または活性化しうる、単一特異性全長抗体または二重特異性全長抗体、単一特異性一価抗体（国際特許出願ＷＯ２００９／０８９００４および米国特許出願公開２００７／０１０５１９９に記述され、その関連部分は、参照により本明細書に援用される。および、米国特許出願公開２００５／０２２７３２４に記述され、その関連部分は参照により本明細書に援用される）、二価単一特異性もしくは二価二重特異性の二量体Ｆｖ−Ｆｃ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、または二特異性抗体Ｆｃ（ｄｉａｂｏｄｙ  Ｆｃ）、単一特異性一価ｓｃＦｖ−Ｆｃ／Ｆｃ‘ｓ、および、多特異性結合タンパク質、ならびに、米国特許出願公開２００９／０３１１２５３（その関連部分は、参照により本明細書に援用される）に記述されるデュアル可変ドメインイムノグロブリンが挙げられる。
【００２３】
「結合領域」とは、本明細書において、たとえば癌細胞、自己免疫もしくは炎症状態を調節する細胞、感染細胞、感染性病原体、もしくは免疫エフェクター機能を調節する細胞（たとえば、ＮＫ細胞）上で高度に発現されているタンパク質等の標的分子に結合する、本明細書に記述される「Ｆｃポリペプチド」、「対照Ｆｃポリペプチド」、または「変異型Ｆｃポリペプチド」に含まれる領域である。結合領域は、重鎖および／または軽鎖イムノグロブリン可変（ＶＨおよび／またはＶＬ）領域、または、非イムノグロブリンポリペプチドを含有することができる。例示的な結合領域としては、たとえば、Ｆｖ（リンカーにより連結されるＶＨおよびＶＬ領域を含む）または、標的分子に結合するヒト受容体の可溶性形態が挙げられる。
【００２４】
「Ｆｃ断片」とは、本明細書において、ヒンジ領域の一部またはすべてと、抗体のＣＨ２およびＣＨ３と、任意選択的に、たとえばＩｇＡまたはＩｇＭ抗体等の一部の天然型アイソタイプ中にあるＣＨ３領域から下流で見いだされる領域からなる、ポリペプチドである。抗体は、ＩｇＧアイソタイプ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４アイソタイプを含む）、またはＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤもしくはＩｇＡアイソタイプであり得る。抗体は、ヒトまたは動物起源のものであり得る。たとえば、抗体は、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヤギまたはヒツジ等の哺乳類由来のものであり得、またはラクダ科もしくはサメ由来のものであり得る。ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４断片の配列は、それぞれ、配列番号１、３、５、および７に記述されている。これらの配列はまた、以下の表１においても示されている。一般に、Ｆｃ断片は、２つの断片内のＣＨ３ドメインの間の相互作用を介して、二量体を形成し、それはヒンジ領域のシステイン残基の間に存在するジスルフィド結合により安定化される。「Ｆｃ領域」として本明細書で言及されるＦｃ断片は、二量体Ｆｃ断片として具体的に定義されるが、Ｆｃ断片は通常、生理条件下で二量体化することを認識されたい。二量体は、強い還元状態で、解離することができる。
【００２５】
本明細書において意図される、「Ｆｃポリペプチド」とは、Ｆｃ断片および結合領域を含むタンパク質である。Ｆｃポリペプチドには、抗体、Ｆｃ融合タンパク質、ならびに、毒素として振る舞うことができ、および／または、生物経路の活性を模倣、拮抗、作動することができ、Ｆｃポリペプチドに共有結合的に結合または融合されている非ペプチド有機部分（すなわち、「小分子」）またはペプチドである、追加の「薬理学的活性部分」を含有する抗体または融合タンパク質、が含まれる。Ｆｃ断片のようなＦｃポリペプチドは、通常、２つのＦｃポリペプチドのヒンジ領域中のシステイン残基の間のジスルフィド結合により安定化される二量体を形成する。
【００２６】
本明細書において意図される、「対照Ｆｃ断片」とは、変異型Ｆｃ断片のようにループ中に挿入を有していないという点を除き、比較される「変異型Ｆｃポリペプチド」と同一であるＦｃ断片である。ゆえに、「対照Ｆｃ断片」は、ループ（変異型Ｆｃ断片は、ここに、ｐＨ５〜６でＦｃＲｎに対する変異型Ｆｃ断片の親和力を増加させる挿入を有している）中に、天然型Ｆｃ断片において見出される非改変の配列を有している。対照Ｆｃ断片は、天然型Ｆｃ断片と比較して、挿入（複数含む）以外の改変を含有し得る。たとえば、変異型Ｆｃ断片および比較される対照Ｆｃ断片の両方において、ヘテロ二量体化改変、または以下に記述される他のマイナーな改変が存在し得る。ゆえに、「対照Ｆｃ断片」および「変異型Ｆｃ断片」の間の差異は、変異型Ｆｃ断片のループの内にある、または隣接する挿入のみである。「対照Ｆｃ領域」は、２つの対照Ｆｃ断片を含む二量体と定義されるが、対照Ｆｃ断片は、通常、二量体の形態で存在することが予期される。
【００２７】
本明細書において、「変異型Ｆｃ断片」とは、Ｆｃ断片のループの内にある、または隣接する、８０を超えないアミノ酸、６０を超えないアミノ酸、４０を超えないアミノ酸、または２０を超えないアミノ酸の挿入を含むＦｃ断片である。ヒトＩｇＧ  Ｆｃ断片のループを表１に示し、挿入がなされるループを図２に示す。他のＦｃ断片のループは、当分野に公知である。多くの配列が当分野に公知である。たとえば、Kabat  et  al.,  Sequences  of  Proteins  of  Immunological  Interest,  Public  Health  Service  N.I.H.,  Bethesda,  MD,  １９９１（そのヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域の配列および３次構造に関連する部分は、参照により本明細書に援用される）を参照のこと。Kabatらにより、多くの配列のアライメントが提供されている。Kabatらに提示されるアライメント、高度に保存されたイムノグロブリンドメインの構造、および本明細書に提示されるループの位置、ならびに当分野にさらに豊富に入手可能な情報を考慮すると、ループは、任意の種由来の任意のアイソタイプのＦｃ断片中に位置されうる。たとえば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋウェブサイトには、多くのタンパク質の３次構造に関する豊富な情報が含まれている。いくつかの実施形態において、挿入されるアミノ酸を、ループ中に天然に存在している１〜１０のアミノ酸から置き換えることができる。挿入されるアミノ酸は、除去されるアミノ酸と同じ数、少ない数、または多い数であり得る。他の実施形態においては、元々ループにあった全てのアミノ酸はそのまま残り、挿入されるアミノ酸が単に追加される。いくつかの実施形態において、変異型ヒトＩｇＧ  Ｆｃ断片は、他の「追加のマイナーな改変」、すなわち、当該挿入が存在するループ以外の位置で、１６アミノ酸を超えない挿入、欠損または置換を含むことができる。いくつかの実施形態において、当該挿入が存在するループ以外の位置で、単一アミノ酸の、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５を超えない挿入、欠損または置換があり得る。他の実施形態において、変異型Ｆｃ断片は、任意の追加のマイナーな改変を含まない。いくつかの実施形態において、追加のマイナーな改変は、たとえば、以下に記述される「ヘテロ二量体化改変」（ヘテロ二量体化Ｆｃ領域の形成を促進する）であり得る。いくつかの実施形態において、これらの追加のマイナーな改変には、保存的アミノ酸置換が含まれても良い。
【００２８】
保存的アミノ酸置換としては、以下が挙げられる：（１）アラニンに対して、バリン、ロイシンまたはイソロイシン；（２）アルギニンに対して、リジン、グルタミンまたはアスパラギン；（３）アスパラギンに対して、グルタミン、グルタミン酸またはアスパラギン酸；（４）アスパラギン酸に対して、グルタミン酸、アスパラギンまたはグルタミン；（５）システインに対して、セリンまたはアラニン；（６）グルタミンに対して、アスパラギン、グルタミン酸またはアスパラギン酸；（７）グルタミン酸に対して、アスパラギン酸、グルタミンまたはアスパラギン；（８）グリシンに対して、プロリンまたはアラニン；（９）ヒスチジンに対して、アスパラギン、グルタミン、リジンまたはアルギニン；（１０）イソロイシンに対して、ロイシン、バリン、メチオニン、アラニンまたはフェニルアラニン；（１１）ロイシンに対して、イソロイシン、バリン、メチオニン、アラニンまたはフェニルアラニン；（１２）リジンに対して、アルギニン、アスパラギン、またはグルタミン；（１３）メチオニンに対して、ロイシン、フェニルアラニンまたはイソロイシン；（１４）フェニルアラニンに対して、ロイシン、バリン、イソロイシン、アラニンまたはチロシン；（１５）プロリンに対して、アラニン；（１６）セリンに対して、スレオニン、アラニン、またはシステイン；（１７）スレオニンに対して、セリン；（１８）トリプトファンに対して、チロシンまたはフェニルアラニン；（１９）チロシンに対して、トリプトファン、フェニルアラニン、スレオニンまたはセリン；および、（２０）バリンに対して、イソロイシン、メチオニン、ロイシン、フェニルアラニンまたはアラニン。
【００２９】
さらに、いくつかの実施形態において、変異型Ｆｃ断片は、追加の「薬理学的に活性な部分」を含有することができ、当該部分は、非ペプチド有機部分（すなわち、「小分子」）またはペプチドであり、毒素として振る舞うことができ、および／または、生物経路の活性を模倣、拮抗または作動することができ、Ｆｃ断片に共有結合的に結合または融合されている。もし変異型Ｆｃ断片がそのような薬理学的に活性な部分を含有する場合、その「対照Ｆｃ断片」もまた、そのような部分を含有する。
【００３０】
他の実施形態において、変異型ヒト  ＩｇＧ  Ｆｃ断片は、挿入が存在するループの中で存在するものの外側に改変を含有しない。「Ｆｃ断片」のように、「変異型Ｆｃ断片」は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４アイソタイプを含む、ＩｇＧアイソタイプであり得、またはＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤもしくはＩｇＡであり得る。ヒトまたは動物起源のものであり得る。たとえば、Ｆｃ断片は、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヤギまたはヒツジ等の哺乳類由来であり得、または、改変して変異型Ｆｃ断片を作製することができるラクダ科もしくはサメ由来のものであり得る。他のＦｃ断片でのように、変異型Ｆｃ断片は通常、二量体であり、「変異型Ｆｃ領域」は、二量体変異型Ｆｃ断片として具体的に定義される。
【００３１】
「変異型Ｆｃポリペプチド」は、本明細書において意図されるのは、変異型Ｆｃ断片および結合領域を含むものである。任意選択的に、変異型Ｆｃポリペプチドは、複数の結合領域を含有することができる。変異型Ｆｃポリペプチドは多量体（たとえば、二量体、三量体、四量体またはより高度な多量体）であり得る。多くの場合において、Ｆｃポリペプチドの変異型Ｆｃ断片部分は、二量体化するようにジスルフィド結合を形成することができる。変異型Ｆｃポリペプチドは、たとえば二量体Ｆｃ融合タンパク質、四量体全長抗体（２つの重鎖と２つの軽鎖を含有）、二量体ｓｃＦｖ−Ｆｃ等を含む。それらは、たとえばヘテロ二量体もしくはホモ二量体等の、ヘテロ多量体またはホモ多量体であり得る。変異型Ｆｃポリペプチドは、抗体、Ｆｃ融合タンパク質であり得、またはいくつかの実施形態においては、追加の非抗体の薬理学的に活性な部分を含むＦｃ融合タンパク質または抗体であり得る。そのような「薬理学的に活性な部分」は、Ｆｃポリペプチドに共有結合的に結合または融合されていてもよく、ならびに、毒素として振る舞うことができるおよび／または、、生物経路の活性を模倣、拮抗もしくは作動することができる、非ペプチド有機部分（すなわち、「小分子」）またはペプチドであり得る。
【００３２】
「Ｆｃ融合タンパク質」とは、本明細書において意図されるのは、他の、非抗体ポリペプチドに融合したＦｃ断片を含有するタンパク質である。非抗体ポリペプチドは、標的分子に結合する結合領域を含み、抗体の重鎖または軽鎖可変領域を含有しない。Ｆｃ融合タンパク質の結合領域は、たとえば受容体の可溶性部分または、標的分子へと結合する１つ以上のペプチド（たとえば、米国特許７，８２０，７９０号に定義される、標的タンパク質に結合する「単量体ドメイン」（米国特許７，８２０，７９０号に説明されるように選択することができる））または、他のポリペプチド等の非抗体ポリペプチドを含み得る。米国特許７，８２０，７９０号の単量体ドメインを記述する部分、および、どのようにそれらを選択するかについて記述される部分は、参照により本明細書に援用される。特定の実施形態において、Ｆｃ融合タンパク質は、エタネルセプト（ＥＮＢＲＥＬ（登録商標）Ａｍｇｅｎ  Ｉｎｃ．より販売）、ロミプロスチム（ＮＰＬＡＴＥ（登録商標）Ａｍｇｅｎ  Ｉｎｃ．より販売）、アレファセプト（ＡＭＥＶＩＶＥ（登録商標）、Ｂｉｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）、アバタセプト（ＯＲＥＮＣＩＡ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ  −Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂより販売）、リロナセプト（ＡＲＣＡＬＹＳＴ（登録商標）、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎより販売）、またはアフリバーセプト（ＥＹＬＥＡ（登録商標）、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎより販売）であり得る。Ｆｃ融合タンパク質の結合領域の一部分であり得る他のポリペプチドとしては、ある部分でランダム化され、ある標的分子への結合のために選択された、スキャホールドドメインを含むポリペプチドが挙げられる。そのようなスキャホールドドメインとしては、たとえば、Ｔ−リンパ球関連タンパク質−４（ＣＴＬＡ−４；Nuttall  et  al.  (１９９９),  Proteins  ３６:  ２１７-２２７）、ブドウ球菌タンパク質１のＺドメイン（Nord  et  al.  (１９９５),  Protein  Eng.  ８:  ６０１-６０８）、緑蛍光タンパク質、およびヒトフィブロネクチンの第１０のＩＩＩ型ドメイン（ＦＮ３;  Koide  et  al.  (１９９８),  J.  Mol.  Biol.  ２８４:  １１４１-１１５１  ;  Karatan  et  al.  (２００４),  Chem.  &  Biol.  １１  :  ８３５-８４４）が挙げられる。スキャホールドドメインおよび、結合ドメインを作製するためのそれらの使用について記述するこれらの参考文献の部分は、参照により本明細書に援用される。他のＦｃ断片含有タンパク質のように、Ｆｃ融合タンパク質は、多量体（二量体であり得る）を形成することができる。これらの多量体は、ヘテロ多量体またはホモ多量体であり得る。Ｆｃ融合タンパク質は、ヘテロ二量体またはホモ二量体であり得、および二重特異性または単一特異性であり得る。
【００３３】
「変異型Ｆｃ融合タンパク質」とは、本明細書において意図されるのは、変異型Ｆｃ断片を含むＦｃ融合タンパク質である。
【００３４】
「対照Ｆｃ融合タンパク質」とは、本明細書において意図されるのは、変異型Ｆｃ融合タンパク質のＦｃ断片部分のループにおける挿入を除き、比較される変異型Ｆｃ融合タンパク質と同じアミノ酸配列を有するＦｃ融合タンパク質である。
【００３５】
「全長ＩｇＧ抗体」とは、本明細書において意図されるのは、２つの完全重鎖および２つの完全軽鎖を含むＩｇＧ抗体である。
【００３６】
「ヘテロ二量体化改変」とは、一般に、ヘテロ二量体Ｆｃ領域（すなわち、Ｆｃ領域のＡ鎖とＢ鎖が同一のアミノ酸配列を有していないＦｃ領域）の形成を促進する、二量体Ｆｃ領域の二つの鎖（すなわち、Ａ鎖とＢ鎖）における改変を指す。ヘテロ二量体化改変は、非対称（すなわち、ある改変を有するＡ鎖は、異なる改変を有するＢ鎖と対になってもよい）であり得る。これらの改変により、ヘテロ二量体化が促進され、ホモ二量体化が減じられる。１つのポリペプチド鎖がＦｃ断片（すなわち、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域以外の配列を欠いている）および他方がｓｃＦｖ−Ｆｃである場合において、ヘテロ二量体またはホモ二量体のいずれが形成されたのかは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定されるサイズ差異により分析することができる。そのような対のヘテロ二量体化改変の一つの例は、いわゆる、「ｋｎｏｂｓ  ａｎｄ  ｈｏｌｅｓ」置換である。たとえば、米国特許第７，６９５，９３６号および米国特許出願公開２００３／００７８３８５（そのような変異を記述する部分は、参照により本明細書に援用される）を参照のこと。本明細書において意図される、ｋｎｏｂｓ  ａｎｄ  ｈｏｌｅｓ置換の一対を含むＦｃ領域は、一つのＦｃ断片（Ａ鎖と規定される）に１つの置換を含有し、他のＦｃ断片（Ｂ鎖と規定される）にもう一つの置換を含む。たとえば、以下のＩｇＧ１  Ｆｃ領域のＡおよびＢ鎖のｋｎｏｂｓ  ａｎｄ  ｈｏｌｅｓ置換は、非改変のＡおよびＢ鎖での場合と比較して、ヘテロ二量体形成を増加させることが判明している：１）１つの鎖においてＹ４０７Ｔおよび他方においてＴ３６６Ｙ；２）１つの鎖においてＹ４０７Ａおよび他方においてＴ３６６Ｗ；３）１つの鎖においてＦ４０５Ａおよび他方においてＴ３９４Ｗ；４）１つの鎖においてＦ４０５Ｗおよび他方においてＴ３９４Ｓ；５）１つの鎖においてＹ４０７Ｔおよび他方においてＴ３６６Ｙ；６）１つの鎖においてＴ３６６ＹおよびＦ４０５Ａ、ならびに他方においてＴ３９４ＷおよびＹ４０７Ｔ；７）１つの鎖においてＴ３６６ＷおよびＦ４０５Ｗ、ならびに他方においてＴ３９４ＳおよびＹ４０７Ａ；８）１つの鎖においてＦ４０５ＷおよびＹ４０７Ａ、ならびに他方においてＴ３６６ＷおよびＴ３９４Ｓ；９）Ｆｃの一つのポリペプチドにおいてＴ３６６Ｗ、および他方において、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ。本明細書において意図される、変異は、以下の方法で示される。ＥＵ付番方式（以下の表１を参照のこと）を用いた、Ｆｃ断片の所与の位置で通常存在するアミノ酸（１文字コードを用いる）に続き、ＥＵ位置、それに続き、その位置に存在する代替アミノ酸が続く。たとえば、Ｙ４０７Ｔは、ＥＵ位置４０７で通常存在するチロシンが、スレオニンで置換されていることを意味する。あるいは、または、そのような改変に加えて、新たなジスルフィド架橋を形成する置換により、ヘテロ二量体の形成を促進することができる。たとえば、米国特許出願公開２００３／００７８３８５（そのような変異について記述する部分は、参照により本明細書に援用される）を参照のこと。ＩｇＧ１  Ｆｃ領域におけるそのような改変には、たとえば、以下の置換が挙げられる：一つのＦｃ断片に��いてＹ３４９Ｃおよび、他方においてＳ３５４Ｃ；一つのＦｃ断片においてＹ３４９Ｃおよび、他方においてＥ３５６Ｃ；一つのＦｃ断片においてＹ３４９Ｃおよび、他方においてＥ３５７Ｃ；一つのＦｃ断片においてＬ３５１Ｃおよび、他方においてＳ３５４Ｃ；一つのＦｃ断片においてＴ３９４Ｃおよび、他方においてＥ３９７Ｃ；または、一つのＦｃ断片においてＤ３９９Ｃおよび、他方においてＫ３９２Ｃ。同様に、一つ以上の残基の電荷を変化させる置換（たとえば、ＣＨ３−ＣＨ３接合点におけるもの）は、ＷＯ２００９／０８９００４（そのような置換について記述する部分は、参照により本明細書に援用される）に概説されるように、ヘテロ二量体形成を増強することができる。そのような置換は、本明細書において「電荷対置換」と呼称され、電荷対置換の１つの対を含有するＦｃ領域は、Ａ鎖に１つの置換を含有し、Ｂ鎖に異なる置換を含有する。電荷対置換の一般的な例としては、以下が挙げられる：１）１つの鎖においてＫ４０９ＤまたはＫ４０９Ｅ、そして他方においてＤ３９９ＫまたはＤ３９９Ｒ；２）１つの鎖においてＫ３９２ＤまたはＫ３９２Ｅ、そして他方においてＤ３９９ＫまたはＤ３９９Ｒ；３）１つの鎖においてＫ４３９ＤまたはＫ４３９Ｅ、そして他方においてＤ３５６ＫまたはＤ３５６Ｒ；４）１つの鎖においてＫ３７０ＤまたはＫ３７０Ｅ、そして他方においてＥ３５７ＫまたはＥ３５７Ｒ。さらに、両鎖におけるＲ３５５Ｄ、Ｒ３５５Ｅ、Ｋ３６０ＤまたはＫ３６０Ｒの置換は、他のヘテロ二量体化改変とともに用いられる際、ヘテロ二量体を安定化させることができる。特定の電荷対置換を、単独または他の電荷対置換と共に、のいずれかで用いることができる。電荷対置換の単一の組み合わせの具体例およびそれらの組み合わせとしては、以下が挙げられる：１）１つの鎖においてＫ４０９Ｅ、そして他方においてＤ３９９Ｋ；２）１つの鎖においてＫ４０９Ｅ、そして他方においてＤ３９９Ｒ；３）１つの鎖においてＫ４０９Ｄ、そして他方においてＤ３９９Ｋ；４）１つの鎖においてＫ４０９Ｄ、そして他方においてＤ３９９Ｒ；５）１つの鎖においてＫ３９２Ｅ、そして他方においてＤ３９９Ｒ；６）１つの鎖においてＫ３９２Ｅ、そして他方においてＤ３９９Ｋ；７）１つの鎖においてＫ３９２Ｄ、そして他方においてＤ３９９Ｒ；８）１つの鎖においてＫ３９２Ｄ、そして他方においてＤ３９９Ｋ；９）１つの鎖においてＫ４０９ＤおよびＫ３６０Ｄ、そして他方においてＤ３９９ＫおよびＥ３５６Ｋ；１０）１つの鎖においてＫ４０９ＤおよびＫ３７０Ｄ、そして他方においてＤ３９９ＫおよびＥ３５７Ｋ；１１）１つの鎖においてＫ４０９ＤおよびＫ３９２Ｄ、そして他方においてＤ３９９Ｋ、Ｅ３５６ＫおよびＥ３５７Ｋ；１２）１つの鎖においてＫ４０９ＤおよびＫ３９２Ｄ、そして他方においてＤ３９９Ｋ；１３）１つの鎖においてＫ４０９ＤおよびＫ３９２Ｄ、そして他方においてＤ３９９ＫおよびＥ３５６Ｋ；１４）１つの鎖においてＫ４０９ＤおよびＫ３９２Ｄ、そして他方においてＤ３９９ＫおよびＤ３５７Ｋ；１５）１つの鎖においてＫ４０９ＤおよびＫ３７０Ｄ、そして他方においてＤ３９９ＫおよびＥ３５７Ｋ；１６）１つの鎖において��３９９Ｋ、そして他方においてＫ４０９ＤおよびＫ３６０Ｄ；１７）１つの鎖においてＫ４０９ＤおよびＫ４３９Ｄ、そして他方においてＤ３９９ＫおよびＥ３５６Ｋ。これらの任意のヘテロ二量体化改変は、本明細書に記述される変異型Ｆｃ領域の一部であり、対照Ｆｃ領域よりも高い親和力でＦｃＲｎに結合することができる。
【００３７】
「ループ」とは、本明細書において意図するのは、コアイムノグロブリンフォールドのβシートを形成するβストランドに結合するＦｃ断片における３次元構造の一部である。ループには、βシートに組み込まれると規定される２を超えない連続した残基を含有し得（たとえばループ１０および１１において見られる。以下の表１を参照）、また、ヘリックス、ターン、単離β架橋またはベンドとして規定される残基を含有し得る。本明細書において意図する、ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域のループ領域を、表１に示す。
【００３８】
「ループの内にある挿入」または、任意のアミノ酸の連続配列の「内にある」（たとえば、ループ１０の内にある挿入）とは、ループの内にある２つの隣接するアミノ酸の間、またはループの内にあるアミノ酸とループの一部ではない隣接するアミノ酸との間の３〜３５、３〜２０、６〜２０、６〜１５、６〜１２、３〜１５、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６のアミノ酸の挿入である。また、「ループの内にある挿入」は、アミノ酸がループから除去され、他のアミノ酸がそのループ内に挿入される場合も包含される。ループ内に挿入されるアミノ酸数は、３〜３５、３〜２２、４〜２０、６〜１８、６〜１５、６〜１２、３〜１５、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６であり得、ループから除去されるアミノ酸数は、ループ内に挿入されるアミノ酸数より少ないか、同じであるか、または多くても良い。たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０のアミノ酸がループから除去され得る。さらに、「ループの内にある挿入」とは、同じループの内で２以上の挿入が存在する実施形態（たとえば、上述のように、ループの内にある、または隣接する２つの異なるアミノ酸対の間の挿入）、またはループの内にある隣接していない１以上のアミノ酸が除去され、そして除去されたアミノ酸よりも少ないか、同じか、または多いアミノ酸で置換される実施形態も包含する。ライブラリＬ３（図２に示す）は、そのような挿入スキームの一例である。
【００３９】
「ループの内にある挿入、または隣接する挿入」は、ループに隣接する第一のアミノ酸と、この第一のアミノ酸に隣接し、ループの外にある他のアミノ酸との間に挿入がある場合もまた含まれる点を除き、上述の「ループの内にある挿入」と類似である。
【００４０】
「生理ｐＨ」は、本明細書において、約７．２〜７．６のｐＨである。
【００４１】
「ｓｃＦｖ−Ｆｃ／Ｆｃ」は、本質的に、１つ以上のジスルフィド結合により結合されるｓｃＦｖ−ＦｃそしてＦｃ断片からなる二量体タンパク質である。さらに、Ｆｃ断片およびｓｃＦｖ−Ｆｃにより形成されるＦｃ領域は、ＣＨ３ドメイン中に「ヘテロ二量体化改変」（たとえば、上述のように、１、２、３またはそれ以上の電荷対置換基の対）を含むことができる。
【００４２】
「ペプチド」は本明細書において、短いポリペプチドである。一般的に、ペプチドは２〜８０、２〜６０、２〜５０、２〜４０、２〜３０、または２〜２０のアミノ酸長である。
【００４３】
「標的分子」は、本明細書において意図されるのは、本明細書に記述されるＦｃポリペプチドの結合領域が結合する分子である。いくつかの実施形態において、標的分子は、たとえば、癌細胞上に高レベルで発現するタンパク質、または自己免疫疾患もしくは炎症状態を調節する細胞上に発現するタンパク質、または感染細胞上もしくは感染性病原体上に発現するタンパク質、または免疫エフェクター機能を調節する細胞（たとえば、ＮＫ細胞）上に発現するタンパク質である。
【００４４】
本明細書に記述される、対照ＦｃポリペプチドよりもＦｃＲｎに対する高い親和力を有する変異型Ｆｃポリペプチドの「治療有効量」とは、たとえば、癌患者の腫瘍組織量を減少もしくは除去する、または、そのタンパク質を用いて治療する任意の疾患状態の症状を、減少もしくは除去する効果を有する量である。治療有効量とは、かならずしも、全ての疾患症状を除去する必要は無いが、１以上の症状の重篤度を減少させ得、またはより重篤な症状の発現を遅延させ得、または疾患治療の後、ある頻度で発生しうるより重篤な疾患の発現を遅延させ得る。あるいは、改変Ｆｃポリペプチドを含有するタンパク質の治療有効量は、ｉｎ  ｖｉｖｏで治療を必要とする患者に投与される際に、関連バイオマーカーの発現に検出可能な影響を与えるのに十分な量である。
【００４５】
本明細書において言及される任意の疾患の「治療」には、疾患の少なくとも１つの症状の緩和、疾患の重篤度の減少、またはより重篤な症状（一部の例においては、疾患に付随して起こりうる、または少なくとも１つの他の疾患をもたらす）へと疾患が進行するのを遅延させる、または予防することが包含される。治療とは、必ずしも疾患が完治することを意味しない。有用な治療剤とは、疾患の重篤度の減少、疾患またはその治療に伴う１つ以上の症状の重篤度の減少、または、より重篤な症状もしくはより重篤な疾患（疾患治療の後、ある頻度で発生しうる）の発生を遅延させることのみが、必要とされる。
【００４６】
変異型Ｆｃポリペプチド
５．０〜６．０のｐＨで、対照Ｆｃポリペプチドよりも高い親和力および／または結合活性でＦｃＲｎに結合する変異型Ｆｃポリペプチドが提供される。そのような変異型Ｆｃポリペプチドは、対照Ｆｃポリペプチドのように、約７．２〜７．６のｐＨで、仮にあったとしても、低い親和力および／または結合活性でＦｃＲｎに結合する。これらの変異型Ｆｃポリペプチドは、（改変の前には）、ヒトまたは動物由来のものであり得、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４を含むＩｇＧアイソタイプのものであり得る。また、ＦｃＲｎは、ヒトまたは動物由来のものであり得る。これらの変異型Ｆｃポリペプチドはさらに、本明細書に記述される、標的分子に結合することができる結合領域を含み、少なくとも部分的に標的分子により調節される状態を治療するために用いることができる。いくつかの実施形態において、標的分子は、治療される疾患状態を直接的に調節しなくとも良いが、標的分子への結合によりＦｃポリペプチドまたはそれが結合する標的分子（複数含む）を局所にとどめることに役立つ。たとえば、二重特異性Ｆｃポリペプチドは、２つの異なる細胞型（たとえば、癌細胞および免疫系細胞。それぞれが、Ｆｃポリペプチドが結合することができる標的分子を表面上に発現している）を、架橋し得る。変異型Ｆｃポリペプチドは、変異型Ｆｃ断片を含む抗体またはＦｃ融合タンパク質であり得る。変異型Ｆｃポリペプチドは、さらに、追加の非抗体結合領域を含む抗体であり得る。任意選択的に、変異型Ｆｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ変異型Ｆｃ断片を含有し得る。
【００４７】
以下の表１において、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４  Ｆｃポリペプチドのアミノ酸配列（それぞれ配列番号１、３、５および７）が整列されている。配列は、Edelman  et  al.  (１９６９),  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  ６３:  ７８-８５（その関連部分は、参照により本明細書に援用される）のＥＵ方式に従い付番される。表１に示されるように、一つの数字を用いて、４つすべてのヒトＩｇＧアイソタイプで類似している位置を指すことができる（線形的な付番スキームでは各アイソタイプのこの位置に対し異なる数値を指定せざるを得ない）。たとえば、２９７位のアスパラギンは良く知られており、考察されているヒトＩｇＧアイソタイプが何であるかに関わらず、全てのヒトＩｇＧ抗体に存在する、高度に保存された、アスパラギン２９７と呼ばれるグリコシル化部位である。
【００４８】
ヒトＩｇＧ３抗体は、他のヒトＩｇＧアイソタイプよりも非常に長いヒンジ領域を有しており、このヒンジ領域の最も大きなカルボキシ末端部位のみを表１に示す。ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４の配列（表１に示す）は、完全なヒンジ領域を含む。表１に示されるように、ヒトＩｇＧ４抗体のヒンジ領域は、ＩｇＧ１抗体のそれよりも３アミノ酸、短い。ヒトＩｇＧ２抗体は、ヒトＩｇＧ１抗体を比べて、やや短いヒンジ領域と、ＣＨ２領域のアミノ末端に近い１つのアミノ酸のギャップを有している。表１のＩｇＧ１系に示されるアミノ酸２１６−４４７、および表１のＩｇＧ４系のアミノ酸２２４〜４４７は、それぞれ、配列番号１のアミノ酸１〜２３２と、配列番号７の６〜２２９に対応している。表１のＩｇＧ３系のアミノ酸２１６〜４４７は、配列番号５のアミノ酸４８〜２７９に対応している。表１のＩｇＧ２系のアミノ酸２３７〜４４７は、配列番号３のアミノ酸１８〜２２８に対応している。
【００４９】
表１において、本明細書で意図されるようにループに位置するアミノ酸は、太字および下線で示される。各ループは、数字でラベルされている。すなわち、下に、「ループ１」、「ループ２」等である。より詳細には、ループは以下の位置で存在している：ループ１、配列番号１のアミノ酸２９〜４３、配列番号３のアミノ酸２５〜３９、配列番号５のアミノ酸７６〜９０、および配列番号７のアミノ酸２６〜４０；ループ２、配列番号１のアミノ酸５０〜５８、配列番号３のアミノ酸４６〜５４、配列番号５のアミノ酸９７〜１０５、および配列番号７のアミノ酸４７〜５５；ループ３、配列番号１のアミノ酸７０〜７２、配列番号３のアミノ酸６６〜６８、配列番号５のアミノ酸１１７〜１１９、および配列番号７のアミノ酸６７〜６９；ループ４、配列番号１のアミノ酸８０〜８４、配列番号３のアミノ酸７６〜８０、配列番号５のアミノ酸１２７〜１３１、および配列番号７のアミノ酸７７〜８１；ループ５、配列番号１のアミノ酸９２〜１０３、配列番号３のアミノ酸８８〜９９、配列番号５のアミノ酸１３９〜１５０、および配列番号７のアミノ酸８９〜１００；ループ６、配列番号１のアミノ酸１１０〜１１６、配列番号３のアミノ酸１０６〜１１２、配列番号５のアミノ酸１５７〜１６３、および配列番号７のアミノ酸１０７〜１１３；ループ７、配列番号１のアミノ酸１２２〜１３１、配列番号３のアミノ酸１１８〜１２７、配列番号５のアミノ酸１６９〜１７８、および配列番号７のアミノ酸１１９〜１２８；ループ８、配列番号１のアミノ酸１３７〜１４６、配列番号３のアミノ酸１３３〜１４２、配列番号５のアミノ酸１８４〜１９３、および配列番号７のアミノ酸１３４〜１４３；ループ９、配列番号１のアミノ酸１５８〜１６２、配列番号３のアミノ酸１５４〜１５８、配列番号５のアミノ酸２０５〜２０９、および配列番号７のアミノ酸１５５〜１５９；ループ１０、配列番号１のアミノ酸１６９〜１７５、配列番号３のアミノ酸１６５〜１７１、配列番号５のアミノ酸２１６〜２２２、および配列番号７のアミノ酸１６６〜１７２；ループ１１、配列番号１のアミノ酸１７９〜１８８、配列番号３のアミノ酸１７５〜１８４、配列番号５のアミノ酸２２６〜２３５、および配列番号７のアミノ酸１７６〜１８５；ループ１２、配列番号１のアミノ酸１９９〜２０７、配列番号３のアミノ酸１９５〜２０３、配列番号５のアミノ酸２４６〜２５４、および配列番号７のアミノ酸１９６〜２０４；ループ１３、配列番号１のアミノ酸２１４〜２２１、配列番号３のアミノ酸２１０〜２１７、配列番号５のアミノ酸２６１〜２６８、および配列番号７のアミノ酸２１１〜２１８。
【００５０】
【表２】
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【００５１】
「ＤＳＳＰ」（Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅを表す）と示されている各アライメント群の５列目における印は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋから入手できる１ＨＺＨ（Ｈ鎖）構造から取られたものであり、以下の意味を有する：「Ｇ」は、３ターンのヘリックス（３１０ヘリックス）を示し、最短で３残基を有する；「Ｈ」は４ターンヘリックス（αヘリックス）を示し、最短で４残基を有する；「Ｉ」は５ターンヘリックス（πヘリックス）を示し、最短で５残基を有する；「Ｔ」は水素結合ターン（３、４または５ターン）を示す；「Ｅ」は、βシート構造と並行して、および／または逆行して伸長されたストランドを示し、最短で２残基を有する；「Ｂ」は単離βブリッジ（βシート水素結合形成の１つの対）における残基を示す；「Ｓ」は、ベンド（唯一の非水素結合ベースの割当）を示す。上述の構造のいずれにもないアミノ酸残基は、「ＤＳＳＰ」の列で空白を割り当てられている。これらの指定は当分野では標準的であり、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）のウェブサイトで入手可能である。
【００５２】
ヒトＩｇＧ  Ｆｃ断片のヒンジ領域は、表１の番号でアミノ酸２１６〜２３０である。ＣＨ２領域は、アミノ酸２３１〜３４０に伸長し、ＣＨ３領域は、アミノ酸３４１〜４４７に伸長する。表１のアライメントより、ヒトＩｇＧ  Ｆｃ断片の配列は高度に保存されていることが明白である。ほとんどの配列の差異はヒンジ領域で発生しており、ごく少数の配列の差異が、ＣＨ２およびＣＨ３領域において発生している。ゆえに、１つのヒトＩｇＧサブタイプのＣＨ２およびＣＨ３領域中に挿入を含むヒトＩｇＧ変異型Ｆｃ断片を含む変異型Ｆｃポリペプチドを用いて得られた結果は、他のヒトＩｇＧサブタイプへも適用可能であろう。
【００５３】
本明細書に記述される変異型ヒトＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドの挿入は、ループ中であると知られている位置で発生し得る。挿入は、ＦｃポリペプチドのＦｃ断片部分のループ１〜１３（上述の表１に示す）の任意のものの内に、または隣接して、発生し得る。いくつかの実施形態において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５もしくは１６、または１〜１８、６〜１６、１０〜１６、１２〜１４、３〜２０、２０〜３０、３０〜５０もしくは５０〜８０アミノ酸の挿入が、２つの隣接するアミノ酸（少なくとも１つはＦｃ断片のループに含まれる）の間で為され得る。いくつかの実施形態において、２つのシステインが、挿入中に非ランダムで含まれており、それぞれ１つは、挿入の最初と最後の４アミノ酸の間にあり、システインの間にあるアミノ酸をジスルフィド結合によりしっかりと結び付けられたループの中に拘束する。いくつかの実施形態において、挿入の最初の３アミノ酸は、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓであり、最後の３アミノ酸はＣｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙである。追加の４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１０−３０アミノ酸の挿入が、これらの２つのシステインの間に挿入されてもよい。さらに他の実施形態において、ループ由来の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸が欠損し、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５もしくは１６または１〜１８、６〜１６、１０〜１６、１２〜１４、１５〜３０、３０〜５０、または５０〜８０アミノ酸の挿入により置換され、および／または、挿入の最初と最後の４アミノ酸の間に２つのシステインを含む挿入により、置換される。欠損されるアミノ酸の数は、挿入されるアミノ酸よりも、同じか、少ないか、多い数であり得る。他の実施形態において、２以上の挿入が、単一のループ内で発生し得る。挿入を含む変異型Ｆｃポリペプチドは、ｐＨ５〜６で、対照Ｆｃポリペプチドよりも、高い親和力でヒトＦｃＲｎに結合することができる。挿入されるアミノ酸は、全２０アミノ酸のいずれか、またはシステイン以外の全アミノ酸のいずれかを含んでも良い。さらに、変異型Ｆｃ断片は、１つのループにのみ挿入を含有し得、または、２以上のループ（たとえば２、３または４つのループ）内に挿入を含み得る。
【００５４】
Ｆｃ断片のループ５、８または１０の内にある、または隣接する挿入は、ｐＨ５〜６で、そのような変異型Ｆｃ断片のヒトＦｃＲｎに対する結合親和力を増加させることができる。特定の実施形態において、挿入は、アミノ酸３５８および３５９の間でループ８の内に、または隣接して、ヒトＩｇＧ  Ｆｃ断片においてなされることができ、または、アミノ酸３８４および３８５の間でループ１０の内に、または隣接して、ヒトＩｇＧ  Ｆｃ断片においてなされることができる（表１に図示されるＥＵ付番スキームを使用）。当該挿入は、４〜２０、１〜１８、６〜１６、１０〜１６、１２〜１４、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６のアミノ酸を含有し得る。任意選択的に、アミノ酸は、システイン以外の全アミノ酸に限定され得る。いくつかの実施形態において、挿入は、挿入の最初と最後の４アミノ酸の間でシステインを含むことができ、および、挿入されるアミノ酸は、別の場合においては、システイン以外のアミノ酸に限定することができる。いくつかの実施形態において、挿入はシステインを含まないことができる。いくつかの実施形態において、挿入は、ＣＸＸＸＸＸＸＣ（配列番号１３）、ＣＸＸＸＸＸＸＸＣ（配列番号１４）、ＣＸＸＸＸＸＸＸＸＣ（配列番号１５）、ＧＣＸＸＸＸＸＸＣＧ（配列番号１６）、ＧＣＸＸＸＸＸＸＸＣＧ  （配列番号１７）、ＧＣＸＸＸＸＸＸＸＸＣＧ（配列番号１８）、ＧＧＣＸＸＸＸＸＸＣＧＧ（配列番号１９）、ＧＧＣＸＸＸＸＸＸＸＣＧＧ（配列番号２０）、および、ＧＧＣＸＸＸＸＸＸＸＸＣＧＧ（配列番号２１）、ＧＧＧＣＸＸＸＸＸＸＣＧＧＧ（配列番号２２）、ＧＧＧＣＸＸＸＸＸＸＸＣＧＧＧ（配列番号２３）、および、ＧＧＧＣＸＸＸＸＸＸＸＸＣＧＧＧ（配列番号２４）からなる群から選択される式を有することができ、ここで、Ｘは、システイン以外の任意のアミノ酸を表す。以下の実施例において記述されるスクリーニングプロセスから実際の挿入が得られるため、Ｆｃ断片の特性の観察された変化において主要な役割を果たす可能性のあるものは、ランダム化アミノ酸である。そのため、上述のように、非ランダムのアミノ酸をいくつか含む、ランダム化された挿入部分のみを含む挿入を有する変異型Ｆｃ断片もまた、所望の特性を有することができる。そのような配列の例としては、配列番号４１〜５３由来の中心の６アミノ酸が挙げられ、それらは配列番号５４〜６６に示される。
【００５５】
他の実施形態において、ループ５の内にある、または隣接するアミノ酸３０８および３０９（表１に示されるＥＵ付番方式を使用）は、欠損または４〜２０、１〜１８、６〜１６、１０〜１６、１２〜１４、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１５−２０、２０〜４０、４０〜６０または６０〜８０アミノ酸（システイン以外の全アミノ酸に限定されてもよい）から置換される。いくつかの実施形態において、挿入は、挿入の最初と最後の４アミノ酸の間でシステインを含むことができ、および、他方で、挿入されたアミノ酸は、システイン以外のアミノ酸に限定することができる。当該挿入は、配列番号１３〜２４からなる群から選択される式を有することができる。
【００５６】
これらの変異型Ｆｃ断片、ならびにそれらを含むＦｃポリペプチド（上述および以下に記述されるアミノ酸挿入を含む）は、ｐＨ５〜６で、対照Ｆｃ断片と比較して高い親和力および／または結合活性でヒトＦｃＲｎに結合することができ、生理ｐＨで、対照Ｆｃ断片のそれよりも、同等かまたは低い親和力および／または結合活性でヒトＦｃＲｎに結合することができる。さらに、これらの変異型Ｆｃ断片は、ｐＨ５〜６でヒトＦｃＲｎに対する、さらに高い親和力および／もしくは結合活性を、生理ｐＨでヒトＦｃＲｎに対する、さらに低い親和力および／もしくは結合活性を、または、たとえば保管での安定性等の、他の所望される特性をもたらすように改変されることができ、および、改変のためのスクリーニングを受けることができる。以下の実施例において、Ｆｃ断片内の既定の部位での、特定のアミノ酸配列の挿入（たとえば、配列番号４１〜６６および、９０〜２４６）が、ｐＨ５〜６でのヒトＦｃＲｎに対するＦｃ断片の親和力および／または結合活性の増加に効果的であることが示されている。
【００５７】
ヒトＩｇＧ変異型Ｆｃ断片を含む変異型Ｆｃポリペプチドはまた、標的分子に結合する結合領域を含む。そのような変異型Ｆｃポリペプチドの標的分子への結合は、標的分子の生物学的活性を調節（任意選択的に拮抗または作動）することができ、および／または、Ｆｃポリペプチドが、標的分子が発現される位置に局在するのに役立つことができる。Ｆｃポリペプチドは、Ｆｃポリペプチド中に、２以上の結合領域（たとえば２、３または４つの結合領域等）を含むことができる。Ｆｃポリペプチドは、多量体（一部の例においては、二量体、三量体または四量体）を形成することができるため、異なるＦｃポリペプチドの多量体化により、２以上の標的分子に結合することができる多量体Ｆｃポリペプチドを形成することができる。もし、Ｆｃポリペプチド中に複数の結合領域が存在する場合、それらは、同じもしくは異なる標的分子、または標的分子の部分に結合することができる。標的分子の活性の調節により、その標的分子により少なくとも部分的に調節されている疾患または状態の経過に影響を与えることができる。ヒトＩｇＧ変異型Ｆｃポリペプチドは、１以上の標的分子に結合する１以上の抗体改変領域を含む結合領域を含むことができる。そのようなヒトＩｇＧ変異型Ｆｃポリペプチドは、たとえば、全長抗体（たとえば、ヒトＩｇＧ抗体、ヒト化ＩｇＧ抗体またはキメラＩｇＧ抗体）、ｓｃＦｃ−Ｆｖ、たとえば国際特許出願公開ＷＯ２００５／０６３８１６号および米国特許出願公開２００７／０１０５１９９（それらの関連部分は、参照により本明細書に援用される）に記述される抗体の一価形態（それらは、二量体Ｆｃ領域、ならびにＶＨ、ＣＨ１、ＶＬ、ＣＬ、およびヒンジ領域を含む）であり得る。たとえば、さらなる形態は、米国特許出願公開２０１０／０２８６３７４（図２を記述するおよび／または図２に言及する文章と共に、参照により本明細書に援用される）の図２において、および米国特許５，８３７，８２１号（Ｆｃ領域に連結したｓｃＦｖを含む「ミニボディ」を記述する）において、記述されている。ミニボディについて記述する米国特許５，８３７，８２１号の部分は、参照により本明細書に援用される。あるいは、結合領域は、標的分子に結合する、非抗体タンパク質（任意選択的に、ヒトタンパク質）の一部またはすべてを含むことができる。たとえば、結合領域は、ヒトｐ７５腫瘍壊死因子受容体（配列番号１３）またはヒトＴリンパ球関連タンパク質（ＣＴＬＡ４）タンパク質（配列番号１４）の細胞外領域等の、受容体の細胞外部分を含み得る。
【００５８】
結合領域は、標的分子に結合する、１以上のペプチド（たとえば、標的分子に結合する、米国特許７，８２０，７９０号に定義され、米国特許７，８２０，７９０号において検討されるように選択されることができる、「単量体ドメイン」）、または他のペプチドを含むことができる。単量体ドメインおよびそれらの選択法を記述する米国特許第７，８２０，７９０号の部分は、参照により本明細書に援用される。そのようなペプチドの１つの例は、Ｆｃ融合タンパク質ロミプロスチム（ＮＰＬＡＴＥ（登録商標）、Ａｍｇｅｎ  Ｉｎｃ．，  Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の結合部分である。処方情報、ＮＰＬＡＴＥ（登録商標）、Ａｍｇｅｎ  Ｉｎｃ．，２００８−２０１１。Ｆｃ融合タンパク質の結合領域の部分でありうる他のポリペプチドとしては、ある部分でランダム化され、ある標的分子への結合に対する選別に供されるスキャホールドドメインを含むポリペプチドが挙げられる。そのようなスキャホールドドメインとしては、たとえば、ＣＴＬＡ−４（Nuttall  et  al.  (１９９９),  Proteins  ３６:  ２１７-２２７）、ブドウ球菌タンパク質１のＺドメイン（Nord  et  al.  (１９９５),  Protein  Eng.  ８:  ６０１-６０８）、緑蛍光タンパク質、およびヒトフィブロネクチンの第１０のＩＩＩ型ドメイン（ＦＮ３；  Koide  et  al.  (１９９８),  J.  Mol.  Biol.  ２８４:  １１４１-１１５１  ;  Karatan  et  al.  (２００４),  Chem.  &  Biol.  １１  :  ８３５-８４４）が挙げられる。スキャホールドドメインおよび、結合ドメインを作製するためのそれらの使用について記述するこれらの参照文献の部分は、参照により本明細書に援用される。
【００５９】
結合領域が結合する、標的分子は、その分子の生物学的活性の調節が、疾患または状態の経過に影響を与える分子、または、たとえば癌細胞表面上に発現されるタンパク質等の疾患領域に局在する分子であり得る。自己免疫状態または炎症状態において、標的分子は、その状態を調節する役割を果たす経路において作用する分子であり得る。標的分子は、標的分子への結合により、疾患の経過が影響を受けるように適切にＦｃポリペプチドを位置づけるように局在する分子であり得る。たとえば、Ｆｃポリペプチドが毒素を含む場合、癌細胞上に高度に発現されているタンパク質に結合する結合領域を用いて、癌細胞のそばに位置づけることによって、有利な効果が得られる。標的分子としては、たとえば、可溶性リガンド、受容体結合リガンド、可溶性受容体、膜結合受容体、膜チャネルタンパク質、可溶性結合タンパク質および膜結合タンパク質、ならびに非タンパク質抗原（細胞外標的分子、細胞内標的分子を含む）等のタンパク質の一般的な種類が挙げられる。例示的な標的分子としては、限定されないが、とりわけ、以下のヒトタンパク質が挙げられる：腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子受容体、インターロイキン−１、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、ＩＬ−６受容体、ＣＤ８０／８６、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、インターロイキン−１２、インターロイキン−２３、インターロイキン−１７、ＨＥＲ２、ＨＥＲ２  ｎｅｕ受容体、上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）、ＲＡＮＫリガンド、ＯＲ５１Ｅ２、クローディン（ｃｌａｕｄｉｎｓ）、ＣＤＨ３、ＣＤ２２、補体因子、およびスクレロスチン（ｓｃｌｅｒｏｓｔｉｎ）。
【００６０】
変異型Ｆｃポリペプチドが産生される宿主細胞および／または用いられた精製方法に部分的に依存して、変異型Ｆｃポリペプチドはさらに、たとえば真核細胞における分泌を促進するシグナル配列（タンパク質の成熟形態では除去されている）、細菌における翻訳を促進するＮ末端メチオニン、および／または、タンパク質精製または同定を容易にするタグ配列（たとえば、ポリヒスチジンタグまたはＦＬＡＧ（登録商標）タグ等）等の追加のアミノ酸配列を含むことができる。
【００６１】
変異型Ｆｃ断片のライブラリをコードする核酸
また、本明細書において、挿入（Ｆｃ断片のループの内にある、または隣接して存在し、少なくとも部分的にランダム化されている）を有するＦｃ断片をコードする核酸のライブラリを記載する。図２に、作製された８つのライブラリそれぞれの形式が図示されており、以下の実施例に記述される。これらのライブラリの配列および、それらによりコードされるアミノ酸配列は、配列番号２５〜４０に開示されている。そのようなライブラリは、ｐＨ５．０〜６．０で対照Ｆｃ断片と比較して増強された親和力でＦｃＲｎに結合する変異型ヒトＩｇＧ  Ｆｃ断片をコードする個々の核酸を選択するためのパンニングに有用である。そのような変異型ヒトＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドはまた、ｐＨ７．２〜７．６で、対照Ｆｃ断片のように、仮にあったとしても、十分にはＦｃＲｎに結合しない可能性がある。
【００６２】
いくつかの実施形態において、ループ領域をコードする領域に挿入を有するＦｃ断片をコードする核酸のこれらのライブラリ（表１に説明される）は、マウス、ラット、ウサギもしくはサルのＦｃ断片、またはラクダ科由来のＦｃ断片をコードする核酸を含む、ヒトまたは動物由来のものであり得る。いくつかの実施形態において、コードされたＦｃ断片は、たとえばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４のＦｃ断片等のＩｇＧ  Ｆｃ断片、またはＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤもしくはＩｇＭアイソタイプのＦｃ断片であり得る。ループをコードする核酸部位における挿入は、ループ１、ループ２、ループ３、ループ４、ループ５、ループ６、ループ７、ループ８、ループ９、ループ１０、ループ１１、ループ１２、またはループ１３をコードする核酸配列（表１に示される）の内にある、または隣接するものであり得る。
【００６３】
ライブラリの異なる変異型の数と比較して、ライブラリのサイズは、重要な検討事項である。最も良いケースでは、ライブラリが供されるパンニング方法において、ライブラリ中に含まれるすべての異なる変異型が含まれる確率が高い。ライブラリ中の異なる変異型の数は、ライブラリ中のランダム化された位置の数、および各ランダム化された位置で用いることができる異なるアミノ酸の数に依存する。たとえば、任意の１９の異なるアミノ酸を含むことができる６つのランダム化された位置を有するライブラリは、理論上、１９６≒４．７×１０７の異なる変異型を有することができる。たとえば、もし、これらの変異型を発現する１０９の独立したファージまたは細菌をパンニングすれば、スクリーニングにおいて、選択特性を有する分離株がすべて回収される可能性が非常に高い。たとえば、Grossman  and  Turner,  Mathematics  for  the  Biological  Sciences,  Chapter  ２,  Section  ２.９,  pp.  ９７-１０４,  Macmillan  Publishing  Co.,  Inc.,  New  York  and  Collier  Macmillan  Publishers,  London,  １９７４を参照のこと（それらの項は、参照により本明細書に援用される）。所望される特性を有する稀な分離株を検出するために、十分な数の分離株をスクリーニングすることができるサイズのライブラリが企図される。ゆえに、１０５〜１０１３、１０６〜１０１２、または１０７〜１０１０の異なる変異型をコードするライブラリが予期される。
【００６４】
Ｆｃ断片のコード部位のループ５、８および１０をコードする核酸配列の内にある、または隣接するランダム化挿入を有するライブラリが、有利となり得る。そのようなライブラリは、２０〜４０、４〜２０、１〜１８、６〜１６、１０〜１６、１２〜１４、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６のランダム化アミノ酸を含むループ５、８または１０の内にある、または隣接する挿入を有するＦｃ断片をコードすることができる。これらのランダム化アミノ酸は、システイン残基により両側を挟まれ得る。また、いくつかの実施形態において、ランダム化アミノ酸の前後に付加的な非ランダム化アミノ酸を挿入することができる。いくつかの実施形態において、コードされるランダム化アミノ酸は、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓが先行し、後ろにＣｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙがあり得る。
【００６５】
変異型Ｆｃポリペプチド、Ｆｃ断片、および挿入をコードする核酸
また、変異型Ｆｃポリペプチドの一部分である、特定の変異型Ｆｃ断片をコードする核酸および、変異型Ｆｃ断片のループの内にある、または隣接する挿入をコードする核酸を記載する。Ｆｃ断片をコードするヌクレオチド配列は、当分野に公知であり（たとえば、Kabat  et  al.,  Sequences  of  Proteins  of  Immunological  Interest,  Public  Health  Service  N.I.H.,  Bethesda,  MD,  １９９１を参照のこと）、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４断片をコードする配列（それぞれ、配列番号２、４、６および８）が、本明細書に報告される。Ｆｃ断片の内にあるループの位置が詳しく説明され（表１）、およびこれらの領域内にある様々な種類の挿入が本明細書に記述される。５〜６の範囲にあるｐＨでＦｃＲｎへの結合が増加するアミノ酸挿入をコードする配列がまた報告される（たとえば、配列番号４１〜５３を参照のこと）。
【００６６】
より一般には、本明細書において、ループの内にある、または隣接する挿入を有する変異型Ｆｃ断片をコードする核酸が記載され、ここで、Ｆｃ断片は、対照Ｆｃ断片と比較して、ｐＨ５〜６で、より高い親和力でヒトＦｃＲｎに結合することができる。そのような挿入が存在する位置としては、Ｆｃポリペプチド内のループ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３が挙げられる。
【００６７】
変異型Ｆｃポリペプチドをコードする核酸を用いて、その核酸を宿主細胞（真核細胞または原核細胞の宿主細胞を含む）に導入し、その細胞を、その核酸によりコードされるタンパク質（複数含む）が発現されるような条件下で培養することにより、変異型ポリペプチドを作製することができる。変異型Ｆｃポリペプチドは、細胞集団または培養上清から回収することができる。そのようなポリペプチドは、たとえば、特に、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィまたはプロテインＧアフィニティークロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、および疎水的相互作用クロマトグラフィー等の当分野公知の方法により精製することができる。
【００６８】
変異型Ｆｃ断片およびＦｃポリペプチドを単離および作製する方法
変異型Ｆｃ断片は、以下の実施例に詳述されるスクリーニング手順を用いて単離することができる。大まかに言えば、ループの内に、または隣接して、ランダム化アミノ酸を含む挿入を有するＦｃ断片をコードする核酸のライブラリが調製される。次いで、このライブラリを、ウイルスまたは細胞に導入し、そのライブラリから核酸が発現されるような条件下でそれらを培養し、ウイルス（たとえば、バキュロウイルスまたは繊維状ファージであり得る）または細胞（たとえば、細菌、酵母、または哺乳類細胞であり得る）が、挿入を含有するＦｃ断片を提示できるようにする。別の実施形態においては、ライブラリは、リボソームディスプレイ系においてｉｎ  ｖｉｔｒｏで翻訳され、所望の特性を有するＦｃ断片、およびそれらをコードする核酸を、この混合物から選び出すことができる。あるいは、ＣＩＳディスプレイ系を用いることもできる。たとえば、Odegrip  ei  al.  (２００４),  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  １０１  (９):  ２８０６-２８１０を参照のこと（その関連部分は参照により、本明細書に援用される）。本発明の方法において、５〜６のｐＨ範囲内で、対照Ｆｃ断片と比較して、高い親和力でヒトＦｃＲｎに結合することができる変異型Ｆｃ断片は、以下の実施例に記述されるように、ＦｃＲｎでパンニングすることにより富化し、たとえば酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ、単離株の群で当初に実施されるか、または単一の単離株で実施されてもよい）を用いて、スクリーニングすることができる。もしＥＬＩＳＡを単離株の群で当初に実施する場合、これらの単離株を増幅させ、個々に再スクリーニングして、対照Ｆｃ断片と比較して、ｐＨ５〜６ではヒトＦｃＲｎに対する高い親和力を有し、生理ｐＨではヒトＦｃＲｎに対してほぼ同じか低い親和力を有する、変異型Ｆｃ断片を発現する個々の単離株を得ることができる。
【００６９】
さらなるステップにおいて、変異型Ｆｃ断片をコードする核酸は、ファージまたは、たとえば細菌、酵母もしくは哺乳類細胞等の細胞から、単離することができ、または、リボソームディスプレイの場合には、ＲＮＡから増幅することができる。これらの核酸を配列解析して、挿入の正確な位置および特質を測定することができる。この情報を用いて、所望の変異型Ｆｃポリペプチドまたは変異型Ｆｃ断片をコードする核酸を、当分野公知の方法を用いて構築することができる。もし所望であれば、変異型Ｆｃ断片またはＦｃポリペプチドをコードする核酸のさらなる改変を行うこともできる。
【００７０】
そのような核酸を、ＦｃポリペプチドまたはＦｃ断片が発現される宿主細胞に適したベクターへと挿入することができる。これらの核酸は、当分野に公知の任意の方法で宿主細胞へと導入することができる。使用されうる宿主細胞としては、細菌（大腸菌を含む）、酵母（出芽酵母またはピキア・パストリスを含む）、昆虫細胞、植物細胞および哺乳類細胞（特に、チャイニーズハムスターの卵巣細胞（ＣＨＯ）、２９３細胞およびベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ）を含む）が挙げられる。これらの宿主細胞を、導入された核酸が発現されるような条件下で培養し、ＦｃポリペプチドまたはＦｃ断片を、細胞集団または培養上清から回収することができる。
【００７１】
一般に、宿主細胞に核酸を導入するために用いられる手順は、核酸が導入される宿主細胞に依存する。核酸を細菌に導入する方法は当分野に公知である。たとえば、エレクトロポレーションまたは塩化カルシウム形質転換が一般的に用いられている。酵母に核酸を導入する方法は当分野に公知であり、たとえば、酢酸リチウムおよびポリエチレングリコールを用いた形質転換法が挙げられる。哺乳類細胞に異種ポリヌクレオチドを導入する方法は当分野に公知であり、限定されないが、デキストラン介在トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン介在トランスフェクション、原形質融合、エレクトロポレーション、リポソーム内へのポリヌクレオチド（複数含む）のカプセル化、および核内へのＤＮＡの直接マイクロインジェクションが挙げられる。
【００７２】
任意の宿主細胞に用いられる発現ベクターは、プラスミド維持ならびに、外因性ヌクレオチド配列のクローニングおよび発現のための配列を含有している。そのような配列は、多くの場合、以下のヌクレオチド配列の１つ以上を含む：プロモーター、１以上のエンハンサー配列、複製起点、転写終止配列、完全イントロン配列（ドナーおよびアクセプタースプライス部位を含有）、ポリペプチド分泌のためのリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現されるポリペプチドをコードする核酸の挿入のためのポリリンカー領域、および選択可能なマーカーエレメント。
【００７３】
変異型Ｆｃポリペプチドの治療的使用
本明細書に記述される変異型Ｆｃポリペプチドは、様々な疾患に対するヒトの治療剤として用いることができる。どの疾患にどの変異型Ｆｃポリペプチドが適切かは、Ｆｃポリペプチドの結合領域（複数含む）、ならびに、場合によって、たとえば付着された毒素部分等の、その構造の他の側面により、決定することができる。変異型Ｆｃポリペプチドは、対照Ｆｃポリペプチドと比較して、ｉｎ  ｖｉｖｏの半減期が延長され得、ゆえに、対照Ｆｃポリペプチドよりも低用量および／または少ない投与頻度で済む可能性がある。ゆえに、変異型Ｆｃポリペプチドは、特に低頻度の投与が望ましい、慢性疾患の治療に良く適している可能性がある。しかしながら、変異型Ｆｃポリペプチドは、対照Ｆｃポリペプチド（ループ中の挿入を有していない点を除き、変異型Ｆｃポリペプチドと同じアミノ酸配列を有する）を用いて治療することができるほぼすべての疾患の治療に用いることができる。本明細書に記述される変異型Ｆｃポリペプチドはまた、治療される疾患の治療に用いられる他の医薬と同時に、用いることができる。
【００７４】
たとえば、ループ中に挿入を含有する変異型Ｆｃポリペプチドである、Ｆｃ融合タンパク質は、対照Ｆｃポリペプチドが用いられる疾患と同じ疾患に対する治療剤として用いることができる。しかしながら、その半減期は延長されているため、変異型Ｆｃポリペプチドの投与量および／または投与頻度は、異なり得る。たとえば、変異型Ｆｃポリペプチドは、たとえばエタネルセプト（中程度から重篤なリウマチ性関節炎、多関節型若年性特発性関節炎、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、および、中程度から重篤な尋常性乾癬に適応される）、アバタセプト（中程度から重篤なリウマチ性関節炎、中程度から重篤な多関節型若年性特発性関節炎に適応される）、またはロミプロスチム（慢性免疫性血小板減少性紫斑病に適応される）等の治療用Ｆｃ融合タンパク質から、これらの分子のそれぞれのＦｃ断片部分のループ中に、たとえば配列番号４１〜５３等の、本明細書に開示されるＦｃＲｎの結合を増強させる挿入のうちの１つを挿入することにより、作製を開始することができうる。挿入は、たとえば、Ｆｃ融合タンパク質のＦｃ断片部分のループ５、８または１０の内に、または隣接して作製されうる。エタネルセプト、アバタセプトまたはロミプロスチムのそのような変異型は、改変していないエタネルセプト、アバタセプトまたはロミプロスチムを用いて治療することができる疾患と同じ疾患の治療に用い得る。
【００７５】
同様に、もし変異型Ｆｃポリペプチドが治療用抗体（たとえば、アダリムマブ、ウスチキヌマブ、ゴリムマブ、ナタリズマブ、インフリキシマブまたはデノスマブ等の治療用抗体）である場合、変異型Ｆｃ断片を含むそのような変異型抗体を用いて、これらの抗体が、改変されていない形態で治療に用いられる疾患と同じ疾患を治療することができる。ゆえに、本明細書に記述される変異型Ｆｃ断片は、投与量または治療頻度を変化させうるが、Ｆｃポリペプチドを用いて治療する疾患は変化させなくともよい。
【００７６】
一般的に、Ｆｃポリペプチドは、腫瘍への適用、自己免疫疾患および炎症性疾患、骨関連疾患、疾患、代謝性疾患および神経性疾患（たとえば、とりわけ慢性疼痛等）を含む広範囲の疾病を治療するために用いられる。
【００７７】
医薬組成物
本発明には、本明細書に記述される変異型Ｆｃ断片または変異型Ｆｃポリペプチドを含む医薬組成物が含まれる。そのような組成物は、変異型Ｆｃポリペプチドまたは変異型Ｆｃ断片の治療有効量と、１つ以上の付加的な成分（たとえば、生理学的に受容可能な担体、賦形剤または希釈剤等）を含み得る。そのような付加的な成分としては、多くの可能性の中でも、緩衝剤、炭水化物、ポリオール類、アミノ酸、キレート剤、安定化剤および／または保存剤が挙げられる。
【００７８】
投与方法
変異型Ｆｃポリペプチドもしくは変異型Ｆｃ断片、またはこれらの分子を含有する医薬組成物は、任意の実行可能な方法により投与することができる。タンパク質を含む治療剤は、通常、注射により投与される（経口投与の場合、いくつかの特別な剤型または状況が無ければ、胃の酸性環境下でタンパク質が加水分解されるため）。皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、動脈内注射、病巣内注射、または腹腔内注射も、投与経路として可能性がある。また、局所投与は、特に皮膚が関与する疾患に対して、可能性がある。あるいは、変異型Ｆｃポリペプチドまたは変異型Ｆｃ断片は、粘膜との接触を介して投与することができる（たとえば、経鼻、舌下、経腟もしくは直腸投与、または吸入）。あるいは、変異型Ｆｃポリペプチドまたは変異型Ｆｃ断片を含む、ある医薬組成物は、経口で投与することができる。
【００７９】
上記に本発明を概括的に記載したが、以下の実施例は、解説目的での提供され、限定するものではない。
【実施例】
【００８０】
実施例１：ヒトＦｃＲｎ：ヒトＩｇＧ１  Ｆｃの３次元構造モデルの作製
以下に記述されるライブラリを設計するのを支援するために、３次元構造のホモロジーモデル、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ断片と複合体化されたヒトＦｃＲｎを、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ＰＤＢアクセッション番号１ＦＲＴ）で入手できる、ラットＦｃＲｎおよびラットＩｇＧ  Ｆｃ断片の複合体構造を元にして、作製した。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ断片（配列番号１）ならびに、ヒトＦｃＲｎαおよびβ−２マイクログロブリン（β２ｍ）鎖（それぞれ配列番号９および１０）のアミノ酸配列で検索した。アミノ酸配列相同性および３次元構造に基づき、いくつかのテンプレートが得られた。ＦｃＲｎα鎖構造（１ＥＸＵ（Ａ鎖）、１ＦＲＴ（Ａ鎖）、および１｜１Ａ（Ａ鎖））、ＦｃＲｎ  β２ｍ差構造（１ＣＥ６（Ｂ鎖）、１ＨＳＡ（Ｂ鎖）、１ＹＰＺ（Ｂ鎖）、１ＨＨＧ（Ｂ鎖）および１｜１Ａ（Ｂ鎖））、およびＦｃ構造１ＨＺＨ（Ｈ鎖）、１｜１Ａ（Ｃ鎖）、１ＯＱＯ（Ａ鎖）、１Ｔ８３（Ａ鎖）および２Ｊ６Ｅ（Ａ鎖））を選択した。ＦｃＲｎα構造１ＥＸＵ（Ａ鎖）、１ＦＲＴ（Ａ鎖）および１｜１Ａ（Ａ鎖）を、重ね合わせ、得られた平均平方根偏差（ＲＭＳＤ）、すなわち、重ね合わせたタンパク質構造中の類似原子の間の平均距離の値は、０．３０Å〜０．７６Å（平均値は０．５９Å）である。ＦｃＲｎ  β２ｍドメイン構造  １ＣＥ６（Ｂ鎖）、１ＨＳＡ（Ｂ鎖）、１ＹＰＺ（Ｂ鎖）、１ＨＨＧ（Ｂ鎖）、および１｜１Ａ（Ｂ鎖）の間のＲＭＳＤの値は、０．３０Å〜０．７６Å（平均値は０．５９Å）の範囲である。Ｆｃ構造  １ＨＺＨ（Ｈ鎖）、１１Ａ（Ｃ鎖）、１０Ｑ０（Ａ鎖）、１Ｔ８３（Ａ鎖）、および２Ｊ６Ｅ（Ａ鎖）の間のＲＭＳＤの値は、０．３０Å〜０．７６Å（平均値は０．５９Å）の範囲である。これらのＲＭＳＤの値より、異なる源由来の鋳型ＦｃＲｎおよびＦｃ構造が、非常に似た３次元構造を共有していることが示唆される。
【００８１】
これらの鋳型構造およびヒトＦｃＲｎ（ｈＦｃＲｎ）、およびヒトＩｇＧ１  Ｆｃ断片（ｈＩｇＧ１  Ｆｃ）のアミノ酸配列に基づいて、ｈＦｃＲｎ：ｈＩｇＧ１  Ｆｃ複合体の相同性モデルを、ｌｉｎｕｘベースの、コンピュータソフトウェア  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ（ＭＯＥ；Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ）の分子モデリングモジュールを用いて、作製した。図１に、このモデル化された、ｈＩｇＧ１  Ｆｃ（下）およびｈＦｃＲｎ（上）は、最も近くで接触する複合体の部分、ならびにこれらのタンパク質の一部の隣接する領域を示す。
【００８２】
実施例２：挿入ライブラリの構築
変異型ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域をコードする８つのライブラリ（各ライブラリは、異なる種類の挿入を有している）を構築した。図２に、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域の配列、およびその位置、および６つの挿入ライブラリの形式を示す。以下に記述される挿入ライブラリが挿入されたループの位置が、図１および２に、Ｌ１、Ｌ２Ａ、Ｌ２Ｂ、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６ＡおよびＬ６Ｂとして示されている。Ｆｃの一部の挿入部位は、ｈＩｇＧ１  ＦｃおよびｈＦｃＲｎの間の最も近接した点の間にあり（たとえば、Ｌ１、Ｌ２Ａ、Ｌ２ＢおよびＬ３）、他は、ｈＦｃおよびｈＦｃＲｎの間の最も近接した点からある程度離れたところにあった（Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６ＡおよびＬ６Ｂ）。
【００８３】
図２に示されるように、Ｌ１、Ｌ２Ａ、Ｌ２ＢおよびＬ３のようないくつかのライブラリにおいては、ループ内のアミノ酸を欠損させ、ランダム化アミノ酸で置換されており、ほとんどの場合、欠損されたときよりもややアミノ酸数が多くなった。ランダム化アミノ酸は、システイン以外のすべてのアミノ酸を含んでいた。Ｌ２Ｂライブラリにおいて、６つのランダム化アミノ酸に、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ配列が先行し、Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ配列が後に続いた。２つのシステインは、近接していることを考慮するとジスルフィド架橋を形成することが期待されるため、システインの間の６つのランダム化アミノ酸は、空間的に拘束されたループを形成することが期待される。たとえば、Ｌ２Ｂでは、配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓが６つのランダム化アミノ酸に先行し、Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙが後に続くことから、ランダム化アミノ酸を含有する空間的に拘束されたループが形成される。他のライブラリ（すなわち、Ｌ４およびＬ５）においては、ランダム化アミノ酸は、通常存在するいずれのアミノ酸も欠損せずに、挿入された。
【００８４】
２ラウンドのＰＣＲを行い、ヒトＩｇＧ１変異型Ｆｃ断片の群をコードするＬ１、Ｌ２Ａ、Ｌ２Ｂ、Ｌ３、Ｌ４およびＬ５ライブラリを構築した。最初の反応ラウンドの第一と第二のＰＣＲ反応セットに用いられた鋳型は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ断片（配列番号２）をコードするＤＮＡが挿入され、適切な細菌株（ｐＩｇＧ１−Ｆｃ）でファージのコートタンパク質の一部としてそれを発現させるファージミドベクターであった。ライブラリ作製のために用いられた、最初の反応ラウンドでのＰＣＲ反応の第一のセットは、ＡｐａＬＩ制限酵素サイトを上流の末端に含むＰＣＲ断片を生成するために、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを利用した。以下のフォワードプライマー（Ｆｃ断片をコードする領域の上流のベクター配列と合致）を、最初の反応ラウンドにおける第一のＰＣＲ反応セットのすべてに用いた：５’−ＧＴＴＣＣＴ  ＴＴＣ  ＴＡＴ  ＴＣＴＣＡＣ−３’（配列番号５２１）。リバースプライマー（Ｆｃをコードする配列の内にある）は以下であった：５’−ＧＡＧ  ＧＧＴ  ＧＴＣ  ＣＴＴ  ＧＧＧ  ＴＴＴ  ＴＧＧ  ＧＧＧ−３’（配列番号５２２；ライブラリＬ１）；５’−ＧＧＴ  ＧＡＧ  ＧＡＣ  ＧＣＴ  ＧＡＣ  ＣＡＣ  ＡＣＧ  ＧＴＡ−３’（配列番号５２３；ライブラリＬ２ＡおよびＬ２Ｂ）；５’−ＡＴＧ  ＣＡＴ  ＣＡＣ  ＧＧＡ  ＧＣＡ  ＴＧＡ  ＧＡＡ  ＧＡＣ−３’（配列番号５２４；ライブラリＬ３）；５’−ＡＴＴ  ＡＴＧ  ＣＡＣ  ＣＴＣ  ＣＡＣ  ＧＣＣ  ＧＴＣ  ＣＡＣ−３’（配列番号５２５；ライブラリ４）；および、５’−ＡＴＴ  ＧＣＴ  ＣＴＣ  ＣＣＡ  ＣＴＣ  ＣＡＣ  ＧＧＣ  ＧＡＴ−３’（配列番号５２６；ライブラリＬ５）。
【００８５】
最初の反応ラウンドの第二のＰＣＲ反応セットは、鋳型としてｐＩｇＧ１−Ｆｃをも用いて、および、リバースプライマーとして、Ｆｃをコードする配列から下流のベクター配列の相補鎖と合致するオリゴヌクレオチドを用いた。このリパースプライマーは以下の配列を有した：５’−ＣＣＣ  ＡＴＴ  ＣＡＧ  ＡＴＣ  ＣＴＣ  ＴＴＣ−３’（配列番号５２７）。これらの反応に用いられたフォワードプライマーは、以下であった：ライブラリＬ１、５’−ＡＡＡ  ＣＣＣ  ＡＡＧ  ＧＡＣ  ＡＣＣ  ＣＴＣ（ＴＲＩＭ）６  ＡＣＣ  ＣＣＴ  ＧＡＧ  ＧＴＣ  ＡＣＡ  ＴＧＣ−３’（配列番号５２８）；ライブラリＬ２Ａ、５’−ＧＴＧ  ＧＴＣ  ＡＧＣ  ＧＴＣ  ＣＴＣ  ＡＣＣ（ＴＲＩＭ）６  ＣＡＣ  ＣＡＧ  ＧＡＣ  ＴＧＧ  ＣＴＧ  ＡＡＴ−３’（配列番号５２９）；ライブラリＬ２Ｂ、５’−ＧＴＧ  ＧＴＣ  ＡＧＣ  ＧＴＣ  ＣＴＣ  ＡＣＣ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＴＧＴ（ＴＲＩＭ）６  ＴＧＴ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＣＡＣ  ＣＡＧ  ＧＡＣ  ＴＧＧ  ＣＴＧ  ＡＡＴ−３’（配列番号５３０）；ライブラリＬ３：５’−ＴＣＡ  ＴＧＣ  ＴＣＣ  ＧＴＧ  ＡＴＧ  ＣＡＴ（ＴＲＩＭ）５  ＣＡＣ  （ＴＲＩＭ）１  ＣＡＣ  ＴＡＣ  ＡＣＧ  ＣＡＧ  ＡＡＧ  ＡＧＣ−３’（配列番号５３１）；ライブラリＬ４：５’−ＧＧＣ  ＧＴＧ  ＧＡＧ  ＧＴＧ  ＣＡＴ  ＡＡＴ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＴＧＴ（ＴＲＩＭ）６  ＴＧＴ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＧＣＣ  ＡＡＧ  ＡＣＡ  ＡＡＧ  ＣＣＧ  ＣＧＧ−３’（配列番号５３２）；およびライブラリＬ５：５’−ＧＴＧ  ＧＡＧ  ＴＧＧ  ＧＡＧ  ＡＧＣ  ＡＡＴ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＴＧＴ（ＴＲＩＭ）６  ＴＧＴ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＧＧＧ  ＣＡＧ  ＣＣＧ  ＧＡＧ  ＡＡＣ  ＡＡＣ−３’（配列番号：５３３）。これらのオリゴヌクレオチドにおいて、「ＴＲＩＭ」とは、システインを除くすべてのアミノ酸をコードするトリヌクレオチドの混合物を表す（Ｔｒｉｍｅｒ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ  Ｍｉｘ  ２，  Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  カタログ番号１３−１９９２−９５）。混合物は、以下のトリヌクレオチドの等モル混合物である：ＡＡＡ、ＡＡＣ、ＡＣＴ、ＡＴＣ、ＡＴＧ、ＣＡＧ、ＣＡＴ、ＣＣＧ、ＣＧＴ、ＣＴＧ、ＧＡＡ、ＧＡＣ、ＧＣＴ、ＧＧＴ、ＧＴＴ、ＴＡＣ、ＴＣＴ、ＴＧＧ、ＴＴＣ。それゆえ、システインを除くすべてのアミノ酸をコードするコドンは、ＴＲＩＭ混合物中におよそ均等に表された。ゆえに、「（ＴＲＩＭ）６」とは、システインを除く任意のアミノ酸をコードする６つのランダムトリヌクレオチドがオリゴ中に含まれることを意味する。
【００８６】
ＰＣＲ反応の２番目のラウンド（各ライブラリに対して１回）において、上述の最初のラウンドからの第一および第二のＰＣＲ反応セット由来の産物を鋳型として用いた。用いられたプライマーは、全てのライブラリに対して同じであり、以下であった：５’−ＧＴＴ  ＣＣＴ  ＴＴＣ  ＴＡＴ  ＴＣＴ  ＣＡＣ−３’（フォワード；配列番号５３４）および、５’−ＣＣＣ  ＡＴＴ  ＣＡＧ  ＡＴＣ  ＣＴＣ  ＴＴＣ−３’（リバース；配列番号５３５）。
【００８７】
ライブラリＬ６ＡおよびＬ６Ｂは、鋳型としてｐＩｇＧ１−Ｆｃを用いて、１回のＰＣＲラウンドで構築された。以下に記述されるＰＣＲ反応において、Ｆｃ断片に対するコード領域におけるＸｍａｌ制限酵素部位（５’−ＣＣＣＧＧＧ−３’）は、プライマー配列に起因して、ＸｈｏＩ制限酵素部位（５’−ＣＴＣＧＡＧ−３’）へと変化された。これらの改変は、非改変ｐＩｇＧ１−Ｆｃと同じアミノ酸をコードする、サイレントな変異であり、Ｘｍａｌ＋ＮｏｔＩ消化よりも、ＸｈｏＩ＋ＮｏｔＩ制限酵素消化のほうがより効率的であるために行われた。これらの反応に用いられたフォワードプライマーは以下であった：ライブラリＬ６Ａ：５’−ＣＴＧ  ＣＣＣ  ＣＣＡ  ＴＣＴ  ＣＧＡ  ＧＡＴ  ＧＡＧ  ＣＴＧ  ＧＧＴ  ＴＧＴ（ＴＲＩＭ）８  ＴＧＴ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＡＣＣ  ＡＡＣ  ＣＡＧ  ＧＴＣ  ＡＧＣ  ＣＴＧ  ＡＣＣ−３’（配列番号５３６）；およびライブラリＬ６Ｂ：５’−ＣＴＧ  ＣＣＣ  ＣＣＡ  ＴＣＴ  ＣＧＡ  ＧＡＴ  ＧＡＧ  ＣＴＧ  ＧＧＴ  ＴＧＴ（ＮＮＫ）８  ＴＧＴ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＡＣＣ  ＡＡＣ  ＣＡＧ  ＧＴＣ  ＡＧＣ  ＣＴＧ  ＡＣＣ−３’（配列番号５３７）。リバースプライマーの配列は、５’−ＧＧＣ  ＣＣＣ  ＧＴＧ  ＡＴＧ  ＧＴＧ  ＡＴＧ  ＡＴＧ−３’（配列番号：５３８）であった。Ｌ６Ｂにおいて、ＮＮＫと呼ばれるトリヌクレオチドの混合物（３２の縮重コドン中に２０すべてのアミノ酸をコードするトリヌクレオチドを含有）を用いた。このトリヌクレオチド混合物において、「Ｎ」は、アデノシン、グアニン、シチジンまたはチミジンのいずれかである、ランダム化された位置を表し、そして「Ｋ」は、グアニジンまたはチミジンのいずれかである、部分的に制約された位置を表す。
【００８８】
すべてのＰＣＲ反応に対して、以下の反応条件で、ＰＣＲコアキット（Ｒｏｃｈｅ、カタログＮｏ．１１  ５７８  ５５３  ００１）を用いた：９５℃  ５分、次いで、９５℃  ４５秒、５５℃  ４５秒、７２℃  ９０秒を３０サイクル、そして最後に、７２℃  １０分。ＰＣＲ反応から得られたＤＮＡを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔｓ  （ＱＩＡＧＥＮ，  ２８１０４）を用いて精製した。ファージミドベクターＤＮＡを約２００μｇ、そして精製されたＰＣＲ産物を１０μｇ（ＰＣＲ反応の３番目のラウンド由来）を、ＡｐａＬＩおよびＮｏｔＩ（ライブラリＬ１〜Ｌ５に対して）、ならびに、ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩ（ライブラリＬ６ＡおよびＬ６Ｂに対して）で、消化した。消化されたＤＮＡを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔｓ  （ＱＩＡＧＥＮ，  ２８７０４）を用いてゲル精製した。
【００８９】
消化されたベクターＤＮＡおよびライブラリＰＣＲ産物（モル比は１：２）を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いてライゲーションした。混合物を１６℃で一晩、インキュベートした。ＤＮＡはエタノール沈殿により精製した。総量２５μｇのＤＮＡを、２００Ωの抵抗、および２５μＦの静電容量を用いた、２．５ｋＶの電場中で、１０００μｌのエレクトロコンピテントＸＬ１ブルー大腸菌細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）へエレクトロポレーションし、約１ｘ１０９の大腸菌形質転換体を得た。ライブラリの正確なサイズは、７ｘ１０８（Ｌ５）〜１．８ｘ１０９（Ｌ４）の範囲であった。細胞を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン、および２％のグルコースを含有する１０００ｍＬの２ｘＹＴ培地（１６ｇ／ＬのＢａｃｔｏ  Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、１０ｇ／ＬのＢａｃｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ、そして５ｇ／ＬのＮａＣｌ（ｐＨ７．０〜７．２）を含有）に、播種し、ＯＤ６００が約０．５になるまで増殖させた。次いで、約３ｘ１０９プラーク形成単位（ｐｌａｑｕｅ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔｓ）／ミリリットル（ＰＦＵ／ｍＬ）のＭ１３ヘルパーファージを添加し、培養物を、１時間、３７℃でインキュベートした。次いで、感染細胞をスピンダウンし、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン、および４０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有する１０００ｍＬの２ｘＹＴ培地で再懸濁した。細胞を、一晩、３０℃で増殖させた。次いで、ファージをＰＥＧ６０００で沈殿させた。
【００９０】
これらの形質転換に用いられたすべてのライブラリ（Ｌ６ＡおよびＬ６Ｂを除く）は、６つのランダム化コドン（各々は、任意の１９の異なるアミノ酸をコード）を含有しており、ゆえに、約４．７ｘ１０７（１９６）の異なる変異型Ｆｃ断片をコードすることが予測された。同様に、Ｌ６Ａは、任意の２０の異なるアミノ酸をコードするランダム化コドンを８つ含有していたため、約１．７６ｘ１０１０（２０８）の異なる変異型Ｆｃ断片をコードすると予測された。ライブラリＬ６ＡおよびＬ６Ｂ以外のライブラリについては、各ライブラリにおいて変異型の数が異なることが予測され、約１０９（７ｘ１０８〜１．８ｘ１０９の範囲）のライブラリのサイズは、変異型の数の７〜３３倍であった。
【００９１】
実施例３：Ｆｃループライブラリのスクリーニング
ｐＨ６．０で、野生型Ｆｃ断片と比較し強い親和力でＦｃＲｎに結合する（そしてｐＨ７．４では低い親和力で結合する）、変異型Ｆｃ断片を発現するファージのための、２ラウンドのパンニングを、以下のように実施した。最初のラウンドでは、ファージを、０．４ｍｌの２０ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ  ６．０、５％スキムミルク、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有する液体中に再懸濁した。ＭＡＸＩＳＯＲＰ（登録商標）イムノプレート（Ｎｕｎｃ，  Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）の４ウェルそれぞれを、１０μｇのｈＦｃＲｎでコートし、５％スキムミルクでブロックし、そして１００μＬのファージを５ｘ１０１１ＰＦＵ／ｍＬで添加した。３７℃、１時間のインキュベーションの後、ウェルを、２０ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ  ６．０、０．２％のＴｗｅｅｎ２０で３〜１０回、洗浄した。各ウェルに１００μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４を添加し、１時間、３７℃でプレートをインキュベートすることによりファージを溶出させた。これらのファージを用いて、対数増殖期にある大腸菌ＸＬ１−ブルー培養物に再感染させ、約０．５のＯＤ６００に達するまで培養させた。次いで、約３ｘ１０９ＰＦＵ／ｍＬのＭ１３ヘルパーファージを添加し、培養物を、１時間、３７℃でインキュベートした。次いで、感染細胞をスピンダウンし、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン、および４０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有する１０００ｍＬの２ｘＹＴ培地に再懸濁した。細胞を、一晩、３０℃で増殖させた。次いで、ファージをＰＥＧ６０００で沈殿させた。
【００９２】
これらのファージを用いて、パンニングの２回目のラウンドを、１回目のラウンドで用いた方法と本質的に同じ方法で実施した。パンニングのストリンジェンシーは、マイクロタイタープレート上にコートされたＦｃＲｎの濃度をやや減少させ、洗浄数を増やすことにより、やや増加した。数回の洗浄の後に溶出されたファージを用いて、約０．５のＯＤ６００で対数増殖期にある大腸菌ＸＬ１−ブルー培養物に再感染させ、次いで、３７℃で１時間培養し、約１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよびカナマイシンを含有するプレート上に撒き、コロニーを得た。
【００９３】
１２０μＬ／ウェルの２ｘＹＴ培地（１００μｇ／ｍＬのアンピシリンおよび２％グルコースを含有）を含む９６ウェル組織培養プレートに、シングルコロニーを、播種した。約０．５のＯＤ６００に達するまで、振とう器上で、３７℃で細胞を増殖させた。次いで、３ｘ１０９／ｍＬのＭ１３ヘルパーファージを各ウェルに添加し、１時間、インキュベートした。次いで、細胞をスピンダウンし、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン、および４０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有する１８０μＬ／ウェルの２ｘＹＴ培地に再懸濁した。次いで、培養物を、３０℃で一晩、振とう器上でインキュベートした。
【００９４】
およそ１００μＬのビオチニル化ヒトＦｃＲｎ（２μｇ／ｍＬ）を、１０μｇ／ｍＬのストレプトアビジンでコートされたＭＡＸＩＳＯＲＰ（登録商標）プレートのウェルに添加した。ＰＢＳ（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を添加）（ＰＢＳＴ）で５回洗浄した後、ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０またはｐＨ７．４）中で一晩培養させた培養物から得たファージをプレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗Ｍ１３抗体を用いて、結合ファージを検出し、プレートを、可視範囲の波長を用いたマイクロタイタープレートリーダーにより、スコア化した。ｐＨ５．５での高いシグナル（対照Ｆｃ断片によるシグナルのおよそ１５０％）および、ｐＨ７．４での対照Ｆｃ断片のそれと同等か、より低いシグナルに基づいて陽性株を選択した。２番目のスクリーニングのラウンドにおいて、単離コロニーの単一９６ウェルマイクロタイタープレートが各ライブラリに対して検証されたが、陽性株は、ライブラリＬ２Ｂ、Ｌ３またはＬ４に対しては検出されなかった。ライブラリＬ２Ａに対して選別されたコロニーの約２０％は陽性株であり、ライブラリＬ６ＡおよびＬ６Ｂに対して選別されたコロニーの約１０％が陽性株であった。ライブラリＬ５は他のすべてのライブラリとは明確に異なっており、選別されたコロニーの約９０％が陽性株であった。従い、ライブラリＬ５は、大幅に他とは異なり、最も陽性株を生み出すライブラリであった。これらのデータより、ライブラリ５が挿入された部位が、ｐＨ５〜６でＦｃＲｎへの結合を増加させ、生理ｐＨではＦｃＲｎに対するＦｃ断片の親和力を低いまま維持する変異型の単離に、特に好ましいということが示唆される。
【００９５】
我々は、ライブラリＬ２Ａ、Ｌ５、Ｌ６ＡおよびＬ６Ｂから陽性株を選択して配列解析し、以下に記述するように特徴をさらに解析した。結合は、定量的酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）により分析した。ＥＬＩＳＡスコアは結合親和力を反映しており、高いスコアであれば、高い親和力であることを意味する。典型的には、約３〜５よりも高いスコアであれば、結合はバックグラウンドを超えていることが示唆される。これらの陽性株の挿入の配列、およびそれらのＥＬＩＳＡのスコアを、以下の表２に示す。ライブラリＬ５に対しては、挿入は、Ｎ１６９とＧ１７０の間である（図２の付番に従う）。ライブラリ６Ａおよび６Ｂに対しては、挿入は、Ｌ１４３とＴ１４４の間である（図２の付番に従う）。
【００９６】
【表３】
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【００９７】
実施例４：結合および解離率に関する実験
ファージＥＬＩＳＡにより特定された変異型Ｆｃ断片の一部の特徴をさらに解析するために、ｐＨ６およびｐＨ７．４での、ＦｃＲｎへの変異型Ｆｃ断片の結合を、特定された変異型Ｆｃ断片のサブセットに対して解析した。選択された変異型Ｆｃ断片単離株（すべてがライブラリＬ５由来）をコードするＤＮＡを、哺乳類発現ベクターに導入し、それを用いて、２９３  ６Ｅ細胞に、原則的にProc.  Natl.  Acad.  Sci.  １０２(１６):  ５６７９-５６８４,  ２００５（関連部分は、参照により本明細書に援用される）に従い、脱アシル化ＰＥＩを用いてトランスフェクトした。ＦｃＲｎへの結合に対し、高いＥＬＩＳＡスコアを有する単離株が選択された。馴化培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉａ、ＣＭ）中の変異型Ｆｃ断片の濃度を、Ｏｃｔｅｔ  Ｒｅｄ（登録商標）（ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｉｎｃ．，  Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）上の、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，  Ｉｎｃ．、カタログ番号１８−５０１０）を用いて、１：２および１：１０希釈されたＣＭ試料を用いて測定した。濃度は、精製Ｆｃ融合タンパク質で作成された標準曲線を用いて算出された。
【００９８】
ビオチニル化ｈＦｃＲｎ（１００ｎＭ）を、ストレプトアビジン（ＳＡ）バイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｉｎｃ．、１８−５０１９）オフライン上で、室温で、２時間、捕捉した。これらの、Ｏｃｔｅｔ  Ｒｅｄ（登録商標）システムのビオチニル化ｈＦｃＲｎでコートしたＳＡバイオセンサーを用いて、非標識のタンパク質の結合と解離を、光の回折を介して、リアルタイムで検出することができる。変異型Ｆｃ断片ＣＭ試料および対照Ｆｃ断片ＣＭ試料を、ｐＨ６またはｐＨ７．４で、１０μｇ／ｍＬにまで希釈した。３つの結合および解離条件を設定した：（１）ｐＨ６での結合およびｐＨ６での解離；（２）ｐＨ６での結合およびｐＨ７．４での解離；ならびに、（３）ｐＨ７．４での結合およびｐＨ７．４での解離。ビオチニル化ｈＦｃＲｎでコートされたＳＡバイオセンサーを、特定のｐＨの緩衝液の中へ１分間浸し、次いで、特定のｐＨの変異型Ｆｃ断片または対照Ｆｃ断片を含有する試料中へ５分間漬けて、ＦｃＲｎと結合させた。次いで、Ｆｃバイオセンサーを特定のｐＨの緩衝液中に５分間浸し、結合Ｆｃ断片を、ＦｃＲｎから解離させた。Ｆｃ断片の結合および解離は、Ｏｃｔｅｔ  Ｒｅｄ（登録商標）システムを用いて実施されるバイオレイヤー干渉分光法を介して検出が可能であり、リアルタイムでの結合および解離を検出することができた。
【００９９】
異なるｐＨでの変異型Ｆｃ断片の結合率および解離率を、対照に対して比較した。対照Ｆｃ断片と比べて、ｐＨ６での高い結合、ｐＨ６での遅い解離率、ｐＨ７．４での非常に弱い結合、およびｐＨ７．４での早い解離率を、さらなる解析に供する変異型Ｆｃ断片の選択に用いる基準とした。検証された６１の変異型Ｆｃ断片のうちいくつかが、対照Ｆｃ断片と比べて、ｐＨ６でより高い結合と遅い解離を、そして、ｐＨ６で結合した後、ｐＨ７．４で同等か、より速い解離を示した。図３に、最も好ましい特性を有した、検証された２４の変異型Ｆｃ断片に対する、ｐＨ６での結合（中心の垂直線の左側まで）およびｐＨ７．４での解離（中心の垂直線の右側）の曲線を示す。曲線の右に、検証された各変異型Ｆｃ断片の名称を、結合相の実験の間に観察された、最大結合応答（ナノメーター（ｎｍ））と共に列挙する。最大応答の絶対数は、実験によりいくらか変化する可能性があり、たとえばＫｏｎ、ＫｄｉｓまたはＫＤ（Ｋｄｉｓ／Ｋｏｎ）等の結合定数に直接的には比例しない。図３において、最も低い結合応答が野生型Ｆｃ断片で観察され、示されるすべての変異型は、ｐＨ６で、より高い応答を有した。ほとんどの変異型Ｆｃ断片は、野生型Ｆｃ断片のように、ｐＨ７．４で急速に解離した。しかしながら、変異型５−１は、ｐＨ７．４で、明らかに他のいずれの変異型よりも非常に遅く解離した一方で、検証された他のすべての変異型は、ｐＨ７．４で野生型Ｆｃ断片のように急速に解離した。Ｆｃ変異型５−８５は、ｐＨ６で最も高い反応性を示し、またｐＨ７．４で急速に解離する変異型として突出している。いくつか他の変異型、たとえば、特に５−１０６、５−１０４、５−１１２、５−７９、５−５１および５−６９等の変異体がまた、ｐＨ６で高い反応性を示し、ｐＨ７．４で急速に解離した。機能改善された多くの変異型Ｆｃ断片が、ライブラリＬ５から単離された。
【０１００】
実施例５：変異型Ｆｃ断片の作製
選択された単離株（すべてがライブラリＬ５由来）をコードするＤＮＡを、哺乳類発現ベクターに導入し、それを用いて、本質的に、Thomas  et  al.  (Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  １０２(１６):  ５６７９-５６８４,  ２００５)（その関連部分は、参照により本明細書に援用される）に記述されるように脱アシル化ＰＥＩを用いて、２９３細胞にトランスフェクトした。哺乳類細胞が、この系における発現のしやすさと、翻訳後プロセッシングにより、選択された。用いられたタンパク質発現および製造方法は、Durocher  et  al.  (Nucl.  Acids  Res.  ３０(２):  e９,  ２００２)（その関連部分は参照により本明細書に援用される）に記述されている。分泌された変異型Ｆｃ断片は、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィおよびサイズ排除クロマトグラフィを用いて、培養培地から精製された。高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）を用いて、Ｆｃ断片の純度をチェックした。精製方法の総論は、Methods  in  Molecular  Biology:  Protein  Purification  Protocols  v.２４４,  Cultler,  ed.,  Humana,  New  Jersey,  ２００４を参照のこと。Ｆｃ断片のタンパク質力価を、ポリアクリルアミドゲルのクマシーブルー染色により分析した。すべての単離株は、検証に適したレベルで発現されていた。
【０１０１】
実施例６：変異型Ｆｃ断片の熱安定性
示差走査熱量計（ＤＳＣ）により、熱変性によるアンフォールディングのエンタルピー（ΔＨ）を測定する。溶液中のタンパク質分子（または他のマクロ分子）は、天然型のフォールディングされた群と、変性された、アンフォールディングの群との間で平衡となる。５０％のタンパク質分子がアンフォールディングされている、温度遷移中間点（Ｔｍ）が高いと、分子はより安定性となる。また、ＤＳＣも用いて、変性の熱容量（ΔＣｐ）における変化を測定する。ＤＳＣ実験は、様々なＦｃ断片のＴｍを測定するために、ＭｉｃｒｏＣａｌ  ＶＰ−Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ＤＳＣ  （ＧＥ  Ｈｅｌａｔｈｃａｒｅ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）を用いて実施した。各実験における、精製対照（Ｆｃ−ＷＴ）または変異型Ｆｃ断片の濃度は、ｐＨ５の１０ｍＭ酢酸ナトリウム、９％スクロース中で、０．５ｍｇ／ｍＬであった。試料を、６０℃／時の加熱速度で、２０℃から９５℃に加熱した。個々のドメインの温度遷移中間点（Ｔｍ）は、５０％の個々のドメインがアンフォールディングされた際に測定した。変異型Ｆｃ断片および対照野生型Ｆｃ断片のＴｍ値のリストを、以下の表３に列挙する。
【０１０２】
【表４】
2018064559.tif 000033
【０１０３】
これらのデータより、ＣＨ２ドメインのＴｍは、ライブラリＬ５の挿入（それらは、ＣＨ３ドメイン中にある）により、大幅に影響を受けないことが示唆される。ＣＨ３ドメインのＴｍは、対照Ｆｃ断片（Ｆｃ−ＷＴ）と比べて、変異型Ｆｃ断片においてやや低下したが、変異型Ｆｃ断片のＣＨ３ドメインのＴｍ値はまだおよそ１０℃ほど、ＣＨ２ドメインのＴｍ値よりも高い。ゆえに、Ｆｃドメイン全体の熱安定性の下限閾値、すなわち、ＣＨ２ドメインのＴｍは、影響を受けることはない。
【０１０４】
実施例７：変異型Ｆｃ断片の、ヒトＦｃＲｎまたはカニクイザルＦｃＲｎへの結合
変異型Ｆｃ断片の、ヒトＦｃＲｎおよびカニクイザルＦｃＲｎへの結合を、ｐＨ５．５およびｐＨ７．４の両方で、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００  分析システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ  Ｐｒｉｖａｔｅ  Ｌｉｍｉｔｅｄ  Ｌｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｕｐｐｓａｌａ，  Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて検証した。検証は、様々な濃度の変異型Ｆｃ断片または対照Ｆｃ断片を、結合条件下で、規定量のヒトＦｃＲｎまたはカニクイザルＦｃＲｎとインキュベートし、次いで、これらの混合物中にある、遊離した、非結合のＦｃＲｎの量を、Ｆｃ断片が固定された表面（ＣＭ５（Ｂｉａｃｏｒｅ）チップのフローセル中）への結合により測定すること、から構成された。チップ上に固定されたＦｃ断片は、混合物中のすべての遊離、非結合ＦｃＲｎが実質的に結合するのに十分な量であった。ゆえに、混合物中の非結合ＦｃＲｎの量を、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００分析システムの使用を介した表面プラズモン共鳴により、定量的に確認することができた。この情報から、ＥＣ５０、すなわち、混合物中の５０％のＦｃＲｎが結合している変異型Ｆｃ断片または対照Ｆｃ断片の濃度が算出された。最初に、上述の実験において特定された２３の変異型Ｆｃ断片の群（対照とみなされるＦｃ−５−１）について、ヒトＦｃＲｎへの結合を検証した。これらのデータに基づき、１４の変異型Ｆｃ断片を選択し、カニクイザルＦｃＲｎへの結合をさらに検証した。
【０１０５】
実験プロトコールを、下記に詳細に記述する。検証されるＦｃ断片を、２９３の細胞中で製造し、上述のように精製した。野生型ヒト対照Ｆｃ断片（Ｆｃ−ＷＴ）および変異型Ｆｃ断片（Ｆｃ−５−１）を、約６０００共鳴単位（ＲＵ）の密度でのアミン結合を用いて、ＣＭ５チップ（Ｂｉａｃｏｒｅ）のフローセル上に固定した。Ｆｃ−５−１は、Ｆｃ−ＷＴと異なり、ｐＨ７．４でＦｃＲｎに良好に結合するため、用いられた。結合される固定タンパク質の無い１つのフローセルを、バックグラウンド対照として用いた。フローセル上に固定されたＦｃ断片に結合したＦｃＲｎを、ｐＨ７．４の溶液で、試料の間に洗浄して放出することにより、連続的な試料測定を一つのフローセルを用いて行うことが可能であった。
【０１０６】
異なる分子および検証条件に対する妥当なシグナルを得るために、異なる分析条件を用いた。ｐＨ５．５での分析に対しては、１０ｎＭのヒトＦｃＲｎまたはカニクイザルＦｃＲｎを、検証される変異型Ｆｃ断片および対照Ｆｃ断片の連続希釈（０．１〜２，０００ｎＭの範囲）と混合し、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．００５％のＰ２０、０．１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ中で、室温で１時間、インキュベートした。陽性対照として、１０ｍＭのヒトＦｃＲｎおよびカニクイザルＦｃＲｎのそれぞれを、上述の同じ溶液中、同じ時間、同じ温度で、ただし、Ｆｃ断片を添加することなく、インキュベートした。これらの試料において、おそらく、すべてのＦｃＲｎは結合しなかった。これらの混合物中の遊離した、非結合のＦｃＲｎの、固定化Ｆｃ−ＷＴおよびＦｃ−５−１への結合は、フローセル表面上への混合物の注入および表面プラズモン共鳴による、表面に結合されたＦｃＲｎを検出することにより測定された。
【０１０７】
ｐＨ７．４での分析に対しては、１０ｎＭのヒトＦｃＲｎまたはカニクイザルＦｃＲｎを、検証される変異型Ｆｃ断片および対照Ｆｃ断片の連続希釈（０．１〜２，０００ｎＭの範囲）と混合し、０．００５％ポリソルベート２０、０．１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で、室温で１時間、インキュベートした。陽性対照として、１０ｍＭのヒトＦｃＲｎおよびカニクイザルＦｃＲｎのそれぞれを、上述の同じ溶液中、同じ時間、同じ温度で、ただし、Ｆｃ断片を添加することなく、インキュベートした。これらの混合物中の、遊離した、非結合のＦｃＲｎの量を、固定化Ｆｃ−５−１  Ｆｃ断片への結合により測定され、それは、Ｆｃ−５−１でコートされたフローセル表面上への混合物の注入、および表面プラズモン共鳴を介した、表面に結合されたＦｃＲｎを検出することにより測定した。Ｆｃ−５−１は、ｐＨ７．４で、Ｆｃ−ＷＴよりもかなり高い親和力でＦｃＲｎに結合するため、これらの分析に用いられた。
【０１０８】
混合物中のＦｃ断片の濃度が増加すると、ＦｃＲｎ結合応答が減少することから、ＦｃＲｎが溶液中のＦｃ断片に結合し、それによってＦｃＲｎのフローセル表面上の固定化Ｆｃ断片への結合が阻害されていたことが示唆された。Ｆｃ断片濃度に対するＦｃＲｎ結合シグナルをプロッティングすることにより、ＥＣ５０を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ５（登録商標）ソフトウェアの片側競合の非線形回帰を用いて算出した。これらの結果を、表４に示す。
【０１０９】
【表５】
2018064559.tif 000034
【０１１０】
表４のデータより、検証された変異型Ｆｃ断片のうち多くが、ｐＨ５．５でのヒトＦｃＲｎへの結合が実質的に改善され（すなわち、Ｆｃ−ＷＴと比較して、実質的に低いＥＣ５０を有する）、ｐＨ７．４での低い結合が維持されていた（すなわち、Ｆｃ−ＷＴと同じような、高いＥＣ５０を有する）ことが示唆される。しかしながら、それらの内、５つ（Ｆｃ−５−５７、Ｆｃ−５−６４、Ｆｃ−５−６６、Ｆｃ−５−７３およびＦｃ−５−１１０）は、ｐＨ５．５で、それほど結合が改善されなかった。それらの内、８つ（Ｆｃ−５−５５、Ｆｃ−５−６０、Ｆｃ−５−７９、Ｆｃ−５−９１、Ｆｃ−５−９２、Ｆｃ−５−９６、Ｆｃ−５−１０１およびＦｃ−５−１１２）は、ｐＨ５．５で、およそ２〜５倍の結合改善を示すのみであった。これらのデータからさらに、ヒトおよびカニクイザルＦｃＲｎへの結合に対する変異型Ｆｃ断片のＥＣ５０は、同等であることが示唆される。検証されたすべての変異型Ｆｃ断片（対照とみなされたＦｃ−５−１以外）で、ｐＨ７．４での、ヒトおよびカニクイザルＦｃＲｎの両方への結合は、低く維持されていた。
【０１１１】
実施例８：さらなる改変を行った変異型Ｆｃ断片の構築
変異型Ｆｃ断片Ｆｃ−５−６９およびＦｃ−５−１０６のさらなる改変版を作製した。Ｆｃ−５−６９の変異型は以下のように作製した。変異型Ｆｃ断片Ｆｃ−５−６９をコードするＤＮＡを、大腸菌でもまた増殖することができる哺乳類発現ベクターへ挿入し、鋳型としてそれを用いた。変異型Ｆｃ−５−６９−Ｗ１Ｆについては、以下の２つのプライマーを用いた：フォワード、ＧＡＧ  ＡＧＣ  ＡＡＴ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＴＧＴ  ＴＴＣ  ＣＣＧ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＧＡＣ  ＴＡＣ（配列番号４９７）；リバース、ＧＴＡ  ＧＴＣ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＣＧＧ  ＧＡＡ  ＡＣＡ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＡＴＴ  ＧＣＴ  ＣＴＣ（配列番号４９８）。Ｆｃ−５−６９−Ｗ１Ｙについては、以下の２つのプライマーを使用した：フォワード、ＧＡＧ  ＡＧＣ  ＡＡＴ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＴＧＴ  ＴＡＣ  ＣＣＧ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＧＡＣ  ＴＡＣ（配列番号４９９）；  リバース、ＧＴＡ  ＧＴＣ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＣＧＧ  ＧＴＡ  ＡＣＡ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＡＴＴ  ＧＣＴ  ＣＴＣ（配列番号５００）。Ｔｈｅ  Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ  （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、２００５１８）プロトコールを用いた。反応混合物は、２００ｎＭのｄＮＴＰｓ、１００ｎＭプライマー（複数）、１ｎｇ  ＤＮＡ  鋳型、１μＬ  ＤＮＡポリメラーゼで、水で総量５０μＬとした。反応は、９５℃で３０秒、次いで、９５℃で３０秒、５５℃で６０秒、６８℃で６分を１６サイクル、そして、６８℃  １０分で、行った。次いで、１μＬのＤｐｎｌを添加し、反応物を、１時間、３７℃でインキュベートした。次いで、２μＬの混合物を用いて４２℃、４５秒で、３０μｌのＸＬ１ブルー  スーパーコンピテント細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）への形質転換に用いた。その後、０．５ｍＬのＳＯＣを添加し、１時間、３７℃、振とう器（３００回転／分（ｒｐｍ））上で細胞をインキュベートした。形質転換された細胞を、ＬＢアンピシリン寒天プレート上に塗抹し、３７℃で一晩、インキュベートした。
【０１１２】
個々のコロニーを選別し、プラスミドＤＮＡを調製して、配列解析を行った。ＤＮＡ配列解析より、変異型Ｆｃ断片は、以下の挿入アミノ酸配列を有したことが示唆された（Ｆｃ−５−６９中の挿入とは、１アミノ酸が異なった）：Ｆｃ−５−６９−Ｗ１Ｆ、ＧＧＣＦＰＬＱＤＹＣＧＧ（配列番号３６７）；および、Ｆｃ−５−６９−Ｗ１Ｙ、ＧＧＣＹＰＬＱＤＹＣＧＧ（配列番号３６８）。これら変異型Ｆｃ断片をコードするＤＮＡを２９３細胞に導入し、上述のように実施されるＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）結合分析での使用のために、上述のようにＦｃ断片が精製された。
【０１１３】
Ｆｃ−５−１０６の改変版を、同様の方法で作製した（ただし、ＰＣＲ反応の鋳型は、哺乳類発現ベクターに挿入された、Ｆｃ−５−１０６をコードするＤＮＡである点を除く）。ＰＣＲ反応に用いられたプライマーは、以下の配列であった：Ｆｃ−５−１０６−Ｍ４Ａ、フォワード、ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＴＧＴ  ＧＴＴ  ＴＴＣ  ＡＡＣ  ＧＣＧ  ＴＴＣ  ＡＡＣ  ＴＧＴ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＧＧＧ（配列番号５０１）およびリバース、ＣＣＣ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＡＣＡ  ＧＴＴ  ＧＡＡ  ＣＧＣ  ＧＴＴ  ＧＡＡ  ＡＡＣ  ＡＣＡ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  （配列番号５０２）；Ｆｃ−５−１０６−Ｍ４Ｇ、フォワード、ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＴＧＴ  ＧＴＴ  ＴＴＣ  ＡＡＣ  ＧＧＧ  ＴＴＣ  ＡＡＣ  ＴＧＴ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＧＧＧ（配列番号５０３）およびリバース、ＣＣＣ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＡＣＡ  ＧＴＴ  ＧＡＡ  ＣＣＣ  ＧＴＴ  ＧＡＡ  ＡＡＣ  ＡＣＡ  ＡＣＣ  ＡＣＣ（配列番号５０４）；Ｆｃ−５−１０６−Ｍ４Ｈ、フォワード、ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＴＧＴ  ＧＴＴ  ＴＴＣ  ＡＡＣ  ＣＡＴ  ＴＴＣ  ＡＡＣ  ＴＧＴ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＧＧＧ（配列番号５０５）およびリバース、ＣＣＣ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＡＣＡ  ＧＴＴ  ＧＡＡ  ＡＴＧ  ＧＴＴ  ＧＡＡ  ＡＡＣ  ＡＣＡ  ＡＣＣ  ＡＣＣ（配列番号５０６）；ＦＣ−５−１０６−Ｍ４Ｉ、フォワード、ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＴＧＴ  ＧＴＴ  ＴＴＣ  ＡＡＣ  ＡＴＣ  ＴＴＣ  ＡＡＣ  ＴＧＴ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＧＧＧ（配列番号５０７）およびリバース、ＣＣＣ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＡＣＡ  ＧＴＴ  ＧＡＡ  ＧＡＴ  ＧＴＴ  ＧＡＡ  ＡＡＣ  ＡＣＡ  ＡＣＣ  ＡＣＣ（配列番号５０８）；Ｆｃ−５−１０６−Ｍ４Ｌ、フォワード、ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＴＧＴ  ＧＴＴ  ＴＴＣ  ＡＡＣ  ＴＴＧ  ＴＴＣ  ＡＡＣ  ＴＧＴ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＧＧＧ（配列番号５０９）およびリバース、ＣＣＣ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＡＣＡ  ＧＴＴ  ＧＡＡ  ＣＡＡ  ＧＴＴ  ＧＡＡ  ＡＡＣ  ＡＣＡ  ＡＣＣ  ＡＣＣ（配列番号５１０）；Ｆｃ−５−１０６−Ｍ４Ｎ、フォワード、ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＴＧＴ  ＧＴＴ  ＴＴＣ  ＡＡＣ  ＡＡＣ  ＴＴＣ  ＡＡＣ  ＴＧＴ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＧＧＧ（配列番号５１１）およびリバース、ＣＣＣ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＡＣＡ  ＧＴＴ  ＧＡＡ  ＧＴＴ  ＧＴＴ  ＧＡＡ  ＡＡＣ  ＡＣＡ  ＡＣＣ  ＡＣＣ（配列番号５１２）；Ｆｃ−５−１０６−Ｍ４Ｑ、フォワード、ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＴＧＴ  ＧＴＴ  ＴＴＣ  ＡＡＣ  ＣＡＧ  ＴＴＣ  ＡＡＣ  ＴＧＴ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＧＧＧ（配列番号５１３）およびリバース、ＣＣＣ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＡＣＡ  ＧＴＴ  ＧＡＡ  ＣＴＧ  ＧＴＴ  ＧＡＡ  ＡＡＣ  ＡＣＡ  ＡＣＣ  ＡＣＣ（配列番号５１４）；Ｆｃ−５−１０６−Ｍ４Ｓ、フォワード、ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＴＧＴ  ＧＴＴ  ＴＴＣ  ＡＡＣ  ＴＣＧ  ＴＴＣ  ＡＡＣ  ＴＧＴ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＧＧＧ（配列番号５１５）およびリバース、ＣＣＣ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＡＣＡ  ＧＴＴ  ＧＡＡ  ＣＧＡ  ＧＴＴ  ＧＡＡ  ＡＡＣ  ＡＣＡ  ＡＣＣ  ＡＣＣ（配列番号５１６）；Ｆｃ−５−１０６−Ｍ４Ｔ、フォワード、ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＴＧＴ  ＧＴＴ  ＴＴＣ  ＡＡＣ  ＡＣＧ  ＴＴＣ  ＡＡＣ  ＴＧＴ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＧＧＧ（配列番号５１７）およびリバース、ＣＣＣ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＡＣＡ  ＧＴＴ  ＧＡＡ  ＣＧＴ  ＧＴＴ  ＧＡＡ  ＡＡＣ  ＡＣＡ  ＡＣＣ  ＡＣＣ（配列番号���１８）；Ｆｃ−５−１０６−Ｍ４Ｖ、フォワード、ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＴＧＴ  ＧＴＴ  ＴＴＣ  ＡＡＣ  ＧＴＧ  ＴＴＣ  ＡＡＣ  ＴＧＴ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＧＧＧ（配列番号５１９）およびリバース、ＣＣＣ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＡＣＡ  ＧＴＴ  ＧＡＡ  ＣＡＣ  ＧＴＴ  ＧＡＡ  ＡＡＣ  ＡＣＡ  ＡＣＣ  ＡＣＣ（配列番号５２０）
【０１１４】
ＰＣＲ反応を上述のように実施し、ＰＣＲ反応物を用いて大腸菌に形質転換した。個々のコロニー由来のプラスミドＤＮＡを配列解析した。以下の挿入配列を有するＦｃ断片をコードする単離株を選択した：Ｆｃ−５−１０６−Ｍ４Ａ、ＧＧＣＶＦＮＡＦＮＣＧＧ（配列番号３６９）；Ｆｃ−５−１０６−Ｍ４Ｇ、ＧＧＣＶＦＮＧＦＮＣＧＧ  （配列番号３７０）；Ｆｃ−５−１０６−Ｍ４Ｈ、ＧＧＣＶＦＮＨＦＮＣＧＧ  （配列番号３７１）；Ｆｃ−５−１０６−Ｍ４Ｉ、ＧＧＣＶＦＮＩＦＮＣＧＧ  （配列番号３７２）；Ｆｃ−５−１０６−Ｍ４Ｌ、ＧＧＣＶＦＮＬＦＮＣＧＧ  （配列番号３７３）；ＦＣ−５−１０６−Ｍ４Ｎ、ＧＧＣＶＦＮＮＦＮＣＧＧ  （配列番号３７４）；Ｆｃ−５−１０６−Ｍ４Ｑ、ＧＧＣＶＦＮＱＦＮＣＧＧ  （配列番号３７５）；Ｆｃ−５−１０６−Ｍ４Ｓ、ＧＧＣＶＦＮＳＦＮＣＧＧ  （配列番号３７６）；Ｆｃ−５−１０６−Ｍ４Ｔ、ＧＧＣＶＦＮＴＦＮＣＧＧ  （配列番号３７７）；Ｆｃ−５−１０６−Ｍ４Ｖ、ＧＧＣＶＦＮＶＦＮＣＧＧ  （配列番号３７８）。
【０１１５】
Ｆｃ−５−６９およびＦｃ−５−１０６のこれらの誘導体を作製し、実施例７に記述される方法を用いて、ｐＨ５．５および７．４での、ヒトＦｃＲｎおよびカニクイザルＦｃＲｎへの相対結合親和力を検証した。
【０１１６】
【表６】
2018064559.tif 000035
【０１１７】
Ｆｃ−５−６９誘導体は両方とも、ｐＨ５．５で、Ｆｃ−５−６９それ自身よりも結合親和力が弱かった。２つの５−１０６誘導体（Ｆｃ−５−１０６−Ｍ４ＩおよびＦｃ−５−１０６−Ｍ４Ｌ）は、Ｆｃ−５−１０６と比べて、ｐＨ７．４でヒトＦｃＲｎおよびカニクイザルＦｃＲｎ両方への結合親和力が高かった。また、これらの２つを含むＦｃ−５−１０６誘導体のうち４つ（Ｆｃ−５−１０６−Ｍ４Ｉ、Ｆｃ−５−１０６−Ｍ４Ｌ、Ｆｃ−５−１０６−Ｍ４ＴおよびＦｃ−５−１０６−Ｍ４Ｖ）は、Ｆｃ−５−１０６それ自身と比べ、ｐＨ５．５で、ほぼ同じか、改善された結合活性を示した。これら４つについて、カニクイザルＦｃＲｎに対する結合親和力を検証した。４つ全てが、ｐＨ５．５および７．４の両方で、ヒトＦｃＲｎに対するものと同等の、カニクイザルＦｃＲｎに対する結合のＥＣ５０を有していた。
【０１１８】
実施例９：変異型Ｆｃ断片のｉｎ  ｖｉｖｏ解析
上で特定された変異型Ｆｃ断片を含有する抗体が、ｉｎ  ｖｉｖｏで改善された薬物動態（ＰＫ）特性を有しているかどうかを測定するために、非改変の抗体Ｘ（ヒトＩｇＧ２抗ヒトＩＬ２３抗体である）および抗体Ｘの変異型版（変異型Ｆｃ断片を含有）を、カニクイザルで、ｉｎ  ｖｉｖｏで検証し、薬物動態的パラメータを明らかにした。抗体Ｘは、線形ｐＫプロファイルを有していることが知られており、そして、ＩＬ−２３は、ｉｎ  ｖｉｖｏでは低レベルで発現していることが公知であることから、変異型Ｆｃ断片の薬物動態的パラメータを検証する適切な抗体として選択された。ゆえに、ＰＫパラメータに対する標的関連効果は、最小限であることが予期され、変異型Ｆｃ断片によるｐＫ効果が検出しやすくなる。
【０１１９】
（Ｘ−５−５１、Ｘ−５−６９、Ｘ−５−１０４、Ｘ−５−１０６、およびＸ−５−１１２）と呼ばれる５つの変異型ＩｇＧ２抗体を作製した。これらＩｇＧ２抗体は、それぞれ、変異型ＩｇＧ１  Ｆｃ断片Ｆｃ−５−５１、Ｆｃ−５−６９、Ｆｃ−５−１０４、Ｆｃ−５−１０６およびＦｃ−５−１１２と同じ位置に、同じ挿入を有していた（表１のアライメントに従う）。より具体的には、挿入はヒトＩｇＧ２  Ｆｃ断片のアミノ酸３８４と３８５の間であった（表１のＥＵ付番）。抗体Ｘの重鎖をコードするＤＮＡを含むプラスミドを、以下のプライマーを用いて行われた５つのＰＣＲ反応の鋳型として用いた：Ｘ−５−５１に対しては、フォワード、５’−ＧＡＧ  ＴＧＧ  ＧＡＧ  ＡＧＣ  ＡＡＴ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＴＧＴ  ＣＡＴ  ＣＴＧ  ＣＣＧ  ＴＴＣ  ＧＣＴ  ＧＴＴ  ＴＧＴ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＧＧＧ  ＣＡＧ  ＣＣＧ  ＧＡＧ  ＡＡＣ−３’（配列番号５３９）およびリバース、５’−ＧＴＴ  ＣＴＣ  ＣＧＧ  ＣＴＧ  ＣＣＣ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＡＣＡ  ＡＡＣ  ＡＧＣ  ＧＡＡ  ＣＧＧ  ＣＡＧ  ＡＴＧ  ＡＣＡ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＡＴＴ  ＧＣＴ  ＣＴＣ  ＣＣＡ  ＣＴＣ−３’（配列番号５４０）；Ｘ−５−６９に対しては、フォワード、５’−ＧＡＧ  ＴＧＧ  ＧＡＧ  ＡＧＣ  ＡＡＴ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＴＧＴ  ＴＧＧ  ＣＣＧ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＧＡＣ  ＴＡＣ  ＴＧＴ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＧＧＧ  ＣＡＧ  ＣＣＧ  ＧＡＧ  ＡＡＣ−３’（配列番号５４１）およびリバース、５’−ＧＴＴ  ＣＴＣ  ＣＧＧ  ＣＴＧ  ＣＣＣ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＡＣＡ  ＧＴＡ  ＧＴＣ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＣＧＧ  ＣＣＡ  ＡＣＡ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＡＴＴ  ＧＣＴ  ＣＴＣ  ＣＣＡ  ＣＴＣ−３’（配列番号５４２）；Ｘ−５−１０４に対しては、フォワード、５’−ＧＡＧ  ＴＧＧ  ＧＡＧ  ＡＧＣ  ＡＡＴ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＴＧＴ  ＧＧＴ  ＣＡＴ  ＧＡＡ  ＴＡＣ  ＡＴＧ  ＴＧＧ  ＴＧＴ  ＧＧＴ  ＧＧＧ  ＣＡＧ  ＣＣＧ  ＧＡＧ  ＡＡＣ−３’（配列番号５４３）およびリバース、５’−ＧＴＴ  ＣＴＣ  ＣＧＧ  ＣＴＧ  ＣＣＣ  ＡＣＣ  ＡＣＡ  ＣＣＡ  ＣＡＴ  ＧＴＡ  ＴＴＣ  ＡＴＧ  ＡＣＣ  ＡＣＡ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＡＴＴ  ＧＣＴ  ＣＴＣ  ＣＣＡ  ＣＴＣ−３’（配列番号５４４）；Ｘ−５−１０６に対しては、フォワード、５’−ＧＡＧ  ＴＧＧ  ＧＡＧ  ＡＧＣ  ＡＡＴ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＴＧＴ  ＧＴＴ  ＴＴＣ  ＡＡＣ  ＡＴＧ  ＴＴＣ  ＡＡＣ  ＴＧＴ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＧＧＧ  ＣＡＧ  ＣＣＧ  ＧＡＧ  ＡＡＣ−３’（配列番号５４５）およびリバース、５’−ＧＴＴ  ＣＴＣ  ＣＧＧ  ＣＴＧ  ＣＣＣ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＡＣＡ  ＧＴＴ  ＧＡＡ  ＣＡＴ  ＧＴＴ  ＧＡＡ  ＡＡＣ  ＡＣＡ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＡＴＴ  ＧＣＴ  ＣＴＣ  ＣＣＡ  ＣＴＣ−３’（配列番号５４６）；Ｘ−５−１１２に対しては、フォワード、５’  −ＧＡＧ  ＴＧＧ  ＧＡＧ  ＡＧＣ  ＡＡＴ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＴＧＴ  ＧＣＴ  ＣＴＧ  ＴＡＣ  ＣＣＧ  ＡＣＴ  ＡＡＣ  ＴＧＴ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＧＧＧ  ＣＡＧ  ＣＣＧ  ＧＡＧ  ＡＡＣ−３’（配列番号５４７）およびリバース、５’−ＧＴＴ  ＣＴＣ  ＣＧＧ  ＣＴＧ  ＣＣＣ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＡＣＡ  ＧＴＴ  ＡＧＴ  ＣＧＧ  ＧＴＡ  ＣＡＧ  ＡＧＣ  ＡＣＡ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＡＴＴ  ＧＣＴ  ＣＴＣ  ＣＣＡ  ＣＴＣ−３’（配列番号５４８）。Ｔｈｅ  Ｑｕ��ｋｃｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ  （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、２００５１８）プロトコールを用いた。反応混合物は、２００ｎＭのｄＮＴＰｓ、１００ｎＭプライマー（複数）、１ｎｇのＤＮＡ鋳型、１μＬのＤＮＡポリメラーゼ、そして水で総量５０μＬとした。反応は、９５℃で３０秒、次いで、９５℃で３０秒、５５℃で６０秒、６８℃で６分を１６サイクル、そして、６８℃で１０分で、行った。次いで、１μＬのＤｐｎＩを添加し、反応物を１時間、３７℃でインキュベートした。次いで、２μＬの混合物を用いて、４２℃で４５秒間、３０μＬのＸＬ１−ブルー  スーパーコンピテント細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換した。その後、０．５ｍＬのＳＯＣを添加し、細胞を、振とう器上（３００ｒｐｍ）で、１時間、３７℃でインキュベートした。形質転換された細胞を、ＬＢアンピシリン寒天プレート上に塗抹し、３７℃で一晩、インキュベートした。個々のコロニーを選別し、プラスミドＤＮＡを調製し、配列解析を行って、選択された単離株が、予測されたＤＮＡ配列を有していることを確認した。
【０１２０】
抗体は、上述のＦｃ断片に対する方法と実質的に同じ方法で調製した（哺乳類宿主細胞が、抗体ＸのＩｇＧ２重鎖（変異型または対照Ｆｃ断片のいずれかをコードする部分を含む）および軽鎖の両方をコードするＤＮＡでトランスフェクトされた点を除く）。宿主細胞は、抗体発現のための適切な条件下でインキュベートされ、抗体を培養培地から回収し、上述のように精製して、以下の実験に用いた。
【０１２１】
カニクイザル（ｎ＝２／群）に、非改変または変異型版の抗体Ｘを、１ｍｇ／ｋｇの投与量で、単回静脈内投与し、８週間の生存期間中、観察を行った。血液試料を、実験の経過の間、特定の時点で回収した。試料は、投与前と、投与後の０．２５、１、４、８、１２、２４、４８、７２、１６８、２４０、３３６、４０８、５０４、５７６、６７２、７４４、８４０、１００８、１１７６および１３４４時間で回収した。
【０１２２】
抗ヒトＩｇＧサンドイッチＥＬＩＳＡを用いて、同じ分子から得られた標準曲線と比較することにより、注射された抗体の全身濃度を測定した。具体的には、マウス抗ヒトＦｃ抗体を、ＰＢＳで希釈し、プレート上にコートし、室温で２時間インキュベートした。ウェルの中身を棄て、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０（ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（登録商標）、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をブロッキング緩衝液としてウェルに添加した。室温、１時間のインキュベーション後、プレートのウェルを、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、血清試料をウェルに添加し、１時間、振とうしてインキュベートした。再度ウェルを洗浄し、セイヨウワサビペルオキシダーゼで標識したマウスの抗ヒトＦｃ抗体をプレートに添加した。１時間のインキュベーションの後、ウェルを洗浄し、３，３´，５，５´テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質を用いて１０分間、発色させた。得られた発色反応を、リン酸または硫酸をプレートに添加してクエンチした。光学濃度（ＯＤ）を、４５０ｎｍおよび６５０ｎｍで測定し、６５０ｎｍでのＯＤを、４５０ｎｍでのＯＤから差し引いた。Ｗａｔｏｓｏｎ  ＬＩＭＳ（７．０．０．０４版）で、重み付けを１／Ｙ２に設定したロジスティックモデルを使用した回帰データから、ＯＤ値を実験試料に対する濃度に変換した。
【０１２３】
薬物動態的分析を、Ｗａｔｏｓｏｎ  ＬＩＭＳ（７．０．０．０４版）内に提供されているＰＫ分析パッケージを用いて、実施した。曝露（曲線下領域（ＡＵＣ））およびクリアランス（ｍＬ／ｋｇ／時）の値を、この分析から得た。各カニクイザルの最後の５回の試料採取時点に対する時間対濃度のデータを用いて、半減期（Ｔ１／２）の値を算出した。
【０１２４】
図４に示されるように、変異型Ｆｃ断片Ｘ−５−５１、Ｘ−５−６９、Ｘ−５−１０４、Ｘ−５−１０６およびＸ−５−１１２を含有する抗体Ｘの変異型版はすべて、非改変の抗体Ｘと比べて、所与のサンプリング時点でのカニクイザルにおけるｍＡｂ濃度が高かったことが示された。表６に示されるように、非改変抗体Ｘと比べて、検証された抗体Ｘのすべての変異型版で、曝露値の増加と、クリアランス値の減少が示された。さらに、抗体Ｘの５つの変異型版のうち４つで、半減期が延長していた。半減期の延長を示さなかった１つの変異型（Ｘ−５−１０６）は、検証された２匹のサルのうち１匹からのデータが、非常に短い半減期（４８時間）を示していた一方で、他のサルは半減期の増加（５３８時間）を示していたことから、その１匹のサルにおいて注射された抗体に対する抗薬物抗体が発現されていた状態である可能性が示唆される。抗薬物抗体の存在を測定するさらなる実験により、この問題は明らかとなるであろう。
表６：半減期、曝露およびクリアランスの平均値
【０１２５】
【表７】
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【０１２６】
概して、これらのデータより、変異型Ｆｃ断片の、カニクイザルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ半減期の延長と関連する、ｐＨ５．５〜６．０での、ＦｃＲｎに対する変異型Ｆｃ断片の結合増強（対照Ｆｃ断片と比較）と、ｐＨ７．４での、ＦｃＲｎからの急速な解離が示唆される。しかしながら、ＩｇＧ１変異型Ｆｃ断片のｐＨ５．５または６での結合の改善の程度と、変異型Ｆｃ断片と同じ挿入を有する全長ＩｇＧ２抗体の薬理学的パラメータにおける改善の程度との間の正確な定量的関係性は、これらのデータからは示されていない。しかしながら、これらのデータにより、Ｘ−５−５１、Ｘ−５−６９、Ｘ−５−１０４およびＸ−５−１１２の半減期が、非改変抗体Ｘと比較して延長していたことが示されており、このことから、Ｘ−５−１０６にも同じことが当てはまることが示唆される。さらに、検証されたすべての変異型抗体が、対照抗体を比較して、クリアランス率が低下し、曝露が増加していた。
【０１２７】
実施例１０：別の部位での挿入を有する変異型Ｆｃ断片の構築
ライブラリＬ５由来の変異型の多くが、望ましい特性を有していたことから、これらの位置での挿入が有利であることが示唆された。以下の実験を行い、Ｌ５挿入部位と同じループの内にある他の部位、または隣接する他の部位が、さらによい特性を有しているかどうかを測定した。この考えを検証するために、選択されたペプチドの内の１つを、このループの異なる位置に挿入し、そして得られた変異型Ｆｃ断片を、ＦｃＲｎ結合について検証した。変異型Ｆｃ断片５−１のペプチド挿入を、挿入するペプチドとして選択した。このペプチドは以下のアミノ酸配列を有している：ＧＧＣＧＭＰＩＥＦＣＧＧ（配列番号６７）。図５（表１に例示されるＥＵ付番方式を使用）に示されるように、このペプチドを、ライブラリＬ５挿入部位以外の、ライブラリＬ５のループの内にある、または隣接する部位に挿入した。得られたＦｃ断片のＦｃＲｎに対する結合を、上述の実施例４のように、ビオチニル化ｈｕＦｃＲｎでコートされたＳＡバイオセンサー（Ｆｏｒｔｅ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．１８−５０１９）を用いて分析した。
【０１２８】
より詳細には、これらの変異型Ｆｃ断片をコードするＤＮＡ構築物を以下のように作製した。Ｔｈｅ  Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ（登録商標）Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，  ２００５１８）プロトコールを使用した。反応混合物は、２００ｎＭのｄＮＴＰ、１００ｎＭのプライマー（複数）、１ｎｇのＤＮＡ鋳型、１μＬのＤＮＡポリメラーゼおよび、水で総量５０μＬとしたものから構成された。各変異体に対するこれらの反応において用いられたプライマーを、以下の表７に示す。ＤＮＡの鋳型は、ベクターに挿入された、野生型ヒトＩｇＧ１  ＦｃポリペプチドをコードするｃＤＮＡとした。反応は、９５℃、３０秒間、次いで、９５℃、３０秒間、５５℃、６０秒間、および６８℃、６分間の１６サイクル、そして最後に６８℃、１０分間のサイクルで行った。次いで、１μＬのＤｐｎｌを添加し、反応物を１時間、３７℃でインキュベートした。次いで、２μＬの混合物を用いて、３０μＬのＸＬ１−ブルー  スーパーコンピテント大腸菌細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に、４２℃、４５秒間、形質転換した。その後、Ｓｕｐｅｒ  Ｏｐｔｉｍａｌ  Ｂｒｏｔｈ  ｗｉｔｈ  Ｃａｔａｂｏｌｉｔｅ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＳＯＣ；２％のｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．５％酵母抽出物、１０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＫＣＩ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、および２０ｍＭグルコースを含有）を０．５ｍＬ、添加し、細胞を振とう器（３００回転／分（ｒｐｍ））上で、１時間、３７℃でインキュベートした。形質転換された細胞をＬＢアンピシリン寒天プレート上に塗抹し、一晩、３７℃でインキュベートした。
【０１２９】
【表８】
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【０１３０】
個々のコロニーを選別し、プラスミドＤＮＡを調製し、配列を解析した。これらの変異型Ｆｃ断片をコードするＤＮＡを２９３−６Ｅ細胞に導入し、これらの細胞由来の馴化培地（ＣＭ）中のＦｃ断片を、ＦｏｒｔｅＢｉｏ結合アッセイの実施（上述）に用いた。実施例４を参照のこと。
【０１３１】
ｐＨ６での結合、およびｐＨ７での解離の結果を、図６に示す。変異型Ｆｃ断片のうちの２つ、５−１−１０および５−１−２は、ｐＨ６で変異型５−１よりも大きな最大応答であったが、ｐＨ７．４での解離もゆっくりとしていた。図６を参照のこと。ｐＨ６で、全ての他の構築物は変異型５−１と比べ、いくらか弱い最大応答を示したが、これらの応答のすべては、野生型Ｆｃ断片（図６、ＦｃＷＴと命名されている）のそれと同等または高いものであった。さらに、ｐＨ７．４でのこれらの構築物の解離は、５−１とは異なり、ＦｃＷＴと同等であった。ゆえに、ループ１０の内、または隣接した挿入を有している、ほとんどのＦｃ変異型（５−１−２および５−１−１０以外。それら両方は、３８３と３８４の間に挿入を有している）は、ｐＨ７．４で、変異型５−１よりも早く解離した。また、５−１−１、５−１−２、５−１−３、５−１−９、および５−１−１０は、ｐＨ６で、ＦｃＷＴ、変異型５−１よりもはっきりと高い最大応答を有していた一方で、変異型５−１−６、５−１−７および５−１−８は、ＦｃＷＴと同等の最大応答を有していた。変異型５−１−４および５−１−５は、ＦｃＷＴよりもわずかに高い応答であった。これらのデータより、ペプチドの挿入は、ループ１０の内のある部位で、より有益な効果をもたらすことが示唆される。特に、３８２と３８３、３８３と３８４、３８４と３８５、３８５と３８６の位置の間の挿入（表１および図５に図示されるＥＵ付番方式を使用）により、ｐＨ６でＦｃＷＴよりも高い最大応答と、ｐＨ７．４で急速な解離を有するＦｃ変異型がもたらされた。対照的に、３８８と３８９、３８９と３９０または３９０と３９１の位置の間の挿入を有するＦｃ変異型は、ＦｃＷＴと似た特性を有していた。最後に、３８６と３８７または３８７と３８８の間に挿入を有するＦｃ変異型は、ｐＨ６でのＦｃＷＴよりわずかに高い応答と、ｐＨ７．４での急速な解離を示した。さらに、変異型５−１−９および５−１−１０のように、アミノ酸３８４−３８６を除去し、その場所にペプチドを挿入することにより、ＦｃＷＴと比較して、これらＦｃ変異型の特性が改善された。５−１−１０のやや長い挿入（挿入の最初と最後に、５−１−９のように２つではなく３つのグリシン残基を含んだ）によって、他のいずれの変異型（３８３と３８４の間の位置に挿入（付随する欠損は無い）を有していた、５−１−２を含む）よりも高い応答が得られた。これらのデータより、３８２位と３８７位の間の領域の内のＦｃＲｎへの結合を増加させることができるペプチドの挿入により、ｐＨ７．４でのＦｃＲｎからの急速な解離を維持しながら、ｐＨ６でのＦｃＲｎへのＦｃ断片の結合を強化することができることが示唆される。他方、３８８位と３９１位の間のペプチドのような挿入では、ＦｃＷＴと比較した、ｐＨ６でのＦｃＲｎへのＦＣ断片の結合活性および／または親和力は実質的に増強されず、また、ｐＨ７．４での解離にもほとんど、または影響はなかった。ゆえに、これらのデータより、ｐＨ６でのＦｃＲｎへの結合活性および／または親和力を増強させることができる挿入の作製に特に好ましい部位を含むものとして、ループ１０の位置、すなわち、３８２位から３８６位、３８７位または３８８位（ＥＵ付番）の間の位置が提示される。
【０１３２】
実施例１１：酵母ディスプレイによる、変異型Ｆｃ断片の選択
変異型Ｆｃポリペプチドの異なる群を得るために、酵母ディスプレイを用いて選別を実施した。酵母におけるスクリーニング用ライブラリを作製するために、従前に作製した３つのライブラリを、開始点として用いた。これらのうち、１つはライブライＬ５である（上述）。図２および実施例２を参照のこと。他の２つのライブラリは、ライブラリＬ５と全く同じ部位に挿入を有しており、ライブラリＬ５を作製するために用いられた一般的な方法と同じ方法を用いて作製されたが、ライブラリＬ５は、６つのランダム化アミノ酸を有する挿入をコードしていた一方で、ライブラリＬ−８とＬ−１０は、それぞれ、８および１０のランダム化アミノ酸を有する挿入をコードしていた点で、挿入の形式が異なっていた。具体的には、これらのライブラリは、以下の形式の挿入をコードしていた：ライブラリＬ−８、ＧＧＣ（１９Ｒ）８ＣＧＧ（配列番号８８）；およびライブラリＬ−１０、ＧＧＣ（１９Ｒ）１０ＣＧＧ（配列番号８９）。これらの挿入は、ライブラリＬ５におけるものと同じように、１６９位の「Ｎ」および１７０位の「Ｇ」（図２の付番スキームによる）の間にある。「（１９Ｒ）８」および「（１９Ｒ）１０」は、それぞれ８および１０のランダム化アミノ酸を示し、システイン以外の任意のアミノ酸であることができる。
【０１３３】
ライブラリＬ５、Ｌ−８およびＬ−１０を、ＳａｃＩＩおよびＮｏｔＩで消化し、得られた断片（変異型Ｆｃ断片をコード）を精製し、大腸菌および出芽酵母の両方における発現に適したベクターにライゲートした。ベクターはまた、挿入を有するフレーム内に、ＨＡタグ（ヒトインフルエンザヘマグルチニン由来の短いペプチド配列（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）（配列番号５７５））をコードしており、Ｆｃ領域が酵母細胞の表面上に提示されたことを確認するために用いられた。これら３つの新たなライブラリを、大腸菌、具体的には、ＸＬ１−ブルー  スーパーコンピテント大腸菌細胞へと導入した。約５ｘ１０８の大腸菌形質転換体由来のＤＮＡを用いて、約１〜２ｘ１０９の出芽酵母細胞へと、標準的な酢酸リチウム法を用いて形質転換した。出芽酵母を一晩培養させたものを、酵母抽出物ぺプトンデキストロース培地（２０ｇ／Ｌのｂａｃｔｏ−ｐｅｐｔｏｎ、１０ｇ／Ｌの酵母抽出物、２％グルコース（ＹＰＤ）を含有）１００ミリリットル中に、０．２〜０．３のＯＤ６００となるまで希釈し、ＯＤ６００が１．０〜２．０に達するまで、３００回転／分（ｒｐｍ）、３０℃で振とうさせ増殖させた。次いで、その細胞を３０ミリリットルの水および３０ミリリットルの１００ｍＭのＬｉＯＡｃで洗浄した。各ライブラリに対し、１ＭのＬｉＯＡｃ、５０％ＰＥＧ、一本鎖担体ＤＮＡ、水および２５ｕｇのライブラリＤＮＡを含む形質転換混合物を、細胞に添加した。各形質転換体に、４５分、４２℃でヒートショックを与えた。細胞をペレット化させ、次いで、１時間、３０℃で、５０ミリリットルのＹＰＤ培地中で増殖させた。細胞を再度ペレット化させ、３０ミリリットルのＳＤ−ｌｅｕ培地（１４．７ｇ／Ｌのクエン酸ナトリウム、４．２９ｇ／Ｌのクエン酸、２％のデキストロース、６．７ｇ／Ｌの酵母窒素塩基（ＹＮＢ）、１．６ｇ／ＬのＹｅａｓｔ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｄｒｏｐ−ｏｕｔ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  Ｌｅｕｃｉｎｅ  （Ｓｉｇｍａ，  Ｙ１３７６)）で洗浄した。次いで、細胞を１０ミリリットルのＳＤ−ｌｅｕ培地中で再懸濁した。次いで、１０ミリリットルの形質転換細胞を、３００ミリリットルのＳＤ−ｌｅｕ培地へ播種し、３０℃で一晩、増殖させた。
【０１３４】
酵母形質転換体中での変異型Ｆｃ断片の発現誘導を、一晩培養させた培養物（約１０８細胞）のアリコートを、誘導培地（５．４ｇ／Ｌ  Ｎａ２ＨＰ０４、８．５６ｇ／Ｌ  ＮａＨ２Ｐ０４、２％ガラクトース、６．７ｇ／Ｌ  ＹＮＢ、および１．６ｇ／Ｌ  Ｙｅａｓｔ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｄｒｏｐ−ｏｕｔ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ（ロイシン無し）（Ｓｉｇｍａ、Ｙ１３７６））へと播種し、２０℃で約４８時間細胞を培養することにより行われた。
【０１３５】
これらの誘導細胞をスピンダウンし、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）緩衝液（＋０．５％のＢＳＡ）（ｐＨ７．４）に再懸濁した。次いで、０．５〜１ｘ１０８の誘導細胞を、１時間、１μＭのビオチニル化ＦｃＲｎ（ビオチン−ＦｃＲｎ）と共にインキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、２μｇ／ｍＬの標識化ストレプトアビジン（ストレプトアビジン（ＳＡ）−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７（カタログ番号  Ｓ３２３５７、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））と共に１５分間、インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、抗Ｃｙ５／抗Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７  Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ（カタログ番号  １３０−０９１−３９５，  ＭＡＣＳ  Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）と共に、１５分間、インキュベートした。細胞を洗浄し、ＬＳ  Ｃｏｌｕｍｎｓ（カタログ番号  １３０−０４２−４０１、ＭＡＣＳ  Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）および、ＱｕａｄｒｏＭＡＣＳ（登録商標）Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｕｎｉｔ（カタログ番号  １３０−０９１−０５１、ＭＡＣＳ  Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて分離した。プレ−カラム、フロースルー、洗浄液および溶出分画のアリコートを、ＦＡＣＳ分析のために採取した。フロースルーおよび洗浄液は、枯渇群（ｄｅｐｌｅｔｅｄ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ、ｐＨ７．４で、非常に低い親和力でＦｃＲｎに結合する変異型Ｆｃポリペプチドを発現する細胞を含有）として採取した。
【０１３６】
この細胞の枯渇群を、次いで、ＳＤ−ｌｅｕ培地中で、一晩、３０℃で増殖させた。次いで、上述の誘導培地中で、約４８時間、２０℃で、細胞を誘導した。引き続く洗浄および播種のステップは、ＭＥＳ緩衝液（２０ｍＭのＭＥＳ、１３７ｍＭのＮａＣｌ、０．５％のＢＳＡ）（ｐＨ５．５）中で行われた。誘導された細胞を、２５０ｎＭのビオチン−ＦｃＲｎと共に、氷上で１時間、インキュベートした。そして、ＳＡ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７（２μｇ／ｍＬ）および抗ＨＡ−ＦＩＴＣ（１μｇ／ｍＬ）を添加し、洗浄およびセルストレイナーを通した後、その細胞を、ｐＨ５．５で、ＦＡＣＳ分析に供した。ゲートは、ＦＩＴＣおよびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）の両方で強いシグナルを示した細胞を採取するように設定した。これらの細胞を、次いで、ＳＤ−ｌｅｕ培地中で３０℃、一晩培養し、次いで、誘導培地中で、約４８時間、２０℃で誘導した。次いで、２回目のラウンドにおいて、誘導細胞を、１時間、２５ｎＭのビオチン−ＦｃＲｎと共に、氷上でインキュベートし、上述のように、標識ステップ、洗浄ステップ、染色ステップ、ＦＡＣＳステップ、培養ステップ、誘導ステップを繰り返した。最後に、３回目のラウンドにおいて、誘導細胞を５ｎＭのビオチン−ＦｃＲｎと共に、１時間、氷上でインキュベートし、次いで、上述の標識ステップ、洗浄ステップ、染色ステップ、ＦＡＣＳステップおよび培養ステップを行った。ゆえに、最終的に得られたものは、ｐＨ５．５で、野生型Ｆｃ断片よりも高い親和力で、ＦｃＲｎに結合する可能性のあるＦｃ断片を発現する細胞群である。
【０１３７】
この細胞群をプレートに撒き、ライブラリＬ５由来の５００コロニー、ならびに、ライブラリＬ−８およびＬ−１０のそれぞれ由来の４００コロニーを、さらなる分析のために選択した。これら個々のコロニーのそれぞれを、３０℃で一晩、上述のようにＳＤ−ｌｅｕ培地中で培養した。これらの単離株のそれぞれにおける挿入の配列は、酵母プラスミドＤＮＡから測定された。すべてにおいて、３１７、２６５、および３１３の固有の配列がそれぞれ、ライブラリＬ５、Ｌ−８、およびＬ−１０の各ライブラリのこれらの単離株の間に存在していた。次いで、細胞を、上述の誘導培地中で４８時間、２０℃で誘導した。引き続き、洗浄ステップおよびインキュベーションステップを、ＭＥＳ緩衝液（２０ｍＭのＭＥＳ、１３７ｍＭのＮａＣｌ、０．５％のＢＳＡ）（ｐＨ５．５）およびＰＢＳ緩衝液（＋０．５％のＢＳＡ）（ｐＨ７．４）中で、並行して行った。約５ｘ１０５細胞／試料を、２５０ｎＭのビオチン−ＦｃＲｎおよび１μｇ／ｍｌの抗ＨＡ−ＦＩＴＣと共に、１時間、インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、２μｇ／ｍＬのＳＡ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７と共に、１５分間、インキュベートした。細胞を洗浄し、そしてＦＡＣＳを介して結合を分析し、それらがｐＨ５．５でＦｃＲｎに強く結合し、ｐＨ７．４で弱く結合しているかどうかを、測定した。ｐＨ５．５での最も強いＦｃＲｎに対する結合シグナルと共に、ｐＨ７．４でのＦｃＲｎに対する弱い結合シグナルを示し、メチオニンもしくはトリプトファン残基がほとんどないか、または無い個々の細胞株を、さらなる分析のために、各ライブラリから選択した。これらの選択された単離株には、それぞれ、Ｌ５、Ｌ−８およびＬ−１０由来の１５８、５９および５０細胞株が含まれ、これら単離株中の挿入配列を、以下の表８に示す（クローン名称５ｙ−３７は、適切なベクターへの再クローニングが上手くいかなかったため、さらなる分析の中には含まれなかったことに留意されたい）。
【０１３８】
【表９】
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【０１３９】
各ライブラリ由来の選択された個々のクローンをプールし、ＤＮＡを、Ｚｙｍｏｐｒｅｐ  Ｙｅａｓｔ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ＩＩ  Ｋｉｔ  （Ｄ２００４，  Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて単離した。ＰＣＲを、フォワードプライマー（５’ＧＧＡ  ＡＡＡ  ＧＴＣ  ＧＡＣ  ＴＡＧ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＧＡ  ３’（配列番号３５７））およびリバースプライマー（５’ＣＴＴ  ＴＧＣ  ＧＧＣ  ＣＧＣ  ＴＣＡ  ＴＴＡ  ＴＴＴ  ３’（配列番号３５８））を用いて、プールされたＤＮＡに対して行った。ＰＣＲ  Ｃｏｒｅ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ，  Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．  １１  ５７８  ５５３  ００１）を、以下の反応条件で用いた：９５℃  ５分、次いで、９５℃  ４５秒、５５℃  ４５秒、７２℃  ９０秒を３０サイクル、そして最後に７２℃  １０分。ＰＣＲ反応物および哺乳類発現ベクターを、ＳａｌｌおよびＮｏｔｌ制限酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で、３７℃、一晩、消化した。消化されたＤＮＡを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （２８７０４，  Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲル精製した。消化されたベクターＤＮＡおよびＰＣＲ産物を、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いてライゲートし、１６℃で一晩インキュベートした。ライゲートされたＤＮＡを用いて、ＸＬ１０−ゴールド  ウルトラコンピテント大腸菌細胞（＃２００３１５，  Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を形質転換し、個々のクローンを選択した。各選択された変異型ＦｃポリペプチドをコードするＤＮＡを含有する大腸菌クローン由来のプラスミドＤＮＡを、２９３−６Ｅ哺乳類細胞へと導入した。具体的には、２９３−６Ｅ細胞を、５ｘ１０４細胞／ウェルで、ポリ−Ｄ−リジンコートされた９６ウェルの平底マイクロタイタープレートに播種し、３７℃で一晩インキュベートした。次いで、２００ｎｇのプラスミドＤＮＡを、Ｆｕｇｅｎｅ（登録商標）ＨＤトランスフェクション試薬（＃Ｅ２３１２、Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて細胞へとトランスフェクトし、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、増殖培地を、０．５％トリプトン含有の無血清培地へと交換した。さらに６日間、３７℃で増殖させた後、馴化培地を回収した。馴化培地（変異型Ｆｃ断片含有）を、次いで、実施例４に記述されるＦｏｒｔｅＢｉｏ技術を用いて、ＦｃＲｎへの結合について検証した。最も好ましい結合プロファイルを有する変異型Ｆｃ断片由来の結合曲線および解離曲線（それぞれ、ｐＨ６および７．４）を図７に示す。
【０１４０】
図７において、酵母ライブラリＬ５由来の２８の最も良い変異型Ｆｃ断片、ならびに野生型Ｆｃ断片（ＦｃＷＴ）の、それぞれｐＨ６およびｐＨ７．４でのＦｃＲｎ結合に対する結合プロファイルおよび解離プロファイルを示し、図８において、酵母ライブラリＬ−８およびＬ−１０から選択された１８の最も良い変異型Ｆｃ断片に対するＦｃＲｎ結合プロファイルを示す。すべてのＬ５変異型Ｆｃ断片は、ｐＨ６で非常により高い最大応答を有し、すなわち、ＦｃＷＴよりも高い結合活性であった。ｐＨ７．４では、すべてが急速に解離、すなわち、ＦｃＷＴと同じように、結合活性がほとんどないか、結合活性が無かった。すべてのＬ−８およびＬ−１０変異型Ｆｃ断片は、ｐＨ６で非常により高い最大応答、すなわち、ＦｃＷＴよりも高い結合活性であった。ｐＨ７．４では、すべてが急速に解離したが、ほとんどが、ＦｃＷＴにおいて観察されなかった低いレベルの残留結合を示した。ゆえに、これら変異型Ｆｃ断片のすべてが、ＦｃＷＴと比較して好ましい特性を有している。それゆえ、異なる長さを有するペプチド挿入を用いて、残留結合がほとんど無いかまたは無い状態でｐＨ７．４でのＦｃＲｎからの急速な解離を維持したまま、ｐＨ６でのＦｃＲｎへの結合活性を成功裏に増強させることができる。
【０１４１】
実施例１２：酵母で選択された変異型Ｆｃ断片のｉｎ  ｖｉｖｏの特性解析
上述の酵母スクリーニングで特定された変異型Ｆｃ断片を含有する抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ薬物動態（ＰＫ）特性が改善されたかどうかを判定するために、非改変抗体Ｘ（ヒトＩｇＧ２抗ヒトＩＬ−２３抗体である）および抗体Ｘの変異型版（変異型Ｆｃ断片を含有）を、カニクイザルにおいて、薬物動態的パラメータを明らかにするためにｉｎ  ｖｉｖｏで検証した。抗体Ｘは、線形のｐＫプロファイルを有していることが知られ、ＩＬ−２３はｉｎ  ｖｉｖｏでは低レベルで発現していることが知られていることから、変異型Ｆｃ断片の薬理学的パラメータを検証するための適切な抗体として選択された。ゆえに、ＰＫパラメータに対する標的関連の影響は最小限であり、変異型Ｆｃ断片によるｐＫの影響が検出しやすくなる。
【０１４２】
（Ｘ−５ｙ−８、Ｘ−５ｙ−１３２、Ｘ−５ｙ−３８、Ｘ−５ｙ−９１、Ｘ−５ｙ−１１９およびＸ−５ｙ−１２７）と呼ばれる６つの変異型ＩｇＧ２抗体を作製した。これらのＩｇＧ２抗体は、それぞれ、変異型ＩｇＧ１  Ｆｃ断片、５ｙ−８、５ｙ−１３２、５ｙ−３８、５ｙ−９１、５ｙ−１１９および５ｙ−１２７と同じ位置で、同じ挿入を有していた。抗体Ｘの重鎖をコードするＤＮＡを含有するプラスミドを鋳型として用いて、以下のプライマーを用いた５つのＰＣＲ反応を行った：Ｘ−５ｙ−８に対しては、フォワード、５’−ＧＡＧ  ＴＧＧ  ＧＡＧ  ＡＧＣ  ＡＡＴ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＴＧＴ  ＣＣＧ  ＧＴＴ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＴＴＣ  ＡＡＣ  ＴＧＴ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＧＧＧ  ＣＡＧ  ＣＣＧ  ＧＡＧ  ＡＡＣ−３’（配列番号３８０）およびリバース、５’−  ＧＴＴ  ＣＴＣ  ＣＧＧ  ＣＴＧ  ＣＣＣ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＡＣＡ  ＧＴＴ  ＧＡＡ  ＣＡＧ  ＣＡＧ  ＡＡＣ  ＣＧＧ  ＡＣＡ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＡＴＴ  ＧＣＴ  ＣＴＣ  ＣＣＡ  ＣＴＣ  −３’（配列番号３８１）；Ｘ−５ｙ−１３２に対しては、フォワード、５’−ＧＡＧ  ＴＧＧ  ＧＡＧ  ＡＧＣ  ＡＡＴ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＴＧＴ  ＧＴＴ  ＴＴＣ  ＴＣＴ  ＧＣＴ  ＣＴＧ  ＴＧＧ  ＴＧＴ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＧＧＧ  ＣＡＧ  ＣＣＧ  ＧＡＧ  ＡＡＣ−３’（配列番号３８２）およびリバース、５’−ＧＴＴ  ＣＴＣ  ＣＧＧ  ＣＴＧ  ＣＣＣ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＡＣＡ  ＣＣＡ  ＣＡＧ  ＡＧＣ  ＡＧＡ  ＧＡＡ  ＡＡＣ  ＡＣＡ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＡＴＴ  ＧＣＴ  ＣＴＣ  ＣＣＡ  ＣＴＣ−３’（配列番号３８３）；Ｘ−５ｙ−３８に対しては、フォワード、５’−  ＧＡＧ  ＴＧＧ  ＧＡＧ  ＡＧＣ  ＡＡＴ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＴＧＴ  ＧＡＡ  ＡＣＴ  ＴＡＣ  ＴＧＧ  ＴＴＧ  ＴＴＣ  ＴＧＴ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＧＧＧ  ＣＡＧ  ＣＣＧ  ＧＡＧ  ＡＡＣ−３’（配列番号３８４）およびリバース、５’−ＧＴＴ  ＣＴＣ  ＣＧＧ  ＣＴＧ  ＣＣＣ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＡＣＡ  ＧＡＡ  ＣＡＡ  ＣＣＡ  ＧＴＡ  ＡＧＴ  ＴＴＣ  ＡＣＡ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＡＴＴ  ＧＣＴ  ＣＴＣ  ＣＣＡ  ＣＴＣ−３’（配列番号３８５）；Ｘ−５ｙ−９１に対しては、フォワード、５’−ＧＡＧ  ＴＧＧ  ＧＡＧ  ＡＧＣ  ＡＡＴ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＴＧＴ  ＣＣＧ  ＣＡＴ  ＴＧＧ  ＣＣＧ  ＴＴＣ  ＧＡＡ  ＴＧＴ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＧＧＧ  ＣＡＧ  ＣＣＧ  ＧＡＧ  ＡＡＣ−３’（配列番号３８６）およびリバース、５’−ＧＴＴ  ＣＴＣ  ＣＧＧ  ＣＴＧ  ＣＣＣ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＡＣＡ  ＴＴＣ  ＧＡＡ  ＣＧＧ  ＣＣＡ  ＡＴＧ  ＣＧＧ  ＡＣＡ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＡＴＴ  ＧＣＴ  ＣＴＣ  ＣＣＡ  ＣＴＣ−３’（配列番号３８７）；Ｘ−５ｙ−１１９に対しては、フォワード、５’−ＧＡＧ  ＴＧＧ  ＧＡＧ  ＡＧＣ  ＡＡＴ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＴＧＴ  ＧＣＴ  ＴＴＣ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＡＴＣ  ＴＡＣ  ＴＧＴ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＧＧＧ  ＣＡＧ  ＣＣＧ  ＧＡＧ  ＡＡＣ−３’（配列番号３８８）およびリバース、５’−  ＧＴＴ  ＣＴＣ  ＣＧＧ  ＣＴＧ  ＣＣＣ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＡＣＡ  ＧＴＡ  ＧＡＴ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＧＡＡ  ＡＧＣ  ＡＣＡ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＡＴＴ  ＧＣＴ  ＣＴＣ  ＣＣＡ  ＣＴＣ  −３’（配列番号３８９）；  および、Ｘ−５ｙ−１２７に対しては、フォワード、５’−ＧＡＧ  ＴＧＧ  ＧＡＧ  ＡＧＣ  ＡＡＴ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＴＧＴ  ＣＡＧ  ＴＡＣ  ＴＴＣ  ＴＴＧ  ＣＣＧ  ＴＧＴ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＧＧＧ  ＣＡＧ  ＣＣＧ  ＧＡＧ  ＡＡＣ−３’（配列番号３９０）およびリバース、５’−ＧＴＴ  ＣＴＣ  ＣＧＧ  ＣＴＧ  ＣＣＣ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＡＣＡ  ＣＧＧ  ＣＡＡ  ＧＡＡ  ＧＴＡ  ＣＴＧ  ＡＣＡ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＡＴＴ  ＧＣＴ  ＣＴＣ  ＣＣＡ  ＣＴＣ−３’（配列番号３９１）。Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、２００５１８）プロトコールを用いた。反応混合物は、２００ｎＭのｄＮＴＰ、１００ｎＭプライマー（複数）、１ｎｇのＤＮＡ鋳型、１μＬのＤＮＡポリメラーゼおよび水で総量５０μＬとした。反応は、９５℃で３０秒間、次いで、９５℃で３０秒間、５５℃で６０秒間、６８℃で６分間を１６サイクル、そして、６８℃、１０分で行った。次いで、１μＬのＤｐｎＩを添加し、反応物を１時間、３７℃でインキュベートした。次いで、２μＬの混合物を用いて、３０μｌのＸＬ１−ブルー  スーパーコンピテント細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）へ、４５秒、４２℃で形質転換した。その後、０．５ｍＬのＳＯＣを添加し、その細胞を、振とう器（３００ｒｐｍ）上で、１時間、３７℃でインキュベートした。形質転換された細胞をＬＢアンピシリン寒天プレート上に塗抹し、３７℃、一晩、インキュベートした。個々のコロニーを選別し、プラスミドＤＮＡを調製、配列解析を行い、選択された単離株が、期待されるＤＮＡ配列を有していたことを確認した。
【０１４３】
抗体は、原則的に上述のＦｃ断片と同じ方法で調製された（哺乳類宿主細胞が、変異型または対照Ｆｃ断片のいずれかをコードする部分を含むＩｇＧ２重鎖、および抗体Ｘの軽鎖の両方をコードするＤＮＡでトランスフェクトされた点を除く）。宿主細胞を、抗体の発現に適した条件下でインキュベートし、抗体を、培養培地から回収し、上述のように精製し、以下の実験に用いた。
【０１４４】
非改変または変異型版の抗体Ｘを、１ｍｇ／ｋｇの投与量で、カニクイザル（ｎ＝２／群）に単回静脈内投与し、８週間の生存期間中、観察を行った。抗体Ｘ−５−１１２（従前に検証されている）、ならびに抗体Ｘそれ自体を、対照として用いた。血液試料を、実験の経過の間、特定の時点で回収した。試料は、投与前と、投与後の０．２５、１、４、８、１２、２４、４８、７２、１６８、２４０、３３６、４０８、５０４、５７６、６７２、７４４、８４０、１００８、１１７６および１３４４時間で回収した。抗体を血液試料中で検出し、薬物動態分析を、基本的に、実施例９に記述されるように実施した。
【０１４５】
図９に示されるように、検証されたすべての変異型Ｆｃ断片を含有する抗体Ｘの変異型版は、ほとんどの試料回収時点（４００時間を超えるすべての時点を含む）で、非改変の抗体Ｘと比べ、カニクイザルにおいて、高いｍＡｂ濃度を示した。さらに、いくつかの変異型は、従前に検証されていた、Ｘ−５−１１２（Ｘ−５ｙ−８、Ｘ−５ｙ−１２７およびＸ−５ｙ−９１を含む）と同等であった。
【０１４６】
以下の表１１に、本実験の各カニクイザルにおける、抗体Ｘおよびそれらの変異型の半減期（Ｔ１／２）、曝露（曲線下面積（ＡＵＣ））およびクリアランス率（ＣＩ）を示す。
【０１４７】
【表１０】
2018064559.tif 000048
【０１４８】
すべての変異型が、抗体Ｘと比較して、それぞれを注射された２匹のサルのうち少なくとも１匹で、半減期およびＡＵＣの増加を示した。サル＃２０７および＃２１３においては、それぞれＸ−５ｙ１３２およびＸ−５ｙ−１１９の半減期は抗体Ｘより短かった。これは、これら特定のサル達が、抗薬剤抗体を発現し、そのために抗体のクリアランスがより早くなったと解釈されうる。ＡＵＣ値もまた、検証されたほとんどの変異型で、抗体Ｘよりも大きかった。
【０１４９】
これら薬物動態パラメータの平均データ（サル＃２０７および＃２１３を除く）を、以下の表１２に示す。上述の表６において報告した従前の実験から得られた値は、抗体ＸおよびＸ−５−１１２に含まれており、このことから、値は、比較的、実験間で一定であることが示される。
【０１５０】
【表１１】
2018064559.tif 000049
【０１５１】
これらのデータにより、抗体ＸおよびＸ−５−１１２に対する薬物動態パラメータは、比較的、実験間で一定であったことが示される。また、これらデータより、検証されたすべての変異型において、半減期と曝露が増加していることが示唆される。ゆえに、概して、これらのデータより、（対照Ｆｃ断片と比較して）、ｐＨ５．５〜６．０でのＦｃＲｎへの変異型Ｆｃ断片の結合増加と、ｐＨ７．４でのＦｃＲｎからの急速な解離が、カニクイザルにおける、変異型Ｆｃ断片を含有する抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期の延長と関連することが示唆される。
【０１５２】
実施例１３：非線形ＰＫプロファイルを有する変異型Ｆｃ含有抗体のｉｎ  ｖｉｖｏの特性解析
非線形ＰＫプロファイルを有する抗体のＰＫ特性が、本明細書に記述されるペプチドの内の１つを挿入することにより改善されるかどうかを判定するため、変異型Ｆｃ断片Ｆｃ−５−１１２における挿入を、抗体Ｙ、すなわち非線形ＰＫプロファイルを有するヒトＩｇＧ２抗体へと移した。抗体Ｙのこの変異型は、Ｙ−５−１１２と呼ばれる変異型ＩｇＧ２抗体であり、基本的に上述のように作製された（異なるＰＣＲプライマー（抗体Ｙにおいて必要な改変を作製するために適したもの）を使用した点を除く）。
【０１５３】
抗体を、実施例９に記述されるように調製した。抗体Ｙまたは抗体Ｙ−５−１１２を、１０ｍｇ／ｋｇの投与量で、カニクイザル（ｎ＝２／群）に単回静脈内投与し、８週間の生存期間中、観察を行った。血液試料を、投与前と、投与後の０．０８３（５分）、０．２５、０．５、１、２、４、６、８、１２、２４、３６、４８、７２、９６、１２０、１４４、１６８、１９２、２６、２４０、２６４、２８８、３１２、３３６、３８４、４３２、４８０、５２８、５７６、６２４、６７２、７２０、７６８、８１６、８６４、９１２、９６０、１００８、１０５６、１１０４、１１５２、１２００、１２４８、１２９６および１３４４時間で回収した。
【０１５４】
カニクイザル血清中の濃度を、サンドイッチＥＬＩＳＡを用いて測定した。マウス抗ヒト抗体を、ＰＢＳ中で希釈し、９６ウェルのマイクロタイタープレートのウェルに添加した。一晩継続して、または３日まで、わずか５℃のインキュベーションの後、ウェルの内容を廃棄し、ｂｌｏｃｋｅｒ  ＢＬＯＴＴＯ（Ｔｈｅｒｍｏ（登録商標）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含むブロッキング緩衝液を、プレートのウェルに分配した。周囲室温（ＡＲＴ）での最低１時間のインキュベーションの後、プレートのウェルを空にし、１Ｘ  Ｗａｓｈ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（２ｍＭイミダゾール、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、１６０ｍＭのＮａＣｌ、２０Ｘ溶液としてＫＰＬ，Ｉｎｃ．より販売されている）で６回、洗浄した。１００％サル血清で調製された実験標本、分析標準、および品質管理用試料を、プレートのウェルに添加する前に、ｂｌｏｃｋｅｒ  ＢＬＯＴＴＯで５０倍希釈した。プレートウェルの中身を、プレート振とう器上で６０分間インキュベートしながら混合した。次に、ウェルを洗浄し、セイヨウワサビペルオキシダーゼ標識マウス抗ヒト抗体をプレートウェルに添加した。最後の１時間のインキュベーションの後、プレートウェルを、洗浄し、１つの成分３，３´，５，５´−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質溶液を用いて発色させた。得られた発色反応を、プレートウェルに硫酸を添加することによりクエンチした。光学濃度を、４５０ｎｍおよび６５０ｎｍの二重波長で測定し、６５０ｎｍで得られた値を、４５０ｎｍで得られた値から差し引いた。希釈実験標本のための、ＯＤ値の濃度への変換を、Ｗａｔｏｓｏｎ  ＬＩＭＳ（７．０．０．０１版）で、重み付けを１／Ｙ２に設定したロジスティックモデルを使用した回帰データを介して得た。
【０１５５】
図１０に示されるように、抗体Ｙは、０時間〜約２１６時間にまたがり、ほぼ線形相の二相性ＰＫプロファイルを有している。その後、抗体Ｙの濃度は、急激に低下する。抗体Ｙ−５−１１２は、プロファイルの線形的で、漸減する部分が０〜４３２時間にわたっている点を除き、同様のプロファイルを有している。ゆえに、抗体Ｙ−５−１１２における挿入は、ＰＫプロファイルの線形部分のスロープを明白に減少させ、ゆえに、抗体Ｙと比較して、総合的な露出を増加させる。
【図１】
2018064559.tif 000050
【図２】
2018064559.tif 000051
【図３】
2018064559.tif 000052
【図４】
2018064559.tif 000053
【図５】
2018064559.tif 000054
【図６】
2018064559.tif 000055
【図７】
2018064559.tif 000056
【図８】
2018064559.tif 000057
【図９】
2018064559.tif 000058
【図１０】
2018064559.tif 000059
【配列表】
2018064559000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成29年11月29日(2017.11.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４変異型Ｆｃ断片を含む変異型Ｆｃポリペプチドであって、
前記変異型Ｆｃ断片は、挿入を含み、
ここで、前記挿入は、ＥＵ付番方式を使用して、アミノ酸３８２と３８３、アミノ酸３８３と３８４、アミノ酸３８４と３８５、アミノ酸３８５と３８６、アミノ酸３８６と３８７、アミノ酸３８７と３８８、若しくは、アミノ酸３８８と３８９の間にあり、又は、
ＥＵ付番方式を使用して、アミノ酸３８４〜３８６が欠失し、前記挿入は、アミノ酸３８３と３８７の間にあり、
前記挿入は、１０〜２０アミノ酸であり、最初の４挿入されたアミノ酸の間に少なくとも１つのシステインと、最後の４挿入されたアミノ酸の間に少なくとも１つのシステインを含み、
前記変異型Ｆｃポリペプチドは、挿入を含まないことを除いて、前記変異型Ｆｃポリペプチドと同じアミノ酸配列を有する対照Ｆｃポリペプチドよりも高い結合活性で、ｐＨ６．０で、ヒト新生児Ｆｃ受容体（ｈＦｃＲｎ）に結合し、ならびに
前記変異型Ｆｃポリペプチドは、ｐＨ７．４でのｈＦｃＲｎ結合の結合活性が、ほとんど又は全く無く、ｐＨ７．４で検出される残留結合応答が、前記対照Ｆｃポリペプチドを用いた検出よりも、０．１ナノメーター以下大きいだけである、変異型Ｆｃポリペプチド。
【請求項２】
前記挿入が１２アミノ酸の長さである、請求項１に記載の変異型Ｆｃポリペプチド。
【請求項３】
前記挿入が、ＥＵ付番方式を使用してアミノ酸３８３〜３８７の内にある、請求項１又は２に記載の変異型Ｆｃポリペプチド。
【請求項４】
前記挿入が、ＥＵ付番方式を使用して、前記変異型Ｆｃ断片のアミノ酸３８２と３８３、アミノ酸３８３と３８４、アミノ酸３８４と３８５、アミノ酸３８５と３８６、アミノ酸３８６と３８７、又はアミノ酸３８７と３８８の間にあるか、又は
ＥＵ付番方式を使用して、アミノ酸３８４〜３８６が欠失し、前記挿入がアミノ酸３８３と３８７の間にある、請求項１又は２に記載の変異型Ｆｃポリペプチド。
【請求項５】
前記挿入が、ＥＵ付番方式を使用して、前記変異型Ｆｃ断片のアミノ酸３８２と３８３、アミノ酸３８４と３８５、又はアミノ酸３８５と３８６の間にあるか、又は
ＥＵ付番方式を使用して、アミノ酸３８４〜３８６が欠失し、前記挿入がアミノ酸３８３と３８７の間にある、請求項１又は２に記載の変異型Ｆｃポリペプチド。
【請求項６】
前記挿入が、ＥＵ付番方式を使用して、アミノ酸３８４と３８５の間にある、請求項１又は２に記載の変異型Ｆｃポリペプチド。
【請求項７】
前記挿入が、配列番号１３〜２４のいずれか一つに記載のアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の変異型Ｆｃポリペプチド。
【請求項８】
前記挿入が、配列番号４１〜６７、９０〜３５６、３５９〜３６７、３６９、３７２、３７３及び３７５〜３７９のいずれか一つに記載のアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の変異型Ｆｃポリペプチド。
【請求項９】
挿入が配列番号４１、４２、４３、４４、４５、５０、９７、１８０、２００及び２１６のいずれか一つに記載のアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の変異型Ｆｃポリペプチド。
【請求項１０】
前記挿入が、アミノ酸配列５４、５５、５６、５７及び５８のいずれか一つに記載のアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の変異型Ｆｃポリペプチド。
【請求項１１】
前記挿入が、
（ａ）配列番号２１６のアミノ酸４〜８；
（ｂ）配列番号４１〜５３、６７、９０〜１６３、１６５〜２１５、２１７〜２４７及び３５９〜３７８のいずれか一つのアミノ酸４〜９；
（ｃ）配列番号１６４のアミノ酸４〜１０；
（ｄ）配列番号２４８〜２８８、２９０〜３０６及び３４２のいずれか一つのアミノ酸４〜１１；
（ｅ）配列番号２８９又は３０７のアミノ酸４〜１２；ならびに
（ｆ）配列番号３０８〜３４１及び３４３〜３５６のいずれか一つのアミノ酸４〜１３
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の変異型Ｆｃポリペプチド。
【請求項１２】
前記変異型ヒトＦｃ断片が、変異型ＩｇＧ１Ｆｃ断片である、請求項１又は２に記載の変異型Ｆｃポリペプチド。
【請求項１３】
前記変異型Ｆｃ断片が、ＩｇＧ２Ｆｃ断片である、請求項１又は２に記載の変異型Ｆｃポリペプチド。
【請求項１４】
前記変異型Ｆｃ断片が、ＩｇＧ４Ｆｃ断片である、請求項１又は２に記載の変異型Ｆｃポリペプチド。
【請求項１５】
前記変異型Ｆｃポリペプチドが、非抗体ポリペプチドを含む変異型Ｆｃ融合タンパク質を含む、請求項１又は２に記載の変異型Ｆｃポリペプチド。
【請求項１６】
前記変異型Ｆｃ融合タンパク質の対照Ｆｃ融合タンパク質が、アレファセプト、リロナセプト、アフリベルセプト、エタネルセプト、ロミプロスチム又はアバタセプトである、請求項１５に記載の変異型Ｆｃポリペプチド。
【請求項１７】
前記変異型Ｆｃポリペプチドが、抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）及び／又は軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、請求項１又は２に記載の変異型Ｆｃポリペプチド。
【請求項１８】
前記変異型Ｆｃポリペプチドが、第一の重鎖定常領域（ＣＨ１）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）をさらに含む、請求項１７に記載の変異型Ｆｃポリペプチド。
【請求項１９】
前記変異型Ｆｃポリペプチドが、ＶＨ領域及びＶＬ領域を含む、請求項１７に記載の変異型Ｆｃポリペプチド。
【請求項２０】
前記変異型Ｆｃポリペプチドが、
（ａ）ＶＨ領域、第一の重鎖定常領域（ＣＨ１）、ヒンジ領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域を含む重鎖；ならびに
（ｂ）ＶＬ領域及び軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む軽鎖
を含む、請求項１８に記載の変異型Ｆｃポリペプチド。
【請求項２１】
前記変異型Ｆｃポリペプチドが一価である、請求項１７に記載の変異型Ｆｃポリペプチド。
【請求項２２】
前記変異型Ｆｃポリペプチドが二量体である、請求項１７に記載の変異型Ｆｃポリペプチド。
【請求項２３】
前記変異型Ｆｃポリペプチドが四量体である、請求項１７に記載の変異型Ｆｃポリペプチド。
【請求項２４】
請求項１〜２３のいずれか一項に記載の変異型Ｆｃポリペプチドをコードする核酸。
【請求項２５】
請求項２４に記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項２６】
宿主細胞に変異型Ｆｃポリペプチドをコードする核酸を導入すること；
前記核酸を含む前記宿主細胞を、核酸を発現させるような条件下で培養すること；及び
発現された変異型Ｆｃポリペプチドを培養培地又は細胞集団から回収すること
を含む、変異型Ｆｃポリペプチドを作製する方法であって、
ここで、前記変異型Ｆｃポリペプチドは、挿入を含む変異型Ｆｃ断片を含み、
前記挿入は、ＥＵ付番方式を使用して、アミノ酸３８２と３８３、アミノ酸３８３と３８４、アミノ酸３８４と３８５、アミノ酸３８５と３８６、アミノ酸３８６と３８７、アミノ酸３８７と３８８、若しくは、アミノ酸３８８と３８９の間にあり、又は、
ＥＵ付番方式を使用して、アミノ酸３８４〜３８６が欠失し、前記挿入は、アミノ酸３８３と３８７の間にあり、
前記挿入は、１０〜２０アミノ酸であり、最初の４挿入されたアミノ酸の間に少なくとも１つのシステインと、最後の４挿入されたアミノ酸の間に少なくとも１つのシステインを含み、
変異型Ｆｃポリペプチドが、ｐＨ６．０においてｈＦｃＲｎに対して対照Ｆｃポリペプチドよりも高い結合活性を有し、
変異型Ｆｃポリペプチドが、ｐＨ７．４でのｈＦｃＲｎ結合の結合活性がほとんど又は全く無く、ｐＨ７．４で検出される残留結合応答が、対照Ｆｃポリペプチドを用いて検出されるよりも、０．１ナノメーター以下大きいだけである、変異型Ｆｃポリペプチドを作製する方法。
【請求項２７】
前記変異型Ｆｃポリペプチドをコードする核酸が、請求項２４に記載の核酸を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ヒトＩｇＧ  Ｆｃ断片を含有するＦｃポリペプチドの半減期を延長させる方法であって、
挿入のために、ループ１０の内の部位又は隣接する部位を選択するステップと、
前記選択部位に、ペプチドを挿入するステップと
を含み、前記ペプチドは、
（ａ）配列番号４１〜６７、９０〜３５６、３５９〜３６７、３６９、３７２、３７３及び３７５〜３７９、
（ｂ）配列番号２１６のアミノ酸４〜８、
（ｃ）配列番号４１〜５３、６７、９０〜１６３、１６５〜２１５及び２１７〜２４７及び３５９〜３７８のいずれか１つのアミノ酸４〜９、
（ｄ）配列番号１６４のアミノ酸４〜１０、
（ｅ）配列番号２４８〜２８８、２９０〜３０６及び３４２のいずれか１つのアミノ酸４〜１１、
（ｆ）配列番号２８９又は３０７のアミノ酸４〜１２、ならびに
（ｇ）配列番号３０８〜３４１及び３４３〜３５６の内のいずれか１つのアミノ酸４〜１３
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、
方法。
【請求項２９】
挿入部位が、ＥＵ付番方式に従って付番されたアミノ酸３８３〜３８７の内にある、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
請求項２８に記載の方法であって、
前記挿入が、ＥＵ付番方式を使用して、前記変異型Ｆｃ断片のアミノ酸３８２と３８３、アミノ酸３８３と３８４、アミノ酸３８４と３８５、又はアミノ酸３８５と３８６の間にあるか、又は
アミノ酸３８４〜３８６が欠失し、及び前記挿入が、ＥＵ付番方式を使用して、アミノ酸３８３と３８７の間にある、
方法。
【請求項３１】
対照Ｆｃポリペプチドと比較して、ヒトＩｇＧ変異型Ｆｃ断片を含むＦｃポリペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を延長させる、ヒトＩｇＧ変異型Ｆｃ断片を特定する方法であって、
挿入を含有するＦｃ断片をコードする核酸のライブラリを作製するステップ、
ここで、前記挿入は、ＥＵ付番方式を使用して、アミノ酸３８２と３８３、アミノ酸３８３と３８４、アミノ酸３８４と３８５、アミノ酸３８５と３８６、アミノ酸３８６と３８７、アミノ酸３８７と３８８、若しくは、アミノ酸３８８と３８９の間にあり、又は、
ＥＵ付番方式を使用して、アミノ酸３８４〜３８６が欠失し、前記挿入は、アミノ酸３８３と３８７の間にあり、
前記挿入は、１０〜２０アミノ酸であり、最初の４挿入されたアミノ酸の間に少なくとも１つのシステインと、最後の４挿入されたアミノ酸の間に少なくとも１つのシステインを含む、
前記ライブラリによりコードされるＦｃ断片をスクリーニングして、（ｉ）ｐＨ６で、対照Ｆｃ断片よりも高い結合活性でｈＦｃＲｎに結合する、及び（ｉｉ）ｐＨ７．４で、ｈＦｃＲｎへの結合に対する結合活性がほとんど又は全く無い、変異型Ｆｃ断片を特定するステップ、
特定された変異型Ｆｃ断片を含む変異型Ｆｃポリペプチドをコードする核酸を構築するステップであって、ここで、前記変異型Ｆｃ断片ではなく対照Ｆｃ断片を含む対照Ｆｃポリペプチドの濃度は、動物にｉｎ  ｖｉｖｏで投与すると、徐々に直線的に減少することが知られているステップ、
宿主細胞に前記構築された核酸を導入し、及び前記核酸によりコードされる前記変異型Ｆｃポリペプチドが発現できるような条件下で前記宿主細胞を培養するステップ、
前記細胞集団又は細胞培養培地から、前記変異型Ｆｃポリペプチドを回収するステップ、
前記変異型Ｆｃポリペプチドを動物に投与し、及び対照Ｆｃポリペプチドを別の動物に投与するステップ、ならびに
投与後、末梢血中の前記変異型Ｆｃポリペプチド及び対照Ｆｃポリペプチドの濃度を経時的にモニターし、それにより、変異型Ｆｃポリペプチドにｉｎ  ｖｉｖｏ半減期の延長と、曝露の増加をもたらす変異型Ｆｃ断片を特定するステップ
を含む、方法。
【請求項３２】
請求項３１に記載の方法であって、
前記挿入が、ＥＵ付番方式を使用して、３８４位と３８５位の間にある、方法。
【請求項３３】
慢性疾患を治療するための医薬を製造するための、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の変異型Ｆｃポリペプチドの使用。
【外国語明細書】
2018064559000001.pdf