(57)【要約】【課題】  高い分生子形成能を維持したまま、プロテアーゼ、マンナナーゼ及びキシラナーゼ等の加水分解酵素を大量生産する麹菌の形質転換体、及び、該形質転換体を培養することによって、該酵素を大量に生産させる方法等を提供すること。【解決手段】  麹菌において、加水分解酵素遺伝子の発現を制御する転写因子をコードする核酸配列の転写制御領域に、該加水分解酵素遺伝子のプロモーターが機能的に連結されていることを特徴とする形質転換体、該形質転換体を培養することを含む、該形質転換体に於ける分生子形成量の減少を抑えつつ、加水分解酵素の生産量又は分泌量を増大させる方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
親株の麹菌に比べて、加水分解酵素の活性が増大し、且つ、分生子形成能の減少が抑制されている麹菌の形質転換体。
【請求項２】
加水分解酵素が、タンパク質加水分解酵素又は糖類加水分解酵素である、請求項１記載の形質転換体。
【請求項３】
加水分解酵素が、アルカリプロテアーゼ、β−マンナナーゼ、及びキシラナーゼから選択される、請求項１又は２記載の形質転換体。
【請求項４】
分生子形成能が、ふすま種麹における分生子数を測定することによって得られる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の形質転換体。
【請求項５】
麹菌がアスペルギルス・ソーヤ又はアスペルギルス・オリゼである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の形質転換体。
【請求項６】
加水分解酵素遺伝子の発現を制御する転写因子をコードする核酸配列の転写制御領域に、該加水分解酵素遺伝子のプロモーターが機能的に連結されていることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の形質転換体。
【請求項７】
転写因子が、Ｚｎ（II）Ｃｙｓ６タイプに属する請求項６記載の形質転換体。
【請求項８】
加水分解酵素遺伝子のプロモーター、及び、該加水分解酵素遺伝子の発現を制御する転写因子の組み合わせが、アルカリプロテアーゼ遺伝子（alp）又はロイシンアミノペプチターゼ遺伝子（ｌａｐＩ）のプロモーターとそれらに対する転写因子であるＰｒｔＴ；β−マンナナーゼ遺伝子（ｍａｎＧ）又はエンドグルカナーゼ遺伝子（ｅｇｌＢ）のプロモーターとそれらに対する転写因子であるＭａｎＲ；並びに、キシラナーゼ遺伝子（ｘｙｎＦ1）、β−キシロシダーゼ遺伝子（ｘｙｌＡ）又はエンドグルカナーゼ遺伝子のプロモーターとそれらに対する転写因子であるＸｌｎＲの各組合せから成る群から選択される、請求項７記載の形質転換体。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載の麹菌の形質転換体を作製するためのＤＮＡカセットであって、麹菌の加水分解酵素遺伝子の発現を制御する転写因子をコードする核酸配列の少なくとも一部、および、該加水分解酵素遺伝子のプロモーターを含み、該転写因子の転写制御領域に該プロモーターが機能的に連結されていることを特徴とする、麹菌の形質転換用ＤＮＡカセット。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれかに記載の麹菌の形質転換体を培養することを含む、該形質転換体に於ける分生子形成量の減少を抑えつつ、加水分解酵素の生産量又は分泌量を増大させる方法。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれかに記載の麹菌の形質転換体を培養し、培地中に蛋白質加水分解酵素を分泌させたのち、培地から加水分解酵素を採取することを特徴とする、加水分解酵素の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、加水分解酵素の活性が増大し、且つ、それに伴う分生子形成能の減少が抑制されている麹菌の形質転換体、該形質転換体を作製するための形質転換用ＤＮＡカセット、及び、該形質転換体を培養することを含む、麹菌に於ける加水分解酵素の活性を増大させる方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ ）及びアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）等の麹菌は、醤油、酒、味噌などの伝統的な食品の醸造や酵素の生産等のために工業的に広く用いられている。また近年のアスペルギルス・オリゼ（Ｍａｃｈｉｄａ，  Ｍ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ４３８，  １１５７−１１６１  （２００５））やアスペルギルス・ソーヤ（Ａｔｓｕｓｈｉ  Ｓａｔｏ，ｅｔ  ａｌ．，  ＤＮＡ  Ｒｅｓ．２０１１  Ｊｕｎ；１８（３）：１６５−１７６）の全ゲノム配列の決定やマイクロアレイを用いた網羅的な遺伝子発現解析などの進展に伴い、遺伝子工学的な改変、特に染色体レベルの改変により酵素等の生産性や増殖速度の改良などの効果が期待される糸状菌である。
【０００３】
このような麹菌は、タンパク質；β−マンナン、セルロース及びキシラン等の多糖類；脂質；並びに、デンプン等の様々な種類の物質の分解系で作用する加水分解酵素類を産生・分泌し、その優れた澱粉糖化能力及び蛋白質分解力等により、醸造食品の製造に幅広く利用されている。
【０００４】
これまでに、麹菌の加水分解酵素類の発現を制御・増大させること等を目的として、本出願人等による特許文献１及び特許文献２に記載されているような、麹菌の加水分解酵素類の遺伝子発現を制御する様々な転写因子の解析が行われてきた。
【０００５】
更に、特許文献３には、アスペルギルス・ニガー等に於いてキシラナーゼＡを過剰発現させるために核酸カセットが記載されており、該核酸カセットの一例として、該酵素のプロモーターが該酵素のレギュレーター（ｘｌｎＲ）の核酸配列のプロモーターとして使用される構成が挙げられている。このように、転写因子のプロモーターとして、その転写因子により活性化される標的遺伝子のプロモーターを使用する系は、一般に、「ポジティブフィードバック（ループ）」と呼ばれている。
【０００６】
また、特許文献４及び特許文献５にも、アスペルギルス・ニガー等のプロテアーゼ発現系に於ける転写因子ｐｒｔＴに関して、このような「ポジティブフィードバック」を構成し得るような発現系が記載されている。
【０００７】
更に、特許文献６及び非特許文献１には、酵母に於ける外来遺伝子の発現システムに於いて、人口転写因子タンパク質の発現が可能な、正のフィードバックループ（ポジティブフィードバックループ）による自己増幅カセットが記載されている。
【０００８】
しかしながら、上記の文献に記載された発明を含む従来技術にあっては、転写因子発現に於けるポジティブフィードバック機能による目的酵素の生成または活性の増加に関しては言及されてはいるものの、麹菌に於けるこのようなポジティブフィードバック機能と分生子形成能との関連については、何ら記載乃至示唆されていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特許第５２５６４０２号明細書
【特許文献２】特許第５７０４６０９号明細書
【特許文献３】特許第４３３９４００号明細書
【特許文献４】特許第４５６３５８５号明細書
【特許文献５】特表２００３−５２６３７４号公報
【特許文献６】特開２０１５−７０８０６号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ａ．Ｂｅｃｓｋｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．１０，ｐｐ．２５２８−２５３５，２００１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従って、本発明が解決しようとする課題は、高い分生子形成能を維持したまま、プロテアーゼ、マンナナーゼ及びキシラナーゼ等の加水分解酵素を大量生産する麹菌の形質転換体、及び、該形質転換体を培養することによって、該酵素を大量に生産させる方法等を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、種々の検討を行った結果、麹菌において、加水分解酵素遺伝子の発現を制御する転写因子をコードする核酸配列の転写制御領域に、当該加水分解酵素遺伝子のプロモーターを機能的に連結させることによって、親株の麹菌に比べて、加水分解酵素の活性（加水分解酵素の発現量）が増大する一方で、分生子形成能の減少は有意に抑制されている麹菌の形質転換体が得られることを見出し、本発明を完成させた。
【００１３】
即ち、本願発明は、以下の態様を有するものである。
[態様１]
親株の麹菌に比べて、加水分解酵素の活性が増大し、且つ、分生子形成能の減少が抑制されている麹菌の形質転換体。
[態様２]
加水分解酵素が、タンパク質加水分解酵素又は糖類加水分解酵素である、態様１記載の形質転換体。
[態様３]
加水分解酵素が、アルカリプロテアーゼ、β−マンナナーゼ、及びキシラナーゼから選択される、態様１又は２記載の形質転換体。
[態様４]
分生子形成能が、ふすま種麹における分生子数を測定することによって得られる、態様１〜３のいずれか一項に記載の形質転換体。
[態様５]
麹菌がアスペルギルス・ソーヤ又はアスペルギルス・オリゼである、態様１〜４のいずれか一項に記載の形質転換体。
[態様６]
加水分解酵素遺伝子の発現を制御する転写因子をコードする核酸配列の転写制御領域に、該加水分解酵素遺伝子のプロモーターが機能的に連結されていることを特徴とする、態様１〜５のいずれか一項に記載の形質転換体。
[態様７]
転写因子が、Ｚｎ（II）Ｃｙｓ６タイプに属する態様６記載の形質転換体。
[態様８]
加水分解酵素遺伝子のプロモーター、及び、該加水分解酵素遺伝子の発現を制御する転写因子の組み合わせが、アルカリプロテアーゼ遺伝子（alp）又はロイシンアミノペプチターゼ遺伝子（ｌａｐＩ）のプロモーターとそれらに対する転写因子であるＰｒｔＴ；β−マンナナーゼ遺伝子（ｍａｎＧ）又はエンドグルカナーゼ遺伝子（ｅｇｌＢ）のプロモーターとそれらに対する転写因子であるＭａｎＲ；並びに、キシラナーゼ遺伝子（ｘｙｎＦ1）、β−キシロシダーゼ遺伝子（ｘｙｌＡ）又はエンドグルカナーゼ遺伝子のプロモーターとそれらに対する転写因子であるＸｌｎＲの各組合せから成る群から選択される、態様７記載の形質転換体。
[態様９]
態様１〜８のいずれかに記載の麹菌の形質転換体を作製するためのＤＮＡカセットであって、麹菌の加水分解酵素遺伝子の発現を制御する転写因子をコードする核酸配列の少なくとも一部、および、該加水分解酵素遺伝子のプロモーターを含み、該転写因子の転写制御領域に該プロモーターが機能的に連結されていることを特徴とする、麹菌の形質転換用ＤＮＡカセット。
[態様１０]
態様１〜８のいずれかに記載の麹菌の形質転換体を培養することを含む、該形質転換体に於ける分生子形成量の減少を抑えつつ、加水分解酵素の生産量又は分泌量を増大させる方法。
[態様１１]
請求項１〜８のいずれかに記載の麹菌の形質転換体を培養し、培地中に蛋白質加水分解酵素を分泌させたのち、培地から加水分解酵素を採取することを特徴とする、加水分解酵素の生産方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によると、転写因子の発現系にポジティブフィードバックを利用することで、分生子形成能に与える影響が減少し、比較的高い分生子形成能を維持したまま、該転写因子の制御（調節）対象である標的遺伝子がコードする加水分解酵素の活性（酵素の生産量）を大幅に向上させることができる。
【００１５】
また、ポジティブフィードバックにより、いったん転写因子が発現され始めると一気に転写量が上昇するため、プロモーターそのものの発現強度が低くても効率的に転写因子を大量発現させることができる。その結果、ｔｅｆ‐１のように恒常的に発現するプロモーターに比べ発現強度（転写活性化作用）が弱いプロモーターを使用する場合であっても、ポジティブフィードバックによりｔｅｆ‐１と同等またはそれ以上の転写活性を示すことができる。
【００１６】
また、本発明の形質転換体では、ｔｅｆ‐１等の恒常的に発現するプロモーターを用いて目的遺伝子を強制発現させた場合にみられるような、酵素活性は上昇するものの分生子形成能が顕著に低下する、という現象は観察されなかった。
【００１７】
更に、本発明の形質転換体では、転写因子の本来の発現パターンが保たれるため、麹菌の生育や分生子形成に与える影響を少なくすることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明の転写因子強制発現用の形質転換用ＤＮＡカセットおよび相同組換えによる形質転換の概要を示す。
【図２】プロテアーゼおよびペプチダーゼの転写因子ｐｒｔＴ強制発現株の解析結果を示す。
【図３】β−マンナナーゼの転写因子ｍａｎＲ強制発現株の解析結果を示す。
【図４】キシラナーゼの転写因子ｘｌｎＲ強制発現株の解析結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、親株である麹菌に比べて、加水分解酵素の活性が増大し、且つ、分生子形成能の減少が抑制されている麹菌の形質転換体（形質転換菌）に関する。
【００２０】
ここで、「麹菌」とは、アスペルギルス属に属する微生物（菌類）の総称であり、その代表的な例として、既に記載したアスペルギルス・オリゼ及びアスペルギルス・ソーヤに加えて、特に食品・醸造分野で使用される菌としてアスペルギルス・リューチュエンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｌｕｃｈｕｅｎｓｉｓ）等を挙げることができる。また、麹菌以外の食品・醸造・化学・医療分野で使用される産業上有用な糸状菌等を用いても実質的に同様の効果を得ることができる。これらの菌は、市販品として、又は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）等の様々な公的寄託機関から入手することも可能である。
【００２１】
本発明の形質転換体の親株（宿主）として使用する麹菌に属する菌としては、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・リューチュエンシス等の任意の菌が挙げられるが、そのうちアスペルギルス・ソーヤ及びアスペルギルス・オリゼに属する菌株が好ましい。
【００２２】
このような菌株としては、例えば、アスペルギルス・ソーヤ ２６２（ＦＥＲＭ Ｐ−２１８８）、アスペルギルス・ソーヤ ２１６５（ＦＥＲＭ Ｐ−７２８０）、アスペルギルス・ソーヤ （ＡＴＣＣ４２２５１）、アスペルギルス・ソーヤ（ＮＢＲＣ４２３９）、アスペルギルス・オリゼ（ＩＡＭ２６３８）、及びアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０（寄託機関：独立行政法人酒類総合研究所、寄託番号ＩＤ：ＲＩＢ４０）等の公的寄託機関で保存されており、当業者には容易に入手可能であるような各菌株等を挙げることができる。尚、アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株のゲノム配列は、２００５年に決定されており（Ｎａｔｕｒｅ，４３８：１１５７，２００５）、その情報はＤＯＧＡＮのデータベースから入手可能である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ.ｂｉｏ.ｎｉｔｅ.ｇｏ.ｊｐ／ｄｏｇａｎ／ＭｉｃｒｏＴｏｐ?ＧＥＮＯＭＥ＿ＩＤ＝ａｏ）。
【００２３】
更に、本発明の形質転換体を作製するために好適な麹菌として、本明細書の実施例でも使用されているような、ｋｕ７０、ｋｕ８０及びｌｉｇＤ等の非相同組換え機構に関与する遺伝子が抑制又は欠失（破壊）等によって、相同組換え頻度が向上している形質転換菌（特開２００６−１５８２６９号公報、Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｔ，  Ｍａｓｕｄａ  Ｔ，  ＆  Ｋｏｙａｍａ  Ｙ，Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ７０  （２００６）、  １３５−１４３；  Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｔ，  Ｍａｓｕｄａ  Ｔ，  ＆  Ｋｏｙａｍａ  Ｙ  （２００６），  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２７５：  ４６０−４７０；Ｍａｒｕｙａｍａ  Ｊ  ＆  Ｋｉｔａｍｏｔｏ  Ｋ  （２００８），  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ３０：  １８１１−１８１７） を挙げることができる。
【００２４】
更に、目的の形質転換体を容易に単離することができるように、当親株としては当業者に公知の適当な栄養要求性株を使用することが好ましい。
【００２５】
「分生子」とは、当該技術分野において、一般に、子嚢菌及び担子菌が無性生殖の手段としてつくる胞子、及び、アスペルギルス・ソーヤ及びアスペルギルス・オリゼ等の麹菌のような有性世代を持たない、不完全菌が形成する胞子を意味する。
【００２６】
既に述べたように、麹菌は、タンパク質；β−マンナン、セルロース及びキシラン等の多糖類；脂質；並びに、デンプン等の様々な種類の物質の分解系で作用する加水分解酵素類を産生・分泌することは当業者には周知である。本発明における加水分解酵素には、当業者に公知のこのような加水分解酵素の任意のものが含まれる。
【００２７】
これらの中で、タンパク質加水分解酵素はプロテアーゼとも呼ばれ、アルカリプロテアーゼ等のタンパク質を主に分解するプロテイナーゼ、又はエンドペプチダーゼ、ロイシンアミノペプチターゼ等の小ペプチドを分解するペプチダーゼなどを含む総称である。また、糖類加水分解酵素の例として、β−マンナナーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、β−キシロシダーゼ、キシラナーゼなどを挙げることができる。
【００２８】
「親株の麹菌に比べて、加水分解酵素の活性が増大し」とは、任意の同条件下で比較した場合に、本発明の形質転換体が発現する該加水分解酵素の活性（加水分解酵素の生産又は分泌量）が該形質転換体を作製する際に宿主として使用した麹菌のものと比べて有意に増加（向上）していること、例えば、親株の麹菌に比べて、数倍から数十倍、より具体的には、約２〜約４０倍程度に増加することを意味する。加水分解酵素の活性は当業者に公知の任意の方法・手段で測定することができる。例えば、本明細書の実施例に記載されているように、マルツ寒天培地上に生育した麹菌の分生子を一定条件下で静置培養した後、培養液から得られたろ液を粗酵素液（原液）として、測定用の試料として用いることが好ましい。
【００２９】
同様に、「親株の麹菌に比べて、分生子形成能の減少が抑制されている」とは、任意の同条件下で比較した場合に、本発明の形質転換体を作製する際に宿主として使用した麹菌が有する分生子形成能（分生子の形成量）と比べて本発明の形質転換体の分生子形成能の低下の度合い（低下率）が有意に抑制されていることを意味する。
【００３０】
分生子形成能（分生子の形成量）は、本明細書の実施例に記載されているように、種麹、特に、ふすま種麹における分生子数を測定した場合に、本発明の形質転換体は、親株の麹菌の分生子形成能を１００％とした場合に、例えば、約５０％以上、好ましくは約８０％以上維持されていることを意味する。更に、本明細書の実施例に示されるように、本発明の形質転換体の中には、親株の麹菌に比べて分生子形成能も数十％程度増加しているものもある。
【００３１】
本発明の形質転換体のより具体的な態様として、加水分解酵素遺伝子の発現を制御（活性化）する転写因子をコードする核酸配列（ＯＲＦ）の転写制御領域に、該加水分解酵素遺伝子のプロモーターが機能的に連結されている形質転換体を挙げることができる。
【００３２】
ここで、「転写因子」とは、遺伝子の転写反応においてＲＮＡポリメラーゼ以外に必要とされるタンパク質を指し、転写開始に必須な基本転写因子、転写開始因子、転写伸長因子、転写終結因子、及び転写調節因子等を含むが、特に、転写開始に関与するタンパク質因子を意味する。転写因子は、当該遺伝子のコード領域の上流に位置するプロモーターに結合して、転写反応を調節・制御する。このように、タンパク質である転写因子はＤＮＡと相互作用する機能を有することから、その立体構造のドメインに共通するモチーフとして、「Ｚｎフィンガー・モチーフ」（Ｃ２Ｈ２クラス、Ｃｙｓｘクラス）、「ヘリックス−ターン−ヘリックス・モチーフ」、「ロイシンジッパー・モチーフ」及び「ヘリックス−ループ−ヘリックス・モチーフ」の４種類が知られている。
【００３３】
ここで、「プロモーター」とは、転写開始反応の効率に関与するＤＮＡの領域をいい、狭義には、通常、転写開始位置前後約４０塩基対程度の領域である。該領域には、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位、及び、転写因子結合部位等が含まれる。尚、本発明に於ける「プロモーター」には、該プロモーターの核酸配列の一部を欠いてはいるが、実質的に該プロモーターとしての機能を有する核酸配列も含まれる。
【００３４】
更に、「転写制御領域」とは、遺伝子のコード領域の上流にあり、該遺伝子の転写効率を制御（調節）するＤＮＡ上の配列であって、プロモーターの他に、エンハンサー及びサイレンサー等の転写調節因子が含まれる。
【００３５】
従って、本発明の形質転換体において「機能的に連結されている」とは、加水分解酵素遺伝子に対する転写因子をコードする核酸配列の転写制御領域に連結された該加水分解酵素遺伝子のプロモーター（強制発現用プロモーター）に含まれる該転写因子結合部位に該転写因子自体が結合し、その結果、該転写因子の発現が、該転写因子の発現を制御する本来のプロモーターに代わって、該転写因子の制御対象（標的遺伝子）である加水分解酵素遺伝子のプロモーターによって制御されることを意味する。このような機序によって、本発明の形質転換体における転写因子の発現系に「ポジティブフィードバック」が形成され、その結果、転写因子が強制発現されて、該転写因子によって発現が制御される（活性化される）加水分解酵素遺伝子の発現量が増大するものと考えられる。
【００３６】
尚、このような形質転換体に於いて、転写因子の本来のプロモーターが加水分解酵素遺伝子のプロモーターと完全に置換されている必要はなく、該転写因子の本来のプロモーターの少なくとも一部の配列はそのまま残されていても良い。しかしながら、そのような場合であっても、位置的又は構造的等の理由から、このようにして残された該転写因子の本来のプロモーター配列はもはやプロモーターとしての機能を発揮することができない。
【００３７】
このような形質転換体におけるポジティブフィードバックを構成する、加水分解酵素遺伝子、及び、該加水分解酵素遺伝子の発現を制御（活性化）する転写因子の組み合わせの好適な例として、アルカリプロテアーゼ遺伝子（alp）又はロイシンアミノペプチターゼ遺伝子（lapI）とそれらに対する転写因子であるＰｒｔＴ；β−マンナナーゼ遺伝子（ｍａｎＧ）又はエンドグルカナーゼ遺伝子（ｅｇｌＢ）とそれらに対する転写因子であるＭａｎＲ；並びに、キシラナーゼ遺伝子（ｘｙｎＦ1）、β−キシロシダーゼ遺伝子（ｘｙｌＡ）又はエンドグルカナーゼ遺伝子とそれらに対する転写因子であるＸｌｎＲの各組合せ等を挙げることができる。尚、これらの転写因子はいずれも、既に挙げた「Ｚｎフィンガー・モチーフ」のＣｙｓｘクラスに属する「Ｚｎ（II）Ｃｙｓ６」タイプである。
【００３８】
従って、該転写因子の制御対象である加水分解酵素遺伝子のプロモーターの核酸配列は、例えば、本発明の形質転換体を作製するための好適例として前述したような各種の麹菌から当業者に公知の任意の方法で調製することができる。尚、加水分解酵素遺伝子のプロモーターの核酸配列は、本発明の形質転換体を作製する際に用いられる宿主と同じ菌株から取得することが好ましいが、他の菌株から取得することも可能である。
【００３９】
例えば、これらの菌体を、本明細書の実施例に記載の方法で培養し、常法によりＤＮＡを抽出し、こうして得られたＤＮＡを鋳型として、本明細書の表１に示されている夫々のプライマー対を用いるＰＣＲ反応によって、ｌａｐＩプロモーター、ｍａｎＧプロモーター、ｅｇｌＢプロモーター、ｘｙｎＦ1プロモーター、及び、ｘｙｌＡプロモーター等の各核酸配列を含むＤＮＡ断片を増幅することができる。尚、このようにして得られたＤＮＡ断片の核酸配列は、必要に応じて、当業者に公知の任意の方法によって、市販の試薬及びＤＮＡシークエンサーを用いて決定することができる。尚、上記のＤＮＡ断片には、各プロモーターの核酸配列の他に、Ｆｕｓｉｏｎ ＰＣＲ用の相同配列等のその他の核酸配列が含まれていてもよい。
【００４０】
尚、表１に記載に記載された各プロモーター増幅用のＰＣＲプライマー対は、例えば、以上の各プロモーターの核酸配列に関する公知情報（Ｋｉｔａｍｏｔｏ  Ｎ１，  Ｍａｔｓｕｉ  Ｊ，  Ｋａｗａｉ  Ｙ，  Ｋａｔｏ  Ａ，  Ｙｏｓｈｉｎｏ  Ｓ，  Ｏｈｍｉｙａ  Ｋ，  Ｔｓｕｋａｇｏｓｈｉ  Ｎ．, Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １９９８  Ｊｕｌ；５０（１）：８５−９２．）等に基づき、当業者が容易に設計・調製することができる。
【００４１】
更に、上記プロモーター等の各核酸配列を含むＤＮＡ断片は、当業者に公知の任意の方法、例えば、ハイブリダイゼーションによる選択法によって取得することもできる。
【００４２】
又、本発明で使用されるプロモーターには、上記のＰＣＲ反応によって得られる各プロモーターの核酸配列（塩基配列）と９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の配列同一性を示す核酸配列（ＤＮＡ）であって、対応する各プロモーターと実質的に同等の構造・機能を有している核酸配列も含まれる。
【００４３】
２つの核酸配列における配列同一性を決定するために、配列は比較に最適な状態に前処理される。例えば、一方の配列にギャップを入れることにより、他方の配列とのアラインメントの最適化を行う。その後、各部位における塩基が比較される。第一の配列における、ある部位に、第二の配列の相当する部位と同じ塩基が存在する場合、それらの配列は、その部位において同一である。２つの配列における配列同一性は、配列間での同一である部位数の全部位（全塩基）数に対する百分率で示される。
【００４４】
上記の原理に従い、２つの塩基配列における配列同一性は、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｈｕｌのアルゴリズム（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４−２２６８，１９９０及びＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７，１９９３）により決定される。このようなアルゴリズムを用いたＢＬＡＳＴプログラムがＡｌｔｓｈｕｌらによって開発された（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０）。さらに、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴはＢＬＡＳＴより感度良く配列同一性を決定するプログラムである（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９９７）。上記のプログラムは、主に与えられた配列に対し、高い配列同一性を示す配列をデータベース中から検索するために用いられる。これらは、例えば米国Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのインターネット上のウェブサイトにおいて利用可能である。
【００４５】
配列間の配列同一性として、Ｔａｔｉａｎａ  Ａ．  Ｔａｔｕｓｏｖａらによって開発されたＢＬＡＳＴ  ２  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓソフトウェア（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．，１７４：２４７−２５０，１９９９）を用いて決定した値を用いる。このソフトウェアは米国Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのインターネット上のウェブサイトにおいて利用可能であり、入手も可能である。用いるプログラム及びパラメーターは以下のとおりである。塩基配列の場合、ｂｌａｓｔｎプログラムを用いパラメーターとしては、Ｒｅｗａｒｄ  ｆｏｒ  ａ  ｍａｔｃｈ：１，Ｐｅｎａｌｔｙ  ｆｏｒ  ａｍｉｓｍａｔｃｈ：−２，  Ｓｔｒａｎｄ  ｏｐｔｉｏｎ：Ｂｏｔｈ  ｓｔｒａｎｄｓ，  Ｏｐｅｎ  ｇａｐ：５  ａｎｄ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｇａｐ：２  ｐｅｎａｌｔｉｅｓ，ｇａｐ  ｘ＿ｄｒｏｐｏｆｆ：５０，ｅｘｐｅｃｔ：１０，ｗｏｒｄ  ｓｉｚｅ：１１，Ｆｉｌｔｅｒ：ＯＮを用いる。いずれのパラメーターも、ウェブサイト上でデフォルト値として用いられているものである。
【００４６】
更に、本発明で使用されるプロモーターには、上記のＰＣＲ反応によって得られる各プロモーターの核酸配列（塩基配列）とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸配列（ＤＮＡ）であって、対応する各プロモーターと実質的に同等の構造・機能を有している核酸配列も含まれる。
【００４７】
ここで、ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドのシグナルが非特異的なハイブリッドのシグナルと明確に識別される条件であり、使用するハイブリダイゼーションの系と、プローブの種類、配列及び長さによって異なる。条件は、ハイブリダイゼーションの温度を変えること、洗浄の温度及び塩濃度を変えることにより決定可能である。例えば、非特異的なハイブリッドのシグナルまで強く検出されてしまう場合には、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を上げるとともに、必要に応じて洗浄の塩濃度を下げることにより特異性を上げることができる。
【００４８】
また、特異的なハイブリッドのシグナルも検出されない場合には、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を下げるとともに、必要に応じて洗浄の塩濃度を上げることにより、ハイブリッドを安定化させることができる。このような最適化は、本技術分野の研究者が容易に行いうるものである。
【００４９】
ストリンジェントな条件の具体例としては、例えば、ハイブリダイゼーションは、５×ＳＳＣ、１．０％（Ｗ／Ｖ）核酸ハイブリダイゼーション用ブロッキング試薬（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）、０．１％（Ｗ／Ｖ）Ｎ−ラウロイルサルコシン、０．０２％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳを用い一晩（８〜１６時間程度）で行い、洗いは、０．５×ＳＳＣ、０．１％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ、好ましくは０．１×ＳＳＣ、０．１％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳを用い、１５分間、２回行う。ハイブリダイゼーションと洗いの温度は、５２℃以上、好ましくは５７℃以上、さらに好ましくは６２℃以上、最も好ましくは６７℃以上である。
【００５０】
本発明の麹菌の形質転換体は、当業者に公知の適当な遺伝子工学的な手段を用いて、例えば、図１に示されるような、麹菌の加水分解酵素遺伝子の発現を制御する転写因子をコードする核酸配列の少なくとも一部（相同組換えに必要な末端配列として機能）、および、該加水分解酵素遺伝子のプロモーターを含み、該転写因子の転写制御領域に該プロモーターが機能的に連結されていることを特徴とする形質転換用ＤＮＡカセットを作製し、該カセットを用いる相同組換えに基づき、親株である麹菌を形質転換することによって作製することができる。
【００５１】
上記形質転換用ＤＮＡカセットには、形質転換された細胞を選択することを可能にするための当業者に公知の任意のマーカー遺伝子、転写因子の本来のプロモーターの少なくとも一部の配列（相同組換えに必要な末端配列として機能）、及びＦｕｓｉｏｎ ＰＣＲ用の相同配列等のその他の各種要素が含まれていてもよい。マーカー遺伝子としては、例えば、ＵＲＡ３、ｎｉａＤのような、宿主の栄養要求性を相補する遺伝子、又はアンピシリン、カナマイシンあるいはオリゴマイシン等の薬剤に対する抵抗遺伝子等が挙げられる。
【００５２】
該形質転換用ＤＮＡカセットよる形成転換は、公知の適当な方法で行うことができる。例えば、プロトプラスト化した後ポリエチレングリコール及び塩化カルシウムを用いる方法（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２１８，９９−１０４（１９８９））を用いることかできる。
体を挙げることができる。
【００５３】
本発明の麹菌の形質転換体を業者に公知の任意の方法で培養することによって、該形質転換体に於ける分生子形成量の減少を抑えつつ、加水分解酵素の生産量又は分泌量を増大させることができる。
【００５４】
或いは、本発明の麹菌の形質転換体を当業者に公知の任意の方法で培養し、培地中に蛋白質加水分解酵素を分泌させたのち、培地から加水分解酵素を採取することによって、加水分解酵素を大量に効率よく生産することができる。
【００５５】
例えば、本発明の麹菌の形質転換体を、固体培地若しくは液体培地で培養して培地中に加水分解酵素を分泌させたのち、培地から加水分解酵素を採取することが可能である。このような生産方法における、培養系・培地の選択、培養温度・時間等の培養条件は、以下の実施例等を参考に、当業者が適宜設定することができる。
【００５６】
また、本発明の麹菌の形質転換体を培養して得られる培養物と蛋白質含有原料とを混合し、原料中の蛋白質を分解することによって、蛋白質分解物を製造することができる。この方法で使用される原料に含まれる蛋白質の種類に特に制限はなく、例えば、ゼラチン、コラーゲン及びグルテン等を挙げることができる。ゼラチン、コラーゲン及びグルテン等含有原料の蛋白質分解物は調味液として有用である。
【実施例】
【００５７】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例によって限定されるものではない。
【００５８】
各種転写因子強制発現株（形質転換体）の作製
［使用培地］
ポリペプトンデキストリン（ＰＤ）培地；ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎ  １％、ｄｅｘｔｒｉｎ  ２％、  ＫＨ２ＰＯ４  ０．５％、ＮａＮＯ３  ０．１％、ＭｇＳＯ４  ０．０５％、ｃａｓａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ０．１％、ｐＨ６．０、麹菌株の栄養要求性に応じてＵｒｉｄｉｎｅを終濃度１０  ｍＭとなるように添加した。
Ｃｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ（ＣＤ）最小培地；Ｃｚａｐｅｋ  Ｄｏｘ  Ｂｒｏｔｈ（日本ＢＤ、Ｃａｔ．  ＃２３３８１０）３．５％、寒天１．５％（重層用のものは０．５％）、ｐＨ６．０、形質転換体の再生の際にはソルビトールを１．２Ｍとなるよう添加した。
マルツ寒天培地；麦芽エキス８％、寒天１．５％、ｐＨ６．０。
【００５９】
［形質転換用ＤＮＡカセットの作製］
図１に、アスペルギルス・ソーヤ及びアスペルギルス・オリゼの転写因子強制発現のための形質転換用ＤＮＡカセットおよび相同組換えによる形質転換の概要を示す。アスペルギルス・ソーヤ（ＮＢＲＣ４２３９株）およびアスペルギルス・オリゼ（ＲＩＢ４０株）より定法に従いゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型として表１に示すプライマーセットを用いて各ＤＮＡ断片をＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲにはＫＯＤ  ｐｌｕｓ  Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いた。増幅したＤＮＡ断片はＧｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した。精製したＤＮＡ断片を用いてｆｕｓｉｏｎ  ＰＣＲを行ない、得られたＰＣＲ産物を鋳型にしてＮｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行なうことで、本発明の形質転換用ＤＮＡカセットを作製した。
【００６０】
［麹菌の形質転換］
アスペルギルス・ソーヤ及びアスペルギルス・オリゼの形質転換体を作成するための宿主（親株）として、ｐｙｒＧ遺伝子に変異を有するためウリジンやウラシルを含まない最小培地では生育することのできない栄養要求性株を使用した。これらの株は非相同末端結合に働くｋｕ７０遺伝子も欠失しているため、ゲノムの相同組み換えが高効率で起こる（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｔ，  Ｍａｓｕｄａ  Ｔ，  ＆  Ｋｏｙａｍａ  Ｙ，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０  （２００６）、１３５−１４３）。これらの株に、ｐｙｒＧマーカー遺伝子を含むＤＮＡカセットが導入されると、ウリジンやウラシルを含まない最小培地においても生育することが可能となるため、目的の形質転換体を容易に単離することができる。
【００６１】
形質転換は具体的に以下に記載の実験操作の通り実施した。５００ｍＬ容のバッフル付き三角フラスコに終濃度１０ｍＭのウリジンを含むＰＤ培地を１００ｍＬ加え、形質転換宿主の分生子を摂取した後に３０℃で１６時間振とう培養した。ｍｉｒａｃｌｏｔｈ（メルクミリポア）を用いて培養液中の菌体を回収し、０．６Ｍ  ＫＣｌ緩衝液（ｐＨ５．５）で洗浄した後に、１．５％セルラーゼオノズカ（ヤクルト）、０．３％  Ｙａｔａｌａｓｅ（大関）、１．５％  Ｌｙｓｉｎｇ  Ｅｎｚｙｍｅ（ＳＩＧＭＡ）を含む０．６Ｍ  ＫＣｌ緩衝液に菌体を懸濁し、３０℃で３時間穏やかに振とう培養することでプロトプラストを調製した。プロトプラストを０．６Ｍ  ＫＣｌ緩衝液および１．２Ｍソルビトール緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄し、プロトプラスト−ＰＥＧ法によりＤＮＡカセットを導入し、形質転換を行なった。形質転換体は１．２Ｍのソルビトールを含むＣＤ最小培地に播種し、得られたコロニーの分生子を、ソルビトールを含まないＣＤ最小培地に３回植え継ぐことで核を純化した。相同組み換えが目的通り起こっていることは、形質転換体のゲノムＤＮＡを鋳型としてＤＮＡカセット挿入領域周辺のゲノム配列をＰＣＲにより増幅し、アガロース電気泳動に供して増幅した断片の長さを解析することで、確認した。
【００６２】
加水分解酵素の活性測定
［麹菌培養方法および粗酵素液の調製］
脱脂大豆、小麦および水を１：１．１：１．５となるよう混合し、１０ｇを１５０ｍＬ容の三角フラスコに量りとり、綿栓をしてオートクレーブにより滅菌した。これに、マルツ寒天培地上に生育した麹菌の分生子を１白金耳分（およそ１×１０５個）接種し、混合したのちに３０℃で７２時間静置培養した。ここに蒸留水を１００ｍＬ添加してよく撹拌し、１時間ごとに撹拌しながら室温にて３時間置いたのちにＮｏ．２のろ紙（ＡＤＶＡＮＴＥＣ）でろ過した。得られたろ液を粗酵素液（原液）とした。
【００６３】
［アルカリプロテアーゼ活性測定］
１ｍＭのＮ−Ｓｕｃｃｉｎｙｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ  ｐＮＡ（Ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ、ＳＩＧＭＡ）を基質とした。基質溶液は、２５ｍｇのＳｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡを２ｍＬのＤＭＳＯに溶解し、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で２０倍希釈することで調製した。基質溶液１８０μＬと、粗酵素液を緩衝液で適宜希釈して得た酵素液２０μＬを混合し、３０℃で２０分間反応させた後に０．１Ｎ  ＨＣｌ溶液を６００μＬ加え、反応を停止した。ブランクは酵素液、反応停止液、基質溶液の順に混合した。反応液およびブランク溶液の４１０ｎｍにおける吸光度を測定し、吸光度の差から酵素活性を算出した。上記の反応条件で１分間に１μｍｏｌのｐ−ＮＡを生成する酵素力価を１Ｕとした。
【００６４】
［β−マンナナーゼ活性測定］
ａｚｏ−ｃａｒｏｂガラクトマンナン（Ｍｅｇａｚｙｍｅ）を２００ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）に２％になるように溶解し、基質とした。粗酵素液１５０μＬを４０℃で５分間加温し、同様に加温した基質溶液１５０μＬを加え、１０分間反応させた。活性の弱いコントロール株のみ６０分間インキュベートした。１００％エタノールを７５０μＬ加えて反応を停止し、１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心した後に上清の５９０ｎｍの吸光度を測定した。ブランクは、粗酵素液に反応停止液、基質溶液の順に加えたものとした。上記の反応条件で１分間に１μｍｏｌのマンノースを生成する酵素力価を１Ｕとした。
【００６５】
［キシラナーゼ活性測定］
粗酵素液を２５ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．７）で適宜希釈して得た酵素液５００μＬを４０℃で５分間加温した後に、Ｘｙｌａｚｙｍｅ  ＡＸタブレット（Ｍｅｇａｚｙｍｅ）を１粒加え、４０℃で１０分間反応させた。２％  Ｔｒｉｓ水溶液（ｐＨ＞９）を１０ｍＬ加えることで反応停止し、室温で５分間静置した後にＮｏ．２のろ紙（Ｗｈａｔｍａｎ）でろ過した。ろ液の５９０ｎｍにおける吸光度を測定した。ブランクは、酵素液に反応停止液、基質タブレットの順に加えたものとした。上記の反応条件で１分間に１μｍｏｌのキシロースを生成する酵素力価を１Ｕとした。
【００６６】
ふすま種麹における分生子形成量の測定
小麦ふすまと水を１：０．８となるよう混合し、５ｇを１５０ｍＬ容の三角フラスコに量りとり、綿栓をしてオートクレーブにより滅菌した。これに、マルツ寒天培地上に生育した麹菌の分生子を１白金耳分（およそ１×１０５個）接種し、混合したのちに３０℃で７２−９６時間静置培養した。培養後のふすま種麹を均一になるよう撹拌したのちに０．３ｇを量りとり、蒸留水を３０ｍＬ添加してよく撹拌した。７０μｍセルストレーナー（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃａｔ．＃３５２３５０）を用いてろ過し、ろ液に含まれる分生子の数を、血球計算板を用いて測定した。
【００６７】
プロテアーゼおよびペプチダーゼの転写因子ｐｒｔＴ強制発現株の解析結果
アスペルギルス・ソーヤを宿主として、恒常的な発現パターンを示すｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  １（ｔｅｆ１）およびｈｉｓｔｏｎｅ  Ｈ３遺伝子のプロモーター、並びに、ＰｒｔＴにより活性化される該宿主由来のロイシンアミノペプチダーゼ遺伝子（ｌａｐI）のプロモーターを用いてｐｒｔＴ強制発現株を作製した（Ｐｔｅｆ１−ｐｒｔＴ＿ＯＥ株、ＰｈｉｓｔｏｎｅＨ３−ｐｒｔＴ＿ＯＥ株、ＰｌａｐI−ｐｒｔＴ＿ＯＥ株）。各強制発現株を用いてしょうゆ麹を作製し、得られた粗酵素液のアルカリプロテアーゼ活性を測定した結果（図２）、Ｐｔｅｆ１−ｐｒｔＴ＿ＯＥ株、ＰｈｉｓｔｏｎｅＨ３−ｐｒｔＴ＿ＯＥ株、ＰｌａｐI−ｐｒｔＴ＿ＯＥ株はそれぞれコントロール株（親株）の２．３倍、１．８倍、２．５倍の活性を示した。一方、ふすま種麹における分生子数は、それぞれコントロール株の１９％、３１％、６１％であった。
【００６８】
マンナナーゼの転写因子ｍａｎＲ強制発現株の解析結果
アスペルギルス・ソーヤを宿主として、ｔｅｆ１、並びに、ＭａｎＲにより活性化される該宿主由来のβ−マンナナーゼ（ｍａｎＧ）およびエンドグルカナーゼ（ｅｇｌＢ）遺伝子のプロモーターを用いてｍａｎＲ強制発現株を作製した（Ｐｔｅｆ１−ｍａｎＲ＿ＯＥ株、ＰｍａｎＧ−ｍａｎＲ＿ＯＥ株、ＰｅｇｌＢ−ｍａｎＲ＿ＯＥ株）。各強制発現株を用いてしょうゆ麹を作製し、得られた粗酵素液のβ−マンナナーゼ活性を測定した結果（図３）、Ｐｔｅｆ１−ｍａｎＲ＿ＯＥ株、ＰｍａｎＧ−ｍａｎＲ＿ＯＥ株、ＰｅｇｌＢ−ｍａｎＲ＿ＯＥ株はそれぞれコントロール株（親株）の４１倍、４６倍、３０倍の活性を示した。一方、ふすま種麹における分生子数は、それぞれコントロール株の０．０５％、１１９％、９２％であった。
【００６９】
キシラナーゼの転写因子ｘｌｎＲ強制発現株の解析結果
アスペルギルス・ソーヤを宿主として、ｔｅｆ１、並びに、ＸｌｎＲにより活性化される該宿主由来のキシラナーゼ遺伝子（ｘｙｎＦ１）およびｅｇｌＢ遺伝子のプロモーターを用いてｘｌｎＲ強制発現株を作製した（Ｐｔｅｆ１−ｘｌｎＲ＿ＯＥ株、ＰｘｙｎＦ１−ｘｌｎＲ＿ＯＥ株、ＰｅｇｌＢ−ｘｌｎＲ＿ＯＥ株）。各強制発現株を用いてしょうゆ麹を作製し、得られた粗酵素液のキシラナーゼ活性を測定した結果（図４上）、Ｐｔｅｆ１−ｘｌｎＲ＿ＯＥ株、ＰｘｙｎＦ１−ｘｌｎＲ＿ＯＥ株、ＰｅｇｌＢ−ｘｌｎＲ＿ＯＥ株はそれぞれコントロール株（親株）の３．８倍、７．５倍、５．６倍の活性を示した。一方、ふすま種麹における分生子数は、それぞれコントロール株の０．７％、５０％、５４％であった。
【００７０】
同様に、アスペルギルス・オリゼを宿主として、ｔｅｆ１、並びに、ＸｌｎＲにより活性化される該宿主由来のｘｙｎＦ１およびβ−キシロシダーゼ遺伝子（ｘｙｌＡ）のプロモーターを用いてｘｌｎＲ強制発現株を作製した（Ｐｔｅｆ１−ｘｌｎＲ＿ＯＥ株、ＰｘｙｎＦ１−ｘｌｎＲ＿ＯＥ株、ＰｘｙｌＡ−ｘｌｎＲ＿ＯＥ株）。各強制発現株を用いてしょうゆ麹を作製し、得られた粗酵素液のキシラナーゼ活性を測定した結果（図４下）、Ｐｔｅｆ１−ｘｌｎＲ＿ＯＥ株、ＰｘｙｎＦ１−ｘｌｎＲ＿ＯＥ株、ＰｘｙｌＡ−ｘｌｎＲ＿ＯＥ株はそれぞれコントロール株の１．９倍、１４倍、１１倍の活性を示した。一方、ふすま種麹における分生子数は、それぞれコントロール株（親株）の０％、８８％、７９％であった。
【００７１】
以上の結果から、麹菌の加水分解酵素の発現を制御するＺｎ（IIＣｙｓ６タイプの転写因子を強制発現する際、ｔｅｆ１やｈｉｓｔｏｎｅＨ３など、恒常的な発現パターンを示す遺伝子のプロモーターを使用すると、ふすま種麹における分生子数が著しく低下することが明らかになった。
【００７２】
一方で、転写因子により活性化される加水分解酵素遺伝子のプロモーターを使用して当該転写因子の強制発現株を作製すると、ｔｅｆ１遺伝子のプロモーターを使用した株と同等またはそれ以上の高い酵素活性を示すと同時に、親株に対する分生子形成能の減少が有意に抑制され、ｔｅｆ１プロモーターを使用した強制発現株よりも高い分生子形成能を示すことがわかった。
【００７３】
以上の結果から、本発明の形質転換体が有するポジティブフィードバック機構を利用して転写因子を強制発現することによって、分生子形成系に与える影響を最小限に抑えつつ、加水分解酵素遺伝子の発現を効率的に促進させることが可能であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
本発明は、調味料の食品製造や、消化剤等の医薬品製造、洗剤用の蛋白質加水分解酵素生産等において産業上極めて重要でかつ有用なものである。
【００７５】
【表１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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