(57)【要約】【課題】  従来法では困難であった試料から微生物のＲＮＡを簡便かつ迅速に抽出し、一定温度でＲＮＡを高感度に増幅検出する方法を提供する。【解決手段】  試料中に存在する微生物のＲＮＡを検出する方法であって、（１）試料中に存在する前記微生物のＲＮＡを抽出する工程、および（２）抽出したＲＮＡを一定温度で増幅／検出する工程を有し、前記工程（１）において前記試料、少なくとも界面活性剤を含む水溶液、および３０μｍ以上かつ３５５μｍ以下の直径を有する破砕ビーズを混合し、これを撹拌することによって前記試料を破砕し、前記微生物のＲＮＡを抽出することを特徴とする前記方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中に存在する微生物のＲＮＡを検出する方法であって、
（１）試料中に存在する前記微生物のＲＮＡを抽出する工程、および
（２）抽出したＲＮＡを一定温度で増幅／検出する工程
を有し、
前記工程（１）において、前記試料、少なくとも界面活性剤を含む水溶液、および３０μｍ以上かつ３５５μｍ以下の直径を有する破砕ビーズを混合し、これを撹拌することによって前記試料を破砕し、前記微生物のＲＮＡを抽出することを特徴とする方法。
【請求項２】
前記界面活性剤がドデシル硫酸及びその塩から選ばれることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記界面活性剤の濃度が０．１％以上かつ１０％以下の範囲であることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記破砕ビーズがジルコニアビーズであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記工程（２）が、
（２−１）前記微生物のＲＮＡ中の特定塩基配列を鋳型とし、いずれか一方の５’末端にプロモーター配列を付加した第一のプライマーおよび第二のプライマー、ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）、並びにＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより、プロモーター配列と、該プロモーター配列下流に前記特定塩基配列とを含む２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（２−２）該２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡポリメラーゼにより、前記特定塩基配列あるいはその相補配列を有するＲＮＡ転写産物を生成する工程、
（２−３）該ＲＮＡ転写産物が引き続き前記２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的に該ＲＮＡ転写産物を増幅する工程、および
（２−４）前記ＲＮＡ転写産物量を測定する工程、
を有し、前記工程（２−４）において、前記ＲＮＡ転写産物量の測定が、標的ＲＮＡと相補的２本鎖を形成するとシグナル特性が変化するように設計された核酸プローブの共存下で、該シグナル特性の変化を測定することによってなされる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中の微生物から簡便かつ迅速にＲＮＡを抽出し、一定温度でＲＮＡを高感度に増幅検出する方法に関するもので、感染症検査などの医療分野、分子生物学などの研究分野、食品安全管理などの産業分野などに適用可能である。
【背景技術】
【０００２】
従来、微生物から核酸を抽出する一般的方法として、変性剤等による化学的な方法、酵素等による生物学的方法がある（非特許文献１参照）。また、細胞壁が堅く、化学的または生物学的な抽出が困難な場合、微粒子を添加し物理的に破砕する方法がある（特許文献１）。
特に、試料中の微生物からＲＮＡを抽出する場合は、ＲＮａｓｅによるＲＮＡの分解を防ぐため、フェノール／クロロホルムやグアニジンチオシアン酸塩と試料を混合して、破砕する方法がある（特許文献２）。
【０００３】
しかし、フェノール／クロロホルムは有害物質であるため取扱いや廃棄に注意が必要であり、グアニジンチオシアン酸塩を使用すると微生物の破砕に用いられるガラスビーズやジルコニアビーズにＲＮＡが吸着してしまい、微量な微生物からのＲＮＡ抽出に使用するには不向きであった。一方、ＲＮａｓｅによるＲＮＡの分解を防ぐため、界面活性剤を使用する方法もあるが、界面活性剤の使用は物理的な破砕の効率を下げてしまい問題であった（特許文献３）。
【０００４】
また、抽出したＲＮＡを高感度に測定する手段として、ＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲで増幅し、増幅産物量を測定する方法があげられる（特許文献４）が、該方法の場合、一般的には逆転写（ＲＴ）工程およびＰＣＲ工程の二段階の工程が必要である。このことは操作を煩雑にして再現性を悪化させる要因となるだけでなく、二次汚染の危険性をも増加させることになる。前記ＲＴ工程およびＰＣＲ工程を合わせると通例２時間以上の時間を要し、多数検体処理や検査コストの低減には不向きであった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第４９０９４８６号公報
【特許文献２】特許第３７８４８２９号公報
【特許文献３】特開２００６−１４１２９２号公報
【特許文献４】特許３７５２１０２号公報公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ  Ａｐｐｅｎｄｉｘ  ７．２３〜７．２５（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、従来法では困難であった試料から微生物のＲＮＡを簡便かつ迅速に抽出し、一定温度でＲＮＡを高感度に増幅検出する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、鋭意検討の結果、試料から微生物のＲＮＡを簡便かつ迅速に抽出し、一定温度でＲＮＡを高感度に増幅検出する方法を見出した。
【０００９】
即ち本発明は以下のとおりである。
［１］試料中に存在する微生物のＲＮＡを検出する方法であって、
（１）試料中に存在する前記微生物のＲＮＡを抽出する工程、及び
（２）抽出したＲＮＡを一定温度で増幅／検出する工程
を有し、
前記工程（１）において前記試料、少なくとも界面活性剤を含む水溶液、および３０μｍ以上かつ３５５μｍ以下の直径を有する破砕ビーズを混合し、これを撹拌することによって前記試料を破砕し、前記微生物のＲＮＡを抽出することを特徴とする、方法。
［２］前記界面活性剤がドデシル硫酸及びその塩から選ばれることを特徴とする［１］に記載の方法。
［３］前記界面活性剤の濃度が０．１％以上かつ１０％以下の範囲であることを特徴とする［１］または［２］に記載の方法。
［４］前記破砕ビーズがジルコニアビーズであることを特徴とする［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］前記工程（２）が、
（２−１）前記微生物のＲＮＡ中の特定塩基配列を鋳型とし、いずれか一方の５’末端にプロモーター配列を付加した第一のプライマーおよび第二のプライマー、ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）、並びにＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより、プロモーター配列と、該プロモーター配列下流に前記特定塩基配列とを含む２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（２−２）該２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡポリメラーゼにより、前記特定塩基配列あるいはその相補配列を有するＲＮＡ転写産物を生成する工程、
（２−３）該ＲＮＡ転写産物が引き続き前記２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的に該ＲＮＡ転写産物を増幅する工程、および
（２−４）前記ＲＮＡ転写産物量を測定する工程、
を有し、前記工程（２−４）において、前記ＲＮＡ転写産物量の測定が、標的ＲＮＡと相補的２本鎖を形成するとシグナル特性が変化するように設計された核酸プローブの共存下で、該シグナル特性の変化を測定することによってなされる、［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１１】
本発明における試料には、喀痰、胃液、尿、気管支洗浄液、膿、肺胞洗浄液、腹水、胸水、心嚢水、糞便、組織、血液、血清、コロニー、スワブ若しくは他の体液等の生体試料の試料懸濁液、食物試料のホモジェナイズ等の試料懸濁液があげられる。試料が喀痰の場合は、ＮＡＬＣ処理等の試料の粘性を落す前処理を行うとより好ましい結果が得られる。また、環境分析等における環境水や排水、土壌の懸濁液等があげられる。
【００１２】
本発明における微生物には、ウィルス、細菌、真菌、原虫、植物又は動物などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明は、特に細胞の破砕が難しい真菌、マイコバクテリウム属などの微生物に有用である。
【００１３】
本発明に用いる界面活性剤としてＲＮａｓｅによるＲＮＡ分解を防ぐ界面活性剤であれば特に限定されないが、ドデシル硫酸及びその塩が好ましい。界面活性剤を溶液として添加する場合、その濃度は０．１％以上かつ１０％以下であってよく、１％以上かつ５％以下が好ましい。
【００１４】
本発明における破砕ビーズの材質は特に限定されないが、例えば、ガラス、ジルコニア、ダイアモンド、アルミナ（酸化アルミニウム）、鉄、合金等が挙げられるが、抽出効率、コストの面から、ジルコニアが好適である。
【００１５】
前記破砕ビーズの直径は、破砕効率の面から、１０μｍ以上かつ５００μｍ以下が好ましく、３０μｍ以上かつ３５５μｍ以下がより好ましい。なお本明細書で直径とは、平均粒径を意味する。また、前記破砕ビーズは複数の粒径の粒子からなる混合物であってもよいが、最も好ましくは９０μｍで単一の粒径からなる。破砕ビーズは狭い粒径分布が好ましく、中心粒径±２５μｍに９５％以上の粒径が含まれることが望ましい。前記単一の粒径とは、外見上ほぼ同様の定型的形状を有し、かつ前記粒径分布を示すものをいう。前記定型的形状については特に限定するものではないが球状であることが好ましく、真球状が特に好ましい。
【００１６】
試料への破砕ビーズの添加量は、試料の種類、攪拌方法、攪拌時間によって適宜決められる。破砕ビーズを添加後、続いて、撹拌により物理的に微生物を破砕する。
【００１７】
攪拌方法は、試料を入れた容器を往復振動させれば良く、振幅の方向は縦でも横でもよいが、好ましくは縦方向に往復振動させるのがよい。あるいは、ボルテックスミキサーで攪拌してもよい。
【００１８】
攪拌時間は、微生物および組織の細胞膜が破壊されるまででよく、具体的には１分間以上でよい。組織が植物の組織の様に、丈夫な細胞壁を持ち硬い場合には、それ以上長くてもよい。
【００１９】
本発明で用いるＲＮＡを一定温度で増幅／検出する方法としては、ＮＡＳＢＡ法（特許２６５０１５９号公報および特許３１５２９２７号公報参照）、およびＴＭＡ法（特許３２４１７１７号公報参照）などが報告されている。該ＲＮＡ増幅方法は、標的となるＲＮＡに対してプロモーター配列を含むプライマー、逆転写酵素および必要に応じてリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）により、プロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを合成し、ＲＮＡポリメラーゼによって標的となるＲＮＡの特定塩基配列を含むＲＮＡを合成し、該ＲＮＡが引き続きプロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型となる連鎖反応を行なうものである。そして、ＲＮＡ増幅後、電気泳動または検出可能な標識を結合させた核酸プローブを用いたハイブリダイゼーション法などにより増幅されたＲＮＡを検出する。
【００２０】
さらに、簡便にＲＮＡを増幅および測定する方法としては，ＴＲＣ法（特開２０００−１４４００号公報およびＩｓｈｉｇｕｒｏ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３１４，７７−８６（２００３）参照）があげられる。該方法は、インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブで、かつ標的核酸と相補的２本鎖を形成するとインターカレーター性蛍光色素部分が前記相補的２本鎖部分にインターカレートすることによって蛍光特性が変化するように設計された核酸プローブの存在下、前記ＲＮＡ増幅方法を実施し、蛍光特性の変化を測定するもので、簡便、一定温度、一段階、かつ密閉容器内でＲＮＡ増幅および測定を同時に実施することが可能である。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、感染症検査などの医療分野、分子生物学などの研究分野、食品安全管理などの産業分野で使用される試料中の微生物から簡便かつ迅速にＲＮＡを抽出し、一定温度でＲＮＡを高感度に増幅検出することが可能となる。
【実施例】
【００２２】
以下実施例により本発明の実施の形態を説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
【００２３】
実施例１
丈夫な細胞壁を持つ抗酸菌について、界面活性剤および各種直径（平均粒径）のジルコニアビーズによる溶菌操作およびＲＮＡの増幅・検出可能であることを評価した。
（１）ＭｙｃｏＢｒｏｔｈ（極東製薬）中で静置培養したＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧ  Ｔｏｋｙｏ株（以下、ＢＣＧと記載）を孔径５μｍの親水性シリンジフィルター（日本ＰＡＬＬ）でろ過後、ろ液の６００ｎｍにおける吸光度（ＯＤ６００）を測定し、その吸光度を基にＯＤ６００が０．１になるように滅菌蒸留水で希釈した（１０７ｃｆｕ（ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ）／ｍＬ相当）。
（２）（１）の希釈液を段階希釈し、１ｍＬ中に１０２ｃｆｕのＢＣＧを含む菌液を調製した。
（３）（２）で調製した菌液２００μＬを容量１．５ｍＬの容器に入れ、３％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）水溶液２００μＬおよび各種直径（平均粒径）のジルコニアビーズ（直径３０μｍ（ＴＺ−Ｂ  ３０  東ソー）、直径５３μｍ（ＴＺ−Ｂ  ５３  東ソー）、直径９０μｍ（ＴＺ−Ｂ  ９０  東ソー）、直径１２５μｍ（ＴＺ−Ｂ  １２５  東ソー）、直径３５５μｍ、および直径２０００μｍ（ＴＹＺボール  ニッカトー））をそれぞれ３００ｍｇ添加し、ボルテックスミキサー（サイエンティフィックインダストリーズ社  ＶＯＲＴＥＸ−ＧＥＮＩＥ  ２）で５分混合することで溶菌操作を行なった。
（４）（３）の処理液のうち３００μＬを、ＴＲＣＲ核酸精製キット（東ソー）およびＴＲＣＲリアルタイムモニター（ＴＲＣＲｅａｄｙ−８０、東ソー）を用いることで精製操作を行ない、溶出液５０μＬを得た。なお本操作は、キットの取扱説明書に従い実施した。
（５）（４）の溶出液１５μＬを、市販の結核菌群ｒＲＮＡ検出試薬（ＴＲＣＲｅａｄｙ  ＭＴＢ、東ソー）およびＴＲＣＲｅａｄｙ−８０を用いて溶出液中のＲＮＡを増幅検出し、前記モニターで陽性判定となる時間（陽性時間）を測定した。なお本操作は、前記試薬の添付文書および前記モニターの取扱説明書に従い実施した。同様の操作を３回繰り返し、陽性時間の平均値を求めた。
【００２４】
結果を表１に示す。
【００２５】
【表１】
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表１の結果より、破砕ビーズの直径３０μｍ以上かつ３５５μｍ以下では陽性時間が早く、抗酸菌を良好に溶菌していることがわかる。一方、破砕ビーズの直径２０００μｍでは陽性時間が遅く、抗酸菌の溶菌が十分に進んでいないことがわかる。このことから、抗酸菌を溶菌するためには、破砕ビーズの直径３０μｍ以上かつ３５５μｍ以下が好ましいことがわかる。また、一定温度でのＲＮＡ増幅／検出法としてＴＲＣ法を用いることで、５分以内に抗酸菌のＲＮＡを検出することが可能であった。