(57)【要約】【課題】骨折治癒期間の短縮及び骨折部位の早期機能回復を可能とする骨折治癒促進剤を提供する。【解決手段】本発明の骨折治癒促進剤はコンドロイチン硫酸（CS）を分解する酵素を含有することを特徴とする。コンドロイチン硫酸（CS）を分解する酵素としては、例えば、細菌由来のコンドロイチナーゼであるコンドロイチナーゼABC、コンドロイチナーゼACII、コンドロイチナーゼB、コンドロイチナーゼC等や、動物由来のヒアルロニダーゼを用いることができる。これらのコンドロイチン硫酸（CS）を分解する酵素を骨折部位に注入することによって、骨折治癒の期間を短くすることができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
コンドロイチン硫酸を分解する酵素を含有することを特徴とする骨折治癒促進剤。
【請求項２】
前記コンドロイチン硫酸を分解する酵素はコンドロイチナーゼであることを特徴とする請求項１に記載の骨折治癒促進剤。
【請求項３】
前記コンドロイチナーゼはコンドロイチナーゼABCである請求項２に記載の骨折治癒促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はコンドロイチナーゼを利用した骨折治癒促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、骨折の治療としてはギプス固定による保存的治療や、インプラント固定による手術治療が行われている。しかし、これらの治療法では骨折治癒までに最低２ヶ月という長期治療期間が必要となる。また、骨折治療中において筋力等の機能が低下するため、骨折治療以外にも機能回復のためのリハビリを行うことが必要となる。骨折部位によっては手術をしても骨癒合が得られるまではリハビリを開始することができないため、リハビリを含めた治療期間は、骨折治癒期間にリハビリ期間を合わせた期間となり、極めて長期の治療期間が必要となる。また、高齢者等においては身体的理由から骨折手術が受けられず、保存的治療を余儀なくされるため、保存治療中の機能低下が著しくなり、リハビリを行っても機能回復が得られず、障害が残ったり、下肢の骨折であれば寝たきりになったりする場合がある。
【０００３】
もし、こうした骨折の治癒過程を促進することができるならば、治癒期間を短縮できるだけでなく、骨折治癒期間中の機能低下を抑制することができる。さらにはリハビリ開始時期を早期に行うことが可能となり、リハビリに必要な期間も短縮できる。このため、骨折治癒促進剤の開発が望まれている。
【０００４】
ところで、骨折の治癒過程においては、炎症、軟性仮骨形成、硬性仮骨形成および骨リモデリングの４期からなる秩序だったプロセスであることが知られている（非特許文献１）。すなわち、軟骨の形成で始まり、それに続いて血管が侵入し骨組織へと置換され、軟骨内骨化が繰り返し起こることによって骨折が治癒されるのである。こうした骨折治癒過程を考慮し、様々な骨折治癒促進剤が開発されている。
【０００５】
例えば、特許文献１には、炎症を抑えるためのＰＤＥ４阻害作用を有するナフタレン化合物を利用した骨折治療用の医薬組成物が記載されている。また、これまでＴリンパ球での作用しか示唆されていなかったＰＥＢＰ２αＡ遺伝子が、骨形成において重要な役割を果たしていることが示されて以来、ＰＥＢＰ２αＡプロモーター活性化作用を奏する様々な化合物が骨折治療薬として開発されている（例えば特許文献２）。
【０００６】
一方、骨折を治療対象とするものではないが、特許文献３には軟骨下骨の全層性欠損を処置するための治療を目的として、抗血管形成因子を利用することが述べられている。また、同文献には、骨折の治療とは全く逆の、骨修復を抑制する治療方法としてコンドロイチナーゼ処理を行うことが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００４−２５６５２８号公報
【特許文献２】特開２００２−２０２８６号公報
【特許文献３】特表２０００−５１３７２１号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Schindeler A, McDonald MM, Bokko P, Little DG. Bone remodeling during fracture repair: The cellular picture. Semin Cell Dev Biol 2008; 19: 459-466.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、上記従来の実情に鑑みてなされたものであり、骨折治癒期間の短縮及び骨折部位の早期機能回復を可能とする骨折治癒促進剤を提供することを解決すべき課題としている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、上記課題を解決するため、コンドロイチン硫酸（以下「CS」と略すことがある）に注目した。CSは軟骨には多量に含まれており、そのほとんどはアグリカンのコアタンパク質と共有結合している。アグリカンはヒアルロナンおよびリンクプロテイン１と安定した会合体を形成し、それに結合したCSがヒアルロナンとともに、軟骨の水分と弾性の保持に寄与している。
【００１１】
従来、複数の突然変異マウスモデルで、発達中の軟骨におけるCS濃度の低下が明らかにされている。例えば、軟骨マトリックス欠損（cmd/cmd）マウスと呼ばれ、アグリカン（aggrecan）（以下「Acan」と略す）に自然突然変異があるマウスではCSがほぼ完全に欠損し、リンクプロテイン1遺伝子欠損マウスが保有するCSは約25％であることが分かっている。コンドロイチンの硫酸化に必要なホスホアデノシンホスホ硫酸合成酵素2をエンコードした遺伝子に突然変異がある自然短肢症（bm/bm）マウスは、軟骨中のCS含有量が若干少ない。Csgalnact 1遺伝子欠損マウスでは軟骨中のCS含有量が大きく低下していることも従来から分っている。これらの突然変異マウスモデルすべてが、軟骨内骨化障害のために矮性を示す。
【００１２】
本発明者らは、上記の事実から、CS濃度と軟骨内骨化との関係は、CS濃度も同様に骨折治癒に影響を及ぼすのではないかと考えた。そして、鋭意研究を行った結果、軟骨中のCS濃度がCsgalnact1およびCss2/Chpf遺伝子欠損マウスよりも大幅に低いCsgalnact1およびCss2/Chpfダブルノックアウト（以下「DKO」と略する）マウスを用いて、CS合成量の低下が骨折治癒に及ぼす影響を検討した。その結果、DKOマウスでは骨折治癒が加速し、軟性仮骨期が短縮することが分かった。さらに、発明者らは、骨折部位のCSの濃度を低下させるために、DKOマウスを用いるのではなく、通常の野生型マウスの骨折部位にCSを分解する酵素を注入することによってもCSの濃度が下がり、同様の効果が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち、本発明の骨折治癒促進剤は、コンドロイチン硫酸を分解する酵素を含有することを特徴とする。
【００１４】
コンドロイチン硫酸を分解する酵素としては特に限定はなく、例えば、細菌由来のコンドロイチナーゼやコンドロイチン硫酸分解活性を有する動物由来のヒアルロニダーゼを用いることができる。コンドロイチナーゼとしては、コンドロイチナーゼABC,コンドロイチナーゼACII、コンドロイチナーゼB、コンドロイチナーゼC等が挙げられる。なお、コンドロイチナーゼABCにはタイプI及びタイプIIが知られている。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の実施例について詳細を述べる。
（実験に供したマウス）
すべての動物実験は、国立大学法人岐阜大学医学部施設内動物実験委員会ならびに愛知医科大学動物実験委員会によって承認されたプロトコールに準拠して実施した。そして、実施例１及び比較例１ではC57BL/6J系の野生型（WT）マウスを使用した。また、比較例２ではCsgalnact1およびCss2/Chpfダブルノックアウト（Csgalnact1-/-; Css2/Chpf/-、DKO）マウスを用いて試験を行った。このDKOマウスは、Csgalnact1-/-マウスとCss2/Chpf/-マウス（両方ともC57BL/6J背景）を交配して作製した。
【００１６】
（大腿骨骨折モデルの調製）
・実施例１
実施例１では、C57BL/6J系の野生型（WT）マウスに対して、ペントバルビタール40 mg/kgの腹腔内注入とジエチルエーテルの吸入を組み合わせた全身麻酔下で、6週齢のマウスの大腿骨に開放骨折を外科的に作製した。膝関節の前面で皮膚を縦軸方向に10 mm切開して大腿骨の遠位部を露出させ、大腿骨の髄内へ針（23ゲージ）を挿入し、ニッパーを用いて大腿骨を中軸骨折させた。手術後、マウスは自由に歩行させた。また、100 μlのコンドロイチナーゼABC（以下「ChABC」という）（10 U/ml、生化学工業、東京）を、POD 5、7、10、12および14にWTマウスの骨折部位に注入し、大腿骨をPOD 7、10、14および21日に採取した（各時点でn=5）。
・比較例１
比較例１では、WTマウスの骨折部位に、ChABCの代わりにリン酸緩衝生理食塩水をPOD 5、7、10、12および14にWTマウスの骨折部位に注入し、大腿骨をPOD 7、10、14および21日に採取した（各時点でn=5）。その他については実施例１と同様であり、説明を省略する。
・比較例２
比較例２では、Csgalnact1およびCss2/Chpfダブルノックアウト（Csgalnact1-/-; Css2/Chpf/-、DKO）マウスに対して、ペントバルビタール40 mg/kgの腹腔内注入とジエチルエーテルの吸入を組み合わせた全身麻酔下で、6週齢のマウスの大腿骨に開放骨折を外科的に作製した。膝関節の前面で皮膚を縦軸方向に10 mm切開して大腿骨の遠位部を露出させ、大腿骨の髄内へ針（25ゲージ）を挿入し、ニッパーを用いて大腿骨を中軸骨折させた。手術後、マウスは自由に歩行させた。術後（POD）7、10、14、21および28日の時点で組織学的な分析のための大腿骨を（各時点でn=5）、またPOD 10に軟性仮骨中のCSを構造解析するための大腿骨を採取した（n=3）。
【００１７】
＜評  価＞
実施例１及び比較例１、２の施術を行ったマウスについて、以下の試験を行った。
（骨折部位の組織学的分析および軟性仮骨面積の測定）
大腿骨に厚さ5 μmの矢状切開を施し、アルシアンブルーおよびシリウスレッドで染色し、軟性仮骨の面積を測定した（各時点でn=5）。DKOマウスはWTマウスより小さかったため、軟性仮骨面積を各マウスの体重について正規化した。切片を、DP21カメラ（オリンパス、東京）を装着したCKX41顕微鏡を用いて40倍の倍率で観察し、Image Jソフトウェア（NIH、ベセスダ、メリーランド州）で解析した。
【００１８】
（骨折部位のX線画像の評価）
骨折治癒の状態を以下に示す１〜６のX線画像スコアによって評価した（各時点でn=3）。
1：明らかな硬性仮骨なし、2：ごくわずかな膜内骨化、3：骨折部のギャップの架橋を伴わない硬性仮骨、4：確認可能な骨折部のギャップの架橋を伴った硬性仮骨、5：新たに形成された硬性仮骨と既存の皮質骨との間の境界が不明瞭、6：リモデリング
X線画像の評価は2名の独立した担当者が、二重盲検下で実施した。
【００１９】
（軟性仮骨中のコンドロイチン硫酸の構造解析）
骨折部位から軟性仮骨を採取し、軟性仮骨からグリコサミノグリカンを抽出した。蛍光ポストラベリング法で二糖成分を分析し（n=3）放射性同位元素ラベリング法およびゲルろ過法でCS鎖の長さを解析した（n=3）。
【００２０】
（骨折治癒の生体力学的分析）
骨折部位の生体力学的特性はPOD 7、10、14および21に、機械的荷重試験機（MZ-500s; マルトー、東京）を用いて評価した（各時点でn=3）。破断時最大荷重（N）およびスティッフネス（N/mm）を、標準化された3点曲げ試験によって測定した。これらのパラメータは、大腿骨中央部の横断面積について正規化した。
【００２１】
（初代軟骨細胞培養）
生後3日目にマウスの初代軟骨細胞を胸郭から分離した。細胞を6ウェルの培養プレートに播き（5 x 105個/ウェル）、10％ウシ胎児血清（Invitrogen、カールスバッド、カリフォルニア州）、ペニシリン100 U/mlおよびストレプトマイシン100 μg/ml添加ダルベッコ変法イーグル培地／Hams F-12培地（和光純薬工業、大阪）中で、37℃、5％CO2、加湿空気下で規定の期間培養した。一部の実験では、細胞をCS（コンドロイチンジサッカライドΔdi-4S；Dextra Laboratories、レディング、英国）で規定の期間にわたり処理した。
【００２２】
（逆転写定量ポリメラーゼ連鎖反応（RT-qPCR））
培養した軟骨細胞から全RNAを抽出し、RT-qPCRに供した（各時点でn=4）。各mRNAの発現レベルを、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（Gapdh）のmRNAについて正規化した。プライマー配列は、請求に応じて提供可能である。
【００２３】
（統計解析）
in vivoおよびin vitro実験のいずれにおいても、パラメータは両側unpaired t検定を用い、WT群とDKO群の間の差を評価した。
【００２４】
＜結  果＞
表１に示すように、DKOマウスを用いた比較例２では、C57BL/6J系の野生型（WT）マウスを用いた比較例１と比較して、軟骨細胞の成熟促進を通じた軟性仮骨期の短縮によって、骨折治癒が加速した。
【００２５】
【表１】
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【００２６】
6週齢のマウスの大腿骨を骨折させ、治癒プロセスを組織学的解析、及びX線画像上での解析を行った。組織学的解析では、比較例１の野生型（WT）マウス、比較例２のDKOマウス、および実施例１のChABCを局所注入したWTマウスについて、骨折治癒のプロセスをアルシアンブルーおよびシリウスレッドで染色した組織標本として時系列で示した（図１参照）。
その結果、比較例２のDKOおよび実施例１のWT+ChABCマウスでは、術後14日目に軟性仮骨の吸収がほぼ完全に終わっているのに対し、比較例１のWTマウスで吸収が終わったのは術後21日目であり、遺伝的DKOまたはChABC注入によって軟骨中のCS含有量を低下させると、骨折治癒が約7日早まることが分かった。また、組織学的検討から、軟性仮骨のサイズは比較例１のWTマウスおよび比較例２のDKOマウスのいずれでも、POD 10で最大に達することが明らかとなった。POD 14では、比較例１のWTマウスの軟性仮骨はPOD 10のサイズの50％を保持していたのに対し、比較例２のDKOマウスの軟性仮骨は既に完全に吸収されていた。POD 21には、比較例１のWTマウスでは軟性仮骨が吸収されて硬性仮骨形成が始まっていたのに対し、比較例２のDKOマウスでは骨リモデリングが既に明らかであった。これらの所見は、比較例２のDKOマウスでは軟性仮骨の代謝促進と骨リモデリング開始の前倒しによって、骨折治癒が加速することを示していた。そして、さらに興味深いことには、ChABCの注入による実施例１のWTマウスの軟性仮骨中のCSの酵素的分解は、比較例２のDKOマウスで認められたものと類似の骨折治癒の加速をもたらした（図１参照）。
【００２７】
比較例２のDKOマウスにおける骨折治癒の加速は、仮骨が小さいことおよび／または加速度的な軟骨細胞の成熟を伴った軟性仮骨の迅速な代謝に起因する可能性がある。このことを検討するために、POD 10で軟性仮骨の面積を測定したところ、比較例１のWTマウスと比較例２のDKOマウスとの間に有意差がないことを明らかにした（4.3±2.3 mm2/体重に対して3.2±1.4 mm2/体重、p=0.43）。また、半定量的RT-qPCRを用いてDKOが軟骨細胞の成熟に及ぼす作用を検討したところ、図２に示すように、DKO軟骨細胞は各時点において、軟骨細胞マーカーAcanおよびCol2al、前肥大軟骨細胞マーカーRunx2、Ihh、Patch1およびGli1/Gli3、また肥大化軟骨細胞マーカーAlpの発現レベルがWT型マウスよりも高かった。さらには、興味深いことに、DKO軟骨細胞に50 μg/mlのCSを添加すると、Runx2、Ihh、Patch1およびGli1/Gli3の発現抑制によって、改変されていた表現型が回復した。
これらの結果は、比較例２のDKOマウスで認められた迅速な骨折治癒が、軟性仮骨のサイズが小さいためではなく、CSの減少を介した軟骨細胞の成熟促進によるものであることを強く示唆するものである。
【００２８】
以上のように、DKOマウスを用いた比較例２では、軟性仮骨中のCS含有量の低下とCS鎖の短縮が顕著であった。Csgalnact1遺伝子欠損マウスでは軟骨中のCS含有量が50％低下してわずかな矮性が認められ（後述する参考文献[1]参照]）、CSS2遺伝子欠損マウスではCS含有量が10％低下していた（後述する参考文献[2]参照]）。したがって、本発明者らはDKOマウスの軟性仮骨におけるCSの生合成を検討した。軟性仮骨をPOD 10に採取してCS分析を行ったところ、DKOマウスの軟性仮骨中のCS含有量はWTマウスの約29％であった。主要なCSの分子量は、DKOで約6800、WTで約11000であった。
【００２９】
DKOマウスを用いた比較例２の骨折治癒において、骨リモデリングは大きな機械的ストレス抵抗性を示した。X線画像の評価では、組織学的分析に一致して迅速な骨折治癒が認められた（X線画像は未掲載）。DKOマウスを用いた比較例２では硬性仮骨の出現がPOD 7、骨折部位上の硬性仮骨の架橋がPOD 10、また硬性仮骨の吸収がPOD 14とWTマウスより早く、骨リモデリングの約7日の促進が示された。骨折治癒のX線画像上の評価では、骨折治癒期間を通じてスコアはDKOマウスのほうが高かった（表１）。POD 14に実施した骨折部位の生体力学的分析では、DKOマウスの破断時最大荷重および骨折部位のスティッフネスはWTマウスを用いた比較例１に比べてそれぞれ4.3倍および7.7倍高く（表１）、DKOマウスでは骨リモデリングが亢進し、修復された骨は機械的ストレスに対して高い抵抗性を有することが示された。
【００３０】
＜考  察＞
上記のごとく、DKOマウスを用いた比較例２では、軟性仮骨期の短縮によって骨折治癒が加速することが証明され、軟性仮骨の代謝においてCSがきわめて重要な役割を果たすことが示された。骨リモデリングの促進および機械的強度の早期回復も、この迅速な骨折治癒の特性である。また、野生型（WT）マウスの骨折部位にChABCを注入した実施例１では、骨折治癒は良好な加速を示し、軟性仮骨におけるCSの酵素的分解が、骨折治癒に要する期間を短縮するための治療となりうることが示された。
【００３１】
CSと軟骨代謝との関係については、いくつかの報告が行われてきた。軟骨中のCS含有量が約50％少ないCsgalnact1遺伝子欠損マウスは、成長板軟骨細胞のカラム構造が短く、またアグリカンの異化が速やかであった（後述する参考文献[1,3]参照）。C4S（軟骨における主要なコンドロイチン硫酸の型）含有量が90％を超えて少ないC4st1遺伝子欠損マウスは、鞘状骨が厚く、また成長板においてアポトーシスをきたした軟骨細胞の数が3.5倍多かった（後述する参考文献[4]参照）。また、上記の試験結果からは、軟性仮骨中のCS含有量が71％少ない比較例２のDKOマウスに、軟性仮骨の吸収の加速と骨モデリングの早期開始が認められた。以上をまとめて考えると、これらの結果は、CSの減少は細胞外マトリックスの迅速な異化、早期の骨リモデリングおよび軟骨細胞のアポトーシスを通じて、軟骨細胞の成熟を促進したことを強く示唆された。そして、このことが、軟性仮骨におけるコンドロイチナーゼの局所投与によって、骨折治癒に要する期間を短縮できる理由であると推定された。
【００３２】
（参考文献）
[1] Sato T, Kudo T, Ikehara Y, Ogawa H, Hirano T, Kiyohara K, et al. Chondroitin
sulfate N-acetylgalactosaminyltransferase 1 is necessary for normal
endochondral ossification and aggrecan metabolism. J Biol Chem 2011; 286:
5803-5812.
[2] Ogawa H, Hatano S, Sugiura N, Nagai N, Sato T, Shimizu K, et al. Chondroitin
sulfate synthase-2 is necessary for chain e 301 xtension of chondroitin sulfate but not
critical for skeletal development. PLoS One 2012; 7: e43806.
[3] Watanabe Y, Takeuchi K, Higa Onaga S, Sato M, Tsujita M, Abe M, et al.
Chondroitin sulfate N-acetylgalactosaminyltransferase-1 is required for normal
cartilage development. Biochem J 2010; 432: 47-55.
[4] Kluppel M, Wight TN, Chan C, Hinek A, Wrana JL. Maintenance of chondroitin
sulfation balance by chondroitin-4-sulfotransferase 319 1 is required for chondrocyte
development and growth factor signaling during cartilage morphogenesis.
Development 2005; 132: 3989-4003.
【００３３】
この発明は上記発明の実施の態様及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】比較例１（野生型マウス）、比較例２（DKOマウス）及び実施例１（DKOマウスにコンドロイチナーゼABCを局所投与）における骨折の治癒過程を示す写真である。
【図２】比較例１（野生型マウス）、比較例２（DKOマウス）及び実施例１（DKOマウスにコンドロイチナーゼABCを局所投与）の軟骨細胞のRT-Qpcrの結果を示すグラフである。
【産業上の利用可能性】
【００３５】
本発明の骨折治癒促進剤は、骨折治癒期間の短縮及び骨折部位の早期機能回復を可能とする医薬品として利用することができる。
【図１】
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【図２】
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