(57)【要約】【課題】ウェル内で培養細胞を生育する細胞培養担体において、培養細胞の播種の際に前記ウェルの外に細胞が残らず、培養液の交換の際に、ウェル内の細胞が前記ウェルの外に出ることのない細胞培養担体を得る。【解決手段】複数のウェル３が形成されたウェル形成面２ａを有し、前記ウェル形成面の周囲に壁部４が形成された基体２を備え、前記壁部の内壁面４ａには、前記ウェル形成面から前記壁部に向かって、所定角度で傾斜する傾斜面４ａ１が形成されている。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のウェルが形成されたウェル形成面を有し、前記ウェル形成面の周囲に壁部が形成された基体を備え、
前記壁部の内壁面には、前記ウェル形成面から前記壁部に向かって、所定角度で傾斜する傾斜面が形成されていることを特徴とする細胞培養担体。
【請求項２】
前記傾斜面の下端部は、前記ウェル形成面における最も外側のウェルの開口端部に接することを特徴とする請求項１に記載された細胞培養担体。
【請求項３】
前記傾斜面には、細胞の接着性を低下させる細胞非接着性膜が形成されていることを特徴とする請求項１または請求項２に記載された細胞培養担体。
【請求項４】
前記基体のウェル形成面において、少なくとも前記ウェルを除く部分に、細胞の接着性を低下させる細胞非接着性膜が形成されていることを特徴とする請求項１乃至請求項３のいずれかに記載された細胞培養担体。
【請求項５】
前記細胞非接着性膜は、ゼラチンを含む材料、ガラス、アガロース、ポリエチレングリコール、ポリジメチルシロキサン、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポロキサマーの少なくとも１種を含む材料により形成されていることを特徴とする請求項３または請求項４に記載された細胞培養担体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）や体性幹細胞等の未分化な細胞の培養に好適な細胞培養担体に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ヒト骨髄液からの幹細胞の分離、目的とする組織細胞への分化・誘導、三次元培養技術、足場材料の開発等の進歩に伴い、細胞培養によって幹細胞から皮膚、骨、軟骨、血管、心臓弁、靭帯等の組織を作製することが可能となり、一部では、既に臨床応用が開始されている。
【０００３】
一方、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞に代表される未分化細胞は、他のすべての組織細胞に分化することができる全能性を有する細胞であることから、再生医療への応用が期待されている細胞である。このため、未分化細胞から組織細胞への分化誘導法の研究が盛んに進められている。
前記ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞を再生医療の目的で使用するためには、これらの細胞を大量に増殖させる技術が必要である。
【０００４】
従来、上記のようなＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等に代表される未分化細胞を増殖または維持するための一般的な培養担体としては、プラスチックシャーレ上に、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、マトリゲル等の生体内成分をコーティングしたものに、マウス由来やヒト組織由来の支持細胞を増殖させたものが用いられている。
【０００５】
例えば特許文献１には、表面が多孔体からなる複数の凹部（以下、ウェルと呼ぶ）が、基体表面にマトリックス状に配列されている細胞培養担体が開示されている。この特許文献１に示された細胞培養担体の構造の模式図を図１１に示す。
この細胞培養担体３０は、表面が多孔体からなる複数のウェル３１が、基体表面にマトリックス状に配列されているものである。このような形状の細胞培養担体３０を用いることにより、基体表面に形成されたウェル３１内のみで細胞を増殖させることが可能となり、ＥＳ細胞等の未分化細胞の細胞凝集塊（スフェロイド）のサイズ制御を行うことができる。
【０００６】
ところで、培養する未分化細胞、及びそれを収容する各ウェルは、非常に微細であるために、ピペット等を用いた培養に係る作業を肉眼で確認しながら行うことが困難である。
例えば、未分化細胞は培養液中で増殖させるが、頻繁に培養液を交換する必要がある。しかしながら、培養液を交換する作業において、ピペット等により古い培養液を吸引する際に、誤ってウェル内の細胞を吸い上げてしまう虞があった。
【０００７】
そのような課題に対し、特許文献２には、容器（ウェル）内の壁に段差部を形成し、その段差部により、ピペットまたは吸引機の先端を係止固定するための台部を設けた細胞培養容器が開示されている。
図１２に、特許文献２に開示される細胞培養容器の断面図を示す。図１２に示す細胞培養容器４０は、略円筒形状を有しており、その内部底面に、培養細胞を成育させるための細胞成育面４１を有している。
【０００８】
細胞培養容器４０の内部には、液体培地５０が満たされ、培養細胞５５は細胞成育面４１に接触した状態で増殖される。細胞培養容器４０の側壁の一部には、細胞成育面４１から所定距離離れた位置に段部４２が設けられている。それにより、細胞培養容器４０の内部側面には、段部４２によって台部４３が形成される。前記台部４３は、ピペット５６等の先端が該台部４３に当接して、係止固定されるために十分な幅に形成されている。
【０００９】
このように容器内の側壁部にピペット５６等の先端を係止する台部４３を設けることにより、ピペット５６等の先端と細胞成育面４１とを所定距離だけ離間させ、液体培地５０のみを交換することができる。即ち、培養細胞５５の誤吸引を防止することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００８−３０６９８７号公報
【特許文献２】実開平５−８８３００号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、図１２に示す培養容器の構成にあっては、前記段部４２を設けることにより隅部４４が形成されるために、未分化細胞を播種する際に、その隅部４４に細胞が集まり易く、隅部４４に溜まった未分化細胞を細胞成育面４１（ウェル）で培養できないという課題があった。
また、培養液を交換する場合に、新たな培養液を容器内に供給すると、段部４２（台部４３）に液が衝突することによって液が波立ち、細胞成育面４１（ウェル）の細胞が外に出る虞があるという課題があった。
【００１２】
本発明は、上記技術的課題を解決するためになされたものであり、ウェル内で細胞を培養する細胞培養担体において、培養細胞の播種の際に前記ウェルの外に細胞が残らず、培養液の交換の際に、ウェル内の細胞が前記ウェルの外に出ることのない細胞培養担体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記目的を達成するためになされた本発明にかかる細胞培養担体は、複数のウェルが形成されたウェル形成面を有し、前記ウェル形成面の周囲に壁部が形成された基体を備え、前記壁部の内壁面には、前記ウェル形成面から前記壁部に向かって、所定角度で傾斜する傾斜面が形成されていることに特徴を有する。
尚、前記傾斜面の下端部は、前記ウェル形成面における最も外側のウェルの開口端部に接することが望ましい。
また、前記傾斜面には、細胞の接着性を低下させる細胞非接着性膜が形成されていることが望ましい。
更には、前記基体のウェル形成面において、少なくとも前記ウェルを除く部分に、細胞の接着性を低下させる細胞非接着性膜が形成されていることが望ましい。
また、前記細胞非接着性膜は、ゼラチンを含む材料、ガラス、アガロース、ポリエチレングリコール、ポリジメチルシロキサン、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポロキサマーの少なくとも１種を含む材料により形成されていることが望ましい。
【００１４】
このように構成することにより、従来、壁部（段部）を設けることにより形成されていた隅部が存在しないため、播種時においては、前記隅部に未分化細胞が貯まることがなく、培養液の交換においては、供給した培養液が前記隅部に当たって波立つことが無く、ウェル内の培養細胞をウェル外に出さずに作業を行うことができる。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、ウェル内で細胞を培養する細胞培養担体において、培養細胞の播種の際に前記ウェルの外に細胞が残らず、培養液の交換の際に、ウェル内の細胞が前記ウェルの外に出ることのない細胞培養担体を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、実施の形態にかかる細胞培養担体の断面図である。
【図２】図２は、図１の一部を拡大して示す断面図である。
【図３】図３は、未分化細胞の播種の際に、図１の細胞培養担体にピペットを当てた状態を示す断面図である。
【図４】図４は、未分化細胞の播種の際に、図１の細胞培養担体にピペットを当てた他の状態を示す断面図である。
【図５】図５は、図１の細胞培養担体のウェル形成面に細胞非接着性膜を形成した例を示す断面図である。
【図６】図６は、培養液の交換の際に、図１の細胞培養担体にピペットを当てた状態を示す断面図である。
【図７】図７は、培養液の交換の際に、図１の細胞培養担体にピペットを当てた他の状態を示す断面図である。
【図８】図８は、培養液の交換の際に、図１の細胞培養担体にピペットを当てた他の状態を示す断面図である。
【図９】図９は、培養液の交換の際に、図１の細胞培養担体にピペットを当てた他の状態を示す断面図である。
【図１０】図１０は、図１の細胞培養担体の変形例を示す断面図である。
【図１１】図１１は、従来の細胞培養担体の一例を示す斜視図である。
【図１２】図１２は、従来の細胞培養容器の一例を示す断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明にかかる細胞培養担体の実施形態を、図面に基づいて説明する。図１は、実施の形態にかかる細胞培養担体の断面図であり、図２は、図１の一部を拡大して示す断面図である。
【００１８】
図示するように、この実施形態の細胞培養担体１は、上面（ウェル形成面２ａ）に複数のウェル３を有する基体２から構成されている。基体２の材料は限定されるものではないが、例えばセラミックス、ガラス、石英、シリコン、プラスチック等のいずれかからなる基板を用いることができる。
【００１９】
また、基体２の周縁部には、上方に突起する壁部４が形成されており、ウェル３の上方位置まで培養液等を保持することが可能となっている。図示しないが、基体２は平面視において例えば円形状または矩形状に形成され、壁部４はいずれの平面形状においても周縁部に沿って形成されている。
【００２０】
図２に示すように、基体２においてウェル３が形成された部分の厚さ（高さ）寸法ｔ１（ウェル形成面２ａから下面（裏面）２ｂまでの距離）は、例えば０．５〜２ｍｍに形成されている。また、ウェル３の開口部の直径ｄは例えば１００〜１０００μｍに形成され、深さｔ２（ウェル形成面２ａからウェル最底部３ａまでの距離）は例えば１００〜１０００μｍに形成されている。
【００２１】
また、壁部４の高さ寸法ｔ３は、例えば２〜６ｍｍに形成され、厚さ寸法ｔ４は、例えば１〜３ｍｍに形成されている。
壁部４の内壁面４ａには、ウェル形成面２ａから壁部４に向かって、角度θで傾斜する傾斜面４ａ１が形成されている。この傾斜面４ａ１の径方向の長さｔ５は、傾斜角θによっても変化するが、少なくとも０．５ｍｍに形成されている。また、傾斜角θは、播種時に担体容器内に満たす細胞懸濁液（培養液に未分化細胞を懸濁したもの）内の未分化細胞が傾斜面４ａ１に落ちて、少なくとも下方に流れ落ちるのに必要な傾斜角（例えば５５°）に設定されている。
【００２２】
また、本実施の形態において、傾斜面４ａ１の下端部は、最も外側のウェル３の開口端部３ｂに接する状態に形成されている。それにより、傾斜面４ａ１から流れ落ちた未分化細胞が直ぐさま前記ウェル３内に集まるようになっている。
【００２３】
このように壁部４の内壁面４ａに傾斜面４ａ１を形成することにより、培養細胞を播種する際に、前記傾斜面４ａ１に沈下した細胞懸濁液中の未分化細胞を、全てウェル３内に集めることができる。
また、このような傾斜面４ａ１を形成することによって、培養液を交換する際に、供給した新しい培養液が前記壁部４付近で波立つことがなく、ウェル３内の培養細胞がウェル３外に出ないようにすることができる。
【００２４】
このように形成された細胞培養担体１を用いて、未分化細胞の播種作業を行う場合、例えば、図３に示すように、細胞懸濁液を保持したピペット１０の先端を壁部４の内壁面４ａに当て、該内壁面４ａに沿って下降させる。
図４に示すようにピペット１０の先端が傾斜面４ａ１の上端部に当たると、ピペット１０の先端をそこで停止させる。
そして、ピペット１０の先端から、細胞懸濁液２０（細胞Ｃを懸濁した培養液）を供給し、図４に示すように壁部４の上端近くまで液を充填する。
【００２５】
このようにピペット１０から細胞懸濁液２０を供給する際は、ピペット１０の先端がウェル３から所定距離だけ離間することになるため、ピペット１０の先端からの噴流が近傍のウェル３内部に達せず、ウェル３内の細胞懸濁液２０の巻き上がりを防止することができる。
また、充填された細胞懸濁液２０においては、時間経過とともに未分化細胞Ｃが沈下していき、複数のウェル３内に播種されることになる。
【００２６】
また、壁部４の内壁面４ａ側においては、傾斜面４ａ１に沈下した未分化細胞Ｃが流れ落ち、傾斜面４ａ１の下方にあるウェル３内に播種される。
即ち、傾斜面４ａ１を設けたことにより、従来は内壁面４ａの下端に形成されていた隅部が存在しないため、そこに細胞Ｃが集まって溜まることがなく、効率的に細胞Ｃをウェル３内に集めることができる。
【００２７】
尚、図５に示すように前記基体２のウェル形成面２ａにおいて、前記複数のウェル３を除く部分には、所定厚さの細胞非接着性膜６を形成することが望ましい。また、傾斜面４ａ１にも前記細胞非接着性膜６を形成することが望ましい。
この細胞非接着性膜６は、細胞Ｃの接着性を著しく低下させる物質、例えば、動物の結合組織の主成分であるコラーゲンから抽出したゼラチンにより形成されている。或いは、ガラス、アガロース、ポリエチレングリコール、ポリジメチルシロキサン、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポロキサマーの少なくとも１種を含む材料によりにより形成されていることが好ましい。それにより細胞培養担体１表面において前記ウェル３を除く部分の細胞接着性が、前記ウェル３内面よりも低くなされる。この細胞非接着性膜６の膜厚は特に限定されるものではないが、１０ｎｍ〜１０μｍの範囲であればよい。
【００２８】
また、細胞培養担体１のウェル形成面２ａ及び傾斜面４ａ１において前記細胞非接着性膜６を形成するには、前記した細胞非接着性膜６の材料を溶かして溶液とし、例えばろ紙、スポンジ材、多孔性のゴム等に浸漬し、これを細胞培養担体１の上面に軽く押し当てる。それにより、ウェル３内部には前記溶液は入り込まず、ウェル３を除く部分に細胞非接着性膜６を形成することができる。
【００２９】
このように細胞培養担体１において、ウェル３を除く部分の細胞接着性が、前記ウェル３内面より低くなされることにより、ウェル３を除く部分に播種された細胞を効率的にウェル３内に集めることができる。
【００３０】
また、各ウェル３に播種した後の培養に係る作業において、前記細胞培養担体１を用いて培養液の交換作業を行う場合、播種時と同様に、図６に示すように、ピペット１０の先端を壁部４の内壁面４ａに当て内壁面４ａに沿って下降させる。図７に示すようにピペット１０の先端が傾斜面４ａ１の上端部に当たると、ピペット１０の先端の移動をそこで停止させる。
【００３１】
この時点で、ピペット１０の先端は、培養液２１中にあるため、ピペット１０により培養液２１を吸引する。
ここで、ピペット１０の先端はウェル３から所定距離だけ離間しているため、ピペット１０がウェル３内の培養細胞Ｃを誤って吸い取ることを防止することができる。
図８の状態となるまで培養液２１を吸引し、新たな培養液２１を供給する場合、新たな培養液２１を保持するピペット１０の先端を傾斜面４ａ１の上端部の位置に固定する（図８の状態）。
【００３２】
そして、図９の状態となるまで、ピペット１０の先端から新たな培養液２１を噴出する。このとき、培養液２１は、傾斜面４ａ１に沿って担体上に供給される。即ち、前記傾斜面４ａ１を設けたことにより、供給された培養液２１が壁部４付近で波立つことがなく、各ウェル３内の培養細胞Ｃをウェル３の外に出さずに液交換作業を行うことができる。
【００３３】
このように本発明に係る実施の形態によれば、基体２のウェル形成面２ａの周囲に壁部４を設け、前記ウェル形成面２ａから前記壁部４の内壁面４ａまで傾斜する傾斜面４ａ１を設けた構成とした。
この構成により、従来、壁部（段部）を設けることにより形成されていた隅部が存在しないため、播種時においては、前記隅部に未分化細胞が貯まることがなく、培養液の交換においては、供給した培養液が前記隅部に当たって波立つことが無く、ウェル３内の培養細胞をウェル３外に出さずに作業を行うことができる。
【００３４】
尚、前記実施の形態においては、傾斜面４ａ１の下端部は、最も外側のウェル３の開口端部３ｂに接する状態に形成されたものとした。
しかしながら、本発明に係る細胞培養担体にあっては、その構成に限定されるものではなく、例えば、図１０に示すように、少なくとも傾斜面４ａ１の下端部がウェル形成面２ａに接続された構成であればよい。
【００３５】
また、前記実施の形態において説明したウェル３の形状は、特に限定されるものではなく、基体２のウェル形成面２ａに上記サイズでの加工が可能である限り、種々の形状とすることができる。
特に、本発明に係る細胞培養担体１から剥離した細胞塊を浮遊培養に用いる場合には、剥離性および形成する塊の形状等の観点から、底面が半球状であることが好ましい。
【００３６】
また、本発明においては、ウェル３のサイズを径と深さで表現しているが、本発明でいうウェル３の径ｄは、開口面が多角形状である場合、細胞培養担体１の基体２のウェル形成面２ａのウェル３の開口面積を円に置き換えた場合の直径である。また、深さｔ２は、ウェル３の最も深い部分の深さである。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明の細胞培養担体は、ＥＳ細胞や成体幹細胞等の未分化な細胞の培養技術の発展、ひいては、生体組織の再生治療への応用に貢献し得る。
【符号の説明】
【００３８】
１      細胞培養担体
２      基体
２ａ    ウェル形成面
２ｂ    下面（裏面）
３      ウェル
３ａ    ウェル最底部
４      壁部
４ａ    内壁面
４ａ１  傾斜面
６      細胞非接着性膜
１０    ピペット
２０    細胞懸濁液
２１    培養液
Ｃ      細胞（未分化細胞、培養細胞）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2018143168.tif 000012
【図１１】
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【図１２】
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