(57)【要約】【課題】1α位水酸基を持つビタミンD誘導体のみならず、1α位水酸基を持たないビタミンD誘導体についても、化合物自身の生理作用を正確に評価することができる評価系を提供する。【解決手段】変異型ビタミンD受容体を発現し、2型くる病の症状を示す遺伝子改変非ヒト動物。前記変異型ビタミンD受容体の変異は、ラットのビタミンD受容体の270番目に相当するアルギニン残基に対する変異である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
変異型ビタミンD受容体を発現し、2型くる病の症状を示す遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項２】
前記変異型ビタミンD受容体の変異は、ラットのビタミンD受容体の270番目に相当するアルギニン残基に対する変異である、請求項１に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項３】
前記変異型ビタミンD受容体の変異は、ヒトのビタミンD受容体の274番目に相当するアルギニン残基に対する変異である、請求項１に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項４】
非ヒト動物がラットである、請求項２又は３に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項５】
非ヒト動物がラットであり、前記変異型ビタミンD受容体の変異がロイシンへの変異R270Lである、請求項２に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項６】
非ヒト動物がラットであり、前記変異型ビタミンD受容体の変異がAla, Val, Met又はIleへの変異R270A、R270V、R270M又はR270Iである、請求項２に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項７】
非ヒト動物の複数の胚のそれぞれのビタミンD受容体遺伝子に、ゲノム編集法により変異を導入して、複数の変異導入胚を得る工程（１）、
得られた複数の変異導入胚を偽妊非ヒト動物に移植し、出産させて遺伝子改変非ヒト動物を得る工程（２）、
を含む、遺伝子改変非ヒト動物の製造方法であって、
但し、前記変異型ビタミンD受容体の変異は、ラットのビタミンD受容体の270番目に相当するアルギニン残基に対する変異であり、
前記工程（２）で得られる遺伝子改変非ヒト動物は、2型くる病の症状を示す遺伝子改変非ヒト動物、及びビタミンD受容体欠損遺伝子改変非ヒト動物を含む、前記製造方法。
【請求項８】
工程（２）で得た遺伝子改変非ヒト動物から、2型くる病の症状を示す遺伝子改変非ヒト動物、及び／又はビタミンD受容体欠損遺伝子改変非ヒト動物を選択する工程を含む、請求項７に記載の製造方法。
【請求項９】
非ヒト動物がラットであり、遺伝子改変非ヒト動物が、遺伝子改変ラットである請求項７又は８に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変異型ビタミン受容体遺伝子を有する2型くる病モデル動物及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビタミンＤは、カルシウム恒常性や骨代謝に重要な栄養素であるとともに、免疫系、生殖、がん予防など、カルシウム代謝調節以外の生理作用にも関与することが報告されている。ビタミンＤ３の代謝についても種々の研究がなされ、様々な代謝物が特定されその活性が研究されつつあり、また、未同定の代謝物も存在すると考えられている。
【０００３】
ビタミンＤが関連する疾患として、くる病（成人においては骨軟化症と称す）が知られており、腎臓の25位水酸化ビタミンＤ 1α位水酸化酵素遺伝子(CYP27B1)の不活性型変異によりビタミンＤ活性化が障害されるビタミンＤ依存症１型と、ビタミンＤ受容体(VDR)遺伝子の不活性型変異によりビタミンＤの作用が障害される２型に分類される。2型はVDRの変異の度合いによって活性型ビタミンの投与がほとんど効果を示さないビタミンD抵抗性と活性型ビタミンの大量投与により治療可能なビタミンD依存性が存在する。
【０００４】
VDRのL304に変異を導入したマウスに関する研究は知られている(非特許文献1)。ジェミニアナログの共存により、不活性化されたVDRが再活性化されることが示されている。非特許文献1には、くる病と関連するVDRの部位への変異導入とその影響に関する記載はない。
【０００５】
一般に、ビタミンD誘導体の評価系としては、例えば、VDRのノックアウト(KO)マウスが知られている(非特許文献2)。しかし、VDRのKOマウスは、ビタミンD誘導体がVDR非依存的に作用を示す場合の評価系に成り得るが、VDR依存的に作用する場合の評価系には成り得ない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Huet et al., 2015, Cell Reports 10, 516-526
【非特許文献２】T. Yoshizawa, et al., Nat. Genet. 16 (1997) 391-396.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ビタミンD誘導体のVDR依存的に作用する場合の評価系を用いれば、ビタミンD誘導体の生理作用を解明することができる。
【０００８】
しかし、本発明者らはビタミンDの生理作用は活性型ビタミンDとされる1,25D3や1,25D2だけでなく、その前駆体とされる25OHD3、25OHD2（VDRに対する親和性は1,25D3、1,25D2の数百分の１）の作用も無視できないと考えている。25OHD3の血中濃度は1,25D3の血中濃度の数百倍であるからである。
【０００９】
正常なCYP27B1とVDRを持つ動物個体を用いた場合は、体内で25OHD3、25OHD2が一部、CYP27B1により1,25D3や1,25D2に変換されるため、25OHD3、25OHD2自身の効果を正確に評価することができない。1α位水酸基を持たないビタミンD誘導体についても同様に、化合物自身の生理作用を正確に評価することができない。
【００１０】
本発明の解決すべき課題は、1α位水酸基を持つビタミンD誘導体のみならず、1α位水酸基を持たないビタミンD誘導体についても、化合物自身の生理作用を正確に評価することができる評価系を提供することである。本発明の目的は、1α位水酸基を持つビタミンD誘導体のみならず、1α位水酸基を持たないビタミンD誘導体についても、化合物自身の生理作用を正確に評価することができる評価系を提供することにある。
【００１１】
そこで、本発明者らはCYP27B1 KOマウスやラットを用いることにより目的を達成できると考え、CYP27B1 KOマウスやラットを作製した。しかし、これらに25D3を投与すると体内で1,25D3が生成することがわかった。CYP27B1以外の酵素が1,25D3をつくったことになるが、これまでにCYP27A1が弱いながらも1α位水酸化活性を有することがわかっており、おそらくCYP27A1が1,25D3を作ったと推測される。
【００１２】
では、CYP27A1とCYP27B1  ダブルKO動物を用いればよいという考えがあるが、CYP27A1はコレステロール代謝や胆汁酸の生合成、ビタミンDの25位水酸化という、生理的に重要な働きが複数ありCYP27B1とCYP27A1のダブルKO動物は生存が危うく飼育もきわめて困難と推測され、この動物を用いて25D3、25D2およびそれらの誘導体を評価することは現実的でないと考えられる。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
そこで、本発明者が着想したのは、1α位が水酸化されてもその効果が見られない変異型VDRをもつ動物を用いることである。この着想に基づいて本発明はなされた。
【００１４】
本発明は以下の通りである。
[１]
変異型ビタミンD受容体を発現し、2型くる病の症状を示す遺伝子改変非ヒト動物。
[２]
前記変異型ビタミンD受容体の変異は、ラットのビタミンD受容体の270番目に相当するアルギニン残基に対する変異である、［１］に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
[３]
前記変異型ビタミンD受容体の変異は、ヒトのビタミンD受容体の274番目に相当するアルギニン残基に対する変異である、［１］に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
[４]
非ヒト動物がラットである、［２］又は［３］に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
[５]
非ヒト動物がラットであり、前記変異型ビタミンD受容体の変異がロイシンへの変異R270Lである、［２］に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
[６]
非ヒト動物がラットであり、前記変異型ビタミンD受容体の変異がAla, Val, Met又はIleへの変異R270A、R270V、R270M又はR270Iである、［２］に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
[７]
非ヒト動物の複数の胚のそれぞれのビタミンD受容体遺伝子に、ゲノム編集法により変異を導入して、複数の変異導入胚を得る工程（１）、
得られた複数の変異導入胚を偽妊非ヒト動物に移植し、出産させて遺伝子改変非ヒト動物を得る工程（２）、
を含む、遺伝子改変非ヒト動物の製造方法であって、
但し、前記変異型ビタミンD受容体の変異は、ラットのビタミンD受容体の270番目に相当するアルギニン残基に対する変異であり、
前記工程（２）で得られる遺伝子改変非ヒト動物は、2型くる病の症状を示す遺伝子改変非ヒト動物、及びビタミンD受容体欠損遺伝子改変非ヒト動物を含む、前記製造方法。
[８]
工程（２）で得た遺伝子改変非ヒト動物から、2型くる病の症状を示す遺伝子改変非ヒト動物、及び／又はビタミンD受容体欠損遺伝子改変非ヒト動物を選択する工程を含む、［７］に記載の製造方法。
[９]
非ヒト動物がラットであり、遺伝子改変非ヒト動物が、遺伝子改変ラットである［７］又は［８］に記載の製造方法。
【００１５】
II型くる病患者由来VDR変異体R274Lがそれに相当する。ヒトArg274（GenBank BAA83389）はマウスではArg269(EDL04218)に、ラットではArg270(NP_058754)に相当する。微量しか存在しないビタミンD誘導体の血中代謝物を測定するためには身体の小さいマウスよりもはるかに身体の大きなラットを用いる方が有利であると考え、実施例では、VDR変異体R270Lを有するラットの作製を試みた。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の遺伝子改変非ヒト動物は、ビタミンD誘導体の評価系になり、これを用いることで、ビタミンD誘導体の生理作用を解明することができる。例えば、天然型25OHD3、25OHD2や1α位水酸基をもたないビタミンD誘導体の評価系としての有用性が高い。特に、II型くる病R274Lを代表とする1α位水酸基との水素結合形成ができないVDRによるくる病患者のための医薬品開発にきわめて有効である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】KIラットの変異挿入部位の波形データ
【図２】KOラットの1塩基欠失部位の波形データ
【発明を実施するための形態】
【００１８】
＜遺伝子改変非ヒト動物＞
本発明は、変異型ビタミンD受容体を発現し、2型くる病の症状を示す遺伝子改変非ヒト動物に関する。本発明の遺伝子改変非ヒト動物は、変異型ビタミンD受容体を発現することにより2型くる病の症状を示す遺伝子改変非ヒト動物であり、
【００１９】
本発明の変異型ビタミンD受容体を発現し、2型くる病の症状を示す遺伝子改変非ヒト動物における変異型ビタミンD受容体の変異は、例えば、ラットのビタミンD受容体の270番目に相当するアルギニン残基に対する変異である。ラットのビタミンD受容体の270番目に相当するアルギニン残基は、ヒトのビタミンD受容体の274目にアルギニン残基に相当する。ヒトのビタミンD受容体の274目のアルギニン残基は、II型くる病患者由来VDR変異体であるR274Lのアルギニン残基である。換言すると、本発明の変異型ビタミンD受容体を発現し、2型くる病の症状を示す遺伝子改変非ヒト動物における変異型ビタミンD受容体の変異は、ヒトのビタミンD受容体の274目に相当するアルギニン残基に対する変異である。
【００２０】
ラットのビタミンD受容体のアミノ酸配列は、NP_058754
ラットのビタミンD受容体の塩基配列は、（Gene: Vdr ENSRNOG00000054420）
ヒトのビタミンD受容体のアミノ酸配列は、GenBank BAA83389
ヒトのビタミンD受容体の塩基配列は、GenBank: AB002168.2
にて参照できる。
【００２１】
尚、ラットのビタミンD受容体の遺伝子は、第7染色体において第１〜第10エキソンに分かれて存在し、前記270番目に相当するアルギニン残基は、第8エキソンに存在する。
【００２２】
前記変異型ビタミンD受容体の前記アルギニン残基に対する変異は、例えば、ロイシン(Lys)への変異R270Lであることができる。但し、ロイシン以外への変異であっても、ある程度結合能があるかも知れない1α-OH基との相互作用が見られないアミノ酸であれば良く、例えば、アラニン、バリン、メチオニン、イソロイシンなどを挙げることかできる。前記変異型ビタミンD受容体のアルギニン残基に対する変異は、R270A、R270V、R270M又はR270Iであることができる。
【００２３】
本発明の遺伝子改変非ヒト動物は、ヒト以外の動物であれば特に限定されないが、好ましくは哺乳動物（例えば、ブタ、イヌ、サル、マウス、ラット、モルモット、ウサギ）であり、より好ましくは、遺伝子組換及び交配による次世代動物取得の容易性の観点からマウス、ラット、モルモット、ウサギ等のげっ歯類動物である。マウス、モルモット、ウサギにおけるビタミンD受容体における、ラットのビタミンD受容体の270番目アルギニン残基に相当するアミノ酸は、マウスでは、269番目のアルギニン残基、モルモットでは、271番目のアルギニン残基、ウサギでは、270番目のアルギニン残基である。
【００２４】
前記遺伝子改変動物を、さらに同系の野性型動物とあるいは遺伝子改変動物同士で交配させることにより、遺伝子改変動物系統を維持できる。各個体のジェノタイプは、サザンブロッティングやＰＣＲ法を利用したジェノタイプ解析によって決定することができる。本発明の遺伝子改変動物の子孫も、変異型ビタミンD受容体が発現され、2型くる病の症状を示している限り、本発明の遺伝子改変動物に含まれる。
【００２５】
本発明の遺伝子改変非ヒト動物は、好ましくは遺伝子改変ラットであり、変異型ビタミンD受容体の変異がR270Lである遺伝子改変ラットであることがより好ましい。変異型ビタミンD受容体の変異がR270Lである遺伝子改変ラットは、変異型ビタミンD受容体を有することにより2型くる病の症状を示す。
【００２６】
＜遺伝子改変非ヒト動物の作製＞
遺伝子改変非ヒト動物の作製は、常法で行うことができる。例えば、いわゆるゲノム編集法と称されるCRISPR/Cas9やTALENといった方法がある。効率よく変異体を作製できれば方法にはこだわらない。実施例では、CRISPR/Cas9法を用いたがこれに限定される意図ではない。
【００２７】
本発明の方法では変異型VDR動物を作製する際に副産物としてVDR KO動物が効率よく得られる。本発明の遺伝子改変非ヒト動物の製造方法であって、
非ヒト動物の複数の胚のそれぞれのビタミンD受容体遺伝子に、ゲノム編集法により変異を導入して、複数の変異導入胚を得る工程（１）、
得られた複数の変異導入胚を偽妊非ヒト動物に移植し、出産させて遺伝子改変非ヒト動物を得る工程（２）、
を含み、
但し、前記変異型ビタミンD受容体の変異は、ラットのビタミンD受容体の270番目に相当するアルギニン残基に対する変異であり、
前記工程（２）で得られる遺伝子改変非ヒト動物は、2型くる病の症状を示す遺伝子改変非ヒト動物、及びビタミンD受容体欠損遺伝子改変非ヒト動物を含む。
【００２８】
工程（２）で得た遺伝子改変非ヒト動物から、2型くる病の症状を示す遺伝子改変非ヒト動物、及び／又はビタミンD受容体欠損遺伝子改変非ヒト動物を選択する工程を含む。本発明の製造方法は変異型VDR動物を作製する際に副産物としてVDR KO動物も同時に作製することができる。
【００２９】
非ヒト動物は、前記で例示した動物を挙げることができるが、好ましくはラットであり、遺伝子改変非ヒト動物は好ましくは遺伝子改変ラットである。
【００３０】
本発明の製造方法では、実施例に示すように、変異型VDR動物を作製する際に副産物としてVDR KO動物が効率よく得られる。即ち、本発明は、ラットのビタミンD受容体遺伝子に変異を導入して、変異型ビタミンD受容体R270Lラット及びビタミンD受容体欠損ラットの2種を同時に得ることを含む、遺伝子改変ラットの製造方法を包含する。遺伝子変異の導入は、例えば、ゲノム編集法により行うことができ、ゲノム編集法は、例えば、CRISPR/Cas9であることができる。但し、これに限定される意図ではない。
【実施例】
【００３１】
以下、本発明を実施例に基づいて更に詳細に説明する。但し、実施例は本発明の例示であって、本発明は実施例に限定される意図ではない。
【００３２】
1. 標的部位および目的部位の一塩基置換
ラットのVDRタンパク質の270番目のアルギニン（CGC）をロイシン（CTC）に変えるために標的アルギニン近傍にtarget site（配列番号１）を設定した。
アンダーライン（１本）：PAM配列
アンダーライン（２本）：target配列
Target site（□囲み：標的アルギニンをコードする配列
【化１】
2018143159.tif 000002
【００３３】
また、CGC→CTCの一塩基置換を起こす場所がPAM配列から18塩基離れていることから、置換後にさらなるDouble Strand Breakによる目的としないin-del mutationが起こる可能性があるため、PAM配列直後にsilent mutation（アミノ酸置換を伴わない一塩基置換）を入れたssODNを準備した。
【００３４】
【化２】
2018143159.tif 000003
【００３５】
ラットビタミンD受容体（VDR）遺伝子の塩基配列は、Gene: Vdr ENSRNOG00000054420を参照できる。
【００３６】
2. インジェクション用核酸
(1)  ガイドRNA
・tracr RNA
・crRNA（tracr RNAと共にtarget siteを認識する）
tracrRNA： 配列
AAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU（配列番号３）
crRNA配列：GCGUAACAUGAUCACCUCAAGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG（配列番号４）
(2)  ssODN（上記１に配列記載）
(3)  Cas9 mRNA
【００３７】
3. 使用動物
(1)  採卵用動物
種              ：ラット
系統            ：Jcl:Wistar
微生物学的グレード     ：SPF
性別            ：♀
入荷時の週齢    ：9週齢
使用動物数      ：15匹
供給源          ：日本クレア株式会社
【００３８】
(2)  自然交配用雄性動物
種              ：ラット
系統            ：Jcl:Wistar
微生物学的グレード     ：SPF
性別            ：♂
入荷時の週齢    ：9週齢
使用動物数      ：15匹
供給源          ：日本クレア株式会社
【００３９】
(3)  過排卵処置
採卵用動物にPMSGを単回腹腔内投与し、その48時間後にヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG）を単回腹腔内投与することにより過排卵処置を実施した。
【００４０】
(4)  交配、採卵
自然交配用雄性動物（♂）と過排卵処置した採卵用動物（♀）を1匹対1匹で雌雄同居させ、翌日採卵用動物から卵管灌流法により前核期胚を採取した。
【００４１】
4. インジェクション
前核期胚細胞質にVDR遺伝子の270番目のアルギニンをコードする塩基配列付近を標的としたcrRNA（終濃度50 ng/μL）およびtracr RNA（終濃度50 ng/μL）、ssODN（終濃度50 ng/μL）、Cas9 mRNA（終濃度100 ng/μL）の混合液をマイクロインジェクションした。
卵管灌流法により311個の前核期胚を得、すべての胚にインジェクションした結果、263個の生存胚を得た。
【００４２】
5. 胚移植および出産
(1) 偽妊娠動物
種              ：ラット
系統            ：Jcl:Wistar
微生物学的グレード     ：SPF
性別            ：♀
入荷時の週齢    ：9週齢
使用動物数      ：11匹
【００４３】
263個のインジェクション済みの胚を上記偽妊娠ラット11腹の卵管に移植した。
出産予定日に出産を11匹すべての妊娠ラットの出産を確認したところ、生まれてきたファウンダーの匹数は、♂47匹・♀62匹であった。
【００４４】
6. 遺伝子型の判定
各ラットの尾の一部を切り取りDNAを抽出し、PCRを用いて遺伝子型を判定した。ラットの尻尾から抽出したゲノムDNAを鋳型にし、Forwardプライマー5'-tgttctagccaggctggaaccccttgacgg-3'（配列番号５）およびReverseプライマー5'-tagagtctgggagctggaggaagtataggag-3'（配列番号６）でPCRを行い、変異挿入部位を挟む領域を増幅した。得られたPCR産物を精製したものをダイレクトシーケンス用の鋳型DNAとし、Forwardプライマー5'-tgttctagccaggctggaaccccttgacgg-3'（配列番号７）を用いてダイレクトシーケンスを行った。DNAシークエンサー（ABI  3130型）によって得られた波形から、109匹のうち74匹の遺伝子型を決定した時点でKI hetero 2匹, KO hetero 6匹得られたため残りは解析しなかった。
【００４５】
KIラットは、標的部位のアミノ酸置換（CGC→CTC）およびPAM配列直後のsilent mutation部位（ATT→ATA）の置換をそれぞれ確認した。また、KO hetero 6匹のうち標的領域内に1塩基の欠失でフレームシフトによって直後に終止コドンが出現する個体を選抜した。
【００４６】
７． F0ラット（VDR KI）の系統化およびhomo化
（１）F0個体とWild個体の交配
F0個体
種              ：ラット
系統            ：VDR KI hetero (あるいはモザイク）
微生物学的グレード     ：SPF
性別            ：♂
使用動物数      ：2匹
【００４７】
Wild個体
種              ：ラット
系統            ：Jcl:Wistar
微生物学的グレード     ：SPF
性別            ：♀
使用動物数      ：4匹
供給源          ：日本クレア株式会社
【００４８】
飼料
種類    ：γ線照射滅菌CRF-1（30k gray）
供給源  ：オリエンタル酵母工業株式会社
【００４９】
（２）F1（Hetero）作出
♂VDR KI heteroラット2匹と♀Jcl:Wistar 4匹の交配によりF1（Hetero）ラットを作出した。♂17匹、♀17匹がF1として生まれ、うちHeteroは♂7匹、♀3匹であった。
【００５０】
（３）F2（Homo）作出
F1（Hetero）同士を交配させることにより、F2（Homo）ラットを作出した。
♂19匹、♀15匹がF2として生まれ、うちHomoが♂8匹、♀7匹であった。
図１に得られたHeteroラットおよびHomoラットの塩基配列データを示す。
【００５１】
８．F0ラット（VDR KO）の系統化およびhomo化
前述したように1塩基欠失変異を有するVDR KO個体を系統化対象個体として選出した。
【００５２】
（１）F1（Hetero）作出
♂上記選抜個体と♀Jcl:Wistar  4匹を交配させることによりF1（Hetero）ラットを作出した。♂9匹、♀15匹がF1として生まれ、そのうちHeteroは♂4匹、♀6匹であった。
【００５３】
（２）F2（Homo）作出
F1（Hetero）同士を交配させることにより、F2（Homo）ラットを作出した。
♂25匹、♀23匹がF2として生まれ、そのうちHomoが♂6匹、♀2匹であった。
図２に得られたHeteroラットおよびHomoラットの塩基配列データを示す。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明は、2型くる病のモデル動物となり得る遺伝子改変非ヒト動物に関する分野に有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００５５】
配列番号１：ラットのVDRタンパク質の標的アルギニン近傍をコードする塩基配列
配列番号２：ssODNの塩基配列
配列番号３：tracrRNAの塩基配列
配列番号４：crRNA配列
配列番号５〜７：プライマー配列
【図１】
2018143159.tif 000004
【図２】
2018143159.tif 000005
【配列表】
2018143159000001.app