(57)【要約】      （修正有）【課題】一塩基多型（ＳＮＰ）を検出するためのプライマーを設計する方法、ＳＮＰを検出する方法、ＳＮＰを区別する方法、プライマー、検出可能オリゴヌクレオチドおよびキットの提供。【解決手段】核酸の試料を用いて増幅反応の実施及び検出、定量化することによるヒト由来の核酸の試料中のＢＲＡＦ遺伝子のエクソン１５におけるアミノ酸位置６００のバリンをコードするコドンの少なくとも１つの突然変異（Ｘ）（Ｖ６００Ｘ）を検出する方法を提供する。【選択図】図１−１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト由来の核酸の試料中のＢＲＡＦ遺伝子のエクソン１５におけるアミノ酸位置６００のバリンをコードするコドンの少なくとも１つの突然変異（Ｘ）（Ｖ６００Ｘ）を検出する方法であって、
（ａ）核酸の試料を用いて増幅反応を実施する段階であって、該増幅反応は、３’末端の最後の３個のヌクレオチドがＸをコードし、かつ３’末端から４番目のヌクレオチドがアデニン（Ａ）以外の塩基を含有するプライマーを含み、Ｘが存在する場合は、該プライマーはＸにアニーリングし、
ここで、核酸の試料がｍＲＮＡである場合、段階（ａ）は、前記増幅反応を実施する前にｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡを得ることまたはｍＲＮＡからｃＤＮＡを逆転写することをさらに含み、
Ｘが存在する場合は、該増幅反応はＸを含有する増幅産物を生成する、段階と、
（ｂ）Ｘを含有する増幅産物を検出し、任意選択的に定量化する段階
を含み、
ここで、Ｘが２以上のコドンによってコードされる場合、前記増幅反応は各々のコドンについてのプライマーを含み、
ヒト由来の核酸の試料中のＢＲＡＦ遺伝子のエクソン１５におけるＶ６００Ｘ突然変異が検出される、方法。
【請求項２】
前記増幅反応が、少なくとも１つのペプチド核酸（ＰＮＡ）クランプをさらに含み、ここで該少なくとも１つのＰＮＡクランプが野生型標的からの増幅をブロックし、前記増幅反応が１以上の他のＰＮＡクランプを含む場合、前記ＰＮＡが、望ましくない標的に結合し、プライマーが望ましくない標的から増幅するのを妨げることによって検出可能オリゴヌクレオチドおよび／またはプライマーを捕捉する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Ｘを含有する増幅産物を検出する段階が、標識プライマーを検出すること、または前記増幅産物を検出可能オリゴヌクレオチドと接触させ、かつ前記Ｘを含有する増幅産物への前記検出可能オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記増幅反応が内部対照プライマーをさらに含み、この場合前記増幅反応が前記内部対照を含有する増幅産物も生成し、この場合段階（ｂ）が、前記内部対照を含有する増幅産物を検出することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記内部対照を含有する増幅産物を検出する段階が、標識プライマーを検出すること、または前記増幅産物を検出可能オリゴヌクレオチドと接触させ、前記内部対照を含有する増幅産物への前記検出可能オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出することを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
Ｘが、Ｅ、Ｋ、Ｄ、ＲおよびＮから成る群より選択される少なくとも１個のアミノ酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
Ｘが、Ｅ、ＫおよびＤから成る群より選択される少なくとも１個のアミノ酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ＸがＥである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
Ｘが、ＥおよびＫであるか、またはＥおよびＤであるか、またはＫおよびＤである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ＸがＥ、ＫおよびＤである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法であって、前記方法が２以上のＸを検出する段階を含む場合、前記方法が、各々のＸについてのＤＮＡの試料を用いた増幅反応を一緒にまたは別々に実施することを含み得る、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
いずれのＸがＤＮＡの試料中に存在するかを決定する段階をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ヒト由来の核酸の試料中のＢＲＡＦ遺伝子のエクソン１５におけるＶ６００Ｘの増幅のためのプライマーのセットであって、前記プライマーのセットが、
（ａ）３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＧＡＡ［配列番号：５９］を含むオリゴヌクレオチドおよび／または３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＧＡＧ［配列番号：６０］を含むオリゴヌクレオチド、
（ｂ）３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＡＡＡ［配列番号：４６］を含むオリゴヌクレオチドおよび／または３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＡＡＧ［配列番号：４７］を含むオリゴヌクレオチド、
（ｃ）３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＧＡＴ［配列番号：４８］を含むオリゴヌクレオチドおよび／または３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＧＡＣ［配列番号：４９］を含むオリゴヌクレオチド、
（ｄ）３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＡＡＴ［配列番号：５０］を含むオリゴヌクレオチドおよび／または３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＡＡＣ［配列番号：５１］を含むオリゴヌクレオチド、
（ｅ）３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＣＧＴ［配列番号：５２］を含むオリゴヌクレオチド、３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＣＧＣ［配列番号：５３］を含むオリゴヌクレオチド、３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＣＧＡ［配列番号：５４］を含むオリゴヌクレオチド、３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＣＧＧ［配列番号：５５］を含むオリゴヌクレオチド、３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮ  ＡＧＡ［配列番号：５６］を含むオリゴヌクレオチド、および３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＡＧＧ［配列番号：５７］を含むオリゴヌクレオチド、
（ｄ）および（ｅ）、
（ａ）および（ｂ）、
（ａ）および（ｃ）、
（ｂ）および（ｃ）、
（ａ）、（ｂ）および（ｃ）、
（ｄ）とのさらなる組合せで、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のいずれか、
（ｅ）とのさらなる組合せで、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のいずれか、ならびに
（ｄ）および（ｅ）とのさらなる組合せで、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のいずれか
から成る群より選択される少なくとも１つのプライマーを含み、
ここでＮは、アデニン（Ａ）以外の塩基を含むヌクレオチドであり、
前記オリゴヌクレオチドは、約１５ヌクレオチドから約３５ヌクレオチドを含む、
プライマーのセット。
【請求項１４】
前記オリゴヌクレオチドが、ヌクレオチド配列の５’末端のＧと隣接して、ヌクレオチド配列の３’末端のＴから始まるヌクレオチド配列５’  ＡＡＴＡＧＧＴＧＡＴＴＴＴ  ３’［配列番号：５８］の１以上の連続するヌクレオチドをさらに含む、請求項１３に記載のプライマーのセット。
【請求項１５】
約１５ヌクレオチドから約３５ヌクレオチドを含むプライマーをさらに含み、ここで、逆プライマーが１５から２７ヌクレオチドを含む場合、該逆プライマーが配列番号：１０の１５から２７個の連続するヌクレオチドを含む、請求項１３に記載のプライマーのセット。
【請求項１６】
約１５ヌクレオチドから約３５ヌクレオチドを含む検出可能オリゴヌクレオチドをさらに含み、ここで、該検出可能オリゴヌクレオチドが１５から２０ヌクレオチドを含む場合、該検出可能オリゴヌクレオチドが配列番号：１１の１５から２０個の連続するヌクレオチドを含む、請求項１３に記載のプライマーのセット。
【請求項１７】
キットであって、
（ｉ）ヒト由来の核酸の試料中のＢＲＡＦ遺伝子のエクソン１５におけるＶ６００Ｘの検出のためのプライマーのセットであって、該プライマーのセットは、
（ａ）３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＧＡＡ［配列番号：５９］を含むオリゴヌクレオチドおよび／または３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＧＡＧ［配列番号：６０］を含むオリゴヌクレオチド、
（ｂ）３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＡＡＡ［配列番号：４６］を含むオリゴヌクレオチドおよび／または３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＡＡＧ［配列番号：４７］を含むオリゴヌクレオチド、
（ｃ）３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＧＡＴ［配列番号：４８］を含むオリゴヌクレオチドおよび／または３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＧＡＣ［配列番号：４９］を含むオリゴヌクレオチド、
（ｄ）３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＡＡＴ［配列番号：５０］を含むオリゴヌクレオチドおよび／または３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＡＡＣ［配列番号：５１］を含むオリゴヌクレオチド、
（ｅ）３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＣＧＴ［配列番号：５２］を含むオリゴヌクレオチド、３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＣＧＣ［配列番号：５３］を含むオリゴヌクレオチド、３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＣＧＡ［配列番号：５４］を含むオリゴヌクレオチド、３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＣＧＧ［配列番号：５５］を含むオリゴヌクレオチド、３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮ  ＡＧＡ［配列番号：５６］を含むオリゴヌクレオチド、および３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＡＧＧ［配列番号：５７］を含むオリゴヌクレオチド、
（ｄ）および（ｅ）、
（ａ）および（ｂ）、
（ａ）および（ｃ）、
（ｂ）および（ｃ）、
（ａ）、（ｂ）および（ｃ）、
（ｄ）とのさらなる組合せで、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のいずれか、
（ｅ）とのさらなる組合せで、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のいずれか、ならびに
（ｄ）および（ｅ）とのさらなる組合せで、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のいずれか
から成る群より選択される少なくとも１つのプライマーを含み、
ここでＮは、アデニン（Ａ）以外の塩基を含むヌクレオチドであり、
前記オリゴヌクレオチドは、約１５ヌクレオチドから約３５ヌクレオチドを含む、プライマーのセット、ならびに
（ｉｉ）ヒト由来の核酸の試料中のＢＲＡＦ遺伝子のエクソン１５におけるアミノ酸位置６００のバリンをコードするコドンの少なくとも１つの変異（Ｘ）（Ｖ６００Ｘ）を検出する方法についての指示書であって、前記方法は、
（ａ）核酸の試料を用いて増幅反応を実施する段階であって、該増幅反応は、３’末端の最後の３個のヌクレオチドがＸをコードし、かつ３’末端から４番目のヌクレオチドがアデニン（Ａ）以外の塩基を含有するプライマーであって、Ｘが存在する場合は、該プライマーはＸにアニーリングするプライマーと、少なくとも１つのペプチド核酸（ＰＮＡ）クランプであって、野生型標的からの増幅をブロックする少なくとも１つのＰＮＡクランプを含み、
ここで、核酸の試料がｍＲＮＡである場合、段階（ａ）は、前記増幅反応を実施する前にｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡを得ることまたはｍＲＮＡからｃＤＮＡを逆転写することをさらに含み、
Ｘが存在する場合は、前記増幅反応はＸを含有する増幅産物を生成する、段階と、
（ｂ）Ｘを含有する増幅産物を検出する段階
を含み、
ここで、Ｘが２以上のコドンによってコードされる場合、前記増幅反応は各々のコドンについてのプライマーを含み、
前記方法が２以上のＸを検出する段階を含む場合、前記方法は、各々のＸについての核酸の試料を用いた増幅反応を一緒にまたは別々に実施することを含むことができ、
前記方法は、いずれのＸが核酸の試料中に存在するかを決定する段階もさらに含む、指示書
を含む、キット。
【請求項１８】
前記（ｉ）のオリゴヌクレオチドが、ヌクレオチド配列の５’末端のＧと隣接して、ヌクレオチド配列の３’末端のＴから始まるヌクレオチド配列５’  ＡＡＴＡＧＧＴＧＡＴＴＴＴ  ３’［配列番号：５８］の１以上の連続するヌクレオチドをさらに含む、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
約１５ヌクレオチドから約３５ヌクレオチドを含むプライマーをさらに含み、ここで、該プライマーが１５から２７ヌクレオチドを含む場合、該プライマーが配列番号：１０の１５から２７個の連続するヌクレオチドを含む、請求項１７に記載のキット。
【請求項２０】
約１５ヌクレオチドから約３５ヌクレオチドを含む検出可能オリゴヌクレオチドをさらに含み、ここで、該検出可能オリゴヌクレオチドが１５から２０ヌクレオチドを含む場合、検出可能オリゴヌクレオチドが配列番号：１１の１５から２０個の連続するヌクレオチドを含む、請求項１７に記載のキット。
【請求項２１】
Ｘが、Ｅ、Ｋ、Ｄ、ＲおよびＮから成る群より選択される少なくとも１個のアミノ酸である、請求項１７に記載のキット。
【請求項２２】
Ｘが、Ｅ、ＫおよびＤから成る群より選択される少なくとも１個のアミノ酸である、請求項１７に記載のキット。
【請求項２３】
ＸがＥである、請求項１７に記載のキット。
【請求項２４】
Ｘが、ＥおよびＫであるか、またはＥおよびＤであるか、またはＫおよびＤである、請求項１７に記載のキット。
【請求項２５】
ＸがＥ、ＫおよびＤである、請求項１７に記載のキット。
【請求項２６】
核酸の試料中の遺伝子におけるコドンの少なくとも１つの突然変異（Ｘ）を検出する方法であって、前記方法は、
（ａ）核酸の試料を用いて増幅反応を実施する段階であって、該増幅反応は、３’末端の最後の３個のヌクレオチドがＸをコードし、かつ３’末端から４番目のヌクレオチドが野生型塩基以外の塩基を含有するプライマーを含み、Ｘが存在する場合は、該プライマーはＸにアニーリングし、
ここで、核酸の試料がｍＲＮＡである場合、段階（ａ）は、前記増幅反応を実施する前にｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡを得ることまたはｍＲＮＡからｃＤＮＡを逆転写することをさらに含み、
Ｘが存在する場合は、前記増幅反応はＸを含有する増幅産物を生成する、段階と、
（ｂ）Ｘを含有する増幅産物を検出する段階
を含み、
ここで、Ｘが２以上のコドンによってコードされる場合、前記増幅反応は各々のコドンについてのプライマーを含み、
ヒト由来の核酸の試料中の遺伝子のコドンにおいて変異が検出される、方法。
【請求項２７】
前記増幅反応は、少なくとも１つのＰＮＡクランプをさらに含み、ここで該少なくとも１つのＰＮＡクランプが野生型標的からの増幅をブロックし、前記増幅反応が１以上の他のＰＮＡクランプを含む場合、前記ＰＮＡは、望ましくない標的に結合し、プライマーが望ましくない標的から増幅するのを妨げることによって検出可能オリゴヌクレオチドおよび／またはプライマーを捕捉し、前記ＰＮＡが、検出可能オリゴヌクレオチドおよび／またはプライマーを捕捉する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記Ｘを含有する増幅産物を検出する段階が、標識プライマーを検出すること、または前記増幅産物を検出可能オリゴヌクレオチドと接触させ、前記Ｘを含有する増幅産物への前記検出可能オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出することを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記増幅反応が内部対照プライマーをさらに含み、この場合前記増幅反応が前記内部対照を含有する増幅産物も生成し、この場合段階（ｂ）が、前記内部対照を含有する増幅産物を検出することを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記内部対照を含有する増幅産物を検出する段階が、標識プライマーを検出すること、または前記増幅産物を検出可能オリゴヌクレオチドと接触させ、前記内部対照を含有する増幅産物への前記検出可能オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出することを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
請求項２９に記載の方法であって、前記方法が２以上のＸを検出する段階を含む場合、前記方法が、各々のＸについてのＤＮＡの試料を用いた増幅反応を一緒にまたは別々に実施することを含み得る、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
核酸の試料中の遺伝子におけるコドンの少なくとも１つの突然変異（Ｘ）を検出するためのプライマーを設計する方法であって、３’末端の最後の３個のヌクレオチドがＸをコードし、かつ３’末端から４番目のヌクレオチドが野生型遺伝子中に存在する塩基以外の塩基を含有するプライマーを合成して、核酸の試料中の遺伝子におけるコドンの少なくとも１つの突然変異（Ｘ）を検出するためのプライマーを設計することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、プライマーを設計する方法、一塩基多型（ＳＮＰ）を検出／区別する方法、プライマー伸長（例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および等温伸長）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ＰＣＲクランプとしてのＰＮＡの使用、プライマー、検出可能オリゴヌクレオチドならびにキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの遺伝的変異（生殖細胞系および体細胞突然変異を含む。）は、遺伝性異常、疾患進行および治療効果についての重要なマーカーである。様々な技術に基づく分子診断アッセイが一塩基多型（ＳＮＰ）を検出するために開発されており、また現在も開発が進められている。広く採用されている方法の１つは対立遺伝子特異的ポリメラーゼ連鎖反応（ＡＳ−ＰＣＲ）であり、この反応では、対立遺伝子特異的プライマーを、プライマーとこの鋳型との間の３’マッチングに従ったポリメラーゼによる選択的伸長に基づき、変異体特異的標的を増幅するように設計する。具体的には、ＰＣＲ増幅はプライマーの３’末端またはこの近傍でプライマーとこの鋳型との間にミスマッチが全くまたはほとんど存在しない場合にのみ十分に有効であり、プライマーの３’またはこの近傍のミスマッチの数がプライマーの鋳型への有効な結合を分断するのに十分である場合は、ＰＣＲ増幅は検出不能である。
【０００３】
このような方法の感度および特異性は、関心対象のＳＮＰを含む鋳型と他の配列を含む非標的鋳型との間のディファレンシャルＰＣＲの効率に有意に依存し、前記他の配列には、生殖細胞系変異の場合は他の対立遺伝子および体細胞変異の場合は野生型（または他の変異）が含まれる。標的鋳型と非標的鋳型との間のＰＣＲ効率の差が十分でない場合、非標的鋳型に関する検出可能な増幅（非特異的シグナル）が存在することがあり、より低い効率であっても、非特異的増幅シグナル（例えばＣｔまたはシグナル強度）が特異的シグナル（例えばＣｔまたはシグナル強度）に近すぎると、低レベルの特異的標的を非特異的標的から十分に分離することができない。このような場合、高レベルの感度と特異性の両方を達成するアッセイカットオフ値を確立することが困難である。十分に差別化されたＰＣＲ効率の技術的要件は、多くの腫瘍関連体細胞変異のような、非常に低い変異体含量を試料から検出する必要がある領域において特に重要である。
【０００４】
腫瘍関連体細胞変異を有する遺伝子の一例であるＢＲＡＦ遺伝子は、セリン／トレオニンプロテインキナーゼのｒａｆ／ｍｉｌファミリーに属するタンパク質（即ちセリン／トレオニンプロテインキナーゼＢ−ｒａｆ）をコードする。Ｂ−ｒａｆは、細胞分裂、細胞分化および分泌に影響を及ぼすＭＡＰＫ（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ）シグナル伝達経路を調節するうえで役割を果たす。ＢＲＡＦ遺伝子の生殖細胞系変異は、心臓欠陥、独特の顔の外観および精神遅滞を特徴とする、心臓・顔・皮膚症候群に関連する。ＢＲＡＦ遺伝子の変異は、肺の腺癌、結腸直腸癌、悪性黒色腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌および甲状腺癌を含む様々な種類の癌にも関連する。
【０００５】
ヌクレオチド１７９６位のチミンのアデニンへの変異が肺癌および頭頸部癌において検出されている（米国特許第７，３７８，２３３号明細書；Ｔ１７９９Ａについては米国特許第７，４４２，５０７号明細書参照）。ＢＲＡＦ遺伝子のエクソン１５におけるＴ１７９６Ａの検出は、報告によれば、悪性甲状腺乳糖癌を良性甲状腺試料から区別することを可能にし（米国特許第７，３７８，２３３号明細書）、またＨＮＰＣＣ腫瘍を散発性結腸直腸腫瘍から区別することも可能にすると報告されている（国際公開第２００５／０７１１０９号）。Ｔ１７９９Ａの検出は、報告によれば転移性黒色腫の存在を示す（米国特許出願第２００６／０２４６４７６号、現在は米国特許第７，４４２，５０７号明細書）。
【０００６】
癌に関連するＢＲＡＦ遺伝子の大部分の変異は、活性化ドメインに位置するアミノ酸位置６００で起こる。アミノ酸位置６００は、文献ではアミノ酸位置５９９とも称されてきた。アミノ酸位置６００のバリン（Ｖ）のグルタミン酸（Ｅ）への変異（例えば米国特許出願公開第２００７／００２０６５７号明細書、Ｄａｖｉｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４１７：９４９−９５４（２００２）、この中ではＶ５９９Ｅと表されている、およびＫｉｍｕｒａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３：１４５４−１４５７（２００３）参照）、リシン（Ｋ）への変異またはアスパラギン酸（Ｄ）への変異は、ＢＲＡＦ遺伝子のすべての突然変異の９０％以上を占める。結腸直腸癌の存在は、１以上の便潜血マーカーと共にＢＲＡＦなどの剥離上皮マーカーの点突然変異を検出することによって決定できると報告されている（米国特許出願公開第２０１１／０２３６９１６号明細書参照）。ＢＲＡＦ変異の分析は、マイクロサテライト安定性と共に、癌を有する患者の生存率の予後判定ならびに患者における癌の重症度の分類を可能にすると報告されている（国際公開第２００７／００９０１３号および米国特許出願公開第２００９／０１８１３７１号明細書参照）。一般的にＢＲＡＦ突然変異の検出については、例えば米国特許出願公開第２０１１／０２６９１２４号明細書および国際公開第２０１１／０１９７０４号参照。ＢＲＡＦのエクソン１５のコドン５９９の突然変異は、報告によれば悪性黒色腫の検出を可能にする（米国特許出願公開第２００７／００８７３５０号明細書参照；また国際公開第２０１０／０９７０２０号、同第２００５／０２７７１０号、同第２００５／０５９１７１号および同第２００５／０６６３４６号も参照のこと）。ＢＲＡＦのコドン６００の変異を検出するための、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に基づくリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）クランピングの使用が国際公開第２０１１／０９３６０６号に記載されており、一方ＢＲＡＦのＶ６００Ｅ変異を検出するための、ロックド核酸プライマーおよびビーコン検出可能オリゴヌクレオチドを用いた対立遺伝子特異的リアルタイム定量ＰＣＲ（ＡＳ−ＱＰＣＲ）は国際公開第２０１１／１０４６９４号に記載され、ＢＲＡＦ遺伝子の変異を検出するための蛍光定量ＰＣＲの使用は国際公開第２０１１／１０３７７０号に記載されている。ＢＲＡＦ遺伝子のＶ６００Ｅ変異を検出するための液体チップは国際公開第２０１１／１３１１４６号に記載されている。このため、Ｖ６００／Ｖ５９９の変異を導く一塩基多型（ＳＮＰ）を検出する能力は、癌の診断および予後について重要な情報を提供する。
【０００７】
癌の診断および予後についての情報を提供することに加えて、Ｖ６００／Ｖ５９９の変異を導くＳＮＰを検出する能力は、ＭＡＰＫ経路を標的とする薬剤の治療効果についての重要な情報も提供する。Ｖ６００ＥなどのＢＲＡＦのコドン６００の変異を、Ｖ６００Ｅを含むポリヌクレオチド配列の増幅によって検出することは、Ｂ−ｒａｆキナーゼ阻害剤に対する癌細胞の感受性の測定を可能にすると報告されている（米国特許出願公開第２０１０／０１７３２９４号明細書および同第２０１１／０２１２９９１号明細書参照）。ホモ接合／ヘテロ接合Ｖ６００ＥもしくはＶ６００Ｄ遺伝子型またはＢＲＡＦの機能獲得表現型を特徴とする任意の遺伝子型の検出は、報告によれば、ＥＲＫ１／ＥＲＫ２／ＭＥＫ阻害剤に対する悪性／腫瘍細胞の感受性の評価を可能にする（米国特許出願公開第２０１１／０１５８９４４号明細書参照；また国際公開第２００９／０７３５１３号も参照のこと）。Ｖ６００ＥなどのＢＲＡＦの変異の検出は、報告によれば、結腸癌を有する患者のセツキシマブまたはパニツムマブによる治療についての個人別報告の作成を可能にする（米国特許出願公開第２０１１／０２３０３６０号明細書参照）。Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１３：２０６８−２０７４（２００７）は、生物化学療法を受けている黒色腫患者を観測するための血清中の循環Ｂ−ＲＡＦ  ＤＮＡ変異の分析を開示する。ＢＲＡＦ突然変異に基づく癌の治療を最適化する方法ならびに他の方法は、国際公開第２０１１／１０６２９８号に記載されている。
【０００８】
シークエンス法、ピロシークエンス法、アレイ、シフトターミネーションアッセイ（ＳＴＡ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）とこれに続く二重プライミングオリゴヌクレオチド（ＤＰＯ）ＰＣＲ、および対立遺伝子特異的プライマーまたは対立遺伝子特異的検出可能オリゴヌクレオチドのいずれかを用いたリアルタイムＰＣＲなどの、ＢＲＡＦ変異を検出するための既存の方法は、様々な不都合を伴う（結腸直腸癌でのＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ変異の検出における自動シークエンス法とリアルタイム化学法の比較については、例えばＢｅｎｌｌｏｃｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．８：５４０−５４３（２００６）参照；メラノサイト病変および甲状腺乳頭癌試料中のＢＲＡＦ変異を同定するのに使用されるＰＣＲ産物の融解曲線分析については、例えばＨａｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｐａｔｈｏｌ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．１３１：１３６１−１３６７（２００７）参照；ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅの検出におけるリアルタイム対立遺伝子特異的増幅については、例えばＪａｒｒｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １８：３４９−３５２（２００４）参照；甲状腺乳頭癌におけるＢＲＡＦ変異を検出するための変異対立遺伝子特異的ＰＣＲ増幅（ＭＡＳＡ）の使用については、例えばＳａｐｉｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１５４：３４１−３４８（２００６）参照；ならびにメラノサイト病変におけるＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅを検出するためのリガーゼ検出反応の使用については、例えばＴｕｒｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｕｔａｎ．Ｐａｔｈｏｌ．３２：３３４−３３９（２００５）参照）。シークエンス法およびピロシークエンス法は感度が限られており、検出可能な最小変異体含量は約１０から２０％（全バックグラウンドに対する変異体％）である。対立遺伝子特異的検出可能オリゴヌクレオチドを利用するリアルタイムＰＣＲ、ＳＴＡ、アレイおよびＰＣＲ／ＤＰＯなどの他の方法も感度が限られている。理想的には、１％以上の感度が望ましい。
【０００９】
リアルタイムＰＣＲなどの十分な特異性を有さない既存方法は、Ｖ６００ＥとＶ６００Ｋのような特定の種類の突然変異を区別することができない。Ｖ６００Ｅはこのアミノ酸位置で認められるすべての変異の９０％を占めるが、黒色腫におけるＶ６００Ｋなどの臨床的に重要な他のアミノ酸置換が、時として高い頻度で、様々な癌において認められている。従って、特定の種類の突然変異を区別する能力はますます重要になりつつある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第７，３７８，２３３号明細書
【特許文献２】米国特許第７，４４２，５０７号明細書
【特許文献３】米国特許第７，３７８，２３３号明細書
【特許文献４】国際公開第２００５／０７１１０９号
【特許文献５】米国特許出願第２００６／０２４６４７６号（米国特許第７，４４２，５０７号明細書）
【特許文献６】米国特許出願公開第２００７／００２０６５７号明細書
【特許文献７】米国特許出願公開第２０１１／０２３６９１６号明細書
【特許文献８】国際公開第２００７／００９０１３号
【特許文献９】米国特許出願公開第２００９／０１８１３７１号明細書
【特許文献１０】米国特許出願公開第２０１１／０２６９１２４号明細書
【特許文献１１】国際公開第２０１１／０１９７０４号
【特許文献１２】米国特許出願公開第２００７／００８７３５０号明細書
【特許文献１３】国際公開第２０１０／０９７０２０号
【特許文献１４】国際公開第２００５／０２７７１０号
【特許文献１５】国際公開第２００５／０５９１７１号
【特許文献１６】国際公開第２００５／０６６３４６号
【特許文献１７】国際公開第２０１１／０９３６０６号
【特許文献１８】国際公開第２０１１／１０４６９４号
【特許文献１９】国際公開第２０１１／１０３７７０号
【特許文献２０】国際公開第２０１１／１３１１４６号
【特許文献２１】米国特許出願公開第２０１０／０１７３２９４号明細書
【特許文献２２】米国特許出願公開第２０１１／０２１２９９１号明細書
【特許文献２３】米国特許出願公開第２０１１／０１５８９４４号明細書
【特許文献２４】国際公開第２００９／０７３５１３号
【特許文献２５】米国特許出願公開第２０１１／０２３０３６０号明細書
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｄａｖｉｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４１７：９４９−９５４（２００２）
【非特許文献２】Ｋｉｍｕｒａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３：１４５４−１４５７（２００３）
【非特許文献３】Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１３：２０６８−２０７４（２００７）
【非特許文献４】Ｂｅｎｌｌｏｃｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．８：５４０−５４３（２００６）
【非特許文献５】Ｈａｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｐａｔｈｏｌ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．１３１：１３６１−１３６７（２００７）
【非特許文献６】Ｊａｒｒｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １８：３４９−３５２（２００４）
【非特許文献７】Ｓａｐｉｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１５４：３４１−３４８（２００６）
【非特許文献８】Ｔｕｒｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｕｔａｎ．Ｐａｔｈｏｌ．３２：３３４−３３９（２００５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
アッセイの作業の流れおよび自動化は、あらゆる診断方法の重要な局面である。シークエンス法などの特定の技術に関して、既存のアッセイ手順は時間が長くかかり、複雑である。ＰＣＲ／ＤＰＯ（二重プライミングオリゴ）およびアレイに基づく方法などの他の技術は、ＰＣＲ後に広範な試料の取り扱いを必要とし得るが、これはアンプリコン汚染を生じやすい。特定の場合には、多数の変異の区別された検出を達成するために付加的な段階を含めなければならない。
【００１３】
本開示は、生殖細胞系および体細胞突然変異、特に遺伝性異常、疾患進行および治療効果に関連する変異を検出する現在使用可能な方法に付随する不都合の一部を克服しようとするものである。この目的および他の目的および利点ならびに発明の特徴は、本明細書で提供する詳細な説明から明らかになる。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、生物学的異常に直接関与するのは突然変異タンパク質であるため、アミノ酸置換の状況下でＳＮＰが維持されることである。もう１つの洞察は、ＳＮＰ自体が、スプライシング事象の阻害などの、遺伝子調節の過程に直接関与することである。また、ＳＮＰの一部は生物学的機能に明らかなまたは公知の影響を及ぼさないが、一次ヌクレオチド配列において関心対象のＳＮＰと共局在することも可能である。
【００１５】
従って、本発明は、ＳＮＰ（即ち標的ＳＮＰ）の改善された検出に適する組成物および方法を対象とする。本発明によって提供されるＳＮＰの改善された検出は、プライマー設計への新しいアプローチの新規で非自明の発見に基づく。ＳＮＰの検出に適するプライマー設計（以下で論じる。）を図２および３に要約する。ここで注目すべきは、すべての設計に共通する特徴が、対立遺伝子特異的プライミングを可能にするために天然のミスマッチの５’側に１以上の付加的なミスマッチ塩基を導入することである。この設計特徴の理論的根拠は以下のとおりである：天然のミスマッチは、ミスマッチの含量、数および位置に依存して、時としてポリメラーゼに許容され得る。導入される付加的なミスマッチは、特異的標的に有意の影響を及ぼさずに非特異的標的についてのＰＣＲ効率をさらに低減するように設計される。結果として、関心対象の突然変異を有する標的は効率良く増幅されるが、非特異的標的は、プライマーの３’末端またはこの近傍に２以上のミスマッチが存在するため効率的に増幅されない。この設計特徴は、対立遺伝子特異的プライミングを可能にするために正プライマーまたは逆プライマーのいずれかに適用することができる。図２および３に記載されているように、このような設計は、既に対立遺伝子特異的検出および／または同定を達成するのに十分であり得る。実際のＳＮＰパターンに依存して、例えば２つの個別ＳＮＰが遠く離れて存在する場合、正プライマーと逆プライマーの両方を対立遺伝子特異的に設計すれば特定のＳＮＰを検出することが実行可能となり得る（図５参照）。関心対象のＳＮＰに加えて、臨床的に関連性がなく、アッセイで許容される必要がある他の既存のＳＮＰが近接して存在することがある。１つの解決法は、これらの位置に縮重塩基（図２、実施例２参照）または無差別的な結合を許容する他の修飾されたヌクレオチド塩基を設計することである。
【００１６】
上記で説明し、以下で例示する設計原理および方法は、単一アミノ酸変異を検出するコドンベースのＡＳ−ＰＣＲでの使用に採用することができる。遺伝子コドン表において、終止コドン（ＴＧＡ／ＵＧＡ）を含むあらゆるアミノ酸が３個のヌクレオチドの異なる配置によってコードされる。他のアミノ酸変異および／または試料中に潜在的に存在し得る名目上の配列からの非特異的シグナルを最小限に抑えるため、全コドンについてのＳＮＰ領域をプライマー設計に含める必要がある。関心対象の１つのアミノ酸変異に対応する複数のコドン（特定のアミノ酸に依存する。）または複数のアミノ酸変異を検出するため、各々が関心対象のコドンの１つに特異的な３’末端配列を担持する、複数の対立遺伝子特異的プライマーを使用する（プールとしてまたは別々に）。これらの対立遺伝子特異的プライマーは、３’末端の最後の３個のヌクレオチドで意図する標的と完全にマッチするが、任意の他のコドンと比較した場合に同じ領域内に少なくとも１つのミスマッチを有する。上記で論じたように、プライマーの最後の３個のヌクレオチドの間での１つのミスマッチは時としてポリメラーゼによって許容され得る；従って関心対象のコドンの５’側のヌクレオチド位置に導入された付加的なミスマッチは、特異的標的に有意の影響を及ぼさずに非特異的標的についてのＰＣＲ効率をさらに低減する。結果として、関心対象のアミノ酸変異だけを有する標的は増幅されるが、他の非特異的標的は、プライマーの３’末端またはこの近傍に２以上のミスマッチが存在するため増幅されない。この方法は、関心対象のアミノ酸をコードするすべての可能な遺伝的変異をカバーするだけでなく、すべての他の潜在的アミノ酸からの非特異的シグナル（変異配列または野生型配列からの）も排除する。
【００１７】
当業者は、本明細書の教示から、任意の所望標的についてのＳＮＰ検出において使用するためのプライマーを設計することができる。以下の一例は、ヒト由来の核酸の試料中のＢＲＡＦ遺伝子のエクソン１５におけるアミノ酸位置６００のバリンをコードするコドンの少なくとも１つの変異（Ｘ）（Ｖ６００Ｘ）を検出する方法を教示し、前記方法を提供する。この方法は、
（ａ）核酸の試料を用いて増幅反応を実施する段階、ここで増幅反応は、３’末端の最後の３個のヌクレオチドがＸをコードし、および３’末端から４番目のヌクレオチドがアデニン（Ａ）以外の塩基を含有するプライマーを含み、ここで、Ｘが存在する場合は、プライマーはＸにアニーリングし、
ここで、核酸の試料がｍＲＮＡである場合、段階（ａ）は、増幅反応を実施する前にｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡを得ることまたはｍＲＮＡからｃＤＮＡを逆転写することをさらに含み、
この後、Ｘが存在する場合は、増幅反応はＸを含有する増幅産物を生成する、
（ｂ）Ｘを含有する増幅産物を検出する段階
を含み、ならびに
ここで、Ｘが２以上のコドンによってコードされる場合、増幅反応は各々のコドンについてのプライマーを含む。増幅反応は少なくとも１つのペプチド核酸（ＰＮＡ）クランプをさらに含むことができ、ここで少なくとも１つのＰＮＡクランプは野生型であり、および増幅反応が１以上の他のＰＮＡクランプを含む場合、ＰＮＡは検出可能オリゴヌクレオチドおよび／またはプライマーを捕捉し、ＰＮＡは、望ましくない標的に結合し、プライマーが望ましくない標的から増幅するのを妨げることによって検出可能オリゴヌクレオチドおよび／またはプライマーを捕捉する。Ｘを含有する増幅産物を検出する段階は、標識プライマーを検出することまたは増幅産物を検出可能オリゴヌクレオチドと接触させ、Ｘを含有する増幅産物への検出可能オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出することを含み得る。増幅反応は、内部対照プライマーをさらに含むことができ、この場合、増幅反応は内部対照を含有する増幅産物も生成し、この場合、段階（ｂ）は、内部対照を含有する増幅産物を検出することを含む。内部対照を含有する増幅産物を検出する段階は、標識プライマーを検出することまたは増幅産物を検出可能オリゴヌクレオチドと接触させ、内部対照を含有する増幅産物への検出可能オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出することを含み得る。Ｘは、Ｅ、Ｋ、Ｄ、ＲおよびＮから成る群より選択される少なくとも１個のアミノ酸である。例えば、Ｘは、Ｅ、ＫおよびＤから成る群より選択される少なくとも１個のアミノ酸であり得る。Ｘは、Ｅ、ＥおよびＫ、ＥおよびＤ、ＫおよびＤ、またはＥ、ＫおよびＤであり得る。この方法が２以上のＸを検出する段階を含む場合、この方法は、各々のＸについてのＤＮＡの試料を用いた増幅反応を一緒にまたは別々に実施することを含み得る。これに関して、この方法はまた、いずれのＸが核酸の試料中に存在するかを決定する段階もさらに含み得る。
【００１８】
本発明はまた、ヒト由来の核酸の試料中のＢＲＡＦ遺伝子のエクソン１５におけるＶ６００Ｘの増幅のためのプライマーのセットも対象とし、このセットを提供する。プライマーのセットは、
（ａ）３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＧＡＡ［配列番号：４４］を含むオリゴヌクレオチドおよび／または３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＧＡＧ［配列番号：４５］を含むオリゴヌクレオチド、
（ｂ）３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＡＡＡ［配列番号：４６］を含むオリゴヌクレオチドおよび／または３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＡＡＧ［配列番号：４７］を含むオリゴヌクレオチド、
（ｃ）３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＧＡＴ［配列番号：４８］を含むオリゴヌクレオチドおよび／または３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＧＡＣ［配列番号：４９］を含むオリゴヌクレオチド、
（ｄ）３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＡＡＴ［配列番号：５０］を含むオリゴヌクレオチドおよび／または３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＡＡＣ［配列番号：５１］を含むオリゴヌクレオチド、
（ｅ）３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＣＧＴ［配列番号：５２］を含むオリゴヌクレオチド、３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＣＧＣ［配列番号：５３］を含むオリゴヌクレオチド、３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＣＧＡ［配列番号：５４］を含むオリゴヌクレオチド、３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＣＧＧ［配列番号：５５］を含むオリゴヌクレオチド、３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮ  ＡＧＡ［配列番号：５６］を含むオリゴヌクレオチド、および３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＡＧＧ［配列番号：５７］を含むオリゴヌクレオチド、
（ｄ）および（ｅ）、
（ａ）および（ｂ）、
（ａ）および（ｃ）、
（ｂ）および（ｃ）、
（ａ）、（ｂ）および（ｃ）、
（ｄ）とのさらなる組合せで、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のいずれか、
（ｅ）とのさらなる組合せで、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のいずれか、ならびに
（ｄ）および（ｅ）とのさらなる組合せで、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のいずれか
から成る群より選択される少なくとも１つのプライマーを含み、
ここでＮは、アデニン（Ａ）以外の塩基を含むヌクレオチドであり、および
ここでオリゴヌクレオチドは、約１５ヌクレオチドから約３５ヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド配列の５’末端のＧと隣接して、ヌクレオチド配列の３’末端のＴから始まるヌクレオチド配列５’  ＡＡＴＡＧＧＴＧＡＴＴＴＴ  ３’［配列番号：５８］の１以上の連続するヌクレオチドをさらに含み得る。プライマーのセットは、約１５ヌクレオチドから約３５ヌクレオチドを含む、逆プライマーなどのプライマーをさらに含むことができ、ここで、プライマーが１５から２７ヌクレオチドを含む場合、プライマーは配列番号：１０の１５から２７個の連続するヌクレオチドを含む。検出可能オリゴヌクレオチドは、約１５ヌクレオチドから約３５ヌクレオチドを含むことができ、ここで、検出可能オリゴヌクレオチドが１５から２０ヌクレオチドを含む場合、検出可能オリゴヌクレオチドは配列番号：１１の１５から２０個の連続するヌクレオチドを含む。
【００１９】
キットも提供される。キットは、
（ｉ）ヒト由来の核酸の試料中のＢＲＡＦ遺伝子のエクソン１５におけるＶ６００Ｘの検出のためのプライマーのセット、ここでプライマーのセットは、
（ａ）３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＧＡＡ［配列番号：４４］を含むオリゴヌクレオチドおよび／または３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＧＡＧ［配列番号：４５］を含むオリゴヌクレオチド、
（ｂ）３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＡＡＡ［配列番号：４６］を含むオリゴヌクレオチドおよび／または３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＡＡＧ［配列番号：４７］を含むオリゴヌクレオチド、
（ｃ）３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＧＡＴ［配列番号：４８］を含むオリゴヌクレオチドおよび／または３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＧＡＣ［配列番号：４９］を含むオリゴヌクレオチド、
（ｄ）３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＡＡＴ［配列番号：５０］を含むオリゴヌクレオチドおよび／または３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＡＡＣ［配列番号：５１］を含むオリゴヌクレオチド、
（ｅ）３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＣＧＴ［配列番号：５２］を含むオリゴヌクレオチド、３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＣＧＣ［配列番号：５３］を含むオリゴヌクレオチド、３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＣＧＡ［配列番号：５４］を含むオリゴヌクレオチド、３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＣＧＧ［配列番号：５５］を含むオリゴヌクレオチド、３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮ  ＡＧＡ［配列番号：５６］を含むオリゴヌクレオチド、および３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＡＧＧ［配列番号：５７］を含むオリゴヌクレオチド、
（ｄ）および（ｅ）、
（ａ）および（ｂ）、
（ａ）および（ｃ）、
（ｂ）および（ｃ）、
（ａ）、（ｂ）および（ｃ）、
（ｄ）とのさらなる組合せで、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のいずれか、
（ｅ）とのさらなる組合せで、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のいずれか、ならびに
（ｄ）および（ｅ）とのさらなる組合せで、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のいずれか
から成る群より選択される少なくとも１つのプライマーを含み、
ここでＮは、アデニン（Ａ）以外の塩基を含むヌクレオチドであり、および
ここでオリゴヌクレオチドは、約１５ヌクレオチドから約３５ヌクレオチドを含む、ならびに
（ｉｉ）ヒト由来の核酸の試料中のＢＲＡＦ遺伝子のエクソン１５におけるアミノ酸位置６００のバリンをコードするコドンの少なくとも１つの変異（Ｘ）（Ｖ６００Ｘ）を検出する方法についての指示書、この方法は、
（ａ）核酸の試料を用いて増幅反応を実施する段階、ここで増幅反応は、３’末端の最後の３個のヌクレオチドがＸをコードし、および３’末端から４番目のヌクレオチドがアデニン（Ａ）以外の塩基を含有するプライマー、ここで、Ｘが存在する場合は、プライマーはＸにアニーリングし、ならびに少なくとも１つのペプチド核酸（ＰＮＡ）クランプを含み、ここで少なくとも１つのＰＮＡクランプは野生型標的からの増幅をブロックし、
ここで、核酸の試料がｍＲＮＡである場合、段階（ａ）は、増幅反応を実施する前にｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡを得ることまたはｍＲＮＡからｃＤＮＡを逆転写することをさらに含み、
この後、Ｘが存在する場合は、増幅反応はＸを含有する増幅産物を生成する、ならびに
（ｂ）Ｘを含有する増幅産物を検出する段階
を含み、
ここで、Ｘが２以上のコドンによってコードされる場合、増幅反応は各々のコドンについてのプライマーを含み、
ここで、この方法が２以上のＸを検出する段階を含む場合、この方法は、各々のＸについての核酸の試料を用いた増幅反応を一緒にまたは別々に実施することを含むことができ、および
ここで、この方法はまた、いずれのＸが核酸の試料中に存在するかを決定する段階もさらに含み得る。オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド配列の５’末端のＧと隣接して、ヌクレオチド配列の３’末端のＴから始まるヌクレオチド配列５’  ＡＡＴＡＧＧＴＧＡＴＴＴＴ  ３’［配列番号：５８］の１以上の連続するヌクレオチドをさらに含み得る。キットは、約１５ヌクレオチドから約３５ヌクレオチドを含む、逆プライマーなどのプライマーをさらに含むことができ、ここで、プライマーが１５から２７ヌクレオチドを含む場合、プライマーは配列番号：１０の１５から２７個の連続するヌクレオチドを含む。キットは、約１５ヌクレオチドから約３５ヌクレオチドを含む検出可能オリゴヌクレオチドをさらに含むことができ、ここで、検出可能オリゴヌクレオチドが１５から２０ヌクレオチドを含む場合、検出可能オリゴヌクレオチドは配列番号：１１の１５から２０個の連続するヌクレオチドを含む。Ｘは、Ｅ、Ｋ、Ｄ、ＲおよびＮから成る群より選択される少なくとも１個のアミノ酸であり得る。Ｘは、Ｅ、ＫおよびＤから成る群より選択される少なくとも１個のアミノ酸、例えばＥ、ＥおよびＫ、ＥおよびＤ、ＫおよびＤ、またはＥ、ＫおよびＤであり得る。
【００２０】
本発明はＢＲＡＦ変異の検出に限定されず、当業者は、本明細書の教示に基づき、任意の所望標的ＳＮＰの検出のためのプライマーおよびアッセイを設計することができる。従って、本発明はまた、核酸の試料中の遺伝子におけるコドンの少なくとも１つの突然変異（Ｘ）を検出する方法も対象とし、この方法も提供する。この方法は、
（ａ）核酸の試料を用いて増幅反応を実施する段階、ここで増幅反応は、３’末端の最後の３個のヌクレオチドがＸをコードし、および３’末端から４番目のヌクレオチドがアデニン（Ａ）以外の塩基を含有するプライマーを含み、ここで、Ｘが存在する場合は、プライマーはＸにアニーリングし、
ここで、核酸の試料がｍＲＮＡである場合、段階（ａ）は、増幅反応を実施する前にｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡを得ることまたはｍＲＮＡからｃＤＮＡを逆転写することをさらに含み、
この後、Ｘが存在する場合は、増幅反応はＸを含有する増幅産物を生成する、
（ｂ）Ｘを含有する増幅産物を検出する段階
を含み、ならびに
ここで、Ｘが２以上のコドンによってコードされる場合、増幅反応は各々のコドンについてのプライマーを含む。増幅反応は少なくとも１つのペプチド核酸（ＰＮＡ）クランプをさらに含むことができ、ここで少なくとも１つのＰＮＡクランプは野生型標的からの増幅をブロックし、およびここで、増幅反応が１以上の他のＰＮＡクランプを含む場合、ＰＮＡは、好ましくは検出可能オリゴヌクレオチドおよび／またはプライマーを捕捉する。Ｘを含有する増幅産物を検出する段階は、標識プライマーを検出することまたは増幅産物を検出可能オリゴヌクレオチドと接触させ、Ｘを含有する増幅産物への検出可能オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出することを含み得る。増幅反応は、内部対照プライマーをさらに含むことができ、この場合増幅反応は内部対照を含有する増幅産物も生成し、この場合段階（ｂ）は、内部対照を含有する増幅産物を検出することを含む。内部対照を含有する増幅産物を検出する段階は、標識プライマーを検出することまたは増幅産物を検出可能オリゴヌクレオチドと接触させ、内部対照を含有する増幅産物への検出可能オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出することを含み得る。この方法が２以上のＸを検出する段階を含む場合、この方法は、各々のＸについての核酸の試料を用いた増幅反応を一緒にまたは別々に実施することを含み得る。これに関して、この方法はまた、いずれのＸが核酸の試料中に存在するかを決定する段階もさらに含み得る。
【００２１】
核酸の試料中の遺伝子におけるコドンの少なくとも１つの突然変異（Ｘ）を検出するためのプライマーを設計する方法も提供される。この方法は、３’末端の最後の３個のヌクレオチドがＸをコードし、および３’末端から４番目のヌクレオチドが、野生型遺伝子中に存在する塩基以外の塩基を含有するプライマーを合成することを含み、この後核酸の試料中の遺伝子におけるコドンの少なくとも１つの突然変異（Ｘ）を検出するためのプライマーを設計する。
【００２２】
本発明はまた、二重対立遺伝子特異的プライマーの設計方法も対象とする。１つの位置につき１つのＳＮＰで、複数の位置に複数の関心対象のＳＮＰが存在する状況では、例えば、所与の試料中に複数のＳＮＰが同時に存在することが検出される。単一ＳＮＰは検出されないはずである。二重対立遺伝子特異的プライマー設計方法の一例を図５に示す。これに関して、図２に例示するプライマー設計は、本発明の二重対立遺伝子特異的プライマー設計方法において正プライマーまたは逆プライマーのいずれかに適用することができる。
【００２３】
本発明はまた、関心対象の標的一塩基多型（ＳＮＰ）（関心対象の１番目のＳＮＰ）を含む核酸の配列を検出するための方法も企図し、前記方法は、ａ）ｉ）標的ＳＮＰを含むことが疑われる核酸の配列、ｉｉ）標的ＳＮＰを含む配列に相補的なプライマー、を提供する段階、ここで標的ＳＮＰに相補的なプライマーヌクレオチドから３塩基５’側に位置する塩基は、標的ＳＮＰ配列を含む核酸の対応する塩基に相補的ではない塩基であり、これによりプライマー中にミスマッチ塩基を作製する；ｂ）標的ＳＮＰを含むことが疑われる試料を、標的ＳＮＰへのプライマーの結合を許容する条件下でプライマーと接触させ、存在する場合は、結合した標的ＳＮＰを作製する段階；ならびにｃ）結合した標的ＳＮＰを検出する段階を含む。本発明はまた、核酸の試料がｍＲＮＡである場合、段階ｂ）は、ｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡを得ることまたはｍＲＮＡからｃＤＮＡを逆転写することをさらに含むことも企図する。
【００２４】
本発明はまた、核酸の配列が２以上のＳＮＰ（関心対象の２番目のＳＮＰ）を含む場合、関心対象の２番目のＳＮＰを検出するために別個のプライマーを使用することも企図する。
【００２５】
本発明はまた、関心対象の標的ＳＮＰを含む核酸の配列が１以上の非標的変異を含む場合、プライマーは前記１以上の非標的変異に相補的なヌクレオチドを含むことも企図する。
【００２６】
本発明はまた、関心対象の標的ＳＮＰ（関心対象の１番目のＳＮＰ）を含む核酸の配列が、同じ配列位置に１以上の付加的な関心対象の標的ＳＮＰを含む場合、本発明の方法は、各々の付加的な１以上の関心対象のＳＮＰに相補的な塩基を含有するプライマーを付加的に含むことも企図する。
【００２７】
本発明はまた、関心対象の標的ＳＮＰ（関心対象の１番目のＳＮＰ）を含む核酸の配列が、関心対象の１番目のＳＮＰの配列位置とは異なる１つまたは複数の配列位置に１以上の付加的な関心対象の標的ＳＮＰを含む場合、プライマーは、１以上の付加的な関心対象のＳＮＰに相補的な１つまたは複数の塩基を付加的に含むことも企図する。
【００２８】
本発明はまた、１以上の関心対象の標的一塩基多型（ＳＮＰ）を含む核酸の配列を検出するための方法も企図し、ここでＳＮＰは核酸の配列上の１以上の位置に存在し、前記方法は、ａ）ｉ）１以上のＳＮＰを含む１番目の配列が第一配列であり、および最も５’側のＳＮＰが第一標的ＳＮＰであり、少なくとも１つのＳＮＰが第一配列の１以上のＳＮＰとは異なる１以上のＳＮＰを含む２番目の配列が第二配列であり、および最も５’側のＳＮＰが第一標的ＳＮＰである、等々のように、１以上の標的ＳＮＰを含むことが疑われる核酸の配列、ｉｉ）１以上の標的ＳＮＰを含む各々の配列に相補的なプライマーを提供する段階、ここで各々のプライマーについて、第一標的ＳＮＰに相補的なプライマーヌクレオチドから３塩基５’側に位置する塩基は、標的ＳＮＰ配列を含む核酸の対応する塩基に相補的ではない塩基であり、これによりプライマー中に１番目のミスマッチ塩基を作製する；ｂ）１以上の標的ＳＮＰを含む配列を含むことが疑われる試料を、１以上の標的ＳＮＰへの１つまたは複数のプライマーの結合を許容する条件下で１つまたは複数のプライマーと接触させ、存在する場合は、結合した標的ＳＮＰを作製する段階；ならびにｃ）結合した標的ＳＮＰを検出する段階を含む。本発明はまた、核酸の試料がｍＲＮＡである場合、段階ｂ）は、ｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡを得ることまたはｍＲＮＡからｃＤＮＡを逆転写することをさらに含むことも企図する。
【００２９】
本発明はまた、ヌクレオチド配列中の複数の標的ＳＮＰの検出のために正プライマーと逆プライマーの両方を作製する、二重対立遺伝子特異的プライマー方法（図５参照）も企図する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１−１】プライマーの設計を例示し、Ｖ６００コドンに下線を付している。
【図１−２】プライマーの設計を例示し、Ｖ６００コドンに下線を付している。
【図２−１】本発明の複数のプライマーの設計方法を示す。
【図２−２】本発明の複数のプライマーの設計方法を示す。
【図２−３】本発明の複数のプライマーの設計方法を示す。
【図２−４】本発明の複数のプライマーの設計方法を示す。
【図２−５】本発明の複数のプライマーの設計方法を示す。
【図２−６】本発明の複数のプライマーの設計方法を示す。
【図３】モデル標的としてＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅを用いたアミノ酸特異的プライマーについての設計原理を説明する概略図を示す。
【図４】モデル標的としてのＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅについてのアミノ酸特異的プライマー設計を示す。
【図５】本発明の二重対立遺伝子特異的プライマー設計方法を示す。
【図６Ａ】ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ検出のための２つの異なるプライマー設計の比較を示す。各プライマー設計におけるミスマッチ塩基の数も示す。
【図６Ｂ】ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ検出のための２つの異なるプライマー設計の比較を示す。各プライマー設計におけるミスマッチ塩基の数も示す。
【図７Ａ】ＣＴとして提示したＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ検出のための２つの異なるプライマー設計の比較を示す。
【図７Ｂ】ＰＣＲ曲線として提示したＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ検出のための２つの異なるプライマー設計の比較を示す。
【図８】Ｖ６００ＥまたはＶ６００Ｋのいずれかに特異的なプライマーを用いたＳＮＰ検出の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本開示は、少なくとも一部には、一塩基多型または多塩基多型（ＳＮＰ）のリアルタイム増幅および検出のためのオリゴヌクレオチドプライマーおよび検出可能オリゴヌクレオチドに基づく。ＢＲＡＦのアミノ酸位置６００におけるＳＮＰの検出は一例である。このＳＮＰは、例えば、グルタミン酸（本明細書ではＶ６００Ｅと称される。）、リシン（本明細書ではＶ６００Ｋと称される。）、アスパラギン酸（Ｖ６００Ｄ）、アルギニン（Ｖ６００Ｒ）またはアスパラギン（Ｖ６００Ｎ）によるバリンの置換をもたらし得る。アミノ酸位置６００のバリンのグルタミン酸、リシンおよび／またはアスパラギン酸への変異はすべてのＢＲＡＦ変異の９０％以上を占めるので、本明細書で提供されるプライマーおよび検出可能オリゴヌクレオチドは、数ある中でも特に、癌の予後判定およびＭＡＰＫ経路を標的とする薬剤の治療効果の評価を可能にする。
【００３２】
ＳＮＰを検出するために対立遺伝子特異的増幅とポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）クランピングを組み合わせる。この組合せは、卓越した特異性で約０．５％以下の変異体含量の感度を可能にする。
【００３３】
以下の定義は本開示に関する：
（ａ）「約」は、指定される値から±１０％の変動を指す。このような変動は、具体的な言及が為されているか否かに関わらず、本明細書で提供される所与の値に常に包含されることが理解されるべきである。
【００３４】
（ｂ）本開示に関連して「対立遺伝子特異的プライマー」は、プライマーの３’末端、通常は３’ヌクレオチドが関心対象の部位、例えばＢＲＡＦのコドン６００における３番目のヌクレオチドであるヌクレオチド１８００と並列するように標的配列にハイブリダイズし、およびＳＮＰのコドンの野生型対立遺伝子または変異対立遺伝子のいずれかに正確に相補的であるプライマー（「プライマー」参照）を指す。対立遺伝子特異的プライマーの使用は、核酸、例えばＤＮＡ増幅の間の伸長産物の区別的形成に基づき対立遺伝子間を識別することを可能にする。
【００３５】
（ｃ）「検出可能オリゴヌクレオチド」は、適切な条件下で標的核酸に選択的にハイブリダイズし、検出され得るオリゴヌクレオチドを指す。
【００３６】
（ｄ）「高親和性核酸類似体」は、同じ塩基配列を有する非修飾核酸よりも高い親和性で、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）などの相補的核酸にハイブリダイズする修飾核酸を指す。高親和性核酸には、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、ホスホルアミデート等が含まれるが、これらに限定されない。
【００３７】
（ｅ）「ハイブリダイゼーション」は、２つの一本鎖核酸の間の相補的塩基対合による二重鎖構造の形成を指す。ハイブリダイゼーションは、正確に相補的な核酸鎖の間でまたは低い数のミスマッチを含む相補的核酸鎖の間で起こり得る。
【００３８】
（ｆ）「ロックド核酸（ＬＮＡ）」は、リボース環に余分な２Ｈ−Ｏ，４Ｈ−Ｃ−メチレン架橋が付加されている立体配座的に拘束されたヌクレオチド類似体である１以上のモノマーの存在を特徴とする核酸類似体（プリンおよび／またはピリミジン塩基のポリマー）を指す。ＬＮＡは、１以上の２Ｈ−Ｏ，４Ｈ−Ｃ−メチレン−（Ｄ−リボフラノシル）ヌクレオチドモノマーを有するオリゴヌクレオチドと定義されてきた。ＬＮＡはエキソヌクレアーゼおよび熱に耐性である。
【００３９】
（ｇ）「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、長さに関わりなく、プライマー、検出可能オリゴヌクレオチドおよびオリゴマーを指し、ポリデオキシリボヌクレオチド、ポリリボヌクレオチドおよび修飾／非修飾プリン／ピリミジン塩基の任意の他のＮ−グリコシドを包含する。例としては、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）および二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が含まれる。このような分子は、ホスホジエステル結合またはホスホトリエステル、ホスホルアミデート、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチルエステル、アセトアミデート、カルバメート、チオエーテル、架橋ホスホルアミデート、架橋メチレンホスホネート、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオエート、架橋ホスホロチオエートもしくはスルホン架橋およびこれらの組合せが含まれるが、これらに限定されない修飾された結合を含むことができる。このような分子は、アデニン、グアニン、チミン、シトシンおよび／またはウラシル、ならびに他の修飾塩基、非標準塩基または誘導体化塩基を含み得る。またはもしくは加えて、このような分子は１以上の修飾糖部分を含み得る。
【００４０】
（ｈ）「ペプチド核酸（ＰＮＡ）」は、通常のホスホジエステル骨格がＮ−（２−アミノエチル）グリシン鎖で置換された合成ＤＮＡ類似体を指す。このヌクレオ塩基は、同じＡ−Ｔ（Ｕ）およびＧ−Ｃ方式でＤＮＡまたはＲＮＡに結合する（Ｎｉｅｌｓｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１４９７−１５００（１９９１）；Ｈａｎｖｅｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５８：１４８１−１４８５（１９９２）；およびＥｇｈｏｌｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６５：５６６−５６８（１９９３））。人工骨格はＰＮＡをヌクレアーゼ耐性にする。ＰＮＡは当分野で公知の方法に従って合成することができる（例えばＨｙｒｕｐ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４：５−２３（１９９６）；国際公開第９２／２０７０２号および同第９２／２０７０３号；ならびに米国特許第５，５３９，０８２号明細書参照、これらすべての内容は、これらの教示に関して参照により本明細書に組み込まれる。）。２つの重要な特徴により、ＰＮＡは特異的対立遺伝子についての優れたＰＣＲクランプとなる。ＰＮＡは重合のためのプライマーとして機能することはできない。Ｔａｑポリメラーゼによるエキソヌクレアーゼ活性の基質として働くこともできない。加えて、完全にマッチするＰＮＡ−ＤＮＡ二重鎖の融解温度は同じ長さのＤＮＡ−ＤＮＡ二重鎖の融解温度より高い；従って、ＰＮＡ−ＤＮＡ二重鎖はより安定である。ＰＮＡ−ＤＮＡハイブリッドにおける単一のミスマッチは、融解温度の約１０から１８℃の低下を生じさせる（Ｋｙｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６０：１４２−１４８（１９９８））。このため、適切な温度範囲にわたってＰＮＡは、ミスマッチ塩基との鋳型上の反応を妨げることなく、完全にマッチする鋳型上のプライマー／検出可能オリゴヌクレオチドのアニーリングまたは鎖伸長を特異的にブロックすることができ（Ｓｕｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１８６−１８９（２００２）；Ｔｈｉｅｄｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：９８３−９８４（１９９６）；およびＴａｂａｃｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  １１１：４０９−４１４（２００４））、これはＰＮＡを介したＰＣＲクランピングと称される（Ｏｒｕｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１：５３３２−５３３６（１９９３））。完全にマッチするハイブリッドとミスマッチハイブリッドの間での融解温度の大きな差により、ＰＮＡは点突然変異の良好なセンサーである（例えばＫａｒａｄａｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３２：ｅ６３（２００４）；Ｔａｂａｃｋ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）前出；Ｈａｎｃｏｃｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４８：２１５５−２１６３（２００２）；Ｔａｋｉｙａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６８：３６０−３６８（２００４）；Ｋｉｒｉｓｈｉｍａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．３７：２５９−２６５（２００２）；およびＯｈｉｓｈｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．７２：５５８−５６５（２００４）参照）。米国特許出願公開第２００４���００１４１０５号明細書は、低い存在率で試料中に存在するポリヌクレオチドの選択的富化のための方法を開示する。この方法は、酵素的に伸長不能なヌクレオ塩基オリゴマー（例えばＰＮＡ）をＰＣＲクランプとして使用して、高い存在率で試料中に存在するポリヌクレオチドへのポリメラーゼ活性を選択的にブロックし、これにより試料中のより存在率の低い種の富化を生じさせる。「ＰＮＡ」はＰＮＡクランプを包含し得る。クランピングは、共通の標的部位についてのＰＮＡとＤＮＡプライマーまたはプローブとの間の物理的競合によって作用し、これによりプライマー伸長を妨げる。
【００４１】
（ｉ）「ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）」は、ＤＮＡ塩基配列のコピーを作製する方法である。この方法は熱サイクリング（即ち、それぞれＤＮＡの変性（または融解）と複製のための加熱と冷却のサイクル）を利用する。コピーしようとするＤＮＡ配列に相補的な配列を含む短いＤＮＡ断片であるプライマー、および熱に安定なＤＮＡポリメラーゼ、例えばＴａｑポリメラーゼと称されるサーマス・アクアチカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）からのものを使用して、ＤＮＡ配列を選択し、これをコピーする（例えば米国特許第４，６８３，１９５号明細書；同第４，８００，１９５号明細書および同第４，９６５，１８８号明細書参照、これらすべては、これらの教示に関して参照により本明細書に組み込まれる。）。反復サイクリングを用いて、作製されたコピーをさらなるコピーを生成するための鋳型として使用する（即ち連鎖反応）。ＰＣＲ技術には、標準ＰＣＲ、対立遺伝子特異的ＰＣＲ、アセンブリＰＣＲ、非対称ＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、ホットスタートＰＣＲ、配列間特異的ＰＣＲ、逆ＰＣＲ、ライゲーション媒介性ＰＣＲ、メチル化特異的ＰＣＲ、ミニプライマーＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、オーバーラップ伸長ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、逆転写ＰＣＲ、固相ＰＣＲ、熱非対称インターレースＰＣＲおよびタッチダウンＰＣＲが含まれるが、これらに限定されない。
【００４２】
（ｊ）本明細書で使用される「プライマー」は、鋳型依存性核酸合成を開始するオリゴヌクレオチドを指す。核酸鋳型、ヌクレオシド三リン酸前駆体、ポリメラーゼおよび補因子の存在下に、温度およびｐＨの適切な条件下で、プライマーは、ポリメラーゼによるヌクレオチドの添加によって３’末端で伸長し、プライマー伸長産物を生成することができる。プライマーは、用いられる特定の条件および増幅の目的によって様々な長さであり得る。例えば、診断目的の増幅のためのプライマーは、典型的には約１５から約３５ヌクレオチド長である。プライマーは、所望の伸長産物の合成を開始させるために所望の鋳型に十分相補的でなければならない。言い換えると、プライマーは、ポリメラーゼによる合成の開始に使用するための適切に並置されたプライマーの３’ヒドロキシル部分を提供するのに十分な方法で所望の鋳型鎖とアニーリングすることができなければならない。プライマーが所望鋳型の正確な相補物である必要はない。例えば、非相補的ヌクレオチド配列が、さもなければ相補的なプライマーの５’末端に存在し得る。または、プライマー配列が、伸長産物の合成のための鋳型−プライマー複合体を提供するために所望鋳型鎖の配列と十分な相補性を有することを条件として、非相補的塩基がオリゴヌクレオチドプライマー中に散在し得る。
【００４３】
（ｋ）本明細書で使用される「特異的にハイブリダイズする」とは、プライマーまたは検出可能オリゴヌクレオチドなどの所与の核酸の、別の核酸に特異的に結合する能力を指す。
【００４４】
（ｌ）「ストリンジェントな」または「配列特異的」ハイブリダイゼーション条件は、正確に相補的な核酸鎖が選択的にハイブリダイズする条件を指す。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は当分野で周知である。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、種々の状況下で異なる。一般に、ストリンジェントな条件は、塩基対の５０％が解離するｐＨおよびイオン強度の定義された条件下で特定の配列についての熱融点（Ｔｍ）より約５℃低く選択される。
【００４５】
（ｍ）「実質的に相補的」とは、ミスマッチの小さな領域を除いて相補的である配列を指す。典型的には、約１５ヌクレオチド長の核酸中のミスマッチの総数は約３ヌクレオチド以下である。
【００４６】
（ｎ）「標的配列」および「標的領域」は、検出しようとする、または検出して分析しようとする核酸の領域を指し、関心対象の多型部位、即ち本開示に関してはＶ６００Ｄ、Ｖ６００Ｅ、Ｖ６００Ｋ、Ｖ６００ＮまたはＶ６００Ｒを含む。
【００４７】
（ｏ）「Ｖ６００Ｄ」は、バリンのアスパラギン酸による置換をもたらす、ＢＲＡＦのヌクレオチド位置１７９９から始まるＴＧ→ＡＴまたはＴＧ→ＡＣ変異を指す。
【００４８】
（ｐ）「Ｖ６００Ｅ」は、バリンのグルタミン酸による置換をもたらす、ＢＲＡＦのヌクレオチド位置１７９９から始まるＴ→ＡまたはＴＧ→ＡＡ変異を指す。Ｖ６００Ｅは、以前の命名システムの下ではＶ５９９Ｅ（ＢＲＡＦのヌクレオチド位置１７９６におけるＴ→Ａ変異）としても知られる（Ｋｕｍａｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．９：３３６２−３３６８（２００３））。
【００４９】
（ｑ）「Ｖ６００Ｋ」は、バリンのリシンによる置換をもたらす、ＢＲＡＦのヌクレオチド位置１７９８から始まるＧＴ→ＡＡまたはＧＴＧ→ＡＡＡ変異を指す。
【００５０】
（ｒ）「Ｖ６００Ｎ」は、バリンのアスパラギンによる置換をもたらす、ＢＲＡＦのヌクレオチド位置１７９８から始まるＧＴＧ→ＡＡＴまたはＧＴＧ→ＡＡＣ変異を指す。
【００５１】
（ｓ）「Ｖ６００Ｒ」は、バリンのアルギニンによる置換をもたらす、ＢＲＡＦのヌクレオチド位置１７９８から始まるＧＴ→ＡＧ、ＧＴ→ＣＧ、ＧＴＧ→ＡＧＡ、ＧＴＧ→ＣＧＴ、ＧＴＧ→ＣＧＣまたはＧＴＧ→ＣＧＡ変異を指す。
【００５２】
本明細書で使用される用語は特定の実施形態を説明することだけを目的とし、限定を意図するものではない。
【００５３】
検出の方法
被験者（例えばヒト被験者）からの核酸の試料中の、例えばＢＲＡＦ遺伝子のエクソン１５におけるアミノ酸位置６００のバリンをコードするコドンの少なくとも１つの変異（Ｘ）（Ｖ６００Ｘ）を検出する方法が提供される。この方法は、
（ａ）核酸の試料を用いて増幅反応を実施する段階、ここで増幅反応は、３’末端の最後の３個のヌクレオチドがＸをコードし、および３’末端から４番目のヌクレオチドがアデニン（Ａ）以外の塩基を含有するプライマーを含み、ここで、Ｘが存在する場合は、プライマーはＸにアニーリングし、
ここで、核酸の試料がｍＲＮＡである場合、段階（ａ）は、増幅反応を実施する前にｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡを得ることまたはｍＲＮＡからｃＤＮＡを逆転写することをさらに含み、
この後、Ｘが存在する場合は、増幅反応はＸを含有する増幅産物を生成する、
（ｂ）Ｘを含有する増幅産物を検出する段階
を含み、ならびに
ここで、Ｘが２以上のコドンによってコードされる場合、増幅反応は各々のコドンについてのプライマーを含む。プライマーに関して、本明細書では３’末端のヌクレオチド（ｎｔ）を以下のように参照する：
ｎｔ  −−  ｎｔ  −−  ｎｔ  −−  ｎｔ  ３’
位置：  ４番目      ３番目      ２番目      １番目
増幅反応は少なくとも１つのペプチド核酸（ＰＮＡ）クランプをさらに含むことができ、ここで少なくとも１つのＰＮＡクランプは野生型標的からの増幅をブロックし、およびここで、増幅反応が１以上の他のＰＮＡクランプを含む場合、ＰＮＡは、好ましくは、望ましくない標的に結合することによって検出可能オリゴヌクレオチドおよび／またはプライマーを捕捉し、プライマーが望ましくない標的から増幅するのを妨げる。Ｘを含有する増幅産物を検出する段階は、標識プライマーを検出することまたは増幅産物を検出可能オリゴヌクレオチドと接触させ、Ｘを含有する増幅産物への検出可能オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出することを含み得る。増幅反応は、内部対照プライマーをさらに含むことができ、この場合増幅反応は内部対照を含有する増幅産物も生成し、この場合段階（ｂ）は、内部対照を含有する増幅産物を検出することを含む。内部対照を含有する増幅産物を検出する段階は、標識プライマーを検出することまたは増幅産物を検出可能オリゴヌクレオチドと接触させ、内部対照を含有する増幅産物への検出可能オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出することを含み得る。Ｘは、Ｅ、Ｋ、Ｄ、ＲおよびＮから成る群より選択される少なくとも１個のアミノ酸である。例えば、Ｘは、Ｅ、ＫおよびＤから成る群より選択される少なくとも１個のアミノ酸であり得る。Ｘは、Ｅ、ＥおよびＫ、ＥおよびＤ、ＫおよびＤ、またはＥ、ＫおよびＤであり得る。Ｘはまた、野生型で認められるもの以外のコドン（即ちサイレント突然変異）または中途終止コドンによってコードされるＶを含む、Ｅ、Ｋ、Ｄ、ＲまたはＮ以外の別のアミノ酸であり得る。好ましくは、しかし、Ｘは、前記のようにＥ、Ｋ、Ｄ、ＲまたはＮの少なくとも１つである。
【００５４】
この方法が２以上のＸを検出する段階を含む場合、この方法は、各々のＸについての核酸の試料を用いた増幅反応を一緒にまたは別々に実施することを含み得る。これに関して、この方法はまた、いずれのＸが核酸の試料中に存在するかを決定する段階もさらに含み得る。
【００５５】
増幅反応は、内部対照（ＩＣ）核酸およびＩＣ核酸を増幅するためのプライマー対を含むことができ、好ましくはこれらを含む。増幅反応がＩＣ核酸を含む場合、増幅を促進する条件は、ＩＣ核酸の増幅も促進する。
【００５６】
従って、プライマーの選択が本開示に従った少なくとも１つの突然変異の検出を可能にする。これは、検出可能オリゴヌクレオチドの選択が突然変異の検出を可能にする先行技術の方法とは明らかに異なる。本発明の方法はまた、アミノ酸レベルでの突然変異にも特異的である（即ちプライマーを、特定のアミノ酸をコードするすべてのコドンを増幅するが、他のアミノ酸をコードするコドンは増幅しないように選択する。）。これは、核酸に特異的であり、コドンの１番目と２番目の位置のヌクレオチドが同じであるコドンによってコードされる複数のアミノ酸を検出する、先行技術の方法とは明らかに異なる。さらに、本発明の方法はＤＮＡまたはＲＮＡに関して実施することができ、本質的に定量的であり、同じ遺伝子中の他の位置のＳＮＰならびに他の遺伝子中のＳＮＰの検出に適合させることができる。
【００５７】
組織または体液の任意の適切な試料を核酸、即ちＤＮＡまたはＲＮＡの試料の供給源として使用することができる。典型的には、供給源は腫瘍または転移部位からの細胞／組織または血液（もしくはこれらの成分）である。例えば血液、血漿、血清、リンパおよび腫瘍生検を使用することができる。他の試料には、尿、脳脊髄液、胸膜液、痰、腹腔液、膀胱洗浄液、分泌物（例えば乳房）、口腔洗浄液、タッチ標本および微細針吸引物が含まれる。血漿または全血は、例えばキレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）またはこの塩、例えば二ナトリウム塩もしくはカルシウム二ナトリウム塩の添加などによって保存することができる。望ましくないタンパク質を消化するためにプロテイナーゼＫなどのプロテイナーゼを試料に添加することができる。
【００５８】
組織試料は、一般にホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）ブロックとして保存することができる。５μｍなどの様々な厚さの組織切片を、標準的な手段によってこのような組織ブロックから切り出し、スライドガラスなどの固体支持体に取り付けるかまたはそのまま取り付けずにおく。組織試料の細胞形態を様々な固定液および／または染色液を用いて明らかにし、顕微鏡で視覚化する。組織試料中の細胞、例えば癌細胞、例えば黒色腫細胞の密度が十分である（約１％を上回る）場合は、切片をスライドガラスからこそげ取り、さらに精製することなくＤＮＡを全組織試料から直接抽出することができる。または、組織試料中の細胞、例えば癌細胞、例えば黒色腫細胞の密度が低い（約１％未満）場合は、組織試料を黒色腫細胞に関して富化する付加的な手順を実施することができる。ＤＮＡはまた、新鮮／凍結組織、微細針吸引物または末梢血から単離することもできる。
【００５９】
試料は、当分野で公知のように任意の適切な方法を用いてアッセイ用に調製し得る。望ましくは、この方法は核酸を抽出し、濃縮する。この方法はまた、望ましくは標的配列を増幅のためにアクセス可能にし、増幅の潜在的な阻害剤を抽出物から除去する。
【００６０】
ＤＮＡは、例えばＱｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）からのＤＮｅａｓｙ  ＤＮＡ単離キット、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ血液キットもしくはＰＡＸｇｅｎｅ血液ＤＮＡキットを用いて、または当業者に公知の他の方法を用いて末梢血から単離することができる。他の組織試料からのＤＮＡも、ＤＮｅａｓｙ  ＤＮＡ単離キットを用いて得ることができる。任意の他のＤＮＡ抽出および精製技術も使用でき、例えばフェノール−クロロホルム抽出から自動磁気ビーズ核酸捕捉システムに及ぶ液−液抽出および固相技術が含まれる。ＲＮＡを単離して逆転写し、生じたｃＤＮＡを増幅することができる（例えば米国特許第５，３１０，６５２号明細書；同第５，３２２，７７０号明細書；同第５，５６１，０５８号明細書；同第５，６４１，８６４号明細書；および同第５，６９３，５１７号明細書に記載されている逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ））。
【００６１】
核酸が得られれば、これを、試料中に変異配列が存在する場合は変異配列の特異的増幅を生じさせるプライマーと接触させることができる。「特異的増幅」は、プライマーが特定の変異配列を増幅し、他の変異配列または野生型配列は増幅しないことを意味する。例えばＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｅｒｌｉｃｈ，Ｅｄｉｔｏｒ，Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９２））；ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｉｔｏｒｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０））；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ，１９９４−１９９９，２００４年４月までの補足更新を含む。）；およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ，３ｒｄ  ｅｄ．，２００１）参照。対立遺伝子特異的増幅に基づく方法または伸長に基づく方法は、国際公開第９３／２２４５６号ならびに米国特許第４，８５１，３３１号明細書；同第５，１３７，８０６号明細書；同第５，５９５，８９０号明細書；および同第５，６３９，６１１号明細書に記載されており、これらすべては、これらの教示に関して参照により本明細書に明確に組み込まれる。リガーゼ連鎖反応、鎖置換アッセイおよび様々な転写に基づく増幅方法などの方法が使用できるが（例えばＡｂｒａｍｓｏｎ  ａｎｄ  Ｍｙｅｒｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４：４１−４７（１９９３）による総説参照）、ＰＣＲ、特にＰＮＡクランプなどのクランプを用いるＰＣＲが好ましい。
【００６２】
複数の変異対立遺伝子または野生型と変異対立遺伝子の様々な組合せなどの、複数の対立遺伝子特異的プライマーを単一増幅反応において同時に用いることができる。増幅産物は、異なる標識または大きさ（例えばゲル電気泳動を用いて）によって区別することができる。
【００６３】
プライマーを、例えば分光、光化学的、生化学的、免疫化学的または化学的手段によって検出できる標識で検出可能に標識化することができる（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．参照）。有用な標識には、蛍光染料などの染料、３２Ｐなどの放射性標識、高電子密度試薬、ペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼなどの酵素、ビオチン、または抗血清もしくはモノクローナル抗体が使用可能なハプテンおよびタンパク質が含まれる。
【００６４】
検出可能オリゴヌクレオチドも、フルオレセインなどで同様に標識することができる。これに関して、プライマーを染料で標識し、および検出可能オリゴヌクレオチドをフルオレセインで標識して、染料と反対側の新生鎖に結合するように設計した場合、ＤＮＡヘリックスを横切る蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）が起こり得る。他の検出可能オリゴヌクレオチドには、分子プローブ、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブ、一本鎖ＤＮＡプローブ、二本鎖ＤＮＡプローブ等が含まれる。
【００６５】
任意の適切な配列をＩＣとして使用することができる。ＩＣ標的配列の例には、本明細書の「実施例」で使用されるものが含まれる。
【００６６】
核酸増幅試薬には、ポリメラーゼ活性を有する酵素（例えばＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（登録商標））、１以上の酵素補因子（例えばＭｇＣｌ２）、ならびにデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ；例えばｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ）が含まれる。
【００６７】
増幅を促進する条件は、プライマーのアニーリングおよび核酸配列の伸長を促進する条件である。アニーリングは様々なパラメータ、例えば温度、イオン強度、増幅される配列の長さ、相補性、および増幅される配列のＧ：Ｃ含量などに依存する。例えば温度を低下させることは相補的核酸配列のアニーリングを促進する。高いＧ：Ｃ含量およびより長い長さは二重鎖形成を安定化する。一般に、約３０ｂｐ以下であって、高いＧ：Ｃ含量を有するプライマーおよび検出可能オリゴヌクレオチドは良好に機能する。好ましい増幅条件、プライマーおよび検出可能オリゴヌクレオチドを本明細書で例示する。
【００６８】
増幅は、反応混合物を約１０回から約１００回、例えば約２０回から約７５回、例えば約２５回から約５０回熱サイクリングすることにより、任意の適切な回数反復することができる。
【００６９】
増幅反応が完了すれば、任意の適切な方法を用いて増幅産物の存在を検出することができる。このような方法には、限定されることなく、当分野で公知の方法、例えば蛍光染料を用いるまたは用いない（産物を染料標識プライマーで増幅したかどうかに依存する。）ゲル電気泳動、インターカレート染料での融解プロフィール（例えばＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｅｒｌｉｃｈ，Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２，Ｃｈａｐｔｅｒ  ７参照）、および内部検出可能オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションが含まれる。方法の他の例には、固相酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、電気化学発光法、逆ドットプロット法、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）（例えばＬａｚａｒ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．４：Ｓ１−Ｓ１４（１９９４））が含まれ、一本鎖ＰＣＲ産物の一本鎖立体配座多型解析も使用できる（例えばＯｒｉｔａ，ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８６：２７６６−２７７０（１９８９）参照）。
【００７０】
増幅された核酸は、反応混合物中の二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の総量の増加を観測することによって検出できる（例えば米国特許第５，９９４，０５６号明細書ならびにＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｐａｔ．Ｐｕｂ．Ｎｏ．４８７，２１８および５１２，３３４参照）。ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎなどのＤＮＡ結合染料を使用する。ｄｓＤＮＡに結合した場合染料は蛍光を発し、蛍光の増大を用いてｄｓＤＮＡの増加を測定する。
【００７１】
ジデオキシ配列決定法およびオリゴヌクレオチド長の産物のＰｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（商標）も増幅核酸を検出するために使用できる。別の配列決定法がＫｏｂａｙａｓｈｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ９：１７５−１８２（１９９５））によって記述されている。
【００７２】
ＰＣＲを実施する場合、本明細書の「実施例」に例示されているような条件が使用できる。標準的なＰＣＲを用いる場合は、増幅が完了した後、例えば増幅の間に標識プライマーを使用した後は、増幅後に標識プライマーを検出可能オリゴヌクレオチドとして使用することによって、またはプライマーとは配列が異なる、増幅後に増幅された標的配列にハイブリダイズする検出可能オリゴヌクレオチドを使用することによって、検出を行うことができる。次に標識増幅産物を分離し、他の手段によって検出することができる。
【００７３】
または、増幅と検出をリアルタイムＰＣＲアッセイにおいて組み合わせることができる。リアルタイムＰＣＲを用いる場合、混合物は、核酸検出試薬、例えば任意の二本鎖ＤＮＡとインターカレートする非特異的蛍光染料、または検出可能オリゴヌクレオチドがこの相補的ＤＮＡ標的とハイブリダイズした後でのみ検出を可能にする配列特異的ＤＮＡ検出可能オリゴヌクレオチドをさらに含むことができ、これにより同時増幅と検出を可能にする。検出可能オリゴヌクレオチドが増幅の間に混合物中に存在する場合、検出可能オリゴヌクレオチドは、増幅を促進する条件下で安定であるべきであり、増幅を妨げてはならず、増幅条件下でこの標的配列に結合すべきであり、およびこの標的配列に結合した後でのみシグナルを発するべきである。これに関して特に適する検出可能オリゴヌクレオチドの例には、分子ビーコン検出可能オリゴヌクレオチド、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）検出可能オリゴヌクレオチド、およびＡｂｒａｖａｙａ，ｅｔ  ａｌ．（米国特許出願公開第２００５／０２２７２５７号明細書）によって記述されているような線状検出可能オリゴヌクレオチドが含まれる。検出可能オリゴヌクレオチドは、単独でまたはステム領域の一部とさらに組み合わせて、分子ビーコンのループ領域を形成することができる。検出可能オリゴヌクレオチドはまた、一方の末端に発蛍光団（例えばＦＡＭ）を有し、他方の末端にＢｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（ＢＨＱ（登録商標）；ＢｉｏＳｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）などの高効率消光剤を有する線状検出可能オリゴヌクレオチドとしても使用できる。
【００７４】
増幅産物の検出は、例えば特定の１つまたは複数の変異ＢＲＡＦ遺伝子（２以上の変異ＢＲＡＦ遺伝子が同時に検出されるか否かに依存する。）を含む細胞が試料中に存在したことを示すが、増幅産物が検出されないことは、特定の変異ＢＲＡＦ遺伝子を含む細胞が試料中に存在しなかったこと、例えば癌が存在するが転移していない場合を示す。これに関して、２以上の特定の変異ＢＲＡＦ遺伝子を同時に（または１以上の特定の変異ＢＲＡＦ遺伝子と野生型ＢＲＡＦ）を増幅する場合は、各々の特定の変異ＢＲＡＦについてのプライマーを異なる検出可能標識で標識することができ、これにより２以上の特定の変異ＢＲＡＦ遺伝子（または１以上の特定の変異ＢＲＡＦ遺伝子と野生型ＢＲＡＦ遺伝子）の検出を区別することが可能になる。変異体と野生型産物の相対的レベルは、特定の変異ＢＲＡＦ遺伝子を含む試料中の細胞の割合を示すことができる。変異ＢＲＡＦ配列を含む細胞の割合が低いことは転移のレベルが低いことを示し、変異配列を含む細胞の割合が高いことは転移のレベルが高いことを示し得る。
【００７５】
所望する場合、この方法は初期ユニバーサル増幅段階をさらに含み得る。例えば、１以上の変異ＢＲＡＦ遺伝子の特異的増幅の前に、単独でまたは野生型ＢＲＡＦもしくは内部対照配列とさらに組み合わせて、試料を縮重プライマーと接触させ、増幅することができる。
【００７６】
好ましくは、この方法はＰＮＡクランプを用いる（例えばＤｅｍｅｒｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：３０６０−３０６５（１９９５））。ＰＮＡクランプは、好ましくは野生型ＢＲＡＦまたは増幅しようとする特定の変異ＢＲＡＦ遺伝子に比べて最も高頻度な変異ＢＲＡＦ遺伝子の増幅を阻害するまたは妨げる。
【００７７】
所望する場合は、核酸試料または検出可能オリゴヌクレオチドを固体支持体上に固定化することができる。固体支持体を利用するアッセイ形式の例には、ドットブロット形式および逆ドットブロット形式が含まれる（例えば米国特許第５，３１０，８９３号明細書；同第５，４５１，５１２号明細書；同第５，４６８，６１３号明細書；および同第５，６０４，０９９号明細書参照、これらすべては、これらの教示に関して参照により本明細書に明確に組み込まれる。）。
【００７８】
増幅後、特異的増幅が起こったかどうかを判定するため、増幅産物を鋳型および過剰のプライマーから分離することが望ましいと考えられる。分離は、標準的な方法を用いてアガロース、アガロース−アクリルアミドまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動によって実施することができる（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）参照）。または、クロマトグラフィを用いて分離を行うことができる。クロマトグラフィの種類の例には、吸着、分配、イオン交換および分子ふるいクロマトグラフィが含まれ、クロマトグラフィ技術の種類の例には、カラム、ペーパー、薄層およびガスクロマトグラフィが含まれる（例えばＦｒｅｉｆｅｌｄｅｒ，Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｔｏ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｗｍ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９８２）参照）。
【００７９】
増幅は可視化によって確認される。例えば、臭化エチジウムで染色したゲルを紫外線で可視化することができる。放射性同位体で標識した増幅産物は、ｘ線フィルムに露光し、現像することによって可視化でき、蛍光標識で標識した増幅産物は、増幅産物を刺激スペクトルに供することによって可視化できる。増幅の可視化の好ましい方法は、増幅産物にハイブリダイズする標識検出可能オリゴヌクレオチドの使用である。Ｑｉａｇｅｎから入手可能なもののような、手動カラムも使用できる。
【００８０】
自動試料調製システム、例えば核酸の精製のために磁気微粒子工程を用いるように設計された自動試料調製システムの使用が好ましいと考えられる。自動試料調製システムの一例は、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬから入手可能なｍ２０００ｓｐである。または、ｍ２４ｓｐ自動試料調製システム（Ａｂｂｏｔｔ）を用いて試料を調製するか、もしくは手作業で調製することができる。自動試料調製はより一貫しているので、手作業での調製より好ましい。試料調製キットの別の例は、Ｑｉａｇｅｎから入手可能なＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  ＦＦＰＥ組織キットである。
【００８１】
Ａｂｂｏｔｔ  ｍＳａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ＳｙｓｔｅｍＤＮＡ（４×２４プレップ；Ａｂｂｏｔｔ）試薬は、核酸を捕捉し、非結合試料成分を除去する。プロテイナーゼＫが、試料に結合したタンパク質を消化する溶解段階に含められる。結合核酸を溶出し、９６ウェルディーププレートに移す。これで核酸はいつでも増幅できる状態にある。工程が各試料について正しく進行したことを明らかにするための内部対照（ＩＣ）として役立つ、無関係なＤＮＡ配列を試料調製手順に導入し、キャリブレータ、対照および標本と共に処理する。
【００８２】
増幅／検出は当分野で公知のように、例えばｍ２０００ｒｔ装置（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｃ．，Ｄｅｓ  Ｐｌａｉｎｅｓ，ＩＬ）の使用によって実施することができる。標的核酸（例えばＤＮＡ、ＲＮＡまたは両方）を、デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）および活性化剤、例えばマグネシウムまたはマンガンの存在下でＤＮＡポリメラーゼ逆転写酵素によって増幅する。増幅試薬は、特定の変異体（例えば変異ＢＲＡＦ）および、好ましくはＩＣについての増幅プライマーの特定のセットを含む。ＰＣＲ増幅の間、二本鎖ＤＮＡの鎖を分離するために高温を用いる。反応物をＤＮＡアニーリングが起こり得る温度に冷却した場合、分析物特異的な一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマーが分析物ＤＮＡに結合する。プライマーはＤＮＡポリメラーゼによって伸長され、これにより分析物ＤＮＡの短い標的ストレッチの正確なコピーを作製する。ＤＮＡポリメラーゼは、これを不活性にする分子によって活性部位で修飾された好熱性酵素であり得るが、そうである必要はない。ＰＣＲの開始前に酵素を加熱する場合、阻害性分子は酵素から切断され、これにより酵素が活性を回復することが可能になる。このように、酵素は特定のＤＮＡ−ＤＮＡ相互作用が起こる温度でのみ活性である。これは、プライマーダイマーなどの非特異的ＰＣＲアーティファクトを大きく低減する。各回の熱サイクリングの間に、増幅産物は高温で一本鎖に解離し、温度が低下すると共にプライマーのアニーリングおよび伸長が可能になる。高温と低温の反復サイクリングを通して標的の指数的増幅が達成される。特定の変異体（例えば変異ＢＲＡＦ）および、存在する場合は、ＩＣ標的の増幅は、同じ反応において同時に起こる。
【００８３】
この方法は、例えばＢＲＡＦ阻害剤、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体、ＭＥＫ阻害剤等による治療選択肢を評価する目的でＢＲＡＦ変異状態を測定するために使用できる。例えば、Ｚｅｌｂｏｒａｆ（商標）（ベムラフェニブ；Ｒｏｃｈｅ）は、報告によればＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ変異陽性の転移性黒色腫を有する人々において生存率を改善することが示された。
【００８４】
この方法はまた、黒色腫などの癌を有すると診断された患者についての転帰を予測するため、例えば黒色腫などの疾患の初期段階（Ｉ／ＩＩ期）を有する患者において転移の危険度を評価するため、および転移性黒色腫などの進行した転移性癌（ＩＩＩ／ＩＶ期）を有する患者を観測するためにも使用できる。癌の転移拡大はしばしば血行性に起こるので、この方法は、末梢血を検定して再発を評価するためにも使用できる。他の癌には、甲状腺癌（例えば甲状腺乳頭癌（ＰＴＣ））、卵巣癌、直腸結腸癌、胃癌、膵癌、バレット腺癌、胸膜中皮腫、非ホジキンリンパ腫、急性白血病、頭頸部の扁平上皮癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌（例えば低悪性度漿液性癌）、肝細胞癌、肉腫、下垂体癌、大腸癌、胆道癌、眼の癌、中枢神経系の癌、造血組織の癌、リンパ組織の癌、横紋筋肉腫、肉腫、神経膠腫、胆管癌および肺腺癌が含まれるが、これらに限定されない。
【００８５】
上記を考慮して、ＤＮＡの試料中の遺伝子におけるコドンの少なくとも１つの変異（Ｘ）を検出する方法も提供される。この方法は、
（ａ）ＤＮＡの試料を用いて増幅反応を実施する段階、ここで増幅反応は、３’末端の最後の３個のヌクレオチドがＸをコードし、および３’末端から４番目のヌクレオチドがアデニン（Ａ）以外の塩基を含有するプライマーを含み、ここで、Ｘが存在する場合は、プライマーはＸにアニーリングし、
この後、Ｘが存在する場合は、増幅反応はＸを含有する増幅産物を生成する、
（ｂ）Ｘを含有する増幅産物を検出する段階
を含み、ならびに
ここで、Ｘが２以上のコドンによってコードされる場合、増幅反応は各々のコドンについてのプライマーを含む。増幅反応は、（ｉｉｉ）少なくとも１つのペプチド核酸（ＰＮＡ）クランプをさらに含むことができ、ここで少なくとも１つのＰＮＡクランプは野生型標的からの増幅をブロックし、およびここで、増幅反応が１以上の他のＰＮＡクランプを含む場合、ＰＮＡは、好ましくは検出可能オリゴヌクレオチドおよび／またはプライマーを捕捉する。Ｘを含有する増幅産物を検出する段階は、標識プライマーを検出することまたは増幅産物を検出可能オリゴヌクレオチドと接触させ、Ｘを含有する増幅産物への検出可能オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出することを含み得る。増幅反応は、内部対照プライマーをさらに含むことができ、この場合、増幅反応は内部対照を含有する増幅産物も生成し、この場合、段階（ｂ）は、内部対照を含有する増幅産物を検出することを含む。内部対照を含有する増幅産物を検出する段階は、標識プライマーを検出することまたは増幅産物を検出可能オリゴヌクレオチドと接触させ、内部対照を含有する増幅産物への検出可能オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出することを含み得る。この方法が２以上のＸを検出する段階を含む場合、この方法は、各々のＸについてのＤＮＡの試料を用いた増幅反応を一緒にまたは別々に実施することを含み得る。これに関して、この方法はまた、ＤＮＡの試料中にいずれのＸが存在するかを決定する段階もさらに含み得る。
【００８６】
プライマー、検出可能オリゴヌクレオチドおよびプライマーを設計する方法
ヒト由来の核酸の試料中のＢＲＡＦ遺伝子のエクソン１５におけるＶ６００Ｘの増幅のためのプライマーのセットも提供される。プライマーのセットは、正プライマーなどのプライマーを含み、これらの各々はオリゴヌクレオチドであり、前記オリゴヌクレオチドは、約１５ヌクレオチドから約３５ヌクレオチド長であり、および３’末端にＸをコードするヌクレオチド配列を含む。Ｖ６００Ｅの増幅のためのプライマーを含むプライマーのセットは、３’末端にＧＡＡをコードする１つのプライマーおよび３’末端にＧＡＧをコードする別のプライマーを含む。Ｖ６００Ｋの増幅のためのプライマーのセットは、３’末端にＡＡＡをコードする１つのプライマーおよび３’末端にＡＡＧをコードする別のプライマーを含む。Ｖ６００Ｄの増幅のためのプライマーを含むプライマーのセットは、３’末端にＧＡＴをコードする１つのプライマーおよび３’末端にＧＡＣをコードする別のプライマーを含む。Ｖ６００Ｎの増幅のためのプライマーのセットは、３’末端にＡＡＴをコードする１つのプライマーおよび３’末端にＡＡＣを含む別のプライマーを含む。Ｖ６００Ｒの増幅のためのプライマーを含むプライマーのセットは、３’末端にＣＧＴをコードする１つのプライマー、３’末端にＣＧＣをコードするプライマー、３’末端にＣＧＡをコードするプライマー、３’末端にＣＧＧをコードするプライマー、３’末端にＡＧＡをコードするプライマーおよび３’末端にＡＧＧをコードするプライマーを含む。前記プライマーのすべてに関して、ヌクレオチド配列の残りの部分（即ち３’側終止コドンまでのヌクレオチド配列）は、プライマーとＶ６００Ｘをコードする正確に相補的な対立遺伝子配列との間で安定な二重鎖が選択的に形成するようなヌクレオチド配列であるべきである。言い換えると、Ｖ６００Ｅの増幅のためのプライマーはＶ６００Ｅを選択的に増幅するが、これ以外、例えばＶ６００、Ｖ６００Ｋ、Ｖ６００Ｄ、Ｖ６００ＮおよびＶ６００Ｒは増幅しない。Ｖ６００Ｋの増幅のためのプライマーはＶ６００Ｋを選択的に増幅するが、Ｖ６００Ｅ、Ｖ６００Ｄ、Ｖ６００ＮおよびＶ６００Ｒは増幅しない。Ｖ６００Ｄの増幅のためのプライマーはＶ６００Ｄを選択的に増幅するが、Ｖ６００Ｅ、Ｖ６００Ｋ、Ｖ６００ＮおよびＶ６００Ｒは増幅しない。Ｖ６００Ｎの増幅のためのプライマーはＶ６００Ｎを選択的に増幅するが、Ｖ６００Ｅ、Ｖ６００Ｋ、Ｖ６００ＤおよびＶ６００Ｒは増幅しない。好ましくは、ＥがＧＡＡによってコードされるＶ６００Ｅの増幅のためのプライマーは、ＥがＧＡＧによってコードされるＶ６００Ｅを選択的に増幅せず、および逆もまた同様であり、ＫがＡＡＡによってコードされるＶ６００Ｋの増幅のためのプライマーは、ＫがＡＡＧによってコードされるＶ６００Ｋを選択的に増幅せず、および逆もまた同様であり、ＤがＧＡＴによってコードされるＶ６００Ｄの増幅のためのプライマーは、ＤがＧＡＣによってコードされるＶ６００Ｄを選択的に増幅せず、および逆もまた同様であり、ＮがＡＡＴによってコードされるＶ６００Ｎの増幅のためのプライマーは、ＮがＡＡＣによってコードされるＶ６００Ｎを選択的に増幅せず、逆もまた同様である。同様に、ＲがＣＧＴによってコードされるＶ６００Ｒの増幅のためのプライマーは、ＲがＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡおよびＡＧＧによってコードされるＶ６００Ｒを選択的に増幅せず、ＲがＣＧＣによってコードされるＶ６００Ｒの増幅のためのプライマーは、ＲがＣＧＴ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡおよびＡＧＧによってコードされるＶ６００Ｒを選択的に増幅せず、ＲがＣＧＡによってコードされるＶ６００Ｒの増幅のためのプライマーは、ＲがＣＧＴ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＡＧＡおよびＡＧＧによってコードされるＶ６００Ｒを選択的に増幅せず、ＲがＣＧＧによってコードされるＶ６００Ｒの増幅のためのプライマーは、ＲがＣＧＴ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＡＧＡおよびＡＧＧによってコードされるＶ６００Ｒを選択的に増幅せず、ＲがＡＧＡによってコードされるＶ６００Ｒの増幅のためのプライマーは、ＲがＣＧＴ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧおよびＡＧＧによってコードされるＶ６００Ｒを選択的に増幅せず、ならびにＲがＡＧＧによってコードされるＶ６００Ｒの増幅のためのプライマーは、ＲがＣＧＴ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧおよびＡＧＡによってコードされるＶ６００Ｒを選択的に増幅しない。好ましくは、プライマーのセットは、
（ａ）３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＧＡＡ［配列番号：４４］を含むオリゴヌクレオチドおよび／または３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＧＡＧ［配列番号：４５］を含むオリゴヌクレオチド、
（ｂ）３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＡＡＡ［配列番号：４６］を含むオリゴヌクレオチドおよび／または３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＡＡＧ［配列番号：４７］を含むオリゴヌクレオチド、
（ｃ）３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＧＡＴ［配列番号：４８］を含むオリゴヌクレオチドおよび／または３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＧＡＣ［配列番号：４９］を含むオリゴヌクレオチド、
（ｄ）３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＡＡＴ［配列番号：５０］を含むオリゴヌクレオチドおよび／または３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＡＡＣ［配列番号：５１］を含むオリゴヌクレオチド、
（ｅ）３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＣＧＴ［配列番号：５２］を含むオリゴヌクレオチド、３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＣＧＣ［配列番号：５３］を含むオリゴヌクレオチド、３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＣＧＡ［配列番号：５４］を含むオリゴヌクレオチド、３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＣＧＧ［配列番号：５５］を含むオリゴヌクレオチド、３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮ  ＡＧＡ［配列番号：５６］を含むオリゴヌクレオチド、および３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＡＧＧ［配列番号：５７］を含むオリゴヌクレオチド、
（ｄ）および（ｅ）、
（ａ）および（ｂ）、
（ａ）および（ｃ）、
（ｂ）および（ｃ）、
（ａ）、（ｂ）および（ｃ）、
（ｄ）とのさらなる組合せで、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のいずれか、
（ｅ）とのさらなる組合せで、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のいずれか、ならびに
（ｄ）および（ｅ）とのさらなる組合せで、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のいずれか
から成る群より選択される少なくとも１つのプライマーを含み、
ここでＮは、アデニン（Ａ）以外の塩基を含むヌクレオチドであり、およびここでオリゴヌクレオチドは、約１５ヌクレオチドから約３５ヌクレオチドを含む。「（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のいずれか」とは、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ａ）および（ｂ）、（ａ）および（ｃ）、（ｂ）および（ｃ）、ならびに（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を意味する。オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド配列の５’末端のＧと隣接して、ヌクレオチド配列の３’末端のＴから始まるヌクレオチド配列５’  ＡＡＴＡＧＧＴＧＡＴＴＴＴ  ３’［配列番号：５８］の１以上の連続するヌクレオチドをさらに含み得る。プライマーのセットは、約１５ヌクレオチドから約３５ヌクレオチドを含む、逆プライマーなどのプライマーをさらに含むことができ、ここで、プライマーが１５から２７ヌクレオチドを含む場合、プライマーは配列番号：１０の１５から２７個の連続するヌクレオチドを含む。検出可能オリゴヌクレオチドは、約１５ヌクレオチドから約３５ヌクレオチドを含むことができ、ここで、検出可能オリゴヌクレオチドが１５から２０ヌクレオチドを含む場合、検出可能オリゴヌクレオチドは配列番号：１１の１５から２０個の連続するヌクレオチドを含む。
【００８７】
オリゴヌクレオチドは、任意の適切な方法、通常は市販の試薬と装置を用いる化学合成（例えば固相合成）によって調製することができる（例えばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、ＤｕＰｏｎｔ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）およびＭｉｌｌｉｇｅｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）参照）。または、オリゴヌクレオチドは商業的供給源を通して購入することができる。オリゴヌクレオチドを合成する方法は当分野で周知である（例えばＮａｒａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０−９９（１９７９）；Ｂｒｏｗｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９−１５１（１９７９）；Ｂｅａｕｃａｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２２：１８５９−１８６２（１９８１）；および米国特許第４，４５８，０６６号明細書参照）。
【００８８】
各々の変異アミノ酸の同定のための遺伝子コドンに基づき、複数の対立遺伝子特異的プライマーを使用する。１つのプライマーは、３’末端の関心対象の変異および３’末端から４番目のヌクレオチドの意図する変異をコードする各々の対応する遺伝子コドンのために設計する。対立遺伝子特異的正プライマーは、プライマーと鋳型の間の３’マッチに従って、ＴａｑポリメラーゼなどのＤＮＡポリメラーゼによる選択的ＰＣＲ増幅に基づきへ変異体特異的標的を増幅する。ｒＴｔｈなどの逆転写酵素−ＤＮＡポリメラーゼも本発明の方法に関連して使用することができる。これに関して、ＲＮＡポリメラーゼの混合、ＤＮＡポリメラーゼの混合物、またはＲＮＡポリメラーゼとＤＮＡポリメラーゼの混合物が使用できる。逆プライマーおよび検出可能オリゴヌクレオチドは、反応の間で共有されるコンセンサス配列に基づく。
【００８９】
従って、上記を考慮して、核酸の試料中の遺伝子におけるコドンの少なくとも１つの変異（Ｘ）を検出するためのプライマーを設計する方法も提供される。この方法は、３’末端の最後の３個のヌクレオチドがＸをコードし、および３’末端から４番目のヌクレオチドが、野生型遺伝子中に存在する塩基以外の塩基を含有するプライマーを合成することを含み、この後核酸の試料中の遺伝子におけるコドンの少なくとも１つの突然変異（Ｘ）を検出するためのプライマーを設計する。本明細書の教示に基づきプライマーを設計する方法は、２以上のＳＮＰの検出のため、および他の非標的変異体も含有する、標的ＳＮＰを有する遺伝子を検出するためのプライマーを設計することも含む。このようなプライマー設計のための方法を表１に示す。
【００９０】
ペプチド核酸（ＰＮＡ）を、これらのＤＮＡ対応物よりも大きな特異性と安定性で相補的核酸配列に結合するＰＣＲクランピング試薬として使用する（ＰＮＡに基づくＰＣＲクランピングの考察については、例えば米国特許出願公開第２０１０／０００９３５５号明細書参照）。ＰＮＡは正プライマーとオーバーラップし、ブロックすべき非特異的配列と完全にマッチする。結果として、ＰＮＡは非特異的標的に結合し、同じ標的へのプライマーの結合を阻害して、これにより非特異的増幅を抑制する（図１参照）。
【００９１】
所与のアミノ酸位置に対応するプライマーを、この位置の特定の変異のすべての可能な変異体を検出するアッセイにおいて使用するために混合することができる。例えば、それぞれ３’末端にＧＡＧおよびＧＡＡを担持する対立遺伝子特異的プライマーは、アミノ酸位置６００のグルタミン酸に対するすべての可能な変異体を検出することができるので、すべてのＶ６００Ｅ変異が検出される（図１および２参照）。
【００９２】
閉管均質形式でこの方法を実施できることは、汚染の危険性を最小限に抑える（例えばＫｒｅｕｚｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．８２：２８４−２８９（２００３）参照）。試料を一対のＰＣＲプライマーと接触させるために通常適用される任意の手段によって、試料を一対のプライマーと接触させることができる。例えば、試料とプライマーを、少容量の混合物用に適合されたマイクロウェルプレート中またはマイクロバイアル中で接触させることができる。
【００９３】
上記を考慮して、ヒトＢＲＡＦ遺伝子のエクソン１５におけるすべての可能なＶ６００Ｅ変異を変異特異的に増幅する、正プライマーなどのプライマー、ヒトＢＲＡＦ遺伝子のエクソン１５におけるすべての可能なＶ６００Ｋ変異を変異特異的に増幅する、正プライマーなどのプライマー、すべての可能なＶ６００Ｄ変異を変異特異的に増幅する、正プライマーなどのプライマー、すべての可能なＶ６００Ｒ変異を変異特異的に増幅する、正プライマーなどのプライマー、すべての可能なＶ６００Ｎ変異を変異特異的に増幅する、正プライマーなどのプライマー、特異性と感度を高めるために非標的ＢＲＡＦ配列の非特異的増幅をブロックする検出可能オリゴヌクレオチドおよびＰＮＡ、ならびに内部対照として役立つ（例えばＤＮＡの適切性、試料の抽出、増幅効率および変異の相対的定量化の標準化（例えば全野生型と変異対立遺伝子のパーセンテージとして））、エクソン１５に近接するＢＲＡＦゲノム配列を検出するためのプライマーおよび検出可能オリゴヌクレオチドが提供される。別々の反応またはプールされた反応においてヒトＢＲＡＦ遺伝子のエクソン１５におけるＶ６００変異を増幅し、検出するために前記プライマーおよび検出可能オリゴヌクレオチドを使用する、診断的リアルタイムＰＣＲ（ｒｔＰＣＲ）方法も提供される。
【００９４】
本明細書で述べるプライマーと少なくとも約８０％同一であるプライマーも使用できる。所望する場合は、一方または両方のプライマー（即ち正プライマーと逆プライマー）を標識するまたはラベルすることができる。標識プライマーの使用は、標識された増幅産物を生じさせる。蛍光標識された増幅産物は、例えばＡＢＩ  ３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ＡｎａｌｙｚｅｒおよびＧｅｎｅｓｃａｎ  ３．１．２ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）などの、蛍光を検出するように設計された任意の適切な装置を用いて検出することができる。
【００９５】
本明細書で述べる方法はゲノムＤＮＡの検出に基づくが、ＲＮＡベースのアッセイも使用できる。しかし、このようなアッセイは、全血からのｍＲＮＡの逆転写およびこの後の増幅に基づく。ｍＲＮＡベースの方法の感度は一般に良好であるが、ＲＮＡの分解および逆転写酵素の低い効率がこのようなアッセイの実用性を制限し、さらには大幅に制限することもある。加えて、関心対象のｍＲＮＡの量が、例えば循環細胞の代謝状態に依存して、大きく変動し得るので、アッセイの結果を再現することが困難であり得る。
【００９６】
所望する場合は、前述したプライマーを、もはやＤＮＡ合成のためのプライマーとしての機能を果たさないように改変することができ、標識して、検出可能オリゴヌクレオチドとして使用することができる。検出可能オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡなどの核酸の試料中のＢＲＡＦ遺伝子のエクソン１５におけるアミノ酸位置６００のバリンをコードするコドンの変異（Ｘ）（Ｖ６００Ｘ）を検出するために異なるアッセイ形式で使用できる。例えば、検出可能オリゴヌクレオチドを５’−ヌクレアーゼアッセイにおいて使用することができる（例えば米国特許第５，２１０，０１５号明細書；同第５，４８７，９７２号明細書；および同第５，８０４，３７５号明細書；ならびにＨｏｌｌａｎｄ，ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８８：７２７６−７２８０（１９８８）参照、これらすべては、これらの教示に関して参照により本明細書に明確に組み込まれる。）。
【００９７】
プライマーおよび検出可能オリゴヌクレオチドを、核酸に基づく増幅方法、例えばＰＣＲ、特にリアルタイムＰＣＲにおけるこれらの使用に関連して本明細書で説明したが、このようなプライマーおよび検出可能オリゴヌクレオチドは、他の核酸に基づく方法、例えばハイブリダイゼーション技術（例えば膜に基づくハイブリダイゼーション技術（サザンブロット法およびノーザンブロット法）、修飾核酸ハイブリダイゼーション技術（例えばＰａｎｄｉａｎ，ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，６２７，０３０号明細書参照）、および固相酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）様の技術）における検出可能オリゴヌクレオチドとして有用であり得、これらの技術は、同一、類似および相補的ポリヌクレオチド配列を検出するために使用される。
【００９８】
一本鎖線状ＤＮＡオリゴヌクレオチドである検出可能オリゴヌクレオチドは、当分野で公知の方法に従って検出可能に標識される。または、所望する場合は、プライマーを同様に標識することができる。任意の適切な標識、例えば発蛍光団、発光団、化学発光団、フォトルミノフォアまたは放射性同位体などが使用できる。例えば、蛍光部分を検出可能オリゴヌクレオチドの一方の末端に共有結合し、消光部分を他方の末端に共有結合することができる。適切な発蛍光団の例には、ＦＡＭ（例えば６’−ＦＡＭ）、フルオレセインおよびこの誘導体、ローダミン、クマリンおよびこの誘導体、ＴＥＴ、ＨＥＸ、ＪＯＥ、ＴＡＭＡ、ＴＡＭＲＡ、ＮＴＢ、ＲＯＸ、ＶＩＣ、ＮＥＤ、４，７−ジクロロフルオレセイン、４，７−ジクロロローダミン、ＤＡＢＣＹＬ、ＤＡＢＳＹＬ、マラカイトグリーン、ＬＣ−Ｒｅｄ  ６１０、ＬＣ−Ｒｅｄ  ６４０、ＬＣ−Ｒｅｄ  ６７０、ＬＣ−Ｒｅｄ  ７０５、ルシファーイエロー、ＴＥＸＡＳ  ＲＥＤ（登録商標）、テトラメチルローダミン、テトラクロロ−６−カルボキシフルオレセイン、５−カルボキシローダミン、ならびにシアニン染料（例えばＣｙ３およびＣｙ５）およびこの誘導体が含まれるが、これらに限定されない。ＦＡＭが好ましい標識である。消光剤の例には、ＤＡＢＣＹＬ、ＤＡＢＳＹＬ、ＤＡＢＭＩ、テトラメチルローダミン、ＴＡＭＲＡおよびＢＨＱ（登録商標）染料が含まれる。前述のように、各回のリアルタイムＰＣＲ増幅の間に、検出可能に標識された検出可能オリゴヌクレオチドは、標的ＤＮＡが存在する場合は、増幅された標的ＤＮＡにアニーリングする。標的配列が存在しない場合は、検出可能オリゴヌクレオチドの各々は、蛍光を発することができる前に、励起された発蛍光団のエネルギーを吸収するのに十分なだけ消光剤を発蛍光団に近接させる立体配座をとる。標的配列の存在下では、各々の検出可能オリゴヌクレオチドは標的中の相補的配列に結合し、発蛍光団と消光剤は離れたままであり、蛍光発光および検出を可能にする。好ましくは、標的特異的検出可能オリゴヌクレオチドおよびＩＣ特異的検出可能オリゴヌクレオチドを、標的ＤＮＡとＩＣ  ＤＮＡを区別することができるように異なって標識する。これに関して、標的特異的検出可能オリゴヌクレオチドを、好ましくはＦＡＭで標識し、ＢＨＱ−１で消光する。
【００９９】
キット
キットも提供される。キットは、
（ｉ）ヒト由来の核酸の試料中のＢＲＡＦ遺伝子のエクソン１５におけるＶ６００Ｘの検出のためのプライマーのセット、ここでプライマーのセットは、
（ａ）３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＧＡＡ［配列番号：４４］を含むオリゴヌクレオチドおよび／または３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＧＡＧ［配列番号：４５］を含むオリゴヌクレオチド、
（ｂ）３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＡＡＡ［配列番号：４６］を含むオリゴヌクレオチドおよび／または３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＡＡＧ［配列番号：４７］を含むオリゴヌクレオチド、
（ｃ）３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＧＡＴ［配列番号：４８］を含むオリゴヌクレオチドおよび／または３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＧＡＣ［配列番号：４９］を含むオリゴヌクレオチド、
（ｄ）３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＡＡＴ［配列番号：５０］を含むオリゴヌクレオチドおよび／または３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＡＡＣ［配列番号：５１］を含むオリゴヌクレオチド、
（ｅ）３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＣＧＴ［配列番号：５２］を含むオリゴヌクレオチド、３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＣＧＣ［配列番号：５３］を含むオリゴヌクレオチド、３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＣＧＡ［配列番号：５４］を含むオリゴヌクレオチド、３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＣＧＧ［配列番号：５５］を含むオリゴヌクレオチド、３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮ  ＡＧＡ［配列番号：５６］を含むオリゴヌクレオチド、および３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＡＧＧ［配列番号：５７］を含むオリゴヌクレオチド、
（ｄ）および（ｅ）、
（ａ）および（ｂ）、
（ａ）および（ｃ）、
（ｂ）および（ｃ）、
（ａ）、（ｂ）および（ｃ）、
（ｄ）とのさらなる組合せで、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のいずれか、
（ｅ）とのさらなる組合せで、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のいずれか、ならびに
（ｄ）および（ｅ）とのさらなる組合せで、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のいずれか
から成る群より選択される少なくとも１つのプライマーを含み、
ここでＮは、アデニン（Ａ）以外の塩基を含むヌクレオチドであり、および
ここでオリゴヌクレオチドは、約１５ヌクレオチドから約３５ヌクレオチドを含む、ならびに
（ｉｉ）ヒト由来の核酸の試料中のＢＲＡＦ遺伝子のエクソン１５におけるアミノ酸位置６００のバリンをコードするコドンの少なくとも１つの変異（Ｘ）（Ｖ６００Ｘ）を検出する方法についての指示書、この方法は、
（ａ）核酸の試料を用いて増幅反応を実施する段階、ここで増幅反応は、３’末端の最後の３個のヌクレオチドがＸをコードし、および３’末端から４番目のヌクレオチドがアデニン（Ａ）以外の塩基を含有するプライマー、ここで、Ｘが存在する場合は、プライマーはＸにアニーリングし、ならびに少なくとも１つのペプチド核酸（ＰＮＡ）クランプを含み、ここで少なくとも１つのＰＮＡクランプは野生型標的からの増幅をブロックし、
ここで、核酸の試料がｍＲＮＡである場合、段階（ａ）は、増幅反応を実施する前にｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡを得ることまたはｍＲＮＡからｃＤＮＡを逆転写することをさらに含み、
この後、Ｘが存在する場合は、増幅反応はＸを含有する増幅産物を生成する、ならびに
（ｂ）Ｘを含有する増幅産物を検出する段階
を含み、
ここで、Ｘが２以上のコドンによってコードされる場合、増幅反応は各々のコドンについてのプライマーを含み、
ここで、この方法が２以上のＸを検出する段階を含む場合、この方法は、各々のＸについての核酸の試料を用いた増幅反応を一緒にまたは別々に実施することを含むことができ、および
ここで、この方法はまた、いずれのＸが核酸の試料中に存在するかを決定する段階もさらに含み得る。オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド配列の５’末端のＧと隣接して、ヌクレオチド配列の３’末端のＴから始まるヌクレオチド配列５’  ＡＡＴＡＧＧＴＧＡＴＴＴＴ  ３’［配列番号：５８］の１以上の連続するヌクレオチドをさらに含み得る。キットは、約１５ヌクレオチドから約３５ヌクレオチドを含む、逆プライマーなどのプライマーをさらに含むことができ、ここで、プライマーが１５から２７ヌクレオチドを含む場合、プライマーは配列番号：１０の１５から２７個の連続するヌクレオチドを含む。
【０１００】
キットは、約１５ヌクレオチドから約３５ヌクレオチドを含む検出可能オリゴヌクレオチドをさらに含むことができ、ここで、検出可能オリゴヌクレオチドが１５から２０ヌクレオチドを含む場合、検出可能オリゴヌクレオチドは配列番号：１１の１５から２０個の連続するヌクレオチドを含む。Ｘは、Ｅ、Ｋ、Ｄ、ＲおよびＮから成る群より選択される少なくとも１個のアミノ酸であり得る。Ｘは、Ｅ、ＫおよびＤから成る群より選択される少なくとも１個のアミノ酸、例えばＥ、ＥおよびＫ、ＥおよびＤ、ＫおよびＤ、またはＥ、ＫおよびＤであり得る。標識の一例はＦＡＭである。これに関して、標識ＦＡＭは、好ましくは消光剤ＢＨＱ−１と組み合わせて使用される。
【０１０１】
キットは、組織または体液の試料を保存するための容器または試料バイアルを含み得る。一対のプライマー、特に正プライマーおよび逆プライマーなどのプライマーは、変異配列の検出を可能にするのに有効な量で組成物中に存在し得る。変異配列の検出は、本明細書で述べる方法または試料中の特定の核酸分子を検出するための当分野で公知の方法のいずれかを用いて実施される。キットはまた、緩衝液、ヌクレオチド塩基、ならびにハイブリダイゼーションおよび／または増幅反応において使用される他の組成物も含み得る。
【０１０２】
キットはｄＮＴＰをさらに含み得る。好ましくは、ｄＮＴＰは、標準染料と共に緩衝液中で供給される。
【０１０３】
プライマー、検出可能オリゴヌクレオチドおよびｄＮＴＰは様々な形状で包装され得る。好ましくは、プライマー、検出可能オリゴヌクレオチドおよびｄＮＴＰは単一容器中に存在する。容器は、好ましくはアジ化ナトリウムおよび／またはＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）９５０などの防腐剤も含む。
【０１０４】
キットは、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、および前記の２つ以上の混合物をさらに含み得る。任意の適切なＤＮＡポリメラーゼが使用できる。好ましいＤＮＡポリメラーゼの一例はＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）である。同様に、任意の適切なＲＮＡポリメラーゼが使用できる。好ましい逆転写酵素−ＤＮＡポリメラーゼの一例はｒＴｔｈである。ポリメラーゼは、場合により安定剤を含有する、および好ましくは安定剤を含有する緩衝液中で供給され得る。
【０１０５】
キットは、緩衝液中の、塩化マグネシウムなどの活性化試薬をさらに含み得る。緩衝液は、好ましくはアジ化ナトリウムおよび／またはＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）９５０などの防腐剤を含有する。
【０１０６】
キットは、場合によりＩＣをさらに含み得る。ＩＣは、工程が各試料について正しく進行したことを明らかにする無関係なＤＮＡ配列である。任意の適切な配列をＩＣとして使用することができる。ＩＣ標的配列の例には、本明細書の「実施例」に示すものが含まれる。標的特異的検出可能オリゴヌクレオチドおよびＩＣ特異的検出可能オリゴヌクレオチドは、標的ＤＮＡとＩＣ  ＤＮＡを区別することができるように異なって標識される。ＩＣ特異的検出可能オリゴヌクレオチドについての標識の一例はＣｙ５である。好ましくは、標識Ｃｙ５は消光剤ＢＨＱ−２と組み合わせて使用される。
【０１０７】
本明細書で言及されるすべての特許、特許出願公開、学術論文、テキストおよび他の公表文献は、本開示が属する分野の技術水準を示すものである。すべてのこのような公表文献は、各々個々の公表文献が、参照により本明細書に組み込まれることが具体的および個別に示されているのと同じように、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０８】
本明細書で例示的に述べる本発明は、本明細書で具体的に開示されていない要素または限定が存在しない場合も適切も実施され得る。従って、例えば、本明細書中の各々の場合の「含む」、「から基本的に成る」および「から成る」という用語のいずれもが、その他の２つの用語のいずれによっても置き換えられ得る。同様に、単数形態の「１つの」および「この」は、文脈上明らかに異なる指示がない限り、複数の言及を包含する。従って、例えば、「この方法」への言及は、本明細書で記述されるおよび／または本開示の読了後に当業者に明らかになる、この種類の１以上の方法および／または段階を包含する。
【０１０９】
使用した用語および表現は説明の用語として使用するものであり、限定ではない。これに関して、特定の用語が「定義」の章で定義され、「発明を実施するための形態」の中の別の部分で異なって定義される、記述されるまたは論じられる場合、すべてのこのような定義、記述および論述はこのような用語に帰することが意図されている。このような用語および表現の使用には、示され、記述される特徴またはこの部分の等価物を除外する意図はない。さらに、小見出し、例えば「定義」を「発明を実施するための形態」の中で使用するが、このような使用は単に参照の容易さのためであり、１つの章の中で為される開示をこの章だけに限定することを意図しない；むしろ、１つの小見出しの下で為される開示は、ありとあらゆる他の小見出しの下での開示を構成することが意図される。
【０１１０】
特許請求される本発明の範囲内で様々な修正が可能であることが認識される。従って、本発明を好ましい実施形態および選択的特徴に関連して具体的に開示したが、当業者は本明細書で開示される概念の修正および変形を用い得ることが理解されるべきである。このような修正および変形は、付属の特許請求の範囲によって提示される本発明の範囲内であるとみなされる。
【実施例】
【０１１１】
以下の実施例は本開示を例示する役割を果たす。実施例は、いかなる意味でも特許請求される本発明の範囲を限定することを意図しない。
【０１１２】
［実施例１］
この実施例は、ＤＮＡ中のＢＲＡＦ遺伝子のエクソン１５におけるＶ６００の個々のＳＮＰの検出のための反応を述べる。
【０１１３】
２つの対立遺伝子（即ちコドン）がＶ６００Ｅ、Ｖ６００ＫおよびＶ６００Ｄ変異について可能である（即ちグルタミン酸（Ｅ）についてはＧＡＧおよびＧＡＡ、リシン（Ｋ）についてはＡＡＧおよびＡＡＡ、ならびにアスパラギン酸（Ｄ）についてはＧＡＴおよびＧＡＣ）。各々の正プライマーを、特定のコドンを選択的に増幅するように設計した。従って、各々のアミノ酸変異の完全な検出を確実にするために各反応には２つの正プライマーが含まれる。
【０１１４】
ＢＲＡＦ逆プライマーおよび、使用する場合は、検出可能オリゴヌクレオチドはコンセンサス配列を標的とする。このため、ＢＲＡＦ逆プライマーおよび、使用する場合は、検出可能オリゴヌクレオチドはすべての反応について同じであり得る。
【０１１５】
内部対照プライマーおよび検出可能オリゴヌクレオチドは、ＢＲＡＦ遺伝子のエクソン１３内の配列を標的とする。これらはすべての反応について同じであった。
【０１１６】
非常に短い、伸長不能なオリゴヌクレオチドであるＰＮＡを、潜在的な非特異的増幅をブロックするために含める。これらは、高度に配列特異的な方法でこれらの相補的標的配列に結合する。ＰＮＡ配列は正プライマーと同じ鎖上にあるので、これらは正プライマーと競合して、非特異的増幅を妨げる。所与の変異特異的ＰＣＲについて複数の非特異的ＳＮＰが存在するが、非特異的増幅を生じさせ得る最も高頻度のもの、例えばＶ６００Ｅ検出の場合は野生型とＶ６００Ｋ、Ｖ６００Ｋ検出の場合は野生型とＶ６００Ｅ、およびＶ６００Ｄ検出の場合は野生型を、ＰＮＡによってブロックする必要がある。
【０１１７】
この方法は、オリゴヌクレオチドと核酸増幅のために必須の他の成分（例えばｄＮＴＰ混合物、緩衝液、酵素、および活性化剤として二価イオン）を含む混合物を形成する段階、混合物を精製核酸と組み合わせる段階、ならびに反応混合物を特定の条件に供して標的配列を増幅し、検出する段階から成った。工程は、熱サイクリングとシグナル検出を同時に実施できる装置によって閉管形式で実施した。細胞株から抽出したゲノムＤＮＡ、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）細胞株および臨床ＦＦＰＥ腫瘍試料を検定した。野生型または様々なＢＲＡＦ変異を担持する細胞株から抽出したゲノムＤＮＡを用いてアッセイの特異性を評価した。感度は、野生型ＢＲＡＦ細胞とＶ６００Ｅ変異ＢＲＡＦ細胞の定義された比率の混合物を用いて評価した。
【０１１８】
【表１】
2018196379.tif 000003
【０１１９】
【表２】
2018196379.tif 000004
【０１２０】
【表３】
2018196379.tif 000005
【０１２１】
ＰＣＲサイクリングは、９２℃で１０分間の１サイクル（ＴａｑＧｏｌｄの活性化）ならびに８８℃／５秒間、９２℃／１５秒間、６７℃／５秒間および６３℃／３５秒間の５５サイクル（サイクル数は変更できる。）（ＤＮＡ増幅および蛍光の読み取り）を含んだ。または、ＰＣＲサイクリングは、９２℃で１０分間の１サイクル（ＴａｑＧｏｌｄの活性化）ならびに９２℃で１５秒間および６５℃で３５秒間の５５サイクル（ＤＮＡ増幅および蛍光の読み取り）を含み得る。
【０１２２】
Ｖ６００ＥアッセイおよびＶ６００Ｋアッセイを用いたゲノムＤＮＡ  １０ｎｇに関する線形性試験は、良好な線形関係を明らかにした。Ｖ６００Ｅアッセイを用いた、ＦＦＰＥ細胞株から抽出したゲノムＤＮＡ  ２．５ｎｇに関する線形性試験も、良好な線形関係を示した。
【０１２３】
他の変異も同じようにして検出することができる。対立遺伝子特異的プライマーを、Ｖ６００Ｅ／Ｋ／Ｄ  ＳＮＰに関して前述したのと同じようにして他の変異について設計することができる。
【０１２４】
［実施例２］
この実施例は、ＢＲＡＦ遺伝子のエクソン１５におけるＶ６００の複数のＳＮＰの検出のためのプールされた反応を述べる。
【０１２５】
ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ、Ｖ６００ＫおよびＶ６００Ｄ変異の２以上も、プールされた反応において検出することができる。
【０１２６】
【表４】
2018196379.tif 000006
【０１２７】
ＰＣＲサイクリングは、９２℃で１０分間の１サイクル（ＴａｑＧｏｌｄの活性化）ならびに８８℃／５秒間、９２℃／１５秒間、６７℃／５秒間および６３℃／３５秒間の５５サイクル（アッセイの性能に影響を及ぼさずにサイクル数を変更することができる。）（ＤＮＡ増幅および蛍光の読み取り）を含んだ。または、ＰＣＲサイクリングは、９２℃で１０分間の１サイクル（ＴａｑＧｏｌｄの活性化）ならびに９２℃で１５秒間および６５℃で３５秒間の５５サイクル（ＤＮＡ増幅および蛍光の読み取り）を含み得る。
【０１２８】
他の変異も同じようにして検出することができる。対立遺伝子特異的プライマーを、Ｖ６００Ｅ／Ｋ／Ｄ  ＳＮＰに関して前述したのと同じようにして他の変異について設計することができる。これに関して、プールされた反応は、１以上の他の変異と組み合わせてＶ６００Ｅ、Ｖ６００Ｋおよび／またはＶ６００Ｄの１以上を検出することができる。
【０１２９】
［実施例３］
この実施例は、本発明の方法における使用のための選択的正プライマーおよび検出可能オリゴヌクレオチドを述べる。
【０１３０】
【表５】
2018196379.tif 000007
【０１３１】
［実施例４］
この実施例は、ｍＲＮＡ中のＢＲＡＦ遺伝子のエクソン１５におけるＶ６００の個々のＳＮＰの検出のための反応を述べる。
【０１３２】
ヒトＦＦＰＥ腫瘍組織からの全核酸またはＲＮＡを、逆転写／ＰＣＲ増幅反応のための鋳型として使用する。全核酸は、ＲＮアーゼ処理を行わずにＱＩＡｍｐ  ＦＦＰＥ  ＤＮＡ組織キット（Ｑｉａｇｅｎ）などの精製キットを用いてＦＦＰＥ試料から単離し、精製する。ＲＮＡは、時としてＤＮアーゼ処理と共に、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）などのＲＮＡ精製キットを用いてＦＦＰＥ試料から単離し、精製することができる。ＲＮＡ検出のために、ＢＲＡＦ遺伝子のエクソン１５内の配列にアニーリングする逆プライマー（ＢＲＡＦ−Ｒ３）から逆転写を開始させる。このＢＲＡＦ配列エレメントは、転写産物を含むすべてのＢＲＡＦエクソン１５に共通である；このため、単一の逆プライマーがＲＮＡからのすべての標的変異体の逆転写を促進することができる。生じたｃＤＮＡのＰＣＲ増幅は、ＳＮＰ部位のＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ、Ｖ６００ＫまたはＶ６００Ｄ配列に特異的にアニーリングする複数の正プライマーと組み合わせて上記逆プライマーによって指令される。同じプライマーを、標的変異体を含むゲノムＤＮＡを増幅するためにも使用できる。
【０１３３】
全核酸またはＲＮＡからＶ６００Ｅ、Ｖ６００ＫまたはＶ６００Ｄを検出するプライマー／検出可能オリゴヌクレオチドセットに加えて、内部対照としてＢＲＡＦのエクソン１３内の配列を検出するようにプライマー／検出可能オリゴヌクレオチドセットを設計する。ＢＲＡＦエクソン１３の増幅レベルを用いて、試料の適切性、試料の抽出工程、全ＢＲＡＦ  ＲＮＡ発現レベルおよび増幅効率の変動に対してＢＲＡＦ変異体検出工程を基準化する。ＲＮＡとゲノムＤＮＡの両方を増幅するため、ＢＲＡＦ内部対照プライマー２をエクソン１３内に設計する。
【０１３４】
ＲＮＡおよび／または全核酸からの検出のための反応形式およびサイクリング条件は、サイクリング条件が通常の熱サイクリングプログラムの前に逆転写段階を含み、および異なる酵素を含んでもよいことを除き、ＤＮＡ  ＳＮＰアッセイにおけるＶ６００Ｅ、Ｖ６００ＫまたはＶ６００Ｄ反応のものと同じまたは類似であり得る（例えば実施例１参照）。ＰＣＲ反応は、表６、７および８に示すオリゴヌクレオチドを含んで構成される。
【０１３５】
ＢＲＡＦ  Ｖ６００変異および内部対照に関して、ゲノムＤＮＡではなくＲＮＡだけを検出することが時として望ましい。これを達成するため、ＲＮＡ特異的試料調製物に加えて、逆プライマーを、隣接するエクソン、即ちＶ６００変異についてはエクソン１６および内部対照についてはエクソン１４に位置するように、例えばエクソン内にまたはエクソン−エクソン接合部にまたがって位置するように設計することができる。エクソン１５と１６の間およびエクソン１３と１４の間の長いイントロン配列のために、このようなＰＣＲオリゴ設計は、ＢＲＡＦ  Ｖ６００変異および内部対照の両方に関して、ＲＮＡ（イントロンなし）だけを増幅することができ、ゲノムＤＮＡ（イントロンを含む。）は増幅しない。
【０１３６】
【表６】
2018196379.tif 000008
【０１３７】
【表７】
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【０１３８】
【表８】
2018196379.tif 000010
【０１３９】
［実施例５］
この実験で使用した配列は上記および図１に示されている。図８は実験からのデータを示し、これらの実験では、野生型ＢＲＡＦ、Ｖ６００Ｅ変異を有するＢＲＡＦおよびＶ６００Ｋ変異を有するＢＲＡＦを区別するようにプライマー（図１のプライマー）を作製した。最初の列に（列は左側から右側へ進む；縦行は上から下へ進む。）、標的配列についての野生型または変異体の名称を示す。標的配列の名称の下は、標的配列の３’末端のヌクレオチド配列である。配列に下線を付し、変異体ヌクレオチドを赤色で示す。配列の下は、示されている配列によってコードされるアミノ酸である。
【０１４０】
例えば、１番目の列の１番目のブロックにおいて、標的配列は「ＷＴ１７９９ａ」と命名され、ヌクレオチド配列は「ＧＴＧ」であり、この配列はバリン「Ｖａｌ（Ｖ）」をコードする。
【０１４１】
図の１番目の縦行は、１）プライマーの名称およびプライマーの３’末端によってコードされる配列、２）標的配列と比較したミスマッチの数、３）対象配列の３’末端からのミスマッチの位置、および４）ｄＣｔ（標的のΔ濃度）で表したＰＣＲ結果を示す。
【０１４２】
従って、縦行２、列２に位置する箱は、ＢＲＡＦ−Ｔ１７９９ａについてのプライマー（ＭＵｆ１ｂ）が２つのミスマッチを有し、これらのミスマッチが２番目と４番目のヌクレオチド上に位置し、およびｄＣｔ結果が、意図する標的Ｔ１７９９ａについて同じプライマーを使用した結果と比較した場合、９．３５であったことを示すと解釈できる。意図する標的についてプライマーを使用した場合のｄＣｔ値を恣意的にゼロと設定し、従ってすべての結果はこの値に対するものである。
【０１４３】
列２、縦行２と３の箱を比較した場合、２番目のミスマッチをプライマーに組み込むと、プライマーは、１つのミスマッチヌクレオチドしか存在しない、意図する標的である変異ＢＲＡＦの検出ほど効率的には野生型標的を検出しないことがわかる。
【０１４４】
遺伝暗号は冗長性であり、１つのアミノ酸が２以上のヌクレオチド三量体によってコードされることを許容する。これに関して、特定のアミノ酸の変化が２以上の異なるヌクレオチド変異によってコードされ得る。図６は、同じアミノ酸変化（例えばＶ６００Ｅ）を生じさせるヌクレオチド変異を検出するように設計されたプライマーは、１つのヌクレオチドミスマッチを有するプライマーと比較して、プライマーが特定の標的配列に関して２以上の変異を有する場合、これらの変異を効率的に検出しないことを示す。このため、このデータは、ＳＮＰの改善された検出に関して本明細書で述べる発明概念が、特定の配列または意図する標的に限定されず、むしろ、ＳＮＰの改善された検出に幅広く適用できる概念であることを示す。
【図１−１】
2018196379.tif 000011
【図１−２】
2018196379.tif 000012
【図２−１】
2018196379.tif 000013
【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
2018196379.tif 000016
【図２−５】
2018196379.tif 000017
【図２−６】
2018196379.tif 000018
【図３】
2018196379.tif 000019
【図４】
2018196379.tif 000020
【図５】
2018196379.tif 000021
【図６Ａ】
2018196379.tif 000022
【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【配列表】
2018196379000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年9月14日(2018.9.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト由来の核酸の試料中のＢＲＡＦ遺伝子のエクソン１５におけるアミノ酸位置６００のバリンをコードするコドンの少なくとも１つの突然変異（Ｘ）（Ｖ６００Ｘ）を検出する方法であって、
（ａ）核酸の試料を用いて増幅反応を実施する段階であって、該増幅反応は、３’末端の最後の３個のヌクレオチドがＸをコードし、かつ３’末端から４番目のヌクレオチドがアデニン（Ａ）以外の塩基を含有し、配列番号８、９、１７、１８、２０および２１から成る群より選択される配列を有するプライマーを含み、Ｘが存在する場合は、該プライマーはＸにアニーリングし、
ここで、核酸の試料がｍＲＮＡである場合、段階（ａ）は、前記増幅反応を実施する前にｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡを得ることまたはｍＲＮＡからｃＤＮＡを逆転写することをさらに含み、
Ｘが存在する場合は、該増幅反応はＸを含有する増幅産物を生成する、段階と、
（ｂ）Ｘを含有する増幅産物を検出し、任意選択的に定量化する段階
を含み、
ここで、Ｘが２以上のコドンによってコードされる場合、前記増幅反応は各々のコドンについてのプライマーを含み、
ヒト由来の核酸の試料中のＢＲＡＦ遺伝子のエクソン１５におけるＶ６００Ｘ突然変異が検出される、方法。
【請求項２】
前記増幅反応が、少なくとも１つのペプチド核酸（ＰＮＡ）クランプをさらに含み、ここで該少なくとも１つのＰＮＡクランプが野生型標的からの増幅をブロックし、前記増幅反応が１以上の他のＰＮＡクランプを含む場合、前記ＰＮＡが、望ましくない標的に結合し、プライマーが望ましくない標的から増幅するのを妨げることによって検出可能オリゴヌクレオチドおよび／またはプライマーを捕捉する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Ｘを含有する増幅産物を検出する段階が、標識プライマーを検出すること、または前記増幅産物を検出可能オリゴヌクレオチドと接触させ、かつ前記Ｘを含有する増幅産物への前記検出可能オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記増幅反応が内部対照プライマーをさらに含み、この場合前記増幅反応が前記内部対照を含有する増幅産物も生成し、この場合段階（ｂ）が、前記内部対照を含有する増幅産物を検出することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記内部対照を含有する増幅産物を検出する段階が、標識プライマーを検出すること、または前記増幅産物を検出可能オリゴヌクレオチドと接触させ、前記内部対照を含有する増幅産物への前記検出可能オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出することを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
Ｘが、Ｅ、ＫおよびＤから成る群より選択される少なくとも１個のアミノ酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ＸがＥである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
Ｘが、ＥおよびＫであるか、またはＥおよびＤであるか、またはＫおよびＤである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ＸがＥ、ＫおよびＤである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法であって、前記方法が２以上のＸを検出する段階を含む場合、前記方法が、各々のＸについてのＤＮＡの試料を用いた増幅反応を一緒にまたは別々に実施することを含み得る、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
いずれのＸがＤＮＡの試料中に存在するかを決定する段階をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ヒト由来の核酸の試料中のＢＲＡＦ遺伝子のエクソン１５におけるＶ６００Ｘの増幅のためのプライマーのセットであって、前記プライマーのセットが、
（ａ）３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＧＡＡ［配列番号：５９］を含むオリゴヌクレオチドおよび／または３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＧＡＧ［配列番号：６０］を含むオリゴヌクレオチド、
（ｂ）３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＡＡＡ［配列番号：４６］を含むオリゴヌクレオチドおよび／または３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＡＡＧ［配列番号：４７］を含むオリゴヌクレオチド、
（ｃ）３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＧＡＴ［配列番号：４８］を含むオリゴヌクレオチドおよび／または３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＧＡＣ［配列番号：４９］を含むオリゴヌクレオチド、
（ｄ）３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＡＡＴ［配列番号：５０］を含むオリゴヌクレオチドおよび／または３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＡＡＣ［配列番号：５１］を含むオリゴヌクレオチド、
（ｅ）３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＣＧＴ［配列番号：５２］を含むオリゴヌクレオチド、３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＣＧＣ［配列番号：５３］を含むオリゴヌクレオチド、３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＣＧＡ［配列番号：５４］を含むオリゴヌクレオチド、３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＣＧＧ［配列番号：５５］を含むオリゴヌクレオチド、３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮ  ＡＧＡ［配列番号：５６］を含むオリゴヌクレオチド、および３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＡＧＧ［配列番号：５７］を含むオリゴヌクレオチド、
（ｄ）および（ｅ）、
（ａ）および（ｂ）、
（ａ）および（ｃ）、
（ｂ）および（ｃ）、
（ａ）、（ｂ）および（ｃ）、
（ｄ）とのさらなる組合せで、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のいずれか、
（ｅ）とのさらなる組合せで、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のいずれか、ならびに
（ｄ）および（ｅ）とのさらなる組合せで、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のいずれか
から成る群より選択される少なくとも１つのプライマーを含み、
ここでＮは、アデニン（Ａ）以外の塩基を含むヌクレオチドであり、
前記オリゴヌクレオチドは、約１５ヌクレオチドから約３５ヌクレオチドを含む、
プライマーのセット。
【請求項１３】
前記オリゴヌクレオチドが、ヌクレオチド配列の５’末端のＧと隣接して、ヌクレオチド配列の３’末端のＴから始まるヌクレオチド配列５’  ＡＡＴＡＧＧＴＧＡＴＴＴＴ  ３’［配列番号：５８］の１以上の連続するヌクレオチドをさらに含む、請求項１２に記載のプライマーのセット。
【請求項１４】
約１５ヌクレオチドから約３５ヌクレオチドを含むプライマーをさらに含み、ここで、逆プライマーが１５から２７ヌクレオチドを含む場合、該逆プライマーが配列番号：１０の１５から２７個の連続するヌクレオチドを含む、請求項１２に記載のプライマーのセット。
【請求項１５】
約１５ヌクレオチドから約３５ヌクレオチドを含む検出可能オリゴヌクレオチドをさらに含み、ここで、該検出可能オリゴヌクレオチドが１５から２０ヌクレオチドを含む場合、該検出可能オリゴヌクレオチドが配列番号：１１の１５から２０個の連続するヌクレオチドを含む、請求項１２に記載のプライマーのセット。
【請求項１６】
キットであって、
（ｉ）ヒト由来の核酸の試料中のＢＲＡＦ遺伝子のエクソン１５におけるＶ６００Ｘの検出のためのプライマーのセットであって、該プライマーのセットは、
（ａ）３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＧＡＡ［配列番号：５９］を含むオリゴヌクレオチドおよび／または３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＧＡＧ［配列番号：６０］を含むオリゴヌクレオチド、
（ｂ）３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＡＡＡ［配列番号：４６］を含むオリゴヌクレオチドおよび／または３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＡＡＧ［配列番号：４７］を含むオリゴヌクレオチド、
（ｃ）３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＧＡＴ［配列番号：４８］を含むオリゴヌクレオチドおよび／または３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＧＡＣ［配列番号：４９］を含むオリゴヌクレオチド、
（ｄ）３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＡＡＴ［配列番号：５０］を含むオリゴヌクレオチドおよび／または３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＡＡＣ［配列番号：５１］を含むオリゴヌクレオチド、
（ｅ）３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＣＧＴ［配列番号：５２］を含むオリゴヌクレオチド、３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＣＧＣ［配列番号：５３］を含むオリゴヌクレオチド、３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＣＧＡ［配列番号：５４］を含むオリゴヌクレオチド、３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＣＧＧ［配列番号：５５］を含むオリゴヌクレオチド、３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮ  ＡＧＡ［配列番号：５６］を含むオリゴヌクレオチド、および３’末端にヌクレオチド配列ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＮＡＧＧ［配列番号：５７］を含むオリゴヌクレオチド、
（ｄ）および（ｅ）、
（ａ）および（ｂ）、
（ａ）および（ｃ）、
（ｂ）および（ｃ）、
（ａ）、（ｂ）および（ｃ）、
（ｄ）とのさらなる組合せで、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のいずれか、
（ｅ）とのさらなる組合せで、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のいずれか、ならびに
（ｄ）および（ｅ）とのさらなる組合せで、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のいずれか
から成る群より選択される少なくとも１つのプライマーを含み、
ここでＮは、アデニン（Ａ）以外の塩基を含むヌクレオチドであり、
前記オリゴヌクレオチドは、約１５ヌクレオチドから約３５ヌクレオチドを含む、プライマーのセット、ならびに
（ｉｉ）ヒト由来の核酸の試料中のＢＲＡＦ遺伝子のエクソン１５におけるアミノ酸位置６００のバリンをコードするコドンの少なくとも１つの変異（Ｘ）（Ｖ６００Ｘ）を検出する方法についての指示書であって、前記方法は、
（ａ）核酸の試料を用いて増幅反応を実施する段階であって、該増幅反応は、３’末端の最後の３個のヌクレオチドがＸをコードし、かつ３’末端から４番目のヌクレオチドがアデニン（Ａ）以外の塩基を含有するプライマーであって、Ｘが存在する場合は、該プライマーはＸにアニーリングするプライマーと、少なくとも１つのペプチド核酸（ＰＮＡ）クランプであって、野生型標的からの増幅をブロックする少なくとも１つのＰＮＡクランプを含み、
ここで、核酸の試料がｍＲＮＡである場合、段階（ａ）は、前記増幅反応を実施する前にｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡを得ることまたはｍＲＮＡからｃＤＮＡを逆転写することをさらに含み、
Ｘが存在する場合は、前記増幅反応はＸを含有する増幅産物を生成する、段階と、
（ｂ）Ｘを含有する増幅産物を検出する段階
を含み、
ここで、Ｘが２以上のコドンによってコードされる場合、前記増幅反応は各々のコドンについてのプライマーを含み、
前記方法が２以上のＸを検出する段階を含む場合、前記方法は、各々のＸについての核酸の試料を用いた増幅反応を一緒にまたは別々に実施することを含むことができ、
前記方法は、いずれのＸが核酸の試料中に存在するかを決定する段階もさらに含む、指示書
を含む、キット。
【請求項１７】
前記（ｉ）のオリゴヌクレオチドが、ヌクレオチド配列の５’末端のＧと隣接して、ヌクレオチド配列の３’末端のＴから始まるヌクレオチド配列５’  ＡＡＴＡＧＧＴＧＡＴＴＴＴ  ３’［配列番号：５８］の１以上の連続するヌクレオチドをさらに含む、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
約１５ヌクレオチドから約３５ヌクレオチドを含むプライマーをさらに含み、ここで、該プライマーが１５から２７ヌクレオチドを含む場合、該プライマーが配列番号：１０の１５から２７個の連続するヌクレオチドを含む、請求項１６に記載のキット。
【請求項１９】
約１５ヌクレオチドから約３５ヌクレオチドを含む検出可能オリゴヌクレオチドをさらに含み、ここで、該検出可能オリゴヌクレオチドが１５から２０ヌクレオチドを含む場合、検出可能オリゴヌクレオチドが配列番号：１１の１５から２０個の連続するヌクレオチドを含む、請求項１６に記載のキット。
【請求項２０】
Ｘが、Ｅ、Ｋ、Ｄ、ＲおよびＮから成る群より選択される少なくとも１個のアミノ酸である、請求項１６に記載のキット。
【請求項２１】
Ｘが、Ｅ、ＫおよびＤから成る群より選択される少なくとも１個のアミノ酸である、請求項１６に記載のキット。
【請求項２２】
ＸがＥである、請求項１６に記載のキット。
【請求項２３】
Ｘが、ＥおよびＫであるか、またはＥおよびＤであるか、またはＫおよびＤである、請求項１６に記載のキット。
【請求項２４】
ＸがＥ、ＫおよびＤである、請求項１６に記載のキット。
【請求項２５】
核酸の試料中の遺伝子におけるコドンの少なくとも１つの突然変異（Ｘ）を検出するためのプライマーを設計する方法であって、３’末端の最後の３個のヌクレオチドがＸをコードし、かつ３’末端から４番目のヌクレオチドが野生型遺伝子中に存在する塩基以外の塩基を含有するプライマーを合成して、核酸の試料中の遺伝子におけるコドンの少なくとも１つの突然変異（Ｘ）を検出するためのプライマーを設計することを含む、方法。
【外国語明細書】
2018196379000001.pdf