(57)【要約】      （修正有）【課題】標的となる塩基に制限がなく、より高効率な標的二本鎖ポリヌクレオチドへの塩基置換の導入方法の提供。【解決手段】植物細胞又は植物体に、タンパク質又はタンパク質をコードする核酸と、標的二本鎖ポリヌクレオチドに特異的なガイドＲＮＡ又はガイドＲＮＡをコードするＤＮＡとを導入する導入工程を備え、タンパク質は、特定のアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、ＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有するタンパク質である、標的二本鎖ポリヌクレオチドへの塩基置換の導入方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物細胞又は植物体に、タンパク質又は該タンパク質をコードする核酸と、標的二本鎖ポリヌクレオチドに特異的なガイドＲＮＡ又は該ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡとを導入する導入工程を備え、
前記タンパク質は、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれか一つのアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、ＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有するタンパク質であることを特徴とする標的二本鎖ポリヌクレオチドへの塩基置換の導入方法。
（ａ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
【請求項２】
前記標的二本鎖ポリヌクレオチドが配列番号３で表されるＰＡＭ配列を有する請求項１に記載の標的二本鎖ポリヌクレオチドへの塩基置換の導入方法。
【請求項３】
前記ガイドＲＮＡの塩基数が２０以上２６以下である請求項１又は２に記載の標的二本鎖ポリヌクレオチドへの塩基置換の導入方法。
【請求項４】
前記タンパク質をコードする核酸が発現ベクターにコードされている請求項１〜３のいずれか一項に記載の標的二本鎖ポリヌクレオチドへの塩基置換の導入方法。
【請求項５】
前記タンパク質をコードする核酸が構成的プロモーターの制御下にある請求項１〜４のいずれか一項に記載の標的二本鎖ポリヌクレオチドへの塩基置換の導入方法。
【請求項６】
前記導入工程において、植物ウイルスを用いて導入を行う請求項１〜５のいずれか一項に記載の標的二本鎖ポリヌクレオチドへの塩基置換の導入方法。
【請求項７】
タンパク質又は該タンパク質をコードする核酸と、
標的二本鎖ポリヌクレオチドに特異的なガイドＲＮＡ又は該ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡと、を備え、
前記タンパク質は、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれか一つのアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、ＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有するタンパク質であることを特徴とする標的二本鎖ポリヌクレオチドへの塩基置換の導入用キット。
（ａ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
【請求項８】
以下の（ｄ）〜（ｆ）のいずれか一つのアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、ＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有することを特徴とするタンパク質。
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号２で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号９４６位以外の部位において、１〜数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
（ｆ）配列番号２で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号９４６位以外の部位において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
【請求項９】
以下の（ｇ）〜（ｊ）のいずれか一つの塩基配列を含む配列からなり、且つ、ＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有するタンパク質をコードすることを特徴とする遺伝子。
（ｇ）配列番号５で表される塩基配列、
（ｈ）配列番号５で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠損、置換又は付加されている塩基配列、
（ｉ）配列番号５で表される塩基配列において、８０％以上の同一性を有する塩基配列、
（ｊ）配列番号５で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列
【請求項１０】
請求項８に記載のタンパク質と、
標的二本鎖ポリヌクレオチドに特異的なガイドＲＮＡと、
を備えることを特徴とするタンパク質−ガイドＲＮＡ複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的二本鎖ポリヌクレオチドへの塩基置換の導入方法、標的二本鎖ポリヌクレオチドへの塩基置換の導入用キット、変異型ＣｊＣａｓ９、変異型ＣｊＣａｓ９をコードする遺伝子、及び変異型ＣｊＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ  −  ＣＲＩＳＰＲ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）は、二本鎖ポリヌクレオチドを切断してゲノム配列の任意の場所を削除、置換、挿入することができる新しい遺伝子改変技術として注目を集めている。
【０００３】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを利用して、二本鎖ポリヌクレオチドを導入するためには、ＰＡＭ配列、ガイドＲＮＡ（ｇｕｉｄｅ  ＲＮＡ；ｇＲＮＡ）、及びＣａｓの３つの要素が必要となる。ＰＡＭ配列に隣接した標的部位に対し、標的部位の塩基配列を元にｇＲＮＡを設計し、ｇＲＮＡ及びＣａｓを細胞又は受精卵にプラスミド又はウイルス粒子で共導入する。
【０００４】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムには、ｔｙｐｅＩ、ＩＩ、ＩＩＩがあるが、ゲノム編集で用いるのはもっぱらｔｙｐｅＩＩ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムであり、ｔｙｐｅＩＩではＣａｓとしてＣａｓ９が用いられている。Ｃａｓ９オルソログとしては、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、又はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）等の細菌由来のＣａｓ９が挙げられる。
【０００５】
また、最近では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを利用した塩基置換を導入する方法が提案されている。具体的には、まず、ヌクレアーゼ活性を除去した失活型Ｃａｓ９（ｄｕｌｌ  Ｃａｓ９；ｄＣａｓ９）に脱アミノ化酵素を融合させた人工酵素複合体を構築する。次いで、この人工酵素複合体を酵母又は動物細胞内で発現させ、狙った点変異を高効率に導入し、ゲノム改変を行うものである。ＤＮＡを切断せずにゲノム改変を行うことができ、従来のヌクレアーゼ型と比較して、細胞毒性が大幅に低減していることから、新たな遺伝子治療手法としての応用が期待されている（例えば、非特許文献１参照。）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Nishida K., et al, “Targeted nucleotide editing using hybrid prokaryotic and vertebrate adaptive immune systems”, Science, vol.353, Issue 6305, DOI:10.1126/science.aaf8729, 2016.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従来のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムに用いられるＣａｓ９によって誘導される変異パターンは、ＰＡＭ配列近傍への塩基欠失及び挿入が殆どであり、塩基置換変異の頻度は高くなかった。
また、非特許文献１に記載の塩基置換の導入方法では、標的配列中にあるシトシンのみをチミンに置換でき、シトシン以外の塩基を置換することができないため、導入できる点変異に制限があった。
【０００８】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、標的となる塩基に制限がなく、より高効率な標的二本鎖ポリヌクレオチドへの塩基置換の導入方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ由来のＣａｓ９（以下、「ＣｊＣａｓ９」と称する場合がある。）を用いたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムにより、植物細胞において、標的二本鎖ポリヌクレオチドへ高効率に塩基置換変異を導入できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
本発明の第１態様に係る標的二本鎖ポリヌクレオチドへの塩基置換の導入方法は、植物細胞又は植物体に、タンパク質又は該タンパク質をコードする核酸と、標的二本鎖ポリヌクレオチドに特異的なガイドＲＮＡ又は該ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡとを導入する導入工程を備え、前記タンパク質は、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれか一つのアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、ＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有するタンパク質である。
（ａ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
【００１１】
前記標的二本鎖ポリヌクレオチドが配列番号３で表されるＰＡＭ配列を有していてもよい。
前記ガイドＲＮＡの塩基数が２０以上２６以下であってもよい。
前記タンパク質をコードする核酸が発現ベクターにコードされていてもよい。
前記タンパク質をコードする核酸が構成的プロモーターの制御下にあってもよい。
前記導入工程において、植物ウイルスを用いて導入を行ってもよい。
【００１２】
本発明の第２態様に係る標的二本鎖ポリヌクレオチドへの塩基置換の導入用キットは、タンパク質又は該タンパク質をコードする核酸と、標的二本鎖ポリヌクレオチドに特異的なガイドＲＮＡ又は該ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡと、を備え、前記タンパク質は、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれか一つのアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、ＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有するタンパク質である。
（ａ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
【００１３】
本発明の第３態様に係るタンパク質は、以下の（ｄ）〜（ｆ）のいずれか一つのアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、ＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有する。
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号２で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号９４６位以外の部位において、１〜数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
（ｆ）配列番号２で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号９４６位以外の部位において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
【００１４】
本発明の第４態様に係る遺伝子は、以下の（ｇ）〜（ｊ）のいずれか一つの塩基配列を含む配列からなり、且つ、ＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有するタンパク質をコードする。
（ｇ）配列番号５で表される塩基配列、
（ｈ）配列番号５で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠損、置換又は付加されている塩基配列、
（ｉ）配列番号５で表される塩基配列において、８０％以上の同一性を有する塩基配列、
（ｊ）配列番号５で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列
【００１５】
本発明の第５態様に係るタンパク質−ガイドＲＮＡ複合体は、前記タンパク質と、標的二本鎖ポリヌクレオチドに特異的なガイドＲＮＡと、を備える。
【００１６】
本発明の第６態様に係る標的二本鎖ポリヌクレオチドへの塩基置換の導入方法は、細胞又は生物体に、タンパク質又は該タンパク質をコードする核酸と、標的二本鎖ポリヌクレオチドに特異的なガイドＲＮＡ又は該ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡとを導入する導入工程を備え、前記タンパク質は、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれか一つのアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、ＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有するタンパク質であり、前記標的二本鎖ポリヌクレオチドが配列番号３で表されるＰＡＭ配列を有する。
（ａ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
【００１７】
本発明の第６態様に係る標的二本鎖ポリヌクレオチドへの塩基置換の導入方法は、細胞又は生物体に、タンパク質又は該タンパク質をコードする核酸と、標的二本鎖ポリヌクレオチドに特異的なガイドＲＮＡ又は該ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡとを導入する導入工程を備え、前記タンパク質は、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれか一つのアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、ＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有するタンパク質であり、前記ガイドＲＮＡの塩基数が２０以上２６以下である。
（ａ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、標的となる塩基に制限がなく、より高効率な標的二本鎖ポリヌクレオチドへの塩基置換の導入方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ】実施例１におけるｓｇＡＣＳ１−１を導入した形質転換カルスでのＣＡＰＳ（Ｃｌｅａｖｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｅｉｄ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）解析による変異を検出した結果を示す画像である。
【図１Ｂ】実施例１におけるｓｇＡＣＳ１−２を導入した形質転換カルスでのＣＡＰＳ解析による変異を検出した結果を示す画像である。
【図１Ｃ】実施例１におけるｓｇＲｂｏｈＢ−１を導入した形質転換カルスでのＣＡＰＳ解析による変異を検出した結果を示す画像である。
【図１Ｄ】実施例１におけるｓｇＲｂｏｈＢ−２を導入した形質転換カルスでのＣＡＰＳ解析による変異を検出した結果を示す画像である。
【図２Ａ】実施例１におけるｓｇＡＣＳ１−１を導入した形質転換カルスでのＤＮＡシークエンスの結果を示す図である。
【図２Ｂ】実施例１におけるｓｇＡＣＳ１−２を導入した形質転換カルスでのＤＮＡシークエンスの結果を示す図である。
【図２Ｃ】実施例１におけるｓｇＲｂｏｈＢ−１を導入した形質転換カルスでのＤＮＡシークエンスの結果を示す図である。
【図２Ｄ】実施例１におけるｓｇＲｂｏｈＢ−２を導入した形質転換カルスでのＤＮＡシークエンスの結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
≪標的二本鎖ポリヌクレオチドへの塩基置換の導入方法≫
本発明の一実施形態に係る標的二本鎖ポリヌクレオチドへの塩基置換の導入方法は、植物細胞又は植物体に、タンパク質又は該タンパク質をコードする核酸と、標的二本鎖ポリヌクレオチドに特異的なガイドＲＮＡ又は該ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡとを導入する導入工程を備え、前記タンパク質は、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれか一つのアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、ＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有するタンパク質である。
（ａ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
【００２１】
一般的なＣａｓ９であるＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９（以下、「ＳｐＣａｓ９」と称する場合がある。）、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９（以下、「ＳａＣａｓ９」と称する場合がある。）、又はＣｐｆ１により導入される変異パターンは、殆どが欠失又は挿入変異であり、塩基置換変異は非常に稀であった。
これに対し、本実施形態の導入方法では、植物細胞又は植物体においてＣｊＣａｓ９を導入することで、標的となる塩基に制限がなく、標的二本鎖ポリヌクレオチドへ高効率に塩基置換を導入することができる。
【００２２】
また、欠失又は挿入変異は、標的遺伝子の機能を喪失させる目的には適している。
これに対し、塩基置換変異は、標的遺伝子の機能を目的に合わせて加工することに適している。例えば、標的遺伝子から翻訳されるタンパク質の酵素活性や基質特異性を向上又は抑制することが可能である。
また、塩基置換変異により新たな機能を与えるだけでなく、変異が誘導された遺伝子を野生型に戻すことも可能である。例えば、育種目的のランダムな変異原処理により有益形質をもつようになった一方で、偶発的に誘導された他の有益遺伝子への変異により不利益な形質を示すようになった場合、ＣｊＣａｓ９による塩基置換変異により、特定の遺伝子のみを野生型に戻すことも可能となる。
【００２３】
本明細書において、「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」とは、アミノ酸残基のポリマーを意味し、互換的に使用される。また、１つ若しくは複数のアミノ酸が、天然に存在する対応アミノ酸の化学的類似体、又は修飾誘導体である、アミノ酸ポリマーを意味する。
【００２４】
本明細書において、「塩基配列」とは、任意の長さのヌクレオチド配列を意味しており、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドであり、線状、環状、又は分岐状であり、一本鎖又は二本鎖である。
【００２５】
本明細書において、「ポリヌクレオチド」とは、線状又は環状配座であり、一本鎖又は二本鎖形態のいずれかである、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドポリマーを意味し、ポリマーの長さに関して制限するものとして解釈されるものではない。また、天然ヌクレオチドの公知の類似体、並びに塩基部分、糖部分及びリン酸部分のうち少なくとも一つの部分において修飾されるヌクレオチド（例えば、ホスホロチエート骨格）を包含する。一般に、特定ヌクレオチドの類似体は、同一の塩基対合特異性を有し、例えば、Ａの類似体は、Ｔと塩基対合する。
本実施形態の導入方法について、以下に詳細を説明する。
【００２６】
＜導入工程＞
まず、植物細胞又は植物体に、ＣｊＣａｓ９又は該ＣｊＣａｓ９をコードする核酸と、標的二本鎖ポリヌクレオチドに特異的なガイドＲＮＡ又は該ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡとを、同時に導入すればよい。又は、タンパク質又は該タンパク質をコードする核酸を導入した後に、ガイドＲＮＡ又は該ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを連続的に導入してもよく、ガイドＲＮＡ又は該ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを導入した後に、タンパク質又は該タンパク質をコードする核酸を連続的に導入してもよい。
【００２７】
また、ＣｊＣａｓ９とガイドＲＮＡとを用いる場合、同時に導入することが好ましく、また、導入前にＣｊＣａｓ９及びガイドＲＮＡを混合し、ＣｊＣａｓ９−ガイドＲＮＡ複合体を形成させておくことが好ましい。
【００２８】
導入方法としては、例えば、アグロバクテリウム属細菌等の植物ウイルスを介する方法、電気穿孔（エレクトロポレーション）法、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、パーティクルガン法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の公知の方法が挙げられる。
また、アグロバクテリウム属細菌等の植物ウイルスを介する方法により導入する場合には、まず、宿主であるアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）へタンパク質又は該タンパク質をコードする核酸と、標的二本鎖ポリヌクレオチドに特異的なガイドＲＮＡ又は該ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡとを組み込む必要がある。
組み込む方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、ウィスカー法等の公知の方法が挙げられる。
導入工程に用いられる構成成分について、以下に詳細を説明する。
【００２９】
［植物］
導入対象となる植物の種類としては、特別な限定はなく、例えば、単子葉植物綱又は双子葉植物綱に属する植物のいずれでもよい。植物の種類としてより具体的には、例えば、イネ科（例えば、イネ、コムギ、オオムギ、ライ麦、トウモロコシ等）、ウリ科（例えば、キュウリ、メロン、スイカ、カボチャ、ニガウリ）、ナス科（例えば、トマト、ナス、ピーマン、パプリカ、トウガラシ、ジャガイモ、ペチュニア）、マメ科（例えば、インゲン、ソラマメ、アズキ、ダイズ、ササゲ、エンドウ）、キク科（例えば、ゴボウ、シュンギク、レタス、キク、ガーベラ、シネラリア、マリーゴールド）、アブラナ科（例えば、ハクサイ、キャベツ、ダイコン、カブ、コマツナ、ブロッコリー、チンゲンサイ、ストック）、アオイ科（例えば、オクラ、ワタ）、セリ科（例えば、セロリ、ニンジン、パセリ）、ユリ科（例えば、タマネギ、ニラ、アスパラガス、ネギ）、ナデシコ科（例えば、カスミソウ、カーネーション）、ミカン科（例えば、ミカン）、バラ科（例えば、バラ、イチゴ、リンゴ、ナシ、洋ナシ、モモ、ネクタリン）、アカザ科（例えば、ホウレンソウ）等に属する植物が挙げられ、これらに限定されない。
また、導入対象となる植物は、植物体全体であってもよく、植物体の一部（例えば葉、花弁、茎、根、種子等の植物器官；例えば、表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織等の植物組織）であってもよく、前記植物体から採取された植物細胞（カルスも含む）であってもよい。
【００３０】
［標的二本鎖ヌクレオチド］
植物体又は植物細胞内における標的二本鎖ヌクレオチドとしては、ＣｊＣａｓ９によって認識されるＰＡＭ配列を有していれば、特別な限定はない。
【００３１】
本明細書において、「ＰＡＭ（ｐｒｏｔｏ−ｓｐａｃｅｒ  ａｄｊａｃｅｎｔ  ｍｏｔｉｆ）配列」とは、標的二本鎖ポリヌクレオチド中に存在し、Ｃａｓ９により認識可能な配列を意味し、ＰＡＭ配列の長さや塩基配列は細菌種によって異なる。本実施形態におけるＰＡＭ配列の長さは、７塩基又は８塩基であることが好ましい。
ＰＡＭ配列として具体的には、例えば、以下の表１に示す塩基配列等が挙げられる。
【００３２】
【表１】
2018143208.tif 000002
【００３３】
なお、本明細書において、塩基配列内における「Ｎ」は、アデニン、シトシン、チミン、及びグアニンからなる群から選択された任意の１塩基を意味し、「Ａ」はアデニン、「Ｇ」はグアニン、「Ｃ」はシトシン、「Ｔ」はチミン、「Ｒ」はプリン骨格を有する塩基（アデニン又はグアニン）、「Ｙ」はピリミジン骨格を有する塩基（シトシン又はチミン）、「Ｍ」はプリン骨格の６位又はピリミジン骨格の２位にアミノ基を有する塩基（アデニン又はシトシン）を意味する。
【００３４】
一般的なＣａｓ９の一つであるＳｐＣａｓ９のＰＡＭ配列は「５’−ＮＧＧ−３’」であり、ゲノム中における出現頻度は、以下のとおりである。
１／４×１／４＝１／１６＝２／３２
これに対し、例えば、配列番号３で表されるＰＡＭ配列である場合、ゲノム中における出現頻度は、以下のとおりである。
３／４×１／２×１／２×１／２＝３／３２
よって、ＣｊＣａｓ９を用いたゲノム編集では、ＳｐＣａｓ９と同等程度のきめ細かなゲノム編集が可能である。
【００３５】
本明細書において、「ゲノム編集」とは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムやＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ−Ｌｉｋｅ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ（ＴＡＬＥＮ）等の技術により標的化された遺伝子組換え又は標的化された変異を実行することにより、特異的な遺伝子破壊やレポーター遺伝子のノックイン、内在性遺伝子の機能改変等を行う新しい遺伝子改変技術を意味する。
【００３６】
［ＣｊＣａｓ９］
（タンパク質）
本実施形態におけるタンパク質は、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）由来のＣａｓ９である。一般的なＣａｓ９の一つであるＳｐＣａｓ９（１３８６ａａ）と比較して、小さいタンパク質（９８４ａａ）である。そのため、ＣｊＣａｓ９はタンパク質の状態のまま細胞に導入しやすく、また導入された細胞内でもＳｐＣａｓ９やＳａＣａｓ９よりも分解されにくい傾向がある。
ＣｊＣａｓ９をタンパク質の状態のまま植物細胞に導入する場合、アグロバクテリウム属細菌等の植物ウイルスを用いて導入することが好ましい。
【００３７】
また、ＳｐＣａｓ９は、Ｔｙｐｅ  ＩＩ−Ａエンドヌクレアーゼであり、ＤＮＡヘリカーゼ活性が強いのに対し、ＣｊＣａｓ９は、Ｔｙｐｅ  ＩＩ−Ｃエンドヌクレアーゼであり、ＤＮＡヘリカーゼ活性が弱いことが知られている。
【００３８】
本実施形態におけるタンパク質として具体的には、下記（ａ）のアミノ酸配列を含む配列からなるタンパク質である。
（ａ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列。
【００３９】
配列番号１は、野生型ＣｊＣａｓ９の全長アミノ酸配列である。
配列番号２は、変異型ＣｊＣａｓ９の全長アミノ酸配列であって、野生型ＣｊＣａｓ９よりも強いＤＮＡ切断活性（ＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性）を有するように点変異を施したタンパク質のアミノ酸配列である。
なお、本明細書において、「エンドヌクレアーゼ」とは、ヌクレオチド鎖の途中を切断する酵素を意味する。よって、本実施形態のタンパク質は、ガイドＲＮＡにより誘導され、ＤＮＡ鎖の途中を切断する酵素活性を有する。
【００４０】
より具体的には、配列番号２は、配列番号１のアミノ酸番号９４６位のグルタミン酸（Ｇｌｕ，Ｅ）をアルギニン（Ａｒｇ，Ｒ）に置換することで、野生型ＣｊＣａｓ９よりも強いＤＮＡ切断活性（ＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性）を有する変異型ＣｊＣａｓ９のアミノ酸配列である。
【００４１】
本実施形態におけるタンパク質は、前記（ａ）のアミノ酸配列を含む配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質として、下記（ｂ）又は（ｃ）のアミノ酸配列を含む配列からなるタンパク質を含有する。
（ｂ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
【００４２】
前記（ａ）のアミノ酸配列を含む配列からなるタンパク質と機能的に同等であるためには８０％以上の同一性を有する。係る同一性としては、８０％以上が好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上が更に好ましく、９５％以上が特に好ましく、９９％以上が最も好ましい。
また、ここで、欠失、置換、若しくは付加されてもよいアミノ酸の数としては、１〜１５個が好ましく、１〜１０個がより好ましく、１〜５個が特に好ましい。
【００４３】
本実施形態のタンパク質は、ＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有するタンパク質であれば、上記（ａ）〜（ｃ）のいずれか一つのアミノ酸配列のみからなるタンパク質であってもかまわない。
【００４４】
本実施形態のタンパク質は、Ｎ末端又はＣ末端に核局在化シグナル（Ｎｕｃｌｅａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌ：ＮＬＳ）ペプチドが結合されていてもよい。
【００４５】
ＮＬＳとしては、例えば、アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号９）からなるポリペプチド、前記配列番号９からなるアミノ酸配列を有する、ＳＶ４０ウイルスラージＴ抗原のＮＬＳ（配列番号１０）等の単極型ＮＬＳ; アミノ酸配列ＭＰＴＥＥＲＶＲＫＲＫＥＳＮＲＥＳＡＲＲＳＲＹＲＫＡＡＨＬＫＣ（配列番号１１）からなるトウモロコシ転写因子Ｏ２のＮＬＳ等の双極型ＮＬＳ；アミノ酸配列ＣＹＭＩＳＥＡＬＲＫＡＩＧＫＲ（配列番号１２）からなるトウモロコシ転写因子ＲのＮＬＳ等のＭａｔ型ＮＬＳ等が挙げられ、これらに限定されない。
【００４６】
本実施形態におけるタンパク質は、例えば次のような方法により作成することができる。まず、前記ＰＡＭ認識が広範化されたＣａｓ９をコードする核酸を含むベクターを用いて、宿主を形質転換する。続いて、当該宿主を培養して前記タンパク質を発現させる。培地の組成、培養の温度、時間、誘導物質の添加等の条件は、形質転換体が生育し、前記タンパク質が効率よく産生されるよう、公知の方法に従って当業者が決定できる。また、例えば、選択マーカーとして抗生物質抵抗性遺伝子を発現ベクターに組み込んだ場合、培地に抗生物質を加えることにより、形質転換体を選択することができる。続いて、宿主が発現した前記タンパク質を適宜の方法により精製することにより、Ｃａｓ９が得られる。
宿主としては、特別な限定はなく、例えば、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、微生物（例えば、大腸菌、枯草菌、酵母等）等が挙げられる。
【００４７】
（核酸）
また、上述のタンパク質をコードする核酸としては、以下の（ｋ）〜（ｎ）のいずれか一つの塩基配列を含む配列からなり、且つ、ＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸が挙げられる。
（ｋ）配列番号４又は５で表される塩基配列、
（ｌ）配列番号４又は５で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠損、置換又は付加されている塩基配列、
（ｍ）配列番号４又は５で表される塩基配列で表される塩基配列と同一性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である塩基配列、
（ｎ）配列番号４又は５で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列。
【００４８】
上述のタンパク質が核酸の形態である場合、該核酸を発現ベクターに挿入し、植物細胞又は植物体に導入し、発現させることで、標的二本鎖ポリヌクレオチドへ高効率に塩基置換を導入することができる。
【００４９】
配列番号４は、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸の塩基配列である。また、配列番号５は、配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸の塩基配列である。
【００５０】
ここで、欠失、置換、若しくは付加されてもよい塩基の数としては、１〜３０個が好ましく、１〜１５個がより好ましく、１〜１０個が特に好ましく、１〜５個が最も好ましい。
【００５１】
本明細書において、「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ ＴＨＩＲＤ  ＥＤＩＴＩＯＮ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）に記載の方法が挙げられる。例えば、５×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣの組成：３Ｍ 塩化ナトリウム，０．３Ｍ クエン酸溶液，ｐＨ７．０）、０．１重量％ Ｎ−ラウロイルサルコシン、０．０２重量％のＳＤＳ、２重量％の核酸ハイブルダイゼーション用ブロッキング試薬、及び５０％フォルムアミドから成るハイブリダイゼーションバッファー中で、５５℃以上７０℃以下で数時間から一晩インキュベーションを行うことによりハイブリダイズさせる条件を挙げることができる。なお、インキュベーション後の洗浄の際に用いる洗浄バッファーとしては、好ましくは０．１重量％ＳＤＳ含有１×ＳＳＣ溶液、より好ましくは０．１重量％ＳＤＳ含有０．１×ＳＳＣ溶液である。
【００５２】
本実施形態において、上述のタンパク質をコードする核酸の塩基配列は、植物細胞における発現のためにコドン最適化されていてもよい。植物の種類としては、上述の［植物］において例示されたものと同様の物が挙げられる。一般に、コドン最適化とは、ネイティブのアミノ酸配列を維持しつつ、ネイティブの配列の少なくとも１つのコドンを、導入される生物種の遺伝子においてより頻繁に又は最も頻繁に使用されるコドンで置き換えることによって、導入される生物種における増強された発現のために核酸配列を改変するプロセスを指す。種々の種が、特定のアミノ酸の特定のコドンについて特定のバイアスを示す。コドンバイアス(生物間のコドン使用頻度における差異)は、ｍＲＮＡの翻訳効率と相関する場合が多く、これは、翻訳されているコドンの特性及び特定のｔＲＮＡの利用可能性にとりわけ依存すると考えられている。細胞中の選択されたｔＲＮＡの優勢は、一般に、ペプチド合成において最も頻繁に使用されるコドンの反映である。従って、遺伝子は、コドン最適化に基づいて、所与の生物における最適な遺伝子発現のために個別化され得る。コドン使用頻度表は、例えば、www.kazusa.or.jp/codon/（２０１７年２月２４日に訪問）に掲載されている「Codon  Usage  Database」において容易に入手可能であり、これらの表を用いて、コドンを最適化することができる（例えば、Nakamura,Y.ら「Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases:status for the year 2000」Nucl. Acids Res. 28:292 (2000)、参照）。特定の生物種における発現のために特定の配列をコドン最適化するためのコンピューターアルゴリズムについても、例えば、Gene Forge（Aptagen社;Jacobus、PA）等において入手可能である。本実施形態において、上述のタンパク質をコードする核酸の塩基配列中の１つ又は複数のコドンは、特定のアミノ酸について最も頻繁に使用されるコドンに対応する。
【００５３】
・発現ベクター
上述のタンパク質をコードする核酸は、上述のタンパク質をコードする核酸が発現ベクターにコードされている形であってもよい。上述のタンパク質をコードする核酸が発現ベクターにコードされている形で植物細胞又は植物体に導入する場合、導入後、植物細胞又は植物体内において発現させることができる。
発現ベクターとしては、例えば、プラスミド、ファージ、コスミド等を用いることができ、導入される植物細胞や導入方法に応じて適宜選択することができる。発現ベクターとしてより具体的には、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ、ｐＢＩ系、ｐＰＺＰ系のベクター等が挙げられる。特に、植物細胞又植物体へのベクターの導入法がアグロバクテリウム属細菌を介する方法である場合には、ｐＢＩ系又はｐＰＺＰ系のバイナリーベクターを用いることが好ましい。ｐＢＩ系のバイナリーベクターとして具体的には、例えば、ｐＢＩＧ、ｐＢＩＮ１９、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ２２１等が挙げられる。ｐＰＺＰ系のバイナリーベクターとして具体的には、例えば、ｐＰＺＰ１００、ｐＰＺＰ２００、ｐＰＺＰ５００、ｐＰＺＰ３４２５等が挙げられる。
【００５４】
上述のタンパク質をコードする核酸は、自己のプロモーター（すなわち、天然においてＣｊＣａｓ９をコードする遺伝子が作動可能に連結しているプロモーター）を作動可能な様式で含んでいてもよく、又は自己のプロモーターを含まない場合若しくは自己のプロモーター以外のプロモーターをさらに含む場合、任意の適切なプロモーターと作動可能に連結されていてもよい。プロモーターとしては、例えば、構成的プロモーター、植物体の一部において選択的に発現するプロモーター、誘導性プロモーター等が挙げられる。中でも、上述のタンパク質をコードする核酸は、構成的プロモーターの制御下にあることが好ましい。
【００５５】
また、発現ベクターにおいて、さらに種々の調節エレメントが宿主植物の細胞中で作動し得る状態で連結されていてもよい。調節エレメントとしては、例えば、マーカー遺伝子、プロモーター、ターミネーター、及びエンハンサー等があげられる。使用される発現ベクターの種類及び調節エレメントの種類は、形質転換の目的に応じて適宜選択すればよい。
【００５６】
ここでいう「マーカー遺伝子」は、形質転換植物の選抜を容易にするために使用されるものを意味する。マーカー遺伝子としては、例えば、ハイグロマイシン耐性を付与するためのハイグロマイシンフォスフォトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）遺伝子、カナマイシン耐性を付与するためのネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼＩＩ（ＮＰＴＩＩ）遺伝子、ビアラフォス耐性を付与するためのフォスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）遺伝子のような薬剤耐性遺伝子等が挙げられ、これらに限定されない。
【００５７】
ここでいう「プロモーター」は、マーカー遺伝子に作動可能に連結される、植物で発現するプロモーターを意味する。プロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、ノパリン合成酵素のプロモーター等が挙げられ、これらに限定されない。
【００５８】
ここでいう「ターミネーター」は、上述のタンパク質をコードする領域の下流に位置し、ＤＮＡがｍＲＮＡに転写される際の転写の終結、及びポリＡ配列の付加に関与する配列を意味する。ターミネーターとしては、例えば、ＣａＭＶ３５Ｓターミネーター、ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター（Ｔｎｏｓ）等が挙げられ、これらに限定されない。
【００５９】
ここでいう「エンハンサー」は、上述のタンパク質をコードする核酸の発現効率を高めるために用いられるものを意味する。エンハンサーとしては、例えば、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター内の上流側の配列を含むエンハンサー領域等が挙げられ、これらに限定されない。エンハンサーは、１つの発現ベクターあたり複数個用いられていてもよい。
【００６０】
［ガイドＲＮＡ］
（ＲＮＡ）
本明細書において、「ガイドＲＮＡ（ｇｕｉｄｅ  ＲＮＡ；ｇＲＮＡ）」とは、細菌及び古細菌において侵入外来核酸に対する獲得耐性を提供する適応免疫系を構成する、外来配列（ガイド配列）を含む小さなＲＮＡ断片（ＣＲＩＳＰＲ−ＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ）と該ｃｒＲＮＡと一部相補的なＲＮＡ（ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ）とを融合させたｔｒａｃｒＲＮＡ−ｃｒＲＮＡキメラのヘアピン構造を模倣したものを意味する。
本実施形態で用いられるｇＲＮＡは、ガイド配列を含むｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとが融合した状態で合成されたｔｒａｃｒＲＮＡ−ｃｒＲＮＡキメラであってもよく、ガイド配列を含むｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとを別々に作製し、導入前にアニーリングしてｔｒａｃｒＲＮＡ−ｃｒＲＮＡキメラとしたものであってもよく、ｔｒａｃｒＲＮＡの必須部分及びｃｒＲＮＡの融合によって作製される一本鎖ＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であってもよい。
【００６１】
本実施形態におけるｇＲＮＡは、標的遺伝子中のＰＡＭ配列の１塩基上流から、好ましくは２０塩基以上２６塩基以下、より好ましくは２２塩基以上２４塩基以下までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを５’末端領域に含むものである。さらに、標的遺伝子と非相補的な塩基配列を含み、一点を軸として対称に相補的な配列になるように並び、ヘアピン構造をとり得る塩基配列からなるポリヌクレオチドを１つ以上含んでいてもよい。
【００６２】
ｇＲＮＡは、単離されたＲＮＡ、発現ベクター内に組み込まれたＲＮＡの形であってもよい。発現ベクターとしては、上述の［ＣｊＣａｓ９］の「・発現ベクター」において例示されたものと同様のものが挙げられる。
【００６３】
ｇＲＮＡの製造方法としては、公知の方法（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ法等）を用いて製造することができる。具体的には、例えば、まず、５‘−Ｔ７プロモーター配列−ｇＲＮＡ（以下、「配列１」と称する場合がある。）となるように配置したＤＮＡ２本鎖を設計する。次いで、ＰＣＲ産物が上記の配列１になるように、配列１の中央でアニールする２本の長いプライマーを設計する。次いで、ＰＣＲ増幅で配列１からなるＤＮＡ２本鎖をＰＣＲ産物として得る。次いで、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ｂｕｆｆｅｒ、ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、及びピロリン酸分解酵素と、ＰＣＲ産物として得られたＤＮＡとを混合し、３７℃で２時間以上４時間以下程度インキュベーションする。次いで、ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ等を用いてｇＲＮＡを精製する。
【００６４】
（ＤＮＡ）
ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡが発現ベクターにコードされている形であってもよい。発現ベクターとしては、上述の［ＣｊＣａｓ９］の「・発現ベクター」において例示されたものと同様のものが挙げられる。
ｇＲＮＡをコードするＤＮＡが発現ベクターにコードされている形で植物細胞又は植物体に導入する場合、導入後、植物細胞又は植物体内において発現させることができる。
【００６５】
植物細胞又は植物体に、上述のタンパク質又は上述のタンパク質をコードする核酸と、ｇＲＮＡ又は該ｇＲＮＡをコードするＤＮＡを導入した後、植物細胞又は植物体内において、上述のタンパク質及びｇＲＮＡは複合体の形で、標的二本鎖ポリヌクレオチド中のＰＡＭ配列を認識し、ＰＡＭ配列近傍の塩基配列に塩基置換を導入する。
塩基置換が導入された植物細胞又は植物体の選抜には、予め薬剤耐性を付与するためのマーカー遺伝子を導入し、当該薬剤を含む培地等を用いて生育することにより行えばよい。さらに、塩基置換部位を特定するために、薬剤により選抜された植物細胞又は植物体からゲノムＤＮＡを抽出し、該ゲノムＤＮＡに含まれる標的二本鎖ポリヌクレオチドをＰＣＲにより増幅し、ＤＮＡシークエンスを行うことで確かめればよい。
【００６６】
≪標的二本鎖ポリヌクレオチドへの塩基置換の導入用キット≫
本発明の一実施形態に係る標的二本鎖ポリヌクレオチドへの塩基置換の導入用キットは、タンパク質又は該タンパク質をコードする核酸と、標的二本鎖ポリヌクレオチドに特異的なｇＲＮＡ又は該ｇＲＮＡをコードするＤＮＡと、を備え、前記タンパク質は、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれか一つのアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、ＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有するタンパク質である。
（ａ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
【００６７】
本実施形態の導入用キットによれば、標的となる塩基に制限がなく、標的二本鎖ポリヌクレオチドへ高効率に塩基置換を導入することができる。
【００６８】
＜ＣｊＣａｓ９＞
［タンパク質］
本実施形態におけるタンパク質は、上述の≪標的二本鎖ポリヌクレオチドへの塩基置換の導入方法≫の［ＣｊＣａｓ９］において記載されたものと同様のものが挙げられる。
【００６９】
［核酸］
本実施形態における上述のタンパク質をコードする核酸は、上述のタンパク質をコードする核酸が発現ベクターにコードされている形であってもよい。上述のタンパク質をコードする核酸が発現ベクターにコードされている形で植物細胞又は植物体に導入する場合、導入後、植物細胞又は植物体内において発現させることができる。
発現ベクターとしては、≪標的二本鎖ポリヌクレオチドへの塩基置換の導入方法≫の［ＣｊＣａｓ９］において記載されたものと同様のものが挙げられる。
【００７０】
＜ｇＲＮＡ＞
［ＲＮＡ］
本実施形態におけるｇＲＮＡは、標的遺伝子中のＰＡＭ配列の１塩基上流から、好ましくは２０塩基以上２６塩基以下、より好ましくは２２塩基以上２４塩基以下までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを５’末端領域に含むものである。
本実施形態におけるｇＲＮＡの詳細は、上述の≪標的二本鎖ポリヌクレオチドへの塩基置換の導入方法≫の［ｇＲＮＡ］において記載されたものと同様のものが挙げられる。
【００７１】
［ＤＮＡ］
ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡが発現ベクターにコードされている形であってもよい。発現ベクターとしては、上述の≪標的二本鎖ポリヌクレオチドへの塩基置換の導入方法≫の［ｇＲＮＡ］において例示されたものと同様のものが挙げられる。
ｇＲＮＡをコードするＤＮＡが発現ベクターにコードされている形で植物細胞又は植物体に導入する場合、導入後、植物細胞又は植物体内において発現させることができる。
【００７２】
＜その他構成＞
［培地］
本実施形態の導入用キットは、さらに、植物細胞又は植物体を形質転換する際に使用する培地等を備えていてもよい。培地等は、植物の種類に応じて適宜選択すればよい。例えば、単子葉植物の形質転換に用いられる導入用キットである場合、オーキシン（例えば、２，４−Ｄ、インドール酢酸（ＩＡＡ）等）、ジベレリン、サイトカイニン等の植物成長因子；Ｎ６Ｄ培地（参考文献：再公表ＷＯ２００５／０９２０８２号公報）；２Ｎ６−ＡＳ培地（参考文献：Hiei Y, et al., “Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA”, The Plant Journal, vol.6, issue 2, p271-282, 1994.）、選抜用薬剤（例えば、ハイグロマイシン、カナマイシン、ビアラフォス等）等を備えていてもよい。
【００７３】
≪変異型ＣｊＣａｓ９≫
本発明の一実施形態に係るタンパク質は、以下の（ｄ）〜（ｆ）のいずれか一つのアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、ＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有する。
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号２で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号９４６位以外の部位において、１〜数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
（ｆ）配列番号２で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号９４６位以外の部位において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
【００７４】
本実施形態のタンパク質によれば、標的となる塩基に制限がなく、標的二本鎖ポリヌクレオチドへ野生型ＣｊＣａｓ９よりも高効率に塩基置換を導入することができる。
【００７５】
本実施形態におけるタンパク質として具体的には、下記（ｄ）のアミノ酸配列を含む配列からなるタンパク質である。
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列。
【００７６】
配列番号２は、変異型ＣｊＣａｓ９の全長アミノ酸配列であって、野生型ＣｊＣａｓ９よりも強いＤＮＡ切断活性（ＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性）を有するように点変異を施したタンパク質のアミノ酸配列である。
より具体的には、配列番号２は、上述の野生型ＣｊＣａｓ９のアミノ酸配列である配列番号１のアミノ酸番号９４６位のグルタミン酸（Ｇｌｕ，Ｅ）をアルギニン（Ａｒｇ，Ｒ）に置換することで、野生型ＣｊＣａｓ９よりも強いＤＮＡ切断活性（ＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性）を有する変異型ＣｊＣａｓ９のアミノ酸配列である。
【００７７】
本実施形態におけるタンパク質は、前記（ｄ）のアミノ酸配列を含む配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質として、下記（ｅ）又は（ｆ）のアミノ酸配列を含む配列からなるタンパク質を含有する。
（ｅ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
（ｆ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
【００７８】
前記（ｄ）のアミノ酸配列を含む配列からなるタンパク質と機能的に同等であるためには８０％以上の同一性を有する。係る同一性としては、８０％以上が好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上が更に好ましく、９５％以上が特に好ましく、９９％以上が最も好ましい。
また、ここで、欠失、置換、若しくは付加されてもよいアミノ酸の数としては、１〜１５個が好ましく、１〜１０個がより好ましく、１〜５個が特に好ましい。
【００７９】
本実施形態のタンパク質は、ＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有するタンパク質であれば、上記（ｄ）〜（ｆ）のいずれか一つのアミノ酸配列のみからなるタンパク質であってもかまわない。
【００８０】
本実施形態のタンパク質は、Ｎ末端又はＣ末端に核局在化シグナル（Ｎｕｃｌｅａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌ：ＮＬＳ）ペプチドが結合されていてもよい。ＮＬＳとしては、上述の≪標的二本鎖ポリヌクレオチドへの塩基置換の導入方法≫の［ＣｊＣａｓ９］において例示されたものと同様のものが挙げられる。
【００８１】
≪変異型ＣｊＣａｓ９をコードする遺伝子≫
本発明の一実施形態に係る遺伝子は、以下の（ｇ）〜（ｊ）のいずれか一つの塩基配列を含む配列からなり、且つ、ＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有するタンパク質をコードする。
（ｇ）配列番号５で表される塩基配列、
（ｈ）配列番号５で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠損、置換又は付加されている塩基配列、
（ｉ）配列番号５で表される塩基配列において、８０％以上の同一性を有する塩基配列、
（ｊ）配列番号５で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列
【００８２】
本実施形態の遺伝子によれば、発現ベクターに挿入し宿主に形質転換することで、標的となる塩基に制限がなく、標的二本鎖ポリヌクレオチドへ野生型ＣｊＣａｓ９よりも高効率に塩基置換を導入可能な変異型ＣｊＣａｓ９を得ることができる。
【００８３】
配列番号５は、配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列である。
【００８４】
ここで、欠失、置換、若しくは付加されてもよい塩基の数としては、１〜３０個が好ましく、１〜１５個がより好ましく、１〜１０個が特に好ましく、１〜５個が最も好ましい。
【００８５】
本実施形態において、上述のタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列は、植物細胞における発現のためにコドン最適化されていてもよい。
【００８６】
本実施形態における上述のタンパク質をコードする遺伝子は、上述のタンパク質をコードする遺伝子が発現ベクターにコードされている形であってもよい。上述のタンパク質をコードする遺伝子が発現ベクターにコードされている形で植物細胞又は植物体に導入する場合、導入後、植物細胞又は植物体内において発現させることができる。
発現ベクターとしては、≪標的二本鎖ポリヌクレオチドへの塩基置換の導入方法≫の［ＣｊＣａｓ９］において記載されたものと同様のものが挙げられる。
【００８７】
≪変異型ＣｊＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体≫
本発明の一実施形態に係るタンパク質−ｇＲＮＡ複合体は、前記タンパク質と、標的二本鎖ポリヌクレオチドに特異的なガイドＲＮＡと、を備える。
【００８８】
本実施形態のタンパク質−ｇＲＮＡ複合体によれば、標的となる塩基に制限がなく、標的二本鎖ポリヌクレオチドへ野生型ＣｊＣａｓ９よりも高効率に塩基置換を導入可能な変異型ＣｊＣａｓ９を得ることができる。
【００８９】
上述のタンパク質及びｇＲＮＡは、iｎ  ｖｉｔｒｏ及びiｎ  ｖｉｖｏにおいて、温和な条件で混合することで、タンパク質−ＲＮＡ複合体を形成することができる。温和な条件とは、タンパク質が分解又は変性しない程度の温度及びｐＨを示しており、温度は４℃以上４０℃以下が好ましく、ｐＨは４以上１０以下が好ましい。
また、前記タンパク質及び前記ガイドＲＮＡを混合し、インキュベートする時間は、０．５時間以上１時間以下が好ましい。前記タンパク質及び前記ガイドＲＮＡによる複合体は、安定しており、室温で数時間静置しても安定性を保つことができる。
【実施例】
【００９０】
以下、実施例及び比較例等を挙げて本発明をさらに詳述するが、本発明はこれらの実施例等に限定されるものではない。
【００９１】
［実施例１］
１．発現ベクターの構築
ＣｊＣａｓ９のアミノ酸配列に基づき、シロイヌナズナ用にコドンを最適化した。コドンの最適化は、ＧｅｎｅＡｒｔ (サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)のアルゴリズムにより行った。コドン最適化後の塩基配列を配列番号３に示す。
次いで、カリフラワーモザイクウイルス由来２ｘ３５Ｓ  プロモーターの下流に、３×ＦＬＡＧ−ｔａｇ、３×ＮＬＳ（核移行シグナル）及びＣｊＣａｓ９（シロイヌナズナ最適化）をこの順に繋いで、ＣｊＣａｓ９の発現ベクターを構築した。また、薬剤耐性マーカー遺伝子として、ハイグロマイシン耐性を付与するＨＲＴ遺伝子を用いた。
【００９２】
２．ｓｇＲＮＡの設計
イネの２つの遺伝子（ＡＣＳ１遺伝子及びＲｂｏｈＢ遺伝子）上に、それぞれ２つの標的配列を設定した。それぞれの標的配列の長さは２２塩基であり、ＰＡＭ配列として配列番号３に示す「ＮＮＮＶＲＹＭ」を有する。なお、標的配列を配列番号１３〜１６、ＰＡＭ配列を配列番号１７〜２０に示す。
ｓｇＲＮＡは、以下の表２に示す標的配列を有するように設計した。なお、各ｓｇＲＮＡの全長配列は、配列番号２１〜２４に示す。
【００９３】
【表２】
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【００９４】
３．イネの形質転換
日本晴を用いて、アグロバクテリウムによる公知の導入方法（参考文献：「Toki S, et al., “Rapid and efficientAgrobacterium-mediated transformation in rice”, Plant Mol. Biol. Rep. vol.15, Issue 1, p16, 1997.」、再公表ＷＯ２００５／０９２０８２号公報）により、イネの形質転換を行った。
【００９５】
（１）種子の滅菌及び前培養
具体的には、まず、イネの種子を７０％エタノールで３０秒、続けて２．５％次亜塩素酸ナトリウム溶液で２０分間滅菌した後、滅菌水で洗浄し、滅菌した。次いで、滅菌後のイネの種子を、オーキシン（２，４−Ｄ）を含むＮ６Ｄ培地に置床し、３０℃明条件下で１〜３日間前培養しアグロバクテリウムによる感染に供した。
なお、Ｎ６Ｄ培地の組成は、以下のとおりである。
３０ｇ／Ｌ  スクロース、０．３ｇ／Ｌ  カザミノ酸、２．８ｇ／Ｌ  プロリン、２ｍｇ／Ｌ  オーキシン（２，４−Ｄ）、４ｇ／Ｌ  ゲルライト、ｐＨ５．８。
【００９６】
（２）アグロバクテリウムの形質転換
「１．発現ベクターの構築」で得られたＣｊＣａｓ９の発現ベクター及び「２．ｓｇＲＮＡの設計」にて得られたｓｇＲＮＡ（ｓｇＡＣＳ１−１、ｓｇＡＣＳ１−２、ｓｇＲｂｏｈＢ−１、又はｓｇＲｂｏｈ−２）をＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ＥＨＡ１０５菌に形質転換した。
【００９７】
（３）アグロバクテリウムの感染
次いで、前培養したイネの種子をそのままアグロバクテリウム菌液に浸せきした後、２Ｎ６−ＡＳ培地（参考文献：Hiei Y, et al., “Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA”, The Plant Journal, vol.6, issue 2, p271-282, 1994.）に移植し、暗黒下２８℃で共存培養を行った。
なお、２Ｎ６−ＡＳ培地の組成は、以下のとおりである。
Ｎ６の無機塩類及びビタミン類（参考文献：Chu C. C., “The N6 medium and its applications to anther culture of cereal crops”, Proc. Symp. Plant Tissue Culture, Science Press, Peking, p43-50, 1978.）、１ｇ／Ｌ  カザミノ酸、２ｍｇ／Ｌ  ２，４−Ｄ、３０ｇ／Ｌ  ショ糖、２ｇ／Ｌ  ゲルライト、アセトシリンゴン２０ｍｇ／ｍＬ）。
【００９８】
（４）アグロバクテリウムの形質転換カルスの選抜
共存培養の完了後、５０ｍｇ／Ｌ  ハイグロマイシンを含むＮ６Ｄ培地を用いてアグロバクテリウムを前培養した種子から洗い流した。次いで、形質転換したカルスを選抜するために、形質転換処理種子を薬剤として５０ ｍｇ／Ｌ  ハイグロマイシンを含むＮ６Ｄ培地（選抜培地）に置床した。選抜培地上における形質転換の検出は、置床後のカルスの出現及び続くＣＡＰＳ解析により評価した。
【００９９】
（５）ＣＡＰＳ（Ｃｌｅａｖｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｅｉｄ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）解析による変異カルスの検出
次いで、ハイグロマイシン耐性カルスからゲノムＤＮＡを抽出し、標的配列領域をＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ には、一般的なＴａｑよりも１０倍正確性が高いＫＯＤ−Ｆｘ  ｎｅｏ（東洋紡社製）を用いた。次いで、制限酵素（ＨｉｎｆＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、又はＸｈｏＩ）で処理後、ＭｕｌｔｉＮＡ（島津製作所製）で電気泳動した。結果を図１Ａ〜図１Ｄに示す。
【０１００】
図１Ａから、ｓｇＡＣＳ１−１を導入し形質転換されたカルスでは、制限酵素ＨｉｎｆＩで切断されない１８３ｂｐのＤＮＡ断片が検出された。ｓｇＡＣＳ１−１を導入し、変異が検出されたカルスにおける変異割合は２％以上９％以下であった。
図１Ｂから、ｓｇＡＣＳ１−２を導入し形質転換されたカルスでは、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断されない１８３ｂｐのＤＮＡ断片が検出された。ｓｇＡＣＳ１−２を導入し、変異が検出されたカルスにおける変異割合は２％以上４％以下であった。
図１Ｃから、ｓｇＲｂｏｈＢ−１を導入し形質転換されたカルスでは、制限酵素ＸｈｏＩで切断されない１７９ｂｐのＤＮＡ断片が検出された。ｓｇＲｂｏｈＢ−１を導入し、変異が検出されたカルスにおける変異割合は２．５％以上８．４％以下であった。
図１Ｄから、ｓｇＲｂｏｈＢ−２を導入し形質転換されたカルスでは、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断されない１８９ｂｐのＤＮＡ断片が検出された。ｓｇＲｂｏｈＢ−２を導入し、変異が検出されたカルスにおける変異割合は２．５％以上１０．１％以下であった。
【０１０１】
（６）変異パターンの解析
変異が検出されたカルスのＤＮＡを鋳型にして、ＫＯＤ−Ｆｘ  ｎｅｏ（東洋紡社製）を用いてＰＣＲを行った。次いで、ＰＣＲ産物を制限酵素で処理後、精製した。次いで、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−Ｔｏｐｏ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）にクローニングした。形質転換により得られた薬剤耐性大腸菌のコロニーに対して、コロニーＰＣＲを行った。次いで、得られたＰＣＲ産物を鋳型にして、クローニングしたＰＣＲ産物領域をＤＮＡシークエンシングした。結果を図２Ａ〜図２Ｂに示す。また、図２Ａ〜図２Ｂにおける各標的配列近傍の塩基配列を配列番号２５〜２８に示す。
また、変異を検出した合計８７サンプルの変異パターンを以下の表３に示す。
【０１０２】
【表３】
2018143208.tif 000004
【０１０３】
図２Ａ〜図２Ｄから、各標的配列において塩基置換変異が検出された。
また、表２から、変異を検出した合計８７サンプルにおいて、すべて塩基置換変異で、欠失変異及び挿入変異は見られなかった。
また、１置換変異のパターンとしては、Ｇ（グアニン）がＴ（チミン）、Ａ（アデニン）、又はＣ（シトシン）に、ＡがＧに、ＴがＣ又はＧに、ＣがＡ、Ｔ、又はＧに置換されるパターンが確認された。
【０１０４】
４．考察
これまで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの実験から、ＣｊＣａｓ９がヌクレアーゼ活性を持ち、ＣｊＣａｓ９のＰＡＭ配列が「ＮＮＮＮＡＣＡ」（配列番号２９）であることが報告されていた（Fonfara I., et al., “Phylogeny of Cas9 determines functional exchangeability of dual-RNA and Cas9 among orthologous type II CRISPR-Cas systems”, Nucleic Acids Res., vol.42, no.4, p2577-2590, 2014.）。しかし、これまで、植物において変異導入活性を持つことは不明であった。
以上の結果から、イネにおいて、ＣｊＣａｓ９は変異導入活性を持つことが明らかとなった。
【０１０５】
また、ＣｊＣａｓ９を含む、一般的なＣａｓ９であるＳｐＣａｓ９、ＳａＣａｓ９、又はＣｐｆ１により導入される変異パターンは、殆どが欠失又は挿入変異であり、塩基置換変異は非常に稀であった。一方、本実施例では、イネにおいてＣｊＣａｓ９により導入された変異は、全て塩基置換変異であった。
欠失又は挿入変異は、標的遺伝子の機能を喪失させる目的には適している。これに対し、塩基置換変異は、標的遺伝子の機能を目的に合わせて加工することに適している。また、塩基置換変異により新たな機能を与えるだけでなく、変異が誘導された遺伝子を野生型に戻すことも可能である。
【産業上の利用可能性】
【０１０６】
本発明の一実施形態に係る標的二本鎖ポリヌクレオチドへの塩基置換の導入方法によれば、標的となる塩基に制限がなく、標的二本鎖ポリヌクレオチドへ高効率に塩基置換を導入することができる。また、本発明の一実施形態に係る標的二本鎖ポリヌクレオチドへの塩基置換の導入方法は、植物の有効な品種改良法となり得る。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【配列表】
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