(57)【要約】【課題】細胞表面抗原のイムノバインダーを同定するための方法の提供。【解決手段】本発明は、細胞表面抗原に特異的に結合し得るイムノバインダー（例えば、ｓｃＦｖ抗体）を同定するための方法、および上記方法に従って同定された組成物を提供する。本発明は、細胞表面抗原に特異的に結合し得るイムノバインダー（例えば、ｓｃＦｖ抗体）を同定するための方法を提供する。本発明の方法は、一般に、標識された抗原発現細胞と、標識されたイムノバインダー発現細胞とを接触させる工程および上記抗原発現細胞に結合するイムノバインダー発現細胞を、セルソーターを使用して単離する工程を包含する。【選択図】図１
2018196395.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞表面抗原のイムノバインダーを同定するための方法など。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（背景情報）
抗体、その結合体および誘導体を包含するイムノバインダー（ｉｍｍｕｎｏｂｉｎｄｅｒ）は、治療剤および診断剤として、非常に産業的に重要である。抗体調製もしくはスクリーニングのための伝統的な方法は、通常は、可溶性の抗原を利用する。しかし、特定の膜結合タンパク質抗原について、上記抗原上のコンフォメーションエピトープ（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｅｐｉｔｏｐｅ）は、上記抗原が、上記膜から可溶化される場合に改変され、抗体調製もしくはスクリーニングの失敗を生じる。さらに、イムノブロッティング法およびアフィニティークロマトグラフィー法における１つの重要な問題は、上記抗原に対して中程度のアフィニティーを有する抗体が選択されることである。このことは、多くの交叉反応性もしくは粘着性の抗体の包含を許容してしまい、連続したスクリーニング手順において負担を引き起こす。膜結合抗原を発現する細胞は、抗体調製に直接使用されてきたが、細胞表面抗原に対する高アフィニティー抗体を検出しかつ富化し得る効率的なスクリーニング方法はなお、不足している。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００２】
（発明の要旨）
本発明は、細胞表面抗原に特異的に結合し得るイムノバインダー（例えば、ｓｃＦｖ抗体）を同定するための方法を提供する。本発明の方法は、一般に、標識された抗原発現細胞と、標識されたイムノバインダー発現細胞とを接触させる工程および上記抗原発現細胞に結合するイムノバインダー発現細胞を、セルソーターを使用して単離する工程を包含する。これら方法は、内在性膜タンパク質（例えば、ＧＰＣＲ）に存在するコンフォメーションエピトープに対するイムノバインダーの迅速かつ効率的な同定のために特に有用である。本発明はまた、本発明の方法を使用して同定された、単離されたイムノバインダーおよびイムノバインダーをコードする核酸を提供する。
【０００３】
一局面において、本発明は、目的の細胞表面抗原に特異的に結合するイムノバインダーを同定するための方法を提供する。上記方法は、第１のソート可能（ｓｏｒｔａｂｌｅ）な標識に作動可能に連結した複数のイムノバインダー発現細胞を提供する工程；第２のソート可能な標識に作動可能に連結した複数の抗原発現細胞を提供する工程であって、ここで上記目的の抗原は、上記抗原発現細胞の表面にディスプレイされる、工程；上記抗原発現細胞と、上記イムノバインダー発現細胞とを接触させる工程；および上記複数のイムノバインダー発現細胞から、上記抗原発現細胞に特異的に結合し得る１個以上のイムノバインダー発現細胞を、セルソーター（例えば、蛍光細胞分析分離装置）を使用して分離する工程であって、ここで単一の細胞複合体（例えば、抗原と、Ｂ細胞レセプターとの間で形成される複合体）における上記第１のおよび第２のソート可能な標識の存在は、抗原発現細胞へのイムノバインダー発現細胞の結合を示し、それによって、目的の抗原に結合するイムノバインダーを同定する、工程を包含する。
【０００４】
いくつかの実施形態において、上記分離されたイムノバインダー発現細胞は、クローン的に単離される。いくつかの実施形態において、上記イムノバインダー発現細胞は、クローン性増殖に供される。他の実施形態において、上記イムノバインダーをコードする核酸配列は、イムノバインダー発現細胞から単離される。上記イムノバインダーをコードする核酸配列を単離するのに適した方法としては、ＰＣＲ（例えば、単一細胞ＰＣＲ（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ＰＣＲ））が挙げられる。上記イムノバインダーをコードする核酸配列は、上記細胞がクローン的に単離された後および／もしくはクローン性増殖の後に、単離され得る。
【０００５】
いくつかの実施形態において、本発明の方法を使用して単離されたイムノバインダー発現細胞は、上記イムノバインダーを機能的に特徴付けるために、細胞ベースのアッセイに供される。適切な細胞ベースのアッセイとしては、ＣＥＬＩＳＡが挙げられる。
【０００６】
いくつかの実施形態において、上記イムノバインダーは抗体である。このような抗体としては、マウス抗体、ウサギ抗体、ウサギ化抗体、ニワトリ抗体、ラクダ抗体、ラクダ化抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体およびキメラ抗体が挙げられる。適切な抗体形式としては、Ｆａｂ、Ｄａｂ、ナノボディーおよびｓｃＦｖが挙げられるが、これらに限定されない。
【０００７】
いくつかの実施形態において、上記目的の抗原は、外因性遺伝子から発現される。他の実施形態において、上記目的の抗原は、遺伝的に操作された抗原である。他の実施形態において、上記目的の抗原は、内在性膜タンパク質である。適切な内在性膜タンパク質としては、ＧＰＣＲ（例えば、ＣＸＣＲ２）もしくはイオンチャネルが挙げられるが、これらに限定されない。
【０００８】
いくつかの実施形態において、上記第１のもしくは第２のソート可能な標識は、蛍光標識である。適切な蛍光標識としては、蛍光タンパク質、抗体／蛍光体結合体（ｆｌｕｏｒ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）および蛍光性細胞標識が挙げられるが、これらに限定されない。
【０００９】
いくつかの実施形態において、上記抗原発現細胞は、酵母細胞もしくは哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）である。いくつかの実施形態において、上記抗原発現細胞は、外因性抗原を発現する。いくつかの実施形態において、上記抗原発現細胞は、発現ベクターでトランスフェクトされる。
【００１０】
いくつかの実施形態において、上記イムノバインダー発現細胞は、酵母細胞もしくは哺乳動物細胞である。適切な哺乳動物細胞としては、Ｂ細胞（例えば、ウサギＢ細胞）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、上記Ｂ細胞は、免疫化した動物（例えば、ＤＮＡワクチン接種によって免疫化した動物）から単離される。いくつかの実施形態において、上記イムノバインダー発現細胞は、発現ベクターから発現されるイムノバインダーを含む。
【００１１】
別の局面において、本発明は、本発明の方法によって同定されたイムノバインダーをコードする単離された核酸分子を提供する。
【００１２】
別の局面において、本発明は、目的の抗原に結合し得るイムノバインダーを産生するための方法を提供し、上記方法は、本発明の方法によって同定されたイムノバインダーをコードする核酸配列を、上記コードされたイムノバインダーが産生されるように、発現環境に導入する工程を包含する。
【００１３】
別の局面において、本発明は、本発明の方法によって産生されたイムノバインダーを提供する。
【００１４】
別の局面において、本発明はまた、目的の細胞表面抗原に特異的に結合するＢ細胞クローンを同定するための方法を提供し、上記方法は、動物を、細胞表面抗原をコードするＤＮＡで免疫化する工程；上記免疫化した動物からＢ細胞を単離する工程；上記Ｂ細胞を、第１のソート可能な標識で標識する工程；第２のソート可能な標識に作動可能に連結した複数の抗原発現細胞を提供する工程であって、ここで上記目的の抗原は、上記抗原発現細胞の表面にディスプレイされる、工程；上記抗原発現細胞と、上記Ｂ細胞とを接触させる工程；および上記複数のＢ細胞から、上記抗原発現細胞に特異的に結合し得る１個以上のＢ細胞を、セルソーターを使用して分離する工程であって、ここで単一の細胞複合体における上記第１のおよび第２のソート可能な標識の存在は、抗原発現細胞へのＢ細胞の結合を示し、それによって、目的の抗原に結合するＢ細胞クローンを同定する、工程を包含する。
本発明の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
目的の細胞表面抗原に特異的に結合するイムノバインダーを同定するための方法であって、該方法は、
（ａ）第１のソート可能な標識に作動可能に連結された複数のイムノバインダー発現細胞を提供する工程；
（ｂ）第２のソート可能な標識に作動可能に連結した複数の抗原発現細胞を提供する工程であって、ここで該目的の抗原は、該抗原発現細胞の表面にディスプレイされる、工程；
（ｃ）該抗原発現細胞と、該イムノバインダー発現細胞とを接触させる工程；および
（ｄ）該複数のイムノバインダー発現細胞から、該抗原発現細胞に特異的に結合し得る１個以上のイムノバインダー発現細胞を、セルソーターを使用して分離する工程であって、ここで単一の細胞複合体における該第１のソート可能な標識および該第２のソート可能な標識の存在は、抗原発現細胞へのイムノバインダー発現細胞の結合を示し、それによって、目的の抗原に結合するイムノバインダーを同定する、工程、
を包含する、方法。
（項目２）
前記工程（ｄ）において得られたイムノバインダー発現細胞をクローン的に単離し、必要に応じて、続いて、該クローン的に単離された細胞のクローン性増殖を行う工程をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記イムノバインダーをコードする核酸配列を、前記単離されたイムノバインダー発現細胞から得る工程をさらに包含する、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記イムノバインダーをコードする核酸配列は、ＰＣＲによって得られる、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記ＰＣＲは、単一細胞ＰＣＲである、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記単離されたイムノバインダー発現細胞を、細胞ベースのアッセイに供して、前記イムノバインダーを機能的に特徴付ける工程をさらに包含する、項目２に記載の方法。
（項目７）
前記細胞ベースのアッセイが、ＣＥＬＩＳＡである、項目６に記載の方法。
（項目８）
細胞複合体が、抗原と、Ｂ細胞レセプターとの間に形成される、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記イムノバインダーは抗体である、上記項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０）
前記抗体は、マウス抗体、ウサギ抗体、ニワトリ抗体、ラクダ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体およびキメラ抗体からなる群より選択される、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記抗体は、全長免疫グロブリン、Ｆａｂ、Ｄａｂおよびナノボディーからなる群より選択される、項目９に記載の方法。
（項目１２）
前記抗体は、ｓｃＦｖである、項目９に記載の方法。
（項目１３）
前記目的の抗原は、外因性遺伝子から発現される、上記項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目１４）
前記目的の抗原は、遺伝的に操作された抗原である、上記項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目１５）
前記目的の抗原は、内在性膜タンパク質である、上記項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目１６）
前記内在性膜タンパク質は、ＧＰＣＲである、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記ＧＰＣＲは、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ６、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ８、ＣＦＴＲ、ＣＩＣ−１、ＣＩＣ−２、ＣＩＣ−４、ＣＩＣ−５、ＣＩＣ−７、ＣＩＣ−Ｋａ、ＣＩＣ−Ｋｂ、Ｂｅｓｔｒｏｐｈｉｎｓ、ＴＭＥＭ１６Ａ、ＧＡＢＡレセプター、グリシンレセプター、ＡＢＣ輸送体、ＮＡＶ１．１、ＮＡＶ１．２、ＮＡＶ１．３、ＮＡＶ１．４、ＮＡＶ１．５、ＮＡＶ１．６、ＮＡＶ１．７、ＮＡＶ１．８、ＮＡＶ１．９、スフィンゴシン−１−ホスフェートレセプター（Ｓ１Ｐ１Ｒ）およびＮＭＤＡチャネルからなる群より選択される、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記内在性膜タンパク質は、イオンチャネルである、項目１５に記載の方法。
（項目１９）
前記第１のソート可能な標識もしくは前記第２のソート可能な標識は、蛍光標識である、上記項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目２０）
前記蛍光標識は、蛍光タンパク質、抗体／蛍光体結合体および蛍光性細胞標識からなる群より選択される、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記セルソーターは、蛍光細胞分析分離装置である、上記項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目２２）
前記抗原発現細胞は、酵母細胞、酵母スフェロプラストもしくは哺乳動物細胞である、上記項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目２３）
前記抗原発現細胞は、ヒト細胞である、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記抗原発現細胞は、外因性抗原を発現する、上記項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目２５）
前記抗原発現細胞は、発現ベクターでトランスフェクトされる、上記項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目２６）
前記イムノバインダー発現細胞は、酵母細胞もしくは哺乳動物細胞である、上記項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目２７）
前記イムノバインダー発現細胞は、Ｂ細胞である、上記項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目２８）
前記Ｂ細胞は、ウサギＢ細胞である、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記Ｂ細胞は、免疫化した動物から単離される、項目２７または２８のいずれか１項に記載の方法。
（項目３０）
前記動物は、ＤＮＡワクチン接種によって免疫化される、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記イムノバインダー発現細胞は、発現ベクターから発現されるイムノバインダーを含む、上記項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目３２）
項目１〜３１のいずれか１項に記載の方法によって選択されるイムノバインダーをコードする、単離された核酸分子。
（項目３３）
目的の抗原に結合し得るイムノバインダーを生成する方法であって、該方法は、項目３２に記載のイムノバインダーをコードする核酸配列を、該コードされたイムノバインダーが生成されるように、発現環境に導入する工程を包含する、方法。
（項目３４）
項目３３に記載の方法によって生成される、イムノバインダー。
（項目３５）
目的の細胞表面抗原に特異的に結合するＢ細胞クローンを同定するための方法であって、該方法は：
（ａ）動物を、細胞表面抗原をコードするＤＮＡで免疫化する工程、
（ｂ）Ｂ細胞を、免疫化した該動物から単離する工程、
（ｃ）該Ｂ細胞を、第１のソート可能な標識で標識する工程；
（ｄ）第２のソート可能な標識に作動可能に連結した複数の抗原発現細胞を提供する工程であって、ここで該目的の抗原は、該抗原発現細胞の表面にディスプレイされる、工程；
（ｅ）該抗原発現細胞と、該Ｂ細胞とを接触させる工程；および
（ｆ）複数の該Ｂ細胞から、該抗原発現細胞に特異的に結合し得る１個以上のＢ細胞を、セルソーターを使用して分離する工程であって、ここで単一の細胞複合体における該第１のソート可能な標識および該第２のソート可能な標識の存在は、抗原発現細胞へのＢ細胞の結合を示し、それによって、目的の抗原に結合するＢ細胞クローンを同定する、工程、
を包含する、方法。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、蛍光抗体２で標識したＢ細胞１が、細胞内色素３で染色した標的発現細胞と相互作用することを模式的に示す（４：選択した標的／抗原；５：Ｂ細胞レセプター（ＢＣＲ））。
【図２】図２は、ＥＳＢＡ９０３可溶性標的に結合しているウサギＢ細胞のＦＡＣＳ選択プロセスを示す。図２Ａ：リンパ球は、前方散乱および側方散乱によってゲート制御した（ｇａｔｅ）。図２Ｂ：それらの中で、ＩｇＧ＋ＩｇＭ−細胞（おそらく、記憶Ｂ細胞）を選択した（丸で示される）。図２Ｃ：ＥＳＢＡ９０３−ＰＥおよびＥＳＢＡ９０３−ＰｅｒＣＰで二重染色された細胞（丸で示される）は、ＥＳＢＡ９０３に対する高アフィニティーＩｇＧをコードすると予測される。最も明るい蛍光を示す細胞（丸で囲まれていない）を、９６ウェルプレートにおいてソートした。
【図３】図３は、抗ＴＮＦα抗体（ＰＥ標識した）でコートしたビーズが、ＴＮＦαをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に結合することを示す（上側パネル）。抗ＣＤ１９抗体（ＡＰＣ標識した）でコートしたコントロールビーズは、ＴＮＦαでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に結合しなかった（中央パネル）。抗ＴＮＦα抗体（ＰＥ標識した）でコートしたビーズは、野生型（ｗｔ）ＣＨＯ細胞に結合しなかった（下側パネル）。左側のトッドプロットは、前方散乱および側方散乱を示し、これは、上記事象のサイズおよび粒度をそれぞれ示す。単一のビーズ（約３μｍ）集団は、Ｐ２においてゲート制御した。ビーズに最終的に結合したＣＨＯ細胞（約３０μｍ）は、Ｐ１においてゲート制御した。中央のドットプロットは、それらのＰＥ染色もしくはＡＰＣ染色に関してＰ１事象（ＣＨＯ細胞）を示す。従って、抗ＴＮＦαビーズと相互作用している細胞は、Ｐ３ゲートに出現し、抗ＣＤ１９ビーズと相互作用している細胞は、Ｐ４ゲートに出現する。右側に、各サンプルについての統計が、詳述される。
【図４】図４は、抗ＴＮＦα−ＰＥでコートしたビーズおよび抗ＣＤ１９−ＡＰＣでコートしたビーズが、ＴＮＦαでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞とともに混合された。ＣＨＯ細胞を、ゲート制御した（Ｐ１）。これらの中で、抗ＴＮＦαＰＥコートビーズもしくは抗ＣＤ１９−ＡＰＣコートビーズのいずれかに結合している細胞は、それぞれ、ゲートＰ３およびゲートＰ４において示される。結合しなかったビーズは、ゲートＰ２において見られる。
【図５】図５ａ：３種の異なるＣＨＯ−ＴＮＦα-記憶Ｂ細胞懸濁物のＦＡＣＳ分析。左上：細胞懸濁物の前方散乱および側方散乱を示すドットプロット。トランスジェニックＣＨＯ細胞の大きな集団および記憶Ｂ細胞の小さな集団を含む生細胞を、ゲート制御した。左下：ＡＰＣ蛍光およびＦＩＴＣ蛍光を示すドットプロット。ここで、上記記憶Ｂ細胞（ＩｇＧ＋／ＩｇＭ−）をゲート制御した。これら２つのドットプロットは、全３つのサンプルについて同一であった；従って、それらは、ただ１つが示される。図５ｂ：上記３個のサンプルのヒストグラムおよび集団階層：上：ＣＨＯ−ＴＮＦα細胞＋ＥＳＢＡ１０５＋ＥＳＢＡ１０５で免疫化したウサギの記憶Ｂ細胞；中央：ＣＨＯ−ＴＮＦα細胞＋ＥＳＢＡ１０５＋免疫化していないウサギの記憶Ｂ細胞；下：ＣＨＯ−ＴＮＦα細胞＋ＥＳＢＡ１０５で免疫化したウサギの記憶Ｂ細胞。ヒストグラムにおいて、ＣＨＯ細胞に結合する記憶Ｂ細胞を、ゲート制御した。
【図６−１】図６は、ＥＳＢＡ１０５で「コート」したＴＮＦαトランスジェニックＣＨＯ細胞と混合した、免疫化したリンパ球からなる懸濁物のＦＡＣＳ分析を示す。図６ａ：細胞懸濁物の前方散乱および側方散乱を示すドットプロット。トランスジェニックＣＨＯ細胞の大きな集団およびリンパ球の小さな集団を含む生細胞を、ゲート制御した。図６ｂ：ＡＰＣ蛍光およびＦＩＴＣ蛍光を示すドットプロット。ここで上記記憶Ｂ細胞（ＩｇＧ＋／ＩｇＭ−）をゲート制御した。図６ｃ：ゲート制御した記憶Ｂ細胞のカルセイン蛍光を示すヒストグラム。ゲート制御した集団を、ソートした（ＣＨＯ−ＴＮＦα−ＥＳＢＡ１０５複合体に結合する記憶Ｂ細胞）。
【図６−２】図６は、ＥＳＢＡ１０５で「コート」したＴＮＦαトランスジェニックＣＨＯ細胞と混合した、免疫化したリンパ球からなる懸濁物のＦＡＣＳ分析を示す。図６ａ：細胞懸濁物の前方散乱および側方散乱を示すドットプロット。トランスジェニックＣＨＯ細胞の大きな集団およびリンパ球の小さな集団を含む生細胞を、ゲート制御した。図６ｂ：ＡＰＣ蛍光およびＦＩＴＣ蛍光を示すドットプロット。ここで上記記憶Ｂ細胞（ＩｇＧ＋／ＩｇＭ−）をゲート制御した。図６ｃ：ゲート制御した記憶Ｂ細胞のカルセイン蛍光を示すヒストグラム。ゲート制御した集団を、ソートした（ＣＨＯ−ＴＮＦα−ＥＳＢＡ１０５複合体に結合する記憶Ｂ細胞）。
【図７】図７は、ＣＨＯ−ＴＮＦα（Ｂ２２０）トランスジェニック細胞と相互作用する、抗ＴＮＦα  ＩｇＧでコートしたビーズの明視野顕微鏡写真を示す。
【図８】図８は、表面に抗ＥＳＢＡ１０５抗体を有するＢ細胞（小さな細胞）に結合したＣＨＯ−ＴＮＦα／ＥＳＢＡ１０５細胞（大きな細胞）の明視野顕微鏡写真（左列）および蛍光顕微鏡写真（右列）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
（詳細な説明）
本発明は、細胞表面抗原に特異的に結合し得るイムノバインダー（例えば、ｓｃＦｖ抗体）を同定するための方法を提供する。本発明の方法は、一般に、標識した抗原発現細胞と、標識したイムノバインダー発現細胞とを接触させる工程、および上記抗原発現細胞に結合するイムノバインダー発現細胞を、セルソーターを使用して単離する工程を包含する。これら方法は、内在性膜タンパク質（例えば、ＧＰＣＲ）に存在するコンフォメーションエピトープに対するイムノバインダーの迅速かつ効率的な同定のために特に有用である。本発明はまた、本発明の方法を用いて同定された、単離されたイムノバインダーおよびイムノバインダーをコードする核酸を提供する。
【００１７】
一局面において、本発明は、目的の細胞表面抗原に特異的に結合するイムノバインダーを同定するための方法を提供する。上記方法は、第１のソート可能な標識に作動可能に連結した複数のイムノバインダー発現細胞を提供する工程；第２のソート可能な標識に作動可能に連結した複数の抗原発現細胞を提供する工程であって、ここで上記目的の抗原は、上記抗原発現細胞の表面にディスプレイされる、工程；上記抗原発現細胞と、上記イムノバインダー発現細胞とを接触させる工程；ならびに上記複数のイムノバインダー発現細胞から、上記抗原発現細胞に特異的に結合し得る１個以上のイムノバインダー発現細胞を、セルソーター（例えば、蛍光細胞分析分離装置）を使用して分離する工程であって、ここで単一の細胞複合体（例えば、抗原と、Ｂ細胞レセプターとの間で形成される複合体）における上記第１のおよび第２のソート可能な標識の存在は、抗原発現細胞へのイムノバインダー発現細胞の結合を示し、それによって、目的の抗原に結合するイムノバインダーを同定する、工程を包含する。
【００１８】
いくつかの実施形態において、上記分離されたイムノバインダー発現細胞は、クローン的に単離される。
【００１９】
特定の実施形態において、上記クローン的に単離されたイムノバインダー発現細胞は、当業者に周知の方法を使用して、クローン性増殖に供される。
【００２０】
他の実施形態において、上記イムノバインダーをコードする核酸配列は、イムノバインダー発現細胞から単離される。上記核酸配列の単離は、クローン性単離の後もしくはクローン性増殖の後に起こり得る。上記イムノバインダーをコードする核酸配列の単離に適した方法としては、ＰＣＲ（例えば、単一細胞ＰＣＲ）が挙げられる。
【００２１】
いくつかの実施形態において、本発明の方法を使用して単離されたイムノバインダー発現細胞は、上記イムノバインダーを機能的に特徴付けるために、細胞ベースのアッセイに供される。適切な細胞ベースのアッセイとしては、ＣＥＬＩＳＡが挙げられる。
【００２２】
いくつかの実施形態において、上記イムノバインダーは、抗体である。このような抗体としては、マウス抗体、ウサギ抗体、ウサギ化抗体、ニワトリ抗体、ラクダ抗体、ラクダ化抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、およびキメラ抗体が挙げられる。適切な抗体形式としては、Ｆａｂ、Ｄａｂ、ナノボディーおよびｓｃＦｖが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２３】
いくつかの実施形態において、上記目的の抗原は、外因性遺伝子から発現される。他の実施形態において、上記目的の抗原は、遺伝的に操作された抗原である。他の実施形態において、上記目的の抗原は、内在性膜タンパク質である。適切な内在性膜タンパク質としては、Ｇタンパク質共役レセプター（ＧＰＣＲ（例えば、ＣＸＣＲ２））もしくはイオンチャネルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２４】
いくつかの実施形態において、上記第１のもしくは第２のソート可能な標識は、蛍光標識である。適切な蛍光標識としては、蛍光タンパク質、抗体／蛍光体結合体および蛍光性細胞標識が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２５】
いくつかの実施形態において、上記抗原発現細胞は、酵母細胞もしくは哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）である。いくつかの実施形態において、上記抗原発現細胞は、外因性抗原を発現する。いくつかの実施形態において、上記抗原発現細胞は、発現ベクターでトランスフェクトされる。
【００２６】
いくつかの実施形態において、上記イムノバインダー発現細胞は、酵母細胞もしくは哺乳動物細胞である。適切な哺乳動物細胞としては、Ｂ細胞（例えば、ウサギＢ細胞）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、上記Ｂ細胞は、免疫化した動物（例えば、ＤＮＡワクチン接種によって免疫化した動物）から単離される。いくつかの実施形態において、上記イムノバインダー発現細胞は、発現ベクターから発現されたイムノバインダーを含む。
【００２７】
別の局面において、本発明は、本発明の方法によって同定されたイムノバインダーをコードする単離された核酸分子を提供する。
【００２８】
別の局面において、本発明は、目的の抗原に結合し得るイムノバインダーを産生するための方法を提供し、上記方法は、本発明の方法によって同定されたイムノバインダーをコードする核酸配列を、上記コードされたイムノバインダーが産生されるように、発現環境に導入する工程を包含する。
【００２９】
別の局面において、本発明は、本発明の方法によって産生されたイムノバインダーを提供する。
【００３０】
別の局面において、本発明はまた、目的の細胞表面抗原に特異的に結合するＢ細胞クローンを同定するための方法を提供し、上記方法は、動物を、細胞表面抗原をコードするＤＮＡで免疫化する工程；Ｂ細胞を、上記免疫化した動物から単離する工程；上記Ｂ細胞を、第１のソート可能な標識で標識する工程；第２のソート可能な標識に作動可能に連結した複数の抗原発現細胞を提供する工程であって、ここで上記目的の抗原は、上記抗原発現細胞の表面にディスプレイされる、工程；上記抗原発現細胞と、上記Ｂ細胞とを接触させる工程；ならびに上記複数のＢ細胞から、上記抗原発現細胞に特異的に結合し得る１個以上のＢ細胞を、セルソーターを使用して分離する工程であって、ここで単一の細胞複合体における上記第１のおよび第２のソート可能な標識の存在は、抗原発現細胞へのＢ細胞の結合を示し、それによって、目的の抗原に結合するＢ細胞クローンを同定する、工程を包含する。
【００３１】
（定義）
本発明が、より容易に理解され得るように、特定の用語が、以下のとおりに定義される。さらなる定義は、詳細な説明全体に記載される。
【００３２】
用語「抗体」とは、完全な抗体および任意の抗原結合フラグメント（すなわち、「抗原結合部分」、「抗原結合ポリペプチド」、もしくは「イムノバインダー」）またはその一本鎖をいう。「抗体」とは、ジスルフィド結合で相互に連結されている少なくとも２個の重（Ｈ）鎖および２個の軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質、またはこれらの抗原結合部分をいう。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてＶＨと省略される）および重鎖定常領域から構成される。上記重鎖定常領域は、３個のドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＶＬと省略される）および軽鎖定常領域から構成される。上記軽鎖定常領域は、１個のドメイン、ＣＬから構成される。上記ＶＨおよびＶＬ領域は、超可変領域（相補性決定領域（ＣＤＲ）といわれる）にさらに分けられ得、超可変領域の間により保存された領域（フレームワーク領域（ＦＲ）といわれる）が散在している。各ＶＨおよびＶＬは、３個のＣＤＲおよび４個のＦＲから構成され、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端へと並べられる：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。上記重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。上記抗体の定常領域は、宿主組織もしくは宿主因子（免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１成分（Ｃｌｑ）が挙げられる）への上記免疫グロブリンの結合を媒介し得る。
【００３３】
用語「キメラ抗体」とは、（ａ）上記抗原結合部位（可変領域）が、異なるかもしくは変化したクラス、エフェクター機能および／もしくは種の定常領域、またはキメラ抗体に新たな特性を付与する全く異なる分子（例えば、酵素、毒素、ホルモン、増殖因子、薬物など）に連結されるように、上記定常領域もしくはその一部が、改変されているか、置換されているか、もしくは交換されている抗体分子；あるいは（ｂ）上記可変領域もしくはその一部が、異なるかもしくは変化した抗原特異性を有する可変領域で改変されているか、置換されているかもしくは交換されている抗体分子をいう。
【００３４】
用語、抗体の「抗原結合部分」（または単に「抗体部分」）は、抗原（例えば、ＴＮＦ）に特異的に結合する能力を保持している抗体の１種以上のフラグメントに言及する。ある抗体の抗原結合機能が全長抗体のフラグメントによって発揮され得ることが示された。用語、抗体の「抗原結合部分」内に含まれる結合フラグメントの例としては、（ｉ）Ｆａｂフラグメント（ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメインおよびＣＨ１ドメインからなる一価のフラグメント）；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（ヒンジ領域でジスルフィド結合によって連結された２個のＦａｂフラグメントを含む二価のフラグメント）；（ｉｉｉ）Ｆｄフラグメント（ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなる）；（ｉｖ）Ｆｖフラグメント（抗体の単腕のＶＬドメインおよびＶＨドメインからなる）；（ｖ）ｄＡｂフラグメントのような１個のドメイン（Ｗａｒｄら，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）（これは、ＶＨドメインからなる）；ならびに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）または（ｖｉｉ）２個以上の単離されたＣＤＲの組み合わせ（これは、合成リンカーによって必要に応じて結合され得る）が挙げられる。さらに、上記Ｆｖフラグメントの２個のドメイン（ＶＬおよびＶＨ）は別個の遺伝子によってコードされるものの、それらは、上記ＶＬ領域およびＶＨ領域が、一価の分子を形成するように対になった１個のタンパク質鎖として作製されることを可能にする合成リンカーによって、組換え法を使用して結合され得る（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知；例えば、Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；およびＨｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３を参照のこと）。このような一本鎖抗体はまた、用語、抗体の「抗原結合部分」内に含まれることが意図される。これら抗体フラグメントは、当業者に公知の従来の技術を使用して得られ、上記フラグメントは、インタクトな抗体と同じ様式で、有用性についてスクリーニングされる。抗原結合部分は、組換えＤＮＡ技術によって、またはインタクトな免疫グロブリンの酵素的もしくは化学的切断によって、産生され得る。抗体は、異なるアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４サブタイプ）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、もしくはＩｇＭ抗体）のものであり得る。
【００３５】
用語「イムノバインダー」とは、抗体の抗原結合部位のうちの全てもしくは一部（例えば、上記重鎖可変ドメインおよび／もしくは軽鎖可変ドメインのうちの全てもしくは一部）を含む分子に言及し、そのため上記イムノバインダーは、標的抗原を特異的に認識する。イムノバインダーの非限定的例としては、全長免疫グロブリン分子およびｓｃＦｖ、ならびに抗体フラグメント（（ｉ）Ｆａｂフラグメント（ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメインおよびＣＨ１ドメインからなる一価のフラグメント）；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（ヒンジ領域でジスルフィド結合によって連結された２個のＦａｂフラグメントを含む二価のフラグメント）；（ｉｉｉ）Ｆａｂ’フラグメント（これは、本質的に、ヒンジ領域の一部を有するＦａｂである）（ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（Ｐａｕｌ  ｅｄ．，３．ｓｕｐ．ｒｄ  ｅｄ．１９９３）を参照のこと）；（ｉｖ）Ｆｄフラグメント（ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなる）；（ｖ）Ｆｖフラグメント（抗体の単腕のＶＬドメインおよびＶＨドメインからなる）；（ｖｉ）単一ドメイン抗体、例えば、Ｄａｂフラグメント（Ｗａｒｄら，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）（これは、ＶＨドメインもしくはＶＬドメインからなる）、ラクダ科の動物の抗体（Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：４４６−４４８（１９９３）、およびＤｕｍｏｕｌｉｎら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １１：５００−５１５（２００２）を参照のこと）またはサメ抗体（例えば、サメＩｇ−ＮＡＲｓ  ナノボディー（登録商標））；ならびに（ｖｉｉ）ナノボディー（１個の可変ドメインおよび２個の定常ドメインを含む重鎖可変領域）が挙げられるが、これらに限定されない）が挙げられる。
【００３６】
本明細書で使用される場合、用語「機能的特性」とは、改善（例えば、従来のポリペプチドと比較して）が当業者にとって望ましいおよび／もしくは有利である（例えば、上記ポリペプチドの製造特性もしくは治療効力を改善するために）、ポリペプチド（例えば、イムノバインダー）の特性である。一実施形態において、上記機能的特性は、改善された安定性（例えば、熱安定性）である。別の実施形態において、上記機能的特性は、改善された溶解度（例えば、細胞条件下で）である。なお別の実施形態において、上記機能的特性は、非凝集性である。さらに別の実施形態において、上記機能的特性は、発現における改善（例えば、原核生物細胞における）である。なお別の実施形態において、上記機能的特性は、封入体精製プロセス後の再折りたたみ収率における改善である。特定の実施形態において、上記機能的特性は、抗原結合アフィニティーにおける改善ではない。
【００３７】
用語「フレームワーク」とは、より多様なＣＤＲ領域の間に存在する抗体可変領域の当該分野で認識された部分である。このようなフレームワーク領域は、代表的には、フレームワーク１〜４（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４）といわれ、三次元空間において、上記ＣＤＲが、抗原結合表面を形成し得るように、重鎖抗体可変領域もしくは軽鎖抗体可変領域において見いだされる３個のＣＤＲを保持するための足場を提供する。このようなフレームワークはまた、足場と言及され得る。なぜなら、それらは、より多様なＣＤＲの提示のための支持物を提供するからである。上記免疫グロブリンスーパーファミリーの他のＣＤＲおよびフレームワーク（例えば、アンキリン反復およびフィブロネクチン）は、抗原結合分子として使用され得る（例えば、米国特許第６，３００，０６４号、同第６，８１５，５４０号および米国特許出願公開第２００４０１３２０２８号もまた参照のこと）。
【００３８】
用語「エピトープ」もしくは「抗原決定基」とは、免疫グロブリンもしくは抗体が特異的に結合する抗原上の部位をいう。エピトープは、代表的には、特有の空間的コンフォメーション中に、少なくとも３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、もしくは１５個のアミノ酸を含む。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６６，Ｇ．Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｅｄ．（１９９６）を参照のこと。
【００３９】
用語「特異的結合」、「選択的結合」、「選択的に結合する」、および「特異的に結合する」とは、抗体が所定の抗原上のエピトープに結合することに言及する。代表的には、上記抗体は、ほぼ１０−７Ｍ未満のアフィニティー（ＫＤ）（例えば、ほぼ１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍ未満もしくは１０−１０Ｍ未満もしくはさらにそれを下回る）で結合する。
【００４０】
用語「ＫＤ」とは、特定の抗体−抗原相互作用の解離平衡定数をいう。代表的には、本発明の抗体は、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ機器において表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術を使用して決定される場合、ほぼ１０−７Ｍ未満の解離平衡定数（ＫＤ）（例えば、ほぼ１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍ未満もしくは１０−１０Ｍ未満もしくはさらにそれを下回る）で抗原に結合する。
【００４１】
本明細書で使用される場合、「同一性」とは、２個のポリペプチド、分子の間、または２個の核酸の間の配列マッチングをいう。上記２個の比較される配列の両方における一部が、同じ塩基もしくはアミノ酸のモノマーサブユニットによって占有されている場合（例えば、２個のＤＮＡ分子のうちの各々におけるある位置が、アデニンによって占有される場合、または２つのポリペプチドのうちの各々におけるある位置がリジンによって占有される場合）、それぞれの分子が、その位置において同一である。２個の配列の間の「パーセンテージ同一性」は、上記２個の配列によって共有されるマッチング位置の数を、比較される位置の数で除算して、それを×１００する関数である。例えば、２個の配列における位置１０個のうちの６個がマッチしている場合、上記２個の配列は、６０％同一性を有する。例示すると、ＤＮＡ配列ＣＴＧＡＣＴとＣＡＧＧＴＴは、５０％同一性（６個の合計位置のうちの３個がマッチしている）を共有する。一般に、比較は、２個の配列が最大同一性を与えるように整列される場合に行われる。このようなアラインメントは、例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら（１９７０）  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３の方法を使用して提供され得、Ａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）のようなコンピュータープログラムによって従来通り実行され得る。上記２個のアミノ酸配列の間の％同一性はまた、ＰＡＭ１２０重み付け残基表、ギャップ長ペナルティー１２、およびギャップペナルティー４を使用するＡＬＩＧＮプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０）へ組み込まれたＥ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，４：１１−１７（１９８８））のアルゴリズムを使用して、決定され得る。さらに、２個のアミノ酸配列の間の％同一性は、Ｂｌｏｓｓｕｍ  ６２マトリクスもしくはＰＡＭ２５０マトリクスのいずれか、ならびにギャップ重み付け１６、１４、１２、１０、８、６、もしくは４、および長さ重み付け１、２、３、４、５、もしくは６を使用するＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）におけるＧＡＰプログラムへと組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３（１９７０））アルゴリズムを使用して決定され得る。
【００４２】
「類似する」配列は、整列される場合、同一および類似のアミノ酸残基を共有する配列であり、ここで類似の残基は、整列された参照配列における対応するアミノ酸残基についての保存的置換である。この点において、参照配列における残基の「保存的置換」は、例えば、類似の大きさ、形状、電荷、化学的特性（共有結合もしくは水素結合などを形成する能力を含む）を有する、上記対応する参照残基に物理的にもしくは機能的に類似の残基による置換である。従って、「保存的置換で改変された」配列は、１個以上の保存的置換が存在するという点で、参照配列もしくは野生型配列とは異なるものである。２個の配列の間の上記「パーセンテージ類似性」は、上記２個の配列によって共有されるマッチする残基もしくは保存的置換を含む位置の数を、比較される位置の数で除算して、それを×１００する関数である。例えば、２個の配列における位置の１０個のうちの６個がマッチし、１０個の位置のうちの２個が、保存的置換を含む場合、上記２個の配列は、８０％陽性類似性を有する。
【００４３】
本明細書で使用される場合、用語「保存的配列改変」とは、アミノ酸配列を含む抗体の結合特徴にネガティブに影響しないかもしくは上記結合特徴を改変しないアミノ酸改変に言及することが意図される。このような保存的配列改変としては、ヌクレオチドおよびアミノ酸の置換、付加および欠失が挙げられる。例えば、改変は、当該分野で公知の標準的技術（例えば、部位指向性変異誘発およびＰＣＲ媒介性変異誘発）によって導入され得る。保存的アミノ酸置換としては、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されているものが挙げられる。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で既に定義されている。これらファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性の極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。従って、所定の非必須アミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸残基で置換され得る。抗原結合を排除しないヌクレオチドおよびアミノ酸保存的置換を同定するための方法は、当該分野で周知である（例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｌら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：１１８０−１１８７（１９９３）；Ｋｏｂａｙａｓｈｉら  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１２（１０）：８７９−８８４（１９９９）；およびＢｕｒｋｓら  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：４１２−４１７（１９９７）を参照のこと）。
【００４４】
「アミノ酸コンセンサス配列」とは、本明細書で使用される場合、少なくとも２個、および好ましくは、より多くの整列されたアミノ酸配列のマトリクスを使用し、各位置における最も頻度の高いアミノ酸残基を決定することが可能になるようにアラインメントにおけるギャップを可能にして、生成され得るアミノ酸配列に言及する。上記コンセンサス配列は、最も頻繁に各位置において現れるアミノ酸を含む配列である。２個以上のアミノ酸が単一の位置において等しく現れる事象において、上記コンセンサス配列は、それらアミノ酸の両方もしくは全てを含む。
【００４５】
タンパク質のアミノ酸配列は、種々のレベルで分析され得る。例えば、保存性もしくは変動性は、上記単一の残基レベル、複数の残基レベル、ギャップを有する複数の残基などで示され得る。残基は、同一の残基の保存を示し得るか、またはクラスレベルで保存され得る。アミノ酸クラスの例としては、極性であるが、非荷電性のＲ基（セリン、スレオニン、アスパラギンおよびグルタミン）；正に荷電したＲ基（リジン、アルギニン、およびヒスチジン）；負に荷電したＲ基（グルタミン酸およびアスパラギン酸）；疎水性Ｒ基（アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、バリンおよびチロシン）；ならびに特別のアミノ酸（システイン、グリシンおよびプロリン）が挙げられる。他のクラスは、当業者に公知であり、置換可能性を評価するために、構造的決定もしくは他のデータを使用して定義され得る。その意味において、置換可能なアミノ酸は、置換され得かつその位置において機能的な保存を維持し得る任意のアミノ酸に言及し得る。
【００４６】
しかし、同じクラスのアミノ酸は、それらの生物物理学的特性によって程度が様々であり得ることは、認識される。例えば、特定の疎水性Ｒ基（例えば、アラニン）は、他の疎水性Ｒ基（例えば、バリンもしくはロイシン）より親水性である（すなわち、親水性が高いかもしくは疎水性が低い）ことが認識される。相対的な親水性もしくは疎水性は、当該分野で認識される方法を使用して決定され得る（例えば、Ｒｏｓｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８３４−８３８（１９８５）およびＣｏｒｎｅｔｔｅら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９５：６５９−６８５（１９８７）を参照のこと）。
【００４７】
本明細書で使用される場合、１個のアミノ酸配列（例えば、第１のＶＨ配列もしくはＶＬ配列）が、１個以上のさらなるアミノ酸配列（例えば、データベース中の１個以上のＶＨ配列もしくはＶＬ配列）とアラインされる場合、１個の配列（例えば、上記第１のＶＨ配列もしくはＶＬ配列）におけるアミノ酸位置は、上記１個以上のさらなるアミノ酸配列における「対応する位置」に対して比較され得る。本明細書で使用される場合、上記「対応する位置」は、比較されている配列（複数可）が最適にアラインされる場合に、すなわち、上記配列が、最高の％同一性もしくは％類似性を達成するようにアラインされる場合に、比較されている配列における等価な位置を表す。
【００４８】
用語「核酸分子」とは、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子に言及する。核酸分子は、一本鎖であっても二本鎖であってもよいが、好ましくは、二本鎖ＤＮＡである。核酸は、別の核酸配列と機能的な関係に配置されている場合に、「作動可能に連結」されている。例えば、プロモーターもしくはエンハンサーは、それらがコード配列の転写に影響を及ぼす場合に、上記配列に作動可能に連結されている。
【００４９】
用語「ベクター」とは、それが連結された別の核酸を輸送し得る核酸分子をいう。ベクターの１つのタイプは「プラスミド」であり、プラスミドは、さらなるＤＮＡセグメントが連結され得る環状の二本鎖ＤＮＡループをいう。ベクターの別のタイプは、ウイルスベクターであり、ここでさらなるＤＮＡセグメントは、上記ウイルスゲノムへと連結され得る。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自律的に複製し得る（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム性の哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム性の哺乳動物ベクター）は、宿主細胞に導入されると、上記宿主細胞のゲノムへと組み込まれ得、それによって、宿主ゲノムとともに複製される。
【００５０】
用語「宿主細胞」とは、発現ベクターが導入される細胞をいう。宿主細胞としては、細菌細胞、微生物細胞、植物細胞もしくは動物細胞が挙げられ得る。細菌（これは、形質転換しやすい）としては、腸内細菌科（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉもしくはＳａｌｍｏｎｅｌｌａの株）；Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）；Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、およびＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのメンバーが挙げられる。適切な微生物としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓが挙げられる。適切な動物宿主細胞株としては、ＣＨＯ（チャイニーズ・ハムスター卵巣株）およびＮＳ０細胞が挙げられる。
【００５１】
用語「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」および「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」とは、本明細書で記載される治療的手段もしくは予防的手段をいう。「処置」方法は、障害もしくは再発している障害の１個以上の症状を予防するため、治癒させるため、遅延させるため、、もしくはその重篤度を軽減するためか、またはそれら症状を改善するために、あるいはこのような処置（本発明の抗体）の非存在下で予測されるものを超えて被験体の生存を長期化するために、このような処置（本発明の抗体）を必要とする被験体（例えば、ＧＰＣＲ媒介性障害を有する被験体もしくはこのような障害を最終的に獲得し得る被験体）に投与することを使用する。
【００５２】
用語「有効用量」もしくは「有効投与量」とは、所望の効果を達成するかもしくは少なくとも部分的に達成するに十分な量をいう。用語「治療上有効な用量」とは、上記疾患に既に罹患している患者において、上記疾患およびその合併症を治癒させるかもしくは少なくとも部分的に抑えるに十分な量として定義される。この使用に有効な量は、処置されている障害の重篤度および患者自身の免疫系の全般的な状態に依存する。
【００５３】
用語「被験体」とは、任意のヒトもしくは非ヒト動物をいう。例えば、本発明の方法および組成物は、ＧＰＣＲ媒介性障害を有する被験体を処置するために使用され得る。
【００５４】
用語「ウサギ（ｒａｂｂｉｔ）」とは、本明細書で使用される場合、ウサギ科（ｌｅｐｏｒｉｄａｅ）のファミリーに属する動物をいう。
【００５５】
用語「セルソーター」とは、検出可能な「ソート可能な」標識の存在に基づいて細胞を分離するための任意の手段に言及する。このような手段としては、蛍光細胞分析分離装置が挙げられるが、これらに限定されない。任意の細胞標識が、ソート可能な標識として使用され得る。上記標識としては、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質）、抗体／蛍光体結合体および蛍光性細胞標識（例えば、蛍光性カルシウムイオンイオノフォア）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５６】
用語「細胞複合体」とは、１個以上のイムノバインダー発現細胞に結合した１個以上の抗原発現細胞に言及し、ここで上記結合は、上記抗原発現細胞の表面上の抗原によって媒介される。いくつかの実施形態において、イムノバインダー発現細胞への抗原発現細胞の結合は、上記抗原発現細胞の表面上の抗原と、上記イムノバインダー発現細胞の表面上のイムノバインダーとの間の直接相互作用からなる。
【００５７】
用語「クローン的に単離する」とは、細胞集団から個々の細胞クローンを単離するための任意の手段に言及する。適切な手段としては、各ウェルが１個を超えない細胞のみを含むようにする、複数ウェルプレートへの細胞の限界希釈および移動が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５８】
用語「イムノバインダーをコードする核酸配列を得る工程」とは、イムノバインダー発現細胞によって発現されるイムノバインダーの核酸配列を得るための任意の手段に言及する。適切な手段としては、上記イムノバインダー発現細胞からの、イムノバインダーをコードする核酸配列の核酸単離、ＰＣＲ増幅およびＤＮＡ配列決定が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、イムノバインダーをコードする核酸配列は、１個の細胞からのＰＣＲ（すなわち、単一細胞ＰＣＲ）によって増幅される。
【００５９】
用語「外因性抗原」とは、特定の宿主細胞において通常発現されない抗原に言及する。例えば、外因性抗原は、上記宿主細胞とは異なる界、門、綱、目、属もしくは種に由来し得る（例えば、酵母細胞において発現されるヒト抗原）。さらにもしくは代わりに、外因性抗原は、同じ種に由来するが、その宿主細胞において不適切に発現され得る（例えば、脳細胞において発現される肺特異的抗原）。「外因性抗原」はまた、正常な細胞において通常見いだされない変異抗原（例えば、肺細胞において発現されるがん特異的変異抗原）に言及する。
【００６０】
用語「遺伝的に操作された抗原」とは、組換えＤＮＡ技術によって産生された任意の抗原に言及し、キメラであるか、または点変異、欠失および／もしくは挿入を含む抗原を包含する。別段定義されなければ、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものに類似もしくは等価な方法および材料は、本発明の実施もしくは試験において使用され得るが、適切な方法および材料が、以下に記載される。矛盾する場合は、定義を含め、本明細書が優先する。さらに、上記材料、方法および例は、例示に過ぎず、限定することを意図しない。
【００６１】
本発明の種々の局面は、以下の小節においてさらに詳細に記載される。上記種々の実施形態、選択および範囲は、随意に組み合わされ得ることが理解される。さらに、特定の実施形態に依存して、選択された定義、実施形態もしくは範囲は、当てはまらない可能性がある。
【００６２】
本発明は、対応する抗原を発現する細胞に付着したイムノバインダー発現細胞を同定および分離するために、ＦＡＣＳを使用するスクリーニング法を提供する。特定の実施形態において、上記イムノバインダーは、抗体である。
【００６３】
（抗原発現）
抗体調製のための標的抗原は、可溶性であるか、もしくは細胞表面上に発現されるか、もしくは形質膜に結合されている任意のタンパク質、ペプチド、ヌクレオチド、炭水化物、脂質、および他の分子であり得る。抗原は、天然抗原であっても合成抗原であってもよい。好ましくは、標的抗原は、タンパク質もしくはペプチドである。標的抗原の非限定的例としては、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ６、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ８、ＣＦＴＲ、ＣＩＣ−１、ＣＩＣ−２、ＣＩＣ−４、ＣＩＣ−５、ＣＩＣ−７、ＣＩＣ−Ｋａ、ＣＩＣ−Ｋｂ、Ｂｅｓｔｒｏｐｈｉｎｓ、ＴＭＥＭ１６Ａ、ＧＡＢＡレセプター、グリシンレセプター、ＡＢＣ輸送体、ＮＡＶ１．１、ＮＡＶ１．２、ＮＡＶ１．３、ＮＡＶ１．４、ＮＡＶ１．５、ＮＡＶ１．６、ＮＡＶ１．７、ＮＡＶ１．８、ＮＡＶ１．９、スフィンゴシン−１−ホスフェートレセプター（Ｓ１Ｐ１Ｒ）、ＮＭＤＡチャネルなどが挙げられる。一実施形態において、上記標的抗原は、膜貫通タンパク質である。別の実施形態において、上記標的抗原は、マルチスパン（ｍｕｌｔｉｓｐａｎ）膜貫通タンパク質（例えば、Ｇタンパク質共役レセプター（ＧＰＣＲ）、イオンチャネルなど）である。
【００６４】
ＧＰＣＲのファミリーは、少なくとも２５０個のメンバーを有する（Ｓｔｒａｄｅｒら  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，９：７４５−７５４，１９９５；Ｓｔｒａｄｅｒら  Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６３：１０１−３２，１９９４）。ヒト遺伝子のうちの１％は、ＧＰＣＲをコードし得ると推測されてきた。ＧＰＣＲは、広く種々のリガンド（光子、低分子の生体アミン（すなわち、エピネフリンおよびヒスタミン）、ペプチド（すなわち、ＩＬ−８）から、大きな糖タンパク質ホルモン（すなわち、副甲状腺ホルモン）に及ぶ）に結合する。リガンド結合の際に、ＧＰＣＲは、グアニンヌクレオチド結合タンパク質（Ｇタンパク質）を活性化することによって細胞内シグナル伝達経路を調節する。興味深いことに、ＧＰＣＲは、ヒトサイトメガロウイルスおよびヘルペスウイルスにおいて機能的ホモログを有し、このことは、ＧＰＣＲが、ウイルス病因の展開の間に獲得され得たことを示唆する（Ｓｔｒａｄｅｒら，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，９：７４５−７５４，１９９５；Ａｒｖａｎｉｔａｋｉｓら  Ｎａｔｕｒｅ，３８５：３４７−３５０，１９９７；Ｍｕｒｐｈｙ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：５９３−６３３，１９９４）。
【００６５】
今までに知られている大部分のＧＰＣＲの独特の特徴は、疎水性アミノ酸残基の７個のクラスタが、１次構造に位置し、その各領域において細胞膜を貫通する（横切る）ことである。上記ドメインは、３個の細胞内ループ、３個の細胞外ループ、ならびにアミノ末端ドメインおよびカルボキシル末端ドメインによって接続された膜貫通α−ヘリックスを表すと考えられている（Ｋ．Ｐａｌｃｚｅｗｓｋｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８９，７３９−４５（２０００））。大部分のＧＰＣＲは、機能的タンパク質構造を安定化させると考えられるジスルフィド結合を形成する最初の２個の細胞外ループの各々に、１個の保存されたシステイン残基を有する。上記７個の膜貫通領域は、ＴＭ１、ＴＭ２、ＴＭ３、ＴＭ４、ＴＭ５、ＴＭ６、およびＴＭ７と称される。上記で詳述されるこれら構造は、Ｇタンパク質共役レセプタータンパク質の中で共通しており、上記タンパク質が膜を貫通する上記領域（膜を横切る領域もしくは膜貫通領域）に対応するアミノ酸配列、および上記膜を横切る領域付近のアミノ酸配列は、しばしば、上記レセプターの中で高度に保存されていることは、周知である。従って、ＧＰＣＲにおける高い相同性の程度に起因して、新規ＧＰＣＲの同定、ならびにこのような新規メンバーの細胞内部分および細胞外部分両方の同定は、当業者によって容易に達成される。例示であるが、Ｗａｔｓｏｎ  ａｎｄ  Ａｒｋｉｎｓｔａｌｌ（１９９４）の書籍（本明細書に参考として援用される）は、５０個より多くのＧＰＣＲの配列を提供する。上記書籍は、各配列について、上記膜貫通ドメインの各々を含む正確な残基をさらに記載する。
【００６６】
Ｇタンパク質共役レセプターの低分子リガンドの結合部位は、細胞外表面付近に位置しかついくつかのＧタンパク質共役レセプター膜貫通ドメインによって形成される親水性ソケット（このソケットは、上記Ｇタンパク質共役レセプターの疎水性残基が取り囲んでいる）を含むと考えられている。各Ｇタンパク質共役レセプター膜貫通ヘリックスの親水性側が、内側へ向き、極性リガンド結合部位を形成すると仮定される。ＴＭ３は、リガンド結合部位（例えば、ＴＭ３アスパラギン酸残基を含む）を有するとして、いくつかのＧタンパク質共役レセプターに影響を与えてきた。さらに、ＴＭ５  セリン、ＴＭ６アスパラギンおよびＴＭ６もしくはＴＭ７フェニルアラニンもしくはチロシンはまた、リガンド結合に関わっている。ペプチドホルモンレセプターおよび他のより大きなリガンド、例えば、糖タンパク質（ＬＨ、ＦＳＨ、ｈＣＧ、ＴＳＨ）を有するレセプター、ならびにレセプターのＣａ２＋／グルタミン酸／ＧＡＢＡクラスのリガンド結合部位は、上記細胞外ドメインおよびループにあるようである。
【００６７】
レセプターを不活性から活性へと切り替えるための重要な事象は、７個の膜貫通の横切るヘリックスを有する上記ＧＰＣＲの膜貫通ヘリックス３（ＴＭ３）および６（ＴＭ６）のリガンド誘導性コンフォメーション変化である（Ｕ．Ｇｅｔｈｅｒ，  ａｎｄ  Ｂ．Ｋ．Ｋｏｌｂｉｌｋａ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，１７９７９−１７９８２（１９９８））。これらヘリックスの動きは、続いて、上記レセプターの細胞内ループのコンフォメーションを変化させて、会合ヘテロトリマーＧタンパク質の活性化を促進する。変異誘発研究（Ｓ．Ｃｏｔｅｃｃｈｉａ，  Ｊ．Ｏｓｔｒｏｗｓｋｉ，  Ｍ．Ａ．Ｋｊｅｌｓｂｅｒｇ，  Ｍ．Ｇ．Ｃａｒｏｎ  ａｎｄ  Ｒ．Ｊ．Ｌｅｆｋｏｗｉｔｚ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，１６３３−１６３９（１９９２）；Ｅ．Ｋｏｓｔｅｎｉｓ，  Ｂ．Ｒ．Ｃｏｎｋｌｉｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ｗｅｓｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６，１４８７−１４９５（１９９７）；Ｍ．Ａ．Ｋｊｅｌｓｂｅｒｇ，  Ｓ．Ｃｏｔｅｅｃｈｉａ，  Ｊ．Ｏｓｔｒｏｗｓｋｉ，  Ｍ．Ｇ．Ｃａｒｏｎ，  ａｎｄ  Ｒ．Ｊ．Ｌｅｆｋｏｗｉｔｚ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，１４３０−１４３３（１９９２））は、第３の細胞内ループ（ｉ３）が、レセプターとＧタンパク質との間の共役の大部分を媒介することを示した。ミニ遺伝子として発現されるＩ３ループはまた、Ｇｑ結合についてアドレナリン作動性レセプターと直接的に競合することが示され（Ｌ．Ｍ．Ｌｕｔｔｒｅｌｌ，  Ｊ．Ｏｓｔｒｏｗｓｋｉ，  Ｓ．Ｃｏｔｅｃｃｈｉａ，  Ｈ．Ｋｅｎｄａｌ  ａｎｄ  Ｒ．Ｊ．Ｌｅｆｋｏｗｉｔｚ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９，１４５３−１４５７（１９９３））、または、無細胞条件下で可溶性ペプチドとしてＧタンパク質を活性化し得る（Ｔ．Ｏｋａｍｏｔｏら，Ｃｅｌｌ  ６７，７２３−７３０（１９９１））。
【００６８】
上記目的の抗原は、標的細胞（ときおり、抗原発現細胞ともいわれる）における内因性供給源のものであり得る。あるいは、外因性分子は、細胞へと導入されて、上記抗原を発現し得る。細胞への上記抗原の導入は、当業者に公知の任意の方法によって行われ得る。一実施形態において、上記抗原をポリペプチドとしてコードするポリヌクレオチドは、インビトロでベクターに挿入され得る。上記ベクターは、発現のために、標的細胞にさらに導入され得る。上記ポリヌクレオチドは、上記標的抗原のｃＤＮＡ配列、ＤＮＡ配列、もしくは当該分野で公知の他の配列を含み得る。上記ベクターは、プラスミド、コスミド、リポソーム、または当該分野で公知の他の天然のもしくは人工のベクターであり得る。上記導入は、トランスフェクション、形質転換、感染、物質の直接マイクロインジェクション、微粒子銃粒子送達（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ）、エレクトロポレーション、もしくは当該分野で公知の他の方法のプロセスであり得る。上記抗原を発現する標的細胞は、当該分野で公知の任意の細胞（例えば、動物から直接採取された細胞（例えば、がん細胞、非がん細胞、初代細胞など）、または分子操作された細胞（例えば、培養細胞、例えば、チャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨＥＫ２９３細胞など）、不死化細胞、トランスフェクトされた／感染させられた細胞、Ｔ細胞などが挙げられる）であり得る。あるいは、上記標的細胞は、非動物供給源（例えば、細菌、昆虫など）に由来し得る。一実施形態において、上記標的抗原を発現する細胞は、酵母細胞、好ましくは、酵母スフェロプラスト（ｓｐｈｅｒｏｂｌａｓｔ）である。あるいは、上記標的「細胞」は、人工細胞様体（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｅｌｌ−ｌｉｋｅ  ｂｏｄｙ）もしくは構造（例えば、リポソーム、単層膜体など）であり得る。上記標的細胞もしくは細胞様体における上記抗原の発現は、一過性であり得（すなわち、上記発現は、比較的短期間（例えば、数分から数日）の後に弱まるかもしくは止まる）、または安定であり得る（すなわち、上記発現は、比較的長期間（例えば、数日後もしくは細胞の数世代後）にわたって比較的安定なレベルを維持する）。１つの好ましい実施形態において、上記抗原は、上記標的細胞の形質膜の細胞外表面上に発現される。別の好ましい実施形態において、上記抗原は、内在性膜抗原もしくはマルチスパン膜抗原である。形質膜上のその位置に達するために、上記抗原は、これら位置で直接発現され得るか、または上記標的細胞の細胞質におけるその発現後に、これら位置へとその位置が変えられ得る。この位置移動は、上記標的細胞の天然のプロセスであり得、あるいは、上記抗原発現の前もしくはその後に、その位置移動をもたらす、例えば、シグナル／タグ分子（例えば、ゴルジソーティングシグナル、特定の膜結合分子に対する抗体など）を結合させること、グラフト（ｇｒａｆｔ）を固定すること（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ）（例えば、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー）、もしくは上記抗原に化学架橋をすること、上記抗原を変異させること、または当該分野で公知の他の方法による、操作されたプロセスであり得る。
【００６９】
（イムノバインダー発現細胞および免疫化）
一実施形態において、本明細書に記載される方法によって選択されるべきイムノバインダー発現細胞は、哺乳動物Ｂ細胞、好ましくは、ウサギＢ細胞である。
【００７０】
好ましい実施形態において、上記Ｂ細胞は、目的の標的で免疫化した動物に由来する。上記動物の免疫化は、当業者に公知の任意の方法によって実施され得る。代表的には、上記Ｂ細胞は、免疫化した動物のリンパ器官（例えば、脾臓もしくはリンパ節）から単離される。
【００７１】
好ましい一実施形態において、上記目的の抗原の免疫化は、ＤＮＡ免疫化／ワクチン接種によって行われる。あるいは、上記標的抗原を発現する細胞は、免疫化のために、動物（例えば、ウサギ、ラット、マウス、ハムスター、ヒツジ、ヤギ、ニワトリなど）へと注射される。この免疫化工程のために好ましい動物は、ウサギである。ＤＮＡ免疫化／ワクチン接種は、急激な免疫応答を誘導し、ならびに、標的抗原の天然の発現（通常、天然の発現のみ）を可能にする。このことは、組換えタンパク質の発現および取り扱いを要しないので、このプロセスは、組換えタンパク質を用いた従来の免疫化より効率的かつ費用効果的である。さらに、より重要なことには、上記インビボで発現された抗原は、その天然の状況における標的タンパク質と同じ二次構造を有し、同じ翻訳後修飾を有しさえし得る。このことは、上記標的抗原に対する調製された抗体による認識の正確さを改善する。例示的ＤＮＡ免疫化は、カナダ国特許出願ＣＡ２３５００７８およびＷＯ０４／０８７２１６に示される。具体的には、上記標的抗原として上記ポリペプチドをコードするＤＮＡは、遺伝子銃法を通じて動物に直接導入され、上記動物においてポリペプチドの発現を生じ、その発現は、上記ポリペプチドに対する抗体の形成を引き起こす。より強い抗体の形成を達成するために、いわゆる遺伝子アジュバントを、上記ポリペプチドをコードするＤＮＡと同時に適用する。これら遺伝子アジュバントは、サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４およびＩＬ−１０）を発現しかつ実験動物の体液性免疫応答を刺激するプラスミドである。好ましい一実施形態において、上記標的抗原に対する抗体は、Ｂ細胞レセプター（ＢＣＲ）としてＢ細胞の細胞表面上に発現される。別の好ましい実施形態において、上記抗体発現細胞は、いかなるＩｇＭもその表面に存在しないことによって特徴付けられ、通常のＢ細胞とは区別される記憶Ｂ細胞である。
【００７２】
一実施形態において、上記イムノバインダー発現細胞は、酵母細胞であり、上記イムノバインダーは、好ましくは、抗体フラグメント、より好ましくは、ｓｃＦｖである。
【００７３】
（蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を使用するスクリーニング）
免疫化工程の後、上記標的抗原に特異的に結合するＢ細胞上の膜結合抗体は、非特異的抗体を発現する他の細胞から区別される必要がある。好ましい一実施形態において、上記抗原−抗体結合を通じて、その形質膜上に上記特異的抗体を発現するＢ細胞は、上記抗原を発現する標的細胞に付着する。もう一つの好ましい実施形態において、他のもしくはより多くの相互作用（例えば、同じもしくは異なる抗原−抗体相互作用、化学的架橋、リガンド−レセプター相互作用など）は、Ｂ細胞と標的細胞との間で起こり得る。上記Ｂ細胞は、種々の抗体を発現するＢ細胞のプール中に、または上記免疫動物から直接、免疫化した／免役状態にしていない動物のプールから、もしくはインビトロ操作プロセス（例えば、Ｖ（Ｄ）Ｊ遺伝的組み換え技術により異なる抗体を発現するＢ細胞のライブラリー）から集められる他の免疫細胞と組み合わせて存在し得る。
【００７４】
上記標的抗原に対して特異的な抗体を発現するＢ細胞の分離は、当該分野で公知の任意の方法で行われ得る。これらとしては、抗原上でのパニング、限界希釈、アフィニティー精製、または上記発現された抗体もしくは上記抗体生成Ｂ細胞の特徴を利用する他の方法が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７５】
好ましい一実施形態において、上記抗原発現細胞は、上記付着したＢ細胞の将来的な検出および／もしくは単離のために有用なタグで標識される。上記タグは、架橋剤（ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ）、抗原／抗体、低分子（例えば、グルタチオン（ＧＳＨ）、ビオチン／アビジンなど）、磁性粒子、蛍光タグなどであり得る。好ましい一実施形態において、上記抗原発現細胞は、蛍光タンパク質／ペプチドで標識される。別の実施形態において、上記抗体生成Ｂ細胞はまた、タグ、好ましくは、異なる蛍光タンパク質／ペプチドで標識される。なお別の実施形態において、上記抗原発現細胞に付着した上記Ｂ細胞は、Ｂ細胞上で標識された上記蛍光タンパク質／ペプチドからの蛍光放出によって検出され得る。さらに別の実施形態において、上記Ｂ細胞および上記付着した抗原発現細胞は、それらの上で標識された２種の異なる蛍光タンパク質／ペプチドからの蛍光放出によって検出され得る。好ましい一実施形態において、上記標的抗原に対して特異的な抗体を発現するＢ細胞は、それらの上でおよび付着したＡＰＣ上で標識された蛍光タンパク質／ペプチドから、両方の蛍光の放出によって、検出され得、かつ他の抗体生成Ｂ細胞とはさらに分離され得る。好ましくは、この検出および分離は、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）技術によって行われ得る。
【００７６】
頭字語ＦＡＣＳは、商標登録されておりかつＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）が所有している。本明細書で使用される場合、用語ＦＡＣＳは、フローサイトメトリーベースのセルソーティングの任意の形態を表すものとする。
【００７７】
蛍光活性化セルソーティングは、フローサイトメトリーの特別なタイプである。それは、各細胞の特異的光散乱および蛍光特徴に基づいて、２個以上の容器の中に、一度に１細胞、生物学的細胞の不均一な混合物をソートするための方法を提供する。それは、個々の細胞からの蛍光シグナルの迅速で、客観的かつ定量的な記録、ならびに特に目的の細胞の物理的分離を提供するので、有用な科学機器である。
【００７８】
代表的ＦＡＣＳシステムにおいて、細胞懸濁物は、狭く、急激に流れる液体ストリームの中心に運ばれる。その流れは、それらの直径に対して細胞間で大まかな分離がされるように、調整される。振動機構は、細胞のストリームを、個々の液滴へとばらばらにする。上記システムは、１個より多くの細胞が液滴中に存在する可能性を低くするように調節される。上記ストリームが液滴へとばらばらになる直前に、上記流れは、各細胞の目的の蛍光特徴が測定される蛍光測定ステーションを通る。電荷をかける環（ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ  ｃｈａｒｇｉｎｇ  ｒｉｎｇ）が、上記ストリームが液滴へとばらばらになるちょうどその地点に配置される。電荷は、直前の蛍光強度測定値に基づいて上記環にかけられ、その逆の電荷が、上記ストリームからばらばらになるにつれて、上記液滴上に捕捉される。上記荷電した液滴は、次いで、それらの電荷に基づいて、容器の中へと液滴をそらす静電的偏向システムを通って落ちる。いくつかのシステムにおいて、上記電荷は、上記ストリームに直接印加され、ばらばらになっている液滴は、上記ストリームと同じ符号の電荷を保持する。次いで、上記ストリームは、上記液滴がばらばらになった後に、中性に戻される。
【００７９】
ＦＡＣＳ技術のための蛍光標識は、蛍光色素を励起するために使用されるランプもしくはレーザー、および利用可能な検出器に依存する。最も一般に利用可能な、シングルレーザー機械のレーザーは、青色アルゴンレーザー（４８８ｎｍ）である。この種のレーザーで機能できる蛍光標識としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：１）緑色蛍光（通常、ＦＬ１で表される）：ＦＩＴＣ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、ＧＦＰ、ＣＦＳＥ、ＣＦＤＡ−ＳＥ、およびＤｙＬｉｇｈｔ  ４８８；２）橙色オレンジ蛍光（通常、ＦＬ２）：ＰＥ、およびＰＩ；３）赤色蛍光（通常、ＦＬ３）：ＰｅｒＣＰ、ＰＥ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００、ＰＥ−Ｃｙ５（ＴＲＩ−ＣＯＬＯＲ）、およびＰＥ−Ｃｙ５．５；ならびに４）赤外蛍光（通常、ＦＬ４；いくつかのＦＡＣＳ機械において）：ＰＥ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０、およびＰＥ−Ｃｙ７。他のレーザーおよびそれらの対応する蛍光標識としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：１）赤色ダイオードレーザー（６３５ｎｍ）：アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、ＡＰＣ−Ｃｙ７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００、Ｃｙ５、およびＤｒａｑ−５；ならびに２）紫色レーザー（４０５ｎｍ）：Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｏｒａｎｇｅ、Ａｍｉｎｅ  Ａｑｕａ、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４０５。
【００８０】
好ましい実施形態において、Ｂ細胞は、標識された抗ＩｇＧ抗体および抗ＩｇＭ抗体で染色され、上記抗ＩｇＧ抗体でのみ陽性染色されるが、抗ＩｇＭ抗体で染色されない記憶Ｂ細胞を優先的に選択する。ＩｇＧは、一般に、ＩｇＭより高いアフィニティーを有する；表面にＩｇＧを発現するが、ＩｇＭを発現しない（これは、記憶Ｂ細胞に特徴的である）陽性Ｂ細胞は、それによって選択される。上記目的のために、マルチカラー染色が、好ましくは使用され、ここでＩｇＧに対して特異的な抗体およびＩｇＭに対して特異的な抗体が、別々に、例えば、ＡＰＣおよびＦＩＴＣでそれぞれ標識される。好ましくは、上記標的抗原および／もしくは上記標的抗原を発現する標的細胞はまた、標識される。一実施形態において、上記標的抗原は、上記標的抗原を発現する細胞を、細胞内蛍光色素で染色することによって、間接的に染色される。
【００８１】
本発明は、Ｂ細胞プールをスクリーニングするためにＦＡＣＳを使用する方法を提供し、ここでＢ細胞は、目的の標的抗原に特異的に結合する抗体を生成するＢ細胞を同定しかつさらに単離するために、上記標的抗原を発現する細胞に付着し得る。好ましくは、上記Ｂ細胞は、蛍光標識で標識され、上記標的抗原を発現する細胞は、異なる蛍光標識で別個に標識される。これら標識は、細胞内、細胞外、もしくは形質膜中に組み込まれるかのいずれかで存在し得る。免疫化および抗体の生成後に、全てのＢ細胞は一緒にプールされ、ＦＡＣＳシステムを通り抜ける。上記標的抗原に対して特異的な抗体を生成するＢ細胞のみが、上記抗原発現細胞に付着する。それらの付着は、他の個々の細胞の間での大まかな分離と比較して、上記流れ中のこれら２種の細胞の間の距離を短くし、このことは、それらが走査レーザービームを同時に通る間に検出可能な「バイカラー事象」をもたらす。従って、上記目的の抗体を生成するＢ細胞は、同定され得、次いで、他の非特異的Ｂ細胞とは異なる収集チューブへとソートされ得る。
【００８２】
別の好ましい実施形態において、上記Ｂ細胞と上記対応する抗原発現細胞との間の相互作用が、細胞特徴の特定の改変（例えば、脱分極、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）など）をもたらす場合、より多くの蛍光標識が、このような改変を可能にする細胞へと添加され得る。従って、Ｂ細胞および接触した抗原発現細胞は、「トリカラー」事象もしくは同時にさらに３色より多くの色を含む事象を表す。
【００８３】
あるいは、付着したＢ細胞の同定およびソーティングは、蛍光標識の存在を必要としない。一実施形態において、上記細胞−細胞相互作用は、いずれか細胞においても機能的変化をもたらす。別の実施形態において、これら機能的変化は、上記標的抗原に特異的に結合する抗体を生成するＢ細胞を同定しさらに分離するために使用され得る。例えば、上記細胞−細胞相互作用は、何れの細胞においてもレセプターシグナル伝達を機能的にブロックもしくは活性化し得、このことは、上記ＦＡＣＳシステムによって検出可能な細胞変化（例えば、Ｃａ２＋流出変化など）をもたらす。従って、これら検出可能な機能的変化をモニターすることによって、目的のＢ細胞はまた、同定されかつ分離され得る。レセプターシグナル伝達を機能的にブロックするかもしくは活性化する１つの特定の実施形態は、Ｂ細胞を、ＧＰＣＲ（Ｇタンパク質共役レセプター）を機能的に発現する細胞とインキュベートすることである。ＧＰＣＲを介してシグナル伝達するアゴニストは、小胞体（ｅｎｄｏｐｌａｓｍａｔｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ）からＧＰＤＲ媒介性Ｃａ２＋流出を誘導するために、上記混合物に添加され得る。Ｂ細胞上に提示される抗体がアゴニストシグナル伝達を機能的にブロックする場合、Ｃａ２＋流出もまた、この細胞−細胞相互作用によって結果的にブロックされる。Ｃａ２＋流出は、例えば、フローサイトメトリーによって定量的に測定され得る。従って、Ｃａ２＋流出の増大もしくは低下のいずれかを示すＢ細胞／標的細胞集団（ｃｏｎｇｌｏｍｅｒａｔｅ）のみが、ソートされる。
【００８４】
（単離されたＢ細胞によって生成される抗体に対するアフィニティーアッセイ）
特定の実施形態において、Ｂ細胞は、抗体が培養培地へと分泌されるように、適切な条件下で培養される。生成された抗体は、例えば、モノクローナル抗体である。上記培養は、ヘルパー細胞株（例えば、胸腺腫ヘルパー細胞株（例えば、ＥＬ４−Ｂ５（Ｚｕｂｌｅｒら，１９８５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３４（６）：３６６２−３６６８を参照のこと））の使用を伴い得る。
【００８５】
必要に応じて、さらなるアフィニティーアッセイが、上記単離されたＢ細胞によって生成される抗体の選択性およびリガンドと競合する能力を評価するために、さらなる処理の前に行われ得る。これらアッセイとしては、細胞ベースのアッセイ（例えば、細胞ＥＬＩＳＡ（ＣＥＬＩＳＡ）（これは、細胞全体がコーティングに使用される改変ＥＬＩＳＡプロセスである）が挙げられるが、これに限定されない。ＣＡ２３５００７８において議論されるように、ＣＥＬＩＳＡは、実施例において以下に記載されるとおりに行われ得る。上記確認工程は、上記標的に特異的に結合することについて、例えば、上記標的タンパク質以外の細胞表面に発現されるタンパク質に対して指向される抗体を排除することについて、生成された抗体を試験するために、行われ得る。
【００８６】
あるいは、上記同定されかつ単離された目的のＢ細胞は、抗体アフィニティーについて直接試験され得、上記Ｂ細胞は、処理の前に、付着した抗原発現細胞から分離させられ得る。
【００８７】
（抗体生成のための、単離されたＢ細胞のさらなる処理）
上記同定されかつ単離された（必要に応じて、アフィニティーアッセイ（例えば、ＣＥＬＩＳＡ）によって試験された）Ｂ細胞は、目的のイムノバインダーを生成するためにさらに処理され得る。伝統的なハイブリドーマ技術が、例えば、使用され得る。これは、上記イムノバインダーを精製し、それらのアミノ酸配列および／もしくは核酸配列を解明するような工程を伴い得る。
【００８８】
あるいは、上記バインダーの特徴付けは、それらのｓｃＦｖ形式において行われる。この目的のために、ソートされたＢ細胞上に発現されるバインダーのＣＤＲ配列が、培養され、ソートされた細胞から、もしくは単一細胞から直接のいずれかで、ＲＴ−ＰＣＲによって回収される。一方のオリゴヌクレオチドプールが上記ＣＤＲをコードし、第２のプールが適切なｓｃＦｖ足場のフレームワーク領域をコードする部分的に重複するオリゴヌクレオチドの２個のプールの組み合わせは、１工程のＰＣＲ手順で、ヒト化ｓｃＦｖの精製を可能にする。ＨＴ配列決定、クローニングおよび生成は、細胞培養上清中の分泌ＩｇＧを特徴付ける代わりに、上記生成されたヒト化ｓｃＦｖの性能に基づいて、クローン選択を行うことを可能にする。任意のウサギ抗体由来のＣＤＲを受容するに適したｓｃＦｖ足場が、同定されかつ特徴付けられてきた（「ウサギ化」ヒトＦＷもしくはウサギアクセプターＲａｂＴｏｒ；ＷＯ０９／１５５７２６を参照のこと（これは、その全体が本明細書に参考として援用される））。いくつかの場合において、上記ウサギ特異的ＣＤＲ間ジスルフィド結合をさらに含む種々のＣＤＲの概念の証明が、示された。
【００８９】
ウサギ化抗体を作製するための一般的説明は、以下に記載される。
【００９０】
（イムノバインダーのグラフト化（ｇｒａｆｔｉｎｇ））
本発明の方法を用いて同定されたイムノバインダーの抗原結合領域もしくはＣＤＲは、アクセプター抗体フレームワークへとグラフト化され得る。このようなグラフト化は、例えば、イムノバインダーの免疫原性を低下させ得るか、またはその機能的特性を改善し得る（例えば、熱力学的安定性を改善し得る）。
【００９１】
ヒトアクセプターフレームワークへＣＤＲをグラフト化するための一般的方法は、米国特許第５，２２５，５３９号（これは、その全体が本明細書に参考として援用される）においてＷｉｎｔｅｒによって開示された。
【００９２】
ウサギモノクローナル抗体由来のＣＤＲをグラフト化するための具体的なストラテジーは、米国仮特許出願第６１／０７５，６９７号および同第６１／１５５，０４１号（これらは、その全体が本明細書に参考として援用される）に開示されている。これらストラテジーは、Ｗｉｎｔｅｒのものに関連するが、上記アクセプター抗体フレームワークが、全てのヒトもしくは非ヒトのドナー抗体についての普遍的アクセプターとして特に適しているという点で、異なっている。特に、上記ヒト一本鎖フレームワークＦＷ１．４（配列番号１（ＷＯ０３／０９７６９７においてａ４３と称される）および配列番号２（ＷＯ０３／０９７６９７）においてＫＩ２７と称される）の組み合わせ）は、ウサギ抗体の抗原結合部位と非常に適合していることが示された。従って、上記ＦＷ１．４は、ウサギループのグラフト化に由来する安定なヒト化ｓｃＦｖ抗体フラグメントを構築するための適切な足場を表す。
【００９３】
さらに、ＦＷ１．４が、ＦＷ１．４の重鎖中の５個もしくは６個の残基位置を置換することによって、および／またはＦＷ１．４の軽鎖中の１個の位置を置換することによって最適化され得ることが、見いだされた。それによって、上記ＶＨ中の非常に種々のウサギＣＤＲのループコンフォメーションが、上記ドナーフレームワークの配列とはほとんど無関係に、完全に維持され得ることが、驚くべきことに見いだされた。ＦＷ１．４の重鎖中の５個もしくは６個の残基およびＦＷ１．４の軽鎖中の１個の位置は、ウサギ抗体において保存されている。上記重鎖中の５個もしくは６個の位置のコンセンサス残基、ならびに上記軽鎖中の１個の位置は、ウサギレパートリーから導き出され、ヒトアクセプターフレームワークの配列へ導入された。結果として、改変フレームワーク１．４（そこでは、ｒＦＷ１．４もといわれる）は、実質的に任意のウサギＣＤＲと適合性である。ウサギ野生型一本鎖とは対照的に、異なるウサギＣＤＲを含むｒＦＷ１．４は、十分に発現され、本来のドナーウサギ抗体のアフィニティーをほとんど完全に保持する。
【００９４】
よって、例示的イムノバインダーアクセプターフレームワークは、以下を含む：
（ｉ）配列番号１に対して少なくとも７０％同一性、好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、より好ましくは、少なくとも９５％同一性を有する可変重鎖フレームワーク；および／または
（ｉｉ）配列番号２に対して少なくとも７０％同一性、好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、より好ましくは、少なくとも９５％同一性を有する可変軽鎖フレームワーク。
【００９５】
好ましい実施形態において、上記可変軽鎖は、８７位（ＡＨｏ番号付け）にスレオニン（Ｔ）を含む。
【００９６】
好ましい実施形態において、上記イムノバインダーアクセプターフレームワークは、以下を含む：
（ｉ）配列番号１、配列番号４および配列番号６からなる群より選択される可変重鎖フレームワーク；および／または
（ｉｉ）配列番号２もしくは配列番号９の可変軽鎖フレームワーク。
【００９７】
好ましい実施形態において、上記可変重鎖フレームワークは、リンカーを介して可変軽鎖フレームワークに連結される。上記リンカーは、任意の適切なリンカー（例えば、配列ＧＧＧＧＳ（配列番号１０）の１〜４回反復、好ましくは、（ＧＧＧＧＳ）４ペプチド（配列番号８）を含むリンカー、またはＡｌｆｔｈａｎら（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８：７２５−７３１に開示されるリンカー）であり得る。
【００９８】
最も好ましい実施形態において、上記イムノバインダーアクセプターフレームワークは、配列番号３に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、より好ましくは、少なくとも９５％の同一性を有する配列である。より好ましくは、上記イムノバインダーアクセプターフレームワークは、配列番号３を含むか、または配列番号３である。
【００９９】
別の好ましい実施形態において、上記イムノバインダーアクセプターフレームワークは、配列番号５に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、より好ましくは、少なくとも９５％の同一性を有する配列である。より好ましくは、上記イムノバインダーアクセプターフレームワークは、配列番号５を含むか、または配列番号５である。
【０１００】
別の好ましい実施形態において、上記イムノバインダーアクセプターフレームワークは、配列番号７に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、より好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する配列である。より好ましくは、上記イムノバインダーアクセプターフレームワークは、配列番号７を含むか、または配列番号７である。
【０１０１】
さらに、配列番号１の例示的な可変重鎖フレームワークが、使用され得、これは、一般に、ウサギイムノバインダーに由来するＣＤＲのコンフォメーションを支持する１個以上のアミノ酸残基をさらに含む。特に、上記残基は、２４Ｈ、２５Ｈ、５６Ｈ、８２Ｈ、８４Ｈ、８９Ｈおよび１０８Ｈ（ＡＨｏ番号付け）からなる群より選択される１個以上のアミノ酸位置に存在する。これら位置は、ＣＤＲコンフォメーションに影響を与えることが証明されているので、ドナーＣＤＲに適合させるための変異が企図される。好ましくは、上記１個以上の残基は、２４位のスレオニン（Ｔ）、２５位のバリン（Ｖ）、５６位のグリシンもしくはアラニン（Ｇ／Ａ）、８２位のリジン（Ｋ）、８４位のスレオニン（Ｔ）、８９位のバリン（Ｖ）および１０８位のアルギニン（Ｒ）（ＡＨｏ番号付け）からなる群より選択される。
【０１０２】
好ましい実施形態において、上記可変重鎖フレームワークは、配列番号４もしくは配列番号６を含むか、または配列番号４もしくは配列番号６である。両方の可変重鎖フレームワークは、例えば、任意の適切な軽鎖フレームワークと組み合わされ得る。
【０１０３】
上記で開示される配列は、以下である（Ｘ残基は、ＣＤＲ挿入部位である）：
【０１０４】
【化１】
2018196395.tif 000003
【０１０５】
【化２】
2018196395.tif 000004
従って、Ｗｉｎｔｅｒの一般的方法とは異なって、本発明のヒト化方法に使用される上記フレームワーク配列は、必ずしも、上記ドナーＣＤＲが由来する非ヒト（例えば、ウサギ）抗体の配列に対して最大の配列類似性を示すフレームワーク配列ではない。さらに、ＣＤＲコンフォメーションを支持するための上記ドナー配列からグラフト化するフレームワーク残基は、必要とされない。
【０１０６】
上記アクセプター抗体フレームワークはまた、米国仮特許出願第６１／０７５，６９２号（これは、その全体が本明細書に参考として援用される）に記載されている安定性増強変異のうちの１個以上を含み得る。上記重鎖フレームワークにおける例示的な溶解度増強置換は、１２位、１０３位および１４４位（ＡＨｏ番号付け）で見いだされる。より好ましくは、上記重鎖フレームワークは、（ａ）１２位にセリン（Ｓ）；（ｂ）１０３位にセリン（Ｓ）もしくはスレオニン（Ｔ）、および／または（ｃ）１４４位にセリン（Ｓ）もしくはスレオニン（Ｔ）を含む。さらに、安定性増強アミノ酸は、上記可変軽鎖フレームワーク（ＡＨｏ番号付け）の１位、３位、４位、１０位、４７位、５７位、９１位、および１０３位の１個以上の位置で存在し得る。より好ましくは、上記可変軽鎖フレームワークは、１位にグルタミン酸（Ｅ）、３位にバリン（Ｖ）、４位にロイシン（Ｌ）、１０位にセリン（Ｓ）；４７位にアルギニン（Ｒ）、５７位にセリン（Ｓ）、９１位にフェニルアラニン（Ｆ）および／もしくは１０３位にバリン（Ｖ）を含む。
【実施例】
【０１０７】
実施例全体を通じて、別段示されなければ、以下の材料および方法を使用した。
【０１０８】
（材料および方法）
一般に、本発明の実施は、別段示されなければ、化学、分子生物学、組換えＤＮＡ技術、免疫学の従来技術（特に、例えば、抗体技術）、およびポリペプチド調製の標準的技術を使用する。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），５１０，Ｐａｕｌ，Ｓ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒ（１９９６）；Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ，１６９），ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｅｄ．，Ｉｒｌ  Ｐｒ（１９９６）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗら，Ｃ．Ｓ．Ｈ．Ｌ．Ｐｒｅｓｓ，Ｐｕｂ．（１９９９）；およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９２）を参照のこと。
【０１０９】
（細胞ＥＬＩＳＡ（ＣＥＬＩＳＡ））
以下の実施例は、ＣＸＣＲ２を発現する細胞を分析するためのＣＥＬＩＳＡの使用を記載する：
ＣＸＣＲ２を発現するＣＨＯ細胞を、９６ウェルの半分の面積のプレートに、５０，０００細胞／ウェルの密度で播種し得る。３７℃で一晩インキュベートした後、細胞を、ＰＢＳ中１％  ホルムアルデヒドで３０分間、室温で固定し得る。細胞層を３回洗浄し得、非特異的結合部位を、１時間にわたって室温で、細胞培養培地でブロックし得る。次に、３回の洗浄工程の後、その上清を、培養培地で１：１に希釈し得、上記ウェルに添加し得る。３個のコントロールウェル中、市販のウサギ抗ＣＸＣＲ２抗体を、上清中において添加し得る。次いで、上清を、１時間半にわたって、室温で、上記細胞層上でインキュベートし得る。最後に、ウサギＩｇＧを、ＨＲＰに結合させたヤギ抗ウサギＩｇＧ  Ｆｃ抗体で検出する。ペルオキシダーゼ基質（Ｒｏｃｈｅの青色ＰＯＤ基質）を添加して、比色反応を行い、これを、１Ｍ  ＨＣｌで２５分後に停止させ得る。吸光度を、４５０ｎｍにおいて測定し得る。
【０１１０】
（実施例１：可溶性抗原を使用するＢ細胞スクリーニングシステム）
本発明において記載されるＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソーティング）ベースのスクリーニングシステムをここで例示し、このシステムは、Ｂ細胞レセプター（ＢＣＲ）を介して目的の標的（特に、可溶性タンパク質）に結合し得るＢ細胞を選択し得る。この実施例において、上記標的は、蛍光色素（ＰＥおよびＰｅｒＣＰ）で標識した一本鎖抗ＶＥＧＦ抗体ＥＳＢＡ９０３であった。リンパ球懸濁物を、組換え標的で免疫化したウサギの脾臓から調製した。次いで、細胞を、ＰＥおよびＰｅｒＣＰで標識したｓｃＦｖと、ならびにＩｇＧに特異的な抗体（ＡＰＣ標識）もしくはＩｇＭに特異的な抗体（ＦＩＴＣ標識）と、インキュベートした。表面にＩｇＧを発現するが、ＩｇＭを発現しないＥＳＢＡ９０３陽性Ｂ細胞をソートし、９６ウェルプレート中に選択した（図２）。図２のパネルＡに示されるように、リンパ球を、前方散乱および側方散乱に従ってゲート制御した。それらの中で、ＩｇＧ＋ＩｇＭ−細胞（おそらく、記憶Ｂ細胞）を選択した（パネルＢ）。ｓｃＦｖ−ＰＥおよびｓｃＦｖ−ＰｅｒＣＰで二重染色された細胞を、上記ｓｃＦｖに対する高アフィニティーＩｇＧをコードすると予測した（パネルＣ）。最も明るい蛍光を示す細胞を、パネルＤにおいて列挙したソーティング統計を用いて、９６ウェルプレートにソートした。胸腺腫ヘルパー細胞株（ＥＬ４−Ｂ５：Ｚｕｂｌｅｒら，１９８５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３４（６）：３６６２−３６６８を参照のこと）によって、選択されたＢ細胞を増殖させ、形質細胞へと分化させ、次いで、抗体を分泌させた。これらＩｇＧ分子の標的タンパク質に対するアフィニティーを、ＥＬＩＳＡおよびＢｉａｃｏｒｅ測定によって確認した。動力学的パラメーターを、７個の選択されたクローンについて表１に示す。これらクローン（約２００個のソートした細胞のプールに由来）は、低ｎＭ〜ｐＭ範囲で高い結合アフィニティーを示す。最後に、分泌ＩｇＧ分子のｍＲＮＡを、６個の目的のクローンから単離し、そのＣＤＲを、ＥＳＢＡＴｅｃｈ  一本鎖フレームワーク  ＲａｂＴｏｒ（フレームワーク  ｒＦＷ１．４ともいわれる）にグラフト化した。
【０１１１】
【表１】
2018196395.tif 000005
（選択された文献：）
Ｚｕｂｅｒら  Ｍｕｔａｎｔ  ＥＬ−４  ｔｈｙｍｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌｌｙ  ａｃｔｉｖａｔｅ  ｍｕｒｉｎｅ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ  ｖｉａ  ｄｉｒｅｃｔ  ｃｅｌｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８５；１３４（６）：３６６２−３６６８。
【０１１２】
（膜貫通標的）
上記で記載されたスクリーニングシステムは、上記標的が可溶性である場合、および組換えタンパク質が利用可能である場合に効率的に機能する。しかし、いくつかの目的の標的は、マルチスパン膜貫通タンパク質（例えば、ＧＰＣＲおよびイオンチャネル）である。組換えタンパク質での伝統的な免疫化は、これらの場合において、得策ではないか、または不可能である。さらに、Ｂ細胞のＦＡＣＳ選択は、上記抗原が内在性膜タンパク質である場合に、精製され標識されたタンパク質の結合に基づいて行うことができない。これらの課題に対処するために、上記の手順の以下の改善を行った。
【０１１３】
１）組換えタンパク質の代わりに、ＤＮＡでの免疫化：
ＤＮＡワクチン接種は、ネイティブ（ｎａｔｉｖｅ）抗原に対して迅速な免疫応答を誘導する。組換えタンパク質が必要とされないので、この技術は、一方で非常に費用効率的であり、他方で、より重要なことには、この方法は、内在性膜複合体および／もしくはマルチスパン膜タンパク質のネイティブ発現を可能にする。
【０１１４】
２）内在性標的膜タンパク質を発現する細胞に結合するＢ細胞のＦＡＣＳ選択：
フローサイトメトリーは、通常、単一の細胞がレーザービームを横切るときに、上記単一の細胞によって発せられる蛍光を測定する。しかし、いくらかの研究者らは、細胞−細胞相互作用（例えば、カドヘリンによって媒介される接着（Ｐａｎｏｒｃｈａｎら，２００６，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１１９，６６−７４；Ｌｅｏｎｇ  ｅｔ  Ｈｉｂｍａ，２００５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，３０２，１１６−１２４）もしくはインテグリンによって媒介される接着（Ｇａｗａｚら，１９９１，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ，８８，１１２８−１１３４））を調査するために血球計算器を既に使用してきた。しかし、このような研究は、このような細胞−細胞相互作用がセルソーティングの物理的工程の間に損なわれないままであるか否かを実証しなかった。さらに、Ｂ細胞レセプターの、別の細胞の表面に存在するその標的への結合が、このような物理的ソーティングを許容にするのに十分強いことを決して示さなかった。
【０１１５】
膜貫通標的に結合するＢ細胞を選択するために、細胞（例えば、ＣＨＯ細胞もしくはＨＥＫ２９３細胞）を、選択した標的で一過性にもしくは優先的に安定にトランスフェクトし得るか、または上記選択した標的を天然に発現する細胞を、使用し得る。このような標的細胞を、細胞内蛍光色素（例えば、カルセイン）で染色し、免疫化したウサギの記憶Ｂリンパ球とインキュベートする。Ｂリンパ球を、細胞表面特異的マーカーに結合する蛍光性の抗体で染色する。従って、ＢＣＲ−標的相互作用を通じて、本来互いに付着する２つの細胞にあるバイカラー「事象」の選択（図１を参照のこと）が、達成され得る。
【０１１６】
これらＢ細胞のさらなる処理を、上記のように行うと、モノクローナル抗体の生成（例えば、ＩｇＧもしくはｓｃＦｖ形式において）がもたらされる．これら抗体の上記標的に対する親和性を推測するために、ＣＥＬＩＳＡ（ＥＬＩＳＡ（ここで、コーティング工程は、細胞全体を用いて行われる））を行う。この方法を用いると、抗体の選択性および上記リガンドと競合する能力が、評価され得る。最後に、目的のクローンのＣＤＲを、オリゴ伸長法での遺伝子合成によって、本発明者らのウサギ化フレームワーク（ＲａｂＴｏｒ）へとクローニングする。
【０１１７】
Ｂ細胞ソーティングの読み取りは、必ずしも、細胞−細胞相互作用を制限しないが、この相互作用がレセプターシグナル伝達を機能的にブロック／活性化する能力を選択するためにも使用され得る。例えば、Ｂ細胞を、ＧＰＣＲを機能的に発現する細胞とインキュベートし得る。ＧＰＣＲを通じてシグナル伝達するアゴニストを、小胞体からのＧＰＣＲ媒介性Ｃａ２＋流出を誘導するために、上記混合物へ添加し得る。Ｂ細胞上に提示された抗体がアゴニストシグナル伝達を機能的にブロックする場合、Ｃａ２＋流出はまた、結果的にこの細胞−細胞相互作用によってブロックされ得る。Ｃａ２＋流出を、フローサイトメトリーによって定量的に測定し得る。従って、Ｃａ２＋流出を示さないＢ細胞／標的細胞集団のみが、ソートされる。
【０１１８】
（実施例２：抗ＴＮＦα抗体でコーティングしたビーズと、膜結合ＴＮＦαを発現するＣＨＯ細胞との間の相互作用の検出）
膜貫通タンパク質に対するＢ細胞スクリーニングを始める前に、細胞−細胞相互作用（および、特に、ＢＣＲと、標的細胞上の膜貫通タンパク質との間の相互作用）が、ＦＡＣＳで確かに選択され得ることを実証しなければならない。フローサイトメトリーストリームにおける高圧が、２個の細胞の間の非共有結合を壊すか否かを決定するために、以下の実験を行った。
【０１１９】
膜結合ＴＮＦα（ＴＮＦαリガンドの切断および分離（ｓｈｅｄｄｉｎｇ）を妨げるＴＡＣＥ切断部位に点変異を含む変異体膜結合ＴＮＦαを含む；例えば、Ｓｃａｌｌｏｎら  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  ２００２；３０１：４１８〜２６を参照のこと）で安定にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞（Ｂ−２２０細胞）を、ＰＥ標識抗ＴＮＦα抗体でコーティングしたビーズとインキュベートした。この設定において、上記ビーズは、記憶Ｂ細胞を模倣する。陰性コントロールとして、トランスフェクトしていないＣＨＯ細胞を使用し、同様に、ＡＰＣ標識した非関連抗体（抗ＣＤ１９）でコーティングしたビーズも使用した。撹拌しながら４℃で２時間にわたってインキュベートした後、上記細胞−ビーズ懸濁物を、ＦＡＣＳ（１３０μｍノズルを使用する）によって分析した。図３は、抗ＴＮＦαビーズとＴＮＦαトランスフェクトしたＣＨＯ細胞との間の特異的結合が、ＦＡＣＳで明らかに検出可能であったことを示す。実際に、このサンプル（上部パネル）において、上記ビーズの約２／３が、細胞に結合した（５８５結合  対  ２６７非結合）。対照的に、上記コントロールサンプル（中央パネルおよび下部パネル）において、ほとんどのビーズは、ＣＨＯ細胞に結合しなかった。さらに、両方のビーズ集団（抗ＴＮＦα−ＰＥおよび抗ＣＤ１９−ＡＰＣ）を、ＴＮＦαトランスフェクトしたＣＨＯ細胞と一緒に混合した。図４は、抗ＴＮＦαビーズのうちの約１／２がＣＨＯ細胞に結合したのに対して、上記抗ＣＤ１９ビーズのうちの大部分が、結合しないままであったことを示す。各サンプルにおける上記細胞に結合するビーズの割合を、表２に詳述する。従って、内在性標的膜タンパク質にそれらのＢ細胞レセプターを通じて結合する単一のＢ細胞の特異的選択が、フローサイトメトリーを使用して可能であったことが実証された。
【０１２０】
【表２−１】
2018196395.tif 000006
【０１２１】
【表２−２】
2018196395.tif 000007
（実施例３：抗ＴＮＦα抗体で免疫化したウサギから単離されたＢ細胞と、抗ＴＮＦα抗体で飽和状態にした膜結合ＴＮＦαを発現するＣＨＯ細胞との間の相互作用の検出）
図５に示される実験については、リンパ球を、抗ＴＮＦα抗体（ＥＳＢＡ１０５，内部で生成）で免疫化したウサギの脾臓もしくは免疫化していないウサギの脾臓のいずれかから単離した。それらを、抗ウサギＩｇＧ−ＡＰＣおよび抗ウサギＩｇＭ−ＦＩＴＣ（ＡｂＤ  ｓｅｒｏｔｅｃ）で染色し、その後、記憶Ｂ細胞（ＩｇＧ＋／ＩｇＭ−）の純粋な集団を得るために、予めソートした。並行して、ＴＮＦα発現ＣＨＯ細胞（Ｄｒ．Ｐ  Ｓｃｈｅｕｒｉｃｈ（Ｕｎｉｖ．ｏｆ  Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ）によって寄付）に、１μｇ／ｍＬ  カルセイン−レッド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（生細胞を蛍光染色する細胞質色素）を添加した。次いで、これら細胞を、１回洗浄し１００μｇ／ｍＬのＥＳＢＡ１０５と（あるいは陰性コントロールについては、なし）インキュベートし、最後に、ＰＢＳで再び３回洗浄した。記憶Ｂ細胞を、約１：１０の比率で上記ＣＨＯ細胞と最終的に混合し、回転プレート上で、４℃で２時間の間インキュベートした（濃度：３×１０７細胞／ｍＬ）。
【０１２２】
以下のサンプルを調製した：
１）ＣＨＯ−ＴＮＦα細胞＋ＥＳＢＡ１０５＋ＥＳＢＡ１０５で免疫化したウサギの記憶Ｂ細胞
２）ＣＨＯ−ＴＮＦα細胞＋ＥＳＢＡ１０５＋免疫化していないウサギの記憶Ｂ細胞
３）ＣＨＯ−ＴＮＦα細胞＋ＥＳＢＡ１０５で免疫化したウサギの記憶Ｂ細胞  。
【０１２３】
２時間のインキュベーション後、上記３サンプルを、７０μｍノズルを使用して、ＦＡＣＳによって測定した。表３ａに示される集団階層によれば、ＥＳＢＡ１０５で免疫化した細胞のうちの５％は、「ＥＳＢＡ１０５でコーティングした」ＴＮＦαトランスジェニックＣＨＯ細胞に結合する。比較すると、ほんの０．５％の免疫化していないＢ細胞が、これら「ＥＳＢＡ１０５でコーティングした」ＴＮＦαトランスジェニックＣＨＯ細胞に結合し（表３ｂ）、０．６％の免疫化したＢ細胞が、ＣＨＯ細胞上のＥＳＢＡ１０５の非存在下で結合する（表３ｃ）。これら結果は、ＢＣＲ（Ｂ細胞レセプター）と、膜貫通標的との間の特異的相互作用が、ＦＡＣＳによって検出され得ることを示す。
【０１２４】
【表３−１】
2018196395.tif 000008
（実施例４：ＥＳＢＡ１０５で免疫化したウサギから単離されたＢ細胞と、ＥＳＢＡ１０５で飽和状態にした膜結合ＴＮＦαを発現するＣＨＯ細胞との間の相互作用の検出）
さらなる実験において、記憶Ｂ細胞の予備ソーティングは行わなかった。リンパ球集団全体を、染色したＣＨＯ−ＴＮＦα−ＥＳＢＡ１０５細胞とインキュベートした。トランスジェニックＣＨＯ細胞を、上記のように調製した。しかし、９６ウェルプレートにおけるソート後にＢ細胞培養培地中でのそれらの増殖を妨げるために、上記細胞を、カルセイン染色の前にマイトマイシンＣ（Ｍ４２８７−２ＭＧ）処理することによって、細胞周期を停止させた。ＥＳＢＡ１０５免疫化ウサギのリンパ球を３：１の比で、上記染色したＣＨＯ細胞と混合し（細胞懸濁物の濃度：約３−１０７細胞／ｍＬ）、回転プレート上で、４℃で２時間の間インキュベートした。その後、上記細胞懸濁物を、ＦＡＣＳ分析し、ＣＨＯ−ＴＮＦα−ＥＳＢＡ１０５に結合している記憶Ｂ細胞を、図６に示されるゲートに従ってソートした（表３に示されるように、１細胞／ウェル、１０細胞／ウェルもしくは１００細胞／ウェルで）。ソートした細胞は、上記記憶Ｂ細胞集団のうちの５．５％（それぞれ、合計事象のうちの０．２％）を表した。
【０１２５】
ソートした細胞を、９６ウェルプレート中に集め、５％  ＣＯ２で、３７℃で１３日間培養した。その後、培養上清を集め、直接ＥＬＩＳＡで試験して、ＥＳＢＡ１０５結合ＩｇＧの存在について調べた。ＥＬＩＳＡ結果（表３）は、ＥＳＢＡ１０５特異的抗体が多くのウェルにおいて検出でき、単一のＢ細胞をソートしたウェルにおいても検出できたことを示す。これら上清のＢｉａｃｏｒｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）分析（表４）は、これら抗体がＥＳＢＡ１０５標的に実際に結合することを確認した。
【０１２６】
【表３−２】
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【０１２７】
【表４】
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（実施例５：ＣＸＣＲ２（ソート２７／２９）で免疫化したウサギのリンパ球のスクリーニング）
３羽のウサギを、ＣＸＣＲ２発現ベクターで免疫化した。ＣＸＣＲ２−ｃＤＮＡの数回の皮内適用の後に、血清を採取し、ＣＸＣＲ２トランスフェクトした細胞で特異的抗体の存在について試験した。次いで、リンパ節細胞を取り出し、各１．６×１０７細胞ずつ５つのアリコートに分けて凍結し、液体窒素タンク中に保存した。
【０１２８】
アリコートを融解し、ＩｇＧに対して特異的な抗体（ＡＰＣ標識）もしくはＩｇＭに対して特異的な抗体（ＦＩＴＣ標識）で染色した。並行して、ＣＸＣＲ２発現ＣＨＯ細胞を、上記細胞を死滅させることなくさらなる増殖を妨げるために、マイトマイシンＣで処理し、１μｇ／ｍＬ  カルセイン−レッドを添加した。次いで、両方の細胞調製物を、最終濃度１０７細胞／ｍｌの、ＣＸＣＲ２トランスフェクトしたＣＨＯ細胞の２倍程度のリンパ球と混合した。４℃で穏やかに攪拌しながら２時間インキュベートした後、細胞懸濁物を、５０μｍフィルタで濾過し、ＦＡＣＳにかけた。図６に記載されるようにゲート制御を行った。１つの「事象」（ＣＸＣＲ２トランスフェクトしたＣＨＯ細胞に結合した記憶Ｂ細胞）を、合計１０×９６ウェルプレート（合計９００事象）で、１ウェルあたりにソートした。ソートした事象は、上記記憶Ｂ細胞集団のうちの３．１％（それぞれ、上記サンプル中の合計細胞量の０．０３５％）を表した。
【０１２９】
選択したリンパ球を、３７℃のインキュベーター中で２１日間培養した。２〜３日毎に、１００μＬの培養上清を上記ウェルから集め、新鮮な培地と交換した。この培養期間の間、Ｂ細胞は増殖し、形質細胞へと分化し、抗体を分泌した。どの上清がＣＸＣＲ２特異的抗体を含んでいたかを可視化するために、ＣＥＬＩＳＡを行った。このために、ＣＸＣＲ２を発現するＣＨＯ細胞を、９６ウェルの半分の面積のプレートに、５０，０００細胞／ウェルの密度で播種した。３７℃で一晩インキュベートした後、細胞を、ＰＢＳ中１％  ホルムアルデヒドで、室温で３０分間にわたって固定した。次いで、細胞層を、３回洗浄し、非特異的結合部位を、室温で１時間、細胞培養培地でブロックした。次に、３回の洗浄工程の後、上記上清を培養培地中で１：１希釈し、各ウェルに添加した。３個のコントロールウェルにおいて、市販のウサギ抗ＣＸＣＲ２抗体を、上清中に添加した。上清を、室温で１時間半、上記細胞層上でインキュベートした。最後に、ウサギＩｇＧを、ＨＲＰに結合させたヤギ抗ウサギＩｇＧ  Ｆｃ抗体で検出した。ペルオキシダーゼ基質（Ｒｏｃｈｅの青色ＰＯＤ基質）を添加して、比色反応を行って、１Ｍ  ＨＣｌで２５分後に停止させた。吸光度を４５０ｎｍで測定した。
【０１３０】
このＣＥＬＩＳＡは、陽性シグナルを示す１．８％のウェルを生じた（１６／９００）。全ての陽性を、第２のＣＥＬＩＳＡで確認した。上清をまた、他の細胞株：ＣＨＯ−Ｋ１（野生型）に対して試験して、起こり得る非特異的結合クローン（ＣＨＯ−ヒトＣＸＣＲ１およびＣＨＯ−マウスＣＸＣＲ２）を明らかにして、密に関連するレセプターもしくは種対応物に対する交叉反応性を実証した。最後に、上清を、４８個のＣＸＣＲ２  Ｎ末端アミノ酸からなるペプチドへの結合について、直接ＥＬＩＳＡにおいて試験した。結果を表５に示す。全ての選択した上清は、ＣＥＬＩＳＡにおいて、ヒトＣＸＣＲ２に対して強いＯＤ４５０シグナルを生成した。それらのうちのいくつかはまた、ＣＨＯ野生型細胞を用いたコントロール実験において僅かに陽性であった。このことは、それらが非特異的な様式で結合し得ることを意味する。上記クローンのうちのいずれも、ヒトＣＸＣＲ１とも、マウスＣＸＣＲ２とも交叉反応しなかった。最後に、いくつかのクローン（しかし、それらのうちの全てではない）は、上記ＣＸＣＲ２  Ｎ末端ペプチドに結合した。このことは、ＣＸＣＲ２上のあり得る代替の結合部位を示す。Ｂｉａｃｏｒｅチップに細胞全体を固定化することが不可能であるとすると、ＣＸＣＲ２レセプターに対する選択された抗体の親和性を定量的に測定することは、現在不可能である。しかし、集められたデータは、ヒトＣＸＣＲ２に特異的な抗体が、上記の細胞−細胞相互作用ソーティングシステムを使用して選択されたことを示すように収束している。
【０１３１】
【表５−１】
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【表５−２】
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（等価物）
本発明に対する多くの改変および代替の実施形態は、前述の説明に鑑みれば、当業者に明らかである。よって、この説明は、例示としてのみ解釈されるべきであり、本発明を実施するためのベストモードを当業者に教示する目的である。構造の詳細は、本発明の趣旨から逸脱することなく実質的に変動し得、添付の特許請求の範囲内にある全ての改変の独占的な使用は確保され得る。本発明は、添付の特許請求の範囲および適用可能な法の支配によって必要とされる程度にのみ限定されることが意図される。
【０１３２】
本願において引用される全ての文献および類似の資料（特許、特許出願、文献、書籍、条約、論文、ウェブページ、図面および／もしくは付録を含む）は、このような文献および類似の資料の形式に拘わらず、それらの全体が本明細書に参考として援用される。援用される文献および類似の資料のうちの１つ以上が、定義された用語、擁護の使用法、記載された技術などを含め、本願と異なるか矛盾する場合には、本願が優先する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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