(57)【要約】      （修正有）【課題】デジタルＰＣＲの熱サイクルにおける変性及びアニーリング／伸長のためのホールド時間をなくし、デジタルＰＣＲの高速化を実現するデジタルＰＣＲ用熱サイクル装置の提供。【解決手段】ＰＣＲ反応液の液滴６と油相７のエマルジョンを収容するための液滴収容部２を有する容器１と、平坦な上面５ａが加熱面をなすヒーター５とを備えるデジタルＰＣＲ用熱サイクル装置。容器１は、上下に貫通する開口３ａが少なくとも１つ形成された容器本体３と、容器本体３の下面に接合された熱伝導性を有する基板４とを有し、容器本体３の開口３ａと基板４から容器１の液滴収容部２が形成され、容器１はヒーター５の上面５ａに載置され、容器１の液滴収容部２に液滴６が単層をなして収容された状態で、容器１の基板４がヒーター５によりＰＣＲの熱サイクルに従って繰り返し温度昇降されるデジタルＰＣＲ用熱サイクル装置。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＣＲ反応液の液滴と油相とのエマルジョンを収容するための液滴収容部を有する容器と、
前記容器を支持するための支持手段と、
前記容器を加熱するための熱源とを備えたデジタルＰＣＲ用熱サイクル装置であって、
前記容器が、
上下に貫通する開口が少なくとも１つ形成された容器本体と、
前記容器本体の下面に接合された熱伝導性を有する基板と、を有し、
前記容器本体の前記開口が前記液滴収容部の内部空間を形成するとともに、前記基板の上面が前記液滴収容部の底面を形成し、
前記熱源が、前記支持手段によって支持された前記容器の下面に接触し、または前記容器の下方において前記容器の下面に対向して配置され、
前記容器の前記液滴収容部に、前記エマルジョンが、前記液滴が単層をなすように収容された状態で、前記容器の前記基板が前記熱源によりＰＣＲの熱サイクルに従って繰り返し温度昇降されるものであることを特徴とするデジタルＰＣＲ用熱サイクル装置。
【請求項２】
前記熱源はヒーターからなり、前記ヒーターの上面が平坦な加熱面を形成するとともに前記支持手段をなし、前記容器は前記ヒーターの上面に載置されていることを特徴とする請求項１に記載のデジタルＰＣＲ用熱サイクル装置。
【請求項３】
前記ヒーターはフラットベッド熱サイクラーからなっていることを特徴とする請求項２に記載のデジタルＰＣＲ用熱サイクル装置。
【請求項４】
前記基板はガラス板からなっていることを特徴とする請求項１〜請求項３のいずれかに記載のデジタルＰＣＲ用熱サイクル装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、デジタルＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法において使用される熱サイクル装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
デジタルＰＣＲ法においては、まず、テンプレート（増幅対象）ＤＮＡ、ＤＮＡ合成酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）およびプライマーと呼ばれるオリゴヌクレオチド等を含む反応液（ＰＣＲ反応液）が、複数の微細ウェル（反応パーティション）に分配される。このとき、微細ウェルのサイズが均一であれば、ＤＮＡ分子の分配はポアソン分布に従う。
【０００３】
その後、微細ウェルは、ＰＣＲ用の熱サイクル装置によって、変性（９４℃程度）・アニーリング（６０℃程度）・伸長（７２℃程度）のための３段階の温度変化を生じさせる熱サイクル、あるいは変性（９４℃程度）・アニーリング／伸長（６０℃〜６８℃程度）のための２段階の温度変化を生じさせる熱サイクルを施され、それによって一斉にＰＣＲ増幅が行われる。
【０００４】
このとき、ＤＮＡ分子が１つ以上存在していた微細ウェル内では、ＰＣＲ増幅が進行し、ＰＣＲ生産物が得られる。なお、ＰＣＲ反応液には予め蛍光プローブが含有され、ＰＣＲ生産物が存在していれば蛍光シグナルが得られるようになっている。
【０００５】
こうして、デジタルＰＣＲ終了後、各微細ウェルの蛍光シグナルのオン／オフが判定される。そして、微細ウェルの全体に占める蛍光陽性ウェルの割合がわかれば、微細ウェル１個当たりの平均ＤＮＡ分子数λが、
λ＝−ｌｎ（１−ｐ）
ここで、ｐは蛍光陽性液滴の割合を表す、によって算出される。
【０００６】
さらに、微細ウェルの個数と微細ウェル１個当たりの体積が既知であるから、ＰＣＲ反応液中のＤＮＡ分子数が算出される。
このように、デジタルＰＣＲは、従来のＰＣＲとは異なり、外部リファレンスを用いることなくＤＮＡの絶対定量を可能とする。
それ故、デジタルＰＣＲ法においては、微細ウェル内において一分子からＰＣＲ増幅ができることが必須条件となる。なぜなら、もしこの条件が満たされないと、上式のｐの値を正しく見積もることができないからである。
【０００７】
また近年では、マイクロ流体チップを用いて製造した微小な液滴（エマルジョン）を微細ウェルの代わりに使用したデジタルＰＣＲ法が盛んに研究されている。
なお、液滴（エマルジョン）を反応パーティションとして使用するデジタルＰＣＲを、特にドロプレットデジタルＰＣＲと呼ぶこともある。
【０００８】
ところで、デジタルＰＣＲにおいても、熱サイクル装置としては、従来のＰＣＲ法で用いられる熱サイクル装置が一般に使用されている。
従来の熱サイクル装置としては、例えば、特許文献１に記載されたものがある。
特許文献１に記載の熱サイクル装置は、基台と、基台の上面に立設された支持壁と、支持壁の一面に取り付けられたモータと、支持壁の他面側に突出するモータの駆動軸に固定された本体とを備えている。
【０００９】
本体は、互いに間隔をあけて対置された一対のフランジと、一対のフランジ間にのび、互いに上下に間隔をあけて配置された第１加熱部、スペーサーおよび第２加熱部と、一対のフランジ間にのび、第１加熱部、スペーサーおよび第２加熱部のそれぞれの両側を被覆する一対の固定板と、一対のフランジおよび一対の固定板によって画成された下部開口を被覆する底板と、一対のフランジおよび一対の固定板によって画成された上部開口を被覆する蓋と、を備えており、一対のフランジのうちの一方のフランジがモータの駆動軸に固定されている。第１および第２加熱部は、それぞれアルミニウム製のヒートブロックと、ヒーターとからなっている。
また、第１加熱部のヒートブロック、スペーサーおよび第２加熱部のヒートブロックの上下に整合する位置に複数の穴が貫通形成されており、これらの貫通穴が、バイオチップを装着するための装着部を形成している。
【００１０】
そして、ＰＣＲ反応液と、ＰＣＲ反応液よりも比重が小さく、かつ反応液と混和しない液体とが充填されたバイオチップが熱サイクル装置の本体の装着部に装着され、第１および第２加熱部の温度が制御されつつ、本体がモータによって回転せしめられて、バイオチップを起立状態に保持する位置と、バイオチップを逆立ち状態に保持する位置の２つの位置に切り替えられることによって、バイオチップ内のＰＣＲ反応液に熱サイクルが施されるようになっている。
【００１１】
しかしながら、この熱サイクル装置においては、第１および第２加熱部のヒートブロックからバイオチップ内のＰＣＲ反応液に熱が伝わるのに一定の時間を要するため、変性・アニーリング・伸長の各設定温度において１０秒〜１分程度のホールド時間（待機時間）が設けられる。
そのため、ＰＣＲ生産物を得るまでに時間がかかるという問題があり、ホールド時間をいかに短縮するかがデジタルＰＣＲ法における主要な課題の１つとなっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開２０１２−１１５２０８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって、本発明の課題は、デジタルＰＣＲの熱サイクルの変性、アニーリングおよび伸長の各設定温度におけるホールド時間（待機時間）をなくし、デジタルＰＣＲの高速化を実現することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記課題を解決するため、本発明によれば、ＰＣＲ反応液の液滴と油相とのエマルジョンを収容するための液滴収容部を有する容器と、前記容器を支持するための支持手段と、前記容器を加熱するための熱源とを備えたデジタルＰＣＲ用熱サイクル装置であって、前記容器が、上下に貫通する開口が少なくとも１つ形成された容器本体と、前記容器本体の下面に接合された熱伝導性を有する基板と、を有し、前記容器本体の前記開口が前記液滴収容部の内部空間を形成するとともに、前記基板の上面が前記液滴収容部の底面を形成し、前記熱源が、前記支持手段によって支持された前記容器の下面に接触し、または前記容器の下方において前記容器の下面に対向して配置され、前記容器の前記液滴収容部に、前記エマルジョンが、前記液滴が単層をなすように収容された状態で、前記容器の前記基板が前記熱源によりＰＣＲの熱サイクルに従って繰り返し温度昇降されるものであることを特徴とするデジタルＰＣＲ用熱サイクル装置が提供される。
【００１５】
本発明の好ましい実施例によれば、前記熱源はヒーターからなり、前記ヒーターの上面が平坦な加熱面を形成するとともに前記支持手段をなし、前記容器は前記ヒーターの上面に載置されている。
本発明の別の好ましい実施例によれば、前記ヒーターはフラットベッド熱サイクラーからなっている。
本発明のさらに別の好ましい実施例によれば、前記基板はガラス板からなっている。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、ＰＣＲ反応液の液滴と油相の比重の違いから、容器の液滴収容部内において、ＰＣＲ反応液の液滴は単層状態で油相中に沈む。こうして、ＰＣＲ反応液の液滴を熱伝導性を有する基板上に単層状態で配置し、基板を加熱手段によってＰＣＲの熱サイクルに従って繰り返し温度昇降するようにしたので、加熱手段から液滴への伝熱効率が著しく向上する。
それによって、デジタルＰＣＲの熱サイクルの変性、アニーリングおよび伸長の各設定温度におけるホールド時間（待機時間）をなくすことができ、ＰＣＲの高速化が実現できる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明の１実施例によるデジタルＰＣＲ用熱サイクル装置を示す図であり、（Ａ）は縦断面図であり、（Ｂ）は（Ａ）のデジタルＰＣＲ用熱サイクル装置の容器の平面図である。
【図２】本発明の別の実施例によるデジタルＰＣＲ用熱サイクル装置の容器を示す図であり、（Ａ）は容器の平面図であり、（Ｂ）は容器の内部構造を示す模式図であり、（Ｃ）は容器の液滴収容部にＰＣＲ反応液の液滴を捕集する状態を示す斜視図である。
【図３】本発明のデジタルＰＣＲ用熱サイクル装置を用いて得られたＰＣＲ生産物の落射蛍光顕微鏡による観察画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、添付図面を参照しつつ、本発明の構成を好ましい実施例に基づいて説明する。
図１Ａは、本発明の１実施例によるデジタルＰＣＲ用熱サイクル装置の縦断面図であり、図１Ｂは、図１ＡのデジタルＰＣＲ用熱サイクル装置の容器の平面図である。
【００１９】
図１を参照して、本発明によれば、ＰＣＲ反応液の液滴６と油相７とのエマルジョンを収容するための液滴収容部２を有する容器１が備えられる。
容器１は、上下に貫通する開口３ａが少なくとも１つ（この実施例では、２つ）形成された容器本体３と、容器本体３の下面に接合された熱伝導性を有する基板４とを有している。
そして、容器本体３の開口３ａが液滴収容部２の内部空間を形成するとともに、基板４の上面）が液滴収容部２の底面を形成している。
【００２０】
基板４は、熱伝導性を有し、かつＰＣＲの熱サイクルに従う温度昇降に耐え得る一定程度の耐熱性を有してさえいれば、どのような材料から形成されていてもよい。この実施例では、基板４はガラス板からなっている。
また、基板４の熱伝導性を上げるため、基板４は十分に薄い方が好ましい。
容器本体３は、ＰＣＲの熱サイクルに従う温度昇降に耐え得る一定程度の耐熱性を有してさえいれば、どのような材料から形成されていてもよい。
【００２１】
図１を参照して、また本発明によれば、容器１を加熱するための熱源５が備えられる。
この実施例では、熱源５はヒーターからなり、ヒーター５の上面５ａが平坦な加熱面を形成している。ヒーター５は、加熱・冷却時にできるだけ大きな温度勾配が得られるものが好ましい。ヒーター５として、例えば、公知のＰＣＲ用フラットベッド熱サイクラーを使用することもできる。
【００２２】
そして、ヒーター５の上面（加熱面）５ａに容器１が載置されている。すなわち、ヒーター５の上面５ａは、容器１を加熱する機能だけでなく、容器１の下面を支持する機能も有している。
【００２３】
こうして、図１Ａに示すように、容器１の液滴収容部２に、ＰＣＲ反応液の液滴６と油相７とのエマルジョンが、液滴６が単層をなすように収容され、その後、容器１（特に基板４）がヒーター５によってＰＣＲの熱サイクル（変性・アニーリング・伸長）に従って繰り返し温度昇降される。
【００２４】
このとき、ＰＣＲ反応液の液滴６と油相７の比重の違いから、容器１の液滴収容部２において、液滴６が油相７中に単層状態で沈む。そして、ＰＣＲ反応液の液滴６を熱伝導性を有する基板４上に単層状態で配置し、基板４をヒーター５によってＰＣＲの熱サイクルに従って繰り返し温度昇降するようにしたので、ヒーター５から液滴６への伝熱効率が著しく向上する。
それによって、通常のデジタルＰＣＲの熱サイクルにおいて生じていた変性、アニーリングおよび伸長の各設定温度におけるホールド時間（待機時間）をなくすことができ、デジタルＰＣＲの高速化が実現できる。
【００２５】
以上、本発明の好ましい実施例を説明したが、本発明の構成は上記実施例に限定されるものではなく、本願の特許請求の範囲に記載した事項の範囲内で種々の変形例が案出可能であることは言うまでもない。
【００２６】
例えば、上記実施例では、熱源５の上面５ａ（加熱面）に容器１が載置され、熱源５が容器１の下面に接触するようにしたが、その代わりに、熱源５が、熱源５とは別個に備えられた支持手段によって支持された容器１の下方において容器１の下面に対向して配置されていてもよい。
また、熱源５はヒーターに限定されず、送風ファンによって噴出される高温空気等を熱源５として使用することもできる。
【００２７】
また、容器１は、上下に貫通する開口３ａが少なくとも１つ形成された容器本体３と、容器本体３の下面に接合された熱伝導性を有する基板４とを有し、容器本体３の開口３ａが液滴収容部２の内部空間を形成するとともに、基板４の上面が液滴収容部２の底面を形成してさえいれば、どのような構成であってもよく、上記実施例の容器１の代わりに、例えば、液滴６と油相７とのエマルジョンを製造する機能を有し、かつ容器本体３と基板４とから形成された液滴収容部２を備えたマイクロ流体チップを用いることもできる。
【００２８】
（実験）
次に、本発明の熱サイクル装置がデジタルＰＣＲ法に適用可能かどうか、すなわち、本発明の熱サイクル装置において、デジタルＰＣＲ法の絶対定量原理の成立のための必須条件（テンプレートＤＮＡの一分子からのＰＣＲ増幅が可能であること）が満たされているかどうかを検証すべく実験を行った。
実験では、本発明のデジタルＰＣＲ用熱サイクル装置の容器として、図２に示すようなマイクロ流体チップを使用した。図２Ａはマイクロ流体チップの平面図であり、図２Ｂはマイクロ流体チップの内部構造を示す模式図である。
なお、このマイクロ流体チップは、特開２０１５−２１１９３１号公報に記載されたマイクロ流体チップと基本的構成が同じである。よって、マイクロ流体チップの構成の詳細については特開２０１５−２１１９３１号公報を参照されたい。
【００２９】
図２を参照して、マイクロ流体チップは、ガスを吸蔵し得る合成樹脂から形成された一定厚の板状のチップ本体１１を有している。この実施例では、チップ本体１１を形成する合成樹脂としてポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）が使用されている。
【００３０】
チップ本体１には、上下に貫通する３つの円柱状の穴１２〜１４が形成されている。
チップ本体１１の下面には、第１の穴１２の開口縁に接続する第１の微細な溝１５と、第２の穴１３の開口縁に接続する第２の微細な溝１６と、第３の穴１４の開口縁に接続する第３の微細な溝１７が形成され、第１〜第３の溝１５〜１７は互いに一点Ｐで連結されている。
第１〜第３の溝１５〜１７は、それぞれ、全長にわたって同じ深さを有するように、また、連結点Ｐの手前から当該連結点Ｐに向かって先細り状に形成されている。
さらに、連結点Ｐにおいて、第１〜第３の溝１５〜１７は、第１および第２の溝１５、１６のうちの一方（この実施例では、第１の溝１５）と第３の溝１７が一直線となり、第１および第２の溝１５、１６のうちの他方（この実施例では、第２の溝１６）が、第１および第２の溝１５、１６のうちの一方（この実施例では、第１の溝１５）および第３の溝１７に対して直交する配置で、互いにＴ字状に連結されている。
【００３１】
そして、チップ本体１１の下面には、ポリカーボネート板（またはアクリル板）１８が気密シールされた状態で接合されている。この場合、チップ本体１１を形成するＰＤＭＳの強い自己吸着性により、チップ本体１１とポリカーボネート板１８を互いに接触させるだけで、両者を気密シールした状態で接合することができる。
また、ポリカーボネート板１８におけるチップ本体１１の第３の穴１４に整合する位置には、第３の穴１４と同一径の穴１９が形成されてポリカーボネート板１８を上下に貫通している、
【００３２】
チップ本体１１とポリカーボネート板１８との接合によって、チップ本体１１の第１および第２の穴１２、１３のそれぞれの一端開口が封閉されて、第１および第２の液溜ｍ１、ｍ２が形成され、また、チップ本体１１下面の第１〜第３の溝１５〜１７のそれぞれの開口部が封閉されて、第１〜第３のマイクロ流路ｎ１〜ｎ３が形成される。
【００３３】
さらに、ポリカーボネート板１８の下面に両面接着テープ２０を介してガラス板２１が接合されて、ポリカーボネート板１８の穴１９の下端開口が封閉されている。
そして、チップ本体１１の第３の穴１４とポリカーボネート板１８の穴１９から液溜収容部ｍ３の内部空間が形成され、ガラス板２１の上面から液溜収容部ｍ３の底面が形成される。
【００３４】
実験では、このマイクロ流体チップをポンプ内蔵真空デシケータ内に収容し、ポンプを作動させてデシケータ内を減圧した後、ポンプを停止させてデシケータ内を３０分間減圧状態に維持した。
【００３５】
その後、脱気したマイクロ流体チップをデシケータから取り出して大気圧下に置き、液滴収容部ｍ３に油相７を第３のマイクロ流路ｎ３の高さまで注入した後、図２Ｃに示すように、液滴収容部ｍ３の開口に蓋体２２を被せるとともに、固定用ホルダー（図示しない）によって蓋体２２をマイクロ流体チップに固定した。さらに、蓋体２２に設けた通気路（図示しない）に吸気管２３の一端を接続し、吸気管２３の他端にはマイクロポンプ（図示しない）を接続した。
【００３６】
次いで、第１の液溜ｍ１に７０μＬの油相７を注入する一方、第２の液溜ｍ２には１０μＬのＰＣＲ反応液を注入した。
ＰＣＲ反応液の成分は表１および表２に示す通りであり、油相７の成分は表３に示す通りである。
【００３７】
【表１】
2018143197.tif 000003
【００３８】
【表２】
2018143197.tif 000004
【００３９】
【表３】
2018143197.tif 000005
【００４０】
そして、ＰＤＭＳのガス吸蔵作用を利用するとともにマイクロポンプによる吸気を行い、第１および第２の液溜ｍ１、ｍ２からそれぞれ油相７およびＰＣＲ反応液を第１および第２のマイクロ流路ｎ１、ｎ２を通じて液滴収容部ｍ３に向けて流し、第３のマイクロ流路ｎ３内にエマルジョンを形成して、液溜収容部ｍ３にＰＣＲ反応液の液滴６を油相７とともに、液滴６が単層をなす状態で捕集した。このとき、液滴収容部ｍ３内において、液滴６は単層状態で油相７中に沈む。
【００４１】
なお、本発明の熱サイクル装置がデジタルＰＣＲ法に適用可能かどうか、すなわち、本発明の熱サイクル装置においてテンプレートＤＮＡの一分子からのＰＣＲ増幅が可能かどうかを検証するため、ここでは、同一の液滴６に複数のテンプレートＤＮＡ分子が内包される確率が極めて低くなるようにＰＣＲ反応液中のテンプレート濃度を調整している。
【００４２】
次に、液滴収容部ｍ３にサンプル溶液の液滴６および油相７が捕集されたマイクロ流体チップを、市販のＰＣＲ用フラットベッド熱サイクラーの平坦な加熱面上に載置し、当該熱サイクラーによって、マイクロ流体チップの液滴収容部ｍ３の液滴６にＰＣＲの変性、およびアニーリング／伸長のための熱サイクルを施した。
熱サイクルは
・初期変性（９８℃、４０秒）＋［変性（９７．５℃、０秒）＋アニーリング／伸長（５８℃、０秒）］×３０サイクル＋２５℃
とした。
ここで、変性（９７．５℃、０秒）とあるのは、アニーリング／伸長温度から温度上昇させて変性のための熱源５の設定温度９７．５℃に達した瞬間に温度下降を開始させることを意味し、また、アニーリング／伸長（５８℃、０秒）とあるのは、変性温度から温度降下させてアニーリング／伸長のための熱源５の設定温度５８℃に達した瞬間に温度上昇を開始させることを意味する。つまり、変性およびアニーリング／伸長の各設定温度においてホールド時間（待機時間）を設けていない。
【００４３】
その後、ＰＣＲによる生産物を落射蛍光顕微鏡を用いて観察した。
図３は、ＰＣＲの生産物の落射蛍光顕微鏡による観察画像である。
図３の画像において白色のドットがいくつか存在するが、実験では、１個の液滴に複数のテンプレートＤＮＡが内包される確率が極めて低くなるような条件を設定している点に鑑みれば、白色のドットの１つ１つが複数のＤＮＡからではなく一分子のＤＮＡから増幅されたＰＣＲ生産物を含む液滴を表すと考えるのが妥当である。
このことから、本発明の熱サイクル装置においてテンプレートＤＮＡの一分子からのＰＣＲ増幅が可能であること、よって、本発明の熱サイクル装置はデジタルＰＣＲ法に適用可能であることがわかる。
【符号の説明】
【００４４】
１  容器
２  液滴収容部
３  容器本体
３ａ  開口
４  基板
５  ヒーター（熱源）
５ａ  上面
６  液滴
７  油相
１１  チップ本体
１２  第１の穴
１３  第２の穴
１４  第３の穴
１５  第１の溝
１６  第２の溝
１７  第３の溝
１８  ポリカーボネート板
１９  穴
２０  両面接着テープ
２１  ガラス板
２２  蓋体
２３  吸気管
ｍ１  第１の液溜
ｍ２  第２の液溜
ｍ３  液滴収容部
ｎ１  第１のマイクロ流路
ｎ２  第２のマイクロ流路
ｎ３  第３のマイクロ流路
【図１】
2018143197.tif 000006
【図２】
2018143197.tif 000007
【図３】
2018143197.tif 000008