(57)【要約】【課題】第ＦＶＩＩＩ因子ポリマー結合体の提供。【解決手段】本発明は、第ＶＩＩＩ因子の炭水化物部分を介して水溶性ポリマーと結合体化された第ＶＩＩＩ因子分子を含むタンパク質性構築物、及びそれを調製する方法である。本発明の一実施形態において、水溶性ポリマーはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、またはデキストランから選択される。本発明は、ポリエチレングリコールなどのポリ（アルキレンオキシド）を含めて、少なくとも１個の水溶性ポリマーに結合した凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）を含むタンパク質性構築物に関する。さらに、本発明は、ＦＶＩＩＩの機能的欠陥又は欠損に関連した出血性疾患を有するほ乳動物の血液中のＦＶＩＩＩのｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を延長する方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
水溶性ポリマーと第ＶＩＩＩ因子の酸化炭水化物部分とを結合体化する方法であって、結合体化を可能とする条件下で前記酸化炭水化物部分を活性化水溶性ポリマーと接触させる工程を含む、方法。
【請求項２】
前記水溶性ポリマーがＰＥＧ、ＰＳＡ及びデキストランからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記活性化水溶性ポリマーがＰＥＧ−ヒドラジド、ＰＳＡ−ヒドラジン及びアルデヒド活性化デキストランからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記炭水化物部分が、ＮａＩＯ４を含むバッファー中でのインキュベーションによって酸化される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＦＶＩＩＩの酸化炭水化物部分が第ＶＩＩＩ因子のＢドメインに存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか一項に記載の方法によって製造される修飾第ＶＩＩＩ因子。
【請求項７】
（ａ）第ＶＩＩＩ因子分子、及び
（ｂ）前記第ＶＩＩＩ因子分子に結合した少なくとも１個の水溶性ポリマーを含むタンパク質性構築物であって、前記水溶性ポリマーが、前記第ＶＩＩＩ因子のＢドメインに存在する１個以上の炭水化物部分を介して前記第ＶＩＩＩ因子に結合している、
タンパク質性構築物。
【請求項８】
前記水溶性ポリマーが、ＰＥＧ、ＰＳＡ及びデキストランからなる群から選択される、請求項７に記載のタンパク質性構築物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本出願は、２００７年３月２９日に出願された米国特許出願第１１／７２９，６２５号の一部継続出願であり、この米国特許出願第１１／７２９，６２５号は、２００６年６月６日に出願された米国仮特許出願第６０／７９０，２３９号、および２００６年３月３１日に出願された米国仮特許出願第６０／７８７，９６８号に対する優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、ポリエチレングリコールなどのポリ（アルキレンオキシド）を含めて、少なくとも１個の水溶性ポリマーに結合した凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）を含むタンパク質性構築物に関する。さらに、本発明は、ＦＶＩＩＩの機能的欠陥又は欠損に関連した出血性疾患を有するほ乳動物の血液中のＦＶＩＩＩのｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を延長する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）は、血漿中をごく低濃度で循環し、フォンウィルブランド因子（ＶＷＦ）に非共有結合する。止血の間、ＦＶＩＩＩはＶＷＦから分離し、カルシウム及びリン脂質又は細胞膜の存在下で活性化速度を増加させることによって、活性化第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）によって媒介される第Ｘ因子（ＦＸ）活性化の補因子として作用する。
【０００４】
ＦＶＩＩＩは、ドメイン構造Ａ１−Ａ２−Ｂ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２を有する約２７０〜３３０ｋＤの単鎖前駆体として合成される。血漿から精製されると（例えば、「血漿由来」又は「血漿の」）、ＦＶＩＩＩは重鎖（Ａ１−Ａ２−Ｂ）と軽鎖（Ａ３−Ｃ１−Ｃ２）で構成される。軽鎖の分子量は８０ｋＤであるが、Ｂドメイン内のタンパク質分解のために、重鎖は９０〜２２０ｋＤの範囲である。
【０００５】
ＦＶＩＩＩは、出血性疾患における治療用の組換えタンパク質としても合成される。種々のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイが、治療薬としての組換えＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）の潜在的有効性を決定するために考案された。これらのアッセイは、内在性ＦＶＩＩＩのｉｎ  ｖｉｖｏ作用を模倣している。ＦＶＩＩＩをｉｎ  ｖｉｔｒｏでトロンビン処理すると、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイで測定して、その凝血促進（ｐｒｏｃｏａｇｕｌａｎｔ）活性が急速に増加し、続いて減少する。この活性化及び不活性化は、重鎖と軽鎖の両方における特異的タンパク質限定加水分解と同時に起き、ＦＶＩＩＩにおける異なる結合エピトープの利用能を変え、例えば、ＦＶＩＩＩがＶＷＦから解離してリン脂質表面に結合できるようにし、又はある特定のモノクローナル抗体に対する結合能力を変化させる。
【０００６】
ＦＶＩＩＩの欠乏又は機能不全は、最も多い出血性疾患である血友病Ａに関連する。血友病Ａの管理に選り抜きの治療は、血漿由来ＦＶＩＩＩ濃縮物又はｒＦＶＩＩＩ濃縮物の補充療法である。ＦＶＩＩＩレベルが１％未満の重度の血友病Ａ患者は、一般に、投薬間のＦＶＩＩＩを１％よりも高く維持することを目的とした予防療法を受ける。循環中の種々のＦＶＩＩＩ製品の平均半減期を考慮すると、これは、通常、ＦＶＩＩＩを２から３回／週投与することによって達成することができる。
【０００７】
血友病Ａ治療用に多数の濃縮物が市販されている。これらの濃縮物の一つは組換え製品Ａｄｖａｔｅ（登録商標）である。これは、ＣＨＯ細胞で産生され、Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって製造されている。この製品の細胞培養プロセス、精製又は最終処方では、ヒトや動物の血漿タンパク質もアルブミンも添加されない。
【０００８】
ＦＶＩＩＩ濃縮物及び治療用ポリペプチド薬の多数の製造者の目的は、他のすべての製品特性を維持しつつ、薬力学的及び薬物動態学的諸性質が向上した次世代製品を開発することである。
【０００９】
治療用ポリペプチド薬は、タンパク質分解酵素によって急速に分解され、抗体によって中和される。これは、その半減期及び循環時間を短縮し、それによってその治療有効性を制限している。ポリペプチドに可溶性ポリマー又は炭水化物を付加すると、分解を抑制し、ポリペプチドの半減期を延長することが判明した。例えば、ポリペプチド薬のＰＥＧ化は、それを保護し、その薬力学的及び薬物動態学的プロファイルを改善する（非特許文献１）。ＰＥＧ化プロセスは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の繰り返し単位をポリペプチド薬に付加する。分子のＰＥＧ化は、薬物の酵素分解抵抗性を増大させ、ｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期を延長し、投薬回数を減少させ、免疫原性を低下させ、物理的及び熱的安定性を増大させ、溶解性を増大させ、液体安定性を増大させ、凝集を抑制することができる。
【００１０】
したがって、ＰＥＧ化などによる可溶性ポリマーの付加は、ＦＶＩＩＩ製品の諸性質を改善する一手法である。現在の技術水準は、様々な特許及び特許出願によって文書化されている。
【００１１】
特許文献１は、ポリ（アルキレンオキシド）−ＦＶＩＩＩ又はＦＩＸ結合体を記載している。このタンパク質は、前記ＦＶＩＩＩのカルボニル基を介して、ポリ（アルキレンオキシド）に共有結合している。
【００１２】
特許文献２は、ＦＶＩＩＩと生体適合性ポリマーの結合体を調製する方法を記載している。この特許は、Ｒｏｅｓｔｉｎ等の刊行物によって補足された（非特許文献２）。この結合体は、モノメトキシポリエチレングリコールで修飾されたＢドメイン欠失組換えＦＶＩＩＩを含む。この結合体は、ＦＶＩＩＩ機能が低下し、血液凝固活性が修飾度に伴って急速に低下した。
【００１３】
特許文献３は、複数の結合体を含むポリマー−ＦＶＩＩＩ分子結合体を記載している。各結合体は、ＦＶＩＩＩ分子に共有結合した１から３個の水溶性ポリマーを有する。ＦＶＩＩＩ分子はＢドメインが欠失している。
【００１４】
特許文献４は、ＦＶＩＩＩ活性を有するタンパク質を含む不融性結合体が非抗原性リガンドに共有結合した、修飾ＦＶＩＩＩを記載している。
【００１５】
特許文献５は、ポリペプチドと生体適合性ポリマーの結合体を記載している。
【００１６】
特許文献６は、５，０００ダルトン以下の好ましい分子量を有するポリエチレングリコールに結合したＦＶＩＩＩを記載している。
【００１７】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのＦＶＩＩＩの半減期を延長する可溶性ポリマーが結合したＦＶＩＩＩ、例えば、非ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩと比べて機能活性を維持しつつｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期が延長されている、１０，０００ダルトンを超えるＰＥＧが結合体化した完全長ＦＶＩＩＩなどの、ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩが、依然として必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】米国特許第６，０３７，４５２号明細書
【特許文献２】欧州特許第１２５８４９７号明細書
【特許文献３】国際公開第０４／０７５９２３号
【特許文献４】米国特許第４，９７０，３００号明細書
【特許文献５】米国特許第６，０４８，７２０号明細書
【特許文献６】国際公開第９４／１５６２５号
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】Ｈａｒｒｉｓ  ＪＭ  ｅｔ  Ｃｈｅｓｓ  ＲＢ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  ２００３；２：２１４−２１
【非特許文献２】Ｒｏｅｓｔｉｎ等  ,Ｂｉｏｃｏｎｊ  Ｃｈｅｍ  ２０００；１１：３８７−９６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２０】
（発明の要旨）
本発明は、第ＶＩＩＩ因子の炭水化物部分を介して水溶性ポリマーと結合体化された第ＶＩＩＩ因子分子を含むタンパク質性構築物、及びそれを調製する方法に関する。
【００２１】
本発明の一実施形態においては、結合体化を可能にする条件下で酸化炭水化物部分を活性化水溶性ポリマーと接触させる工程を含む、水溶性ポリマーとＦＶＩＩＩの酸化炭水化物部分を結合体化する方法を提供する。関連する態様においては、水溶性ポリマーは、ＰＥＧ、ＰＳＡ及びデキストランからなる群から選択される。更に別の態様においては、活性化水溶性ポリマーは、ＰＥＧ−ヒドラジド、ＰＳＡ−ヒドラジン及びアルデヒド活性化デキストランからなる群から選択される。本発明の別の態様においては、炭水化物部分は、ＮａＩＯ４を含むバッファー中でのインキュベーションによって酸化される。本発明の更に別の態様においては、ＦＶＩＩＩの酸化炭水化物部分は、ＦＶＩＩＩのＢドメインに存在する。
【００２２】
本発明の別の実施形態においては、上記方法のいずれかによる方法によって製造される修飾ＦＶＩＩＩが提供される。更に別の実施形態においては、（ａ）第ＶＩＩＩ因子分子と、（ｂ）前記第ＶＩＩＩ因子分子に結合した少なくとも１個の水溶性ポリマーとを含み、水溶性ポリマーが、第ＶＩＩＩ因子のＢドメインに存在する１個以上の炭水化物部分を介して第ＶＩＩＩ因子に結合している、タンパク質性構築物が提供される。本発明の関連の態様においては、水溶性ポリマーは、ＰＥＧ、ＰＳＡ及びデキストランからなる群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとそれに続く免疫ブロットによって測定された、ＰＥＧとの結合体化後のｒＦＶＩＩＩの広がり及び質量増加を示す図である。
【図２】図２は、血友病マウスにおける非結合体化ＦＶＩＩＩと比較したＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ結合体の薬物動態学を示すグラフである。白抜きの四角：ＰＥＧｒＦＶＩＩＩ、ＦＶＩＩＩ用量２００ＩＵ／ｋｇ。塗りつぶされた菱形：未変性（ｎａｔｉｖｅ）ｒＦＶＩＩＩ、ＦＶＩＩＩ用量２００ＩＵ／ｋｇ。
【図３】図３は、種々の抗ＦＶＩＩＩ抗体を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥによる、ＰＥＧ化部位の詳細な分析を示す図である。
【図４】図４は、トロンビンによって誘導される、未変性ｒＦＶＩＩＩ及びＰＥＧ化ｒＦＶＩＩＩの活性化及び不活性化を示すグラフである。
【図５】図５は、未変性ｒＦＶＩＩＩ及びＰＥＧ化ｒＦＶＩＩＩのドメインを示すバンドを示す図である。
【図６】図６は、未変性ｒＦＶＩＩＩ及びＰＥＧ化ｒＦＶＩＩＩの種々のドメインのＰＥＧ化度を示すグラフである。
【図７】図７は、未変性ｒＦＶＩＩＩ及びＰＥＧ化ｒＦＶＩＩＩのトロンビン不活性化速度を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
（発明の詳細な説明）
本発明は、水溶性ポリマーに結合した、完全な（ｉｎｔａｃｔ）Ｂドメインの少なくとも一部を有するＦＶＩＩＩ分子を含むタンパク質性構築物である。水溶性ポリマーとしては、ポリアルキレンオキシド、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、又はポリシアル酸（ＰＳＡ）、デキストランなどの炭水化物が挙げられる。本発明の一実施形態においては、水溶性ポリマーは、１０，０００ダルトンを超える分子量を有するポリエチレングリコール分子である。別の実施形態においては、水溶性ポリマーは、１０，０００Ｄａを超えて約１２５，０００Ｄａまで、約１５，０００Ｄａから２０，０００Ｄａ、又は約１８，０００Ｄａから約２５，０００Ｄａの分子量を有する。一実施形態においては、構築物は、標準の治療用ＦＶＩＩＩ製品の完全な機能活性を保持し、標準の治療用ＦＶＩＩＩ製品よりも長いｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を与える。別の実施形態においては、構築物は、未変性第ＶＩＩＩ因子に対して少なくとも５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１１０、１２０、１３０、１４０又は１５０パーセント（％）の生物活性を保持する。関連の態様においては、構築物及び未変性第ＶＩＩＩ因子の生物活性は、色素生産活性とＦＶＩＩＩ抗原値の比によって求められる（ＦＶＩＩＩ：Ｃｈｒ：ＦＶＩＩＩ：Ａｇ）。本発明の更に別の実施形態においては、構築物の半減期は、未変性第ＶＩＩＩ因子のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期に対して０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０倍減少又は増加する。
【００２５】
本発明の出発材料は、ＦＶＩＩＩである。ＦＶＩＩＩは、ヒト血漿から得ることができ、又は米国特許第４，７５７，００６号、米国特許第５，７３３，８７３号、米国特許第５，１９８，３４９号、米国特許第５，２５０，４２１号、米国特許第５，９１９，７６６号、欧州特許第３０６９６８号に記載のように組換え操作技術によって製造することができる。
【００２６】
本明細書で使用する「第ＶＩＩＩ因子」又は「ＦＶＩＩＩ」という用語は、完全なＢドメインの少なくとも一部を有し、未変性ＦＶＩＩＩに関連した生物活性を示す、任意のＦＶＩＩＩ分子を指す。本発明の一実施形態においては、ＦＶＩＩＩ分子は完全長第ＶＩＩＩ因子である。ＦＶＩＩＩ分子は、第ＶＩＩＩ：Ｃ因子をコードするＤＮＡとハイブリダイズすることが可能なＤＮＡ配列によってコードされるタンパク質である。かかるタンパク質は、ドメインＡ１−Ａ２−Ｂ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２間又はその中の種々の部位におけるアミノ酸欠失を含み得る（米国特許第４，８６８，１１２号）。ＦＶＩＩＩ分子は、１個以上のアミノ酸残基が部位特異的変異誘発によって置換された、未変性ＦＶＩＩＩの類似体でもあり得る。
【００２７】
本発明に有用であるＦＶＩＩＩ分子としては、完全長タンパク質、そのタンパク質の前駆体、そのタンパク質の生物学的に活性な又は機能的なサブユニット又は断片、及びその機能的誘導体、並びに本明細書の以下に記述するその変異体が挙げられる。ＦＶＩＩＩという表記は、かかるタンパク質のすべての潜在的な形態を含むものとする。ここで、ＦＶＩＩＩの形態の各々は、完全な未変性Ｂドメイン配列の少なくとも一部又は全部を有する。
【００２８】
本発明による「組換え第ＶＩＩＩ因子」（ｒＦＶＩＩＩ）という用語は、組換えＤＮＡ技術によって得られる、異種若しくは天然に存在する任意のｒＦＶＩＩＩ、又はその生物活性誘導体を含み得る。ある特定の実施形態においては、この用語は、上記タンパク質、及び本発明のｒＦＶＩＩＩをコードする核酸を包含する。かかる核酸としては、例えば、遺伝子、プレｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ、多形変異体、対立遺伝子、合成及び天然に存在する変異体が挙げられるが、それだけに限定されない。ｒＦＶＩＩＩという用語に包含されるタンパク質としては、例えば、本明細書の上記のタンパク質及びポリペプチド、上記核酸によってコードされるタンパク質、（１）（成熟未変性タンパク質の４０６個のアミノ酸の完全長配列まで）少なくとも約２５、約５０、約１００、約２００、約３００、約４００個以上のアミノ酸の領域にわたって、本明細書に記載の基準核酸又はアミノ酸配列によってコードされるポリペプチドに対して約６０％を超える、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％以上のアミノ酸配列相同性を有するアミノ酸配列を有し、及び／又は（２）本明細書に記載の基準アミノ酸配列を含む免疫原、その免疫原性断片、及び／又はその保存的に修飾された変異体に対して生成された抗体、例えばポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体に特異的に結合する、種間ホモログ及び別のポリペプチドが挙げられるが、それだけに限定されない。
【００２９】
本発明のｒＦＶＩＩＩをコードするポリヌクレオチドとしては、（１）厳密なハイブリダイゼーション条件下で、本明細書に記載の基準アミノ酸配列、及びその保存的に修飾された変異体をコードする核酸と特異的にハイブリダイズし、（２）（成熟タンパク質の１２１８個のヌクレオチドの完全長配列まで）少なくとも約２５、約５０、約１００、約１５０、約２００、約２５０、約５００、約１０００個以上のヌクレオチドの領域にわたって、本明細書に記載の基準核酸配列に対して約９５％を超える、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％以上のヌクレオチド配列相同性を有する核酸配列を有する、ポリヌクレオチドが挙げられるが、それだけに限定されない。
【００３０】
本明細書で使用する「内在性ＦＶＩＩＩ」は、治療を受けようとするほ乳動物に由来するＦＶＩＩＩを含む。この用語は、前記ほ乳動物に存在する導入遺伝子又は任意の他の外来性ＤＮＡから転写されたＦＶＩＩＩも含む。本明細書で使用する「外因性ＦＶＩＩＩ」は、前記ほ乳動物に由来しないＦＶＩＩＩを含む。
【００３１】
変異体（又は類似体）ポリペプチドは、１個以上のアミノ酸残基が本発明のＦＶＩＩＩアミノ酸配列に付加した挿入変異体を含む。挿入は、そのタンパク質の一方若しくは両方の末端に位置し得、及び／又はＦＶＩＩＩアミノ酸配列の内部領域内に位置し得る。一方又は両方の末端に追加の残基を有する挿入変異体としては、例えば、融合タンパク質、及びアミノ酸タグ又は別のアミノ酸標識を含むタンパク質が挙げられる。一態様においては、ＦＶＩＩＩ分子は、特にその分子がＥ．ｃｏｌｉなどの細菌細胞で組換え発現されるときには、Ｎ末端Ｍｅｔを場合によっては含み得る。
【００３２】
欠失変異体においては、本明細書に記載のＦＶＩＩＩポリペプチドの１個以上のアミノ酸残基が除去される。欠失は、ＦＶＩＩＩポリペプチドの一方若しくは両方の末端において、及び／又はＦＶＩＩＩアミノ酸配列内の１個以上の残基の除去によって、引き起こすことができる。したがって、欠失変異体としては、ＦＶＩＩＩポリペプチド配列のすべての断片が挙げられる。
【００３３】
置換変異体においては、ＦＶＩＩＩポリペプチドの１個以上のアミノ酸残基が除去され、代替残基によって置換される。一態様においては、置換は、本質的に保存的であり、このタイプの保存的置換は当技術分野で周知である。あるいは、本発明は、非保存的でもある置換を包含する。例示的な保存的置換は、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７５），ｐｐ．７１−７７］に記載されており、すぐ下に述べる。
【００３４】
【数１】
2018115170.tif 000002
あるいは、例示的な保存的置換をすぐ下に述べる。
【００３５】
【数２】
2018115170.tif 000003
「天然に存在する」ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列は、典型的には、霊長類、例えばヒト；げっ歯類、例えばラット、マウス、ハムスター；ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ又は任意のほ乳動物を含むが、ただしそれだけに限定されないほ乳動物に由来する。本発明の核酸及びタンパク質は、（例えば、非相同で野生型配列若しくはその変異体をコードする、又は天然に存在しない）組換え分子とすることができる。基準ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列としては、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ｐ００４５１（ＦＡ８＿ＨＵＭＡＮ）、Ｇｉｔｓｃｈｉｅｒ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ  ｇｅｎｅ，Ｎａｔｕｒｅ，３１２（５９９２）：３２６−３０（１９８４）、Ｖｅｈａｒ  ＧＨ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ，Ｎａｔｕｒｅ，３１２（５９９２）：３３７−４２（１９８４）、及びＴｈｏｍｐｓｏｎ  ＡＲ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆａｃｔｏｒ
ＶＩＩＩ  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｓｅｍｉｎ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈｅｍｏｓｔ，２００３：２９；１１−２９（２００２）が挙げられる（参照によりその全体を本明細書に援用する）。
【００３６】
本明細書で使用する「生物活性誘導体」又は「生物活性変異体」は、結合性などの、分子の実質的に同じ機能的及び／又は生物学的特性、及び／又はペプチド骨格、または基本重合単位などの同じ構造基盤を有する、前記分子の任意の誘導体又は変異体を含む。
【００３７】
本明細書で使用する「血漿由来ＦＶＩＩＩ」又は「血漿の」は、凝固経路を活性化する性質を有する、ほ乳動物から得られる血中に見出されるすべての形態のタンパク質を含む。
【００３８】
種々の態様においては、ｒＦＶＩＩＩの製造は、（ｉ）遺伝子操作による組換えＤＮＡの製造、（ｉｉ）それだけに限定されないが、例えば、形質移入、電気穿孔法又は微量注入によって、組換えＤＮＡを原核細胞又は真核細胞に導入する工程、（ｉｉｉ）前記形質転換細胞を培養する工程、（ｉｖ）例えば構成的に又は誘導によって、ｒＦＶＩＩＩを発現させる工程、及び（ｖｉ）精製ｒＦＶＩＩＩを得るために、（ｖ）例えば培地から、又は形質転換細胞を収集する工程によって、前記ｒＦＶＩＩＩを単離する工程、の当技術分野で公知の任意の方法を含む。
【００３９】
別の態様においては、ｒＦＶＩＩＩは、薬理学的に許容されるｒＦＶＩＩＩ分子を産生することを特徴とする、適切な原核生物又は真核生物宿主系における発現によって製造される。真核細胞の例は、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、ＳＫ−Ｈｅｐ、ＨｅｐＧ２などのほ乳動物細胞である。
【００４０】
更に別の態様においては、多種多様なベクターが、ｒＦＶＩＩＩの調製に使用され、真核生物及び原核生物発現ベクターから選択される。原核生物発現用ベクターの例としては、ｐＲＳＥＴ、ｐＥＴ、およびｐＢＡＤなど、ただしそれだけに限定されないプラスミドが挙げられる。ここで、原核生物発現ベクターに使用されるプロモーターとしては、それだけに限定されないが、１個以上のｌａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｐ、ｒｅｃＡ又はａｒａＢＡＤが挙げられる。真核生物発現用ベクターの例としては、（ｉ）酵母における発現の場合、ＡＯＸ１、ＧＡＰ、ＧＡＬ１、またはＡＵＧ１など、ただしそれだけに限定されないプロモーターを使用する、ｐＡＯ、ｐＰＩＣ、ｐＹＥＳ、またはｐＭＥＴなど、ただしそれだけに限定されないベクター、（ｉｉ）昆虫細胞における発現の場合、ＰＨ、ｐ１０、ＭＴ、Ａｃ５、ＯｐＩＥ２、ｇｐ６４、ｐｏｌｈなど、ただしそれだけに限定されないプロモーターを使用する、ｐＭＴ、ｐＡｃ５、ｐＩＢ、ｐＭＩＢ、またはｐＢＡＣなど、ただしそれだけに限定されないベクター、及び（ｉｉｉ）ほ乳動物細胞における発現の場合、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＥＦ−１、ＵｂＣ、ＲＳＶ、ＡＤＶ、ＢＰＶ、βアクチンなど、ただしそれだけに限定されないプロモーターを使用する、ｐＳＶＬ、ｐＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡ３、またはｐＢＰＶなど、ただしそれだけに限定されないベクター、及び一態様においては、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルスなど、ただしそれだけに限定されないウイルス系由来のベクターが挙げられる。
【００４１】
ある特定の態様においては、ＦＶＩＩＩ分子は、種々の化学的方法のいずれかによって水溶性ポリマーと結合体化される（Ｒｏｂｅｒｔｓ  ＪＭ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖａｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ  ２００２；５４：４５９−７６）。例えば、一実施形態においては、ＦＶＩＩＩは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルを用いて、ＰＥＧとタンパク質の遊離アミノ基との結合体化によってＰＥＧ化される。別の実施形態においては、水溶性ポリマー、例えばＰＥＧは、マレイミド化学反応、又は前酸化の後のＰＥＧヒドラジド若しくはＰＥＧアミンとＦＶＩＩＩの炭水化物部分とのカップリングによって、遊離ＳＨ基とカップリングされる。
【００４２】
別の実施形態においては、ＦＶＩＩＩは、別の水溶性ポリマーと結合体化される。その水溶性ポリマーは、例えば、ポリアルキレンオキシド、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリシアル酸（ＰＳＡ）またはデキストランなどの炭水化物又は多糖である。水溶性ポリマーのカップリングは、タンパク質との直接カップリングによって、又はリンカー分子を介して、実施することができる。化学リンカーの一例は、炭水化物選択的ヒドラジドとスルフヒドリル反応性マレイミド基とを含むＭＢＰＨ（４−［４−Ｎ−マレイミドフェニル］酪酸ヒドラジド）である（Ｃｈａｍｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９２；２６７：１５９１６−２２）。
【００４３】
結合体化は、安定な結合の形成下で、水溶性ポリマーと第ＶＩＩＩ因子の直接カップリング（又はリンカー系を介したカップリング）によって実施することができる。さらに、分解性、遊離性又は加水分解性のリンカー系を本発明で使用することができる（Ｔｓｕｂｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００４；２７９：３８１１８−２４、Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  １９９９；４２：３６５７−６７、Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ  Ｃｈｅｍ  ２００６；１７：３４１−５１、国際公開第２００６／１３８５７２号Ａ２、米国特許第７２５９２２４号Ｂ２、米国特許第７０６０２５９号Ｂ２）。
【００４４】
本明細書で考察するように、本発明の実施形態は、活性化可溶性ポリマーとＦＶＩＩＩの酸化炭水化物部分とのカップリングである。「活性化水溶性ポリマー」という用語は、本明細書では、水溶性ポリマーとリンカー又は直接的に（活性アルデヒド基を含む）ＦＶＩＩＩとの化学結合体化を可能にする、活性官能基を有するＦＶＩＩＩとのカップリングに使用される水溶性ポリマーを指すのに使用される。本明細書で使用する「酸化炭水化物部分」という用語は、ＮａＩＯ４などの酸化剤によって生成される遊離アルデヒド基を含むＦＶＩＩＩを指す。本発明の一態様においては、（活性アルデヒド基を含む）アルデヒド活性化デキストランを、ジヒドラジドリンカーを介してＦＶＩＩＩのアルデヒド基とカップリングさせる。
【００４５】
ＦＶＩＩＩのグリコシル化パターン（Ｌｅｎｔｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ；Ｂｌｏｏｄ，９２：３９８３−９６（１９９８））によれば、炭水化物部分を介したＦＶＩＩの結合体化は、ＦＶＩＩＩのＢドメインで起こる可能性が高いはずである。ＢドメインはＦＶＩＩＩの活性に役割を果たさないので、Ｂドメインをかかる結合体化反応の標的にすることが望ましい。酵素による糖結合体化（ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）は、米国特許出願公開第２００８／００７００２７５号に記載されている。
【００４６】
本発明の一実施形態においては、ＦＶＩＩＩは、コハク酸スクシンイミジル、グルタル酸スクシンイミジル、またはプロピオン酸スクシンイミジルなどの活性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）を含むポリエチレングリコール誘導体を使用することによって、リジン残基を介して修飾された。これらの誘導体は、安定なアミド結合を形成することによって、穏和な条件下でＦＶＩＩＩのリジン残基と反応する。本発明の一実施形態においては、ＰＥＧ誘導体の鎖長は５，０００Ｄａである。線状構造及び分枝構造を含めて、５００から２，０００Ｄａ、２，０００から５，０００Ｄａ、５，０００を超えて１０，０００Ｄａまで、又は１０，０００を超えて２０，０００Ｄａまで、又は２０，０００を超えて１５０，０００Ｄａまでの鎖長を有する別のＰＥＧ誘導体が種々の実施形態に使用される。
【００４７】
アミノ基のＰＥＧ化の別法は、ウレタン結合を形成することによるＰＥＧカルボナートとの化学結合体化、又は第二級アミド結合を形成する還元アミノ化によるアルデヒド又はケトンとの反応である。
【００４８】
本発明では、ＦＶＩＩＩ分子は、市販ＰＥＧ誘導体を用いて化学修飾される。これらのＰＥＧ誘導体は、線状構造又は分枝構造を有することができる。ＮＨＳ基を含むＰＥＧ誘導体の例を以下に示す。
【００４９】
以下のＰＥＧ誘導体は、Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓから市販されているものの例である（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，Ａｌａ．、ｗｗｗ．ｎｅｋｔａｒ．ｃｏｍ／ＰＥＧ  ｒｅａｇｅｎｔ  ｃａｔａｌｏｇ；Ｎｅｋｔａｒ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ，ｐｒｉｃｅ  ｌｉｓｔ  ２００５−２００６参照）。
【００５０】
【化１】
2018115170.tif 000004
【００５１】
【化２】
2018115170.tif 000005
分枝構造を有するこの試薬は、Ｋｏｚｌｏｗｓｋｉ等によってより詳細に記述されている（ＢｉｏＤｒｕｇｓ  ２００１；５：４１９−２９）。
【００５２】
ＰＥＧ誘導体の別の例は、ＮＯＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（東京、日本。ｗｗｗ．ｎｏｆ．ｃｏ．ｊｐ／ｅｎｇｌｉｓｈ：Ｃａｔａｌｏｇｕｅ２００５参照）から市販されている。
【００５３】
【化３】
2018115170.tif 000006
【００５４】
【化４】
2018115170.tif 000007
【００５５】
【化５】
2018115170.tif 000008
これらのプロパン誘導体は、１，２置換パターンを有するグリセロール骨格を示す。本発明では、１，３置換を有するグリセロール構造、又は米国特許出願公開第２００３／０１４３５９６号Ａ１に記載の別の分枝構造に基づく分枝ＰＥＧ誘導体を使用することもできる。
【００５６】
Ｔｓｕｂｅｒｙ等（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００４；２７９：３８１１８−２４）及びＳｈｅｃｈｔｅｒ他（国際公開第０４０８９２８０号Ａ３）によって記述された分解性（例えば、加水分解性リンカー）を有するＰＥＧ誘導体を本発明に使用することもできる。
【００５７】
目ざましいことに、本発明のＰＥＧ化ＦＶＩＩＩは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの長いＦＶＩＩＩ半減期と一緒に十分な機能活性を示す。さらに、ＰＥＧ化ｒＦＶＩＩＩは、トロンビン不活性化に対してより抵抗性であると考えられる。これは、種々のｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ方法によって示された。そしてそれは以下の実施例で説明される。
【００５８】
本明細書で使用する「シアル酸部分」は、水溶液又は懸濁液に可溶であり、薬学的に有効な量のＰＳＡ−ＦＶＩＩＩ結合体の投与によってほ乳動物に副作用などの悪影響をほとんど又は全く及ぼさない、シアル酸モノマー又はポリマー（「多糖」）を含む。本発明に従って使用されるシアル酸単位に特別な制限はない。ポリマーは、一態様においては、１から４単位を有する特徴がある。ある特定の態様においては、異なるシアル酸単位が鎖に結合される。
【００５９】
本発明の種々の態様においては、シアル酸部分は、例えば、参照により本明細書に援用する米国特許第４，３５６，１７０号に記載の方法によって、ＦＶＩＩＩに結合する。本発明の種々の実施形態においては、多糖化合物は、天然に存在する多糖、天然に存在する多糖の誘導体、又は天然に存在する多糖誘導体である。一般に、化合物における糖残基のすべては、シアル酸残基である。
【００６０】
ＰＳＡとポリペプチドをカップリングさせる別の技術も公知である。例えば、米国特許出願公開第２００７／０２８２０９６号は、例えばＰＳＡの、アミン又はヒドラジド誘導体をタンパク質と結合体化することを記載している。さらに、米国特許出願公開第２００７／０１９１５９７号は、基質（例えば、タンパク質）との反応のためのアルデヒド基を還元末端に含むＰＳＡ誘導体を記載している。
【００６１】
本発明の一実施形態においては、多糖化合物のポリシアル酸部分は極めて親水性であり、別の実施形態においては、化合物全体が極めて親水性である。親水性は、主に、シアル酸単位のペンダントカルボキシル基、並びにヒドロキシル基によって付与される。糖単位は、アミン、ヒドロキシル、または硫酸基などの別の官能基又はその組合せを含み得る。これらの基は、天然に存在する糖化合物に存在し得、又は誘導体多糖化合物に導入し得る。
【００６２】
本発明の特定用途の多糖化合物は、一態様においては、細菌によって産生されるものである。これらの天然に存在する多糖の一部は、糖脂質として知られる。一実施形態においては、多糖化合物は、末端ガラクトース単位が実質的に無い。
【００６３】
本発明の一実施形態においては、タンパク質性構築物のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期が延長される。関連実施形態においては、水溶性ポリマーと結合していないＦＶＩＩＩに比べて、タンパク質性構築物のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期が少なくとも２倍延長され、別の実施形態においては、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期が少なくとも３倍延長される。
【００６４】
一実施形態においては、本発明のタンパク質性構築物は、静脈内、筋肉内、腹腔内注射などの注射によって投与することができる。
【００６５】
本発明のタンパク質性構築物を含む組成物をヒト又は試験動物に投与するために、一態様においては、該組成物は、１種類以上の薬学的に許容される担体を含む。「薬学的に」又は「薬理学的に許容される」という用語は、安定であり、凝集や、分解産物などのタンパク質分解を阻害し、さらに以下に示すように、当技術分野で周知である経路によって投与したときにアレルギー反応や他の有害反応を生じない、分子実体及び組成物を指す。「薬学的に許容される担体」は、上に開示した薬剤を含めて、任意及びすべての臨床的に有用である溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤、および抗真菌剤、等張化剤、および吸収遅延剤などを含む。
【００６６】
本明細書で使用する「有効量」は、上で概説した出血性疾患を有するほ乳動物の治療に適切な用量を含む。
【００６７】
組成物は、経口的に、局所的に、経皮的に、非経口的に、吸入噴霧によって、経膣的に、経直腸的に、又は頭蓋内注射によって、投与することができる。本明細書で使用する非経口という用語は、皮下注射、静脈内、筋肉内、大槽内注射又は注入技術を含む。静脈内、皮内、筋肉内、乳房内、腹腔内、鞘内（ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ）、眼球後、肺内注射、及び又は特定部位における外科的移植による投与も同様に意図される。一般に、組成物は、発熱物質、及びレシピエントに有害である可能性がある他の不純物を本質的に含まない。
【００６８】
組成物の単回又は複数回投与を実施することができ、その用量レベル及びパターンは、治療する医師によって選択される。疾患の予防又は治療の場合、適切な投与量は、上述したように、治療する疾患タイプ、疾患の重症度及び経過、薬物を予防目的で投与するか治療目的で投与するか、以前の治療、患者の病歴及び薬物に対する反応、並びに主治医の裁量によって決まる。
【００６９】
本発明は、有効量の上で定義したタンパク質性構築物を含む医薬組成物にも関する。医薬組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤、塩、緩衝剤又は賦形剤を更に含み得る。医薬組成物は、上で定義した出血性疾患の治療に使用することができる。本発明の医薬組成物は、溶液又は凍結乾燥製品であり得る。医薬組成物の溶液は、任意の適切な凍結乾燥プロセスに供し得る。
【００７０】
追加の態様として、本発明は、被検体への投与のための使用を容易にするようにパッケージ化された本発明の組成物を含むキットを含む。一実施形態においては、かかるキットは、密封された瓶又は容器（ｖｅｓｓｅｌ）などの容器（ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）にパッケージされた本明細書に記載の化合物又は組成物（例えば、タンパク質性構築物を含む組成物）を含み、方法を実施する際の化合物又は組成物の使用を記述したラベルが容器（ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）に貼られ、又はパッケージに含まれる。一実施形態においては、キットは、タンパク質性構築物を含む組成物を含む第１の容器と、第１の容器の組成物のための生理的に許容される再構成溶液を含む第２の容器とを含む。一態様においては、化合物又は組成物は単位剤形としてパッケージされる。キットは、さらに、特定の投与経路に従って組成物を投与するのに適切な装置を含み得る。好ましくは、キットは、治療用タンパク質又はペプチド組成物の使用を記述したラベルを含む。
【実施例】
【００７１】
（実施例１）
ｍＰＥＧコハク酸スクシンイミジルを用いたｒＦＶＩＩＩのリジン残基のＰＥＧ化  Ａｄｖａｔｅ製造プロセス由来のｒＦＶＩＩＩバルクの溶液（３，４００Ｕ／ｍｌ）を、０．５％スクロース及び０．１％ポリソルベート８０を含む２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓバッファー、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４を用いたＥｃｏｎｏ−Ｐａｃ  １０ＤＧカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用してゲルろ過した。次いで、この溶液に鎖長５，０００ＤａのｍＰＥＧコハク酸スクシンイミジル（Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  １９８４；７：１７５−８６）（ＰＥＧ−ＳＳ５０００）を静かに撹拌しながら添加し（ＰＥＧ−ＳＳ  ５ｍｇ／ｍｇタンパク質）、０．５Ｍ  ＮａＯＨを滴下してｐＨ値を７．４に調節した。次いで、静かに撹拌しながらＰＥＧ化を室温で１時間実施した。
【００７２】
続いて、０．５％スクロース及び０．１％ポリソルベート８０を含む２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓバッファー、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４に平衡化したイオン交換クロマトグラフィー樹脂（Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＴＭＡＥ６５０Ｍ／Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＸＫ−１０カラム、ベッド高１５．０ｃｍ）に反応混合物を適用した。次いで、カラムを２０ＣＶの平衡化バッファーで洗浄して過剰の試薬を除去し、ＰＥＧ化ｒＦＶＩＩＩを溶出バッファー（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１．０Ｍ  ＮａＣｌ、０．５％スクロース、０．１％ポリソルベート８０、ｐＨ７．４）で溶出させた。再生セルロースからなる分子量カットオフ３０ｋＤの膜を使用し、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％スクロース、ｐＨ７．４からなるバッファー系を用いて、限外ろ過／透析ろ過（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）によって溶出物を濃縮した。
【００７３】
（実施例２）
ＰＥＧ化ｒＦＶＩＩＩのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生化学的特性分析
Ａｄｖａｔｅ製造プロセス由来のrＦＶＩＩＩを、実施例１に従ってＰＥＧ化し、ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩ生成物を生化学的に特徴づけた。ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩの機能活性を、ＦＶＩＩＩ色素形成アッセイを使用して決定した（Ｒｏｓｅｎ  Ｓ，Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ  １９８４；３３（Ｓｕｐｐｌ４０）：１３９−４５）。この方法は、Ｐｈ．Ｅｕｒ．５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（５．０５）２．７．４  Ａｓｓａｙ  ｏｆ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩに基づく。
【００７４】
第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ：Ｃ）を含む試料を、カルシウムを含むバッファー中でトロンビン、活性化第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）、リン脂質及び第Ｘ因子（ＦＸ）と混合する。ＦＶＩＩＩはトロンビンによって活性化され、続いてリン脂質、ＦＩＸａ及びカルシウムイオンと結合体を形成する。この結合体は、第Ｘ因子を第Ｘａ因子に活性化して、次いで第Ｘａ因子は、色素形成基質ＦＸａ−１（ＡｃＯＨ＊ＣＨ３ＯＣＯ−Ｄ−ＣＨＡ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ）を切断する。遊離したパラ−ニトロアニリン（ｐＮＡ）の時間的経過をマイクロプレートリーダーによって４０５ｎｍで測定する。反応の傾きは、試料中の第ＶＩＩＩ因子濃度に比例する。軽微な変更を加えた市販ＥＬＩＳＡシステム（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ、Ｈｏｒｎｂｙ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）を使用して、ＦＶＩＩＩ抗原値を測定した。これらの値からＦＶＩＩＩ色素体／ＦＶＩＩＩ抗原比を計算した。調製物中のタンパク質含有量を、２８０ｎｍにおける光学濃度を測定することによって決定した。これらのデータから、タンパク質含有量を計算し（Ｈｏｙｅｒ  ＬＷ  ｉｎ：Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ．Ｉｎｓｔａｌｌｍｅｎｔｓ  １−６；Ｈｅｂｅｒｌｉ  Ｅｄ．；Ｗｉｌｅｙ  ＶＣＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ，１９９８）、ｍｇ／ｍｌで表した。
【００７５】
【表１】
2018115170.tif 000009
表１のデータによれば、ＰＥＧ化ｒＦＶＩＩＩ調製物においては、（ＦＶＩＩＩ色素形成活性とＦＶＩＩＩ抗原の比で表される）生物活性は、未変性ｒＦＶＩＩＩの生物活性（１００％）に比べて９０％を超えるまで回収される。
【００７６】
（実施例３）
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び免疫ブロット技術によるＰＥＧ化ｒＦＶＩＩＩの特性分析
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）から入手した４〜１２％ポリアクリルアミド勾配ゲルを使用し、製造者の指示に従って、還元条件下でＳＤＳ  ＰＡＧＥによって未変性ｒＦＶＩＩＩの特性を分析した。分子量マーカー（ＭＷ）として、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）から入手したＰｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓマーカー（１０ｋＤ〜２５０ｋＤ）を使用した。次いで、そのタンパク質を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）から入手したＰＶＤＦ膜上にエレクトロブロッティングによって移し、続いてＣｅｄａｒｌａｎｅ（Ｈｏｒｎｂｙ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）から入手したポリクローナルヒツジ抗ヒトＦＶＩＩＩ：Ｃ抗体と一緒にインキュベートした。免疫染色手順の最終段階は、Ａｃｃｕｒａｔｅ（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、Ｎ．Ｙ．、ＵＳＡ）から入手したアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）結合体化抗ヒツジ抗体と一緒のインキュベーションと、それに続くＡＬＰ基質キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）の使用による最終可視化であった。結果を図１に要約する。このブロットは、未変性ｒＦＶＩＩＩ及びＰＥＧ化ｒＦＶＩＩＩのドメイン構造を示す。ＰＥＧ化ｒＦＶＩＩＩは、未変性組換えタンパク質よりも広いバンド及びより高い分子量を有することが判明した。
【００７７】
（実施例４）
ＦＶＩＩＩ欠損ノックアウトマウスモデルにおけるＰＥＧ化ｒＦＶＩＩＩの薬物動態学
Ｂｉ等（Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  １９９５；１０：１１９−２１）によって詳述されたＦＶＩＩＩ欠損マウスを重度ヒト血友病Ａのモデルとして使用した。５匹のマウスの群（複数）に、実施例１に従って調製されたＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ（ＰＥＧ−ＳＳ、５Ｋ）又は未変性ｒＦＶＩＩＩをＦＶＩＩＩ２００ＩＵ／ｋｇ体重の用量で尾静脈を介してボーラス注射した（１０ｍｌ／ｋｇ）。麻酔後の心臓穿刺によるクエン酸塩血漿を、それぞれの群から、注射５分、３、６、９及び２４時間後に調製した。血漿試料中のＦＶＩＩＩ活性レベルを測定した。この実験結果を図２に要約する。平均半減期は１．９時間（未変性ｒＦＶＩＩＩについて）から４．９時間（ＰＥＧ化ｒＦＶＩＩＩについて）に増加し、曲線下面積（ＡＵＣ）は１３．０から２５．２時間＊ＩＵ／ｍｌに増加した。ＭｉｃｒｏＭａｔｈ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔの、薬物動態学的ライブラリー由来のモデル１（ＭｉｃｒｏＭａｔｈ、Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．、ＵＳＡ）を使用して半減期計算を実施した。
【００７８】
（実施例５）
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び免疫ブロット技術によるｒＦＶＩＩＩのＰＥＧ化の詳細な分析
未変性及びＰＥＧ化ｒＦＶＩＩＩを１ｎＭトロンビンを用いて６０℃で６０分間消化すると、ＦＶＩＩＩ分子の特異的切断が起こり、明確に定義された分解産物が生成した。これらの重鎖及び軽鎖断片を、実施例３に記載のように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてエレクトロブロッティングによって分離した。切断断片を可視化するために、重鎖Ａ１およびＡ２ドメイン、Ｂドメイン及び軽鎖Ｎ末端Ａ３ドメインに対するポリクローナル抗体並びにモノクローナル抗体を適用した。
【００７９】
図３に示すように、程度の差はあるが、３つのすべてのドメインがＰＥＧ化された。Ｂドメインは強力にＰＥＧ化された。重鎖のＡ１とＡ２ドメインの両方は部分的にＰＥＧ化された。種々のＰＥＧ化度（モノ−、ジ−、トリ−．．．）を軽鎖Ａ３ドメインに観察することができた。実施例６に一致して、ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩは、トロンビンに対してより抵抗性であると考えられた。
【００８０】
（実施例６）
ＰＥＧ化ｒＦＶＩＩＩのトロンビン抵抗性
ＦＶＩＩＩをｉｎ  ｖｉｔｒｏでトロンビン処理すると、その凝血促進活性が急速に増加し、続いて減少する。活性化と不活性化の速度は、トロンビン濃度及びＦＶＩＩＩの完全性に依存し、以下のようにＦＩＸａ補因子アッセイによってモニターされた。
【００８１】
ＦＶＩＩＩを０．５又は１ｎＭトロンビンと一緒に３７℃でインキュベートした。副次試料（ｓｕｂｓａｍｐｌｅ）を０．５から４０分の間の時間間隔で抜き出し、特定のトロンビン阻害剤も含むＦＩＸａ、ＦＸ、ＰＬ小胞及びＣａＣｌ２の混合物に添加して更なるトロンビン媒介性反応を停止させ、３分間インキュベートした。副次試料を色素形成基質に添加した。その色素形成基質は、ＦＸａによって選択的に切断され、更なるＸａ活性化を停止するＥＤＴＡを含んだ。１５分間インキュベーション後、反応を酢酸によって終結させた。ＦＸａ濃度に比例する吸光度（Ａ４０５）値をＥＬＩＳＡリーダーによって測定し、精製ＦＸａ基準曲線を使用してＦＸａ濃度に変換した。得られたＦＸａ濃度をトロンビンとのインキュベーション時間に対してプロットした。
【００８２】
曲線の減衰部を単一指数関数フィット（ｓｉｎｇｌｅ  ｅｘｐｏｍｅｎｔｉａｌ  ｆｉｔ）によりフィッティングさせて、ＦＶＩＩＩの擬一次不活性化速度を決定した。
【００８３】
【表２】
2018115170.tif 000010
図４及び表２に示すように、ＰＥＧ化ｒＦＶＩＩＩは、適用した両方のトロンビン濃度においてより遅い不活性化速度を示した。
【００８４】
（実施例７）
分枝２，３−ビス（メチルポリオキシエチレン−オキシ）−１−（１，５−ジオキソ−５−スクシンイミジルオキシ、ペンチルオキシ）プロパンを用いたｒＦＶＩＩＩのリジン残基のＰＥＧ化
１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％スクロース及び０．１％ポリソルベート８０を含む２０ｍＭ  ＨｅｐｅｓバッファーｐＨ７．４中のｒＦＶＩＩＩの溶液を、ＦＶＩＩＩ４８９ＩＵ／ｍｌを含む、Ａｄｖａｔｅ製造プロセス由来のバルク材料から調製した。ＮＯＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（東京、日本）から入手した分子量２０ｋＤの分枝ＰＥＧグルタル酸スクシンイミジル（ＰＥＧ−ＳＧ）試薬（２，３−ビス（メチルポリオキシエチレン−オキシ）−１−（１，５−ジオキソ−５−スクシンイミジルオキシ、ペンチルオキシ）プロパン）を、この溶液１５３ｍｌに静かに撹拌しながら添加し（試薬５ｍｇ／ｍｇタンパク質）、１０分後に０．５Ｍ  ＮａＯＨを滴下してｐＨ値を７．４に調節した。次いで、ｒＦＶＩＩＩのＰＥＧ化を、静かに撹拌しながら室温で１時間実施した。
【００８５】
続いて、０．５％スクロース及び０．１％ポリソルベート８０を含む２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓバッファー、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４に平衡化したイオン交換クロマトグラフィー樹脂（Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＴＭＡＥ６５０Ｍ／Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＸＫ−５０カラム、ベッド高１４．５ｃｍ）に線流速１ｃｍ／ｍｉｎを用いて反応混合物を適用した。カラムを２５ＣＶの平衡化バッファーで洗浄して過剰の試薬を除去し（線流速２ｃｍ／ｍｉｎ）、ＰＥＧ化ｒＦＶＩＩＩを溶出バッファー（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１．０Ｍ  ＮａＣｌ、０．５％スクロース、０．１％ポリソルベート８０、ｐＨ７．４）を用いて線流速０．５ｃｍ／ｍｉｎで溶出させた。次いで、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％スクロース、ｐＨ７．４からなるバッファー系を用いて、再生セルロースからなる分子量カットオフ３０ｋＤの膜を用いた限外ろ過／透析ろ過によって溶出物を濃縮した。
【００８６】
（実施例８）
分枝ＰＥＧ−ＳＧ２０ｋＤでＰＥＧ化されたｒＦＶＩＩＩのｉｎ−ｖｉｔｒｏ特性分析
Ａｄｖａｔｅ製造プロセス由来のｒＦＶＩＩＩを実施例７に従って分枝ＰＥＧ−ＳＧ試薬を用いてリジン残基を介してＰＥＧ化し、ＰＥＧ化ｒＦＶＩＩＩ生成物を実施例２に記載のように生化学的に特徴づけた。
【００８７】
【表３】
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表３のデータによれば、ＰＥＧ化ｒＦＶＩＩＩ調製物においては、（ＦＶＩＩＩ色素形成活性とＦＶＩＩＩ抗原の比で表される）生物活性は、未変性ｒＦＶＩＩＩの生物活性（１００％）に比べて完全に回収された。
【００８８】
実施例３に記載のように、４〜１２％ポリアクリルアミド勾配ゲルを用いて、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び免疫ブロット技術によって、ＰＥＧ化ｒＦＶＩＩＩの特性を分析した。結果を図５に要約する。このブロットは、未変性及びＰＥＧ化ｒＦＶＩＩＩのドメイン構造を示す。ＰＥＧ化ｒＦＶＩＩＩは、未変性組換えタンパク質よりも広いバンド及び高い分子量を有することが判明した。
【００８９】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び免疫ブロット技術によるｒＦＶＩＩＩ調製物のＰＥＧ化のより詳細な分析のために、実施例５に記載のように、未変性及びＰＥＧ化ｒＦＶＩＩＩを１ｎＭトロンビンを用いて６０°で６０分間消化すると、ＦＶＩＩＩ分子の特異的切断が起こり、明確に定義された分解産物が生成した。その断片をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてエレクトロブロッティングによって分離し、異なる抗ＦＶＩＩＩ抗体によって可視化した。図６に示すように、程度の差はあるが、すべてのドメインがＰＥＧ化された。Ｂドメインは強力にＰＥＧ化された。種々のＰＥＧ化度（モノ−、ジ−、トリ−ＰＥＧ化）を軽鎖Ａ３ドメインに観察することができた。その結果から、ＰＥＧ化ｒＦＶＩＩＩは、トロンビンに対してより抵抗性であると考えられた。
【００９０】
実施例６に記載のように、トロンビンによる活性化及び不活性化の速度をＦＩＸａ補因子アッセイによってモニターした。曲線の減衰部を単一指数関数フィットによりフィッティングさせて、ＦＶＩＩＩの擬一次不活性化速度を決定した。
【００９１】
【表４】
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図７及び表４に示すように、ＰＥＧ化ｒＦＶＩＩＩは、適用した両方のトロンビン濃度においてより遅い不活性化速度を示した。
【００９２】
（実施例９）
炭水化物部分を介したｒＦＶＩＩＩのＰＥＧ化
炭水化物残基を介したＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ結合体の調製のために、ｒＦＶＩＩＩ溶液（最終濃度１．２ｍｇ／ｍｌ）を２５ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ６．７で調製する。炭水化物残基の酸化のために、ＮａＩＯ４を添加する（最終濃度０．３ｍＭ）（Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．；Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌ  Ｒｅｖ．；５４：４５９−７６（２００２）；Ｍｅｉｒ  ａｎｄ  Ｗｉｌｃｈｅｋ；Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ；１３８：４２９−４２（１９８７））。最終濃度１０％でグリセロールを添加して反応をクエンチし、Ａｍｉｃｏｎ  Ｍｉｃｒｏｎ−１０装置（Ａｍｉｃｏｎ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を用いて遠心分離を繰り返して過剰の試薬を分離した。ＰＥＧ−ヒドラジド（ＭＷ３３００Ｄａ／Ｎｅｋｔａｒ、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、Ａｌａｂａｍａ）を添加して、最終濃度１．５ｍＭの試薬を得た。次いで、ＰＥＧ化を室温で２時間実施した。続いて、得られた結合体と過剰の試薬を、２５ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ６．７を用い、Ａｍｉｃｏｎ  Ｍｉｃｒｏｎ−１０装置による遠心分離を繰り返して分離した。
【００９３】
（実施例１０）
ＰＳＡ−ヒドラジンを用いたｒＦＶＩＩＩのポリシアル化
炭水化物残基を介したＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩ結合体の調製のために、ｒＦＶＩＩＩ溶液（最終濃度１ｍｇ／ｍｌ）を２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー、ｐＨ６．０で調製する。炭水化物残基の酸化のために、ＮａＩＯ４を添加する（最終濃度０．２５ｍＭ）。酸化を４℃で暗所で６０分間実施する。亜硫酸水素ナトリウム（最終濃度２５ｍＭ）を添加して反応を停止させる。過剰の過ヨウ素酸ナトリウムをＤＧ−１０カラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）のゲルろ過によって分離する。続いて、（国際公開第２００６／０１６１６８号に従って調製した）鎖長２０ｋＤのＰＳＡ−ヒドラジンを添加する（最終濃度１０ｍＭ）。ポリシアル化手順を室温で２時間実施する。ポリシアル化ｒＦＶＩＩＩをＢｕｔｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のＨＩＣによって精製する。５Ｍ  ＮａＣｌ溶液をその混合物に添加して最終濃度３Ｍ  ＮａＣｌにする。この混合物をＢｕｔｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）充填カラムにかけ、６．７ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓバッファー、ｐＨ７．４を使用してｒＦＶＩＩＩ−ＰＳＡ結合体を溶出させる。結合体の溶出後、ｐＨをｐＨ６．９に調節する。
【００９４】
（実施例１１）
ポリシアル酸の精製及び誘導体化
国際公開第０６０１６１６１号Ａ１に記載のように、ポリシアル酸をＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦの陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。２５ｍＭ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭトリエタノールアミンバッファー、ｐＨ７．４（＝出発バッファー）５０ｍＬにＰＳＡ５グラムを溶解させた。この溶液を、出発バッファーで平衡化したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を充填したＰｈａｒｍａｃｉａ  ＸＫ５０カラムにかけた。次いで、カラムを８カラム体積（ＣＶ）の出発バッファーで洗浄し、出発バッファー中の３ＣＶの２００ｍＭ  ＮａＣｌ、３５０ｍＭ  ＮａＣｌ及び５００ｍＭ  ＮａＣｌで段階的に結合ＰＳＡを溶出させた。３５０ｍＭ  ＮａＣｌで溶出された画分は、ＳＤＳゲル電気泳動によって示されるように分子量が２０ｋＤａであった。この画分を再生セルロースでできた５ｋＤ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を用いた限外ろ過によって濃縮し、続いて５０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ７．２で透析ろ過した。国際公開第０５０１６９７３号Ａ１に記載のように、ＰＳＡをＮａＩＯ４で酸化し、末端第一級アミノ基を還元アミノ化によって導入した。還元アミノ化のために、２Ｍ  ＮＨ４Ｃｌ溶液１１ｍＬを、５０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ７．２中の酸化ＰＳＡ５８ｍｇ／ｍｌを含有する溶液２０ｍＬに添加した。次いで、１Ｍ  ＮａＯＨ中の５Ｍ  ＮａＣＮＢＨ３溶液を添加して、最終濃度７５ｍＭにした。反応を室温でｐＨ８．０で５日間実施した。
【００９５】
次いで、混合物を、１０ｍＭ  ＮａＣｌを含む（ＮＨ４）２ＣＯ３溶液（５０ｍｇ／Ｌ）、続いて５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む５０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ８．０で透析した。次いで、末端第一級アミノ基と２−イミノチオラン（Ｔｒａｕｔ試薬／Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）の反応によってスルフヒドリル基を導入した。５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む５０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ８．０中で２０倍モル過剰の試薬を用いて室温で１時間反応を実施した。最後に、末端遊離ＳＨ基を含むＰＳＡ溶液を、再生セルロースでできたカットオフ５ｋＤの膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を用いた限外ろ過／透析ろ過に供した。
【００９６】
（実施例１２）
ヘテロ二官能性架橋剤を使用したｒＦＶＩＩＩのポリシアル化
ＰＳＡ−ＳＨとｒＦＶＩＩＩのカップリングのために、炭水化物選択的ヒドラジド及びスルフヒドリル反応性マレイミド基を含むヘテロ二官能性架橋剤ＭＢＰＨ（４−［４−Ｎ−マレイミドフェニル］酪酸ヒドラジドＨＣｌ／Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用した（Ｃｈａｍｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ；２６７：１５９１６−２２（１９９２））。活性スルフヒドリル基を含むＰＳＡ−ＳＨを実施例１１に従って調製した。
【００９７】
２ｍｌ  ｒＦＶＩＩＩ（６３８ｍｇ、３．８５６ｍｇ／ｍｌタンパク質濃度）を、脱塩カラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｅｃｏｎｏｐａｃ  １０ＤＧ）を使用して製造者の指示に従って酸化バッファー（５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ６）に移した。次いで、タンパク質を０．２５ｍＭ  ＮａＩＯ４（Ｍｅｒｃｋ）で酸化した（４℃で暗所で１時間）。酸化反応を最終濃度１０％のグリセロールを用いてクエンチした。グリセロール及びＮａＩＯ４を除去し、脱塩カラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｅｃｏｎｏｐａｃ  １０ＤＧ）を使用して製造者の指示に従って、タンパク質を反応バッファー（５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．５）に移した。次いで、ＭＢＰＨ１ｍｇ／ｍｇタンパク質とＰＳＡ−ＳＨ（タンパク質に対して２００倍モル過剰）を含む混合物を室温でｐＨ６．５で２時間インキュベートした。脱塩カラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｅｃｏｎｏｐａｃ  １０ＤＧ）を使用して製造者の指示に従って過剰のリンカーを除去し、リンカー−ＰＳＡ結合体を反応バッファー中に移した。
【００９８】
ＭＰＢＨ−ＰＳＡ結合体を酸化ｒＦＶＩＩＩ（０．１０５ｍｇ／ｍｌタンパク質）に添加し、反応混合物を静かに振とうしながら室温で２時間インキュベートした。ｒＦＶＩＩＩ−ＰＳＡ結合体を充填済みＢｕｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｂｕｔｙｌ  ＨｉＴｒａｐ  ＦＦ５ｍｌ）を用いたＨＩＣによって精製した。結合体をＢｕｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅと疎水性相互作用させるために、試料を２〜８℃に冷却し、５Ｍ  ＮａＣｌを含有する緩衝剤溶液（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、５Ｍ  ＮａＣｌ、６．７ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０１％Ｔｗｅｅｎ、ｐＨ６．９）を添加して、反応混合物のイオン強度を伝導率約１８５ｍＳ／ｃｍに増加させた。（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、３Ｍ  ＮａＣｌ、６．７ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０を含む）平衡化バッファーｐＨ６．９で平衡化したカラムに反応混合物を流量１．２ｃｍ／ｍｉｎで負荷した。１０カラム体積（ＣＶ）の平衡化バッファーを使用して非結合試料を洗い流した。低イオン強度のバッファー、ｐＨ７．４（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、６．７ｍＭ  ＣａＣｌ２）を使用して流量１．２ｃｍ／ｍｉｎで結合体を溶出させた。クロマトグラフィー工程の間、試料及びバッファーを氷浴によって冷却した。最後に、溶出物のｐＨを６．９に調節した。
【００９９】
（実施例１３）
ｒＦＶＩＩＩとデキストランの結合体化
ｒＦＶＩＩＩとデキストランの結合体化のために、ｒＦＶＩＩＩ（６３８ｍｇ、３．４ｍｇ／ｍｌタンパク質）２ｍｌを、脱塩カラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｅｃｏｎｏｐａｃ  １０ＤＧ）を使用して製造者の指示に従って酸化バッファー（５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ６）に移した。次いで、そのタンパク質を０．２５ｍＭ  ＮａＩＯ４で酸化した（４℃で暗所で１時間）。酸化タンパク質を、まず、ＭＷＣＯ３０ｋＤａのｖｉｖａｓｐｉｎ限外ろ過スピンカラム（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ）を使用して製造者の指示に従って濃縮した。次いで、試料を反応バッファー（５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７）で終夜４℃で透析した。
【０１００】
透析後、アジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）（Ｓｉｇｍａ）２６．５８ｍｇを添加し（５００倍モル過剰）、反応混合物を静かに振とうしながら室温でｐＨ７で２時間インキュベートした。脱塩カラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｅｃｏｎｏｐａｃ  １０ＤＧ）を使用して製造者の指示に従ってＡＤＨを除去した。アルデヒド活性化デキストラン（Ｐｉｅｒｃｅ）１０ｍｇを添加し（タンパク質に対して１７倍モル過剰）、混合物を室温、ｐＨ７で２時間インキュベートした。
【０１０１】
結合体をＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のＩＥＸクロマトグラフィーによって精製した。バッファーＡ（５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．８）で平衡化したカラム（６．４ｍｍ×３ｃｍ、Ｖ＝１ｍｌ）に流量０．５ｍｌ／ｍｉｎで試料を負荷した。非結合試料を５ＣＶのバッファーＡで洗い流した。最後に、結合体を線形塩勾配（１０ＣＶの０〜１００％バッファーＢ［５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．８＋１Ｍ  ＮａＣｌ］）を用い流量０．５ｍｌ／ｍｉｎで溶出させた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【外国語明細書】
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