(57)【要約】【課題】病害応答性MAPK活性のより簡便且つ効率的な評価手段、及び該手段を用いたPA等のスクリーニング方法を提供すること。【解決手段】アクセプター蛍光ドメイン、構造可変ドメイン、及びドナー蛍光ドメインを含み、前記アクセプター蛍光ドメインと前記ドナー蛍光ドメインとの間に前記構造可変ドメインを含み、前記構造可変ドメインが、（1）リン酸化セリン結合性WWドメイン、（2）リンカー、並びに（3）植物病害応答性MAPK応答性WRKY型転写因子の、病害応答性MAPK結合Dドメイン及びリン酸化対象SPクラスターを含む領域からなる、MAPKシグナル受容ドメインを含み、且つこれらがこの順で配置されてなるドメインである、ポリペプチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アクセプター蛍光ドメイン、構造可変ドメイン、及びドナー蛍光ドメインを含み、
前記アクセプター蛍光ドメインと前記ドナー蛍光ドメインとの間に前記構造可変ドメインを含み、
前記構造可変ドメインが、
（1）リン酸化セリン結合性WWドメイン、
（2）リンカー、並びに
（3）植物病害応答性MAPK応答性WRKY型転写因子の、病害応答性MAPK結合Dドメイン及びリン酸化対象SPクラスターを含む領域からなる、MAPKシグナル受容ドメイン
を含み、且つこれらがこの順で配置されてなるドメインである、
ポリペプチド。
【請求項２】
前記植物病害応答性MAPK応答性WRKY型転写因子がタバコ属植物のWRKY8又はそのオーソログである、請求項１に記載のポリペプチド
【請求項３】
前記MAPKシグナル受容ドメインのアミノ酸残基数が100〜200である、請求項１又は２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記MAPKシグナル受容ドメインが、配列番号31で示されるアミノ酸配列を含むアミノ酸残基数113〜123のドメインである、請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記リンカーのアミノ酸残基数が40〜80である、請求項１〜４のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記WWドメインがPin1タンパク質のWWドメインである、請求項１〜５のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記ドナー蛍光ドメインがCFPドメインであり、且つ前記アクセプター蛍光ドメインがYFPドメインである、請求項１〜６のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項８】
N末端側から、前記アクセプター蛍光ドメイン、前記リン酸化セリン結合性WWドメイン、前記リンカー、前記MAPKシグナル受容ドメイン、ドナー蛍光ドメインの順で配置されている、請求項１〜７のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記アクセプター蛍光ドメインと前記リン酸化セリン結合性WWドメインとが直接連結されており、且つ前記MAPKシグナル受容ドメインとドナー蛍光ドメインとが直接連結されている、請求項１〜８のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１０】
分子内FRETバイオセンサーである、請求項１〜９のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載のポリペプチドのコード配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１１に記載のポリヌクレオチドを含む、形質転換体。
【請求項１３】
植物細胞、植物体、又は植物体の一部である、請求項１２に記載の形質転換体。
【請求項１４】
請求項１〜９のいずれかに記載のポリペプチドを発現する形質転換植物体若しくはその一部又は植物細胞のFRETシグナルを指標とする、植物病害応答性MAPK活性の検出方法。
【請求項１５】
請求項１〜９のいずれかに記載のポリペプチドを発現する形質転換植物体若しくはその一部又は植物細胞の、被検物質の存在下におけるFRETシグナル強度を指標とする、植物病害応答性MAPK調節物質のスクリーニング方法。
【請求項１６】
前記植物病害応答性MAPK調節物質がプラントアクチベーターである、請求項１５に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、MAPキナーゼのバイオセンサーに関する。
【背景技術】
【０００２】
プラントアクチベーター（PA）は、植物の免疫系を高め、これにより植物の病害に対する耐性を向上させることができる。PAは20年以上前から使用されており、PAとしては例えばジブチルヒドロキシトルエンやプロペラゾール等が知られている。
【０００３】
従来、PA候補化合物のスクリーニングは、通常は、ポット栽培されている植物に対して被検化合物を塗布することにより行われていた。しかしながら、この方法は、多数のポット栽培植物の準備や塗布作業等の煩雑な作業を要するので、大規模のスクリーニングには適していない。
【０００４】
一方、近年、生体内のシグナルを簡便に検出、評価できるFRETバイオセンサーの開発が各種分野で進められている。例えば、非特許文献１には、動物細胞のシグナルを検出するためのFRETバイオセンターについて報告されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Nature, Vol 411, 2001, pp1065-1068
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、鋭意研究を進めた結果、ある病害応答性MAPキナーゼ（MAPK）経路とそれによりリン酸化されるWRKY型転写因子に着目するに至った。そして、この経路の活性化を指標とすることにより、PAをスクリーニングできるという着想に至った。ただ、従来技術においては、植物のMAPK活性を測定する際には、組織を破砕して粗酵素液を調整しなければならなかった。
【０００７】
そこで、本発明は、病害応答性MAPK活性のより簡便且つ効率的な評価手段、及び該手段を用いたPA等のスクリーニング方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は上記課題に鑑みて更に鋭意研究を進めた結果、アクセプター蛍光ドメイン、構造可変ドメイン、及びドナー蛍光ドメインを含み、前記アクセプター蛍光ドメインと前記ドナー蛍光ドメインとの間に前記構造可変ドメインを含み、前記構造可変ドメインが、（1）リン酸化セリン結合性WWドメイン、（2）リンカー、及び（3）植物病害応答性MAPK応答性WRKY型転写因子の、病害応答性MAPK結合Dドメイン及びリン酸化対象SPクラスターを含む領域からなる、MAPKシグナル受容ドメインを含み、且つこれらがこの順で配置されてなるドメインである、ポリペプチド（本明細書において、「本発明のポリペプチド」と示すこともある。）を用いることにより、病害応答性MAPK活性を評価できることを見出した。さらに、該ポリペプチドを用いて病害応答性MAPK活性化能があると判定できた物質は、病害耐性のみならず虫害耐性をも植物に付与できることを見出した。
【０００９】
即ち、本発明は、下記の態様を包含する。
【００１０】
項１．  アクセプター蛍光ドメイン、構造可変ドメイン、及びドナー蛍光ドメインを含み、前記アクセプター蛍光ドメインと前記ドナー蛍光ドメインとの間に前記構造可変ドメインを含み、前記構造可変ドメインが、（1）リン酸化セリン結合性WWドメイン、（2）リンカー、並びに（3）植物病害応答性MAPK応答性WRKY型転写因子の、病害応答性MAPK結合Dドメイン及びリン酸化対象SPクラスターを含む領域からなる、MAPKシグナル受容ドメインを含み、且つこれらがこの順で配置されてなるドメインである、ポリペプチド。
【００１１】
項２．  前記植物病害応答性MAPK応答性WRKY型転写因子がタバコ属植物のWRKY8又はそのオーソログである、項１に記載のポリペプチド
【００１２】
項３．  前記MAPKシグナル受容ドメインのアミノ酸残基数が100〜200である、項１又は２に記載のポリペプチド。
【００１３】
項４．  前記MAPKシグナル受容ドメインが、配列番号31で示されるアミノ酸配列を含むアミノ酸残基数113〜123のドメインである、項１〜３のいずれかに記載のポリペプチド。
【００１４】
項５．  前記リンカーのアミノ酸残基数が40〜80である、項１〜４のいずれかに記載のポリペプチド。
【００１５】
項６．  前記WWドメインがPin1タンパク質のWWドメインである、項１〜５のいずれかに記載のポリペプチド。
【００１６】
項７．  前記ドナー蛍光ドメインがCFPドメインであり、且つ前記アクセプター蛍光ドメインがYFPドメインである、項１〜６のいずれかに記載のポリペプチド。
【００１７】
項８．  N末端側から、前記アクセプター蛍光ドメイン、前記リン酸化セリン結合性WWドメイン、前記リンカー、前記MAPKシグナル受容ドメイン、ドナー蛍光ドメインの順で配置されている、項１〜７のいずれかに記載のポリペプチド。
【００１８】
項９．  前記アクセプター蛍光ドメインと前記リン酸化セリン結合性WWドメインとが直接連結されており、且つ前記MAPKシグナル受容ドメインとドナー蛍光ドメインとが直接連結されている、項１〜８のいずれかに記載のポリペプチド。
【００１９】
項１０．  分子内FRETバイオセンサーである、項１〜９のいずれかに記載のポリペプチド。
【００２０】
項１１．  項１〜１０のいずれかに記載のポリペプチドのコード配列を含む、ポリヌクレオチド。
【００２１】
項１２．  項１１に記載のポリヌクレオチドを含む、形質転換体。
【００２２】
項１３．  植物細胞、植物体、又は植物体の一部である、項１２に記載の形質転換体。
【００２３】
項１４．  項１〜９のいずれかに記載のポリペプチドを発現する形質転換植物体若しくはその一部又は植物細胞の、被検物質の存在下におけるFRETシグナルを指標とする、植物病害応答性MAPK活性の検出方法。
【００２４】
項１５．  項１〜９のいずれかに記載のポリペプチドを発現する形質転換植物体若しくはその一部又は植物細胞の、被検物質の存在下におけるFRETシグナル強度を指標とする、植物病害応答性MAPK調節物質のスクリーニング方法。
【００２５】
項１６．  前記植物病害応答性MAPK調節物質がプラントアクチベーターである、項１５に記載のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００２６】
本発明のポリペプチドによれば、病害応答性MAPK活性をより簡便且つ効率的に評価することができる。また、これにより病害応答性MAPK活性化能があると判定できた物質を、植物に病虫害耐性を付与する物質、プラントアクチベーター等としてスクリーニングすることも可能である。
【００２７】
本発明のポリペプチドを用いることにより、非破壊組織を用いて、時空間的に細胞・組織レベルで、病害応答性MAPK活性を評価することができる。また、本発明のポリペプチドを用いた病害応答性MAPK活性評価方法は、より多くの検体、より多くの被検物質を用いて病害応答性MAPK活性化物質をスクリーニングすることに、特に適している。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】試験例1でデザインした植物病害応答性MAPKバイオセンサーの一例の、構造及び機能メカニズムを表す模式図である。上側は、植物病害応答性MAPKが活性化されていない状態の構造を示し、下側は、該MAPKの活性化シグナルを受容した場合の構造を示す。「YFP」はアクセプター蛍光ドメインであるYFPドメインを示し、YFPに隣接する部分はリン酸化セリン結合性WWドメインを示し、線はリンカーを示し、「D」はMAPKシグナル受容ドメインにおける病害応答性MAPK結合Dドメインを示し、「SP」はMAPKシグナル受容ドメインにおけるリン酸化対象SPクラスターを示し、「CFP」はドナー蛍光ドメインであるCFPドメインを示し、「MAPK」は植物病害応答性MAPKを示し、「P」はSPクラスター上のリン酸化セリンを示す。
【図２】試験例2のウェスタンブロッティングの結果を示す。写真上方は発現させたタンパク質を示す（Cはネガティブコントロール）。写真左側はStrep-Tactin精製の有無、及びウェスタンブロッティングに使用した抗体を示す。
【図３】Ａは、試験例3において発現させたMAPKセンサーの構造を示す模式図である。Ｂは、試験例3のウェスタンブロッティングの結果を示す写真である。写真上方は、発現させたMAPKセンサー、及びこれと共発現させたMEK2変異体を示す。写真左側は、ウェスタンブロッティングに使用した抗体を示す。
【図４】グラフ左側は、試験例4において発現させたMAPKセンサーの構造を示す模式図である。グラフは、試験例4で測定されたFRET強度比（FRET gain）の平均値（n=3）を示す。点線は、FRET強度比1.3を示す。
【図５】試験例4のウェスタンブロッティングの結果を示す。写真上方は発現させたMAPKセンサー、及びこれと共発現させたMEK2変異体を示す。写真左側は、ウェスタンブロッティングに使用した抗体を示す。
【図６】グラフ左側は、試験例5において発現させたMAPKセンサーの構造を示す模式図である。グラフは、試験例5で測定されたFRET強度比（FRET gain）の平均値（n=3）を示す。点線は、FRET強度比1.3を示す。PI＋／−は、フォスファターゼインヒビター添加の有無を示す。
【図７】Ａは、試験例5のウェスタンブロッティングの結果の一部、及び特異的リン酸化（Phosphorylation ratio）の算出式を示す。Ｂ中、グラフの左側は、試験例5において発現させたMAPKセンサーの構造を示す模式図を示し、グラフは、算出した特異的リン酸化の値の平均値（n=3）を示す。点線は、FRET強度比1.3を示す。PI＋／−は、フォスファターゼインヒビター添加の有無を示す。
【図８】グラフ左側は、試験例6において発現させたMAPKセンサーの構造を示す模式図である。グラフは、試験例6で測定されたFRET強度比（FRET gain）の平均値（n=3）を示す。点線は、FRET強度比1.3を示す。
【図９】試験例6のウェスタンブロッティングの結果を示す。写真上方は発現させたMAPKセンサー、及びこれと共発現させたMEK2変異体を示す。写真左側は、ウェスタンブロッティングに使用した抗体を示す。
【図１０】試験例6の蛍光共焦点顕微鏡観察像を示す。写真上方は観察対象を示し、写真左側は発現させたMAPKセンサーを示す。バーの長さは50 μmを示す。
【図１１】グラフ上方は、試験例7において発現させたMAPKセンサーの構造を示す模式図である。グラフは、試験例7で測定されたFRET強度比（FRET gain）の平均値（n=3）を示す。点線は、FRET強度比1.3を示す。
【図１２】試験例7のウェスタンブロッティングの結果を示す。写真上方は発現させたMAPKセンサー、及びこれと共発現させたMEK2変異体を示す。写真左側は、ウェスタンブロッティングに使用した抗体を示す。
【図１３】試験例8の蛍光共焦点顕微鏡観察像を示す。写真上方は観察対象を示し、写真左側は発現させたMAPKセンサーを示す。バーの長さは50 μmを示す。
【図１４】試験例9の蛍光共焦点顕微鏡観察像を示す。(A) はMAPK sensor-NESを発現させた場合、(B) はMAPK sensor-NLSを発現させた場合を示す。各写真の時間は、写真左側の物質で処理してからの経過時間を示す。バーの長さは50 μmを示す。
【図１５】試験例10の蛍光共焦点顕微鏡観察像を示す。写真上方は、発現させたMAPKセンサーが有するシグナル配列を示し、写真左側はMAPKセンサーと共発現したものを示す。バーの長さは50 μmを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
1．定義
本明細書中において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。
【００３０】
本明細書中において、「保存的置換」とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換されることを意味する。例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジンといった塩基性側鎖を有するアミノ酸残基同士で置換されることが、保存的な置換にあたる。その他、アスパラギン酸、グルタミン酸といった酸性側鎖を有するアミノ酸残基；グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システインといった非帯電性極性側鎖を有するアミノ酸残基；アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンといった非極性側鎖を有するアミノ酸残基；スレオニン、バリン、イソロイシンといったβ−分枝側鎖を有するアミノ酸残基；チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンといった芳香族側鎖を有するアミノ酸残基同士での置換も同様に、保存的な置換にあたる。
【００３１】
本明細書において、DNA、RNAなどのヌクレオチドには、次に例示するように、公知の化学修飾が施されていてもよい。ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、各ヌクレオチドのリン酸残基（ホスフェート）を、例えば、ホスホロチオエート（PS）、メチルホスホネート、ホスホロジチオネート等の化学修飾リン酸残基に置換することができる。また、各リボヌクレオチドの糖（リボース）の2位の水酸基を、-OR（Rは、例えばCH3（2´-O-Me）、CH2CH2OCH3（2´-O-MOE）、CH2CH2NHC(NH)NH2、CH2CONHCH3、CH2CH2CN等を示す）に置換してもよい。さらに、塩基部分（ピリミジン、プリン）に化学修飾を施してもよく、例えば、ピリミジン塩基の5位へのメチル基やカチオン性官能基の導入、あるいは2位のカルボニル基のチオカルボニルへの置換などが挙げられる。さらには、リン酸部分やヒドロキシル部分が、例えば、ビオチン、アミノ基、低級アルキルアミン基、アセチル基等で修飾されたものなどを挙げることができるが、これに限定されない。また、ヌクレオチドの糖部の2´酸素と4´炭素を架橋することにより、糖部のコンフォーメーションをN型に固定したものであるBNA（LNA）等もまた、好ましく用いられ得る。
【００３２】
2．ポリペプチド
本発明は、その一態様において、アクセプター蛍光ドメイン、構造可変ドメイン、及びドナー蛍光ドメインを含み、前記アクセプター蛍光ドメインと前記ドナー蛍光ドメインとの間に前記構造可変ドメインを含み、前記構造可変ドメインが、（1）リン酸化セリン結合性WWドメイン、（2）リンカー、（3）植物病害応答性MAPK応答性WRKY型転写因子の、病害応答性MAPK結合Dドメイン及びリン酸化対象SPクラスターを含む領域からなる、MAPKシグナル受容ドメインを含み、且つこれらがこの順で配置されてなるドメインである、ポリペプチド（本発明のポリペプチド）に関する。以下、これについて説明する。
【００３３】
アクセプター蛍光ドメイン及びドナー蛍光ドメインは、近接した場合に蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）が起こり、アクセプター蛍光ドメインの励起波長光の照射によりドナー蛍光ドメインの蛍光波長光の放射が起こる組み合わせである限り、特に制限されない。アクセプター蛍光ドメイン及びドナー蛍光ドメインそれぞれは、蛍光タンパク質のアミノ酸配列を示す。該蛍光タンパク質としては、例えばGFP、Azami-Green、ZsGreen、GFP2、EGFP、HyPer、Sirius、BFP、CFP、Cerulean、Turquoise、Cyan、TFP1、YFP、Venus、ZsYellow、Banana、KusabiraOrange、RFP、mRuby、DsRed、AsRed、Strawberry、Jred、KillerRed、Cherry、HcRed、mPlum等、或いはこれらの変異蛍光タンパク質が挙げられる。変異蛍光タンパク質としては、例えばアミノ酸の置換、欠失、付加、挿入等の変異のみならず、円順列変異させた蛍光タンパク質も挙げられる。アクセプター蛍光ドメインとドナー蛍光ドメインとの組み合わせとしては、好ましくはYFPドメイン（アクセプター蛍光ドメイン）とCFPドメイン（ドナー蛍光ドメイン）との組み合わせが挙げられる。
【００３４】
構造可変ドメインは、アクセプター蛍光ドメインとドナー蛍光ドメインとの間に配置される。この際、構造可変ドメインとアクセプター蛍光ドメイン及び／又はドナー蛍光ドメインとは、直接（リンカーを介さずに）連結されていてもよく、間接的に（リンカーを介して）連結されていてもよい。本発明の一態様において、構造可変ドメインとアクセプター蛍光ドメイン及び／又はドナー蛍光ドメインとは、直接又は20アミノ酸残基以下からなるリンカーを介して連結されていることが好ましく、直接又は10アミノ酸残基以下からなるリンカーを介して連結されていることがより好ましく、直接又は5アミノ酸残基以下からなるリンカーを介して連結されていることがさらに好ましく、直接又は2アミノ酸残基以下からなるリンカーを介して連結されていることがより更に好ましく、直接連結されていることがよりさらに好ましい。
【００３５】
構造可変ドメインは、リン酸化セリン結合性WWドメイン（1）、リンカー（2）、及び（3）MAPKシグナル受容ドメインを含み、且つこれらがこの順で配置されてなるドメインである。好ましい一態様においては、構造可変ドメインは、リン酸化セリン結合性WWドメイン（1）、リンカー（2）、及び（3）MAPKシグナル受容ドメインからなるドメインである。また、別の好ましい一態様においては、構造可変ドメインは、N末端側から、リン酸化セリン結合性WWドメイン（1）、リンカー（2）、（3）MAPKシグナル受容ドメインの順に配置されてなるドメインである。
【００３６】
リン酸化セリン結合性WWドメイン（1）は、後述のリン酸化対象SPクラスター上のSP配列のリン酸化セリンに結合性を有するWWドメインである限り特に制限されない。該WWドメインは、各種タンパク質（例えば、Pin1タンパク質、好ましくはヒトPin1タンパク質）中に含まれることが知られており、本発明においては、これらのタンパク質中のWWドメインを使用することができる。
【００３７】
WWドメイン（1）としては、好ましくは下記（a）又は（b）のドメインが挙げられる：
（a）配列番号2で示されるアミノ酸配列からなるドメイン、又は
（b）配列番号2に示されるアミノ酸配列に対して1若しくは複数個のアミノ酸が変異（例えば置換、欠失、付加、挿入等、好ましくは置換、より好ましくは保存的置換）したアミノ酸配列からなるドメインであって、リン酸化対象SPクラスター上のSP配列のリン酸化セリンに結合性を有するドメイン。
【００３８】
上記（b）において、複数個とは、例えば2〜8個、好ましくは2〜4個、より好ましくは2個である。
【００３９】
リン酸化対象SPクラスター上のSP配列のリン酸化セリンへの結合性の判定は、公知の方法に従って又は準じて行うことが可能である。例えば、WWドメイン（1）が判定対象ドメインに置換された本発明のポリペプチドを植物細胞又は植物体に導入し、得られた形質転換体において、病害応答性MAPK活性化物質によってFRETシグナル強度が向上すれば、判定対象ドメインはリン酸化対象SPクラスター上のSP配列のリン酸化セリンに結合性を有する、と判定することができる。或いは、別の例として、判定対象ドメインとSP配列のセリンがリン酸化されたSPクラスターとを接触させ、両者の結合の有無を測定し（例えばプルダウン法、免疫沈降法等）、両者の結合が検出できれば、判定対象ドメインはリン酸化対象SPクラスター上のSP配列のリン酸化セリンに結合性を有する、と判定することができる。
【００４０】
リンカー（2）は、リンカーとして機能するものである限り、特に制限されない。リンカー（2）は、αヘリックス構造やβシート構造などの2次構造を作らず、且つ自由に折り曲がるアミノ酸配列であることが好ましい。リンカーは、数アミノ酸残基からなる単位が連結してなるアミノ酸配列であることが好ましい。リンカーの単位としては、例えばSAGG（配列番号31）、GGGS（配列番号32）、GGSG（配列番号33）等が挙げられ、好ましくはSAGGが挙げられる。リンカー（2）のアミノ酸残基数は、特に制限されるものではないが、例えば8以上、好ましくは15〜250、より好ましくは30〜120、さらに好ましくは40〜80、よりさらに好ましくは50〜70、よりさらに好ましくは55〜65である。
【００４１】
MAPKシグナル受容ドメイン（3）は、植物病害応答性MAPK応答性WRKY型転写因子が含む連続する領域であって、病害応答性MAPK結合Dドメイン及びリン酸化対象SPクラスター領域を含む領域からなるドメインである。
【００４２】
植物病害応答性MAPKは、植物において、病因物質によって活性化するMAPKであって、該活性化によってWRKY型転写因子をリン酸化するMAPKである限り、特に制限されない。植物病害応答性MAPKとしては、例えばSIPK、NTF4、WIPK、NTF6等、さらにはこれらのホモログ、オーソログ等が挙げられる。
【００４３】
植物病害応答性MAPK応答性WRKY型転写因子は、植物病害応答性MAPKによってリン酸化される、WRKY型転写因子である限り、特に制限されない。ここで、WRKY型転写因子とは、DNA結合ドメインであるWRKYドメインを含む転写因子である。植物病害応答性MAPK応答性WRKY型転写因子としては、例えばタバコ属植物のWRKY8又はそのホモログ（好ましくはオーソログ）が挙げられる。タバコ属植物のWRKY8のオーソログとしては、例えば、StWRKY8（NCBI Accession Number：BAI63294.1）、CaWRKY2（NCBI Accession Number：ABD65255.1）、OsWRKY53（NCBI Accession Number：NP_001055252.1）、NbWRKY7（NCBI Accession Number：BAI63295.1）、NaWRKY6（NCBI Accession Number：AAS13440.1）、NtWRKY-6（NCBI Accession Number：BAB61053.1）、CaWRKY-a（NCBI Accession Number：AAR26657.1）、AtWRKY33（NCBI Accession Number：NP_181381.2）、AtWRKY26.1（NCBI Accession Number：NP_196327.1）、OsWRKY24（NCBI Accession Number：NP_001044675.1）、AtWRKY25（NCBI Accession Number：NP_180584.1）、AtWRKY20（NCBI Accession Number：NP_849450.1）、OsWRKY78（NCBI Accession Number：NP_001060116.1）、AtWRKY3（NCBI Accession Number：NP_178433.1）、AtWRKY4.1（NCBI Accession Number：NP_172849.1）等が挙げられる。
【００４４】
病害応答性MAPK結合Dドメインは、植物病害応答性MAPK応答性WRKY型転写因子が有するドメインであり、病害応答性MAPKが結合するドメインである限り、特に制限されない。病害応答性MAPK結合Dドメインが植物病害応答性MAPK応答性WRKY型転写因子内のどの領域であるかは、公知であり、例えばCurrent Opinion in Plant Biology 2012, 15:431-437.に記載されている。例えば、NbWRKY8において、病害応答性MAPK結合Dドメインは、N末端から49番目のアミノ酸から61番目のアミノ酸までのアミノ酸配列からなるドメインである。
【００４５】
病害応答性MAPK結合Dドメインは、病害応答性MAPKに対する結合性を有する限りにおいて、野生型のアミノ酸配列に対して1若しくは複数個（例えば2個）のアミノ酸が変異（例えば置換、欠失、付加、挿入等、好ましくは置換、より好ましくは保存的置換）したアミノ酸配列からなるドメインであってもよい。変異部位は、各植物種間で保存された部位以外の部位であることが望ましい。
【００４６】
病害応答性MAPKに対する結合性の判定は、公知の方法に従って又は準じて行うことが可能である。例えば、病害応答性MAPK結合Dドメインが判定対象ドメインに置換された本発明のポリペプチドを植物細胞又は植物体に導入し、得られた形質転換体において、病害応答性MAPK活性化物質によってFRETシグナル強度が向上すれば、判定対象ドメインは病害応答性MAPKに対する結合性を有する、と判定することができる。或いは、別の例として、判定対象ドメインと病害応答性MAPKとを接触させ、両者の結合の有無を測定し（例えばプルダウン法、免疫沈降法等）、両者の結合が検出できれば、判定対象ドメインは病害応答性MAPKに対する結合性を有する、と判定することができる。
【００４７】
リン酸化対象SPクラスターは、植物病害応答性MAPK応答性WRKY型転写因子が有するドメインであり、病害応答性MAPKによってリン酸化されるSP配列を含むドメインである限り、特に制限されない。リン酸化対象SPクラスターが植物病害応答性MAPK応答性WRKY型転写因子内のどの領域であるかは、公知であり、例えばCurrent Opinion in Plant Biology 2012, 15:431-437.に記載されている。例えば、NbWRKY8において、病害応答性MAPK結合Dドメインは、N末端から62番目のアミノ酸から102番目のアミノ酸までのアミノ酸配列からなるドメインである。
【００４８】
リン酸化対象SPクラスターは、セリンが病害応答性MAPKによりリン酸化される限りにおいて、野生型のアミノ酸配列に対して1若しくは複数個（例えば8個、好ましくは4個、より好ましくは2個）のアミノ酸が変異（例えば置換、欠失、付加、挿入等、好ましくは置換、より好ましくは保存的置換）したアミノ酸配列からなるドメインであってもよい。変異部位は、各植物種間で保存された部位（例えばSP配列）以外の部位であることが望ましいが、病害応答性MAPKによりリン酸化されないSP配列であってもよい。例えば、NbWRKY8においては、86番目のセリン以外のSP配列のセリンは他のアミノ酸に変異されていてもよい。
【００４９】
病害応答性MAPKによりリン酸化されるか否かの判定は、公知の方法に従って又は準じて行うことが可能である。例えば、リン酸化対象SPクラスターが判定対象ドメインに置換された本発明のポリペプチドを植物細胞又は植物体に導入し、得られた形質転換体において、病害応答性MAPK活性化物質によってFRETシグナル強度が向上すれば、判定対象ドメインのセリンは病害応答性MAPKによりリン酸化される、と判定することができる。或いは、別の例として、判定対象ドメインと病害応答性MAPKとを接触させ、判定対象ドメインのセリンリン酸化の有無を測定し（例えばウェスタンブロッティング法等）、セリンリン酸化が検出できれば、判定対象ドメインのセリンは病害応答性MAPKによりリン酸化される、と判定することができる。
【００５０】
「病害応答性MAPK結合Dドメイン及びリン酸化対象SPクラスターを含む領域」とは、植物病害応答性MAPK応答性WRKY型転写因子が含む連続する領域であって、病害応答性MAPK結合Dドメイン及びリン酸化対象SPクラスター領域である。該領域中、病害応答性MAPK結合Dドメイン及びリン酸化対象SPクラスター以外のアミノ酸配列は、野生型のアミノ酸配列に対して1若しくは複数個（例えば10個、好ましくは5個、より好ましくは2個）のアミノ酸が変異（例えば置換、欠失、付加、挿入等、好ましくは置換、より好ましくは保存的置換）していてもよい。
【００５１】
MAPKシグナル受容ドメインのアミノ酸残基数は、特に制限されないが、例えば100〜200、好ましくは100〜150、より好ましくは100〜130、よりさらに好ましくは110〜125、よりさらに好ましくは113〜123、よりさらに好ましくは116〜120である。
【００５２】
MAPKシグナル受容ドメイン（3）は、好ましくは、植物病害応答性MAPK応答性WRKY型転写因子のN末端のアミノ酸から、N末端から例えば100〜200、好ましくは100〜150、より好ましくは100〜130、よりさらに好ましくは110〜125、よりさらに好ましくは113〜123、よりさらに好ましくは116〜120のアミノ酸までの領域である。
【００５３】
MAPKシグナル受容ドメイン（3）は、好ましくは、タバコ属WRKY8が含む連続する領域である、配列番号31で示されるアミノ酸配列を含むアミノ酸残基数113〜123、より好ましくは116〜120のドメインである。
【００５４】
本発明のポリペプチドにおいては、一態様において、N末端側から、アクセプター蛍光ドメイン、リン酸化セリン結合性WWドメイン（1）、リンカー（2）、MAPKシグナル受容ドメイン（3）、ドナー蛍光ドメインの順で配置されていることが好ましい。
【００５５】
本発明のポリペプチドにおいては、一態様において、アクセプター蛍光ドメインとリン酸化セリン結合性WWドメイン（1）とが直接連結されており、且つMAPKシグナル受容ドメイン（3）とドナー蛍光ドメインとが直接連結されていることが好ましい。
【００５６】
本発明のポリペプチドは、FRETを大きく阻害しない限りにおいて、その他の配列を含んでいてもよい。その他の配列は、アクセプター蛍光ドメインよりも末端側又はドナー蛍光ドメインよりも末端側に配置されていることが好ましい。その他の配列としては、例えば各種シグナル配列（例えば核移行シグナル、核外移行シグナル、葉緑体移行シグナル等）、タンパク質タグ（例えばビオチン、Hisタグ、FLAGタグ、Haloタグ、MBPタグ、HAタグ、Mycタグ、V5タグ、PAタグ等）が挙げられる。
【００５７】
本発明のポリペプチドは、FRETが大きく阻害されない限りにおいて、化学修飾されたものであってもよい。
【００５８】
本発明のポリペプチドは、C末端がカルボキシル基（−COOH）、カルボキシレート（−COO−）、アミド（−CONH2）またはエステル（−COOR）の何れであってもよい。
【００５９】
ここでエステルにおけるRとしては、例えば、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチルなどのC1−6アルキル基；例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのC3−8シクロアルキル基；例えば、フェニル、α−ナフチルなどのC6−12アリール基；例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−C1−2アルキル基；α−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−C1−2アルキル基などのC7−14アラルキル基；ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
【００６０】
本発明のポリペプチドは、C末端以外のカルボキシル基（またはカルボキシレート）が、アミド化またはエステル化されていてもよい。この場合のエステルとしては、例えば上記したC末端のエステルなどが用いられる。
【００６１】
さらに、本発明のポリペプチドには、N末端のアミノ酸残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのC1−6アルカノイルなどのC1−6アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成し得るN末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば−OH、−SH、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのC1−6アルカノイル基などのC1−6アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども包含される。
【００６２】
本発明のポリペプチドは、酸または塩基との薬学的に許容される塩の形態であってもよい。塩は、薬学的に許容される塩である限り特に限定されず、酸性塩、塩基性塩のいずれも採用することができる。例えば酸性塩の例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；  酢酸塩、プロピオン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩等の有機酸塩；  アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩等のアミノ酸塩等が挙げられる。また、塩基性塩の例として、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；  カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩等が挙げられる。
【００６３】
本発明のポリペプチドは、溶媒和物の形態であってもよい。溶媒は、薬学的に許容されるものであれば特に限定されず、例えば水、エタノール、グリセロール、酢酸等が挙げられる。
【００６４】
本発明のポリペプチドは、公知の遺伝子工学的手法に従って容易に作製することができる。例えば、PCR、制限酵素切断、DNA連結技術、in vitro転写・翻訳技術、リコンビナントタンパク質作製技術等を利用して作製することができる。
【００６５】
本発明のポリペプチドは、分子内FRETバイオセンサーとして、より好適には植物病害応答性MAPK調節物質、プラントアクチベーター等のスクリーニング用に、用いることができる。この観点から、本発明のポリペプチドは、これを含有するキット（好ましくは植物病害応答性MAPK調節物質、プラントアクチベーター等のスクリーニング用キット）として提供することができる。
【００６６】
3．ポリヌクレオチド
本発明は、その一態様において、本発明のポリペプチドのコード配列を含む、ポリヌクレオチド（本明細書において、「本発明のポリヌクレオチド」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
【００６７】
本発明のポリペプチドのコード配列は、本発明のポリヌクレオチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドである限り、特に制限されない。ただ、反復配列が1つの分子内に存在すると、RNAi装置に依存したde novoなDNAのメチル化が起こる例が知られており (Chan, et al., 2004, Science 303: 1336.)、2つの蛍光ドメインをコードするMAPKセンサーは、特定細胞では抑制される可能性がある。そこで、より確実により多種類の細胞でMAPKセンサーを発現させるという観点から、アクセプター蛍光ドメイン及びドナー蛍光ドメインのいずれか一方又は両方のコード配列は、分子内反復配列が無くなるように、変換されていることが望ましい。この際、アミノ酸配列には変化が無いことが望ましいが、本発明のポリペプチドが所望の活性を発揮できる限りにおいて、アミノ酸配列が変化していてもよい。
【００６８】
本発明のポリヌクレオチドは、一態様において、本発明のポリペプチドのコード配列の上流に、プロモーターが配置されていることが好ましい。プロモーターは、通常、本発明のポリペプチドをコードするmRNAが発現可能なように、配置されている。具体的な配置の態様としては、例えばプロモーターの3´側直下に本発明のポリペプチドのコード配列が配置されている態様（例えば、プロモーター3´末端の塩基から本発明のポリペプチドのコード配列の5´末端の塩基までの間の塩基対数（bp）が、例えば100 bp以下、好ましくは50 bp以下である態様）が挙げられる。プロモーターとしては、特に制限されず、例えばCaMV35Sプロモーター、UBQ（ユビキチン）プロモーター、NOSプロモーター等が挙げられる。
【００６９】
本発明のポリヌクレオチドは、一態様において、本発明のポリペプチドのコード配列の下流に、該コード配列からの転写の終結シグナルを含むことが好ましい。終結シグナルは、本発明のポリペプチドのコード配列からの転写を終結させ（好ましくは、さらに本発明のポリペプチドのコード配列から転写されるmRNAにpolyA配列を付加でき）ることができる塩基配列である限り特に制限されない。「本発明のポリペプチドのコード配列の下流に」とは、特に制限されないが、例えば本発明のポリペプチドのコード配列の3´末端の塩基から終結シグナルの5´末端の塩基までの間の塩基対数（bp）が、例えば500 bp以下、好ましくは200 bp以下である態様が挙げられる。終結シグナルとしては、例えば、ヒットショックタンパク質終結シグナル（NosT (Noparin synthase Terminator)、HspT (Heat shock protein Terminator)、35sT (CaMV35S Terminator)等が挙げられる。
【００７０】
本発明のポリヌクレオチドは、一態様において、本発明のポリペプチドのコード配列の上流に、T-DNA領域の左境界領域（LB: left border）を、該コード配列の下流にT-DNA領域の右境界領域（RB: right border）を有していることが好ましい。
【００７１】
本発明のポリヌクレオチドは、上記以外の他の配列を、或いは上記の配列に加えて更に他の配列を含むものであってもよい。他の配列としては、特に制限されず、サブクローニング用ベクターや発現ベクターが含み得る公知の配列を各種採用することができる。このような配列の一例としては、例えば複製起点、薬剤耐性遺伝子等が挙げられる。薬剤耐性遺伝子としては、例えばクロラムフェニコール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、ホスフィノトリシン耐性遺伝子、クロルスルフロン耐性遺伝子、メトトレキサート耐性遺伝子、イミダゾリノン耐性遺伝子、グリホサート耐性遺伝子等が挙げられる。
【００７２】
本発明のポリヌクレオチドはベクターの形態であってもよい。ベクターの種類としては、特に制限されず、例えばバイナリーベクター）、タバコモザイクウイルス、キュウリモザイクウイルス、アフリカキャッサバモザイクウイルス、リンゴ小球形潜在ウイルス、オオムギ斑葉モザイクウイルス、Bean pod mottle virus、Beet curly top virus、Brome mosaic virus、Cabbage leaf curl virus、Cotton leaf crumple virus、シンビジュームモザイクウイルス、ブドウAウイルス、Pea early browning virus、Poplar mosaic virus、ジャガイモXウイルス、Rice tungro bacilliform virus、サテライトタバコモザイクウイルス、Tobacco curly shoot virus、タバコ茎えそウイルス等の植物ウイルスベクター）、サブクローニング用ベクター等が挙げられる。
【００７３】
本発明のポリヌクレオチドは、公知の遺伝子工学的手法に従って容易に作製することができる。例えば、PCR、制限酵素切断、DNA連結技術、in vitro転写技術等を利用して作製することができる。
【００７４】
4．形質転換体
本発明は、その一態様において、本発明のポリヌクレオチドを含む、形質転換体（本明細書において、「本発明の形質転換体」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
【００７５】
本発明の形質転換体は、本発明のポリヌクレオチドを、全細胞又は少なくとも一部の細胞のゲノム外及び／又はゲノム内に含む限りにおいて、特に制限されない。
【００７６】
本発明の形質転換体の宿主としては、例えば植物細胞、植物体、植物体の一部（例えばリーフディスク等）、大腸菌などの原核細胞、動物細胞、動物等が挙げられる。後述の本発明のスクリーニング方法にそのまま使用し得るという観点から、宿主としては、好ましくは植物細胞、植物体、植物体の一部が挙げられる。
【００７７】
本発明の形質転換体は、全細胞又は少なくとも一部の細胞において、本発明のポリペプチドを発現していることが好ましい。この態様において、本発明の形質転換体の宿主は、植物細胞、植物体、又は植物体の一部であることが好ましい。この好ましい態様の形質転換体であれば、そのまま、後述の本発明のスクリーニング方法において使用することができる。この態様においては、よりハイスループットのスクリーニングを可能ならしめるという観点から、宿主は、植物細胞又は植物体の一部（好ましくはリーフディスク）であることが好ましい。
【００７８】
本発明の形質転換体は、宿主に、本発明のポリヌクレオチドを導入することにより作製することができる。導入方法は、特に制限されず、導入対象に応じて、適宜選択することができる。導入方法としては、例えばリーフディスク法、フローラル・ディップ法、フローラル・スプレー法等のアグロバクテリウム法）、パーティクル・ガン法）、ウイルス媒介性核酸送達）、エレクトロポレーション法等が挙げられる。これらの中でも、簡便性や安全性等の観点から、好ましくはアグロバクテリウム法が挙げられる。
【００７９】
5．検出方法
本発明は、その一態様において、本発明のポリペプチドを発現する形質転換植物体若しくはその一部又は植物細胞のFRETシグナルを指標とする、植物病害応答性MAPK活性の検出方法（本明細書において、「本発明の検出方法」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
【００８０】
本発明のポリペプチドを発現する形質転換植物体若しくはその一部又は植物細胞については、上述の「4．形質転換体」で説明したとおりである。ここで用いる植物種については、特に制限されない。病害応答性MAPKカスケードは植物種間でよく保存されているので、MAPKシグナル受容ドメイン（3）の由来植物種以外の植物種を用いても、検出可能である。植物としては、例えば、例えばコケ植物、シダ植物、裸子植物、被子植物のモクレン類、単子葉類、真正双子葉類（バラ類I、バラ類II、キク類I、キク類II及びそれらの外群）を含む広い範囲の植物を挙げることができる。植物のより具体的な例としては、トマト、ピーマン、トウガラシ、ナス、タバコ等のナス類；  キュウリ、カボチャ、メロン、スイカ等のウリ類；  キャベツ、ブロッコリー、ハクサイ等の菜類；  セルリー、パセリー、レタス等の生菜・香辛菜類；  ネギ、タマネギ、ニンニク等のネギ類；  ダイズ、ラッカセイ、インゲン、エンドウ、アズキ等の豆類；  イチゴ、メロン等のその他果菜類；  ダイコン、カブ、ニンジン、ゴボウ等の直根類；  サトイモ、キャッサバ、ジャガイモ、バレイショ、サツマイモ、ナガイモ等のイモ類；  イネ、トウモロコシ、コムギ、ソルガム、オオムギ、ライムギ、ミナトカモジグサ、ソバ等の穀類；  ダイズ、アズキ、リョクトウ、ササゲ、インゲンマメ、ラッカセイ、エンドウ、ソラマメ等のマメ類；  アスパラガス、ホウレンソウ、ミツバ等の柔菜類；  トルコギキョウ、ストック、カーネーション、キク等の花卉類；  ベントグラス、コウライシバ等の芝類；  ナタネ、ラッカセイ、セイヨウアブラナ、ナンヨウアブラギリ等の油料作物類；  ワタ、イグサ等の繊維料作物類；  クローバー、デントコーン、タルウマゴヤシ等の飼料作物類；  リンゴ、ナシ、ブドウ、モモ等の落葉性果樹類；  ウンシュウミカン、オレンジ、レモン、グレープフルーツ等の柑橘類；  サツキ、ツツジ、スギ、ポプラ、パラゴムノキ等の木本類等が挙げられる。
【００８１】
本発明の検出方法においては、FRETシグナルが検出された場合、植物病害応答性MAPK活性が検出されたといえる。
【００８２】
本発明の検出方法の好ましい一態様において、被検物質の存在下におけるFRETシグナル強度を指標とすることにより、被検物質のFRETシグナルへの影響を評価することもできる。
【００８３】
被検物質としては、天然に存在する化合物又は人工に作られた化合物を問わず広く使用することができる。また、精製された化合物に限らず、多種の化合物を混合した組成物や、動植物の抽出液も使用することができる。化合物には、低分子化合物に限らず、タンパク質、核酸、多糖類等の高分子化合物も包含される。また、被検物質として病原菌の構成分子によって誘導される免疫（PTI：Pattern-Triggered- Immunity）又は病原菌が宿主に分泌するある種のタンパク質によって誘導される免疫（ETI：Effector-Triggered- Immunity）、或いはこれらに加えてさらに別の被検物質を用いることにより、PTIへの影響や、ETIへの影響を評価することも可能である。
【００８４】
「被検物質の存在下」とは、本発明のポリペプチドを発現する形質転換植物体若しくはその一部又は植物細胞に被検物質が接触できる状態である限り特に制限されない。被検物質を接触させる態様は、特に制限されず、対象の種類に応じて適宜設定することができる。例えば、対象が植物体やその一部である場合、接触の態様としては、例えば散布、滴下、塗布、環境中（例えば土壌中、水中、固形培地中、液体培地中等）への混合や溶解等が挙げられる。また、対象が植物細胞である場合、接触の態様としては、例えば培地への添加等が挙げられる。
【００８５】
被検物質の接触時間は、被検物質が植物病害応答性MAPK調節作用を有する場合に、該被検物質が植物病害応答性MAPKを調節できる程度の時間である限り、特に制限されない。該接触時間は、例えば1秒〜72時間程度である。
【００８６】
FRETシグナル強度の測定は、公知の方法に従って又は準じて行うことができる。例えば、本発明のポリペプチド中のドナー蛍光ドメインの励起波長光を照射した際に検出されるアクセプター蛍光ドメインの蛍光波長光の強度を測定することによって、行われる。
【００８７】
本発明の検出方法によって、非破壊組織を用いて、時空間的に細胞・組織レベルで、病害応答性MAPK活性を評価することができる。
【００８８】
6．スクリーニング方法
本発明は、その一態様において、本発明のポリペプチドを発現する形質転換植物体若しくはその一部又は植物細胞の、被検物質の存在下におけるFRETシグナル強度を指標とする、植物病害応答性MAPK調節物質のスクリーニング方法（本明細書において、「本発明のスクリーニング方法」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
【００８９】
本発明のポリペプチドを発現する形質転換植物体若しくはその一部又は植物細胞については、上述の「4．形質転換体」及び「5．検出方法」で説明したとおりである。
【００９０】
被検物質については、「5．検出方法」で説明したとおりである。
【００９１】
「被検物質の存在下」については、「5．検出方法」で説明したとおりである。
【００９２】
被検物質の接触時間については、「5．検出方法」で説明したとおりである。
【００９３】
FRETシグナル強度の測定については、「5．検出方法」で説明したとおりである。
【００９４】
本発明のスクリーニング方法は、より具体的な一態様（態様1）においては、被検物質の存在下におけるFRETシグナル強度（以下、「被検シグナル強度」と示すこともある。）を、被検物質の非存在下におけるFRETシグナル強度（以下、「対照シグナル強度」）と比較した結果、両者に差があった場合（例えば、両者の差が1.1倍、1.3倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍の場合）に、被検物質を植物病害応答性MAPK調節物質として選択することにより行うことができる。
【００９５】
本発明のスクリーニング方法は、より具体的な一態様（態様2）においては、被検シグナル強度を対照シグナル強度と比較した結果、被検シグナル強度が対照シグナル強度よりも高い場合（例えば、被検シグナル強度が対照シグナル強度の1.1倍、1.3倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍の場合）に、被検物質を植物病害応答性MAPK活性化物質として選択することにより行うことができる。この場合、該活性化物質を、プラントアクチベーター又はその候補物質として選択することもできる。
【００９６】
本発明のスクリーニング方法は、より具体的な一態様（態様3）においては、被検シグナル強度を対照シグナル強度と比較した結果、被検シグナル強度が対照シグナル強度よりも低い場合（例えば、対照シグナル強度が被検シグナル強度の1.1倍、1.3倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍の場合）に、被検物質を植物病害応答性MAPK抑制物質として選択することにより行うことができる。
【００９７】
本発明のスクリーニング方法の上記態様1〜3は、より具体的には、下記工程（a）、工程（b）、並びに工程（c）を含む：
（a）本発明のポリペプチドを発現する形質転換体と被検物質とを接触させる工程、
（b）被検物質を接触させた前記形質転換体における被検FRETシグナル強度を測定し、該被検FRETシグナル強度と、被検物質を接触させない前記形質転換体における対照FRETシグナル強度と比較する工程、並びに
（c）下記工程（c1）、工程（c2）、及び工程（c3）からなる群より選択される少なくとも一種の工程；
（c1）被検シグナル強度と対照シグナル強度との間に差がある場合に、被検物質を植物病害応答性MAPK調節物質として選択する工程、
（c2）被検シグナル強度が対照シグナル強度よりも高い場合に、被検物質を植物病害応答性MAPK活性化物質（一例として、プラントアクチベーター又はその候補物質）として選択する工程、及び
（c3）被検シグナル強度が対照シグナル強度よりも低い場合に、被検物質を植物病害応答性MAPK抑制物質として選択する工程。
【実施例】
【００９８】
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００９９】
材料と方法
以下の各試験例で行った各実験の材料及び方法は、特に制約しない限り、以下に示す方法で行った。
【０１００】
材料と方法1.  供試植物の栽培
タバコ属植物として日本たばこ産業株式会社から分譲された Nicotiana benthamiana (ベンサミアナタバコ) を用いた。乾熱滅菌した土太郎 (スミリン農産工業株式会社) とバーミキュライトを2:1で混ぜた混合土を8割ほど入れ、その上にソイルミックス (サカタのタネ) を重層したポリエチレンポットに播種し、25℃の恒温室において24時間の明条件下で生育させた。
【０１０１】
材料と方法2.  アグロバクテリウムを介した一過的発現
アグロバクテリウムを介した一過的発現は、下記に示す点以外、定法に従って行った。
【０１０２】
MAPKセンサー、およびタバコMAPKキナーゼの1種であり、SIPK、NTF4、及びWIPKをリン酸化して活性化させるMEK2の変異体の共発現は、pEAQ-M2ベクターのマルチクローニングサイトに、NheIで消化したMAPKセンサーを挿入したプラスミドを保持するアグロバクテリウムを用いた。pEAQ-M2ベクターは、pEAQ-HTベクター (Sainsbury et al., 2009, Plant Biotechnol. J. 7: 682-693) のマルチクローニングサイトを変更し、35Sp: p19配列を35SpΩ: MEK2に置換することで作製した。
【０１０３】
H2B-mRFPの発現は、以下のように行った。シロイヌナズナCol-0のゲノムDNAを鋳型とし、PCRによりAtH2Bを増幅し、クローニングした。AtH2Bの5’側および3’側には、PCRによりPstIおよびBamHIサイトを付加した。ClaI/XbaIで消化したpGreen0229ベクターに、マルチクローニングサイト(ClaI/PstI/BamHI-XbaI) およびリンカー (GAGAGA) をコードする配列を付加したmRFP (monomeric RFP) (Campbell et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 7877-7882.) を挿入した。pGreen0229-35Sp:mRFPをPstI/BamHIで消化し、AtH2Bを挿入した。得られたpGreen0229-35Sp: AtH2B-mRFPを形質転換したアグロバクテリウムを用いた。
【０１０４】
GFP-SIPKWTの発現には、pGWB452ベクター (Nakagawa et al., 2009, Plant Biotech. 26: 275-284.) にGFP-SIPKWTを挿入したプラスミドを保持するアグロバクテリウムを用いた (Ishihama et al., 2011, Plant Cell 23: 1153-1170)。MAPKおよびMEK2の野生型または変異体、WRKY8の発現には、pEL2ΩベクターにFLAG-SIPKWT、FLAG-SIPKCA、FLAG-WIPKCA、FLAG-NTF6CA、FLAG-MEK2KR、FLAG-MEK2DDおよびWRKY8-HA-StrepIIを挿入したプラスミドを保持するアグロバクテリウムを用いた (Ishihama et al., 2011, Plant Cell 23: 1153-1170)。
【０１０５】
材料と方法3.  ベンサミアナタバコの形質転換
ベンサミアナタバコ種子を70% エタノール中に1分間浸した後、種子消毒溶液 [1% 次亜塩素酸ナトリウム、0.02% Triton-X 100] に10分間浸した。その後、滅菌水で3回洗浄し、ベンサミアナタバコ用育成寒天培地 [1 x Murashige and Skoog Basal Medium (Sigma), pH 5.8、3% スクロース、0.8% BactoTMAgar (BD)] 上に播種した。25℃の人工気象器内で2週間静置し、本葉が3-4枚展開するまで育成した。
【０１０６】
アグロバクテリウムを介したベンサミアナタバコの形質転換は、以下のように行った。pBINplus-Rpi-blb2コンストラクト (Oliva et al., 2015, Mol. Plant-Microbe Interact. 28: 901-912.) を保有するアグロバクテリウム (LBA4404菌株) を50 μg/mLリファンピシン、50 μg/mLカナマイシンを含むLB培地中で、OD600= 0.8になるまで28℃で振とう培養した。その後、1 mLの培養液を10 mLの浸潤用溶液 [1 x Murashige and Skoog Basal Medium (Sigma), pH 5.8、3% スクロース] と混合した。培地上で育成したベンサミアナタバコ葉の葉片 (0.5 cm x 0.5 cm) を混合液に5分間浸し、ろ紙を用いて混合液を除去後、0.1 μg/mL 1-Naphthaleneacetic acidおよび0.5 μg/mL 6-Benzylaminopurineを含むベンサミアナタバコ用育成寒天培地上に移した。25℃の暗所で3-4日間静置することで、アグロバクテリウムを葉片に感染させた。その後、ベンサミアナタバコ用選抜培地 [1x Murashige and Skoog Basal Medium (Sigma), pH 5.8、3% スクロース、0.8% BactoTMAgar (BD)、0.1 μg/mL 1-Naphthaleneacetic acid、0.5 μg/mL 6-Benzylaminopurine、100 μg/mL カナマイシン、500 μg/mL カルベニシリン、300 μg/mL クラフォラン] に移し、23℃の人工気象器内でカルス化を誘導した。カルスから再分化した植物体は、カルスを含まないよう切り離し、新しいベンサミアナタバコ用選抜培地に移すことで発根を促した。十分に発根した植物体は、培養土に移植して育成した。
【０１０７】
材料と方法4.  ベンサミアナタバコ葉からの全タンパク質抽出
ベンサミアナタバコ葉からの全タンパク質の抽出は以下のように行った。約0.5 mgのベンサミアナタバコ葉を粉砕器 [Shake Master (Bio Medical Science)] で粉砕し、1 mLのタンパク質抽出緩衝液 [20 mM HEPES-NaOH, pH 7.5、10 mM KCl、10 mM MgCl2、10% glycerol、1% Triton X-100、40 mM β-glycerophosphate、10 mM NaF、1 mM Na3VO4、5 mM DTT、Protease inhibitor cocktail for plant cell tissue extracts (Sigma-Aldrich)] に懸濁した。懸濁液を4℃で10分間静置した後、4 M NaClを終濃度が420 mMになるように加え、4℃で1時間ゆっくりと振とうした。この懸濁液を、超音波ホモジナーザー [VCX130 (SONICS)] を用いた超音波処理により均一化した後、遠心分離した (20,000 x g、4℃、10分間)。得られた上清を全タンパク質画分とした。
【０１０８】
材料と方法5.  StrepIIタグ融合タンパク質のアフィニティー精製
各全タンパク質画分サンプルのタンパク質濃度を一定に調整した後、600 μLの全タンパク質画分溶液に対し1 mLの希釈緩衝液 [20 mM HEPES-NaOH, pH 7.5、5 mM DTT、10% glycerol、25 μg/mL avidin、1% Triton X-100] を加えて攪拌した。得られた溶液に、洗浄緩衝液 [20 mM HEPES-NaOH, pH 7.5、150 mM NaCl、5 mM DTT、10% glycerol、1% Triton X-100] で平衡化した40 μLのStrep-Tactin磁気ビーズ (MagStrep “type 2” Beads, IBA) を加え、4℃で一晩振とうした。Strep-Tactin磁気ビーズは磁気スタンドを用いて捕集し、上清を廃棄した後、1 mL の洗浄緩衝液により3回洗浄した。得られたStrep-Tactin磁気ビーズに2 x SDS-PAGE試料緩衝液を添加して攪拌することで、精製されたタンパク質を溶出した。
【０１０９】
材料と方法6.  SDS-PAGE
SDS-PAGEは、定法に従って行った。試料を等量の2 x SDS試料緩衝液 [1 x SDS試料緩衝液）、50 mM Tris-HCl, pH 6.8、2% SDS、10% glycerol、20 mM DTT、0.002% BPB] と混合し、5分間煮沸した後氷冷し、ポリアクリルアミドゲル (厚さ1 mm) を用いて電気泳動を行った。泳動後、CBB染色液 [0.25% CBB G-250、45% methanol、9% acetic acid] でゲル中のタンパク質を染色し、脱色液 [45% methanol、9% 酢酸] で脱色した後、染色されたバンドを検出した。
【０１１０】
材料と方法7.  ウエスタンブロット解析
ウエスタンブロット解析は、定法に従って行った。SDS-PAGE後のゲル、濾紙およびニトロセルロース膜 (PROTRAN、Whatman) をそれぞれ転写用緩衝液 [0.1 M Tris-HCl, pH 7.5、0.192 M glycine、0.1% SDS、20% methanol] に浸した後、セミドライブロッター (ATTO) のステージ上に設置し、2 mA/cm2の定電流で60分間通電することにより、ゲル中のタンパク質をニトロセルロース膜に転写した。このニトロセルロース膜を1 x ブロックエース溶液 (雪印) 中で4℃一晩振とうし、ブロッキングを行った。この膜をTBS-T [0.1 M Tris-HCl, pH 7.5、0.15 M NaCl、0.1% Tween20] 中で5分間の洗浄を3回行った後、一次抗体を含むTBS-T中で1時間振とうした。再び膜をTBS-T中で洗浄した後、二次抗体を含むTBS-T中で30分間振とうした。膜をTBS-T中で洗浄後、Super Signal West Dura Substrate (PIERCE) に浸漬し、Light-Capture (ATTO) を用いてシグナルの検出を行った。WRKY8のSer79、Ser86のリン酸化は、Ishihamaら (2011) が精製 (Plant Cell 23: 1153-1170)したanti-pSer79 antibody (CIPPGLS[PO3H2]PTELL)、anti-pSer86 antibody (CTELLDS[PO3H2]PLLLS) を用いて検出した。その他の使用した1次抗体を以下に示す。
【０１１１】
・anti-FLAG antibody (clone M2）、Sigma-Aldrich)
・anti-pMAPK antibody (Phospho-p44/42 MAPK Erk1/2 Thr202/Tyr204 XP Rabbit mAb #4370）、Cell Signaling Technology)
・anti-GFP antibody (Mouse anti-GFP）、Life technologies)。
【０１１２】
WRKY8のSer62、Ser67、Ser98のリン酸化は、Ishihamaら (2014) の方法 (Methods Mol. Biol. 1171: 171-181.) に準じて精製したanti-pSer62 antibody、anti-pSer67 antibody、anti-pSer98 antibodyを用いて検出した。精製手法を以下に示す。
【０１１３】
抗リン酸化ペプチド抗体の作製はBioGate Co., Ltdに依頼した。リン酸化した62、67、98番目のセリン残基を含むWRKY8のペプチド[pSer62 (CKSLPPPSLPLS[PO3H2]PPPF)、pSer67 (CKSLPPPSLPLSPPPFS[PO3H2]PSSY) あるいはpSer98 (ILPS[PO3H2]PTTGTFPAQAFNWK)] を合成し、キャリアタンパク質に結合させてウサギを免疫した。
【０１１４】
得られた抗血清より、抗リン酸化ペプチド抗体をそれぞれの添付のプロトコールに従い、以下の方法で精製した。1 mgの各リン酸化ペプチドをHitrap NHS-activated column (GE Healthcare) の担体に結合させ、それぞれのリン酸化ペプチドに結合するIgGをアフィニティー精製した。溶出された画分に対して、さらに、それぞれの非リン酸化ペプチド [Ser62 (CKSLPPPSLPLSPPPF)、Ser67 (CKSLPPPSLPLSPPPFSPSSY) あるいはSer98 (ILPSPTTGTFPAQAFNWK)] を結合させたCellufine FORMYL (Chisso Co., Ltd) を用いて吸収作業を行い、非リン酸化部位を認識するIgGを除いた。非吸着画分を回収し、Microcon YM-30を用いて濃縮したものを抗リン酸化ペプチド抗体として実験に使用した。
【０１１５】
材料と方法8.  FRET効率の評価
約0.5 mgのベンサミアナタバコ葉を粉砕器 [Shake Master (Bio Medical Science)] で粉砕し、0.4 mLの蛍光タンパク質抽出緩衝液 [20 mM Tris-HCl, pH 7.5、100 mM NaCl、1 mM EDTA、40 mM β-glycerophosphate、10 mM NaF、1 mM Na3VO4、1 mM DTT、1% Protease inhibitor cocktail for plant cell tissue extracts (Sigma-Aldrich)] に懸濁した。懸濁液を遠心分離し (20,000 x g、4℃、5分間)、0.1 mLの上清を96穴プレート (Thermo) に加え、マルチプレートリーダー (CFP: 430 nm excitation/485 nm emission、FRET: 430 nm excitation/540 nm emission) (Mithras LB 941, Berthold) を用いて蛍光強度を測定した。
【０１１６】
材料と方法9.  顕微鏡観察
MAPKセンサーの局在解析は、共焦点レーザー走査型顕微鏡 FV1000-D IX-81 (Olympus) を用いて行った。Multi argon laserによる440 nm、515 nm波長のレーザーを、それぞれmCerulean、mVenus、葉緑体の励起に用いた。得られた画像は、FV10-ASWソフトウェアを用いて解析した。
【０１１７】
GFP-SIPKのlive imagingおよびFRETのratio imagingは、蛍光正立顕微鏡 KT-Zeiss AxioImagerM1 (Zeiss)、ペルチェ冷却型CCDカメラ AxioCam MRm (Zeiss)、水銀ランプ HBO 100 (Osram) を用いて行った。Excitation/emissionフィルターとして、Filter set 38、43、46、47、48 (Zeiss) を、それぞれGFP、mRFP、mVenus、mCerulean、FRETの可視化に用いた。得られた画像は、AxioVision 4.8ソフトウェアを用いて解析した。FRET ratioは、Youvan ら (1997) の方法に従って計算した。
【０１１８】
試験例1．植物病害応答性MAPKのバイオセンサーのデザイン
植物病害応答性MAPKのバイオセンサーとして、
（領域A）アクセプター蛍光ドメイン、
（領域B）リン酸化セリン結合性WWドメイン、
（領域C）リンカー、
（領域D）植物病害応答性MAPK応答性WRKY型転写因子の、病害応答性MAPK結合Dドメイン及びリン酸化対象SPクラスターを含む領域からなる、MAPKシグナル受容ドメイン、及び
（領域E）ドナー蛍光ドメイン
が、N末端側から領域AからEへと配置されてなるポリペプチドをデザインした。
【０１１９】
このバイオセンサー（以下、単に「MAPKセンサー」と示すこともある）の一例の構造及び機能メカニズムを表す模式図を、図１に示す。図１に示されるように、このバイオセンサーは、植物病害応答性MAPKの活性化シグナルにより、SPクラスターの特定のセリン残基がリン酸化され、このリン酸化セリンにWWドメインが結合することにより、アクセプター蛍光ドメインとドナー蛍光ドメインが近接してFRETが起こるように、デザインされている。
【０１２０】
試験例2．（領域D）MAPKシグナル受容ドメインの最適化1
SIPKの活性を特異的にモニターするためには、SIPKの基質特異性をセンサーに反映する必要がある。In vitroにおいて、WRKY8には、SIPKによりリン酸化されるSP配列が5つ存在することが推定されている (Ishihama et al., 2011, Plant Cell 23: 1153-1170)。In vivoにおいて、どのSP配列がSIPKにより最も強くリン酸化されるか調べるため、病害応答性MAPK (SIPK、WIPK、NTF6) の恒常活性型変異体 (MAPKCA) とWRKY8をベンサミアナタバコ葉に共発現させ、抗リン酸化WRKY8抗体を用いたウエスタンブロット解析により、5つのSP配列のリン酸化を検出した。SIPKおよびWIPKの上流キナーゼのMEK2の不活性型変異体 (MEK2KR) および恒常活性型変異体 (MEK2DD) も、それぞれ負および正の対照区として同様に供試した。
【０１２１】
解析の操作は、具体的には次のようにして行った。N. benthamianaの葉において、WRKY8-HA-StrepII をFLAG-tagged MEK2、SIPK、WIPK、又はNTF6 変異体と共に、アグロフィルトレーション法により共発現させた。アグロフィルトレーションから36時間後に全タンパク質を調製した。Strep-Tactin精製後、anti-HA又はanti-pWRKY8 抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った。Anti-FLAG抗体はFLAG-tagged MEK2、SIPK、WIPK、又はNTF6 変異体の検出のために用いた。タンパク質ロードはMem Code染色によりモニターした。
【０１２２】
結果を図２に示す。他のMAPKと比較して、WRKY8のSer79およびSer86が、SIPKCA発現によって特異的にリン酸化されることが示唆された。
【０１２３】
試験例3．（領域D）MAPKシグナル受容ドメインの最適化2
WRKY8のSer79およびSer86をモニターするMAPKセンサーを構築し、MEK2変異体の発現に伴うリン酸化をウエスタンブロット解析により検出した。使用したMAPKセンサーの各領域（領域A〜E）の配列情報及び配列番号を表１及び表２に示す。領域EのC末端側には、核外移行シグナル (NES）、LALKLAGLDIN：配列番号30) (Wen et al., 1995, Cell 82: 463-473.) を付加した。
【０１２４】
解析の操作は、具体的には次のようにして行った。MAPKセンサー及びMEK2変異体をアグロフィルトレーション法により共発現させた。アグロフィルトレーションから48時間後の葉から、全タンパク質を抽出し、anti-pSer79、anti-pSer86及びanti-GFP抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った。タンパク質ロードはCBB染色によりモニターした。
【０１２５】
【表１】
2018143119.tif 000002
【０１２６】
【表２】
2018143119.tif 000003
【０１２７】
結果を図３に示す。生体内でMAPKセンサーのリン酸化を評価する場合、pSer86の方がより特異的なシグナルとして検出できることがわかった。
【０１２８】
試験例4．（領域D）MAPKシグナル受容ドメインの最適化3
MAPKセンサーとMEK2変異体をアグロフィルトレーション法により共発現させ、アグロフィルトレーションから48時間後に葉から全タンパク質を抽出し、FRET強度比［＝（MEK2の恒常活性型変異体 (MEK2DD)共発現時のFRET/CFP）／（MEK2の不活性型変異体 (MEK2KR) 共発現時のFRET/CFP）］を求めた。使用したMAPKセンサーの領域Dの配列情報及び配列番号を表３に示す。領域D以外は、試験例3と同じである。
【０１２９】
【表３】
2018143119.tif 000004
【０１３０】
結果を図４に示す。86-16センサーが最も高いFRET強度比を示すことが分かった。
【０１３１】
また、同時に、抗GFP抗体（MAPKセンサーの検出用）および抗リン酸化抗体を用いたウエスタンブロット解析により、植物細胞内におけるセンサータンパク質の蓄積量・リン酸化状態も併せて解析した。その結果、いずれのセンサーを用いた場合も、MEK2KRおよびMEK2DD発現区においてMAPKセンサーが同程度蓄積しており、MEK2DD発現に応答して強くリン酸化されていた（図５）。
【０１３２】
試験例5．（領域D）MAPKシグナル受容ドメインの最適化4
86-16センサーに用いたWRKY8の断片長で、他のセリン残基のリン酸化をモニターするMAPKセンサーを作製した (62-16、67-16、79-16、98-16)。また、野生型のWRKY8断片を用いたWT-16センサー、5つのSP配列のセリン残基を全てアラニン置換した5A-16センサーも作製した。これらのMAPKセンサーの領域Dの配列情報及び配列番号を表４に示す。領域D以外は、試験例3と同じである。これらのMAPKセンサーを用いて、試験例4と同様にしてFRET強度比を求めた。
【０１３３】
【表４】
2018143119.tif 000005
【０１３４】
結果を図６に示す。WT-16センサー及び86-16センサーについては、FRET強度比が一定水準以上であり、実用性があることが示唆された。
【０１３５】
また、同時に、それぞれのセリン残基のリン酸化をウエスタンブロットにより検出し、特異的リン酸化を定量した（図７Ａ）。その結果、86-16センサーにおけるSer86が他のセンサーと比べて強くリン酸化されることがわかった（図７Ｂ）。さらに、PI (phosphatase inhibitor) を除いた緩衝液を用いて86-16センサーを抽出した場合、FRET強度比ならびに特異的リン酸化の程度が低下した（図７ＡＢ）。この結果は、86-16センサーのSer86が、脱リン酸化酵素による脱リン酸化の影響を受けることを示しており、リン酸化・脱リン酸化反応に依存してセンサー構造が可逆的に変化するものと期待される。
【０１３６】
試験例6．（領域A, E）蛍光ドメインの最適化
反復配列が1つの分子内に存在すると、RNAi装置に依存したde novoなDNAのメチル化が起こる例が知られており (Chan, et al., 2004, Science 303: 1336.)、2つの蛍光タンパク質をコードするMAPKセンサーは、特定細胞では抑制される可能性がある。そこで、より確実により多種類の細胞でMAPKセンサーを発現させるべく、mVenusのコドンを変え、さらに2週の蛍光ドメインの配向を調整すべく、mCerulean配列に円順列変異を施した。これらのMAPKセンサーの領域A及びEの配列情報及び配列番号を表５及び６に示す。これらのMAPKセンサーを用いて、試験例4と同様にしてFRET強度比を求めた。
【０１３７】
【表５】
2018143119.tif 000006
【０１３８】
【表６】
2018143119.tif 000007
【０１３９】
結果を図８に示す。原因は不明であるが、コドン変異を施した86-16ccセンサーでは、FRET効率が低下していた。86-16ccセンサーに円順列変異を施すと、CP1変異によってFRET強度比が顕著に上昇した。
【０１４０】
これらセンサーのリン酸化をウエスタンブロットにより検出すると、MEK2DD発現区において、それぞれのセンサーは強くリン酸化されていた（図９）。さらに、アグロフィルトレーションから48時間後の葉を蛍光共焦点顕微鏡で観察してこれらセンサーの細胞内局在を調べると、86-16ccおよびCP2-CP5センサーは、NES付加によりサイトゾルへ蓄積している様子が観察されたが、86-16cc CP1センサーは、サイトゾルとは異なる局在パターンを示した（図１０）。この結果から、CP1変異が86-16ccセンサーの局在に影響を与える可能性が考えられた。
【０１４１】
試験例7．（領域C）リンカーの最適化
リンカーの配列、長さを変更したMAPKセンサーを作製し、試験例6と同様にしてFRET強度比を求めた。使用したMAPKセンサーの領域Cの配列情報及び配列番号を表７に示す。領域C以外は試験例6と同じである。
【０１４２】
【表７】
2018143119.tif 000008
【０１４３】
結果を図１１に示す。86-16ccセンサーに (SAGG)12リンカーを挿入した場合、FRET効率が顕著に増加した。
【０１４４】
また、ウエスタンブロットにより、MAPKセンサーのリン酸化を検出したところ、SAGGの繰り返し数を増やすとMEK2KR発現区におけるリン酸化のバックグラウンドが低下していた（図１２）。
【０１４５】
以上の結果から、(SAGG)15リンカーを有する86-16ccセンサーを、MAPKセンサーとして以降の解析に用いた。
【０１４６】
試験例8．各種移行シグナルの付加によるMAPKセンサーの局在変化
本発明者の検討により、免疫応答におけるSIPKの細胞内動態を観察した結果、SIPKはサイトゾル、及び核において活性を保持する可能性が分かった。サイトゾル、及び核でのSIPK活性を可視化するため、(SAGG)15リンカーを有する86-16ccセンサーに各種移行シグナル (NES、NLS) を付加することで、3種類の局在の異なるMAPKセンサーを作製した。MAPKセンサーとH2B-mRFPをアグロフィルトレーション法により共発現させ、アグロフィルトレーションから4時間後に共焦点レーザー顕微鏡下でMAPKセンサーの局在を観察した。
【０１４７】
結果を図１３に示す。NESを付加したセンサーはサイトゾルに、NLSを付加したセンサーは核にに局在する様子が観察された
試験例9．バイオセンサーによるPTI-MAPK活性のライブイメージング
植物には、病原菌の構成分子によって誘導される免疫（PTI：Pattern-Triggered- Immunity）又は病原菌が宿主に分泌するある種のタンパク質によって誘導される免疫（ETI：Effector-Triggered- Immunity）の2種類の免疫システムが存在する。本試験例では、MAPKセンサーがPTIを検出できるか否かを調べた。
【０１４８】
病害応答性MAPKは、flg22（細菌の鞭毛タンパクの一部であり、植物のレセプターであるFLS2 (flagellin-sensing 2) によって認識され、免疫応答（PTI）を誘導する。）を含む、種々のPAMPs（pathogen-associated molecular patterns：病原体関連分子パターン、各種病原菌の構成成分の総称）に応答し、処理後5〜15分程度で活性化するなど、迅速かつ一過的な活性化パターンを示すことが報告されている。ベンサミアナタバコ葉を、ジャガイモ疫病菌が生産するタンパク質PAMPsであるINF1で処理した場合、SIPKは処理後30分以内に活性化し、処理9時間後でもSIPK活性が認められるようである。試験例8で作製した3種類のMAPKセンサーを、アグロバクテリウムを介してベンサミアナタバコ葉に導入し、flg22およびINF1で処理した際のSIPKの活性を、5分おきに30分間MAPKセンサーのratio imagingにより可視化した。水処理対照区においては、処理直後に、サイトゾルおよび核局在型MAPKセンサーのFRETによる蛍光が弱く観察されたが、迅速に低下した（図１４）。一方、flg22およびINF1処理後には、約10〜15分後をピークとして強いFRETによる蛍光が認められた（図１４）。葉緑体に局在させたMAPKセンサーは、いずれの処理区においても応答性を示さなかった（図１４）。以上の結果は、flg22およびINF1処理後初期に、SIPKがサイトゾルおよび核で活性化することを示している。
【０１４９】
試験例10．バイオセンサーによるETI-MAPK活性のライブイメージング
本試験例では、MAPKセンサーがETIを検出できるか否かを調べた。
【０１５０】
MAPKは、ETI反応において持続的に活性化することが知られている。ETIにおけるSIPK活性を可視化するため、サイトゾルおよび核局在型のMAPKセンサーを一過的に導入したベンサミアナタバコ葉に、R3a/AVR3aを共発現させた。ジャガイモの細胞内受容体であるR3aがジャガイモ疫病菌のエフェクターであるAVR3aを認識すると、細胞死を伴う免疫応答（ETI）が誘導される。アグロバクテリウム接種2日後に観察したところ、対照区であるR3a発現区では、FRETによる蛍光はほとんど観察されなかった（図１５）。一方で、R3a/AVR3a共発現区では、FRETによる強い蛍光が観察された（図１５）。以上の結果は、R3a/AVR3aに依存したETIにおいて、SIPKがサイトゾルおよび核で強く活性化することを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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