(57)【要約】【課題】高濃度の持続型ｈＧＨ結合体の安定性を向上させて、経済的で安定した液剤を提供すること。【解決手段】本発明は、ヒト成長ホルモン(Human Growth Hormone, hGH)と免疫グロブリンＦｃ領域が結合された薬理学的有効量の持続型ヒト成長ホルモン(ｈＧＨ)結合体と、アルブミン非含有安定化剤とを含み、前記安定化剤は、緩衝液、糖アルコール、非イオン性界面活性剤及び等張化剤としての塩化ナトリウムを含有する、持続型ヒト成長ホルモン結合体の高濃度液剤、並びに前記液剤の作製方法に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト成長ホルモン(Human Growth Hormone, hGH)が免疫グロブリンＦｃ領域に結合された薬理学的有効量の持続型ヒト成長ホルモン(ｈＧＨ)結合体と、アルブミン非含有安定化剤とを含み、
前記安定化剤が、緩衝液、非イオン性界面活性剤、糖アルコール及び等張化剤としての塩化ナトリウムを含有する、持続型ヒト成長ホルモン結合体の高濃度液剤。
【請求項２】
前記緩衝液が酢酸緩衝液である請求項１に記載の液剤。
【請求項３】
前記持続型ヒト成長ホルモン(ｈＧＨ)結合体の濃度が２０ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬである請求項１に記載の液剤。
【請求項４】
前記糖アルコールがマンニトール、ソルビトール及びそれらの組み合わせからなる群から選択される請求項１に記載の液剤。
【請求項５】
前記糖アルコールの濃度が製剤の総体積の１％(ｗ／ｖ)〜１０％(ｗ／ｖ)である請求項４に記載の液剤。
【請求項６】
前記緩衝液のｐＨの範囲が５．０〜６．０である請求項１に記載の液剤。
【請求項７】
前記塩化ナトリウムの濃度が５ｍＭ〜２００ｍＭである請求項１に記載の液剤。
【請求項８】
前記非イオン性界面活性剤がポリソルベート８０である請求項１に記載の液剤。
【請求項９】
前記非イオン性界面活性剤の濃度が製剤の総体積の０．００１％(ｗ／ｖ)〜０．０５％(ｗ／ｖ)である請求項８に記載の液剤。
【請求項１０】
前記安定化剤が、糖類、多価アルコール及びアミノ酸からなる群から選択される少なくとも１つの成分をさらに含有する請求項１に記載の液剤。
【請求項１１】
前記液剤が保存剤を含有する請求項１に記載の液剤。
【請求項１２】
前記保存剤がベンジルアルコール又はｍ−クレゾールである請求項１１に記載の液剤。
【請求項１３】
前記保存剤の濃度が１ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬである請求項１２に記載の液剤。
【請求項１４】
前記ヒト成長ホルモン(ｈＧＨ)が、天然ｈＧＨと同じアミノ酸配列を有する請求項１に記載の液剤。
【請求項１５】
前記免疫グロブリンＦｃ領域が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭに由来するＦｃ領域である請求項１に記載の液剤。
【請求項１６】
前記免疫グロブリンＦｃ領域のそれぞれのドメインが、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭからなる群から選択される免疫グロブリンに由来する異なる起源を有するドメインのハイブリッドである請求項１５に記載の液剤。
【請求項１７】
前記免疫グロブリンＦｃ領域が、同じ起源のドメインからなる単鎖免疫グロブリンで構成された二量体又は多量体である請求項１５に記載の液剤。
【請求項１８】
前記免疫グロブリンＦｃ領域がＩｇＧ４ Ｆｃ領域である請求項１５に記載の液剤。
【請求項１９】
前記免疫グロブリンＦｃ領域がヒト非グリコシル化ＩｇＧ４ Ｆｃ領域である請求項１８に記載の液剤。
【請求項２０】
前記持続型ヒト成長ホルモン結合体が、ヒト成長ホルモンが非ペプチド性重合体により免疫グロブリンＦｃ領域に連結された形態、又は遺伝子組換え技術を用いて連結された形態の結合体である請求項１に記載の液剤。
【請求項２１】
前記非ペプチド性重合体が、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、ポリ乳酸(ＰＬＡ)、ポリ乳酸−グリコール酸(ＰＬＧＡ)などの生分解性高分子、脂質重合体、キチン類、ヒアルロン酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択される請求項２０に記載の液剤。
【請求項２２】
前記非ペプチド性重合体がポリエチレングリコールである請求項２１に記載の液剤。
【請求項２３】
ヒト成長ホルモンがポリエチレングリコールにより免疫グロブリン断片に結合された持続型ヒト成長ホルモン(ｈＧＨ)結合体と、アルブミン非含有安定化剤とを含み、
前記安定化剤が、酢酸緩衝液、マンニトール、ポリソルベート８０及び塩化ナトリウムを含む、持続型ヒト成長ホルモン結合体の高濃度液剤。
【請求項２４】
前記液剤が保存剤をさらに含む請求項２３に記載の液剤。
【請求項２５】
持続型ヒト成長ホルモン結合体を緩衝液、糖アルコール、非イオン性界面活性剤及び等張化剤としての塩化ナトリウムを含む安定化剤と混合する工程を含む、請求項１〜２２のいずれかの持続型ヒト成長ホルモン結合体の高濃度液剤の作製方法。
【請求項２６】
前記方法が、保存剤を持続型ヒト成長ホルモン結合体及び安定化剤とさらに混合する請求項２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト成長ホルモン(Human Growth Hormone, hGH)が免疫グロブリンＦｃ領域に結合された薬理学的有効量の持続型ヒト成長ホルモン結合体と、アルブミン非含有安定化剤とを含み、前記安定化剤は、緩衝液、糖アルコール、非イオン性界面活性剤及び等張化剤としての塩化ナトリウムを含有する持続型ヒト成長ホルモン結合体の高濃度液剤、並びに前記液剤の作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト成長ホルモン(Human Growth Hormone, , hGH、以下「ｈＧＨ」という)とは、ヒトの脳下垂体で生成される１９１個のアミノ酸で構成された分子量約２２，０００Ｄａのポリペプチドホルモンである。ヒト成長ホルモンは、主に小児の下垂体性小人症の治療に用いられている。従来は、ヒトの脳下垂体から抽出したｈＧＨが用いられていたが、その量が限られていた。よって、治療を受けることのできる人数が極めて限られていた。また、脳下垂体から抽出したｈＧＨを用いた患者の一部で致命的な神経系疾患である｛さんぱつせい｝クロイツフェルト・ヤコブ病が発生した例が報告されたため、このような脳下垂体から抽出したｈＧＨの使用は中断された。近年、遺伝工学技術の発展に伴い、大腸菌、酵母などからｈＧＨの生産に成功した。このような遺伝子工学で生産された組換えｈＧＨ製剤は、毒性及び臨床試験を経て、１９８５年以降に数か国で許可を得て市販されている。
【０００３】
ｈＧＨなどのポリペプチドは、一般に安定性が低いので変性しやすい。また、血液内のタンパク質加水分解酵素により分解され、腎臓や肝臓で容易に除去される。よって、薬理成分としてポリペプチドを含むタンパク質性薬物の血中濃度及び力価を維持するためには、タンパク質医薬品を患者に頻繁に投与する必要がある。しかし、ほとんどのタンパク質医薬品は注射剤で患者に投与されるので、活性ポリペプチドの血中濃度を維持するための頻繁な注射は患者に苦痛をもたらす。これらの問題を解決するために、タンパク質医薬品の血中安定性を向上させ、血中薬物濃度を長期間高く持続することにより、薬物の治療効果を最大化する努力が続けられてきた。このようなタンパク質医薬品の持続性製剤を開発するために、当業者は前記製剤が患者に免疫反応を起こさず、タンパク質医薬品の安定性を向上させると共に、薬物自体の力価を十分に高く維持する必要があることを確認しなければならない。
【０００４】
タンパク質を安定化させてプロテアーゼ接触及び腎臓損失を抑制する方法として、従来はポリエチレングリコール(PEG)などの溶解度の高い高分子をタンパク質医薬品の表面に化学的に付加する方法が用いられてきた。ＰＥＧは、標的タンパク質の特定部位又は様々な部位に非特異的に結合してタンパク質の溶解度を向上させることにより、タンパク質を安定化させる。また、ＰＥＧは、タンパク質の加水分解の防止にも効果的であり、特に副作用を起こさない。しかし、ＰＥＧを結合させると、タンパク質の安定性は向上させることができるが、生理活性タンパク質の力価が著しく低下し、ＰＥＧの分子量が増加するにつれてタンパク質との反応性が低下し、収率が減少する。
【０００５】
生理活性タンパク質の生体内安定性を向上させる他の方法として、遺伝子組換えにより血中安定性の高いタンパク質遺伝子と生理活性タンパク質遺伝子を連結し、その後前記組換え遺伝子で形質転換された動物細胞などを培養して融合タンパク質を生産する方法が開発されている。例えば、タンパク質の安定性向上に効果が高いことが知られているアルブミン又はその断片を遺伝子組換えにより標的とする生理活性タンパク質に結合させて融合タンパク質を生産することができる(特許文献１、２及び３)。
【０００６】
また、免疫グロブリンを用いる方法として、特許文献４は、架橋剤を用いてヒト成長ホルモンにウシ血清アルブミン(BSA)又はマウスの免疫グロブリンを結合させることにより、変形していない成長ホルモンに比べて成長ホルモンの活性が向上することを開示している。しかし、上記特許においては、架橋剤としてカルボジイミドやグルタルアルデヒドなどの低分子量の化学物質のみを開示している。このような低分子量の架橋剤を用いると、非特異的結合により均質な組成物を得ることは困難であり、生体内毒性を有するという問題がある。また、上記特許においては、単に化学的結合による成長ホルモン活性の向上についてのみ開示しており、他の種類のポリペプチド薬物の活性に対する化学的結合の影響については記載しておらず、持続時間や血中半減期の延長などのタンパク質の安定性との関連については全く認識すらしていない。
【０００７】
近年、タンパク質活性減少の最小化とタンパク質安定性の向上を同時に実現できる持続性タンパク質性薬物として、免疫グロブリンＦｃ領域、非ペプチド性重合体及び生理活性ポリペプチドを結合させて製造した結合体が特許文献５(生体内持続性が向上した生理活性ポリペプチド結合体)及び特許文献６(免疫グロブリン断片を用いたタンパク質複合体及びその製造方法)に開示されている。上記方法により生理活性ポリペプチドとしてｈＧＨを用いて持続型ｈＧＨ結合体を作製することができるが、持続型ｈＧＨ結合体が含まれる薬物を製品として供給するためには、貯蔵輸送過程において光、熱又は添加剤内の不純物により生じた劣化による変性、凝集、吸着、又は加水分解などの物理化学的な変化を抑制することにより、ｈＧＨの生体内の効力を維持することが必須である。ｈＧＨポリペプチドに比べて持続型ｈＧＨ結合体は体積が大きくなり、分子量が増加するので、結合体の安定化は非常に困難である。
【０００８】
製薬産業において、液状でのタンパク質の安定性の低さが問題であった。よって、タンパク質を凍結乾燥する方法によりこのような安定性の問題を解決しようとする試みがあった。もっとも、凍結乾燥されたタンパク質製剤は長期間安定性を維持するという利点を有するが、注射時に溶解補助剤で再構成しなければならないという不便さが伴う。また、溶解補助剤で再構成するとき、若しくは凍結乾燥過程中に重合体などの生成により多少活性が消失し、凍結乾燥過程にコスト及び時間がかかるという問題がある。よって、このような問題を解決するために、特許文献７及び８は、安定した液状ｈＧＨ製剤を開発し、それを開示している。安定した液状ｈＧＨ製剤を開発するためには、脱アミド化、重合体形の成及び酸化過程による分解産物の生成速度調節など、ｈＧＨの分解様相を調節することが重要である。液剤の温度、ｐＨ、添加剤などが分解産物の生成速度に影響を及ぼすが、全てのタンパク質を安定化させて臨床に適用できるようにする組成は現在まで知られていない。また、特定のタンパク質で安定化効果を示す液状製剤は、他のタンパク質の安定化には適用できないことが多い。これらのことから、上記文献は、ｈＧＨタンパク質の液状での安定性を向上させるために、タンパク質の特異分解産物の生成速度を最小限に抑えることのできる因子及び添加剤の選定、並びにそれらの組み合わせを広範囲に行うべきであることを開示している。
【０００９】
また、異なるタンパク質は、それらの化学的差異により、貯蔵中に異なる比率及び異なる条件下で徐々に不活性化することがある。すなわち、安定化のために用いられる物質による貯蔵期間延長効果は他のタンパク質に対して同等でない。よって、貯蔵安定性を付与するために用いられる安定化剤は、標的タンパク質の物理化学的特性に応じて好適な比率、濃度及び種類が異なる。しかし、他の安定化剤を同時に使用すると、互いの競争作用及び副作用により、目的と異なる逆効果をもたらすことがある。また、貯蔵中に貯蔵タンパク質の性質や濃度が変化するので、異なる効果を示すことがある。よって、溶液中のタンパク質を安定化するためには、多くの努力と注意を要する。
【００１０】
特に、生体内持続性及び安定性を向上させた持続型ｈＧＨ結合体の場合、生理活性ペプチドであるヒト成長ホルモンと免疫グロブリンＦｃ領域が結合された形態であるので、分子量及び体積が一般的なヒト成長ホルモンと明確に異なるため、タンパク質を安定化するための特別な組成が求められる。また、生理活性ペプチドであるヒト成長ホルモンと免疫グロブリンＦｃ領域はそれぞれ物理化学的特性が異なるので、生理活性ペプチドであるヒト成長ホルモンと免疫グロブリンＦｃ領域を同時に安定化しなければならない。しかし、前述したように、異なるペプチド又はタンパク質は、それらの物理化学的性質の違いにより、貯蔵中に異なる比率及び異なる条件下で徐々に不活性化することがある。また、それぞれのペプチド又はタンパク質に好適な安定化剤を併用すると、互いの競争作用及び副作用により、目的と異なる逆効果をもたらすことがある。また、貯蔵中に貯蔵タンパク質の性質や濃度が変化するので、異なる効果を示すことがある。よって、持続型ｈＧＨ結合体の場合、生理活性ペプチドであるヒト成長ホルモンと免疫グロブリンＦｃ領域を同時に安定化できる安定化剤の組成の探索に多くの困難が伴う。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第９３／０１５１９９号
【特許文献２】国際公開第９３／０１５２００号
【特許文献３】欧州特許出願公開第０４１３６２２号明細書
【特許文献４】米国特許第５０４５３１２号明細書
【特許文献５】韓国登録特許第１０−０５６７９０２号公報
【特許文献６】韓国登録特許第１０−０７２５３１５号公報
【特許文献７】国際公開第９３／０１９７７６号
【特許文献８】国際公開第９４／００３１９８号
【特許文献９】国際公開第９７／０３４６３１号
【特許文献１０】国際公開第９６／０３２４７８号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York,1979
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
持続型ヒト成長ホルモン結合体の高濃度液剤をウイルス汚染の恐れなく長期間保管できるように、安定性を向上させてタンパク質沈殿を減少させる組成の探索に鋭意努力した結果、本発明者らは、緩衝液、糖アルコール、等張化剤としての塩化ナトリウム及び非イオン性界面活性剤を含む安定化剤を用いると、高濃度の持続型ｈＧＨ結合体の安定性を向上させることができ、それにより経済的で安定した液剤を提供できることを明らかにした。また、保存剤をさらに含んでも高濃度の持続型ｈＧＨ結合体を安定して保存できることを確認し、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、生理活性ペプチドであるヒト成長ホルモン(Human Growth Hormone, hGH)と免疫グロブリンＦｃ領域が結合された薬理学的有効量の持続型ヒト成長ホルモン(ｈＧＨ)結合体と、アルブミン非含有安定化剤とを含み、前記安定化剤は、緩衝液、非イオン性界面活性剤、糖アルコール及び等張化剤としての塩化ナトリウムを含有する持続型ヒト成長ホルモン結合体の高濃度液剤を提供することを目的とする。
【００１５】
また、本発明は、前記持続型ヒト成長ホルモン結合体の高濃度液剤の製造方法を提供することを目的とする。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の持続型ｈＧＨ結合体の高濃度液剤は、緩衝液、糖アルコール、等張化剤としての塩化ナトリウム及び非イオン性界面活性剤を含有する安定化剤を含み、ヒト血清アルブミン及び人体に潜在的に有害な因子を含まない。よって、ウイルス感染の恐れがない。また、ｈＧＨポリペプチドと免疫グロブリンＦｃ領域の結合により形成されるので、天然のものに比べて分子量が大きく、生理活性持続期間が延長された持続型ｈＧＨ結合体に対して優れた安定性を付与することができる。また、前記液剤は、保存剤を含んでも安定しているので、多回投与用製剤として用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ５．６)、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、５％マンニトール、及び０．００５％ポリソルベート８０を含有する持続型ｈＧＨ結合体液剤の各濃度における加速安定性試験の結果であり、試料の安定性をＩＥ−ＨＰＬＣで分析したグラフである。低濃度の持続型ｈＧＨ結合体液剤と、高濃度の持続型ｈＧＨ結合体液剤とが同程度の安定性を維持することが分かる。
【図２】２０ｍＭ酢酸ナトリウム(ｐＨ５．６)、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、５％マンニトール、及び０．００５％ポリソルベート８０を含有する持続型ｈＧＨ結合体液剤に９ｍｇ／ｍＬのベンジルアルコール又は３ｍｇ／ｍＬのｍ−クレゾールをさらに含有させた高濃度の持続型ｈＧＨ結合体液剤の濃度に応じた加速安定性試験結果であり、試料の安定性をＩＥ−ＨＰＬＣで分析したグラフである。保存剤としてベンジルアルコール又はｍ−クレゾールを含有する高濃度の持続型ｈＧＨ結合体液剤と、保存剤を含まない高濃度の持続型ｈＧＨ結合体液剤(対照群)とが同程度の安定性を維持することが分かる。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の一実施態様は、生理活性ペプチドであるヒト成長ホルモン(hGH)と免疫グロブリンＦｃ領域が結合された薬理学的有効量の持続型ヒト成長ホルモン(ｈＧＨ)結合体と、アルブミン非含有安定化剤とを含み、前記安定化剤は、緩衝液、非イオン性界面活性剤、糖アルコール及び等張化剤としての塩化ナトリウムを含有する、持続型ヒト成長ホルモン結合体の高濃度液剤を提供する。
【００１９】
本発明の持続型ｈＧＨ結合体の高濃度液剤は、アルブミン非含有安定化剤を含むので、持続型ｈＧＨ結合体に安定性を確保することができ、ウイルス感染の恐れがない。また、簡単な剤形で優れた保存安定性を示すので、他の安定化剤や凍結乾燥製剤に比べて経済的に提供することができる製剤である。さらに、本発明の液剤は、野生型タンパク質に比べて生理活性持続期間が延長された持続型ｈＧＨ結合体を含むので、通常のｈＧＨ製剤に比べて人体内でタンパク質活性を長期間維持することから効率的な薬物製剤として用いることができ、高濃度の持続型ｈＧＨ結合体に対しても優れた安定性を確保することができるという特徴を有する。
【００２０】
本発明において使用される用語「持続型ヒト成長ホルモン(human growth hormone, hGH)結合体」とは、生理活性ペプチドであるヒト成長ホルモンと免疫グロブリンＦｃ領域が連結された形態のタンパク質であり、天然ヒト成長ホルモンに比べて生理活性持続期間が延長されたことを特徴とする結合体を意味する。本発明において使用される用語「持続型」とは、生理活性持続期間が野性型ｈＧＨに比べて延長されたことを意味する。 本発明において使用される用語「結合体」とは、ヒト成長ホルモンと免疫グロブリンＦｃ領域が結合された形態を意味する。
【００２１】
本発明において使用される用語「ヒト成長ホルモン(human growth hormone, hGH)」とは、ヒトの成長、細胞繁殖及び再生を促進するペプチドホルモンを意味する。前記ｈＧＨの配列などの情報は、ＮＣＢＩのジェンバンク(ＧｅｎＢａｎｋ)などの公知のデータベースから得ることができる。ｈＧＨの活性を示すものであれば、野性型ヒト成長ホルモンの配列と７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するタンパク質も本発明の範囲に含まれる。また、生物学的活性に大きく影響を及ぼさない範囲でのアミノ酸の置換、除去、挿入による変異体も本発明の範囲に含まれる。
【００２２】
本発明に有用なｈＧＨは、野性型ｈＧＨ、その変異体、その誘導体又はそれらの断片の配列であってもよい。
【００２３】
本発明において使用される用語「ｈＧＨ変異体」とは、野性型ｈＧＨとアミノ酸配列が少なくとも１つ異なるペプチドであり、ｈＧＨの活性を示すものを意味する。前記ｈＧＨ変異体は、野戦型ｈＧＨから一部のアミノ酸の置換、追加、除去及び修飾のいずれかの方法又はそれらの方法の組み合わせにより作製することができる。
【００２４】
本発明において使用される用語「ｈＧＨ誘導体」とは、野性型ｈＧＨに比べて少なくとも８０％のアミノ酸配列で相同性を示し、ｈＧＨの活性を示し、アミノ酸残基の一部が化学的に置換(例えば、α‐メチル化、 α-ヒドロキシル化)、除去(例えば、脱アミノ化)又は修飾(例えば、Ｎ− メチル化)されたペプチドを意味する。
【００２５】
本発明において使用される用語「ｈＧＨ断片」とは、ｈＧＨのＮ末端又はＣ末端に少なくとも１つのアミノ酸が追加又は除去された形態であり、ｈＧＨの活性を有するペプチドを意味し、追加されるアミノ酸は天然に存在しないアミノ酸(例えば、Ｄ型アミノ酸)であってもよい。
【００２６】
また、本発明に用いられるｈＧＨは、天然或いは組換えタンパク質から得ることができ、大腸菌を宿主細胞として用いて作製した組換えｈＧＨであることが好ましいが、これに限定されるものではない。
【００２７】
本発明において使用される用語「免疫グロブリンＦｃ領域」とは、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖の可変領域、重鎖定常領域１(ＣＨ1)及び軽鎖定常領域(ＣＬ1)を除いたものであり、免疫グロブリンの一部分を意味する。前記免疫グロブリンＦｃ領域は、重鎖定常領域２(ＣＨ2)及び重鎖定常領域３(ＣＨ3)部分であってもく、前記重鎖定常領域にヒンジ部分を含んでもよいが、これらに限定されるものではない。また、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、天然のものと実質的に同等であるか又は向上した効果を有するものであれば、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖の可変領域を除き、一部又は全部の重鎖定常領域１(ＣＨ1)及び／又は軽鎖定常領域１(ＣＬ1)を含む拡張されたＦｃ領域であってもよい。また、ＣＨ2及び／又はＣＨ3に相当する非常に長い一部のアミノ酸配列が除去された領域であってもよい。すなわち、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、１)ＣＨ1ドメイン、ＣＨ2ドメイン、ＣＨ3ドメイン及びＣＨ4ドメイン、２)ＣＨ1ドメイン及びＣＨ2ドメイン、３)ＣＨ1ドメイン及びＣＨ3ドメイン、４)ＣＨ2ドメイン及びＣＨ3ドメイン、５)少なくとも１つのドメインと免疫グロブリンヒンジ領域(又はヒンジ領域の一部)との組み合わせ、６)重鎖定常領域の各ドメインと軽鎖定常領域の二量体であってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００２８】
また、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域には、天然アミノ酸配列だけでなく、その配列誘導体(変異体)も含まれる。アミノ酸配列誘導体とは、天然アミノ酸配列中の少なくとも１つのアミノ酸残基が欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより異なる配列を有するものを意味する。例えば、ＩｇＧ Ｆｃの場合、結合に重要であることが知られている２１４〜２３８、２９７〜２９９、３１８〜３２２又は３２７〜３３１位のアミノ酸残基が修飾に適した部位として用いられる。
【００２９】
また、ジスルフィド結合を形成する部位が除去された誘導体、天然ＦｃからＮ末端のいくつかのアミノ酸が除去された誘導体、天然ＦｃのＮ末端にメチオニン残基が付加された誘導体など、様々な種類の誘導体が用いられる。また、エフェクター機能をなくすために、補体結合部位、例えばＣ１ｑ結合部位が除去されてもよく、抗体依存性細胞傷害(antibody dependent cell mediated cytotoxicity、ＡＤＣＣ)部位が除去されてもよい。このような免疫グロブリンＦｃ領域の配列誘導体を作製する技術は、特許文献９、１０などに開示されている。
【００３０】
タンパク質の活性を全体的に変化させないタンパク質及びペプチドにおけるアミノ酸交換は、当該分野において公知である(非特許文献１)。最も一般的な交換は、アミノ酸残基Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｈｙ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ間の交換である。場合によっては、リン酸化、硫酸化、アクリル化、グリコシル化、メチル化、ファルネシル化、アセチル化、アミド化などにより修飾されてもよい。前述したＦｃ誘導体は、本発明のＦｃ領域と同じ生物学的活性を示し、Ｆｃ領域の熱、ｐＨなどにおける構造的安定性を向上させた誘導体である。
【００３１】
また、このようなＦｃ領域は、ヒト及びウシ、ヤギ、ブタ、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、モルモットなどの動物の生体内から分離した天然のものから得てもよく、形質転換された動物細胞もしくは微生物から得られた組換え体又はその誘導体であってもよい。ここで、天然の免疫グロブリンからＦｃ領域を得る方法は、全免疫グロブリンをヒト又は動物の生体から分離し、その後タンパク質分解酵素で処理して得ることができる。パパインで処理するとＦａｂ及びＦｃに切断され、ペプシンで処理するとｐＦ’ｃ及びＦ(ａｂ)2に切断される。これらは、サイズ排除クロマトグラフィーなどを用いてＦｃ又はｐ
Ｆ’ｃを分離することができる。ヒト由来のＦｃ領域は、微生物から得られた組換え免疫グロブリンＦｃ領域であることが好ましい。
【００３２】
また、免疫グロブリンＦｃ領域は、天然糖鎖、天然のものに比べて増加した糖鎖、天然のものに比べて減少した糖鎖、又は糖鎖が除去された形態であってもよい。このような免疫グロブリンＦｃ糖鎖の増減又は除去には、化学的方法、酵素学的方法及び微生物を用いた遺伝工学的方法などの通常の方法が用いられる。ここで、Ｆｃから糖鎖が除去された免疫グロブリンＦｃ領域は、補体(ｃ１ｑ)との結合力が著しく低下し、抗体依存性細胞毒性又は補体依存性細胞毒性が低減又は除去されるので、生体内で不要な免疫反応を引き起こさない。このようなことから、糖鎖が除去されるか、非グリコシル化された免疫グロブリンＦｃ領域は、薬物のキャリアとしての本発明の目的に適する。
【００３３】
本発明で使用される用語「糖鎖の除去(Deglycosylation)」とは、酵素で糖を除去したＦｃ領域を意味し、非グリコシル化(Aglycosylation)とは、原核動物、好ましくは大腸菌で生産されてグリコシル化されていないＦｃ領域を意味する。
【００３４】
一方、免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒト起源、又はウシ、ヤギ、ブタ、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、モルモットなどの動物起源であり、ヒト起源であることが好ましい。
【００３５】
また、免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ由来であるか、又はそれらの組み合わせもしくはそれらのハイブリッドによるＦｃ領域であってもよい。ヒト血液に最も豊富なＩｇＧ又はＩｇＭ由来であることが好ましく、リガンド結合タンパク質の半減期を向上させることが知られているＩｇＧ由来であることが最も好ましい。
【００３６】
一方、本発明において使用される用語「組み合わせ」とは、二量体又は多量体を形成する際に、同一起源の単鎖免疫グロブリンＦｃ領域をコードするポリペプチドが異なる起源の単鎖ポリペプチドに結合することを意味する。すなわち、ＩｇＧ Ｆｃ、ＩｇＡ Ｆｃ、ＩｇＭ Ｆｃ、ＩｇＤ Ｆｃ及びＩｇＥ Ｆｃ断片からなる群から選択される少なくとも２つの断片から二量体又は多量体を作製することができる。
【００３７】
本発明において使用される用語「ハイブリッド」とは、単鎖の免疫グロブリンＦｃ領域内に、少なくとも２つの異なる起源の免疫グロブリンＦｃ断片に相当する配列が存在することを意味する。本発明においては、様々な形態のハイブリッドが可能である。すなわち、ＩｇＧ Ｆｃ、ＩｇＭ Ｆｃ、ＩｇＡ Ｆｃ、ＩｇＥ Ｆｃ及びＩｇＤ ＦｃのＣＨ1、ＣＨ2、ＣＨ3及びＣＨ4からなる群から１つ〜４つのドメインのハイブリッドが可能であり、ヒンジ領域を含んでもよい。
【００３８】
一方、ＩｇＧもＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のサブクラスに分けられ、本発明においては、それらの組み合わせ又はそれらのハイブリッド化も可能である。ＩｇＧ２及びＩｇＧ４サブクラスであることが好ましく、補体依存性細胞毒性(Complement dependent cytotoxicity, CDC)などのエフェクター機能のほとんどないＩｇＧ４のＦｃ領域であることが最も好ましい。
【００３９】
すなわち、本発明の結合体として最も好ましい免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ４由来の非グリコシル化されたＦｃ領域である。ヒト由来のＦｃ領域は、ヒト生体において抗原として作用し、それに対する新規な抗体を生成するなどの好ましくない免疫反応を起こす非ヒト由来のＦｃ領域に比べて好ましい。
【００４０】
本発明の持続型ｈＧＨ結合体は、天然又は組換え起源のいずれかの方法で作製されたｈＧＨと、天然ＩｇＧを特定タンパク質分解酵素で処理するか、組換え技術を用いて形質転換細胞から作製した免疫グロブリンＦｃ領域とを互いに結合させることにより作製することができる。
【００４１】
ここで、用いられる結合方法としては、ｈＧＨと免疫グロブリンＦｃ領域を非ペプチド性重合体を用いて交差結合させることもでき、組換え技術を用いてｈＧＨと免疫グロブリンＦｃ領域が連結された形態の融合タンパク質に作製することもできる。すなわち、前記結合体は、ヒト成長ホルモンと免疫グロブリンＦｃが非ペプチド性リンカーにより連結された形態に作製することもでき、ｈＧＨ及び免疫グロブリンＦｃの融合タンパク質の形態に作製することもできる。前記融合タンパク質は、ｈＧＨ及び免疫グロブリンＦｃがペプチド性リンカーにより連結された形態を含むが、これに限定されるものではない。
【００４２】
本発明において使用される用語「非ペプチド性重合体」とは、繰り返し単位が少なくとも２つ結合された生体適合性ポリマーを意味し、前記繰り返し単位はペプチド結合を除く任意の共有結合により互いに連結される。本発明における前記非ペプチド性重合体は、非ペプチド性リンカーと混用される。
【００４３】
交差結合の際に用いられる非ペプチド性重合体は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、ポリ乳酸(ＰＬＡ)、ポリ乳酸−グリコール酸(ＰＬＧＡ)などの生分解性高分子、脂質重合体、キチン類、ヒアルロン酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択され、ポリエチレングリコールであることが好ましいが、これらに限定されるものではない。当該分野に知られたこれらの誘導体や当該分野の技術水準で容易に作製できる誘導体も本発明の範囲に含まれる。
【００４４】
本発明に用いられる持続型ｈＧＨ結合体の作製については、特許文献６などが参考文献として挙げられる。当業者であれば上記文献から本発明に用いられる持続型ｈＧＨ結合体を作製することができるが、これに限定されるものではない。
【００４５】
本発明において使用される用語「持続型ｈＧＨ結合体の高濃度液剤」とは、持続型ｈＧＨ結合体を高濃度で含む液剤を意味する。本発明において、前記持続型ｈＧＨ結合体液剤は、治療学的有効量の持続型ｈＧＨ結合体を含んでもよい。一般にｈＧＨの治療学的有効量は、単回使用バイアル(single-use vial)内に含まれる約１〜３ｍｇの量であるが、これに限定されるものではない。
【００４６】
また、本発明の液剤に含まれる持続型ｈＧＨ結合体の濃度は、１ｍｇ／ｍＬ〜１５０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは１５ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは２０ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬであるが、これらに限定されるものではない。
【００４７】
本発明の前記持続型ヒト成長ホルモン結合体の高濃度液剤は、従来の低濃度液剤に比べてｈＧＨ結合体が単位剤形当たり高濃度で存在するので、安定して生体内にｈＧＨを供給することができ、従来の液剤とは異なり、高濃度のｈＧＨ結合体が沈殿することなく安定して保存できるという利点がある。特に、２０ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬの高濃度ｈＧＨ結合体を含む場合でも安定性を維持できるという効果がある。
【００４８】
このような本発明の持続型ｈＧＨ高濃度液剤は、薬理学的有効量の持続型ｈＧＨ結合体と、アルブミン非含有安定化剤とを含む。
【００４９】
本発明において使用される用語「安定化剤」とは、持続型ｈＧＨ結合体が安定して保存されるようにする物質を意味する。前記安定化剤は、緩衝液、糖アルコール、等張化剤としての塩化ナトリウム及び非イオン性界面活性剤を含有することが好ましい。持続型ｈＧＨ結合体などのタンパク質において、保存安定性は、正確な投与量を保証するためだけでなく、持続型ｈＧＨ結合体に対する抗原性物質の潜在的な生成を抑制するためにも重要である。
【００５０】
本発明において使用される用語「緩衝液」とは、本発明の安定化剤に含まれ、持続型ｈＧＨ結合体の安定のために、溶液の剤形のｐＨが急激に変化しないように溶液のｐＨを維持する役割を果たす溶液を意味する。前記緩衝液は、アルカリ塩(リン酸ナトリウムもしくはリン酸カリウム又はそれらの水素塩もしくは二水素塩)、クエン酸ナトリウム／クエン酸、酢酸ナトリウム／酢酸をはじめとする当業界で公知の任意の他の製薬上許容されるｐＨ緩衝剤を含んでもよく、それらの緩衝剤の混合物も用いることができる。本発明の目的上、前記緩衝液は酢酸緩衝液であることが好ましいが、これに限定されるものではない。酢酸ナトリウム緩衝液を構成する酢酸塩の濃度は、好ましくは５ｍＭ〜１００ｍＭ、より好ましくは１０ｍＭ〜５０ｍＭであるが、これらに限定されるものではない。前記緩衝液のｐＨは、好ましくは４．０〜７．０、より好ましくは５．０〜６．０、さらに好ましくは５．２〜６．０である。本発明の一実施例において、ｐＨ５．６の酢酸ナトリウム緩衝液が様々な濃度の持続型ｈＧＨ結合体の安定に好ましいことが確認された(表５)。
【００５１】
本発明において使用される用語「糖アルコール」とは、本発明の液剤に含まれ、持続型ｈＧＨ結合体の安定性を向上させる役割を果たす水素化炭水化物を意味する。本発明に用いられる糖アルコールの濃度は、溶液全体に対する比率が好ましくは１％〜１０％(ｗ／ｖ)、より好ましくは５％〜１０％(ｗ／ｖ)であるが、これらに限定されるものではない。本発明において、前記糖アルコールは、特にこれらに限定されるものではないが、マンニトール及びソルビトールからなる群から選択される少なくとも１つを用いることができ、マンニトールを用いることが好ましい。
【００５２】
本発明において使用される用語「等張化剤」とは、高濃度の持続型ｈＧＨ結合体を溶液状で体内に投与するとき浸透圧を適切に維持する役割を果たす物質を意味する。また、前記等張化剤は、持続型ｈＧＨ結合体を溶液状でより安定化する付随的な効果も有する。前記等張化剤の代表的な例としては水溶性無機塩が挙げられ、塩化ナトリウムが好ましい。本発明に用いられる塩化ナトリウムの濃度は５ｍＭ〜２００ｍＭであることが好ましいが、これに限定されるものではない。また、製剤に含まれる成分は、種類及び量に応じて各混合物が全て含まれる溶液の剤形が等張液となるように適切な含有量に調節される。
【００５３】
本発明において使用される用語「非イオン性界面活性剤」とは、タンパク質溶液の表面張力を低減し、疎水性表面へのタンパク質の吸着や凝集を防止する物質を意味する。本発明に用いられる非イオン性界面活性剤の好ましい例としては、ポリソルベート系非イオン性界面活性剤及びポロキサマー系非イオン性界面活性剤などが挙げられ、これらを単独で用いてもよく、２つ以上組み合わせて用いてもよく、とりわけポリソルベート系非イオン性界面活性剤がより好ましい。ポリソルベート系非イオン性界面活性剤の例としては、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０及びポリソルベート８０などが挙げられ、とりわけポリソルベート８０が好ましいが、これらに限定されるものではない。
【００５４】
一方、前記非イオン性界面活性剤を液剤に高濃度で用いることは好ましくない。非イオン性界面活性剤が高濃度で存在すると、ＵＶ分光法や等焦点法(IEF)などの分析法によるタンパク質の濃度測定や安定性の評価を行う際に干渉効果を引き起こし、タンパク質の安定性の正確な評価が困難になるからである。よって、本発明の液剤には、前記非イオン性界面活性剤が好ましくは０．１％(ｗ／ｖ)以下の低濃度、より好ましくは０．００１％〜０．１％(ｗ／ｖ)、さらに好ましくは０．００１％〜０．０５％(ｗ／ｖ)の濃度で含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明の一実施例において、酢酸緩衝液、糖アルコール、等張化剤としての塩化ナトリウム及びポリソルベート８０を含有する安定化剤中において、ポリソルベート８０の濃度が０．２％(ｗ／ｖ)である場合、２週間後から持続型ｈＧＨタンパク質の沈殿を引き起こすことが確認された(表８)。
【００５５】
また、本発明の前記安定化剤は、アルブミンを含有しないことが好ましい。
【００５６】
タンパク質の安定化剤として用いられるヒト血清アルブミンは、人体の血液から製造されるので、ヒト由来の病原性ウイルスによる汚染の可能性がある。また、ゼラチンやウシ血清アルブミンは、疾患を引き起こしたり、一部の患者にアレルギー反応を引き起こす可能性がある。本発明のアルブミン非含有安定化剤は、ヒト又は動物由来の血清アルブミンや精製されたゼラチンなどの異種タンパク質を含有しないので、ウイルス感染の恐れがない。
【００５７】
本発明の前記安定化剤は、糖類、多価アルコール又は中性アミノ酸をさらに含むことが好ましい。
【００５８】
持続型ｈＧＨ結合体の保存安定性を向上させるためにさらに含まれる糖類及び多価アルコールのうち、糖類の好ましい例としては、マンノース、グルコース、フルクトース及びキシロースなどの単糖類や、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノース及びデキストランなどの多糖類などが挙げられ、多価アルコールの好ましい例としては、プロピレングリコール、低分子量のポリエチレングリコール、グリセロール、低分子量のポリプロピレングリコールなどが挙げられ、これらを単独で用いてもよく、２つ以上組み合わせて用いてもよい。
【００５９】
また、本発明の液剤には、前述した緩衝液、等張化剤、糖アルコール及び非イオン性界面活性剤以外に、本発明の効果を損なわない範囲で当業界で公知の他の成分又は物質が選択的にさらに含まれてもよい。
【００６０】
特に、本発明の液剤は、保存剤をさらに含んでもよい。
【００６１】
本発明において使用される用語「保存剤」とは、製剤においてバクテリア作用を実質的に減少させる物質を意味する。特に、多回投与用製剤の生産を容易にするために製剤に含まれる化合物である。保存剤の例としては、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム(アルキル基が長鎖化合物である塩化アルキルベンジルジメチルアンモニウムの混合物)、塩化ベンゼトニウムなどが挙げられる。他のタイプの保存剤としては、芳香族アルコール(例えば、フェノール、ブチル、ベンジルアルコール)、アルキルパラベン(例えば、メチル、プロピルパラベン)、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、ｍ−クレゾールなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明の液剤における前記保存剤は、ベンジルアルコール又はｍ−クレゾールが好ましいが、これらに限定されるものではない。本発明の液剤における前記保存剤は、１ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在することが好ましい。
【００６２】
本発明の一実施例において、異なるｐＨ及び緩衝液における免疫グロブリンＦｃ領域の安定性を調べた。ｐＨの場合は、ｐＨ５．６〜６．０で安定し、特にｐＨ５．６で安定性が高いことが確認された(実施例２及び表１)。クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム及びヒスチジン緩衝液のうち、酢酸ナトリウムで特に安定性が高いことが確認された(実施例３及び表２)。これらに基づいて、２０ｍｇ／ｍＬ以上の高濃度の持続型ｈＧＨ結合体と、緩衝液、等張化剤である塩化ナトリウムと、糖アルコールであるマンニトールと、界面活性剤であるポリソルベート８０とを含む液剤を作製した。緩衝液として酢酸ナトリウムを用いると、２週間保管後も沈殿が発生しなかった。また、対照群に比べても安定性が高いことが確認された(実施例４)。また、液剤に含まれる糖アルコール及び界面活性剤の濃度が持続型ｈＧＨ結合体に及ぼす影響を確認した。その結果、結合体は５％〜１０％の濃度のマンニトールで安定し、０．２％(ｗ／ｖ)未満のポリソルベート８０で沈殿を生じないことが確認された(実施例５)。さらに、本発明の液剤への保存剤の添加が、持続型ｈＧＨ結合体の安定性に影響を及ぼすか否かを確認した。その結果、保存剤ベンジルアルコール又はクレゾールを添加する場合も、対照群と類似していたことが立証された。安定性を示した。よって、本発明の液剤は、反復投与が必要な場合は保存剤をさらに含んでもよいことが確認された(実施例６)。
【００６３】
本発明の他の実施態様は、前記持続型ｈＧＨ結合体の高濃度液剤の作製方法を提供する。本発明の作製方法は、持続型ｈＧＨ結合体と、緩衝液、糖アルコール、等張化剤としての塩化ナトリウムと、非イオン性界面活性剤を含有するアルブミン非含有安定化剤とを含む、安定した持続型ｈＧＨ結合体液剤を作製する方法である。
【００６４】
前記持続型ｈＧＨ結合体、液剤、緩衝液、糖アルコール、等張化剤及び非イオン性界面活性剤については前述した通りである。
【００６５】
前記持続型ｈＧＨ結合体の高濃度液剤の作製方法は、持続型ｈＧＨ結合体を緩衝液、糖アルコール、非イオン性界面活性剤及び等張化剤としての塩化ナトリウムを含む安定化剤と混合する工程を含んでもよい。より具体的に、前記方法は、ａ)持続型ｈＧＨ結合体を作製する工程、又は作製された持続型ｈＧＨ結合体を準備する工程と、ｂ)ａ)工程で作製された持続型ｈＧＨ結合体を緩衝液、糖アルコール、非イオン性界面活性剤及び等張化剤としての塩化ナトリウムを含む安定化剤と混合する工程とを含んでもよいが、これに限定されるものではない。
【００６６】
また、上記方法のｂ)工程において、持続型ｈＧＨ結合体と安定化剤の混合時に保存剤をさらに混合してもよいが、これに限定されるものではない。
【００６７】
本発明の方法で作製した液剤が保存剤を含む場合は、多回投与で用いることができる。
【００６８】
本発明の実施例によれば、酢酸ナトリウム緩衝液と、等張化剤としての塩化ナトリウムと、糖アルコールとしてのマンニトールと、界面活性剤としてのポリソルベート８０とを含む安定化剤は、高濃度の持続型ｈＧＨ結合体においても沈殿を生じさせず、安定性を維持することが示された(実施例１〜５)。すなわち、２０．０ｍｇ／ｍＬ以上の持続型ｈＧＨ結合体の高濃度においても沈殿を生じさせず、安定した液剤を作製することができることが確認された。また、前記液剤に保存剤としてベンジルアルコール又はｍ−クレゾールをさらに含む場合も安定性が維持された。よって、反復投与が必要な場合は保存剤をさらに含んでもよいことが確認された(実施例６及び図２)。
【実施例】
【００６９】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。ただし、これらの実施例は本発明を例示するためのものにすぎず、本発明の範囲がこれらに限定されるものではない。
【００７０】
実施例１：持続型ヒト成長ホルモン(ｈＧＨ)結合体の作製
両末端にアルデヒド基を有する分子量３．４ｋＤａのポリエチレングリコールであるＡＬＤ−ＰＥＧ−ＡＬＤ(ＩＤＢ社)をヒト成長ホルモン(ｈＧＨ，分子量２２ｋＤａ)と結合させ、これをヒトＩｇＧ４由来の非グリコシル化されたＦｃ領域(分子量５０ｋＤａ)のＮ末端に結合させた。こうすることにより、本発明の代表的な持続型ヒト成長ホルモン結合体であるｈＧＨ−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体を作製及び精製した。
【００７１】
実施例２：各ｐＨにおける免疫グロブリンＦｃ領域の安定性評価
持続型ｈＧＨ結合体を構成するｈＧＨポリペプチドと免疫グロブリンＦｃ領域の安定性を異なる条件下で評価した。緩衝液、塩化ナトリウム(ＮａＣｌ)、マンニトール、及びポリソルベート８０を含む液剤における異なるｐＨで免疫グロブリンＦｃ領域の安定性を比較した。
【００７２】
下記表１に示す組成をそれぞれ免疫グロブリンＦｃ領域の緩衝液として用いて４０℃で４週間保管し、その後イオン交換クロマトグラフィー法(IE-HPLC)で免疫グロブリンの安定性を分析した。表２にＩＥ−ＨＰＬＣ(％)は初期純度に対する免疫グロブリンＦｃ領域の残存純度を示し、(Ａｒｅａ％／Ｓｔａｒｔ Ａｒｅａ％)％で表示した。
【００７３】
【表１】
2018115166.tif 000003
【００７４】
【表２】
2018115166.tif 000004
※Ｎ／Ａ：凝集による沈殿によりデータ使用不可
【００７５】
上記表２から分かるように、４週間後のｐＨ５．６（♯５)のときに、IE-HPLC(%)が６７．９％を示し、免疫グロブリンＦｃ領域が最も高い安定性を示した。ｐＨ４．８〜５．２(＃１〜＃３)では初期からタンパク沈殿が大量に発生して安定性を評価することができず、ｐＨ５．４(＃４)では３週間後からタンパク沈殿が発生した。
【００７６】
実施例３：各緩衝液における免疫グロブリンの安定性評価
ｈＧＨの市販剤形に基づき、緩衝液として主に用いる酢酸塩、クエン酸塩及びヒスチジンを含む各緩衝液における免疫グロブリンＦｃ領域の安定性を比較した。
【００７７】
下記表３に示す組成をそれぞれ免疫グロブリンＦｃ領域の緩衝液として用いて４０℃で３週間保管し、その後イオン交換クロマトグラフィー法で免疫グロブリンＦｃ領域の安定性を分析した。表４のＩＥ−ＨＰＬＣ(％)は初期純度に対する免疫グロブリンＦｃ領域の残存純度を示し、(Ａｒｅａ％／Ｓｔａｒｔ Ａｒｅａ％) ％で示す。
【００７８】
【表３】
2018115166.tif 000005
【００７９】
【表４】
2018115166.tif 000006
【００８０】
表４に示す結果から分かるように、ｐＨ５．６(＃２)の酢酸ナトリウムを緩衝液として用いた場合、免疫グロブリンＦｃ領域の残存率は８８．９％(１週間)、７７．６％(２週間)及び６８．２％(３週間)であった。
【００８１】
これらの結果から、クエン酸ナトリウム(＃１)及びヒスチジン(＃３)を用いる場合より、酢酸ナトリウム(＃２)を緩衝液として用いる免疫グロブリンのＦｃ領域の安定性が高いことが分かる。
【００８２】
実施例４：タンパク濃度及び緩衝液に応じた持続型ｈＧＨ結合体の安定性評価
実施例３で確認された緩衝液を用いて、高濃度持続型ｈＧＨ結合体の安定性を比較した。下記表５に示す組成をそれぞれ高濃度の持続型ｈＧＨ結合体の液剤として用いて、これを２５℃で４週間保管し、その後イオン交換クロマトグラフィー法とサイズ排除クロマトグラフィー法(SE-HPLC)を用いて安定性評価を行った。
【００８３】
表６のＩＥ−ＨＰＬＣ(％)及びＳＥ−ＨＰＬＣ(％)は分析時点での高濃度の持続型ｈＧＨ結合体の純度を示す。
【００８４】
【表５】
2018115166.tif 000007
【００８５】
【表６】
2018115166.tif 000008
【００８６】
表６に示す結果から分かるように、ｐＨ５．６(＃３，＃６，♯９)の２０ｍＭ酢酸ナトリウムを緩衝液として用いた場合、保管４週間後に高濃度の持続型ｈＧＨ結合体の安定性が、ｐＨ５．６の２０ｍＭクエン酸ナトリウムを緩衝液として用いた場合(♯２，♯５，♯８)に比べて高かった。
【００８７】
また、タンパク濃度が３９．０ｍｇ／ｍＬ〜７８．０ｍｇ／ｍＬと高濃度では、ｐＨ５．２(♯１，♯４，♯７)のクエン酸ナトリウム又はｐＨ５．６(♯２，♯５，♯８)のクエン酸ナトリウムを緩衝液として用いた場合、保管２週間後からタンパク沈殿が発生し、保管３週間後にはタンパク沈殿のレベルが増加した。
【００８８】
実施例５：糖アルコール及び界面活性剤の濃度に応じた高濃度の持続型ｈＧＨ結合体の安定性評価
実施例４で確認された液剤(２０ｍＭ酢酸ナトリウム，ｐＨ５．６，１５０ｍＭ塩化ナトリウム，５％(ｗ／ｖ)マンニトール，０．００５％(ｗ／ｖ)ポリソルベート８０)を用いて、 糖アルコール及び界面活性剤の濃度に応じた高濃度持続型ｈＧＨ結合体の安定性を比較した。ここで、糖アルコール及び界面活性剤の濃度は市販の製剤及び許可機関が提示する最大許容範囲内に選定した。
【００８９】
下記表７に示す組成をそれぞれ高濃度の持続型ｈＧＨ結合体の液剤として用いて２５℃で４週間保管し、その後イオン交換クロマトグラフィー法とサイズ排除クロマトグラフィー法で安定性評価を行った。
【００９０】
表８のＩＥ−ＨＰＬＣ(％)及びＳＥ−ＨＰＬＣ(％)は分析時点での高濃度の持続型ｈＧＨ結合体の純度を示す。
【００９１】
【表７】
2018115166.tif 000009
【００９２】
【表８】
2018115166.tif 000010
【００９３】
表８から分かるように、ｐＨ５．６の２０ｍＭ酢酸ナトリウムをマンニトールとポリソルベート８０と共に用いた場合、対照群−１、対照群−２で高濃度の持続型ｈＧＨ結合体の安定性が最も高かった。また、ポリソルベート８０の濃度が０．２％(ｗ／ｖ)の場合、＃２、＃３、＃５及び＃６実験群において全ての濃度で２週間後からタンパク沈殿が発生した。
【００９４】
実施例６：各保存剤に応じた高濃度の持続型ｈＧＨ結合体製剤の安定性評価
実施例５で確認された液剤(ｐＨ５．６の２０ｍＭ酢酸ナトリウム，１５０ｍＭ塩化ナトリウム，５％(ｗ／ｖ)マンニトール，０．００５％(ｗ／ｖ)ポリソルベート８０)を用いて、各保存剤に応じた高濃度持続型ｈＧＨ結合体の安定性を比較した。ここで、代表的な保存剤としてベンジルアルコールとｍ−クレゾールを用いた。
【００９５】
具体的には、下記表９に示す組成を高濃度の持続型ｈＧＨ結合体の液剤としてそれぞれ用いて、これを２５℃で４週間保管し、その後イオン交換クロマトグラフィー法とサイズ排除クロマトグラフィー法で安定性評価を行った。
【００９６】
表１０のＩＥ−ＨＰＬＣ(％)及びＳＥ−ＨＰＬＣ(％)は初期に対する分析時点での高濃度の持続型ｈＧＨ結合体の純度を示す。
【００９７】
【表９】
2018115166.tif 000011
【００９８】
【表１０】
2018115166.tif 000012
【００９９】
表１０から分かるように、保存剤として９ｍｇ／ｍＬベンジルアルコール又は３ｍｇ／ｍＬ ｍ−クレゾールを用いた場合、対照群と同程度の安定性を示す。
【０１００】
これらの結果は、本発明の高濃度の持続型ｈＧＨ結合体を含む製剤は、保存剤をさらに含んでもｈＧＨの安定性に影響がないことを示唆するものである。よって、保存剤を含む本発明の製剤は、反復投与が可能である。
【０１０１】
以上の説明から、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、前記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明の範囲は、前述の詳細な説明よりは添付の請求項の範囲で定義され、従って、特許請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態を含むものであると解釈すべきである。
【図１】
2018115166.tif 000013
【図２】
2018115166.tif 000014
【手続補正書】
【提出日】平成30年3月23日(2018.3.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト成長ホルモン(Human Growth Hormone, hGH)が免疫グロブリンＦｃ領域に結合された薬理学的有効量の持続型ヒト成長ホルモン(ｈＧＨ)結合体と、アルブミン非含有安定化剤とを含み、
前記安定化剤が、緩衝液、非イオン性界面活性剤、糖アルコール及び等張化剤としての塩化ナトリウムを含有し、
前記持続型ヒト成長ホルモン結合体の濃度が２０ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬである、持続型ヒト成長ホルモン結合体の高濃度液剤。
【請求項２】
前記緩衝液が酢酸緩衝液である請求項１に記載の液剤。
【請求項３】
前記緩衝液のｐＨの範囲が５．６〜６．０である請求項１に記載の液剤。
【請求項４】
前記糖アルコールがマンニトール、ソルビトール及びそれらの組み合わせからなる群から選択される請求項１に記載の液剤。
【請求項５】
前記糖アルコールの濃度が製剤の総体積の１％(ｗ／ｖ)〜１０％(ｗ／ｖ)である請求項４に記載の液剤。
【請求項６】
前記緩衝液のｐＨの範囲が５．０〜６．０である請求項１に記載の液剤。
【請求項７】
前記塩化ナトリウムの濃度が５ｍＭ〜２００ｍＭである請求項１に記載の液剤。
【請求項８】
前記非イオン性界面活性剤がポリソルベート８０である請求項１に記載の液剤。
【請求項９】
前記非イオン性界面活性剤の濃度が製剤の総体積の０．００１％(ｗ／ｖ)〜０．０５％(ｗ／ｖ)である請求項８に記載の液剤。
【請求項１０】
前記安定化剤が、糖類、多価アルコール及びアミノ酸からなる群から選択される少なくとも１つの成分をさらに含有する請求項１に記載の液剤。
【請求項１１】
前記液剤が保存剤を含有する請求項１に記載の液剤。
【請求項１２】
前記保存剤がベンジルアルコール又はｍ−クレゾールである請求項１１に記載の液剤。
【請求項１３】
前記保存剤の濃度が１ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬである請求項１２に記載の液剤。
【請求項１４】
前記ヒト成長ホルモン(ｈＧＨ)が、天然ｈＧＨと同じアミノ酸配列を有する請求項１に記載の液剤。
【請求項１５】
前記免疫グロブリンＦｃ領域が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭに由来するＦｃ領域である請求項１に記載の液剤。
【請求項１６】
前記免疫グロブリンＦｃ領域のそれぞれのドメインが、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭからなる群から選択される免疫グロブリンに由来する異なる起源を有するドメインのハイブリッドである請求項１５に記載の液剤。
【請求項１７】
前記免疫グロブリンＦｃ領域が、同じ起源のドメインからなる単鎖免疫グロブリンで構成された二量体又は多量体である請求項１５に記載の液剤。
【請求項１８】
前記免疫グロブリンＦｃ領域がＩｇＧ４ Ｆｃ領域である請求項１５に記載の液剤。
【請求項１９】
前記免疫グロブリンＦｃ領域がヒト非グリコシル化ＩｇＧ４ Ｆｃ領域である請求項１８に記載の液剤。
【請求項２０】
前記持続型ヒト成長ホルモン結合体が、ヒト成長ホルモンが非ペプチド性重合体により免疫グロブリンＦｃ領域に連結された形態、又は遺伝子組換え技術を用いて連結された形態の結合体である請求項１に記載の液剤。
【請求項２１】
前記非ペプチド性重合体が、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、ポリ乳酸(ＰＬＡ)、ポリ乳酸−グリコール酸(ＰＬＧＡ)、脂質重合体、キチン類、ヒアルロン酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択される生分解性高分子である、請求項２０に記載の液剤。
【請求項２２】
前記非ペプチド性重合体がポリエチレングリコールである請求項２１に記載の液剤。
【請求項２３】
ヒト成長ホルモンがポリエチレングリコールにより免疫グロブリン断片に結合された持続型ヒト成長ホルモン(ｈＧＨ)結合体と、アルブミン非含有安定化剤とを含み、
前記安定化剤が、酢酸緩衝液、マンニトール、ポリソルベート８０及び塩化ナトリウムを含み、
前記持続型ヒト成長ホルモン結合体の濃度が２０ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬである、持続型ヒト成長ホルモン結合体の高濃度液剤。
【請求項２４】
前記液剤が保存剤をさらに含む請求項２３に記載の液剤。
【請求項２５】
持続型ヒト成長ホルモン結合体を緩衝液、糖アルコール、非イオン性界面活性剤及び等張化剤としての塩化ナトリウムを含む安定化剤と混合する工程を含む、請求項１〜２２のいずれかの持続型ヒト成長ホルモン結合体の高濃度液剤の作製方法であって、
前記持続型ヒト成長ホルモン結合体の濃度が２０ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬである、作製方法。
【請求項２６】
前記方法が、保存剤を持続型ヒト成長ホルモン結合体及び安定化剤とさらに混合する請求項２５に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０１】
以上の説明から、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、前記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明の範囲は、前述の詳細な説明よりは添付の請求項の範囲で定義され、従って、特許請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態を含むものであると解釈すべきである。
次に、本発明の好ましい態様を示す。
１．  ヒト成長ホルモン(Human Growth Hormone, hGH)が免疫グロブリンＦｃ領域に結合された薬理学的有効量の持続型ヒト成長ホルモン(ｈＧＨ)結合体と、アルブミン非含有安定化剤とを含み、
前記安定化剤が、緩衝液、非イオン性界面活性剤、糖アルコール及び等張化剤としての塩化ナトリウムを含有する、持続型ヒト成長ホルモン結合体の高濃度液剤。
２．  前記緩衝液が酢酸緩衝液である上記１に記載の液剤。
３．  前記持続型ヒト成長ホルモン(ｈＧＨ)結合体の濃度が２０ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬである上記１に記載の液剤。
４．  前記糖アルコールがマンニトール、ソルビトール及びそれらの組み合わせからなる群から選択される上記１に記載の液剤。
５．  前記糖アルコールの濃度が製剤の総体積の１％(ｗ／ｖ)〜１０％(ｗ／ｖ)である上記４に記載の液剤。
６．  前記緩衝液のｐＨの範囲が５．０〜６．０である上記１に記載の液剤。
７．  前記塩化ナトリウムの濃度が５ｍＭ〜２００ｍＭである上記１に記載の液剤。
８．  前記非イオン性界面活性剤がポリソルベート８０である上記１に記載の液剤。
９．  前記非イオン性界面活性剤の濃度が製剤の総体積の０．００１％(ｗ／ｖ)〜０．０５％(ｗ／ｖ)である上記８に記載の液剤。
１０．  前記安定化剤が、糖類、多価アルコール及びアミノ酸からなる群から選択される少なくとも１つの成分をさらに含有する上記１に記載の液剤。
１１．  前記液剤が保存剤を含有する上記１に記載の液剤。
１２．  前記保存剤がベンジルアルコール又はｍ−クレゾールである上記１１に記載の液剤。
１３．  前記保存剤の濃度が１ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬである上記１２に記載の液剤。
１４．  前記ヒト成長ホルモン(ｈＧＨ)が、天然ｈＧＨと同じアミノ酸配列を有する上記１に記載の液剤。
１５．  前記免疫グロブリンＦｃ領域が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭに由来するＦｃ領域である上記１に記載の液剤。
１６．  前記免疫グロブリンＦｃ領域のそれぞれのドメインが、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭからなる群から選択される免疫グロブリンに由来する異なる起源を有するドメインのハイブリッドである上記１５に記載の液剤。
１７．  前記免疫グロブリンＦｃ領域が、同じ起源のドメインからなる単鎖免疫グロブリンで構成された二量体又は多量体である上記１５に記載の液剤。
１８．  前記免疫グロブリンＦｃ領域がＩｇＧ４ Ｆｃ領域である上記１５に記載の液剤。
１９．  前記免疫グロブリンＦｃ領域がヒト非グリコシル化ＩｇＧ４ Ｆｃ領域である上記１８に記載の液剤。
２０．  前記持続型ヒト成長ホルモン結合体が、ヒト成長ホルモンが非ペプチド性重合体により免疫グロブリンＦｃ領域に連結された形態、又は遺伝子組換え技術を用いて連結された形態の結合体である上記１に記載の液剤。
２１．  前記非ペプチド性重合体が、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、ポリ乳酸(ＰＬＡ)、ポリ乳酸−グリコール酸(ＰＬＧＡ)などの生分解性高分子、脂質重合体、キチン類、ヒアルロン酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択される上記２０に記載の液剤。
２２．  前記非ペプチド性重合体がポリエチレングリコールである上記２１に記載の液剤。
２３．  ヒト成長ホルモンがポリエチレングリコールにより免疫グロブリン断片に結合された持続型ヒト成長ホルモン(ｈＧＨ)結合体と、アルブミン非含有安定化剤とを含み、
前記安定化剤が、酢酸緩衝液、マンニトール、ポリソルベート８０及び塩化ナトリウムを含む、持続型ヒト成長ホルモン結合体の高濃度液剤。
２４．  前記液剤が保存剤をさらに含む上記２３に記載の液剤。
２５．  持続型ヒト成長ホルモン結合体を緩衝液、糖アルコール、非イオン性界面活性剤及び等張化剤としての塩化ナトリウムを含む安定化剤と混合する工程を含む、上記１〜２２のいずれかの持続型ヒト成長ホルモン結合体の高濃度液剤の作製方法。
２６．  前記方法が、保存剤を持続型ヒト成長ホルモン結合体及び安定化剤とさらに混合する上記２５に記載の方法。