(57)【要約】      （修正有）【課題】関連分野において、再プログラム化プロセスを受けている細胞、又は再プログラム化された細胞を自動的に検出することができる方法を提供する。【解決手段】１つ以上の細胞の蛍光顕微鏡画像から、再プログラム化を受けている細胞、及び再プログラム化された細胞を特定するための方法を提供する。当該方法は、画像処理工程、細胞検出工程、及び、必要に応じて、クラスタリング工程を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上の細胞の蛍光顕微鏡画像から、再プログラム化を受けている細胞、及び再プログラム化された細胞を特定するための方法であって、
（ａ）グレースケール変換、及びアンシャープマスキングを、上記蛍光顕微鏡画像に適用し、強調画像を取得する工程と、
（ｂ）上記強調画像を２値画像に変換する工程と、
（ｃ）上記２値画像において、細胞に対して細胞様楕円境界を特定する工程であって、各細胞様楕円境界が、孤立細胞、又は細胞群を示す工程と、
（ｄ）各孤立細胞又は各細胞群をランダムな色で標識化し、着色された複数のコンポーネントを取得する工程であって、各着色コンポーネントが、再プログラム化を受けている１つ以上の細胞、又は再プログラム化された１つ以上の細胞を示す、工程と、を含む、方法。
【請求項２】
上記アンシャープマスキングは、式１に従ったアンシャープマスキングを適用することによって実行され、
【数１】
2018173273.tif 000017
上記fs(x,y)は、上記強調画像であり、x及びyは、上記画像の座標であり、*は、上記画像のコンボリューションを示し、Gσは、標準偏差σ、及びフィルタサイズ2σ+1のガウジアンフィルタである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
フィルタサイズは、上記細胞の直径である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
上記（ｂ）の工程は、式２に従って実行され、
【数２】
2018173273.tif 000018
Tは、上記蛍光顕微鏡画像のための閾値である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
上記閾値は、３である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
（ｅ）上記着色コンポーネントの各ピクセルの滑らかさを、ピクセルの局所領域と比較し、下記（ｅ−１）及び（ｅ−２）：
（ｅ−１）式３に従って、各ピクセルの画像階調度M(x,y)を決定する工程であって、
【数３】
2018173273.tif 000019
【数４】
2018173273.tif 000020
及び
【数５】
2018173273.tif 000021
であり、
Gx及びGyは、それぞれ、ｘ方向及びｙ方向における上記画像階調を示している工程、及び、
（ｅ−２）式４に従って、各ピクセルの上記滑らかさσ(x,y)を決定する工程であって、
【数６】
2018173273.tif 000022
Nは、ピクセルの総数であり、μは、上記局所領域における平均ピクセル値である工程、
によって評価する工程、並びに、
（ｆ）式５の基準を満たす曖昧な領域Ｒの存在を決定する工程、
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【数７】
2018173273.tif 000023
【請求項７】
上記曖昧な領域は、細胞クラスターを示している、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
上記方法は、上記１つ以上の細胞の一連の蛍光顕微鏡画像に対して、工程（ａ）から工程（ｆ）を実行し、上記細胞の再プログラム化の開始を特定することを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
１つ以上の細胞の蛍光顕微鏡画像から、再プログラム化を受けている細胞、及び再プログラム化された細胞を特定するための方法を実行するための、コンピュータが読み取り可能な命令が符号化された、有形のコンピュータ可読記憶媒体であって、
上記方法は、
（ａ）グレースケール変換、及びアンシャープマスキングを、上記蛍光顕微鏡画像に適用し、強調画像を取得する工程と、
（ｂ）上記強調画像を２値画像に変換する工程と、
（ｃ）上記２値画像において、細胞に対して細胞様楕円境界を特定する工程であって、各細胞様楕円境界が、孤立細胞、又は細胞群を示す、工程と、
（ｄ）各孤立細胞又は各細胞群をランダムな色で標識化し、着色された複数のコンポーネントを取得する工程であって、各着色コンポーネントが、再プログラム化を受けている１つ以上の細胞、又は再プログラム化された１つ以上の細胞を示す、工程と、を含む、有形のコンピュータ可読記憶媒体。
【請求項１０】
上記アンシャープマスキングは、式１に従ったアンシャープマスキングを適用することによって実行され、
【数８】
2018173273.tif 000024
上記fs(x,y)は、上記強調画像であり、x及びyは、上記画像の座標であり、*は、上記画像のコンボリューションを示し、Gσは、標準偏差σ、及びフィルタサイズ2σ+1のガウジアンフィルタである、請求項９に記載の有形のコンピュータ可読記憶媒体。
【請求項１１】
フィルタサイズは、上記細胞の直径である、請求項９に記載の有形のコンピュータ可読記憶媒体。
【請求項１２】
上記（ｂ）の工程は、式２に従って実行され、
【数９】
2018173273.tif 000025
Tは、上記蛍光顕微鏡画像のための閾値である、請求項９に記載の有形のコンピュータ可読記憶媒体。
【請求項１３】
上記方法は、
（ｅ）上記着色コンポーネントの各ピクセルの滑らかさを、ピクセルの局所領域と比較し、下記（ｅ−１）及び（ｅ−２）： 
（ｅ−１）式３に従って、各ピクセルの画像階調度M(x,y)を決定する工程であって、
【数１０】
2018173273.tif 000026
【数１１】
2018173273.tif 000027
及び
【数１２】
2018173273.tif 000028
であり、
Gx及びGyは、それぞれ、ｘ方向及びｙ方向における上記画像階調を示している工程、及び、
（ｅ−２）式４に従って、各ピクセルの上記滑らかさσ(x,y)を決定する工程であって、
【数１３】
2018173273.tif 000029
Nは、ピクセルの総数であり、μは、上記局所領域における平均ピクセル値である工程、
によって評価する工程、並びに、
（ｆ）式５の基準を満たす曖昧な領域Ｒの存在を決定する工程、
をさらに含む、請求項９に記載の有形のコンピュータ可読記憶媒体。
【数１４】
2018173273.tif 000030
【請求項１４】
上記曖昧な領域は、細胞クラスターを示している、請求項１３に記載の有形のコンピュータ可読記憶媒体。
【請求項１５】
１つ以上の細胞の蛍光顕微鏡画像から、再プログラム化を受けている細胞、及び再プログラム化された細胞を特定するためのシステムであって、
１つ以上の細胞の蛍光顕微鏡画像を取得するように構成された装置と、
制御ユニットであって、プロセッサ、及び複数の命令を保存するためのメモリを備え、上記複数の命令は、上記プロセッサによって実行された場合、
（ａ）グレースケール変換、及びアンシャープマスキングを、上記蛍光顕微鏡画像に適用し、強調画像を取得する工程と、
（ｂ）上記強調画像を２値画像に変換する工程と、
（ｃ）上記２値画像において、細胞に対して細胞様楕円境界を特定する工程であって、各細胞様楕円境界が、孤立細胞、又は細胞群を示す、工程と、
（ｄ）各孤立細胞又は各細胞群をランダムな色で標識化し、着色された複数のコンポーネントを取得する工程であって、各着色コンポーネントが、再プログラム化を受けている１つ以上の細胞、又は再プログラム化された１つ以上の細胞を示す、工程と、を含む方法を上記プロセッサに実行させる、制御ユニットと、を備えている、システム。
【請求項１６】
上記アンシャープマスキングは、式１に従ったアンシャープマスキングを適用することによって実行され、
【数１５】
2018173273.tif 000031
上記fs(x,y)は、上記強調画像であり、x及びyは、上記画像の座標であり、*は、上記画像のコンボリューションを示し、Gσは、標準偏差σ、及びフィルタサイズ2σ+1のガウジアンフィルタである、請求項１５に記載のシステム。
【請求項１７】
フィルタサイズは、上記細胞の直径である、請求項１５に記載のシステム。
【請求項１８】
上記（ｂ）の工程は、式２に従って実行され、
【数１６】
2018173273.tif 000032
Tは、上記蛍光顕微鏡画像のための閾値である、請求項１５に記載のシステム。
【請求項１９】
上記方法は、
（ｅ）上記着色コンポーネントの各ピクセルの滑らかさを、ピクセルの局所領域と比較し、下記（ｅ−１）及び（ｅ−２）：
（ｅ−１）式３に従って、各ピクセルの画像階調度M(x,y)を決定する工程であって、
【数１７】
2018173273.tif 000033
【数１８】
2018173273.tif 000034
【数１９】
2018173273.tif 000035
であり、
Gx及びGyは、それぞれ、ｘ方向及びｙ方向における上記画像階調を示している工程、及び、
（ｅ−２）式４に従って、各ピクセルの上記滑らかさσ(x,y)を決定する工程であって、
【数２０】
2018173273.tif 000036
Nは、ピクセルの総数であり、μは、上記局所領域における平均ピクセル値である工程、によって評価する工程、並びに、
（ｆ）式５の基準を満たす曖昧な領域Ｒの存在を決定する工程、
をさらに含む、請求項１５に記載のシステム。
【数２１】
2018173273.tif 000037
【請求項２０】
上記曖昧な領域は、細胞クラスターを示している、請求項１５に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、細胞の再プログラム化プロセスの特定に関し、特に、再プログラム化を受けている細胞、及び再プログラム化された細胞を検出するための方法及び装置に関する。
【０００２】
〔発明者又は共同発明者による先行開示に関する陳述〕
本願に記載された本発明の対象の大半は、発明者のYuan-Hsiang Chang、Hideo Yokota、Kuniya Abe及びMing-Dar Tsaiによって、“Detection and Localization of Mouse Induced Pluripotent Stem Cell Formation using Time-Lapse Fluorescence Microscopy Images.”というタイトルの論文において公開された。当該論文は、２０１６年８月１６日から２０１６年８月２０日までに開催されたIEEE Engineering in Medicine and Biology Society (EMBC)の２０１６年第３８回年次国際会議中に開示され、２０１６年１０月１８日にIEEE Xploreによってオンラインで公開された。従って、当該公開又は開示は、本願の出願日前の６か月以内に、本発明の発明主体の全てのメンバーによって行われ、及び／又は、本発明の発明者である全てのメンバーによって行われた。
【背景技術】
【０００３】
人工多能性幹（ｉＰＳ：induced pluripotent stem）細胞は、分化型細胞から産生される多能性細胞である。線維芽細胞などの細胞は、ウイルスベクター、アデノウイルス、プラスミド及び裸のＤＮＡを用いて、特定の転写因子をコードする遺伝子を細胞に導入することによって、多能性状態に誘導される。ｉＰＳ細胞は、同種異系免疫拒絶の潜在的な問題を回避することができるため、患者特有の細胞に基づいた再生医療のための理想的な源を与える。
【０００４】
ｉＰＳ細胞は、ヒトの細胞を含む種々の哺乳類細胞から確立されており、インビトロで分化型細胞へ誘導し、組織や臓器様の構造体を形成することに成功している。現在、ｉＰＳ細胞由来の網膜色素上皮などの臨床調査及び臨床試験が開始されている。ｉＰＳ細胞の実用的な医療用途を促進するために、ｉＰＳ細胞の大規模な増殖と、ｉＰＳ形成中に発生する可能性のある変異を修正するための方法とが、急務である。
【０００５】
しかし、ウイルスベクターを用いた場合、ｉＰＳ細胞を誘導する効率は、一般的に低く、０．００１％から０．１％の範囲である。従って、膨大な数の非ｉＰＳ細胞のうちで、小さいサブセットの細胞のみが、ｉＰＳ細胞になる。よって、再プログラム化を受けている細胞を特定し、追跡することは、厄介な課題である。さらに、今のところ、分化型細胞からｉＰＳ細胞への詳細な“経路図”は、まだ得られていない。
【０００６】
再プログラム化プロセスを追跡する１つのアプローチは、Oct4などの多能性遺伝子のプロモータによって駆動される蛍光レポーター遺伝子を用いることである。次に、経時的蛍光顕微鏡分析が、再ブログラム化細胞の一連の画像をキャプチャするために使用され、これは、再プログラム化プロセスの概要を与える。そうは言うものの、経時的画像の手動による分析は、大きな労力を要し、時間がかかり、多くの場合、不正確である。
【０００７】
上述の点で、関連分野において、再プログラム化プロセスを受けている細胞、又は再プログラム化された細胞を自動的に検出することができる方法を提供する必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００８】
以下で、読者に基本的な理解を提供するために、本開示の簡略化された概要を示す。この概要は、本開示の広範な概要ではなく、それは、本発明の主要な又は重要な要素を特定するものでも、本発明の範囲を規定するものでもない。そのたった１つの目的は、後で示されるより詳細な説明の前置きとして、簡略化された形で本願明細書に開示されるいくつかのコンセプトを提供することである。
【０００９】
一態様において、本開示は、１つ以上の細胞の蛍光顕微鏡画像から、再プログラム化を受けている細胞、及び再プログラム化された細胞を自動的に特定する方法を規定する。いくつかの実施形態では、当該方法は、自動的に、一連の蛍光顕微鏡画像を処理し、上記再プログラム化プロセスの開始、及び上記再プログラム化プロセスが生じる位置を検出する。本開示の一実施形態によれば、
本開示のいくつかの実施形態によれば、当該方法は、以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む。（ａ）グレースケール変換、及びアンシャープマスキングを、上記蛍光顕微鏡画像に適用し、強調画像を取得する工程、（ｂ）上記強調画像を２値画像に変換する工程、（ｃ）上記２値画像において、細胞に対して細胞様楕円境界を特定する工程であって、各細胞様楕円境界が、孤立細胞、又は細胞群を示す工程、並びに（ｄ）各孤立細胞又は各細胞群をランダムな色で標識化し、着色された複数のコンポーネントを取得する工程であって、各着色コンポーネントが、再プログラム化を受けている１つ以上の細胞、又は再プログラム化された１つ以上の細胞を示す、工程。
【００１０】
いくつかの任意の実施形態によると、上記（ａ）の工程における上記アンシャープマスキングは、式１に従ったアンシャープマスキングを適用することによって実行され、
【００１１】
【数１】
2018173273.tif 000002
【００１２】
上記fs(x,y)は、上記強調画像であり、x及びyは、上記画像の座標であり、*は、上記画像のコンボリューションを示し、Gσは、標準偏差σ、及びフィルタサイズ2σ+1のガウジアンフィルタである。いくつかの実施形態では、上記細胞の直径が上記フィルタサイズである。
【００１３】
いくつかの実施形態によると、  上記（ｂ）の工程は、式２に従って実行され、
【００１４】
【数２】
2018173273.tif 000003
【００１５】
Tは、上記蛍光顕微鏡画像のための閾値である。例えば、いくつかの実施形態における上記閾値は、３である。
【００１６】
いくつかの任意の実施形態において、上記方法は、（ｅ）上記着色コンポーネントの各ピクセルの滑らかさをピクセルの局所領域と比較して評価する工程をさらに含む。より具体的には、上記（ｅ）の工程は、（ｅ−１）及び（ｅ−２）によって実行される。
【００１７】
（ｅ−１）式３に従って、各ピクセルの画像階調度M(x,y)を決定する工程であって、
【００１８】
【数３】
2018173273.tif 000004
【００１９】
【数４】
2018173273.tif 000005
【００２０】
及び
【００２１】
【数５】
2018173273.tif 000006
【００２２】
であり、
Gx及びGyは、それぞれ、ｘ方向及びｙ方向における上記画像階調を示している工程、及び、
（ｅ−２）式４に従って、各ピクセルの上記滑らかさσ(x,y)を決定する工程であって、
【００２３】
【数６】
2018173273.tif 000007
【００２４】
Nは、ピクセルの総数であり、μは、上記局所領域における平均ピクセル値である。
【００２５】
さらに、上記方法は、（ｆ）式５の基準を満たす曖昧な領域Ｒの存在を決定する工程をさらに含む。
【００２６】
【数７】
2018173273.tif 000008
【００２７】
いくつかの実施形態では、上記曖昧な領域は、細胞クラスターを示す。
【００２８】
本開示の任意の実施形態によると、上記方法は、上記１つ以上の細胞の一連の蛍光顕微鏡画像に対して、工程（ａ）から工程（ｆ）を実行し、上記細胞の再プログラム化の開始を特定することを含む。
【００２９】
別の態様では、本開示は、プログラムで制御可能なデバイス（プロセッサ又はコンピュータ）によって実行された場合、１つ以上の細胞の蛍光顕微鏡画像から、再プログラム化を受けている細胞、及び再プログラム化された細胞を特定するための本願の方法を、上記デバイスに実行させる、コンピュータが読み取り可能な命令（コンピュータプログラム又はソフトウェア）が符号化された、有形のコンピュータ可読記憶媒体を規定する。本願明細書に記載されている本発明に係る方法の全実施形態又は種々の実施形態は、上記プログラムで制御可能なデバイスにおいて実行された場合、これらの符号化された命令によって実行され得る。
【００３０】
さらなる別の態様では、本発明は、１つ以上の細胞の蛍光顕微鏡画像から、再プログラム化を受けている細胞、及び再プログラム化された細胞を特定するためのシステムを規定する。
【００３１】
ある実施形態によると、上記システムは、１つ以上の細胞の蛍光顕微鏡画像を取得するように構成された装置と、制御ユニットであって、プロセッサ及び複数の命令を保存するためのメモリを備え、上記複数の命令が上記プロセッサによって実行された場合、当該方法を上記プロセッサに実行させる、制御ユニットと、を備えている。本願明細書に記載されている本発明に係る方法の全実施形態又は種々の実施形態は、上記プロセッサによって実行され得る。
【００３２】
本開示の実施形態の別の態様は、ｉＰＳ検出装置を規定する。上記ｉＰＳ検出装置は、入力部、ＣＮＮ部、及び確率マップ生成部を備え、上記入力部は、入力画像をＣＮＮ部に供給し、上記ＣＮＮ部は、上記入力画像におけるＣＮＮディープラーニングフレームワーク（CNN deep learning framework）に基づいた計算を実行して各分類の確率を出力し、上記確率マップ生成部は、上記ＣＮＮ部によって供給された確率に基づいて、少なくとも１つの分類の確率マップを生成する。
【００３３】
本開示の付随する特徴及び効果の多くは、添付の図面と関連して検討された下記の詳細な説明を参照することにより、より理解される。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
当該特許書類又は出願書類は、カラーで製作された少なくとも１つの図面を含む。必要な手数料を請求し、必要な手数料が納付された上で、カラーの図面を伴ったこの特許公報又は特許出願公報の写しが、特許庁によって提供される。
【００３５】
本願明細書は、添付図面を考慮して整理された下記の詳細な説明から、より理解される。
【図１】図１は、本開示の実施形態に係る１つ以上の細胞の蛍光顕微鏡画像から、再プログラム化を受けている細胞、及び再プログラム化された細胞を特定するための方法を実行するための工程を説明するフローチャートである。
【図２Ａ】図２Ａは、本開示の一実施例に係るマウスｉＰＳ細胞培養物の蛍光顕微鏡画像である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、図２Ａにおけるハイライト領域の拡大図である。
【図３】図３は、当該方法の実施例を示し、パネル（ａ）は、元の蛍光画像であり、パネル（ｂ）は、前処理工程後の画像であり、パネル（ｃ）は、細胞検出工程後の画像であり、パネル（ｄ）は、元の明視野コントラスト画像である。
【図４】図４は、当該方法の実施例を示し、パネル（ａ）は、元の蛍光画像であり、パネル（ｂ）は、元の明視野コントラスト画像であり、パネル（ｃ）及び（ｄ）は、階調度の標準偏差を変えてクラスタリング工程を行った後の画像である。
【図５】図５は、実施形態２におけるシステムのブロック図を示す。
【図６】図６は、実施形態３における各分類に対する例示的な画像を示す。
【図７】図７は、実施形態３に係るｉＰＳ検出装置のブロック図である。
【図８】図８は、実施形態３における各分類に対するトレーニング画像の詳細な手順の例を示す。
【図９】図９は、実施形態３における、画像上のｉＰＳを検出するための方法を実行するための工程を説明するフローチャートである。
【図１０】図１０は、実施形態３における、画像からｉＰＳを検出する詳細な手順の例を示す。
【図１１】図１１は、上記例における、テスト画像及びトレーニング画像のうちの１つを示す。
【図１２】図１２は、上記例における、テスト画像及びトレーニング画像のうちの１つを示す。
【図１３】図１３は、上記例における、テスト画像及びトレーニング画像のうちの１つを示す。
【図１４】図１４は、上記例における、テスト画像及びトレーニング画像のうちの１つを示す。
【図１５】図１５は、上記例における、テスト画像及びトレーニング画像のうちの１つを示す。
【図１６】図１６は、上記例における、テスト画像及びトレーニング画像のうちの１つを示す。
【図１７】図１７は、上記例における、テスト画像及びトレーニング画像のうちの１つを示す。
【図１８】図１８は、上記例における、テスト画像及びトレーニング画像のうちの１つを示す。
【図１９】図１９は、上記例における、テスト画像及びトレーニング画像のうちの１つを示す。
【図２０】図２０は、上記例における、テスト画像及びトレーニング画像のうちの１つを示す。
【図２１】図２１は、上記例における、テスト画像及びトレーニング画像のうちの１つを示す。
【図２２】図２２は、上記例における、テスト画像及びトレーニング画像のうちの１つを示す。
【図２３】図２３は、実施形態４に係る例示的な分類された領域を示す。
【図２４】図２４は、実施形態４における、クラス５（ｉＰＳ）の例示的なテンプレート示す。
【図２５】図２５は、実施形態４における、トレーニング方法及びテスト方法を実行するための工程を説明するフローチャートである。
【図２６】図２６は、実施形態４におけるトレーニング方法で実行される詳細な手順の例を示す。
【図２７】図２７は、実施形態４におけるｉＰＳ検出装置によって実行される詳細な手順の例を示す。
【図２８】図２８は、結果を示す。
【図２９】図２９は、結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
〔実施形態の説明〕
添付図面に関連して、以下に与えられた詳細な説明は、本実施例の説明として意図されるが、本実施例が構成される唯一の形態、又は本実施例が利用される唯一の形態だけを示すことは意図していない。当該説明は、当該実施例の機能を示し、当該実施例を構成し、処理するための工程の手順を示す。しかし、同一の機能及び手順、又は同等の機能及び手順が、異なる実施例によって達成されてもよい。
【００３７】
便宜上、本願明細書、実施例、及び添付された特許請求の範囲で採用される特定の用語を、ここに纏める。本願明細書で別に定義されない限り、本開示で採用された科学技術用語は、当業者によって一般的に理解され、使用される意味を有する。
【００３８】
文脈によって別に要求されない限り、単数形の用語は、同一のものの複数の形態を含み、複数形の用語は単数も含む。また、本願明細書、及び特許請求の範囲で用いられるように、用語「少なくとも１つの」及び「１つ以上の」は、同一の意味を有し、１つ、２つ、３つ、又はそれ以上を含む。さらに、この明細書及び添付された特許請求の範囲にわたって用いられる用語「Ａ、Ｂ及びＣの少なくとも１つ」「Ａ、Ｂ又はＣの少なくとも１つ」及び「Ａ、Ｂ及び／又はＣの少なくとも１つ」は、Ａ単独、Ｂ単独、Ｃ単独、Ａ及びＢ共に、Ｂ及びＣ共に、Ａ及びＣ共に、並びに、Ａ、Ｂ及びＣ共に、を対象とすることを意図している。
【００３９】
本発明の広範な範囲を示す数値範囲及び数値パラメータが近似であるにもかかわらず、特定の実施例で示された数値は、可能な限り正確に報告されている。しかし、何れの数値も、各実験の測定において見出される標準偏差から必然的に生じたいくらかの誤差を本質的に含む。また、本明細書で使用されるように、用語「約」は、通常、所定の値又は範囲の１０％、５％、１％又は０．５％以内を意味する。あるいは、用語「約」は、当業者によって判断される場合の、平均の許容範囲内の標準偏差以内を意味する。動作例／作業例以外において、又は、別に明白に指定しない限り、本明細書に開示されている数値範囲、量、値及びパーセンテージ、例えば、材料の量、期間、温度、動作条件、量の比などの、数値範囲、量、値及びパーセンテージは、全ての場合で、用語「約」によって修正されるものとして理解されるべきである。従って、それとは反対のことを示さない限り、本開示及び添付された特許請求の範囲に記載された数値パラメータは、意図するように変更し得る近似値である。最低限でも、各数値パラメータは、少なくとも、報告された有効数字の数を考慮し、通常の丸め処理の技術を適用することによって解釈されるべきである。範囲は、本願明細書において、一方の端点から別の端点までの範囲、又は、２つの端点の間の範囲で表現される。本願明細書に開示された全ての範囲は、別に指定されない限り、端点を含む。
【００４０】
本願明細書で用いられるように、用語「多能性」は、異なる条件下で、３つ全ての胚細胞層、すなわち、内胚葉（例えば、内蔵組織）、中胚葉（血液、筋肉及び血管を含む）、及び外胚葉（皮膚及び神経など）、の細胞型特性に分化する能力を有する細胞のことをいう。従って、本願明細書で使用される用語「多能性」又は「多能性状態」は、細胞が３つ全ての胚葉に分化する能力を備える細胞の発生能を示している。
【００４１】
本開示に通じて、用語「人工多能性幹細胞」又はｉＰＳ細胞は、分化した成熟細胞から作成された幹細胞であり、３つ全ての胚葉又は皮層の組織に分化することができる細胞に誘導されたもの又は変化したもの（すなわち、「再プログラム化される」）を意味する。
【００４２】
本願明細書で使用される用語「再プログラム化」は、分化型成熟細胞の分化した状態を多能性のフェノタイプに変化させるプロセスを示す。換言すれば、再プログラム化は、より高い発生能を有する状態、すなわち、より分化していない状態に遡った状態、に細胞を駆動するプロセスを示す。本願明細書に記載の態様のいくつかの実施形態では、再プログラム化は、多能性状態を有する細胞の発生能への、分化状態の完全又は部分的な復帰、すなわち、細胞の発生能の増強を包含する。よって、いくつかのケースでは、本発明の再プログラム化は、脱分化した及び／又は若返った少なくとも１つの細胞を与え、特に、複数の分化能を有する細胞、特に、多能性幹細胞を与える。結果として得られる細胞は、本明細書において、「再プログラム化された細胞」として示される。
【００４３】
生きた細胞の蛍光イメージングは、胚形成及び細胞分化などの、細胞の動的なプロセス及びイベントの研究に対する強力な手段である。イメージング技術の進歩に伴って、蛍光イメージングは、高い空間分解能及び時間分解能をもたらすことができる。
【００４４】
（実施形態１）
上記を考慮して、本開示の第１の態様は、１つ以上の細胞の蛍光顕微鏡画像から、再プログラム化を受けている細胞、及び再プログラム化された細胞を特定するための方法を規定する。
【００４５】
図１は、本開示の実施形態に係る方法１００を説明するフローチャートである。図１によると、蛍光顕微鏡画像は、最初に、画像処理工程Ｓ１０１の対象となる。
【００４６】
具体的には、画像処理工程Ｓ１０１は、グレースケール変換工程を含み、当該工程の次に、アンシャープマスキング工程が続く。これらの工程は、ノイズを除去するように設計され、これにより、蛍光顕微鏡画像の信号対雑音比を向上させる。
【００４７】
アンシャープマスキング工程に関して、アンシャープマスキングは、グレースケールに変換された蛍光顕微鏡画像f(x,y)に適用し、式１による強調画像fs(x,y)を取得する。
【００４８】
【数８】
2018173273.tif 000009
【００４９】
ここで、fs(x,y)は、強調画像であり、ｘ及びｙは、画像の座標であり、*は、画像のコンボリューションを示し、Gσは、標準偏差σ、及びフィルタサイズ2σ+1のガウジアンフィルタである。いくつかの任意の実施形態では、フィルタサイズとして、細胞の直径のサイズを選択している（例えば、約２０μｍ）。
【００５０】
次に、画像処理工程Ｓ１０１による強調画像は、細胞検出工程Ｓ１０３の対象となる。この段階は、全ての孤立した細胞又は複数の細胞を検出することを目的とする。最初に、画像２値化工程において、強調画像fs(x,y)を、式２によって２値画像g(x,y)に変換する。
【００５１】
【数９】
2018173273.tif 000010
【００５２】
ここで、Tは、蛍光顕微鏡画像のための閾値である。いくつかの任意の実施形態では、Tは、蛍光顕微鏡画像のための、３の値を有する閾値である。
【００５３】
さらに、細胞検出工程Ｓ１０３において、２値画像は、モルフォロジー画像処理工程の対象となる。当該モルフォロジー画像処理工程において、蛍光細胞（再プログラム化しているｉＰＳ細胞、及び再プログラム化されたｉＰＳ細胞）の輪郭を分別する。例えば、モルフォロジークローズ技術（すなわち、モルフォロジーの膨張（dilation）の後に収縮（erosion））が、いくつかの実施形態においては、細胞様楕円境界を得るために使用される。ここで、各細胞様楕円境界は、孤立細胞又は細胞群を示す。
【００５４】
細胞検出工程Ｓ１０３の最後の工程は、結合コンポーネント標識化工程である。当該結合コンポーネント標識化工程において、各孤立細胞又は細胞群（すなわち、各細胞様楕円境界によって限定された領域）は、ランダムな色で標識化され、着色された複数のコンポーネントが得られる。ここで、各着色コンポーネントは、再プログラム化を受けている１つ以上の細胞、又は、再プログラム化された１つ以上の細胞を示す。理解されるように、この工程では、任意の２つ以上の隣接した孤立細胞又は隣接した細胞群を、好ましくは、異なる色で標識化する。さらに、蛍光顕微鏡画像の倍率から判断して、画像における単一の孤立細胞のピクセルサイズを確認することができる。この情報は、着色コンポーネントが、蛍光を発する孤立した１つの細胞を示しているか、又は細胞群を示しているかを決定するために使用され得る。例えば、各ピクセルの幅が約１μｍである場合、検出された孤立した蛍光領域は、当該領域のｘ方向及びｙ方向の何れかのピクセル数が２０ピクセル（約２０μｍ）を超える場合、蛍光を発する複数の細胞からなるものであると判断される。
【００５５】
理解されるように、結合コンポーネント標識化工程後に、蛍光を発する１つ以上の細胞、又は蛍光を発する１つ以上の細胞群を特定する。従って、本開示のいくつかの実施形態によると、方法１００は、細胞検出工程Ｓ１０３が完了すると、いったん中止してもよい。
【００５６】
任意の実施形態において、方法１００は、クラスター特定工程Ｓ１０５をさらに含む。この段階は、ｉＰＳ細胞形成の開始を特定することを目的としている。ｉＰＳ細胞形成の開始において、再プログラム化している細胞は、多くの場合、互いに積み重なっている。従って、蛍光顕微鏡画像におけるクラスターの存在を探索することは、再プログラム化プロセスの開始を特定することに役立つ。これは、２つ以上の蛍光顕微鏡画像が順に処理される実施形態において、特に有用であり、これにより、本願の方法１００は、ｉＰＳ細胞形成が発生する時及び場所を自動的に特定するために使用され得る。
【００５７】
具体的には、クラスター特定工程Ｓ１０５は、階調度の標準偏差を決定するための工程と、曖昧領域検出工程とを含む。
【００５８】
最初に、局所領域における各ピクセルに関する曖昧さを定量的に評価するために、階調度の標準偏差を決定する。まず、画像の階調度M(x,y)を、式３によって計算する。
【００５９】
【数１０】
2018173273.tif 000011
【００６０】
ここで、
【００６１】
【数１１】
2018173273.tif 000012
【００６２】
及び
【００６３】
【数１２】
2018173273.tif 000013
【００６４】
であり、
Gx及びGyは、それぞれ、ｘ方向及びｙ方向における画像階調度を示す。次に、各ピクセルの曖昧さ（滑らかさ）σ(x,y)は、式４に従った、局所領域における画像階調度の標準偏差として定義される。
【００６５】
【数１３】
2018173273.tif 000014
【００６６】
ここで、Ｎは、ピクセルの総数であり、μは、局所領域における平均ピクセル値である。例えば、いくつかの実施形態では、当該局所領域として、１１×１１ピクセル（約１０μｍ×１０μｍ）を選択した。
【００６７】
次に、曖昧領域検出工程において、再プログラム化された細胞クラスターを示している可能性がある曖昧な領域を、自動的に検出する。本開示では、曖昧な領域は、式５の基準を満たす領域Ｒとして定義される。
【００６８】
【数１４】
2018173273.tif 000015
【００６９】
ここで、Ｔは、閾値である。理解されるように、各曖昧な領域は、細胞クラスターを示す。
【００７０】
本開示のある実施形態によると、本願の方法は、Open Source Computer Vision (OpenCV) library Version 2.4.11を使用して開発されるコンピュータプロダクトとして、Intel（登録商標） Core i5及び4G RAMが搭載されたパーソナルコンピュータを用いて実施され得、０．１秒未満で１つの蛍光顕微鏡画像を処理する。
【００７１】
本願明細書に記載の対象は、プロセッサが読み取り可能な命令を保存した非一時的な有形のプロセッサ可読記憶媒体を用いて実施され得る。当該命令は、プログラムで制御可能なデバイスによって実行された場合、プログラムで制御可能なデバイスが本開示の実施形態に係る方法を実行するように制御する。本願明細書に記載の対象を実施するのに適した例示的なプロセッサ可読記憶媒体は、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、フラッシュメモリ又は他の半導体メモリ技術、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ又は他の光学記憶装置、磁気カセット、磁気テープ，磁気ディスク記憶装置又は他の磁気記憶デバイス、及び、所望の情報を記憶するために使用され、且つプロセッサによってアクセスされ得る任意の他の媒体を含むが、これらに限定されない。さらに、本願明細書に記載の対象を実施するプロセッサ可読記憶媒体は、単一のデバイス、若しくはコンピューティングプラットホームに設置されてもよく、又は、複数のデバイス若しくは複数のコンピューティングプラットホームにわたって分散されてもよい。
【００７２】
本願明細書に記載された対象の別の態様では、再プログラム化を受けている細胞と再プログラム化された細胞とを、１つ以上の細胞の蛍光顕微鏡画像から特定するためのシステムが提供される。当該システムは、１つ以上の細胞の蛍光顕微鏡画像を取得するように構成された装置（以下では、蛍光画像キャプチャ装置）、及び制御ユニットを含む。当該蛍光画像キャプチャ装置は、例えば、適当な任意の蛍光顕微鏡である。当該制御ユニットは、蛍光画像キャプチャ装置と通信接続され、当該装置によってキャプチャされた蛍光顕微鏡画像を処理するように構成されている。特に、制御ユニットは、プロセッサと、複数の命令を保存するためのメモリとを含み、当該命令は、プロセッサによって実行された場合、プロセッサに本願の方法を行わせる。
【００７３】
当該蛍光画像キャプチャ装置と当該制御ユニットとの間の通信は、種々の技術を用いて実施されてもよい。例えば、当該システムは、ネットワーク（ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）、広域ネットワーク（ＷＡＮ）、インターネット、又はワイヤレスネットワークなど）を介した、蛍光画像キャプチャ装置と制御ユニットとの間の通信を可能にするネットワークインターフェースを含んでもよい。別の例では、当該システムは、種々のシステムコンポーネントを結合するシステムバスを有してもよく、当該システムバスは、蛍光画像キャプチャ装置を制御ユニットに結合するシステムバスを含む。さらなる別の実施形態では、当該システムは、蛍光顕微鏡画像を示すデータを出力する蛍光画像キャプチャ装置用出力デバイスと、これらのデータを制御ユニットに入力するための入力デバイスとを有してもよい。
【００７４】
下記の実施例は、本発明のある態様を説明し、当業者が本発明を実施するのを助けるために提供される。これらの実施例は、決して、いかなる方法によっても本発明の範囲を限定するとみなされるべきではない。さらなる詳細無しで、当業者は、本願明細書の記載に基づいて、その最も完全な程度まで本発明を利用し得ると確信される。
【００７５】
材料及び方法
（１）ＩＰＳ細胞形成
胚線維芽細胞は、ドキシサイクリン誘導性Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃを宿すマウス系の１３．５ｄｐｃの胚に由来する。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）の３ｃｍシャーレ中で、１×１０４個の胚線維芽細胞を播種し、３７℃で一晩、培養した。１０％ＥＳ細胞用ウシ胎児血清（ES-certified FBS）、１％非必須アミノ酸、０．１％ｂ−メルカプトエタノール、１０００μｇ／ｍｌのＬＩＦ、５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸、３μＭのCHIR99021を含有するＧＭＥＭであるＥＳ培地で、培地を交換した。２μｇ／ｍｌのドキシサイクリンを培地に添加し、導入遺伝子の発現を誘導した。ドキシサイクリンを添加した日を０日目とした。
【００７６】
（２）イメージング条件
この研究では、Leica Microsystem AF 6000LX (DFC360FX-442880310)を使用して、生きた細胞の経時的な画像を取得した。顕微鏡の設定を下記の表１に要約した。２つのチャンネル（チャンネル１及び２）で、顕微鏡画像を同時に取得した。経時的な蛍光顕微鏡画像を８時間おきに１８日間撮った。
【００７７】
【表１】
2018173273.tif 000016
【００７８】
図２Ａは、１４４（１２×１２）の蛍光顕微鏡画像からなる大きい画像を示す。この画像は、培養するフィールドを明らかにしており、ハイライトの顕微鏡画像が、図２Ｂに、最大の解像度（１３９２×１０２０ピクセル）で示されている。各ピクセルの幅は、０．９２μｍである。図２Ｂでは、蛍光を発する細胞を有する領域を観察することができる。
【００７９】
実施例１
この実施例では、図２Ｂからの蛍光画像を、上述のように、画像処理工程Ｓ１０１及び細胞検出工程Ｓ１０３によって処理し、結果を、図３に示した。図３において、パネル（ａ）は、元の画像である。パネル（ｂ）は、画像処理工程Ｓ１０１後の結果を示す。当該工程では、蛍光を発する孤立細胞が、アンシャープマスキングによりはっきりと強調されている。パネル（ｃ）は、細胞検出工程Ｓ１０３後の結果を示す。当該工程では、ランダムな色を、検出された蛍光を発する細胞又は細胞群に割り当てる。また、パネル（ｄ）は、明視野コントラスト技術によって得られた画像を示す。
【００８０】
図３のパネル（ａ）において、蛍光を発する細胞を手集計した結果、蛍光を発する細胞は３３８個であった。他方、本願の方法を用いると、図３のパネル（ｃ）において、蛍光を発するｉＰＳ細胞は３３４個と計算される。つまり、本願の方法を用いることで、約９８．５％の精度が達成された。
【００８１】
さらに、図３のパネル（ｃ）と（ｄ）とを比較することにより、本願の方法によって特定された蛍光を発する細胞（パネル（ｃ）で着色されたコンポーネントとして示される）がパネル（ｄ）に示された再プログラム化されたｉＰＳ細胞及び再プログラム化しているｉＰＳ細胞と一致していることがわかる。
【００８２】
実施例２
この実施例では、上述の画像処理工程Ｓ１０１、細胞検出工程Ｓ１０３及びクラスター特定工程Ｓ１０５によって、２つの連続的な蛍光画像を処理し、図４に結果を示した。図４において、パネル（ａ）及び（ｂ）は、それぞれ、元の画像、及び対応する明視野コントラスト画像を示し、パネル（ｃ）及び（ｄ）は、パネル（ａ）の画像において工程Ｓ１０１から工程Ｓ１０３までを行ったあとの結果を示すが、パネル（ｃ）及び（ｄ）は、階調度の標準偏差が異なる。
【００８３】
図４のパネル（ｃ）及び（ｄ）に見られるように、ｉＰＳ細胞の形成が起きている場所では、曖昧な（又は滑らかな）領域が見出される。この曖昧さ又は滑らかさは、再プログラム化プロセス中の、蛍光を発する細胞の積み重なりに起因する。この結果から、本願の方法によって、再プログラム化プロセスが発生する時及び場所を蛍光顕微鏡画像から自動的に特定できることが示される。
【００８４】
これらの再プログラム化された細胞クラスターは、細胞生物学者によって、その明視野コントラスト画像を用いるなどしてさらに確認され得る。
【００８５】
図４のパネル（ｃ）及び（ｄ）の結果から明らかなように、クラスター特定工程Ｓ１０５において階調度の標準偏差を調整することによって、異なる結果が得られてもよい。従って、種々のイメージング条件として階調度の標準偏差が種々のものを使用し得、細胞生物学者は、最適な条件を選択することができる。
【００８６】
上述の点で、本願の方法は、経時的蛍光顕微鏡画像を自動的に分析し、マウスのｉＰＳ細胞形成プロセスを特徴づけ、これにより、再プログラム化プロセスが発生している可能性がある時及び場所を特定する。この自動化された検出方法は、オンラインモニタリングとして使用され得る。
【００８７】
理解されるように、図２Ａに提示された画像のサイズは、非常に大きく、この画像に対する手動によるオンライン検出は、不可能であると思われる。しかし、高度なイメージングデバイス（例えば、高倍率、高解像度、又は４Ｄ蛍光顕微鏡若しくはカメラ）と共に、本願の適切に自動化された検出方法を用いることにより、一旦、再プログラム化プロセスの開始が検出されると、画像キャプチャユニットは、再プログラム化が発生している位置に導かれ得る（例えば、当該位置に焦点を定め直す）。このように、その後の画像化範囲は、再プログラム化している細胞、及び／又は、再プログラム化された細胞がいる位置に限定され、これにより、再プログラム化している細胞、及び／又は、再プログラム化された細胞を特定するためのより効率的な方法を提供する。
【００８８】
また、本願の方法、有形のコンピュータ可読記憶媒体、コンピュータプロダクト、及び／又はシステムは、種々の試薬又は培養条件下におけるｉＰＳ形成及び増殖のメカニズムを分析及び理解するための定量分析に適用可能である。例えば、細胞検出工程Ｓ１０３からの結果を分析し、時間の経過と共に、蛍光を発する細胞の数とｉＰＳ形成領域とをカウントして、これらの、ｉＰＳ形成についての時間、位置及び速度に対する関係も分析し得る。
【００８９】
さらに、本願の方法は、短い時間で、経時的蛍光顕微鏡画像の大きなセットを分析し得る。これにより、従来、細胞生物学者によって行われてきた単調な作業を軽減する。本願の方法は高い精度を示し、顕微鏡画像において、蛍光を発する細胞を検出し、位置を特定することに役立つ。さらに、クラスター特定工程Ｓ１０５は、再プログラム化プロセスが発生する時及び場所を特定することに役立つ。本願の方法を用いることにより、再プログラム化している細胞、及び再プログラム化された細胞をキャプチャすることができ、ｉＰＳ形成プロセスの理解、及び、このプロセスと細胞環境との関係の理解を容易にすることができる。
【００９０】
（実施形態２）
この実施形態では、実施形態１のシステムの例示的な実施が記載されている。
【００９１】
図５は、第１の実施形態で説明した１つ以上の細胞の蛍光顕微鏡画像から再プログラム化している細胞及び再プログラム化された細胞を特定するためのシステムのブロック図を示す。
【００９２】
図５によると、システム１０００は、プロセッサ１１００、メモリ１２００、画像キャプチャ装置１３００、及び記憶媒体１４００を備えている。図５に示されるように、プロセッサ１１００、メモリ１２００、画像キャプチャ装置１３００、及び記憶媒体１４００は、システムバスによって互いに相互接続されている。
【００９３】
画像キャプチャ装置１３００は、第１の実施形態の蛍光画像キャプチャ装置に相当する。
【００９４】
図５によると、プロセッサ１１００は、画像処理部１０１、細胞検出部１０３、及びクラスター特定部１０５を備えている。画像処理部１０１。画像処理部１０１は、第１の実施形態の工程Ｓ１０１を実行する。細胞検出部１０３は、第１の実施形態の工程Ｓ１０３を実行する。クラスター特定部１０５は、第１の実施形態の工程Ｓ１０５を実行する。
【００９５】
メモリ１２００は、複数の命令を記憶し、当該命令は、プロセッサ１１００によって実行された場合、第１の実施形態で説明した方法をプロセッサに実行させる。
【００９６】
記憶媒体１４００は、第１の実施形態における有形のコンピュータ可読記憶媒体に相当する。
【００９７】
（実施形態３）
本開示の第３の態様は、ディープラーニングによるｉＰＳ検出のための方法及び装置を規定する。本実施形態３は、実施形態１及び２で既に説明した方法、システム及び装置、並びに、下記で説明する方法及び装置を含む。
【００９８】
本実施形態のディープラーニングによるｉＰＳ検出のための方法及び装置は、下記の６つのタイプのクラス（分類０〜５）を扱う。当該クラスは、細胞の分布、及び画像のテクスチャによって定義される（特に、分類３〜５）。
【００９９】
分類０：全く何も無し（細胞無し）
分類１：孤立細胞で周囲にゲル状物質を伴っている
分類２：増殖しているがクラスターを形成していない細胞
分類３：ｉＰＳクラスターの形成
分類４：別のタイプの細胞クラスター
分類５：別のタイプの細胞クラスター
図６は、上記の各分類に対する例示的な画像である。
【０１００】
図７は、本開示の第３の実施形態に係るｉＰＳ検出装置２００のブロック図である。図７によると、ｉＰＳ検出装置２００は、クリップ部２０１、入力部２０２、ＣＮＮ（畳み込みニューラルネットワーク（Convolutional Neural Network））部２０３、規格化部２０４、及び、確率マップ生成部を備えている。ｉＰＳ検出装置２００は、システム１０００に（特に、プロセッサ１１００に）実装されてもよい。
【０１０１】
入力画像は、ｉＰＳ検出装置２００に供給される。クリップ部２０１は、入力画像をＲＯＩ（関心領域（Region of Interest））としてクリップする。例えば、クリップ部２０１は、最終的なテスト画像であるIWP-2コロニー1以外の、コントロール（対照）、DMSO及びIWP-2の画像セットから、トレーニング画像をクリップする。
【０１０２】
ここで留意すべきは、ＲＯＩのサイズは、本開示の技術を限定しないが、ＲＯＩの例示的なサイズは、２５６×２５６ピクセルであるということである。他のサイズ（３２×３２、６４×６４、１２８×１２８）と比較して、２５６×２５６ピクセルのサイズは、特に、臨界的特徴（critical feature）に関して有効である。
【０１０３】
クリップ部２０１によってクリップされたＲＯＩは、入力部２０２に供給される。入力部は、ＲＯＩをＣＮＮ部２０３に入力する。ＣＮＮ部２０３は、ＲＯＩにおいて、ＣＮＮディープラーニングのフレームワークに基づいた計算を実行する。ＣＮＮ部２０３は、各分類の確率（０％〜１００％）を出力する。規格化部２０４は、分類３（ｉＰＳ）の確率を取得し、それをグレースケール（０〜２５５）に規格化する。確率マップ生成部２０５は、グレースケール値をその対応する(x, y)ピクセルに与えることにより、分類３の確率マップを生成する。
【０１０４】
図８は、各分類のトレーニング画像の詳細な手順の例を示す。
【０１０５】
図９は、画像においてｉＰＳを検出するための方法を実行するための工程を説明するフローチャートである。
【０１０６】
工程Ｓ２０１において、クリップ部２０１は、入力画像をＲＯＩとしてクリップする。工程Ｓ２０２において、入力部は、ＲＯＩをＣＮＮ部２０３に入力する。
【０１０７】
工程Ｓ２０３において、ＣＮＮ部２０３は、ＲＯＩにおいて、ＣＮＮディープラーニングのフレームワークに基づいた計算を実行する。ＣＮＮ部２０３は、各分類の確率（０％〜１００％）を出力する。
【０１０８】
工程Ｓ２０４において、規格化部２０４は、分類３（ｉＰＳ）の確率を取得し、それをグレースケール（０〜２５５）に規格化する。
【０１０９】
工程Ｓ２０５において、確率マップ生成部は、グレースケール値をその対応する(x, y)ピクセルに与えることにより、分類３の確率マップを生成する。
【０１１０】
図１０は、画像からｉＰＳを検出する詳細な手順の例を示す。
【０１１１】
上記で説明したように、本実施形態の一態様は、ｉＰＳ検出装置を規定する。ｉＰＳ検出装置は、入力部、ＣＮＮ部、及び確率マップ生成部を備え、入力部は、入力画像をＣＮＮ部に供給し、ＣＮＮ部は、入力画像において、ＣＮＮディープラーニングのフレームワークに基づいた計算を実行し、次に、各分類の確率を出力し、また、確率マップ生成部は、ＣＮＮ部によって供給された確率に基づいて、少なくとも１つの分類の確率マップを生成する。
【０１１２】
実施例３
本実施形態に記載された構成に基づいて、トレーニング段階において、クリップ部２０１は、最終的なテスト画像であるIWP-2コロニー1以外の、コントロール、DMSO及びIWP-2の画像セットから、トレーニング画像をクリップした。ＲＯＩのサイズを、２５６×２５６ピクセルに固定した。他のサイズ（３２×３２、６４×６４、１２８×１２８）と比較して、２５６×２５６ピクセルのサイズは、特に、臨界的特徴（critical feature）に関して有効であった。
【０１１３】
ＣＮＮフレームワークの例として、我々は、ＣＮＮプラットフォーム「Caffe」を使用した。
【０１１４】
トレーニング画像及びテスト画像として、６つの分類のそれぞれについて、８０枚のトレーニング画像及び２０枚のテスト画像を用いた。より具体的には、入力部は、ＣＮＮ部２０３におけるＣＮＮ分類器（CNN classifier）を訓練するために、換言すれば、ＣＮＮ分類器におけるパラメータを計算するために、８０枚のトレーニング画像をＣＮＮ部２０３に供給した。さらに、入力部２０２は、パラメータを改善し、ＣＮＮ分類器においてベクトルを計算するために、２０枚のテスト画像（２５６×２５６ピクセル）をＣＮＮ部２０３に供給した。さらに、入力部２０２は、ＣＮＮ分類器においてパラメータ及びベクトルをさらに改善するために、８０枚のトレーニング画像をＣＮＮ部２０３に供給した。
【０１１５】
トレーニング画像が多くなるほど、精度はより高くなる。１００００回の反復でテスト画像のトレーニングを行い、９４％の精度を達成した。
【０１１６】
図１１〜２２は、テスト画像及びトレーニング画像を示す。我々は、IWP-2コロニー1をテスト画像として用いた。我々は、７日目のDMSOコロニー3をトレーニング画像として用いた。
【０１１７】
（実施形態４）
この実施形態は、ディープラーニングによるｉＰＳ検出のための方法及び装置の別の例を提供する。本実施形態の一態様は、第３の実施形態の変形を含む。本実施形態の別の態様は、第３の実施形態の補足を含む。
【０１１８】
本実施形態のディープラーニングによるｉＰＳ検出のための方法及び装置は、下記の６タイプのクラス（クラス０から５）を扱う。
【０１１９】
クラス０：全く何も無し
クラス１：周囲にゲル状の物体を伴った細胞
クラス２：群がらないいくつかの細胞
クラス３：粗いパターンで群がるいくつかの細胞
クラス４：精細なパターンで群がるいくつかの細胞
クラス５：ｉＰＳ
図２３は、上記の分類基準（クラス０から５）に従った例示的な分類領域を示す。
【０１２０】
図２４は、クラス５（ｉＰＳ）の例示的なテンプレートを示す。
【０１２１】
本発明のｉＰＳ検出装置は、基本的に、第３の実施形態のｉＰＳ検出装置と同一である。
【０１２２】
図２５は、ＣＮＮ部２０３のトレーニング工程及びテスト工程を実行するための工程を説明するフローチャートである。図２５に示されるように、全プロセスは、トレーニング工程及びテスト工程を含む。当該トレーニング工程は、工程Ｓ３０１〜Ｓ３０３を含み、当該テスト工程は、工程Ｓ３１１〜Ｓ３１３を含む。
【０１２３】
工程Ｓ３０１において、入力部２０２は、複数のトレーニング画像（テンプレート画像ともいう）を、ＣＮＮ部２０３に供給する。
【０１２４】
工程Ｓ３０２において、ＣＮＮ部２０３は、複数のテンプレート画像を反復することにより、ＣＮＮ分類器を最適化し、ディープラーニングモデルの全体のエラーを最小限にする。テンプレート画像の数が本実施形態を限定することはないが、テンプレート画像の例示的な数は、１００（テンプレート）×６（クラス）＝６００である。
【０１２５】
工程Ｓ３０２で導かれた、最適化された係数は、工程Ｓ３０３において、メモリに記憶される。
【０１２６】
本実施形態の一態様によると、特徴を得るために、ｉＰＳクラスのテンプレートが使用される（次に係数最適化のために使用される）。
【０１２７】
図２６は、本実施形態のトレーニング方法で実行される詳細な手順の例を示す。注目すべきは、図２６が図８の一部に対応してもよいということである。
【０１２８】
トレーニング工程後に、入力部２０２は、工程Ｓ３１１において、ＣＮＮ部２０３に複数のテスト画像を供給し、ＣＮＮ部２０３は、工程Ｓ３１２において、各分類の確率（０％〜１００％）を出力する。例えば、ｉＰＳ検出装置２００は、テスト画像における全てのピクセルを、６つのクラスの６つの確率に分類する。工程Ｓ３１３において、確率マップ生成部２０５は、ＣＮＮ部２０３で導出された確率に基づいて、確率マップを生成する。
【０１２９】
注目すべきは、規格化部２０４が、クラス５（ｉＰＳ）の確率を取得し、それをグレースケール（０〜２５５）に規格化してもよいということである。次に、確率マップ生成部２０５は、グレースケール値をその対応する(x, y)ピクセルに与えることによって、クラス５の確率マップを生成してもよい。
【０１３０】
図２７は、本実施形態のテスト段階において、本発明のｉＰＳ検出装置２００によって実行される詳細な手順の例を示す。
【０１３１】
注目すべきは、トレーニング工程及びテスト工程は、繰り返し実行されてもよいということである。当該反復では、テスト工程において一度使用されたテスト画像は、トレーニング工程において、入力画像として再度使用されてもよい。また、当該テストの結果は、トレーニング工程にフィードバックされ、ＣＮＮ分類器において、パラメータ及びベクトルを改善してもよい。これらの手順を反復することにより、ＣＮＮ分類器のさらなる最適化が達成される。
【０１３２】
実施例４
本実施形態に記載された構成に基づいた例示的な結果は、図２８及び２９に示される。この実施例では、我々は下記のｉＰＳデータ及び構成も使用した。
【０１３３】
８つの対照用コロニー、８つのDMSOコロニー、及び８つのIWP-2コロニー
１枚の画像（２５６０×１９２０ピクセル）は、たった１つのコロニーを含む。４日目、７日目、８日目、９日目、１０日目及び１１日目に撮影された同一のコロニーの６つの画像は、１セットの、時系列に沿った画像を構成する。
【０１３４】
全体として、２４個のコロニーに関する２４個のセットの３×８×６枚の（１４４枚の）画像を用意した。
【０１３５】
１３８枚のトレーニング画像から、我々は、テンプレート（２５６×２５６ピクセル）のクラス（当該クラスは、第４の実施形態で説明されている）を手動で特定する。複数のテンプレート、又はテンプレートが無いことを、画像において特定してもよく、各クラスに関する１００個のテンプレートを特定する。
【０１３６】
トレーニング画像からの、６つのクラスのそれぞれについての上記１００個のテンプレートを用いることで、ＣＮＮ部２０３において、ＣＮＮ（Caffe）分類器が得られる。より詳細には、実施例３のように、入力部は、ＣＮＮ部２０３におけるＣＮＮ分類器を訓練するために、換言すれば、ＣＮＮ分類器におけるパラメータを計算するために、ＣＮＮ部２０３に８０枚のトレーニング画像を供給した。さらに、入力部２０２は、パラメータを改善するために、また、ＣＮＮ分類器におけるベクトルを計算するために、ＣＮＮ部２０３に２０枚のテスト画像（２５６×２５６ピクセル）を供給した。さらに、入力部２０２は、ＣＮＮ分類器におけるパラメータ及びベクトルをさらに改善するために、ＣＮＮ部２０３に８０枚のトレーニング画像を供給した。
【０１３７】
次に、ＣＮＮ部２０３は、テスト画像を６つのクラスの領域に分類する。１セットの、時系列（６つ）に沿った画像間における、６つのクラスの領域変化は、ｉＰＳ細胞と他のタイプの細胞との間の、増殖の関係を示す。
【０１３８】
我々は、トレーニングデータとして、２２セット（１３２枚（３×８×６−１２））の画像を使用した。時系列に沿った画像の残りの２セット（１２枚）は、テストセットとして使用される。
【０１３９】
結果は、４つのコロニー：ｉＰＳ細胞を含むコントロールコロニー1、DMSOコロニー3、IWP-2コロニー1及びIWP-2コロニーが存在することを示す。
【０１４０】
図２８において、IWP-2コロニー1に関する、時系列に沿った画像のテストセットの結果が示されている。図２９において、コントロール2に関する、時系列に沿った画像のテストセットの結果が示されている。トレーニング精度は、我々がｉＰＳ細胞を含む画像をさらに有している場合に改善され得る。
【０１４１】
（実施形態５）
この実施形態は、トレーニング画像及びテスト画像についてのより詳細な説明を提供する。本実施形態の一態様は、第３の実施形態の変形と、第４の実施形態の変形とを含む。本実施形態の別の態様は、第３の実施形態の補足と、第４の実施形態の補足とを含む。
【０１４２】
本実施形態によれば、トレーニング画像及びテスト画像として、下記のようなものを用いてもよい。
【０１４３】
（ケース１）トレーニング画像は、蛍光画像であり、テスト画像は、非蛍光画像である。
【０１４４】
（ケース２）トレーニング画像は、非蛍光画像であり、テスト画像は、非蛍光画像である。
【０１４５】
（ケース３）トレーニング画像は、蛍光画像であり、テスト画像は、蛍光画像である。
【０１４６】
（ケース４）トレーニング画像は、非蛍光画像であり、テスト画像は、蛍光画像である。
【０１４７】
本実施形態によれば、上記の何れのケースにおいても、テスト結果をトレーニング工程にフィードバックしてもよい。
【０１４８】
例えば、上記のケース１及びケース２において、蛍光画像又は非蛍光画像に基づいて、トレーニング工程を実行してもよい。次に、非蛍光テスト画像に基づいて、テスト工程を実行してもよい。ここで、非蛍光テスト画像に基づいたテスト結果を、非蛍光トレーニング画像を扱うトレーニング工程にフィードバックしてもよい。この手順は、我々が第２のトレーニング工程において標的の細胞に蛍光物質を与える必要がないという意味において、好適であり得る。また、この手順は、非蛍光トレーニング画像を用いたトレーニング工程は費用効率がよいため、好適であり得る。また、この手順は、当該検出が非蛍光画像に基づいて実行される場合に、より高い処理能力を得られるという意味において、好適であり得る。
【０１４９】
上記のケース１及びケース２における別の例として、トレーニング工程を、蛍光画像又は非蛍光画像に基づいて実行してもよい。次に、テスト工程を、非蛍光テスト画像に基づいて実行する。ここで、非蛍光テスト画像に基づいたテスト結果を、蛍光トレーニング画像を扱うトレーニング工程にフィードバックしてもよい。この手順は、当該検出が非蛍光画像に基づいて実行される場合に、より高い処理能力を得られるという意味において、好適であり得る。従って、トレーニング工程を、非蛍光画像に基づいて実行し、テスト工程において、蛍光画像をテスト画像として使用することが好ましい。
【０１５０】
上記のケース３及びケース４に関して、例えば、トレーニング工程を、蛍光画像又は非蛍光画像に基づいて実行してもよい。次に、テスト工程を、蛍光テスト画像に基づいて実行する。ここで、蛍光テスト画像に基づいたテスト結果を、非蛍光トレーニング画像を扱うトレーニング工程にフィードバックしてもよい。この手順は、我々が第２のトレーニング工程において標的の細胞に蛍光物質を与える必要がないという意味において、好適であり得る。また、この手順は、非蛍光トレーニング画像を用いたトレーニング工程は費用効率がよいため、好適であり得る。
【０１５１】
上記のケース３及びケース４における別の例として、トレーニング工程を、蛍光画像又は非蛍光画像に基づいて実行してもよい。次に、テスト工程を、蛍光テスト画像に基づいて実行する。ここで、蛍光テスト画像に基づいたテスト結果は、蛍光トレーニング画像を扱うトレーニング工程にフィードバックしてもよい。この手順は、蛍光画像を用いたトレーニング工程及びテスト工程が検出精度を向上させるため、好適であり得る。
【０１５２】
上記のケース１からケース４までに示されるように、蛍光画像又は非蛍光画像を用いて、トレーニング工程を実行してもよい。この態様は、それがトレーニング工程を実行する方法の自由度を高めるため、好適であり得る。また、上記のケース１からケース４までに示されるように、蛍光画像又は非蛍光画像を用いて、テスト工程も実行してもよい。この態様は、それがテスト工程を実行する方法の自由度を高めるため、好適であり得る。
【０１５３】
また、注目すべきは、トレーニング画像及びテスト画像が同一の種類のトレーニング画像及びテスト画像である場合（例えば、上記のケース２及びケース３において）、すなわち、トレーニング画像及びテスト画像の両方が非蛍光のものである場合、又は、トレーニング画像及びテスト画像の両方が蛍光のものである場合、トレーニングの精度と検出の精度とが上昇し得ることである。
【０１５４】
上記の実施形態の説明は、例として与えられ、種々の変形及び組合せが当業者によって行われ得ることが理解される。上記の明細書、実施例及びデータは、本発明の例示的な実施形態の構造及び使用の完全な説明を提供する。本発明の種々の実施形態が、ある程度、詳細に記載されているか、又は、１つ以上の個々の実施形態を参照して記載されているが、当業者は、この発明の精神又は範囲から離れることなく、開示された実施形態に対して多くの変更を行うことができる。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【外国語明細書】
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