(57)【要約】      （修正有）【課題】プロモーターのＯＮ／ＯＦＦの切替機能を向上させ、生物的な物質生産を良好に制御することのできる核酸分子とこれを用いた物質の製造方法の提供。【解決手段】フィコエリスロシアニンを有するシアノバクテリアに由来する特定の塩基配列を有するプロモーターを微生物等に備えさせることで、照射した光に応じて目的遺伝子の発現強化と抑制とをそれぞれ生じさせる方法であり、発現段階においては、プロモーターが通常の他のプロモータ―に比べて著しく活性化され、目的遺伝子を顕著に発現させ、発現量を顕著に増大させて物資生産量を大幅に向上させることができ、抑制段階においては発現を著しく抑制、不活性化することで、発現状態と抑制状態とを大きく相違させることができ、プロモーターの活性化、即ち目的遺伝子の発現を適正に制御することができる、遺伝子カセット。【選択図】図１
2018143117.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光応答性のタンパク質により活性化されるプロモーターであって以下の（ａ）〜（ｅ）からなる群から選択されるＤＮＡを含むプロモーター：
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号５に記載の塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｃ）配列番号６に記載の塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｄ）配列番号１、５、６のいずれかに示す塩基配列において、１もしくは数個の置換、付加および／もしくは欠失を有する塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｅ）配列番号１、５、６のいずれかに示す塩基配列からなるＤＮＡと８０％以上の配列の同一性を有するＤＮＡ。
【請求項２】
前記配列番号１、５、６に記載の塩基配列が、フィコエリスロシアニンを有するシアノバクテリアに由来する、請求項１に記載のプロモーター。
【請求項３】
シアノバクテリアに由来するプロモーターであって、フィコエリスロシアニンをコードする遺伝子の開始コドン上流側領域において２００ｂｐ以内に存在し、配列番号７に示す塩基配列を含み、光応答性のタンパク質により活性化されるプロモーター。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のプロモーターと、
ＣｃａＳタンパク質をコードするｃｃａＳ遺伝子領域と、
ＣｃａＲタンパク質をコードするｃｃａＲ遺伝子領域とを有し、
ＣｃａＳタンパク質とＣｃａＲタンパク質とが光照射に起因して反応することに基づき、前記プロモーターが活性化される遺伝子カセット。
【請求項５】
前記ｃｃａＳ遺伝子領域は、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるＣｃａＳタンパク質または当該アミノ酸配列と４０％以上の同一性を有するＣｃａＳタンパク質のいずれかをコードするものであり、
前記ｃｃａＲ遺伝子領域は、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるＣｃａＲタンパク質または当該アミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するＣｃａＲタンパク質のいずれかをコードするものである、請求項４に記載の遺伝子カセット。
【請求項６】
前記プロモーターの下流に機能的に結合された所望の目的遺伝子を更に含んでいる請求項４又は５に記載の遺伝子カセット。
【請求項７】
前記目的遺伝子は、フィコエリスロシアニンをコードするものである請求項６に記載の遺伝子カセット。
【請求項８】
請求項３〜６のいずれかに記載の遺伝子カセットを含む組換えベクター。
【請求項９】
生物を用いて物質を製造する方法であって、
該生物は請求項１〜３に記載のプロモーター、請求項４〜７に記載の遺伝子カセット、または請求項８記載の組換えベクターのいずれかを含むものであり、
当該生物に緑色光を照射して物質生産を増大させる一方、赤色光を照射して物質生産を抑制する制御を行うことのできる物質製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物的な物質生産を光照射によって制御するための核酸分子とこれを用いた物質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、有用物質（例えば着色に使用可能な物質、バイオマス原料、燃料等）を、光合成生物において生産させる方法が、カーボンニュートラルで地球環境に負荷の少ない手法として注目されている。特に、原核生物であるシアノバクテリアは、遺伝子操作が容易で、代謝経路に関する基礎的な知見も蓄積されていることから、多くの研究者が生産の宿主として注目している。
【０００３】
微生物の遺伝子の働きを光スイッチによって制御する手法は、微生物の増殖と微生物内で行われる物質の生産の切り替えることを可能とする。細胞の増殖と物質の生産を分ける事で、産業上重要な物質だが、微生物にとって有害な物質の生産を、細胞増殖後に大量に生産させることができる。また、光スイッチを用いれば、既存の恒常的な代謝改変では実現できなかった。微生物の増殖に影響を与えるような大規模な代謝改変を実現でき、生産物質量の大幅な増強を可能とする。光スイッチは、照射光の波長を変更することによって遺伝子の働きのON/OFFの切り替えを何度も行う事ができる。また、セロハンなど安価なフィルターを使用する事で、波長切り替えコストも削減できる。
【０００４】
シアノバクテリアの有する光合成のアンテナ色素（光を捕集する色素）タンパク質としては、赤色光を吸収するフィコシアニン、緑色光を吸収するフィコエリスリン、緑色光と赤色光の両方を吸収するフィコエリスロシアニンが知られている。シアノバクテリアは保有するアンテナ色素タンパク質によって、フィコシアニンのみを持つ種、フィコシアニンとフィコエリスリンを持つ種、フィコシアニンとフィコエリスロシアニンを持つ種のいずれかに大別される（非特許文献１）。
【０００５】
シアノバクテリアのアンテナ色素タンパク質の遺伝子発現を調節する機構として、CcaSタンパク質とCcaRタンパク質の組合せが知られている。CcaSタンパク質は緑色光を感知し、転写因子CcaRタンパク質を特異的にリン酸化し活性化する。Synechocsytsis sp. PCC 6803では、リン酸化されたCcaRはフィコシアニンリンカーcpcG2遺伝子のプロモーター（PcpcG2）領域に結合し発現を誘導する（非特許文献２及び３）。この、Synechocsytis sp. PCC 6803のccaS遺伝子及びccaR遺伝子の組合せ（以下、ccaS遺伝子−ccaR遺伝子という）並びにPcpcG2は、光により遺伝子発現を制御する光スイッチとして応用が進んでいる。例えば、細胞増殖に必須な遺伝子であるピルビン酸脱水素酵素のβサブユニットの発現を制御する事で、細胞の増殖を制御する技術や（特許文献１）、細胞溶菌遺伝子を制御する事で、細胞の自己溶菌を促し、細胞内の物質を抽出する技術（非特許文献６）などが開発されている。また、ccaS遺伝子−ccaR遺伝子およびPcpcG2を大腸菌へと異種発現させることで、大腸菌の遺伝子発現制御が報告され、今後幅広い生物種への応用が期待されている（非特許文献４）。
【０００６】
なお本明細書でいう光スイッチとは、緑色光の照射により物質生産が促進され（ON）、赤色光の照射により物質生産が止まる（OFF）スイッチをいう。また、プロモーターを表記する場合、大文字「Ｐ」を遺伝子を表す記号の先頭に付して使用することがある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】PCT/JP2015/005259
【特許文献２】PCT/JP2014/064017
【非特許文献１】Bryant, D.A. (1982). J. Gen. Microbiol. 128, 825-844
【非特許文献２】Hirose, Y. et al (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105:9528-9533.
【非特許文献３】Hirose, Y. et al (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107:8854-8859.
【非特許文献４】Tabor, J. J. et al (2011) J. Mol. Biol. 405:315-324.
【非特許文献５】Abe, K. et al (2013) Microb. Biotechnol. 7(2):177−183
【非特許文献６】Miyake, K. et al (2104) Biotechnol. Biofuels. 7:56.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
光スイッチの部品としてccaS遺伝子−ccaR遺伝子を用いる場合、誘導時のPcpcG2の発現強度が十分でなく、また、発現のON/OFFの切替機能が不十分であるという課題が存在している（特許文献１）。これを改善するため、例えばフィコエリスリン制御型のNostoc punctiforme ATCC 29133のccaS遺伝子を利用する方法（特許文献１）が提案されているが、ON/OFFの切替機能は大きく改善したが、誘導時の発現強度は不十分であった。またリン酸化されたCcaRタンパク質により活性化されるプロモーターPcpcG2の5’領域の配列を置換して翻訳高率を高めることで発現強度を高める方法（特許文献２）が提案されているが、ONとOFFの両方の発現強度が上昇し、ON/OFFの切替機能は改善していない（非特許文献５）。光スイッチ技術を工業的に利用するためには、十分な発現強度と、優れた発現のON/OFFの切替機能という相反する２つの性能を共に向上させる技術が必要であるが、その技術はこれまでに開発されていない。
【０００９】
本発明は、上述した問題点を解決するためになされたものであり、プロモーターのON/OFFの切替機能を向上させ、生物的な物質生産を良好に制御することのできる核酸分子とこれを用いた物質の製造方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
これまで、ccaS遺伝子−ccaR遺伝子はフィコシアニンもしくはフィコエリスリンを持つシアノバクテリアのみに存在し、フィコエリスロシアニンを持つシアノバクテリアには存在しないことが生化学的な解析から示されていた（非特許文献１）。しかしながら本発明者は上記課題を解決するため、フィコエリスロシアニンを持つシアノバクテリアのゲノム情報を網羅的に精査し、フィコエリスロシアニンを持つ一部のシアノバクテリアLeptolyngbya sp. PCC 6406、Anabaena cylindrica PCC 7122、Anabaena sp. 39865、Anabaena sp. WA 90、Nostoc azollae 0708、Pormidium sp. OSCRなどにはccaS遺伝子−ccaR遺伝子が存在する事を見出した。その中で、Leptolyngbya sp. PCC 6406の光スイッチ機能を調査した結果、本株のccaS遺伝子−ccaR遺伝子とフィコエリスロシアニンのディスクタンパク質をコードするＤＮＡのプロモーター（PpecB）を用いることで、フィコシアニンやフィコエリスリン制御型の光スイッチよりも発現強度とON/OFF性能の両方が格段に優れている事を見出したことに基づき、本発明を完成させた。
【００１１】
そして、上記目的を達成するために、請求項１記載のプロモーターは、光応答性のタンパク質により活性化されるプロモーターであって以下の（ａ）〜（ｅ）からなる群から選択されるＤＮＡを含むものである。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号５に記載の塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｃ）配列番号６に記載の塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｄ）配列番号１、５、６のいずれかに示す塩基配列において、１もしくは数個の置換、付加および／もしくは欠失を有する塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｅ）配列番号１、５、６のいずれかに示す塩基配列からなるＤＮＡと８０％以上の配列の同一性を有するＤＮＡ。
【００１２】
請求項２記載のプロモーターは、請求項１に記載のプロモーターにおいて、前記配列番号１、５、６に記載の塩基配列が、フィコエリスロシアニンを有するシアノバクテリアに由来するものである。
【００１３】
請求項３記載のプロモーターは、シアノバクテリアに由来するプロモーターであって、フィコエリスロシアニンをコードする遺伝子の開始コドン上流側領域において２００ｂｐ以内に存在し、配列番号７に示す塩基配列を含み、光応答性のタンパク質により活性化されるものである。
【００１４】
請求項４記載の遺伝子カセットは、請求項１〜３のいずれかに記載のプロモーターと、ＣｃａＳタンパク質をコードするｃｃａＳ遺伝子領域と、ＣｃａＲタンパク質をコードするｃｃａＲ遺伝子領域とを有し、ＣｃａＳタンパク質とＣｃａＲタンパク質とが光照射に起因して反応することに基づき、前記プロモーターが活性化されるものである。
【００１５】
請求項５記載の遺伝子カセットは、請求項４に記載の遺伝子カセットにおいて、前記ｃｃａＳ遺伝子領域は、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるＣｃａＳタンパク質または当該アミノ酸配列と４０％以上の同一性を有するＣｃａＳタンパク質のいずれかをコードするものであり、前記ｃｃａＲ遺伝子領域は、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるＣｃａＲタンパク質または当該アミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するＣｃａＲタンパク質のいずれかをコードするものである。
【００１６】
請求項６記載の遺伝子カセットは、請求項４又は５に記載の遺伝子カセットにおいて、前記プロモーターの下流に機能的に結合された所望の目的遺伝子を更に含んでいる。
【００１７】
請求項７記載の遺伝子カセットは、請求項６に記載の遺伝子カセットにおいて、前記目的遺伝子は、フィコエリスロシアニンをコードするものである。
【００１８】
請求項８記載の組換えベクターは、請求項３〜６のいずれかに記載の遺伝子カセットを含むものである。
【００１９】
請求項９記載の物質製造方法は、生物を用いて物質を製造する方法であって、該生物は請求項１〜３に記載のプロモーター、請求項４〜７に記載の遺伝子カセット、または請求項８記載の組換えベクターのいずれかを含むものであり、当該生物に緑色光を照射して物質生産を増大させる一方、赤色光を照射して物質生産を抑制する制御を行うことのできるものである。
【発明の効果】
【００２０】
本発明のプロモーターによれば、当該プロモーターを微生物等に備えさせた場合に、照射した光に応じて目的遺伝子の発現強化と抑制とをそれぞれ生じさせることができる。ここで、発現段階においては、本プロモーターが通常の他のプロモータ―に比べて著しく活性化され、目的遺伝子を顕著に発現させる。また、発現量を顕著に増大させる（物資生産量を大幅に向上させる）ことができる上、抑制段階においては発現を著しく抑制（不活性化）できる。その結果、発現状態と抑制状態とを大きく相違させることができ、プロモーターの活性化、即ち目的遺伝子の発現を適正に制御することができるという効果がある。
【００２１】
さらに、本発明の物質製造方法によれば、例えば、シアノバクテリア中に本発明のプロモーターを含む核酸分子を備えさせることにより、緑色光の照射により、遺伝子産物を非常に高い発現量で発現（製造）させることができる。また、赤色光の照射により適宜発現を抑制することができる。生物的な物質生産においては、間欠的に遺伝子の発現を抑制することで安定に物質生産をなしえる場合も多い。通常は、発現強化と抑制とを適宜制御することが困難であるが、本製造方法によれば、発現状態と抑制状態との発現強度のダイナミックレンジが十分に大きいので、光照射の作用によって、応答性良く両状態を切り替えることができ、物質の生産性を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明の１実施形態におけるプロモーターを含む遺伝子カセットを説明する図である。
【図２】Leptolyngbya sp. PCC 6406の遺伝子発現強度を説明する図である。
【図３】Leptolyngbya sp. PCC 6406のフィコエリスロシアニンタンパク質の生産量を、緑色光と赤色光を照射して培養した後に測定した結果を示した図である。
【図４】図４は、本発明にかかるプロモーターの性能を示す図であり、緑色光及び赤色光をそれぞれ照射した場合の遺伝子発現強度について従来のプロモーターと対比して示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下に本発明の好ましい実施形態について、添付図面を参照して説明する。以下に説明する実施形態は、本発明を例示的に説明するものであって、本発明は以下の実施形態になんら限定されるものではなく、本発明の要旨を変更しない範囲において実施される各種の変形形態も含む。なお以下で説明される構成の全てが本発明の必須構成要素であるとは限らない。
【００２４】
（１）光応答性のタンパク質により活性化されるプロモーター
プロモーターとは、転写開始反応に関与するＤＮＡの領域であって、ＲＮＡポリメラーゼや転写因子が結合する領域のことをいう。
【００２５】
本発明のプロモーターは、光照射に応じてその下流に連結された目的遺伝子を発現誘導できるものである。活性化されたプロモーターの発現誘導が強い程、目的遺伝子は強く発現してＲＮＡ転写量が増大し、コードされたタンパク質の生産量が増加する。一方で、生物的物質生産においては、生物に物質生産を間欠的に行わせることが望ましい。これにより、総合的に物質生産量を向上し得るからである。このため、物質生産を抑制（停止）させるべく、目的遺伝子の発現を抑制することが必要となる。一般に、発現と抑制との強弱差（Ｓ／Ｎ）は大きい程、物質生産に適した系となる。ここで、本発明のプロモーターは、目的遺伝子の発現誘導に非常に優れると共に、光照射によって顕著に発現抑制が可能なものとなっている。なお、塩基配列においては、アデニンを「Ａ」、グアニンを「Ｇ」、シトシンを「Ｃ」、チミンを「Ｔ」で表している。
【００２６】
本プロモ−ターは配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡである。
ATATTTGTTGCGTTCTGTAACAGATGACACATTTTCCCTGGTCTTTCCGATTTCTTTACGACTTCCGTACCGATTTTCTTACCTTTCACGCCGTAAGCTCCTAACTCATGTGGATTGAGGGCAAAACCTTCTTACACAGACCCCAGAAAAATTAGGAGACTTTACACT（配列番号１）
なお、塩基配列は５’末端から３’末端を表している。
【００２７】
また、本プロモーターは、配列番号５に記載の塩基配列からなるＤＮＡである。
TTACACATTCAATTGCGAATTGTAACGATTTTAGTTTTTCTACTAATCTTTCCGATTTATTTACAATTTCCTTACCTATTTATTTACACCAGACCCCTTAATCTTCAATCAAGGTGGGTAAAGGAAATGTCTACTTTCCAAAACCTAAAAATTTAGGAGAAATTGAA（配列番号５）
【００２８】
更に、本プロモーターは、配列番号６に記載の塩基配列からなるＤＮＡである。
AACATCTGTAAAGATTGCCGTGGTTCTACTAATCTTTCCGAATTTTTTACAAATCTCTTACCAATTTATTTACAACTAACCAATTACTCTTCTAAAGTAAGGCGGGTCAAGATAATACTCCGATACCAAAACCCAGCCAAAACCTAACAGTTTAGGAGAAATTGAAG（配列番号６）
また、本プロモータは、配列番号１、５、６のいずれかに記載の塩基配列において、１もしくは数個の置換、付加および／もしくは欠失を有する塩基配列からなるＤＮＡであるか、配列番号１、５、６のいずれかに示す塩基配列からなるＤＮＡと８０％以上の配列の同一性を有するＤＮＡである。より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上同一の塩基配列を有する。
【００２９】
以下、配列番号１、５、６に記載の塩基配列および、１もしくは数個の置換、付加および／もしくは欠失を有する塩基配列、更には、配列番号１、５、６と８０％以上の配列類似性を有するＤＮＡを含めて、本プロモ−ターをＰｐｅｃＢともいう。
【００３０】
ＰｐｅｃＢは、かかる塩基配列を有することで波長５００ｎｍ〜５６０ｎｍの範囲の光（緑色光）を照射することで目的遺伝子を発現誘導し、波長６２０ｎｍ〜７００ｎｍの範囲の光（赤色光）を照射することで目的遺伝子の発現を抑制するものとなっている。
【００３１】
本プロモーターはフィコエリスロシアニンをもつシアノバクテリアの種から調整される。かかるフィコエリスロシアニンをもつシアノバクテリアの種としては、例えば、Leptolyngbya sp. PCC 6406、Anabaena cylindrica PCC 7122、Anabaena sp. 39865、Anabaena sp. WA 90、Nostoc azollae 0708、Pormidium sp. OSCRなどが例示される。好適には、Leptolyngbya sp. PCC 6406から調製される。本プロモーターはフィコエリスロシアニンのサブユニット（ＰｅｃＢタンパク質）がコードされた遺伝子のプロモーターである。本プロモ−ターの調製に当たっては、シアノバクテリアの種類の制限はなく、フィコエリスロシアニンをもつシアノバクテリアであればよい。例えば、配列番号１の塩基配列は、Leptolyngbya sp. PCC 6406に由来し、配列番号５の塩基配列は、Anabaena cylindrica PCC 7122に由来し、配列番号６の塩基配列は、Nostoc azollae 0708に由来する。
【００３２】
ＰｐｅｃＢは、上述のように、フィコエリスロシアニンをもつシアノバクテリアの種から調整することができるが、例えば、配列番号１の塩基配列を備えた場合、緑色光を照射した際に、当該シアノバクテリアの有する全プロモーターの中で発現誘導性が最も高い群に属する高いプロモーターに分類される。更には、赤色光が照射されると目的遺伝子の発現を抑制する作用を有しており、発現状態と抑制状態とを発現物質（タンパク質）量で比較すると、その比率を１００：１程度にもすることができるのである。
【００３３】
また、本プロモーターは、上記した以外に、ｐｅｃＢを有する例えばシアノバクテリアにおいて、ｐｅｃＢ配列の開始コドン上流の２００ｂｐ以内の範囲の塩基配列であって、配列番号７に記載の塩基配列（結合モチーフ）を有するＤＮＡからなるものが含まれる。
CTTTCCGATTTC（配列番号７）
尚、かかる結合モチーフは、配列番号７に記載の塩基配列のうち、３塩基以下の変異があっても良い。例えば、１２番目の塩基は「Ｃ」に変えて「Ａ」であってよい。また、例えば、４番目の塩基が「Ａ」、７番目の塩基が「Ａ」、１２番目の塩基が「Ａ」であってよい。
【００３４】
本実施形態において、アミノ酸残基は以下すなわち：アラニン（Ａｌａ；Ａ）、アスパラギン（Ａｓｎ；Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）、アルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）、システイン（Ｃｙｓ；Ｃ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）、グルタミン（Ｇｌｎ；Ｑ）、グリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ；Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ；Ｌ）、リジン（Ｌｙｓ；Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ；Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ；Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ；Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ；Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ；Ｗ）チロシン（Ｔｙｒ；Ｙ）、およびバリン（Ｖａｌ；Ｖ）、のように略される。
【００３５】
本実施形態において、フィコエリスロシアニンは、以下のアミノ酸配列からなるフィコエリスロシアニンのサブユニット（ＰｅｃＢタンパク質）と７５％以上同一のアミノ酸配列を有するタンパク質である。
MLDAFSRVVEQADRQGSYLSDTQVNALSAMVADSNKRLDVVNRLTSNAAAITSNAYRALVADQPQVFGPGGACFHHRNQAACLRDLGFILRYVTYSMLSGDASVMDDRCLNGLRETYQALGTPGATVASGIGKMKDAALAIANDSNGITQGDCKSLMSELAGYFDRAAASVA（配列番号２）
なお、本プロモーターは、好適には、配列番号２と８０％以上同一のアミノ酸配列を有するＰｅｃＢタンパク質を含むフィコエリスロシアニンをもつシアノバクテリアから調製される。
【００３６】
（２）光応答性タンパク質
光応答性タンパク質は、ＰｐｅｃＢを活性化するタンパク質であり、かかる機能を有する限りにおいて特に制限はない。好適には、ＣｃａＳタンパク質とＣｃａＲタンパク質が上げられる。ＣｃａＳタンパク質は、ccaS遺伝子領域にコードされたタンパク質であり、緑色光に感応して自己リン酸化が生じるものである。ＣｃａＲタンパク質は、ccaR遺伝子領域にコードされたタンパク質であり、ＣｃａＳタンパク質により特異的にリン酸化され、ＰｐｅｃＢを活性化する。
【００３７】
なお、CcaSタンパク質とは、例えば、Leptolyngbya sp. PCC 6406から調製され、一例として、以下に示すアミノ酸配列または当該配列と４０％以上同一のアミノ酸配列を有するものが示される。
DLDEVLATTVAEVKQFLQADRVLIYQISEDATGSAIAEAVSSHYIAILDETFPEEVFPREYHHAYTLGKTRVIANVEQLDVEPCLAEFVQQFGVKAKLVVPILQERLEKAEPSASDPAVLPTQPQPNSAPPLTQPYLWGLLIAHQCSQPRQWHPWEVELMQQLSTQIAIAIQQSELYERLQ（配列番号３）
また、ＣｃａＲタンパク質とは、ccaR遺伝子領域にコードされたタンパク質であり、自己リン酸化されたＣｃａＳタンパク質によって特異的にリン酸化を受ける（リン酸基が転移される）タンパク質である。このリン酸化されたＣｃａＲタンパク質によって、ＰｐｅｃＢは活性化され、その下流の目的遺伝子が発現誘導されることとなる。即ち、ＣｃａＳタンパク質とＣｃａＲタンパク質との両者がＰｐｅｃＢの活性化に寄与する。
【００３８】
このＣｃａＲタンパク質は、例えば、Leptolyngbya sp. PCC 6406から調製され、一例として、以下に示すアミノ酸配列または当該配列と５０％以上同一のアミノ酸配列を有するものが示される。MRILLVEDDIPLAETLAEAMTDHLYVVDLAEDGEQGWDCVKAFDYDLMLLDVMLPETDGLTLCQRLRSHGYQIPVLMITARDTISDKITGLDAGADDYIIKPIDLGELFARIRALLRRGSNITPPILEWGDLQLNPSTYEVSYNHHPLRLTPKEFSLLELLLRNNRRVLSRSVIIEHLWKTESSPDEHTIKVHIRSLRKKLKATGADEDFIETVHSIGYRLKSL（配列番号４）
図１は、本発明の一実施形態であり、ＰｐｅｃＢの近傍にccaS遺伝子領域とccaR遺伝子領域とを備えた本発明の遺伝子カセットの一例を説明する図である。
【００３９】
本実施形態においては、遺伝子カセットは、ＰｐｅｃＢ（図１において三角の記号にて示す）の下流側にccaS遺伝子領域を有し、ＰｐｅｃＢの上流側にccaR遺伝子領域に備えて構成される。
【００４０】
ccaS遺伝子領域には、CcaSタンパク質がコードされた遺伝子（以下ccaSという。）が配置されており、本実施形態においては、ccaSには配列番号３に記載のCcaSタンパク質と４０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列がコードされている。なお、ccaSは、好ましくは配列番号３と６０％以上同一のアミノ酸配列がコードされたものであり、さらに好ましくは、８０％以上同一のアミノ酸配列がコードされたものである。
【００４１】
ccaＲ遺伝子領域には、ＣｃａＲタンパク質がコードされた遺伝子（以下ccaRという。）が配置されており、本実施形態においては、ccaRには配列番号４に記載のCcaRタンパク質と50%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列がコードされている。ccaRは、好ましくは配列番号４と７０％以上同一のアミノ酸配列がコードされたものであり、さらに好ましくは、８０％以上同一のアミノ酸配列がコードされたものである。
【００４２】
なお、配列同一性は、配列解析ソフト、具体的には、Vector NTI、GENETYX、公共のデータベース例えばNCBIや国立遺伝学研究所が運営するDDBJで提供される解析ツールを用いて測定される。これらのデータベースは、当業者には一般的に利用可能である。
【００４３】
なお、図１に示すように本遺伝子カセットにおいては、ＰｐｅｃＢの下流に目的遺伝子としてフィコエリスロシアニンをコードする遺伝子が結合されており、ｐｅｃＢの下流側に、ｐｅｃＡ、ｐｅｃＣ、ｐｅｃＥ、ｐｅｃＦ、ｃｐｃＧ２、ＩＳ４が順次連なったオペロンを備えた構造となっている。尚、かかるオペロンに対してＰｐｅｃＢがプロモーターとして作用する。このプロモーター領域は、ｐｅｃＢ配列の開始コドン上流の２００ｂｐ以内に位置している。
【００４４】
本実施形態における目的遺伝子とは、本プロモーターの下流に配置され、本プロモーターによって発現誘導される遺伝子である。このため、かかる目的遺伝子は、フィコエリスロシアニンをコードする遺伝子に限られるものではない。また、単独の遺伝子を備えたものであってもよく、複数の遺伝子で構成されていても良い。
【００４５】
更に、かかる目的遺伝子は、その由来は特に限定されず、宿主生物の内在性遺伝子であってもよいし、プラスミドベクター等による形質転換で外部から導入された外因性遺伝子であってもよい。また、目的遺伝子がコードするタンパク質についても、特に限定されず、例えば、酵素、抗体、溶菌タンパク質、細胞凝集関連タンパク質等とすることができる。
【００４６】
目的遺伝子の具体的な例としては、フィコエリスロシアニン、エタノールの生産に必要な酵素をコードするadhE、炭化水素合成関連酵素をコードするAcyl-ACP Reductase、およびAldehyde Decarbonylase、溶菌タンパク質をコードするホーリン、エンドライシン、細胞凝集関連タンパク質をコードするAntigen43、AIDA-I、tibA等を挙げることができる。目的遺伝子は、各種微生物の遺伝子の１種であってもよいし、複数種であってもよい。さらには、シアノバクテリアの遺伝子の１種であってもよいし、複数種であってもよい。
【００４７】
本実施形態でいう外因性とは、分子生物学的技法によって生物に導入した特定の遺伝子配列であり、野生型の細胞または生物のゲノムＤＮＡ中に存在するものと区別するために用いる。野生型の細胞または生物において、ゲノム中に存在するか否かを問わず、ゲノム中に存在する配列を、分子生物学的技法により導入した場合においても、外因性遺伝子とする。また内在性は、所定の野生型の細胞または生物中に見つかり得る、ゲノムＤＮＡ中に存在する遺伝子配列をいう。
【００４８】
（３）目的遺伝子の発現
本実施形態において目的遺伝子の発現は、遺伝子カセットを用いて行われ、微生物を宿主として目的遺伝子を発現させる。具体的には、緑色光照射によって、ＣｃａＳタンパク質の自己リン酸化が生じ、次いで、このＣｃａＳタンパク質によって特異的にリン酸化されたＣｃａＲタンパク質にてＰｐｅｃＢは活性化され、その下流の目的遺伝子が発現誘導されることとなる。そして、目的とするタンパク質が生産される。
【００４９】
なお、目的遺伝子の開始コドンの上流側に、発現調節配列が挿入されていてもよい。発現調節配列は、上述のプロモーターとして機能する塩基配列の下流側であって、上述の目的遺伝子の開始コドンの上流側に、定法により、挿入することができる。発現調節配列は、特定のＤＮＡ配列としてもよい。例えば、発現調節配列は、特定の遺伝子の開始コドンの上流の５’非翻訳領域の塩基配列とすることができる。発現調節配列を特定の遺伝子の５’非翻訳領域の塩基配列とすることにより、目的遺伝子の発現量を増大させることができる場合がある。
【００５０】
また本実施形態の目的遺伝子の発現に当たって、宿主微生物を培養する条件は、微生物が生存できる条件であれば特に制限されず、微生物に合わせて適宜選択される。培地についても特に制限はなく、固形培地、液体培地等を使用することができる。培養の条件についても特に制限されず、公知の条件にしたがう。なお宿主微生物としては、好適には、シアノバクテリアが選択される。培養するシアノバクテリアは、下記（４）記載の遺伝子発現カセットを含む組換えベクターの形質転換体でもよく、培養の条件としては、シアノバクテリアが生存できる条件であれば特に制限されず、シアノバクテリアに合わせて適宜選択される。培地についても特に制限はなく、固形培地、液体培地等を使用することができる。培養の条件についても特に制限されず、公知の条件にしたがう。
【００５１】
培養の際には、培地温度、培地濃度、組成を変化させたり、種々の波長の光を照射したりすることを含んでもよい。また、本実施形態において、光により発現が誘導されるプロモーターの場合には、その特性に応じた波長域の光を照射してもよく、複数の互いに異なる波長域の光を照射してもよい。
【００５２】
（４）遺伝子発現カセットを含む組換えベクター
遺伝子発現カセットを含むプラスミドベクターを調製することにより、組換えベクターとして種々の微生物で発現させることが可能な組替えベクターを提供する。本ベクターにより微生物の形質転換を行い、緑色光を照射する光照射によって、目的遺伝子を発現させ、目的とするタンパク質を製造することができる。また、赤色光を照射することによって目的遺伝子の発現を抑制することができる。本実施形態の目的遺伝子の発現において、本ベクターと外因性遺伝子を共発現させてもよい。外因性遺伝子を共発現させると、目的遺伝子の発現量を増大させることができる場合がある。共発現させる外因性遺伝子としては、導入することによって宿主の微生物が生存できる限り任意である。共発現させる外因性遺伝子は、同一の本組替えベクターによって宿主に導入されてもよいし、それぞれ別個の本組替えベクター宿主に導入されてもよい。宿主内では本組替えベクターと他のベクターが共存してもよい。
【００５３】
本組替えベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、宿主の種類および使用目的により適宜選択される。本組替えベクターは、天然に存在するＤＮＡを抽出して得られたベクターＤＮＡの他、複製に必要な部分以外のＤＮＡの部分が一部欠落しているベクターＤＮＡでもよい。代表的なベクターＤＮＡとしては例えば、プラスミド、バクテリオファージおよびウイルス由来のベクターＤＮＡを挙げることができる。本実施形態で使用するベクターの具体例としては、例えば、ＲＳＦ１０１０、ｐＫＴ２３０、ｐＢＢＲ１２２等が挙げられる。また、プラスミドベクターの構築にあたっては、適宜の制限酵素を用いることができ、ＰＣＲ、インバースＰＣＲ、クローニング、リン酸化、脱リン酸化、二本鎖処理、ライゲーション等の処理を行うことができる。
【００５４】
微生物の形質転換体の調製に当たっては、大腸菌等の微生物のほか、宿主としてシアノバクテリアを形質転換することを含んでもよい。形質転換は、分子生物学的な一般的な手法、エレクトロポレーション等、適宜選択して行うことができる。
【００５５】
（５）目的遺伝子からの目的物質の製造方法
本実施形態の目的物質の製造方法は、目的物質を産生する能力を有する微生物を培地中に、緑色光および赤色光の照射により培養し、当該目的物質を生成させ、当該目的物質を採取することを含む。
【００５６】
また本実施形態の目的物質の製造方法は、目的物質を産生する能力を有するシアノバクテリアを培地中に、緑色光および赤色光の照射により培養し、当該目的物質を生成させ、当該目的物質を採取することを含む。
【００５７】
本実施形態の目的遺伝子から製造される目的物質としては、バイオ燃料に関連する化合物（水素、エタノール、セルロース、２，３ブタンジオール、イソブチルアルデヒド、アルカン、アルケン、脂肪酸、トリグリセリド等）、バイオプラスチック（ポリヒドロキシ酪酸等）、酵素（グルコース脱水素酵素、ルシフェラーゼ等）、外来タンパク質産物（細胞凝集関連タンパク質、溶菌関連タンパク質等）、アミノ酸、ヌクレオシド、ヌクレオチド、ビタミン等が挙げられる。また、目的物質は、目的遺伝子の発現によって生じるタンパク質等であってもよいし、目的遺伝子の発現によって生じるタンパク質（酵素等）が触媒する反応等によって生じる物質であってもよい。
【００５８】
微生物や培養液等の培養物からの目的物質の採取は、通常には、イオン交換樹脂法、沈澱法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施することができる。
【００５９】
（６）遺伝子カセットを有する微生物
微生物としては真核生物、原核生物が上げられる。藻類、原生生物、菌類、粘菌が含まれ、クロレラ、クラミドモナス、酵母、大腸菌、シアノバクテリア等であればよい。
【００６０】
（７）遺伝子カセットを有するシアノバクテリア
一般にシアノバクテリアは、光合成を行うことができる原核生物であり、真正細菌ドメインの一門を構成する。本実施形態の目的遺伝子の発現の制御方法は、シアノバクテリアを宿主として該目的遺伝子の発現を制御してもよい。
【００６１】
本実施形態において宿主として使用するシアノバクテリアとしては、Leptolyngbya sp. PCC 6406、Anabaena cylindrica PCC 7122、Anabaena sp. 39865、Anabaena sp. WA 90、Nostoc azollae 0708、Pormidium sp. OSCR、Synechocystis sp. PCC6803、Nostoc punctiforme PCC 73102、Synechococcus sp. NKBG15041c、Synechococcus sp. PCC7002、Synechococcus elongatus PCC7942、Thermosynechococcus elongatusBP-1、Synechococcus sp. JA-3-3Ab、Chroococcacae、Stigonematacae、Mastigocladacae、Oscillatroriacae、Mastigocladus、Phormidium、Symploca、Aphanocapsa、Fisherella、等を例示することができる。
【００６２】
これらのシアノバクテリアのうち、Leptolyngbya sp. PCC 6406、Synechocystis sp. PCC6803、Nostoc punctiforme PCC 73102、Synechococcus sp. NKBG15041c、Synechococcus sp. PCC7002、Synechococcus elongatus PCC7942、Thermosynechococcus elongatus BP-1、およびSynechococcus sp.JA-3-3Abからなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましい。また、本実施形態で宿主として使用するシアノバクテリアは、Leptolyngbya sp. PCC 6406、Anabaena cylindrica PCC 7122、Anabaena sp. 39865、Anabaena sp. WA 90、Nostoc azollae 0708、Pormidium sp. OSCR、Synechocystis sp. PCC6803、および／またはNostoc punctiforme PCC 73102であることがより好ましい。
【実施例】
【００６３】
以下、実施例に基づいて本発明を詳述する。本発明は、その要旨を超えない限り、これらの実施例に制約されるものではない。また異なる実施形態に開示された技術的要素を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本開示に係る実施形態の範囲に含まれる。
【００６４】
（実施例１）
シアノバクテリアLeptolyngbya sp. PCC 6406のフィコエリスロシアニンタンパク質の生産量を、緑色光と赤色光を照射する事で調節した。
【００６５】
Leptolyngbya sp. PCC 6406を以下のＢＧ１１液体培地とＡＳＮIII液体培地を９：１で混ぜた液体培地で培養した。それぞれの培地成分は以下の通り。
【００６６】
＜ＢＧ１１液体培地＞
NaNO3             150 mg
K2HPO4・3H2O       4 mg
MgSO4・7H2O        7.5 mg
CaCl2・2H2O        3.6 mg
Citric acid       0.6 mg
Ferric ammonium citrate 0.6 mg
Na2EDTA−Mg       0.1 mg
Na2CO3             2 mg
Trace metal mix   0.1 mL
1M HEPES-NaOH pH 7.8    2 mL 
Distilled water to 100 mL
＜ＡＳＮIII液体培地＞
NaCl        25.0 g
MgSO4・7H2O 3.5 g
MgCl2・6H2O 2.0 g
NaNO3       0.75 g
K2HPO4・3H2O 0.75 g
CaCl2・2H2O  0.5 g
KCl         0.5 g
NaCO3       0.02 g
Citric acid 3.0 mg
Ferric ammonium citrate 3.0 mg
Mg EDTA     0.5 mg
Vitamin B12  10.0 μg
Trace metal mix   1.0 ml
Distilled water to      1.0 L
＜Trace metal mix＞
H3BO3              286 mg
MnCl2・4H2O        181 mg
ZnSO4・7H2O        22.2 mg
Na2MoO4・2H2O 39 mg
CuSO4・5H2O        7.9 mg
Co(NO3)2・6H2O           4.9 mg
Distilled water to      100 mL
培養温度は２６℃、１％ＣＯ２を含む空気で通気した。緑色光として２５μＥm−２s−１の緑色蛍光灯（極光電気製）、赤色光として１５μＥm−２s−１の赤色蛍光灯（極光電気製）を使用した。蛍光灯の輝線を除くため、ＲＧＢカラーパイプグリーンおよびレッド（パナソニック製）を使用した。連続明条件で、一週間ほど培養を行い、細胞の吸収スペクトルを積分球測定ユニット（ＩＳＶ−７２２、日本分光）を備えた分光光度計（Ｖ−６５０、日本分光）によって測定し、フィコエリスロシアニンの検出を行った。図３に示す通り、緑色光下で培養した細胞では、586 nmと628 nmのフィコエリスロシアニンの吸収ピークが観測されたが、赤色光下で培養した細胞では629 nmのフィコシアニンのピークのみが観測され、フィコエリスロシアニンは観測されなかった。
【００６７】
続いて、培養中の細胞からＲＮＡを調製し、Ｔｒｕｓｅｑ  Ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｍＲＮＡ  Ｐｒｅｐ  ｋｉｔによって次世代シークエンサー用ライブラリーを調製した。調製したライブラリの片側５０塩基を次世代シークエンサーＭｉＳｅｑによってシークエンスを行った。得られたリードデータを、Leptolyngbya sp. PCC 6406の参照ゲノム配列（アクセッションＮｏ）に対してソフトウェアＢＷＡを用いてマッピングし、遺伝子あたりにマップされたリード数をソフトウェアＨｔｓｅｑで定量し、全遺伝子にマップされたリード数で正規化し、遺伝子発現強度とした。３反復を平均して得られたデータを図２に示す。
【００６８】
図２においては、横軸は緑色光照射下における遺伝子発現強度を示し、縦軸は赤色光照射下での遺伝子発現強度を示している。図２中の各点によって各遺伝子の発現強度が示されており、図１において示した遺伝子についてはその名称を表示している。図２からもわかるように、大部分の遺伝子は、緑色光照射した場合と赤色光照射した場合において発現強度に大差がないため、グラフの対角線上に集中している。一方で、本発明にかかるプロモータにて発現誘導される遺伝子（pecB）は対角線から最も離れた距離にあり、PｐｅｃＢによって発現と抑制とがダイナミックに制御されることが示されている。
【００６９】
従来型のフィコエリスロシアニン調節型のCcaSとCcaRによって調節されるPｐｅｃＢは、ONとOFFの遺伝子の発現の差が１５００倍であった。また、PｐｅｃＢの遺伝子発現強度は、Leptolyngbya sp. PCC ６４０６の中で最大であり、光合成反応中心遺伝子プロモーターPｐｓａＡをも上回ることが示された。これにより、PcpcG2よりも10倍以上の転写レベルの向上を達成した（図４参照）。尚、図４（ａ）は、緑色光を照射した場合の遺伝子発現強度を従来のプロモーターと対比して示しており、図４（ｂ）は、緑色光及び赤色光をそれぞれ照射した場合の遺伝子発現の差を、従来のプロモーターと対比して示した図である。図４（ａ）、図４（ｂ）共に、本発明にかかるプロモーターの実験結果は右端の棒グラフにて示されている。また、黒の棒グラフは緑色光照射時の遺伝子発現強度であり、白の棒グラフは赤色光照射時の遺伝子発現強度である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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