(57)【要約】【課題】タンパク質や核酸等の生体関連物質の非特異吸着が少なく、診断や検出等の際に高いＳ／Ｎ比を発現可能なプローブ結合担体および該担体の製造方法を提供すること。【解決手段】トシル基を有する担体とプローブとを混合する工程１と、担体表面のトシル基量を減少させる工程２とを含み、前記工程１で用いる担体表面のトシル基１個あたりが占める面積Ｓ１Ａに対する、前記工程２で得られた担体表面のトシル基１個あたりが占める面積Ｓ２の割合（Ｓ２／Ｓ１Ａ×１００％）が、１４０％以上である、プローブ結合担体の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
トシル基を有する担体とプローブとを混合する工程１と、
担体表面のトシル基量を減少させる工程２とを含み、
前記工程１で用いる担体表面のトシル基１個あたりが占める面積Ｓ１Ａに対する、前記工程２で得られた担体表面のトシル基１個あたりが占める面積Ｓ２の割合（Ｓ２／Ｓ１Ａ×１００％）が、１４０％以上である、
プローブ結合担体の製造方法。
【請求項２】
前記工程１が、硫酸アンモニウムの存在下で前記担体とプローブとを混合する工程である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記工程１で得られた担体表面のトシル基１個あたりが占める面積Ｓ１Ｂに対する、前記工程２で得られた担体表面のトシル基１個あたりが占める面積Ｓ２の割合（Ｓ２／Ｓ１Ｂ×１００％）が、１１０％以上である、請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記工程１が、
トシル基を有する担体と硫酸アンモニウムとを混合する工程１ａ、および、
該工程１ａの後、プローブを混合する工程１ｂを含む、
請求項１〜３のいずれか１つに記載の製造方法。
【請求項５】
前記担体が磁性粒子である、請求項１〜４のいずれか１つに記載の製造方法。
【請求項６】
前記磁性粒子がコアシェル構造を有する、請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
前記磁性粒子の体積平均粒子径が、０．１〜２０μｍである、請求項５または６に記載の製造方法。
【請求項８】
前記工程１が、硫酸アンモニウムを含む液体中で担体とプローブとを混合する工程であり、担体とプローブとが接触する際の液体中の硫酸アンモニウム濃度が２．０ｍｏｌ／Ｌ以下である、請求項１〜７のいずれか１つに記載の製造方法。
【請求項９】
前記工程１が、液体中で担体とプローブとを混合する工程であり、該液体のｐＨが６〜１２である、請求項１〜８のいずれか１つに記載の製造方法。
【請求項１０】
前記工程１で用いる担体表面のトシル基１個あたりが占める面積Ｓ１Ａが、５Å2／トシル基以上である、請求項１〜９のいずれか１つに記載の製造方法。
【請求項１１】
前記プローブがタンパク質または核酸である、請求項１〜１０のいずれか１つに記載の製造方法。
【請求項１２】
前記工程１における混合時間が２時間以上である、請求項１〜１１のいずれか１つに記載の製造方法。
【請求項１３】
前記工程２が、工程１で得られた担体とブロッキング剤とを混合するか、または、担体表面のトシル基を加水分解反応する工程であり、該混合時間または反応時間が２時間以上である、請求項１〜１２のいずれか１つに記載の製造方法。
【請求項１４】
トシル基を有する担体にプローブを結合したプローブ結合担体であって、
該プローブ結合担体表面のトシル基１個あたりが占める面積が１５Å2／トシル基以上である、
プローブ結合担体。
【請求項１５】
ブロッキング剤が共有結合している、請求項１４に記載のプローブ結合担体。
【請求項１６】
プローブ結合前の担体表面のトシル基１個あたりが占める面積Ｓ１Ａ'に対する、プローブ結合担体表面のトシル基１個あたりが占める面積Ｓ２'の割合（Ｓ２'／Ｓ１Ａ'×１００％）が、１４０％以上である、請求項１４または１５に記載のプローブ結合担体。
【請求項１７】
体外診断薬用または生体関連物質検出用である、請求項１４〜１６のいずれか１つに記載のプローブ結合担体。
【請求項１８】
請求項１４〜１６のいずれかに１つに記載のプローブ結合担体を用いる、標的物質を検出または分離する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プローブ結合担体の製造方法、プローブ結合担体および標的物質を検出または分離する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
有機ポリマー粒子および磁性粒子等の担体は、例えば、感染症・癌マーカー・ホルモン等の標的物質（検査対象物質）の検出を行うため、抗原抗体反応を利用した診断薬の反応固相などとして用いられている。例えば、このような診断薬においては、抗体または抗原等の検査用プローブ（一次プローブ）が担体上に固定化される。サンプル中の検査対象物質は一次プローブを介して担体上に捕捉された後、第二の検査プローブ（二次プローブ）と反応する。二次プローブが蛍光物質や酵素で標識等されていれば、蛍光や酵素反応等によって検出を行うことができる。
【０００３】
近年、疾病の早期発見等の目的のため、検査の高感度化が求められており、診断薬の感度向上は大きな課題となっている。担体を用いた診断薬においても、感度向上のため、検出法として酵素発色を用いる方式から、より高い感度が得られる蛍光や化学発光を用いる方式へと切り替わりつつある。
【０００４】
このような用途における前記担体としては、例えば、表面にトシル基を有する磁性粒子が知られている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平３−４６５６５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
前記特許文献に記載の磁性粒子等の従来の担体は、該担体を用いた診断や検出等の際のシグナル／ノイズ（Ｓ／Ｎ）比が十分ではなく、この点で改良の余地があった。
本発明の目的は、タンパク質や核酸等の生体関連物質の非特異吸着が少なく、診断や検出等の際に高いＳ／Ｎ比を発現可能なプローブ結合担体および該担体の製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、前記課題を解決すべく鋭意検討した結果、下記構成例によれば前記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明の構成例は以下の通りである。
【０００８】
＜１＞  トシル基を有する担体とプローブとを混合する工程１と、
担体表面のトシル基量を減少させる工程２とを含み、
前記工程１で用いる担体表面のトシル基１個あたりが占める面積Ｓ１Ａに対する、前記工程２で得られた担体表面のトシル基１個あたりが占める面積Ｓ２の割合（Ｓ２／Ｓ１Ａ×１００％）が、１４０％以上である、
プローブ結合担体の製造方法。
【０００９】
＜２＞  前記工程１が、硫酸アンモニウムの存在下で前記担体とプローブとを混合する工程である、＜１＞に記載の製造方法。
【００１０】
＜３＞  前記工程１で得られた担体表面のトシル基１個あたりが占める面積Ｓ１Ｂに対する、前記工程２で得られた担体表面のトシル基１個あたりが占める面積Ｓ２の割合（Ｓ２／Ｓ１Ｂ×１００％）が、１１０％以上である、＜１＞または＜２＞に記載の製造方法。
【００１１】
＜４＞  前記工程１が、
トシル基を有する担体と硫酸アンモニウムとを混合する工程１ａ、および、
該工程１ａの後、プローブを混合する工程１ｂを含む、
＜１＞〜＜３＞のいずれかに記載の製造方法。
【００１２】
＜５＞  前記担体が磁性粒子である、＜１＞〜＜４＞のいずれかに記載の製造方法。
＜６＞  前記磁性粒子がコアシェル構造を有する、＜５＞に記載の製造方法。
＜７＞  前記磁性粒子の体積平均粒子径が、０．１〜２０μｍである、＜５＞または＜６＞に記載の製造方法。
【００１３】
＜８＞  前記工程１が、硫酸アンモニウムを含む液体中で担体とプローブとを混合する工程であり、担体とプローブとが接触する際の液体中の硫酸アンモニウム濃度が２．０ｍｏｌ／Ｌ以下である、＜１＞〜＜７＞のいずれかに記載の製造方法。
＜９＞  前記工程１が、液体中で担体とプローブとを混合する工程であり、該液体のｐＨが６〜１２である、＜１＞〜＜８＞のいずれかに記載の製造方法。
【００１４】
＜１０＞  前記工程１で用いる担体表面のトシル基１個あたりが占める面積Ｓ１Ａが、５Å2／トシル基以上である、＜１＞〜＜９＞のいずれかに記載の製造方法。
【００１５】
＜１１＞  前記プローブがタンパク質または核酸である、＜１＞〜＜１０＞のいずれかに記載の製造方法。
【００１６】
＜１２＞  前記工程１における混合時間が２時間以上である、＜１＞〜＜１１＞のいずれかに記載の製造方法。
＜１３＞    前記工程２が、工程１で得られた担体とブロッキング剤とを混合するか、または、担体表面のトシル基を加水分解反応する工程であり、該混合時間または反応時間が２時間以上である、＜１＞〜＜１２＞のいずれかに記載の製造方法。
【００１７】
＜１４＞  トシル基を有する担体にプローブを結合したプローブ結合担体であって、
該プローブ結合担体表面のトシル基１個あたりが占める面積が１５Å2／トシル基以上である、
プローブ結合担体。
【００１８】
＜１５＞  ブロッキング剤が共有結合している、＜１４＞に記載のプローブ結合担体。
【００１９】
＜１６＞  プローブ結合前の担体表面のトシル基１個あたりが占める面積Ｓ１Ａ'に対する、プローブ結合担体表面のトシル基１個あたりが占める面積Ｓ２'の割合（Ｓ２'／Ｓ１Ａ'×１００％）が、１４０％以上である、＜１４＞または＜１５＞に記載のプローブ結合担体。
【００２０】
＜１７＞  体外診断薬用または生体関連物質検出用である、＜１４＞〜＜１６＞のいずれかに記載のプローブ結合担体。
【００２１】
＜１８＞  ＜１４＞〜＜１６＞のいずれかにに記載のプローブ結合担体を用いる、標的物質を検出または分離する方法。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、タンパク質や核酸等の生体関連物質の非特異吸着が少なく、プローブ活性が高いプローブ結合担体を容易に得ることができ、また、診断や検出等の際、特に化学発光免疫測定（ＣＬＩＡ）、化学発光酵素免疫測定（ＣＬＥＩＡ）、生物発光酵素免疫測定（ＢＬＥＩＡ）や電気化学発光免疫測定（ＥＣＬＩＡ）等のイムノアッセイの際に該担体を用いることで、Ｓ／Ｎ比の高い結果を得ることができる（診断や検出等を高感度化することができる）。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明に係る好適な実施形態について詳細に説明する。なお、本発明は、以下に記載された実施形態のみに限定されるものではなく、本発明の要旨を変更しない範囲において実施される各種の変形例も含むものとして理解されるべきである。なお、本明細書において、数値範囲を表す「Ａ〜Ｂ」等の記載は、「Ａ以上、Ｂ以下」と同義であり、ＡおよびＢをその数値範囲内に含む。
また、本明細書において、「〜（メタ）アクリレート」とは、「〜アクリレート」および「〜メタクリレート」の双方を包括する概念である。同様の記載は、同様の意味を有する。
【００２４】
≪プローブ結合担体の製造方法およびプローブ結合担体≫
本発明に係るプローブ結合担体の製造方法（以下「本方法」ともいう。）は、
トシル基を有する担体とプローブとを混合する工程１と、
担体表面のトシル基量を減少させる工程２とを含み、
前記工程１で用いる担体表面のトシル基１個あたりが占める面積Ｓ１Ａに対する、前記工程２で得られた担体表面のトシル基１個あたりが占める面積Ｓ２の割合（Ｓ２／Ｓ１Ａ×１００％）が、１４０％以上である。
【００２５】
本発明に係るプローブ結合担体は、トシル基を有する担体にプローブを結合した担体であって、表面のトシル基１個あたりが占める面積Ｓ２'が１５Å2／トシル基以上の担体である。
該プローブ結合担体の製造方法は特に制限されず、従来公知の方法であってもよいが、本方法であることが好ましい。
【００２６】
＜工程１＞
前記工程１は、トシル基を有する担体とプローブとを混合すれば特に制限されないが、担体とプローブとが容易に接触して、所望のプローブ結合担体を容易に得ることができる等の点から、液体中で前記担体とプローブとを混合する工程であることが好ましい。この場合、前記担体とプローブとの混合物に液体を添加して混合してもよく、プローブの分散液やプローブを含む試料に前記担体を添加して混合してもよいが、前記担体の分散液にプローブを添加して混合することが好ましい。
【００２７】
前記混合の方法としては特に制限されず、液体中で前記担体とプローブとを混合する場合には、静置するだけでもよく、撹拌等してもよい。
【００２８】
前記工程１における混合時間は、用いる担体やプローブの種類、量等により変化するが、プローブが十分に結合したプローブ結合担体を容易に得ることができる等の点から、好ましくは２時間以上、より好ましくは６時間以上、特に好ましくは８時間以上である。また、効率よくプローブ結合担体を作製できる等の点から、好ましくは４８時間以下、より好ましくは３６時間以下、特に好ましくは２４時間以下である。
【００２９】
前記工程１は、室温で行ってもよく、加熱等の下で行ってもよい。
該加熱の際の温度としては、用いる担体やプローブの種類等により適宜選択すればよいが、プローブ活性を保ちつつ、効率よくプローブ結合担体を作製できる等の点から、好ましくは４〜５０℃、より好ましくは２０〜４５℃、特に好ましくは３５〜４０℃である。
【００３０】
また、前記工程１が、液体中で担体とプローブとを混合する工程である場合、担体へのプローブ結合量を高める等の点から、該液体のｐＨは、好ましくは６〜１２、より好ましくは７〜１１、特に好ましくは８〜１０である。
【００３１】
前記工程１は、通常大気中で行われるが、用いる担体やプローブ等に応じて、不活性ガス雰囲気などの特定のガス雰囲気下や、グローボックス等の特定の容器や装置内で行ってもよい。
【００３２】
前記工程１は、硫酸アンモニウム（硫安）存在下で前記担体とプローブとを混合する工程であることが好ましい。
前記担体とプローブとを混合する際の系中に硫安が存在することで、前記担体へのプローブ結合量が増加し、特に、プローブとして親水性が高いプローブを用いる場合には、担体とプローブとの結合量が低下しやすいが、塩析によるタンパク質等の疎水化により、このようなプローブを用いた場合でも、前記担体へのプローブ結合量が多いプローブ結合担体を容易に得ることができる。
【００３３】
前記工程１は、前記担体と硫安とを混合する工程１ａ、および、該工程１ａの後、プローブを混合する工程１ｂを含む工程であることが好ましい。斯かる工程によれば、プローブが局所的に高濃度の硫安に晒されることを抑制できるため、プローブが沈殿や凝集し難く、より均一に担体に結合させることができるため、得られる担体を用いた診断や検出等の際に低ノイズ、高シグナルを発現できる。
【００３４】
また、前記工程１は、前記と同様の理由から、硫安を含む液体中で担体とプローブとを混合する工程であることが好ましい。この場合、担体とプローブとが接触する際の液体中の硫安濃度は、プローブの親水性に応じて調整すればよく、特に限定されないが、好ましくは２．０ｍｏｌ／Ｌ以下、より好ましくは０．１〜２．０ｍｏｌ／Ｌ、特に好ましくは０．２〜１．０ｍｏｌ／Ｌである。
硫安濃度が前記下限未満の場合、担体に十分な量のプローブを結合できない恐れがあり、このために、得られる担体を用いた診断や検出等の際のシグナルの低下を招く場合があり、硫安濃度が前記上限を超える場合、プローブが沈殿や凝集しやすくなり、得られる担体を用いた診断や検出等の際のシグナルの低下を招く場合がある。
【００３５】
一般的にトシル基で保護された水酸基とプローブのアミノ基等とを結合させる場合、プローブの親水性が低く、担体表面と相互作用しやすい場合には硫安は低濃度または不要だが、親水性が高いプローブを使用する場合には担体への結合効率は著しく低下することが分かった。親水性が高いプローブを使用する場合、プローブの担体への結合効率を高めるためにプローブの親水性を低下させ、担体表面と相互作用しやすいようにする必要があるが、硫安濃度が前記範囲にあることで、十分な量のプローブの結合が完了するまでの時間、プローブが沈殿し難いため好ましい。また、硫安濃度が前記範囲にあることで、プローブが変性したり凝集したりすることを抑制できるため、プローブが十分に結合した、プローブの有する特性が損なわれない（プローブ活性が高い）プローブ結合担体を容易に得ることができ、診断や検出等の際、特にＣＬＩＡ、ＣＬＥＩＡ等のイムノアッセイの際に該担体を用いることで、Ｓ／Ｎ比の高い結果を得ることができる（診断や検出等を高感度化することができる）。
【００３６】
前記工程１を液体中で行う場合、該液体としては特に制限されず、用いる担体やプローブに応じて選択すればよいが、生化学用途等に好適に使用することができ、環境に対して悪影響を及ぼす程度が低くなり、取扱作業者に対する安全性も高くなる等の点から、通常、水系媒体が用いられる。より具体的には、各種緩衝液、水、水と任意の割合で混和するアルコール等の有機溶剤と水との混合溶媒等が用いられる。これらの中でも緩衝液が好ましい。緩衝液としてはｐＨ６〜１２で緩衝能を有する緩衝液が好ましく、ｐＨ７〜１１で緩衝能を有する緩衝液がより好ましく、ｐＨ８〜１０で緩衝能を有する緩衝液が特に好ましい。また、このような緩衝液としては、トシル基と反応する成分を含まないことが好ましく、例えばホウ酸ナトリウム緩衝液が挙げられる。
前記水系媒体としては、水を含有すれば特に制限されず、１種または２種以上の水以外の非水媒体を含んでいてもよい。
【００３７】
また、前記液体には、前記担体、プローブ、硫安および水系媒体の他に、従来公知の添加剤が含まれていてもよく、このような添加剤としては、例えば、界面活性剤、分散剤、ｐＨ調整剤、塩類、高分子ポリマーなどの安定化剤が挙げられる。
【００３８】
〈トシル基を有する担体〉
前記担体は、トシル基をその表面に有すれば特に制限されない。該トシル基を有する担体は、通常、プローブと混合または接触させるだけで、プローブを担体の表面に化学的に結合させることができるため、トシル基を有する担体が好適に用いられる。また、担体がトシル基を有することで、縮合剤等を用いなくても、該担体とプローブとを結合させることができるため、該担体を用いることで、簡便に診断や検出等を行うためのプローブ結合担体を容易に得ることができる。
前記工程１で用いる担体は、２種以上であってもよいが、通常は１種である。
なお、本発明においてトシル基とは、ｐ−トルエンスルホニル基のことをいう。
【００３９】
前記担体の形状は特に限定されず、粒子状、プレート状、フィルター状、シート状等のいずれでも構わないが、粒子状が好ましい。粒子状の担体としては、有機ポリマーから構成される粒子、無機材料から構成される粒子、または、その両方を含む粒子が挙げられる。これらの中でも、軽量であり、所望の粒子を容易に形成できる等の点から、有機ポリマーを含む有機ポリマー粒子が好ましい。
【００４０】
前記有機ポリマー粒子は、架橋重合体であっても非架橋重合体であってもよいが、架橋重合体を少なくとも表面に有する粒子が好ましい。この架橋重合体による架橋構造によって、液体中で本方法を行う場合の、液体への粒子の溶解、または、該液体による粒子表面の膨潤を抑制することができる。有機ポリマー粒子において、架橋重合体を少なくともその表面に有さない場合であって、液体中で本方法を行う場合、該液体に粒子表面が溶解し、結合したプローブが脱離して感度低下を招く場合があり、または、該液体により粒子表面が膨潤して生体関連物質の非特異吸着を増加させる場合がある。
なお、本発明における「少なくとも粒子表面に有する」とは、粒子表面を構成する成分を指し、有機ポリマー粒子が必ずしもコアシェル構造を有することを要件とするわけではない。従って、前記有機ポリマー粒子全体が架橋重合体であってもよい。
【００４１】
前記担体としては、磁性体を有する磁性粒子が好ましい。前記担体として磁性粒子を用いることで、該担体に結合した成分とそれ以外の成分とを除去等することが容易となるため、診断、検出、分離等の操作を大幅に簡略化できる。
【００４２】
前記磁性粒子としては、具体的には、以下の（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれかの粒子が挙げられる。これらの中でも、粒径や磁性体含量を容易に調整できる等の点から、コアシェル構造を有する下記（ｉｉ）または（ｉｉｉ）の粒子が好ましく、（ｉｉｉ）の粒子がより好ましい。
（ｉ）有機ポリマーを含む連続相やシリカ等の無機材料中に磁性体粒子が分散している粒子
（ｉｉ）磁性体粒子または磁性体粒子の２次凝集体をコアとし、有機ポリマーやシリカ等の無機材料をシェルとする粒子
（ｉｉｉ）有機ポリマーやシリカ等の無機材料からなる核粒子と、該核粒子の表面に設けられた磁性体粒子を含む磁性体層（２次凝集体層）とを有する母粒子をコアとし、有機ポリマーを含む層をシェルとする粒子
（ｉｖ）粒子の最外層に有機ポリマーを含む層がシェルとして設けられていてもよい、有機ポリマーや無機材料からなる多孔質粒子の孔内に磁性体粒子が分散している粒子
【００４３】
前記有機ポリマーとしては特に限定されず、アガロース、デキストラン、セルロース等の天然高分子でもよく、合成高分子でもよい。前記有機ポリマーとしては、単官能性モノマーおよび架橋性モノマーから選ばれる１種または２種以上に由来するポリマーが挙げられる。
【００４４】
単官能性モノマーとしては、例えば、スチレン、α−メチルスチレン、ハロゲン化スチレン等の単官能性芳香族ビニル系モノマー；メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ステアリル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、イソボルニル（メタ）アクリレート、２−アミノエチル（メタ）アクリレート、１，４−シクロヘキサンジメタノールモノ（メタ）アクリレート等の単官能性（メタ）アクリレート系モノマー；グリシジル（メタ）アクリレート、アリルグリシジルエーテル、３，４−エポキシシクロヘキシル（メタ）アクリレート、メチルグリシジル（メタ）アクリレート等のグリシジル基含有モノマー；２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリルアミド、２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリルアミド、２−ヒドロキシブチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシブチル（メタ）アクリルアミド、グリセロールモノ（メタ）アクリレート、グリセロールモノ（メタ）アクリルアミド等の水酸基含有モノマーが挙げられる。
【００４５】
架橋性モノマーとしては、例えば、ジビニルベンゼン等の多官能性芳香族ビニル系モノマー；エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールヘキサ（メタ）メタクリレート、アリル（メタ）アクリレート等の多官能性（メタ）アクリレート系モノマー；ブタジエン、イソプレン等の共役ジオレフィンが挙げられる。
【００４６】
前記有機ポリマーとしては、担体表面に容易にトシル基を導入できる等の点から、グリシジル基含有モノマーおよび水酸基含有モノマーから選ばれる１種または２種以上を用いることが好ましい。
【００４７】
以下、（ｉｉｉ）の粒子について説明する。
【００４８】
前記核粒子は、基本的に非磁性物質であり、有機物質および無機物質のいずれも使用可能であり、プローブ結合担体の使用目的等によって適宜選択することができるが、複合化の際の加工性、軽量性等の点から有機ポリマーからなる粒子が好ましい。
前記核粒子を構成する有機ポリマーとしては、ビニル系ポリマーが好ましく、より好ましくは、架橋ポリスチレン、架橋アクリレート、架橋ポリメチルメタクリレートである。これらポリマーは、カルボキシル基などの官能基が導入されていてもよい。
このような核粒子は、従来公知の方法、例えば、特公昭５７−２４３６９号公報、特開昭６１−２１５６０２号公報、特開昭６１−２１５６０３号公報、特開昭６１−２１５６０４号公報に記載の方法によって製造することができる。
【００４９】
前記核粒子の体積平均粒子径（以下、単に「粒径」ともいう。）は、実施例に記載の方法により測定できる。粒径は、磁気分離性に優れ、重力沈降が起こりにくく、反応場を均一にできる等の点から、好ましくは０．１〜１０μｍ、さらに好ましくは０．２〜５μｍ、特に好ましくは０．３〜２μｍである。
【００５０】
前記磁性体としては、例えば、四三酸化鉄（Ｆｅ3Ｏ4）、三二酸化鉄（γ−Ｆｅ2Ｏ3）、各種フェライト、鉄、マンガン、ニッケル、コバルト、クロムなどの金属や、コバルト、ニッケル、マンガンなどの合金が挙げられる。
これらの中でも、粒径が５０ｎｍ以下、好ましくは５〜３０ｎｍの酸化鉄系の超常磁性微粒子が好ましく、ＡＦｅ2Ｏ4（Ａは、Ｍｎ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍｇ、Ｃｕ、ＺｎまたはＬｉ0.5Ｆｅ0.5等）で表されるフェライト、マグネタイト（Ｆｅ3Ｏ4）またはγ−Ｆｅ2Ｏ3を含む超常磁性微粒子がより好ましく、飽和磁化が強く、かつ残留磁化が少ない等の点から、γ−Ｆｅ2Ｏ3およびＦｅ3Ｏ4からなる超常磁性微粒子が特に好ましい。なお、磁性体の粒子径は、電子顕微鏡写真中の無作意に選択した１００個の粒子の粒子径の平均値である。
【００５１】
前記磁性体粒子は、表面が疎水化処理された粒子であることが好ましい。
磁性体粒子表面の疎水化処理方法は特に限定されないが、例えば、磁性体粒子と親和性の高い部分と疎水性の部分とを分子内に有する疎水性物質を、磁性体粒子に接触させて結合させる方法が挙げられる。該方法としては、より具体的には、市販の油性磁性流体から粒子を得、該粒子を乾燥させる方法等が挙げられる。
【００５２】
前記磁性体粒子の使用量は、母粒子や磁性体粒子の粒径等により適宜変化させればよく、特に制限されないが、複数の磁性体粒子が核粒子表面の全体を被覆するような量で使用することが好ましく、核粒子と磁性体粒子の質量比が１０：１〜１：３となるような量で使用することがより好ましい。
【００５３】
核粒子の表面に前記磁性体層が形成された母粒子の製造方法としては特に制限されないが、例えば、非磁性体である有機ポリマー粒子などの核粒子と磁性体粒子とをドライブレンドして、物理的な力を外部から加えることにより双方の粒子を複合化させる方法が挙げられる。
物理的な力をかける方法としては、例えば、乳鉢、自動乳鉢、ボールミル、ブレード加圧式粉体圧縮法、メカノフュージョン法のようなメカノケミカル効果を利用する方法や、ジェットミル、ハイブリダイザーなどの高速気流中での衝撃を利用する方法が挙げられる。効率よくかつ強固に複合化を実施するには、物理吸着力が強いことが望ましい。その方法としては、例えば、撹拌翼付き容器中で撹拌翼の周速度が、好ましくは１５ｍ／秒以上、より好ましくは３０ｍ／秒以上、さらに好ましくは４０〜１５０ｍ／秒で撹拌することが挙げられる。撹拌翼の周速度が１５ｍ／秒より低いと、核粒子の表面に磁性体粒子を十分に吸着させることができない場合がある。なお、撹拌翼の周速度の上限については、特に制限はないが、使用する装置、エネルギー効率等の点から決定すればよい。
【００５４】
前記シェルは、例えば前述の方法で調製される母粒子の存在下で、主原料（前記単官能性モノマーおよび架橋性モノマーから選ばれる１種または２種以上）と、必要に応じて副原料（重合開始剤、乳化剤、分散剤、界面活性剤、電解質、架橋剤、分子量調節剤など）とが添加された液体中で重合を行なうことにより形成することができる。
【００５５】
前記有機ポリマー粒子や磁性粒子は、その表面にトシル基を有する。表面にトシル基を有する粒子の製造方法は、トシル基を有するモノマーを用いて粒子を作製する方法や、シェル等を形成する際の反応等によってトシル基を生じさせる方法等であってもよいが、所望の担体を容易に得ることができる等の点から、水酸基を表面に有する粒子を作製した後、該水酸基に対し、アミン等の存在下で塩化ｐ−トルエンスルホニルなどのトシル基含有化合物を反応させるなどによりトシル基を導入する方法が好ましい。
【００５６】
前記水酸基を表面に有する粒子の製造方法は特に制限されず、従来公知の方法で行えばよいが、例えば、前記シェルを形成する際の有機ポリマーとして、前記水酸基含有モノマーを用いる方法や、前記シェルを形成する際の有機ポリマーとして、グリシジル基含有モノマーを用い、該グリシジル基を酸などにより開環する方法が好ましい。
前記水酸基としては、担体表面に容易に、効率的にトシル基を導入できる等の点から、２，３−ジヒドロキシプロピル基（−ＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ2（ＯＨ））が好ましい。
【００５７】
トシル基を導入する前の担体は、親水性が高いことが好ましく、水（２５℃）との接触角が、好ましくは４０°以下、より好ましくは３０°以下、特に好ましくは１０°〜２５°である。
接触角が前記範囲にあると、診断や検出等の際に高いＳ／Ｎ比を発現可能なプローブ結合担体を容易に得ることができる。接触角が前記範囲の上限を超えると、プローブ結合担体への生体関連物質の非特異吸着が増加する場合がある。
【００５８】
なお、本発明において、担体が粒子状である場合には、接触角は、担体からなる乾燥塗膜を用いて測定する。
該乾燥塗膜は、５０ｍｇの担体粒子を含む０．２ｍｌの水分散液を、アプリケーターを用いてスライドガラス等の平滑な基材に塗布し、湿度４０％、気温２５℃で２４時間乾燥することにより得られる塗膜である。
該乾燥塗膜と水との接触角は、約１μＬの水滴（２５℃）を乾燥塗膜に滴下し、直ちに該塗膜の水平方向からの画像をカメラで撮影し、水滴の輪郭を円周の一部と仮定して塗膜の水平線との角度から求めることができる。
【００５９】
接触角が前記範囲にあるトシル基を導入する前の担体は、粒子（表面）を形成する際に用いるモノマーの量および種類等により調整することができる。
【００６０】
前記トシル基を導入する際には、粒子表面の水酸基の少なくとも１つとトシル基含有化合物とを反応させればよい。
従って、２，３−ジヒドロキシプロピル基を有する粒子にトシル基を導入して得られる粒子は、２−ヒドロキシ−３−（４’−メチルフェニル）スルホニルオキシプロピル基、３−ヒドロキシ−２−（４’−メチルフェニル）スルホニルオキシプロピル基または２，３−ジ（４’−メチルフェニル）スルホニルオキシプロピル基を有する粒子のいずれであってもよい。
なお、トシル化されていない残余の水酸基は、担体の親水化に寄与するため、診断や検出等の際の低ノイズ化に寄与する傾向がある。
【００６１】
・粒径
前記担体が粒子である場合、好ましくは磁性粒子である場合、担体の粒径は、好ましくは０．１〜２０μｍ、より好ましくは０．２〜１５μｍ、特に好ましくは０．３〜１０μｍである。
粒径が前記範囲にあると、単位体積当たりのプローブの結合量が多い担体を容易に得ることができ、該担体を用いることで、診断や検出等の際における感度が良好になる。粒径が前記範囲の下限を下回る場合、遠心分離などを用いた分離に長時間を要しやすく、水などの洗浄溶媒と粒子との分離が不十分になる傾向にあるため、目的外の分子（例えば、タンパク質や核酸等の生体関連物質）の除去が不十分になり、充分な精製ができない場合がある。一方、粒径が前記範囲の上限を上回ると、比表面積が小さくなり、プローブの結合量が少なくなる結果、感度が低くなる場合がある。
粒径は、詳細は後述するが、細孔電気抵抗法（電気的検知帯法）により求められる。
【００６２】
・担体表面のトシル基１個あたりが占める面積
前記担体表面のトシル基１個あたりが占める面積（工程１で用いる担体表面のトシル基１個あたりが占める面積Ｓ１Ａおよびプローブ結合前の担体表面のトシル基１個あたりが占める面積Ｓ１Ａ'）は、好ましくは５Å2／トシル基以上、より好ましくは１０Å2／トシル基以上、特に好ましくは２０Å2／トシル基以上であり、好ましくは８０Å2／トシル基以下、より好ましくは６０Å2／トシル基以下、特に好ましくは４０Å2／トシル基以下である。
面積Ｓ１ＡおよびＳ１Ａ'が前記範囲にあると、診断や検出等の際に高いＳ／Ｎ比を発現可能なプローブ結合担体を容易に得ることができる。
面積Ｓ１ＡおよびＳ１Ａ'が前記範囲の下限を下回る場合、担体表面のトシル基密度が高いためにプローブが担体表面に多点で結合しやすい傾向にあり、プローブが変性することによるシグナルの低下を招く場合があり、また、プローブ結合担体に過剰なトシル基が残存しやすくなり、担体表面がより疎水的になる傾向にあるため、該担体を用いた診断や検出等の際のノイズの増大を招く場合がある。一方、面積Ｓ１ＡおよびＳ１Ａ'が前記範囲の上限を上回る場合、担体に十分な量のプローブを結合できない傾向にあり、このために、該担体を用いた診断や検出等の際のシグナルの低下を招く場合がある。
【００６３】
本発明者が鋭意検討した結果、担体が有機ポリマーを含む粒子である場合、有機溶媒中でトシル基量を測定すると、該担体の膨潤によって担体表面だけでなく、内部に存在するトシル基量も併せて測定され、担体の表面物性を評価する方法として適さないことが分かった。このため、詳細は後述するが、担体表面のトシル基量を水系媒体中で測定することで、担体表面のみのトシル基を定量することに成功した。これによりプローブの結合に関与するトシル基量や、非特異吸着の一因となり得るトシル基量を評価することが可能となった。
本発明におけるトシル基１個あたりが占める面積は、詳細は後述するが、水系媒体中で測定した値である。
【００６４】
・接触角
トシル基を有する担体表面の水（２５℃）との接触角は５０°以上であることが好ましい。該担体が粒子状である場合には、該担体からなる乾燥塗膜と水（２５℃）との接触角が、好ましくは７０°以上、より好ましくは９０°以上、特に好ましくは１０５°〜１２０°である。
接触角が前記範囲にあると、診断や検出等の際に高いＳ／Ｎ比を発現可能なプローブ結合担体を容易に得ることができる。接触角が前記範囲の下限未満であると、得られるプローブ結合担体を用いた診断や検出等の際の感度が低下する場合がある。
また、トシル基を導入する前の担体の接触角が前記範囲にあり、かつ、トシル基を導入した後の担体の接触角がこの範囲にある担体を用いることで、プローブ結合担体への生体関連物質の非特異吸着を抑制することができ、プローブ結合担体を用いた診断や検出等を高感度化することができる。
【００６５】
接触角が前記範囲にあるトシル基を有する担体は、トシル基の導入度合い等によって調整することができる。
【００６６】
〈プローブ〉
前記プローブとしては特に制限されず、診断や検出等に用いる物質であればよいが、特異結合性物質であることが好ましく、具体的には、タンパク質または核酸が好ましく、抗原、抗体またはアビジンであることがより好ましく、抗原または抗体であることが特に好ましい。
工程１で用いるプローブは、２種以上であってもよいが、通常１種である。
【００６７】
前記抗原または抗体としては、被検体中に一般に含まれている成分に反応するものであることが好ましく、例えば、アンチプラスミン検査用抗アンチプラスミン抗体、Ｄダイマー検査用抗Ｄダイマー抗体、ＦＤＰ検査用抗ＦＤＰ抗体、ｔＰＡ検査用抗ｔＰＡ抗体、ＴＡＴ検査用抗ＴＡＴ複合体抗体、ＦＰＡ検査用抗ＦＰＡ抗体等の凝固線溶関連検査用抗原または抗体；ＢＦＰ検査用抗ＢＦＰ抗体、ＣＥＡ検査用抗ＣＥＡ抗体、ＡＦＰ検査用抗ＡＦＰ抗体、フェリチン検査用抗フェリチン抗体、ＣＡ１９−９検査用抗ＣＡ１９−９抗体等の腫瘍関連検査用抗原または抗体；アポリポタンパク検査用抗アポリポタンパク抗体、β２−ミクログロブリン検査用抗β２−ミクログロブリン抗体、α１−ミクログロブリン検査用抗α１−ミクログロブリン抗体、免疫グロブリン検査用抗免疫グロブリン抗体、ＣＲＰ検査用抗ＣＲＰ抗体等の血清蛋白関連検査用抗原または抗体；ＨＣＧ検査用抗ＨＣＧ抗体等の内分泌機能検査用抗原または抗体；ＨＢｓ抗原検査用抗ＨＢｓ抗体、ＨＢｓ抗体検査用ＨＢｓ抗原、ＨＣＶ抗体検査用ＨＣＶ抗原、ＨＩＶ−１抗体用ＨＩＶ−１抗原、ＨＩＶ−２抗体検査用ＨＩＶ−２抗原、ＨＴＬＶ−１検査用ＨＴＬＶ−１抗原、マイコプラズマ症検査用マイコプラズマ抗原、トキソプラズマ検査用トキソプラズマ抗原、ＡＳＯ検査用ストレプトリジンＯ抗原等の感染症関連検査用抗原または抗体；抗ＤＮＡ抗体検査用ＤＮＡ抗原、ＲＦ検査用熱変成ヒトＩｇＧ等自己免疫関連検査用抗原または抗体；ジゴキシン検査用抗ジゴキシン抗体、リドカイン検査用抗リドカイン抗体等の薬物分析用抗原または抗体が挙げられる。
前記抗体としては、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のどちらを用いてもかまわない。
【００６８】
前記親水性が高いプローブとしては、例えば、プローブ１質量％および硫安３３質量％の水溶液または緩衝溶液中においても塩析による沈殿を生じないプローブが挙げられる。
【００６９】
前記工程１で用いるプローブの使用量は、得られるプローブ結合担体を用いた診断や検出等を高感度化することができる等の点から、前記工程１で用いる（プローブを結合する前の）担体表面のトシル基１個あたりが占める面積Ｓ１Ａに対する、工程１で得られた担体表面のトシル基１個あたりが占める面積Ｓ１Ｂの割合（Ｓ１Ｂ／Ｓ１Ａ×１００％）が下記範囲となる量で使用することが好ましい。
【００７０】
また、担体として磁性粒子を用いる態様では、得られるプローブ結合担体を用いた診断や検出等を高感度化できる等の点から、前記工程１で用いるプローブの使用量は、磁性粒子１００質量部に対して、０．５質量部以上であることが好ましく、１質量部以上であることがより好ましい。また上限は、２００質量部以下であることが好ましく、１００質量部以下であることがより好ましい。
【００７１】
・工程１で得られた担体表面のトシル基１個あたりが占める面積Ｓ１Ｂ
前記工程１で得られた担体表面のトシル基１個あたりが占める面積Ｓ１Ｂは、好ましくは１０Å2／トシル基以上、より好ましくは２５Å2／トシル基以上、特に好ましくは４０Å2／トシル基以上である。
面積Ｓ１Ｂが前記範囲にあると、診断や検出等の際に高いＳ／Ｎ比を発現可能なプローブ結合担体を容易に得ることができる。
【００７２】
前記工程１で用いる担体表面のトシル基１個あたりが占める面積Ｓ１Ａに対する、工程１で得られた担体表面のトシル基１個あたりが占める面積Ｓ１Ｂの割合（Ｓ１Ｂ／Ｓ１Ａ×１００％）は、好ましくは１１０％以上、より好ましくは１２０％以上、特に好ましくは１３０％以上である。
面積の割合が斯かる範囲にあると、診断や検出等の際に高いＳ／Ｎ比を発現可能なプローブ結合担体を容易に得ることができる。
【００７３】
＜工程２＞
前記工程２は、担体表面のトシル基量を減少させる工程であれば特に制限されないが、担体表面のトシル基を遊離する工程であることが好ましい。該工程２は、通常、前記工程１の後に行う。
工程２の後に残存するトシル基は、疎水性が高いために、生体関連物質の非特異吸着の要因となる傾向にあり、トシル基が残存した担体を診断や検出等の際に用いると、ノイズの増大を招く傾向にあるため、工程１で得られた担体表面のトシル基量を減少させること、特に化学的にトシル基を遊離することが好ましい。
【００７４】
前記工程２は、具体的には、酸またはアルカリによってトシル基を加水分解により遊離する方法、ブロッキング剤をトシル基と反応させ、トシル基を遊離する方法が挙げられる。前記工程２は、これらの方法のうちどちらか一方を行ってもよく、２つ以上の方法を行ってもよい。
前記工程２としては、得られるプローブ結合担体の非特異吸着性をより抑制できる等の点から、ブロッキング剤をトシル基と反応させる方法が好ましい。
【００７５】
前記ブロッキング剤をトシル基と反応させる際には、担体とブロッキング剤とを混合すれば特に制限されないが、担体とブロッキング剤とが容易に接触して、所望のプローブ結合担体を容易に得ることができる等の点から、液体中で担体とブロッキング剤とを混合する方法であることが好ましい。この方法における液体は、前記工程１で挙げた液体と同様の液体が挙げられ、工程１を液体中で行う場合には、工程１で得られた液体をそのまま工程２に用いてもよい。
【００７６】
前記混合の方法としては特に制限されず、液体中で前記担体とブロッキング剤とを混合する場合には、静置するだけでもよく、撹拌等してもよい。
【００７７】
前記混合の際の混合時間（担体とブロッキング剤との反応時間）や加水分解反応の際の反応時間は、用いる担体やブロッキング剤の種類、量等により変化するが、ブロッキングが十分に行われ、面積Ｓ２が下記範囲にあるプローブ結合担体を容易に得ることができる等の点から、好ましくは２時間以上、より好ましくは６時間以上、特に好ましくは８時間以上である。また、効率よくプローブ結合担体を作製できる等の点から、好ましくは４８時間以下、より好ましくは３６時間以下、特に好ましくは２４時間以下である。
【００７８】
前記工程２は、室温で行ってもよく、加熱等の下で行ってもよい。
該加熱の際の温度としては、用いる担体やブロッキング剤等の種類などにより適宜選択すればよいが、効率よく所定のプローブ結合担体を作製できる等の点から、好ましくは４〜５０℃、より好ましくは２０〜４５℃、特に好ましくは３５〜４０℃である。
【００７９】
前記工程２は、通常大気中で行われるが、用いる担体やブロッキング剤等に応じて、不活性ガス雰囲気などの特定のガス雰囲気下や、グローボックス等の特定の容器や装置内で行ってもよい。
【００８０】
〈ブロッキング剤〉
前記ブロッキング剤としては、トシル基に対し反応性の官能基を有する物質であれば特に制限されないが、被検体中のタンパク質や脂質、核酸等の生体分子や細胞、測定試薬中のタンパク質や発光基質、吸光物質等の担体表面への非特異吸着を抑制できる親水性官能基を有する物質であることが好ましい。
【００８１】
前記トシル基に対し反応性の官能基としては、アミノ基やメルカプト基等の求核性基が挙げられる。
前記親水性官能基としては、水酸基、カルボキシ基、スルホン酸基、リン酸基、糖を含む基、双性イオンを含む基、ポリエチレングリコールを含む基等が挙げられる。
【００８２】
前記ブロッキング剤は、プローブ結合担体への非特異吸着をより抑制できる等の点から、水溶性であることが好ましい。ここで水溶性とは、水と任意の割合で混和するか、２５℃の水１ｇに対し、１０ｍｇ以上溶解する性質のことをいう。
【００８３】
前記ブロッキング剤としては、低分子化合物、ペプチドやタンパク質等の生体高分子、合成高分子のいずれであってもよいが、立体障害による非特異吸着抑制効果が高い点で生体高分子または合成高分子が好ましく、測定系に生体由来物質を持ち込こまない等の点で合成高分子がより好ましい。
【００８４】
ブロッキング剤として機能する低分子化合物としては、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、エタノールアミン等が挙げられ、非特異吸着を特に抑制できる等の点からトリスヒドロキシメチルアミノメタンが好ましい。
ブロッキング剤として機能する生体高分子としては、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、カゼイン、ゼラチンが挙げられ、非特異吸着を特に抑制できる等の点からＢＳＡが好ましい。
ブロッキング剤として機能する合成ポリマーとしては、ポリオキシエチレン等の親水ポリマーを側鎖に有するビニルモノマーの共重合体、ポリオキシエチレン等の親水性ポリマーと他ポリマーのブロック共重合体、末端に官能基を有するポリオキシエチレン等の親水性ポリマーなどが公知である。特に、特開２００８−１７０４１７号公報に示されるポリオキシエチレンの片末端にポリアミンを有する構造の合成ポリマーは、担体表面への非特異吸着抑制のみならず、抗体等プローブの配向を整列させ反応性を向上させる効果も見られることから、本発明の目的に好適に使用できる。このようなブロッキング剤としてＪＳＲライフサイエンス（株）製ブロックマスターＣＥ５１０やＣＥ２１０が挙げられる。
【００８５】
前記ブロッキング剤を用いる場合の該ブロッキング剤の使用量は、得られる担体を用いた診断や検出等を高感度化することができる等の点から、前記工程１で得られた担体表面のトシル基１個あたりが占める面積Ｓ１Ｂに対する、前記工程２で得られた担体表面のトシル基１個あたりが占める面積Ｓ２の割合（Ｓ２／Ｓ１Ｂ×１００％）が下記範囲となる量で使用することが好ましい。
【００８６】
また、担体として磁性粒子を用いる態様では、前記工程１で用いるブロッキング剤の使用量は、得られるプローブ結合担体を用いた診断や検出等を高感度化できる等の点から、磁性粒子１００質量部に対して、１質量部以上であることが好ましく、２質量部以上であることがより好ましい。また上限は、２００質量部以下であることが好ましく、１００質量部以下であることがより好ましい。
【００８７】
・プローブ結合担体表面のトシル基１個あたりが占める面積
プローブ結合担体表面のトシル基１個あたりが占める面積（前記工程２で得られた担体表面のトシル基１個あたりが占める面積Ｓ２およびプローブ結合担体表面のトシル基１個あたりが占める面積Ｓ２'）は、好ましくは１５Å2／トシル基以上である。
本発明者が鋭意検討した結果、このような面積を有するプローブ結合担体によれば、非特異吸着が少なく、プローブ活性が高いことを見出した。
また、面積Ｓ２およびＳ２'は、非特異吸着を少なくし、プローブ活性を高める等の点で、好ましくは３０Å2／トシル基以上、より好ましくは４０Å2／トシル基以上、特に好ましくは４５Å2／トシル基以上である。
残存するトシル基は、生体関連物質等の非特異吸着の要因となる傾向にあり、トシル基が残存した担体を診断や検出等の際に用いると、ノイズの増大を招く傾向にあるため、トシル基は、プローブ結合担体表面に存在していなくてもよい。
【００８８】
前記工程１で用いる担体表面のトシル基１個あたりが占める面積Ｓ１Ａに対する、前記工程２で得られた担体表面のトシル基１個あたりが占める面積Ｓ２の割合（Ｓ２／Ｓ１Ａ×１００％）、および、プローブ結合前の担体表面のトシル基１個あたりが占める面積Ｓ１Ａ'に対する、プローブ結合担体表面のトシル基１個あたりが占める面積Ｓ２'の割合（Ｓ２'／Ｓ１Ａ'×１００％）は、好ましくは１４０％以上、より好ましくは１５０〜２５０％、さらに好ましくは１６０〜２２０％、特に好ましくは１７０〜１９０％である。
面積の割合が斯かる範囲にあるプローブ結合担体は、タンパク質や核酸等の生体関連物質の非特異吸着を十分に抑制できるだけトシル基が低減されており、該担体を用いることで、診断や検出の際に、特にＣＬＩＡ、ＣＬＩＥＡ等のイムノアッセイにおいて優れた低ノイズ、高いＳ／Ｎ比を達成できる。
面積の割合が前記範囲の下限未満の場合、生体関連物質の非特異吸着が増大する傾向にあり、面積の割合が前記範囲の上限を超える場合、十分な量のプローブが結合したプローブ結合担体が得られない傾向にあり、該担体を用いた診断や検出等において高いシグナルが得られない場合がある。
【００８９】
また、前記工程１で得られた担体表面のトシル基１個あたりが占める面積Ｓ１Ｂに対する、前記工程２で得られた担体表面のトシル基１個あたりが占める面積Ｓ２の割合（Ｓ２／Ｓ１Ｂ×１００％）は、好ましくは１１０％以上、より好ましくは１１５〜１６０％、さらに好ましくは１２０〜１５０％、特に好ましくは１２５〜１４０％である。
面積の割合が斯かる範囲にあるプローブ結合担体は、タンパク質や核酸等の生体関連物質などの非特異吸着を十分に抑制できるだけトシル基が低減されており、該担体を用いることで、診断や検出の際に、特にＣＬＩＡ、ＣＬＥＩＡ等のイムノアッセイにおいて優れた低ノイズ、高いＳ／Ｎ比を達成できる。
面積の割合が前記範囲の下限未満の場合、生体関連物質の非特異吸着が増大する傾向にあり、面積の割合が前記範囲の上限を超える場合、十分な量のプローブが結合したプローブ結合担体が得られない傾向にあり、該担体を用いた診断や検出等において高いシグナルが得られない場合がある。
【００９０】
＜用途＞
前記本法で得られるプローブ結合担体および本発明に係るプローブ結合担体は、標的物質の診断や検出に、特にＣＬＩＡ、ＣＬＥＩＡ等のイムノアッセイに好適に用いることができ、体外診断薬用または生体関連物質用として好適に用いることができる。具体的には、生化学分野での化合物担体用粒子および診断薬用の化学結合担体用粒子等のアフィニティー担体として用いることができ、好ましくは免疫診断や核酸検出に用いられ、特に、抗原または抗体等のプローブを結合させた免疫検査用のプローブ結合粒子として用いることができる。
【００９１】
前記標的物質としては特に制限されないが、前記プローブと特異的に結合する物質であることが好ましく、具体的には、免疫検査用試薬および被検査試料等に含まれる生体関連物質および化学物質などが挙げられる。
前記生体関連物質とは、生体に関するすべての物質をいうが、例えば、生体に含まれる物質、生体に含まれる物質から誘導された物質、生体内で利用可能な物質が挙げられる。前記生体関連物質としては特に限定されないが、例えば、タンパク質（例：酵素、抗体、アプタマー、受容体）、ペプチド（例：グルタチオン）、核酸（例：ＤＮＡ、ＲＮＡ）、糖質、脂質、およびその他の細胞または物質（例：血小板、赤血球、白血球等の各種血球細胞を含む各種血液由来物質、各種浮遊細胞）が挙げられる。
【００９２】
≪標的物質を検出または分離する方法≫
本発明における、標的物質を検出または分離する方法（以下「本検出方法」ともいう。）は、前記プローブ結合担体を用いる。
本検出方法では、前記プローブ結合担体を用いるため、特出する高感度で被検出物質を検出することができる。
【００９３】
検出方法の一例としては、前記プローブ結合担体と、被検体中の標的物質とを接触させることで、標的物質をプローブ結合担体に含まれるプローブを介して該担体上に捕捉した後、二次プローブと反応させる。この際に、二次プローブとして、蛍光物質や放射性同位体、酵素等で標識されたプローブを用い、必要に応じさらに発光試薬等を用いることで、蛍光や酵素反応等によって標的物質の検出を行うことができる。
【００９４】
分離方法の一例としては、前記プローブ結合担体と標的物質とを反応させた後、集磁し、洗浄することで、標的物質以外を除去分離する方法が挙げられる。
【実施例】
【００９５】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されない。
【００９６】
［粒径の測定］
各磁性粒子の粒径は、Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ４ｅ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）で測定した。電解液（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社製ＩＳＯＴＯＮ  ＩＩ）１００ｍＬに、０．１質量％Ｔｗｅｅｎ  ２０水溶液に分散させた１質量％の磁性粒子を、濃度センサが４〜１０％の値を示すまで投入し、粒子５０，０００個の粒子の粒径を測定し、その平均値を算出することで、体積平均粒子径を測定した。
【００９７】
［トシル基の定量］
水１ｍＬに分散させた磁性粒子（合成例１で得られた磁性粒子または各工程後の磁性粒子）１００ｍｇをマイクロチューブに採取し、エチレンジアミンを１００μＬ加え、４０℃で１５時間反応した。反応後、マイクロチューブを磁気スタンドに立て上清を回収した。上清２０μＬをイオンクロマトグラフィー（装置：ＤＩＯＮＥＸ社製ＩＣＳ２０００、カラム：ＡＳ１８、検出：電気伝導度、流速：１．０ｍＬ／分、測定時間：３０分、溶離液：５０ｍＭ  水酸化カリウム水溶液）で分析し、保持時間２３分程度に現れるピークの面積を求めた。別途、ｐ−トルエンスルホン酸ナトリウムをイオンクロマトグラフィーで分析することで得られた検量線から、磁性粒子１００ｍｇあたりの表面トシル基量を算出した。
【００９８】
［磁性粒子表面のトシル基１個あたりが占める面積の算出］
磁性粒子表面のトシル基１個あたりが占める面積は、以下の式で求められる。
磁性粒子表面のトシル基１個あたりが占める面積＝磁性粒子の表面積／表面トシル基の個数
具体的には以下の式で求められる。
磁性粒子表面のトシル基１個あたりが占める面積［Å2／トシル基］＝１／（１．００４×磁性粒子比重［ｇ／ｃｍ3］×粒径［μｍ］×トシル基量［ｍｍｏｌ／ｇ］）
【００９９】
実施例で用いた磁性粒子の比重は、以下の方法で求めた。
磁性粒子粉末３０ｍｇを、示差熱熱重量同時測定装置（（株）日立ハイテクサイエンス製ＳＴＡ７３００）に入れ、昇温温度：１０℃／分、リミット温度：５００℃、ホールド時間：２０分、サンプリング時間：１．０秒、ガス種：窒素、ガス流量：２００ｍＬ／分の条件で測定し、磁性粒子に含まれる酸化鉄と樹脂の質量％をそれぞれ求めた。酸化鉄比重を５．２［ｇ／ｃｍ3］、樹脂比重を１．１［ｇ／ｃｍ3］とし、前記得られたそれぞれの質量％の値から、磁性粒子の比重を算出した。
【０１００】
［抗体結合量の定量］
ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用い、磁性粒子に結合した抗体の定量を行った。
まず、抗体０μｇ、５μｇ、１０μｇまたは１５μｇが溶解したＭＥＳ緩衝液（０．１ｍｏｌ／Ｌ）５０μＬをそれぞれマイクロチューブに分注し、前記キット中の試薬Ａと試薬Ｂとを５０／１（ｖ／ｖ）で混合して作製したｗｏｒｋｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔ  １ｍＬを各マイクロチューブに添加した。３７℃で３０分インキュベートした後、マイクロチューブを磁気スタンドに立て上清を回収し、ＯＤ５６２の測定を行い、検量線を作成した。
続いて、ＭＥＳ緩衝液（０．１ｍｏｌ／Ｌ）５０μＬに分散させた抗ＰＳＡ抗体結合磁性粒子１ｍｇをマイクロチューブに採取した。Ｗｏｒｋｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔ  １ｍＬを添加し、３７℃で３０分インキュベートした後、マイクロチューブを磁気スタンドに立て上清を回収し、ＯＤ５６２の測定を行った。検量線から抗体結合量を算出した。
【０１０１】
［化学発光酵素免疫測定（ＣＬＥＩＡ）］
白色９６ウェルプレートのウェル１およびウェル２に、ＴＢＳ−Ｔ緩衝液（１３７ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、２．７ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カリウム、２５ｍｍｏｌ／Ｌトリスヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩（以下「Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ」ともいう。）、０．１質量％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）５０μＬに分散した抗ＰＳＡ抗体結合磁性粒子１５μｇをそれぞれ添加した。
次に、ノイズ測定用として、ＢＳＡ／ＴＢＳ緩衝液（１質量％ＢＳＡ、１３７ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、２．７ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カリウム、２５ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）１０μＬをウェル１に添加し、また、シグナル測定用として、ＢＳＡ／ＴＢＳ緩衝液（１質量％のＢＳＡを含む）１０μＬに溶解したＰＳＡ抗原１０μｇをウェル２に添加し、３７℃で１０分間反応させた。その後、抗体結合粒子を磁石で集磁し、上清除去を行い、ＴＢＳ−Ｔ緩衝液で粒子を洗浄した。この集磁−洗浄操作を計５回行った。その後、アルカリフォスファターゼを標識した抗ＰＳＡ抗体を５０μＬ添加し、３７℃で１０分間反応させた。反応後、前記と同様にＴＢＳ−Ｔ緩衝液を用いて集磁−洗浄操作を計５回行い、発光基質（富士レビオ（株）製クラスＩＩＩシリーズ  ルミパルス基質液）を５０μＬ添加した。発光基質添加から５分後にルミノメーターを用いてノイズおよびシグナルの発光強度を測定した。
【０１０２】
［合成例１］
油性磁性流体（「ＥＸＰシリーズ、ＥＭＧ」、（株）フェローテック製）にアセトンを加えて粒子を析出沈殿させた後、これを乾燥することにより、疎水化処理された表面を有するフェライト系（酸化鉄）の磁性体粒子（平均一次粒径：０．０１μｍ）を得た。
【０１０３】
次いで、ポリスチレン粒子（体積平均粒子径：１．５μｍ）３０ｇおよび前記疎水化処理された磁性体粒子１５ｇをミキサーでよく混合し、この混合物をハイブリダイゼーションシステムＮＨＳ−０型（（株）奈良機械製作所製）を使用して、羽根（撹拌翼）の周速度１００ｍ／秒（１６，２００ｒｐｍ）で５分間処理し、磁性体粒子からなる磁性体層を表面に有する母粒子（粒径：２．０μｍ）を得た。
【０１０４】
次に、ドデシル硫酸ナトリウム０．５０質量％を含む水溶液３７５ｇを１Ｌセパラブルフラスコに投入し、次いで、前記磁性体層を有する母粒子１５ｇを投入し、ホモジナイザーで分散した後、６０℃に加熱した。
ドデシル硫酸ナトリウム０．５０質量％を含む水溶液１５０ｇに、メチルメタクリレート（以下「ＭＭＡ」という。）２７ｇ、トリメチロールプロパントリメタクリレート（以下「ＴＭＰ」という。）３ｇおよびジ（３，５，５−トリメチルヘキサノイル）パーオキサイド（日油（株）製パーロイル３５５（以下「パーロイル３５５」という。））０．６ｇを入れて分散させたプレエマルジョンを、６０℃にコントロールした前記１Ｌセパラブルフラスコに２時間かけて滴下した。滴下終了後、６０℃に保持し、１時間攪拌した後、ドデシル硫酸ナトリウム０．５０質量％を含む水溶液７５ｇに、グリシジルメタクリレート（以下「ＧＭＡ」という。）１３．５ｇ、ＴＭＰ１．５ｇおよびパーロイル３５５  ０．３ｇを入れて分散させたプレエマルジョンを、６０℃にコントロールした前記１Ｌセパラブルフラスコに１時間３０分かけて滴下した。その後７５℃に昇温した後さらに２時間重合を続けて、反応を完了させた。
【０１０５】
続けて、この１Ｌセパラブルフラスコに１ｍｏｌ／Ｌ硫酸６０ｍｌを入れ、６０℃で６時間撹拌した。次いで、前記セパラブルフラスコ中の粒子を、磁気を用いて分離した後、蒸留水を用いて繰り返し洗浄した。以上により、水酸基を含む磁性粒子（Ａ）を得た。
【０１０６】
次に、磁性粒子（Ａ）を凍結乾燥し、乾燥後の磁性粒子（Ａ）１．０ｇを８ｍＬのピリジンに分散させた後、ｐ−トルエンスルホニルクロリド０．２ｇを加えて室温で２時間撹拌した。反応後、磁気を用いて粒子を分離し、アセトンで４回、続いて蒸留水で４回洗浄して、トシル基を含む磁性粒子（Ｂ）を得た。粒径は３．０μｍであった。
【０１０７】
［実施例１］
合成例１で得られた磁性粒子（Ｂ）１０ｍｇを硫酸アンモニウムが溶解したホウ酸緩衝液（硫酸アンモニウム：０．５ｍｏｌ／Ｌ、ホウ酸：０．１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ９．５）１．５ｍＬに分散させた。磁性粒子分散液に前立腺特異抗原（ＰＳＡ）に対する抗体（以下「抗ＰＳＡ抗体」という。）１００μｇを加えて３７℃で８時間反応させた。続いてブロッキング剤としてＣＥ５１０（２．０質量％、ＪＳＲ（株）製）５０μＬを加えて３７℃で１５時間反応させた。反応後、磁気スタンドを用いて粒子を磁気分離し、洗浄液（２５ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．０１質量％Ｔｗｅｅｎ２０含有）で繰り返し洗浄し、抗ＰＳＡ抗体結合磁性粒子（Ｃ−１）を得た。
【０１０８】
［実施例２］
ブロッキングの反応時間を６時間とした以外は実施例１と同様の操作を行い、抗ＰＳＡ抗体結合磁性粒子（Ｃ−２）を得た。
［実施例３］
ブロッキング剤としてＢＳＡを用いた以外は実施例１と同様の操作を行い、抗ＰＳＡ抗体結合磁性粒子（Ｃ−３）を得た。
【０１０９】
［実施例４］
合成例１で得られた磁性粒子（Ｂ）１０ｍｇをホウ酸緩衝液（０．１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ９．５）１．０ｍＬに分散させ、抗ＰＳＡ抗体１００μｇを加えた。続いて、硫酸アンモニウムが溶解したホウ酸緩衝液（硫酸アンモニウム：１．５ｍｏｌ／Ｌ、ホウ酸：０．１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ９．５）０．５ｍＬを加え、３７℃で８時間反応させた。続いてブロッキング剤としてＣＥ５１０（２．０質量％、ＪＳＲ（株）製）５０μＬを加えて３７℃で１５時間反応させた。反応後、磁気スタンドを用いて粒子を磁気分離し、洗浄液（２５ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．０１質量％Ｔｗｅｅｎ２０含有）で繰り返し洗浄した後、粒子濃度が０．０３質量％になるように該洗浄液で希釈して、抗ＰＳＡ抗体結合磁性粒子（Ｃ−４）を得た。
【０１１０】
［実施例５］
硫酸アンモニウムが溶解したホウ酸緩衝液中の硫酸アンモニウム濃度を１．０ｍｏｌ／Ｌとした以外は実施例１と同様の操作を行い、抗ＰＳＡ抗体結合磁性粒子（Ｃ−５）を得た。
【０１１１】
［実施例６］
粒子として、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２８０  Ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いた以外は実施例２と同様の操作を行い、抗ＰＳＡ抗体結合磁性粒子（Ｃ−６）を得た。
【０１１２】
［実施例７］
硫酸アンモニウムが溶解したホウ酸緩衝液中の硫酸アンモニウム濃度を３．０ｍｏｌ／Ｌとした以外は実施例１と同様の操作を行い、抗ＰＳＡ抗体結合磁性粒子（Ｃ−７）分散液を得た。
【０１１３】
［比較例１］
磁性粒子として磁性粒子（Ｂ）の代わりに磁性粒子（Ａ）を用いた以外は実施例１と同様の操作を行い、抗ＰＳＡ抗体結合磁性粒子（Ｄ−１）を得た。
【０１１４】
［比較例２］
ブロッキングを行わない以外は実施例１と同様の操作を行い、抗ＰＳＡ抗体結合磁性粒子（Ｄ−２）を得た。
【０１１５】
［比較例３］
ブロッキングの反応時間を１時間とした以外は実施例１と同様の操作を行い、抗ＰＳＡ抗体結合磁性粒子（Ｄ−３）を得た。
【０１１６】
［比較例４］
ブロッキングを行わない以外は実施例６と同様の操作を行い、抗ＰＳＡ抗体結合磁性粒子（Ｄ−４）を得た。
【０１１７】
［比較例５］
ブロッキングの反応時間を１時間とした以外は実施例６と同様の操作を行い、抗ＰＳＡ抗体結合磁性粒子（Ｄ−５）を得た。
【０１１８】
【表１】
2018173361.tif 000002
【手続補正書】
【提出日】平成29年10月13日(2017.10.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トシル基を有する担体とプローブとを混合する工程１と、
担体表面のトシル基量を減少させる工程２とを含み、
前記工程１で用いる担体表面のトシル基１個あたりが占める面積Ｓ１Ａに対する、前記工程２で得られた担体表面のトシル基１個あたりが占める面積Ｓ２の割合（Ｓ２／Ｓ１Ａ×１００％）が、１４０％以上である、
プローブ結合担体の製造方法。
【請求項２】
前記工程１が、硫酸アンモニウムの存在下で前記担体とプローブとを混合する工程である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記工程１で得られた担体表面のトシル基１個あたりが占める面積Ｓ１Ｂに対する、前記工程２で得られた担体表面のトシル基１個あたりが占める面積Ｓ２の割合（Ｓ２／Ｓ１Ｂ×１００％）が、１１０％以上である、請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記工程１が、
トシル基を有する担体と硫酸アンモニウムとを混合する工程１ａ、および、
該工程１ａの後、プローブを混合する工程１ｂを含む、
請求項１〜３のいずれか１つに記載の製造方法。
【請求項５】
前記担体が磁性粒子である、請求項１〜４のいずれか１つに記載の製造方法。
【請求項６】
前記磁性粒子がコアシェル構造を有する、請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
前記磁性粒子の体積平均粒子径が、０．１〜２０μｍである、請求項５または６に記載の製造方法。
【請求項８】
前記工程１が、硫酸アンモニウムを含む液体中で担体とプローブとを混合する工程であり、担体とプローブとが接触する際の液体中の硫酸アンモニウム濃度が２．０ｍｏｌ／Ｌ以下である、請求項１〜７のいずれか１つに記載の製造方法。
【請求項９】
前記工程１が、液体中で担体とプローブとを混合する工程であり、該液体のｐＨが６〜１２である、請求項１〜８のいずれか１つに記載の製造方法。
【請求項１０】
前記工程１で用いる担体表面のトシル基１個あたりが占める面積Ｓ１Ａが、５Å2／トシル基以上である、請求項１〜９のいずれか１つに記載の製造方法。
【請求項１１】
前記プローブがタンパク質または核酸である、請求項１〜１０のいずれか１つに記載の製造方法。
【請求項１２】
前記工程１における混合時間が２時間以上である、請求項１〜１１のいずれか１つに記載の製造方法。
【請求項１３】
前記工程２が、工程１で得られた担体とブロッキング剤とを混合するか、または、担体表面のトシル基を加水分解反応する工程であり、該混合時間または反応時間が２時間以上である、請求項１〜１２のいずれか１つに記載の製造方法。
【請求項１４】
トシル基を有する担体にプローブを結合し、ブロッキング剤が共有結合しているプローブ結合担体であって、
該プローブ結合担体表面のトシル基１個あたりが占める面積が１５Å2／トシル基以上である、
プローブ結合担体。
【請求項１５】
プローブ結合前およびブロッキング剤結合前の担体表面のトシル基１個あたりが占める面積Ｓ１Ａ'に対する、プローブ結合担体表面のトシル基１個あたりが占める面積Ｓ２'の割合（Ｓ２'／Ｓ１Ａ'×１００％）が、１４０％以上である、請求項１４に記載のプローブ結合担体。
【請求項１６】
体外診断薬用または生体関連物質検出用である、請求項１４〜１５のいずれか１つに記載のプローブ結合担体。
【請求項１７】
請求項１４〜１５のいずれかに１つに記載のプローブ結合担体を用いる、標的物質を検出または分離する方法。