(57)【要約】【課題】工業規模の散布のためのバイオマトリックス足場を提供する。【解決手段】本発明の方法は、結合性マトリックス成分ならびに成熟細胞と幹/前駆細胞細胞集団の系統限定の両方に総合的により再現性があり強力な分化作用を発揮する、マトリックス結合性ホルモン、増殖因子およびサイトカインを含む、組織のコラーゲンの大部分が富化した組織特異的抽出物の製造をもたらす。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養装置への工業規模の散布のための、生体組織からのバイオマトリックス足場の製造方法であって、
a)塩濃度約3.5M NaCl〜約4.5M NaClを含む緩衝液で生体組織を灌流するかまたは生体組織をホモジナイズし；
b)第1培地にリパーゼおよび/または洗浄剤を含む脱脂緩衝液で段階(a)の生体組織を灌流するかまたは段階(a)のホモジネートを抽出し、ここで前記第1培地の重量オスモル濃度は約250mOsm/kg〜約350mOsm/kgであり、前記第1培地は無血清かつ中性pHであり；
c)中性pHかつ約2.0M NaCl〜約5.0M NaClの塩濃度であって、生体組織内で同定されるコラーゲンを不溶性に保つように選択された塩濃度を含む緩衝液で段階(b)の組織を灌流するかまたは段階(b)のホモジネートを抽出し;
d)緩衝液中、RNアーゼおよびDNアーゼで段階(c)の組織を灌流するかまたは段階(c)のホモジネートを抽出し;
e)中性pHかつ無血清であり、約250mOsm/kg〜約350mOsm/kgの重量オスモル濃度を有する第2培地で段階(d)の組織またはホモジネートをリンスし、それによって、生体組織から、無傷のまたはホモジナイズしたバイオマトリックス足場であって、コラーゲンの少なくとも95%および生体組織のコラーゲン結合性マトリックス成分およびマトリックス結合性増殖因子、ホルモンおよびサイトカインの大部分を含む前記足場を製造し；
f)基礎培地でバイオマトリックス足場を希釈し；
g)約-80℃で(f)のバイオマトリックス足場を凍結し；
h)大きさが約1μm〜約100μmのバイオマトリックス粒子に低温粉砕することによって(g)のバイオマトリックス足場を粉砕し；
i)(h)のバイオマトリックス粒子を基礎培地中、懸濁状態で解凍し；
j)段階(i)のバイオマトリックス粒子を培養装置に散布すること
を含み、それによって、培養装置への工業規模の散布のための、生体組織からのバイオマトリックス足場を製造する前記方法。
【請求項２】
バイオマトリックス足場を滅菌する段階をさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
滅菌する段階がγ線照射によって行われる、請求項3に記載の方法。
【請求項４】
(f)のバイオマトリックス足場が約1:6比で基礎培地に希釈される、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
(i)のバイオマトリックス粒子が約1:24比で基礎培地に希釈される、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
第1培地が塩、ミネラル、アミノ酸、ビタミンおよび糖を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
第1培地が基礎培地である、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
基礎培地がRPMI1640、DME/F12、DME、F12、ウェイマウス培地およびウィリアム培地からなる群から選択される、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
第2培地が、間質液に存在する成分の少なくとも１つを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
段階(b)の脱脂緩衝液が、第1培地に、約20単位/L〜約50単位/LのホスホリパーゼＡ2および約1%のデオキシコール酸ナトリウムを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
段階(c)の緩衝液の塩濃度が、成人肝臓からの足場製造に用いる場合、約3.4M NaCl〜約3.5M NaClであり、胎児肝臓からの足場製造に用いる場合、約4.0M NaCl〜約4.5M NaClである、請求項1に記載の方法。
【請求項１２】
段階(c)の緩衝液が、プロテアーゼインヒビターをさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１３】
プロテアーゼインヒビターが大豆トリプシンインヒビターである、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
段階(d)の緩衝液が、プロテアーゼインヒビターをさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１５】
プロテアーゼインヒビターが大豆トリプシンインヒビターである、請求項13に記載の方法。
【請求項１６】
段階(a)〜(e)のすべての培地および緩衝液が、細胞外マトリックス成分を分解する酵素の検出可能な量を含まない、請求項1に記載の方法。
【請求項１７】
生体組織が、肝臓組織、肺組織、膵臓組織、甲状腺組織、腸管組織、皮膚組織、血管組織、膀胱組織、心臓組織および腎組織からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項１８】
生体組織が哺乳動物由来である、請求項1に記載の方法。
【請求項１９】
請求項1〜18のいずれかに記載の方法によって製造されるバイオマトリックス足場。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の主張
本願は、35 U.S.C § 119(e)に基づき、2010年7月2日出願の米国仮出願出願番号61/360,939による優先権を主張するものであり、その全内容は、参照により本願に組み込まれる。
【０００２】
政府の支援の陳述
本発明の側面は、米国国立衛生研究所(National Institutes of Health)(NIH)助成金番号AA014243およびIP30-DK065933、国立糖尿病・消化器・腎疾病研究所(National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases)(NIDDK)助成金番号DK34987、米国立癌研究所(National Cancer Institute)(NCI)助成金番号CA016086ならびに国立歯科・頭蓋顔面研究所(National Institute of Dental and Craniofacial Research)番号DE019569の下に政府の支援を受けて行われた。アメリカ合衆国政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
技術分野
本発明は、バイオマトリックス足場、バイオマトリックス足場の製造方法および、無傷の足場としてのあるいは特定の実験および臨床用途のために切片化されるかまたは粉砕されさまざまに分散された足場としての、様々な用途におけるバイオマトリックス足場の使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
ex vivoにおいて、あるいは細胞治療などの臨床試験プログラムにおいて分化細胞を使用する能力は、成人表現型を有し完全に機能する細胞を維持する能力、あるいは幹細胞または前駆細胞(“幹/前駆細胞”)がその成人表現型を達成するように系統を限定することができる能力に依存する。幹細胞研究における現在進行中の革命によって、胚組織、胎児組織および出生後組織からのものを含む幹/前駆細胞細胞集団の同定および単離が可能になった1。すべての成人細胞型に関する幹/前駆細胞を単離同定し、それらを増殖させ分化させる能力によって、医薬および他の産業研究プログラム、学術調査ならびに細胞治療および生体組織工学などの臨床試験プログラムにそれらを利用するためのその潜在能力は大幅に高まる2。
【０００５】
ex vivoにおいて、分化細胞の維持または幹細胞の成人運命への系統限定のための現行の方法は部分的に成功しており、細胞外マトリックス成分の基材(単数または複数)と成人表現型に合わせた特定のホルモン、増殖因子および栄養素を含む培地中とに細胞をプレーティングするかまたは組み込むことを含む。胚性幹(ES)細胞、人工多能性幹(iPS)細胞などの大変初期の幹細胞あるいは間葉系幹細胞(MSC)または羊水由来幹細胞(AFSC)などの複数の成人運命をとることができる出生後由来幹細胞に関しては、幹細胞は、可溶性シグナルおよび/細胞外マトリックス成分にさらされ、数週間かけて、これらのシグナルの複数のセットで処理されなければならない。一般的には、達成される成人表現型は各調製物ごとで異なり、特定の成人特異的遺伝子の過剰発現もしくは過小発現および/または成人組織特異的遺伝子の1以上の異常制御を示す。
【０００６】
細胞外マトリックスは、細胞によって分泌され、細胞表面の1以上で細胞と隣接し、細胞の構造支持体であると長い間理解されてきた7。細胞外マトリックスは、高度に制御され、接着された細胞の形態、増殖および分化の決定に不可欠な種々の生物活性分子で構成される極めて複雑な足場である8。培養細胞における組織特異的遺伝子発現は、マトリックス抽出物または精製マトリックス成分上で細胞を培養することによって改善される9。しかしながら、個々のマトリックス成分は、単独または組み合わせでは、組織の複雑なマトリックスの化学的性質と構造を再現することができない。このことは、マトリックス成分が、天然の組織領域および組織構造、例えば血管と関連した勾配を有するという事実と関連する。組織マトリックスのこの複雑さは、組織を脱細胞化し、マトリックスを残留物として残す抽出によって容易に達成される10,11。しかしながら、現行の脱細胞化(decellularization)プロトコルでは、マトリックス分解酵素の使用または、マトリックス成分を可溶化する緩衝液の使用によって、マトリックス成分の一部が大きく損失してしまう。
【０００７】
本発明は、バイオマトリックス足場、バイオマトリックス足場の製造方法およびバイオマトリックス足場の使用に関する。本発明の方法は、結合性マトリックス成分ならびに成熟細胞と幹/前駆細胞細胞集団の系統限定の両方に総合的により再現性があり強力な分化作用を発揮する、マトリックス結合性ホルモン、増殖因子およびサイトカインを含む、組織のコラーゲンの大部分が富化した組織特異的抽出物の製造をもたらす。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、培養装置への散布(例えば、実施例2に示すプロトコルに記載されている容量を用いる工業規模の散布（industrial scale dispersal））のための、生体組織からのバイオマトリックス足場（）の製造方法であって、a)塩濃度約3.5M NaCl〜約4.5M NaClを含む緩衝液で生体組織を灌流するかまたは生体組織をホモジナイズし；b)第1培地にリパーゼおよび/または洗浄剤を含む脱脂緩衝液で段階(a)の生体組織を灌流するかまたは段階(a)のホモジネートを抽出し、ここで前記第1培地の重量オスモル濃度は約250mOsm/kg〜約350mOsm/kgであり、前記第1培地は無血清かつ中性pHであり；c)中性pHかつ約2.0M NaCl〜約5.0M NaClの塩濃度であって、生体組織内で同定されるコラーゲンを不溶性に保つ（keep insoluble collagens identified in the biological tissue）ように選択された塩濃度を含む緩衝液で段階(b)の組織を灌流するかまたは段階(b)のホモジネートを抽出し;d)緩衝液中、RNアーゼおよびDNアーゼで段階(c)の組織を灌流するかまたは段階(c)のホモジネートを抽出し;e)中性pHかつ無血清であり、約250mOsm/kg〜約350mOsm/kgの重量オスモル濃度を有する第2培地で段階(d)の組織またはホモジネートをリンス（rinse）し、それによって、生体組織から、無傷のまたはホモジナイズしたバイオマトリックス足場であって、コラーゲンの少なくとも95%および生体組織のコラーゲン結合性マトリックス成分およびマトリックス結合性増殖因子、ホルモンおよびサイトカインの大部分を含む前記足場を製造し；f)基礎培地（basal medium）でバイオマトリックス足場を希釈し；g)約-80℃で(f)のバイオマトリックス足場を凍結し；h)大きさが約1μm〜約100μmのバイオマトリックス粒子に低温粉砕（cryogenic grinding）することによって(g)のバイオマトリックス足場を粉砕（pulverizing）し；i)(h)のバイオマトリックス粒子の基礎培地中、懸濁状態で解凍し（thawing the biomatrix particles of (h) in suspension in basal medium）；j)段階(i)のバイオマトリックス粒子を培養装置に散布することを含み、それによって、培養装置への散布(例えば、本明細書に記載の工業規模の散布）のための生体組織からのバイオマトリックス足場を製造する前記方法を提供する。本発明は、さらに、本発明の方法によって製造されるバイオマトリックス足場を提供する。
【０００９】
ここで、本発明の他の実施形態に関して、本発明の前述および他の側面をさらに詳細に説明する。当然のことながら、本発明は、他の形態で実施することが可能であり、本発明を本明細書に示す実施形態に限定するものと解釈してはならない。むしろ、これらの実施形態は、本開示を詳細かつ完全なものにするために、かつ本発明の範囲を当業者に十分に知らしめるために提供されるものである。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１−１】ラット肝臓バイオマトリックス足場の製造を示す図である。  図1Aは、潅流洗浄、PLA2およびSDCでの脱脂、高塩洗浄ならびに核酸除去のためのヌクレアーゼ処理を含む4段階脱細胞化プロセスを示す。  図1B〜1Dは、ラットバイオマトリックス足場の製造における4段階を示す。  図1Bは、基礎培地での10分間の潅流洗浄後に肝臓の色がうすくなることを示す。  図1Cは、脱脂中、GCの下で肝臓が部分的に透明になることを示している。  図1Dは、最終の無傷の足場が、潅流40分で透明に見えることを示している。  図1Eは、低倍率でのバイオマトリックス足場を示す。図1E1は、ローダミン標識デキストラン粒子を用いて潅流した足場の可視化により、チャンネルに沿って、漏出なしに、大血管から微細血管枝まで色素の連続した流れがあることが明らかであることを示し、これは足場における親血管を示している。異なる段階におけるバイオマトリックス足場の対応するヘマトキシリン・エオジン(H&E)染色は、組織構造、例えば血管および実質を包むレース状マトリックスが保存されており、一方で細胞が除去されていることを示した。図1B1は、門脈(PV)、肝動脈(HA)、および胆管(BD)からなる正常ラット肝の肝三つ組（portal triad）構造を示し;図1C1は、脱細胞化プロセス中、細胞が徐々に除去されるに従って、マトリックス繊維が明らかになることを示し;図1D1は、脱細胞化した肝三つ組領域(図1B1と比較のこと)を示し;図1D2および図1D3は、マトリックス足場からすべての細胞が除去されているが、メッシュ構造、例えば、血管、GCおよび、実質細胞の壁を囲むレース状マトリックスが保存されていることを示している。
【図１−２】ラット肝臓バイオマトリックス足場の製造を示す図である。  図1Aは、潅流洗浄、PLA2およびSDCでの脱脂、高塩洗浄ならびに核酸除去のためのヌクレアーゼ処理を含む4段階脱細胞化プロセスを示す。  図1B〜1Dは、ラットバイオマトリックス足場の製造における4段階を示す。  図1Bは、基礎培地での10分間の潅流洗浄後に肝臓の色がうすくなることを示す。  図1Cは、脱脂中、GCの下で肝臓が部分的に透明になることを示している。  図1Dは、最終の無傷の足場が、潅流40分で透明に見えることを示している。  図1Eは、低倍率でのバイオマトリックス足場を示す。図1E1は、ローダミン標識デキストラン粒子を用いて潅流した足場の可視化により、チャンネルに沿って、漏出なしに、大血管から微細血管枝まで色素の連続した流れがあることが明らかであることを示し、これは足場における親血管を示している。異なる段階におけるバイオマトリックス足場の対応するヘマトキシリン・エオジン(H&E)染色は、組織構造、例えば血管および実質を包むレース状マトリックスが保存されており、一方で細胞が除去されていることを示した。図1B1は、門脈(PV)、肝動脈(HA)、および胆管(BD)からなる正常ラット肝の肝三つ組（portal triad）構造を示し;図1C1は、脱細胞化プロセス中、細胞が徐々に除去されるに従って、マトリックス繊維が明らかになることを示し;図1D1は、脱細胞化した肝三つ組領域(図1B1と比較のこと)を示し;図1D2および図1D3は、マトリックス足場からすべての細胞が除去されているが、メッシュ構造、例えば、血管、GCおよび、実質細胞の壁を囲むレース状マトリックスが保存されていることを示している。
【図２−１】ラット肝臓バイオマトリックス足場のTEM画像（A-C）及びSEM画像（D-H）である。  図２Ａは、低倍率の、厚い壁(W)を有する血管(BV)を示す。I型コラーゲン(大きな矢印)が多く存在し、重金属染色剤で染色されない個々の繊維の断面(白色の点、小さな矢印)を含む。  図２Ｂは、ラット肝臓バイオマトリックス足場のTEM画像である。高倍率の血管壁は、基底膜(大きな矢印)、非晶質エラスチン(*)および関連弾性線維、まれな膜小胞残存物(小さな矢印)、I型コラーゲンに結合した繊維(矢印)ならびに小さな細繊維(小さな矢印)を示す。小さな細繊維は、恐らくは、I型コラーゲンと密接に関連し、組織化することを手伝うフィブリリン(VI型コラーゲン)である。  図２Ｃは、ラット肝臓バイオマトリックス足場のTEM画像である。図2Cは、64nmの縞模様(矢印)を有する高倍率のI型コラーゲンを示す。
【図２−２】ラット肝臓バイオマトリックス足場のTEM画像（A-C）及びSEM画像（D-H）である。  図２Ｄは、ラット肝臓バイオマトリックス足場のSEM画像である。図2Dは、低倍率の、薄い壁を有する血管(BV)および大きな血管壁(W)を示す。  図２Ｅは、ラット肝臓バイオマトリックス足場のSEM画像である。高倍率では、大きな血管壁(W)はホタテガイの縁のように波を打っており、肝三つ組の肝動脈と一致する。図2Aを参照のこと。壁の下には、長い分枝した薄い網状の(III型)コラーゲン細繊維(小さな矢印)と結合した多数のI型コラーゲン線維束(大きな矢印)が存在する。  図２Ｆは、ラット肝臓バイオマトリックス足場のSEM画像である。I型コラーゲンの大きな線維束は、種々の小さな繊維(矢印)および結節型または珠状に連なった繊維(矢印)と関連する特徴的な平行した繊維(大きな矢印)を有する。  図２Ｇは、ラット肝臓バイオマトリックス足場のSEM画像である。図2Gは、例えば、肝臓類洞との境界を形成する平面に連結する大きな/小さな繊維の3次元的な網を示す。  図２Ｈは、ラット肝臓バイオマトリックス足場のSEM画像である。図2Hは、高倍率での、種々の繊維(矢印):III型コラーゲン(大きな直径のまっすぐな部分)、弾性線維またはVI型コラーゲンを示す網を示す。
【図３Ａ】バイオマトリックス足場における、コラーゲンの化学分析および細胞外マトリックス(ECM)成分の発現を示す図である。図3Aは、すべてのコラーゲンに存在する3つのアミノ酸、ヒドロキシプロリン(Hyp)、ヒドロキシリジン(Hyl)およびグリシン(Gly)の含量を示す。数値は、各アミノ酸残基/1,000アミノ酸を示す。このデータは、脱細胞化プロセスにおいて、肝臓における<0.2%からバイオマトリックス足場における15%を超えるところまで、コラーゲン含量が劇的に増加したことを示している。
【図３Ｂ】バイオマトリックス足場における、コラーゲンの化学分析および細胞外マトリックス(ECM)成分の発現を示す図である。図3Bは、肝臓バイオマトリックス足場におけるラミニン(LAM)、ヘパラン硫酸(HS)、コラーゲンIII型(COL3)およびフィブロネクチン(FN)ならびに血管の残存物と関連する典型的な基底膜タンパク質の分布を示す、バイオマトリックス足場におけるマトリックス分子の免疫組織化学染色を示す図である。高倍率では、IV型コラーゲン(COL4)、エンタクチン(Ent;ナイドジェンとも呼ばれる)、ラミニン(LAM)および、肝三つ組の近くの足場の部分におけるHS-PG体であるパールカン(Per)を含む、基底膜の主要なメンバーを観察することができる。
【図４−１】バイオマトリックス足場における肝三つ組から中心静脈までのECM成分のパターンを示す図である。正常肝臓(図4A)と肝臓バイオマトリックス足場(図4B)の肝三つ組(第1領域)から中心静脈(第3領域)までの組織比較を示す。共にヘマトキシリン/エオジン染色切片である。
【図４−２】バイオマトリックス足場における肝三つ組から中心静脈までのECM成分のパターンを示す図である。図4Cは、肝臓の帯状分布と関連するパターンを形成することが示されている典型的なマトリックス成分を有する肝臓における幹細胞および成熟系統系を説明するモデルである。成分は、免疫組織化学の所見からの存在量の順に示してある。ヒト肝臓内の既知の系統段階は、第1領域における門脈周囲(肝三つ組の周囲)から開始され、成熟につれて進行し、第3領域におけるアポトーシス細胞で終わる。肝臓の幹細胞ニッチにおいて同定される既知のマトリックスの化学的性質は、ヒアルロナン、III型コラーゲン、ラミニンとα6β4インテグリンとの結合体および低硫酸化CS-PGを含む43,44。幹細胞ニッチの少し外側には、IV型コラーゲン、普通に硫酸化されたCS-PGおよびHS-PG、ならびにαβ1インテグリンに結合したラミニンが見られる。HP-PGは、中心静脈周辺に特有に位置していることが記録されている45,46。
【図４−３】バイオマトリックス足場における肝三つ組から中心静脈までのECM成分のパターンを示す図である。図4Dは、肝臓におけるマトリックス成分およびその位置とバイオマトリックス足場におけるマトリックス成分およびその位置との比較を概略を示すものであるが、データは、免疫組織化学の所見からまとめた(N/D=未試験。*中心静脈付近にのみ存在することが他の著者により見出されている)。細胞骨格の成分の大部分は、洗浄中に失われるが、残留物の全部ではないが、その一部の細胞骨格タンパク質は存在している。足場には、チューブリン、デスミンおよびアクチンの検出可能な量は存在しない(ファロイジンアッセイ)。しかしながら、足場に無作為に散らばった微量のサイトケラチン;肝三つ組における血管残存物の周囲の微量のα-平滑筋アクチン;および全体にわたる低レベルのビメンチンが存在する。
【図５−１】肝臓バイオマトリックス足場上でのhHpSCに対するタイプ1コラーゲン上でのhHpSCの解析を示す図である。図5Aは、自己複製条件の1つである、組織培養プラスチック上、無血清Kubota培地中で培養した、同じ肝臓由来のhHpSCコロニーの形態学的変化を示す位相コントラスト画像を示す。図5Bは、I型コラーゲン上、肝臓のための無血清分化培地の分化条件で培養した、同じ肝臓由来のhHpSCコロニーの形態学的変化を示す位相コントラスト画像を示す。図5C、図5D、図5Eは、ウシ肝臓バイオマトリックス足場上、肝臓のための無血清分化培地の分化条件で培養した、同じ肝臓由来のhHpSCコロニーの形態学的変化を示す位相コントラスト画像を示す。機能性を有し、完全に生存している培養物は、I型コラーゲン上では〜2週間を超えなかった。一方、肝臓バイオマトリックス足場上の培養物は、少なくとも1ヶ月は続いて生存し、健常であり、機能の完全なレパートリーを有していた。7〜12日までには、培養物は、核細胞質比の増加と著しいグリコーゲン発現を有する細胞に移行し(図5C)、ついで、透明な毛細胆管が散在する古典的多角形肝細胞形態を有する細胞に移行し(図5D)、24日目における典型的な培養物に示されるように、その後持続する典型的な形態である(図5E)。RT-PCRアッセイは、培養プラスチック上での自己複製条件下でのhHpSCの遺伝子発現変化(図5F)に対する7日目でのラット肝臓バイオマトリックス足場上での自己複製条件下でのhHpSCの遺伝子発現変化(図5G)を示す。我々は、CXCR4およびEpCAMを含むhHpSCマーカー;CK19(KRT19)、HNF6、FOXA2、AFPおよび低レベルのアルブミンを含む初期肝細胞遺伝子;高濃度のアルブミン(ALB)、トランスフェリン(TF)、CYP450-3A4、チロシンアミノトランスフェラーゼ(TAT)およびグルコース-6-ホスファターゼ(G6PC)を含む成熟肝細胞マーカーならびに、CFTR、γ-グルタミルトランスペプチターゼ(GGT1)、陰イオン交換2(AE2)および頂膜ナトリウム依存性胆汁酸輸送体(ASBT)を含む胆管細胞遺伝子の発現を比較した。図5Hは、I型コラーゲン上の培養物で合成された尿素の測定に対するラット肝臓バイオマトリックス足場上の培養物で合成された尿素の測定の生化学的アッセイを示し、図5Iは、I型コラーゲン上の培養物におけるCYP450-3A4活性の測定に対するラットまたはウシ肝臓のいずれかから製造されたバイオマトリックス足場上の培養物におけるCYP450-3A4活性の測定の生化学的アッセイを示す。自己複製培養条件下(III型コラーゲン)、あるいはI型コラーゲン上での分化条件下に対する肝臓バイオマトリックス足場上での分化条件下での、新鮮分離hHpSCの接着、生存率、増殖、培養物の寿命および組織特異的遺伝子発現を比較する定量的測定の概要を表7に示す。
【図５−２】肝臓バイオマトリックス足場上でのhHpSCに対するタイプ1コラーゲン上でのhHpSCの解析を示す図である。図5Aは、自己複製条件の1つである、組織培養プラスチック上、無血清Kubota培地中で培養した、同じ肝臓由来のhHpSCコロニーの形態学的変化を示す位相コントラスト画像を示す。図5Bは、I型コラーゲン上、肝臓のための無血清分化培地の分化条件で培養した、同じ肝臓由来のhHpSCコロニーの形態学的変化を示す位相コントラスト画像を示す。図5C、図5D、図5Eは、ウシ肝臓バイオマトリックス足場上、肝臓のための無血清分化培地の分化条件で培養した、同じ肝臓由来のhHpSCコロニーの形態学的変化を示す位相コントラスト画像を示す。機能性を有し、完全に生存している培養物は、I型コラーゲン上では〜2週間を超えなかった。一方、肝臓バイオマトリックス足場上の培養物は、少なくとも1ヶ月は続いて生存し、健常であり、機能の完全なレパートリーを有していた。7〜12日までには、培養物は、核細胞質比の増加と著しいグリコーゲン発現を有する細胞に移行し(図5C)、ついで、透明な毛細胆管が散在する古典的多角形肝細胞形態を有する細胞に移行し(図5D)、24日目における典型的な培養物に示されるように、その後持続する典型的な形態である(図5E)。RT-PCRアッセイは、培養プラスチック上での自己複製条件下でのhHpSCの遺伝子発現変化(図5F)に対する7日目でのラット肝臓バイオマトリックス足場上での自己複製条件下でのhHpSCの遺伝子発現変化(図5G)を示す。我々は、CXCR4およびEpCAMを含むhHpSCマーカー;CK19(KRT19)、HNF6、FOXA2、AFPおよび低レベルのアルブミンを含む初期肝細胞遺伝子;高濃度のアルブミン(ALB)、トランスフェリン(TF)、CYP450-3A4、チロシンアミノトランスフェラーゼ(TAT)およびグルコース-6-ホスファターゼ(G6PC)を含む成熟肝細胞マーカーならびに、CFTR、γ-グルタミルトランスペプチターゼ(GGT1)、陰イオン交換2(AE2)および頂膜ナトリウム依存性胆汁酸輸送体(ASBT)を含む胆管細胞遺伝子の発現を比較した。図5Hは、I型コラーゲン上の培養物で合成された尿素の測定に対するラット肝臓バイオマトリックス足場上の培養物で合成された尿素の測定の生化学的アッセイを示し、図5Iは、I型コラーゲン上の培養物におけるCYP450-3A4活性の測定に対するラットまたはウシ肝臓のいずれかから製造されたバイオマトリックス足場上の培養物におけるCYP450-3A4活性の測定の生化学的アッセイを示す。自己複製培養条件下(III型コラーゲン)、あるいはI型コラーゲン上での分化条件下に対する肝臓バイオマトリックス足場上での分化条件下での、新鮮分離hHpSCの接着、生存率、増殖、培養物の寿命および組織特異的遺伝子発現を比較する定量的測定の概要を表7に示す。
【図６】バイオマトリックス足場上のhHpSCから限定された細胞系統の免疫蛍光染色を示す図である。  図6Aは、肝臓特異的マーカー:アルブミン(Alb、ライトグレー)および肝幹細胞表面マーカー:EpCAM(白色)での染色を示す。バイオマトリックス足場上にプレーティングした細胞はEpCAMを発現しないことに注意されたい。スケールバー=200μm。  図6Bは、初期肝マーカーα-フェトプロテイン(AFP、ライトグレー)およびヒト胆管細胞マーカー、サイトケラチン19(CK19、白色)(この発現レベルは成熟胆管細胞を示す)に対する抗体での染色を示す。CK19アッセイに対する抗体はヒト特異的であり、細胞を播種されない足場においてラットCK19における残留物を染色しなかった。AFP発現は弱いが、7日目においても明白である。スケールバー=200μm.  図6Cは、Alb(ライトグレー)および肝星細胞マーカー、α-平滑筋アクチン(ASMA、白色)での染色を示す。アルブミンおよびASMAの発現は、成熟肝細胞および星細胞の両方が存在するという強力な指標である。スケールバー=100μm。  図6Dは、機能性肝タンパク質CYP450-3A4(ライトグレー)および胆管細胞特異的マーカー、セクレチン受容体(SR、白色)での染色を示す。これは、成熟肝細胞および胆管細胞が機能性であり、これらの2つ細胞型の古典的マーカーを発現することを示す。スケールバー=200μm。
【図７−１】バイオマトリックス足場での完全に機能する成熟ヒト肝細胞の安定性を示す図である。成人のヒト肝細胞を、分化培地に入れ、I型コラーゲン上(図7A、図7B)にプレーティングしたものと、低温粉砕し、培地に分散し、プレート上に沈降させたウシ肝臓バイオマトリックス足場上(図7C)にプレーティングしたものとを比較した。I型コラーゲン上の細胞は完全に生存しており、7〜12日目に分化のピークを示した(図7A、7日目を示す);これらの細胞は、〜2週間後には悪化し始め、20日目(図7B)までには、それらは死ぬか、死にかけているか、非機能性である。一方、肝臓バイオマトリックス足場上にプレーティングした細胞(図7C)は、少なくとも8週間(これ以上は試験していない)機能性である。ここでは、粉砕され肝臓バイオマトリックス足場上での培養の21日後を示す。図7Dに、バイオマトリックス足場上にプレーティングした凍結保存された成人のヒト肝細胞と、I型コラーゲン上にプレーティングした凍結保存された成人のヒト肝細胞の2つの別々の製造物の培養物に関する12日目でのCYP450-3A4アッセイを示す。試料ZHep-007は、解凍後に良好な接着を示す凍結保存された試料を代表し、試料ZL-013は、解凍後に接着が弱いかまたは接着を示さないロットを代表する。従って、これらのより品質の劣る試料であっても、バイオマトリックス足場に接着し、長期に生存のままでいることができる。アッセイした両方の試料において、肝臓バイオマトリックス足場で培養された場合、P450のレベルは高かった。バイオマトリックス足場での時間と共に、低品質の凍結保存された細胞のロットは改善する。
【図７−２】バイオマトリックス足場での完全に機能する成熟ヒト肝細胞の安定性を示す図である。成人のヒト肝細胞を、分化培地に入れ、I型コラーゲン上(図7A、図7B)にプレーティングしたものと、低温粉砕し、培地に分散し、プレート上に沈降させたウシ肝臓バイオマトリックス足場上(図7C)にプレーティングしたものとを比較した。I型コラーゲン上の細胞は完全に生存しており、7〜12日目に分化のピークを示した(図7A、7日目を示す);これらの細胞は、〜2週間後には悪化し始め、20日目(図7B)までには、それらは死ぬか、死にかけているか、非機能性である。一方、肝臓バイオマトリックス足場上にプレーティングした細胞(図7C)は、少なくとも8週間(これ以上は試験していない)機能性である。ここでは、粉砕され肝臓バイオマトリックス足場上での培養の21日後を示す。図7Dに、バイオマトリックス足場上にプレーティングした凍結保存された成人のヒト肝細胞と、I型コラーゲン上にプレーティングした凍結保存された成人のヒト肝細胞の2つの別々の製造物の培養物に関する12日目でのCYP450-3A4アッセイを示す。試料ZHep-007は、解凍後に良好な接着を示す凍結保存された試料を代表し、試料ZL-013は、解凍後に接着が弱いかまたは接着を示さないロットを代表する。従って、これらのより品質の劣る試料であっても、バイオマトリックス足場に接着し、長期に生存のままでいることができる。アッセイした両方の試料において、肝臓バイオマトリックス足場で培養された場合、P450のレベルは高かった。バイオマトリックス足場での時間と共に、低品質の凍結保存された細胞のロットは改善する。
【図８】リゾレシチンを生成させるためのデオキシコール酸ナトリウムによるホスホリパーゼA2の活性化を示す図である。プロトコルの原理:デオキシコール酸ナトリウムによって活性化されたホスホリパーゼA2(PLA2)は、細胞質膜およびミトコンドリア膜に位置するホスホグリセリドを分解し、強力な界面活性剤であり、細胞壊死を誘導するリゾレシチンを生成する。
【図９】ラット肝臓のコラーゲン組成に対するラット肝臓バイオマトリックス足場のコラーゲン組成の分析を示す図である。バイオマトリックスのアミノ酸組成(黒)および全肝臓のアミノ酸組成(ライトグレー)をローズダイヤグラムを用いて示した。分析した各アミノ酸に関して3文字略語を用いている。トリプトファンおよびシステインは分析しなかった。数値はアミノ酸残基/1,000を示す。
【図１０】ラット肝臓バイオマトリックス足場の核酸分析を示す図である。図10Aは、肝臓バイオマトリックススライドの位相コントラスト写真を示す。図10Bは、肝臓バイオマトリックススライドの蛍光性DAPI染色を示す。図10Cは、ラット新鮮肝臓組織からの全DNAおよびRNAに対するバイオマトリックス足場からの全DNAおよびRNAに関する定量的アッセイを示す。
【図１１】バイオマトリックス足場へのhHpSCのプレーティング後のバイオマトリックス足場の染色を示す図である。生(カルセイン-AM、白色)/死(臭化エチジウムまたはEtD-Br1、ライトグレー)アッセイは、hHpSCコロニーが、バイオマトリックス足場切片上で生存していたが、生体色素を除去する幹細胞(例えば、MDR1)の既知のポンプによって最初の数日間、コロニーの中央で色素を取り込むことができなかった(図11A、図11B)ことを示している。図11Bにおいて、蛍光画像は、フェーズ1と融合し、これはコロニーの中央が細胞を含んでいることを示している。図11Cは、7日目までに、コロニーを通じて細胞が分化しており、コロニーを通じて、ほとんどの細胞に生体色素が取り込まれたことを示す。
【図１２−１】I型コラーゲンで培養されたラット肝細胞とラット肝臓バイオマトリックス足場で培養されたラット肝細胞との比較を示す図である。3日目(図12A、図12C)および10日目(図12B、図12D)における、I型コラーゲンおよびバイオマトリックス足場で培養された成人ラット肝細胞を示す。これらの細胞は、数分以内に肝臓バイオマトリックス足場に接着し、試験期間の最後まで、8週間を超えて生存した(図12C、図12D)。それ以上の期間は試験していない。バイオマトリックス足場では、培養物は大変立体的である。
【図１２−２】I型コラーゲンで培養されたラット肝細胞とラット肝臓バイオマトリックス足場で培養されたラット肝細胞との比較を示す図である。図12Eは、1、3、5、7、10、14、21および28日目における、n=3での尿素合成アッセイを示す。図12Fは、1、3、5、7、10、14、21および28日目における、n=3での細胞生存率アッセイを示す。
【図１３】ヒト膵臓とヒト膵臓バイオマトリックス足場との比較を示す図である。パラフィン包埋し、切片を作成しヘマトキシリン・エオジン(H&E)で染色したヒト膵臓(図13A)に対するヒト膵臓バイオマトリックス足場(図13B、図13C、図13D)を示す。膵島構造は、概略を図12Bに示した。膵臓バイオマトリックス足場の腺房領域を図13Cおよび図13Dに示す。
【図１４】ヒト膵臓組織に存在する典型的なマトリックス成分および細胞骨格成分ビメンチンと、ラット膵臓バイオマトリックス足場に存在するそれらとの比較を示す図である。他の細胞骨格成分(デスミン、チューブリン、アクチン)は検出可能な量では存在しなかったか、あるいは微量(サイトケラチン)に存在した。膵島を点線で囲んである。膵臓組織およびバイオマトリックス足場の両方での膵島において、シンデカン1およびVI型コラーゲンが強陽性であることに注意されたい。シンデカン1は膵島(点線)にのみ存在し、腺房細胞(矢印)には存在しない。III型コラーゲンは、腺房細胞および周囲の血管(矢印)により富化しているが、膵島には存在しない。
【図１５−１】ヒト十二指腸バイオマトリックス足場の組織学的染色および免疫組織化学染色を示す図である。図15Aは、ヒト十二指腸バイオマトリックス足場の外側および管腔側を示す。正常組織(図15B)とバイオマトリックス足場(図15C)の多層構造をH&E染色切片で比較した。結果は、足場が粘膜および粘膜下層における絨毛および血管を保持していることを示している。下パネルは、種々の量の細胞外マトリックスタンパク質が足場に保持されていることを示す、ヒト十二指腸バイオマトリックス足場の免疫組織化学染色を示す。
【図１５−２】ヒト十二指腸バイオマトリックス足場の組織学的染色および免疫組織化学染色を示す図である。図15Aは、ヒト十二指腸バイオマトリックス足場の外側および管腔側を示す。正常組織(図15B)とバイオマトリックス足場(図15C)の多層構造をH&E染色切片で比較した。結果は、足場が粘膜および粘膜下層における絨毛および血管を保持していることを示している。下パネルは、種々の量の細胞外マトリックスタンパク質が足場に保持されていることを示す、ヒト十二指腸バイオマトリックス足場の免疫組織化学染色を示す。
【図１６】ヒト胆嚢組織とヒト胆嚢バイオマトリックス足場の比較を示す図である。ヒト胆嚢組織(図16A、図16B)とそれに対するバイオマトリックス足場(図16C、図16D)をそれから製造した。組織およびバイオマトリックス足場をパラフィン包埋し、切片を作成し、ヘマトキシリン・エオジンで染色した。
【図１７】1:24希釈のためのバイオマトリックス溶液製造の例を示す図である。30mlx3=90ml。30mlバイオマトリックス+90ml溶液5=1:24希釈のための120mlバイオマトリックス溶液。
【００１１】
発明の詳細な説明
ここで、本発明を以下にさらに詳細に説明する。しかしながら、本発明は、他の形態で実施することが可能であり、本発明を本明細書に示す実施形態に限定するものと解釈してはならない。むしろ、これらの実施形態は、本開示を詳細かつ完全なものにするために、かつ本発明の範囲を当業者に十分に伝えるために提供されるものである。
【００１２】
本明細書において、発明の詳細な説明で用いられる用語法は、単に特定の実施形態を説明するためのものであって、本発明を限定するためのものではない。発明の詳細な説明および添付の特許請求の範囲に用いられる場合、単数形"ある(a)"、"ある(an)"および"その(the)"は、文脈によって明確に否定されない限り、複数形もまた含むものとする。
【００１３】
特記しない限り、本明細書で用いられるすべての用語(学術用語を含む)は、本発明が属する当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。さらに、一般的に用いられる辞書に定義されているような用語は、本願および関連技術分野の文脈における意味と一致する意味を有するものと解釈されるべきであり、本明細書に明示的に規定されていない限り、理想化された意味又は過度に形式的な意味に解釈されるべきではないこともまた明らかであろう。本明細書において、発明の詳細な説明で用いられる用語法は、単に特定の実施形態を説明するためのものであって、本発明を限定するためのものではない。本明細書に記載のすべての公報、特許出願、特許および他の文献は、参照としてその全体が包含される。
【００１４】
同様に、本明細書において、"および/または"とは、関連する記載項目の1以上の全ての可能な組み合わせばかりでなく、選択肢"または"で説明される場合の組み合わせの欠如のことも言い、かつ含む。
【００１５】
文脈によって否定されない限り、本明細書に記載の本発明の種々の特徴は、任意の組み合わせで使用することができるものとする。さらに、本発明はまた、本発明のいくつかの実施形態において、本明細書において示される任意の特徴または特徴の組み合わせを除外または排除することができることを考える。例えば、複合体が成分A、BおよびCを含むと明細書が述べている場合、A、BまたはCのいずれか、またはそれらの組み合わせを排除することができ、単独で、あるいは任意の組み合わせで放棄することができることが特に意図される。
【００１６】
本明細書において、移行句“から本質的になっている(consisting essentially of)”(およびその文法的変形)は、記載されている物質または段階ならびに、請求の範囲記載の発明の基本的および新規特徴(単数または複数)に実質的に作用しない物質または段階を含むと解釈されるべきである。In re Herz, 537 F.2d 549, 551-52, 190 U.S.P.Q. 461, 463 (CCPA1976)(強調は原文のまま)を参照のこと;同様に、MPEP § 2111.03もまた参照のこと。従って、本明細書において、用語"から本質的になっている"は、"を含む"と等しいと解釈されるべきである。
【００１７】
本明細書において、量または濃度(例えば、バイオマトリックス足場での総タンパク質におけるコラーゲンの百分率)などの測定可能な値について言う場合の用語"約"などは、特定の量の20%、10%、5%、1%、0.5%、あるいは0.1%までもの変化を含むと解される。
【００１８】
本発明は、現在知られている脱細胞化した組織足場を超える予期せぬ改善および利点を有するバイオマトリックス足場の発見および開発に関する。このような改善および利点の例には、効率的に成熟細胞を維持するためのおよび/または、系統を成熟運命に限定するためのおよび/または幹細胞を成熟運命に分化するためのおよび/または、このような成熟細胞の機能性を長期間維持するための本発明のバイオマトリックス足場の使用がある。さらなる例として、本発明のバイオマトリックス足場の使用により、成熟運命の細胞を製造する時間が、約3〜6週間あるいはそれ以上から約1〜2週間に短縮される。本発明のバイオマトリックス足場は、塩濃度およびイオン強度の適切なバランス(異なるコラーゲンは異なる溶解度定数を有する(23))を所定の組織に用いて、その組織に存在する天然コラーゲンを不溶型に維持することを可能にし、系統を限定および分化させるシグナルを与える高いパーセントの天然コラーゲンを保持するバイオマトリックス足場をもたらす特定のプロトコルを用いて製造される。対照的に、既知のプロトコルに従って製造される脱細胞化した足場は、高いパーセントのこれらの天然コラーゲンの維持を可能にする塩濃度およびイオン強度のこのようなバランスを用いず、これらの既知のプロトコルが用いられる場合、これらの天然コラーゲンの大部分は失われる。さらにまた、本発明のバイオマトリックス足場は、実験および/または治療用途に十分な量の系統依存性(例えば分化依存性)ウイルスおよび/または病原体の製造(例えばワクチンの製造)を可能にする。
【００１９】
従って、一実施形態において、本発明は、生体組織からのバイオマトリックス足場の製造方法であって、a)第1培地で生体組織を灌流するかまたは生体組織をホモジナイズし、ここで前記第1培地の重量オスモル濃度は約250mOsm/kg〜約350mOsm/kgであり、前記第1培地は無血清かつ中性pHであり;b)前記第1培地にリパーゼおよび/または洗浄剤を含む脱脂緩衝液で段階(a)の生体組織を灌流するかまたは段階(a)のホモジネートを抽出し;c)中性pHかつ約2.0M NaCl〜約5.0NaClの塩濃度であって、生体組織内で同定されるコラーゲンを不溶性に保つように選択された塩濃度を含む緩衝液で段階(b)の組織を灌流するかまたは段階(b)のホモジネートを抽出し;d)緩衝液中、RNアーゼおよびDNアーゼで段階(c)の組織を灌流するかまたは段階(c)のホモジネートを抽出し;e)中性pHかつ無血清であり、約250mOsm/kg〜約350mOsm/kgの重量オスモル濃度を有する第2培地で段階(d)の組織またはホモジネートをリンスする段階;を含み、それによって生体組織から、無傷のまたはホモジナイズしたバイオマトリックス足場であって、コラーゲンの少なくとも95%(例えば、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%)および、未処理の生体組織のコラーゲン結合性マトリックス成分およびマトリックス結合性増殖因子、ホルモンおよびサイトカインの大部分を含む前記足場を製造する前記方法を提供する。本明細書において、本発明の方法のいずれかによって製造されるバイオマトリックス足場もまた提供される。
【００２０】
本明細書において、“バイオマトリックス足場（biomatrix scaffold）”とは、コラーゲンおよび生体組織に天然に存在するコラーゲン結合性因子の多くまたは大部分を保持する本明細書に記載の細胞外マトリックスが富化した単離された組織抽出物のことを言う。いくつかの実施形態において、本質的にコラーゲンおよびコラーゲン結合性因子のすべてが保持され、他の実施形態において、バイオマトリックス足場は、組織に存在することが知られているコラーゲンのすべてを含む。バイオマトリックス足場は、天然の生体組織に存在するコラーゲン、コラーゲン結合性マトリックス成分および/またはマトリックス結合性増殖因子、ホルモンおよび/またはサイトカインの少なくとも約50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、99.5%または100%を任意の組み合わせで含むことができる。いくつかの実施形態において、バイオマトリックス足場は、生体組織のコラーゲンの少なくとも95%および、生体組織のコラーゲン結合性マトリックス成分およびマトリックス結合性増殖因子、ホルモンおよびサイトカインの大部分を含む。本明細書においては、“生体組織のコラーゲン結合性マトリックス成分（collagen-associated matrix components）ならびにマトリックス結合性（matrix bound）増殖因子、ホルモンおよび/またはサイトカインの大部分”とは、天然の(例えば未処理の)生体組織に存在するコラーゲン結合性マトリックス成分およびマトリックス結合性増殖因子、ホルモンおよび/またはサイトカインの約50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、99.5%または100%を保持するバイオマトリックス足場のことを言う。
【００２１】
例示的なコラーゲンは、すべてのタイプのコラーゲン、例えば、限定するものではないが、I型〜XXIX型コラーゲンを含む。バイオマトリックス足場は、天然の生体組織に存在するコラーゲンの1以上の少なくとも約50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、99.5%以上を含むことができ、かつ/または天然の生体組織に存在する濃度の少なくとも約50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、99.5%以上の濃度で存在するコラーゲンの1以上を有することができる。バイオマトリックス足場におけるコラーゲンの量は、当該技術分野で公知であり、本明細書に記載される種々の方法によって、例えば、限定するものではないが、ヒドロキシプロリン含量を測定することによって測定することができる。
【００２２】
例示的なコラーゲン結合性マトリックス成分は、限定するものではないが、接着分子;接着タンパク質;L-およびP-セレクチン;ヘパリン結合性増殖関連分子(HB-GAM);トロンボスポンジンタイプIリピート(TSR);アミロイドP(AP);ラミニン;ナイドジェン/エンタクチン;フィブロネクチン;エラスチン;ビメンチン;プロテオグリカン(PG);コンドロイチン硫酸-PG(CS-PG);デルマタン硫酸-PG(DS-PG);スモールロイシンリッチプロテオグリカン(SLRP)ファミリーのメンバー、例えば、バイグリカンおよびデコリン;ヘパリン-PG(HP-PG);ヘパラン硫酸-PG(HS-PG)、例えば、グリピカン、シンデカンおよびパールカン;ならびにグリコサミノグリカン(GAG)、例えば、ヒアルロナン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ケラチン硫酸およびヘパリンを含む。いくつかの実施形態において、バイオマトリックス足場は、種々のマトリックス成分に結合するコラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ナイドジェン/エンタクチン、エラスチン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、増殖因子、ホルモンおよびサイトカイン(任意の組み合わせ)を含むか、それらからなるか、または本質的にそれらからなる。バイオマトリックス足場は、天然の生体組織に存在するコラーゲン結合性マトリックス成分、ホルモンおよび/またはサイトカインの1以上の少なくとも約50%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、99.5%以上を含むことができ、かつ/または天然の生体組織に存在する濃度の少なくとも約50%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、99.5%以上の濃度で存在するこれらの成分の1以上を有することができる。いくつかの実施形態において、バイオマトリックス足場は、生体組織に存在することが知られているコラーゲン結合性マトリックス成分、ホルモンおよび/またはサイトカインのすべてまたは大部分を含む。他の実施形態において、バイオマトリックス足場は、天然の生体組織に存在する濃度(例えば、天然の組織に存在する濃度の約50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%または100%)に近い濃度でコラーゲン結合性マトリックス成分、ホルモンおよび/またはサイトカインの1以上を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる。
【００２３】
例示的な増殖因子は、限定するものではないが、線維芽細胞増殖因子(FGF)、神経成長因子(NGF)、上皮増殖因子(EGF)、トランスフォーミング増殖因子、肝細胞増殖因子(HGF)、血小板由来増殖因子(PDGF)、インスリン様成長因子(IGF)、IGF結合タンパク質、塩基性線維芽細胞増殖因子、および血管内皮細胞増殖因子(VEGF)を含む。例示的なサイトカインは、限定するものではないが、インターロイキン、リンホカイン、モノカイン、コロニー刺激因子、ケモカイン、インターフェロンおよび腫瘍壊死因子(TNF)を含む。バイオマトリックス足場は、天然の生体組織に存在するマトリックス結合性増殖因子および/またはサイトカインの1以上の少なくとも約50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、99.5%、100%以上(任意の組み合わせ)を含むことができ、かつ/または天然の生体組織に存在する濃度の少なくとも約50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、99.5%、100%以上の濃度で存在するこれらの増殖因子および/またはサイトカインの1以上(任意の組み合わせ)を有することができる。いくつかの実施形態において、バイオマトリックス足場は、天然の組織に存在することが知られ、かつ/または天然の組織において検出されるマトリックス結合性増殖因子、ホルモンおよび/またはサイトカインの多くまたは大部分を生理的レベルまたはほぼ生理的レベルで含み、他の実施形態において、バイオマトリックス足場は、天然の生体組織に存在する生理的濃度に近い濃度(例えば、相対的に、約30%、25%、20%、25%、20%、15%、10%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%以下の差)でマトリックス結合性増殖因子、ホルモンおよび/またはサイトカインの1以上を含む。バイオマトリックス足場に存在する増殖因子またはサイトカインの量または濃度は、当該技術分野で公知であり、本明細書に記載される種々の方法、例えば、限定するものではないが、種々の抗体アッセイおよび増殖因子アッセイによって測定することができる。
【００２４】
本明細書において、“生体組織”とは、生きたもしくは死んだ生物体の任意の組織または生きたもしくは死んだ生物体由来の任意の組織のことを言う。本明細書において、用語“天然の生体組織”およびその変形は、その生物体に、その天然のまたは未改変の状態で存在する生体組織を指す。本発明のバイオマトリックス足場は、任意の生体組織から製造できる。生体組織は、任意の単一組織(例えば、相互に連結することができる一群の細胞)であることもできるし、生物体の身体の臓器または部分または領域を形成する一群の組織であることもできる。組織は、均一な細胞物質を含むこともできるし、組織は、例えば、肺組織、骨格組織、および/または筋肉組織を含むことができる胸部を含む身体の領域に存在する複合構造物であることもできる。
【００２５】
本発明の例示的な生体組織は、限定するものではないが、肝臓、肺、甲状腺、皮膚、膵臓、血管、膀胱、腎臓、脳、胆管、十二指腸、腹部大動脈、腸骨静脈、心臓および腸ならびにそれらの任意の組み合わせを含む。生体組織が関連するまたは由来する生物体(すなわち被験者)は、哺乳動物および非哺乳動物、例えば無脊椎動物を含む任意の動物であることができる。
【００２６】
例示的な被験者は、限定するものではないが、哺乳動物、例えば、限定するものではないが、ヒト、マウス、ラット、フェレット、ハムスター、ウサギ、モルモット、ブタ(pig)、ブタ(porcine)、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、サルおよびチンパンジーならびに非哺乳動物、例えば、限定するものではないが鳥、爬虫類および無脊椎動物を含む。被験者は、任意の年齢および/またはサイズであることができる。生体組織は、健常であることもでき、罹患していることもでき、かつ/または遺伝子突然変異を有することもできる。いくつかの実施形態において、本発明のバイオマトリックス足場は，その化学的性質および機能性において組織特異的である。すなわち、そのバイオマトリックス足場は、その化学的性質および機能性に関して、それが由来する生体組織を代表するかまたはそれと同等である。
【００２７】
いくつかの実施形態において、バイオマトリックス足場において、天然組織構造および親脈管構造が維持される。これは、生体組織の主要な組織実体の認識しうる残存物、例えば、限定するものではないが、任意の組織の血管および他の脈管構造;肝臓の胆管およびグリッソン嚢(GC);膵臓の膵管、膵島および膵腺房;肺の気管支、気管および肺胞などを含むことができる。他の実施形態において、バイオマトリックス足場の化学的性質が組織構造にマッチされる(例えば、血管の周囲のマトリックスは、肝細胞の周囲のマトリックスとは異なる)。いくつかの実施形態において、バイオマトリックス足場の化学的性質は、組織構造と関連した勾配を有する。例えば、生体組織が肝臓である場合、バイオマトリックス足場は、肝三つ組から中心静脈への肝腺房第1領域〜第3領域と組織実体例えば、脈管チャンネルおよびグリッソン嚢(GC)とに関連する、マトリックスの化学的性質における勾配を保持することができる。さらなる例は、限定するものではないが、血管の周囲のマトリックスの化学的性質が高濃度のネットワークコラーゲン(例えば、IV型およびVI型)、エラスチンおよびHS-PG体で充満されている血管;CS-PGおよびHS-PGの混合体に加えてラミニンの濃度が高い、門脈周囲領域(第1領域)における肝細胞の周囲の血管(中心静脈周辺領域(第3領域)の周囲は、HS-PGおよびHP-PGの混合体によって囲まれた肝細胞である);I型コラーゲン、フィブロネクチン、CS-PG体およびDS-PG体が高濃度である胆管と関連する血管を含む。あらゆる組織において、マトリックスの化学的性質における類似した勾配が存在する。
【００２８】
本発明に用いることができる多くのリンス培地(例えば、第1および第2培地)およびリンス緩衝液が存在する。特に、コラーゲンおよび結合性因子(例えば、マトリックス成分、増殖因子およびサイトカイン)を不溶性状態に維持するための任意のリンス培地またはリンス緩衝液を用いることができる。培地または緩衝液を選択する場合、その塩濃度、pHおよびイオン強度は、コラーゲンならびに/またはコラーゲン結合性マトリックス成分および他の因子(例えば、コラーゲンとの直接または間接の化学的結合によって)の大部分もしくは多くを不溶性状態に維持するのに適していなければならない。表1は、コラーゲン、コラーゲン結合性マトリックス成分およびマトリックス結合性増殖因子およびサイトカインが不溶性のままでいるのを確実にするための培地および緩衝液を当業者が用意するのに助けとなる種々のタイプのコラーゲンのための塩化ナトリウムのモル濃度範囲を提供する。Deyl ら (Preparative procedures and purity assessment of collagen proteins” Journal of Chromatography B 790 (2003) 245-275) は、さらに、コラーゲンおよび結合性因子を不溶性状態に維持するための最適条件の同定を容易にすることができるコラーゲンの化学的性質に関する情報を提供している。
【００２９】
表1は、pHが、塩濃度との組み合わせで作用して溶解性を限定する変数であることを示している。高い塩濃度を有することによって、pHは中性であることができる。本発明のいくつかの実施形態において、選択される塩濃度は、組織のすべてのコラーゲンを不溶性状態に維持するものであって、組織のコラーゲンの1つだけを不溶性状態に保つものではない。例えば、胎児肝臓における既知のコラーゲンは約4.5M NaClの塩濃度で不溶性であり、成人肝臓組織における既知のコラーゲンは約3.4M〜3.5M NaClの塩濃度で不溶性である。
【００３０】
リンス培地および/または緩衝液のいずれかの重量オスモル濃度は、例えば、約200mOsm/kg〜約400mOsm/kg、約250mOsm/kg〜約350mOsm/kg、約275mOsm/kg〜約325mOsm/kgまたは約300mOsm/kg〜約325mOsm/kgであることができ、かつ、限定するものではないが、これらの範囲内の本明細書に明記されていない任意の値を含むことができる。蒸留水および希釈緩衝液(例えば、100mOsm/kg未満の重量オスモル濃度を有する)は、かなりな量のコラーゲン、コラーゲン結合性マトリックス成分およびマトリックス結合性増殖因子およびサイトカインの損失を招くであろう。従って、本発明の方法のいくつかの実施形態において、蒸留水および希釈緩衝液は含まれない。
【００３１】
重量オスモル濃度（osmolality）は、質量当たりの溶質の浸透圧濃度の式であるのに対し、容量オスモル濃度（osmolarity）は溶媒量当たりの溶質の浸透圧濃度の式であることは、当業者には明らかであろう。従って、容量オスモル濃度から重量オスモル濃度への変換は、密度に質量を掛けることによって行うことができる。重量オスモル濃度は、束一的性質、例えば凝固点降下、蒸気圧および沸点上昇を測定する浸透圧計を用いて測定することができる。
【００３２】
容量オスモル濃度は、溶液1リットル(L)当たりの溶質のオスモル数(Osm)で定義される溶質濃度の尺度(osmol/LまたはOsm/L)である。溶液の容量オスモル濃度は、通例Osm/Lで表される。モル濃度が溶液の単位体積当たりの溶質のモル数を測定するのに対し、容量オスモル濃度は、溶液の単位体積当たりの溶質粒子のオスモル数を測定する。重量オスモル濃度は、溶媒1キログラム当たりの溶質のオスモルの尺度(osmol/kgまたはOsm/kg)である。
【００３３】
モル濃度および容量オスモル濃度は、それらが温度依存性であるため、浸透圧測定には一般的には用いられない。これは、水の容量が温度によって変化するからである。しかしながら、溶質の濃度が大変低い場合、容量オスモル濃度と重量オスモル濃度は等しいと考えられる。
【００３４】
溶液の容量オスモル濃度は、以下の式によって算出することができる:
【数１】
2018143249.tif 000002
(式中、φは浸透圧係数であり、これは溶液の非理想特性の程度を説明し;nは、分子が解離する粒子(例えばイオン)の数であり;Cは溶質のモル濃度であり、指数iは、特定の溶質の識別を表す)。最も簡単な場合は、φは溶質の解離度である。次に、1が100%の解離を示す場合、φは0と1の間である。しかしながら、φは1より大きい場合もある(例えばショ糖の場合)。塩の場合、100%の解離が生じた場合でも、静電効果によってφが1より小さくなる。
【００３５】
任意の培地または緩衝液での生体組織の潅流は、生体組織の関連脈管構造に培地または緩衝液を流れさせることによって達成されることができる。例えば、生体組織が肝臓である場合、肝臓の門脈に培地または緩衝液を潅流させることができる。あるいは、培地または緩衝液は、生体組織に注ぐこともできるし、かつ/または生体組織を介して拡散させることもできる。例えば、生体組織を、培地または緩衝液に浸し、かつ/または透析し、生体組織に培地または緩衝液を拡散させることができる。培地または緩衝液に浸しかつ/または透析する間、溶液および生体組織は例えば揺り子で振盪し、かつ/または撹拌することができる。いくつかの実施形態において、培地および緩衝液は、生体組織の関連脈管構造に潅流される。
【００３６】
あるいは、組織は、第1培地および緩衝液でホモジナイズし、その後、ホモジネートの抽出のために培地を用いることができる。バイオマトリックス足場のホモジナイズによるバージョンは、大きな臓器から(例えば、ウシまたはブタ組織から)調製され、次いで液体窒素温度で粉末に粉砕され、この粉末はディッシュ上で培養研究に用いられる。
【００３７】
いくつかの実施形態において、第1培地および/または第2培地は基礎培地であり、例えば、限定するものではないがRPMI 1640、DME/F12、DME、F12、BME、DMEM、ウェイマウス(Waymouth)またはウィリアム(William)培地である。他の例示的な基礎培地は当該技術分野で公知であり市販されている。第1培地および/または第2培地は、本明細書に記載されるように(例えば、重量オスモル濃度およびイオン強度の特定の組み合わせならびに血清の非存在によって)、大部分のコラーゲンを不溶性にかつ天然分子として保つように混合された成分を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなることができる。第1培地および/または第2培地は、間質液に存在する成分か、それらに類似する成分か、またはそれらを模倣する成分、例えば、限定するものではないが、水;塩、例えば、限定するものではないが無機塩;ビタミン;ミネラル;アミノ酸、例えば、限定するものではないがグリシン、セリン、トレオニン、システイン、アスパラギンおよび/またはグルタミン;糖;脂肪酸;補酵素;ホルモン;ならびに神経伝達物質を含むか、それらからなるか、または本質的にそれらからなることができる。第1培地および/または第2培地が間質液に存在する成分か、それらに類似する成分か、またはそれらを模倣する成分を含む特定の実施形態において、前記成分は、市販の基礎培地の重量オスモル濃度におおよそ等しい重量オスモル濃度を生じるかまたは、約250mOsm/kg〜約350mOsm/kgの重量オスモル濃度を生じる。いくつかの実施形態において、第1培地および/または第2培地は、無血清であり、間質液に存在する成分を含み、かつ/または約250mOsm/kg〜約350mOsm/kgの重量オスモル濃度を有する。このような培地は中性pHであることもできる。特定の実施形態において、第1培地および/または第2培地の特定の組成は、バイオマトリックス足場の製造に用いられる生体組織のコラーゲンの不溶性係数(insolubility constant)によって決まり、これらは当業者には公知であろう。
【００３８】
本発明の脱脂緩衝液は有効でありかつ穏やかでなければならない。脱脂緩衝液は、洗浄剤もしくは界面活性剤、基礎培地、塩および/またはリパーゼを含むか、それらからなるか、または本質的にそれらからなることができる。脱脂緩衝液の成分を選択する場合、マトリックス成分の損失を最少にするために、過酷な洗浄剤(例えば、ドデシル硫酸ナトリウム;TritonX-100)は避けなければならない。本発明の例示的な洗浄剤は、限定するものではないが、陰イオン洗浄剤、例えば、デオキシコール酸、1-ヘプタンスルホン酸、N-ラウリルサルコシン、ラウリル硫酸、1-オクタンスルホン酸およびタウロコール酸の塩;陽イオン洗浄剤、例えば、塩化ベンザルコニウム、セチルピリジニウム、塩化メチルベンゼトニウムおよび臭化デカメトニウム;双性イオン洗浄剤、例えば、アルキルベタイン、アルキルアミドアルキルベタイン、N-ドデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホナートおよびホスファチジルコリン;ならびに非イオン性洗浄剤、例えば、n-デシルα-D-グルコピラノシド、n-デシルβ-D-マルトピラノシド、n-ドデシルβ-D-マルトシド、n-オクチルβ-D-グルコピラノシド、ソルビタンエステル、n-テトラデシルβ-D-マルトシド、トリトン、Nonidet-P-40、ポロキサマー188およびツイーングループの洗浄剤のいずれか;ラウリル硫酸ナトリウム;およびデオキシコール酸ナトリウムを含む。いくつかの実施形態において、脱脂緩衝液はデオキシコール酸ナトリウムを含む。
【００３９】
例示的なリパーゼは、限定するものではないが、ホスホリパーゼ、例えばホスホリパーゼA2、ヒト膵リパーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、リソソームリパーゼ、内皮リパーゼおよび肝臓リパーゼを含む。いくつかの実施形態において、脱脂緩衝液はホスホリパーゼA2を含む。他の実施形態において、脱脂緩衝液はデオキシコール酸ナトリウムおよびホスホリパーゼA2を含む。いくつかの実施形態において、この組み合わせは、中性pHかつ無血清である基礎培地で調製した約20〜約50単位/LホスホリパーゼA2および約1%デオキシコール酸ナトリウムを含むことができ、これは例えば第1培地であることができる。デオキシコール酸ナトリウムおよびホスホリパーゼA2の組み合わせは、細胞質膜およびミトコンドリア膜上に位置するホスホグリセリドをリゾレシチンに急速に分解し、これは強力な界面活性剤であり、壊死および細胞溶解を誘導することができる。当業者には明らかなように、リパーゼおよび/または洗浄剤の量およびタイプは、生体組織によって決めることができる。
【００４０】
いくつかの実施形態において、脱脂緩衝液で生体組織を灌流する段階は、組織が透明になるまで行われる。他の実施形態において、脱脂緩衝液で生体組織を灌流する段階は、滲出液が澄明になるまで行われる。いくつかの実施形態において、脱脂段階は、組織が透明になり、滲出液が澄明になるまで行われる。
【００４１】
いくつかの実施形態において、破壊された細胞からの酵素へのバイオマトリックス足場の長期の暴露は、それによってエラスチンの含量ならびに、サイトカインおよび増殖因子の結合部位であるグリコサミノグリカン、例えばヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸およびヘパリンの含量を著しく減少させる恐れがあるため、避けられる。破壊された細胞からの酵素への暴露は、例えば、脱脂および/または脱脂後の洗浄中に避けることができる。いくつかの実施形態において、破壊された細胞からのプロテアーゼおよび/または他の酵素の作用を限定するために、プロテアーゼインヒビターの使用ならびに/またはpH、温度および/または時間の慎重な制御を用いることができる。
【００４２】
例示的なプロテアーゼインヒビターは、限定するものではないが、セリンプロテアーゼインヒビター、例えば、限定するものではないが、アンチパイン、アプロチニン、キモスタチン、エラスタチナール、フッ化フェニルメチルスルホニル(PMSF)、APMSF、TLCK、TPCK、ロイペプチンおよび大豆トリプシンインヒビター;システインプロテアーゼ、例えば、限定するものではないが、IAA(インドール酢酸)およびE-64;アスパラギン酸プロテアーゼインヒビター、例えば、限定するものではないが、ペプスタチンおよびVdLPFFVdL;メタロプロテアーゼ、例えば、限定するものではないが、EDTA、1,10-フェナントロリンおよびホスホラモドン(phosphoramodon);エキソペプチダーゼ、例えば、限定するものではないが、アマスタチン、べスタチン、ジプロチンAおよびジプロチンB;チオールプロテアーゼ;α-2-マクログロブリン、大豆またはライマメトリプシンインヒビター;膵臓プロテアーゼインヒビター;卵白オボスタチン;卵白シスタチン;ならびに、阻害剤の販売業者によって通常"プロテアーゼ阻害剤カクテル"と呼ばれるプロテアーゼインヒビターの組み合わせを含む。
【００４３】
バイオマトリックス足場、緩衝液および/または培地のpHは、約6.0〜約9.0、約6.5〜約8.5、約7.0〜約8.0または約7.5〜約8.0に維持することができる。いくつかの実施形態において、バイオマトリックス足場、緩衝液および/または培地は、約7.5〜約8.0のpHに維持されるか、または約7.3〜約7.5のpHに維持されるか、あるいは、限定するものではないが、本明細書に明記されていないがこれらの範囲に含まれる任意の値を含むpHに維持される。他の実施形態において、バイオマトリックス足場、緩衝液および/または培地は中性pHに維持される。バイオマトリックス足場(例えば、調製中および/または調製後)、緩衝液および/または培地の温度は、約0℃〜約30℃、約5℃〜約25℃または約10℃〜約20℃であることができ、あるいは、限定するものではないが、本明細書において明記されていないが、これらの範囲に含まれる任意の値であることができる。いくつかの実施形態において、温度は約20℃に維持される。任意の培地または緩衝液での生体組織の灌流時間は、約5時間以下、約3時間以下、約1時間以下、約30分以下または約15分以下であることができる。いくつかの実施形態において、脱脂緩衝液での生体組織の灌流段階は約30分以下である。いくつかの実施形態において、酸性pHを用いる場合、コラーゲンおよびコラーゲン結合性成分を不溶性に維持する塩濃度は異なりうる。コラーゲンの化学的性質に関する現存している文献により、コラーゲンを不溶性に維持する塩濃度を選択することによって、前記塩濃度を決定することができる。
【００４４】
例示的な緩衝液は、限定するものではないが、塩化ナトリウム、乳酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、グルコン酸ナトリウム、クエン酸緩衝液、ビス/トリス緩衝液、リン酸緩衝液、リン酸カリウム、クエン酸ブドウ糖、炭酸水素ナトリウム、塩化アンモニウム、3-{[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]アミノ}プロパンスルホン酸、トリス(ヒドロキシメチル)メチルアミン、N-トリス(ヒドロキシメチル)メチルグリシン、4-2-ヒドロキシエチル-1-ピペラジンエタンスルホン酸および3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸を含む。
【００４５】
いくつかの実施形態において、本発明の緩衝液(例えば、本明細書に記載の段階cに用いる緩衝液)は、約2.0M以上の濃度の塩を含むことができる。例えば、いくつかの実施形態において、塩は約2.0M〜約5.0M、約2.5M〜約5.0M、約3.0M〜約4.5Mまたは約3.0M〜約4.0Mの濃度あることができ、あるいは、限定するものではないが、本明細書において本明細書に明記されていないが、これらの範囲に含まれる任意の値であることもできる。例えば、いくつかの実施形態において、本発明の方法に用いられる緩衝液は、塩、例えば、約2.0M NaCl〜約4.5M NaClの濃度の塩化ナトリウムを含むことができる。他の実施形態において、例えば、成人肝臓用には、用いられる緩衝液は約3.4M〜約3.5M NaClを含むことができる。例えば、胎児肝臓用の実施形態において、用いられる緩衝液は、塩、例えば、約4.0M〜約4.50Mの濃度の塩化ナトリウムを含むことができる。いくつかの実施形態において、塩洗浄剤での生体組織の潅流、例えば本明細書に記載の例示的な方法の段階c)の潅流は、潅流液(すなわち、潅流に用いられる流体、例えば、血管を通じて流れさせられた流体)が、280nmの吸光度(OD)によってタンパク陰性になるまで行われる。
【００４６】
本発明の培地および/または緩衝液のいずれかは、プロテアーゼインヒビターを含むことができる。例示的なプロテアーゼインヒビターは前述されている。いくつかの実施形態において、緩衝液、例えば、本明細書に記載の例示的な方法の段階(c)の緩衝液は、プロテアーゼインヒビター、例えば、大豆トリプシンインヒビターを含む。他の実施形態において、段階(d)の緩衝液は、1以上のプロテアーゼインヒビター、例えば、大豆トリプシンインヒビターを含む。
【００４７】
本発明の培地および/または緩衝液は、1以上のヌクレアーゼを含むことができ、いくつかの実施形態において、これらはこれらの酵素の販売業者によって推奨される標準緩衝液で調製することができる。例えば、いくつかの実施形態において、段階d)の緩衝液は、1以上のヌクレアーゼ、例えば、限定するものではないが、RNアーゼおよびDNアーゼを含む。ヌクレアーゼでの潅流により、核酸の残留物が除去される。他の実施形態において、段階d)の緩衝液は、RNアーゼ、DNアーゼおよび1以上のプロテアーゼインヒビターを含む。いくつかの実施形態において1以上のヌクレアーゼでの生体組織の潅流は、潅流液(すなわち、潅流に用いられる流体、例えば、血管を通じて流れさせられた流体)が、260nmの吸光度(OD)によって核酸陰性になるまで行われる。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼは、生体組織における核酸の75%、80%、85%、90%、95%、98%または100%を除去する。
【００４８】
第2培地(例えば、最終リンス培地)は、コラーゲンおよび結合性因子(例えば、マトリックス成分、増殖因子およびサイトカイン)が、前述のように不溶性のままでいることを確実にする任意の培地であることができる。例示的な最終リンス培地は、第1培地に関して前述したものであり、無血清、中性pHで、250〜350mOsm/kgの重量オスモル濃度を有する。例えば、いくつかの実施形態において、第2培地は基礎培地を含む。いくつかの実施形態において第2培地は無血清基礎培地である。他の実施形態において、第2培地は、ホルモン、増殖因子、脂質および血清アルブミンを含む無血清ホルモン添加培地(HDM)であり、培養される細胞の要求に合わせられる。例示的な第2培地は、肝幹細胞、肝芽細胞および他の前駆細胞のために設計されたKubota培地(Kubota and Reid,PNAS97:12132-12137,2000)である。特定の実施形態において、第2培地は、血清または血清由来因子、例えば、限定するものではないが、ヒト血清アルブミンの補充を含むこともできるし、含まないこともできる。いくつかの実施形態において、第2培地での組織のリンスによって、脱脂緩衝液およびヌクレアーゼの残留物が除去される。他の実施形態において、第2培地および/または任意のその後の緩衝液もしくは培地での洗浄によって、バイオマトリックス足場が培地または緩衝液で平衡化される。いくつかの実施形態において、第1培地と第2培地は同じであることもできるし、いくつかの実施形態において、第1培地と第2培地は異なることもできる。それによって、生体組織からバイオマトリックス足場を製造する。
【００４９】
いくつかの実施形態において、バイオマトリックス足場の製造に用いられる培地および/または緩衝液の1以上は、細胞外マトリックス成分を分解する1以上の酵素を含まない(すなわち、検出可能な量を含まない)。他の実施形態において、バイオマトリックス足場の製造に用いられるすべての培地および緩衝液は、細胞外マトリックス成分を分解する1以上の酵素を含まない(すなわち、検出可能な量を含まない)。例示的な酵素は、限定するものではないがコラゲナーゼ;プロテアーゼ;グリコシダーゼ、例えばヘパリナーゼ、ヘパリチナーゼ、コンドロイチナーゼおよびヒアルロニダーゼ;ならびにエラスターゼを含む。
【００５０】
本発明の生体組織、ホモジネートおよび/またはバイオマトリックス足場の滅菌は、当該技術分野で公知の任意の方法によって達成されることができる。ただし、バイオマトリックス足場に結合することができる因子(例えば、エチレンオキシド)を用いる方法は避けなければならない。例示的な滅菌方法は、限定するものではないが、γ線照射、ラジオ周波数グロー放電(RFGD)プラズマ滅菌、電子線滅菌、および超臨界二酸化炭素滅菌を含む。いくつかの実施形態において、組織、ホモジネートおよび/またはバイオマトリックス足場の滅菌は、約5,000radのγ線照射で達成される。足場が直ちに再細胞化に使用される予定がなく、滅菌手順が脱細胞化プロセスに用いられる場合(特に高塩抽出後)、滅菌は必要ではない。
【００５１】
バイオマトリックス足場の貯蔵は、当該技術分野で公知の任意の方法によって達成されることができる。いくつかの実施形態において(例えば、足場が無傷で用いられる場合)、バイオマトリックス足場は約4℃で保存することができ、他の実施形態において、例えば、足場が切片に分散される場合、バイオマトリックス足場は例えば約-80℃で凍結される。
【００５２】
いくつかの実施形態において、バイオマトリックス足場は、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ナイドジェン/エンタクチン、エラスチン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカンおよびそれらの任意の組み合わせ、すべてバイオマトリックス足場の一部として(例えば、バイオマトリックス足場に結合させて)を含むか、それらからなるか、または本質的にそれらからなる。いくつかの実施形態において、バイオマトリックス足場は、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ナイドジェン/エンタクチン、エラスチン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカンおよびそれらの任意の組み合わせの検出可能な量を欠く。
【００５３】
本発明のバイオマトリックス足場は、細胞の強力な分化基材であることが証明され、多くの細胞型、例えば、限定するものではないが任意の成熟細胞に使用することもできるし、種々の幹細胞集団に使用することもできる。これらは、例えば、胚性幹(ES)細胞、人工多能性幹(iPS)細胞、胚葉幹細胞(例えば、胚体内胚葉幹細胞)、決定された幹細胞(例えば、肝、肺、膵臓もしくは消化管幹細胞)、ヒト肝幹細胞(hHpSC)、周産期幹細胞(例えば、羊水由来幹細胞(AFSC))、間葉系幹細胞(MSC)、例えば骨髄もしくは脂肪組織由来、分化方向を決定された前駆細胞、任意の組織型の成人細胞、罹患細胞、腫瘍細胞、成熟細胞、実質細胞、星細胞、胆管細胞、胆樹細胞、例えば胆管細胞ではないもの、肝細胞、腎細胞、尿路上皮細胞、間葉細胞、平滑筋もしくは骨格筋細胞、筋細胞(筋肉幹細胞)、線維芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、繊維芽細胞、内皮細胞、外胚葉細胞(導管細胞および皮膚細胞を含む)、神経系細胞、島細胞、腸に存在する細胞、骨芽細胞、骨もしくは軟骨を形成する他の細胞ならびにそれらの任意の組み合わせを含む。これらの細胞は正常細胞であることもできるし、疾患細胞であることもできる。
【００５４】
いくつかの実施形態において、組織から新鮮に分離された細胞であっても、系統が限定された幹細胞であっても、バイオマトリックス足場は、細胞の生物学、医薬、遺伝学、分子および/またはウイルス学の研究に用いられる。他の実施形態において、バイオマトリックス足場は、操作された植込み型血管化臓器、例えば、限定するものではないが肝臓に用いられる。他の例示的なバイオマトリックス足場の使用は、限定するものではないが、タンパク質製造、薬物毒性試験、薬物開発、抗体スクリーニング、および/またはウイルスのワクチン製剤のためのウイルス産生を含む。系統依存性ウイルス(例えば、乳頭腫ウイルスおよびC型肝炎)のウイルス産生は、組織特異的バイオマトリックス足場に幹細胞集団をプレーティングし、次いで、バイオマトリックス足場と組み合わせて細胞の分化を完全に誘導するように作用する培地中で培養することによって達成することができる。細胞が完全に成熟したときに成熟ビリオンが産生される。ウイルス自身が細胞生存率に影響しない限り、ウイルスに感染した成熟細胞は、少なくとも8週間維持することができ、それによって、安定な培養系で大量のウイルスを生成させる手段を提供する。
【００５５】
バイオマトリックス足場は無傷で使用することができ、例えば、限定するものではないが細胞の二次元および/または三次元培養に使用できる。いくつかの実施形態において、バイオマトリックス足場は、細胞株、例えば、限定するものではないが、幹細胞からの任意の成熟系統段階から後期段階細胞までの正常または罹患細胞の二次元および/または三次元培養において分化のために特定の培地と組み合わせて使用することができる。
【００５６】
あるいは、バイオマトリックス足場は凍結することができる。これらの凍結切片を調製し、基材として用いることができる。バイオマトリックス足場は、ドライアイスで急速に凍結し、クリオスタットで凍結切片を調製し、培養装置(例えば、ディッシュ、フラスコ、布、トランスウェルなど)上に置き、滅菌し、細胞を播種する前に培地で再水和することができる。いくつかの実施形態において、本発明の凍結したバイオマトリックス足場は、切片化されることができる。
【００５７】
いくつかの実施形態において、a)本発明の方法によってバイオマトリックス足場を製造し;b)段階(a)のバイオマトリックス足場と細胞培養培地を培養装置内で接触させ;c)段階(b)のバイオマトリックス足場に細胞を播種すること;を含み、それによって細胞培養物を製造することによって細胞培養物が製造される。
【００５８】
いくつかの実施形態において、a)本発明のバイオマトリックス足場を製造し;b)段階(a)のバイオマトリックス足場を凍結し;c)段階(b)のバイオマトリックス足場から細胞培養基材として凍結切片を調製し;d)段階(c)の細胞培養基材と細胞培養培地を培養装置内で接触させ;e)段階(d)の細胞培養基材に細胞を播種すること;を含み、それによって細胞培養物を製造することによって細胞培養物が製造される。
【００５９】
他の実施形態において、バイオマトリックス足場は粉末に粉砕されることができる。バイオマトリックス足場を粉末に粉砕する1つの方法は、液体窒素温度またはその付近の温度のフリーザーミルでバイオマトリックス足場を粉末に粉砕することを含む。液体窒素または同等の温度(例えば、ドライアイスでの凍結)で粉砕するための他の装置は当該技術分野で公知である。この粉末は、室温にするとペイントのコンシステンシーが得られ、これは滅菌ペイントブラシまたは同等な装置を用いて培養装置上にコーティングすることができる。粉末またはプレートは滅菌することができる。
【００６０】
従って、いくつかの実施形態において、a)本発明のバイオマトリックス足場を製造し;b)段階(a)のバイオマトリックス足場を粉末に粉砕し;c)段階(b)の粉末で培養装置をコーティングして細胞培養基材を製造し;d)(c)の細胞培養基材と細胞培養培地を培養装置内で接触させ;e)(d)の細胞培養基材に細胞を播種すること;を含み、それによって細胞培養物を製造することによって細胞培養物が製造される。本方法のいくつかの実施形態において、バイオマトリックスの粉砕は、液体窒素温度またはその付近の温度のフリーザーミル(例えば、低温粉砕)で行うことができる。
【００６１】
いくつかの実施形態において、細胞を細胞培養物に播種する前に、培地の一部が培養装置に添加される。なぜなら、細胞は数秒以内に接着できるからである。いくつかの実施形態において、正常な成人細胞に関して、細胞は数秒から数分以内に接着し、種々のタイプの幹細胞に関して、細胞は数分から数時間以内に接着する。いくつかの実施形態において、細胞の接着は、培養物に使用するためにバイオマトリックス足場が分散されているかによって決まることができる。細胞培地は、細胞培養物を製造するのに適した任意の培地であることができる。いくつかの実施形態において、細胞培養培地は間質液に存在する成分の少なくとも1つを含み、前記培地の重量オスモル濃度は約250mOsm/kg〜約350mOsm/kgであり、前記培地は無血清であり、そのpHは中性である。他の実施形態において、細胞培養培地は、基礎培地、例えば、限定するものではないが、RPMI-1640、DME/F12、Ham培地、Kubota培地などであることができる。
【００６２】
いくつかの実施形態において、バイオマトリックス足場で製造される細胞培養物は、バイオマトリックス足場の製造に用いられた生体組織の細胞と同じタイプの細胞を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる。限定するものではない本発明の細胞の例は、胚性幹(ES)細胞、人工多能性幹(iPS)細胞、決定された幹細胞、周産期幹細胞、羊水由来幹細胞(AFSC)、任意の起源の間葉系幹細胞(MSC)、任意の組織型の、分化方向を決定された前駆細胞または成人細胞、成熟細胞、正常細胞、罹患細胞、腫瘍細胞およびそれらの任意の組み合わせを含む。さらなる、限定するものではない例は、肝臓細胞、実質細胞、星細胞、内皮細胞、肝細胞、胆管細胞、胆管細胞ではない胆樹細胞および膵臓細胞を含む。
【００６３】
いくつかの実施形態において、初期の幹細胞(ES、iPS、MSCまたはAFSCのいずれにせよ)は、バイオマトリックス足場の製造に用いられた組織型に、少なくとも部分的にその細胞の系統を限定する。決定された所定の胚葉の幹細胞は、足場がその胚葉由来の組織から調製される場合、バイオマトリックス足場の製造に用いられた組織型に系統を限定し、異なる胚葉由来の組織からの足場上では、その成人運命に部分的に分化することができる。従って、成人細胞の完全に分化する能力は、バイオマトリックス足場の組織型によって規定される。同時に、幹細胞の運命は、バイオマトリックス足場の組織型によって部分的にまたは完全に規定されることもできるし、幹細胞の運命は、バイオマトリックス足場の組織型によって完全に規定されることもできる。いくつかの実施形態において、細胞培養物の細胞は、バイオマトリックス足場の製造に用いられた生体組織の細胞とは異なるタイプである。上記に詳細に説明されているように、細胞培養物の製造に使用できる細胞の例示的なタイプは、限定するものではないが、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、間葉系幹細胞、羊水由来幹細胞、決定された幹細胞、成熟細胞、正常細胞、罹患細胞、腫瘍細胞およびそれらの任意の組み合わせを含む。これらの細胞は、本明細書に記載の任意の生体組織由来であることができる。
【００６４】
いくつかの実施形態において、幹細胞か成熟細胞かを問わず、バイオマトリックス足場は、正常細胞の分化と関連する増殖の低下または増殖停止を誘導する。いくつかの実施形態において、成熟細胞は、数時間以内に完全に分化し、その後少なくとも8週間、安定に分化を維持する。いくつかの実施形態において、成人細胞(すなわち、完全に成熟した細胞)は、数分以内に接着し、その後8週間を超えてその完全分化を保持する。いくつかの実施形態において、幹細胞は、数回の分裂を繰り返し、次いで増殖停止状態に入り、完全に分化する。幹細胞は、少なくとも8週間、安定に、増殖停止し、生存し、完全に分化した状態でいる。いくつかの実施形態において、バイオマトリックス足場に播種された幹細胞は、増殖停止または緩慢増殖の状態に入り、幹細胞マーカーを消失し、おおよそ1週間で成熟した機能的細胞に分化し、安定な表現型および少なくとも8週間以上の生存率(例えば、長期間(例えば、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、少なくとも4週間、少なくとも5週間、少なくとも6週間、少なくとも7週間、少なくとも8週間、少なくとも9週間、少なくとも10週間、少なくとも11週間、少なくとも12週間、少なくとも13週間、少なくとも14週間、少なくとも15週間、少なくとも16週間、少なくとも1ヶ月、少なくとも2ヶ月、少なくとも3ヶ月、少なくとも4ヶ月、少なくとも5ヶ月、少なくとも6ヶ月、少なくとも7ヶ月、少なくとも8ヶ月、少なくとも9ヶ月、少なくとも10ヶ月、少なくとも11ヶ月、少なくとも1年など)40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%または100%の生存率を保持する。
【００６５】
他の実施形態において、バイオマトリックス足場は、特定の運命への胚性幹(ES)細胞の分化および/または特定の運命への多能性幹(IPS)細胞の誘導に用いられる。例えば、いくつかの実施形態において、組織特異的バイオマトリックス足場は、胚性幹細胞または人口多能性細胞の特定の運命への分化を促進するために用いられる。
【００６６】
本発明の特定の実施形態において、バイオマトリックス足場は、羊水由来幹細胞(AFSC)または骨髄、脂肪組織、任意の胎児組織もしくは任意の出生後組織からの間葉系幹細胞(MSC)または任意の決定された幹細胞(例えば、肺 腸、胆管、腎臓、皮膚、心臓など)の特定の成人運命への分化に使用される。いくつかの実施形態において、本発明のバイオマトリックス足場は、細胞培養物を製造することによって成熟細胞への幹細胞の分化を促進し加速させるために使用される。
【００６７】
他の実施形態において、本発明は、幹細胞および/または前駆細胞の成熟細胞への分化を促進し加速させる方法であって、本発明の方法によって細胞培養物を製造することを含む前記方法において、細胞が幹細胞であり、成熟細胞のための細胞培養培地を処方し、それによって幹細胞および/または前駆細胞の成熟細胞の分化を促進し加速させる前記方法を提供する。細胞培養培地は、成熟細胞のために処方される任意の培地であることができる。培地の成分は、各細胞型によって異なる。分化は、成人に特異的な遺伝子産物を産生する成熟細胞型、成人細胞型へとその条件がさせることを意味する。これらの方法に用いられる細胞は、任意のタイプの成人細胞または幹細胞または前駆細胞であることができ、それらの限定するものではない例は、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、胚葉幹細胞、決定された幹細胞、周産期幹細胞、羊水由来幹細胞、間葉系幹細胞、一過性増殖細胞または分化方向を決定された任意の組織型の前駆細胞を含む。
【００６８】
バイオマトリックス足場(例えば、無傷のバイオマトリックス足場、足場の切片または他の植込み型材料/上に混合された粉末化されたバイオマトリックス足場)に播種された細胞は、in vivoで細胞を移植する方法として、動物またはヒトに移植することができる。いくつかの実施形態において、被験者に細胞を送達する方法であって、本発明のバイオマトリックス足場に被験者を接触させることを含む前記方法において、バイオマトリックス足場が細胞を含む前記方法が提供される。他の実施形態において、被験者に細胞を送達する方法であって、本発明のバイオマトリックス足場に細胞を播種し、次いで、細胞を播種されたバイオマトリックス足場を被験者に移植することを含む前記方法が提供される。いくつかの実施形態において、任意の細胞を播種されていないバイオマトリックス足場を被験者に移植することができる。
【００６９】
いくつかの実施形態において、バイオマトリックス足場は、被験者において組織または臓器を再生するために使用することができる移植片として使用できる。
【００７０】
本発明のバイオマトリックス足場は、分析および/または臨床試験プログラムに有用な人工臓器を確立するために用いることができる。バイオマトリックス足場はまた、疾病状態の特定の遺伝子産物または因子を同定するために用いることができる。いくつかの実施形態において、バイオマトリックス足場が変異動物の組織から製造され、続いて、変異(単数または複数)と関連する関連因子(単数または複数)を明らかにするために用いられる。他の実施形態において、バイオマトリックス足場が病変組織から製造され、疾患と関連するマトリックスにおける変化を明らかにするために用いられる。
【００７１】
本発明のバイオマトリックス足場の使用の追加の限定するものではない例は、1)転移能を明らかにするための悪性細胞を培養するための足場の使用(所定のタイプのバイオマトリックス足場上で細胞の増殖コロニーを形成させる腫瘍細胞の能力は、足場が製造された組織へ転移するその細胞の能力を予測する;2)被験者への移植のために、使用される足場に組織の移植片を入れること;3)補助デバイスとして使用される足場の再細胞化によって形成されるオルガノイド、例えば次いで肝不全被験者に連結される肝臓オルガノイドの製造;4)タンパク質製造のための足場の使用およびそれに続く精製(足場での細胞は、培地および/または細胞から単離されることができる因子を産生する;および5)系統依存性ウイルスの製造;ワクチンとして使用するために十分な粒子を生じる分化細胞を必要とするウイルスの製造のための足場の使用を含む。
【００７２】
従って、本発明は、組織型における腫瘍細胞の転移能を同定する方法であって、a)本発明の方法によってバイオマトリックス足場を製造し;b)(a)のバイオマトリックス足場と細胞培養培地を培養装置内で接触させ;c)(b)のバイオマトリックス足場に腫瘍細胞を播種し;d)(c)のバイオマトリックス足場を培養条件下に維持し;e)(d)のバイオマトリックス足場での腫瘍細胞の増殖をモニタリングすること;を含む前記方法において、バイオマトリックス足場での腫瘍細胞の増殖が、バイオマトリックス足場が製造された組織型に腫瘍細胞がin vivoでコロニーを形成することができることを同定し、それによって前記組織型における腫瘍細胞の転移能を同定する前記方法を提供する。
【００７３】
同様に、本明細書において、抗腫瘍処置に感受性のある腫瘍細胞を同定する方法であって、a)本発明の方法によってバイオマトリックス足場を製造し;b)(a)のバイオマトリックス足場と細胞培養培地を培養装置内で接触させ;c)(b)のバイオマトリックス足場に腫瘍細胞を播種し;d)(c)のバイオマトリックス足場を培養条件下に維持し;e)バイオマトリックス足場での腫瘍細胞に抗腫瘍処置を適用し;f)(e)のバイオマトリックス足場での腫瘍細胞の増殖をモニタリングすること;を含む前記方法において、(e)のバイオマトリックス足場での腫瘍細胞の増殖の欠如および/または腫瘍細胞の死が抗腫瘍処置に感受性のある腫瘍細胞を同定する前記方法が提供される。抗腫瘍処置の限定するものではない例は、当該分野で公知のように、化学療法剤、抗体、放射線療法、免疫療法、ホルモン療法などを含む。いくつかの実施形態において、被験者からの腫瘍細胞は、本発明の種々のバイオマトリックス足場に播種され、それぞれの抗腫瘍処置に用いられる。種々の抗腫瘍処置のこれらの各分析の結果に従って、被験者の腫瘍細胞に対して有効である抗腫瘍処置を選択することができ、被験者の腫瘍を治療するために、被験者にその抗腫瘍処置を施すことができる。
【００７４】
さらなる実施形態において、本発明は、宿主動物への移植のための腫瘍移植片の製造方法であって、
a)本発明の方法によってバイオマトリックス足場を製造し;b)(a)のバイオマトリックス足場と細胞培養培地を培養装置内で接触させ;c)(b)のバイオマトリックス足場に腫瘍細胞を播種し;d)(c)のバイオマトリックス足場を培養条件下に維持し;e)(d)のバイオマトリックス足場での腫瘍細胞集団を確立すること;を含み、それによって宿主動物への移植のための腫瘍移植片を製造する前記方法を提供する。いくつかの実施形態において、本方法は、宿主動物に腫瘍移植片を移植する段階をさらに含むことができる。種々の実施形態において、腫瘍移植片は宿主動物に対して同系、同種または異種であることができる。
【００７５】
同様に、本明細書において、系統依存性ウイルスのウイルス粒子の製造方法であって、a)本発明の方法によってバイオマトリックス足場を製造し;b)(a)のバイオマトリックス足場と細胞培養培地を培養装置内で接触させ;c)(b)のバイオマトリックス足場に、系統依存性ウイルスに感染されることができる型および系統段階の細胞を播種し;d)(c)の細胞を系統依存性ウイルスに感染させ;e)バイオマトリックス足場での感染細胞を培養条件下に維持し;f)感染細胞内で製造されるウイルス粒子を採取すること;を含み、それによって系統依存性ウイルスのウイルス粒子を製造する前記方法が提供される。
【００７６】
本発明の系統依存性ウイルスの限定するものではない例は、C型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、ノロウイルスヒト乳頭腫ウイルスおよび、系統依存性が知られていないかまたは後になって同定された任意の他のウイルスを含む。系統依存性とは、当該技術分野で公知のように、ウイルスが存在する細胞が、その細胞中でウイルスが複製に成功し、ウイルス粒子を産生することができる前に、特定の段階に成熟または分化しなければならないことを意味する。
【００７７】
さらにまた、本発明は、バイオマトリックス足場の再細胞化によって形成されるオルガノイドの製造方法であって、a)本発明の方法によってバイオマトリックス足場を製造し;b)(a)のバイオマトリックス足場と細胞培養培地を培養装置内で接触させ;c)(b)のバイオマトリックス足場に、バイオマトリックス足場の製造に用いた生体組織と同じ組織型の細胞を播種し;d)バイオマトリックス足場での細胞を培養条件下に維持し、それによって細胞からオルガノイドが形成されること;を含み、それによってバイオマトリックス足場の再細胞化によって形成されるオルガノイドを製造する前記方法を提供する。本方法は、当該技術分野で公知のように、補助デバイスとして使用するために、段階(a)〜(d)によって製造されるオルガノイドを被験者に接触させる段階をさらに含むことができる。本発明のバイオマトリックス足場の製造に使用することができる任意の細胞型を本方法に用いることができる。いくつかの実施形態において、細胞は肝臓細胞である。
【００７８】
本発明は、さらに、バイオマトリックス足場で培養された細胞内での目的とするタンパク質の製造方法であって、a)本発明の方法によってバイオマトリックス足場を製造し;b)(a)のバイオマトリックス足場と細胞培養培地を培養装置内で接触させ;c)(b)のバイオマトリックス足場に目的とするタンパク質を製造する細胞を播種し;d)バイオマトリックス足場での(c)の細胞を培養条件下に維持し;e)(d)の細胞によって製造される目的とするタンパク質を採取すること;を含み、それによってバイオマトリックス足場で培養された細胞内で目的とするタンパク質を製造する前記方法を提供する。本方法は、段階(f)において、採取した目的とするタンパク質を精製するさらなる段階を含むことができる。本発明の目的とするタンパク質は、培養物中の細胞および/または培地から採取することができる量で、内在性遺伝子から、かつ/または組換えタンパク質として、細胞によって製造される任意のタンパク質であることができる。このような目的とするタンパク質の多数の例は当該技術分野で公知である。
【００７９】
限定するものではない以下の実施例において、本発明をさらに詳細に説明する。
【実施例】
【００８０】
〔実施例１〕
組織特異的バイオマトリックス足場によって、ヒト肝幹細胞の成熟運命への系統限定が効率的となる
要約。幹細胞の分化のための現行のプロトコルは、可溶性シグナルおよび/またはマトリックス因子の複数の処理を利用し、一般的には、成人組織特異的遺伝子の過小発現または過剰発現を伴う成熟細胞への部分的分化をもたらす。本発明において、目的とする成人細胞型に合わせた、無血清ホルモン添加培地(HDM)と組み合わせた、バイオマトリックス足場の基材である細胞外マトリックスの富化した組織特異的抽出物と関連する増殖因子およびサイトカインとを用いる、幹細胞の迅速かつ効率的な分化のための戦略が開発された。本明細書に記載の研究は、ヒト肝幹細胞(hHpSC)を成熟運命に分化させることおよび、成熟実質細胞を完全に機能するように長期間維持することにおける本発明のバイオマトリックス足場の有効性を明らかにしている。バイオマトリックス足場は、すべてのコラーゲンタイプを不溶性に保つように設計された条件を用いる新規4段階潅流脱細胞化プロトコルによって製造された。この足場は、天然組織構造、親血管、おおよそ1%の組織タンパク質(ただし組織のコラーゲンは95%を超える)、組織のコラーゲン結合性マトリックス成分の大部分ならびに生理的レベルのマトリックス結合性増殖因子およびサイトカインを維持していた。コラーゲンは、ほとんど検出できないレベルから足場のタンパク質の15%を超えるレベルまで増加し、残りは、組織構造と関連したパターンでラミニン、フィブロネクチン、エラスチン、ナイドジェン/エンタクチン、プロテオグリカンならびにマトリックス結合性サイトカインおよび増殖因子を含んでいた。肝臓バイオマトリックス足場に播種され、成人肝臓細胞に合わせたHDMに入れられたヒト肝幹細胞(hHpSC)は、おおよそ1週間で幹細胞マーカーを消失し、機能しうる成熟実質細胞に分化し、8週間を超えて生存し、安定な成熟細胞表現型を維持していた。従って、本発明のバイオマトリックス足場は、系統が限定された幹細胞の生物学的および医薬研究に、成熟細胞の維持に、そして操作された植込み型血管化組織または臓器に用いることができる。
【００８１】
脱細胞化のための手順。ケタミン-キシラジンで麻酔後、ラット腹腔を切開し、全肝臓を潅流するために門脈にカニューレ付きスリーブを挿入した。(1)RPMI 1640で潅流を10分間行い;次いで、(2)穏やかな洗浄剤、例えば、1%デオキシコール酸ナトリウム(SDC)が混合されたリパーゼ(例えば、20〜50単位のホスホリパーゼA2--PLA2)で、組織が透明になり滲出液が澄明になるまで約30〜60分間脱脂し;(3)高塩洗浄(胎児肝臓用:4.5M NaCl、成人肝臓用:3.4M〜3.5M NaCl)での潅流を、280nmの吸光度(OD)によって潅流液がタンパク質陰性になるまで行い;(4)潅流液が、OD260によって核酸陰性になるまで、ヌクレアーゼ(DNアーゼ、RNアーゼ)のRPMI 1640液で潅流し、(5)RPMI 1640で2時間以上最終リンスを行う。
【００８２】
このバイオマトリックス足場をドライアイスで急速に凍結し、クリオスタットで凍結切片を調製し、24ウェル細胞培養プレート上に置き、γ線照射(5000rad)で滅菌し、細胞を播種する前に30分間培地(KM)で再水和した。バイオマトリックス足場の切片は、24ウェルプレートにおけるウェル表面の〜95%を覆っていた。
【００８３】
液体窒素を充填したフリーザーミルを用いてバイオマトリックス足場を粉末に粉砕することからなる方法を、培養ディッシュへのバイオマトリックス足場の配置の代替法に用いた。粉砕された粉末は、室温にするとペイントのコンシステンシーが得られ、これは細胞および/または細胞培養物を接着させるために用いる任意の表面、例えば、ディッシュ、スライド、布、フィルターまたは他の表面にコーティングすることができる。足場を粉砕することによって、マトリックス成分およびシグナルの勾配は失われるが、存在する成分の混合物は、なお強力な分化作用を誘導する。in vivoでの移植のために、あるいは三次元培養のために、操作された臓器の調製において、この足場は無傷で細胞を再播種して使用することもできる。
【００８４】
ブタおよびウシの肝臓に用いるための代わりの方法を開発した。ブタおよびウシの肝臓は、USDA認定食肉処理施設(CT)から入手した。典型的プロトコルの概要については実施例3を参照のこと。各肝臓はUSDAによる検査済みであり、施設を出る前にUSDA印を受けた。肝臓は、ESP-Gro培地(Gigacyte社、ブランフォード、コネチカット州;カタログ番号1101-250)に入れて運んだ。研究室で受け取った肝臓を計量し、写真を記録し、潅流用に調製した。粉砕後、混合物を解凍し、1:48の培地:バイオマトリックス比で希釈した。次いで、このバイオマトリックススラリーを、プレートをコーティングするために用いた。乾燥後に、バイオマトリックスを3回洗浄し、次いで細胞を塗布した。成人肝臓細胞は、10分以内にプレートに接着した。幹/前駆細胞は、より長い時間かかる場合がある(数時間)。しかしながら、幹/前駆細胞および成人肝臓細胞の両方に関して、本質的に100%の生存細胞が接着する。
【００８５】
培地および溶液。使用前に、すべての培地を無菌濾過し(0.22μmフィルター)、暗所で4℃に保った。バイオマトリックスにおいてコラーゲンを安定に保つために、バイオマトリックス足場製造物のための潅流培地のpHを7.5〜8.0に保った。バイオマトリックス足場の製造のためおよび肝細胞もしくは肝幹細胞培養物のための基礎培地としてRPMI-1640(Gibco/Invitrogen社、カールズバッド、カリフォルニア州)を用いた。特記しない限り、すべての試薬はSigma社(セントルイス、ミズーリ州)から入手した。
【００８６】
バイオマトリックス足場製造のための潅流培地
(1).潅流洗浄および潅流リンス:無血清基礎培地(例えば、RPMI-1640);
(2).洗浄剤での潅流:36単位/L PLA2+1%SDC;
(3).高塩での潅流:0.1mg/ml大豆トリプシンインヒビターを含む3.4M NaCl;
(4).ヌクレアーゼでの潅流:5mg/100ml RNアーゼ、1mg/100ml DNアーゼおよび0.1mg/ml大豆トリプシンインヒビター(例えば、RPMI 1640で調製)。
【００８７】
Kubota培地。KMは、もともとは肝芽細胞47のために設計されたが、今回、ヒト肝前駆細胞48ならびに胆管(Wang et al. “Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes and pancreatic islets”  Hepatology, 2011, 印刷中) および膵臓(Wang,Y and Reid L,未公表データ)からのものを含む他の内胚葉前駆細胞に有効であることが見出された。これは、銅なし、低カルシウム(0.3mM)、10-9Mセレン、0.1%BSA、4.5mMニコチンアミド、0.1nM硫酸亜鉛・七水和物 (Specpure、Johnson Matthew Chemicals社、ロイストン、イングランド)、10-8Mヒドロコルチゾン、5μg/mlトランスフェリン/Fe、5μg/mlインスリン、10μg/ml高密度リポタンパク質および、精製ヒト血清アルブミンに結合させて添加される遊離脂肪酸の混合物を含む任意の基礎培地(ここではRPMI 1640)からなる。
【００８８】
細胞を成人運命に分化させるために、所望の成人細胞型に合わせた無血清ホルモン添加培地(HDM)を使用することができる。例えば、我々は、0.6mM濃度を達成するためのカルシウム、10-12M銅、1nMトリヨードサイロニン(T3)、7ng/mlグルカゴン、20ng/ml FGF、2g/Lガラクトース、10ng/mlオンコスタチンM(OSM)、10ng/ml上皮増殖因子(EGF)、20ng/ml肝細胞増殖因子(HGF)および10-8Mヒドロコルチゾンをさらに添加したKMからなる成人肝臓運命のためのHDMを用いた。
【００８９】
細胞を足場にプレーティングしたら、この無血清HDMに播種した。細胞または組織を処理するために酵素が用いられる場合は、HDMに5%FBS(HyClone社、ウォルサム、マサチューセッツ州)を数時間添加し、その後無血清HDMに交換した。並行して、対照実験において、培養物を最後まで5%FBSを含むHDMで維持したが、血清の存在により、時間と共に細胞が分化した機能を失うことを我々は見出した。バイオマトリックス足場には因子の非常に多くが結合していることを考慮すれば、可溶性因子への要求は、他の基材での培養に関する通常の要求よりも少ない。バイオマトリックス足場には因子の非常に多くが結合していることを考慮すれば、可溶性因子への要求は、他の基材での培養に関する通常の要求よりも少ない。
【００９０】
肝臓バイオマトリックス足場における無傷の脈管樹の解析。ラット肝臓バイオマトリックス足場における毛細血管のネットワークを含む血管の分枝し小区分化されたマトリックス残存物を、それぞれ光学および蛍光顕微鏡検査によって可視化した。バイオマトリックス足場における脈管系のマトリックス残存物の完全性をチェックするために、門脈の残存物を介して肝臓バイオマトリックス足場にローダミン標識した250kDaデキストラン粒子を注入した。Leica MZ16FA蛍光解剖顕微鏡(電動化)を用いて映画を作成した。
【００９１】
ヒト胎児肝臓の処理。妊娠の選択的終結によって得られた在胎齢16〜20週齢の胎児からの胎児肝臓組織は、認定機関(Advanced Biological Resources, San Francisco, CA)によって提供を受けた。本研究プロトコルは、ノースカロライナ大学チャペルヒル校におけるヒト研究倫理委員会(Institutional Review Board for Human Research Studies at the University of North Carolina at Chapel Hill)の審査を受け、承認された。胎児ヒト肝臓細胞の懸濁液は、以前の報告48,49と同様に調製した。簡潔に言えば、0.1%ウシ血清アルブミン、1nMセレンおよび抗生物質を添加したRPMI 1640で処理を行った。300U/mlのIV型コラゲナーゼおよび0.3mg/mlのデオキシリボヌクレアーゼを含む酵素処理緩衝液で、32℃において、15〜20分間急速に撹拌した。富化した懸濁液を75ゲージメッシュに加圧して通し、1200RPMで5分間遠心分離し、次いで再懸濁した。トリパンブルー排除法によって算出される細胞生存率は、ルーチンに95%より高かった。
【００９２】
hHpSCの富化およびバイオマトリックス足場での培養。hHpSCの精製または富化のために我々は2つ方法を用いた:
1)培養選択。10cm組織培養ディッシュのKM中におおよそ3x105細胞をプレーティングした。培地を3日毎に交換した。コロニーは5〜7日以内に形成され、これを3ヶ月目まで観察した。14〜18日後に、倒立顕微鏡(1X-FLAIII;Olympus社、日本およびメルヴィル、ニューヨーク)を用いて、コロニーを手で拾った。
2)多能性肝前駆細胞サブ母集団(hHpSCおよびhHB)の磁気免疫選択は、製造業者による使用説明書50に従って、Miltenyi Biotech MACSシステム(ベルギッシュ・グラートバッハ、ドイツ)による磁性ビーズ免疫選択技術を用いて、上皮細胞接着分子(EpCAM、CD326)に陽性な細胞を選択することによって達成した。簡潔に言えば、磁気マイクロビーズに結合させたEpCAM抗体と共に解離した細胞を4℃で30分間インキュベートし、製造業者の推奨する手順に従って、Miltenyi製の磁気カラム分離システムを用いて分離した。
【００９３】
250のhHpSCコロニーまたは5×105の富化したhHpSCもしくは2.5×105の成人肝細胞のいずれかの培養物を播種した。培地を毎日交換し、培地を採取し、-20℃で保存してさらに分析を行った。I型コラーゲンをコーティングした24ウェルプレート上で培養された細胞を対照として用いた。
【００９４】
成人ラット肝細胞の単離。体重200〜250gの3ヶ月齢の成体オスLewisラット(Charles River Laboratories社、ウィルミントン、MA)から、ラット肝細胞の新鮮分離懸濁液を得た。ラット肝細胞の分離精製に関しては、以前報告した改善された2段階潅流法を用いた。EGTAを含むカルシウム不含緩衝液で肝臓を10〜15分間潅流し、次いでコラゲナーゼを含むカルシウム含有緩衝液で10〜15分間潅流した。次いで、チーズクロスを通して消化された肝臓を圧迫することによって肝臓を機械的に分離し、次いで、狭められたメッシュサイズのふるいで細胞浮遊液をフィルタリングした。細胞を2回洗浄し、次いで50gでペレット化した。トリパンブルー染色後に細胞を計数することによって、生存率を明らかにした。89〜96%の生存率と99%を超える純度でラット1匹当たり2億〜3億の細胞がルーチンに単離された。
【００９５】
ヒト成人の肝臓細胞の単離および培養。新鮮なヒト肝臓細胞浮遊液は、CellzDirect社(現在、Invitrogen社、RTP、NCの一部)から得た。懸濁液は、CellzDirect社の方法によって処理され、次いでHeptoMAIN培地(カタログ番号1103-250;GigaCyte社、ブランフォード、コネチカット州)に再懸濁し、肝臓バイオマトリックス足場でコーティングされたマルチウェルプレートに、またはI型コラーゲン(1μg/ml;Meridian社カタログ番号A33704H)に1.88x105細胞/cm2でプレーティングした。
【００９６】
コラーゲンの化学的性質の分析。ヒドロキシプロリン(hyp)含量に基づいて、バイオマトリックス足場におけるコラーゲンの量を評価した。全肝臓試料およびバイオマトリックス足場試料を粉砕し、洗浄し、凍結乾燥した。次いでアリコートをアミノ酸分析51に供し、300残基/コラーゲンのhyp値に基づいて、総タンパク質当たりのコラーゲン含量を算出した。
【００９７】
DNAおよびRNA含量の定量分析。脱細胞化した肝臓バイオマトリックスに残っている全DNAを評価するために、新鮮ラット肝臓組織および脱細胞化したバイオマトリックスの両方を計量し、切断し、プロテイナーゼKで消化し、全細胞内DNAを単離した52。脱細胞化した肝臓バイオマトリックスに残っている全RNAを評価するために、新鮮ラット肝臓組織および脱細胞化したラット肝臓バイオマトリックスの両方を計量し、次いでTRIzol溶液(Invitrogen社)でホモジナイズし、全細胞RNAを単離した。
【００９８】
増殖因子アッセイ。ラット肝臓、ラット肝臓バイオマトリックス足場、ヒト胆管組織およびヒト胆管バイオマトリックス足場の試料(それぞれ試料2つ)を増殖因子の分析のためにRayBiotech社(ノークロス、ジョージア州)に送った。試料をホモジナイズし、溶解物として調製し、次いで、1mg/mlのタンパク質を用いてアッセイし、蛍光を生じさせ、蛍光強度単位(FIU)で特徴づけた。RayBio(登録商標)ヒト増殖因子アレイGシリーズ1(Human Growth Factor Arrays, G series 1)を用いて半定量的増殖因子アッセイを行った。タンパク質濃度に対して正規化した非特異的結合に関する陰性対照からのFIUをこのFIUから差し引いた。2連試験からのデータを平均化した。〜40の増殖因子の調査を可能にする4つのアレイを用いた。本アッセイは、ヒト増殖因子用に開発されたものであるが、ラットおよびヒト試料の両方の使用を可能にする、ラット増殖因子に対する交差反応における十分なオーバーラップがある。
【００９９】
透過型電子顕微鏡法および走査型電子顕微鏡法(TEMおよびSEM)。TEMのために、バイオマトリックス足場をリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)でリンスし、3%グルタルアルデヒド/0.1カコジル酸ナトリウム(pH7.4)で終夜で固定した。カコジル酸ナトリウム緩衝液での3回のリンス後に、1%四酸化オスミウム/0.1カコジル酸ナトリウム緩衝液で1時間バイオマトリックス足場を後固定した。脱イオン水中で洗浄後、これを脱水し、Polybed 812エポキシ樹脂(Polysciences社、ナイルズ、イリノイ州)に封入した。菱形ナイフを用いて、70nmで、支持体と直角にバイオマトリックス足場を切片化した。200メッシュ銅グリッド上に超薄切片を採取し、4%酢酸ウラニル水溶液で15分間、次いでReynoldsのクエン酸鉛で7分間染色した。80kVで作動するLEO EM910透過電子顕微鏡(LEO Electron Microscopy社、オーバーコッヘン、ドイツ)を用いて試料を調べた。Gatan Orius SC1000 CCD Digital Camera および Digital Micrograph 3.11.0 (Gatan社、プリザントン、カリフォルニア州)を用いてデジタル画像を得た。
【０１００】
SEMのために、固定およびリンス後、バイオマトリックス足場を脱水し、100%エタノールに含ませてBalzers CPD-020臨界点乾燥機(Bal-Tec AG、Balzers社、スイス)に移し、二酸化炭素を抽出溶媒として用いて乾燥した。炭素製接着性タブを有するアルミニウム製試料台にこのマトリックスを乗せ、Hummer Xスパッタコーター(Anatech社、ウスター、マサチューセッツ州)を用いて、厚さ10nmの金-パラジウム金属(60:40合金)でコーティングした。加速電圧5kVでZeiss Supra 55 FESEMを用いて試料を検査し、Zeiss SmartSEMソフトウェア(Carl Zeiss SMT社、ドイツおよびソーンウッド、ニューヨーク)を用いてデジタル画像を得た。
【０１０１】
免疫細胞化学および免疫組織学。バイオマトリックス足場での培養細胞の蛍光染色のために、室温で20分間4%パラホルムアルデヒド(PFA)で細胞を固定し、HBSSでリンスし、10%ヤギ血清HBSS溶液で2時間ブロッキングし、リンスした。固定した細胞を、一次抗体と共に4℃で終夜インキュベートし、洗浄し、標識されたアイソタイプ特異的二次抗体で1時間インキュベートし、洗浄し、細胞核を可視化するために4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)で対比染色し、Leica DMIRB倒立顕微鏡(Leica社、ヒューストン、テキサス州)を用いて観察した。
【０１０２】
免疫組織化学のために、バイオマトリックス足場を4%PFAで終夜固定し、70%エタノール中で保存した。それらをパラフィン包埋し、5μmの切片にした。切片を脱パラフィンし、抗原を回復した。0.3%H2O2溶液で30分間インキュベートすることによって内因性ペルオキシダーゼをブロックした。10%ウマ血清でブロッキング後、終夜4℃で一次抗体で処理し、RTU Vectastainキット(Vector Laboratories社、バーリンゲーム、カリフォルニア州)を用いて二次抗体およびABC染色を行った。基質としてVector Nova REDを用いた。切片を脱水し、固定し、Eukitt Mounting Media(Electron Microscopy Scineces社、ハットフィールド、ペンシルベニア州)に封入し、これを倒立顕微鏡を用いて分析した。肝臓切片および培養物のために用いた抗体を表4に示す。
【０１０３】
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)分析。hHpSCを細胞培養プレートで培養し、コロニーをバイオマトリックス足場に移した。さらに7日間培養した後、RT-PCRのためにコロニーを溶解した。製造業者の使用説明書に従って、RNeasy Plus Mini Kit(Qiagen GmbH社、バレンシア、カリフォルニア州)を用いて全RNAを抽出した。RT-PCRのためのSuperScript First-Strand Sybthesis System(Invitrogen社、カールズバッド、カリフォルニア州)を用いて逆転写を行った。PCRのためにHotStarTaq Master Mix Kit(Qiagen社)を用いた。表5にPCRプライマーを示した。
【０１０４】
生死(LIVE/DEAD)アッセイおよび細胞生存率アッセイ。接着および増殖アッセイのために生死(LIVE/DEAD)生存率アッセイキット(Molecular Probes社/Invitrogen社、カールズバッド、カリフォルニア州)を用いた。それぞれ細胞内エステラーゼ活性および血漿膜の完全性に関する2つプローブ、カルセイン-AM(生(LIVE)、ライトグレー)およびエチジウムホモダイマー-1(EtdD-1、死(Dead))と共にhHpSCまたは肝細胞をインキュベートした。蛍光Olympus SZX12双眼実体顕微鏡(OLYMPUS社、日本およびメルビル、ニューヨーク州)で試料を観察した。製造業者のマニュアルに従って、レサズリン細胞生存率アッセイキット(Biotium社、ヘイワード、カリフォルニア州)を用いた。簡潔に言えば、10%レサズリン溶液を培地に添加し、37℃で終夜インキュベートした。Biotek Synergy HTマルチ検出マイクロプレートリーダー(ウイヌースキ、ベルモント州)を用いて吸光度OD570-OD600を測定し、生存率曲線をプロットした。実験条件当たり最低限3つの試料を用い、すべての実験を3回行った。
【０１０５】
肝臓特異的機能アッセイ。P450-Glo(登録商標)スクリーニングシステム(Promega社、マディソン、ウィスコンシン州)を用いてCYP450 3A4活性を検出した。簡潔に言えば、CYPの発光性CYP3A4基質であるルシフェリン-PPXEを含む培地と共に培養細胞を37℃で4時間インキュベートした。製造業者の使用説明書に従って、Wallace Victor2 Multilabel Counter (現在、Perkins/Elmer社(ウォルサム、マサチューセッツ州)の一部である)を用いてルシフェリンの検出および分析を行った。ヒトアルブミンELISA定量キット(Bethyl Laboratories社、モンゴメリー、テキサス州)を用いて、アルブミン分泌量の定量を行った。尿素合成アッセイのために、2mMアンモニウムと共に細胞を24時間インキュベートし、上清を採取し、Quantichrom尿素アッセイキット(Bioassay Systems社、ヘイワード、カリフォルニア州)を用いてアッセイした。各培養条件に関して1つの試料から上清を3連でアッセイし、この実験を3回繰り返した。
【０１０６】
統計解析。各条件に関して2連または3連の試料を用いて実験を少なくとも2〜3回繰り返した。典型的実験からのデータを示すが、複数の試験において同様な傾向が見られた。すべてのエラーバーは標準誤差を示す。
【０１０７】
バイオマトリックス足場は新規4段階プロトコルで製造する。脱脂に続く高塩抽出を含むプロトコルを用い、潅流法を用いてバイオマトリックス足場を製造した(図1)。本方法におけるプロトコルの詳細な紹介を行う。これは新規4段階プロトコルによって達成される:1)穏やかな脱脂;2)コラーゲンを不溶性状態に維持することが知られている塩濃度23(緩衝液の正確な濃度およびpHは組織におけるコラーゲンの型によって規定される)コラーゲンを不溶性状態に維持することが知られている濃度23である、塩濃度約2.0M〜約5.0M(例えば、2.0M〜2.5M、2.6M〜3.0M;3.1M〜3.5M、3.6M〜4.0M、4.1M〜4.5M;4.6M〜5.0M)を有する緩衝液での洗浄;3)残留核酸を除去するためのヌクレアーゼ処理;および4)洗浄剤、塩およびヌクレアーゼ残留物を除去し、マトリックス成分を培地で平衡化させるための基礎培地でのリンス(図1A)。
【０１０８】
ヌクレアーゼのためのリンス培地または緩衝液の選択は、その塩濃度およびイオン強度が、例えば、マトリックス成分を不溶性状態に維持する限り、多くの選択肢のいずれであることもできる。有効でありかつ穏やかであるためには、脱脂方法の選択が重要である。細胞質膜およびミトコンドリア膜に位置するホスホグリセリドを、強力な界面活性剤であり、壊死および細胞溶解を誘導することができるリゾレシチンに急速に分解するために、我々は、デオキシコール酸ナトリウム(SDC)およびホスホリパーゼA2(PLA2)の組み合わせを選択する。反応式を図8に示す。マトリックス成分の一部、例えばグリコサミノグリカンを溶解する恐れのある過酷な洗浄剤、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)またはトリトン-X100を我々は避けた(Gilbert et al.  “Decellularization of tissues and organs” Biomaterials 27:3675-3683 (2006) による概説を参照のこと)。
【０１０９】
我々は、脱脂および高塩洗浄中における、破壊された細胞からの酵素への足場の長期の暴露を避けた。なぜなら、それによって、エラスチンの含量ならびに、サイトカインおよび増殖因子の結合部位であるグリコサミノグリカン(GAG)、例えばヘパラン硫酸(HS)、コンドロイチン硫酸(CS)、デルマタン硫酸(DS)およびヘパリン(HP)の含量を著しく減少させる恐れがあるためである24。我々は、破壊された細胞由来のプロテアーゼの活性を抑制するために、大豆トリプシンインヒビターを用い、pH(7.5〜8.0)、温度(20℃)および時間(30〜60分間)の注意深い調節を行った。
【０１１０】
我々は、関連脈管構造(例えば、肝臓における門脈)を介して全組織を潅流したが、これにより、マトリックス成分の損失を最小限に抑えて、バイオマトリックス足場を急速に(数時間以内に)分離することが可能になった。単離の迅速さは、おおよそ30〜60分以内（他の著者により用いられたプロトコルのように数時間または数日ではない)に組織を脱脂する洗浄剤での最初の段階のおかげである。得られたバイオマトリックス足場は半透明または白色である(図1)。さらに、この潅流法を用いて、我々は、主要な脈管チャンネル、門脈、肝静脈および肝臓における脈管枝の大部分を維持し、それにより脱細胞化効率が増加した。バイオマトリックス足場を通じて潅流した蛍光性ローダミン標識デキストラン粒子は、血管の残存物内にとどまり、それらが明白であることを示している(図1E)。チャンネルに沿って、漏出なしに、大血管から微細血管枝まで色素の連続した流れがある。この事実は、三次元培養および/またはex vivoでの移植のいずれかのために操作された組織を調製する手段として、足場の血行再建術に役に立つと考えられる。
【０１１１】
切片にされた場合、足場は、主要な組織実体例えば、認識しうる血管、胆管およびグリッソン嚢(GC)の残存物を含む元の組織の組織構造を保持している(図1)。肝臓組織の切片がバイオマトリックス足場の切片と対比される図1B1と1D1を比較されたい。実質細胞の壁のマトリックス残存物は、レース状のネットワークからなっていた(図1D2〜1D3)。
【０１１２】
コラーゲン、コラーゲン結合タンパク質および結合性サイトカインはバイオマトリックス足場に維持されている。バイオマトリックス足場におけるコラーゲンの量を、以前用いた方法を用い、アミノ酸分析によって評価した25。ヒドロキシプロリン(Hyp)は、コラーゲンおよびコラーゲン性タンパク質に特有であるため、総タンパク質に対するコラーゲンの組成を、1,000アミノ酸当たりのHypの残基数として表した。その結果、肝臓における、ほとんど検出できないレベル、すなわち、ヒドロキシプロリン(Hyp)0.2残基未満/1,000から、バイオマトリックス足場におけるHyp〜13残基/1,000までコラーゲン含量が増加したことが明らかとなった。このことは、前述の脱脂および高塩洗浄によってコラーゲンは除去されず、コラーゲンのほとんどはバイオマトリックス足場に残っていたことを示している。バイオマトリックス足場におけるヒドロキシリジン(Hyl)、他のコラーゲン結合性アミノ酸および高レベルのグリシン(Gly)の有意なレベルの検出は、バイオマトリックス足場においてI型コラーゲンが著しく富化しているという我々の結論を支持している(図2A、9および表2)。
【０１１３】
免疫組織化学および超微細構造研究を用いて、原繊維コラーゲン(I型、III型およびV型コラーゲン、細繊維は直径10〜30nm、集合繊維は直径500〜3,000nm)および珠状に連なったフィラメント(恐らくはVI型)を含む、in situで肝臓に存在するコラーゲンのすべての既知の型を足場において同定することができた。これらの繊維およびフィラメントは、中皮細胞層の下に位置する嚢下結合組織層に存在する。肝三つ組から中心静脈までの類洞に沿って、典型的な基底膜の構造は見いだせなかったが、IV型コラーゲンおよび一部の結合性小細繊維が実質細胞の足場としての機能を果たす網状多孔質3D格子を形成しているのを観察した(図2)。I型コラーゲン線維束が、他の型のコラーゲン、糖タンパク質およびプロテオグリカンが接着した足場の主要な構造として見ることができる。ディッセ腔において、I型コラーゲンの小線維束と、III型およびVI型ならびに肝三つ組および中心静脈により豊富なV型の一部のコラーゲンの繊維を見出した。典型的な免疫組織化学データを図3Bに示し、正常肝臓組織におけるマトリックス成分およびそれらの位置に対するバイオマトリックス足場におけるマトリックス成分およびそれらの位置の概要のリストを図4Dに示す。バイオマトリックス足場製造のためのプロトコルの開発における初期の研究によって、細胞骨格成分の大部分が洗浄剤中に失われることが示された。さらに、我々は免疫組織化学によって足場を評価したところ、チューブリン、デスミンまたはアクチンの証拠は見いだせず、微量のサイトケラチン18および19ならびに、足場全体に散在する低レベルのビメンチンが認められた。
【０１１４】
胆管および一部の肝脈管系(動脈血管および静脈血管)と関連するマトリックスは典型的な基底膜構造からなり、類洞に存在する脈管構造と関連するマトリックス薄層とはきわめて異なる。肝三つ組にはラミニン、エンタクチン/ナイドジェン、パールカンおよびIV型コラーゲンが存在するのに対し、ディッセ腔には、パールカンおよび少しのIV型コラーゲンのみが存在する。疎水性で波状の大量のエラスチンが存在する。これは、互いに架橋し、主として嚢下結合組織、門部および動脈壁に限定してシートおよび繊維を形成する。フィブロネクチンは、肝マトリックスを通じて偏在し、優勢であり、特にディッセ腔において豊富であり、そこでフィブロネクチンは微細フィラメントまたは粒状沈着物のいずれかを形成する(図2および3)。
【０１１５】
組織における既知のプロテオグリカンは、バイオマトリックス足場に保存されていることを免疫組織化学は示している(図3B、4D)。同定された不均一なプロテオグリカンの中で、シンデカンは、類洞に沿って連続的にインターカレートしていることが見出され、パールカンは、ディッセ腔においてより強調されている。バイオマトリックス足場における類洞の残存物を通じて、肝臓組織の既知の帯状配列に関連したパターンでHS-PG体およびCS-PG体が見出される。
【０１１６】
プロテオグリカンおよび他のマトリックス成分は、サイトカインおよび増殖因子の重要な貯蔵器であり、それらのGAGに強く結合する26。増殖因子およびホルモンの大部分は、元の組織に存在する濃度に近い濃度でバイオマトリックス足場に存在する。ラット肝臓の溶解物に対するラット肝臓バイオマトリックス足場の溶解物からのデータを表6に示し、ヒト胆管組織に対する胆管バイオマトリックス足場からの類似したデータを表3に示す。興味深いことに、肝臓溶解物に存在するものよりも肝臓バイオマトリックス足場において強く富化したいくつかの例(例えば、bFGF)があった。結合している増殖因子およびサイトカインは、肝臓の足場に対する胆管組織の足場で定性的かつ定量的に異なっており、組織特異性または種特異性のいずれかを意味している。あるいは、一部分において、胆管足場は、必要性から、ロッカー上で緩衝液中で組織を振盪することによって製造したものであって、脈管を介した潅流によって製造したものではないという事実による可能性もある。
【０１１７】
バイオマトリックス足場の化学的性質は、組織構造に関連する。この新規プロトコルの著しい特徴は、図4A〜Cに示すように、肝三つ組から中心静脈への肝腺房第1領域〜第3領域と、組織実体例えば、脈管チャンネルおよびグリッソン嚢(GC)とに関連するパターンにマトリックスの化学的性質を維持していることである。第1領域における門脈周囲のマトリックスの化学的性質は、胎児肝臓においてみられるものと類似しており、一部分において、III型コラーゲン、ラミニンからなり、CS-PGを形成する。中心腺房(第2領域)および中心静脈周辺領域(第3領域)において異なるマトリックスの化学的性質に移行し、高濃度IV型コラーゲンおよびHP-PGを含む大変安定なマトリックスになる27。
【０１１８】
無数のタンパク質(例えば、増殖因子およびホルモン、凝固タンパク質、種々の酵素)がマトリックスに結合し、GAGまたは他のマトリックス成分における不連続な特定の硫酸化パターンへの結合によって安定に保持されていることが知られている24。従って、マトリックスの化学的性質は、高い回転および最小限の硫酸化と関連する不安定なマトリックスの化学的性質を有する幹細胞ニッチにおけるその開始点から、中心静脈周辺領域への進行と共に硫酸化の量が増加する、安定なマトリックスの化学的性質へと移行する。我々は、天然の構造と、組織構造に関連するマトリックスの化学的性質の維持は、バイオマトリックス足場での特定部位に細胞を導くことによって、かつ/または増殖および/または成熟細胞に分化させるシグナルの適当な混合物を提供することによって、組織工学プロセスにおける再細胞化を促進すると予想している。
【０１１９】
バイオマトリックス足場は、異なる組織および種から製造できる。バイオマトリックス足場は、正常または病気の任意の組織および任意の種から容易に製造できる。図13〜16に、ヒト膵臓、胆管および十二指腸ならびにラットおよびブタ膵臓からのバイオマトリックス足場を示す。図5〜7および図12に、肝細胞に対するウシまたはラット肝臓のバイオマトリックス足場の効果を示す。さらに、ヒト腹部大動脈、腸骨静脈ならびにラットおよびブタ腸からバイオマトリックス足場を製造した。バイオマトリックス足場での組織、超微細構造および免疫組織化学研究は、それらの構造、化学組成物および機能における著しい組織特異性を示しているが、種特異性を示してはいない。
【０１２０】
バイオマトリックス足場は、細胞の分化を誘導および/または維持した。肝臓バイオマトリックス足場の切片を含むディッシュにhHpSCをプレーティングし、成人肝臓細胞に合わせたHDMに入れることによって、数時間以内に、バイオマトリックス足場に、それが無傷であっても、低温粉砕後であっても、本質的に100%の生存細胞が接着した。足場の切片に最初に形成される細胞のコロニーは、それらの幹細胞表現型の一部を保持していた。なぜなら、コロニーの中央における細胞は、色素での染色に抵抗することができたし(図11)、古典的肝前駆細胞マーカー、例えば、ケモカイン(C-X-Cモチーフ)受容体4(CXCR4)および上皮細胞接着分子(EpCAM)を発現したからである(図5)。それらは1回かまたは2回分割し、次いで細胞周期停止に移行し、成熟実質細胞の培養物に典型的な3次元(3-D)索状形態に移行した(図5および6は幹細胞分化を示す;図7および図12と比較のこと)。用いたHDMは、通常のサイトカインまたは増殖因子を全部は必要としなかった。なぜなら、これらはバイオマトリックス足場に結合して存在しているからである。増殖停止への移行は、生細胞染色色素でのコロニーの端から端までの染色(図12)、EpCAMおよびCXCR4の発現の消失ならびに、成人特異的肝細胞および胆管細胞遺伝子、例えば尿素およびシトクロムP450 3A4の発現における安定した増加と関連していた(図5)。
【０１２１】
正常成人ラットおよび成人ヒト幹細胞をI型コラーゲンまたは、ラットもしくはウシ肝臓からのバイオマトリックス足場にプレーティングし、これらを成人細胞のためのHDMに入れた。成人実質細胞は、10分以内に(無血清培地中であっても)足場に接着することができたのに対し、I型コラーゲン上では数時間以内であり、それらは結合時点から増殖停止のままであり;足場上では8週間を超えて生存し、完全に機能したのに対し、I型コラーゲン上では約〜2週間のみであった(図7および12)。バイオマトリックス足場での数週間にわたる成熟肝臓細胞の機能のレベルは、他の新鮮分離成人肝細胞の所見と同じか同様であることが判明した28。劇的な相違は、I型コラーゲンの培養物が2週間後に急速に悪化するのに対し、バイオマトリックス足場上の培養物は、培養物が維持されている限りは(これまでは〜8週間)、形態的におよび機能的に安定なままでいたことである。
【０１２２】
バイオマトリックス足場は、成人肝臓運命にhHpSCを誘導するばかりでなく、数週間完全に分化させたままで成人細胞を維持する異例な能力を有する、不溶性で安定な足場として使用できる化学シグナルの複合セットを提供する、組織の細胞外マトリックス成分およびマトリックス結合性サイトカインおよび増殖因子の大部分を含む。研究者によって製造されたマトリックス抽出物の現存しているタイプと本発明のバイオマトリックス足場との比較において、物理的、酵素的および化学的処理は、組成、機械的挙動および、天然組織および臓器の脱細胞化由来の生体足場に対する宿主反応に対して実質的影響を有し、従って、それらのin vitroおよびin vivo応用に関して重要な意味を有することは明らかである。基材または足場の製造のためのすべての他の既存の方法は、マトリックス分解酵素の使用16または、マトリックスの主要部分を溶解する緩衝液の使用11のいずれかによって、マトリックス成分の大部分の除去をもたらす。層状構造物を有する組織、例えば真皮(例えば、SIS、BSM)29からマトリックス抽出物を製造するために物理的な方法(例えば、瞬間凍結および撹拌)は役に立つことはできるが、複雑な組織構造を有する臓器、例えば肝臓には有用ではない。一方、バイオマトリックス足場のための我々の方法では、大部分の細胞タンパク質の損失をもたらしたが、本質的にすべてのまたは少なくとも大部分のコラーゲンならびに、マトリックス結合性サイトカイン、ホルモンおよび増殖因子を含むコラーゲン結合性成分が保存された。
【０１２３】
細胞外マトリックスは、モザイク式の脂質二重層に封入されているが、これは最も単純な生物体においてさえも、複雑で不均一で動的な環境である。本脱脂方法は、本プロトコルの決定的な側面である。組織の脱細胞化に一般的に用いられる方法は、イオン性洗浄剤、例えばSDCおよびドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を含む。SDCは、SDSよりも比較的穏やかであり、天然組織構造に破壊をおこしにくく、細胞質膜および核細胞膜の両方の溶解に影響が少ない30。SDC単独を用いての組織脱細胞化の報告はない。多くの研究は、過酷な非イオン性洗浄剤(例えば、トリトンX-100)31または双性イオン洗浄剤(例えば、3-(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホナート、CHAPS)32を利用している。一方、SDCおよびPLA2の組み合わせを用いる我々の方法は、急速にかつ穏やかに組織を脱脂する。
【０１２４】
これまで、脊椎動物において、細胞接着、分化、増殖、組織発達および構造健全性に機能的役割を有する少なくとも29の型のコラーゲン(I〜XXIX)が同定されている33,34。マトリックスにおける主要構造成分であるコラーゲンは、高い塩濃度および中性pHでは不溶性のままでいることが知られており35,36、これは、バイオマトリックス足場の製造における我々の戦略の基礎となる発見である。この戦略は、コラーゲンが、それに結合するマトリックス成分、例えばラミニンおよびフィブロネクチン(FN)、スモールロイシンリッチプロテオグリカン(PG)およびGAGの保存を可能にし、それによって今度はそれらに結合するサイトカイン、増殖因子または細胞表面受容体を保存するという利点が加わった。
【０１２５】
本バイオマトリックス足場は、迅速かつ堅実な幹/前駆細胞の分化、例えばhHpSCから成人運命への分化を誘導し、これらの系統が限定された細胞を維持し、これらの系統が限定された細胞を維持するかまたは足場にプレーティングした成人細胞を多くの週間(>8週間)生存させ、完全に機能的な細胞として維持する高い能力において独特である。
【０１２６】
幹細胞、例えば、胚性幹(ES)細胞、人工多能性幹(iPS)細胞または種々の形態の間葉系幹細胞(MSC)の完全成熟肝臓細胞型への分化は、1つのセットによる誘導が異なるセットに反応するプライミングに必要な、複数の段階で提示される複数のシグナルのセット(可溶性およびマトリックス)を必要とし、成人肝臓運命を有する細胞を生じるために、多くの週間(6週間まで)の培養を必要とする場合がある37。さらに、MSCの肝臓運命への系統限定は、成人細胞が混合した幹細胞およびMSC表現型を有する、首尾一貫しない結果を与える。ES細胞、iPS細胞およびMSCの分化は、主要な肝臓特異的遺伝子の一部(すべてではない)を発現する肝細胞様細胞をもたらし;遺伝子における変異が観察され;発現される肝遺伝子のタンパク質レベルは通例低い40か、あるいは、ある肝遺伝子に関しては高く、他の遺伝子に関してはごくわずかである41.42。一方、バイオマトリックス足場でのhHpSCの分化によって、本質的にすべての細胞が1週間の培養後に正常に近いレベルで尿素、アルブミンおよびCYP450活性を有する古典的成人表現型を発現していた。
【０１２７】
これらの前駆体のいずれかからの肝細胞様細胞およびバイオマトリックス足場以外のプロトコルによって分化された肝細胞様細胞は、主要な肝臓特異的遺伝子の一部(すべてではない)を発現し、遺伝子における変異が観察され、肝遺伝子のタンパク質レベルは通例低いか、あるいは、ある肝遺伝子に関しては高く、他の遺伝子に関してはごくわずかである。未知の理由によって、結果は製造によって異なる。本発明のバイオマトリックス足場の利用によって、これらの幹細胞集団のより迅速な分化と、安定な成人表現型を有する細胞の達成におけるより優れたコンシステンシーをもたらすと予想される。
【０１２８】
決定された幹細胞集団の分化、例えばバイオマトリックス足場でのhHpSCは、培養1〜2週間以内に、本質的にすべての細胞が、正常濃度に近い濃度で、尿素、アルブミンおよびCYP450活性で古典的成人レパートリーの遺伝子を発現し、多くの週間の間、その表現型の安定性を維持する。従って、本発明のバイオマトリックス足場は、決定された幹細胞集団の成人肝臓表現型への分化を著しく促進する潜在能を有する。
【０１２９】
バイオマトリックス足場で幹細胞を分化させて成熟した機能的な細胞および組織を達成する能力は、学術、産業および臨床試験プログラムに少なからぬ機会を提供する。この能力は、あらゆるタイプの分析研究のための高分化細胞型の使用を可能にし、さらに刺激的なことには、基礎研究および臨床試験プログラムに使用できる、植込み型再血管化組織または臓器の作成にまでも用いることができる。
【０１３０】
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【０１３１】
〔実施例２〕
バイオマトリックス足場の工業規模の散布のための方法
GigaCyte, LLC社(ブランフォード、コネチカット州)において、粉砕後にディッシュ上にバイオマトリックス足場を散布する追加の方法が開発された。大きな哺乳動物を含む任意の組織(例えば、ヒト、ブタ、ウシ組織など)からのバイオマトリックス足場を用いることができる。ブタおよびウシの組織は、USDA認定食肉処理施設から入手し、RPMI 1640に移した。この培地は、間質液の成分を真似する組成を有し、250〜350mOsm/Kgの範囲の重量オスモル濃度を有する任意の培地であることができる。次いで、本明細書に記載されるように組織を処理して、バイオマトリックス足場を製造する。
【０１３２】
これらの方法は、自動化を用いてプレートをコーティングするために、懸濁液中でμmサイズ粒子まで粒度を減少させるためのバイオマトリックス足場の処理をさらに含む。限定するものではない１例において、処理は、コラーゲンを不溶性のままでいるのを確実にする高塩溶液中でのバイオマトリックス足場のホモジナイズを含む。36単位/LホスホリパーゼＡ2＋1%デオキシコール酸ナトリウムおよび0.1mg/ml大豆トリプシンインヒビターを含む改変脱脂緩衝液を緩衝液:ホモジネート比1:1で加え、それによってバイオマトリックス材料が上部まで軽快に浮き上がるので、さらなる処理のためにそれを採取する。バイオマトリックス材料を脱脂緩衝液の除去のためにさらに処理し、ヌクレアーゼを除去するためのヌクレアーゼ溶液:5mg/100mlRNアーゼ、1mg/100mlＤＮアーゼおよび0.1mg/ml大豆トリプシンインヒビターで洗浄した。次いで、すべての残渣を除去を確実にし、コラーゲンを不溶性に保ち、プロテアーゼ活性を最少にするために、バイオマトリックス材料を高塩(>3.4M NaCl)緩衝液でさらに処理する。抗菌薬/抗真菌薬、ゲンタマイシンおよびHEPES緩衝液を含む基礎培地中でバイオマトリックス材料を洗浄することによって、バイオマトリックス材料をさらに処理して高濃度の塩を除き、粒度減少の準備をする。次いで、抗菌薬/抗真菌薬、ゲンタマイシンおよびHEPES緩衝液を含む基礎培地中、任意の希釈の懸濁液、最適には1:6の懸濁液でバイオマトリックス材料を-80℃で凍結し、低温粉砕で粉砕することによりさらに処理して、バイオマトリックス材料の粒度をμmサイズ粒子(1〜100μmの範囲)まで減少させる。粉砕前にバイオマトリックスが希釈されない場合は、マトリックスは扱いが困難で、均等にプレートをコーティングできない。粉砕を可能にし、プレートを均一にコーティングするためにはこれは重要なステップである。バイオマトリックス粒子は、任意の希釈で懸濁液にできるが、最適には1:6である。バイオマトリックス粒子は解凍され、幹細胞の分化に用いられるプレートにコーティングされる。バイオマトリックス粒子は、さらに、抗菌薬/抗真菌薬、ゲンタマイシンおよびHEPES緩衝液を含む基礎培地で任意に、最適には1:24に希釈することができ、初代新鮮分離細胞型、冷凍保存細胞型もしくは幹細胞由来最終分化細胞型の長期維持のために、または任意の幹細胞源を肝細胞に分化させるために、プレートにコーティングされる。バイオマトリックスをコーティングしたプレートの滅菌は、例えばγ線照射(5,000rad)を用い、使用するまで4℃で（または-８０℃で凍結して）保存することによって行うことができる。バイオマトリックスに細胞をプレーティングして接着させるためには血清含有は必要ないが、バイオマトリックスに細胞を塗布するために血清含有培地を用いることはできる。プレートおよび他の装置にコーティングするために、任意の組織由来のバイオマトリックス粒子の組成物を用いることができる。
【０１３３】
他の例として、本発明は、培養装置への工業規模の散布のための、生体組織からのバイオマトリックス足場の製造方法であって、a)本明細書に記載の本発明の方法のいずれかによりバイオマトリックス足場を製造し、b)基礎培地で(a)のバイオマトリックス足場を希釈し；c)(b)のバイオマトリックス足場を約-80℃で凍結し；d)大きさが約1μm〜約100μm(例えば、約1μm、2μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、95μm100μm、110μm、120μm、150μm、200μmなど)のバイオマトリックス粒子に低温粉砕することによって(c)のバイオマトリックス足場を粉砕し；e)(d)のバイオマトリックス粒子を基礎培地中、懸濁状態で解凍し；f)段階(e)のバイオマトリックス粒子を培養装置に散布することを含み、それによって、培養装置への工業規模の散布のための、生体組織からのバイオマトリックス足場を製造する方法を提供する。いくつかの実施形態において、本方法は、さらに、バイオマトリックス粒子を滅菌する段階を含むことができ、これは、例えばγ線照射によって行うことができる。
【０１３４】
前述の方法のいくつかの実施形態において、段階(b)のバイオマトリックス足場は、基礎培地に、約1:6(例えば、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9など)比で希釈することができる。いくつかの実施形態において、段階(e)のバイオマトリックス粒子は、基礎培地に、約1:24(例えば、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:21、1:22、1:23、1:24、1:25、1:26、1:27:1:28、1:29、1:30など)で希釈することができる。
【０１３５】
成人肝臓に用いる例示的なプロトコルの概略
1000x大豆トリプシンインヒビター
・最終濃度0.1mg/ml
組織輸送用溶液
・RPMI 1640またはカルシウムおよびマグネシウムを含むリン酸緩衝化生理食塩水などの基礎培地
・抗生物質/抗真菌薬100x溶液(Gibco#15240-112)
・ゲンタマイシン(25ug/ml)(Gibco#15710-072)
溶液1:組織混合用溶液
・3.4M NaCl
・0.1mg/ml大豆トリプシンインヒビター(Gibco#17075-029)
溶液2:脱脂溶液
・溶液1と1:1PBS(w/Ca&Mg)との混合物（1:2、1:3、1:4の比率も選択できる)あるいはRPMI 1640などの基礎培地
・0.1%デオキシコール酸ナトリウム(Sigma D6750-100g)
・36u/LホスホリパーゼＡ2(Sigma P9279-25mg)
・0.1mg/ml大豆トリプシンインヒビター(Gibco#17075-029)
溶液3:ヌクレアーゼ溶液
・RPMI 1640などの基礎培地
・5mg/100ml RNアーゼ(Sigma R6513-1g)
・1mg/100ml ＤＮアーゼ(DN25-1g)
・0.1mg/ml大豆トリプシンインヒビター
溶液4:高塩溶液
・3.M NaCl
溶液5:塩の除去&粉砕溶液
・ウイリアムE
・抗生物質/抗真菌薬(100x)
・ゲンタマイシン(30ug/ml)
大きな臓器のためのバイオマトリックス単離プロセス段階
1.高塩での組織のホモジナイズ
2.脱細胞化および脱脂
3.ヌクレアーゼ除去
4.高塩洗浄
5.塩の除去
6.バイオマトリックスの粒度減少
7.バイオマトリックスでのプレートのコーティング
【０１３６】
バイオマトリックス単離プロセス
1.0 組織破砕
1.1 USDA認定食肉処理施設から臓器組織を入手
1.2 USDA施設からGigaCyte研究室まで、プラスチック容器に入れた組織輸送用溶液に入れた臓器組織を輸送
1.3 潅流またはホモジナイズのために組織を調製
1.3.1 マルチウェルプレートでのin vitro用途にホモジナイズは好ましい
2.0 組織のホモジナイズ
2.1 無菌的に、手術用ナイフNo.22で組織を小片(〜3x3cm)に切断し、組織輸送用溶液に入れて血液を除く
2.2 組織片を組織輸送用溶液に入れて3〜4回リンスし、血液をできるだけ除く
2.3 〜400gの組織を同容量の溶液1中で混合物が均一になるまで(〜3〜5分間)ホモジナイズする
2.4 脱細胞化のために、ホモジナイズした組織溶液を2Lのローラーボトルに注ぐ
2.5 組織片の全バッチに関して繰り返す
3.0 脱細胞化および脱脂
3.1 同容量の溶液2を加えて、ローラーボトル中で組織をホモジナイズする
3.2 ボトル数回逆さにすることによって十分に混合し、次いで15〜30分間放置する
3.3 浮揚性のあるマトリックス物質は上部まで上昇し、肝臓色の溶液の上部に明るいマトリックス物質の明瞭な分離が生じる
3.4 浮揚性のあるマトリックス物質をピペットで吸い取り、他のローラーボトルに移す
3.5 複数のホモジナイズからのマトリックスをプールする
3.6 〜375mlマトリックス物質を750ml遠心ボトルに移し、各ボトルに同容量の溶液2を加え、〜1分間激しく振り動かして、十分な脱細胞化および脱脂を確実にする
3.7 高速度(3750RPM)で10分間遠心分離してペレット化し、次いで上清を除く
3.8 このプロセスをもう一回繰り返す（全部で２回）
4.0 ヌクレアーゼ除去
4.1 最終脱細胞化洗浄後に、バイオマトリックスペレットを乱さないように注意して上清を取り除く
4.2 各ボトルに同容量の溶液3を加え、1分間激しく振り動かして、すべての材料が懸濁液中にあり、ヌクレアーゼが完全に除去されるのを確実にする
4.3 高速度(3750RPM)で10分間遠心分離してペレット化し、次いで上清を取り除く
4.4 このプロセスをもう一回繰り返す（全部で２回）
5.0 高塩洗浄
5.1 最終ヌクレアーゼ洗浄後に、バイオマトリックスペレットを乱さないように注意して上清を取り除く
5.2 各ボトルに同容量の溶液4を加え、すべての材料が懸濁液中にあることを確実にするように注意して激しく振り動かす
5.3高速度(3750RPM)で10分間遠心分離してペレット化し、次いで上清を取り除く
5.3.1 この段階では、バイオマトリックスは十分にペレット化せず、遠心分離後に浮揚性がある
5.3.2 ピペットで上清を取り除き、ナイロンフィルターに通過させて浮揚性のある材料を回収する
5.3.3 採取した浮揚性のあるマトリックスを遠心ボトルに戻す
5.4 停止の前に、このプロセスを少なくとも2回繰り返す
5.4.1 最終の塩洗浄後に上清はわずかに黄褐色から澄明である
5.5 2回目の高塩洗浄後は、遅めの時間の場合は、良い停止点である
5.6 すべての遠心ボトルの内容物を１つのローラーボトルに注ぎ、溶液4を上部まで継足し、次いでバイオマトリックスを4℃で終夜放置する
5.7 翌日、残りの塩洗浄を続ける
5.8 バイオマトリックスボトルを激しく振り動かしてバイオマトリックス材料を十分に混合し、次いでバイオマトリックスを遠心ボトルに移し、3〜4回さらに塩洗浄を続ける
5.9 できるだけ少ないボトルにバイオマトリックスを圧縮し、塩洗浄が可能なように、それぞれ最大の半分まで充填する
6.0 塩の除去
6.1 最終塩洗浄後に、バイオマトリックスペレットを乱さないように注意して上清を取り除く
6.2 同容量の溶液5を加え、激しく振り動かして、すべてのバイオマトリックス材料が懸濁液中にあることを確実にする
6.3 高速(3750RPM)で10分間遠心分離してペレット化し
6.4. 上清を取り除き、同容量の溶液5を加え、ついで激しく振り動かす
6.5. 2回繰り返して(合計で3回)、上清が澄明であることを確実にする
6.5.1 バイオマトリックスは、各遠心分離によってさらにしっかりとペレット化する
6.5.2 最終洗浄後に色は無く、上清は澄明なはずである
6.6 最終の溶液5洗浄後に、各ボトルからのマトリックスペレットの容量を記録する
6.7 移し、すべてのバイオマトリックスペレットを新規のローラーボトルにプールする
6.8 バイオマトリックス材料の容量を測定する
6.9 プールしたバイオマトリックスを溶液5で1:6に希釈する
6.9.1 必要な溶液5の量を算出する
6.9.1.1 例：200mlバイオマトリックスx6=1,200
6.9.1.2 1Lの溶液5を200mlのバイオマトリックスに加えて1:6のバイオマトリックス懸濁液を調製する
6.10 30mlバイオマトリックスの1:6懸濁液を等分して前もってレベルしたフリーザーバッグに入れる
6.11 バイオマトリックスのバッグを-80℃で凍結させ、粉砕するまで保存する
6.12 新規バイオマトリックスロットのために“バイオマトリックスロット粉砕データシート”を作成する
6.12.1 この新規バッチから製造されたバッグの番号を記録する
6.12.2 各バッグは、同じロットからの別々のすりつぶしである
6.13 このバッチから製造されたバイオマトリックス材料は1つのロットとみなす
6.14 バッチにロット番号を割り当てる
7.0 バイオマトリックスの粒度減少
7.1 LN2を有する粉砕ミル(Spex Sample Prep 6870)を準備し、粉砕チャンバーを冷やす
7.2 フリーザーから凍結したバイオマトリックスバッグを取り除く
7.3 小片に砕く
7.4 凍結したバイオマトリックス片を予備冷却した粉砕ミルチャンバーに移す
7.5 クライオミルにおいて、それぞれ48分、粉砕を２回運転する（１回の運転は、12x2分の粉砕であり、それぞれ２分間のクールダウンが続く）
7.6 粉砕されたバイオマトリックスを、ロット番号およびバッグ番号（バッグ番号により、粉砕した日がわかる）が前もってラベルされた100mlのボトルに移す
7.7 プレートのコーティングの準備ができるまで、-80℃で凍結しておく
8.0 プレートのコーティングのためのバイオマトリックスの製造
8.1 37℃の水浴中で迅速解凍法でバイオマトリックスのボトルの1つを解凍する
8.2 解凍したバイオマトリックス懸濁液を測定する(〜30ml±2mlのはずである）
8.3 溶液5で1:24に希釈（図１７を参照）
8.3.1 1:6バイオマトリックス懸濁液に加えるための溶液5の容量を算出する
8.3.1.1 バイオマトリックス懸濁液の容量に3を掛ける
8.3.1.2その容量を、1:24希釈のために1:6懸濁液に加える
8.4直ちにプレートをコーティングする（希釈したバイオマトリックスを放置すると凝集が生じる）
9.0バイオマトリックスでのプレートのコーティング
9.1コーティングされるプレート数を決定する。プレーティング容量に関して表8を参照する
・パッケージングからプレートを無菌的に取り除き、層流フード内に配置する
・必要に応じて多チャネルピペットを用い、各ウェルにバイオマトリックス懸濁液の適切な量を移す。プレーティング容量に関しては、表１を参照する
・必要に応じて、懸濁液をウェルタッププレートに均等に分配されるのを確実にするが、フードの平らな表面からは除去しない
・終夜、プレートをそのままにしておく
・翌日、最初に各ウェルから溶液を取り除く
マトリックスコーティングが乱れないように注意深くプレートを扱う
フードの表面からプレートの縁を取り除くことなく、プレートをあなたの方に傾ける。これにより、バイオマトリックスがプレートから落下する痙攣様の動きを防ぐためにプレートを安定化する
小さなチップピペットを備えた吸引装置を用いて、各ウェルから全溶液を吸引する。ピペットでマトリックス表面に触れないこと!!!
プレートを穏やかに置き、ふたを取り除き、十分に乾燥させる(〜2時間)
まだ湿った状態でプレートを動かすと、バイオマトリックスコーティングが乱れる
マトリックスが乾燥するまでプレートを動かさないこと
十分に乾燥したら、ふたを戻し、品質を試験する
なめらかなコーティングを有するプレートをプレートポーチに置く
ポーチにシールをし、ラベルを貼る
γ線照射(5,000rad)で滅菌する
コーティングしたプレートを4℃で保存する
コーティングしたプレートをパックを氷冷しながら、5のパックにして発送する
10.0 バイオマトリックスプレートの使用
10.1 パッケージングからプレートを無菌的に取り除き、生物学的安全キャビネットに置く
10.2 各ウェルに培地を加え、使用前に少なくとも2時間インキュベーターに入れる
10.3 細胞をプレーティングする準備ができたら、再水和培地を取り除き、組織培養培地で1回洗浄する
10.4細胞を加える
【０１３７】
前記のものは本発明の例示であって、本発明を限定するものと解釈してはならない。本発明は、以下の請求項によって規定され、該請求項に等価なものは、本発明に含まれる。すべての公報、特許出願、特許、特許公報、GenBank(登録商標)データベースおよび/またはSNPアクセッション番号によって規定される配列ならびに本明細書において引用した他の参照文献は、その参照箇所が提示されている文および/またはパラグラフに関連する教示に関して参照としてその全体が包含される。
【表１】
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【０１３８】
これらのデータは、不溶性に関するコラーゲンの型の条件を示す。組織内のコラーゲンの型を同定し、バイオマトリックス足場の製造に用いる緩衝液のための塩濃度として、その組織内のコラーゲンに関して同定された最も高い塩濃度を用いなければならない。例えば、皮膚のためには、I型およびIII型コラーゲンを不溶性に保つ塩濃度である4.0Mの塩濃度を有する中性pHの緩衝液が用いられる。一方、胎盤のためには、IV型およびV型コラーゲンの両方を不溶性に保つ4.5Mの塩を有する中性pHの緩衝液が用いられる。
【０１３９】
組織に存在するコラーゲンの型は、宿主の年齢によって異なる。例えば、胎児肝臓は、高濃度のIII、IVおよびV型コラーゲン(4.0Mより上の塩濃度を必要とする)を有するのに対し、成人肝臓は、I、III、IV、V、VIおよびXVIII型コラーゲンの混合物(より低い塩濃度を必要とする)を有する。従って、バイオマトリックス足場の製造に必要な塩濃度は、その組織において優位なコラーゲンのレパートリーによって規定される。さらなる詳細に関しては、実施例1の文献23を参照のこと。
【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【０１４０】
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕培養装置への工業規模の散布のための、生体組織からのバイオマトリックス足場の製造方法であって、
a)塩濃度約3.5M NaCl〜約4.5M NaClを含む緩衝液で生体組織を灌流するかまたは生体組織をホモジナイズし；
b)第1培地にリパーゼおよび/または洗浄剤を含む脱脂緩衝液で段階(a)の生体組織を灌流するかまたは段階(a)のホモジネートを抽出し、ここで前記第1培地の重量オスモル濃度は約250mOsm/kg〜約350mOsm/kgであり、前記第1培地は無血清かつ中性pHであり；
c)中性pHかつ約2.0M NaCl〜約5.0M NaClの塩濃度であって、生体組織内で同定されるコラーゲンを不溶性に保つように選択された塩濃度を含む緩衝液で段階(b)の組織を灌流するかまたは段階(b)のホモジネートを抽出し;
d)緩衝液中、RNアーゼおよびDNアーゼで段階(c)の組織を灌流するかまたは段階(c)のホモジネートを抽出し;
e)中性pHかつ無血清であり、約250mOsm/kg〜約350mOsm/kgの重量オスモル濃度を有する第2培地で段階(d)の組織またはホモジネートをリンスし、それによって、生体組織から、無傷のまたはホモジナイズしたバイオマトリックス足場であって、コラーゲンの少なくとも95%および生体組織のコラーゲン結合性マトリックス成分およびマトリックス結合性増殖因子、ホルモンおよびサイトカインの大部分を含む前記足場を製造し；
f)基礎培地でバイオマトリックス足場を希釈し；
g)約-80℃で(f)のバイオマトリックス足場を凍結し；
h)大きさが約1μm〜約100μmのバイオマトリックス粒子に低温粉砕することによって(g)のバイオマトリックス足場を粉砕し；
i)(h)のバイオマトリックス粒子を基礎培地中、懸濁状態で解凍し；
j)段階(i)のバイオマトリックス粒子を培養装置に散布すること
を含み、それによって、培養装置への工業規模の散布のための、生体組織からのバイオマトリックス足場を製造する前記方法。
〔２〕バイオマトリックス足場を滅菌する段階をさらに含む、前記〔1〕に記載の方法。
〔３〕滅菌する段階がγ線照射によって行われる、前記〔3〕に記載の方法。
〔４〕(f)のバイオマトリックス足場が約1:6比で基礎培地に希釈される、前記〔1〕に記載の方法。
〔５〕(i)のバイオマトリックス粒子が約1:24比で基礎培地に希釈される、前記〔1〕に記載の方法。
〔６〕第1培地が塩、ミネラル、アミノ酸、ビタミンおよび糖を含む、前記〔1〕に記載の方法。
〔７〕第1培地が基礎培地である、前記〔1〕に記載の方法。
〔８〕基礎培地がRPMI1640、DME/F12、DME、F12、ウェイマウス培地およびウィリアム培地からなる群から選択される、前記〔7〕に記載の方法。
〔９〕第2培地が、間質液に存在する成分の少なくとも１つを含む、前記〔1〕に記載の方法。
〔１０〕段階(b)の脱脂緩衝液が、第1培地に、約20単位/L〜約50単位/LのホスホリパーゼＡ2および約1%のデオキシコール酸ナトリウムを含む、前記〔1〕に記載の方法。
〔１１〕段階(c)の緩衝液の塩濃度が、成人肝臓からの足場製造に用いる場合、約3.4M NaCl〜約3.5M NaClであり、胎児肝臓からの足場製造に用いる場合、約4.0M NaCl〜約4.5M NaClである、前記〔1〕に記載の方法。
〔１２〕段階(c)の緩衝液が、プロテアーゼインヒビターをさらに含む、前記〔1〕に記載の方法。
〔１３〕プロテアーゼインヒビターが大豆トリプシンインヒビターである、前記〔12〕に記載の方法。
〔１４〕段階(d)の緩衝液が、プロテアーゼインヒビターをさらに含む、前記〔1〕に記載の方法。
〔１５〕プロテアーゼインヒビターが大豆トリプシンインヒビターである、前記〔13〕に記載の方法。
〔１６〕段階(a)〜(e)のすべての培地および緩衝液が、細胞外マトリックス成分を分解する酵素の検出可能な量を含まない、前記〔1〕に記載の方法。
〔１７〕生体組織が、肝臓組織、肺組織、膵臓組織、甲状腺組織、腸管組織、皮膚組織、血管組織、膀胱組織、心臓組織および腎組織からなる群から選択される、前記〔1〕に記載の方法。
〔１８〕生体組織が哺乳動物由来である、前記〔1〕に記載の方法。
〔１９〕前記〔1〕〜〔18〕のいずれかに記載の方法によって製造されるバイオマトリックス足場。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年6月27日(2018.6.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養装置への工業規模の散布のための、生体組織からのバイオマトリックス足場の製造方法であって、
a)塩濃度3.5M NaCl〜4.5M NaClを含む緩衝液で生体組織を灌流するかまたは生体組織をホモジナイズし、ここで、前記生体組織が、肝臓、肺、甲状腺、皮膚、膵臓、血管、膀胱、腎臓、脳、胆管、十二指腸、腹部大動脈、腸骨静脈、心臓および腸からなる群より選択され；
b)第1培地中に、ホスホリパーゼA2およびデオキシコール酸ナトリウムを含む脱脂緩衝液で、段階(a)の生体組織を灌流するかまたは段階(a)のホモジネートを抽出し、ここで前記第1培地の重量オスモル濃度は250mOsm/kg〜350mOsm/kgであり、前記第1培地は無血清かつ中性pHであり；
c)中性pHかつ2.0M NaCl〜5.0M NaClの塩濃度であって、前記生体組織内で同定されるコラーゲンを不溶性に保つように選択された塩濃度を含む緩衝液で段階(b)の組織を灌流するかまたは段階(b)のホモジネートを抽出し;
d)緩衝液中、RNアーゼおよびDNアーゼで段階(c)の組織を灌流するかまたは段階(c)のホモジネートを抽出し;
e)中性pHかつ無血清であり、250mOsm/kg〜350mOsm/kgの重量オスモル濃度を有する第2培地で段階(d)の組織またはホモジネートをリンスし、それによって、前記生体組織から、無傷のまたはホモジナイズしたバイオマトリックス足場であって、前記生体組織に見いだされるコラーゲンの少なくとも95%並びにコラーゲン結合性マトリックス成分、マトリックス結合性増殖因子、ホルモンおよびサイトカインの大部分を含む前記足場を製造し；
f)基礎培地でバイオマトリックス足場を希釈し；
g)-80℃で(f)のバイオマトリックス足場を凍結し；及び
h)大きさが1μm〜100μmのバイオマトリックス粒子に低温粉砕することによって(g)のバイオマトリックス足場を粉砕すること；
を含み、それによって、培養装置への工業規模の散布のための、生体組織からのバイオマトリックス足場を製造する前記方法。
【請求項２】
バイオマトリックス足場を滅菌する段階をさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
滅菌する段階がγ線照射によって行われる、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
(f)のバイオマトリックス足場が1:6比で基礎培地に希釈される、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
(i)のバイオマトリックス粒子が1:24比で基礎培地に希釈される、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
第1培地が塩、ミネラル、アミノ酸、ビタミンおよび糖を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
第1培地が基礎培地である、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
基礎培地がRPMI1640、DME/F12、DME、F12、ウェイマウス培地およびウィリアム培地からなる群から選択される、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
第2培地が、間質液に存在する成分の少なくとも１つを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
段階(b)の脱脂緩衝液が、第1培地に、20単位/L〜50単位/LのホスホリパーゼＡ2および1%のデオキシコール酸ナトリウムを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
段階(c)の緩衝液の塩濃度が、成人肝臓からの足場製造に用いる場合、3.4M NaCl〜3.5M NaClであり、胎児肝臓からの足場製造に用いる場合、4.0M NaCl〜4.5M NaClである、請求項1に記載の方法。
【請求項１２】
段階(c)の緩衝液が、プロテアーゼインヒビターをさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１３】
プロテアーゼインヒビターが大豆トリプシンインヒビターである、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
段階(d)の緩衝液が、プロテアーゼインヒビターをさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１５】
プロテアーゼインヒビターが大豆トリプシンインヒビターである、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
段階(a)〜(e)のすべての培地および緩衝液が、細胞外マトリックス成分を分解する酵素の検出可能な量を含まない、請求項1に記載の方法。
【請求項１７】
生体組織が哺乳動物由来である、請求項1に記載の方法。
【請求項１８】
請求項1に記載の方法の段階a)〜e)によって製造され、
生体組織に見いだされるコラーゲンの少なくとも95%並びにコラーゲン結合性マトリックス成分、マトリックス結合性増殖因子、ホルモンおよびサイトカインの大部分を含む、バイオマトリックス足場。
【外国語明細書】
2018143249000001.pdf