(57)【要約】【課題】    微生物が生産した有用物質を効率よく培養液中への分泌できる有用物質の生産方法を提供する。【解決手段】  Ｏｇａｔａｅａ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｙａｒｒｏｗｉａ属及びＣａｎｄｉｄａ属からなる群より選ばれる少なくとも１種の酵母により、培養液中にノニオン界面活性剤（Ａ）を含有し、（Ａ）が脂肪族多価アルコールの脂肪酸エステル（Ａ１）、脂肪族多価アルコールのアルキレンオキサイド付加物の脂肪酸エステル（Ａ２）、ポリアルキレングリコール脂肪酸エステル（Ａ３）、脂肪族１価アルコールアルキレンオキサイド付加物（Ａ４）、脂肪酸のアルキレンオキサイド付加物（Ａ５）及び脂肪族炭化水素基を有する芳香族１価アルコールのアルキレンオキサイド付加物（Ａ６）からなる群より選ばれる少なくとも１種のノニオン界面活性剤である有用物質の生産方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養液中に含まれる酵母により有用物質を培養液中に分泌生産する有用物質の生産方法であって、酵母がＯｇａｔａｅａ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｙａｒｒｏｗｉａ属及びＣａｎｄｉｄａ属からなる群より選ばれる少なくとも１種であり、培養液中にノニオン界面活性剤（Ａ）を含有し、（Ａ）が脂肪族多価アルコールの脂肪酸エステル（Ａ１）、脂肪族多価アルコールのアルキレンオキサイド付加物の脂肪酸エステル（Ａ２）、ポリアルキレングリコール脂肪酸エステル（Ａ３）、脂肪族１価アルコールアルキレンオキサイド付加物（Ａ４）、脂肪酸のアルキレンオキサイド付加物（Ａ５）及び脂肪族炭化水素基を有する芳香族１価アルコールのアルキレンオキサイド付加物（Ａ６）からなる群より選ばれる少なくとも１種のノニオン界面活性剤である有用物質の生産方法。
【請求項２】
培養液中のノニオン界面活性剤（Ａ）の含有量が、培養開始時の培養液の重量を基準として、０．０００１〜２０重量％である請求項１に記載の有用物質の生産方法。
【請求項３】
ノニオン界面活性剤（Ａ）のＨＬＢが６〜２０である請求項１又は２に記載の有用物質の生産方法。
【請求項４】
脂肪族多価アルコールの脂肪酸エステル（Ａ１）、脂肪族多価アルコールのアルキレンオキサイド付加物の脂肪酸エステル（Ａ２）、ポリアルキレングリコール脂肪酸エステル（Ａ３）、又は脂肪酸のアルキレンオキサイド付加物（Ａ５）を構成する脂肪酸の少なくとも１つが炭素数が８〜２２である請求項１〜３のいずれか記載の有用物質の生産方法。
【請求項５】
有用物質が、タンパク質である請求項１〜４のいずれかに記載の有用物質の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有用物質の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物によりアミノ酸やタンパク質等の有用物質を生産する技術は、医療等の産業分野で広く利用されている。
アミノ酸やタンパク質等の有用物質を生産する微生物としては、大腸菌により生産する方法が知られている。しかしながら、生産する有用物質が限定されることや分泌生産が難しいという課題がある。そのため、グラム陽性菌、酵母及び担子菌等の菌類を用いることで、幅広い有用物質を分泌生産することが可能となっている（例えば非特許文献１及び２）。
【０００３】
しかしながら、このようなグラム陽性菌、酵母及び担子菌等の菌類は、外界からのストレスに耐えるため、厚い多糖よりなる細胞壁を有している。この多糖からなる細胞壁は、有用物質の吸着や有用物質の透過を抑制などの原因となり、分泌効率が悪化し、分泌生産において大きな課題となっている。
【０００４】
そのため、酵母においては、多糖による細胞壁を薄くすることを目的として、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅやＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの糖合成関連遺伝子破壊株を用いることで、タンパク質分泌量を増加させる技術（非特許文献３）がある。しかしながら、この方法で得られた糖タンパク質では糖鎖付加しないタンパク質に限定されるなどの問題点が指摘されており、依然、有用な解決策は見出されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】バイオインダストリー協会、発酵ハンドブック、共立出版、２００１年７月
【非特許文献２】新生物化学工学（第２版）、三共出版、２０１３年３月、ｐ１７−２１
【非特許文献３】Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１９９８、ｖｏｌ．１８０、ｎｏ．２４、ｐ６７３６−６７４２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、酵母が生産した有用物質を効率よく培養液中へ分泌できる有用物質の生産方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、これらの問題点を解決するべく鋭意検討した結果、本発明に到達した。
すなわち本発明は、培養液中に含まれる酵母により有用物質を培養液中に分泌生産する有用物質の生産方法であって、酵母がＯｇａｔａｅａ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｙａｒｒｏｗｉａ属及びＣａｎｄｉｄａ属からなる群より選ばれる少なくとも１種であり、培養液中にノニオン界面活性剤（Ａ）を含有し、（Ａ）が脂肪族多価アルコールの脂肪酸エステル（Ａ１）、脂肪族多価アルコールのアルキレンオキサイド付加物の脂肪酸エステル（Ａ２）、ポリアルキレングリコール脂肪酸エステル（Ａ３）、脂肪族１価アルコールアルキレンオキサイド付加物（Ａ４）、脂肪酸のアルキレンオキサイド付加物（Ａ５）及び脂肪族炭化水素基を有する芳香族１価アルコールのアルキレンオキサイド付加物（Ａ６）からなる群より選ばれる少なくとも１種のノニオン界面活性剤である有用物質の生産方法である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の有用物質の生産方法を用いることで、微生物が生産した有用物質を高効率で培養液中へ分泌させることができる。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の有用物質の生産方法は、培養液中に含まれる酵母により有用物質を培養液中に分泌生産する有用物質の生産方法であって、酵母がＯｇａｔａｅａ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｙａｒｒｏｗｉａ属及びＣａｎｄｉｄａ属からなる群より選ばれる少なくとも１種であり、培養液中にノニオン界面活性剤（Ａ）を含有し、（Ａ）が脂肪族多価アルコールの脂肪酸エステル（Ａ１）、脂肪族多価アルコールのアルキレンオキサイド付加物の脂肪酸エステル（Ａ２）、ポリアルキレングリコール脂肪酸エステル（Ａ３）、脂肪族１価アルコールアルキレンオキサイド付加物（Ａ４）、脂肪酸のアルキレンオキサイド付加物（Ａ５）及び脂肪族炭化水素基を有する芳香族１価アルコールのアルキレンオキサイド付加物（Ａ６）からなる群より選ばれる少なくとも１種のノニオン界面活性剤である有用物質の生産方法である。
【００１０】
本発明の生産方法に用いる培養液としては、当技術分野で一般的に用いられる細胞培養用培地あれば特に制限なく用いることができ、炭素源、窒素源その他の必須栄養素を含む天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【００１１】
炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が挙げられる。
【００１２】
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸あるいは有機酸のアンモニウム塩またはその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスチープリカー等が挙げられる。
【００１３】
その他の必須栄養素としては、無機塩類が挙げられ、無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
【００１４】
本発明における酵母は、Ｏｇａｔａｅａ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｙａｒｒｏｗｉａ属及びＣａｎｄｉｄａ属からなる群より選ばれる少なくとも１種である。
好ましくはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属及びＣａｎｄｉｄａ属からなる群より選ばれる少なくとも１種である。
【００１５】
本発明における有用物質は、特に限定されないが、タンパク質（酵素、ホルモンタンパク質、抗体及びペプチド等）、オリゴ糖及び核酸等が含まれる。
【００１６】
タンパク質としては、酵素｛酸化還元酵素（コレステロールオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ及びペルオキシダーゼ等）、加水分解酵素（リゾチーム、プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ及びグルコアミラーゼ等）、異性化酵素（グルコースイソメラーゼ等）、転移酵素（アシルトランスフェラーゼ及びスルホトランスフェラーゼ等）、合成酵素（脂肪酸シンターゼ、リン酸シンターゼ及びクエン酸シンターゼ等）及び脱離酵素（ペクチンリアーゼ等）等｝；  ホルモンタンパク質｛骨形成因子（ＢＭＰ）、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターロイキン１〜１２、成長ホルモン、エリスロポエチン、インスリン、顆粒状コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、ナトリウム利尿ペプチド、血液凝固第ＶＩＩＩ因子、ソマトメジン、グルカゴン、成長ホルモン放出因子、血清アルブミン及びカルシトニン等｝；
抗体｛１本鎖抗体、ＩｇＧラージサブユニット、ＩｇＧスモールサブユニット等｝、抗原タンパク質｛Ｂ型肝炎表面抗原等｝；
機能性タンパク質｛プロネクチン（登録商標）、不凍ペプチド、抗菌ペプチド等｝；
蛍光タンパク質（ＧＦＰ等）、発光タンパク質（ルシェラーゼ等）及びペプチド（特にアミノ酸組成を限定するものではなく、オリゴペプチド、ジペプチド及びトリペプチド等）等が挙げられる。
【００１７】
オリゴ糖としては、ヒアルロン酸、コンドロイチン、キサンタン、セルロース、スクロース、ラクトース、トレハロース、マルトース、ラフィノース、パノース、シクロデキストリン、ガラクトオリゴ糖及びフラクトオリゴ糖等が挙げられる。
【００１８】
核酸としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、イノシン一リン酸、アデノシン一リン酸及びグアノシン一リン酸等が挙げられる。
【００１９】
これらの有用物質のうち、有用物質の作製の容易さの観点から、タンパク質が好ましく、さらに好ましくは酵素、ホルモンタンパク質及び抗体である。
【００２０】
有用物質がタンパク質である場合、タンパク質が微生物内で発現した後、一部又は全てがペリプラズムへ移行する性質をタンパク質が有している事が好ましい。さらに好ましくはペリプラズムへの移行に必要なシグナル配列をＯＲＦ中にコードしているタンパク質である。
ペリプラズムとは、微生物の細胞質膜より外側の空間と多糖を含む細胞壁層の事である。
ペリプラズムへの移行に必要なシグナル配列としては、α−シグナル配列、ＰＨＯ１遺伝子のシグナル配列等が挙げられる。
【００２１】
本発明の有用物質の生産方法で使用されるノニオン界面活性剤（Ａ）は、脂肪族多価アルコールの脂肪酸エステル（Ａ１）、脂肪族多価アルコールのアルキレンオキサイド付加物の脂肪酸エステル（Ａ２）、ポリアルキレングリコール脂肪酸エステル（Ａ３）、脂肪族１価アルコールアルキレンオキサイド付加物（Ａ４）、脂肪酸のアルキレンオキサイド付加物（Ａ５）及び脂肪族炭化水素基を有する芳香族１価アルコールのアルキレンオキサイド付加物（Ａ６）からなる群より選ばれる少なくとも１種のノニオン界面活性剤である。
【００２２】
脂肪族炭化水素基としては、１価又は２価の脂肪族炭化水素基が含まれ、具体的には、１価の脂肪族炭化水素基｛直鎖又は分岐のアルキル基、直鎖又は分岐のアルケニル基、脂環式炭化水素基等｝、２価の脂肪族炭化水素基｛直鎖又は分岐のアルキレン基等｝等が挙げられる。
脂肪族炭化水素基としては、分泌効率の観点から、１価の脂肪族炭化水素基が好ましく、さらに好ましくは直鎖又は分岐のアルキル基及び直鎖又は分岐のアルケニル基である。
脂肪族炭化水素基の炭素数は、細胞毒性及び分泌効率の観点から、８〜２２が好ましく、さらに好ましくは８〜１８である。
【００２３】
本発明の脂肪族多価アルコールの脂肪酸エステル（Ａ１）は、脂肪族多価アルコールと脂肪酸とのエステル化合物であり、多価アルコールの１個以上の水酸基がエステル結合していればよい
脂肪酸の具体的には、オクタン酸、ノナン酸、デカン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、オレイン酸、バクセン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキジン酸、ベヘン酸等が挙げられる。
これらのうち、細胞毒性及び分泌効率の観点から、炭素数８〜２２の脂肪酸が好ましく、さらに好ましくは８〜１８である。
【００２４】
脂肪族多価アルコールとしては、２価の脂肪族アルコール｛炭素数２〜２０のアルキレングリコール（エチレングリコール、１，２−プロピレングリコール、１，３−プロピレングリコール、１，４−ブタンジオール、ネオペンチルグリコール、１，６−ヘキサンジオール、１，９−ノナンジオール及び１，１０−デカンジオール等）、３価以上の脂肪族アルコール｛炭素数３〜２０のものが含まれ、例えば、アルカンポリオールおよびその分子内もしくは分子間脱水物（グリセリン、トリメチロールエタン、トリメチロールプロパン、ペンタエリスリトール、ソルビトール、ソルビタン、ポリグリセリン、及びジペンタエリスリトール）、糖類及びその誘導体（ショ糖及びメチルグルコシド）等｝等が挙げられる。
【００２５】
本発明の脂肪族多価アルコールの脂肪酸エステル（Ａ２）は、脂肪族多価アルコールのアルキレンオキサイド（以下、アルキレンオキサイドをＡＯと略称することがある。）付加物と脂肪酸とのエステル化合物であり、多価アルコールのＡ付加物の１個以上の水酸基がエステル結合していればよい。
脂肪族多価アルコールのＡＯ付加物としては、上記脂肪族多価アルコールへの炭素数２〜４のＡＯ（エチレンオキサイド、１，２−プロピレンオキサイド及び１，３−プロピレンオキサイド等）付加物等が挙げられる。
ＡＯの付加（重合）は、単重合でもよく、共重合でもよい。共重合の場合は、ブロック共重合、ランダム共重合、ブロックとランダムの併用等いずれでもよいが、分泌効率の観点から、ブロック共重合体が好ましい。
分泌効率の観点から、ＡＯの重合度は、１〜１００が好ましく、さらに好ましくは１〜５０である。
脂肪酸としては（Ａ１）で例示したものが挙げられ、これらのうち、細胞毒性及び分泌効率の観点から、炭素数８〜２２の脂肪酸が好ましく、さらに好ましくは８〜１８である。
【００２６】
本発明のポリアルキレングリコール脂肪酸エステル（Ａ３）は、ポリアルキレングリコールと脂肪酸とのエステル化合物であり、ポリアルキレングリコールの１個以上の水酸基がエステル結合していればよい。
ポリアルキレングリコールとしては、炭素数２〜４のアルキレングリコール（エチレングリコール、プロピレングリコール及びブチレングリコール等）への炭素数が２〜４のＡＯ（エチレンオキサイド、１，２−プロピレンオキサイド及び１，３−プロピレンオキサイド等）付加物等が挙げられる。
ＡＯの付加（重合）は、単重合でもよく、共重合でもよい。共重合の場合は、ブロック共重合、ランダム共重合、ブロックとランダムの併用等いずれでもよいが、分泌効率の観点から、ブロック共重合体が好ましい。
分泌効率の観点から、ＡＯの重合度は、１〜１００が好ましく、さらに好ましくは１〜５０である。
脂肪酸としては（Ａ１）で例示したものが挙げられ、これらのうち、細胞毒性及び分泌効率の観点から、炭素数８〜２２の脂肪酸が好ましく、さらに好ましくは８〜１８である。
【００２７】
脂肪族１価アルコールアルキレンオキサイド付加物（Ａ４）は、脂肪族１価アルコールのアルキレンオキサイド付加物である。
脂肪族１価アルコールとしては、カプリルアルコール、２−エチルヘキサノール、ペラルゴンアルコール、カプリンアルコール、ウンデシルアルコール、ラウリルアルコール、トリデシルアルコール、ミリスチルアルコール、ペンタデシルアルコール、パルミチルアルコール、セトステアリルアルコール、パルミトレイルアルコール、１−ヘプタデカノール、ステアリルアルコール、エライジルアルコール、オレイルアルコール、リノレイルアルコール、エライドリノレイルアルコール、リノレニルアルコール、ノナデシルアルコール、アラキジルアルコール、ヘンエイコサノール、ベヘニルアルコール及びエルシルアルコール等が挙げられる。
ＡＯの付加（重合）は、単重合でもよく、共重合でもよい。共重合の場合は、ブロック共重合、ランダム共重合、ブロックとランダムの併用等いずれでもよいが、分泌効率の観点から、ブロック共重合体が好ましい。
分泌効率の観点から、ＡＯの重合度は、１〜１００が好ましく、さらに好ましくは１〜５０である。
【００２８】
脂肪酸のアルキレンオキサイド付加物（Ａ５）で、脂肪酸としては、（Ａ１）で例示したものが挙げられ、好ましいものも同様である。
ＡＯの付加（重合）は、単重合でもよく、共重合でもよい。共重合の場合は、ブロック共重合、ランダム共重合、ブロックとランダムの併用等いずれでもよいが、分泌効率の観点から、ブロック共重合体が好ましい。
分泌効率の観点から、ＡＯの重合度は、１〜１００が好ましく、さらに好ましくは１〜５０である。
これらのうち、細胞毒性及び分泌効率の観点から、炭素数８〜２２の脂肪酸が好ましく、さらに好ましくは８〜１８である。
【００２９】
脂肪族炭化水素基を有する芳香族１価アルコールのアルキレンオキサイド付加物（Ａ６）の脂肪族炭化水素基を有する芳香族１価アルコールとしては、炭素数８〜２２のアルキル基を有するアルキルフェノールが含まれ、具体的には、４−オクチルフェノール、４−ｔ−オクチルフェノール、ノニルフェノール及びドデシルフェノール等が挙げられる。
ＡＯの付加（重合）は、単重合でもよく、共重合でもよい。共重合の場合は、ブロック共重合、ランダム共重合、ブロックとランダムの併用等いずれでもよいが、分泌効率の観点から、ブロック共重合体が好ましい。
分泌効率の観点から、ＡＯの重合度は、１〜１００が好ましく、さらに好ましくは１〜５０である。
【００３０】
ノニオン界面活性剤の親水性及び疎水性を示す尺度としてＨＬＢが知られている。ＨＬＢの値が高いほど親水性が高いことを意味する。本発明におけるＨＬＢとは下記式（１）で計算される数値である（藤本武彦著、界面活性剤入門、２１２頁、三洋化成工業株式会社発行）。
ＨＬＢ＝１０×（無機性／有機性） （１）
【００３１】
ノニオン界面活性剤（Ａ）のＨＬＢは、培養液への分散性及び分泌効率の観点から、６〜２０が好ましく、特に好ましくは６〜１７である。
【００３２】
脂肪族多価アルコールの脂肪酸エステル（Ａ１）としては、具体的には、ソルビタンヤシ油脂肪酸エステル（ＨＬＢ＝８．５）等が挙げられる。
【００３３】
脂肪族多価アルコールのアルキレンオキサイド付加物の脂肪酸エステル（Ａ２）としては、具体的には、ソルビタンＥＯ２０モル付加物のモノヤシ油脂肪酸エステル（ＨＬＢ＝１６．３）、ソルビタンＥＯ２０モル付加物のモノオレイン酸エステル（ＨＬＢ＝１５．４、Ｔｗｅｅｎ８０）、ソルビタンＥＯ２０モル付加物のモノラウリン酸エステル（ＨＬＢ＝１６．７、Ｔｗｅｅｎ２０）、ＥＯ１２モル付加物のジオレイン酸エステル（ＨＬＢ＝１０．４）、ＥＯ２０モル付加物のジオレイン酸エステル（ＨＬＢ＝１２．９）等が挙げられる。
【００３４】
ポリアルキレングリコール脂肪酸エステル（Ａ３）としては、具体的には、ＥＯ６モル付加のポリエチレングリコールのステアリン酸エステル（ＨＬＢ＝７．３）、ＥＯ６５モル付加のポリエチレングリコールのステアリン酸エステル（ＨＬＢ＝１７．０）、ＥＯ９モル付加のポリエチレングリコールのオレイン酸エステル（ＨＬＢ＝９．４）、ＥＯ１２モル付加のポリエチレングリコールのオレイン酸エステル（ＨＬＢ＝１０．４）、ＥＯ３０モルのポリエチレングリコールのＰＯ１５モル付加物のオレイン酸エステル（ＨＬＢ＝７．０）、ＥＯ２９０モル付加のポリエチレングリコールのラウリル酸エステル（ＨＬＢ＝１８．４）等が挙げられる。
【００３５】
脂肪族１価アルコールアルキレンオキサイド付加物（Ａ４）としては、具体的には、ラウリルアルコールＥＯ９モル付加物（ＨＬＢ＝１３．６）、ラウリルアルコールＥＯ１１モル付加物（ＨＬＢ＝１４．４）、ラウリルアルコール及びミリスチルアルコール混合物のＥＯ８モル付加物（ＨＬＢ＝１３．６）、ヘキサデカノール及びステアリルアルコール混合物のＥＯ１０モル付加物（ＨＬＢ＝１３．３）及びオレイルアルコールＥＯ１０モル付加物（ＨＬＢ＝１２．４）等が挙げられる。
【００３６】
脂肪酸のアルキレンオキサイド付加物（Ａ５）としては、具体的には、オレイン酸ＥＯ９モル付加物（ＨＬＢ＝１１．８）、ステアリン酸ＥＯ２３モル付加物（ＨＬＢ＝１５．７）及びステアリン酸ＥＯ９モル付加物（ＨＬＢ＝１１．９）等が挙げられる。
なお、ポリアルキレングリコール脂肪酸エステル（Ａ３）と脂肪酸のアルキレンオキサイド付加物（Ａ５）とでは、（Ａ３）のポリアルキレングリコール部分と（Ａ５）のアルキレンオキサイドが付加した部分、及び（Ａ３）の脂肪酸部分と（Ａ５）の脂肪酸部分とが同じであれば、同等の効果があると推察される。
【００３７】
脂肪族炭化水素基を有する芳香族１価アルコールのアルキレンオキサイド付加物（Ａ６）としては、具体的には、４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェニル−ポリエチレングリコール（ＨＬＢ＝１３．５、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）、オクチルフェニル−ポリエチレングリコール（ＨＬＢ＝１３．０、ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０）等が挙げられる。
【００３８】
ノニオン界面活性剤（Ａ）としては、分泌効率の観点から、脂肪族多価アルコールの脂肪酸エステル（Ａ１）、脂肪族多価アルコールのアルキレンオキサイド付加物の脂肪酸エステル（Ａ２）、ポリアルキレングリコール脂肪酸エステル（Ａ３）、脂肪酸のアルキレンオキサイド付加物（Ａ５）及び脂肪族炭化水素基を有する芳香族１価アルコールのアルキレンオキサイド付加物（Ａ６）からなる群より選ばれる少なくとも１種が好ましく、さらに好ましくは脂肪族多価アルコールの脂肪酸エステル（Ａ１）、脂肪族多価アルコールのアルキレンオキサイド付加物の脂肪酸エステル（Ａ２）、ポリアルキレングリコール脂肪酸エステル（Ａ３）及び脂肪族炭化水素基を有する芳香族１価アルコールのアルキレンオキサイド付加物（Ａ６）からなる群より選ばれる少なくとも１種である。
【００３９】
また、ノニオン界面活性剤（Ａ）として、細胞毒性の観点から、脂肪族多価アルコールの脂肪酸エステル（Ａ１）、脂肪族多価アルコールのアルキレンオキサイド付加物の脂肪酸エステル（Ａ２）、ポリアルキレングリコール脂肪酸エステル（Ａ３）、又は脂肪酸のアルキレンオキサイド付加物（Ａ５）を構成する脂肪酸の少なくとも１つが炭素数が８〜２２である。
【００４０】
本発明の有用物質の生産方法で使用されるノニオン界面活性剤（Ａ）の使用量（重量％）は、対象となる微生物、生産される有用物質の種類及び抽出方法の種類によって適宜選択されるが、培養開始時（植菌時）の培養液の重量を基準として、分泌効率の観点から、０．０００１〜２０重量％が好ましく、さらに好ましくは０．００５〜１０重量％であり、次にさらに好ましくは０．００７〜７重量％、特に好ましくは０．０１〜５重量％である。
【００４１】
本発明の有用物質の生産方法において、培養液中の界面活性剤による分泌効率（％）は、生産性の観点から、５５〜１００％が好ましく、さらに好ましくは６０〜１００％、次にさらに好ましくは６５〜１００％、特に好ましくは７０〜１００％である。
【００４２】
分泌効率とは、界面活性剤により微生物内の有用物質が微生物外（培養液中）へ分泌されることを示している。
なお、本発明においては、下記式によって定義される。
分泌効率（％）＝１００×（Ｘ／ＯＤ）／｛（Ｘ／ＯＤ）＋（Ｙ／ＯＤ）｝
Ｘ（培養上清）：遠心分離による菌体除去後に残る培養液中の有用物質の濃度
Ｙ（菌体表面）：遠心分離により集めた菌体を洗浄し、再懸濁した菌体懸濁液中の有用物質の濃度
ＯＤ：遠心分離時の菌体の濃度
【００４３】
分泌効率は、例えば微生物内で生産されたタンパク質がよりペリプラズム移行するようにすれば分泌効率は上がり、よりペリプラズム移行しないようにすれば分泌効率は下がる。また、スクリーニングによって分泌効率の高い界面活性剤を選定することにより分泌効率を上げることができる。
【００４４】
ノニオン界面活性剤（Ａ）はあらかじめ培養液と混合して使用する以外に、微生物を懸濁させた培養液に後から添加しても良い。培養液との混合は、培養液に界面活性剤を添加し、撹拌羽根又はスターラー等で撹拌することで行うことができる。後から混合する際は、撹拌羽根等で撹拌しながら添加することで行うことができる。
【００４５】
＜培養液の濁度の測定方法＞
サンプリングで回収した微生物を含む培養液を用いて、濁度計［（株）島津製作所社製、ＵＶ−１７００］を用いて、光路長１ｃｍの石英セルを用いて濁度の測定を行う。
培養液は、１５００ｒｐｍ、５分、４℃で遠心し、上清を破棄する。沈澱をサンプル液量と同量の生理食塩水で再懸濁し、適切な吸光度（０．１〜０．８）になるように生理食塩水で希釈して６００ｎｍの吸光度を測定する。培養液の濁度は下記数式（１）によって算出する。
培養液の濁度（ＯＤ）＝（希釈した培養液の６００ｎｍの吸光度）×培養液の希釈倍率  （数式１）
【００４６】
本発明の有用物質の生産方法における培養液の濁度は、好ましくは１〜３００ＯＤであり、さらに好ましくは１０〜３００ＯＤであり、特に好ましくは２０〜３００ＯＤである。
培養液の濁度が１ＯＤ以上であると有用物質の生産量が多くなり、３００ＯＤ以下であると有用物質の生産が容易であるので好ましい。
本発明の有用物質の生産方法において、上記範囲内であれば、培養液の濁度が大きければ大きいほど有用物質の生産量は増加する。
【００４７】
本発明の有用物質の生産方法において、有用物質の生産量の観点から、培養液の濁度が上記範囲内である時間が、有用物質を分泌させる工程に要する時間の１０％以上であることが好ましく、さらに好ましくは５０％以上である。
【００４８】
培養液の濁度は、例えば十分な通気条件下で半回分培養法を用いて適切な速度で流加を行うことによって増加させることができ、制限した通気条件下で回分培養を行うことによって減らすことができる。
また、培養開始（植菌時）から界面活性剤を入れるまでの時間を長くすることによって増加し、培養開始から界面活性剤を入れるまでの時間を短くすることによって減らすことができる。また、界面活性剤の投入速度を遅くすれば増加し、早くすれば減らすことができる。
【００４９】
本発明の有用物質の生産方法において、有用物質の分泌生産をする生産方法には、下記工程（ａ）及び（ｂ）を含む微生物外分泌生産方法が含まれる。下記工程において、有用物質を分泌生産する工程は工程（ａ）である。
工程（ａ）：有用物質を生産する微生物（酵母等）を培養する培養液と界面活性剤を同時に存在させて有用物質を微生物外（培養液中）に分泌させる工程。
工程（ｂ）：工程（ａ）の後、培養液から有用物質を分離する工程。
【００５０】
以下に本発明のノニオン界面活性剤（Ａ）を使用する有用物質の生産方法の一例を示す。
（ｉ）遺伝子組み換え
（ｉ−１）目的タンパク質を発現している細胞からメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分離し、該ｍＲＮＡから単鎖のｃＤＮＡを、次に二重鎖ＤＮＡを合成し、該二重鎖ＤＮＡをファージＤＮＡ又はプラスミドに組み込む。得られた組み換えファージ又はプラスミドを微生物に形質転換しｃＤＮＡライブラリーを作製する。
（ｉ−２）目的とするＤＮＡを含有するファージＤＮＡ又はプラスミドをスクリーニングする方法としては、ファージＤＮＡ又はプラスミドと目的タンパク質遺伝子又は相補配列の一部をコードするＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション法が挙げられる。
（ｉ−３）スクリーニング後のファージ又はプラスミドから目的とするクローン化ＤＮＡ又はその一部を切りだし、該クローン化ＤＮＡ又はその一部を発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することによって、目的遺伝子の発現ベクターを作成することができる。内膜を移行させるシグナル配列（ペリプラズムに目的物質を発現させるシグナル配列）をコードするＤＮＡを同時に連結することもできる。
（ｉｉ）培養
（ｉｉ−１）宿主微生物を発現ベクターで形質転換して組み換え微生物を作製し、組み換え微生物を前培養する。前培養は寒天培地上で通常１５〜４３℃で３〜７２時間行う。
（ｉｉ−２）有用物質の生産に用いる培養液を１２１℃、２０分間オートクレーブ滅菌を行い、ここに寒天培地で前培養した組み換え微生物を培養する。培養は、通常１５〜４３℃で１２〜７２時間行う。なお、培養開始と同時に界面活性剤（Ａ）を使用する場合は、界面活性剤（Ａ）と培養液を混合し均一化したものを、培養液として用いて同様の操作を行う。また、培養後６時間から７２時間後に界面活性剤（Ａ）を加える場合は、界面活性剤を加えてから１〜１０００時間培養を継続する。
（ｉｉｉ）精製
（ｉｉｉ−１）培養液中に分泌されたタンパク質は、遠心分離、中空糸分離、ろ過等で微生物及び微生物残さと分離される。
（ｉｉｉ−２）タンパク質を含む培養液は、イオン交換カラム、ゲルろ過カラム、疎水カラム、アフィニティカラム及び限外カラム等のカラム処理を繰り返し、エタノール沈殿、硫酸アンモニウム沈殿及びポリエチレングリコール沈殿等の沈殿処理を必要に応じ適宜行うことによって分離精製される。
【００５１】
（ｉｉｉ−１）で分離された宿主微生物は、その後、新たに培養液を供給することにより、さらに培養することができる。その培養液等をさらに（ｉｉｉ）の工程に供し精製、培養を繰り返すことにより、有用物質の連続生産を行うことができる。
【００５２】
上記の（ｉｉｉ）の精製工程においてカラム処理をおこなう場合、カラムクロマトグラフィーに使用される充填剤としては、シリカ、デキストラン、アガロース、セルロース、アクリルアミド及びビニルポリマー等が挙げられ、市販品ではＣａｐｔｏシリーズ、Ｓｅｐｈａｄｅｘシリーズ、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌシリーズ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅシリーズ（以上、ＧＥヘルスケア社）、Ｂｉｏ−Ｇｅｌシリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）等が挙げられる。
【００５３】
本発明の有用物質の生産方法を使用することにより、酵母が生産した有用物質を高効率で培養液中へ分泌させることができ、短時間で高い収量を得ることができるため、高生産量を達成することができる。また、本発明の有用物質の生産方法は、有用物質が培養液中に分泌されるため、有用物質の精製が容易である。
【００５４】
本発明の生産方法で得られる有用物質は、上記の方法で得られるため、従来よりも比活性が高い。
【００５５】
本発明の有用物質生産方法は、界面活性剤と微生物とを同時に存在させて、有用物質を培養液中に分泌させる工程を含む。この工程において、微生物が生存している限り、微生物が有用物質を作製し培養液中に分泌することができると推測される。さらに、微生物が有用物質を作製する能力を有していれば、作製する有用物質の種類は問わず本発明の生産方法が使用できると推測される。
本発明の有用物質生産方法は、微生物内で作製した有用物質が微生物のペリプラズムに移行している場合に特に有効である。有用物質がペリプラズムに移行していることによって、有用物質が培養液中に分泌されやすくなる。
【実施例】
【００５６】
以下の実施例、比較例により本発明をさらに説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、特記しない限り、部は重量部を意味する。
【００５７】
＜実施例１〜１０＞
ルシフェラーゼ発現酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、（独立行政法人製品評価技術基盤機構  バイオテクノロジーセンター）より分譲していただいたＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを用いて形質転換を行った。ｐＹＥＳ２ベクター（Ｔｈｅｒｍｏ社製）をＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩで切断し、人工合成（Ｔｈｅｒｍｏ社で委託合成）した両端にＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩ切断部位を持つαファクター‐ルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだ。αファクター‐ルシフェラーゼ遺伝子組み込みｐＹＥＳ２ベクターの微生物への形質転換は、ｐＹＥＳ２ベクター取り扱い説明書に記載の方法で行った。ルシフェラーゼ発現微生物をＹＰＤ培養液（Ｄｉｆｃｏ社製Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  １ｗｔ％、Ｄｉｆｃｏ社製Ｂａｃｔｏ  ｐｅｐｔｏｎｅ  ２ｗｔ％、グルコース２ｗｔ％）に白金耳を用いて植菌して３０℃で１５時間、２００ｒｐｍで振とう培養して作製した培養液を最終濁度（以下ＯＤと略記することがある）が０．１ＯＤ／ｍｌとなるように、１２５ｍｌＹＰＤ培養液（１００ｍＭリン酸水素カリウム緩衝液含有  ｐＨ６）に再懸濁した。
なお、培養液の濁度は、後述の「培養液の濁度の測定方法」と同様の条件で測定した。
更に、その再懸濁液を、３０℃で約１７時間、１１００ｒｐｍでＯＤが２０〜３０となるまで攪拌培養を続けた。ＯＤが２０〜３０となった時点で培養液を遠心（１５００ｇ、１０分）し、１２５ｍｌのガラクトース誘導培養液（前記のＹＰＤ培養液に１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液含有し、グルコースの代わりに２％ガラクトースを含む  ｐＨ６）に再懸濁し、３０℃、１１００ｒｐｍで２時間培養した。その後、表１に記載の界面活性剤を表１に記載の重量％となるように添加し、８時間３０℃、１１００ｒｐｍで培養した。その後、濁度（培養終了時の濁度）測定用にサンプリングし、遠心分離機によって、培養液から菌体と培養上清を分離し、培養上清、菌体を回収した。
【００５８】
＜比較例１＞
実施例１において、界面活性剤の代わりに純水を添加する以外は同様にして実施し、培養上清と菌体を回収した。
【００５９】
＜実施例１１〜２０＞
ルシフェラーゼ発現酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）は、（独立行政法人製品評価技術基盤機構  バイオテクノロジーセンター）より分譲していただいたＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓを用いて形質転換を行った。ｐＰＩＣＺαベクター（Ｔｈｅｒｍｏ社製）をＸｈｏＩとＸｂａＩで切断し、人工合成（Ｔｈｅｒｍｏ社で委託合成）した両端にＸｈｏＩとＸｂａＩ切断部位を持つルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだ。ルシフェラーゼ遺伝子組み込みｐＰＩＣＺαベクターの微生物への形質転換は、ｐＰＩＣＺαベクター取り扱い説明書に記載の方法で行った。ルシフェラーゼ発現微生物をＢＭＧＹ培養液に白金耳を用いて植菌して３０℃で１５時間、２００ｒｐｍで振とう培養して作製した培養液を最終ＯＤが０．１ＯＤ／ｍｌとなるように、１２５ｍｌＢＭＧＹ培養液（Ｄｉｆｃｏ社製Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  １ｗｔ％、Ｄｉｆｃｏ社製Ｂａｃｔｏ  ｐｅｐｔｏｎｅ  ２ｗｔ％、Ｄｉｆｃｏ社製Ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  １．３４ｗｔ％、グルコース２ｗｔ％、１００ｍＭリン酸水素カリウム、ｐＨ６．０）に再懸濁した。さらに、その再懸濁液を、３０℃で約１７時間、１１００ｒｐｍでＯＤが２０〜３０となるまで攪拌培養を続けた。ＯＤが２０〜３０となった時点で培養液を遠心（１５００×ｇ、１０分）し、１２５ｍｌＢＭＭＹ培養液に再懸濁し、３０℃、１１００ｒｐｍで２時間培養した。２時間経過後、表２に記載の界面活性剤を表２に記載の重量％となるように添加し、８時間３０℃、１１００ｒｐｍで培養した。その後、濁度（培養終了時の濁度）測定用にサンプリングし、遠心分離機によって、培養液から菌体と培養上清を分離し、培養上清と菌体を回収した。
【００６０】
＜比較例２＞
実施例１１において、界面活性剤の代わりに純水を添加する以外は同様にして実施し、培養上清と菌体を回収した。
【００６１】
＜実施例２１〜３０＞
酸性ホスファターゼ発現酵母（Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉ、公知文献（Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｉｖｅ  ｍｅｔｈａｎｏｌ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｙｅａｓｔ  Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉ，  Ｈ．  Ｙｕｒｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，  １４９３，  ２０００，  ５６−６３）に記載の方法で作製した。）をＢＭＧＹ培地に白金耳を用いて植菌して３０℃で１５時間、２００ｒｐｍで振とう培養して作製した培養液を最終ＯＤが０．１ＯＤ／ｍｌとなるように、１２５ｍｌＢＭＧＹ培地に再懸濁した。さらに、その再懸濁液を、３０℃で約１７時間、１１００ｒｐｍでＯＤが２〜５となるまで攪拌培養を続けた。ＯＤが２〜５となった時点で２ｖ／ｖ％となるようにメタノールを添加し、３０℃、１１００ｒｐｍで２時間培養した。２時間経過後、表３に記載の界面活性剤を表３に記載の重量で添加し、８時間３０℃、１１００ｒｐｍで培養した。８時間後、濁度（培養終了時の濁度）測定用にサンプリングし、遠心分離機によって、培養液から菌体と培養上清を分離し、培養上清と菌体を回収した。
菌体に５０ｍＭ  酢酸ＮａＢｆ（ｐＨ４．０）を加え、遠心することで菌体を洗浄した。洗浄した菌体に、５０ｍＭ  酢酸ＮａＢｆ（ｐＨ４．０）で再懸濁し、菌体表面の酸性ホスファターゼ活性測定サンプルとした。
【００６２】
＜比較例３＞
実施例２１において、界面活性剤の代わりに純水を添加する以外は同様にして実施し、培養上清と菌体を回収した。
【００６３】
【表１】
2018143237.tif 000002
【００６４】
【表２】
2018143237.tif 000003
【００６５】
【表３】
2018143237.tif 000004
【００６６】
なお、表１〜３中、ノニオン界面活性剤は下記を使用した。
ノニオン界面活性剤（Ａ１−１）：ソルビタンヤシ油脂肪酸エステル、ＨＬＢ＝８．５
ノニオン界面活性剤（Ａ２−１）：ソルビタンＥＯ２０モル付加物のモノヤシ油脂肪酸エステル、ＨＬＢ＝１６．３モル付加物）のオレイン酸エステル化物、ＨＬＢ＝７．０
ノニオン界面活性剤（Ａ２−２）：ソルビタンＥＯ２０モル付加物のモノオレイン酸エステル、ＨＬＢ＝１５．４（Ｔｗｅｅｎ８０）
ノニオン界面活性剤（Ａ２−３）：ソルビタンＥＯ２０モル付加物のモノラウリン酸エステル、ＨＬＢ＝１６．７（Ｔｗｅｅｎ２０）
ノニオン界面活性剤（Ａ３−１）：ポリアルキレングリコール（ＥＯ３０モルＰＯ１５のオレイン酸エステル化物、ＨＬＢ＝７．０
ノニオン界面活性剤（Ａ６−１）：４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェニル−ポリエチレングリコール、ＨＬＢ＝１３．５（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）
ノニオン界面活性剤（Ａ６−２）：オクチルフェニル−ポリエチレングリコール、ＨＬＢ＝１３．０（ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０）
【００６７】
実施例１〜３０及び比較例１〜３で得た培養上清について、培養液の濁度、有用物質の分泌生産量及び分泌効率等の評価を下記に記載の通り行った。結果を表１〜３に記載する。
【００６８】
＜培養液の濁度の測定方法＞
サンプリングで回収した微生物を含む培養液を用いて、濁度計［（株）島津製作所社製、ＵＶ−１７００］を用いて、光路長１ｃｍの石英セルを用いて濁度の測定を行った。
培養液は、１５００ｒｐｍ、５分、４℃で遠心し、上清を破棄した。沈澱をサンプル液量と同量の生理食塩水で再懸濁し、適切な吸光度（０．１〜０．８）になるように生理食塩水で希釈して６００ｎｍの吸光度を測定した。培養液の濁度は下記数式（１）によって算出した。
培養液の濁度（ＯＤ）＝（希釈した培養液の６００ｎｍの吸光度）×培養液の希釈倍率  （数式１）
【００６９】
＜有用物質の分泌生産量の評価：分泌生産した有用物質のルシフェラーゼ活性測定＞
実施例１〜２０及び比較例１〜２で得た各培養上清を０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ７．４）で１０〜１０００倍希釈したもの２０μｌに、下記のルシフェリン溶液６０μｌ添加した混合液を試料として、ルミノメーターを用いて以下の条件で測定した発光強度を、下記式に当てはめて得られた値を分泌生産した有用物質のルシフェラーゼ活性とした。
ルミノメーター：プロメガ株式会社製の「Ｇｌｏｍａｘ  Ｎａｖｉｇａｔｏｒ」
ルシフェリン溶液：ニュー・イングランド・バイオラボ・ジャパン株式会社製品測定温度：２５℃
検出装置：発光検出器
検出波長：３５０〜７００ｎｍ
〔分泌生産した有用物質のルシフェラーゼ活性〕＝〔発光強度〕×希釈倍率／〔培養終了時の濁度〕
なお、表１〜２中、ルシフェラーゼ活性は、比較例１又は２を１とした場合の相対値で表した。
分泌生産した有用物質のルシフェラーゼ活性が高い程、有用物質の分泌生産量が多いことを示す。
【００７０】
＜菌体表面に残った有用物質のルシフェラーゼ活性測定＞
実施例１〜２０及び比較例１〜２で得た菌体に、除去した上清と同量の０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ７．４）２００μｌを加え、遠心することで菌体を洗浄した。洗浄した菌体に、洗浄した上清と同量の０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ７．４）２００μｌで再懸濁し、０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ７．４）で１０〜１０００倍希釈したものを菌体表面のルシフェラーゼ活性測定用サンプルとした。
この菌体表面のルシフェラーゼ活性測定用サンプル２０μｌに上記のルシフェリン溶液６０μｌ添加した混合液を試料として、「分泌生産した有用物質のルシフェラーゼ活性測定」と同様の条件で発光強度を測定し、測定した発光強度を、下記式に当てはめて得られた値を菌体表面に残った有用物質のルシフェラーゼ活性とした。
〔菌体表面に残った有用物質のルシフェラーゼ活性〕＝〔発光値〕×希釈倍率／〔培養終了時の濁度〕
なお、表１〜２中、ルシフェラーゼ活性は、比較例１又は２を１とした場合の相対値で表した。
【００７１】
＜分泌効率の評価＞
実施例１〜２０及び比較例１〜２で得た各培養上清と菌体を用いて、各実施例における分泌効率を下記式により算出した。
分泌効率（％）＝１００×「分泌生産した有用物質のルシフェラーゼ活性」／「ルシフェラーゼ活性合計」
なお、ルシフェラーゼ活性合計は、「分泌生産した有用物質のルシフェラーゼ活性」＋「菌体表面に残った有用物質のルシフェラーゼ活性」を意味する。
【００７２】
＜タンパク質量の測定：酸性ホスファターゼ活性測定＞
実施例２１〜３０及び比較例３で得た各培養上清に１／４０量の２Ｍ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）５μｌを添加した。緩衝液を添加した培養上清又は実施例２１〜３０で得た各菌体表面測定サンプルに基質溶液（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ０．６４ｍｇ／ｍｌ含有  ５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４．０）を容量比＝１：１で混合し、３５℃で１０分間反応した。
反応後、反応液と等量の１０％トリクロロ酢酸溶液を添加し反応停止をした。反応停止をした溶液に、炭酸ナトリム飽和溶液を反応液全体と等量加え、発色させた。発色させた液は、１５００ｇ、５分で不溶画分を除去し、（Ｂｉｏｔｅｋ社製マイクロプレートリーダーＰｏｗｅｒＷａｖｅ）を用いて４２０ｎｍの吸光度を測定した。参照波長には６３０ｎｍを測定した。
培養上清、菌体表面測定サンプルそれぞれについて、下記の式より算出した値を酸性ホスファターゼ活性とした。得られた培養上清の酸性ホスファターゼ活性の結果において、比較例３の値を１とした場合の相対値を「分泌生産した有用物質の酸性ホスファターゼ活性」とし、菌体表面測定サンプルの酸性ホスファターゼ活性の結果において、比較例３の値を１とした場合の相対値を「菌体表面に残った有用物質の酸性ホスファターゼ活性」として表３に記載した。
酸性ホスファターゼ活性＝｛（Ａｂｓ４２０ｎｍ）−（Ａｂｓ６３０ｎｍ）｝／（培養終了時の濁度）
【００７３】
＜分泌効率の評価＞
実施例２１〜３０及び比較例３で得た「分泌生産した有用物質の酸性ホスファターゼ活性」及び「菌体表面に残った有用物質の酸性ホスファターゼ活性」の値を用いて、下記数式より分泌効率を算出した。結果を表３に示す。
分泌効率（％）＝１００×「分泌生産した有用物質の酸性ホスファターゼ活性」／「酸性ホスファターゼ活性合計」
なお、酸性ホスファターゼ活性合計は、「分泌生産した有用物質の酸性ホスファターゼ活性」＋「菌体表面に残った有用物質の酸性ホスファターゼ活性」を意味する。
【００７４】
表１〜３から、培養液中にノニオン界面活性剤（Ａ）を含有することで、分泌生産した有用物質のルシフェラーゼ活性又は酸性ホスファターゼ活性が高くなっており、有用物質の微生物外への分泌効率が上昇していることがわかる。
また、実施例１〜３０では、ノニオン界面活性剤（Ａ）を用いることにより、比較例１〜３と比較して、濁度が同等以上であることから、菌の増殖性が高くなっていることがわかる。また、ルシフェラーゼ活性合計又は酸性ホスファターゼ活性合計が同等以上であることから、微生物菌当たりの有用物質の生産量が同等以上であり、得られた有用物質が変性しにくいことがわかる。
したがって、本発明の有用物質の生産方法を用いることにより、有用物質を大量に得ることができることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本発明の有用物質の生産方法は、タンパク質などの有用物質を酵母で生産する際に使用できる。タンパク質としては酵素、ホルモンタンパク質、抗体及びペプチド等が挙げられる。生産されるタンパク質が、酵素（プロテアーゼ、セルラーゼ、リパーゼ及びアミラーゼ等）の場合には、食品加工用、洗浄剤用、繊維処理用、製紙用途及び酵素変換用途などとして好適に使用でき、特にバイオ医薬品の製造に用いる上で有用である。