(57)【要約】      （修正有）【課題】ＩＬ−６の発現を亢進し、高い免疫誘導効果を有する、剤の提供。【解決手段】ＣｐＧモチーフを有するＣｐＧ−オリゴＤＮＡと、特定の配列に示される配列と相同性が９０％以上の塩基配列を有する免疫相乗オリゴＤＮＡと、を組み合わせてなる、ＩＬ−６発現促進剤。【効果】炎症性サイトカインであるＩＬ−６を高発現させる促進剤、及び当該促進剤を含む免疫誘導剤を提供することが可能になる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣｐＧモチーフを有するＣｐＧ−オリゴＤＮＡと、配列番号１に示される配列と相同性が９０％以上の塩基配列を有する免疫相乗オリゴＤＮＡと、を組み合わせてなることを特徴とする、ＩＬ−６発現促進剤。
【請求項２】
前記免疫相乗オリゴＤＮＡは、配列番号２に示される配列に対して９０％以上の相同性を有する塩基配列を含むオリゴＤＮＡであることを特徴とする、請求項１記載の剤。
【請求項３】
前記免疫相乗オリゴＤＮＡは、配列番号３７に示される配列に対して９０％以上の相同性を有する塩基配列を含むオリゴＤＮＡであることを特徴とする、請求項１または２記載の剤。
【請求項４】
前記ＣｐＧ−オリゴＤＮＡは、Ｂ型のＣｐＧ−オリゴＤＮＡであることを特徴とする、請求項１−３のいずれか１項記載の剤。
【請求項５】
請求項１−４のいずれか１項記載の剤を含むことを特徴とする免疫誘導剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はオリゴＤＡＮを用いたＩＬ−６発現促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌ＤＮＡは脊椎動物の免疫システムによって認識される病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）の一つであり、自然免疫システムを誘導しつつ、獲得免疫システムを制御することが知られている（例えば特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１７−０３６２９０号
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｓｈｉｍｏｓａｔｏ  Ｔ，  Ｆｕｊｉｍｏｔｏ  Ｍ，  Ｔｏｈｎｅ  Ｍ，  Ｓａｔｏ  Ｔ，  Ｔａｔｅｏ  Ｍ，  Ｏｔａｎｉ  Ｈ，  Ｋｉｔａｚａｗａ  Ｈ．  ＣｐＧ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｉｎｄｕｃｅ  ｓｔｒｏｎｇ  ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ３３  ｖｉａ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ９．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２０１０；３９４：８１−８６．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
非メチル化ＣｐＧ−オリゴＤＮＡも、ＰＡＭＰの一つと考えられる。これまで非メチル化ＣｐＧ−オリゴＤＮＡは、単体もしくは他の菌生成物との組み合わせでＩＬ−６、ＩＬ−１２、インターフェロン（ＩＦＮ）−γ、そして免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｍの放出を誘発することが報告されている。
【０００６】
生体内において（in vivo）、ＩＬ−６の過剰産生は、多種多様な臨床的な症状や異常を引き起こすことが実験モデルにおいて示されている。この結果は様々な炎症性の病気、例えば関節リウマチ（ＲＡ）や、全身型若年性特発性関節炎（ｓｏＪＩＡ）を持つ患者にみられる兆候を説明できる可能性がある。
【０００７】
非メチル化ＣｐＧ−オリゴＤＮＡをはじめとした細菌ＤＮＡのＩＬ−６誘導能力は、免疫が関係する様々な症状の説明や治療に役立つことが示唆されており、より免疫誘導効果の高い物質が求められていた。
【０００８】
上記課題を解決するため、発明者らは非メチル化ＣｐＧ−オリゴＤＮＡと、所定のオリゴＤＮＡとを組み合わせて投与することにより、対象のＩＬ−６発現が亢進することを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は、ＩＬ−６の発現を亢進し、高い免疫誘導効果を有する、ＩＬ−６発現促進剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の一態様は、ＣｐＧモチーフを有するＣｐＧ−オリゴＤＮＡと、配列番号１に示される配列と相同性が９０％以上の塩基配列を有する免疫相乗オリゴＤＮＡとを組み合わせてなることを特徴とする、ＩＬ−６発現促進剤である。
また、本発明の別の態様は、前記免疫相乗オリゴＤＮＡが、配列番号２に示される配列に対して９０％以上の相同性を有する塩基配列を含むオリゴＤＮＡであることを特徴とする、請求項１記載の剤である。
また、本発明の別の態様は、前記免疫相乗オリゴＤＮＡが、配列番号３７に示される配列に対して９０％以上の相同性を有する塩基配列を含むオリゴＤＮＡであることを特徴とする、請求項１または２記載の剤である。
また、本発明の別の態様は、前記ＣｐＧ−オリゴＤＮＡが、Ｂ型のＣｐＧ−オリゴＤＮＡであることを特徴とする、請求項１−３のいずれか１項記載の剤である。
また、本発明の別の態様は、請求項１−４のいずれか１項記載の剤を含むことを特徴とする免疫誘導剤である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、炎症性サイトカインであるＩＬ−６を高発現させる剤を提供することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】オリゴＤＮＡの相乗効果の測定結果のグラフである。
【図２】ｉＳＮ３４を加えた後ＩＬ−６の分泌のグラフである。
【図３】ｉＳＮ３４＋ＣｐＧ導入後の、ＩＬ−６陽性細胞の増殖傾向を示すグラフである。
【図４】ｉＳＮ３４＋ＣｐＧの腹腔内注射の効果を示すグラフである。
【図Ｓ１】本発明の一形態で用いたオリゴＤＮＡの塩基配列とＩＬ−６ｍＲＮＡ出現の相対比率を示すグラフである。
【図Ｓ２】本発明の実施例におけるマウス体重の増加を示すグラフである。
【図Ｓ３】本発明の実施例におけるマウス脾臓の写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の一態様に係る実施の形態（以下、本実施形態）について説明する。
【００１３】
本発明は、炎症性サイトカインであるＩＬ−６の発現を亢進させるＣｐＧ−オリゴＤＮＡを、所定の配列を有する免疫相乗オリゴＤＮＡと組み合わせて使用することで、そのＩＬ−６発現誘導効果を相乗的に増加させるものである。相乗的に増加させる、とは、組み合わせて使用する以前のオリゴＤＮＡをそれぞれ単体で使用した場合に対して、より大きな効果を生じさせることをいう。
【００１４】
本明細書において、オリゴＤＮＡは、およそ２０塩基対かそれ以下の長さの短いヌクレオチドの配列をいう。また、ヌクレオチドとは、ヌクレオシドにリン酸基が結合した物質であって、ＤＮＡ、ＲＮＡの構成単位をいう。
【００１５】
本発明に使用するＣｐＧ−オリゴＤＮＡは、その配列中にＣｐＧモチーフを有している。ＣｐＧモチーフとは、シトシンとグアニンがホスホジエステル結合でつながった配列をいい、特にメチル化されていない場合に、ＴＬＲ９を強く刺激することが知られている。ＴＬＲ９はＩＬ−６の発現に関係することが広く知られた受容体である。
【００１６】
本発明に使用するＣｐＧ−オリゴＤＮＡは、ホスホジエステル結合を有する天然型、またはリン酸基の一部または全部がＳ化されたホスホロチオエート型（化学修飾体）のいずれも好適に適用できる。
【００１７】
本発明に使用するＣｐＧ−オリゴＤＮＡは、末端にポリＧ配列を有するＡ型、同配列を有さないＢ型のいずれであっても好適に適用することが可能であるが、Ｂ型であると、より望ましい。
【００１８】
本発明に使用する免疫相乗オリゴＤＮＡは、配列表の配列番号１に示される塩基配列と９０％以上の同一性を有することを特徴とする。本明細書においては、免疫相乗オリゴＤＮＡのそれぞれの配列を便宜上ｉＳＮと番号と組み合わせて呼称する。免疫相乗オリゴＤＮＡは、ＣｐＧ−オリゴＤＮＡを組み合わせて使用する際に、両末端にさらに１または２以上の塩基が結合されていても良く、Ｎ末端、Ｃ末端の両側に、次の塩基配列が結合されていると特に望ましい。当該塩基が結合した塩基配列を配列番号２に示す。
【００１９】
5’-cct-3’
【００２０】
本発明に使用する免疫相乗オリゴＤＮＡの濃度は、これと組み合わせて使用するＣｐＧ−オリゴＤＮＡの濃度を大きく超えない範囲の濃度であれば、特に制限なく適用することが可能である。ただし、ＣｐＧ−オリゴＤＮＡの濃度が３．０μＭであるときに、免疫相乗オリゴＤＮＡの濃度は、０．１６μＭ−２．５μＭであると特に好適である。
【００２１】
本発明において、ＣｐＧ−オリゴＤＮＡと、免疫相乗オリゴＤＮＡの組み合わせるタイミング、具体的には投与するタイミングについては、同時であっても良いが、必ずしもこれに限定する必要はなく、免疫相乗オリゴＤＮＡの投与後に、ＣｐＧ−オリゴＤＮＡを投与しても良い。ただし、ＣｐＧ−オリゴＤＮＡの投与を免疫相乗オリゴＤＮＡの投与より先に行った場合には、得られる効果は前者ほど大きくない。
【実施例】
【００２２】
実験に使う動物は、無菌Ｃ５７ＢＬ／６雌マウス（４週齢）（日本ＳＬＣ社より購入）を、適度に温度・照度制御された条件下で飼育した。これらのマウスにはラボＭＲブリーダー（日本農産（株））が与えられた。
【００２３】
オリゴＤＮＡを、インテグレーテッドＤＮＡテクノロジーズ（株）にて合成した。各オリゴＤＮＡは使用する前に無エンドトキシンフリーの超純水で溶解し、水中で再構成し、０．２２μｍ孔のマイクロフィルター（日本ミリポア（株））を通してろ過滅菌した。
【００２４】
マウス脾細胞を、同モル量のＣｐＧ−オリゴＤＮＡ１５５５、コントロール（control）オリゴＤＮＡ１６１２、ＣｐＧ−オリゴＤＮＡ１５８５、ＭｓＳＴ、ＣｐＧ−オリゴＤＮＡ２３９５、本実施例に係るＣｐＧ−オリゴＤＮＡ（ｉＳＮ３４）（表１）を用いて処理した。
【００２５】
【表１】
2018143185.tif 000002
【００２６】
脾細胞は標準的な方法で準備した。４ウェルプレート（ＮａｌｇｅＮｕｎｃＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（株））を用い、３連もしくは４連で２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で培養した。その際、ウシ胎仔血清（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）１０％、ペニシリン１００Ｕ／ｍＬ、スプレプトマイシン１００ｍｇ／ｍＬ、ＨＥＰＥＳを２５  ｍＭ、ピルビン酸ナトリウム１．０ｍＭ、可欠アミノ酸、および２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）０．００３５％を補充したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を１ｍＬ／ｗｅｌｌの量だけ添加した。
【００２７】
遺伝子発現の解析のため、全ＲＮＡをオリゴＤＮＡ刺激性マウス脾細胞から回収し、ＲＮａｓｅ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ  ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．,ドイツ）を用いて１５分間常温で処理した。ここでヌクレアーゼは１５分間７０℃で混合培養することで加熱不活性となった。次にｃＤＮＡをサンプルあたり１マイクログラムの全ＲＮＡから逆転写によって生成した。このとき、Ｐｒｉｍｅ Ｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＴ試薬キット（タカラバイオ（株））を用いた。
【００２８】
サイトカインｃＤＮＡの定量化のために、Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ（登録商標）リアルタイムシステム（タカラバイオ社製）を用いた。ｑＰＣＲ解析はＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製）を使用し、遺伝子特異的なプライマーを利用した。β−ａｃｔｉｎとＩＬ−６遺伝子特異的プライマーはタカラバイオから購入した。
【００２９】
データは、類似の結果が得られた３つの独立した実験のうち代表的な一つの実験の平均および標準偏差（ＳＤ）で表した。
【００３０】
脾細胞は標準的な方法で準備した。これらの細胞は２４ウェルプレート（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（株））中、１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で培養した。その際、ウシ胎仔血清（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）１０％、ペニシリン１００Ｕ／ｍＬ、スプレプトマイシン１００ｍｇ／ｍＬ、ＨＥＰＥＳを２５ｍＭ、ピルビン酸ナトリウム１．０ｍＭ、非必須アミノ酸、および２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）０．００３５％を補充したＲＰＭＩ１６４０培地を１ｍＬ／ｗｅｌｌの量だけ添加した。
【００３１】
細胞は３μＭのｉＳＮ３４の存在下で、５％のＣＯ２環境化において３７°Ｃで２４時間インキュベートされた。その後細胞を６時間ＣｐＧ−Ｂ（１５５５）を３μＭ補充した新鮮培地中で再懸濁し、上記のｑＰＣＲによりサイトカインの発現を検出した。データは、類似の結果が得られた３つの独立した実験のうち代表的な一つの実験の平均および標準偏差（ＳＤ）で表した。
【００３２】
４８時間にわたる様々な処理の後、ＥＬＩＳＡキット（Ｍｏｕｓｅ  ＩＬ−６  ＤｕｏＳｅｔ（登録商標）ＥＬＩＳＡ，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，米国、カナダ）を用い、当該メーカーの指示に従って、細胞培養上清におけるＩＬ−６レベルを定量化した。
【００３３】
さらに、脾細胞（２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）はｉＳＮ３４を０．６２５μＭもしくは同量の水を加えて培地中で予め３時間インキュベートされた。その後、細胞をオリゴＤＮＡ除去のため培地とともに洗浄し、ＣｐＧ−Ｂ（１５５５）を３．０μＭ含む培地中で１２時間再懸濁した。この刺激の後、細胞を、ウシ胎仔血清１０％、ペニシリン１００Ｕ／ｍＬ、スプレプトマイシン１００ｍｇ／ｍＬ、ブレフェルジンＡを１０μｇ／ｍＬ、イオノマイシンを２μｇ／ｍＬ、さらにホルボール１２−ミリスタート１３−アセテートを２０ｎｇ／ｍＬを補充したＲＰＭＩ１６４０培地中において、３７℃で４時間培養した。
【００３４】
細胞内染色にあたり、４％のＰＦＡの中、室温で１５分間細胞を固定し、洗浄し、その後１５分間のインキュベーションにより透過処理を行った。その後、フィコエリスリン標識抗マウスＩＬ−６抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）を加えてさらにインキュベーションを行った。
【００３５】
脾細胞を、抗マウスＩＬ−６抗体を用いて６０分間氷上で染色処理した。細胞を洗浄し、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ  （ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いてＣＤ１９陽性かつＩＬ−６陽性細胞を特定した。データはＦｌｏｗ  Ｊｏソフトを用いて解析した。全ての解析は少なくとも３回行い、代表的な結果を表示した。
【００３６】
本実施例では、先述のように得られ飼育された４週齢のＣ５７ＢＬ／６雌マウスを用いた。２週間の準備期間の後、複数マウス（６週齢）にそれぞれＰＢＳ＋ＰＢＳ、ＰＢＳ＋ＣｐＧ−Ｂ（ＭｓＳＴ）、ｉＳＮ３４（２０μｇ／２０μＬ）＋ＰＢＳ、ｉＳＮ３４（２０μｇ／２０μＬ）＋ＣｐＧ−Ｂ（ＭｓＳＴ）のいずれかを２００μｇ、２週間に１回ずつ、全３回にわたり腹腔内注射した。
【００３７】
本実施例では、ＭｓＳＴをＣｐＧ−オリゴＤＮＡとして用いた。ＭｓＳＴはサーモフィルス菌（Streptococcus thermophilus）ＡＴＣＣ１９２５８のｌａｃＺ遺伝子から抽出された強力な免疫賦活ＣｐＧ−オリゴＤＮＡであり、炎症性サイトカイン産生と細胞増殖を誘導するＣｐＧ−オリゴＤＮＡ（１５５５）に似た能力を有する。
【００３８】
複数マウスは最終の腹腔内注射の後１１週間後に安楽死させ解剖に処された。この処置の際、体重、脾臓重量、脾臓長を測定し、さらなる分析のために血液を採取した。
【００３９】
全ての統計分析は統計ソフトパッケージ（Ｐｒｉｓｍ７，ＧｒａｐｈＰａｄ，Ｉｎｃ．，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，米国）を使って実施した。体重傾向以外の全ての実験における違いの顕著性を決定するため、テューキークレーマー検定と共にTwo-tailed One-way ANOVAが用いられた。
【００４０】
体重の増変は処置と時間効果を比較しながら双方向分散分析によって解析を行った。相違はＰ＜０．０５において顕著であると考えられる。生体内（in vivo）実験（脾臓重量と脾臓長）の値は箱髭図を用いて表示してある。他の生体内の値は平均および分散値で表示される。
【００４１】
（ＬＧＧオリゴＤＮＡの免疫相乗活性と免疫細胞によるＩＬ−６ｍＲＮＡの発現）
本実施例において、ＬＧＧ−ＤＮＡ配列に基づいて設計されたオリゴＤＮＡの相乗効果について実験・評価した。まず事前スクリーニングで相乗効果陽性を示した脾臓細胞の候補を対象とし、ＩＬ−６ｍＲＮＡの出現による相乗活性の確認を行った（図Ｓ１）。また、サイトカインの出現と分泌におけるｉＳＮ３４の効果を決定するため、ｉＳＮ３４＋ＣｐＧ-オリゴＤＮＡの組合せに晒されたマウス脾細胞におけるＩＬ−６転写を評価した。この試験に用いるｉＳＮ３４の最適濃度を決定するため、発明者らは、濃度が０．０１から１０μＭの範囲のｉＳＮ３４の存在下で、ＩＬ−６ｍＲＮＡの発現量を調べた。
【００４２】
図１Ａに示されるように、ｉＳＮ３４（ＣｐＧ―オリゴＤＮＡ存在下で）は濃度０．１６〜２．５μＭにおいてＩＬ−６発現の用量依存的な刺激を示した。次に、ＣｐＧ−Ａ（１５８５）、ＣｐＧ−Ｂ（１５５５）、ＣｐＧ−Ｃ（２３９５）、コントロール（１６１２）オリゴＤＮＡとそれぞれ組み合わせたときのｉＳＮ３４の活性を比較した。図１Ｂに示されるように、ｉＳＮ３４は、Ａ型またはＢ型のＣｐＧ―オリゴＤＮＡと組み合わせたときのＩＬ−６ｍＲＮＡ発現において相乗効果を示した。これらの結果はｉＳＮ３４とＣｐＧ−Ｂ（１５５５）との組み合わせにおいて相乗効果が最も強く出ることを示唆している。
【００４３】
さらにｉＳＮ３４の活性を調べるため、本実施例では洗浄試験（wash-out assay）におけるマウス脾細胞に及ぼす分子の効果を調べた。培養物を３．０μＭのｉＳＮ３４と３．０μＭのＣｐＧ−Ｂまたはコントロール（水）に２４時間晒し、その後ｉＳＮ３４を除去し、その後の免疫相乗活性を観察した。興味深いことに、図１Ｃに示されるように培養物からｉＳＮ３４が除去された後も脾細胞において免疫相乗活性が維持された。すなわち、ＩＬ−６ｍＲＮＡレベルはオリゴＤＮＡを洗浄（wash-out）した後も実質変わらなかった。これは、ＣｐＧ−オリゴＤＮＡと免疫相乗オリゴＤＮＡとの投与が必ずしも同時である必要がないことを示している。
【００４４】
（低濃度ｉＳＮ３４に晒されたことによるＩＬ−６の産生の誘導）
次に、異なる濃度のｉＳＮ３４（０．０１〜１０μＭ）＋ＣｐＧ−オリゴＤＮＡ混合体が存在する中で４８時間育成したマウス脾細胞を用いてＩＬ−６の分泌量を調べた。本実験では、ＩＬ−６レベルを、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて検出した。
【００４５】
結果によると、ｉＳＮ３４を加えた後ＩＬ−６の分泌は、ｉＳＮ３４が０．６３μＭ存在するときにピークが検出され、用量依存的に定量化できることが示される（図２）。この結果は、低濃度のｉＳＮ３４はＩＬ−６の産生を誘発することを示唆する。
【００４６】
（マウス脾細胞におけるＩＬ−６陽性細胞の発現の拡大）
免疫相乗オリゴＤＮＡによるＣｐＧ誘発免疫反応の刺激の後のＩＬ−６マウス脾細胞の素性を分類するためにフローサイトメトリーを使用した。ｉＳＮ３４＋ＣｐＧの導入の後、ＣＤ１９陽性（CD19+）かつＩＬ−６陽性（IL-6+）細胞が増殖することを見出した（図３Ａ）。同図に示されるように、ＣＤ１９陽性細胞の割合はｉＳＮ３４＋ＣｐＧで処理された細胞において顕著に増加する。つまり、この刺激により全細胞中3割近くがＣＤ１９陽性かつＩＬ−６陽性細胞に変わった（図３Ｂ）。このように、ｉＳＮ３４＋ＣｐＧの相乗効果はＣＤ１９陽性Ｂリンパ球におけるＩＬ−６発現増加を引き起こすことがわかった。
【００４７】
（ｉＳＮ３４＋ＣｐＧの腹腔内注射の効果）
次に、生体内（in vivo）でのｉＳＮ３４＋ＣｐＧの相乗効果の分析をさらに進めた（図４Ａ）。全てのマウス群（ｎ＝４／グループ；それぞれＰＢＳ＋ＰＢＳ、ＰＢＳ＋ＣｐＧ−Ｂ、ｉＳＮ３４＋ＰＢＳ、ｉＳＮ３４＋ＣｐＧ−Ｂのいずれかを腹腔内注射した）は研究期間中ずっと顕著な体重増加を示した。また、終末期の体重については４グループ間で顕著な差はなかった（図Ｓ２）。
【００４８】
しかしｉＳＮ３４＋ＣｐＧ−Ｂで処理されたマウスの脾臓は他のグループと比べて肥大が目立った。また、これらの効果は脾臓の重量、長さのいずれを評価しても顕著であった（図Ｓ３）。これらの発見はｉＳＮ３４とＣｐＧ−Ｂの組み合わせが免疫反応を活性化すること示している。
【００４９】
以上、本実施例によれば、免疫相乗オリゴＤＮＡであるｉＳＮ３４がＣｐＧ−オリゴＤＮＡと組み合わさったときに相乗的に免疫効果を示すことが明らかになった。特に、培養脾細胞のin vitroでの曝露の後、ＩＬ−６ｍＲＮＡが蓄積し、ＩＬ−６タンパクが分泌され、そしてＩＬ−６陽性細胞が産生されるレベルにおける、ｉＳＮ３４＋ＣｐＧの相乗活性が実証された。
【００５０】
本実施例においてテストされたオリゴＤＮＡの中では、ｉＳＮ３４が、続いてｉＳＮ３５が最も顕著にこれらの効果を示した。これらのオリゴＤＮＡは共通して塩基配列５’−ＴＣＣＴＡＡＧＣＴＴＧＡＧＧＣＣＴ−３’を有する。また、前二者に及ばないものの、効果が得られたオリゴＤＮＡは、５’−ＡＡＧＣＴＴＧＡＧＧ−３’を有している。さらにこれらの効果はＣｐＧ―オリゴＤＮＡとの組み合わせにおいてのみ観察された。ＣｐＧ―オリゴＤＮＡは樹状細胞とマクロファージを非常に強力に刺激し、その結果  ＩＬ−６やＩＬ−１２といったＴｈ−１を伴うサイトカインの誘導を引き起こす。現在の研究では、オリゴＤＮＡであるｉＳＮ３４は（ＣｐＧとの組み合わせで）ＩＬ−６の産生を刺激する。このことは、ｉＳＮ３４が、Ｔｈ−１が媒介するワクチンに対する高効率なアジュバントとなり得ることを示唆する。
【００５１】
他の研究によれば、ＩＬ−６は、Ｂ細胞を増殖させ、形質細胞を残存させ、さらに抗体を産生する強力な刺激として振る舞うことが示されている。本実施例におけるｉＳＮ３４＋ＣｐＧは、ＲＡ、炎症性腸炎、多発性硬化症、全身型の若年性慢性関節炎（ＪＣＡ）、乾癬、などの炎症性疾患が関係する病気の予防と治療に役立つ可能性が示唆される。
【００５２】
本実施例において、ｉＳＮ３４はＣｐＧ−ＡおよびＣｐＧ−Ｂと組み合わせたときにより大きな相乗効果を示すことが示された。この結果は他グループが報告したもの（図１Ｂ）と矛盾しない。また、ｉＳＮ３４は、ＣｐＧ−Ｂとの組み合わせることで特に高い相乗効果を示した。これらの結果はＣｐＧ−ＢはｉＳＮ３４と共に用いる最適な相乗効果誘導因子であることを示している。また、本実施例において、ｉＳＮ３４＋ＣｐＧをともに投与すると洗浄試験でも効果があることが示された。特にｉＳＮ３４で処理された脾細胞は、そのｉＳＮ３４が洗い流された後においても、免疫反応を刺激する能力を保持することが実証された。本実施例により、ＩＬ−６タンパク分泌を測定する（酵素免疫測定法による）ことによりｉＳＮ３４＋ＣｐＧの免疫相乗効果を調べた結果、ｉＳＮ３４が０．６２５μＭのときに相乗有効性のピークが発生することが実証された。
【００５３】
ＣＤ１９はＩＦＮ、ＩＬ−４、ＩＬ−６を含むさまざまなサイトカインから陽性の刺激を受けることができるＢ細胞バイオマーカーの一つであり、増殖、分化、サイトカイン産生、そして他のエフェクター機能を起こさせる。さらに、Ｂ細胞は、ＣｐＧ−オリゴＤＮＡへの反応性と関連してＴＬＲ９に対しｍＲＮＡを発現することが示されている。このとき、ＣｐＧとｉＳＮ３４から得られたＢ細胞はコントロールと比較して顕著なＣＤ１９を誘導することが示された。  
【００５４】
細胞の特定の下位個体群がｉＳＮ３４によって選択的に活性化されたのかどうか明らかにするために、発明者らは、さらにフローサイトメトリーを用いてＩＬ−６産生脾細胞を特徴づけた。このフローサイトメトリー分析により、脾細胞中のＣＤ１９陽性Ｂ細胞から分泌されるＩＬ−６の比率は、マウスをｉＳＮ３４＋ＣｐＧ混合オリゴＤＮＡで処理している間に、コントロールと比較してほぼ２倍以上に増えることが明らかになった（図３Ｃ）。これらの発見は自己免疫と炎症の研究と高い関連性があることを示している。
【００５５】
さらに、マウス生体内でのｉＳＮ３４＋ＣｐＧ混合オリゴＤＮＡの投与は、脾臓の重量と長さの増加を生じさせることが明らかになった。なお、他のコントロールと比較して、この処理による体重の顕著な変化は生じなかった。このことはｉＳＮ３４がおおむね毒性と係わりないことを示唆している（毒性があれば体重減少や増加率の低減で示される）。しかし、ｉＳＮ３４＋ＭｓＳＴの腹腔内注射で感作されることによりマウスに脾臓肥大が見られた。ＭｓＳＴは、先天性免疫反応を誘導し、脾腫を誘発することが報告されている（非特許文献１）。
【００５６】
なお、ｉＳＮ３４がＩＬ−６以外の炎症性サイトカインの顕著な相乗的誘導を示すことは全く知られていない。この事実から、ｉＳＮ３４を併用した療法は粘膜免疫の有益な効果を顕著に補完し、さらに強めるであろうことがわかる。
【００５７】
以上、本実施例によれば、ｉＳＮ３４はＣｐＧ−オリゴＤＮＡとの組み合わせにおいてＩＬ−６の誘導に相乗的に振る舞うことが確認された。このＩＬ−６は、もともとはＴ細胞由来因子として識別され、その後、免疫反応、炎症、および造血を含む生物学的活性を伴った活性Ｂ細胞の抗体産生細胞への分化を誘導することが示された。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本開示の炎症誘導剤は、消炎剤開発のための一時的な炎症促進手段に利用可能であり、例えば炎症を有すモデルマウスを短時間で生成することができる。さらに医薬品としても、全身性の炎症性疾患の新しい治療薬として応用できる可能性がある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図Ｓ１】
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【図Ｓ２】
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【図Ｓ３】
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【配列表】
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