(57)【要約】【課題】ＳＩＲＰＡ発現に基づく多能性幹細胞に由来する心筋細胞前駆細胞および心筋細胞を濃縮するための方法を提供すること。【解決手段】本発明は、多能性幹細胞に由来する心筋細胞前駆細胞および心筋細胞をＳＩＲＰＡの発現に基づいて濃縮するための方法に関する。一実施形態において、細胞の集団を心筋細胞および心筋細胞前駆細胞について濃縮する方法が提供され、この方法は：（ａ）心筋細胞および心筋細胞前駆細胞が単離される予定の該細胞の集団を提供する工程；ならびに（ｂ）該集団からＳＩＲＰＡを発現している細胞を単離する工程；を包含し、ここで、該細胞の集団は、心筋細胞および心筋細胞前駆細胞に分化するように誘導されたヒト多能性幹細胞の集団を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
シグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰＡ）＋心筋細胞、ＳＩＲＰＡ＋心筋細胞前駆細胞またはその両方の、候補薬物に対するインビトロでの反応に基づいて該候補薬物の毒性学を予測するためのキットであって、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）またはヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）に由来する、ＳＩＲＰＡ＋心筋細胞、ＳＩＲＰＡ＋心筋細胞前駆細胞またはその両方の濃縮された集団を含む、キット。
【請求項２】
前記ＳＩＲＰＡ＋心筋細胞、ＳＩＲＰＡ＋心筋細胞前駆細胞またはその両方が、
−前記細胞の集団を、ＳＩＲＰＡ＋心筋細胞前駆細胞およびＳＩＲＰＡ＋心筋細胞の表面に発現されるＳＩＲＰＡに特異的に結合するシグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰＡ）特異的リガンドと接触させ；
−ＳＩＲＰＡ＋心筋細胞前駆細胞もしくはＳＩＲＰＡ＋心筋細胞、またはその両方に対する該ＳＩＲＰＡリガンドの結合に基づいて、該細胞集団を選別し；そして
−該選別された細胞集団から、ＳＩＲＰＡ＋心筋細胞前駆細胞もしくはＳＩＲＰＡ＋心筋細胞、またはその両方を選択する
方法によって濃縮される、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
前記方法が、前記選別された細胞集団から、ＳＩＲＰＡ＋心筋細胞前駆細胞もしくはＳＩＲＰＡ＋心筋細胞、またはその両方を選択する前に、以下の細胞表面マーカー：ＣＤ９０、ＣＤ３１、ＣＤ１４０ＢおよびＣＤ４９Ａのうち少なくとも１つを発現する細胞を枯渇させることをさらに含む、請求項２に記載のキット。
【請求項４】
ＣＤ９０、ＣＤ３１、ＣＤ１４０ＢおよびＣＤ４９Ａのうち少なくとも１つを発現する前記細胞が、対応する抗体を用いて枯渇される、請求項３に記載のキット。
【請求項５】
前記ＳＩＲＰＡ特異的リガンドが、抗ＳＩＲＰＡ抗体、抗ＳＩＲＰＡ抗体フラグメント、および、抗ＳＩＲＰＡ抗体様分子からなる群より選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項６】
前記心筋細胞前駆細胞もしくは心筋細胞、またはその両方が、蛍光励起細胞分取、抗体でコーティングされた磁気ビーズを用いた磁気分離、アフィニティークロマトグラフィー、および物理的特性の差異の利用からなる群より選択される少なくとも１つの方法を用いて選別される、請求項１〜５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項７】
前記ＳＩＲＰＡ＋細胞の濃縮された集団が、ＳＩＲＰＡ遺伝子座の制御性調節エレメントに作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含むことによって、該レポーター遺伝子が、ＳＩＲＰＡを発現する細胞において発現され、そして、該ＳＩＲＰＡを発現する細胞を単離する工程が、該レポーター遺伝子を発現する細胞を単離する工程を包含する、請求項１〜６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項８】
前記レポーター遺伝子が、細胞傷害性因子に対する耐性を付与する、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
前記レポーター遺伝子が、細胞表面タグである、請求項７に記載のキット。
【請求項１０】
前記ＳＩＲＰＡ＋細胞の濃縮された集団が、心筋細胞、心筋細胞前駆細胞、またはその両方を少なくとも６０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１１】
前記ＳＩＲＰＡ＋細胞の濃縮された集団が、心臓特異的構造タンパク質を発現する心筋細胞前駆細胞、ヒト心筋細胞、またはその両方を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１２】
前記ＳＩＲＰＡ＋細胞の濃縮された集団が、収縮する心筋細胞を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、２０１０年８月２７日に出願された米国仮特許出願第６１／３７７，６６５号からの優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、多能性幹細胞に由来する心筋細胞前駆細胞および心筋細胞をＳＩＲＰＡの発現に基づいて濃縮するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）およびヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）が培養下で心臓血管細胞を発生させる潜在能力は、これらの系統（ｌｉｎｅａｇｅｓ）の特異化、拘束および成熟を支配する細胞間相互作用および分子制御因子を研究するための強力なモデル系、ならびに薬物試験および再生医学のストラテジーのためのヒト心筋細胞の独特かつ無制限の供給源を提供する１−４（非特許文献１〜非特許文献４）。しかしながら、混入する細胞型が、インビトロでは薬物反応および他の機能特性に影響し得、インビボでは移植後の異常な成長および奇形腫形成のリスクを高め得るので、この注目すべき潜在能力の実用化は、高度に濃縮された心筋細胞集団を再現可能に生成できる技術次第である５（非特許文献５）。ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）は、最適な心臓の条件下で誘導されると、効率的に分化することにより、心筋細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞および内皮細胞を含む混合された心臓血管集団を作製する３（非特許文献３）。所与のいずれのｈＰＳＣ株の場合も、心筋細胞はその集団の最大７０％に相当し得るが、この系統を生成する効率は、種々の幹細胞株間で大幅に異なる。誘導条件のさらなる操作は、未だ、幅広いｈＰＳＣ株から純粋な心筋細胞集団を作製するためのストラテジーをもたらしていない。
【０００４】
分化培養物から心筋細胞を濃縮するために、心筋細胞特異的な蛍光レポーターまたは薬物選択可能エレメントが、ｈＰＳＣに導入された６−８。分化後、心筋細胞は、蛍光励起細胞分取（ＦＡＣＳ）または適切な選択薬物の添加によって濃縮され得る。これらのストラテジーは、濃縮された心筋細胞集団の作製を可能にするが、使用される各ｈＰＳＣ株にレポーターベクターを導入しなければならず、結果として遺伝的に改変された心筋細胞が生じ、ゆえに、臨床用途での有用性が低下するので、それらのストラテジーは、重大な欠点に悩まされる。より最近の研究において、Ｈａｔｔｏｒｉらは、心筋細胞をその高ミトコンドリア含有量に基づいてＦＡＣＳによって単離することが可能であることを実証した９。このアプローチは、成熟心筋細胞の単離にとって有用であるとみられるが、ミトコンドリアの数がより少ない細胞（例えば、ｈＰＳＣに由来する未熟な心筋細胞）は、他の細胞型と区別しにくい可能性がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｍｕｒｒｙ，Ｃ．Ｅ．およびＫｅｌｌｅｒ，Ｇ．  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ  ｒｅｌｅｖａｎｔ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ：  ｌｅｓｓｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．  Ｃｅｌｌ（２００８）１３２、６６１〜６８０
【非特許文献２】Ｋａｔｔｍａｎ，Ｓ．Ｊ．ら、Ｓｔａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｔｉｖｉｎ／ｎｏｄａｌ  ａｎｄ  ＢＭＰ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｃａｒｄｉａｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ（２０１１）８、２２８〜２４０
【非特許文献３】Ｙａｎｇ，Ｌ．ら、Ｈｕｍａｎ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｄｅｖｅｌｏｐ  ｆｒｏｍ  ａ  ＫＤＲ＋  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ−ｓｔｅｍ−ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．  Ｎａｔｕｒｅ（２００８）４５３、５２４〜５２８
【非特許文献４】Ｚｗｉ，Ｌ．ら、Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ（２００９）１２０、１５１３〜１５２３
【非特許文献５】Ｂｒａａｍ，Ｓ．Ｒ．、Ｐａｓｓｉｅｒ，Ｒ．およびＭｕｍｍｅｒｙ，Ｃ．Ｌ．  Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｃｉ（２００９）３０、５３６〜５４５
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の要旨
ある態様において、心筋細胞および心筋細胞前駆細胞について細胞の集団を濃縮する方法が提供され、その方法は、心筋細胞および心筋細胞前駆細胞が単離される予定の細胞の集団を提供する工程；およびその集団からＳＩＲＰＡを発現している細胞を単離する工程を包含し；ここで、その細胞の集団は、心筋細胞および心筋細胞前駆細胞に分化するように誘導されたヒト多能性幹細胞の集団を含む。
【０００７】
さらなる態様において、本明細書中に記載される方法のいずれか１つを用いて得られた心筋細胞および心筋細胞前駆細胞の濃縮された集団が提供される。
【０００８】
さらなる態様において、心筋細胞および心筋細胞前駆細胞について濃縮された単離された細胞の集団が提供され、ここで、その細胞の集団は、心筋細胞および心筋細胞前駆細胞を少なくとも６０％、好ましくは少なくとも９０％含む。
【０００９】
さらなる態様において、細胞の集団から心筋細胞および心筋細胞前駆細胞を単離するためのＳＩＲＰＡの使用が提供され、ここで、その細胞の集団は、心筋細胞および心筋細胞前駆細胞に分化するように誘導されたヒト多能性幹細胞の集団を含む。
【００１０】
さらなる態様において、細胞の集団を心筋細胞および心筋細胞前駆細胞について枯渇させる方法が提供され、その方法は：心筋細胞および心筋細胞前駆細胞が枯渇される予定の細胞の集団を提供する工程；およびその集団からＳＩＲＰＡを発現している細胞を枯渇させる工程を包含し；ここで、その細胞の集団は、心筋細胞、心筋細胞前駆細胞および非心筋細胞に分化するように誘導されたヒト多能性幹細胞の集団を含む。
【００１１】
さらなる態様において、心筋細胞および心筋細胞前駆細胞について細胞の集団を濃縮する方法が提供され、その方法は：心筋細胞および心筋細胞前駆細胞が単離される予定の細胞の集団を提供する工程；ならびにＣＤ９０、ＣＤ３１、ＣＤ１４０ＢおよびＣＤ４９Ａのうちの少なくとも１つを発現している細胞をその集団から枯渇させる工程を包含し；ここで、その細胞の集団は、心筋細胞および心筋細胞前駆細胞および非心筋細胞に分化するように誘導されたヒト多能性幹細胞の集団を含む。
【００１２】
本願は特定の実施形態において例えば以下の項目を提供する：
（項目１）
細胞の集団を心筋細胞および心筋細胞前駆細胞について濃縮する方法であって：
（ａ）心筋細胞および心筋細胞前駆細胞が単離される予定の該細胞の集団を提供する工程；ならびに
（ｂ）該集団からＳＩＲＰＡを発現している細胞を単離する工程；
を包含し、ここで、該細胞の集団は、心筋細胞および心筋細胞前駆細胞に分化するように誘導されたヒト多能性幹細胞の集団を含む、方法。
（項目２）
前記ヒト多能性幹細胞が、胚性幹細胞である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記ヒト多能性幹細胞が、人工多能性幹細胞である、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記ヒト多能性幹細胞が、細胞分化を誘導するのに有効な量の少なくとも１つの誘導因子に曝露される、項目１〜３のいずれか１項に記載の方法。
（項目５）
前記少なくとも１つの誘導因子の量が、前記集団中のＳＩＲＰＡ濃度に基づいて最適化される、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記少なくとも１つの誘導因子が、サイトカインを含む、項目４および５のいずれか１項に記載の方法。
（項目７）
前記少なくとも１つの誘導因子が、好ましくは４０ｎｇ／ｍｌまでの濃度、さらに好ましくは約６ｎｇ／ｍｌまたは約３０ｎｇ／ｍｌの濃度の、アクチビンＡを含む、項目４〜６のいずれか１項に記載の方法。
（項目８）
前記少なくとも１つの誘導因子が、好ましくは４０ｎｇ／ｍｌまでの濃度、さらに好ましくは約１０ｎｇ／ｍｌの濃度の、骨形成タンパク質４を含む、項目４〜７のいずれか１項に記載の方法。
（項目９）
前記ヒト多能性幹細胞が、さらに骨形成タンパク質インヒビターに曝露される、項目４〜８のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０）
前記骨形成タンパク質インヒビターが、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ、Ｎｏｇｇｉｎおよび可溶性骨形成タンパク質レセプターからなる群から選択される、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記ヒト多能性幹細胞が、さらにＶＥＧＦ、ＤＫＫおよびｂＦＧＦのうちの少なくとも１つに曝露される、項目４〜１０のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２）
前記ヒト多能性幹細胞が、約１日間〜約５日間、好ましくは約３日間、前記誘導因子に曝露される、項目４〜１１のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３）
前記ヒト多能性幹細胞の誘導の開始と前記ＳＩＲＰＡを発現している細胞を単離する工程との間の時間が、約５日間〜約４５日間、好ましくは約８日間〜約２５日間である、項目１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
（項目１４）
前記ＳＩＲＰＡを発現している細胞が、該細胞によるＮｋｘ２．５発現の開始時点ごろに現われる、該細胞によるＳＩＲＰＡの発現の開始後に単離される、項目１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
（項目１５）
ＳＩＲＰＡ細胞表面抗原を有する前記細胞が、該細胞によるＮｋｘ２．５発現の開始時と、該細胞による収縮および心臓特異的構造タンパク質発現の開始時との間に単離される、項目１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
（項目１６）
ＣＤ９０、ＣＤ３１、ＣＤ１４０ＢおよびＣＤ４９Ａのうちの少なくとも１つを発現している細胞を前記集団から枯渇させる工程をさらに包含する、項目１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
（項目１７）
ＣＤ９０、ＣＤ３１、ＣＤ１４０ＢおよびＣＤ４９Ａのうちの１つを発現している前記細胞が、対応する抗体を用いて枯渇される、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記ＳＩＲＰＡを発現している細胞が、ＳＩＲＰＡ特異的リガンドを用いて単離される、項目１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
（項目１９）
前記ＳＩＲＰＡを発現している細胞が、抗ＳＩＲＰＡ抗体もしくは抗体フラグメントまたは抗体様分子、好ましくは抗ＳＩＲＰＡ抗体を用いて単離される、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記ＳＩＲＰＡを発現している細胞が、磁気ビーズを用いて単離される、項目１８または１９に記載の方法。
（項目２１）
前記ＳＩＲＰＡを発現している細胞が、フローサイトメトリーを用いて単離される、項目１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
（項目２２）
前記集団中の細胞が、ＳＩＲＰＡ遺伝子座の制御性調節エレメントに作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含み、ここで、該レポーター遺伝子は、ＳＩＲＰＡを発現する細胞において発現され、該ＳＩＲＰＡを発現している細胞を単離する工程は、該レポーター遺伝子を発現している細胞を単離する工程を包含する、項目１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
（項目２３）
前記レポーター遺伝子が、細胞傷害性因子に対する耐性を付与する、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記レポーター遺伝子が、細胞表面タグである、項目２２に記載の方法。
（項目２５）
前記細胞の濃縮された集団が、心筋細胞および心筋細胞前駆細胞を少なくとも６０％、好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは９８％含む、項目１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
（項目２６）
項目１〜２４に記載の方法のいずれか１つを用いて得られた心筋細胞および心筋細胞前駆細胞の濃縮された集団。
（項目２７）
心筋細胞および心筋細胞前駆細胞について濃縮された細胞の単離された集団であって、該細胞の集団は、心筋細胞および心筋細胞前駆細胞を少なくとも６０％、好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは９８％含む、集団。
（項目２８）
細胞の集団から心筋細胞および心筋細胞前駆細胞を単離するためのＳＩＲＰＡの使用であって、ここで、該細胞の集団は、心筋細胞および心筋細胞前駆細胞に分化するように誘導されたヒト多能性幹細胞の集団を含む、使用。
（項目２９）
細胞の集団を心筋細胞および心筋細胞前駆細胞について枯渇させる方法であって：
（ａ）心筋細胞および心筋細胞前駆細胞が枯渇される予定の該細胞の集団を提供する工程；ならびに
（ｂ）該集団からＳＩＲＰＡを発現している細胞を枯渇させる工程；
を包含し、ここで、該細胞の集団は、心筋細胞、心筋細胞前駆細胞および非心筋細胞に分化するように誘導されたヒト多能性幹細胞の集団を含む、方法。
（項目３０）
細胞の集団を心筋細胞および心筋細胞前駆細胞について濃縮する方法であって：
（ａ）心筋細胞および心筋細胞前駆細胞が単離される予定の該細胞の集団を提供する工程；ならびに
（ｂ）ＣＤ９０、ＣＤ３１、ＣＤ１４０ＢおよびＣＤ４９Ａのうちの少なくとも１つを発現している細胞を該集団から枯渇させる工程；
を包含し、ここで、該細胞の集団は、心筋細胞および心筋細胞前駆細胞および非心筋細胞に分化するように誘導されたヒト多能性幹細胞の集団を含む、方法。
本発明の実施形態は、以下の説明および添付の図面を参照することによって最も良く理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、ｈＥＳＣ由来の心臓血管系統の特異化を示している。（ａ）ｈＥＳＣを心臓系統に分化させるために使用されたプロトコルの概要（Ｙａｎｇら、２００８から改変されたもの）。（ｂ）分化中の種々の段階のＨＥＳ２に由来する胚様体（ＥＢ）における、ＢＲＡＣＨＵＲＹ（Ｔ）、ＭＥＳＰ１、ＩＳＬＥＴ１（ＩＳＬ１）、ＮＫＸ２−５、ＭＹＨ６（αＭＨＣ）、ＭＹＨ７（βＭＨＣ）、ＭＹＬ２（ＭＬＣ２ｖ）、ＭＹＬ７（ＭＬＣ２ａ）、ＮＥＵＲＯＤ１およびＦＯＸＡ２の定量的ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）解析。０日目、ｈＥＳ細胞；ＬＶ、ヒト胎児左心室；ＬＡ、ヒト胎児左心房；ＡＨ、ヒト成人心臓、Ｅｄ、ｈＥＳＣに由来する内胚葉１３。バーは、平均値±その平均値の標準誤差を表す。ｎ＝３。
【図２】図２は、ｈＥＳＣ分化中の細胞表面レセプターＳＩＲＰＡの発現を示している。（ａ）ＮＫＸ２−５−ＧＦＰ  ｈＥＳＣに由来するＥＢ上のＳＩＲＰＡ（ＳＩＲＰＡ）のフローサイトメトリー解析。（ｂ）記載の時点におけるＨＥＳ２由来ＥＢ集団上のＳＩＲＰＡの発現。（ｃ）分化の種々の時点におけるＨＥＳ２由来ＥＢにおけるＳＩＲＰＡおよびそのリガンドのＣＤ４７の発現のＲＴ−ｑＰＣＲ解析。０日目、ＥＳ細胞；ＬＶ、ヒト胎児左心室；ＬＡ、ヒト胎児左心房；ＡＨ、ヒト成人心臓。バーは、平均値±その平均値の標準誤差を表す。ｎ＝４。（ｄ）心臓単層培養物におけるＳＩＲＰＡおよび心臓トロポニンＩ（ｃＴＮＩ）に対する免疫染色。単層は、ｄ２０のＨＥＳ２由来ＥＢから得られた。
【図３】図３は、ＳＩＲＰＡの発現に基づく細胞選別によるｈＥＳＣ由来培養物からの心筋細胞の濃縮を示している。（ａ）分化のｄ８、ｄ１２およびｄ２０のＥＢにおけるＳＩＲＰＡ発現のフローサイトメトリー解析。ＳＩＲＰＡに対する蛍光励起細胞分取（ＦＡＣＳ）をｄ８、ｄ１２およびｄ２０において行った。各時点からの選別前（ＰＳ）、ＳＩＲＰＡ＋およびＳＩＲＰＡ−画分を、細胞内フローサイトメトリーによって心臓トロポニンＴ（ｃＴＮＴ）の発現について解析した。ｄ８、ｄ１２およびｄ２０におけるｃＴＮＴ＋細胞の頻度は、ＳＩＲＰＡ−細胞（８日目：１３．０±２．１、１２日目：１４．３±３．９、２０日目：１５．７±６．０）と比べて、ＳＩＲＰＡ＋画分において有意に高かった（８日目：９５．２％±１．９、１２日目：９４．４±１．７、２０日目：８９．６±３．６）。（ｂ）３つの異なる細胞分離実験からのｃＴＮＴ＋細胞の平均濃縮。バーは、平均値の標準誤差を表す。アスタリスクは、スチューデントのｔ検定によって決定された統計的有意性を示している。＊＊＊（ｐ≦０．００１）。（ｃ）ＰＳ、ＳＩＲＰＡ＋およびＳＩＲＰＡ−細胞のＱＰＣＲ解析。ＳＩＲＰＡ、ＮＫＸ２−５、ＭＹＨ６、ＭＹＨ７およびＭＹＬ７の発現は、解析されたすべての段階（ｄ８、ｄ１２およびｄ２０）において、ＳＩＲＰＡ−画分と比べてＳＩＲＰＡ＋画分において有意に高かった。非心臓系統に対するマーカー（ＰＥＣＡＭおよびＤＤＲ２）の発現は、ＳＩＲＰＡ−画分に分離した。バーは、平均値±その平均値の標準誤差を表す。アスタリスクは、スチューデントのｔ検定によって決定された統計的有意性を示している。＊（ｐ≦０．０５）、＊＊（ｐ≦０．０１）、＊＊＊（ｐ≦０．００１），ｎ＝３。（ｄ）２０日目において選別されたＰＳ、ＳＩＲＰＡ＋およびＳＩＲＰＡ−細胞から得られた単層培養物に対する心臓トロポニンＩ（ｃＴＮＩ）の免疫染色。
【図４】図４は、ＳＩＲＰＡの発現に基づく細胞選別によるｈｉＰＳＣ由来培養物からの心筋細胞の濃縮を示している。（ａ）分化のｄ２０における、３８−２およびＭＳＣ−ｉＰＳ１  ｈｉＰＳＣに由来する細胞上のＳＩＲＰＡ発現のフローサイトメトリー解析。ＳＩＲＰＡに対する蛍光励起細胞分取（ＦＡＣＳ）をｄ２０において行い、選別前（ＰＳ）、ＳＩＲＰＡ＋およびＳＩＲＰＡ−画分を、細胞内フローサイトメトリーによって心臓トロポニンＴ（ｃＴＮＴ）の発現について解析した。（ｂ）ｃＴＮＴ＋細胞の頻度は、ＳＩＲＰＡ−細胞と比べて（ＭＳＣ−ｉＰＳ１：４．９±２．１、３８−２：６．２±０．９）、両方のｈｉＰＳＣ由来培養物のＳＩＲＰＡ＋画分において有意に高かった（ＭＳＣ−ｉＰＳ１：６７．０±３．６、３８−２：７１．４±３．８）。バーは、平均値±その平均値の標準誤差を表す。アスタリスクは、スチューデントのｔ検定によって決定された統計的有意性を示している。＊＊（ｐ≦０．０１）、＊＊＊（ｐ≦０．００１），ｎ＝３。（ｃ）ｄ２０における細胞選別後のＭＳＣ−ｉＰＳ１および３８−２  ｈｉＰＳＣに由来するＰＳ、ＳＩＲＰＡ＋およびＳＩＲＰＡ−細胞のＱＰＣＲ解析。心臓系統に特異的なマーカー（ＳＩＲＰＡ、ＮＫＸ２−５、ＭＹＨ６、ＭＹＨ７、ＭＹＬ２およびＭＹＬ７）の発現は、ＳＩＲＰＡ−画分と比べてＳＩＲＰＡ＋において有意に高かった。非心臓系統に対するマーカー（ＤＤＲ２、ＰＤＧＦＲＢおよびＮＥＵＲＯＤ１）の発現は、ＳＩＲＰＡ−画分およびＰＳ細胞に分離した。バーは、平均値±その平均値の標準誤差を表す。アスタリスクは、スチューデントのｔ検定によって決定された統計的有意性を示している。＊（ｐ≦０．０５）、＊＊（ｐ≦０．０１）、＊＊＊（ｐ≦０．００１）、ｎ＝５。
【図５】図５は、ヒト胎児心筋細胞上および成人ヒト心臓におけるＳＩＲＰＡの発現を示している。（ａ）ヒト胎児心臓組織および成人心臓におけるＳＩＲＰＡについてのＲＴ−ｑＰＣＲ解析。ＬＶ、左心室；ＲＶ、右心室；ＡＰ、心尖部；ＬＡ、左心房；ＲＡ、右心房、ＡＶＪ、房室接合部；ＨＥＫ、ヒト胎児腎細胞；ＡＨ、成人心臓；０日目、ｈＥＳ細胞；ｄ２０、心臓分化の２０日目、ＲＴ、逆転写酵素コントロール。バーは、平均値±その平均値の標準誤差を表す。ｎ＝６。（ｂ）ヒト胎児心室細胞上のＳＩＲＰＡ（緑色）に対する免疫染色、ならびにＭｉｔｏ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ（赤色、ミトコンドリアマトリックスに蓄積する）およびＤＡＰＩ（青色、核の色素）による染色。（ｃ）ヒト胎児心臓組織上のＳＩＲＰＡに対するフローサイトメトリー解析。（ｄ）ヒト胎児心臓組織上のｃＴＮＴに対する細胞内フローサイトメトリー解析。
【図６】図６は、心臓分化効率を予測するためのＳＩＲＰＡの利用を示している。（ａ）アクチビンＡ（ＡＣＴＡ０、３、６、９ｎｇ／ｍｌ）およびＢＭＰ４（１０、３０ｎｇ／ｍｌ）の様々な組み合わせによって誘導された心臓分化培養物の５日目のＫＤＲ／ＰＤＧＦＲＡフローサイトメトリープロファイル。ＫＤＲ＋ＰＤＧＦＲＢ＋集団は、心臓中胚葉細胞を含むと示されている２。（ｂ）（ａ）に記載された培養物の９日目のＳＩＲＰＡフローサイトメトリー解析発現プロファイル。（ｃ）（ａ）に記載された培養物の２０日目のｃＴＮＴプロファイル（細胞内フローサイトメトリー解析）。（ｄ）ａ〜ｃの定量。９日目におけるＳＩＲＰＡの発現（緑色の点）と２０日目におけるｃＴＮＴの発現（赤色の菱形）との密接な相関は、心臓分化効率に対するＳＩＲＰＡの予測的な潜在能力を実証している。
【図７】図７は、ネガティブ選択による心筋細胞の濃縮を示している。（ａ）２０日目の分化培養物（ＨＥＳ２）中の非筋細胞（ＳＩＲＰＡ陰性）細胞上で特異的に発現されたマーカーのフローサイトメトリー解析。（ｂ）非筋細胞上で特異的に発現されるマーカー（ＰＥにおいて：ＣＤ３１、ＣＤ９０、ＣＤ１４０Ｂ、ＣＤ４９Ａ）の組み合わせに対する蛍光励起細胞分取。（ｃ）選別前細胞、ＰＥ陰性（ＬＩＮ−）およびＰＥ陽性（ＬＩＮ＋）サンプルのＳＩＲＰＡに対するフローサイトメトリー解析。（ｄ）分化の２０日目における非筋細胞マーカー（（ａ）に示されたようなマーカー）の定量。ｎ＝４。（ｅ）ＰＳ、細胞選別後のＬＩＮ−およびＬＩＮ＋画分におけるＳＩＲＰＡ陽性細胞の定量。アスタリスクは、スチューデントのｔ検定によって決定された統計的有意性を示している。＊＊＊（ｐ≦０．００１），ｎ＝３。（ｆ）非心臓マーカー（ＰＥＣＡＭ１、ＰＤＧＦＲＢ、ＴＨＹ１およびＤＤＲ２）および心臓特異的遺伝子（ＳＩＲＰＡ、ＮＫＸ２−５、ＭＹＨ６およびＭＹＨ７）に対する、選別前（ＰＳ）、ＬＩＮ−およびＬＩＮ＋サンプルのＱＰＣＲ解析。バーは、平均値±その平均値の標準誤差を表す。アスタリスクは、スチューデントのｔ検定によって決定された統計的有意性を示している。＊（ｐ≦０．０５）、＊＊（ｐ≦０．０１）、＊＊＊（ｐ≦０．００１）、ｎ＝３。
【図８】図８は、ＮＫＸ２．５−ＧＦＰ  ＨＥＳ３  ｈＥＳＣ株の分化動態を示している。分化の様々な時点におけるＮＫＸ２．５−ＧＦＰ  ｈＥＳＣ株に由来するＥＢのフローサイトメトリー解析。ＧＦＰ発現は、分化の８日目において初めて検出され、時間とともに増加し、２０日目に最大の発現を迎える。
【図９】図９は、ＮＫＸ２．５−ＧＦＰ  ＨＥＳ３およびＨＥＳ２  ｈＥＳＣ株のＳＩＲＰＡの発現動態を示している。（ａ）フローサイトメトリー解析によるＳＩＲＰＡ＋／ＮＫＸ２．５−ＧＦＰ＋細胞の解析および定量。ＮＫＸ２．５−ＧＦＰ  ｈＥＳＣ株に由来するＥＢを、分化の様々な時点において解析した。ｎ＝５。（ｂ）フローサイトメトリー解析によるＳＩＲＰＡ＋細胞の解析および定量。ＨＥＳ２  ｈＥＳＣ株に由来するＥＢを、分化の様々な時点において解析した。ｎ＝８。ｄ０＝未分化なＥＳ細胞、ｄ５〜ｄ２０＝５日目〜２０日目における分化したＥＢ。
【図１０】図１０は、フローサイトメトリー解析のストラテジーおよび染色コントロールを示している。（ａ）２０日目のＥＢ由来細胞のフローサイトメトリー解析。すべての細胞を生死判別色素ＤＡＰＩで染色し、ＤＡＰＩ陰性細胞（＝生細胞）だけを各実験のために解析した。（ｂ）残骸、および対になった細胞（ｄｏｕｂｌｅｔ）または細胞凝集塊を除外するために、生存可能な単一細胞をＦＳＣ／ＳＳＣ（細胞のサイズおよび粒度）によってさらに測定した。（ｃ）分化の２０日目におけるＥＢ由来細胞の染色されなかったコントロール。（ｄ）ＳＩＲＰＡ−ＰＥ−Ｃｙ７抗体および対応するＩｇＧコントロールを用いた、２０日目のＥＢ由来細胞のフローサイトメトリー解析。（ｅ）ＳＩＲＰＡ−ビオチン／ストレプトアビジン−ＡＰＣ（ＳＩＲＰＡ−ｂｉｏ／ＳＡ−ＡＰＣ）抗体の組み合わせ、対応するＩｇＧコントロールおよび二次抗体だけの染色を用いた、２０日目のＥＢ由来細胞のフローサイトメトリー解析。（ｆ）ＦＳＣおよびＳＳＣによる、ＳＩＲＰＡ−細胞集団とＳＩＲＰＡ＋細胞集団（（ｅ）からのもの）との細胞サイズの比較。
【図１１】図１１は、ウエスタンブロット解析およびＳＩＲＰＡ抗体の特異性の確認を示している。（ａ）未分化なＥＳ細胞（ｄ０）と比較されている、２０日目（ｄ２０）の分化培養物からの３つのサンプルのウエスタンブロット解析。ＳＩＲＰＡ  ＳＥ５Ａ５抗体を使用し、ポンソー染色を充填コントロールのために示す。（ｂ）コントロールとともに、ＳＩＲＰＡ  ＳＥ５Ａ５ａ抗体を用いた免疫共沈降。ＳＩＲＰＡは、以前にＴｉｍｍｓら、１９９９に記載され、解析されたような予測サイズに泳動した。
【図１２】図１２は、ＳＩＲＰＡ抗体染色とｍｉｔｏ  ｔｒａｃｋｅｒ色素の保持標識との比較を示している。（ａ）ＨＥＳ２  ｈＥＳＣからの分化の５、８、１２および２０日目におけるｍｉｔｏ  ｔｒａｃｋｅｒ色素標識のフローサイトメトリー解析。（ｂ）ＨＥＳ２  ｈＥＳＣからの分化の５、８、１２および２０日目におけるＳＩＲＰＡのフローサイトメトリー解析。（ｃ）ＨＥＳ２  ｈＥＳＣからの分化の５、８、１２および２０日目における、ＳＩＲＰＡとｍｉｔｏ  ｔｒａｃｋｅｒ色素標識との同時染色の後のフローサイトメトリー解析。
【図１３】図１３は、ＳＩＲＰＡとｃＴＮＴとの同時発現を示している。細胞を、最初にＳＩＲＰＡについて染色し、次いで、固定した（４％ＰＦＡ，２０分間）後、ｃＴＮＴについて細胞内染色した。両方の１次抗体が、マウスにおいて産生されていたので、適切なコントロールも同様に示される。細胞を、抗ＳＩＲＰＡ−ビオチン／ストレプトアビジン−ＡＰＣ（ＳＩＲＰＡ単一染色）、抗ＳＩＲＰＡ−ビオチン／ストレプトアビジン−ＡＰＣおよび抗マウス−ＰＥ（ｃＴＮＴに対する二次抗体が固定後のＳＩＲＰＡを認識しないことを実証するためのコントロール）、抗ＳＩＲＰＡ−ビオチン／ストレプトアビジン−ＡＰＣおよび抗ｃＴＮＴおよび抗マウス−ＰＥ（ＳＩＲＰＡとｃＴＮＴとの同時染色）に対して染色した。
【図１４】図１４は、マウス胚性幹細胞に由来する心筋細胞および成体マウス組織サンプルにおけるＳｉｒｐａの発現の解析を示している。（ａ）ｍＥＳＣに由来する心臓ＥＢ培養物のフローサイトメトリー解析。細胞を、Ｓｉｒｐａ−ＡＰＣに対して染色し、４％ＰＦＡで固定し、ｃＴｎＴ／抗マウスＰＥで染色した。Ｓｉｒｐａを発現している細胞は、ｃＴｎＴを発現している細胞と同時染色しなかったことから、ｍＥＳ細胞に由来する心筋細胞がＳｉｒｐａを発現しないことが示唆される。（ｂ）ｍＥＳＣに由来する心臓ＥＢ培養物のフローサイトメトリー解析。Ｓｉｒｐａ陽性細胞は、ＣＤ４５−ＰＥ−Ｃｙ７と同時に染色されることから、これらの培養物中に存在するＳｉｒｐａ陽性細胞が、Ｓｉｒｐａを発現すると以前に記載された（ｒｅｆ）造血細胞に相当することが示唆される。（ｃ）成体マウス組織サンプルにおけるＳｉｒｐａのＱＰＣＲ解析。ＴＡ、前脛骨筋；ＧＡ、腓腹筋；ＧＩ、消化管；ＲＴ、逆転写酵素コントロール；ＥＳＣＭ、マウス胚性幹細胞に由来する分化の７日目の心筋細胞（Ｋａｔｔｍａｎら、２０１１）。マウス脳組織をポジティブコントロールとして使用した。（ｄ）コントロール（ｃ）およびＳｉｒｐａ欠損マウス（ｋｏ）（Ｔｉｍｍｓら、１９９９）由来の成体の心臓、脳および腎臓組織ならびにマウスＥＳＣ由来心筋細胞（ｄ）のウエスタンブロット解析。Ｓｉｒｐａの発現は、コントロールマウスの脳組織だけで検出されたが、いずれのＳｉｒｐａ欠損サンプルまたはコントロール心臓、腎臓もしくはｍＥＳＣ由来サンプルでも検出されなかった。抗体＃１６および＃９（すべてのＳｉｒｐａアイソフォームに共通の細胞質ドメインに特異的、ＡＢ＃１６、ＡＢ＃９）を、Ｔｉｍｍｓら、１９９９に記載されているように使用した。ＡＢＣＡＭ：抗Ｓｉｒｐａ抗体（Ａｂｃａｍ，８１２０）。
【図１５】図１５は、ＦＡＣＳ後のＳＩＲＰＡ−およびＳＩＲＰＡ＋画分の純度の解析を示している。（ａ）選別前の画分、細胞選別後のＳＩＲＰＡに対するＳＩＲＰＡ−およびＳＩＲＰＡ＋画分のフローサイトメトリー解析。（ｂ）選別前の画分、細胞選別後のＳＩＲＰＡ−およびＳＩＲＰＡ＋画分におけるＳＩＲＰＡ＋細胞の定量。ｎ＝３。
【図１６ａ】図１６は、ＳＩＲＰＡの発現に基づく細胞選別によるｈＥＳＣ由来培養物からの心筋細胞の濃縮を示している。（ａ）ＮＫＸ２．５−ＧＦＰ  ＨＥＳ３  ｈＥＳＣからの分化の（ｄ）８日目、ｄ１２およびｄ２０におけるＳＩＲＰＡ発現のフローサイトメトリー解析。ＳＩＲＰＡに対する蛍光励起細胞分取（ＦＡＣＳ）をｄ８、ｄ１２およびｄ２０において行い、選別前（ＰＳ）、ＳＩＲＰＡ＋およびＳＩＲＰＡ画分を、細胞内フローサイトメトリーによって心臓トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）の発現について解析した。ｄ８、ｄ１２およびｄ２０におけるｃＴｎＴ＋細胞の頻度は、ＳＩＲＰＡ−細胞（８日目：９．９±１．７、１２日目：２１．９±２．５、２０日目：５．２±０．５）と比べて、ＳＩＲＰＡ＋画分において有意に高かった（８日目：８９．８％±１．９、１２日目：９５．０±１．３、２０日目：８９．４±４．４）。ｎ＝３。（ｂ）細胞選別後のＰＳ、ＳＩＲＰＡ＋およびＳＩＲＰＡ−細胞のＱＰＣＲ解析。心臓系統に特異的なマーカー（ＮＫＸ２．５、ＭＹＨ６、ＭＹＨ７およびＭＹＬ７）の発現は、解析されたすべての段階（ｄ８、ｄ１２およびｄ２０）において、ＳＩＲＰＡ−画分と比べてＳＩＲＰＡ＋において有意に高かった。非心臓系統に対するマーカー（ＰＥＣＡＭおよびＤＤＲ２）の発現は、ＳＩＲＰＡ−画分およびＰＳ細胞に分離した。ｎ＝３。
【図１６ｂ】図１６は、ＳＩＲＰＡの発現に基づく細胞選別によるｈＥＳＣ由来培養物からの心筋細胞の濃縮を示している。（ａ）ＮＫＸ２．５−ＧＦＰ  ＨＥＳ３  ｈＥＳＣからの分化の（ｄ）８日目、ｄ１２およびｄ２０におけるＳＩＲＰＡ発現のフローサイトメトリー解析。ＳＩＲＰＡに対する蛍光励起細胞分取（ＦＡＣＳ）をｄ８、ｄ１２およびｄ２０において行い、選別前（ＰＳ）、ＳＩＲＰＡ＋およびＳＩＲＰＡ画分を、細胞内フローサイトメトリーによって心臓トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）の発現について解析した。ｄ８、ｄ１２およびｄ２０におけるｃＴｎＴ＋細胞の頻度は、ＳＩＲＰＡ−細胞（８日目：９．９±１．７、１２日目：２１．９±２．５、２０日目：５．２±０．５）と比べて、ＳＩＲＰＡ＋画分において有意に高かった（８日目：８９．８％±１．９、１２日目：９５．０±１．３、２０日目：８９．４±４．４）。ｎ＝３。（ｂ）細胞選別後のＰＳ、ＳＩＲＰＡ＋およびＳＩＲＰＡ−細胞のＱＰＣＲ解析。心臓系統に特異的なマーカー（ＮＫＸ２．５、ＭＹＨ６、ＭＹＨ７およびＭＹＬ７）の発現は、解析されたすべての段階（ｄ８、ｄ１２およびｄ２０）において、ＳＩＲＰＡ−画分と比べてＳＩＲＰＡ＋において有意に高かった。非心臓系統に対するマーカー（ＰＥＣＡＭおよびＤＤＲ２）の発現は、ＳＩＲＰＡ−画分およびＰＳ細胞に分離した。ｎ＝３。
【図１７】図１７は、ビーズ選別を介したＳＩＲＰＡ＋心筋細胞の単離を示している。（ａ）ＳＩＲＰＡのフローサイトメトリー解析。ＨＥＳ２に由来するＥＢを、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ磁気ビーズ選別システムを用いて選別し、ＰＳ、選別後のＳＩＲＰＡ＋およびＳＩＲＰＡ画分をＳＩＲＰＡの発現について解析した。（ｂ）ＰＳ、ＳＩＲＰＡ＋およびＳＩＲＰＡ−画分の細胞内のｃＴｎＴフローサイトメトリー解析。
【図１８】図１８は、ヒト成人組織の遺伝子発現解析を示している。（ａ）ＳＩＲＰＡのＱＰＣＲ  ＲＴ解析。（ｂ）ＣＤ４７のＱＰＣＲ  ＲＴ解析。
【図１９】図１９は、Ｙ２−１に由来する分化培養物における非筋細胞マーカーの発現を示している。（ａ）２０日目の分化培養物において非筋細胞（ＳＩＲＰＡ−）上で特異的に発現されているマーカーのフローサイトメトリー解析。（ｂ）Ｙ２−１  ｉＰＳ細胞からの分化の２０日目における、非筋細胞マーカーの発現の定量。
【図２０】図２０は、ＳＩＲＰＡ抗体を用いた蛍光励起細胞分取（ＦＡＣＳ）の効率を示している表である。（ａ）分化の２０日目における、ＨＥＳ２からのＥＢ由来細胞のＦＡＣＳ後のＳＩＲＰＡ−細胞の回収。ｎ＝８。（ｂ）分化の２０日目における、ＨＥＳ２からのＥＢ由来細胞のＦＡＣＳ後のＳＩＲＰＡ＋細胞の回収。ｎ＝９。全細胞＃＝フローサイトメーターを通過した全細胞；ＳＩＲＰＡ−（ＳＩＲＰＡ＋）＃＝選別手順後に回収された全ＳＩＲＰＡ−（ＳＩＲＰＡ＋）細胞；ＳＩＲＰＡ−（ＳＩＲＰＡ＋）％＝ＳＩＲＰＡ抗体での染色によって決定されたＳＩＲＰＡ−（ＳＩＲＰＡ＋）細胞のパーセンテージ；ＳＩＲＰＡ−（ＳＩＲＰＡ＋）ｅｘｐ細胞＃＝ＳＩＲＰＡ抗体での染色および選別された全細胞数に基づいて予想されるＳＩＲＰＡ−（ＳＩＲＰＡ＋）細胞の細胞数；Ｅｆｆ  ＳＩＲＰＡ−（ＳＩＲＰＡ＋）＝ＳＩＲＰＡ−（ＳＩＲＰＡ＋）細胞の回収効率：ＳＩＲＰＡ−（ＳＩＲＰＡ＋）細胞＃／ＳＩＲＰＡ−（ＳＩＲＰＡ＋）ｅｘｐ細胞＃；Ｅｆｆ  ＳＩＲＰＡ−（ＳＩＲＰＡ＋）＝ＳＩＲＰＡ−（ＳＩＲＰＡ＋）細胞の回収効率（単位はパーセンテージ）。
【図２１】図２１は、非筋細胞マーカーを用いた蛍光励起細胞分取（ＦＡＣＳ）の効率を示している表である。（ａ）分化の２０日目における、ＨＥＳ２からのＥＢ由来細胞のＦＡＣＳ後のＬＩＮ−細胞の回収。ｎ＝６。（ｂ）分化の２０日目における、ＨＥＳ２からのＥＢ由来細胞のＦＡＣＳ後のＬＩＮ＋細胞の回収。ｎ＝６。全細胞＃＝フローサイトメーターを通過した全細胞；ＬＩＮ−（ＬＩＮ＋）＃＝選別手順後に回収された全ＬＩＮ−（ＬＩＮ＋）細胞；ＬＩＮ−（ＬＩＮ＋）％＝ＬＩＮ抗体での染色によって決定されたＬＩＮ−（ＬＩＮ＋）細胞のパーセンテージ；ＬＩＮ−（ＬＩＮ＋）ｅｘｐ細胞＃＝ＬＩＮ抗体での染色および選別された全細胞数に基づいて予想されるＬＩＮ−（ＬＩＮ＋）細胞の細胞数；Ｅｆｆ  ＬＩＮ−（ＬＩＮ＋）＝ＬＩＮ−（ＬＩＮ＋）細胞の回収効率：ＬＩＮ−（ＬＩＮ＋）細胞＃／ＬＩＮ−（ＬＩＮ＋）ｅｘｐ細胞＃；Ｅｆｆ  ＬＩＮ−（ＬＩＮ＋）＝ＬＩＮ−（ＬＩＮ＋）細胞の回収効率（単位はパーセンテージ）。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
詳細な説明
ヒト心筋細胞に特異的な細胞表面マーカーを同定するためのハイスループットフローサイトメトリースクリーニングの使用が本明細書中に記載される。ここで、本発明者らは、細胞表面レセプターＳＩＲＰＡが、ｈＰＳＣに由来する心筋細胞上ならびにヒト胎児心筋細胞上に発現されることを報告する。本発明者らは、ＳＩＲＰＡに対する抗体を用いた細胞選別を使用して、最大９８％の心筋細胞からなる集団をｈＰＳＣ分化培養物から単離することが可能であることを実証する。
【００１５】
細胞表面抗原であるＳＩＲＰＡ（ＣＤ１７２ａ、ＢＩＴ、ＳＨＰＳ１としても知られる）は、適切な分化条件下でヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）から発生される心臓前駆細胞上およびトロポニンＴ陽性心筋細胞上にもっぱらかつ特異的に見出され得る。
【００１６】
本願より前には、当該分野において、発生中のマウスまたはヒトの心臓血管細胞上にＳＩＲＰＡが発現されるという示唆または証拠はなかった。ヒトＳＩＲＰＡのＲＮＡ発現は、脳の種々の部分ならびに血液において、および低レベルで肺において、見出されている。しかしながら、ＳＩＲＰＡ  ＲＮＡの発現は、心臓では見出されていない（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｇｐｓ．ｇｎｆ．ｏｒｇ）。ＳＩＲＰＡタンパク質発現は、脳、血液およびリンパ系組織および結腸において、ならびに中程度から弱いレベルで胎盤、膵臓、脾臓、膀胱および胃において検出されている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｔｅｉｎａｔｌａｓ．ｏｒｇ／）。しかしながら、タンパク質発現は、成人ヒト心臓について報告されていない。したがって、ＳＩＲＰＡがｈＰＳＣに由来する心臓前駆細胞および心筋細胞において発現されるという発見は、新規であり、かつ驚くべきことである。
【００１７】
１つの例において、ＳＩＲＰＡ抗体などのＳＩＲＰＡ結合部分を使用することによって、ヒト胚性幹細胞および人工多能性幹細胞に由来する集団から心筋細胞およびその前駆細胞を識別する、モニターする、および単離する簡便かつ新規の方法が提供される。細胞の単離は、容易かつ効率的であり、１つの実施形態において、生存可能なままで、本明細書中に開示される用途のために使用され得る、９０％を超える心筋細胞からなる集団が得られる。
【００１８】
ＳＩＲＰＡは、Ｏｎｔａｒｉｏ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙによって供給される３５０を超える商業的に入手可能な抗体のスクリーニングにおいて、有望な心臓マーカーとして同定された。それらの抗体は、以前に公開されたプロトコル（Ｙａｎｇら、２００８）３を用いて、ｈＥＳＣの定方向分化（ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）によってもたらされた心臓発生の種々の段階を代表するｈＥＳＣ由来集団に対してスクリーニングされた。分化培養物中の心筋細胞集団（心臓トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）染色によって定義されるような）と同様のサイズの細胞集団を染色する抗体をさらに研究し、細胞選別のために使用した。その３５０個の表面抗体のうち、１つの抗体であるＳＩＲＰＡが、ｈＥＳＣに由来する心筋細胞集団をもっぱらかつ特異的に染色した。
【００１９】
ＳＩＲＰＡの発現に基づいて単離される細胞は、様々な用途（患者特異的疾患モデルの確立、ならびに正常および患者特異的な多能性幹細胞由来の心臓前駆細胞および心筋細胞の遺伝的解析、エピジェネティック解析およびプロテオミクス解析が挙げられるがこれらに限定されない）のための、多能性幹細胞に由来する高度に濃縮された心筋細胞前駆細胞（例えば、Ｎｋｘ２．５の発現開始時であるが、細胞の収縮および心臓特異的構造タンパク質の発現の前）および心筋細胞の新しい供給源となる。
【００２０】
心臓細胞上およびその前駆体上のＳＩＲＰＡの特異的発現は、心臓の発生および分化の間のこのレセプターおよびその下流のシグナル伝達経路に対する機能を示唆する。
【００２１】
ＳＩＲＰＡは、非心臓性ＰＳＣに由来する系統（例えば、体節（骨格筋、骨および軟骨／軟骨細胞の前駆細胞）に由来する系統を含む）について濃縮する細胞選別実験のための陰性マーカーとしても使用され得る。
【００２２】
ゆえに、１つの態様において、心筋細胞および心筋細胞前駆細胞について細胞の集団を濃縮する方法が提供され、その方法は、心筋細胞および心筋細胞前駆細胞が単離される予定の細胞の集団を提供する工程；およびその集団からＳＩＲＰＡを発現している細胞を単離する工程を包含し；ここで、その細胞の集団は、心筋細胞および心筋細胞前駆細胞に分化するように誘導されたヒト多能性幹細胞の集団を含む。
【００２３】
１つの実施形態において、ヒト多能性幹細胞は、胚性幹細胞である。別の実施形態において、ヒト多能性幹細胞は、人工多能性幹細胞である。
【００２４】
いくつかの実施形態において、ヒト多能性幹細胞は、細胞分化を誘導するのに有効な量の少なくとも１つの誘導因子（ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）に曝露される。
【００２５】
好ましい実施形態において、その少なくとも１つの誘導因子は、サイトカインを含む。その少なくとも１つの誘導因子は、好ましくは４０ｎｇ／ｍｌまでの濃度、さらに好ましくは約６ｎｇ／ｍｌまたは約３０ｎｇ／ｍｌの濃度のアクチビンＡを含み得る。その少なくとも１つの誘導因子はまた、独立して、好ましくは４０ｎｇ／ｍｌまでの濃度、さらに好ましくは約１０ｎｇ／ｍｌの濃度の骨形成タンパク質４を含み得る。
【００２６】
いくつかの実施形態において、ヒト多能性幹細胞はさらに、好ましくはＤｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ、Ｎｏｇｇｉｎおよび可溶性骨形成タンパク質レセプターからなる群から選択される骨形成タンパク質インヒビターに曝露される。
【００２７】
いくつかの実施形態において、ヒト多能性幹細胞はさらに、ＶＥＧＦ、ＤＫＫおよびｂＦＧＦのうちの少なくとも１つに曝露される。
【００２８】
いくつかの実施形態において、ヒト多能性幹細胞は、約１〜約５日間、好ましくは約３日間、誘導因子に曝露される。
【００２９】
いくつかの実施形態において、ヒト多能性幹細胞の誘導の開始とＳＩＲＰＡを発現している細胞の単離との間の時間は、約５日間〜約４５日間、好ましくは約８〜約２５日間である。
【００３０】
いくつかの実施形態において、ＳＩＲＰＡを発現している細胞は、その細胞によるＳＩＲＰＡの発現（その細胞によるＮｋｘ２．５の発現の開始時点ごろに現われる）の開始後に単離される。好ましくは、ＳＩＲＰＡ細胞表面抗原を有する細胞は、その細胞によるＮｋｘ２．５の発現の開始時と、その細胞による収縮および心臓特異的構造タンパク質発現の開始時との間に単離される。
【００３１】
いくつかの実施形態において、上記方法はさらに、ＣＤ９０、ＣＤ３１、ＣＤ１４０ＢおよびＣＤ４９Ａのうちの少なくとも１つを発現している細胞を、好ましくは対応する抗体を使用して、上記集団から枯渇させる工程を包含する。
【００３２】
特定の分子、この場合、ＳＩＲＰＡを発現している細胞を単離するための方法は、当業者に公知である。いくつかの実施形態において、ＳＩＲＰＡ特異的リガンドを使用することによって、好ましくは抗ＳＩＲＰＡ抗体もしくは抗体フラグメントまたは抗体様分子、およびさらに好ましくは抗ＳＩＲＰＡ抗体を使用することによって細胞を単離するために、ＳＩＲＰＡの存在は直接用いられる。いくつかの実施形態において、次いで、それらの細胞は、磁気ビーズおよび／またはフローサイトメトリーを使用して単離される。あるいは、ＳＩＲＰＡを発現している細胞は、間接的に選択され得る。例えば、いくつかの実施形態において、その集団中の細胞は、ＳＩＲＰＡ遺伝子座の制御性調節エレメント（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ）に作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含み、ここで、そのレポーター遺伝子は、ＳＩＲＰＡを発現する細胞において発現され、ＳＩＲＰＡを発現している細胞を単離する工程は、そのレポーター遺伝子を発現している細胞を単離する工程を包含する。１つの好ましい実施形態において、レポーター遺伝子は、細胞傷害性因子に対する耐性を付与する。別の好ましい実施形態において、レポーター遺伝子は、細胞表面タグである。
【００３３】
いくつかの実施形態において、濃縮された細胞集団は、心筋細胞および心筋細胞前駆細胞を少なくとも６０％、好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは９８％含む。
【００３４】
さらなる態様において、本明細書中に記載される方法のいずれか１つを用いて得られる心筋細胞および心筋細胞前駆細胞の濃縮された集団が提供される。
【００３５】
さらなる態様において、心筋細胞および心筋細胞前駆細胞について濃縮された単離された細胞の集団が提供され、ここで、その細胞の集団は、心筋細胞および心筋細胞前駆細胞を少なくとも６０％、好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは９８％含む。
【００３６】
さらなる態様において、細胞の集団から心筋細胞および心筋細胞前駆細胞を単離するためのＳＩＲＰＡの使用が提供され、ここで、その細胞の集団は、心筋細胞および心筋細胞前駆細胞に分化するように誘導されたヒト多能性幹細胞の集団を含む。
【００３７】
さらなる態様において、細胞の集団を心筋細胞および心筋細胞前駆細胞について枯渇させる方法が提供され、その方法は：心筋細胞および心筋細胞前駆細胞が枯渇される予定の細胞の集団を提供する工程；およびその集団からＳＩＲＰＡを発現している細胞を枯渇させる工程を包含し；ここで、その細胞の集団は、心筋細胞、心筋細胞前駆細胞および非心筋細胞に分化するように誘導されたヒト多能性幹細胞の集団を含む。
【００３８】
さらなる態様において、細胞の集団を心筋細胞および心筋細胞前駆細胞について濃縮する方法が提供され、その方法は：心筋細胞および心筋細胞前駆細胞が単離される予定の細胞の集団を提供する工程；ならびにＣＤ９０、ＣＤ３１、ＣＤ１４０ＢおよびＣＤ４９Ａのうちの少なくとも１つを発現している細胞をその集団から枯渇させる工程を包含し；ここで、その細胞の集団は、心筋細胞および心筋細胞前駆細胞および非心筋細胞に分化するように誘導されたヒト多能性幹細胞の集団を含む。
【００３９】
用語「濃縮すること」は、本発明の文脈において使用されるとき、細胞の集団中の所望の細胞型（複数含む）の相対存在量を増加させる任意の単離または選別プロセスを含む。
【００４０】
本明細書中で使用されるとき、用語「心筋細胞」とは、心筋を構成する細胞をいう。
【００４１】
用語「心筋細胞前駆細胞」とは、心筋細胞に分化する能力を有するヒト多能性幹細胞に由来する前駆細胞を意味する。
【００４２】
本明細書中で使用されるとき、「細胞を単離する」プロセスとは、細胞を選別するための当業者に公知の任意の方法を指し、それらとしては、フローサイトメトリー、蛍光励起細胞分取、抗体でコーティングされた磁気ビーズを用いた磁気分離、アフィニティークロマトグラフィー、および物理的特性の差異の利用（例えば、密度勾配遠心分離）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００４３】
「胚性幹細胞」（「ＥＳＣ」）は、初期胚に由来する多能性幹細胞である。
【００４４】
「人工多能性幹細胞」（「ｉＰＳＣ」）は、本発明の文脈において使用されるとき、特定の遺伝子の発現を誘導することによって非多能性細胞から人工的に得られた多能性幹細胞の１タイプである。
【００４５】
用語「細胞表面抗原」とは、免疫系によって認識されることが可能であり、かつ抗体に特異的に結合することができる、細胞の表面上の抗原を指す。
【００４６】
本明細書中で使用されるとき、句「分化するように誘導された」とは、ヒト多能性幹細胞が特殊化された細胞型に分化するのを惹起するために使用される当該分野で公知の任意の方法を指す。これらの方法は、ヒト多能性幹細胞を誘導因子に曝露することを包含し得る。
【００４７】
本明細書中で使用されるとき、用語「誘導因子」とは、ｈＰＳＣが特殊化された細胞型（心筋細胞および心筋細胞前駆細胞を含む）に分化するのを惹起することができる任意の因子を指す。ゆえに、誘導因子は、サイトカインを含み、それらとしては、アクチビンＡ、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、塩基性線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ２としても知られるｂＦＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦＡとしても知られるＶＥＧＦ）、ｄｉｃｋｋｏｐｆホモログ１（ＤＫＫ１）およびそれらからの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。
【００４８】
心筋細胞および心筋細胞前駆細胞に分化するようにヒト多能性幹細胞を誘導するための方法は、当業者に公知である（例えば、Ｙａｎｇら３およびＬａｆｌａｍｍｅら１９を参照のこと）。いくつかの実施形態において、誘導条件（例えば、誘導因子の濃度およびそれを使用するタイミング）は、得られる濃縮された集団におけるＳＩＲＰＡ濃度を測定することによって最適化され得る。
【００４９】
ヒト多能性幹細胞ｈＰＳＣ（胚性幹細胞；ｈＥＳＣおよび人工多能性幹細胞；ｈｉＰＳＣを含む）から心臓系統の細胞を発生させることができることにより、１）予測薬物毒性学および創薬、２）循環器疾患の処置のための移植、ならびに３）インビトロにおける心臓血管の発生および疾患のモデル化のために有用であるヒト心筋細胞の新規かつ無制限の供給がもたらされる。
【００５０】
以下の実施例は、本発明の様々な態様の例証であり、本明細書中に開示されるような本発明の広範な態様を限定しない。
【実施例】
【００５１】
材料および方法
ＨＰＳＣの維持および分化
ＨＰＳＣを、記載されているように２６維持した。胚様体（ＥＢ）を、以前に記載されているように２，３心臓血管系統に分化させた（図１ａ）。簡潔には：０日目（ｄ０）にＥＢを作製し、分化の初日にわたって（ｄ０〜ｄ１）ＢＭＰ４（１ｎｇ／ｍｌ）を加えた。ｄ１に、ＥＢを回収し、誘導培地（塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ；２．５ｎｇ／ｍｌ）、アクチビンＡ（６ｎｇ／ｍｌ）およびＢＭＰ−４（１０ｎｇ／ｍｌ））に再懸濁した。その培地をｄ４に交換し、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ；１０ｎｇ／ｍｌ）およびＤＫＫ（１５０ｎｇ／ｍｌ）を補充した。培地を再度ｄ８に交換し、ＶＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）およびｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を補充した。ＥＢを、この実験全体にわたってＳｔｅｍＰｒｏ−３４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において培養した。培養物を、ｄ０〜ｄ１２は５％ＣＯ２、５％Ｏ２、９０％Ｎ２環境において維持し、次いで、残りの培養期間は５％ＣＯ２／大気環境に移した。
【００５２】
以前に記載されたプロトコル２７を用いて、ＧＦＰをコードする配列をＨＥＳ３細胞のＮＫＸ２−５遺伝子座に標的化することによって、ＮＫＸ２−５−ＧＦＰ  ｈＥＳＣを作製した（Ｄ．Ｅ．、Ａ．Ｇ．Ｅ．およびＥ．Ｇ．Ｓ．、投稿済み）。
【００５３】
ヒト組織の採取および解析を含む作業は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｅａｌｔｈ  ＮｅｔｗｏｒｋにおけるＨｕｍａｎ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅに従って行われ、そこによって承認された。
【００５４】
フローサイトメトリーおよび細胞選別
５日目〜１２日目のＥＢに対する解離手順：ｈＰＳＣ分化実験から作製されたＥＢを、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡを用いて解離した。１３日目以降のＥＢおよびヒト胎児組織に対する解離手順：ｈＰＳＣ分化培養物から得られたＥＢを、Ｈａｎｋｓ溶液（ＮａＣｌ  １３６ｍＭ、ＮａＨＣＯ３  ４．１６ｍＭ、ＮａＰＯ４  ０．３４ｍＭ、ＫＣｌ  ５．３６ｍＭ、ＫＨ２ＰＯ４  ０．４４ｍＭ、デキストロース５．５５ｍＭ、Ｈｅｐｅｓ  ５ｍＭ）中のＩＩ型コラゲナーゼ（１ｍｇ／ｍｌ；Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ，ＬＳ００４１７６）において、静かに振盪しながら一晩室温でインキュベートした２８。翌日、その細胞懸濁液に、等量の解離溶液（Ｈａｎｋｓ溶液中：タウリン（ｔａｕｒｉｎ）、１０ｍＭ、ＥＧＴＡ  ０．１ｍＭ、ＢＳＡ  １ｍｇ／ｍｌ、ＩＩ型コラゲナーゼ１ｍｇ／ｍｌ）を加え、完全に解離するためにＥＢを静かにピペッティングした。細胞を遠心分離し（１０００ｒｐｍ，５分）、濾過した。分化の４０日目を過ぎたＥＢの場合、単一の細胞に完全に解離するために、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡによるさらなる処理が必要な場合がある。
【００５５】
細胞を、２．５×１０６細胞／ｍｌの濃度において、抗ＫＤＲ−アロフィコシアニン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；１：１０）および抗ＰＤＧＦＲＡ−フィコエリトリン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；１：２０）、抗ＳＩＲＰＡ−ＩｇＧ−フィコエリトリン−Ｃｙ７（クローンＳＥ５Ａ５；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄｓ；１：５００）１０，２９、抗ＳＩＲＰＡ−ＩｇＧ−ビオチン（クローンＳＥ５Ａ５；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄｓ；１：５００）１０、抗心臓トロポニンＴ（ｃＴＮＴ）アイソフォーム（クローン１３−１１；ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ；１：４００）、ヤギ抗マウスＩｇＧ−アロフィコシアニン（ＢＤ；１：２００）、ストレプトアビジン−アロフィコシアニン（ＢＤ：１：２００）、抗ＩｇＧ１κ−フィコエリトリン−Ｃｙ７（クローンＭＯＰＣ−２１；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄｓ；１：５００）、抗ＩｇＧ１κ−ビオチン（クローンＭＯＰＣ−２１；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄｓ；１：５００）で染色した。
【００５６】
細胞表面マーカーの場合、染色は、１０％ＦＣＳを含むＰＢＳ中で行った。細胞内タンパク質の場合、染色は、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈａｔｆｉｅｌｄ，ＰＡ，ＵＳＡ）で固定された細胞に対して行い、１０％ＦＣＳおよび０．５％サポニン（Ｓｉｇｍａ）を含むＰＢＳ中で染色を行った。染色された細胞は、ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ）を使用して解析した。蛍光励起細胞分取の場合、ＦＡＣＳＡｒｉａＴＭＩＩ（ＢＤ）細胞選別機（ＳｉｃｋＫｉｄｓ−ＵＨＮ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）を使用して、ＩＭＤＭ／６％ＦＣＳ中、１０６細胞／ｍｌの濃度で細胞を選別した。圧力および剪断応力に起因する細胞死を防ぐために、すべての選別を、１００ミクロンのノズルを用いて行った。磁気ビーズ選別の場合、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ＭＡＣＳビーズ選別システムを使用し、製造者のガイドラインおよび発現強度が弱い（ｄｉｍ）マーカー用の選別条件に従って実験を行った。ハイスループットフローサイトメトリー解析の場合、ＬＳＲＩＩ用のＢＤハイスループットサンプラー（ＨＴＳ）を、製造者のガイドラインに従って使用した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ，ＵＳＡ）を使用して、データを解析した。
【００５７】
免疫染色
免疫染色は、以下の１次抗体：ウサギ抗心臓トロポニンＩ（Ａｂｃａｍ；１：１００）、マウス抗ＳＩＲＰＡ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄｓ；１：１００）を使用して、以前に記載されたように１３行った。使用された二次抗体は：ヤギ抗マウスＩｇＧＣｙ３（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ；１：４００）、ロバ抗マウスＩｇＧ−Ａｌｅｘａ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；１：４００）だった。核を対比染色するためにＤＡＰＩを使用した。ミトコンドリアを染色するためにＭｉｔｏ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。染色された細胞は、蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ＣＴＲ６０００）を使用して可視化し、Ｌｅｉｃａ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｕｉｔｅソフトウェアを使用して画像を得た。
【００５８】
定量的リアルタイムＰＣＲ
ＲＮＡｑｕｅｏｕｓ−Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて全ＲＮＡを調製し、ＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅ（Ａｍｂｉｏｎ）で処理した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともにランダムヘキサマーおよびＯｌｉｇｏ（ｄＴ）を使用して、５００ｎｇ〜１μｇのＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。以前に記載されたように１３、ＱｕａｎｔｉＦａｓｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用し、ＭａｓｔｅｒＣｙｃｌｅｒ  ＥＰ  ＲｅａｌＰｌｅｘ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）において、ＱＰＣＲを行った。発現レベルをハウスキーピング遺伝子ＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）に対して正規化した。サンプル間の正規化のためのＴＢＰに加えて、ゲノムＤＮＡをＤＮＡ標準物質として使用した。ゲノムＤＮＡに存在する標的遺伝子のコピー数は、直接計算され得る（ヒトゲノムサイズ：２．７×１０９ｂｐ（＝１．７８×１０１２ダルトン）は、単一コピー遺伝子の６．０２２×１０２３コピーに相当し；１μｇのゲノムＤＮＡは、単一コピー遺伝子の３．４×１０５コピーに相当する）。ＲＴ−ｑＰＣＲグラフのＹ軸は、ＴＢＰのコピー数で除した目的の遺伝子のコピー数であり、ゆえに、実験間を比較し得る任意単位であるが絶対単位である。
【００５９】
全ヒト成人心臓ＲＮＡをＡｍｂｉｏｎから購入し、全ヒトＲＮＡマスターパネルをＣｌｏｎｔｅｃｈから購入した。
【００６０】
結果および考察
ｈＥＳＣ由来心筋細胞上に発現される新規マーカーの同定
ＨＥＳ２  ｈＥＳＣ株は、適切な濃度のアクチビンＡおよびＢＭＰ４で誘導されたとき（図１ａ）、効率的かつ再現可能に分化して、心臓血管系統細胞を発生する２，３。分化培養物の動態解析から、ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ（Ｔ）の発現によって定義される原始線条様の集団（２〜４日目）から、初期中胚葉の発生（ＭＥＳＰ１；３〜４日目）ならびにＮＫＸ２−５およびＩＳＬＥＴ１（ＩＳＬ１）陽性心臓前駆体の出現（４〜８日目）への段階的な発生の進行が明らかになった。ＭＹＨ６（αＭＨＣ）、ＭＹＨ７（βＭＨＣ）およびＭＹＬ７（ＭＬＣ２ａ）のアップレギュレーションならびにその後のＭＹＬ２（ＭＬＣ２ｖ）の発現と一致して（図１ｂ）、分化の９〜１２日目に初めて収縮する心筋細胞が検出された。ｈＥＳＣに由来する集団における心臓特異的遺伝子のいくつかの発現レベルは、胎児および成人の心臓組織において見られるレベルよりもかなり低かった。低レベルのＮＥＵＲＯＤ１およびＦＯＸＡ２の発現は、それらの培養物に、神経外胚葉または内胚葉に由来する相当な数の細胞が混入していなかったことを示す。心筋細胞の発生をリアルタイムでモニターすることを可能にするために、本発明者らは、上記プロトコルを、ＨＥＳ３  ｈＥＳＣのＮＫＸ２−５遺伝子座に挿入されたＥＧＦＰ  ｃＤＮＡを含むＮＫＸ２−５−ＧＦＰレポーターｈＥＳＣ株に適用した（Ｅｌｌｉｏｔｔら、投稿済み）。最初のＮＫＸ２−５−ＧＦＰ＋細胞は、分化の７〜８日目に発生した。ＮＫＸ２−５−ＧＦＰ＋集団のサイズは、時間と共に増大し、１２〜２０日目に最大に達した（図８）。ＮＫＸ２−５−ＧＦＰ  ＥＳＣに由来する胚様体（ＥＢ）の落射蛍光下での解析によって、それらの細胞の大部分において核のＧＦＰ発現が確認された。ＮＫＸ２−５−ＧＦＰ発現の動態が、ＨＥＳ２培養物におけるＮＫＸ２−５発現の開始と密接に対応することから、両方のｈＥＳＣ株由来の心臓の特異化（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）が、分化の６〜８日目に起こると示唆される（図１ｂ、図８）。２０日目の培養物における高い割合のＮＫＸ２−５−ＧＦＰ＋細胞は、使用された分化プロトコルが、このｈＥＳＣ株からの心筋細胞の発生を効率的に促進することを実証する。
【００６１】
上記の発生段階が細胞表面マーカーによって区別され得るか否かを決定するために、本発明者らは、ＧＦＰ−ＮＫＸ２−５細胞株から発生した８、１２および２０日目の集団を使用して、３７０個の公知の抗体（ｈｔｔｐ：／／ｄａｔａ．ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ．ｃａ／ＡｎｔｉｂｏｄｙＷｅｂ）のスクリーニングを行った。最初のスクリーニングは、ＮＫＸ２−５−ＧＦＰ＋集団上に存在する抗原を認識する抗体を同定することに焦点を当てた。このスクリーニングから、抗ＳＩＲＰＡ抗体１０が、ＮＫＸ２−５−ＧＦＰ＋細胞の大部分を染色し、かつ陰性細胞のほとんどを染色しなかったので（図２ａ）、本発明者らは、シグナル調節タンパク質アルファ（ＳＩＲＰＡ、ＳＨＰＳ−１としても知られるＳＩＲＰＡ）を潜在的な心臓特異的マーカーとして同定した。解析された抗体のパネルのうち、ＳＩＲＰＡは、この心筋細胞特異的な発現パターンを示す唯一の抗体だった。ＳＩＲＰＡは、分化の８日目に、発生の心臓前駆体段階に相当すると考えられる集団である新生のＧＦＰ−ＮＫＸ２−５＋細胞上で初めて検出された。発現は、２０日間の実験経過全体にわたってＧＦＰ−ＮＫＸ２−５＋集団上で維持された（図２ａ、図９ａ）。ＳＩＲＰＡ＋細胞は、未分化なｈＥＳＣ集団またはＫＤＲとＰＤＧＦＲＡとの同時発現を特徴とする５日目の心臓中胚葉集団では検出されなかった（図２ａおよびデータ示さず）２。遺伝的に改変されていないＨＥＳ２株から作製したＥＢの解析は、抗ＳＩＲＰＡ抗体を用いたとき、類似の染色パターンを明らかにした。ＳＩＲＰＡ＋細胞は、分化の７〜８日目に初めて検出され、陽性細胞のパーセンテージは、次の２〜４日間にわたって有意に増加した（図２ｂ、図９ｂ）。直接結合体化された抗体（ＳＩＲＰＡ−ＰＥ−ＣＹ７）とビオチン化された抗体（ＳＩＲＰＡ−ｂｉｏ）の両方が、２０日目のＥＢ集団の同様の部分を染色した（図１０ａ〜ｅ）。興味深いことに、２０日目のＥＢにおいて検出されたＳＩＲＰＡ＋細胞は、ＳＩＲＰＡ−集団に見られる細胞よりも実質的に大きいとみられることから（図１０ｆ）、これらの集団の細胞のサイズがフローサイトメトリーによって評価され得ると示唆される。ＳＩＲＰＡ抗体の特異性を確かめるために、本発明者らは、ウエスタンブロット解析、および免疫沈降に続いてウエスタンブロット解析を行った（図１１）。これらの実験は、３つの独立した２０日目のＥＢ由来集団においてＳＩＲＰＡタンパク質の存在を実証したが、未分化なｈＥＳＣには存在しなかった（図１１ａ）。免疫沈降解析は、ＳＩＲＰＡタンパク質に対して以前に記載されたサイズのバンドを明らかにした（図１１ｂ）１１。
【００６２】
フローサイトメトリーによるＳＩＲＰＡとｃＴＮＴとの同時染色は、それらの２つのマーカーの明らかな同時発現を示したことから（図１２ａ／ｂ）、ＳＩＲＰＡが、改変されていないＨＥＳ２細胞株から発生し分化した集団中の心筋細胞系統上で特異的に発現されたと示唆される。
【００６３】
ＲＴ−ｑＰＣＲ解析から、フローサイトメトリーの抗体染色プロファイルを細密に反映したＳＩＲＰＡに対する発現パターンが明らかになった（分化の６〜８日目にＳＩＲＰＡ  ｍＲＮＡがアップレギュレートした後、４２日間の時間経過にわたって発現が持続した）。ＳＩＲＰＡに対するリガンドであるＣＤ４７の発現は、ＳＩＲＰＡに対して観察された発現と対応した（図２ｃ）。ＣＤ４７のフローサイトメトリー解析は、その遺伝子発現パターンを反映し、未分化なＥＳ細胞上および５日目の分化培養物上での低レベルの染色、それに続く８および２０日目の集団全体における広範な染色を示した（データ示さず）。
【００６４】
２０日目のＥＢに由来する単層培養物の免疫蛍光解析から、心臓トロポニンＩ（ｃＴＮＩ）との同時発現を特徴とするもっぱら心筋細胞上でのＳＩＲＰＡの表面発現が明らかになった（図２ｄ）。それぞれのコントロール（ＩｇＧおよび二次抗体のみ）は、いかなるシグナルも示さなかった（データ示さず）。まとめると、これらの動態研究は、ＮＫＸ２−５＋前駆体細胞の出現から始まり、収縮する集団の発生および増殖を通じて続くＳＩＲＰＡの発現が、ｈＥＳＣ分化培養物中の心臓系統を一意的に特徴付けることを示す。
【００６５】
Ｈａｔｔｏｒｉらは、最近、ｍｉｔｏ  ｔｒａｃｋｅｒ色素（ｍｉｔｏ  ｔｒａｃｋｅｒ  ｄｙｅ）の保持によって測定されるミトコンドリア含有量に基づいて心筋細胞を単離することが可能であることを実証した９。ｍｉｔｏ  ｔｒａｃｋｅｒ色素による標識とＳＩＲＰＡ染色との比較から、両方の手順が、２０日目のＥＢ中の同じ心筋細胞集団を標識すると示唆された（図１３ｃ）。しかしながら、その色素が、分化の１２日目にそれほど明確ではない集団を標識し、８日目ではほとんどの細胞を標識しなかったので、その色素保持アプローチは、心臓血管の発生開始の追跡ではそれほど有用でなかった（図１３ａ／ｂ）。対照的に、相当なＳＩＲＰＡ＋集団が、これらの両方の時点において明らかに分離され得ることから、この表面マーカーが、種々の心臓発生段階の細胞をモニターすることおよび単離することを可能にする一方で、ｍｉｔｏ  ｔｒａｃｋｅｒ色素による標識は、比較的成熟した心筋細胞を含む集団に対してのみ使用され得ると示唆される。
【００６６】
ヒト細胞とは対照的に、Ｓｉｒｐａは、抗体染色によってマウスＥＳＣ由来心筋細胞上では検出されなかった（図１４ａ）。その培養物中のＳｉｒｐａ＋集団は、心臓トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）陰性かつＣＤ４５陽性だったことから、それらが造血細胞に相当すると示唆される（図１４ａ／ｂ）。遺伝子発現解析は、フローサイトメトリーデータを裏付け、脳における高発現と比べて、ｍＥＳＣ由来心筋細胞ならびに成体マウスの心房および心室組織における低レベルのＳｉｒｐａ  ｍＲＮＡのみを示した（図１４ｃ）。これらの組織のいずれにおいても、マウスにおける他の公知の唯一のＳｉｒｐファミリーメンバーであるＳｉｒｐｂの発現を、ｑＰＣＲによって検出できなかった（データ示さず）。コントロールおよびＳｉｒｐａ欠損マウス組織のウエスタンブロット解析から、コントロールマウスの脳において高Ｓｉｒｐａ発現が確かめられたが、Ｓｉｒｐａ欠損マウス由来の組織のいずれにおいても確かめられなかった（図１４ｄ）。最も重要なことには、Ｓｉｒｐａの発現は、コントロールマウスの心臓、腎臓またはｍＥＳＣ由来心筋細胞において検出されなかった。マウスおよびヒトについてのＳＩＲＰＡの機能およびタンパク質相同性の差異は、マクロファージと赤血球との相互作用について以前に記載されている１２。
【００６７】
ｈＥＳＣ由来集団からの心筋細胞の精製
心筋細胞の濃縮された集団を作製するためにＳＩＲＰＡ表面レセプターの発現を使用することができるか否かを評価するために、ＳＩＲＰＡ陽性（ＳＩＲＰＡ＋）およびＳＩＲＰＡ陰性（ＳＩＲＰＡ−）の画分を、分化の８、１２および２０日目におけるＨＥＳ２由来ＥＢから細胞選別によって単離し、細胞内フローサイトメトリーによって心臓トロポニンＴ（ｃＴＮＴ）の発現について解析した（図３ａ）。選別前（未選別，ＰＳ）集団の解析は、ｃＴＮＴの発現が、分化中の対応する段階において、ＳＩＲＰＡの発現と密接に対応することを実証した（ＰＳ：ｄ８、ｄ１２、ｄ２０）。選別後、各段階からのＳＩＲＰＡ＋画分は、ｃＴＮＴ＋心筋細胞について高度に濃縮された一方で、ＳＩＲＰＡ−画分では、これらの細胞が枯渇していた。ＳＩＲＰＡ−画分中に存在する少数のｃＴＮＴ＋細胞が、選別手順からの夾雑物であるのか、または真のＳＩＲＰＡ陰性心筋細胞に相当するのかは、不明である。複数の実験におけるＦＡＣＳベースの分離は、有意に濃縮された心筋細胞集団を再現可能にもたらした（ＳＩＲＰＡ＋：８日目（９５．２％±１．９）、１２日目（９４．４％±１．７）、２０日目（８９．６％±３．６）；ＳＩＲＰ−：８日目（１３．０％±２．１）、１２日目（１４．３％±３．９）、２０日目（１５．７％±６．０））（図３ｂ）。ＳＩＲＰＡ＋およびＳＩＲＰＡ−の選別された集団の純度ならびに選別手順からの細胞回収の効率は、図１５および図２０（表１）にまとめられている。
【００６８】
分子解析によって、ＳＩＲＰＡ＋細胞が、ＳＩＲＰＡ−集団よりも有意に高いレベルのＮＫＸ２−５、ＭＹＨ６、ＭＹＨ７およびＭＹＬ７を発現することが明らかになったことから（図３ｃ）、心筋細胞の濃縮がさらに実証された。予想どおり、ＳＩＲＰＡの発現は、ＳＩＲＰＡ＋集団に分離した。心臓マーカーとは対照的に、非筋細胞マーカー（例えば、線維芽細胞マーカーＤＤＲ２およびＴＨＹ１（ＣＤ９０、データ示さず）および内皮マーカーＰＥＣＡＭ（ＣＤ３１））は、ＳＩＲＰＡ−集団においてより高レベルに発現された（図３ｃ）。
【００６９】
ＳＩＲＰＡ−画分とＳＩＲＰＡ＋画分の両方からの細胞は、単層培養物で平板培養されると、数週間にわたって容易に維持され得る生存可能集団を形成した。収縮する細胞は、未選別の集団（ＰＳ）およびＳＩＲＰＡ＋由来集団において検出されたが、ＳＩＲＰＡ−細胞から発生した集団では検出されなかった。免疫組織化学的解析によって、これらの培養物における高い割合の心筋細胞を裏付ける、ＳＩＲＰＡ＋集団における広範なｃＴＮＩ発現が明らかになった。ＳＩＲＰＡ−集団では、ほんのわずかなｃＴＮＩ陽性細胞しか検出されなかった（図３ｄ）。
【００７０】
ＳＩＲＰＡとＮＫＸ２−５−ＧＦＰとの同時発現から予測されるように、抗ＳＩＲＰＡ抗体を用いた選別によってＮＫＸ２−５−ＧＦＰ  ＨＥＳ３由来培養物から心臓系統細胞について濃縮された集団を単離することも可能だった。遺伝子発現およびｃＴＮＴ染色によって定義される心臓前駆体（８日目）および心筋細胞（１２および２０日目）は、ＳＩＲＰＡ＋画分に分離した一方で、ＳＩＲＰＡ−集団では非筋細胞が濃縮された（図１６）。
【００７１】
多数の細胞の迅速な処理を可能にするために、本発明者らは、磁気ビーズ選別によるＳＩＲＰＡ細胞の単離も試みた。このアプローチによるＮＫＸ２−５−ＧＦＰ分化培養物からのＳＩＲＰＡ＋細胞の単離は、ＦＡＣＳ実験から得られた集団と類似の、心筋細胞について高度に濃縮された集団をもたらした（図１７ａ〜ｃ）。しかしながら、この磁気ビーズ選別プロトコルを用いると、このプロセス中に相当量の細胞が失われ、ＦＡＣＳと比べてこのアプローチの効率は低くなる（図１７ｄと図２０（表１）とを比較のこと）。
【００７２】
まとめると、これらの細胞選別研究からの知見は、ＳＩＲＰＡの発現が、ｈＥＳＣに由来する分化培養物中の心臓系統を特徴付けること、および抗ＳＩＲＰＡ抗体を用いた細胞選別が、心筋細胞について高度に濃縮された集団の単離を可能にすることを明らかに実証する。
【００７３】
ヒト人工多能性幹細胞からの心筋細胞の精製
ＳＩＲＰＡの発現が、他のｈＰＳＣ由来集団中の心臓系統を特徴付けるか否かを決定するために、本発明者らは次に、２つの異なるｈｉＰＳＣ株であるＭＳＣ−ｉＰＳ１（Ｙ２−１としても知られる）および３８−２から作製したＥＢを解析した１３，１４。ｃＴＮＴ＋細胞の割合によって実証されるように、両方の株からの心臓分化の効率は低かった（ＭＳＣ−ｉＰＳ１：１２．２％±５．６、３８−２：２６．７％±５．７；図４ａ）。同様の低レベルのＳＩＲＰＡ発現が、両方のＥＢ集団において検出された。両方のｉＰＳＣ株由来のＳＩＲＰＡ＋細胞のＦＡＣＳは、ｃＴＮＴ＋心筋細胞について有意に濃縮された集団をもたらした（ＳＩＲＰＡ＋：ＭＳＣ−ｉＰＳ１（６７．０％±３．６）、３８−２（７１．４％±３．８）；ＳＩＲＰＡ−：ＭＳＣ−ｉＰＳ１（４．９％±２．１）、３８−２（６．２％±０．９））（図４ａ，ｂ）。これらのＳＩＲＰＡ＋集団は、対応するＳＩＲＰＡ−細胞よりも有意に高いレベルのＮＫＸ２−５、ＭＹＨ６、ＭＹＨ７、ＭＹＬ２およびＭＹＬ７を発現した。ｈＥＳＣ由来細胞を用いたときに観察されたように、ＤＤＲ２、ＰＤＧＦＲＢ、ＴＨＹ１およびＮＥＵＲＯＤを含む非筋細胞マーカーは、ＳＩＲＰＡ−画分に分離した（図４ｂ、ｃおよびデータ示さず）。これらのデータは、このプロトコルを用いたときの、心臓系統に効率的に分化しない細胞株を含む一連の多能性幹細胞株から濃縮された心臓集団をもたらすためのこのマーカーの有用性を明らかに実証するものである。
【００７４】
ヒト胎児および成人の心臓細胞におけるＳＩＲＰＡの発現
ＳＩＲＰＡが、初代ヒト心筋細胞上で発現されるか否かを決定するために、本発明者らは次に、ＲＴ−ｑＰＣＲによって胎児（妊娠１８〜２０週）および成人の心臓組織の発現パターンを解析した。図５ａに示されるように、ＳＩＲＰＡ転写物は、すべての胎児由来心臓組織（左心房（ＬＡ）および右心房（ＲＡ）細胞、左心室（ＬＶ）および右心室（ＲＶ）細胞、心尖部（ＡＰ）ならびに房室接合部（ＡＶＪ））において、２０日目のｈＥＳＣ由来細胞に見られるレベルに匹敵するレベルで検出された（図３ａ）。ＳＩＲＰＡは、未分化なｈＥＳＣ（ｄ０）またはコントロールＨＥＫ（ヒト胎児腎）細胞では発現されなかった。胎児の心臓と同様に、成人の心臓においてもＳＩＲＰＡの発現が検出されたことから、その発現が、ヒト心臓発生の種々の段階において心筋細胞を特徴付けると示唆される。高レベルのＳＩＲＰＡが、成人の脳および肺において検出され（図１８ａ）、多くの他の組織では低レベルで見られた。これらの低レベルは、このレセプターを発現すると知られる組織マクロファージの存在を反映し得る１５，１６。ＳＩＲＰＡリガンドであるＣＤ４７が、ほとんどの組織において発現されたことから、以前の研究において記載されたパターンが裏付けられた（図１８ｂ）１５。免疫蛍光染色は、ＳＩＲＰＡが、胎児の心室細胞の表面膜上に局在するが、Ｍｉｔｏ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄで同時染色されなかったことによって示唆されるようにミトコンドリア膜などの他の膜画分上には存在しないことを示した（図５ｂ）。フローサイトメトリー解析から、すべての胎児心臓組織における高い割合のＳＩＲＰＡ＋細胞がそれぞれの画分中のｃＴＮＴ＋細胞のパーセンテージと相関するレベルで明らかになった（図５ｃ、ｄ）。
【００７５】
これらの知見は、ＳＩＲＰＡが、胎児心筋細胞上、ならびに成人心臓において発現されることを明らかに実証し、その心臓特異的発現が、多能性幹細胞に由来する培養物のアーティファクトでないことが実証される。
【００７６】
ｈＰＳＣの分化効率をモニターするためのＳＩＲＰＡ発現の使用
最近、本発明者らは、ＫＤＲとＰＤＧＦＲＡとの同時発現が、ＢＭＰ４およびアクチビンＡで処理した後の心臓中胚葉の誘導をモニターする信頼性のある方法を提供することを報告した２（図６ａ）。この研究は、ＫＤＲ＋ＰＤＧＦＲＡ＋集団の誘導が、心筋細胞集団の発生において必要不可欠な最初の工程であることを示したが、すべてのＫＤＲ＋ＰＤＧＦＲＡ＋集団が分化して心臓系統細胞を生じるわけでなかった（このタイプの集団の例：３０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４および外来性のアクチビンＡなし（Ａ０）によって誘導されたもの）。ＳＩＲＰＡが、分化中の集団の心臓になる潜在能力を初期段階においてより正確に予測し得るか否かを決定するために、本発明者らは、種々の濃度のアクチビンＡおよびＢＭＰ４を用いて誘導された９日目のＥＢにおいてその発現をモニターした（図６ｂ）。同じ集団を、５日目にＫＤＲおよびＰＤＧＦＲＡの発現について（図６ａ）ならびに２０日目にｃＴＮＴの発現について（図６ｃ）評価した。５日目におけるＫＤＲ＋ＰＤＧＦＲＡ＋集団のサイズと２０日目におけるｃＴＮＴ＋細胞の割合との間に相関はほとんどなかったが、９日目における最も大きいＳＩＲＰＡ集団を含む培養物（アクチビンＡ  ６ｎｇ／ｍｌ、ＢＭＰ４  １０ｎｇ／ｍｌ）は、その後の時点において最大数のｃＴＮＴ＋細胞を含んだ。ＳＩＲＰＡの発現は、試験されたほとんどの条件に対するｃＴＮＴの出力（ｏｕｔｐｕｔ）とよく相関し、最も高いレベルのＳＩＲＰＡは、２０日目における最も高い心筋細胞の発生を予測した（図６ｄ）。これらのデータは、９日目におけるＳＩＲＰＡの発現が、心筋細胞になる潜在能力の信頼性のある指標であること、ならびに同様に、ｈＰＳＣが心臓系統に定方向分化するための誘導プロトコルをモニターするためおよび最適化するために使用され得ることを実証する。
【００７７】
非筋細胞系統細胞の枯渇によるｈＰＳＣ由来心筋細胞の濃縮
本発明者らのフローサイトメトリースクリーニングは、心筋細胞を認識する抗体に加えて、分化培養物中の非筋細胞集団を標識する抗体のパネルも同定した。抗ＣＤ９０（ＴＨＹ１、線維芽細胞上で発現される）、抗ＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ１、内皮細胞上で発現される）、抗ＣＤ１４０Ｂ（ＰＤＧＦＲＢ、平滑筋細胞上で発現される）および抗ＣＤ４９Ａ（ＩＮＴＥＧＲＩＮ１Ａ）を含むこの抗体のセットはすべて、２０日目のＨＥＳ２由来ＥＢの種々の割合のＳＩＲＰＡ−集団を認識した（図７ａ／ｄ）。これらの抗体の組み合わせは、培養物中の非筋細胞（ＳＩＲＰＡ−）の大部分を特徴付けた（図７ｃ，選別前）。非筋細胞マーカーを発現している細胞を枯渇させることによって心筋細胞について濃縮することが可能であるか否かを決定するために、本発明者らは、これらの抗体を組み合わせ、２０日目のＥＢを系統陽性（ＬＩＮ＋）および系統陰性（ＬＩＮ−）画分に選別した（図７ｂ）。このアプローチは、いかなる結合した抗体または磁気ビーズも含まない濃縮された集団を作製する際に有利である。予想どおり、ＬＩＮ−集団は、ＳＩＲＰＡ＋細胞について有意に濃縮された一方で、ＬＩＮ＋集団では、心筋細胞が枯渇していた（図７ｃ／ｅ）。ＬＩＮ−およびＬＩＮ＋細胞に対するＦＡＣＳ後の細胞回収の効率は、図２１（表２）にまとめられている。遺伝子発現解析によって、ＰＥＣＡＭ１、ＰＤＧＦＲＢ、ＴＨＹ１およびＤＤＲ２を含む非筋細胞特異的遺伝子が、ＬＩＮ＋画分において主に発現される一方で、心臓遺伝子発現が、ＬＩＮ−画分に限定されることが明らかになった（図７ｆ）。ＬＩＮ−画分は、ゼラチンコートされたディッシュ上に平板培養されるか、または細胞塊として再凝集されると、高い割合の収縮する心筋細胞を含む集団を作製した（データ示さず）。同じ抗体の系統カクテルもまた、ｉＰＳＣ（ＭＳＣ−ｉＰＳ１）由来の２０日目のＥＢ集団の非筋細胞（ＳＩＲＰＡ−）画分を標識したことから（図１９）、この枯渇アプローチが、変動する分化効率を有する種々のＰＳＣ株に適用され得ることが示唆される。
【００７８】
まとめると、これらのデータは、心筋細胞が、非筋細胞（ｎｏｎ−ｍｙｏｃｔｅ）系統の枯渇によってｈＰＳＣ由来分化培養物から濃縮され得ること実証する。ゆえに、この方法は、高度に精製された心筋細胞培養物を得る代替アプローチであることから、いかなる結合した抗体も含まない精製された心筋細胞集団を必要とするストラテジーのために使用され得る。
【００７９】
系統の特異化を制御するシグナル伝達経路に関する本発明者らの理解が進んだことにより、ｈＰＳＣから特定の細胞型への効率的かつ再現性のある定方向分化のためのストラテジーに至った１。心臓系統の発生に関しては、ヒトの心臓に見られる主要な細胞型（心筋細胞、内皮細胞、血管平滑筋細胞および線維芽細胞を含む）に相当する心臓血管の混合集団の発生を促進するプロトコルが確立された。心筋細胞は、代表的には、使用されるＰＳＣ株に応じてそのような混合集団の１０％〜７０％に相当する２，３。そのような混合集団は、予測毒性学５、インビトロにおけるヒト疾患のモデル化１７，１８、および心臓疾患のための移植に基づく治療１９のためのＰＳＣ由来細胞の潜在的な有用性を実証するために使用されているが、最終的には、この潜在性を実用化に移すために、高度に濃縮され、十分に定義された細胞集団が必要とされ得る。
【００８０】
本発明者らがＳＩＲＰＡを心筋細胞特異的マーカーとして同定したことにより、ｈＥＳＣおよびｈｉＰＳＣから高度に濃縮された心筋細胞の集団を容易かつ日常的に入手することがここで初めて可能になる。これらの心筋細胞が濃縮された集団は、ＦＡＣＳまたは磁気ビーズ選別によって単離され得、後者のアプローチは、インビボ研究に必要な多数の細胞の単離を可能にする。簡便な選別アプローチによる高度に濃縮された心筋細胞集団の入手は、明確なハイスループット創薬および毒性学アッセイの開発、患者特異的ｈＰＳＣから得られる細胞の詳細な表現型評価、ならびに移植にとって安全な定義された集団の産生を可能にし得る。ＳＩＲＰＡが、心臓の最も初期の段階から、収縮しかつより成熟した心筋細胞までの心臓系統細胞上で発現されるという事実は、その種々の集団のインビボにおける潜在能力の比較を可能にし得る。
【００８１】
本発明者らのスクリーニングは、ＳＩＲＰＡに加えて、ＰＳＣ由来の心臓血管集団の非筋細胞画分を定義するマーカーのパネルも同定した。使用されたマーカーは、それらの画分が、線維芽細胞（ＣＤ９０、ＴＨＹ１）２０、血管平滑筋細胞（ＣＤ１４０Ｂ、ＰＤＧＦＲＢ）２１および内皮細胞（ＣＤ３１、ＰＥＣＡＭ１）の組み合わせに相当することを示唆する。心筋細胞とともにこれらの各細胞型の濃縮された集団を入手することは、可能であり得る。ＰＳＣ由来心筋細胞に対して提案される用途の多くは、成体の心臓の薬物反応および機能をより正確に反映するために、３次元の創出された組織を必要とし得る。最近の研究から、インビトロまたはインビボにおいて心臓細胞、内皮細胞および線維芽細胞が最も良く機能するためには、それらの細胞の適切な組み合わせが、そのような組織構築物に組み込まれる必要があると示唆されている２２−２４。本発明者らが純粋な筋細胞集団および非筋細胞集団を作製できることによって、様々な割合の異なる細胞型からなる創出された構築物を作製することが可能になり得、ヒト心臓と最も類似の構造的特性および機能的特性を備えた心臓組織を形成するために必要な各々の最適な割合を決定することが可能になり得る。
【００８２】
ＰＳＣ由来集団および胎児心臓組織におけるＳＩＲＰＡの特異的な発現パターンは、このレセプターが、おそらく早くも発生の前駆体段階に、ヒト心筋細胞系統においていくらか機能的な役割を果たすことを示唆する。リガンドであるＣＤ４７の発現が、ＥＢにおいてＳＩＲＰＡと平行してアップレギュレートされ、ＣＤ４７が、その培養物中の高い割合の細胞上に見られるという事実は、このリガンド／レセプター対がヒト心筋細胞の発生および／または機能において役割を果たすという解釈をさらに支持する。ＳＩＲＰＡに対する１つの徹底的に研究された役割は、マクロファージにおけるものであり、それは、リガンドＣＤ４７を発現しない細胞を身体から排除するシグナルを媒介するとみられる１６。ヒト細胞において提唱されている他の唯一の機能は、平滑筋系統におけるものであり、ＳＩＲＰＡは、ＩＧＦ−１によって誘導される分裂促進的なシグナル伝達の媒介において重要な役割を果たすと示されている２５。ＳＩＲＰＡが、マウス心筋細胞において検出されないならば、ヒト細胞におけるその機能は、それらの２種間で異なる心筋細胞の生理学および／または機能の局面に関し得る可能性がある。
【００８３】
要約すると、本明細書中で報告された知見は、ＳＩＲＰＡの発現が、ＰＳＣ分化培養物中の心筋細胞系統を一意的に特徴付けることを実証する。ＦＡＣＳまたは磁気ビーズ選別によるＳＩＲＰＡ＋細胞の単離は、このプロトコルを使用したとき、心臓血管の系統に効率的に分化しない集団を含む、幅広いＰＳＣ株から高度に濃縮された心筋細胞の集団を作製するための簡便なアプローチを提供する。
【００８４】
本発明の好ましい実施形態が本明細書中に記載されてきたが、当業者は、本発明の精神または添付の請求項の範囲から逸脱することなく、それらに対して変更が行われ得ることを理解するだろう。以下の参考文献のリスト中の参考文献を含む、この説明におけるすべての参考文献が、本明細書によって参考として援用される。
【００８５】
【化１】
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【００８６】
【化２】
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【００８７】
【化３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６ａ】
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【図１６ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【外国語明細書】
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