(57)【要約】      （修正有）【課題】耐熱性カビであるタラロマイセス・マクロスポラス、タラロマイセス・トラキスペルマス、ユーペニシリウム・クラスタセウム、ユーペニシリウム・ジャバニカム、ユーペニシリウム・ブレフェルディアナム、ユーペニシリウム・ラピドサム、ビソクラミス・フルバ、ビソクラミス・ニベア、タラロマイセス・ウォルトマニー、ハミゲラ・アベラネア及びハミゲラ・ストリアータを迅速かつ精度高く特異的に検出することを可能とするカビ検出用担体、カビの検出方法、及びカビ検出用キット。【解決手段】特定の塩基配列を有するプローブ（ａ）、ブローブ（ａ）に相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブ（ｂ）、（ａ）又は（ｂ）のプローブに対して相補的な塩基配列を有するプローブ（ｃ）のプローブ群から選択された二以上のプローブを固定化したカビ検出用担体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（a）、（b）、又は（c）に記載の塩基配列を有するプローブ群から選択された二以上のプローブを固定化したことを特徴とするカビ検出用担体。
（a）配列番号１〜４７に示す塩基配列を有するプローブ。
（b）配列番号１〜４７に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブ。
（c）（a）又は（b）のプローブに対して相補的な塩基配列を有するプローブ。
【請求項２】
タラロマイセス・マクロスポラス（Talaromyces  macrosporus）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号２に示す塩基配列を有するプローブからなる第一のプローブ群、
タラロマイセス・トラキスペルマス（Talaromyces  trachyspermus）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号３に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号４に示す塩基配列を有するプローブからなる第二のプローブ群、
ユーペニシリウム・クラスタセウム（Eupenicillium  crustaceum）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号５に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号６〜７に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれかからなる第三のプローブ群、
ユーペニシリウム・ジャバニカム（Eupenicillium  javanicum）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号８に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号９に示す塩基配列を有するプローブからなる第四のプローブ群、
ユーペニシリウム・ブレフェルディアナム（Eupenicillium  brefeldianum）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号８に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号１０〜１５に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれかからなる第五のプローブ群、並びに、
ユーペニシリウム・ラピドサム（Eupenicillium  lapidosum）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１６に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号１７〜１９に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれかからなる第六のプローブ群のプローブを固定化した
ことを特徴とする請求項１記載のカビ検出用担体。
【請求項３】
ビソクラミス・フルバ（Byssochlamys  fulva）を検出するための、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号２０〜２６に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれかからなる第七のプローブ群、及び、
ビソクラミス・ニベア（Byssochlamys  nivea）を検出するための、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号２７〜３３に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれかからなる第八のプローブ群のプローブを固定化した
ことを特徴とする請求項１記載のカビ検出用担体。
【請求項４】
ビソクラミス・フルバ（Byssochlamys  fulva）又はビソクラミス・ニベア（Byssochlamys  nivea）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号３４に示す塩基配列を有するプローブ、及び／又は、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号３５に示す塩基配列を有するプローブからなる第九のプローブ群、
タラロマイセス・ウォルトマニー（Talaromyces  wortmannii）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号３６〜３８に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれか、及び／又は、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号３９〜４２に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれかからなる第十のプローブ群、
ハミゲラ・アベラネア（Hamigera  avellanea）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号４３に示す塩基配列を有するプローブ、及び／又は、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号４４に示す塩基配列を有するプローブからなる第十一のプローブ群、並びに、
ハミゲラ・ストリアータ（Hamigera  striata）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号４５〜４６に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれか、及び／又は、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号４７に示す塩基配列を有するプローブからなる第十二のプローブ群のプローブを固定化した
ことを特徴とする請求項１記載のカビ検出用担体。
【請求項５】
請求項２記載の第一乃至第六のプローブ群のプローブと、請求項３記載の第七乃至第八のプローブ群のプローブと、請求項４記載の第九乃至第十二のプローブ群のプローブを固定化したことを特徴とするカビ検出用担体。
【請求項６】
検出対象のカビのＤＮＡにおける標的領域をＰＣＲにより増幅させて、増幅産物の有無を確認する工程を含むカビの検出方法であって、
ＰＣＲ用反応液に、配列番号５６に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号５７に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるＩＴＳ領域を増幅させるためのプライマーセット、及び、配列番号５８に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号５９に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるβ−チューブリン遺伝子を増幅させるためのプライマーセットと、試料とを含有させ、
前記試料に、タラロマイセス・マクロスポラス（Talaromyces  macrosporus）、タラロマイセス・トラキスペルマス（Talaromyces  trachyspermus）、ユーペニシリウム・クラスタセウム（Eupenicillium  crustaceum）、ユーペニシリウム・ジャバニカム（Eupenicillium  javanicum）、ユーペニシリウム・ブレフェルディアナム（Eupenicillium  brefeldianum）、及びユーペニシリウム・ラピドサム（Eupenicillium  lapidosum）の少なくともいずれかのＤＮＡが含有されている場合、
前記ＰＣＲ用反応液を使用して、前記試料に含有されるＤＮＡにおける標的領域を増幅させ、
得られた増幅産物を、請求項２又は５記載のカビ検出用担体に滴下して、相補的な塩基配列を有するプローブと結合させる
ことを特徴とするカビの検出方法。
【請求項７】
検出対象のカビのＤＮＡにおける標的領域をＰＣＲにより増幅させて、増幅産物の有無を確認する工程を含むカビの検出方法であって、
ＰＣＲ用反応液に、配列番号５８に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号５９に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるβ−チューブリン遺伝子を増幅させるためのプライマーセットと、試料とを含有させ、
前記試料に、ビソクラミス・フルバ（Byssochlamys  fulva）、及びビソクラミス・ニベア（Byssochlamys  nivea）の少なくともいずれかのＤＮＡが含有されている場合、
前記ＰＣＲ用反応液を使用して、前記試料に含有されるＤＮＡにおける標的領域を増幅させ、
得られた増幅産物を、請求項３又は５記載のカビ検出用担体に滴下して、相補的な塩基配列を有するプローブと結合させる
ことを特徴とするカビの検出方法。
【請求項８】
検出対象のカビのＤＮＡにおける標的領域をＰＣＲにより増幅させて、増幅産物の有無を確認する工程を含むカビの検出方法であって、
ＰＣＲ用反応液に、配列番号５６に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号５７に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるＩＴＳ領域を増幅させるためのプライマーセット、及び、配列番号５８に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号５９に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるβ−チューブリン遺伝子を増幅させるためのプライマーセットと、試料とを含有させ、
前記試料に、ビソクラミス・フルバ（Byssochlamys  fulva）、ビソクラミス・ニベア（Byssochlamys  nivea）、タラロマイセス・ウォルトマニー（Talaromyces  wortmannii）、ハミゲラ・アベラネア（Hamigera  avellanea）、及びハミゲラ・ストリアータ（Hamigera  striata）の少なくともいずれかのＤＮＡが含有されている場合、
前記ＰＣＲ用反応液を使用して、前記試料に含有されるＤＮＡにおける標的領域を増幅させ、
得られた増幅産物を、請求項４又は５記載のカビ検出用担体に滴下して、相補的な塩基配列を有するプローブと結合させる
ことを特徴とするカビの検出方法。
【請求項９】
検出対象のカビのＤＮＡにおける標的領域をＰＣＲにより増幅させて、増幅産物の有無を確認する工程を含むカビの検出方法であって、
ＰＣＲ用反応液に、配列番号５６に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号５７に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるＩＴＳ領域を増幅させるためのプライマーセット、及び、配列番号５８に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号５９に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるβ−チューブリン遺伝子を増幅させるためのプライマーセットと、試料とを含有させ、
前記試料に、タラロマイセス・マクロスポラス（Talaromyces  macrosporus）、タラロマイセス・トラキスペルマス（Talaromyces  trachyspermus）、ユーペニシリウム・クラスタセウム（Eupenicillium  crustaceum）、ユーペニシリウム・ジャバニカム（Eupenicillium  javanicum）、ユーペニシリウム・ブレフェルディアナム（Eupenicillium  brefeldianum）、ユーペニシリウム・ラピドサム（Eupenicillium  lapidosum）、ビソクラミス・フルバ（Byssochlamys  fulva）、ビソクラミス・ニベア（Byssochlamys  nivea）、タラロマイセス・ウォルトマニー（Talaromyces  wortmannii）、ハミゲラ・アベラネア（Hamigera  avellanea）、及びハミゲラ・ストリアータ（Hamigera  striata）の少なくともいずれかのＤＮＡが含有されている場合、
前記ＰＣＲ用反応液を使用して、前記試料に含有されるＤＮＡにおける標的領域を増幅させ、
得られた増幅産物を、請求項５記載のカビ検出用担体に滴下して、相補的な塩基配列を有するプローブと結合させる
ことを特徴とするカビの検出方法。
【請求項１０】
検出対象のカビのＤＮＡにおける標的領域を増幅させるためのプライマーセットと、増幅産物の有無を確認するためのプローブが固定された担体を含むカビ検出用キットであって、
前記プライマーセットが、
配列番号５６に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号５７に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるＩＴＳ領域を増幅させるためのプライマーセット、及び、配列番号５８に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号５９に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるβ−チューブリン遺伝子を増幅させるためのプライマーセットを含み、
前記担体が、
タラロマイセス・マクロスポラス（Talaromyces  macrosporus）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号２に示す塩基配列を有するプローブからなる第一のプローブ群、
タラロマイセス・トラキスペルマス（Talaromyces  trachyspermus）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号３に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号４に示す塩基配列を有するプローブからなる第二のプローブ群、
ユーペニシリウム・クラスタセウム（Eupenicillium  crustaceum）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号５に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号６〜７に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれかからなる第三のプローブ群、
ユーペニシリウム・ジャバニカム（Eupenicillium  javanicum）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号８に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号９に示す塩基配列を有するプローブからなる第四のプローブ群、
ユーペニシリウム・ブレフェルディアナム（Eupenicillium  brefeldianum）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号８に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号１０〜１５に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれかからなる第五のプローブ群、並びに、
ユーペニシリウム・ラピドサム（Eupenicillium  lapidosum）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１６に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号１７〜１９に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれかからなる第六のプローブ群のプローブを固定化した
ことを特徴とするカビ検出用キット。
【請求項１１】
検出対象のカビのＤＮＡにおける標的領域を増幅させるためのプライマーセットと、増幅産物の有無を確認するためのプローブが固定された担体を含むカビ検出用キットであって、
前記プライマーセットが、
配列番号５８に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号５９に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるβ−チューブリン遺伝子を増幅させるためのプライマーセットを含み、
前記担体が、
ビソクラミス・フルバ（Byssochlamys  fulva）を検出するための、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号２０〜２６に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれかからなる第七のプローブ群、及び、
ビソクラミス・ニベア（Byssochlamys  nivea）を検出するための、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号２７〜３３に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれかからなる第八のプローブ群のプローブを固定化した
ことを特徴とするカビ検出用キット。
【請求項１２】
検出対象のカビのＤＮＡにおける標的領域を増幅させるためのプライマーセットと、増幅産物の有無を確認するためのプローブが固定された担体を含むカビ検出用キットであって、
前記プライマーセットが、
配列番号５６に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号５７に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるＩＴＳ領域を増幅させるためのプライマーセット、及び、配列番号５８に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号５９に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるβ−チューブリン遺伝子を増幅させるためのプライマーセットを含み、
前記担体が、
ビソクラミス・フルバ（Byssochlamys  fulva）又はビソクラミス・ニベア（Byssochlamys  nivea）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号３４に示す塩基配列を有するプローブ、及び／又は、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号３５に示す塩基配列を有するプローブからなる第九のプローブ群、
タラロマイセス・ウォルトマニー（Talaromyces  wortmannii）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号３６〜３８に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれか、及び／又は、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号３９〜４２に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれかからなる第十のプローブ群、
ハミゲラ・アベラネア（Hamigera  avellanea）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号４３に示す塩基配列を有するプローブ、及び／又は、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号４４に示す塩基配列を有するプローブからなる第十一のプローブ群、並びに、
ハミゲラ・ストリアータ（Hamigera  striata）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号４５〜４６に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれか、及び／又は、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号４７に示す塩基配列を有するプローブからなる第十二のプローブ群のプローブを固定化した
ことを特徴とするカビ検出用キット。
【請求項１３】
検出対象のカビのＤＮＡにおける標的領域を増幅させるためのプライマーセットと、増幅産物の有無を確認するためのプローブが固定された担体を含むカビ検出用キットであって、
前記プライマーセットが、
配列番号５６に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号５７に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるＩＴＳ領域を増幅させるためのプライマーセット、及び、配列番号５８に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号５９に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるβ−チューブリン遺伝子を増幅させるためのプライマーセットを含み、
前記担体が、
タラロマイセス・マクロスポラス（Talaromyces  macrosporus）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号２に示す塩基配列を有するプローブからなる第一のプローブ群、
タラロマイセス・トラキスペルマス（Talaromyces  trachyspermus）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号３に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号４に示す塩基配列を有するプローブからなる第二のプローブ群、
ユーペニシリウム・クラスタセウム（Eupenicillium  crustaceum）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号５に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号６〜７に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれかからなる第三のプローブ群、
ユーペニシリウム・ジャバニカム（Eupenicillium  javanicum）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号８に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号９に示す塩基配列を有するプローブからなる第四のプローブ群、
ユーペニシリウム・ブレフェルディアナム（Eupenicillium  brefeldianum）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号８に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号１０〜１５に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれかからなる第五のプローブ群、
ユーペニシリウム・ラピドサム（Eupenicillium  lapidosum）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１６に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号１７〜１９に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれかからなる第六のプローブ群、
ビソクラミス・フルバ（Byssochlamys  fulva）を検出するための、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号２０〜２６に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれかからなる第七のプローブ群、
ビソクラミス・ニベア（Byssochlamys  nivea）を検出するための、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号２７〜３３に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれかからなる第八のプローブ群、
ビソクラミス・フルバ（Byssochlamys  fulva）又はビソクラミス・ニベア（Byssochlamys  nivea）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号３４に示す塩基配列を有するプローブ、及び／又は、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号３５に示す塩基配列を有するプローブからなる第九のプローブ群、
タラロマイセス・ウォルトマニー（Talaromyces  wortmannii）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号３６〜３８に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれか、及び／又は、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号３９〜４２に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれかからなる第十のプローブ群、
ハミゲラ・アベラネア（Hamigera  avellanea）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号４３に示す塩基配列を有するプローブ、及び／又は、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号４４に示す塩基配列を有するプローブからなる第十一のプローブ群、並びに、
ハミゲラ・ストリアータ（Hamigera  striata）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号４５〜４６に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれか、及び／又は、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号４７に示す塩基配列を有するプローブからなる第十二のプローブ群のプローブを固定化した
ことを特徴とするカビ検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、耐熱性カビを検出するためのカビ検出用担体、カビの検出方法、及びカビ検出用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、食品製造現場や臨床現場、農業現場、文化財保護環境等において、カビなどの微生物が存在するか否かを検査して安全性、健全性を確認するとともに、その繁殖を防止することが重要となっている。
このようなカビの検査では、一般的に、環境中からカビを採取して前培養し、次いで菌種ごとに最適な培地で２０日程度の培養を行った後に、形態的特徴を観察することで、カビを同定する形態観察法（培養法）が行われている（特許文献１参照）。
【０００３】
しかしながら、この方法では、カビ種ごとに分離培養することが必要であるため、検査工程が煩雑になるという問題があった。また、培養に長期間を要するため、例えばヒトが生活する屋内の検査や食物の検査、農業現場での植物病害診断など、迅速性が要求される検査には不適切であるという問題があった。さらに、形態的特徴を表す胞子が形成されないと同定ができず、労力が無駄になってしまう場合があるという問題もあった。
【０００４】
また、最近は、カビの検査において遺伝子を用いた同定法も行われている。例えば、環境中から採取したカビを培養した後、培養されたカビからＤＮＡを抽出して、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法などにより標的領域を増幅し、その増幅産物を解析することで、環境中のカビを同定することが行われている。増幅産物を解析する方法としては、電気泳動によって増幅産物のサイズを分析する方法や、増幅産物と相補的に結合するプローブを固定化したＤＮＡチップを用いる方法などが提案されている（特許文献２、３参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００７−１９５４５４号公報
【特許文献２】特許第５６７０６２３号公報
【特許文献３】特許第５１９６８４８号公報
【特許文献４】特許第５５４８３４５号公報
【特許文献５】特許第５５４８３８５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＤＮＡチップを用いる場合は、まず検出対象のカビのＤＮＡにおける標的領域に特異的に結合するプローブを作成して、ＤＮＡチップに固定化する。そして、環境もしくは製品や植物の検体中から採取したカビを培養して、カビのＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法などによりカビのＤＮＡにおける標的領域を増幅する。さらに、その増幅産物をＤＮＡチップに滴下して、増幅産物をプローブにハイブリダイズさせ、増幅産物に含まれる標識の蛍光強度等を測定することでカビを検出する。
ところで、環境中の検出対象のカビには様々な種類があるため、１個のＤＮＡチップにより複数のカビを同時に検出できることが望ましい。そのためには、ＤＮＡチップ上に複数のカビから選択されたプローブを固定化する必要がある。
【０００７】
一方、プローブにハイブリダイズさせる標的領域の増幅産物は、所定のプライマーセットを用いてＰＣＲ法などにより得られるが、カビの種類によっては、単一の標的領域のみでは偽陽性反応が生じやすいものがあるため、複数のプライマーセットにより、複数の標的領域を同時に増幅させることが望ましい場合がある。また、培養したカビを個別に増幅させるのではなく、複数種類のカビを同時に増幅し、これら複数種類のカビから選択されたプローブを固定化したＤＮＡチップによるカビの検出を行えば、検査の迅速性は向上する。
しかしながら、複数の標的領域を同時に増幅させるマルチプレックスＰＣＲを行う場合には、プローブにもより高い精度で機能するものが求められる。また、同時に増幅させる検出対象のカビの数が増加すれば、プローブに要求される精度は一層高くなる。
【０００８】
本発明者らは、耐熱性カビである、タラロマイセス・マクロスポラス（Talaromyces  macrosporus）、タラロマイセス・トラキスペルマス（Talaromyces  trachyspermus）、ユーペニシリウム・クラスタセウム（Eupenicillium  crustaceum）、ユーペニシリウム・ジャバニカム（Eupenicillium  javanicum）、ユーペニシリウム・ブレフェルディアナム（Eupenicillium  brefeldianum）、ユーペニシリウム・ラピドサム（Eupenicillium  lapidosum）、ビソクラミス・フルバ（Byssochlamys  fulva）、ビソクラミス・ニベア（Byssochlamys  nivea）、タラロマイセス・ウォルトマニー（Talaromyces  wortmannii）、ハミゲラ・アベラネア（Hamigera  avellanea）、及びハミゲラ・ストリアータ（Hamigera  striata）の１１種類を検出対象のカビとし、これらを検出可能なカビ検出用担体を作成するために鋭意研究を行った。
これら複数種類のカビのそれぞれのＤＮＡにおける特定の標的領域のうち、それぞれのカビにのみ特異的に結合する塩基配列を有し、かつ他の種類のカビには結合しない塩基配列を選択してプローブを作成すれば、理論上、各プローブによりこれら複数種類のカビをそれぞれ特異的に検出することが可能である。
【０００９】
しかし、実際にはこのようにして得られたプローブであっても有効に機能するとは限らない。このため、各プローブを作成するためには、実験によってプローブの効果を確認しつつ、試行錯誤を繰り返すことによって、有効に機能するプローブを見いだすことが必要であった。
【００１０】
ここで、タラロマイセス属菌、ビソクラミス属菌、及びハミゲラ属菌のＤＮＡにおける標的領域をＬＡＭＰ法によって増幅させて検出するためのプライマーセットが特許文献４に記載されている。また、これらの菌のＤＮＡにおける標的領域をＰＣＲ法によって増幅させて検出するためのプライマーセットが特許文献５に記載されている。
しかしながら、タラロマイセス・マクロスポラス、タラロマイセス・トラキスペルマス、ユーペニシリウム・クラスタセウム、ユーペニシリウム・ジャバニカム、ユーペニシリウム・ブレフェルディアナム、ユーペニシリウム・ラピドサム、ビソクラミス・フルバ、ビソクラミス・ニベア、タラロマイセス・ウォルトマニー、ハミゲラ・アベラネア、及びハミゲラ・ストリアータの１１種類のカビを、それぞれ精度高く特異的に検出することが可能なプローブを固定化したカビ検出用担体は知られていない。
【００１１】
本発明は、上記事情に鑑みなされたものであり、耐熱性カビであるタラロマイセス・マクロスポラス、タラロマイセス・トラキスペルマス、ユーペニシリウム・クラスタセウム、ユーペニシリウム・ジャバニカム、ユーペニシリウム・ブレフェルディアナム、ユーペニシリウム・ラピドサム、ビソクラミス・フルバ、ビソクラミス・ニベア、タラロマイセス・ウォルトマニー、ハミゲラ・アベラネア、及びハミゲラ・ストリアータの１１種類のカビを、迅速かつ精度高く特異的に検出することが可能なカビ検出用担体、カビの検出方法、及びカビ検出用キットの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記目的を達成するため、本発明のカビ検出用担体は、以下の（a）、（b）、又は（c）に記載の塩基配列を有するプローブ群から選択された二以上のプローブを固定化したことを特徴とするカビ検出用担体としてある。
（a）配列番号１〜４７に示す塩基配列を有するプローブ。
（b）配列番号１〜４７に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブ。
（c）（a）又は（b）のプローブに対して相補的な塩基配列を有するプローブ。
【００１３】
また、本発明のカビ検出用担体は、タラロマイセス・マクロスポラス（Talaromyces  macrosporus）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号２に示す塩基配列を有するプローブからなる第一のプローブ群、タラロマイセス・トラキスペルマス（Talaromyces  trachyspermus）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号３に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号４に示す塩基配列を有するプローブからなる第二のプローブ群、ユーペニシリウム・クラスタセウム（Eupenicillium  crustaceum）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号５に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号６〜７に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれかからなる第三のプローブ群、ユーペニシリウム・ジャバニカム（Eupenicillium  javanicum）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号８に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号９に示す塩基配列を有するプローブからなる第四のプローブ群、ユーペニシリウム・ブレフェルディアナム（Eupenicillium  brefeldianum）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号８に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号１０〜１５に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれかからなる第五のプローブ群、並びに、ユーペニシリウム・ラピドサム（Eupenicillium  lapidosum）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１６に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号１７〜１９に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれかからなる第六のプローブ群のプローブを固定化した構成とすることが好ましい。
【００１４】
また、本発明のカビ検出用担体は、ビソクラミス・フルバ（Byssochlamys  fulva）を検出するための、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号２０〜２６に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれかからなる第七のプローブ群、及び、ビソクラミス・ニベア（Byssochlamys  nivea）を検出するための、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号２７〜３３に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれかからなる第八のプローブ群のプローブを固定化した構成とすることが好ましい。
【００１５】
また、本発明のカビ検出用担体は、ビソクラミス・フルバ（Byssochlamys  fulva）又はビソクラミス・ニベア（Byssochlamys  nivea）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号３４に示す塩基配列を有するプローブ、及び／又は、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号３５に示す塩基配列を有するプローブからなる第九のプローブ群、タラロマイセス・ウォルトマニー（Talaromyces  wortmannii）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号３６〜３８に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれか、及び／又は、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号３９〜４２に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれかからなる第十のプローブ群、ハミゲラ・アベラネア（Hamigera  avellanea）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号４３に示す塩基配列を有するプローブ、及び／又は、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号４４に示す塩基配列を有するプローブからなる第十一のプローブ群、並びに、ハミゲラ・ストリアータ（Hamigera  striata）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号４５〜４６に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれか、及び／又は、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号４７に示す塩基配列を有するプローブからなる第十二のプローブ群のプローブを固定化した構成とすることが好ましい。
【００１６】
また、本発明のカビ検出用担体は、上記第一乃至第六のプローブ群のプローブと、上記第七乃至第八のプローブ群のプローブと、上記第九乃至第十二のプローブ群のプローブを固定化した構成とすることが好ましい。
【００１７】
また、本発明のカビの検出方法は、検出対象のカビのＤＮＡにおける標的領域をＰＣＲにより増幅させて、増幅産物の有無を確認する工程を含むカビの検出方法であって、ＰＣＲ用反応液に、配列番号５６に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号５７に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるＩＴＳ領域を増幅させるためのプライマーセット、及び、配列番号５８に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号５９に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるβ−チューブリン遺伝子を増幅させるためのプライマーセットと、試料とを含有させ、前記試料に、タラロマイセス・マクロスポラス（Talaromyces  macrosporus）、タラロマイセス・トラキスペルマス（Talaromyces  trachyspermus）、ユーペニシリウム・クラスタセウム（Eupenicillium  crustaceum）、ユーペニシリウム・ジャバニカム（Eupenicillium  javanicum）、ユーペニシリウム・ブレフェルディアナム（Eupenicillium  brefeldianum）、及びユーペニシリウム・ラピドサム（Eupenicillium  lapidosum）の少なくともいずれかのＤＮＡが含有されている場合、前記ＰＣＲ用反応液を使用して、前記試料に含有されるＤＮＡにおける標的領域を増幅させ、得られた増幅産物を、これらの菌を検出するためのプローブが固定化された上記カビ検出用担体に滴下して、相補的な塩基配列を有するプローブと結合させる方法としてある。
【００１８】
また、本発明のカビの検出方法は、検出対象のカビのＤＮＡにおける標的領域をＰＣＲにより増幅させて、増幅産物の有無を確認する工程を含むカビの検出方法であって、ＰＣＲ用反応液に、配列番号５８に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号５９に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるβ−チューブリン遺伝子を増幅させるためのプライマーセットと、試料とを含有させ、前記試料に、ビソクラミス・フルバ（Byssochlamys  fulva）、及びビソクラミス・ニベア（Byssochlamys  nivea）の少なくともいずれかのＤＮＡが含有されている場合、前記ＰＣＲ用反応液を使用して、前記試料に含有されるＤＮＡにおける標的領域を増幅させ、得られた増幅産物を、これらの菌を検出するためのプローブが固定化された上記カビ検出用担体に滴下して、相補的な塩基配列を有するプローブと結合させる方法としてある。
【００１９】
また、本発明のカビの検出方法は、検出対象のカビのＤＮＡにおける標的領域をＰＣＲにより増幅させて、増幅産物の有無を確認する工程を含むカビの検出方法であって、ＰＣＲ用反応液に、配列番号５６に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号５７に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるＩＴＳ領域を増幅させるためのプライマーセット、及び、配列番号５８に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号５９に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるβ−チューブリン遺伝子を増幅させるためのプライマーセットと、試料とを含有させ、前記試料に、ビソクラミス・フルバ（Byssochlamys  fulva）、ビソクラミス・ニベア（Byssochlamys  nivea）、タラロマイセス・ウォルトマニー（Talaromyces  wortmannii）、ハミゲラ・アベラネア（Hamigera  avellanea）、及びハミゲラ・ストリアータ（Hamigera  striata）の少なくともいずれかのＤＮＡが含有されている場合、前記ＰＣＲ用反応液を使用して、前記試料に含有されるＤＮＡにおける標的領域を増幅させ、得られた増幅産物を、これらの菌を検出するためのプローブが固定化された上記カビ検出用担体に滴下して、相補的な塩基配列を有するプローブと結合させる方法としてある。
【００２０】
また、本発明のカビの検出方法は、検出対象のカビのＤＮＡにおける標的領域をＰＣＲにより増幅させて、増幅産物の有無を確認する工程を含むカビの検出方法であって、ＰＣＲ用反応液に、配列番号５６に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号５７に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるＩＴＳ領域を増幅させるためのプライマーセット、及び、配列番号５８に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号５９に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるβ−チューブリン遺伝子を増幅させるためのプライマーセットと、試料とを含有させ、前記試料に、タラロマイセス・マクロスポラス（Talaromyces  macrosporus）、タラロマイセス・トラキスペルマス（Talaromyces  trachyspermus）、ユーペニシリウム・クラスタセウム（Eupenicillium  crustaceum）、ユーペニシリウム・ジャバニカム（Eupenicillium  javanicum）、ユーペニシリウム・ブレフェルディアナム（Eupenicillium  brefeldianum）、ユーペニシリウム・ラピドサム（Eupenicillium  lapidosum）、ビソクラミス・フルバ（Byssochlamys  fulva）、ビソクラミス・ニベア（Byssochlamys  nivea）、タラロマイセス・ウォルトマニー（Talaromyces  wortmannii）、ハミゲラ・アベラネア（Hamigera  avellanea）、及びハミゲラ・ストリアータ（Hamigera  striata）の少なくともいずれかのＤＮＡが含有されている場合、前記ＰＣＲ用反応液を使用して、前記試料に含有されるＤＮＡにおける標的領域を増幅させ、得られた増幅産物を、これらの菌を検出するためのプローブが固定化された上記カビ検出用担体に滴下して、相補的な塩基配列を有するプローブと結合させる方法としてある。
【００２１】
また、本発明のカビ検出用キットは、検出対象のカビのＤＮＡにおける標的領域を増幅させるためのプライマーセットと、増幅産物の有無を確認するためのプローブが固定された担体を含むカビ検出用キットであって、前記プライマーセットが、配列番号５６に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号５７に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるＩＴＳ領域を増幅させるためのプライマーセット、及び、配列番号５８に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号５９に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるβ−チューブリン遺伝子を増幅させるためのプライマーセットを含み、前記担体が、タラロマイセス・マクロスポラス（Talaromyces  macrosporus）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号２に示す塩基配列を有するプローブからなる第一のプローブ群、タラロマイセス・トラキスペルマス（Talaromyces  trachyspermus）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号３に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号４に示す塩基配列を有するプローブからなる第二のプローブ群、ユーペニシリウム・クラスタセウム（Eupenicillium  crustaceum）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号５に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号６〜７に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれかからなる第三のプローブ群、ユーペニシリウム・ジャバニカム（Eupenicillium  javanicum）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号８に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号９に示す塩基配列を有するプローブからなる第四のプローブ群、ユーペニシリウム・ブレフェルディアナム（Eupenicillium  brefeldianum）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号８に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号１０〜１５に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれかからなる第五のプローブ群、並びに、ユーペニシリウム・ラピドサム（Eupenicillium  lapidosum）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１６に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号１７〜１９に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれかからなる第六のプローブ群のプローブを固定化した構成としてある。
【００２２】
また、本発明のカビ検出用キットは、検出対象のカビのＤＮＡにおける標的領域を増幅させるためのプライマーセットと、増幅産物の有無を確認するためのプローブが固定された担体を含むカビ検出用キットであって、前記プライマーセットが、配列番号５８に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号５９に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるβ−チューブリン遺伝子を増幅させるためのプライマーセットを含み、前記担体が、ビソクラミス・フルバ（Byssochlamys  fulva）を検出するための、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号２０〜２６に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれかからなる第七のプローブ群、及び、ビソクラミス・ニベア（Byssochlamys  nivea）を検出するための、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号２７〜３３に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれかからなる第八のプローブ群のプローブを固定化した構成としてある。
【００２３】
また、本発明のカビ検出用キットは、検出対象のカビのＤＮＡにおける標的領域を増幅させるためのプライマーセットと、増幅産物の有無を確認するためのプローブが固定された担体を含むカビ検出用キットであって、前記プライマーセットが、配列番号５６に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号５７に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるＩＴＳ領域を増幅させるためのプライマーセット、及び、配列番号５８に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号５９に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるβ−チューブリン遺伝子を増幅させるためのプライマーセットを含み、前記担体が、ビソクラミス・フルバ（Byssochlamys  fulva）又はビソクラミス・ニベア（Byssochlamys  nivea）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号３４に示す塩基配列を有するプローブ、及び／又は、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号３５に示す塩基配列を有するプローブからなる第九のプローブ群、タラロマイセス・ウォルトマニー（Talaromyces  wortmannii）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号３６〜３８に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれか、及び／又は、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号３９〜４２に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれかからなる第十のプローブ群、ハミゲラ・アベラネア（Hamigera  avellanea）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号４３に示す塩基配列を有するプローブ、及び／又は、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号４４に示す塩基配列を有するプローブからなる第十一のプローブ群、並びに、ハミゲラ・ストリアータ（Hamigera  striata）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号４５〜４６に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれか、及び／又は、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号４７に示す塩基配列を有するプローブからなる第十二のプローブ群のプローブを固定化した構成としてある。
【００２４】
また、本発明のカビ検出用キットは、検出対象のカビのＤＮＡにおける標的領域を増幅させるためのプライマーセットと、増幅産物の有無を確認するためのプローブが固定された担体を含むカビ検出用キットであって、前記プライマーセットが、配列番号５６に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号５７に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるＩＴＳ領域を増幅させるためのプライマーセット、及び、配列番号５８に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号５９に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるβ−チューブリン遺伝子を増幅させるためのプライマーセットを含み、前記担体が、タラロマイセス・マクロスポラス（Talaromyces  macrosporus）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号２に示す塩基配列を有するプローブからなる第一のプローブ群、タラロマイセス・トラキスペルマス（Talaromyces  trachyspermus）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号３に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号４に示す塩基配列を有するプローブからなる第二のプローブ群、ユーペニシリウム・クラスタセウム（Eupenicillium  crustaceum）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号５に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号６〜７に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれかからなる第三のプローブ群、ユーペニシリウム・ジャバニカム（Eupenicillium  javanicum）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号８に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号９に示す塩基配列を有するプローブからなる第四のプローブ群、ユーペニシリウム・ブレフェルディアナム（Eupenicillium  brefeldianum）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号８に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号１０〜１５に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれかからなる第五のプローブ群、ユーペニシリウム・ラピドサム（Eupenicillium  lapidosum）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１６に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号１７〜１９に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれかからなる第六のプローブ群、ビソクラミス・フルバ（Byssochlamys  fulva）を検出するための、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号２０〜２６に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれかからなる第七のプローブ群、ビソクラミス・ニベア（Byssochlamys  nivea）を検出するための、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号２７〜３３に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれかからなる第八のプローブ群、ビソクラミス・フルバ（Byssochlamys  fulva）又はビソクラミス・ニベア（Byssochlamys  nivea）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号３４に示す塩基配列を有するプローブ、及び／又は、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号３５に示す塩基配列を有するプローブからなる第九のプローブ群、タラロマイセス・ウォルトマニー（Talaromyces  wortmannii）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号３６〜３８に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれか、及び／又は、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号３９〜４２に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれかからなる第十のプローブ群、ハミゲラ・アベラネア（Hamigera  avellanea）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号４３に示す塩基配列を有するプローブ、及び／又は、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号４４に示す塩基配列を有するプローブからなる第十一のプローブ群、並びに、ハミゲラ・ストリアータ（Hamigera  striata）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号４５〜４６に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれか、及び／又は、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号４７に示す塩基配列を有するプローブからなる第十二のプローブ群のプローブを固定化した構成としてある。
【００２５】
なお、本明細書及び特許請求の範囲において、「プローブ群」は、プローブの集合を意味しており、複数のプローブからなる場合のみを意味するものではなく、一のプローブからなるものを含めてプローブ群と称している。
【発明の効果】
【００２６】
本発明によれば、耐熱性カビであるタラロマイセス・マクロスポラス、タラロマイセス・トラキスペルマス、ユーペニシリウム・クラスタセウム、ユーペニシリウム・ジャバニカム、ユーペニシリウム・ブレフェルディアナム、ユーペニシリウム・ラピドサム、ビソクラミス・フルバ、ビソクラミス・ニベア、タラロマイセス・ウォルトマニー、ハミゲラ・アベラネア、及びハミゲラ・ストリアータを、迅速かつ精度高く特異的に検出することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本発明の実施形態に係るカビ検出用担体に固定化されるプローブ（検出対象のカビ：タラロマイセス・マクロスポラス（１），タラロマイセス・トラキスペルマス（２），ユーペニシリウム・クラスタセウム（３），ユーペニシリウム・ジャバニカム（４），ユーペニシリウム・ブレフェルディアナム（５），ユーペニシリウム・ラピドサム（６））の塩基配列を示す図である。
【図２】本発明の実施形態に係るカビ検出用担体に固定化されるプローブ（検出対象のカビ：ビソクラミス・フルバ（７），ビソクラミス・ニベア（８））の塩基配列を示す図である。
【図３】本発明の実施形態に係るカビ検出用担体に固定化されるプローブ（検出対象のカビ：ビソクラミス・フルバ（７），ビソクラミス・ニベア（８），タラロマイセス・ウォルトマニー（９），ハミゲラ・アベラネア（１０），ハミゲラ・ストリアータ（１１））の塩基配列を示す図である。
【図４】本発明の実施形態に係るカビ検出用担体に固定化できるプローブ（検出対象のカビ：ネオサルトリア・フィッシェリ（１２），ユーロチウム・チェバリエリ（１３），ペシロマイセス・バリオッティ（１４），ペシロマイセス・リラシナス（１５））の塩基配列を示す図である。
【図５】本発明の実施形態に係るカビ検出用担体により検出する対象のカビの標的領域を増幅させるためのプライマーの塩基配列を示す図である。
【図６】本発明の実施形態に係るカビ検出用担体に固定化したプローブ（検出対象のカビ：タラロマイセス・マクロスポラス（１），タラロマイセス・トラキスペルマス（２），ユーペニシリウム・クラスタセウム（３），ユーペニシリウム・ジャバニカム（４），ユーペニシリウム・ブレフェルディアナム（５），ユーペニシリウム・ラピドサム（６））について検出された蛍光強度のＳ／Ｎ比値を示す図である。
【図７】本発明の実施形態に係るカビ検出用担体に固定化したプローブ（検出対象のカビ：ビソクラミス・フルバ（７），ビソクラミス・ニベア（８））について検出された蛍光強度のＳ／Ｎ比値を示す図である。
【図８】本発明の実施形態に係るカビ検出用担体に固定化したプローブ（検出対象のカビ：ビソクラミス・フルバ（７），ビソクラミス・ニベア（８），タラロマイセス・ウォルトマニー（９），ハミゲラ・アベラネア（１０），ハミゲラ・ストリアータ（１１））について検出された蛍光強度のＳ／Ｎ比値を示す図である。
【図９】本発明の実施形態に係るカビ検出用担体に固定化したプローブ（検出対象のカビ：ネオサルトリア・フィッシェリ（１２），ユーロチウム・チェバリエリ（１３），ペシロマイセス・バリオッティ（１４），ペシロマイセス・リラシナス（１５））について検出された蛍光強度のＳ／Ｎ比値を示す図である。
【図１０】本発明の実施形態に係るカビ検出用担体により検出する対象のカビを５種類ずつ含めた試料と各検出対象のカビに対応するプローブの配列番号を示す図である。
【図１１】本発明の実施形態に係るカビ検出用担体により検出する対象のカビを５種類ずつ含めた試料について検出されたプローブ毎の蛍光強度のＳ／Ｎ比値を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下、本発明のカビ検出用担体、カビの検出方法、及びカビ検出用キットの一実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は、以下の本実施形態及び後述する実施例の具体的な内容に限定されるものではない。
【００２９】
［カビ検出用担体］
（検出対象カビ）
本実施形態のカビ検出用担体により検出する対象のカビは、耐熱性カビである、タラロマイセス・マクロスポラス（Talaromyces  macrosporus）、タラロマイセス・トラキスペルマス（Talaromyces  trachyspermus）、ユーペニシリウム・クラスタセウム（Eupenicillium  crustaceum）、ユーペニシリウム・ジャバニカム（Eupenicillium  javanicum）、ユーペニシリウム・ブレフェルディアナム（Eupenicillium  brefeldianum）、ユーペニシリウム・ラピドサム（Eupenicillium  lapidosum）、ビソクラミス・フルバ（Byssochlamys  fulva）、ビソクラミス・ニベア（Byssochlamys  nivea）、タラロマイセス・ウォルトマニー（Talaromyces  wortmannii）、ハミゲラ・アベラネア（Hamigera  avellanea）、及びハミゲラ・ストリアータ（Hamigera  striata）の１１種類である。
【００３０】
これらの耐熱性カビは、子嚢果などの厚い殻の中に胞子を保持することによって、７５℃で３０分間の加熱処理を行っても生残することができる。耐熱性カビは、低温殺菌では完全な殺滅が困難であることから、食品や環境中においてこれらのカビの存在の有無を確認可能にすることが望ましい。
【００３１】
（プローブ）
本実施形態の対象カビを検出するためのプローブは、図１〜図３に示す配列番号１〜４７によりそれぞれ特定される塩基配列からなる核酸断片である。
配列番号１に示す塩基配列からなるプローブは、タラロマイセス・マクロスポラスを検出するためのＩＴＳ領域から選択されたプローブであり、配列番号２に示す塩基配列からなるプローブは、同カビを検出するためのβ−チューブリン遺伝子から選択されたプローブである。
【００３２】
配列番号３に示す塩基配列からなるプローブは、タラロマイセス・トラキスペルマスを検出するためのＩＴＳ領域から選択されたプローブであり、配列番号４に示す塩基配列からなるプローブは、同カビを検出するためのβ−チューブリン遺伝子から選択されたプローブである。
【００３３】
配列番号５に示す塩基配列からなるプローブは、ユーペニシリウム・クラスタセウムを検出するためのＩＴＳ領域から選択されたプローブであり、配列番号６〜７に示す塩基配列からなるプローブは、同カビを検出するためのβ−チューブリン遺伝子から選択されたプローブである。
【００３４】
配列番号８に示す塩基配列からなるプローブは、ユーペニシリウム・ジャバニカムを検出するためのＩＴＳ領域から選択されたプローブであり、配列番号９に示す塩基配列からなるプローブは、同カビを検出するためのβ−チューブリン遺伝子から選択されたプローブである。
【００３５】
配列番号８に示す塩基配列からなるプローブは、ユーペニシリウム・ブレフェルディアナムを検出するためのＩＴＳ領域から選択されたプローブでもあり、配列番号１０〜１５に示す塩基配列からなるプローブは、同カビを検出するためのβ−チューブリン遺伝子から選択されたプローブである。
【００３６】
配列番号１６に示す塩基配列からなるプローブは、ユーペニシリウム・ラピドサムを検出するためのＩＴＳ領域から選択されたプローブであり、配列番号１７〜１９に示す塩基配列からなるプローブは、同カビを検出するためのβ−チューブリン遺伝子から選択されたプローブである。
【００３７】
配列番号２０〜２６に示す塩基配列からなるプローブは、ビソクラミス・フルバを検出するためのβ−チューブリン遺伝子から選択されたプローブである。
また、配列番号２７〜３３に示す塩基配列からなるプローブは、ビソクラミス・ニベアを検出するためのβ−チューブリン遺伝子から選択されたプローブである。
【００３８】
配列番号３４に示す塩基配列からなるプローブは、ビソクラミス・フルバ又はビソクラミス・ニベアを検出するためのＩＴＳ領域から選択されたプローブであり、配列番号３５に示す塩基配列からなるプローブは、同カビを検出するためのβ−チューブリン遺伝子から選択されたプローブである。
【００３９】
配列番号３６〜３８に示す塩基配列からなるプローブは、タラロマイセス・ウォルトマニーを検出するためのＩＴＳ領域から選択されたプローブであり、配列番号３９〜４２に示す塩基配列からなるプローブは、同カビを検出するためのβ−チューブリン遺伝子から選択されたプローブである。
【００４０】
配列番号４３に示す塩基配列からなるプローブは、ハミゲラ・アベラネアを検出するためのＩＴＳ領域から選択されたプローブであり、配列番号４４に示す塩基配列からなるプローブは、同カビを検出するためのβ−チューブリン遺伝子から選択されたプローブである。
【００４１】
配列番号４５〜４６に示す塩基配列からなるプローブは、ハミゲラ・ストリアータを検出するためのＩＴＳ領域から選択されたプローブであり、配列番号４７に示す塩基配列からなるプローブは、同カビを検出するためのβ−チューブリン遺伝子から選択されたプローブである。
【００４２】
なお、図４に示す配列番号４８に示す塩基配列からなるプローブは、ネオサルトリア・フィッシェリ（Neosartorya  fischeri）を検出するためのＩＴＳ領域から選択されたプローブであり、配列番号４９に示す塩基配列からなるプローブは、同カビを検出するためのβ−チューブリン遺伝子から選択されたプローブである。また、同図に示す配列番号５０に示す塩基配列からなるプローブは、ユーロチウム・チェバリエリ（Eurotium  chevalieri）を検出するためのＩＴＳ領域から選択されたプローブであり、配列番号５１に示す塩基配列からなるプローブは、同カビを検出するためのβ−チューブリン遺伝子から選択されたプローブである。また、同図に示す配列番号５２に示す塩基配列からなるプローブは、ペシロマイセス・バリオッティ（Paecilomyces  variotii）、又はそのテレオモルフ型であるタラロマイセス・スペクタブリス（Talaromyces  spectablis）を検出するためのＩＴＳ領域から選択されたプローブであり、配列番号５３に示す塩基配列からなるプローブは、同カビを検出するためのβ−チューブリン遺伝子から選択されたプローブである。また、同図に示す配列番号５４に示す塩基配列からなるプローブは、ペシロマイセス・リラシナス（Paecilomyces  lilacinus）を検出するためのＩＴＳ領域から選択されたプローブであり、配列番号５５に示す塩基配列からなるプローブは、同カビを検出するためのβ−チューブリン遺伝子から選択されたプローブである。本実施形態のカビ検出用担体において、これらのプローブを固定化しても良い。
【００４３】
本実施形態のカビ検出用担体では、上記の通り、プローブとして、カビのゲノムＤＮＡにおけるＩＴＳ領域及び／又はβ−チューブリン遺伝子から選択されたものを用いている。
具体的には、以下の検出タイプ（Ａ）のカビについては、ＩＴＳ領域及びβ−チューブリン遺伝子から選択されたプローブの両方を用いて、これらの両方において陽性反応が得られた場合のみに当該カビが検出されたと判定する。これらのカビについては、このようにすることで、偽陽性反応にもとづく過誤判断のリスクを低減することが可能となっている。
【００４４】
検出タイプ（Ａ）：以下の６種類
タラロマイセス・マクロスポラス，タラロマイセス・トラキスペルマス、ユーペニシリウム・クラスタセウム、ユーペニシリウム・ジャバニカム、ユーペニシリウム・ブレフェルディアナム，ユーペニシリウム・ラピドサム
【００４５】
検出タイプ（Ｂ）のカビについては、β−チューブリン遺伝子のみから選択されたプローブにおいて陽性反応が得られた場合に、当該カビが存在していると判定することができる。これらのカビのβ−チューブリン遺伝子から選択されたプローブは特異性が高く、偽陽性反応が比較的生じにくいため、これらのカビについては、β−チューブリン遺伝子のみから選択されたプローブを用いて検出を行うことが可能となっている。
【００４６】
検出タイプ（Ｂ）：以下の２種類
ビソクラミス・フルバ，ビソクラミス・ニベア
【００４７】
検出タイプ（Ｃ）のカビについては、少なくともＩＴＳ領域又はβ−チューブリン遺伝子から選択されたプローブのいずれかにおいて陽性反応が得られた場合に、当該カビが存在していると判定することができる。これらのカビには、本実施形態のカビ検出用担体におけるＩＴＳ領域から選択されたプローブ又はβ−チューブリン遺伝子から選択されたプローブの一方でしか検出できない場合のあるものが含まれるが、それぞれのプローブの特異性は高く、偽陽性反応を生じることなく検出することが可能となっている。
【００４８】
検出タイプ（Ｃ）：以下の５種類
ビソクラミス・フルバ，ビソクラミス・ニベア，タラロマイセス・ウォルトマニー，ハミゲラ・アベラネア，ハミゲラ・ストリアータ
【００４９】
以上の通り、本実施形態のカビ検出用担体によれば、カビの種類毎に検出に用いるプローブの組み合わせを適切に設定することで、検出の精度をより向上させることが可能になっている。なお、ビソクラミス・フルバとビソクラミス・ニベアについては、上記の通り、検出タイプＢで使用するプローブの他、検出タイプＣで使用するプローブも作成した。
【００５０】
したがって、本実施形態のカビ検出用担体によれば、検出タイプＡのカビについては、上記のＩＴＳ領域及びβ−チューブリン遺伝子から選択されたプローブを共に固定化して、両方のプローブが陽性を示した場合に、検出対象のカビが存在すると判定することができる。また、検出タイプＢのカビについては、上記のβ−チューブリン遺伝子のみから選択されたプローブを固定化し、当該プローブが陽性を示した場合に、検出対象のカビが存在すると判定することができる。さらに、検出タイプＣのカビについては、上記のＩＴＳ領域及びβ−チューブリン遺伝子から選択されたプローブを共に固定化することが好ましく、少なくともいずれか一方のプローブが陽性を示した場合に、検出対象のカビが存在すると判定することができる。
【００５１】
（プローブの合成）
本実施形態のカビ検出用担体に固定化される上記プローブは、いずれも２１〜３４塩基程度の長さであり、一般的なＤＮＡ合成装置により合成できる。後述する実施例でカビ検出用担体に固定化した配列番号１〜５５に示す塩基配列からなるプローブは、いずれもＤＮＡ合成装置により合成したものを使用した。なお、後述する実施例でＰＣＲに用いた配列番号５６〜５９に示す塩基配列からなるプライマーも１９〜２６塩基程度の長さであり、ＤＮＡ合成装置により合成したものを使用した。
【００５２】
また、本実施形態における配列番号１〜５５に示す塩基配列からなるプローブは、当該配列そのものに限定されず、配列番号１〜５５に示す塩基配列において１又は数個の塩基が欠失、置換又は付加されたプローブを用いることができる。また、配列番号１〜５５に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブを用いることもできる。また、これらのプローブや、配列番号１〜５５に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列を有するプローブを用いることもできる。
【００５３】
なお、ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡに対して高い相同性（相同性が９０％以上、好ましくは９５％以上）を有するＤＮＡが、配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ハイブリダイズする条件が挙げられる。通常、完全ハイブリッドの溶解温度（Ｔｍ）より約５℃〜約３０℃、好ましくは約１０℃〜約２５℃低い温度でハイブリダイゼーションが起こる場合をいう。ストリンジェントな条件については、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、特に11.45節「Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｒｏｂｅｓ」に記載されている条件等を使用することができる。
【００５４】
なお、図５に示す配列番号５６〜５９の塩基配列からなる各プライマー（配列番号５６及び５７のプライマーセット、配列番号５８及び５９のプライマーセットにおける各プライマー）についても同様に、当該配列そのものに限定されず、配列番号５６〜５９に示す塩基配列において１又は数個の塩基が欠失、置換又は付加されたプライマーであって、配列番号５６〜５９に示す塩基配列からなるプライマーを用いた場合と同一の領域を増幅できるものを用いることもできる。また、配列番号５６〜５９に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対して特異的にアニーリングできる核酸断片からなるプライマーであって、配列番号５６〜５９に示す塩基配列からなるプライマーを用いた場合と同一の領域を増幅できるものを用いることもできる。
【００５５】
（カビ検出用担体の作成）
本実施形態のカビ検出用担体は、配列番号１〜４７に示す塩基配列を有するプローブを用いて、既存の一般的な方法で製造することができる。
例えば、本実施形態のカビ検出用担体として貼り付け型のＤＮＡチップを作成する場合は、ＤＮＡスポッターによりプローブをガラス基板上に固定化して、各プローブに対応するスポットを形成することにより作成することができる。また、合成型ＤＮＡチップを作成する場合は、光リソグラフィ技術により、ガラス基板上で上記配列を備えた一本鎖オリゴＤＮＡを合成することにより作成することができる。さらに、基板はガラス製に限定されず、プラスチック基板やシリコンウエハー等を用いることもできる。また、基板の形状は平板状のものに限定されず、様々な立体形状のものとすることもでき、その表面に化学反応が可能となるように官能基を導入したものなどを用いることもできる。
【００５６】
本実施形態のカビ検出用担体は、配列番号１〜４７に示す塩基配列を有するプローブの全部又は一部を固定化したものとすることができる。
また、本実施形態のカビ検出用担体は、上記検出タイプ（Ａ），（Ｂ），（Ｃ）毎に、それぞれのグループのカビを検出するためのプローブを固定化したものとすることができる。また、その他の数種類ずつのカビからなるグループ毎に、それぞれのグループのカビを検出するためのプローブを固定化したものとすることもできる。
さらに、本実施形態のカビ検出用担体は、配列番号１〜４７に示す塩基配列において１又は数個の塩基が欠失、置換又は付加されたプローブの全部又は一部を固定化したものとすることも、配列番号１〜４７に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブの全部又は一部を固定化したものとすることもでき、これらのプローブ又は配列番号１〜４７に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列を有するプローブの全部又は一部を固定化したものとすることもできる。
【００５７】
［カビの検出方法］
本実施形態のカビの検出方法は、検出対象のカビのＤＮＡにおける標的領域をＰＣＲにより増幅させて、増幅産物の有無を確認する工程を含むカビの検出方法であって、標的領域の増幅を行うためのＰＣＲ用反応液において、上記のＩＴＳ領域を増幅させるためのプライマーセット、及び／又は、β−チューブリン遺伝子を増幅させるためのプライマーセットと、試料とを含有させ、試料に検出対象のカビの少なくともいずれかのＤＮＡが含有されている場合、ＰＣＲ用反応液を使用して、試料に含有されるＤＮＡにおける標的領域を増幅させ、得られた増幅産物を上述したカビ検出用担体に滴下して、増幅産物を相補的な塩基配列を有するプローブに結合させる方法であれば良く、具体的な実施形態及び実施例の構成に限定されるものではないが、例えば（１）カビの採取、（２）ＤＮＡの抽出、（３）標的領域の増幅、及び（４）増幅産物の確認を含むものとすることができる。
【００５８】
（１）カビの採取
例えば空中浮遊カビを採取する場合、検査対象の環境中における室内又は屋外の空気を採取する。そして、採取した空気を専用培地に吹き付けて、空気中に含まれるカビの培養を行う。培地としては、所定の寒天培地などをエアーサンプラー用にストリップ形状にしたものを使用することが好ましい。培養条件としては、２５℃で暗所に６５時間以上静置することが好ましい。
次に、ストリップにおいて培養されたカビのコロニーを、コロニー毎に個別に採取し、又は二以上のコロニーを一括して採取し、液体窒素などによりコロニーを凍結して、コロニーに含まれるカビの細胞を破砕する。
例えば植物検体のカビを採取する場合、ハサミやカッターなどを用いて、検査対象の罹病組織片あるいは健全組織片を採取する。そして採取した植物組織片を次亜塩素酸やエタノールで表面殺菌後、専用培地に置床して、植物組織中に含まれるカビの培養を行う。培養条件としては、２０℃〜２５℃の範囲内で６５時間以上静置することが好ましい。
【００５９】
（２）ＤＮＡの抽出
次に、このようにして得られたカビの細胞の破砕物からゲノムＤＮＡを抽出する。ゲノムＤＮＡの抽出は、ＣＴＡＢ法（Cetyl  trimethyl  ammonium  bromide）による方法やＤＮＡ抽出装置を用いる方法など、一般的な手法により行うことができる。
また土壌中から直接カビのＤＮＡを抽出することもできる。ＤＮＡの抽出は直接溶菌法（Direct  Lysis  Method）による方法や土壌ＤＮＡ抽出キットを用いる方法など、一般的な手法により行うことができる。
【００６０】
（３）標的領域の増幅
次に、抽出したゲノムＤＮＡにおける標的領域を増幅させる。すなわち、ゲノムＤＮＡにおける標的領域を含むＤＮＡ断片を増幅させる。この標的領域の増幅方法は、特に限定されないが、ＰＣＲ法を好適に用いることができる。ＰＣＲ法では、標的領域を増幅させるためのプライマーセットを含有するＰＣＲ反応液を用いて、標的領域を増幅させる。ＰＣＲ装置としては、一般的なサーマルサイクラーなどを用いることができる。
本実施形態のカビの検出方法では、例えば以下のような反応条件でＰＣＲを行うことにより、各種カビの標的領域を好適に増幅させることができる。
（ａ）９５℃  １０分、（ｂ）９５℃（ＤＮＡ変性工程）  ３０秒、（ｃ）５６℃（アニーリング工程）  ３０秒、（ｄ）７２℃（ＤＮＡ合成工程）  ６０秒（（ｂ）〜（ｄ）を４０サイクル）、（ｅ）７２℃  １０分
【００６１】
ＰＣＲ用反応液としては、例えば以下の組成からなるものを使用することが好ましい。すなわち、核酸合成基質（ｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅ（dCTP、dATP、dTTP、dGTP）など）、プライマーセット、核酸合成酵素（Ｎｏｖａ  Ｔａｑ  ＨｏｔＳｔａｒｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅなど）、蛍光標識試薬（Ｃｙ５−ｄＣＴＰなど）、試料のゲノムＤＮＡ、緩衝液、及び残りの成分として水を含むＰＣＲ反応液を好適に使用することができる。なお、緩衝液としては、例えばＡｍｐｄｉｒｅｃｔ（登録商標）（株式会社島津製作所製）を用いることができる。
【００６２】
本実施形態では、カビのゲノムＤＮＡにおけるＩＴＳ領域及び／又はβ−チューブリン遺伝子を標的領域として、ＤＮＡ断片の増幅が行われる。
このとき、ＩＴＳ領域を増幅させるためのプライマーセットとしては、図５に示す配列番号５６及び５７の塩基配列からなるもの（配列番号５６：フォワードプライマー、配列番号５７：リバースプライマー）を用いることが好ましい。
また、β−チューブリン遺伝子を増幅させるためのプライマーセットとしては、同図に示す配列番号５８及び５９の塩基配列からなるもの（配列番号５８：フォワードプライマー、配列番号５９：リバースプライマー）を用いることが好ましい。
【００６３】
（４）増幅産物の確認
次に、増幅産物を本実施形態のカビ検出用担体に滴下し、このカビ検出用担体に固定化されたプローブにハイブリダイズした増幅産物の標識を検出することで、増幅産物の有無を確認する。これによって、検査対象の環境中に存在しているカビを特定することができる。
標識の検出は、蛍光スキャニング装置など一般的な標識検出装置を用いて行うことができ、例えば東洋鋼鈑株式会社のＢＩＯＳＨＯＴ（登録商標）を用いて、増幅産物の蛍光強度を測定することにより行うことができる。測定結果は、Ｓ／Ｎ比値（Signal  to  Noise  ratio）値として得ることが好ましい。Ｓ／Ｎ比値にもとづいて、測定結果が陽性であるか陰性であるかを精度高く判定することができるためであり、一般にＳ／Ｎ比値が３以上の場合に、陽性と判定することができる。本明細書中に記載のＳ／Ｎ比値は、（メディアン蛍光強度値−バックグラウンド値）÷バックグラウンド値にて算出される。なお、標識としては蛍光に限定されず、その他のものを用いることもできる。
【００６４】
［カビ検出用キット］
本実施形態のカビ検出用キットには、カビのＤＮＡにおける標的領域を含む核酸断片を増幅させるためのプライマーセットと、増幅産物の有無を確認するためのプローブが固定されたカビ検出用担体とが含まれる。
プライマーセット及びカビ検出用担体は、上述したカビの検出タイプ（Ａ），（Ｂ），（Ｃ）毎に、それぞれ以下の構成とすることが好ましい。
【００６５】
検出タイプ（Ａ）：
検出対象のカビが、タラロマイセス・マクロスポラス、タラロマイセス・トラキスペルマス、ユーペニシリウム・クラスタセウム、ユーペニシリウム・ジャバニカム、ユーペニシリウム・ブレフェルディアナム、ユーペニシリウム・ラピドサムの少なくともいずれかの場合、プライマーセットとしては、ＩＴＳ領域を増幅させるための配列番号５６に示す塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号５７に示す塩基配列からなるリバースプライマーを備えたプライマーセット、並びに、β−チューブリン遺伝子を増幅させるための配列番号５８に示す塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号５９に示す塩基配列からなるリバースプライマーを備えたプライマーセットを用いることが好ましい。
【００６６】
また、検出対象のカビが検出タイプ（Ａ）の場合、カビ検出用担体としては、具体的には、以下の構成とすることが好ましい。
タラロマイセス・マクロスポラス（Talaromyces  macrosporus）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号２に示す塩基配列を有するプローブからなる第一のプローブ群、
タラロマイセス・トラキスペルマス（Talaromyces  trachyspermus）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号３に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号４に示す塩基配列を有するプローブからなる第二のプローブ群、
ユーペニシリウム・クラスタセウム（Eupenicillium  crustaceum）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号５に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号６〜７に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれかからなる第三のプローブ群、
ユーペニシリウム・ジャバニカム（Eupenicillium  javanicum）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号８に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号９に示す塩基配列を有するプローブからなる第四のプローブ群、
ユーペニシリウム・ブレフェルディアナム（Eupenicillium  brefeldianum）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号８に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号１０〜１５に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれかからなる第五のプローブ群、並びに、
ユーペニシリウム・ラピドサム（Eupenicillium  lapidosum）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１６に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号１７〜１９に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれかからなる第六のプローブ群のプローブを固定化したカビ検出用担体。
【００６７】
すなわち、検出タイプ（Ａ）のカビについてのカビ検出用キットは、上記プライマーセットを用いて増幅された増幅産物を当該カビ検出用担体に滴下して、増幅産物を相補的な塩基配列を有するプローブに結合させることによってカビを検出するために用いられる。
【００６８】
検出タイプ（Ｂ）：
検出対象のカビが、ビソクラミス・フルバ、ビソクラミス・ニベアの少なくともいずれかの場合、プライマーセットとしては、β−チューブリン遺伝子を増幅させるための配列番号５８に示す塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号５９に示す塩基配列からなるリバースプライマーを備えたプライマーセットを用いることが好ましい。
【００６９】
また、検出対象のカビが検出タイプ（Ｂ）の場合、カビ検出用担体としては、具体的には、以下の構成とすることが好ましい。
ビソクラミス・フルバ（Byssochlamys  fulva）を検出するための、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号２０〜２６に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれかからなる第七のプローブ群、及び、
ビソクラミス・ニベア（Byssochlamys  nivea）を検出するための、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号２７〜３３に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれかからなる第八のプローブ群のプローブを固定化したカビ検出用担体。
【００７０】
すなわち、検出タイプ（Ｂ）のカビについてのカビ検出用キットは、上記プライマーセットを用いて増幅された増幅産物を当該カビ検出用担体に滴下して、増幅産物を相補的な塩基配列を有するプローブに結合させることによってカビを検出するために用いられる。
【００７１】
検出タイプ（Ｃ）
検出対象のカビが、ビソクラミス・フルバ、ビソクラミス・ニベア、タラロマイセス・ウォルトマニー、ハミゲラ・アベラネア、ハミゲラ・ストリアータの少なくともいずれかの場合、プライマーセットとしては、ＩＴＳ領域を増幅させるための配列番号５６に示す塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号５７に示す塩基配列からなるリバースプライマーを備えたプライマーセット、並びに、β−チューブリン遺伝子を増幅させるための配列番号５８に示す塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号５９に示す塩基配列からなるリバースプライマーを備えたプライマーセットを用いることが好ましい。
【００７２】
また、検出対象のカビが検出タイプ（Ｃ）の場合、カビ検出用担体としては、具体的には、以下の構成とすることが好ましい。
ビソクラミス・フルバ（Byssochlamys  fulva）又はビソクラミス・ニベア（Byssochlamys  nivea）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号３４に示す塩基配列を有するプローブ、及び／又は、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号３５に示す塩基配列を有するプローブからなる第九のプローブ群、
タラロマイセス・ウォルトマニー（Talaromyces  wortmannii）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号３６〜３８に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれか、及び／又は、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号３９〜４２に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれかからなる第十のプローブ群、
ハミゲラ・アベラネア（Hamigera  avellanea）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号４３に示す塩基配列を有するプローブ、及び／又は、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号４４に示す塩基配列を有するプローブからなる第十一のプローブ群、並びに、
ハミゲラ・ストリアータ（Hamigera  striata）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号４５〜４６に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれか、及び／又は、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号４７に示す塩基配列を有するプローブからなる第十二のプローブ群のプローブを固定化したカビ検出用担体。
【００７３】
すなわち、カビの検出タイプ（Ｃ）についてのカビ検出用キットは、上記プライマーセットを用いて増幅された増幅産物を当該カビ検出用担体に滴下して、増幅産物を相補的な塩基配列を有するプローブに結合させることによってカビを検出するために用いられる。
【００７４】
また、本実施形態のカビ検出用キットとして、ＩＴＳ領域を増幅させるための配列番号５６に示す塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号５７に示す塩基配列からなるリバースプライマーを備えたプライマーセット、並びに、β−チューブリン遺伝子を増幅させるための配列番号５８に示す塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号５９に示す塩基配列からなるリバースプライマーを備えたプライマーセットを用いると共に、カビの検出タイプ（Ａ），（Ｂ），（Ｃ）で用いた全ての群のプローブを固定化したカビ検出用担体を用いることも好ましい。
【００７５】
本実施形態のカビ検出用担体、カビの検出方法、及びカビ検出用キットによれば、上記１１種類の耐熱性カビを特異的に識別できるプローブを用いることにより、これらのカビを適切に検出することができる。このため、本実施形態により、カビの存否を確認するための環境検査等において、これらのカビを迅速かつ精度高く検出することが可能となる。
【実施例】
【００７６】
以下、本発明の実施形態に係るカビ検出用担体、カビの検出方法、及びカビ検出用キットの実施例の効果を確認するために行った試験について、具体的に説明する。
【００７７】
［試験１］
カビ検出用担体としては、ジーンシリコン（登録商標）（東洋鋼鈑株式会社製）を用い、図１〜４に示される配列番号１〜５５のプローブを固定化したものを使用した。各プローブは、シグマ  アルドリッチジャパン株式会社により合成したものを使用した。また、各プローブの基板への固定化は、マイクロアレイヤーにより行った。
【００７８】
検出対象のカビとしては、独立行政法人理化学研究所  バイオリソースセンター  微生物材料開発室（Japan  Collection  of  Microorganisms）及び独立行政法人製品評価技術基盤機構  バイオテクノロジー本部  生物遺伝資源部門（NITE  Biological  Resource  Center）から入手した菌株を使用した。具体的には、以下の１１種類のカビにつき、１２種類の菌株を使用した。
【００７９】
（１）タラロマイセス・マクロスポラス  JCM22818T
（２）タラロマイセス・トラキスペルマス  NBRC31360
（３）ユーペニシリウム・クラスタセウム  NBRC6094T
（４）ユーペニシリウム・ジャバニカム  NBRC6095T
（５）ユーペニシリウム・ブレフェルディアナム  NBRC31730T，NBRC31731T，
（６）ユーペニシリウム・ラピドサム  NBRC6100T
（７）ビソクラミス・フルバ  NBRC31767T
（８）ビソクラミス・ニベア  JCM12806
（９）タラロマイセス・ウォルトマニー  NBRC7738
（１０）ハミゲラ・アベラネア  NBRC31667T
（１１）ハミゲラ・ストリアータ  NBRC6106T
【００８０】
これらのカビを上記菌株毎に培養した。培養は、ＰＤＡ培地またはＭ４０Ｙ培地を用いて、２５℃の暗所で、７日間静置させて行った。
さらに、培養したカビのコロニーを採取し、φ０．５ｍｍジルコニアビーズを入れたバイアル瓶に個別に入れ、液体窒素に浸して試料を凍結した後、振盪装置を用いて、カビの細胞を破砕した。
次いで、ＤＮＡ抽出装置によりカビのゲノムＤＮＡを抽出して、ＰＣＲ法により、各カビのＩＴＳ領域及びβ−チューブリン遺伝子を菌株毎に増幅した。
【００８１】
ここで、検出タイプ（Ａ）の各カビ、検出タイプ（Ｂ）の各カビ、及び検出タイプ（Ｃ）の各カビのいずれについても、ＰＣＲ用反応液にＩＴＳ領域増幅用プライマーセットとβ−チューブリン遺伝子増幅用プライマーセットの両方を含有させて、これらの標的領域の増幅反応を行った。
このとき、ＩＴＳ領域増幅用プライマーセットとして、図５に示す配列番号５６の塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号５７の塩基配列からなるリバースプライマーを用いた。また、β−チューブリン遺伝子増幅用プライマーセットとして、同図に示す配列番号５８の塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号５９の塩基配列からなるリバースプライマーを用いた。これらのプライマーは、シグマ  アルドリッチジャパン株式会社により合成したものを使用した。
なお、検出タイプ（Ｂ）のカビについては、β−チューブリン遺伝子のみから選択されたプローブにおいて陽性反応が得られた場合に、当該カビが存在していると判定することができる。したがって、当該カビのみを検出対象にする場合には、ＰＣＲ用反応液にβ−チューブリン遺伝子増幅用プライマーセットを含有させ、ＩＴＳ領域増幅用プライマーセットを含有させることなく、標的領域の増幅反応を行うようにすることも勿論可能である。
【００８２】
ＰＣＲ用反応液としては、Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ（株式会社島津製作所製）を使用し、１２種類の菌株毎に、次の組成のものを２０μｌ作成した。
１．Ampdirect(G/Crich)  4.0μl
２．Ampdirect(addition-4)  4.0μl
３．dNTPmix  1.0μl
４．Cy-5dCTP  0.2μl
５．ITS1-Fw  primer（配列番号５６）(2.5μM)  1.0μl
６．ITS1-Rv  primer（配列番号５７）(2.5μM)  1.0μl
７．BtF  primer（配列番号５８）(10μM)  1.0μl
８．BtR  primer（配列番号５９）(10μM)  1.0μl
９．Template  DNA  1.0μl
１０．NovaTaq  HotStart  DNA  polymerase  0.2μl
１１．水（全体が２０．０μｌになるまで加水）
【００８３】
上記ＰＣＲ用反応液を使用して、核酸増幅装置（ＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ（登録商標）  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  タカラバイオ株式会社製）により、次の条件でＤＮＡの増幅を行った。
（a）９５℃  １０分
（b）９５℃  ３０秒
（c）５６℃  ３０秒
（d）７２℃  ６０秒（（b）〜（d）を４０サイクル）
（e）７２℃  １０分
【００８４】
次に、ＰＣＲ増幅産物に緩衝液（３×ＳＳＣクエン酸−生理食塩水＋０．３％ＳＤＳ）を混合して、９４℃で５分間加温し、上記カビ検出用担体（ＤＮＡチップ）に滴下した。このカビ検出用担体を４５℃で１時間静置し、上記緩衝液を用いてハイブリダイズしなかったＰＣＲ産物をＤＮＡチップから洗い流した。
そして、標識検出装置（ＢＩＯＳＨＯＴ，東洋鋼鈑株式会社製）を用いて、カビ検出用担体に固定化された各プローブにおける蛍光強度（プローブに結合した増幅産物の蛍光強度）を測定して、各プローブにおけるＳ／Ｎ比値を算出した。その結果を図６〜図８に示す。
【００８５】
これらの図に示すように、配列番号１〜４７に示される塩基配列をそれぞれ有するプローブにおけるＳ／Ｎ比値は、いずれも３以上となっており、陽性と判断できる。したがって、これらのプローブは、ぞれぞれの対象カビを検出するために、有効に機能していることがわかる。
【００８６】
具体的には、検出タイプ（Ａ）の各カビについては、ＩＴＳ領域から選択されたプローブ及びβ−チューブリン遺伝子から選択されたプローブにおいて、両方共に陽性反応が得られた場合に、当該カビが存在していると判定される。
これらのカビについては、図６に示すように、ＩＴＳ領域から選択されたプローブとβ−チューブリン遺伝子から選択されたプローブにおけるＳ／Ｎ比値は共に３以上であり、陽性反応を示した。また、各カビについて、その他のプローブにおける偽陽性反応は、見られなかった。したがって、これらのカビを検出対象とする各プローブは、いずれも有効に機能していることがわかる。
【００８７】
検出タイプ（Ｂ）の各カビについては、β−チューブリン遺伝子のみから選択されたプローブにおいて陽性反応が得られた場合に、当該カビが存在していると判定される。
これらのカビについては、図７に示すように、β−チューブリン遺伝子から選択されたプローブにおけるＳ／Ｎ比値は３以上であり、陽性反応を示した。また、各カビについて、その他のプローブにおける偽陽性反応は、見られなかった。したがって、これらのカビを検出対象とする各プローブは、いずれも有効に機能していることがわかる。
【００８８】
検出タイプ（Ｃ）の各カビについては、ＩＴＳ領域又はβ−チューブリン遺伝子から選択されたプローブの少なくともいずれかにおいて陽性反応が得られた場合に、当該カビが存在していると判定される。
これらのカビについては、図８に示すように、ＩＴＳ領域から選択されたプローブとβ−チューブリン遺伝子から選択されたプローブにおけるＳ／Ｎ比値は３以上であり、陽性反応を示した。また、各カビについて、その他のプローブにおける偽陽性反応は、見られなかった。したがって、これらのカビを検出対象とする各プローブは、いずれも有効に機能していることがわかる。
【００８９】
なお、図４及び図９に示すネオサルトリア・フィッシェリ、ユーロチウム・チェバリエリ、ペシロマイセス・バリオッティ、及びペシロマイセス・リラシナスの各カビのプローブは、検出タイプ（Ａ）で使用し、ＩＴＳ領域から選択されたプローブ及びβ−チューブリン遺伝子から選択されたプローブにおいて、両方共に陽性反応が得られた場合に、当該カビが存在していると判定することができる。
これらのカビについて、上述した検出タイプ（Ａ）のカビと同様に試験を行った結果、ＩＴＳ領域から選択されたプローブとβ−チューブリン遺伝子から選択されたプローブにおけるＳ／Ｎ比値は共に３以上であり、陽性反応を示した。また、各カビについて、その他のプローブにおける偽陽性反応は、見られなかった。したがって、これらのカビを検出対象とする各プローブは、いずれも有効に機能していることがわかる。
【００９０】
［試験２］
検出対象の複数のカビのＤＮＡにおける標的領域を同時に増幅させるマルチプレックスＰＣＲを行った場合に、本実施形態のカビ検出用担体に固定化したプローブが有効に機能するかを確認するための試験を行った。
【００９１】
カビ検出用担体は、試験１と同じものを使用した。また、検出対象のカビも試験１と同じく１１種類のカビについて、１２種類の菌株を使用した。
本試験では、図１０に示すように、これらのカビをランダムに５種類ずつ組み合わせ、以下の５つのグループの混合ＤＮＡ試料を作成した。したがって、一部のカビは、複数の試料に重複して含まれている。培養は、ＰＤＡ培地またはＭ４０Ｙ培地を用いて、２５℃の暗所で、７日間静置させて行った。
【００９２】
（試料１）
（１）タラロマイセス・マクロスポラス  JCM22818T
（３）ユーペニシリウム・クラスタセウム  NBRC6094T
（５）ユーペニシリウム・ブレフェルディアナム  NBRC31730T
（７）ビソクラミス・フルバ  NBRC31767T
（１０）ハミゲラ・アベラネア  NBRC31667T
【００９３】
（試料２）
（２）タラロマイセス・トラキスペルマス  NBRC31360
（４）ユーペニシリウム・ジャバニカム  NBRC6095T
（６）ユーペニシリウム・ラピドサム  NBRC6100T
（８）ビソクラミス・ニベア  JCM12806
（９）タラロマイセス・ウォルトマニー  NBRC7738
【００９４】
（試料３）
（１）タラロマイセス・マクロスポラス  JCM22818T
（５）ユーペニシリウム・ブレフェルディアナム  NBRC31731T
（６）ユーペニシリウム・ラピドサム  NBRC6100T
（１０）ハミゲラ・アベラネア  NBRC31667T
（１１）ハミゲラ・ストリアータ  NBRC6106T
【００９５】
（試料４）
（１）タラロマイセス・マクロスポラス  JCM22818T
（５）ユーペニシリウム・ブレフェルディアナム  NBRC31730T
（８）ビソクラミス・ニベア  JCM12806
（９）タラロマイセス・ウォルトマニー  NBRC7738
（１１）ハミゲラ・ストリアータ  NBRC6106T
【００９６】
（試料５）
（２）タラロマイセス・トラキスペルマス  NBRC31360
（３）ユーペニシリウム・クラスタセウム  NBRC6094T
（５）ユーペニシリウム・ブレフェルディアナム  NBRC31731T
（７）ビソクラミス・フルバ  NBRC31767T
（１０）ハミゲラ・アベラネア  NBRC31667T
【００９７】
そして、培養したカビのコロニーを採取し、φ０．５ｍｍジルコニアビーズを入れたバイアル瓶に入れ、液体窒素に浸してコロニーを凍結した後、振盪装置を用いて、カビの細胞を破砕した。
次いで、ＤＮＡ抽出装置により各カビのゲノムＤＮＡを抽出したものを試料１〜５のように混合した。そして、ＰＣＲ法により、各カビのＩＴＳ領域及び／又はβ−チューブリン遺伝子を試料毎に同時に増幅した。ＰＣＲ法で用いたプライマーセットは、試験１におけるものと同一であり、ＩＴＳ領域を増幅するためのプライマーセットとして、配列番号５６及び５７に示される塩基配列を有するプライマーを使用し、β−チューブリン遺伝子を増幅するためのプライマーセットとして、配列番号５８及び５９に示される塩基配列を有するプライマーを使用した。
【００９８】
ＰＣＲ用反応液としては、Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ（株式会社島津製作所製）を使用し、試料毎に、次の組成のものを２０μｌ作成した。
１．Ampdirect(G/Crich)  4.0μl
２．Ampdirect(addition-4)  4.0μl
３．dNTPmix  1.0μl
４．Cy-5dCTP  0.2μl
５．ITS1-Fw  primer(2.5μM)  1.0μl
６．ITS1-Rv  primer(2.5μM)  1.0μl
７．BtF  primer(10μM)  1.0μl
８．BtR  primer(10μM)  1.0μl
９．Template  DNA（1.0μl／菌株）  1.0μl×菌株数
１０．NovaTaq  HotStart  DNA  polymerase  0.2μl
１１．水（全体が２０．０μｌになるまで加水）
【００９９】
上記各ＰＣＲ用反応液を使用して、核酸増幅装置（ＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  タカラバイオ株式会社製）により、試験１と同様に、次の条件でＤＮＡの増幅を行った。
（a）９５℃  １０分
（b）９５℃  ３０秒
（c）５６℃  ３０秒
（d）７２℃  ６０秒（（b）〜（d）を４０サイクル）
（e）７２℃  １０分
【０１００】
次に、ＰＣＲ増幅産物に緩衝液（３×ＳＳＣクエン酸−生理食塩水＋０．３％ＳＤＳ）を混合して、９４℃で５分間加温し、カビ検出用担体（ＤＮＡチップ）に滴下した。このカビ検出用担体を４５℃で１時間静置し、上記緩衝液を用いてハイブリダイズしなかったＰＣＲ産物をＤＮＡチップから洗い流した。
そして、標識検出装置（ＢＩＯＳＨＯＴ，東洋鋼鈑株式会社製）を用いて、カビ検出用担体に固定化された各プローブにおける蛍光強度（プローブに結合した増幅産物の蛍光強度）を測定し、各プローブにおけるＳ／Ｎ比値を取得した。その結果を図１１に示す。
【０１０１】
試料１に含まれるカビを検出するためのプローブは、図１０に示すように、配列番号１，２，５〜７，８，１０〜１２，２０〜２６，３４，３５，４３，４４に示す塩基配列を有するプローブである。
配列番号１，２に示す塩基配列を有するプローブは、図１に示すように、検出タイプ（Ａ）のタラロマイセス・マクロスポラスを検出するためのプローブであり、ＩＴＳ領域から選択されたプローブ及びβ−チューブリン遺伝子から選択されたプローブが共に陽性反応を示した場合に、検出対象のカビが存在すると判定するものである。図１１に示すように、これらのＳ／Ｎ比値は共に３以上であり、陽性反応を示した。
【０１０２】
配列番号５〜７に示す塩基配列を有するプローブは、図１に示すように、検出タイプ（Ａ）のユーペニシリウム・クラスタセウムを検出するためのプローブであり、ＩＴＳ領域から選択されたプローブ及びβ−チューブリン遺伝子から選択されたプローブが共に陽性反応を示した場合に、検出対象のカビが存在すると判定するものである。図１１に示すように、これらのＳ／Ｎ比値は共に３以上であり、陽性反応を示した。
【０１０３】
配列番号８，１０〜１２に示す塩基配列を有するプローブは、図１及び図６に示すように、検出タイプ（Ａ）のユーペニシリウム・ブレフェルディアナム（NBRC31730T）を検出するためのプローブであり、ＩＴＳ領域から選択されたプローブ及びβ−チューブリン遺伝子から選択されたプローブが共に陽性反応を示した場合に、検出対象のカビが存在すると判定するものである。図１１に示すように、これらのＳ／Ｎ比値は共に３以上であり、陽性反応を示した。
【０１０４】
配列番号２０〜２６に示す塩基配列を有するプローブは、図２に示すように、検出タイプ（Ｂ）のビソクラミス・フルバを検出するためのプローブであり、β−チューブリン遺伝子のみから選択されたプローブが陽性反応を示した場合に、検出対象のカビが存在すると判定するものである。図１１に示すように、これらのＳ／Ｎ比値はいずれも３以上であり、陽性反応を示した。
【０１０５】
配列番号３４，３５に示す塩基配列を有するプローブは、図３に示すように、検出タイプ（Ｃ）のビソクラミス・フルバ又はビソクラミス・ニベアを検出するためのプローブであり、ＩＴＳ領域から選択されたプローブ及びβ−チューブリン遺伝子から選択されたプローブの少なくともいずれか一方が陽性反応を示した場合に、検出対象のカビが存在すると判定するものである。図１１に示すように、これらのＳ／Ｎ比値はいずれも３以上であり、陽性反応を示した。
【０１０６】
配列番号４３，４４に示す塩基配列を有するプローブは、図３に示すように、検出タイプ（Ｃ）のハミゲラ・アベラネアを検出するためのプローブであり、ＩＴＳ領域から選択されたプローブ及びβ−チューブリン遺伝子から選択されたプローブの少なくともいずれか一方が陽性反応を示した場合に、検出対象のカビが存在すると判定するものである。図１１に示すように、これらのＳ／Ｎ比値はいずれも３以上であり、陽性反応を示した。
また、これら以外のプローブについては、陽性反応は見られない。すなわち、これら以外のプローブについて偽陽性反応は生じておらず、試料１に含まれるカビを検出するための各プローブによれば、検出対象のカビ以外のカビが、誤って検出されないことが示されている。
【０１０７】
試料２に含まれるカビを検出するためのプローブは、図１０に示すように、配列番号３，４，８，９，１６〜１９，２７〜３５，３６〜４２に示す塩基配列を有するプローブである。
配列番号３，４に示す塩基配列を有するプローブは、図１に示すように、グループ（Ａ）のタラロマイセス・トラキスペルマスを検出するためのプローブであり、ＩＴＳ領域から選択されたプローブ及びβ−チューブリン遺伝子から選択されたプローブが共に陽性反応を示した場合に、検出対象のカビが存在すると判定するものである。図１１に示すように、これらのＳ／Ｎ比値は共に３以上であり、陽性反応を示した。
【０１０８】
配列番号８，９に示す塩基配列を有するプローブは、図１に示すように、検出タイプ（Ａ）のユーペニシリウム・ジャバニカムを検出するためのプローブであり、ＩＴＳ領域から選択されたプローブ及びβ−チューブリン遺伝子から選択されたプローブが共に陽性反応を示した場合に、検出対象のカビが存在すると判定するものである。図１１に示すように、これらのＳ／Ｎ比値は共に３以上であり、陽性反応を示した。
【０１０９】
配列番号１６〜１９に示す塩基配列を有するプローブは、図１に示すように、検出タイプ（Ａ）のユーペニシリウム・ラピドサムを検出するためのプローブであり、ＩＴＳ領域から選択されたプローブ及びβ−チューブリン遺伝子から選択されたプローブが共に陽性反応を示した場合に、検出対象のカビが存在すると判定するものである。図１１に示すように、これらのＳ／Ｎ比値は共に３以上であり、陽性反応を示した。
【０１１０】
配列番号２７〜３３に示す塩基配列を有するプローブは、図２に示すように、検出タイプ（Ｂ）のビソクラミス・ニベアを検出するためのプローブであり、β−チューブリン遺伝子のみから選択されたプローブが陽性反応を示した場合に、検出対象のカビが存在すると判定するものである。図１１に示すように、これらのＳ／Ｎ比値はいずれも３以上であり、陽性反応を示した。
【０１１１】
配列番号３４，３５に示す塩基配列を有するプローブは、図３に示すように、検出タイプ（Ｃ）のビソクラミス・フルバ又はビソクラミス・ニベアを検出するためのプローブであり、ＩＴＳ領域から選択されたプローブ及びβ−チューブリン遺伝子から選択されたプローブの少なくともいずれか一方が陽性反応を示した場合に、検出対象のカビが存在すると判定するものである。図１１に示すように、これらのＳ／Ｎ比値はいずれも３以上であり、陽性反応を示した。
【０１１２】
配列番号３６〜４２に示す塩基配列を有するプローブは、図３に示すように、検出タイプ（Ｃ）のタラロマイセス・ウォルトマニーを検出するためのプローブであり、ＩＴＳ領域から選択されたプローブ及びβ−チューブリン遺伝子から選択されたプローブの少なくともいずれか一方が陽性反応を示した場合に、検出対象のカビが存在すると判定するものである。図１１に示すように、配列番号３７のプローブ以外においてＳ／Ｎ比値はいずれも３以上であり、陽性反応を示した。
また、これら以外のプローブについては、陽性反応は見られない。すなわち、これら以外のプローブについて偽陽性反応は生じておらず、試料２に含まれるカビを検出するための各プローブによれば、検出対象のカビ以外のカビが、誤って検出されないことが示されている。
【０１１３】
試料３に含まれるカビを検出するためのプローブは、図１０に示すように、配列番号１，２，８，１０，１３〜１５，１６〜１９，４３，４４，４５〜４７に示す塩基配列を有するプローブである。
配列番号１，２に示す塩基配列を有するプローブは、図１に示すように、グループ（Ａ）のタラロマイセス・マクロスポラスを検出するためのプローブであり、ＩＴＳ領域から選択されたプローブ及びβ−チューブリン遺伝子から選択されたプローブが共に陽性反応を示した場合に、検出対象のカビが存在すると判定するものである。図１１に示すように、これらのＳ／Ｎ比値は共に３以上であり、陽性反応を示した。
【０１１４】
配列番号８，１０，１３〜１５に示す塩基配列を有するプローブは、図１及び図６に示すように、検出タイプ（Ａ）のユーペニシリウム・ブレフェルディアナム（NBRC31731T）を検出するためのプローブであり、ＩＴＳ領域から選択されたプローブ及びβ−チューブリン遺伝子から選択されたプローブが共に陽性反応を示した場合に、検出対象のカビが存在すると判定するものである。図１１に示すように、これらのＳ／Ｎ比値は共に３以上であり、陽性反応を示した。
【０１１５】
配列番号１６〜１９に示す塩基配列を有するプローブは、図１に示すように、検出タイプ（Ａ）のユーペニシリウム・ラピドサムを検出するためのプローブであり、ＩＴＳ領域から選択されたプローブ及びβ−チューブリン遺伝子から選択されたプローブが共に陽性反応を示した場合に、検出対象のカビが存在すると判定するものである。図１１に示すように、これらのＳ／Ｎ比値は共に３以上であり、陽性反応を示した。
【０１１６】
配列番号４３，４４に示す塩基配列を有するプローブは、図３に示すように、検出タイプ（Ｃ）のハミゲラ・アベラネアを検出するためのプローブであり、ＩＴＳ領域から選択されたプローブ及びβ−チューブリン遺伝子から選択されたプローブの少なくともいずれか一方が陽性反応を示した場合に、検出対象のカビが存在すると判定するものである。図１１に示すように、これらのＳ／Ｎ比値はいずれも３以上であり、陽性反応を示した。
【０１１７】
配列番号４５〜４７に示す塩基配列を有するプローブは、図３に示すように、検出タイプ（Ｃ）のハミゲラ・ストリアータを検出するためのプローブであり、ＩＴＳ領域から選択されたプローブ及びβ−チューブリン遺伝子から選択されたプローブの少なくともいずれか一方が陽性反応を示した場合に、検出対象のカビが存在すると判定するものである。図１１に示すように、これらのＳ／Ｎ比値はいずれも３以上であり、陽性反応を示した。
また、これら以外のプローブについては、陽性反応は見られない。すなわち、これら以外のプローブについて偽陽性反応は生じておらず、試料３に含まれるカビを検出するための各プローブによれば、検出対象のカビ以外のカビが、誤って検出されないことが示されている。
【０１１８】
試料４に含まれるカビを検出するためのプローブは、図１０に示すように、配列番号１，２，８，１０〜１２，２７〜３５，３６〜４２，４５〜４７に示す塩基配列を有するプローブである。
配列番号１，２に示す塩基配列を有するプローブは、図１に示すように、グループ（Ａ）のタラロマイセス・マクロスポラスを検出するためのプローブであり、ＩＴＳ領域から選択されたプローブ及びβ−チューブリン遺伝子から選択されたプローブが共に陽性反応を示した場合に、検出対象のカビが存在すると判定するものである。図１１に示すように、これらのＳ／Ｎ比値は共に３以上であり、陽性反応を示した。
【０１１９】
配列番号８，１０〜１２に示す塩基配列を有するプローブは、図１及び図６に示すように、検出タイプ（Ａ）のユーペニシリウム・ブレフェルディアナム（NBRC31730T）を検出するためのプローブであり、ＩＴＳ領域から選択されたプローブ及びβ−チューブリン遺伝子から選択されたプローブが共に陽性反応を示した場合に、検出対象のカビが存在すると判定するものである。図１１に示すように、これらのＳ／Ｎ比値は共に３以上であり、陽性反応を示した。
【０１２０】
配列番号２７〜３３に示す塩基配列を有するプローブは、図２に示すように、検出タイプ（Ｂ）のビソクラミス・ニベアを検出するためのプローブであり、β−チューブリン遺伝子のみから選択されたプローブが陽性反応を示した場合に、検出対象のカビが存在すると判定するものである。図１１に示すように、これらのＳ／Ｎ比値はいずれも３以上であり、陽性反応を示した。
【０１２１】
配列番号３４，３５に示す塩基配列を有するプローブは、図３に示すように、検出タイプ（Ｃ）のビソクラミス・フルバ又はビソクラミス・ニベアを検出するためのプローブであり、ＩＴＳ領域から選択されたプローブ及びβ−チューブリン遺伝子から選択されたプローブの少なくともいずれか一方が陽性反応を示した場合に、検出対象のカビが存在すると判定するものである。図１１に示すように、これらのＳ／Ｎ比値はいずれも３以上であり、陽性反応を示した。
【０１２２】
配列番号３６〜４２に示す塩基配列を有するプローブは、図３に示すように、検出タイプ（Ｃ）のタラロマイセス・ウォルトマニーを検出するためのプローブであり、ＩＴＳ領域から選択されたプローブ及びβ−チューブリン遺伝子から選択されたプローブの少なくともいずれか一方が陽性反応を示した場合に、検出対象のカビが存在すると判定するものである。図１１に示すように、配列番号３６〜３８においてＳ／Ｎ比値はいずれも３以上であり、陽性反応を示した。
【０１２３】
配列番号４５〜４７に示す塩基配列を有するプローブは、図３に示すように、検出タイプ（Ｃ）のハミゲラ・ストリアータを検出するためのプローブであり、ＩＴＳ領域から選択されたプローブ及びβ−チューブリン遺伝子から選択されたプローブの少なくともいずれか一方が陽性反応を示した場合に、検出対象のカビが存在すると判定するものである。図１１に示すように、これらのＳ／Ｎ比値はいずれも３以上であり、陽性反応を示した。
また、これら以外のプローブについては、陽性反応は見られない。すなわち、これら以外のプローブについて偽陽性反応は生じておらず、試料４に含まれるカビを検出するための各プローブによれば、検出対象のカビ以外のカビが、誤って検出されないことが示されている。
【０１２４】
試料５に含まれるカビを検出するためのプローブは、図１０に示すように、配列番号３，４，５〜７，８，１０，１３〜１５，２０〜２６，３４，３５，４３，４４に示す塩基配列を有するプローブである。
配列番号３，４に示す塩基配列を有するプローブは、図１に示すように、グループ（Ａ）のタラロマイセス・トラキスペルマスを検出するためのプローブであり、ＩＴＳ領域から選択されたプローブ及びβ−チューブリン遺伝子から選択されたプローブが共に陽性反応を示した場合に、検出対象のカビが存在すると判定するものである。図１１に示すように、これらのＳ／Ｎ比値は共に３以上であり、陽性反応を示した。
【０１２５】
配列番号５〜７に示す塩基配列を有するプローブは、図１に示すように、検出タイプ（Ａ）のユーペニシリウム・クラスタセウムを検出するためのプローブであり、ＩＴＳ領域から選択されたプローブ及びβ−チューブリン遺伝子から選択されたプローブが共に陽性反応を示した場合に、検出対象のカビが存在すると判定するものである。図１１に示すように、これらのＳ／Ｎ比値は共に３以上であり、陽性反応を示した。
【０１２６】
配列番号８，１０，１３〜１５に示す塩基配列を有するプローブは、図１及び図６に示すように、検出タイプ（Ａ）のユーペニシリウム・ブレフェルディアナム（NBRC31731T）を検出するためのプローブであり、ＩＴＳ領域から選択されたプローブ及びβ−チューブリン遺伝子から選択されたプローブが共に陽性反応を示した場合に、検出対象のカビが存在すると判定するものである。図１１に示すように、配列番号８及び配列番号１４〜１５におけるＳ／Ｎ比値は共に３以上であり、陽性反応を示した。
【０１２７】
配列番号２０〜２６に示す塩基配列を有するプローブは、図２に示すように、検出タイプ（Ｂ）のビソクラミス・フルバを検出するためのプローブであり、β−チューブリン遺伝子のみから選択されたプローブが陽性反応を示した場合に、検出対象のカビが存在すると判定するものである。図１１に示すように、これらのＳ／Ｎ比値はいずれも３以上であり、陽性反応を示した。
【０１２８】
配列番号３４，３５に示す塩基配列を有するプローブは、図３に示すように、検出タイプ（Ｃ）のビソクラミス・フルバ又はビソクラミス・ニベアを検出するためのプローブであり、ＩＴＳ領域から選択されたプローブ及びβ−チューブリン遺伝子から選択されたプローブの少なくともいずれか一方が陽性反応を示した場合に、検出対象のカビが存在すると判定するものである。図１１に示すように、これらのＳ／Ｎ比値はいずれも３以上であり、陽性反応を示した。
【０１２９】
配列番号４３，４４に示す塩基配列を有するプローブは、図３に示すように、検出タイプ（Ｃ）のハミゲラ・アベラネアを検出するためのプローブであり、ＩＴＳ領域から選択されたプローブ及びβ−チューブリン遺伝子から選択されたプローブの少なくともいずれか一方が陽性反応を示した場合に、検出対象のカビが存在すると判定するものである。図１１に示すように、これらのＳ／Ｎ比値はいずれも３以上であり、陽性反応を示した。
また、これら以外のプローブについては、陽性反応は見られない。すなわち、これら以外のプローブについて偽陽性反応は生じておらず、試料５に含まれるカビを検出するための各プローブによれば、検出対象のカビ以外のカビが、誤って検出されないことが示されている。
【０１３０】
以上の通り、本実施形態のカビ検出用担体に固定化したプローブは、検出対象の複数のカビのＤＮＡにおける標的領域を同時に増幅させるマルチプレックスＰＣＲを行った場合でも、有効に機能することが明らかとなった。また、これらのプローブは、特異性が高く、偽陽性反応が見られないことも明らかとなった。
【０１３１】
本発明は、以上の実施形態や実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。
例えば、本実施形態のカビ検出用担体に固定化するプローブは、１種類につき１スポットずつに限定されるものではなく、それぞれのプローブを複数スポットずつ固定化しても良い。また、本実施形態の検出対象カビ以外のカビを検出するためのその他のプローブが、本実施形態におけるプローブと共に本実施形態のカビ検出用担体に固定化されていても良く、適宜変更することが可能である。
また、本発明における対象カビに関連するアナモルフ型・テレオモルフ型・異名を持つカビも当然検出可能であり、検出対象カビ名は最新の系統分類研究に準ずるものとする。
【産業上の利用可能性】
【０１３２】
本発明は、環境検査、食品検査、疫学的環境検査、臨床試験、家畜衛生、植物病害診断等において、耐熱性カビであるタラロマイセス・マクロスポラス、タラロマイセス・トラキスペルマス、ユーペニシリウム・クラスタセウム、ユーペニシリウム・ジャバニカム、ユーペニシリウム・ブレフェルディアナム、ユーペニシリウム・ラピドサム、ビソクラミス・フルバ、ビソクラミス・ニベア、タラロマイセス・ウォルトマニー、ハミゲラ・アベラネア、及びハミゲラ・ストリアータを特異的かつ多重に検出する場合に好適に利用することが可能である。
【図１】
2018143147.tif 000002
【図２】
2018143147.tif 000003
【図３】
2018143147.tif 000004
【図４】
2018143147.tif 000005
【図５】
2018143147.tif 000006
【図６】
2018143147.tif 000007
【図７】
2018143147.tif 000008
【図８】
2018143147.tif 000009
【図９】
2018143147.tif 000010
【図１０】
2018143147.tif 000011
【図１１】
2018143147.tif 000012
【配列表】
2018143147000001.app