(57)【要約】      （修正有）【課題】酵母を用いた有用物質の生産量に優れる生産方法の提供。【解決手段】培養液に含まれる酵母により有用物質を培養液中に分泌生産する有用物質の生産方法で、前記酵母が、Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ株であり、前記培養液が、式（１）で表される化合物（Ａ）を含有し、化合物（Ａ）のＨＬＢ値が０．１〜１６であって、かつ数平均分子量が２００〜３００００であり、化合物（Ａ）の重量割合が、前記培養液の重量を基準として０．０００１〜１０重量％である有用物質の生産方法。ＨＯ−（Ａ１Ｏ）ｍ１−（Ａ２Ｏ）ｍ２−（Ａ３Ｏ）ｍ３−Ｈ（１）［Ａ１Ｏ〜Ａ３Ｏは夫々独立にＣ２〜４のオキシアルキレン基Ａ１ＯとＡ２Ｏは構造式が異なっており、Ａ２ＯとＡ３Ｏは構造式が異なっており；ｍ１〜ｍ３は平均付加モル数で夫々独立に１〜６００］【選択図】図１
2018143100.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養液に含まれる酵母により有用物質を培養液中に分泌生産する有用物質の生産方法であって、前記酵母が、Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ株であり、前記培養液が、一般式（１）で表される化合物（Ａ）を含有し、前記化合物（Ａ）のＨＬＢ値が０．１〜１６であって、かつ数平均分子量が２００〜３００００であり、前記化合物（Ａ）の重量割合が、前記培養液の重量を基準として０．０００１〜１０重量％である有用物質の生産方法。
ＨＯ−（Ａ１Ｏ）ｍ１−（Ａ２Ｏ）ｍ２−（Ａ３Ｏ）ｍ３−Ｈ  （１）
［一般式（１）中、Ａ１Ｏ、Ａ２Ｏ及びＡ３Ｏはそれぞれ独立に炭素数２〜４のオキシアルキレン基を表し、Ａ１ＯとＡ２Ｏは構造式が異なっており、Ａ２ＯとＡ３Ｏは構造式が異なっており、ｍ１、ｍ２及びｍ３は、Ａ１Ｏ、Ａ２Ｏ及びＡ３Ｏの平均付加モル数を表し、それぞれ独立に１〜６００の数である。］
【請求項２】
前記有用物質が、タンパク質である請求項１に記載の有用物質の生産方法。
【請求項３】
前記一般式（１）で表される化合物（Ａ）におけるＡ１Ｏ、Ａ２Ｏ及びＡ３Ｏが、それぞれ独立にオキシエチレン基又は１，２−オキシプロピレン基である請求項１又は２に記載の有用物質の生産方法。
【請求項４】
前記一般式（１）で表される化合物（Ａ）におけるＡ１Ｏ及びＡ３Ｏが、オキシエチレン基であって、Ａ２Ｏが、１，２−オキシプロピレン基である請求項１〜３のいずれか１項に記載の有用物質の生産方法。
【請求項５】
前記一般式（１）で表される化合物（Ａ）の数平均分子量が１０００〜２００００であり、Ａ２Ｏが、１，２−オキシプロピレン基であり、ｍ２が１０〜７０の数である請求項１〜４のいずれか１項に記載の有用物質の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有用物質の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵母は、アミノ酸やタンパク質等の有用物質を生産するために広く利用されている。特に近年は、医薬上・産業上有用なタンパク質の遺伝子を酵母に導入することで形質転換した酵母によってタンパク質を効率的に生産する技術が知られるようになっている。
【０００３】
有用物質生産に用いる細菌として大腸菌を用いる場合は、大腸菌体内には糖鎖合成酵素が存在しないため、糖の付いていないタンパク質の生産に限定される。一方で、有用物質生産に酵母を用いると、酵母が発現するタンパク質は糖鎖合成酵素によって糖鎖付加などの翻訳後修飾を受けた後に菌体外へ分泌されるため、糖の付いたタンパク質生産が可能である（非特許文献１）。
【０００４】
しかし、酵母によるタンパク質生産方法では、大腸菌と比較し、タンパク質生産量が低いという課題があった（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】馬場  忠、「構造生物」Ｖｏｌ．５、Ｎｏ．１（１９９８）、ｐ．３５〜３９
【非特許文献２】江崎信芳等著、「生化学基礎の基礎」、化学同人、２００２年３月、ｐ．２８８−２８９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、酵母を用いた有用物質の生産量に優れる生産方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、これらの問題点を解決するべく鋭意検討した結果、本発明に到達した。即ち、本発明は、培養液に含まれる酵母により有用物質を培養液中に分泌生産する有用物質の生産方法であって、前記酵母が、Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ株であり、前記培養液が、一般式（１）で表される化合物（Ａ）を含有し、前記化合物（Ａ）のＨＬＢ値が０．１〜１６であって、かつ数平均分子量が２００〜３００００であり、前記化合物（Ａ）の重量割合が、前記培養液の重量を基準として０．０００１〜１０重量％である有用物質の生産方法である。
ＨＯ−（Ａ１Ｏ）ｍ１−（Ａ２Ｏ）ｍ２−（Ａ３Ｏ）ｍ３−Ｈ  （１）
［一般式（１）中、Ａ１Ｏ、Ａ２Ｏ及びＡ３Ｏはそれぞれ独立に炭素数２〜４のオキシアルキレン基を表し、Ａ１ＯとＡ２Ｏは構造式が異なっており、Ａ２ＯとＡ３Ｏは構造式が異なっており、ｍ１、ｍ２及びｍ３は、Ａ１Ｏ、Ａ２Ｏ及びＡ３Ｏの平均付加モル数を表し、それぞれ独立に１〜６００の数である。］
【発明の効果】
【０００８】
本発明の有用物質の生産方法を用いることで、酵母を用いて有用物質を多量に生産させることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】製造例１２で用いるベクターを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の有用物質の生産方法は、培養液に含まれる酵母により有用物質を培養液中に分泌生産する有用物質の生産方法であって、培養液が、下記一般式（１）で表される化合物（Ａ）を含有し、下記一般式（１）で表される化合物（Ａ）のＨＬＢ値が０．１〜１６であって、かつ数平均分子量が２００〜３００００であり、培養液中に下記一般式（１）で表される化合物（Ａ）が、培養液の重量を基準として０．０００１〜１０重量％含むことを特徴とする有用物質の生産方法である。
ＨＯ−（Ａ１Ｏ）ｍ１−（Ａ２Ｏ）ｍ２−（Ａ３Ｏ）ｍ３−Ｈ  （１）
［一般式（１）中、Ａ１Ｏ、Ａ２Ｏ及びＡ３Ｏはそれぞれ独立に炭素数２〜４のオキシアルキレン基を表し、Ａ１ＯとＡ２Ｏは構造式が異なっており、Ａ２ＯとＡ３Ｏは構造式が異なっており、ｍ１、ｍ２及びｍ３は、Ａ１Ｏ、Ａ２Ｏ及びＡ３Ｏの平均付加モル数を表し、それぞれ独立に１〜６００の数である。］
【００１１】
本発明の生産方法に用いる培養する培地としては、当技術分野で通常用いられる細胞培養用培地であれば特に制限なく用いることができ、炭素源、窒素源その他の必須栄養素を含む天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【００１２】
炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール及びプロパノール等のアルコール類が挙げられる。
【００１３】
窒素源としては、無機酸又は有機酸のアンモニウム塩（塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等）、アンモニア、ペプトン、肉エキス及びコーンスチープリカー等が挙げられる。
【００１４】
その他の必須栄養素としては、無機塩類が挙げられ、無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅及び炭酸カルシウム等が用いられる。
【００１５】
遺伝子操作が可能であり、産業利用のしやすさの観点から、Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ株を用いる。
Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ株としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｙａｎｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｋａｔａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐａｒａｄｏｘｕｓ及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ等を用いることが好ましい。
【００１６】
本発明の生産方法に用いる酵母としては、目的とする有用物質の種類に応じて遺伝子組み換えを行った酵母を用いてもよい。
遺伝子組み換えをする方法としては、例えば以下のように、細菌（大腸菌及び酵母等）を用いて酵母に組み込むためのプラスミドを作製し、作製したプラスミドを酵母に組み込んで形質転換する方法が挙げられる。
【００１７】
１）酵母に組み込むためのプラスミドの作製
酵母に組み込むためのプラスミドの作製は、以下の方法等を用いることができる。
目的タンパク質を発現している細胞（動物細胞及び植物細胞等）からメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分離し、該ｍＲＮＡから単鎖のｃＤＮＡを作製し、次に二本鎖ＤＮＡを合成する。その後、合成した二本鎖ＤＮＡを、細菌に組み込むためのファージＤＮＡ又はプラスミドに組み込み、得られた組み換えファージ又はプラスミドを宿主となる細菌に形質転換しｃＤＮＡライブラリーを作製する。
次に、形質転換した細菌から得たｃＤＮＡライブラリーの中から、目的とするＤＮＡを含有するプラスミドをスクリーニングする。スクリーニングの方法としては、プラスミドと、目的タンパク質遺伝子又は相補配列の一部をコードするＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション法が挙げられる。
スクリーニング後、細菌中の目的とするクローン化ＤＮＡを有するプラスミドから、該クローン化ＤＮＡ又はその一部を切りだし、該クローン化ＤＮＡ又はその一部をプロモーターの下流に連結することによって、目的遺伝子を有する酵母に組み込むためのプラスミドを作製することができる。
また、該クローン化ＤＮＡ又はその一部を酵母に組み込むためのプラスミドに導入する際に、内膜を移行させるシグナル配列（ペリプラズムに目的物質を発現させるシグナル配列）をコードするＤＮＡを連結することもできる。
このような酵母に組み込むためのプラスミドの作製方法としては、例えばバイオ実験イラストレイティッド７（水野貴之著、２００３年１０月３０日発行）の４７〜６９項に記載の方法を用いることができる。
【００１８】
２）酵母の形質転換
上記１）で作製した酵母に組み込むためのプラスミドを用いて酵母を形質転換する方法としては、リチウム塩で処理して自然にＤＮＡを取込みやすい状態にしてプラスミドを取り込ませる方法や、あるいは電気的にＤＮＡを細胞内に導入する方法を採用できる（Ｂｅｃｋｅｒ  ａｎｄ  Ｇｕａｒｅｎｔｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２−１８７（１９９１））。
【００１９】
本発明の生産方法で用いる培養液は、一般式（１）で表される化合物（Ａ）を含有する。化合物（Ａ）は、１種を単独で用いても、２種以上を併用して用いても良い。
一般式（１）中、Ａ１Ｏ、Ａ２Ｏ及びＡ３Ｏはそれぞれ独立に炭素数２〜４のオキシアルキレン基を表す。
また、Ａ１ＯとＡ２Ｏは構造式が異なっており、Ａ２ＯとＡ３Ｏは構造式が異なっている。
炭素数２〜４のオキシアルキレン基としては、オキシエチレン基（以下ＥＯと略記）、１，２−又は１，３−オキシプロピレン基（以下ＰＯと略記）及び１，２−、１，３−、１，４−又は２，３−オキシブチレン基（以下ＢＯと略記）が挙げられる。
このうち、Ａ１Ｏ、Ａ２Ｏ及びＡ３Ｏは、有用物質の生産量の観点から、それぞれ独立にＥＯ又はＰＯであることが好ましく、更に好ましい組み合わせは、Ａ１Ｏ及びＡ３Ｏが、ＥＯであって、Ａ２Ｏが、ＰＯである組み合わせである。
また、上記の組み合わせにおけるＰＯは、有用物質の生産量の観点から、１，２−オキシプロピレン基であることが好ましい。
【００２０】
一般式（１）中、ｍ１、ｍ２及びｍ３は、それぞれ独立にＡ１Ｏ、Ａ２ＯとＡ３Ｏの平均付加モル数を表し、１〜６００の数である。
このうち、ｍ１、ｍ２及びｍ３は、有用物質の生産量の観点から、ｍ１及びｍ３が１〜２００の数であり、かつ、ｍ２が１０〜７０の数であることが好ましい。
【００２１】
本発明の方法で用いる一般式（１）で表される化合物（Ａ）のＨＬＢ値は、０．１〜１６であり、好ましくは９〜１６である。ＨＬＢ値が０．１〜１６の範囲外の場合、有用物質の生産量が悪化する。
一般式（１）で表される化合物（Ａ）のＨＬＢ値は親水系と親油性のバランスを示す指標であって、例えば「界面活性剤入門」〔２００７年三洋化成工業株式会社発行、藤本武彦著〕１４２頁に記載されているグリフィン法によって、一般式（１）で表される化合物（Ａ）の分子量の値と一般式（１）で表される化合物の親水基部分の分子量の値との比率から以下の式で計算することができる。
ＨＬＢ値＝２０×化合物（Ａ）の親水基部分の分子量／化合物（Ａ）の分子量
【００２２】
本発明の方法において、一般式（１）で表される化合物（Ａ）の数平均分子量は、２００〜３００００であり、有用物質の生産量の観点から、好ましくは１０００〜２００００である。
本発明の方法において、一般式（１）で表される化合物（Ａ）の数平均分子量は下記の方法により算出することができる。
数平均分子量は、テトラヒドロフラン（以下、ＴＨＦと略記）への可溶分に対し、ＧＰＣ（Ｇｅｌ  Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を用いて以下の条件で測定することができる。
測定装置：東ソー株式会社製の「ＨＬＣ−８１２０」
カラム：東ソー株式会社製の「ＴＳＫｇｅｌＧＭＨＸＬ」（２本）と東ソー（株）製の「Ｔ  ＳＫｇｅｌＭｕｌｔｉｐｏｒｅＨＸＬ−Ｍ」（１本）
試料溶液：０．２５質量％のＴＨＦ溶液
カラムへの試料溶液の注入量：１００μｌ
流速：１ｍｌ／分
測定温度：４０℃
検出装置：屈折率検出器
基準物質：東ソー株式会社製の標準ポリスチレン（ＴＳＫ  ｓｔａｎｄａｒｄ  ＰＯＬＹＳＴＹＲＥＮＥ）１２点（数平均分子量：５００、１０５０、２８００、５９７０、９１００、１８１００、３７９００、９６４００、１９００００、３５５０００、１０９００００、２８９００００）。
【００２３】
本発明の生産方法では、一般式（１）で表される化合物（Ａ）が、酵母の培養のいずれかの時期に、培養液に含まれていれば良い。
例えば、培養開始時点において、あらかじめ培養液に一般式（１）で表される化合物（Ａ）が加えられていてもよく、培養途中で培養液に一般式（１）で表される化合物（Ａ）を加えてもよい。
有用物質の生産効率等の観点から、培養開始時点の培養液は一般式（１）で表される化合物（Ａ）を含んでいないことが好ましい。この場合、一般式（１）で表される化合物（Ａ）を酵母の対数増殖期に加えることが好ましい。
また、溶解性の観点から、一般式（１）で表される化合物（Ａ）は、水溶液の状態で培養液に加えることが好ましい。
【００２４】
本発明の方法において、使用される一般式（１）で表される化合物（Ａ）の合計使用量（重量％）は、対象となる微生物、生産される有用物質の種類及び抽出方法の種類によって適宜選択されるが、培養液の重量に基づいて、０．０００１〜１０重量％であり、生産したタンパク質の変性を抑制する観点から、好ましくは０．００５〜１０重量％である。
なお、培養液の重量は、培養開始時点の培養液の重量を基準とする。
【００２５】
本発明の有用物質の製造方法で製造される有用物質としては、タンパク質（酵素、ホルモンタンパク質、抗体及びペプチド等）、多糖、オリゴ糖及び核酸等が挙げられる。
【００２６】
タンパク質としては、酵素｛酸化還元酵素（コレステロールオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ及びペルオキシダーゼ等）、加水分解酵素（リゾチーム、プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ及びグルコアミラーゼ等）、異性化酵素（グルコースイソメラーゼ等）、転移酵素（アシルトランスフェラーゼ及びスルホトランスフェラーゼ等）、合成酵素（脂肪酸シンターゼ、リン酸シンターゼ及びクエン酸シンターゼ等）及び脱離酵素（ペクチンリアーゼ等）等｝、ホルモンタンパク質｛骨形成因子（ＢＭＰ）、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターロイキン１〜１２、成長ホルモン、エリスロポエチン、インスリン、顆粒状コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、ナトリウム利尿ペプチド、血液凝固第ＶＩＩＩ因子、ソマトメジン、グルカゴン、成長ホルモン放出因子、血清アルブミン及びカルシトニン等｝、抗体、抗原タンパク質（Ｂ型肝炎表面抗原等）、機能性タンパク質｛プロネクチン（登録商標）、不凍ペプチド、抗菌ペプチド等｝、蛍光タンパク質（ＧＦＰ等）、発光タンパク質（ルシェラーゼ等）及びペプチド（特にアミノ酸組成を限定するものではなく、オリゴペプチド、ジペプチド及びトリペプチド等）等が挙げられる。
【００２７】
多糖としては、ヒアルロン酸、コンドロイチン、キサンタン及びセルロース等が挙げられる。
【００２８】
オリゴ糖としては、スクロース、ラクトース、トレハロース、マルトース、ラフィノース、パノース、シクロデキストリン、ガラクトオリゴ糖及びフラクトオリゴ糖等が挙げられる。
【００２９】
核酸としては、イノシン一リン酸、アデノシン一リン酸及びグアノシン一リン酸等が挙げられる。
【００３０】
これらのうち、有用物質の生産効率等の観点からタンパク質が好ましい。
【００３１】
本発明の有用物質の生産方法は、培養工程及び精製工程を有することが好ましい。
【００３２】
培養工程では、以下の有用物質の生産に用いる培養液のオートクレーブ滅菌（好ましくは１２０℃、２０分間）を行い、ここに前培養した酵母を本培養することが好ましい。
酵母の培養の温度は、好ましくは１５〜３２℃であり、更に好ましくは２５〜３０℃である。
培地のｐＨは、４〜７であることが好ましい。
本培養開始から６〜８００時間後に培養温度を維持したまま一般式（１）で表される化合物（Ａ）の水溶液を添加し、本培養開始から２０〜１０００時間培養を継続する等で培養工程を実施することが好ましい。
培養中の培養液は公知の撹拌装置（撹拌羽根及びマグネティックスターラー等）を用いて撹拌することが好ましい。培養工程に用いる装置としては、公知の培養装置を用いることができるが、試験管、ディープウェルプレート（ビーエム機器株式会社製品等）及び微生物培養装置（エイブル社製等）等が挙げられる。
【００３３】
なお、培養工程で用いる前培養した酵母として組み替え酵母を用いる場合、前培養は酵母を発現ベクターで形質転換して組み換え酵母を作製し、組み換え酵母を前培養する。前培養は寒天培地上で好ましくは１５〜３２℃で３〜７２時間行うことで行うことができる。
【００３４】
精製工程は、培養液中に分泌された有用物質（タンパク質等）を分離する工程であり、遠心分離、中空糸分離、ろ過、溶剤による沈殿処理及びカラム処理（イオン交換カラム、ゲルろ過カラム、疎水カラム、アフィニティカラム及び限外カラム等）等の公知の分離方法で微生物及び微生物残さと分離することで行うことができる。
溶剤による沈殿処理としては、エタノール沈殿、硫酸アンモニウム沈殿及びポリエチレングリコール沈殿等の沈殿処理が挙げられる。
【００３５】
精製工程においてカラム処理をおこなう場合、カラムクロマトグラフィーに使用される充填剤としては、シリカ、デキストラン、アガロース、セルロース、アクリルアミド及びビニルポリマー等が挙げられ、市販品ではＳｅｐｈａｄｅｘシリーズ、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌシリーズ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅシリーズ（以上、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、Ｂｉｏ−Ｇｅｌシリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）等が挙げられる。
【００３６】
精製工程で分離された酵母は、その後、新たに培養液を供給することにより、更に培養することができる。その培養液等を更に精製工程に供して精製、培養を繰り返すことにより、有用物質の連続生産を行うことができる。
【実施例】
【００３７】
以下の実施例及び比較例により本発明をさらに説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。以下、特に定めない限り部は重量部を示す。
【００３８】
なお、実施例及び比較例で用いる一般式（１）で表される化合物（Ａ）として、化合物（Ａ−１）〜（Ａ−１１）を以下の製造方法に従って製造した。
また、製造した化合物（Ａ−１）〜（Ａ−１１）の数平均分子量及びＨＬＢ値を表１に示す。
【００３９】
＜製造例１＞
ステンレス製加圧反応装置に１，２−プロパンジオール１９部と水酸化ナトリウム０．０５部を仕込み、窒素置換後に１１０〜１３０℃で１，２−プロピレンオキサイド４２０部を４時間かけてオートクレーブ内圧が０．３ＭＰａ以上にならないようにして、徐々に滴下した。同温度でさらに１０時間反応させた。
その後、同温度でエチレンオキサイド６６部を４時間かけてオートクレーブ内圧が０．３ＭＰａ以上にならないようにして、徐々に滴下した後、同温度でさらに１０時間反応させ、化合物（Ａ−１）を得た。
【００４０】
＜製造例２＞
製造例１において、１，２−プロパンジオールの仕込み量を１９部から１５．８部に変更し、１，２−プロピレンオキサイドの滴下量を４２０部から３５０部に変更し、エチレンオキサイドの滴下量を６６部から１３８部に変更した以外は同様の操作を行い、化合物（Ａ−２）を得た。
【００４１】
＜製造例３＞
製造例１において、１，２−プロパンジオールの仕込み量を１９部から１２．２部に変更し、１，２−プロピレンオキサイドの滴下量を４２０部から２７０部に変更し、エチレンオキサイドの滴下量を６６部から２２０部に変更した以外は同様の操作を行い、化合物（Ａ−３）を得た。
【００４２】
＜製造例４＞
製造例１において、１，２−プロパンジオールの仕込み量を１９部から４．８部に変更し、１，２−プロピレンオキサイドの滴下量を４２０部から１０６部に変更し、エチレンオキサイドの滴下量を６６部から３９４部に変更した以外は同様の操作を行い、化合物（Ａ−４）を得た。
【００４３】
＜製造例５＞
ステンレス製加圧反応装置にサンニックスＰＰ−２０００［三洋化成工業（株）製；１，２−オキシプロピレン基を構成単位とするポリオキシプロピレングリコール（数平均分子量：２０００）］４５０部と水酸化ナトリウム０．０５部を仕込み、窒素置換後に１１０〜１３０℃でエチレンオキサイド５０部を４時間かけてオートクレーブ内圧が０．３ＭＰａ以上にならないようにして、徐々に滴下した後、同温度でさらに１０時間反応させ、化合物（Ａ−５）を得た。
【００４４】
＜製造例６＞
製造例５において、サンニックスＰＰ−２０００の仕込み量を４５０部から３２３部に変更し、エチレンオキサイドの滴下量を５０部から１７８部に変更した以外は同様の操作を行い、化合物（Ａ−６）を得た。
【００４５】
＜製造例７＞
製造例５において、サンニックスＰＰ−２０００の仕込み量を４５０部から１０６部に変更し、エチレンオキサイドの滴下量を５０部から３９２部に変更した以外が同様の操作を行い、化合物（Ａ−７）を得た。
【００４６】
＜製造例８＞
製造例５において、サンニックスＰＰ−２０００  ４５０部に代えてサンニックスＰＰ−３０００［三洋化成工業（株）製；１，２−オキシプロピレン基を構成単位とするポリオキシプロピレングリコール（数平均分子量：３２００）］を１０１部使用し、エチレンオキサイドの滴下量を５０部から４０２部に変更した以外は同様の操作を行い、化合物（Ａ−８）を得た。
【００４７】
＜製造例９＞
製造例１において、１，２−プロピレンオキサイドの滴下量を４２０部から２９０部に変更し、エチレンオキサイドの滴下量を６６部から２５０部に変更した以外は同様の操作を行い、化合物（Ａ−９）を得た。
【００４８】
＜製造例１０＞
ステンレス製加圧反応装置にエチレングリコール１０部と水酸化ナトリウム０．０５部を仕込み、窒素置換後に１１０〜１３０℃でエチレンオキサイド３５部を４時間かけてオートクレーブ内圧が０．３ＭＰａ以上にならないようにして、徐々に滴下した。同温度でさらに１０時間反応させた。
その後、同温度で１，２−プロピレンオキサイド４０２部を４時間かけてオートクレーブ内圧が０．３ＭＰａ以上にならないようにして、徐々に滴下した。同温度でさらに１０時間反応させて、化合物（Ａ−１０）を得た。
【００４９】
＜製造例１１＞
製造例１０において、エチレンオキサイドの滴下量を３５部から９２部に変更した以外は同様の操作を行い、化合物（Ａ−１１）を得た。
【００５０】
【表１】
2018143100.tif 000003
【００５１】
実施例及び比較例で使用した一般式（１）で表される化合物（Ａ）の数平均分子量は下記の方法により測定した。
数平均分子量は、テトラヒドロフラン（以下、ＴＨＦと略記）への可溶分に対し、ＧＰＣ（Ｇｅｌ  Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を用いて以下の条件で測定した。
測定装置：東ソー株式会社製の「ＨＬＣ−８１２０」
カラム：東ソー株式会社製の「ＴＳＫｇｅｌＧＭＨＸＬ」（２本）と東ソー（株）製の「Ｔ  ＳＫｇｅｌＭｕｌｔｉｐｏｒｅＨＸＬ−Ｍ」（１本）
試料溶液：０．２５質量％のＴＨＦ溶液
カラムへの試料溶液の注入量：１００μｌ
流速：１ｍｌ／分
測定温度：４０℃
検出装置：屈折率検出器
基準物質：東ソー株式会社製の標準ポリスチレン（ＴＳＫ  ｓｔａｎｄａｒｄ  ＰＯＬＹＳＴＹＲＥＮＥ）１２点（数平均分子量：５００、１０５０、２８００、５９７０、９１００、１８１００、３７９００、９６４００、１９００００、３５５０００、１０９００００、２８９００００）。
【００５２】
＜製造例１２：酵母の作製＞
Ｇａｕｓｓｉａ  ｐｒｉｎｃｅｐｓ由来のルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）のアミノ酸配列については、ＵｎｉｐｒｏｔにおけるＡＡＧ５４０９５で開示されている。
このアミノ酸配列を基に、出芽酵母のコドン使用に合わせた遺伝子配列を設計し、Ｇａｕｓｓｉａ  ｐｒｉｎｃｅｐｓ由来のルシフェラーゼタンパク質をコードする遺伝子（下記配列番号１）の合成を行なった。
得られた合成遺伝子は市販のＥｃｏＲＩとＳａｌＩで切断、ＹＥｐ３５２ＧＡＰＩＩベクターは市販のＥｃｏＲＩとＳａｌＩで切断後、それぞれアガロースゲル電気泳動を行い、それぞれの断片に相当するバンドをゲルから切り出した。切り出したゲルからプロメガ社のＷｉｚａｒｄ  ＳＶ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍを用いてＤＮＡ断片を抽出、精製した。ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｌｉｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）でＤＮＡ濃度を測定後、それぞれの断片５０ｎｇずつを混合しＨ２Ｏで７．５μＬとし、３．７５μＬのＬｉｇａｔｉｏ  Ｈｉｇｈ  Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ社）を加え、１６℃、３０分間反応した。うち２μＬを用いて、大腸菌ＥＣＯＳＴＭ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅ．  ｃｏｌｉ．  ＤＨ５α（ニッポンジーン社）を形質転換した。５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地で３７℃、１６時間培養し、形質転換体を得た。
得られたコロニーを、５０ｕｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ液体培地で３７℃、１６時間培養を行った。菌体よりプロメガ社のＷｉｚａｒｄ  Ｐｌｕｓ  ＳＶ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを用いてＹＥｐ３５２ＧＡＰＩＩ−ＧＬｕｃベクターを精製した。シークエンス解析を行い、塩基配列に間違いがないことを確認し、ＹＥｐ３５２ＧＡＰＩＩ−ＧＬｕｃベクターとした。
得られたＹＥｐ３５２ＧＡＰＩＩ−ＧＬｕｃベクターからＢａｍＨＩを用いてＧＡＰＤＨプロモーターとターミネーターを含む領域を上記と同様に回収し、酵母インテグレーション型プラスミドｐＲＳ３０５のＢａｍＨＩ部位に同様に挿入し、形質転換を行なった。得られたコロニーを培養後、プラスミドを回収することで図１に示すベクター（ｐＲＳ３０５−ＧＬｕｃ）を作製した。このベクター（ｐＲＳ３０５−ＧＬｕｃ）をＥｃｏＲＶで切断して線状化した後、常法に従い出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｗ３０３−１Ｂ株の形質転換を行なった。
形質転換後の菌液をＳＤ−Ｌｅｕ寒天培地（２．６７％  Ｍｉｎｉｍａｌ  ＳＤ  Ｂａｓｅ  Ｍｅｄｉｕｍ、０．０６９％  ＤＯ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  −Ｌｅｕ  （ＴａＫａＲａ  Ｂｉｏ社）、２％  Ａｇａｒ）に塗布し、３０℃で２日間培養することで形質転換体のコロニーを得た。コロニーをプレートから掻きとり、ＰＣＲ反応液に懸濁する簡易ＰＣＲ法にて染色体上への組み込みを確認し、このＳａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ株である酵母をＧＬｕｃ発現出芽酵母とした。
【００５３】
＜実施例１〜１０＞
製造例１２で製造したＧＬｕｃ発現出芽酵母をカザミノ酸培地５ｍｌ〔０．５重量％カザミノ酸［Ｃａｓａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ，ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ＤｉｆｃｏＴＭ、Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ社（以下ＢＤ社）製］、０．６７重量％イーストナイトロジェンベース（Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ  ＤｉｆｃｏＴＭ、ＢＤ社製）、２重量％グルコース［Ｄ（＋）−Ｇｌｕｃｏｓｅ、和光純薬工業社製］〕に白金耳を用いて植菌して３０℃で６時間、２００ｒｐｍで振とう培養して作製した培養液１５μｌを、２ｍｌＹＰＡＤ培地〔２重量％ペプトン（Ｂａｃｔｏ  Ｐｅｐｔｏｎｅ  ＤｉｆｃｏＴＭ、ＢＤ社製）、１重量％酵母エキス（Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ  ＤｉｆｃｏＴＭ、ＢＤ社製）、２重量％グルコース［Ｄ（＋）−Ｇｌｕｃｏｓｅ、和光純薬工業社製］、アデニン（Ａｄｅｎｉｎｅ  Ｓｕｌｆａｔｅ、和光純薬工業社製）（４０ｍｇ／ｌ）〕に再懸濁した。
再懸濁して得られた培養液を３０℃で２時間、１１００ｒｐｍで振とう培養を続けた後に、表２に記載する化合物（Ａ）を、培養液の重量を基準として０．３重量％になるように添加した。
その後、更に、３０℃で２４時間、１１００ｒｐｍで振とう培養を続けた。
その後、培養液のサンプリングを行い、遠心分離機によって、酵母を含む培養液から菌体と培養上清を分離した後、培養上清を回収した。
【００５４】
＜比較例１＞
化合物（Ａ）を添加しなかったこと以外は実施例１と同様にして、実施し、培養上清を得た。
【００５５】
＜実施例１１〜１４＞
実施例８において、添加する化合物（Ａ−８）の添加量を、培養液の重量を基準として、表３に記載の重量％になるように加えたこと以外は実施例８と同様にして、培養上清を得た。
【００５６】
＜培養液の濁度の評価＞
各培養上清を、１ｍｌ（光路長：１０ｍｍ）の石英セルに加え、濁度計［ＵＶ−１７００、（株）島津製作所製］を用いて、濁度の測定を行った。
なお、培養上清は、適切な吸光度になるように生理食塩水で希釈して測定を行った。
また、実施例１〜１４で得た培養上清に対しては、ＹＰＡＤ培地２ｍｌをブランクとして用いた。培養液の濁度は下記数式（１）によって算出した。
培養液の濁度＝［（希釈した培養液の濁度の測定値）−（ブランクの濁度の測定値）］×培養液の希釈倍率      ［数式（１）］
実施例１〜１４及び比較例１の場合、実施例１〜１４及び比較例１毎の「培養液の濁度」を、比較例１の培養液の濁度で除し、この値を実施例１〜１４及び比較例１毎の培養液の濁度比とした。評価結果を表２及び表３に示す。
培養液の濁度比が高いほど、酵母濃度が高いことを意味している。
また、酵母濃度あたりのタンパク質の活性値が高いほど活性を維持したタンパク質を効率的に生産できていることを意味する。
【００５７】
＜ルシフェラーゼ活性の評価＞
ルシフェラーゼ活性評価は、ルシフェラーゼ発現酵母の培養上清２０μｌに、ルシフェリン溶液６０μｌ添加した混合液に対し、ルミノメーターを用いて以下の条件で測定することができる。
ルミノメーター：アトー株式会社製の「アトー（株）製 ＡＢ−２３５０  ＰＨＥＬＩＯＳ」
ルシフェリン溶液：ニュー・イングランド・バイオラボ・ジャパン株式会社製品またはアトー株式会社製品
試料溶液：製造例に記載の通り、ルシフェラーゼ発現酵母を所定時間培養した培養上清
測定温度：２５℃
検出装置：発光検出器
検出波長：４６０ｎｍ
実施例１〜１４及び比較例１の場合、実施例１〜１４及び比較例１毎の測定した発光強度を、比較例１の発光強度で除し、この値を実施例１〜１４及び比較例１毎のルシフェラーゼ活性値比とした。評価結果を表２及び表３に示す。
ルシフェラーゼ活性値比が高いほど、培養液上清の単位体積あたりのタンパク質の活性値が高いことを意味している。
また、各実施例又は各比較例のルシフェラーゼ活性比を、各実施例及び各比較例の培養液の濁度比で除すことで、酵母濃度あたりのルシフェラーゼ活性値比を求めることができる。
この酵母濃度あたりのルシフェラーゼ活性値比が高いほど、ルシフェラーゼ活性を維持したタンパク質を効率的に生産できていることを意味する。
【００５８】
＜ルシフェラーゼの発現量の評価＞
ルシフェラーゼ発現量の評価は、以下に詳述するウェスタンブロッティング（電気泳動、転写及び発色を含む）により評価した。
（１）電気泳動
電気泳動は、組み換え酵母の培養上清１０μｌに、サンプルバッファー溶液１０μｌ添加した混合液を用いて以下の条件で実施した。
試料溶液：各実施例又は各比較例で得た培養上清
ポリアクリルアミドゲル：Ｅ−Ｒ１５Ｌ  ｅ・パジェル［アトー（株）製］
電気泳動槽：ＷＳＥ−１１００Ｐ パジェラン−Ｒ［アトー（株）製］
電気泳動時間：９０分  
サンプルバッファー溶液：４Ｘ  Ｌａｅｍｍｌｉ サンプルバッファー［バイオ・ラッド（株）製品］９００μｌと２−メルカプトエタノール１００μｌの混合液
（２）転写
転写は、上記条件で電気泳動後、転写メンブレンを用いて以下の条件で実施することができる。
転写メンブレン：Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｈｙｂｏｎｄ  Ｐ０．４５  ＰＶＤＦ［ＧＥヘルスケア（株）製］
転写液：ＡＥ−１４６５ＥｚＦａｓｔＢｌｏｔ ［アトー（株）製］を蒸留水で１０倍に希釈した液
電圧／電流：１２Ｖ／４００ｍＡ
転写時間：３０分
（３）発色
上記条件で転写後、その転写メンブレンをブロッキング、次いで一次抗体及び二次抗体で抗原抗体反応を行った。本試験においては、一次抗体としてＡｎｔｉ−Ｇｌｕｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢｉｏＬａｂｓ社製）を使用し、二次抗体として、ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ＨＲＰ標識二次抗体を用い、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＬＡＳ４０００を用いて以下の条件で発色させた。
検出器：ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＬＡＳ４０００（富士フィルム株式会社製品）
ブロッキング時間：４５分
一次抗体反応時間：１２０分
二次抗体反応時間：６０分
（４）発現量の解析方法
（１）〜（３）の操作の後、転写メンブレンにルシフェラーゼのバンドが検出された後、そのバンドの濃さをイメージＪ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，ＵＳＡ）によって、定量した。
実施例１〜１４及び比較例１の場合、実施例１〜１４及び比較例１毎の定量したバンドの濃さを、比較例１のバンドの濃さで除し、この値を実施例１〜１４及び比較例１毎のルシフェラーゼの発現量比とした。評価結果を表２及び表３に示す。
ルシフェラーゼ発現量比が高いほど、培養液上清の単位体積あたりのルシフェラーゼの発現量が高いことを意味している。
また、各実施例又は各比較例のルシフェラーゼの発現量比を、各実施例及び各比較例の培養液の濁度比で除すことで、酵母濃度あたりのルシフェラーゼの発現量比を求めることができる。
この酵母濃度あたりのルシフェラーゼの発現量比が高いほど、ルシフェラーゼ活性を維持したタンパク質を効率的に生産できていることを意味する。
【００５９】
【表２】
2018143100.tif 000004
【００６０】
【表３】
2018143100.tif 000005
【００６１】
一般式（１）で表される化合物（Ａ）を含有する実施例１〜１４は、化合物（Ａ）を含有しない比較例１と比較して、有用物質であるタンパク質としての酵素（ルシフェラーゼ）の生産量に優れることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明の有用物質の生産方法は、効率的にバイオ医薬品製造に用いる上で有用である。
【符号の説明】
【００６３】
Ａｍｐｒ：アンピシリン耐性遺伝子
ＬＥＵ２：ロイシン合成酵素
ＧＡＰｐ：ＧＡＰプロモーター
ＧＡＰｔ：ＧＡＰターミネーター
ＧＬｕｃ：Ｇａｕｓｓｉａ  ｐｒｉｎｃｅｐｓ由来のルシフェラーゼ
【図１】
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【配列表】
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