(57)【要約】      （修正有）【課題】末梢神経又は脊髄に存在する膜に特異的に結合する化合物を指標とするスクリーニング方法の提供。【解決手段】化学式（Ｉ）で示される環状アミン誘導体と、末梢神経又は脊髄から調製して得られる膜画分とを混合して対照サンプルを得る工程と、2018173307.tif 000008上記環状アミン誘導体と上記膜画分に評価化合物を混合した評価サンプルを得る工程と、上記対照サンプルと上記評価サンプルの物性値を比較する工程と、を備える、鎮痛作用を有する候補化合物のスクリーニング方法。【選択図】図４
2018173307.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の化学式（Ｉ）で示される環状アミン誘導体と、末梢神経又は脊髄から調製して得られる膜画分とを混合して前記環状アミン誘導体を前記膜画分に含まれる細胞膜に結合させる結合ステップ１と、前記結合ステップ１の後に前記細胞膜に結合していない前記環状アミン誘導体を除去して除去後の膜画分を得る回収ステップ１と、を備える、対照サンプル調製工程と、
【化１】
2018173307.tif 000007
前記環状アミン誘導体と、末梢神経又は脊髄から調製して得られる膜画分と、評価化合物とを混合して前記環状アミン誘導体と前記評価化合物とを競合させて前記膜画分に含まれる細胞膜に結合させる結合ステップ２と、前記結合ステップ２の後に前記細胞膜に結合していない前記環状アミン誘導体及び前記評価化合物を除去して除去後の膜画分を得る回収ステップ２と、を備える、評価サンプル調製工程と、
前記対照サンプルと前記評価サンプルの物性値を比較する工程と、
を備える、末梢神経又は脊髄に存在する膜に特異的に結合して鎮痛作用を有する候補化合物のスクリーニング方法。
【請求項２】
化学式（Ｉ）で示される環状アミン誘導体は、放射性同位体により標識されている、請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記末梢神経は、後根神経節、三叉神経節又は坐骨神経である、請求項１又は２記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は末梢神経又は脊髄に存在する膜に特異的に結合して鎮痛作用を有する候補化合物のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
末梢神経は、感覚神経や運動神経等の体性神経、交感神経や副交感神経等の自律神経からなり、それらの末梢神経機能の障害は様々な症状を引き起こす。例えば糖尿病による代謝性末梢神経障害において、体性神経の機能が障害された場合には感覚の鈍麻、慢性的な痛み、しびれ等が生じ、自律神経系が障害された場合には下痢、便秘、発汗異常等が生じる。また外傷や手術による傷害、ウイルス感染、腫瘍、化学療法剤の投薬、自己免疫反応（ギラン・バレー症候群等）及び遺伝性の疾患（シャルコー・マリー・トゥース病等）等は、末梢神経の機能障害を引き起こすことが知られている。特に、末梢神経障害により誘発される痛みは神経障害性疼痛と総称され、多数の患者において日常生活に苦痛を伴うことが知られている。
【０００３】
末梢神経障害の治療としては、原因疾患の治癒、原因物の除去及びメチルコバラミン等の神経障害を保護する薬物又は末梢神経の障害に付随する症状を緩和する薬物の投薬等が行われている。例えば、神経障害性疼痛に対しては、頻用される薬物としてプレガバリン、デュロキセチン及びアミトリプチリンが挙げられるが、これらの薬物に共通する問題として、有効性が認められない患者が多数存在すること、中枢神経の機能を抑制することにより眠気やふらつき等の副作用が発現しやすいことが知られている。
【０００４】
一方、神経に作用する多くの薬物は細胞膜上の受容体又はイオンチャネルを分子標的として神経の機能に影響を与えるため、神経系の治療薬の開発においては、特定の分子標的に対する結合性を指標に評価化合物から目的の候補化合物をスクリーニングする方法が広く行われている。
【０００５】
具体的には、目的の分子標的に対し特異的に結合することが知られている既知の化合物を指標として評価化合物と競合させ、目的の分子標的に対する結合能の比較から目的の化合物のスクリーニングを行う方法が一般的である。例えば、神経障害性疼痛に対して頻用される薬物であるプレガバリンの分子標的であるカルシウムチャネルα２δ−１サブユニットを用いる方法としては、放射標識されたガバペンチンを指標として比較を行い、評価化合物から神経に作用する薬物をスクリーニングする方法が報告されている（特許文献１及び非特許文献１）。また、抗不安作用や催眠鎮静作用を有するベンゾジアゼピン系化合物の分子標的であるγ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）受容体を含む脳から調製して得られる膜画分を用いる方法としては、放射標識されたジアゼパムを指標として比較を行い、評価化合物から神経に作用する薬物をスクリーニングする方法が報告されている（特許文献２及び非特許文献２）。
【０００６】
一方、齧歯類の神経障害性疼痛モデルに対し有効性を示す化合物として、１−（４−（ジメチルアミノ）ピペリジン−１−イル）−３−（１−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）プロパン−１−オンに代表される化合物が報告されている（特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許公表第２００３−５１２６０２号
【特許文献２】米国特許第５５９７９２０号
【特許文献３】国際公開２０１３／１４７１６０号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Gee NS, Brown JP, Dissanayake VU, Offord J, Thurlow R, Woodruff GN. J Biol Chem. 1996 Mar 8;271(10):5768-76.
【非特許文献２】Mohler H, Okada T. Science. 1977 Nov 25;198(4319):849-51.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、末梢神経障害を治療若しくは末梢神経障害に付随する症状を治療又は緩和する新たな薬物を見出すために、従来使用されている化合物を指標として用いたスクリーニング方法では、有効性・安全性の面から十分ではない可能性がある。
【００１０】
例えば、特許文献１及び非特許文献１に記載されるような、神経障害性疼痛に対して処方されるプレガバリン、デュロキセチン及びアミトリプチリンにより引き起こされる中枢性の副作用は、薬効を示すための分子標的と無関係の化合物の結合を阻害した結果ではなく、薬効を示すための分子標的そのものを阻害した結果であると考えられている。そのため、これらの化合物を指標として用いた場合、目的以外の分子との結合能はスクリーニングからは見出すことができず、副作用の懸念を払拭することはできない。
【００１１】
また、既存の神経障害性疼痛に対して処方される薬物の多くは中枢神経を作用点としているのに対し、末梢神経を作用組織とする薬物の数は少ない。また、特許文献３に記載の化合物の作用点は不明であり、どの組織に対して結合するかは評価されていなかった。
【００１２】
そこで本発明は、末梢神経又は脊髄に存在する膜に特異的に結合する化合物を指標として用いた、鎮痛作用を有する候補化合物のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、特許文献３に記載される化合物が、末梢神経又は脊髄に存在する膜に対し特異的に結合し、脳又はその他臓器から調製して得られる膜画分には殆ど又は全く結合しないことを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１４】
すなわち、本発明は、上記課題を解決するための（１）〜（３）の発明を提供する。
（１）  以下の化学式（Ｉ）で示される環状アミン誘導体と、末梢神経又は脊髄から調製して得られる膜画分とを混合して上記環状アミン誘導体を上記膜画分に含まれる細胞膜に結合させる結合ステップ１と、上記結合ステップ１の後に上記細胞膜に結合していない上記環状アミン誘導体を除去して除去後の膜画分を得る回収ステップ１と、を備える、対照サンプル調製工程と、
【化１】
2018173307.tif 000003
上記環状アミン誘導体と、末梢神経又は脊髄から調製して得られる膜画分と、評価化合物とを混合して上記環状アミン誘導体と上記評価化合物とを競合させて上記膜画分に含まれる細胞膜に結合させる結合ステップ２と、上記結合ステップ２の後に上記細胞膜に結合していない上記環状アミン誘導体及び上記評価化合物を除去して除去後の膜画分を得る回収ステップ２と、を備える、評価サンプル調製工程と、上記対照サンプルと上記評価サンプルの物性値を比較する工程と、を備える、末梢神経又は脊髄に存在する膜に特異的に結合して鎮痛作用を有する候補化合物のスクリーニング方法。
（２）  化学式（Ｉ）で示される環状アミン誘導体は、放射性同位体により標識されている、（１）記載のスクリーニング方法。
（３）  上記末梢神経は、後根神経節、三叉神経節又は坐骨神経である、（１）又は（２）記載のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の方法により、末梢神経又は脊髄に存在する膜画分中の分子標的に対し特異的に結合し、他の分子標的には結合しない鎮痛作用を有する候補化合物をスクリーニングする新規の方法が提供される。この方法によりスクリーニングされた化合物は、末梢神経に結合することが予想され、これまでに困難であった末梢神経障害の治療薬若しくは末梢神経障害に付随する症状を治療又は緩和する薬物を開発する上で有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、化学式（Ｉ）で示される環状アミン誘導体が、既知の特異的結合に対する阻害作用を示さないたんぱく質の一覧である。
【図２】図２は、マウスの各組織から調製して得られた各種の膜画分に対する化学式（Ｉ）で示される環状アミン誘導体の特異的結合（ｄｐｍ／μｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）のグラフである。
【図３】図３は、神経障害性疼痛モデルラットの各組織から調製して得られた各種の膜画分に対する化学式（Ｉ）で示される環状アミン誘導体の特異的結合（ｄｐｍ／μｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）のグラフである。
【図４】図４は、各種の評価化合物を添加した際の結合率を比較したグラフである。
【図５】図５は、マウス坐骨神経部分結紮モデルに対する化学式（ＩＩ）で示される化合物の効果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の末梢神経又は脊髄に存在する膜に特異的に結合して鎮痛作用を有する候補化合物のスクリーニング方法は、以下の化学式（Ｉ）で示される環状アミン誘導体と、末梢神経又は脊髄から調製して得られる膜画分とを混合して上記環状アミン誘導体を上記膜画分に含まれる細胞膜に結合させる結合ステップ１と、上記結合ステップ１の後に上記細胞膜に結合していない上記環状アミン誘導体を除去して除去後の膜画分を得る回収ステップ１と、を備える、対照サンプル調製工程と、
【化２】
2018173307.tif 000004
上記環状アミン誘導体と、末梢神経又は脊髄から調製して得られる膜画分と、評価化合物とを混合して上記環状アミン誘導体と上記評価化合物とを競合させて上記膜画分に含まれる細胞膜に結合させる結合ステップ２と、上記結合ステップ２の後に上記細胞膜に結合していない上記環状アミン誘導体及び上記評価化合物を除去して除去後の膜画分を得る回収ステップ２と、を備える、評価サンプル調製工程と、上記対照サンプルと上記評価サンプルの物性値を比較する工程と、を備えることを特徴とする。
【００１８】
本発明においては、末梢神経又は脊髄に存在する膜に対し、特異的に結合する以下の化学式（Ｉ）で示される環状アミン誘導体（以下、上記環状アミン誘導体）を、評価化合物との競合化合物として用いることで、候補化合物をスクリーニングすることができる。ここで、以下の化学式（Ｉ）で示される環状アミン誘導体とは、その環状アミン誘導体の塩も含んだものを意味する。
【化３】
2018173307.tif 000005
【００１９】
なお、本発明において、上記対照サンプルと上記評価サンプルの物性値を比較する工程として、放射性トレーサ法による放射能の比較を行うことが好ましい。具体的には、放射性同位体により標識された上記環状アミン誘導体を用いて、対照サンプル及び評価サンプルを調製する。この際、対照サンプルでは評価化合物との競合が起きないため、放射性同位体により標識された上記環状アミン誘導体と膜画分の結合は最大になるが、評価サンプルでは評価化合物との競合により、放射性同位体により標識された上記環状アミン誘導体と膜画分の結合は減少する。これにより、対照サンプルと評価サンプルでは、放射性同位体により標識された化合物の結合量が異なるため、対照サンプルと評価サンプルの放射能の比較を放射性トレーサ法によって行う工程により、評価化合物が上記環状アミン誘導体と比較してどの程度末梢神経又は脊髄に存在する膜と特異的結合を行うか示すことができる。ここで、標識に用いる放射性同位体としては、３Ｈ又は１４Ｃが好ましい。
【００２０】
本発明において、膜画分は、後根神経節、三叉神経節、坐骨神経又はその他の末梢神経若しくは脊髄を含む動物の組織から調製して得られたものが好ましく、後根神経節、三叉神経節、坐骨神経又はその他の末梢神経若しくは脊髄を含むマウス又はラットの組織から調製して得られたものがさらに好ましい。
【００２１】
本発明において、膜画分としては、機械式組織破砕装置を用いて組織を破砕し、遠心機によって分画を施すことで得られた破砕された膜画分又は界面活性剤によって生体由来材料を破壊し、遠心機によって分画を施すことで得られた溶解された膜画分を使用できる。
【００２２】
本発明において、上記環状アミン誘導体と末梢神経又は脊髄から調製して得られる膜画分とを混合して上記環状アミン誘導体を上記膜画分に含まれる細胞膜に結合させる結合ステップ１、並びに、上記環状アミン誘導体と、末梢神経又は脊髄から調製して得られる膜画分と、評価化合物とを混合して上記環状アミン誘導体と上記評価化合物とを競合させて上記膜画分に含まれる細胞膜に結合させる結合ステップ２の条件としては、４℃から３７℃までの温度条件で、５分から７２時間までの任意の時間を設定することができる。結合ステップ１及び２で用いる水溶液としては、Ｋｒｅｂｓ溶液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液及びリン酸緩衝液を含む緩衝液を使用することができる。膜に対して特異的結合した放射性同位体により標識された上記環状アミン誘導体の放射能を測定する方法としては、ガラスフィルター等のフィルターを用いて膜画分を吸着する方法のほか、シンチレーション近接アッセイ、遠心操作により膜画分を分離する方法、ゲルろ過法等で界面活性剤により可溶化した膜画分を分離する方法を使用することができる。
【実施例】
【００２３】
実施例１：既知の特異的結合に対する、化学式（Ｉ）で示される環状アミン誘導体（以下、化合物１）の阻害作用
既知のたんぱく質を含む生体試料とそれに対応する各種リガンドの特異的結合に対する、化合物１の阻害作用を網羅的に検討した。具体的には、図１に示される８８種類の既知の受容体、チャネル及びトランスポーターに対して、対応する各種リガンドの放射標識体との混合物であるサンプルを調製した。また、さらに１０μｍｏｌ／Ｌの化合物１を加え、リガンドとたんぱく質の特異的結合に対して化合物１を競合させる工程を行い、阻害作用を検討した。その結果、図１に示す８８種類の既知の受容体、チャネル及びトランスポーターとそれに対応する各種リガンドとの特異的結合に対して、上記環状アミン誘導体の阻害作用は３０％未満であった。このことから、化合物１は未知の分子標的に対する結合を有することが示唆された。
【００２４】
実施例２：マウス組織から調製して得られた膜画分と３Ｈで標識された化合物１の結合評価
マウスの各組織から調製して得られた膜画分と３Ｈで標識された化合物１の結合性を評価することにより、化合物１の未知の分子標的を含む組織を明らかにした。
【００２５】
マウスは５週齢で入荷したＩＣＲ系雄性マウス（日本チャールズリバー株式会社製）を６週齢で使用した。マウスをイソフルランで麻酔し、ヘパリン（１０００Ｕ／Ｌ；味の素株式会社製）を含む室温リン酸緩衝生理食塩液（以下、ＰＢＳ）（タカラバイオ株式会社製）を用いて左心室より灌流脱血した。その後断頭し、頭部から以下の組織を採取した。目は単離したのち赤道面上で切断し、網膜側を採取した。頭蓋を冷ＰＢＳにて１分間冷却した後、頭蓋骨をはがして全脳を取り出した。また、全脳から小脳及び脳幹を採取し、全脳のうち残る部分をすべて大脳として採取した。全脳を取り出した後の頭蓋から、下垂体と三叉神経節を採取した。体部からは肩部からＬ６脊髄までの脊柱を取り出し、脊髄、脊髄後根神経節（以下、ＤＲＧ）を採取した。肝臓、腎臓は皮膜を取り除いて採取した。脂肪は精巣の周辺を採取した。小腸はシリンジにより内容物を除いてから採取した。骨格筋は大腿部の一部を採取した。皮膚は大腿部の毛刈りをした後に５ｍｍ四方程度に切断して採取した。その他、坐骨神経、心臓、肺、副腎、脾臓、膀胱、膵臓を定法に従って採取した。採取した組織は直ちにドライアイスにて凍結し、−８０oＣにて保存した。下垂体、三叉神経節、ＤＲＧ、坐骨神経は３匹の個体から採取した組織を混合し、１サンプルとして扱った。その他の組織は１匹から採取した組織を１サンプルとして扱った。各組織２群により構成し、本検討では計６匹のマウスを使用した。
【００２６】
膜画分の取得はＣｏｘらの方法（Ｂ．Ｃｏｘ，Ａ．Ｅｍｉｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ，１，１８７２−７８（２００６））に準じて行った。採取した組織にホモジナイズバッファー（スクロース（２５０ｍｍｏｌ／Ｌ）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（５０ｍｍｏｌ／Ｌ）、１×プロテアーゼインヒビターカクテル（シグマアルドリッチ社製）；ホモジナイズバッファーのｐＨ：７．６）を加えてポリトロンホモジナイザーで破砕した。６０００×ｇの遠心にて核・ミトコンドリア成分を沈殿として除去した後、上清中のミクロソームを１０万×ｇの超遠心により沈殿させた。沈殿をＫｒｅｂｓ溶液（ＮａＣｌ（１１７ｍｍｏｌ／Ｌ）、ＫＣｌ（３．６ｍｍｏｌ／Ｌ）、ＣａＣｌ２（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）、ＭｇＣｌ２（１．２ｍｍｏｌ／Ｌ）、ＮａＨ２ＰＯ４（１．２ｍｍｏｌ／Ｌ）、ＮａＨＣＯ３（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）、グルコース（１１ｍｍｏｌ／Ｌ）；Ｋｒｅｂｓ溶液のｐＨ：７．４）にて懸濁し、ＢＣＡプロテインアッセイキット（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）でたんぱく質量を定量した膜画分として−８０℃にて保存した。
【００２７】
膜画分と化合物１の反応は９６穴プレート中で、すべて上記Ｋｒｅｂｓ溶液を用いて行った。添加後のたんぱく質量がおよそ２〜１０μｇとなるよう、Ｋｒｅｂｓ溶液に対し各種の膜画分を２５μＬ添加した。この各種の膜画分に対し、３０μｍｏｌ／Ｌ（終濃度１０μｍｏｌ／Ｌ）の化合物１（非標識体）を２５μＬ添加したものをサンプルＡ群とし、溶媒（蒸留水）２５μＬを添加したものをサンプルＢ群とした。
【００２８】
上記のサンプルＡ群及びＢ群に対し、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド（終濃度０．１％（ｗ／ｖ））を含む３０ｎｍｏｌ／Ｌ（終濃度１０ｎｍｏｌ／Ｌ）の３Ｈで標識された化合物１を２５μＬ添加し、速やかに３７℃のインキュベーター中に移動して反応を開始させた。１時間インキュベーションした後、４℃にて５分間冷却を行い、反応を停止させた。ガラスフィルタープレート（パーキンエルマー株式会社製）に膜画分を吸着させた。ガラスフィルタープレートを洗浄（６回）後、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔ２０（パーキンエルマー株式会社製）を２０μＬ添加し、結合した３Ｈで標識された化合物１の放射能について、壊変率（以下、ｄｐｍ）を液体シンチレーション法により測定した。サンプルＢ群に対するｄｐｍの測定値の平均から、サンプルＡ群に対するｄｐｍの測定値の平均を引いた差を、たんぱく質量で除した値を特異的結合（ｄｐｍ／μｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）として算出し、図２に示した。
【００２９】
その結果、各種の膜画分に対する化合物１の特異的結合は、後根神経節、三叉神経節又は坐骨神経といった末梢神経から調製して得られた膜画分で顕著であった。次いで脊髄から調製して得られた膜画分では、後根神経節から調製して得られた膜画分の１９％であった。脳幹から調製して得られた膜画分では、後根神経節から調製して得られた膜画分の１５％未満であり、脳を含むその他の組織から調製して得られた膜画分では、後根神経節から調製して得られた膜画分の５％未満であった。化合物１が末梢神経又は脊髄から調製して得られた膜画分に対して特異的に結合したことから、化合物１の分子標的は、末梢神経又は脊髄に存在し、末梢神経又は脊髄に存在する膜に結合して作用することが見出された。
【００３０】
実施例３：神経障害性疼痛モデルラット組織から調製して得られた膜画分と３Ｈで標識した化合物１の結合評価
神経障害性疼痛モデルラット組織から調製して得られた膜画分と３Ｈで標識した化合物１の結合評価を行った。
【００３１】
ラットは５週齢で入荷したＳｐｒａａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ系雄性ラット（日本チャールズリバー株式会社製）を６週齢で使用した。神経障害性疼痛モデルは、Ｃｈｕｎｇらの方法（Ｓ．Ｋｉｍ，Ｊ．Ｃｈｕｎｇ，Ｐａｉｎ，５０，３５５−６３（１９９２））に準じ作製した。イソフルラン吸入麻酔下にてラットの右側腰背部を切開、脊髄椎弓を切除し脊髄神経のＬ５，Ｌ６の神経根を完全結紮することにより、神経障害性疼痛モデルを作製した。神経結紮後１週間が経過したラットに対しｖｏｎ  Ｆｒｅｙ試験を行い、アロディニアを呈した個体を以下の実験に使用した。
【００３２】
ラットをイソフルランで麻酔し、腹部大静脈より約５ｍＬの採血を行った。続いて冷ＰＢＳ溶液（タカラバイオ株式会社製）を用いて左心室よりを灌流脱血した。その後、大脳、脊髄、後根神経節（結紮側Ｌ４〜Ｌ６）、坐骨神経（結紮側）、皮膚（結紮側の後肢裏側より裁断）及び肝臓の一部を採取し、冷ＰＢＳにて洗浄し裁断した。血液は１匹あたり１０Ｕのヘパリンを加えて常温で放置した後、血液の１／５の容量のＨｅｔａＳｅｐ（ステムセル・テクノロジーズ社製）を加えて白血球と血小板を多く含む画分を用いた。大脳、肝臓はラット１匹分を、その他組織はラット２匹分を合わせて１例としてサンプル調製を行い、１群を３例とした。標識されていない化合物１の添加群及び溶媒添加群の２群は１例の組織を分割して用いており、計６匹のラットを使用した。
【００３３】
膜画分の取得は実施例２で示した方法と同様に実施した。膜画分を、およそ４０μｇのたんぱく質となるよう１５０μＬ添加した。この各種の膜画分に対し、５００μｍｏｌ／Ｌ（終濃度１００μｍｏｌ／Ｌ）の化合物１（非標識体）を５０μＬ添加したものをサンプルＡ群とし、溶媒（蒸留水）５０μＬを添加したものをサンプルＢ群とした。
【００３４】
上記のサンプルＡ群及びＢ群に対し、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド（終濃度０．１％（ｗ／ｖ））を含む５０ｎｍｏｌ／Ｌ（終濃度１０ｎｍｏｌ／Ｌ）の３Ｈで標識された化合物１を５０μＬ添加し、速やかに３７℃のインキュベーター中に移動して反応を開始させた。１時間インキュベーションした後、０．０３％（ｗ／ｖ）ポリエチレンイミンを処理したガラスフィルター（ブランデル社製）に膜画分を吸着させた。ガラスフィルターを洗浄（６回）後、ポリエチレンバイアルに挿入し、クリアゾルＩ（ナカライテスク株式会社製）を加えて結合した３Ｈで標識された化合物１の放射能について、ｄｐｍを液体シンチレーション法により測定した。サンプルＢ群に対するｄｐｍの測定値の平均から、サンプルＡ群に対するｄｐｍの測定値の平均を引いた差を、たんぱく質量で除した値を特異的結合（ｄｐｍ／μｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）として算出し、図３に示した。
【００３５】
その結果、化合物１の特異的結合は、三叉神経節、後根神経節及び坐骨神経といった末梢神経又は脊髄から調製して得られた膜画分のみに見られ、脳やその他の組織から調製して得られた膜画分に対する特異的結合は、後根神経節から調製して得られた膜画分の５％未満であった。すなわち、神経障害性疼痛モデルラットの末梢神経組織を用いた実験によっても、実施例２と同様に、化合物１の分子標的は末梢神経又は脊髄に存在し、末梢神経又は脊髄に存在する膜に結合して作用することが見出された。
【００３６】
実施例４：ラット組織から調製して得られた膜画分と３Ｈで標識した化合物１の特異的結合に対する各種の評価化合物の影響評価
放射標識された化合物１を用いてスクリーニング法を確立するため、ラット組織から調製して得られた膜画分と３Ｈで標識された化合物１の特異的結合に対する各種の評価化合物の影響を評価した。
【００３７】
ラットは５週齢で入荷したＳｐｒａａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ系雄性ラット（日本チャールズリバー株式会社製）を６週齢で使用した。上記のラットをイソフルラン麻酔下放血により安楽死させ、後根神経節を採取し、冷ＰＢＳにて洗浄し裁断した。各種の膜画分の取得は実施例２で示した方法と同様に実施した。膜画分をおよそ４０μｇのたんぱく質となるよう１５０μＬ添加した。この各種の膜画分に対し、図４に示す終濃度（１０ｎｍｏｌ／Ｌ又は１００ｎｍｏｌ／Ｌ）となるように、各種の評価化合物（非標識体）を５０μＬ添加したものをサンプルＡ群とし、溶媒（ジメチルスルホキシド又は蒸留水）５０μＬを添加したものをサンプルＢ群とした。
【００３８】
上記のサンプルＢ群に対し、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド（終濃度０．１％（ｗ／ｖ））を含む５０ｎｍｏｌ／Ｌ（終濃度１０ｎｍｏｌ／Ｌ）の３Ｈで標識された化合物１を５０μＬ添加し、速やかに３７℃のインキュベーター中に移動して反応を開始させた。ここで、１時間インキュベーションすることで化合物１を上記膜画分に含まれる細胞膜に結合させる結合ステップ１を行った。インキュベーション後、０．０３％（ｗ／ｖ）ポリエチレンイミンを処理したガラスフィルター（ブランデル社製）に膜画分を吸着させ、ガラスフィルターを洗浄（６回）して細胞膜に結合していない化合物１の除去を行い、除去後の膜画分を得る回収ステップを行い、対照サンプル群を調製した。
【００３９】
上記のサンプルＡ群に対し、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド（終濃度０．１％（ｗ／ｖ））を含む５０ｎｍｏｌ／Ｌ（終濃度１０ｎｍｏｌ／Ｌ）の３Ｈで標識された化合物１を５０μＬ添加し、速やかに３７℃のインキュベーター中に移動して反応を開始させた。ここで、１時間インキュベーションすることで、化合物１と上記評価化合物とを競合させて上記膜画分に含まれる細胞膜に結合させる結合ステップ２を行った。インキュベーション後、０．０３％（ｗ／ｖ）ポリエチレンイミンを処理したガラスフィルター（ブランデル社製）に膜画分を吸着させた。ガラスフィルターを洗浄（６回）して細胞膜に結合していない化合物１及び上記評価化合物の除去を行い、除去後の膜画分を得る回収ステップを行い、評価サンプル群を調製した。
【００４０】
上記の対照サンプル群及び評価サンプル群をそれぞれポリエチレンバイアルに挿入し、クリアゾルＩ（ナカライテスク株式会社製）を加え、各種の膜画分に結合した３Ｈで標識された化合物１の放射能について、ｄｐｍを液体シンチレーション法により測定した。評価サンプル群に対するｄｐｍの測定値の平均を、対照サンプル群の測定値の平均で除した値を結合率（％）として算出した（図４Ａ〜Ｃ）。
【００４１】
それぞれ、評価化合物として用いた、μオピオイド受容体アゴニストであるＤＡＭＧＯ（シグマアルドリッチ社製）、ＧＡＢＡＡ受容体に作用するジアゼパム（シグマアルドリッチ社製）、カンナビノイド受容体アゴニストであるＷＩＮ５５，２１２−２（シグマアルドリッチ社製）、ヒスタミンＨ３及びＨ４受容体のアンタゴニストであるチオペラミド（シグマアルドリッチ社製）及びカルシウムチャネルα２δ−１サブユニットに作用するプレガバリンは、それぞれが高濃度（１００μｍｏｌ／Ｌ）の条件においても３Ｈで標識された化合物１の結合率は７５％以上であり（図４Ａ及びＢ）、化合物１の特異的結合を阻害しなかったことから、これらの分子標的は化合物１の分子標的と異なることが示された。
【００４２】
さらに、以下の化学式（ＩＩ）で示される化合物（以下、化合物２）は、１００μｍｏｌ／Ｌの条件においても３Ｈで標識された化合物１の結合率が４０％未満であり（図４Ｃ）、化合物１の特異的結合を阻害した。ここから、化合物２は化合物１と同一の分子標的に結合し、末梢神経に存在する膜に特異的に結合することを見出した。
【化４】
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【００４３】
実施例５：マウス坐骨神経部分結紮モデルに対する効果
神経障害性疼痛を評価できるマウス坐骨神経部分結紮モデル（Ｓｅｌｔｚｅｒモデル）を用い、実施例４において本スクリーニング方法から見出された化合物２の鎮痛作用を検討した。
【００４４】
マウス坐骨神経部分結紮モデルは、Ｓｅｌｔｚｅｒらの方法（Ｍａｌｍｂｅｒｇら、Ｐａｉｎ、１９９８年、第７６巻、ｐ．２１５−２２２）に従って作製した。
【００４５】
マウスは４齢で入荷したＩＣＲ系雄性マウス（日本チャールズリバー株式会社製）を５週齢で使用した。マウスをペントバルビタールナトリウム（７０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内投与）にて麻酔し、右側後肢大腿部の坐骨神経を露出させ、実体顕微鏡下で８−０の絹糸（株式会社夏目製作所製）を用いて坐骨神経を半周だけ強度に三重結紮した群を坐骨神経部分結紮群とし、坐骨神経を露出しただけで、結紮しなかった群を偽手術群とした。
【００４６】
神経障害性疼痛の評価（以下、ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ試験）は、網上に設置した測定用アクリル製ケージ（株式会社シナノ製作所製）内でマウスを最低２時間馴化させた後、０．１６ｇの圧がかかるフィラメント（ニューロサイエンス社製）を用い、右側後肢の足底にフィラメントを３秒間押し当てる機械的触刺激を３秒間隔で３回繰り返し行い、機械的触刺激を加えたときの逃避行動の強度をスコア化（０：無反応、１：刺激に対して緩徐でわずかな逃避行動、２：ｆｌｉｎｃｈｉｎｇ（足をすばやく連続的に振る行動）やｌｉｃｋｉｎｇ（足舐め行動）を伴わない刺激に対する素早い逃避行動、３：ｆｌｉｎｃｈｉｎｇ又はｌｉｃｋｉｎｇを伴う素早い逃避行動）し、その３回のスコアの合計値（以下、総スコア）を痛みの指標とした。
【００４７】
坐骨神経結紮手術７日後に、坐骨神経部分結紮群のマウスに、化合物２（０．１ｍｇ／ｋｇ）又は陽性対照としてプレガバリン（３ｍｇ／ｋｇ；ケンプロテック社製）を、生理食塩液に溶解して尾静脈より投与した。坐骨神経部分結紮群のマウスに、化合物２を投与した群を、「坐骨神経部分結紮＋化合物２」群とし、プレガバリンを投与した群を、「坐骨神経部分結紮＋プレガバリン」群とした。また、坐骨神経部分結紮群のマウスに生理食塩液を静脈内投与した群を、「坐骨神経部分結紮＋生理食塩液」群とし、偽手術群のマウスに生理食塩液を静脈内投与した群を、「偽手術＋生理食塩液」群とした。ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ試験は、被験化合物の静脈内投与前（ｐｒｅ値）、静脈内投与３０分後及び１２０分後に実施した。
【００４８】
結果を図５に示す。図において、縦軸はｖｏｎ  Ｆｒｅｙ試験の総スコア（平均値±標準誤差；ｎ＝５〜６である。）を示し、数値が高いほど痛みが強いことを示す。横軸には被験化合物投与後の時間（ｈｒ）を示す。薬効評価は、プレガバリンを投与した群（図中の「坐骨神経部分結紮＋プレガバリン」）については、測定時間毎の「坐骨神経部分結紮＋生理食塩液」群（図中の「坐骨神経部分結紮＋生理食塩液」）を対照として、対応のない２群のＷｅｌｃｈ検定により統計処理を行った。一方、化合物２を投与した群（図中の「坐骨神経部分結紮＋化合物２」）については、測定時間毎の「坐骨神経部分結紮＋生理食塩液」群（図中の「坐骨神経部分結紮＋生理食塩液」）を対照として、Ｗｅｌｃｈ検定により統計処理を行った。図中の＊印は、「坐骨神経部分結紮＋生理食塩液」群との比較で統計学的に有意である（ｐ＜０．０５）ことを示す（対応のない２群のＷｅｌｃｈ検定）。
【００４９】
ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ試験の結果によれば、化合物２の静脈内投与（図中の「坐骨神経部分結紮＋化合物２」）は、陽性対照であるプレガバリン（図中の「坐骨神経部分結紮＋プレガバリン」）と同様に、統計学的に有意な鎮痛作用を示した。このことから、本スクリーニング方法が、末梢神経又は脊髄に存在する膜に特異的に結合して鎮痛作用を有する候補化合物のスクリーニング方法として有用であることを見出した。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
主に末梢神経に存在する膜に結合する候補化合物をスクリーニングする方法を用いて、末梢神経に作用する薬物を開発することで、中枢神経に対する副作用を低減し、末梢神経の障害の進行の抑制若しくは障害された末梢神経の機能を補強又は回復可能な薬物を提供できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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