(57)【要約】【課題】簡便で高感度なルシフェラーゼアッセイを可能とする阻害剤の提供。【解決手段】下記一般式（Ａ）等の化合物を含むことを特徴とする、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応の阻害剤。［式（Ａ）中、Ｒ１及びＲ３は炭素数１〜４のアルキル基を表し、Ｒ２、Ｒ４及びＲ５は、水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表し、ｎ１はＲ１の数を表し、ｎ３はＲ３の数を表す。］［化１］2018143140.tif 000029【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（Ａ）、下記一般式（Ｂ）、及び下記一般式（Ｃ）で表される化合物、並びにそれらの塩からなる群より選択される少なくとも一種の化合物を含むことを特徴とする、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応の阻害剤。
【化１】
2018143140.tif 000025
［式（Ａ）中、
Ｒ１及びＲ３は、それぞれ独立して、炭素数１〜４の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基を表し、
Ｒ２、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素数１〜４の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基を表し、
ｎ１はＲ１の数を表し、０〜４のいずれかの整数であり、ｎ１が２以上である場合、複数個のＲ１同士は互いに同一でも異なっていてもよく、
ｎ３はＲ３の数を表し、０〜４のいずれかの整数であり、ｎ３が２以上である場合、複数個のＲ３同士は互いに同一でも異なっていてもよい。］
【化２】
2018143140.tif 000026
［式（Ｂ）中、
Ｒ６及びＲ８は、それぞれ独立して、炭素数１〜４の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基を表し、
Ｒ７、Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素数１〜４の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基を表し、
ｎ６はＲ６の数を表し、０〜４のいずれかの整数であり、ｎ６が２以上である場合、複数個のＲ６同士は互いに同一でも異なっていてもよく、
ｎ８はＲ８の数を表し、０〜３のいずれかの整数であり、ｎ８が２以上である場合、複数個のＲ８同士は互いに同一でも異なっていてもよい。］
【化３】
2018143140.tif 000027
［式（Ｃ）中、
Ｒ１１及びＲ１３は、それぞれ独立して、炭素数１〜４の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基を表し、
Ｒ１２は、水素原子又は炭素数１〜４の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基を表し、
ｎ１１はＲ１１の数を表し、０〜８のいずれかの整数であり、ｎ１１が２以上である場合、複数個のＲ１１同士は互いに同一でも異なっていてもよく、
ｎ１３はＲ１３の数を表し、０〜５のいずれかの整数であり、ｎ１３が２以上である場合、複数個のＲ１３同士は互いに同一でも異なっていてもよい。］
【請求項２】
下記一般式（Ｄ）で表される化合物、及びそれらの塩からなる群より選択される少なくとも一種の化合物を含むことを特徴とする、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応の阻害剤。
【化４】
2018143140.tif 000028
［式（Ｄ）中、
Ｒ１４及びＲ１７は、それぞれ独立して、炭素数１〜４の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基を表し、
Ｒ１５は、水素原子又は炭素数１〜４の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基を表し、
Ｒ１６は、２価の連結基を表す。
ｎ１４はＲ１４の数を表し、０〜３のいずれかの整数であり、ｎ１４が２以上である場合、複数個のＲ１４同士は互いに同一でも異なっていてもよい。
ｎ１７はＲ１７の数を表し、０〜５のいずれかの整数であり、ｎ１７が２以上である場合、複数個のＲ１７同士は互いに同一でも異なっていてもよい。］
【請求項３】
請求項１又は２に記載のルシフェリン−ルシフェラーゼ反応の阻害剤を用いて、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応を阻害する阻害方法。
【請求項４】
第１ルシフェラーゼ、第１発光物質である第１ルシフェリン、及び第２発光物質を含む測定対象物の、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンとを反応させ、前記測定対象物から発せられた光の発光量Ｌ１を測定する第１測定工程、
請求項１又は２に記載の阻害剤と前記測定対象物とを接触させて、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンとの反応によって生じる発光量を低下させ、前記測定対象物から発せられた発光量Ｌ２を測定する第２測定工程、並びに
前記発光量Ｌ１の値と、前記発光量Ｌ２の値とに基づいて、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンの反応により生じた光Ａ、及び前記第２発光物質により生じた光Ｂを識別する識別工程、
を含む光識別方法。
【請求項５】
前記第２発光物質が第２ルシフェリンであり、
前記測定対象物が、前記第１ルシフェリン、前記第１ルシフェラーゼ、前記第２ルシフェリン、及び前記第２ルシフェリンと反応させる第２ルシフェラーゼを含み、
前記測定対象物の、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンとを反応させ、前記第２ルシフェラーゼと前記第２ルシフェリンとを反応させ、前記測定対象物から発せられた光の発光量Ｌ１を測定する第１測定工程、
請求項１又は２に記載の阻害剤と前記測定対象物とを接触させて、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンとの反応によって生じる発光量を低下させ、前記測定対象物から発せられた発光量Ｌ２を測定する第２測定工程、並びに
前記発光量Ｌ１の値と、前記発光量Ｌ２の値とに基づいて、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンとの反応により生じた光Ａ、及び前記第２ルシフェラーゼと前記第２ルシフェリンとの反応により生じた光Ｂを識別する識別工程、
を含む請求項４に記載の光識別方法。
【請求項６】
前記阻害剤非存在下における、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンの反応により生じた光Ａの発光量を発光量Ａ１とし、
前記阻害剤存在下における、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンの反応により生じた光Ａの発光量を発光量Ａ２とし、
前記阻害剤非存在下における、前記第２ルシフェラーゼと前記第２ルシフェリンの反応により生じた光Ｂの発光量を発光量Ｂ１とし、
前記阻害剤存在下における、前記第２ルシフェラーゼと前記第２ルシフェリンの反応により生じた光Ｂの発光量を発光量Ｂ２としたときに、
光Ａの発光量の低下率（Ａ２/Ａ１）と、光Ｂの発光量の低下率（Ｂ２/Ｂ１）が異なる、請求項５に記載の光識別方法。
【請求項７】
前記阻害剤が請求項１に記載の阻害剤であり、
前記第１ルシフェラーゼがＦｌｕｃ、Ｌｕｃ２又はＣＢＲであり、前記第２ルシフェラーゼがＣＢＧである請求項５又は６に記載の光識別方法。
【請求項８】
前記測定対象物が、さらに第３発光物質を含み、
前記測定対象物の、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンとを反応させ、前記第２ルシフェラーゼと前記第２ルシフェリンとを反応させ、前記測定対象物から発せられた光の発光量Ｌ１を測定する第１測定工程、
請求項２に記載の阻害剤と前記測定対象物とを接触させて、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンとの反応によって生じる発光量を低下させ、前記測定対象物から発せられた発光量Ｌ２を測定する第２測定工程、
請求項１に記載の阻害剤と前記測定対象物とを接触させて、前記第２ルシフェラーゼと前記第２ルシフェリンとの反応によって生じる発光量を低下させ、前記測定対象物から発せられた発光量Ｌ３を測定する第３測定工程、並びに
前記発光量Ｌ１の値と、前記発光量Ｌ２の値と、前記発光量Ｌ３の値とに基づいて、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンとの反応により生じた光Ａ、前記第２ルシフェラーゼと前記第２ルシフェリンとの反応により生じた光Ｂ、及び前記第３発光物質により生じた光Ｃを識別する識別工程、
を含む請求項５又は６に記載の光識別方法。
【請求項９】
請求項２に記載の阻害剤及び請求項１に記載の阻害剤非存在下における、前記第２ルシフェラーゼと前記第２ルシフェリンの反応により生じた光Ｂの発光量を発光量Ｂ１とし、
請求項２に記載の阻害剤が存在し、請求項１に記載の阻害剤非存在下における、前記第２ルシフェラーゼと前記第２ルシフェリンの反応により生じた光Ｂの発光量を発光量Ｂ２とし、
請求項１に記載の阻害剤が存在し、請求項２に記載の阻害剤非存在下における、前記第２ルシフェラーゼと前記第２ルシフェリンの反応により生じた光Ｂの発光量を発光量Ｂ３としたとき、
光Ｂの発光量の低下率（Ｂ２/Ｂ１）と、光Ｂの発光量の低下率（Ｂ３/Ｂ１）とで、
前記（Ｂ２/Ｂ１）の値が、前記（Ｂ３/Ｂ１）の値よりも小さい、請求項８に記載の光識別方法。
【請求項１０】
前記第２ルシフェリンが、前記第１ルシフェリンと同じ種類のルシフェリンである請求項５〜９のいずれか一項に記載の光識別方法。
【請求項１１】
前記第１ルシフェラーゼがＣＢＲであり、前記第２ルシフェラーゼがＦｌｕｃ又はＬｕｃ２である請求項８〜１０のいずれか一項に記載の光識別方法。
【請求項１２】
前記第１ルシフェリンが、Ｄ−ルシフェリン又はその類縁体である請求項４〜１１のいずれか一項に記載の光識別方法。
【請求項１３】
前記測定対象物が細胞であり、測定対象物の前記細胞から発せられた光を、細胞非破壊的に測定する請求項４〜１２のいずれか一項に記載の光識別方法。
【請求項１４】
請求項４〜１３のいずれか一項に記載の光識別方法を用いる物質の検出方法。
【請求項１５】
請求項４〜１３のいずれか一項に記載の光識別方法を用いるレポーターアッセイ方法。
【請求項１６】
第１ルシフェラーゼ、第１発光物質である第１ルシフェリン、及び第２発光物質を含む前記測定対象物が、遺伝子調節領域の下流に前記第１ルシフェラーゼ遺伝子が連結された融合遺伝子が導入され、前記第１ルシフェラーゼを発現している組み換え細胞又はその抽出物を含む請求項１５に記載のレポーターアッセイ方法。
【請求項１７】
請求項３に記載の阻害方法、請求項４〜１３のいずれか一項に記載の光識別方法、請求項１４に記載の物質の検出方法、又は請求項１５又は１６に記載のレポーターアッセイ方法に使用されるキットであって、請求項１又は２に記載の阻害剤を備えるキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応の阻害剤、阻害方法、光識別方法、物質の検出方法、レポーターアッセイ方法及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
発光タンパク質であるルシフェラーゼは、発光活性を測定するという簡便さと、高感度であることから、遺伝子発現や酵素活性、ＡＴＰ等の定量に広く用いられている。
正確な発光活性測定には、内在する比較標準（内部標準）が必要となる。そのためには、同時に複数の発光活性を測定できるアッセイ系であることが望ましい。そのような要求を満たす技術としてデュアルルシフェラーゼアッセイがあり、既存のデュアルルシフェラーゼアッセイとしては以下の手法のものが知られている。
【０００３】
従来のデュアルルシフェラーゼアッセイでは、基質が異なる２種類のルシフェラーゼを用いた方法（Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ａｓｓａｙ：ＤＬＲＡ、又はデュアルシーパンジー発光キットとして販売されている。）があり、遺伝子発現定量等に広く用いられている（非特許文献１）。図１２左は、ＤＬＲＡの手順を説明する模式図である。
また、発光波長帯が異なる２種類のルシフェラーゼを用いた方法もある。これは、マルチカラールシフェラーゼを用い、発光測定時に偏光フィルターを切り替えることによって、例えば、緑色発光と赤色発光を独立に測定することが可能であり、上記ＤＬＲＡとは異なり、同一の発光基質（Ｄ−ルシフェリン）を用いることが可能である。これは、Ｄｕａｌ−ｃｏｌｏｒ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙ（ＤＣＬＡ）又はマルチカラールックレポーターアッセイシステムと称され、市販されており、遺伝子発現定量等に広く用いられている（非特許文献２）。図１２右は、ＤＣＬＡの手順を説明する模式図である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Matsuo N, Minami M, Maeda T, Hiratsuka K, Dual luciferase assay for monitoring transient gene expression in higher plants., Plant Biotechnology, 18, 71-75, 2001
【非特許文献２】Ogura R, Matsuo N, Wako N, Tanaka T, Ono S, Hiratsuka K, Multi-color luciferases as reporters for monitoring transient gene expression in higher plants. Plant Biotechnol. 22, 151-155. 2005
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記に挙げたＤＬＲＡでは、例えば、ホタルルシフェラーゼ（ｆｉｒｅｆｌｙ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ：Ｆｌｕｃ）とウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｅｎｉｌｌａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ：Ｒｌｕｃ）の基質特異性と反応条件の差異を利用しており、一般的には、ルシフェリン添加によるＦｌｕｃ活性を測定後、続いてＲｌｕｃの基質であるセレンテラジン添加と同時にＦｌｕｃが不活性化される反応条件にすることで、Ｒｌｕｃ活性を測定している。したがって、この方法では、異なる２種類の発光基質と、それらに対応する緩衝液を準備する必要がある。
上記に挙げたＤＣＬＡでは、マルチカラールシフェラーゼを用いて、発光測定時に偏光フィルターを切り替えることによって、例えば緑色発光と赤色発光を独立に測定することが可能であり、ＤＬＲＡとは異なり、同一の発光基質（Ｄ−ルシフェリン）を用いることが可能である。しかし、ＤＣＲＡでは変更フィルターを装備した測定器を準備する必要があり、また、偏光フィルターの介在によって、発光活性の定量限界は大きく低下する。
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、従来法であるＤＬＲＡよりも簡便で、ＤＣＬＡよりも高感度にルシフェラーゼアッセイを行うこと等を可能とする、阻害剤、阻害方法、光識別方法、物質の検出方法、レポーターアッセイ方法及びキットの提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するため、本発明は、下記の特徴を有する阻害剤、阻害方法、光識別方法、物質の検出方法、レポーターアッセイ方法及びキットを提供する。
【０００７】
［１］下記一般式（Ａ）、下記一般式（Ｂ）、及び下記一般式（Ｃ）で表される化合物、並びにそれらの塩からなる群より選択される少なくとも一種の化合物を含むことを特徴とする、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応の阻害剤。
【０００８】
【化１】
2018143140.tif 000002
［式（Ａ）中、
Ｒ１及びＲ３は、それぞれ独立して、炭素数１〜４の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基を表し、
Ｒ２、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素数１〜４の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基を表し、
ｎ１はＲ１の数を表し、０〜４のいずれかの整数であり、ｎ１が２以上である場合、複数個のＲ１同士は互いに同一でも異なっていてもよく、
ｎ３はＲ３の数を表し、０〜４のいずれかの整数であり、ｎ３が２以上である場合、複数個のＲ３同士は互いに同一でも異なっていてもよい。］
【０００９】
【化２】
2018143140.tif 000003
［式（Ｂ）中、
Ｒ６及びＲ８は、それぞれ独立して、炭素数１〜４の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基を表し、
Ｒ７、Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素数１〜４の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基を表し、
ｎ６はＲ６の数を表し、０〜４のいずれかの整数であり、ｎ６が２以上である場合、複数個のＲ６同士は互いに同一でも異なっていてもよく、
ｎ８はＲ８の数を表し、０〜３のいずれかの整数であり、ｎ８が２以上である場合、複数個のＲ８同士は互いに同一でも異なっていてもよい。］
【００１０】
【化３】
2018143140.tif 000004
［式（Ｃ）中、
Ｒ１１及びＲ１３は、それぞれ独立して、炭素数１〜４の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基を表し、
Ｒ１２は、水素原子又は炭素数１〜４の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基を表し、
ｎ１１はＲ１１の数を表し、０〜８のいずれかの整数であり、ｎ１１が２以上である場合、複数個のＲ１１同士は互いに同一でも異なっていてもよく、
ｎ１３はＲ１３の数を表し、０〜５のいずれかの整数であり、ｎ１３が２以上である場合、複数個のＲ１３同士は互いに同一でも異なっていてもよい。］
［２］下記一般式（Ｄ）で表される化合物、及びそれらの塩からなる群より選択される少なくとも一種の化合物を含むことを特徴とする、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応の阻害剤。
【００１１】
【化４】
2018143140.tif 000005
［式（Ｄ）中、
Ｒ１４及びＲ１７は、それぞれ独立して、炭素数１〜４の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基を表し、
Ｒ１５は、水素原子又は炭素数１〜４の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基を表し、
Ｒ１６は、２価の連結基を表す。
ｎ１４はＲ１４の数を表し、０〜３のいずれかの整数であり、ｎ１４が２以上である場合、複数個のＲ１４同士は互いに同一でも異なっていてもよい。
ｎ１７はＲ１７の数を表し、０〜５のいずれかの整数であり、ｎ１７が２以上である場合、複数個のＲ１７同士は互いに同一でも異なっていてもよい。］
［３］［１］又は［２］に記載のルシフェリン−ルシフェラーゼ反応の阻害剤を用いて、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応を阻害する阻害方法。
［４］第１ルシフェラーゼ、第１発光物質である第１ルシフェリン、及び第２発光物質を含む測定対象物の、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンとを反応させ、前記測定対象物から発せられた光の発光量Ｌ１を測定する第１測定工程、
［１］又は［２］に記載の阻害剤と前記測定対象物とを接触させて、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンとの反応によって生じる発光量を低下させ、測定対象物から発せられた発光量Ｌ２を測定する第２測定工程、並びに
前記発光量Ｌ１の値と、前記発光量Ｌ２の値とに基づいて、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンの反応により生じた光Ａ、及び前記第２発光物質により生じた光Ｂを識別する識別工程、
を含む光識別方法。
［５］前記第２発光物質が第２ルシフェリンであり、
前記測定対象物が、前記第１ルシフェリン、前記第１ルシフェラーゼ、前記第２ルシフェリン、及び前記第２ルシフェリンと反応させる第２ルシフェラーゼを含み、
前記測定対象物の、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンとを反応させ、前記第２ルシフェラーゼと前記第２ルシフェリンとを反応させ、前記測定対象物から発せられた光の発光量Ｌ１を測定する第１測定工程、
請求項１又は２に記載の阻害剤と前記測定対象物とを接触させて、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンとの反応によって生じる発光量を低下させ、前記測定対象物から発せられた発光量Ｌ２を測定する第２測定工程、並びに
前記発光量Ｌ１の値と、前記発光量Ｌ２の値とに基づいて、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンとの反応により生じた光Ａ、及び前記第２ルシフェラーゼと前記第２ルシフェリンとの反応により生じた光Ｂを識別する識別工程、
を含む［４］に記載の光識別方法。
［６］前記阻害剤非存在下における、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンの反応により生じた光Ａの発光量を発光量Ａ１とし、
前記阻害剤存在下における、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンの反応により生じた光Ａの発光量を発光量Ａ２とし、
前記阻害剤非存在下における、前記第２ルシフェラーゼと前記第２ルシフェリンの反応により生じた光Ｂの発光量を発光量Ｂ１とし、
前記阻害剤存在下における、前記第２ルシフェラーゼと前記第２ルシフェリンの反応により生じた光Ｂの発光量を発光量Ｂ２としたときに、
光Ａの発光量の低下率（Ａ２/Ａ１）と、光Ｂの発光量の低下率（Ｂ２/Ｂ１）が異なる、［５］に記載の光識別方法。
［７］前記阻害剤が［１］に記載の阻害剤であり、
前記第１ルシフェラーゼがＦｌｕｃ、Ｌｕｃ２又はＣＢＲであり、前記第２ルシフェラーゼがＣＢＧである［５］又は［６］に記載の光識別方法。
［８］前記測定対象物が、さらに第３発光物質を含み、
前記測定対象物の、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンとを反応させ、前記第２ルシフェラーゼと前記第２ルシフェリンとを反応させ、前記測定対象物から発せられた光の発光量Ｌ１を測定する第１測定工程、
［２］に記載の阻害剤と前記測定対象物とを接触させて、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンとの反応によって生じる発光量を低下させ、前記測定対象物から発せられた発光量Ｌ２を測定する第２測定工程、並びに
［１］に記載の阻害剤と前記測定対象物とを接触させて、前記第２ルシフェラーゼと前記第２ルシフェリンとの反応により生じる発光量を低下させ、前記測定対象物から発せられた発光量Ｌ３を測定する第３測定工程、
前記発光量Ｌ１の値と、前記発光量Ｌ２の値と、前記発光量Ｌ３の値とに基づいて、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンの反応により生じた光Ａ、前記第２ルシフェラーゼと前記第２ルシフェリンとの反応によって生じた光Ｂ、及び前記第３発光物質により生じた光Ｃを識別する識別工程、
を含む［５］又は［６］に記載の光識別方法。
［９］［２］に記載の阻害剤及び［１］に記載の阻害剤非存在下における、前記第２ルシフェラーゼと前記第２ルシフェリンの反応により生じた光Ｂの発光量を発光量Ｂ１とし、
［２］に記載の阻害剤が存在し、［１］に記載の阻害剤非存在下における、前記第２ルシフェラーゼと前記第２ルシフェリンの反応により生じた光Ｂの発光量を発光量Ｂ２とし、
［１］に記載の阻害剤が存在し、［２］に記載の阻害剤非存在下における、前記第２ルシフェラーゼと前記第２ルシフェリンの反応により生じた光Ｂの発光量を発光量Ｂ３としたとき、
光Ｂの発光量の低下率（Ｂ２/Ｂ１）と、光Ｂの発光量の低下率（Ｂ３/Ｂ１）とで、
前記（Ｂ２/Ｂ１）の値が、前記（Ｂ３/Ｂ１）の値よりも小さい、［８］に記載の光識別方法。
［１０］前記第２ルシフェリンが、前記第１ルシフェリンと同じ種類のルシフェリンである［５］〜［９］のいずれか一項に記載の光識別方法。
［１１］前記第１ルシフェラーゼがＣＢＲであり、前記第２ルシフェラーゼがＦｌｕｃ又はＬｕｃ２である［８］〜［１０］のいずれか一項に記載の光識別方法。
［１２］前記第１ルシフェリンが、Ｄ−ルシフェリン又はその類縁体である［４］〜［１１］のいずれか一項に記載の光識別方法。
［１３］前記測定対象物が細胞であり、測定対象物の前記細胞から発せられた光を、細胞非破壊的に測定する［４］〜［１２］のいずれか一項に記載の光識別方法。
［１４］［４］〜［１３］のいずれか一項に記載の光識別方法を用いる物質の検出方法。
［１５］［４］〜［１３］のいずれか一項に記載の光識別方法を用いるレポーターアッセイ方法。
［１６］第１ルシフェラーゼ、第１発光物質である第１ルシフェリン、及び第２発光物質を含む前記測定対象物が、遺伝子調節領域の下流に前記第１ルシフェラーゼ遺伝子が連結された融合遺伝子が導入され、前記第１ルシフェラーゼを発現している組み換え細胞又はその抽出物を含む［１５］に記載のレポーターアッセイ方法。
［１７］［３］に記載の阻害方法、［４］〜［１３］のいずれか一項に記載の光識別方法、［１４］に記載の物質の検出方法、又は［１５］又は［１６］に記載のレポーターアッセイ方法に使用されるキットであって、［１］又は［２］に記載の阻害剤を備えるキット。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の阻害剤によれば、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応による発光を阻害できる。
本発明の阻害方法によれば、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応による発光を阻害できる。
本発明の光識別方法によれば、測定対象物中の第１発光物質である第１ルシフェリン由来の光と、第２発光物質由来の光とを識別できる。
また、本発明の物質の検出方法によれば、従来のＤＬＲＡよりも簡便で、従来のＤＣＬＡよりも高感度に物質を検出することが可能となる。
また、本発明のレポーター遺伝子アッセイ方法によれば、従来のＤＬＲＡよりも簡便で、従来のＤＣＬＡよりも高感度にルシフェラーゼアッセイを行うことが可能となる。
また、本発明のキットによれば、前記阻害方法、前記光識別方法、前記物質の検出方法、又は前記レポーターアッセイ方法を実施できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の１実施形態に係る光識別方法の手順を説明する模式図である。
【図２】本発明の１実施形態に係る光識別方法の手順を説明する模式図である。
【図３】本発明の１実施形態に係る光識別方法の手順を説明する模式図である。
【図４】実施例における、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応の、各阻害剤による阻害の結果を示すグラフである。
【図５】実施例において作製した、ＣＢＲとＣＢＧの混合溶液の混合比率を模式的に表す図である。
【図６】実施例において取得した、ＣＢＲ及びＣＢＧの発光量の理論値と、阻害剤Ａ〜Ｃを用いて測定されたＣＢＲ及びＣＢＧの発光量の測定値と、偏光フィルターを用いて測定されたＣＢＲ及びＣＢＧの発光量の測定値との比較結果を示すグラフである。
【図７】実施例において取得した、Ｆｌｕｃ及びＣＢＧの発光量の理論値と、阻害剤Ａ〜Ｃを用いて測定されたＦｌｕｃ及びＣＢＧの発光量の測定値との比較結果を示すグラフである。
【図８】実施例における、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応の、阻害剤Ａ及びＤによる阻害の結果を示すグラフである。
【図９】実施例において取得した、Ｆｌｕｃ、ＣＢＲ、ＣＢＧの混合比と、阻害剤Ａ及びＤを用いて測定されたＦｌｕｃ、ＣＢＲ、ＣＢＧの発光量の測定値とを示すグラフである。
【図１０】実施例において取得した、Ｆｌｕｃ、ＣＢＲ、ＣＢＧの混合比と、阻害剤Ａ及びＤを用いて測定されたＦｌｕｃ、ＣＢＲ、ＣＢＧの発光量の測定値とを示すグラフである。
【図１１】実施例において取得した、Ｆｌｕｃ、ＣＢＲ、ＣＢＧの混合比と、阻害剤Ａ及びＤを用いて測定されたＦｌｕｃ、ＣＢＲ、ＣＢＧの発光量の測定値とを示すグラフである。
【図１２】従来の２種類のルシフェラーゼを用いたルシフェラーゼアッセイの手順を説明するための模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
≪阻害剤≫
以下、本発明のルシフェリン−ルシフェラーゼ反応の阻害剤について説明する。
下記一般式（Ａ）、下記一般式（Ｂ）、下記一般式（Ｃ）、及び下記一般式（Ｄ）で表される化合物、並びにそれらの塩は、ルシフェラーゼとルシフェリンとの反応を阻害することができ、本発明の光識別方法における、ルシフェラーゼとルシフェリンとの反応を阻害する阻害剤として、好適に用いることができる。
本発明の第１実施形態の阻害剤は、下記一般式（Ａ）、下記一般式（Ｂ）、及び下記一般式（Ｃ）で表される化合物、並びにそれらの塩からなる群より選択される少なくとも一種の化合物を含む、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応の阻害剤（以下、当該阻害剤のことを「第１阻害剤」ということがある。）である。
【００１５】
阻害剤の上記ルシフェラーゼに対する活性阻害率は、「（阻害剤を含む反応溶液におけるルシフェリン−ルシフェラーゼ反応により生じた発光量）/（阻害剤を含まない反応溶液におけるルシフェリン−ルシフェラーゼ反応により生じた発光量）」の値として求められる。反応溶液に含まれる阻害剤の濃度は、非特異的な発光活性の低下が観察できない程度の濃度で行うこととする。阻害剤による発光量の低下が生じない場合、活性阻害率は１（１００％）となる。
阻害剤のルシフェラーゼに対する活性阻害率は、０．８未満であることが好ましく、０．４未満であることがより好ましく、０．２未満であることがさらに好ましく、０．１未満であることが特に好ましい。
【００１６】
下記一般式（Ａ）、下記一般式（Ｂ）、及び下記一般式（Ｃ）で表される化合物並びにそれらの塩は、ルシフェリンのうち、Ｌｕｃ２、Ｆｌｕｃ又はＣＢＲ（Ｃｌｉｃｋ  Ｂｅｅｔｌｅ  Ｒｅｄ）に対して特異的に反応を阻害するという点において、共通の特徴を有する。
ここでいう特異的とは、Ｌｕｃ２、Ｆｌｕｃ又はＣＢＲ以外のルシフェラーゼ（例えばＣＢＧ）に対しての活性阻害率が０．９以上であってもよく、０．９５以上であってもよく、且つ、Ｌｕｃ２、Ｆｌｕｃ又はＣＢＲに対しての活性阻害率が０．３以下であってもよく、０．２以下であってもよい。
【００１７】
本発明の第２実施形態の阻害剤は、下記一般式（Ｄ）で表される化合物、及びそれらの塩からなる群より選択される少なくとも一種の化合物を含む、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応の阻害剤（以下、当該阻害剤のことを「第２阻害剤」ということがある。）である。
【００１８】
化合物（Ｄ）及びその塩は、ルシフェリンのうち、ＣＢＲに対して特異的に反応を阻害するという点において、共通の特徴を有する。
ここでいう特異的とは、ＣＢＲ以外のルシフェラーゼ（例えばＬｕｃ２、Ｆｌｕｃ又はＣＢＧ）に対しての活性阻害率が０．９以上であってもよく、０．９５以上であってもよく、ＣＢＲに対しての活性阻害率が０．３以下であってもよく、０．２以下であってもよく、０．１以下であってもよい。
【００１９】
＜化合物（Ａ）＞
化合物（Ａ）は、下記一般式（Ａ）で表される化合物である。以下、化合物（Ａ）について説明する。
【００２０】
【化５】
2018143140.tif 000006
［式（Ａ）中、
Ｒ１及びＲ３は、それぞれ独立して、炭素数１〜４の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基を表し、
Ｒ２、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素数１〜４の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基を表し、
ｎ１はＲ１の数を表し、０〜４のいずれかの整数であり、ｎ１が２以上である場合、複数個のＲ１同士は互いに同一でも異なっていてもよく、
ｎ３はＲ３の数を表し、０〜４のいずれかの整数であり、ｎ３が２以上である場合、複数個のＲ３同士は互いに同一でも異なっていてもよく、
波線で示した結合は、化合物（Ａ）が、Ｅ、Ｚ又はそれらの混合体であることを表す。］
【００２１】
ｎ１及びｎ３は、それぞれ独立して、例えば、０〜２のいずれかの整数であってもよく、０又は１であってもよく、０であってもよい。
ｎ１が１〜４の場合、Ｒ１のベンゼン環骨格への結合位置は特に限定されない。
ｎ３が１〜４の場合、Ｒ３のベンゼン環骨格への結合位置は特に限定されない。
【００２２】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４又はＲ５の炭素数１〜４の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等を例示できる。
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４又はＲ５のアルキル基は、炭素数が１〜３であることが好ましく、炭素数が１〜２であることがより好ましく、炭素数１がさらに好ましく、すなわち炭素数１のメチル基がさらに好ましい。
【００２３】
第１実施形態の阻害剤は、化合物（Ａ）の光学異性体のうちの一種のみを含んでもよく、二種以上を含んでもよい。
【００２４】
上記一般式（Ａ）において、波線で示した結合は、化合物（Ａ）が、Ｅ、Ｚ又はそれらの混合体であることを表す。化合物（Ａ）のＥ，Ｚ異性体としては、例えば、下記一般式（Ａ−ａ）で表される化合物、及び下記一般式（Ａ−ｂ）で表される化合物が挙げられる。
【００２５】
【化６】
2018143140.tif 000007
［式（Ａ−ａ）及び式（Ａ−ｂ）中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、ｎ１及びｎ３は、前記一般式（Ａ）におけるものと同じである。］
【００２６】
一般式（Ａ）で表される化合物において、ｎ１及びｎ３が０であり、Ｒ２が水素原子である場合、下記一般式（Ａ−１）で表される化合物が挙げられる。
【００２７】
【化７】
2018143140.tif 000008
［式（Ａ−１）中、Ｒ４及びＲ５は、前記一般式（Ａ）におけるものと同じである。］
【００２８】
一般式（Ａ−１）で表される化合物において、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して、炭素数１〜４の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基であることが好ましい。
【００２９】
前記一般式（Ａ−１）で表される化合物又はその塩のより具体的な例として、前記式（Ａ−１）において、Ｒ４及びＲ５がメチル基である場合、下記式（Ａ−１−１）で表される化合物３−（４−ジメチルアミノベンジリデニル）−２−インドリノン（ＳＵ  ４３１２）又はその塩を挙げることができる。
【００３０】
【化８】
2018143140.tif 000009
【００３１】
＜化合物（Ｂ）＞
化合物（Ｂ）は、下記一般式（Ｂ）で表される化合物である。以下、化合物（Ｂ）について説明する。
【００３２】
【化９】
2018143140.tif 000010
［式（Ｂ）中、
Ｒ６及びＲ８は、それぞれ独立して、炭素数１〜４の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基を表し、
Ｒ７、Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素数１〜４の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基を表し、
ｎ６はＲ６の数を表し、０〜４のいずれかの整数であり、ｎ６が２以上である場合、複数個のＲ６同士は互いに同一でも異なっていてもよく、
ｎ８はＲ８の数を表し、０〜３のいずれかの整数であり、ｎ８が２以上である場合、複数個のＲ８同士は互いに同一でも異なっていてもよく、
波線で示した結合は、化合物（Ｂ）が、Ｅ、Ｚ又はそれらの混合体であることを表す。］
【００３３】
ｎ６及びｎ８は、それぞれ独立して、例えば、０〜２のいずれかの整数であってもよく、０又は１であってもよく、０であってもよい。
ｎ６が１〜４の場合、Ｒ６のベンゼン環骨格への結合位置は特に限定されない。
ｎ８が１〜３の場合、Ｒ８のベンゼン環骨格への結合位置は特に限定されない。
【００３４】
Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９又はＲ１０の炭素数１〜４の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等を例示できる。
Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９又はＲ１０のアルキル基は、炭素数が１〜３であることが好ましく、炭素数が１〜２であることがより好ましく、炭素数１がさらに好ましく、すなわち炭素数１のメチル基がさらに好ましい。
【００３５】
第１実施形態の阻害剤は、化合物（Ｂ）の光学異性体のうちの一種のみを含んでもよく、二種以上を含んでもよい。
【００３６】
前記一般式（Ｂ）において、波線で示した結合は、化合物（Ｂ）が、Ｅ、Ｚ又はそれらの混合体であることを表す。化合物（Ｂ）のＥ，Ｚ異性体としては、例えば、下記一般式（Ｂ−ａ）で表される化合物、下記一般式（Ｂ−ｂ）で表される化合物、下記一般式（Ｂ−ｃ）で表される化合物、及び下記一般式（Ｂ−ｄ）で表される化合物、が挙げられる。
【００３７】
【化１０】
2018143140.tif 000011
［式（Ｂ−ａ）、式（Ｂ−ｂ）、式（Ｂ−ｃ）及び式（Ｂ−ｄ）中、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９Ｒ１０、ｎ６及びｎ８は、前記一般式（Ｂ）におけるものと同じである。］
【００３８】
一般式（Ｂ）で表される化合物において、ｎ６及びｎ８が０であり、Ｒ７水素原子である場合、下記一般式（Ｂ−１）で表される化合物が挙げられる。
【００３９】
【化１１】
2018143140.tif 000012
［式（Ｂ−１）中、Ｒ９及びＲ１０は、前記一般式（Ｂ）におけるものと同じである。］
【００４０】
一般式（Ｂ−１）で表される化合物において、Ｒ９及びＲ１０はそれぞれ独立して、炭素数１〜４の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基であることが好ましい。
【００４１】
前記一般式（Ｂ−１）で表される化合物又はその塩のより具体的な例として、前記式（Ｂ−１）において、Ｒ９及びＲ１０がメチル基である場合、下記式（Ｂ−１−１）で表される化合物（トラニラスト）又はその塩を挙げることができる。
【００４２】
【化１２】
2018143140.tif 000013
【００４３】
＜化合物（Ｃ）＞
化合物（Ｃ）は、下記一般式（Ｃ）で表される化合物である。以下、化合物（Ｃ）について説明する。
【００４４】
【化１３】
2018143140.tif 000014
［式（Ｃ）中、
Ｒ１１及びＲ１３は、それぞれ独立して、炭素数１〜４の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基を表し、
Ｒ１２は、水素原子又は炭素数１〜４の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基を表し、
ｎ１１はＲ１１の数を表し、０〜８のいずれかの整数であり、ｎ１１が２以上である場合、複数個のＲ１１同士は互いに同一でも異なっていてもよく、
ｎ１３はＲ１３の数を表し、０〜５のいずれかの整数であり、ｎ１３が２以上である場合、複数個のＲ１３同士は互いに同一でも異なっていてもよく、
波線で示した結合は、化合物（Ｃ）が、Ｅ、Ｚ又はそれらの混合体であることを表す。］
【００４５】
ｎ１１は、例えば、０〜２のいずれかの整数であってもよく、０又は１であってもよく、０であってもよい。
ｎ１１が１〜８の場合、Ｒ１１のシクロヘキサン環骨格への結合位置は特に限定されない。
【００４６】
ｎ１３は、例えば、０〜３のいずれかの整数であってもよく、１又は２であってもよく、１であってもよい。
ｎ１３が１〜５の場合、Ｒ１３のベンゼン環骨格への結合位置は特に限定されない。
【００４７】
Ｒ１１、Ｒ１２又はＲ１３の炭素数１〜４の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等を例示できる。
Ｒ１１、Ｒ１２又はＲ１３のアルキル基は、炭素数が１〜３であることが好ましく、炭素数が１〜２であることがより好ましく、炭素数１がさらに好ましく、すなわち炭素数１のメチル基がさらに好ましい。
【００４８】
実施形態の阻害剤は、化合物（Ｃ）の光学異性体のうちの一種のみを含んでもよく、二種以上を含んでもよい。
【００４９】
前記一般式（Ｃ）において、波線で示した結合は、Ｅ、Ｚ又はそれらの混合体であることを表す。化合物（Ｃ）のＥ，Ｚ異性体としては、例えば、下記一般式（Ｃ−ａ）で表される化合物、及び下記一般式（Ｃ−ｂ）で表される化合物が挙げられる。
【００５０】
【化１４】
2018143140.tif 000015
［式（Ｃ−ａ）及び式（Ｂ−ｂ）中、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、ｎ１１及びｎ１３は、前記一般式（Ｃ）におけるものと同じである。］
【００５１】
化合物（Ｃ）の塩は、例えば溶媒中で化合物（Ｃ）のイオンとなり得る。化合物（Ｃ）のイオンとしては、化合物（Ｃ）がカチオンとなったものでもよく、化合物（Ｃ）がアニオンとなったものでもよい。
化合物（Ｃ）がカチオンとなったものとしては、例えば下記一般式（Ｃ−ｉ）で表される化合物が挙げられる。
【００５２】
【化１５】
2018143140.tif 000016
［式（Ｃ−ｉ）中、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、ｎ１１及びｎ１３は、前記一般式（Ｃ）におけるものと同じである。］
【００５３】
一般式（Ｃ）で表される化合物は、下記一般式（Ｃ−１）で表される化合物を包含する。
【００５４】
【化１６】
2018143140.tif 000017
［式（Ｃ−１）中、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３及びｎ１１は、前記一般式（Ｃ）におけるものと同じである。］
【００５５】
一般式（Ｃ−１）で表される化合物において、ｎ１１が０であり、Ｒ１２が水素原子である場合、下記一般式（Ｃ−１−１）で表される化合物が挙げられる。
【００５６】
【化１７】
2018143140.tif 000018
［式（Ｃ−１−１）中、Ｒ１３は、前記一般式（Ｃ）におけるものと同じである。］
【００５７】
一般式（Ｃ−１−１）で表される化合物において、Ｒ１３は、炭素数１〜４の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基であることが好ましい。
【００５８】
前記一般式（Ｃ−１−１）で表される化合物又はその塩のより具体的な例として、前記式（Ｃ−１−１）において、Ｒ１３がメチル基である場合、下記式（Ｃ−１−２）で表される化合物が挙げられ、下記式（Ｃ−１−２）で表される化合物の臭化水素酸塩（ピフィスリンα）を挙げることができる。
【００５９】
【化１８】
2018143140.tif 000019
【００６０】
＜化合物（Ｄ）＞
化合物（Ｄ）は、下記一般式（Ｄ）で表される化合物である。以下、化合物（Ｄ）について説明する。
【００６１】
【化１９】
2018143140.tif 000020
［式（Ｄ）中、
Ｒ１４及びＲ１７は、それぞれ独立して、炭素数１〜４の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基を表し、
Ｒ１５は、水素原子又は炭素数１〜４の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基を表し、
Ｒ１６は、２価の連結基を表す。
ｎ１４はＲ１４の数を表し、０〜３のいずれかの整数であり、ｎ１４が２以上である場合、複数個のＲ１４同士は互いに同一でも異なっていてもよい。
ｎ１７はＲ１７の数を表し、０〜５のいずれかの整数であり、ｎ１７が２以上である場合、複数個のＲ１７同士は互いに同一でも異なっていてもよい。］
【００６２】
ｎ１４及びｎ１７は、それぞれ独立して、例えば、０〜２のいずれかの整数であってもよく、０又は１であってもよく、０であってもよい。
ｎ１４が１〜３の場合、Ｒ１４のベンゼン環骨格への結合位置は特に限定されない。
ｎ１７が１〜５の場合、Ｒ１７のベンゼン環骨格への結合位置は特に限定されない。
【００６３】
Ｒ１４、Ｒ１５、又はＲ１７の炭素数１〜４の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等を例示できる。
Ｒ１４、Ｒ１５、又はＲ１７のアルキル基は、炭素数が１〜３であることが好ましく、炭素数が１〜２であることがより好ましく、炭素数１がさらに好ましく、すなわち炭素数１のメチル基がさらに好ましい。
【００６４】
Ｒ１６の２価の連結基としては、炭素数１〜４の直鎖状のアルキレン基であってよく、−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−で表される基が挙げられる。
【００６５】
第２実施形態の阻害剤は、化合物（Ｄ）の光学異性体のうちの一種のみを含んでもよく、二種以上を含んでもよい。
【００６６】
一般式（Ｄ）において、ｎ１４及びｎ１７が０であり、Ｒ１５水素原子である場合、下記一般式（Ｄ−１）で表される化合物が挙げられる。
【００６７】
【化２０】
2018143140.tif 000021
［式（Ｄ−１）中、Ｒ１６は、前記一般式（Ｄ）におけるものと同じである。］
【００６８】
前記一般式（Ｄ−１）で表される化合物又はその塩のより具体的な例として、前記式（Ｄ−１）において、Ｒ１６が−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−で表される基である場合、下記式（Ｄ−１−１）で表される化合物  ＮＰＰＢ（５−ニトロ−２−（３−フェニルプロピルアミノ）安息香酸）が挙げられる。
【００６９】
【化２１】
2018143140.tif 000022
【００７０】
化合物（Ａ）、化合物（Ｂ）、化合物（Ｃ）、及び化合物（Ｄ）は、これらに由来する分子とそれ以外の分子とで塩を形成していてもよい。化合物（Ａ）、化合物（Ｂ）、化合物（Ｃ）、及び化合物（Ｄ）がカチオンとなったものとともに塩を形成するアニオンは、特に限定されない。具体的には、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオン、硫酸イオン、硝酸イオン等の無機アニオンや、カルボン酸のアニオン、スルホン酸のアニオン等の有機アニオン等が例示できる。化合物（Ａ）、化合物（Ｂ）、化合物（Ｃ）、及び化合物（Ｄ）がアニオンとなったものとともに塩を形成するカチオンは、ナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、アルミニウムイオン等の無機カチオンや、アミンのカチオン等の有機カチオン等が例示できる。
【００７１】
化合物（Ａ）、化合物（Ｂ）、化合物（Ｃ）、及び化合物（Ｄ）は、それらの塩の各種の水和物や溶媒和物、及び結晶多形の形態であってもよい。また、化合物（Ａ）、化合物（Ｂ）、化合物（Ｃ）、及び化合物（Ｄ）は、種々の放射性又は非放射性同位体でラベルされていてもよい。
【００７２】
本発明において、化合物（Ａ）、化合物（Ｂ）、化合物（Ｃ）、及び化合物（Ｄ）、並びにそれらの塩は、市販された化合物及びその塩を使用することができる。また、化合物（Ａ）、化合物（Ｂ）、化合物（Ｃ）、及び化合物（Ｄ）、並びにそれらの塩は、その基本構造あるいは置換基の種類に基づく特徴を利用し、種々の公知の化合物に対し、公知の合成法を適用して製造することができる。その際、官能基の種類によっては、当該官能基を原料から中間体へ至る段階で、当業者によく知られた適切な保護基に置き換えておくことが製造技術上効果的な場合がある。
【００７３】
化合物（Ａ）、化合物（Ｂ）、化合物（Ｃ）、及び化合物（Ｄ）、並びにそれらの塩の反応液における濃度は、反応液に含まれるルシフェラーゼ及びルシフェリンの濃度に応じて適宜定めればよいが、０．０１μＭ〜１０００μＭ程度としてもよく、０．１〜１００μＭ程度としてもよく、広い濃度範囲で使用可能である。化合物（Ａ）については０．１μＭ以下でも阻害剤として使用可能であり、化合物（Ｂ）、化合物（Ｃ）、及び化合物（Ｄ）では、１００μＭ以上で使用してもＣＢＲ特異的阻害活性を示すことがある。
【００７４】
前記式（Ａ−１−１）で表される化合物は、チロシンキナーゼの阻害剤として知られている。よって、化合物（Ａ）、及びそれらの塩からなる群より選択される少なくとも一種の化合物を含むルシフェリン−ルシフェラーゼ反応の阻害剤は、チロシンキナーゼの反応阻害剤として用いられる場合を除き、使用されることが好ましい。
前記式（Ｂ−１−１）で表される化合物は、アレルギー性疾患の治療薬として知られている。よって、化合物（Ｂ）、及びそれらの塩からなる群より選択される少なくとも一種の化合物を含むルシフェリン−ルシフェラーゼ反応の阻害剤は、アレルギー反応の反応阻害剤として用いられる場合を除き、使用されることが好ましい。
前記式（Ｃ−１−２）で表される化合物は、ｐ５３の阻害剤として知られている。よって、化合物（Ｃ）、及びそれらの塩からなる群より選択される少なくとも一種の化合物を含むルシフェリン−ルシフェラーゼ反応の阻害剤は、ｐ５３の阻害剤として用いられる場合を除き、使用されることが好ましい。
前記式（Ｄ−１−１）で表される化合物は、クロライドチャネルのブロッカーとして知られている。よって、化合物（Ｄ）、及びそれらの塩からなる群より選択される少なくとも一種の化合物を含むルシフェリン−ルシフェラーゼ反応の阻害剤は、クロライドチャネルのブロッカーとして用いられる場合を除き、使用されることが好ましい。
このことは、本発明の阻害剤が、後述の阻害方法、光識別方法、物質の検出方法、レポーターアッセイ方法、スクリーニング方法、及びキットに用いられる場合にも同様に適用されてよい。
【００７５】
第１阻害剤は、化合物（Ａ）、化合物（Ｂ）、及び化合物（Ｃ）、並びにそれらの塩からなる群より選択される少なくとも一種の化合物を溶解可能な溶媒を含んでいてもよい。また、第２阻害剤は、化合物（Ｄ）、及びそれらの塩からなる群より選択される少なくとも一種の化合物を溶解可能な溶媒を含んでいてもよい。第１阻害剤及び第２阻害剤のいずれにおいても、溶媒の種類は特に制限されず、化合物の種類に応じて適宜選択すればよいが、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等のスルホキシド化合物；Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）等のアミド化合物等、親水性溶媒が好ましいものとして例示できる。
【００７６】
≪阻害方法≫
本発明の阻害方法は、本発明のルシフェリン−ルシフェラーゼ反応の阻害剤を用いて、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応を阻害する方法である。
例えば、第１ルシフェラーゼ、及び第１発光物質である第１ルシフェリンを含む反応系に、本発明の阻害剤を添加することで、第１ルシフェラーゼと第１ルシフェリンとの反応を阻害することができる。
【００７７】
阻害剤が、前記第１阻害剤である場合、ここでいう第１ルシフェラーゼは、ホタルルシフェラーゼ（ｆｉｒｅｆｌｙ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ： Ｆｌｕｃ）、Ｌｕｃ２、赤色発光タンパク質（Ｃｌｉｃｋ  Ｂｅｅｔｌｅ  Ｒｅｄ：ＣＢＲ）が好ましい。
【００７８】
阻害剤が、前記第２阻害剤である場合、ここでいう第１ルシフェラーゼは、ＣＢＲが好ましい。
【００７９】
第１ルシフェラーゼ、第１発光物質である第１ルシフェリン、及び第２発光物質を含む反応系に、本発明の阻害剤を添加することで、第１ルシフェラーゼと第１発光物質である第１ルシフェリンとの反応を阻害することができる。
【００８０】
なお、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンの反応により生じた光Ａと、前記第２発光物質により生じた光Ｂの発光波長が異なっている場合、本発明の阻害剤を添加することで、反応系から発せられた光の色調を、阻害剤存在下と阻害剤非存在下とで変化させることができる。
本発明のルシフェリン−ルシフェラーゼ反応阻害剤を用いた色調制御方法としては、例えば、第１ルシフェラーゼ、第１発光物質である第１ルシフェリン、及び第２発光物質を含み、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンの反応により生じた光Ａと、前記第２発光物質により生じた光Ｂの発光波長が異なる反応液に、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンとの反応を阻害する阻害剤を接触させて、前記反応液から発せられる光の色調を変化させる色調制御方法とすることができる。
本発明の阻害剤は、該色調制御方法に使用される色調変化剤として提供可能である。
【００８１】
≪光識別方法≫
本発明の光識別方法は、第１測定工程、第２測定工程、及び識別工程を含む。
第1測定工程は、第１ルシフェラーゼ、第１発光物質である第１ルシフェリン、及び第２発光物質を含む測定対象物の、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンとを反応させ、前記測定対象物から発せられた光の発光量Ｌ１を測定する工程である。
第２測定工程は、前記第１阻害剤又は前記第２阻害剤と、前記測定対象物とを接触させて、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンとの反応によって生じる発光量を低下させ、測定対象物から発せられた発光量Ｌ２を測定する工程である。
識別工程は、前記発光量Ｌ１の値と、前記発光量Ｌ２の値とに基づいて、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンの反応により生じた光Ａ、及び前記第２発光物質により生じた光Ｂを識別する工程である。
【００８２】
以下、本発明の光識別方法を、第２発光物質が第２ルシフェリンである場合について、説明する。
【００８３】
＜第１実施形態＞
（第１測定工程）
本実施形態の光識別方法は、前記測定対象物が、第１ルシフェリン、第１ルシフェラーゼ、第２ルシフェリン、及び第２ルシフェリンと反応させる第２ルシフェラーゼを含み、
測定対象物の、第１ルシフェラーゼと第１ルシフェリンとを反応させ、第２ルシフェラーゼと第２ルシフェリンとを反応させ、前記測定対象物から発せられた光の発光量Ｌ１を測定する第１測定工程を含む。
【００８４】
図１は、本実施形態における光識別方法の手順を模式的に示した図である。図１に示す例では、測定対象物は、第１ルシフェラーゼとしてＦｌｕｃを、第１ルシフェリンとしてＤ−ルシフェリンを、第２ルシフェラーゼとしてＣＢＧ（Ｃｌｉｃｋ  Ｂｅｅｔｌｅ  Ｇｒｅｅｎ）を含む。また、本実施形態の１例においては、第２ルシフェリンと第１ルシフェリンとは同じ種類のルシフェリンであり、Ｆｌｕｃ（第１ルシフェラーゼ）及びＣＢＧ（第２ルシフェラーゼ）ともにＤ−ルシフェリンと反応して、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応による発光が生じる。この場合、Ｆｌｕｃと反応したＤ−ルシフェリンが第１ルシフェリン（第１発光物質）であり、ＣＢＧと反応したＤ−ルシフェリンが第２ルシフェリン（第２発光物質）である。
本実施形態の１例において、測定対象物は細胞抽出物の調整物である。例えば、細胞抽出物の由来となる細胞には、細胞内で発現させたＦｌｕｃ及びＣＢＧが含まれている。例えば、当該細胞抽出物、Ｄ−ルシフェリン、及びバッファーを混合し、Ｆｌｕｃ、ＣＢＧ及びＤ−ルシフェリンを含む液である第１測定工程の測定対象物を得ることができる。第１測定工程の測定対象物は、上述した阻害剤を含まない液であり、発光量Ｌ１の測定は、阻害剤非存在下における測定となる。
【００８５】
次いで、第１測定工程の測定対象物から発せられた光の発光量Ｌ１を測定する。発光量の測定は、公知のルミノメーターを用いて行うことができる。上記例示した第１測定工程の測定対象物中では、ＦｌｕｃとＤ−ルシフェリンの反応により光Ａが生じ、ＣＢＧとＤ−ルシフェリンの反応により光Ｂが生じている。阻害剤非存在下における、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンの反応により生じた光Ａの発光量を発光量Ａ１とし、阻害剤非存在下における、前記第２ルシフェラーゼと前記第２ルシフェリンの反応により生じた光Ｂの発光量を発光量Ｂ１とすると、第１測定工程の測定対象物から発せられた光の発光量Ｌ１の値は、発光量Ｌ１ ＝ 発光量Ａ１ ＋ 発光量Ｂ１である。
【００８６】
（第２測定工程）
本実施形態の光識別方法は、前記第１阻害剤又は前記第２阻害剤と前記測定対象物とを接触させて、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンとの反応によって生じる発光量を低下させ、前記測定対象物から発せられた発光量Ｌ２を測定する第２測定工程を含む。
【００８７】
図１に示すように、本実施形態の第２測定工程では、第１測定工程の測定対象物に、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンとの反応を阻害する阻害剤を添加し、第２測定工程の測定対象物を得る。第２測定工程の測定対象物は、阻害剤を含む液であり、発光量Ｌ２の測定は、阻害剤存在下における測定となる。
【００８８】
次いで、第２測定工程の測定対象物から発せられた光の発光量Ｌ２を測定する。発光量の測定は、公知のルミノメーターを用いて行うことができる。
阻害剤存在下における、第１ルシフェラーゼと第１ルシフェリンの反応により生じた光Ａの発光量を発光量Ａ２とし、阻害剤存在下における、前記第２ルシフェラーゼと前記第２ルシフェリンの反応により生じた光Ｂの発光量を発光量Ｂ２とすると、第２測定工程の測定対象物から発せられた光の発光量Ｌ２の値は、発光量Ｌ２ ＝ 発光量Ａ２＋ 発光量Ｂ２である。
阻害剤は、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンとの反応を阻害するので、第２測定工程の測定対象物から発せられた光の発光量Ｌ２は、第１測定工程の測定対象物から発せられた光の発光量Ｌ１よりも低下している。図１では、阻害剤として、ＦｌｕｃとＤ−ルシフェリンの反応を阻害する阻害剤を用い、該阻害剤は発光量Ａ２の値をＡ１の１／１０にする作用がある場合を例示する。
【００８９】
なお、上記の例では、第１測定工程に用いられた第１測定工程の測定対象物に阻害剤を添加して第２測定工程の測定対象物を得たが、第２測定工程の測定対象物に含まれる第１測定工程の測定対象物の要素は、必ずしも第１測定工程を経たものでなくともよい。
例えば、第１測定工程で測定する第１測定工程の測定対象物の液と、第１測定工程の測定対象物と同一の組成であって第１測定工程で測定しない液との、２つの液を予め用意しておき、第１測定工程で測定しない液に阻害剤を添加して、これを第２測定工程の測定対象物としてもよい。
【００９０】
なお、上記の例においては、第１測定工程に用いられた第１測定工程の測定対象物に阻害剤を添加して第２測定工程の測定対象物を得たために、第１測定工程の後に、第２測定工程を行った。しかし、必ずしも、第１測定工程の後に、第２測定工程を行う必要は無く、第１測定工程の前に、第２測定工程を行なってもよく、第１測定工程と同時に第２測定工程を行なってもよい。
【００９１】
（識別工程）
本実施形態の光識別方法は、前記発光量Ｌ１の値と、前記発光量Ｌ２の値とに基づいて、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンの反応により生じた光Ａ、及び前記第２ルシフェラーゼと第２ルシフェリンの反応により生じた光Ｂを識別する識別工程を含む。
【００９２】
ここで、光を識別するとは、測定対象物から光Ａと光Ｂとを区別せずに検出した場合であっても、前記発光量Ｌ１の値と、前記発光量Ｌ２の値とに基づいて、検出された発光量のうち、光Ａ由来の発光量と光Ｂ由来の発光量とを算出することにより、光Ａと光Ｂを識別することである。
【００９３】
光Ａ由来の発光量と光Ｂ由来の発光量との算出には、阻害剤による光Ａの発光量の低下率（Ａ２／Ａ１）が予め既知である必要がある。
阻害剤による光Ａの発光量の低下率を求めるには、第２発光物質を含まないこと以外は同様の条件で、前記第１測定工程及び前記第２測定工程を行えばよい。この場合、測定対象物から発せられる光は光Ａのみに由来するものであるので、阻害剤非存在下での発光量Ａ１及び阻害剤存在下での発光量Ａ２を測定し、発光量の低下率（Ａ２／Ａ１）を求めればよい。
【００９４】
なお、上記の例では、阻害剤が第１ルシフェラーゼと第１ルシフェリンとの反応のみを阻害し、第２ルシフェラーゼと第２ルシフェリンとの反応は阻害しない場合を示している。しかし、本発明に用いられる阻害剤としては、第１ルシフェラーゼと第１ルシフェリンとの反応のみならず、第２発光物質の発光量を変化させるものであってもよい。例えば、第１ルシフェラーゼと第１ルシフェリンとの反応のみならず、第２ルシフェラーゼと第２ルシフェリンとの反応を阻害するものであってもよい。
この場合の第２測定工程としては、阻害剤と測定対象物とを接触させて、第１ルシフェラーゼと第１ルシフェリンとの反応によって生じる発光量、及び前記第２ルシフェラーゼと前記第２ルシフェリンとの反応によって生じる発光量を低下させ、測定対象物から発せられた発光量Ｌ２を測定する工程が例示できる。
この場合、阻害剤による第１発光物質の発光量の変化率が予め既知であることに加えて、阻害剤による第２発光物質の発光量の変化率が予め既知である必要があり、光Ａ由来の発光量と光Ｂ由来の発光量との算出には、阻害剤による光Ｂの発光量の低下率（Ａ２／Ａ１）及び阻害剤による光Ｂの発光量の低下率（Ｂ２／Ｂ１）が予め既知である必要がある。
光Ｂの発光量の低下率を求めるには、第１発光物質及び第１ルシフェリンを含まないこと以外は同様の条件で、前記第１測定工程及び前記第２測定工程を行えばよい。この場合、測定対象物から発せられる光は光Ｂのみに由来するものであるので、阻害剤非存在下での発光量Ｂ１及び阻害剤存在下での発光量Ｂ２を測定し、発光量の低下率（Ｂ２／Ｂ１）を求めればよい。
【００９５】
光Ａの発光量の低下率（Ａ２／Ａ１）がｘ％であり、光Ｂの発光量の低下率（Ｂ２／Ｂ１）がｙ％であるとすると、下記式（Ｉ）で示されるように、Ｌ１ ＝ Ａ１ ＋ Ｂ１、Ｌ２ ＝ ｘ／１００Ａ１＋ｙ／１００Ｂ１となり、Ａ１及びＢ１を計算できる。
【００９６】
【数１】
2018143140.tif 000023
【００９７】
阻害剤による光Ａの発光量の低下率（Ａ２／Ａ１）や光Ｂの発光量の低下率（Ｂ２／Ｂ１）の差は、阻害剤の特異性を反映している。発光量の低下率は、同様の反応条件下においてほぼ一定であるので、これらの低下率についての情報が既知であれば、本発明の光識別方法を行う際に、これらの低下率を改めて求める必要はない。
【００９８】
本実施形態において、光Ａの発光量の低下率（Ａ２/Ａ１）と、光Ｂの発光量の低下率（Ｂ２/Ｂ１）は異なることが好ましい。これは阻害剤がルシフェラーゼによって反応の阻害に特異性を有することを意味する。
光Ａの発光量の低下率（Ａ２/Ａ１）と、光Ｂの発光量の低下率（Ｂ２/Ｂ１）との比の値は、大きいほうが好ましい。当該比の値が大きいと、阻害剤の効果が誤差範囲内となるおそれが低減され、光分離の精度をより向上させることができる。光Ａの発光量の低下率（Ａ２/Ａ１）と、光Ｂの発光量の低下率（Ｂ２/Ｂ１）との比は、１．１倍以上、１．５倍以上、２倍以上、２．５倍以上、３倍以上、３．５倍以上、４倍以上、４．５倍以上、５倍以上、５．５倍以上、６倍以上、又は６．５倍以上が好ましく、７倍以上、７．５倍以上、８倍以上、又は８．５倍以上がより好ましく、９倍以上、９．５倍以上、１０倍以上、１５倍以上、又は２０倍以上がさらに好ましい。
【００９９】
なお、上記発光量を発光強度として、本発明の光識別方法を行ってもよい。発光量はRLU（relative light unit）として測定されたものであってもよい。
【０１００】
（発光物質）
ルシフェラーゼは生物発光を触媒する酵素の総称であり、ルシフェリンは、ルシフェラーゼと反応して光を生み出す化合物の総称である。
これまでに様々な種類のルシフェラーゼ及びルシフェリンが発見されており、代表的なルシフェラーゼとしては、ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）、ホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）、ヒカリコメツキ（Click beetle）由来の緑色発光タンパク質（ＣＢＧ：Ｃｌｉｃｋ  Ｂｅｅｔｌｅ  Ｇｒｅｅｎ）及び赤色発光タンパク質（ＣＢＲ：Ｃｌｉｃｋ  Ｂｅｅｔｌｅ  Ｒｅｄ）が挙げられる。代表的なルシフェリンとしては、ウミシイタケルシフェリン、ホタルルシフェリン、セレンテラジン等が挙げられる。
ルシフェラーゼには、基質特異性がある。特定のルシフェラーゼと反応して光を生み出すルシフェリンは、当業者によって適宜選択することができる。
ルシフェラーゼは、天然に存在する天然型のタンパク質であっても、天然型とは異なるアミノ酸配列、修飾、付加等を有する突然変異型又は人為的改変型のタンパク質であってもよい。ルシフェリンは、ルシフェラーゼと反応して光を生み出すものであれば、天然に存在する天然型の化合物であっても、天然型とは異なる構造を有する化合物であってもよい。
【０１０１】
前記阻害剤が前記第１阻害剤である場合、前記第１ルシフェラーゼがＦｌｕｃ、Ｌｕｃ２又はＣＢＲであり、前記第２ルシフェラーゼがＣＢＧであることが好ましい。
前記阻害剤が前記第２阻害剤である場合、第１ルシフェラーゼがＣＢＲであり、前記第２ルシフェラーゼがＣＢＧ、Ｆｌｕｃ又はＬｕｃ２であることが好ましい。
【０１０２】
本明細書中において前記第１ルシフェラーゼとは、ルシフェラーゼのうち、阻害剤によってルシフェラーゼとルシフェリンとの反応が阻害されるルシフェラーゼである。本明細書中において、第１発光物質である第１ルシフェリンとは、前記第１ルシフェラーゼと反応して光を生み出す化合物である。第１ルシフェリンは、Ｄ−ルシフェリン又はその類縁体であることが好ましい。Ｄ−ルシフェリンの類縁体は、Ｄ−ルシフェリンを基質とするルシフェラーゼが反応して光を生み出す化合物が好ましく、Ｄ−ルシフェリンの類縁体としては、例えば、アカルミネ（登録商標）が挙げられる。第１ルシフェラーゼは、Ｄ−ルシフェリン又はその類縁体を基質とするルシフェラーゼであることが好ましい。
【０１０３】
前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンの反応により生じた光Ａは、第１ルシフェリンから発せられた光そのものに限定されない。同じく、第２発光物質により生じた光Ｂは、第２発光物質から発せられた光そのものに限定されない。例えば、光Ａとしては、生物発光共鳴エネルギー移動（Bioluminescence resonance energy transfer：BRET）により生じたものであってもよく、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンの反応により生じた光がエネルギー転移して生じた光も包含される。
【０１０４】
なお、上記実施形態では、第２発光物質が、第２ルシフェラーゼと反応する第２ルシフェリンである例について説明したが、第２発光物質は、光を発する物質であれば特に制限されない。第２発光物質として用いられる物質としては、フルオロセイン、ローダミン、シアニン等の蛍光色素、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光タンパク質、イクオリン等の発光タンパク質、ルシフェリン等を挙げることができる。
【０１０５】
第２発光物質は、発せられる光が検出対象である場合に限られない。例えば、第２発光物質は、検出対象でないノイズの発光であってもよい。本実施形態の光識別方法によれば、第１ルシフェラーゼと第１ルシフェリンの反応により生じた光Ａと、第２発光物質により生じたノイズの光Ｂを識別でき、信頼度の高い光の検出が可能となる。
【０１０６】
上記実施形態で説明したように、第２ルシフェリンは、第１ルシフェリンと同じ種類のルシフェリンであることが好ましい。
従来用いられてきたＤＬＲＡでは、例えば、ホタルルシフェラーゼ（firefly luciferase:Fluc）とウミシイタケルシフェラーゼ（Renilla luciferase: Rluc）を用い、基質特異性と反応条件の差異を利用するので、異なる２種類の発光基質と、それらに対応する緩衝液を準備する必要がある。
一方、本実施形態の光識別方法では、適切なルシフェラーゼ及びルシフェリンを選択することにより、第１ルシフェラーゼ及び第２ルシフェラーゼをともに同じ種類のルシフェリンと反応させることが可能であるので、ルシフェラーゼの反応条件を変更することなく、第１ルシフェラーゼと第１ルシフェリン及び第２ルシフェラーゼと第２ルシフェリンの両方の反応を同一反応系で行うことができる。そのため、緩衝液を変更する必要もなく、より簡便にルシフェラーゼアッセイを行うことができる。
共通のルシフェリンと反応する第１ルシフェラーゼ、第２ルシフェラーゼ及びルシフェリンの組合せとしては、種々の組み合わせが例示できる。Ｄ−ルシフェリンと反応するルシフェラーゼとしては、例えば、Ｆｌｕｃ、ＣＢＲ、ＣＢＧ、ＳＬＧ（緑色発光ルシフェラーゼ）、ＳＬＯ（橙色発光ルシフェラーゼ）、及びＳＬＲ（赤色発光ルシフェラーゼ）からなる群から、それぞれ異なるものをそれぞれ第１ルシフェラーゼ及び第２ルシフェラーゼとして選択すればよい。
【０１０７】
（測定対象物）
本発明の光識別方法に係る測定対象物は、第１ルシフェラーゼ、第１発光物質である第１ルシフェリン、及び第２発光物質を含むものであれば特に制限されないが、好ましい測定対象物として、細胞又は、細胞由来の物質が挙げられる。細胞を測定対象とすることは、細胞の集合である細胞集団、組織、器官、又は生物個体を測定対象とすることを包含する。細胞としては、例えば、植物細胞、植物体、動物細胞、昆虫細胞、酵母、真菌などの真核細胞であり、単細胞生物、微生物等も含む。細胞由来の物質としては、細胞抽出物、細胞培養上清、それらの調整物等が挙げられる。
測定対象物中には、第１ルシフェラーゼ、第１発光物質である第１ルシフェリン、及び第２発光物質が均一に含まれていなくともよい。例えば、測定対象物が個体である場合、個体を構成する一部の細胞にのみ第１ルシフェラーゼ、第１発光物質である第１ルシフェリン、及び第２発光物質が含まれていてもよい。他の例としては、個体を構成する一部の細胞にのみ第１ルシフェラーゼ及び第１発光物質である第１ルシフェリンが含まれており、さらに前記部分とは異なる部分に第２発光物質が含まれていてもよい。
【０１０８】
本発明の光識別方法は、測定対象物が細胞であって、測定対象物の細胞から発せられた光を、細胞非破壊的に測定してもよい。
上記に挙げたＤＬＲＡでは、例えば、ホタルルシフェラーゼ（firefly luciferase:Fluc）とウミシイタケルシフェラーゼ（Renilla luciferase: Rluc）を用い、Flucに対する基質としてホタルルシフェリンを用い、Ｒｌｕｃに対する基質としてはセレンテラジンを用いる場合がある。しかし、セレンテラジンは比較的高分子なため、細胞への浸透が起こり難い。そのため、細胞内で発現させたＲｌｕｃとセレンテラジンとを反応させるため、測定対象物としては細胞を破壊して得た細胞抽出物としなければならない。
一方、本発明の光識別方法では、上述のように第１ルシフェラーゼ及び第２ルシフェラーゼは、同一種のルシフェリンを用いて反応系を構築することも可能であるため、細胞浸透性に劣るルシフェリンを選択しなければならない必要性を低くすることができる。
例えば、上記実施形態では、細胞抽出物の調整物を測定対象物としていたが、上記第１実施形態では、細胞浸透性に優れるホタルルシフェリンのみを発光基質として用いているため、測定対象物を細胞とし、測定対象物の細胞から発せられた光を細胞非破壊的に測定することも可能である。
【０１０９】
なお、本実施形態の光識別方法は、他のルシフェラーゼアッセイ方法と組み合わせて用いることができる。例えば、本実施形態の光識別方法に加えて、ＤＬＲＡを行うことを例示できる。例えば、本発明の光識別方法において反応させる第１ルシフェラーゼとは異なるルシフェリンを基質とする第３ルシフェラーゼが測定対象物に含有されており、本発明の光識別方法を行った測定対象物に、第３ルシフェラーゼ用の反応溶液及び第３ルシフェラーゼと反応させるルシフェリンを添加し、第３ルシフェラーゼとルシフェリンとを反応させる。
図２には、第３ルシフェラーゼとしてＲｌｕｃを用いる場合を例示する。このようにして、識別して検出可能な光の種類を増やすことができる。
【０１１０】
＜第２実施形態＞
本実施形態の光識別方法は、上記第1実施形態の光識別方法が、前記測定対象物が更に第３発光物質を含み、上記第１測定工程及び第２測定工程に加えて更に第三測定工程を有し、識別工程において、前記光Ａ及び光Ｂに加えて前記第３発光物質により生じた光Ｃを更に識別するものである。
上記第１実施形態の光識別方法と共通する事柄について、説明を省略する。
【０１１１】
以下、第２実施形態の光識別方法を、第３発光物質が第３ルシフェリンである場合について、説明する。
【０１１２】
本実施形態の各工程において使用される阻害剤は、本方法を実施可能なものであれば特に制限されない。一例として、第２測定工程では上記第２阻害剤を用い、第３測定工程では、上記第１阻害剤を用いることができ、これらを用いる場合について説明する。
【０１１３】
すなわち、本実施形態の光識別方法は、
前記測定対象物の、第１ルシフェラーゼと第１ルシフェリンとを反応させ、第２ルシフェラーゼと第２ルシフェリンとを反応させ、第３ルシフェラーゼと第３ルシフェリンとを反応させ前記測定対象物から発せられた光の発光量Ｌ１を測定する第１測定工程、
第２阻害剤と前記測定対象物とを接触させて、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンとの反応によって生じる発光量を低下させ、測定対象物から発せられた発光量Ｌ２を測定する第２測定工程、
第１阻害剤と前記測定対象物とを接触させて、前記第２ルシフェラーゼと前記第２ルシフェリンとの反応によって生じる発光量を低下させ、測定対象物から発せられた発光量Ｌ３を測定する第３測定工程、並びに
前記発光量Ｌ１の値と、前記発光量Ｌ２の値と、前記発光量Ｌ３の値とに基づいて、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンとの反応により生じた光Ａ、前記第２ルシフェラーゼと前記第２ルシフェリンとの反応により生じた光Ｂ、及び前記第３ルシフェラーゼと前記第３ルシフェリンとの反応により生じた光Ｃを識別する識別工程、を含む。
【０１１４】
図３は、本実施形態における光識別方法の手順を模式的に示した図である。
図３の例では、測定対象物は、第１ルシフェラーゼとしてＣＢＲを、第１ルシフェリンとしてＤ−ルシフェリンを、第２ルシフェラーゼとしてＦｌｕｃを、第３ルシフェラーゼとしてＣＢＧを含む。また、本実施形態の１例においては、第１ルシフェリンと、第２ルシフェリンと、第３ルシフェリンとは同じ種類のルシフェリンであり、ＣＢＲ（第１ルシフェラーゼ）、Ｆｌｕｃ（第２ルシフェラーゼ）、及びＣＢＧ（第３ルシフェラーゼ）ともにＤ−ルシフェリンと反応して、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応による発光が生じる。この場合、ＣＢＲと反応したＤ−ルシフェリンが第１ルシフェリン（第１発光物質）であり、Ｆｌｕｃと反応したＤ−ルシフェリンが第２ルシフェリン（第２発光物質）であり、ＣＢＧと反応したＤ−ルシフェリンが第３ルシフェリン（第３発光物質）である。
なお、前記第２ルシフェラーゼは、Ｆｌｕｃ又はＬｕｃ２であってもよい。
【０１１５】
（第１測定工程）
図３に示すように、第１測定工程の測定対象物中では、ＣＢＲとＤ−ルシフェリンの反応により光Ａが生じ、ＦｌｕｃとＤ−ルシフェリンの反応により光Ｂが生じ、ＣＢＧとＤ−ルシフェリンの反応により光Ｃが生じている。阻害剤非存在下における、第１ルシフェラーゼと第１ルシフェリンの反応により生じた光Ａの発光量を発光量Ａ１とし、第２ルシフェラーゼと第２ルシフェリンの反応により生じた光Ｂの発光量を発光量Ｂ１とし、第３ルシフェラーゼと第３ルシフェリンの反応により生じた光Ｃの発光量を発光量Ｃ１とすると、第１測定工程の測定対象物から発せられた光の発光量Ｌ１の値は、発光量Ｌ１＝発光量Ａ１＋発光量Ｂ１＋発光量Ｃ１である。
【０１１６】
（第２測定工程）
図３に示すように、第１測定工程の測定対象物である液に、第１ルシフェラーゼと第１ルシフェリンとの反応を阻害する第２の阻害剤を添加し、第２測定工程の測定対象物を得る。第２測定工程の測定対象物は、第２の阻害剤を含む液であり、発光量Ｌ２の測定は、第２の阻害剤存在下における測定となる。
【０１１７】
次いで、第２測定工程の測定対象物から発せられた光の発光量Ｌ２を測定する。
阻害剤存在下における、第１ルシフェラーゼと第１ルシフェリンの反応により生じた光Ａの発光量を発光量Ａ２とし、前記第２ルシフェラーゼと前記第２ルシフェリンの反応により生じた光Ｂの発光量を発光量Ｂ２とし、第３ルシフェラーゼと第３ルシフェリンの反応により生じた光Ｃの発光量を発光量Ｃ２とすると、、第２測定工程の測定対象物から発せられた光の発光量Ｌ２の値は、発光量Ｌ２＝発光量Ａ２＋発光量Ｂ２＋発光量Ｃ２である。
阻害剤は、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンとの反応を阻害するので、第２測定工程の測定対象物から発せられた光の発光量Ｌ２は、第１測定工程の測定対象物から発せられた光の発光量Ｌ１よりも低下している。図３では、阻害剤として、ＣＢＲとＤ−ルシフェリンの反応を阻害する阻害剤を用い、該阻害剤は発光量Ａ２の値をＡ１の１／１０にする作用がある場合を例示する。
【０１１８】
（第３測定工程）
図３に示すように、第１測定工程の測定対象物である液に、第２ルシフェラーゼと第２ルシフェリンとの反応を阻害する第１の阻害剤を添加し、第３測定工程の測定対象物を得る。第３測定工程の測定対象物は、第１の阻害剤を含む液であり、発光量Ｌ３の測定は、第１の阻害剤存在下における測定となる。
【０１１９】
次いで、第３測定工程の測定対象物から発せられた光の発光量Ｌ３を測定する。
阻害剤存在下における、第１ルシフェラーゼと第１ルシフェリンの反応により生じた光Ａの発光量を発光量Ａ３とし、阻害剤存在下における、第２ルシフェラーゼと第２ルシフェリンの反応により生じた光Ｂの発光量を発光量Ｂ３とし、第３ルシフェラーゼと第３ルシフェリンの反応により生じた光Ｃの発光量を発光量Ｃ３とすると、第２測定工程の測定対象物から発せられた光の発光量Ｌ３の値は、発光量Ｌ３＝発光量Ａ３＋発光量Ｂ３＋発光量Ｃ３である。
阻害剤は、第２ルシフェラーゼと第２ルシフェリンとの反応を阻害するので、第３測定工程の測定対象物から発せられた光の発光量Ｌ３は、第３測定工程の測定対象物から発せられた光の発光量Ｌ２よりも低下している。図３では、阻害剤として、ＦｌｕｃとＤ−ルシフェリンの反応を阻害する阻害剤を用い、該阻害剤は発光量Ｂ３の値をＢ２の１／１０にする作用がある場合を例示する。
【０１２０】
なお、上記の例では、第１測定工程に用いられた第１測定工程の測定対象物に阻害剤を添加して第２測定工程の測定対象物を得たが、第２測定工程の測定対象物に含まれる第１測定工程の測定対象物の要素は、必ずしも第１測定工程を経たものでなくともよい。
例えば、第１測定工程で測定する第１測定工程の測定対象物の液と、第１測定工程の測定対象物と同一の組成であって第１測定工程で測定しない液との、２つの液を予め用意しておき、第１測定工程で測定しない液に阻害剤を添加して、これを第２測定工程の測定対象物としてもよい。
【０１２１】
同様に、第３測定工程の測定対象物に含まれる第２測定工程の測定対象物の要素は、必ずしも第２測定工程を経たものでなくともよい。
例えば、第１測定工程で測定する第１測定工程の測定対象物の液と、第１測定工程の測定対象物と同一の組成であって第１測定工程で測定しない液との、２つの液を予め用意しておき、第１測定工程で測定しない液に阻害剤を添加して、これを第３測定工程の測定対象物としてもよい。
【０１２２】
なお、上記の例においては、第１測定工程に用いられた第１測定工程の測定対象物に阻害剤を添加して第２測定工程の測定対象物を得たために、第１測定工程の後に、第２測定工程を行った。また、第２測定工程に用いられた第２測定工程の測定対象物に阻害剤を添加して第３測定工程の測定対象物を得たために、第２測定工程の後に、第３測定工程を行った。
しかし、必ずしも、第１測定工程の後に第２測定工程を行う必要は無く、第２測定工程の後に第３測定工程を行う必要は無い。第１〜第３測定工程はそれぞれ独立に行うことができる。例えば、第１測定工程の前に、第２測定工程を行なってもよく、第１測定工程と同時に第２測定工程を行なってもよい。
【０１２３】
本実施形態に示すように、同じ測定対象物に阻害剤を添加していく方法は、用意する測定液を少なくできることと、試料間での差が生じ難いことから好ましい。一方、当該方法では、第３測定工程で第２ルシフェラーゼと第２ルシフェリンとの反応の阻害を生じさせるため、第３測定工程よりも前の第２測定工程で、第２ルシフェラーゼと第２ルシフェリンの反応が既に阻害されていないことが好ましい。
したがって、第２の阻害剤及び第１の阻害剤非存在下における、前記第２ルシフェラーゼと前記第２ルシフェリンの反応により生じた光Ｂの発光量を発光量Ｂ１とし、
第２の阻害剤が存在し、第１の阻害剤非存在下における、前記第２ルシフェラーゼと前記第２ルシフェリンの反応により生じた光Ｂの発光量を発光量Ｂ２とし、
第１の阻害剤が存在し、第２の阻害剤非存在下における、前記第２ルシフェラーゼと前記第２ルシフェリンの反応により生じた光Ｂの発光量を発光量Ｂ３としたとき、
光Ｂの発光量の低下率（Ｂ２/Ｂ１）と、光Ｂの発光量の低下率（Ｂ３/Ｂ１）とで、
前記（Ｂ２/Ｂ１）の値が、前記（Ｂ３/Ｂ１）の値よりも小さいことが好ましい。
【０１２４】
（識別工程）
本実施形態の光識別方法は、前記発光量Ｌ１の値と、前記発光量Ｌ２の値と、前記発光量Ｌ３の値とに基づいて、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンとの反応により生じた光Ａ、前記第２ルシフェラーゼと前記第２ルシフェリンとの反応により生じた光Ｂ、及び前記第３ルシフェラーゼと前記第３ルシフェリンとの反応により生じた光Ｃを識別する工程を含む。
【０１２５】
第２実施形態の識別工程は、上記第１実施形態の識別工程において、発光量Ｌ２に代えて発光量Ｌ３の値を用いた式を追加してさらに算出を行うことで、上記第１実施形態の識別工程と同様に実施でき、詳細な説明を省略する。
算出に用いる発光量の低下率としては、（Ａ２／Ａ１）、（Ｂ２／Ｂ１）、（Ｃ２／Ｃ１）、
（Ａ３／Ａ１）、（Ａ３／Ａ２）、（Ｂ３／Ｂ１）、（Ｂ３／Ｂ２）、（Ｃ３／Ｃ１）及び（Ｃ３／Ｃ２）が挙げられる。実際の測定対象に応じて適宜選択できる。活性阻害率が１であって発光量の低下が生じないことが値については、算出に使用しなくともよい。これらの値は、上記第１実施形態の識別工程と同様に、測定対象以外のルシフェリンを含まない条件において、予め求めることができる。
【０１２６】
光Ｂの発光量の低下率（Ｂ３／Ｂ２）と、光Ｃの発光量の低下率（Ｃ３／Ｃ２）は異なることが好ましい。これは第１の阻害剤がルシフェラーゼによって反応の阻害に特異性を有することを意味する。
光Ｂの発光量の低下率（Ｂ３／Ｂ２）と、光Ｃの発光量の低下率（Ｃ３／Ｃ２）との比の値は、大きいほうが好ましい。当該比の値が大きいと、阻害剤の効果が誤差範囲内となるおそれが低減され、光分離の精度をより向上させることができる。光Ｂの発光量の低下率（Ｂ３／Ｂ２）と、光Ｃの発光量の低下率（Ｃ３／Ｃ２）との比は、１．１倍以上、１．５倍以上、２倍以上、２．５倍以上、３倍以上、３．５倍以上、４倍以上、４．５倍以上、５倍以上、５．５倍以上、６倍以上、又は６．５倍以上が好ましく、７倍以上、７．５倍以上、８倍以上、又は８．５倍以上がより好ましく、９倍以上、９．５倍以上、１０倍以上、１５倍以上、又は２０倍以上がさらに好ましい。
【０１２７】
≪物質の検出方法≫
本発明の物質の検出方法は、本発明の光識別方法を用いるものである。
検出とは、測定及び定量を含む。本発明の光識別方法は、従来ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応により生じた光の検出を利用して行われてきた、物質の検出方法に幅広く用いることができる。
例えば、ホタルルシフェラーゼとホタルルシフェリンの発光反応は、ＡＴＰ存在下でのみ生じる反応であるので、本発明の光識別方法を用いれば、測定対象物中のＡＴＰの存在を検出することができる。検出対象をＡＴＰとする場合、本発明の物質の検出方法の一実施形態としては、
以下の工程；
検出対象であるＡＴＰを含み得る被験試料、第１ルシフェラーゼ、第１発光物質である第１ルシフェリン、及び第２発光物質を含む測定対象物の、第１ルシフェラーゼと第１ルシフェリンとを反応させ、測定対象物から発せられた光の発光量Ｌ１を測定する第１測定工程、
前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンとの反応を阻害する前記第１阻害剤又は前記第２阻害剤と、測定対象物とを接触させて、第１ルシフェラーゼとルシフェリンとの反応によって生じる発光量を低下させ、測定対象物から発せられた発光量Ｌ２を測定する第２測定工程、
発光量Ｌ１の値と、発光量Ｌ２の値とに基づいて、第１ルシフェラーゼと第１ルシフェリンの反応により生じた光Ａ、及び第２発光物質により生じた光Ｂを識別する識別工程、
を含むものとすることができる。
また、ＡＴＰと同様に、ＡＴＰase等の酵素活性の測定、ＡＴＰを生産する細胞の測定、微生物の測定等を行うことができる。
【０１２８】
第２発光物質は、発せられる光が検出対象である場合に限られない。例えば、第２発光物質は、検出対象でないノイズの発光であってもよい。本実施形態の光識別方法によれば、第１ルシフェラーゼと第１ルシフェリンの反応により生じた光Ａと、第２発光物質により生じたノイズの光Ｂを識別でき、信頼度の高い光の検出が可能となる。
【０１２９】
本発明の物質の検出方法では、例えば、第１発光物質又は第２発光物質を標準物質（コントロール）としてもよいため、簡便で高精度に物質を検出することが可能となる。
【０１３０】
上記に挙げたＡＴＰ以外にも、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応に必須な要素が反応系に存在することを検出対象とすることができる。ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応に必須な要素としては、ＡＴＰの他、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、Ｍｇ２＋、酸素が挙げられる。
【０１３１】
測定対象の物質がルシフェリン−ルシフェラーゼ反応に必須な上記要素を反応系に生じさせることを利用して、物質の検出を行ってもよい。例えば、検出対象の酵素が触媒する反応によってルシフェラーゼの基質となるルシフェリンが産生されるような反応系を測定対象物中に構築すれば、該酵素の存在を検出することが可能である。
【０１３２】
第１ルシフェラーゼが付加された検出対象物質、第１ルシフェリン、及び第２発光物質を含む測定対象物に対して本発明の光識別方法を行い、当該検出対象物質を検出する物質の検出方法を実施してもよい。
第１ルシフェラーゼが付加された検出対象物質としては、第１ルシフェラーゼとタンパク質との融合タンパク質が挙げられる。融合タンパク質は、第１ルシフェラーゼ遺伝子に任意のタンパク質の遺伝子が連結された融合遺伝子から合成されてもよい。タンパク質は、任意のタンパク質を用いてよく、例えばプロテインＡ、抗体等が挙げられる。
【０１３３】
検出対象物は第３発光物質を含んでもよい。第３発光物質としては、上記＜光識別方法＞において説明したものが挙げられる。
【０１３４】
≪レポーターアッセイ方法≫
本発明のレポーターアッセイ方法は、本発明の光識別方法を用いるものである。レポーターアッセイは、レポーターからのシグナルを介して、遺伝子の発現、遺伝子調節、細胞応答等を検出する手法である。本発明の光識別方法は、従来ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応により生じた光の検出を利用して行われてきた、レポーターアッセイに幅広く用いることができる。
例えば、本発明の光識別方法における前記測定対象物が、遺伝子調節領域の下流に前記第１ルシフェラーゼ遺伝子が連結された融合遺伝子が導入され、前記第１ルシフェラーゼを発現している組み換え細胞又はその抽出物を含むものであってもよい。ここで、遺伝子調節領域とは、下流に連結された遺伝子の転写を制御可能な配列であればよく、例えば、プロモーター、エンハンサー、ホルモン応答配列等である。
ルシフェラーゼ遺伝子は、天然に存在する天然型の塩基配列を有するものであっても、天然型とは異なる塩基配列、修飾、付加等を有する突然変異型又は人為的改変型の塩基配列を有するものであってもよい。例えば、Ｌｕｃ２は、ホタルルシフェラーゼの哺乳類細胞での発現効率化を目的としてコドンが最適化されている。ルシフェリンについても、天然に存在する天然型の化合物であっても、ルシフェラーゼと反応して光を生み出すものであれば、天然型とは異なる構造を有する化合物であってもよい。
【０１３５】
組み換え細胞となる細胞としては、特に制限されず、植物細胞、動物細胞、昆虫細胞、酵母、真菌などの真核細胞が好ましく、植物細胞であることがより好ましい。植物細胞の形質転換体を得る場合、融合遺伝子が導入される細胞としては、植物体に再生可能なあらゆる種類の形態の植物細胞を含めることができる。例えば、培養細胞、プロトプラスト、苗条原基、多芽体、毛状根、カルス等が挙げられる。また、形質転換される植物種としては、特に限定されるものではなく、単子葉植物でも双子葉植物でもよいが、農作物あるいは園芸用作物であることが好ましい。たとえば、イネ、オオムギ、コムギ、ライムギ、トウモロコシ、サトウキビなどの穀類、じゃがいも、さつまいもなどの根茎又は塊根を形成する作物、インゲンマメ、ソラマメ、エンドウなどのマメ科植物、ピーナッツ、ごま、ナタネ、綿実、ヒマワリ、サフラワーなどの種子作物、リンゴ、メロン、ブドウなどの果実を有する作物、トマト、ナスなどの作物、各種花卉植物であることが好ましい。植物の形質転換体は、所定の再生工程を実施することで細胞を植物体に変換することができる。再生の方法は、植物の種類によって異なるが、各種公知の方法を使用できる。
【０１３６】
また、組み換え細胞としては、特に限定しないで全ての種類、形態の細胞を包含し、各種細胞の他、動植物個体、その動植物個体を構成しうる真核細胞、およびその一部である組織や器官ならびに生殖細胞を含む。また、ウイルス粒子も包含する。さらに、また植物個体の一部であるその繁殖媒体（種子、根茎、果実、切穂等）も包含する。
【０１３７】
検出対象物は第２発光物質を含む。第２発光物質としては、光を発する物質であれば特に制限されず、上記＜光識別方法＞において説明したものを同様に用いることができる。
【０１３８】
本発明のレポーターアッセイ方法において、前記測定対象物は、例えば、遺伝子調節領域の下流に前記第１ルシフェラーゼ遺伝子が連結された融合遺伝子が導入され、さらに、遺伝子調節領域の下流にレポーター遺伝子が連結された融合遺伝子が導入され、前記第１ルシフェラーゼ及び前記レポーター遺伝子を発現している組み換え細胞又はその抽出物を含むものであってもよい。
レポーター遺伝子としては、ＧＦＰ等の蛍光タンパク質、ルシフェラーゼが挙げられ、ルシフェラーゼまたはそれらの融合タンパク質であることが好ましい。ルシフェラーゼとしては、上記と同様のものが挙げられる。
よって、前記検出対象物は、遺伝子調節領域の下流に前記第１ルシフェラーゼ遺伝子が連結された融合遺伝子が導入され、さらに、遺伝子調節領域の下流に前記第２ルシフェラーゼ遺伝子が連結された融合遺伝子が導入され、前記第１ルシフェラーゼ及び前記第２ルシフェラーゼを発現している組み換え細胞又はその抽出物を含むものであってもよい。遺伝子調整領域としては、上記と同様のものが挙げられる。以下に本発明のレポーターアッセイ方法の実施態様の一例を示す。
【０１３９】
まず、遺伝子発現量を測定したい目的遺伝子の遺伝子調節領域を第１ルシフェラーゼ遺伝子の上流に連結し、第１ルシフェラーゼ融合遺伝子を得る。第１ルシフェラーゼ融合遺伝子は、該遺伝子を測定対象物の細胞内で発現可能な発現ベクターとして構築されていてもよい。同様に、内部コントロールとしたい遺伝子の遺伝子調節領域を第２ルシフェラーゼ遺伝子の上流に連結し、第２ルシフェラーゼ融合遺伝子を得る。第２ルシフェラーゼ融合遺伝子は、該遺伝子を測定対象物の細胞内で発現可能な発現ベクターとして構築されていてもよい。
前記発現ベクターは、染色体外で自律複製できるものの他、染色体組込み型ベクターとして構築されていてもよい。また、形態としては、線状の断片、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、トランスポゾン、酵母人工染色体（ＹＡＣ）や植物人工染色体（ＰＡＣ）、哺乳類人工染色体（ＭＡＣ）等を採ることができる。これらの中でも、プラスミドベクターが好ましい。
【０１４０】
第１ルシフェラーゼ融合遺伝子及び第２ルシフェラーゼ融合遺伝子を細胞に導入する。
当該融合遺伝子の細胞への導入方法は、常法により行えばよく、エレクトロポレーション、遺伝子銃等の物理的手段、アグロバクテリウム法等による生物的手段を用いることが挙げられる。必要により細胞をインキュベートし、第１ルシフェラーゼ及び第２ルシフェラーゼを発現させる。
次いで、該細胞を前記第１ルシフェラーゼ及び第２ルシフェラーゼと反応するルシフェリンを含む溶液に浸し、細胞内にルシフェリンを導入する。このようにして、第１ルシフェラーゼ、第１発光物質である第１ルシフェリン、及び第２発光物質であるルシフェリン、前記ルシフェリンと反応させる第２ルシフェラーゼを含む測定対象物である細胞を得ればよい。
次いで、本発明の光識別方法に係る第１測定工程、第２測定工程及び識別工程を行い、第１ルシフェリンの反応により生じた光Ａと第２ルシフェリンにより生じた光Ｂを識別する。例えば、光Ａは目的遺伝子の遺伝子発現を表し、光Ｂは内部コントロールの遺伝子の遺伝子発現を表す。
【０１４１】
検出対象物は第３発光物質を含んでもよい。第３発光物質としては、上記＜光識別方法＞において説明したものが挙げられる。
【０１４２】
検出対象物が、さらに遺伝子調節領域の下流に前記第３ルシフェラーゼ遺伝子が連結された融合遺伝子が導入され、前記第１ルシフェラーゼ、前記第２ルシフェラーゼ、及び前記第３ルシフェラーゼを発現している組み換え細胞又はその抽出物を含むものであってもよい。
この場合、上記第２実施形態の光識別方法に係る第１測定工程、第２測定工程、第３測定工程及び識別工程を行い、第１ルシフェリンの反応により生じた光Ａと第２ルシフェリンにより生じた光Ｂと、第３ルシフェリンにより生じた光Ｃを識別する。例えば、光Ａと光Ｂは目的遺伝子の遺伝子発現を表し、光Ｃは内部コントロールの遺伝子の遺伝子発現を表すものであってもよい。
【０１４３】
なお、上述の例では、レポーターアッセイの検出の対象は目的遺伝子の発現量であり、目的遺伝子調節領域の下流に前記第１ルシフェラーゼ遺伝子が連結される場合を例示したが、例えば、上述の目的遺伝子の調節領域に代えて、各種細胞応答又はシグナル伝達に係る因子の遺伝子調節領域とすることで、細胞応答、シグナル伝達等の細胞情報を取得することができる。細胞情報の例としては、免疫応答、アポトーシス、細胞毒性、細胞増殖、細胞分化、細胞周期等が挙げられる。
【０１４４】
実施形態のレポーターアッセイ方法によれば、例えば、第１発光物質を検出対象、第２発光物質を標準物質（コントロール）、第３発光物質をノイズの発光物質とすることも可能であり、簡便で高精度に物質を検出することが可能となる。
【０１４５】
本発明のレポーターアッセイ方法は、他のルシフェラーゼアッセイ方法と組み合わせて用いることができる。例えば、本発明の光識別方法を用いた本発明のレポーターアッセイ方法に加えて、ＤＬＲＡを行うことを例示できる。例えば、本発明の光識別方法において反応させる第１ルシフェラーゼとは異なるルシフェリンを基質とする第３ルシフェラーゼが測定対象物に含有されており、本発明の光識別方法を行った測定対象物に、第３ルシフェラーゼ用の反応溶液及び第３ルシフェラーゼと反応させるルシフェリンを添加し、第３ルシフェラーゼとルシフェリンとを反応させる。
図２には、第３ルシフェラーゼとしてＲｌｕｃを用いる場合を例示する。このようにして、識別して検出可能な光の種類を増やすことができる。
【０１４６】
≪スクリーニング方法≫
更には、本発明のレポーターアッセイ方法を用いることで、化合物の細胞に与える影響を評価することや、生理活性物質、薬物等のスクリーニングを行うことも可能である。
以下に、免疫応答に係る生理活性物質のスクリーニングを行う場合について説明する。
【０１４７】
例えば、まず、細胞に免疫応答関連因子の遺伝子調節領域の下流に前記第１ルシフェラーゼ遺伝子が連結された融合遺伝子を導入し、さらに、内部コントロールとする遺伝子の遺伝子調節領域の下流に前記第２ルシフェラーゼ遺伝子が連結された融合遺伝子を導入し、前記第１ルシフェラーゼ及び前記第２ルシフェラーゼを発現している組み換え細胞を用意する。続いて、生理活性物質であることが疑われる被験物質と当該組み換え細胞とを接触させ、ルシフェリンと当該組み換え細胞とを接触させる。被験物質としては特に制限はなく、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、低分子化合物、合成化合物、等が挙げられる。被験物質と細胞との接触は、被験物質を含む被験試料と細胞との接触であってもよい。被験試料としては特に制限はなく、例えば、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液等である。被験物質が免疫応答に係る生理活性物質である場合には、第１ルシフェラーゼが細胞内に発現が誘導され、ルシフェリンは第１ルシフェラーゼ及び第２ルシフェラーゼと反応する。
次いで、本発明の光識別方法に係る第１測定工程、第２測定工程及び識別工程を行い、第１ルシフェリンの反応により生じた光Ａと第２ルシフェリンにより生じた光Ｂを識別する。光Ａは免疫応答関連因子の遺伝子発現を表し、光Ｂは内部コントロールの遺伝子の遺伝子発現を表す。そして、例えば、予め被験物質の非存在下で同様のアッセイを行って光Ａ及び光Ｂの発光量を取得しておき、被験物質の存在下と非存在下での光Ａ及び光Ｂの発光量の変化に基づいて、被験物質が免疫応答に係る生理活性物質であるかを判別して被験物質を選択すればよい。例えば、被験物質を組み換え細胞と接触させない場合の光Ｂの発光量により補正した後の光Ａの発光量と比較して、光Ｂの発光量により補正した後の光Ａの発光量を増加させる被験物質を、免疫応答に係る生理活性物質の候補として選択すればよい。
【０１４８】
検出対象物は第３発光物質を含んでもよい。第３発光物質としては、上記＜光識別方法＞において説明したものが挙げられる。
この場合、上記第２実施形態の光識別方法に係る第１測定工程、第２測定工程、第３測定工程及び識別工程を行い、第１ルシフェリンの反応により生じた光Ａと第２ルシフェリンにより生じた光Ｂと、第３発光物質により生じた光Ｃを識別する。例えば、光Ａは免疫応答関連因子の遺伝子発現を表し、光Ｂは内部コントロールの遺伝子の遺伝子発現を表し、光Ｃはノイズ発光物質由来の光を表すものであってもよい。
【０１４９】
本発明のスクリーニング方法によれば、例えば、第１発光物質を検出対象、第２発光物質を標準物質（コントロール）、第３発光物質をノイズの発光物質とすることも可能であり、簡便で高精度に物質を検出することが可能となる。
【０１５０】
≪キット≫
本発明のキットは、本発明の光識別方法、本発明の物質の検出方法、又は、本発明のレポーターアッセイ方法を行うためのキットであって、前記第１ルシフェラーゼと前記第１ルシフェリンとの反応を阻害する阻害剤を備えるものである。キットは、前記第２ルシフェラーゼと前記第２ルシフェリンとの反応を阻害する阻害剤を更に備えてもよい。
当該阻害剤は、上述の≪阻害剤≫及び≪光識別方法≫で説明した阻害剤を好適なものとして例示できる。
本発明のキットは、上記阻害剤の他に、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応のためのバッファー及び試薬類、反応容器および取扱い説明書を備えていてもよい。
バッファーは、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応の反応系となる液のｐＨを、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応に適したｐＨに保つ役割を有する。バッファーの種類は、反応させるルシフェリン、ルシフェラーゼの種類及び測定対象物の種類にあわせて当業者が適宜選択することができる。バッファーにはルシフェリン等の試薬が予め含まれていてもよい。
【０１５１】
本発明のキットは、遺伝子調節領域の下流に前記第１ルシフェラーゼ遺伝子が連結された融合遺伝子を備えていてもよく、さらに、遺伝子調節領域の下流に前記第２ルシフェラーゼ遺伝子が連結された融合遺伝子を備えていてもよく、さらに遺伝子調節領域の下流に前記第３ルシフェラーゼ遺伝子が連結された融合遺伝子を備えていてもよい。上記融合遺伝子は、該遺伝子を測定対象物の細胞内で発現可能な発現ベクターとして構築されていてもよい。
或いは、本発明のキットは、検出対象の遺伝子の遺伝子調節領域の下流に前記第１ルシフェラーゼ遺伝子が連結された融合遺伝子を構築するためのベクターを備えていてもよく、検出対象の遺伝子の遺伝子調節領域の下流に前記第１ルシフェラーゼ遺伝子が連結された融合遺伝子を構築するためのベクター、及び検出対象の遺伝子の遺伝子調節領域の下流に前記第２ルシフェラーゼ遺伝子が連結された融合遺伝子を構築するためのベクターを備えていてもよい。遺伝子調節領域の下流に前記第１ルシフェラーゼ遺伝子が連結された融合遺伝子を構築するためのベクターの一例としては、第１ルシフェラーゼタンパク質をコードする第１ルシフェラーゼ遺伝子を含むものであり、第１ルシフェラーゼ遺伝子の上流に検出対象の遺伝子の遺伝子調節領域を挿入することにより、融合遺伝子を構築することができる。
また、本発明のキットは、免疫応答、アポトーシス、細胞毒性、細胞増殖、細胞分化、細胞周期等の細胞情報を取得するために用いられる試薬類をさらに備えていてもよい。
【実施例】
【０１５２】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
各反応液中のルシフェラーゼに対する各阻害剤の量は、非特異的な発光活性の低下が観察できない程度の濃度で行った。
【０１５３】
＜各種ルシフェラーゼに対する、化合物Ａ〜Ｃの反応阻害効力の比較＞
ルシフェラーゼは、Ｌｕｃ２、Ｆｌｕｃ、ＣＢＲ、ＣＢＧの計４種を用意した。これらのうち、Ｌｕｃ２とＦｌｕｃはｃDNAの塩基配列は異なるが、アミノ酸配列は同一である。
各ルシフェラーゼは、TnT（登録商標） Coupled Reticulocyte Lysate Systems（プロメガ社製）によって、添付の説明書に沿って合成し、ルシフェラーゼ含有溶液（ＲＬＬ  ｅｘｔｒａｃｔ）を得た。ＲＬＬ  ｅｘｔｒａｃｔのルシフェラーゼ活性を測定し、各ルシフェラーゼが合成されたことを確認した。また、大腸菌を用いた組換えタンパク質を用いる場合は、大腸菌BL21(DE3)株にプラスミドDNA（pET30-CBG，pET30-CBR，pET30-luc2，pET30-Fluc）を導入した形質転換大腸菌を用いた。新しく画線培養したプレートから単一コロニーを採取し、カナマイシンを含むLB培地2 mlに植菌して、37℃，170 rpmで16時間振とう培養した。 培養液1 mlを、カナマイシンを含む新しい培地50 mlに植菌し、OD600が0.6〜0.8に達するまで、37℃，200 rpmで振とう培養した。100 mM IPTG（イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド）を最終濃度が1 mMとなるように加え、28℃，200 rpmでさらに3時間培養を続けた。5分間氷中で静置した後、遠心分離（6,000rpm，5min，4℃）によって集菌し、上清を除去した。1 mlの1×Passive Lysis Buffer（Promega社）を加え、測定時は適宜希釈して用いた。
測定バッファーは、Dual luciferase Assay kit（プロメガ社製）に添付のＬＡＲＩＩバッファーを用いた。ＬＡＲＩＩバッファーには、Ｄ−ルシフェリンが含有されている。
反応容器に、上記で得た各ルシフェラーゼ含有溶液（ＲＬＬ  ｅｘｔｒａｃｔ）２．５μＬ、測定バッファー５０μＬを加えて混合し、反応溶液（阻害剤（−））を調製した。上記で得た各ルシフェラーゼ含有溶液（ＲＬＬ  ｅｘｔｒａｃｔ）２．５μＬ、測定バッファー５０μＬ、化合物Ａ，Ｂ，又はＣのＤＭＳＯ溶液３μＬを加えて混合し、反応溶液（阻害剤（＋））を調製した。このようにして、計２４種（化合物３種×ルシフェラーゼ４種×阻害剤有無）の反応溶液を用意した。
化合物Ａは、上記式（Ａ−１−１）で表される化合物である。化合物Ｂは、上記式（Ｂ−１−１）で表される化合物である。化合物Ｃは、上記式（Ｃ−１−２）で表される化合物である。
各反応溶液中の各化合物の終濃度は、いずれも２μＭとなるように調整した。反応溶液中でのルシフェリン−ルシフェラーゼ反応により生じた発光をルミノメーター（ＡＢ−２２７０、アトー社製）により測定した。
【０１５４】
測定結果を図４に示す。図４（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）のグラフはそれぞれ、Ｌｕｃ２、Ｆｌｕｃ、ＣＢＲ、ＣＢＧの、阻害剤（−）の反応溶液から得られた発光量を１としたときの、相対発光活性を示す。
化合物Ａ〜Ｃは、緑色発光型ルシフェラーゼであるＣＢＧの発光活性にはあまり影響しなかった。
化合物Ａ及び化合物Ｃは、Ｌｕｃ２、Ｆｌｕｃ、及びＣＢＲの相対発光活性を０．３未満に低下させた。化合物Ｂは、Ｌｕｃ２及びＦｌｕｃの相対発光活性を０．４未満に低下させ、ＣＢＲの相対発光活性を０．８未満に低下させた。
【０１５５】
＜デュアルアッセイでの発光活性分離精度の検証＞
（ＣＢＲとＣＢＧの混合溶液を用いたデュアルアッセイ）
上記と同様にして、ＣＢＲ含有溶液及びＣＢＧ含有溶液を得た。次いで、２種類のルシフェラーゼＣＢＲとＣＢＧを、図５に示す４パターンの比率（モル）で混合し、混合溶液を作製した。
混合溶液におけるＣＢＲ及びＣＢＧの発光量の理論値を、それぞれ図５に示す式から算出した。式中、ＣＢＲとＣＢＧの混合比が、ＣＢＲ：ＣＢＧ＝α：β（α＋β＝５）である。ＣＢＲの発光量は、ＣＢＲ単独での反応での発光量の測定結果から予め求めた、混合比１単位あたりのＣＢＲの発光量である。式中のＣＢＧの発光量は、ＣＢＧ単独での反応での発光量の測定結果から予め求めた、混合比１単位あたりのＣＢＧの発光量である。
【０１５６】
反応容器に、上記で得た４パターンのＣＢＲとＣＢＧとの混合溶液２．５μＬ、測定バッファー５０μＬを加えて混合し、反応溶液を調製した。
各反応溶液から発せられた発光量（発光量Ｌ１）をルミノメーター（ＡＢ−２２７０、アトー社製）により測定した。次いで、各反応溶液に化合物Ａ、Ｂ又はＣを添加し、各反応溶液から発せられた発光量（発光量Ｌ２）を、ルミノメーターを用いて発光を測定した。各反応溶液中の化合物の終濃度は、いずれも２μＭとなるように調整した。
【０１５７】
化合物Ａによる、ＣＢＲとＤ−ルシフェリンとの反応による発光の発光量の低下率と、ＣＢＧとＤ−ルシフェリンとの反応による発光の発光量の低下率が１００％（阻害なし）として、各反応液中の阻害剤非存在下におけるＣＢＲとＤ−ルシフェリンとの反応による発光量、及びＣＢＧとＤ−ルシフェリンとの反応による発光の発光量をそれぞれ求めた。これを化合物Ａによる、ＣＢＲ又はＣＢＧの発光量の測定値とした。
【０１５８】
化合物Ｂによる、ＣＢＲとＤ−ルシフェリンとの反応による発光の発光量の低下率と、ＣＢＧとＤ−ルシフェリンとの反応による発光の発光量の低下率が１００％（阻害なし）として、化合物Ｂによる、ＣＢＲ及びＣＢＧの発光量の測定値を求めた。これを化合物Ｂによる、ＣＢＲ又はＣＢＧの発光量の測定値とした。
【０１５９】
化合物Ｃによる、ＣＢＲとＤ−ルシフェリンとの反応による発光の発光量の低下率と、ＣＢＧとＤ−ルシフェリンとの反応による発光の発光量の低下率が１００％（阻害なし）として、化合物Ｃによる、ＣＢＲ及びＣＢＧの発光量の測定値を求めた。これを化合物Ｃによる、ＣＢＲ又はＣＢＧの発光量の測定値とした。
【０１６０】
また、各反応溶液から発せられた発光量（発光量Ｌ１）をルミノメーターにより測定する代わりに、偏光フィルターを使用するＤＣＬＡ法により、ＣＢＲ由来の光の発光量と、ＣＢＧ由来の光の発光量をそれぞれ測定した。
【０１６１】
結果を図６に示す。図６（ａ）〜（ｃ）は、ＣＢＲ及びＣＢＧの発光量の理論値と、化合物Ａ〜Ｃを用いて測定されたＣＢＲ及びＣＢＧの発光量の測定値とを比較したグラフである。図６（ｄ）は、ＣＢＲ及びＣＢＧの発光量の理論値と、偏光フィルターを用いて測定されたＣＢＲ及びＣＢＧの発光量の測定値とを比較したグラフである。
発光量の理論値との整合について比較すると、阻害剤を用いて測定されたＣＢＧ及びＣＢＲの発光量の測定値は、偏光フィルターを使用するＤＣＬＡ法により測定されたＣＢＧ及びＣＢＲの発光量の測定値と同程度に、理論値との整合がみられた。
以上のことから、測定対象物からＣＢＲとＤ−ルシフェリンとの反応による光とＣＢＧとＤ−ルシフェリンとの反応による光とを区別せずに検出した場合であっても、発光量Ｌ１の値と、発光量Ｌ２の値とに基づいて両光を識別でき、２種類のルシフェラーゼを用いたデュアルアッセイを実施可能であることが実証された。
当該デュアルアッセイは、従来広く用いられているＤＣＬＡ法と同等の測定精度を有することが示された。
【０１６２】
＜デュアルアッセイでの発光活性分離精度の検証＞
（ＦｌｕｃとＣＢＧの混合溶液を用いたデュアルアッセイ）
上記の、ＣＢＲとＣＢＧの混合溶液を用いたデュアルアッセイで行った方法において、ＣＢＲの代わりにＦｌｕｃを用いたこと以外は同様にして、デュアルアッセイを行った。
【０１６３】
化合物Ａによる、ＦｌｕｃとＤ−ルシフェリンとの反応による発光の発光量の低下率と、ＣＢＧとＤ−ルシフェリンとの反応による発光の発光量の低下率が１００％（阻害なし）として、各反応液中の阻害剤非存在下におけるＦｌｕｃとＤ−ルシフェリンとの反応による発光量、及びＣＢＧとＤ−ルシフェリンとの反応による発光の発光量をそれぞれ求めた。これを化合物Ａによる、Ｆｌｕｃ又はＣＢＧの発光量の測定値とした。
【０１６４】
化合物Ｂによる、ＦｌｕｃとＤ−ルシフェリンとの反応による発光の発光量の低下率と、ＣＢＧとＤ−ルシフェリンとの反応による発光の発光量の低下率が１００％（阻害なし）として、化合物Ｂによる、Ｆｌｕｃ及びＣＢＧの発光量の測定値を求めた。これを化合物Ｂによる、Ｆｌｕｃ又はＣＢＧの発光量の測定値とした。
【０１６５】
化合物Ｃによる、ＦｌｕｃとＤ−ルシフェリンとの反応による発光の発光量の低下率と、ＣＢＧとＤ−ルシフェリンとの反応による発光の発光量の低下率が１００％（阻害なし）として、化合物Ｃによる、Ｆｌｕｃ及びＣＢＧの発光量の測定値を求めた。これを化合物Ｃによる、Ｆｌｕｃ又はＣＢＧの発光量の測定値とした。
【０１６６】
なお、ＤＣＬＡ法では、Ｆｌｕｃ由来の光とＣＢＧ由来の光とを分離するのは難しく、ＤＣＬＡ法は使用できなかった。
【０１６７】
結果を図７に示す。図７（ａ）〜（ｃ）は、Ｆｌｕｃ及びＣＢＧの発光量の理論値と、化合物Ａ〜Ｃを用いて測定されたＦｌｕｃ及びＣＢＧの発光量の測定値とを比較したグラフである。阻害剤を用いて測定されたＦｌｕｃ及びＣＢＧの発光量の測定値は、発光量の理論値に対して非常に優れた整合がみられた。
以上のことから、測定対象物からＦｌｕｃとＤ−ルシフェリンとの反応による光と、ＣＢＧとＤ−ルシフェリンとの反応による光とを区別せずに検出した場合であっても、発光量Ｌ１の値と、発光量Ｌ２の値とに基づいて両光を識別でき、２種類のルシフェラーゼを用いたデュアルアッセイを実施可能であることが実証された。
ＦｌｕｃとＣＢＧの組み合わせのデュアルアッセイは、従来の偏光フィルターを使用するＤＣＬＡ法では実施が難しかった。一方、本発明に係る阻害剤を利用したアッセイ方法によれば、従来の偏光フィルターを使用するＤＣＬＡ法では識別の難しい組み合わせのデュアルアッセイを、精度よく実施可能であることが実証された。
【０１６８】
＜各種ルシフェラーゼに対する、化合物Ａ，Ｄの反応阻害効力の比較＞
ルシフェラーゼは、ＦｌｕｃとＣＢＲとＣＢＧの計３種を用意した。
各ルシフェラーゼは、TnT（登録商標） Coupled Reticulocyte Lysate Systems（プロメガ社製）によって、添付の説明書に沿って合成し、ルシフェラーゼ含有溶液（ＲＬＬ  ｅｘｔｒａｃｔ）を得た。ＲＬＬ  ｅｘｔｒａｃｔのルシフェラーゼ活性を測定し、各ルシフェラーゼが合成されたことを確認した。
測定バッファーは、Dual luciferase Assay kit（プロメガ社製）に添付のＬＡＲＩＩバッファーを５倍希釈で用いた。ＬＡＲＩＩバッファーには、Ｄ−ルシフェリンが含有されている。
【０１６９】
反応容器に、上記で得た各ルシフェラーゼ含有溶液（ＲＬＬ  ｅｘｔｒａｃｔ）、測定バッファーを加えて混合し、反応溶液（阻害剤（−））を調製した。上記で得た各ルシフェラーゼ含有溶液（ＲＬＬ  ｅｘｔｒａｃｔ）、測定バッファー、化合物Ａ又は化合物ＤのＤＭＳＯ溶液を加えて混合し、反応溶液（阻害剤（＋））を調製した。反応溶液中の化合物Ａの終濃度は１μＭとなるように調整した。反応液中の化合物Ｄの終濃度は２μＭとなるように調整した。このようにして、計１２種（化合物２種×ルシフェラーゼ３種×阻害剤有無）の反応溶液を用意した。
化合物Ａは、上記式（Ａ−１−１）で表される化合物である。化合物Ｄは、上記式（Ｄ−１−１）で表される化合物である。
各反応溶液から発せられた発光量を、ルミノメーター（Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓｅｒ−Ｏｃｔａ、アトー社製）により測定した。
【０１７０】
測定結果を図８に示す。図８のグラフはそれぞれ、Ｆｌｕｃ、ＣＢＲ、ＣＢＧの、阻害剤（−）の反応溶液から得られた発光量を１としたときの、相対発光活性を示す。
化合物Ａは、緑色発光型ルシフェラーゼであるＣＢＧの発光活性にはあまり影響しなかった。化合物Ａは、Ｆｌｕｃ及びＣＢＲの相対発光活性を０．０２未満に低下させた。
化合物Ｄは、Ｆｌｕｃ及びＣＢＧの発光活性にはあまり影響しなかった。化合物Ｄは、ＣＢＲの相対発光活性を０．４未満に低下させ、ＣＢＲの相対発光活性を０．０１未満に低下させた。
【０１７１】
＜ＦｌｕｃとＣＢＲとＣＢＧとの混合溶液を用いたトリプルアッセイ＞
反応容器に、上記で得た各ルシフェラーゼ含有溶液（ＲＬＬ  ｅｘｔｒａｃｔ）を用い、ＦｌｕｃとＣＢＲとＣＢＧの各ルシフェラーゼが下記表に示す１３パターンの比率（モル）となるよう、測定バッファー５０μＬと混合し、１３種の反応溶液（阻害剤（−））を用意した。
各反応溶液から発せられた発光量（Ｌ１）を、ルミノメーター（Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓｅｒ−Ｏｃｔａ、アトー社製）により測定した。
【０１７２】
【表１】
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【０１７３】
次いで、各反応溶液（阻害剤（−））に化合物ＤのＤＭＳＯ溶液を加えて混合し、反応溶液（阻害剤（＋））を調整した、化合物Ｄは、上記式（Ｄ−１−１）で表される化合物である。各反応溶液中の化合物Ｄの終濃度は、２μＭとなるように調整した。
各反応溶液から発せられた発光量（Ｌ２）、ルミノメーター（Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓｅｒ−Ｏｃｔａ、アトー社製）により測定した。
【０１７４】
次いで、各反応溶液（阻害剤（＋））に化合物ＡのＤＭＳＯ溶液を加えて混合し、反応溶液（阻害剤（＋＋））を調整した、化合物Ａは、上記式（Ａ−１−１）で表される化合物である。各反応溶液中の化合物Ａの終濃度は、１μＭとなるように調整した。
各反応溶液から発せられた発光量（Ｌ３）、ルミノメーター（Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓｅｒ−Ｏｃｔａ、アトー社製）により測定した。
【０１７５】
上記の「デュアルアッセイでの発光活性分離精度の検証」と同様にして、化合物Ａ及び化合物Ｄによる、各ルシフェラーゼとＤ−ルシフェリンとの反応による発光の発光量の低下率から、ＦｌｕｃとＣＢＲとＣＢＧの発光量の測定値を求めた。実験は３反復行った。
【０１７６】
結果を図９〜１１に示す。ＦｌｕｃとＣＢＲとＣＢＧの反応溶液中の混合比と、化合物Ａ及びＤを用いて測定されたＣＢＲ及びＣＢＧの発光量の測定値を示すグラフである。
上記混合比と、上記発光量の測定値に相関がみられた。このことから、測定対象物からＦｌｕｃとＤ−ルシフェリンとの反応による光と、ＣＢＲとＤ−ルシフェリンとの反応による光と、ＣＢＧとＤ−ルシフェリンとの反応による光と、を区別せずに検出した場合であっても、発光量Ｌ１の値と、発光量Ｌ２の値と、発光量Ｌ３の値とに基づいて各光を識別でき、３種類のルシフェラーゼを用いたトリプルアッセイを実施可能であることが実証された。
【０１７７】
以上で説明した各実施形態における各構成及びそれらの組み合わせ等は一例であり、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、構成の付加、省略、置換、およびその他の変更が可能である。
【産業上の利用可能性】
【０１７８】
本発明は、ルシフェラーゼ発光を利用したあらゆる活性評価に応用可能である。ルシフェラーゼレポーターを用いたデュアルルシフェラーゼ法等による遺伝子発現定量技術のほか、酵素活性定量技術あるいは微生物検出技術等への応用があり、それらを利用した創薬技術等への応用も考えられる。
また、多色ルシフェラーゼの組成を変化させずに，ルシフェラーゼ発光の色調を変化させる一般的手法としても用いることが出来る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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