(57)【要約】【課題】  本発明は、組織、特に、骨格筋組織又は神経組織をin vitroで効率的に作製するための足場となる基材等を提供することを課題とする。【解決手段】  本発明者らは、高い導電率を誇る導電性ポリマー細胞と接着用ポリマーを用いて、これらを混ぜ合わせるのではなく、積層された多層膜、又は、導電性ポリマーを芯とし生分解性ポリマーを鞘とする同軸二層構造のファイバー足場材料を作製すると、このファイバーでは細胞が導電性ポリマーに直接接触しないにも関わらず、かつ、該ファイバーに、電圧を負荷しないにもかかわらず筋管形成効率が向上するとの新たな現象を見出した。ファイバー形状を有する細胞の培養用の基材であって、導電性ポリマー層と細胞接着用層との多層膜基材、特に、導電性ポリマーを内包し、最外層に前記細胞接着用ポリマーを同軸状に積層した同軸多層ファイバーである基材等が提供される。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を分化誘導及び／又は増殖するための培養用の基材であって、導電性ポリマーを含む導電性ポリマー層と、細胞接着用ポリマーを含む細胞接着用ポリマー層とを含む少なくとも２層構造を有する多層膜であることを特徴とする、基材。
【請求項２】
前記細胞がファイバー形状形成能を有する細胞であり、
前記多層膜がファイバー状の前記導電性ポリマー層を内包し、最外層に前記導電性ポリマー層と同軸状に、少なくとも１層の前記細胞接着用ポリマー層が積層されることにより芯・鞘構造又は同軸多層構造を有する多層ファイバーであることを特徴とする、請求項１に記載の基材。
【請求項３】
前記導電性ポリマーが、PEDOT/PSS[ポリ（3,4-エチレン. ジオキシチオフェン）/ポリ（4-スチレンスルホン酸）]、ポリアニリン又はポリピロールから選択され、
前記細胞接着用ポリマーが、
ポリカプロラクトン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、又はこれらの共重合体を含む細胞接着性ポリマー；
ポリメタクリル酸メチル又はポリスチレンを含む汎用培養器材用ポリマー；及び、
コラーゲン又はゼラチンを含む生体由来ポリマー；
からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の基材。
【請求項４】
前記ファイバー形状形成能を有する細胞が筋芽細胞、神経細胞、これらの株化細胞若しくは初代細胞又はモデル細胞から選択されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の基材。
【請求項５】
細胞の分化誘導及び／又は増殖を促進する方法であって、導電性ポリマーを含む導電性ポリマー層と細胞接着用ポリマーを含む細胞接着用ポリマー層とを含む多層膜を基材として、前記細胞を培養することを特徴とする、方法。
【請求項６】
前記細胞が、ファイバー形状形成能を有する細胞であり、
前記基材が、ファイバー状の導電性ポリマー層を内包し、最外層に少なくとも１層の細胞接着用ポリマー層を有する同軸多層ファイバーであり、
前記細胞を前記基材上で培養することを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記導電性ポリマーが、PEDOT/PSS[ポリ（3,4-エチレン. ジオキシチオフェン）/ポリ（4-スチレンスルホン酸）]、ポリアニリン又はポリピロールから選択され、
前記細胞接着用ポリマーが、
ポリカプロラクトン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸又はこれらの共重合体を含む細胞接着性ポリマー；
ポリメタクリル酸メチル又はポリスチレンを含む汎用培養器材用ポリマー；及び、
コラーゲン又はゼラチンを含む生体由来ポリマー；
からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
ファイバー形状形成能を有する細胞が筋芽細胞、神経細胞、これらの株化細胞若しくは初代細胞、又はこれらのモデル細胞から選択されることを特徴とする、請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか1項に記載の基材を用いて培養されることを特徴とする、細胞。
【請求項１０】
請求項５〜８のいずれか１項に記載の方法を用いて培養されることを特徴とする、細胞。
【請求項１１】
前記細胞が、細胞工学用及び/又は再生医療用の細胞であることを特徴とする、請求項９又は１０に記載の細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、導電性ポリマー層と細胞接着用ポリマー層とを含む多層膜からなる細胞培養用基材、該基材を用いる細胞分化誘導及び／又は増殖方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞工学及び再生医療等への応用を目的として、培養細胞の分化誘導及び／又は増殖を促進し、所望とする細胞を得るための方法及びそのための基材の研究がなされている。
【０００３】
例えば、筋管細胞に分化する筋芽細胞や神経線維や突起形成を有する神経細胞については、これらの細胞を効率よく培養し、分化誘導及び／又は増殖を促進し、所望とする細胞を作製する技術の確立が求められている。これらの細胞は、電気信号に対して応答性を有するところから、培養基材として導電性ポリマーを使用し、電気的刺激を負荷した条件や（非特許文献１）、金属含有導電性ポリマーの利用による細胞培養が試みられている（非特許文献２）。
【０００４】
骨格筋組織をin vitroで効率的に作製するためには電気刺激が有利に働き、導電性ポリマーとしてポリピロールやポリアニリン等が知られ（特許文献１、２）、ポリアニリンを生分解性で細胞接着性を有するポリマー（ポリカプロラクトン）に混ぜ合わせたファイバー状の細胞足場材料での筋芽細胞の培養において、電圧を負荷しなくとも筋管形成効率が向上するとの報告もなされている（非特許文献３）。
【０００５】
さらに、導電性ポリマーPPY/PLCL(polypyrrole/poly(l-lactic acid- co-ε-caprolactone)を抹消神経細胞の足場基材として用い、電気刺激の負荷と共に神経細胞を培養することにより神経細胞線維（軸索）径の拡大促進効果や神経機能の回復促進効果等をもたらすことが報告されている（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開昭63-40211号公報
【特許文献２】特開2006-241613号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Song Jら、Front Mol Neurosci. Vol. 9:Art.117: 1-13 (2016).
【非特許文献２】Yang H Sら、Adv Healthc Mater. 5: 137-145 (2016)
【非特許文献３】S H Kuら、Biomaterials, 33: 6098-6104 (2012).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、組織、特に、骨格筋組織又は神経組織をin vitroで効率的に作製するための足場となる基材、該組織の作製効率を向上させる方法、及び、該方法で製造される細胞を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、高い導電率を誇る導電性ポリマー層と細胞接着用ポリマー層を用いて、これらを混ぜ合わせるのではなく、導電性ポリマー層の培養液側に細胞接着用ポリマー層を積層させた多層膜の足場材料、特に、導電性ポリマー層を芯としてその外側に細胞接着ポリマー層を積層した芯・鞘構造又は同軸多層構造を有する多層ファイバーを作製すると、この足場構造において細胞が導電性ポリマーに直接接触しないにも関わらず、かつ、該ファイバーに、電圧を負荷しないにもかかわらず筋管形成効率が向上するとの現象を見出し、本発明を完成した。
【００１０】
具体的には、本発明は、細胞を分化誘導及び／又は増殖するための培養用の基材であって、導電性ポリマーを含む導電性ポリマー層と、細胞接着用ポリマーを含む細胞接着用ポリマー層とを含む少なくとも２層構造を有する多層膜である基材を提供する。
【００１１】
本発明の基材において、前記細胞がファイバー形状形成能を有する細胞であり、前記多層膜がファイバー状の前記導電性ポリマー層を内包し、最外層に前記導電性ポリマー層と同軸状に、少なくとも１層の前記細胞接着用ポリマー層が積層されることにより芯・鞘構造又は同軸多層構造を有する多層ファイバーである場合がある。
【００１２】
本発明の基材において、前記導電性ポリマーが、PEDOT/PSS[ポリ（3,4-エチレン. ジオキシチオフェン）/ポリ（4-スチレンスルホン酸）]、ポリアニリン又はポリピロールから選択され、前記細胞接着用ポリマーが、ポリカプロラクトン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、又はこれらの共重合体を含む細胞接着性ポリマー；ポリメタクリル酸メチル又はポリスチレンを含む汎用培養器材用ポリマー；及び、コラーゲン又はゼラチンを含む生体由来ポリマー；からなる群から選択される少なくとも１種である場合がある。
【００１３】
本発明の基材において、前記ファイバー形状形成能を有する細胞が筋芽細胞、神経細胞、これらの株化細胞若しくは初代細胞又はモデル細胞から選択される場合がある。
【００１４】
また、本発明は、細胞の分化誘導及び／又は増殖を促進する方法であって、導電性ポリマーを含む導電性ポリマー層と細胞接着用ポリマーを含む細胞接着用ポリマー層とを含む多層膜を基材として、前記細胞を培養する方法を提供する。
【００１５】
本発明の方法において、前記細胞が、ファイバー形状形成能を有する細胞であり、
前記基材が、ファイバー状の導電性ポリマー層を内包し、最外層に少なくとも１層の細胞接着用ポリマー層を有する同軸多層ファイバーであり、
前記細胞を前記基材上で培養する場合がある。
【００１６】
また、本発明の方法において、前記導電性ポリマーが、PEDOT/PSS[ポリ（3,4-エチレン. ジオキシチオフェン）/ポリ（4-スチレンスルホン酸）]、ポリアニリン又はポリピロールから選択され、
前記細胞接着用ポリマーが、
ポリカプロラクトン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸又はこれらの共重合体を含む細胞接着性ポリマー；
ポリメタクリル酸メチル又はポリスチレンを含む汎用培養器材用ポリマー；及び、
コラーゲン又はゼラチンを含む生体由来ポリマー；
からなる群から選択される少なくとも１種である場合がある。
【００１７】
また、本発明の方法において、ファイバー形状形成能を有する細胞が筋芽細胞、神経細胞、これらの株化細胞若しくは初代細胞、又はこれらのモデル細胞から選択される場合がある。
【００１８】
さらに、本発明は、前記本発明の基材を用いて培養される細胞を提供する。
【００１９】
さらに、本発明は、前記本発明の方法を用いて培養される細胞を提供する。
【００２０】
本発明の細胞において、前記細胞が、組織工学用又は再生医療用の細胞である場合がある。
【発明の効果】
【００２１】
本発明により、組織、特に、骨格筋組織又は神経組織をin vitroで効率的に作製するための足場となる基材、該組織の作製効率を向上させる方法、及び、該方法で製造される細胞を提供することができ、これらの基材や方法で作製される細胞は、組織工学や再生医療の分野で利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】PEDOT/PSS、ポリアニリン（polyaniline)、ポリピロール（polypyrrole)各材料についてのファイバー足場の電子顕微鏡（SEM）像を表す図(スケールバーは20 μmを表す)。コアシース：芯・鞘二重構造のファイバー足場、ブレンド液：芯と鞘の成分を混合した場合のファイバー足場、シース溶液のみ：鞘成分のみでのファイバー足場をそれぞれ表す。
【図２】図１の芯・鞘ファイバーの拡大電子顕微鏡写真を表す図。
【図３】PEDOT/PSSを用い、シース溶液のみ：鞘溶液のみで形成したファイバー足場、コアシース：芯・鞘構造二重構造のファイバー足場、ブレンド溶液：芯・鞘混合溶液の各ファイバー足場での筋管形成促進効果を表す写真図 （スケールバーは200 μmを表す）
【図４】PEDOT/PSSを用いたファイバー足場作製条件での筋管面積占有率を評価した結果を表す図 。シース：鞘成分のみで形成したファイバー足場（N=4）、コアシース:芯・鞘二重構造のファイバー足場（N = 4）、ブレンド:芯・鞘成分を混合して形成したファイバー足場（N = 3）、**p < 0.01、*p <0.05)
【図５Ａ】芯流量を変化させた場合での筋管形成評価における分化誘導培養液に変更後0日目の顕微鏡写真図を表す。スケールバーは 200 μmを表し、緑はミオシン重鎖を、青は核を表す。
【図５Ｂ】芯流量を変化させた場合での筋管形成評価における分化誘導培養液に変更後5日目の顕微鏡写真図を表す。スケールバーは 200 μmを表し、緑はミオシン重鎖を 青は核を表す。
【図６】芯流量を変えた場合での筋管形成を評価した結果を表す図。各分化誘導日数における（A）細胞密度の変化、（B）ミオシン重鎖を発現している細胞の占有面積比率、（C）融合細胞率、（D）筋管本数、（E）筋管長さを表す（Mean±S.D., * : p<0.05, ** : p<0.01, n= 3）。
【図７】鞘PCL/ゼラチン溶液の濃度を変更した場合での各分化誘導日数における (A)分化誘導中の細胞密度変化、(B) ミオシン重鎖（MHC）を発現する細胞の占有面積比率、(C)筋管本数、(D) 筋管長さ、(E) 細胞融合率を表す（n = 1）。
【図８】鞘PCL/ゼラチン溶液濃度を変化させて作製した足場上での筋管形成の継時変化を表す顕微鏡写真図。緑はミオシン重鎖（MHC）を表し、青は細胞核を表し、スケールバーは200 μmを表す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
１．細胞培養用基材
本発明の実施形態の１つは、細胞を分化誘導及び／又は増殖するための培養用の基材であって、導電性ポリマーを含む導電性ポリマー層と、細胞接着用ポリマーを含む細胞接着用ポリマー層とを含む少なくとも２層構造を有する多層膜である基材である。好ましくは、該基材は、前記細胞がファイバー形状形成能を有する細胞であり、前記多層膜がファイバー状の前記導電性ポリマー層を内包し、最外層に前記導電性ポリマー層と略同軸状に、少なくとも１層の前記細胞接着用ポリマー層が積層されることにより芯・鞘構造又は略同軸多層構造を有する多層ファイバーである。
【００２４】
前記基材において、前記導電性ポリマーの例としては、PEDOT/PSS[ポリ（3,4-エチレン. ジオキシチオフェン）/ポリ（4-スチレンスルホン酸）]、ポリアニリン又はポリピロールから選択され、前記細胞接着用ポリマーの例としては、ポリカプロラクトン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、又はこれらの共重合体を含む細胞接着性ポリマー；ポリメタクリル酸メチル又はポリスチレンを含む汎用培養器材用ポリマー；並びに、コラーゲン又はゼラチンを含む生体由来ポリマー；からなる群から選択される少なくとも１種である。
【００２５】
本発明の基材についてのより具体的な例として、PEDOT/PSS を導電性ポリマーとして使用する場合が挙げられる。PEDOT/PSSは、ポリ（4-スチレンスルホン酸）をドープしたポリ（3,4-エチレン. ジオキシチオフェン）であり、PEDOTは、導電性が良好なこと、ドーピングされた（導体）状態での環境安定性が優れていること、および薄膜として使用した場合の光透過性も有する。PEDOTコーティングは、一般的に、PEDOTとポリアニオンポリ（スチレンスルホン酸塩）すなわちPEDOT-PSSの混合物からなる水分散液を使用して行うことができる。
【００２６】
本明細書において、「細胞接着用ポリマー」とは、本発明の多層性ポリマー基材において、細胞に直接接触することのない導電性ポリマー層と、培養細胞との間に配置され、培養細胞に直接接触するポリマー層のポリマー材料のことをいう。すなわち、「細胞接着用ポリマー」とは、細胞が接着すればよく、細胞接着を促進する活性を有する分子を含む優れた細胞接着活性を有するポリマーに限定されるものではない。本明細書において、この「細胞接着用ポリマー」を、その材料の種類等により、「細胞接着性ポリマー」、「汎用培養器材用ポリマー」及び「生体由来ポリマー」に分類して記載する。しかし、これらは、いずれも優れた細胞接着性を有することを必ずしも意味するものではない。
【００２７】
細胞接着用ポリマーの例としては、ポリカプロラクトン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、又はこれらの共重合体を含む細胞接着性ポリマー；ポリメタクリル酸メチル又はポリスチレンを含む汎用培養器材用ポリマー；及び、コラーゲン又はゼラチンを含む生体由来ポリマー等が挙げられる。
【００２８】
本明細書において、前記多層性ポリマー基材を構成する積層膜の製造のためのコーティング方法として、スピン・コーティング法、ディッピング法、スプレー・コーティング法、電界重合法、蒸着法、蒸着重合法、ブラシコーティング法、ブレードコーティング法、ローラコーティング法及びロール・ツー・ロール法等の公知の方法が使用できる。また、芯・鞘構造又は同軸多層構造を有する多層ファイバーを製造する場合には、エレクトロスピニング法を用いることができる。
【００２９】
エレクトロスピニング法によって、前記同軸多層ファイバーを製造する場合には、導電性ポリマーの溶液を芯溶液とし、細胞接着用ポリマーの溶液又は該ポリマーの架橋反応前の原料溶液を鞘溶液として使用し、電界紡糸装置を用いて、導電性ポリマーを芯として、その外側に生分解性ポリマーを積層させることにより、芯・鞘構造を形成する同軸２層構造のファイバーを製造することができる。
【００３０】
上記の方法で製造した導電性ポリマー層と細胞接着用ポリマー層との多層膜基材、又は、これらのポリマー層を有する同軸２層構造のファイバー基材を足場として培養液中に配置し、当業者に公知の適切な培養液中で、細胞を培養することにより、細胞の細胞分化誘導及び／又は細胞増殖を促進し、所望とする組織、組織モデル、バイオアクチュエーター等を取得できる。また、同軸多層構造ファイバーを基材として用いる場合には、この足場基材に沿って細胞が配列した人工組織を得ることができる。
【００３１】
また、前記ファイバー形状形成能を有する細胞は、細胞線維や細胞突起を延伸可能な細胞である限り含まれ、より具体的な例としては、筋管を形成する能力を有する細胞及び／又は突起を伸張させる能力を有する細胞が挙げられる。具体的には、筋芽細胞、神経細胞、これらの株化細胞若しくは初代細胞又はモデル細胞から選択される。モデル細胞の例としては、筋芽細胞モデルとしてC2C12細胞が、神経細胞モデルとして、PC12細胞が挙げられる。また、人工多能性幹細胞(iPS細胞）又は胚性幹細胞（ES細胞）を分化誘導して作製した細胞を使用することができる。
【００３２】
これらの本発明の実施で使用する細胞は、哺乳類由来の細胞であればよく、例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ネコ、サル、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ又はウサギ由来の細胞が挙げられる。
【００３３】
筋芽細胞を上記足場と共に培養した場合、筋管（myotube)に分化誘導することができる。また、人工多能性幹細胞や胚性幹細胞を、前記各細胞に分化誘導した後、本発明の足場基材と共に培養することにより、所望とするファイバー形状を有する細胞を、本発明の足場基材を使用しない場合と比較して、短期間の培養期間で取得することもできる。
【００３４】
本発明の培養基材を用いて製造される細胞は、例えば、組織工学や再生医療等の分野に応用できる。
【００３５】
本発明の培養基材を用いて製造される細胞を組織工学に用いる場合、例えば、創薬研究分野において、3次元的に構築された培養組織を組織モデルとして、薬剤の有効性や安全性の評価を行うための研究材料、及び、人工筋肉としてのバイオアクチュエーター等への利用等が可能となる。
【００３６】
また、本発明の培養基材を用いて作製される細胞を再生医療に用いる場合、例えば、上記の基材を使用して製造される培養細胞を、組織が損傷した患者の損傷部位に移植し使用することにより、損傷組織を再生させるための再生医療用の材料として使用できる。特に、同軸多層ファイバー基材を使用して分化誘導又は増殖させた細胞は移植用の細胞として使用できる。また、本発明の基材を患者の損傷部位に移植することにより、損傷部位の修復を促進できる。
【００３７】
上記組織損傷にかかわる疾患としては、遺伝的欠陥、損傷、適切な細胞分化の欠如（例えば、細胞増殖性疾患におけるもの）、正常な身体の摩耗、又は生活習慣により、影響を受けた組織または臓器の機能または構造が、時間をかけて徐々に悪化する生活習慣病等の疾患を含む。より具体的には、組織損傷にかかわる疾患の例としては、例えば、交通事故等を典型例とする事故による筋肉組織や脳挫傷等の脳組織への外傷性の組織損傷、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）等の神経変性疾患での組織損傷；例えば、横断性脊髄炎、脳または脊髄への外傷後に生じる脱髄、急性脳損傷、頭部外傷、脊髄損傷、末梢神経損傷、虚血性脳損傷、ＣＮＳの遺伝性ミエリン障害、てんかん、周生期仮死、仮死、低酸素症、てんかん重積状態、シャイ−ドレーガー症候群、自閉症、および脳卒中等の神経系障害等での組織損傷；例えば、肺癌、肝臓がん等のがん、若しくは化学療法剤による抗癌治療から生じる薬剤の細胞毒性によって惹起される組織損傷；例えば、糖尿病及びニーマンピック病等の代謝障害による組織損傷；例えば、エリテマトーデス、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、前立腺炎、変形性関節症、骨粗鬆症、関節リウマチ、狼瘡、糖尿病、および喘息等の自己免疫又は炎症関連障害による組織損傷；例えば、緑内障、網膜色素変性症、ノリエ病、および黄斑変性症等の眼障害による組織損傷；例えば、アテローム性動脈硬化症、心不全、心筋梗塞及び狭心症等の循環器障害による組織損傷；例えば、ウィスコット−アルドリッチ症候群等の血液障害；筋ジストロフィー；消化器疾患、腎臓疾患、肝臓疾患又は肺疾患での組織損傷；例えば、アジソン病等の副腎疾患での組織損傷；例えば、Ｃ型肝炎感染および後天的免疫不全症等のウイルスや微生物等の感染による感染性組織障害による組織損傷等が挙げられる。
【００３８】
２．ファイバー形状形成能を有する細胞の培養方法
本発明のもう１つの実施形態は、培養細胞の増殖を促進する方法であって、導電性ポリマーを含む導電性ポリマー層と細胞接着用ポリマーを含む細胞接着用ポリマー層とを含む多層膜を基材として、前記細胞を培養する方法である。特に、本方法において、前記細胞がファイバー形状形成能を有する細胞であり、前記基材が、ファイバー状の導電性ポリマー層を内包し、最外層に少なくとも１層の細胞接着用ポリマー層を有する同軸多層ファイバーからなる基材であり、前記細胞を前記基材上で培養する方法が好ましい。
【００３９】
本発明のファイバー状細胞の培養方法に用いる基材を構成する導電性ポリマー、細胞接着用ポリマーは、上記細胞培養用基材の実施形態に記載した各材料を使用して、上記の培養用基材を製造し、本発明の方法に使用することができる。
【００４０】
また、ファイバー形状を有する細胞を形成するために培養する細胞は、ファイバー形状を形成する能力を有する細胞であり、より具体的には、筋管を形成する能力を有する細胞及び／又は突起を伸張させる能力を有する細胞が挙げられ、例えば、筋管を形成する能力を有する細胞として筋芽細胞が、突起を伸張させる能力を有する細胞として、神経細胞が挙げられる。さらに、これらの株化細胞若しくは初代細胞、又はこれらのモデル細胞等も使用できる。モデル細胞としては、例えば、筋芽細胞モデルとしてC2C12細胞が、神経細胞のモデル細胞であるPC12細胞等が挙げられる。また、人工多能性幹細胞や胚性幹細胞を、これらの細胞に分化誘導し、これらの細胞を使用することができる。
【００４１】
前記ファイバー状細胞の培養方法で製造されるファイバー状細胞は、細胞工学用、より具体的には、創薬研究分野における薬剤の有効性や安全性を評価するための組織モデル、若しくは、バイオアクチュエーター等、又は、再生医療分野における、上記各種疾患における組織損傷を受けた患者の組織の再生を促進させるために損傷部位に移植等を行うことにより使用できる。
【００４２】
３．ファイバー形状を有する細胞
本発明のもう１つの実施態様は、前記基材及び培養方法を用いて分化誘導及び／又は増殖された細胞である。特に、前記多層ファイバー基材を使用して、又は、前記多層ファイバー基材を使用する方法によって培養される細胞は、ファイバー形状形成能を有する細胞が好ましい。ファイバー形状形成能を有する細胞として筋管を形成する能力を有する細胞、及び／又は、突起を伸張させる能力を有する細胞が挙げられ、具体的には、ファイバー形状形成能を有する細胞として筋管を形成する能力を有する細胞として筋芽細胞が、神経突起から軸索を伸張させる、すなわち、神経線維を伸張させる能力を有する細胞として、神経細胞が挙げられる。また、これらの細胞の株化細胞若しくは初代細胞、又はこれらのモデル細胞が挙げられる。
【００４３】
例えば、これらの細胞を同軸多層ファイバー基材と共に培養することにより、細胞が、本基材に接着し、分化誘導及び／又は増殖が、本基材を使用しないときと比較し、促進される。これにより、所望とするファイバー形状を有する細胞を取得できる。また、これらの細胞によって構成される組織や組織モデルは、組織工学や再生医療等に利用できる。
【００４４】
例えば、これらの細胞を組織工学に利用する場合、より具体的には、創薬研究分野における薬剤の有効性や安全性を評価するための組織モデル、若しくは、バイオアクチュエーター等に利用できる。
【００４５】
また、このファイバー形状を有する細胞を、組織損傷のある患者の損傷部位に移植することにより、再生医療用の細胞、又はこれらの細胞によって構成される組織は、再生医療用の組織として利用できる。この再生医療用の細胞又は組織を使用する対象疾患としては、上記培養細胞用基材の実施形態に記載した各種疾患が挙げられる。
【００４６】
また、筋芽細胞を前記同軸多層ファイバー基材を用いて培養して得られる細胞を筋肉損傷部位を有する患者の損傷部位に移植することにより、筋肉損傷に対して治癒までの期間を短縮でき、再生医療用の細胞として使用できる。また、神経細胞を前記同軸多層ファイバー基材を用いて培養して得られる細胞を神経損傷を有する患者の損傷部位に移植することにより、神経損傷に対して治癒までの期間を短縮でき、再生医療用の細胞として使用できる。これらの筋肉損傷や神経損傷の例としては、交通事故等の筋肉や神経の外傷性損傷や老化等に伴うヘルニア等による神経損傷を伴う疾患が挙げられる。
【００４７】
本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。ここに記述される実施例は本発明の実施形態を例示するものであり、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【００４８】
１．実験材料及び装置
ポリカプロラクトンはSigmaAldrich社製、1,1,3,3,3-hexafluoro-2-isopropanol (HFIP)は和光純薬社製、PEDOT/PSS分散液はDenatron（ナガセケムテクス社製）、ポリアニリン及びポリピロールはSigma Aldrich社製を使用した。その他の実験に使用した試薬は、適宜、実験方法の記載で記載した。
電界紡糸装置 Nanon（MECC社製）の芯・鞘ファイバー作製システムを紡糸に使用した。また、電子顕微鏡は、3Dリアルサーフェスビュー顕微鏡（VE-9800、Keyence社製）を使用した。
【００４９】
２．ファイバーの作製方法
鞘溶液として、ポリカプロラクトン（PCL、平均分子量85,000）を有機溶媒である1,1,3,3,3-hexafluoro-2-isopropanol (HFIP) に溶かし5 wt%溶液を作製し、HFIP容量に対し5% (w/v)になるようにゼラチンを混合し、作製した。これを鞘溶液とした。導電性ポリマーを形成するための芯溶液としてPEDOT/PSS分散液（Denatron, ナガセケムテクス社製）原液を使用した。電界紡糸装置 Nanon（MECC社製）の芯・鞘ファイバー作製システムを用い、エレクトロスピニング法で紡糸した。その際、芯溶液と鞘溶液の流量比は1:10とし、電圧は25 kV、紡糸距離は15 cmとした（図１、２）。
【００５０】
紡糸されたファイバーは高速回転（毎分2500回転）するドラムコレクターで巻き取り回収した。
【００５１】
比較サンプルとして鞘溶液と芯溶液の各溶液を完全に混合した液（ブレンド液）を調製し、上記と同様に紡糸した。PEDOT/PSS以外の他の導電性ポリマーとしてポリアニリンとポリピロールを使用して、それ以外は、上記と同様の材料について、それぞれをHFIPに1 %(w/v)の溶液に調整し、芯溶液として使用し、ファイバーを作製した（図１）。上記の方法で作成した各ファイバーの平均径を表１に示した。なお、コアシースは芯・鞘二重構造のファイバー足場を、ブレンド液は芯及び鞘の各成分を混合して形成したファイバー足場を、シース溶液のみは鞘成分で形成したファイバー足場を表す。
【００５２】
【表１】
2018196370.tif 000003
【００５３】
３． PEDOT/PSSを用いたファイバー足場における筋管形成効率の評価
実験方法
ファイバー足場に含有されたゼラチンが培地中に溶け出ないようにするため、化学架橋による構造の安定化が必須であった。そこで、使用前に25%グルタルアルデヒドの蒸気に曝し架橋処理をおこなった。未反応のグルタルアルデヒドにより細胞に損傷を与える可能性があるため、細胞を播種する前日に足場を培地に浸漬させ、培地中のアミノ酸やタンパク質と反応させた。
【００５４】
ファイバー足場上にマウス筋芽細胞由来の株化細胞であるC2C12細胞を足場面積に対し、5.0×104 cells/cm2の密度で播種した。その後、通常の増殖用培地 (DMEM, 10%ウシ胎児血清, 1% ペニシリン/ストレプトマイシン)で37℃, 5% CO2のインキュベーター内で24h培養した。その後、分化誘導用培地 (DMEM, 2% ウマ血清, 1% ペニシリン/ストレプトマイシン) に交換し、5日間培養を継続し、1日おきに分化誘導用培地を交換した。
【００５５】
培養終了後に細胞を4%パラホルムアルデヒドで固定し、ミオシン重鎖を蛍光免疫染色（緑色）し、筋管への分化を定量的に評価した。細胞の核はHoechst（青）蛍光試薬（Invitrogen社製）を用いて染色した。統計学的解析は、一元配置分散分析(ANOVA)とTukey-Kramer法を使用し、post-hoc解析を行った。
【００５６】
実験結果
芯・鞘のファイバー足場を用いた場合、その他2条件と比べ有意に筋管形成率が向上した。鞘のみのファイバーとブレンドのファイバーとの比較から、PEDOT/PSSの存在が筋管の形成に有利に働いていることが分かるが、芯・鞘構造によって筋管の形成効率は最大となった（図３、４）。
【００５７】
小活
上記のマウスの筋芽細胞であるC2C12細胞を用い、PEDOT/PSSを導電性ポリマーとして、ポリカプロラクトンとゼラチンとを細胞接着用ポリマーとして製造した同軸多層ファイバー基材と共に培養することにより、細胞分化効率について、顕著な促進効果を発揮することを認めた。
【００５８】
４．表面抵抗率測定による電気的性質の評価
ファイバーマットの表面抵抗値、及び導電率を測定した。その結果を表２に示す。本実験で使用した抵抗測定器Hiresta-UXでは1000Vの高電圧を印加することにより、〜1014(Ω)と非常に高い抵抗値までを測定を可能とし、極微弱な電流を検出できる。本実験でも、全サンプルについて1000 Vの電圧を印加して測定した。「鞘PCL/Gelatin溶液のみ」と「芯鞘材料混合」の時に表面抵抗値は最も高くなり、芯PEDOT/PSS水分散液を導入することで表面抵抗値は2〜3桁低下した。またPEDOT/PSS流量を上げることによる表面抵抗値の低下も見られた。これは芯PEDOT/PSS水分散液の流量を上げたことにより、ファイバー内へのPEDOT/PSS層が厚くなったためと考えられる。いずれの条件で作製した足場でも抵抗値は絶縁体というべき1010(Ω)を超えているものの、導電性の芯層を絶縁体の鞘で覆っているにも関わらず導電性が向上した。この点から、測定時に芯層まで電流が届いている可能性が考えられた。これらの値は既往研究において導電性ポリマーPolyanilineやPolypyrroleを混合したファイバーと比べと比べると抵抗値が8〜9桁高い値である。単純に足場へ混合している系では、足場表面に均一に導電性ポリマーが存在しているため測定値が高くなると考えられる。
【表２】
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【００５９】
さらに、鞘PCL/Gelatin溶液濃度が4 wt (%) のとき、5 wt (%) のときと比べ1ケタ表面抵抗値が下がることを確認した（表３）。これはTEM観察から見えた様に、鞘層が薄くなったことで芯部分と通電しやすくなった可能性が考えられた。
【００６０】
本実験の測定時に印加した電圧は1000 Vと生体における電位（数十mV）と比べ非常に高いため、足場の導電性と細胞挙動と結びつけることは現状では難しい。
【表３】
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【００６１】
５．芯流量を変えて作製したファイバー足場上での筋管形成の比較
芯・鞘二重構造を有するファイバーをエレクトロスピニング法で作製する際、芯のPEDOT/PSS水分散液の流量を変化させて作製し、筋管形成に対する影響を比較した。
【００６２】
芯のPEDOT/PSS水分散液の流量を変化させて作製した足場の場合、培養液を分化誘導培養液に変更することによる分化誘導開始後の細胞密度が統計学的に有意ではないものの継時的に減少する傾向を示した。分化誘導5日目において最も芯流量が大きい「芯流量0.63 ml/h」の足場で、融合細胞率、本数、筋管長さがいずれも全足場条件の中で最大になる傾向を示した（図５Ｂ、図６Ａ‐Ｃ）。
【００６３】
分化誘導初期0日目と1日目から筋管形成が確認でき、誘導日数0日目〜3日目でも「芯流量0.5 ml/h」と「芯流量0.63 ml/h」で最も筋管形成が高くなった。分化誘導最終日ので5日目では、「芯流量0.5 ml/h」と「芯流量0.63 ml/h」で同等の筋管形率となった。また、芯流量0〜0.33 ml/hの間では筋管形成に大きな影響が見られず、0.50 ml/h以上で筋管形成効率が高まったことから、ある量以上の芯PEDOT/PSS水分散液を導入すると筋管形成が促進されることが示された（図６Ｂ）。
【００６４】
６．鞘PCL（ポリカプロラクトン）/ゼラチン溶液濃度を変更させて作製した足場での筋管形成評価
次に、鞘層の厚みを変化させた場合での筋管形成を評価した。
【００６５】
芯・鞘二重構造ファイバーの紡糸において、各層の厚みはポリマー溶液の濃度に関係することが示されている（Elahi, M. F. et al., J. Bioeng. Biomed. Sci. 3, 1-14 2013）。仮に鞘層表面のC2C12細胞と内部のPEDOT/PSSが影響を及ぼし合っていると仮定した場合、鞘層が薄くなることでより表面の細胞が影響を受けやすくなる、つまり、筋管形成が促進されやすくなると仮定した。
【００６６】
筋管形成評価の結果を図７、８に示した。分化誘導期間全日において各足場の細胞密度に大きな差は見られなかった。一方、鞘PCL/ゼラチン溶液濃度を低下するにつれてミオシン重鎖が陽性の面積比率、筋管本数、融合細胞率が向上し、鞘PCL/ゼラチン溶液濃度が最も低い3 wt (%)の時にそれぞれ最大となる傾向が見られた。筋管長さについては分化誘導5日目にて鞘濃度4 wt (%)と3 wt (%)の間で顕著な差は見られない。しかし、組織全体として機能する骨格筋を効率的に作製する場合、筋管形成の評価項目として面積比率や筋管本数が多い方が重要と考えられるため、3 wt (%)足場が筋管形成誘導足場として優れていると考えた。また、鞘濃度を4 wt (%)にした際に足場の表面抵抗値が鞘濃度5 wt (%)と比べ、1桁低下した点を踏まえると、芯・鞘二重ファイバーの鞘層を薄くしたことにより優位に筋管形成を促進したと考えられる。
【００６７】
総括
以上の結果より、導電性ポリマーを芯として内包し、その外側に細胞接着性を有するゲルを鞘として芯・鞘構造の二重層を有する足場として、筋芽細胞を培養すると、筋管形成誘導作用を有することを本研究で認めた。
【００６８】
この鞘構造は、高い表面抵抗値を有することから培養液が直接導電性ポリマーと接触することにより培養細胞に作用するものではないと考えられる。また、本作用は、芯構造を厚くする、又は、鞘構造を薄くすることにより促進されることから、芯構造の導電性ポリマーの効果が、筋管形成作用の発揮に影響するものと考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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