(57)【要約】      （修正有）【課題】本発明は、ペプチドの結合力を向上させる変異を、計算機上で効率的、かつ、より高精度でスクリーニングする方法を提供する。【解決手段】ペプチドの結合力を向上させる変異のスクリーニング方法は、ペプチドの結合状態および解離状態におけるポテンシャルエネルギーを計算し、その差を算出し、天然型ペプチドと変異ペプチドとの間でその変化量を比較することで結合力を評価するに当たり、分子動力学法で求め、且つそのシミュレーション時間を１００ピコ秒以下にすることを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
結合力を向上させる変異をスクリーニングするための方法であって、
結合状態にある対照ペプチドのポテンシャルエネルギーを、シミュレーション時間が１００ピコ秒以下の分子動力学法により求める工程、
解離状態にある対照ペプチドのポテンシャルエネルギーを、上記シミュレーション時間が１００ピコ秒以下の分子動力学法により求める工程、
結合状態と解離状態の対照ペプチドの間のポテンシャルエネルギーの差を算出する工程、
結合状態にある変異ペプチドのポテンシャルエネルギーを、上記シミュレーション時間が１００ピコ秒以下の分子動力学法により求める工程、
解離状態にある変異ペプチドのポテンシャルエネルギーを、上記シミュレーション時間が１００ピコ秒以下の分子動力学法により求める工程、
結合状態と解離状態の変異ペプチドの間のポテンシャルエネルギーの差を算出する工程、
対照ペプチドと変異ペプチドとの間の上記ポテンシャルエネルギー差を比較することにより、変異がペプチドの結合力に与える影響を評価する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
上記シミュレーション時間を１０ピコ秒以上５０ピコ秒以下とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記対照ペプチドのアミノ酸残基数が５００以下である請求項１または２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチドの結合力を向上させる変異を計算機上で効率的かつより高精度でスクリーニングする方法に関するものである
【背景技術】
【０００２】
タンパク質は一般的に溶液中で一定の三次構造を形成するが、タンパク質を構成している個々の原子は完全に静止しておらず絶えず動いている。この動きは、タンパク質の物性や機能に密接に関連するため、その動きをウエットな実験やドライな解析で評価する研究は盛んになされている。ウエットな実験とは実験動物や細胞などを用いた実験であるのに対して、ドライな解析とは、実験動物や細胞などを用いることなく、主にコンピュータを用いるものである。ドライな解析として、タンパク質などの生体分子の個々の原子の動きをコンピュータ上でシミュレーションする手法は「分子動力学」と呼ばれる（非特許文献１）。
【０００３】
分子動力学法（Molecular Dynamics:MDと呼ぶ）を用いたタンパク質の結合力（ΔG：結合自由エネルギー）の予測に関して、これまで様々な予測法が開発されているが、それらの大多数は精度と計算効率がトレードオフの関係、すなわち「大雑把だけれども速い」か「精確だが長い計算時間を要する」ものとなっている。スクリーニングで用いられる、ドッキングスコアは大量の化合物を非常に速く処理し、化合物の活性の有無を判別するには向いているが、定量的なΔG予測には向いていない。一方、FreeEnergy Perturbation（FEP）法やThermo-dynamic Integration（TI）法は構造の差異が小さい２つの化合物間のΔGの差(ΔΔG)を求めることで、計算誤差がある程度相殺されることもあり、予測精度としては現在最も満足できる計算手法の一つであると云える。しかし、FEP/TI法の計算には、数多くの中間状態の分子シミュレーションが必要で、マイクロ秒スケールの長時間シミュレーションを要する。また中間状態を考慮しないエネルギー表示法による結合力評価法も提案されている（特許文献１）が、それでも数ナノ秒スケールのシミュレーションを要し、コンピュータ・スペックの目覚ましい発展はあるものの、多数のタンパク質の計算が必要となる変異スクリーニングにこれらの計算手法を適用するのは非現実的である。もちろん、ペプチドの変異をデザインするごとにそのペプチドを実際に合成してアッセイすることは、時間や労力が過剰にかかるため考えられない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】WO2016/052662号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｋａｒｐｌｕｓ  Ｍ，ＭｃＣａｍｍｏｎ  ＪＡ．，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２００２年，９巻，６４６−６５２頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
分子動力学法（ＭＤ法）は、原子間力を受けた原子がどのように運動するかをニュートンの運動方程式に基づいて計算し、原子の配置がどのように変わったかを明らかにする。かかるプロセスを繰り返して結合力を評価する場合、多大な時間がかかるという課題があった。特にペプチドの結合力を向上させる変異を見出すには、多数の変異体を評価する必要があるため、ＭＤ法は不向きであると考えられてきた。そこで本発明は、ペプチドの結合力を向上させる変異を計算機上で効率的かつより高精度でスクリーニングする方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために、鋭意研究を進めた。その結果、対照ペプチドを変異させた場合の結合力の変化量を予測するに当たり、対照ペプチドとそのペプチドが相互作用するタンパク質が結合した状態（複合体状態）および解離した状態（単量体状態）、両状態において同一のセルサイズを設定し、定温・定圧条件下の分子動力学法でポテンシャルエネルギーを求め、且つそのシミュレーション時間を１００ピコ秒以下にしても、計算されたポテンシャルエネルギーの両状態間の差の変異前後における変化量は対照ペプチドの変異前後において期待される効果（安定化／不安定化）と高い相関を示すことを見出して、本発明を完成した。以下、本発明を示す。
【０００８】
［１］  結合力を向上させる変異をスクリーニングするための方法であって、
結合状態にある対照ペプチドのポテンシャルエネルギーを、シミュレーション時間が１００ピコ秒以下の分子動力学法により求める工程、
解離状態にある対照ペプチドのポテンシャルエネルギーを、上記シミュレーション時間が１００ピコ秒以下の分子動力学法により求める工程、
結合状態と解離状態の対照ペプチドの間のポテンシャルエネルギーの差を算出する工程、
結合状態にある変異ペプチドのポテンシャルエネルギーを、上記シミュレーション時間が１００ピコ秒以下の分子動力学法により求める工程、
解離状態にある変異ペプチドのポテンシャルエネルギーを、上記シミュレーション時間が１００ピコ秒以下の分子動力学法により求める工程、
結合状態と解離状態の変異ペプチドの間のポテンシャルエネルギーの差を算出する工程、
対照ペプチドと変異ペプチドとの間の上記ポテンシャルエネルギー差を比較することにより、変異がペプチドの結合力に与える影響を評価する工程を含むことを特徴とする方法。
【０００９】
［２］  上記シミュレーション時間を１０ピコ秒以上５０ピコ秒以下とする上記［１］に記載の方法。
【００１０】
［３］  上記対照ペプチドのアミノ酸残基数が５００以下である上記［１］または［２］に記載の方法。
【発明の効果】
【００１１】
ペプチドの結合力を向上させる変異をスクリーニングするに当たり、変異をデザインする毎にペプチドを実際に合成してアッセイしていては労力、時間、コストなどがかかり過ぎるので、現実的ではない。そこで、変異前後のペプチドの結合力の変化量を計算機で評価することが考えられる。
【００１２】
しかし、計算機を用いた結合力の変化量の評価方法のうち分子動力学法を用いる方法は、原子の動きの計算を繰り返すものであることから、一つのペプチドの一つの変異前後の結合力の変化量を評価するだけでも多大な時間を要する。
【００１３】
それに対して本発明方法は、評価時間が比較的短い上に、評価結果が期待される効果（安定化/不安定化）と高い相関を示すことから、膨大な数の変異ペプチドデザインの中から高い結合力を示すものをスクリーニングする場合に非常に有用であるといえる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】タンパク質Aとタンパク質Bとの結合における熱力学的サイクルを示した図である。
【図２】タンパク質AをA’に変異させたときの結合エネルギー差（ΔΔG_bind）の計算系を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明方法は、ペプチドの結合力を向上させる変異を効率的かつより高精度でスクリーニングするための方法である。以下に本発明で考案した結合力評価方法を示す。
【００１６】
タンパク質Aとタンパク質Bとの結合における熱力学的サイクルは図１のように図示され、原理的に結合力（ΔG_bind）は溶液中にあるタンパク質Ａと真空中にあるタンパク質Ｂが結合するエネルギーΔG_A-Bcomplexとタンパク質Ｂが溶液中に溶ける溶媒和エネルギーΔG_B-solvateの差で算出できる。
【００１７】
ΔG_bind = ΔG_A-Bcomplex - ΔG_B-solvate
【００１８】
タンパク質AをA’に変異させた場合も同様に以下の式で記述できる。
【００１９】
ΔG’_bind = ΔG_A’-Bcomplex - ΔG_B-solvate
【００２０】
したがって、タンパク質AをA’に変異させたときの結合自由エネルギーの差（ΔΔG_bind）は
【００２１】
ΔΔG_bind = ΔG’_bind - ΔG_bind
= ΔG_A’-Bcomplex - ΔG_A_Bcomplex
【００２２】
すなわち図２のように計算系１、２を準備して、それぞれの計算系でΔG_complexを計算し、差をとることで変異による結合力の変化量（ΔΔG_bind）を算出することが出来る。一般的にΔΔＧ_bindが負の値の場合、変異による効果は安定化、逆に正の場合は変異による効果は不安定化になる。
【００２３】
ΔG_A-Bcomplexは図２のような複合体、単量体2種類の計算系を準備しセルサイズを一致させ水分子をタンパク質の周りに配置させて、MD計算を実施して得られるポテンシャルエネルギー（E）の差（ΔE）で近似する。
【００２４】
ΔG_A-Bcomplex ≒ E_A_Bcomplex - E_Amonomer = ΔE
【００２５】
以下、本発明方法の具体的な工程を工程毎に説明する。
【００２６】
工程１：対照ペプチドの結合状態のポテンシャルエネルギーの計算工程
本工程では、結合対象となるタンパク質と結合状態（複合体状態）にある対照ペプチドのポテンシャルエネルギーを、シミュレーション時間が１００ピコ秒以下の分子動力学法により求める。
【００２７】
本発明において「ペプチド」とは、ポリペプチド構造を有するあらゆる分子を含むものであって、いわゆるタンパク質のみならず、断片化されたものや、ペプチド結合によって他のペプチドが連結されたものも包含されるものとする。例えば、ペプチドにはペプチドドメインも含まれる。「ペプチドドメイン」とは、タンパク質の高次構造上の単位であり、数十から数百のアミノ酸残基配列から構成され、なんらかの物理化学的または生物化学的な機能を発現するに十分なペプチドの単位をいう。本発明においては、ペプチドとタンパク質は基本的に同義であるが、一般的には立体構造を取る程度のアミノ酸数からなるペプチドはタンパク質と呼ぶ。
【００２８】
本発明が適応されるペプチドの大きさに特に制限はないが、スクリーニングする変異数、計算ソフトの仕様、計算機のスペック、および、予定する計算所要時間によって、実用上の上限は決まる。ペプチドのアミノ酸残基数の上限としては、好ましくは５００残基であり、より好ましくは３００残基であり、さらにより好ましくは１００残基である。アミノ酸残基数の下限は、立体構造を取る限りにおいて特に制限はないが、好ましくは１０残基であり、より好ましくは３０残基であり、さらにより好ましくは５０残基である。
【００２９】
本工程で結合状態のポテンシャルエネルギーを計算する「対照ペプチド」は、後記の変異ペプチドの結合力を評価する基準となるものであれば特に制限されない。例えば、天然型のペプチドを挙げることができる。ただし、この天然型ペプチドは、厳密な意味で天然由来のものである必要は無く、立体構造を形成したり或いは機能を発揮する最小単位のものであれば、糖鎖やその他のペプチド部分を欠失させたものであってもよい。また、対照ペプチドは、ある程度の結合力を示す変異ペプチドであってもよい。
【００３０】
本工程では、結合対象となるタンパク質と結合状態（複合体状態）にある対照ペプチドのポテンシャルエネルギーを分子動力学法（ＭＤ法）により計算する。ペプチドを構成する原子は、例えば溶液中で静止しているわけではなく、少しずつ位置を変えている。このような原子の動きを計算機の中で再現するために使用されるのが分子動力学法である。
【００３１】
分子動力学法では、先ず、Ｘ線結晶構造などの三次元構造情報を基に、原子の最初の配置を決める。計算に用いるペプチドの結合状態における複合体の立体構造は、Ｘ線結晶構造、ＮＭＲ、電子顕微鏡イメージング等の公知の実験手法によって得られ、そのような情報が無くても、一次配列の類似性に基づく立体構造ホモロジーモデリングやドッキングシミュレーションによって構築することも可能である。立体構造モデリングは、例えば、専用ソフトであるＭｏｄｅｌｌｅｒ（ｈｔｔｐｓ：／／Ｓａｌｉｌａｂ．Ｏｒｇ／Ｍｏｄｅｌｌｅｒ／）や、Ｈｏｍｏｌｏｇｙ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｈｙｐｅｒｃｈｅｍ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｏｌｆｕｎｃｔｉｏｎ．ｃｏｍ／ｊｐ／ｓｏｆｔｗａｒｅ１．ｈｔｍ）など、ドッキングシミュレーションはＡｕｔｏＤｏｃｋ（ｈｔｔｐ：／／ａｕｔｏｄｏｃｋ．ｓｃｒｉｐｐｓ．ｅｄｕ／）,ｒＤｏｃｋ（ｈｔｔｐ：／／ｒｄｏｃｋ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／）を利用して実施することができる。いずれの手法においても、変異した残基の側鎖は、立体構造上で適切な立体配置と立体配座を取るよう、側鎖ロータマーの最適化を行うことが好ましい。
【００３２】
以上の通り原子の最初の配置を決めた後に，安定な分子シミュレーションを実施するために、十分大きなセルサイズを設定し、周りに溶媒分子を配置させ、セル内の環境が生理的な溶液状態で中性になるようにNa+イオン、Cl-イオンを挿入し、周期的境界条件のもと、１個の原子に他の原子から及ぶ力を計算する。かかる力としては、結合の伸縮エネルギー、結合角の変角エネルギー、ねじれ（トーション）エネルギー、ファンデルワールス相互作用エネルギー、静電相互作用エネルギー、水素結合エネルギーなどを挙げることができる。分子を構成する全ての原子に働く力の総和が「ポテンシャルエネルギー」である。
【００３３】
次に、その力を受けた原子がどのように運動するかをニュートンの運動方程式に基づいて計算する。これにより、最初の配置から短い刻み時間の後に、原子の配置がどう変わったかが分かる。変化後の配置を新たな出発点として、同様の計算を再び行う。非常に短い時間の刻みでこれを繰り返すと、原子が徐々に動く様子が再現できる。このように、（ｉ）原子の配置の決定、（ｉｉ）原子に働く力の計算、（ｉｉｉ）原子の動きの計算、という（ｉ）〜（ｉｉｉ）を計算機で繰り返し、時間の経過に伴って変化する物理量や立体構造を任意に抽出し、それらを統計処理したり画像表示するなどして、生体分子や化合物の構造、物性を解析する方法が分子動力学法（ＭＤ法）である。結合力の変化量の予測に必要な安定な分子シミュレーションを実施するためには、溶媒分子の構造緩和と計算系のセルサイズの決定が必要である。そのため、まずセルサイズを固定したまま、タンパク質の主鎖原子に位置拘束をかけた粒子数、体積、温度一定のＭＤ計算（ＮＶＴ計算と呼ぶ）を行って溶媒分子の構造緩和を行った後、粒子数、圧力、温度一定のＭＤ計算（ＮＰＴ計算と呼ぶ）を行って計算系全体の平衡化を行うことで計算系のセルサイズを決定するのが好ましい。平衡化の計算で得られた最終構造のセルサイズを用いてＮＰＴ計算を実施し、安定な分子シミュレーションを継続する。様々な解析方法の１つとして、平衡化後のシミュレーション中の一定時間において変化したポテンシャルエネルギーの平均を求める方法がある。
【００３４】
本発明における分子動力学法の「シミュレーション時間」とは、上記計算の継続によって原子の動きを追った計算系の平衡化後のシミュレーション時間を指す。上記の短い刻みの時間を、本発明では「ステップ時間」と定義する。ステップ時間は、通常は０．１〜１０フェムト（１０-15）秒であり、好ましくは０．５〜２フェムト秒である。本発明では、特段の断りが無い限り、ステップ時間は0.5フェムト秒（0.5ｆｓ）とする。上記の計算系の平衡化後のシミュレーションの繰り返しの回数を、本発明では「ループ回数」と定義する。本発明におけるループ回数は、ステップ時間を0.5フェムト秒としたときに、その下限は、１０，０００が好ましく、２０，０００がより好まししい。一方、その上限は、２００，０００が好ましく、１００，０００がより好ましい。本明細書における「シミュレーション時間」とは、「ステップ時間」と「ループ回数」の積で表される時間を指す。すなわち、本発明におけるシミュレーション時間は、５ピコ秒（５ｐｓ）以上、１００ピコ秒以下が好ましい。本工程でのシミュレーション時間が少なくとも５ピコ秒以上であれば、シミュレーションの系がより確実に平衡に達し得るので期待する効果（安定化/不安定化）と十分な相関のある結合力の変化量を最終的に導き出すことができる。一方、当該シミュレーション時間が１００ピコ秒以下であれば、十分に高精度な結合力の変化量を最終的に導き出せる範囲で、効率的なスクリーニングが可能になる。当該シミュレーション時間としては、１０ピコ秒以上がより好ましく、５０ピコ秒以下がより好ましい。
【００３５】
ペプチドなどの分子中に存在する各原子が、どのような力を受けているのかを関数として数式化したものが分子力場である。分子力場に基づく分子力学計算や分子動力学計算では、原子間に働く力を、原子間の結合を表すパラメータ（結合距離や結合角など）を変数とし、原子の種類や結合様式によって決まるポテンシャル関数で数値として表す。分子の「ポテンシャルエネルギー」は、分子中に働くこれらの全てのポテンシャル関数の総和で表現される。ペプチドのポテンシャルエネルギーは、結合の伸縮エネルギー、結合角の変角エネルギー、ねじれ（トーション）エネルギー、ファンデルワールス相互作用エネルギー、静電相互作用エネルギー、および水素結合エネルギーなどの総和で表されるが、これらに限定されない。また、どのエネルギー項を計算に取り入れるかの選択も、特に限定はされない。また、計算の効率を考慮して、原子間の距離が一定以上であれば計算しない、一般的にカットオフ法と呼ばれる手法を導入してもよい。
【００３６】
ポテンシャルエネルギーは、ある一定のシミュレーション時間内における、各ステップで算出されるポテンシャルエネルギーの平均として計算することが好ましいが、これには限定されない。例えば、最大値や最小値を評価に用いても構わない。平均を求める際のサンプリングの時間は、特に限定されないが、ポテンシャルエネルギーの値が平衡に達して安定になる、シミュレーション後半の１０ピコ秒程度が好ましい。例えば、シミュレーション時間が５０ピコ秒の場合には、４０ピコ秒以上、５０ピコ秒以下をポテンシャルエネルギーの平均を求めるサンプリング時間とすることができる。
【００３７】
本発明においては、ペプチドを変異させたときの結合力の変化量を、結合状態と解離状態のペプチドのポテンシャルエネルギー差の変異前後の差を指標として評価する。ポテンシャルエネルギー差は、同じ原子数で同じ原子構成の分子であっても、その値が大きい程、エネルギー的に不安定とされる。したがって、結合力を比較する対照ペプチドと変異した対照ペプチドに関して、比較条件を何らかの条件や考えに基づいて揃えた場合は、ポテンシャルエネルギー差の変化量の値が低い、すなわち値が小さい方が結合力は高いと評価される。このように、ポテンシャルエネルギー差の数値そのものは、何らかの実験値を示す訳では無いので、ポテンシャルエネルギー差を指標とした適当なスコア関数を用いてもよい。
【００３８】
ペプチドの分子動力学法による計算用プログラムとしては、ＡＭＢＥＲ（ｈｔｔｐ：／／ａｍｂｅｒｍｄ．ｏｒｇ／）、ＣＨＡＲＭＭ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈａｒｍｍ．ｏｒｇ／ｃｈａｒｍｍ／）、ＮＡＭＤ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋｓ．ｕｉｕｃ．ｅｄｕ／Ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｎａｍｄ／）、ＧＲＯＭＡＣＳ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｒｏｍａｃｓ．ｏｒｇ／）、および、ＭｙＰｒｅｓｔｏ（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｅｓｔｏ．ｐｒｏｔｅｉｎ．ｏｓａｋａ−ｕ．ａｃ．ｊｐ／ｍｙＰｒｅｓｔｏ４／）などが挙げられる。計算に関しては、通常の一定温度下での粒子数・圧力一定（ＮＰＴアンサンブル）計算が好ましいが、特にこれには限定されない。
【００３９】
計算は、２８０Ｋ以上、３２０Ｋ以下程度の設定温度下で行うのが一般的であるが、対象とするペプチドや見たい現象によっては、３２０Ｋ超の高温で計算しても問題は無い。通常のＷｅｔ実験では実施が困難な温度でのシミュレーションが可能なことが計算機での計算の利点であり、計算時の設定温度は特に限定されない。
【００４０】
計算においては、溶媒効果を考慮することが好ましく、溶媒分子をペプチドなどと同じ様に１個１個の分子として取り扱う系で計算するのが好ましい。
【００４１】
工程２：解離状態にある対照ペプチドのポテンシャルエネルギーの計算工程
本工程では、結合状態にある対照ペプチドの代わりに解離状態にある対照ペプチドを用いる以外は上記工程１と同様に実施する。
【００４２】
工程３：ポテンシャルエネルギーの差の算出工程
本工程では、上記工程１で求めた結合対象となるタンパク質と結合状態（複合体状態）にある対照ペプチドのポテンシャルエネルギー（以下、「Ｅcomplex」と表記する場合がある）と、上記工程２で求めた解離状態にある対照ペプチドのポテンシャルエネルギー（以下、「Ｅmonomer」と表記する場合がある）との差（以下、「ΔＥ」と表記する場合がある）を算出する。ΔＥはＥComplexの値からＥmonomerの値を減ずることにより算出する。
【００４３】
工程４：変異ペプチドのポテンシャルエネルギーの計算工程
本工程では、結合対象となるタンパク質と結合状態（複合体状態）にある変異ペプチドのポテンシャルエネルギーを、シミュレーション時間が１００ピコ秒以下の分子動力学法により求める。
【００４４】
ペプチドの「変異」は、野生型ペプチドなど上記の対照ペプチドのアミノ酸配列に対し、少なくとも１つ以上のアミノ酸残基の置換、付加および／または欠失が導入することをいい、「変異ペプチド」とは、かかる変異が導入されたペプチドをいう。
【００４５】
本工程は、対照ペプチドの代わりに変異ペプチドを用いる以外は上記工程１と同様に実施する。例えば変異ペプチドの立体構造も、対照ペプチドと同様に立体構造ホモロジーモデリングによって構築することが可能である。ただし、変異ペプチドの立体構造は、対照ペプチドの立体構造に対して、特にアミノ酸残基を置換のみする場合には、変異するアミノ酸残基の側鎖が変更されるだけなので、側鎖原子の構築だけに特化したプログラムであるＳＣＷＲＬ（ｈｔｔｐ：／／ｄｕｎｂｒａｃｋ．ｆｃｃｃ．ｅｄｕ／ｓｃｗｒｌ４／ｓｃｗｒｌ４．ｐｈｐ）を利用すると、変異ペプチドの立体構造の決定を自動化することもできる。
【００４６】
工程５：解離状態にある変異ペプチドのポテンシャルエネルギーの計算工程
本工程は、対照ペプチドの代わりに変異ペプチドを用いる以外は上記工程２と同様に実施する。
【００４７】
工程６：ポテンシャルエネルギーの差の算出工程
本工程では、上記工程４で求めた結合対象となるタンパク質と結合状態（複合体状態）にある変異ペプチドのポテンシャルエネルギー（Ｅcomplex）と、上記工程５で求めた解離状態にある変異ペプチドのポテンシャルエネルギー（Ｅmonomer）との差（ΔＥ）を算出する。本工程は、変異ペプチドの結合状態と解離状態におけるポテンシャルエネルギーの差を求める以外、上記工程３と同様に実施する。
【００４８】
工程７：変異の評価工程
本工程では、対照ペプチドと変異ペプチドとの間の上記ポテンシャルエネルギー差を比較することにより、変異がペプチドの結合力に与える影響を評価する。上記工程６で算出した「結合状態と解離状態の変異ペプチドの間のポテンシャルエネルギーの差」から、上記工程３で算出した「結合状態と解離状態の対照ペプチドの間のポテンシャルエネルギーの差」を減じて両者の差（ΔΔＥ）を算出した上で、複数の変異ペプチドと対照ペプチドとのΔΔＥ値を比較することにより、結合力をより向上させる変異を特定することが可能になる。
【００４９】
本発明において「変異スクリーニング」とは、変異による分子の結合力の変化を網羅的に評価し、分子の結合力を向上させる変異を選出することを意味する。基本的には、変異を導入したペプチド（変異ペプチド）と変異を導入していないペプチド（対照ペプチド）の、同じ条件で計算した場合の結合―解離状態間のポテンシャルエネルギー差の変化量が、変異が結合力に与える影響を評価する上での代表的な基準の一つとなる。正確には、変異による分子の原子数や構成の違いを補正する必要があるが、結合状態と解離状態のポテンシャルエネルギー差は、同じアミノ酸配列からなる異なる立体構造のポテンシャルエネルギーの差に該当する為、変異による分子の原子数や構成の違いを補正（キャンセレーション）する役割を果たす。したがって、ポテンシャルエネルギー差（ΔＥ）の差（ΔΔＥ）は、変異の有無による結合力の違いを評価する上での指標となる。例えば、上記変異ペプチドのΔＥの値が対照ペプチドより小さい場合にはΔΔＥの値が負となり、変異ペプチドの結合力は対照ペプチドより高いといえる。このように、変異ペプチドと対照ペプチドとの間でΔΔＥの値を比較することにより、結合力を向上できる変異をスクリーニングすることが可能になる。
【実施例】
【００５０】
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。以下では、変位を導入しない野生型ペプチドは、「ペプチド名−Ｗｉｌｄ」の形で表記し、変異としてアミノ酸残基置換した変異ペプチドについては、「ペプチド名−導入した変異」の形で表記する。例えば、野生型ペプチドの第３位におけるチロシンをフェニルアラニンに置換した変異を導入した変異ペプチドは、「ペプチド名−Ｙ３Ｆ」と表記する。複数の置換を同時に導入した変異ペプチドの変異は、スラッシュを用いて併記する。例えば、変異Ｙ３ＦおよびＬ７Ｉを導入した変異体は、「ペプチド名−Ｙ３Ｆ／Ｌ７Ｉ」と表記する。
【００５１】
上記した結合力評価法を構造既知のコイルドコイル構造に適用し、（１）コイルドコイル構造を安定に保つのに必要なコア領域の疎水性相互作用を担うアミノ酸をアラニン置換することで不安定化することが再現できるかどうかの検討（不安定化検討と呼ぶ）、（２）ロイシンジッパー構造を参考に、コイルドコイル構造内部のコア領域の疎水性相互作用を強める変異を入れる（２つのへリックスの間でロイシンペアを作るようにロイシンに置換する)ことで安定化することが再現できるかどうかの検討（安定化検討と呼ぶ）を実施した。
【００５２】
（１）不安定化検討
１）計算系の構築とポテンシャルエネルギーの算出
本実施例の野生型ペプチドはヒト由来のコイルドコイル構造で、ＮＭＲで解かれた全体の３次元構造がＰｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／ｈｏｍｅ／ｈｏｍｅ．ｄｏ，ＰＤＢコード：２ＤＪＶ）に登録されており、コイルドコイル構造を形成するアミノ酸配列がＣＣ＋Ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｃｏｉｌｅｄｃｏｉｌｓ．ｃｈｍ．ｂｒｉｓ．ａｃ．ｕｋ／ｃｃｐｌｕｓ／ｓｅａｒｃｈ／）に登録されていたので、これらを利用した。該当するコイルドコイル部分のアミノ酸一次配列は以下の通りであり、Ｎ、Ｃ末端をキャップし、変異を入れて結合力を評価するペプチドをＡ鎖（２ＤＪＶＡ−Ｗｉｌｄ）、相互作用する相手のペプチドをＢ鎖（２ＤＪＶＢ−Ｗｉｌｄ）として、結合力評価を実施した。
２ＤＪＶＡ−Ｗｉｌｄ：  ＩＱＡＬＭＤＥＶＴＫＱＧＮＩＶＲＥＬ
２ＤＪＶＢ−Ｗｉｌｄ：  ＶＡＡＥＶＡＫＬＬＤＬＫＫＱＬＡＶＡ
【００５３】
変異させるアミノ酸としてコイルドコイル構造を安定に保つのに重要なコア領域の疎水性相互作用を担うアミノ酸を選択し（２ＤＪＶＡ−Ｗｉｌｄの第４位のロイシン、第８位のバリン、第１１位のグルタミン、第１５位のバリン：L４, V８, Q１１, V１５）、それぞれをアラニンに置換することで不安定化するかどうか検討した。すなわち、計算対象は２ＤＪＶＡ−Ｗｉｌｄを含めて、２ＤＪＶＡ−Ｌ４Ａ、２ＤＪＶＡ−Ｖ８Ａ，２ＤＪＶＡ−Ｑ１１Ａ、２ＤＪＶＡ−Ｖ１５Ａの５つである。wildtypeが一番結合力が強く、他の変異体は結合力が弱くなることが期待される。５つの計算対象に対して、それぞれ結合状態（２ＤＪＶＡ−Ｗｉｌｄと２ＤＪＶＢ−Ｗｉｌｄ）と解離状態（２ＤＪＶＡ−Ｗｉｌｄのみ）の計算系を準備した。評価する４種の変異ペプチドについては、側鎖原子構築プログラムＳＣＷＲＬを用いて、２ＤＪＶＡ−Ｗｉｌｄの立体構造をベースに、変異する残基の側鎖ロータマーを探索・置換したモデリング構造を構築した。
【００５４】
ＭＤ計算の工程に進む前に、タンパク質表面から10 nm離れた領域までを１つのボックスとして、タンパク質周りに水分子を配置し、計算系の中性化を行った後、分子力学（ＭＭ）計算によるエネルギー極小化を行った。エネルギー極小化計算は、共役勾配法（ｃｏｓｇｅｎｅでのオプション名はＣＯＮＪ）を用い、最初のステップでの原子移動距離ＲＭＳＤ＝０．０１［Ａ］、最大計算ステップ数１００００、収束判定条件ＲＭＳＦ＝０．１［ｋｃａｌ／ｍｏｌ／Ａ］として行った。次に周期境界条件の下、溶媒の平衡化（重原子位置拘束付エネルギー極小化、位置拘束無しエネルギー極小化、主鎖原子位置拘束付ＮＶＴ計算）、構造緩和（位置拘束無しＮＰＴ計算（Ｂｅｒｅｎｄｅｓｅｎの温度制御））を行ったのち、シミュレーション時間50 [ps] (Δt = 0.5 fs、計100,000step)のＮＰＴ計算（カノニカルアンサンブルを実現するＡｎｄｅｒｓｏｎの温度制御）を実施した。ＭＤ計算のエンジンとしては、ｍｙＰｒｅｓｔｏのパッケージのｃｏｓｇｅｎｅ（ｃｏｓｇｅｎｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．２０８  ｓｉｎｇｌｅ版）を用いた。エネルギーや座標等のトラジェクトリ出力は全てデフォルトの設定とし、４０〜５０ｐｓのスナップショットのポテンシャルエネルギーの平均を結合状態、解離状態のポテンシャルエネルギー（Ｅcomplex、Ｅmonomer）とした。ペプチド１種あたり複数回初速度を変えて同じ条件でMD計算を実施し、平均のポテンシャルエネルギーとその標準誤差を算出した。
【００５５】
このＭＤ計算には、ＣＰＵがXeon E5-2690 v3(クロック周波数2.6GHz、計24コア）、メモリが128GBのスペックの計算機を使っており、この際に今回の３６残基からなるペプチド１種のシミュレーション時間５０ピコ秒のＭＤ計算に掛かった計算所要時間は4コア並列計算で約１２時間であった。仮にシミュレーション時間１ナノ秒のＭＤ計算を行うと、単純に２０倍の２４０時間が必要となる。したがって、通常のラボで用いられるワークステーションで、数多くの変異体のＭＤ計算をナノ秒オーダーで計算することは、この程度のアミノ酸数のペプチドでも現実的とは言えない。したがって、シミュレーション時間を１オーダー以上下げたことは、実用面でも非常に意味があると云える。
【００５６】
２）ポテンシャルエネルギー差の変異前後の変化量の算出
野生型（対照ペプチド）および各種変異体（変異ペプチド）のポテンシャルエネルギー差（ΔＥ）は、単純に結合状態のポテンシャルエネルギー値（Ｅcomplex）から解離状態のポテンシャルエネルギー値（Ｅmonomer）をそのまま減ずる形で算出し、このポテンシャルエネルギー差の野生型からの変化量（ΔΔＥ）は変異体のポテンシャルエネルギー差から野生型のポテンシャルエネルギー差を減ずる形で算出した。それらを表１にまとめた。ΔΔＥ値が低い程、計算では結合力が高いと予測されたことになる。ポテンシャルエネルギー差は、計算評価の指標となる一種のスコア関数であり、その絶対値は特別な意味は無い。
【００５７】
【表１】
2018173848.tif 000002
【００５８】
期待通り疎水性コアの相互作用を壊すような変異を入れると不安定化することが確認された。
【００５９】
（２）安定化検討
１）計算系の構築とポテンシャルエネルギーの算出
天然に存在するロイシンジッパーは分子内に周期的に７残基ごとにロイシンペアを形成し疎水性相互作用を強くすることで安定化していることが知られている。そこで本実施例の野生型ペプチドを２本鎖に分けたときのアミノ酸配列である２ＤＪＶＢ−Ｗｉｌｄが２ＤＪＶＡ−Ｗｉｌｄとロイシンペアを形成できるように第４位のグルタミン酸と第１８位のアラニンをＳＣＷＲＬでロイシンに置換した。置換したＢ鎖を２ＤＪＶＢ−Ｗｉｌｄ’と呼ぶ。
２ＤＪＶＡ−Ｗｉｌｄ  ：  ＩＱＡＬＭＤＥＶＴＫＱＧＮＩＶＲＥＬ
２ＤＪＶＢ−Ｗｉｌｄ’：  ＶＡＡＬＶＡＫＬＬＤＬＫＫＱＬＡＶＬ
【００６０】
変異させるアミノ酸として、ロイシンペアを形成するようにアミノ酸を選択（２ＤＪＶＡ−ＷＩＬＤの第１位のイソロイシン、第８位のバリン、第１５位のバリン：I1、V８、V１５）し、それぞれをロイシンに置換することで安定化するかどうか検討した。すなわち、計算対象は２ＤＪＶＡ−Ｗｉｌｄを含めて、２ＤＪＶＡ−Ｉ１Ｌ、２ＤＪＶＡ−Ｖ８Ｌ, ２ＤＪＶＡ−Ｖ１５Ｌ, ２ＤＪＶＡ−Ｉ１Ｌ／Ｖ８L, ２ＤＪＶＡ−Ｉ１Ｌ／Ｖ１５Ｌ, ２ＤＪＶＡ−Ｖ８Ｌ／Ｖ１５Ｌ, ２ＤＪＶＡ−Ｉ１Ｌ／Ｖ８Ｌ／Ｖ１５Ｌの８つである。変異を導入することで結合力が強くなることが期待される。８つの計算対象に対して、それぞれ結合状態（２ＤＪＶＡ−Ｗｉｌｄと２ＤＪＶB−Ｗｉｌｄ’）と解離状態（２ＤＪＶＡ−Ｗｉｌｄのみ）の計算系を準備した。評価する７種の変異ペプチドについては、側鎖原子構築プログラムＳＣＷＲＬを用いて、２ＤＪＶＡ−Ｗｉｌｄの立体構造をベースに、変異する残基の側鎖ロータマーを探索・置換したモデリング構造を構築した。
【００６１】
（１）の不安定化検討と同様の計算系の構築を実施し、分子力学（ＭＭ）計算によるエネルギー極小化を行ったのち周期境界条件の下、溶媒の平衡化（重原子位置拘束付エネルギー極小化、位置拘束無しエネルギー極小化、主鎖原子位置拘束付ＮＶＴ計算）、構造緩和（位置拘束無しＮＰＴ計算（Ｂｅｒｅｎｄｅｓｅｎの温度制御））を行ったのち、シミュレーション時間50 [ps] (Δt = 0.5 fs、計100,000step)のＮＰＴ計算（カノニカルアンサンブルを実現するＡｎｄｅｒｓｏｎの温度制御）を実施した。エネルギーや座標等のトラジェクトリ出力は全てデフォルトの設定とし、４０〜５０ｐｓのスナップショットのポテンシャルエネルギーの平均を結合状態、解離状態のポテンシャルエネルギー（Ｅcomplex、Ｅmonomer）とした。ペプチド１種あたり複数回初速度を変えて同じ条件でMD計算を実施し、平均のポテンシャルエネルギーとその標準誤差を算出した。
【００６２】
２）ポテンシャルエネルギー差の変異前後の変化量の算出
野生型（対照ペプチド）および各種変異体（変異ペプチド）のポテンシャルエネルギー差（ΔＥ）は、単純に結合状態のポテンシャルエネルギー値（Ｅcomplex）から解離状態のポテンシャルエネルギー値（Ｅmonomer）をそのまま減ずる形で算出し、このポテンシャルエネルギー差の野生型からの変化量（ΔΔＥ）は変異体のポテンシャルエネルギー差から野生型のポテンシャルエネルギー差を減ずる形で算出した。それらを表２にまとめた。
【００６３】
【表２】
2018173848.tif 000003
【００６４】
期待通り疎水性コアの相互作用を強くする変異を入れるとおおむね安定化することが確認された。２ＤＪＶ−Ｉ１Ｌ、２ＤＪＶ−Ｖ８ＬはΔΔＥが正の値となり、期待する安定化の効果が得られなかったが、その理由はＩ１Ｌに関しては溶媒分子と接する末端の変異であり期待する疎水性相互作用が得られなかったため、Ｖ８Ｌに関しては、他と比べて標準誤差が大きく期待する安定な疎水性相互作用が形成できていなかったためと推測される。
【図１】
2018173848.tif 000004
【図２】
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