(57)【要約】【課題】容認できる官能特性を有する微細藻類食品と、本食品の製造方法とを提供すること。【解決手段】所望の量の脂質を産生するために容認できるｐＨおよび溶存酸素の条件下でクロレラ・プロトテコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）株の微細藻類細胞を培養することによって微細藻類粉を製造することができる。微細藻類細胞を溶解、熱処理、洗浄および乾燥させて、様々な製品に取り込み可能な微細藻類粉を製造することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下、２０１３年１月２８日に出願された米国仮特許出願第６１／７５７，５３４号（その内容全体は参照によって本明細書に援用される）に対する優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、改善されたフレーバーを有する微細藻類食品と、本食品の製造方法とに関する。
【背景技術】
【０００３】
人口が増加し続けるにつれて、更なる食物源、特に安価に生産できるが栄養価の高い食物源に対する必要性が高まっている。さらに、少なくとも最先進国では、多くの食事の中心的な要素としての食肉への現在の依存は、温室ガスの放出の大きな一因となっている。生産するために環境に対する害が少ない新しい食糧が必要とされている。
【０００４】
成長するために「水および日光」のみを必要とするので、藻類は長い間潜在的な食物源として期待されている。特定の種類の藻類（主に、海藻）は確かに人間の食用として重要な食糧を提供するが、藻類の食糧としての見込みは十分に実現されていない。屋外の池または光バイオリアクタにおいて光合成で成長された藻類で作られる藻類粉末は市販されているが、深緑色（クロロフィルによる）であり、強烈な不快な味を有する。食品中に配合される、または栄養補助食品として配合される場合、これらの藻類粉末は食品または栄養補助食品に視覚的に魅力のない緑色を付与し、魚、海藻または他の不快なフレーバーを有する。
【０００５】
今日食糧において使用される藻類種はいくつか存在し、そのほとんどは、ケルプ、アサクサノリ（ｐｕｒｐｌｅ  ｌａｖｅｒ）（ポルフィラ属（Ｐｏｒｐｈｙｒａ）、海苔に使用される）、ダルス（パルマリア・パルメート（Ｐａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔｅ））およびアオサ（ウルバ・ラクツカ（Ｕｌｖａ  ｌａｃｔｕｃａ））などの大型藻類である。スピルリナ属（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）（アルトロスピラ・プラテンシス（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ））などの微細藻類は、栄養補助食品として使用するために、あるいはスムージーまたはジュース飲料に少量（通常、０．５％ｗ／ｗ未満）取り込むために、開放池において（光合成で）商業的に成長される。クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）のいくつかの種を含む他の微細藻類は、アジアの国々で栄養補助食品として人気がある。
【０００６】
悪いフレーバーは、食物における微細藻類の広範な採用を妨害している主要な因子である。国際公開第２０１０／１２０９３号パンフレットは、食物としての微細藻類バイオマスの製造および使用方法を開示する。この参考文献には、微細藻類バイオマスを製造するために、暗所での微細藻類の成長が開示される。しかしながら、微細藻類バイオマスのフレーバーのさらなる改善は、さらなる採用を促進するはずである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２０１０／１２０９３号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、容認できる官能特性を有する微細藻類食品と、本食品の製造方法とに関する。所望の量の脂質を産生するために容認できるｐＨおよび溶存酸素の条件下でクロレラ・プロトテコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）株の微細藻類細胞を培養することによって微細藻類粉を製造することができる。微細藻類細胞を溶解、熱処理、洗浄および乾燥させて、様々な製品に取り込み可能な微細藻類粉を製造することができる。
【０００９】
本発明の一実施形態では、緑藻植物門の微細藻類細胞を含む、食物での使用に適した微細藻類粉が提供されており、内部標準に対して実施例６の化合物の濃度を決定するための実施例４に従うＳＰＭＥおよび／または実施例５に従うＳＢＳＥまたは他の分析技術による分析と、その後の実施例９の手順に従う分析とによって、実施例７のグラフの黒丸に相当する正のフレーバー群に対して３つの標準偏差を定義する実施例８の楕円体の範囲内に入るフレーバー記述子が得られる。
【００１０】
上述の微細藻類粉は、本発明の一実施形態では、３０％よりも高い溶存酸素レベルを維持しながら、開始ｐＨ６．８で固定炭素源としてグルコースの存在下、クロレラ・プロトテコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）の細胞ブロスを暗所で培養し、ブロスを７５℃で１分間の高温短時間プロセスにさらし、水中で６．４倍に希釈して遠心分離により細胞を採取し、粉砕により細胞を溶解させ、酸化防止剤を添加し、移動ベルトに対して出力する噴霧乾燥ノズルを用いて乾燥させるというプロセスによって得ることができる。
【００１１】
本発明の特徴は、添付図面を参照して解釈される以下の詳細な説明を参照することによってより容易に理解されるであろう。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
緑藻植物門の微細藻類細胞を含み、食物での使用に適した微細藻類粉であって、ＰＣ１、ＰＣ２およびＰＣ３の次元を有するフレーバー記述空間の楕円体の範囲内に入るフレーバー記述子を特徴とし、前記フレーバー記述子が、ＳＰＭＥおよび／またはＳＢＳＥ分析を用いて、以下の化合物：
ジメチル．スルフィド
２．３．ブタンジオン
ブタナール
プロパナール．．２．メチル．
フラン．．３．メチル．
エチル．アセタート
２．ブテナール．．．Ｅ．．
ブタナール．．３．メチル．
１．ブタノール
ブタナール．．２．メチル．
チオフェン
１．ペンテン．３．オール
１．ペンテン．３．オン
２．ペンタノン
２．３．ペンタンジオン
ペンタナール
フラン．．２．エチル．
チアゾール
３．ペンテン．２．オン
ジスルフィド．．ジメチル
２．ペンテナール．．．Ｅ．．
ピロール 
オキサゾール．．４．５．ジメチル．
２．ペンテン．１．オール．．．Ｚ．．
チオフェン．．３．メチル．
ヘキサナール
４．メチルチアゾール
ピラジン．．メチル．
フルフラール
オキサゾール．．トリメチル．
ブタン酸．．３．メチル．
ブタン酸．．２．メチル．
２．ヘキセナール
１．ヘキサノール
４．ヘプタノン
ピリジン．．２．６．ジメチル．
チアゾール．．２．４．ジメチル．
３．ヘプタノン
２．ヘプタノン
３．ヘプタノール
ヘプタナール
メチオナール
ピラジン．．２．５．ジメチル．
ピラジン．．２．６．ジメチル．
ピラジン．．エチル．
ピラジン．．２．３．ジメチル．
ピラジン．．エテニル．
チアゾール．．４．５．ジメチル．
２．ヘプタノン．．６．メチル．
ヘキサナール．．２．エチル．
２．ヘプテナール．．．Ｚ．．
５．ノネン．２．オン
２．フランカルボキシアルデヒド．．５．メチル
ベンズアルデヒド
ヘキサン酸
１．オクテン．３．オール
ジメチル．トリスルフィド
２．５．オクタンジオン
５．ヘプテン．２．オン．．６．メチル．
フラン．．２．ペンチル．
２．４．ヘプタジエナール．．．Ｅ．Ｅ．．
ピラジン．．２．エチル．６．メチル．
オクタナール
ピラジン．．トリメチル．
ピラジン．．２．エチル．３．メチル．
２．４．ヘプタジエナール．．．Ｅ．Ｅ．．．１
ピラジン．．２．エテニル．６．メチル．
１．ヘキサノール．．２．エチル．
３．オクテン．２．オン．．．Ｅ．．
２Ｈ．ピラン．２．オン．．５．６．ジヒドロ．
ベンゼンアセトアルデヒド
３．５．オクタジエン．２．オン．．．Ｅ．Ｅ．．
アセトフェノン
１．デセン．３．オン
ピラジン．．３．エチル．２．５．ジメチル．
ピラジン．．テトラメチル．
５．メチル．２．チオフェンカルボキシアルデヒド
ｇ．ヘプタラクトン
リナロール
ノナナール
チモール
フェニルエチル．アルコール
２．３．５．トリメチル．６．エチルピラジン．
酢酸．．フェニルメチル．エステル
サフラナール
２．デセナール．．．Ｅ．．
ｇ．オクタラコン
ｏ．アミノ．アセトフェノン
２．４．デカジエナール
ｇ．ノンラクトン
イオノン
ゲラニル．アセトン
イオネン
ｇ．ノンラクトン．１
２．４．ノナジエナール．．．Ｅ．Ｅ．．
２．４．デカジエナール．１
ｇ．ヘプタラクトン．１
イオノン．１
ゲラニル．アセトン．１
ａ．イオノン
ピーチ．ラクトン．ｇ．ウンデカラクトン
ｄ．デカラクトン
ｃｉｓ．ゲラニルアセトン
ｄ．ドデカラクトン．．δ．ノニル．δ．バレララクトン．
ｄ．ウンデカラクトン
の濃度を内部標準に対して決定することによって得られ、前記楕円体が、式Ａｘ２＋Ｂｘｙ＋Ｃｙ２＋Ｄｘ＋Ｅｙ＋Ｆ＝０によって定義され、そして以下の表：
【表１】
2018143255.tif 000002
に従ってパラメータ化され、前記楕円体の範囲内に入ることが、
各化合物について、相対濃度を決定し、
各化合物について、以下の表に従ってセンター因子を差し引き、
各化合物について、以下の表に従ってスケール因子で除し、
スケール化および中心化されたデータのドット積をとって、ＰＣ１、ＰＣ２およびＰＣ３の値を生じさせ、そして
ＰＣ１、ＰＣ２およびＰＣ３によって定義される前記フレーバー記述子が前記楕円体の範囲内に入るかどうかを決定する
という手順によって決定される、微細藻類粉。
【表２】
2018143255.tif 000003
【表３】
2018143255.tif 000004
【表４】
2018143255.tif 000005
【表５】
2018143255.tif 000006
【表６】
2018143255.tif 000007
（項目２）
前記フレーバー記述子が以下の表：
【表７】
2018143255.tif 000008
によってパラメータ化されるより狭い楕円の範囲内に入る、項目１に記載の微細藻類粉。
（項目３）
前記フレーバー記述子が以下の表：
【表８】
2018143255.tif 000009
によってパラメータ化されるさらにより狭い楕円の範囲内に入る、項目２に記載の微細藻類粉。
（項目４）
３０％よりも高い溶存酸素レベルを維持しながら、開始ｐＨ６．８で固定炭素源としてグルコースの存在下、クロレラ・プロトテコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）の細胞ブロスを暗所で培養し、前記ブロスを７５℃で１分間の高温短時間プロセスにさらし、水中で６．４倍に希釈して遠心分離により前記細胞を採取し、酸化防止剤を添加し、粉砕により前記細胞を溶解させ、移動ベルトに対して出力する噴霧乾燥ノズルを用いて乾燥させるというプロセスによって得ることができる、項目１〜３のいずれか一項に記載の微細藻類粉。
（項目５）
ＳＰＭＥまたはＳＢＳＥによって決定したときに、ウンデカラクトン（４００〜１８００ｐｐｂ）、３−メチルブタナール（０〜１１，０００ｐｐｂ）、ペンタナール（１６０〜１０，７００ｐｐｂ）、２−メチルブタナール（０〜２５００ｐｐｂ）、２−ペンタノン（３９〜１０，６００ｐｐｂ）、および／または３−ペンテン−２−オン（０〜１５００ｐｐｂ）を含む、項目１〜４のいずれか一項に記載の微細藻類粉。
（項目６）
前記粉が脱イオン水中に１０％（ｗ／ｖ）で分散される場合、試験パネルによって検出するときに魚またはキャベツフレーバーが検出不能である、項目１〜５のいずれか一項に記載の微細藻類粉。
（項目７）
２０００μｍにおいて１５〜３５重量％のオーバーサイズを特徴とする流動性を有する、項目１〜６のいずれか一項に記載の微細藻類粉。
（項目８）
前記粉が白色、淡黄色または黄色である、項目１〜７のいずれか一項に記載の微細藻類粉。
（項目９）
前記粉が５〜２０％の脂質を含む、項目１〜８のいずれか一項に記載の微細藻類粉。
（項目１０）
前記粉が３０〜７０％の脂質を含む、項目１〜８のいずれか一項に記載の微細藻類粉。
（項目１１）
前記粉が４０〜６０％の脂質を含む、項目の１〜８いずれか一項に記載の微細藻類粉。
（項目１２）
１％（ｗ／ｖ）で水中に溶解したときの前記粉のｐＨが５．５〜８．５の間である、項目１〜１１のいずれか一項に記載の微細藻類粉。
（項目１３）
１％（ｗ／ｖ）で水中に溶解したときの前記粉のｐＨが６．０〜８．０の間である、項目１〜１１のいずれか一項に記載の微細藻類粉。
（項目１４）
１％（ｗ／ｖ）で水中に溶解したときの前記粉のｐＨが６．５〜７．５の間である、項目１〜１１のいずれか一項に記載の微細藻類粉。
（項目１５）
２ｐｐｍ未満のクロロフィルを有する、項目１〜１４のいずれか一項に記載の微細藻類粉。
（項目１６）
添加された酸化防止剤をさらに含む、項目１〜１５のいずれか一項に記載の微細藻類粉。
（項目１７）
前記粉中の前記細胞の大部分が溶解され、任意選択的に、前記細胞の５０％〜９０％が溶解される、項目１〜１６のいずれか一項に記載の微細藻類粉。
（項目１８）
緑藻植物門の微細藻類細胞を含み、食物での使用に適した微細藻類粉であって、内部標準に対して実施例６の化合物の濃度を決定するための実施例４のＳＰＭＥおよび／または実施例５のＳＢＳＥによる分析と、その後の実施例９の手順に従う分析とによって、図２のグラフの黒丸に相当する正のフレーバー群に対して３つの標準偏差を定義する実施例８の楕円体の範囲内に入るフレーバー記述子が得られる、微細藻類粉。
（項目１９）
前記フレーバー記述子が、実施例７（図２）のグラフの黒丸に相当する正のフレーバー群に対して２つの標準偏差を定義する実施例８の楕円体の範囲内に入る、項目１８に記載の微細藻類粉。
（項目２０）
前記フレーバー記述子が、実施例７（図２）のグラフの黒丸に相当する正のフレーバー群に対して１つの標準偏差を定義する実施例８の楕円体の範囲内に入る、項目１８に記載の微細藻類粉。
（項目２１）
３０％よりも高い溶存酸素レベルを維持しながら、開始ｐＨ６．８で固定炭素源としてグルコースの存在下、クロレラ・プロトテコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）の細胞ブロスを暗所で培養し、前記ブロスを７５℃で１分間の高温短時間プロセスにさらし、水中で６．４倍に希釈して遠心分離により前記細胞を採取し、酸化防止剤を添加し、粉砕により前記細胞を溶解させ、移動ベルトに対して出力する噴霧乾燥ノズルを用いて乾燥させるというプロセスによって得ることができる、項目１８に記載の微細藻類粉。
（項目２２）
ＳＰＭＥまたはＳＢＳＥによって決定したときに、ウンデカラクトン（４００〜１８００ｐｐｂ）、３−メチルブタナール（０〜１１，０００ｐｐｂ）、ペンタナール（１６０〜１０，７００ｐｐｂ）、２−メチルブタナール（０〜２５００ｐｐｂ）、２−ペンタノン（３９〜１０，６００ｐｐｂ）、および／または３−ペンテン−２−オン（０〜１５００ｐｐｂ）を含む、項目１８に記載の微細藻類粉。
（項目２３）
前記粉が脱イオン水中に１０％（ｗ／ｖ）で分散される場合、試験パネルによって検出するときに魚またはキャベツフレーバーが検出不能である、項目１８に記載の微細藻類粉。
（項目２４）
２０００μｍにおいて１５〜３５重量％のオーバーサイズを特徴とする流動性を有する、項目１８に記載の微細藻類粉。
（項目２５）
前記粉が白色、淡黄色または黄色である、項目１８に記載の微細藻類粉。
（項目２６）
明白な緑色を含まない、項目１８に記載の微細藻類粉。
（項目２７）
前記粉が５〜２０％の脂質を含む、項目１８に記載の微細藻類粉。
（項目２８）
前記粉が３０〜７０％の脂質を含む、項目１８に記載の微細藻類粉。
（項目２９）
前記粉が４０〜６０％の脂質を含む、項目１に記載の微細藻類粉。
（項目３０）
１％（ｗ／ｖ）で水中に溶解したときの前記粉のｐＨが５．５〜８．５の間である、項目１８に記載の微細藻類粉。
（項目３１）
１％（ｗ／ｖ）で水中に溶解したときの前記粉のｐＨが６．０〜８．０の間である、項目１８に記載の微細藻類粉。
（項目３２）
１％（ｗ／ｖ）で水中に溶解したときの前記粉のｐＨが６．５〜７．５の間である、項目１８に記載の微細藻類粉。
（項目３３）
２ｐｐｍ未満のクロロフィルを有する、項目１８に記載の微細藻類粉。
（項目３４）
添加された酸化防止剤をさらに含む、項目１８に記載の微細藻類粉。
（項目３５）
前記粉中の細胞の大部分が溶解され、任意選択的に、前記細胞の５０％〜９０％が溶解される、項目１８に記載の微細藻類粉。
（項目３６）
３０％よりも高い溶存酸素レベルを維持しながら、開始ｐＨ６．８で固定炭素源としてグルコースの存在下、クロレラ・プロトテコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）の細胞ブロスを暗所で培養し、前記ブロスを７５℃で１分間の高温短時間プロセスにさらし、水中で６．４倍に希釈して遠心分離により前記細胞を採取し、粉砕により前記細胞を溶解させ、酸化防止剤を添加し、移動ベルトに対して出力する噴霧乾燥ノズルを用いて乾燥させるというプロセスによって得ることができる微細藻類粉。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の実施形態に従う食品の製造方法を表す流れ図を示す。
【図２】容認できるフレーバーおよび粗悪なフレーバーを有する微細藻類粉サンプルを表す点を有する、ＰＣＡクラスタリング分析を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
定義
培地に関連して、「ＤＯ」と略される「溶存酸素」は、大気と酸素平衡状態にある培地の酸素化と比較した、培地の相対的な酸素化を意味する。
【００１４】
「微細藻類粉」は、微細藻類の細胞を含む、人間の食用に適した乾燥微粒子組成物である。
【００１５】
本明細書で使用される場合、「オフフレーバー」は、食物中、例えば焼いた食物（ケーキなど）中に消費者が期待し得ないフレーバーおよび／または所望されないフレーバーを意味する。オフフレーバーの例としては、キャベツまたは魚のフレーバーが挙げられる。特定のフレーバーは、ガスクロマトグラフィ−質量分析（ＧＣ−ＭＳと略される）などの現代の分析技術によって測定することができるが、多くの場合、オフフレーバーの最も便利で効果的な測定手段は、人で構成される試験パネルである。人のオフフレーバーの知覚に関連して、これらは、例えば１０人の官能パネルによって決定することができ、フレーバーまたは臭気がないことは、１０人のうち２人以下がフレーバーを検出可能な場合に、あるいは統計的有意性を確立するために十分な試験を実施することによって確立される。
【００１６】
概観
本発明は、特定の微細藻類株が、特定の条件下で培養および加工される場合に、フレーバー、臭気および色の点で食欲をそそるバイオマスを産生できるという発見に根付いている。改善されたフレーバーは、単にオフフレーバーがないことに起因するだけでなく、培養および／または加工の間に産生される望ましいフレーバー化合物の存在にも起因すると考えられる。以下の実施例において、微細藻類は暗所で従属栄養的に培養されたクロレラ・プロトテコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）の株であるが、以下で提供される方法の使用などによる従属栄養培養および慎重な加工によって非緑色を生成できることを条件として、クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）の別の種または緑藻植物門の他の種の可能性もある。これらの技術の使用により、製品は、本明細書で開示される新たに同定された合格判定基準の範囲内に入り得る。
【００１７】
微細藻類粉の多数のバッチについての人の官能パネルデータは、主成分分析により表されるようなフレーバー／臭気空間におけるクラスタリングを同定するために、水中の溶解度が様々であるフレーバーおよび臭気化合物の広範な分析からのデータと相関させた。従って、同定されたクラスタの範囲内に入る微細藻類粉は、人間の食用に容認できる確率が高い。
【００１８】
図１は、本発明の実施形態に従って少量のオフフレーバーを有する微細藻類粉を製造するためのプロセスの流れ図である。結果として得られる粉は、様々な食物および飲料に取り込むことができる。
【００１９】
図２は、容認できるフレーバーおよび粗悪なフレーバーを有する微細藻類粉サンプルを表す点を有する代表的なＰＣＡクラスタリング分析を示すプロットである。
【００２０】
改善された微細藻類粉の製造
微細藻類は培養される（ステップ１０５）。例えば、微細藻類粉が脱イオン水中に１０％（ｗ／ｖ）で分散され、人の官能パネルによって評価される場合に、暗所における微細藻類の培養により、キノコおよびキャベツまたは魚フレーバーなどのオフフレーバーがより低レベルである微細藻類バイオマスが作られることが分かった。従って、好ましい実施形態では、微細藻類は、固定（すなわち、非ＣＯ２）炭素源において、暗所で従属栄養的に培養される。以下の実施例ではグルコースを使用したが、フルクトース、スクロース／フルクトース混合物、または酢酸／酢酸塩などの他の固定炭素源も同等の結果を生じ得る。糖の濃度は、連続供給によって管理することができる。３〜１０ｇ／ｌのグルコース濃度により有利な結果が達成された。微細藻類の適切な属には、クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）およびプロテテカ属（Ｐｒｏｔｅｔｈｅｃａ）が含まれる。例えば、クロレラ・プロトテコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）、プロトテカ・モリフォルミス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）またはプロトテカ・ゾフィ（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｚｏｐｆｉｉ）が使用され得る。人間の栄養のために使用されるクロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）のその他の種、例えばクロレラ・プロトテコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）なども本明細書で開示されるように成長および加工することができる。微細藻類の種または株の組み合わせも使用され得る。任意選択的に微細藻類細胞は変異され、バイオマスを取り込んだ食品の色を変化させ得る色素が実質的に低減された株が選択される。以下の実施例では、クロレラ・プロトテコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）の細胞から適切なフレーバーおよび観察不能な緑色が得られることが分かった。例えば、粉は、２００ｐｐｍ未満、２０ｐｐｍ未満、または２ｐｐｍ未満のクロロフィルを含み得る。以下の実施例では、色は黄色／金色であることが分かったが、使用される株および培養／ｃｏｄｉｍｎｄｉｔｉｏｎｓに応じて、例えば、淡黄色、オフホワイト、または白色でもあり得る。
【００２１】
微細藻類は、所望の密度および脂質濃度まで培養される。脂質濃度は、栄養制限条件、特に窒素制限条件下で培養することによって増大され得る。本発明の実施形態では、培養は、乾燥細胞重量で測定される場合に、微細藻類が１０〜２０％、２０〜３０％、４０〜５０％、４０〜６０％、３０〜７０％、３５〜７５％、５０〜６０％、６０〜７０％、または７０〜８５％の脂質に到達するように窒素を制限する条件下で実施される。例示的な実施形態において、微細藻類は約５０％の脂質を含む。脂質レベルの向上は、脂肪およびコレステロールプロファイルが改善された食品の製造において、またはこのような食品の口あたりの改善において特に有用である。高脂質微細藻類を使用して粉を製造する場合、脂質の粘着性は、測定可能および／または流動可能な粉の形成に対する妨害であり得る。あるいは、窒素充満条件下での培養は高タンパク質の微細藻類粉を与えることができ、粉は、例えば、乾燥細胞重量で５〜２０％または１０〜１８％の脂質を有し得る。以下で説明されるように、望ましい味、臭気および色特性を保持しながら流動可能な粉末を与える乾燥方法が確認されている。
【００２２】
微細藻類は、不透明な培養容器内で培養され得る。微細藻類は、好気性条件下で培養され得る。驚くことに、クロレラ・プロトテコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）の従属栄養培養中に酸素レベルを３０％ＤＯ以上まで増大させると、改善されたフレーバーを有する微細藻類バイオマスが得られることが分かった。ＤＯの±３０％の変動（すなわち、３０±９％ＤＯ）が考えられる。さらに、発酵中に酸素が上昇されると（例えば、４０％を超えるＤＯ、５０％を超えるＤＯ、６０％を超えるＤＯ、または６０〜７０％のＤＯ）、少量のオフフレーバーを有する白色またはオフホワイト色の微細藻類バイオマスが生じ得る。白色度は、Ｈｕｎｔｅｒ比色計を用いて測定され得る。実施形態では、白色度は、約３０〜４０％のＤＯで成長された微細藻類バイオマスの対照サンプルの白色度よりも高い。特定の実施形態では、酸素は、約６０〜７０％の溶存酸素まで上昇される。酸素化の上昇は、例えば精製酸素の導入によって達成することができる。
【００２３】
フレーバーは、微細藻類を所望のｐＨで培養することによって改善され得る。例えば、ｐＨは、４〜９、または５〜８であり得る。ｐＨは、緩衝および／または滴定によるｐＨモニタリングを用いて調節され得る。酸性ｐＨが使用される場合、例えば乾燥の前に渋いフレーバーを除去するためにｐＨを６〜８または６．５〜７．８、または約７に調整することによって、ｐＨを中和することができる。最終の粉は、１％ｗ／ｖの粉の水溶液について、ｐＨ５．５〜８．５、６．０〜８．０、または６．５〜７．５によって特徴付けることができる。
【００２４】
培養の後、微細藻類は不活性化される（ステップ１１０）。不活性化条件は、オフフレーバーを生じる酵素を不活性化するのに十分であるように選択される。これらの条件は微細藻類を死滅させることもあるし、あるいは微細藻類および汚染種（もしあれば）の成長を停止させることもある。厳密な低温殺菌（すなわち、高温および／または長時間）は望ましくないフレーバー／臭気を導き得るが、十分に厳密でない処理も容認できないフレーバー／臭気を導き得ることが分かった。従って、低温殺菌が使用される場合、微妙なバランスを取らなければならない。実験によって、高温短時間の低温殺菌（「ＨＴＳＴ」）処理体制を使用して、容認できる微細藻類バイオマス製品を製造可能であることが示された。例えば、処理の温度は、１０〜１８０、３０〜１２０、または４５〜９０秒間に対して７０℃〜９５℃、または７２℃〜９０℃であり得る。一実施形態では、微細藻類は、培養した微細藻類ブロスを、熱交換器を通して捕集容器内へ流すことによって７５℃で１分間処理される。長期の加熱を回避するために、ＨＴＳＴの出力を冷却することが好ましい。時間および温度の両方を調整することによって、同様の結果が得られるはずである。不活性化までの遅延は、酵素活性により作られると考えられるオフフレーバーの発生を防止するように最小限にされなければならない。従って、本発明の実施形態では、酵素の不活性化ステップは、酵素的に発生されるオフフレーバーが微細藻類において生じることを可能にするのに十分な時間遅延することなく実施される。また酸性ｐＨにおける培養は、さらにより穏やかな低温殺菌が使用されることを可能にし得る。例えば、微細藻類細胞は、５〜６．５のｐＨで培養された後、約６０〜約７０℃で１分間低温殺菌され、乾燥の前に中和させることができる。
【００２５】
フレーバーをさらに改善するために、微細藻類細胞は洗浄され得る（ステップ１１５）。理論に縛られることは望まないが、洗浄はオフフレーバーを除去し得る。さらに、洗浄の前に不活性化ステップを用いると、細胞が透過性にされるか、あるいは別の形で微細藻類バイオマスから望まれないフレーバーまたは臭気の除去が促進され得る。洗浄は、遠心分離、ろ過、透析または当該技術分野で既知の他の方法によって促進され得る。任意選択的に、洗浄は、微細藻類細胞の容積と同等またはそれよりも多い容積の洗浄液（例えば、水または緩衝液）を用いて実施される（例えば、遠心分離によって測定される場合）。洗浄液の容積は、細胞の容積の２倍、または好ましくは、細胞の容積の少なくとも３倍であり得る。細胞容積の６．４倍における遠心分離によって、有利なフレーバーを有する微細藻類バイオマスが得られることが分かった。従って、本発明の実施形態では、細胞は３〜１２容積の水で洗浄される。これらの目的のために、細胞容積の測定は、細胞から水を除去する（すなわち、液体成長培地から取り出す）ことによって達成される。例えば、細胞は、遠心分離またはろ過によって水が除去され得る。任意選択的に、洗浄ステップは、１回または複数回繰り返すことができる。
【００２６】
任意選択的に、洗浄の後、防腐剤が添加され得る（ステップ１２０）。例えば、静菌剤および静真菌剤として安息香酸ナトリウムおよび／またはソルビン酸カリウムが添加され得る。安息香酸ナトリウムは酸性条件下でより活性なので、ｐＨは必要に応じて低下され得る。その場合、ｐＨは、望まれない酸性フレーバーを回避するためにプロセスの後期に上昇される。
【００２７】
任意選択的に、微細藻類細胞は次に溶解される（ステップ１２５）。溶解は部分的であっても全体的であってもよい。例えば、細胞の５％〜９５％または大部分（５０％よりも多い）が溶解され得る。溶解は、高脂質微細藻類において脂質を放出するために特に望ましいことがある。ここで、脂質の放出は、微細藻類バイオマスを取り込んだ食品の質または栄養価を改善する。溶解は、ビーズミルまたは当該技術分野において既知の任意の他の適切な方法を用いて達成され得る。任意選択的に、細胞の大部分を溶解させることができる。一実施形態では、微細藻類細胞の約３０〜７５％が溶解される。別の実施形態では、微細藻類細胞の約３０〜７５％が溶解され、微細藻類細胞は、乾燥細胞重量で約３０〜７５％の脂質を有する。さらに別の実施形態では、微細藻類細胞は６０〜９０％溶解される。このパラメータの組み合わせは、高度に溶解された細胞に関連し得る乾燥または他の加工ステップにおける困難を回避しながら、微細藻類バイオマスが組み込まれた食物の口あたり、空気保持容量または他の機能パラメータを改善する微細藻類バイオマスをもたらすと考えられる。以下の実施例３では、細胞を約８０％まで溶解させた。
【００２８】
任意選択的に、バイオマスは均質化され得る（ステップ１３０）。例えば、細胞および／または溶解細胞を含有する懸濁液は、高圧で狭いチャネルまたはオリフィスを通して押出され得る（すなわち、高圧ホモジナイザーの使用）。ブレードまたは超音波ホモジナイザーなどの他のタイプのホモジナイザーも使用され得る。
【００２９】
バイオマスの貯蔵期間を向上させるために酸化防止剤が添加され得る（ステップ１３５）。例えば、トコフェロール、ＢＨＡ、ＢＨＴ、ローズマリー抽出物、または他の適切な食品グレードの酸化防止剤を使用することができる。貯蔵期間の向上に加えて、この段階での酸化防止剤の添加は、乾燥ステップで望まれない酸化フレーバーが形成されることを防止し得る。上流プロセスで低ｐＨ条件を使用した場合、この段階でｐＨを高めるために塩基を添加すると、低ｐＨに関連する渋いフレーバーが防止され得る。
【００３０】
乾燥の前（例えば、均質化の後で、かつ任意選択的な酸化防止剤の添加の前または後）に、微細藻類は、高温で一定期間保持され得る（１４０）。理論に縛られることは望まないが、このステップはフレーバーの安定性を促進し、酵素の不活性化を保証し、正のフレーバーの形成を促進し得ると考えられる。例えば、溶解した微細藻類の懸濁液は、７０〜８５°で１〜６分間保持され得る。製造された粉において容認できる官能特性が得られた以下の実施例３では、この加熱ステップを７７℃で３分間実施した。例えば、約８７℃で約９０秒間または約６７℃で約６分間加熱することによって、同等の結果を得ることができる。
【００３１】
次に、バイオマスは乾燥される（ステップ１４５）。一実施形態では、粉（粉末状）物質を形成するために、バイオマスは噴霧乾燥される。噴霧乾燥は、例えば、ボックスドライヤー、またはトール型スプレードライヤー、流動床ドライヤー、または移動流動床ドライヤー（例えば、ＦｉｌｔｅｒＭａｔ（登録商標）スプレードライヤー、ＧＥＡ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｉｎｃ．）を使用することができる。実施例３には、ＦｉｌｔｅｒＭａｔドライヤーによる乾燥のために使用される条件が記載される。
【００３２】
結果として得られる粉は、脂質が多い（例えば、乾燥細胞重量で３０〜７０または４０〜６０％の脂質）場合でも測定可能または流動可能であり得る。特定の実施形態では、粉は、０．３０〜０．５０のゆるみ密度、０．５０〜０．６５のかさ密度、２０００μｍにおいて１５〜３５重量％（すなわち、２０００μｍのふるいを通過するには大き過ぎる％）、１４００μｍにおいて４０〜７０％、および８００μｍにおいて１〜２０％のオーバーサイズ、１〜２５ｍｍの湿潤性、ならびに０．１〜０．７ｍ２／ｇの表面積を有する。
【００３３】
湿潤性を試験するために：
−  ５００ｍｌの脱イオン水を２０℃で６００ｍｌのスクワット型ビーカー（Ｆｉｓｈｅｒｂｒａｎｄ  ＦＢ３３１１４）に導入し、
−  混合せずに、２５ｇの微細藻類粉末を水の表面に均一に入れ、
−  接触の３時間後に粉末の挙動を観察し、
−  水の表面を貫通してビーカーの底に沈下した製品の高さを測定する。
【００３４】
ゆるみかさ密度は、従来のゆるみかさ密度の測定方法を用いて、すなわち、既知の容積の空の容器の質量（ｇ）を測定し、試験すべき製品が充填された同じ容器の質量を測定することによって決定される。
−  充填された容器の質量と空の容器の質量との差を、容積（ｍｌ）で除することにより、ゆるみかさ密度の値が得られる。
−  この試験のために、１００ｍｌの容器、充填に使用されるスクープ、および使用されるスクレーパーは、Ｈｏｓｏｋａｗａ社によって商標Ｐｏｗｄｅｒ  Ｔｅｓｔｅｒ型ＰＴＥで販売される装置と共に供給される。
−  測定を実施するために、製品は、２０００μｍの開口を有するふるい（ＳＡＵＬＡＳにより販売）によって選別される。密度は、そのふるい上に保持されなかった製品において測定される。
【００３５】
比表面積は、例えば、分析が行われる製品の表面への窒素の吸収試験に基づき、Ｓ．ＢＲＵＮＡＵＥＲらによる論文「窒素吸収によるＢＥＴ表面積（ＢＥＴ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ａｒｅａ  ｂｙ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ）」（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ
Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，６０，３０９，１９３８）に記載される技術に従い、Ｂｅｃｋｍａｎｎ  ＣｏｕｌｔｅｒからのＳＡ３１００装置において実行されるＱｕａｎｔａｃｈｒｏｍｅ比表面積アナライザーを用いて、微細藻類粉の顆粒の粒径分布全体にわたって決定される。
【００３６】
微細藻類粉は、容認できるフレーバー、色、臭気、および／または口あたりについて試験される（ステップ１５０）。例えば、人の官能パネルおよび／またはヘッドスペースＧＣ−ＭＳ、ＳＰＭＥ、またはＳＢＳＥなどの分析技術が使用され得る。任意選択的に、フレーバーは、先行の官能パネルおよび／または分析試験によって決定される容認できるフレーバーと共にグループ化されるかどうか、またはそれに関連する境界の範囲内に入るかどうかを決定するために評価され得る。グループ化／境界は、主成分分析（ＰＣＡ）を使用して決定され得る（以下の実施例を参照）。次に、包装および将来の使用のために、容認できるロットが選択され得る。
【００３７】
乾燥および任意選択の試験の後、微細藻類粉またはバイオマスを取り込んだ食品の製造に必要とされる任意のさらなる加工または包装（ステップ１５５）を、バイオマスに行うことができる。例えば、微細藻類粉を製造するために、バイオマスは攪拌されてもよいし、ふるいを通過されてもよい。また微細藻類粉は、スープ、ソース、生地、ケーキ、クッキー、焼成食品用ドライミックスなどを作るための他の成分と混合されてもよい。試験は、以下の実施例４、５および８に従って実施することもできる。
【００３８】
本発明の実施形態によると、上記の技術の任意の２つまたはそれ以上を組み合わせて、微細藻類バイオマス製品（例えば、微細藻類粉など）においてこれまで前例のないフレーバーに到達することができる。例えば、上記のようにＨＴＳＴ処理の後に液体で洗浄することによって、低オフフレーバーを有する微細藻類粉を生じることができる。培養中の酸素化および上記の他のステップはフレーバーをさらに改善し得る。
【００３９】
適切な微細藻類株を選択し、本明細書に開示される方法を使用することによって、容認できる官能特性を有する微細藻類バイオマスまたはこのバイオマスから製造される粉が得られる。微細藻類粉は、１：２、１：５、１：１０、１：２０、１：３０、または１：４０の比率（容積による）で水中に希釈すると緑色ではなく、検出不能なレベルの魚、キノコまたはキャベツフレーバーまたは臭気を有し得る。実施形態では、試験パネルにより検出する場合に、魚およびキャベツのオフフレーバーは、水中に容積で１：２０に希釈されると検出不能である。
【００４０】
以下のフレーバー／臭気化合物は実施例４または５の方法によって決定されたが、これらは容認できる官能試験と相関すると考えられる：ウンデカラクトン（４００〜１８００ｐｐｂ）、３−メチルブタナール（０〜１１，０００ｐｐｂ）、ペンタナール（１６０〜１０，７００ｐｐｂ）、２−メチルブタナール（０〜２５００ｐｐｂ）、２−ペンタノン（３９〜１０，６００ｐｐｂ）、３−ペンテン−２−オン（０〜１５００ｐｐｂ）。
【００４１】
また容認できるサンプルはしきい値よりも少ない量のピロール、ピラジン、またはピリジン含有化合物を有したが、これらの化合物は、ｗｗｗ．ｎｕｔｓ．ｃｏｍから得られる、緑色で容認できないフレーバーおよび臭気のクロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）のサンプル中に見出された。
【００４２】
実施形態において、上記の方法によって製造される微細藻類粉は、水分および酸素不透過性の包装（例えば、Ｍｙｌａｒ（登録商標）食品貯蔵バッグ）内で室温において暗所で貯蔵したときに、少なくとも２週間、１か月間、３か月間または６か月間、言及される少量のオフフレーバーを保持する。
【００４３】
任意選択的に、より大きい粒子、顆粒またはペレットを、乾燥微細藻類材料から製造することができる。例えば、粉は、当該技術分野において既知の様々な方法を用いて、凝集化、顆粒化、押出、またはペレット化させることができる。
【実施例】
【００４４】
実施例１．低ｐＨにおける低色素株を用いた微細藻類粉の製造
クロレラ・プロトテコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）の多数の発酵を７Ｌ〜１０００Ｌの範囲のスケールで実施した。クロレラ・プロトテコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）の２つの株、株Ａと、低色素突然変異体である株Ｂとを使用した。発酵は、約５〜６のｐＨにおいて、固定炭素源としてのグルコースに対して暗所で実施した。発酵の後、微細藻類を含有する発酵ブロスを加熱処理して微細藻類を不活性化し、過剰の水で直ちに希釈し、遠心分離して、微細藻類を洗浄および濃縮した。粉砕により細胞を溶解させてから、噴霧乾燥して微細藻類粉を製造した。株Ａから作られた微細藻類粉は淡黄色であり、株Ｂから作られた微細藻類粉は黄褐色であった。株Ｂの発酵は、ほぼ中性のｐＨでも実施した。
【００４５】
実施例２．高酸素条件を用いた薄色の粉
株Ｂを高レベル（約６０％〜７０％）および低レベル（約３０〜４０％）の溶存酸素において培養し、実施例１と同様に処理して、微細藻類粉を形成した。高酸素実験の場合、より少ない酸素で製造された微細藻類と比較して、ブロス、遠心分離したバイオマスおよび最終の粉において、黄色の低下が注目された。
【００４６】
実施例３：改善された微細藻類粉の製造
クロレラ・プロトテコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）の種培養物を限定培地ブロスに添加し、９，０００Ｌの培養物を得た。炭素源として加熱滅菌グルコース（５５％ｗ／ｗ）を使用した。発酵槽内で通気、背圧および攪拌を調節することにより、溶存酸素を最低３０％に保持した。培養温度は２８℃であった。ブロスのｐＨは培養の開始時は６．８であり、培養の過程で約６まで降下した。グルコースを３〜１０ｇ／Ｌ濃度の濃度まで供給した。ＯＤ７５０により測定されるように中間対数期になるまで成長を４〜５日間にわたって継続させた。得られた生成物は、１８．５％ｗ／ｖの乾燥細胞重量（ＤＣＷ）を有した。成長培地中の窒素レベルは限定的であり、長時間の糖供給の結果として、微細藻類に約５０％の脂質を強制的に蓄積させた。
【００４７】
次に、オンラインＨＴＳＴによりブロスを７５℃で１分間熱処理して、６．２℃に冷却してから、７℃で貯蔵した。次に、脱炭酸水中での６．４倍希釈によってＨＴＳＴ処理したブロスを洗浄し、Ａｌｆａ  Ｌａｖａｌ  ＦＥＵＸ  ５１０遠心機を用いて遠心分離した。
【００４８】
７５％のリン酸を用いてｐＨをｐＨto４．１まで低下させ、５００ｐｐｍの安息香酸ナトリウム／１０００ｐｐｍのソルビン酸カリウム（乾燥ベースで）を防腐剤として添加した。
【００４９】
次に、材料を１０℃よりも低い温度において攪拌下で貯蔵した。
【００５０】
０．５ｍｍのケイ酸ジルコニウムビーズを用いてＮＥＴＺＳＣＨ  ＬＭＥ５００ビーズミルにおいて粉砕することによって溶解を達成し、８８％の細胞破壊を生じた。出口を６℃に冷却した。
【００５１】
酸化を防止するためにアスコルビン酸（乾燥ベースで１５０ｐｐｍ）および混合トコフェロール（乾燥ベースで５００ｐｐｍ）を材料に添加した。水酸化カリウムを添加して、ｐＨを中和させた。
【００５２】
次に、材料を７７℃に３分間加熱した。
【００５３】
乾燥は、サイクロンを有するＦｉｌｔｅｒｍａｔ  ＦＭＤ１２５ドライヤーにおいて達成した。ノズル圧力は１６０〜１７０バールであった。
【００５４】
実施例４：ＳＰＭＥ（固相マイクロ抽出）
サンプル（５００ｍｇ）および３ｍＬの蒸留水および１ｇｍのＮａＣｌおよびエタノール中０．０２２ｕｇ／ｕＬの２−ウンデカノン内部標準５ｕＬを５０℃で１０分間インキュベートし、次に、Ｇｅｒｓｔｅｌ  ＭＰＳ２のオービタルシェーカーで攪拌しながら、ＳＰＭＥにより５０℃で２０分間抽出した。使用したＳＰＭＥ繊維は、ＤＶＢ／ＣＡＲ／ＰＤＭＳ（ジビニルベンゼン／カルボキセン／ポリジメチルシロキサン）、ｄｆ５０／３０μｍであった。Ａｇｉｌｅｎｔスプリット／スプリットレスインジェクタにおいて繊維を２６０℃で３分間脱着させた。揮発性物質をＬｅｃｏ  Ｐｅｇａｓｕｓ  ＧＣ−ＴＯＦＭＳ内に脱着させ、１．０ｍＬ／分のヘリウムキャリアガス流を用いてＤＢ５−ＭＳカラム（３０ｍ、０．２５ｍｍ、０．２５ｕｍ）で分離した。初期カラム温度は４０℃（３分間）であり、次に１５℃／分で２７０℃まで上昇させ、２７０℃で５分間保持した。質量検出を電子衝撃モード（ＥＩ）で実施した。注入は全てスプリットレスであった。ピーク同定は、サンプルのＥＩ質量スペクトルとＮＩＳＴライブラリのＥＩ質量スペクトルとの比較に基づく。データは、内部標準と比較した相対濃度（ｐｐｂで表される）として報告される。
【００５５】
実施例５：ＳＢＳＥ（スターバー抽出（ＳｔｉｒＢａｒ  Ｓｏｒｐｔｉｖｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ））
サンプル（５００ｍｇ）および１０ｍＬの蒸留水およびエタノール中０．０２２ｕｇ／ｕＬの２−ウンデカノン内部標準５ｕＬを、２ｃｍのＧｅｒｓｔｅｌ  ＰＤＭＳ  Ｔｗｉｓｔｅｒを使用して１０００ｒｐｍで攪拌しながら１時間抽出した。次に、１グラムのＮａＣｌをサンプルに添加し、抽出をさらに１時間継続した。この技術は、逐次ＳＢＳＥとして知られている。次に、ツイスターをサンプルから取り出し、蒸留水で洗い流し、リントレスな布で押さえて乾かし、スプリットレスモードで使用されるＧｅｒｓｔｅｌ  ＴＤＵにおいて熱的に脱着させた。ＴＤＵでは、脱着された揮発性物質を始めに−１００℃で捕捉し、次に、ツイスターに補足された揮発性物質を２８０℃で３分間脱着させた。揮発性物質をＡｇｉｌｅｎｔ  ＧＣ−ＭＳＤ内に脱着させ、１．０ｍＬ／分のヘリウムキャリアガス流を用いてＤＢ５−ＭＳカラム（３０ｍ、０．２５ｍｍ、０．２５ｕｍ）で分離した。初期カラム温度は４０℃（３分間）であり、次に１０℃／分で２７０℃まで上昇させ、２７０℃で５分間保持した。質量検出を電子衝撃モード（ＥＩ）で実施した。注入は全てスプリットレスであった。ピーク同定は、サンプルのＥＩ質量スペクトルとＮＩＳＴライブラリのＥＩ質量スペクトルとの比較に基づく。データは、内部標準と比較した相対濃度（ｐｐｂで表される）として報告される。
【００５６】
実施例６：実施例３の容認できるサンプルのフレーバー／臭気データ
実施例３で製造したサンプルを官能パネルにより試験し、実施例４および５のようなＳＰＭＥおよびＳＢＳＥで分析した。結果は、２−ウンデカノン内部標準に対して決定される１０億分の１の単位で以下の表に報告される。以下の表において、ａはアルファ、ｄはデルタ、ｇはガンマを表すために使用される。化合物のＣＡＳ番号は実施例７において記載される。
【００５７】
【表１】
2018143255.tif 000010
【００５８】
【表２】
2018143255.tif 000011
【００５９】
【表３】
2018143255.tif 000012
【００６０】
実施例７：ＰＣＡ分析
上記の方法に従って、クロレラ・プロトテコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）微細藻類粉の多数の製造ロットを製造した。さらに、クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）粉末の市販のサンプルを、ｎｕｔｓ．ｃｏｍから入手した。製品情報は出願日時点のものである。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｕｔｓ．ｃｏｍ／では、粉は、従属栄養製造された韓国起源であるとされている。実施例４および５のようなＳＢＳＥおよびＳＰＭＥによって測定された全部で１２のサンプルを２通り使用した。さらに、ボランティアのパネルを用いて官能試験を行った。スケーリングされた主成分分析（相関行列を用いる）を、ｐｒｃｏｍｐ機能を用いてＲソフトウェアバージョン２．１５．１（統計的計算のためのＲプロジェクト、ｗｗｗ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ）により実施した。フレーバー／臭気化合物の変動を十分に特徴付ける３つの主成分が見出された。３つの主成分を定義するベクトルは、各化合物を決定するために使用される方法と共に、ＰＣ１、ＰＣ２、およびＰＣ３として以下の表に記載される。容認できる官能特性を有するサンプルと相関するサンプルのクラスタがこの低次元空間において見出される。
【００６１】
【表４】
2018143255.tif 000013
【００６２】
【表５】
2018143255.tif 000014
【００６３】
【表６】
2018143255.tif 000015
【００６４】
【表７】
2018143255.tif 000016
【００６５】
【表８】
2018143255.tif 000017
【００６６】
図２は、ＰＣＡ分析クラスタリングを示す。各プロット点は、主成分ＰＣ１、ＰＣ２、およびＰＣ３（それぞれ、ｄｉｍ１、ｄｉｍ２およびｄｉｍ３）によって定義される空間にプロットされた微細藻類粉末サンプルを表す。黒丸は、容認できるフレーバーを有するクロレラ・プロトテコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）粉サンプルを表す。白丸は、粗悪なフレーバーを有するクロレラ・プロトテコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）粉サンプルを表す。白い四角は、Ｎｕｔｓ．ｃｏｍから得られるクロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）を表す。
【００６７】
実施例８：容認できるフレーバーの境界の決定
実施例７のＰＣＡ分析に基づき、ＦａｃｔｏｍｉｎｅＲパッケージｖ．１．２．１（Ｈｕｓｓｏｎら）を用いて、容認できる官能試験と相関するサンプルのクラスタを統計的に定義した。ＦａｃｔｏｍｉｎｅＲ分析の結果は、ＰＣ１、ＰＣ２およびＰＣ３の３つの次元の３つの楕円体であった。楕円体は、正の人の官能分析（実施例７のグラフからの黒丸）に関連するクラスタの中心点からの１、２、および３つの標準偏差を特徴付ける。各３次元楕円体は、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、およびＦ値に対する以下の表のデータを用いて、式Ａｘ２＋Ｂｘｙ＋Ｃｙ２＋Ｄｘ＋Ｅｙ＋Ｆ＝０で定義される３つの直交する２次元楕円によって定義される。従って、最小の楕円体の範囲内に入るサンプルは、約９９．７％の確率で人のパネルにより正の官能分析を有することが予想され、中間サイズの楕円体の範囲にのみ入るサンプルは、約９５％の確率で人のパネルにより正の官能分析を有することが予想され、最大の楕円体の範囲内にしか入らないサンプルは、約６８％の確率で人のパネルにより正の官能分析を有することが予想されるであろう。
【００６８】
【表９】
2018143255.tif 000018
【００６９】
実施例９：ＰＣＡ分析の結果を用いるＱＣ分析
実施例８の楕円体を使用して、サンプルが正のフレーバーに関連するクラスタの範囲内に入るかどうかを決定することができる。例えば、上記の方法に従って製造された微細藻類粉のバッチにおいて品質管理実験を実施することができる。粉は、実施例４および５のようなＳＰＭＥおよびＳＢＳＥによって分析され、次に、データが実施例８の楕円体の１つまたは複数の範囲内に入るかどうかが決定される。
【００７０】
これを実行するために、以下の手順（その他の手順も適用され得るが）を使用することができる。１０５の化合物の相対濃度から始める。各濃度からそのセンター因子を差し引き、そのスケール因子（以下の表で与えられる）で除し、これはデータを中心化およびスケール化する。スケール化および中心化されたデータのドット積をとり、そして主成分（ＰＣ）ローディングにより、これは各ＰＣに対して１つの値を生じるであろう。各値をその関連のプロッティング因子で除すると、これは、データポイントが３次元の藻類−化学空間にプロットされることを可能にするであろう。信頼楕円体により境界される空間の範囲内に点が入れば、この点は、統計的に異ならない（Ｐ＜０．０５）。例えば、９５％の信頼楕円体により境界される空間の範囲内に点が入れば、統計的に異ならない（Ｐ＜０．０５）。
【００７１】
【表１０】
2018143255.tif 000019
【００７２】
【表１１】
2018143255.tif 000020
【００７３】
【表１２】
2018143255.tif 000021
【００７４】
【表１３】
2018143255.tif 000022
【００７５】
【表１４】
2018143255.tif 000023
【００７６】
本発明の実施形態のさらなる議論
以下の段落において、本発明の特定の実施形態は便宜上番号が付けられている。各実施形態に関連する番号は任意であり、種々の実施形態の相対的な重要性を示すことは意図されない。
【００７７】
１．緑藻植物門の微細藻類細胞を含む、食物での使用に適した微細藻類粉であって、内部標準に対して実施例６の化合物の濃度を決定するための実施例４に従うＳＰＭＥおよび／または実施例５に従うＳＢＳＥによる分析と、その後の実施例９の手順に従う分析とにより、実施例７のグラフ（すなわち、図２）の黒丸に相当する正のフレーバー群に対して３つの標準偏差を定義する実施例８の楕円体の範囲内に入るフレーバー記述子が得られる。
【００７８】
２．実施形態１の微細藻類粉であって、フレーバー記述子は、実施例７のグラフ（すなわち、図２）の黒丸に相当する正のフレーバー群に対して２つの標準偏差を定義する実施例８の楕円体の範囲内に入る。
【００７９】
３．先行する実施形態のいずれかの微細藻類粉であって、フレーバー記述子は、実施例７のグラフ（すなわち、図２）の黒丸に相当する正のフレーバー群に対して１つの標準偏差を定義する実施例８の楕円体の範囲内に入る。
【００８０】
４．先行する実施形態のいずれかの微細藻類粉であって、３０％よりも高い溶存酸素レベルを維持しながら、開始ｐＨ６．８で固定炭素源としてグルコースの存在下、クロレラ・プロトテコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）の細胞ブロスを暗所で培養し、ブロスを７５℃で１分間の高温短時間プロセスにさらし、水中で６．４倍に希釈して遠心分離により細胞を採取し、酸化防止剤を添加し、粉砕により細胞を溶解させ、移動ベルトに対して出力する噴霧乾燥ノズルを用いて乾燥させるというプロセスによって得られる。
【００８１】
５．先行する実施形態のいずれかの微細藻類粉であって、ＳＰＭＥまたはＳＢＳＥによって決定したときに、ウンデカラクトン（４００〜１８００ｐｐｂ）、３−メチルブタナール（０〜１１，０００ｐｐｂ）、ペンタナール（１６０〜１０，７００ｐｐｂ）、２−メチルブタナール（０〜２５００ｐｐｂ）、２−ペンタノン（３９〜１０，６００ｐｐｂ）、および／または３−ペンテン−２−オン（０〜１５００ｐｐｂ）を含む。
【００８２】
６．先行する実施形態のいずれかの微細藻類粉であって、粉が脱イオン水中に１０％（ｗ／ｖ）で分散される場合、試験パネルによって検出するときに魚またはキャベツフレーバーは検出不能である。
【００８３】
７．先行する実施形態のいずれかの微細藻類粉であって、２０００μｍにおいて１５〜３５重量％のオーバーサイズを特徴とする流動性を有する。
【００８４】
８．先行する実施形態のいずれかに従う微細藻類粉であって、粉は白色、淡黄色または黄色である。
【００８５】
９．先行する実施形態のいずれかに従う微細藻類粉であって、明白な緑色を含まない。
【００８６】
１０．先行する実施形態のいずれかに従う微細藻類粉であって、粉は５〜２０％の脂質を含む。
【００８７】
１１．先行する実施形態のいずれかに従う微細藻類粉であって、粉は３０〜７０％の脂質を含む。
【００８８】
１２．先行する実施形態のいずれかに従う微細藻類粉であって、粉は４０〜６０％の脂質を含む。
【００８９】
１３．先行する実施形態のいずれかに従う微細藻類粉であって、１％（ｗ／ｖ）で水中に溶解したときの粉のｐＨは５．５〜８．５の間である。
【００９０】
１４．先行する実施形態のいずれかに従う微細藻類粉であって、１％（ｗ／ｖ）で水中に溶解したときの粉のｐＨは６．０〜８．０の間である。
【００９１】
１５．先行する実施形態のいずれかに従う微細藻類粉であって、１％（ｗ／ｖ）で水中に溶解したときの粉のｐＨは６．５〜７．５の間である。
【００９２】
１６．先行する実施形態のいずれかに従う微細藻類粉であって、２ｐｐｍ未満のクロロフィルを有する。
【００９３】
１７．先行する実施形態のいずれかに従う微細藻類粉であって、添加された酸化防止剤をさらに含む。
【００９４】
１８．先行する実施形態のいずれかに従う微細藻類粉であって、粉中の細胞の大部分が溶解され、任意選択的に、細胞の５０％〜９０％が溶解される。
【００９５】
１９．３０％よりも高い溶存酸素レベルを維持しながら、開始ｐＨ６．８で固定炭素源としてグルコースの存在下、クロレラ・プロトテコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）の細胞ブロスを暗所で培養し、ブロスを７５℃で１分間の高温短時間プロセスにさらし、水中で６．４倍に希釈して遠心分離により細胞を採取し、粉砕により細胞を溶解させ、酸化防止剤を添加し、移動ベルトに対して出力する噴霧乾燥ノズルを用いて乾燥させるというプロセスによって得ることができる微細藻類粉。
【００９６】
２０．緑藻植物門の微細藻類細胞を含み、食物での使用に適した微細藻類粉であって、ＰＣ１、ＰＣ２およびＰＣ３の次元を有するフレーバー記述空間の楕円体の範囲内に入るフレーバー記述子を特徴とする。フレーバー記述子は、ＳＰＭＥおよび／またはＳＢＳＥ分析を用いて、以下の化合物：
ジメチル．スルフィド
２．３．ブタンジオン
ブタナール
プロパナール．．２．メチル．
フラン．．３．メチル．
エチル．アセタート
２．ブテナール．．．Ｅ．．
ブタナール．．３．メチル．
１．ブタノール
ブタナール．．２．メチル．
チオフェン
１．ペンテン．３．オール
１．ペンテン．３．オン
２．ペンタノン
２．３．ペンタンジオン
ペンタナール
フラン．．２．エチル．
チアゾール
３．ペンテン．２．オン
ジスルフィド．．ジメチル
２．ペンテナール．．．Ｅ．．
ピロール
オキサゾール．．４．５．ジメチル．
２．ペンテン．１．オール．．．Ｚ．．
チオフェン．．３．メチル．
ヘキサナール
４．メチルチアゾール
ピラジン．．メチル．
フルフラール
オキサゾール．．トリメチル．
ブタン酸．．３．メチル．
ブタン酸．．２．メチル．
２．ヘキセナール
１．ヘキサノール
４．ヘプタノン
ピリジン．．２．６．ジメチル．
チアゾール．．２．４．ジメチル．
３．ヘプタノン
２．ヘプタノン
３．ヘプタノール
ヘプタナール
メチオナール
ピラジン．．２．５．ジメチル．
ピラジン．．２．６．ジメチル．
ピラジン．．エチル．
ピラジン．．２．３．ジメチル．
ピラジン．．エテニル．
チアゾール．．４．５．ジメチル．
２．ヘプタノン．．６．メチル．
ヘキサナール．．２．エチル．
２．ヘプテナール．．．Ｚ．．
５．ノネン．２．オン
２．フランカルボキシアルデヒド．．５．メチル．．
ベンズアルデヒド
ヘキサン酸
１．オクテン．３．オール
ジメチル．トリスルフィド
２．５．オクタンジオン
５．ヘプテン．２．オン．．６．メチル．
フラン．．２．ペンチル．
２．４．ヘプタジエナール．．．Ｅ．Ｅ．．
ピラジン．．２．エチル．６．メチル．
オクタナール
ピラジン．．トリメチル．
ピラジン．．２．エチル．３．メチル．
２．４．ヘプタジエナール．．．Ｅ．Ｅ．．．１
ピラジン．．２．エテニル．６．メチル．
１．ヘキサノール．．２．エチル．
３．オクテン．２．オン．．．Ｅ．．
２Ｈ．ピラン．２．オン．．５．６．ジヒドロ．
ベンゼンアセトアルデヒド
３．５．オクタジエン．２．オン．．．Ｅ．Ｅ．．
アセトフェノン
１．デセン．３．オン
ピラジン．．３．エチル．２．５．ジメチル．
ピラジン．．テトラメチル．
５．メチル．２．チオフェンカルボキシアルデヒド
ｇ．ヘプタラクトン
リナロール
ノナナール
チモール
フェニルエチル．アルコール
２．３．５．トリメチル．６．エチルピラジン．
酢酸．．フェニルメチル．エステル
サフラナール
２．デセナール．．．Ｅ．．
ｇ．オクタラコン
ｏ．アミノ．アセトフェノン
２．４．デカジエナール
ｇ．ノンラクトン
イオノン
ゲラニル．アセトン
イオネン
ｇ．ノンラクトン．１
２．４．ノナジエナール．．．Ｅ．Ｅ．．
２．４．デカジエナール．１
ｇ．ヘプタラクトン．１
イオノン．１
ゲラニル．アセトン．１
ａ．イオノン
ピーチ．ラクトン．ｇ．ウンデカラクトン
ｄ．デカラクトン
ｃｉｓ．ゲラニルアセトン
ｄ．ドデカラクトン．．δ．ノニル．δ．バレララクトン．
ｄ．ウンデカラクトンの濃度を内部標準に対して決定することによって得られる。楕円体は、式Ａｘ２＋Ｂｘｙ＋Ｃｙ２＋Ｄｘ＋Ｅｙ＋ｆ＝０によって定義され、そして以下の表：
【００９７】
【表１５】
2018143255.tif 000024
に従ってパラメータ化される。楕円体の範囲内に入ることは、
各化合物について、相対濃度を決定し、
各化合物について、以下の表に従ってセンター因子を差し引き、
各化合物について、以下の表に従ってスケール因子で除し、
スケール化および中心化されたデータのドット積をとって、ＰＣ１、ＰＣ２およびＰＣ３の値を生じさせ、そして
ＰＣ１、ＰＣ２およびＰＣ３によって定義されるフレーバー記述子が楕円体の範囲内に入るかどうかを決定する
という手順によって決定される。
【００９８】
【表１６】
2018143255.tif 000025
【００９９】
【表１７】
2018143255.tif 000026
【０１００】
【表１８】
2018143255.tif 000027
【０１０１】
【表１９】
2018143255.tif 000028
【０１０２】
【表２０】
2018143255.tif 000029
【０１０３】
２１．実施形態２０の微細藻類粉であって、フレーバー記述子は、以下の表：
【０１０４】
【表２１】
2018143255.tif 000030
によってパラメータ化されるより狭い楕円の範囲内に入る。
【０１０５】
２２．実施形態２１の微細藻類粉であって、フレーバー記述子は、以下の表：
【０１０６】
【表２２】
2018143255.tif 000031
によってパラメータ化されるさらにより狭い楕円の範囲内に入る。
【０１０７】
２３．実施形態２０〜２２のいずれかの微細藻類粉であって、３０％よりも高い溶存酸素レベルを維持しながら、開始ｐＨ６．８で固定炭素源としてグルコースの存在下、クロレラ・プロトテコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）の細胞ブロスを暗所で培養し、ブロスを７５℃で１分間の高温短時間プロセスにさらし、水中で６．４倍に希釈して遠心分離により細胞を採取し、酸化防止剤を添加し、粉砕により細胞を溶解させ、移動ベルトに対して出力する噴霧乾燥ノズルを用いて乾燥させるというプロセスによって得られる。
【０１０８】
２４．実施形態２０〜２３のいずれかの微細藻類粉であって、ＳＰＭＥまたはＳＢＳＥによって決定したときに、ウンデカラクトン（４００〜１８００ｐｐｂ）、３−メチルブタナール（０〜１１，０００ｐｐｂ）、ペンタナール（１６０〜１０，７００ｐｐｂ）、２−メチルブタナール（０〜２５００ｐｐｂ）、２−ペンタノン（３９〜１０，６００ｐｐｂ）、および／または３−ペンテン−２−オン（０〜１５００ｐｐｂ）を含む。
【０１０９】
２５．実施形態２０〜２４のいずれかの微細藻類粉であって、粉が脱イオン水中に１０％（ｗ／ｖ）で分散される場合、試験パネルによって検出するときに魚またはキャベツフレーバーが検出不能である。
【０１１０】
２６．実施形態２０〜２５のいずれかの微細藻類粉であって、２０００μｍにおいて１５〜３５重量％のオーバーサイズを特徴とする流動性を有する。
【０１１１】
２７．実施形態２０〜２６のいずれかの微細藻類粉であって、粉は白色、淡黄色または黄色である。
【０１１２】
２８．実施形態２０〜２７のいずれかの微細藻類粉であって、粉は５〜２０％の脂質を含む。
【０１１３】
２９．実施形態２０〜２７のいずれかの微細藻類粉であって、粉は３０〜７０％の脂質を含む。
【０１１４】
３０．実施形態２０〜２７のいずれかの微細藻類粉であって、粉は４０〜６０％の脂質を含む。
【０１１５】
３１．実施形態２０〜３０のいずれかの微細藻類粉であって、１％（ｗ／ｖ）で水中に溶解したときの粉のｐＨは５．５〜８．５の間である。
【０１１６】
３２．実施形態２０〜３０のいずれかの微細藻類粉であって、１％（ｗ／ｖ）で水中に溶解したときの粉のｐＨは６．０〜８．０の間である。
【０１１７】
３３．実施形態２０〜３０のいずれかの微細藻類粉であって、１％（ｗ／ｖ）で水中に溶解したときの粉のｐＨは６．５〜７．５の間である。
【０１１８】
３４．実施形態２０〜２３のいずれかの微細藻類粉であって、２ｐｐｍ未満のクロロフィルを有する。
【０１１９】
３５．実施形態２０〜３４のいずれかの微細藻類粉であって、添加された酸化防止剤をさらに含む。
【０１２０】
３６．実施形態２０〜３５のいずれかの微細藻類粉であって、粉中の細胞の大部分が溶解され、任意選択的に、細胞の５０％〜９０％が溶解される。
【０１２１】
記載される本発明の実施形態は単に例示的であることが意図され、多数の変化および修正は当業者には明らかであろう。このような変化および修正は全て特許請求の範囲で定義される本発明の範囲内に含まれることが意図される。
【図１】
2018143255.tif 000032
【図２】
2018143255.tif 000033
【外国語明細書】
2018143255000001.pdf