(57)【要約】【課題】立体的であり且つ容易に回収できる細胞凝集塊を形成できる細胞凝集塊形成用基材を提供すること。【解決手段】水を接触させたときの接触角が８５°以上である表面を有する、細胞凝集塊形成用基材。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
水を接触させたときの接触角が８５°以上である表面を有する、細胞凝集塊形成用基材。
【請求項２】
前記表面が、フィブロネクチンを吸着させたときにフィブロネクチンの吸着量が０．３〜３．５ｎｇ／ｍｍ2となる表面である、請求項１に記載の基材。
【請求項３】
前記表面が、牛血清アルブミンを吸着させたときに牛血清アルブミンの吸着量が０．９５ｎｇ／ｍｍ2未満となる表面である、請求項１又は２に記載の基材。
【請求項４】
前記表面が、スルフィニル基を有する化合物を有する表面である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の基材。
【請求項５】
前記化合物が、スルフィニル基を側鎖に有する重合体である、請求項４に記載の基材。
【請求項６】
前記表面が、重合体でコートされてなる表面である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の基材。
【請求項７】
前記重合体が非水溶性である、請求項５又は６に記載の基材。
【請求項８】
前記重合体のＨＬＢ値が１２以下である、請求項５〜７のいずれか１項に記載の基材。
【請求項９】
前記重合体が、親水性繰り返し単位と疎水性繰り返し単位とを含む重合体である、請求項５〜８のいずれか１項に記載の基材。
【請求項１０】
前記重合体が、前記親水性繰り返し単位として、スルフィニル基を側鎖に有する親水性繰り返し単位を含む、請求項９に記載の基材。
【請求項１１】
前記重合体が、前記疎水性繰り返し単位として、スチレン系疎水性繰り返し単位を含む、請求項９又は１０に記載の基材。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の基材を用いて細胞を培養して細胞凝集塊を形成する工程を含むことを特徴とする、
細胞凝集塊の形成方法。
【請求項１３】
前記細胞が接着性細胞である、請求項１２に記載の形成方法。
【請求項１４】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の基材を用いて細胞を培養して細胞凝集塊を形成する工程と、
当該細胞凝集塊を用いて物質をスクリーニングする工程とを含むことを特徴とする、
物質のスクリーニング方法。
【請求項１５】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の基材を用いて細胞を培養して細胞凝集塊を形成する工程と、
当該細胞凝集塊を用いて細胞の機能を探索する工程とを含むことを特徴とする、
細胞の機能探索方法。
【請求項１６】
細胞培養基材をコーティングするためのコーティング剤であって、スルフィニル基を有する化合物を含む、コーティング剤。
【請求項１７】
前記化合物が、スルフィニル基を側鎖に有する重合体である、請求項１６に記載のコーティング剤。
【請求項１８】
前記重合体が、スルフィニル基を側鎖に有する親水性繰り返し単位とスチレン系疎水性繰り返し単位とを含む重合体である、請求項１７に記載のコーティング剤。
【請求項１９】
前記重合体が、前記疎水性繰り返し単位を全繰り返し単位中３５〜８２質量％含む、請求項１８に記載のコーティング剤。
【請求項２０】
スルフィニル基を有する化合物を含む、細胞凝集塊形成促進剤。
【請求項２１】
前記化合物が、スルフィニル基を側鎖に有する重合体である、請求項２０に記載の細胞凝集塊形成促進剤。
【請求項２２】
前記重合体が、スルフィニル基を側鎖に有する親水性繰り返し単位とスチレン系疎水性繰り返し単位とを含む重合体である、請求項２１に記載の細胞凝集塊形成促進剤。
【請求項２３】
前記重合体が、前記疎水性繰り返し単位を全繰り返し単位中３５〜８２質量％含む、請求項２２に記載の細胞凝集塊形成促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞凝集塊形成用基材、細胞凝集塊の形成方法、物質のスクリーニング方法、細胞の機能探索方法、細胞培養基材用コーティング剤、及び細胞凝集塊形成促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来の細胞凝集形成用容器は、細胞が接着しにくい材料を利用した成形品が主流であったが（特許文献１及び２）、細胞接着性が過度に低いことに起因するアポトーシスによる細胞死や、栄養の供給不足による凝集体内部の壊死が問題となっていた。また、立体的な細胞凝集塊を形成させるためには、例えば壁で隔てられた小空間、Ｕ底やＶ底、或いはマイクロパターンのような特殊な形状にして重力等によって細胞を一か所に集合させることが必要だった（特許文献３、４及び５）。
そこで、基材上の特定の官能基の有無によって細胞の接着を制御し、細胞の凝集塊を形成する手法が報告されている（特許文献６及び７）。しかしながら、この手法を利用するためにはシランカップリング剤等により、基材表面を直接化学修飾する必要があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第２０１３／０９９９０１号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２０１３／０２２０８５号パンフレット
【特許文献３】特開２００６−３１４２８５号公報
【特許文献４】国際公開第２００７／１０５４１８号パンフレット
【特許文献５】国際公開第２０１１／０８３７６８号パンフレット
【特許文献６】国際公開第２０１０／１４７１２２号パンフレット
【特許文献７】特開２０１２−１８７０９７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
また、従来の技術では、立体的な細胞凝集塊を形成することと、この細胞凝集塊を容易に回収することを両立することが難しく、この要求を満足することが望まれる。
本発明が解決しようとする課題は、立体的であり且つ容易に回収できる細胞凝集塊を形成できる細胞凝集塊形成用基材を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
そこで、本発明者らは鋭意検討した結果、水を接触させたときの接触角が８５°以上である基材表面上で細胞凝集塊を形成させることにより、立体的であり且つ容易に回収できる細胞凝集塊を形成できることを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明は、以下の〔１〕〜〔２３〕を提供するものである。
【０００７】
〔１〕  水を接触させたときの接触角が８５°以上である表面を有する、細胞凝集塊形成用基材（以下、「本発明の基材」とも称する）。
〔２〕  前記表面が、フィブロネクチンを吸着させたときにフィブロネクチンの吸着量が０．３〜３．５ｎｇ／ｍｍ2となる表面である、前記〔１〕に記載の基材。
〔３〕  前記表面が、牛血清アルブミンを吸着させたときに牛血清アルブミンの吸着量が０．９５ｎｇ／ｍｍ2未満となる表面である、前記〔１〕又は〔２〕に記載の基材。
〔４〕  前記表面が、スルフィニル基を有する化合物を有する表面である、前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の基材。
〔５〕  前記化合物が、スルフィニル基を側鎖に有する重合体である、前記〔４〕に記載の基材。
〔６〕  前記表面が、重合体でコートされてなる表面である、前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の基材。
〔７〕  前記重合体が非水溶性である、前記〔５〕又は〔６〕に記載の基材。
〔８〕  前記重合体のＨＬＢ値が１２以下である、前記〔５〕〜〔７〕のいずれかに記載の基材。
〔９〕  前記重合体が、親水性繰り返し単位と疎水性繰り返し単位とを含む重合体である、前記〔５〕〜〔８〕のいずれかに記載の基材。
〔１０〕  前記重合体が、前記親水性繰り返し単位として、スルフィニル基を側鎖に有する親水性繰り返し単位を含む、前記〔９〕に記載の基材。
〔１１〕  前記重合体が、前記疎水性繰り返し単位として、スチレン系疎水性繰り返し単位を含む、前記〔９〕又は〔１０〕に記載の基材。
【０００８】
〔１２〕  前記〔１〕〜〔１１〕のいずれかに記載の基材を用いて細胞を培養して細胞凝集塊を形成する工程を含むことを特徴とする、細胞凝集塊の形成方法（以下、「本発明の細胞凝集塊の形成方法」とも称する）。
〔１３〕  前記細胞が接着性細胞である、前記〔１２〕に記載の形成方法。
〔１４〕  前記〔１〕〜〔１１〕のいずれかに記載の基材を用いて細胞を培養して細胞凝集塊を形成する工程と、当該細胞凝集塊を用いて物質をスクリーニングする工程とを含むことを特徴とする、物質のスクリーニング方法（以下、「本発明の物質のスクリーニング方法」とも称する）。
〔１５〕  前記〔１〕〜〔１１〕のいずれかに記載の基材を用いて細胞を培養して細胞凝集塊を形成する工程と、当該細胞凝集塊を用いて細胞の機能を探索する工程とを含むことを特徴とする、細胞の機能探索方法（以下、「本発明の細胞の機能探索方法」とも称する）。
【０００９】
〔１６〕  細胞培養基材をコーティングするためのコーティング剤であって、スルフィニル基を有する化合物を含む、コーティング剤（以下、「本発明のコーティング剤」とも称する）。
〔１７〕  前記化合物が、スルフィニル基を側鎖に有する重合体である、前記〔１６〕に記載のコーティング剤。
〔１８〕  前記重合体が、スルフィニル基を側鎖に有する親水性繰り返し単位とスチレン系疎水性繰り返し単位とを含む重合体である、前記〔１７〕に記載のコーティング剤。
〔１９〕  前記重合体が、前記疎水性繰り返し単位を全繰り返し単位中３５〜８２質量％含む、前記〔１８〕に記載のコーティング剤。
【００１０】
〔２０〕  スルフィニル基を有する化合物を含む、細胞凝集塊形成促進剤（以下、「本発明の細胞凝集塊形成促進剤」とも称する）。
〔２１〕  前記化合物が、スルフィニル基を側鎖に有する重合体である、前記〔２０〕に記載の細胞凝集塊形成促進剤。
〔２２〕  前記重合体が、スルフィニル基を側鎖に有する親水性繰り返し単位とスチレン系疎水性繰り返し単位とを含む重合体である、前記〔２１〕に記載の細胞凝集塊形成促進剤。
〔２３〕  前記重合体が、前記疎水性繰り返し単位を全繰り返し単位中３５〜８２質量％含む、前記〔２２〕に記載の細胞凝集塊形成促進剤。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の細胞凝集塊形成用基材、細胞凝集塊の形成方法、細胞凝集塊形成促進剤によれば、立体的であり且つ容易に回収できる細胞凝集塊を形成できる。
また、本発明のコーティング剤を用いて細胞培養基材の表面をコートすることにより、立体的であり且つ容易に回収できる細胞凝集塊を形成できる細胞凝集塊形成用基材とすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】牛血清アルブミン、フィブロネクチンをそれぞれ別に、本発明の基材の表面に吸着させたときの吸着量を示す図である。
【図２】本発明の基材の細胞（ヒト間葉系幹細胞）接着性を示す図である。
【図３−１】本発明の基材で１２時間培養したヒト間葉系幹細胞の接着の様子を示す共焦点蛍光顕微鏡写真である。
【図３−２】フィブロネクチンコートした基材、比較例１〜３の基材で１２時間培養したヒト間葉系幹細胞の接着の様子を示す共焦点蛍光顕微鏡写真である。
【図４−１】実施例１の基材でヒト間葉系幹細胞を培養したときの経時変化の様子を示す光学顕微鏡写真（培養開始から６、１２、２４時間後、倍率：４０倍）である。
【図４−２】実施例２の基材でヒト間葉系幹細胞を培養したときの経時変化の様子を示す光学顕微鏡写真（培養開始から６、１２、２４時間後、倍率：４０倍）である。
【図４−３】比較例３の基材でヒト間葉系幹細胞を培養したときの経時変化の様子を示す光学顕微鏡写真（培養開始から１２、２４時間後、倍率：４０倍）である。
【図５−１】実施例１、２の基材で４８時間培養したヒト間葉系幹細胞の凝集塊の様子を示す光学顕微鏡写真（倍率：４０倍、１００倍）である。
【図５−２】比較例３の基材で４８時間培養したヒト間葉系幹細胞の様子を示す光学顕微鏡写真（倍率：４０倍、１００倍）である。
【図６】実施例１、２の基材からピペッティングしたヒト間葉系幹細胞の凝集塊の走査型電子顕微鏡写真である。
【図７−１】実施例１、２の基材で１９２時間培養したヒト間葉系幹細胞の凝集塊の様子を示す共焦点顕微鏡写真（倍率：４０倍）である。
【図７−２】比較例３の基材で１９２時間培養したヒト間葉系幹細胞の様子を示す共焦点顕微鏡写真（倍率：４０倍）である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
＜細胞凝集塊形成用基材＞
本発明の細胞凝集塊形成用基材は、水を接触させたときの接触角が８５°以上である表面を有するものである。この表面としては、細胞凝集塊形成に用いる場合に細胞を播種する領域（細胞播種領域）の表面が好ましい。また、基材としては、細胞凝集塊形成に用いる場合に細胞を播種する領域を備え、且つ前記領域の表面の一部又は全部に水を接触させたときの接触角が８５°以上である細胞凝集塊形成用基材が好ましい。
なお、本明細書において、数値範囲等を表す「Ａ〜Ｂ」はＡ以上、Ｂ以下を意味し、Ａ及びＢをその数値範囲に含む。
【００１４】
（接触角）
本発明の基材は、水を接触させたときの接触角が８５°以上である表面を有するものである。この接触角が８５°未満の場合、細胞の接着が不充分又は過度になり、立体的な細胞凝集塊を形成できなくなる、或いは細胞凝集塊の回収が困難になる。
上記接触角は、本発明の所望の効果を高める点や細胞死を抑える点から、好ましくは８６°以上、より好ましくは８８°以上であり、また、本発明の所望の効果を高める点や細胞死を抑える点から、好ましくは１２０°以下、より好ましくは１１０°以下、更に好ましくは１００°以下、更に好ましくは９８°以下、更に好ましくは９５°以下、特に好ましくは９２°以下である。
ここで、本明細書において、接触角とは、液滴法により測定される静的接触角を意味し、具体的には、後述する実施例に記載の方法に従いθ／２法で測定される接触角をいう。
【００１５】
（フィブロネクチンの吸着量）
上記表面は、フィブロネクチンを吸着させたときのフィブロネクチン吸着量が、本発明の所望の効果を高める点から、好ましくは０．３ｎｇ／ｍｍ2以上、より好ましくは０．５ｎｇ／ｍｍ2以上、特に好ましくは１ｎｇ／ｍｍ2以上であり、また、適度な大きさの細胞凝集塊が形成され本発明の所望の効果が改善される点から、好ましくは５ｎｇ／ｍｍ2以下、より好ましくは３．５ｎｇ／ｍｍ2以下、更に好ましくは３ｎｇ／ｍｍ2以下、更に好ましくは２．５ｎｇ／ｍｍ2以下、特に好ましくは２ｎｇ／ｍｍ2以下である。
特に、フィブロネクチンを吸着させたときにフィブロネクチンの吸着量が０．３ｎｇ／ｍｍ2以上となる表面とすることにより、細胞の接着性が改善され、本発明の所望の効果を著しく高めることができる。また、フィブロネクチンを吸着させたときにフィブロネクチンの吸着量が３．５ｎｇ／ｍｍ2以下となる表面とすることにより、細胞の単層化・伸展を抑えることができ、立体的な細胞凝集塊を形成させやすくなる。
【００１６】
（牛血清アルブミンの吸着量）
上記表面は、牛血清アルブミンを吸着させたときの牛血清アルブミンの吸着量が、細胞接着性を足場として適度な範囲とすることにより本発明の所望の効果が高まる点で、好ましくは０．０５ｎｇ／ｍｍ2以上、より好ましくは０．１ｎｇ／ｍｍ2以上、更に好ましくは０．２ｎｇ／ｍｍ2以上、特に好ましくは０．３ｎｇ／ｍｍ2以上であり、また、適度な大きさの細胞凝集塊が形成され本発明の所望の効果が改善される点から、好ましくは３．７５ｎｇ／ｍｍ2未満、より好ましくは０．９５ｎｇ／ｍｍ2未満、更に好ましくは０．９ｎｇ／ｍｍ2以下、更に好ましくは０．８５ｎｇ／ｍｍ2以下、特に好ましくは０．８ｎｇ／ｍｍ2以下である。
特に、牛血清アルブミンを吸着させたときに牛血清アルブミンの吸着量が０．９５ｎｇ／ｍｍ2未満となる表面とすることにより、細胞凝集塊形成能が向上し、形成される細胞凝集塊の立体性・三次元性が改善される。
(質量比〔ＢＳＡ／ＦＮ〕)
上記表面は、牛血清アルブミンを吸着させたときの牛血清アルブミンの吸着量とフィブロネクチンを吸着させたときのフィブロネクチンの吸着量との質量比〔ＢＳＡ／ＦＮ〕が、本発明の所望の効果を高める点から、好ましくは０．２８以上、より好ましくは０．３以上、特に好ましくは０．３１以上であり、また、本発明の所望の効果を高める点から、好ましくは０．４８以下、より好ましくは０．４７以下、更に好ましくは０．４６以下、特に好ましくは０．４５以下である。
ここで、本明細書において、フィブロネクチンの吸着量は、非ラベル化フィブロネクチン溶液（溶媒：ＰＢＳ、濃度：１ｍｇ／ｍＬ程度）を用いて、125Ｉで放射ラベル化したフィブロネクチンの濃度を１０μｇ／ｍＬ程度に調整した液を、基材の底面積に対して約３μＬ／ｍｍ2相当量加えて、約３７℃で２時間程度静置した後、３５０ｍＬ程度のＰＢＳで３回洗浄したときにおけるフィブロネクチンの吸着量を意味し、この吸着量はガンマカウンター等により測定できる。フィブロネクチンの吸着量は、具体的には、後述する実施例に記載の方法に従い測定される吸着量をいう。
また、牛血清アルブミンの吸着量についても、上記と同様にして測定される吸着量をいうものとする。
なお、従来、基材表面の疎水性が大きい方が細胞凝集塊を形成させやすいと一般には考えられていたが、本発明者らはフィブロネクチンや牛血清アルブミンの吸着量、質量比〔ＢＳＡ／ＦＮ〕を上記のような範囲とすることにより、疎水性が大きい表面を有する基材よりも本発明の所望の効果を高めることができることを見出した。
【００１７】
（元素組成）
上記表面は、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）によって元素分析することにより算出されるイオウ原子濃度が、本発明の所望の効果を高める点から、好ましくは１ａｔｏｍ％以上、より好ましくは２ａｔｏｍ％以上、更に好ましくは２．５ａｔｏｍ％以上、特に好ましくは４ａｔｏｍ％以上であり、また、本発明の所望の効果を高める点から、好ましくは１２ａｔｏｍ％以下、より好ましくは１０ａｔｏｍ％以下、特に好ましくは８ａｔｏｍ％以下である。
また、上記表面は、ＸＰＳによって元素分析することにより算出される酸素原子濃度が、本発明の所望の効果を高める点から、好ましくは５ａｔｏｍ％以上、より好ましくは１０ａｔｏｍ％以上、特に好ましくは２０ａｔｏｍ％以上であり、また、本発明の所望の効果を高める点から、好ましくは４０ａｔｏｍ％以下、より好ましくは３５ａｔｏｍ％以下、特に好ましくは３０ａｔｏｍ％以下である。
また、上記表面は、ＸＰＳによって元素分析することにより算出される炭素原子濃度が、本発明の所望の効果を高める点から、好ましくは４０ａｔｏｍ％以上、より好ましくは５０ａｔｏｍ％以上、特に好ましくは６０ａｔｏｍ％以上であり、また、本発明の所望の効果を高める点から、好ましくは８５ａｔｏｍ％以下、より好ましくは８０ａｔｏｍ％以下、特に好ましくは７５ａｔｏｍ％以下である。
なお、上記各原子濃度は、具体的には、後述する実施例に記載の方法に従い元素分析することにより算出される原子濃度をいう。
【００１８】
（表面化合物）
本発明の基材としては、上記表面が化合物を有する表面であるものが挙げられる（以下、この化合物を化合物αとも称する）。
【００１９】
化合物αとしては、本発明の所望の効果を高める点から、スルフィニル基を有する化合物が好ましく、下記式（１）で表される基を有する化合物がより好ましい。
【００２０】
【化１】
2018164412.tif 000002
【００２１】
〔式（１）中、
Ｒ3は、直接結合又は炭素数１〜２４の２価の有機基を示し、
Ｒ4は、炭素数１〜１０の有機基を示す。〕
【００２２】
Ｒ3は、直接結合又は炭素数１〜２４の２価の有機基を示す。斯かる直接結合としては、単結合が挙げられる。
【００２３】
斯様なＲ3の中でも、炭素数１〜２４の２価の有機基が好ましい。斯かる２価の有機基の炭素数は、好ましくは２〜１８であり、より好ましくは２〜１０であり、更に好ましくは２〜９であり、特に好ましくは３〜６である。
【００２４】
上記２価の有機基としては、２価の炭化水素基が挙げられる。２価の炭化水素基は、好ましくは２価の脂肪族炭化水素基であり、直鎖状でも分岐状でもよい。具体的には、メタン−１，１−ジイル基、エタン−１，１−ジイル基、エタン−１，２−ジイル基、プロパン−１，１−ジイル基、プロパン−１，２−ジイル基、プロパン−１，３−ジイル基、プロパン−２，２−ジイル基、ブタン−１，２−ジイル基、ブタン−１，３−ジイル基、ブタン−１，４−ジイル基、ペンタン−１，４−ジイル基、ペンタン−１，５−ジイル基、ヘキサン−１，５−ジイル基、ヘキサン−１，６−ジイル基、ヘプタン−１，７−ジイル基、オクタン−１，８−ジイル基等のアルカンジイル基が挙げられる。
【００２５】
また、上記２価の有機基は、置換基を有していてもよく、炭素−炭素結合間にエーテル結合を含んでいてもよい。
上記２価の有機基が有していてもよい置換基としては、親水性基が挙げられる。親水性基としては、スルフィニル基、ヒドロキシ基、カルボキシ基、アミノ基、スルホ基、チオール基、リン酸基、アルデヒド基等が挙げられる。これらの中でも、適度な親水性が付与され、本発明の所望の効果が高まる点から、ヒドロキシ基が好ましい。
また、置換基の個数は、好ましくは１〜５であり、より好ましくは１〜３であり、更に好ましくは１又は２である。
また、上記エーテル結合の個数としては、０〜５が好ましく、０〜３がより好ましい。
【００２６】
また、２価の有機基の好適な具体例としては、下記式（３）で表される連結基、炭素数１〜２４のアルカンジイル基が挙げられ、より好ましくは式（３）で表される連結基である。
【００２７】
【化２】
2018164412.tif 000003
【００２８】
〔式（３）中、
Ｒ6は、単結合、−Ｒ8−Ｏ−（Ｒ8は、炭素数１〜４のアルカンジイル基を示す）又は下記式（４）で表される連結基を示し、
Ｒ7は、炭素数１〜４のアルカンジイル基を示し、
ｎは、１又は２を示し、
＊＊は、式（１）中のイオウ原子と結合する位置を示す。〕
【００２９】
【化３】
2018164412.tif 000004
【００３０】
〔式（４）中、
Ｒ9は、炭素数１〜４のアルカンジイル基を示し、
Ｒ10は、炭素数２又は３のアルカンジイル基を示し、
ｍ1は、１又は２を示し、
ｍ2は、１〜３の整数を示す。〕
【００３１】
上記Ｒ6としては、単結合、−Ｒ8−Ｏ−が好ましく、単結合が特に好ましい。
【００３２】
また、上記Ｒ7、Ｒ8及びＲ9で示されるアルカンジイル基の炭素数は１〜４であるが、１又は２が好ましい。
また、上記アルカンジイル基は直鎖状でも分岐状でもよい。具体的には、メタン−１，１−ジイル基、エタン−１，１−ジイル基、エタン−１，２−ジイル基、プロパン−１，１−ジイル基、プロパン−１，２−ジイル基、プロパン−１，３−ジイル基、プロパン−２，２−ジイル基、ブタン−１，２−ジイル基、ブタン−１，３−ジイル基、ブタン−１，４−ジイル基が挙げられる。
【００３３】
また、上記Ｒ10で示されるアルカンジイル基の炭素数は、好ましくは２である。また、該アルカンジイル基は直鎖状でも分岐状でもよく、例えば、エタン−１，１−ジイル基、エタン−１，２−ジイル基、プロパン−１，１−ジイル基、プロパン−１，２−ジイル基、プロパン−１，３−ジイル基、プロパン−２，２−ジイル基が挙げられる。なお、ｍ2が２又は３の場合、ｍ2個のＲ10は同一であっても異なっていてもよい。
また、ｎ及びｍ1としては１が好ましく、ｍ2としては１又は２が好ましい。
【００３４】
また、Ｒ4は、炭素数１〜１０の有機基を示す。該有機基の炭素数は、好ましくは２〜８であり、更に好ましくは２〜６である。上記有機基としては、炭化水素基が挙げられる。斯かる炭化水素基は、脂肪族炭化水素基、脂環式炭化水素基及び芳香族炭化水素基を包含する概念である。
【００３５】
上記Ｒ4における脂肪族炭化水素基は直鎖状でも分岐状でもよく、具体的には、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基等のアルキル基が挙げられる。
また、上記脂環式炭化水素基は、単環の脂環式炭化水素基と橋かけ環炭化水素基に大別される。上記単環の脂環式炭化水素基としては、シクロプロピル基、シクロヘキシル基等のシクロアルキル基が挙げられる。また、橋かけ環炭化水素基としては、イソボルニル基等が挙げられる。
また、上記芳香族炭化水素基としては、フェニル基等のアリール基が挙げられる。
【００３６】
また、Ｒ4で示される有機基は置換基を有していてもよく、該置換基及びその個数としては、Ｒ3における２価の有機基が有していてもよいものと同様のものが挙げられる。
また、親水性の観点から、Ｒ4としては、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基等の環構造を含まないものが好ましい。
【００３７】
上述のようなＲ4の好適な具体例としては、親水性基を有する炭素数１〜１０の有機基、炭素数１〜１０のアルキル基が挙げられ、好ましくは親水性基を有する炭素数１〜１０の有機基であり、より好ましくは親水性基を有する炭素数１〜１０のアルキル基であり、特に好ましくは下記式（５）で表される１価の基である。
【００３８】
【化４】
2018164412.tif 000005
【００３９】
〔式（５）中、
ｋ1は、１〜４の整数を示し、
ｋ2は、０〜４の整数を示し、
＊＊＊は、式（１）中のイオウ原子と結合する位置を示す。〕
【００４０】
式（５）中、ｋ1としては、１又は２が好ましい。また、ｋ2としては、０〜２の整数が好ましく、０又は１がより好ましい。
【００４１】
また、化合物αは低分子化合物でも高分子化合物（重合体）でもよいが、好ましくは重合体である（以下、この重合体を重合体βとも称する）。
重合体βとしては、本発明の所望の効果を高める点から、スルフィニル基を側鎖に有する重合体が好ましく、式（１）で表される基を側鎖に有する重合体がより好ましい。
【００４２】
また、重合体βとしては、本発明の所望の効果を高める点から、親水性繰り返し単位を含む重合体が好ましく、親水性繰り返し単位と疎水性繰り返し単位とを含む重合体がより好ましい（以下、親水性繰り返し単位を繰り返し単位（Ａ）とも称し、疎水性繰り返し単位を繰り返し単位（Ｂ）とも称する）。
【００４３】
（親水性繰り返し単位）
繰り返し単位（Ａ）は親水性を示す。繰り返し単位（Ａ）によって、基材表面を適度に親水化することができ、本発明の所望の効果を高めることができる。
ここで、本明細書において、親水性とは、水との親和力が強い性質を持つことを意味する。具体的には１種の繰り返し単位のみからなるホモポリマー（実施例の測定法による数平均分子量が１万〜１０万程度のもの）が、常温（２５℃）において純水１００ｇに対して１ｇ以上溶解する場合にはその繰り返し単位は親水性である。
【００４４】
また、繰り返し単位（Ａ）は、親水疎水の尺度を示すＨｙｄｒｏｐｈｉｌｅ−Ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ  Ｂａｌａｎｃｅ(ＨＬＢ値)が、好ましくは１０以上、より好ましくは１５以上、特に好ましくは２０以上であり、また、好ましくは５０以下、より好ましくは４０以下である。
また、本明細書において、ＨＬＢ値は、化合物の有機性の値と無機性の値の比率から算出されるもの（小田式）を意味し、「Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｗｉｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｏｎｃｅｐｔｉｏｎ  Ｄｉａｇｒａｍ」[１９９８年、ＮＩＨＯＮ  ＥＭＵＬＳＩＯＮ  ＣＯ．，ＬＴＤ]に記載の計算方法により算出できる。例えば、下記式で表される親水性繰り返し単位のＨＬＢ値は、（１００×３＋６０×１＋１４０）／（４０−１０×３＋２０×１０）×１０＝２３．８である。
【００４５】
【化５】
2018164412.tif 000006
【００４６】
また、繰り返し単位（Ａ）は、ノニオン性、アニオン性、カチオン性のいずれでもよく、また、ベタイン等の双性イオン構造をもつものでもよいが、ノニオン性のものが好ましい。
【００４７】
繰り返し単位（Ａ）を構成するモノマー種は特に限定されるものではなく、繰り返し単位（Ａ）としては、（メタ）アクリレート系親水性繰り返し単位、（メタ）アクリルアミド系親水性繰り返し単位、スチレン系親水性繰り返し単位等が挙げられ、これらのうち１種を単独で又は２種以上を含んでいてよい。中でも、（メタ）アクリレート系親水性繰り返し単位が好ましい。
なお、（メタ）アクリレート系のモノマー種に由来する繰り返し単位を（メタ）アクリレート系繰り返し単位といい、（メタ）アクリルアミド系のモノマー種に由来する繰り返し単位を、（メタ）アクリルアミド系繰り返し単位といい、スチレン系のモノマー種に由来する繰り返し単位を、スチレン系繰り返し単位という。
【００４８】
また、繰り返し単位（Ａ）としては、スルフィニル基を側鎖に有する親水性繰り返し単位が好ましい。なお、スルフィニル基の個数としては、繰り返し単位１個中に、１〜６個が好ましく、１〜３個がより好ましく、１又は２個が特に好ましい。
【００４９】
また、繰り返し単位（Ａ）は、スルフィニル基の他に、ヒドロキシ基、カルボキシ基、アミノ基、スルホ基、チオール基、リン酸基、アルデヒド基等のスルフィニル基以外の親水性基を有していてもよい。また、スルフィニル基以外の親水性基の位置及び個数は任意であるが、その位置は好ましくは重合体の側鎖である。また、スルフィニル基以外の親水性基の個数としては、適度な親水性を得る観点から、繰り返し単位１個中に、０〜１２個が好ましく、０〜１０個がより好ましく、０〜５個が更に好ましく、０〜３個が更に好ましく、１〜３個が更に好ましく、２又は３個が特に好ましい。また、上記親水性基の中でも、適度な親水性を得る観点から、ヒドロキシ基が好ましい。
【００５０】
また、上記繰り返し単位（Ａ）の好適な具体例としては、上記式（１）で表される基を側鎖に有する親水性繰り返し単位が挙げられ、より具体的には下記式（２）で表される繰り返し単位が挙げられる。
【００５１】
【化６】
2018164412.tif 000007
【００５２】
〔式（２）中、
Ｒ1は、水素原子又はメチル基を示し、
Ｒ2は、−Ｏ−、＊−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−、＊−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＲ5−、＊−ＮＲ5−（Ｃ＝Ｏ）−（Ｒ5は、水素原子又は炭素数１〜１０の有機基を示し、＊は、式（２）中のＲ1が結合している炭素原子と結合する位置を示す）又はフェニレン基を示し、
Ｒ3及びＲ4は前記と同義である。〕
【００５３】
Ｒ1は、水素原子又はメチル基を示すが、メチル基が好ましい。
【００５４】
また、Ｒ2は、−Ｏ−、＊−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−、＊−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＲ5−、＊−ＮＲ5−（Ｃ＝Ｏ）−又はフェニレン基を示す。斯かるフェニレン基としては、１，２−フェニレン基、１，３−フェニレン基、１，４−フェニレン基が挙げられる。
【００５５】
また、上記Ｒ5で示される有機基の炭素数は、好ましくは１〜１０であり、より好ましくは２〜８であり、更に好ましくは２〜６である。上記有機基としては、炭化水素基が挙げられる。斯かる炭化水素基は、脂肪族炭化水素基、脂環式炭化水素基及び芳香族炭化水素基を包含する概念である。
【００５６】
上記Ｒ5における脂肪族炭化水素基は直鎖状でも分岐状でもよく、具体的には、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基等のアルキル基が挙げられる。
また、上記脂環式炭化水素基は、単環の脂環式炭化水素基と橋かけ環炭化水素基に大別される。上記単環の脂環式炭化水素基としては、シクロプロピル基、シクロヘキシル基等のシクロアルキル基が挙げられる。また、橋かけ環炭化水素基としては、イソボルニル基等が挙げられる。
また、上記芳香族炭化水素基としては、フェニル基等のアリール基が挙げられる。
【００５７】
上述のようなＲ2の中でも、本発明の所望の効果を高める点から、＊−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−、フェニレン基が好ましく、＊−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−が特に好ましい。
【００５８】
なお、スルフィニル基を側鎖に有する親水性繰り返し単位以外の親水性繰り返し単位としては、スルフィニル基を含まないアニオン性の親水性繰り返し単位、スルフィニル基を含まないカチオン性の親水性繰り返し単位、スルフィニル基を含まないノニオン性の親水性繰り返し単位が挙げられる。スルフィニル基を含まないアニオン性の親水性繰り返し単位としては、ビニル安息香酸、（メタ）アクリル酸等の不飽和カルボン酸モノマー；スチレンスルホン酸、２−（メタ）アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、イソプレンスルホン酸等の不飽和スルホン酸モノマーに由来するものが挙げられる。スルフィニル基を含まないカチオン性の親水性繰り返し単位としては、アリルアミン、アミノスチレン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミド塩化メチル４級塩等の１〜４級アミノ基と不飽和結合を有するモノマーに由来するものが挙げられる。スルフィニル基を含まないノニオン性の親水性繰り返し単位としては、（メタ）アクリル酸ヒドロキシエチル、（メタ）アクリル酸グリセリル、（メタ）アクリル酸ポリオキシエチレン等のヒドロキシ基を有する不飽和カルボン酸エステルモノマー；Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）（メタ）アクリルアミド等のヒドロキシ基を有する（メタ）アクリルアミドモノマーに由来するものが挙げられる。
【００５９】
また、繰り返し単位（Ａ）の含有量は、本発明の所望の効果を高める点から、全繰り返し単位中、好ましくは８モル％以上、より好ましくは１２モル％以上、特に好ましくは１９モル％以上であり、また、本発明の所望の効果を高める点から、全繰り返し単位中、好ましくは４３モル％以下、より好ましくは４０モル％以下、特に好ましくは３５モル％以下である。
【００６０】
また、質量％としての繰り返し単位（Ａ）の含有量は、本発明の所望の効果を高める点から、全繰り返し単位中、好ましくは１７質量％以上、より好ましくは２２質量％以上、更に好ましくは３０質量％以上、特に好ましくは４０質量％以上であり、また、本発明の所望の効果を高める点から、全繰り返し単位中、好ましくは６６質量％以下、より好ましくは６１質量％以下、特に好ましくは５６質量％以下である。
なお、繰り返し単位（Ａ）の含有量は、後述する実施例に記載の方法に従い測定可能である。
【００６１】
（疎水性繰り返し単位）
繰り返し単位（Ｂ）は疎水性を示す。繰り返し単位（Ｂ）によって、本発明の所望の効果を高めることができる。
ここで、疎水性とは、水との親和性が低い性質を持つことを意味する。具体的には、１種の繰り返し単位のみからなるホモポリマー（実施例の測定法による数平均分子量が１万〜１０万程度のもの）が、常温（２５℃）において純水１００ｇに対して溶解する量が１ｇ未満である場合にはその繰り返し単位は疎水性である。
また、繰り返し単位（Ｂ）のＨＬＢ値は、好ましくは０．１以上であり、また、好ましくは１０未満、より好ましくは５未満、特に好ましくは１未満である。例えば、スチレン由来の繰り返し単位のＨＬＢ値は、０．９である。
【００６２】
繰り返し単位（Ｂ）を構成するモノマー種は特に限定されるものではなく、繰り返し単位（Ｂ）としては、スチレン系疎水性繰り返し単位、（メタ）アクリレート系疎水性繰り返し単位、（メタ）アクリルアミド系疎水性繰り返し単位等が挙げられ、これらのうち１種を単独で又は２種以上を含んでいてよい。中でも、スチレン系疎水性繰り返し単位が好ましい。
上記スチレン系疎水性繰り返し単位としては、下記式（６）で表される繰り返し単位が好ましい。
【００６３】
【化７】
2018164412.tif 000008
【００６４】
〔式（６）中、
Ｒ11は、水素原子又はメチル基を示し、
Ｒ12は、炭素数１〜１０の有機基を示し、
ｐは、０〜５の整数を示す。〕
【００６５】
式（６）中、Ｒ12で示される有機基としては、Ｒ5で示される有機基と同様のものが挙げられるが、その炭素数は、好ましくは１〜６であり、より好ましくは１〜３である。また、親水性基がないものが好ましい。なお、斯かる有機基は、炭素数１〜３のアルコキシ基等が置換していてもよい。また、ｐが２〜５の整数の場合、ｐ個のＲ12は同一であっても異なっていてもよい。
【００６６】
また、ｐは０〜５の整数を示すが、０〜３が好ましく、０がより好ましい。
【００６７】
スチレン系疎水性繰り返し単位の具体例としては、スチレン、４−メチルスチレン、２，４−ジメチルスチレン、２，４，６−トリメチルスチレン、４−エチルスチレン、４−イソプロピルスチレン、４−ｔｅｒｔ−ブチルスチレン、α−メチルスチレン等に由来する繰り返し単位が挙げられる。
【００６８】
また、繰り返し単位（Ｂ）の含有量は、本発明の所望の効果を高める点から、全繰り返し単位中、好ましくは６０モル％以上、より好ましくは６５モル％以上、特に好ましくは７０モル％以上であり、また、本発明の所望の効果を高める点から、全繰り返し単位中、好ましくは９１モル％以下、より好ましくは８９モル％以下、特に好ましくは８７モル％以下である。
また、質量％としての繰り返し単位（Ｂ）の含有量は、本発明の所望の効果を高める点から、全繰り返し単位中、好ましくは３５質量％以上、より好ましくは４０質量％以上、特に好ましくは４５質量％以上であり、また、本発明の所望の効果を高める点から、全繰り返し単位中、好ましくは８２質量％以下、より好ましくは８０質量％以下、更に好ましくは７８質量％以下、特に好ましくは７６質量％以下である。
なお、繰り返し単位（Ｂ）の含有量は、繰り返し単位（Ａ）の含有量と同様にして測定すればよい。
【００６９】
また、重合体βに含まれる繰り返し単位（Ａ）と繰り返し単位（Ｂ）とのモル比〔（Ａ）：（Ｂ）〕としては、本発明の所望の効果を高める点から、８：９２〜３５：６５が好ましく、１０：９０〜３０：７０がより好ましい。
また、上記繰り返し単位（Ａ）と繰り返し単位（Ｂ）との質量比＜（Ａ）：（Ｂ）＞としては、本発明の所望の効果を高める点から、２０：８０〜６０：４０が好ましく、２５：７５〜５５：４５がより好ましい。
【００７０】
また、繰り返し単位（Ａ）と繰り返し単位（Ｂ）の組み合わせとしては、本発明の所望の効果を高める点から、
（Ａ）スルフィニル基を側鎖に有する親水性繰り返し単位
（Ｂ）スチレン系疎水性繰り返し単位
の組み合わせが好ましく、
（Ａ）式（２）で表される親水性繰り返し単位
（Ｂ）スチレン系疎水性繰り返し単位
の組み合わせがより好ましく、
（Ａ）式（２）で表され、且つ式（２）中の側鎖部のヒドロキシ基の数が０〜３個である親水性繰り返し単位
（Ｂ）スチレン系疎水性繰り返し単位
の組み合わせが更に好ましく、
（Ａ）式（２）で表され、且つ式（２）中の側鎖部のヒドロキシ基の数が１〜３個である親水性繰り返し単位
（Ｂ）スチレン系疎水性繰り返し単位
の組み合わせが更に好ましく、
（Ａ）式（２）で表され、式（２）中の側鎖部のヒドロキシ基の数が１〜３個であり、且つ式（２）中のＲ2が＊−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−である親水性繰り返し単位
（Ｂ）スチレン系疎水性繰り返し単位
の組み合わせが特に好ましい。
また、これら組み合わせにおける繰り返し単位（Ａ）の含有量としては、全繰り返し単位中、１７〜６６質量％が好ましく、２２〜６１質量％がより好ましい。また、繰り返し単位（Ｂ）の含有量としては、全繰り返し単位中、３５〜８２質量％が好ましく、４０〜８０質量％がより好ましい。
【００７１】
また、重合体βとしては、コートを簡便且つ容易にする点や本発明の所望の効果を高める点から、線状重合体が好ましい。また、重合体βが共重合体である場合、その繰り返し単位の配列の態様は特に限定されず、共重合体は、ブロック共重合体、グラフト共重合体、ランダム共重合体、交互共重合体のいずれであってもよい。
また、重合体βの数平均分子量（Ｍn）としては、５０００〜１００万が好ましく、７０００〜２０万がより好ましく、１万〜１５万が特に好ましい。
また、分子量分布（Ｍw／Ｍn）としては、１．０〜５．０が好ましく、１．１〜４．０がより好ましく、１．２〜３．０が更に好ましく、１．５〜２．５が特に好ましい。
なお、上記数平均分子量及び分子量分布は、後述する実施例に記載の方法に従い測定すればよい。
【００７２】
また、化合物αは水溶性でも非水溶性でもよいが、化合物αとしては、コートを簡便且つ容易にする点や本発明の所望の効果を高める点から、非水溶性のものが好ましい。特に、化合物αとして非水溶性重合体を用いることにより、コートの簡便性や容易性、本発明の所望の効果を著しく高めることができる。
非水溶性の化合物αとしては、化合物の固形分１質量部に対して水（２５℃）９９質量部を添加・混合したときに、目視で透明にならない（沈殿や濁りが生じる）ものが好ましく、化合物の固形分１質量部に対して水（２５℃）１０００質量部を添加・混合したときに、目視で透明にならない（沈殿や濁りが生じる）ものがより好ましい。
また、化合物αは、エタノール可溶性のものでもエタノール不溶性のものでもよいが、化合物αとしては、エタノール可溶性のものが好ましい。エタノール可溶性の化合物αとしては、化合物の固形分１質量部に対してエタノール（２５℃）１０００質量部を添加・混合したときに、目視で透明になるものが好ましい。
また、化合物αとしては、ノニオン性のものが好ましい。
【００７３】
（化合物のＨＬＢ値）
化合物αのＨＬＢ値は、本発明の所望の効果を高める点から、好ましくは１．５以上、より好ましくは２．５以上、更に好ましくは３．５以上、特に好ましくは４以上であり、また、本発明の所望の効果を高める点から、好ましくは１２以下、より好ましくは１１．５以下、更に好ましくは１１以下、更に好ましくは１０．５以下、特に好ましくは１０以下である。特に、化合物αとしてＨＬＢ値が１２以下の重合体を用いることにより、本発明の所望の効果を著しく高めることができる。
【００７４】
なお、化合物αは常法を適宜組み合わせて製造できる。重合体βは、例えば、国際公開第２０１３／０９９９０１号パンフレット、国際公開第２０１３／０２２０８５号パンフレット等に記載の製造方法に準じ、必要に応じてモノマーの共重合割合を変更するなどして製造することができる。
【００７５】
また、本発明の基材は、化合物αで基材そのものが構成されているもの（例えば、化合物αのみから構成される基材）でも、化合物αで基材の上記表面がコートされてなるものでもよい。中でも、基材表面の化学修飾等を行うことなく低コスト且つ簡便に作製できる点から、水を接触させたときの接触角が８５°以上である表面として、化合物αでコートされてなる表面を有する基材が好ましく、水を接触させたときの接触角が８５°以上である表面として、重合体βでコートされてなる表面を有する基材がより好ましい。
また、化合物αのコート量は、好ましくは２０ｎｇ／ｍｍ2以上、より好ましくは３０ｎｇ／ｍｍ2以上、特に好ましくは４０ｎｇ／ｍｍ2以上であり、また、好ましくは１５０ｎｇ／ｍｍ2以下、より好ましくは１００ｎｇ／ｍｍ2以下、特に好ましくは８０ｎｇ／ｍｍ2以下である。なお、斯かるコート量は、後述する実施例に記載の方法に準じて測定することができる。
【００７６】
本発明の基材の形態としては、細胞培養基材（培養容器）として使用される形態が挙げられる。より具体的には、ディッシュ、シャーレ、マイクロプレート（マルチウェルプレート等）、フラスコ、ローラーボトル、細胞培養プロセスを有するデバイスのユニット等が挙げられる。
また、本発明の基材は、壁で隔てられた小空間、Ｕ底やＶ底、マイクロパターンのような特殊な形状をもたないような、平底タイプの基材である場合でも、その平面上で立体的（３次元的）な細胞凝集塊を形成させることができる。
【００７７】
また、化合物αでコートされる基材（細胞培養基材）の材質は、ポリカーボネート、ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）、ポリスチレン、アクリル樹脂等の有機材料；金、チタン、アルミ、鉄、銅、ステンレス、アルミナ、酸化チタン、酸化亜鉛等の無機材料のいずれでもよい。中でも、化合物αでコートされる基材の材質としては、有機材料が好ましい。化合物αは低温条件でコート処理を行うことができるため、有機材料で構成される細胞培養基材のコートに適する。
【００７８】
また、上記有機材料としては、高分子材料が好ましい。斯様な高分子材料としては、ポリスチレン、ＡＢＳ樹脂等のスチレン系ポリマー；ポリエチレン、ポリプロピレン等のオレフィン系ポリマー（環状オレフィン樹脂を含む）；ポリビニルアセテート、ポリ塩化ビニル、ポリビニルカルバゾール、ポリビニルピロリジン等のビニル系ポリマー；ポリ塩化ビニリデン、ポリフッ化ビニリデン等のハロゲン化ビニリデン系ポリマー；ポリアミド、ポリアクリルアミド等のアミド系ポリマー；ポリイミド、ポリエチレンイミド等のイミド系ポリマー；ポリシロキサン、ポリジメチルシロキサン等のシリコーン系ポリマー；ポリアセトニトリル、ポリアクリロニトリル等のニトリル系ポリマー；ポリビニルフェノール等のビニルフェノール系ポリマー；ポリビニルアルコール等のビニルアルコール系ポリマー；ポリウレタン等のウレタン系ポリマー；ポリカーボネート等のカーボネート系ポリマー；ポリベンゾイミダゾール等のベンゾイミダゾール系ポリマー；ポリエーテルエーテルケトン等のポリエーテルエーテルケトン系ポリマー；ポリアニリン等のアニリン系ポリマー；ポリアクリレート等のポリ（メタ）アクリレート類；ポリカプロラクトン等のポリエステル（ポリエチレンテレフタレート等の芳香族ポリエステル；ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリ乳酸・グリコール酸等のヒドロキシカルボン酸系ポリエステルを含む）；エポキシ樹脂（ＳＵ−８等を含む）；フェノール樹脂；メラミン樹脂；公知のレジスト材料の他、糖鎖高分子、タンパク質等が挙げられ、これらのうち１種又は２種以上含まれていてよい。また、上記糖鎖高分子としては、アガロース又はその誘導体、セルロース又はその誘導体（酢酸セルロース等）等の多糖類が挙げられる。また、上記タンパク質としては、コラーゲン又はその誘導体等が挙げられる。
本発明においては、高分子材料の中でもスチレン系ポリマーが特に好ましい。
【００７９】
そして、本発明の細胞凝集塊形成用基材によれば、細胞を単層化させることなく、立体的であり且つ容易に回収できる細胞凝集塊（スフェロイド）を形成できる。また、アポトーシスによる細胞死等を抑制することもでき、内部の細胞が生存している細胞凝集塊を形成させやすい。
【００８０】
＜コーティング剤、細胞凝集塊形成促進剤＞
本発明の細胞培養基材をコーティングするためのコーティング剤は、スルフィニル基を有する化合物を含むものである。
本発明の細胞凝集塊形成促進剤は、スルフィニル基を有する化合物を含むものである。
上記スルフィニル基を有する化合物は、上記化合物αのうちスルフィニル基を有するものであれば、いずれでもよい。
スルフィニル基を有する化合物の含有量としては、塗膜容易性や膜の均一性の観点から、本発明のコーティング剤、細胞凝集塊形成促進剤中、０．００１〜１０質量％が好ましく、０．１〜１質量％がより好ましい。
【００８１】
また、本発明のコーティング剤、細胞凝集塊形成促進剤は、溶剤、殺菌剤、防腐剤等を含んでいてもよい。溶剤としては、特に限定されないが、水；脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素、塩素化炭化水素等の炭化水素類；ジオキサン等の鎖状又は環状エーテル類；炭素数が１〜４の１〜４価の脂肪族アルコール等のアルコール類；エチルセロソルブ、ブチルセロソルブ等のセロソルブ類；酢酸メチル等のエステル類；ジホルムアミド等のアミド類が挙げられ、これら溶剤のうち１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いてよい。
【００８２】
そして、本発明のコーティング剤、細胞凝集塊形成促進剤を用いて、細胞培養基材の表面をコートすることにより、立体的であり且つ容易に回収できる細胞凝集塊（スフェロイド）を形成できる細胞凝集塊形成用基材とすることができる。また、アポトーシスによる細胞死等を抑制することもでき、内部の細胞が生存している細胞凝集塊を形成させやすい。
【００８３】
＜細胞凝集塊形成用基材の製造方法＞
本発明の基材は、常法に従い製造すればよい。例えば、細胞培養基材と化合物αを含む液剤（例えば、本発明のコーティング剤、細胞凝集塊形成促進剤）とを接触させることにより製造できる。この接触は、細胞培養基材に行われる通常のコーティング処理と同様に行えばよく、浸漬塗布法、スプレー塗布法、スピンキャスト法などのいずれでもよいが、具体的な方法としては、
【００８４】
（１）化合物αを含む液剤の溶液を細胞培養基材に接触させ、溶媒を残したまま溶液中で化合物αを細胞培養基材の表面に物理吸着させる方法、
（２）化合物αを含む液剤の溶液を細胞培養基材に接触させ、乾燥により溶媒を揮発させ、化合物αの乾燥膜を細胞培養基材の表面に形成させる方法
が挙げられる。
上記方法（１）においては、上記物理吸着をさせたのち、通常、溶液が流れ出るように基材を傾ける、基材を溶液から引き上げる、基材上の溶液を吹き飛ばす、溶媒を多量に注ぎ込むなどの方法により、溶液を取り除く工程を経て、化合物αが吸着した基材（細胞凝集塊形成用基材）を得ることができる。
【００８５】
＜細胞凝集塊の形成方法＞
本発明の細胞凝集塊の形成方法は、本発明の基材を用いて細胞を培養して細胞凝集塊を形成する工程を含むことを特徴とするものである。本発明の細胞凝集塊の形成方法は、本発明の基材を用いる以外は常法の細胞凝集塊形成方法と同様にして行えばよい。
【００８６】
培養する細胞としては、特に限定されないが、間葉系幹細胞、骨芽前駆細胞、肝細胞、肝幹細胞、心筋細胞、ガン細胞、ガン幹細胞、繊維芽細胞、神経細胞、血管内皮前駆細胞等の接着性細胞；神経系幹細胞、造血幹細胞、リンパ腫細胞等の非接着性細胞が挙げられ、多能性幹細胞でもよい。これらの中でも、接着性細胞が好ましい。本発明は、接着性細胞の細胞凝集塊を形成させるのに特に適している。
また、細胞は、立体的な細胞凝集塊が得やすくなる点で、１×１０3〜５×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｍ2の細胞密度で播種するのが好ましく、５×１０3〜１×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｍ2の細胞密度で播種するのがより好ましく、１×１０4〜５×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｍ2の細胞密度で播種するのが特に好ましい。
【００８７】
細胞の培養に使用する培地としては、特に限定されるものではないが、例えば、イーグル培地、Ｈａｍ’ｓ培地、Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ培地、ダルベッコ改変ＭＥＭ（ＤＭＥＭ）培地、ＭＥＭ培地、Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＭＣＤＢ１０４培地、１９９培地、ＭＣＤＢ１５３培地、Ｌ１５培地、ＳｋＢＭ培地、Ｂａｓａｌ培地、これらの混合培地が挙げられる。
また、培地は血清培地、無血清培地のいずれでもよいが、好ましくは血清培地である。血清としてはウシ胎児血清が挙げられる。また、培地には、炭素源（グルコース、二酸化炭素等）、窒素源（グルタミン等）、抗生物質、ビタミン源、ミネラル源等を添加してもよい。
また、培養条件としては好気的条件又は微好気的条件が好ましい。また、培養温度は、好ましくは１５〜４０℃であり、培養するときの初発ｐＨは、好ましくは３．０〜９．０であり、培養時間は、好ましくは５〜３６０時間である。
【００８８】
そして、本発明の細胞凝集塊の形成方法を用いることにより、培養した細胞各々が基材上で単層化せずにマイグレーションすることで立体的な細胞凝集塊（スフェロイド）を形成できる。また、基材上に形成された細胞凝集塊は、例えば、チップを装着させたマイクロピペット等を使用して、容易に剥離させることができ、また、細胞凝集塊として回収することができる。
したがって、本発明の細胞凝集塊の形成方法によれば、立体的であり且つ容易に回収できる細胞凝集塊（スフェロイド）を形成できる。さらに、アポトーシスによる細胞死等を抑制することができ、内部の細胞が生存している細胞凝集塊を形成させやすい。
また、ヒト、ラット、マウス、霊長類等の哺乳類等に由来する体細胞を培養細胞として用いた場合、体細胞を用いて形成された細胞凝集塊に特定の物質を所定量添加することで薬効を精査することができるため、本発明の物質のスクリーニング方法や本発明の細胞の機能探索方法に有用となる。
【００８９】
＜物質のスクリーニング方法＞
本発明の物質のスクリーニング方法は、本発明の基材を用いて細胞を培養して細胞凝集塊を形成する工程と、当該細胞凝集塊を用いて物質をスクリーニングする工程とを含むことを特徴とするものである。本発明の物質のスクリーニング方法は、本発明の基材を用いる以外は常法のスクリーニング方法と同様にして行えばよい。
物質のスクリーニングとしては、具体的には、肝細胞や心筋細胞を用いた物質の毒性の評価、ガン細胞を用いた薬剤の効果試験等が挙げられる。物質の毒性を評価する方法としては、ＭＴＴアッセイ、アラマーブルーアッセイ等の細胞増殖を基準とする方法が挙げられる。また、ＲＴ−ＰＣＲ、ＥＬＩＳＡ等の方法により、炎症性サイトカインの産生放出、癌化に関連する因子であるＳＤＦ−１、ＬＩＦ、ＥＧＦＲ等の量を定量することもできる。
また、個体毎の体細胞の細胞凝集塊を用いて物質をスクリーニングすることによって、テーラーメイド医療に応用することもできる。
【００９０】
＜細胞の機能探索方法＞
本発明の細胞の機能探索方法は、本発明の基材を用いて細胞を培養して細胞凝集塊を形成する工程と、当該細胞凝集塊を用いて細胞の機能を探索する工程とを含むことを特徴とするものである。本発明の細胞の機能探索方法は、本発明の基材を用いる以外は常法の細胞の機能探索方法と同様にして行えばよい。
本発明の細胞の機能探索方法は、細胞の生化学的機能の解明やバイオマーカーの探索に利用できる。
【実施例】
【００９１】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００９２】
〔実施例１〕
（重合体の合成）
以下の合成経路に従い、重合体を合成した。
【００９３】
【化８】
2018164412.tif 000009
【００９４】
グリシジルメタクリレート２．３０ｇ及びスチレン３．７０ｇと、重合開始剤として２，２’−アゾビス（イソブチロニトリル）０．０６０ｇと、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド１１．３ｇとを混合しフラスコに入れた。これに窒素を吹き込み、７５℃まで昇温し、８時間重合させ、その後室温に冷却した。この溶液をメタノールによる再沈殿で精製し、減圧乾燥した。プロトンＮＭＲにより測定したところ、得られた重合体のグリシジルメタクリレートから誘導された繰り返し単位の含有量は２９モル％であり、スチレンから誘導された繰り返し単位の含有量は７１モル％であった。
次いで、得られた重合液１７．３ｇ、チオグリセロール２．６２ｇ及びメタノール７．７６ｇを混合してフラスコに入れた。これに窒素を吹き込みながら６０℃まで昇温し、触媒としてトリエチルアミン０．３３ｇを添加した後２時間反応させ、その後室温に冷却した。
次いで、得られた重合体２８．０ｇを、メタノール８．５６ｇと水８．７３ｇとの混合溶媒に溶解させ、フラスコへ入れた。これに、３０質量％過酸化水素水溶液を５．４９ｇ添加し、４０℃で２時間反応させた。このようにして、目的とする重合体を得た。この重合体を重合体Ａとも称する。
【００９５】
（重合体の分析）
ＢＲＵＫＥＲ製モデルＡＶＡＮＣＥ５００（５００ＭＨｚ）を用いて（溶媒：ｄ６−ＤＭＳＯ、内部標準物質：ＴＭＳ）、1Ｈ−ＮＭＲ及び13Ｃ−ＮＭＲスペクトルにより、目的とする化学構造の重合体Ａが得られていることを確認した。また、重合体Ａにおける繰り返し単位の組成比を1Ｈ−ＮＭＲの積分比より確認した。
重合体Ａ  １ｇを純水１０００ｇに添加し混合したところ、重合体Ａは常温（２５℃）で純水に溶解しきらなかった。一方、重合体Ａ  １ｇをエタノール１０００ｇに添加したところ、重合体Ａは常温（２５℃）でエタノールに溶解した。このことから、重合体Ａは非水溶性であり、且つエタノールに可溶であることがわかった。
重合体Ａの数平均分子量（Ｍｎ）及び重量平均分子量（Ｍｗ）を、東ソー社製  ＴＳＫｇｅｌ  α−Ｍカラムを用い、流量：０．５ミリリットル／分、溶出溶媒：ＮＭＰ溶媒（Ｈ3ＰＯ4：０．０１６Ｍ、ＬｉＢｒ：０．０３０Ｍ）、カラム温度：４０℃の分析条件で、ポリスチレンを標準とするゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）により測定した。重合体Ａの数平均分子量は５６，０００であり、分子量分布は２．１１であった。
これら分析結果を表１に示す。
【００９６】
（細胞凝集塊形成用基材の作製（コート処理））
合成した重合体Ａ  １ｇを９０質量％エタノール水溶液９９ｇに溶解させ、濃度１質量％のポリマー溶液を得た。この溶液を３０ｇとり、９０質量％エタノール水溶液７０ｇに溶解させ、濃度０．３質量％のポリマー塗布液を得た。次に、９６ウェルのポリスチレン製マイクロプレート（ＩＷＡＫＩ製、表面処理なしＣａｔ．Ｎｏ．１８６０−０９６）に上記ポリマー塗布液を添加した後、３，０００ｒｐｍの速さでスピンコートした。室温で３０分間乾燥させた後、水洗し、更に室温で約一晩乾燥させ、細胞凝集塊形成用基材を得た。
【００９７】
〔実施例２及び３〕
共重合比が表１に示す比率になるように重合体原料の仕込み量を変更した以外は（実施例２：グリシジルメタクリレート１．４６ｇ、スチレン４．５４ｇ、実施例３：グリシジルメタクリレート０．９２ｇ、スチレン５．０８ｇ）、実施例１と同様にして各重合体及び細胞凝集塊形成用基材を得た。
【００９８】
〔比較例１及び２〕
（重合体の合成）
共重合比が表１に示す比率になるように重合体原料の仕込み量を変更した以外は（比較例１：グリシジルメタクリレート６．００ｇ、スチレン０ｇ、比較例２：グリシジルメタクリレート３．２９ｇ、スチレン２．７１ｇ）、実施例１と同様にして各重合体を得た。
（細胞凝集塊形成用基材の作製（コート処理））
得られた各重合体１ｇをそれぞれ水９９ｇに溶解させ、濃度１質量％のポリマー塗布液を得た。次に、９６ウェルのポリスチレン製マイクロプレート（ＩＷＡＫＩ製、表面処理なしＣａｔ．Ｎｏ．１８６０−０９６）に上記ポリマー塗布液を添加した後、２５℃で３０分間静置し、３回水洗することで、細胞凝集塊形成用基材を得た。
【００９９】
〔参考例〕
共重合比が表１に示す比率になるように重合体原料の仕込み量を変更した以外は（グリシジルメタクリレート０．５９ｇ、スチレン５．４１ｇ）、実施例１と同様にして重合体を得た。得られた重合体１ｇを純水１０００ｇに添加し混合したところ、重合体は常温（２５℃）で純水に溶解しなかった。さらに、得られた重合体１ｇをエタノール１０００ｇに添加し混合した場合も同様に溶解しなかった。なお、純水、エタノールの量を９９ｇに変更しても重合体は溶解しなかった。
【０１００】
実施例１〜３、比較例１〜２及び参考例で得た重合体の物性等を表１に示す。なお、分析方法は、実施例１で示したとおりである。
【０１０１】
【表１】
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【０１０２】
〔比較例３〕
比較例３の細胞凝集塊形成用基材として、９６ウェルのポリスチレン製マイクロプレート（ＩＷＡＫＩ製、表面処理なしＣａｔ．Ｎｏ．１８６０−０９６）をそのまま用いた。
【０１０３】
〔試験例１  接触角測定〕
各実施例及び比較例の細胞凝集塊形成用基材について、水を表面に接触させたときの接触角を液滴法により測定した。具体的には、協和界面科学株式会社製接触角計  ＤＲＯＰ  ＭＡＳＴＥＲ  ５００を用いて、１０μＬの水滴が基材表面に着滴してから１８０秒経過した後の水の接触角を、θ／２法により測定した。結果を表２に示す。
表２に示すとおり、実施例１〜３の基材は、水を表面に接触させたときの接触角が８５°以上であり、比較例１〜３の基材は、水を表面に接触させたときの接触角が８５°未満であった。
【０１０４】
〔試験例２  Ｘ線光電子分光分析〕
各実施例及び比較例の細胞凝集塊形成用基材について、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）により表面の元素組成分析を行なった。ＸＰＳの測定は、基材の表面を超音波カッターで切り出し、Ｘ線光電子分光分析装置（島津製作所製ＥＳＣＡ−３４００）を用いて分析することで行なった。結果を表２に示す。
表２に示すとおり、実施例１〜３の基材は、基材表面を構成する炭素原子の割合が小さく、酸素原子、硫黄原子の割合が大きかった。このことから、実施例１〜３の基材は、基材表面に重合体が吸着していることがわかる。
【０１０５】
〔試験例３  水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）による物理吸着量の定量〕
実施例１〜３及び比較例１〜２のコート処理によってポリスチレン表面に物理吸着した重合体のコート量を、ＱＣＭ測定法により見積もった。具体的手順を以下に示す。
０．２５質量％のポリスチレンクロロホルム溶液を振動子の金電極上にスピンコートして乾燥した。このポリスチレン表面に、実施例１におけるコート処理と同様の手法で実施例１〜３の各重合体をコート処理した（スピンコート法）。また、比較例１〜２の各重合体については、比較例１におけるコート処理と同様の手法でポリスチレン表面をコート処理した（ディップ法）。これら試料について、ＡＦＦＩＮＩＸ−Ｑ（イニシアム製）を用いて、振動子の振動数の変化を測定したところ、重合体の電極への吸着に伴って振動子の振動数が低下する様子が観測された。この振動数の減衰値から重合体の物理吸着量を見積もった。結果を表２に示す。
表２に示すとおり、実施例１〜３の重合体は、ポリスチレン表面に物理吸着しやすいものであった。
【０１０６】
【表２】
2018164412.tif 000011
【０１０７】
表２中の実施例１〜３及び比較例１〜２のＨＬＢ値は、これら実施例、比較例で得た重合体のＨＬＢ値を意味する。また、表２中の比較例３のＨＬＢ値は、マイクロプレートを構成する重合体（ポリスチレン）が有する繰り返し単位のＨＬＢ値を意味する。
【０１０８】
〔試験例４  タンパク吸着量の測定〕
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）又はフィブロネクチン（ＦＮ）を、濃度が１ｍｇ／ｍＬになるようにＰＢＳに添加し、タンパク質含有液を得た。このタンパク質含有液５０μＬに３．７ＭＢｑのＮａ125Ｉを５μＬ加え、クロラミンＴ存在下、室温で５分間振盪撹拌した後、ピロ亜硫酸ナトリウム（ＳＭＳ）水溶液を加えて反応を停止し、ＰＤ１０カラム（ＧＥヘルスケアライフサイエンス製）で放射ラベル化タンパクを精製した。次に、マイクロＢＣＡアッセイにて放射ラベル化タンパク量を測定し、非ラベル化タンパク溶液（溶媒：ＰＢＳ、濃度：１ｍｇ／ｍＬ）で、放射ラベル化タンパクの濃度を１０μｇ／ｍＬに調整した。この放射ラベル化タンパク含有液１００μＬ（基材の底面積に対して約３μＬ／ｍｍ2相当量）を、各実施例及び比較例の基材に添加し、３７℃で２時間静置した。次に、ＰＢＳ３５０ｍＬで３回洗浄し、ガンマカウンター（アロカ製ＡＲＣ−３８０ＣＬ）により吸着したタンパクの放射線量を測定した。上記と同じタンパク含有液の放射線量から検量線を作成し、この放射線量からタンパク吸着量を算定した。結果を図１及び表３に示す。
図１及び表３に示すとおり、実施例１〜３の基材は、牛血清アルブミンを表面に吸着させたときの牛血清アルブミンの吸着量とフィブロネクチンを表面に吸着させたときのフィブロネクチンの吸着量との質量比〔ＢＳＡ／ＦＮ〕が０．２８〜０．４８の範囲内であった。
【０１０９】
【表３】
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【０１１０】
〔試験例５  細胞（ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ））接着性の評価〕
各実施例及び比較例の細胞凝集塊形成用基材について、ヒト間葉系幹細胞ｈＭＳＣを用いて細胞接着性を評価した。具体的手順を以下に示す。
各実施例及び比較例の基材に、無血清ＤＭＥＭ培地（１質量％−ペニシリンストレプトマイシン含有）に分散したｈＭＳＣを、６×１０4ｃｅｌｌｓ／ｍｍ2の細胞密度で播種した後、３７℃でインキュベートした。インキュベート開始から２時間経過後及び６時間経過後に基材を洗浄することで基材に接着していない細胞を除去し、各洗浄終了後に、接着した生細胞のミトコンドリア活性をＭＴＴアッセイにより測定した。なお、上記洗浄は、培地を除去後、無血清培地を加える操作を２回繰り返し、新たなＤＭＥＭ培地（１０質量％−ＦＢＳ、１質量％−ペニシリンストレプトマイシン含有）で置換することで行なった。
また、ポリスチレン製マイクロプレート（ＩＷＡＫＩ製、表面処理なしＣａｔ．Ｎｏ．１８６０−０９６）をフィブロネクチン（溶媒：水、濃度：５０μｇ／ｍＬ）でコートした基材についても同様の測定を行い、このミトコンドリア活性を１．０として実施例及び比較例の基材の細胞接着性を評価した。結果を図２に示す。
図２に示すように、実施例１〜３の基材は、比較例１、３の基材よりも細胞接着がある程度抑えられており、また、比較例２の基材のように細胞接着がほとんどみられないということもなかった。実施例１〜３の基材は、細胞接着性が適度なものであると推察される。
【０１１１】
〔試験例６  接着細胞の蛍光観察〕
各実施例及び比較例の基材に、試験例５と同じ条件でｈＭＳＣを播種し、３７℃で１２時間インキュベートした後、ＰＢＳで非接着細胞を洗い、接着した細胞をパラホルムアルデヒドで固定化した。０．１％−ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で細胞の可溶化処理を行なった後、ファロイジンにより細胞骨格であるアクチンを、ＴＯ−ＰＲＯ−３により細胞核を、それぞれ染色し、共焦点レーザースキャン顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ製ＬＳＭ５１０）を用いて、基材上の接着細胞の様子を観察した。
また、ポリスチレン製マイクロプレート（ＩＷＡＫＩ製、表面処理なしＣａｔ．Ｎｏ．１８６０−０９６）をフィブロネクチン（溶媒：水、濃度：５０μｇ／ｍＬ）でコートした基材に播種を行う以外は上記と同様の操作を行ない、フィブロネクチンコート上の接着細胞の様子を蛍光観察した。
これらの結果を図３−１〜図３−２に示す。
【０１１２】
図３−２に示すとおり、フィブロネクチンコートした基材、比較例１、３の基材を用いた場合は、アクチン繊維の広い伸展が見られ、丸い形状の細胞凝集塊は確認できなかった（図３−２：フィブロネクチンコート、比較例１、比較例３）。これは、基材の細胞接着性が過度に高いためと推察される。また、比較例２の基材を用いた場合では、細胞やその凝集塊を確認できなかった（図３−２：比較例２）。これは、基材の細胞接着性が過度に低いためと推察される。
これに対し、実施例１〜３の基材を用いた場合は、アクチン繊維の伸展は見られず、丸い形状の細胞凝集塊が多数形成されていた（図３−１）。
【０１１３】
〔試験例７  細胞凝集塊形成の観察〕
実施例１、２及び比較例１〜３の基材で培養した細胞の経時変化の様子を観察した。また、細胞凝集塊の回収も試みた。具体的手順を以下に示す。
実施例１、２及び比較例１〜３の基材に、ＤＭＥＭ培地（１０質量％−ＦＢＳ、１質量％−ペニシリンストレプトマイシン含有（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製））に分散したｈＭＳＣを、６×１０4ｃｅｌｌｓ／ｍｍ2、１．５×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｍ2、３×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｍ2の異なる細胞密度で播種し、３７℃で培養した。培養開始から６時間、１２時間、２４時間、４８時間経過後に、光学顕微鏡（キーエンス製ＢＺ−Ｘ７００）で細胞の様子を観察した。また、細胞密度６×１０4ｃｅｌｌｓ／ｍｍ2の培養開始から４８時間経過後において、細胞の接着が観察されたものについては、当該観察後に、２００μＬチップを装着させたマイクロピペット（Ｇｉｌｓｏｎ製ピペットマン（商標））を使用して、細胞凝集塊の回収（ピペッティング）を試みた。
【０１１４】
その結果、比較例１、３の基材を用いた場合は、いずれの細胞密度で播種したときでも、６時間経過時には細胞の分散がみられたものの、その後細胞が単層の状態で伸展・増殖し、立体的な細胞凝集塊は形成されなかった（一例として、比較例３の基材に６×１０4ｃｅｌｌｓ／ｍｍ2で細胞を播種したときの１２時間、２４時間経過後の光学顕微鏡写真を図４−３に示す。また、４８時間経過後の光学顕微鏡写真の拡大図を図５−２に示す。）。また、細胞密度６×１０4ｃｅｌｌｓ／ｍｍ2の培養開始から４８時間経過後に、細胞凝集塊の回収を試みたが、比較例１、３の基材を用いた場合には、細胞凝集塊を回収することはできなかった。
また、比較例２の基材を用いた場合では、いずれの細胞密度で播種したときでも、基材に細胞が接着していないことが６時間経過時の観察で確認された。なお、細胞が接着していなかったため、比較例２の基材を用いた培養は６時間で停止した。
これに対して、実施例１、２の基材を用いた場合は、いずれの細胞密度で播種したときでも、細胞が均一に分散した後、単層化せずに自主的に集合・増殖して立体的な細胞凝集塊が形成された（一例として、実施例１、２の基材に６×１０4ｃｅｌｌｓ／ｍｍ2で細胞を播種したときの６時間、１２時間、２４時間経過後の光学顕微鏡写真を図４−１、図４−２に示す。また、４８時間経過後の光学顕微鏡写真の拡大図を図５−１に示す。）。さらに、細胞密度６×１０4ｃｅｌｌｓ／ｍｍ2の培養開始から４８時間経過後に、細胞凝集塊の回収を試みたところ、実施例１、２の基材で形成された細胞凝集塊は、容易に回収することができた。回収した細胞凝集塊のＳＥＭ像を図６に示す。なお、ＳＥＭ像は、日立製作所製Ｓ−４５０で撮影した。
【０１１５】
〔試験例８  ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤアッセイ〕
実施例１、２及び比較例３の基材で長期間培養したときの細胞の生存状態をＬＩＶＥ／ＤＥＡＤアッセイで確認した。具体的手順を以下に示す。
実施例１、２及び比較例３の基材に、無血清ＤＭＥＭ培地（１質量％−ペニシリンストレプトマイシン含有）に分散したｈＭＳＣを、６×１０4ｃｅｌｌｓ／ｍｍ2の細胞密度で播種した後、３日ごとに基材を洗浄して３７℃で合計１９２時間培養した。なお、基材の洗浄は、培地を除去後、無血清培地を加える操作を２回繰り返し、新たなＤＭＥＭ培地（１０質量％−ＦＢＳ、１質量％−ペニシリンストレプトマイシン含有）で置換することで行なった。
培養終了後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、カルセインＡＭ  約２μＭ及びＥｔｈＤ−１（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）  約４μＭを含有するワーキング溶液を細胞に直接添加することで多重染色を行なった。室温で１時間静置した後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、共焦点顕微鏡（キーエンス製ＢＺ−Ｘ７００）で観察を行なった。結果を図７−１〜図７−２に示す。
【０１１６】
図７−２に示すとおり、比較例３の基材を用いた場合は、培養開始から１９２時間経過後でも細胞の生存がみられたものの、カルセインＡＭによる染色で、単層化に起因するものとみられる細かい緑色蛍光が観測された。
これに対し、実施例１、２の基材を用いた場合は、単層化せずに立体的な細胞凝集塊が形成されており、しかも、カルセインＡＭによる生細胞の緑色蛍光が観測された一方で、ＥｔｈＤ−１による死細胞の赤色蛍光はほとんど観測されず、１９２時間経過後でも細胞凝集塊内部の細胞が生存していることが確認された（図７−１）。
【０１１７】
また、ｈＭＳＣを骨芽前駆細胞（ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１）に変更する以外は上記と同様にしてＬＩＶＥ／ＤＥＡＤアッセイを行なったところ、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１を用いた場合でも、実施例１、２の基材を用いたときは立体的な細胞凝集塊の形成が確認され、１９２時間経過後でも細胞凝集塊内部の細胞が生存していた。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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