(57)【要約】【課題】所望の遺伝子を幅広い植物種に効率よく導入するための手段を開発する。【解決手段】下記タンパク質：（ａ）１個のＶｉｒＤ２タンパク質、（ｂ）１個以上のＶｉｒＥ２タンパク質、または（ｃ）１個のＶｉｒＤ２タンパク質および１個以上のＶｉｒＥ２タンパク質、および植物細胞に導入される遺伝子を含む複合体であって、ＶｉｒＤ２タンパク質、ＶｉｒＥ２タンパク質のいずれかまたは両方に細胞膜透過ペプチド（ＣＰＰ）を融合させた複合体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記タンパク質：
（ａ）１個のＶｉｒＤ２タンパク質、
（ｂ）１個以上のＶｉｒＥ２タンパク質、または
（ｃ）１個のＶｉｒＤ２タンパク質および１個以上のＶｉｒＥ２タンパク質
および植物細胞に導入される遺伝子
を含む複合体であって、ＶｉｒＤ２タンパク質、ＶｉｒＥ２タンパク質のいずれかまたは両方に細胞膜透過ペプチド（ＣＰＰ）を融合させた複合体。
【請求項２】
ＣＰＰの８０％以上のアミノ酸残基がヒスチジン残基であり、ＣＰＰの長さが８アミノ酸以上である、請求項１記載の複合体。
【請求項３】
ＣＰＰの長さが１６アミノ酸以上である、請求項２記載の複合体。
【請求項４】
ＣＰＰのすべてのアミノ酸残基がヒスチジン残基である請求項１〜３のいずれか１項記載の複合体。
【請求項５】
下記の２つのプラスミド：
（ａ）１個のＶｉｒＤ２タンパク質、
（ｂ）１個以上のＶｉｒＥ２タンパク質、または
（ｃ）１個のＶｉｒＤ２タンパク質および１個以上のＶｉｒＥ２タンパク質
をコードする遺伝子を含むプラスミド；および
植物細胞に導入される遺伝子を含むプラスミド
をアグロバクテリウム属の細菌に導入し、該プラスミドを導入されたアグロバクテリウム属の細菌を培養し、次いでアグロバクテリウム属の細菌から該複合体を得ることを含む、請求項１記載の複合体の製造方法であって、ＶｉｒＤ２タンパク質をコードする遺伝子、ＶｉｒＥ２タンパク質をコードする遺伝子のいずれかまたは両方にＣＰＰをコードするポリヌクレオチドが融合されている、方法。
【請求項６】
下記のプラスミド：
（ａ）１個のＶｉｒＤ２タンパク質をコードする遺伝子および植物細胞に導入される遺伝子を含むプラスミド、
（ｂ）１個以上のＶｉｒＥ２タンパク質をコードする遺伝子および植物細胞に導入される遺伝子を含むプラスミド、または
（ｃ）１個のＶｉｒＤ２タンパク質および１個以上のＶｉｒＥ２タンパク質をコードする遺伝子および植物細胞に導入される遺伝子を含むプラスミド
をアグロバクテリウム属の細菌に導入し、該プラスミドを導入されたアグロバクテリウム属の細菌を培養し、次いでアグロバクテリウム属の細菌から該複合体を得ることを含む、請求項１記載の複合体の製造方法であって、ＶｉｒＤ２タンパク質をコードする遺伝子、ＶｉｒＥ２タンパク質をコードする遺伝子のいずれかまたは両方にＣＰＰをコードするポリヌクレオチドが融合されている、方法。
【請求項７】
ＣＰＰの８０％以上のアミノ酸残基がヒスチジン残基であり、ＣＰＰの長さが８アミノ酸以上である、請求項５または６記載の方法。
【請求項８】
ＣＰＰの長さが１６アミノ酸以上である請求項７記載の方法。
【請求項９】
ＣＰＰのすべてのアミノ酸残基がヒスチジン残基である請求項５〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれか１項記載の複合体を植物細胞に導入することを含む、植物細胞への遺伝子導入方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物細胞に遺伝子を導入するためのＤＮＡとタンパク質の複合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子導入技術は、基礎・応用研究を問わず多方面で利用されつつあり、現代における必須基盤技術である。しかし、植物を対象とした従来の遺伝子導入技術には、導入効率が必ずしも高くないという効率の悪さに加え、適用可能な生物種が限定されている汎用性の低さという二つの致命的な課題が存在している。
【０００３】
この最大の理由として、従来の遺伝子導入技術では、アグロバクテリウムによる植物細胞への感染を介する植物細胞内への遺伝子導入を必須のプロセスとしている点が挙げられる。従来法では、アグロバクテリウムの細胞内で、ＤＮＡとタンパク質（ＶｉｒＤ２、  ＶｉｒＥ２）の複合体（これをＴ−ＤＮＡ複合体と呼ぶ）を発現させ、アグロバクテリウムを植物細胞に感染させることで、このＴ−ＤＮＡ複合体を植物細胞内に導入する手法がとられている（非特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Gelvin SB. Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the "gene-jockeying" tool. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 67, 16-37. (2003)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
植物細胞側の防御反応によりアグロバクテリウムが感染しにくい植物種や、そもそもアグロバクテリウムが感染できない植物種では、遺伝子の導入効率が悪い、または遺伝子導入自体ができないという問題点が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を重ね、Ｔ−ＤＮＡ複合体を形成するＶｉｒＤ２タンパク質、ＶｉｒＥ２タンパク質のいずれかまたは両方に細胞膜透過ペプチド（ＣＰＰ）を融合させることにより、アグロバクテリウムの感染を要することなく所望の遺伝子を植物細胞に直接導入できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００７】
すなわち本発明は以下のものを提供する：
（１）下記タンパク質：
（ａ）１個のＶｉｒＤ２タンパク質、
（ｂ）１個以上のＶｉｒＥ２タンパク質、または
（ｃ）１個のＶｉｒＤ２タンパク質および１個以上のＶｉｒＥ２タンパク質
および植物細胞に導入される遺伝子
を含む複合体であって、ＶｉｒＤ２タンパク質、ＶｉｒＥ２タンパク質のいずれかまたは両方に細胞膜透過ペプチド（ＣＰＰ）を融合させた複合体；
（２）ＣＰＰの８０％以上のアミノ酸残基がヒスチジン残基であり、ＣＰＰの長さが８アミノ酸以上である、（１）記載の複合体；
（３）ＣＰＰの長さが１６アミノ酸以上である、（２）記載の複合体；
（４）ＣＰＰのすべてのアミノ酸残基がヒスチジン残基である（１）〜（３）のいずれか記載の複合体；
（５）下記の２つのプラスミド：
（ａ）１個のＶｉｒＤ２タンパク質、
（ｂ）１個以上のＶｉｒＥ２タンパク質、または
（ｃ）１個のＶｉｒＤ２タンパク質および１個以上のＶｉｒＥ２タンパク質
をコードする遺伝子を含むプラスミド；および
植物細胞に導入される遺伝子を含むプラスミド
をアグロバクテリウム属の細菌に導入し、該プラスミドを導入されたアグロバクテリウム属の細菌を培養し、次いでアグロバクテリウム属の細菌から該複合体を得ることを含む、請求項１記載の複合体の製造方法であって、ＶｉｒＤ２タンパク質をコードする遺伝子、ＶｉｒＥ２タンパク質をコードする遺伝子のいずれかまたは両方にＣＰＰをコードするポリヌクレオチドが融合されている、方法；
（６）下記のプラスミド：
（ａ）１個のＶｉｒＤ２タンパク質をコードする遺伝子および植物細胞に導入される遺伝子を含むプラスミド、
（ｂ）１個以上のＶｉｒＥ２タンパク質をコードする遺伝子および植物細胞に導入される遺伝子を含むプラスミド、または
（ｃ）１個のＶｉｒＤ２タンパク質および１個以上のＶｉｒＥ２タンパク質をコードする遺伝子および植物細胞に導入される遺伝子を含むプラスミド
をアグロバクテリウム属の細菌に導入し、該プラスミドを導入されたアグロバクテリウム属の細菌を培養し、次いでアグロバクテリウム属の細菌から該複合体を得ることを含む、請求項１記載の複合体の製造方法であって、ＶｉｒＤ２タンパク質をコードする遺伝子、ＶｉｒＥ２タンパク質をコードする遺伝子のいずれかまたは両方にＣＰＰをコードするポリヌクレオチドが融合されている、方法；
（７）ＣＰＰの８０％以上のアミノ酸残基がヒスチジン残基であり、ＣＰＰの長さが８アミノ酸以上である、（５）または（６）記載の方法；
（８）ＣＰＰの長さが１６アミノ酸以上である、（７）記載の方法；
（９）ＣＰＰのすべてのアミノ酸残基がヒスチジン残基である（５）〜（８）のいずれか記載の方法；
（１０）（１）〜（４）のいずれか記載の複合体を植物細胞に導入することを含む、植物細胞への遺伝子導入方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、アグロバクテリウムの感染を要することなく所望の遺伝子を植物細胞に直接導入できる。したがって、植物細胞側の防御反応によりアグロバクテリウムが感染しにくい植物種や、そもそもアグロバクテリウムが感染できない植物種に対して、効率良く遺伝子を導入できる。すなわち、本発明の複合体を用いれば、所望の遺伝子を幅広い植物種に効率よく迅速に導入することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、本発明の複合体の製造に用いたプラスミドの模式図である。Ａはプラスミド＃１、Ｂはプラスミド＃２、Ｃはこれらのプラスミドを導入したアグロバクテリウム菌体内での複合体の生成を示す。図中、Ｈ０〜Ｈ２０はヒスチジン残基０個〜２０個のＣＰＰ（ポリヒスチジン）を意味する。
【図２】図２は、アガロースゲル電気泳動による本発明により得られた複合体の同定結果を示す写真である。
【図３】図３は、様々な長さのポリヒスチジンを融合させた本発明の複合体（レポーター遺伝子としてルシフェラーゼを用いた）を植物細胞に導入して、植物細胞中のルシフェラーゼ活性を測定した結果を示すグラフである。ＶｉｒＤ２−ＨｎはＶｉｒＤ２タンパク質にヒスチジン残基ｎ個からなるポリヒスチジンが融合していることを示す。ＶｉｒＥ２−ＨｎはＶｉｒＥ２タンパク質にヒスチジン残基ｎ個からなるポリヒスチジンが融合していることを示す。縦軸はルシフェラーゼ活性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、１の態様において、下記タンパク質：
（ａ）１個のＶｉｒＤ２タンパク質、
（ｂ）１個以上のＶｉｒＥ２タンパク質、または
（ｃ）１個のＶｉｒＤ２タンパク質および１個以上のＶｉｒＥ２タンパク質
および植物細胞に導入される遺伝子
を含む複合体であって、ＶｉｒＤ２タンパク質、ＶｉｒＥ２タンパク質のいずれかまたは両方に細胞膜透過ペプチド（ＣＰＰ）を融合させた複合体（以下、「本発明の複合体」という）に関する。
【００１１】
ＶｉｒＤ２タンパク質およびＶｉｒＥ２タンパク質は、Ｔｉプラスミドの毒性領域中の遺伝子によってコードされている。これらのタンパク質は、植物に導入される遺伝子と複合体を形成することができる。
【００１２】
１の具体例において、本発明の複合体は、１個のＶｉｒＤ２タンパク質と植物に導入される遺伝子とを含む。この具体例において、ＶｉｒＤ２以外のＶｉｒタンパク質（ＶｉｒＡ、ＶｉｒＢ、ＶｉｒＣ、ＶｉｒＤ、ＶｉｒＥ、ＶｉｒＧタンパク質が知られている）が複合体に含まれていてもよい。この具体例において、複合体中の上記Ｖｉｒタンパク質の順序は任意であるが、植物に導入される遺伝子はＶｉｒＤ２タンパク質に結合している。
【００１３】
さらなる具体例において、本発明の複合体は、１個以上のＶｉｒＥ２タンパク質と植物に導入される遺伝子とを含む。ＶｉｒＥ２タンパク質の個数は１個ないし数個または数十個であってもよい。この具体例において、ＶｉｒＥ２以外のＶｉｒタンパク質が複合体に含まれていてもよい。この具体例において、複合体中の上記Ｖｉｒタンパク質の順序は任意であるが、植物に導入される遺伝子はＶｉｒＥ２タンパク質に結合している。
【００１４】
さらなる具体例において、本発明の複合体は、１個のＶｉｒＤ２タンパク質および１個以上のＶｉｒＥ２タンパク質と植物に導入される遺伝子とを含む。ＶｉｒＥ２タンパク質の個数は１個ないし数個または数十個であってもよい。この具体例において、ＶｉｒＤ２およびＶｉｒＥ２以外のＶｉｒタンパク質が複合体に含まれていてもよい。この具体例において、複合体中の上記Ｖｉｒタンパク質の順序は任意である。植物に導入される遺伝子はＶｉｒＤ２タンパク質またはＶｉｒＥ２タンパク質に結合している。
【００１５】
本発明の複合体において、ＶｉｒＤ２タンパク質、ＶｉｒＥ２タンパク質のいずれかまたは両方にＣＰＰが融合されている。融合とは化学結合によってＣＰＰがＶｉｒＤ２タンパク質またはＶｉｒＥ２タンパク質に結合されることをいう。ＶｉｒＤ２タンパク質またはＶｉｒＥ２タンパク質におけるＣＰＰの結合位置はいずれの位置であってもよいが、好ましくは、ＣＰＰはこれらのタンパク質のＮ末端またはＣ末端に結合している。
【００１６】
本発明の複合体中のＣＰＰは、長さが数アミノ酸以上、好ましくは８アミノ酸以上で、構成アミノ酸の半数以上がヒスチジンであるペプチドを提供する。このようなＣＰＰを融合させた本発明の複合体は、植物細胞への遺伝子導入効率が高い。
【００１７】
本発明の複合体中のＣＰＰの構成アミノ酸はヒスチジンが豊富であり、好ましくは構成アミノ酸残基の約８０％以上がヒスチジン残基であり、より好ましくは構成アミノ酸残基の約９０％以上がヒスチジン残基であり、さらに好ましくはすべての構成アミノ酸残基がヒスチジン残基である。
【００１８】
本発明の複合体中のＣＰＰの長さは８アミノ酸以上、好ましくは１６アミノ酸以上、より好ましくは２０アミノ酸以上である。したがって、本発明のペプチドの長さは、例えば、８アミノ酸〜数十アミノ酸、好ましくは１６アミノ酸〜数十アミノ酸、より好ましくは２０アミノ酸〜数十アミノ酸の範囲であってもよい。ここで、数十アミノ酸とは、１０〜１００未満の範囲の任意のアミノ酸数を意味する。
【００１９】
本発明の複合体中のＣＰＰの特に好ましい例として、すべての構成アミノ酸残基がヒスチジン残基であるＣＰＰが挙げられる。
【００２０】
本発明のペプチドを構成するヒスチジン以外のアミノ酸残基はいずれのアミノ酸残基であってもよく、天然アミノ酸残基、非天然アミノ酸残基、修飾アミノ酸残基、あるいは合成アミノ酸残基であってもよい。アミノ酸の合成や修飾は当業者が適宜行いうることである。好ましくは、本発明のペプチドを構成するヒスチジン以外のアミノ酸残基は、アルギニン、リジンなどの塩基性アミノ酸残基、あるいはヒスチジンと類似の特性を有するアミノ酸残基である。
【００２１】
植物に導入される遺伝子は１個であってもよく、複数個であってもよい。植物に導入される遺伝子の種類は１種類であってもよく、複数種類であってもよい。
【００２２】
本発明の複合体を用いれば、アグロバクテリウムによる感染というプロセスを経ずに、所望の遺伝子を直接植物細胞に導入することができる。そのため、所望の遺伝子を幅広い植物種に効率よく迅速に導入することができる。
【００２３】
本発明の複合体を遺伝子工学的手法によって製造してもよい。したがって、本発明は、さらなる態様において、下記の２つのプラスミド：
（ａ）１個のＶｉｒＤ２タンパク質、
（ｂ）１個以上のＶｉｒＥ２タンパク質、または
（ｃ）１個のＶｉｒＤ２タンパク質および１個以上のＶｉｒＥ２タンパク質
をコードする遺伝子を含むプラスミド；および
植物細胞に導入される遺伝子を含むプラスミド
をアグロバクテリウム属の細菌に導入し、該プラスミドを導入されたアグロバクテリウム属の細菌を培養し、次いでアグロバクテリウム属の細菌から該複合体を得ることを含む、本発明の複合体の製造方法であって、ＶｉｒＤ２タンパク質をコードする遺伝子、ＶｉｒＥ２タンパク質をコードする遺伝子のいずれかまたは両方にＣＰＰをコードするポリヌクレオチドが融合されている、方法に関する。
【００２４】
本発明の方法に用いられる、タンパク質をコードする遺伝子を含むプラスミドは、アグロバクテリウムの複製開始点を含む公知のプラスミド、例えばｐＢＩＮ１９、ｐＰＺＰ１１１、ｐＧｒｅｅｎ００２９、またはこれらを骨格としたプラスミドなどを骨格として用いて構築することができる。プラスミド中のプロモーター等のエレメントは、当業者が適宜選択することができる。
【００２５】
本発明の方法に用いられる、植物に導入される遺伝子をコードする遺伝子を含むプラスミドは、公知のプラスミド、例えばｐＢＩＮ１９、ｐＰＺＰ１１１、ｐＧｒｅｅｎ００２９、またはこれらを骨格としたプラスミドなどを骨格として用いて構築することができる。プラスミド中のプロモーター等のエレメントは、当業者が適宜選択することができる。
【００２６】
本発明の複合体の製造方法において、上記Ｖｉｒタンパク質をコードする遺伝子と植物細胞に導入される遺伝子とが１つのプラスミド中に含まれていてもよい。したがって、本発明は、さらなる態様において、下記のプラスミド：
（ａ）１個のＶｉｒＤ２タンパク質をコードする遺伝子および植物細胞に導入される遺伝子を含むプラスミド、
（ｂ）１個以上のＶｉｒＥ２タンパク質をコードする遺伝子および植物細胞に導入される遺伝子を含むプラスミド、または
（ｃ）１個のＶｉｒＤ２タンパク質および１個以上のＶｉｒＥ２タンパク質をコードする遺伝子および植物細胞に導入される遺伝子を含むプラスミド
をアグロバクテリウム属の細菌に導入し、該プラスミドを導入されたアグロバクテリウム属の細菌を培養し、次いでアグロバクテリウム属の細菌から該複合体を得ることを含む、請求項１記載の複合体の製造方法であって、ＶｉｒＤ２タンパク質をコードする遺伝子、ＶｉｒＥ２タンパク質をコードする遺伝子のいずれかまたは両方にＣＰＰをコードするポリヌクレオチドが融合されている、方法に関する。
【００２７】
本発明の複合体の製造方法において、ＶｉｒＥ２タンパク質をコードする遺伝子、ＶｉｒＤ２タンパク質をコードする遺伝子のいずれかまたは両方にＣＰＰをコードするポリヌクレオチドを融合させる。融合は、ＶｉｒＥ２タンパク質をコードする遺伝子またはＶｉｒＤ２タンパク質をコードする遺伝子の３’側で行ってもよく、５’側で行ってもよい。融合は、スペーサー配列を介して行ってもよく、介さずに行ってもよい。
【００２８】
次いで、プラスミドをアグロバクテリウム属の細菌に導入する。プラスミドの導入は公知の方法にて行うことができる。例えばヘルパープラスミドを用いたＭａｔｉｎｇによる方法、ヒートショックを用いる方法、もしくはエレクトロポレーションを用いる方法などを用いてもよい。
【００２９】
プラスミドを導入したアグロバクテリウム属の細菌を培養する。培養は公知の方法にて行うことができる。例えば、アグロバクテリウム属の細菌をＬＢ培地中、２８℃で適当時間培養してもよい。培養中にアグロバクテリウム属の細菌の菌体内で、プラスミドから発現したＶｉｒタンパク質と植物に導入される遺伝子が複合体を形成する。
【００３０】
次いで、遠心分離等の公知の方法を用いて、培養物からアグロバクテリウム属の細菌を分離し、菌体を破砕することによって本発明の複合体を得ることができる。菌体の破砕は、超音波処理、ホモジナイザー、ミル等の公知の手段を用いて行うことができる。
【００３１】
必要に応じて、カラムクロマトグラフィー等の公知の手段を用いて本発明の複合体を精製してもよい。
【００３２】
本発明の複合体は、上記のような遺伝子工学的手法によって製造できるが、化学合成法によって、あるいは遺伝子工学的手法と化学合成法を併用することによって製造してもよい。
【００３３】
さらに、本発明の複合体は、ＶｉｒＤ２タンパク質および／またはＶｉｒＥ２タンパク質、ならびに植物細胞に導入される遺伝子をインビトロにて混合することによって製造してもよい（ＶｉｒＤ２タンパク質、ＶｉｒＥ２タンパク質のいずれかまたは両方にＣＰＰが融合されている）。例えば、下記の組換えタンパク質：
（ａ）１個のＶｉｒＤ２タンパク質を含む組換えタンパク質、
（ｂ）１個以上のＶｉｒＥ２タンパク質を含む組換えタンパク質、または
（ｃ）１個のＶｉｒＤ２タンパク質および１個以上のＶｉｒＥ２タンパク質を含む組換えタンパク質
および
植物細胞に導入される遺伝子
をインビトロにて混合することにより、本発明の複合体を製造してもよい（ＶｉｒＤ２タンパク質、ＶｉｒＥ２タンパク質のいずれかまたは両方にＣＰＰが融合されている）。
【００３４】
本発明はさらなる態様において、本発明の複合体を植物細胞に導入することを含む、植物細胞への遺伝子導入方法に関する。本発明の複合体と植物細胞を培地中でインキュベーションすることにより、植物細胞に遺伝子を直接的に導入することができる。植物細胞への複合体の導入方法、培地の種類やインキュベーションの条件は、植物細胞の種類に応じて当業者が適宜選択、変更することができる。
【００３５】
本発明の遺伝子導入方法は、アグロバクテリウムの感染という従来法のボトルネックを排除しているため、従来法の課題点であった導入効率の悪さと植物細胞の汎用性の低さを克服するものである。
【００３６】
以下に実施例を示して本発明をより詳細かつ具体的に説明するが、実施例は本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００３７】
１）供試細胞
ポリヒスチジン融合Ｔ−ＤＮＡ複合体を発現させるアグロバクテリウムとしてＧＶ３１０１株を使用した。一方で、植物細胞としてタバコ培養細胞であるＢＹ−２株（ｒｐｃ００００１）を使用した。
【００３８】
２）組換えアグロバクテリウムの構築
Ｔ−ＤＮＡ複合体を構成するＶｉｒＤ２、ＶｉｒＥ２の両タンパク質に、ポリヒスチジンを融合したポリヒスチジン融合ＶｉｒＤ２、ＶｉｒＥ２を発現するプラスミド「プラスミド＃１」を構築した（図１Ａ）。この際、ＶｉｒＤ２とＶｉｒＥ２にそれぞれ５通りの鎖長のポリヒスチジン（ヒスチジン０、８、１２、１６、２０残基）を融合した組み合わせを設計したため、プラスミド＃１は全２５種類（５種類×５種類）を構築した。また、遺伝子導入を評価するためのレポーター遺伝子として、ルシフェラーゼ遺伝子（Ｌｕｃ遺伝子）を導入したプラスミド「プラスミド＃２」を構築した（図１Ｂ）。これらプラスミド＃１および＃２を一緒にアグロバクテリウムに導入することで、組換えアグロバクテリウム（全２５種類）を構築した。
【００３９】
プラスミド＃１を以下のようにして構築した。ｐＧｒｅｅｎ０２２９プラスミドの５３６位をインバースＰＣＲにより開環した。次いでこの開環部位に対して、５’側にＶｉｒＥ２発現カセット（ＶｉｒＥ ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ＶｉｒＥ２−ＣＰＰ−ＮＯＳ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）を、３’側にＶｉｒＤ２発現カセット（ＶｉｒＤ ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ＶｉｒＤ２−ＣＰＰ−ＮＯＳ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ法により導入することで、プラスミド＃１を構築した。
【００４０】
プラスミド＃２を以下のようにして構築した。ｐＰＺＰ１１１を骨格としたｐＧＷＢ４０２Ωプラスミドの１１６５位から２９０６位の間を、インバースＰＣＲにより開環・除去した。次いでこの開環部位に対して、ルシフェラーゼをコードする遺伝子をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ法により導入することで、プラスミド＃２を構築した。
【００４１】
アグロバクテリウムへのプラスミドの導入を以下のようにして行った。アグロバクテリウムのコンピテントセルを常温で溶解し、コンピテントセル２０μＬ に対し、プラスミド＃１とプラスミド＃２をそれぞれ５０ｎｇ加え、数回タッピングした。コンピテントセルとプラスミドの混合溶液を、あらかじめ氷上で冷やしておいたキュベットに移し、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ エレクトロポレーションシステム（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いて、エレクトロポレーションを行った。このときのＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒの設定は、２５μＦ、２００Ω、２，５００Ｖの条件で行った。エレクトロポレーション後、キュベットに素早く１ｍＬのＳＯＣ培地を加えた。３回ほどピペッティングし、１．５ ｍＬ容チューブに移した後に、２８℃、２時間で振とうしながらインキュベーションを行った。その後、ＬＢ寒天培地（１００μｇ／ｍＬ  スペクチノマイシン、５０μｇ／ｍＬ  カナマイシン含有）に植菌し、２８℃で一晩培養した。
【００４２】
３）ポリヒスチジン融合Ｔ−ＤＮＡ複合体の調製（図１Ｃ）
上記で構築した全２５種類の組換えアグロバクテリウムを、５ｍＬのＬＢ液体培地に植菌し、２８℃で一晩振とう培養した（前培養）。一晩培養した前培養液４ｍＬを、５０ｍＬのＬＢ液体誘導培地［カナマイシン５０μｇ／ｍＬ、スペクチノマイシン１００μｇ／ｍＬ、アセトシリンゴン２０μＭ、ＭＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ５．７）１０ｍＭ］に加え、２８℃で一晩振とう培養した。その後、遠心分離（５，０００ｇ  ｘ  ２０分、室温）により沈殿を回収した後、Ａｇｒｏ−ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ［ＭｇＣｌ２  １０ｍＭ、ＭＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ５．７）１０ｍＭ、アセトシリンゴン２００μＭ］にてＯＤ６００＝０．５になるように懸濁した。次いで、遮光した状態で、室温で一晩インキュベーションした。その後、１０ｍＬを１５ｍＬファルコンチューブに移し、遠心分離（４，０００ｒｐｍ  ｘ  １５分、４℃）により沈殿を回収した。沈殿に１ｍＬのＬＳ培地を加え懸濁した。この懸濁液を超音波破砕に供することで、菌体破砕液を得た。菌体破砕液を遠心分離（１３，０００ｒｐｍ  ｘ  １０分、４℃）に供し、上清を０．２２μｍシリンジフィルターに通過させることで、ポリヒスチジン融合Ｔ−ＤＮＡ複合体抽出液を得た。
【００４３】
生成された複合体（ＶｉｒＤ２タンパク質＋ＶｉｒＥ２タンパク質＋遺伝子）の確認は、Ｎｉ樹脂を用いたアフィニティー精製とＰＣＲを用いて行った。
【００４４】
まず、上記と同様の手法により、ポリヒスチジンが融合されていない複合体（ＶｉｒＤ２−Ｈ０  ＋  ＶｉｒＥ２−Ｈ０  ＋  Ｌｕｃ遺伝子）、ポリヒスチジンがＶｉｒＤ２のみに融合された複合体（ＶｉｒＤ２−Ｈ８  ＋  ＶｉｒＥ２−Ｈ０  ＋  Ｌｕｃ遺伝子）、ポリヒスチジンがＶｉｒＥ２のみに融合された複合体（ＶｉｒＤ２−Ｈ０  ＋  ＶｉｒＥ２−Ｈ８  ＋  Ｌｕｃ遺伝子）、ポリヒスチジンがＶｉｒＤ２とＶｉｒＥ２の両方に融合された複合体（ＶｉｒＤ２−Ｈ８  ＋  ＶｉｒＥ２−Ｈ８  ＋  Ｌｕｃ遺伝子）を調製した。
【００４５】
次いで、これらの複合体を、Ｎｉ樹脂を用いたアフィニティー精製に供することで、ポリヒスチジンが融合された複合体を回収した。アフィニティー精製Ｈｉｓ Ｍａｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｎｉ（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）を用いた。
最後に、回収した複合体にＬｕｃ遺伝子が含まれているか（ポリヒスチジンが融合されたＶｉｒＤ２またはＶｉｒＥ２とＬｕｃ遺伝子が複合体を形成しているか）を、ＰＣＲで確認した。回収した複合体を鋳型として、またＬｕｃ遺伝子に選択的なプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。
【００４６】
その結果、ポリヒスチジンがＶｉｒＤ２のみに融合された複合体（ＶｉｒＤ２−Ｈ８  ＋  ＶｉｒＥ２−Ｈ０  ＋  Ｌｕｃ遺伝子）、ポリヒスチジンがＶｉｒＥ２のみに融合された複合体（ＶｉｒＤ２−Ｈ０  ＋  ＶｉｒＥ２−Ｈ８  ＋  Ｌｕｃ遺伝子）、ポリヒスチジンがＶｉｒＤ２とＶｉｒＥ２の両方に融合された複合体（ＶｉｒＤ２−Ｈ８  ＋  ＶｉｒＥ２−Ｈ８  ＋  Ｌｕｃ遺伝子）を、Ｎｉ樹脂を用いたアフィニティー精製に供し、ＰＣＲを行った結果、Ｌｕｃ遺伝子の検出が確認された。すなわち、ポリヒスチジンを融合したＶｉｒＤ２およびＶｉｒＥ２は、Ｌｕｃ遺伝子と複合体を形成していることが確認された（図２）。
【００４７】
４）ポリヒスチジン融合Ｔ−ＤＮＡ複合体の細胞内導入の評価
継代３日目のＢＹ−２細胞（１ｍＬ）を２．０  ｍＬエッペンドルフチューブに分注した。このＢＹ−２細胞１ｍＬに対して、上記で得たポリヒスチジン融合Ｔ−ＤＮＡ複合体抽出液１ｍＬを加え、２８℃にて一晩振とう培養した。次いで、遠心分離（４，０００ｒｐｍ  ｘ  １０分、４℃）によりＢＹ−２細胞を回収し、１００μＬの×１  Ｐａｓｓｉｖｅ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製品）に懸濁した後、室温で１０分インキュベーションすることでＢＹ−２細胞を破砕した。細胞破砕液を遠心分離（１５，０００ｒｐｍ  ｘ  １０分、室温）し、上清にセレンテラジンを終濃度２μＭになるように添加し、室温で１０分インキュベーションした。ルミノメーター（ＧＥＮＥ  ＬＩＧＨＴ  ＧＬ−２２０Ａ）を用いて、細胞破砕液中のルシフェラーゼ活性を測定することで、ＢＹ−２細胞に対するポリヒスチジン融合Ｔ−ＤＮＡ複合体の導入を評価した。
【００４８】
５）結果
全２５種類の組換えアグロバクテリウムから調製したポリヒスチジン融合Ｔ−ＤＮＡ複合体について、ＢＹ−２細胞に対する遺伝子の直接導入を評価した。その結果、５種類のポリヒスチジン融合Ｔ−ＤＮＡ複合体（ＶｉｒＤ２−Ｈ８  ＋  ＶｉｒＥ２−Ｈ０、ＶｉｒＤ２−Ｈ１６  ＋  ＶｉｒＥ２−Ｈ０、ＶｉｒＤ２−Ｈ８  ＋  ＶｉｒＥ２−Ｈ８、ＶｉｒＤ２−Ｈ１６  ＋  ＶｉｒＥ２−Ｈ１２、ＶｉｒＤ２−Ｈ２０  ＋  ＶｉｒＥ２−Ｈ２０）を処理したＢＹ−２細胞において、ルシフェラーゼ活性が検出されたことから、これら５種類のポリヒスチジン融合Ｔ−ＤＮＡ複合体はＢＹ−２細胞に導入され、機能している（Ｌｕｃ遺伝子が発現している）ことが確認された（図３）。特に、ＶｉｒＤ２−Ｈ２０  ＋  ＶｉｒＥ２−Ｈ２０から構成されるポリヒスチジン融合Ｔ−ＤＮＡ複合体において、もっとも高いルシフェラーゼ活性が検出された。なお、上の表記、例えば「ＶｉｒＤ２−Ｈ２０  ＋  ＶｉｒＥ２−Ｈ２０」という場合は、ＶｉｒＤ２タンパク質に２０個のヒスチジン残基からなるポリヒスチジンが融合し、ＶｉｒＥ２タンパク質に２０個のヒスチジン残基からなるポリヒスチジンが融合しているＴ−ＤＮＡ複合体を意味する。
【００４９】
これらの結果から、本発明の複合体を用いた遺伝子導入方法の効果が実証された。
【００５０】
アグロバクテリウム感染を利用した従来の遺伝子導入法では、アグロバクテリウム感染から導入遺伝子の発現が確認されるまでに数日（３日以上）を要することが知られている。しかし、本発明の複合体を用いた遺伝子導入法においては、ポリヒスチジン融合Ｔ−ＤＮＡ複合体を処理してから１日後には導入遺伝子の発現が確認された。直接導入法においてこのような即効性が確認された理由として、直接導入法ではアグロバクテリウムの感染というプロセスを必要とせず、効率的（迅速）な遺伝子導入が実現できたためであると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明は、植物の研究、育種、品種改良などに利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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