(57)【要約】【課題】少なくとも１つのヒスチジンを含む免疫グロブリン可変ドメインを発現する、遺伝子改変された非ヒト動物であって、少なくとも１つのヒスチジンが、該動物の生殖細胞系列における非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換、または生殖細胞系列の免疫グロブリンの核酸配列におけるヒスチジンコドンの挿入によりコードされる、遺伝子改変された非ヒト動物を提供すること。【解決手段】１つまたは複数のＣＤＲに、Ｎ末端領域に、および／またはループ４領域にヒスチジンを含む免疫グロブリン遺伝子もまた提供される。非抗原結合性の非ヒスチジン残基を置換した、１つまたは複数のヒスチジン（例えば、ヒスチジンクラスター）を含む、免疫グロブリン可変ドメインである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書および図面に記載の物、方法またはシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
ｐＨ依存的な様式での抗原への結合が可能な抗体を発現する、遺伝子改変された非ヒト
動物である。プロトン化可能なアミノ酸をコードするコドンによる少なくとも１カ所の置
換またはプロトン化可能なアミノ酸をコードするコドンの少なくとも１カ所の挿入を含有
するように改変された免疫グロブリン遺伝子座を含む、遺伝子改変された非ヒト動物であ
る。免疫グロブリンの重鎖Ｖ遺伝子セグメント、重鎖Ｄ遺伝子セグメント、もしくは重鎖
Ｊ遺伝子セグメント、または軽鎖Ｖセグメントもしくは軽鎖Ｊセグメント、またはこれら
の再構成された重鎖ＶＤＪ領域もしくは再構成された軽鎖ＶＪ領域に少なくとも１カ所の
ヒスチジン置換および／または少なくとも１カ所のヒスチジン挿入を含有するように改変
された免疫グロブリン遺伝子座を含む、遺伝子改変された非ヒト動物である。抗原への結
合においてｐＨ感受性を示す免疫グロブリンを発現する、遺伝子改変された非ヒト動物で
ある。少なくとも１つのヒスチジンを含む免疫グロブリン可変ドメインに関して富化され
たＢ細胞集団を含む遺伝子改変動物である。免疫グロブリンの重鎖Ｖ遺伝子セグメント、
重鎖Ｄ遺伝子セグメント、および／もしくは重鎖Ｊ遺伝子セグメント、ならびに／または
軽鎖Ｖ遺伝子セグメントおよび／もしくは軽鎖Ｊ遺伝子セグメント、ならびに／またはこ
れらの再構成された重鎖ＶＤＪ配列もしくは再構成された軽鎖ＶＪ配列における挿入およ
び／または置換として存在する２つ以上のヒスチジンのクラスターを含む、遺伝子改変さ
れた非ヒト動物である。
【０００２】
再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列を含む、非ヒト動物の遺伝子
改変された免疫グロブリン遺伝子座であって、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌ
クレオチド配列が、少なくとも１つのヒスチジンコドンの付加または少なくとも１つの内
因性非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む免疫グロブリン遺伝子座で
ある。齧歯動物、例えば、マウスおよびラットを含む非ヒト動物は、それらのゲノムに、
再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列を含む遺伝子改変された免疫グ
ロブリン遺伝子座を含み、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、
少なくとも１つのヒスチジンコドンの付加または少なくとも１つの非ヒスチジンコドンの
ヒスチジンコドンによる置換を含む。遺伝子操作非ヒト動物は、ｐＨ依存性抗原結合、リ
サイクル性の改善、および／または血清半減期の延長を特徴とする抗原結合タンパク質を
発現することが可能である。
【背景技術】
【０００３】
背景
免疫グロブリンの結合ドメインは、同種の軽鎖（ｃｏｇｎａｔｅ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａ
ｉｎ）と会合するホモ二量体免疫グロブリン重鎖という従来の抗体フォーマットを含む多
種多様なフォーマットで治療的に使用されている。従来のフォーマットを含むこれらのフ
ォーマットの多くは、多種多様な因子に起因して、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける最適未満の薬
物動態特徴を示す。ここ数十年間において、薬物動態を改善するための異なる手法が試み
られてきた。これらは、例えば、ポリマーへのコンジュゲーション（例えば、ＰＥＧ；例
えば、Duncan,  R.（２００６年）、「Polymer  conjugates  as  anticancer  nanomedi
cines」、Nat.  Rev.  Cancer、６巻：６８８〜７０１頁において総説されている）によ
り流体力学半径を増加させて、腎クリアランスを低減すること；Ｎ−グリカンのシアル化
（例えば、Stork,  R.ら、「N-glycosylation  as  novel  strategy  to  improve  pha
rmacokinetic  properties  of  bispecific  single-chain  diabodies」、J.  Biol.  
Chem.、２８３巻（１２号）：７８０４〜７８１２頁において総説されている）；中性ｐ
ＨではＦｃ−ＦｃＲｎ間結合を促進するが、エンドソームのｐＨでは放出を促進するため
のＦｃ改変、および血清アルブミンとの会合（例えば、Chuangら（２００２年）、「Phar
maceutical  Strategies  Utilizing  Recombinant  Serum  Albumin」、Pharm.  Res.、
１９巻（５号）：５６９〜５７７頁を参照されたい）を含む。適切な適用では、そして、
適切なフォーマットでは、これらの手法の各々は、何らかの利益をもたらし得る。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Duncan,  R.（２００６年）、「Polymer  conjugates  as  anticancer  nanomedicines」、Nat.  Rev.  Cancer、６巻：６８８〜７０１頁
【非特許文献２】Stork,  R.ら、「N-glycosylation  as  novel  strategy  to  improve  pharmacokinetic  properties  of  bispecific  single-chain  diabodies」、J.  Biol.  Chem.、２８３巻（１２号）：７８０４〜７８１２頁
【非特許文献３】Chuangら（２００２年）、「Pharmaceutical  Strategies  Utilizing  Recombinant  Serum  Albumin」、Pharm.  Res.、１９巻（５号）：５６９〜５７７頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、当技術分野には、ｐＨ依存性結合を示す可変ドメインを工学的に作製する（ｅ
ｎｇｉｎｅｅｒ）ように免疫グロブリン可変ドメイン構造を操作すること（ｍａｎｉｐｕ
ｌａｔｉｎｇ）を含むがこれらに限定されない、生物医薬品のための治療効果および治療
モダリティーの改善に対する必要性が依然としてある。様々なフォーマットの抗原結合タ
ンパク質における使用のための可変ドメインであって、抗原結合タンパク質に、標的抗原
または受容体への結合に関するｐＨ感受性を付与する可変ドメイン（またはその抗原結合
断片）に対する必要性がある。当技術分野には、ｐＨ依存性の免疫グロブリン可変ドメイ
ンおよびその抗原結合断片を生成するための系および方法に対する必要性もまたある。多
種多様な免疫グロブリン可変ドメインを生成し得る生物学的系であって、多種多様性が、
可変ドメインに、ｐＨ感受性、例えば、１つのｐＨ（例えば、中性ｐＨ、または高ｐＨ）
では標的抗原またはエピトープに結合するが、第二のｐＨ（例えば、低ｐＨまたはエンド
ソームのｐＨ）では標的抗原またはエピトープを放出する能力を付与し得る、滴定可能な
アミノ酸に関して富化される生物学的系に対する必要性がある。
【０００６】
ある種のフォーマットにある免疫グロブリン軽鎖は、固有の難題を提示する。抗体は、
各重鎖モノマーが同一の軽鎖と会合しているホモダイマー重鎖成分を一般的に含む。ヘテ
ロダイマー重鎖成分を有する抗体（例えば、二重特異性抗体）は、治療抗体として望まし
い。しかし、二重特異性抗体の重鎖の各々と十分に会合することができる好適な軽鎖成分
を有する二重特異性抗体を作製することには、問題があることが判明した。  
【０００７】
１つの手法では、全ての軽鎖可変ドメインの使用統計値を調査し、ヒト抗体で最も頻繁
に使用される軽鎖を同定し、その軽鎖を異なる特異性の２つの重鎖とｉｎ  ｖｉｔｒｏで
対合させることによって、軽鎖を選択することができる可能性がある。
【０００８】
別の手法では、ファージディスプレイライブラリー（例えば、ヒト軽鎖可変領域配列を
含むファージディスプレイライブラリー、例えばヒトｓｃＦｖライブラリー）において軽
鎖配列を観察し、最も一般的に用いられる軽鎖可変領域をライブラリーから選択すること
によって、軽鎖を選択することができる可能性がある。次に、軽鎖を、目的の２つの異な
る重鎖について試験することができる。
【０００９】
別の手法では、目的の両方の重鎖の重鎖可変配列をプローブとして用いて、軽鎖可変配
列のファージディスプレイライブラリーを分析することによって、軽鎖を選択することが
できる可能性がある。両方の重鎖可変配列と会合する軽鎖は、それら重鎖のための軽鎖と
して選択することができる可能性がある。
【００１０】
別の手法では、候補軽鎖を重鎖の関連軽鎖とアラインメントさせることができ、両方の
重鎖の関連軽鎖に共通する配列特性により緊密に一致するように軽鎖が改変される。免疫
原性の可能性を最小にする必要がある場合、改変は好ましくは、公知のヒト軽鎖配列に存
在する配列をもたらし、ここで、タンパク分解プロセシングが、免疫原性の可能性を評価
するための当技術分野で公知であるパラメータおよび方法（すなわち、ｉｎ  ｓｉｌｉｃ
ｏおよびウェットアッセイ）に基づいたＴ細胞エピトープを生成する可能性は低い。
【００１１】
このような手法のいずれも、例えば配列同一性、特異的な前選択された重鎖と会合する
能力などのいくつかのアプリオリ制限を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法に依存する。共通す
る軽鎖を含むヒトエピトープ結合タンパク質を作製するための、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件に
おける操作に頼らず、代わりにより生物学的で実用的な手法を使用する組成物および方法
への必要性が当技術分野にある。
【００１２】
加えて、治療抗体、例えば、二重特異性治療抗体は、それらが、所望の有効性を達成す
るには、しばしば、高用量を必要とするという点で、ある限界を有する。これは、抗体−
抗原複合体がエンドソームへと内部移行して、標的介在性クリアランスと呼ばれるプロセ
スにおけるリソソーム分解の標的とされるという事実に部分的に起因する。したがって、
当技術分野には、より効率的な抗体リサイクリング、例えば、二重特異性抗体リサイクリ
ングをもたらし、抗体の抗原に対する特異性および親和性を損なわずに、エンドソームコ
ンパートメント内の抗体−抗原複合体の解離を促進することにより、抗体の分解を防止す
る方法および組成物に対する必要性がある。
【００１３】
体内へと投与される、治療用モノクローナル抗体を含む薬物は、糸球体濾過（例えば、
尿への）、分泌（例えば、胆汁への）、および細胞による異化を含む様々な排泄機構から
影響を受ける可能性がある。低分子が体内から腎濾過を介して除去されるのに対し、分泌
される抗体の大部分（例えば、ＩｇＧは糸球体を介して濾過されるには大きすぎる）は、
主に細胞介在性異化、例えば、液相エンドサイトーシス（食作用）または受容体介在性エ
ンドサイトーシスを介して体内から除去される。例えば、いくつかの反復エピトープを有
する可溶性分子には、複数の循環抗体が結合し、結果として生じる大型の抗原−抗体複合
体は、細胞内に迅速に貪食されて、分解される。他方、抗体が結合する細胞表面の標的受
容体（すなわち、受容体−抗体複合体）は、用量依存的な様式で標的介在性エンドサイト
ーシスを受け、これにより、細胞内部でのリソソームによる分解を予定されたエンドソー
ムの形成がなされる。場合によって、エンドサイトーシスを受けた受容体−抗体複合体は
、エンドソームの内部において、ｐＨ依存的な様式で、胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に
結合し、細胞表面へと戻り、中性の細胞外ｐＨ（例えば、ｐＨ７．０〜７．４）へと曝露
されると、血漿または間質液へと放出される。
【００１４】
当技術分野には、系、例えば、滴定可能な残基を有する抗原結合タンパク質を生成する
非ヒト動物、細胞、およびゲノム遺伝子座、例えば、ｐＨの変化に応答する重鎖可変ドメ
イン、例えば、プロトンを供与または受容し、例えば、それらの結合特徴がプロトン化状
態に応じて異なる重鎖可変ドメインを生成するように、免疫グロブリン遺伝子セグメント
を再構成する、遺伝子改変された遺伝子座に対する必要性がある。
【００１５】
当技術分野には、目的の抗原に対する抗原結合タンパク質の特異性および親和性を損な
うことなく、抗原結合タンパク質の受容体−抗原結合タンパク質複合体からの解離を促進
すること、または酸性のエンドソームコンパートメント内でのＦｃＲｎに対する抗原結合
タンパク質の親和性を増大させることにより、エンドサイトーシスを受けた抗原結合タン
パク質のリサイクリング効率をさらに増大させることが可能な方法および組成物に対する
必要性もある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
非ヒト動物の生殖細胞系列の改変によりコードされる、少なくとも１つのヒスチジン残
基を含む免疫グロブリン可変ドメインを作製する遺伝子改変動物を作製するための組成物
および方法であって、生殖細胞系列における改変が、重鎖Ｖセグメント、重鎖Ｄセグメン
ト、または重鎖Ｊセグメントへのヒスチジンコドンの挿入、軽鎖Ｖセグメントまたは軽鎖
Ｊセグメントへのヒスチジンコドンの挿入、再構成された軽鎖ＶＪ遺伝子へのヒスチジン
コドンの挿入、重鎖Ｖセグメント、重鎖Ｄセグメント、または重鎖Ｊセグメントにおける
非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換、軽鎖Ｖセグメントまたは軽鎖Ｊセグ
メントにおける非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換、再構成された軽鎖Ｖ
Ｊ配列における非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換のうちの少なくとも１
つを含む組成物および方法が提供される。
【００１７】
非ヒト動物の生殖細胞系列の免疫グロブリン配列にヒスチジンコドンのクラスターを導
入するための組成物および方法もまた提供される。
【００１８】
免疫グロブリン遺伝子のＮ末端コード領域に、免疫グロブリン遺伝子のループ４コード
領域に、免疫グロブリン遺伝子のＣＤＲコード領域（例えば、再構成されたＶ（Ｄ）Ｊ配
列、またはＶ遺伝子セグメント、（Ｄ）遺伝子セグメント、Ｊ遺伝子セグメント）に、ヒ
スチジンの挿入、または非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を導入するた
めの組成物および方法もまた提供される。
【００１９】
免疫グロブリン重鎖遺伝子座および免疫グロブリン軽鎖遺伝子座の両方に、ヒスチジン
コドンの挿入および／または非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む非
ヒト動物の子孫を作製するための組成物および方法である。
【００２０】
一態様では、免疫グロブリン可変遺伝子座に、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンの
ヒスチジンコドンによる置換または挿入を含む、免疫グロブリン遺伝子座をその生殖細胞
系列に含む、遺伝子改変された非ヒト動物である。一実施形態では、可変遺伝子座（例え
ば、再構成されていないＶ（Ｄ）Ｊセグメント遺伝子座）は、ヒト可変（Ｖ（Ｄ）Ｊセグ
メント）遺伝子座の少なくとも一部分を含む。
【００２１】
一実施形態では、遺伝子改変された非ヒト動物は、第一の可変遺伝子座（例えば、再構
成されていない免疫グロブリン重鎖（Ｖ（Ｄ）Ｊセグメント遺伝子座）および第二の可変
遺伝子座（例えば、再構成されていない免疫グロブリン軽鎖（Ｖセグメント遺伝子座、Ｊ
セグメント遺伝子座；または再構成された免疫グロブリン軽鎖ＶＪ配列）をその生殖細胞
系列に含む。
【００２２】
一実施形態では、非ヒト動物は、第一の可変遺伝子座および第二の可変遺伝子座を含み
、少なくとも第一の可変遺伝子座または第二の可変遺伝子座は、少なくとも１つのヒスチ
ジンコドンの挿入または少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる
置換を含む。
【００２３】
一実施形態では、第一の可変遺伝子座および第二の可変遺伝子座の両方が各々、少なく
とも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換または挿入を含む。
【００２４】
一実施形態では、第一の可変遺伝子座は、再構成されていない重鎖可変遺伝子座（再構
成されていないＶセグメント、Ｄセグメント、Ｊセグメント）の少なくとも機能性部分を
含む。
【００２５】
一実施形態では、再構成されていない重鎖可変遺伝子座は、ヒト遺伝子座（再構成され
ていないＶセグメント、Ｄセグメント、Ｊセグメント）の少なくとも一部分を含む。
【００２６】
一実施形態では、再構成されていない重鎖遺伝子座は、再構成されていないＶセグメン
ト、リンカーを含む合成Ｄセグメント、およびヒトＪセグメントを含むヒト遺伝子座であ
る。一実施形態では、合成Ｄセグメントは、少なくとも１つのヒスチジンコドンを含む。
【００２７】
一実施形態では、第二の可変遺伝子座は、再構成されていない軽鎖遺伝子座（再構成さ
れていないＶセグメント、Ｊセグメント）の少なくとも１つの機能性部分を含む。
【００２８】
一実施形態では、第二の可変遺伝子座は、再構成された免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子
配列（再構成されたＶＪ配列）を含む。
【００２９】
一実施形態では、非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換および／またはヒ
スチジンコドンの挿入は、可変ドメインをコードする核酸配列内においてであり、ヒスチ
ジンは、免疫グロブリン鎖のＮ末端領域、免疫グロブリン鎖のループ４領域、重鎖のＣＤ
Ｒ１、重鎖のＣＤＲ２、重鎖のＣＤＲ３、軽鎖のＣＤＲ１、軽鎖のＣＤＲ２、軽鎖のＣＤ
Ｒ３、およびこれらの組合せから選択される領域にある。
【００３０】
一実施形態では、第一の可変遺伝子座または第二の可変遺伝子座の少なくとも１つは、
内因性非ヒト免疫グロブリン遺伝子座において、内因性非ヒト定常領域の核酸配列に作動
可能に連結されている。
【００３１】
一実施形態では、第一の可変遺伝子座（再構成されていないヒトＶセグメント、ヒトＤ
セグメント、ヒトＪセグメント）は、内因性非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域の核酸配
列に作動可能に連結されている。
【００３２】
一実施形態では、第一の可変遺伝子座（再構成されていないヒトＶセグメント、ヒトＤ
セグメント、ヒトＪセグメント）は、内因性非ヒト免疫グロブリン遺伝子座において、内
因性非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域の核酸配列に作動可能に連結されている。
【００３３】
一実施形態では、第二の可変遺伝子座（再構成されていないＶセグメント、Ｊセグメン
ト）は、内因性非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域配列に作動可能に連結されている。
【００３４】
一実施形態では、内因性非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域配列は、内因性非ヒト免疫
グロブリン遺伝子座にある。
【００３５】
一実施形態では、可変領域配列は、非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換
および／またはヒスチジンコドンの挿入である、２つ、３つ、４つ、または５つのヒスチ
ジンによるクラスターを含む。
【００３６】
一実施形態では、再構成されていない重鎖遺伝子座は、重鎖遺伝子座の配向の方向に対
して反転されたＤ遺伝子セグメントを含む。一実施形態では、反転されたＤセグメントは
、親水性のリーディングフレームにある。
【００３７】
一態様では、定常領域遺伝子配列に作動可能に連結された再構成されていないヒト免疫
グロブリン重鎖可変領域の核酸配列（再構成されていないＶセグメント、Ｄセグメント、
Ｊセグメント）の少なくとも一部分であって、Ｖ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント
、およびＪ遺伝子セグメントのうちの１つまたは複数が、少なくとも１カ所の非ヒスチジ
ンコドンのヒスチジンコドンによる置換、または少なくとも１カ所のヒスチジンコドンの
挿入を含む、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域の核酸配列の少なくと
も一部分と；定常領域遺伝子配列に作動可能に連結された再構成されていないヒト免疫グ
ロブリン軽鎖可変領域の核酸配列（再構成されていないＶセグメント、Ｊセグメント）の
少なくとも一部分であって、Ｖ遺伝子セグメントおよびＪ遺伝子セグメントのうちの１つ
または複数が、少なくとも１カ所の非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換、
または少なくとも１カ所のヒスチジンコドンの挿入を含む、再構成されていないヒト免疫
グロブリン軽鎖可変領域の核酸配列の少なくとも一部分とを含み、マウスの生殖細胞系列
におけるヒスチジン置換またはヒスチジン挿入に由来するヒスチジンを含む、免疫グロブ
リン重鎖可変ドメインおよび／または免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを発現する、遺伝
子改変された非ヒト動物が提供される。
【００３８】
一実施形態では、非ヒト動物は、哺乳動物である。一実施形態では、哺乳動物は、齧歯
動物である。一実施形態では、齧歯動物は、マウス、ラット、およびハムスターからなる
群から選択される。
【００３９】
一実施形態では、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域の核酸配列は、
非ヒト定常領域配列に作動可能に連結されている。
【００４０】
一実施形態では、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域の核酸配列に作
動可能に連結された非ヒト定常領域核酸配列は、非ヒト動物の生殖細胞系列における内因
性非ヒト免疫グロブリン遺伝子座にある。
【００４１】
一実施形態では、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域の核酸配列に作
動可能に連結された非ヒト定常領域核酸配列は、非ヒト動物の生殖細胞系列における内因
性非ヒト免疫グロブリン遺伝子座にある。
【００４２】
一態様では、定常領域遺伝子配列に作動可能に連結された再構成されていないヒト免疫
グロブリン重鎖可変領域の核酸配列（再構成されていないＶセグメント、Ｄセグメント、
Ｊセグメント）の少なくとも一部分であって、再構成されていないＶ遺伝子セグメント、
Ｄ遺伝子セグメント、およびＪ遺伝子セグメントのうちの１つまたは複数が、少なくとも
１カ所の非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換、または少なくとも１カ所の
ヒスチジンコドンの挿入を含む、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域の
核酸配列の少なくとも一部分と；軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結された再構成
されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域の核酸配列（再構成されたＶＪ配列）の少なくと
も一部分であって、再構成されたＶＪ配列が、少なくとも１カ所の非ヒスチジンコドンの
ヒスチジンコドンによる置換、または少なくとも１カ所のヒスチジンコドンの挿入を含む
、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域の核酸配列の少なくとも一部分とを含み
、マウスの生殖細胞系列におけるヒスチジン置換またはヒスチジン挿入に由来するヒスチ
ジンを含む、免疫グロブリン重鎖可変ドメインおよび／または免疫グロブリン軽鎖可変ド
メインを発現する、遺伝子改変された非ヒト動物が提供される。
【００４３】
一実施形態では、遺伝子改変された非ヒト動物は、哺乳動物である。一実施形態では、
哺乳動物は、齧歯動物である。一実施形態では、齧歯動物は、マウス、ラット、およびハ
ムスターからなる群から選択される。
【００４４】
一実施形態では、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域の核酸配列は、
非ヒト定常領域配列に作動可能に連結されている。一実施形態では、再構成されていない
ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域の核酸配列に作動可能に連結された非ヒト定常領域配列
は、非ヒト動物の生殖細胞系列における内因性非ヒト免疫グロブリン遺伝子座にある。一
実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域の核酸配列に作動可能に連
結された非ヒト定常領域配列は、非ヒト動物の生殖細胞系列における内因性非ヒト免疫グ
ロブリン遺伝子座にある。
【００４５】
一態様では、遺伝子改変された非ヒト動物であって、野生型の非ヒト動物と比較した、
Ｂ細胞集団の免疫グロブリン重鎖におけるおよび免疫グロブリン軽鎖におけるヒスチジン
残基の存在の増強を特徴とするＢ細胞集団を含む、遺伝子改変された非ヒト動物が提供さ
れる。一実施形態では、増強は、約２〜４倍である。一実施形態では、増強は、約２〜１
０倍である。
【００４６】
一態様では、非ヒト動物の生殖細胞系列の免疫グロブリン配列における置換および／ま
たは挿入によりコードされるヒスチジンを含む免疫グロブリン軽鎖および免疫グロブリン
重鎖を発現する、遺伝子改変された非ヒト動物が提供される。
【００４７】
一態様では、生殖細胞系列のヒスチジンコドンによりコードされるヒスチジンを有する
抗体可変ドメインを作製する非ヒト動物を作製するための方法であって、非ヒト動物をそ
の生殖細胞系列内で、少なくとも１カ所のヒスチジンコドンによる非ヒスチジンコドンの
置換またはヒスチジンコドンの挿入を、再構成されていない免疫グロブリン重鎖可変（再
構成されていないＶセグメント、Ｄセグメント、Ｊセグメント）遺伝子座に含むように改
変するステップと；非ヒト動物をその生殖細胞系列において、少なくとも１カ所のヒスチ
ジンコドンによる非ヒスチジンコドンの置換またはヒスチジンコドンの挿入を、再構成さ
れていない免疫グロブリン軽鎖可変（再構成されていないＶセグメント、Ｊセグメント）
遺伝子座に含むように改変するステップとを含む方法が提供される。
【００４８】
一実施形態では、方法は、マウスの生殖細胞系列を、再構成されていないヒト免疫グロ
ブリン重鎖可変（Ｖセグメント、Ｄセグメント、Ｊセグメント）遺伝子座の少なくとも一
部分を含むように遺伝子改変するステップと、ヒスチジン置換またはヒスチジン挿入を、
再構成されていない免疫グロブリン重鎖可変（再構成されていないＶセグメント、Ｄセグ
メント、Ｊセグメント）ヒト遺伝子座に施すステップとを含む。
【００４９】
一実施形態では、方法は、マウスの生殖細胞系列を、再構成されていないヒト免疫グロ
ブリン軽鎖（再構成されていないＶセグメント、Ｊセグメント）遺伝子座の少なくとも一
部分を含むように遺伝子改変するステップと、ヒスチジン置換またはヒスチジン挿入を、
再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に施すステップとを含む。
【００５０】
方法の一実施形態では、非ヒト動物は、齧歯動物である。一実施形態では、齧歯動物は
、マウス、ラット、およびハムスターから選択される。
【００５１】
一態様では、生殖細胞系列のヒスチジンコドンによりコードされるヒスチジンを有する
抗体可変ドメインを作製する非ヒト動物を作製するための方法であって、非ヒト動物を、
少なくとも１カ所のヒスチジンコドンによる非ヒスチジンコドンの置換またはヒスチジン
コドンの挿入を、再構成されていない免疫グロブリン重鎖可変（再構成されていないＶセ
グメント、Ｄセグメント、Ｊセグメント）遺伝子座に含むように改変するステップと；非
ヒト動物を、生殖細胞系列における再構成された免疫グロブリン軽鎖可変配列（再構成さ
れたＶＪ配列）に、少なくとも１カ所のヒスチジンコドンによる非ヒスチジンコドンの置
換またはヒスチジンコドンの挿入を含むように改変するステップとを含む方法が提供され
る。
【００５２】
方法の一実施形態では、非ヒト動物は、齧歯動物である。一実施形態では、齧歯動物は
、マウス、ラット、およびハムスターから選択される。
【００５３】
様々な態様および実施形態では、多能性細胞または全能性細胞（例えば、胚性幹（ＥＳ
）細胞）を遺伝子改変し、遺伝子改変細胞をドナー細胞として、宿主胚と共に、代理母体
内で使用して、遺伝子改変ドナー細胞に由来する動物を懐胎させることにより、非ヒト動
物を遺伝子改変する。様々な態様および実施形態では、当技術分野で公知の他の任意の方
法により、非ヒト動物を遺伝子改変する。
【００５４】
ｐＨ依存性の抗原結合を示す抗体可変ドメインを作製するための方法および組成物が提
供される。低（例えば、エンドソームの）ｐＨでは、標的抗原に低い親和性で結合し、高
（例えば、細胞外の）または中性ｐＨでは、同じ標的抗原に高い親和性で結合する、改変
された抗原結合タンパク質、ならびにそれらを作製するための組成物および方法が提供さ
れる。
【００５５】
一態様では、ｐＨ依存性結合を示す抗体を作製するための方法であって、抗体の可変ド
メインの配列を、ヒスチジン残基を付加するか、もしくは既存の残基をヒスチジン残基で
置換するか、ヒスチジン改変された可変ドメインを形成するように改変するステップを含
む方法が提供される。一実施形態では、置換は、抗原への結合（例えば、中性ｐＨまたは
細胞外ｐＨにおける）にそれほど重要でない残基の置換である。
【００５６】
一実施形態では、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ以上の残基を、ヒスチジンへと
置換する。一実施形態では、ヒスチジンへと置換された２つ、３つ、４つ、５つ、または
６つ以上の残基はクラスターをなす。一実施形態では、クラスターは、２カ所以上の連続
のヒスチジン置換を含む。一実施形態では、クラスターは、１つまたは複数の非ヒスチジ
ン残基で隔てられた２カ所以上のヒスチジン置換を含む。一実施形態では、クラスターは
、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０残基の長さであり、抗原への結合（例え
ば、中性ｐＨまたは細胞外ｐＨにおける）にそれほど重要でない全ての残基を、ヒスチジ
ンへと改変する。
【００５７】
一実施形態では、可変ドメインは、軽鎖可変ドメイン（例えば、κまたはλ）である。
一実施形態では、可変ドメインは、重鎖可変ドメインにある。一実施形態では、軽鎖可変
ドメインおよび重鎖可変ドメインの配列を改変する。
【００５８】
一実施形態では、可変ドメインの配列は、ＣＤＲ配列である。一実施形態では、ＣＤＲ
配列は、重鎖のＣＤＲ配列である。一実施形態では、ＣＤＲ配列は、軽鎖のＣＤＲ配列で
ある。一実施形態では、ＣＤＲ配列は、重鎖のＣＤＲ配列および軽鎖のＣＤＲ配列である
。
【００５９】
一実施形態では、ＣＤＲ配列は、ＣＤＲ３配列である。一実施形態では、ＣＤＲ配列は
、ＣＤＲ２配列である。一実施形態では、ＣＤＲ配列は、ＣＤＲ３配列である。
【００６０】
一実施形態では、ＣＤＲ配列は、軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３
配列である。一実施形態では、ＣＤＲ配列は、重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／また
はＣＤＲ３配列である。
【００６１】
一実施形態では、抗体の可変ドメインの配列は、ループ４配列である。一実施形態では
、ループ４配列は、重鎖のループ４配列である。一実施形態では、ループ４配列は、軽鎖
のループ４配列である。
【００６２】
一実施形態では、抗体の可変ドメインの配列は、Ｎ末端配列である。一実施形態では、
Ｎ末端配列は、重鎖のＮ末端配列である。一実施形態では、Ｎ末端配列は、軽鎖のＮ末端
配列である。
【００６３】
一実施形態では、抗体の可変ドメインの配列は、重鎖のＣＤＲ配列、軽鎖のＣＤＲ配列
、重鎖のループ４配列、軽鎖のループ４配列、重鎖のＮ末端配列、軽鎖のＮ末端配列、お
よびこれらの組合せから選択される。
【００６４】
一実施形態では、可変ドメインは、重鎖からの可変ドメインであり、可変ドメインの配
列は、第一のＣＤＲ配列、ならびにＮ末端配列、ループ４配列、第二のＣＤＲ配列、第三
のＣＤＲ配列、およびこれらの組合せから選択される配列を含む。具体的な実施形態では
、第一のＣＤＲ配列は、ＣＤＲ３であり、可変ドメインの配列は、Ｎ末端配列、ループ４
配列、ＣＤＲ２配列、ＣＤＲ１配列、およびこれらの組合せから選択される配列をさらに
含む。
【００６５】
一実施形態では、ヒスチジン改変された可変ドメインは、重鎖からの可変ドメインであ
り、ヒスチジン改変は、ループ４配列に、ならびにＣＤＲ１またはＣＤＲ２またはＣＤＲ
３、Ｎ末端配列、およびこれらの組合せから選択される配列にある。具体的な実施形態で
は、ヒスチジン改変は、ループ４配列におよびＣＤＲ３配列にある。具体的な実施形態で
は、ヒスチジン改変は、ループ４配列におよびＣＤＲ３配列におよびＮ末端配列にある。
具体的な実施形態では、ヒスチジン改変は、ループ４配列におよびＮ末端配列にある。
【００６６】
一態様では、本明細書で記載される、ｈｉｓで改変した免疫グロブリン可変ドメインで
あって、目的の抗原に結合しないか、または６未満のｐＨでは、目的の抗原に第一の親和
性で結合し、約７以上のｐＨでは、同じ目的の抗原に第二の親和性で結合する、ｈｉｓで
改変した免疫グロブリン可変ドメインが提供される。一実施形態では、第一のｐＨは、５
．５未満または５未満である。一実施形態では、第一のｐＨは、５．７５である。一実施
形態では、第二のｐＨは、約７以上である。一実施形態では、第二のｐＨは、ヒト細胞の
外のｐＨである。一実施形態では、第二のｐＨは、７．２〜７．４である。具体的な実施
形態では、第二のｐＨは、７．２である。
【００６７】
一実施形態では、ｈｉｓで改変した可変ドメインは、１、２、３、４、５、または６カ
所以上のヒスチジン置換を、ＣＤＲ、Ｎ末端、ループ４、およびこれらの組合せから選択
される配列に含む。具体的な実施形態では、ｈｉｓで改変した可変ドメインはＣＤＲ３に
おける改変を含む。一実施形態では、ｈｉｓで改変した可変ドメインは、重鎖におけるＣ
ＤＲ３の改変、軽鎖におけるＣＤＲ３の改変、およびこれらの組合せから選択される改変
を含む。一実施形態では、ｈｉｓで改変した可変ドメインは、少なくとも１カ所の置換を
ＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ３）に含み、少なくとも１カ所の置換を、Ｎ末端、ループ４、お
よびこれらの組合せから選択される配列に含む。
【００６８】
一実施形態では、ＣＤＲは、重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３、軽鎖ＣＤＲ
１、軽鎖ＣＤＲ２、軽鎖ＣＤＲ３、およびこれらの組合せからなる群から選択される。
【００６９】
一実施形態では、少なくとも１つのＣＤＲは、軽鎖ＣＤＲ３を含む。一実施形態では、
少なくとも１つのＣＤＲは、軽鎖ＣＤＲ３および重鎖ＣＤＲ３を含む。
【００７０】
一実施形態では、ｈｉｓで改変した免疫グロブリン可変ドメインは、目的の抗原に、中
性ｐＨまたは塩基性ｐＨ（例えば、ｐＨ７〜７．４）では、約１０−６以下（例えば、１
０−７、１０−８、１０−９、１０−１０、１０−１１、１０−１２）のＫＤで結合し、
ｈｉｓで改変した免疫グロブリン可変ドメインは、非抗原結合性のアミノ酸残基の全てが
ヒスチジンで置換されているＣＤＲ１を含むか、またはヒスチジン置換のクラスターを含
むＣＤＲ１を含む。一実施形態では、可変ドメインは、酸性ｐＨ（例えば、ｐＨ５〜６、
一実施形態では、ｐＨ６）では、目的の抗原に結合しないか、または目的の抗原に、１０
２〜１０６倍弱く結合する。
【００７１】
一実施形態では、ｈｉｓで改変した免疫グロブリン可変ドメインは、目的の抗原に、中
性ｐＨまたは塩基性ｐＨ（例えば、ｐＨ７〜７．４）では、約１０−６以下（例えば、１
０−７、１０−８、１０−９、１０−１０、１０−１１、１０−１２）のＫＤで結合し、
ｈｉｓで改変した免疫グロブリン可変ドメインは、非抗原結合性のアミノ酸残基の全てが
ヒスチジンで置換されているＣＤＲ２を含むか、またはヒスチジン置換のクラスターを含
むＣＤＲ２を含む。一実施形態では、可変ドメインは、酸性ｐＨ（例えば、ｐＨ５〜６、
一実施形態では、ｐＨ６）では、目的の抗原に結合しないか、または目的の抗原に、１０
２〜１０６倍弱く結合する。
【００７２】
一実施形態では、ｈｉｓで改変した免疫グロブリン可変ドメインは、目的の抗原に、中
性ｐＨまたは塩基性ｐＨ（例えば、ｐＨ７〜７．４）では、約１０−６以下（例えば、１
０−７、１０−８、１０−９、１０−１０、１０−１１、１０−１２）のＫＤで結合し、
ｈｉｓで改変した免疫グロブリン可変ドメインは、非抗原結合性のアミノ酸残基の全てが
ヒスチジンで置換されているＣＤＲ３を含むか、またはヒスチジン置換のクラスターを含
むＣＤＲ３を含む。一実施形態では、可変ドメインは、酸性ｐＨ（例えば、ｐＨ５〜６、
一実施形態では、ｐＨ６）では、目的の抗原に結合しないか、または目的の抗原に、１０
２〜１０６倍弱く結合する。
【００７３】
一態様では、ｈｉｓで改変したドメインを含むヒト抗原結合ポリペプチドを作製するた
めの方法であって、本明細書で記載される免疫グロブリン可変ドメインヌクレオチド配列
を、１つまたは複数のヒスチジンをコードするように改変して、ｈｉｓで改変したドメイ
ンをコードする核酸配列を形成するステップと、ｈｉｓで改変したドメインをコードする
核酸配列をヒト免疫グロブリン配列へと融合させる（直接またはリンカーにより）ステッ
プとを含む方法が提供される。
【００７４】
一実施形態では、ヒト免疫グロブリン配列は、免疫グロブリン定常ドメイン配列である
。具体的な実施形態では、ヒト免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＣＨ１、ヒンジ、Ｃ
Ｈ２、ＣＨ３、およびこれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列をコードす
る。
【００７５】
一態様では、本明細書で記載される通りに改変される、ｈｉｓで改変した可変ドメイン
を発現する細胞が提供される。一実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。一実施形
態では、細胞は、ＨｅＬａ細胞、ＤＵ１４５細胞、Ｌｎｃａｐ細胞、ＭＣＦ−７細胞、Ｍ
ＤＡ−ＭＢ−４３８細胞、ＰＣ３細胞、Ｔ４７Ｄ細胞、ＴＨＰ−１細胞、Ｕ８７細胞、Ｓ
ＨＳＹ５Ｙ（ヒト神経芽細胞腫）細胞、Ｓａｏｓ−２細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＨＯ細胞、
ＧＨ３細胞、ＰＣ１２細胞、ヒト網膜細胞（例えば、ＰＥＲＣ．６（商標）細胞）、およ
びＭＣ３Ｔ３細胞から選択される。具体的な実施形態では、細胞は、ＣＨＯ細胞である。
【００７６】
一態様では、本明細書で記載される、ｈｉｓで改変した免疫グロブリン可変ドメインで
あって、５〜６（例えば、５．７５）のｐＨでは、目的の抗原に結合しないか、または目
的の抗原に第一の親和性で結合し、７〜７．４（例えば、７．２）のｐＨでは、同じ目的
の抗原に第二の親和性で結合し、少なくとも１つのＣＤＲが２カ所以上のヒスチジン置換
を含み、少なくとも１つの非ＣＤＲ配列が１カ所または複数カ所のヒスチジン置換を含み
、少なくとも１つの非ＣＤＲ配列がＮ末端配列、ループ４配列、およびこれらの組合せか
ら選択されるｈｉｓで改変した免疫グロブリン可変ドメインが提供される。
【００７７】
一実施形態では、第一の親和性は、結合しないこと、または１０−６以上（例えば、１
０−３）のＫＤを特徴とし、第二の親和性は、第一の親和性の少なくとも２倍、少なくと
も５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１０２倍、少なくとも１０３倍、少なくとも１０
４倍、少なくとも１０５倍、または少なくとも１０６倍の強さであることとして特徴付け
られる。
【００７８】
一実施形態では、非ＣＤＲ配列は、少なくとも１つのＣＤＲ配列と同じポリペプチド上
にある。一実施形態では、非ＣＤＲ配列は、少なくとも１つのＣＤＲ配列と異なるポリペ
プチド上にある。
【００７９】
一実施形態では、少なくとも１つのＣＤＲは、重鎖および／または軽鎖のＣＤＲ３であ
り、ＣＤＲ３は、非抗原結合アミノ酸残基の少なくとも半分のヒスチジンへの置換を含む
。具体的な実施形態では、ＣＤＲ３の非抗原結合アミノ酸残基のうちの全てを、ヒスチジ
ンへと置換する。
【００８０】
一実施形態では、少なくとも１つのＣＤＲは重鎖および／または軽鎖のＣＤＲ３であり
、ＣＤＲ３は３つ以上の非抗原結合アミノ酸残基のヒスチジンへの置換を含む。一実施形
態では、非抗原結合アミノ酸残基のうちの４つ以上をヒスチジンへと置換する。
【００８１】
一実施形態では、少なくとも１つのＣＤＲは重鎖および／または軽鎖のＣＤＲ３であり
、ＣＤＲ３は２つ以上の連続的な非抗原結合アミノ酸残基のヒスチジンへの置換を含む。
一実施形態では、ＣＤＲ３は３つ以上の連続的な非抗原結合アミノ酸残基のヒスチジンへ
の置換を含む。
【００８２】
一実施形態では、少なくとも１つのＣＤＲは、軽鎖および／または重鎖のＣＤＲ３であ
り、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、およびこれらの組合せから選択されるＣＤＲをさらに
含む。
【００８３】
一実施形態では、少なくとも１つのＣＤＲは、軽鎖および／または重鎖のＣＤＲ３であ
り、重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、およびこれらの組合せから選択されるＣＤＲをさらに
含む。
【００８４】
一実施形態では、ＣＤＲは、重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３、軽鎖ＣＤＲ
１、軽鎖ＣＤＲ２、軽鎖ＣＤＲ３、およびこれらの組合せからなる群から選択される。
【００８５】
一実施形態では、少なくとも１つのＣＤＲは軽鎖ＣＤＲ３を含む。一実施形態では、少
なくとも１つのＣＤＲは軽鎖ＣＤＲ３および重鎖ＣＤＲ３を含む。
【００８６】
一実施形態では、少なくとも１つのＣＤＲは軽鎖および／または重鎖のＣＤＲ３であり
、少なくとも１つの非ＣＤＲ配列はループ４配列であり、ループ４配列は１カ所または複
数カ所のヒスチジン置換を含む。
【００８７】
一実施形態では、少なくとも１つのＣＤＲは軽鎖および／または重鎖のＣＤＲ３であり
、少なくとも１つの非ＣＤＲ配列はＮ末端配列であり、Ｎ末端配列は１カ所または複数カ
所のヒスチジン置換を含む。
【００８８】
一実施形態では、少なくとも１つのＣＤＲは軽鎖のＣＤＲ３であり、少なくとも１つの
非ＣＤＲ配列は、１カ所または複数カ所のヒスチジン置換を有するＮ末端配列、および１
カ所または複数カ所のヒスチジン置換を有するループ４配列を含む。
【００８９】
一実施形態では、少なくとも１つのＣＤＲは重鎖のＣＤＲ３であり、少なくとも１つの
非ＣＤＲ配列は、１カ所または複数カ所のヒスチジン置換を有するＮ末端配列、および１
カ所または複数カ所のヒスチジン置換を有するループ４配列を含む。
【００９０】
一実施形態では、ｈｉｓで改変した免疫グロブリン可変ドメインは、目的の抗原に、ｐ
Ｈ７〜７．４（例えば、ｐＨ７．２）では、約１０−７以下（例えば、１０−８、１０−
９、１０−１０、１０−１１、１０−１２）のＫＤで結合し、ｈｉｓで改変した免疫グロ
ブリン可変ドメインは、非抗原結合性のアミノ酸残基の全てがヒスチジンで置換されてい
るＣＤＲ１を含む。
【００９１】
一実施形態では、ｈｉｓで改変した免疫グロブリン可変ドメインは、目的の抗原に、ｐ
Ｈ７〜７．４（例えば、ｐＨ７．２）では、約１０−７以下（例えば、１０−８、１０−
９、１０−１０、１０−１１、１０−１２）のＫＤで結合し、ｈｉｓで改変した免疫グロ
ブリン可変ドメインは、非抗原結合性のアミノ酸残基の全てがヒスチジンで置換されてい
るＣＤＲ２を含む。
【００９２】
一実施形態では、ｈｉｓで改変した免疫グロブリン可変ドメインは、目的の抗原に、ｐ
Ｈ７〜７．４（例えば、ｐＨ７．２）では、約１０−７以下（例えば、１０−８、１０−
９、１０−１０、１０−１１、１０−１２）のＫＤで結合し、ｈｉｓで改変した免疫グロ
ブリン可変ドメインは、非抗原結合性のアミノ酸残基の全てがヒスチジンで置換されてい
るＣＤＲ３を含む。
【００９３】
一態様では、本明細書で記載される方法の、ヒト疾患または障害を処置するための医薬
の製造における使用が提供される。一実施形態では、医薬は、抗体である。具体的な実施
形態では、抗体は、ヒト抗体である。
【００９４】
一態様では、本明細書で記載される、ｈｉｓで改変した可変ドメインの、ヒト疾患また
は障害を処置するための医薬の製造における使用が提供される。一実施形態では、医薬は
、抗体である。具体的な実施形態では、抗体は、ヒト抗体である。
【００９５】
一態様では、本明細書で記載される方法またはｈｉｓで改変した可変ドメインの、ヒト
疾患または障害を処置するための医薬の製造における使用であって、医薬が、抗体、多重
特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ｓｃＦｖ、二重特異性ｓｃＦｖ、ダイアボディ
ー、トリアボディー、テトラボディー、Ｖ−ＮＡＲ、ＶＨＨ、ＶＬ、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａ
ｂ）２、ＤＶＤ（すなわち、二重可変ドメイン抗原結合タンパク質）、ＳＶＤ（すなわち
、単一可変ドメイン抗原結合タンパク質）、または二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（す
なわち、ＢｉＴＥ）から選択される抗原結合タンパク質を含む使用が提供される。
【００９６】
一態様では、本明細書で記載される方法であって、重鎖および／または軽鎖のｈｉｓで
改変した可変領域配列をヒト重鎖定常領域配列およびヒト軽鎖定常領域配列へと融合させ
（直接またはリンカーを介して）て、融合配列を形成するステップと、融合配列を細胞内
で発現させるステップと、融合配列を含む発現させた抗原結合タンパク質を回収するステ
ップとをさらに含む方法を使用して、ヒト抗原結合タンパク質を作製するための重鎖可変
領域配列およびκ軽鎖可変領域配列またはλ軽鎖可変領域配列を生成する。様々な実施形
態では、ヒト重鎖定常領域は、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、およびＩｇＧから選択
される。様々な具体的な実施形態では、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およ
びＩｇＧ４から選択される。様々な実施形態では、ヒト重鎖定常領域は、ＣＨ１、ヒンジ
、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４、およびこれらの組合せを含む配列から選択される。具体的な
実施形態では、組合せは、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３である。具体的な実施
形態では、組合せは、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３である。具体的な実施形態では、組
合せは、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３である。具体的な実施形態では、組合せは、ヒン
ジ、ＣＨ２、およびＣＨ３である。
【００９７】
一態様では、中性ｐＨでは、標的抗原に結合するが、酸性ｐＨ（例えば、ｐＨ５．０〜
６．０）では、同じ抗原の結合の低減を示す抗体または抗体可変ドメインを生成するため
の生物学的系が提供される。生物学的系は、１つまたは複数のヒスチジン改変を含む、再
構成された軽鎖配列（例えば、再構成されたＶ−Ｊ）を有する非ヒト動物、例えば、齧歯
動物（例えば、マウスまたはラット）を含む。様々な態様では、１つまたは複数のヒスチ
ジン改変は、軽鎖ＣＤＲ３コドンにおいてである。様々な態様では、非ヒト動物は、ヒト
重鎖免疫グロブリン遺伝子座またはヒト化重鎖免疫グロブリン遺伝子座を含む。様々な態
様では、非ヒト動物は、内因性非ヒト重鎖可変遺伝子セグメントの、１つまたは複数のヒ
ト重鎖ＶＨセグメント、ヒト重鎖ＤＨセグメント、およびヒト重鎖ＪＨセグメントによる
置きかえを含み、ここで、ヒトセグメントは、非ヒト免疫グロブリン定常領域に作動可能
に連結されている。様々な態様では、非ヒスチジン残基のヒスチジン残基による置換を有
する軽鎖可変ドメインを含む、ユニバーサル軽鎖を有する非ヒト動物が提供される。様々
な態様では、これらのヒスチジン改変ユニバーサル軽鎖非ヒト動物（例えば、齧歯動物、
例えば、マウス）を、ヒスチジン−ユニバーサル軽鎖マウス、ヒスチジン−ＵＬＣマウス
、またはＨＵＬＣマウスと称する。
【００９８】
したがって、一態様では、ヒトＶＬセグメント配列およびヒトＪＬセグメント配列を含
む、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列を含む、免疫グロ
ブリン軽鎖遺伝子座をその生殖細胞系列内に含む、遺伝子改変された非ヒト動物であって
、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列が、少なくとも１つの非ヒ
スチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、遺伝子改変された非ヒト動物が本
明細書において提供される。一実施形態では、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン
可変領域配列を、免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結する。一実施
形態では、免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列は、非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領
域遺伝子配列である。一実施形態では、非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列は
、内因性免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列である。一実施形態では、非ヒト動物は
、機能的な、再構成されていない免疫グロブリン軽鎖可変領域を欠く。一実施形態では、
免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、内因性非ヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子座にある。
【００９９】
一実施形態では、動物は、免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結さ
れた、ヒトＶＨセグメント、ヒトＤＨセグメント、およびヒトＪＨセグメントを含む、再
構成されていない免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子配列を含む、免疫グロブリン重鎖遺
伝子座を、その生殖細胞系列内にさらに含む。一実施形態では、免疫グロブリン重鎖定常
領域遺伝子配列は、非ヒト重鎖定常領域遺伝子配列である。一実施形態では、非ヒト重鎖
定常領域遺伝子配列は、内因性免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列である。一実施形
態では、免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座にある。
【０１００】
一実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換
が、相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするヌクレオチド配列内にある。一実施形態では
、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換が、ＣＤＲ３をコ
ードするヌクレオチド配列内にある。一実施形態では、置換は、１つ、２つ、３つ、４つ
、またはそれ超のＣＤＲ３コドンの置換である。一態様では、免疫グロブリン軽鎖遺伝子
座に含まれる、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列は、ヒトＶκ
１−３９遺伝子セグメントまたはＶκ３−２０遺伝子セグメントに由来する。一実施形態
では、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域は、再構成されたＶκ１−
３９／Ｊκ５遺伝子配列またはＶκ３−２０／Ｊκ１遺伝子配列に由来する。一実施形態
では、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域は、再構成されたＶκ１−
３９／Ｊκ５遺伝子配列に由来し、Ｖκ１−３９／Ｊκ５遺伝子配列は、１０５、１０６
、１０８、１１１位、およびこれらの組合せから選択される位置においてヒスチジンを発
現するようにデザインされた、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドン
による置きかえを含む。別の実施形態では、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽
鎖可変領域は、再構成されたＶκ３−２０／Ｊκ１遺伝子配列に由来し、Ｖκ３−２０／
Ｊκ１遺伝子配列は、１０５、１０６、１０７、１０９位、およびこれらの組合せから選
択される位置においてヒスチジンを発現するようにデザインされた、少なくとも１つの非
ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置きかえを含む。
【０１０１】
一態様では、本明細書に記載されている非ヒト動物は、目的の抗原に応答するＢ細胞集
団であって、中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨにおける解離半減期（ｔ１／２）が少なくと
も約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０
倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、または少なくとも
約３０倍の短縮を示す抗体が富化されたＢ細胞集団を含む。一実施形態では、中性ｐＨと
比較して、酸性ｐＨにおけるｔ１／２の短縮は、約３０倍以上である。
【０１０２】
一実施形態では、動物は、免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列内で置換された少な
くとも１つのコドンによりコードされるアミノ酸位置において、少なくとも１つの非ヒス
チジン残基のヒスチジン残基による置換を有する、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン
を含む抗体を発現する。一実施形態では、動物は、体細胞超変異にもかかわらず、発現す
るヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン内に、少なくとも１つの非ヒスチジン残基のヒス
チジン残基による置換を保持する抗体を発現する。
【０１０３】
一実施形態では、非ヒト動物は、哺乳動物である。一実施形態では、哺乳動物は、齧歯
動物、例えば、ラットまたはマウスである。一実施形態では、非ヒト動物は、マウスであ
る。したがって、一態様では、ヒトＶＬセグメント配列およびヒトＪＬセグメント配列を
含む、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列を含む、免疫グ
ロブリン軽鎖遺伝子座をその生殖細胞系列内に含む遺伝子改変マウスであって、単一の、
再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列が、少なくとも１つの非ヒスチジンコ
ドンのヒスチジンによる置換を含む遺伝子改変マウスもまた本明細書において提供される
。一実施形態では、マウスは、機能的な、再構成されていない免疫グロブリン軽鎖可変領
域を欠く。
【０１０４】
一実施形態では、マウスの生殖細胞系列内の、単一の、再構成された免疫グロブリン軽
鎖可変領域遺伝子配列を、免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結する
。一実施形態では、免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列は、ラットまたはマウスの免
疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列から選択される。一実施形態では、免疫グロブリン
軽鎖定常領域遺伝子配列は、マウス配列である。一実施形態では、免疫グロブリン軽鎖遺
伝子座は、内因性マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座にある。
【０１０５】
さらなる実施形態では、マウスはまた、免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列に作動
可能に連結された、ヒトＶＨセグメント、ヒトＤＨセグメント、およびヒトＪＨセグメン
トを含む、再構成されていない免疫グロブリン重鎖可変領域配列を含む、免疫グロブリン
重鎖遺伝子座もその生殖細胞系列内に含む。一態様では、免疫グロブリン重鎖定常領域遺
伝子配列は、ラットまたはマウスの重鎖定常領域遺伝子配列である。一実施形態では、免
疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列は、マウス配列である。一実施形態では、免疫グロ
ブリン重鎖遺伝子座は、内因性マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座にある。
【０１０６】
一態様では、マウスは、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによ
る置換を含み、ここで、置換は、ＣＤＲをコードするヌクレオチド配列内にある。一実施
形態では、置換は、ＣＤＲ３コドン、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ超の
ＣＤＲ３コドンにある。一実施形態では、マウスの免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、ヒト
Ｖκ１−３９遺伝子セグメントまたはヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントに由来する、単
一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列を含み、例えば、単一の、再構
成された免疫グロブリン軽鎖可変領域配列は、再構成されたＶκ１−３９／Ｊκ５遺伝子
配列またはＶκ３−２０／Ｊκ１遺伝子配列に由来する。一実施形態では、単一の、再構
成された免疫グロブリン軽鎖可変領域配列は、再構成されたＶκ１−３９／Ｊκ５遺伝子
配列に由来し、Ｖκ１−３９／Ｊκ５配列は、１０５、１０６、１０８、１１１位、およ
びこれらの組合せから選択される位置においてヒスチジンを発現するようにデザインされ
た、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置きかえを含む。一
実施形態では、このような置きかえを、１０５、１０６、１０８、および１１１位におい
てヒスチジンで置きかえるようにデザインする。別の実施形態では、このような置きかえ
を、１０６、１０８、および１１１位においてヒスチジンで置きかえるようにデザインす
る。
【０１０７】
別の実施形態では、単一の、再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域配列は、再構成
されたＶκ３−２０／Ｊκ１遺伝子配列に由来し、Ｖκ３−２０／Ｊκ１配列は、１０５
、１０６、１０７、１０９位、およびこれらの組合せから選択される位置においてヒスチ
ジンを発現するようにデザインされた、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジ
ンコドンによる置きかえを含む。一実施形態では、このような置きかえを、１０５、１０
６、１０７、および１０９位においてヒスチジンで置きかえるようにデザインする。別の
実施形態では、このような置きかえを、１０５、１０６、および１０９位においてヒスチ
ジンで置きかえるようにデザインする。
【０１０８】
一実施形態では、本明細書に記載されているマウスは、目的の抗原に応答するＢ細胞集
団であって中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨでの解離半減期（ｔ１／２）が少なくとも約２
倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少
なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、または少なくとも約３０
分倍の短縮を示す抗体が富化されたＢ細胞集団を含む。一実施形態では、中性ｐＨと比較
して、酸性ｐＨにおけるｔ１／２の短縮は約３０倍以上である。
【０１０９】
一実施形態では、本明細書に記載されているマウスは、目的の抗原に応答する抗原特異
的抗体の集団を発現し、ここで、全ての抗体は、（ａ）少なくとも１つの非ヒスチジンコ
ドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、同じ、単一の、再構成されたヒト軽鎖可変領
域遺伝子配列に由来する免疫グロブリン軽鎖可変ドメインと、（ｂ）ヒト重鎖Ｖセグメン
ト、ヒト重鎖Ｄセグメント、およびヒト重鎖Ｊセグメントのレパートリーに由来する重鎖
可変ドメインを含む免疫グロブリン重鎖とを含む。
【０１１０】
本明細書では、ヒトＶＬセグメント配列およびヒトＪＬセグメント配列を含む、単一の
、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列を含む非ヒト遺伝子座、例え
ば、マウス遺伝子座であって、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺
伝子配列が、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む
非ヒト遺伝子座もまた提供される。一実施形態では、遺伝子座は、非ヒト動物の生殖細胞
系列内に含まれる。一実施形態では、遺伝子座は、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントま
たはヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントに由来する、例えば、再構成されたＶκ１−３９
／Ｊκ５遺伝子配列またはＶκ３−２０／Ｊκ１遺伝子配列に由来する、単一の、再構成
されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列を含む。遺伝子座内に存在する、単一
の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列が、再構成されたＶκ１−
３９／Ｊκ５配列に由来する一実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒ
スチジンコドンによる置換を、１０５、１０６、１０８、１１１位、およびこれらの組合
せから選択される位置においてヒスチジンを発現するようにデザインする。遺伝子座内に
存在する、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列が、再構成
されたＶκ３−２０／Ｊκ１配列に由来する別の実施形態では、少なくとも１つの非ヒス
チジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を、１０５、１０６、１０７、１０９位、お
よびこれらの組合せから選択される位置においてヒスチジンを発現するようにデザインす
る。様々な実施形態では、本明細書に記載されている非ヒト遺伝子座は、遺伝子改変され
た非ヒト動物を作製するための、下記で記載される方法を用いて生成することができる。
【０１１１】
さらに別の態様では、遺伝子改変された免疫グロブリン軽鎖遺伝子座をその生殖細胞系
列内に含む非ヒト動物を作製するための方法であって、非ヒト動物のゲノムを改変して、
免疫グロブリン軽鎖遺伝子座内の、内因性免疫グロブリンの軽鎖Ｖセグメントおよび軽鎖
Ｊセグメントを欠失させるか、または非機能的にするステップと、少なくとも１つの非ヒ
スチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、単一の、再構成されたヒト軽鎖可
変領域遺伝子配列をゲノムに配置するステップとを含む方法が本明細書において提供され
る。一実施形態では、このような方法は、目的の抗原へのｐＨ依存性結合を示す抗体が富
化されたＢ細胞集団を含む、遺伝子改変された非ヒト動物を結果としてもたらす。一実施
形態では、ゲノムに配置される、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域
配列は、ヒトＶκ１−３９またはヒトＶκ３−２０、例えば、再構成されたＶκ１−３９
／Ｊκ５遺伝子配列またはＶκ３−２０／Ｊκ１遺伝子配列に由来する。したがって、単
一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列が、再構成されたＶκ１−３９
／Ｊκ５に由来する実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコ
ドンによる置換を、１０５、１０６、１０８、１１１位、およびこれらの組合せから選択
される位置においてヒスチジンを発現するようにデザインする。単一の、再構成されたヒ
ト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列が、再構成されたＶκ３−２０／Ｊκ１に由来する実
施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換が、１
０５、１０６、１０７、１０９位、およびこれらの組合せから選択される位置においてヒ
スチジンを発現するようにデザインする。
【０１１２】
別の態様では、目的の抗原へのｐＨ依存性結合を示す抗体を生成する方法であって、（
ａ）本明細書に記載されているマウス（例えば、ヒトＶＬセグメント配列およびヒトＪＬ
セグメント配列を含む、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列を含
み、その再構成された軽鎖可変領域配列内に、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒ
スチジンコドンによる置換を含む、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座をその生殖細胞系列内に
含むマウス）を生成するステップと、（ｂ）マウスを目的の抗原で免疫するステップと、
（ｃ）中性ｐＨでは、目的の抗原に所望の親和性で結合するが、酸性ｐＨでは、抗原への
結合の低減を提示する抗体を選択するステップとを含む方法が本明細書において提供され
る。一実施形態では、方法は、酸性ｐＨおよび３７℃で、約２分間以下のｔ１／２を示す
抗体の生成を結果としてもたらす。一実施形態では、方法は、中性ｐＨと比較して、酸性
ｐＨにおける解離半減期（ｔ１／２）が少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくと
も約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約
２０倍、少なくとも約２５倍、または少なくとも約３０倍の短縮を提示する抗体の生成を
結果としてもたらす。
【０１１３】
他の態様では、目的の抗原へのｐＨ依存性結合を示す抗体を生成するさらなる方法が本
明細書において提供される。１つのこのような方法は、（ａ）目的の抗原に所望の親和性
で結合する第一の抗体を選択するステップと、（ｂ）第一の抗体の免疫グロブリン軽鎖ヌ
クレオチド配列を、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換
を含むように改変するステップと、（ｃ）第一の抗体の免疫グロブリン重鎖および改変さ
れた免疫グロブリン軽鎖を細胞内で発現させるステップと、（ｄ）細胞内で発現した第二
の抗体であって、中性ｐＨでは、目的の抗原に対する所望の親和性を保持し、酸性ｐＨで
は、目的の抗原への結合の低減を提示する第二の抗体を選択するステップとを含む。一実
施形態では、第一の抗体の免疫グロブリン軽鎖ヌクレオチド配列は、単一の、再構成され
たヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列を含む。一実施形態では、第一の抗体を、単一の
、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列に由来する免疫グロブリン軽鎖配列
を含む非ヒト動物、例えば、マウスにおいて生成し、免疫グロブリン軽鎖の改変を、単一
の、再構成されたヒト免疫グロブリン可変領域配列内に施す。一実施形態では、第一の抗
体を、ヒトＶＨセグメント、ヒトＤＨセグメント、およびヒトＪＨセグメントのレパート
リーに由来する免疫グロブリン重鎖配列をさらに含む非ヒト動物、例えば、マウスにおい
て生成する。一実施形態では、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配
列は、Ｖκ１−３９／Ｊκ５遺伝子配列およびＶκ３−２０／Ｊκ１遺伝子配列から選択
される。単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列が、Ｖκ１−３９／
Ｊκ５である実施形態では、第一の抗体の免疫グロブリン軽鎖ヌクレオチド配列内の改変
を、１０５、１０６、１０８、１１１位、およびこれらの組合せから選択される位置でＣ
ＤＲ３コドンにおいて施す。単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列
が、Ｖκ３−２０／Ｊκ１である実施形態では、第一の抗体の免疫グロブリン軽鎖ヌクレ
オチド配列内の改変を、１０５、１０６、１０７、１０９位、およびこれらの組合せから
選択される位置でＣＤＲ３コドンにおいて施す。
【０１１４】
一実施形態では、本明細書に記載されている、目的の抗原へのｐＨ依存性結合を示す抗
体を生成する方法は、中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨにおける解離半減期（ｔ１／２）が
少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくと
も約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、または少
なくとも約３０倍の短縮を提示する抗体を結果としてもたらす。一実施形態では、抗体を
生成する方法は、酸性ｐＨおよび３７℃で、約２分間以下のｔ１／２を示す抗体を結果と
してもたらす。
【０１１５】
非ヒト動物の生殖細胞系列ゲノムにおける、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝
子座であって、遺伝子改変された、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列
（例えば、１つまたは複数の遺伝子改変されたヒトＶＨ遺伝子セグメント、ヒトＤ遺伝子
セグメント、および／またはヒトＪＨ遺伝子セグメント）を含み、再構成されていない重
鎖可変領域のヌクレオチド配列が、少なくとも１つのヒスチジンコドンの付加または少な
くとも１つの内因性非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む免疫グロブ
リン重鎖遺伝子座が提供される。様々な実施形態では、遺伝子改変された、再構成されて
いない重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードす
る少なくとも１つのリーディングフレームに少なくとも１つのヒスチジンコドンを含む。
様々な実施形態では、少なくとも１つのヒスチジンコドンを含む、再構成されていない重
鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ヒトまたは非ヒトの重鎖定常領域のヌクレオチド配列
（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、およびＩｇＧから選択される免疫グロブリ
ンアイソタイプをコードする、重鎖定常領域のヌクレオチド配列）に作動可能に連結され
ている。
【０１１６】
免疫グロブリン重鎖のゲノム遺伝子座を、それらの生殖細胞系列ゲノムに含有するよう
に遺伝子操作された非ヒト動物（哺乳動物、例えば、マウス、ラット、またはハムスター
などの齧歯動物）であって、ゲノム遺伝子座が、再構成されていない重鎖可変領域のヌク
レオチド配列（例えば、１つまたは複数の遺伝子改変されたヒトＶＨ遺伝子セグメント、
ヒトＤ遺伝子セグメント、および／またはヒトＪＨ遺伝子セグメント）を含み、再構成さ
れていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、少なくとも１つのヒスチジンコドンの付
加または少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含
む非ヒト動物が提供される。様々な実施形態では、非ヒト動物のゲノムは、（ｉ）内因性
免疫グロブリンのＶＨ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、および／またはＪＨ遺伝
子セグメントの全てまたは実質的に全てを欠失させるか、または非機能性にする（例えば
、免疫グロブリン遺伝子座内にヌクレオチド配列、例えば、外因性ヌクレオチド配列の挿
入を介して、または内因性のＶＨ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、および／もし
くはＪＨ遺伝子セグメントの非機能性の再構成もしくは反転を介して）改変；ならびに（
ｉｉ）再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列（例えば、遺伝子改変さ
れたヒトＶＨ遺伝子セグメント、ヒトＤ遺伝子セグメント、またはヒトＪＨ遺伝子セグメ
ント）を導入する改変であって、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列が
、少なくとも１つのヒスチジンコドンの付加または少なくとも１つの内因性非ヒスチジン
コドンのヒスチジンコドンによる置換を含む改変を含む。様々な実施形態では、再構成さ
れていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、内因性遺伝子座に存在する（すなわち、
再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列が野生型の非ヒト動物にある場合）
か、または異所性に（例えば、そのゲノムにおける内因性免疫グロブリンの重鎖遺伝子座
と異なる遺伝子座に）存在するか、またはその内因性の遺伝子座内に存在する（例えば、
免疫グロブリン可変遺伝子座内に存在し、ここで、該内因性の遺伝子座は、ゲノムにおけ
る異なる位置に配置されるか、またはゲノムにおける異なる位置へと移動している）。様
々な実施形態では、免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ヒトまたは非ヒ
トの重鎖定常領域のヌクレオチド配列（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、およ
びＩｇＧから選択される免疫グロブリンアイソタイプをコードする、重鎖定常領域のヌク
レオチド配列）に作動可能に連結されている。
【０１１７】
１つまたは複数のヒスチジンを含む、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖可変ドメイ
ンを発現させることが可能な、遺伝子改変された非ヒト動物であって、１つまたは複数の
ヒスチジンが、対応する野生型非ヒト動物の生殖細胞系列遺伝子セグメントによりコード
されない非ヒト動物が提供される。
【０１１８】
対応する野生型非ヒト動物の生殖細胞系列遺伝子セグメントによりコードされない、１
つまたは複数のヒスチジンを有する免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードする、再構
成された免疫グロブリン重鎖可変遺伝子を特徴とするＢ細胞集団を含む、遺伝子改変され
た非ヒト動物が提供される。
【０１１９】
重鎖可変ドメインをコードする少なくとも１つのリーディングフレームに１つまたは複
数のヒスチジンコドンを含有する、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド
配列を含む、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座を含む非ヒト動物を作製
するための方法および組成物が提供される。
【０１２０】
抗原のｐＨ依存性結合を示す、抗原結合タンパク質を作製する非ヒト動物のための方法
および組成物が提供される。ｐＨ依存性の抗原結合タンパク質、例えば、特に、重鎖可変
ドメインおよび／またはこれらの抗原結合断片が富化された（対応する野生型動物と比較
して）、Ｂ細胞集団または抗体集団を有する非ヒト動物を作製するための方法および組成
物が提供される。
【０１２１】
一態様では、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列を含む、非ヒト
動物の生殖細胞系列ゲノムにおける遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座であって、
再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、少なくとも１つのヒスチジンコ
ドンの付加または少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる
置換を含む免疫グロブリン遺伝子座が提供される。
【０１２２】
一実施形態では、非ヒト動物は、齧歯動物、例えば、マウス、ラット、またはハムスタ
ーを含む哺乳動物である。
【０１２３】
一実施形態では、付加または置換されたヒスチジンコドンは、ヒトＶＨ遺伝子セグメン
ト、ヒトＤ遺伝子セグメント、ヒトＪＨ遺伝子セグメント、およびこれらの組合せから選
択される、免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントに存在する。一実施形態では、免疫グロ
ブリン重鎖遺伝子セグメントは、ヒト生殖細胞系列ＶＨ遺伝子セグメント、ヒト生殖細胞
系列Ｄ遺伝子セグメント、ヒト生殖細胞系列ＪＨ遺伝子セグメント、およびこれらの組合
せから選択される。
【０１２４】
一実施形態では、ヒトＶ遺伝子セグメント（ＶＨ）は、ＶＨ１−２、ＶＨ１−３、ＶＨ
１−８、ＶＨ１−１８、ＶＨ１−２４、ＶＨ１−４５、ＶＨ１−４６、ＶＨ１−５８、Ｖ
Ｈ１−６９、ＶＨ２−５、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−７０、ＶＨ３−７、ＶＨ３−９、ＶＨ
３−１１、ＶＨ３−１３、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−１６、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−２１、
ＶＨ３−２３、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−３０−３、ＶＨ３−３０−５、ＶＨ３−３３、Ｖ
Ｈ３−３５、ＶＨ３−３８、ＶＨ３−４３、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−４９、ＶＨ３−５３
、ＶＨ３−６４、ＶＨ３−６６、ＶＨ３−７２、ＶＨ３−７３、ＶＨ３−７４、ＶＨ４−
４、ＶＨ４−２８、ＶＨ４−３０−１、ＶＨ４−３０−２、ＶＨ４−３０−４、ＶＨ４−
３１、ＶＨ４−３４、ＶＨ４−３９、ＶＨ４−５９、ＶＨ４−６１、ＶＨ５−５１、ＶＨ
６−１、ＶＨ７−４−１、ＶＨ７−８１、およびこれらの組合せからなる群から選択され
る。
【０１２５】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントは、Ｄ１−１、Ｄ１−７、Ｄ１−１４、Ｄ１
−２０、Ｄ１−２６、Ｄ２−２、Ｄ２−８、Ｄ２−１５、Ｄ２−２１、Ｄ３−３、Ｄ３−
９、Ｄ３−１０、Ｄ３−１６、Ｄ３−２２、Ｄ４−４、Ｄ４−１１、Ｄ４−１７、Ｄ４−
２３、Ｄ５−１２、Ｄ５−５、Ｄ５−１８、Ｄ５−２４、Ｄ６−６、Ｄ６−１３、Ｄ６−
１９、Ｄ６−２５、Ｄ７−２７、およびこれらの組合せからなる群から選択される。
【０１２６】
一実施形態では、ヒトＪ遺伝子セグメントは、ＪＨ１、ＪＨ２、ＪＨ３、ＪＨ４、ＪＨ
５、ＪＨ６、およびこれらの組合せからなる群から選択される。
【０１２７】
一実施形態では、付加または置換されたヒスチジンコドンは、Ｎ末端領域、ループ４領
域、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、またはこれらの組合せをコードする、再構成されて
いない重鎖可変領域のヌクレオチド配列に存在する。
【０１２８】
一実施形態では、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、２つ以上、
３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０以上、
１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、
１９以上、２０以上、２１以上、２２以上、２３以上、２４以上、または２５以上、２６
以上、２７以上、２８以上、２９以上、３０以上、３１以上、３２以上、３３以上、３４
以上、３５以上、３６以上、３７以上、３８以上、３９以上、４０以上、４１以上、４２
以上、４３以上、４４以上、４５以上、４６以上、４７以上、４８以上、４９以上、５０
以上、５１以上、５２以上、５３以上、５４以上、５５以上、５６以上、５７以上、５８
以上、５９以上、６０以上、または６１以上のヒスチジンコドンを含む。
【０１２９】
一実施形態では、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ＩｇＭ、Ｉ
ｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、およびＩｇＡから選択される免疫グロブリンアイソタイプをコー
ドする、ヒトまたは非ヒトの重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されてい
る。
【０１３０】
一実施形態では、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド
配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、およびこれらの組合せから選択される、ヒト
または非ヒトの重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。一実施形
態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３（
ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）を含む。
【０１３１】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、内因性遺伝子座に存在する（す
なわち、ヌクレオチド配列が野生型の非ヒト動物にある場合）か、または異所性に存在す
る（例えば、そのゲノムにおける内因性免疫グロブリン鎖の遺伝子座と異なる遺伝子座に
存在する、またはその内因性の遺伝子座内に、例えば、免疫グロブリン可変遺伝子座内に
存在し、ここで、該内因性の遺伝子座は、ゲノムにおける異なる位置に配置されるか、ま
たはゲノムにおける異なる位置へと移動している）。
【０１３２】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ＣＨ２におけるまたはＣＨ３に
おける改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲である
エンドソーム内で）重鎖定常領域アミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を
含む。
【０１３３】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、２５０位における改変（例えば
、ＥまたはＱ）；２５０および４２８位における改変（例えば、ＬまたはＦ）；２５２位
における改変（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／ＷまたはＴ）、２５４位における改変（例えば、Ｓ
またはＴ）、および２５６位における改変（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤまたはＴ）；ま
たは４２８および／もしくは４３３位における改変（例えば、Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／Ｑまたは
Ｋ）、および／もしくは４３４位における改変（例えば、Ｈ／ＦまたはＹ）；または２５
０および／もしくは４２８位における改変；または３０７もしくは３０８位における改変
（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）、ならびに４３４位における改変を含むヒト重鎖定常
領域アミノ酸配列をコードする。一実施形態では、改変は、４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８
Ｌ）および４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）の改変；４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えば、Ｖ２
５９Ｉ）、および３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）の改変；４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３
Ｋ）および４３４位（例えば、４３４Ｙ）の改変；２５２、２５４、および２５６位（例
えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅ）における改変；２５０Ｑおよび４２８Ｌの
改変（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ４２８Ｌ）；ならびに３０７および／または３０８位
における改変（例えば、３０８Ｆまたは３０８Ｐ）であって、酸性の環境で（例えば、ｐ
Ｈが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）重鎖定常領域アミノ酸配列の
ＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む。
【０１３４】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、２５２位のアミノ酸残基と２５
７位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、
ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣＨ２のアミノ酸配列
のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣＨ２のアミノ酸配列をコードする
。
【０１３５】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、３０７位のアミノ酸残基と３１
１位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、
ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣＨ２のアミノ酸配列
のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣＨ２のアミノ酸配列をコードする
。
【０１３６】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、４３３位のアミノ酸残基と４３
６位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、
ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣＨ３のアミノ酸配列
のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣＨ３のアミノ酸配列をコードする
。
【０１３７】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ｓ、およ
びこれらの組合せからなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列を
コードする。
【０１３８】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｍ４２８Ｌ、Ｖ２５９Ｉ、Ｖ３
０８Ｆ、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域ア
ミノ酸配列をコードする。
【０１３９】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｎ４３４Ａ変異を含むヒト重鎖
定常領域アミノ酸配列をコードする。
【０１４０】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２
５６Ｅ、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域ア
ミノ酸配列をコードする。
【０１４１】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｔ２５０Ｑ、Ｍ２４８Ｌ、また
はこれらの両方からなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコ
ードする。
【０１４２】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ｙ、また
はこれらの両方からなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコ
ードする。
【０１４３】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、（１）本明細書に記載
されている、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド配列が
、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、およびこれらの組合せから選択されるヒトＩｇＧの第
一のＣＨ３のアミノ酸配列をコードする第一の重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可
能に連結されている、第一の対立遺伝子；ならびに（２）本明細書に記載されている、再
構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、ＩｇＧ１、Ｉ
ｇＧ２、ＩｇＧ４、およびこれらの組合せから選択されるヒトＩｇＧの第二のＣＨ３のア
ミノ酸配列をコードする第二の重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されて
おり、第二のＣＨ３のアミノ酸配列が、第二のＣＨ３のアミノ酸配列のプロテインＡへの
結合を低減するか、または消失させる改変（例えば、ＵＳ２０１０／０３３１５２７Ａ１
を参照されたい）を含む、第二の対立遺伝子を含む。
【０１４４】
一実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、Ｈ９５Ｒの改変（ＩＭＧＴエクソン
番号付けによる；ＥＵ番号付けによるＨ４３５Ｒ）を含む。一実施形態では、第二のＣＨ
３のアミノ酸配列は、Ｙ９６Ｆの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵによるＨ
４３６Ｆ）をさらに含む。別の実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、Ｈ９５Ｒ
の改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵ番号付けによるＨ４３５Ｒ）およびＹ９
６Ｆの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵによるＨ４３６Ｆ）の両方を含む。
【０１４５】
一実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、改変ヒトＩｇＧ１からのアミノ酸配
列であり、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭ
ＧＴ；ＥＵによるＤ３５６Ｅ、Ｌ３８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、および
Ｖ４２２Ｉ）からなる群から選択される変異をさらに含む。
【０１４６】
一実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、改変ヒトＩｇＧ２からのアミノ酸配
列であり、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ：ＥＵによるＮ３８４Ｓ、Ｋ
３９２Ｎ、およびＶ４２２Ｉ）からなる群から選択される変異をさらに含む。
【０１４７】
一実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、改変ヒトＩｇＧ４からのアミノ酸配
列であり、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、およびＶ８
２Ｉ（ＩＭＧＴ：ＥＵによるＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０
９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、およびＶ４２２Ｉ）からなる群から選択される変異をさらに含む。
【０１４８】
一実施形態では、重鎖定常領域アミノ酸配列は、非ヒト定常領域のアミノ酸配列であり
、重鎖定常領域アミノ酸配列は、上記の種類の改変のうちのいずれかのうちの１つまたは
複数を含む。
【０１４９】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ヒト重鎖定常領域のアミノ酸配
列であり、ヒト重鎖定常領域のアミノ酸配列は、上記で記載した種類の改変のうちのいず
れかのうちの１つまたは複数を含む。
【０１５０】
一実施形態では、全てまたは実質的に全ての内因性のＶＨ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子
セグメント、およびＪＨ遺伝子セグメントを、免疫グロブリン重鎖遺伝子座から欠失させ
るか、または非機能性にする（例えば、免疫グロブリン遺伝子座内にヌクレオチド配列（
例えば、外因性ヌクレオチド配列）の挿入を介して、または内因性のＶＨセグメント、Ｄ
セグメント、ＪＨセグメントの非機能性の再構成または反転を介して）。一実施形態では
、例えば、全ての内因性のＶＨ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、またはＪＨ遺伝
子セグメントのうちの約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９
６％以上、約９７％以上、約９８％以上、または約９９％以上を欠失させるか、または非
機能性にする。一実施形態では、例えば、内因性の機能性Ｖ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子
セグメント、またはＪ遺伝子セグメントのうちの少なくとも９５％、９６％、９７％、９
８％、または９９％を欠失させるか、または非機能性にする。
【０１５１】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、全てまたは実質的
に全ての内因性のＶＨ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、およびＪＨ遺伝子セグメ
ントを欠失させるか、または非機能性にする改変を含み、遺伝子改変された遺伝子座は、
１つまたは複数のヒスチジンコドンを有する、１つまたは複数のヒトＶＨ遺伝子セグメン
ト、ヒトＤ遺伝子セグメント、および／またはヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む、再構成
されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列を含み、再構成されていない重鎖可変領域
のヌクレオチド配列は、内因性位置に存在する（すなわち、ヌクレオチド配列が野生型の
非ヒト動物にある場合）か、または異所性に存在し（例えば、そのゲノムにおける内因性
免疫グロブリン鎖の遺伝子座と異なる遺伝子座に存在するか、またはその内因性の遺伝子
座内、例えば、免疫グロブリン可変遺伝子座内に存在し、ここで、該内因性の遺伝子座は
、ゲノムにおける異なる位置に配置されるか、またはゲノムにおける異なる位置へと移動
している）。
【０１５２】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、内因性Ａｄａｍ６ａ遺
伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはこれらの両方を含み、遺伝子改変は、内因性のＡｄａ
ｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはこれらの両方の発現および／または機能に影
響を及ぼさない。
【０１５３】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、異所性に存在するＡｄ
ａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはこれらの両方を含む。一実施形態では、Ａ
ｄａｍ６ａ遺伝子は、非ヒトＡｄａｍ６ａ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ａ
遺伝子は、ヒトＡｄａｍ６ａ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子は、非
ヒトＡｄａｍ６ｂ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子は、ヒトＡｄａｍ
６ｂ遺伝子である。
【０１５４】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、ヒト化された、再構成
されていないλ軽鎖可変遺伝子配列および／またはκ軽鎖可変遺伝子配列をさらに含む。
一実施形態では、ヒト化された、再構成されていないλ軽鎖可変遺伝子配列および／また
はκ軽鎖可変遺伝子配列は、λ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列およびκ軽鎖定常領域の
ヌクレオチド配列から選択される、免疫グロブリン軽鎖定常領域のヌクレオチド配列に作
動可能に連結されている。一実施形態では、ヒト化された、再構成されていないλ軽鎖可
変領域のヌクレオチド配列は、λ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結され
ている。一実施形態では、λ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列は、マウス配列、ラット配
列、またはヒト配列である。一実施形態では、ヒト化された、再構成されていないκ軽鎖
可変領域のヌクレオチド配列は、κ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結さ
れている。一実施形態では、κ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列は、マウス配列、ラット
配列、またはヒト配列である。
【０１５５】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、軽鎖可変ドメインをコ
ードする少なくとも１つのリーディングフレームに少なくとも１つのヒスチジンコドンを
導入する少なくとも１つの改変を含有する、再構成されていない軽鎖可変遺伝子配列を含
む。一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、軽鎖ＣＤＲに１つ、
２つ、３つ、または４つのヒスチジンコドンを含む、再構成された（例えば、再構成され
たλまたはκのＶ／Ｊ配列）配列を含む。一実施形態では、ＣＤＲは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ
２、ＣＤＲ３、およびこれらの組合せから選択される。一実施形態では、再構成されてい
ないかまたは再構成された軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、再構成されていないかま
たは再構成されたヒトλ軽鎖可変領域またはヒトκ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列であ
る。一実施形態では、再構成されていないかまたは再構成されたヒトλ軽鎖可変領域また
はヒトκ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、内因性のマウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子
座に存在する。一実施形態では、マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、マウスκ遺伝子
座である。一実施形態では、マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、マウスλ遺伝子座で
ある。
【０１５６】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子
座は、マウスの免疫グロブリン重鎖遺伝子座に存在する。一実施形態では、遺伝子改変さ
れた免疫グロブリン遺伝子座は、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスにおけるヒ
ト化免疫グロブリン重鎖遺伝子座に存在する。
【０１５７】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺
伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、酸性の環境で（
例えば、約５．５〜約６．０のｐＨで）、遺伝子改変なしの、対応する野生型の重鎖可変
ドメインより弱い抗原結合を示す。
【０１５８】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺
伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ１
／２）は、２５℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、２分間未満であ
る。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖
遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ
１／２）は、３７℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、２分間未満で
ある。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重
鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（
ｔ１／２）は、２５℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、１分間未満
である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン
重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期
（ｔ１／２）は、３７℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、１分間未
満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリ
ン遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、酸性ｐＨ（
例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、解離半減期（ｔ１／２）を、中性ｐＨ（例えば
、約７．０〜約７．４のｐＨ）における抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ１／２）と
比較して、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍
、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍
、または少なくとも約３０倍短縮する。
【０１５９】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子
座は、目的の抗原で刺激されると、抗原結合タンパク質、例えば、１つまたは複数のヒス
チジン残基を有する重鎖可変ドメインを含む抗体を産生することが可能なＢ細胞集団を含
む。本明細書に記載されている抗原結合タンパク質は、被験体へと投与されると、重鎖可
変ドメインをコードするが、重鎖可変ドメインにヒスチジン残基を含まない、類似するか
、または十分に類似するアミノ酸配列を保有する、対応する野生型の抗原結合タンパク質
を凌駕する血清半減期の延長を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されてい
る抗原結合タンパク質は、重鎖可変ドメインをコードするが、重鎖可変ドメインにヒスチ
ジン残基を含まない、類似するか、または十分に類似するアミノ酸配列を保有する、対応
する野生型の抗原結合タンパク質の少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約
１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍の血清半減期の延長を示す。
【０１６０】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子
座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、本明細書に記載され
ている遺伝子改変なしの、野生型の抗原結合タンパク質と比較して、ｐＨ依存性リサイク
ル性の改善、血清半減期の延長、またはこれらの両方を特徴とする。
【０１６１】
一態様では、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列を含む、非ヒト
動物の生殖細胞系列ゲノムにおける遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座であって、
再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、少なくとも１つの内因性非
ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む免疫グロブリン遺伝子座が提供さ
れる。
【０１６２】
一実施形態では、非ヒト動物は、齧歯動物、例えば、マウス、ラット、またはハムスタ
ーを含む哺乳動物である。
【０１６３】
一実施形態では、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８
つ以上、９つ以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１
６以上、１７以上、１８以上、１９以上、２０以上、２１以上、２２以上、２３以上、２
４以上、２５以上、２６以上、２７以上、２８以上、２９以上、３０以上、３１以上、３
２以上、３３以上、３４以上、３５以上、３６以上、３７以上、３８以上、３９以上、４
０以上、４１以上、４２以上、４３以上、４４以上、４５以上、４６以上、４７以上、４
８以上、４９以上、５０以上、５１以上、５２以上、５３以上、５４以上、５５以上、５
６以上、５７以上、５８以上、５９以上、６０以上、または６１以上の内因性の非ヒスチ
ジンコドンを、ヒスチジンコドンで置きかえる。
【０１６４】
一実施形態では、内因性の非ヒスチジン（histone）コドンは、Ｙ、Ｎ、Ｄ、Ｑ、Ｓ、
Ｗ、およびＲから選択されるアミノ酸をコードする。
【０１６５】
一実施形態では、ヒスチジンコドンによって置換された内因性の非ヒスチジンコドンは
、Ｎ末端領域、ループ４領域、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、これらの組合せから選択
される免疫グロブリン可変ドメインをコードする、再構成されていない重鎖可変領域のヌ
クレオチド配列に存在する。
【０１６６】
一実施形態では、置換されたヒスチジンコドンは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、お
よびこれらの組合せから選択される相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードする、再構成され
ていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列に存在する。
【０１６７】
一実施形態では、置換されたヒスチジンコドンは、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４、
およびこれらの組合せから選択されるフレーム領域（ＦＲ）をコードする、再構成されて
いない重鎖可変領域のヌクレオチド配列に存在する。
【０１６８】
一実施形態では、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ヒトＶＨ遺
伝子セグメントの少なくとも１つのリーディングフレームにおける１つまたは複数の内因
性非ヒスチジンコドンが、ヒスチジンコドンで置きかえられた、遺伝子改変されたヒトＶ
Ｈ遺伝子セグメントを含む。
【０１６９】
一実施形態では、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ヒトＶ
Ｈ遺伝子セグメントの少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで
置きかえる改変であって、ヒトＶＨ遺伝子セグメントが、ＶＨ１−２、ＶＨ１−３、ＶＨ
１−８、ＶＨ１−１８、ＶＨ１−２４、ＶＨ１−４５、ＶＨ１−４６、ＶＨ１−５８、Ｖ
Ｈ１−６９、ＶＨ２−５、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−７０、ＶＨ３−７、ＶＨ３−９、ＶＨ
３−１１、ＶＨ３−１３、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−１６、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−２１、
ＶＨ３−２３、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−３０−３、ＶＨ３−３０−５、ＶＨ３−３３、Ｖ
Ｈ３−３５、ＶＨ３−３８、ＶＨ３−４３、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−４９、ＶＨ３−５３
、ＶＨ３−６４、ＶＨ３−６６、ＶＨ３−７２、ＶＨ３−７３、ＶＨ３−７４、ＶＨ４−
４、ＶＨ４−２８、ＶＨ４−３０−１、ＶＨ４−３０−２、ＶＨ４−３０−４、ＶＨ４−
３１、ＶＨ４−３４、ＶＨ４−３９、ＶＨ４−５９、ＶＨ４−６１、ＶＨ５−５１、ＶＨ
６−１、ＶＨ７−４−１、ＶＨ７−８１、およびこれらの組合せからなる群から選択され
る改変を含む。
【０１７０】
一実施形態では、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、遺伝子
改変されたヒトＪＨ遺伝子セグメントであって、ヒトＪＨ遺伝子セグメントの少なくとも
１つのリーディングフレームにおける１つまたは複数の内因性非ヒスチジンコドンが、ヒ
スチジンコドンで置きかえられた遺伝子改変されたヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む。
【０１７１】
一実施形態では、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ヒトＪ
Ｈセグメントの少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きか
える改変であって、ヒトＪＨ遺伝子セグメントが、ＪＨ１、ＪＨ２、ＪＨ３、ＪＨ４、Ｊ
Ｈ５、ＪＨ６、およびこれらの組合せからなる群から選択される改変を含む。
【０１７２】
一実施形態では、置換されたヒスチジンコドンは、ＣＤＲ３の一部をコードする重鎖可
変領域のヌクレオチド配列に存在する。一実施形態では、ＣＤＲ３の一部は、リーディン
グフレームにおける少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置
きかえる改変を含む、遺伝子改変されたヒトＤ遺伝子セグメントのリーディングフレーム
に由来するアミノ酸配列を含む。
【０１７３】
一実施形態では、ヒスチジンコドンで置換される内因性非ヒスチジンコドンは、Ｙ、Ｎ
、Ｄ、Ｑ、Ｓ、Ｗ、およびＲから選択されるアミノ酸をコードする。
【０１７４】
一実施形態では、置換されるヒスチジンコドンは、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標
）ヒト化免疫グロブリンマウス内で最も高頻度に観察されるヒトＤ遺伝子セグメントの少
なくとも１つのリーディングフレームに存在する。
【０１７５】
一実施形態では、ＣＤＲ３の一部をコードする、遺伝子改変されたヒトＤ遺伝子セグメ
ントのリーディングフレームは、疎水性フレーム、終止フレーム、および親水性フレーム
から選択される。
【０１７６】
一実施形態では、リーディングフレームは、ヒトＤ遺伝子セグメントの疎水性フレーム
である。
【０１７７】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの疎水性フレームは、Ｄ１−１（ＧＴＴＧＴ
；配列番号８８）、Ｄ１−７（ＧＩＴＧＴ；配列番号８９）、Ｄ１−２０（ＧＩＴＧＴ；
配列番号８９）、およびＤ１−２６（ＧＩＶＧＡＴ；配列番号９０）からなる群から選択
されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、
ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコド
ンで置きかえる改変をさらに含む。
【０１７８】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの疎水性フレームは、Ｄ２−２（ＤＩＶＶＶ
ＰＡＡＩ；配列番号９２）、Ｄ２−８（ＤＩＶＬＭＶＹＡＩ；配列番号９４）、Ｄ２−１
５（ＤＩＶＶＶＶＡＡＴ；配列番号９５）、およびＤ２−２１（ＨＩＶＶＶＴＡＩ；配列
番号９７）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み
、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒス
チジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。
【０１７９】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの疎水性フレームは、Ｄ３−３（ＩＴＩＦＧ
ＶＶＩＩ；配列番号９８）、Ｄ３−９（ＩＴＩＦ＊ＬＶＩＩ；配列番号９９、配列番号１
００）、Ｄ３−１０（ＩＴＭＶＲＧＶＩＩ；配列番号１０１）、Ｄ３−１６（ＩＭＩＴＦ
ＧＧＶＩＶＩ；配列番号１０２）、およびＤ３−２２（ＩＴＭＩＶＶＶＩＴ；配列番号１
０３）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒ
トＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性コドンをヒ
スチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。
【０１８０】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの疎水性フレームは、Ｄ４−４（ＴＴＶＴ；
配列番号１０５）、Ｄ４−１１（ＴＴＶＴ；配列番号１０５）、Ｄ４−１７（ＴＴＶＴ；
配列番号１０５）、Ｄ４−２３（ＴＴＶＶＴ；配列番号１０６）からなる群から選択され
るアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌク
レオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで
置きかえる改変をさらに含む。
【０１８１】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの疎水性フレームは、Ｄ５−５（ＶＤＴＡＭ
Ｖ；配列番号１０７）、Ｄ５−１２（ＶＤＩＶＡＴＩ；配列番号１０８）、Ｄ５−１８（
ＶＤＴＡＭＶ；配列番号１０７）、およびＤ５−２４（ＶＥＭＡＴＩ；配列番号１０９）
からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺
伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコド
ンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。
【０１８２】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの疎水性フレームは、Ｄ６−６（ＳＩＡＡＲ
；配列番号１１１）、Ｄ６−１３（ＧＩＡＡＡＧ；配列番号１１３）、およびＤ６−１９
（ＧＩＡＶＡＧ；配列番号１１５）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする
ヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なく
とも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む
。
【０１８３】
一実施形態では、疎水性フレームは、ヒトＤ７−２７（ＬＴＧ）をコードするヌクレオ
チド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つ
の内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。
【０１８４】
一実施形態では、リーディングフレームは、ヒトＤ遺伝子セグメントの終止リーディン
グフレームである。
【０１８５】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの終止リーディングフレームは、Ｄ１−１（
ＶＱＬＥＲ；配列番号８）、Ｄ１−７（Ｖ＊ＬＥＬ）、Ｄ１−２０（Ｖ＊ＬＥＲ）、Ｄ１
−２６（Ｖ＊ＷＥＬＬ；配列番号１２）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコード
するヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少
なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに
含む。
【０１８６】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの終止リーディングフレームは、Ｄ２−２（
ＲＩＬ＊＊ＹＱＬＬＹ；配列番号１４）、Ｄ２−８（ＲＩＬＹ＊ＷＣＭＬＹ；配列番号１
６および配列番号１７）、Ｄ２−１５（ＲＩＬ＊ＷＷ＊ＬＬＬ）、およびＤ２−２１（Ｓ
ＩＬＷＷ＊ＬＬＦ；配列番号１９）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする
ヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なく
とも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む
。
【０１８７】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの終止リーディングフレームは、Ｄ３−３（
ＶＬＲＦＬＥＷＬＬＹ；配列番号２１）、Ｄ３−９（ＶＬＲＹＦＤＷＬＬ＊；配列番号２
３）、Ｄ３−１０（ＶＬＬＷＦＧＥＬＬ＊；配列番号２５）、Ｄ３−１６（ＶＬ＊ＬＲＬ
ＧＥＬＳＬＹ；配列番号２７）、およびＤ３−２２（ＶＬＬ＊＊＊ＷＬＬＬ；配列番号２
９）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒト
Ｄ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジン
コドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変を含む。
【０１８８】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの終止リーディングフレームは、Ｄ４−４（
＊ＬＱ＊Ｌ）、Ｄ４−１１（＊ＬＱ＊Ｌ）、Ｄ４−１７（＊ＬＲ＊Ｌ）、およびＤ４−２
３（＊ＬＲＷ＊Ｌ）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配
列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因
性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変を含む。
【０１８９】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの終止リーディングフレームは、Ｄ５−５（
ＷＩＱＬＷＬ；配列番号３５）；Ｄ５−１２（ＷＩ＊ＷＬＲＬ；配列番号３７）、Ｄ５−
１８（ＷＩＱＬＷＬ；配列番号３５）、およびＤ５−２４（＊ＲＷＬＱＬ；配列番号３９
）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ
遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコ
ドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変を含む。
【０１９０】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの終止リーディングフレームは、Ｄ６−６（
Ｖ＊ＱＬＶ）、Ｄ６−１３（Ｖ＊ＱＱＬＶ；配列番号４１）、およびＤ６−１９（Ｖ＊Ｑ
ＷＬＶ；配列番号４３）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチ
ド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの
内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。
【０１９１】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの終止リーディングフレームは、Ｄ７−２７
（＊ＬＧ）をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオ
チド配列におけるヒトＤ遺伝子セグメントの少なくとも１つの内因性コドンをヒスチジン
コドンで置きかえる改変をさらに含む。
【０１９２】
一実施形態では、リーディングフレームは、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレーム
である。
【０１９３】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームは、Ｄ１−１（ＹＮＷＮＤ
；配列番号４５）、Ｄ１−７（ＹＮＷＮＹ；配列番号４７）、Ｄ１−２０（ＹＮＷＮＤ；
配列番号４５）、およびＤ１−２６（ＹＳＧＳＹＹ；配列番号４９）からなる群から選択
されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、
ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性コドンをヒスチジンコドンで置きかえ
る改変をさらに含む。一実施形態では、親水性フレームは、配列番号４６、配列番号４８
、配列番号５０、およびこれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列をコード
するヌクレオチド配列を含む。
【０１９４】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームは、Ｄ２−２（ＧＹＣＳＳ
ＴＳＣＹＴ；配列番号５１）、Ｄ２−８（ＧＹＣＴＮＧＶＣＹＴ；配列番号５３）、Ｄ２
−１５（ＧＹＣＳＧＧＳＣＹＳ；配列番号５５）、およびＤ２−２１（ＡＹＣＧＧＤＣＹ
Ｓ；配列番号５７）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配
列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因
性コドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。一実施形態では、親水性フ
レームは、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、およびこれらの
組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１９５】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームは、Ｄ３−３（ＹＹＤＦＷ
ＳＧＹＹＴ；配列番号５９）、Ｄ３−９（ＹＹＤＩＬＴＧＹＹＮ；配列番号６１）、Ｄ３
−１０（ＹＹＹＧＳＧＳＹＹＮ；配列番号６３）、Ｄ３−１６（ＹＹＤＹＶＷＧＳＹＲＹ
Ｔ；配列番号６５）、およびＤ３−２２（ＹＹＹＤＳＳＧＹＹＹ；配列番号６７）からな
る群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セ
グメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性コドンをヒスチジンコド
ンで置きかえる改変をさらに含む。一実施形態では、親水性フレームは、配列番号６０、
配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、およびこれらの組合せから
なる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１９６】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームは、Ｄ４−４（ＤＹＳＮＹ
；配列番号６９）、Ｄ４−１１（ＤＹＳＮＹ；配列番号６９）、Ｄ４−１７（ＤＹＧＤＹ
；配列番号７１）、およびＤ４−２３（ＤＹＧＧＮＳ；配列番号７３）からなる群から選
択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは
、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性コドンをヒスチジンコドンで置きか
える改変を含む。一実施形態では、親水性フレームは、配列番号７０、配列番号７２、配
列番号７４、およびこれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする
ヌクレオチド配列を含む。
【０１９７】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームは、Ｄ５−５（ＧＹＳＹＧ
Ｙ；配列番号７５）、Ｄ５−１２（ＧＹＳＧＹＤＹ；配列番号７７）、Ｄ５−１８（ＧＹ
ＳＹＧＹ；配列番号７５）、およびＤ５−２４（ＲＤＧＹＮＹ；配列番号７９）からなる
群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグ
メントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性コドンをヒスチジンコドン
で置きかえる改変をさらに含む。一実施形態では、親水性フレームは、配列番号７６、配
列番号７８、配列番号８０、およびこれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配
列をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１９８】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームは、Ｄ６−６（ＥＹＳＳＳ
Ｓ；配列番号８１）、Ｄ６−１３（ＧＹＳＳＳＷＹ；配列番号８３）、およびＤ６−１９
（ＧＹＳＳＧＷＹ；配列番号８５）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする
ヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なく
とも１つの内因性コドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。一実施形態
では、親水性フレームは、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号７６、
およびこれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド
配列を含む。
【０１９９】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームは、Ｄ７−２７（ＮＷＧ）
をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列に
おける少なくとも１つの内因性コドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む
。
【０２００】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームは、配列番号４６、配列番
号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配
列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０
、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号
８２、配列番号８４、配列番号８６、およびこれらの組合せからなる群から選択されるア
ミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０２０１】
一実施形態では、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド
配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、およびこれらの組合せから選択される、ヒト
または非ヒトの重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。一実施形
態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３（
ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）を含む。
【０２０２】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、内因性遺伝子座に存在する（す
なわち、ヌクレオチド配列が野生型の非ヒト動物にある場合）か、または異所性に存在す
る（例えば、そのゲノムにおける内因性免疫グロブリン鎖の遺伝子座と異なる遺伝子座に
存在するか、またはその内因性の遺伝子座内に、例えば、免疫グロブリン可変遺伝子座内
に存在し、ここで、該内因性の遺伝子座は、ゲノムにおける異なる位置に配置されるか、
またはゲノムにおける異なる位置へと移動している）。
【０２０３】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ＣＨ２におけるまたはＣＨ３に
おける改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲である
エンドソーム内で）重鎖定常領域アミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を
含む。
【０２０４】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、２５０位における改変（例えば
、ＥまたはＱ）；２５０および４２８位における改変（例えば、ＬまたはＦ）；２５２位
における改変（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／ＷまたはＴ）、２５４位における改変（例えば、Ｓ
またはＴ）、および２５６位における改変（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤまたはＴ）；ま
たは４２８および／もしくは４３３位における改変（例えば、Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／Ｑまたは
Ｋ）、および／もしくは４３４位における改変（例えば、Ｈ／ＦまたはＹ）；または２５
０および／もしくは４２８位における改変；または３０７もしくは３０８位における改変
（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）、ならびに４３４位における改変を含むヒト重鎖定常
領域アミノ酸配列をコードする。一実施形態では、改変は、４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８
Ｌ）および４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）の改変；４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えば、Ｖ２
５９Ｉ）、および３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）の改変；４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３
Ｋ）および４３４位（例えば、４３４Ｙ）の改変；２５２、２５４、および２５６位（例
えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅ）における改変；２５０Ｑおよび４２８Ｌの
改変（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ４２８Ｌ）；ならびに３０７および／または３０８位
における改変（例えば、３０８Ｆまたは３０８Ｐ）であって、酸性の環境で（例えば、ｐ
Ｈが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）重鎖定常領域アミノ酸配列の
ＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む。
【０２０５】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、２５２位のアミノ酸残基と２５
７位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、
ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣＨ２のアミノ酸配列
のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣＨ２のアミノ酸配列をコードする
。
【０２０６】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、３０７位のアミノ酸残基と３１
１位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、
ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣＨ２のアミノ酸配列
のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣＨ２のアミノ酸配列をコードする
。
【０２０７】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、４３３位のアミノ酸残基と４３
６位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、
ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣＨ３のアミノ酸配列
のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣＨ３のアミノ酸配列をコードする
。
【０２０８】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ｓ、およ
びこれらの組合せからなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列を
コードする。
【０２０９】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｍ４２８Ｌ、Ｖ２５９Ｉ、Ｖ３
０８Ｆ、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域ア
ミノ酸配列をコードする。
【０２１０】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｎ４３４Ａ変異を含むヒト重鎖
定常領域アミノ酸配列をコードする。
【０２１１】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２
５６Ｅ、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域ア
ミノ酸配列をコードする。
【０２１２】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｔ２５０Ｑ、Ｍ２４８Ｌ、また
はこれらの両方からなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコ
ードする。
【０２１３】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ｙ、また
はこれらの両方からなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコ
ードする。
【０２１４】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、（１）本明細書に記載
されている、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド配列が
、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、およびこれらの組合せから選択されるヒトＩｇＧの第
一のＣＨ３のアミノ酸配列をコードする第一の重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可
能に連結されている、第一の対立遺伝子；ならびに（２）本明細書に記載されている、再
構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、ＩｇＧ１、Ｉ
ｇＧ２、ＩｇＧ４、およびこれらの組合せから選択されるヒトＩｇＧの第二のＣＨ３のア
ミノ酸配列をコードする第二の重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されて
おり、第二のＣＨ３のアミノ酸配列が、第二のＣＨ３のアミノ酸配列の、プロテインＡへ
の結合を低減するか、または消失させる改変（例えば、ＵＳ２０１０／０３３１５２７Ａ
１を参照されたい）を含む、第二の対立遺伝子を含む。
【０２１５】
一実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、Ｈ９５Ｒの改変（ＩＭＧＴエクソン
番号付けによる；ＥＵ番号付けによるＨ４３５Ｒ）を含む。一実施形態では、第二のＣＨ
３のアミノ酸配列は、Ｙ９６Ｆの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵによるＨ
４３６Ｆ）をさらに含む。別の実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、Ｈ９５Ｒ
の改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵ番号付けによるＨ４３５Ｒ）およびＹ９
６Ｆの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵによるＨ４３６Ｆ）の両方を含む。
【０２１６】
一実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、改変ヒトＩｇＧ１からのアミノ酸配
列であり、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭ
ＧＴ；ＥＵによるＤ３５６Ｅ、Ｌ３８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、および
Ｖ４２２Ｉ）からなる群から選択される変異をさらに含む。
【０２１７】
一実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、改変ヒトＩｇＧ２からのアミノ酸配
列であり、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ：ＥＵによるＮ３８４Ｓ、Ｋ
３９２Ｎ、およびＶ４２２Ｉ）からなる群から選択される変異をさらに含む。
【０２１８】
一実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、改変ヒトＩｇＧ４からのアミノ酸配
列であり、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、およびＶ８
２Ｉ（ＩＭＧＴ：ＥＵによるＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０
９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、およびＶ４２２Ｉ）からなる群から選択される変異をさらに含む。
【０２１９】
一実施形態では、重鎖定常領域アミノ酸配列は、非ヒト定常領域のアミノ酸配列であり
、重鎖定常領域アミノ酸配列は、上記の種類の改変のうちのいずれかのうちの１つまたは
複数を含む。
【０２２０】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列
であり、ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列は、上記の種類の改変のうちのいずれかのうちの
１つまたは複数を含む。
【０２２１】
一実施形態では、全てまたは実質的に全ての内因性のＶＨ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子
セグメント、およびＪＨ遺伝子セグメントを、免疫グロブリン重鎖遺伝子座から欠失させ
るか、または非機能性にする（例えば、免疫グロブリン遺伝子座にヌクレオチド配列（例
えば、外因性ヌクレオチド配列）の挿入を介して、または内因性のＶＨセグメント、Ｄセ
グメント、ＪＨセグメントの非機能性の再構成または反転を介して）。一実施形態では、
例えば、全ての内因性のＶＨ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、またはＪＨ遺伝子
セグメントのうちの約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９６
％以上、約９７％以上、約９８％以上、または約９９％以上を欠失させるか、または非機
能性にする。一実施形態では、例えば、内因性の機能性Ｖ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セ
グメント、またはＪ遺伝子セグメントのうちの少なくとも９５％、９６％、９７％、９８
％、または９９％を欠失させるか、または非機能性にする。
【０２２２】
一実施形態では、遺伝子改変された遺伝子座は、全てまたは実質的に全ての内因性のＶ
Ｈ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、およびＪＨ遺伝子セグメントを欠失させるか
、または非機能性にする改変を含み、ゲノム遺伝子座は、少なくとも１つのリーディング
フレームに少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を
含む、遺伝子改変された、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列を含
む。一実施形態では、遺伝子改変された、再構成されていない免疫グロブリン重鎖可変遺
伝子配列は、内因性位置に存在する（すなわち、ヌクレオチド配列が野生型の非ヒト動物
にある場合）か、または異所性に存在する（例えば、そのゲノムにおける内因性免疫グロ
ブリン鎖の遺伝子座と異なる遺伝子座に存在するか、またはその内因性の遺伝子座内に、
例えば、免疫グロブリン可変遺伝子座内に存在し、ここで、該内因性の遺伝子座は、ゲノ
ムにおける異なる位置に配置されるか、またはゲノムにおける異なる位置へと移動してい
る）。
【０２２３】
一実施形態では、遺伝子改変された遺伝子座は、内因性Ａｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ
６ｂ遺伝子、またはこれらの両方を含み、遺伝子改変は、内因性のＡｄａｍ６ａ遺伝子、
Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはこれらの両方の発現および／または機能に影響を及ぼさない
。
【０２２４】
一実施形態では、遺伝子改変された遺伝子座は、異所性に存在するＡｄａｍ６ａ遺伝子
、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはこれらの両方を含む。一実施形態では、Ａｄａｍ６ａ遺伝
子は、非ヒトＡｄａｍ６ａ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ａ遺伝子は、マウ
スＡｄａｍ６ａ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ａ遺伝子は、ヒトＡｄａｍ６
ａ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子は、非ヒトＡｄａｍ６ｂ遺伝子で
ある。一実施形態では、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子は、マウスＡｄａｍ６ｂ遺伝子である。一実
施形態では、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子は、ヒトＡｄａｍ６ｂ遺伝子である。
【０２２５】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、ヒト化された、再構成
されていないλ軽鎖可変遺伝子配列および／またはκ軽鎖可変遺伝子配列をさらに含む。
一実施形態では、ヒト化された、再構成されていないλ軽鎖可変遺伝子配列および／また
はκ軽鎖可変遺伝子配列は、λ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列およびκ軽鎖定常領域の
ヌクレオチド配列から選択される、免疫グロブリン軽鎖定常領域のヌクレオチド配列に作
動可能に連結されている。一実施形態では、ヒト化された、再構成されていないλ軽鎖可
変領域のヌクレオチド配列は、λ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結され
ている。一実施形態では、λ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列は、マウス配列、ラット配
列、またはヒト配列である。一実施形態では、ヒト化された、再構成されていないκ軽鎖
可変領域のヌクレオチド配列は、κ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結さ
れている。一実施形態では、κ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列は、マウス配列、ラット
配列、またはヒト配列である。
【０２２６】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、軽鎖可変ドメインをコ
ードする少なくとも１つのリーディングフレームに少なくとも１つのヒスチジンコドンを
導入する少なくとも１つの改変を含有する、再構成されていない軽鎖可変遺伝子配列を含
む。一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、軽鎖ＣＤＲに１つ、
２つ、３つ、または４つのヒスチジンコドンを含む、再構成された（例えば、再構成され
たλまたはκのＶ／Ｊ配列）配列を含む。一実施形態では、ＣＤＲは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ
２、ＣＤＲ３、およびこれらの組合せから選択される。一実施形態では、再構成されてい
ないかまたは再構成された軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、再構成されていないかま
たは再構成されたヒトλ軽鎖可変領域またはヒトκ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列であ
る。一実施形態では、再構成されていないかまたは再構成されたヒトλ軽鎖可変領域また
はヒトκ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、内因性のマウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子
座に存在する。一実施形態では、マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、マウスκ遺伝子
座である。一実施形態では、マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、マウスλ遺伝子座で
ある。
【０２２７】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子
座は、マウスの免疫グロブリン重鎖遺伝子座に存在する。一実施形態では、遺伝子改変さ
れた免疫グロブリン遺伝子座は、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスにおけるヒ
ト化免疫グロブリン重鎖遺伝子座に存在する。
【０２２８】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺
伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、酸性の環境で（
例えば、約５．５〜約６．０のｐＨで）、本明細書に記載されている遺伝子改変なしの、
対応する野生型の重鎖可変ドメインより弱い抗原結合を示す。
【０２２９】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺
伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ１
／２）は、２５℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、２分間未満であ
る。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖
遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ
１／２）は、３７℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、２分間未満で
ある。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重
鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（
ｔ１／２）は、２５℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、１分間未満
である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン
重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期
（ｔ１／２）は、３７℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、１分間未
満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリ
ン遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、酸性ｐＨ（
例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、解離半減期（ｔ１／２）を、中性ｐＨ（例えば
、約７．０〜約７．４のｐＨ）における抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ１／２）と
比較して、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍
、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍
、または少なくとも約３０倍短縮する。
【０２３０】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子
座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、遺伝子改変なしの野
生型の抗原結合タンパク質と比較して、ｐＨ依存性リサイクル性の改善、血清半減期の延
長、またはこれらの両方を特徴とする。
【０２３１】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子
座は、目的の抗原で刺激されると、１つまたは複数のヒスチジン残基を含む重鎖可変ドメ
インを含む抗原結合タンパク質、例えば、抗体を産生することが可能なＢ細胞集団を含む
。本明細書に記載されている、抗原結合タンパク質は、被験体へと投与されると、重鎖可
変ドメインをコードするが、重鎖可変ドメインにヒスチジン残基を含まない、類似するか
、または十分に類似するアミノ酸配列を保有する、対応する野生型の抗原結合タンパク質
を凌駕する血清半減期の延長を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されてい
る抗原結合タンパク質は、重鎖可変ドメインをコードするが、重鎖可変ドメインにヒスチ
ジン残基を含まない、類似するか、または十分に類似するアミノ酸配列を保有する、対応
する野生型の抗原結合タンパク質の少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約
１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍の血清半減期の延長を示す。
【０２３２】
一態様では、ヒトＶＨ遺伝子セグメント、ヒトＤ遺伝子セグメント、およびヒトＪＨ遺
伝子セグメントを含む、非ヒト動物の遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座であって
、ヒトＤ遺伝子セグメントの少なくとも１つを、５’側から３’側にかけて、対応する野
生型配列に対して反転させており、反転させたヒトＤ遺伝子セグメントの少なくとも１つ
のリーディングフレームが、ヒスチジンコドンを含む遺伝子改変された免疫グロブリン遺
伝子座が提供される。
【０２３３】
一実施形態では、非ヒト動物は、齧歯動物、例えば、マウス、ラット、またはハムスタ
ーを含む哺乳動物である。
【０２３４】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、生殖細胞系列ゲノムに
存在する。
【０２３５】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、１つまたは複数、２つ
以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０
以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８
以上、１９以上、２０以上、２１以上、２２以上、２３以上、２４以上、２５以上、２６
以上、２７以上、２８以上、２９以上、３０以上、３１以上、３２以上、３３以上、また
は３４以上のヒスチジン残基を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードする。
【０２３６】
一実施形態では、機能性ヒトＤ遺伝子セグメントのうちの少なくとも２つ、少なくとも
３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも
８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも
１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも
１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも
２３、少なくとも２４、または全てもしくは実質的に全ては、対応する野生型配列に対し
て逆配向である。
【０２３７】
一実施形態では、内因性免疫グロブリンのＶＨ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント
、ＪＨ遺伝子セグメントの全てまたは実質的に全てを、免疫グロブリン重鎖遺伝子座から
欠失させるか、または非機能性にする（例えば、免疫グロブリン遺伝子座にヌクレオチド
配列、例えば、外因性ヌクレオチド配列の挿入を介して、または内因性の免疫グロブリン
ＶＨセグメント、Ｄセグメント、ＪＨセグメントの全てもしくは実質的に全ての非機能性
の再構成もしくは反転を介して）が、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、ヒト
ＶＨ遺伝子セグメント、ヒトＤ遺伝子セグメント、およびヒトＪＨ遺伝子セグメントを含
み、ヒトＤ遺伝子セグメントの少なくとも１つは、対応する野生型配列に対して逆配向で
存在し、反転させたヒトＤ遺伝子セグメントにおける少なくとも１つのリーディングフレ
ームは、少なくとも１つのヒスチジンコドンを含む。
【０２３８】
一実施形態では、反転させたヒトＤ遺伝子セグメントは、ヒトＶＨ遺伝子セグメントお
よび／またはヒトＪＨ遺伝子セグメントに作動可能に連結されている。
【０２３９】
一実施形態では、対応する野生型配列と比べて逆配向で存在するヒトＤ遺伝子セグメン
トは、Ｄ１−１、Ｄ１−７、Ｄ１−２０、Ｄ１−２６、Ｄ２−２、Ｄ２−８、Ｄ２−１５
、Ｄ２−２１、Ｄ３−３、Ｄ３−９、Ｄ３−１０、Ｄ３−１６、Ｄ３−２２、Ｄ４−４、
Ｄ４−１１、Ｄ４−１７、Ｄ４−２３、Ｄ５−５、Ｄ５−１２、Ｄ５−１８、Ｄ５−２４
、Ｄ６−６、Ｄ６−１３、Ｄ６−１９、Ｄ７−２７、およびこれらの組合せからなる群か
ら選択される。
【０２４０】
一実施形態では、対応する野生型配列と比べて逆配向で存在するヒトＤ遺伝子セグメン
トは、Ｄ１−１、Ｄ１−７、Ｄ１−２０、Ｄ１−２６、およびこれらの組合せからなる群
から選択されるＤ１遺伝子セグメントである。
【０２４１】
一実施形態では、対応する野生型配列と比べて逆配向で存在するヒトＤ遺伝子セグメン
トは、Ｄ２−２、Ｄ２−８、Ｄ２−１５、Ｄ２−２１、およびこれらの組合せからなる群
から選択されるＤ２遺伝子セグメントである。
【０２４２】
一実施形態では、対応する野生型配列と比べて逆配向で存在するヒトＤ遺伝子セグメン
トは、Ｄ３−３、Ｄ３−９、Ｄ３−１０、Ｄ３−１６、Ｄ３−２２、およびこれらの組合
せからなる群から選択されるＤ３遺伝子セグメントである。
【０２４３】
一実施形態では、対応する野生型配列と比べて逆配向で存在するヒトＤ遺伝子セグメン
トは、Ｄ４−４、Ｄ４−１１、Ｄ４−１７、Ｄ４−２３、およびこれらの組合せからなる
群から選択されるＤ４遺伝子セグメントである。
【０２４４】
一実施形態では、対応する野生型配列と比べて逆配向で存在するヒトＤ遺伝子セグメン
トは、Ｄ５−５、Ｄ５−１２、Ｄ５−１８、Ｄ５−２４、およびこれらの組合せからなる
群から選択されるＤ５遺伝子セグメントである。
【０２４５】
一実施形態では、対応する野生型配列と比べて逆配向で存在するヒトＤ遺伝子セグメン
トは、Ｄ６−６、Ｄ６−１３、Ｄ６−１９、およびこれらの組合せからなる群から選択さ
れるＤ６遺伝子セグメントである。
【０２４６】
一実施形態では、対応する野生型配列と比べて逆配向で存在するヒトＤ遺伝子セグメン
トは、Ｄ７−２７である。
【０２４７】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントのリーディングフレームは、終止リーディン
グフレーム、親水性リーディングフレーム、および疎水性リーディングフレームから選択
され、反転させたヒトＤ遺伝子セグメントの少なくとも１つのリーディングフレームは、
ヒスチジンコドンを含む。
【０２４８】
一実施形態では、反転させたヒトＤ遺伝子セグメントを含む、再構成されていない重鎖
可変領域のヌクレオチド配列は、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、およびＩｇＡから選
択される免疫グロブリンアイソタイプをコードする、ヒトまたは非ヒトの重鎖定常領域の
ヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。
【０２４９】
一実施形態では、反転させたヒトＤ遺伝子セグメントを含む、再構成されていない重鎖
可変領域のヌクレオチド配列は、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、およびＩｇＡから選
択される免疫グロブリンアイソタイプをコードする、ヒトまたは非ヒトの重鎖定常領域の
ヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。
【０２５０】
一実施形態では、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド
配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、およびこれらの組合せから選択される、ヒト
または非ヒトの重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。一実施形
態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３（
すなわち、ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）を含む。
【０２５１】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、内因性遺伝子座に存在する（す
なわち、ヌクレオチド配列が野生型の非ヒト動物にある場合）か、または異所性に存在す
る（例えば、そのゲノムにおける内因性免疫グロブリン鎖の遺伝子座と異なる遺伝子座に
存在するか、またはその内因性の遺伝子座内に、例えば、免疫グロブリン可変遺伝子座内
に存在し、ここで、該内因性の遺伝子座は、ゲノムにおける異なる位置に配置されるか、
またはゲノムにおける異なる位置へと移動している）。
【０２５２】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ＣＨ２におけるまたはＣＨ３に
おける改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲である
エンドソーム内で）重鎖定常領域アミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を
含む。
【０２５３】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、２５０位における改変（例えば
、ＥまたはＱ）；２５０および４２８位における改変（例えば、ＬまたはＦ）；２５２位
における改変（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／ＷまたはＴ）、２５４位における改変（例えば、Ｓ
またはＴ）、および２５６位における改変（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤまたはＴ）；ま
たは４２８および／もしくは４３３位における改変（例えば、Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／Ｑまたは
Ｋ）、および／もしくは４３４位における改変（例えば、Ｈ／ＦまたはＹ）；または２５
０および／もしくは４２８位における改変；または３０７もしくは３０８位における改変
（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）、ならびに４３４位における改変を含むヒト重鎖定常
領域アミノ酸配列をコードする。一実施形態では、改変は、４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８
Ｌ）および４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）の改変；４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えば、Ｖ２
５９Ｉ）、および３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）の改変；４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３
Ｋ）および４３４位（例えば、４３４Ｙ）の改変；２５２、２５４、および２５６位（例
えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅ）における改変；２５０Ｑおよび４２８Ｌの
改変（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ４２８Ｌ）；ならびに３０７および／または３０８位
における改変（例えば、３０８Ｆまたは３０８Ｐ）であって、酸性の環境で（例えば、ｐ
Ｈが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）重鎖定常領域アミノ酸配列の
ＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む。
【０２５４】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、２５２位のアミノ酸残基と２５
７位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、
ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣＨ２のアミノ酸配列
のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣＨ２のアミノ酸配列をコードする
。
【０２５５】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、３０７位のアミノ酸残基と３１
１位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、
ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣＨ２のアミノ酸配列
のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣＨ２のアミノ酸配列をコードする
。
【０２５６】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、４３３位のアミノ酸残基と４３
６位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、
ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣＨ３のアミノ酸配列
のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣＨ３のアミノ酸配列をコードする
。
【０２５７】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ｓ、およ
びこれらの組合せからなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列を
コードする。
【０２５８】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｍ４２８Ｌ、Ｖ２５９Ｉ、Ｖ３
０８Ｆ、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域ア
ミノ酸配列をコードする。
【０２５９】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｎ４３４Ａ変異を含むヒト重鎖
定常領域アミノ酸配列をコードする。
【０２６０】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２
５６Ｅ、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域ア
ミノ酸配列をコードする。
【０２６１】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｔ２５０Ｑ、Ｍ２４８Ｌ、また
はこれらの両方からなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコ
ードする。
【０２６２】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ｙ、また
はこれらの両方からなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコ
ードする。
【０２６３】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、（１）本明細書に記載
されている、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド配列が
、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、およびこれらの組合せから選択されるヒトＩｇＧの第
一のＣＨ３のアミノ酸配列をコードする第一の重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可
能に連結されている、第一の対立遺伝子；ならびに（２）本明細書に記載されている、再
構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、ＩｇＧ１、Ｉ
ｇＧ２、ＩｇＧ４、およびこれらの組合せから選択されるヒトＩｇＧの第二のＣＨ３のア
ミノ酸配列をコードする第二の重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されて
おり、第二のＣＨ３のアミノ酸配列が、第二のＣＨ３のアミノ酸配列の、プロテインＡへ
の結合を低減するか、または消失させる改変（例えば、ＵＳ２０１０／０３３１５２７Ａ
１を参照されたい）を含む、第二の対立遺伝子を含む。
【０２６４】
一実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、Ｈ９５Ｒの改変（ＩＭＧＴエクソン
番号付けによる；ＥＵ番号付けによるＨ４３５Ｒ）を含む。一実施形態では、第二のＣＨ
３のアミノ酸配列は、Ｙ９６Ｆの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵによるＨ
４３６Ｆ）をさらに含む。別の実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、Ｈ９５Ｒ
の改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵ番号付けによるＨ４３５Ｒ）およびＹ９
６Ｆの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵによるＨ４３６Ｆ）の両方を含む。
【０２６５】
一実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、改変ヒトＩｇＧ１からのアミノ酸配
列であり、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭ
ＧＴ；ＥＵによるＤ３５６Ｅ、Ｌ３８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、および
Ｖ４２２Ｉ）からなる群から選択される変異をさらに含む。
【０２６６】
一実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、改変ヒトＩｇＧ２からのアミノ酸配
列であり、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ：ＥＵによるＮ３８４Ｓ、Ｋ
３９２Ｎ、およびＶ４２２Ｉ）からなる群から選択される変異をさらに含む。
【０２６７】
一実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、改変ヒトＩｇＧ４からのアミノ酸配
列であり、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、およびＶ８
２Ｉ（ＩＭＧＴ：ＥＵによるＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０
９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、およびＶ４２２Ｉ）からなる群から選択される変異をさらに含む。
【０２６８】
一実施形態では、重鎖定常領域アミノ酸配列は、非ヒト定常領域のアミノ酸配列であり
、重鎖定常領域アミノ酸配列は、上記の種類の改変のうちのいずれかのうちの１つまたは
複数を含む。
【０２６９】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列
であり、ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列は、上記の種類の改変のうちのいずれかのうちの
１つまたは複数を含む。
【０２７０】
一実施形態では、全てまたは実質的に全ての内因性のＶＨ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子
セグメント、およびＪＨ遺伝子セグメントを、免疫グロブリン重鎖遺伝子座から欠失させ
るか、または非機能性にする（例えば、免疫グロブリン遺伝子座におけるヌクレオチド配
列（例えば、外因性ヌクレオチド配列）の挿入を介して、または内因性のＶＨセグメント
、Ｄセグメント、ＪＨセグメントの非機能性の再構成または反転を介して）。一実施形態
では、例えば、全ての内因性のＶＨ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、またはＪＨ
遺伝子セグメントのうちの約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、
約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上、または約９９％以上を欠失させるか、また
は非機能性にする。一実施形態では、例えば、内因性の機能性Ｖ遺伝子セグメント、Ｄ遺
伝子セグメント、またはＪ遺伝子セグメントのうちの少なくとも９５％、９６％、９７％
、９８％、または９９％を欠失させるか、または非機能性にする。
【０２７１】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、全てまたは実質的
に全ての内因性のＶＨ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、およびＪＨ遺伝子セグメ
ントを欠失させるか、または非機能性にする改変を含み、遺伝子改変された遺伝子座は、
本明細書に記載されている、少なくとも１つの反転させたヒトＤ遺伝子セグメントを含む
、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列を含み、再構成されていない重鎖
可変領域のヌクレオチド配列は、内因性位置に存在する（すなわち、ヌクレオチド配列が
野生型の非ヒト動物にある場合）か、または異所性に存在する（例えば、そのゲノムにお
ける内因性免疫グロブリン鎖の遺伝子座と異なる遺伝子座に存在する、またはその内因性
の遺伝子座内に、例えば、免疫グロブリン可変遺伝子座内に存在し、ここで、該内因性の
遺伝子座は、ゲノムにおける異なる位置に配置されるか、またはゲノムにおける異なる位
置へと移動している）。
【０２７２】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、内因性Ａｄａｍ６ａ遺
伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはこれらの両方を含み、遺伝子改変は、内因性のＡｄａ
ｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはこれらの両方の発現および／または機能に影
響を及ぼさない。
【０２７３】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、異所性に存在するＡｄ
ａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはこれらの両方を含む。一実施形態では、Ａ
ｄａｍ６ａ遺伝子は、非ヒトＡｄａｍ６ａ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ａ
遺伝子は、マウスＡｄａｍ６ａ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ａ遺伝子は、
ヒトＡｄａｍ６ａ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子は、非ヒトＡｄａ
ｍ６ｂ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子は、マウスＡｄａｍ６ｂ遺伝
子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子は、ヒトＡｄａｍ６ｂ遺伝子である。
【０２７４】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、ヒト化された、再構成
されていないλ軽鎖可変遺伝子配列および／またはκ軽鎖可変遺伝子配列をさらに含む。
一実施形態では、ヒト化された、再構成されていないλ軽鎖可変遺伝子配列および／また
はκ軽鎖可変遺伝子配列は、λ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列およびκ軽鎖定常領域の
ヌクレオチド配列から選択される、免疫グロブリン軽鎖定常領域のヌクレオチド配列に作
動可能に連結されている。一実施形態では、ヒト化された、再構成されていないλ軽鎖可
変領域のヌクレオチド配列は、λ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結され
ている。一実施形態では、λ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列は、マウス配列、ラット配
列、またはヒト配列である。一実施形態では、ヒト化された、再構成されていないκ軽鎖
可変領域のヌクレオチド配列は、κ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結さ
れている。一実施形態では、κ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列は、マウス配列、ラット
配列、またはヒト配列である。
【０２７５】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、軽鎖可変ドメインをコ
ードする少なくとも１つのリーディングフレームに少なくとも１つのヒスチジンコドンを
導入する少なくとも１つの改変を含有する、再構成されていない軽鎖可変遺伝子配列を含
む。一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、軽鎖ＣＤＲに１つ、
２つ、３つ、または４つのヒスチジンコドンを含む、再構成された（例えば、再構成され
たλまたはκのＶ／Ｊ配列）配列を含む。一実施形態では、ＣＤＲは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ
２、ＣＤＲ３、およびこれらの組合せから選択される。一実施形態では、再構成されてい
ないかまたは再構成された軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、再構成されていないかま
たは再構成されたヒトλ軽鎖可変領域またはヒトκ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列であ
る。一実施形態では、再構成されていないかまたは再構成されたヒトλ軽鎖可変領域また
はヒトκ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、内因性のマウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子
座に存在する。一実施形態では、マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、マウスκ遺伝子
座である。一実施形態では、マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、マウス免疫グロブリ
ン軽鎖遺伝子座は、マウスλ遺伝子座である。
【０２７６】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子
座は、マウスの免疫グロブリン重鎖遺伝子座に存在する。一実施形態では、遺伝子改変さ
れた免疫グロブリン遺伝子座は、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスにおけるヒ
ト化免疫グロブリン重鎖遺伝子座に存在する。
【０２７７】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺
伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、酸性の環境で（
例えば、約５．５〜約６．０のｐＨで）、遺伝子改変なしの、対応する野生型の重鎖可変
ドメインより弱い抗原結合を示す。
【０２７８】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺
伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ１
／２）は、２５℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、２分間未満であ
る。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖
遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ
１／２）は、３７℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、２分間未満で
ある。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重
鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（
ｔ１／２）は、２５℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、１分間未満
である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン
重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期
（ｔ１／２）は、３７℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、１分間未
満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリ
ン遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、酸性ｐＨ（
例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、解離半減期（ｔ１／２）を、中性ｐＨ（例えば
、約７．０〜約７．４のｐＨ）における抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ１／２）と
比較して、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍
、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍
、または少なくとも約３０倍短縮する。
【０２７９】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子
座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、遺伝子改変なしの野
生型の抗原結合タンパク質と比較して、ｐＨ依存性リサイクル性の改善、血清半減期の延
長、またはこれらの両方を特徴とする。
【０２８０】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子
座は、目的の抗原で刺激されると、１つまたは複数のヒスチジン残基を含む重鎖可変ドメ
インを含む抗原結合タンパク質、例えば、抗体を産生することが可能なＢ細胞集団を含む
。本明細書に記載されている抗原結合タンパク質は、被験体へと投与されると、重鎖可変
ドメインをコードするが、重鎖可変ドメインにヒスチジン残基を含まない、類似するか、
または十分に類似するアミノ酸配列を保有する、対応する野生型の抗原結合タンパク質を
凌駕する血清半減期の延長を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている
抗原結合タンパク質は、重鎖可変ドメインをコードするが、重鎖可変ドメインにヒスチジ
ン残基を含まない、類似するか、または十分に類似するアミノ酸配列を保有する、対応す
る野生型の抗原結合タンパク質の少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１
０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍の血清半減期の延長を示す。
【０２８１】
一態様では、その生殖細胞系列ゲノムに、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌク
レオチド配列を含む、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト動物であっ
て、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、少なくとも１つのヒスチジ
ンコドンの付加または少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンに
よる置換を含む非ヒト動物が提供される。
【０２８２】
一実施形態では、非ヒト動物は、齧歯動物、例えば、マウス、ラット、またはハムスタ
ーを含む哺乳動物である。
【０２８３】
一実施形態では、付加または置換されたヒスチジンコドンは、ヒトＶＨ遺伝子セグメン
ト、ヒトＤ遺伝子セグメント、ヒトＪＨ遺伝子セグメント、およびこれらの組合せから選
択される、免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントに存在する。一実施形態では、免疫グロ
ブリン重鎖遺伝子セグメントは、ヒト生殖細胞系列ＶＨ遺伝子セグメント、ヒト生殖細胞
系列Ｄ遺伝子セグメント、ヒト生殖細胞系列ＪＨ遺伝子セグメント、およびこれらの組合
せから選択される。
【０２８４】
一実施形態では、ヒトＶＨ遺伝子セグメントは、ＶＨ１−２、ＶＨ１−３、ＶＨ１−８
、ＶＨ１−１８、ＶＨ１−２４、ＶＨ１−４５、ＶＨ１−４６、ＶＨ１−５８、ＶＨ１−
６９、ＶＨ２−５、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−７０、ＶＨ３−７、ＶＨ３−９、ＶＨ３−１
１、ＶＨ３−１３、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−１６、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−２１、ＶＨ３
−２３、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−３０−３、ＶＨ３−３０−５、ＶＨ３−３３、ＶＨ３−
３５、ＶＨ３−３８、ＶＨ３−４３、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−４９、ＶＨ３−５３、ＶＨ
３−６４、ＶＨ３−６６、ＶＨ３−７２、ＶＨ３−７３、ＶＨ３−７４、ＶＨ４−４、Ｖ
Ｈ４−２８、ＶＨ４−３０−１、ＶＨ４−３０−２、ＶＨ４−３０−４、ＶＨ４−３１、
ＶＨ４−３４、ＶＨ４−３９、ＶＨ４−５９、ＶＨ４−６１、ＶＨ５−５１、ＶＨ６−１
、ＶＨ７−４−１、ＶＨ７−８１、およびこれらの組合せからなる群から選択される。
【０２８５】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントは、Ｄ１−１、Ｄ１−７、Ｄ１−１４、Ｄ１
−２０、Ｄ１−２６、Ｄ２−２、Ｄ２−８、Ｄ２−１５、Ｄ２−２１、Ｄ３−３、Ｄ３−
９、Ｄ３−１０、Ｄ３−１６、Ｄ３−２２、Ｄ４−４、Ｄ４−１１、Ｄ４−１７、Ｄ４−
２３、Ｄ５−１２、Ｄ５−５、Ｄ５−１８、Ｄ５−２４、Ｄ６−６、Ｄ６−１３、Ｄ６−
１９、Ｄ６−２５、Ｄ７−２７、およびこれらの組合せからなる群から選択される。
【０２８６】
一実施形態では、ヒトＪＨ遺伝子セグメントは、ＪＨ１、ＪＨ２、ＪＨ３、ＪＨ４、Ｊ
Ｈ５、ＪＨ６、およびこれらの組合せからなる群から選択される。
【０２８７】
一実施形態では、付加または置換されたヒスチジンコドンは、Ｎ末端領域、ループ４領
域、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、またはこれらの組合せをコードする、再構成されて
いない重鎖可変領域のヌクレオチド配列に存在する。
【０２８８】
一実施形態では、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、２つ以上、
３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０以上、
１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、
１９以上、２０以上、２１以上、２２以上、２３以上、２４以上、または２５以上、２６
以上、２７以上、２８以上、２９以上、３０以上、３１以上、３２以上、３３以上、３４
以上、３５以上、３６以上、３７以上、３８以上、３９以上、４０以上、４１以上、４２
以上、４３以上、４４以上、４５以上、４６以上、４７以上、４８以上、４９以上、５０
以上、５１以上、５２以上、５３以上、５４以上、５５以上、５６以上、５７以上、５８
以上、５９以上、６０以上、または６１以上のヒスチジンコドンを含む。
【０２８９】
一実施形態では、反転させたヒトＤ遺伝子セグメントを含む、再構成されていない重鎖
可変領域のヌクレオチド配列は、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、およびＩｇＡから選
択される免疫グロブリンアイソタイプをコードする、ヒトまたは非ヒトの重鎖定常領域の
ヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。
【０２９０】
一実施形態では、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド
配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、およびこれらの組合せから選択される、ヒト
または非ヒトの重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。一実施形
態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３（
ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）を含む。
【０２９１】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、内因性遺伝子座に存在する（す
なわち、ヌクレオチド配列が野生型の非ヒト動物にある場合）か、または異所性に存在す
る（例えば、そのゲノムにおける内因性免疫グロブリン鎖の遺伝子座と異なる遺伝子座に
存在するか、またはその内因性の遺伝子座内に、例えば、免疫グロブリン可変遺伝子座内
に存在し、ここで、該内因性の遺伝子座は、ゲノムにおける異なる位置に配置されるか、
またはゲノムにおける異なる位置へと移動している）。
【０２９２】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ＣＨ２におけるまたはＣＨ３に
おける改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲である
エンドソーム内で）重鎖定常領域アミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を
含む。
【０２９３】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、２５０位における改変（例えば
、ＥまたはＱ）；２５０および４２８位における改変（例えば、ＬまたはＦ）；２５２位
における改変（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／ＷまたはＴ）、２５４位における改変（例えば、Ｓ
またはＴ）、および２５６位における改変（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤまたはＴ）；ま
たは４２８および／もしくは４３３位における改変（例えば、Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／Ｑまたは
Ｋ）、および／もしくは４３４位における改変（例えば、Ｈ／ＦまたはＹ）；または２５
０および／もしくは４２８位における改変；または３０７もしくは３０８位における改変
（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）、ならびに４３４位における改変を含むヒト重鎖定常
領域アミノ酸配列をコードする。一実施形態では、改変は、４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８
Ｌ）および４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）の改変；４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えば、Ｖ２
５９Ｉ）、および３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）の改変；４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３
Ｋ）および４３４位（例えば、４３４Ｙ）の改変；２５２、２５４、および２５６位（例
えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅ）における改変；２５０Ｑおよび４２８Ｌの
改変（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ４２８Ｌ）；ならびに３０７および／または３０８位
における改変（例えば、３０８Ｆまたは３０８Ｐ）であって、酸性の環境で（例えば、ｐ
Ｈが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）重鎖定常領域アミノ酸配列の
ＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む。
【０２９４】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、２５２位のアミノ酸残基と２５
７位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、
ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣＨ２のアミノ酸配列
のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣＨ２のアミノ酸配列をコードする
。
【０２９５】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、３０７位のアミノ酸残基と３１
１位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、
ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣＨ２のアミノ酸配列
のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣＨ２のアミノ酸配列をコードする
。
【０２９６】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、４３３位のアミノ酸残基と４３
６位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、
ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣＨ３のアミノ酸配列
のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣＨ３のアミノ酸配列をコードする
。
【０２９７】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ｓ、およ
びこれらの組合せからなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列を
コードする。
【０２９８】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｍ４２８Ｌ、Ｖ２５９Ｉ、Ｖ３
０８Ｆ、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域ア
ミノ酸配列をコードする。
【０２９９】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｎ４３４Ａ変異を含むヒト重鎖
定常領域アミノ酸配列をコードする。
【０３００】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２
５６Ｅ、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域ア
ミノ酸配列をコードする。
【０３０１】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｔ２５０Ｑ、Ｍ２４８Ｌ、また
はこれらの両方からなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコ
ードする。
【０３０２】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ｙ、また
はこれらの両方からなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコ
ードする。
【０３０３】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、（１）本明細書に記載
されている、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド配列が
、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、およびこれらの組合せから選択されるヒトＩｇＧの第
一のＣＨ３のアミノ酸配列をコードする第一の重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可
能に連結されている、第一の対立遺伝子；ならびに（２）本明細書に記載されている、再
構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、ＩｇＧ１、Ｉ
ｇＧ２、ＩｇＧ４、およびこれらの組合せから選択されるヒトＩｇＧの第二のＣＨ３のア
ミノ酸配列をコードする第二の重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されて
おり、第二のＣＨ３のアミノ酸配列が、第二のＣＨ３のアミノ酸配列の、プロテインＡへ
の結合を低減するか、または消失させる改変（例えば、ＵＳ２０１０／０３３１５２７Ａ
１を参照されたい）を含む、第二の対立遺伝子を含む。
【０３０４】
一実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、Ｈ９５Ｒの改変（ＩＭＧＴエクソン
番号付けによる；ＥＵ番号付けによるＨ４３５Ｒ）を含む。一実施形態では、第二のＣＨ
３のアミノ酸配列は、Ｙ９６Ｆの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵによるＨ
４３６Ｆ）をさらに含む。別の実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、Ｈ９５Ｒ
の改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵ番号付けによるＨ４３５Ｒ）およびＹ９
６Ｆの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵによるＨ４３６Ｆ）の両方を含む。
【０３０５】
一実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、改変ヒトＩｇＧ１からのアミノ酸配
列であり、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭ
ＧＴ；ＥＵによるＤ３５６Ｅ、Ｌ３８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、および
Ｖ４２２Ｉ）からなる群から選択される変異をさらに含む。
【０３０６】
一実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、改変ヒトＩｇＧ２からのアミノ酸配
列であり、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ：ＥＵによるＮ３８４Ｓ、Ｋ
３９２Ｎ、およびＶ４２２Ｉ）からなる群から選択される変異をさらに含む。
【０３０７】
一実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、改変ヒトＩｇＧ４からのアミノ酸配
列であり、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、およびＶ８
２Ｉ（ＩＭＧＴ：ＥＵによるＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０
９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、およびＶ４２２Ｉ）からなる群から選択される変異をさらに含む。
【０３０８】
一実施形態では、重鎖定常領域アミノ酸配列は、非ヒト定常領域のアミノ酸配列であり
、重鎖定常領域アミノ酸配列は、上記の種類の改変のうちのいずれかのうちの１つまたは
複数を含む。
【０３０９】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列
であり、ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列は、上記の種類の改変のうちのいずれかのうちの
１つまたは複数を含む。
【０３１０】
一実施形態では、全てまたは実質的に全ての内因性のＶＨ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子
セグメント、およびＪＨ遺伝子セグメントを、免疫グロブリン重鎖遺伝子座から欠失させ
るか、または非機能性にする（例えば、免疫グロブリン遺伝子座内にヌクレオチド配列（
例えば、外因性ヌクレオチド配列）の挿入を介して、または内因性のＶＨセグメント、Ｄ
セグメント、ＪＨセグメントの非機能性の再構成または反転を介して）。一実施形態では
、例えば、全ての内因性のＶＨ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、またはＪＨ遺伝
子セグメントのうちの約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９
６％以上、約９７％以上、約９８％以上、または約９９％以上を欠失させるか、または非
機能性にする。一実施形態では、例えば、内因性の機能性Ｖ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子
セグメント、またはＪ遺伝子セグメントのうちの少なくとも９５％、９６％、９７％、９
８％、または９９％を欠失させるか、または非機能性にする。
【０３１１】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、全てまたは実質的
に全ての内因性のＶＨ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、およびＪＨ遺伝子セグメ
ントを欠失させるか、または非機能性にする改変を含み、遺伝子改変された遺伝子座は、
１つまたは複数のヒスチジンコドンを有する、１つまたは複数のヒトＶＨ遺伝子セグメン
ト、ヒトＤ遺伝子セグメント、および／またはヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む、再構成
されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列を含み、再構成されていない重鎖可変領域
のヌクレオチド配列は、内因性位置に存在する（すなわち、ヌクレオチド配列が野生型の
非ヒト動物にある場合）か、または異所性に存在する（例えば、そのゲノムにおける内因
性免疫グロブリン鎖の遺伝子座と異なる遺伝子座に存在する、またはその内因性の遺伝子
座内に、例えば、免疫グロブリン可変遺伝子座内に存在し、ここで、該内因性の遺伝子座
は、ゲノムにおける異なる位置に配置されるか、またはゲノムにおける異なる位置へと移
動している）。
【０３１２】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、内因性Ａｄａｍ６ａ遺
伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはこれらの両方を含み、遺伝子改変は、内因性のＡｄａ
ｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはこれらの両方の発現および／または機能に影
響を及ぼさない。
【０３１３】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、異所性に存在するＡｄ
ａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはこれらの両方を含む。一実施形態では、Ａ
ｄａｍ６ａ遺伝子は、非ヒトＡｄａｍ６ａ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ａ
遺伝子は、ヒトＡｄａｍ６ａ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子は、非
ヒトＡｄａｍ６ｂ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子は、ヒトＡｄａｍ
６ｂ遺伝子である。
【０３１４】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、ヒト化された、再構成
されていないλ軽鎖可変遺伝子配列および／またはκ軽鎖可変遺伝子配列をさらに含む。
一実施形態では、ヒト化された、再構成されていないλ軽鎖可変遺伝子配列および／また
はκ軽鎖可変遺伝子配列は、λ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列およびκ軽鎖定常領域の
ヌクレオチド配列から選択される、免疫グロブリン軽鎖定常領域のヌクレオチド配列に作
動可能に連結されている。一実施形態では、ヒト化された、再構成されていないλ軽鎖可
変領域のヌクレオチド配列は、λ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結され
ている。一実施形態では、λ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列は、マウス配列、ラット配
列、またはヒト配列である。一実施形態では、ヒト化された、再構成されていないκ軽鎖
可変領域のヌクレオチド配列は、κ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結さ
れている。一実施形態では、κ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列は、マウス配列、ラット
配列、またはヒト配列である。
【０３１５】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、軽鎖可変ドメインをコ
ードする少なくとも１つのリーディングフレームに少なくとも１つのヒスチジンコドンを
導入する少なくとも１つの改変を含有する、再構成されていない軽鎖可変遺伝子配列を含
む。一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、軽鎖ＣＤＲに１つ、
２つ、３つ、または４つのヒスチジンコドンを含む、再構成された（例えば、再構成され
たλまたはκのＶ／Ｊ配列）配列を含む。一実施形態では、ＣＤＲは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ
２、ＣＤＲ３、およびこれらの組合せから選択される。一実施形態では、再構成されてい
ないかまたは再構成された軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、再構成されていないかま
たは再構成されたヒトλ軽鎖可変領域またはヒトκ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列であ
る。一実施形態では、再構成されていないかまたは再構成されたヒトλ軽鎖可変領域また
はヒトκ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、内因性のマウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子
座に存在する。一実施形態では、マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、マウスκ遺伝子
座である。一実施形態では、マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、マウスλ遺伝子座で
ある。
【０３１６】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子
座は、マウスの免疫グロブリン重鎖遺伝子座に存在する。一実施形態では、遺伝子改変さ
れた免疫グロブリン遺伝子座は、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスにおけるヒ
ト化免疫グロブリン重鎖遺伝子座に存在する。
【０３１７】
一実施形態では、非ヒト動物は、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座につい
てヘテロ接合性であり、非ヒト動物は、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免
疫グロブリン重鎖遺伝子座に主に由来する、少なくとも１つのヒスチジン残基を含むヒト
免疫グロブリン重鎖可変ドメインを発現させることが可能である。
【０３１８】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺
伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、酸性の環境で（
例えば、約５．５〜約６．０のｐＨで）、遺伝子改変なしの、対応する野生型の重鎖可変
ドメインより弱い抗原結合を示す。
【０３１９】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺
伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ１
／２）は、２５℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、２分間未満であ
る。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖
遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ
１／２）は、３７℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、２分間未満で
ある。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重
鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（
ｔ１／２）は、２５℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、１分間未満
である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン
重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期
（ｔ１／２）は、３７℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、１分間未
満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリ
ン遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、酸性ｐＨ（
例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、解離半減期（ｔ１／２）を、中性ｐＨ（例えば
、約７．０〜約７．４のｐＨ）における抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ１／２）と
比較して、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍
、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍
、または少なくとも約３０倍短縮する。
【０３２０】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子
座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、遺伝子改変なしの野
生型の抗原結合タンパク質と比較して、ｐＨ依存性リサイクル性の改善、血清半減期の延
長、またはこれらの両方を特徴とする。
【０３２１】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子
座は、目的の抗原で刺激されると、１つまたは複数のヒスチジン残基を含む重鎖可変ドメ
インを含む抗原結合タンパク質、例えば、抗体を産生することが可能なＢ細胞集団を含む
。本明細書に記載されている抗原結合タンパク質は、被験体へと投与されると、重鎖可変
ドメインをコードするが、重鎖可変ドメインにヒスチジン残基を含まない、類似するか、
または十分に類似するアミノ酸配列を保有する、対応する野生型の抗原結合タンパク質を
凌駕する血清半減期の延長を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている
抗原結合タンパク質は、重鎖可変ドメインをコードするが、重鎖可変ドメインにヒスチジ
ン残基を含まない、類似するか、または十分に類似するアミノ酸配列を保有する、対応す
る野生型の抗原結合タンパク質の少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１
０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍の血清半減期の延長を示す。
【０３２２】
一態様では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト動物であって、遺
伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座が、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌク
レオチド配列を含み、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、少な
くとも１つの内因性非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む非ヒト動物
が提供される。
【０３２３】
一実施形態では、非ヒト動物は、齧歯動物、例えば、マウス、ラット、またはハムスタ
ーを含む哺乳動物である。
【０３２４】
一実施形態では、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８
つ以上、９つ以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１
６以上、１７以上、１８以上、１９以上、２０以上、２１以上、２２以上、２３以上、２
４以上、２５以上、２６以上、２７以上、２８以上、２９以上、３０以上、３１以上、３
２以上、３３以上、３４以上、３５以上、３６以上、３７以上、３８以上、３９以上、４
０以上、４１以上、４２以上、４３以上、４４以上、４５以上、４６以上、４７以上、４
８以上、４９以上、５０以上、５１以上、５２以上、５３以上、５４以上、５５以上、５
６以上、５７以上、５８以上、５９以上、６０以上、または６１以上の内因性の非ヒスチ
ジンコドンを、ヒスチジンコドンで置きかえる。
【０３２５】
一実施形態では、内因性の非ヒスチジンコドンは、Ｙ、Ｎ、Ｄ、Ｑ、Ｓ、Ｗ、およびＲ
から選択されるアミノ酸をコードする。
【０３２６】
一実施形態では、置換されたヒスチジンコドンは、Ｎ末端領域、ループ４領域、ＣＤＲ
１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、これらの組合せから選択される免疫グロブリン可変ドメインを
コードする、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列に存在する。
【０３２７】
一実施形態では、置換されたヒスチジンコドンは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、お
よびこれらの組合せから選択される相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードする、再構成され
ていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列に存在する。
【０３２８】
一実施形態では、置換されたヒスチジンコドンは、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４、
およびこれらの組合せから選択されるフレーム領域（ＦＲ）をコードする、再構成されて
いない重鎖可変領域のヌクレオチド配列に存在する。
【０３２９】
一実施形態では、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ヒトＶＨ遺
伝子セグメントの少なくとも１つのリーディングフレームにおける１つまたは複数の内因
性非ヒスチジンコドンが、ヒスチジンコドンで置きかえられた、遺伝子改変されたヒトＶ
Ｈ遺伝子セグメントを含む。
【０３３０】
一実施形態では、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ヒトＶ
Ｈ遺伝子セグメントの少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで
置きかえる改変であって、ヒトＶＨ遺伝子セグメントが、ＶＨ１−２、ＶＨ１−３、ＶＨ
１−８、ＶＨ１−１８、ＶＨ１−２４、ＶＨ１−４５、ＶＨ１−４６、ＶＨ１−５８、Ｖ
Ｈ１−６９、ＶＨ２−５、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−７０、ＶＨ３−７、ＶＨ３−９、ＶＨ
３−１１、ＶＨ３−１３、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−１６、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−２１、
ＶＨ３−２３、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−３０−３、ＶＨ３−３０−５、ＶＨ３−３３、Ｖ
Ｈ３−３５、ＶＨ３−３８、ＶＨ３−４３、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−４９、ＶＨ３−５３
、ＶＨ３−６４、ＶＨ３−６６、ＶＨ３−７２、ＶＨ３−７３、ＶＨ３−７４、ＶＨ４−
４、ＶＨ４−２８、ＶＨ４−３０−１、ＶＨ４−３０−２、ＶＨ４−３０−４、ＶＨ４−
３１、ＶＨ４−３４、ＶＨ４−３９、ＶＨ４−５９、ＶＨ４−６１、ＶＨ５−５１、ＶＨ
６−１、ＶＨ７−４−１、ＶＨ７−８１、およびこれらの組合せからなる群から選択され
る改変を含む。
【０３３１】
一実施形態では、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、遺伝子
改変されたヒトＪＨ遺伝子セグメントであって、ヒトＪＨ遺伝子セグメントの少なくとも
１つのリーディングフレームにおける１つまたは複数の内因性非ヒスチジンコドンが、ヒ
スチジンコドンで置きかえられた遺伝子改変されたヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む。
【０３３２】
一実施形態では、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ヒトＪ
Ｈセグメントの少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きか
える改変であって、ヒトＪＨ遺伝子セグメントが、ＪＨ１、ＪＨ２、ＪＨ３、ＪＨ４、Ｊ
Ｈ５、ＪＨ６、およびこれらの組合せからなる群から選択される改変を含む。
【０３３３】
一実施形態では、置換されたヒスチジンコドンは、ＣＤＲ３の一部をコードする重鎖可
変領域のヌクレオチド配列に存在する。一実施形態では、ＣＤＲ３の一部は、リーディン
グフレームにおける少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置
きかえる改変を含む、遺伝子改変されたヒトＤ遺伝子セグメントのリーディングフレーム
に由来するアミノ酸配列を含む。
【０３３４】
一実施形態では、ヒスチジンコドンで置換される内因性非ヒスチジンコドンは、Ｙ、Ｎ
、Ｄ、Ｑ、Ｓ、Ｗ、およびＲから選択されるアミノ酸をコードする。
【０３３５】
一実施形態では、置換されるヒスチジンコドンは、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標
）ヒト化免疫グロブリンマウス内で最も高頻度に観察されるヒトＤ遺伝子セグメントの少
なくとも１つのリーディングフレームに存在する。
【０３３６】
一実施形態では、ＣＤＲ３の一部をコードする、遺伝子改変されたヒトＤ遺伝子セグメ
ントのリーディングフレームは、疎水性フレーム、終止フレーム、および親水性フレーム
から選択される。
【０３３７】
一実施形態では、リーディングフレームは、ヒトＤ遺伝子セグメントの疎水性フレーム
である。
【０３３８】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの疎水性フレームは、Ｄ１−１（ＧＴＴＧＴ
；配列番号８８）、Ｄ１−７（ＧＩＴＧＴ；配列番号８９）、Ｄ１−２０（ＧＩＴＧＴ；
配列番号８９）、およびＤ１−２６（ＧＩＶＧＡＴ；配列番号９０）からなる群から選択
されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、
ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコド
ンで置きかえる改変をさらに含む。
【０３３９】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの疎水性フレームは、Ｄ２−２（ＤＩＶＶＶ
ＰＡＡＩ；配列番号９２）、Ｄ２−８（ＤＩＶＬＭＶＹＡＩ；配列番号９４）、Ｄ２−１
５（ＤＩＶＶＶＶＡＡＴ；配列番号９５）、およびＤ２−２１（ＨＩＶＶＶＴＡＩ；配列
番号９７）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み
、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒス
チジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。
【０３４０】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの疎水性フレームは、Ｄ３−３（ＩＴＩＦＧ
ＶＶＩＩ；配列番号９８）、Ｄ３−９（ＩＴＩＦ＊ＬＶＩＩ；配列番号９９、配列番号１
００）、Ｄ３−１０（ＩＴＭＶＲＧＶＩＩ；配列番号１０１）、Ｄ３−１６（ＩＭＩＴＦ
ＧＧＶＩＶＩ；配列番号１０２）、およびＤ３−２２（ＩＴＭＩＶＶＶＩＴ；配列番号１
０３）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒ
トＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性コドンをヒ
スチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。
【０３４１】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの疎水性フレームは、Ｄ４−４（ＴＴＶＴ；
配列番号１０５）、Ｄ４−１１（ＴＴＶＴ；配列番号１０５）、Ｄ４−１７（ＴＴＶＴ；
配列番号１０５）、Ｄ４−２３（ＴＴＶＶＴ；配列番号１０６）からなる群から選択され
るアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌク
レオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで
置きかえる改変をさらに含む。
【０３４２】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの疎水性フレームは、Ｄ５−５（ＶＤＴＡＭ
Ｖ；配列番号１０７）、Ｄ５−１２（ＶＤＩＶＡＴＩ；配列番号１０８）、Ｄ５−１８（
ＶＤＴＡＭＶ；配列番号１０７）、およびＤ５−２４（ＶＥＭＡＴＩ；配列番号１０９）
からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺
伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコド
ンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。
【０３４３】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの疎水性フレームは、Ｄ６−６（ＳＩＡＡＲ
；配列番号１１１）、Ｄ６−１３（ＧＩＡＡＡＧ；配列番号１１３）、およびＤ６−１９
（ＧＩＡＶＡＧ；配列番号１１５）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする
ヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なく
とも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む
。
【０３４４】
一実施形態では、疎水性フレームは、ヒトＤ７−２７（ＬＴＧ）をコードするヌクレオ
チド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つ
の内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。
【０３４５】
一実施形態では、リーディングフレームは、ヒトＤ遺伝子セグメントの終止リーディン
グフレームである。
【０３４６】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの終止リーディングフレームは、Ｄ１−１（
ＶＱＬＥＲ；配列番号８）、Ｄ１−７（Ｖ＊ＬＥＬ）、Ｄ１−２０（Ｖ＊ＬＥＲ）、Ｄ１
−２６（Ｖ＊ＷＥＬＬ；配列番号１２）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコード
するヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少
なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに
含む。
【０３４７】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの終止リーディングフレームは、Ｄ２−２（
ＲＩＬ＊＊ＹＱＬＬＹ；配列番号１４）、Ｄ２−８（ＲＩＬＹ＊ＷＣＭＬＹ；配列番号１
６および配列番号１７）、Ｄ２−１５（ＲＩＬ＊ＷＷ＊ＬＬＬ）、およびＤ２−２１（Ｓ
ＩＬＷＷ＊ＬＬＦ；配列番号１９）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする
ヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なく
とも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む
。
【０３４８】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの終止リーディングフレームは、Ｄ３−３（
ＶＬＲＦＬＥＷＬＬＹ；配列番号２１）、Ｄ３−９（ＶＬＲＹＦＤＷＬＬ＊；配列番号２
３）、Ｄ３−１０（ＶＬＬＷＦＧＥＬＬ＊；配列番号２５）、Ｄ３−１６（ＶＬ＊ＬＲＬ
ＧＥＬＳＬＹ；配列番号２７）、およびＤ３−２２（ＶＬＬ＊＊＊ＷＬＬＬ；配列番号２
９）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒト
Ｄ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジン
コドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変を含む。
【０３４９】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの終止リーディングフレームは、Ｄ４−４（
＊ＬＱ＊Ｌ）、Ｄ４−１１（＊ＬＱ＊Ｌ）、Ｄ４−１７（＊ＬＲ＊Ｌ）、およびＤ４−２
３（＊ＬＲＷ＊Ｌ）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配
列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因
性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変を含む。
【０３５０】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの終止リーディングフレームは、Ｄ５−５（
ＷＩＱＬＷＬ；配列番号３５）；Ｄ５−１２（ＷＩ＊ＷＬＲＬ；配列番号３７）、Ｄ５−
１８（ＷＩＱＬＷＬ；配列番号３５）、およびＤ５−２４（＊ＲＷＬＱＬ；配列番号３９
）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ
遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコ
ドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変を含む。
【０３５１】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの終止リーディングフレームは、Ｄ６−６（
Ｖ＊ＱＬＶ）、Ｄ６−１３（Ｖ＊ＱＱＬＶ；配列番号４１）、およびＤ６−１９（Ｖ＊Ｑ
ＷＬＶ；配列番号４３）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチ
ド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの
内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。
【０３５２】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの終止リーディングフレームは、Ｄ７−２７
（＊ＬＧ）をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオ
チド配列におけるヒトＤ遺伝子セグメントの少なくとも１つの内因性コドンをヒスチジン
コドンで置きかえる改変をさらに含む。
【０３５３】
一実施形態では、リーディングフレームは、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレーム
である。
【０３５４】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームは、Ｄ１−１（ＹＮＷＮＤ
；配列番号４５）、Ｄ１−７（ＹＮＷＮＹ；配列番号４７）、Ｄ１−２０（ＹＮＷＮＤ；
配列番号４５）、およびＤ１−２６（ＹＳＧＳＹＹ；配列番号４９）からなる群から選択
されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、
ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性コドンをヒスチジンコドンで置きかえ
る改変をさらに含む。一実施形態では、親水性フレームは、配列番号４６、配列番号４８
、配列番号５０、およびこれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列をコード
するヌクレオチド配列を含む。
【０３５５】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームは、Ｄ２−２（ＧＹＣＳＳ
ＴＳＣＹＴ；配列番号５１）、Ｄ２−８（ＧＹＣＴＮＧＶＣＹＴ；配列番号５３）、Ｄ２
−１５（ＧＹＣＳＧＧＳＣＹＳ；配列番号５５）、およびＤ２−２１（ＡＹＣＧＧＤＣＹ
Ｓ；配列番号５７）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配
列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因
性コドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。一実施形態では、親水性フ
レームは、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、およびこれらの
組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０３５６】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームは、Ｄ３−３（ＹＹＤＦＷ
ＳＧＹＹＴ；配列番号５９）、Ｄ３−９（ＹＹＤＩＬＴＧＹＹＮ；配列番号６１）、Ｄ３
−１０（ＹＹＹＧＳＧＳＹＹＮ；配列番号６３）、Ｄ３−１６（ＹＹＤＹＶＷＧＳＹＲＹ
Ｔ；配列番号６５）、およびＤ３−２２（ＹＹＹＤＳＳＧＹＹＹ；配列番号６７）からな
る群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セ
グメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性コドンをヒスチジンコド
ンで置きかえる改変をさらに含む。一実施形態では、親水性フレームは、配列番号６０、
配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、およびこれらの組合せから
なる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０３５７】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームは、Ｄ４−４（ＤＹＳＮＹ
；配列番号６９）、Ｄ４−１１（ＤＹＳＮＹ；配列番号６９）、Ｄ４−１７（ＤＹＧＤＹ
；配列番号７１）、およびＤ４−２３（ＤＹＧＧＮＳ；配列番号７３）からなる群から選
択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは
、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性コドンをヒスチジンコドンで置きか
える改変を含む。一実施形態では、親水性フレームは、配列番号７０、配列番号７２、配
列番号７４、およびこれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする
ヌクレオチド配列を含む。
【０３５８】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームは、Ｄ５−５（ＧＹＳＹＧ
Ｙ；配列番号７５）、Ｄ５−１２（ＧＹＳＧＹＤＹ；配列番号７７）、Ｄ５−１８（ＧＹ
ＳＹＧＹ；配列番号７５）、およびＤ５−２４（ＲＤＧＹＮＹ；配列番号７９）からなる
群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグ
メントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性コドンをヒスチジンコドン
で置きかえる改変をさらに含む。一実施形態では、親水性フレームは、配列番号７６、配
列番号７８、配列番号８０、およびこれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配
列をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０３５９】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームは、Ｄ６−６（ＥＹＳＳＳ
Ｓ；配列番号８１）、Ｄ６−１３（ＧＹＳＳＳＷＹ；配列番号８３）、およびＤ６−１９
（ＧＹＳＳＧＷＹ；配列番号８５）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする
ヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なく
とも１つの内因性コドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。一実施形態
では、親水性フレームは、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号７６、
およびこれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド
配列を含む。
【０３６０】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームは、Ｄ７−２７（ＮＷＧ）
をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列に
おける少なくとも１つの内因性コドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む
。
【０３６１】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームは、配列番号４６、配列番
号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配
列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０
、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号
８２、配列番号８４、配列番号８６、およびこれらの組合せからなる群から選択されるア
ミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０３６２】
一実施形態では、反転させたヒトＤ遺伝子セグメントを含む、再構成されていない重鎖
可変領域のヌクレオチド配列は、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、およびＩｇＡから選
択される免疫グロブリンアイソタイプをコードする、ヒトまたは非ヒトの重鎖定常領域の
ヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。
【０３６３】
一実施形態では、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド
配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、およびこれらの組合せから選択される、ヒト
または非ヒトの重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。一実施形
態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３（
ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）を含む。
【０３６４】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、内因性遺伝子座に存在する（す
なわち、ヌクレオチド配列が野生型の非ヒト動物にある場合）か、または異所性に存在す
る（例えば、そのゲノムにおける内因性免疫グロブリン鎖の遺伝子座と異なる遺伝子座に
存在する、またはその内因性の遺伝子座内に、例えば、免疫グロブリン可変遺伝子座内に
存在し、ここで、該内因性の遺伝子座は、ゲノムにおける異なる位置に配置されるか、ま
たはゲノムにおける異なる位置へと移動している）。
【０３６５】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ＣＨ２におけるまたはＣＨ３に
おける改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲である
エンドソーム内で）重鎖定常領域アミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を
含む。
【０３６６】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、２５０位における改変（例えば
、ＥまたはＱ）；２５０および４２８位における改変（例えば、ＬまたはＦ）；２５２位
における改変（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／ＷまたはＴ）、２５４位における改変（例えば、Ｓ
またはＴ）、および２５６位における改変（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤまたはＴ）；ま
たは４２８および／もしくは４３３位における改変（例えば、Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／Ｑまたは
Ｋ）、および／もしくは４３４位における改変（例えば、Ｈ／ＦまたはＹ）；または２５
０および／もしくは４２８位における改変；または３０７もしくは３０８位における改変
（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）、ならびに４３４位における改変を含むヒト重鎖定常
領域アミノ酸配列をコードする。一実施形態では、改変は、４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８
Ｌ）および４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）の改変；４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えば、Ｖ２
５９Ｉ）、および３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）の改変；４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３
Ｋ）および４３４位（例えば、４３４Ｙ）の改変；２５２、２５４、および２５６位（例
えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅ）における改変；２５０Ｑおよび４２８Ｌの
改変（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ４２８Ｌ）；ならびに３０７および／または３０８位
における改変（例えば、３０８Ｆまたは３０８Ｐ）であって、酸性の環境で（例えば、ｐ
Ｈが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）重鎖定常領域アミノ酸配列の
ＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む。
【０３６７】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、２５２位のアミノ酸残基と２５
７位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、
ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣＨ２のアミノ酸配列
のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣＨ２のアミノ酸配列をコードする
。
【０３６８】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、３０７位のアミノ酸残基と３１
１位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、
ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣＨ２のアミノ酸配列
のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣＨ２のアミノ酸配列をコードする
。
【０３６９】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、４３３位のアミノ酸残基と４３
６位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、
ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣＨ３のアミノ酸配列
のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣＨ３のアミノ酸配列をコードする
。
【０３７０】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ｓ、およ
びこれらの組合せからなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列を
コードする。
【０３７１】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｍ４２８Ｌ、Ｖ２５９Ｉ、Ｖ３
０８Ｆ、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域ア
ミノ酸配列をコードする。
【０３７２】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｎ４３４Ａ変異を含むヒト重鎖
定常領域アミノ酸配列をコードする。
【０３７３】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２
５６Ｅ、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域ア
ミノ酸配列をコードする。
【０３７４】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｔ２５０Ｑ、Ｍ２４８Ｌ、また
はこれらの両方からなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコ
ードする。
【０３７５】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ｙ、また
はこれらの両方からなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコ
ードする。
【０３７６】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、（１）本明細書に記載
されている、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド配列が
、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、およびこれらの組合せから選択されるヒトＩｇＧの第
一のＣＨ３のアミノ酸配列をコードする第一の重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可
能に連結されている、第一の対立遺伝子；ならびに（２）本明細書に記載されている、再
構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、ＩｇＧ１、Ｉ
ｇＧ２、ＩｇＧ４、およびこれらの組合せから選択されるヒトＩｇＧの第二のＣＨ３のア
ミノ酸配列をコードする第二の重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されて
おり、第二のＣＨ３のアミノ酸配列が、第二のＣＨ３のアミノ酸配列の、プロテインＡへ
の結合を低減するか、または消失させる改変（例えば、ＵＳ２０１０／０３３１５２７Ａ
１を参照されたい）を含む、第二の対立遺伝子を含む。
【０３７７】
一実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、Ｈ９５Ｒの改変（ＩＭＧＴエクソン
番号付けによる；ＥＵ番号付けによるＨ４３５Ｒ）を含む。一実施形態では、第二のＣＨ
３のアミノ酸配列は、Ｙ９６Ｆの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵによるＨ
４３６Ｆ）をさらに含む。別の実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、Ｈ９５Ｒ
の改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵ番号付けによるＨ４３５Ｒ）およびＹ９
６Ｆの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵによるＨ４３６Ｆ）の両方を含む。
【０３７８】
一実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、改変ヒトＩｇＧ１からのアミノ酸配
列であり、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭ
ＧＴ；ＥＵによるＤ３５６Ｅ、Ｌ３８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、および
Ｖ４２２Ｉ）からなる群から選択される変異をさらに含む。
【０３７９】
一実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、改変ヒトＩｇＧ２からのアミノ酸配
列であり、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ：ＥＵによるＮ３８４Ｓ、Ｋ
３９２Ｎ、およびＶ４２２Ｉ）からなる群から選択される変異をさらに含む。
【０３８０】
一実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、改変ヒトＩｇＧ４からのアミノ酸配
列であり、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、およびＶ８
２Ｉ（ＩＭＧＴ：ＥＵによるＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０
９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、およびＶ４２２Ｉ）からなる群から選択される変異をさらに含む。
【０３８１】
一実施形態では、重鎖定常領域アミノ酸配列は、非ヒト定常領域のアミノ酸配列であり
、重鎖定常領域アミノ酸配列は、上記の種類の改変のうちのいずれかのうちの１つまたは
複数を含む。
【０３８２】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列
であり、ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列は、上記の種類の改変のうちのいずれかのうちの
１つまたは複数を含む。
【０３８３】
一実施形態では、全てまたは実質的に全ての内因性のＶＨ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子
セグメント、およびＪＨ遺伝子セグメントを、免疫グロブリン重鎖遺伝子座から欠失させ
るか、または非機能性にする（例えば、免疫グロブリン遺伝子座内にヌクレオチド配列（
例えば、外因性ヌクレオチド配列）の挿入を介して、または内因性のＶＨセグメント、Ｄ
セグメント、ＪＨセグメントの非機能性の再構成または反転を介して）。一実施形態では
、例えば、全ての内因性のＶＨ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、またはＪＨ遺伝
子セグメントのうちの約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９
６％以上、約９７％以上、約９８％以上、または約９９％以上を欠失させるか、または非
機能性にする。一実施形態では、例えば、内因性の機能性Ｖ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子
セグメント、またはＪ遺伝子セグメントのうちの少なくとも９５％、９６％、９７％、９
８％、または９９％を欠失させるか、または非機能性にする。
【０３８４】
一実施形態では、遺伝子改変された遺伝子座は、全てまたは実質的に全ての内因性のＶ
Ｈ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、およびＪＨ遺伝子セグメントを欠失させるか
、または非機能性にする改変を含み、ゲノム遺伝子座は、少なくとも１つのリーディング
フレームに少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を
含む、遺伝子改変された、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列を含
む。一実施形態では、遺伝子改変された、再構成されていない免疫グロブリン重鎖可変遺
伝子配列は、内因性位置に存在する（すなわち、ヌクレオチド配列が野生型の非ヒト動物
にある場合）か、または異所性に存在する（例えば、そのゲノムにおける内因性免疫グロ
ブリン鎖の遺伝子座と異なる遺伝子座に存在するか、またはその内因性の遺伝子座内に、
例えば、免疫グロブリン可変遺伝子座内に存在し、ここで、該内因性の遺伝子座は、ゲノ
ムにおける異なる位置に配置されるか、またはゲノムにおける異なる位置へと移動してい
る）。
【０３８５】
一実施形態では、遺伝子改変された遺伝子座は、内因性Ａｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ
６ｂ遺伝子、またはこれらの両方を含み、遺伝子改変は、内因性のＡｄａｍ６ａ遺伝子、
Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはこれらの両方の発現および／または機能に影響を及ぼさない
。
【０３８６】
一実施形態では、遺伝子改変された遺伝子座は、異所性に存在するＡｄａｍ６ａ遺伝子
、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはこれらの両方を含む。一実施形態では、Ａｄａｍ６ａ遺伝
子は、非ヒトＡｄａｍ６ａ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ａ遺伝子は、マウ
スＡｄａｍ６ａ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ａ遺伝子は、ヒトＡｄａｍ６
ａ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子は、非ヒトＡｄａｍ６ｂ遺伝子で
ある。一実施形態では、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子は、マウスＡｄａｍ６ｂ遺伝子である。一実
施形態では、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子は、ヒトＡｄａｍ６ｂ遺伝子である。
【０３８７】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、ヒト化された、再構成
されていないλ軽鎖可変遺伝子配列および／またはκ軽鎖可変遺伝子配列をさらに含む。
一実施形態では、ヒト化された、再構成されていないλ軽鎖可変遺伝子配列および／また
はκ軽鎖可変遺伝子配列は、λ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列およびκ軽鎖定常領域の
ヌクレオチド配列から選択される、免疫グロブリン軽鎖定常領域のヌクレオチド配列に作
動可能に連結されている。一実施形態では、ヒト化された、再構成されていないλ軽鎖可
変領域のヌクレオチド配列は、λ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結され
ている。一実施形態では、λ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列は、マウス配列、ラット配
列、またはヒト配列である。一実施形態では、ヒト化された、再構成されていないκ軽鎖
可変領域のヌクレオチド配列は、κ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結さ
れている。一実施形態では、κ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列は、マウス配列、ラット
配列、またはヒト配列である。
【０３８８】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、軽鎖可変ドメインをコ
ードする少なくとも１つのリーディングフレームに少なくとも１つのヒスチジンコドンを
導入する少なくとも１つの改変を含有する、再構成されていない軽鎖可変遺伝子配列を含
む。一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、軽鎖ＣＤＲに１つ、
２つ、３つ、または４つのヒスチジンコドンを含む、再構成された（例えば、再構成され
たλまたはκのＶ／Ｊ配列）配列を含む。一実施形態では、ＣＤＲは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ
２、ＣＤＲ３、およびこれらの組合せから選択される。一実施形態では、再構成されてい
ないかまたは再構成された軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、再構成されていないかま
たは再構成されたヒトλ軽鎖可変領域またはヒトκ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列であ
る。一実施形態では、再構成されていないかまたは再構成されたヒトλ軽鎖可変領域また
はヒトκ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、内因性のマウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子
座に存在する。一実施形態では、マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、マウスκ遺伝子
座である。一実施形態では、マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、マウスλ遺伝子座で
ある。
【０３８９】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子
座は、マウスの免疫グロブリン重鎖遺伝子座に存在する。一実施形態では、遺伝子改変さ
れた免疫グロブリン遺伝子座は、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスにおけるヒ
ト化免疫グロブリン重鎖遺伝子座に存在する。
【０３９０】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺
伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、酸性の環境で（
例えば、約５．５〜約６．０のｐＨで）、遺伝子改変なしの、対応する野生型の重鎖可変
ドメインより弱い抗原結合を示す。
【０３９１】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺
伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ１
／２）は、２５℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、２分間未満であ
る。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖
遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ
１／２）は、３７℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、２分間未満で
ある。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重
鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（
ｔ１／２）は、２５℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、１分間未満
である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン
重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期
（ｔ１／２）は、３７℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、１分間未
満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリ
ン遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、酸性ｐＨ（
例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、解離半減期（ｔ１／２）を、中性ｐＨ（例えば
、約７．０〜約７．４のｐＨ）における抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ１／２）と
比較して、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍
、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍
、または少なくとも約３０倍短縮する。
【０３９２】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子
座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、遺伝子改変なしの野
生型の抗原結合タンパク質と比較して、ｐＨ依存性リサイクル性の改善、血清半減期の延
長、またはこれらの両方を特徴とする。
【０３９３】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子
座は、目的の抗原で刺激されると、１つまたは複数のヒスチジン残基を含む重鎖可変ドメ
インを含む抗原結合タンパク質、例えば、抗体を産生することが可能なＢ細胞集団を含む
。本明細書に記載されている抗原結合タンパク質は、被験体へと投与されると、重鎖可変
ドメインをコードするが、重鎖可変ドメインにヒスチジン残基を含まない、類似するか、
または十分に類似するアミノ酸配列を保有する、対応する野生型の抗原結合タンパク質を
凌駕する血清半減期の延長を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている
抗原結合タンパク質は、重鎖可変ドメインをコードするが、重鎖可変ドメインにヒスチジ
ン残基を含まない、類似するか、または十分に類似するアミノ酸配列を保有する、対応す
る野生型の抗原結合タンパク質の少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１
０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍の血清半減期の延長を示す。
【０３９４】
一実施形態では、非ヒト動物は、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座につい
てヘテロ接合性であり、非ヒト動物は、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免
疫グロブリン重鎖遺伝子座に主に由来する、少なくとも１つのヒスチジン残基を含むヒト
免疫グロブリン重鎖可変ドメインを発現させることが可能である。
【０３９５】
一態様では、ヒトＶＨ遺伝子セグメント、ヒトＤ遺伝子セグメント、およびヒトＪＨ遺
伝子セグメントを含む、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト動物であ
って、ヒトＤ遺伝子セグメントのうちの少なくとも１つを、５’側から３’側にかけて、
対応する野生型配列に対して反転させており、反転させたヒトＤ遺伝子セグメントの少な
くとも１つのリーディングフレームが、ヒスチジンコドンを含む非ヒト動物が提供される
。
【０３９６】
一実施形態では、非ヒト動物は、齧歯動物、例えば、マウス、ラット、またはハムスタ
ーを含む哺乳動物である。
【０３９７】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、生殖細胞系列ゲノムに
存在する。
【０３９８】
一実施形態では、反転させたヒトＤ遺伝子セグメントのリーディングフレームは、１つ
または複数、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上
、９つ以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上
、１７以上、１８以上、１９以上、２０以上、２１以上、２２以上、２３以上、２４以上
、２５以上、２６以上、２７以上、２８以上、２９以上、３０以上、３１以上、３２以上
、３３以上、または３４以上のヒスチジンコドンを含む。
【０３９９】
一実施形態では、機能性ヒトＤ遺伝子セグメントのうちの少なくとも２つ、少なくとも
３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも
８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも
１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも
１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも
２３、少なくとも２４、または全てもしくは実質的に全ては、対応する野生型配列に対し
て逆配向である。
【０４００】
一実施形態では、内因性免疫グロブリンのＶＨ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント
、ＪＨ遺伝子セグメントの全てまたは実質的に全てを、免疫グロブリン重鎖遺伝子座から
欠失させるか、または非機能性にする（例えば、免疫グロブリン遺伝子座にヌクレオチド
配列、例えば、外因性ヌクレオチド配列の挿入を介して、または内因性の免疫グロブリン
ＶＨセグメント、Ｄセグメント、ＪＨセグメントの全てもしくは実質的に全ての非機能性
の再構成もしくは反転を介して）が、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、ヒト
ＶＨ遺伝子セグメント、ヒトＤ遺伝子セグメント、およびヒトＪＨ遺伝子セグメントを含
み、ヒトＤ遺伝子セグメントのうちの少なくとも１つは対応する野生型配列に対して逆配
向で存在し、反転させたヒトＤ遺伝子セグメントの少なくとも１つのリーディングフレー
ムは、少なくとも１つのヒスチジンコドンを含む。
【０４０１】
一実施形態では、反転させたヒトＤ遺伝子セグメントは、ヒトＶＨ遺伝子セグメントお
よび／またはヒトＪＨ遺伝子セグメントに作動可能に連結されている。
【０４０２】
一実施形態では、対応する野生型配列と比べて逆配向で存在するヒトＤ遺伝子セグメン
トは、Ｄ１−１、Ｄ１−７、Ｄ１−２０、Ｄ１−２６、Ｄ２−２、Ｄ２−８、Ｄ２−１５
、Ｄ２−２１、Ｄ３−３、Ｄ３−９、Ｄ３−１０、Ｄ３−１６、Ｄ３−２２、Ｄ４−４、
Ｄ４−１１、Ｄ４−１７、Ｄ４−２３、Ｄ５−５、Ｄ５−１２、Ｄ５−１８、Ｄ５−２４
、Ｄ６−６、Ｄ６−１３、Ｄ６−１９、Ｄ７−２７、およびこれらの組合せからなる群か
ら選択される。
【０４０３】
一実施形態では、対応する野生型配列と比べて逆配向で存在するヒトＤ遺伝子セグメン
トは、Ｄ１−１、Ｄ１−７、Ｄ１−２０、Ｄ１−２６、およびこれらの組合せからなる群
から選択されるＤ１遺伝子セグメントである。
【０４０４】
一実施形態では、対応する野生型配列と比べて逆配向で存在するヒトＤ遺伝子セグメン
トは、Ｄ２−２、Ｄ２−８、Ｄ２−１５、Ｄ２−２１、およびこれらの組合せからなる群
から選択されるＤ２遺伝子セグメントである。
【０４０５】
一実施形態では、対応する野生型配列と比べて逆配向で存在するヒトＤ遺伝子セグメン
トは、Ｄ３−３、Ｄ３−９、Ｄ３−１０、Ｄ３−１６、Ｄ３−２２、およびこれらの組合
せからなる群から選択されるＤ３遺伝子セグメントである。
【０４０６】
一実施形態では、対応する野生型配列と比べて逆配向で存在するヒトＤ遺伝子セグメン
トは、Ｄ４−４、Ｄ４−１１、Ｄ４−１７、Ｄ４−２３、およびこれらの組合せからなる
群から選択されるＤ４遺伝子セグメントである。
【０４０７】
一実施形態では、対応する野生型配列と比べて逆配向で存在するヒトＤ遺伝子セグメン
トは、Ｄ５−５、Ｄ５−１２、Ｄ５−１８、Ｄ５−２４、およびこれらの組合せからなる
群から選択されるＤ５遺伝子セグメントである。
【０４０８】
一実施形態では、対応する野生型配列と比べて逆配向で存在するヒトＤ遺伝子セグメン
トは、Ｄ６−６、Ｄ６−１３、Ｄ６−１９、およびこれらの組合せからなる群から選択さ
れるＤ６遺伝子セグメントである。
【０４０９】
一実施形態では、対応する野生型配列と比べて逆配向で存在するヒトＤ遺伝子セグメン
トは、Ｄ７−２７である。
【０４１０】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントのリーディングフレームは、終止リーディン
グフレーム、親水性リーディングフレーム、疎水性リーディングフレーム、およびこれら
の組合せから選択され、反転させたヒトＤ遺伝子セグメントの少なくとも１つのリーディ
ングフレームは、ヒスチジンコドンを含む。
【０４１１】
一実施形態では、反転させたヒトＤ遺伝子セグメントを含む、再構成されていない重鎖
可変領域のヌクレオチド配列は、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、およびＩｇＡから選
択される免疫グロブリンアイソタイプをコードする、ヒトまたは非ヒトの重鎖定常領域の
ヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。
【０４１２】
一実施形態では、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド
配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、およびこれらの組合せから選択される、ヒト
または非ヒトの重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。一実施形
態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３（
すなわち、ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）を含む。
【０４１３】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、内因性遺伝子座に存在する（す
なわち、ヌクレオチド配列が野生型の非ヒト動物にある場合）か、または異所性に存在す
る（例えば、そのゲノムにおける内因性免疫グロブリン鎖の遺伝子座と異なる遺伝子座に
存在する、またはその内因性の遺伝子座内に、例えば、免疫グロブリン可変遺伝子座内に
存在し、ここで、該内因性の遺伝子座は、ゲノムにおける異なる位置に配置されるか、ま
たはゲノムにおける異なる位置へと移動している）。
【０４１４】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ＣＨ２におけるまたはＣＨ３に
おける改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲である
エンドソーム内で）重鎖定常領域アミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を
含む。
【０４１５】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、２５０位における改変（例えば
、ＥまたはＱ）；２５０および４２８位における改変（例えば、ＬまたはＦ）；２５２位
における改変（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／ＷまたはＴ）、２５４位における改変（例えば、Ｓ
またはＴ）、および２５６位における改変（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤまたはＴ）；ま
たは４２８および／もしくは４３３位における改変（例えば、Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／Ｑまたは
Ｋ）、および／もしくは４３４位における改変（例えば、Ｈ／ＦまたはＹ）；または２５
０および／もしくは４２８位における改変；または３０７もしくは３０８位における改変
（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）、ならびに４３４位における改変を含むヒト重鎖定常
領域アミノ酸配列をコードする。一実施形態では、改変は、４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８
Ｌ）および４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）の改変；４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えば、Ｖ２
５９Ｉ）、および３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）の改変；４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３
Ｋ）および４３４位（例えば、４３４Ｙ）の改変；２５２、２５４、および２５６位（例
えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅ）における改変；２５０Ｑおよび４２８Ｌの
改変（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ４２８Ｌ）；ならびに３０７および／または３０８位
における改変（例えば、３０８Ｆまたは３０８Ｐ）であって、酸性の環境で（例えば、ｐ
Ｈが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）重鎖定常領域アミノ酸配列の
ＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む。
【０４１６】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、２５２位のアミノ酸残基と２５
７位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、
ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣＨ２のアミノ酸配列
のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣＨ２のアミノ酸配列をコードする
。
【０４１７】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、３０７位のアミノ酸残基と３１
１位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、
ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣＨ２のアミノ酸配列
のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣＨ２のアミノ酸配列をコードする
。
【０４１８】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、４３３位のアミノ酸残基と４３
６位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、
ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣＨ３のアミノ酸配列
のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣＨ３のアミノ酸配列をコードする
。
【０４１９】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ｓ、およ
びこれらの組合せからなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列を
コードする。
【０４２０】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｍ４２８Ｌ、Ｖ２５９Ｉ、Ｖ３
０８Ｆ、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域ア
ミノ酸配列をコードする。
【０４２１】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｎ４３４Ａ変異を含むヒト重鎖
定常領域アミノ酸配列をコードする。
【０４２２】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２
５６Ｅ、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域ア
ミノ酸配列をコードする。
【０４２３】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｔ２５０Ｑ、Ｍ２４８Ｌ、また
はこれらの両方からなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコ
ードする。
【０４２４】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ｙ、また
はこれらの両方からなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコ
ードする。
【０４２５】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、（１）本明細書に記載
されている、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド配列が
、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、およびこれらの組合せから選択されるヒトＩｇＧの第
一のＣＨ３のアミノ酸配列をコードする第一の重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可
能に連結されている、第一の対立遺伝子；ならびに（２）本明細書に記載されている、再
構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、ＩｇＧ１、Ｉ
ｇＧ２、ＩｇＧ４、およびこれらの組合せから選択されるヒトＩｇＧの第二のＣＨ３のア
ミノ酸配列をコードする第二の重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されて
おり、第二のＣＨ３のアミノ酸配列が、第二のＣＨ３のアミノ酸配列の、プロテインＡへ
の結合を低減するか、または消失させる改変（例えば、ＵＳ２０１０／０３３１５２７Ａ
１を参照されたい）を含む、第二の対立遺伝子を含む。
【０４２６】
一実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、Ｈ９５Ｒの改変（ＩＭＧＴエクソン
番号付けによる；ＥＵ番号付けによるＨ４３５Ｒ）を含む。一実施形態では、第二のＣＨ
３のアミノ酸配列は、Ｙ９６Ｆの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵによるＨ
４３６Ｆ）をさらに含む。別の実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、Ｈ９５Ｒ
の改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵ番号付けによるＨ４３５Ｒ）およびＹ９
６Ｆの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵによるＨ４３６Ｆ）の両方を含む。
【０４２７】
一実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、改変ヒトＩｇＧ１からのアミノ酸配
列であり、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭ
ＧＴ；ＥＵによるＤ３５６Ｅ、Ｌ３８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、および
Ｖ４２２Ｉ）からなる群から選択される変異をさらに含む。
【０４２８】
一実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、改変ヒトＩｇＧ２からのアミノ酸配
列であり、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ：ＥＵによるＮ３８４Ｓ、Ｋ
３９２Ｎ、およびＶ４２２Ｉ）からなる群から選択される変異をさらに含む。
【０４２９】
一実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、改変ヒトＩｇＧ４からのアミノ酸配
列であり、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、およびＶ８
２Ｉ（ＩＭＧＴ：ＥＵによるＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０
９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、およびＶ４２２Ｉ）からなる群から選択される変異をさらに含む。
【０４３０】
一実施形態では、重鎖定常領域アミノ酸配列は、非ヒト定常領域のアミノ酸配列であり
、重鎖定常領域アミノ酸配列は、上記の種類の改変のうちのいずれかのうちの１つまたは
複数を含む。
【０４３１】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列
であり、ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列は、上記の種類の改変のうちのいずれかのうちの
１つまたは複数を含む。
【０４３２】
一実施形態では、全てまたは実質的に全ての内因性のＶＨ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子
セグメント、およびＪＨ遺伝子セグメントを、免疫グロブリン重鎖遺伝子座から欠失させ
るか、または非機能性にする（例えば、免疫グロブリン遺伝子座内にヌクレオチド配列（
例えば、外因性ヌクレオチド配列）の挿入を介して、または内因性のＶＨセグメント、Ｄ
セグメント、ＪＨセグメントの非機能性の再構成または反転を介して）。一実施形態では
、例えば、全ての内因性のＶＨ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、またはＪＨ遺伝
子セグメントのうちの約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９
６％以上、約９７％以上、約９８％以上、または約９９％以上を欠失させるか、または非
機能性にする。一実施形態では、例えば、内因性の機能性Ｖ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子
セグメント、またはＪ遺伝子セグメントのうちの少なくとも９５％、９６％、９７％、９
８％、または９９％を欠失させるか、または非機能性にする。
【０４３３】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、全てまたは実質的
に全ての、内因性のＶＨ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、およびＪＨ遺伝子セグ
メントを欠失させるか、または非機能性にする改変を含み、遺伝子改変された遺伝子座は
、本明細書に記載されている、少なくとも１つの反転させたヒトＤ遺伝子セグメントを含
む、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列を含み、再構成されていない重
鎖可変領域のヌクレオチド配列は、内因性位置に存在する（すなわち、ヌクレオチド配列
が野生型の非ヒト動物にある場合）か、または異所性に存在する（例えば、そのゲノムに
おける内因性免疫グロブリン鎖の遺伝子座と異なる遺伝子座に存在する、またはその内因
性の遺伝子座内に、例えば、免疫グロブリン可変遺伝子座内に存在し、ここで、該内因性
の遺伝子座は、ゲノムにおける異なる位置に配置されるか、またはゲノムにおける異なる
位置へと移動している）。
【０４３４】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、内因性Ａｄａｍ６ａ遺
伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはこれらの両方を含み、遺伝子改変は、内因性のＡｄａ
ｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはこれらの両方の発現および／または機能に影
響を及ぼさない。
【０４３５】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、異所性に存在するＡｄ
ａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはこれらの両方を含む。一実施形態では、Ａ
ｄａｍ６ａ遺伝子は、非ヒトＡｄａｍ６ａ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ａ
遺伝子は、マウスＡｄａｍ６ａ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ａ遺伝子は、
ヒトＡｄａｍ６ａ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子は、非ヒトＡｄａ
ｍ６ｂ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子は、マウスＡｄａｍ６ｂ遺伝
子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子は、ヒトＡｄａｍ６ｂ遺伝子である。
【０４３６】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、ヒト化された、再構成
されていないλ軽鎖可変遺伝子配列および／またはκ軽鎖可変遺伝子配列をさらに含む。
一実施形態では、ヒト化された、再構成されていないλ軽鎖可変遺伝子配列および／また
はκ軽鎖可変遺伝子配列は、λ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列およびκ軽鎖定常領域の
ヌクレオチド配列から選択される、免疫グロブリン軽鎖定常領域のヌクレオチド配列に作
動可能に連結されている。一実施形態では、ヒト化された、再構成されていないλ軽鎖可
変領域のヌクレオチド配列は、λ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結され
ている。一実施形態では、λ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列は、マウス配列、ラット配
列、またはヒト配列である。一実施形態では、ヒト化された、再構成されていないκ軽鎖
可変領域のヌクレオチド配列は、κ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結さ
れている。一実施形態では、κ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列は、マウス配列、ラット
配列、またはヒト配列である。
【０４３７】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、軽鎖可変ドメインをコ
ードする少なくとも１つのリーディングフレームに少なくとも１つのヒスチジンコドンを
導入する少なくとも１つの改変を含有する、再構成されていない軽鎖可変遺伝子配列を含
む。一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、軽鎖ＣＤＲに１つ、
２つ、３つ、または４つのヒスチジンコドンを含む、再構成された（例えば、再構成され
たλまたはκのＶ／Ｊ配列）配列を含む。一実施形態では、ＣＤＲは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ
２、ＣＤＲ３、およびこれらの組合せから選択される。一実施形態では、再構成されてい
ないかまたは再構成された軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、再構成されていないかま
たは再構成されたヒトλ軽鎖可変領域またはヒトκ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列であ
る。一実施形態では、再構成されていないかまたは再構成されたヒトλ軽鎖可変領域また
はヒトκ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、内因性のマウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子
座に存在する。一実施形態では、マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、マウスκ遺伝子
座である。一実施形態では、マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、マウス免疫グロブリ
ン軽鎖遺伝子座は、マウスλ遺伝子座である。
【０４３８】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子
座は、マウスの免疫グロブリン重鎖遺伝子座に存在する。一実施形態では、遺伝子改変さ
れた免疫グロブリン遺伝子座は、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスにおけるヒ
ト化免疫グロブリン重鎖遺伝子座に存在する。
【０４３９】
一実施形態では、非ヒト動物は、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座につい
てヘテロ接合性であり、非ヒト動物は、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免
疫グロブリン重鎖遺伝子座に主に由来する、少なくとも１つのヒスチジン残基を含むヒト
免疫グロブリン重鎖可変ドメインを発現させることが可能である。
【０４４０】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺
伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、酸性の環境で（
例えば、約５．５〜約６．０のｐＨで）、遺伝子改変なしの、対応する野生型の重鎖可変
ドメインより弱い抗原結合を示す。
【０４４１】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺
伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ１
／２）は、２５℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、２分間未満であ
る。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖
遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ
１／２）は、３７℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、２分間未満で
ある。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重
鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（
ｔ１／２）は、２５℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、１分間未満
である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン
重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期
（ｔ１／２）は、３７℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、１分間未
満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリ
ン遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、酸性ｐＨ（
例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、解離半減期（ｔ１／２）を、中性ｐＨ（例えば
、約７．０〜約７．４のｐＨ）における抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ１／２）と
比較して、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍
、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍
、または少なくとも約３０倍短縮する。
【０４４２】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子
座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、遺伝子改変なしの野
生型の抗原結合タンパク質と比較して、ｐＨ依存性リサイクル性の改善、血清半減期の延
長、またはこれらの両方を特徴とする。
【０４４３】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子
座は、目的の抗原で刺激されると、１つまたは複数のヒスチジン残基を含む重鎖可変ドメ
インを含む抗原結合タンパク質、例えば、抗体を産生することが可能なＢ細胞集団を含む
。本明細書に記載されている抗原結合タンパク質は、被験体へと投与されると、重鎖可変
ドメインをコードするが、重鎖可変ドメインにヒスチジン残基を含まない、類似するか、
または十分に類似するアミノ酸配列を保有する、対応する野生型の抗原結合タンパク質を
凌駕する血清半減期の延長を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている
抗原結合タンパク質は、重鎖可変ドメインをコードするが、重鎖可変ドメインにヒスチジ
ン残基を含まない、類似するか、または十分に類似するアミノ酸配列を保有する、対応す
る野生型の抗原結合タンパク質の少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１
０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍の血清半減期の延長を示す。
【０４４４】
一態様では、ｐＨ依存性リサイクル性が増強され、かつ／または血清半減期が延長した
抗原結合タンパク質を発現することが可能な非ヒト動物であって、その生殖細胞系列ゲノ
ムに、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド配列を含み、
再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、本明細書に記載されている、少
なくとも１つのヒスチジンコドンの付加または少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコド
ンのヒスチジンコドンによる置換を含む非ヒト動物が提供される。
【０４４５】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺
伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、酸性の環境で（
例えば、約５．５〜約６．０のｐＨで）、遺伝子改変なしの、対応する野生型の重鎖可変
ドメインより弱い抗原結合を示す。
【０４４６】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺
伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ１
／２）は、２５℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、２分間未満であ
る。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖
遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ
１／２）は、３７℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、２分間未満で
ある。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重
鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（
ｔ１／２）は、２５℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、１分間未満
である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン
重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期
（ｔ１／２）は、３７℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、１分間未
満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリ
ン遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、酸性ｐＨ（
例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、解離半減期（ｔ１／２）を、中性ｐＨ（例えば
、約７．０〜約７．４のｐＨ）における抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ１／２）と
比較して、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍
、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍
、または少なくとも約３０倍短縮する。
【０４４７】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子
座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、遺伝子改変なしの野
生型の抗原結合タンパク質と比較して、ｐＨ依存性リサイクル性の改善、血清半減期の延
長、またはこれらの両方を特徴とする。
【０４４８】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子
座は、目的の抗原で刺激されると、１つまたは複数のヒスチジン残基を含む重鎖可変ドメ
インを含む抗原結合タンパク質、例えば、抗体を産生することが可能なＢ細胞集団を含む
。本明細書に記載されている抗原結合タンパク質は、被験体へと投与されると、重鎖可変
ドメインをコードするが、重鎖可変ドメインにヒスチジン残基を含まない、類似するか、
または十分に類似するアミノ酸配列を保有する、対応する野生型の抗原結合タンパク質を
凌駕する血清半減期の延長を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている
抗原結合タンパク質は、重鎖可変ドメインをコードするが、重鎖可変ドメインにヒスチジ
ン残基を含まない、類似するか、または十分に類似するアミノ酸配列を保有する、対応す
る野生型の抗原結合タンパク質の少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１
０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍の血清半減期の延長を示す。
【０４４９】
一態様では、非ヒト動物のゲノムＤ領域またはゲノムＶ領域およびゲノムＪ領域と相同
な５’側および３’側のターゲッティングアームを含むターゲッティング構築物であって
、少なくとも１つのＶＨ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、またはＪＨ遺伝子セグ
メントが、本明細書に記載されている改変、例えば、少なくとも１つのヒスチジンコドン
の付加、少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンへの置換、およ
び／または少なくとも１つの機能性Ｄ遺伝子セグメントの、対応する野生型配列に対する
反転のうちのいずれかを含むターゲッティング構築物が提供される。
【０４５０】
一態様では、本明細書に記載されている任意の非ヒト動物の細胞に由来するハイブリド
ーマまたはクァドローマが提供される。一実施形態では、非ヒト動物は、齧歯動物、例え
ば、マウス、ラット、またはハムスターである。
【０４５１】
一態様では、記載される本発明の様々なゲノムの改変を含む非ヒト動物に由来する多能
性幹細胞、人工多能性幹細胞、または全能性幹細胞が提供される。具体的な実施形態では
、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、または全能性幹細胞は、マウスまたはラットの胚性
幹（ＥＳ）細胞である。一実施形態では、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、または全能
性幹細胞は、ＸＸ核型またはＸＹ核型を有する。一実施形態では、多能性幹細胞または人
工多能性幹細胞は、造血幹細胞である。
【０４５２】
一態様では、本明細書に記載されている遺伝子改変、例えば、前核注射により細胞へと
導入された改変を含有する核を含む細胞もまた提供される。一実施形態では、多能性幹細
胞、人工多能性幹細胞、または全能性幹細胞は、遺伝子改変された免疫グロブリンのゲノ
ム遺伝子座であって、５’側から３’側にかけて、（１）ＦＲＴ組換え部位、（２）ヒト
ＶＨ遺伝子セグメント、（３）マウスａｄａｍ６遺伝子、（４）ｌｏｘＰ組換え部位、（
５）ヒスチジンで置換したヒトＤ遺伝子セグメント、（６）ヒトＪＨ遺伝子セグメントに
続いて、（７）マウスＥｉ（イントロンエンハンサー）、および（８）マウスＩｇＭ定常
領域のヌクレオチド配列を含むゲノム遺伝子座を含む。
【０４５３】
一態様では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物から単離された
リンパ球が提供される。一実施形態では、リンパ球は、再構成されていない重鎖可変領域
のヌクレオチド配列を含む免疫グロブリンのゲノム遺伝子座を含み、再構成されていない
重鎖可変遺伝子配列が、少なくとも１つのヒスチジンコドンの付加または少なくとも１つ
の内因性非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含むＢ細胞である。
【０４５４】
一態様では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物から単離された
リンパ球が提供される。一実施形態では、リンパ球は、ヒトＶ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝
子セグメント、およびＪ遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン遺伝子座を含み、ヒトＤ
遺伝子セグメントのうちの少なくとも１つを、５’側から３’側にかけて、野生型配列に
対して反転させており、反転させたヒトＤ遺伝子セグメントの少なくとも１つのリーディ
ングフレームが、少なくとも１つのヒスチジン残基をコードするＢ細胞である。一実施形
態では、Ｂ細胞は、本明細書に記載されている、遺伝子改変された重鎖可変ドメインを含
む、抗原結合タンパク質を産生することが可能である。一実施形態では、本明細書に記載
されている、遺伝子改変された重鎖可変ドメインは、重鎖定常領域アミノ酸配列に作動可
能に連結されている。
【０４５５】
一態様では、抗原結合タンパク質を発現することが可能なＢ細胞集団が提供され、ここ
で、この抗原結合タンパク質は、重鎖可変ドメインに少なくとも１つのヒスチジン残基を
含み、このＢ細胞集団は、本明細書に記載されている任意の遺伝子改変を含む。一実施形
態では、少なくとも１つのヒスチジン残基は、重鎖ＣＤＲに存在する。一実施形態では、
ＣＤＲは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、およびこれらの組合せから選択される。一実
施形態では、少なくとも１つのヒスチジン残基は、ＣＤＲ３に存在する。
【０４５６】
一態様では、血清半減期が延長し、かつ／またはｐＨ依存性リサイクル性が増強した抗
原結合タンパク質を発現することが可能なＢ細胞集団であって、本明細書に記載されてい
る任意の遺伝子改変を含むＢ細胞集団が提供される。
【０４５７】
一態様では、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座を含む非ヒト動物を作
製するための方法であって、
（ａ）非ヒト動物のゲノムを改変して、内因性免疫グロブリン重鎖のＶ遺伝子セグメン
ト、Ｄ遺伝子セグメント、およびＪ遺伝子セグメントを欠失させるか、または非機能性に
する（例えば、免疫グロブリン遺伝子座にヌクレオチド配列、例えば、外因性ヌクレオチ
ド配列の挿入を介して、または内因性のＶＨセグメント、Ｄセグメント、ＪＨセグメント
の非機能性の再構成もしくは反転を介して）ステップと、
（ｂ）ゲノムに、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列を配置するステ
ップであって、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、本明細書に記載
されている、少なくとも１つのヒスチジンコドンの付加または少なくとも１つの内因性非
ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含むステップと
を含む方法が提供される。
【０４５８】
一実施形態では、非ヒト動物は、齧歯動物、例えば、マウス、ラット、またはハムスタ
ーを含む哺乳動物である。
【０４５９】
一実施形態では、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８
つ以上、９つ以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１
６以上、１７以上、１８以上、１９以上、２０以上、２１以上、２２以上、２３以上、２
４以上、２５以上、２６以上、２７以上、２８以上、２９以上、３０以上、３１以上、３
２以上、３３以上、３４以上、３５以上、３６以上、３７以上、３８以上、３９以上、４
０以上、４１以上、４２以上、４３以上、４４以上、４５以上、４６以上、４７以上、４
８以上、４９以上、５０以上、５１以上、５２以上、５３以上、５４以上、５５以上、５
６以上、５７以上、５８以上、５９以上、６０以上、または６１以上の内因性の非ヒスチ
ジンコドンを、ヒスチジンコドンで置きかえる。
【０４６０】
一実施形態では、内因性の非ヒスチジンコドンは、Ｙ、Ｎ、Ｄ、Ｑ、Ｓ、Ｗ、およびＲ
から選択されるアミノ酸をコードする。
【０４６１】
一実施形態では、付加または置換されたヒスチジンコドンは、Ｎ末端領域、ループ４領
域、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、これらの組合せから選択される免疫グロブリン可変
ドメインをコードする、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列に存在する
。
【０４６２】
一実施形態では、付加、置換されたヒスチジンコドンヒスチジンコドンは、ＣＤＲ１、
ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、およびこれらの組合せから選択される相補性決定領域（ＣＤＲ）を
コードする、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列に存在する。
【０４６３】
一実施形態では、付加または置換されたヒスチジンコドンは、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３
、ＦＲ４、およびこれらの組合せから選択されるフレーム領域（ＦＲ）をコードする、再
構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列に存在する。
【０４６４】
一実施形態では、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ヒトＶＨ遺
伝子セグメントの少なくとも１つのリーディングフレームにおける１つまたは複数の内因
性非ヒスチジンコドンが、ヒスチジンコドンで置きかえられた、遺伝子改変されたヒトＶ
Ｈ遺伝子セグメントを含む。
【０４６５】
一実施形態では、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ヒトＶ
Ｈ遺伝子セグメントの少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで
置きかえる改変であって、ヒトＶＨ遺伝子セグメントが、ＶＨ１−２、ＶＨ１−３、ＶＨ
１−８、ＶＨ１−１８、ＶＨ１−２４、ＶＨ１−４５、ＶＨ１−４６、ＶＨ１−５８、Ｖ
Ｈ１−６９、ＶＨ２−５、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−７０、ＶＨ３−７、ＶＨ３−９、ＶＨ
３−１１、ＶＨ３−１３、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−１６、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−２１、
ＶＨ３−２３、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−３０−３、ＶＨ３−３０−５、ＶＨ３−３３、Ｖ
Ｈ３−３５、ＶＨ３−３８、ＶＨ３−４３、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−４９、ＶＨ３−５３
、ＶＨ３−６４、ＶＨ３−６６、ＶＨ３−７２、ＶＨ３−７３、ＶＨ３−７４、ＶＨ４−
４、ＶＨ４−２８、ＶＨ４−３０−１、ＶＨ４−３０−２、ＶＨ４−３０−４、ＶＨ４−
３１、ＶＨ４−３４、ＶＨ４−３９、ＶＨ４−５９、ＶＨ４−６１、ＶＨ５−５１、ＶＨ
６−１、ＶＨ７−４−１、ＶＨ７−８１、およびこれらの組合せからなる群から選択され
る改変を含む。
【０４６６】
一実施形態では、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、遺伝子
改変されたヒトＪＨ遺伝子セグメントであって、ヒトＪＨ遺伝子セグメントの少なくとも
１つのリーディングフレームにおける１つまたは複数の内因性非ヒスチジンコドンが、ヒ
スチジンコドンで置きかえられた遺伝子改変されたヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む。
【０４６７】
一実施形態では、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ヒトＪ
Ｈセグメントの少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きか
える改変であって、ヒトＪＨ遺伝子セグメントが、ＪＨ１、ＪＨ２、ＪＨ３、ＪＨ４、Ｊ
Ｈ５、ＪＨ６、およびこれらの組合せからなる群から選択される改変を含む。
【０４６８】
一実施形態では、付加または置換されたヒスチジンコドンは、ＣＤＲ３の一部をコード
する重鎖可変領域のヌクレオチド配列に存在する。一実施形態では、ＣＤＲ３の一部は、
リーディングフレームにおける少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジン
コドンで置きかえる改変を含む、遺伝子改変されたヒトＤ遺伝子セグメントのリーディン
グフレームに由来するアミノ酸配列を含む。
【０４６９】
一実施形態では、ヒスチジンコドンで置換される内因性非ヒスチジンコドンは、Ｙ、Ｎ
、Ｄ、Ｑ、Ｓ、Ｗ、およびＲから選択されるアミノ酸をコードする。
【０４７０】
一実施形態では、付加または置換されるヒスチジンコドンは、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ
（登録商標）ヒト化免疫グロブリンマウス内で最も高頻度に観察されるヒトＤ遺伝子セグ
メントの少なくとも１つのリーディングフレームに存在する。
【０４７１】
一実施形態では、ＣＤＲ３の一部をコードする、遺伝子改変されたヒトＤ遺伝子セグメ
ントのリーディングフレームは、疎水性フレーム、終止フレーム、および親水性フレーム
から選択される。
【０４７２】
一実施形態では、リーディングフレームは、ヒトＤ遺伝子セグメントの疎水性フレーム
である。
【０４７３】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの疎水性フレームは、Ｄ１−１（ＧＴＴＧＴ
；配列番号８８）、Ｄ１−７（ＧＩＴＧＴ；配列番号８９）、Ｄ１−２０（ＧＩＴＧＴ；
配列番号８９）、およびＤ１−２６（ＧＩＶＧＡＴ；配列番号９０）からなる群から選択
されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、
ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコド
ンで置きかえる改変をさらに含む。
【０４７４】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの疎水性フレームは、Ｄ２−２（ＤＩＶＶＶ
ＰＡＡＩ；配列番号９２）、Ｄ２−８（ＤＩＶＬＭＶＹＡＩ；配列番号９４）、Ｄ２−１
５（ＤＩＶＶＶＶＡＡＴ；配列番号９５）、およびＤ２−２１（ＨＩＶＶＶＴＡＩ；配列
番号９７）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み
、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒス
チジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。
【０４７５】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの疎水性フレームは、Ｄ３−３（ＩＴＩＦＧ
ＶＶＩＩ；配列番号９８）、Ｄ３−９（ＩＴＩＦ＊ＬＶＩＩ；配列番号９９、配列番号１
００）、Ｄ３−１０（ＩＴＭＶＲＧＶＩＩ；配列番号１０１）、Ｄ３−１６（ＩＭＩＴＦ
ＧＧＶＩＶＩ；配列番号１０２）、およびＤ３−２２（ＩＴＭＩＶＶＶＩＴ；配列番号１
０３）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒ
トＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性コドンをヒ
スチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。
【０４７６】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの疎水性フレームは、Ｄ４−４（ＴＴＶＴ；
配列番号１０５）、Ｄ４−１１（ＴＴＶＴ；配列番号１０５）、Ｄ４−１７（ＴＴＶＴ；
配列番号１０５）、Ｄ４−２３（ＴＴＶＶＴ；配列番号１０６）からなる群から選択され
るアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌク
レオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで
置きかえる改変をさらに含む。
【０４７７】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの疎水性フレームは、Ｄ５−５（ＶＤＴＡＭ
Ｖ；配列番号１０７）、Ｄ５−１２（ＶＤＩＶＡＴＩ；配列番号１０８）、Ｄ５−１８（
ＶＤＴＡＭＶ；配列番号１０７）、およびＤ５−２４（ＶＥＭＡＴＩ；配列番号１０９）
からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺
伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコド
ンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。
【０４７８】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの疎水性フレームは、Ｄ６−６（ＳＩＡＡＲ
；配列番号１１１）、Ｄ６−１３（ＧＩＡＡＡＧ；配列番号１１３）、およびＤ６−１９
（ＧＩＡＶＡＧ；配列番号１１５）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする
ヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なく
とも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む
。
【０４７９】
一実施形態では、疎水性フレームは、ヒトＤ７−２７（ＬＴＧ）をコードするヌクレオ
チド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つ
の内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。
【０４８０】
一実施形態では、リーディングフレームは、ヒトＤ遺伝子セグメントの終止リーディン
グフレームである。
【０４８１】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの終止リーディングフレームは、Ｄ１−１（
ＶＱＬＥＲ；配列番号８）、Ｄ１−７（Ｖ＊ＬＥＬ）、Ｄ１−２０（Ｖ＊ＬＥＲ）、Ｄ１
−２６（Ｖ＊ＷＥＬＬ；配列番号１２）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコード
するヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少
なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに
含む。
【０４８２】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの終止リーディングフレームは、Ｄ２−２（
ＲＩＬ＊＊ＹＱＬＬＹ；配列番号１４）、Ｄ２−８（ＲＩＬＹ＊ＷＣＭＬＹ；配列番号１
６および配列番号１７）、Ｄ２−１５（ＲＩＬ＊ＷＷ＊ＬＬＬ）、およびＤ２−２１（Ｓ
ＩＬＷＷ＊ＬＬＦ；配列番号１９）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする
ヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なく
とも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む
。
【０４８３】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの終止リーディングフレームは、Ｄ３−３（
ＶＬＲＦＬＥＷＬＬＹ；配列番号２１）、Ｄ３−９（ＶＬＲＹＦＤＷＬＬ＊；配列番号２
３）、Ｄ３−１０（ＶＬＬＷＦＧＥＬＬ＊；配列番号２５）、Ｄ３−１６（ＶＬ＊ＬＲＬ
ＧＥＬＳＬＹ；配列番号２７）、およびＤ３−２２（ＶＬＬ＊＊＊ＷＬＬＬ；配列番号２
９）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒト
Ｄ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジン
コドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変を含む。
【０４８４】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの終止リーディングフレームは、Ｄ４−４（
＊ＬＱ＊Ｌ）、Ｄ４−１１（＊ＬＱ＊Ｌ）、Ｄ４−１７（＊ＬＲ＊Ｌ）、およびＤ４−２
３（＊ＬＲＷ＊Ｌ）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配
列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因
性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変を含む。
【０４８５】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの終止リーディングフレームは、Ｄ５−５（
ＷＩＱＬＷＬ；配列番号３５）；Ｄ５−１２（ＷＩ＊ＷＬＲＬ；配列番号３７）、Ｄ５−
１８（ＷＩＱＬＷＬ；配列番号３５）、およびＤ５−２４（＊ＲＷＬＱＬ；配列番号３９
）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ
遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコ
ドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変を含む。
【０４８６】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの終止リーディングフレームは、Ｄ６−６（
Ｖ＊ＱＬＶ）、Ｄ６−１３（Ｖ＊ＱＱＬＶ；配列番号４１）、およびＤ６−１９（Ｖ＊Ｑ
ＷＬＶ；配列番号４３）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチ
ド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの
内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。
【０４８７】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの終止リーディングフレームは、Ｄ７−２７
（＊ＬＧ）をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオ
チド配列におけるヒトＤ遺伝子セグメントの少なくとも１つの内因性コドンをヒスチジン
コドンで置きかえる改変をさらに含む。
【０４８８】
一実施形態では、リーディングフレームは、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレーム
である。
【０４８９】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームは、Ｄ１−１（ＹＮＷＮＤ
；配列番号４５）、Ｄ１−７（ＹＮＷＮＹ；配列番号４７）、Ｄ１−２０（ＹＮＷＮＤ；
配列番号４５）、およびＤ１−２６（ＹＳＧＳＹＹ；配列番号４９）からなる群から選択
されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、
ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性コドンをヒスチジンコドンで置きかえ
る改変をさらに含む。一実施形態では、親水性フレームは、配列番号４６、配列番号４８
、配列番号５０、およびこれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列をコード
するヌクレオチド配列を含む。
【０４９０】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームは、Ｄ２−２（ＧＹＣＳＳ
ＴＳＣＹＴ；配列番号５１）、Ｄ２−８（ＧＹＣＴＮＧＶＣＹＴ；配列番号５３）、Ｄ２
−１５（ＧＹＣＳＧＧＳＣＹＳ；配列番号５５）、およびＤ２−２１（ＡＹＣＧＧＤＣＹ
Ｓ；配列番号５７）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配
列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因
性コドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。一実施形態では、親水性フ
レームは、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、およびこれらの
組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０４９１】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームは、Ｄ３−３（ＹＹＤＦＷ
ＳＧＹＹＴ；配列番号５９）、Ｄ３−９（ＹＹＤＩＬＴＧＹＹＮ；配列番号６１）、Ｄ３
−１０（ＹＹＹＧＳＧＳＹＹＮ；配列番号６３）、Ｄ３−１６（ＹＹＤＹＶＷＧＳＹＲＹ
Ｔ；配列番号６５）、およびＤ３−２２（ＹＹＹＤＳＳＧＹＹＹ；配列番号６７）からな
る群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セ
グメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性コドンをヒスチジンコド
ンで置きかえる改変をさらに含む。一実施形態では、親水性フレームは、配列番号６０、
配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、およびこれらの組合せから
なる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０４９２】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームは、Ｄ４−４（ＤＹＳＮＹ
；配列番号６９）、Ｄ４−１１（ＤＹＳＮＹ；配列番号６９）、Ｄ４−１７（ＤＹＧＤＹ
；配列番号７１）、およびＤ４−２３（ＤＹＧＧＮＳ；配列番号７３）からなる群から選
択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは
、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性コドンをヒスチジンコドンで置きか
える改変を含む。一実施形態では、親水性フレームは、配列番号７０、配列番号７２、配
列番号７４、およびこれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする
ヌクレオチド配列を含む。
【０４９３】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームは、Ｄ５−５（ＧＹＳＹＧ
Ｙ；配列番号７５）、Ｄ５−１２（ＧＹＳＧＹＤＹ；配列番号７７）、Ｄ５−１８（ＧＹ
ＳＹＧＹ；配列番号７５）、およびＤ５−２４（ＲＤＧＹＮＹ；配列番号７９）からなる
群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグ
メントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性コドンをヒスチジンコドン
で置きかえる改変をさらに含む。一実施形態では、親水性フレームは、配列番号７６、配
列番号７８、配列番号８０、およびこれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配
列をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０４９４】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームは、Ｄ６−６（ＥＹＳＳＳ
Ｓ；配列番号８１）、Ｄ６−１３（ＧＹＳＳＳＷＹ；配列番号８３）、およびＤ６−１９
（ＧＹＳＳＧＷＹ；配列番号８５）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする
ヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なく
とも１つの内因性コドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。一実施形態
では、親水性フレームは、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号７６、
およびこれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド
配列を含む。
【０４９５】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームは、Ｄ７−２７（ＮＷＧ）
をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列に
おける少なくとも１つの内因性コドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む
。
【０４９６】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームは、配列番号４６、配列番
号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配
列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０
、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号
８２、配列番号８４、配列番号８６、およびこれらの組合せからなる群から選択されるア
ミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０４９７】
一実施形態では、反転させたヒトＤ遺伝子セグメントを含む、再構成されていない重鎖
可変領域のヌクレオチド配列は、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、およびＩｇＡから選
択される免疫グロブリンアイソタイプをコードする、ヒトまたは非ヒトの重鎖定常領域の
ヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。
【０４９８】
一実施形態では、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド
配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、およびこれらの組合せから選択される、ヒト
または非ヒトの重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。一実施形
態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３（
ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）を含む。
【０４９９】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、内因性遺伝子座に存在する（す
なわち、ヌクレオチド配列が野生型の非ヒト動物にある場合）か、または異所性に存在す
る（例えば、そのゲノムにおける内因性免疫グロブリン鎖の遺伝子座と異なる遺伝子座に
存在する、またはその内因性の遺伝子座内に、例えば、免疫グロブリン可変遺伝子座内に
存在し、ここで、該内因性の遺伝子座は、ゲノムにおける異なる位置に配置されるか、ま
たはゲノムにおける異なる位置へと移動している）。
【０５００】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ＣＨ２におけるまたはＣＨ３に
おける改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲である
エンドソーム内で）重鎖定常領域アミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を
含む。
【０５０１】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、２５０位における改変（例えば
、ＥまたはＱ）；２５０および４２８位における改変（例えば、ＬまたはＦ）；２５２位
における改変（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／ＷまたはＴ）、２５４位における改変（例えば、Ｓ
またはＴ）、および２５６位における改変（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤまたはＴ）；ま
たは４２８および／もしくは４３３位における改変（例えば、Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／Ｑまたは
Ｋ）、および／もしくは４３４位における改変（例えば、Ｈ／ＦまたはＹ）；または２５
０および／もしくは４２８位における改変；または３０７もしくは３０８位における改変
（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）、ならびに４３４位における改変を含むヒト重鎖定常
領域アミノ酸配列をコードする。一実施形態では、改変は、４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８
Ｌ）および４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）の改変；４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えば、Ｖ２
５９Ｉ）、および３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）の改変；４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３
Ｋ）および４３４位（例えば、４３４Ｙ）の改変；２５２、２５４、および２５６位（例
えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅ）における改変；２５０Ｑおよび４２８Ｌの
改変（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ４２８Ｌ）；ならびに３０７および／または３０８位
における改変（例えば、３０８Ｆまたは３０８Ｐ）であって、酸性の環境で（例えば、ｐ
Ｈが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）重鎖定常領域アミノ酸配列の
ＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む。
【０５０２】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、２５２位のアミノ酸残基と２５
７位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、
ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣＨ２のアミノ酸配列
のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣＨ２のアミノ酸配列をコードする
。
【０５０３】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、３０７位のアミノ酸残基と３１
１位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、
ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣＨ２のアミノ酸配列
のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣＨ２のアミノ酸配列をコードする
。
【０５０４】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、４３３位のアミノ酸残基と４３
６位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、
ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣＨ３のアミノ酸配列
のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣＨ３のアミノ酸配列をコードする
。
【０５０５】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ｓ、およ
びこれらの組合せからなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列を
コードする。
【０５０６】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｍ４２８Ｌ、Ｖ２５９Ｉ、Ｖ３
０８Ｆ、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域ア
ミノ酸配列をコードする。
【０５０７】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｎ４３４Ａ変異を含むヒト重鎖
定常領域アミノ酸配列をコードする。
【０５０８】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２
５６Ｅ、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域ア
ミノ酸配列をコードする。
【０５０９】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｔ２５０Ｑ、Ｍ２４８Ｌ、また
はこれらの両方からなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコ
ードする。
【０５１０】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ｙ、また
はこれらの両方からなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコ
ードする。
【０５１１】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、（１）本明細書に記載
されている、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド配列が
、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、およびこれらの組合せから選択されるヒトＩｇＧの第
一のＣＨ３のアミノ酸配列をコードする第一の重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可
能に連結されている、第一の対立遺伝子；ならびに（２）本明細書に記載されている、再
構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、ＩｇＧ１、Ｉ
ｇＧ２、ＩｇＧ４、およびこれらの組合せから選択されるヒトＩｇＧの第二のＣＨ３のア
ミノ酸配列をコードする第二の重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されて
おり、第二のＣＨ３のアミノ酸配列が、第二のＣＨ３のアミノ酸配列の、プロテインＡへ
の結合を低減するか、または消失させる改変（例えば、ＵＳ２０１０／０３３１５２７Ａ
１を参照されたい）を含む、第二の対立遺伝子を含む。
【０５１２】
一実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、Ｈ９５Ｒの改変（ＩＭＧＴエクソン
番号付けによる；ＥＵ番号付けによるＨ４３５Ｒ）を含む。一実施形態では、第二のＣＨ
３のアミノ酸配列は、Ｙ９６Ｆの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵによるＨ
４３６Ｆ）をさらに含む。別の実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、Ｈ９５Ｒ
の改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵ番号付けによるＨ４３５Ｒ）およびＹ９
６Ｆの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵによるＨ４３６Ｆ）の両方を含む。
【０５１３】
一実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、改変ヒトＩｇＧ１からのアミノ酸配
列であり、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭ
ＧＴ；ＥＵによるＤ３５６Ｅ、Ｌ３８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、および
Ｖ４２２Ｉ）からなる群から選択される変異をさらに含む。
【０５１４】
一実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、改変ヒトＩｇＧ２からのアミノ酸配
列であり、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ：ＥＵによるＮ３８４Ｓ、Ｋ
３９２Ｎ、およびＶ４２２Ｉ）からなる群から選択される変異をさらに含む。
【０５１５】
一実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、改変ヒトＩｇＧ４からのアミノ酸配
列であり、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、およびＶ８
２Ｉ（ＩＭＧＴ：ＥＵによるＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０
９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、およびＶ４２２Ｉ）からなる群から選択される変異をさらに含む。
【０５１６】
一実施形態では、重鎖定常領域アミノ酸配列は、非ヒト定常領域のアミノ酸配列であり
、重鎖定常領域アミノ酸配列は、上記の種類の改変のうちのいずれかのうちの１つまたは
複数を含む。
【０５１７】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列
であり、ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列は、上記の種類の改変のうちのいずれかのうちの
１つまたは複数を含む。
【０５１８】
一実施形態では、全てまたは実質的に全ての内因性のＶＨ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子
セグメント、およびＪＨ遺伝子セグメントを、免疫グロブリン重鎖遺伝子座から欠失させ
るか、または非機能性にする（例えば、免疫グロブリン遺伝子座内にヌクレオチド配列（
例えば、外因性ヌクレオチド配列）の挿入を介して、または内因性のＶＨセグメント、Ｄ
セグメント、ＪＨセグメントの非機能性の再構成または反転を介して）。一実施形態では
、例えば、全ての内因性のＶＨ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、またはＪＨ遺伝
子セグメントのうちの約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９
６％以上、約９７％以上、約９８％以上、または約９９％以上を欠失させるか、または非
機能性にする。一実施形態では、例えば、内因性の機能性Ｖ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子
セグメント、またはＪ遺伝子セグメントのうちの少なくとも９５％、９６％、９７％、９
８％、または９９％を欠失させるか、または非機能性にする。
【０５１９】
一実施形態では、遺伝子改変された遺伝子座は、全てまたは実質的に全ての内因性のＶ
Ｈ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、およびＪＨ遺伝子セグメントを欠失させるか
、または非機能性にする改変を含み、ゲノム遺伝子座は、少なくとも１つのリーディング
フレームに少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を
含む、遺伝子改変された、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列を含
む。一実施形態では、遺伝子改変された、再構成されていない免疫グロブリン重鎖可変遺
伝子配列は、内因性位置に存在する（すなわち、ヌクレオチド配列が野生型の非ヒト動物
にある場合）か、または異所性に存在する（例えば、そのゲノムにおける内因性免疫グロ
ブリン鎖の遺伝子座と異なる遺伝子座に存在するか、またはその内因性の遺伝子座内に、
例えば、免疫グロブリン可変遺伝子座内に存在し、ここで、該内因性の遺伝子座は、ゲノ
ムにおける異なる位置に配置されるか、またはゲノムにおける異なる位置へと移動してい
る）。
【０５２０】
一実施形態では、遺伝子改変された遺伝子座は、内因性Ａｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ
６ｂ遺伝子、またはこれらの両方を含み、遺伝子改変は、内因性のＡｄａｍ６ａ遺伝子、
Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはこれらの両方の発現および／または機能に影響を及ぼさない
。
【０５２１】
一実施形態では、遺伝子改変された遺伝子座は、異所性に存在するＡｄａｍ６ａ遺伝子
、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはこれらの両方を含む。一実施形態では、Ａｄａｍ６ａ遺伝
子は、非ヒトＡｄａｍ６ａ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ａ遺伝子は、マウ
スＡｄａｍ６ａ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ａ遺伝子は、ヒトＡｄａｍ６
ａ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子は、非ヒトＡｄａｍ６ｂ遺伝子で
ある。一実施形態では、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子は、マウスＡｄａｍ６ｂ遺伝子である。一実
施形態では、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子は、ヒトＡｄａｍ６ｂ遺伝子である。
【０５２２】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、ヒト化された、再構成
されていないλ軽鎖可変遺伝子配列および／またはκ軽鎖可変遺伝子配列をさらに含む。
一実施形態では、ヒト化された、再構成されていないλ軽鎖可変遺伝子配列および／また
はκ軽鎖可変遺伝子配列は、λ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列およびκ軽鎖定常領域の
ヌクレオチド配列から選択される、免疫グロブリン軽鎖定常領域のヌクレオチド配列に作
動可能に連結されている。一実施形態では、ヒト化された、再構成されていないλ軽鎖可
変領域のヌクレオチド配列は、λ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結され
ている。一実施形態では、λ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列は、マウス配列、ラット配
列、またはヒト配列である。一実施形態では、ヒト化された、再構成されていないκ軽鎖
可変領域のヌクレオチド配列は、κ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結さ
れている。一実施形態では、κ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列は、マウス配列、ラット
配列、またはヒト配列である。
【０５２３】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、軽鎖可変ドメインをコ
ードする少なくとも１つのリーディングフレームに少なくとも１つのヒスチジンコドンを
導入する少なくとも１つの改変を含有する、再構成されていない軽鎖可変遺伝子配列を含
む。一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、軽鎖ＣＤＲに１つ、
２つ、３つ、または４つのヒスチジンコドンを含む、再構成された（例えば、再構成され
たλまたはκのＶ／Ｊ配列）配列を含む。一実施形態では、ＣＤＲは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ
２、ＣＤＲ３、およびこれらの組合せから選択される。一実施形態では、再構成されてい
ないかまたは再構成された軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、再構成されていないかま
たは再構成されたヒトλ軽鎖可変領域またはヒトκ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列であ
る。一実施形態では、再構成されていないかまたは再構成されたヒトλ軽鎖可変領域また
はヒトκ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、内因性のマウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子
座に存在する。一実施形態では、マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、マウスκ遺伝子
座である。一実施形態では、マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、マウスλ遺伝子座で
ある。
【０５２４】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子
座は、マウスの免疫グロブリン重鎖遺伝子座に存在する。一実施形態では、遺伝子改変さ
れた免疫グロブリン遺伝子座は、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスにおけるヒ
ト化免疫グロブリン重鎖遺伝子座に存在する。
【０５２５】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺
伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、酸性の環境で（
例えば、約５．５〜約６．０のｐＨで）、遺伝子改変なしの、対応する野生型の重鎖可変
ドメインより弱い抗原結合を示す。
【０５２６】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺
伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ１
／２）は、２５℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、２分間未満であ
る。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖
遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ
１／２）は、３７℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、２分間未満で
ある。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重
鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（
ｔ１／２）は、２５℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、１分間未満
である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン
重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期
（ｔ１／２）は、３７℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、１分間未
満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリ
ン遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、酸性ｐＨ（
例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、解離半減期（ｔ１／２）を、中性ｐＨ（例えば
、約７．０〜約７．４のｐＨ）における抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ１／２）と
比較して、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍
、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍
、または少なくとも約３０倍短縮する。
【０５２７】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子
座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、遺伝子改変なしの野
生型の抗原結合タンパク質と比較して、ｐＨ依存性リサイクル性の改善、血清半減期の延
長、またはこれらの両方を特徴とする。
【０５２８】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子
座は、目的の抗原で刺激されると、１つまたは複数のヒスチジン残基を含む重鎖可変ドメ
インを含む抗原結合タンパク質、例えば、抗体を産生することが可能なＢ細胞集団を含む
。本明細書に記載されている抗原結合タンパク質は、被験体へと投与されると、重鎖可変
ドメインをコードするが、重鎖可変ドメインにヒスチジン残基を含まない、類似するか、
または十分に類似するアミノ酸配列を保有する、対応する野生型の抗原結合タンパク質を
凌駕する血清半減期の延長を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている
抗原結合タンパク質は、重鎖可変ドメインをコードするが、重鎖可変ドメインにヒスチジ
ン残基を含まない、類似するか、または十分に類似するアミノ酸配列を保有する、対応す
る野生型の抗原結合タンパク質の少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１
０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍の血清半減期の延長を示す。
【０５２９】
一態様では、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座を含む非ヒト動物を作
製するための方法であって、
（ａ）非ヒト動物のゲノムを改変して、内因性免疫グロブリン重鎖のＶ遺伝子セグメン
ト、Ｄ遺伝子セグメント、およびＪ遺伝子セグメントを欠失させるか、または非機能性に
する（例えば、免疫グロブリン遺伝子座内にヌクレオチド配列（例えば、外因性ヌクレオ
チド配列）の挿入を介して、または内因性のＶＨセグメント、Ｄセグメント、ＪＨセグメ
ントの非機能性の再構成もしくは反転を介して）ステップと、
（ｂ）ゲノムに、ヒトＶＨ遺伝子セグメント、ヒトＤ遺伝子セグメント、およびヒトＪ
Ｈ遺伝子セグメントを配置するステップであって、ヒトＤ遺伝子セグメントのうちの少な
くとも１つを、５’側から３’側にかけて、対応する野生型配列に対して反転させており
、反転させたヒトＤ遺伝子セグメントの少なくとも１つのリーディングフレームが、ヒス
チジンコドンを含むステップと
を含む方法が提供される。
【０５３０】
一実施形態では、非ヒト動物は、齧歯動物、例えば、マウス、ラット、またはハムスタ
ーを含む哺乳動物である。
【０５３１】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、生殖細胞系列ゲノムに
存在する。
【０５３２】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、１つまたは複数、２つ
以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０
以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８
以上、１９以上、２０以上、２１以上、２２以上、２３以上、２４以上、２５以上、２６
以上、２７以上、２８以上、２９以上、３０以上、３１以上、３２以上、３３以上、また
は３４以上のヒスチジン残基を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードする。
【０５３３】
一実施形態では、機能性ヒトＤ遺伝子セグメントのうちの少なくとも２つ、少なくとも
３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも
８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも
１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも
１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも
２３、少なくとも２４、または全てもしくは実質的に全ては、対応する野生型配列に対し
て逆配向である。
【０５３４】
一実施形態では、内因性免疫グロブリンのＶＨ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント
、ＪＨ遺伝子セグメントの全てまたは実質的に全てを、免疫グロブリン重鎖遺伝子座から
欠失させるか、または非機能性にする（例えば、免疫グロブリン遺伝子座にヌクレオチド
配列、例えば、外因性ヌクレオチド配列の挿入を介して、または内因性の免疫グロブリン
ＶＨセグメント、Ｄセグメント、ＪＨセグメントの全てもしくは実質的に全ての非機能性
の再構成もしくは反転を介して）が、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、ヒト
ＶＨ遺伝子セグメント、ヒトＤ遺伝子セグメント、およびヒトＪＨ遺伝子セグメントを含
み、ヒトＤ遺伝子セグメントのうちの少なくとも１つは、対応する野生型配列に対して逆
配向で存在し、反転させたヒトＤ遺伝子セグメントにおける少なくとも１つのリーディン
グフレームは、少なくとも１つのヒスチジンコドンを含む。
【０５３５】
一実施形態では、反転させたヒトＤ遺伝子セグメントは、ヒトＶＨ遺伝子セグメントお
よび／またはヒトＪＨ遺伝子セグメントに作動可能に連結されている。
【０５３６】
一実施形態では、野生型配列と比べて逆配向で存在するヒトＤ遺伝子セグメントは、Ｄ
１−１、Ｄ１−７、Ｄ１−２０、Ｄ１−２６、Ｄ２−２、Ｄ２−８、Ｄ２−１５、Ｄ２−
２１、Ｄ３−３、Ｄ３−９、Ｄ３−１０、Ｄ３−１６、Ｄ３−２２、Ｄ４−４、Ｄ４−１
１、Ｄ４−１７、Ｄ４−２３、Ｄ５−５、Ｄ５−１２、Ｄ５−１８、Ｄ５−２４、Ｄ６−
６、Ｄ６−１３、Ｄ６−１９、Ｄ７−２７、およびこれらの組合せからなる群から選択さ
れる。
【０５３７】
一実施形態では、対応する野生型配列と比べて逆配向で存在するヒトＤ遺伝子セグメン
トは、Ｄ１−１、Ｄ１−７、Ｄ１−２０、Ｄ１−２６、およびこれらの組合せからなる群
から選択されるＤ１遺伝子セグメントである。
【０５３８】
一実施形態では、対応する野生型配列と比べて逆配向で存在するヒトＤ遺伝子セグメン
トは、Ｄ２−２、Ｄ２−８、Ｄ２−１５、Ｄ２−２１、およびこれらの組合せからなる群
から選択されるＤ２遺伝子セグメントである。
【０５３９】
一実施形態では、対応する野生型配列と比べて逆配向で存在するヒトＤ遺伝子セグメン
トは、Ｄ３−３、Ｄ３−９、Ｄ３−１０、Ｄ３−１６、Ｄ３−２２、およびこれらの組合
せからなる群から選択されるＤ３遺伝子セグメントである。
【０５４０】
一実施形態では、対応する野生型配列と比べて逆配向で存在するヒトＤ遺伝子セグメン
トは、Ｄ４−４、Ｄ４−１１、Ｄ４−１７、Ｄ４−２３、およびこれらの組合せからなる
群から選択されるＤ４遺伝子セグメントである。
【０５４１】
一実施形態では、対応する野生型配列と比べて逆配向で存在するヒトＤ遺伝子セグメン
トは、Ｄ５−５、Ｄ５−１２、Ｄ５−１８、Ｄ５−２４、およびこれらの組合せからなる
群から選択されるＤ５遺伝子セグメントである。
【０５４２】
一実施形態では、対応する野生型配列と比べて逆配向で存在するヒトＤ遺伝子セグメン
トは、Ｄ６−６、Ｄ６−１３、Ｄ６−１９、およびこれらの組合せからなる群から選択さ
れるＤ６遺伝子セグメントである。
【０５４３】
一実施形態では、対応する野生型配列と比べて逆配向で存在するヒトＤ遺伝子セグメン
トは、Ｄ７−２７である。
【０５４４】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントのリーディングフレームは、終止リーディン
グフレーム、親水性リーディングフレーム、疎水性リーディングフレーム、およびこれら
の組合せから選択される。
【０５４５】
一実施形態では、反転させたヒトＤ遺伝子セグメントを含む、再構成されていない重鎖
可変領域のヌクレオチド配列は、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、およびＩｇＡから選
択される免疫グロブリンアイソタイプをコードする、ヒトまたは非ヒトの重鎖定常領域の
ヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。
【０５４６】
一実施形態では、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド
配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、およびこれらの組合せから選択される、ヒト
または非ヒトの重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。一実施形
態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３（
ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）を含む。
【０５４７】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、内因性遺伝子座に存在する（す
なわち、ヌクレオチド配列が野生型の非ヒト動物にある場合）か、または異所性に存在す
る（例えば、そのゲノムにおける内因性免疫グロブリン鎖の遺伝子座と異なる遺伝子座に
存在する、またはその内因性の遺伝子座内に、例えば、免疫グロブリン可変遺伝子座内に
存在し、ここで、該内因性の遺伝子座は、ゲノムにおける異なる位置に配置されるか、ま
たはゲノムにおける異なる位置へと移動している）。
【０５４８】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ＣＨ２におけるまたはＣＨ３に
おける改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲である
エンドソーム内で）重鎖定常領域アミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を
含む。
【０５４９】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、２５０位における改変（例えば
、ＥまたはＱ）；２５０および４２８位における改変（例えば、ＬまたはＦ）；２５２位
における改変（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／ＷまたはＴ）、２５４位における改変（例えば、Ｓ
またはＴ）、および２５６位における改変（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤまたはＴ）；ま
たは４２８および／もしくは４３３位における改変（例えば、Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／Ｑまたは
Ｋ）、および／もしくは４３４位における改変（例えば、Ｈ／ＦまたはＹ）；または２５
０および／もしくは４２８位における改変；または３０７もしくは３０８位における改変
（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）、ならびに４３４位における改変を含むヒト重鎖定常
領域アミノ酸配列をコードする。一実施形態では、改変は、４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８
Ｌ）および４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）の改変；４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えば、Ｖ２
５９Ｉ）、および３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）の改変；４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３
Ｋ）および４３４位（例えば、４３４Ｙ）の改変；２５２、２５４、および２５６位（例
えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅ）における改変；２５０Ｑおよび４２８Ｌの
改変（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ４２８Ｌ）；ならびに３０７および／または３０８位
における改変（例えば、３０８Ｆまたは３０８Ｐ）であって、酸性の環境で（例えば、ｐ
Ｈが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）重鎖定常領域アミノ酸配列の
ＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む。
【０５５０】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、２５２位のアミノ酸残基と２５
７位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、
ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣＨ２のアミノ酸配列
のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣＨ２のアミノ酸配列をコードする
。
【０５５１】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、３０７位のアミノ酸残基と３１
１位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、
ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣＨ２のアミノ酸配列
のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣＨ２のアミノ酸配列をコードする
。
【０５５２】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、４３３位のアミノ酸残基と４３
６位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、
ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣＨ３のアミノ酸配列
のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣＨ３のアミノ酸配列をコードする
。
【０５５３】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ｓ、およ
びこれらの組合せからなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列を
コードする。
【０５５４】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｍ４２８Ｌ、Ｖ２５９Ｉ、Ｖ３
０８Ｆ、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域ア
ミノ酸配列をコードする。
【０５５５】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｎ４３４Ａ変異を含むヒト重鎖
定常領域アミノ酸配列をコードする。
【０５５６】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２
５６Ｅ、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域ア
ミノ酸配列をコードする。
【０５５７】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｔ２５０Ｑ、Ｍ２４８Ｌ、また
はこれらの両方からなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコ
ードする。
【０５５８】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ｙ、また
はこれらの両方からなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコ
ードする。
【０５５９】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、（１）本明細書に記載
されている、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド配列が
、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、およびこれらの組合せから選択されるヒトＩｇＧの第
一のＣＨ３のアミノ酸配列をコードする第一の重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可
能に連結されている、第一の対立遺伝子；ならびに（２）本明細書に記載されている、再
構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、ＩｇＧ１、Ｉ
ｇＧ２、ＩｇＧ４、およびこれらの組合せから選択されるヒトＩｇＧの第二のＣＨ３のア
ミノ酸配列をコードする第二の重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されて
おり、第二のＣＨ３のアミノ酸配列が、第二のＣＨ３のアミノ酸配列の、プロテインＡへ
の結合を低減するか、または消失させる改変（例えば、ＵＳ２０１０／０３３１５２７Ａ
１を参照されたい）を含む、第二の対立遺伝子を含む。
【０５６０】
一実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、Ｈ９５Ｒの改変（ＩＭＧＴエクソン
番号付けによる；ＥＵ番号付けによるＨ４３５Ｒ）を含む。一実施形態では、第二のＣＨ
３のアミノ酸配列は、Ｙ９６Ｆの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵによるＨ
４３６Ｆ）をさらに含む。別の実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、Ｈ９５Ｒ
の改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵ番号付けによるＨ４３５Ｒ）およびＹ９
６Ｆの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵによるＨ４３６Ｆ）の両方を含む。
【０５６１】
一実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、改変ヒトＩｇＧ１からのアミノ酸配
列であり、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭ
ＧＴ；ＥＵによるＤ３５６Ｅ、Ｌ３８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、および
Ｖ４２２Ｉ）からなる群から選択される変異をさらに含む。
【０５６２】
一実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、改変ヒトＩｇＧ２からのアミノ酸配
列であり、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ：ＥＵによるＮ３８４Ｓ、Ｋ
３９２Ｎ、およびＶ４２２Ｉ）からなる群から選択される変異をさらに含む。
【０５６３】
一実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、改変ヒトＩｇＧ４からのアミノ酸配
列であり、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、およびＶ８
２Ｉ（ＩＭＧＴ：ＥＵによるＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０
９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、およびＶ４２２Ｉ）からなる群から選択される変異をさらに含む。
【０５６４】
一実施形態では、重鎖定常領域アミノ酸配列は、非ヒト定常領域のアミノ酸配列であり
、重鎖定常領域アミノ酸配列は、上記の種類の改変のうちのいずれかのうちの１つまたは
複数を含む。
【０５６５】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列
であり、ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列は、上記の種類の改変のうちのいずれかのうちの
１つまたは複数を含む。
【０５６６】
一実施形態では、全てまたは実質的に全ての内因性のＶＨ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子
セグメント、およびＪＨ遺伝子セグメントを、免疫グロブリン重鎖遺伝子座から欠失させ
るか、または非機能性にする（例えば、免疫グロブリン遺伝子座内にヌクレオチド配列（
例えば、外因性ヌクレオチド配列）の挿入を介して、または内因性のＶＨセグメント、Ｄ
セグメント、ＪＨセグメントの非機能性の再構成または反転を介して）。一実施形態では
、例えば、全ての内因性のＶＨ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、またはＪＨ遺伝
子セグメントのうちの約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９
６％以上、約９７％以上、約９８％以上、または約９９％以上を欠失させるか、または非
機能性にする。一実施形態では、例えば、内因性の機能性Ｖ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子
セグメント、またはＪ遺伝子セグメントのうちの少なくとも９５％、９６％、９７％、９
８％、または９９％を欠失させるか、または非機能性にする。
【０５６７】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、全てまたは実質的
に全ての、内因性のＶＨ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、およびＪＨ遺伝子セグ
メントを欠失させるか、または非機能性にする改変を含み、遺伝子改変された遺伝子座は
、本明細書に記載されている、少なくとも１つの反転させたヒトＤ遺伝子セグメントを含
む、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列を含み、再構成されていない重
鎖可変領域のヌクレオチド配列は、内因性位置に存在する（すなわち、ヌクレオチド配列
が野生型の非ヒト動物にある場合）か、または異所性に存在する（例えば、そのゲノムに
おける内因性免疫グロブリン鎖の遺伝子座と異なる遺伝子座に存在する、またはその内因
性の遺伝子座内に、例えば、免疫グロブリン可変遺伝子座内に存在し、ここで、該内因性
の遺伝子座は、ゲノムにおける異なる位置に配置されるか、またはゲノムにおける異なる
位置へと移動している）。
【０５６８】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、内因性Ａｄａｍ６ａ遺
伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはこれらの両方を含み、遺伝子改変は、内因性のＡｄａ
ｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはこれらの両方の発現および／または機能に影
響を及ぼさない。
【０５６９】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、異所性に存在するＡｄ
ａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはこれらの両方を含む。一実施形態では、Ａ
ｄａｍ６ａ遺伝子は、非ヒトＡｄａｍ６ａ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ａ
遺伝子は、マウスＡｄａｍ６ａ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ａ遺伝子は、
ヒトＡｄａｍ６ａ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子は、非ヒトＡｄａ
ｍ６ｂ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子は、マウスＡｄａｍ６ｂ遺伝
子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子は、ヒトＡｄａｍ６ｂ遺伝子である。
【０５７０】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、ヒト化された、再構成
されていないλ軽鎖可変遺伝子配列および／またはκ軽鎖可変遺伝子配列をさらに含む。
一実施形態では、ヒト化された、再構成されていないλ軽鎖可変遺伝子配列および／また
はκ軽鎖可変遺伝子配列は、λ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列およびκ軽鎖定常領域の
ヌクレオチド配列から選択される、免疫グロブリン軽鎖定常領域のヌクレオチド配列に作
動可能に連結されている。一実施形態では、ヒト化された、再構成されていないλ軽鎖可
変領域のヌクレオチド配列は、λ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結され
ている。一実施形態では、λ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列は、マウス配列、ラット配
列、またはヒト配列である。一実施形態では、ヒト化された、再構成されていないκ軽鎖
可変領域のヌクレオチド配列は、κ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結さ
れている。一実施形態では、κ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列は、マウス配列、ラット
配列、またはヒト配列である。
【０５７１】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、軽鎖可変ドメインをコ
ードする少なくとも１つのリーディングフレームに少なくとも１つのヒスチジンコドンを
導入する少なくとも１つの改変を含有する、再構成されていない軽鎖可変遺伝子配列を含
む。一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、軽鎖ＣＤＲに１つ、
２つ、３つ、または４つのヒスチジンコドンを含む、再構成された（例えば、再構成され
たλまたはκのＶ／Ｊ配列）配列を含む。一実施形態では、ＣＤＲは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ
２、ＣＤＲ３、およびこれらの組合せから選択される。一実施形態では、再構成されてい
ないかまたは再構成された軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、再構成されていないかま
たは再構成されたヒトλ軽鎖可変領域またはヒトκ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列であ
る。一実施形態では、再構成されていないかまたは再構成されたヒトλ軽鎖可変領域また
はヒトκ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、内因性のマウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子
座に存在する。一実施形態では、マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、マウスκ遺伝子
座である。一実施形態では、マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、マウス免疫グロブリ
ン軽鎖遺伝子座は、マウスλ遺伝子座である。
【０５７２】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子
座は、マウスの免疫グロブリン重鎖遺伝子座に存在する。一実施形態では、遺伝子改変さ
れた免疫グロブリン遺伝子座は、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスにおけるヒ
ト化免疫グロブリン重鎖遺伝子座に存在する。
【０５７３】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺
伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、酸性の環境で（
例えば、約５．５〜約６．０のｐＨで）、遺伝子改変なしの、対応する野生型の重鎖可変
ドメインより弱い抗原結合を示す。
【０５７４】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺
伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ１
／２）は、２５℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、２分間未満であ
る。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖
遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ
１／２）は、３７℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、２分間未満で
ある。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重
鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（
ｔ１／２）は、２５℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、１分間未満
である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン
重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期
（ｔ１／２）は、３７℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、１分間未
満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリ
ン遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、酸性ｐＨ（
例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、解離半減期（ｔ１／２）を、中性ｐＨ（例えば
、約７．０〜約７．４のｐＨ）における抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ１／２）と
比較して、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍
、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍
、または少なくとも約３０倍短縮する。
【０５７５】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子
座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、遺伝子改変なしの野
生型の抗原結合タンパク質と比較して、ｐＨ依存性リサイクル性の改善、血清半減期の延
長、またはこれらの両方を特徴とする。
【０５７６】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子
座は、目的の抗原で刺激されると、１つまたは複数のヒスチジン残基を含む重鎖可変ドメ
インを含む抗原結合タンパク質、例えば、抗体を産生することが可能な、富化されたＢ細
胞集団を含む。本明細書に記載されている抗原結合タンパク質は、被験体へと投与される
と、重鎖可変ドメインをコードするが、重鎖可変ドメインにヒスチジン残基を含まない、
類似するか、または十分に類似するアミノ酸配列を保有する、対応する野生型の抗原結合
タンパク質を凌駕する血清半減期の延長を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記
載されている抗原結合タンパク質は、重鎖可変ドメインをコードするが、重鎖可変ドメイ
ンにヒスチジン残基を含まない、類似するか、または十分に類似するアミノ酸配列を保有
する、対応する野生型の抗原結合タンパク質の少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少
なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍の血清半減期の延長を示す
。
【０５７７】
一態様では、血清半減期が延長し、かつ／またはｐＨ依存性リサイクル性が増強された
免疫グロブリン重鎖可変ドメインを産生することが可能な非ヒト動物を作製するための方
法であって、
（ａ）非ヒト動物のゲノムを改変して、内因性免疫グロブリン重鎖のＶ遺伝子セグメン
ト、Ｄ遺伝子セグメント、およびＪ遺伝子セグメントを欠失させるか、または非機能性に
する（例えば、免疫グロブリン遺伝子座内にヌクレオチド配列（例えば、外因性ヌクレオ
チド配列）の挿入を介して、または内因性のＶＨセグメント、Ｄセグメント、ＪＨセグメ
ントの非機能性の再構成もしくは反転を介して）ステップと、
（ｂ）ゲノムに、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列を配置する
ステップであって、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、少なくとも
１つのヒスチジンコドンの付加または少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンのヒス
チジンコドンによる置換を含み、非ヒト動物により産生される免疫グロブリン重鎖可変ド
メインを含む抗原結合タンパク質が、野生型の免疫グロブリン重鎖ドメインと比較して、
血清半減期の延長および／またはｐＨ依存性リサイクル性の増強を示すステップと
を含む方法が提供される。
【０５７８】
一実施形態では、非ヒト動物は、抗原と接触させると、血清半減期が延長し、かつ／ま
たはｐＨ依存性リサイクル性が増強した抗原結合タンパク質を発現する、富化されたＢ細
胞レパートリーの集団であって、本明細書に記載されている任意の遺伝子改変を含む、富
化されたＢ細胞集団を産生しうる。
【０５７９】
一実施形態では、遺伝子改変された非ヒト動物により産生される抗原結合タンパク質は
、中性ｐＨ（例えば、約７．０〜約７．４のｐＨ）における、目的の抗原への十分な親和
性、および中性ｐＨ未満のｐＨにおける（例えば、エンドソームのｐＨ、例えば、約５．
５〜６．０のｐＨにおける）、抗原−抗原結合タンパク質複合体からの抗体の解離の増強
を特徴とする。
【０５８０】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺
伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ１
／２）は、２５℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、２分間未満であ
る。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖
遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ
１／２）は、３７℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、２分間未満で
ある。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重
鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（
ｔ１／２）は、２５℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、１分間未満
である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン
重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期
（ｔ１／２）は、３７℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、１分間未
満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリ
ン遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、酸性ｐＨ（
例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、解離半減期（ｔ１／２）を、中性ｐＨ（例えば
、約７．０〜約７．４のｐＨ）における抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ１／２）と
比較して、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍
、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍
、または少なくとも約３０倍短縮する。
【０５８１】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子
座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、遺伝子改変なしの野
生型の抗原結合タンパク質と比較して、ｐＨ依存性リサイクル性の改善、血清半減期の延
長、またはこれらの両方を特徴とする。
【０５８２】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子
座は、目的の抗原で刺激されると、１つまたは複数のヒスチジン残基を含む重鎖可変ドメ
インを含む抗原結合タンパク質、例えば、抗体を産生することが可能な、富化されたＢ細
胞集団を含む。本明細書に記載されている抗原結合タンパク質は、被験体へと投与される
と、重鎖可変ドメインをコードするが、重鎖可変ドメインにヒスチジン残基を含まない、
類似するか、または十分に類似するアミノ酸配列を保有する、対応する野生型の抗原結合
タンパク質を凌駕する血清半減期の延長を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記
載されている抗原結合タンパク質は、重鎖可変ドメインをコードするが、重鎖可変ドメイ
ンにヒスチジン残基を含まない、類似するか、または十分に類似するアミノ酸配列を保有
する、対応する野生型の抗原結合タンパク質の少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少
なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍の血清半減期の延長を示す
。
【０５８３】
一実施形態では、抗原結合タンパク質は、中性ｐＨ（約７．０〜約７．４のｐＨ）にお
いて、目的の抗原に、１０−６未満、１０−７未満、１０−８未満、１０−９未満、１０
−１０未満、１０−１１未満、および１０−１２未満の親和性（ＫＤ）で、特異的に結合
することが可能な免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含む。
【０５８４】
一態様では、リサイクル性が増強され、かつ／または血清半減期が改善された抗原結合
タンパク質を得るための方法であって、
（ａ）本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座を有する
非ヒト動物を免疫するステップであって、非ヒト動物が、少なくとも１つのヒスチジンコ
ドンの付加または少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる
置換を含む、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列を含むステップと
、
（ｂ）非ヒト動物に免疫応答を開始させるステップと、
（ｃ）リンパ球（例えば、Ｂ細胞）を、免疫した非ヒト動物から採取するステップと、
（ｄ）リンパ球を、骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成するステップ
と、
（ｅ）ハイブリドーマ細胞により産生される抗原結合タンパク質を得るステップであっ
て、抗原結合タンパク質が、リサイクル性の増強および／または血清中の安定性を示すス
テップと
を含む方法が提供される。
【０５８５】
一態様では、本明細書に記載されている方法のうちのいずれかにより得ることができる
、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座が提供される。
【０５８６】
一態様では、本明細書に記載されている方法のうちのいずれかにより得ることができる
、遺伝子改変された非ヒト動物が提供される。
【０５８７】
様々な実施形態では、非ヒト動物は、哺乳動物である。一実施形態では、哺乳動物は、
齧歯動物、例えば、マウス、ラット、またはハムスターである。
【０５８８】
様々な実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺
伝子座は、非ヒト動物、例えば、哺乳動物、例えば、齧歯動物、例えば、マウス、ラット
、またはハムスターの生殖細胞系列ゲノムに存在する。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換または挿入を免疫
グロブリン可変遺伝子座に含む、免疫グロブリン遺伝子座をその生殖細胞系列に含む、遺
伝子改変された非ヒト動物であって、該ヒスチジンコドンは、対応する野生型生殖細胞系
列遺伝子セグメントによってコードされない。非ヒト動物。
（項目２）
第一の可変遺伝子座および第二の可変遺伝子座を含み、少なくとも該第一の可変遺伝子
座または該第二の可変遺伝子座は、少なくとも１つのヒスチジンコドンの挿入または少な
くとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、項目１に記載の
非ヒト動物。
（項目３）
前記第一の可変遺伝子座および前記第二の可変遺伝子座の両方が各々、少なくとも１つ
の非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換または挿入を含む、項目２に記載の
非ヒト動物。
（項目４）
前記第一の可変遺伝子座が、再構成されていない重鎖可変遺伝子座（再構成されていな
いＶセグメント、Ｄセグメント、Ｊセグメント）の少なくとも１つの機能性部分を含む、
項目３に記載の非ヒト動物。
（項目５）
前記再構成されていない重鎖可変遺伝子座が、ヒト遺伝子座（再構成されていないＶセ
グメント、Ｄセグメント、Ｊセグメント）の少なくとも一部分を含む、項目４に記載の非
ヒト動物。
（項目６）
前記再構成されていない重鎖遺伝子座が、再構成されていないＶセグメント、リンカー
を含む合成Ｄセグメント、およびヒトＪセグメントを含むヒト遺伝子座である、項目４に
記載の非ヒト動物。
（項目７）
前記合成Ｄセグメントが、少なくとも１つのヒスチジンコドンを含む、項目６に記載の
非ヒト動物。
（項目８）
前記第二の可変遺伝子座が、再構成されていない軽鎖遺伝子座（再構成されていないＶ
セグメント、Ｊセグメント）の少なくとも１つの機能性部分を含む、項目３に記載の非ヒ
ト動物。
（項目９）
前記第二の可変遺伝子座が、再構成された免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子配列（再構成
されたＶＪ配列）を含む、項目４に記載の非ヒト動物。
（項目１０）
非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる前記置換および／またはヒスチジンコド
ンの前記挿入が、可変ドメインをコードする核酸配列においてであり、ヒスチジンが、免
疫グロブリン鎖のＮ末端領域、免疫グロブリン鎖のループ４領域、重鎖のＣＤＲ１、重鎖
のＣＤＲ２、重鎖のＣＤＲ３、軽鎖のＣＤＲ１、軽鎖のＣＤＲ２、軽鎖のＣＤＲ３、およ
びこれらの組合せから選択される領域にある、項目１に記載の非ヒト動物。
（項目１１）
前記第一の可変遺伝子座または前記第二の可変遺伝子座のうちの少なくとも１つが、内
因性非ヒト免疫グロブリン遺伝子座において、内因性非ヒト定常領域の核酸配列に作動可
能に連結された、項目２に記載の非ヒト動物。
（項目１２）
前記第一の可変遺伝子座（再構成されていないヒトＶセグメント、ヒトＤセグメント、
ヒトＪセグメント）が、内因性非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域の核酸配列に作動可能
に連結された、項目５に記載の非ヒト動物。
（項目１３）
前記第一の可変遺伝子座（再構成されていないヒトＶセグメント、ヒトＤセグメント、
ヒトＪセグメント）が、内因性非ヒト免疫グロブリン遺伝子座において、前記内因性非ヒ
ト免疫グロブリン重鎖定常領域の核酸配列に作動可能に連結された、項目１２に記載の非
ヒト動物。
（項目１４）
前記第二の可変遺伝子座（再構成されていないＶセグメント、Ｊセグメント）が、内因
性非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域配列に作動可能に連結された、項目６に記載の非ヒ
ト動物。
（項目１５）
前記内因性非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域配列が、内因性非ヒト免疫グロブリン遺
伝子座にある、項目１４に記載の非ヒト動物。
（項目１６）
定常領域遺伝子配列に作動可能に連結された再構成されていないヒト免疫グロブリン重
鎖可変領域の核酸配列（再構成されていないＶセグメント、Ｄセグメント、Ｊセグメント
）の少なくとも一部分であって、該Ｖ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、およびＪ
遺伝子セグメントのうちの１つまたは複数が、少なくとも１カ所の非ヒスチジンコドンの
ヒスチジンコドンによる置換、または少なくとも１カ所のヒスチジンコドンの挿入を含み
、該再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域の核酸配列の該ヒスチジンコド
ンは、対応するヒト生殖細胞系列遺伝子セグメントによってコードされない、再構成され
ていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域の核酸配列の少なくとも一部分と；
定常領域遺伝子配列に作動可能に連結された再構成されていないヒト免疫グロブリン軽
鎖可変領域の核酸配列（再構成されていないＶセグメント、Ｊセグメント）の少なくとも
一部分であって、該Ｖ遺伝子セグメントおよびＪ遺伝子セグメントのうちの１つまたは複
数が、少なくとも１カ所の非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換、または少
なくとも１カ所のヒスチジンコドンの挿入を含み、該再構成されていないヒト免疫グロブ
リン軽鎖可変領域の核酸配列の該ヒスチジンコドンは、対応するヒト生殖細胞系列遺伝子
セグメントによってコードされない、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領
域の核酸配列の少なくとも一部分と
を含み、
マウスの生殖細胞系列におけるヒスチジン置換またはヒスチジン挿入に由来するヒスチ
ジンを含む、免疫グロブリン重鎖可変ドメインおよび／または免疫グロブリン軽鎖可変ド
メインを発現する、遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目１７）
哺乳動物である、項目１６に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目１８）
齧歯動物である、項目１７に記載の遺伝子改変された哺乳動物。
（項目１９）
マウス、ラット、およびハムスターからなる群から選択される、項目１８に記載の齧歯
動物。
（項目２０）
前記再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域の核酸配列が、非ヒト定常領
域配列に作動可能に連結された、項目１６に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目２１）
前記再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域の核酸配列に作動可能に連結
された前記非ヒト定常領域核酸配列が、前記非ヒト動物の生殖細胞系列における内因性非
ヒト免疫グロブリン遺伝子座にある、項目２０に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目２３）
前記再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域の核酸配列に作動可能に連結
された前記非ヒト定常領域核酸配列が、前記非ヒト動物の生殖細胞系列における内因性非
ヒト免疫グロブリン遺伝子座にある、項目１６に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目２４）
定常領域遺伝子配列に作動可能に連結された再構成されていないヒト免疫グロブリン重
鎖可変領域の核酸配列（再構成されていないＶセグメント、Ｄセグメント、Ｊセグメント
）の少なくとも一部分であって、該再構成されていないＶ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セ
グメント、およびＪ遺伝子セグメントのうちの１つまたは複数が、少なくとも１カ所の非
ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換、または少なくとも１カ所のヒスチジン
コドンの挿入を含み、該再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域の核酸配列
の該ヒスチジンコドンは、対応するヒト生殖細胞系列遺伝子セグメントによってコードさ
れない、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域の核酸配列の少なくとも一
部分と；
軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結された再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖
可変領域の核酸配列（再構成されたＶＪ配列）であって、該再構成されたＶＪ配列が、少
なくとも１カ所の非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換、または少なくとも
１カ所のヒスチジンコドンの挿入を含み、該再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領
域の核酸配列の該ヒスチジンコドンは、対応するヒト生殖細胞系列遺伝子セグメントによ
ってコードされない、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域の核酸配列と
を含み、
マウスの生殖細胞系列におけるヒスチジン置換またはヒスチジン挿入に由来するヒスチ
ジンを含む、免疫グロブリン重鎖可変ドメインおよび／または免疫グロブリン軽鎖可変ド
メインを発現する、遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目２５）
哺乳動物である、項目２４に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目２６）
齧歯動物である、項目２５に記載の遺伝子改変された哺乳動物。
（項目２７）
マウス、ラット、およびハムスターからなる群から選択される、項目２６に記載の齧歯
動物。
（項目２８）
前記再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域の核酸配列が、非ヒト定常領
域配列に作動可能に連結された、項目２４に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目２９）
前記再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域の核酸配列に作動可能に連結
された前記非ヒト定常領域配列が、前記非ヒト動物の生殖細胞系列における内因性非ヒト
免疫グロブリン遺伝子座にある、項目２８に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目３０）
前記再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域の核酸配列に作動可能に連結された
前記非ヒト定常領域配列が、前記非ヒト動物の生殖細胞系列における内因性非ヒト免疫グ
ロブリン遺伝子座にある、項目２９に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目３１）
遺伝子改変された非ヒト動物であって、
その生殖細胞系列に、
免疫グロブリン重鎖遺伝子での非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる少なくと
も１カ所の挿入または少なくとも１カ所の置換であって、該免疫グロブリン重鎖遺伝子座
の該ヒスチジンコドンが、対応する生殖細胞系列遺伝子セグメントによってコードされな
い、挿入または置換、および
免疫グロブリン軽鎖遺伝子での非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる少なくと
も１カ所の挿入または少なくとも１カ所の置換であって、該免疫グロブリン軽鎖遺伝子座
の該ヒスチジンコドンが、対応する生殖細胞系列遺伝子セグメントによってコードされな
い、挿入または置換、および
野生型の非ヒト動物と比較した、Ｂ細胞集団の免疫グロブリン重鎖におけるおよび免疫
グロブリン軽鎖におけるヒスチジン残基の存在の増強を特徴とするＢ細胞集団
を含む、遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目３２）
前記増強が、約２〜４倍である、項目３１に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目３３）
前記増強が、約２〜１０倍である、項目３１に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目３４）
非ヒト動物の生殖細胞系列の免疫グロブリン配列における置換および／または挿入によ
りコードされるヒスチジンを含む、免疫グロブリン軽鎖および免疫グロブリン重鎖を発現
する、遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目３５）
前記可変領域配列が、ヒスチジンコドンによる非ヒスチジンコドンの置換および／また
はヒスチジンコドンの挿入である、２つ、３つ、４つ、または５つのヒスチジンによるク
ラスターを含む、項目１に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目３６）
前記再構成されていない重鎖遺伝子座が、前記重鎖遺伝子座の配向の方向に対して反転
されたＤ遺伝子セグメントを含む、項目５に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目３７）
生殖細胞系列のヒスチジンコドンによりコードされるヒスチジンを有する抗体可変ドメ
インを作製する非ヒト動物を作製するための方法であって、
該非ヒト動物を、その生殖細胞系列において、少なくとも１カ所のヒスチジンコドンに
よる非ヒスチジンコドンの置換またはヒスチジンコドンの挿入を、再構成されていない免
疫グロブリン重鎖可変（再構成されていないＶセグメント、Ｄセグメント、Ｊセグメント
）遺伝子座に含むように改変するステップであって、該再構成されていない免疫グロブリ
ン重鎖可変遺伝子座の該ヒスチジンコドンが、対応する野生型生殖細胞系列遺伝子セグメ
ントによってコードされない、ステップと、
該非ヒト動物を、その生殖細胞系列において、少なくとも１カ所のヒスチジンコドンに
よる非ヒスチジンコドンの置換またはヒスチジンコドンの挿入を、再構成されていない免
疫グロブリン軽鎖可変（再構成されていないＶセグメント、Ｊセグメント）遺伝子座に含
むように改変するステップであって、該再構成されていない免疫グロブリン軽鎖可変遺伝
子座の該ヒスチジンコドンが、対応する野生型生殖細胞系列遺伝子セグメントによってコ
ードされない、ステップと
を含む方法。
（項目３８）
マウスの生殖細胞系列を、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変（Ｖセグメ
ント、Ｄセグメント、Ｊセグメント）遺伝子座の少なくとも一部分を含むように遺伝子改
変するステップと、ヒスチジン置換またはヒスチジン挿入を、該再構成されていない免疫
グロブリン重鎖可変（再構成されていないＶセグメント、Ｄセグメント、Ｊセグメント）
ヒト遺伝子座に施すステップとを含む、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
マウスの生殖細胞系列を、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖（再構成されて
いないＶセグメント、Ｊセグメント）遺伝子座の少なくとも一部分を含むように遺伝子改
変するステップと、ヒスチジン置換またはヒスチジン挿入を、該再構成されていないヒト
免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に施すステップとを含む、項目３７に記載の方法。
（項目４０）
前記非ヒト動物が、齧歯動物である、項目３７に記載の方法。
（項目４１）
前記齧歯動物が、マウス、ラット、およびハムスターから選択される、項目４０に記載
の方法。
（項目４２）
生殖細胞系列のヒスチジンコドンによりコードされるヒスチジンを有する抗体可変ドメ
インを作製する非ヒト動物を作製するための方法であって、
該非ヒト動物を、少なくとも１カ所のヒスチジンコドンによる非ヒスチジンコドンの置
換またはヒスチジンコドンの挿入を、再構成されていない免疫グロブリン重鎖可変（再構
成されていないＶセグメント、Ｄセグメント、Ｊセグメント）遺伝子座に含むように改変
するステップであって、該再構成されていない免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座の該ヒス
チジンコドンが、対応する野生型生殖細胞系列遺伝子セグメントによってコードされない
、ステップと、
該非ヒト動物を、少なくとも１カ所のヒスチジンコドンによる非ヒスチジンコドンの置
換またはヒスチジンコドンの挿入を、該生殖細胞系列における再構成された免疫グロブリ
ン軽鎖可変配列（再構成されたＶＪ配列）に含むように改変するステップであって、該再
構成された免疫グロブリン軽鎖可変配列に含まれる該ヒスチジンコドンが、対応する野生
型生殖細胞系列遺伝子セグメントによってコードされない、ステップと
を含む方法。
（項目４３）
前記非ヒト動物が、齧歯動物である、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
前記齧歯動物が、マウス、ラット、およびハムスターから選択される、項目４３に記載
の方法。
【図面の簡単な説明】
【０５８９】
【図１Ａ】図１Ａおよび１Ｂは、ヒトＤ遺伝子セグメント（Ｄ）の３つのリーディングフレーム（すなわち、終止リーディングフレーム、親水性リーディングフレーム、および疎水性リーディングフレーム）によりコードされるアミノ酸配列、およびヒスチジンで置換したヒトＤ遺伝子セグメント（ＨＤ）の３つのリーディングフレームによりコードされるアミノ酸配列を例示する。親水性リーディングフレームにおけるヒスチジンコドンの導入（太字で印字される）はまた、終止リーディングフレームにおいても、多くの終止コドンをＳｅｒコドン（太字で印字される）に変えたが、疎水性リーディングフレームには変化がほとんど導入されなかった。「＊」の記号は、終止コドンを表し、２つの配列番号の間のカンマは、２つのアミノ酸配列が、終止コドンにより隔てられていることを示す。
【図１Ｂ】図１Ａおよび１Ｂは、ヒトＤ遺伝子セグメント（Ｄ）の３つのリーディングフレーム（すなわち、終止リーディングフレーム、親水性リーディングフレーム、および疎水性リーディングフレーム）によりコードされるアミノ酸配列、およびヒスチジンで置換したヒトＤ遺伝子セグメント（ＨＤ）の３つのリーディングフレームによりコードされるアミノ酸配列を例示する。親水性リーディングフレームにおけるヒスチジンコドンの導入（太字で印字される）はまた、終止リーディングフレームにおいても、多くの終止コドンをＳｅｒコドン（太字で印字される）に変えたが、疎水性リーディングフレームには変化がほとんど導入されなかった。「＊」の記号は、終止コドンを表し、２つの配列番号の間のカンマは、２つのアミノ酸配列が、終止コドンにより隔てられていることを示す。
【図２】図２は、スペクチノマイシン選択カセットを含有するｐＬＭａ０１７４を、ＭＡＩＤ  １１１６の５’端へとターゲッティングするためのスキームを例示する（ステップ１：ＢＨＲ（Ｓｐｅｃ））。ステップ１では、それらの全てがｈＶＨ６−１の上流に位置する、クロラムフェニコール選択カセット、ネオマイシン選択カセット、ｌｏｘＰ部位、２つのＶＨ遺伝子セグメント（ｈＶＨ１−３およびｈＶＨ１−２）、ヒトＡｄａｍ６遺伝子を、クローンから欠失させ、スペクチノマイシンカセットで置きかえて、ＶＩ４３３クローンを作製した。ステップ２（ＢＨＲ（Ｈｙｇ＋Ｓｐｅｃ））では、ＦＲＴ部位に挟まれるハイグロマイシンカセットを含有するｐＮＴｕ０００２を、ヒト免疫グロブリンＤ遺伝子セグメントを含む領域へとターゲッティングした。ステップ２を介して、全てのヒトＤ遺伝子セグメントを、ＶＩ４３３から欠失させ、ハイグロマイシンカセットで置きかえて、ＭＡＩＤ６０１１  ＶＩ４３４（クローン１）を作製した。
【図３】図３は、逐次的ライゲーションを介して、ヒスチジンで置換したヒトＤ遺伝子セグメントをアセンブルするためのスキームを例示する。
【図４】図４は、あらかじめアセンブルされた、ネオマイシンカセットを含有する、ヒスチジンで置換したヒトＤ遺伝子セグメントの、Ｄ遺伝子セグメントに最も近位のＶＨ遺伝子セグメント（ＶＨ６−１）とＤ遺伝子セグメントに最も近位のＪＨ遺伝子セグメント（ＪＨ１）との間の領域への、酵素介在性消化（ＰＩ−ＳｃｅＩおよびＩ−ＣｅｕＩ）およびライゲーションを介する導入を例示する。このプロセスは、ハイグロマイシンカセットを、ＭＡＩＤ  ６０１１  ＶＩ４３４から除去し、あらかじめアセンブルされた、ヒスチジンで置換したヒトＤ遺伝子セグメントをクローンへと導入する。ターゲッティングが成功したクローンを含む細菌細胞を、ネオマイシン耐性およびスペクチノマイシン耐性の両方に基づき選択する。結果として生じるクローン（ＭＡＩＤ６０１２  ＶＩ４６９）は、５’側から３’側にかけて、（１）スペクチノマイシン選択カセット、（２）ヒトＶＨ遺伝子セグメント（ＶＨ６−１）を含む５０ｋｂのアーム、（３）ｌｏｘＰ部位に挟まれるネオマイシンカセット、（４）ヒスチジン置換を含有するヒトＤ遺伝子セグメント（ＨＤ１．１−６．６（９５８６ｂｐ；配列番号１）、ＨＤ１．７−６．１３（９２６８ｂｐ；配列番号２）、ＨＤ１．１４−６．１９（９４４１ｂｐ；配列番号３）、およびＨＤ１．２０−６．２５、１．２６（１１５９２ｂｐ；配列番号４））、（５）約２５ｋｂのヒトＪＨ遺伝子セグメントを含有するゲノム領域、（６）マウスＥｉ配列（配列番号５；発達しつつあるＢ細胞内でＶＨからＤＪＨへの再構成を促進するイントロンエンハンサー）、および（７）マウスＩｇＭ定常領域のヌクレオチド配列（ｍＩｇＭエクソン１；配列番号７）を含む。
【図５】図５は、ＭＡＩＤ  １４６０  ｈｅｔの１２９系統に由来する染色体を、ＭＡＩＤ  ６０１１  ＶＩ４３４内のハイグロマイシン選択カセットでターゲッティングすることにより、ヒト免疫グロブリン重鎖のＤ遺伝子領域を、ＭＡＩＤ  １４６０ヘテロ接合性ＥＳ細胞から欠失させるためのスキームを例示する。
【図６】図６は、ＭＡＩＤ  ６０１１を同定するためのスクリーニングアッセイにおいて、対立遺伝子の喪失（ＬＯＡ）、対立遺伝子の獲得（ＧＯＡ）、または親対立遺伝子（親）を確認するために用いられるプライマーおよびプローブのリストを示す。
【図７】図７は、ＭＡＩＤ  ６０１１ヘテロ接合性ＥＳ細胞を、ＭＡＩＤ  ６０１２  ＶＩ４６９でターゲッティングすることにより、ＭＡＩＤ  ６０１２  ｈｅｔを構築するためのスキームを例示する。ＭＡＩＤ  ６０１２  ＶＩ４６９構築物の、ＭＡＩＤ  ６０１１ヘテロ接合性ＥＳ細胞へのエレクトロポレーションにより、１２９系統に由来する染色体を、５’側から３’  側の方向において、ＦＲＴ部位、ヒトＶＨ遺伝子セグメント、ａｄａｍ６遺伝子を含むマウスゲノム領域、ｌｏｘＰに挟まれた（ｆｌｏｘｅｄ）ネオマイシン選択カセット、ヒスチジン置換を含むヒトＤ遺伝子セグメント（ＨＤ１．１−６．６（９５８６ｂｐ；配列番号１）、ＨＤ１．７−６．１３（９２６８ｂｐ；配列番号２）、ＨＤ１．１４−６．１９（９４４１ｂｐ；配列番号３）、およびＨＤ１．２０−６．２５、１．２６（１１５９２ｂｐ；配列番号４））、ヒトＪＨ遺伝子セグメント、マウスＥｉ配列（配列番号５；発達しつつあるＢ細胞内でＶＨからＤＪＨへの再構成を促進するイントロンエンハンサー）、およびマウスＩｇＭ定常領域のヌクレオチド配列（ｍＩｇＭエクソン１；配列番号７）を含有するように改変した、ＭＡＩＤ  ６０１２ヘテロ接合性ＥＳ細胞が作製された。
【図８】図８は、ＭＡＩＤ  ６０１２を同定するためのスクリーニングアッセイにおいて、対立遺伝子の喪失（ＬＯＡ）、対立遺伝子の獲得（ＧＯＡ）、または親対立遺伝子（親）を確認するために用いられるプライマーおよびプローブのリストを示す。
【図９】図９は、ネオマイシンカセットを、ＭＡＩＤ  ６０１２ヘテロ接合性ＥＳ細胞から除去するためのスキームを例示する。Ｃｒｅ発現プラスミドの、ＭＡＩＤ  ６０１２  ＥＳ細胞へのエレクトロポレーションにより、ｌｏｘＰに挟まれたネオマイシンカセットの組換えおよび欠失がもたらされ、ＭＡＩＤ  ６０１３ヘテロ接合性ＥＳ細胞が作製される。
【図１０Ａ】図１０Ａ〜１０Ｅは、６つのリーディングフレーム、すなわち、５’から３’方向の配向の３つのリーディングフレームおよび逆配向（３’〜５’配向）の３つのリーディングフレームの各々について、翻訳を有するヒトＤ遺伝子セグメントのヌクレオチド配列を例示する。「＊」の記号は、終止コドンを表し、２つの配列番号の間のカンマは、２つのアミノ酸配列が、終止コドンにより隔てられていることを示す。
【図１０Ｂ】図１０Ａ〜１０Ｅは、６つのリーディングフレーム、すなわち、５’から３’方向の配向の３つのリーディングフレームおよび逆配向（３’〜５’配向）の３つのリーディングフレームの各々について、翻訳を有するヒトＤ遺伝子セグメントのヌクレオチド配列を例示する。「＊」の記号は、終止コドンを表し、２つの配列番号の間のカンマは、２つのアミノ酸配列が、終止コドンにより隔てられていることを示す。
【図１０Ｃ】図１０Ａ〜１０Ｅは、６つのリーディングフレーム、すなわち、５’から３’方向の配向の３つのリーディングフレームおよび逆配向（３’〜５’配向）の３つのリーディングフレームの各々について、翻訳を有するヒトＤ遺伝子セグメントのヌクレオチド配列を例示する。「＊」の記号は、終止コドンを表し、２つの配列番号の間のカンマは、２つのアミノ酸配列が、終止コドンにより隔てられていることを示す。
【図１０Ｄ】図１０Ａ〜１０Ｅは、６つのリーディングフレーム、すなわち、５’から３’方向の配向の３つのリーディングフレームおよび逆配向（３’〜５’配向）の３つのリーディングフレームの各々について、翻訳を有するヒトＤ遺伝子セグメントのヌクレオチド配列を例示する。「＊」の記号は、終止コドンを表し、２つの配列番号の間のカンマは、２つのアミノ酸配列が、終止コドンにより隔てられていることを示す。
【図１０Ｅ】図１０Ａ〜１０Ｅは、６つのリーディングフレーム、すなわち、５’から３’方向の配向の３つのリーディングフレームおよび逆配向（３’〜５’配向）の３つのリーディングフレームの各々について、翻訳を有するヒトＤ遺伝子セグメントのヌクレオチド配列を例示する。「＊」の記号は、終止コドンを表し、２つの配列番号の間のカンマは、２つのアミノ酸配列が、終止コドンにより隔てられていることを示す。
【図１１】図１１〜１３は、６０１３  Ｆ０ヘテロ接合性マウスが発現したｍＲＮＡ配列およびそれらにコードされるタンパク質配列を例示し、これらは、それらの１２９系統に由来する染色体における免疫グロブリン重鎖遺伝子座に、ヒスチジンで置換したヒトＤ遺伝子セグメント（ＨＤ１．１−６．６（９５８６ｂｐ；配列番号１）、ＨＤ１．７−６．１３（９２６８ｂｐ；配列番号２）、ＨＤ１．１４−６．１９（９４４１ｂｐ；配列番号３）、およびＨＤ１．２０−６．２５、１．２６（１１５９２ｂｐ；配列番号４））を含む。各図内の枠囲いされた配列は、ヒスチジンで置換したヒトＤ遺伝子セグメントを含む、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座に由来する、ＣＤＲ３配列におけるヒスチジンコドンの存在を示す。ＦＷＲは、フレーム領域を表し、ＣＤＲは、相補性決定領域を表す。アラインメントでは、ドット「.」は、クエリー配列と同一な配列を示し、ダッシュ「−」は、配列におけるギャップを示す。
【図１２】図１１〜１３は、６０１３  Ｆ０ヘテロ接合性マウスが発現したｍＲＮＡ配列およびそれらにコードされるタンパク質配列を例示し、これらは、それらの１２９系統に由来する染色体における免疫グロブリン重鎖遺伝子座に、ヒスチジンで置換したヒトＤ遺伝子セグメント（ＨＤ１．１−６．６（９５８６ｂｐ；配列番号１）、ＨＤ１．７−６．１３（９２６８ｂｐ；配列番号２）、ＨＤ１．１４−６．１９（９４４１ｂｐ；配列番号３）、およびＨＤ１．２０−６．２５、１．２６（１１５９２ｂｐ；配列番号４））を含む。各図内の枠囲いされた配列は、ヒスチジンで置換したヒトＤ遺伝子セグメントを含む、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座に由来する、ＣＤＲ３配列におけるヒスチジンコドンの存在を示す。ＦＷＲは、フレーム領域を表し、ＣＤＲは、相補性決定領域を表す。アラインメントでは、ドット「.」は、クエリー配列と同一な配列を示し、ダッシュ「−」は、配列におけるギャップを示す。
【図１３】図１１〜１３は、６０１３  Ｆ０ヘテロ接合性マウスが発現したｍＲＮＡ配列およびそれらにコードされるタンパク質配列を例示し、これらは、それらの１２９系統に由来する染色体における免疫グロブリン重鎖遺伝子座に、ヒスチジンで置換したヒトＤ遺伝子セグメント（ＨＤ１．１−６．６（９５８６ｂｐ；配列番号１）、ＨＤ１．７−６．１３（９２６８ｂｐ；配列番号２）、ＨＤ１．１４−６．１９（９４４１ｂｐ；配列番号３）、およびＨＤ１．２０−６．２５、１．２６（１１５９２ｂｐ；配列番号４））を含む。各図内の枠囲いされた配列は、ヒスチジンで置換したヒトＤ遺伝子セグメントを含む、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座に由来する、ＣＤＲ３配列におけるヒスチジンコドンの存在を示す。ＦＷＲは、フレーム領域を表し、ＣＤＲは、相補性決定領域を表す。アラインメントでは、ドット「.」は、クエリー配列と同一な配列を示し、ダッシュ「−」は、配列におけるギャップを示す。
【図１４】図１４は、免疫グロブリン重鎖ＣＤＲ３配列におけるヒスチジン組込み頻度を例示する。Ｘ軸は、各ＣＤＲ３配列に現れるヒスチジンコドンの数を表し、Ｙ軸は、対応する読取りの比率を表す。「６０１３  Ｆ０  ｈｅｔ」は、ヒスチジンで置換したＤ遺伝子セグメントを含む６０１３ヘテロ接合性マウスが発現したＣＤＲ３配列を示す。「ＶＩ３−Ａｄａｍ６」は、本明細書に記載されているヒスチジン改変なしのヒトＶＨ遺伝子セグメント、ヒトＤ遺伝子セグメント、およびヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む対照マウスから得られたＣＤＲ３配列を示す。「ＡＳＡＰ」は、別の対照として用いられたＲｅｇｅｎｅｒｏｎ抗体データベースから得られるＣＤＲ３配列を示す。
【図１５】図１５は、様々な抗原特異的抗体（Ａ〜Ｋ抗体）からのヒトＶκ１−３９に由来する軽鎖のアミノ酸アラインメントを例示する。各軽鎖配列内に位置するヒスチジン（Ｈ）残基は、太字とする。様々な軽鎖領域（フレームワークおよびＣＤＲ）を、アラインメントの上方に表示する。
【図１６】図１６は、ヒトＶκ１−３９に由来する軽鎖のＣＤＲ３領域内で、変異生成により操作された（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）ヒスチジン残基の組合せおよび位置を例示する。対応する核酸配列を含める。変異生成を介して導入されたヒスチジン残基および対応する核酸残基を太字で示す。アミノ酸位置（１０５、１０６位など）は、Lefrancら（２００３年）、Dev.  Comp.  Immunol.、２７巻：５５〜７７頁において記載されており、また、www.imgt.org上でも調べることができる、固有の番号付けに基づく。
【図１７】図１７は、５つの（１〜５の）異なる重鎖およびＣＤＲ３内の表示される位置（Ｙ軸を参照されたい）に操作したヒスチジン残基を有するＶκ１−３９に由来する軽鎖をコードする核酸をトランスフェクトされたＣＨＯ細胞の上清中で検出される、ｎｇ／ｍＬ単位の抗体発現レベルを例示する。
【図１８】図１８は、ＣＨＯ細胞上清中の、ヒスチジン操作した軽鎖を含有する選択された抗原特異的ヒト抗体の発現を示すウェスタンブロットである。
【図１９Ａ】図１９Ａ〜１９Ｊは、様々なヒスチジン操作した軽鎖と対合させた、抗原特異的抗体から選択された重鎖についての、中性（７．４）および酸性（５．５）ｐＨにおける結合キネティクスを示す。
【図１９Ｂ】図１９Ａ〜１９Ｊは、様々なヒスチジン操作した軽鎖と対合させた、抗原特異的抗体から選択された重鎖についての、中性（７．４）および酸性（５．５）ｐＨにおける結合キネティクスを示す。
【図１９Ｃ】図１９Ａ〜１９Ｊは、様々なヒスチジン操作した軽鎖と対合させた、抗原特異的抗体から選択された重鎖についての、中性（７．４）および酸性（５．５）ｐＨにおける結合キネティクスを示す。
【図１９Ｄ】図１９Ａ〜１９Ｊは、様々なヒスチジン操作した軽鎖と対合させた、抗原特異的抗体から選択された重鎖についての、中性（７．４）および酸性（５．５）ｐＨにおける結合キネティクスを示す。
【図１９Ｅ】図１９Ａ〜１９Ｊは、様々なヒスチジン操作した軽鎖と対合させた、抗原特異的抗体から選択された重鎖についての、中性（７．４）および酸性（５．５）ｐＨにおける結合キネティクスを示す。
【図１９Ｆ】図１９Ａ〜１９Ｊは、様々なヒスチジン操作した軽鎖と対合させた、抗原特異的抗体から選択された重鎖についての、中性（７．４）および酸性（５．５）ｐＨにおける結合キネティクスを示す。
【図１９Ｇ】図１９Ａ〜１９Ｊは、様々なヒスチジン操作した軽鎖と対合させた、抗原特異的抗体から選択された重鎖についての、中性（７．４）および酸性（５．５）ｐＨにおける結合キネティクスを示す。
【図１９Ｈ】図１９Ａ〜１９Ｊは、様々なヒスチジン操作した軽鎖と対合させた、抗原特異的抗体から選択された重鎖についての、中性（７．４）および酸性（５．５）ｐＨにおける結合キネティクスを示す。
【図１９Ｉ】図１９Ａ〜１９Ｊは、様々なヒスチジン操作した軽鎖と対合させた、抗原特異的抗体から選択された重鎖についての、中性（７．４）および酸性（５．５）ｐＨにおける結合キネティクスを示す。
【図１９Ｊ】図１９Ａ〜１９Ｊは、様々なヒスチジン操作した軽鎖と対合させた、抗原特異的抗体から選択された重鎖についての、中性（７．４）および酸性（５．５）ｐＨにおける結合キネティクスを示す。
【図２０Ａ】図２０Ａ〜２０Ｅは、様々なヒスチジン操作した軽鎖と対合させた、抗原特異的抗体から選択された重鎖（１〜５）についての、中性（７．４）および酸性（５．７５）ｐＨにおける結合キネティクスを示す。ｋａ、ｋｄ、ＫＤ、およびｔ１／２を含む様々な動力学的パラメータが示される。ＮＢ＝結合がみられない。
【図２０Ｂ】図２０Ａ〜２０Ｅは、様々なヒスチジン操作した軽鎖と対合させた、抗原特異的抗体から選択された重鎖（１〜５）についての、中性（７．４）および酸性（５．７５）ｐＨにおける結合キネティクスを示す。ｋａ、ｋｄ、ＫＤ、およびｔ１／２を含む様々な動力学的パラメータが示される。ＮＢ＝結合がみられない。
【図２０Ｃ】図２０Ａ〜２０Ｅは、様々なヒスチジン操作した軽鎖と対合させた、抗原特異的抗体から選択された重鎖（１〜５）についての、中性（７．４）および酸性（５．７５）ｐＨにおける結合キネティクスを示す。ｋａ、ｋｄ、ＫＤ、およびｔ１／２を含む様々な動力学的パラメータが示される。ＮＢ＝結合がみられない。
【図２０Ｄ】図２０Ａ〜２０Ｅは、様々なヒスチジン操作した軽鎖と対合させた、抗原特異的抗体から選択された重鎖（１〜５）についての、中性（７．４）および酸性（５．７５）ｐＨにおける結合キネティクスを示す。ｋａ、ｋｄ、ＫＤ、およびｔ１／２を含む様々な動力学的パラメータが示される。ＮＢ＝結合がみられない。
【図２０Ｅ】図２０Ａ〜２０Ｅは、様々なヒスチジン操作した軽鎖と対合させた、抗原特異的抗体から選択された重鎖（１〜５）についての、中性（７．４）および酸性（５．７５）ｐＨにおける結合キネティクスを示す。ｋａ、ｋｄ、ＫＤ、およびｔ１／２を含む様々な動力学的パラメータが示される。ＮＢ＝結合がみられない。
【図２１】図２１は、表示される重鎖（２、３、および６）と対合させた、親のユニバーサル軽鎖またはヒスチジン改変ユニバーサル軽鎖を含む抗体についての動力学的パラメータ（ＫＤおよびｔ１／２）を示す。ヒスチジン置換は、複数の抗体において強力なｐＨ依存性をもたらす。ＣＤＲ３内でヒスチジン置換を施して、配列１０５ＱＱＳＹＳＴＰ１１１（配列番号３）を１０５ＨＨＳＹＳＴＨ１１１（配列番号３２９）へと転換した。ＮＢ＝結合が検出されない（ＫＤ＞１０マイクロモル濃度）ことに注意されたい。
【図２２】図２２は、ヒスチジン残基を、再構成されたヒトＶκ１−３９／Ｊκ５軽鎖配列のＣＤＲ３へと操作するのに用いられる、選択された変異生成プライマーの配列および特性（ＧＣ含量％、Ｎ、ミスマッチ％、Ｔｍ）を示す。下記の表には、配列表において用いられるこれらのプライマーの配列番号が含まれる。Ｆ＝フォワードプライマー、Ｒ＝リバースプライマー。
【図２３Ａ】図２３Ａ〜２３Ｂは、改変されたヒト軽鎖を含有する抗体を発現する遺伝子改変マウスを作製するために、ヒスチジン残基を、Ｖκ１−３９／Ｊκ５可変領域に由来する、再構成されたヒト軽鎖可変領域配列へと操作するためのターゲッティングベクターを構築するための一般的戦略を示す。図２３Ｃ〜２３Ｄが、ＵＬＣ−Ｈ１０５／１０６／１０８／１１１置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示すのに対し、図２３Ｅ〜２３Ｆは、ＵＬＣ−Ｈ１０６／１０８／１１１置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示す。略図は、縮尺通りに提示するわけではない。特に示されない限り、塗りつぶされた描形および実線は、マウス配列を表し、白抜きの描形および二重線は、ヒト配列を表す。
【図２３Ｂ】図２３Ａ〜２３Ｂは、改変されたヒト軽鎖を含有する抗体を発現する遺伝子改変マウスを作製するために、ヒスチジン残基を、Ｖκ１−３９／Ｊκ５可変領域に由来する、再構成されたヒト軽鎖可変領域配列へと操作するためのターゲッティングベクターを構築するための一般的戦略を示す。図２３Ｃ〜２３Ｄが、ＵＬＣ−Ｈ１０５／１０６／１０８／１１１置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示すのに対し、図２３Ｅ〜２３Ｆは、ＵＬＣ−Ｈ１０６／１０８／１１１置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示す。略図は、縮尺通りに提示するわけではない。特に示されない限り、塗りつぶされた描形および実線は、マウス配列を表し、白抜きの描形および二重線は、ヒト配列を表す。
【図２３Ｃ】図２３Ａ〜２３Ｂは、改変されたヒト軽鎖を含有する抗体を発現する遺伝子改変マウスを作製するために、ヒスチジン残基を、Ｖκ１−３９／Ｊκ５可変領域に由来する、再構成されたヒト軽鎖可変領域配列へと操作するためのターゲッティングベクターを構築するための一般的戦略を示す。図２３Ｃ〜２３Ｄが、ＵＬＣ−Ｈ１０５／１０６／１０８／１１１置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示すのに対し、図２３Ｅ〜２３Ｆは、ＵＬＣ−Ｈ１０６／１０８／１１１置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示す。略図は、縮尺通りに提示するわけではない。特に示されない限り、塗りつぶされた描形および実線は、マウス配列を表し、白抜きの描形および二重線は、ヒト配列を表す。
【図２３Ｄ】図２３Ａ〜２３Ｂは、改変されたヒト軽鎖を含有する抗体を発現する遺伝子改変マウスを作製するために、ヒスチジン残基を、Ｖκ１−３９／Ｊκ５可変領域に由来する、再構成されたヒト軽鎖可変領域配列へと操作するためのターゲッティングベクターを構築するための一般的戦略を示す。図２３Ｃ〜２３Ｄが、ＵＬＣ−Ｈ１０５／１０６／１０８／１１１置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示すのに対し、図２３Ｅ〜２３Ｆは、ＵＬＣ−Ｈ１０６／１０８／１１１置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示す。略図は、縮尺通りに提示するわけではない。特に示されない限り、塗りつぶされた描形および実線は、マウス配列を表し、白抜きの描形および二重線は、ヒト配列を表す。
【図２３Ｅ】図２３Ａ〜２３Ｂは、改変されたヒト軽鎖を含有する抗体を発現する遺伝子改変マウスを作製するために、ヒスチジン残基を、Ｖκ１−３９／Ｊκ５可変領域に由来する、再構成されたヒト軽鎖可変領域配列へと操作するためのターゲッティングベクターを構築するための一般的戦略を示す。図２３Ｃ〜２３Ｄが、ＵＬＣ−Ｈ１０５／１０６／１０８／１１１置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示すのに対し、図２３Ｅ〜２３Ｆは、ＵＬＣ−Ｈ１０６／１０８／１１１置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示す。略図は、縮尺通りに提示するわけではない。特に示されない限り、塗りつぶされた描形および実線は、マウス配列を表し、白抜きの描形および二重線は、ヒト配列を表す。
【図２３Ｆ】図２３Ａ〜２３Ｂは、改変されたヒト軽鎖を含有する抗体を発現する遺伝子改変マウスを作製するために、ヒスチジン残基を、Ｖκ１−３９／Ｊκ５可変領域に由来する、再構成されたヒト軽鎖可変領域配列へと操作するためのターゲッティングベクターを構築するための一般的戦略を示す。図２３Ｃ〜２３Ｄが、ＵＬＣ−Ｈ１０５／１０６／１０８／１１１置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示すのに対し、図２３Ｅ〜２３Ｆは、ＵＬＣ−Ｈ１０６／１０８／１１１置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示す。略図は、縮尺通りに提示するわけではない。特に示されない限り、塗りつぶされた描形および実線は、マウス配列を表し、白抜きの描形および二重線は、ヒト配列を表す。
【図２４】図２４は、二回目の採血における、ヒスチジンユニバーサル軽鎖（ＨＵＬＣ）についてヘテロ接合性のマウス（４カ所のＨｉｓ置換を有するマウス（ＨＵＬＣ  １９２７マウス）；３カ所のＨｉｓ置換を有するマウス（ＨＵＬＣ  １９３０マウス））および野生型動物からの、免疫原に対する抗血清力価を示す。
【図２５】図２５は、ＨＵＬＣ（１９２７対１９３０）マウスおよびＷＴマウスからのハイブリドーマ融合体から得られる、全抗原陽性クローンの数と、ｐＨ感受性抗原結合を提示する抗原陽性クローンの数との比較である。図は、各マウス種類（「マウス１」および「マウス２」）につき２匹ずつのマウスについてのデータを含む。
【図２６Ａ】図２６Ａ〜２６Ｃは、中性ｐＨ（ｐＨ７．４）において、ヘテロ接合性ＨＵＬＣマウスまたはＷＴマウスからのモノクローナル抗体（ＡＡ、ＢＢ、ＣＣ、ＤＤ、ＨＨ、ＧＧ、ＮＮ、およびＯＯ）を、免疫原と会合させるのに続いて、解離相のためのｐＨを７．４または６．０とする緩衝液へとシフトさせる、表面プラズモン共鳴結合実験からのセンサーグラムを示す。各グラフ内の個々の直線は、それぞれの抗体の異なる濃度における結合応答を表す。全ての実験は、２５℃で実行した。解離半減期の値（ｔ１／２）を、それぞれのセンサーグラムの上方に注記し、ｔ１／２の倍数変化を、各センサーグラムの右側に含める。抗体ＡＡ、ＢＢ、ＣＣ、ＤＤ、ＨＨ、およびＧＧは、Ｈｉｓ置換された軽鎖を用いるＨＵＬＣ  １９２７マウスからの抗体であり、ＮＮは、ＷＴ軽鎖を用いるＨＵＬＣ  １９２７マウスからの抗体であり、ＯＯは、ＷＴマウスからの抗体である（明確化のために表５を参照されたい）。
【図２６Ｂ】図２６Ａ〜２６Ｃは、中性ｐＨ（ｐＨ７．４）において、ヘテロ接合性ＨＵＬＣマウスまたはＷＴマウスからのモノクローナル抗体（ＡＡ、ＢＢ、ＣＣ、ＤＤ、ＨＨ、ＧＧ、ＮＮ、およびＯＯ）を、免疫原と会合させるのに続いて、解離相のためのｐＨを７．４または６．０とする緩衝液へとシフトさせる、表面プラズモン共鳴結合実験からのセンサーグラムを示す。各グラフ内の個々の直線は、それぞれの抗体の異なる濃度における結合応答を表す。全ての実験は、２５℃で実行した。解離半減期の値（ｔ１／２）を、それぞれのセンサーグラムの上方に注記し、ｔ１／２の倍数変化を、各センサーグラムの右側に含める。抗体ＡＡ、ＢＢ、ＣＣ、ＤＤ、ＨＨ、およびＧＧは、Ｈｉｓ置換された軽鎖を用いるＨＵＬＣ  １９２７マウスからの抗体であり、ＮＮは、ＷＴ軽鎖を用いるＨＵＬＣ  １９２７マウスからの抗体であり、ＯＯは、ＷＴマウスからの抗体である（明確化のために表５を参照されたい）。
【図２６Ｃ】図２６Ａ〜２６Ｃは、中性ｐＨ（ｐＨ７．４）において、ヘテロ接合性ＨＵＬＣマウスまたはＷＴマウスからのモノクローナル抗体（ＡＡ、ＢＢ、ＣＣ、ＤＤ、ＨＨ、ＧＧ、ＮＮ、およびＯＯ）を、免疫原と会合させるのに続いて、解離相のためのｐＨを７．４または６．０とする緩衝液へとシフトさせる、表面プラズモン共鳴結合実験からのセンサーグラムを示す。各グラフ内の個々の直線は、それぞれの抗体の異なる濃度における結合応答を表す。全ての実験は、２５℃で実行した。解離半減期の値（ｔ１／２）を、それぞれのセンサーグラムの上方に注記し、ｔ１／２の倍数変化を、各センサーグラムの右側に含める。抗体ＡＡ、ＢＢ、ＣＣ、ＤＤ、ＨＨ、およびＧＧは、Ｈｉｓ置換された軽鎖を用いるＨＵＬＣ  １９２７マウスからの抗体であり、ＮＮは、ＷＴ軽鎖を用いるＨＵＬＣ  １９２７マウスからの抗体であり、ＯＯは、ＷＴマウスからの抗体である（明確化のために表５を参照されたい）。
【図２７】図２７は、ヒトＶκ３−２０に由来する軽鎖のＣＤＲ３領域内で、変異生成により操作したヒスチジン残基の位置を示す。変異生成を介して導入されたヒスチジン残基および対応する核酸残基を太字で示す。アミノ酸位置（１０５、１０６位など）は、Lefrancら（２００３年）、Dev.  Comp.  Immunol.、２７巻：５５〜７７頁において記載されている固有の番号付けに基づいており、また、www.imgt.org上でも調べることができる。
【図２８】図２８は、ヒスチジン残基を、再構成されたヒトＶκ３−２０／Ｊκ１軽鎖配列のＣＤＲ３へと操作するのに用いられる、選択された変異生成プライマーの配列および特性（ＧＣ含量％、Ｎ、ミスマッチ％、Ｔｍ）を示す。下記の表には、配列表において用いられるこれらのプライマーの配列番号が含まれる。Ｆ＝フォワードプライマー、Ｒ＝リバースプライマー。
【図２９Ａ】図２９Ａ〜２９Ｂは、改変されたヒト軽鎖を含有する抗体を発現する遺伝子改変マウスを作製するために、ヒスチジン残基を、Ｖκ３−２０／Ｊκ１軽鎖可変領域に由来する、再構成されたヒト軽鎖可変領域配列へと操作するためのターゲッティングベクターを構築するための一般的戦略を示す。図２９Ｃが、ＵＬＣ−Ｑ１０５Ｈ／Ｑ１０６Ｈ／Ｙ１０７Ｈ／Ｓ１０９Ｈ置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示すのに対し、図２９Ｄは、ＵＬＣ−Ｑ１０５Ｈ／Ｑ１０６Ｈ／Ｓ１０９Ｈ置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示す。略図は、縮尺通りに提示するわけではない。特に示されない限り、塗りつぶされた描形および実線は、マウス配列を表し、白抜きの描形および二重線は、ヒト配列を表す。
【図２９Ｂ】図２９Ａ〜２９Ｂは、改変されたヒト軽鎖を含有する抗体を発現する遺伝子改変マウスを作製するために、ヒスチジン残基を、Ｖκ３−２０／Ｊκ１軽鎖可変領域に由来する、再構成されたヒト軽鎖可変領域配列へと操作するためのターゲッティングベクターを構築するための一般的戦略を示す。図２９Ｃが、ＵＬＣ−Ｑ１０５Ｈ／Ｑ１０６Ｈ／Ｙ１０７Ｈ／Ｓ１０９Ｈ置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示すのに対し、図２９Ｄは、ＵＬＣ−Ｑ１０５Ｈ／Ｑ１０６Ｈ／Ｓ１０９Ｈ置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示す。略図は、縮尺通りに提示するわけではない。特に示されない限り、塗りつぶされた描形および実線は、マウス配列を表し、白抜きの描形および二重線は、ヒト配列を表す。
【図２９Ｃ】図２９Ａ〜２９Ｂは、改変されたヒト軽鎖を含有する抗体を発現する遺伝子改変マウスを作製するために、ヒスチジン残基を、Ｖκ３−２０／Ｊκ１軽鎖可変領域に由来する、再構成されたヒト軽鎖可変領域配列へと操作するためのターゲッティングベクターを構築するための一般的戦略を示す。図２９Ｃが、ＵＬＣ−Ｑ１０５Ｈ／Ｑ１０６Ｈ／Ｙ１０７Ｈ／Ｓ１０９Ｈ置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示すのに対し、図２９Ｄは、ＵＬＣ−Ｑ１０５Ｈ／Ｑ１０６Ｈ／Ｓ１０９Ｈ置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示す。略図は、縮尺通りに提示するわけではない。特に示されない限り、塗りつぶされた描形および実線は、マウス配列を表し、白抜きの描形および二重線は、ヒト配列を表す。
【図２９Ｄ】図２９Ａ〜２９Ｂは、改変されたヒト軽鎖を含有する抗体を発現する遺伝子改変マウスを作製するために、ヒスチジン残基を、Ｖκ３−２０／Ｊκ１軽鎖可変領域に由来する、再構成されたヒト軽鎖可変領域配列へと操作するためのターゲッティングベクターを構築するための一般的戦略を示す。図２９Ｃが、ＵＬＣ−Ｑ１０５Ｈ／Ｑ１０６Ｈ／Ｙ１０７Ｈ／Ｓ１０９Ｈ置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示すのに対し、図２９Ｄは、ＵＬＣ−Ｑ１０５Ｈ／Ｑ１０６Ｈ／Ｓ１０９Ｈ置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示す。略図は、縮尺通りに提示するわけではない。特に示されない限り、塗りつぶされた描形および実線は、マウス配列を表し、白抜きの描形および二重線は、ヒト配列を表す。
【発明を実施するための形態】
【０５９０】
詳細な説明
このような方法および条件は変化しうるので、本発明は、記載される特定の方法および
実験条件に限定されるものではない。本発明の範囲は、特許請求の範囲により規定される
ので、本明細書で用いられる用語法は、特定の実施形態だけを説明することを目的とする
ものであり、限定的であることを意図するものではないこともまた理解されたい。
【０５９１】
別に定義されない限り、本明細書で用いられる全ての用語および語句は、反対のことが
明らかに示されない限り、またはその用語または語句が用いられる文脈から明らかに明白
でない限り、その用語および語句が当技術分野で獲得した意味を含む。本発明の実施また
は試験では、本明細書に記載されている方法および材料と類似するかまたは同等な任意の
方法および材料を用いることができるが、ここでは、特定の方法および材料を記載する。
【０５９２】
定義
本明細書で用いる用語「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互接続する４つのポリ
ペプチド鎖、２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む免疫グロブリン分子を含む
。各重鎖は、重鎖可変ドメインおよび重鎖定常領域（ＣＨ）を含む。重鎖定常領域は、３
つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変ドメインおよび
軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む。重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインは、フレームワ
ーク領域（ＦＲ）と呼ばれる保存されている領域の間に散在する、相補性決定領域（ＣＤ
Ｒ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分化することができる。各重鎖可変ドメインお
よび軽鎖可変ドメインは、アミノ末端からカルボキシ末端まで以下の順序で配置される３
つのＣＤＲおよび４つのＦＲを含む：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、Ｃ
ＤＲ３、ＦＲ４（重鎖ＣＤＲは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３と略すことが
でき；軽鎖ＣＤＲは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と略すことができる）。
用語「高親和性」抗体は、その標的エピトープに関して約１０−９Ｍ以下のＫＤ（例えば
、約１×１０−９Ｍ、１×１０−１０Ｍ、１×１０−１１Ｍまたは約１×１０−１２Ｍ）
を有する抗体を指す。一実施形態では、ＫＤは表面プラズモン共鳴、例えばＢＩＡＣＯＲ
ＥＴＭによって測定され、別の実施形態では、ＫＤはＥＬＩＳＡによって測定される。
【０５９３】
語句「二重特異性抗体」は、２つ以上のエピトープに選択的に結合することが可能な抗
体を含む。二重特異性抗体は、２つの同一ではない重鎖を一般に含み、各重鎖は、２つの
異なる分子上（例えば、２つの異なる免疫原上の異なるエピトープ）または同じ分子上（
例えば、同じ免疫原上の異なるエピトープ）の異なるエピトープに特異的に結合する。二
重特異性抗体が２つの異なるエピトープ（第一のエピトープおよび第二のエピトープ）に
選択的に結合することが可能な場合、第一のエピトープに対する第一の重鎖の親和性は、
第二のエピトープに対する第一の重鎖の親和性より少なくとも１桁から２桁、または３桁
または４桁またはそれ超、一般に低く、逆もまた同じである。二重特異性抗体が特異的に
結合するエピトープは、同じか異なる標的の上（例えば、同じか異なるタンパク質の上）
にあってよい。例示的な二重特異性抗体は、腫瘍抗原に対して特異的な第一の重鎖、およ
び細胞傷害性マーカー、例えば、Ｆｃ受容体（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、Ｆｃ
γＲＩＩＩなど）またはＴ細胞のマーカー（例えば、ＣＤ３、ＣＤ２８など）に対して特
異的な第二の重鎖を有する二重特異性抗体を含む。さらに、第二の重鎖可変ドメインは、
異なる所望の特異性を有する重鎖可変ドメインで置換することができる。例えば、毒素（
例えば、サポリン、ビンカアルカロイドなど）を腫瘍細胞へと送達するように、腫瘍抗原
に対して特異的な第一の重鎖および毒素に対して特異的な第二の重鎖を有する二重特異性
抗体を対合させることができる。他の例示的な二重特異性抗体は、活性化受容体（例えば
、Ｂ細胞受容体、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃαＲＩ、Ｔ細胞
受容体など）に対して特異的な第一の重鎖および抑制性受容体（例えば、ＦｃγＲＩＩＢ
、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７２、ＣＤ３００ａなど）に対して特異的な第二の重鎖を有す
る二重特異性抗体を含む。細胞の活性化（例えば、アレルギーおよび喘息）と関連する治
療条件のためには、このような二重特異性抗体を構築することができる。二重特異性抗体
は、例えば、同じ免疫原の異なるエピトープを認識する重鎖を組み合わせることによって
作ることができる。例えば、同じ免疫原の異なるエピトープを認識する重鎖可変配列をコ
ードする核酸配列は、同じか異なる重鎖定常領域をコードする核酸配列に融合させること
ができ、そのような配列は免疫グロブリン軽鎖を発現する細胞で発現させることができる
。一般的な二重特異性抗体は、各々３つの重鎖ＣＤＲと、続く（Ｎ末端からＣ末端にかけ
て）ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを有する２つの重鎖
、ならびに、エピトープ結合特異性を付与しないが各重鎖と会合することができるか、ま
たは各重鎖と会合することができ、かつ重鎖エピトープ結合領域が結合するエピトープの
１つもしくは複数に結合することができるか、または各重鎖と会合することができ、かつ
一方もしくは両方のエピトープへの重鎖の一方もしくは両方の結合を可能にすることがで
きる免疫グロブリン軽鎖を有する。
【０５９４】
用語「細胞」には、組換え核酸配列を発現させるのに適する任意の細胞が含まれる。細
胞には、原核生物および真核生物（単細胞または多細胞）のもの、細菌細胞（例えば、Ｅ
．ｃｏｌｉの株、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．な
ど）、マイコバクテリア細胞、真菌細胞、酵母細胞（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
、Ｓ．ｐｏｍｂｅ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａなど）、植物細
胞、昆虫細胞（例えば、ＳＦ−９、ＳＦ−２１、バキュロウイルス感染昆虫細胞、Ｔｒｉ
ｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉなど）、ヒト以外の動物細胞、ヒト細胞、または細胞融合体、
例えばハイブリドーマもしくはクアドローマが含まれる。一部の実施形態では、細胞はヒ
ト、サル、類人猿、ハムスター、ラットまたはマウスの細胞である。一部の実施形態では
、細胞は真核細胞であり、以下の細胞から選択される：ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ  Ｋ１、
ＤＸＢ−１１  ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ−ＣＨＯ）、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ−７）、網膜
細胞、Ｖｅｒｏ、ＣＶ１、腎臓（例えば、ＨＥＫ２９３、２９３  ＥＢＮＡ、ＭＳＲ  ２
９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ）、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ３８、ＭＲＣ  ５、Ｃ
ｏｌｏ２０５、ＨＢ  ８０６５、ＨＬ−６０（例えば、ＢＨＫ２１）、Ｊｕｒｋａｔ、Ｄ
ａｕｄｉ、Ａ４３１（表皮性）、ＣＶ−１、Ｕ９３７、３Ｔ３、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、
ＳＰ２／０、ＮＳ−０、ＭＭＴ  ０６０５６２、Ｓｅｒｔｏｌｉ細胞、ＢＲＬ  ３Ａ細胞
、ＨＴ１０８０細胞、骨髄腫細胞、腫瘍細胞および前記細胞に由来する細胞系。一部の実
施形態では、細胞は、１つまたは複数のウイルス遺伝子を含む（例えばウイルス遺伝子を
発現する網膜細胞（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６ＴＭ細胞））。
【０５９５】
本明細書で用いられる用語「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」には、通常は（すなわ
ち、野生型動物では）免疫グロブリン分子（例えば、抗体またはＴ細胞受容体）の軽鎖可
変領域内または重鎖可変領域における２つのフレームワーク領域の間に現れる生物体の免
疫グロブリン遺伝子の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列が含まれる。ＣＤＲは、
例えば、生殖細胞系列配列によりコードされてもよく、再構成された配列によりコードさ
れてもよく、例えば、ナイーブＢ細胞またはナイーブＴ細胞によりコードされてもよく、
成熟Ｂ細胞または成熟Ｔ細胞によりコードされてもよい。ＣＤＲは、体細胞変異させる（
例えば、動物の生殖細胞系列内でコードされる配列から変化する）こともでき、ヒト化さ
せることもでき、かつ／またはアミノ酸置換、アミノ酸付加、もしくはアミノ酸欠失によ
り改変することもできる。状況によって（例えば、ＣＤＲ３では）、ＣＤＲは、例えば、
配列のスプライシングまたは接続（例えば、重鎖ＣＤＲ３を形成するＶ−Ｄ−Ｊ組換え）
の結果として、連続的でない（例えば、再構成されていない核酸配列内では）が、Ｂ細胞
の核酸配列内では連続的な２つ以上の配列（例えば、生殖細胞系列配列）によりコードさ
れてもよい。
【０５９６】
保存的なアミノ酸置換を記載するために用いられる場合、用語「保存的」には、類似し
た化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖Ｒ基を有する別のアミノ酸残基
によるアミノ酸残基の置換が含まれる。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の目
的の機能特性、例えば標的エピトープに所望の親和性で特異的に結合する可変領域の能力
を実質的に変えない。類似した化学特性を有する側鎖を有するアミノ酸の群の例には、グ
リシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンなどの脂肪族側鎖；セリンおよ
びトレオニンなどの脂肪族ヒドロキシル側鎖；アスパラギンおよびグルタミンなどのアミ
ドを含む側鎖；フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンなどの芳香族の側鎖；
リシン、アルギニンおよびヒスチジンなどの塩基性側鎖；アスパラギン酸およびグルタミ
ン酸などの酸性側鎖；ならびにシステインおよびメチオニンなどの硫黄を含む側鎖が含ま
れる。保存的アミノ酸置換基には、例えば、バリン／ロイシン／イソロイシン、フェニル
アラニン／チロシン、リシン／アルギニン、アラニン／バリン、グルタミン酸／アスパラ
ギン酸、およびアスパラギン／グルタミンが含まれる。一部の実施形態では、例えばアラ
ニンスキャニング変異生成で用いられるように、保存的アミノ酸置換は、アラニンによる
タンパク質の任意の天然の残基の置換であってよい。一部の実施形態では、Ｇｏｎｎｅｔ
ら（１９９２年）Ｅｘｈａｕｓｔｉｖｅ  Ｍａｔｃｈｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｎｔｉｒ
ｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５６巻：
１４４３〜４５頁に開示されるＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスで正の値を有する保存
的置換がもたらされる。一部の実施形態では、置換は、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリック
スで置換が負ではない値を有するような適度に保存的な置換である。
【０５９７】
一部の実施形態では、免疫グロブリン軽鎖または重鎖での残基位置は、１つまたは複数
の保存的アミノ酸置換によって異なる。一部の実施形態では、免疫グロブリン軽鎖または
その機能的断片（例えば、Ｂ細胞などからの発現および分泌を可能にする断片）における
残基位置は、アミノ酸配列が本明細書に記載されている軽鎖と同一ではなく、１つまたは
複数の保存的アミノ酸置換によって異なる。
【０５９８】
本明細書で用いられる用語「解離半減期」または「ｔ１／２」は、以下の式：ｔ１／２
（分）＝（ｌｎ２／ｋｄ）／６０［式中、ｋｄは、解離速度定数を表す］により計算され
る値を指す。
【０５９９】
語句「エピトープ結合タンパク質」には、少なくとも１つのＣＤＲを有し、エピトープ
を選択的に認識することが可能な、例えばエピトープに約１マイクロモル以下のＫＤ（例
えば、約１×１０−６Ｍ、１×１０−７Ｍ、１×１０−９Ｍ、１×１０−９Ｍ、１×１０
−１０Ｍ、１×１０−１１Ｍまたは約１×１０−１２ＭのＫＤ）で結合することが可能で
あるタンパク質が含まれる。治療的なエピトープ結合タンパク質（例えば、治療的な抗体
）は、ナノモルまたはピコモルの範囲のＫＤをしばしば必要とする。
【０６００】
例えば、機能性ポリペプチドを参照して本明細書で使用される用語「機能性」は、天然
のタンパク質と通常関連する少なくとも１つの生物学的活性を保持するポリペプチドを含
む。別の場合には、機能性免疫グロブリン遺伝子セグメントは、再構成された免疫グロブ
リン遺伝子配列を生成するための産生性の再構成が可能な可変遺伝子セグメントを含み得
る。
【０６０１】
語句「機能的断片」には、発現、分泌させることができ、マイクロモル、ナノモルまた
はピコモルの範囲のＫＤでエピトープに特異的に結合するエピトープ結合タンパク質の断
片が含まれる。特異的な認識には、少なくともマイクロモルの範囲、ナノモルの範囲また
はピコモルの範囲のＫＤを有することが含まれる。
【０６０２】
本明細書中で使用される場合、免疫グロブリン核酸配列を参照した用語「生殖細胞系列
」には、子孫に渡されることができる核酸配列への参照が含まれる。
【０６０３】
語句「重鎖」または「免疫グロブリン重鎖」には、任意の生物体からの免疫グロブリン
重鎖配列（免疫グロブリン重鎖定常領域配列を含む）が含まれる。特に明記しない限り、
重鎖可変ドメインには３つの重鎖ＣＤＲおよび４つのＦＲ領域が含まれる。重鎖の断片に
は、ＣＤＲ、ＣＤＲおよびＦＲ、ならびにこれらの組合せが含まれる。一般的な重鎖は、
可変ドメインに続いて、（Ｎ末端からＣ末端に向かって）ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ
２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを有する。重鎖の機能性断片には、エピトープを特異
的に認識する（例えば、マイクロモル濃度、ナノモル濃度、またはピコモル濃度範囲のＫ
Ｄでエピトープを認識する）ことが可能で、細胞から発現および分泌させることが可能で
、少なくとも１つのＣＤＲを含む断片が含まれる。重鎖可変ドメインは、生殖細胞系列に
存在するＶＨセグメント、ＤＨセグメント、およびＪＨセグメントのレパートリーに由来
する、ＶＨセグメント、ＤＨセグメント、およびＪＨセグメントを一般に含む可変領域の
ヌクレオチド配列によりコードされる。様々な生物体のＶ重鎖セグメント、Ｄ重鎖セグメ
ント、およびＪ重鎖セグメントについての配列、位置、および命名法は、インターネット
を介してＵＲＬ「ｉｍｇｔ．ｏｒｇ．」のワールドワイドウェブ（ｗｗｗ）上でアクセス
可能な、ＩＭＧＴデータベース内で見出すことができる。
【０６０４】
配列に関連して用いられる場合、用語「同一性」には、ヌクレオチドおよび／またはア
ミノ酸配列の同一性を測定するために用いることができる当技術分野で公知であるいくつ
かの異なるアルゴリズムで決定される同一性が含まれる。本明細書に記載される一部の実
施形態では、同一性は、１０．０のオープンギャップペナルティ、０．１のエクステンド
ギャップペナルティを使用するＣｌｕｓｔａｌＷ  ｖ．１．８３（スロー）アラインメン
トを用い、およびＧｏｎｎｅｔの類似度マトリックス（ＭＡＣＶＥＣＴＯＲＴＭ１０．０
．２、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ  Ｉｎｃ．、２００８）を用いて決定される。配列の同一性に
関して比較される配列の全長は特定の配列に依存するが、軽鎖定常ドメインの場合、全長
は、自己会合して正規の軽鎖定常ドメインを形成することが可能な、例えばベータストラ
ンドを含む２つのβシートを形成することが可能であり、およびヒトまたはマウスの少な
くとも１つのＣＨ１ドメインと相互作用することが可能な軽鎖定常ドメインに折り畳まれ
るのに十分な長さの配列を含むべきである。ＣＨ１ドメインの場合、配列の全長は、ベー
タストランドを含む２つのβシートを形成することが可能であり、およびマウスまたはヒ
トの少なくとも１つの軽鎖定常ドメインと相互作用することが可能なＣＨ１ドメインに折
り畳まれるのに十分な長さの配列を含むべきである。
【０６０５】
語句「免疫グロブリン分子」には、２つの免疫グロブリン重鎖および２つの免疫グロブ
リン軽鎖が含まれる。重鎖は同一であっても異なってもよく、軽鎖は同一であっても異な
ってもよい。
【０６０６】
語句「軽鎖」には、任意の生物体からの免疫グロブリン軽鎖配列が含まれ、特に明記し
ない限りヒトカッパ（κ）およびラムダ（λ）軽鎖およびＶｐｒｅＢ、ならびに代わりの
軽鎖が含まれる。特に明記しない限り、軽鎖可変ドメインには３つの軽鎖ＣＤＲおよび４
つのフレームワーク（ＦＲ）領域が一般に含まれる。一般に、完全長軽鎖には、アミノ末
端からカルボキシル末端にかけて、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤ
Ｒ３−ＦＲ４を含む可変ドメインおよび軽鎖定常領域アミノ酸配列が含まれる。軽鎖可変
ドメインは、生殖細胞系列に存在する軽鎖Ｖ遺伝子セグメントおよび軽鎖Ｊ遺伝子セグメ
ントのレパートリーに由来する、軽鎖ＶＬ遺伝子セグメントおよび軽鎖ＪＬ遺伝子セグメ
ントを一般に含む軽鎖可変領域のヌクレオチド配列によりコードされる。様々な生物体の
軽鎖Ｖ遺伝子セグメントおよび軽鎖Ｊ遺伝子セグメントについての配列、位置、および命
名法は、インターネットを介してＵＲＬ「ｉｍｇｔ．ｏｒｇ．」のワールドワイドウェブ
（ｗｗｗ）上でアクセス可能な、ＩＭＧＴデータベース内で見出すことができる。軽鎖に
は、例えば、軽鎖が現れるエピトープ結合タンパク質が選択的に結合する第一または第二
のエピトープのいずれにも選択的に結合しないものが含まれる。軽鎖には、エピトープ結
合タンパク質（その中に軽鎖が現れる）が選択的に結合する１つまたは複数のエピトープ
に結合し認識するものか、重鎖による結合および認識を助けるものがさらに含まれる。軽
鎖には、軽鎖が現れるエピトープ結合タンパク質が選択的に結合する１つまたは複数のエ
ピトープに結合し認識するものか、重鎖による結合および認識を助けるものがさらに含ま
れる。共通軽鎖またはユニバーサル軽鎖はヒトＶκ１−３９Ｊκ５遺伝子またはヒトＶκ
３−２０Ｊκ１遺伝子に由来するものを包含し、それの体細胞変異（例えば、親和性成熟
）バージョンを包含する。
【０６０７】
語句「マイクロモルの範囲」は、１〜９９９マイクロモルを意味するものとする。語句
「ナノモルの範囲」は、１〜９９９ナノモルを意味するものとする。語句「ピコモルの範
囲」は、１〜９９９ピコモルを意味するものとする。
【０６０８】
「中性ｐＨ」は、ｐＨ約７．０〜約８．０の間、例えば、ｐＨ約７．０〜約７．４の間
、例えば、約７．２〜約７．４の間のｐＨ、例えば、マウスまたはヒトにおける、例えば
、生理学的ｐＨを含む。「酸性ｐＨ」は、６．０以下のｐＨ、例えば、ｐＨ約５．０〜約
６．０の間、ｐＨ約５．７５〜約６．０の間のｐＨ、例えば、エンドソームコンパートメ
ントまたはリソソームコンパートメントのｐＨを含む。
【０６０９】
用語「作動可能に連結した」は、作動可能に連結した成分が、それらの意図される様式
で機能する関係を指す。１つの場合には、適正な転写調節を保持するように、タンパク質
をコードする核酸配列を、調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサ
ー配列など）に作動可能に連結することができる。１つの場合には、免疫グロブリン可変
領域（またはＶ（Ｄ）Ｊセグメント）の核酸配列を免疫グロブリン定常領域の核酸配列に
作動可能に連結することにより、該配列の間の免疫グロブリン重鎖配列または免疫グロブ
リン軽鎖配列への適正な組換えを可能にすることができる。
【０６１０】
本明細書で使用される語句「体細胞変異」には、クラススイッチングを経たＢ細胞から
の核酸配列への言及が含まれ、ここで、クラススイッチングされたＢ細胞における免疫グ
ロブリン可変領域、例えば重鎖可変領域（例えば、重鎖可変ドメインまたは重鎖ＣＤＲも
しくはＦＲ配列を含む領域）の核酸配列は、クラススイッチングの前のＢ細胞の核酸配列
と同一ではなく、例えば、例えば、クラススイッチングを経ていないＢ細胞とクラススイ
ッチングを経たＢ細胞との間のＣＤＲまたはフレームワーク核酸配列において差がある。
語句「体細胞変異した」には、親和性成熟していないＢ細胞での対応する免疫グロブリン
可変領域ヌクレオチド配列（すなわち、生殖細胞系列細胞のゲノム中の配列）と同一では
ない親和性成熟Ｂ細胞からの核酸配列への言及が含まれる。語句「体細胞変異した」には
、目的のエピトープへのＢ細胞の曝露の後のＢ細胞からの免疫グロブリン可変領域核酸配
列への言及も含まれ、ここで、核酸配列は、目的のエピトープへのＢ細胞の曝露の前の対
応する核酸配列と異なる。語句「体細胞変異した」は、免疫原チャレンジに応じて動物で
、例えばヒト免疫グロブリン可変領域核酸配列を有するマウスで生成される、かつそのよ
うな動物で生得的に作動する選択プロセスから生じる抗体からの配列も指す。
【０６１１】
核酸配列を参照した用語「再構成されていない」は、動物細胞の生殖細胞系列に存在す
る核酸配列を含む。
【０６１２】
語句「可変ドメイン」は、Ｎ末端からＣ末端にかけて（特に示されない限り）、配列に
おいて以下のアミノ酸領域：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、
ＦＲ４を含む免疫グロブリン軽鎖または免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列（所望に応じ
て改変された）を含む。
【０６１３】
語句「作動可能に連結した」は、そのように記載された成分が、それらの意図される様
式で機能することを可能とする関係にある並置を指す。１つの場合には、適正な転写調節
を保持するように、タンパク質をコードする核酸配列を調節配列（例えば、プロモーター
、エンハンサー、サイレンサー配列など）に作動可能に連結することができる。１つの場
合には、免疫グロブリン可変領域（またはＶ（Ｄ）Ｊセグメント）の核酸配列を免疫グロ
ブリン定常領域の核酸配列に作動可能に連結することにより、該配列の間の免疫グロブリ
ン重鎖配列または免疫グロブリン軽鎖配列への適正な組換えを可能にすることができる。
【０６１４】
遺伝子置きかえに関連する用語「置きかえ」は、外因性遺伝物質を内因性遺伝子座に配
置し、これにより、内因性遺伝子の全部または一部分を、オーソロガスな核酸配列または
相同な核酸配列で置きかえることを指す。
【０６１５】
本明細書で使用される、例えば、機能性ポリペプチドを参照した用語「機能性」は、天
然のタンパク質と通常関連する少なくとも１つの生物学的活性を保持するポリペプチドを
含む。別の場合には、機能性免疫グロブリン遺伝子セグメントは、再構成された免疫グロ
ブリン遺伝子配列を生成するための産生性の再構成が可能な可変遺伝子セグメントを含み
得る。
【０６１６】
ヒスチジン置換を有する可変ドメイン
ヒト免疫グロブリンベースの治療剤のデザインは、十分に研究された現象であるが、あ
る種の未解決の問題が、最適の特徴を有するこのような治療剤の作製すること、例えば、
このような治療剤の血清半減期の延長、または治療用分子１つ当たりでより多くの標的に
結合するそれらの能力の他の方法での改善することにおいて依然として存続している。こ
こ数十年にわたる、血清免疫グロブリンの代謝回転を解明することを目的とする多くの研
究は、抗体の構造を改変することにより、治療的に重要な抗体、または免疫グロブリンベ
ースの治療剤の血清半減期を延長する方途に焦点を当ててきた。大半の場合、この改変研
究は、抗体の定常ドメインの胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）との相互作用に焦点を当てて
きた。細胞外表面上の胎児性Ｆｃ受容体は、それらのＦｃ領域を介して循環抗体に結合し
て、抗体−ＦｃＲｎ複合体を形成し、これは、細胞へと組み込まれるかまたはエンドサイ
トーシスを受け（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｅｄ）、ここで、リガンドと抗体とは離別し、抗体
−ＦｃＲｎ複合体は、サイクリングプロセスを経、これにより、抗体およびＦｃＲｎが細
胞の表面へと戻り、ここで、抗体は、放出され、新たな標的分子に再結合し得る。抗体−
ＦｃＲｎ複合体のサイクリングは、受容体サイクリングの一般的機構の発見に続き、強い
関心の領域となった。
【０６１７】
受容体のサイクリングは様々な機構により進行し得る。受容体を媒介するエンドサイト
ーシスは、細胞表面受容体（場合によっては、例えば、ＦｃＲｎ）およびそれらのリガン
ドのリサイクリングを調節するためのエンドソーム経路をもたらす。（他の方法で、ピノ
サイトーシスを受けた（ｐｉｎｏｃｙｔｏｓｅｄ）分子は典型的に、分解に終わるエンド
ソーム経路を介してシャトリングされる）。受容体を媒介するエンドサイトーシス機構の
発見および膜受容体のリサイクリングに関する一連の研究は、受容体−リガンド代謝回転
一般についての詳細な理解のための枠組みをもたらした（総説については、例えば、Brow
n,  M.S.、Anderson,  R.G.W.、およびGoldstein,  J.L.（１９８３年）、「Recycling  
Receptors:  The  Round-Trip  Itinerary  of  Migrant  Membrane  Proteins」、Cell
３２巻：６６３〜６６７頁を参照されたい;  Goldstein,  J.L.およびBrown,  M.S.（
２００９年）、「The  LDL  Receptor」、Arterioscler.  Thromb.  Vasc.  Biol.、２９
巻：４３１〜４３８頁;  Basu,  S.K.（１９８４年）、「Receptor-mediated  endocytos
is:  An  overview  of  a  dynamic  process」、J.  Biosci.、６巻（４号）：５３５
〜５４２頁もまた参照されたい）。エンドソームソーティングについての他の研究も、循
環免疫グロブリンの運命および免疫グロブリン受容体リサイクリングの現象ならびに抗体
薬物の薬物動態の問題に適正な枠組みを与える一助となった。この研究は、血清中のＩｇ
Ｇ分子の比較的長い半減期の主な一因となっているようである、複雑な抗体−ＦｃＲｎ複
合体のサイクリングプロセスを明らかにした。実際、この領域におけるやや早期の研究も
、エンドソームが、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける最も豊富なＦｃＲｎの供給源であることを確
立した（Roberts,  D.M.ら（１９９０年）、「Isolation  and  Characterization  of  
the  Fc  Receptor  from  the  Fetal  Yolk  Sac  of  the  Rat」、J.  Cell.  Biol.
、１１１巻：１８６７〜１８７６頁を参照されたい）。そして、受容体陽性のエンドソー
ム画分は、凝集（例えば、Dunn,  K.W.ら（１９８９年）、「Iterative  Fractionation
of  Recycling  Receptors  from  Lysosomally  Destined  Ligands  in  an  Early
Sorting  Endosome」、J.  Cell.  Biol.、１０９巻（６号）：３３０３〜３３１４頁
を参照されたい）の非存在下では、大部分、リソソーム分解に向かわないことが以前から
観察されている（例えば、Brown,  M.S.ら（１９８３年）、「Recycling  Receptors:  T
he  Round-Trip  Itinerary  of  Migrant  Membrane  Proteins」、Cell  ３２巻：６６
３〜６６７頁を参照されたい;  von  Figuraら（１９８４年）、「Antibody  to  mannos
6-phosphate  specific  receptor  induces  receptor  deficiency  in  human  fib
roblasts」、EMBO  J.、３巻（６号）：１２８１〜１２８６頁もまた参照されたい）。Ｆ
ｃＲｎによく結合する抗体（例えば、ヒトＩｇＧ１抗体）が、酸性の条件下では、長時間
にわたり血清中に依然として存在することを確実にするサイクリングプロセスに関与する
のは、このエンドソーム系である。
【０６１８】
いくつかの報告によれば、ＦｃＲｎを含有するエンドソームのリサイクリング機構は新
規であり、独特である。それは、ユビキチン依存性の完全な細胞小器官融合（ｍｅｒｇｉ
ｎｇ）を伴わず、キスアンドリンガーモデル（ｋｉｓｓ−ａｎｄ−ｌｉｎｇｅｒ  ｍｏｄ
ｅｌ）（Gan,  Z.ら（２００９年）、「Analyses  of  the  recycling  receptor,  FcR
n,  in  live  cells  reveal  novel  pathways  for  lysosomal  delivery」、Traffi
c、１０巻（５号）：６００頁；Tzaban,  S.ら（２００９年）、「The  recycling  and
transcytotic  pathways  for  IgG  transport  by  FcRn  are  distinct  and  dis
play  an  inherent  polarity」、J.  Cell  Biol.、１８５巻（４号）：６７３〜６８
４頁もまた参照されたい）にいっそう類似する小管の伸展（ｔｕｂｕｌａｒ  ｅｘｔｅｎ
ｓｉｏｎ）により媒介される不完全な融合に酷似する。したがって、抗体−ＦｃＲｎサイ
クリングモデルは、他のエンドソーム経路とは異なるようである。
【０６１９】
抗体−ＦｃＲｎエンドソームサイクリング機構は、ＦｃＲｎによく結合する抗体が、多
かれ少なかれ持続的なＦｃＲｎ保護プロセスであって、結合した抗体をエンドソームコン
パートメントに封鎖し、そこで、抗体のＦｃＲｎへの結合を維持し、ＦｃＲｎへと結合し
た抗体のリソソーム分解を阻止することを伴う、ＦｃＲｎ保護プロセスを介して、血清中
の存続の延長を維持することが可能であることを確保する。典型的に、循環抗体分子は、
細胞表面上でＦｃＲｎに結合する。抗体−ＦｃＲｎ複合体は、エンドソームに、持続的な
エンドサイトーシスプロセスの結果として現れる。ＦｃＲｎに結合した分子（例えば、抗
体、またはＦｃ融合タンパク質）は、酸安定性のＦｃ−ＦｃＲｎ間相互作用を介して、酸
性のエンドソームコンパートメントにおいてＦｃＲｎとの会合を維持する。エンドソーム
表面に結合（例えば、ＦｃＲｎまたは別の受容体を介して）しない分子が、リソソーム経
路へとシャトリングされ、分解されるのに対し、受容体に結合した分子は、エンドソーム
が形質膜と融合すると、形質膜へとリサイクルされる。形質膜と融合すると、酸安定性の
Ｆｃ−ＦｃＲｎ間相互作用は、中性に近い細胞外ｐＨへと曝露され、そこで、Ｆｃは、Ｆ
ｃＲｎから容易に解離する。ＦｃＲｎへの結合を介して血清濃度を維持するある種のＦｃ
の能力の主な一因となると考えられるのは、プロトン化状態と共に変化するＦｃＲｎの示
差的な熱安定性と組み合わさった、ＦｃのｐＨ結合性の差である。エンドソームサイクリ
ング機構への鍵は、酸性のエンドソームコンパートメントにおける受容体によるリガンド
の放出である（例えば、Brown,  M.S.ら（１９８３年）において総説されている）。
【０６２０】
ＩｇＧ１Ｆｃ部分は、ｐＨ６．０〜約６．５では、ＦｃＲｎに、高い親和性で結合する
が、ｐＨ７．０〜約７．５では、結合は、ＦｃＲｎに結合するＦｃの領域の近くのヒスチ
ジン残基である残基３１０〜４３３の滴定（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）、およびプロトン化状
態により媒介されるＦｃＲｎの分子間の熱安定性の差におそらく起因して約２桁弱くなり
（Raghaven,  M.ら（１９９５年）、「Analysis  of  the  pH  dependence  of  the  n
eonatal  Fc  receptor/immunoglobulin  G  interaction  using  antibody  and  rece
ptor  variants」、Biochemistry、３４巻：１４６４９〜１４６５７頁;  Vaughn,  D.E.
およびBjorkman,  P.J.  （１９９８年）、「Structural  basis  of  pH-dependent  an
tibody  binding  by  the  neonatal  Fc  receptor」、Structure、６巻：６３〜７３
頁）、ラットＦｃＲｎも、ｐＨ６．０で、ｐＨ８．０における場合より良好な熱安定性プ
ロファイルを示すことが実証されている（Raghavan,  M.ら（１９９３年）、「The  clas
s  I  MHC-related  Fc  receptor  shows  pH  dependent  stability  differences  c
orrelating  with  immunoglobulin  binding  and  release」、Biochemistry、３２巻
：８６５４〜８６６０頁）。
【０６２１】
自然は、ＦｃＲｎに示差的に結合するＦｃ構造物をもたらしたが、ＦｃＲｎへのより緊
密な結合および（おそらく）より長い血清半減期を結果としてもたらすＦｃ構造物をデザ
インするためのＦｃ操作（Ｆｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）の科学が生じた。本明細書で
総説するには多数に過ぎる、多くのこのような構造物がデザインされ、試験されたが、成
功の度合いは様々であった。免疫グロブリン定常領域配列を変異させて、ＦｃＲｎへの結
合特徴を改変することにより、抗体のリサイクリングを促進することには、長く、変化に
とんだ歴史がある。今日まで、変異を同定しようとする、全てではないにせよ大半の試み
は、ＦｃＲｎへの結合またはＦｃＲｎとの相互作用において極めて重要であると考えられ
る残基、すなわち、その改変がＦｃのＦｃＲｎに対する親和性に影響を及ぼす残基に焦点
を当てている。
【０６２２】
しかし、ＦｃのＦｃＲｎへの結合は、それ自体複雑なことがらである。異なる種類の治
療抗体（ヒト化、キメラ、およびマウス）、そして、種類内の治療抗体（例えば、異なる
ヒト化抗体を互いと比較する場合、ＩｇＧ１アイソタイプ抗体を互いと比較する場合など
）でもなお、ＦｃＲｎに対して、約２倍ほど変動する解離定数を示す（例えば、Suzuki,
T.ら（２０１０年）、「Importance  of  Neonatal  FcR  in  Regulating  the  Seru
m  Half-Life  of  Therapeutic  Proteins  Containing  the  Fc  Domain  of  Human
IgG1:  A  Comparative  Study  of  the  Affinity  of  Monoclonal  Antibodies  a
nd  Fc-Fusion  Proteins  to  Human  Neonatal  FcR」、J.  Immunol.、１８４巻：１
９６８〜１９７６頁を参照されたい）。この観察は、定常領域の一次構造で全ての薬物動
態挙動を説明することはできないという推論を可能とする。他の研究者らは、抗体の全等
電点（ｐＩ）が、定常領域の一次構造を一定に保ちながら、血清半減期の重要な決定因子
である（おそらく性状不明のＦｃＲｎに依存しない機構を介して）ことを仮定している（
Igawa,  T.ら（２０１０年）、「Reduced  elimination  of  IgG  antibodies  by  eng
ineering  the  variable  region」、Protein  Engineering,  Design  &  Selection、
２３巻（５号）：３８５〜３９２頁）。この視点によれば、抗体のｐＩが低下するほど、
ＦｃＲｎへの結合はより緊密となる（同上文献）。少なくとも１つのＩｇＧ４アイソタイ
プ抗体について、ｐＩの９．２から７．２への変化は、半減期の２．４倍の延長およびク
リアランスの４．４倍の低減と相関し（同上文献）、これは、重鎖可変領域および軽鎖可
変領域の両方における残基も一緒に改変することによる、ｐＩの非特異的な低下も、薬物
動態挙動に有意に影響を及ぼし得るという推論と符合する。この報告では、残基の改変は
、いかなる特定のパターンにも従わず、いかなる残基もヒスチジンへと置換しなかったが
、軽鎖ＣＤＲ２における少なくとも１つの残基は、ヒスチジン残基からグルタミン酸残基
に変化させた（同上文献、図５、３９０頁）。さらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＦｃＲ
ｎへの結合とｉｎ  ｖｉｖｏにおける薬物動態とを比較すると、奇妙な逆説が生じる。Ｆ
ｃ領域に複数の置換を有する、少なくとも１つの臨床的に重要なＩｇＧ１抗体であって、
ＦｃＲｎと相互作用するＩｇＧ１抗体では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＦｃＲｎへの結合
は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける薬物動態挙動と相関しなかった（Petkova,  S.B.ら（２００
６年）、「Enahanced  half-life  of  genetically  engineered  human  IgG1  antibo
dies  in  a  humanized  FcRn  mouse  model:  potential  application  in  humoral
ly  mediated  autoimmune  disease」、Int’l  Immunol.、１８巻（１２号）：１７５
９〜１７６９頁を参照されたい）。最後に、形質膜と融合したときの、ＦｃリガンドのＦ
ｃＲｎからの放出は、未知の機構による２相（短時間相および長時間相）で生じるようで
ある（Ober,  R.J.ら（２００４年）、「Exocytosis  of  IgG  as  mediated  by  the
receptor  FcRn:  an  analysis  at  the  single-molecule  level」、Proc.  Natl
Acad.  Sci.  USA、１０１巻：１１０７６〜１１０８１頁を参照されたい）。
【０６２３】
最後に、血清中の抗体半減期の延長は、抗体療法の有効性を増強する１つの方途である
。２つまたは３つまたはそれより多くの標的分子に結合し、これらを消失させる同じ抗体
または可変ドメインの有効性の改善、またはアベイラビリティーの改善は、標的抗原に影
響を及ぼすＦｃＲｎへの結合および代謝回転の改善により必ずしも対処するわけではない
。ＦｃのＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変は、代謝回転を増大させ、したがって、治
療抗体の薬物動態を改善することが期待される。抗原−抗体複合体がＦｃＲｎに緊密に結
合する結果として、抗原−抗体複合体は、リソソーム経路により分解されるのではなく、
細胞外腔へとサイクリングにより戻される。しかし、この情況では、抗原または標的は大
部分、抗体との複合体化を維持し、抗体と一緒に細胞外腔へとリサイクルされる。治療抗
体にとって、この現象は、全く望ましくないものであり得る。
【０６２４】
しかし、抗原とのそれらの相互作用がｐＨ依存性である抗体、すなわち、エンドソーム
のｐＨでは、抗原に低い親和性で結合するように工学的に作製された抗体であれば、エン
ドソームコンパートメントにおいて抗原−抗体複合体の不安定性に起因して、ＦｃＲｎ依
存的な様式で抗原をリサイクルすることもないことになる。これは、エンドソームの酸性
環境では、抗原は抗体−ＦｃＲｎ複合体から離脱し、抗体に結合したＦｃＲｎが細胞の表
面へとリサイクルされる一方で、脱離した遊離抗原はリソソーム分解経路へとシャトリン
グされるためである。このようにして、ｐＨ依存性の抗原結合は、ＦｃＲｎを媒介するサ
イクリングの状況では、サイクリングした抗体を遊離させて抗原に結合させ、ＦｃＲｎに
結合させ、エンドソームを介してサイクルさせ、細胞外腔に戻し、より多くの抗原に結合
させ、より多くの抗原をリソソーム分解経路へとシャトリングさせることにより、有効性
および／または薬物動態の増強をもたらし得る（しかし、Ｆｃ−ＦｃＲｎ間相互作用には
直接依存しない）。
【０６２５】
エンドソームのｐＨでは、リガンドは、それらの受容体から高頻度で解離するという観
察を活用することにより、毒素を細胞へと移入させ、エンドソームにおいて毒素を放出す
るする目的で、特定の細胞を標的とする、ある種の特異的な多機能性分子を作製するため
に、エンドソームのｐＨでは、抗原を効果的に放出する抗体を探索することが示唆された
（例えば、米国特許第５，５９９，９０８号および米国特許第５，６０３，９３１号を参
照されたい）。しかし、これは、抗原−抗体サイクリング、特に、ヒト治療剤のための抗
原−抗体サイクリングに対処するものではない。
【０６２６】
抗原−ＦｃＲｎ複合体のＦｃＲｎ依存性サイクリングを維持しながら、エンドソームで
脱離させた抗原を、リソソーム経路を介してシャトリングするために抗体の構造を活用す
る目的で、ｐＨ依存性の抗原結合へのある種の手法が探索されている。このような手法は
、残基をヒスチジンで置換し、ヒスチジン置きかえの一般化された手法が、所望されるｐ
Ｈ依存性の抗原結合を有する抗体をもたらすのかどうかを確かめるために試験するための
、可変領域にわたる一般化されたヒスチジンスキャニング（例えば、Igawa,  T.ら（２０
１０年）、「Antibody  recycling  by  engineered  pH-dependent  antigen  binding
improves  the  duration  of  antigen  neutralization」、Nature  Biotech.、２８
巻（１１号）：１２０３〜１２０８頁を参照されたい；米国特許出願公開第２０１１／０
１１１４０６Ａ１号もまた参照されたい）を含む。この手法の可能性のある欠点は、抗原
結合に重要な残基の改変が、酸性ｐＨでも中性ｐＨでも、結合を破壊し、これにより、エ
ンドソームコンパートメントと細胞外腔との間のｐＨ差に起因するいかなる効力も消失さ
せ得る可能性があることである。
【０６２７】
様々な態様では、抗体可変領域（重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメイン）
におけるいくつかの熟慮により選択された領域において１カ所または複数カ所のヒスチジ
ン置換を施すための組成物および方法が提供され、標的抗原にｐＨ依存的な様式で結合す
る抗体可変ドメイン、例えば、中性ｐＨもしくは塩基性ｐＨまたは細胞外ｐＨでは、目的
の抗原に、第一の親和性で結合するが、酸性ｐＨでは、同じ目的の抗原に、第二の親和性
で結合し、ここで、第一の親和性は高く、第二の親和性は低い可変ドメインを作製するた
めの方法も提供される。
【０６２８】
様々な態様では、１カ所または複数カ所のヒスチジン置換は、ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２
配列、ＣＤＲ３配列、Ｎ末端配列、および／またはループ４配列においてである。
【０６２９】
いくつかの態様では、１カ所または複数カ所のヒスチジン置換は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２
、および／またはＣＤＲ３においてである。
【０６３０】
いくつかの態様では、１カ所または複数カ所のヒスチジン置換は、ＣＤＲ３配列および
ループ４配列においてである。さらなる実施形態では、置換はまた、Ｎ末端配列において
である。
【０６３１】
いくつかの態様では、１カ所または複数カ所のヒスチジン置換は、ＣＤＲ３配列および
Ｎ末端配列においてである。さらなる実施形態では、置換はまた、ループ４配列において
である。
【０６３２】
いくつかの態様では、１カ所または複数カ所のヒスチジン置換は、ＣＤＲ２配列および
ループ４配列においてである。さらなる実施形態では、置換はまた、Ｎ末端配列において
である。
【０６３３】
いくつかの態様では、ループ４配列は、λ軽鎖可変ドメインでは、残基８３〜８８であ
り、κ軽鎖可変ドメインでは、残基８３〜８８であり、重鎖可変領域では８２〜８８（Ｉ
ＭＧＴ番号付け）である。
【０６３４】
いくつかの態様では、軽鎖可変ドメインまたは重鎖可変ドメインのＮ末端配列は、残基
１〜２６（ＩＭＧＴ番号付け）である。一実施形態では、１カ所または複数カ所の（例え
ば、クラスター化された）ヒスチジン置換を含むＮ末端配列は、残基１〜５であり、一実
施形態では、残基１〜１０であり、一実施形態では、１〜１５であり、一実施形態では、
１〜２０であり、一実施形態では、１〜２５であり、一実施形態では、５〜１０であり、
一実施形態では、１０〜１５であり、一実施形態では、１５〜２０であり、一実施形態で
は、２０〜２５であり、一実施形態では、５〜１５であり、一実施形態では、１０〜２０
であり、一実施形態では、５〜２０である。一実施形態では、ヒスチジン置換は、２カ所
以上（例えば、３カ所、４カ所、５カ所、または６カ所以上）であり、ヒスチジン置換の
うちの少なくとも２カ所以上は、約３残基、４残基、５残基、または６残基以上のＮ末端
配列のストレッチ内で施す。一実施形態では、複数カ所のヒスチジン置換をＮ末端におい
て施し、ヒスチジン置換は、少なくとも２カ所、少なくとも３カ所、または少なくとも４
カ所のヒスチジン置換のクラスターを含む。一実施形態では、ヒスチジン置換の少なくと
も１つのクラスターは、１つまたは複数の非ヒスチジン置換で隔てられたヒスチジン置換
を含む。
【０６３５】
いくつかの態様では、ＣＤＲにおける１カ所または複数カ所のヒスチジン置換は、ＣＤ
Ｒにおける２カ所、３カ所、４カ所、５カ所、または６カ所の置換である。一実施形態で
は、中性ｐＨにおける結合にそれほど重要でないＣＤＲにおける全ての残基をヒスチジン
で置換する。一実施形態では、２カ所、３カ所、４カ所、５カ所、または６カ所の置換は
連続的であり；一実施形態では、２カ所、３カ所、４カ所、５カ所、または６カ所の置換
のうちの１カ所または複数カ所はクラスターで存在し、クラスターは少なくとも１つの非
ヒスチジン残基を含み；一実施形態では、クラスターは２つの非ヒスチジン残基を含み；
一実施形態では、クラスターは３つの非ヒスチジン残基を含み；一実施形態では、クラス
ターは４つの非ヒスチジン残基を含む。
【０６３６】
いくつかの態様では、Ｎ末端における１カ所または複数カ所のヒスチジン置換は、１カ
所、２カ所、３カ所、４カ所、５カ所、または６カ所の置換である。一実施形態では、中
性ｐＨにおける抗原結合を低減しない（例えば、１％超、２％超、３％超、４％超、また
は５％超）Ｎ末端における全ての残基をヒスチジンで置換する。一実施形態では、２カ所
、３カ所、４カ所、５カ所、または６カ所の置換は連続的であり；一実施形態では、２カ
所、３カ所、４カ所、５カ所、または６カ所の置換のうちの１カ所または複数カ所はクラ
スターで存在し、クラスターは少なくとも１つの非ヒスチジン残基を含み；一実施形態で
は、クラスターは２つの非ヒスチジン残基を含み；一実施形態では、クラスターは３つの
非ヒスチジン残基を含み；一実施形態では、クラスターは４つの非ヒスチジン残基を含む
。
【０６３７】
いくつかの態様では、方法は、可変ドメインを、ヒスチジン置換のクラスター（例えば
、本明細書で記載される通り、連続的であるか、または１つまたは複数の非ヒスチジン残
基で中断された）を、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、Ｎ末端、ループ４、およびこれら
の組合せから選択される領域に含むように改変するステップを含む。いくつかの態様では
、クラスターとは、上流で第一のヒスチジン残基が結合し、下流で第二のヒスチジン残基
が結合した配列であり、第一のヒスチジン残基と第二のヒスチジン残基との間に１つまた
は複数の残基を含む。一実施形態では、第一のヒスチジン残基と第二のヒスチジン残基と
の間の１つまたは複数の残基は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ以上の非ヒ
スチジン残基である。一実施形態では、第一のヒスチジン残基と第二のヒスチジン残基と
の間の１つまたは複数の残基は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのヒスチジ
ン残基である。一実施形態では、クラスターは、３つの残基であり、一実施形態では、４
つの残基であり、一実施形態では、５つの残基であり、一実施形態では、６つの残基であ
り、一実施形態では、７つの残基であり、一実施形態では、８つ以上の残基である。
【０６３８】
様々な態様では、方法は、抗原への結合（例えば、中性ｐＨ、例えば、ｐＨ７〜７．４
、例えば、ｐＨ７．２、例えば、細胞外ｐＨにおける）に極めて重要な抗体可変ドメイン
（重鎖および／または軽鎖）における配列を同定するステップと、配列内の１つまたは複
数の残基をヒスチジンへと置換するステップとを含み、ここで、ヒスチジンへの置換は、
中性ｐＨにおける可変ドメインの標的抗原への結合を消失させない。様々な態様では、中
性ｐＨにおける結合にそれほど重要でない２つ以上、３つ以上、４つ以上、または５つ以
上の残基のクラスターを、ヒスチジン残基で置換する。様々な態様では、ヒスチジン残基
のクラスターは、ＣＤＲ内、ループ４内、Ｎ末端内、またはこれらの組合せ内にある。
【０６３９】
様々な態様では、結合に極めて重要な残基を、ほぼ中性の（または細胞外）ｐＨで、代
わりのアミノ酸で置換すると、可変ドメインの結合を、一実施形態では、少なくとも５％
、一実施形態では、少なくとも１０％、一実施形態では、少なくとも２０％、一実施形態
では、少なくとも３０％、一実施形態では、少なくとも４０％、一実施形態では、少なく
とも５０％、一実施形態では、少なくとも６０％、一実施形態では、少なくとも７０％、
一実施形態では、少なくとも８０％、一実施形態では、少なくとも９０％低減し、一実施
形態では、検出可能な結合を結果としてもたらさない残基として同定する。一実施形態で
は、代わりのアミノ酸はヒスチジンである。一実施形態では、代わりのアミノ酸はアラニ
ンである。
【０６４０】
一態様では、酸性ｐＨでは、抗原に、中性ｐＨまたは塩基性ｐＨにおいて同じ抗原に結
合するより弱く結合する抗体可変ドメインを作製するための方法であって、可変領域の１
つまたは複数のアミノ酸残基を、１つまたは複数のヒスチジン残基で置換するステップを
含む方法が提供される。一実施形態では、酸性ｐＨにおける結合は、無視できる程度であ
るかまたはゼロである。
【０６４１】
一実施形態では、置換される１つまたは複数のアミノ酸残基は軽鎖にある。具体的な実
施形態では、１つまたは複数の残基は軽鎖のＮ末端領域にある。具体的な実施形態では、
Ｎ末端残基は、１〜２６、１〜２０、１〜１５、１〜１０、１〜６、または１〜５（ＩＭ
ＧＴ番号付け）から選択される。一実施形態では、１つまたは複数の残基はループ３にあ
る。具体的な実施形態では、ループ４残基は、Ｖκ内またはＶλの８３〜８８であり、Ｖ
Ｈの８２〜８８（ＩＭＧＴ番号付け）である。
【０６４２】
一実施形態では、１つまたは複数の残基は重鎖にある。具体的な実施形態では、１つま
たは複数の残基は重鎖のＮ末端領域にある。具体的な実施形態では、Ｎ末端残基は、１〜
２６、１〜２０、１〜１５、１〜１０、１〜６、または１〜５（ＩＭＧＴ番号付け）から
選択される。一実施形態では、１つまたは複数の残基はループ４にある。具体的な実施形
態では、ループ３残基は、（Ｖκおよび／またはＶλでは）８３、８４、８５、８６、８
７、８８、およびこれらの組合せ（ＩＭＧＴ番号付け）；または（ＶＨでは）８２、８３
、８４、８５、８６、８７、８８、およびこれらの組合せ（ＩＭＧＴ番号付け）；ならび
にこれらの組合せから選択される。
【０６４３】
一実施形態では、１つまたは複数の残基は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３から
選択されるＣＤＲにあり、１つまたは複数の残基は、置換されて（例えば、アラニンまた
はヒスチジンで）も、中性ｐＨまたは塩基性ｐＨにおける標的抗原の結合の減少を結果と
してもたらさない。具体的な実施形態では、（例えば、アラニン置換またはヒスチジン置
換による）置換の結果としての、中性ｐＨまたは塩基性ｐＨにおける標的抗原の結合の減
少は、置換されていない可変ドメインと比較して５％以下、１０％以下、１５％以下、ま
たは２０％以下、２５％以下、または３０％以下である。
【０６４４】
いくつかの態様では、標的抗原と複合体化した、ｈｉｓで改変した可変ドメインは、高
ｐＨ（例えば、細胞外ｐＨ、またはｐＨ７〜７．４、例えば、ｐＨ７．２）では、少なく
とも約２０分間の半減期を示し、エンドソームのｐＨ、または例えば、ｐＨ５〜６、例え
ば、ｐＨ５．７５のｐＨでは、５分間未満、４分間未満、３分間未満、２分間未満、また
は１分間未満の半減期を示す。一実施形態では、標的抗原と複合体化した、ｈｉｓで改変
した可変ドメインは、高ｐＨでは、少なくとも約２０分間の半減期を示し、エンドソーム
のｐＨでは、６０秒間未満、３０秒間未満、１０秒間未満、５秒間未満、４秒間未満、３
秒間未満、または２秒間未満の半減期を示す。一実施形態では、標的抗原と複合体化した
、ｈｉｓで改変した可変ドメインは、高ｐＨ（例えば、ｐＨ７〜７．４、例えば、ｐＨ７
．２）では、少なくとも約２０分間の半減期を示し、エンドソームのｐＨでは、約１秒間
未満、０．５秒間未満、０．１秒間未満、または０．０５秒間未満の半減期を示す。一実
施形態では、標的抗原と複合体化した、ｈｉｓで改変した可変ドメインを、ＢＩＡＣＯＲ
Ｅ（商標）チップの表面上において、中性ｐＨまたは高ｐＨで平衡化し、エンドソームの
ｐＨ（または、例えば、ｐＨ５〜６、例えば、ｐＨ５．７５）の緩衝液を複合体上に流す
、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）アッセイを使用して、エンドソームのｐＨにおける半減期を測
定する。
【０６４５】
様々な態様では、細胞外ｐＨでは第一の親和性で標的抗原に結合し、エンドソームのｐ
Ｈでは標的抗原に結合しないかまたは標的抗原に第二の親和性で結合する抗体可変ドメイ
ンを作製するための方法であって、第一の親和性が、第二の親和性の約１０、１０２、１
０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、または
１０１２倍である（またはこれらを超える）方法。いくつかの態様では、第一の親和性は
ピコモル濃度〜ナノモル濃度の範囲にあり（例えば、ＫＤは、１０−１２〜１０−９であ
り）、第二の親和性はマイクロモル濃度以上の範囲（例えば、ＫＤ＝１０−６以上、例え
ば、１０−５、１０−４、１０−３、１０−２、１０−１、１以上）である。いくつかの
態様では、第一の親和性は約ＫＤ１０−９〜約ＫＤ１０−１２の範囲にあり、第二の親和
性は約ＫＤ１０−３〜約１以上の範囲にある。一実施形態では、第一の親和性は約ＫＤ１
０−９〜約ＫＤ１０−１２の範囲にあり、第二の親和性はＫＤ＞１を特徴とし；具体的な
実施形態では、第二の親和性はＫＤ＞＞１（例えば、１０、１０２、１０３以上）を特徴
とする。具体的な実施形態では、第一の親和性は約１０−９〜約１０−１２のＫＤを特徴
とし、第二の親和性は、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）結合アッセイにおいて、バックグラウン
ドを超えて結合を検出することが不可能なことを特徴とする。
【０６４６】
様々な態様を特定の事例で例示するが、そこでは、ヒト軽鎖可変配列を、軽鎖ＣＤＲ３
において、クラスターを含め、１つまたは複数のヒスチジンを含有するように改変し、軽
鎖を、同種のヒト重鎖を有するＣＨＯ細胞内で発現させる。軽鎖可変ドメインの特定の配
列は重要でないので、ヒスチジン改変された抗体が結合する抗原の同定（ｉｄｅｎｔｉｔ
ｙ）は重要ではない。実施例で例示される原理は、ＣＤＲ３、ＣＤＲ２、ＣＤＲ１、Ｎ末
端領域、またはループ４に適用可能である。例えば、列挙される領域における残基は、単
独または例えば、２つ、３つ、４つ、または５つのクラスターのヒスチジンで置換し、結
果として得られる抗体をｐＨ依存性の抗原結合について試験することができる。
【０６４７】
抗原にｐＨ依存的な様式で結合することが可能な抗体を工学的に作製するための方法は
、記載される軽鎖の配列（例えば、ＣＤＲ３、ＣＤＲ２、ＣＤＲ１、ループ４、Ｎ末端に
おける配列）に沿った１つまたは複数の位置において、免疫グロブリン軽鎖可変領域の改
変を施すことにより作製することができる。ヒスチジンは、ＣＤＲ領域で忍容され、軽鎖
は、可変領域配列に沿って体細胞超変異を典型的に示し、場合によって、このような変異
は、ＣＤＲにおけるヒスチジン残基による置換を結果としてもたらし得る（図１５）。
【０６４８】
実施例では、中性ｐＨにおける標的抗原の結合にそれほど重要でない残基である、軽鎖
ＣＤＲ３領域の１つ〜４つの位置において、ヒスチジン置換を同定し、これにより、１５
の変異体構築物を作製した。示される特定の軽鎖（様々な異なるが同種の重鎖を有する）
は、単一のＶκセグメントおよび単一のＪκセグメント（Ｖκ１−３９／Ｊκ５）に由来
する。このような変異体は、発現させると、抗体（同種の重鎖とともに）に、ｐＨ依存性
の抗原結合の特性を付与する。抗原特異的な抗体可変ドメインを使用して変異体構築物を
作製し、ほぼ中性のｐＨにおける発現および抗原結合ならびに低ｐＨにおける放出につい
て試験した（「キャッチアンドリリース」）。示されるある種の例では、４つの同定され
る残基の位置（ヒスチジンへの変異が中性ｐＨにおける結合にそれほど重要でない位置）
は、Ｑ１０５Ｈ、Ｑ１０６Ｈ、Ｙ１０８Ｈ、およびＰ１１１Ｈである。異なる標的抗原に
結合する抗体、または異なる再構成されたＶ−Ｊ配列を含む抗体では、ｐＨ依存性可変ド
メインを作製するためのｈｉｓ変異可能な残基は、どの残基が中性ｐＨにおける結合にそ
れほど重要でないのかを同定し、次いで、これらの残基（例えば、クラスターにおける）
のうちの１つまたは複数を改変し、変異を含む抗体を発現させ、中性ｐＨ（例えば、細胞
外ｐＨ）および酸性ｐＨ（例えば、エンドソームのｐＨ）における結合（および／または
放出時間、例えば、ｔ１／２）について試験することにより見出される。本実施例で示さ
れるデータは、Ｖκ１−３９／Ｊκ５軽鎖についてのデータであるが、Ｖκ３−２０／Ｊ
κ１再構成に由来する軽鎖を含む他の軽鎖も、重鎖と同様、本明細書で記載される手法に
適する。
【０６４９】
本実験で作製された、ヒスチジンを工学的に作製した（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ−ｅｎｇｉ
ｎｅｅｒｅｄ）軽鎖構築物の全ては、重鎖と共に良好に発現した。さらに、ｐＨ依存的な
様式での抗体の抗原への結合も、同じ細胞表面抗原を特異的に認識する５つの異なる重鎖
を有する１５の変異体について、ほぼ中性のｐＨおよび酸性ｐＨにおける抗原の結合を示
す、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）アッセイのデータから実証された（図１９Ａ〜Ｊ）。
【０６５０】
記載された方法、および本明細書の例および図のうちのあるものにおいて例示を目的と
して使用された特定の方法は、例えば、ヒスチジンをＣＤＲ３に含むヒト免疫グロブリン
可変ドメインによりそれらの標的に結合する、ヒト治療用結合タンパク質を作製するのに
使用され得る、抗体の可変領域を生成するのに有用である。治療剤は、細胞表面で標的に
結合し、エンドソームへと内部移行し、治療剤がリサイクルされて、さらに別の標的の分
子（例えば、別の細胞にまたは同じ細胞に）に結合し得るように、エンドソームにおいて
標的からより容易にまたはより迅速に解離するため、低ｐＨにおける結合が変化すれば、
状況によっては、より迅速な代謝回転が可能となる。様々な実施形態では、これは、治療
剤を低用量で投与するか、または治療剤をそれほど高頻度でなく投与する可能性を結果と
してもたらす。これは、安全性または毒性の理由で、高頻度で投与するかまたはある投与
量を上回って投与することが所望でない場合には特に有用である。例えば、結果として、
被験体の血清中における抗体治療剤の半減期が延長される。
【０６５１】
したがって、様々な実施形態では、再構成されたヒト軽鎖をコードする遺伝子における
コドンを、１０５、１０６、１０８、１１１位、またはこれらの組合せにおいて施すこと
ができる。例えば、１０６、１０８、および１１１位のうちの１つまたは複数とともに１
０５位；１０５、１０８、および１１１位のうちの１つまたは複数とともに１０６位；１
０５、１０６、および１１１位のうちの１つまたは複数とともに１０８位；１０５、１０
６、および１０８位のうちの１つまたは複数とともに１１１位。様々な実施形態には、他
の軽鎖（すなわち、他のＶ−Ｊ再構成に由来する）における対応する位置も含める。
【０６５２】
ヒスチジン残基を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメインを発現する非ヒト動物
記載される本発明は、ｐＨ依存性の抗原結合性特徴を有する抗原結合タンパク質を産生
しうる、遺伝子改変された非ヒト動物を提供する。様々な実施形態では、本明細書に記載
されている、遺伝子改変された非ヒト動物により産生される抗原結合タンパク質は、ｐＨ
依存性のリサイクリング効率の増大および／または血清半減期の延長を示す。特に、記載
される本発明は、免疫グロブリン重鎖遺伝子座における遺伝子改変を使用して、ヒスチジ
ンコドンをヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列へと導入し、必要に応じて、ＣＨ２ドメ
インおよび／またはＣＨ３ドメインをコードする定常領域のヌクレオチド配列に、抗体定
常領域のＦｃＲｎ受容体への結合を増大させる変異（複数可）を導入し、これにより、抗
原結合タンパク質のリサイクリングを容易とする。酸性の細胞内コンパートメント内で（
例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）は、抗原結合部位
にあるプロトン化されたヒスチジン残基に起因して、改変を含む抗原結合タンパク質は、
その標的への結合が、細胞外環境または細胞表面における（すなわち、生理学的ｐＨ、例
えば、約７．０〜約７．４の範囲のｐＨにおける）場合より緩くなり得る。したがって、
本明細書に記載されている遺伝子改変を含む抗原結合タンパク質であれば、標的介在性エ
ンドサイトーシスに続き、このような遺伝子改変を含まない野生型の抗原結合タンパク質
より、迅速または効率的にリサイクルすることが可能である。さらに、改変されたヒスチ
ジン残基は、酸性環境だけにおいてプロトン化され、中性ｐＨではプロトン化されないの
で、このような改変であれば、生理学的ｐＨにおける抗原結合タンパク質の目的の抗原に
対する結合親和性および／または特異性に影響を及ぼさないと予測される。
【０６５３】
様々な態様では、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列を含む免疫
グロブリン重鎖遺伝子座を含む非ヒト動物であって、再構成されていないヒト重鎖可変領
域のヌクレオチド配列が、少なくとも１つのヒスチジンコドンの付加または少なくとも１
つの内因性非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む非ヒト動物が提供さ
れる。
【０６５４】
様々な態様では、非ヒト動物を作製し、用いる方法もまた、提供される。目的の抗原で
免疫すると、遺伝子改変された非ヒト動物は、ヒスチジン残基を有する重鎖可変ドメイン
を含む抗原結合タンパク質を産生するＢ細胞集団であって、抗原結合タンパク質が、ｐＨ
依存性リサイクリングの増強および／または血清半減期の延長を示すＢ細胞集団を生成す
ることが可能である。様々な実施形態では、非ヒト動物は、ヒト重鎖可変ドメインを同系
のヒト軽鎖可変ドメインと共よって発現するＢ細胞集団を生成する。様々な実施形態では
、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、非ヒト動物の生殖細胞系列ゲノムに
存在する。
【０６５５】
様々な実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、全てまたは実
質的に全ての、内因性のＶＨ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、およびＪＨ遺伝子
セグメントを、欠失させるかまたは非機能性にする改変を含み、遺伝子改変された遺伝子
座は、１つまたは複数のヒスチジンコドンを有する、１つまたは複数のヒトＶＨ遺伝子セ
グメント、ヒトＤ遺伝子セグメント、および／またはヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む、
再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列を含み、ここで、再構成されていな
い重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、内因性位置に存在する（すなわち、ヌクレオチド
配列が野生型の非ヒト動物にある場合）か、または異所性に存在する（例えば、そのゲノ
ムにおける内因性免疫グロブリン鎖の遺伝子座と異なる遺伝子座に存在する、またはその
内因性の遺伝子座内に、例えば、免疫グロブリン可変遺伝子座内に存在し、ここで、該内
因性の遺伝子座は、ゲノムにおける異なる位置に配置されるか、またはゲノムにおける異
なる位置へと移動している）。一実施形態では、全ての内因性重鎖のＶ遺伝子セグメント
、Ｄ遺伝子セグメント、またはＪ遺伝子セグメントのうちの、例えば、約８０％以上、約
８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上
、または約９９％以上を、欠失させるか、または非機能性にする。一実施形態では、内因
性機能的重鎖のＶ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、またはＪ遺伝子セグメントの
うちの、例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を、欠失さ
せるか、または非機能性にする。
【０６５６】
一実施形態では、非ヒト動物は、哺乳動物である。本明細書では、ヒスチジンコドンを
マウスにおける再構成されていないヒト重鎖可変遺伝子配列へと導入することを対象とす
る実施形態について広範に論じるが、少なくとも１つのヒスチジンコドンの付加または少
なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、再構成
されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列を含有する遺伝子改変された免疫グロ
ブリン遺伝子座を含む他の非ヒト動物もまた提供される。このような非ヒト動物は、本明
細書で開示される、ヒスチジンを含有する重鎖可変ドメインを発現するように遺伝子改変
されうる、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ（例えば、雌牛、雄牛、野牛）
、シカ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、フェレット、霊長動物（例えば、マーモ
セット、アカゲザル）などを含む、非ヒト動物のうちのいずれかを含む。例えば、好適な
遺伝子改変可能なＥＳ細胞が容易に利用可能でない非ヒト動物には、他の方法を用いて、
遺伝子改変を含む非ヒト動物を作製する。このような方法は、例えば、非ＥＳ細胞ゲノム
（例えば、線維芽細胞または人工多能性細胞）を改変すること、体細胞核移植（ＳＣＮＴ
）を用いて、遺伝子改変されたゲノムを、好適な細胞、例えば、除核卵母細胞へと移植す
ること、改変された細胞（例えば、改変卵母細胞）を、胚を形成するのに好適な条件下で
、非ヒト動物に懐胎させることを含む。非ヒト動物ゲノム（例えば、ブタ、雌牛、齧歯動
物、ニワトリなどのゲノム）を改変するための方法は、例えば、亜鉛フィンガーヌクレア
ーゼ（ＺＦＮ）または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を用い
て、コードするヌクレオチド配列を含むようにゲノムを改変することを含む。  
【０６５７】
一実施形態では、非ヒト動物は、小型の哺乳動物、例えば、Ｄｉｐｏｄｏｉｄｅａ上科
またはＭｕｒｏｉｄｅａ上科の動物である。一実施形態では、遺伝子改変された動物は、
齧歯動物である。一実施形態では、齧歯動物は、マウス、ラット、およびハムスターから
選択される。一実施形態では、齧歯動物は、Ｍｕｒｏｉｄｅａ上科から選択される。一実
施形態では、遺伝子改変された動物は、Ｃａｌｏｍｙｓｃｉｄａｅ科（例えば、マウス様
ハムスター）、Ｃｒｉｃｅｔｉｄａｅ科（例えば、ハムスター、新世界ラット、およびマ
ウス、ハタネズミ）、Ｍｕｒｉｄａｅ科（真性（ｔｒｕｅ）マウスおよびラット、アレチ
ネズミ、トゲネズミ、タテガミネズミ）、Ｎｅｓｏｍｙｉｄａｅ科（キノボリネズミ、イ
ワネズミ、オジロキヌゲネズミ（ｗｉｔｈ−ｔａｉｌｅｄ  ｒａｔ）、マダカスカルラッ
トおよびマダカスカルマウス）、Ｐｌａｔａｃａｎｔｈｏｍｙｉｄａｅ科（例えば、トゲ
ヤマネ）、およびＳｐａｌａｃｉｄａｅ科（例えば、デバネズミ（ｍｏｌｅ  ｒａｔｅｓ
）、タケネズミ、およびモグラネズミ）から選択される科由来の動物である。具体的な実
施形態では、遺伝子改変された齧歯動物は、真性マウスまたはラット（Ｍｕｒｉｄａｅ科
）、アレチネズミ、トゲネズミ、およびタテガミネズミから選択される。一実施形態では
、遺伝子改変されたマウスは、Ｍｕｒｉｄａｅ科のメンバー由来のマウスである。一実施
形態では、動物は、齧歯動物である。具体的な実施形態では、齧歯動物は、マウスおよび
ラットから選択される。一実施形態では、非ヒト動物は、マウスである。
【０６５８】
一実施形態では、非ヒト動物は、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／Ｇ
ｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６
ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０
ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、およびＣ５７ＢＬ／Ｏｌａから選択されるＣ５７ＢＬ
系統のマウスである齧歯動物である。別の実施形態では、マウスは、１２９系統である。
一実施形態では、１２９系統は、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１
２９Ｓ１（例えば、１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／ＳｖＩｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ
４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１
２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、１２９Ｔ２からなる群から選択される（例えば、Fe
stingら（１９９９年）、「Revised  nomenclature  for  strain  129  mice,  Mammali
an  Genome」、１０巻：８３６頁を参照されたい;  Auerbachら（２０００年）、「Estab
lishment  and  Chimera  Analysis  of  129/SvEv-  and  C57BL/6-Derived  Mouse  Em
bryonic  Stem  Cell  Lines」もまた参照されたい）。一実施形態では、遺伝子改変され
たマウスは、前述の１２９系統と前述のＣ５７ＢＬ系統（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６系統）
とのミックスである。別の実施形態では、マウスは、前述の１２９系統のミックスまたは
前述のＣ５７ＢＬ／６系統のミックスである。一実施形態では、ミックスの１２９系統は
、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）系統である。別の実施形態では、マウスは、１
２９／ＳｖＥｖに由来する系統とＣ５７ＢＬ／６に由来する系統とのミックスである。具
体的な実施形態では、マウスは、Auerbachら、２０００年、BioTechniques、２９巻：１
０２４〜１０３２頁において記載されている、１２９／ＳｖＥｖに由来する系統とＣ５７
ＢＬ／６に由来する系統とのミックスである。別の実施形態では、マウスは、ＢＡＬＢ系
統、例えば、ＢＡＬＢ／ｃ系統である。別の実施形態では、マウスは、ＢＡＬＢ系統（例
えば、ＢＡＬＢ／ｃ系統）と別の前述の系統とのミックスである。
【０６５９】
一実施形態では、非ヒト動物は、ラットである。一実施形態では、ラットは、Ｗｉｓｔ
ａｒラット、ＬＥＡ系統、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ系統、Ｆｉｓｃｈｅｒ系統、Ｆ
３４４、Ｆ６、およびＤａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉから選択される。一実施形態では、ラット
系統は、Ｗｉｓｔａｒ、ＬＥＡ、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ、Ｆｉｓｃｈｅｒ、Ｆ３
４４、Ｆ６、およびＤａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉからなる群から選択される系統のうちの２つ
以上のミックスである。
【０６６０】
一実施形態では、非ヒト動物は、マウスである。一実施形態では、マウスは、ＶＥＬＯ
ＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスである。
【０６６１】
内因性のマウス遺伝子座における、マウス免疫グロブリン可変領域の、ヒト免疫グロブ
リン可変領域による正確な置きかえを含有するＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト
化マウス（例えば、ＵＳ６，５９６，５４１、ＵＳ７，１０５，３４８、およびＵＳ２０
１２０３２２１０８Ａ１を参照されたい）は、Ｂ細胞の発生に関して、野生型マウスとの
驚くべき顕著な類似性を提示する。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスは
、１つの重要な点だけで野生型マウスと異なり（免疫に応答して生成される可変領域は、
完全にヒト可変領域である）、免疫に対する本質的に正常な野生型応答を提示する。
【０６６２】
ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスは、内因性の遺伝子座における、マ
ウス免疫グロブリン重鎖（ＩｇＨ）およびマウス免疫グロブリン軽鎖（例えば、κ軽鎖、
Ｉｇκ）の生殖細胞系列可変領域のヌクレオチド配列の、対応するヒト免疫グロブリン可
変領域のヌクレオチド配列による正確で大スケールの置きかえを含有する（例えば、ＵＳ
６，５９６，５４１、ＵＳ７，１０５，３４８、およびＵＳ２０１２０３２２１０８Ａ１
を参照されたい）。合計で、約６メガ塩基（ｍｅｇａｂａｓｅ）のマウス遺伝子座を、約
１．５メガ塩基のヒトゲノム配列で置きかえる。この正確な置きかえにより、ヒト可変領
域およびマウス定常領域を有する重鎖および軽鎖を作製するハイブリッド免疫グロブリン
遺伝子座を有するマウスが結果としてもたらされる。マウスＶＨ−Ｄ−ＪＨセグメントお
よびＶκ−Ｊκセグメントの正確な置きかえは、ハイブリッド免疫グロブリン遺伝子座に
おけるフランキングマウス配列を無傷かつ機能的のままとする。マウスの体液性免疫系は
、野生型マウスの体液性免疫系と同様に機能する。いかなる重要な点でも、Ｂ細胞発生は
妨げられず、抗原チャレンジされると、マウスにおいて、ヒト可変領域の豊かな多様性が
生成される。
【０６６３】
重鎖およびκ軽鎖の免疫グロブリン遺伝子セグメントは、ヒトおよびマウスにおいて同
様に再構成されるために、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスが可能であ
るが、これは、それらの遺伝子座が同じということでも、ほぼ同じということでさえない
（明らかに同じではない）。しかし、遺伝子座は、重鎖可変遺伝子の遺伝子座のヒト化を
、全てのＶＨ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、およびＪＨ遺伝子セグメントを含
有する、約３百万塩基対の連続的なマウス配列を、ヒト免疫グロブリン遺伝子座からの基
本的に同等な配列を網羅する約百万塩基の連続的なヒトゲノム配列で置きかえることによ
り達成するのに十分な程度類似する。
【０６６４】
いくつかの実施形態では、ある特定のマウス定常領域のヌクレオチド配列の、ヒト定常
領域のヌクレオチド配列によるさらなる置きかえ（例えば、マウス重鎖ＣＨ１ヌクレオチ
ド配列のヒト重鎖ＣＨ１ヌクレオチド配列による置きかえ、およびマウス軽鎖定常領域の
ヌクレオチド配列の、ヒト軽鎖定常領域のヌクレオチド配列による置きかえ）により、例
えば、完全ヒト抗体断片、例えば、完全ヒトＦａｂ’を作製するのに好適な、ヒト可変領
域および部分ヒト定常領域を有する抗体を作製する、ハイブリッド免疫グロブリン遺伝子
座を有するマウスが結果としてもたらされる。ハイブリッド免疫グロブリン遺伝子座を有
するマウスは、正常な可変遺伝子セグメントの再構成、正常な体細胞超変異頻度、および
正常なクラススイッチングを示す。これらのマウスは、野生型マウスと識別不可能な体液
性免疫系を示し、Ｂ細胞発生の全ての段階で正常な細胞集団および正常なリンパ器官構造
を提示する（マウスがヒト可変領域ヌクレオチドセグメントの完全なレパートリーを欠く
場合であっても）。これらのマウスを免疫することにより、多種多様な可変遺伝子セグメ
ントの使用を提示する頑健な体液性応答が結果としてもたらされる。
【０６６５】
マウス生殖細胞系列可変領域のヌクレオチド配列の正確な置きかえは、部分ヒト免疫グ
ロブリン遺伝子座を有するマウスを作製することを可能とする。部分ヒト免疫グロブリン
遺伝子座は、再構成し、超変異し、および正常にクラススイッチするため、部分ヒト免疫
グロブリン遺伝子座は、マウスにおいて、ヒト可変領域を含む抗体を生成する。可変領域
をコードするヌクレオチド配列は、同定およびクローニングし、次いで、任意の選り抜き
の配列、例えば、特定の使用に好適な任意の免疫グロブリンアイソタイプと融合させる（
例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ系において）ことから、ヒト配列に完全に由来する抗体または
抗原結合タンパク質を結果としてもたらすことができる。
【０６６６】
様々な実施形態では、少なくとも１つのヒスチジンコドンは、Ｎ末端領域、ループ４領
域、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、またはこれらの組合せをコードする、再構成されて
いない重鎖可変領域のヌクレオチド配列に存在する。
【０６６７】
様々な実施形態では、少なくとも１つのヒスチジンコドンは、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３
、およびＦＲ４からなる群から選択されるフレームワーク領域（ＦＲ）をコードする、再
構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列に存在する。
【０６６８】
様々な態様では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、少なくとも１つのコド
ンが、ヒスチジンコドンで置きかえられたヌクレオチド配列を含む。
【０６６９】
様々な態様では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、少なくとも１つの内因
性非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、再構成されていないヒト重
鎖可変領域のヌクレオチド配列を含む。
【０６７０】
一実施形態では、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８
つ以上、９つ以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１
６以上、１７以上、１８以上、１９以上、２０以上、２１以上、２２以上、２３以上、２
４以上、２５以上、２６以上、２７以上、２８以上、２９以上、３０以上、３１以上、３
２以上、３３以上、３４以上、３５以上、３６以上、３７以上、３８以上、３９以上、４
０以上、４１以上、４２以上、４３以上、４４以上、４５以上、４６以上、４７以上、４
８以上、４９以上、５０以上、５１以上、５２以上、５３以上、５４以上、５５以上、５
６以上、５７以上、５８以上、５９以上、６０以上、または６１以上の内因性の非ヒスチ
ジンコドンを、ヒスチジンコドンで置きかえる。
【０６７１】
ヒト免疫グロブリンＤ遺伝子セグメントのリーディングフレーム使用についての先行研
究は、３つのリーディングフレーム（すなわち、終止リーディングフレーム、疎水性リー
ディングフレーム、および親水性リーディングフレーム）のうち、終止フレームの用いら
れる頻度が極めて低いことを示している。明白に、一部の終止フレームは、繰り返し用い
られ（ｃｈｅｗｅｄ  ｂａｃｋ）、結果として発現する。しかし、終止リーディングフレ
ームは、用いられる頻度が余りに低いので、ヒスチジンコドンを操作する目的では、終止
リーディングフレームを用いない方が効率的である。親水性リーディングフレームと疎水
性リーディングフレームとのどちらかとなれば、親水性リーディングフレームが好ましい
ようである。したがって、一実施形態では、１つまたは複数のヒスチジンコドンを含有す
る（終止フレームまたは疎水性フレームと比較して）ように、ヒトＤ遺伝子セグメントの
親水性リーディングフレームを操作する。
【０６７２】
当技術分野では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて変異を導入する方法、例えば、部位指向変
異生成の方法が周知である。記載される本発明のいくつかの実施形態では、一緒にライゲ
ーションし戻すための（固有の）制限酵素部位を伴って合成（例えば、化学合成）される
、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで、ヒスチジンで置換したヒトＤ遺伝子セグメントをデザインする
ことにより（例えば、Ｙコドン、Ｄコドン、およびＮコドンのＨコドンへの変異、例えば
、ＣＡＴ、ＣＡＣ）、ヒスチジンコドンを富化する。合成されるＤ遺伝子セグメントは、
上流および下流の適切な組換えシグナル配列（ＲＳＳ）を伴って作製される。一実施形態
では、互いとライゲーションされると、合成されたヒスチジンで置換したＤ遺伝子セグメ
ントは、ヒトの各Ｄ遺伝子セグメント間で観察される遺伝子間配列を含む。
【０６７３】
１つまたは複数のヒスチジンをコードするコドンは、再構成し、かつ／または体細胞超
変異すると、ヒスチジンのうちの１つまたは複数が、別のアミノ酸へと変わるように変化
しうることが理解される。しかし、これは、非ヒト動物におけるありとあらゆる再構成に
おいて、ヒスチジンをコードするありとあらゆるコドンについて生じうるわけではない。
このような変化が生じる場合、変化は、一部のＢ細胞で生じうるが、全てのＢ細胞で生じ
うるわけではなく、一部の重鎖可変配列で生じうるが、全ての重鎖可変配列で生じうるわ
けではない。
【０６７４】
様々な態様では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、ヒト重鎖のＶ遺伝子セ
グメント、Ｄ遺伝子セグメント、およびＪ遺伝子セグメントを含み、ヒトＤ遺伝子セグメ
ントのうちの少なくとも１つを、５’側から３’側にかけて、対応する野生型配列に対し
て反転させており、反転させたヒトＤ遺伝子セグメントの少なくとも１つのリーディング
フレームは、ヒスチジンコドンを含む。
【０６７５】
様々な実施形態では、ヌクレオチド配列は、１つまたは複数、２つ以上、３つ以上、４
つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０以上、１１以上、１
２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上、２
０以上、２１以上、２２以上、２３以上、２４以上、または２５以上のヒスチジンコドン
を含む。
【０６７６】
各々３つ〜５つずつのメンバーによる６つのファミリー（１つのファミリー（Ｄ７ファ
ミリー）は、単一のメンバーを有する）に２５の機能性ヒトＤ遺伝子セグメントがある。
逆方向リーディングフレーム（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ）の方が
より多くのヒスチジンコドンを示すが、ヒトＤ遺伝子セグメントの定方向組み換え（ｄｉ
ｒｅｃｔ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）の方が、反転よりはるかに高頻度である。いく
つかのＤ遺伝子セグメントおよびリーディングフレームは、他のＤ遺伝子セグメントおよ
びリーディングフレームより高頻度で用いられる。全ての機能性Ｄ遺伝子セグメントのた
めの、３つの定方向リーディングフレーム（ｄｉｒｅｃｔ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ
）の全ておよび３つの逆配向リーディングフレームの全てを、図１０Ａ〜１０Ｅに提示す
る。図１０Ａ〜１０Ｅに示される通り、逆方向リーディングフレームには、定方向リーデ
ィングフレーム内より多くのヒスチジンコドンがある。より具体的には、逆方向リーディ
ングフレームには、３４のヒスチジンがあるが、定方向リーディングフレームにおけるヒ
スチジンは４つだけである。加えて、定方向リーディングフレームにおける４つのうち、
３つのヒスチジンは、偽遺伝子によりコードされるか、または代替対立遺伝子に存在する
。したがって、ヒスチジンコドンを含有するヒト生殖細胞系列のＤ遺伝子セグメントの定
方向リーディングフレームは、ただ１つだけであり、さらなるヒスチジンコドンには、お
そらく、代替対立遺伝子（おそらく、ヒト集団のサブセットにおける）内で遭遇する。
【０６７７】
逆方向Ｄ再構成は、極めてまれである。Ｔｕａｉｌｌｏｎら（J.  Immunol.、１５４巻
（１２号）：５４５３〜６４６５頁）は、逆方向リーディングフレームの使用（限界希釈
ＰＣＴにより測定される場合の）が、極めてまれである、すなわち、定方向再構成の間接
再構成（ｉｎｄｉｒｅｃｔ  ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）に対する比は、大半の場合におい
て、１００〜１０００であることを示した。定方向再構成の間接再構成に対する比が低い
程度に応じて、それは、極めて低度の使用を示すＤセグメントだけにおいて観察された。
Ｊ１に隣接して（他のＤファミリーメンバーよりはるかに下流に）位置するＤ遺伝子セグ
メントのファミリー７が、大半は胎児で用いられ、成人では低度の使用を呈示することも
また示された（Schroederら、Immunology、３０巻、２００６年、１１９〜１３５頁）。
したがって、一実施形態では、Ｄファミリー７の配列は、５’側から３’側にかけて逆方
向ではない。
【０６７８】
一実施形態では、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ
、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０
、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５
、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０
、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、または全てもし
くは実質的に全てのヒト機能性Ｄ遺伝子セグメントは、５’側から３’側にかけて、対応
する野生型配列に対して逆方向である。
【０６７９】
一実施形態では、少なくとも１つの天然に存在しないヒスチジン残基を含むヒト免疫グ
ロブリン重鎖可変ドメインは、ｐＨ依存性の抗原結合性特徴を示す。例えば、改変された
免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含む抗体は、ほぼ中性ｐＨ（例えば、約７．０〜約７
．４のｐＨ）では、標的に十分な親和性で結合するが、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約
６．０のｐＨ）では、同じ標的に結合しないかまたは弱く結合する。一実施形態では、酸
性ｐＨは、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、および約６．０から選
択される。一実施形態では、中性ｐＨは、約７．０、約７．１、約７．２、約７．３、お
よび約７．４から選択される。
【０６８０】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺
伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ１
／２）は、２５℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、２分間未満であ
る。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖
遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ
１／２）は、３７℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、２分間未満で
ある。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重
鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（
ｔ１／２）は、２５℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、１分間未満
である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン
重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期
（ｔ１／２）は、３７℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、１分間未
満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリ
ン遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、酸性ｐＨ（
例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、解離半減期（ｔ１／２）を、中性ｐＨ（例えば
、約７．０〜約７．４のｐＨ）における抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ１／２）と
比較して、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍
、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍
、または少なくとも約３０倍短縮する。
【０６８１】
一実施形態では、遺伝子改変されたヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含む抗原結
合タンパク質は、中性ｐＨまたは生理学的ｐＨ（約７．０〜約７．４のｐＨ）において、
目的の抗原に、１０−６未満、１０−７未満、１０−８未満、１０−９未満、または１０
−１０未満、１０−１１未満、１０−１２未満の親和性（ＫＤ）で、特異的に結合するこ
とが可能である。
【０６８２】
治療抗体は、細胞表面で標的に結合し、エンドソームへと内部移行し、治療剤がリサイ
クルされて、別の細胞に存在するさらに別の標的の分子に結合しうるように、エンドソー
ム内で標的からより容易にまたはより迅速に解離するため、酸性ｐＨ（例えば、約５．５
〜約６．０のｐＨ）において免疫グロブリン重鎖可変ドメインの変化させた結合特性は、
状況によっては、抗体の代謝回転の増大を可能とする。これは、治療抗体を低用量で投与
するか、または治療抗体をそれほど高頻度でなく投与することを可能とする。これは、安
全性または毒性の理由で、治療抗体を高頻度で投与するかまたはある特定の投与量を上回
るレベルで投与することが望ましくない状況では特に有用である。
【０６８３】
様々な実施形態では、本明細書に記載されているヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌ
クレオチド配列は、ヒトまたは非ヒトの重鎖定常領域のヌクレオチド配列（例えば、Ｉｇ
Ｍ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、およびＩｇＡから選択される免疫グロブリンアイソタイプ
をコードする重鎖定常領域のヌクレオチド配列）に作動可能に連結されている。様々な実
施形態では、ヒトまたは非ヒトの重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ＣＨ１、ヒンジ、
ＣＨ２、ＣＨ３、およびこれらの組合せからなる群から選択される。一実施形態では、定
常領域のヌクレオチド配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３（例えば、ＣＨ１
−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）を含む。
【０６８４】
様々な実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、内因性遺伝子座に存在する
（すなわち、ヌクレオチド配列が野生型の非ヒト動物にある場合）か、または異所性に存
在する（例えば、そのゲノムにおける内因性免疫グロブリン鎖の遺伝子座と異なる遺伝子
座に存在する、またはその内因性の遺伝子座内に、例えば、免疫グロブリン可変遺伝子座
内に存在し、ここで、該内因性の遺伝子座は、ゲノムにおける異なる位置に配置されるか
、またはゲノムにおける異なる位置へと移動している）。
【０６８５】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ＣＨ２におけるまたはＣＨ３に
おける改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲である
エンドソーム内で）重鎖定常領域アミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を
含む。
【０６８６】
ＩｇＧに対する胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）は、母体からその胎児への、胎盤および
近位小腸を介する受動体液性免疫の移入において、十分に特徴づけられている（Roopenia
n,  D.およびAkilesh,  S.、Nat.  Rev.  Immun.、２００７年、７巻：７１５〜７２５頁
）。ＦｃＲｎは、ＩｇＧのＦｃ部分に、古典的なＦｃγＲまたは補体活性化の古典的な経
路を開始する補体のＣ１ｑ成分の結合部位とは異なる部位で結合する。より具体的には、
ＦｃＲｎは、ＩｇＧ抗体のＣＨ２−ＣＨ３間のヒンジ領域（ブドウ球菌プロテインＡ、連
鎖球菌プロテインＧ、およびリウマチ因子にも結合するＦｃの多目的領域）に結合するこ
とが示された。しかし、他のＦｃ結合タンパク質とは異なり、ＦｃＲｎは、ＩｇＧのＦｃ
領域に、厳密にｐＨ依存的な様式で結合する。生理学的なｐＨ７．４では、ＦｃＲｎは、
ＩｇＧに結合しないのに対し、エンドソーム（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範
囲である）の酸性ｐＨでは、ＦｃＲｎは、ＩｇＧのＦｃ領域に対して、低マイクロモル濃
度〜ナノモル濃度の親和性を示す。このｐＨ依存性相互作用は、ＩｇＧのＣＨ２−ＣＨ３
間領域におけるヒスチジン残基の滴定（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）、およびＦｃＲｎの表面上
の酸性残基とのそれらの後続の相互作用により媒介されることが示されている（Roopenia
n,  D.およびAkilesh,  S.、Nat.  Rev.  Immun.、２００７年、７巻：７１５〜７２５頁
）。
【０６８７】
当技術分野では、酸性ｐＨにおけるＦｃ領域のＦｃＲｎへの親和性を増大させうる、Ｉ
ｇＧのＣＨ２−ＣＨ３間領域における様々な変異が公知である。これらは、２５０位にお
ける改変（例えば、ＥまたはＱ）；２５０および４２８位における改変（例えば、Ｌまた
はＦ）；２５２位における改変（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／ＷまたはＴ）、２５４位における
改変（例えば、ＳまたはＴ）、および２５６位における改変（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／
ＤまたはＴ）；または４２８および／もしくは４３３位における改変（例えば、Ｌ／Ｒ／
Ｓ／Ｐ／ＱまたはＫ）、および／もしくは４３４位における改変（例えば、Ｈ／Ｆまたは
Ｙ）；または２５０および／もしくは４２８位における改変；または３０７もしくは３０
８位における改変（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）、ならびに４３４位における改変を
含むが、これらに限定されない。別の例では、改変は、４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８Ｌ）
および４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）の改変；４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えば、Ｖ２５９
Ｉ）、および３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）の改変；４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３Ｋ）
および４３４位（例えば、４３４Ｙ）における改変；２５２、２５４、および２５６位（
例えば、５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅ）における改変；２５０Ｑおよび４２８Ｌの
改変、またはこれらの組合せを含みうる。
【０６８８】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、２５２位のアミノ酸残基と２５
７位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、
ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣＨ２のアミノ酸配列
のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣＨ２のアミノ酸配列をコードする
。
【０６８９】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、３０７位のアミノ酸残基と３１
１位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、
ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣＨ２のアミノ酸配列
のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣＨ２のアミノ酸配列をコードする
。
【０６９０】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、４３３位のアミノ酸残基と４３
６位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、
ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣＨ３のアミノ酸配列
のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣＨ３のアミノ酸配列をコードする
。
【０６９１】
一実施形態では、本明細書に記載されている重鎖定常領域のヌクレオチド配列によりコ
ードされるヒト定常領域のアミノ酸配列は、Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ｓ、およびこれらの組
合せからなる群から選択される変異を含む。一実施形態では、ヒト定常領域のアミノ酸配
列は、Ｍ４２８Ｌ、Ｖ２５９Ｉ、Ｖ３０８Ｆ、およびこれらの組合せからなる群から選択
される変異を含む。一実施形態では、ヒト定常領域のアミノ酸配列は、Ｎ４３４Ａ変異を
含む。一実施形態では、ヒト定常領域のアミノ酸配列は、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２
５６Ｅ、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異を含む。一実施形態では、
ヒト定常領域のアミノ酸配列は、Ｔ２５０Ｑ、Ｍ２４８Ｌ、またはこれらの両方からなる
群から選択される変異を含む。一実施形態では、ヒト定常領域のアミノ酸配列は、Ｈ４３
３Ｋ、Ｎ４３４Ｙ、またはこれらの両方からなる群から選択される変異を含む。
【０６９２】
一実施形態では、重鎖定常領域アミノ酸配列は、非ヒト定常領域のアミノ酸配列であり
、重鎖定常領域アミノ酸配列は、上記の種類の改変のうちのいずれかのうちの１つまたは
複数を含む。
【０６９３】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列
であり、ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列は、上記の種類の改変のうちのいずれかのうちの
１つまたは複数を含む。
【０６９４】
免疫グロブリン軽鎖遺伝子における工学的に作製したヒスチジン残基
様々な実施形態では、ｐＨ依存性の抗原結合を示すヒト抗体分子をコードするヌクレオ
チド配列（複数可）、例えば、ｐＨ依存性の抗原結合を示す抗体をコードする、再構成さ
れたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列を含む、免疫グロブリン軽鎖のヌクレオチド配
列をそれらのゲノムに、例えば、それらの生殖細胞系列に含む、遺伝子改変された非ヒト
動物（例えば、例えば、マウス、ラット、ウサギなどの哺乳動物）；これと同じ免疫グロ
ブリン軽鎖のヌクレオチド配列を含む胚、細胞、および組織；これらを作製する方法；な
らびにこれらを使用する方法が提供される。
【０６９５】
本発明者らは、ｐＨ依存的な様式で抗原への結合が可能な抗体を発現する非ヒト動物を
、軽鎖の配列に沿った１つまたは複数の位置において免疫グロブリン軽鎖可変領域の改変
を施すことにより作製し得ることを発見した。動物が、抗体のＣＤＲ内でヒスチジンを発
現するように、非ヒト動物の生殖細胞系列内に改変を施す方法が記載される。特に、マウ
スの生殖細胞系列内の免疫グロブリン軽鎖可変配列内に改変を施すための方法が記載され
る。例えば、軽鎖の可変領域配列は典型的に、可変領域配列に沿った体細胞超変異を示す
。場合によって、このような変異は、ヒスチジン残基による置換（例えば、図１５を参照
されたい）を結果としてもたらし得る。このような変異は、抗原結合の一因となる可変ド
メインの領域である相補性決定領域（ＣＤＲ）内でもなお生じ得る。場合によって、この
ような変異は、ｐＨ依存性の抗原結合を示す、例えば、酸性ｐＨにおける抗原結合の、中
性ｐＨにおける抗原結合と比較した低減を示す抗体を結果としてもたらし得る。このよう
なｐＨ依存性の抗原結合が所望される。なぜなら、抗体が、細胞の外部の抗原に結合し、
エンドソームへと内部移行すると、抗原を放出し、表面へと再度リサイクルされて、別の
抗原に結合し、標的介在性クリアランスを回避することを可能とし得るからである。ラン
ダムｈｉｓスキャニング変異生成を用いて、抗ＩＬ−６Ｒ抗体におけるｐＨ依存性の結合
特性を操作することにより、ヒスチジン残基を導入して、この効果を達成するための手法
が報告されている（ＵＳ２０１１／０１１１４０６Ａ１）。しかし、抗体残基のランダム
変異生成は、抗体の抗原への親和性の低下を結果としてもたらし得る。抗体配列内のヒス
チジン置換を発現させるために遺伝子改変された非ヒト動物は、目的の抗原に応答する高
親和性抗体であって、ヒスチジン改変（複数可）に起因して、ｐＨ依存性の抗原結合もま
た提示する高親和性抗体の生成を可能とする。
【０６９６】
したがって、様々な実施形態では、抗原にｐＨ依存的な様式で結合することが可能な抗
体を発現する動物を結果としてもたらす改変を含む、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配
列をそのゲノム内に、例えば、その生殖細胞系列に含む、遺伝子改変された非ヒト動物（
例えば、齧歯動物、例えば、マウスまたはラット）が本明細書において提供される。一実
施形態では、非ヒト動物は、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンに
よる置換（場合によってまた、「ヒスチジン置換」、「ヒスチジンコドン置換」などとも
称し得る）を含む、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列（例えば、ＶＬセグメント配列
および／またはＪＬセグメント配列）内の改変を含む。一実施形態では、動物は、ヒト免
疫グロブリン軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ；例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／ま
たはＣＤＲ３）のヌクレオチド配列内に、少なくとも１カ所の、非ヒスチジンコドンのヒ
スチジンコドンによる置換を含む。一実施形態では、置換は、ＣＤＲ３コドンにおいてで
ある。一実施形態では、軽鎖は、κ軽鎖である。一実施形態では、動物は、少なくとも１
つのアミノ酸のヒスチジンによる置換を含む免疫グロブリン軽鎖、例えば、軽鎖ＣＤＲ、
例えば、軽鎖ＣＤＲ３を発現する。別の実施形態では、軽鎖は、λ軽鎖である。さらに別
の実施形態では、マウスは、κ軽鎖内およびλ軽鎖内のいずれにおいても、少なくとも１
つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む。
【０６９７】
ヒスチジン残基は、２つの異なるコドン、ＣＡＴおよびＣＡＣ（デオキシリボ核酸残基
）によりコードされる。したがって、非ヒスチジンコドンは、ＣＡＴまたはＣＡＣで置換
することができる。置換は、その生殖細胞系列内の立体配置（すなわち、非体細胞変異状
態）では、ヒスチジン残基をコードしないコドンにおいて操作する。
【０６９８】
一実施形態では、軽鎖は、ユニバーサル軽鎖（また、共通軽鎖とも称する）である。米
国特許出願第１３／０２２，７５９号、同第１３／０９３，１５６号、同第１３／４１２
，９３６号、および同第１３／４８８，６２８号（米国出願公開第２０１１／０１９５４
５４号、同第２０１２／００２１４０９号、同第２０１２／０１９２３００号、および同
第２０１３／００４５４９２号）において記載されている通り、複数の重鎖のために共通
軽鎖を選択する非ヒト動物（例えば、マウス）は、実際的な有用性を有する。様々な実施
形態では、共通の軽鎖だけを含む、非ヒト動物で発現される抗体は、同一であるか実質的
に同一の軽鎖と会合して発現することができる重鎖を有する。これは、二重特異性抗体の
作製で特に有益である。例えば、そのような動物は第一の免疫原で免疫して、第一のエピ
トープに特異的に結合する抗体を発現するＢ細胞を生成することができる。動物（または
、遺伝的に同じ動物）は、第二の免疫原で免疫して、第二のエピトープに特異的に結合す
る抗体を発現するＢ細胞を生成することができる。重鎖可変領域はＢ細胞からクローニン
グすることができ、細胞中で同じ重鎖定常領域および同じ軽鎖（例えば、共通軽鎖）と共
に発現されて二重特異性抗体を作製することができ、ここで、二重特異性抗体の重鎖成分
は、同じ軽鎖成分と会合して発現するように動物によって選択される。記載される様々な
実施形態では、遺伝子操作マウスの可変領域は、ヒト可変領域である。
【０６９９】
したがって、ヒト可変領域が生殖細胞系列配列から逸脱する重鎖、例えば親和性成熟ま
たは体細胞変異可変領域を含む、重鎖のかなり多様なファミリーと好適に対合する免疫グ
ロブリン軽鎖を生成することができるマウスが操作された。様々な実施形態では、マウス
は、ヒト軽鎖可変ドメインが、体細胞変異を含むヒト重鎖可変ドメインと対合するように
工夫され、このようにして、ヒト治療法として使用するのに適する高親和性結合タンパク
質への経路を可能にする。
【０７００】
生物体における抗体選択の長く複雑なプロセスを介して、遺伝子操作マウスは、ヒト重
鎖可変ドメインの多様なコレクションを限定された数のヒト軽鎖選択肢と対合させること
において、生物学的に適当な選択をする。これを達成するために、多様なヒト重鎖可変ド
メイン選択肢と一緒に限定された数のヒト軽鎖可変ドメイン選択肢を提示するようにマウ
スは操作される。免疫原チャレンジに際して、マウスは免疫原に対する抗体を発生させる
ためにそのレパートリーにおける解法の数を最大にし、これは、そのレパートリーでの軽
鎖選択肢の数によって大きく、またはそれ単独で制限される。様々な実施形態では、これ
は、軽鎖可変ドメインの好適で適合性の体細胞変異をマウスに達成させることを含み、該
変異は、それにもかかわらず、特に体細胞変異ヒト重鎖可変ドメインを含む、比較的多様
なヒト重鎖可変ドメインに適合する。
【０７０１】
米国出願公開第２０１１／０１９５４５４号、同第２０１２／００２１４０９号、同第
２０１２／０１９２３００号、および同第２０１３／００４５４９２号において記載され
ている、操作された共通軽鎖マウスは、軽鎖選択肢の限定されたレパートリー、例えば、
２つ以下のＶＬセグメントまたは単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域
配列を含む、共通軽鎖またはユニバーサル軽鎖「ＵＬＣ」をコードする核酸配列を含んだ
。このような限られたレパートリーを達成するために、天然のマウス軽鎖可変ドメインを
作製または再構成する能力を、非機能的または実質的に非機能的にするようにマウスを操
作する。１つの態様において、これは、例えば、マウスの軽鎖可変領域遺伝子セグメント
を欠失させることによって達成された。以前に記載されたとおり、内因性マウス遺伝子座
は、次に、外来性のヒト可変領域遺伝子セグメントが内因性マウス軽鎖定常領域遺伝子と
組み合わさることができ、再構成されたリバースキメラ軽鎖遺伝子（ヒト可変、マウス定
常）を形成することができる方法で、選択された外来性の好適なヒト軽鎖可変領域遺伝子
セグメント（これは、内因性のマウス軽鎖定常ドメインに作動可能に連結される）によっ
て改変され得る。様々な実施形態では、軽鎖可変領域は、体細胞変異させることが可能で
ある。様々な実施形態では、体細胞変異を得る軽鎖可変領域の能力を最大にするために、
適切なエンハンサー（複数可）がマウスで保持される。１つの態様において、ヒトκ軽鎖
遺伝子セグメントで内因性マウスκ軽鎖遺伝子セグメントを置換するためにマウスκ軽鎖
遺伝子座を改変することにおいて、マウスのκイントロンエンハンサーおよびマウスκ３
’エンハンサーは機能的に維持されるか、破壊されない。
【０７０２】
したがって、多様なリバースキメラ（ヒト可変、マウス定常）重鎖と会合する限られた
レパートリーのリバースキメラ（ヒト可変、マウス定常）軽鎖を発現する遺伝子操作マウ
スが提供された。様々な実施形態では、内因性マウスκ軽鎖領域遺伝子セグメントが欠失
し、内因性マウスＣκ遺伝子に作動可能に連結された単一の（または２つの）再構成され
たヒト軽鎖領域で置換される。再構成されたヒト軽鎖領域の体細胞超変異を最大にするた
めの実施形態では、マウスκイントロンエンハンサーおよびマウスκ３’エンハンサーが
維持される。様々な実施形態では、マウスは非機能的なλ軽鎖遺伝子座、またはその欠失
、またはその遺伝子座がλ軽鎖を作製できないようにする欠失をさらに含む。
【０７０３】
ユニバーサル軽鎖マウスは、多様なＶＨセグメント、ＤＨセグメント、およびＪＨセグ
メントのレパートリーを含む、重鎖可変領域配列の多様なレパートリーを使用することが
可能な、様々な抗原に応答する抗体を生成した。このような遺伝子操作ＵＬＣマウスにお
いて生成される抗体は、二重特異性治療抗体をデザインするのに有用であるが、他の任意
の抗体と同様に、各二重特異性抗体も、血漿中のその寿命の間に１つの標的だけに結合す
ることが可能であり、その抗体は、エンドソームへと内部移行して、リソソーム分解の標
的とされる。研究は、ＭＨＣクラスＩ様Ｆｃγ受容体であるＦｃＲｎが、免疫グロブリン
を、ソーティングエンドソームから細胞表面へとリサイクリングして戻すことにより、リ
ソソーム分解からレスキューすることが可能であることを示している（SimisterおよびMo
stov  （１９８９年）、An  Fc  receptor  structurally  related  to  MHC  class  I
antigens、Nature、３３７巻：１８４〜８７頁）。上記で説明した通り、抗体リサイク
リングの効率を改善するには、抗体配列へのさらなる改変、例えば、酸性ｐＨ（例えば、
エンドソームのｐＨ）では、抗原結合の低下を結果としてもたらすが、中性ｐＨ（例えば
、血液などの体液のｐＨ）では、抗体−抗原の親和性および特異性を保持する改変が有益
である。ユニバーサル軽鎖配列内の非ヒスチジン残基をヒスチジン残基で置換した、本明
細書に記載されている非ヒト動物は、ｐＨ依存性結合もまた提示する、例えば、酸性ｐＨ
における抗原への結合の、中性ｐＨにおける抗原への結合と対比した低減もまた提示する
、ユニバーサル軽鎖フォーマットに基づく高親和性抗体を産生することが可能であるため
に有益である。
【０７０４】
したがって、一実施形態では、ヒト軽鎖可変領域の限定されたレパートリー、またはヒ
ト軽鎖可変遺伝子セグメントの限定されたレパートリーからの単一のヒト軽鎖可変領域を
そのゲノム内に、例えば、その生殖細胞系列内に含む非ヒト動物（例えば、齧歯動物、例
えば、マウスまたはラット）であって、ヒト軽鎖可変領域（複数可）が、少なくとも１カ
所の、非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む非ヒト動物が本明細書に
提供される。いくつかの実施形態では、提供される非ヒト動物を、単一の軽鎖を発現する
（または２つの軽鎖の一方もしくは両方を発現する）、再構成されたヒト軽鎖可変領域遺
伝子（または２つの再構成された軽鎖可変領域遺伝子）を形成するように再構成する、単
一の再構成されていないヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメント（または２つのヒト軽鎖可変
領域遺伝子セグメント）を含むように遺伝子操作し、ここで、軽鎖可変領域遺伝子（複数
可）は、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む。こ
れらのヒスチジン置換した軽鎖可変領域遺伝子（複数可）によりコードされる、再構成さ
れたヒト軽鎖可変ドメインは、動物により選択される、複数の親和性成熟させたヒト重鎖
であって、重鎖可変領域が異なるエピトープに特異的に結合するヒト重鎖と対合すること
が可能である。様々な実施形態では、少なくとも１カ所の、非ヒスチジン残基のヒスチジ
ン残基による置換は、同種の（ｃｏｇｎａｔｅ）重鎖と共に発現すると、その抗原にｐＨ
依存的な様式で結合する、再構成されたヒト軽鎖を結果としてもたらす。
【０７０５】
ヒト軽鎖可変ドメインの限定されたレパートリー、またはヒト軽鎖可変領域遺伝子配列
の限定されたレパートリーからの単一のヒト軽鎖可変ドメインを発現する遺伝子操作動物
であって、可変領域遺伝子配列が、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコ
ドンによる置換を含む遺伝子操作動物が提供される。いくつかの実施形態では、提供され
る動物を、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含み、
単一の軽鎖の可変領域を発現する（または２つの可変領域の一方もしくは両方を発現する
）、単一のＶ／Ｊヒト軽鎖配列（または２つのＶ／Ｊ配列）を含むように遺伝子操作する
。一態様では、可変配列を含む軽鎖は、動物によりクローン選択される、複数の親和性成
熟させたヒト重鎖であって、重鎖可変領域が異なるエピトープに特異的に結合するヒト重
鎖と対合させることが可能である。一実施形態では、抗体は、その抗原（複数可）にｐＨ
依存的な様式で結合する。一実施形態では、単一のＶ／Ｊヒト軽鎖配列は、Ｖκ１−３９
Ｊκ５およびＶκ３−２０Ｊκ１から選択される。一実施形態では、２つのＶ／Ｊ配列は
、Ｖκ１−３９Ｊκ５およびＶκ３−２０Ｊκ１である。一実施形態では、Ｖκ１−３９
Ｊκ５配列およびＶκ３−２０Ｊκ１配列は、再構成されたＶ／Ｊ配列である。
【０７０６】
一態様では、ヒトＪＬ遺伝子セグメント（１つまたは複数のＪＬセグメントから選択さ
れる）と共に再構成することが可能であり、免疫グロブリン軽鎖のヒト可変ドメインをコ
ードすることが可能な、単一のヒト免疫グロブリン軽鎖ＶＬ遺伝子セグメントを含む、遺
伝子改変された非ヒト動物であって、単一のヒト免疫グロブリン軽鎖ＶＬ遺伝子セグメン
トおよび／またはヒトＪＬ遺伝子セグメントが、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンの
ヒスチジンコドンによる置換を含む、遺伝子改変された非ヒト動物が提供される。別の態
様では、それらの各々が、ヒトＪＬ遺伝子セグメント（１つまたは複数のＪＬセグメント
から選択される）と共に再構成することが可能であり、免疫グロブリン軽鎖のヒト可変ド
メインをコードすることが可能な、２つ以下のヒトＶＬ遺伝子セグメントを含む遺伝子改
変マウスであって、２つ以下のＶＬ遺伝子セグメントおよび／またはＪＬ遺伝子セグメン
トの各々が、少なくとも１つの非ヒスチジン残基のヒスチジン残基による置換を含む遺伝
子改変マウスが提供される。
【０７０７】
本明細書では、ヒトＶＬ配列およびヒトＪＬ配列を含む、単一の、再構成されたヒト免
疫グロブリン軽鎖可変領域配列をそのゲノム内に、例えば、その生殖細胞系列内に含む、
遺伝子改変された非ヒト動物であって、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可
変領域が、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、
遺伝子改変された非ヒト動物もまた提供される。一態様では、単一の、再構成されたヒト
免疫グロブリン軽鎖可変領域配列は、ヒスチジン置換（複数可）を除けば、ヒト生殖細胞
系列のＶＬ遺伝子配列およびＪＬ遺伝子配列に由来する。一実施形態では、ヒト免疫グロ
ブリン軽鎖は、ヒト免疫グロブリンκ鎖である。したがって、一実施形態では、ヒトＶＬ
遺伝子配列は、Ｖκ１−３９およびＶκ３−２０から選択される。一実施形態では、単一
の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列は、再構成されたＶκ１−３９／
Ｊ配列またはＶκ３−２０／Ｊ配列を含む。一実施形態では、ヒトＪＬ遺伝子配列は、Ｊ
κ１、Ｊκ２、Ｊκ３、Ｊκ４、およびＪκ５から選択される。一実施形態では、ヒトＪ
Ｌ配列は、Ｊκ１およびＪκ５から選択される。一実施形態では、単一の、再構成された
ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列は、Ｖκ１−３９Ｊκ５およびＶκ３−２０Ｊκ１
から選択される（例えば、ヒスチジン置換（複数可）を除けば）。代替的な実施形態では
、ヒト免疫グロブリン軽鎖は、ヒトλ鎖である。
【０７０８】
一実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換
は、軽鎖可変ドメインの相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするヌクレオチド配列内にあ
る。一実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置
換は、軽鎖可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３をコードするヌクレオチ
ド配列内にある。具体的な一実施形態では、置換は、ＣＤＲ３をコードするヌクレオチド
配列内にある。
【０７０９】
一態様では、置換は、ヒト軽鎖可変領域遺伝子配列のＣＤＲ３コドンにおける、少なく
とも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換である。一実施形態では、
置換は、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ超のＣＤＲ３コドンの置換である。単一の
、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域が、Ｖκ１−３９Ｊκ５可変領域である
実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置きかえ
は、１０５、１０６、１０８、１１１位、およびこれらの組合せから選択される位置にお
いてヒスチジンを発現するようにデザインされた、ＣＤＲ３をコードする免疫グロブリン
軽鎖遺伝子配列内の位置における置きかえを含む。一実施形態では、置きかえは、１０５
および１０６位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施形態では、置
きかえは、１０５および１１１位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。一
実施形態では、置きかえは、１０５および１０８位においてヒスチジンを発現するように
デザインする。一実施形態では、置きかえは、１０５、１０８、および１１１位において
ヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施形態では、置きかえは、１０５、１０
６、および１０８位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施形態では
、置きかえは、１０６および１０８位においてヒスチジンを発現するようにデザインする
。一実施形態では、置きかえは、１０６および１１１位においてヒスチジンを発現するよ
うにデザインする。一実施形態では、置きかえは、１０８および１１１位においてヒスチ
ジンを発現するようにデザインする。一実施形態では、置きかえは、１０６、１０８、お
よび１１１位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。さらに別の実施形態で
は、置きかえは、１０６、１０８、および１１１位においてヒスチジンを発現するように
デザインする。一実施形態では、置きかえは、１０５、１０６、および１１１位において
ヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施形態では、置きかえは、１０５、１０
６、１０８、および１１１位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。ヒスチ
ジン置換した領域の核酸配列およびアミノ酸配列を、図１６の配列アラインメントに示し
、配列番号３２７〜３５７にも示す。
【０７１０】
単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域が、Ｖκ３−２０Ｊκ１可変領
域である実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる
置きかえは、１０５、１０６、１０７、１０９位、およびこれらの組合せから選択される
位置においてヒスチジンを発現するようにデザインされた、ＣＤＲ３領域をコードする免
疫グロブリン軽鎖遺伝子配列内の位置における置きかえを含む。一実施形態では、置きか
えは、１０５および１０６位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施
形態では、置きかえは、１０５および１０７位においてヒスチジンを発現するようにデザ
インする。一実施形態では、置きかえは、１０５および１０９位においてヒスチジンを発
現するようにデザインする。一実施形態では、置きかえは、１０６および１０７位におい
てヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施形態では、置きかえは、１０６およ
び１０９位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施形態では、置きか
えは、１０７および１０９位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施
形態では、置きかえは、１０５、１０６、および１０７位においてヒスチジンを発現する
ようにデザインする。一実施形態では、置きかえは、１０５、１０７、および１０９位に
おいてヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施形態では、置きかえは、１０６
、１０８、および１１１位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施形
態では、置きかえは、１０５、１０６、および１０９位においてヒスチジンを発現するよ
うにデザインする。別の実施形態では、置きかえは、１０５、１０６、１０７、および１
０９位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。例示的な、ヒスチジン置換し
た領域の核酸配列およびアミノ酸配列を、図２７の配列アラインメントに示し、配列番号
３９８〜４０３に示す。
【０７１１】
アミノ酸位置（１０５、１０６位など）は、Lefrancら（２００３年）、Dev.  Comp.  
Immunol.、２７巻：５５〜７７頁において記載されている固有の番号付けに基づいており
、また、www.imgt.org上でも調べることができる。
【０７１２】
一実施形態では、ヒトＶＬ遺伝子セグメントを、ヒトリーダー配列または非ヒトリーダ
ー配列に作動可能に連結する。一実施形態では、リーダー配列は、非ヒトリーダー配列で
ある。具体的な実施形態では、非ヒトリーダー配列は、マウスＶκ３−７リーダー配列で
ある。具体的な実施形態では、リーダー配列を、再構成されていないヒトＶＬ遺伝子セグ
メントに作動可能に連結する。具体的な実施形態では、リーダー配列を、再構成されたヒ
トＶＬ／ＪＬ配列に作動可能に連結する。したがって、具体的な一実施形態では、少なく
とも１つのヒスチジン置換を含む、単一の、再構成されたＶκ１−３９／Ｊκ５可変領域
遺伝子配列またはＶκ３−２０／Ｊκ１可変領域遺伝子配列を、マウスＶκ３−７リーダ
ー配列に作動可能に連結する。
【０７１３】
一実施形態では、ＶＬ遺伝子セグメントを、免疫グロブリンプロモーター配列に作動可
能に連結する。一実施形態では、プロモーター配列は、ヒトプロモーター配列である。具
体的な実施形態では、ヒト免疫グロブリンプロモーターは、ヒトＶκ３−１５プロモータ
ーである。具体的な実施形態では、プロモーターを、再構成されていないヒトＶＬ遺伝子
セグメントに作動可能に連結する。具体的な実施形態では、プロモーターを、再構成され
たヒトＶＬ／ＪＬ配列に作動可能に連結する。したがって、具体的な一実施形態では、少
なくとも１つのヒスチジン置換を含む、単一の、再構成されたＶκ１−３９／Ｊκ５可変
領域遺伝子配列またはＶκ３−２０／Ｊκ１可変領域遺伝子配列を、ヒトＶκ３−１５プ
ロモーターに作動可能に連結する。
【０７１４】
一実施形態では、軽鎖遺伝子座は、５’側（ＶＬ遺伝子セグメントの転写方向に対して
）でヒト免疫グロブリンプロモーターと隣接し、３’側でヒトＪＬセグメントと共に再構
成するヒトＶＬ遺伝子セグメントと隣接した、リーダー配列を含み、内因性非ヒト軽鎖定
常領域（ＣＬ）を含むリバースキメラ軽鎖の可変ドメインをコードする。具体的な実施形
態では、ＶＬ遺伝子セグメントおよびＪＬ遺伝子セグメントは、非ヒトＶκ遺伝子座にあ
り、非ヒトＣＬは、非ヒトＣκ（例えば、マウスＣκ）である。具体的な一実施形態では
、可変領域配列を、非ヒト定常領域配列、例えば、非ヒトＣκ遺伝子配列に作動可能に連
結する。
【０７１５】
一実施形態では、軽鎖遺伝子座は、５’側（ＶＬ遺伝子セグメントの転写方向に対して
）でヒト免疫グロブリンプロモーターと隣接し、３’側で再構成されたヒト可変領域配列
（ＶＬ／ＪＬ配列）と隣接した、リーダー配列を含み、内因性非ヒト軽鎖定常領域（ＣＬ
）を含むリバースキメラ軽鎖の可変ドメインをコードする。具体的な実施形態では、再構
成されたヒトＶＬ／ＪＬ配列は、非ヒトカッパ（κ）遺伝子座にあり、非ヒトＣＬは、非
ヒトＣκである。具体的な一実施形態では、再構成されたヒト可変領域配列を、非ヒト免
疫グロブリン軽鎖定常領域配列、例えば、非ヒトＣκ遺伝子配列に作動可能に連結する。
一実施形態では、非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域配列は、内因性非ヒト配列である。
一実施形態では、非ヒト動物は、マウスであり、Ｃκ遺伝子配列は、マウスＣκ遺伝子配
列である。一実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンに
よる置換を含む、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列は、内因性非ヒト（
例えば、マウス）免疫グロブリン軽鎖遺伝子座（κ遺伝子座）にある。遺伝子座の例示的
な実施形態を、図２３Ｃ、２３Ｅ、２９Ｃ、および２９Ｄに提示する。
【０７１６】
一実施形態では、遺伝子改変された非ヒト動物は、マウスであり、マウスの可変領域遺
伝子座は、κ軽鎖遺伝子座であり、κ軽鎖遺伝子座は、マウスκイントロンエンハンサー
、マウスκ３’側エンハンサー、またはイントロンエンハンサーおよび３’側エンハンサ
ーの両方を含む。
【０７１７】
一実施形態では、非ヒト動物（例えば、齧歯動物、例えば、ラットまたはマウス）は、
非機能的な免疫グロブリンラムダ（λ）軽鎖遺伝子座を含む。具体的な実施形態では、λ
軽鎖遺伝子座は、遺伝子座の１つまたは複数の配列の欠失であって、λ軽鎖遺伝子座を再
構成して、軽鎖遺伝子を形成することを不可能とする１つまたは複数の欠失を含む。別の
実施形態では、λ軽鎖遺伝子座のＶＬ遺伝子セグメントの全てまたは実質的に全てを欠失
させる。一実施形態では、非ヒト動物（例えば、齧歯動物、例えば、マウスまたはラット
）は、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、再構
成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列を含み、機能的な、再構成されていない免
疫グロブリン軽鎖可変領域、例えば、内因性の、再構成されていない軽鎖可変領域を欠く
。一実施形態では、再構成された、ヒスチジン置換したヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域
遺伝子配列により、内因性の、再構成されていない免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配
列を置きかえる。
【０７１８】
一実施形態では、動物により、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコド
ンによる置換を含むヒト可変領域配列に由来する体細胞変異可変ドメインを含む軽鎖を作
製する。一実施形態では、軽鎖は、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコ
ドンによる置換を含む、ヒト可変領域配列に由来する体細胞変異可変ドメイン、および非
ヒトＣκ領域を含む。一実施形態では、非ヒト動物は、λ軽鎖を発現しない。
【０７１９】
当業者ならば、少なくとも１つの非ヒスチジン残基のヒスチジン残基による置換（複数
可）を、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域へと遺伝子操作しても、体細胞超変異に起因し
て、遺伝子改変された非ヒト動物において生成される全ての抗体が、このヒスチジン残基
（複数可）を、操作された位置（複数可）において保有するわけではないことを十分に理
解する。しかし、非ヒト動物における広範な抗体レパートリーの生成は、ｉｎ  ｖｉｖｏ
において生成される抗原特異的抗体であって、目的の抗原に対する高親和性を提示する一
方で、生殖細胞系列へと導入され、したがって、ｐＨ依存性の抗原結合を示すヒスチジン
改変を保持する抗原特異的抗体について選択することを可能とする。
【０７２０】
したがって、一実施形態では、動物は、非ヒスチジンアミノ酸のヒスチジンコドンによ
る少なくとも１つの置換を保持する。一実施形態では、動物は、その可変領域遺伝子へと
導入された、その体細胞変異軽鎖可変ドメイン内の全てまたは実質的に全てのヒスチジン
置換を保持する。
【０７２１】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物はまた、Ｖ
Ｈ遺伝子セグメント配列、ＤＨ遺伝子セグメント配列、およびＪＨ遺伝子セグメント配列
を含む、再構成されていない免疫グロブリン重鎖可変領域もそのゲノム内に、例えば、そ
の生殖細胞系列に含む。一実施形態では、ＶＨ遺伝子セグメント配列、ＤＨ遺伝子セグメ
ント配列、およびＪＨ遺伝子セグメント配列は、ヒトＶＨ遺伝子セグメント配列、ヒトＤ
Ｈ遺伝子セグメント配列、およびヒトＪＨ遺伝子セグメント配列であり、再構成されてい
ない免疫グロブリン重鎖可変領域は、ヒト重鎖可変領域である。一実施形態では、ヒトＶ
Ｈ遺伝子セグメント配列、ヒトＤＨ遺伝子セグメント配列、およびヒトＪＨ遺伝子セグメ
ント配列は、非ヒト重鎖定常領域配列に作動可能に連結されている。一実施形態では、非
ヒト重鎖定常領域配列は、内因性非ヒト重鎖定常領域配列である。一実施形態では、ヒト
重鎖遺伝子セグメント配列は、内因性非ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座にある。一実施
形態では、非ヒト動物に含まれるヒト免疫グロブリン重鎖可変領域配列はまた、少なくと
も１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換も含む。
【０７２２】
一実施形態では、本明細書に記載されている非ヒト動物は、非ヒト軽鎖定常領域配列を
含む免疫グロブリン軽鎖を発現する。一実施形態では、非ヒト動物は、ヒト軽鎖定常領域
配列を含む免疫グロブリン軽鎖を発現する。
【０７２３】
一実施形態では、本明細書に記載されている非ヒト動物は、ＣＨ１配列、ヒンジ配列、
ＣＨ２配列、ＣＨ３配列、およびこれらの組合せから選択される非ヒト配列を含む免疫グ
ロブリン重鎖を発現する。
【０７２４】
一実施形態では、非ヒト動物は、ＣＨ１配列、ヒンジ配列、ＣＨ２配列、ＣＨ３配列、
およびこれらの組合せから選択されるヒト配列を含む免疫グロブリン重鎖を発現する。
【０７２５】
動物が、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、
単一の、再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む実施形態では、動物の生殖細胞
系列内の、再構成された免疫グロブリン軽鎖配列は、内因性非ヒト免疫グロブリン軽鎖遺
伝子座にある。具体的な実施形態では、動物の生殖細胞系列内の、少なくとも１つの非ヒ
スチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、再構成された免疫グロブリン軽鎖
配列は、内因性非ヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子座における、全てまたは実質的に全ての
内因性非ヒト軽鎖Ｖセグメント配列および内因性非ヒト軽鎖Ｊセグメント配列を置きかえ
る。
【０７２６】
一実施形態では、非ヒト動物は、内因性ＶＨ遺伝子セグメントの１つまたは複数のヒト
ＶＨ遺伝子セグメントによる置きかえを含み、ここで、非ヒト動物がヒトＶＨ遺伝子セグ
メントを再構成し、ヒトＶＨドメインおよび非ヒトＣＨを含むリバースキメラ免疫グロブ
リン重鎖を発現するように、ヒトＶＨ遺伝子セグメントは、非ヒトＣＨ領域遺伝子に作動
可能に連結されている。一実施形態では、再構成されていない非ヒトＶＨ遺伝子セグメン
トのうちの９０〜１００％を、少なくとも１つの、再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セ
グメントで置きかえる。具体的な実施形態では、内因性非ヒトＶＨ遺伝子セグメントの全
てまたは実質的に全て（例えば、９０〜１００％）を、少なくとも１つの、再構成されて
いないヒトＶＨ遺伝子セグメントで置きかえる。一実施形態では、置きかえは、少なくと
も１９、少なくとも３９、または少なくとも８０もしくは８１の再構成されていないヒト
ＶＨ遺伝子セグメントによる置きかえである。一実施形態では、置きかえは、少なくとも
１２の機能的な、再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメント、少なくとも２５の機能
的な、再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメント、または少なくとも４３の機能的な
、再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメントによる置きかえである。一実施形態では
、非ヒト動物は、全ての非ヒトＤＨセグメントおよび非ヒトＪＨセグメントの、少なくと
も１つの、再構成されていないヒトＤＨセグメント、および少なくとも１つの、再構成さ
れていないヒトＪＨセグメントによる置きかえを含む。一実施形態では、非ヒト動物は、
全ての非ヒトＤＨセグメントおよび非ヒトＪＨセグメントの、全ての、再構成されていな
いヒトＤＨセグメント、および全ての、再構成されていないヒトＪＨセグメントによる置
きかえを含む。
【０７２７】
ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域の限定されたレパートリー、例えば、少なくとも１つ
の非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を有する、単一の、再構成されたヒ
ト免疫グロブリン軽鎖可変領域（例えば、Ｖκ１−３９／Ｊκ５またはＶκ３−２０／Ｊ
κ１）、ならびに再構成されていないヒトＶＨセグメント、ヒトＤＨセグメント、および
ヒトＪＨセグメントの多様なレパートリーをそのゲノム内に、例えば、その生殖細胞系列
内に含む非ヒト動物、例えば、マウスは、再構成されていないヒトＶＨセグメント、ヒト
ＤＨセグメント、およびヒトＪＨセグメントの様々な順列に由来する、重鎖可変領域配列
によりコードされる、抗原結合タンパク質を生成することが可能であり、ここで、重鎖可
変配列内に存在するＶＨセグメント、ＤＨセグメント、およびＪＨセグメントは、動物の
ゲノム内に存在する、全てまたは実質的に全ての機能的なヒトＶＨセグメント、ヒトＤＨ
セグメント、およびヒトＪＨセグメントに由来する。本明細書に記載されている遺伝子改
変動物の細胞、例えば、Ｂ細胞内で発現させた重鎖可変ドメイン配列（すなわち、様々な
、機能的なヒトＶセグメント、ヒトＤセグメント、およびヒトＪセグメントの組合せに由
来する）の様々な利用可能性は、米国出願公開第２０１１／０１９５４５４号、同第２０
１２／００２１４０９号、同第２０１２／０１９２３００号、および同第２０１３／００
４５４９２号において記載されている。様々な実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチ
ジンコドンのヒスチジンコドンによる置換（複数可）を含む、再構成されたヒト免疫グロ
ブリン軽鎖可変領域配列、および再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域配
列は、非ヒト動物の生殖細胞系列内に含まれる。
【０７２８】
一実施形態では、非ヒト動物は、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコ
ドンによる置換（複数可）を含む、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列、
および再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域配列の一方または両方の１つ
のコピーを含む。別の実施形態では、非ヒト動物は、少なくとも１つの非ヒスチジンコド
ンのヒスチジンコドンによる置換（複数可）を含む、再構成されたヒト免疫グロブリン軽
鎖可変領域配列、および再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域配列の一方
または両方の２つのコピーを含む。したがって、非ヒト動物は、少なくとも１つの非ヒス
チジンコドンのヒスチジンコドンによる置換（複数可）を含む、再構成されたヒト免疫グ
ロブリン軽鎖可変領域配列、および再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域
配列の一方または両方について、ホモ接合性であってもよく、ヘテロ接合性であってもよ
い。
【０７２９】
少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換（例えば、軽鎖の
ＣＤＲ３内の）を含む、免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列（例えば、単一の、再構
成された免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列）をそれらのゲノム内に含む、遺伝子改
変された非ヒト動物に加えて、本明細書では、発現した可変ドメインが、体細胞超変異に
かけられない場合は、ヒスチジンである、さらなるアミノ酸（複数可）を含むように、ヒ
スチジンコドン（複数可）の１つまたは複数の付加を有する、免疫グロブリン軽鎖可変領
域遺伝子配列を含む、遺伝子改変された非ヒト動物もまた提供される。
【０７３０】
本明細書に記載されている、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドン
による置換を有する、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列を含む遺伝子改変され
た非ヒト動物は、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ（例えば、雌牛、雄牛、野牛）、
シカ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、フェレット、霊長動物（例えば、マーモセ
ット、アカゲザル）からなる群から選択することができる。好適な遺伝子改変可能なＥＳ
細胞が容易に利用可能でない非ヒト動物には、本明細書に記載されている方法とは異なる
方法を用いて、遺伝子改変を含む非ヒト動物を作製する。このような方法は、例えば、非
ＥＳ細胞ゲノム（例えば、線維芽細胞または人工多能性細胞）を改変するステップと、核
移植を用いて、改変されたゲノムを、好適な細胞、例えば、卵母細胞へと導入するステッ
プと、改変された細胞（例えば、改変卵母細胞）を、胚を形成するのに好適な条件下で、
非ヒト動物に懐胎させるステップとを含む。
【０７３１】
一態様では、非ヒト動物は、哺乳動物である。一態様では、非ヒト動物は、小型の哺乳
動物、例えば、Ｄｉｐｏｄｏｉｄｅａ上科またはＭｕｒｏｉｄｅａ上科の小型の哺乳動物
である。一実施形態では、遺伝子改変された動物は、齧歯動物である。一実施形態では、
齧歯動物は、マウス、ラット、およびハムスターから選択される。一実施形態では、齧歯
動物は、Ｍｕｒｏｉｄｅａ上科から選択される。一実施形態では、遺伝子改変された動物
は、Ｃａｌｏｍｙｓｃｉｄａｅ科（例えば、マウス様ハムスター）、Ｃｒｉｃｅｔｉｄａ
ｅ科（例えば、ハムスター、新世界ラット、およびマウス、ハタネズミ）、Ｍｕｒｉｄａ
ｅ科（真性（ｔｒｕｅ）マウスおよびラット、アレチネズミ、トゲネズミ、タテガミネズ
ミ）、Ｎｅｓｏｍｙｉｄａｅ科（キノボリネズミ、イワネズミ、オジロキヌゲネズミ（ｗ
ｉｔｈ−ｔａｉｌｅｄ  ｒａｔ）、マダカスカルラットおよびマダカスカルマウス）、Ｐ
ｌａｔａｃａｎｔｈｏｍｙｉｄａｅ科（例えば、トゲヤマネ）、およびＳｐａｌａｃｉｄ
ａｅ科（例えば、デバネズミ（mole  rates）、タケネズミ、およびモグラネズミ）から
選択される科由来の動物である。具体的な実施形態では、遺伝子改変された齧歯動物は、
真性マウスまたはラット（Ｍｕｒｉｄａｅ科）、アレチネズミ、トゲネズミ、およびタテ
ガミネズミから選択される。一実施形態では、遺伝子改変されたマウスは、Ｍｕｒｉｄａ
ｅ科由来のメンバーのマウスである。一実施形態では、動物は、齧歯動物である。具体的
な実施形態では、齧歯動物は、マウスおよびラットから選択される。一実施形態では、非
ヒト動物は、マウスである。
【０７３２】
具体的な実施形態では、非ヒト動物は、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７Ｂ
Ｌ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７Ｂ
Ｌ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ
５７ＢＬ／１０Ｃｒ、およびＣ５７ＢＬ／Ｏｌａから選択されるＣ５７ＢＬ系統のマウス
である齧歯動物である。別の実施形態では、マウスは、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９
Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば、１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／ＳｖＩｍ）、
１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９Ｓ６（１２９／
ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、１２９Ｔ２である系統からな
る群から選択される、１２９系統である（例えば、Festingら（１９９９年）、Revised  
nomenclature  for  strain  129  mice、Mammalian  Genome、１０巻：８３６頁を参照
されたい;  Auerbachら（２０００年）、Establishment  and  Chimera  Analysis  of  
129/SvEv-  and  C57BL/6-Derived  Mouse  Embryonic  Stem  Cell  Linesもまた参照さ
れたい）。具体的な実施形態では、遺伝子改変されたマウスは、前述の１２９系統と前述
のＣ５７ＢＬ／６系統とのミックスである。別の具体的な実施形態では、マウスは、前述
の１２９系統のミックスまたは前述のＢＬ／６系統のミックスである。具体的な実施形態
では、ミックスの１２９系統は、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）系統である。別
の実施形態では、マウスは、ＢＡＬＢ系統、例えば、ＢＡＬＢ／ｃ系統である。さらに別
の実施形態では、マウスは、ＢＡＬＢ系統と別の前述の系統とのミックスである。
【０７３３】
一実施形態では、非ヒト動物は、ラットである。一実施形態では、ラットは、Ｗｉｓｔ
ａｒラット、ＬＥＡ系統、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ系統、Ｆｉｓｃｈｅｒ系統、Ｆ
３４４、Ｆ６、およびＤａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉから選択される。一実施形態では、ラット
系統は、Ｗｉｓｔａｒ、ＬＥＡ、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ、Ｆｉｓｃｈｅｒ、Ｆ３
４４、Ｆ６、およびＤａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉからなる群から選択される２つ以上の系統の
ミックスである。
【０７３４】
したがって、一実施形態では、遺伝子改変された非ヒト動物は、齧歯動物である。一実
施形態では、遺伝子改変された非ヒト動物は、ラットまたはマウスである。一実施形態で
は、動物は、マウスである。したがって、本発明の一実施形態では、ヒトＶＬ遺伝子配列
およびヒトＪＬ遺伝子配列を含む、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領
域をそのゲノム内に、例えば、その生殖細胞系列に含む遺伝子改変マウスであって、単一
の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域が、少なくとも非ヒスチジンコドンの
ヒスチジンコドンによる置換を含む遺伝子改変マウスが本明細書において提供される。一
実施形態では、マウスは、機能的な、再構成されていない免疫グロブリン軽鎖可変領域を
欠く（例えば、機能的な、再構成されていないＶ遺伝子セグメント配列およびＪ遺伝子セ
グメント配列を欠く）。一実施形態では、ヒスチジンコドンの置換（複数可）を有する、
再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域は、Ｖκ１−３９／Ｊκ可変領域またはＶ
κ３−２０／Ｊκ可変領域である。一実施形態では、Ｊセグメント配列は、Ｊκ１、Ｊκ
２、Ｊκ３、Ｊκ４、およびＪκ５から選択される。一実施形態では、Ｊセグメント配列
は、Ｊκ１またはＪκ５である。一実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドン
のヒスチジンコドンによる置換は、ＣＤＲ３領域をコードするヌクレオチド配列内にある
。再構成された可変領域配列が、Ｖκ１−３９／Ｊκ５配列である一実施形態では、ヒス
チジン置換（複数可）を、１０５、１０６、１０８、１１１位、およびこれらの組合せか
ら選択される位置において発現するようにデザインする。再構成された可変領域配列が、
Ｖκ３−２０／Ｊκ１配列である別の実施形態では、ヒスチジン置換（複数可）を、１０
５、１０６、１０７、１０９位、およびこれらの組合せから選択される位置において発現
するようにデザインする。一実施形態では、置換されたヒスチジンコドン（複数可）を有
する、再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域を、内因性のマウス免疫グロブリン定常
領域遺伝子配列（例えば、Ｃκ遺伝子配列）に作動可能に連結する。一実施形態では、マ
ウスは、そのゲノム内に、例えば、その生殖細胞系列に、ヒトＶＨセグメント、ヒトＤＨ
セグメント、およびヒトＪＨセグメントを含む、再構成されていない免疫グロブリン重鎖
可変領域をさらに含む。一実施形態では、ヒトＶＨセグメント、ヒトＤＨセグメント、お
よびヒトＪＨセグメントは、内因性のマウス免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列に作
動可能に連結されている。様々な実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンの
ヒスチジンコドンによる置換（複数可）を含む、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可
変領域配列、および再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域配列は、マウス
の生殖細胞系列内に含まれる。
【０７３５】
本明細書では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物、例えば、マ
ウスを生成するためのターゲッティングベクターもまた提供される。一態様では、ベクタ
ーの５’側マウス相同性アームおよび３’側マウス相同性アームの配列に関する転写方向
の５’側から３’側にかけて、５’側マウス相同性アーム、ヒト免疫グロブリンプロモー
ターまたはマウス免疫グロブリンプロモーター、ヒトリーダー配列またはマウスリーダー
配列、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む再構成
されたヒトＶκ１−３９Ｊκ５または再構成されたヒトＶκ３−２０Ｊκ１から選択され
るヒト可変領域、および３’側マウス相同性アームを含む、ターゲッティングベクターが
提供される。一実施形態では、５’側相同性アームおよび３’側相同性アームは、ベクタ
ーを、５’側に存在し、マウスＣκ遺伝子に対して近位である、エンハンサー配列に対し
て５’側の配列へとターゲッティングする。別の実施形態では、ターゲッティングベクタ
ーは、５’側マウス相同性アームに続いて、組換え部位により挟まれた選択カセット、ヒ
ト免疫グロブリンプロモーターまたはマウス免疫グロブリンプロモーター、ヒトリーダー
配列またはマウスリーダー配列、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコド
ンによる置換を含む再構成されたヒトＶκ１−３９Ｊκ５または再構成されたヒトＶκ３
−２０Ｊκ１から選択されるヒト可変領域に続いて、マウスエンハンサーおよび定常領域
（Ｃκ）配列を含む、３’側マウス相同性アームを含む。
【０７３６】
選択カセットとは、目的の構築物を組み込んだ細胞（例えば、ＥＳ細胞）の選択を容易
にするために、ターゲッティング構築物へと挿入されるヌクレオチド配列である。当技術
分野では、いくつかの好適な選択カセットが公知である。一般に、選択カセットは、特定
の抗生剤（例えば、Ｎｅｏ、Ｈｙｇ、Ｐｕｒ、ＣＭ、Ｓｐｅｃなど）の存在下で、陽性選
択を可能とする。加えて、選択カセットは、レコンビナーゼ酵素で処理したときに、選択
カセットの欠失を可能とする、組換え部位で挟むことができる。一般に用いられる組換え
部位は、Ｃｒｅ酵素およびＦｌｐ酵素のそれぞれにより認識されるｌｏｘＰおよびＦｒｔ
であるが、当技術分野では、他の組換え部位も公知である。
【０７３７】
一実施形態では、プロモーターは、ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントプロ
モーターである。具体的な実施形態では、プロモーターは、ヒトＶκ３−１５プロモータ
ーである。一実施形態では、リーダー配列は、マウスリーダー配列である。具体的な実施
形態では、マウスリーダー配列は、マウスＶκ３−７リーダー配列である。ターゲッティ
ングベクターの例示的な実施形態を、図２３Ｂおよび２９Ｂに提示する。
【０７３８】
一態様では、ターゲッティングベクターを、上記で記載した通りに提供するが、５’側
マウス相同性アームの代わりに、ヒトプロモーターまたはマウスプロモーターに、５’側
で、部位特異的レコンビナーゼ認識部位（ＳＲＲＳ）を隣接させ、３’側マウス相同性ア
ームの代わりに、ヒトＶＬ領域に、３’側で、ＳＲＲＳを隣接させる。
【０７３９】
本明細書では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物（例えば、齧
歯動物、例えば、マウスまたはラット）を作製する方法もまた提供される。一態様では、
本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物を作製するための方法は、実施
例において記載されている通り、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）技術を用いて作製さ
れるターゲッティングベクターを使用し、構築物をＥＳ細胞へと導入し（ｉｎｔｒｏｄｕ
ｃｉｎｇ）、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を用いて、ターゲッティングされ
たＥＳ細胞クローンをマウス胚へと導入する。ヒスチジン改変は、様々な分子生物学技法
、例えば、部位指向変異生成またはデノボのＤＮＡ合成を用いて、ターゲッティングベク
ターへと導入することができる。遺伝子ターゲッティングが完了したら、遺伝子改変され
た非ヒト動物のＥＳ細胞をスクリーニングして、目的の外因性ヌクレオチド配列の組込み
または外因性ポリペプチドの発現の成功を確認する。当業者には、数多くの技法が公知で
あり、サザンブロット法、長鎖ＰＣＲ、定量的ＰＣＴ（例えば、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標
）を用いるリアルタイムＰＣＲ）、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ノーザ
ンブロット法、フローサイトメトリー、ウェスタン分析、免疫細胞化学検査、免疫組織化
学検査などが挙げられる（が、これらに限定されない）。一例では、目的の遺伝子改変を
保有する非ヒト動物（例えば、マウス）は、Valenzuelaら（２００３年）、High-through
put  engineering  of  the  mouse  genome  coupled  with  high-resolution  expres
sion  analysis、Nature  Biotech.、２１巻（６号）：６５２〜６５９頁において記載さ
れている、対立遺伝子アッセイの改変型を用いて、マウス対立遺伝子の喪失および／また
はヒト対立遺伝子の獲得についてスクリーニングすることにより同定することができる。
当業者には、遺伝子改変動物における具体的なヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を同
定する他のアッセイも公知である。
【０７４０】
したがって、一実施形態では、遺伝子改変された非ヒト動物を生成する方法は、動物に
おける免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列を、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝
子配列（ヒトＶＬ遺伝子セグメントおよびヒトＪＬ遺伝子セグメントを含む）で置きかえ
るステップを含み、ここで、ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子配列は、少なくとも１つ
の非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む。一実施形態では、少なくと
も１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換は、ＣＤＲ領域、例えば、Ｃ
ＤＲ３領域をコードするヌクレオチド配列内にある。
【０７４１】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物を生成する
方法は、動物における免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列を、ヒトＶＬ遺伝子セグメ
ント配列およびヒトＪＬ遺伝子セグメント配列を含む、単一の、再構成されたヒト免疫グ
ロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列で置きかえるステップを含み、ここで、単一の、再構成
されたヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子配列は、少なくとも１つの非ヒスチジンコドン
のヒスチジンコドンによる置換を含む。一実施形態では、置換は、ＣＤＲコドンにおいて
である。一実施形態では、置換は、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ超のＣＤＲ３コ
ドンの置換である。一実施形態では、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変
領域遺伝子配列は、Ｖκ１−３９Ｊκ５およびＶκ３−２０Ｊκ１から選択される、ヒト
生殖細胞系列の、再構成された軽鎖可変領域配列に基づく。したがって、単一の、再構成
されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列が、Ｖκ１−３９Ｊκ５に由来する一
実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置きかえ
を、１０５、１０６、１０８、１１１位、およびこれらの組合せから選択される位置にお
いて、ヒスチジンを発現するようにデザインする。単一の、再構成されたヒト免疫グロブ
リン軽鎖可変領域遺伝子配列が、Ｖκ３−２０κ１に由来する一実施形態では、少なくと
も１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置きかえを、１０５、１０６、１
０７、１０９位、およびこれらの組合せから選択される位置において、ヒスチジンを発現
するようにデザインする。
【０７４２】
別の実施形態では、本明細書に記載されている非ヒト動物（すなわち、本明細書に記載
されている、遺伝子改変された免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を含む）を生成する方法は、
非ヒト動物のゲノムを改変して、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座内の、内因性免疫グロブリ
ンの軽鎖Ｖセグメントおよび軽鎖Ｊセグメントを欠失させるか、または非機能的にするス
テップと、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、
単一の、再構成されたヒト軽鎖可変領域遺伝子配列をゲノムに配置するステップとを含む
。一実施形態では、方法は、目的の抗原へのｐＨ依存性結合を示す抗体が富化されたＢ細
胞集団を含む、遺伝子改変された非ヒト動物を結果としてもたらす。
【０７４３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物を
生成する方法は、内因性非ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子配列の、上記で記載し
たヒトＶＨ配列、ヒトＤＨ配列、およびヒトＪＨ配列の各々またはレパートリーのうちの
少なくとも１つを含むヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子配列による置きかえもまた
含む動物において、免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列を、ヒト配列で置きかえるス
テップを含む。一実施形態では、内因性免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列の、少な
くとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、ヒト軽鎖可変領
域遺伝子配列による置きかえと、内因性非ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子配列の
、ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子配列による置きかえとを含む、非ヒト動物を生
成するために、軽鎖可変領域遺伝子配列の置きかえを有する動物を、重鎖可変領域遺伝子
配列の置きかえを有する動物と交配させる。
【０７４４】
発明者らは、本明細書において、１つまたは複数のヒスチジン改変を含むユニバーサル
軽鎖、例えば、ヒトユニバーサル軽鎖（例えば、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリ
ン軽鎖可変領域に由来する軽鎖）を含む抗原結合タンパク質、例えば、抗体を発現する、
遺伝子操作非ヒト動物（例えば、齧歯動物、例えば、ラットまたはマウス）であって、抗
原結合タンパク質が、標的抗原のｐＨ依存性の抗原結合を示す、遺伝子操作非ヒト動物を
提供する。動物は、１つまたは複数のヒスチジン改変を含む軽鎖ＣＤＲ３を含むように遺
伝子操作する。様々な実施形態では、軽鎖ＣＤＲ３は、クラスター内に、２つ、３つ、ま
たは４つ以上のヒスチジン残基を含む。
【０７４５】
一実施形態では、軽鎖可変領域遺伝子配列内のコドン改変の結果として、ヒスチジン残
基（複数可）を発現して、標的抗原のｐＨ依存性結合を提示する、抗原特異的抗体の集団
を含む、遺伝子操作非ヒト動物が本明細書において提供される。一実施形態では、これら
の動物は、本明細書に記載されている免疫グロブリン軽鎖可変領域内に、少なくとも１つ
の非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含まない動物において生成される
抗原特異的抗体の集団と比較して、ｐＨ依存性の結合特性（例えば、酸性ｐＨにおける解
離半減期（ｔ１／２）の、中性ｐＨにおけるｔ１／２と対比した短縮）を提示する抗体、
例えば、抗原特異的抗体が富化されたＢ細胞集団を含む。一実施形態では、本明細書に記
載されている遺伝子操作動物において生成されるｐＨ依存性の抗原結合特性を提示する抗
原特異的抗体の富化は、軽鎖可変領域内にヒスチジン置換を含む同様の動物と比較して、
約２倍を超える、例えば、約５倍を超え、例えば、約１０倍を超える。したがって、本発
明の遺伝子改変動物は、標的介在性クリアランスを低減し、ならびに、このような、ｉｎ
ｖｉｖｏにおいて生成される抗体フォーマットに基づいて開発される治療用抗原結合タ
ンパク質の用量および／または投与頻度を低減するのに所望される、抗体リサイクリング
特性の改善を有する抗体が富化されている。
【０７４６】
したがって、本明細書では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物
において生成される抗原結合タンパク質であって、ｐＨ依存性の抗原結合を提示する抗原
結合タンパク質が提供される。一実施形態では、抗原結合タンパク質は、抗体、例えば、
抗原特異的抗体である。一実施形態では、抗体は、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子セ
グメントの再構成に由来する、ヒト軽鎖可変ドメインを含む軽鎖を含み、この場合、生殖
細胞系列遺伝子配列内の、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンは、ヒスチジンコドンで
置換され、抗体は、その発現したヒト軽鎖可変ドメイン内に、少なくとも１つのヒスチジ
ン置換を保持する。一実施形態では、抗体は、単一の、再構成されたヒト軽鎖可変領域遺
伝子配列に由来する、ヒト軽鎖可変ドメインを含む軽鎖を含み、単一の、再構成された軽
鎖可変領域遺伝子配列は、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによ
る置換を含み、抗体は、その発現した軽鎖可変ドメイン内に、少なくとも１つのヒスチジ
ン置換を保持する。一実施形態では、抗体は、ヒトＶκ１−３９Ｊκ５の再構成またはヒ
トＶκ３−２０Ｊκ１の再構成に由来する軽鎖を含み、ヒトＶκ１−３９Ｊκ５遺伝子配
列またはヒトＶκ３−２０Ｊκ１遺伝子配列は、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンの
ヒスチジンコドンによる置換を含み、抗体は、その発現した軽鎖可変ドメイン内に、少な
くとも１つのヒスチジン置換を保持する。いくつかの実施形態では、抗体は、その発現し
た軽鎖可変ドメイン内に、全てまたは実質的に全てのヒスチジン置換を保持する。一実施
形態では、置換は、軽鎖可変領域遺伝子配列のＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列内
の、３つの非ヒスチジンコドンの３つのヒスチジンコドンによる置換であり、抗体は、そ
の発現した軽鎖可変ドメイン内に、３つのヒスチジン置換全てを保持する。一実施形態で
は、置換は、軽鎖可変領域遺伝子配列のＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列内の、４
つの非ヒスチジンコドンの４つのヒスチジンコドンによる置換であり、抗体は、その発現
した軽鎖可変ドメイン内に、３または４つのヒスチジン置換を保持する。
【０７４７】
一実施形態では、抗体の軽鎖は、非ヒト軽鎖定常領域のアミノ酸配列、例えば、内因性
軽鎖定常領域のアミノ酸配列をさらに含む。加えて、本明細書に記載されている、遺伝子
改変された非ヒト動物において生成される抗体、例えば、抗原特異的抗体はまた、ヒト重
鎖Ｖセグメント、ヒト重鎖Ｄセグメント、およびヒト重鎖Ｊセグメントの再構成に由来す
る、ヒト重鎖可変ドメインを含む重鎖も含む。ヒト重鎖Ｖセグメント、ヒト重鎖Ｄセグメ
ント、およびヒト重鎖Ｊセグメントは、内因性非ヒト重鎖遺伝子座、例えば、少なくとも
１つの機能的なＶセグメント、少なくとも１つの機能的なＤセグメント、および少なくと
も１つの機能的なＪセグメントに存在するヒト重鎖セグメントのレパートリー、例えば、
最大で、機能的なヒトＶセグメント、ヒトＤセグメント、およびヒトＪセグメントの完全
なレパートリーから選択することができる。ヒト重鎖可変セグメントの例示的な、可能な
再構成は、ＩＭＧＴデータベース内の機能的なヒトＶセグメント、ヒトＤセグメント、お
よびヒトＪセグメントの列挙、ならびに米国出願公開第２０１１／０１９５４５４号、同
第２０１２／００２１４０９号、同第２０１２／０１９２３０９号、および同第２０１３
／００４５４９２号から収集することができる。さらに、一実施形態では、抗体の重鎖は
、非ヒト重鎖定常領域のアミノ酸配列、例えば、内因性非ヒト重鎖定常領域のアミノ酸配
列を含む。一実施形態では、非ヒト重鎖定常領域は、ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメイン、
ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む。一実施形態では、抗体は、ＩｇＧアイソ
タイプ、ＩｇＥアイソタイプ、ＩｇＤアイソタイプ、ＩｇＭアイソタイプ、またはＩｇＡ
アイソタイプである。
【０７４８】
したがって、一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動
物において生成される結合タンパク質であって、（ａ）少なくとも１つの非ヒスチジンコ
ドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、ヒトＶκ１−３９Ｊκ５の再構成に由来する
軽鎖可変ドメインであり、軽鎖が、その発現した軽鎖可変ドメイン内に、少なくとも１つ
のヒスチジン置換を保持する軽鎖可変ドメインと、（ｂ）非ヒト軽鎖定常領域のアミノ酸
配列、例えば、マウス軽鎖定常領域のアミノ酸配列とを含む、リバースキメラ軽鎖を含み
、ここで、軽鎖が、（ａ）ヒトＶセグメント、ヒトＤセグメント、およびヒトＪセグメン
トの再構成に由来する重鎖可変ドメインであり、Ｖセグメント、Ｄセグメント、およびＪ
セグメントが、動物において存在するヒトＶセグメント、ヒトＤセグメント、およびヒト
Ｊセグメントのレパートリーから選択される重鎖可変ドメインと、（ｂ）非ヒト重鎖定常
領域のアミノ酸配列、例えば、マウス重鎖定常領域のアミノ酸配列とを含む、リバースキ
メラ重鎖と関連する、結合タンパク質が本明細書において提供される。一実施形態では、
ヒトＶセグメント、ヒトＤセグメント、およびヒトＪセグメントのレパートリーは、少な
くとも１つの機能的なＶセグメント、少なくとも１つの機能的なＤセグメント、および少
なくとも１つの機能的なＪセグメント、例えば、最大で、機能的なヒトＶセグメント、ヒ
トＤセグメント、およびヒトＪセグメントの完全なレパートリーを含む。一実施形態では
、重鎖定常ドメインおよび軽鎖定常ドメインは、内因性の重鎖定常領域および軽鎖定常領
域である。一実施形態では、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインは、体細胞変異ド
メインである。一実施形態では、体細胞変異軽鎖ドメインは、生殖細胞系列配列へと導入
された少なくとも１つのヒスチジン置換を保持する。いくつかの実施形態では、体細胞変
異軽鎖ドメインは、生殖細胞系列配列へと導入された、全てまたは実質的に全てのヒスチ
ジン置換を保持する。一実施形態では、抗原結合タンパク質は、ｐＨ依存性の抗原結合特
性を提示する。
【０７４９】
別の実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物において
生成される結合タンパク質であって、（ａ）少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒス
チジンコドンによる置換を含む、ヒトＶκ３−２０Ｊκ１の再構成に由来する軽鎖可変ド
メインであり、軽鎖が、その発現した軽鎖可変ドメイン内に、少なくとも１つのヒスチジ
ン置換を保持する軽鎖可変ドメインと、（ｂ）非ヒト軽鎖定常領域のアミノ酸配列、例え
ば、マウス軽鎖定常領域のアミノ酸配列とを含む、リバースキメラ軽鎖を含み、ここで、
軽鎖が、（ａ）ヒトＶセグメント、ヒトＤセグメント、およびヒトＪセグメントの再構成
に由来する重鎖可変ドメインであり、Ｖセグメント、Ｄセグメント、およびＪセグメント
が、動物において存在するヒトＶセグメント、ヒトＤセグメント、およびヒトＪセグメン
トのレパートリーから選択される重鎖可変ドメインと、（ｂ）非ヒト重鎖定常領域のアミ
ノ酸配列、例えば、マウス重鎖定常領域のアミノ酸配列とを含む、リバースキメラ重鎖と
関連する、結合タンパク質が本明細書において提供される。一実施形態では、ヒトＶセグ
メント、ヒトＤセグメント、およびヒトＪセグメントのレパートリーは、少なくとも１つ
の機能的なＶセグメント、少なくとも１つの機能的なＤセグメント、および少なくとも１
つの機能的なＪセグメント、例えば、最大で、機能的なヒトＶセグメント、ヒトＤセグメ
ント、およびヒトＪセグメントの完全なレパートリーを含む。一実施形態では、重鎖定常
領域および軽鎖定常領域は、内因性の重鎖定常領域および軽鎖定常領域である。一実施形
態では、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインは、体細胞変異ドメインである。一実
施形態では、体細胞変異軽鎖ドメインは、生殖細胞系列配列へと導入された少なくとも１
つのヒスチジン置換を保持する。いくつかの実施形態では、体細胞変異軽鎖ドメインは、
生殖細胞系列配列へと導入された、全てまたは実質的に全てのヒスチジン置換を保持する
。一実施形態では、抗原結合タンパク質は、ｐＨ依存性の抗原結合特性を提示する。
【０７５０】
一実施形態では、本明細書に記載されている遺伝子改変動物のＢ細胞であって、ヒスチ
ジン改変ヒト軽鎖可変領域配列、例えば、本明細書に記載されている、ヒスチジン改変、
単一の、再構成されたヒト軽鎖可変領域配列をその生殖細胞系列内に含み、本明細書に記
載されている抗原結合タンパク質を発現するＢ細胞もまた本明細書において提供される。
一実施形態では、Ｂ細胞内で発現させた抗原結合タンパク質、例えば、抗体は、生殖細胞
系列へと導入された、少なくとも１つのヒスチジン残基を保持し、ｐＨ依存性の抗原結合
特性を提示する。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞内で発現させた抗原結合タンパク質、
例えば、抗体は、生殖細胞系列へと導入された、全てまたは実質的に全てのヒスチジン残
基を保持し、ｐＨ依存性の抗原結合特性を提示する。
【０７５１】
様々な実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物は、ヒ
ト軽鎖可変領域遺伝子配列、例えば、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジン
コドンによる置換（またはヒスチジンコドンの生殖細胞系列配列への付加）を含む、単一
の、再構成されたヒト軽鎖可変領域遺伝子配列（例えば、Ｖκ１−３９Ｊκ５またはＶκ
３−２０Ｊκ１配列）を含む。これらの付加または置換は、それらの抗原に対するｐＨ依
存性の結合特性を有する、抗原結合タンパク質が富化されたＢ細胞集団を含む、非ヒト動
物を結果としてもたらす。一実施形態では、本明細書に記載されている非ヒト動物におい
て、抗原刺激に応答して生成される抗原結合タンパク質、例えば、抗体は、中性ｐＨ、例
えば、約７．０〜約８．０の間のｐＨ、例えば、約７．０〜約７．４の間のｐＨ、例えば
、約７．２〜約７．４の間、例えば、血液のような体液のｐＨでは、抗原に対する高親和
性を示して、ｐＨ依存性の抗原結合を提示する。一実施形態では、中性ｐＨにおける解離
定数（ＫＤ）として表される、抗原結合タンパク質のその抗原に対する親和性は、１０−
６Ｍ未満、例えば、１０−８Ｍ未満、例えば、１０−９Ｍ未満、例えば、１０−１０Ｍ未
満、例えば、１０−１１Ｍ未満、例えば、１０−１２Ｍ未満である。
【０７５２】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物において生
成される、抗原結合タンパク質、例えば、抗体は、中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨ（例え
ば、６．０以下のｐＨ、例えば、約５．０〜約６．０の間のｐＨ、約５．７５〜約６．０
の間のｐＨ、例えば、エンドソームコンパートメントまたはリソソームコンパートメント
のｐＨ）で、その抗原に対する結合の低減を示す。一実施形態では、本明細書に記載され
ている、遺伝子改変された非ヒト動物において生成される、抗原結合タンパク質、例えば
、抗体は、中性ｐＨでは、抗原への結合を保持するが、酸性ｐＨでは、抗原への結合を示
さない。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物によ
り生成される抗原結合タンパク質は、中性ｐＨにおける抗原結合タンパク質の解離半減期
（ｔ１／２）と比較して、酸性ｐＨで、解離半減期（ｔ１／２）の少なくとも約２倍、少
なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくと
も約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、または少なくとも約３０倍への
短縮を有する。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動
物が発現する抗原結合タンパク質のｔ１／２は、酸性ｐＨおよび３７℃で、約２分間以下
である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物が発
現する抗原結合タンパク質のｔ１／２は、酸性ｐＨおよび３７℃で、約１分間未満である
。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物が発現する
抗原結合タンパク質のｔ１／２は、酸性ｐＨおよび２５℃で、約２分間以下である。一実
施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物が発現する抗原結
合タンパク質のｔ１／２は、酸性ｐＨおよび２５℃で、約１分間未満である。
【０７５３】
平衡解離定数（ＫＤ）および解離半減期（ｔ１／２）などの動力学的パラメータは、Ｋ
Ｄ（Ｍ）＝ｋｄ／ｋａ；およびｔ１／２（分）＝ｌｎ２／（６０×ｋｄ）として、動力学
的速度定数から計算することができる。
【０７５４】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物において生
成される、抗原結合タンパク質、例えば、抗体は、ＦｃＲｎ分子への結合の増大を示す。
上記で記載したＦｃＲｎとは、エンドソームコンパートメントの内部に存在する受容体で
あって、酸性ｐＨにおいて、免疫グロブリンに結合し、それらを表面へとリサイクリング
して戻すことが可能な受容体である。本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒ
ト動物における抗体分子をスクリーニングすることにより、３つの有益なパラメータ：抗
原に対する高親和性、ｐＨ依存性の抗原結合（酸性ｐＨでは抗原結合が弱い）、およびＦ
ｃＲｎへの結合の増大を有する抗体について選択する固有の機会が提供される。
【０７５５】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物は、抗原結
合タンパク質、例えば、抗体を産生し、これらが富化された、抗原に応答するＢ細胞集団
であって、治療剤へと再フォーマットされる場合に、治療用量を被験体へと投与されると
、それらのヒト軽鎖可変領域遺伝子配列内にヒスチジン改変（複数可）を含まない非ヒト
動物において同じ抗原に応答して産生される、同等なＢ細胞集団を凌駕する、血清半減期
の延長を示すＢ細胞集団を含む。したがって、一実施形態では、本明細書に記載されてい
る、遺伝子改変された非ヒト動物において、目的の抗原に応答して産生される抗原結合タ
ンパク質、例えば、抗体は、治療剤へと再フォーマットされる場合に、治療用量を被験体
へと投与されると（治療剤へと再フォーマットされ、同じ治療用量で投与されるる場合）
、そのヒト軽鎖可変領域遺伝子配列内にヒスチジン改変（複数可）を含まない非ヒト動物
において同じ抗原に応答して産生された抗原結合タンパク質の血清半減期を凌駕する、血
清半減期の延長を示す。いくつかの実施形態では、血清半減期の延長は、約２倍、例えば
、約５倍、例えば、約１０倍、例えば、約１５倍、例えば、約２０倍、またはそれ超であ
る。
【０７５６】
一態様では、本明細書に記載されている非ヒトに由来する多能性細胞、人工多能性細胞
、または全能性細胞が提供される。具体的な実施形態では、細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞
である。
【０７５７】
一態様では、本明細書に記載されている非ヒト動物に由来する組織が提供される。一実
施形態では、組織は、本明細書に記載されている、非ヒト動物の脾臓、リンパ節、または
骨髄に由来する。
【０７５８】
一態様では、本明細書に記載されている非ヒト動物に由来する核が提供される。一実施
形態では、核は、Ｂ細胞ではない二倍体細胞からの核である。
【０７５９】
一態様では、本明細書に記載されている非ヒト動物（例えば、齧歯動物、例えば、マウ
スまたはラット）から単離された非ヒト細胞が提供される。一実施形態では、細胞は、Ｅ
Ｓ細胞である。一実施形態では、細胞は、リンパ球である。一実施形態では、リンパ球は
、Ｂ細胞である。一実施形態では、Ｂ細胞は、ヒト遺伝子セグメントに由来する可変ドメ
インを含むキメラ重鎖と；少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによ
る置換を有する、再構成されたヒトＶκ１−３９／Ｊ配列、少なくとも１つの非ヒスチジ
ンコドンのヒスチジンコドンによる置換を有する、再構成されたヒトＶκ３−２０／Ｊ配
列、またはこれらの組合せに由来し、生殖細胞系列内でコードされる少なくとも１つのア
ミノ酸のヒスチジンによる置換をさらに含む軽鎖とを発現し、重鎖可変ドメインは非ヒト
定常領域に融合し、軽鎖可変ドメインは非ヒト定常領域またはヒト定常領域に融合してい
る。
【０７６０】
一態様では、本明細書に記載されている、非ヒト動物のＢ細胞により作製されるハイブ
リドーマが提供される。具体的な実施形態では、Ｂ細胞は、目的のエピトープを含む免疫
原で免疫された、本明細書に記載されているマウスからのＢ細胞であり、Ｂ細胞は、目的
のエピトープに結合する結合タンパク質を発現し、結合タンパク質は、体細胞変異ヒト可
変重鎖ドメインおよびマウスＣＨを有し、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチ
ジンコドンによる置換を有する、再構成されたヒトＶκ１−３９Ｊκ５、または少なくと
も１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を有する、再構成されたヒト
Ｖκ３−２０Ｊκ１に由来するヒト可変軽鎖ドメイン、およびマウスＣＬを有し、ヒト軽
鎖ドメインは、生殖細胞系列内でコードされる少なくとも１つのアミノ酸のヒスチジンに
よる置換を含む。
【０７６１】
本明細書に記載されている非ヒト動物において生成される抗原結合タンパク質を発現す
る細胞もまた提供される。一実施形態では、細胞は、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、２９３細
胞、ＨｅＬａ細胞、およびウイルス核酸配列を発現する網膜細胞（例えば、ＰＥＲＣ．６
ＴＭ細胞）から選択される。
【０７６２】
一態様では、本明細書に記載されている非ヒト動物に由来するドナーＥＳ細胞を含む非
ヒト胚が提供される。
【０７６３】
本明細書に記載されている非ヒト動物は、ヒスチジンをＣＤＲ３内に有する抗体を発現
するＢ細胞を生成するのに有用である。ヒスチジンをＣＤＲ３に配置する動物は、抗体を
作製するのに一般に有用であり、中性ｐＨまたはその近くでは、標的に十分な親和性で結
合するが、酸性ｐＨでは、同じ標的に結合しないかまたは弱く結合する抗体を開発するの
に特に有用である。
【０７６４】
非ヒト動物は、例えば、ヒスチジンをＣＤＲ３内に含むヒト免疫グロブリン可変ドメイ
ンによりそれらの標的に結合する、ヒト治療用結合タンパク質を作製するのに用いられ得
る、抗体の可変領域を生成するのに有用である。治療剤は、細胞表面で標的に結合し、エ
ンドソームへと内部移行し、治療剤がリサイクルされて、さらに別の標的の分子（例えば
、別の細胞上または同じ細胞上の）に結合し得るように、エンドソーム内で標的からより
容易にまたはより迅速に解離するため、より低いｐＨにおける結合が変化すれば、状況に
よっては、より迅速な代謝回転が可能となる。状況によっては、これにより、結果として
、治療剤を低用量で投与するか、または治療剤を低頻度で投与することができる。これは
、安全性または毒性の理由で、頻繁に投与することやある特定の投与量を上回って投与す
ることが望ましくない場合に特に有用である。結果として、被験体へと投与される場合の
抗体治療剤の血清半減期が延長される。
【０７６５】
非ヒト動物、例えば、齧歯動物、例えば、マウスまたはラットは、１つまたは複数のヒ
スチジンをその中に有するＣＤＲ３を有する抗体可変領域を示す動物におけるＢ細胞の数
を増大させるための方法において有用である。非ヒト動物は、ｐＨ依存性の抗原結合を示
す抗体配列を生成するのに有用である。非ヒト動物は、単回の免疫から、抗体がｐＨ依存
性の抗原結合を示す、より多数の抗体配列を生成するのに有用である。
【０７６６】
抗原結合タンパク質およびこれを生成する方法
一態様では、当技術分野で用いられる標準的な方法により、本明細書に記載されている
、遺伝子改変された非ヒト動物から、ｐＨ依存性の抗原結合を示すヒト抗原結合タンパク
質、例えば、抗体を生成するための方法もまた本明細書において提供される。
【０７６７】
抗体を生成するための複数の技法が記載されている。例えば、様々な実施形態では、本
明細書に記載されているマウスにおいてキメラ抗体が産生される。抗体は、免疫したマウ
スのＢ細胞から直接単離することができ（例えば、Ｕ．Ｓ．２００７／０２８０９４５Ａ
１を参照されたい）、かつ／または免疫したマウスのＢ細胞を用いて、ハイブリドーマを
作製することができる（KohlerおよびMilstein、１９７５年、Nature、２５６巻：４９５
〜４９７頁）。本明細書に記載されている非ヒト動物からの抗体（ヒト重鎖および／また
はヒト軽鎖）をコードするＤＮＡは、従来の技法を用いて、容易に単離および配列決定さ
れる。本明細書に記載されている非ヒト動物に由来するハイブリドーマおよび／またはＢ
細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。単離されると、ＤＮＡは、発
現ベクターに入れることができ、次いで、これを、他の形では免疫グロブリンタンパク質
を産生しない宿主細胞へとトランスフェクトして、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗
体の合成を得る。ＤＮＡはまた、例えば、ヒト重鎖定常ドメインおよび軽鎖定常ドメイン
のコード配列を、非ヒト配列の代わりに置換することにより改変することもできる。した
がって、所望の特徴、例えば、親和性、エピトープ、ｐＨ依存性の抗原結合などを有する
抗体の核酸配列が決定されたら、非ヒト定常領域遺伝子配列を、所望のヒト定常領域配列
で置きかえて、非ＩｇＭアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、または
ＩｇＧ４を含有する完全ヒト抗体を生成する。
【０７６８】
したがって、一実施形態では、ｐＨ依存性の抗原結合特性を示す抗体を生成する方法で
あって、本明細書に記載されている非ヒト動物（例えば、マウス）を生成するステップと
、マウスを目的の抗原で免疫するステップと、非ヒト動物に抗原への免疫応答を開始させ
るステップと、非ヒト動物において、ｐＨ依存性の抗原結合特性を示す、例えば、酸性ｐ
Ｈでは、中性ｐＨにおける場合より抗原への結合が弱い抗原特異的抗体を選択するステッ
プとを含む方法が本明細書において提供される。
【０７６９】
本明細書では、多重特異性抗原結合タンパク質、例えば、二重特異性抗原結合タンパク
質を作製する方法もまた提供される。これらは、複数のエピトープに高親和性で結合する
ことが可能な分子である。本発明の利点には、その各々が単一の軽鎖と会合する好適に高
い結合性の（例えば、親和性成熟した）重鎖免疫グロブリン鎖を選択できることが挙げら
れる。加えて、本発明の利点には、ｐＨ依存性の抗原結合を示す、多重特異性、例えば、
二重特異性の抗原結合タンパク質を生成できることが挙げられる。
【０７７０】
二重特異性抗体の二重の性質（すなわち、１つのポリペプチドの異なるエピトープに特
異的な場合もあり、複数の標的ポリペプチドに特異的な抗原結合ドメインを含有する場合
もある；例えば、Tuttら、１９９１年、J.  Immunol.、１４７巻：６０〜６９頁;  Kufer
ら、２００４年、Trends  Biotechnol.、２２巻：２３８〜２４４頁を参照されたい）の
ため、それらは、治療適用に有用な多くの利点をもたらす。例えば、二重特異性抗体は、
方向転換された細胞傷害作用（例えば、腫瘍細胞を死滅させる）のために用いることもで
き、ワクチンアジュバントとして用いることもでき、血栓溶解剤をクロットへと送達する
ために用いることもでき、標的部位（例えば、腫瘍）において酵素活性化型プロドラッグ
を転換するために用いることもでき、感染性疾患を処置するために用いることもでき、免
疫複合体を細胞表面受容体へとターゲッティングするために用いることもでき、免疫毒素
を腫瘍細胞へと送達するために用いることもできる。
【０７７１】
本明細書に記載されている二重特異性抗体はまた、酵素イムノアッセイ、二部位イムノ
アッセイ、様々な疾患（例えば、がん）に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ
における免疫診断法、競合結合アッセイ、直接サンドイッチアッセイおよび間接サンドイ
ッチアッセイ、ならびに免疫沈降アッセイなど、複数の治療的アッセイ法ならびに非治療
的アッセイ法および／または診断的アッセイ法においても用いることができる。当業者に
は、二重特異性抗体の他の使用が明らかである。
【０７７２】
二重特異性抗体断片を、組換え細胞培養物から作製するための複数の技法が報告されて
いる。しかし、二重特異性結合タンパク質の合成および発現は、２つの異なる重鎖と会合
して発現し得る好適な軽鎖の同定と関連する問題に部分的に起因し、単離の問題にも部分
的に起因して、問題含みであった。様々な実施形態では、本明細書に記載されている組成
物および方法は、成分の安定性／相互作用を増大させることにより、従来の免疫グロブリ
ン構造を維持するのに特殊な改変（複数可）を必要としない完全長の二重特異性抗体の利
点を提供する。様々な実施形態では、このような改変（複数可）は、煩瑣であることがわ
かっており、二重特異性抗体技術の開発およびヒト疾患のための処置におけるそれらの潜
在的な使用に対する障害として作用した。したがって、様々な実施形態では、複数の特異
性という特性を付加した、天然の免疫グロブリン構造（すなわち、完全長）を提供するこ
とを介して、完全長の二重特異性抗体は、かつての二重特異性断片が欠いた、それらの極
めて重要なエフェクター機能を維持し、半減期の延長という重要な薬物動態パラメータを
明らかに示す治療剤をさらに提供する。
【０７７３】
本明細書に記載される方法および組成物は、遺伝子改変マウスが、他の点では天然であ
るプロセスを介して、体細胞変異された（例えば、親和性成熟した）重鎖を含む複数の重
鎖と会合して発現することができる好適な軽鎖を選択することを可能にし、ここで、この
軽鎖は、抗原結合タンパク質にそのｐＨ依存性抗原結合特性をさらに付与する。リバース
キメラ重鎖（すなわち、ヒト可変およびマウス定常）を有する親和性成熟抗体を発現する
、本明細書に記載される免疫マウスの適するＢ細胞からのヒト重鎖および軽鎖の可変領域
配列を同定して、適するヒト定常領域遺伝子配列（例えば、ヒトＩｇＧ１）を有する発現
ベクターにインフレームでクローニングすることができる。２つのそのような構築物を調
製することができ、ここで、各構築物は異なるエピトープに結合するヒト重鎖可変ドメイ
ンをコードする。少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を
含むヒト軽鎖可変領域の１つ（例えば、ヒトＶκ１−３９Ｊκ５またはヒトＶκ３−２０
Ｊκ１）は、適するヒト軽鎖定常領域遺伝子（例えば、ヒトκ定常遺伝子）にインフレー
ムで融合させることができる。これら３つの完全なヒトの重鎖および軽鎖構築物は、発現
のために適する細胞に入れることができる。細胞は、２つの主要な種を発現する：同一の
軽鎖を有するホモダイマー重鎖、および同一の軽鎖を有するヘテロダイマー重鎖。これら
の主要な種の容易な分離を可能にするために、重鎖の１つはプロテインＡ結合決定基が削
除されるように改変され、これにより、ヘテロダイマー結合タンパク質とは異なるホモダ
イマー結合タンパク質の親和性がもたらされる。この問題に対処する組成物および方法は
、ＵＳ２０１０／０３３１５２７Ａ１として公開された、２０１０年６月２５日に出願さ
れた「Ｒｅａｄｉｌｙ  Ｉｓｏｌａｔｅｄ  Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅ
ｓ  ｗｉｔｈ  Ｎａｔｉｖｅ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｆｏｒｍａｔ」という名
称のＵＳＳＮ１２／８３２，８３８に記載される。同一な軽鎖を有するヘテロ二量体重鎖
を含む上記種が選択されたら、この二重特異性抗原結合タンパク質をスクリーニングして
、そのｐＨ依存性の抗原結合特性の保持を確認することができる。
【０７７４】
一態様では、本明細書に記載されるエピトープ結合タンパク質が提供され、ここで、ヒ
ト軽鎖および重鎖の可変領域配列は、目的のエピトープを含む抗原で免疫されている本明
細書に記載される動物に由来する。
【０７７５】
一実施形態では、第一および第二のポリペプチドを含むエピトープ結合タンパク質が提
供され、第一のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、第一のエピトープに選択的
に結合する第一のエピトープ結合領域、続いてＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４およびその
組合せから選択されるヒトＩｇＧの第一のＣＨ３領域を含む定常領域を含み；第二のポリ
ペプチドは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、第二のエピトープに選択的に結合する第二のエ
ピトープ結合領域、続いてＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４およびその組合せから選択され
るヒトＩｇＧの第二のＣＨ３領域を含む定常領域を含み、第二のＣＨ３領域は、プロテイ
ンＡへの第二のＣＨ３ドメインの結合を低減または除去する改変を含む。様々なこのよう
な改変は、例えば、米国出願公開第２０１０／０３３１５２７号、および同第２０１１／
０１９５４５４号において記載されている。
【０７７６】
複数のエピトープに結合し、ｐＨ依存性のエピトープ結合特性を示すエピトープ結合タ
ンパク質を作製するための１つの方法は、本発明に従い第一のマウスを、第一の目的のエ
ピトープを含む抗原で免疫することであり、ここで、マウスは、（１）軽鎖を再構成して
形成することが可能な内因性マウス軽鎖可変領域遺伝子配列を含有しない、内因性免疫グ
ロブリン軽鎖可変領域遺伝子座であって、内因性マウス免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝
子座には、マウス内因性軽鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結された、単一の、再構成さ
れたヒト軽鎖可変領域があり、再構成されたヒト軽鎖可変領域が、少なくとも１つの非ヒ
スチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、ヒトＶκ１−３９Ｊκ５およびヒ
トＶκ３−２０Ｊκ１から選択される、内因性免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子座と、
（２）マウスにより作製される免疫グロブリン重鎖が、単独でまたは実質的にヒト可変ド
メインおよびマウス定常ドメインを含む重鎖であるように、ヒトＶＨ遺伝子セグメントで
全体的または部分的に置きかえられた内因性マウスＶＨ遺伝子セグメントとを含む。免疫
すると、このようなマウスにより、２つのヒト軽鎖可変ドメインのうちの１つ（例えば、
例えば、少なくとも１つのアミノ酸のヒスチジンによる置換を含む、ヒトＶκ１−３９Ｊ
κ５またはヒトＶκ３−２０Ｊκ１のうちの１つ）だけを含むリバースキメラ抗体が作製
される。一般に、生殖細胞系列配列へと導入された、置換されたヒスチジン残基の少なく
とも一部は、リバースキメラ抗体内で保持される。目的のエピトープに結合する重鎖可変
ドメインをコードするＢ細胞を同定し、ｐＨ依存性の抗原結合特性を示す抗体を発現させ
たら、重鎖可変領域（そして、必要に応じて、軽鎖可変領域）のヌクレオチド配列を取り
出し（例えば、ＰＣＲにより）、好適なヒト免疫グロブリン重鎖定常領域配列に対してイ
ンフレームで、発現構築物へとクローニングすることができる。このプロセスを繰り返し
て、第二のエピトープに結合する第二の重鎖可変ドメインを同定し、第二の重鎖可変領域
遺伝子配列を取り出し、第二の好適なヒト免疫グロブリン重鎖定常領域配列とインフレー
ムで、発現ベクターへとクローニングすることができる。定常領域遺伝子配列によりコー
ドされる第一の免疫グロブリン定常ドメインと、第二の免疫グロブリン定常ドメインとは
、同じアイソタイプであってもよく、異なるアイソタイプであってもよく、免疫グロブリ
ン定常ドメインのうちの一方を、本明細書またはＵＳ２０１０／０３３１５２７Ａ１に記
載されている通りに改変することができ（しかし、他方は改変しない）、エピトープ結合
タンパク質を、好適な細胞内で発現させ、そのプロテインＡに対する、例えば、ＵＳ２０
１０／０３３１５２７Ａ１において記載されているホモ二量体のエピトープ結合タンパク
質と比較した、示差的な親和性に基づき単離することができる。
【０７７７】
したがって、様々な実施形態では、ＤＮＡの単離、ならびに所望の特異性／親和性を有
する第一のヒト重鎖可変ドメインおよび第二のヒト重鎖可変ドメインをコードする第一の
核酸配列および第二の核酸配列、ならびにヒト軽鎖ドメインをコードし、少なくとも１つ
の非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む第三の核酸配列（本明細書に
記載されている非ヒト動物から単離された、生殖細胞系列の再構成された配列または軽鎖
配列）の選択に続き、当技術分野で広範に利用可能な組換え技法を用いて、分子をコード
する３つの核酸配列を発現させて、二重特異性抗体を形成する。しばしば、二重特異性抗
体が、適切にグリコシル化される（例えば、グリコシル化された抗体ドメインを含む二重
特異性抗体の場合）ように、選り抜きの発現系は、哺乳動物細胞の発現ベクターおよび宿
主を包含する。しかし、分子はまた、原核生物発現系において産生させることもできる。
通常、宿主細胞は、第一のヒト重鎖可変ドメイン、第二のヒト重鎖可変ドメイン、ヒト軽
鎖ドメインの全てを、単一のベクター上または独立のベクター上でコードするＤＮＡによ
り形質転換される。しかし、第一のヒト重鎖可変ドメイン、第二のヒト重鎖可変ドメイン
、およびヒト軽鎖ドメイン（二重特異性抗体の成分）を、独立の発現系において発現させ
、発現させたポリペプチドをｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてカップリングさせることも可能で
ある。様々な実施形態では、ヒト軽鎖ドメインは、例えば、ＣＤＲコドンにおける、少な
くとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を除けば、生殖細胞系列
配列に由来する。様々な実施形態では、ヒト軽鎖ドメインは、軽鎖ドメインの軽鎖可変配
列内に、１カ所以下、２カ所以下、３カ所以下、４カ所以下、または５カ所以下の体細胞
超変異を含む。いくつかの実施形態では、体細胞超変異は、軽鎖可変領域の生殖細胞系列
配列へと導入された、少なくとも１つのヒスチジン残基の存在を変化させない。
【０７７８】
様々な実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンのヒスチジンによる置換を有する
２つの重鎖および単一のヒト軽鎖をコードする核酸（複数可）（例えば、ｃＤＮＡまたは
ゲノムＤＮＡ）を、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）および／または発現のために
、複製可能なベクターへと挿入する。多くのベクターが利用可能であり、以下：シグナル
配列、複製起点、１つまたは複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモー
ター、および転写終結配列のうちの１つまたは複数を一般に含むが、これらに限定されな
い。各成分は、個別に選択することもでき、宿主細胞の選択に基づき選択することもでき
、実験により決定される他の基準に基づき選択することもできる。当技術分野では、各成
分の複数の例が公知である。
【０７７９】
発現ベクターおよびクローニングベクターは通常、宿主生物体により認識されるプロモ
ーターを含有し、二重特異性抗体の各成分または全ての成分をコードする核酸配列に作動
可能に連結される。様々な潜在的な宿主細胞により認識される多数のプロモーターが周知
である。これらのプロモーターは、制限酵素消化により供給源のＤＮＡからプロモーター
を除去し、単離されたプロモーター配列をベクターへと挿入することにより、二重特異性
抗体をコードするＤＮＡに作動可能に連結する。
【０７８０】
真核生物の宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または他の多細胞生物体
からの有核細胞）において用いられる発現ベクターはまた、転写の終結およびｍＲＮＡの
安定化に必要な配列も含有し得る。このような配列は、真核生物またはウイルスのＤＮＡ
またはｃＤＮＡの５’側非翻訳領域から一般に入手可能であり、必要に応じて、真核生物
またはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの３’側非翻訳領域からも入手可能である。これ
らの領域は、二重特異性抗体成分をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分内のポリアデニル化
断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含有する。様々な実施形態に好適な発現
ベクターは、二重特異性抗体をコードするＤＮＡの、哺乳動物細胞における一過性発現を
もたらす発現ベクターを含む。宿主細胞が、発現ベクターの多くのコピーを蓄積し、発現
ベクターによりコードされる高レベルの、所望のポリペプチドを合成するように、一般に
、一過性発現は、宿主細胞内で効率的に複製することが可能な発現ベクターの使用を包含
する。好適な発現ベクターおよび宿主細胞を含む一過性発現系は、第一のヒト重鎖可変ド
メインまたは第二のヒト重鎖可変ドメインのホモ二量体を有する親抗体と比べて、クロー
ニングされるＤＮＡによりコードされるポリペプチドの簡便な陽性同定、ならびに所望の
結合特異性／親和性または所望のゲル移動特徴を有する二重特異性抗体の迅速なスクリー
ニングを可能とする。
【０７８１】
様々な実施形態では、二重特異性抗体の成分をコードするＤＮＡが、上記で記載した所
望のベクター（複数可）へとアセンブルされたら、それらを、発現および回収に好適な宿
主細胞へと導入する。宿主細胞をトランスフェクトすることにより、選択された宿主細胞
に適切な、当技術分野で公知の標準的な技法（例えば、エレクトロポレーション、核内マ
イクロインジェクション、インタクトの細胞との細菌プロトプラスト融合、またはポリカ
チオン、例えば、ポリブレン、ポリオルニチンなど）を用いて達成することができる。
【０７８２】
様々な実施形態では、成分を含有し、二重特異性抗体種の最も効率的で好適な産生を可
能とする発現ベクターに最適な宿主細胞を選択する。発現のための例示的な宿主細胞には
、原核生物および真核生物（単細胞または多細胞）のもの、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏ
ｌｉの株、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．など）、
マイコバクテリア細胞、真菌細胞、酵母細胞（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．
ｐｏｍｂｅ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａなど）、植物細胞、昆
虫細胞（例えば、ＳＦ−９、ＳＦ−２１、バキュロウイルス感染昆虫細胞、Ｔｒｉｃｈｏ
ｐｌｕｓｉａ  ｎｉなど）、ヒト以外の動物細胞、ヒト細胞、または例えばハイブリドー
マもしくはクアドローマなどの細胞融合体が挙げられる。種々の実施形態では、細胞はヒ
ト、サル、類人猿、ハムスター、ラットまたはマウスの細胞である。種々の実施形態では
、細胞は、以下から選択される真核細胞である：ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ  Ｋ１、ＤＸＢ
−１１  ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ−ＣＨＯ）、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ−７）、網膜細胞、
Ｖｅｒｏ、ＣＶ１、腎臓（例えば、ＨＥＫ２９３、２９３  ＥＢＮＡ、ＭＳＲ  ２９３、
ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ）、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ３８、ＭＲＣ  ５、Ｃｏｌｏ
２０５、ＨＢ  ８０６５、ＨＬ−６０（例えば、ＢＨＫ２１）、Ｊｕｒｋａｔ、Ｄａｕｄ
ｉ、Ａ４３１（表皮性）、ＣＶ−１、Ｕ９３７、３Ｔ３、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２
／０、ＮＳ−０、ＭＭＴ  ０６０５６２、Ｓｅｒｔｏｌｉ細胞、ＢＲＬ  ３Ａ細胞、ＨＴ
１０８０細胞、骨髄腫細胞、腫瘍細胞および前記細胞に由来する細胞系。種々の実施形態
では、細胞は、１つまたは複数のウイルス遺伝子を含む（例えばウイルス遺伝子を発現す
る網膜細胞（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６ＴＭ細胞））。
【０７８３】
二重特異性抗体を産生するのに用いられる哺乳動物の宿主細胞は、様々な培地中で培養
することができる。ハムＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）；Ｓｉｇｍａ
）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、およびダルベッコ改変イーグル培地（（ＤＭＥ
Ｍ）；Ｓｉｇｍａ）などの市販される培地は、宿主細胞を培養するのに好適である。培地
には、必要に応じて、ホルモンおよび／もしくは他の成長因子（インスリン、トランスフ
ェリン、または上皮成長因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、
およびリン酸塩など）、バッファ（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオシド（アデノシンおよび
チミジンなど）、抗生剤（ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮＴＭなど）、微量元素（通常マイクロモ
ル濃度範囲の最終濃度で存在する無機化合物として定義される）、ならびにブドウ糖、ま
たは同等なエネルギー供給源を補充することができる。他の任意の補充物質もまた、当業
者に公知の適切な濃度で含めることができる。様々な実施形態では、温度、ｐＨなどの培
養条件は、発現について選択された宿主細胞で既に用いられた培養条件であり、当業者に
は明らかである。
【０７８４】
二重特異性抗体は、分泌されるポリペプチドとして、培養培地から回収することができ
るが、分泌シグナルを伴わずに直接産生される場合は、宿主細胞溶解物からも回収するこ
とができる。二重特異性抗体が、膜結合型である場合は、好適な洗浄剤溶液（例えば、Ｔ
ｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００）を用いて、膜から放出させることができる。
【０７８５】
単離に続き、２つのヒト重鎖と、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコ
ドンによる置換を含む、Ｖκ１−３９Ｊκ５配列およびＶκ３−２０／κ１配列から選択
される、再構成されたヒト軽鎖可変領域遺伝子配列に由来する、単一のヒト軽鎖とを含む
二重特異性抗体を、その抗原の一方、好ましくは両方の、ｐＨ依存性結合を示すその能力
についてスクリーニングする。その抗原に対し、中性ｐＨと酸性ｐＨとで結合が異なる二
重特異性抗体の能力（例えば、酸性ｐＨにおいて、中性ｐＨにおける場合と比較してｔ１
／２の短縮を明らかに示すそれらの能力）は、当技術分野で利用可能な様々な技法により
決定することができ、下記の実施例、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥＴＭアッセイにおいて記載
されている。
【０７８６】
ｐＨ依存性の抗原結合を有する抗原結合タンパク質を生成するためのさらなる方法
本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物において、ｐＨ依存性の抗原
結合特性を有する抗原結合タンパク質を生成する様々な方法が提供される。ｐＨ依存性の
抗原結合特性を有する抗原結合タンパク質をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて生成する方法もま
た提供される。このような方法は、抗原結合タンパク質の様々な成分を、遺伝子改変され
た非ヒト動物において、ｉｎ  ｖｉｖｏで生成するステップと、次いで、それらを改変す
るステップと、生物体の外部において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、哺乳動物細胞培養物中で発
現させるタンパク質複合体としてそれらを再アセンブルするステップとを包含し得る。
【０７８７】
一実施形態では、ｐＨ依存性の抗原結合特性を有する抗原結合タンパク質を生成する方
法は、米国出願公開第２０１１／０１９５４５４号、同第２０１２／００２１４０９号、
同第２０１２／０１９２３００号、および同第２０１３／００４５４９２号において記載
されているマウスなどの「ユニバーサル軽鎖」マウスまたは「共通軽鎖」マウス（「ＵＬ
Ｃ」マウス）である、軽鎖可変領域のＶセグメントおよびＪセグメント、例えば、ヒト軽
鎖可変領域のＶセグメントおよびＪセグメントの限定されたレパートリーを含むマウスに
おいて生成される抗原結合タンパク質配列、例えば、抗体配列を使用する。一実施形態で
は、ｐＨ依存性の抗原結合特性を有する抗原結合タンパク質を生成する方法は、単一の、
再構成されたヒト軽鎖可変領域遺伝子配列を含むマウスにおいて生成される抗原結合タン
パク質配列を使用する。一実施形態では、方法は、ヒトＶκ１−３９Ｊκ５およびヒトＶ
κ３−２０Ｊκ１から選択される、単一の、再構成されたヒト軽鎖可変領域遺伝子配列を
含むマウスにおいて生成される抗原結合タンパク質を使用する。
【０７８８】
一実施形態では、ｐＨ依存性の抗原結合特性を有する抗原結合タンパク質、例えば、抗
体を生成するための方法は、目的の抗原に結合する（例えば、目的の抗原に所望の親和性
で結合する）第一の抗体を選択するステップと、第一の抗体の免疫グロブリン軽鎖ヌクレ
オチド配列を、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含
むように改変するステップと、第一の抗体の免疫グロブリン重鎖および改変された免疫グ
ロブリン軽鎖を細胞内で発現させるステップと、細胞内で発現させた第二の抗体であって
、中性ｐＨでは、目的の抗原への結合を保持し（例えば、目的の抗原に対する所望の親和
性を保持し）、酸性ｐＨでは、目的の抗原への結合の低減を提示する第二の抗体を選択す
るステップとを含む。
【０７８９】
一実施形態では、ｐＨ依存性の抗原結合特性を有する抗原結合タンパク質、例えば、抗
体を生成するための方法は、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列
を有する免疫グロブリン軽鎖を含む抗体（例えば、非ヒト動物、例えば、マウス、例えば
、ＵＬＣマウスから得られる）からの免疫グロブリン重鎖であって、抗体が目的の抗原に
結合する（例えば、目的の抗原に所望の親和性で結合する）免疫グロブリン重鎖を選択す
るステップと；免疫グロブリン軽鎖の核酸配列を、単一の、再構成されたヒト免疫グロブ
リン軽鎖可変領域配列が、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによ
る置換を含むように改変するステップと；選択された免疫グロブリン重鎖および少なくと
も１つのアミノ酸のヒスチジンによる置換をその可変ドメイン内に含む免疫グロブリン軽
鎖を発現させるステップと；中性ｐＨでは、目的の抗原への結合を保持する（例えば、目
的の抗原への所望の親和性を保持する）が、酸性ｐＨでは、目的の抗原への結合の低減を
提示する抗体を選択するステップとを含む。様々な実施形態では、免疫グロブリン重鎖は
、ヒト重鎖可変遺伝子セグメント（ヒトＶセグメント、ヒトＤセグメントおよびヒトＪセ
グメント）の再構成に由来する。
【０７９０】
一実施形態では、ｐＨ依存性の抗原結合特性を有する抗原結合タンパク質、例えば、抗
体を生成するための方法は、（１）単一の、再構成されたヒト軽鎖可変領域遺伝子配列お
よび再構成されていないヒト重鎖可変遺伝子セグメント（Ｖセグメント、Ｄセグメント、
およびＪセグメント）のレパートリーを含む非ヒト動物、例えば、マウスを、目的の抗原
で免疫し、マウスに前記抗原に対する免疫応答を開始させるステップと、（２）非ヒト動
物において、例えば、マウスにおいて、目的の抗原に所望の親和性で結合する抗体を選択
するステップと、（３）非ヒト動物から、例えば、マウスから、目的の抗原に所望の親和
性で結合する抗体の免疫グロブリン重鎖のヌクレオチド配列を単離するステップと、（４
）前記重鎖のヌクレオチド配列を決定するステップと、（５）単一の、再構成されたヒト
免疫グロブリン軽鎖可変領域を含有する免疫グロブリン軽鎖のヌクレオチド配列を、少な
くとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含むように改変するス
テップと、（６）目的の抗原に所望の親和性で結合する抗体の免疫グロブリン重鎖および
ヒスチジン改変を含む免疫グロブリン軽鎖を細胞内で発現させるステップと、（７）細胞
内で発現した抗体が、中性ｐＨでは、抗原への結合を保持するが、酸性ｐＨでは、結合の
低減を提示するのかどうかを決定するステップとを含む。一実施形態では、細胞内で発現
した抗体は、中性ｐＨにおいて、抗原への所望の親和性を示す。様々な実施形態では、免
疫グロブリン重鎖は、ヒト重鎖可変遺伝子セグメント（ヒトＶセグメント、ヒトＤセグメ
ント、およびヒトＪセグメント）の再構成に由来する。
【０７９１】
一実施形態では、単一の、再構成されたヒト軽鎖可変領域遺伝子配列を含むマウスは、
例えば、米国出願公開第２０１１／０１９５４５４号、同第２０１２／００２１４０９号
、同第２０１２／０１９２３００号、および同第２０１３／００４５４９２号において記
載されている、ユニバーサル軽鎖マウスまたは共通軽鎖マウスまたは「ＵＬＣ」マウスで
ある。一実施形態では、単一の、再構成されたヒト軽鎖可変領域遺伝子配列は、ヒトＶκ
１−３９Ｊκ５およびヒトＶκ３−２０Ｊκ１配列から選択される。
【０７９２】
一実施形態では、目的の抗原は、可溶性抗原、細胞表面抗原（例えば、腫瘍抗原）、お
よび細胞表面受容体から選択される。具体的な実施形態では、細胞表面受容体は、免疫グ
ロブリン受容体である。具体的な実施形態では、免疫グロブリン受容体は、Ｆｃ受容体で
ある。
【０７９３】
一実施形態では、中性ｐＨにおける解離定数（ＫＤ）として表される、抗原に対する抗
体の所望の親和性は、１０−６Ｍ未満、例えば、１０−８Ｍ未満、例えば、１０−９Ｍ未
満、例えば、１０−１０Ｍ未満、例えば、１０−１１Ｍ未満、例えば、１０−１２Ｍ未満
である。
【０７９４】
上記で説明した通り、一実施形態では、ＵＬＣマウスは、単一の、再構成されたヒト免
疫グロブリン軽鎖可変遺伝子配列を含み、抗原に応答して抗体を発現するが、この場合、
抗体の抗原への親和性は、主にそれらの抗体の重鎖によって媒介される。これらのマウス
は、単一の、再構成されたヒト軽鎖可変配列に由来する軽鎖もまた含む抗体のヒト重鎖可
変ドメインをコードするように再構成する、ヒト重鎖可変（Ｖ、Ｄ、およびＪ）セグメン
トのレパートリーを含む。一実施形態では、抗原曝露により、これらのマウスは、多様な
ヒト重鎖可変（Ｖ、Ｄ、およびＪ）セグメントのレパートリーを使用して、抗原に対する
親和性および特異性を有する抗体を生成する。したがって、抗原へと曝露したら、ＵＬＣ
マウスにおいて生成される抗体の免疫グロブリン重鎖のヌクレオチド配列を単離し、これ
を使用して、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列（例えば、少な
くとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を有する、単一の、再構
成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列）に由来する免疫グロブリン軽鎖もまた含
む、所望の結合タンパク質を生成することができる。
【０７９５】
ＵＬＣマウスの一実施形態では、再構成されていない非ヒトＶＨ遺伝子セグメントのう
ちの９０〜１００％を、少なくとも１つの、再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメン
トで置きかえる。具体的な実施形態では、内因性非ヒトＶＨ遺伝子セグメントの全てまた
は実質的に全て（例えば、９０〜１００％）を、少なくとも１つの、再構成されていない
ヒトＶＨ遺伝子セグメントで置きかえる。一実施形態では、置きかえは、少なくとも１９
、少なくとも３９、または少なくとも８０もしくは８１の再構成されていないヒトＶＨ遺
伝子セグメントによる置きかえである。一実施形態では、置きかえは、少なくとも１２の
機能的な、再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメント、少なくとも２５の機能的な、
再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメント、または少なくとも４３の機能的な、再構
成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメントによる置きかえである。一実施形態では、非ヒ
ト動物は、全ての非ヒトＤＨセグメントおよび非ヒトＪＨセグメントの、少なくとも１つ
の、再構成されていないヒトＤＨセグメント、および少なくとも１つの、再構成されてい
ないヒトＪＨセグメントによる置きかえを含む。一実施形態では、非ヒト動物は、全ての
非ヒトＤＨセグメントおよび非ヒトＪＨセグメントの、全ての、再構成されていないヒト
ＤＨセグメント、および全ての、再構成されていないヒトＪＨセグメントによる置きかえ
を含む。したがって、ＵＬＣマウスは、ヒト可変領域遺伝子セグメント（Ｖセグメント、
Ｄセグメント、およびＪセグメント）の多様なレパートリーを使用して、目的の抗原に応
答する抗体を生成する。
【０７９６】
目的の抗原に所望の親和性で結合する抗体の重鎖を決定したら、重鎖のヌクレオチド配
列を単離および配列決定する。配列は、好適な宿主細胞、例えば、真核生物細胞、例えば
、ＣＨＯ細胞における発現のためのベクターへとクローニングする。一実施形態では、ヒ
ト重鎖定常領域の配列を、マウス（例えば、ＵＬＣマウス）から単離されたヒト重鎖可変
領域配列の下流にクローニングする。
【０７９７】
一実施形態では、ｐＨ依存性の抗原結合特性を有する抗原結合タンパク質の生成は、免
疫グロブリン軽鎖のヌクレオチド配列、特に、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン
軽鎖可変領域の配列を、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる
置換を含むように改変するステップを含む。当技術分野では、ヌクレオチド配列を改変す
るための様々な技法、例えば、部位指向変異生成が公知である。加えて、所望のヒスチジ
ン置換を含むヌクレオチド配列は、デノボ合成することもできる。
【０７９８】
一実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換
は、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ超のヒスチジン残基の発現を結果としてもたら
す置換を含む。一実施形態では、置換（複数可）は、３つまたは４つのヒスチジン残基の
発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換（複数可）は、免疫グロブリン軽鎖可
変領域においてである。一実施形態では、置換（複数可）は、ＣＤＲコドン、例えば、Ｃ
ＤＲ１コドン、ＣＤＲ３コドン、および／またはＣＤＲ３においてである。一実施形態で
は、置換（複数可）は、ＣＤＲ３コドンにおいてである。
【０７９９】
免疫グロブリン軽鎖核酸配列がＶκ１−３９Ｊκ５遺伝子配列を含み、置換（複数可）
がＣＤＲ３コドンにおいてである一実施形態では、置換は、１０５、１０６、１０８、１
１１位、およびこれらの組合せから選択される位置におけるヒスチジンの発現を結果とし
てもたらす。一実施形態では、置換は、１０５、１０６、１０８、および１１１位におけ
るヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０５および１０
６位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０５
および１０８位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換
は、１０５および１１１位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態
では、置換は、１０６および１０８位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。
一実施形態では、置換は、１０６および１１１位におけるヒスチジンの発現を結果として
もたらす。一実施形態では、置換は、１０８および１１１位におけるヒスチジンの発現を
結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０５、１０６、および１０８位におけ
るヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０５、１０６、
および１１１位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換
は、１０５、１０８、および１１１位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。
一実施形態では、置換は、１０６、１０８、および１１１位におけるヒスチジンの発現を
結果としてもたらす。様々なヒスチジン置換を含むＶκ１−３９Ｊκ５のＣＤＲ３領域の
アミノ酸配列および核酸配列を、図２に示し、配列表にも含める。
【０８００】
免疫グロブリン軽鎖核酸配列がＶκ３−２０Ｊκ１遺伝子配列を含み、置換（複数可）
がＣＤＲ３コドンにおいてである一実施形態では、置換は、１０５、１０６、１０７、１
０９位、およびこれらの組合せから選択される位置におけるヒスチジンの発現を結果とし
てもたらす。一実施形態では、置換は、１０５、１０６、１０７、および１０９位におけ
るヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０５および１０
６位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０５
および１０７位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換
は、１０５および１０９位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態
では、置換は、１０６および１０７位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。
一実施形態では、置換は、１０６および１０９位におけるヒスチジンの発現を結果として
もたらす。一実施形態では、置換は、１０７および１０９位におけるヒスチジンの発現を
結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０５、１０６、および１０７位におけ
るヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０５、１０６、
および１０９位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換
は、１０５、１０７、および１０９位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。
一実施形態では、置換は、１０６、１０７、および１０９位におけるヒスチジンの発現を
結果としてもたらす。様々なヒスチジン置換を含むＶκ３−２０Ｊκ１のＣＤＲ３領域の
選択されたアミノ酸配列および核酸配列を、図２７に示し、配列表にも含める。
【０８０１】
免疫グロブリン軽鎖、例えば、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインの配列を、ヒスチ
ジン残基を所望の位置に含むように改変したら、軽鎖のヌクレオチド配列を、好適な宿主
細胞、例えば、真核生物細胞、例えば、ＣＨＯ細胞における発現のためのベクターへとク
ローニングする。一実施形態では、ヒト軽鎖定常領域の配列を、ヒト可変領域の改変され
たヌクレオチド配列の下流にクローニングする。
【０８０２】
一実施形態では、改変されたヒト免疫グロブリン軽鎖および選択されたヒト免疫グロブ
リン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含むベクターを、好適な宿主細胞、例えば、真
核生物の宿主細胞、例えば、ＣＨＯ細胞内で共発現させて、抗原結合タンパク質を生成す
る。当技術分野では、発現のために用い得る様々な宿主細胞が公知であり、本明細書を通
して言及される。
【０８０３】
宿主細胞において生成される抗原結合タンパク質、例えば、抗体は、細胞上清へと分泌
させることができ、これを、中性ｐＨにおける適正な発現および元の抗原に対する親和性
についてスクリーニングする。抗原結合タンパク質はまた、細胞溶解物からも回収するこ
とができ、膜結合型である場合は、好適な洗浄剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ）を用いて
、膜から放出させることもできる。所望の特徴を有する抗原結合タンパク質は、精製する
ことができる。
【０８０４】
一実施形態では、ヒスチジン改変（複数可）を含む抗原結合タンパク質は、ヒスチジン
改変（複数可）を含まない同じ（元の）抗原結合タンパク質の抗原に対する親和性と同等
な、抗原に対する親和性を保持する。一実施形態では、中性ｐＨにおける解離定数（ＫＤ
）として表される、ヒスチジン改変抗原結合タンパク質の目的の抗原に対する親和性は、
１０−６Ｍ未満、例えば、１０−８Ｍ未満、例えば、１０−９Ｍ未満、例えば、１０−１
０Ｍ未満、例えば、１０−１１Ｍ未満、例えば、１０−１２Ｍ未満である。
【０８０５】
一実施形態では、本明細書に記載されているヒスチジン改変を含む抗原結合タンパク質
、例えば、抗体は、ｐＨ依存性の抗原結合特性を示す。一実施形態では、ヒスチジン改変
を含む抗原結合タンパク質は、ヒスチジン改変を有さない同等な抗原結合タンパク質（ヒ
スチジン改変を除けば、同じアミノ酸配列の抗原結合タンパク質）を凌駕する、増強した
ｐＨ依存特性を保有する。一実施形態では、本明細書に記載されている抗原結合タンパク
質は、中性ｐＨでは、抗原への結合を保持する（例えば、中性ｐＨでは、抗原に対する所
望の親和性を保持する）が、酸性ｐＨでは、結合の低減を提示する。一実施形態では、本
明細書に記載されている、抗原結合タンパク質、例えば、抗体は、中性ｐＨでは、抗原へ
の結合を保持するが、酸性ｐＨでは、抗原への結合を示さない。一実施形態では、本明細
書に記載されている抗原結合タンパク質は、中性ｐＨにおける抗原結合タンパク質の解離
半減期（ｔ１／２）と比較して、酸性ｐＨで、解離半減期（ｔ１／２）の少なくとも約２
倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少
なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、または少なくとも約３０
倍の短縮を有する。一実施形態では、本明細書に記載されている抗原結合タンパク質のｔ
１／２は、酸性ｐＨおよび３７℃で、約２分間以下である。一実施形態では、本明細書に
記載されている抗原結合タンパク質のｔ１／２は、酸性ｐＨおよび３７℃で、約１分間未
満である。一実施形態では、本明細書に記載されている抗原結合タンパク質のｔ１／２は
、酸性ｐＨおよび２５℃で、約２分間以下である。一実施形態では、本明細書に記載され
ている抗原結合タンパク質のｔ１／２は、酸性ｐＨおよび２５℃で、約１分間未満である
。
【０８０６】
一実施形態では、本明細書に記載されているヒスチジン改変を含む抗原結合タンパク質
、例えば、抗体は、治療用量を被験体へと投与すると、同等な治療用量の、ヒスチジン改
変を含まない抗原結合タンパク質（例えば、ヒスチジン改変を含まない、元の抗原結合タ
ンパク質）を投与したときの血清半減期と比較して、血清半減期の延長を示す。いくつか
の実施形態では、ある用量の、本明細書に記載されているヒスチジン改変を含む抗原結合
タンパク質を投与したときの血清半減期の、同じ用量の、ヒスチジン改変を含まない抗原
結合タンパク質を投与したときの血清半減期に対する延長は、約２倍、例えば、約５倍、
例えば、約１０倍、例えば、約１５倍、例えば、約２０倍、またはそれ超である。一実施
形態では、血清半減期は、少なくとも約１日間、例えば、少なくとも約２日間、例えば、
少なくとも約７日間、例えば、少なくとも約１４日間、例えば、少なくとも約３０日間、
例えば、少なくとも約６０日間である。
【０８０７】
上記で記載した、ｐＨ依存性の抗原結合特性を有する抗原結合タンパク質をｉｎ  ｖｉ
ｔｒｏで生成するための方法に加えて、本明細書では、前記方法により生成される抗原結
合タンパク質、例えば、抗体もまた提供される。加えて、前記方法は、マウスにおける共
通（ユニバーサル）軽鎖に結合する、２つの異なるヒト免疫グロブリン重鎖を選択し、重
鎖のヌクレオチド配列を決定し、ユニバーサル軽鎖を、上記で記載したヒスチジン置換を
含むように改変し、単一の、ヒスチジン改変ユニバーサル軽鎖を有する２つのヒト重鎖を
宿主細胞内で共発現させることにより、多重特異性、例えば、二重特異性の抗原結合タン
パク質を生成するのにも使用することができる。上記で記載した抗原結合タンパク質を生
成するための様々なステップは、二重特異性抗原結合タンパク質を生成する方法へも適用
することができる。抗原（複数可）に対する所望の親和性およびｐＨ依存性の抗原結合特
性を保有することが確認された二重特異性抗原結合タンパク質は、精製することができる
。したがって、２つのヒト重鎖および、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジ
ンコドンによる置換を含むヒト可変領域遺伝子、例えば、Ｖκ１−３９Ｊκ５可変領域遺
伝子またはＶκ３−２０Ｊκ１可変領域遺伝子によりコードされるヒト軽鎖可変ドメイン
配列を含む単一のヒト軽鎖を含む二重特異性抗体が提供される。
【０８０８】
ヒト免疫グロブリン重鎖と、ヒスチジン置換を含むヒト免疫グロブリン軽鎖とを含む抗
原結合タンパク質の作製において使用される構築物もまた提供される。本明細書に記載さ
れている抗原結合タンパク質、例えば、抗体を発現する宿主細胞もまた提供される。
【実施例】
【０８０９】
以下の実施例は、本発明を作製および使用する方法についての完全な開示および記載を
当業者に提示するように示されるものであり、本発明者らが自身の発明とみなすものの範
囲を限定することを意図するものでも、下記の実験が、実施される全てまたは唯一の実験
であることを表すことを意図するものでもない。用いる数（例えば、量、温度など）に関
して正確性を保証するように努めたが、多少の実験誤差および偏差があることが考慮され
るべきである。特に明記しない限り、部分は重量部分であり、分子量は重量平均分子量で
あり、温度は摂氏度で示され、気圧は大気圧またはその近くである。
【０８１０】
（実施例１）
ヒスチジンで置換したＤ遺伝子セグメントを含むヒト化免疫グロブリン重鎖遺伝子座の構
築
細菌人工染色体（ＢＡＣ）のＤＮＡを用いる、細菌細胞における一連の相同組換え反応
（ＢＨＲ）により、ヒスチジンで置換したヒトＤ遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン
重鎖遺伝子座の構築を実行した。ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）遺伝子操作技術（例
えば、米国特許第６，５８６，２５１号およびValenzuela,  D.  M.ら（２００３年）、
「High-throughput  engineering  of  the  mouse  genome  coupled  with  high-reso
lution  expression  analysis」、Nature  Biotechnology、２１巻（６号）：６５２〜
６５９頁を参照されたい）を用いて、１つまたは複数のヒスチジン残基を含む重鎖可変ド
メインを発現する遺伝子操作マウスを作製するためのいくつかのターゲッティング構築物
を生成した。
【０８１１】
まず、ヒトＤ遺伝子セグメントを、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで、親水性フレームにおけるチ
ロシン（Ｙ）、アスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）、グリシン（Ｇ）、およびアスパラギ
ン酸（Ｄ）をコードするコドンをヒスチジンコドンで置換した４つの部分（４つの反復配
列）（以下では、「ヒスチジンで置換したヒトＤ遺伝子セグメント」、すなわち、ＨＤ１
．１−６．６（９５８６ｂｐ；配列番号１）、ＨＤ１．７−６．１３（９２６８ｂｐ；配
列番号２）、ＨＤ１．１４−６．１９（９４４１ｂｐ；配列番号３）、およびＨＤ１．２
０−６．２５、１．２６（１１５９２ｂｐ；配列番号４）；図３）として合成した。４つ
の反復配列はまた、末端に、それらを一緒にライゲーションし戻すための固有の制限酵素
部位も含有した。各ヒトＤ遺伝子セグメントにおけるヒスチジン置換の具体的な位置（太
字の字体で表示された）を、図１Ａおよび１Ｂの「親水性」と表示された列に示す。図１
に示す通り、改変は、ヒスチジンコドンを親水性リーディングフレームに導入する一方で
、「終止」リーディングフレームにおける一部の終止コドンをセリンコドンに変えもした
。しかし、改変は、「疎水性」リーディングフレームにおける変化をほとんどもたらさな
かった。４つの合成されたＤセグメントの反復配列をライゲーションするための詳細な手
順を、図３に例示する（逐次的ライゲーション）。結果として得られるクローンは、５’
側から３’側にかけて、５’側マウス相同性アーム、ｌｏｘＰに挟まれたネオマイシンカ
セット、ヒスチジン置換を含むヒトＤ遺伝子セグメント（すなわち、ＨＤ１．１−６．６
（９５８６ｂｐ；配列番号１）、ＨＤ１．７−６．１３（９２６８ｂｐ；配列番号２）、
ＨＤ１．１４−６．１９（９４４１ｂｐ；配列番号３）、およびＨＤ１．２０−６．２５
、１．２６（１１５９２ｂｐ；配列番号４））、クロラムフェニコール選択カセット、お
よび３’側相同性アームを含有した。
【０８１２】
ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスにおける内因性のヒトＤ遺伝子セグ
メントを、上記のヒスチジンで置換したヒトＤ遺伝子セグメントで置きかえるために、以
下の６つの遺伝子改変を実行した。
【０８１３】
第一に、スペクチノマイシン選択カセットおよびＡｓｉＳＩ制限部位を含有するｐＬＭ
ａ０１７４を、ＭＡＩＤ  １１１６クローンの５’端へとターゲッティングした（ステッ
プ１：  ＢＨＲ（Ｓｐｅｃ）；図２）。ステップ１の間、それらの全てがｈＶＨ６−１の
５’側上流に位置する、クロラムフェニコール選択カセット、ネオマイシン選択カセット
、ｌｏｘＰ部位、２つのＶＨ遺伝子セグメント（ｈＶＨ１−３およびｈＶＨ１−２）、お
よびヒトＡｄａｍ６ｐ遺伝子を、ＭＡＩＤ  １１１６クローンから欠失させ、スペクチノ
マイシンカセットで置きかえて、ＶＩ４３３クローンを作製した。
【０８１４】
第二に、ステップ２（ＢＨＲ（Ｈｙｇ＋Ｓｐｅｃ）；図２）では、ＦＲＴ部位に挟まれ
るハイグロマイシンカセットを含有するｐＮＴｕ０００２を、ヒト免疫グロブリンＤＨ遺
伝子セグメントを含む領域へとターゲッティングした。ステップ２の間、全てのヒト重鎖
Ｄ遺伝子セグメントを、ＶＩ４３３から欠失させ、ハイグロマイシンカセットで置きかえ
て、ＭＡＩＤ６０１１  ＶＩ４３４（クローン１）を作製した。改変はまた、ハイグロマ
イシンカセットの５’端および３’端に、ＰＩ−ＳｃｅＩ制限部位およびＩ−ＣｅｕＩ制
限部位も導入した。
【０８１５】
第三に、制限消化およびライゲーションを介して、ヒスチジンで置換したヒトＤ遺伝子
セグメント（ＨＤ１．１−６．６（９５８６ｂｐ；配列番号１）、ＨＤ１．７−６．１３
（９２６８ｂｐ；配列番号２）、ＨＤ１．１４−６．１９（９４４１ｂｐ；配列番号３）
、およびＨＤ１．２０−６．２５、１．２６（１１５９２ｂｐ；配列番号４））を含むゲ
ノム領域を、ＭＡＩＤ  ６０１１  ＶＩ４３４のＰＩ−ＳｃｅＩ部位とＩ−ＣｅｕＩ部位
との間の領域へと導入した（ＰＩ−ＳｃｅＩ／Ｉ−ＣｅｕＩ間のライゲーションにより、
１１１６を改変した（Ｋａｎ＋Ｓｐｅｃ）；図４）。これは、５’側から３’側にかけて
、スペクチノマイシンカセット、ＶＨ６−１を含む約５０ｋｂのゲノム領域、ｌｏｘＰに
挟まれたネオマイシンカセット、約４０ｋｂのヒスチジンで置換したヒトＤ遺伝子セグメ
ント（ＨＤ１．１−６．６（９５８６ｂｐ；配列番号１）、ＨＤ１．７−６．１３（９２
６８ｂｐ；配列番号２）、ＨＤ１．１４−６．１９（９４４１ｂｐ；配列番号３）、およ
びＨＤ１．２０−６．２５、１．２６（１１５９２ｂｐ；配列番号４））、およびヒトＪ
Ｈ遺伝子セグメントを含有する約２５ｋｂのゲノム領域に続いて、マウスＥｉ（ｍＩｇＨ
イントロンエンハンサー；配列番号５）、マウススイッチ領域（配列番号６）、ならびに
マウスＩｇＭ定常領域のヌクレオチド配列（ｍＩｇＭエクソン１；配列番号７）を含有す
るＭＡＩＤ６０１２  ＶＩ４６９を作製した。改変を含有する細菌細胞を、カナマイシン
選択およびスペクチノマイシン選択に基づき選択した。
【０８１６】
第四に、図５に例示される通り、全ての内因性のヒトＤ遺伝子セグメントを、ＭＡＩＤ
１４６０クローンから除去するために、ＭＡＩＤ  １４６０ヘテロ接合性マウスＥＳ細
胞を、エレクトロポレーションを介して、ＭＡＩＤ  ６０１１  ＶＩ４３４でターゲッテ
ィングした。これにより、その免疫グロブリン重鎖遺伝子座に（１２９系統に由来する染
色体に）、５’側から３’側にかけて、ＦＲＴ部位、ヒトＶＨ遺伝子セグメント、ａｄａ
ｍ６ａ／ｂ遺伝子を包含するマウスゲノム領域、ＦＲＴ部位に挟まれるハイグロマイシン
カセット、およびヒトＪＨセグメントに続いて、マウスＥｉ配列およびＩｇＭ定常領域の
ヌクレオチド配列を含むＭＡＩＤ  ６０１１ヘテロ接合性マウスＥＳ細胞が作製された。
ＭＡＩＤ  ６０１１の遺伝子改変（対立遺伝子の喪失、対立遺伝子の獲得、および親対立
遺伝子の存在）は、図６に示されるプローブおよびプライマーを用いることにより確認し
た。
【０８１７】
第五に、ヒスチジンで置換したヒトＤ遺伝子セグメント（すなわち、ＨＤ１．１−６．
６（９５８６ｂｐ；配列番号１）、ＨＤ１．７−６．１３（９２６８ｂｐ；配列番号２）
、ＨＤ１．１４−６．１９（９４４１ｂｐ；配列番号３）、およびＨＤ１．２０−６．２
５、１．２６（１１５９２ｂｐ；配列番号４））を、ＭＡＩＤ  ６０１１へと導入するた
めに、ＭＡＩＤ  ６０１１ヘテロ接合性マウスＥＳ細胞に、ＭＡＩＤ  ６０１２  ＶＩ４
６９でエレクトロポレーションした。ターゲッティングステップにより、ｌｏｘＰに挟ま
れたハイグロマイシン選択カセットを、ＭＡＩＤ  ６０１１から除去し、配列を、ヒスチ
ジンで置換したヒトＤ遺伝子セグメントで置きかえた。これにより、野生型のヒトＶＨ遺
伝子セグメントおよびＪＨ遺伝子セグメントならびに本明細書に記載されているヒスチジ
ンで置換したヒトＤ遺伝子セグメントを含む、野生型のＣ５７ＢＬ／６系統に由来する染
色体および遺伝子改変された１２９系統に由来する染色体を含む、ＭＡＩＤ  ６０１２ヘ
テロ接合性ＥＳ細胞がもたらされた。加えて、ＥＳ細胞は、ＶＨセグメントとＤセグメン
トとの間に、ａｄａｍ６ａ／ｂ遺伝子を包含するマウスゲノム領域およびｌｏｘＰに挟ま
れたネオマイシンカセットを含有した（図７）。ＭＡＩＤ６０１２の遺伝子改変（対立遺
伝子の喪失、対立遺伝子の獲得、および親対立遺伝子の存在）は、図８に示されるプロー
ブおよびプライマーを用いることにより確認した。
【０８１８】
最後に、ネオマイシン選択カセットを、ＭＡＩＤ  ６０１２  ＥＳ細胞から除去するた
めに、ＭＡＩＤ  ６０１２  ＥＳ細胞に、Ｃｒｅレコンビナーゼを発現するプラスミドで
エレクトロポレーションし、その結果として、ＭＡＩＤ  ６０１３ヘテロ接合性ＥＳ細胞
が得られた（図９）。最終のＭＡＩＤ  ６０１３ヘテロ接合性（「ＭＡＩＤ  ６０１３  
ｈｅｔ」）ＥＳ細胞は、その免疫グロブリン重鎖遺伝子座に、図９に例示される通り、５
’側から３’側にかけて、（１）ＦＲＴ部位；（２）ヒトＶＨ遺伝子セグメント；（３）
ａｄａｍ６ａ／ｂ遺伝子を包含するマウスゲノム領域；（４）ｌｏｘＰに挟まれたネオマ
イシン選択カセット；（５）ヒスチジンで置換したヒトＤ遺伝子セグメント（ＨＤ１．１
−６．６（９５８６ｂｐ；配列番号１）、ＨＤ１．７−６．１３（９２６８ｂｐ；配列番
号２）、ＨＤ１．１４−６．１９（９４４１ｂｐ；配列番号３）、およびＨＤ１．２０−
６．２５、１．２６（１１５９２ｂｐ；配列番号４））；（６）ヒトＪＨ遺伝子セグメン
トに続いて；（７）マウスＥｉ配列（ｍＩｇＨイントロンエンハンサー；配列番号５）；
（８）スイッチ領域（配列番号６）；および（９）マウスＩｇＭ定常領域のヌクレオチド
配列（ｍＩｇＭエクソン１；配列番号７）を含む野生型のＣ５７ＢＬ／６系統に由来する
染色体および遺伝子改変された１２９系統に由来する染色体を含有する。
【０８１９】
ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法により、上記のターゲッティングＥＳ細胞（Ｍ
ＡＩＤ  ６０１３）をドナーＥＳ細胞として用い、８細胞期マウス胚へと導入した（例え
ば、ＵＳ７，５７６，２５９、ＵＳ７，６５９，４４２、ＵＳ７，２９４，７５４、ＵＳ
２００８−００７８０００Ａ１を参照されたい）。図８に示されるプライマーおよびプロ
ーブを用いる遺伝子型決定により、本明細書に記載されているヒスチジンで置換したヒト
重鎖Ｄ遺伝子セグメントを含む、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座を保有す
るマウスを同定した。結果として得られる遺伝子改変されたＦ０マウスを、野生型マウス
へと交配させて、Ｆ１子孫を得た。Ｆ１仔マウスを遺伝子型決定し、ヒスチジンで置換し
たヒト重鎖Ｄ遺伝子セグメントを含む、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座につい
てヘテロ接合性のＦ１仔マウスを、さらなる特徴づけのために選択した。
【０８２０】
（実施例２）
再構成された重鎖可変領域ヌクレオチド配列の解析
次に、本明細書に記載されている、ヒスチジンで置換したヒトＤ遺伝子セグメントを含
む、遺伝子改変されたマウス、例えば、その生殖細胞系列に、ヒトＶＨ遺伝子セグメント
、ヒトＪＨ遺伝子セグメント、およびヒスチジンで置換したヒトＤ遺伝子セグメント（Ｈ
Ｄ１．１−６．６（９５８６ｂｐ；配列番号１）、ＨＤ１．７−６．１３（９２６８ｂｐ
；配列番号２）、ＨＤ１．１４−６．１９（９４４１ｂｐ；配列番号３）、およびＨＤ１
．２０−６．２５、１．２６（１１５９２ｂｐ；配列番号４）を含む、１２９系統に由来
する染色体を含む、６０１３Ｆ０ヘテロ接合性マウスが、遺伝子改変された免疫グロブリ
ン重鎖遺伝子座に由来する１つまたは複数のヒスチジンコドンを含む、再構成された重鎖
Ｖ（Ｄ）Ｊ配列を発現することができるかどうかを調査した。
【０８２１】
この目的で、６０１３  Ｆ０ヘテロ接合性マウスの脾臓Ｂ細胞から単離したｍＲＮＡ配
列を、ヒスチジンで置換したヒトＤ遺伝子セグメントに由来するＩｇＭ  ＣＤＲ３配列の
存在について、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって解析した。
【０８２２】
手短には、脾臓を摘出し、スライドガラスを用いて、１倍濃度のＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）
中でホモジナイズした。遠心分離器内で細胞をペレット化し（５００×ｇで５分間にわた
り）、ＡＣＫ  Ｌｙｓｉｓ緩衝液（Ｇｉｂｃｏ）中で、３分間にわたり赤血球を溶解させ
た。細胞は、１倍濃度のＰＢＳで洗浄し、０．７μｍの細胞ストレーナーを用いて濾過し
た。ＣＤ１９についてのＭＡＣＳ磁気陽性選択（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用
いて、Ｂ細胞を脾臓細胞から単離した。ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓキット（Ｑｉａｇｅｎ）
を用いて、全ＲＮＡを、ペレット化されたＢ細胞から単離した。Ｏｌｉｇｏｔｅｘ（登録
商標）Ｄｉｒｅｃｔ  ｍＲＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ポリＡ＋ｍＲＮＡ
を、全ＲＮＡから単離した。
【０８２３】
ＳＭＡＲＴｅｒ（商標）Ｐｉｃｏ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎ
ｔｅｃｈ）を用いる５’ＲＡＣＥにより、二本鎖ｃＤＮＡを、脾性Ｂ細胞ｍＲＮＡから調
製した。Ｃｌｏｎｔｅｃｈによる逆転写酵素およびｄＮＴＰを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製
のＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩおよびｄＮＴＰで代用した。ＩｇＭ定常領域に特異的な
プライマーおよびＳＭＡＲＴｅｒ（商標）５’ＲＡＣＥプライマーを用いて、重鎖可変領
域（ＶＨ）抗体レパートリーを、ｃＤＮＡから増幅した（表１）。ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登
録商標）ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ＰＣＲ
産物を清浄化した。同じ５’ＲＡＣＥプライマーおよびＩｇＭ定常領域に特異的なネステ
ッド３’プライマーを用いて、第二ラウンドのＰＣＲを行った（表２）。ＳｉｚｅＳｅｌ
ｅｃｔ（商標）Ｅ−ｇｅｌ（登録商標）システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、第
二ラウンドのＰＣＲ産物を精製した。４５４のアダプターおよびバーコードを付加したプ
ライマーを用いて、三回目のＰＣＲを実施した。Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ（登録商標）ＡＭＰ
ｕｒｅ（登録商標）ＸＰ  Ｂｅａｄｓを用いて、第三ラウンドのＰＣＲ産物を精製した。
精製されたＰＣＲ産物は、ＫＡＰＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  
Ｋｉｔ（ＫＡＰＡ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いるＳＹＢＲ（登録商標）−ｑＰＣＲに
より定量化した。４５４  ＧＳ  Ｊｕｎｉｏｒ  Ｔｉｔａｎｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｌｉ
ｂ−Ａ  ｅｍＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて、プール
されたライブラリーを、エマルジョンＰＣＲ（ｅｍＰＣＲ）にかけ、製造元のプロトコー
ルに従い、Ｒｏｃｈｅ  ４５４  ＧＳ  Ｊｕｎｉｏｒ装置を用いて、二方向配列決定を行
った。
【０８２４】
【表１】
2018164462.tif 000002
【０８２５】
【表２】
2018164462.tif 000003
【０８２６】
バイオインフォマティックス解析
【０８２７】
試料バーコードの完全なマッチに基づき、４５４の配列を分取し、品質について調整し
た。ｉｇｂｌａｓｔ（ＮＣＢＩ、ｖ２．２．２５＋）のローカルインストールを用いて、
再構成されたＩｇ配列の、ヒト生殖細胞系列のＶセグメント、ＤセグメントおよびＪセグ
メントのデータベースに照らしたアラインメントに基づき、配列に注記した。スコアが同
一な複数のベストヒットが検出された場合は、配列を不明確（ａｍｂｉｇｕｏｕｓ）とマ
ークし、解析から除外した。ｐｅｒｌスクリプトのセットを開発して、結果を解析し、デ
ータを、ｍｙｓｑｌデータベースに保存した。ＣＤＲ３領域は、軽鎖については、保存的
ＣコドンとＦＧＸＧモチーフ（配列番号３２０）との間と定義し、重鎖については、保存
的ＣコドンとＷＧＸＧモチーフ（配列番号３２１）との間と定義した。ＣＤＲ３の長さは
、産生性抗体だけを用いて決定した。
【０８２８】
図１１〜１３に示す通り、６０１３Ｆ０ヘテロ接合性マウスは、ＣＤＲ３における１つ
または複数のヒスチジンコドンをコードする、再構成された重鎖可変領域ｍＲＮＡ配列（
再構成されたＶ−Ｄ−Ｊ配列）の多様なレパートリーを発現した。配列決定データは、Ｃ
ＤＲ３に現れるヒスチジンコドンは、本明細書に記載されている６０１３マウスの、遺伝
子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座に存在する、様々なヒスチジンで置換したヒト
Ｄ遺伝子セグメントに由来することを示唆した。
【０８２９】
（実施例３）
抗原特異的なヒト軽鎖におけるヒスチジンの使用
抗原特異的なヒト抗体から選択された軽鎖のアミノ酸配列をアライメントした。選択さ
れた数の抗原特異的なヒト抗体について、ヒトＶκ１−３９に由来する軽鎖のＣＤＲにお
けるヒスチジン変異を同定した（図１５）。ヒトＶκ１−３９に由来する軽鎖を、単一の
、再構成されたヒトＶκ１−３９軽鎖を含有し（ＵＳ２０１１／０１９５４５４Ａ１を参
照されたい）、マウスの抗体レパートリーにおいて生成されたとおりの体細胞超変異を保
有するように操作した（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）免疫マウスから単離した。
【０８３０】
当技術分野で公知の分子変異誘発法を使用して、再構成されたヒトＶκ１−３９軽鎖内
にヒスチジン残基を工学的に作製した。工学的に作製された残基の位置を、図１６に示す
。
【０８３１】
工学的に作製されたヒスチジン残基を含有するヒトＶκ１−３９に由来する軽鎖可変領
域を構築し、ヒト細胞表面受容体に特異的な抗体フォーマットにおける様々なヒト重鎖可
変領域と対合させて、ＣＨＯ細胞における発現を解析した。
【０８３２】
表示されるｈｉｓ改変（例えば、１０５、１０６、１０８、１１１）を有する特定の重
鎖および軽鎖を有するＣＨＯ細胞を、４８ウェルプレートのウェルへと播種した。翌日、
等重量（４００ｎｇ）の、重鎖および軽鎖に対応するＤＮＡを、トランスフェクション試
薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ  ２０００）と混合し、インキュベーションにより複合体を形
成させ、複合体を、プレート培養した細胞へと添加した。４日間後、培地を回収した。培
地は、発現した抗体を含有した。
【０８３３】
ＣＤＲ３に１つまたは複数のｈｉｓ置換を有する同じ軽鎖と対合させた異なる重鎖を有
するＣＨＯ細胞は、発現が良好である。軽鎖のＣＤＲ３の選択された位置において工学的
に作製されたヒスチジン残基を有する抗体遺伝子をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の上
清中で検出される、ｎｇ／ｍＬ単位の抗体発現レベル（ｎｇ／ｍＬ）を決定した。
【０８３４】
選択した重鎖を使用して、ヒスチジンを工学的に作製した軽鎖と対合させた抗原特異的
重鎖の、タンパク質ブロットにより測定した、ＣＨＯ細胞上清中の発現を図１８に示す。
ＵＬＣとは、再構成されたヒトＶκ１−３９に由来する軽鎖を指す。
【０８３５】
培地のアリコートを、抗体の標的抗原（細胞表面受容体の配列）を使用するＢＩＡＣＯ
ＲＥ（商標）装置での解析にかけた。抗体はチップ上で捕捉した。抗体の捕捉レベルを、
図１９Ａ〜１９Ｊに、ＲＵとして示す。ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）チップ上で捕捉された抗
体を、標的抗原の配列を含有する流動に供した。標的抗原の抗体による捕捉ならびに会合
速度および示される他のパラメータを測定した。抗原の流動を停止させ、抗原が結合した
抗体から脱離するときの解離速度を決定した。
【０８３６】
選択された抗体上清についての平衡解離定数（ＫＤ）（見かけの）を、ＢＩＡＣＯＲＥ
（商標）Ｔ１００装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用するＳＰＲ（表面プラズモ
ン共鳴）により決定した。  キネティクスは、ｐＨ７．４およびｐＨ５．７５において測
定した。結果を、図１９Ａ〜１９Ｊに示す。
【０８３７】
図１９Ａ〜１９Ｊに示される通り、ＣＤＲの特異的な位置においてヒスチジン残基をコ
ードするように軽鎖を改変した場合の、表示される重鎖と対合させたＶκ１−３０／Ｊκ
５軽鎖についての、細胞表面受容体への抗体の結合についてのデータは、ヒスチジン改変
が、ｐＨ７．４およびｐＨ５．７５において、異なる親和性を有して抗原（例えば、細胞
表面受容体）の結合に直接影響を及ぼすことを実証する。ｐＨ７．４では、結合を保持す
るが、ｐＨ５．７５では、弱い結合を示すか、または検出可能な結合を示さないヒスチジ
ン改変が所望される。
【０８３８】
（実施例４）
抗原特異的なヒト軽鎖におけるヒスチジン残基の同定
共通軽鎖マウス（例えば、Ｖκ１−３９共通軽鎖マウスまたはＶκ３−２０共通軽鎖マ
ウス）の生成、およびこれらのマウスにおける抗原特異的抗体の生成は、米国特許出願第
１３／０２２，７５９号、同第１３／０９３，１５６号、および同第１３／４１２，９３
６号（それぞれ、特許公開第２０１１／０１９５４５４号、同第２０１２／００２１４０
９号、および同第２０１２／０１９２３００号）において記載されている。手短には、マ
ウスゲノム細菌人工染色体（ＢＡＣ）クローンを改変するために、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ
（登録商標）技術（例えば、米国特許第６，５８６，２５１号およびＶａｌｅｎｚｕｅｌ
ａら（２００３年）Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  
ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌ
ｕｔｉｏｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ
．２１巻（６号）：６５２〜６５９頁を参照）を用いて、再構成されたヒト生殖細胞系列
軽鎖ターゲッティングベクターが作製され、そして、ゲノム構築物を単一の再構成された
ヒト生殖細胞系列軽鎖領域を含むように操作し、内因性κ可変および連結遺伝子セグメン
トを欠失させるために事前に改変しておいた内因性κ軽鎖遺伝子座に挿入した。再構成さ
れたヒト生殖細胞系列Ｖκ１−３９Ｊκ５またはＶκ３−２０Ｊκ１領域を発現するキメ
ラマウスを生成するための改変ＥＳ細胞を形成するために、マウスＥＳ細胞をエレクトロ
ポレーションするために、次にターゲッティングＢＡＣ  ＤＮＡを用いた。標的ＥＳ細胞
をドナーＥＳ細胞として用い、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法によって８細胞期
マウス胚に導入した（例えば、米国特許第７，２９４，７５４号およびＰｏｕｅｙｍｉｒ
ｏｕら（２００７年）Ｆ０  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｍｉｃｅ  ｔｈａｔ  ａｒｅ  ｅｓ
ｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｆｕｌｌｙ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｄｏｎｏｒ  ｇ
ｅｎｅ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ＥＳ  ｃｅｌｌｓ  ａｌｌｏｗｉｎｇ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ
ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ａｎａｌｙｓｅｓ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５巻（
１号）：９１〜９９頁を参照）。特有な再構成されたヒト生殖細胞系列軽鎖領域の存在を
検出する対立遺伝子アッセイ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、上記）の改変型を用いる遺伝子
タイピングによって、操作されたヒト生殖細胞系列Ｖκ１−３９Ｊκ５またはＶκ３−２
０Ｊκ１軽鎖領域を独立して有するＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）を同定した。
【０８３９】
操作されたヒト生殖細胞系列の軽鎖遺伝子座を保有するマウス（ＵＬＣマウス）を、内
因性マウス重鎖可変遺伝子座のヒト重鎖可変遺伝子座による置きかえを含有するマウス（
ＵＳ６，５９６，５４１を参照されたい；ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス、
Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）と交配させた。
【０８４０】
単一の、再構成されたヒト生殖細胞系列の軽鎖領域を含有するＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ
（登録商標）マウスを、目的の抗原でチャレンジし、ユニバーサル軽鎖（例えば、Ｖκ１
−３９Ｊκ５）を含む抗体を単離および配列決定する。共通Ｖκ１−３９Ｊκ５軽鎖マウ
スにおいて生成される抗原特異的ヒト抗体から選択された軽鎖（Ａ〜Ｋ）のアミノ酸配列
をアラインメントした。選択された数の抗原特異的ヒト抗体について、ヒトＶκ１−３９
に由来する軽鎖のＣＤＲ内のヒスチジン変異を同定した（図１５）。生殖細胞系列のＶκ
１−３９Ｊκ５可変ドメインの部分的なアミノ酸配列をアラインメントの上方に示し、配
列番号３２５にも示し、完全な可変ドメインのアミノ酸配列を配列番号４０４に示す。
【０８４１】
（実施例５）
ヒスチジン置換したヒトユニバーサル軽鎖抗体の操作および特徴付け
（実施例５．１）
ヒスチジン残基の生殖細胞系列ヒト再構成軽鎖への操作
操作したヒスチジン残基を、ヒトＶκ１−３９Ｊκ５軽鎖のＱ１０５、Ｑ１０６、Ｙ１
０８、およびＰ１１１位に導入するように特別にデザインされた部位指向変異生成プライ
マーを用いて、ヒスチジン残基を、再構成されたヒトＶκ１−３９Ｊκ５軽鎖へと操作し
た。当技術分野で公知の分子技法（例えば、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  ＸＬ  Ｓｉｔ
ｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、部位指向変異生成を実施した。ＣＤＲ３内の操作された残基
の位置を図２に示し、図１６に示された、ヒスチジン置換したＣＤＲ３の核酸配列を、配
列番号３２８、３３０、３３２、３３４、３３６、３３８、３４０、３４２、３４４、３
４６、３４８、３５０、３５２、３５４、および３５６に示す（対応するアミノ酸配列を
、配列番号３２９、３３１、３３３、３３５、３３７、３３９、３４１、３４３、３４５
、３４７、３４９、３５１、３５３、３５５、および３５７に示す）。生殖細胞系列の、
再構成されたＶκ１−３９Ｊκ５  ＣＤＲ３の核酸配列およびアミノ酸配列を、それぞれ
、配列番号３２６および３２７に示す。
【０８４２】
（実施例５．２）
ヒスチジン操作した軽鎖の構築および発現
実施例２に従い作製された、生殖細胞系列の、操作したヒスチジン残基を含有するヒト
Ｖκ１−３９に由来する軽鎖を構築し、ヒト細胞表面受容体に特異的である、様々なヒト
重鎖（１〜５と表示される）と対合させて、ＣＨＯ細胞における発現を解析した。ヒスチ
ジン置換したＶκ１−３９に由来する軽鎖と対合させた、ヒト細胞表面受容体に特異的な
５つのヒト重鎖は、単一の、再構成されたヒト軽鎖（ヒトＶκ１−３９／Ｊκ５の再構成
された軽鎖；ＵＳ２０１１／０１９５４５４Ａ１を参照されたい）を有するマウスから得
た。
【０８４３】
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）：ＣＨＯ細胞からの抗体の分泌は、Ｆｃ  Ｅ
ＬＩＳＡを用いて、５つの異なる重鎖を有する、表示されるヒスチジン改変を有する軽鎖
について検出した。軽鎖配列および重鎖配列（改変を除く）は、単一の、再構成されたヒ
ト軽鎖（例えば、ヒトＶκ１−３９／Ｊκ５の再構成された軽鎖；ＵＳ２０１１／０１９
５４５４Ａ１を参照されたい）を有するマウスにおいて生成された。捕捉抗体は、ヤギ抗
ヒトＩｇＧであり、検出抗体は、ヤギ抗ヒト（Ｆｃガンマ特異的）−ＨＲＰであった。結
果を図１７に示す。ＵＬＣ＋重鎖：特異的重鎖および改変されていないヒトＶκ１−３９
に由来する軽鎖。図１７に示される通り、発現は、ほぼ全ての変異体において検出された
。
【０８４４】
タンパク質イムノブロット：ＣＨＯ細胞の上清中の、ヒスチジン操作した軽鎖と対合さ
せた抗原特異的重鎖の発現を、ウェスタンブロットによりさらに解析した。試料を、４〜
１２％のトリス−グリシンゲル上で泳動させた。選択された重鎖（重鎖３）を用いた結果
を、図１８に示す。ＵＬＣとは、再構成されたヒトＶκ１−３９に由来する軽鎖（上記で
記載した）を指す。
【０８４５】
（実施例５．３）
ヒスチジン操作した軽鎖の結合親和性の決定
選択された抗体上清についての平衡解離定数（ＫＤ）、解離半減期（ｔ１／２）、およ
び他の動力学的パラメータは、ＢＩＡＣＯＲＥＴＭＴ２００装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃ
ａｒｅ）を用いるＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）により決定した。キネティクスは、ｐＨ
７．４およびｐＨ５．７５で測定した。結果を図２０Ａ〜２０Ｅに示す。
【０８４６】
中性ｐＨ（ｐＨ７．４）および酸性ｐＨ（ｐＨ５．７５）における、抗体の免疫原への
結合についての動力学的結合特性（ｋｉｎｅｔｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｐｅｒｔｙ
）（例えば、ｋａ、ｋｄ、ＫＤ、ｔ１／２など）の数値は、リアルタイム表面プラズモン
共鳴バイオセンサー（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００）を用いて得た。Ｂｉａｃｏｒｅ  ＣＭ
５センサーチップを、マウス抗ヒトＦｃ抗体で誘導体化して、上清からの抗体を捕捉した
。次いで、単一濃度（５０ｎＭ）の免疫原を、抗体捕捉表面上に、３０μｌ／分の流量で
注入した。抗体−抗原間の会合を、２．５分間にわたりモニタリングし、次いで、抗原の
、捕捉抗体からの解離を、８分間にわたりモニタリングした。会合動力学速度定数（ｋａ
）および解離動力学速度定数（ｋｄ）は、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００  Ｅｖａｌｕａｔｉ
ｏｎソフトウェアｖｅｒｓｉｏｎ  １．０を用い、データを処理して物質移動モデルによ
る１：１の結合へとフィッティングすることにより、決定した。平衡解離定数（ＫＤ）お
よび解離半減期（ｔ１／２）は、ＫＤ（Ｍ）＝ｋｄ／ｋａ；およびｔ１／２（分）＝（ｌ
ｎ２／（６０×ｋｄ）として、動力学速度定数から計算した。
【０８４７】
図２０に示される通り、抗体の細胞表面受容体への結合アッセイでは、抗原特異的ヒト
重鎖と対合させた、ヒスチジン改変共通軽鎖（Ｖκ１−３９／Ｊκ５軽鎖のヒスチジン改
変ＣＤＲ３）を有する５つの抗体のうちの２つが、ｐＨ７．４およびｐＨ５．７５におい
て、異なる親和性で、抗原へ（例えば、細胞表面受容体への）の結合を示した。ｐＨ７．
４では、結合を保持するが、ｐＨ５．７５では、低度の結合を示すか、または検出可能な
結合を示さない、ヒスチジン改変を有する抗体が望ましい。ｐＨ５．７５におけるｔ１／
２のｐＨ７．４におけるｔ１／２と比較した短縮を示す、ヒスチジン改変を有する抗体が
望ましい。
【０８４８】
ヒスチジン改変共通軽鎖および３つの抗原特異的重鎖を含む３つの抗体（２、３、およ
び６と表示される）についての、異なるｐＨにおける抗原結合データを、図２１にさらに
まとめる。例えば、ｐＨ５．７５におけるｔ１／２の短縮または結合が検出されないこと
により裏付けられる通り、これらの抗体は、ｐＨ５．７５において、ｐＨ７．４における
抗原結合と比較した、抗原結合の有意な低下を示した。
【０８４９】
（実施例６）
ヒスチジン置換したＶκ１−３９Ｊκ５ユニバーサル軽鎖を含む遺伝子改変マウスの操作
および特徴付け
（実施例６．１）
再構成されたヒト軽鎖可変領域内のヒスチジン残基を操作するためのターゲッティングベ
クターの構築
当技術分野で公知の標準的な分子クローニング技法により作製されるターゲッティング
ベクターを用いて、ヒト軽鎖のＣＤＲ領域へと操作したヒスチジン残基を有する、再構成
されたヒト軽鎖遺伝子を含有する遺伝子改変マウスを作製する。
【０８５０】
手短には、マウスゲノムの細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＤＮＡを、単一の、再構成された
ヒト生殖細胞系列の軽鎖領域を含有するように改変するために、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（
登録商標）技術（例えば、米国特許第６，５８６，２５１号およびValenzuelaら（２００
３年）、High-throughput  engineering  of  the  mouse  genome  coupled  with  hig
h-resolution  expression  analysis、Nature  Biotech.、２１巻（６号）：６５２〜６
５９頁を参照されたい）を用いて、様々な、再構成されたヒト生殖細胞系列の軽鎖ターゲ
ッティングベクターを作製し、内因性κ可変遺伝子セグメントおよび内因性κ接合遺伝子
セグメントを欠失させるように既に改変された内因性κ軽鎖遺伝子座へと挿入する。再構
成されたヒト生殖細胞系列の軽鎖領域を、軽鎖の配列内の１つまたは複数のヌクレオチド
位置において、生殖細胞系列配列のそれぞれの位置には通常存在しないヒスチジン残基を
コードするように改変する。ターゲッティングベクターを、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞へ
とエレクトロポレーションして作製し、定量的ＰＣＲアッセイ（例えば、ＴＡＱＭＡＮＴ
Ｍ）を用いて確認する。
【０８５１】
具体的には、これらのターゲッティングベクターを構築するための戦略を、図２３Ａ〜
２３Ｆに示す。共通（ユニバーサル）軽鎖マウス（例えば、ＵＳ２０１１／０１９５４５
４Ａ１において記載されている「ＵＬＣマウス」）のターゲッティングベクターを生成す
るために用いられるプラスミドであって、ｐＢＳ＋ＦＲＴ−Ｕｂ−Ｈｙｇ−ＦＲＴ＋マウ
スＶκ３−７リーダー＋ヒトＶκ１−３９Ｊκ５を含有するプラスミドを、部位指向変異
生成（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  ＸＬ  Ｋｉｔ）により、図２２に示される部位指
向変異生成プライマーを用いて、ＣＤＲ３領域内のＱ１０５、Ｑ１０６、Ｙ１０８、およ
びＰ１１１、またはＱ１０６、Ｙ１０８、およびＰ１１１を、ヒスチジン残基で置きかえ
るように改変した（この操作ステップについては、図２３Ａを参照されたい）。結果とし
て得られるベクター（Ｈ１０５／１０６／１０８／１１１およびＨ１０６／１０８／１１
１）をさらに改変し、マウスＩｇκ定常領域、マウスエンハンサー、マウス３’側相同性
アーム、およびＳＰＥＣカセットを含むベクターへとライゲーションした（図２３Ｂ）。
さらなる改変は、５’側マウスアームを保有し、Ｆｒｔ−Ｕｂ−ＮＥＯ−Ｆｒｔカセット
を含むベクターへのライゲーションを包含した（図２３Ｂ）。結果として得られるターゲ
ッティングベクターを、マウスＩｇκ可変遺伝子座（κ可変遺伝子セグメントおよびκ接
合遺伝子セグメントを含む）の欠失を含むＥＳ細胞へとエレクトロポレーションした（図
２３Ｃ〜２３Ｆ）。
【０８５２】
陽性のＥＳ細胞クローンは、内因性κ軽鎖遺伝子座へと挿入される、操作されたＶκ１
−３９Ｊκ５軽鎖領域に対して特異的なプローブを用いる、対立遺伝子アッセイ（Valenz
uelaら）の改変型を用いることにより確認した。アッセイにおいて用いられるプライマー
およびプローブを、下記の表３に示し、配列表にも示し、プローブの位置を、図２３Ｃ〜
２３Ｆに示す。
【表３】
2018164462.tif 000004
【０８５３】
ターゲッティング構築物により導入されるＮＥＯ選択カセットは、ＥＳ細胞に、ＦＬＰ
を発現するプラスミドをトランスフェクトすることにより欠失させた（図２３Ｃおよび２
３Ｅ）。必要に応じて、ネオマイシンカセットは、ＦＬＰレコンビナーゼを発現するマウ
ス（例えば、ＵＳ６，７７４，２７９）と交配させることにより除去することもできる。
必要に応じて、ネオマイシンカセットを、マウスに保持させる。
【０８５４】
上記で記載した標的ＥＳ細胞をドナーＥＳ細胞として用い、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（
登録商標）法により、８細胞期マウス胚へと導入した（例えば、米国特許第７，２９４，
７５４号；およびPoueymirouら（２００７年）、F0  generation  mice  that  are  ess
entially  fully  derived  from  the  donor  gene-targeted  ES  cells  allowing  
immediate  phenotypic  analyses、Nature  Biotech.、２５巻（１号）：９１〜９９頁
を参照されたい）。配列に沿った１つまたは複数の位置において変異させたヒスチジン残
基を含有する、操作されたヒト軽鎖遺伝子を独立に保有するＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録
商標）を、上記で記載した標的ＥＳ細胞から作製した。
【０８５５】
仔マウスを遺伝子型決定し、操作された、ヒスチジン改変ヒト軽鎖についてヘテロ接合
性の仔マウスを、軽鎖の発現および発現させた抗体の結合能を特徴づけるために選択した
。３カ所の（Ｈ１０６／１０８／１１１；「１９３０」）ヒスチジン改変または４カ所の
（Ｈ１０５／１０５／１０８／１１１；「１９２７」）ヒスチジン改変を有するユニバー
サル軽鎖遺伝子を特異的に含むマウスを遺伝子型決定するためのプライマーおよびプロー
ブを、下記の表４に列挙し、配列表にも示す。本明細書では、ヒスチジン改変をそれらの
ユニバーサル軽鎖内に含有するマウスを、「ＨＵＬＣ」マウス（ヒスチジンユニバーサル
軽鎖マウス）と称する。
【０８５６】
【表４】
2018164462.tif 000005
【０８５７】
（実施例６．２）
ヒスチジン置換したユニバーサル軽鎖を有するマウスにおける抗原への免疫応答の解析
細胞表面受容体（「抗原Ａ」）を、ＣＤＲ３内に４カ所のヒスチジン置換を有するＶκ
１−３９およびＪκ５を使用して既定の（ｐｒｅ−ａｒｒａｎｇｅｄ）ヒトカッパ軽鎖の
発現についてヘテロ接合性であるマウス（以下では、「ＨＵＬＣ  １９２７」とする）、
もしくはＣＤＲ３内に３カ所のヒスチジン置換を有するＶκ１−３９およびＪκ５を使用
して既定のヒトカッパ軽鎖の発現についてヘテロ接合性であるマウス（以下では、「ＨＵ
ＬＣ１９３０」とする）のいずれか、またはホモ接合性のＷＴマウスを免疫する免疫原と
して用いた。免疫を開始する前に、免疫前血清を、マウスから収集した。免疫原は、足蹠
（ｆ．ｐ．）を介して、容量２５μｌ中に、アジュバントとしてのＣｐＧオリゴヌクレオ
チド（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）１０μｇと混合した、初回抗原刺激による免疫のためのタン
パク質２．３５μｇを投与した。その後、３、６、１１、１３、１７、２０日目において
、合計６回の追加免疫のために、マウスに、同じ経路を介して、２．３５μｇの抗原Ａを
、アジュバントとしての１０μｇのＣｐＧおよび２５μｇのＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（Ｂｒｅ
ｎｎｔａｇ）と共に追加免疫した。それぞれ、４および６回目の追加免疫の後の１５およ
び２２日目において、マウスから採血した。それらの抗血清を、抗原Ａに対する抗体力価
についてアッセイした。
【０８５８】
免疫原に対する抗体血清力価は、標準的なＥＬＩＳＡにより決定した。ＥＬＩＳＡを実
施するために、９６ウェルマイクロ滴定プレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ
）を、リン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ；Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中の２μｇ／
ｍｌの抗原Ａにより、４℃で一晩にわたりコーティングした。翌日、プレートを、プレー
ト洗浄機（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて、０．０５％のＴｗｅｅｎ  
２０を含有するリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ−Ｔ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で、４回
にわたり洗浄した。次いで、プレートを、ＰＢＳ中の０．５％のウシ血清アルブミン（Ｂ
ＳＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）２５０μｌでブロッキングし、室温で１時間にわた
りインキュベートした。次いで、プレートを、ＰＢＳ−Ｔで４回にわたり洗浄した。免疫
したマウスからの血清および免疫前血清を、０．５％のＢＳＡ−ＰＢＳ中に、１：３００
または１：１０００で始めて３倍の系列希釈を行い、ブロッキングしたプレートへと二連
で添加し、次いで、室温で１時間にわたりインキュベートした。最後の２つのウェルは、
ブランクのまま放置して、二次抗体対照（バックグラウンド対照）として用いた。プレー
ト洗浄機により、プレートを、ＰＢＳ−Ｔで、４回にわたり再度洗浄した。次いで、ヤギ
抗マウスＩｇＧ−Ｆｃ−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート二次抗体
（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を、１：５０００／１：１０，００
０の希釈率でプレートへと添加し、室温で１時間にわたりインキュベートした。次いで、
プレートを、ＰＢＳ−Ｔで８回にわたり洗浄し、ＴＭＢ／Ｈ２Ｏ２を基質として用いて発
色させた。基質を２０分間にわたりインキュベートし、２Ｎの硫酸（Ｈ２ＳＯ４；ＶＷＲ
、カタログ番号ＢＤＨ３５００−１）または１Ｎのリン酸（ＪＴ  Ｂａｋｅｒ、カタログ
番号７６６４−３８−２）で反応を停止させた。プレートは、分光光度計（Ｖｉｃｔｏｒ
；Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）において４５０ｎｍで読み取った。抗体力価は、Ｇｒａｐ
ｈｐａｄ  ＰＲＩＳＭソフトウェアを用いて計算した。
【０８５９】
マウスにおいて、注入された免疫原に対して誘導された免疫応答は、抗原結合の吸光度
がバックグラウンドの２倍となる最大の血清希釈率の逆数として定義される、抗体力価と
して表される。したがって、抗体力価数が大きいほど、免疫原に対する体液性免疫応答が
大きくなる。免疫原に対して誘導された抗体力価は、ＨＵＬＣマウスの両方の系統でも、
ＷＴマウスでも、極めて大きく、系統の間で有意差は観察されなかった（図２４）。
【０８６０】
（実施例６．３）
ｐＨ感受性モノクローナル抗体の生成
ＨＵＬＣマウス両方の系統でも、ＷＴマウスでも、免疫原に対する所望の免疫応答が達
成されたら、各マウス系統からの脾細胞を採取し、マウス骨髄腫細胞と融合させて、ハイ
ブリドーマ細胞を生成し、９６ウェルプレート内で成長させた。１０日間成長後、各ハイ
ブリドーマ細胞含有ウェルからの上清を、免疫原特異的ＥＬＩＳＡを介してスクリーニン
グして、陽性の抗原結合試料を同定した。ＥＬＩＳＡのために、９６ウェルマイクロ滴定
プレートを、１ｕｇ／ｍＬの抗ｍｙｃポリクローナル抗体（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉ
ｃａｌｓ、番号ＮＢ６００−３４）により、４℃で一晩にわたりコーティングして、ｍｙ
ｃタグ付けされた抗原を固定し、これに続いて、ＰＢＳ中の０．５％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ
溶液でブロッキングした。プレートを洗浄し、抗原溶液を、１μｇ／ｍＬの濃度でプレー
トへと添加し、室温で１時間にわたり、コーティングしたプレートに結合させた。その後
、ハイブリドーマ細胞からの上清を、１：５０の希釈率でウェルへと添加し、室温で１時
間にわたり結合させた。プレートに結合した抗体は、ＨＲＰとコンジュゲートさせた抗マ
ウスＩｇＧポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、番号
１１５−０３５−１６４）を用いて検出した。ＴＭＢ基質を、プレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓ
ｃｉｅｎｃｅｓ、番号５１−２６０６ＫＣ／５１−２６０７ＫＣ）へと添加し、製造元に
より推奨されるプロトコールに従い、比色シグナルを生じさせた。吸光度は、Ｖｉｃｔｏ
ｒ  Ｗａｌｌａｃプレートリーダーにおいて４５０ｎｍで記録した。ＯＤが０．５以上（
ベースラインのＯＤは約０．１）を有するとして定義される抗原陽性試料は、リアルタイ
ム表面プラズモン共鳴バイオセンサー（Ｂｉａｃｏｒｅ  ４０００）を用いて、親和性ス
クリーニングにかけた。
【０８６１】
中性ｐＨ（ｐＨ７．４）および酸性ｐＨ（ｐＨ６．０）における、抗体の免疫原への結
合についての動力学的結合パラメータ（例えば、ｋａ、ｋｄ、ＫＤ、ｔ１／２など）を記
録した。Ｂｉａｃｏｒｅ  ＣＭ４センサーチップを、ポリクローナルヤギ抗マウスＦｃ抗
体で誘導体化して、上清からの抗体を捕捉した。次いで、単一濃度（１００ｎＭ）の免疫
原を、抗体捕捉表面上に、３０μｌ／分の流量で注入した。抗体−抗原間の会合を、１．
５分間にわたりモニタリングし、次いで、抗原の、捕捉抗体からの解離を、２．５分間に
わたりモニタリングした。会合動力学速度定数（ｋａ）および解離動力学速度定数（ｋｄ
）は、Ｂｉａｃｏｒｅ  ４０００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアｖｅｒｓｉｏｎ  
１．０を用い、データを処理して物質移動モデルによる１：１の結合へとフィッティング
することにより、決定した。平衡解離定数（ＫＤ）および解離半減期（ｔ１／２）は、Ｋ
Ｄ（Ｍ）＝ｋｄ／ｋａ；およびｔ１／２（分）＝ｌｎ２／（６０×ｋｄ）として、動力学
速度定数から計算した。ｐＨ６．０において、ｐＨ７．４における結合と比較して結合の
低下を提示する試料のセット（ｐＨ感受性）、ならびにｐＨ７．４とｐＨ６．０との間で
有意な速度の変化を提示しない対照試料のセット（ｐＨ非感受性の対照）を、クローン作
製するために選択した。図２５は、全抗原陽性クローンの数と、ＨＵＬＣマウスおよびＷ
ＴマウスからのｐＨ感受性抗原結合を提示する抗原陽性クローンの数との比較を示す。
【０８６２】
抗原陽性クローンのうち、２匹のヘテロ接合性ＨＵＬＣ１９２７マウスおよび２匹のＨ
ＵＬＣ１９３０のそれぞれから単離された１８のクローンおよび７つのクローン、ならび
にＷＴマウスからの１つのクローンは、モノクローナルとなった。モノクローナルハイブ
リドーマの上清を、中性ｐＨおよび低ｐＨにおける抗原解離速度（オフ速度）解析にかけ
、細胞ペレットを軽鎖可変ドメインＤＮＡの配列決定に用いた。
【０８６３】
（実施例６．４）
Ｖκ１−３９Ｊκ５に基づくヒスチジンユニバーサル軽鎖マウスのＣＤＲ３領域における
配列決定および体細胞超変異
ＨＵＬＣマウスおよびＷＴマウスによるモノクローナルハイブリドーマからの細胞ペレ
ットを、軽鎖可変ドメインＤＮＡの配列決定に用いた。２６のクローンがモノクローナル
となり（上記の実施例３．３を参照されたい）、これらを配列決定にかけ、１５のクロー
ンを、ＨＵＬＣマウス軽鎖またはＷＴマウス軽鎖（ＭＭおよびＮＮ；表４を参照されたい
）を用いて確認した。１４のクローンは、ＨＵＬＣヘテロ接合性マウス（１９２７マウス
または１９３０マウス）に由来し、１つのクローンは、ＷＴマウスに由来した。
【０８６４】
ＨＵＬＣヘテロ接合性マウスに由来する１４の抗原陽性試料のうち、１２のモノクロー
ナル抗体が、それらの対応するＨＵＬＣ軽鎖を使用したのに対し、２つのモノクローナル
抗体は、ＷＴマウスの軽鎖を使用した。表３に示される通り、ＨＵＬＣを使用する抗体の
うちの１つ（斜字体の抗体）を除く全ては、導入されたヒスチジン変異の全てを保持した
。クローンＡＡを配列決定したところ、２つの異なるＨＵＬＣ配列がもたらされたが、表
５では、これらを２つの項目で表す。
【表５】
2018164462.tif 000006
【０８６５】
（実施例６．５）
Ｖκ１−３９Ｊκ５に基づくヒスチジンユニバーサル軽鎖マウスにおいて生成されるモノ
クローナル抗体のｐＨ依存性結合
ＨＵＬＣマウスおよびＷＴマウスから単離されたモノクローナル抗体のｐＨ依存性結合
特徴をさらに評価するために、中性ｐＨにおいて抗体／抗原間の会合相を観察し、中性ま
たは酸性ｐＨにおいて抗体／抗原間の解離相を観察する、結合実験を実行した。
【０８６６】
Ｂｉａｃｏｒｅ  ＣＭ４センサーチップを、ポリクローナルウサギ抗マウスＦｃ抗体で
誘導体化した。モノクローナル抗体上清を抗マウスＦｃセンサー表面上に捕捉した。次い
で、５０ｎＭ（二連で）および１６．７ｎＭという２つの濃度の免疫原を、モノクローナ
ル抗体捕捉表面上に、３０μｌ／分の流量で注入した。抗体−抗原間の会合を、ｐＨ７．
４で４分間にわたりモニタリングし、次いで、捕捉モノクローナル抗体からの抗原の解離
を、ｐＨ７．４またはｐＨ６．０で１５分間にわたりモニタリングした。解離速度定数（
ｋｄ）は、Ｓｃｒｕｂｂｅｒ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０曲線フィッティングソフトウェア
を用い、データを処理してフィッティングすることにより決定し、これを、表６に示す。
解離半減期（ｔ１／２）は、ｔ１／２（分）＝（ｌｎ２／ｋｄ）／６０として、解離速度
定数から計算し、これを、表６に示す。表４に列挙される複数の抗体の、様々なｐＨ条件
下における会合／解離特徴を示すセンサーグラムを、図２６にグラフで示す。各グラフ内
の個々の線は、それぞれの抗体の異なる濃度における結合応答を表す。全ての実験は、２
５℃で実行した。解離半減期の値（ｔ１／２）を、それぞれのセンサーグラムの上方に注
記する。応答は、ＲＵ単位で測定する。
【表６】
2018164462.tif 000007
【０８６７】
（実施例７）
ヒスチジン置換したＶκ３−２０Ｊκ１ユニバーサル軽鎖を含む遺伝子改変マウスの操作
例えば、米国特許出願第１３／０２２，７５９号、同第１３／０９３，１５６号、同第
１３／４１２，９３６号、および同第１３／４８８，６２８号（それぞれ、特許公開第２
０１１／０１９５４５４号、同第２０１２／００２１４０９号、同第２０１２／０１９２
３００号、および同第２０１３／００４５４９２号）、ならびに上記の実施例１において
記載されている通りに、共通Ｖκ３−２０Ｊκ１軽鎖を含むマウスを生成した。生殖細胞
系列のユニバーサルＶκ３−２０Ｊκ１軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を、配列番号３
８３に示す。
【０８６８】
Ｖκ１−３９Ｊκ５ヒスチジン改変ユニバーサル軽鎖マウス（ＨＵＬＣ  １９２７およ
びＨＵＬＣ  １９３０）について、上記の実施例３で記載した戦略と同様の戦略を用いて
、ヒスチジン置換を、Ｖκ３−２０Ｊκ１ユニバーサル軽鎖のターゲッティングベクター
へと導入し、このベクターからマウスを生成した。
【０８６９】
手短には、ヒスチジン改変Ｖκ３−２０Ｊκ１ユニバーサル軽鎖ターゲッティングベク
ターを生成するための戦略を、図２９Ａ〜２９Ｄにまとめる。共通（ユニバーサル）軽鎖
マウス（例えば、ＵＳ２０１１／０１９５４５４Ａ１において記載されている「ＵＬＣマ
ウス」）のためのターゲッティングベクターを生成するために用いられるプラスミドであ
って、ｐＢＳ＋ＦＲＴ−Ｕｂ−Ｈｙｇ−ＦＲＴ＋マウスＶκ３−７リーダー＋ヒトＶκ３
−２０Ｊκ１を含有するプラスミドを、部位指向変異生成（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｌ
ｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｋｉｔ）により、図２８に示される部位指向変異生成プライマーを用
いて、ＣＤＲ３領域内のＱ１０５、Ｑ１０６、Ｙ１０７、およびＳ１０９、またはＱ１０
５、Ｑ１０６、およびＳ１０９（図２７のアラインメントを参照されたい）を、ヒスチジ
ン残基で置きかえるように改変した（この操作ステップについては、図２９Ａを参照され
たい）。結果として得られるベクター（Ｈ１０５／１０６／１０７／１０９およびＨ１０
５／１０６／１０９）をさらに改変し、マウスＩｇκ定常領域、マウスエンハンサー、マ
ウス３’側相同性アーム、およびＳＰＥＣカセットを含むベクターへとライゲーションし
た（図２９Ｂ）。さらなる改変は、５’側マウスアームを保有し、Ｆｒｔ−ＵＢ−ＮＥＯ
−Ｆｒｔカセットを含むベクターへのライゲーションを包含した（図２９Ｂ）。結果とし
て得られるターゲッティングベクターを、マウスＩｇκ可変遺伝子座（κ可変遺伝子セグ
メントおよびκ接合遺伝子セグメントを含む）の欠失を含むＥＳ細胞へとエレクトロポレ
ーションした（図２９Ｃ〜２９Ｄ）。
【０８７０】
陽性のＥＳ細胞クローンは、内因性κ軽鎖遺伝子座へと挿入される、操作されたＶκ３
−２０κＪ１軽鎖領域に対して特異的なプローブを用いる、対立遺伝子アッセイ（Valenz
uelaら）の改変型を用いることにより確認した。アッセイにおいて用いられるプライマー
およびプローブを、下記の表７に示し、配列表にも示し、プローブの位置を、図２９Ｃ〜
２９Ｄに示す。
【表７】
2018164462.tif 000008
【０８７１】
ターゲッティング構築物により導入されるＮＥＯ選択カセットは、ＥＳ細胞を、ＦＬＰ
を発現するプラスミドでトランスフェクトすることにより欠失させる（図２９Ｃおよび２
９Ｄ）。必要に応じて、ネオマイシンカセットは、ＦＬＰレコンビナーゼを発現するマウ
ス（例えば、ＵＳ６，７７４，２７９）と交配させることにより除去することもできる。
必要に応じて、ネオマイシンカセットを、マウスに保持させる。
【０８７２】
上記で記載した標的ＥＳ細胞をドナーＥＳ細胞として用い、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（
登録商標）法により、８細胞期マウス胚へと導入する（例えば、米国特許第７，２９４，
７５４号；およびPoueymirouら（２００７年）、F0  generation  mice  that  are  ess
entially  fully  derived  from  the  donor  gene-targeted  ES  cells  allowing  
immediate  phenotypic  analyses、Nature  Biotech.、２５巻（１号）：９１〜９９頁
を参照されたい）。配列に沿った１つまたは複数の位置において変異させたヒスチジン残
基を含有する、操作されたヒト軽鎖遺伝子を独立に保有するＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録
商標）を、上記で記載した標的ＥＳ細胞から作製する。
【０８７３】
仔マウスを遺伝子型決定し、操作された、ヒスチジン改変ヒト軽鎖についてヘテロ接合
性の仔マウスを、軽鎖の発現および発現させた抗体の結合能を特徴づけるために選択する
。３カ所の（Ｈ１０５／１０６／１０９；「６１８３」）ヒスチジン改変または４カ所の
（Ｈ１０５／１０５／１０８／１１１；「６１８１」）ヒスチジン改変を有するユニバー
サル軽鎖遺伝子を特異的に含むマウスを遺伝子型決定するためのプライマーおよびプロー
ブを、下記の表６に列挙し、配列表にも示す。本明細書では、ヒスチジン改変をそれらの
ユニバーサル軽鎖内に含有するマウスを、「ＨＵＬＣ」マウス（ヒスチジンユニバーサル
軽鎖マウス）と称する。
【０８７４】
【表８】
2018164462.tif 000009
【０８７５】
マウスを目的の抗原で免疫し、ｐＨ依存性結合を有する抗体を生成する能力について調
べる。
【０８７６】
（実施例８）
ヒスチジン置換した単一の、再構成されたヒトユニバーサル軽鎖マウス（ＨＵＬＣ）を含
むマウスの交配
本実施例は、本明細書に記載されているＨＵＬＣマウスのうちのいずれか１つと交配さ
せて、多重の遺伝子改変免疫グロブリン遺伝子座を保有する、多重の遺伝子改変マウス系
統を作製し得る、複数の他の遺伝子改変マウス系統について記載する。
【０８７７】
内因性Ｉｇλノックアウト（ＫＯ）
操作された軽鎖遺伝子座の使用頻度を最適化するために、上記のＨＵＬＣ動物（例えば
、Ｖκ１−３９Ｊκ５またはＶκ３−２０Ｊκ１ヒスチジン置換したユニバーサル軽鎖を
含む）のうちの任意の１つを、内因性λ軽鎖遺伝子座に欠失を含む別のマウスと交配させ
得る。この様式において、得られる子孫は、それらの唯一の軽鎖として、上記の実施例３
および４に記載されるとおりの再構成されたヒスチジン置換したヒト生殖細胞系列軽鎖領
域を発現する。交配は、当技術分野で認められる標準技術によって、あるいは商業的な繁
殖家（例えば、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）によって実施される。操作され
たヒスチジン置換した軽鎖遺伝子座、および内因性λ軽鎖遺伝子座の欠失を有するマウス
系統は、特有な軽鎖領域の存在および内因性マウスλ軽鎖の非存在についてスクリーニン
グされる。
【０８７８】
ヒト化内因性重鎖遺伝子座
操作されたヒト生殖細胞系列軽鎖遺伝子座を有するマウス（ＨＵＬＣマウス）は、ヒト
重鎖可変遺伝子の遺伝子座による内因性マウス重鎖可変遺伝子の遺伝子座の置換を含むマ
ウスと交配させられる（ＵＳ６，５９６，５４１を参照；ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録
商標）マウス、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）。Ｖ
ＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスは、マウスが抗原刺激に応じてヒト重鎖可変ド
メインおよびマウス重鎖定常領域を含む抗体を生成するように、内因性マウス定常領域遺
伝子座に作動可能に連結されたヒト重鎖可変領域を含むゲノムを含む。
【０８７９】
内因性マウス重鎖可変領域遺伝子座のヒト重鎖可変領域遺伝子座による置きかえ、およ
び内因性κ軽鎖遺伝子座内に、ヒスチジン置換した、単一の、再構成されたヒト軽鎖可変
領域を保有するマウスを得る。目的の抗原で免疫すると、ヒスチジン置換した単一のヒト
軽鎖（ＨＵＬＣ；ヒト軽鎖可変ドメインおよびマウスＣＬ）を有する体細胞変異重鎖（ヒ
ト重鎖可変ドメインおよびマウスＣＨ）を含有するリバースキメラ抗体が得られる。この
ようなマウスにおいて生成されるｐＨ依存性ヒト抗体は、当技術分野で公知であるかまた
は上記で記載した抗体の単離およびスクリーニング法を用いて同定する。抗体、例えば、
ｐＨ感受性抗体を発現するＢ細胞の可変軽鎖領域および可変重鎖領域のヌクレオチド配列
を同定し、好適な発現系で、可変重鎖領域および可変軽鎖領域のヌクレオチド配列を、ヒ
トＣＨヌクレオチド配列およびヒトＣＬヌクレオチド配列のそれぞれへと融合させること
により、完全ヒト抗体を作製する。
【０８８０】
（実施例９）
遺伝子改変マウスの子孫
再構成されたヒト軽鎖可変領域配列の限定的なレパートリー、または本明細書で記載さ
れる、単一の、再構成されたヒト軽鎖可変領域配列を含む操作されたヒト生殖細胞系列の
軽鎖遺伝子座を保有するマウス（ＨＵＬＣマウス）を、本明細書で記載されるヒスチジン
改変されたヒト重鎖可変遺伝子遺伝子座を含有するマウスと交配させる。マウスを得、ヒ
スチジン改変されたヒト軽鎖可変領域を含有する軽鎖配列およびヒスチジン改変されたヒ
ト重鎖可変領域を含有する重鎖配列の存在を遺伝子型解析により確認する。
【０８８１】
目的の抗原により免疫すると、ヒスチジン改変された重鎖（ヒスチジン改変されたヒト
重鎖可変ドメインおよびマウスＣＨ）およびヒスチジン改変された単一ヒト軽鎖（ＨＵＬ
Ｃ；ヒスチジン改変されたヒト軽鎖可変ドメインおよびマウスＣＬ）を含有するリバース
キメラ抗体が得られる。このようなマウスにおいて生成されるｐＨ依存性ヒト抗体は、当
技術分野で公知であるかまたは上記で記載した抗体の単離およびスクリーニング法を使用
して同定する。抗体、例えば、ｐＨ感受性抗体を発現するＢ細胞の可変軽鎖領域および可
変重鎖領域のヌクレオチド配列を同定し、好適な発現系において、可変重鎖領域および可
変軽鎖領域のヌクレオチド配列を、ヒトＣＨヌクレオチド配列およびヒトＣＬヌクレオチ
ド配列のそれぞれへと融合させることにより、完全ヒト抗体を作製する。
【０８８２】
均等物
当業者は、日常的な程度の実験を用いて、本明細書に記載されている本発明の具体的な
実施形態の多くの均等物を認識するか、または確認することが可能である。このような均
等物は、以下の特許請求の範囲に包含されることを意図する。記載される本発明を、その
具体的な実施形態を参照しながら記載してきたが、当業者は、本発明の真の精神および範
囲から逸脱することなく、様々な変更を行うことができ、同等物を代用しうることを理解
されたい。加えて、多くの改変も行って、特定の状況、材料、物質組成、プロセス、１つ
または複数のプロセスステップを、記載される本発明の目的および精神および範囲に照ら
して採用することができる。全てのこのような改変は、本明細書に付属の特許請求の範囲
内にあることを意図する。
【０８８３】
（項目１）
少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換または挿入を免疫
グロブリン可変遺伝子座に含む、免疫グロブリン遺伝子座をその生殖細胞系列に含む、遺
伝子改変された非ヒト動物。
（項目２）
第一の可変遺伝子座および第二の可変遺伝子座を含み、少なくとも該第一の可変遺伝子
座または該第二の可変遺伝子座は、少なくとも１つのヒスチジンコドンの挿入または少な
くとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、項目１に記載の
非ヒト動物。
（項目３）
前記第一の可変遺伝子座および前記第二の可変遺伝子座の両方が各々、少なくとも１つ
の非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換または挿入を含む、項目２に記載の
非ヒト動物。
（項目４）
前記第一の可変遺伝子座が、再構成されていない重鎖可変遺伝子座（再構成されていな
いＶセグメント、Ｄセグメント、Ｊセグメント）の少なくとも１つの機能性部分を含む、
項目３に記載の非ヒト動物。
（項目５）
前記再構成されていない重鎖可変遺伝子座が、ヒト遺伝子座（再構成されていないＶセ
グメント、Ｄセグメント、Ｊセグメント）の少なくとも一部分を含む、項目４に記載の非
ヒト動物。
（項目６）
前記再構成されていない重鎖遺伝子座が、再構成されていないＶセグメント、リンカー
を含む合成Ｄセグメント、およびヒトＪセグメントを含むヒト遺伝子座である、項目４に
記載の非ヒト動物。
（項目７）
前記合成Ｄセグメントが、少なくとも１つのヒスチジンコドンを含む、項目６に記載の
非ヒト動物。
（項目８）
前記第二の可変遺伝子座が、再構成されていない軽鎖遺伝子座（再構成されていないＶ
セグメント、Ｊセグメント）の少なくとも１つの機能性部分を含む、項目３に記載の非ヒ
ト動物。
（項目９）
前記第二の可変遺伝子座が、再構成された免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子配列（再構成
されたＶＪ配列）を含む、項目４に記載の非ヒト動物。
（項目１０）
非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる前記置換および／またはヒスチジンコド
ンの前記挿入が、可変ドメインをコードする核酸配列においてであり、ヒスチジンが、免
疫グロブリン鎖のＮ末端領域、免疫グロブリン鎖のループ４領域、重鎖のＣＤＲ１、重鎖
のＣＤＲ２、重鎖のＣＤＲ３、軽鎖のＣＤＲ１、軽鎖のＣＤＲ２、軽鎖のＣＤＲ３、およ
びこれらの組合せから選択される領域にある、項目１に記載の非ヒト動物。
（項目１１）
前記第一の可変遺伝子座または前記第二の可変遺伝子座のうちの少なくとも１つが、内
因性非ヒト免疫グロブリン遺伝子座において、内因性非ヒト定常領域の核酸配列に作動可
能に連結された、項目２に記載の非ヒト動物。
（項目１２）
前記第一の可変遺伝子座（再構成されていないヒトＶセグメント、ヒトＤセグメント、
ヒトＪセグメント）が、内因性非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域の核酸配列に作動可能
に連結された、項目５に記載の非ヒト動物。
（項目１３）
前記第一の可変遺伝子座（再構成されていないヒトＶセグメント、ヒトＤセグメント、
ヒトＪセグメント）が、内因性非ヒト免疫グロブリン遺伝子座において、前記内因性非ヒ
ト免疫グロブリン重鎖定常領域の核酸配列に作動可能に連結された、項目１２に記載の非
ヒト動物。
（項目１４）
前記第二の可変遺伝子座（再構成されていないＶセグメント、Ｊセグメント）が、内因
性非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域配列に作動可能に連結された、項目６に記載の非ヒ
ト動物。
（項目１５）
前記内因性非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域配列が、内因性非ヒト免疫グロブリン遺
伝子座にある、項目１４に記載の非ヒト動物。
（項目１６）
定常領域遺伝子配列に作動可能に連結された再構成されていないヒト免疫グロブリン重
鎖可変領域の核酸配列（再構成されていないＶセグメント、Ｄセグメント、Ｊセグメント
）の少なくとも一部分であって、該Ｖ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、およびＪ
遺伝子セグメントのうちの１つまたは複数が、少なくとも１カ所の非ヒスチジンコドンの
ヒスチジンコドンによる置換、または少なくとも１カ所のヒスチジンコドンの挿入を含む
、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域の核酸配列の少なくとも一部分と
；
定常領域遺伝子配列に作動可能に連結された再構成されていないヒト免疫グロブリン軽
鎖可変領域の核酸配列（再構成されていないＶセグメント、Ｊセグメント）の少なくとも
一部分であって、該Ｖ遺伝子セグメントおよびＪ遺伝子セグメントのうちの１つまたは複
数が、少なくとも１カ所の非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換、または少
なくとも１カ所のヒスチジンコドンの挿入を含む、再構成されていないヒト免疫グロブリ
ン軽鎖可変領域の核酸配列の少なくとも一部分と
を含み、
マウスの生殖細胞系列におけるヒスチジン置換またはヒスチジン挿入に由来するヒスチ
ジンを含む、免疫グロブリン重鎖可変ドメインおよび／または免疫グロブリン軽鎖可変ド
メインを発現する、遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目１７）
哺乳動物である、項目１６に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目１８）
齧歯動物である、項目１７に記載の遺伝子改変された哺乳動物。
（項目１９）
マウス、ラット、およびハムスターからなる群から選択される、項目１８に記載の齧歯
動物。
（項目２０）
前記再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域の核酸配列が、非ヒト定常領
域配列に作動可能に連結された、項目１６に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目２１）
前記再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域の核酸配列に作動可能に連結
された前記非ヒト定常領域核酸配列が、前記非ヒト動物の生殖細胞系列における内因性非
ヒト免疫グロブリン遺伝子座にある、項目２０に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目２３）
前記再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域の核酸配列に作動可能に連結
された前記非ヒト定常領域核酸配列が、前記非ヒト動物の生殖細胞系列における内因性非
ヒト免疫グロブリン遺伝子座にある、項目１６に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目２４）
定常領域遺伝子配列に作動可能に連結された再構成されていないヒト免疫グロブリン重
鎖可変領域の核酸配列（再構成されていないＶセグメント、Ｄセグメント、Ｊセグメント
）の少なくとも一部分であって、該再構成されていないＶ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セ
グメント、およびＪ遺伝子セグメントのうちの１つまたは複数が、少なくとも１カ所の非
ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換、または少なくとも１カ所のヒスチジン
コドンの挿入を含む、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域の核酸配列の
少なくとも一部分と；
軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結された再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖
可変領域の核酸配列（再構成されたＶＪ配列）であって、該再構成されたＶＪ配列が、少
なくとも１カ所の非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換、または少なくとも
１カ所のヒスチジンコドンの挿入を含む、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域
の核酸配列と
を含み、
マウスの生殖細胞系列におけるヒスチジン置換またはヒスチジン挿入に由来するヒスチ
ジンを含む、免疫グロブリン重鎖可変ドメインおよび／または免疫グロブリン軽鎖可変ド
メインを発現する、遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目２５）
哺乳動物である、項目２４に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目２６）
齧歯動物である、項目２５に記載の遺伝子改変された哺乳動物。
（項目２７）
マウス、ラット、およびハムスターからなる群から選択される、項目２６に記載の齧歯
動物。
（項目２８）
前記再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域の核酸配列が、非ヒト定常領
域配列に作動可能に連結された、項目２４に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目２９）
前記再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域の核酸配列に作動可能に連結
された前記非ヒト定常領域配列が、前記非ヒト動物の生殖細胞系列における内因性非ヒト
免疫グロブリン遺伝子座にある、項目２８に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目３０）
前記再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域の核酸配列に作動可能に連結された
前記非ヒト定常領域配列が、前記非ヒト動物の生殖細胞系列における内因性非ヒト免疫グ
ロブリン遺伝子座にある、項目２９に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目３１）
野生型の非ヒト動物と比較した、Ｂ細胞集団の免疫グロブリン重鎖におけるおよび免疫
グロブリン軽鎖におけるヒスチジン残基の存在の増強を特徴とするＢ細胞集団を含む、遺
伝子改変された非ヒト動物。
（項目３２）
前記増強が、約２〜４倍である、項目３１に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目３３）
前記増強が、約２〜１０倍である、項目３１に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目３４）
非ヒト動物の生殖細胞系列の免疫グロブリン配列における置換および／または挿入によ
りコードされるヒスチジンを含む、免疫グロブリン軽鎖および免疫グロブリン重鎖を発現
する、遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目３５）
前記可変領域配列が、ヒスチジンコドンによる非ヒスチジンコドンの置換および／また
はヒスチジンコドンの挿入である、２つ、３つ、４つ、または５つのヒスチジンによるク
ラスターを含む、項目１に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目３６）
前記再構成されていない重鎖遺伝子座が、前記重鎖遺伝子座の配向の方向に対して反転
されたＤ遺伝子セグメントを含む、項目５に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目３７）
生殖細胞系列のヒスチジンコドンによりコードされるヒスチジンを有する抗体可変ドメ
インを作製する非ヒト動物を作製するための方法であって、
該非ヒト動物を、その生殖細胞系列において、少なくとも１カ所のヒスチジンコドンに
よる非ヒスチジンコドンの置換またはヒスチジンコドンの挿入を、再構成されていない免
疫グロブリン重鎖可変（再構成されていないＶセグメント、Ｄセグメント、Ｊセグメント
）遺伝子座に含むように改変するステップと、
該非ヒト動物を、その生殖細胞系列において、少なくとも１カ所のヒスチジンコドンに
よる非ヒスチジンコドンの置換またはヒスチジンコドンの挿入を、再構成されていない免
疫グロブリン軽鎖可変（再構成されていないＶセグメント、Ｊセグメント）遺伝子座に含
むように改変するステップと
を含む方法。
（項目３８）
マウスの生殖細胞系列を、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変（Ｖセグメ
ント、Ｄセグメント、Ｊセグメント）遺伝子座の少なくとも一部分を含むように遺伝子改
変するステップと、ヒスチジン置換またはヒスチジン挿入を、該再構成されていない免疫
グロブリン重鎖可変（再構成されていないＶセグメント、Ｄセグメント、Ｊセグメント）
ヒト遺伝子座に施すステップとを含む、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
マウスの生殖細胞系列を、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖（再構成されて
いないＶセグメント、Ｊセグメント）遺伝子座の少なくとも一部分を含むように遺伝子改
変するステップと、ヒスチジン置換またはヒスチジン挿入を、該再構成されていないヒト
免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に施すステップとを含む、項目３７に記載の方法。
（項目４０）
前記非ヒト動物が、齧歯動物である、項目３７に記載の方法。
（項目４１）
前記齧歯動物が、マウス、ラット、およびハムスターから選択される、項目４０に記載
の方法。
（項目４２）
生殖細胞系列のヒスチジンコドンによりコードされるヒスチジンを有する抗体可変ドメ
インを作製する非ヒト動物を作製するための方法であって、
該非ヒト動物を、少なくとも１カ所のヒスチジンコドンによる非ヒスチジンコドンの置
換またはヒスチジンコドンの挿入を、再構成されていない免疫グロブリン重鎖可変（再構
成されていないＶセグメント、Ｄセグメント、Ｊセグメント）遺伝子座に含むように改変
するステップと、
該非ヒト動物を、少なくとも１カ所のヒスチジンコドンによる非ヒスチジンコドンの置
換またはヒスチジンコドンの挿入を、該生殖細胞系列における再構成された免疫グロブリ
ン軽鎖可変配列（再構成されたＶＪ配列）に含むように改変するステップと
を含む方法。
（項目４３）
前記非ヒト動物が、齧歯動物である、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
前記齧歯動物が、マウス、ラット、およびハムスターから選択される、項目４３に記載
の方法。
【図１Ａ】
2018164462.tif 000010
【図１Ｂ】
2018164462.tif 000011
【図２】
2018164462.tif 000012
【図３】
2018164462.tif 000013
【図４】
2018164462.tif 000014
【図５】
2018164462.tif 000015
【図６】
2018164462.tif 000016
【図７】
2018164462.tif 000017
【図８】
2018164462.tif 000018
【図９】
2018164462.tif 000019
【図１０Ａ】
2018164462.tif 000020
【図１０Ｂ】
2018164462.tif 000021
【図１０Ｃ】
2018164462.tif 000022
【図１０Ｄ】
2018164462.tif 000023
【図１０Ｅ】
2018164462.tif 000024
【図１１】
2018164462.tif 000025
【図１２】
2018164462.tif 000026
【図１３】
2018164462.tif 000027
【図１４】
2018164462.tif 000028
【図１５】
2018164462.tif 000029
【図１６】
2018164462.tif 000030
【図１７】
2018164462.tif 000031
【図１８】
2018164462.tif 000032
【図１９Ａ】
2018164462.tif 000033
【図１９Ｂ】
2018164462.tif 000034
【図１９Ｃ】
2018164462.tif 000035
【図１９Ｄ】
2018164462.tif 000036
【図１９Ｅ】
2018164462.tif 000037
【図１９Ｆ】
2018164462.tif 000038
【図１９Ｇ】
2018164462.tif 000039
【図１９Ｈ】
2018164462.tif 000040
【図１９Ｉ】
2018164462.tif 000041
【図１９Ｊ】
2018164462.tif 000042
【図２０Ａ】
2018164462.tif 000043
【図２０Ｂ】
2018164462.tif 000044
【図２０Ｃ】
2018164462.tif 000045
【図２０Ｄ】
2018164462.tif 000046
【図２０Ｅ】
2018164462.tif 000047
【図２１】
2018164462.tif 000048
【図２２】
2018164462.tif 000049
【図２３Ａ】
2018164462.tif 000050
【図２３Ｂ】
2018164462.tif 000051
【図２３Ｃ】
2018164462.tif 000052
【図２３Ｄ】
2018164462.tif 000053
【図２３Ｅ】
2018164462.tif 000054
【図２３Ｆ】
2018164462.tif 000055
【図２４】
2018164462.tif 000056
【図２５】
2018164462.tif 000057
【図２６Ａ】
2018164462.tif 000058
【図２６Ｂ】
2018164462.tif 000059
【図２６Ｃ】
2018164462.tif 000060
【図２７】
2018164462.tif 000061
【図２８】
2018164462.tif 000062
【図２９Ａ】
2018164462.tif 000063
【図２９Ｂ】
2018164462.tif 000064
【図２９Ｃ】
2018164462.tif 000065
【図２９Ｄ】
2018164462.tif 000066
【配列表】
2018164462000001.app
【外国語明細書】
2018164462000001.pdf