(57)【要約】【課題】血液内の核酸を精製することなく、核酸増幅が可能である反応組成物を提供する。【解決手段】トリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）またはビシン（Ｂｉｃｉｎｅ）が含有した反応組成により、血液内のＤＮＡを、精製工程を経ることなく、良好な核酸増幅を実現できること特徴とする核酸増幅方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料中に含まれる標的核酸を増幅する方法であって、該生体試料を精製工程を経ることなく核酸増幅反応液に添加し、かつ、該核酸増幅反応液にトリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）またはビシン（Ｂｉｃｉｎｅ）を含むことを特徴とする核酸増幅方法。
【請求項２】
ＤＮＡポリメラーゼがファミリーＡに属するＤＮＡポリメラーゼである請求項１に記載の核酸増幅方法。
【請求項３】
ＤＮＡポリメラーゼが配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性があるＤＮＡポリメラーゼである請求項１または２に記載の核酸増幅方法。
【請求項４】
ＤＮＡポリメラーゼが配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性があるＤＮＡポリメラーゼである請求項３に記載の核酸増幅方法。
【請求項５】
ＤＮＡポリメラーゼがＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼまたはその変異体である請求項１〜４のいずれかに記載の核酸増幅方法。
【請求項６】
ＤＮＡポリメラーゼがＺ０５ ＤＮＡポリメラーゼまたはその変異体である請求項１〜４のいずれかに記載の核酸増幅方法。
【請求項７】
生体試料が血液である請求項１〜６にいずれかに記載の核酸増幅方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の核酸増幅方法に用いることを特徴とする核酸増幅用試薬。
【請求項９】
請求項８に記載の核酸増幅用試薬を含むことを特徴とする核酸増幅用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＣＲに用いられる核酸増幅方法に関する。本発明は、研究の目的のみならず、臨床診断や環境検査等にも利用することができる。
【背景技術】
【０００２】
ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）とは、（１）熱処理によるＤＮＡ変性（２本鎖ＤＮＡから１本鎖ＤＮＡへの解離）、（２）鋳型１本鎖ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、（３）ＤＮＡポリメラーゼを用いた前記プライマーの伸長、という３ステップを１サイクルとし、このサイクルを繰り返すことによって、試料中の標的核酸を増幅する方法である。数コピーといった微量サンプルからでも標的核酸を何十万倍に増幅することができ、研究分野のみならず、遺伝子診断、臨床診断といった法医学分野、あるいは、食品や環境中の微生物検査等においても、広く用いられるようになってきている。
【０００３】
しかしながら、ＰＣＲは、色素やタンパク質、糖類などの夾雑物の影響を受けやすく、夾雑物が反応を阻害することも知られている（非特許文献１）。診断用途では血液などがサンプルとしてよく使用されるが、血液内の夾雑物質が反応を阻害するため、通常、血液等の生体試料内の遺伝子を増幅する場合は、核酸の精製が必要とされていた。しかし、核酸の精製においては、その操作は煩雑であり、かつ、時間を要し、操作中にコンタミネーションを生じる危険性がある。また、試料中の目的核酸含量が少ない場合には、十分量を回収することができない場合もあった。これらの事情から、血液などの生体由来のサンプルから精製工程を経ることなく、核酸を増幅する方法が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２００６−５０７０１２号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ,  Ｖｏｌ．３９,  Ｎｏ．２，  ｐ４８５−４９３（２００１）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明は核酸増幅、特にＰＣＲにおいて、標的核酸の効率的な増幅を実現することを目的とする。より詳細には、血液等の生体試料内の核酸について、精製工程を経ることなく増幅することが可能な核酸増幅方法を提供する。さらに本発明の他の目的は、上記の目的に適した試薬またはキットを提供することにある。要約すれば、本発明の目的は、血液内に存在する遺伝子の増幅に適した核酸反応、特にＰＣＲ反応の新規な組成物および反応試薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記課題を達成するための本発明の核酸増幅方法は、トリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）またはビシン（Ｂｉｃｉｎｅ）を含有した組成で核酸増幅することを特徴とするものである。
【０００８】
本発明者らは、上記事情に鑑み鋭意研究の結果、血液等の生体試料そのものと遺伝子増幅反応液を混合し反応させる核酸増幅反応組成において、Ｔｒｉｃｉｎｅ、またはＢｉｃｉｎｅを含んだＢｕｆｆｅｒを用いることで、血液等の生体試料由来の夾雑物が多量に存在していても、ＰＣＲが可能となることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
代表的な本願発明は、以下の通りである。
項１．生体試料中に含まれる標的核酸を増幅する方法であって、該生体試料を精製工程を経ることなく核酸増幅反応液に添加し、かつ、該核酸増幅反応液にトリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）またはビシン（Ｂｉｃｉｎｅ）を含むことを特徴とする核酸増幅方法。
項２．ＤＮＡポリメラーゼがファミリーＡに属するＤＮＡポリメラーゼである項１に記載の核酸増幅方法。
項３．ＤＮＡポリメラーゼが配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性があるＤＮＡポリメラーゼである項１または２に記載の核酸増幅方法。
項４．ＤＮＡポリメラーゼが配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性があるＤＮＡポリメラーゼである項３に記載の核酸増幅方法。
項５．ＤＮＡポリメラーゼがＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼまたはその変異体である項１〜４のいずれかに記載の核酸増幅方法。
項６．ＤＮＡポリメラーゼがＺ０５ ＤＮＡポリメラーゼまたはその変異体である項１〜４のいずれかに記載の核酸増幅方法。
項７．生体試料が血液である項１〜６にいずれかに記載の核酸増幅方法。
項８．項１〜７のいずれかに記載の核酸増幅方法に用いることを特徴とする核酸増幅用試薬。
項９．項８に記載の核酸増幅用試薬を含むことを特徴とする核酸増幅用キット。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の核酸増幅方法を用いることによって、核酸精製の際のロスやキャリーオーバーの危険性をなくし、さらに核酸増幅の時間・コストを削減することができる。また、研究分野だけではなく、遺伝子診断などの臨床分野もしくは法医学分野においても広く利用することができる
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例１における、血液中のＤＮＡ増幅を検討した結果を示す図である。
【図２】実施例２における、血液中のＤＮＡ増幅を検討した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の実施形態を示しつつ、本発明についてさらに詳説する。
【００１３】
（１）本発明の特徴
本発明における核酸増幅方法は、血液等の生体試料中の標的核酸を増幅する際に特に有用である。生体試料を、精製工程を経る必要がなく直接核酸増幅反応液に添加し、トリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）またはビシン（Ｂｉｃｉｎｅ）を含む反応組成を用いることにより、効率的に標的核酸を増幅することが実現されるものである。本発明において、生体試料としては、生体に由来する試料全般を指すものであり、具体的には、血液、唾液、喀痰などの体液、口腔粘膜、皮膚、爪、臓器などの動植物組織、排泄物などが挙げられる。特に、血液中の標的核酸の増幅に有用である。
【００１４】
（２）精製工程を経ないこと
本発明における核酸増幅方法を用いることにより、生体試料中に含まれている核酸を精製することなく増幅することが可能である。ここで、精製とは、生体試料の組織、細胞壁などの夾雑物質と生体試料中の核酸を分離する方法であり、フェノールあるいはフェノール・クロロホルム等を用いて、核酸を分離する方法や、イオン交換樹脂、ガラスフィルターあるいはタンパク質凝集作用を有する試薬によって核酸を分離する方法がある。
【００１５】
本発明において、前記核酸を抽出するための処理（物理的な処理による細胞破壊、界面活性剤などを使用した細胞破壊など）は精製に該当しない。また、生体試料を緩衝液などにより希釈する行為も本発明においては精製に該当しない。
【００１６】
本発明においては、生体試料をこれらの精製法を経ることなく、核酸増幅反応液に添加し増幅することが可能である。本発明において生体試料を「精製工程を経ずに」核酸増幅反応液に添加しとは、生体試料それ自体、あるいは生体試料を水などの溶媒を用いて希釈したもの、生体試料を水などの溶媒に添加し熱をかけて破砕させたものなどを核酸増幅反応液に添加することも含まれるが、精製工程を経ていなければ、核酸増幅反応液中に添加される生体試料は、特にこれらに限定されるものではない。
【００１７】
（３）トリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）またはビシン（Ｂｉｃｉｎｅ）
本発明に用いるトリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）またはビシン（Ｂｉｃｉｎｅ）はＧｏｏｄ Ｂｕｆｆｅｒの一種を示す。トリシンまたはビシンはｐＨを調整したものが挙げられるが、特にｐＨを調整していないものであってもよい。好ましくは水酸化カリウムや水酸化ナトリウムでｐＨを７．０〜９．０、好ましくは８．０〜８．８、より好ましくは８．２〜８．５に調整したものが挙げられるが特に限定されない。
トリシン、ビシンは、ＰＣＲ反応用のＢｕｆｆｅｒや前処理用のＢｕｆｆｅｒとして含有させることによる使用が考えられるが、最終的に核酸増幅反応時に反応液中に含まれていればよく、特に使用用途やこれらが含まれる試薬やキットのパーツについては限定されない。核酸増幅反応に使用する際のトリシンまたはビシンの濃度は、反応液中の濃度として２５ｍＭ〜１５０ｍＭの範囲が好ましく、より好ましくは５０ｍＭ〜１００ｍＭであるが、特に限定されない。
【００１８】
（４）核酸増幅に用いられる酵素
本発明に用いられる酵素としては、例えば配列番号１（Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ）と８０％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性があるＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。あるいは、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるＤＮＡポリメラーゼであってもよい。具体的には、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｚ０５  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、またはこれらの変異体などが挙げられるが、特にこれらに限定されない。
【００１９】
アミノ酸配列の同一性を算出する方法としては、種々の方法が知られている。例えば、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。本発明では、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の同一性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／においてデフォルト（初期設定）のパラメーターを用いることにより、アミノ酸配列の同一性を算出する。
【００２０】
（５）ＤＮＡポリメラーゼ変異体
本発明の核酸増幅方法に用いるＤＮＡポリメラーゼ変異体として、より好ましい態様としては、配列番号１の５０９位に相当するアミノ酸をアルギニンやリシン、ヒスチジンに置換したもの、あるいは配列番号１の７４４位に相当するアミノ酸をアルギニンやリシン、ヒスチジンに置換したものなどが挙げられるが、特に限定されない。
【００２１】
本発明において、配列番号１に示されるアミノ酸配列と完全同一ではないアミノ酸配列おける、配列番号１上のある位置（順番）と対応する位置とは、配列の一次構造を比較（アラインメント）したとき、配列番号１の当該位置と対応する位置とする。配列の一次構造を比較する方法としては、種々の方法が知られている。例えば、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。
本発明においては、ＤＮＡ  Ｄａｔａｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）のＣｌｕｓｔａｌＷ（ｈｔｔｐ：／／ｃｌｕｓｔａｌｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ？ｌａｎｇ＝ｊａ）においてデフォルト（初期設定）のパラメーターを用いることにより、配列の一次構造を比較するものとする。
【００２２】
（６）ＤＮＡポリメラーゼ活性測定法
本発明に用いるＤＮＡポリメラーゼは以下のように活性を測定する。酵素活性が強い場合には、保存緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），５０ｍＭ  ＫＣｌ，１ｍＭ  ジチオスレイトール，０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０，０．１％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０，５０％  グリセリン）でサンプルを希釈して測定を行う。
（１）下記のＡ液２５μｌ、Ｂ液５μｌ、Ｃ液５μｌ、滅菌水１０μｌ、及び酵素溶液５μｌをマイクロチューブに加えて７５℃にて１０分間反応する。
（２）その後氷冷し、Ｅ液５０μｌ、Ｄ液１００μｌを加えて、攪拌後更に１０分間氷冷する。
（３）この液をガラスフィルター（ワットマン製ＧＦ／Ｃフィルター）で濾過し、０．１Ｎ  塩酸およびエタノールで十分洗浄する。
（４）フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンターＴｒｉ−Ｃａｒｂ２８１０  ＴＲ（パッカード製）で計測し、鋳型ＤＮＡのヌクレオチドの取り込みを測定する。酵素活性の１単位はこの条件で３０分当りの１０ｎｍｏｌのヌクレオチドを酸不溶性画分（即ち、Ｄ液を添加したときに不溶化する画分）に取り込む酵素量とする。
Ａ：４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）１６ｍＭ  塩化マグネシウム１５
ｍＭ  ジチオスレイトール１００μｇ／ｍＬ  ＢＳＡ（牛血清アルブミン）
Ｂ：１．５μｇ／μｌ  活性化仔牛胸腺ＤＮＡ
Ｃ：１．５ｍＭ  ｄＮＴＰ（２５０ｃｐｍ／ｐｍｏｌ  ［３Ｈ］ｄＴＴＰ）
Ｄ：２０％  トリクロロ酢酸（２ｍＭ  ピロリン酸ナトリウム）
Ｅ：１ｍｇ／ｍＬ仔牛胸腺ＤＮＡ
【００２３】
本発明に用いるＤＮＡポリメラーゼを改変する方法は、既に当該技術分野において確立されている。よって、公知の方法に従い改変を行うことが出来、その態様は特に制限されない。
【００２４】
アミノ酸の改変を導入する方法の一態様として、Ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ法に基づく部位特異的変異導入法を用いることが好ましい。例えば、ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｔｏｙｏｂｏ製）は、（１）目的とする遺伝子を挿入したプラスミドを変性させ、該プラスミドに変異プライマーをアニーリングさせ、続いてＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長反応を行う、（２）（１）のサイクルを１５回繰り返す、（３）制限酵素ＤｐｎＩを用いて鋳型としたプラスミドのみを選択的に切断する、（４）新たに合成された遺伝子をリン酸化、Ｌｉｇａｔｉｏｎを実施し環化させる、（５）環化した遺伝子を大腸菌に形質転換し、目的とする変異の導入されたプラスミドを保有する形質転換体を取得することのできる、キットである。
【００２５】
上記改変ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を、必要に応じて発現ベクターに移し替え、宿主として例えば大腸菌を、該発現ベクターを用いて形質転換した後、アンピシリン等の薬剤を含む寒天培地に塗布し、コロニーを形成させる。コロニーを栄養培地、例えばＬＢ培地や２×ＹＴ培地に接種し、３７℃で１２〜２０時間培養した後、菌体を破砕して粗酵素液を抽出する。ベクターとしては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ由来のものが好ましい。菌体を破砕する方法としては公知のいかなる手法を用いても良いが、例えば超音波処理、フレンチプレスやガラスビーズ破砕のような物理的破砕法や、リゾチームのような溶菌酵素を用いることができる。この粗酵素液を８０℃、３０分間熱処理し、宿主由来のＤＮＡポリメラーゼを失活させ、ＤＮＡポリメラーゼ活性を測定する。
【００２６】
上記方法により選抜された菌株から精製ＤＮＡポリメラーゼを取得する方法は、いかなる手法を用いても良いが、例えば下記のような方法が、好適な態様として挙げられる。栄養培地に培養して得られた菌体を回収した後、酵素的または物理的破砕法により破砕抽出して、粗酵素液を得る。得られた粗酵素抽出液から熱処理、例えば８０℃、３０分間処理し、その後硫安沈殿によりＤＮＡポリメラーゼ画分を回収する。この粗酵素液を、セファデックスＧ−２５（アマシャムファルマシア・バイオテク製）を用いたゲル濾過等の方法により脱塩を行うことができる。この操作の後、ヘパリンセファロースカラムクロマトグラフィーにより分離、精製し、精製酵素標品を得ることができる。該精製酵素標品は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってほぼ単一バンドを示す程度に純化される。
【００２７】
（７）核酸増幅法
本発明に適用可能な核酸増幅法としては、典型的にはＰＣＲが挙げられるが、本発明はＰＣＲのみならず、ＤＮＡを鋳型とし、１種のプライマー、ｄＮＴＰ（デオキシリボヌクレオチド３リン酸）を反応させることによりプライマーを伸長して、ＤＮＡプライマー伸長物を合成する他の核酸増幅方法にも使用される。具体的には、プライマーエクステンション法、シークエンス法、従来の温度サイクルを行わない方法およびサイクルシーケンス法などを含む。
【００２８】
本発明の核酸増幅方法は必要に応じて、さらに、ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性及び／又は３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を抑制する活性を有する抗体を用いても良い。前記抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体などが挙げられる。抗体を用いた反応組成は、ＰＣＲの感度上昇、非特異的な増幅の軽減に特に有効である。
【００２９】
（８）核酸増幅用試薬、キット
本発明の核酸増幅用試薬またはキットは、上述の通り、トリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）またはビシン（Ｂｉｃｉｎｅ）を反応液中に含んでいればよく、それ以外の構成については特に限定されない。適用する核酸増幅法についても特に限定されない。
【００３０】
前記試薬またはキットには、必要に応じて、その他の成分として、たとえばＰＣＲ増強因子、ＢＳＡ、非イオン界面活性剤などをさらに加えて用いてもよい。
【実施例】
【００３１】
以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。なお、実施例は、いかなる意味においても、本発明を限定するものではない。
（実施例１）
【００３２】
実施例１
血液を含む反応液での増幅（１）
１００コピーのＶＴ遺伝子（Ｖｉｒｃｅｌｌ製）を増幅する反応系に血液を添加し、増幅を比較した。反応液は、ＴｒｉｓをＨＣｌでｐＨ８．２に調整したもの、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＰＩＰＥＳをＫＯＨでｐＨ８．２に調整したものをそれぞれ使用し、ＴａｑＭａｎ  Ｐｒｏｂｅの検出における増幅曲線、Ｃｑ値を比較した。
【００３３】
ＰＣＲの反応液としては、以下の組成２０μｌで実施した。
５０ｍＭ  各Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．２）
１００ｍＭ  ＫＣｌ
１０％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ
０．４ｍＭ  ｄＮＴＰｓ
２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２
１Ｕ  抗体混合Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）
１ｐｍｏｌ  Ｆｗｄ  Ｐｒｉｍｅｒ（配列番号２）
１ｐｍｏｌ  Ｒｅｖ  Ｐｒｉｍｅｒ（配列番号３）
ＲＯＸで標識された０．４ｐｍｏｌ  ＴａｑＭａｎ（登録商標）  Ｐｒｏｂｅ（配列番号４）
１００コピーのＶＴ遺伝子
【００３４】
上記反応液の中に血液２μｌを含んだものと含んでいないもの、それぞれＮ＝２で９５℃、１分の前反応の後、９５℃、１５秒→６０℃、４５秒を５０サイクル繰り返すスケジュールでＬＣ９６（Ｒｏｃｈｅ製）を用いてｑＰＣＲを行った。
反応終了後、ＬＣ９６のデフォルトで示されるＣｑ値と増幅曲線を比較した。
【００３５】
表１および図１は、Ｔｒｉｓ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＰＩＰＥＳ  Ｂｕｆｆｅｒをそれぞれ使用し、ＴａｑＭａｎ（登録商標）  Ｐｒｏｂｅの検出を血液ありなしで比較した増幅曲線、およびＣｑ値を示す。
【００３６】
結果、Ｔｒｉｓ、ＰＩＰＥＳ  Ｂｕｆｆｅｒで増幅したものは、血液なしでは問題なく増幅しているものの、血液を添加することで阻害がかかり、蛍光値の増加がほとんど見られない結果となった。一方、Ｂｉｃｉｎｅ、Ｔｒｉｃｉｎｅ  Ｂｕｆｆｅｒを用いた場合、血液を添加しても増幅が確認できた。なかでも、Ｔｒｉｃｉｎｅ  Ｂｕｆｆｅｒを用いた場合、血液添加の場合における蛍光値の低下がほとんど見られることがなく、血液の影響を受けずに増幅できることが確認された。
【００３７】
【表１】
2018164421.tif 000002
【００３８】
同様に、Ｚ０５  ＤＮＡポリメラーゼやＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ変異体（Ｑ５０９Ｒ、Ｑ５０９Ｋ、Ｅ７４４Ｋ、Ｅ７４４Ｒ）、およびＺ０５  ＤＮＡポリメラーゼ変異体（Ｑ５０９Ｒ、Ｑ５０９Ｋ、Ｅ７４４Ｋ、Ｅ７４４Ｒ）を用いた場合においても、同様の結果が得られた。
【００３９】
実施例２
血液を含む反応液での増幅（２）
実施例１と同様、１００コピーのＶＴ遺伝子を増幅する反応系に血液を添加し、増幅を比較した。反応液は、ＴｒｉｓをＨＣｌでｐＨ８．２に調整したもの、ＴｒｉｓをＨＣｌでｐＨ８．２に調整したものにＰＣＲ促進剤として知られ、血液耐性能を向上させることが知られているベタインを１Ｍになるよう添加したもの、およびＴｒｉｃｉｎｅ、ＢｉｃｉｎｅをＫＯＨでｐＨ８．２に調整したものをそれぞれ使用し、ＴａｑＭａｎ（登録商標）  Ｐｒｏｂｅの検出においての増幅曲線、Ｃｑ値を比較した。
【００４０】
ＰＣＲの反応液としては、以下の組成２０μｌで実施した。
５０ｍＭ  各Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．２）
１００ｍＭ  ＫＣｌ
１０％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ
０．４ｍＭ  ｄＮＴＰｓ
２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２
１Ｕ  抗体混合Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）
１ｐｍｏｌ  Ｆｗｄ  Ｐｒｉｍｅｒ（配列番号２）
１ｐｍｏｌ  Ｒｅｖ  Ｐｒｉｍｅｒ（配列番号３）
ＲＯＸで標識された０．４ｐｍｏｌ  ＴａｑＭａｎ（登録商標）  Ｐｒｏｂｅ（配列番号４）
１００コピーのＶＴ遺伝子
ベタインを添加する場合は、反応液に１Ｍになるよう添加したものを使用した。
【００４１】
上記反応液中に、血液２μｌを含んだものと含んでいないもの、それぞれＮ＝２で９５℃、１分の前反応の後、９５℃、１５秒→６０℃、４５秒を５０サイクル繰り返すスケジュールでＬＣ９６（Ｒｏｃｈｅ製）を用いてｑＰＣＲを行った。反応終了後、ＬＣ９６のデフォルトで示されるＣｑ値と増幅曲線を比較した。
【００４２】
表２および図２は、Ｔｒｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ、Ｔｒｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒにベタインを添加したもの、Ｔｒｉｃｉｎｅ  Ｂｕｆｆｅｒをそれぞれ使用し、ＴａｑＭａｎ（登録商標）  Ｐｒｏｂｅの検出を血液ありなしで比較した増幅曲線、およびＣｑ値を示す。
【００４３】
結果、実施例１と同様、Ｔｒｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒで増幅したものは、血液なしでは問題なく増幅しているものの、血液を添加することで阻害がかかり、蛍光値の増加がほとんど見られない結果となった。一方、ＰＣＲ促進剤として知られているベタインを添加した場合は、血液添加でも増幅が得られた。しかし、Ｔｒｉｃｉｎｅ  Ｂｕｆｆｅｒの結果と比較すると、ベタインを添加したものでも、血液添加での蛍光値の低下が目立つ結果となった。Ｔｒｉｃｉｎｅ  Ｂｕｆｆｅｒを用いた場合、ベタインのようなＰＣＲ促進剤がなくても、血液の影響を受けずに増幅でき、血液からの増幅においてＰＣＲ促進剤を用いる場合よりも優れた性能が得られることが確認された。
【００４４】
【表２】
2018164421.tif 000003
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明により、血液等の生体試料中の核酸を簡便に増幅することができる。ＤＮＡ精製の際のロスやキャリーオーバーの危険性をなくし、さらに時間・コストを削減することができる。本発明は、研究分野だけでなく、遺伝子診断などの臨床分野もしくは法医学分野においても広く利用することができる
【図１】
2018164421.tif 000004
【図２】
2018164421.tif 000005
【配列表】
2018164421000001.app