(57)【要約】【課題】癌等の各種疾患の発症や細胞分化に関連する遺伝子群の発現をより上流で制御する内在性制御因子を効率的に同定する方法を開発すること。【解決手段】１）遺伝子発現を活性化する物質または遺伝子発現を抑制する物質と複合体を形成しており且つＤＮＡ配列を認識して該ＤＮＡ配列に結合することができる、ピロール−イミダゾールポリアミド化合物群に含まれるポリアミド化合物で細胞を処理する工程、２）工程１）の処理によって細胞応答をもたらすポリアミド化合物を前記ピロール−イミダゾールポリアミド化合物群の中から選択する工程、および３）工程２）で選択された前記ポリアミド化合物が認識するＤＮＡ配列に基づいて、該細胞応答に関連する内在性制御因子を同定する工程を含む、内在性制御因子のスクリーニング方法が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１）遺伝子発現を活性化する物質または遺伝子発現を抑制する物質と複合体を形成しており且つＤＮＡ配列を認識して該ＤＮＡ配列に結合することができる、ピロール−イミダゾールポリアミド化合物群に含まれるポリアミド化合物で細胞を処理する工程、
２）工程１）の処理によって細胞応答をもたらす前記ポリアミド化合物を前記ピロール−イミダゾールポリアミド化合物群の中から選択する工程、および
３）工程２）で選択された前記ポリアミド化合物が認識するＤＮＡ配列に基づいて、該細胞応答に関連する内在性制御因子を同定する工程
を含む、内在性制御因子のスクリーニング方法。
【請求項２】
前記ピロール−イミダゾールポリアミド化合物群は、遺伝子発現を活性化する物質と複合体を形成している活性化ポリアミド化合物および遺伝子発現を抑制する物質と複合体を形成している抑制化ポリアミド化合物を含み、
前記工程２）において、相反する細胞応答をもたらし且つ同一のＤＮＡ配列を認識して該ＤＮＡ配列に結合することができる前記活性化ポリアミド化合物および前記抑制化ポリアミド化合物を前記ピロール−イミダゾールポリアミド化合物群の中から選択する、
請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記相反する細胞応答をもたらし且つ同一のＤＮＡ配列を認識して該ＤＮＡ配列に結合することができる前記活性化ポリアミド化合物および前記抑制化ポリアミド化合物が、互いに共通するＤＮＡ配列認識部分を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記工程３）において、前記工程２）で選択されたポリアミド化合物が認識するＤＮＡ配列と、前記工程１）に供した細胞の遺伝子発現プロファイルから、該細胞応答に関連する内在性制御因子を同定する、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記細胞応答が、細胞生存率、細胞増殖率、疾患関連遺伝子もしくは疾患関連タンパク質の発現レベル、または分化マーカー遺伝子もしくは分化マーカーの発現レベルの増加または減少、あるいは細胞形態上の変化である、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記細胞が疾患細胞または幹細胞である、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記工程３）において、細胞の増殖、疾患関連遺伝子または遺伝子群の発現、または分化関連遺伝子または遺伝子群の発現を制御する内在性制御因子が同定される、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
疾患または細胞分化を制御する因子をスクリーニングするための、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
前記内在性制御因子がシスエレメントまたはトランス制御因子である、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
前記遺伝子発現を活性化する物質がヒストン脱アセチル化酵素阻害剤であり、前記遺伝子発現を抑制する物質がアルキル化剤である、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
前記疾患が、癌、神経変性疾患、代謝内分泌系疾患、またはウイルス感染症である、請求項５〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
遺伝子発現を活性化する物質がコンジュゲートされたピロール−イミダゾールポリアミド化合物群からなるライブラリー、および遺伝子発現を抑制する物質がコンジュゲートされたピロール−イミダゾールポリアミド化合物群からなるライブラリーを含む、２以上のピロール−イミダゾールポリアミド化合物ライブラリーのセットであって、該ピロール−イミダゾールポリアミド化合物群が該２以上のライブラリー間で共通するＤＮＡ配列認識部分のパターンを含む、セット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ピロール−イミダゾールポリアミド化合物群を用いて疾患等の内在性制御因子をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌等の疾患を制御する分子標的薬は、疾患細胞上にある特定の細胞表面抗原、レセプター、シグナル伝達因子等に作用するが、その特定分子の変異等による耐性出現が問題となる。そこで、疾患関連因子群の機能発現をより上流で束ねて制御するような転写制御因子等の内在性制御因子の同定が、耐性が出現しにくい革新的な分子標的薬の研究開発において極めて有望であると考えられる。しかし、このような内在性制御因子の同定は、通常、網羅的な遺伝学的スクリーニングと最先端の遺伝子発現解析技術等の手法を駆使して行われ、手間が掛かる上に、困難を伴う場合が多い。例えば、ある制御因子にパラログが存在している場合、当該パラログが相補的に機能する可能性もあり、その場合には、ＲＮＡｉ等での遺伝学的スクリーニングによって当該制御因子を同定することは極めて困難となる。また、従来の網羅的な遺伝学的スクリーニング法は、変異解析に負うところが大きく、変異が存在していない場合に制御因子を同定することはほぼ不可能である。最先端の遺伝子発現解析技術等でも、その多彩な遺伝子変化パターンにより、実際に疾患特性を担う重要な制御因子を抽出することは極めて困難である。
【０００３】
一方、ピロール−イミダゾールポリアミド（以下、「ＰＩポリアミド」と略す）は、合成オリゴマーであり、ヘアピン連結によって対面するＮ−メチルピロール（Ｐ）およびＮ−メチルイミダゾール（Ｉ）対により、ＤＮＡの副溝内に結合して特定の配列を認識することが知られている。ＰＩポリアミドは、Ｐ／Ｉ対がＣ・Ｇ塩基対を、Ｐ／Ｐ対がＡ・ＴまたはＴ・Ａ塩基対を、Ｉ／Ｐ対がＧ・Ｃ塩基対を認識し、これにより任意の二重鎖ＤＮＡ配列に特異的に結合することができる。したがって、分子構造内にＮ−メチルピロールおよびＮ−メチルイミダゾールを適切に配置することによって、ＰＩポリアミドの塩基配列特異性を任意に設計することができる。
【０００４】
ＰＩポリアミドは、その比較的大きい分子量にもかかわらず、細胞膜透過性であり、細胞の核に局在し、ナノモルレベルで内在性遺伝子発現に影響を及ぼす。標的遺伝子に結合したＰＩポリアミドは、転写因子のＤＮＡへの結合を阻害し、特定の遺伝子発現を制御する人工遺伝子スイッチとして研究されている。近年の研究では、強力なヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤であるスベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）とコンジュゲートしたＰＩポリアミドが合成された（非特許文献１、非特許文献２）。該ＳＡＨＡコンジュゲートＰＩポリアミドは、標的遺伝子の調節領域のアセチル化により、該標的遺伝子の発現を特異的にアップレギュレートすることができる。また、ナイトロジェンマスタード系アルキル化剤であるクロラムブシル（chlorambucil）をＰＩポリアミドにコンジュゲートすることにも成功した（非特許文献３、非特許文献４）。該コンジュゲートは、ゲノム配列に対する結合能を強化しており、標的遺伝子発現の強力なダウンレギュレーションをもたらすことが分かった。さらに、非特許文献１では、ＳＡＨＡとコンジュゲートしたＰＩポリアミドのライブラリーを用いてヒト皮膚繊維芽細胞を処理して、ＳＡＨＡ単独では効果がないが、当該コンジュゲートによって転写が活性化される遺伝子をスクリーニングする研究が報告されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Pandian, G. N. et al., Sci Rep 4, 3843, doi:10.1038/srep03843 (2014)
【非特許文献２】Saha, A. et al., Bioorg Med Chem 21, 4201-4209, doi:10.1016/j.bmc.2013.05.002 (2013)
【非特許文献３】Bando, T. et al., Acc Chem Res 39, 935-944, doi:10.1021/ar030287f (2006)
【非特許文献４】Minoshima, M. et al., Nucleic Acids Symp Ser (Oxf), 69-70, doi:10.1093/nass/nrp035 (2009)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、癌等の各種疾患の発症や細胞分化に関連する遺伝子群の発現をより上流で制御する内在性制御因子を効率的に同定する方法を開発する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、遺伝子発現を活性化する物質または遺伝子発現を抑制する物質をコンジュゲートしたＰＩポリアミドのライブラリーを用いて疾患細胞等の細胞を処理し、該処理によって細胞応答をもたらすＰＩポリアミドを選択することにより、該細胞応答に関連する内在性制御因子を同定することができることを見出した。
【０００８】
すなわち、本発明は下記を提供する。
［１］  １）遺伝子発現を活性化する物質または遺伝子発現を抑制する物質と複合体を形成しており且つＤＮＡ配列を認識して該ＤＮＡ配列に結合することができる、ピロール−イミダゾールポリアミド化合物群に含まれるポリアミド化合物で細胞を処理する工程、
２）工程１）の処理によって細胞応答をもたらす前記ポリアミド化合物を前記ピロール−イミダゾールポリアミド化合物群の中から選択する工程、および
３）工程２）で選択された前記ポリアミド化合物が認識するＤＮＡ配列に基づいて、該細胞応答に関連する内在性制御因子を同定する工程
を含む、内在性制御因子のスクリーニング方法、
［２］  前記ピロール−イミダゾールポリアミド化合物群は、遺伝子発現を活性化する物質と複合体を形成している活性化ポリアミド化合物および遺伝子発現を抑制する物質と複合体を形成している抑制化ポリアミド化合物を含み、
前記工程２）において、相反する細胞応答をもたらし且つ同一のＤＮＡ配列を認識して該ＤＮＡ配列に結合することができる前記活性化ポリアミド化合物および前記抑制化ポリアミド化合物を前記ピロール−イミダゾールポリアミド化合物群の中から選択する、
［１］記載の方法、
［３］  前記相反する細胞応答をもたらし且つ同一のＤＮＡ配列を認識して該ＤＮＡ配列に結合することができる前記活性化ポリアミド化合物および前記抑制化ポリアミド化合物が、互いに共通するＤＮＡ配列認識部分を有する、［２］に記載の方法、
［４］  前記工程３）において、前記工程２）で選択されたポリアミド化合物が認識するＤＮＡ配列と、前記工程１）に供した細胞の遺伝子発現プロファイルから、該細胞応答に関連する内在性制御因子を同定する、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法、
［５］  前記細胞応答が、細胞生存率、細胞増殖率、疾患関連遺伝子もしくは疾患関連タンパク質の発現レベル、または分化マーカー遺伝子もしくは分化マーカーの発現レベルの増加または減少、あるいは細胞形態上の変化である、［１］〜［４］のいずれかに記載の方法、
［６］  前記細胞が疾患細胞または幹細胞である、［１］〜［５］のいずれかに記載の方法、
［７］  前記工程３）において、細胞の増殖、疾患関連遺伝子または遺伝子群の発現、または分化関連遺伝子または遺伝子群の発現を制御する内在性制御因子が同定される、［１］〜［６］のいずれかに記載の方法、
［８］  疾患または細胞分化を制御する因子をスクリーニングするための、［１］〜［７］のいずれかに記載の方法、
［９］  前記内在性制御因子がシスエレメントまたはトランス制御因子である、［１］〜［８］のいずれかに記載の方法、
［１０］  前記遺伝子発現を活性化する物質がヒストン脱アセチル化酵素阻害剤であり、前記遺伝子発現を抑制する物質がアルキル化剤である、［１］〜［９］のいずれかに記載の方法、
［１１］  前記疾患が、癌、神経変性疾患、代謝内分泌系疾患、またはウイルス感染症である、［５］〜［１０］のいずれかに記載の方法、および
［１２］  遺伝子発現を活性化する物質がコンジュゲートされたピロール−イミダゾールポリアミド化合物群からなるライブラリー、および遺伝子発現を抑制する物質がコンジュゲートされたピロール−イミダゾールポリアミド化合物群からなるライブラリーを含む、２以上のピロール−イミダゾールポリアミド化合物ライブラリーのセットであって、該ピロール−イミダゾールポリアミド化合物群が該２以上のライブラリー間で共通するＤＮＡ配列認識部分を含む、セット。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、癌等の各種疾患を制御するＤＮＡ配列（シスエレメント）、および当該配列に結合する内在性転写制御因子の候補を簡便に同定することが可能となり、耐性が出現しにくい革新的な分子標的薬の創薬ターゲットを見出すことができる。また、本発明の方法は、各種疾患だけでなく、各種幹細胞等から特定の細胞系譜への分化制御に関わる新たな因子の同定にも適用できる。本発明によれば、標的の疾患細胞について、網羅的な遺伝学的スクリーニングを行うことなく、疾患関連遺伝子の内在性制御因子を同定することができる。また、本発明によれば、遺伝子変異を伴わない疾患関連遺伝子の内在性制御因子も同定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】１つのウェルに１種類のＰＩポリアミド化合物を添加したウェルプレートの例を示す模式図である。図中、ウェル２−ａ〜ウェル１２−ｈについて、添加されるＰＩポリアミド化合物の記載を省略しているが、これらのウェルにもそれぞれ、１種類ずつ異なる種類のＰＩポリアミド化合物が添加される。
【図２−１】２個以上のウェルプレートとして提供される、２以上のポリアミド化合物ライブラリーの例を示す模式図である。図中、右側に、各ウェルに添加されるＰＩポリアミド化合物が示される。ウェル２−ａ〜ウェル１２−ｈについて、添加されるＰＩポリアミド化合物の記載を省略しているが、これらのウェルにもそれぞれ、１種類ずつ異なる種類のＰＩポリアミド化合物が添加される。
【図２−２】２個以上のウェルプレートとして提供される、２以上のポリアミド化合物ライブラリーの例を示す模式図である。図中、右側に、各ウェルに添加されるＰＩポリアミド化合物が示される。ウェル２−ａ〜ウェル１２−ｈについて、添加されるＰＩポリアミド化合物の記載を省略しているが、これらのウェルにもそれぞれ、１種類ずつ異なる種類のＰＩポリアミド化合物が添加される。
【図３−１】実施例１で合成されたＳＡＨＡ−ＰＩポリミアドコンジュゲートの模式図である。
【図３−２】実施例１で合成されたＳＡＨＡ−ＰＩポリミアドコンジュゲートの模式図の説明および１つのＳＡＨＡ−ＰＩポリミアドコンジュゲートの対応する化学式を示す。
【図４】各ＳＡＨＡ−ＰＩポリアミドコンジュゲートで処理したヒト骨髄性白血病細胞ＭＶ４−１１におけるＩＬ３、ＣＳＦ２およびＣＳＦ２ＲＢ遺伝子の発現レベルを示す。ＤＭＳＯ処理細胞での各遺伝子の発現量を１として、各ＳＡＨＡ−ＰＩポリアミドコンジュゲート処理細胞で得られた値をＤＭＳＯ処理細胞に対する相対値として示す。「＊」はＰ＜０．０５を示す。
【図５−１】実施例１で使用したＰＩポリアミドコンジュゲートを表す化学式を示す。
【図５−２】実施例１で使用したＰＩポリアミドコンジュゲートを表す化学式を示す。
【図６】各クロラムブシル−ＰＩポリアミドコンジュゲートで処理したヒト骨髄性白血病細胞ＭＶ４−１１におけるＩＬ３、ＣＳＦ２およびＣＳＦ２ＲＢ遺伝子の発現レベルを示す。ＤＭＳＯ処理細胞での各遺伝子の発現量を１として、各ＰＩポリアミド−クロラムブシルコンジュゲート処理細胞で得られた値をＤＭＳＯ処理細胞に対する相対値として示す。図中、データは平均±ＳＥＭ値で示し、「＊」はＰ＜０．０５を示す。
【図７】各Ｃｈｂ−ＰＩポリアミドコンジュゲートで処理した各種癌細胞および正常細胞の増殖率を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
１．ＰＩポリアミド
ＰＩポリアミドは、Ｎ−メチルピロール単位（Ｐ）とＮ−メチルイミダゾール単位（Ｉ）と、γ−アミノ酪酸部分とを含むポリアミドであり、ＰとＩとγ−アミノ酪酸部分とは互いにアミド結合（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）で連結される（Trauger et al, Nature, 382, 559-61(1996); White et al, Chem.Biol., 4,569-78(1997);およびDervan, Bioorg. Med. Chem., 9, 2215-35(2001)）。ＰＩポリアミドは、γ−アミノ酪酸部分がリンカー（γ−リンカー）となって全体が折りたたまれてＵ字型のコンフォメーション（ヘアピン型）をとる。Ｕ字型のコンフォメーションにおいては、リンカーを挟んでＰとＩとを含む２本の鎖が並列に並ぶ。この２本の鎖の間で対面するＰとＩの対が特定の組み合わせ（Ｐ／Ｉ対、Ｉ／Ｐ対またはＰ／Ｐ対）のときに、ＤＮＡ中の特定の塩基対に高い親和性で結合することができる。例えば、Ｐ／Ｉ対はＣ・Ｇ塩基対に結合することができ、Ｉ／Ｐ対はＧ・Ｃ塩基対に結合することができ、Ｐ／Ｐ対はＡ・Ｔ塩基対およびＴ・Ａ塩基対の両方に結合することができる。また、ＰＩポリアミドには、ＰおよびＩの他に、３−ヒドロキシピロール（Ｈｐ）、またはβアラニンが含まれていてもよい。Ｈｐ／Ｐ対は、Ｔ・Ａ塩基対に結合することができる（White at al., Nature, 391, 468-71 (1998)）。βアラニン／βアラニン対は、Ｔ・Ａ塩基対もしくはＡ・Ｔ塩基対に結合することができる。βアラニン／Ｉ対はＣ・Ｇ塩基対に、Ｉ／βアラニン対はＧ・Ｃ塩基対に結合することができる。βアラニン／Ｐ対およびＰ／βアラニン対は、Ｔ・Ａ塩基対もしくはＡ・Ｔ塩基対に結合することができる。また、γ−リンカー部分や、ＰＩポリアミドのＮ末端に付加したβアラニン部分も、Ｔ・Ａ塩基対もしくはＡ・Ｔ塩基対に結合することができる。Ｐ、Ｉ、Ｈｐ、および／またはβアラニンによって形成される対の構成、順序、および組み合わせ等を適宜変更することにより、標的のＤＮＡ配列を認識し、結合するＰＩポリアミドを設計することができる。
【００１２】
本発明において、ＰＩポリアミドを構成するＰまたはＩの１位の窒素上のメチル基は、水素あるいはメチル基以外のアルキル基で置き換わっていてもよい。メチル基以外のアルキル基の例としては、炭素数２〜１０個の直鎖、分枝鎖または環状の飽和または不飽和アルキル基、好ましくは、炭素数２〜５個の直鎖、分枝鎖直鎖、分枝鎖または環状の飽和または不飽和アルキル基が挙げられ、例えば、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル等が挙げられる。また、メチル基を含め、アルキル基は置換されていてもよく、例えば、アルキル基中のメチレンは、酸素等で置換されていてもよい。
【００１３】
ＰＩポリアミドのＮ末端およびＣ末端には、種々の官能基が付加されていてもよい。例えば、Ｎ末端にはアセチルアミノ基が付加されていてもよい。例えば、Ｃ末端にはジメチルアミノプロピルアミド基を付加されていてもよい。または、ＰＩポリアミドの末端には、β−アラニン残基、γ−アミノ酪酸残基などのカルボキシル基を付加することもできる。
【００１４】
本発明において、ＰＩポリアミドは修飾されていてもよく、例えば、ＤＮＡに対する結合能力を維持または向上するように修飾されていてもよい。修飾されたＰＩポリアミドの例としては、限定するものではないが、ＰＩポリアミドのγ−リンカーのα位またはβ位がアミノ基で置換されたもの、すなわち、γ−リンカーがＮ−α−Ｎ−γ−アミノ酪酸、またはＮ−β−Ｎ−γ−アミノ酪酸であるもの、さらに該アミノ基が蛍光基やビオチン等の分子で修飾されたもの、ＰＩポリアミドのＮ末端を蛍光基やビオチン等の分子で修飾したもの、およびＰＩポリアミドのＣ末端を蛍光基やビオチン、イソフタル酸等の分子で修飾した修飾物等が挙げられる。本願明細書において、蛍光基としては、限定するものではないが、例えば、フルオレセイン、ローダミン系色素、シアニン系色素、ＡＴＴＯ系色素、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ系色素、ＢＯＤＩＰＹが挙げられる。フルオレセインには、フルオレセイン誘導体（例えば、フルオレセインイソチオシアネート等）も含まれる。
【００１５】
また、ＰＩポリアミドは、環状ＰＩポリアミドであってもよい。環状ＰＩポリアミドとして、例えば、ＰＩポリアミドのＮ末端およびＣ末端がγ−リンカーで連結されたもの、またはＰＩポリアミドのＮ末端に付加されたクロロアセチル基とＣ末端に付加されたシステイン基との間の反応により形成されるスルフィド結合によって環化されたものが挙げられる。ＰＩポリアミドは、また、ヘアピン型ＰＩポリアミドをつなげたタンデム型のＰＩポリアミド化合物であってもよい。
【００１６】
本発明において使用されるＰＩポリアミドは、任意のＤＮＡ配列を認識するように設計される。本発明において使用されるＰＩポリアミドを構成する、Ｐ、Ｉ、Ｈｐ、および／またはβアラニンによって形成される対の数は、２個以上であれば特に限定されないが、例えば３〜１２個、好ましくは４〜１０個、より好ましくは４〜８個が挙げられる。対の個数が５個以上のＤＮＡ配列認識部分を有するＰＩポリアミドを設計する場合は、好ましくはβアラニンを含むように設計される。
【００１７】
ＰＩポリアミドの設計方法および製造方法は公知である（例えば、特許第３０４５７０６号、特開２００１−１３６９７４号、ＷＯ０３／０００６８３号、特開２０１３−２３４１３５号、特開２０１４−１７３０３２号参照）。例えば、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）を用いた固相合成法（Ｆｍｏｃ固相合成法）による自動合成法によって簡便に製造することができる。
【００１８】
本発明において使用されるＰＩポリアミドは、そのＮ末端、Ｃ末端、またはγリンカー部位に、遺伝子発現を活性化する物質または遺伝子発現を抑制する物質が結合されて複合体を形成している。以下、本明細書において、上記物質がコンジュゲートされたＰＩポリアミド（すなわち、上記物質と複合体を形成しているＰＩポリアミド）を「ＰＩポリアミド化合物」または「ＰＩポリミアドコンジュゲート」と称する。また、本明細書において、遺伝子発現を活性化する物質と複合体を形成しているＰＩポリアミドを「活性化ポリアミド化合物」、遺伝子発現を抑制する物質と複合体を形成しているＰＩポリアミドを「抑制化ポリアミド化合物」と称する。また、本明細書において、遺伝子発現を活性化する物質および遺伝子発現を抑制する物質を総称して「物質」と記載する場合がある。
【００１９】
遺伝子発現を活性化する物質としては、限定するものではないが、例えば、ヒストンアセチル化酵素（ＨＡＴ）活性化剤、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤等が挙げられる。ＨＡＴ活性化剤としては、例えば、Ｎ−（４−クロロ−３−（トリフルオロメチル）フェニル）−２−エトキシベンズアミド（ＣＴＢ）、ヒストンメチル化酵素制御剤、ヒストン脱メチル化酵素制御剤等が挙げられる。ＨＤＡＣ阻害剤としては、例えば、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）等が挙げられる。
【００２０】
遺伝子発現を抑制する物質としては、限定するものではないが、例えば、アルキル化剤、ＨＡＴ阻害剤、ＨＤＡＣ活性化剤、ヒストンメチル化酵素制御剤、ヒストン脱メチル化酵素制御剤等が挙げられる。ＨＡＴ阻害剤としては、例えば、Ｃ６４６等が挙げられる。ＨＤＡＣ活性化剤としては、例えば、１−ベンゾイル−３−フェニル−２−チオ尿素（ＴＭ−２−５１）等が挙げられる。
【００２１】
アルキル化剤とは、ＤＮＡと共有結合を作る官能基を有する化合物である。アルキル化剤としては、例えば、クロラムブシル（chlorambucil）（本明細書において、「Ｃｈｂ」と略すこともある）、デュオカルマイシン（duocarmycin）、ｓｅｃｏ−ＣＢＩ（１−クロロメチル−５−ヒドロキシ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール）、ピロロベンゾジアゼピン、ナイトロジェンマスタード等が挙げられる。ｓｅｃｏ−ＣＢＩをＰＩポリアミドにコンジュゲートする場合は、ＰＩポリアミドとｓｅｃｏ−ＣＢＩとの間にインドールを挿入してもよい。ＰＩポリアミドとインドールとｓｅｃｏ−ＣＢＩとの複合体（以下、「コンジュゲート」ともいう）において、インドール部分は２つのＰまたはＩ単位と対になり、インドール／Ｉ対はＣ・Ｇ塩基対、インドール／Ｐ対はＴ・Ａ塩基対もしくはＡ・Ｔ塩基対を認識する。
【００２２】
遺伝子発現を活性化する物質または遺伝子発現を抑制する物質と、ＰＩポリアミドとのコンジュゲートは、常法により行うことができる（例えば、J. Am. Chem. SOC. 1995, 117, 2479-2490参照）。上記物質は、ＰＩポリアミドのＮ末端、Ｃ末端、またはγリンカー部位に、直接結合してもよいし、リンカーを介して結合してもよい。リンカーとしては、上記物質の作用を妨げず、かつＰＩポリアミドのＤＮＡ配列認識を妨げないものであれば特に限定されないが、例えば、アミド結合、ホスホジスルフィド結合、エステル結合、配位結合、またはエーテル結合等そのもの、あるいはこれらの結合の１種類以上を形成する官能基を含む分子を例示することができる。「これらの結合の１種類以上を形成する官能基を含む分子」は、ＰＩポリアミドおよび／または作用剤の末端部分と共に、アミド結合、ホスホジスルフィド結合、エステル結合、配位結合、およびエーテル結合等からなる群から選択される１種類以上の結合を形成する官能基を含む分子である。「これらの結合の１種類以上を形成する官能基を含む分子」はまた、アミド結合、ホスホジスルフィド結合、エステル結合、配位結合、およびエーテル結合等からなる群から選択される１種類以上の結合を１個以上含む分子であってもよい。好ましいリンカーとしては、アミド結合、またはアミド結合を形成する官能基を含む分子が挙げられる。
【００２３】
２．ＰＩポリアミド化合物ライブラリーおよびＰＩポリアミド化合物群
本発明において「ピロール−イミダゾールポリアミド化合物ライブラリー」（以下、「ＰＩポリアミド化合物ライブラリー」と略す）は、上記の遺伝子発現を活性化する物質および／または遺伝子発現を抑制する物質がコンジュゲートされたＰＩポリアミド化合物を含む化合物群である。したがって、本明細書において、「ＰＩポリアミド化合物ライブラリー」を「ピロール−イミダゾールポリアミド化合物群」（以下、「ＰＩポリアミド化合物群」と略す）と記載する場合がある。
【００２４】
本発明において、ＰＩポリアミド化合物群に含まれるＰＩポリミアド化合物のＤＮＡ配列認識部分は、任意に設計される。上記したとおり、ＰＩポリミアドのＤＮＡ配列認識部分を構成するＰ、Ｉ、Ｈｐ、および／またはβアラニンによって形成される対の数は、２個以上であれば特に限定されないが、例えば３〜１２個、好ましくは４〜１０個、より好ましくは４〜８個である。本発明において、ＰＩポリアミド化合物群に含まれる２種以上のＰＩポリミアド化合物は、同じ長さのＤＮＡ配列認識部分を有していてもよいし、異なる長さのＤＮＡ配列認識部分を有していてもよい。また、ＰＩポリアミド化合物群に含まれるＰＩポリミアド化合物の種類は、２種以上であれば特に限定されず、ＤＮＡ配列認識部分の長さ等の条件を考慮して適宜決定すればよい。例えば、ＰＩポリアミド化合物群は、同じ長さのＤＮＡ配列認識部分を有し、かつ、各ＰＩポリアミドが異なるＤＮＡ配列を認識する構成にするとよい。このような構成の場合、あらゆるＤＮＡ認識配列パターンを網羅する数のＰＩポリミアド化合物群とすることが可能になる。
【００２５】
本発明において、ＰＩポリアミド化合物群は、同一の物質がコンジュゲートされているが、ＤＮＡ配列認識部分が異なる、２種以上のＰＩポリアミド化合物を含んでいてもよい。すなわち、該ＰＩポリアミド化合物群に含まれる２種以上のＰＩポリミアド化合物は、互いに異なるＤＮＡ配列認識部分を有する以外は同じ構造を有していてもよい。好ましくは、ＰＩポリアミド化合物群は、遺伝子発現を活性化する物質であって同一の物質がコンジュゲートされているが、ＤＮＡ配列認識部分が異なる、２種以上の活性化ポリアミド化合物から構成されていてもよく、または、遺伝子発現を抑制する物質であって同一の物質がコンジュゲートされているが、ＤＮＡ配列認識部分が異なる、２種以上の抑制化ポリアミド化合物から構成されていてもよい。さらに、ＰＩポリアミド化合物群は、活性化ポリアミド化合物および抑制化ポリアミド化合物の両方を含んでいてもよく、好ましくは、該活性化ポリアミド化合物と該抑制化ポリアミド化合物は互いに共通するＤＮＡ認識部分を有していてもよい。
【００２６】
３．スクリーニング方法
本発明では、１）上記ＰＩポリアミド化合物群に含まれるＰＩポリアミド化合物で細胞を処理し、２）該処理によって細胞応答をもたらすＰＩポリアミド化合物を選択し、３）該選択されたＰＩポリアミド化合物が認識するＤＮＡ配列に基づいて、該細胞応答に関連する内在性制御因子を同定することにより、内在性制御因子をスクリーニングする。
【００２７】
上記工程１）において、ＰＩポリアミド化合物で処理する細胞は、疾患細胞、非疾患細胞、正常細胞、または幹細胞のいずれであってもよく、スクリーニングの目的に応じて適宜選択される。例えば、ある疾患に関連する内在性制御因子を同定したい場合は、当該疾患細胞を使用するのが好ましく、例えば、疾患モデル細胞が使用される。また、例えば、細胞分化に関連する内在性制御因子を同定したい場合は、幹細胞を使用するのが好ましい。幹細胞の代わりに、ｉＰＳ細胞を用いることもできる。例えば、疾患とは無関係に何らかの内在性制御因子を同定したい場合は、非疾患細胞または正常細胞を使用することができる。疾患と無関係な内在性制御因子の例としては、限定するものではないが、例えば、アポトーシスを誘導する因子、ｉＰＳ細胞誘導に促進的に働く因子等が挙げられる。
【００２８】
本発明において使用される細胞は、好ましくは哺乳動物細胞であり、より好ましくはヒト由来の細胞である。また、本発明においては、初代培養細胞も使用できるが、好ましくは各種の樹立された細胞株が使用される。本発明において、非疾患細胞には、何の疾患にも罹患していない個体または組織由来の細胞、および目的の疾患には罹患していないが、その他のいずれかの疾患に罹患している個体または組織由来の細胞が包含される。
【００２９】
上記工程１）の処理は、ＰＩポリアミド化合物群の存在下で細胞を培養することによって実施することができる。すなわち、ＰＩポリアミド化合物群に含まれる各ＰＩポリミアド化合物の存在下において、細胞を同一条件で培養する。培養培地、培養温度等の培養条件は、使用する細胞の種類に応じて適宜決定することができる。培養時間は、いずれかのＰＩポリミアド化合物での処理によって何らかの細胞応答が生ずる時間であればよく、当業者が適宜決定することができる。
【００３０】
上記工程１）は、例えば、ウェルプレートを用いて実施することができる。ウェルプレートを用いる場合、１つのウェルに１種類のＰＩポリアミド化合物を添加し、各ウェルに細胞を添加し、培養する。ＰＩポリアミド化合物を添加したウェルプレートの例を図１に示す。例えば、９６ウェルプレートを用いる場合、最大９６種類のＰＩポリアミド化合物を用いることができる。
【００３１】
上記工程２）における、細胞応答をもたらすＰＩポリミアド化合物の選択は、他のＰＩポリミアド化合物での処理と比べて何らかの細胞応答を示しているＰＩポリミアド化合物を選択することによって行う。例えば、本発明のスクリーニング方法が図１に示されるようなウェルプレートを用いて実施される場合、各ウェルについて細胞応答の有無を調べ、細胞応答があったウェル中のＰＩポリアミド化合物を選択すればよい。
【００３２】
さらに、必要により、本発明のＰＩポリアミド化合物ライブラリーで処理していない細胞や、または当該スクリーニングに疾患細胞を用いた場合は、非疾患細胞または正常細胞を対照として用いてもよく、かかる対照細胞と比べて何らかの細胞応答を示しているＰＩポリミアド化合物を選択してもよい。例えば、本発明のスクリーニング方法が図１に示されるようなウェルプレートを用いて実施される場合、同一の該ウェルプレートを２つ用意し、一方のウェルプレートの各ウェルには疾患細胞を添加し（以下、「試験プレート」という）、もう一方のウェルプレートの各ウェルには対照細胞を添加し（以下、「対照プレート」という）、該２つのプレートの各ウェルについて細胞応答の有無を調べ、試験プレートにおいて、対照プレートにおける対応するウェルと比べて細胞応答が示されたウェルのＰＩポリアミド化合物を選択してもよい。
【００３３】
本発明において、「細胞応答」とは、細胞が何らかの事象をもたらすことをいい、特に限定されない。細胞応答としては、例えば、細胞生存率、細胞増殖率、または特定の遺伝子もしくは特定のタンパク質の発現レベルの増加または減少、または細胞形態上の変化が挙げられる。特定の遺伝子および特定のタンパク質としては、例えば、疾患関連遺伝子、疾患関連遺伝子によってコードされるタンパク質（本明細書において、「疾患関連タンパク質」ともいう）、分化マーカー遺伝子、分化マーカー遺伝子によってコードされるタンパク質（本明細書において、単に「分化マーカー」ともいう）、アポトーシス関連遺伝子、アポトーシス関連遺伝子によってコードされるタンパク質等が挙げられる。ここで、「増加または減少」は、あるＰＩポリミアド化合物での処理が他のＰＩポリミアド化合物での処理と比べて細胞応答を増加または減少させたこと、あるＰＩポリミアド化合物での処理が本発明のＰＩポリアミド化合物ライブラリーで処理していない細胞と比べて細胞応答を増加または減少させたこと、および疾患細胞を用いた場合、あるＰＩポリミアド化合物での疾患細胞の処理が非疾患細胞または正常細胞を該ＰＩポリミアド化合物で処理した場合と比べて細胞応答を増加または減少させたことのいずれも包含する。細胞形態上の変化は、あるＰＩポリミアド化合物で処理した細胞が他のＰＩポリミアド化合物で処理した細胞と比べて形態が変化すること、あるＰＩポリミアド化合物で処理した細胞が本発明のＰＩポリアミド化合物ライブラリーで処理していない細胞と比べて形態が変化すること、および疾患細胞を用いた場合、あるＰＩポリミアド化合物で処理した疾患細胞が該ＰＩポリミアド化合物で処理した非疾患細胞または正常細胞と比べて形態が変化することのいずれも包含する。細胞形態上の変化の例としては、限定するものではないが、骨髄系の幼弱な細胞が分化する場合の、（アズール）顆粒の出現、核の分葉化、クロマチン凝集の変化等、およびリンパ球系細胞が分化する場合の、各細胞比率（Ｎ／Ｃ比）の増加、核の円形化等が挙げられる。
【００３４】
上記疾患関連遺伝子とは、例えば、目的の疾患の既知の関連遺伝子である。疾患関連遺伝子としては、例えば、限定するものではないが、多くの癌腫におけるＣ−Ｍｙｃ遺伝子、腫瘍共通低酸素機構を制御する遺伝子ＨＩＦ、ＣＭＬやＰｈＡＬＬの原因となるＢＣＲ−ＡＢＬヒュージョン遺伝子、膵癌、大腸癌におけるＫｒａｓ（変異）遺伝子、ｐ５３変異遺伝子、Ｃ−Ｍｙｂ遺伝子、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子等が挙げられる。上記分化マーカー遺伝子としては、例えば、限定するものではないが、ＣＤ１１ｂ遺伝子、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子、Ｃ−Ｍｙｂ遺伝子、ＰＡＸ５遺伝子等が挙げられる。上記アポトーシス関連遺伝子としては、例えば、限定するものではないが、Ｃ−Ｍｙｃ遺伝子等が挙げられる。遺伝子発現レベルの増加または減少は、例えば、遺伝子発現レベルを定量または遺伝子がコードするタンパク質の発現レベルを定量することによって判断することができる。遺伝子発現レベルの定量は、当該分野で既知の方法によって行えばよく、例えば、リアルタイム定量ＰＣＲ法によるｍＲＮＡの定量、ウェスタン・ブロット法によるタンパク質の定量等によって行うことができる。
【００３５】
本発明のスクリーニング方法においては、複数の細胞応答に基づいてＰＩポリアミド化合物を選択してもよい。
【００３６】
上記工程３）では、上記選択されたＰＩポリミアド化合物が認識するＤＮＡ配列に基づいて、上記の細胞応答に関連する内在性制御因子を同定する。「内在性制御因子」とは、細胞に内在する標的遺伝子の発現を制御する因子を意味し、主にタンパク質とＤＮＡとの結合を介して標的遺伝子の発現を制御する因子である。本発明において、内在性制御因子は、シスエレメントおよびトランス制御因子（転写因子）を包含する。シスエレメントは、ＰＩポリミアドコンジュゲートが認識し、結合するＤＮＡ配列そのものである。トランス制御因子は、ＰＩポリミアドコンジュゲートが結合するＤＮＡ配列（シスエレメント）に結合して転写を調節する因子である。
【００３７】
上記選択されたＰＩポリミアド化合物が認識するＤＮＡ配列は、上記の細胞応答に関連する内在性制御因子（シスエレメント）として同定される。さらに、工程３）では、上記選択されたＰＩポリミアド化合物が認識するＤＮＡ配列に基づいて、上記処理に供した細胞の遺伝子発現プロファイルから、上記の細胞応答に関連する内在性制御因子を同定してもよい。上記遺伝子発現プロファイルは、公知のものを利用することができる。種々の細胞の遺伝子発現プロファイルが公開されており、例えば、ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）のデータベース、ＴＲＡＮＳＦＡＣ、ＴＦＳＥＡＲＣＨ、ＣｏｒｅＰｒｏｍｏｔｅｒ等を使用することができる。例えば、上記遺伝子発現プロファイルにおいて、上記選択されたＰＩポリミアド化合物が認識するＤＮＡ配列と同一の配列を含む内在性制御因子を検索し、それを上記の細胞応答に関連する内在性制御因子（シスエレメント）として同定するか、または上記選択されたＰＩポリミアド化合物が認識するＤＮＡ配列と同一の配列を含む配列に結合する内在性制御因子を検索し、それを上記の細胞応答に関連する内在性制御因子（転写因子）として同定する。さらに、上記選択されたＰＩポリミアド化合物で処理した細胞において、上記同定された転写因子の複数個のターゲット遺伝子の発現レベルをＲＴ−ＰＣＲ法によって定量することにより、実際に当該ＰＩポリアミド化合物が内在性制御因子の代わりに働いているかどうかを確認することができる。また、上記同定された転写因子のＣｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｓｈＲＮＡｉベクターまたはＣｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  Ｏｖｅｒ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎベクターを作成し、実際にＰＩポリミアド化合物による細胞応答との妥当性を検証することにより、目的の内在性制御因子を確定することが可能である。
【００３８】
本発明のスクリーニング方法では、上記工程１）において、２以上のＰＩポリアミド化合物ライブラリーを用いてもよい。好ましくは、２以上のＰＩポリアミド化合物ライブラリーを構成するＰＩポリミアド化合物のＤＮＡ配列認識部分のパターンは、該２以上のライブラリー間で共通していている。すなわち、好ましくは、１のＰＩポリアミド化合物ライブラリーは、異なるＤＮＡ配列認識部分を有する２種以上のＰＩポリミアド化合物から構成されており、１のライブラリーに含まれるＰＩポリミアド化合物のＤＮＡ配列認識部分と同じＤＮＡ配列認識部分を有する、対応するＰＩポリアミド化合物が別のライブラリーにも存在する。また、好ましくは、２以上のＰＩポリアミド化合物ライブラリーを構成するＰＩポリアミド化合物には、各ライブラリー内で同一で、かつ、ライブラリー間で異なる物質がコンジュゲートされている。さらに好ましくは、２以上のＰＩポリアミド化合物ライブラリーは、該ライブラリー間で共通する一連のＤＮＡ認識配列パターンをカバーしており、かつ、該２以上のＰＩポリアミド化合物ライブラリーを構成するＰＩポリアミド化合物は、各ライブラリー内で同一で、かつ、該ライブラリー間で異なる物質をコンジュゲートしている。例えば、２以上のＰＩポリアミド化合物ライブラリーは、１のライブラリーが１つのウェルプレートに含まれる２個以上のウェルプレートとして提供することができる。該２個以上のウェルプレートの例を図２−１および図２−２（以下、まとめて図２という）に示す。例えば、図２に示すように、各ウェルプレートの対応するウェルには、同じＰＩポリアミド部分（ＤＮＡ認識部分）を有するＰＩポリアミド化合物を添加するのが好ましい（すなわち、図２において、ライブラリーＩのウェル１−ａに添加されるＰＩポリアミド化合物と、ライブラリーＩＩのウェル１−ａに添加されるＰＩポリアミド化合物と、ライブラリーＩＩＩのウェル１−ａに添加されるＰＩポリアミド化合物は、同じＰＩポリアミド構造を有し、ウェル１−ｂ〜ウェル１２−ｈについても同様である）。また、図２に示すように、ウェルプレートに添加されるＰＩポリアミド化合物にコンジュゲートされている物質は、ウェルプレート毎に異なるが、同じウェルプレート内のウェルには同じ物質がコンジュゲートされたＰＩポリアミド化合物が添加されるのが好ましい（すなわち、図２において、ライブラリーＩに添加されるＰＩポリアミド化合物は全て物質Ｘがコンジュゲートされており、ライブラリーＩＩに添加されるＰＩポリアミド化合物は全て物質Ｙがコンジュゲートされており、ライブラリーＩＩＩに添加されるＰＩポリアミド化合物は全て物質Ｚがコンジュゲートされている）。
【００３９】
例えば、限定するものではないが、２以上のＰＩポリアミド化合物ライブラリーの１のライブラリーが、図３−１の模式図で表されるようなＡないしφで示される異なる種類のＤＮＡ配列認識部分を含み、かつ、ＳＡＨＡがコンジュゲートされたＰＩポリアミド化合物の群から構成され、別のライブラリーが、同様にＡないしφで示される異なる種類のＤＮＡ配列認識部分を含むが、ＳＡＨＡ以外の物質、例えば限定するものではないが、Ｃｈｂまたはｓｅｃｏ−ＣＢＩ、がコンジュゲートされたＰＩポリアミド化合物の群から構成されていてもよい。
【００４０】
上記２以上のＰＩポリアミド化合物ライブラリーは、２種以上の活性化ポリアミド化合物からなる２以上のライブラリーの組み合わせであって、各ＰＩポリアミド化合物にコンジュゲートされた遺伝子発現を活性化する物質が各ライブラリー内で同一であり、かつ、該２以上のライブラリー間で異なる、ライブラリーの組み合わせであってもよい。図２を用いて説明すると、物質Ｘ、ＹおよびＺがいずれも遺伝子発現を活性化する物質である場合である。また、上記２以上のＰＩポリアミド化合物ライブラリーは、２種以上の抑制化ポリアミド化合物からなる２以上のライブラリーの組み合わせであって、各ＰＩポリアミド化合物にコンジュゲートされた遺伝子発現を抑制する物質が各ライブラリー内で同一であり、かつ、該２以上のライブラリー間で異なる、ライブラリーとの組み合わせであってもよい。図２を用いて説明すると、物質Ｘ、ＹおよびＺがいずれも遺伝子発現を抑制する物質である場合である。また、上記２以上のＰＩポリアミド化合物ライブラリーは、２種以上の活性化ポリアミド化合物からなるライブラリーと２種以上の抑制化ポリアミド化合物からなるライブラリーの両方を含む組み合わせであってもよい。図２を用いて説明すると、例えば、物質ＸおよびＹが遺伝子発現を活性化する物質であり、物質Ｚが遺伝子発現を抑制する物質である場合等である。
【００４１】
好ましくは、上記工程１）において、活性化ポリアミド化合物および抑制化ポリアミド化合物を含むＰＩポリアミド化合物群を用いてもよい。例えば、上記工程１）において、２以上のＰＩポリアミド化合物ライブラリーであって、該２以上のＰＩポリアミド化合物ライブラリーのうち、少なくとも１つは、活性化ポリアミド化合物群からなるライブラリーであり、かつ、少なくとも１つは、抑制化ポリアミド化合物群からなるライブラリーである、２以上のＰＩポリアミド化合物ライブラリーを使用する。
【００４２】
上記２以上のＰＩポリアミド化合物ライブラリーは、限定するものではないが、例えば、活性化ポリアミド化合物群からなる１つのライブラリーと、抑制化ポリアミド化合物群からなる１つのライブラリーとからなる２つのＰＩポリアミド化合物ライブラリー、または活性化ポリアミド化合物群からなる２つのライブラリーと、抑制化ポリアミド化合物群からなる１つのライブラリーとからなる３つのＰＩポリアミド化合物ライブラリーであってもよい。
【００４３】
本発明のスクリーニング方法において２以上のＰＩポリアミド化合物ライブラリーを用いる場合、工程２）において、少なくとも２つのライブラリーにおいて細胞応答をもたらし、かつ、同一のＤＮＡ配列を認識するＰＩポリミアド化合物を選択する。好ましくは、少なくとも２つのライブラリーにおいて細胞応答をもたらし、かつ、互いに共通するＤＮＡ配列認識部分を有するＰＩポリアミド化合物を選択する。例えば、本発明のスクリーニング方法が図２に示されるようなウェルプレートを用いて実施される場合、各ウェルプレートの各ウェルについて細胞応答の有無を調べ、２以上のウェルプレートの対応するウェルにおいて細胞応答があった場合、当該ウェル中のＰＩポリアミド化合物を選択する（例えば、ライブラリーＩのウェル１−ｂとライブラリーＩＩのウェル１−ｂにおいて何らかの細胞応答が検出された場合、各プレートのウェル１−ｂに添加されているＰＩポリアミド化合物を選択する）。
【００４４】
本発明のスクリーニング方法において、活性化ポリアミド化合物および抑制化ポリアミド化合物を含むＰＩポリアミド化合物群を用いる場合、工程２）において、相反する細胞応答をもたらし、かつ、同一のＤＮＡ配列を認識して該ＤＮＡ配列に結合することができる活性化ポリアミド化合物および抑制化ポリアミド化合物を選択する。好ましくは、相反する細胞応答をもたらし、かつ、互いに共通するＤＮＡ配列認識部分を有する活性化ポリアミド化合物および抑制化ポリアミド化合物を選択する。例えば、本発明のスクリーニング方法において、活性化ポリアミド化合物ライブラリーと抑制化ポリアミド化合物ライブラリーの両方を含む２以上のＰＩポリアミド化合物ライブラリーを用いる場合、工程２）において、該２以上のライブラリーにおいて相反する細胞応答をもたらし、かつ、同一のＤＮＡ配列を認識して該ＤＮＡ配列に結合することができる活性化ポリアミド化合物および抑制化ポリアミド化合物を選択する。好ましくは、相反する細胞応答をもたらし、かつ、互いに共通するＤＮＡ配列認識部分を有する活性化ポリアミド化合物および抑制化ポリアミド化合物を選択する。図２を用いて説明すると、例えば、物質ＸおよびＹが遺伝子発現を活性化する物質であり、物質Ｚが遺伝子発現を抑制する物質である場合、ライブラリーＩまたはＩＩのいずれかのウェルにおいて細胞応答が検出され、かつ、ライブラリーＩＩＩの対応するウェルにおいて、ライブラリーＩまたはＩＩにおいて検出されたのと相反する細胞応答が検出された場合、当該ウェル中のＰＩポリアミド化合物を選択する（例えば、ライブラリーＩまたはＩＩのウェル１−ｂとライブラリーＩＩＩのウェル１−ｂにおいて相反する細胞応答が検出された場合、各プレートのウェル１−ｂに添加されているＰＩポリアミド化合物を選択する）。好ましくは、ライブラリーＩおよびＩＩのいずれかの対応するウェルにおいて細胞応答が検出され、かつ、ライブラリーＩＩＩの対応するウェルにおいて、ライブラリーＩおよびＩＩにおいて検出されたのと相反する細胞応答が検出された場合、当該ウェル中のＰＩポリアミド化合物を選択する（例えば、ライブラリーＩおよびＩＩのウェル１−ｂとライブラリーＩＩＩのウェル１−ｂにおいて相反する細胞応答が検出された場合、各プレートのウェル１−ｂに添加されているＰＩポリアミド化合物を選択する）。
【００４５】
上記「相反する細胞応答」とは、例えば、限定するものではないが、遺伝子発現を活性化する物質がコンジュゲートされたＰＩポリアミド化合物ライブラリーに含まれるあるＰＩポリミアド化合物での処理がある細胞事象の増加をもたらし、遺伝子発現を抑制する物質がコンジュゲートされたＰＩポリアミド化合物ライブラリーに含まれる対応するＰＩポリミアド化合物での処理が同じ細胞事象の減少をもたらす場合をいう。このように、相反する作用を有する物質をコンジュゲートした、２種以上のＰＩポリミアド化合物を含むＰＩポリアミド化合物群を用いてスクリーニングすることにより、目的の内在性制御因子をより効率的に同定することができる。
【００４６】
本発明のスクリーニング方法によれば、疾患または細胞分化を制御する因子、あるいは他の有用な内在性制御因子をスクリーニングすることが可能である。例えば、本発明のスクリーニング方法により、細胞の増殖、疾患関連遺伝子または遺伝子群の発現、あるいは分化関連遺伝子または遺伝子群の発現を制御する内在性制御因子を同定することができる。
【００４７】
本発明のスクリーニング方法によれば、いずれの疾患の内在性制御因子もスクリーニング可能であり、対象疾患としては、特に限定されない。例えば、各種の癌、神経変性疾患（アルツハイマー、パーキンソン病等）、代謝内分泌系疾患（糖尿病、高脂血症、高血圧症等）、ウイルス感染症（ＨＩＶ等）等のあらゆる疾患が挙げられる。例えば、脂質関連の代謝疾患の場合、３Ｔ３−Ｌ１細胞株（細胞質内に脂肪酸誘導が可能）において上記ＰＩポリアミド化合物群を用いてスクリーニングを行って、脂肪酸を増減させる代謝疾患制御因子を同定可能である。例えば、アルツハイマーの内在性制御因子をスクリーニングする場合は、上記ＰＩポリアミド化合物群を用いて当該疾患細胞を処理し、タウ蛋白やベータアミロイド等の当該疾患関連遺伝子またはタンパク質の発現レベルを減少または増加させるＰＩポリミアド化合物を選択する。
【００４８】
例えば、本発明のスクリーニング方法を用いて癌の内在性制御因子をスクリーニングする場合、上記ＰＩポリアミド化合物群で癌細胞を処理し、細胞生存率、細胞増殖率、または癌関連遺伝子もしくはタンパク質の発現レベルを増加または減少させるか、または培養中に細胞を死滅させるＰＩポリミアド化合物を選択する。例えば、該ＰＩポリアミド化合物群が活性化ポリアミド化合物と抑制化ポリアミド化合物の両方を含む場合は、同一のＤＮＡ配列を認識して該ＤＮＡ配列に結合することができる活性化ポリアミド化合物および抑制化ポリアミド化合物であって、該活性化ポリアミド化合物および抑制化ポリアミド化合物の一方が細胞生存率、細胞増殖率、または癌関連遺伝子もしくはタンパク質の発現レベルを増加させ、他方が細胞生存率、細胞増殖率、または癌関連遺伝子もしくはタンパク質の発現レベルを減少させるか、または培養中に細胞を死滅させるＰＩポリミアド化合物を選択する。
【００４９】
例えば、本発明のスクリーニング方法を用いて細胞分化を制御する因子をスクリーニングする場合、上記ＰＩポリアミド化合物群で幹細胞等の細胞を処理し、分化マーカー遺伝子または分化マーカーの発現レベル、細胞生存率または細胞増殖率を増加または減少させるか、または培養中に細胞を死滅させるＰＩポリミアド化合物を選択する。例えば、該ＰＩポリアミド化合物群が活性化ポリアミド化合物と抑制化ポリアミド化合物の両方を含む場合は、同一のＤＮＡ配列を認識して該ＤＮＡ配列に結合することができる活性化ポリアミド化合物および抑制化ポリアミド化合物であって、該活性化ポリアミド化合物および抑制化ポリアミド化合物の一方が分化マーカー遺伝子または分化マーカーの発現レベル、細胞生存率または細胞増殖率を増加させ、他方が分化マーカー遺伝子または分化マーカーの発現レベル、細胞生存率または細胞増殖率を減少させるか、または培養中に細胞を死滅させるＰＩポリミアド化合物を選択する。例えば、ＫＧ１細胞（非常に幼弱な骨髄芽球性白血病細胞株）を用いて上記ＰＩポリアミド化合物群でスクリーニングする場合、ＣＤ１１ｂ等の骨髄系成熟マーカーの発現レベルを増加させるＰＩポリアミド化合物、または細胞形態上の分化を表す顆粒が肉眼的に観察されるＰＩポリミアド化合物を選択する。例えば、臍帯血のＣＤ３４陽性幹細胞等の初代造血幹細胞を上記ＰＩポリアミド化合物群で処理し、表面マーカー解析で、特定の細胞系（lineage）への分化を誘導するＰＩポリミアド化合物を選択することも可能である。
【００５０】
本発明のスクリーニングによって内在性制御因子を同定した後、該内在性制御因子（転写因子）のゲノム上の結合部位の同定、または該内在性制御因子（シスエレメント）のゲノム上の位置の同定や、ＰＩポリミアド化合物が結合したＤＮＡ配列の決定を行ってもよく、当該分野で既知の方法、例えば、ＣｈＩＰ−Ｓｅｑ法、Ｃｈｅｍ−Ｓｅｑ法、ＣｈＩＰ−ｑＰＣＲ法、Ｂｉｎｄ ｎ Ｓｅｑ法等によって行うことができる。
【００５１】
本発明のスクリーニングによって同定された転写因子および転写因子結合配列等の内在性制御因子は、疾患治療薬、例えば抗癌剤、または細胞分化制御剤（分化誘導剤、分化抑制剤）等の創薬ターゲットとすることができる。また、本発明のスクリーニング方法によって同定された内在性制御因子（シスエレメント）に結合するＰＩポリミアドと薬剤とのコンジュゲートを、疾患治療薬、例えば抗癌剤、または分化誘導剤等として用いることもできる。
【００５２】
４．ＰＩポリアミド化合物ライブラリーのセット
本発明はさらに、上記のＰＩポリアミド化合物ライブラリーを２個以上組み合わせて含む、ＰＩポリアミド化合物ライブラリーのセットを提供する。該ＰＩポリアミド化合物ライブラリーのセットは、好ましくは、活性化ポリアミド化合物群からなるライブラリーおよび抑制化ポリアミド化合物群からなるライブラリーを含む。好ましくは、該ＰＩポリアミド化合物ライブラリーのセットに含まれる各ライブラリーを構成するＰＩポリミアド化合物のＤＮＡ配列認識部分のパターンは、該ライブラリー間で共通していてもよい。
【００５３】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００５４】
実施例１：ラント関連転写因子（Runt-related transcription factor：ＲＵＮＸ）の同定
（１）ＰＩポリアミド化合物ライブラリーの作成
イミダゾールを種々の位置に置くことによって、Ｐ、Ｉおよびβアラニンから形成される４つの対を含む３２種のＰＩポリアミドを設計し、それらのＮ末端にβアラニンリンカーを介してスベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）をコンジュゲートしたＰＩポリミアド（以下、「ＳＡＨＡ−ＰＩポリミアドコンジュゲート」ともいう）を合成した。ＳＡＨＡ−ＰＩポリミアドコンジュゲートの合成は、Tetrahedron Letters 50 (2009) 7288-7292に記載の方法にしたがって行った。合成された３２種のＰＩポリミアドコンジュゲート（Ａ〜Ｚおよびα〜φ）を図３−１および３−２に示す。
【００５５】
簡単に言うと、β−アラニンを結合したＣＬＥＡＲ−酸樹脂を用いるＦｍｏｃ固相合成法による段階的反応によって、末端アミノ基を有するＰＩポリアミドを調製した。Ｎ，Ｎ−ジメチル−１，３−プロパンジアミンを加え、５５℃で一晩処理して、固相上からのＰＩポリアミドの切り出しを行った。４−（８−メトキシ−８−オキソオクタンアミド）安息香酸を、アミノ安息香酸と８−クロロ−８−オキソオクタン酸メチルをカップリングによって調製し、ペンタフルオロフェニルジフェニルホスフィネート（ＦＤＰＰ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を用いて活性化エステルに変換し、次いで、ＰＩポリアミドとカップリングして、４−（８−メトキシ−８−オキソオクタンアミド）ベンゾイルがコンジュゲートしたＰＩポリアミドを製造した。次いで、該ＰＩポリアミドコンジュゲートから、水／ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（１／１）中のヒドロキシルアミン溶液を用いるアミノ−脱アルコキシル化によって、ＳＡＨＡ−ＰＩポリミアドコンジュゲートを調製した。粗生成物を逆相高速液体クロマトグラフィーで精製後、ＥＳＩ−ＴＯＦ  ＭＳ（Electrospray ionization time-of-flight mass spectrometry）によって確認した。なお、試薬および溶媒は、標準的な供給元から入手し、さらに精製することなく使用した。ＥＳＩ−ＴＯＦ  ＭＳ（Electrospray ionization time-of-flight mass spectrometry）は、Ｂｉｏ−ＴＯＦ  ＩＩ（Bruker Daltonics）マススペクトロメ−ターで、陽イオン化モードを用いて行った。機械によるポリアミド合成は、コンピューター制御されたＰＳＳＭ−８（Shimadzu）システムで行った。
【００５６】
（２）骨髄性白血病細胞における内在性制御因子のスクリーニング
上記（１）で調製したＳＡＨＡ−ＰＩポリミアドコンジュゲートライブラリーの各ＳＡＨＡ−ＰＩポリミアドコンジュゲート２０μＭで、ヒト骨髄性白血病細胞ＭＶ４−１１細胞［ＡＴＣＣ（American Type Culture Collection, USA）から入手］を１２時間処理した。処理後の細胞から全ＲＮＡを抽出し、リアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）により、ＲＵＮＸ１標的遺伝子ＩＬ３、ＣＳＦ２およびＣＳＦ２ＲＢの発現量を定量した。対照としてＤＭＳＯで処理した細胞を用い、各処理細胞で得られた値をＤＭＳＯ処理細胞の値に対して標準化した（ｎ＝３）。なお、ＲＵＮＸ１は、急性骨髄性白血病１タンパク質（ＡＭＬ１）としても知られ、血液関連遺伝子および造血幹細胞関連遺伝子の発現を制御する転写因子である。
【００５７】
リアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）は、下記のように行った。全ＲＮＡをＲＮｅａｓｙミニキット（Qiagen）で単離し、Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｓｃｒｉｐｔキット（TOYOBO）で逆転写してｃＤＮＡを生成した。リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、７５００  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Applied Biosystems）を用いて、製造者の指示書にしたがって実施した。結果は、ＧＡＰＤＨレベルに対して標準化した。相対的発現レベルは、２−ΔΔＣｔ法を用いて算出した。ｑＲＴ−ＰＣＲに用いたプライマーを表１に示す。
【００５８】
【表１】
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【００５９】
結果を図４に示す。図４から明らかなように、特にＳＡＨＡ−ＰＩポリミアドコンジュゲートＭがＩＬ３、ＣＳＦ２およびＣＳＦ２ＲＢの発現量を増加させた。ＳＡＨＡ−ＰＩポリミアドコンジュゲートＭ（以下、「コンジュゲートＭ」という）の認識配列は、５’−ＷＧＷＧＧＷ−３’（ＷはＡもしくはＴのいずれか）である。ＭＶ４−１１細胞のＮＣＢＩデータベースにおいて、配列５’−ＷＧＷＧＧＷ−３’を検索した結果、該配列がＲＵＮＸ１のコンセンサス結合配列であることが分かった。これにより、本発明のＰＩポリアミド化合物ライブラリーが内在性制御因子のスクリーニングに使用できることが確認された。
【００６０】
さらに、コンジュゲートＭのＤＮＡ結合配列をＢｉｎｄ−ｎ−Ｓｅｑ法によって決定した。簡単に言えば、ビオチン標識したコンジュゲートＭ、および二本鎖ランダムオリゴヌクレオチドを合成し、ビオチン標識コンジュゲートＭを二本鎖ランダムオリゴヌクレオチドに結合させた。ビオチン−ストレプトアビジン親和性精製により、コンジュゲートＭが結合したＤＮＡを濃縮した。濃縮されたＤＮＡをＰＣＲにより増幅し、配列決定した。その結果、コンジュゲートＭが結合した配列が、「５’−ＴＧＴＧＧＴ−３’」であることが分かった。
【００６１】
（３）スクリーニング結果の確認
次に、４つのピロール−イミダゾール対の連続的な結合により、５’−ＴＧＴＧＧＴ−３’および５’−ＴＧＣＧＧＴ−３’のＲＵＮＸコンセンサス結合配列を特異的に認識するＰＩポリアミドを設計し、ＳＡＨＡまたはクロラムブシル（Ｃｈｂ）をＮ末端に有するＰＩポリミアドコンジュゲート（ＳＡＨＡ−Ｍ’、ＳＡＨＡ−５０、Ｃｈｂ−Ｍ’、Ｃｈｂ−５０）を合成した（図５−１および図５−２）。ここで、ＳＡＨＡ−Ｍ’およびＣｈｂ−Ｍ’は、５’−ＴＧＴＧＧＴ−３’を標的とし、ＳＡＨＡ−５０およびＣｈｂ−５０は、５’−ＴＧＣＧＧＴ−３’を標的とする。ＳＡＨＡ−ＰＩポリミアドコンジュゲートの合成方法は上記と同様に行った。
【００６２】
クロラムブシル−ＰＩポリミアドコンジュゲートの合成は次のように行った。Ｆｍｏｃ固相合成法による段階的反応によって、オキシム樹脂によって担持されたＰＩポリアミドを調製した。オキシム樹脂を有する生産物に、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１，３−プロパンジアミン（１．０ｍＬ）を加え、４５℃で３時間処理して、切り出しを行った。ろ過により樹脂を除き、残留物を最少量のジクロロメタン中に溶解し、ジエチルエーテルで洗浄して、５９．６ｍｇを得た。この粗化合物（５９．６ｍｇ、４８．１μｍｏｌ）に、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（３００μＬ）中のクロラムブシル（３２．６ｍｇ、１０７μｍｏｌ）、ＰｙＢＯＰ（ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）（１０１ｍｇ、１９５μｍｏｌ）、およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１００μＬ、５８１μｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で１．５時間インキュベートし、ジエチルエーテルおよびＤＭＦで３回洗浄し、真空乾燥させた。該粗生成物を逆相フラッシュカラムクロマトグラフィー（０．１％トリフルオロ酢酸水溶液／ＭｅＣＮ）で精製した。凍結乾燥後、生成物を得た（３０．２ｍｇ、１９．８μｍｏｌ）。
【００６３】
ＳＡＨＡ−Ｍ’およびＳＡＨＡ−５０を用いて、上記（２）と同様にＭＶ４−１１細胞を処理して、骨髄性白血病の関連遺伝子ＩＬ３、ＣＳＦ２およびＣＳＦ２ＲＢの発現量を定量した。結果を図４に示す。図４から明らかなように、ＳＡＨＡ−Ｍ’およびＳＡＨＡ−５０は、コンジュゲートＭと同様にＩＬ３、ＣＳＦ２およびＣＳＦ２ＲＢの発現量を増加させた。
【００６４】
５μＭのＣｈｂ−Ｍ’またはＣｈｂ−５０でＭＶ４−１１細胞を６時間処理し、処理後の細胞から全ＲＮＡを抽出し、上記（２）と同様にｑＲＴ−ＰＣＲにより、ＩＬ３、ＣＳＦ２およびＣＳＦ２ＲＢの発現量を定量した。対照としてＤＭＳＯで処理した細胞を用い、各処理細胞で得られた値をＤＭＳＯ処理細胞の値に対して標準化した（ｎ＝３）。結果を図６に示す。図６から明らかなように、ＳＡＨＡ−ＰＩポリミアドコンジュゲートとは反対に、Ｃｈｂ−Ｍ’およびＣｈｂ−５０は、ＩＬ３、ＣＳＦ２ＲＢ、およびＣＳＦ２の発現を抑制した。
【００６５】
さらに、コンジュゲートＭの認識配列「５’−ＷＧＷＧＧＷ−３’」より該当転写因子候補と推測した転写因子ＲＵＮＸ１を特異的に抑制するために、常法によりＲＵＮＸ１遺伝子をターゲットとするＣｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｓｈＲＮＡｉベクターを作成し、ＭＶ４−１１細胞に該ベクターを導入した細胞増殖実験で、該細胞増殖が抑制されることが確認された。したがって、ＲＵＮＸ１が「５’−ＷＧＷＧＧＷ−３’」より適合する転写因子として確定できた。
【実施例２】
【００６６】
実施例２：特定の疾患細胞の増殖を制御する内在性制御因子の同定
実施例１に記載されたのと同様の方法で、クロラムブシル−ＰＩポリミアドコンジュゲートのライブラリーを合成した。合成された１６種のＰＩポリミアドコンジュゲート（Ｃｈｂ−Ａ〜Ｐ）のＰＩポリアミド部分は、実施例１で合成されたＳＡＨＡ−ＰＩポリミアドコンジュゲートＡ〜ＰのＰＩポリアミド部分と同一である。
【００６７】
正常乳腺細胞株（ＭＣＦ１０Ａ）、トリプルネガティブ（ＴＮＢＣ）乳癌細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）、前立腺癌細胞株（ＰＣ３）、腎癌細胞株（７８６Ｏ）、大腸癌細胞株（ＨＣＴ１１６、ＬＯＶＯ）、スキルス胃癌細胞株（４４Ａｓ３）、胃癌細胞株（ＭＫＮ７）、食道癌細胞株（ＴＥ１１、ＴＥ５）、膵臓癌細胞株（ｐａｎｃ１、ＡｓＰＣ１、ＭｉａＰａｃａ２）、チロシンキナーゼ耐性慢性骨髄性白血病（ＴＫ耐性ＣＭＬ）細胞株（ＭｙＬ−Ｒ）、ＭＬＬ関連急性骨髄性白血病（ＭＬＬ−ＡＭＬ）細胞株（ＭＶ４−１１）、ＭＬＬ−ＡＭＬ Ｍ細胞株（ＭＶ４−１１Ｒ）、ＭＤＳ−ＡＭＬ細胞株（ＭＯＬＭ１３）、肺癌細胞株（ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＭＳ）、神経芽細胞種株（ＮＢ）、および悪性小児脳腫瘍細胞株（ＭＲＴ−ＮＳ、ＭＲＴ−ｙＭ）を各種Ｃｈｂ−ＰＩポリミアドコンジュゲート５μＭを含む培地中、３７℃で２日間培養した。Ｃｈｂ−ＰＩポリミアドコンジュゲートを含有しない培地中、同条件下で培養した場合の細胞増殖率を１００として、各種Ｃｈｂ−ＰＩポリミアドコンジュゲートの存在下における細胞増殖率を求めた。結果を図７に示す。
【００６８】
図７の結果に基づき、細胞増殖率が特に低いＣｈｂ−ＰＩポリアミドコンジュゲートを選択した。次いで、選択したＰＩポリミアドコンジュゲートの結合配列をＢｉｎｄ−ｎ−Ｓｅｑ法により決定するか、または当該細胞の遺伝子発現プロファイルにおいて当該コンジュゲートのＤＮＡ認識配列を検索することにより、当該癌の内在性制御因子が同定される。また、多くの癌細胞において細胞増殖率を減少させるＣｈｂ−ＰＩポリアミドコンジュゲートを選択することにより、幅広い種類の癌に関与する内在性制御因子を同定することができる。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明によれば、遺伝子発現を活性化する物質または遺伝子発現を抑制する物質がコンジュゲートしたＰＩポリミアド化合物ライブラリーを用いることにより、癌等の各種疾患を制御するＤＮＡ配列（シスエレメント）、および当該配列に結合する内在性転写制御因子の候補を簡便に同定することが可能である。このような内在性制御因子は、耐性が出現しにくい革新的な分子標的薬の創薬ターゲットとして利用することができる。また、本発明の方法は、各種疾患だけでなく、各種幹細胞等から特定の細胞系譜への分化制御に関わる新たな因子の同定にも適用できる。また、本発明のスクリーニング方法により同定した内在性転写制御因子が結合する配列を標的とするＰＩポリミアドコンジュゲートを抗癌剤、各種疾患治療用医薬、細胞分化制御剤等として使用することもできる。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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