(57)【要約】      （修正有）【課題】バイオフィルム関連感染症を治療するペプチドまたはペプチド模倣薬の提供。【解決手段】バイオフィルム関連感染症の治療に用いる、ａ）正味の正電荷を帯び、ｂ）１〜６アミノ酸の長さであるか、または同等の大きさのペプチド模倣薬であり、ｃ）両親媒性の性質を持ち、１つ以上の親油基を有し、当該親油基の１つが少なくとも７個の非水素原子を含む、ペプチドまたはペプチド模倣薬。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオフィルム関連感染症の治療に用いるペプチドまたはペプチド模倣薬であって、該ペプチドまたはペプチド模倣薬は、
ａ）正味の正電荷を帯び、
ｂ）１〜６アミノ酸の長さであるか、または同等の大きさのペプチド模倣薬であり、
ｃ）１つ以上の親油基を有する両親媒性の性質を持ち、該親油基の１つが少なくとも７個の非水素原子を含む、ペプチドまたはペプチド模倣薬。
【請求項２】
被験体のバイオフィルム関連感染症を治療する方法であって、該被験体にペプチドまたはペプチド模倣薬を投与する工程を包含し、該ペプチドまたはペプチド模倣薬は、
ａ）正味の正電荷を帯び、
ｂ）１〜６アミノ酸の長さであるか、または同等の大きさのペプチド模倣薬であり、
ｃ）１つ以上の親油基を有する両親媒性の性質を持ち、該親油基の１つが少なくとも７個の非水素原子を含む、方法。
【請求項３】
バイオフィルム関連感染症の治療薬の製造における、
ａ）正味の正電荷を帯び、
ｂ）１〜６アミノ酸の長さであるか、または同等の大きさのペプチド模倣薬であり、
ｃ）１つ以上の親油基を有する両親媒性の性質を持ち、該親油基の１つが少なくとも７個の非水素原子を含む、ペプチドまたはペプチド模倣薬の使用。
【請求項４】
前記感染は、慢性創傷感染、自然弁心内膜炎、急性中耳炎、慢性細菌性前立腺炎、肺炎、歯垢、歯周炎、呼吸器疾患におけるバイオフィルム感染、または埋め込み型もしくは人工医療器具に関連した器具による感染である、請求項１に記載のペプチドまたはペプチド模倣薬、請求項２に記載の方法、あるいは請求項３に記載の使用。
【請求項５】
バイオフィルム形成を抑制するかまたはバイオフィルムを除去する方法であって、該バイオフィルムをペプチドまたはペプチド模倣薬に接触させる工程を包含し、該ペプチドまたはペプチド模倣薬は、
ａ）正味の正電荷を帯び、
ｂ）１〜６アミノ酸の長さであるか、または同等の大きさのペプチド模倣薬であり、
ｃ）１つ以上の親油基を有する両親媒性の性質を持ち、該親油基の１つが少なくとも７個の非水素原子を含む、方法。
【請求項６】
前記バイオフィルムは医療器具上に存在する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ペプチドまたはペプチド模倣薬は少なくとも＋２の正味電荷を有する、請求項１〜６のいずれか１項先行する請求項のいずれか１つに記載のペプチドもしくはペプチド模倣薬、方法、あるいは使用。
【請求項８】
前記ペプチドは３アミノ酸の長さであるか、または前記ペプチド模倣薬は同等の大きさである、先行する請求項のいずれか１つに記載のペプチドまたはペプチド模倣薬、方法、あるいは使用。
【請求項９】
前記親油基は９〜１２個の非水素原子を有する、先行する請求項のいずれか１つに記載のペプチドまたはペプチド模倣薬、方法、あるいは使用。
【請求項１０】
前記親油基は、随意に芳香族となる環状基を含む、先行する請求項のいずれか１つに記載のペプチドまたはペプチド模倣薬、方法、あるいは使用。
【請求項１１】
前記親油基は、随意に縮合される２つ以上の環状基を含む、請求項１０に記載のペプチドまたはペプチド模倣薬、方法、あるいは使用。
【請求項１２】
前記親油基はアミノ酸のＲ基である、先行する請求項のいずれか１つに記載のペプチドまたはペプチド模倣薬、方法、あるいは使用。
【請求項１３】
前記アミノ酸は、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、トリブチルトリプトファン（Ｔｂｔ）、ビフェニルアラニン、ジフェニルアラニン、およびビフェニルアラニン誘導体を含む群から選択される、請求項１２に記載のペプチドまたはペプチド模倣薬、方法、あるいは使用。
【請求項１４】
前記親油基は極性基を２つ以下含む、先行する請求項のいずれか１つに記載のペプチドまたはペプチド模倣薬、方法、あるいは使用。
【請求項１５】
前記親油基は極性基を含まない、請求項１４に記載のペプチドまたはペプチド模倣薬、方法、あるいは使用。
【請求項１６】
前記ペプチドは３つのアミノ酸部分を含み、任意の順で、該アミノ酸部分の２つはカチオン性アミノ酸であり、該アミノ酸の１つは、親油Ｒ基を有するアミノ酸であり、該Ｒ基は、１４〜２７個の非水素原子を有する、先行する請求項のいずれか１つに記載のペプチド、方法、あるいは使用。
【請求項１７】
前記ペプチドは下記式（Ｖ）を有し、
ＡＡ−ＡＡ−ＡＡ−Ｒ1−Ｒ2  （Ｖ）
任意の順で、該ＡＡ（アミノ酸）部分の２つはカチオン性アミノ酸であり、該ＡＡの１つは、親油Ｒ基を有するアミノ酸であり、該Ｒ基は、１４〜２７個の非水素原子を有し；
Ｒ1は、分岐鎖または非分岐鎖Ｃ1〜Ｃ10アルキルまたはアリール基と置換され得るＮ原子であり、該基は、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択されたヘテロ原子を最大で２個組み込んでもよく；
Ｒ2は、２〜２０個の非水素原子を有する脂肪族部分であり、該部分は、直鎖、分岐鎖、または環状である、先行する請求項のいずれか１つに記載のペプチド、方法、または使用。
【請求項１８】
前記バイオフィルムはグラム陽性細菌を含む、先行する請求項のいずれか１つに記載のペプチドまたはペプチド模倣薬、方法、あるいは使用。
【請求項１９】
前記グラム陽性細菌はブドウ球菌を含む、請求項１８に記載のペプチドまたはペプチド模倣薬。
【請求項２０】
前記ブドウ球菌は溶血性連鎖球菌である、請求項１９に記載のペプチドまたはペプチド模倣薬。
【請求項２１】
前記ペプチドまたはペプチド模倣薬は固形支持体に付着する、先行する請求項のいずれか１つに記載のペプチドまたはペプチド模倣薬、方法、あるいは使用。
【請求項２２】
先行する請求項のいずれか１つに記載のペプチドまたはペプチド模倣薬を含む固形支持体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオフィルム関連感染症を治療する方法、ならびに医療および環境の分野において、バイオフィルム形成の抑制またはバイオフィルムの除去に関する。特に、本発明は、上記方法における細胞溶解性を有するペプチドおよびペプチド模倣薬の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的な用語においては、バイオフィルムは、細胞外ポリマー（当該分野では糖衣としても公知である）のマトリクスに囲まれた微生物の集合体または群集である。これらの細胞外ポリマーは、典型的には、多糖類であり、とりわけ、該生物自体により産生された多糖類であるが、他の生体高分子も同様に含有し得るものである。バイオフィルムは、典型的には、不活性表面または生体表面に付着するが、相互に付着した微生物または何らかの界面に付着した微生物からバイオフィルムが形成され得ることも観察されている。そのような成長様式は微生物を保護し、それらの除去または根絶を困難にする。バイオフィルムは、商業、産業、および医療において、感染、汚染、汚損、および損傷等に関する重大な問題を生じる。
【０００３】
バイオフィルム群集中の微生物は、そのプランクトン様（浮遊性）の同等物が共有しない細胞レベルの性質（表現型）を示す。そのような固着微生物は、プランクトン様浮遊性細胞とは大きく異なると思われる。また、さらなる相違点が群集レベルで観察でき、その相違点は、細胞外マトリクスの影響によるものである。恐らく、最も顕著であるのは、バイオフィルム環境中の微生物が、例えば、抗生物質、抗真菌剤、および殺菌剤等の抗菌剤、ならびに宿主免疫防御またはクリアランス機構に対して同じ感受性を示さないというよく観察される現象である。この抵抗性は、細胞外マトリクスの障壁効果および／または微生物自体の表現型変化によるものと考えられる。また、バイオフィルム中の微生物は、成長がより遅くなり、結果として、抗菌剤の取り込みがより遅くなると思われる。
【０００４】
バイオフィルムの形成は、典型的には、浮遊性微生物が表面に付着することで始まる。この最初のコロニストは、まず、弱い可逆的ファンデルワールス力で表面に付着し得る。コロニストは、表面からすぐに離れない場合には、線毛等の細胞接着構造を用いて、自身をより恒久的にしっかりと固着することができる。この最初のコロニストは、典型的には、より多様な接着場所を提供するとともに、バイオフィルムをまとめるマトリクスの構築を開始することにより、他の細胞の出現を容易にする。それ自体では表面に付着できない種も存在するが、マトリクスに固着したり、先に存在するコロニストに直接固着したりできる場合が多い。このコロニーの形成時に、上記細胞は、菌対数感知機構により情報伝達を行うことができる。コロニー形成が一旦開始されると、バイオフィルムは、細胞分裂と細胞動員との組み合わせにより成長し得る。バイオフィルム形成の最終段階は、発達として知られ、バイオフィルムが確立され、形状および大きさのみが変化し得る段階である。このバイオフィルムの発達により、細胞は抗生物質耐性をより強くすることができる。「発達」段階のバイオフィルムは、「成熟」バイオフィルムと呼ばれることがある。
【０００５】
バイオフィルムは、表面上に容易に形成され、水に触れた表面（「湿潤」表面）上に確立された微生物コロニーは、バイオフィルム構造として存在し得る。さらに、バイオフィルムは細菌感染の場合（すなわち、感染宿主内またはその上）にも形成し得ることが現在では明らかになってきており、そのことがますます文書化されてきている。よって、バイオフィルム形成は、「生理学的な」表面上、すなわち、有生もしくは生物表面、または感染宿主生物（例えば、ヒトまたは非ヒト動物被験体）上の表面もしくはその内部の表面上、例えば、体内もしくは体外表面または外部もしくは内部組織表面上でも発生し得る。そのような体組織上でのバイオフィルム形成（または感染）は、例えば、自然弁心内膜炎（僧帽弁、大動脈弁、三尖弁（ｔｒｉｃｕｐｓｉｄ）、肺性心弁）、急性中耳炎（中耳）、慢性細菌性前立腺炎（前立腺）、嚢胞性線維症（肺）、肺炎（気道）、歯周炎（歯を支える組織；例えば、歯肉、歯周靭帯、歯槽骨（ａｌｖｅｌｏｒ  ｂｏｎｅ）を含む様々な感染症の一因となるとますます考えられるようになってきている。医療器具が埋め込まれる場合には、バイオフィルムニッチ（ｂｉｏｆｉｌｍ  ｎｉｃｈｅｓ）が存在し、そのような埋め込み（「留置」）器具の表面にバイオフィルムが形成されることで、その部位における人工弁心内膜炎や、例えば、子宮内避妊具、コンタクトレンズ、人工器官（例えば、人工関節）等の器具による感染等の感染、ならびにカテーテル挿入部位における、例えば、中心静脈または尿道カテーテルによる感染等の臨床上の問題が生じることがある。
【０００６】
そのようなバイオフィルム感染の重大な問題およびリスクは、微生物（より特定的には、微小コロニー）がバイオフィルムから剥がれるか分離し、重大な場合には、血液循環を含む、他の組織内に入り得ることである。そのような循環するバイオフィルム由来の微生物は、さらなる感染を引き起こすとともに、重大な臨床上の問題を生じ得るが、これは、特に、分離した循環微生物は親群集の全ての抵抗特性を有することがあるためである。
【０００７】
死滅もしくは損傷（例えば、壊死または炎症）した体表面または組織表面は、特にバイオフィルム感染を生じやすい。創傷は感染しやすく、短時間で治癒しない創傷にはバイオフィルム形成が発生し得る。創傷は、その汚染に対する感受性ならびにバイオフィルム付着のための基質および表面としての利用可能性のため、バイオフィルムの形成にとって理想的な環境である。創傷の感染は治癒をさらに遅らせる場合が多く、それにより、その創傷がバイオフィルム形成および確立した感染をより起こし易くすることが問題である。治癒が遅れた慢性創傷は、バイオフィルム形成が特に懸念される部位の典型である。慢性創傷は、炎症状態にあり、炎症性サイトカインのレベルが上昇する。そのサイトカインの効果は、免疫細胞（好中球およびマクロファージ）であふれた領域を産生することである。この防御系の作用が何らかの理由により遅れた場合、細菌または他の微生物には、表面に付着し、バイオフィルムの成長状態に入る時間がある。慢性および急性創傷の両方がバイオフィルム感染部位となり得る証拠が、創傷、特に、慢性創傷に多様な微生物群集または個体群が存在する（慢性創傷内の嫌気性細菌を含む）という証拠とともにますます増加している。慢性創傷感染は、健常な自然および適応免疫反応を有する個体においても宿主免疫系によって排除されない持続感染、ならびに全身および局所抗菌薬に対する抵抗性といった、他のバイオフィルム感染と２つの重要な属性を共有するものである。従って、バイオフィルムに基づく感染は、治療が非常に困難であり、バイオフィルム汚染は根絶が非常に困難である。
【０００８】
慢性創傷は、世界的に主要な健康問題であり、臨床的資源の重大な浪費原因の典型である。慢性創傷の３つの基本的種別は、糖尿病性足潰瘍、静脈性下肢潰瘍、および褥瘡性潰瘍であるが、外科的創傷を含む他の創傷が慢性化することがある。そのような創傷の手当ては、材料費および患者の負担が莫大となるため、効果的な抗バイオフィルム治療、あるいは実際には、バイオフィルムの処置を補助または容易にし、それによって創傷の治癒を促進または容易にするあらゆる治療が非常に大きな影響を有する。より詳細には、バイオフィルムは、慢性創傷感染および医療器具による感染に関係していることが多い、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）およびコアグラーゼ陰性ブドウ球菌（ＣｏＮＳ：ｃｏａｇｕｌａｓｅ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）により生じる重篤感染の発症において中心的な役割を果たす。
【０００９】
バイオフィルム中で増殖した細菌は、それらのプランクトン様の対応物よりも抗菌薬に対する耐性がある。プランクトン様細菌の感受性試験では、器具による感染の抗菌薬に対するｉｎ  ｖｉｖｏ抵抗を予測できないことがある。
【００１０】
よって、有効な抗菌性を有するとともに、バイオフィルムとして存在する微生物に対しても効果を発揮することができる薬剤が必要とされている。
【００１１】
従来の抗生物質に対して抵抗力がある細菌分離株による感染が増加したことで、新規な抗生物質が徹底的に研究されるようになった。カチオン性抗菌ペプチド（ＣＡＰ：Ｃａｔｉｏｎｉｃ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ）は、自然界に広く存在し、先天性免疫の一部として重要な役割を果たす。一般に、ＣＡＰは、正味の正電荷を帯びるとともに、約５０％の疎水性残基を含有する、かなり大きな分子である。その作用機序には、微生物膜上の負に帯電した構造分子に結合することが含まれる。一旦結合すると、ＣＡＰは、細胞膜透過性を増大させ、最終的に、細胞溶解を引き起こす細孔を形成する。また、細胞内標的との相互作用および自己分解酵素の活性化等の他の抗菌機構に関する証拠もある。ＣＡＰは、幅広い抗菌活性を有し、抵抗性発現は稀である。ＣＡＰの修飾の結果、ＳＡＭＰと呼ばれる、極めて短い合成抗菌ペプチド模倣薬が開発された（ハウグら（Ｈａｕｇ）著、［２００８年］、「ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．）」、第５１巻、ｐ．４３０６−４３１４）。ＳＡＭＰは、ＣＡＰの効果を模倣するが、薬物動態特性が改善されている場合がある。
【００１２】
ベクロフら（Ｂｅｃｋｌｏｆｆ）は、「アンチマイクロバイアル・エージェンツ・アンド・ケモセラピー（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ）」、［２００７年］、ｐ．４１２５〜４１３２において、バイオフィルムに対する活性剤としての小分子メタ−フェニレンエチニレンの使用を記載しているが、この分子は、本発明に従って用いるペプチド系分子とは構造的に非常に異なる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明者らは、特定のＣＡＰ型分子およびＳＡＭＰが抗バイオフィルム剤として優れた活性を有することを見出した。
【００１４】
よって、１つの態様において、本発明は、バイオフィルム関連感染症の治療に用いるペプチドまたはペプチド模倣薬であって、
ａ）正味の正電荷を帯び、
ｂ）１〜６アミノ酸の長さ、好ましくは、少なくとも１もしくは２アミノ酸の長さで、最大で４、５もしくは６アミノ酸の長さ、例えば、２〜５もしくは２〜６アミノ酸の長さであるか、または同等の大きさのペプチド模倣薬であり、
ｃ）両親媒性の性質を持ち、１つ以上の親油基を有し、当該親油基の１つが少なくとも７個の非水素原子を含む、ペプチドまたはペプチド模倣薬を提供する。
【００１５】
「バイオフィルム」とは、基質もしくは界面に付着するかまたは相互に付着し、細胞外ポリマー（より詳細には、それらが産生した細胞外ポリマー）のマトリクスに埋め込まれ、（例えば、その「非バイオフィルム」または浮遊性もしくはプランクトン様の対応物と比較して）増殖速度および遺伝子転写に関して表現型が変化した細胞を特徴とする微生物の付着群集を意味する。
【００１６】
ヒトおよび非ヒト動物被験体にとって問題となる細菌感染におけるバイオフィルムの蔓延に関しては現在評価中である。これらは、特に慢性創傷感染および医療器具による感染に関与している。よって、好適な実施形態では、本発明は、慢性創傷感染に関連するバイオフィルムまたは医療器具による感染に関連するバイオフィルムに対する治療に用いる本明細書中に規定のペプチドおよびペプチド模倣薬を提供する。
【００１７】
別の観点からは、本発明は、バイオフィルム関連感染症の治療薬の製造における本明細書中に規定のペプチドまたはペプチド模倣薬の使用を提供する。
【００１８】
別の観点からは、本発明は、被験体のバイオフィルム関連感染症を治療する方法であって、本明細書中に規定のペプチドまたはペプチド模倣薬を上記被験体に投与することを含む、方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本研究で用いるＳＡＭＰの化学構造を示す。構造１は、化合物Ａ：Ｒ＝ｉＰｒ、化合物Ｂ：Ｒ＝（ＣＨ2）2Ｐｈ、および化合物Ｃ：Ｒ＝ｎ−Ｃ6Ｈ13の構造である。
【図２】６つの異なるブドウ球菌株から形成後２４時間のバイオフィルムにおける、クリスタルバイオレット（ＣＶ：Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｖｉｏｌｅｔ）を用いたバイオマス定量（上段）およびアラマーブルー（ＡＢ：Ａｌａｍａｒ  ｂｌｕｅ）を用いた代謝活性の定量（下段）を示す。ＣＶとＡＢの間には明確な相関関係を見ることができる。
【図３】（上段）６つの異なるブドウ球菌株から形成後２４時間のバイオフィルム上における、リファンピシンを用いた２４時間処理の効果を示すグラフである。各株について、棒は、左から右方向に、陰性対照、陽性対照、抗生物質（バンコマイシン、リネゾルド（ｌｉｎｅｚｏｌｄ）、テトラサイクリン）濃度５ｍｇ／Ｌ、５０ｍｇ／Ｌ、および５００ｍｇ／Ｌでの処理を表す。リファンピシンについては、濃度は、０．０１ｍｇ／Ｌ、０．１ｍｇ／Ｌ、および１ｍｇ／Ｌであった。数値は、３回の実験の平均±ＳＤである。＊は、代謝活性の強い抑制を意味する。＊＊は、代謝活性の完全抑制を意味する。（下段）６つの異なるブドウ球菌株から形成後２４時間のバイオフィルム上における、リネゾリドを用いた２４時間処理の効果を示すグラフである。各株について、棒は、左から右方向に、陰性対照、陽性対照、抗生物質（バンコマイシン、リネゾルド（ｌｉｎｅｚｏｌｄ）、テトラサイクリン）濃度５ｍｇ／Ｌ、５０ｍｇ／Ｌ、および５００ｍｇ／Ｌでの処理を表す。リファンピシンについては、濃度は、０．０１ｍｇ／Ｌ、０．１ｍｇ／Ｌ、および１ｍｇ／Ｌであった。数値は、３回の実験の平均±ＳＤである。＊は、代謝活性の強い抑制を意味する。＊＊は、代謝活性の完全抑制を意味する。
【図４】（上段）６つの異なるブドウ球菌株から形成後２４時間のバイオフィルム上における、テトラサイクリンを用いた２４時間処理の効果を示すグラフである。各株について、棒は、左から右方向に、陰性対照、陽性対照、抗生物質（バンコマイシン、リネゾルド（ｌｉｎｅｚｏｌｄ）、テトラサイクリン）濃度５ｍｇ／Ｌ、５０ｍｇ／Ｌ、および５００ｍｇ／Ｌでの処理を表す。リファンピシンについては、濃度は、０．０１ｍｇ／Ｌ、０．１ｍｇ／Ｌ、および１ｍｇ／Ｌであった。数値は、３回の実験の平均±ＳＤである。＊は、代謝活性の強い抑制を意味する。＊＊は、代謝活性の完全抑制を意味する。（下段）６つの異なるブドウ球菌株から形成後２４時間のバイオフィルム上における、バンコマイシンを用いた２４時間処理の効果を示すグラフである。各株について、棒は、左から右方向に、陰性対照、陽性対照、抗生物質（バンコマイシン、リネゾルド（ｌｉｎｅｚｏｌｄ）、テトラサイクリン）濃度５ｍｇ／Ｌ、５０ｍｇ／Ｌ、および５００ｍｇ／Ｌでの処理を表す。リファンピシンについては、濃度は、０．０１ｍｇ／Ｌ、０．１ｍｇ／Ｌ、および１ｍｇ／Ｌであった。数値は、３回の実験の平均±ＳＤである。＊は、代謝活性の強い抑制を意味する。＊＊は、代謝活性の完全抑制を意味する。
【図５】（上段）６つの異なるブドウ球菌株から形成後２４時間のバイオフィルム上における、３つの異なるＳＡＭＰ（化合物Ａ）を用いた２４時間処理の効果を示すグラフである。各株について、棒は、左から右方向に、陰性対照、陽性対照、濃度が５ｍｇ／Ｌ、５０ｍｇ／Ｌ、および５００ｍｇ／ＬのＳＡＭＰでの処理を表す。数値は、３回の実験の平均±ＳＤである。＊は、代謝活性の強い抑制を意味する。＊＊は、代謝活性の完全抑制を意味する。（下段）６つの異なるブドウ球菌株から形成後２４時間のバイオフィルム上における、３つの異なるＳＡＭＰ（化合物Ｂ）を用いた２４時間処理の効果を示すグラフである。各株について、棒は、左から右方向に、陰性対照、陽性対照、濃度が５ｍｇ／Ｌ、５０ｍｇ／Ｌ、および５００ｍｇ／ＬのＳＡＭＰでの処理を表す。数値は、３回の実験の平均±ＳＤである。＊は、代謝活性の強い抑制を意味する。＊＊は、代謝活性の完全抑制を意味する。
【図６】６つの異なるブドウ球菌株から形成後２４時間のバイオフィルム上における、３つの異なるＳＡＭＰ（化合物Ｃ）を用いた２４時間処理の効果を示すグラフである。各株について、棒は、左から右方向に、陰性対照、陽性対照、濃度が５ｍｇ／Ｌ、５０ｍｇ／Ｌ、および５００ｍｇ／ＬのＳＡＭＰでの処理を表す。数値は、３回の実験の平均±ＳＤである。＊は、代謝活性の強い抑制を意味する。＊＊は、代謝活性の完全抑制を意味する。
【図７】Ａ）カバースライドディスク（ｃｏｖｅｒ  ｓｌｉｄｅ  ｄｉｓｃｓ）上で成長後４８時間の溶血性連鎖球菌５１−０７バイオフィルムを示す写真である。当該バイオフィルムは、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色により染色するとともに、共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて調べた。未処理のバイオフィルム。Ｂ）カバースライドディスク（ｃｏｖｅｒ  ｓｌｉｄｅ  ｄｉｓｃｓ）上で成長後４８時間の溶血性連鎖球菌５１−０７バイオフィルムを示す写真である。当該バイオフィルムは、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色により染色するとともに、共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて調べた。バンコマイシン５０ｍｇ／Ｌで２４時間処理したバイオフィルム。Ｃ）カバースライドディスク（ｃｏｖｅｒ  ｓｌｉｄｅ  ｄｉｓｃｓ）上で成長後４８時間の溶血性連鎖球菌５１−０７バイオフィルムを示す写真である。当該バイオフィルムは、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色により染色するとともに、共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて調べた。バンコマイシン５００ｍｇ／Ｌで２４時間処理したバイオフィルム。Ｄ）カバースライドディスク（ｃｏｖｅｒ  ｓｌｉｄｅ  ｄｉｓｃｓ）上で成長後４８時間の溶血性連鎖球菌５１−０７バイオフィルムを示す写真である。当該バイオフィルムは、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色により染色するとともに、共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて調べた。テトラサイクリン５０ｍｇ／Ｌで２４時間処理したバイオフィルム。Ｅ）カバースライドディスク（ｃｏｖｅｒ  ｓｌｉｄｅ  ｄｉｓｃｓ）上で成長後４８時間の溶血性連鎖球菌５１−０７バイオフィルムを示す写真である。当該バイオフィルムは、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色により染色するとともに、共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて調べた。テトラサイクリン５００ｍｇ／Ｌで２４時間処理したバイオフィルム。
【図８】Ｆ）カバースライドディスク（ｃｏｖｅｒ  ｓｌｉｄｅ  ｄｉｓｃｓ）上で成長後４８時間の溶血性連鎖球菌５１−０７バイオフィルムを示す写真である。当該バイオフィルムは、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色により染色するとともに、共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて調べた。化合物１  ５０ｍｇ／Ｌで２４時間処理したバイオフィルム。Ｇ）カバースライドディスク（ｃｏｖｅｒ  ｓｌｉｄｅ  ｄｉｓｃｓ）上で成長後４８時間の溶血性連鎖球菌５１−０７バイオフィルムを示す写真である。当該バイオフィルムは、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色により染色するとともに、共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて調べた。化合物１  ５００ｍｇ／Ｌで２４時間処理したバイオフィルム。
【図９】Ａ）非被覆アミノメチル化ポリスチレンＨＬ粒子、Ｂ）表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）との２４時間培養後の非被覆アミノメチル化ポリスチレンＨＬ粒子、Ｃ）表皮ブドウ球菌との２４時間培養後のアルギニニル−（２，５，７−トリ−ｔｅｒｔ−ブチル）トリプトファニル−アルギニニル−ポリスチレン粒子、Ｄ）表皮ブドウ球菌との２４時間培養後のアルギニニル−（２，５，７−トリ−ｔｅｒｔ−ブチル）トリプトファニル−アルギニニル−アミノヘキサノイル−ポリスチレン粒子、Ｅ）表皮ブドウ球菌との２４時間培養後のアルギニニル−（２，５，７−トリ−ｔｅｒｔ−ブチル）トリプトファニル−アルギニニル−フェニルアラニニル−ポリスチレン粒子、Ｆ）表皮ブドウ球菌との２４時間培養後のアルギニニル−（２，５，７−トリ−ｔｅｒｔ−ブチル）トリプトファニル−アルギニニル−フェニルアラニニル−アミノヘキサノイル−ポリスチレン粒子の顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
「バイオフィルム関連感染症」は、微生物がバイオフィルムとして存在することが既知であるかまたはその疑いがある被験体の微生物感染である。典型的には、バイオフィルムの存在が臨床状況、例えば、診断もしくは予後、治療計画、感染の重篤度、治療時までのもしくは将来予測される感染期間に関係する感染である。「治療」は、予防的治療を含むとともに、バイオフィルムの縮小、バイオフィルム内での生きた微生物数の低減、およびバイオフィルム内の微生物の離脱および新たなバイオフィルムコロニーの形成の予防またはその傾向の減少を包含する。また、治療は、上記感染に関連する症状の１つ以上において臨床医または患者により観察される改善を含む。
【００２１】
バイオフィルム中の微生物の大きさ、構造、完全性、および数は、任意の便宜的方法により分析することができる。例えば、走査型透過電子顕微鏡法を用いてバイオフィルムの大きさ、完全性、および構造を評価する場合が多い。バイオフィルムの分析については、本発明の実施例において説明する。
【００２２】
本発明に従って治療し得るバイオフィルムは、それらが含有する微生物に関して限定されることはなく、本明細書中に記載の溶解性分子は、細胞膜を標的とするため、かなりの非特異的活性を有する。従って、上記バイオフィルムは、任意の綱、属または種の微生物、すなわち、バイオフィルムを形成し得るあらゆる微生物を含み得る。そのような微生物は、典型的には、細菌を含み、それにはあらゆる属または種の細菌が含まれる。よって、上記細菌は、グラム陽性もしくはグラム陰性、またはグラム染色試験非応答性であってもよい。これらは、好気性または嫌気性であってもよい。上記細菌は、病原性または非病原性であってもよい。
【００２３】
本明細書中に規定する分子が成熟バイオフィルム中の細菌を殺菌することができることは特に驚くべきことであり、そのようなバイオフィルムに対しての治療が特に好ましい。上記バイオフィルムは、グラム陽性細菌、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）および／または真菌を含み得る。グラム陽性細菌を含むか、またはそれで構成されるバイオフィルムは、標的として好ましい。
【００２４】
ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）を含むバイオフィルムは、標的として好ましく、溶血性連鎖球菌（Ｓ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）を含むバイオフィルムが特に好ましい。
【００２５】
また、バイオフィルムは真菌、藻類、および寄生原虫等の他の生物を含み得る。混合コロニーバイオフィルムは公知であり、本明細書に記載の方法により治療可能である。慢性創傷については上述しており、それらは好適な治療標的であり、糖尿病性足潰瘍、静脈性下肢潰瘍および褥瘡性潰瘍、ならびに慢性化した外科的創傷（術後創感染）を含む。医療器具は、バイオフィルムが形成し得る表面の特定の種類であり、本発明に係るさらに好適な治療標的の典型である。
【００２６】
このようなものとしては、カテーテル（例えば、中心静脈および尿道カテーテル）を含むあらゆる種類のライン、人工装具、例えば、心臓弁、人工関節、義歯、歯科クラウン、歯科キャップ、および軟組織インプラント）が挙げられる。また、あらゆる種類の埋め込み型（または「留置」）医療器具も挙げられる（例えば、ステント、子宮内避妊具、ペースメーカー、挿管チューブ、人工器官もしくは人工装具、ラインもしくはカテーテル）。「留置」医療器具は、そのいずれかの部分が体内に納まった器具を含み得、すなわち、当該器具は、全体的または部分的に体内に留置されていてもよい。
【００２７】
本発明の特定の実施形態では、上記ペプチドおよびペプチド模倣薬は、自然弁心内膜炎、急性中耳炎、慢性細菌性前立腺炎、肺炎、歯垢、歯周炎、嚢胞性線維症を含み得る呼吸器疾患におけるバイオフィルム感染、および埋め込み型もしくは人工医療器具に関連する器具による感染、例えば、人工弁心内膜炎、またはラインもしくはカテーテルまたは人工関節もしくは組織置換の感染の治療に用いられ得る。
【００２８】
創傷は、急性または慢性であってもよい。急性創傷は、認識される３つの段階からなる治癒過程（すなわち、炎症段階、増殖段階、および再形成フェーズ）を通して、遷延化することなく、順序正しく進行する創傷である。しかしながら、慢性創傷は、規則的にならんだ生化学的事象を終えることがない創傷であり、これは、創傷が治癒段階の１つに止まるためである。代替的には、慢性創傷は、少なくとも４０日、好ましくは少なくとも５０日、より好ましくは少なくとも６０日、最も好ましくは少なくとも７０日以内には治癒しない創傷である。
【００２９】
治療される創傷は、例えば、外科的切開または外傷により生じた組織の損傷または剥離、例えば、機械的外傷、熱傷、電気的外傷、化学的外傷、または放射線外傷；皮膚潰瘍等の自然に形成される病変（例えば、静脈性潰瘍、糖尿病性潰瘍、または褥瘡性潰瘍）；水疱（例えば、摩擦もしくは熱による水疱、または水疱瘡等の病原体感染により生じた水疱）；裂肛、または口腔内潰瘍であり得る。
【００３０】
慢性創傷の治療は、本発明の特に好適な態様である。
【００３１】
現在では、バイオフィルムは医学的状態の一因となることがより広く認識されているが、これらはまた、表面の微生物コロニー形成によって生じる非医学的問題にも関与する。これは、例えば、表面が細菌汚染されないようにする必要がある家庭内環境、工業環境、研究の場、または病院内であり得る。
【００３２】
上述したように、上記バイオフィルムは表面上に存在していてもよい。当該表面は特に限定されるものではなく、微生物が発生し得るいずれの表面も含み、特に、上述したように、水または湿気に曝された表面を含む。上記表面は、生物的でも非生物的であってもよく、無生物（または非生物）表面は、微生物と接触し得るかまたは汚染され得るいずれの表面も含む。よって、特に、機械、とりわけ、工業機械の表面、または水性環境に曝されるあらゆる表面（例えば、舶用機器、または船舶もしくはボートまたはその一部もしくは構成要素）、または上記環境のいずれかの部分に曝されるあらゆる表面、例えば、配管または建造物が含まれる。微生物に接触するかまたは汚染されるそのような無生物表面は、特に、食品または飲料の加工、調製、貯蔵または分配吐出の機械または機器、空調機器、例えば、化学または生物工学処理の工場における工業機械、貯蔵タンク、および医用または外科用の機器のいずれかの部分を含む。水または湿気に曝され得る材料を搬送、運搬、または送達する任意の装置または機器には、バイオフィルムが形成され易い。そのような表面は、特に、配管（本明細書中ではあらゆる導管またはラインを含む広義の意味で本用語を用いる）を含む。代表的な無生物または非生物表面は、食品の加工、貯蔵、分配吐出または調製の機器または表面や、タンク、コンベヤー、床、排水管、冷却器、冷凍器、機器表面、壁、弁、ベルト、配管、空調導管、冷却装置、食品または飲料の分配吐出ライン、熱交換器、船体またはボート構造における水に曝される部分、歯科用送水管、石油掘削管、コンタクトレンズおよび貯蔵ケースを含むがこれらに限定されない。
【００３３】
よって、さらなる態様において、本発明は、バイオフィルム形成を抑制するかまたはバイオフィルムを除去する方法であって、上記バイオフィルムを本明細書中に規定のペプチドまたはペプチド模倣薬に接触させる工程を含む、方法を提供する。上記バイオフィルムは、上述したいずれの表面上にあってもよい。
【００３４】
「接触させる」という用語は、上記ペプチドまたはペプチド模倣薬を上記バイオフィルムに直接または間接的に送達する任意の手段、および上記ペプチドまたは模倣薬を上記バイオフィルムに塗布するかまたは上記バイオフィルムを上記ペプチドまたは模倣薬に曝す手段、例えば、上記ペプチドまたは模倣薬を上記バイオフィルムに直接塗布する手段を含む。
【００３５】
上記ペプチドまたはペプチド模倣薬は、正味電荷が少なくともプラス２またはプラス３であれば有利である。
【００３６】
好適なペプチドは、２〜４アミノ酸の長さであり、最も好ましくは、３アミノ酸の長さである。
【００３７】
好適なペプチド模倣薬は、同等の大きさであり、ペプチドの好適な特徴は、必要な変更を加えた、上記ペプチド模倣薬の好適な特徴であると説明できる。
【００３８】
上記分子は、少なくとも９、１０、１１または１２個の非水素原子を持つ親油基を有することが好ましい。非水素原子が７個または８個のみの親油基を分子に組み込む場合、当該分子は、非水素原子を少なくとも３個、典型的には、少なくとも６個有するさらなる親油基を含むことが好ましい。
【００３９】
最大の親油基は、典型的には、アミノ酸のＲ基であるが、Ｎ末端修飾の一部、好ましくは、Ｃ末端修飾の一部として存在し得る。上記親油基を提供する適切な遺伝的にコードされたアミノ酸は、フェニルアラニン（非水素原子７個）、トリプトファン（非水素原子１０個）、およびチロシン（非水素原子８個）である。これ以降、アミノ酸に言及する場合、標準的な１文字でのアミノ酸の略語または標準的な３文字のアミノ酸コードを用いる場合がある。
【００４０】
上記親油基の１つは、通常、芳香族であり得る環状基を含み、縮合したまたは縮合していない環状基を２つ有する親油基が好ましい。上記親油基は、Ｏ、Ｎ、ＳまたはＦ等のヘテロ原子を含有し得るが、典型的には、ヘテロ原子は１つのみであり、窒素が好ましい。上記親油基には、好ましくは、極性基が２つのみであり、より好ましくは、０または１つ、最も好ましくは０個である。
【００４１】
上記親油基を供する好適な非遺伝的アミノ酸は、トリブチルトリプトファン（Ｔｂｔ）、ビフェニルアラニンもしくはジフェニルアラニンであるか、またはＢｉｐ（４−（２−ナフチル））、Ｂｉｐ（４−（１−ナフチル））、Ｂｉｐ（４−ｎ−Ｂｕ）、Ｂｉｐ（４−Ｐｈ）、もしくはＢｉｐ（４−Ｔ−Ｂｕ）またはＰｈｅ（４−（２'−ナフチル））、Ｐｈｅ（４−（１'−ナフチル））、Ｐｈｅ（４−ｎ−ブチルフェニル）、Ｐｈｅ（４−４'−ビフェニル）もしくはＰｈｅ（４'−ｔ−ブチルフェニル）等のビフェニルアラニン誘導体である。
【００４２】
上記ペプチドは、典型的には、１、２または３個のカチオン性アミノ酸、好ましくは、２個のカチオン性アミノ酸、好ましくは、リジンまたはアルギニン、場合によっては、ヒスチジン、またはｐＨ７．０の正に帯電した任意の非遺伝的にコードされたアミノ酸または修飾アミノ酸を含む。
【００４３】
カチオン性アミノ酸を提供することができる適切な非遺伝的にコードされたアミノ酸および修飾アミノ酸は、ホモリジン、オルニチン、ジアミノ酪酸、ジアミノピメリン酸、ジアミノプロピオン酸およびホモアルギニン、ならびにトリメチルリジンおよびトリメチルオルニチン、４−アミノピペリジン−４−カルボン酸、４−アミノ−１−カルバムイミドイルピペリジン−４−カルボン酸（４−ａｍｉｎｏ−１−ｃａｒｂａｍｉｍｉｄｏｙｌｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ−４−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）、および４−グアニジノフェニルアラニン等のリジン、アルギニンおよびヒスチジンの類似体を含む。本発明に係る使用に好適な分子は、３個のアミノ酸部分を含む化合物、好ましくは、ペプチドであり、任意の順で、上記アミノ酸部分の２つはカチオン性アミノ酸であり、好ましくは、リジンまたはアルギニンであるが、ヒスチジンまたはｐＨ７．０の正に帯電した任意の非遺伝的にコードされたアミノ酸もしくは修飾アミノ酸であってもよく、上記アミノ酸の１つは大きな親油Ｒ基を有するアミノ酸であり、当該Ｒ基は、１４〜２７個の非水素原子を有するとともに、好ましくは、２以上、例えば、２または３個の縮合または結合し得る環状基を含有し、これらの環状基は、典型的には、５または６個の非水素原子、好ましくは、６個の非水素原子を含む。縮合環またはコース（ｏｒ  ｃｏｕｒｓｅ）の場合、上記非水素原子は共有されてもよい。
【００４４】
これらの好適な化合物は、３アミノ酸の長さ、すなわち、トリペプチドであってもよい。しかしながら、最大で６アミノ酸の長さ、好ましくは、４または５アミノ酸の長さの化合物も含まれる。３アミノ酸の長さよりも大きな化合物は、上記トリペプチドのＮおよび／またはＣ末端にさらなるアミノ酸を含み得る。あるいは、またはさらに、上記３アミノ酸の長さよりも大きな化合物は、上述したトリペプチドのアミノ酸を直線状配列において１つ以上のさらなるアミノ酸により分けられた状態で含んでもよい。好ましくは、上記化合物が３アミノ酸の長さよりも大きい場合、上記さらなるアミノ酸は、カチオン性または親油アミノ酸のいずれかである。４アミノ酸の長さのペプチドは、典型的には、２個のカチオン性アミノ酸および２個の親油アミノ酸を含み、５アミノ酸の長さのペプチドは、典型的には、３個のカチオン性アミノ酸および２個の親油アミノ酸、または２個のカチオン性アミノ酸および３個の親油アミノ酸を含む。３アミノ酸の長さよりも大きい、好適な化合物群は、フェニルアラニンをＣ末端アミノ酸として有する。必要に応じて、本発明において用いる化合物は、固形支持体に固定され、バイオフィルムがその上にまたは当該固形支持体の周囲環境に形成されることを予防するようにしてもよい。本発明の文脈においては、「固形支持体」および「表面」という用語は相互に置き換え可能である。
【００４５】
よって、さらなる態様では、本発明に従って用いる本明細書中に記載の化合物が固定された固形支持体が提供される。そのような固形支持体は、上述した表面を含むがこれに限定されない。バイオフィルムが形成し得る表面は、水または他の流体等を搬送する医療器具、容器、運搬具またはダクトを含む。医療器具は、バイオフィルムが形成し得る特定の種類の表面であり、本発明において用いる化合物が固定される好適な表面を表す。「医療器具」という用語は、カテーテル（例えば、中心静脈および尿道カテーテル）を含むあらゆる種類のライン、人工装具、例えば、心臓弁、人工関節、義歯、歯科クラウン、歯科キャップ、および軟組織インプラント）を含む。あらゆる種類の埋め込み型（または「留置」）医療器具が含まれる（例えば、ステント、子宮内避妊具、ペースメーカー、挿管チューブ、人工器官もしくは人工装具、ラインもしくはカテーテル）。「留置」医療器具は、そのいずれかの部分が体内に納まった器具を含み得るが、すなわち、当該器具は、全体的または部分的に留置され得る。
【００４６】
本発明において用いる化合物は、当該分野で公知の任意の手段により、固形支持体に固定させることができる。上記化合物は、上記固形支持体に直接または間接的に固定させてもよく、すなわち、結合基によって固定させてもよい。好ましくは、上記化合物は、上記固形支持体に直接固定されるが、後述するように、上記化合物の修飾が固定を可能にするために必要である。典型的には、上記化合物は、共有結合により所望の固形支持体に固定される。それゆえ、必要に応じて、本発明において用いる化合物は、当該固形支持体に対して共有結合による固定を可能にする化学基を含む。あるいは、上記化合物は、上記固形支持体に対して共有結合による固定が可能になるように修飾される。
【００４７】
「修飾された」または「修飾」という用語は、本発明において用いる化合物の化学基を上記支持体に対する共有結合による固定を可能にする化学基に置き換えることを含む。また、この用語は、既存の化学基を、上記支持体に対する共有結合による固定を可能にする化学基にさらに置換することも含む。また、この用語は、本発明において用いる予め存在する化合物の化学基を置き換えたり、さらに置換したりすることなく、上記化合物が、上記固形支持体に対して共有結合による固定を可能にするような化学基を含むように設計されるとともに、この形態で調製される場合も含む。
【００４８】
上記支持体に対する共有結合による固定を可能にする化学基の正確な性質は、上記化合物が固定されている上記所望の表面の化学的性質に依存する。同様に、上記固形支持体の表面を、固定が可能となるように修飾してもよい。各種の適切な化学基が当該分野で周知であり、固定に適した基は、当業者には容易に判断可能である。例示のみを目的とするが、表面に対する共有結合による固定を可能にする化学基は、カルボキシル基等の酸素含有基、アミド基等の窒素含有基、およびチオール基等の硫黄含有基を含むヘテロ原子含有基であってもよい。本発明において用いる化合物と上記所望の支持体との間に存在し得る共有結合は、エーテル結合、エステルアミド結合、アミン結合、硫化物結合、チオエーテル結合、およびチオエステル結合を含むがこれらに限定されない。よって、例えば、支持体上のアルコール部分および本発明において用いる化合物内のカルボン酸部分から、またはその逆から、エステル結合が形成されていてもよい。あるいは、表面に対する本発明において用いる化合物の共有結合による固定を、ヘテロ原子を伴わない結合により、例えば、アルケン基またはビニル基を用いて行ってもよく、その場合には、アルケン基またはビニル基のいずれかが本発明において用いる化合物内にあり、他方の必要な基が所望の表面上にある。付加環化反応を用いて、所望の表面に対する本発明において用いる化合物の共有結合による固定を行ってもよい。
【００４９】
好ましくは、上記共有結合による固定は、上記化合物のＣ末端と上記支持体との間である。よって、好ましくは、上記化合物は、そのＣ末端に、上記支持体に対する共有結合による固定を可能にする化学基を含有するかまたはそれを含有するように修飾される。必要に応じて、上記修飾は、上記支持体との共有結合を可能にする化学基を含有する１つ以上の親油基をＣ末端において組み込むことである。例えば、上記親油基が固定される形態は、−ＮＨＣＨ（ＣＨ3）ＣＯ−、−ＮＨ（ＣＨ2）5ＣＯ−、−ＮＨ（ＣＨ２）3ＣＯ−、−ＮＨ（ＣＨ2）2ＣＯ−、および−ＮＨＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）ＣＯ−からなる群から選択され得るが、−ＮＨＣＨ（ＣＨ3）ＣＯ−または−ＮＨ（ＣＨ2）5ＣＯ−が最も好ましい。これらの基のカルボキシル基は、上記化合物が共有結合により上記支持体に固定されることを可能にする。
【００５０】
好適な分子は、その内容を本明細書において参考として援用する国際公開第０１／６６１４７号において定義されるものである。
【００５１】
特に好適な分子群は、同様にその内容を本明細書において参考として援用する英国特許出願第０７２４９５１．９号に記載されている。
【００５２】
よって、本発明に従って用いる好適な分子は、式（Ｉ）の化合物、好ましくは、ペプチドである。
ＡＡ−ＡＡ−ＡＡ−Ｘ−Ｙ−Ｚ  （Ｉ）
ここで、任意の順で、上記ＡＡ（アミノ酸）部分の２つはカチオン性アミノ酸であり、好ましくは、リジンまたはアルギニンであるが、ヒスチジンまたはｐＨ７．０の正に帯電した任意の非遺伝的にコードされたアミノ酸もしくは修飾アミノ酸であってもよく、上記ＡＡの１つは、大きな親油Ｒ基を有するアミノ酸であり、当該Ｒ基は、１４〜２７個の非水素原子を有するとともに、好ましくは、２以上、例えば、２または３個の縮合または結合し得る環状基を含有し、これらの環状基は、典型的には、５または６個の非水素原子、好ましくは、６個の非水素原子を含み；
Ｘは、分岐鎖または非分岐鎖Ｃ1〜Ｃ10アルキルまたはアリール基、例えば、メチル、エチルまたはフェニルと置換されてもよいが、好ましくは、非置換のＮ原子であり、この基は、Ｎ、ＯおよびＳから選択されたヘテロ原子を最大で２個組み込んでもよく；
Ｙは、−Ｒa−Ｒb−、−Ｒa−Ｒb−Ｒb−、および−Ｒb−Ｒb−Ｒa−から選択された基を表し、ここで、
Ｒaは、Ｃ、Ｏ、Ｓ、ＮまたはＦ、好ましくはＣであり、
Ｒbは、Ｃであり；ＲaおよびＲbの各々は、例えば、Ｃ1〜Ｃ4アルキル基またはカルボキシル基と置換されるかまたは非置換であり、好ましくは、Ｙは、−Ｒa−Ｒb−であり（ＲaはＣであることが好ましい）、好ましくは、この基は非置換であり、Ｙが−Ｒa−Ｒb−Ｒb−、またはＲb−Ｒb−Ｒa−である場合、好ましくは、ＲaとＲbの１つ以上が置換され；
Ｚは、各々が５または６個の非水素原子（好ましくはＣ原子）の１〜３個の環状基を含む基であり、上記環状基の２つ以上は縮合していてもよく；当該環の１つ以上は置換されてもよく、これらの置換は、極性基を含んでもよいが、典型的には含んでおらず、適切な置換基は、ハロゲン類、好ましくは、フッ素、およびＣ1〜Ｃ4アルキル基を含み、上記Ｚ部分は、非水素原子を最大で１５個、好ましくは、５〜１２個組み込み、最も好ましくは、フェニルであり；
上記ＹとＺ間の結合は、ＹのＲaまたはＲbとＺの上記環状基の１つの非水素原子との共有結合である。
【００５３】
特に好適な実施形態では、上記化合物は、好ましくは、式（ＩＩ）のペプチドである。
ＡＡ1−ＡＡ2−ＡＡ1−Ｘ−Ｙ−Ｚ  （ＩＩ）
ここで、
ＡＡ1はカチオン性アミノ酸、好ましくは、リジンまたはアルギニンであるが、ヒスチジンまたはｐＨ７．０の正に帯電した任意の非遺伝的にコードされたアミノ酸または修飾アミノ酸であってもよく；
ＡＡ2は、大きな親油Ｒ基を有するアミノ酸であり、当該Ｒ基は、１４〜２７個の非水素原子を有するとともに、好ましくは、２以上、例えば、２または３個の縮合または結合し得る環状基を含有し、これらの環状基は、典型的には、５または６個の非水素原子、好ましくは、６個の非水素原子を含み；
Ｘ、ＹおよびＺは上記で規定したとおりである。
【００５４】
さらに有用な化合物は、式（ＩＩＩ）および（ＩＶ）の化合物を含む：
ＡＡ2−ＡＡ1−ＡＡ1−Ｘ−Ｙ−Ｚ  （ＩＩＩ）
ＡＡ1−ＡＡ1−ＡＡ2−Ｘ−Ｙ−Ｚ  （ＩＶ）
ＡＡ1、ＡＡ2、Ｘ、ＹおよびＺは、上記で規定したとおりである。
【００５５】
上記化合物のうち、特定のものが好ましい。特に、本明細書中において便宜上ＡＡ2と呼ぶ上記大きな親油Ｒ基を有するアミノ酸がトリブチルトリプトファン（Ｔｂｔ）、またはＢｉｐ（４−（２−ナフチル））、Ｂｉｐ（４−（１−ナフチル））、Ｂｉｐ（４−ｎ−Ｂｕ）、Ｂｉｐ（４−Ｐｈ）もしくはＢｉｐ（４−Ｔ−Ｂｕ、）、等（Ｂｉｐ（４−（２−ナフチル））およびＴｂｔが最も好ましい）のビフェニルアラニン誘導体である化合物である。他の好適な化合物群は、Ｙが上記で規定した−Ｒa−Ｒb−であるものであり、好ましくは、ＲaおよびＲbは非置換であり、最も好ましくは、ＲaおよびＲbはともに炭素原子である。
【００５６】
さらに好適な化合物群は、−Ｘ−Ｙ−Ｚが全体として−ＮＨＣＨ2ＣＨ2Ｐｈ基のものである。
【００５７】
上記化合物は、ＤおよびＬアミノ酸と、アミノ酸のＲ基およびＹまたはＺ部分内のキラル中心から生じる鏡像異性体との両方の全ての鏡像異性体の形態を含む。
【００５８】
特に好適な化合物は以下のものである：
【００５９】
【化１】
2018008937.tif 000002
【００６０】
【化２】
2018008937.tif 000003
【００６１】
本発明に従って用いられる好適な分子のさらなる群は、式（Ｖ）の化合物、好ましくはペプチドである。
ＡＡ−ＡＡ−ＡＡ−Ｒ1−Ｒ2  （Ｖ）
ここで、任意の順で、上記ＡＡ（アミノ酸）部分の２つはカチオン性アミノ酸であり、好ましくは、リジンまたはアルギニンであるが、ヒスチジンまたはｐＨ７．０の正に帯電した任意の非遺伝的にコードされたアミノ酸もしくは修飾アミノ酸であってもよく、上記ＡＡの１つは、大きな親油Ｒ基を有するアミノ酸であり、当該Ｒ基は、１４〜２７個の非水素原子を有するとともに、好ましくは、２以上、例えば、２または３個の縮合または結合し得る環状基を含有し、これらの環状基は、典型的には、５または６個の非水素原子、好ましくは、６個の非水素原子を含み；
Ｒ1は、分岐鎖または非分岐鎖Ｃ1〜Ｃ10アルキルまたはアリール基、例えば、メチル、エチルまたはフェニルと置換されてもよいが、好ましくは、非置換のＮ原子であり、この基は、Ｎ、Ｏ、Ｓ、およびＦ（Ｆが最も優先度が低い）から選択されたヘテロ原子を最大で２個組み込んでもよく；
Ｒ2は、２〜２０個の非水素原子を有する脂肪族部分であり、好ましくは、これらは炭素原子であるが、酸素、窒素、または硫黄原子を組み込んでもよく、好ましくは、Ｒ2は、３〜１０、最も好ましくは、３〜６個の非水素原子を含み、上記部分は、直鎖、分岐鎖、または環状であってもよい。上記Ｒ2基が環状基を含む場合、これは、Ｒ1の窒素原子に直接固定されることが好ましい。
【００６２】
好適な化合物は、直鎖または分岐鎖のＲ2基、特に、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチルおよびその異性体、ヘキシルおよびその異性体を含む、直鎖または分岐鎖アルキル基を組み込み、プロピル、イソプロピル、ブチル、およびイソブチルは特に好適である。
環状基を含むＲ2基のうち、Ｒ2がシクロヘキシルまたはシクロペンチルである分子が好ましい。
【００６３】
カチオン性アミノ酸を提供し得る適切な非遺伝的にコードされたアミノ酸および修飾アミノ酸は、ホモリジン、オルニチン、ジアミノ酪酸、ジアミノピメリン酸、ジアミノプロピオン酸およびホモアルギニン、ならびにトリメチルリジンおよびトリメチルオルニチン、４−アミノピペリジン−４−カルボン酸、４−アミノ−１−カルバムイミドイルピペリジン−４−カルボン酸および４−グアニジノフェニルアラニン等のリジン、アルギニンおよびヒスチジンの類似体を含む。
【００６４】
上記大きな親油性Ｒ基は、Ｏ、Ｎ、ＳまたはＦ等のヘテロ原子を含有してもよいが、典型的には、ヘテロ原子はわずかに１つだけであり、好ましくは、窒素である。このＲ基は、好ましくは、極性基がわずかに２つだけであり、より好ましくは、０または１つ、最も好ましくは０個である。
【００６５】
特に好適な実施形態では、上記化合物（好ましくは、ペプチド）は、式（ＶＩ）のものである。
ＡＡ1−ＡＡ2−ＡＡ1−Ｒ1−Ｒ2  （ＶＩ）
ここで、
ＡＡ1は、カチオン性アミノ酸、好ましくは、リジンまたはアルギニンであるが、ヒスチジンまたはｐＨ７．０の正に帯電した任意の非遺伝的にコードされたアミノ酸もしくは修飾アミノ酸であってもよく；
ＡＡ2は、大きな親油Ｒ基を有するアミノ酸であり、当該Ｒ基は、１４〜２７個の非水素原子を有するとともに、好ましくは、２以上、例えば、２または３個の縮合または結合し得る環状基を含有し、これらの環状基は、典型的には、５または６個の非水素原子、好ましくは、６個の非水素原子を含み；
Ｒ1およびＲ2は上記で規定したとおりである。
【００６６】
さらに有用な化合物は、式（ＶＩＩ）および式（ＶＩＩＩ）の化合物を含む：
ＡＡ2−ＡＡ1−ＡＡ1−Ｒ1−Ｒ2  （ＶＩＩ）
ＡＡ1−ＡＡ1−ＡＡ2−Ｒ1−Ｒ2  （ＶＩＩＩ）
ここで、ＡＡ1、ＡＡ2、Ｒ1、およびＲ2は上記で規定したとおりである。
【００６７】
上記化合物のうち、特定のものが好ましい。特に、本明細書中において便宜上ＡＡ2と呼ぶ上記大きな親油Ｒ基を有するアミノ酸がトリブチルトリプトファン（Ｔｂｔ）、またはＰｈｅ（４−（２'−ナフチル））、Ｐｈｅ（４−（１'−ナフチル））、Ｐｈｅ（４'−ｎ−ブチルフェニル）、Ｐｈｅ（４−４'−ビフェニル）もしくはＰｈｅ（４'−ｔ−ブチルフェニル）等のビフェニルアラニン誘導体（Ｐｈｅ（４−（２'−ナフチル））およびＴｂｔが最も好ましい）である化合物である。
【００６８】
さらに好適な化合物群は、−Ｒ1−Ｒ2が全体として、−ＮＨＣＨ（ＣＨ3）2、−ＮＨ（ＣＨ2）5ＣＨ3、−ＮＨ（ＣＨ2）3ＣＨ3、−ＮＨ（ＣＨ2）2ＣＨ3、−ＮＨＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）2、−ＮＨシクロヘキシル、および−ＮＨシクロペンチルの群から選択されたものであり、−Ｒ1−Ｒ2が−ＮＨＣＨ（ＣＨ3）2基または−ＮＨ（ＣＨ2）5ＣＨ3基である化合物が最も好ましい。
【００６９】
上記化合物は、ＤおよびＬアミノ酸と、アミノ酸のＲ基およびＲ2内のキラル中心から生じる鏡像異性体との両方の全ての鏡像異性体の形態を含む。
【００７０】
特に好適な化合物は、下記表内の化合物、特に、化合物１および化合物２であり、上記化合物は、式ＶＩ、式ＶＩＩまたは式ＶＩＩＩ、好ましくは、式ＶＩ、特に、式がＡｒｇ−ＡＡ2−Ａｒｇ−Ｒ1−Ｒ2のものである。
【００７１】
【表１】
2018008937.tif 000004
【００７２】
上記では、カチオン性が２個と親油性が１個の３個のアミノ酸からなる好適なモチーフがより長いペプチドまたはペプチド模倣薬にどのようにして拡張または延長されるかを一般的な言葉で論じている。式（Ｉ）〜式（ＶＩＩＩ）の好適な化合物は、上述のように、特に、４または５個のアミノ酸からなるペプチドに拡張または延長してもよく、これらは、本発明に従って用いられるさらに好適な化合物群を表す。
【００７３】
ペプチド模倣薬は、典型的には、そのペプチド同等物の極性、３次元サイズ、および官能性（生物活性）を保つことを特徴とするが、上記ペプチド結合は、より安定した連鎖と置き換えられることが多い。「安定した」とは、加水分解酵素による酵素分解に対してより耐性があることを意味する。一般に、上記アミド結合（アミド結合サロゲート）と置き換わる結合は、アミド結合の特徴の多く、例えば、立体配座、立体的かさ高さ、静電特性、水素結合の可能性等を保存する。「ドラッグデザイン・アンド・ディベロップメント（Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）」、クログスガード（Ｋｒｏｇｓｇａａｒｄ）、ラーセン（Ｌａｒｓｅｎ）、リリェフォシュ（Ｌｉｌｊｅｆｏｒｓ）およびマドセン（Ｍａｄｓｅｎ）編、１９９６年、ホーウッド・アカデミック・パブリッシャーズ（Ｈｏｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄ．Ｐｕｂ）の１４章には、ペプチド模倣薬の設計および合成技術の一般的に論じられている。このケースでは、分子は、酵素の特定の活性部位ではなく膜と反応し、親和性および有効性または基質機能を正確に模倣することに関して記載された問題のいくつかは無関係であり、ペプチド模倣薬は、所与のペプチド構造または必要な官能基のモチーフに基づいて容易に調製可能である。適切なアミド結合サロゲートは以下を含む：Ｎ−アルキル化基（Ｒ．シュミットら（Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｒ．）著、「インターナショナル・ジャーナル・オブ・ペプチド・アンド・プロテイン・リサーチ（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．）」、１９９５年、第４６巻、ｐ．４７）、レトロインバースアミド（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｅ  ａｍｉｄｅ）基（Ｍ．ホレフ（Ｃｈｏｒｅｖ，Ｍ）およびＭ．グッドマン（Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｍ．）著、「アカウンツ・オブ・ケミカル・リサーチ（Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ）」、１９９３年、第２６巻、ｐ．２６６）、チオアミド基（Ｄ．Ｂ．シャーマン（Ｓｈｅｒｍａｎ  Ｄ．Ｂ．）およびＡ．Ｆ．スパトーラ（Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．）著、「ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）」、１９９０年、第１１２巻、ｐ．４３３）、チオエステル基、ホスホン酸塩基、ケトメチレン基（Ｒ．Ｖ．ホフマン（Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｒ．Ｖ．）およびＨ．Ｏ．キム（Ｋｉｍ，Ｈ．Ｏ．）著、「ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．）」、１９９５年、第６０巻、ｐ．５１０７）、ヒドロキシメチレン基、フルオロビニル基（Ｔ．アルメンディンガーら（Ａｌｌｍｅｎｄｉｎｇｅｒ，Ｔ．）著、「テトラハイドロンレターズ（Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．）」、１９９０年、第３１巻、ｐ．７２９７）、ビニル基、メチレンアミノ基（Ｙ．ササキ（Ｓａｓａｋｉ，Ｙ）およびＪ．アベ（Ａｂｅ  Ｊ．）著、「ケミカル・アンド・ファーマシューティカル・ブレティン（Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．）」、１９９７年、第４５巻、ｐ．１３）、メチレンチオ基（Ａ．Ｆ．スパトーラ（Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．）著、「メソッズ・ニューロサイ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ）」、１９９３年、第１３巻、ｐ．１９）、アルカン基（Ｓ．ラヴィ��ユら（Ｌａｖｉｅｌｌｅ，Ｓ．）、「インターナショナル・ジャーナル・オブ・ペプチド・アンド・プロテイン・リサーチ（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．）」、１９９３年、第４２巻、ｐ．２７０）、およびスルホンアミド基（Ｇ．ルイージら（Ｌｕｉｓｉ，Ｇ．）著、「テトラへドロンレターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．）」、１９９３年、第３４巻、ｐ．２３９１）。
【００７４】
本発明のペプチド模倣化合物は、典型的には、アミノ酸、好ましくは、カチオン性アミノ酸および親油アミノ酸と大きさおよび機能がほぼ同じである同定可能なサブユニットを有する。このように、本明細書では、「アミノ酸」という用語は、ペプチド模倣化合物の同等のサブユニットに言及する際に便宜的に用いられ得る。さらに、ペプチド模倣薬は、アミノ酸のＲ基と等価の基を有し得るものであり、本明細書中における適切なＲ基ならびにＮおよびＣ末端修飾基の説明は、必要な変更を加えることにより、ペプチド模倣化合物にも適用される。
【００７５】
上記で参照したテキストで説明されるように、アミド結合の置換に加えて、ペプチド模倣薬は、より大きな構造部分とジペプチド模倣薬構造またはトリペプチド模倣薬構造との置換も伴い得るが、この場合、アゾール由来模倣薬等のペプチド結合を伴う模倣薬部分は、ジペプチド置換として用いられ得る。
【００７６】
しかしながら、上述のようにアミド結合のみが置き換えられているペプチド模倣薬、ひいてはペプチド類似骨格は好ましい。
適切なペプチド模倣薬は、還元剤、例えば、ボラン、または水素化アルミニウムリチウム等のヒドリド試薬を用いた処理によりアミド結合がメチレンアミンに還元された還元ペプチドを含む。そのような還元には、分子の全体的なカチオン性を増大させるという利点がさらにある。
【００７７】
他のペプチド模倣薬は、例えば、アミド官能性ポリグリシンの段階的合成により形成されたペプトイドを含む。ペプチド類似骨格には、完全メチル化されたペプチド等、それらのペプチド前駆体から容易に入手可能なものがあり、適切な方法は、Ｊ．Ｍ．オストレッシュら（Ｏｓｔｒｅｓｈ，Ｊ．Ｍ．）著、「プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）」、（１９９４年）、第９１巻、ｐ．１１１３８−１１１４２に記載されている。強塩基性条件は、Ｏ−メチル化よりもＮ−メチル化に有利に働き、ペプチド結合の窒素原子およびＮ末端窒素のいくつかまたは全てがメチル化される。
【００７８】
好適なペプチド類似骨格は、ポリエステル、ポリアミン、およびそれらの誘導体、ならびに置換アルカンおよびアルケンを含む。上記ペプチド模倣薬は、好ましくは、本明細書中に記載されたように修飾され得るＮおよびＣ末端を有する。
【００７９】
βおよびγアミノ酸、ならびにαアミノ酸は、Ｎ−置換グリシンと同様に、「アミノ酸」という用語に含まれる。本発明の化合物は、βペプチドおよびデプシペプチドを含む。
【００８０】
医療用途の場合、上記ペプチドおよびペプチド模倣薬は、任意の便宜的形態で、または任意の便宜的手段で、例えば、局所経路、経口経路、非経口経路、経腸経路、非経口経路、または吸入により被験体に投与され得るが、局所経路、経口経路、または非経口経路が好ましい。
【００８１】
当業者は、当該分野で公知であるとともに、広く文献に記載された従来法のいずれかに従って、本発明の分子を、これらの投与経路に適合した医薬組成物に調合することができる。
【００８２】
活性成分は、必要に応じて、他の活性剤と、１つ以上の従来の担体、希釈剤、および／または賦形剤とともに組み込み、タブレット、丸薬、粉末（例えば、吸入用粉末）、トローチ剤、袋剤、カシェ剤、エリキシル剤、懸濁液、乳剤、溶液、シロップ剤、噴霧剤（固形としてまたは液状媒体中において）、軟膏、軟質および硬質ゼラチンカプセル、座薬、無菌注射液、無菌包装粉末等の従来のガレヌス製剤を製造するようにしてもよい。口腔面、頬面および歯の表面に対しては、具体的には、練り歯磨きおよび口内洗浄液が適用される。
【００８３】
適切な担体、賦形剤、および希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、不活性アルギネート、トラガカント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水シロップ剤、水、水／エタノール、水／グリコール、水／ポリエチレン、高張食塩水、グリコール、プロピレングリコール、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、鉱油、もしくはハードファット等の脂肪物質、またはそれらの適切な混合物がある。好適な賦形剤および希釈剤は、マンニトールおよび高張食塩水（生理食塩水）である。
【００８４】
該組成物は、滑剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、保存料、甘味料、香料等をさらに含んでいてもよい。
【００８５】
非経口で投与可能な形態、例えば静脈内注射用溶液は、無菌であるとともに、生理学的に許容不可能な薬剤が含まれていない形態とし、さらに投与時の刺激または他の悪影響を最小化するために低浸透圧とすべきであり、ひいては溶液は、等張またはわずかに高張である、例えば、高張食塩水（生理食塩水）であることが好ましい。適切なビヒクルには、塩化ナトリウム注射液、リンゲル液、デキストロース注射液、デキストロースおよび塩化ナトリウム注射液、乳酸加リンゲル液、ならびに「レミントンズ・ファーマシューティカル・サイエンシズ（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、第１５版、イーストン（Ｅａｓｔｏｎ）：マック・パブリッシング・カンパニー（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．）、ｐ．１４０５−１４１２、およびｐ．１４６１−１４８７（１９７５年）、ならびに「ザ・ナショナル・フォーミュラリー（Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ）ＸＩＶ」、第１４版、ワシントン（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）：アメリカン・ファーマシューティカル・アソシエーション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）、（１９７５年）に記載されるような他の溶液等の非経口溶液を投与するために習慣的に使用されている水性ビヒクルが含まれる。上記溶液は、生体高分子と適合するとともに、製品の製造、貯蔵、または使用を妨げない非経口溶液、賦形剤、および他の添加物に従来用いられる保存料、抗菌剤、緩衝液、および抗酸化剤を含有するようにすることができる。
【００８６】
局所投与のために、上記ペプチドまたはペプチド模倣薬を、クリーム、軟膏、ゲル、経皮パッチ等の中に組み込むことができる。上記分子は、医療用被覆材、例えば、創傷被覆材（例えば、織（例えば、布）被覆材、または不織被覆材（例えばゲル、またはゲル成分を有する被覆材））中に組み込むこともできる。
【００８７】
適切であると考えられるさらなる局所系は、例えば、固体、半固体、非晶質、または液体結晶ゲルマトリクスがｉｎ  ｓｉｔｕで形成されるとともに、当該マトリクスからの活性剤の放出を制御するように好都合に設計することができ、例えば、選択した一定期間にわたり放出を遅延および／または持続させることができるゲルのようなｉｎ  ｓｉｔｕ薬物送達システムである。そのような系は、生物学的組織または流体と接触しただけで、ゲルを形成し得る。典型的には、ゲルは生体接着性を有する。
【００８８】
無生物表面上のバイオフィルムの場合、上記ペプチドまたは模倣薬を、任意の便宜的組成物もしくは製剤で、または任意の便宜的手段により、治療すべき表面に塗布し得る。例えば、液体、ゲル、ゲル−ゾル、半固体、または固体の形態（例えば、溶液、懸濁液、ホモジネート、乳化液、ペースト、粉末、エアロゾル、蒸気）。典型的には、そのような無生物表面のバイオフィルムを治療する組成物は、薬学的に許容可能ではない組成物である。組成物の形態の選択は、バイオフィルム構造ならびにコロニーの組成および位置により影響される。例えば、バイオフィルムの位置が流体ラインである場合、流体組成物を適用することが好都合な場合がある。当業者は、その通常の一般知識により、適切な組成物を容易に調製することができる。
【００８９】
医療用途では、上記ペプチドまたは模倣薬は、５〜５００ｍｇ／ｌ、好ましくは、２０〜１００ｍｇ／ｌ、例えば、４０〜６０ｍｇ／ｌの濃度で好都合に投与され得る。
【００９０】
次に、以下の非限定的な実施例および図面を参照して本発明をさらに説明する。
【実施例１】
【００９１】
材料および方法
ペプチド合成
化学物質
保護アミノ酸Ｂｏｃ−Ａｒｇ−ＯＨおよびＢｏｃ−４−フェニル−Ｐｈｅをバッヘム・アーゲー（Ｂａｃｈｅｍ  ＡＧ）から購入し、Ｂｏｃ−４−ヨードフェニルアラニンをアルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）から購入した。ペプチドのＣ末端を構成するイソプロピルアミン、プロピルアミン、ヘキシルアミン、ブチルアミン、ヘキサデシルアミン、イソブチルアミン、シクロヘキシルアミン、およびシクロペンチルアミンをフルカ（Ｆｌｕｋａ）から購入した。ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（１−ＨＯＢｔ）、クロロトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＰｙＣｌｏＰ）、およびＯ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ）をフルカから購入した。４−ｎ−ブチルフェニルボロン酸、４−ｔ−ブチルフェニルボロン酸、４−ビフェニルボロン酸、２−ナフチルボロン酸、トリオルソ−トリルホスフィン、臭化ベンジル、および酢酸パラジウムをアルドリッチから購入した。溶剤をメルク（Ｍｅｒｃｋ）、リーデル・デ・ヘーン（Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅ  Ｈａｅｎ）、またはアルドリッチから購入した。
【００９２】
アミノ酸の調製
Ｂｏｃ−２，５，７−トリ−ｔｅｒｔ−ブチルトリプトファン−ＯＨの調製：Ｈ２Ｎ−Ｔｒｐ−ＯＨ（１．８ｇ、８．８ｍｍｏｌ）、ｔ−ＢｕＯＨ（４．７ｇ、６３．４ｍｍｏｌ）のトリフルオロ酢酸（１９ｍＬ）混合液を７０℃で３時間撹拌する。その結果得られた中間的な褐色系の半透明の溶液を室温で３０分間ロータリーエバポレーターにかけて還元させた後、６０ｍＬの７％（重量）ＮａＨＣＯ３を滴下して粉末にする。次いで、得られた灰色／白色粒状固体を真空ろ過により回収し、室温で２４時間かけて真空乾燥させる。生成物を結晶化により近沸点４０％エタノール混合水から分離する。体積は、典型的には、粗生成物１グラムあたり２０ｍＬ程度である。
【００９３】
粗生成物からの最初の結晶化により、サンプル中の他の全ての物質に対して純度８０〜８３％（ＨＰＬＣ）で、公知のＴＢＴ類似体に対して純度９４〜９５％程度の分離生成物を生成する。この段階での収量は６０〜６５％の範囲である。
【００９４】
Ｂｏｃ−４−ヨードフェニルアラニンのベンジル化。Ｂｏｃ−４−ヨードフェニルアラニン（１等量）を９０％メタノール水中に溶解し、弱アルカリ性ｐＨになるまで（リトマス紙により判定）炭酸セシウムを加えて中和した。溶剤を回転蒸発により除去し、Ｂｏｃ−４−ヨードフェニルアラニンのセシウム塩中の残留水分を、トルエンとの共沸蒸留を繰り返してさらに低減させた。その結果得られた乾燥塩をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解し、臭化ベンジル（１．２等量）を加え、その結果得られた混合物を６〜８時間撹拌した。反応の終わりに、ＤＭＦを減圧下で除去し、標記化合物を含有する油が形成される。この油を酢酸エチル中に溶解し、その結果得られた溶液を等量のクエン酸溶液（３回）、重炭酸ナトリウム溶液、および塩水で洗浄した。ジクロロメタン：酢酸エチル（９５：５）を溶離剤として用いて、標記化合物をフラッシュクロマトグラフィにより８５％の収率で淡黄色の油として分離した。結晶ベンジルＢｏｃ−４−ヨードフェニルアラニンをｎ−ヘプタンからの再結晶により得ることができた。
【００９５】
鈴木カップリングの基本手順：ベンジルＢｏｃ−４−ヨードフェニルアラニン（１等量）、アリールボロン酸（１．５等量）、炭酸ナトリウム（２等量）、酢酸パラジウム（０．０５等量）、およびトリオルソ−トリルホスフィン（０．１等量）を、ジメトキシエタン（６ｍｌ／ｍｍｏｌベンジルＢｏｃ−４−ヨードフェニルアラニン）と水（１ｍｌ／ｍｍｏｌベンジルＢｏｃ−４−ヨードフェニルアラニン）の脱気混合液に加えた。その反応混合液をアルゴン雰囲気下に保持し、８０℃まで４〜６時間かけて加熱した。室温まで冷却した後、当該混合液をシリカゲルと炭酸ナトリウムのショートパッドに通してろ過する。このろ過ケーキを酢酸エチルでさらに洗浄した。ろ液を混ぜて、その溶剤を減圧下で除去した。酢酸エチルとｎ−ヘキサンの混合物を溶離剤として用いて、フラッシュクロマトグラフィにより生成物を分離した。
【００９６】
Ｂｏｃ−Ｐｈｅ（４−４'−ビフェニル）−ＯＢｎの調製：鈴木カップリングの基本手順を用いて、４−ビフェニルボロン酸から６１％の収率で標記化合物を調製した。Ｂｏｃ−Ｐｈｅ（４−４'−ビフェニル）−ＯＢｎをｎ−ヘプタンからの粗生成物の再結晶により分離した。
【００９７】
Ｂｏｃ−Ｐｈｅ（４−（２'−ナフチル））−ＯＢｎの調製：鈴木カップリングの基本手順を用いて、２−ナフチルボロン酸から６８％の収率で標記化合物を調製した。Ｂｏｃ−Ｐｈｅ（４−（２'−ナフチル））−ＯＢｎをｎ−ヘプタンからの粗生成物の再結晶により分離した。
【００９８】
ベンジルエステル類の脱エステル化の基本手順：ベンジルエステルをＤＭＦ中に溶解し、１０％炭素上パラジウムを触媒として用いて、周囲圧力で２日間かけて水素化する。反応の最後に、その触媒をろ過により除去し、その溶剤を減圧下で除去する。ジエチルエーテルからの再結晶により遊離酸を分離する。
Ｂｏｃ−Ｐｈｅ（４−４'−ビフェニル）−ＯＨの調製：脱エステル化の基本手順を用いて、Ｂｏｃ−Ｐｈｅ（４−４'−ビフェニル）−ＯＢｎから６１％の収率で標記化合物を調製した。
【００９９】
Ｂｏｃ−Ｐｈｅ（４−（２'−ナフチル））−ＯＨの調製：脱エステル化の基本手順を用いて、Ｂｏｃ−Ｐｈｅ（４−（２−ナフチル））−ＯＢｎから６８％の収率で標記化合物を調製した。
【０１００】
ＨＢＴＵを用いた液相ペプチド合成の基本手順。下記の基本手順に従ったＢｏｃ保護戦略を用いて、段階的アミノ酸結合により溶液中で上記ペプチドを調製した。遊離アミノ基（１等量）およびＢｏｃ保護アミノ酸（１．０５等量）を有するＣ末端ペプチド部分ならびに１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（１−ＨＯＢｔ）（１．８等量）をＤＭＦ（２〜４ｍｌ／ｍｍｏｌアミノ成分）中に溶解した後、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（４．８等量）を加えた。この混合液を氷冷し、Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ）（１．２等量）を加えた。この反応混合液を周囲温度で１〜２時間振盪した。この反応混合液を酢酸エチルで希釈し、クエン酸、重炭酸ナトリウム、および塩水で洗浄した。溶剤を真空下で除去し、その結果得られたペプチドのＢｏｃ保護基を、９５％ＴＦＡまたは塩化アセチル無水メタノール溶液を用いて暗所で脱保護した。
【０１０１】
ＰｙＣｌｏＰを用いた液相アミド生成。Ｂｏｃ−Ａｒｇ−Ｎ（ＣＨ2Ｐｈ）2の合成。Ｂｏｃ−Ａｒｇ−ＯＨ（１等量）、ＮＨ（ＣＨ2Ｐｈ）2（１．１等量）、およびＰｙＣｌｏＰ（１等量）の乾燥ＤＣＭ（アルミナでろ過したもの）（２ｍｌ）とＤＭＦ（１ｍｌ）の溶液。この溶液を氷冷し、ＤＩＰＥＡ（２等量）を撹拌しながら加えた。その溶液を１時間室温で撹拌した。その反応混合液を蒸発させ、酢酸エチル中に再度溶解し、クエン酸、重炭酸ナトリウム、および塩水で洗浄した。上記溶剤を真空下で除去し、その結果得られたペプチドのＢｏｃ保護基を、９５％ＴＦＡを用いて暗所で脱保護した。
【０１０２】
ペプチド精製および分析。Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ（ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ））Ｃ18カラム（１００Å、１５μｍ、２５×１００ｍｍ）で逆相ＨＰＬＣを用い、水とアセトニトリル（ともに０．１％ＴＦＡを含有）の混合液を溶離剤として上記ペプチドを精製した。そのペプチドを、Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ（ウォーターズ）Ｃ18分析カラム（１００Å、５μｍ、３．９×１５０ｍｍ）でのＲＰ−ＨＰＬＣ、およびＶＧ  Ｑｕａｔｔｒｏ四重極質量分析計（ブイジー・インストゥルメンツ・インク（ＶＧ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．）、オルトリンガム（Ａｌｔｒｉｎｇｈａｍ）、英国（ＵＫ））での陽イオンエレクトロスプレー質量分析により分析した。
【０１０３】
菌株および成長条件
本研究において用いた６つのブドウ球菌株（２つの表皮ブドウ球菌、２つの溶血性連鎖球菌、および２つの黄色ブドウ球菌）は、それらの以前より公知のバイオフィルム形成能（表１）に基づいて選択した。
陽イオン調整ミューラーヒントンＩＩ液体培地（ＭＨＩＩＢ）で細菌を３７℃で一晩成長させた。
【０１０４】
【表２】
2018008937.tif 000005
【０１０５】
抗生物質、ＳＡＭＰ、およびプランクトン様成長条件下での感受性試験
我々は、Ｅ−ｔｅｓｔ（アーベー・バイオディスク（ＡＢ  Ｂｉｏｄｉｓｋ）、ソルナ（Ｓｏｌｎａ）、スウェーデン（Ｓｗｅｄｅｎ））を用いて、オキサシリン、ゲンタマイシン、テトラサイクリン、バンコマイシン、およびリネゾリドのＭＩＣを判定するとともに、微量液体希釈アッセイを用いてリファンピシンのＭＩＣを判定した。ブレイクポイントは、ＥＵＣＡＳＴの基準に従ってに解釈した。我々は、以前より公知の抗菌活性に基づいて３つの異なるＳＡＭＰ（化合物Ａ、Ｂ、およびＣ；リティクス・バイオファーマ（Ｌｙｔｉｘ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａ）、トロムソ（Ｔｒｏｍｓｏｅ）、ノルウェー（Ｎｏｒｗａｙ）、図１参照）選択し、微量液体希釈アッセイでそれらの正確なＭＩＣを判定した。３つのＳＡＭＰの全てがそれらのカチオン性部分を提供する２つのアルギニン残基を有するトリペプチドである（図１）。親油性バルクが修飾トリプトファン誘導体により提供される。上記化合物間の相違点は、Ｃ末端修飾の大きさであり、化合物Ａは、Ｃ末端修飾が最小であり、化合物Ｂは最大である（図１）。ＳＡＭＰの分子量は、７００〜８００ダルトンの範囲である。
【０１０６】
バイオフィルム形成およびバイオフィルムに対する活性の定量化
９６ウェル平底マイクロタイタープレート（ヌンクロン・サーフェス（Ｎｕｎｃｌｏｎ  Ｓｕｒｆａｃｅ）、ヌンク（ＮＵＮＣ）、ロスキレ（Ｒｏｓｋｉｌｄｅ）、デンマーク（Ｄｅｎｍａｒｋ））中でバイオフィルム形成を誘発した。まず、一晩培養物をＭＨＩＩＢ（表皮ブドウ球菌および溶血性連鎖球菌）またはトリプティックソイブロス（ＴＳＢ）において、５％ブドウ糖および５％ＮａＣｌ（黄色ブドウ球菌）で１：１００に希釈した。各ウェルにこの細菌懸濁液（１０7ｃｆｕ／ｍｌ）を２００μｌ加え、３７℃で２４時間かけて培養した。２４時間後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）でウェルを入念に２度洗浄してプランクトン様細菌を除去した。この洗浄手順を、下記で詳述するアラマーブルー法でＰＢＳの代謝活性を測定して評価した。ＤＮＡ抽出およびｉｃａオペロンのマーカーとしてのｉｃａＤのＰＣＲを、以前より報告されているように実施した（デ・シルバら（ｄｅ  Ｓｉｌｖａ）著、ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）、［２００２年］、第４０巻：ｐ．３８２−３８８）。洗浄したバイオフィルムを異なる濃度の抗生物質またはＳＡＭＰで処理した。テトラサイクリン（シグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、バンコマイシン（アルファーマ（Ａｌｐｈａｒｍａ））およびリネゾリド（ファイザー（Ｐｆｉｚｅｒ））の原液をＭＨＩＩＢで５ｍｇ／Ｌ、５０ｍｇ／Ｌ、および５００ｍｇ／Ｌに希釈し、リファンピシン（シグマ・アルドリッチ）をＭＨＩＩＢで０．０１ｍｇ／Ｌ、０．１ｍｇ／Ｌ、および１ｍｇ／Ｌに希釈した。上記ＳＡＭＰのトリフルオロ酢酸塩を滅菌水中に溶解し、ＭＨＩＩＢで５ｍｇ／Ｌ、５０ｍｇ／Ｌ、および５００ｍｇ／Ｌに希釈した。各ウェルに２００μｌの抗生物質またはＳＡＭＰを異なる濃度で加え、３７℃で２４時間かけて培養した。陽性対照は、２００μｌのＭＨＩＩＢのみを加えた未処理のバイオフィルムであった。陰性対照は、２００μｌのＭＨＩＩＢのみで、細菌は加えなかった。
【０１０７】
我々は、これまでにペティットら（Ｐｅｔｔｉｔ）により、「アンチマイクロバイアル・エージェンツ・アンド・ケモセラピー（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．）」、２００５年；第４９巻：ｐ．２６１２−７において記載された方法をわずかに変更してバイオフィルムの代謝活性を定量化した。簡潔に説明すると、上記ウェルをＰＢＳで２回洗浄した。次いで、我々は、２５０μｌのＭＨＩＩＢを５％アラマーブルー（ＡＢ；インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ）、カリフォルニア（ＣＡ）、米国（ＵＳＡ））とともに各ウェルに加えた。ＡＢは、化学還元に応じて蛍光を発するとともに変色する酸化還元指示薬である。還元の度合いは、細菌細胞生存性を反映する。３７℃での１時間の培養後、Ｖｅｒｓａｍａｘチューナブルマイクロプレートリーダー（モレキュラー・デバイス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）、サニーヴェール（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ）、カリフォルニア（ＣＡ）、米国（ＵＳＡ））を用いて５７０および６００ｎｍでの吸光度を記録した。全てのアッセイは８つの類似物を用いて３回行った。各回の最高値および最低値を分析から除外し、残りの１８個の値を平均した。
【０１０８】
この代謝活性を定量化するバイオフィルム法を９６ウェルマイクロタイタープレートにおける標準的な半定量的生物量の定量法と比較した。この実験のために、我々は、６つのブドウ球菌株全ての２４時間バイオフィルムを成長させ、上述したように、ＡＢを用いて代謝活性を分析した。２４時間バイオフィルム上の生物量の定量は、当該バイオフィルムをクリスタルバイオレット（ＣＶ）で染色して行った。染色後、各ウェルにエタノール：アセトン（７０：３０）を加えて、残りのクリスタルバイオレットをウェルの壁に沿って溶解した。次いで、分光光度計を用いて５７０ｎｍでの光学密度（ＯＤ：ｏｐｔｉｃａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ）を記録した。
【０１０９】
バイオフィルムの画像化
ＭＨＨＢで希釈した一晩培養物の１ｍｌアリコートを用いて溶血性連鎖球菌ＴＵＨ  ５１−０７バイオフィルムを２４ウェルディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ３０４７、ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ニュージャージー（ＮＪ）、米国（ＵＳＡ））中のプラスティックカバースライド（Ｔｈｅｒｍａｎｏｘ、片側を細胞培養処理、ヌンク、ロスキレ、デンマーク）上に２４時間かけて成長させた。次いで、このカバースライドをＰＢＳで入念に洗浄し、新たなプレートに移し、２４時間かけて５０ｍｇ／Ｌと５００ｍｇ／Ｌのテトラサイクリン、５０ｍｇ／Ｌと５００ｍｇ／Ｌのバンコマイシン、または５０ｍｇ／Ｌと５００ｍｇ／Ｌの化合物Ａで処理した。カバースライドを９％ＮａＣｌで再度洗浄し、製造者の使用説明書に従ってＬＩＶＥ／ＤＥＡＤキット（インビトロジェン・モレキュラー・プローブズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、ユージーン（Ｅｕｇｅｎｅ）、オレゴン（Ｏｒｅｇｏｎ）、米国（ＵＳＡ））で染色した。この染色剤は、ＳＹＴＯ９（緑色蛍光）およびヨウ化プロピジウム（ＰＩ；赤色蛍光）を含有し、これらはともにＤＮＡと結合する。単独で用いる場合、ＳＹＴＯ９は、一般に、個体群中の全ての細菌（膜が無傷のものと、膜が損傷しているものの両方）を染色する。対照的に、ＰＩは、膜が損傷した細菌だけに浸透し、両方の染料が存在する場合には、ＳＹＴＯ９染色剤の緑色蛍光を低減させる。我々は、処理したバイオフィルムおよび未処理のバイオフィルムをＬｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＰ５（ライカ・マイクロシステムズ・ツェーエムエス・ゲーエムベーハー（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＣＭＳ  Ｇｍｂｈ）、マンハイム（Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、ドイツ（Ｇｅｒｍａｎｙ））共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）で観察した。６３Ｘ  １．２  ＮＡ  ＨＣＸＰＬ  ＡＰＯ水浸レンズを用いて画像を得た。ＳＹＴＯ９（緑色チャネル）の検出のために、我々は、４８８ｎｍラインのアルゴンレーザーおよび４９５〜５１５ｎｍの検出帯域幅を用いた。ＰＩ検出（赤色チャネル）については、我々は、５６１ｎｍラインおよび６１５〜６６０ｎｍの検出帯域幅を用いた。これら２つの蛍光信号を４００Ｈｚで連続して採取した。Ｌｅｉｃａ  ＬＡＳ  ＡＦバージョン１．８．２を用いて画像の解析および出力を行った。
【０１１０】
統計的分析および評価
製造者の公式（インビトロジェン、カールズバッド、米国）に従ってＡＢの低減パーセントを計算した。我々は、反復測定全ての平均値および標準偏差（ＳＤ）を計算した。６つのブドウ球菌株全ての平均データに基づいてピアソンの両側相関をＡＢ法とＣＶ法（図２）間に関して計算した。ＳＰＳＳ  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓのソフトウェアバージョン１４．０を用いて統計的分析を行った。
【０１１１】
我々は、陽性および陰性対照を含む、ＡＢ低減に関する未加工のパーセント値を提示する（図３および図４）。我々は、代謝活性の２つのレベルの抗菌抑制を定義した。陰性対照について調整後の特定の濃度の薬剤がＡＢを陽性対照と比べて≧７５％低減させた場合に、強い抑制が得られた。特定の濃度の薬剤がＡＢを≦陰性対照の値＋２ＳＤ低減させた場合に、完全抑制が得られた。
【０１１２】
結果
上記表１は、抗生物質およびＳＡＭＰのＭＩＣをまとめたものである。６つの株全てがバンコマイシン、リネゾリド、リファンピシン、バンコマイシン、およびテトラサイクリンに対して感受性を示した。２つの黄色ブドウ球菌株は、ゲンタマイシンおよびオキサシリンに対して感受性を示したが、他の４つのブドウ球菌株はこれらの薬剤に耐性があった。ＳＡＭＰのＭＩＣは、一般に、抗生物質のＭＩＣより高かった。
ＣＶ染色で定量化した生物量と形成後２４時間のバイオフィルムにおけるＡＢ低減で定量化したバイオフィルム代謝活性（図２）との間には強い相関関係（Ｒ０．９３９、ｐ＝０．００２）があった。洗浄後のＰＢＳにおける代謝活性はごくわずかしかなく、プランクトン様細菌がウェルからほぼ完全に除去されたことを示す（データの記載なし）。
図３および図４は、未処理および処理済のバイオフィルムにおけるＡＢ低減のパーセンテージを示す。ほとんど例外なく、試験を行った抗生物質は、ＭＩＣ近傍の濃度で全ての株の代謝活性を低減させた。抗生物質濃度を高くする（概ね１０〜２０×ＭＩＣ）ことで、全ての抗生物質が黄色ブドウ球菌ＰＩＡ９を除いて代謝活性を強く抑制した。しかしながら、１つの株（黄色ブドウ球菌ＰＩＡ９０）における代謝活性を完全に抑制したのはテトラサイクリンだけであった。黄色ブドウ球菌ＰＩＡ９バイオフィルムにおいてＡＢを≧５０％低減した抗生物質はなかった。この株は、バンコマイシンに対して完全な耐性を持つバイオフィルムを生成したようであった。
【０１１３】
化合物Ａ、化合物Ｂ、および化合物Ｃは、５０ｍｇ／Ｌの濃度で、黄色ブドウ球菌ＰＩＡ９を除く全てのバイオフィルムにおける代謝活性を強くまたは完全に抑制した。いくつかの株では、５ｍｇ／Ｌの濃度でも十分に完全抑制がなされた。
図５は、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色を用いた溶血性連鎖球菌ＴＵＨ５１−０７バイオフィルムの共焦点顕微鏡写真を示す。予想どおり、未処理のバイオフィルムは、無傷の細胞膜を有する緑色の細胞を示した。５０ｍｇ／Ｌ、特には、５００ｍｇ／Ｌの濃度の化合物Ａで処理したバイオフィルムでは、ほぼ全ての細胞が赤色に染色され、細菌が死んでいることが示される。５００ｍｇ／Ｌテトラサイクリンで処理したバイオフィルムでは、細胞のかなりの部分がなお緑色であり、細胞膜が無傷である細菌が生きていることが示される。臨床診療で得られたピーク値近傍の濃度のバンコマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）を用いたバイオフィルムの処理（図５ｄ）では、大部分が緑色の細胞（生きた生物）が示された。
試験を行ったＳＡＭＰの全ては、抗生物質と比べて低い濃度で、ブドウ球菌バイオフィルムにおける代謝活性の低減に明らかにより効果的であったが、一般には、プランクトン様成長条件下ではＭＩＣが高かった。プランクトン様成長条件では、本研究に用いられた全ての株が、バンコマイシン、リネゾリド、リファンピシン、およびテトラサイクリンに対して感受性があった。ブドウ球菌バイオフィルム上のバンコマイシンは抗菌活性が低いことが以前より報告されている。我々の研究では、５０ｍｇ／Ｌのバンコマイシンは、試験を行った６株中４つにおいて成熟バイオフィルムにおける代謝活性に対して強い抑制力を発揮した。それでもなお、この濃度では多くの細菌が殺されなかったことがＣＬＳＭで確認された。一般に、抗生物質は、代謝活性を完全に抑制することはほとんどない。対照的に、ＳＡＭＰは、代謝活性を完全に抑制できることが多く、効果的に殺菌できることが示されている。ＣＬＳＭによって得られた画像は、この知見をさらに裏付けている。５００ｍｇ／Ｌの化合物Ａを用いた処理では、全ての細胞の膜が損傷し、溶血性連鎖球菌バイオフィルムにおける細胞溶解が示されている。５００ｍｇ／Ｌテトラサイクリンで処理したバイオフィルムは、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色で記録される、かなりの数の生きた細胞をなおも含有していたが、対応するバイオフィルムアッセイでは、測定可能な代謝活性はほとんどなかった。
【実施例２】
【０１１４】
ポリスチレン粒子のペプチド表面修飾
被覆粒子の調製
１．
２０ｍＬペプチド反応装置に、５６０ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）のアミノメチル化ポリスチレンＨＬ粒子（１００〜２００メッシュ、０．９０ｍｍｏｌ／ｇ置換）を加えた後、８ｍＬのＤＣＭで１０分間ずつ２回洗浄した。次いで、さらに８ｍＬのＤＣＭを加え、上記粒子を１時間かけて膨張させた後、最初の結合の前に反応装置の内部を排出した。
【０１１５】
２．
８ｍＬのＤＭＦに、３等量のＢｏｃアミノ酸および６８３ｍｇ（３．６等量）のＯ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチルウロニウム（ＨＢＴＵ）カップリング試薬を加えた。この混合液を反応装置に移す直前に、０．８５５ｍＬ（１０等量）のＮ−エチルジイソプロピルアミン（ＤＩＰＥＡ）を加え、その混合液を上記反応装置に一度で移した。次いで、反応装置を適度に掻き混ぜながら、一晩の間室温で反応を行った。
【０１１６】
３．
次いで、粒子を８ｍＬのＤＭＦで１５分間ずつ３回洗浄するとともに、８ｍＬのＤＣＭで１０分間ずつ２回洗浄した。
【０１１７】
４．
この時点で、小サンプルを反応装置から取り出し、結合していないアミンが残っていないかを判断するためにカイザーテストを行った。
【０１１８】
５．
カイザーテストの結果が陽性であった場合、上記ポイント２から、それを含む手順を同じアミノ酸で繰り返した。テストが陰性（結合していないアミンが残っていない）の場合には、８ｍＬのＴＦＡ／ＤＣＭ（１：１）を反応装置に加えて、新たに結合したアミノ酸からＢｏｃ基を除去し、反応装置を１時間適度に掻き混ぜた。
【０１１９】
６．
次いで、粒子を８ｍＬのＤＣＭで１５分ずつ３回洗浄するとともに、８ｍＬのＤＭＦで１０分ずつ２回洗浄した。
【０１２０】
７．
ここで、上記ポイント２からポイント６までを含む上記手順を次に結合すべきアミノ酸に対して繰り返した。
【０１２１】
８．
最後のアミノ酸単位が上記手順のステージ５を終えると、粒子を８ｍＬのＤＣＭで１５分ずつ４回洗浄し、反応装置内において窒素気流下で３０分間かけて乾燥させた後、真空下において室温で２４時間かけて乾燥させた。次いで、上記粒子を、密閉したバイアル内において４℃で貯蔵した。
上記の方法で、下記のペプチド被覆粒子をほぼ定量的収率で調製したが、これには以下の適切なアミノ酸を用いた：
アルギニニル−（２，５，７−トリ−ｔｅｒｔ−ブチル）トリプトファニル−アルギニニル−ポリスチレン（本発明に係るペプチド）
アルギニニル−（２，５，７−トリ−ｔｅｒｔ−ブチル）トリプトファニル−アルギニニル−アミノヘキサノイル−ポリスチレン（本発明に係るペプチド）
アルギニニル−（２，５，７−トリ−ｔｅｒｔ−ブチル）トリプトファニル−アルギニニル−フェニルアラニニル−ポリスチレン（本発明に係るペプチド）
アルギニニル−（２，５，７−トリ−ｔｅｒｔ−ブチル）トリプトファニル−アルギニニル−フェニルアラニニル−アミノヘキサノイル−ポリスチレン（本発明に係るペプチド）
表面被覆粒子の細菌コロニー形成の低減
表皮ブドウ球菌を用いて上記で調製した粒子を２４時間かけて培養した。標準的な手順に従ってＳｙｔｏ９によりバイオフィルムを形成する細菌を染色した後、細菌表面上の細菌コロニー形成量を蛍光顕微鏡法（励起周波数４８５ｎｍ、放射周波数４９８ｎｍ）により判定した。
【０１２２】
ポリスチレン粒子の顕微鏡写真を目視して、コロニー形成に対する効果を判定した。図６は、下記のものの顕微鏡写真を示す：
Ａ）非被覆アミノメチル化ポリスチレンＨＬ粒子
Ｂ）表皮ブドウ球菌との２４時間培養後の非被覆アミノメチル化ポリスチレンＨＬ粒子
Ｃ）表皮ブドウ球菌との２４時間培養後のアルギニニル−（２，５，７−トリ−ｔｅｒｔ−ブチル）トリプトファニル−アルギニニル−ポリスチレン粒子
Ｄ）表皮ブドウ球菌との２４時間培養後のアルギニニル−（２，５，７−トリ−ｔｅｒｔ−ブチル）トリプトファニル−アルギニニル−アミノヘキサノイル−ポリスチレン粒子
Ｅ）表皮ブドウ球菌との２４時間培養後のアルギニニル−（２，５，７−トリ−ｔｅｒｔ−ブチル）トリプトファニル−アルギニニル−フェニルアラニニル−ポリスチレン粒子
Ｆ）表皮ブドウ球菌との２４時間培養後のアルギニニル−（２，５，７−トリ−ｔｅｒｔ−ブチル）トリプトファニル−アルギニニル−フェニルアラニニル−アミノヘキサノイル−ポリスチレン粒子
図Ｂ）のポリスチレン粒子のバイオフィルムコロニー形成は、図Ａ）のポリスチレン粒子の滑らかな表面と比較して、粒子の表面がふわふわしたような線毛のようなもの（Ｆｌｕｆｆｙ）により容易に観察できる。図Ｃ）、図Ｄ）、図Ｅ）および図Ｆ）は、表皮ブドウ球菌によるコロニー形成に対する４つのペプチド被覆の効果を示す。アルギニニル−（２，５，７−トリ−ｔｅｒｔ−ブチル）トリプトファニル−アルギニニル（図Ｃ））、アルギニニル−（２，５，７−トリ−ｔｅｒｔ−ブチル）トリプトファニル−アルギニニル−アミノヘキサノイル（図Ｄ）、アルギニニル−（２，５，７−トリ−ｔｅｒｔ−ブチル）トリプトファニル−アルギニニル−フェニルアラニニル（図Ｅ））、およびアルギニニル−（２，５，７−トリ−ｔｅｒｔ−ブチル）トリプトファニル−アルギニニル−フェニルアラニニル−アミノヘキサノイル（図Ｆ））での被覆は、それぞれ、細菌コロニー形成を妨げることにより、バイオフィルム形成の予防に効果的であることが示されている。
【実施例３】
【０１２３】
バイオフィルム形成およびバイオフィルムに対する活性の定量化
９６ウェル平底マイクロタイタープレート（ヌンクロン・サーフェス、ヌンク）中でバイオフィルム形成を誘発した。まず、一晩培養物をＭＨＩＩＢ（表皮ブドウ球菌および溶血性連鎖球菌）またはトリプティックソイブロス（ＴＳＢ）において、５％ブドウ糖および５％ＮａＣｌ（黄色ブドウ球菌）で１：１００に希釈した。各ウェルにこの細菌懸濁液（１０７ｃｆｕ／ｍｌ）を２００ｍｌ加え、３７℃で２４時間かけて培養した。２４時間後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）でウェルを入念に２度洗浄してプランクトン様細菌を除去した。この洗浄手順を、下記で詳述するアラマーブルー法でＰＢＳの代謝活性を測定して評価した。
【０１２４】
洗浄したバイオフィルムを異なる濃度の上記化合物で処理した。それら化合物のトリフルオロ酢酸塩を滅菌水中に溶解し、ＭＨＩＩＢ中で５ｍｇ／Ｌ、５０ｍｇ／Ｌ、および５００ｍｇ／Ｌに希釈した。各ウェルに上記化合物２００μｌを異なる濃度で加え、３７℃で２４時間かけて培養した。陽性対照は、２００μｌのＭＨＩＩＢのみを加えた未処理のバイオフィルムであった。陰性対照は、２００μｌのＭＨＩＩＢのみで、細菌は加えなかった。
【０１２５】
これまでにペティットら（Ｐｅｔｔｉｔ）著、「アンチマイクロバイアル・エージェンツ・アンド・ケモセラピー（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．）」、２００５年；第４９巻：ｐ．２６１２−７に記載された方法をわずかに変更してバイオフィルムの代謝活性を定量化した。簡潔に説明すると、抗菌薬との培養の２４時間後に、上記ウェルを再度ＰＢＳで２回洗浄し、次いで、２５０ｍｌのＭＨＩＩＢを５％アラマーブルー（ＡＢ；バイオソース（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）、カマリロ（Ｃａｍａｒｉｌｌｏ）、カリフォルニア（ＣＡ）、米国（ＵＳＡ））とともに各ウェルに加えた。ＡＢは、化学還元に応じて蛍光を発するとともに変色する酸化還元指示薬である。還元の度合いは、細菌細胞生存性を反映する。３７℃での１時間の培養後、Ｖｅｒｓａｍａｘチューナブルマイクロプレートリーダー（モレキュラー・デバイス、サニーヴェール、カリフォルニア、米国）を用いて５７０および６００ｎｍでの吸光度を記録した。全てのアッセイは８つの類似物を用いて３回行った。各回の最高値および最低値を分析から除外し、残りの１８個の値を平均した。
【０１２６】
【表３】
2018008937.tif 000006
【０１２７】
【表４】
2018008937.tif 000007
【０１２８】
【表５】
2018008937.tif 000008
【０１２９】
【表６】
2018008937.tif 000009
【０１３０】
【表７】
2018008937.tif 000010
【図１】
2018008937.tif 000011
【図２】
2018008937.tif 000012
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年8月17日(2017.8.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）正味の正電荷を帯び、
ｂ）３〜６アミノ酸の長さであり、
ｃ）１つ以上の親油基を有する両親媒性の性質を持ち、該親油基の１つが少なくとも７個の非水素原子を含む、ペプチドを含むバイオフィルム関連感染症の治療に用いる医薬組成物。
【請求項２】
バイオフィルム関連感染症の治療薬の製造における、
ａ）正味の正電荷を帯び、
ｂ）３〜６アミノ酸の長さであり、
ｃ）１つ以上の親油基を有する両親媒性の性質を持ち、該親油基の１つが少なくとも７個の非水素原子を含む、ペプチドの使用。
【請求項３】
前記感染は、慢性創傷感染、自然弁心内膜炎、急性中耳炎、慢性細菌性前立腺炎、肺炎、歯垢、歯周炎、呼吸器疾患におけるバイオフィルム感染、または埋め込み型もしくは人工医療器具に関連した器具による感染である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記感染は、慢性創傷感染、自然弁心内膜炎、急性中耳炎、慢性細菌性前立腺炎、肺炎、歯垢、歯周炎、呼吸器疾患におけるバイオフィルム感染、または埋め込み型もしくは人工医療器具に関連した器具による感染である、請求項２に記載の使用。
【請求項５】
バイオフィルム形成を抑制するかまたはバイオフィルムを除去する方法であって、該バイオフィルムをペプチドに接触させる工程を包含し、該ペプチドは、
ａ）正味の正電荷を帯び、
ｂ）３〜６アミノ酸の長さであり、
ｃ）１つ以上の親油基を有する両親媒性の性質を持ち、該親油基の１つが少なくとも７個の非水素原子を含む、方法。
【請求項６】
前記バイオフィルムは医療器具上に存在する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ペプチドは少なくとも＋２の正味電荷を有する、請求項１または３に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記ペプチドは少なくとも＋２の正味電荷を有する、請求項２または４に記載の使用。
【請求項９】
前記ペプチドは少なくとも＋２の正味電荷を有する、請求項５または６に記載の方法。
【請求項１０】
前記ペプチドは３アミノ酸の長さであるか、または前記ペプチド模倣薬は同等の大きさである、請求項１、３および７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記ペプチドは３アミノ酸の長さであるか、または前記ペプチド模倣薬は同等の大きさである、請求項２、４、および８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１２】
前記ペプチドは３アミノ酸の長さであるか、または前記ペプチド模倣薬は同等の大きさである、請求項５、６、および９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記親油基は９〜１２個の非水素原子を有する、請求項１、３、７、および１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記親油基は９〜１２個の非水素原子を有する、請求項２、４、８、および１１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１５】
前記親油基は９〜１２個の非水素原子を有する、請求項５、６、９、および１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記親油基は、随意に芳香族となる環状基を含む、請求項１、３、７、１０、および１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記親油基は、随意に芳香族となる環状基を含む、請求項２、４、８、１１、および１４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１８】
前記親油基は、随意に芳香族となる環状基を含む、請求項５、６、９、１２、および１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記親油基は、随意に縮合される２つ以上の環状基を含む、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記親油基は、随意に縮合される２つ以上の環状基を含む、請求項１７に記載の使用。
【請求項２１】
前記親油基は、随意に縮合される２つ以上の環状基を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記親油基はアミノ酸のＲ基である、請求項１、３、７、１０、１３、１６、および１９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記親油基はアミノ酸のＲ基である、請求項２、４、８、１１、１４、１７、および２０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２４】
前記親油基はアミノ酸のＲ基である、請求項５、６、９、１２、１５、１８、および２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記アミノ酸は、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、トリブチルトリプトファン（Ｔｂｔ）、ビフェニルアラニン、ジフェニルアラニン、およびビフェニルアラニン誘導体を含む群から選択される、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
前記アミノ酸は、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、トリブチルトリプトファン（Ｔｂｔ）、ビフェニルアラニン、ジフェニルアラニン、およびビフェニルアラニン誘導体を含む群から選択される、請求項２３に記載の使用。
【請求項２７】
前記アミノ酸は、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、トリブチルトリプトファン（Ｔｂｔ）、ビフェニルアラニン、ジフェニルアラニン、およびビフェニルアラニン誘導体を含む群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記親油基は極性基を２つ以下含む、請求項１、３、７、１０、１３、１６、１９、２２、および２５のいずれか１つに記載の医薬組成物。
【請求項２９】
前記親油基は極性基を２つ以下含む、請求項２、４、８、１１、１４、１７、２０、２３、および２６のいずれか１つに記載の使用。
【請求項３０】
前記親油基は極性基を２つ以下含む、請求項５、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、および２７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３１】
前記親油基は極性基を含まない、請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
前記親油基は極性基を含まない、請求項２９に記載の使用。
【請求項３３】
前記親油基は極性基を含まない、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記ペプチドは３つのアミノ酸部分を含み、任意の順で、該アミノ酸部分の２つはカチオン性アミノ酸であり、該アミノ酸の１つは、親油Ｒ基を有するアミノ酸であり、該Ｒ基は、１４〜２７個の非水素原子を有する、請求項１、３、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８、および３１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
前記ペプチドは３つのアミノ酸部分を含み、任意の順で、該アミノ酸部分の２つはカチオン性アミノ酸であり、該アミノ酸の１つは、親油Ｒ基を有するアミノ酸であり、該Ｒ基は、１４〜２７個の非水素原子を有する、請求項２、４、８、１１、１４、１７、２０、２３、２６、２９、および３２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３６】
前記ペプチドは３つのアミノ酸部分を含み、任意の順で、該アミノ酸部分の２つはカチオン性アミノ酸であり、該アミノ酸の１つは、親油Ｒ基を有するアミノ酸であり、該Ｒ基は、１４〜２７個の非水素原子を有する、請求項５、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、および３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記ペプチドは下記式（Ｖ）を有し、
ＡＡ−ＡＡ−ＡＡ−Ｒ1−Ｒ2  （Ｖ）
任意の順で、該ＡＡ（アミノ酸）部分の２つはカチオン性アミノ酸であり、該ＡＡの１つは、親油Ｒ基を有するアミノ酸であり、該Ｒ基は、１４〜２７個の非水素原子を有し；
Ｒ1は、分岐鎖または非分岐鎖Ｃ1〜Ｃ10アルキルまたはアリール基と置換され得るＮ原子であり、該基は、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択されたヘテロ原子を最大で２個組み込んでもよく；
Ｒ2は、２〜２０個の非水素原子を有する脂肪族部分であり、該部分は、直鎖、分岐鎖、または環状である、請求項１、３、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８、３１、および３４のいずれか１つに記載の医薬組成物。
【請求項３８】
前記ペプチドは下記式（Ｖ）を有し、
ＡＡ−ＡＡ−ＡＡ−Ｒ1−Ｒ2  （Ｖ）
任意の順で、該ＡＡ（アミノ酸）部分の２つはカチオン性アミノ酸であり、該ＡＡの１つは、親油Ｒ基を有するアミノ酸であり、該Ｒ基は、１４〜２７個の非水素原子を有し；
Ｒ1は、分岐鎖または非分岐鎖Ｃ1〜Ｃ10アルキルまたはアリール基と置換され得るＮ原子であり、該基は、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択されたヘテロ原子を最大で２個組み込んでもよく；
Ｒ2は、２〜２０個の非水素原子を有する脂肪族部分であり、該部分は、直鎖、分岐鎖、または環状である、請求項２、４、８、１１、１４、１７、２０、２３、２６、２９、３２、および３５のいずれか１つに記載の使用。
【請求項３９】
前記ペプチドは下記式（Ｖ）を有し、
ＡＡ−ＡＡ−ＡＡ−Ｒ1−Ｒ2  （Ｖ）
任意の順で、該ＡＡ（アミノ酸）部分の２つはカチオン性アミノ酸であり、該ＡＡの１つは、親油Ｒ基を有するアミノ酸であり、該Ｒ基は、１４〜２７個の非水素原子を有し；
Ｒ1は、分岐鎖または非分岐鎖Ｃ1〜Ｃ10アルキルまたはアリール基と置換され得るＮ原子であり、該基は、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択されたヘテロ原子を最大で２個組み込んでもよく；
Ｒ2は、２〜２０個の非水素原子を有する脂肪族部分であり、該部分は、直鎖、分岐鎖、または環状である、請求項５、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、および３６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項４０】
前記バイオフィルムはグラム陽性細菌を含む、請求項１、３、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８、３１、３４、および３７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項４１】
前記バイオフィルムはグラム陽性細菌を含む、、請求項２、４、８、１１、１４、１７、２０、２３、２６、２９、３２、３５、および３８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４２】
前記バイオフィルムはグラム陽性細菌を含む、請求項５、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、および３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記グラム陽性細菌はブドウ球菌を含む、請求項４０に記載の医薬組成物。
【請求項４４】
前記ブドウ球菌は溶血性連鎖球菌である、請求項４３に記載の医薬組成物。
【請求項４５】
前記ペプチドまたはペプチド模倣薬は固形支持体に付着する、請求項１、３、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８、３１、３４、７、４０、４３、および４４のいずれか１つに記載の医薬組成物。
【請求項４６】
前記ペプチドまたはペプチド模倣薬は固形支持体に付着する、請求項２、４、８、１１、１４、１７、２０、２３、２６、２９、３２、３５、３８、および４１のいずれか１つに記載の使用。
【請求項４７】
前記ペプチドまたはペプチド模倣薬は固形支持体に付着する、請求項５、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、および４２のいずれか１つに記載の方法。