(57)【要約】【課題】製剤化工程および保存中における微生物の生存率が向上された、無芽胞菌を含む生菌製剤の製造方法を提供する。【解決手段】炭素数１４〜１８のモノ不飽和脂肪酸を含む培地で培養した無芽胞菌および水を含む付着液を、多孔質担体に付着させることを含む、生菌製剤の製造方法である。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭素数１４〜１８のモノ不飽和脂肪酸を含む培地で培養した無芽胞菌および水を含む付着液を、多孔質担体に付着させることを含む、生菌製剤の製造方法。
【請求項２】
前記モノ不飽和脂肪酸がオレイン酸である、請求項１に記載の生菌製剤の製造方法。
【請求項３】
前記培地が液体培地であり、前記モノ不飽和脂肪酸を、前記液体培地に対して、１０μｇ／ｍＬ以上含む、請求項１または２のいずれか１項に記載の生菌製剤の製造方法。
【請求項４】
前記付着液は、さらに、トレハロース、乳タンパク質、アミノ酸、および金属塩を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の生菌製剤の製造方法。
【請求項５】
前記アミノ酸がグリシンおよびその誘導体から選択される１種以上である、請求項４に記載の生菌製剤の製造方法。
【請求項６】
前記金属塩が、Ｎａ、Ｋ、ＭｇおよびＣａからなる群から選択される元素の、硫酸塩、炭酸塩、リン酸塩、またはそれらの組み合わせである、請求項４または５に記載の生菌製剤の製造方法。
【請求項７】
前記多孔質担体が、珪藻土である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の生菌製剤の製造方法。
【請求項８】
前記無芽胞菌が、酵母である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の生菌製剤の製造方法。
【請求項９】
前記無芽胞菌が、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である、請求項８に記載の生菌製剤の製造方法。
【請求項１０】
前記生菌製剤の製剤化が流動層造粒法によって行われる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の生菌製剤の製造方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の生菌製剤の製造方法で得られた生菌製剤を、油分を含む排水に接触させる工程を含み、
前記無芽胞菌として、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）を含む、排水処理方法。
【請求項１２】
無芽胞菌および水を含む付着液を多孔質担体に付着させてなる生菌製剤の保存安定性向上方法であって、
前記無芽胞菌を炭素数１４〜１８のモノ不飽和脂肪酸を含む培地で培養して得る、生菌製剤の保存安定性の向上方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生菌製剤の製造方法、ならびに生菌製剤およびこれを用いた排水処理方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生きた微生物を有効成分として含む製剤（生菌製剤）は、食品や医薬品分野のみならず、環境、農薬、公衆衛生など、産業界において広範囲で応用が検討されている。
【０００３】
生菌製剤の利用方法の一つとして、排水処理技術への応用が検討されており、一例としては、油分分解能を有する微生物のグリーストラップへの利用がある。厨房や食品工場などの施設において、油分を集積して上層部に浮上した油分を分離して廃棄するためのグリーストラップが敷設されている。グリーストラップに油分分解能を有する微生物を投入することにより、油分の分解・資化を行うことができる。これにより、固形化した油分がグリーストラップの水面にスカム（油の塊）として残留したり、グリーストラップの内壁面や配管内部に集積・付着して配管を閉塞したりすることを低コストで予防できる。このため、油分の酸化・腐敗による悪臭・害虫の発生の防止方法として期待されている。かような油分分解能を有する微生物の一つとして、特許文献１には、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）に属し、ｐＨ３．５〜１０．５の条件で、１％（ｗ／ｖ）の油分を２０時間で５０重量％以上低減する、微生物が開示されている。
【０００４】
生菌製剤に関する問題点として、製剤化工程や製品の保存中に微生物の生存率が低下するという技術的課題が存在していた。このような問題に対し、微生物農薬組成物中の芽胞を長期間安定して、生存した状態で保存する技術として、特許文献２には、バシルス・サチリス及び／又はバシルス・アミロリケファシエンスの生芽胞と金属酸化物、金属水酸化物、金属酸化物ケイ酸塩、金属水酸化物ケイ酸塩から選択される少なくとも１種以上を配合してなる微生物農薬組成物が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１５−１９２６１１号公報
【特許文献２】国際公開第２０１２／０６３８２４号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
芽胞を形成する微生物は、芽胞を利用することによって過酷な環境においても生存する能力に長けているため、優れた耐熱性や乾燥耐性などを示す。
【０００７】
しかしながら、特許文献１に記載されるような芽胞を形成しない微生物（無芽胞菌）の場合、芽胞を形成する微生物に比べて耐熱性や乾燥耐性に優れていないため、その後の保存期間中、特に高温条件下での保存期間中に生存率が顕著に低下する場合が存在していた。このため、特許文献２に記載されるような芽胞を形成する微生物向けの製剤化技術では、依然として保存中における、特に高温下での無芽胞菌の生存率を十分に高くできない場合が存在していた。
【０００８】
したがって、本発明は、上記事情を鑑みてなされたものであり、高温保存下における微生物の生存率が向上された、無芽胞菌を含む生菌製剤の製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記の問題を解決すべく鋭意研究を行った。その結果、炭素数１４〜１８のモノ不飽和脂肪酸を含む培地で培養した無芽胞菌および水を含む付着液を、多孔質担体に付着させることを含む、生菌製剤の製造方法とすることで上記課題が解決されることを見出し、本発明の完成に至った。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の製造方法によれば、生菌製剤が高温下にて保存された場合であっても無芽胞菌の生菌率が高いものとなる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、グリーストラップによる排水処理の仕組みを模式的に表す。
【図２】図２は、実施例１および比較例１、２における、４０℃または５０℃での保存期間中の生菌率を経時的に求めた結果を示す。
【図３】図３は、実施例１〜４における、４０℃または５０℃での保存期間中の生菌率を経時的に求めた結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の一実施形態は、炭素数１４〜１８のモノ不飽和脂肪酸を含む培地で培養した無芽胞菌および水を含む付着液を、多孔質担体に付着させることを含む、生菌製剤の製造方法である。本発明によれば、高温保存下における無芽胞菌の生菌率が向上された、無芽胞菌を含む生菌製剤の製造方法を提供することができる。本発明により上記のような効果が得られる詳細なメカニズムは依然として明確ではないが、以下のように推測される。炭素数１４〜１８のモノ不飽和脂肪酸が無芽胞菌内に取り込まれることで、細胞内にある炭素間二重結合の生成を触媒する酵素の働きがフィードバック阻害される。これにより、細胞膜を構成する脂肪酸に占める飽和脂肪酸の割合が高まる。その結果、細胞膜の流動性が低下し、膜の強度が高まったため、高温保存下での生菌率が向上したものと考えられる。
【００１３】
以下、本発明の実施の形態を説明する。なお、本発明は、以下の実施の形態のみには限定されない。また、図面の寸法比率は、説明の都合上誇張されており、実際の比率とは異なる場合がある。
【００１４】
本明細書において、範囲を示す「Ｘ〜Ｙ」は「Ｘ以上Ｙ以下」を意味する。また、特記しない限り、操作および物性等の測定は室温（２０〜２５℃）／相対湿度４０〜５０％ＲＨの条件で行う。
【００１５】
＜生菌製剤の製造方法＞
（１）無芽胞菌の培養
本実施形態では、無芽胞菌を炭素数１４〜１８のモノ不飽和脂肪酸を含む培地で培養する。
【００１６】
本発明においては種々の無芽胞菌（芽胞非形成菌）を用いることができる。本明細書における「無芽胞菌」には酵母、細菌、かび等が含まれ、例えば、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、キャンディダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｒａ）、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、リポマイセス属（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）、ロードトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒ
ｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、スフィンゴモナス属（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属、ウェイセラ属（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アクロモバクター属（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）、アセトバクター属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、アルスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アルカニボラックス属（Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｘ）、アルカリバクテリウム属（Ａｌｋａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ステノトロフォモナス属（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、リゾムコール属（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）、モルティエレラ属（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、リゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アエロモナス属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）等に属する無芽胞菌が例示できるが、これらに限定されない。無芽胞菌は１種を単独で、または２種以上を混合して用いることができる。本発明においては、無芽胞菌として酵母が好適に用いられる。
【００１７】
後述の排水処理方法に生菌製剤を用いる場合には、無芽胞菌としては、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、キャンディダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｒａ）、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、リポマイセス属（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）、ロードトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）等の酵母が好ましく用いられ、油分分解活性の高さから、ヤロウィア・リポリティカ  ＡＴＣＣ４８４３６、ヤロウィア・リポリティカ  ＮＢＲＣ１５４８、ヤロウィア・リポリティカ  ＬＭ０２−０１１（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０１８１３）、ヤロウィア・リポリティカ  ＮＢＲＣ０７４６、ヤロウィア・リポリティカ  ＮＢＲＣ１２０９のようなヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、ヤロウィア  ＹＨ−０１のようなヤロウィア  スピーシーズ（Ｙａｒｒｏｗｉａ
ｓｐ．）等のヤロウィア属の酵母であることがより好ましく、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）であることが好ましく、広範囲のｐＨ領域で高い油分分解活性を有するという観点から、ヤロウィア・リポリティカ  ＬＭ０２−０１１（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０１８１３）が特に好ましい。
【００１８】
本実施形態では、炭素数１４〜１８のモノ不飽和脂肪酸を含む培地で無芽胞菌を培養する。炭素数１４〜１８のモノ不飽和脂肪酸（以下、単にモノ不飽和脂肪酸とも称する）は、二重結合を１つ有する炭素数１４〜１８の脂肪酸を指す。炭素数１４〜１８のモノ不飽和脂肪酸のうち、炭素数１４〜１８のｃｉｓ型モノ不飽和脂肪酸であることが好ましい。炭素数１４〜１８のｃｉｓ型モノ不飽和脂肪酸としては、例えば、炭素数１４のｃｉｓ−９−モノ不飽和脂肪酸であるミリストレイン酸、炭素数１６のｃｉｓ−６−モノ不飽和脂肪酸であるサピエン酸、炭素数１６のｃｉｓ−９−モノ不飽和脂肪酸であるパルミトレイン酸、炭素数１８のｃｉｓ−９−モノ不飽和脂肪酸であるオレイン酸、炭素数１８のｃｉｓ−１１−モノ不飽和脂肪酸であるバクセン酸などが挙げられる。本発明の効果が一層奏されることから、モノ不飽和脂肪酸としては、炭素数１４〜１８のｃｉｓ型−９−モノ不飽和脂肪酸であることが好ましく、具体的には、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、
およびオレイン酸であることが好ましく、オレイン酸であることがより好ましい。炭素数１４〜１８のモノ不飽和脂肪酸は、１種単独でも２種以上併用してもよい。
【００１９】
培地中におけるモノ不飽和脂肪酸の含有量は、本発明の効果が一層奏されることから、液体培地の場合、１０μｇ／ｍＬ以上であることが好ましく、１５μｇ／ｍＬ以上であることがより好ましく、２０μｇ／ｍＬ以上であることがさらに好ましい。培地中におけるモノ不飽和脂肪酸の含有量の上限は特に制限されるものではないが、効果が飽和し、添加に見合った効果が得られなくなることから、１５０μｇ／ｍＬ以下であることが好ましく、１００μｇ／ｍＬ以下であることがより好ましい。
【００２０】
また、培地の他の成分としては、使用する微生物が資化しうる炭素源、適量の窒素源、無機塩及びその他の栄養素が挙げられる。
【００２１】
無芽胞菌の培養において使用できる炭素源としては、使用する菌株が資化できる炭素源であれば特に制限されない。具体的には、微生物の資化性を考慮して、グルコース、フラクトース、セロビオース、ラフィノース、キシロース、マルトース、ガラクトース、ソルボース、グルコサミン、リボース、アラビノース、ラムノース、スクロース、α−メチル−Ｄ−グルコシド、サリシン、メリビオース、ラクトース、メレジトース、イヌリン、エリスリトール、グルシトール、マンニトール、ガラクチトール、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、デンプン、デンプン加水分解物、糖蜜、廃糖蜜等の糖類、麦、米等の天然物、グリセロール、メタノール、エタノール等のアルコール類、酢酸、乳酸、コハク酸、グルコン酸、ピルピン酸、クエン酸等の有機酸類、ヘキサデカン等の炭化水素などが挙げられる。中でも、炭素源としては、グルコースであることが好ましい。上記炭素源は、培養する無芽胞菌による資化性を考慮して適宜選択される。また、上記炭素源は１種単独で用いてもよいし、２種以上併用してもよい。
【００２２】
また、無芽胞菌の培養において使用できる窒素源としては、肉エキス、ペプトン、ポリペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、大豆加水分解物、大豆粉末、カゼイン、ミルクカゼイン、カザミノ酸、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸等の各種アミノ酸、コーンスティープリカー、その他の動物、植物、微生物の加水分解物等の有機窒素源；アンモニア、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムなどのアンモニウム塩、硝酸ナトリウムなどの硝酸塩、亜硝酸ナトリウムなどの亜硝酸塩、尿素等の無機窒素源などが挙げられる。上記窒素源は、培養する無芽胞菌による資化性を考慮して適宜選択される。中でも、窒素源は、酵母エキス、麦芽エキス、および硝酸ナトリウムからなる群から選択される少なくとも１種であることがより好ましい。また、上記窒素源は１種単独で用いてもよいし、２種以上併用してもよい。
【００２３】
無芽胞菌の培養に使用できる無機物としては、マグネシウム、マンガン、カルシウム、ナトリウム、カリウム、銅、鉄及び亜鉛などの、リン酸塩、塩酸塩、硫酸塩、酢酸塩、炭酸塩、重炭酸塩、塩化物等のハロゲン化物などが挙げられる。上記無機物は、培養する無芽胞菌による資化性を考慮して適宜選択される。また、上記無機物を１種または２種以上選択して使用することができる。また、培養中に発泡が生じる場合には、公知の各種消泡剤を適宜培地中に添加することもできる。
【００２４】
培地は、固体または液体培地のいずれでもよく、また、使用する無芽胞菌が資化しうる炭素源、適量の窒素源、無機塩及びその他の栄養素を含有する培地であれば、合成培地または天然培地のいずれでもよい。
【００２５】
無芽胞菌の培養条件は、当該無芽胞菌が生育・増殖できるものであれば、いずれのものであってよく、通常の方法によって行える。
【００２６】
無芽胞菌の種類によって、好気的条件下または嫌気的条件下で、無芽胞菌を培養する。前者の場合には、振とう培養または通気攪拌などによって行われる。通気攪拌培養の場合、通気の量は、培養の容量と時間、および菌の初発濃度を考慮して、適宜決定することができる。例えば、通気は０．２〜２ｖｖｍ（Ｖｏｌｕｍｅ  ｐｅｒ  ｖｏｌｕｍｅ  ｐｅｒ  ｍｉｎｕｔｓ）程度で行われる。また、攪拌は５０〜８００ｒｐｍ程度で行なうことができる。
【００２７】
また、無芽胞菌を培養をするにあたって、寒天培地等の固体培地に斜面培養したものを直接培養用の培地に植菌して、培養を行なってもよい（場合によっては、種培養と区別するために「本培養」とも記載する）が、無芽胞菌を予め液体培地で培養（種培養）したものを、さらに培養（本培養）してもよい。この際、種培養の培地についても、炭素数１４〜１８のモノ不飽和脂肪酸を含む培地を用いることが好ましい。
【００２８】
また、培養温度は、好ましくは１５〜４０℃、より好ましくは２５〜３５℃である。また、培養に適当な培地のｐＨは、好ましくは３〜１１、より好ましくは３．５〜１０．５であり、さらに好ましくは、４．０〜８．０である。特に、工業的に培養物を量産する場合には、培地中のｐＨを定期的に測定し、ｐＨ４．０〜８．０に維持するよう調整することが好ましい。培養時間は、無芽胞菌が十分に増殖するまで行えばよいが、例えば、本培養で通常０．５〜５日であり、好ましくは１〜５日である。
【００２９】
無芽胞菌を連続的にまたはバッチで培養することができる。
【００３０】
なお、無芽胞菌を湿菌体として付着液に用いてもよいし、凍結乾燥やスプレードライ等により乾燥した乾燥菌体として付着液に用いてもよいが、後述する各微生物保護剤の添加量は、無芽胞菌を乾燥菌体に換算した量に対する値である。乾燥菌体に換算した量とは、菌体を乾燥させた後の重量を意味する。乾燥後の菌体重量を求める方法では、例えば、まず、酵母の培養物を遠心分離処理することにより、菌体を沈殿として回収する。回収した菌体を遠心分離操作により２回水洗した後、１０５℃で５時間乾燥させた後の重量を測定することにより、乾燥菌体重量を求めることができる。
【００３１】
培養物から無芽胞菌を回収する方法は、特に限定されるものではなく、培養物から無芽胞菌を回収する場合に通常行なわれている回収方法のいずれを用いてもよい。培養物から無芽胞菌を回収する方法として、例えば、培養物を遠心分離処理する方法等が挙げられる。
【００３２】
（２）付着液
本実施形態では、付着液が上記培地で培養された無芽胞菌および水を含む。付着液は多孔質担体に付着される液を指し、好適には噴霧液である。
【００３３】
上記培地で培養された無芽胞菌を付着液として用いることで、得られる生菌製剤の高温での保存安定性が顕著に向上する。
【００３４】
付着液が含む水は、水道水、蒸留水、イオン交換水、純水、超純水など、いずれを使用してもよいが、不純物の少ない蒸留水、イオン交換水、純水、または超純水を用いることが好ましい。メタノール、エタノール、プロパノール等の低級アルコールや、アセトンなどの極性溶媒を、本発明の目的効果が損なわれない程度において水に添加した混合液を用いてもよい。
【００３５】
付着液中の無芽胞菌の量は特に制限されないが、例えば、付着液中に乾燥菌体として１
〜２０重量％となる量であり、好ましくは５〜１５重量％となる量である。
【００３６】
付着液は好適には、トレハロース、乳タンパク質、アミノ酸、および金属塩を含む。付着液に存在するトレハロース、乳タンパク質、アミノ酸、および金属塩が無芽胞菌の安定化剤として製剤化工程における無芽胞菌に対するダメージを軽減するため、製剤化工程における生存率を高く維持することができる。本明細書において、トレハロース、乳タンパク質、アミノ酸、および金属塩をまとめて微生物保護剤とも称する。
【００３７】
付着液中のトレハロースの量は、乾燥菌体として１重量部の無芽胞菌に対して、０．８重量部以上１．５重量部未満であることが好ましい。付着液中のトレハロースの量が上記範囲内にあることで、製造化工程直後および生菌製剤の保存期間中の微生物の生存率が向上する。微生物の製剤化工程後における生存率と保存期間中の生存率とのさらなる好適なバランスの観点から、付着液中のトレハロース含有量は、乾燥菌体換算で１重量部の無芽胞菌に対して、好ましくは０．９重量部を超えて１．５重量部未満であり、より好ましくは１重量部以上１．４重量部以下である。
【００３８】
なお、本発明においては、トレハロース以外の二糖類、たとえばスクロース、ラクトース、マルトース等のトレハロース以外の二糖類を、１種単独でまたは２種以上を混合して、トレハロースと併用してもよい。この場合、トレハロース以外の二糖類の含有量は、乾燥菌体として１重量部の無芽胞菌に対して、例えば０．０１重量部以上０．８重量部未満であり、好ましくは０．１重量部以上０．５重量部以下である。
【００３９】
乳タンパク質としては特に制限されず、従来公知の各種の乳タンパク質を含む材料を用いることができる。全脂粉乳のような乳脂肪分の多い原料を用いることもできるが、グリーストラップで使用するような油脂分解用生菌製剤を製造する場合は、製剤中の油分は少ない方が好ましいので、例えば、好ましい具体例としては、カゼイン、カゼインナトリウム、ホエイ、濃縮ホエイ、ホエイタンパク質濃縮物（ＷＰＣ）、ホエイタンパク質分離物（ＷＰＩ）、ホエイパウダー、スキムミルク、乳タンパク濃縮物（ＭＰＣ）、脱脂粉乳、α−ラクトアルブミン、β−ラクトグロブリン等が例示でき、これらを１種単独でまたは２種以上を混合して用いることができる。乳タンパク質原料としてスキムミルクや脱脂粉乳のようなラクトースを含む材料を用いることで、二糖類としてラクトースを付着液に添加する原料としても使用できる。
【００４０】
付着液中の乳タンパク質の含有量は、本発明の所望の効果が達成される限りにおいて、特に制限されない。製剤化工程における微生物の生存率の観点から、好ましくは、付着液が、乾燥菌体として１重量部の前記無芽胞菌に対して、０．０１〜５重量部の乳タンパク質を含み、より好ましくは０．０２〜１重量部の乳タンパク質を含み、更に好ましくは０．０５〜０．５重量部の乳タンパク質を含む。
【００４１】
アミノ酸は、例えばグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、リジン、セリン、スレオニン、メチオニン、トリプトファン、ヒスチジン、アルギン、プロリン、チロシン、およびこれらの誘導体が例示できる。付着液がアミノ酸を含むことにより、製剤化工程における微生物の生存率が向上する。アミノ酸の誘導体としては、アミノ酸の塩（例えば、カリウム塩、ナトリウム塩）、エステル体、水和物、溶媒和物等が例示できる。上記のアミノ酸は、１種を単独で、または２種以上を混合して用いることができる。上記のうち、製剤化工程における微生物の生存率の観点から、アミノ酸はグリシン、アラニン、およびこれらの誘導体からなる群から選択される１種以上であることが好ましく、グリシンおよびその誘導体から選択される１種以上であることが更に好ましい。
【００４２】
付着液中のアミノ酸の含有量は、本発明の所望の効果が達成される限りにおいて、特に制限されない。製剤化工程における微生物の生存率の観点から、好ましくは、付着液が、乾燥菌体として１重量部の前記無芽胞菌に対して、０．０３〜１０重量部のアミノ酸を含み、より好ましくは０．１〜５重量部のアミノ酸を含み、さらに好ましくは０．１〜３重量部のアミノ酸を含む。なお、付着液が２種以上のアミノ酸を含む場合、上記数値は、２種以上の合計量を示す。
【００４３】
金属塩は、例えばナトリウム（Ｎａ）、カリウム（Ｋ）、マグネシウム（Ｍｇ）、カルシウム（Ｃａ）、マンガン（Ｍｎ）、鉄（Ｆｅ）、ニッケル（Ｎｉ）、亜鉛（Ｚｎ）、銅（Ｃｕ）などの金属元素の、硫酸塩、亜硫酸塩、次亜硫酸塩、過硫酸塩、チオ硫酸塩、炭酸塩、リン酸塩、ピロリン酸、塩酸塩、硝酸塩、亜硝酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、ハロゲン化物（たとえば、フッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物）等が例示できるが、これらに限定されない。製剤化工程における付着液に金属塩を存在させることで、好適なトレハロースの含有量である０．８重量部以上１．５重量部未満としても、保存期間中における微生物の生存率の低下を防止し得る。金属塩は、より具体的には、例えば、硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、次亜硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、過硫酸ナトリウム、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸三ナトリウム、酢酸ナトリウム、硝酸ナトリウム、亜硝酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、シュウ酸ナトリウム、塩化ナトリウム、硫酸カリウム、亜硫酸カリウム、次亜硫酸カリウム、チオ硫酸カリウム、炭酸カリウム、過硫酸カリウム、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、リン酸三カリウム、酢酸カリウム、硝酸カリウム、亜硝酸カリウム、酢酸カリウム、クエン酸カリウム、シュウ酸カリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、亜硫酸マグネシウム、チオ硫酸マグネシウム、炭酸マグネシウム、第一リン酸マグネシウム、第二リン酸マグネシウム、第三リン酸マグネシウム、ピロリン酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、亜硝酸マグネシウム、酢酸マグネシウム、クエン酸マグネシウム、シュウ酸マグネシウム、塩化マグネシウム、硫酸カルシウム、亜硫酸カルシウム、チオ硫酸カルシウム、炭酸カルシウム、硝酸カルシウム、亜硝酸カルシウム、酢酸カルシウム、クエン酸カルシウム、シュウ酸カルシウム、塩化カルシウム等が例示できる。上記の金属塩は、１種を単独で、または２種以上を混合して用いることができる。
【００４４】
保存期間中における微生物の生存率が特に優れるという観点から、金属塩が、Ｎａ、Ｋ、ＭｇおよびＣａからなる群から選択される元素の、硫酸塩、炭酸塩、リン酸塩、またはそれらの組み合わせであることが好ましく、Ｍｇおよび／またはＣａの硫酸塩であることがより好ましい。なお、上記の「金属塩」には、金属塩の水和物や溶媒和物も含まれる。
【００４５】
付着液中の金属塩の含有量は、本発明の所望の効果が達成される限りにおいて、特に制限されない。保存期間中における微生物の生存率の観点から、好ましくは、付着液が、乾燥菌体として１重量部の前記無芽胞菌に対して、０．０２〜１０重量部の金属塩を含み、より好ましくは０．０５〜１．５重量部の金属塩を含み、更に好ましくは０．１〜１重量部の金属塩を含む。なお、付着液が２種以上の金属塩を含む場合、上記数値は、２種以上の合計量を示す。
【００４６】
付着液には、上記の各成分のほか、本発明の目的効果が阻害されない範囲において、任意に、例えばグルコース、フルクトース等の単糖類；スクロース、ラクトース、マルトース等のトレハロース以外の二糖類；シクロデキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、結晶セルロース、コーンスターチ等の多糖類；大豆タンパク等のタンパク質；大豆ペプチド、ゼラチン、ペプトン、トリプトン等のタンパク加水分解物やペプチド；大豆油、菜種油、パーム油、ゴマ油、オリーブ油等の油脂；アスコルビン酸やその塩、トコフェロール等のビタミン類
；ポリグリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル等の界面活性剤；ポリエチエレングリコール、グリセリンなどを添加してもよい。
【００４７】
付着液の固形分量は、多孔質担体への付着が可能であれば特に制限されないが、生産性等の観点から、付着液全体中の例えば３〜７０重量％であり、好ましくは２０〜５０重量％である。付着液の調製方法も特に制限されず、上記した付着液に含まれる各成分を水に添加し、必要に応じて撹拌して調製する。
【００４８】
（３）多孔質担体
本実施形態では無芽胞菌の担体として多孔質担体を用い、これに直接無芽胞菌を付着させている。これにより、製剤化後及び保存中の含水率が微生物にとって最適な値となるため、微生物の生存率が向上するものと考えられる。
【００４９】
本発明においては、有機または無機の多孔質担体を広く利用することができる。多孔質担体に上記のような無芽胞菌を含む付着液を付着させると、多孔質担体を用いない場合や、多孔質以外の担体に付着させた場合と比較して、製剤化工程後の微生物の生存率を向上させることができる。ここで、付着させるとは、付着液を多孔質担体に噴霧する形態；付着液を多孔質担体に浸漬する形態などが挙げられる。好適には、無芽胞菌および水を含む噴霧液を、多孔質担体に噴霧する。
【００５０】
本発明において用いられうる多孔質担体の材料としては、特に制限されるものではないが、例えば、珪藻土、パーライト、バーミキュライト、タルク、クレー、ゼオライト、ベントナイト、カオリン、炭酸カルシウム、活性白土、二酸化チタン、珪砂、軽石、活性炭、カーボンブラック、グラファイト、ポリ乳酸、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル等が例示できるが、これらに限定されない。製剤化工程後の微生物の生存率の観点から、多孔質担体としては、珪藻土、および活性炭からなる群から選択されることが好ましく、珪藻土であることがより好ましい。
【００５１】
なお、本明細書において「多孔質」とは、担体の表面に多数の小さな気泡状の空隙を有する状態をいう。好ましくは、多孔質担体の嵩密度（タッピング嵩密度）が０．０１〜２ｇ／ｍｌである。上記のような嵩密度の多孔質担体を用いることにより、製剤化工程後の微生物の生存率をより一層向上できる。多孔質担体の嵩密度は、より好ましくは０．０５〜１．５ｇ／ｍｌであり、更に好ましくは０．２〜１ｇ／ｍｌである。なお、上記の嵩密度は、タッピング嵩密度測定法により測定した値である。
【００５２】
製剤化工程後の微生物の生存率の観点から、担体は、平均粒径（直径、体積基準）が１〜３００μｍの粒子状であることが好ましく、平均粒径（直径、体積基準）が１０〜２００μｍの粒子状であることがより好ましく、３０〜１５０μｍであることが更に好ましい。なお、担体の粒径は、レーザー回折法にて測定した値である。
【００５３】
上記の多孔質担体に対して、上述した無芽胞菌と場合により微生物保護剤とを含む付着液を付着させて製剤化する。
【００５４】
好適な形態である多孔質担体への噴霧液の噴霧は、流動層造粒機を用いて行うことが好ましい。すなわち、本発明の一実施形態では、生菌製剤の製剤化が流動層造粒法によって行われる。流動層造粒法により製剤化することにより、無芽胞菌と微生物保護剤とを含む無芽胞菌含有層を比較的低温で多孔質担体上に形成することができる。このため、製剤化工程における生存率の向上の観点から有利である。また、流動層造粒法により製剤化することにより、上記の無芽胞菌含有層を均一に多孔質担体上に形成することができる、という点においても有利である。
【００５５】
多孔質担体に対する噴霧液の噴霧量は任意に設定でき、特に制限されるものではないが、１重量部の多孔質担体に対して、噴霧液の固形分として、例えば、０．１〜１０重量部となる割合であり、好ましくは０．５〜５重量部となる割合である。
【００５６】
噴霧液は、通常は５０〜３００ｇ／分程度の速度で多孔質担体へ噴霧される。
【００５７】
流動層造粒法により製剤化する場合は、温風の温度は微生物の耐熱性等を考慮して適宜設定すればよいが、例えば、入口温度３０〜６０℃であり、好ましくは３５〜５０℃である。流動層の温度も微生物の耐熱性等を考慮して適宜設定すればよいが、例えば、温度３０〜６０℃であり、好ましくは３５〜５０℃である。噴霧後、噴霧液を噴霧した多孔質担体を流動層造粒機内でそのまま乾燥してもよいし、別途乾燥機で乾燥してもよい。
【００５８】
粉末化した生菌製剤は、用途に応じて、公知のコーティング剤で表面の一部または全部を被覆してもよい。また、滑沢剤（例えば、タルク、マイカ、シリカ、ステアリン酸マグネシウム）、乾燥剤（酸化カルシウム、シリカゲル）、フィラーなどの粉末を、任意の割合で生菌製剤と混合し、混合製剤としてもよい。また、所望の粒度となるように製剤を粉砕したり、分級をしたりしてもよい。
【００５９】
保存期間中の微生物の生存率の観点から、製剤化後の生菌製剤の水分含量は、３〜８重量％であることが好ましく、４．５〜７．５重量％であることがより好ましい。
【００６０】
＜排水処理方法＞
本発明の第二の実施形態は、第一実施形態の製造方法で得られた生菌製剤を、油分を含む排水に接触させる工程を含み、生菌製剤中の無芽胞菌として、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）を含む、排水処理方法に関する。ヤロウィア属の酵母は油分分解活性が高い油分分解性微生物であるため、排水処理用の生菌製剤に含まれる無芽胞菌として適している。以下、図１を参酌しながら、本側面に係る排水処理方法についてより詳細に説明する。なお、本発明の排水処理方法が、図１に限定されるものではない。
【００６１】
図１は、グリーストラップ１０による排水処理（廃水処理）の仕組みを模式的に表している。本発明に係る方法において、上記の生菌製剤は、グリーストラップ１０に排出する前の排水にあらかじめ添加されていても良いが、典型的には、排水処理槽１中の排水へ添加される。但し、本発明に係る排水処理方法は、上記生菌製剤と油分含有排水とを接触させることができる限り特に限定されない。
【００６２】
グリーストラップ１０は、埋設式、可動式など、設置形態は特に制限されない。埋設式の場合、例えば厨房や食品加工場において、排水路に流出した排水が残渣受け３に注ぎ込まれるように、グリーストラップ１０を埋設する。可動式の場合、例えば、シンクの排水溝の下部に残渣受け３が位置するようにグリーストラップ１０を設置する。
【００６３】
図１において、排水は、矢印の方向へ流れる。なお、グリーストラップ１０への排水の投入は、回分式であっても連続式であっても良い。油分含有排水は、残渣受け３を通じて排水処理槽１へと流れ込む。このとき、生ゴミ等の残渣の全部または一部は残渣受け３で捕集されるが、大部分の油分は残渣受け３を通過して排水処理槽１へと流入する。排水処理槽１へ流入した油分６は水面５へ向かって浮上し、仕切り板２ａと２ｃとで仕切られた空間に集まる。従って、油分分解性微生物を含む生菌製剤を排水に加えない場合、仕切り板２ａと２ｃとで仕切られた空間で油分６が次第に凝集し、スカムを形成することとなる。
【００６４】
生菌製剤をグリーストラップ１０に適用した場合、排水処理槽１にて（主として、仕切り板２ａと２ｃとで仕切られた空間にて）、油分を含む排水と生菌製剤（油分分解性微生物）とが接触することとなる。生菌製剤に含まれるヤロウィア・リポリティカは油分の分解活性が高く、資化性を有するため、油分６の凝集を抑制し、スカムが形成されることを有効に防止し得る。特に、ヤロウィア・リポリティカ  ＬＭ０２−０１１株は、広範なｐＨ領域（例えば、ｐＨ３．０〜１１．０）においても高い油分分解活性を備える。これにより、排水のｐＨに依存せず、油分がトラップ管４を通じて外部環境へ流出することを防止し、環境保全の観点からも利点がある。
【００６５】
本実施形態に係る方法において使用される生菌製剤は、例えば、排水中へ添加され、排水と接触させられる。生菌製剤を容器に収容してグリーストラップ内に設置し、容器に排水を通液させることにより生菌製剤と排水とを接触させることもできる。これにより、排水と共に油分分解性微生物が流出して菌数が低下することを防止し得る。
【００６６】
本実施形態にかかる方法において、排水に生菌製剤を添加して接触させる場合、添加する菌量は任意に設定できる。排水に添加する生菌製剤の量は、特に制限されるものではないが、排水に含まれる油分１ｇに対して、製剤中の生菌数として例えば１×１０４〜１×１０１２ＣＦＵであり、好ましくは１×１０５〜１×１０１１ＣＦＵである。あるいは、排水に含まれる油分１ｇに対して、添加される生菌製剤の量は、例えば０．１ｍｇ〜１００ｇであり、好ましくは１ｍｇ〜５ｇである。または、グリーストラップ内の排水に対して、製剤中の生菌数として例えば１×１０６〜１×１０１２ＣＦＵ／Ｌ、より好ましくは１×１０７〜１×１０１１ＣＦＵ／Ｌとなるような量を添加してもよい。あるいは、グリーストラップ内の排水に対して、添加される生菌製剤の量は、例えば１０ｍｇ〜１０００ｇ／Ｌであり、好ましくは０．５ｇ〜５０ｇ／Ｌである。
【００６７】
排水を外部環境へ排出する際、生菌製剤が排水と共にグリーストラップ外へと排出される場合があるので、本実施形態においては、グリーストラップ（排水）に、定期的に生菌製剤を添加してもよい。添加する間隔は特に制限されないが、例えば、１回／３時間、１回／２４時間、または２〜３日に１回の間隔で添加するのが好ましい。添加する方法は特に制限されず、排水が連続的にグリーストラップに流入する場合には、排水に混在させて添加してもよいし、グリーストラップ内の排水に直接、添加してもよい。厨房のシンクなどの排水口から生菌製剤を添加すれば、洗浄により排出される排水とともに、生菌製剤をグリーストラップ内に導入することができる。
【００６８】
本明細書において「油分」とは、トリグリセリド、ジグリセリドおよびモノグリセリドのようなアシルグリセロールを５０重量％以上含む（例えば、６５重量％以上、好ましくは８０重量％以上、より好ましくは９０重量％以上（上限１００重量％）のグリセリド類を含む）食用または工業用油脂、ならびに脂肪酸を指す。油脂は、ステロール、リン脂質等のアシルグリセロール以外の脂質を含むものであっても良い。
【００６９】
油脂としては、各種の動植物性油脂が含まれ、例えば、オリーブ油、キャノーラ油、ココナッツ油、ごま油、米油、米ぬか油、サフラワー油、大豆油、トウモロコシ油、菜種油、パーム油、パーム核油、ひまわり油、綿実油、やし油、落花生油、カカオ脂、牛脂、ラード、鶏油、魚油、鯨油、バター、マーガリン、ファットスプレッド、ショートニング等の食用油脂；およびアマニ油、ジャトロファ油、トール油、ハマナ油、ひまし油、ホホバ油等の工業用油脂；が例示できるが、好ましくはグリーストラップが設置されることが多いレストラン等で頻繁に排出される食用油脂である。
【００７０】
脂肪酸としては、特に限定されるものではないが、例えば、酪酸、ヘキサン酸、ヘプタ
ン酸、オクタン酸、デカン酸、ラウリン酸、トリデカン酸、ミリスチン酸、ペンタデカン酸、ペンタデカン酸、パルミチン酸、ヘプタデカン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸等の飽和脂肪酸；デセン酸、ミリストレイン酸、ペンタデセン酸、パルミトレイン酸、ヘプタデセン酸、オレイン酸、イコセン酸、ドコセン酸、テトラコセン酸、ヘキサデカジエン酸、ヘキサデカトリエン酸、ヘキサデカテトラエン酸、リノール酸、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、オクタデカテトラエン酸、イコサジエン酸、イコサトリエン酸、イコサテトラエン酸、アラキドン酸、イコサペンタエン酸、ヘンイコサペンタエン酸、ドコサジエン酸、ドコサテトラエン酸、ドコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸等の不飽和脂肪酸；が挙げられる。脂肪酸は、食用または工業用油脂が分解されて生じたものであっても良い。
【００７１】
排水中の油分の含有量は、特に制限されない。排水中に含まれる油分は、２種類以上であっても良い。
【００７２】
本実施形態の方法において、第一実施形態の製造方法で得られる生菌製剤に加えて、油分をより効率的に減少させる観点から、他の成分を排水に添加してもよい。他の成分としては、例えば、リパーゼやホスホリパーゼ等の油分分解性酵素、ｐＨ調整剤などが挙げられる。
【００７３】
油分分解性酵素としては、たとえば、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、リゾムコール（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、ペシロマイセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）属、リゾクトニア（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ）属、アブシディア（Ａｂｓｉｄｉａ）属、アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属、エロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属、アルテルナリア（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）属、アウレオバシジウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）属、ボーベリア（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ）属、クロモバクター（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属、コプリヌス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、ゲオトリクム（Ｇｅｏｔｒｉｃｕｍ）属、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、ハイホジーマ（Ｈｙｐｈｏｚｙｍａ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、メタリジウム（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ）属、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、および／またはトリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属から得ることができる。
【００７４】
市販の油分分解性酵素としては、リパーゼＭＹ、リパーゼＯＦ、リパーゼＰＬ、リパーゼＱＬＭ（名糖産業株式会社）；リパーゼＡ「アマノ（登録商標）」６、リパーゼＤＦ「アマノ（登録商標）」１５、リパーゼＧ「アマノ（登録商標）」５０、リパーゼＡＹ「アマノ（登録商標）」３０ＳＤ、リパーゼＲ「アマノ（登録商標）」、リパーゼＭＥＲ「アマノ（登録商標）」、ニューラーゼ（登録商標）Ｆ（アマノエンザイム株式会社）；スミチーム（登録商標）ＮＬＳ、スミチーム（登録商標）ＲＬＳ（新日本化学工業株式会社）；リリパーゼ（登録商標）Ａ−１０Ｄ、リリパーゼ（登録商標）ＡＦ−５、ＰＬＡ２ナガセ（ナガセケムテックス株式会社）；エンチロンＡＫＧ−２０００、エンチロンＬＰ、エンチロンＬＰＧ（洛東化成工業株式会社）；Ｌｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）１００Ｔ、Ｌｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）１００Ｌ、Ｐａｌａｔａｓｅ２００００Ｌ、Ｌｉｐｅｘ（登録商標）１００Ｔ、Ｌｉｐｅｘ（登録商標）１００Ｌ、Ｌｉｐｏｚｙｍｅ（登録商標）ＲＭＩＭ、Ｌｉｐｏｚｙｍｅ（登録商標）ＴＬＩＭ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ（登録商標）４３５ＦＧ（ノボザイムズ社製）；ピカンターゼＡ、ピカンターゼＲ８００（ディー・エス・エ
ムジャパン社製）等が挙げられる。これらを２種以上組み合わせて用いることもできる。
【００７５】
油分分解性酵素の量は、酵素が油分と反応できれば特に制限されないが、排水に含まれる油分１ｇに対して、１０〜２，０００Ｕで用いることが好ましい。より好ましくは５０〜１，５００Ｕ、さらに好ましくは１００〜１，０００Ｕである。または、グリーストラップの容量に対して、好ましくは１，０００〜１００，０００Ｕ／Ｌ、より好ましくは２，０００〜８０，０００Ｕ／Ｌとなるような量であってもよい。なお、油分分解性酵素の活性単位（Ｕ）は、３７℃、ｐＨ７の条件で１分間に１μモルの脂肪酸を遊離する酵素量である。
【００７６】
グリーストラップは、油分含有排水を連続的に導入し、処理後の排水を連続的に排出する形態であってもよいし、油分含有排水を導入し、一括して処理した後に、処理後の排水を一括して排出する形態であってもよい。
【００７７】
また、本実施形態の方法において、生菌製剤と油分とを接触させる際の温度、すなわちグリーストラップ内の排水の温度としては、任意に設定することができる。また、生菌製剤と油分とを接触させる際のｐＨ、すなわちグリーストラップ内の排水のｐＨとしても、任意に設定することができる。一般的には、温度は、例えば１０〜６０℃であり、２０〜５０℃が好ましく、２５〜４０℃がより好ましい。ｐＨは例えば３〜１０であり、ｐＨ４〜９が好ましく、ｐＨ５〜８がさらに好ましい。さらに、必要に応じて、排水基準を満たす範囲で、曝気等により排水にエアレーションを行っても良い。
【００７８】
＜生菌製剤の保存安定方法＞
本発明の第三実施形態は、無芽胞菌および水を含む付着液を多孔質担体に付着させてなる生菌製剤の保存安定性向上方法であって、無芽胞菌を炭素数１４〜１８のモノ不飽和脂肪酸を含む培地で培養して得る、生菌製剤の保存安定性の向上方法である。無芽胞菌を炭素数１４〜１８のモノ不飽和脂肪酸を含む培地で培養することは、第一実施形態について説明したものと同様である。
【００７９】
炭素数１４〜１８のモノ不飽和脂肪酸を含む培地で培養した無芽胞菌を多孔質担体に付着させてなる生菌製剤により、４０℃または５０℃での保存安定性が顕著に向上する。例えば、製造直後の生菌数を１００％とした場合、生菌製剤を５０℃、７日間保存後の生菌率が５０％以上、好ましくは８０％以上となる。なお、ここでの生菌率は下記実施例に記載の方法により得られた値を採用する。
【実施例】
【００８０】
本発明の効果を、以下の実施例および比較例を用いて説明する。ただし、本発明の技術的範囲が以下の実施例のみに制限されるわけではない。
【００８１】
（実施例１）
（１）液体培地の調製
終濃度が１．１重量％グルコース、０．３重量％硝酸ナトリウム、０．３重量％酵母エキス、０．４重量％麦芽エキス、０．００２重量％オレイン酸（２０μｇ／ｍＬ）、０．０３重量％消泡剤（アデカネートＢ−３１７Ｆ：ＡＤＥＫＡ社製）となるように純水に溶解したものを液体培地とした（培地ｐＨ４．７）。
【００８２】
（２）種培養
坂口フラスコに上記の培地を各１００ｍＬ入れ、オートクレーブ滅菌した。ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＬＭ０２−０１１株（平成
２６年３月６日付で、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託されており、その受託番号は、ＮＩＴＥ  Ｐ−０１８１３である。）を白金耳を用いて液体培地に接種して、ジャーファーメンターにて３０℃で４８時間（撹拌速度：３００ｒｐｍ）培養し、培養液を得た。
【００８３】
（３）本培養
１Ｌビーカーに液体培地を０．５Ｌ入れ、滅菌した。種培養を行った培養液１００μＬを液体培地に添加し、培養した（温度：３０℃、通気量：１．６ｖｖｍ、攪拌速度：１４０ｒｐｍ、培養時間７２ｈ）。
【００８４】
（４）懸濁液の調製
得られた培養液を１０分間遠心分離（×１０，０００ｇ）し、菌体を回収した。得られた菌体に対して下記表１の比率で各成分を蒸留水に添加し、混合して噴霧液を調製した。なお、乳タンパク質としては、固形分中にタンパク質を３５重量％、乳糖を５２重量％の割合で含むスキムミルクを用いた。
【００８５】
【表１】
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【００８６】
流動層造粒機（ＦＡ−ＬＡＢ−１、株式会社パウレック社）に３００ｇの珪藻土（平均粒径７５μｍ、嵩密度０．３３ｇ／ｍｌ、ラヂオライト（登録商標）♯３０００、昭和化学工業株式会社）をセットした。珪藻土に対して、１０７７ｇの上記噴霧液を１４３ｇ／分の速度で噴霧するとともに、４０℃の温風を送風して内容物を流動させた状態で乾燥させた。噴霧後、引き続いて流動層造粒機内で４０℃の温風を４０分間送風して、造粒物を乾燥させた。これにより、生菌製剤を得た。生菌製剤の水分含量は５．５重量％であった。
【００８７】
（比較例１）
下記液体培地を用いたこと以外は、実施例１と同様にして生菌製剤を得た。
【００８８】
（１）液体培地の調製
終濃度が１．１重量％グルコース、０．３重量％硝酸ナトリウム、０．３重量％酵母エキス、０．４重量％麦芽エキス、０．０３重量％消泡剤（アデカネート（登録商標）Ｂ−３１７Ｆ：ＡＤＥＫＡ社製）となるように純水に溶解したものを液体培地とした（培地ｐＨ４．７）。
【００８９】
（比較例２）
下記液体培地を用いたこと以外は、実施例１と同様にして生菌製剤を得た。
【００９０】
（１）液体培地の調製
終濃度が１．１重量％グルコース、０．３重量％硝酸ナトリウム、０．３重量％酵母エキス、０．４重量％麦芽エキス、０．０２重量％ステアリン酸（２０μｇ／Ｌ）、０．０３重量％消泡剤（アデカネートＢ−３１７Ｆ：ＡＤＥＫＡ社製）となるように純水に溶解したものを液体培地とした（培地ｐＨ４．７）。
【００９１】
（評価：高温での保存安定性）
作製後の生菌製剤を、遮光３０ｍＬガラスバイアル瓶内に封入し、４０℃および５０℃の恒温槽に静置した。保存から３日後、５日後、および７日後における生菌製剤１ｇ当たりの生菌数を以下の手法により求めた。
【００９２】
実施例、比較例において製剤化直後（温風乾燥から６０分以内）における生菌製剤中の生菌数を求めた。すなわち、生菌製剤を、１００倍量の蒸留水中（２５℃）で１分間撹拌して段階希釈し、得られた希釈液を寒天培地（組成：ＹＭ培地に、終濃度２重量％となるように寒天を添加したもの）の表面に塗布した。菌を３０℃で４８時間培養した後、寒天培地上に形成されたコロニー数を計測した。コロニー数から、製剤１ｇ当たりの生菌数を算出した。なお、ＹＭ培地の組成は、０．３重量％酵母エキス、０．４重量％麦芽エキス、０．５重量％ペプトン、１．０重量％グルコース（各濃度は終濃度）である。
【００９３】
各サンプルを４０℃、および５０℃に保存し、３日後、５日後および７日後について同様にコロニー数から、製剤１ｇ当たりの生菌数を算出した。
【００９４】
製剤化直後の生菌数１００％に対する各状態での生菌数を表２および図２に示す。
【００９５】
【表２】
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【００９６】
図２に示すように、実施例で得られた生菌製剤は、製剤化工程における生菌率に優れていた。また、図２に示すように、実施例で得られた生菌製剤は４０℃、または５０℃での高温保存安定性に優れるものであった。特に５０℃という高温環境下であっても７日後に５０％以上が生存していたことは顕著に保存安定性に優れることを示す。一方、オレイン酸を含まない比較例１、オレイン酸の代わりに飽和脂肪酸であるステアリン酸を用いた比較例２は、４０℃での保存安定性が５日目には両者とも８０％未満であり、また５０℃での保存安定性は、５日目には５０％以下、７日目には２０％未満となった。したがって、培地中にオレイン酸を添加することで、高温保存下での保存安定性が顕著に向上することが示された。
【００９７】
＜オレイン酸濃度の違いによる評価＞
（実施例２）
実施例１の液体培地の調製において、オレイン酸濃度を２０μｇ／ｍＬから１０μｇ／ｍＬに変更したこと以外は、実施例１と同様にして液体培地を得た。
【００９８】
得られた液体培地を用いたこと以外は、実施例１と同様にして生菌製剤を得た。
【００９９】
（実施例３）
実施例１の液体培地の調製において、オレイン酸濃度を２０μｇ／ｍＬから４０μｇ／ｍＬに変更したこと以外は、実施例１と同様にして液体培地を得た。
【０１００】
得られた液体培地を用いたこと以外は、実施例１と同様にして生菌製剤を得た。
【０１０１】
（実施例４）
実施例１の液体培地の調製において、オレイン酸濃度を２０μｇ／ｍＬから８０μｇ／ｍＬに変更したこと以外は、実施例１と同様にして液体培地を得た。
【０１０２】
得られた液体培地を用いたこと以外は、実施例１と同様にして生菌製剤を得た。
【０１０３】
上記実施例２〜４で得られた生菌製剤について、上記実施例１と同様にして５０℃での保存安定性を評価した。結果を下記表３に示す。
【０１０４】
【表３】
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【０１０５】
上記結果より、いずれの実施例も、５０℃という高温環境下であっても５日後に７５％以上、７日後に５０％以上が生存していたことから、高温での保存安定性に優れることが示された。特に添加濃度が２０μｇ／ｍＬ以上になると、５０℃、７日後の生存率が８０％以上と、顕著に高くなり、高温での保存安定性に一層優れることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１０６】
本発明に係る生菌製剤の製造方法を利用することで、環境、食品、医薬品、農薬、公衆衛生等の分野において利用可能な生菌製剤を高い生存率で提供できる。好ましくは、本発明に係る生菌製剤の製造方法は、水質環境改善用生菌製剤、特に排水処理用生菌製剤の製造において好適に利用され得る。
【符号の説明】
【０１０７】
１    排水処理槽、
２ａ、２ｂ、２ｃ    仕切り板、
３    残渣受け、
４    トラップ管、
５    水面、
６    油分、
１０    グリーストラップ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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