(57)【要約】【課題】改善されたウイルスによる形質導入のための化合物の提供。【解決手段】本発明は、細胞へのウイルスによる形質導入の有効性を改善するための方法および組成物を提供する。より詳細には、本発明は、ヒト造血幹細胞（ＨＳＣ）などの細胞にウイルスおよび／またはウイルスベクターを用いて形質導入するための方法の効率を安全かつ確実に改善するために有用な方法および材料を提供する。該組成物および方法は、造血幹細胞遺伝子治療を用いた処置に適した治療適応症に対して有用である。種々の実施形態では、本発明は、一部において、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる化合物１つまたは複数を含む培養培地で細胞およびレトロウイルスを培養する工程を含む、レトロウイルスと一緒に培養した細胞の形質導入効率を上昇させるための方法を意図している。一実施形態では、化合物は小分子である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１１年９月３０日に出願された米国仮特許出願第６１／５４１，７３６号の利益を、米国特許法§１１９（ｅ）の下、主張する。この出願はその全体が本明細書において参照として援用される。
【０００２】
配列表に関する陳述
本出願に付随する配列表は、紙コピーの代わりにテキスト形式で提供され、これによって参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称はＢＬＢＤ＿００６＿０１ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。テキストファイルは３０ＫＢであり、２０１２年９月２７日に作成され、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。
【０００３】
背景
技術分野
本発明は、一般には、細胞へのウイルスによる形質導入の方法の有効性を改善することに関する。より詳細には、本発明は、治療適応症に対して有用であり得る、ヒト造血幹細胞（ＨＳＣ）などの細胞へのウイルスおよび／またはウイルスベクターを用いた形質導入の効率を改善するために有用な方法および材料を提供する。
【背景技術】
【０００４】
関連技術の記載
食品医薬品局（Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）（ＦＤＡ）は、販売のためのいかなるヒト遺伝子治療製品もまだ承認していない。現行の遺伝子治療は実験的なものであり、臨床試験において大きな成功は証明されていない。１９９０年に開始された最初の遺伝子治療の臨床試験からほとんど進歩していない。１９９９年に、１８歳のＪｅｓｓｅ  Ｇｅｌｓｉｎｇｅｒが死亡して、遺伝子治療は重大な妨げに直面した。Ｊｅｓｓｅは、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症（ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ  ｔｒａｎｓｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）（ＯＴＣＤ）に対する遺伝子治療試験に参加していた。彼は、処置を開始した４日後に多臓器不全により死亡した。彼の死亡はアデノウイルスキャリアに対する重度の免疫応答によって誘発されたものと考えられている。
【０００５】
別の重大な打撃が２００３年１月にあり、その時、ＦＤＡは血液幹細胞にレトロウイルスベクターを使用する遺伝子治療試験を全て一時的に停止させた。ＦＤＡは、フランスの遺伝子治療試験において処置された２人目の小児で白血病様状態が発生したことを知った後にこの措置を取った。２００２年８月に、「重症複合免疫不全症候群（ｂｕｂｂｌｅ  ｂａｂｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）」としても公知のＸ連鎖重症複合型免疫不全症（Ｘ−ＳＣＩＤ）に対して遺伝子治療によって首尾よく処置されていたこの小児および別の小児の両方において同様の状態が発生した。２００３年２月の終わりに、ＦＤＡのＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ  Ａｄｖｉｓｏｒｙ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＢＲＭＡＣ）が開催され、生命にかかわる疾患を処置するためのいくつかのレトロウイルス遺伝子治療試験を適切な保護手段を伴って進行させることを可能にする、可能性のある施策について検討した。２００３年４月に、ＦＤＡは血液幹細胞にレトロウイルスベクターを使用する遺伝子治療試験に対する禁止令を緩和した。
【０００６】
しかし、最近、いくつかのグループが、いくつかの疾患との闘いにおいてある程度成功した遺伝子治療試験を導いた。２００８年に、ＵＫのＵＣＬ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｆｉｅｌｄｓ  Ｅｙｅ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ＮＩＨＲ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｒｅの研究者により、遺伝性失明の一種であるレーバー先天性黒内障を処置するための遺伝子治療の臨床試験の成功が発表された。その結果は、この実験的処置が安全であり、視力を改善できることを示した（非特許文献１）。
【０００７】
２０１１年に、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｘ，Ｉｎｃ．により、進行性パーキンソン病（ＰＤ）に対する治験遺伝子治療であるＮＬＸ−Ｐ１０１の第２相試験における肯定的な結果が発表された。ＮＬＸ−Ｐ１０１を受けた試験参加者において、模擬外科手術を受けた対照の被験体と比較して、非薬物療法（ｏｆｆ−ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎ）における運動スコアの統計的に有意であり、臨床的に意味のある改善が生じた。この試験では、この利益は１カ月目に見られ、６カ月の盲検試験期間全体を通して実質的に変化せずに継続された。この結果は、ＮＬＸ−Ｐ１０１についての肯定的な安全性プロファイルも実証し、遺伝子治療または外科手技に関連する重篤な有害事象は報告されていない。この試験に登録された患者は中程度から進行したＰＤを有し、現行の療法には適切に応答しなかった。
【０００８】
２００９年に、フランスの科学者のグループにより、造血幹細胞媒介性遺伝子治療を用いることによるＸ連鎖副腎白質ジストロフィー（ＡＬＤ）の処置の成功が報告された。患者から自己由来幹細胞を取り出し、ｅｘ  ｖｉｖｏで遺伝的に調整し、次いで、患者が骨髄破壊的処置を受けた後に該患者に再度注入した。２４〜３０カ月間の追跡調査の期間にわたって、顆粒球、単球、Ｔリンパ球およびＢリンパ球の９〜１４％でＡＬＤタンパク質を発現するポリクローナル再構成が検出された。これらの結果により、患者に造血幹細胞が形質導入されたことが強力に示唆される。遺伝的に調整された細胞を注入した１４〜１６カ月後に始まって、患者２人の進行性大脳脱髄が停止した。
【０００９】
遺伝子治療の分野における最近の進歩により、βサラセミアおよび鎌状赤血球貧血などの異常ヘモグロビン症を患っている患者が新規の治療的手法から恩恵を受けることになるという期待が高まっている。β−グロビン遺伝子を保有するレンチウイルスベクターを用いて改変した造血細胞（ＨＣ）を移植することにより、ヘモグロビン障害のいくつかのマウスモデルの長期にわたる調整（ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）がもたらされた（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５）が、対照的に、わずか１名のβサラセミア患者で輸血非依存が導かれた（非特許文献６）。
【００１０】
遺伝子改変された自己細胞を注入することの主要な利点は、ＧＶＨＤおよび免疫抑制性移植前処置のリスクを回避すること、ならびに適合するドナーの不足に対処することであるが、現行の療法では、少なくとも３つの実質的な警告：毒性の骨髄破壊が必要条件であること（非特許文献７）；現行の遺伝子移入方法では造血幹細胞（ＨＳＣ）をほんの一部しか形質導入することができないこと（非特許文献８）；ならびに、利用可能な種々のｉｎ  ｖｉｖｏ選択戦略は有効性および安全性が最適以下になること（非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１）に直面する。例えば、造血幹細胞療法に適した障害、例えば、鎌状赤血球症、β−サラセミア、副腎白質ジストロフィー、および副腎脊髄神経障害に対しては、制限として、これだけに限定されないが、造血幹細胞または造血前駆細胞の形質導入が非効率的であること、毒性の骨髄抑制性療法または骨髄破壊的療法が必要であること、および形質導入された細胞をｉｎ  ｖｉｖｏにおいて選択するための最適な方法がないことが挙げられる。
【００１１】
したがって、当技術分野において、改善された遺伝子治療、特に、造血障害を処置または予防するための改善された遺伝子治療の方法が必要である。本発明は、当技術分野で厄介なこれらおよび他の問題に対する解決を提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｍａｇｕｉｒｅら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．  ３５８巻（２１号）：２２４０頁（２００８年）
【非特許文献２】Ｉｍｒｅｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ２００２年；９９巻（２２号）：１４３８０〜１４３８５頁
【非特許文献３】Ｍａｌｉｋら、Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．  ２００５年；１０５４巻：２３８〜２４９頁
【非特許文献４】Ｍａｙら、Ｎａｔｕｒｅ．  ２０００年；４０６巻（６７９１号）：８２〜８６頁
【非特許文献５】Ｐａｗｌｉｕｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２００１年；２９４巻（５５５０号）：２３６８〜２３７１頁
【非特許文献６】Ｃａｖａｚｚａｎａ−Ｃａｌｖｏら、Ｎａｔｕｒｅ．  ２０１０年；４６７巻（７３１３号）：３１８〜３２２頁
【非特許文献７】Ｄｕｎｂａｒら、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  １９９８年；９巻（１７号）：２６２９〜２６４０頁
【非特許文献８】Ｓａｎｔｏｎｉ  ｄｅ  ＳｉｏおよびＮａｌｄｉｎｉ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ２００９年；５０６巻：５９〜７０頁
【非特許文献９】Ｂｅａｒｄら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．  ２０１０年；１２０巻（７号）：２３４５〜２３５４頁
【非特許文献１０】Ｃｏｒｎｅｔｔａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ２００６年；１３巻（９号）：８８６〜８９５頁
【非特許文献１１】Ｍｉｌｓｏｍら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２００８年；６８巻（１５号）：６１７１〜６１８０頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
簡単な要旨
本発明は、一般に、ウイルスによる形質導入効率を改善するための、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる化合物を含む方法および組成物を提供する。本発明の組成物および方法は、さらに、ウイルスおよび／またはウイルスベクターを用いてヒト造血幹細胞（ＨＳＣ）などの細胞に形質導入するための、より安全であり、より信頼できる方法を提供する。組成物および方法は、造血幹細胞遺伝子治療を用いた処置に適した治療適応症に対して有用である。
【００１４】
種々の実施形態では、本発明は、一部において、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる化合物１つまたは複数を含む培養培地で細胞およびレトロウイルスを培養する工程を含む、レトロウイルスと一緒に培養した細胞の形質導入効率を上昇させるための方法を意図している。一実施形態では、化合物は小分子である。
【００１５】
一実施形態では、細胞は幹細胞または前駆細胞である。
【００１６】
特定の実施形態では、幹細胞または前駆細胞は、胚性幹細胞および人工多能性幹細胞からなる群から選択される。
【００１７】
さらなる実施形態では、幹細胞または前駆細胞は、間葉幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、網膜幹細胞、心筋幹細胞、骨格筋幹細胞、脂肪組織由来幹細胞、軟骨形成幹細胞、肝幹細胞、腎幹細胞、および膵幹細胞からなる群から選択される。
【００１８】
ある実施形態では、幹細胞または前駆細胞は造血幹細胞または造血前駆細胞である。
【００１９】
さらなる実施形態では、細胞は、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、骨格筋、心筋、ニューロン、星状膠細胞、オリゴデンドロサイト、シュワン細胞、網膜細胞、角膜細胞、皮膚細胞、単球、マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球、樹状細胞、Ｔ−リンパ球、Ｂリンパ球、ＮＫ細胞、胃細胞、腸細胞、平滑筋細胞、血管細胞、膀胱細胞、膵アルファ細胞、膵ベータ細胞、膵デルタ細胞、肝細胞、腎細胞、副腎細胞、および肺細胞からなる群から選択される。
【００２０】
さらなる特定の実施形態では、細胞は造血幹細胞または造血前駆細胞である。
【００２１】
一実施形態では、造血幹細胞または造血前駆細胞の少なくとも約５０％が形質導入されている。
【００２２】
別の実施形態では、造血幹細胞または造血前駆細胞の少なくとも約７５％が形質導入されている。
【００２３】
さらに別の実施形態では、造血幹細胞または造血前駆細胞の少なくとも約９０％が形質導入されている。
【００２４】
特定の実施形態では、本明細書に開示されている組成物または方法はいずれも、ＰＧＡ２；ＰＧＢ２；ＰＧＤ２；ＰＧＥ１；ＰＧＥ２；ＰＧＦ２；ＰＧＩ２；ＰＧＨ２；ＰＧＪ２；ならびにその前駆体、代謝産物、誘導体および類似体からなる群から選択される、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる化合物１つまたは複数を含む。
【００２５】
ある実施形態では、本明細書に開示されている組成物または方法はいずれも、１５ｄ−ＰＧＪ２；デルタ１２−ＰＧＪ２；２−ヒドロキシヘプタデカトリエン酸（ＨＨＴ）；トロンボキサンＡ２；トロンボキサンＢ２；イロプロスト；トレプロスチニル；トラボプロスト；カルボプロスト・トロメタミン；タフルプロスト；ラタノプロスト；ビマトプロスト；イソプロピルウノプロストン；クロプロステノール；エストロファン；スーパーファン（Ｓｕｐｅｒｐｈａｎ）；ミソプロストール；ブタプロスト；リノール酸；１３（ｓ）−ＨＯＤＥ；ＬＹ１７１８８３；ミード酸；エイコサトリエン酸；エポキシエイコサトリエン酸；ＯＮＯ−２５９；Ｃａｙ１０３９；ＰＧＥ２受容体アゴニスト；１６，１６−ジメチルＰＧＥ２；１９（Ｒ）−ヒドロキシＰＧＥ２；１６，１６−ジメチルＰＧＥ２ｐ−（ｐ−アセトアミドベンズアミド）フェニルエステル；１１−デオキシ−１６，１６−ジメチルＰＧＥ２；９−デオキシ−９−メチレン−１６，１６−ジメチルＰＧＥ２；９−デオキシ−９−メチレンＰＧＥ２；スルプロストン；ＰＧＥ２セリノールアミド；ＰＧＥ２メチルエステル；１６−フェニルテトラノルＰＧＥ２；１５（Ｓ）−１５−メチルＰＧＥ２；１５（Ｒ）−１５−メチルＰＧＥ２；Ｃｏｒｅｙアルコール−Ａ；Ｃｏｒｅｙアルコール−Ｂ；Ｃｏｒｅｙジオール；ＢＩＯ；８−ブロモ−ｃＡＭＰ；フォルスコリン；Ｂａｐｔａ−ＡＭ；フェンジリン；ニカルジピン；ニフェジピン；ピモジド；ストロファンチジン；ラナトシド；Ｌ−Ａｒｇ；ニトロプルシドナトリウム；バナジン酸ナトリウム；ブラジキニン；メベベリン；フルランドレノリド；アテノロール；ピンドロール；ガボキサドール；キヌレン酸；ヒドララジン；チアベンダゾール；ビククリン（Ｂｉｃｕｃｌｌｉｎｅ）；ベサミコール；ペルボシド；イミプラミン；クロルプロパミド；１，５−ペンタメチレンテトラゾール；４−アミノピリジン；ジアゾキシド；ベンフォチアミン；１２−メトキシドデセン酸（１２−Ｍｅｔｈｏｘｙｄｏｄｅｃｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）；Ｎ−ホルミル−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ；ガラミン；ＩＡＡ９４；およびクロロトリアニセンからなる群から選択される、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる化合物１つまたは複数を含む。
【００２６】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている組成物または方法はいずれも、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、または１６，１６−ジメチルＰＧＥ２からなる群から選択される、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる化合物１つまたは複数を含む。
【００２７】
さらなる実施形態では、本明細書に開示されている方法はいずれも、細胞およびレトロウイルスをヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤の存在下で培養する工程をさらに含む。
【００２８】
一実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤は、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、バルプロ酸（ＶＰＡ）、酪酸ナトリウム、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、フェニル酪酸ナトリウム、デプシペプチド、トラポキシン（ＴＰＸ）、環状ヒドロキサム酸含有ペプチド１（ＣＨＡＰｌ）、ＭＳ−２７５、ＬＢＨ５８９、およびＰＸＤ−１０１からなる群から選択される。
【００２９】
種々の実施形態では、本明細書に開示されている組成物または方法はいずれも、レンチウイルスであるレトロウイルスを含む。
【００３０】
特定の実施形態では、本明細書に開示されている組成物または方法はいずれも、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ウイルスであるレトロウイルスを含む。
【００３１】
ある実施形態では、本明細書に開示されている組成物または方法はいずれも、水疱性口内炎ウイルスＧタンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）エンベロープタンパク質でシュードタイピングされたレトロウイルスを含む。
【００３２】
さらなる実施形態では、本明細書に開示されている方法はいずれも、細胞を、形質導入の前に、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる化合物の存在下で培養する工程を含む。
【００３３】
特定の実施形態では、細胞を、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる化合物と一緒に少なくとも約２時間にわたって培養する。
【００３４】
さらなる実施形態では、細胞を、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる化合物と一緒に少なくとも約４時間にわたって培養する。
【００３５】
ある実施形態では、細胞を、形質導入の間にプロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる化合物の存在下で培養する。
【００３６】
さらなる実施形態では、細胞を、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる化合物の存在下で少なくとも約２４時間にわたって培養する。
【００３７】
さらなる実施形態では、細胞を、形質導入の最初の２４時間、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる化合物の存在下で培養する。
【００３８】
いくつかの実施形態では、細胞を、形質導入の最初の４８時間、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる化合物の存在下で培養する。
【００３９】
特定の実施形態では、本明細書に開示されている組成物または方法はいずれも、左側の（５’）レトロウイルスＬＴＲと、目的の遺伝子に作動可能に連結した発現制御配列と、右側の（３’）レトロウイルスＬＴＲとを含むベクターを含むトロウイルスを含む。
【００４０】
ある実施形態では、本明細書に開示されている組成物または方法はいずれも、左側の（５’）ＨＩＶ−１  ＬＴＲと、プサイパッケージング配列（Ψ＋）と、ＨＩＶ−１セントラルポリプリントラクト（ｃｅｎｔｒａｌ  ｐｏｌｙｐｕｒｉｎｅ  ｔｒａｃｔ）／ＤＮＡフラップ（ＤＮＡ  ｆｌａｐ）（ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）と、ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）と、目的の遺伝子に作動可能に連結したβ−グロビンプロモーターおよびβ−グロビン遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）と、１つまたは複数のインスレーターエレメント、またはウサギβ−グロビンポリＡ配列（ｒβｇｐＡ）を含む右側の（３’）レトロウイルスＬＴＲとを含むベクターを含むトロウイルスを含む。種々の実施形態では、造血幹細胞または造血前駆細胞を異常ヘモグロビン症に罹患している患者に投与する。
【００４１】
種々の特定の実施形態では、異常ヘモグロビン症はβ−サラセミアまたは鎌状赤血球症である。
【００４２】
ある実施形態では、本明細書に開示されている組成物または方法はいずれも、左側の（５’）ＨＩＶ−１  ＬＴＲと、プサイ（Ψ）パッケージングシグナルと、ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰと、ＲＲＥと、ヒトＡＢＣＤ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結したＭＮＤプロモーターと、右側の（３’）ＨＩＶ−１  ＬＴＲと、ウサギβ−グロビンポリアデニル化配列とを含むベクターを含む。種々のある実施形態では、造血幹細胞または造血前駆細胞を副腎白質ジストロフィーまたは副腎脊髄神経障害に罹患している患者に投与する。
【００４３】
種々の実施形態では、レトロウイルスは複製欠損性である。
本発明は、例えば、以下の項目も提供する。
（項目１）
レトロウイルスと一緒に培養した細胞の形質導入効率を上昇させるための方法であって、該細胞および該レトロウイルスを、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる化合物を含む培養培地中で培養する工程を含む方法。
（項目２）
前記細胞が幹細胞または前駆細胞である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記幹細胞または前駆細胞が、胚性幹細胞および人工多能性幹細胞からなる群から選択される、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記幹細胞または前駆細胞が、間葉幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、網膜幹細胞、心筋幹細胞、骨格筋幹細胞、脂肪組織由来幹細胞、軟骨形成幹細胞、肝幹細胞、腎幹細胞、および膵幹細胞からなる群から選択される、項目２に記載の方法。
（項目５）
前記幹細胞または前駆細胞が造血幹細胞または造血前駆細胞である、項目２に記載の方法。
（項目６）
前記細胞が、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、骨格筋、心筋、ニューロン、星状膠細胞、オリゴデンドロサイト、シュワン細胞、網膜細胞、角膜細胞、皮膚細胞、単球、マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球、樹状細胞、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ＮＫ細胞、胃細胞、腸細胞、平滑筋細胞、血管細胞、膀胱細胞、膵アルファ細胞、膵ベータ細胞、膵デルタ細胞、肝細胞、腎細胞、副腎細胞、および肺細胞からなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記細胞が造血幹細胞または造血前駆細胞である、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記造血幹細胞または造血前駆細胞の少なくとも約５０％が形質導入されている、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記造血幹細胞または造血前駆細胞の少なくとも約７５％が形質導入されている、項目７に記載の方法。
（項目１０）
前記造血幹細胞または造血前駆細胞の少なくとも約９０％が形質導入されている、項目７に記載の方法。
（項目１１）
プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる前記化合物が、ＰＧＡ２；ＰＧＢ２；ＰＧＤ２；ＰＧＥ１；ＰＧＥ２；ＰＧＦ２；ＰＧＩ２；ＰＧＨ２；ＰＧＪ２；ならびにその前駆体、代謝産物、誘導体および類似体からなる群から選択される、項目１から１０までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる前記化合物が、１５ｄ−ＰＧＪ２；デルタ１２−ＰＧＪ２；２−ヒドロキシヘプタデカトリエン酸（ＨＨＴ）；トロンボキサンＡ２；トロンボキサンＢ２；イロプロスト；トレプロスチニル；トラボプロスト；カルボプロスト・トロメタミン；タフルプロスト；ラタノプロスト；ビマトプロスト；イソプロピルウノプロストン；クロプロステノール；エストロファン；スーパーファン；ミソプロストール；ブタプロスト；リノール酸；１３（ｓ）−ＨＯＤＥ；ＬＹ１７１８８３；ミード酸；エイコサトリエン酸；エポキシエイコサトリエン酸；ＯＮＯ−２５９；Ｃａｙ１０３９；ＰＧＥ２受容体アゴニスト；１６，１６−ジメチルＰＧＥ２；１９（Ｒ）−ヒドロキシＰＧＥ２；１６，１６−ジメチルＰＧＥ２ｐ−（ｐ−アセトアミドベンズアミド）フェニルエステル；１１−デオキシ−１６，１６−ジメチルＰＧＥ２；９−デオキシ−９−メチレン−１６，１６−ジメチルＰＧＥ２；９−デオキシ−９−メチレンＰＧＥ２；スルプロストン；ＰＧＥ２セリノールアミド；ＰＧＥ２メチルエステル；１６−フェニルテトラノルＰＧＥ２；１５（Ｓ）−１５−メチルＰＧＥ２；１５（Ｒ）−１５−メチルＰＧＥ２；ＢＩＯ；８−ブロモ−ｃＡＭＰ；フォルスコリン；Ｂａｐｔａ−ＡＭ；フェンジリン；ニカルジピン；ニフェジピン；ピモジド；ストロファンチジン；ラナトシド；Ｌ−Ａｒｇ；ニトロプルシドナトリウム；バナジン酸ナトリウム；ブラジキニン；メベベリン；フルランドレノリド；アテノロール；ピンドロール；ガボキサドール；キヌレン酸；ヒドララジン；チアベンダゾール；ビククリン；ベサミコール；ペルボシド；イミプラミン；クロルプロパミド；１，５−ペンタメチレンテトラゾール；４−アミノピリジン；ジアゾキシド；ベンフォチアミン；１２−メトキシドデセン酸；Ｎ−ホルミル−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ；ガラミン；ＩＡＡ９４；およびクロロトリアニセンからなる群から選択される、項目１から１０までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる前記化合物が、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、または１６，１６−ジメチルＰＧＥ２からなる群から選択される、項目１から１０までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
前記細胞およびレトロウイルスをヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤の存在下で培養する工程をさらに含む、項目１から１３までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
前記ＨＤＡＣ阻害剤が、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、バルプロ酸（ＶＰＡ）、酪酸ナトリウム、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、フェニル酪酸ナトリウム、デプシペプチド、トラポキシン（ＴＰＸ）、環状ヒドロキサム酸含有ペプチド１（ＣＨＡＰｌ）、ＭＳ−２７５、ＬＢＨ５８９、およびＰＸＤ−１０１からなる群から選択される、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記レトロウイルスがレンチウイルスである、項目１から１５までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
前記レトロウイルスがヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ウイルスである、項目１から１６までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
前記レトロウイルスが水疱性口内炎ウイルスＧタンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）エンベロープタンパク質でシュードタイピングされている、項目１から１７までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
前記細胞を、形質導入の前にプロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる前記化合物の存在下で培養する、項目１から１８までのいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
前記細胞を、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる前記化合物と一緒に少なくとも約２時間にわたって培養する、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記細胞を、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる前記化合物と一緒に少なくとも約４時間にわたって培養する、項目１９に記載の方法。
（項目２２）
前記細胞を、形質導入の間にプロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる前記化合物の存在下で培養する、項目１から１９までのいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
前記細胞を、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる前記化合物の存在下で少なくとも約２４時間にわたって培養する、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記細胞を、形質導入の最初の２４時間の間に、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる前記化合物の存在下で培養する、項目２１から２３までのいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記細胞を、形質導入の最初の４８時間の間に、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる前記化合物の存在下で培養する、項目２１から２４までのいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
前記レトロウイルスが、
ａ）左側の（５’）レトロウイルスＬＴＲと、
ｂ）目的の遺伝子に作動可能に連結した発現制御配列と、
ｃ）右側の（３’）レトロウイルスＬＴＲと
を含むベクターを含む、項目１から２５までのいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
前記レトロウイルスが、
ａ）左側の（５’）ＨＩＶ−１  ＬＴＲと、
ｂ）プサイパッケージング配列（Ψ＋）と、
ｃ）ＨＩＶ−１セントラルポリプリントラクト／ＤＮＡフラップ（ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）と、
ｄ）ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）と、
ｅ）目的の遺伝子に作動可能に連結したβ−グロビンプロモーターおよびβ−グロビン遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）と、
ｆ）
ｉ）１つまたは複数のインスレーターエレメント、または
ｉｉ）ウサギβ−グロビンポリＡ配列（ｒβｇｐＡ）
を含む右側の（３’）レトロウイルスＬＴＲと
を含むベクターを含む、項目８から２６までのいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
前記造血幹細胞または造血前駆細胞を異常ヘモグロビン症に罹患している患者に投与する、項目８から２６までのいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
前記異常ヘモグロビン症がβ−サラセミアまたは鎌状赤血球症である、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記レトロウイルスが、
（ａ）左側の（５’）ＨＩＶ−１  ＬＴＲと、
（ｂ）プサイ（Ψ）パッケージングシグナルと、
（ｃ）ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰと、
（ｄ）ＲＲＥと、
（ｅ）ヒトＡＢＣＤ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結したＭＮＤプロモーターと、
（ｆ）右側の（３’）ＨＩＶ−１  ＬＴＲと、
（ｇ）ウサギβ−グロビンポリアデニル化配列と
を含むベクターを含む、項目８から２６までのいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
前記レトロウイルスが複製欠損性である、項目１から３０までのいずれか一項に記載の方法。
（項目３２）
前記造血幹細胞または造血前駆細胞を副腎白質ジストロフィーまたは副腎脊髄神経障害に罹患している患者に投与する、項目３０に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図１は、ＣＤ３４＋細胞のウイルスによる形質導入を促進する化合物についてのスクリーニングの結果を示す。ＣＤ３４＋細胞を解凍し、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＦｌｔＬ、およびＩＬ３を用いて予備刺激し、次いで、ＧＦＰ＋レンチウイルスを用いて形質導入した。細胞を、高濃度、中間の濃度、または低濃度（表１参照）の可溶性因子に、予備刺激期間中（０〜２４時間）または形質導入期間中（２４〜４８時間）にさらに曝露させた。次いで、およそ１週間培養した後に、細胞を洗浄し、フローサイトメトリーによって分析した。ＧＦＰ＋であった細胞の百分率を決定し、ヒートマップとして図示した。灰色は、およそ４５％の細胞が形質導入されたことを示し、ダイナミックレンジは０％（黒色）から約９２％（白色）までであった。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
配列識別子の簡単な説明
配列番号１は、ヒトアルファグロビンｃＤＮＡのポリヌクレオチド配列を示す。
【００４６】
配列番号２は、ヒトアルファグロビンポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【００４７】
配列番号３は、マウスアルファグロビンポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【００４８】
配列番号４は、ラットアルファグロビンポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【００４９】
配列番号５は、ヒトベータグロビンｃＤＮＡのポリヌクレオチド配列を示す。
【００５０】
配列番号６は、ヒトベータグロビンポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【００５１】
配列番号７は、変異ヒトベータグロビンポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【００５２】
配列番号８は、マウスベータグロビンポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【００５３】
配列番号９は、ラットベータグロビンポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【００５４】
配列番号１０は、ヒトガンマグロビンｃＤＮＡのポリヌクレオチド配列を示す。
【００５５】
配列番号１１は、ヒトガンマグロビンポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【００５６】
配列番号１２は、マウスガンマグロビンポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【００５７】
配列番号１３は、ラットガンマグロビンポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【００５８】
配列番号１４は、ヒトデルタグロビンｃＤＮＡのポリヌクレオチド配列を示す。
【００５９】
配列番号１５は、ヒトデルタグロビンポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【００６０】
配列番号１６は、ＡＣＢＤ１ポリヌクレオチドをコードするｃＤＮＡ配列を示す。
【００６１】
配列番号１７は、ＡＣＢＤ１ポリヌクレオチドをコードするｃＤＮＡ配列を示す。
【００６２】
配列番号１８は、ＡＣＢＤ１ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【００６３】
詳細な説明
Ａ．概要
本発明は、一般には、改善された遺伝子治療組成物、およびそれを使用して、遺伝的障害を処置する、予防する、または軽減する方法に関する。遺伝子治療に関する１つの著しい難題は、被験体に送達される治療用遺伝子を含む細胞の形質導入効率を上昇させることであり、ここで、調整された細胞は非形質導入細胞に対する内因性の選択的利点を有さない。
【００６４】
本発明は、一部において、本発明の新規な細胞への形質導入方法を用いて、治療用細胞、すなわち、調整された細胞の数を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｖｏで増大させるかまたは増加させて、遺伝子治療の有効性をさらに増加させることができるという予想外の発見に基づく。いかなる特定の理論にも縛られることを望むことなく、本発明は、一部において、細胞への形質導入効率を上昇させることにより、形質導入当たりより多くの調整された細胞が生成され、したがって、本発明の遺伝子治療の方法において遺伝子治療を受けている被験体に治療的、予防的、または軽減的なエンドポイントをもたらすために必要な投与細胞の数が少なくなることを意図している。さらに、より多数の形質導入された細胞が患者に送達されるので、治療的、予防的、または軽減的なエンドポイントを実現するために骨髄抑制性療法または骨髄破壊的療法が必ずしも必要にならない。
【００６５】
したがって、本発明は、遺伝病の処置における遺伝子治療の効率を改善する、まだ満たされていない臨床的必要性に取り組み、それにより、形質導入された細胞集団内のより多数の治療用細胞を被験体に投与して、治療的、予防的、または軽減的な効果をもたらすことができる。本発明は、詳細には、遺伝子治療の所望の臨床転帰を容易にするための、驚くほど効率的な細胞への形質導入の方法、ベクター、および遺伝子操作された細胞に関する。
【００６６】
本発明の実施では、特に反対のことが示されなければ、分子生物学の従来の方法および当技術分野の技術の範囲内の組換えＤＮＡ技法が用いられ、その多くが例示のために下に記載されている。そのような技法は、文献において十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９年）；Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８２年）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｉ巻およびＩＩ巻（Ｄ．  Ｇｌｏｖｅｒ編）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．  Ｇａｉｔ編、１９８４年）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．  Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８５年）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．  Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４年）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８６年）；Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｂ．  Ｐｅｒｂａｌ編、１９８４年）を参照されたい。
【００６７】
本明細書において引用されている全ての刊行物、特許および特許出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００６８】
Ｂ．定義
別段の定義のない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。本発明の目的に関して、以下の用語が下で定義されている。
【００６９】
本明細書で使用される場合、「レトロウイルス」という用語は、そのゲノムＲＮＡを直鎖状の二本鎖ＤＮＡコピーに逆転写し、その後、そのゲノムＤＮＡを宿主ゲノムに共有結合により組み込むＲＮＡウイルスを指す。レトロウイルスは遺伝子を送達するための一般的なツールである（Ｍｉｌｌｅｒ、２０００年、Ｎａｔｕｒｅ．  ３５７巻：４５５〜４６０頁）。ウイルスが宿主ゲノムに組み込まれたら、そのウイルスは「プロウイルス」と称される。プロウイルスは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの鋳型としての機能を果たし、新しいウイルス粒子を産生するために必要な構造タンパク質および酵素をコードするＲＮＡ分子の発現を導く。
【００７０】
例示的なレトロウイルスとしては、これだけに限定されないが、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭｕＬＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭｏＭＳＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳腺癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）、スプーマウイルス、フレンドマウス白血病ウイルス、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ））およびレンチウイルスが挙げられる。
【００７１】
本明細書で使用される場合、「レンチウイルス」という用語は、複合レトロウイルスの群（または属）を指す。例示的なレンチウイルスとしては、これだけに限定されないが、ＨＩＶ（ＨＩＶ１型、およびＨＩＶ２型を含めたヒト免疫不全ウイルス）；ビスナ・マエディウイルス（ＶＭＶ）ウイルス；ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）；ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）；ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）；ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）；サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられる。一実施形態では、ＨＩＶに基づくベクターの骨格（すなわち、ＨＩＶシス作用性配列エレメント）が好ましい。
【００７２】
レトロウイルスベクター、より詳細にはレンチウイルスベクターを本発明の実施において使用することができる。したがって、「レトロウイルス」または「レトロウイルスベクター」という用語は、本明細書で使用される場合、それぞれ「レンチウイルス」および「レンチウイルスベクター」を包含するものとする。
【００７３】
「ベクター」という用語は、本明細書では、別の核酸分子を移行または運搬することができる核酸分子を指すために使用される。移行される核酸は、一般に、ベクター核酸分子と連結している、例えば、それに挿入されている。ベクターは、細胞における自律複製を導く配列を含んでもよく、宿主細胞のＤＮＡへの組み込みを可能にするために十分な配列を含んでもよい。有用なベクターとしては、例えば、プラスミド（例えば、ＤＮＡプラスミドまたはＲＮＡプラスミド）、トランスポゾン、コスミド、細菌性人工染色体、およびウイルスベクターが挙げられる。有用なウイルスベクターとしては、例えば、複製欠損性のレトロウイルスおよびレンチウイルスが挙げられる。
【００７４】
当業者には明らかになる通り、「ウイルスベクター」という用語は、広く使用されており、一般には核酸分子の移行または細胞のゲノムへの組み込みを容易にするウイルス由来の核酸エレメントを含む核酸分子（例えば、移行プラスミド）、または核酸の移行を媒介するウイルス粒子のいずれかを指す。ウイルス粒子は、一般には、種々のウイルスの構成成分を含み、時には核酸（複数可）に加えて宿主細胞の構成成分も含む。
【００７５】
ウイルスベクターという用語は、核酸を細胞内に移行することができるウイルスもしくはウイルス粒子、または移行された核酸自体のいずれかを指す場合がある。ウイルスベクターおよび移行プラスミドは、主にウイルスに由来する構造的遺伝エレメントおよび／または機能的遺伝エレメントを含有する。「レトロウイルスベクター」という用語は、主にレトロウイルスに由来する構造的遺伝エレメントおよび機能的遺伝エレメントまたはそれらの部分を含有するウイルスベクターまたはプラスミドを指す。「レンチウイルスベクター」という用語は、主にレンチウイルスに由来するＬＴＲを含めた構造的遺伝エレメントおよび機能的遺伝エレメントまたはそれらの部分を含有するウイルスベクターまたはプラスミドを指す。「ハイブリッド」という用語は、レトロウイルス、例えば、レンチウイルスの配列と非レンチウイルスのウイルス配列の両方を含有するベクター、ＬＴＲまたは他の核酸を指す。一実施形態では、ハイブリッドベクターとは、逆転写、複製、組み込みおよび／またはパッケージングのためのレトロウイルス、例えば、レンチウイルスの配列を含むベクターまたは移行プラスミドを指す。
【００７６】
特定の実施形態では、「レンチウイルスベクター」、「レンチウイルス発現ベクター」という用語は、レンチウイルス移行プラスミドおよび／または感染性レンチウイルス粒子を指すために使用することができる。本明細書において、クローニング部位、プロモーター、調節エレメント、異種核酸などのエレメントに言及している場合、これらのエレメントの配列は、本発明のレンチウイルス粒子ではＲＮＡ形態で存在し、本発明のＤＮＡプラスミドではＤＮＡ形態で存在することが理解されるべきである。
【００７７】
プロウイルスの各末端は「長い末端反復」または「ＬＴＲ」と称される構造である。「長い末端反復（ＬＴＲ）」という用語は、それらの天然の配列の状況では、直接反復であり、Ｕ３領域、Ｒ領域およびＵ５領域を含有する、レトロウイルスのＤＮＡの末端に位置する塩基対のドメインを指す。ＬＴＲにより、一般に、レトロウイルスの遺伝子の発現（例えば、促進、開始および遺伝子転写物のポリアデニル化）およびウイルス複製の基礎をなす機能がもたらされる。ＬＴＲは、転写制御エレメント、ポリアデニル化シグナルおよびウイルスのゲノムの複製および組み込みのために必要な配列を含めた多数の調節シグナルを含有する。ウイルスＬＴＲは、Ｕ３、ＲおよびＵ５と称される３つの領域に分けられる。Ｕ３領域はエンハンサーエレメントおよびプロモーターエレメントを含有する。Ｕ５領域はプライマー結合部位とＲ領域の間の配列であり、ポリアデニル化配列を含有する。Ｒ（反復）領域にはＵ３領域およびＵ５領域が隣接する。ＬＴＲは、Ｕ３領域、Ｒ領域およびＵ５領域で構成され、ウイルスのゲノムの５’末端および３’末端の両方に出現する。５’ＬＴＲにはゲノムの逆転写のために必要な配列（ｔＲＮＡプライマー結合部位）および粒子へのウイルスＲＮＡの効率的なパッケージングのために必要な配列（プサイ部位）が近接している。
【００７８】
本明細書で使用される場合、「パッケージングシグナル」または「パッケージング配列」という用語は、ウイルスカプシドまたは粒子内へのウイルスＲＮＡの挿入のために必要な、レトロウイルスのゲノム内に位置する配列を指す。例えば、Ｃｌｅｖｅｒら、１９９５年  Ｊ．  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、６９巻、４号；２１０１〜２１０９頁を参照されたい。いくつかのレトロウイルスベクターは、ウイルスのゲノムのキャプシド形成のために必要な最小のパッケージングシグナル（プサイ［Ψ］または［Ψ＋］配列とも称される）を使用する。したがって、本明細書で使用される場合、「パッケージング配列」、「パッケージングシグナル」、「プサイ」という用語および「Ψ」という符号は、ウイルス粒子形成の間のレトロウイルスのＲＮＡ鎖のキャプシド形成のために必要な非コード配列への言及に使用される。
【００７９】
種々の実施形態では、ベクターは、改変された５’ＬＴＲおよび／または３’ＬＴＲを含む。３’ＬＴＲの改変は、多くの場合、ウイルスを複製欠損性にすることによってレンチウイルス系またはレトロウイルス系の安全性を改善するために行われる。本明細書で使用される場合、「複製欠損性」という用語は、完全な、有効な複製ができず、したがって、感染性ビリオンが産生されない（例えば、複製欠損性レンチウイルス後代）ウイルスを指す。「複製コンピテント」という用語は、複製することができ、したがって、ウイルスのウイルス複製により感染性ビリオン（例えば、複製コンピテントレンチウイルス後代）を産生することができる野生型ウイルスまたはバリアントウイルスを指す。
【００８０】
「自己不活性化」（ＳＩＮ）ベクターとは、１回目のウイルス複製を越えてウイルスが転写されることを防ぐために、Ｕ３領域として公知の右側の（３’）ＬＴＲのエンハンサー−プロモーター領域が改変された（例えば、欠失および／または置換によって）複製欠損性ベクター、例えば、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターを指す。これは、ウイルス複製の間に右側の（３’）ＬＴＲのＵ３領域が左側の（５’）ＬＴＲのＵ３領域の鋳型として使用され、したがって、ウイルスの転写物はＵ３エンハンサー−プロモーターなしでは生じ得ないことに起因する。本発明の別の実施形態では、３’ＬＴＲは、Ｕ５領域が、例えば、異種もしくは合成ポリ（Ａ）配列、１つまたは複数のインスレーターエレメント、および／または誘導性プロモーターに置き換わるように改変されている。ＬＴＲに対する改変、例えば、３’ＬＴＲ、５’ＬＴＲ、または３’ＬＴＲと５’ＬＴＲの両方に対する改変なども、本発明に包含されることに留意するべきである。
【００８１】
５’ＬＴＲのＵ３領域を、ウイルス粒子の産生の間にウイルスのゲノムの転写を駆動するための異種プロモーターで置き換えることによって、さらなる安全性の増強がもたらされる。使用することができる異種プロモーターの例としては、例えば、ウイルス性のシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター（例えば、初期または後期）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（例えば、最初期）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーターが挙げられる。典型的なプロモーターは、Ｔａｔに依存しない様式で高レベルの転写を駆動することができる。この置き換えにより、ウイルス産生系に完全なＵ３配列が存在しないので、複製コンピテントウイルスが生成される組換えの可能性が低下する。ある実施形態では、異種プロモーターは、誘導性であり得、したがって、１つまたは複数の誘導因子が存在する場合にのみウイルスのゲノムの全部または一部の転写が起こる。誘導因子としては、これだけに限定されないが、１つまたは複数の化合物または宿主細胞が培養される温度もしくはｐＨなどの生理的条件が挙げられる。
【００８２】
いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、ＴＡＲエレメントを含む。「ＴＡＲ」という用語は、レンチウイルス（例えば、ＨＩＶ）のＬＴＲのＲ領域に位置する「トランス活性化反応」遺伝エレメントを指す。このエレメントは、レンチウイルスのトランス活性化因子（ｔａｔ）遺伝エレメントと相互作用して、ウイルス複製を増強する。しかし、このエレメントは、５’ＬＴＲのＵ３領域が異種プロモーターで置き換えられている実施形態では必要ない。
【００８３】
「Ｒ領域」とは、レトロウイルスＬＴＲ内の、キャップ形成基の開始点（すなわち、転写の開始点）で始まり、ポリＡトラクトの開始点の直前で終わる領域を指す。Ｒ領域は、Ｕ３領域およびＵ５領域と隣接しているとも定義される。Ｒ領域は、逆転写の間に新生ＤＮＡをゲノムの一方の末端から他方の末端まで移行させることにおいて役割を果たす。
【００８４】
本明細書で使用される場合、「ＦＬＡＰエレメント」という用語は、その配列がレトロウイルス、例えば、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２のセントラルポリプリントラクトおよび中心終結配列（ｃＰＰＴおよびＣＴＳ）を含む核酸を指す。適切なＦＬＡＰエレメントは米国特許第６，６８２，９０７号およびＺｅｎｎｏｕら、２０００年、Ｃｅｌｌ、１０１巻：１７３頁に記載されている。ＨＩＶ−１の逆転写の間、セントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）にあるプラス鎖ＤＮＡの中心開始点および中心終結配列（ＣＴＳ）にある中心終結点により、３本鎖ＤＮＡ構造：ＨＩＶ−１中心ＤＮＡフラップの形成が導かれる。いかなる理論に縛られることも望むものではないが、ＤＮＡフラップは、レンチウイルスのゲノム核内移行のシス活性決定因子として働く可能性があり、かつ／またはウイルスの力価を増大させる可能性がある。特定の実施形態では、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターの骨格は、ベクター内の、目的の異種遺伝子の上流または下流の１つまたは複数のＦＬＡＰエレメントを含む。例えば、特定の実施形態では、移行プラスミドはＦＬＡＰエレメントを含む。一実施形態では、本発明のベクターは、ＨＩＶ−１から単離されたＦＬＡＰエレメントを含む。
【００８５】
一実施形態では、レトロウイルス移行ベクターまたはレンチウイルス移行ベクターは、１つまたは複数の輸送エレメントを含む。「輸送エレメント」という用語は、核から細胞の細胞質へのＲＮＡ転写物の輸送を調節するシス作用性転写後調節エレメントを指す。ＲＮＡ輸送エレメントの例としては、これだけに限定されないが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）（例えばＣｕｌｌｅｎら、１９９１年  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６５巻：１０５３頁；Ｃｕｌｌｅｎら、１９９１年  Ｃｅｌｌ  ５８巻：４２３頁を参照されたい）、およびＢ型肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＨＰＲＥ）が挙げられる。一般に、ＲＮＡ輸送エレメントは遺伝子の３’ＵＴＲ内に配置され、１つまたは多数のコピーとして挿入することができる。
【００８６】
特定の実施形態では、ウイルスベクターにおける異種配列の発現は、転写後調節エレメント、効率的なポリアデニル化部位、および必要に応じて、転写終結シグナルをベクターに組み入れることによって増大する。種々の転写後調節エレメント、例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ；Ｚｕｆｆｅｒｅｙら、１９９９年、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、７３巻：２８８６頁）；Ｂ型肝炎ウイルスに存在する転写後調節エレメント（ＨＰＲＥ）（ＨｕａｎｇおよびＹｅｎ、１９９５、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．、５巻：３８６４頁）；および同様のもの（Ｌｉｕら、１９９５年、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、９巻：１７６６頁）により、タンパク質における異種核酸の発現が増大し得る。いくつかの場合には、ＷＰＲＥまたはＨＰＲＥなどの転写後調節エレメントにより、細胞の形質転換のリスクが増大し、かつ／またはｍＲＮＡ転写物の量が実質的にもしくは有意に増大しない、またはｍＲＮＡの安定性が増大しないので、特定の実施形態では、本発明のベクターはこれらのエレメントを欠くまたはそれを含まない。したがって、いくつかの実施形態では、本発明のベクターは、追加的な安全対策としてＷＰＲＥまたはＨＰＲＥを欠くまたはそれを含まない。
【００８７】
異種核酸転写物の効率的な終結およびポリアデニル化を導くエレメントにより、異種性の遺伝子発現が増加する。転写終結シグナルは、一般に、ポリアデニル化シグナルの下流に見いだされる。「ポリＡ部位」または「ポリＡ配列」という用語は、本明細書で使用される場合、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによる新生ＲＮＡ転写物の終結およびポリアデニル化の両方を導くＤＮＡ配列を指す。ポリＡ尾部を欠く転写物は不安定であり、急速に分解されるので、組換え転写物の効率的なポリアデニル化が望ましい。本発明のベクターにおいて使用することができるポリＡシグナルの実例としては、理想的なポリＡ配列（例えば、ＡＡＴＡＡＡ、ＡＴＴＡＡＡ  ＡＧＴＡＡＡ）、ウシ成長ホルモンポリＡ配列（ＢＧＨｐＡ）、ウサギβ−グロビンポリＡ配列（ｒβｇｐＡ）、または当技術分野で公知の別の適切な異種性または内在性のポリＡ配列が挙げられる。
【００８８】
ある実施形態では、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターは、１つまたは複数のインスレーターエレメントをさらに含む。インスレーターエレメントは、レンチウイルスにより発現された配列、例えば、治療用ポリペプチドを、ゲノムＤＮＡ内に存在するシス作用性エレメントによって媒介され、移行した配列（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の調節解除された発現をもたらす可能性がある組み込み部位の影響（すなわち、位置の影響；例えば、Ｂｕｒｇｅｓｓ−Ｂｅｕｓｓｅら、２００２年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、９９巻：１６４３３頁；Ｚｈａｎら、２００１年、Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅｔ．、１０９巻：４７１頁を参照されたい）から保護することに寄与し得る。いくつかの実施形態では、移行ベクターは、３’ＬＴＲに１つまたは複数のインスレーターエレメントを含み、プロウイルスを宿主ゲノムに組み込む際に、プロウイルスは、３’ＬＴＲの重複によって５’ＬＴＲまたは３’ＬＴＲの両方に１つまたは複数のインスレーターを含む。本発明において使用するための適切なインスレーターとしては、これだけに限定されないが、ニワトリβ−グロビンインスレーター（参照により本明細書に組み込まれるＣｈｕｎｇら、１９９３年、Ｃｅｌｌ  ７４巻：５０５頁；Ｃｈｕｎｇら、１９９７年、ＰＮＡＳ  ９４巻：５７５頁；およびＢｅｌｌら、１９９９年、Ｃｅｌｌ  ９８巻：３８７頁を参照されたい）が挙げられる。インスレーターエレメントの例としては、これだけに限定されないが、ニワトリＨＳ４などのβ−グロビン遺伝子座由来のインスレーターが挙げられる。
【００８９】
本発明の特定の実施形態によると、ウイルスベクターの骨格配列の大部分または全ては、レンチウイルス、例えば、ＨＩＶ−１に由来する。しかし、レンチウイルスの配列の多くの異なる供給源を用いることができ、特定のレンチウイルスの配列における多数の置換および変更を、移行ベクターの本明細書に記載の機能を行う能力を損なうことなく適応させることができることが理解されるべきである。さらに、種々のレンチウイルスベクターが当技術分野で公知であり、その多くが本発明のウイルスベクターまたは移行プラスミドを作製するために適合させることができる。Ｎａｌｄｉｎｉら、（１９９６年ａ、１９９６年ｂ、および１９９８年）；Ｚｕｆｆｅｒｅｙら、（１９９７年）；Ｄｕｌｌら、１９９８年、米国特許第６，０１３，５１６号；および同第５，９９４，１３６号を参照されたい。
【００９０】
本明細書で使用される場合、「化合物」という用語は、小有機分子、プロスタグランジン、ｃＡＭＰエンハンサー、Ｗｎｔ経路アゴニスト、ｃＡＭＰ／ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路アゴニスト、Ｃａ２＋二次メッセンジャー経路アゴニスト、一酸化窒素（ＮＯ）／アンジオテンシンシグナル伝達アゴニストおよび無機化学物質を、これだけに限定することなく、それらの類似体および誘導体の全てを含め包含する。
【００９１】
「小分子」、「小有機分子」または「小分子化合物」とは、約５ｋＤ未満、約４ｋＤ未満、約３ｋＤ未満、約２ｋＤ未満、約１ｋＤ未満、または約０．５ｋＤ未満の分子量を有する低分子量の化合物を指す。特定の実施形態では、小分子として、核酸、ペプチド、ペプチド模倣物、ペプトイド、および他の小さな有機化合物または薬物などを挙げることができる。真菌抽出物、細菌抽出物、または藻類抽出物などの化学的混合物および／または生物学的混合物のライブラリーは当技術分野で公知であり、本発明のアッセイのいずれかを用いてスクリーニングすることができる。分子ライブラリーを合成するための方法の例は、（Ｃａｒｅｌｌら、１９９４年ａ；Ｃａｒｅｌｌら、１９９４年ｂ；Ｃｈｏら、１９９３年；ＤｅＷｉｔｔら、１９９３年；Ｇａｌｌｏｐら、１９９４年；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら、１９９４年）に見いだすことができる。
【００９２】
化合物のライブラリーは、溶液中（Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、１９９２年）またはビーズ上（Ｌａｍら、１９９１年）、チップ上（Ｆｏｄｏｒら、１９９３年）、細菌、胞子（Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第５，２２３，４０９号、１９９３年）、プラスミド（Ｃｕｌｌら、１９９２年）またはファージ上（Ｃｗｉｒｌａら、１９９０年；Ｄｅｖｌｉｎら、１９９０年；Ｆｅｌｉｃｉら、１９９１年；Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第５，２２３，４０９号、１９９３年；ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ、１９９０年）に提供され得る。本明細書に開示されている発明は、細胞シグナル伝達経路の任意の点でプロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる小分子を同定するために種々のライブラリーを使用することを包含する。本発明の目的に関して有用なライブラリーとしては、これだけに限定されないが、（１）化学物質ライブラリー、（２）天然物ライブラリー、および（３）ランダムペプチド、オリゴヌクレオチドおよび／または有機分子で構成されるコンビナトリアルライブラリーが挙げられる。
【００９３】
化学物質ライブラリーは、公知の化合物または天然物スクリーニングによって「ヒット（ｈｉｔ）」または「リード（ｌｅａｄ）」と同定される化合物の構造類似体および誘導体からなる。天然物ライブラリーは、スクリーニング用の混合物を創製するために使用される微生物、動物、植物、または海洋生物体の収集物から（１）土壌、植物または海洋微生物由来のブロスの発酵および抽出または（２）植物または海洋生物体の抽出によって得られる。天然物ライブラリーは、ポリケチド、非リボソーム性ペプチド、およびそのバリアント（天然に存在しない）を含む。概説について、Ｃａｎｅ，  Ｄ．  Ｅ．ら、（１９９８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２巻：６３〜６８頁を参照されたい。コンビナトリアルライブラリーは、混合物としての、多数のペプチド、オリゴヌクレオチドまたは有機化合物で構成される。これらは従来の自動合成方法、ＰＣＲ、クローニングまたは独自の合成方法によって調製することが比較的容易である。ペプチドとオリゴヌクレオチドのコンビナトリアルライブラリーが特に重要である。
【００９４】
より詳細には、コンビナトリアル化学物質ライブラリーは、化学合成または生物学的合成のいずれかによって、試薬などのいくつもの化学的「基本要素」を組み合わせることによって生成した多様な化合物の収集物である。例えば、ポリペプチドライブラリーなどの線状コンビナトリアル化学ライブラリーは、化学的基本要素（アミノ酸）のセットを、所与の化合物の長さ（すなわち、ポリペプチド化合物におけるアミノ酸の数）についてあらゆる可能なやり方で組み合わせることによって形成される。化学物質の基本要素のそのようなコンビナトリアル混合によって数百万の化合物を合成することができる。
【００９５】
コンビナトリアルケミストリーおよびそれから創製されるライブラリーの概説については、Ｈｕｃ，  Ｉ．およびＮｇｕｙｅｎ，  Ｒ．（２００１年）Ｃｏｍｂ．  Ｃｈｅｍ．  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎ  ４巻：５３〜７４頁；Ｌｅｐｒｅ，  Ｃ  Ａ．（２００１年）Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．  Ｔｏｄａｙ  ６巻：１３３〜１４０頁；Ｐｅｎｇ，  Ｓ．  Ｘ．（２０００年）Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．  １４巻：４３０〜４４１頁；Ｂｏｈｍ，  Ｈ．  Ｊ．およびＳｔａｈｌ，  Ｍ．（２０００年）Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  ４巻：２８３〜２８６頁；Ｂａｒｎｅｓ，  ＣおよびＢａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，  Ｓ．（２０００年）Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  ４巻：３４６〜３５０頁；Ｌｅｐｒｅ，  Ｅｎｊａｌｂａｌ，  Ｃら、（２０００年）Ｍａｓｓ  Ｓｅｐｔｒｏｍ  Ｒｅｖ．  １９巻：１３９〜１６１頁；Ｈａｌｌ，  Ｄ．  Ｇ．、（２０００年）Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １８巻：２６２〜２６２頁；Ｌａｚｏ，  Ｊ．  Ｓ．、およびＷｉｐｆ，  Ｐ．（２０００年）Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｅｘｐ．  Ｔｈｅｒ．  ２９３巻：７０５〜７０９頁；Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，  Ｒ．  Ａ．、（２０００年）Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｔｏｘｉｃｏｌ．  ４０巻：２７３〜２８２頁；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，  Ｓ．（２０００年）Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．（２０００年）４巻：３３８〜３４５頁；Ｋｏｐｙｌｏｖ，  Ａ．  Ｍ．およびＳｐｉｒｉｄｏｎｏｖａ，  Ｖ．  Ａ．（２０００年）Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．（Ｍｏｓｋ）３４巻：１０９７〜１１１３頁；Ｗｅｂｅｒ，  Ｌ．（２０００年）Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  ４巻：２９５〜３０２頁；Ｄｏｌｌｅ，  Ｒ．  Ｅ．（２０００年）Ｊ．  Ｃｏｍｂ．  Ｃｈｅｍ．  ２巻：３８３〜４３３頁；Ｆｌｏｙｄ，  Ｃ  Ｄ．ら、（１９９９年）Ｐｒｏｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ３６巻：９１〜１６８頁；Ｋｕｎｄｕ，  Ｂ．ら、（１９９９年）Ｐｒｏｇ．  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．  ５３巻：８９〜１５６頁；Ｃａｂｉｌｌｙ，  Ｓ．（１９９９年）Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １２巻：１４３〜１４８頁；Ｌｏｗｅ，  Ｇ．（１９９９年）Ｎａｔ．  Ｐｒｏｄ．  Ｒｅｐ．  １６巻：６４１〜６５１頁；Ｄｏｌｌｅ，  Ｒ．  Ｅ．およびＮｅｌｓｏｎ，  Ｋ．  Ｈ．（１９９９年）Ｊ．  Ｃｏｍｂ．  Ｃｈｅｍ．  １巻：２３５〜２８２頁；Ｃｚａｒｎｉｃｋ，  Ａ．  Ｗ．およびＫｅｅｎｅ，  Ｊ．  Ｄ．（１９９８年）Ｃｕｒｒ．  Ｂｉｏｌ．  ８巻：Ｒ７０５〜Ｒ７０７頁；Ｄｏｌｌｅ，  Ｒ．  Ｅ．（１９９８年）Ｍｏｌ．  Ｄｉｖｅｒｓ．  ４巻：２３３〜２５６頁；Ｍｙｅｒｓ，  Ｐ．  Ｌ．、（１９９７年）Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ８巻：７０１〜７０７頁；およびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，  Ａ．およびＣｏｒｔｅｓｅ，  Ｒ．（１９９７年）Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ３７８巻：４４３頁を参照されたい。
【００９６】
コンビナトリアルライブラリーを調製するためのデバイスが市販されている（例えば、３５７ＭＰＳ、３９０ＭＰＳ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｔｅｃｈ、Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ  Ｋｙ．、Ｓｙｍｐｈｏｎｙ、Ｒａｉｎｉｎ、Ｗｏｂｕｒｎ、Ｍａｓｓ．、４３３Ａ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．、９０５０Ｐｌｕｓ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、Ｍａｓｓ．を参照されたい）。さらに、多数のコンビナトリアルライブラリー自体が市販されている（例えば、ＣｏｍＧｅｎｅｘ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．、Ａｓｉｎｅｘ、Ｍｏｓｃｏｗ、Ｒｕ、Ｔｒｉｐｏｓ，  Ｉｎｃ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．、ＣｈｅｍＳｔａｒ、Ｌｔｄ．、Ｍｏｓｃｏｗ、ＲＵ、３Ｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｅｘｔｏｎ、Ｐａ．、Ｍａｒｔｅｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ、Ｍｄ．などを参照されたい）。
【００９７】
本明細書で使用される場合、「代謝前駆体」という用語は、所望の化合物に代謝される化合物の形態を指す。
【００９８】
本明細書で使用される場合、「代謝産物」という用語は、化合物が代謝された結果として生じた形態を指す。
【００９９】
有機化学物質などの化学物質に関して、「類似体」または「誘導体」とは、別の化学的物質と構造および機能が類似しており、多くの場合は単一のエレメントまたは基によって構造的に異なるが、親化学物質と同じ機能を保持する場合には２つ以上の基（例えば、２つ、３つ、または４つの基）の改変によって異なってよい化学分子に関する。そのような改変は当業者には常套的なものであり、それらとして、例えば、酸のエステルまたはアミドなどの付加した化学的部分または置換された化学的部分、保護基、例えば、アルコールまたはチオールに対するベンジル基およびアミンに対するｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（ｂｕｔｏｘｙｌｃａｒｂｏｎｙｌ）基が挙げられる。アルキル側鎖に対する改変、例えば、アルキル置換（例えば、メチル、ジメチル、エチルなど）、側鎖の飽和または不飽和のレベルに対する改変、および置換されたフェニルおよびフェノキシなどの改変された基の付加も包含される。誘導体は、ビオチン部分またはアビジン部分などのコンジュゲート、および、西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素なども含んでよく、放射性標識部分、生物発光部分、化学発光部分、または蛍光部分を含んでよい。また、本明細書に記載の作用剤（ａｇｅｎｔ）に部分を付加して、それらの薬物動態的特性を変更すること、例えば、他の望ましい特性の中でも、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにおける半減期を増加させること、またはそれらの細胞への浸透性を増加させることができる。医薬品の多数の望ましい品質（例えば、溶解性、生物学的利用能、製造など）を増強することが公知であるプロドラッグも包含される（例えば、例示的なＥＰアゴニストプロドラッグについては、そのようなアゴニストに関するその開示に関して参照により組み込まれるＷＯ／２００６／０４７４７６を参照されたい）。
【０１００】
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＲＮＡ、ゲノムＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、プラス鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ（＋））、マイナス鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ（−））、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）またはＤＮＡを指す。ポリヌクレオチドは一本鎖ポリヌクレオチドおよび二本鎖ポリヌクレオチドを包含する。本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に記載の参照配列（例えば、配列表を参照されたい）のいずれかに対して少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドまたはバリアントを包含し、一般にはバリアントが参照配列の少なくとも１つの生物活性を維持することが好ましい。種々の例示的な実施形態では、本発明は、一部において、ウイルスベクターおよび移行プラスミドのポリヌクレオチド配列、ならびにそれを含む組成物を意図している。特定の実施形態では、本発明は、１つまたは複数の治療用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび／または他の目的の遺伝子を提供する。特定の実施形態では、本発明は、本明細書の他の箇所で考察されているグロビンポリペプチドまたはＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＤ（ＡＬＤ）、メンバー１（ＡＢＣＤ１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【０１０１】
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチドバリアント」および「バリアント」などの用語は、参照ポリヌクレオチド配列、または参照配列と下で定義されているストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドと実質的な配列同一性を示すポリヌクレオチドを指す。これらの用語は、参照ポリヌクレオチドと比較して１つまたは複数のヌクレオチドが付加もしくは欠失している、または異なるヌクレオチドに置き換えられているポリヌクレオチドを包含する。この点について、参照ポリヌクレオチドに、変更されたポリヌクレオチドに参照ポリヌクレオチドの生物学的機能または活性が保持される変異、付加、欠失および置換を含めた特定の変更を行うことができることが当技術分野ではよく理解されている。
【０１０２】
本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、そのネイティブな状態では通常それに付随する構成成分を実質的にまたは基本的に含まない材料、例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、細胞を意味する。特定の実施形態では、「得られた」または「由来する」という用語は、単離されたと同義に使用される。例えば、「単離されたポリヌクレオチド」とは、本明細書で使用される場合、天然に存在する状態でそれに隣接する配列から精製されたポリヌクレオチド、例えば、通常はその断片に近接する配列から取り出されたＤＮＡ断片を指す。
【０１０３】
ポリヌクレオチドの方向を説明する用語としては、５’（通常、ポリヌクレオチドの遊離ホスフェート基を有する末端）および３’（通常、ポリヌクレオチドの遊離ヒドロキシル（ＯＨ）基を有する末端）が挙げられる。ポリヌクレオチド配列は、５’から３’の方向または３’から５’の方向にアノテートされ得る。
【０１０４】
「相補的な」および「相補性」という用語は、塩基対合規則によって関連するポリヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）を指す。例えば、ＤＮＡ配列５’ＡＧＴＣＡＴＧ３’の相補鎖は３’ＴＣＡＧＴＡＣ５’である。後者の配列は多くの場合、逆相補体として左側に５’末端、右側に３’末端の５’ＣＡＴＧＡＣＴ３’と書かれる。その逆相補体と等しい配列は、パリンドローム配列であると言える。相補性は、塩基対合規則に従って核酸の塩基の一部のみがマッチする場合、「部分的」であり得る。または、核酸間には「完全な」または「全体的な」相補性があり得る。
【０１０５】
「核酸カセット」という用語は、本明細書で使用される場合、ＲＮＡ、その後、ポリペプチドを発現することができるベクター内の遺伝子配列を指す。一実施形態では、核酸カセットは、目的の遺伝子（複数可）、例えば、目的のポリヌクレオチド（複数可）を含有する。別の実施形態では、核酸カセットは、１つまたは複数の発現制御配列および目的の遺伝子（複数可）、例えば、目的のポリヌクレオチド（複数可）を含有する。ベクターは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれより多くの核酸カセットを含んでよい。核酸カセットは、ベクター内で位置的におよび逐次的に特定の方向に向けられ、したがって、カセット内の核酸がＲＮＡに転写され、必要な場合にはタンパク質またはポリペプチドに翻訳され、形質転換された細胞における活性のために必要な適切な翻訳後改変を受け、適切な細胞内区画にターゲティングされるまたは細胞外区画に分泌されることによって生物活性について適した区画に転置され得る。カセットは、ベクターへの迅速な挿入に適した３’末端および５’末端を有することが好ましく、例えば、カセットは、各末端に制限エンドヌクレアーゼ部位を有する。本発明の好ましい実施形態では、核酸カセットは、造血障害などの遺伝的障害を処置する、予防する、または軽減するために使用する治療用遺伝子の配列を含有する。カセットは、単一の単位としてプラスミドまたはウイルスベクターから除去することおよびそれに挿入することができる。
【０１０６】
ポリヌクレオチドとは目的のポリヌクレオチド（複数可）を包含する。本明細書で使用される場合、「目的のポリヌクレオチド（複数可）」という用語は、１つまたは複数のポリヌクレオチド、例えば、発現することが望まれる発現ベクターに挿入された、ポリペプチド（すなわち、目的のポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドを指す。
好ましい実施形態では、本発明のベクターおよび／またはプラスミドは、１つまたは複数の目的のポリヌクレオチド、例えば、グロビン遺伝子またはＡＢＣＤ１遺伝子を含む。ある実施形態では、目的のポリヌクレオチド、例えばグロビン遺伝子は、造血性の疾患または障害の処置、予防、または軽減において治療効果をもたらすポリペプチドをコードし、該ポリペプチドは、「治療用ポリペプチド」と称することができる。例えば、その完全な開示および特許請求の範囲が参照により本明細書に詳細に組み込まれる米国特許第６，０５１，４０２号および同第７，９０１，６７１号を参照されたい。例えば、配列番号１、配列番号５、配列番号１０、および配列番号１４を参照されたい。
【０１０７】
ある他の実施形態では、目的のポリヌクレオチドは、「治療用ポリペプチド」と称することができる、副腎白質ジストロフィーまたは副腎脊髄神経障害の処置、予防、または軽減における治療効果をもたらすポリペプチド、例えば、ＡＢＣＤ１遺伝子をコードする。例えば、配列番号１６〜１７を参照されたい。例えば、その完全な開示および特許請求の範囲が参照により本明細書に詳細に組み込まれる米国特許第５，８６９，０３９号および同第６，０１３，７６９号を参照されたい。
【０１０８】
本明細書で使用される「グロビン」という用語は、ヘム部分と共有結合または非共有結合することができ、したがって、酸素を輸送または貯蔵することができる全てのタンパク質またはタンパク質サブユニットを意味する。脊椎動物および無脊椎動物のヘモグロビンのサブユニット、脊椎動物および無脊椎動物のミオグロビンまたはその変異体はグロビンという用語に含まれる。グロビンの例としては、α−グロビンまたはそのバリアント、β−グロビンまたはそのバリアント、γ−グロビンまたはそのバリアント、およびδ−グロビンまたはそのバリアントが挙げられる。
【０１０９】
一実施形態では、目的のポリヌクレオチドは、異常ヘモグロビン症を処置するための治療的機能をもたらすポリペプチド、例えば、α−グロビン、β−グロビンまたはβ−グロビンＡ−Ｔ８７Ｑをコードする遺伝子である。目的のポリヌクレオチド、およびそれにコードされるポリペプチドとは、野生型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびにその機能的なバリアントおよび断片をどちらも包含する。特定の実施形態では、機能的なバリアントは、対応する野生型参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を有する。ある実施形態では、機能的なバリアントまたは断片は、対応する野生型ポリペプチドの生物活性の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、または少なくとも１１０％またはそれより多くを有する。本発明において使用するために適した代表的なポリヌクレオチド配列としては、これだけに限定されないが、α−グロビン、β−グロビン、およびβ−グロビンＡ−Ｔ８７Ｑが挙げられる。
【０１１０】
本発明のポリヌクレオチドは、コード配列自体の長さにかかわらず、他のＤＮＡ配列、例えば、本明細書の他の箇所で開示されているまたは当技術分野で公知のプロモーターおよび／またはエンハンサー、非翻訳領域（ＵＴＲ）、コザック配列、ポリアデニル化シグナル、追加的な制限酵素部位、多重クローニング部位、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、リコンビナーゼ認識部位（例えば、ＬｏｘＰ部位、ＦＲＴ部位、およびＡｔｔ部位）、終結コドン、転写終結シグナル、および自己切断性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、エピトープタグなどと組み合わせることができ、したがって、それらの全体の長さは相当に変動してよい。したがって、ほぼどんな長さのポリヌクレオチド断片も用いることができ、全長は調製の容易さおよび意図された組換えＤＮＡプロトコールにおける使用によって限定されることが好ましいことが意図されている。
【０１１１】
「発現制御配列」という用語は、作用的に連結したポリヌクレオチドの転写または発現を導くこと、増大させること、調節すること、または制御することができる１つまたは複数のプロモーター、エンハンサー、または他の転写制御エレメントまたはそれらの組み合わせを含むポリヌクレオチド配列を指す。特定の実施形態では、本発明のベクターは、特定の細胞、細胞型、または細胞系列、例えば、標的細胞に特異的な１つまたは複数の発現制御配列を含む、すなわち、特定の細胞、細胞型、または細胞系列に特異的な発現制御配列に作用的に連結したポリヌクレオチドの発現は、標的細胞では発現され、他の非標的細胞では発現されない。細胞特異的である、ベクターにおける１つまたは複数の発現制御配列のひとつひとつは、所望の療法に応じて、同じ細胞型または異なる細胞型において発現し得る。好ましい実施形態では、ベクターは、造血幹細胞または造血前駆細胞などの造血細胞に特異的な１つまたは複数の発現制御配列を含む。他の好ましい実施形態では、ベクターは、赤血球系細胞に特異的な１つまたは複数の発現制御配列を含む。
【０１１２】
「プロモーター」という用語は、本明細書で使用される場合、ＲＮＡポリメラーゼが結合するポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の認識部位を指す。「エンハンサー」という用語は、転写の増強をもたらすことができる配列を含有し、いくつかの場合には別の制御配列に対するその方向とは独立して機能することができるＤＮＡのセグメントを指す。エンハンサーは、プロモーターおよび／または他のエンハンサーエレメントと協同的または相加的に機能することができる。「プロモーター／エンハンサー」という用語は、プロモーター機能とエンハンサー機能の両方をもたらすことができる配列を含有するＤＮＡのセグメントを指す。
【０１１３】
特定の実施形態では、本発明のベクターは、外因性、内在性、または異種性の制御配列、例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサーを含む。「内在性の」制御配列とは、ゲノムにおける所与の遺伝子と天然に連結している制御配列である。「外因性の」制御配列とは、遺伝子操作（すなわち、分子生物学的技法）によって遺伝子の近位に配置され、したがってその遺伝子の転写が、連結したエンハンサー／プロモーターによって導かれるような制御配列である。「異種性の」制御配列は、遺伝的に操作される細胞とは異なる種由来の外因性の配列である。「合成」制御配列は、もう１つの内在性配列および／または外因性配列、ならびに／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｓｉｌｉｃｏにおいて特定の遺伝子治療のための最適なプロモーター活性および／またはエンハンサー活性をもたらすことが決定された配列のエレメントを含んでよい。
【０１１４】
「作動可能に連結した」という用語は、記載されている構成成分が、それらの意図された様式で機能することを可能にする関係にある近位を指す。一実施形態では、この用語は、核酸発現制御配列（例えば、プロモーター、および／またはエンハンサー、または他の発現制御配列）と第２のポリヌクレオチド配列、例えば、目的のポリヌクレオチドとの間の機能的な連結であって、ここで、該発現制御配列により、第２の配列に対応する核酸の転写が導かれる連結を指す。
【０１１５】
本明細書で使用される場合、「構成的発現制御配列」という用語は、作動可能に連結した配列の転写を継続的または連続的に可能にするプロモーター、エンハンサー、またはプロモーター／エンハンサーを指す。構成的発現制御配列は、多種多様な細胞および組織型における発現を可能にする「遍在」プロモーター、エンハンサー、またはプロモーター／エンハンサーであってもよく、制限されたいろいろの種類の細胞および組織型の発現をそれぞれ可能にする「細胞特異的」、「細胞型特異的」「細胞系列特異的」または「組織特異的」プロモーター、エンハンサー、またはプロモーター／エンハンサーであってもよい。例示的な遍在する発現制御配列としては、これだけに限定されないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、ウイルス性のシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、初期または後期）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）ＬＴＲプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲ、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーター、ワクシニアウイルス由来のＨ５プロモーター、Ｐ７．５プロモーター、およびＰ１１プロモーター、伸長因子１−アルファ（ＥＦ１ａ）プロモーター、初期増殖応答１（ＥＧＲ１）、フェリチンＨ（ＦｅｒＨ）、フェリチンＬ（ＦｅｒＬ）、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、真核生物翻訳開始因子４Ａ１（ＥＩＦ４Ａ１）、熱ショック７０ｋＤａタンパク質５（ＨＳＰＡ５）、熱ショックタンパク質９０ｋＤａベータ、メンバー１（ＨＳＰ９０Ｂ１）、熱ショックタンパク質７０ｋＤａ（ＨＳＰ７０）、β−キネシン（β−ＫＩＮ）、ヒトＲＯＳＡ２６遺伝子座（Ｉｒｉｏｎｓら、（２００７年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２５巻、１４７７〜１４８２頁）、ユビキチンＣプロモーター（ＵＢＣ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１（ＰＧＫ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ−アクチン（ＣＡＧ）プロモーター、およびβ−アクチンプロモーターが挙げられる。
【０１１６】
特定の実施形態では、所望のポリヌクレオチド配列の細胞型特異的、系列特異的、または組織特異的な発現を実現する（例えば、ポリペプチドをコードする特定の核酸を細胞型、細胞系列、もしくは組織のあるサブセットにおいてのみ、または特定の発生段階に発現させる）ために、細胞、細胞型、細胞系列または組織特異的な発現制御配列を使用することが望ましい場合がある。
【０１１７】
組織特異的プロモーターの実例としては、これだけに限定されないが、Ｂ２９プロモーター（Ｂ細胞での発現）、ｒｕｎｔ転写因子（ＣＢＦａ２）プロモーター（幹細胞特異的発現）、ＣＤ１４プロモーター（単核球細胞での発現）、ＣＤ４３プロモーター（白血球および血小板での発現）、ＣＤ４５プロモーター（造血細胞での発現）、ＣＤ６８プロモーター（マクロファージでの発現）、ＣＹＰ４５０  ３Ａ４プロモーター（肝細胞での発現）、デスミンプロモーター（筋肉での発現）、エラスターゼ１プロモーター（膵腺房細胞での発現、エンドグリンプロモーター（内皮細胞での発現）、線維芽細胞特異的タンパク質１プロモーター（ＦＳＰ１）プロモーター（線維芽細胞での発現）、フィブロネクチンプロモーター（線維芽細胞での発現）、ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ１（ＦＬＴ１）プロモーター（内皮細胞での発現）、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター（星状膠細胞での発現）、インスリンプロモーター（膵ベータ細胞での発現）、インテグリン、アルファ２ｂ（ＩＴＧＡ２Ｂ）プロモーター（巨核球）、細胞内接着分子２（ＩＣＡＭ−２）プロモーター（内皮細胞）、インターフェロンベータ（ＩＦＮ−β）プロモーター（造血細胞）、ケラチン５プロモーター（ケラチノサイトでの発現）、ミオグロビン（ＭＢ）プロモーター（筋肉での発現）、筋性分化１（ＭＹＯＤ１）プロモーター（筋肉での発現）、ネフリンプロモーター（有足突起での発現）、骨ガンマ−カルボキシグルタミン酸タンパク質２（ＯＧ−２）プロモーター（骨芽細胞での発現）、３−オキソ酸ＣｏＡトランスフェラーゼ２Ｂ（Ｏｘｃｔ２Ｂ）プロモーター、（一倍体−精子細胞での発現）、サーファクタントタンパク質Ｂ（ＳＰ−Ｂ）プロモーター（肺での発現）、シナプシンプロモーター（ニューロンでの発現）、ウィスコット−アルドリッチ症候群タンパク質（ＷＡＳＰ）プロモーター（造血細胞での発現）が挙げられる。
【０１１８】
一実施形態では、本発明のベクターは、ヒトβ−グロビンプロモーター；ヒトβ−グロビンＬＣＲ；ならびにヒトα−グロビンＨＳ４０エンハンサーおよびアンキリン−１プロモーターからなる群から選択される１つまたは複数の造血細胞または組織特異的なプロモーターおよび／またはエンハンサーを含み、これらは、グロビンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結している。
【０１１９】
別の実施形態では、本発明のベクターは、ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＤ、メンバー１（ＡＢＣＤ１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、小膠細胞において活性なプロモーターを含む。ある実施形態では、プロモーターは、骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域の欠失した、ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位が置換された（ＭＮＤ）プロモーターまたは転写的に活性なその断片を含む。
【０１２０】
本明細書で使用される場合、「条件発現」とは、これだけに限定されないが、誘導性発現；抑圧可能な発現；特定の生理的、生物学的、または疾患の状態を有する細胞または組織における発現などを含めた任意の種類の条件発現を指し得る。この定義は、細胞型または組織特異的な発現を排除するものではない。本発明のある特定の実施形態は、例えば、細胞、組織、生物体などを、ポリヌクレオチドの発現を引き起こす処理もしくは条件、または目的のポリヌクレオチドによりコードされるポリヌクレオチドの発現の増大または減少を引き起こす処理または条件に供することによって発現が制御される、目的のポリヌクレオチドの条件発現を提供する。
【０１２１】
誘導性プロモーター／系の実例としては、これだけに限定されないが、ステロイド誘導性プロモーター、例えば、グルココルチコイドまたはエストロゲン受容体をコードする遺伝子のプロモーターなど（対応するホルモンで処理することによって誘導される）、メタロチオネイン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎｅ）プロモーター（種々の重金属で処理することによって誘導される）、ＭＸ−１プロモーター（インターフェロンによって誘導される）、「ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ」ミフェプリストン調節可能系（Ｓｉｒｉｎら、（２００３年）、Ｇｅｎｅ、３２３巻：６７頁）、クメート（ｃｕｍａｔｅ）誘導性遺伝子スイッチ（ＷＯ２００２／０８８３４６）、テトラサイクリン依存性調節系などが挙げられる。
【０１２２】
条件発現は、部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼを使用することによって実現することもできる。本発明のある特定の実施形態によると、ベクターは、部位特異的リコンビナーゼによって媒介される組換えのための部位を少なくとも１つ（一般には２つ）含む。本明細書で使用される場合、「リコンビナーゼ」または「部位特異的リコンビナーゼ」という用語は、野生型タンパク質であってよい、１箇所または複数箇所の組換え部位（例えば、２箇所、３箇所、４箇所、５箇所、７箇所、１０箇所、１２箇所、１５箇所、２０箇所、３０箇所、５０箇所など）が関与する組換え反応に関与する切除的または統合的なタンパク質、酵素、補因子または関連するタンパク質（Ｌａｎｄｙ（１９９３年）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３巻：６９９〜７０７頁を参照されたい）、またはその変異体、誘導体（例えば、組換えタンパク質配列またはその断片を含有する融合タンパク質）、断片、およびバリアントを包含する。本発明の特定の実施形態において使用するために適したリコンビナーゼの実例としては、これだけに限定されないが、Ｃｒｅ、Ｉｎｔ、ＩＨＦ、Ｘｉｓ、Ｆｌｐ、Ｆｉｓ、Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、ΦＣ３１、Ｃｉｎ、Ｔｎ３リゾルバーゼ、ＴｎｄＸ、ＸｅｒＣ、ＸｅｒＤ、ＴｎｐＸ、Ｈｊｃ、Ｇｉｎ、ＳｐＣＣＥ１、およびＰａｒＡが挙げられる。
【０１２３】
ベクターは、多種多様な部位特異的リコンビナーゼのいずれかのための１箇所または複数箇所の組換え部位を含んでよい。部位特異的リコンビナーゼの標的部位は、ベクター、例えば、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターの組み込みのために必要な任意の部位（複数可）に加えたものであることが理解されるべきである。本明細書で使用される場合、「組換え配列」、「組換え部位」または「部位特異的な組換え部位」という用語は、リコンビナーゼが認識し、結合する特定の核酸配列を指す。
【０１２４】
例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼのための１つの組換え部位は、８塩基対のコア配列と隣接した１３塩基対の逆方向反復（リコンビナーゼ結合部位としての機能を果たす）を２つ含む３４塩基対の配列であるｌｏｘＰである（Ｓａｕｅｒ，  Ｂ．、（１９９４年）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５巻：５２１〜５２７頁の図１を参照されたい）。他の例示的なｌｏｘＰ部位としては、これだけに限定されないが、ｌｏｘ５１１（Ｈｏｅｓｓら、１９９６年；ＢｅｔｈｋｅおよびＳａｕｅｒ、１９９７年）、ｌｏｘ５１７１（ＬｅｅおよびＳａｉｔｏ、１９９８年）、ｌｏｘ２２７２（ＬｅｅおよびＳａｉｔｏ、１９９８年）、ｍ２（Ｌａｎｇｅｒら、２００２年）、ｌｏｘ７１（Ａｌｂｅｒｔら、１９９５年）、およびｌｏｘ６６（Ａｌｂｅｒｔら、１９９５年）が挙げられる。
【０１２５】
ＦＬＰリコンビナーゼのために適切な認識部位としては、これだけに限定されないが、ＦＲＴ（ＭｃＬｅｏｄら、１９９６年）、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３（ＳｃｈｌａｋｅおよびＢｏｄｅ、１９９４年）、Ｆ４、Ｆ５（ＳｃｈｌａｋｅおよびＢｏｄｅ、１９９４年）、ＦＲＴ（ＬＥ）（Ｓｅｎｅｃｏｆｆら、１９８８年）、ＦＲＴ（ＲＥ）（Ｓｅｎｅｃｏｆｆら、１９８８年）が挙げられる。
【０１２６】
認識配列の他の例は、ａｔｔＢ配列、ａｔｔＰ配列、ａｔｔＬ配列、およびａｔｔＲ配列であり、これらはリコンビナーゼ酵素λインテグラーゼ、例えばフィーｃ３１によって認識される。φＣ３１ＳＳＲは、ヘテロタイプの部位ａｔｔＢ（長さ３４ｂｐ）とａｔｔＰ（長さ３９ｂｐ）の間の組換えのみを媒介する（Ｇｒｏｔｈら、２０００年）。ａｔｔＢおよびａｔｔＰは、それぞれ、細菌ゲノムおよびファージゲノムに対するファージインテグラーゼの付着部位に対して名づけられ、どちらも、φＣ３１ホモ二量体が結合する可能性がある不完全な逆方向反復を含有する（Ｇｒｏｔｈら、２０００年）。産物の部位であるａｔｔＬおよびａｔｔＲは、さらなるφＣ３１媒介性組換えに対して有効に不活性であり（Ｂｅｌｔｅｋｉら、２００３年）、それにより反応が不可逆的になる。挿入を触媒するために、ゲノムのａｔｔＰ部位へのａｔｔＢを有するＤＮＡの挿入が、ゲノムのａｔｔＢ部位へのａｔｔＰ部位の挿入よりも容易であることが見いだされている（Ｔｈｙａｇａｒａｊａｎら、２００１年；Ｂｅｌｔｅｋｉら、２００３年）。したがって、典型的な戦略では、相同組換えによってａｔｔＰを有する「ドッキング部位」を定義済みの遺伝子座に位置づけ、次いでそれを挿入のために、ａｔｔＢを有する入ってくる配列とパートナーにする。
【０１２７】
本明細書で使用される場合、「内部リボソーム侵入部位」または「ＩＲＥＳ」とは、ＡＴＧなどの開始コドンへのシストロン（タンパク質をコードする領域）の直接内部リボソーム侵入を促進し、それにより、キャップに依存しない遺伝子の翻訳を導くエレメントを指す。例えば、Ｊａｃｋｓｏｎら、（１９９０年）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  １５巻（１２号）：４７７〜８３頁）およびＪａｃｋｓｏｎおよびＫａｍｉｎｓｋｉ．  （１９９５年）  ＲＮＡ  １巻（１０号）：９８５〜１０００頁を参照されたい。特定の実施形態では、本発明によって意図されているベクターは、１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の目的のポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、複数のポリペプチドのそれぞれの効率的な翻訳を実現するために、ポリヌクレオチド配列を１つまたは複数のＩＲＥＳ配列または自己切断性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列によって分離することができる。
【０１２８】
本明細書で使用される場合、「コザック配列」という用語は、ｍＲＮＡのリボソームの小サブユニットへの最初の結合を著しく容易にし、翻訳を増大させる短いヌクレオチド配列を指す。コンセンサスコザック配列は（ＧＣＣ）ＲＣＣＡＴＧＧであり、Ｒはプリン（ＡまたはＧ）である（Ｋｏｚａｋ、（１９８６年）  Ｃｅｌｌ．  ４４巻（２号）：２８３〜９２頁、およびＫｏｚａｋ、（１９８７年）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １５巻（２０号）：８１２５〜４８頁）。特定の実施形態では、本発明によって意図されているベクターは、コンセンサスコザック配列を有するポリヌクレオチドおよび所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
【０１２９】
ある特定の実施形態では、ベクターは、選択マーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、ハイグロマイシン、メトトレキセート、ゼオシン、ブラストサイジン、またはテトラサイクリンに対する耐性を付与する、（ｂ）栄養要求性欠損を補完する、または（ｃ）複合培地からは入手不可能な重大な栄養分を供給するタンパク質をコードする（例えば、バチルス属のＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子）。任意の数の選択系を用いて、形質転換された細胞系を回収することができる。それらとしては、これだけに限定されないが、それぞれｔｋ細胞またはａｐｒｔ細胞において使用することができる単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（Ｗｉｇｌｅｒら、（１９７７年）  Ｃｅｌｌ  １１巻：２２３〜２３２頁）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｌｏｗｙら、（１９９０年）  Ｃｅｌｌ  ２２巻：８１７〜８２３頁）が挙げられる。
【０１３０】
種々の実施形態では、本発明のベクターを使用して、１つまたは複数のポリペプチド、例えば、グロビンの発現を増大させる、確立するおよび／または維持する。「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書では互換的に使用され、アミノ酸残基のポリマーならびにそのバリアントおよび合成類似体を指す。したがって、これらの用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が合成の天然に存在しないアミノ酸、例えば、対応する天然に存在するアミノ酸の化学的類似体であるアミノ酸のポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸のポリマーに当てはまる。本発明の特定の実施形態の組成物および方法において使用するために適したグロビンポリペプチドの実例は、例えば、配列番号２〜４、配列番号６〜９、配列番号１１〜１３、および配列番号１５である。また、例えば、その完全な開示および特許請求の範囲が参照により本明細書に詳細に組み込まれる米国特許第６，０５１，４０２号および同第７，９０１，６７１号も参照されたい。
【０１３１】
本発明の特定の実施形態の組成物および方法において使用するために適したＡＢＣＤ１ポリペプチドの実例は、例えば、配列番号１８である。また、例えば、その完全な開示および特許請求の範囲が参照により本明細書に詳細に組み込まれる米国特許第５，８６９，０３９号および同第６，０１３，７６９号も参照されたい。
【０１３２】
本発明の特定の実施形態は、ポリペプチド「バリアント」も包含する。ポリペプチド「バリアント」という記述は、参照ポリペプチドと少なくとも１つのアミノ酸残基の付加、欠失、切断、および／または置換によって区別され、生物活性を保持するポリペプチドを指す。ある実施形態では、当技術分野で公知の通り、ポリペプチドバリアントは、参照ポリペプチドと、保存されていても保存されていなくてもよい１つまたは複数の置換によって区別される。
【０１３３】
ある実施形態では、バリアントポリペプチドは、参照ポリペプチドの対応する配列に対して少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性または類似性を有するアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、アミノ酸の付加または欠失は参照ポリペプチドのＣ末端および／またはＮ末端において起こる。
【０１３４】
上記の通り、本発明のポリペプチドは、アミノ酸置換、欠失、切断、および挿入を含めた種々のやり方で変更することができる。そのような操作のための方法は当技術分野で一般に、公知である。例えば、参照ポリペプチドのアミノ酸配列バリアントは、ＤＮＡの変異によって調製することができる。変異誘発およびヌクレオチド配列の変更のための方法は当技術分野で周知である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．  ８２巻：４８８〜４９２頁）、Ｋｕｎｋｅｌら、（１９８７年）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ、１５４巻：３６７〜３８２頁）、Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏ．  ４，８７３，１９２、Ｗａｔｓｏｎ、Ｊ．  Ｄ．ら、（１９８７年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ、第４版、Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、Ｃａｌｉｆ．）およびそこに引用されている参考文献を参照されたい。目的のタンパク質の生物活性に影響を及ぼさない適切なアミノ酸置換に関する手引きは、Ｄａｙｈｏｆｆら、（１９７８年）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｒｅｓ．  Ｆｏｕｎｄ．、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．）のモデルにおいて見いだすことができる。
【０１３５】
「宿主細胞」とは、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、本発明の組換えベクターまたはポリヌクレオチドを用いてトランスフェクトする、感染させる、または形質導入する細胞を包含する。宿主細胞は、パッケージング細胞、産生細胞、およびウイルスベクターを感染させた細胞を含んでよい。特定の実施形態では、本発明のウイルスベクターを感染させた宿主細胞を、治療を必要とする被験体に投与する。ある実施形態では、「標的細胞」という用語は、宿主細胞と互換的に使用され、トランスフェクトする、感染させる、または形質導入する、所望の細胞型の細胞を指す。好ましい実施形態では、標的細胞は、幹細胞または前駆細胞である。ある好ましい実施形態では、標的細胞は、体細胞、例えば、成体幹細胞、前駆細胞、または分化細胞である。特定の好ましい実施形態では、標的細胞は、造血細胞、例えば、造血幹細胞または造血前駆細胞である。さらなる治療標的細胞は以下で考察されている。
【０１３６】
「幹細胞」という用語は、（１）長期にわたって自己再生できる、または元の細胞と同一のコピーを少なくとも１つ生成することができる、（２）単一細胞レベルで、多数の、およびいくつかの例ではただ１つの特殊化した細胞型に分化することができる、および（３）ｉｎ  ｖｉｖｏで組織の機能的再生をすることができる、未分化細胞である細胞を指す。幹細胞は、それらの発生の潜在性に従って、全能性、多能性、多分化能および少能性（ｏｌｉｇｏｐｏｔｅｎｔ）／単能性に細分類される。「自己再生」とは、変更されていない娘細胞を産生する独特の能力および特殊化した細胞型を生成する独特の能力（分化能（ｐｏｔｅｎｃｙ））を有する細胞を指す。自己再生は、２つのやり方で実現することができる。非対称細胞分裂により、親の細胞と同一である娘細胞が１つと、親の細胞とは異なり、前駆細胞または分化細胞である娘細胞が１つ産生される。非対称細胞分裂では細胞の数は増加しない。対称細胞分裂により、同一の娘細胞が２つ産生される。細胞の「増殖」または「増大」とは、細胞が対称的に分割されることを指す。
【０１３７】
本明細書で使用される場合、「全能性」という用語は、細胞の、生物体の全ての細胞系列を形成する能力を意味する。例えば、哺乳動物では、接合体および最初の卵割期割球のみが全能性である。本明細書で使用される場合、「多能性」という用語は、細胞の、体（ｂｏｄｙ）または体質（ｓｏｍａ）（すなわち、胚本体（ｅｍｂｒｙｏ  ｐｒｏｐｅｒ））の全ての系列を形成する能力を意味する。例えば、胚性幹細胞は、３つの胚葉である、外胚葉、中胚葉、および内胚葉のそれぞれから細胞を形成することができる多能性幹細胞の一種である。本明細書で使用される場合、「多分化能」という用語は、成体幹細胞の、１つの系列の多数の細胞型を形成する能力を指す。例えば、造血幹細胞は、血液細胞系列の全ての細胞、例えば、リンパ系細胞および骨髄系細胞を形成することができる。本明細書で使用される場合、「少能性」という用語は、成体幹細胞の、少数の異なる細胞型にのみ分化する能力を指す。例えば、リンパ系幹細胞および骨髄系幹細胞は、それぞれリンパ系列または骨髄系列のいずれかの細胞を形成することができる。本明細書で使用される場合、「単能性」という用語は、細胞の、単一の細胞型を形成する能力を意味する。例えば、精原幹細胞は精子細胞のみを形成することができる。
【０１３８】
本明細書で使用される場合、「前駆体」または「前駆細胞」という用語は、自己再生する能力、およびより成熟した細胞に分化する能力を有する細胞を指す。多くの前駆細胞は単一の系列に沿って分化するが、かなり大規模な増殖能力を有する可能性がある。
【０１３９】
造血幹細胞（ＨＳＣ）は、生物体の生存期間にわたって成熟血液細胞のレパートリー全体を生成することができる拘束された造血前駆細胞（ＨＰＣ）を生じさせる。「造血幹細胞」または「ＨＳＣ」という用語は、骨髄系列（例えば、単球およびマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板、樹状細胞）、およびリンパ系列（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）、および当技術分野で公知のその他の系列を含めた、生物体の血液細胞の種類の全てを生じさせる多分化能幹細胞を指す（Ｆｅｉ，  Ｒ．ら、米国特許第５，６３５，３８７号；ＭｃＧｌａｖｅら、米国特許第５，４６０，９６４号；Ｓｉｍｍｏｎｓ  Ｐ．ら、米国特許第５，６７７，１３６号；Ｔｓｕｋａｍｏｔｏら、米国特許第５，７５０，３９７号；Ｓｃｈｗａｒｔｚら、米国特許第５，７５９，７９３号；ＤｉＧｕｉｓｔｏら、米国特許第５，６８１，５９９号；Ｔｓｕｋａｍｏｔｏら、米国特許第５，７１６，８２７号を参照されたい）。致死的に放射線照射した動物またはヒトに移植すると、造血幹細胞および造血前駆細胞は赤血球、好中球−マクロファージ、巨核球およびリンパ系の造血細胞プールを再配置させる（ｒｅｐｏｐｕｌａｔｅ）ことができる。
【０１４０】
妥当なウイルス力価を実現するためには、多くの場合、大規模なウイルス粒子産生が必要である。ウイルス粒子は、移行ベクターをウイルスの構造遺伝子および／またはアクセサリー遺伝子、例えば、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、ｅｎｖ遺伝子、ｔａｔ遺伝子、ｒｅｖ遺伝子、ｖｉｆ遺伝子、ｖｐｒ遺伝子、ｖｐｕ遺伝子、ｖｐｘ遺伝子、またはｎｅｆ遺伝子または他のレトロウイルスの遺伝子を含むパッケージング細胞系にトランスフェクトすることによって産生される。
【０１４１】
本明細書で使用される場合、「パッケージングベクター」という用語は、パッケージングシグナルを欠き、１つ、２つ、３つ、４つまたはそれより多くのウイルスの構造遺伝子および／またはアクセサリー遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターまたはウイルスベクターを指す。一般には、パッケージングベクターはパッケージング細胞に含まれ、トランスフェクション、形質導入または感染によって細胞に導入される。トランスフェクション、形質導入または感染のための方法は当業者に周知である。本発明のレトロウイルス／レンチウイルス移行ベクターを、トランスフェクション、形質導入または感染によってパッケージング細胞系に導入して、産生細胞または産生細胞系を生成することができる。本発明のパッケージングベクターは、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポフェクションまたは電気穿孔を含めた標準の方法によってヒト細胞または細胞系に導入することができる。いくつかの実施形態では、パッケージングベクターを、優性選択マーカー、例えば、ネオマイシン、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、ブラストサイジン、ゼオシン、チミジンキナーゼ、ＤＨＦＲ、Ｇｌｎ合成酵素またはＡＤＡなどと一緒に細胞に導入し、その後、適切な薬物の存在下でクローンを選択し、単離することができる。選択マーカー遺伝子は、コード遺伝子に、パッケージングベクターによって、例えば、ＩＲＥＳまたは自己切断性ウイルスペプチドによって物理的に連結させることができる。
【０１４２】
ウイルスエンベロープタンパク質（ｅｎｖ）により、細胞系から生成される組換えレトロウイルスによって最終的に感染させ、形質転換することができる宿主細胞の範囲が決定される。レンチウイルス、例えば、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、ＦＩＶおよびＥＩＶなどの場合では、ｅｎｖタンパク質としてはｇｐ４１およびｇｐ１２０が挙げられる。以前に記載されている通り、本発明のパッケージング細胞によって発現されるウイルスｅｎｖタンパク質は、ウイルスのｇａｇ遺伝子およびｐｏｌ遺伝子とは別のベクター上にコードされることが好ましい。
【０１４３】
本発明において使用することができるレトロウイルス由来のｅｎｖ遺伝子の実例としては、これだけに限定されないが、ＭＬＶエンベロープ、１０Ａ１エンベロープ、ＢＡＥＶ、ＦｅＬＶ−Ｂ、ＲＤ１１４、ＳＳＡＶ、Ｅｂｏｌａ、Ｓｅｎｄａｉ、ＦＰＶ（家禽ペストウイルス）、およびインフルエンザウイルスエンベロープが挙げられる。同様に、ＲＮＡウイルス（例えば、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ科、Ｃａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅ科、Ａｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ科、Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ科、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ科、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ科、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科、Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ科、Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ科、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科、Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ科、Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ科、Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ科、Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ科、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ科のＲＮＡウイルス）由来のエンベロープならびにＤＮＡウイルス（Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ科、Ｃｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅ科、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科、Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ科、Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ科、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ科、Ｐｏｘｙｉｒｉｄａｅ科、およびＩｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅ科）由来のエンベロープをコードする遺伝子を利用することができる。代表例としては、ＦｅＬＶ、ＶＥＥ、ＨＦＶＷ、ＷＤＳＶ、ＳＦＶ、狂犬病、ＡＬＶ、ＢＩＶ、ＢＬＶ、ＥＢＶ、ＣＡＥＶ、ＳＮＶ、ＣｈＴＬＶ、ＳＴＬＶ、ＭＰＭＶ、ＳＭＲＶ、ＲＡＶ、ＦｕＳＶ、ＭＨ２、ＡＥＶ、ＡＭＶ、ＣＴ１０、およびＥＩＡＶが挙げられる。
【０１４４】
他の実施形態では、本発明のウイルスをシュードタイピングするためのエンベロープタンパク質としては、これだけに限定されないが、以下のウイルスのいずれかが挙げられる：Ａ型インフルエンザ、例えば、Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ３Ｎ２およびＨ５Ｎ１（トリインフルエンザ）など、Ｂ型インフルエンザ、Ｃ型インフルエンザウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ロタウイルス、ノーウォークウイルス群の任意のウイルス、腸内アデノウイルス、パルボウイルス、デング熱ウイルス、サル痘、モノネガウイルス目、リッサウイルス、例えば、狂犬病ウイルス、ラゴスコウモリウイルス、モコラウイルス、ドゥベンヘイジウイルス、ヨーロッパコウモリウイルス（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｂａｔ  ｖｉｒｕｓ）１＆２およびオーストラリアコウモリウイルス（Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  ｂａｔ  ｖｉｒｕｓ）など、エフェメロウイルス、ベシクロウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ヘルペスウイルス、例えば、単純ヘルペスウイルス１型および２型、水痘帯状疱疹、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）、ヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶ）、ヒトヘルペスウイルス６型および８型など、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、パピローマウイルス、マウスガンマヘルペスウイルス、アレナウイルス、例えば、アルゼンチン出血熱ウイルス、ボリビア出血熱ウイルス、サビア関連出血熱ウイルス（Ｓａｂｉａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｆｅｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、ベネズエラ出血熱ウイルス、ラッサ熱ウイルス、マチュポウイルス、リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）など、Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄｉａｅ科、例えば、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、ハンタウイルス、腎症候群を伴う出血熱を引き起こすウイルス、リフトバレー熱ウイルスなど、エボラ出血熱およびマールブルグ出血熱を含めたＦｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ科（フィロウイルス）、キャサヌール森林病（Ｋａｙｓａｎｕｒ  Ｆｏｒｅｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ）ウイルス、オムスク出血熱ウイルス、ダニ媒介脳炎を引き起こすウイルスを含めたＦｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ科ならびにＰａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科、例えば、ヘンドラウイルスおよびニパーウイルスなど、大痘瘡、小痘瘡（天然痘）、アルファウイルス、例えば、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、ＳＡＲＳ関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）、西ナイルウイルス、任意の脳炎（ｅｎｃｅｐｈａｌｉｌｔｉｓ）を引き起こすウイルスなど。
【０１４５】
一実施形態では、本発明は、組換えレトロウイルス、例えば、ＶＳＶ−Ｇ糖タンパク質でシュードタイピングされたレンチウイルスを産生するパッケージング細胞を提供する。
【０１４６】
「シュードタイプ」または「シュードタイピング」という用語は、本明細書で使用される場合、ウイルスエンベロープタンパク質が、好ましい特性を保有する別のウイルスのウイルスエンベロープタンパク質で置換されたウイルスを指す。例えば、ＨＩＶは、水疱性口内炎ウイルスＧタンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）エンベロープタンパク質を用いてシュードタイピングすることができ、これにより、ＨＩＶエンベロープタンパク質（ｅｎｖ遺伝子によりコードされる）は通常ウイルスをＣＤ４＋提示細胞にターゲティングするので、ＨＩＶがより広い範囲の細胞に感染することが可能になる。本発明の好ましい実施形態では、レンチウイルスのエンベロープタンパク質はＶＳＶ−Ｇでシュードタイピングされている。一実施形態では、本発明は、組換えレトロウイルス、例えば、ＶＳＶ−Ｇエンベロープ糖タンパク質を用いてシュードタイピングされたレンチウイルスを産生するパッケージング細胞を提供する。
【０１４７】
本明細書で使用される場合、「パッケージング細胞系」という用語は、パッケージングシグナルを含有しないが、ウイルス粒子の正しいパッケージングに必要であるウイルスの構造タンパク質および複製酵素（例えば、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ）を安定にまたは一過性に発現する細胞系への言及において使用される。本発明のパッケージング細胞を調製するために、任意の適切な細胞系を使用することができる。一般に、細胞は哺乳動物細胞である。特定の実施形態では、パッケージング細胞系を作製するために使用される細胞はヒト細胞である。使用することができる適切な細胞系としては、例えば、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞、ＦＬＹ細胞、Ｐｓｉ−２細胞、ＢＯＳＣ２３細胞、ＰＡ３１７細胞、ＷＥＨＩ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＳＣ１細胞、ＢＳＣ４０細胞、ＢＭＴ１０細胞、ＶＥＲＯ細胞、Ｗ１３８細胞、ＭＲＣ５細胞、Ａ５４９細胞、ＨＴ１０８０細胞、２９３細胞、２９３Ｔ細胞、Ｂ−５０細胞、３Ｔ３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｓａｏｓ−２細胞、Ｈｕｈ７細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｗ１６３細胞、２１１細胞、および２１１Ａ細胞が挙げられる。好ましい実施形態では、パッケージング細胞は２９３細胞、２９３Ｔ細胞、またはＡ５４９細胞である。別の好ましい実施形態では、細胞はＡ５４９細胞である。
【０１４８】
本明細書で使用される場合、「産生細胞系」という用語は、パッケージング細胞系およびパッケージングシグナルを含む移行ベクター構築物を含む、組換えレトロウイルス粒子を産生することができる細胞系を指す。感染性のウイルス粒子およびウイルスストック溶液の作製は、従来の技法を用いて行うことができる。ウイルスストック溶液を調製する方法は当技術分野で公知であり、例えば、Ｙ．  Ｓｏｎｅｏｋａら（１９９５年）Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２３巻：６２８〜６３３頁、およびＮ．  Ｒ．  Ｌａｎｄａｕら（１９９２年）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６６巻：５１１０〜５１１３頁によって例示されている。感染性ウイルス粒子はパッケージング細胞から従来の技法を用いて収集することができる。例えば、感染性粒子は、当技術分野で公知の通り、細胞溶解、または細胞培養物の上清を収集することによって収集することができる。必要に応じて、収集されたウイルス粒子は、所望であれば精製することができる。適切な精製技法は当業者に周知である。
【０１４９】
「増強する（ｅｎｈａｎｃｅ）」または「促進する（ｐｒｏｍｏｔｅ）」または「増加させる（ｉｎｃｒｅａｓｅ）」または「増大させる（ｅｘｐａｎｄ）」とは、一般に、本発明の組成物および／または方法により、ビヒクルまたは対照分子／組成物のいずれかによって形質導入された細胞の数と比較してより多数の形質導入された細胞を引き出す、引き起こす、または産生することができることを指す。一実施形態では、本発明の組成物および方法を用いて形質導入された造血幹細胞は、現行の形質導入組成物および方法と比較して形質導入された細胞の数の増加を含む。細胞への形質導入の増加は、とりわけ、レポーターアッセイ、ＲＴ−ＰＣＲ、および細胞表面タンパク質発現などの当技術分野で公知の方法を用いて確認することができる。「増加した（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ）」または「増強された（ｅｎｈａｎｃｅｄ）」形質導入の量とは、一般には、「統計的に有意な」量であり、ビヒクル、対照組成物、または他の形質導入方法によって形質導入された細胞の数の１．１倍、１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍またはそれを超える倍数（例えば、５００倍、１０００倍）（１との間および１を超える全ての整数および小数点、例えば、１．５、１．６、１．７、１．８などを含む）である増加を含んでよい。
【０１５０】
「減少する（ｄｅｃｒｅａｓｅ）」または「低減する（ｌｏｗｅｒ）」または「減る（ｌｅｓｓｅｎ）」または「低下する（ｒｅｄｕｃｅ）」または「弱める（ａｂａｔｅ）」とは、一般に、本発明による組成物および／または方法を用いて形質導入された細胞と比較して比較的より少ない形質導入された細胞をもたらす組成物または方法を指す。「減少した（ｄｅｃｒｅａｓｅ）」または「低下した（ｒｅｄｕｃｅｄ）」形質導入された細胞の量とは、一般には「統計的に有意な」量であり、本発明による組成物および／または方法によって生成される形質導入された細胞の数（参照応答）の１．１分の１、１．２分の１、１．５分の１、２分の１、３分の１、４分の１、５分の１、６分の１、７分の１、８分の１、９分の１、１０分の１、１５分の１、２０分の１、３０分の１またはそれ未満（例えば、５００分の１、１０００分の１）（分母が１との間および１を超える全ての整数および小数点、例えば、１．５、１．６、１．７、１．８などを含む）である減少を含んでよい。
【０１５１】
「維持する（ｍａｉｎｔａｉｎ）」または「保全する（ｐｒｅｓｅｒｖｅ）」または「維持（ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ）」または「変化なし（ｎｏ  ｃｈａｎｇｅ）」または「実質的な変化なし（ｎｏ  ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ  ｃｈａｎｇｅ）」または「実質的な減少なし（ｎｏ  ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ  ｄｅｃｒｅａｓｅ）」とは、一般に、ビヒクル、対照分子／組成物のいずれかによって引き起こされる応答、または特定の細胞系列における応答に匹敵する生理応答を指す。匹敵する応答とは、参照応答と有意差がないまたは測定可能には異ならない応答である。
【０１５２】
冠詞「ａ（１つの）」、「ａｎ（１つの）」、および「ｔｈｅ（その）」は、本明細書では、その冠詞の文法上の目的語の１つ、または１つより多く（すなわち少なくとも１つ）を指すために使用される。例として、「ａｎ（１つの）エレメント」とは、１つのエレメントまたは１つより多いエレメントを意味する。
【０１５３】
選択肢（例えば、「ｏｒ（または）」）の使用は、その選択肢のいずれか一方、その両方、またはそれらの任意の組み合わせを意味すると理解されるべきである。本明細書で使用される場合、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語は同義に使用される。
【０１５４】
本明細書で使用される場合、「約」または「およそ」という用語は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量または長さに対して１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％だけ変動する数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量または長さを指す。一実施形態では、「約」または「およそ」という用語は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量または長さに関して±１５％、±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％、または±１％の数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量または長さの範囲を指す。
【０１５５】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という単語は、本明細書全体を通して、文脈上異なる解釈を要する場合を除き、明記されているステップもしくはエレメントまたはステップもしくはエレメントの群を包含するが、任意の他のステップもしくはエレメントまたはステップもしくはエレメントの群を排除するものではないと理解されたい。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」とは、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という句に続くいかなるものも含み、それに限定されることを意味する。したがって、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という句は、列挙されているエレメントが必要または必須であること、および他のエレメントは存在してはならないことを示す。「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」とは、この句の後に列挙されている任意のエレメントを包含し、列挙されているエレメントに関する本開示に明記されている活性または作用に干渉または寄与しない他のエレメントに限定されるものとする。したがって、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という句は、列挙されているエレメントが必要または必須であるが、他のエレメントは任意選択ではなく、それらが列挙されているエレメントの活性または作用に影響を及ぼすかどうかに応じて存在するかもしれないし、存在しないかもしれないことを示す。
【０１５６】
本明細書全体を通して「一実施形態」、または「一つの実施形態」への言及は、実施形態に関連して記載されている特定の特徴、構造または特性が本発明の少なくとも１つの実施形態に包含されることを意味する。したがって、本明細書全体を通して種々の箇所における句「一実施形態」、または「一つの実施形態」の出現は、必ずしも全てが同じ実施形態に言及しているのではない。さらに、特定の特徴、構造、または特性を任意の適切な様式で１つまたは複数の実施形態に組み合わせることができる。
【０１５７】
以下の説明において、特定の詳細は、本発明の種々の実施形態の徹底的な理解をもたらさすために記載されている。しかし、当業者には、これらの詳細なしで本発明を実施することができることが理解されよう。さらに、本明細書に記載の構造および置換基の種々の組み合わせに由来する個々のベクター、またはベクターの群が、各ベクターまたはベクターの群が個別に記載されているのと同じ程度に本出願により開示されていることが理解されるべきである。したがって、特定のベクター構造または特定の置換基の選択は本開示の範囲内である。
【０１５８】
Ｃ．ウイルスベクター
レトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターは試験され、目的の遺伝子を広範囲の標的細胞のゲノムに安定に導入するための、例えば治療的ポリペプチドをエンコードするための、適切な送達ビヒクルであることが見いだされている。本発明は、一部において、遺伝子治療を提供するために被験体に投与される細胞の集団に対する遺伝子治療ベクターの改善された送達を意図している。
【０１５９】
本発明は、本発明の方法を実施するために使用することができる移行ベクターをさらに提供する。そのような移行ベクターは種々の異なるウイルスベクターを使用して作製することができることが当業者には理解されるが、特定の実施形態では、レンチウイルスベクターがｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏのどちらにおいても非分裂細胞への導入遺伝子の効率的な送達、組み込みおよび長期発現をもたらすことができることに一部起因して、移行ベクターはレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである。種々のレンチウイルスベクターが当技術分野で公知であり、いずれも本発明の移行ベクターを作製するために適合させることができる。Ｎａｌｄｉｎｉら、（１９９６年ａ、１９９６年ｂ、および１９９８年）；Ｚｕｆｆｅｒｅｙら、（１９９７年）；Ｄｕｌｌら、１９９８年、米国特許第６，０１３，５１６号；および同第５，９９４，１３６号を参照されたい。
【０１６０】
一般に、これらのベクターは、プラスミドに基づくかウイルスに基づき、治療用ポリペプチドをコードする核酸を宿主細胞内に移行させるために必須な配列を有するように構成されている。
【０１６１】
例示的な実施形態では、レトロウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。したがって、ベクターは、ヒト免疫不全−１（ＨＩＶ−１）、ヒト免疫不全−２（ＨＩＶ−２）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、ジェンブラナ病ウイルス（ＪＤＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）などに由来してよい。本発明の大部分の態様に関して、ＨＩＶに基づく構築物がヒト細胞の形質導入において最も効率的であるという点で、ＨＩＶに基づくベクターの骨格（すなわち、ＨＩＶのシス作用性配列エレメントならびにＨＩＶのｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子およびｒｅｖ遺伝子）が一般に好ましい。
【０１６２】
特定の例示的な実施形態は、造血障害、例えば、異常ヘモグロビン症を調整するために使用するベクター、組成物および方法についてのより詳細な記載を含むが、本発明は、本開示によって限定されるものと解釈されるべきではない。本明細書において例示されている原理を、他の系、例えば、眼、中枢神経系、および末梢神経系を含めた神経系；循環系；筋肉系；骨格系；および皮膚、心臓、肺、膵臓、肝臓、腎臓、腸を含めた器官などにおける遺伝子治療に適用することができることは当業者には容易に理解されよう。
【０１６３】
一実施形態では、本発明は、特に細胞型または細胞系列における、目的のポリヌクレオチドの発現を導く発現制御配列、例えば、グロビン遺伝子を含むベクター、例えば、レンチウイルスベクターを提供する。細胞型または細胞系列の発現制御配列を使用することにより、ポリヌクレオチドの発現を単一の系列における細胞分化の所望の段階に制限することにおいて安全性の利点がもたらされ、したがって、本発明のベクターにより、望ましくない細胞型におけるポリペプチドの異所性発現に対処する懸念が緩和される。
【０１６４】
１つの非限定的な例では、発現制御配列は、本明細書の他の箇所で開示されている遍在発現制御配列であってよい。
【０１６５】
別の非限定的な例では、発現制御配列は、胚性幹細胞、神経幹細胞、間葉幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、心臓幹細胞、腎幹細胞、または造血幹細胞における目的のポリヌクレオチドの幹細胞特異的発現を導く幹細胞特異的発現制御配列であってよい。
【０１６６】
さらに別の非限定的な例では、発現制御配列は、造血幹細胞、造血前駆細胞、骨髄系細胞、リンパ系細胞、血小板新生系列、肥満細胞、赤血球生成系列細胞、顆粒球形成系列細胞、および単核球形成系列細胞における目的のポリヌクレオチドの発現を導く、細胞型特異的発現制御配列または細胞系列特異的発現制御配列であってよい。
【０１６７】
特定の実施形態では、本発明のベクターを使用して、これだけに限定されないが、造血幹細胞、造血前駆細胞、骨髄系前駆体、リンパ系前駆体、血小板新生前駆体、赤血球前駆体、顆粒球形成前駆体、単核球形成前駆体、巨核芽球、前巨核球、巨核球、栓球／血小板、前赤芽球、好塩基性赤芽球、多染赤芽球、正染性赤芽球、多染赤血球、赤血球（ＲＢＣ）、好塩基性前骨髄球、好塩基性骨髄球、好塩基性後骨髄球、好塩基球、好中性前骨髄球、好中性骨髄球、好中性後骨髄球、好中球、好酸性前骨髄球、好酸性骨髄球、マクロファージ、樹状細胞、リンパ芽球、前リンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、小リンパ球、Ｔ−リンパ球、Ｂ−リンパ球、形質細胞、およびリンパ系樹状細胞を含めた造血細胞の１つまたは複数または全てにおいて、ポリヌクレオチド、例えば、目的の遺伝子を発現させることができる。
【０１６８】
好ましい実施形態では、本発明のベクターを使用して、１つまたは複数の赤血球系細胞、例えば、前赤芽球、好塩基性赤芽球、多染赤芽球、正染性赤芽球、多染赤血球、および赤血球（ＲＢＣ）においてポリヌクレオチド、例えば、目的の遺伝子を発現させることができる。
【０１６９】
一実施形態では、ベクターは、目的の遺伝子、例えば、グロビンに作動可能に連結した造血細胞プロモーター、エンハンサー、またはプロモーター／エンハンサーを含む。
【０１７０】
適切な細胞型または細胞系列に特異的な発現制御配列としては、これだけに限定されないが、例えば、造血幹細胞プロモーター、および造血前駆細胞プロモーターなどの造血細胞発現制御配列が挙げられる。１つまたは複数の赤血球系細胞における目的の遺伝子の発現が望まれる実施形態では、適切な造血細胞発現制御配列として、これだけに限定されないが、赤血球系細胞特異的プロモーターおよび必要に応じて赤血球系細胞特異的エンハンサー、ヒトβ−グロビンプロモーター、ヒトβ−グロビンＬＣＲ、またはヒトα−グロビンＨＳ４０エンハンサーおよびアンキリン−１プロモーターを挙げることができる。
【０１７１】
一実施形態では、適切な細胞型特異的発現制御配列または細胞系列特異的発現制御配列としては、これだけに限定されないが、小膠細胞において活性なプロモーターが挙げられる。ある実施形態では、プロモーターは、目的の遺伝子、例えば、ＡＢＣＤ１に作動可能に連結したＭＮＤプロモーターまたは転写的に活性なその断片を含む。
【０１７２】
細胞型または細胞系列発現制御配列を使用することにより、ポリヌクレオチドの発現を単一の系列における細胞分化の所望の段階に制限することにおいて安全性の利点がもたらされ、したがって、本発明のベクターにより、望ましくない細胞型におけるポリペプチドの異所性発現に対処する懸念が緩和される。一実施形態では、本発明は、１つまたは複数のＬＴＲと、目的の遺伝子に作動可能に連結した発現制御配列とを含むベクターを提供する。関連の実施形態では、発現制御配列は、赤血球系細胞特異的発現制御配列であり、ヒトβ−グロビンプロモーター；ヒトβ−グロビンＬＣＲ；ならびにヒトα−グロビンＨＳ４０エンハンサーおよびアンキリン−１プロモーターからなる群から選択することができる。
【０１７３】
種々の実施形態では、ベクターの設計は、特定の造血疾患、障害、または状態を処置する、予防するまたは軽減することを目的として行う。例えば、本発明は、ヒトα−グロビン、ヒトβ−グロビン、ヒトδ−グロビン、およびヒトγ−グロビンまたはその生物学的な活性バリアントもしくは断片からなる群から選択される目的の遺伝子を含む、異常ヘモグロビン症の遺伝子治療のためのベクターを意図している。一実施形態では、グロビン遺伝子は、野生型ヒトβ−グロビン遺伝子、イントロン配列の１つまたは複数の欠失を含む欠失ヒトβ−グロビン遺伝子、および少なくとも１つの抗鎌状赤血球化アミノ酸残基をコードする変異ヒトβ−グロビン遺伝子からなる群から選択される。
【０１７４】
処置されている状態が鎌状赤血球異常ヘモグロビン症である特定の実施形態では、目的の遺伝子は抗鎌状赤血球化タンパク質であってよい。本明細書で使用される場合、「抗鎌状赤血球化タンパク質」とは、鎌状赤血球の状態における赤血球の鎌状化を導く病理学的事象を予防するまたは逆転させるポリペプチドを指す。本発明の一実施形態では、本発明の形質導入された細胞を使用して、抗鎌状赤血球化タンパク質を異常血色素症の状態を有する被験体に送達する。抗鎌状赤血球化タンパク質は、抗鎌状赤血球化アミノ酸残基を含む変異したβ−グロビン遺伝子も包含する。
【０１７５】
好ましい実施形態では、そのようなグロビンバリアントの１つはコドン８７におけるトレオニンからグルタミンへの変異（βＡ−Ｔ８７Ｑ）をコードするヒトβＡ−グロビン遺伝子またはヒトβＡ−グロビン遺伝子である（成熟型のグロビンポリペプチドがＮ末端メチオニンの切断によってプロセシングされており、成熟グロビンポリペプチドのコドン８７はトレオニンであり、全長の、切断されていないグロビンポリペプチドのコドン８８はトレオニンである）。他の抗鎌状赤血球化アミノ酸残基は当技術分野で公知であり、本発明において有用であり得る。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，０５１，４０２号；米国特許第５，８６１，４８８号；米国特許第６，６７０，３２３号；米国特許第５，８６４，０２９号；米国特許第５，８７７，２８８号；およびＬｅｖａｓｓｅｕｒら、Ｂｌｏｏｄ  １０２巻：４３１２〜４３１９頁（２００３年）を参照されたい。
【０１７６】
ある実施形態では、赤血球特異的発現制御配列を含むベクターを使用して、異常ヘモグロビン症を優に超える膨大な数の障害を処置する、予防する、または軽減する。赤血球前駆体は、循環中に分泌させ、したがって、全身に送達することができるポリペプチドを発現させるために有用な細胞集団である。そのようなｉｎ  ｖｉｖｏにおけるタンパク質の送達の例は、血友病Ｂの患者において欠けている凝固因子であるヒト第ＩＸ因子である。例えば、参照により本明細書に組み込まれるＡ．  Ｈ．  Ｃｈａｎｇら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ（２００８年）を参照されたい。
【０１７７】
一実施形態では、本発明のベクターを用いて形質導入された細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、タンパク質を分泌させるための「工場」として使用することができる。例えば、赤血球系細胞特異的発現制御配列を含むベクターを、ＨＳＣから分化した赤血球系細胞から、または胚性幹細胞からタンパク質を大規模にｉｎ  ｖｉｔｒｏ生成するために使用することができる。
【０１７８】
このように発現させることができる目的のポリヌクレオチドとしては、これだけに限定されないが、リソソーム蓄積症に影響を及ぼす酵素であるアデノシンデアミナーゼ、アポリポタンパク質Ｅ、脳由来神経栄養因子（ｂｒａｉｎ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｉｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）（ＢＤＮＦ）、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）、骨形成タンパク質６（ＢＭＰ−６）、骨形成タンパク質７（ＢＭＰ−７）、カルジオトロフィン１（ＣＴ−１）、ＣＤ２２、ＣＤ４０、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、ＣＣＬ１−ＣＣＬ２８、ＣＸＣＬ１−ＣＸＣＬ１７、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸ３ＣＬ１、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、ドーパミン、エリスロポエチン、第ＩＸ因子、第ＶＩＩＩ因子、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、エストロゲン、ＦＡＳ−リガンド、線維芽細胞増殖因子１（ＦＧＦ−１）、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ−２）、線維芽細胞増殖因子４（ＦＧＦ−４）、線維芽細胞増殖因子５（ＦＧＦ−５）、線維芽細胞増殖因子６（ＦＧＦ−６）、線維芽細胞増殖因子１（ＦＧＦ−７）、線維芽細胞増殖因子１（ＦＧＦ−１０）、Ｆｌｔ−３、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージ刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、成長ホルモン、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インターフェロンアルファ（ＩＦＮ−ａ）、インターフェロンベータ（ＩＦＮ−ｂ）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮｇ）、インスリン、グルカゴン、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）、インスリン様増殖因子２（ＩＧＦ−２）、インターロイキン１（ＩＬ−１）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン５（ＩＬ−５）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン７（ＩＬ−７）、インターロイキン８（ＩＬ−８）、インターロイキン９（ＩＬ−９）、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン１１（ＩＬ−１１）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン１３（ＩＬ−１３）、インターロイキン１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン１７（ＩＬ−１７）、インターロイキン１９（ＩＬ−１９）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）、マクロファージ炎症性タンパク質３ａ（ＭＩＰ−３ａ）、マクロファージ炎症性タンパク質３ｂ（ＭＩＰ−３ｂ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン３（ＮＴ−３）、ニューロトロフィン４（ＮＴ−４）、副甲状腺ホルモン、血小板由来増殖因子ＡＡ（ＰＤＧＦ−ＡＡ）、血小板由来増殖因子ＡＢ（ＰＤＧＦ−ＡＢ）、血小板由来増殖因子ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）、血小板由来増殖因子ＣＣ（ＰＤＧＦ−ＣＣ）、血小板由来増殖因子ＤＤ（ＰＤＧＦ−ＤＤ）、ＲＡＮＴＥＳ、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ストロマ細胞由来因子１（ＳＤＦ−１）、テストステロン、形質転換増殖因子アルファ（ＴＧＦ−ａ）、形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦ−ｂ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−ａ）、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ／１３、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ７ｃ、Ｗｎｔ８、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ８ｃ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ１４、Ｗｎｔ１５、またはＷｎｔ１６、ソニックヘッジホッグ、デザートヘッジホッグ、およびインディアンヘッジホッグが挙げられる。
【０１７９】
一実施形態では、本発明のベクターは、少なくとも１つの改変されたまたは改変されていないレトロウイルスＬＴＲ、例えば、レンチウイルスＬＴＲと、目的のポリヌクレオチドに作動可能に連結した（例えばグロビンポリペプチドをコードする）β−グロビンプロモーターおよびβ−グロビン遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）とを含む。ＬＴＲの適切な改変としては、これだけに限定されないが、５’ＬＴＲを異種プロモーター、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、チミジンキナーゼプロモーター、またはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーターで置き換えること、および本明細書の他の箇所で考察されている３’ＬＴＲの１つまたは複数の改変、付加、および／または欠失が挙げられる。
【０１８０】
特定の実施形態では、ヒトβ−グロビンプロモーター、ヒトβ−グロビンＬＣＲ由来のＤＮＡアーゼＩ高感受性部位２、３および４のうちの１つまたは複数を含むβ−グロビンＬＣＲ、および／またはヒトβ−グロビン３’エンハンサーエレメントを使用して、ポリヌクレオチドの赤血球での特異的発現を実現する。
【０１８１】
種々の実施形態では、本発明のベクターは、本明細書の他の箇所で考察されている通り、プサイパッケージング配列（Ψ＋）、セントラルポリプリントラクト／ＤＮＡフラップ（ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）、レトロウイルス輸送エレメント、転写後調節エレメント、１つまたは複数のインスレーターエレメント、ポリアデニル化配列、選択マーカー、および細胞自殺遺伝子からなる群から選択される１つまたは複数のエレメントを含む。
【０１８２】
種々の実施形態では、本発明のベクターは、異常ヘモグロビン症に対する治療をもたらすポリペプチドをコードする遺伝子に作動可能に連結した、造血細胞において作動可能なプロモーターを含む。ベクターは１つまたは複数のＬＴＲを有してよく、いずれのＬＴＲも、１つまたは複数の改変、例えば、１つまたは複数のヌクレオチドの置換、付加、または欠失を含む。ベクターは、形質導入効率を上昇させるための（例えば、ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）、ウイルスパッケージングのための（例えば、プサイ（Ψ）パッケージングシグナル、ＲＲＥ）１つまたは複数の（ｏｎｅ  ｏｆ  ｍｏｒｅ）アクセサリーエレメント、および／または治療用遺伝子発現を増加させる他のエレメント（例えば、ポリ（Ａ）配列）をさらに含んでよい。
【０１８３】
一実施形態では、ベクターは、左側の（５’）レトロウイルスＬＴＲと、プサイパッケージング配列（Ψ＋）と、セントラルポリプリントラクト／ＤＮＡフラップ（ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）と、レトロウイルス輸送エレメントと、β−グロビンプロモーターと、β−グロビン遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）と、必要に応じて目的のポリヌクレオチドに作動可能に連結した３’β−グロビンエンハンサーと、１つまたは複数のインスレーターエレメント、またはポリアデニル化配列を含む右側の（３’）レトロウイルスＬＴＲとを含む。
【０１８４】
特定の実施形態では、本発明のベクターは、左側の（５’）ＨＩＶ−１  ＬＴＲと、プサイパッケージング配列（Ψ＋）と、ＨＩＶ−１セントラルポリプリントラクト／ＤＮＡフラップ（ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）と、ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）と、β−グロビンプロモーターと、β−グロビン遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）と、必要に応じて目的のポリヌクレオチドに作動可能に連結した３’β−グロビンエンハンサーと、１つまたは複数のインスレーターエレメント、およびウサギβ−グロビンポリＡ配列（ｒβｇｐＡ）を含む右側の（３’）レトロウイルスＬＴＲとを含むレンチウイルスベクターである。
【０１８５】
種々の実施形態では、本発明のベクターは、副腎白質ジストロフィーおよび／または副腎脊髄神経障害に対する治療をもたらすポリペプチドをコードする遺伝子に作動可能に連結した、小膠細胞において作動可能なプロモーターを含む。ベクターは１つまたは複数のＬＴＲを有してよく、いずれのＬＴＲも、１つまたは複数の改変、例えば、１つまたは複数のヌクレオチドの置換、付加、または欠失を含む。ベクターは、形質導入効率を上昇させるための（例えば、ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）、ウイルスパッケージングのための（例えば、プサイ（Ψ）パッケージングシグナル、ＲＲＥ）１つまたは複数の（ｏｎｅ  ｏｆ  ｍｏｒｅ）アクセサリーエレメント、および／または治療用遺伝子発現を増加させる他のエレメント（例えば、ポリ（Ａ）配列）をさらに含んでよい。
【０１８６】
特定の実施形態では、本発明の移行ベクターは、左側の（５’）レトロウイルスＬＴＲと、セントラルポリプリントラクト／ＤＮＡフラップ（ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）と、レトロウイルス輸送エレメント（ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｅｘｐｏｒｔ  ｅｌｅｍｅｎｔ）と、ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＤ、メンバー１（ＡＢＣＤ１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、小膠細胞において活性なプロモーターと、右側の（３’）レトロウイルスＬＴＲとを含む。
【０１８７】
ある実施形態では、本発明は、左側の（５’）ＨＩＶ−１  ＬＴＲと、プサイ（Ψ）パッケージングシグナルと、ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰと、ＲＲＥと、ヒトＡＢＣＤ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結したＭＮＤプロモーターと、右側の（３’）自己不活性化（ｓｅｌｆ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ）（ＳＩＮ）ＨＩＶ−１  ＬＴＲと、ウサギβ−グロビンポリアデニル化配列とを含むレンチウイルスベクターを提供する。
【０１８８】
多くの他の異なる実施形態を本発明の現行の実施形態から適合させ得、したがって、治療用導入遺伝子または目的の遺伝子を、造血系列以外の標的細胞型または細胞系列（例えば、神経系列）において発現させることが当業者には理解されよう。
【０１８９】
Ｄ．形質導入の方法
本発明は、一部において、標的細胞への形質導入効率を有意に増加させる方法および組成物を意図している。いかなる特定の理論にも縛られることを望むことなく、本発明の組成物および方法を用いて、有意に少ないウイルスを用いて有意に多くの細胞に形質導入し、それにより、治療用細胞のゲノムにおけるゲノムの変質（ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）および／または癌原遺伝子の挿入活性化のリスクを最小化することができることが意図されている。治療用細胞における癌原遺伝子の挿入活性化および他のゲノムの変質のリスクを最小化することは、それにより、がん様特性を含む形質導入された細胞がｉｎ  ｖｉｖｏにおいてクローン的に増大し、がん、腫瘍または異常な細胞増殖を伴う他の疾患を生じさせる機会が最小限になるので、適切な遺伝子治療プロトコールを案出することおける重要な考慮事項である。さらに、当技術分野では、大量のウイルスを用いて形質導入することは、一般に、形質導入された細胞に対して細胞傷害性である可能性があることが留意されている。したがって、本発明の組成物および方法により、形質導入された細胞の生存性がさらに増強される。したがって、本発明は、より安全かつより効率的な遺伝子治療を提供する。
【０１９０】
レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターを使用し、トランスフェクションではなくウイルス感染によって遺伝子（複数可）または他のポリヌクレオチド配列を送達することは、「形質導入」と称される。一実施形態では、感染およびプロウイルスの組み込みによってレトロウイルスベクターを細胞に形質導入する。ある実施形態では、細胞、例えば、標的細胞は、ウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターを使用して感染によって細胞に送達された遺伝子または他のポリヌクレオチド配列を含む場合に「形質導入される」。特定の実施形態では、形質導入された細胞は、細胞のゲノム内に、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターによって送達された遺伝子または他のポリヌクレオチド配列を１つまたは複数含む。
【０１９１】
特定の実施形態では、本発明のウイルスベクターを用いて形質導入された宿主細胞または標的細胞は治療用ポリペプチドを発現し、疾患、障害、または状態を処置および／または予防するために被験体に投与される。
【０１９２】
感染性のウイルス粒子およびウイルスストック溶液の作製は、従来の技法を用いて行うことができる。ウイルスストック溶液を調製する方法は当技術分野で公知であり、例えば、Ｙ．  Ｓｏｎｅｏｋａら（１９９５年）Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２３巻：６２８〜６３３頁、およびＮ．  Ｒ．  Ｌａｎｄａｕら（１９９２年）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６６巻：５１１０〜５１１３頁によって例示されている。
【０１９３】
特定の実施形態では、ＨＩＶ１型（ＨＩＶ−１）に基づくウイルス粒子は、産生細胞においてビリオンパッケージングエレメントと移入ベクターを共発現させることによって生成することができる。これらの細胞には、いくつものプラスミドを一過性にトランスフェクトすることができる。一般には３〜４つのプラスミドが使用されるが、この数はレンチウイルス構成成分を別々の単位に分ける程度に応じてこれよりも大きくてよい。例えば、１つのプラスミドはＨＩＶ−１に由来するビリオンのコア構成成分および酵素構成成分をコードし得る。このプラスミドはパッケージングプラスミドと称される。別のプラスミドは、一般には、エンベロープタンパク質（複数可）、最も一般的には、安定性が高く、トロピズムが広範にわたることに起因して水疱性口内炎ウイルスのＧタンパク質（ＶＳＶ  Ｇ）をコードする。このプラスミドは、エンベロープ発現プラスミドと称することができる。さらに別のプラスミドは、標的細胞に移行されるゲノム、すなわち、移入ベクターと称されるベクター自体をコードする。パッケージングプラスミドは、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポフェクションまたは電気穿孔を含めた公知の技法によってヒト細胞系に導入することができる。この技法およびその変形により、１ミリリットル当たりの形質導入単位（ＴＵ／ｍｌ）の力価が数百万の組換えウイルスを生成することができる。超遠心分離後に、約１０８ＴＵ／ｍｌ、１０９ＴＵ／ｍｌ、１０１０ＴＵ／ｍｌ、１０１１ＴＵ／ｍｌ、１０１２ＴＵ／ｍｌ、または約１０１３ＴＵ／ｍｌの濃縮ストックを得ることができる。
【０１９４】
感染性ウイルス粒子は、パッケージング細胞から従来の技法を用いて収集することができる。例えば、感染性粒子は、当技術分野で公知の通り、細胞溶解によって、または細胞培養物の上清を収集することによって収集することができる。必要に応じて、収集されたウイルス粒子は、所望であれば精製することができる。適切な精製技法は当業者には周知である。
【０１９５】
ウイルスを使用して、当技術分野で周知の技法を用いてｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて細胞を感染させることができる。例えば、細胞、例えばＣＤ３４＋細胞、樹状細胞、末梢血液細胞または幹細胞にｅｘ  ｖｉｖｏで形質導入する場合、ベクター粒子を細胞と一緒に、一般に、細胞１０５個当たり１×１０５〜５０×１０５形質導入単位のウイルスベクターにも対応する１〜５０の感染多重度（ＭＯＩ）の桁の用量を用いてインキュベートすることができる。これは、当然、１ＭＯＩ、２ＭＯＩ、３ＭＯＩ、４ＭＯＩ、５ＭＯＩ、６ＭＯＩ、７ＭＯＩ、８ＭＯＩ、９ＭＯＩ、１０ＭＯＩ、１５ＭＯＩ、２０ＭＯＩ、２５ＭＯＩ、３０ＭＯＩ、３５ＭＯＩ、４０ＭＯＩ、４５ＭＯＩ、および５０ＭＯＩに対応する量のベクターを包含する。
【０１９６】
ウイルスは、治療を必要とする細胞、組織、または器官に直接注射することによってｉｎ  ｖｉｖｏで被験体に送達することができる。直接注射には、細胞１０５個当たり１×１０５〜５０×１０５形質導入単位のウイルスベクターにも対応するおよそ１〜５０感染多重度（ＭＯＩ）が必要である。
【０１９７】
ウイルスは、例えば、ｐ２４ウイルスコートタンパク質に対するＥＬＩＳＡである市販のｐ２４力価アッセイを使用することによって測定することができるウイルス力価（ＴＵ／ｍＬ）に従って送達することもできる。次式を用いてｐ２４のｐｇ／ｍＬを算出することができる：レンチウイルスの物理的粒子（ＰＰ）当たりおよそ２０００分子のｐ２４が存在する：（２×１０３）×（ＰＰ当たり２４×１０３Ｄａのｐ２４）、４８×１０６／アボガドロ＝（４８×１０６）／（６×１０２３）＝ＰＰ当たり８×１０〜１７ｇのｐ２４、１×１０〜１６ｇのｐ２４当たりおよそ１ＰＰ、１ｐｇのｐ２４当たり１×１０４ＰＰ。合理的に首尾よくパッケージングされ、ＶＳＶ−Ｇでシュードタイピングされたレンチウイルスベクターの感染指数は、１０００物理的粒子（ＰＰ）当たり１ＴＵ〜１００ＰＰ当たり１ＴＵ（またはそれ未満）の範囲になる。したがって、範囲はおよそ１０〜１００ＴＵ／ｐｇのｐ２４である。この変換によりＴＵ／ｍＬが得られる。
【０１９８】
以前の経験に基づいて、直接注射するレンチウイルスの量は総ＴＵによって決定され、部位に実施可能に注射することができる体積および注射を受ける組織の種類の両者に基づいて変動し得る。例えば、脳の注射部位には、非常に小さな体積のウイルスのみを注射することが可能であり、したがって、力価の高い調製物（ｐｒｅｐ）が好ましく、注射当たり約１×１０６〜１×１０７、約１×１０６〜１×１０８、１×１０６〜１×１０９、約１×１０７〜１×１０１０、１×１０８〜１×１０１１、約１×１０８〜１×１０１２、または約１×１０１０〜１×１０１２またはそれを超えるＴＵを使用することができる。しかし、全身送達ははるかに大きなＴＵに適応させることができ、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、１×１０１４、または１×１０１５の負荷量を送達することができる。
【０１９９】
本発明は、上に開示されている、本明細書において提供される組成物および方法の非存在下で匹敵する形質導入効率が実現されるウイルス力価よりも低いウイルス力価を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、およびｉｎ  ｖｉｖｏにおける細胞への高効率の形質導入を提供する組成物および方法を意図している。
【０２００】
本発明のある態様は、細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、レトロウイルスおよびプロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達経路を刺激する１つまたは複数の化合物、例えば、小分子、またはそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２００７／１１２０８４およびＷＯ２０１０／１０８０２８に開示されている化合物などと接触させることによって形質導入効率が有意に増加するという予想外の知見から生じた。本明細書で使用される場合、「プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を刺激する」、「プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を活性化する」または「プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる」という用語は、一般に、化合物１つまたは複数と接触させた細胞におけるプロスタグランジンＥＰ受容体の下流の細胞シグナル伝達の活性を、化合物１つまたは複数の非存在下のプロスタグランジンＥＰ受容体の下流の細胞シグナル伝達の活性と比較して増加させる、化合物の能力を指す。プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達経路の活性化または刺激を測定するために用いることができるアッセイは当技術分野で公知であり、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１０／１０８０２８に記載されている。
【０２０１】
プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達経路を刺激する化合物の実例としては、これだけに限定されないが、メベベリン、フルランドレノリド、アテノロール、ピンドロール、ガボキサドール、キヌレン酸、ヒドララジン、チアベンダゾール、ビククリン、ベサミコール、ペルボシド、イミプラミン、クロルプロパミド、１，５−ペンタメチレンテトラゾール、４−アミノピリジン、ジアゾキシド、ベンフォチアミン、１２−メトキシドデセン酸、Ｎ−ホルミル−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ、ガラミン、ＩＡＡ９４、クロロトリアニセンからなる群から選択される、小分子、例えば小有機分子、プロスタグランジン、Ｗｎｔ経路アゴニスト、ｃＡＭＰ／ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路アゴニスト、Ｃａ２＋二次メッセンジャー経路アゴニスト、一酸化窒素（ＮＯ）／アンジオテンシンシグナル伝達アゴニスト、およびプロスタグランジンシグナル伝達経路を刺激することが公知の他の化合物、およびこれらの化合物の誘導体が挙げられる。
【０２０２】
好ましい実施形態では、プロスタグランジン経路を刺激する化合物は、ＥＰ受容体に結合し、かつ／またはＥＰ受容体と相互作用して、一般には、本明細書に記載されており、また当技術分野で公知のプロスタグランジンＥＰ受容体に関連する下流シグナル伝達経路の１つまたは複数を活性化するまたは増加させる、天然に存在する分子もしくはポリペプチドまたは合成化学分子もしくはポリペプチドである。
【０２０３】
一実施形態では、プロスタグランジン経路を刺激する化合物は、ＰＧＡ２；ＰＧＢ２；ＰＧＤ２；ＰＧＥ１（アルプロスタジル（Ａｌｐｒｏｓｔａｄｉｌ）（Ｃａｖｅｒｊｅｃｔ（商標）；Ｅｄｅｘ（商標）；Ｍｕｓｅ（商標）；Ｐｒｏｓｔｉｎ  ＶＲ（商標））；ＰＧＥ２；ＰＧＦ２；ＰＧＩ２（エポプロステノール（Ｅｐｏｐｒｏｓｔｅｎｏｌ）（Ｆｌｏｌａｎ（商標）；Ｐｒｏｓｔａｃｙｃｌｉｎ（商標）））；ＰＧＨ２；ＰＧＪ２；ならびにその前駆体、代謝産物、誘導体および類似体からなる群から選択される。
【０２０４】
プロスタグランジン（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ）経路を刺激する追加の例示的な化合物としては、これだけに限定されないが、１５ｄ−ＰＧＪ２；デルタ１２−ＰＧＪ２；２−ヒドロキシヘプタデカトリエン酸（ＨＨＴ）；トロンボキサン（ＴＸＡ２およびＴＸＢ２）；ＰＧＩ２類似体、例えば、イロプロスト（Ｖｅｎｔａｖｉｓ（商標））およびトレプロスチニル（Ｒｅｍｏｄｕｌｉｎ（商標））；ＰＧＦ２類似体、例えば、トラボプロスト（Ｔｒａｖａｔａｎ（商標））、カルボプロスト・トロメタミン（Ｈｅｍａｂａｔｅ（商標））、タフルプロスト（ＺｉｏｐｔａｎＩ（商標））、ラタノプロスト（Ｘａｌａｔａｎ（商標））、ビマトプロスト（Ｌｕｍｉｇａｎ（商標）；Ｌａｔｉｓｓｅ（商標））、イソプロピルウノプロストン（Ｒｅｓｃｕｌａ（商標））、クロプロステノール（Ｃｉｏｓｉｎ（商標）、Ｃｙｃｌｉｘ（商標）、Ｅｓｔｒｕｍａｔｅ（商標）、Ｌｕｔａｐｒｏｓｔ（商標）、Ｏｎｓｅｔｔ（商標）、Ｐｌａｎａｔｅ（商標））、エストロファン、およびスーパーファン；ＰＧＥ１類似体、例えば、ミソプロストール（ＣｙｔｏｔｅｃＴＭ）およびブタプロスト；ならびにＣｏｒｅｙアルコール−Ａ［［３ａα，４α，５β，６ａα］−（−）−［ヘキサヒドロ−４−（ヒドロキシメチル）−２−オキソ−２Ｈ−シクロペンタ／ｂ／フラン−５−イル］［１，１’−ビフェニル］−４−カルボキシレート］；Ｃｏｒｅｙアルコール−Ｂ［２Ｈ−シクロペンタ［ｂ］フラン−２−オン，５−（ベンゾイルオキシ）ヘキサヒドロ−４−（ヒドロキシメチル）［３ａＲ−（３ａα，４α，５β，６ａα）］］；およびＣｏｒｅｙジオール（（３ａＲ，４Ｓ，５Ｒ，６ａＳ）−ヘキサヒドロ−５−ヒドロキシ−４−（ヒドロキシメチル）−２Ｈ−シクロペンタ［ｂ］フラン−２−オン）が挙げられる。
【０２０５】
一実施形態では、化合物は、これだけに限定されないが、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、およびその「類似体」または「誘導体」を含めたプロスタグランジンＥＰ受容体リガンドである。プロスタグランジンは、本明細書に記載されており、また当技術分野で公知の通り、概して、５炭素環を含めた炭素原子２０個を含有する脂肪酸に由来するホルモン様分子に関する。
【０２０６】
ＰＧＥ２「類似体」または「誘導体」の実例としては、これだけに限定されないが、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２、１６−１６ジメチルＰＧＥ２ｐ−（ｐ−アセトアミドベンズアミド）フェニルエステル、１１−デオキシ−１６，１６−ジメチルＰＧＥ２、９−デオキシ−９−メチレン−１６、１６−ジメチルＰＧＥ２、９−デオキシ−９−メチレンＰＧＥ２、９−ケトフルプロステノール、５−トランスＰＧＥ２、１７−フェニル−オメガ−トリノルＰＧＥ２、ＰＧＥ２セリノールアミド、ＰＧＥ２メチルエステル、１６−フェニルテトラノルＰＧＥ２、１５（Ｓ）−１５−メチルＰＧＥ２、１５（Ｒ）−１５−メチルＰＧＥ２、８−イソ−１５−ケトＰＧＥ２、８−イソＰＧＥ２イソプロピルエステル、２０−ヒドロキシＰＧＥ２、１１−デオキシＰＧＥｉ、ノクロプロスト、スルプロストン、ブタプロスト、１５−ケトＰＧＥ２、および１９（Ｒ）ヒドロキシ（ｈｙｄｒｏｘｙｙ）ＰＧＥ２が挙げられる。
【０２０７】
９位においてハロゲンで置換された、ＰＧＥ２と同様の構造を有するプロスタグランジン類似体または誘導体（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２００１／１２５９６を参照されたい）、および２−デカルボキシ−２−ホスフィニコプロスタグランジン誘導体、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００６／０２４７２１４号に記載のものも挙げられる。
【０２０８】
いくつかの実施形態では、化合物は、ＰＧＥ２に基づかないリガンドである。ある実施形態では、ＰＧＥ２に基づかないリガンドは、ＥＰ１アゴニスト、ＥＰ２アゴニスト、ＥＰ３アゴニスト、およびＥＰ４アゴニストからなる群から選択される。
【０２０９】
特定の実施形態では、プロスタグランジンＥＰ受容体はＥＰ１、ＥＰ２、ＥＰ３、およびＥＰ４から選択される。
【０２１０】
ＰＧＥ２に基づかないＥＰ１アゴニストの実例としては、これだけに限定されないが、ＯＮＯ−ＤＩ−００４およびＯＮＯ−８７１３が挙げられる。ＰＧＥ２に基づかないＥＰ２アゴニストの実例としては、これだけに限定されないが、ＣＡＹ１０３９９、ＯＮＯ＿８８１５Ｌｙ、ＯＮＯ−ＡＥ１−２５９、およびＣＰ−５３３，５３６が挙げられる。ＰＧＥ２に基づかないＥＰ２アゴニストのさらなる例としては、そのような作用剤に関するその開示について参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２００７／０７１４５６に開示されているカルバゾールおよびフルオレンが挙げられる。ＰＧＥ２に基づかないＥＰ３アゴニストの実例としては、これだけに限定されないが、ＡＥ５−５９９、ＭＢ２８７６７、ＧＲ６３７９９Ｘ、ＯＮＯ−ＮＴ０１２、およびＯＮＯ−ＡＥ−２４８が挙げられる。ＰＧＥ２に基づかないＥＰ４アゴニストの実例としては、これだけに限定されないが、ＯＮＯ−４８１９、ＡＰＳ−９９９Ｎａ、ＡＨ２３８４８、およびＯＮＯ−ＡＥ１−３２９が挙げられる。ＰＧＥ２に基づかないＥＰ４アゴニストのさらなる例は、それぞれが、そのようなアゴニストに関するそれらの開示に関して参照により組み込まれるＷＯ／２０００／０３８６６３；米国特許第６，７４７，０３７号；および米国特許第６，６１０，７１９号に見いだすことができる。
【０２１１】
一実施形態では、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達経路を刺激する化合物は、Ｗｎｔアゴニストである。Ｗｎｔアゴニストの実例としては、これだけに限定されないが、Ｗｎｔポリペプチドおよびグリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤が挙げられる。プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達経路を刺激する化合物として使用するために適したｗｎｔポリペプチドとしては、これだけに限定されないが、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ／１３、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ７ｃ、Ｗｎｔ８、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ８ｃ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ１４、Ｗｎｔ１５、またはＷｎｔ１５、および生物活性のあるその断片が挙げられる。
【０２１２】
プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達経路を刺激する化合物として使用するために適したＧＳＫ３阻害剤は、ＧＳＫ３α、またはＧＳＫ３βに結合し、ＧＳＫ３α、またはＧＳＫ３βの活性を減少させる。ＧＳＫ３阻害剤の実例としては、これだけに限定されないが、ＢＩＯ（６−ブロモインジルビン−３’−オキシム）、ＬｉＣｌまたは米国特許第６，０５７，１１７号および同第６，６０８，０６３号；ならびに米国特許出願第２００４／００９２５３５号および同第２００４／０２０９８７８号において例証されている他のＧＳＫ−３阻害剤；ＡＴＰ競合的選択的ＧＳＫ−３阻害剤であるＣＨＩＲ−９１１およびＣＨｌＲ−８３７（それぞれＣＴ−９９０２１およびＣＴ−９８０２３とも称される）が挙げられる。Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ）。
【０２１３】
別の実施形態では、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達経路を刺激する化合物は、ｃＡＭＰ／Ｐ１３Ｋ／ＡＫＴ二次メッセンジャー経路を通じてシグナル伝達を増加させるものであり、ジブチリルｃＡＭＰ（ＤＢｃＡＭＰ）、ホルボールエステル、フォルスコリン、スクラレリン（ｓｃｌａｒｅｌｉｎｅ）、８−ブロモ−ｃＡＭＰ、コレラ毒素（ＣＴｘ）、アミノフィリン、２，４  ジニトロフェノール（ＤＮＰ）、ノルエピネフリン、エピネフリン、イソプロテレノール、イソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、カフェイン、テオフィリン（ジメチルキサンチン）、ドーパミン、ロリプラム、イロプロスト、脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）、および血管活性腸ポリペプチド（ＶＩＰ）、ならびにこれらの作用剤の誘導体からなる群から選択される。
【０２１４】
さらに別の実施形態では、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達経路を刺激する化合物は、Ｃａ２＋二次メッセンジャー経路を通じてシグナル伝達を増加させるものであり、Ｂａｐｔａ−ＡＭ、フェンジリン、ニカルジピンおよびこれらの化合物の誘導体からなる群から選択される。
【０２１５】
別の実施形態では、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達経路を刺激する化合物は、ＮＯ／アンジオテンシンシグナル伝達経路を通じてシグナル伝達を増加させるものであり、Ｌ−Ａｒｇ、ニトロプルシドナトリウム、バナジン酸ナトリウム、ブラジキニン、およびそれらの誘導体からなる群から選択される。
【０２１６】
一実施形態では、本発明は、形質導入の効率を改善する方法であって、細胞の集団を、レトロウイルスおよびプロスタグランジンＰＧＥ２；ＰＧＤ２；ＰＧＩ２；リノール酸；１３（ｓ）−ＨＯＤＥ；ＬＹ１７１８８３；ミード酸；エイコサトリエン酸；エポキシエイコサトリエン酸；ＯＮＯ−２５９；Ｃａｙ１０３９；ＰＧＥ２受容体アゴニスト；１６，１６−ジメチルＰＧＥ２；１９（Ｒ）−ヒドロキシＰＧＥ２；１６，１６−ジメチルＰＧＥ２ｐ−（ｐ−アセトアミドベンズアミド）フェニルエステル；１１−デオキシ−１６，１６−ジメチルＰＧＥ２；９−デオキシ−９−メチレン−１６，１６−ジメチルＰＧＥ２；９−デオキシ−９−メチレンＰＧＥ２；ブタプロスト；スルプロストン；ＰＧＥ２セリノールアミド；ＰＧＥ２メチルエステル；１６−フェニルテトラノルＰＧＥ２；１５（Ｓ）−１５−メチルＰＧＥ２；１５（Ｒ）−１５−メチルＰＧＥ２；ＢＩＯ；８−ブロモ−ｃＡＭＰ；フォルスコリン；Ｂａｐｔａ−ＡＭ；フェンジリン；ニカルジピン；ニフェジピン；ピモジド；ストロファンチジン；ラナトシド；Ｌ−Ａｒｇ；ニトロプルシドナトリウム；バナジン酸ナトリウム；ブラジキニン；メベベリン；フルランドレノリド；アテノロール；ピンドロール；ガボキサドール；キヌレン酸；ヒドララジン；チアベンダゾール；ビククリン；ベサミコール；ペルボシド；イミプラミン；クロルプロパミド；１，５−ペンタメチレンテトラゾール；４−アミノピリジン；ジアゾキシド；ベンフォチアミン；１２−メトキシドデセン酸；Ｎ−ホルミル−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ；ガラミン；ＩＡＡ９４；およびクロロトリアニセンからなる群から選択されるプロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる化合物１つまたは複数と一緒に培養する工程を含む方法を提供する。
【０２１７】
特定の実施形態では、本発明は、形質導入の効率を改善する方法であって、細胞の集団を、レトロウイルスおよび１６，１６−ジメチルＰＧＥ２、１６−１６ジメチルＰＧＥ２ｐ−（ｐ−アセトアミドベンズアミド）フェニルエステル、１１−デオキシ−１６，１６−ジメチルＰＧＥ２、９−デオキシ−９−メチレン−１６，１６−ジメチルＰＧＥ２、９−デオキシ−９−メチレンＰＧＥ２、９−ケトフルプロステノール、５−トランスＰＧＥ２、１７−フェニル−オメガ−トリノルＰＧＥ２、ＰＧＥ２セリノールアミド、ＰＧＥ２メチルエステル、１６−フェニルテトラノルＰＧＥ２、１５（Ｓ）−１５−メチルＰＧＥ２、１５（Ｒ）−１５−メチルＰＧＥ２、８−イソ−１５−ケトＰＧＥ２、８−イソＰＧＥ２イソプロピルエステル、２０−ヒドロキシＰＧＥ２、１１−デオキシＰＧＥｉ、ノクロプロスト、スルプロストン、ブタプロスト、１５−ケトＰＧＥ２、および１９（Ｒ）ヒドロキシ（ｈｙｄｒｏｘｙｙ）ＰＧＥ２からなる群から選択される、プロスタグランジンＥＰ受容体のリガンドである化合物１つまたは複数と一緒に培養する工程を含む方法を提供する。
【０２１８】
本発明は、細胞への形質導入効率を、細胞を、レトロウイルス、プロスタグランジンＥＰ受容体経路を刺激する化合物、例えばＰＧＥ２、および１つまたは複数のヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤の存在下で培養することによって増加させることができることも意図している。
【０２１９】
本発明の組成物および方法において使用するために適したＨＤＡＣ阻害剤の実例としては、これだけに限定されないが、ＴＳＡ（トリコスタチンＡ）（例えば、Ａｄｃｏｃｋ、（２００７年）Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １５０巻：８２９〜８３１頁を参照されたい）、ＶＰＡ（バルプロ酸）（例えば、Ｍｕｎｓｔｅｒら、（２００７年）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ
２５巻：１８Ｓ：１０６５頁を参照されたい）、酪酸ナトリウム（ＮａＢｕ）（例えば、Ｈａｎら、（２００７年）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １０８巻：１４３〜１５０頁を参照されたい）、ＳＡＨＡ（スベロイルアニリドヒドロキサム酸またはボリノスタット）（例えば、Ｋｅｌｌｙら、（２００５年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２巻：１５０〜１５７頁を参照されたい）、フェニル酪酸ナトリウム（例えば、Ｇｏｒｅら、（２００６年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６６巻：６３６１〜６３６９頁を参照されたい）、デプシペプチド（ＦＲ９０１２２８、ＦＫ２２８）（例えば、Ｚｈｕら、（２００３年）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３巻（３号）：１８７〜１９９頁を参照されたい）、トラポキシン（ＴＰＸ）（例えば、Ｆｕｒｕｍａｉら、（２００１年）ＰＮＡＳ  ９８巻（１号）：８７〜９２頁を参照されたい）、環状ヒドロキサム酸含有ペプチド１（ＣＨＡＰ１）（Ｆｕｒｕｍａｉ  上記を参照されたい）、ＭＳ−２７５（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＣａｒｎｉｎｃｉら、ＷＯ２００８／１２６９３２を参照されたい））、ＬＢＨ５８９（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＧｏｈら、ＷＯ２００８／１０８７４１を参照されたい）およびＰＸＤ−１０１（Ｇｏｈ、上記を参照されたい）を限定せずに含むＨＤＡＣ阻害剤が挙げられる。
【０２２０】
本発明は、細胞を、レトロウイルスの存在下で培養することができ、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達経路を刺激する化合物および／またはＨＤＡＣ阻害剤に、約１０分間〜約７２時間、約３０分間〜約７２時間、約３０分間〜約４８時間、約３０分間〜約２４時間、約３０分間〜約１２時間、約３０分間〜約８時間、約３０分間〜約６時間、約３０分間〜約４時間、約３０分間〜約２時間、約１時間〜約２時間、または間の任意の期間にわたって曝露させる（接触させる）ことができることを意図している。
【０２２１】
一実施形態では、レトロウイルスと一緒に培養した細胞を、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達経路を刺激する化合物および／またはＨＤＡＣ阻害剤に、約３０分間、約１時間、約２時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間、約４８時間、または約７２時間、または間の任意の期間にわたって曝露させる（接触させる）。
【０２２２】
本発明は、細胞を、レトロウイルスと一緒に培養する前に、レトロウイルスと一緒に培養している間に、またはレトロウイルスと一緒に培養した後に、またはそれらの任意の組み合わせで、本明細書に開示されている前記のいずれかの期間にわたって、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達経路を刺激する化合物１つまたは複数および／または１つまたは複数のＨＤＡＣ阻害剤と一緒に培養することができることを意図している。
【０２２３】
本発明は、さらに、細胞を、１つまたは複数のＨＤＡＣ阻害剤と一緒に培養する前に、１つまたは複数のＨＤＡＣ阻害剤と一緒に培養している間に、または１つまたは複数のＨＤＡＣ阻害剤と一緒に培養した後に、またはそれらの任意の組み合わせで、本明細書に開示されている前記のいずれかの期間にわたって、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達経路を刺激する化合物１つまたは複数およびレトロウイルスと一緒に培養することができることを意図している。
【０２２４】
本発明は、細胞を、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達経路を刺激する化合物１つまたは複数および／または１つまたは複数のＨＤＡＣ阻害剤と一緒に培養する前に、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達経路を刺激する化合物１つまたは複数および／または１つまたは複数のＨＤＡＣ阻害剤と一緒に培養している間に、またはプロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達経路を刺激する化合物１つまたは複数および／または１つまたは複数のＨＤＡＣ阻害剤と一緒に培養した後に、またはそれらの任意の組み合わせで、本明細書に開示されている前記のいずれかの期間にわたってレトロウイルスと一緒に培養することができることも意図している。
【０２２５】
さらに、形質導入を増加させるための本発明の方法は、細胞を、レトロウイルス、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達経路を刺激する化合物１つまたは複数および／または１つまたは複数のＨＤＡＣ阻害剤と一緒に、形質導入の最初の６時間の間、形質導入の最初の１２時間の間、形質導入の最初の２４時間の間、形質導入の最初の４８時間の間、または形質導入の最初の７２時間の間、または間の任意の形質導入の期間培養する工程を含むことは当業者には理解されよう。
【０２２６】
さらに、本発明は、細胞に、レトロウイルスおよびプロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達経路を刺激する化合物１つまたは複数および／または１つまたは複数のＨＤＡＣ阻害剤の存在下で１回、２回、３回またはそれより多くの回数形質導入することができることを意図している。別の実施形態では、本発明は、細胞に、レトロウイルスの存在下で１回、２回、３回またはそれより多くの回数形質導入し、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達経路を刺激する化合物１つまたは複数および／または１つまたは複数のＨＤＡＣ阻害剤に１回または２回のみ曝露させる（接触させる）ことができることを意図している。
【０２２７】
特定の実施形態では、本発明は、細胞を、レトロウイルス、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達経路を刺激する化合物１つまたは複数および／または１つまたは複数のＨＤＡＣ阻害剤中で培養することができ、そこで、細胞をそれらに、本明細書の他の箇所で開示されているものと同じまたは異なる期間にわたって前記のものに曝露または接触させることを意図している。
【０２２８】
本発明は、本発明の組成物および方法により、実質的に任意の細胞型への形質導入を、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％まで増加させることができることも意図している。
【０２２９】
特定の実施形態では、形質導入効率の増加は、形質導入された細胞が、ベクター単独で形質導入された細胞と比べて少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍、またはそれより大きな倍数富化されたことを表す。
【０２３０】
形質導入の前、形質導入の間、および／または形質導入の後に、細胞を、細胞の維持、成長、または増殖に適した培地で培養することができる。適切な培養培地および条件は当技術分野で周知である。そのような培地としては、これだけに限定されないが、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（登録商標）（ＤＭＥＭ）、ＤＭＥＭ  Ｆ１２  ｍｅｄｉｕｍ（登録商標）、Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｉｎｉｍｕｍ
Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（登録商標）、Ｆ−１２Ｋ  ｍｅｄｉｕｍ（登録商標）、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（登録商標）、ＲＰＭＩ−１６４０  ｍｅｄｉｕｍ（登録商標）、およびｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ  ｍｅｄｉｕｍ  ｆｏｒ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ＳＦＥＭ（登録商標）が挙げられる。多くの培地は、ピルビン酸ナトリウムを含む、または含まない低グルコース調合物としても利用可能である。
【０２３１】
最適な成長および増大のために必要な微量元素を細胞に供給するために、追加の補充剤を有利に使用することもできる。そのような補充剤として、インスリン、トランスフェリン、セレンナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｓｅｌｅｎｉｕｍ）およびそれらの組み合わせが挙げられる。これらの構成成分は、これだけに限定されないが、Ｈａｎｋｓ’Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（登録商標）（ＨＢＳＳ）、Ｅａｒｌｅ’ｓ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（登録商標）、抗酸化剤補充剤、ＭＣＤＢ−２０１（登録商標）補充剤、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、アスコルビン酸およびアスコルビン酸−２−リン酸、ならびに追加のアミノ酸などの塩類溶液中に含めることができる。多くの細胞培養培地はアミノ酸をすでに含有するが、いくつかは細胞を培養する前に補充する必要がある。そのようなアミノ酸としては、これだけに限定されないが、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、およびＬ−バリンが挙げられる。これらの補充剤の適切な濃度を決定することは十分に当業者の技術の範囲内である。
【０２３２】
ホルモンも本発明の細胞培養物に有利に使用することができ、それらとしては、これだけに限定されないが、Ｄ−アルドステロン、ジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）、デキサメタゾン、β−エストラジオール、ヒドロコルチゾン、インスリン、プロラクチン、プロゲステロン、ソマトスタチン／ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）、甲状腺刺激ホルモン、チロキシンおよびＬ−チロニンが挙げられる。
【０２３３】
脂質および脂質キャリアも、細胞の種類および分化細胞の発生運命に応じて細胞培養培地への補充に使用することができる。そのような脂質およびキャリアとしては、これだけに限定されないが、とりわけ、シクロデキストリン（α、β、γ）、コレステロール、アルブミンとコンジュゲートしたリノール酸、アルブミンとコンジュゲートしたリノール酸およびオレイン酸、コンジュゲートしていないリノール酸、アルブミンとコンジュゲートしたリノール酸−オレイン酸−アラキドン酸ならびにアルブミンとコンジュゲートしていないオレイン酸およびコンジュゲートしたオレイン酸を挙げることができる。
【０２３４】
細胞は、低血清または無血清の培養培地で培養することもできる。細胞を培養するために使用する無血清培地は、例えば、米国特許第７，０１５，０３７号に記載されている。多くの細胞が無血清培地または低血清培地で成長している。
【０２３５】
形質導入後に、形質導入された細胞を、それらの維持、成長または増殖に適した条件下で培養することができる。特定の実施形態では、形質導入された細胞を、移植前に約１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間または１４日間培養する。
【０２３６】
形質導入の前、形質導入の間、および／または形質導入の後に、細胞を、幹細胞または前駆細胞の増大を促進する条件下で培養することができる。当技術分野で公知の任意の方法を用いることができる。ある実施形態では、形質導入の前、形質導入の間、または形質導入の後に、細胞を、幹細胞または前駆細胞の増大を促進する１つまたは複数の増殖因子の存在下で培養する。幹細胞または前駆細胞の増大を促進する増殖因子の例としては、これだけに限定されないが、マウス造血幹細胞の自己再生を促進することが実証されている胎児肝臓チロシンキナーゼ（Ｆｌｔ３）リガンド、幹細胞因子、インターロイキン６、およびインターロイキン１１が挙げられる。他のものとしては、骨形成タンパク質４を活性化することによって初期の造血前駆体の増殖を誘導するソニックヘッジホッグ、ＨＳＣの自己再生を刺激するＷｎｔ３ａ、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＦ）、形質転換増殖因子−β（ＴＧＦ−β）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ、例えば、塩基性ＦＧＦ、酸性ＦＧＦ、ＦＧＦ−１７、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−８ｂ、ＦＧＦ−８ｃ、ＦＧＦ−９）、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ、例えば、ＰＤＧＦＡＡ、ＰＤＧＦＡＢ、ＰＤＧＦＢＢ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ストロマ細胞由来因子（ＳＣＤＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）またはインターロイキン−３（ＩＬ−３）が挙げられる。特定の実施形態では、形質導入の前、形質導入の間、または形質導入の後に、細胞を、幹細胞または前駆細胞の増大を促進する１つまたは複数の増殖因子の存在下で培養する。
【０２３７】
本明細書において提供される記載および実施例では特に造血幹細胞を含めた多分化能細胞の形質導入および選択に焦点が合わされているが、本発明の方法および組成物は、他の種類の多能性幹細胞または多分化能幹細胞および以前は治療的に使用するために形質導入される細胞の選択を適用できなかった脆弱細胞を含めた他の細胞型の形質導入および選択にも用いることができる。
【０２３８】
本発明の方法に従って使用する細胞は、任意の動物、好ましくは哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類またはヒト、より好ましくはヒトから得ることができ、それらの細胞は、任意の動物、好ましくは哺乳動物、およびより好ましくはヒトに移植することができる。
【０２３９】
本発明の遺伝子治療の方法における形質導入および投与に適した細胞としては、これだけに限定されないが、幹細胞、前駆細胞、および分化細胞が挙げられる。
【０２４０】
本発明の組成物および方法を用いて形質導入するために適した幹細胞の実例としては、これだけに限定されないが、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、中胚葉幹細胞、内胚葉幹細胞、および外胚葉幹細胞が挙げられる。
【０２４１】
特定の実施形態では、本明細書において意図されている組成物および方法を用いて形質導入された細胞の集団または供給源は、間葉幹細胞および／または前駆細胞、中胚葉幹細胞および／または前駆細胞、内胚葉幹細胞および／または前駆細胞、または外胚葉幹細胞および／または前駆細胞を含む。ある実施形態では、本明細書において意図されている方法において使用する細胞の集団または供給源は、骨髄幹細胞、臍帯血幹細胞および／または前駆細胞、骨幹細胞および／または前駆細胞、筋肉幹細胞および／または前駆細胞、造血幹細胞および／または前駆細胞、脂肪幹細胞および／または前駆細胞、軟骨幹細胞および／または前駆細胞、神経幹細胞および／または前駆細胞、皮膚幹細胞および／または前駆細胞、肝幹細胞および／または前駆細胞、膵幹細胞および／または前駆細胞、腎幹細胞および／または前駆細胞、胃幹細胞および／または前駆細胞、および腸幹細胞および／または前駆細胞を含む。
【０２４２】
ある実施形態では、本発明の組成物および方法を用いて形質導入された細胞の集団または供給源としては、これだけに限定されないが、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、骨格筋、心筋、ニューロン、グリア細胞（星状膠細胞、オリゴデンドロサイト、シュワン細胞）、網膜細胞（桿状体細胞、錐状体細胞）、角膜細胞、皮膚細胞、単球およびマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板、樹状細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、胃細胞、腸細胞、平滑筋細胞、血管細胞、膀胱細胞、膵島細胞（膵アルファ細胞、膵ベータ細胞、膵デルタ細胞）、肝細胞、腎細胞、副腎細胞、および肺細胞が挙げられる。
【０２４３】
種々の実施形態では、幹細胞を使用することが好ましく、これは、幹細胞がｉｎ  ｖｉｖｏで特定の生物学的ニッシェに投与されると適切な細胞型に分化する能力を有するためである。
【０２４４】
好ましい実施形態では、本発明の組成物および方法を用いて、造血幹細胞または造血前駆細胞の形質導入を増加させる。
【０２４５】
本発明は、細胞の集団の単離および形質導入も意図している。本明細書で使用される場合、「細胞の集団」という用語は、任意の数および／または組み合わせの、本明細書の他の箇所に記載の同種細胞型または異種細胞型で構成されていてよい複数の細胞を指す。例えば、造血幹細胞または造血前駆細胞に形質導入するために、細胞の集団を、臍帯血、胎盤血、骨髄、または末梢血から単離するまたは得ることができる。細胞の集団は、形質導入される標的細胞型を約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％含んでよい。ある実施形態では、造血幹細胞または造血前駆細胞を、異種細胞の集団から当技術分野で公知の方法を用いて単離または精製することができる。特定の実施形態では、細胞の集団に形質導入した後に造血幹細胞または造血前駆細胞を精製し、他の実施形態では、形質導入の前に造血幹細胞または造血前駆細胞を単離する。
【０２４６】
本発明の細胞は、形質導入の前にまたは形質導入の後に当技術分野で公知の方法を用いて（ｓｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｋｎｏｗｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｒｔ）凍結保存することもできる。培養物中で確立されたら、細胞は、新鮮にまたは凍結して使用すること、および、例えば、４０％ＦＣＳおよび１０％ＤＭＳＯを含むＤＭＥＭを使用して凍結ストックとして保管することができる。当業者は培養細胞の凍結ストックを調製するための他の方法も利用可能である。
【０２４７】
特定の実施形態では、幹細胞または前駆細胞を含む細胞の集団を、レトロウイルス、例えば、レンチウイルス、およびプロスタグランジンシグナル伝達を増加させる化合物１つまたは複数、例えば、ＰＧＥ２またはその類似体または誘導体などのプロスタグランジンＥＰ受容体リガンドと接触させる。ある実施形態では、細胞の集団を、さらに１つまたは複数のＨＤＡＣ阻害剤と接触させる。種々の実施形態では、細胞の集団をｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｖｏで接触させる。
【０２４８】
ある好ましい実施形態では、幹細胞または前駆細胞は造血幹細胞または造血前駆細胞である。
【０２４９】
Ｅ．細胞培養物組成物
本発明は、さらに、レトロウイルスおよびプロスタグランジンシグナル伝達を増加させる化合物１つまたは複数を含む培養培地における細胞の培養物を含む、細胞に基づく組成物を意図している。本明細書全体を通して考察されている通り、特定の実施形態では、本組成物および方法は、ｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおける細胞に基づく遺伝子治療に有用である。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、薬学的に許容される細胞培養培地である。
【０２５０】
本発明の細胞に基づく組成物を含む治療用の培養物、細胞培養物、培養系、または細胞培養物組成物（ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）は、経腸投与方法もしくは非経口投与方法によって単独で、または所望の処置目的を果たすための他の適切な化合物、例えば、１つまたは複数の増殖因子と組み合わせて投与することができる。
【０２５１】
例示的な一実施形態では、本発明の形質導入された細胞を含む治療用の培養物、細胞培養物、培養系、または細胞培養物組成物を組織内に直接注射することによって全身的に投与する。
【０２５２】
Ｆ．組成物および製剤
本発明の製剤および組成物は、単独で、または１つまたは複数の他の治療のモダリティと組み合わせて、細胞、組織、器官、または動物に投与するための、薬学的に許容されるまたは生理的に許容される溶液（例えば、培養培地）中に製剤化された、本明細書に記載の、任意の数の形質導入された細胞または形質導入されていない細胞またはそれらの組み合わせ、ウイルスベクター、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、および１つまたは複数の化合物、例えば、プロスタグランジンシグナル伝達を増加させる化合物および／またはＨＤＡＣ阻害剤の組み合わせを含んでよい。
【０２５３】
本発明の特定のｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ製剤および組成物は、単独で、または１つまたは複数の他の治療のモダリティと組み合わせて、細胞、組織、器官、または動物に投与するための、薬学的に許容されるまたは生理的に許容される溶液（例えば、培養培地）中に製剤化された、本明細書に記載の、形質導入された細胞または形質導入されていない細胞またはそれらの組み合わせ、ウイルスベクター、および１つまたは複数の化合物、例えば、プロスタグランジンシグナル伝達を増加させる化合物および／またはＨＤＡＣ阻害剤の組み合わせを含んでよい。
【０２５４】
本発明の特定のｉｎ  ｖｉｖｏ製剤および組成物は、単独で、または１つまたは複数の他の治療のモダリティと組み合わせて、動物内の細胞または組織に投与し、それに形質導入するための、薬学的に許容されるまたは生理的に許容される溶液（例えば、培養培地）中に製剤化された、本明細書に記載の、ウイルスベクター、および化合物１つまたは複数、例えば、プロスタグランジンシグナル伝達を増加させる化合物および／またはＨＤＡＣ阻害剤の組み合わせを含んでよい。
【０２５５】
ある実施形態では、本発明は、１種または複数種の薬学的に許容されるキャリア（添加物）および／または希釈剤（例えば、薬学的に許容される細胞培養培地）と一緒に製剤化された、治療有効量の本明細書に記載の形質導入された細胞を含む組成物を提供する。
【０２５６】
他のある実施形態では、本発明は、１種または複数種の薬学的に許容されるキャリア（添加物）および／または希釈剤（例えば、薬学的に許容される細胞培養培地）と一緒に製剤化された、本明細書に記載のレトロウイルスベクターおよびプロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる化合物１つまたは複数を含む組成物を提供する。
【０２５７】
特定の実施形態では、本発明は、１種または複数種の薬学的に許容されるキャリア（添加物）および／または希釈剤（例えば、薬学的に許容される細胞培養培地）と一緒に製剤化された、本明細書に記載の幹細胞または前駆細胞を含む細胞の集団、レトロウイルスベクター、およびプロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる化合物１つまたは複数を含む組成物を提供する。関連する実施形態では、細胞の集団は、造血幹細胞および造血前駆細胞を含む。
【０２５８】
本発明は、本明細書に記載の方法によって生成された形質導入された細胞および薬学的に許容されるキャリアを含む医薬組成物をさらに含む。他の実施形態では、本発明は、本明細書に記載のレトロウイルスベクターおよび１つまたは複数の化合物、例えば、プロスタグランジンシグナル伝達を増加させる化合物および／またはＨＤＡＣ阻害剤を含む医薬組成物を提供する。
【０２５９】
「薬学的に許容される」という句は、ヒトに投与されたときにアレルギー性または同様の不都合な反応を生じさせない分子実体および組成物を指す。タンパク質を活性成分として含有する水性組成物の調製は当技術分野ではよく理解されている。一般には、そのような組成物は、液体の溶液または懸濁物のいずれかの注射剤として調製され、注射前に液体での溶液、または液体での懸濁物に適した固体形態も調製することができる。調製物は乳化されていてもよい。
【０２６０】
本明細書で使用される場合、「キャリア」とは、任意のかつ全ての溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤、緩衝剤、キャリア溶液、懸濁物、およびコロイドなどを包含する。薬学的に活性な物質へのそのような媒体および作用剤の使用は当技術分野において周知である。任意の従来の媒体または作用剤が活性成分と適合しない場合を除く限りでは、治療用組成物におけるその使用が意図されている。補充の活性成分も組成物に組み入れることができる。
【０２６１】
本発明は、本明細書に記載の方法に従って作製された形質導入された細胞と、薬学的に許容されるキャリアとを含む医薬組成物をさらに含む。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容されるキャリア」とは、薬学的に許容される細胞培養培地を含めた生理的に適合性の任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などを包含する。一実施形態では、キャリアを含む組成物は、非経口投与、例えば、血管内投与（静脈内投与または動脈内投与）、腹腔内投与または筋肉内投与に適している。薬学的に許容されるキャリアとしては、滅菌注射用液剤または分散剤を即時調製するための滅菌水溶液または分散液および滅菌粉末が挙げられる。薬学的に活性な物質へのそのような媒体および作用剤（ａｇｅｎｔ）の使用は当技術分野において周知である。任意の従来の媒体または作用剤が形質導入された細胞と適合しない場合を除く限りでは、本発明の医薬組成物におけるそれらの使用が意図されている。
【０２６２】
本発明の組成物は、細胞または動物に投与するために、単独で、または１つまたは複数の他の療法のモダリティと組み合わせて、薬学的に許容されるまたは生理的に許容される液剤に製剤化される、本明細書に記載の１つまたは複数のポリペプチド、ポリヌクレオチド、それを含むベクター、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる化合物、ＨＤＡＣ阻害剤、および形質導入された細胞などを含んでよい。所望であれば、本発明の組成物は、他の作用剤、例えば、サイトカイン、増殖因子、ホルモン、小分子または種々の薬学的に活性な作用剤などとも組み合わせて投与することができることも理解されよう。同様に組成物に含めることができる他の構成成分に対する限定は、追加的な作用剤が、意図された遺伝子治療を送達する組成物の能力に悪影響を及ぼさないのであれば、実質的に存在しない。
【０２６３】
本発明の医薬組成物では、薬学的に許容される賦形剤およびキャリア溶液の処方は、本明細書に記載の特定の組成物を、例えば、経口的、非経口的、静脈内、鼻腔内、および筋肉内への投与および処方を含めた種々の治療レジメンにおいて使用するための適切な投薬および治療レジメンの開発と同様に当業者に周知である。
【０２６４】
ある特定の状況では、本明細書に開示されている組成物を、例えば、米国特許第５，５４３，１５８号；同第５，６４１，５１５号および同第５，３９９，３６３号（そのそれぞれの全体が参照により具体的に本明細書に組み込まれる）に記載の通り、非経口的に、静脈内に、筋肉内に、またはさらには腹腔内に送達することが望ましい。遊離塩基または薬理学的に許容される塩としての活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合した水中に調製することができる。分散物をグリセロール、液体ポリエチレングリコール、ならびにそれらの混合物中に、および油中に調製することもできる。通常の保管および使用の条件下では、これらの調製物は、微生物の成長を予防するために防腐剤を含有する。
【０２６５】
注射による使用に適した医薬形態としては、滅菌水溶液または分散物、および滅菌の注射可能な溶液または分散物を即時調製するための滅菌粉末が挙げられる（米国特許第５，４６６，４６８号、その全体が参照により具体的に本明細書に組み込まれる）。全ての場合において、形態は滅菌されているべきであり、また、容易に注射可能である程度まで流体であるべきである。形態は製造および保管の条件下で安定であるべきであり、また、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されるべきである。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、適切なそれらの混合物、ならびに／または植物油を含有する溶媒または分散媒であってよい。妥当な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することによって、分散の場合では必要な粒度を維持することによって、および界面活性剤を使用することによって維持することができる。微生物の作用の予防は、種々の抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによって容易にすることができる。多くの場合、等張化剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の持続的な吸収は、吸収を遅延させる作用物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に使用することによってもたらすことができる。
【０２６６】
水溶液中で非経口投与するためには、例えば、溶液は、必要であれば適切に緩衝されているべきであり、液体希釈剤は最初に十分な食塩水またはグルコースを用いて等張性にされる。これらの特定の水溶液は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与および腹腔内投与に特に適している。これに関連して、使用することができる滅菌水性媒体は本開示を考慮すれば当業者に公知になろう。例えば、１投与量を、等張性のＮａＣｌ溶液１ｍｌに溶解させ、皮下注入用流体１０００ｍｌに添加するか、提唱された注入部位に注射することができる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、２００５年を参照されたい）。治療されている被験体の状態に応じて、投与量にいくらかの変動が必ず生じる。いずれにしても、投与に関与する人が個々の被験体に対する適切な用量を決定する。さらに、ヒトに投与するためには、調製物は、ＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  ｓｔａｎｄａｒｄｓにより必要とされる滅菌、発熱性、および一般的な安全性および純度の標準に適うべきである。
【０２６７】
滅菌注射用溶液は、必要量の活性化合物を、必要に応じて上に列挙されている種々の他の成分を含む適切な溶媒中に組み入れ、その後、濾過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散物は、種々の滅菌された活性成分を、基本的な分散媒および上に列挙されているものからの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に組み入れることによって調製される。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌粉末の場合では、好ましい調製方法は、活性成分の粉末と、それに加えて任意の追加的な所望の成分を、予め滅菌濾過したその溶液から得る真空乾燥および凍結乾燥技法である。
【０２６８】
本明細書に開示されている組成物は、中性の形態または塩の形態に製剤化することができる。薬学的に許容される塩としては酸付加塩（タンパク質の遊離のアミノ基と形成される）が挙げられ、これは、例えば、塩酸またはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸と形成される。遊離のカルボキシル基と形成される塩も、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化第二鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から得ることができる。製剤化の際、溶液を投与製剤と適合する様式および治療的に有効な量で投与する。製剤は、注射用溶液、薬物放出カプセル剤などの種々の剤形で容易に投与される。
【０２６９】
ある特定の実施形態では、組成物は、鼻腔内噴霧、吸入、および／または他のエアロゾル送達ビヒクルによって送達することができる。遺伝子、ポリヌクレオチド、およびペプチド組成物を経鼻エアロゾル噴霧によって肺に直接送達するための方法は、例えば、米国特許第５，７５６，３５３号および同第５，８０４，２１２号（そのそれぞれの全体が参照により具体的に本明細書に組み込まれる）に記載されている。同様に、鼻腔内微小粒子樹脂（Ｔａｋｅｎａｇａら、１９９８年）およびリゾホスファチジル−グリセロール化合物（米国特許第５，７２５，８７１号、その全体が参照により具体的に本明細書に組み込まれる）を使用した薬物の送達も、製薬技術分野において周知である。同様に、ポリテトラフルオロエチレン（ｐｏｌｙｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｅｔｈｅｙｌｅｎｅ）支持マトリックスの形態での経粘膜薬物送達は、米国特許第５，７８０，０４５号（その全体が参照により具体的に本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０２７０】
ある特定の実施形態では、送達は、本発明の組成物を適切な宿主細胞に導入するために、リポソーム、ナノカプセル、微小粒子、ミクロスフェア、脂質粒子、小胞を、必要に応じて、ＣＰＰポリペプチドなどと混合して使用することによって起こり得る。具体的には、本発明の組成物は、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフェア、ナノ粒子などのいずれかに封入して送達するために製剤化することができる。そのような送達ビヒクルの製剤化および使用は、公知かつ従来の技法を用いて行うことができる。本発明の製剤および組成物は、細胞または動物に投与するために、単独で、または１つまたは複数の他の療法のモダリティと組み合わせて、薬学的に許容されるまたは生理的に許容される溶液（例えば、培養培地）中に製剤化された、本明細書に記載の任意の数のポリペプチド、ポリヌクレオチド、および小分子の組み合わせで構成される１つまたは複数の抑制因子および／または活性化因子を含んでよい。所望であれば、本発明の組成物は、他の作用物質、例えば、細胞、他のタンパク質またはポリペプチドまたは種々の薬学的に活性な作用物質などとも組み合わせて投与することができることも理解されよう。
【０２７１】
ある特定の実施形態では、本発明は、これだけに限定されないが、レトロウイルス（例えば、レンチウイルス）ベクターを含めたウイルスベクター系を送達するため（すなわち、ウイルス媒介性形質導入）に適した製剤または組成物を提供する。
【０２７２】
ｅｘ  ｖｉｖｏ送達のための例示的な製剤は、当技術分野で公知の種々のトランスフェクション薬剤、例えば、リン酸カルシウム、電気穿孔、熱ショックおよび種々のリポソーム製剤（すなわち、脂質媒介性トランスフェクション）などの使用も含んでよい。下でより詳細に説明されている通り、リポソームは、水性流体の画分が閉じ込められた脂質二重層である。ＤＮＡは、自発的にカチオン性リポソームの外面と会合し（その電荷によって）、これらのリポソームは細胞膜と相互作用する。
【０２７３】
ある特定の態様では、本発明は、１種または複数種の薬学的に許容されるキャリア（添加物）および／または希釈剤（例えば、薬学的に許容される細胞培養培地）と一緒に製剤化された治療有効量の本明細書に記載の１つまたは複数のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含む薬学的に許容される組成物を提供する。
【０２７４】
本発明の特定の実施形態は、他の製剤、例えば、製薬技術分野で周知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、２００５年に記載されているものなどを含んでよい。
【０２７５】
ある実施形態では、本発明の組成物は、有効量の組成物を含み、必要に応じて、１つまたは複数の補助的治療剤を含む。本発明のある実施形態では、細胞に基づく組成物を含み、必要に応じて１つまたは複数の補助的治療剤を含む組成物は、滅菌食塩水、リンゲル液、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）、またはＩｓｏｌｙｔｅ  Ｓ、ｐＨ７．４、無血清細胞培地、または本明細書の他の箇所で考察されている別の薬学的に許容される培地（例えば、細胞培養培地）をさらに含んでよい。
【０２７６】
特定の実施形態では、細胞の集団を含む組成物を、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる化合物１つまたは複数および／または１つまたは複数のＨＤＡＣ阻害剤をそれぞれ独立に約１μＭ〜約１００μＭの最終濃度で用いて処理する（例えば、それに接触させる）。ある実施形態では、細胞の集団を、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる化合物１つまたは複数および／または１つまたは複数のＨＤＡＣ阻害剤をそれぞれ独立に約１×１０−１４Ｍ〜約１×１０−３Ｍ、約１×１０−１３Ｍ〜約１×１０−４Ｍ、約１×１０−１２Ｍ〜約１×１０−５Ｍ、約１×１０−１１Ｍ〜約１×１０−４Ｍ、約１×１０−１１Ｍ〜約１×１０−５Ｍ、約１×１０−１０Ｍ〜約１×１０−４Ｍ、約１×１０−１０Ｍ〜約１×１０−５Ｍ、約１×１０−９Ｍ〜約１×１０−４Ｍ、約１×１０−９Ｍ〜約１×１０−５Ｍ、約１×１０−８Ｍ〜約１×１０−４Ｍ、約１×１０−７Ｍ〜約１×１０−４Ｍ、約１×１０−６Ｍ〜約１×１０−４Ｍの最終濃度、または間の任意の範囲の最終濃度で用いて処理する。
【０２７７】
別の特定の実施形態では、細胞の集団を、それぞれ独立に約１×１０−１４Ｍ、約１×１０−１３Ｍ、約１×１０−１２Ｍ、約１×１０−１０Ｍ、約１×１０−９Ｍ、約１×１０−８Ｍ、約１×１０−７Ｍ〜約１×１０−６Ｍ、約１×１０−５Ｍ、約１×１０−４Ｍ、約１×１０−３Ｍの最終濃度、または間の任意の最終濃度のプロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる化合物の１つまたは複数および／または１つまたは複数のＨＤＡＣ阻害剤と接触させる。プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる化合物１つまたは複数（ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ  ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ）および／または１つまたは複数のＨＤＡＣ阻害剤を含む組成物では、化合物は互いと異なる濃度であっても同じ濃度であってもよい。
【０２７８】
当業者は、本発明の方法のための、形質導入された細胞および／またはプロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる化合物１つまたは複数および／または１つまたは複数のＨＤＡＣ阻害剤を含む有効量の組成物の適切な投与経路および適正な投与量を決定するために常套的な方法を用いることができる。特定の療法では、治療をもたらすために本発明の医薬組成物を複数回投与することが必要になることが理解されることも当業者に公知である。
【０２７９】
例えば、組成物を、１週間、２週間、３週間、１カ月間、２カ月間、３カ月間、４カ月間、５カ月間、６カ月間、１年間、２年間、５年間、１０年間にわたって、またはそれを超えて、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、または１０回またはそれより多くの回数投与することができる。
【０２８０】
さらに、本発明の同じまたは異なる組成物の複数の投与を、上記の通り、長期間にわたって複数回施行することができる。
【０２８１】
さらに、形質導入された細胞および／またはプロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる化合物１つまたは複数および／または１つまたは複数のＨＤＡＣ阻害剤の投与は、本明細書の他の箇所で考察されている通り同じ経路によるものであっても異なる経路によるものであってもよい。形質導入された細胞および／またはプロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる化合物１つまたは複数および／または１つまたは複数のＨＤＡＣ阻害剤の投与は、異なる部位に、同じまたは異なる投与経路の投与を用いて実施することもできる。さらに、形質導入された細胞および／またはプロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる化合物１つまたは複数および／または１つまたは複数のＨＤＡＣ阻害剤の投与は、同じ部位に、同じ経路によって、同時に、または異なる時間に行うことができる。
【０２８２】
Ｇ．遺伝子治療の方法
形質導入された細胞および対応するレトロウイルスベクターにより、遺伝子治療の改善された方法がもたらされる。本明細書で使用される場合、「遺伝子治療」という用語は、細胞のゲノムへの遺伝子の導入を指す。種々の実施形態では、本発明のウイルスベクターは、造血幹細胞治療に適した単一遺伝子の疾患、障害、もしくは状態または造血系の疾患、障害、もしくは状態を有すると診断された被験体またはそれを有する疑いがある被験体に治癒的、予防的、または軽減的利益をもたらすポリペプチドをコードする治療用導入遺伝子を発現する造血発現制御配列を含む。
【０２８３】
好ましい一実施形態では、本発明は、脳小膠細胞に発達する潜在性を有する形質導入された細胞を提供する。特定の実施形態では、造血幹細胞を、本発明のベクターを用いて形質導入し、副腎白質ジストロフィーまたは副腎脊髄神経障害に対する治療を必要とする個体に投与する。造血幹細胞は脳小膠細胞を起源とし、したがって好ましい。
【０２８４】
特定の実施形態では、形質導入された造血幹細胞または造血前駆細胞は、単一遺伝子の疾患、障害、もしくは状態または造血系の疾患、障害、もしくは状態と診断されたか、あるいは単一遺伝子の疾患、障害、もしくは状態または造血系の疾患、障害、もしくは状態を有する疑いがある被験体に治癒的、予防的、または軽減的利益をもたらすポリペプチドをコードする治療用導入遺伝子を発現する造血発現制御配列を有するウイルスベクターを含む。
【０２８５】
ウイルス、例えば、レンチウイルス、および／またはプロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる化合物１つまたは複数および／または１つまたは複数のＨＤＡＣ阻害剤を含む組成物を、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ベクターを単独で用いて形質導入された細胞と比較して増加した効率で細胞に感染させ、それに形質導入することができる。ｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける実施形態では、次いで、形質導入された細胞を、治療を必要とする被験体に投与することができる。本発明は、本発明のベクター、ウイルス粒子、および形質導入された細胞を使用して、被験体における単一遺伝子の疾患、障害、もしくは状態または造血系の疾患、障害、もしくは状態、例えば、異常ヘモグロビン症を処置する、予防する、および／または軽減することを意図している。
【０２８６】
本明細書で使用される場合、「造血」とは、前駆細胞からの血液細胞の形成および発達ならびに幹細胞からの前駆細胞の形成を指す。血液細胞としては、これだけに限定されないが、赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）または赤血球（ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ）（ＲＢＣ）、網状赤血球、単球、好中球、巨核球、好酸球、好塩基球、Ｂ細胞、マクロファージ、顆粒球、肥満細胞、栓球、および白血球が挙げられる。
【０２８７】
本明細書で使用される場合、「異常ヘモグロビン症」または「異常ヘモグロビン症の状態」という用語は、血液中に異常なヘモグロビン分子が存在することを伴う任意の障害を包含する。異常ヘモグロビン症の例としては、これだけに限定されないが、ヘモグロビンＣ症、ヘモグロビン鎌状赤血球症（ＳＣＤ）、鎌状赤血球貧血、およびサラセミアが挙げられる。血液中に異常なヘモグロビンの組み合わせが存在する異常ヘモグロビン症（例えば、鎌状赤血球／Ｈｂ−Ｃ症）も包含される。
【０２８８】
「鎌状赤血球貧血」または「鎌状赤血球症」という用語は、本明細書では、赤血球の鎌状化に起因する任意の症候性の貧血性の状態を包含すると定義される。鎌状赤血球症の徴候としては、貧血；疼痛；ならびに／または臓器機能障害、例えば、腎不全、網膜症、急性胸部症候群、虚血、持続勃起症および脳卒中が挙げられる。本明細書で使用される場合、「鎌状赤血球症」という用語は、特にＨｂＳにおける鎌状赤血球置換についてホモ接合体である被験体における鎌状赤血球貧血に伴う種々の臨床的問題を指す。本明細書において鎌状赤血球症という用語を使用することによって言及される体質性徴候としては、成長および発達の遅延、特に肺炎球菌に起因する重篤な感染症が発生する傾向の増加、再発性梗塞および最終的な脾組織の破壊を伴う、循環している細菌の有効なクリアランスが妨げられる脾機能の著しい欠陥がある。「鎌状赤血球症」という用語には、主に腰椎、腹部、および大腿骨幹（ｆｅｍｏｒａｌ  ｓｈａｆｔ）に影響を及ぼし、機構および重症度が減圧痛と同様である筋骨格痛の急性エピソードも包含される。成人では、そのような発作（ａｔｔａｃｋ）は、一般に、数週間または数カ月ごとに持続時間の短い軽度または中程度の発作（ｂｏｕｔ）として顕在化し、その間に平均で１年に約１回、５〜７日間続く苦痛な発作（ａｔｔａｃｋ）に襲われる。そのような発症のトリガーとなることが公知の事象はアシドーシス、低酸素症および脱水であり、これらは全て細胞内でのＨｂＳの重合を増強する（Ｊ．  Ｈ．  Ｊａｎｄｌ、Ｂｌｏｏｄ：  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ、第２版、Ｌｉｔｔｌｅ，  Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｂｏｓｔｏｎ、１９９６年、５４４〜５４５頁）。本明細書で使用される場合、「サラセミア」という用語は、ヘモグロビンの合成に影響を及ぼす変異に起因して起こる遺伝性貧血を包含する。したがって、この用語は、重度のまたはβサラセミア、サラセミアメジャー、中等症サラセミア、ヘモグロビンＨ症などのαサラセミアなどのサラセミアの状態によって生じる任意の症候性貧血を包含する。
【０２８９】
本明細書で使用される場合、「サラセミア」とは、ヘモグロビンの生成の欠陥を特徴とする遺伝性障害を指す。サラセミアの例としては、αサラセミアおよびβサラセミアが挙げられる。βサラセミアは、ベータグロビン鎖の変異によって引き起こされ、重症型または軽症型で（ｉｎ  ａ  ｍａｊｏｒ  ｏｒ  ｍｉｎｏｒ  ｆｏｒｍ）起こり得る。重症型のβサラセミアでは、出生時には小児は正常であるが、生後１年間で貧血を発症する。軽症型のβサラセミアでは、小さな赤血球が産生され、グロビン鎖由来の１つまたは複数の遺伝子の欠失によってサラセミアが引き起こされる。軽症型サラセミアは、一方の親のみから欠陥のある遺伝子を受けついだ場合に起こる。この型の障害を有する人は、疾患の保有者であり、通常は症状を有さない。
【０２９０】
αサラセミアは、一般には、ＨＢＡ１遺伝子およびＨＢＡ２遺伝子が関与する欠失によって生じる。これらの遺伝子はどちらも、ヘモグロビンの構成成分（サブユニット）であるα−グロビンをコードする。各細胞のゲノムにはＨＢＡ１遺伝子の２つのコピーおよびＨＢＡ２遺伝子の２つのコピーが存在する。結果として、α−グロビンを産生する４つの対立遺伝子が存在する。種々の種類のαサラセミアがこれらの対立遺伝子の一部または全部の喪失に起因する。αサラセミアの最も重度の型であるＨｂ  Ｂａｒｔ症候群は、α−グロビン対立遺伝子４つ全てが喪失することによって生じる。ＨｂＨ症は、α−グロビン対立遺伝子４つのうち３つが喪失することによって引き起こされる。これらの２つの状態では、α−グロビンの不足により、細胞が正常なヘモグロビンを作ることが妨げられる。その代わりに、細胞は、ヘモグロビンＢａｒｔ（Ｈｂ  Ｂａｒｔ）またはヘモグロビンＨ（ＨｂＨ）と称される異常な形態のヘモグロビンを産生する。これらの異常なヘモグロビン分子は酸素を体の組織に有効に運搬することができない。Ｈｂ  ＢａｒｔまたはＨｂＨで正常なヘモグロビンが置換されることにより、αサラセミアに関連する貧血および他の重篤な健康問題が引き起こされる。
【０２９１】
好ましい実施形態では、本発明の遺伝子治療の方法を用いて、ヘモグロビンＣ症、ヘモグロビン鎌状赤血球症（ＳＣＤ）、鎌状赤血球貧血、遺伝性貧血、サラセミア、β−サラセミア、サラセミメジャーア、中等症サラセミア、α−サラセミア、およびヘモグロビンＨ症からなる群から選択される異常ヘモグロビン症を処置する、予防する、または軽減する。
【０２９２】
種々の実施形態では、レトロウイルスベクターを、遺伝子治療を必要とする被験体の細胞、組織、または器官にｉｎ  ｖｉｖｏで直接注射することによって投与する。種々の他の実施形態では、細胞に、本発明のベクターを用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで形質導入し、必要に応じてｅｘ  ｖｉｖｏで増大させる。次いで、形質導入された細胞を、遺伝子治療を必要とする被験体に投与する。
【０２９３】
本発明の遺伝子治療の方法における形質導入および投与に適した細胞としては、これだけに限定されないが、本明細書の他の箇所に記載のとおり、幹細胞、前駆細胞、および分化細胞が挙げられる。ある実施形態では、形質導入される細胞は胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、骨髄幹細胞、臍帯幹細胞、胎盤幹細胞、間葉幹細胞、神経幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、心臓幹細胞、腎幹細胞、造血幹細胞である。
【０２９４】
好ましい実施形態では、形質導入される細胞は、骨髄、臍帯血、または末梢循環から単離された造血幹細胞および／または造血前駆細胞である。特に好ましい実施形態では、形質導入される細胞は、骨髄、臍帯血、または末梢循環から単離された造血幹細胞である。
【０２９５】
ＨＳＣは、特定の表現型マーカーまたは遺伝子型マーカーに応じて同定することができる。例えば、ＨＳＣは、それらのサイズが小さいこと、系列（ｌｉｎ）マーカーを欠くこと、生体染色色素、例えば、ローダミン１２３（ローダミンＤＵＬＬ、ｒｈｏｌｏとも称される）またはＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２での染色性が低いこと（サイドポピュレーション）、およびそれらの表面上に、その多くが分化シリーズのクラスターに属する種々の抗原マーカー（例えば、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ９０、ＣＤ１３３、ＣＤ１０５、ＣＤ４５、Ｔｅｒ１１９、およびｃ−ｋｉｔ、幹細胞因子の受容体）が存在することによって同定することができる。ＨＳＣは、系列拘束を検出するために一般に使用されるマーカーについて主に陰性であり、したがって、多くの場合、Ｌｉｎ（−）細胞と称される。
【０２９６】
一実施形態では、ヒトＨＳＣは、ＣＤ３４＋、ＣＤ５９＋、Ｔｈｙ１／ＣＤ９０＋、ＣＤ３８ｌｏ／−、Ｃ−ｋｉｔ／ＣＤ１１７＋、およびＬｉｎ（−）と特徴付けることができる。しかし、特定のＨＳＣはＣＤ３４−／ＣＤ３８−であるので、全ての幹細胞がこれらの組み合わせに包含されるとは限らない。いくつかの試験では、最初期の幹細胞は細胞表面上のｃ−ｋｉｔを欠く場合があることも示唆されている。ヒトＨＳＣに関しては、ＣＤ３４＋ＨＳＣおよびＣＤ３４−ＨＳＣはどちらもＣＤ１３３＋であることが示されているので、ＣＤ１３３は初期のマーカーを意味することができる。ＣＤ３４＋細胞およびＬｉｎ（−）細胞は、造血前駆細胞も含むことは当技術分野で公知である。
【０２９７】
別の実施形態では、造血階層をＳＬＡＭコードによって決定する。ＳＬＡＭ（シグナル伝達リンパ球活性化分子）ファミリーは、遺伝子が、第１染色体（マウス）上の単一の遺伝子座に大部分がタンデムに位置し、全てが免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのサブセットに属し、最初はＴ細胞刺激に関与すると考えられていた＞１０分子の群である。このファミリーは、ＣＤ４８、ＣＤ１５０、ＣＤ２４４などを含み、ＣＤ１５０は創始メンバー（ｆｏｕｎｄｉｎｇ  ｍｅｍｂｅｒ）であり、したがって、ｓｌａｍＦ１、すなわち、ＳＬＡＭファミリーメンバー１とも称される。造血階層についてのサインＳＬＡＭコードは、造血幹細胞（ＨＳＣ）−ＣＤ１５０＋ＣＤ４８−ＣＤ２４４−；多分化能性前駆細胞（ＭＰＰｓ）−ＣＤ１５０−ＣＤ４８−ＣＤ２４４＋；系列制限前駆細胞（ＬＲＰｓ）−ＣＤ１５０−ＣＤ４８＋ＣＤ２４４＋；一般的な骨髄系前駆細胞（ＣＭＰ）−ｌｉｎ−ＳＣＡ−１−ｃ−ｋｉｔ＋ＣＤ３４＋ＣＤ１６／３２ｍｉｄ；顆粒球−マクロファージ前駆体（ＧＭＰ）−ｌｉｎ−ＳＣＡ−１−ｃ−ｋｉｔ＋ＣＤ３４＋ＣＤ１６／３２ｈｉ；および巨核球−赤血球前駆細胞（ＭＥＰ）−ｌｉｎ−ＳＣＡ−１−ｃ−ｋｉｔ＋ＣＤ３４−ＣＤ１６／３２ｌｏｗである。
【０２９８】
マウスでは、スタンフォード大学のＩｒｖｉｎｇ  Ｗｅｉｓｓｍａｎのグループが１９８８年にマウス造血幹細胞を初めて単離し、マウス造血階層を区別するためのマーカーも初めて解明した。造血階層に関するマーカーは、長期造血幹細胞（ＬＴ−ＨＳＣ）−ＣＤ３４−、ＳＣＡ−１＋、Ｔｈｙ１．１＋／ｌｏ、Ｃ−ｋｉｔ＋、ｌｉｎ−、ＣＤ１３５−、Ｓｌａｍｆ１／ＣＤ１５０＋；短期造血幹細胞（ＳＴ−ＨＳＣ）−ＣＤ３４＋、ＳＣＡ−１＋、Ｔｈｙ１．１＋／ｌｏ、Ｃ−ｋｉｔ＋、ｌｉｎ−、ＣＤ１３５−、Ｓｌａｍｆ１／ＣＤ１５０＋、Ｍａｃ−１（ＣＤ１１ｂ）ｌｏ；初期多分化能性前駆体−（初期ＭＰＰ）−ＣＤ３４＋、ＳＣＡ−１＋、Ｔｈｙ１．１−、Ｃ−ｋｉｔ＋、ｌｉｎ−、ＣＤ１３５＋、Ｓｌａｍｆ１／ＣＤ１５０−、Ｍａｃ−１（ＣＤ１１ｂ）ｌｏ、ＣＤ４ｌｏ；および後期多分化能性前駆体（後期ＭＰＰ）−ＣＤ３４＋、ＳＣＡ−１＋、Ｔｈｙ１．１−、Ｃ−ｋｉｔ＋、ｌｉｎ−、ＣＤ１３５ｈｉｇｈ、Ｓｌａｍｆ１／ＣＤ１５０−、Ｍａｃ−１（ＣＤ１１ｂ）ｌｏ、ＣＤ４ｌｏである。
【０２９９】
一実施形態では、造血細胞はＣＤ１０５＋Ｓｃａ１＋細胞である。
【０３００】
本発明の細胞は、自己由来／自源性（ａｕｔｏｇｅｎｅｉｃ）（「自己」）であっても非自己由来（「非自己」、例えば、同種異系、同系または異種）であってもよい。「自己由来」とは、本明細書で使用される場合、同じ被験体由来の細胞を指す。「同種異系」とは、本明細書で使用される場合、比較する細胞とは遺伝的に異なる同じ種の細胞を指す。「同系」とは、本明細書で使用される場合、比較する細胞と遺伝的に同一である、異なる被験体の細胞を指す。「異種」とは、本明細書で使用される場合、比較する細胞とは異なる種の細胞を指す。好ましい実施形態では、本発明の細胞は同種異系のものである。
【０３０１】
「被験体」とは、本明細書で使用される場合、本明細書の他の箇所で開示されている遺伝子治療ベクター、細胞に基づく治療薬、および方法を用いて処置することができる単一遺伝子の疾患、障害、または状態の症状を示す任意の動物を包含する。好ましい実施形態では、被験体として、本明細書の他の箇所で開示されている遺伝子治療ベクター、細胞に基づく治療薬、および方法を用いて処置することができる造血系の疾患、障害、または状態、例えば、異常ヘモグロビン症の症状を示す任意の動物が挙げられる。適切な被験体（例えば、患者）としては、実験動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、またはモルモット）、農場動物、および家畜動物または愛玩動物（例えば、ネコまたはイヌ）が挙げられる。非ヒト霊長類、好ましくはヒト患者が含まれる。典型的な被験体としては、遺伝子治療によって調節することができる１つまたは複数の生理的活性の量が異常である（「正常な」または「健常な」被験体よりも少量または多量である）動物が挙げられる。
【０３０２】
本明細書で使用される場合、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」とは、疾患または病的状態の症状または病態に対する任意の有益なまたは望ましい効果を包含し、また、治療されている疾患または状態の１種または複数種の測定可能なマーカーの最低限の減少でさえ含んでよい。治療は、必要に応じて、疾患もしくは状態の症状の軽減もしくは改善、または疾患もしくは状態の進行の遅延を含んでよい。「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」とは、必ずしも疾患もしくは状態、またはそれに付随する症状の完全な根絶もしくは治癒を示すものではない。
【０３０３】
本明細書で使用される場合、「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」および同様の単語、例えば、「予防される（ｐｒｅｖｅｎｔｅｄ）」、「予防すること（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」などは、疾患または状態の発生または再発を予防するため、阻害するため、またはその可能性を低下させるための手法を指す。この用語は、疾患もしくは状態の発症もしくは再発を遅延させること、または疾患もしくは状態の症状の発生もしくは再発を遅延させることも指す。本明細書で使用される場合、「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」および同様の単語は、疾患または状態が発症または再発する前に、疾患または状態の強さ、影響、症状および／または負荷を軽減することも包含する。
【０３０４】
本明細書で使用される場合、「量」という用語は、臨床結果を含めた有益なまたは所望の予防結果または治療結果を実現するためのウイルスまたは形質導入された治療用細胞の「有効な量（ａｎ  ａｍｏｕｎｔ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ）」または「有効量（ａｎ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）」を指す。
【０３０５】
「予防有効量」とは、所望の予防結果を実現するために有効なウイルスまたは形質導入された治療用細胞の量を指す。必ずではないが一般には、予防的な用量は疾患の前に、または疾患のより早い段階で被験体に用いられるので、予防有効量は治療有効量よりも少ない。
【０３０６】
ウイルスまたは形質導入された治療用細胞の「治療有効量」は、個体の病態、年齢、性別、および体重、ならびに、幹細胞および前駆細胞の個体における所望の応答を引き出す能力などの要因に応じて変動してよい。治療有効量は、ウイルスまたは形質導入された治療用細胞のいかなる毒性の影響または有害な影響よりも治療的に有益な影響が上回る量でもある。「治療有効量」という用語は、被験体（例えば、患者）を「治療する」ために有効な量を包含する。
【０３０７】
いかなる特定の理論にも縛られることを望むことなく、本発明のベクター、組成物、および方法によってもたらされる重要な利点は、既存の方法と比較して高い百分率の形質導入された細胞を含む細胞の集団を投与することによって実現することができる、遺伝子治療の有効性の高さである。
【０３０８】
形質導入された細胞は、骨髄切除療法を受けた個体または受けていない個体において骨髄移植または臍帯血移植の一部として投与することができる。一実施形態では、本発明の形質導入された細胞を、化学的切除（ｃｈｅｍｏａｂｌａｔｉｖｅ）または放射線切除（ｒａｄｉｏａｂｌａｔｉｖｅ）骨髄療法を受けた個体に骨髄移植において投与する。
【０３０９】
一実施形態では、ある用量の形質導入された細胞を被験体に静脈内送達する。好ましい実施形態では、形質導入された造血幹細胞を被験体に静脈内投与する。
【０３１０】
例示的な一実施形態では、被験体に提供される有効量の形質導入された細胞は、該被験体の体重１００ｋｇ当たり細胞１×１０１２個未満、１００ｋｇ当たり細胞１×１０１１個未満、１００ｋｇ当たり細胞１×１０１０個未満、１００ｋｇ当たり細胞１×１０９個未満、１００ｋｇ当たり細胞１×１０８個未満、１００ｋｇ当たり細胞１×１０７個未満、１００ｋｇ当たり細胞５×１０６個未満、１００ｋｇ当たり細胞４×１０６個未満、１００ｋｇ当たり細胞３×１０６個未満、１００ｋｇ当たり細胞２×１０６個未満、１００ｋｇ当たり細胞１×１０６個未満、１００ｋｇ当たり細胞５×１０５個未満、１００ｋｇ当たり細胞４×１０５個未満、１００ｋｇ当たり細胞３×１０５個未満、１００ｋｇ当たり細胞２×１０５個未満、１００ｋｇ当たり細胞１×１０５個未満、１００ｋｇ当たり細胞５×１０４個未満、または１００ｋｇ当たり細胞１×１０４個未満である。
【０３１１】
別の例示的な実施形態では、被験体に提供される有効量の形質導入された細胞は、１００ｋｇ当たり細胞約１×１０１２個、１００ｋｇ当たり細胞約１×１０１１個、１００ｋｇ当たり細胞約１×１０１０個、１００ｋｇ当たり細胞約１×１０９個、１００ｋｇ当たり細胞約１×１０８個、１００ｋｇ当たり細胞約１×１０７個、１００ｋｇ当たり細胞約５×１０６個、１００ｋｇ当たり細胞約４×１０６個、１００ｋｇ当たり細胞約３×１０６個、１００ｋｇ当たり細胞約２×１０６個、１００ｋｇ当たり細胞約１×１０６個、１００ｋｇ当たり細胞約５×１０５個、１００ｋｇ当たり細胞約４×１０５個、１００ｋｇ当たり細胞約３×１０５個、１００ｋｇ当たり細胞約２×１０５個、１００ｋｇ当たり細胞約１×１０５個、１００ｋｇ当たり細胞約５×１０４個、または１００ｋｇ当たり細胞約１×１０４個である。
【０３１２】
別の例示的な実施形態では、被験体に提供される有効量の形質導入された細胞は、１００ｋｇ当たり細胞約１×１０１個〜１００ｋｇ当たり細胞約１×１０１２個、１００ｋｇ当たり細胞約１×１０２個〜１００ｋｇ当たり細胞約１×１０１１個、１００ｋｇ当たり細胞約１×１０３個〜１００ｋｇ当たり細胞約１×１０１０個、１００ｋｇ当たり細胞約１×１０４個〜１００ｋｇ当たり細胞約１×１０９個、１００ｋｇ当たり細胞約１×１０５個〜１００ｋｇ当たり細胞約１×１０８個、１００ｋｇ当たり細胞約１×１０６個〜１００ｋｇ当たり細胞約１×１０７個、または１００ｋｇ当たりの間の任意の細胞数の範囲である。
【０３１３】
種々の実施形態では、本発明の方法は、既存の方法よりも頑強かつ安全な遺伝子治療を提供し、かつ、形質導入された細胞を約５％、形質導入された細胞を約１０％、形質導入された細胞を約１５％、形質導入された細胞を約２０％、形質導入された細胞を約２５％、形質導入された細胞を約３０％、形質導入された細胞を約３５％、形質導入された細胞を約４０％、形質導入された細胞を約４５％、形質導入された細胞を約５０％、形質導入された細胞を約５５％、形質導入された細胞を約６０％、形質導入された細胞を約６５％、形質導入された細胞を約７０％、形質導入された細胞を約７５％、形質導入された細胞を約８０％、形質導入された細胞を約８５％、形質導入された細胞を約９０％、形質導入された細胞を約９５％、形質導入された細胞を約９８％、または形質導入された細胞を約１００％含む細胞の集団または細胞の用量を被験体に投与する工程を含む。
【０３１４】
種々の実施形態では、本発明のベクター、組成物、および方法により、ｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子治療および自家移植を用いた遺伝子治療の方法の改善がもたらされる。好ましい一実施形態では、本発明は、形質導入された細胞、例えば、幹細胞、例えば、造血幹細胞を提供する。特定の実施形態では、造血幹細胞を、本発明のベクターを用いて形質導入し、異常ヘモグロビン症に対する治療を必要とする個体に投与する。
【０３１５】
特定の実施形態では、造血幹細胞を、本発明のベクターを用いて形質導入し、副腎白質ジストロフィーまたは副腎脊髄神経障害に対する治療を必要とする個体に投与する。
【０３１６】
好ましい一実施形態では、本発明は、赤血球系細胞または赤血球前駆体細胞において１つまたは複数の治療用タンパク質を高レベルで発現させるように最適化された改善されたウイルスベクター系を提供する。本発明のレンチウイルスベクターを含めたレトロウイルスベクターは、例えば、グロビン遺伝子または抗鎌状赤血球化タンパク質をコードする遺伝子を含めた目的のポリヌクレオチドをさらに含む。一実施形態では、本発明のレトロウイルスベクターで発現させるグロビン遺伝子は、β−グロビン、δ−グロビン、またはγ−グロビンである。別の実施形態では、ヒトβ−グロビン遺伝子は野生型ヒトβ−グロビン遺伝子またはヒトβＡ−グロビン遺伝子である。別の実施形態では、ヒトβ−グロビン遺伝子は、イントロン配列の１つまたは複数の欠失を含む、または、少なくとも１つの抗鎌状赤血球化アミノ酸残基をコードする変異ヒトβ−グロビン遺伝子である。抗鎌状赤血球化アミノ酸は、ヒトδ−グロビンまたはヒトγ−グロビンに由来してよい。別の実施形態では、変異ヒトβ−グロビン遺伝子は、コドン８７におけるトレオニンからグルタミンへの変異（βＡ−Ｔ８７Ｑ）をコードする。
【０３１７】
本発明の、レンチウイルスベクターを含めたレトロウイルスベクターは、異常ヘモグロビン症を処置するためのものを含めた遺伝子治療において使用することができる。特定の実施形態では、本発明は、例えば赤血球特異的疾患を処置するために、前記のベクターを使用して、赤血球系細胞において安定な高レベルの遺伝子発現を実現するための方法を提供する。特定の実施形態では、遺伝子治療ベクターを、例えば、鎌状赤血球症（ＳＣＤ）を含めた異常ヘモグロビン症を処置するために使用する。別の好ましい実施形態では、遺伝子治療ベクターを、これだけに限定されないが、β−サラセミアを含めたサラセミアを処置するために使用する。
【０３１８】
別の好ましい実施形態では、副腎白質ジストロフィーおよび／または副腎脊髄神経障害を処置するために、ＡＢＣＤ１遺伝子を含む本発明のベクターを用いて造血幹細胞に形質導入する。
【０３１９】
ここで、本発明を以下の実施例によってより詳細に記載する。しかし、本発明は、多くの異なる形態で具体化することができ、本明細書に記載の実施形態に限定されると解釈されるべきではなく、これらの実施形態は、本開示が徹底的かつ完全なものになるよう、また本発明の範囲が当業者に十分に伝わるように提供される。
【実施例】
【０３２０】
（実施例１）
形質導入のための細胞の予備刺激
ＣＤ３４＋細胞（ＡｌｌＣｅｌｌｓ）のバイアルを１つ、３７℃で１〜２分間インキュベートすることによって解凍し、内容物を１５ｍＬのコニカルチューブ中１０ｍＬの幹細胞成長培地（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉａ）（以降ＳＣＧＭと称される）に移した。細胞を標準の卓上遠心分離機において１５００ＲＰＭで５分間回転させ、１０ｍＬのＳＣＧＭに再懸濁させ、血球計で計数した。適切な数の細胞と相関する体積を新しい１５ｍＬのコニカルチューブに移し、再度１５００ＲＰＭで５分間回転させた。細胞をＳＣＧＭ＋１×サイトカイン（１００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、１００ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、１００ｎｇ／ｍＬのＦｌｔＬ、および３０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−３）中に所望の細胞濃度まで再懸濁させ、標準の加湿組織培養インキュベーター（５％ＣＯ２）内、３７℃で滅菌非接着性表面上にプレーティングした。
【０３２１】
ＣＤ３４＋細胞へのウイルスによる形質導入効率を上昇させる化合物についてのスクリーニングを、いくつものクラス由来の可溶性化合物を種々の濃度で使用して行った（表１）。スクリーニングの結果が図１に示されている。
【０３２２】
【表１】
2018099124.tif 000002
（実施例２）
形質導入
予備刺激した細胞（実施例１）を１８〜２４時間培養した後に計数した。細胞を収集し、１５００ＲＰＭで５分間回転させた。予備刺激したＣＤ３４＋細胞１．２×１０６個を６０μＬの１０×サイトカイン（１０００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、１０００ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、１０００ｎｇ／ｍＬのＦｌｔＬ、および３００ｎｇ／ｍＬのＩＬ−３）、７．８μＬの硫酸プロタミン、１１１μＬのウイルス上清、および３６１．２μＬのＳＣＧＭに再懸濁させた。９０μＬの細胞／ウイルス懸濁液（細胞約２００，０００個）を標準の非接着性９６ウェルプレートの各ウェルに加えた。このウイルスによる形質導入ステップの間に、ｄｍＰＧＥ２を１００μＭ、５０μＭ、２５μＭ、１２．５μＭ、１μＭ、または０μＭの最終濃度で加えた。ウイルスストックの力価は２．７×１０８ＴＵ／ｍＬであり、感染多重度（ＭＯＩ）は約２５であった。
【０３２３】
細胞を、標準の加湿組織培養インキュベーター（５％ＣＯ２）内、３７℃でインキュベートした。
【０３２４】
（実施例３）
細胞のｄｍＰＧＥ２刺激
予め処理したｄｍＰＧＥ２（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）１ｍｇから、ＤＭＳＯ中１０ｍＭのｄｍＰＧＥ２の一定分量を調製した。簡単に述べると、ｄｍＰＧＥ２のバイアルに、酢酸メチルが蒸発するまで空気をピペットで入れた。２６３μＬのＤＭＳＯをバイアルに存在するＰＧＥ２に加え、２５μＬの一定分量を１．５ｍＬのＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに加え、−８０℃で保管した。ｄｍＰＧＥ２をＳＣＧＭで段階希釈することによって１０×作業ストック溶液を調製し、次いで、表２に従って適切な作業濃度で細胞に加えた。次いで、細胞を標準の加湿組織培養インキュベーター（５％ＣＯ２）内、３７℃でインキュベートした。
【０３２５】
【表２】
2018099124.tif 000003
（実施例４）
バリデーションアッセイ
バリデーションアッセイのための細胞の調製
細胞を、ウイルスおよびｄｍＰＧＥ２と一緒に２４時間培養した後に、洗浄し、その後、機能バリデーションアッセイを行った。細胞を９６ウェルＵ底プレートに移し、標準の卓上遠心分離機において１５００ＲＰＭで５分間回転させることによって、洗浄を実施した。培地を吸引し、細胞を２００μＬのＳＣＧＭに再懸濁させた。細胞を、再度１５００ＲＰＭで５分間回転させ、培地を吸引した。細胞を、再度２００μＬのＳＣＧＭに再懸濁させ、次いで、１５００ＲＰＭで５分間回転させ、再度培地を吸引した。特定の機能バリデーションアッセイは下に記載されている。
【０３２６】
７日間の液体培養
洗浄した細胞を、２００μＬのＳＣＧＭ＋１×サイトカイン（実施例１に記載の通り）に再懸濁させ、追加の８００μＬのＳＣＧＭ＋１×サイトカインを含有する標準の１２ウェル非接着性組織培養プレートに移した。細胞をさらに６日間、標準の加湿組織培養インキュベーター（５％ＣＯ２）内で維持し、次いで、ベクターのコピー数の解析（実施例５）およびＦＡＣＳ分析に供した。ＦＡＣＳ分析については、細胞を、ウイルスにコードされる導入遺伝子、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の存在についてアッセイした。培養細胞のプール内のウイルスにより標識された細胞の発生頻度を集団内のＧＦＰ＋細胞の発生頻度として数量化した。標識された細胞の平均蛍光強度を数量化した。種々の濃度のｄｍＰＧＥ２を用いた７日間の液体培養アッセイの結果が表３に示されている。
【０３２７】
メチルセルロースにおけるコロニー形成単位活性の評価
洗浄した細胞を、２００μＬのＳＣＧＭに再懸濁させ、次いで、サイトカインを補充したメチルセルロース（例えば、Ｍｅｔｈｏｃｕｌｔ  Ｍ４４３４  Ｃｌａｓｓｉｃ）の一定分量３ｍＬに移した。次いで、１．５ｍＬをとがっていない１６−ゲージの針を使用して平行３５ｍｍ組織培養ディッシュに移した。ディッシュを、標準の加湿組織培養インキュベーター内で１４〜１６日間維持し、コロニーを、サイズ、形態、および細胞の組成についてスコア化した。次いで、個々のコロニーをその後ベクターのコピー数の解析（実施例５）のために選定したか、または３５ｍｍディッシュ全体の内容物をプールし、次いで、ベクターのコピー数の解析（実施例５）に供した。
【０３２８】
長期培養開始細胞（ＬＴＣ−ＩＣ）
細胞を、２００μＬのＳＣＧＭに再懸濁させ、計数し、次いで、予めプレーティングしたＭＳ−５間質層に、種々の希釈（１００Ｕ／ｍＬ−１００μｇ／ｍＬのｐｅｎ−ｓｔｒｅｐを補充したＳｔｅｍＳｐａｎ  ＳＦＥＭ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ番号０９６５０）２００μＬ中、１ウェル当たり細胞２０００個；１０００個；５００個；２５０個；１２５個；６２個；３１個；１６個）で、かつ１希釈当たり２４反復で移した。週に１回の間隔で１００μＬを新鮮な培地１００μＬで交換した。５週目に、培養物を収穫した。１００μＬを破棄し、細胞を残りの１００μＬで洗い流し、ウェルを新鮮な培地５０μＬですすぎ、全内容物を、Ｍｅｔｈｏｃｕｌｔ（商標）Ｈ４４３４中に播種し、細胞懸濁液１５０μＬを６００μＬのＭｅｔｈｏｃｕｌｔ  Ｈ４４３４を用いてホモジナイズし、１２ウェルプレートの１つのウェルに１４日間プレーティングした。次いで、コロニーを計数した。各希釈について分析した少なくとも１つのコロニー（細胞４０個超）を含有するウェルの数およびウェルの総数を用い、Ｌ−ｃａｌｃソフトウェア（Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＬＴＣ−ＩＣの発生頻度および９５％信頼区間を算出した。各処理群からの１００コロニーを選び取って１００個の異なるウェルに入れ、ベクターの存在について個別にスコア化した。各処理群から１００コロニーをプールし、ゲノムＤＮＡを抽出し、平均ベクターコピー数をｑＰＣＲによって評価した（実施例５）。
【０３２９】
ＮＯＤ／ＳＣＩＤガンマ（ＮＳＧ）マウスへの移植
ｄｍＰＧＥ２が最小限の残留毒性でヒト長期造血幹細胞へのウイルスによる形質導入を促進するかどうかを決定するために、形質導入された細胞を洗浄し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁させ、放射線照射した成体ＮＳＧマウスの尾静脈へと移植した。マウスを、標準のＩＡＣＵＣ動物管理ガイドラインに従って病原体を含まない環境に収容した。計画した時点で、末梢血に対するヒトドナーに由来する寄与を、標準のプロトコールによってマウスから収集することによって数量化した。簡単に述べると、２％デキストランを用いて赤血球をペレット化し、次いで、上清を赤血球溶解緩衝液で処理することによってさらに清澄にした。次いで、単核細胞をＭａｊｅｔｉらによる、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ２００７年に記載されている通りフルオロフォアとコンジュゲートした抗体を用いて染色し、ＬＳＲ−ＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）でフローサイトメトリーによって分析した。
【０３３０】
組み込み部位分析
ｄｍＰＧＥ２により、レンチウイルスベクターの組み込み部位の優先度が変化するかどうかを決定するために、ｄｍＰＧＥ２処理した、ウイルスにより形質導入されたヒト造血幹細胞および造血前駆細胞を移植したマウス由来の骨髄試料、ならびにモック処理した、ウイルスにより形質導入されたヒト造血幹細胞および造血前駆細胞を移植したマウス由来の骨髄試料を、線形増幅媒介ＰＣＲに供した（Ｃａｒｔｉｅｒ、（２００９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６巻（５９５４号）：８１８〜２３頁）。簡単に述べると、１〜１０００ｎｇのＤＮＡが、レトロウイルスＬＴＲ特異的ビオチン化プライマーを使用した線形ＰＣＲのための鋳型としての機能を果たした。線形ＰＣＲ産物を常磁性ビーズで分離した。さらに第２鎖ＤＮＡ合成、制限消化（Ｔｓｐ５０９Ｉ、ＮｌａＩＩＩまたはＨｐｙＣＨ４ＩＶ）およびリンカーカセットのライゲーションを半固体相で実現し、その後に２つの追加の指数関数的ＰＣＲステップを続けた。生じたＬＡＭ−ＰＣＲアンプリコンを、４５４パイロシークエンシング（ＧＳ  Ｆｌｘ；Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）のために、追加の指数関数的ＰＣＲを実施してＧＳ  Ｆｌｘ特異的増幅および配列決定プライマーＡおよびＢをＬＡＭ−ＰＣＲアンプリコンの両末端に付加することによってさらに調製した。プライマーの設計は製造者によって示された通り行った。異なる試料を単一の配列決定の実行で同時に分析するために６塩基の認識配列をプライマーＡに組み入れた。精製されたＬＡＭ−ＰＣＲ産物４０ｎｇを使用した。ＰＣＲ条件は以下の通りであった：９５℃で１２０秒間の最初の変性；９５℃で４５秒間、６０℃で４５秒間および７２℃で６０秒間を１２サイクル；７２℃で３００秒間の最後の伸長。ＬＡＭ−ＰＣＲアンプリコン配列をトリミングし、ＢＬＡＳＴを使用してアラインメントした。
【０３３１】
（実施例５）
ベクターのコピー数の解析
簡単に述べると、標準のプロトコールによって（例えば、ＱｉａｇｅｎのＤＮＥａｓｙカラムによって）細胞から全ゲノムＤＮＡを単離した。ゲノムＤＮＡを、ウイルスＬＴＲおよびヒトベータアクチンに対するＴａｑＭａｎプローブを用いた定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）に供した。ウイルスシグナルおよびベータアクチンシグナルについてのＣｔ値を標準化した対照に対して正規化し、ベータアクチンのコピー当たりのウイルスコピーの数を算出した。ＧＦＰをコードするウイルス構築物を使用したところ、ベクターのコピー数と平均蛍光強度（実施例４）の間に直線関係が観察された。種々の濃度のｄｍＰＧＥ２を用いたベクターのコピー数（ＶＣＮ）の解析についての結果を表３Ａ〜Ｃに示す。
【０３３２】
表３Ａ〜Ｃは、３つの別々の実験についてのＣＤ３４＋細胞のウイルスによる形質導入の促進におけるｄｍＰＧＥ２の用量応答を示す。ＣＤ３４＋細胞を解凍し、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＦｌｔＬ、およびＩＬ３で予備刺激し、次いで、（Ａ）ＧＦＰ＋レンチウイルスを用いて感染多重度２５で、（Ｂ）ＧＦＰ＋レンチウイルスを用いて感染多重度５で形質導入した、または（Ｃ）ＡＬＤ（ＡＢＣＤ１）を発現しているレンチウイルスを用いて感染多重度２５で形質導入した。細胞を、ウイルスによる形質導入ステップ（２４〜４８時間の培養）の間、ｄｍＰＧＥ２に曝露させた。次いで、細胞を洗浄し、およそ１週間培養した後にフローサイトメトリーおよびＰＣＲによって分析した。ＦＡＣＳ染色によるＧＦＰ（Ａ、Ｂ）またはＡＬＤ（Ｃ）について陽性である細胞の百分率が、平均蛍光強度（ＭＦＩ）およびベクターのコピー数（ＶＣＮ）（Ａ、Ｂ）と一緒に示されている。
【０３３３】
【表３】
2018099124.tif 000004
（実施例６）
ＣＤ３４＋細胞のウイルスによる形質導入の促進における時間経過およびｄｍＰＧＥ２の用量応答
ＭＣＤ−３４＋細胞を解凍し、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＦｌｔＬおよびＩＬ３で予備刺激し、次いで、ＧＦＰ＋レンチウイルスを用いて感染多重度２５で形質導入した。細胞を、ウイルスによる形質導入ステップ（２４〜２５時間の培養；２４〜２６時間の培養；２４〜２８時間の培養；または２４〜４８時間の培養）の間、ｄｍＰＧＥ２に曝露させ、次いで、洗浄し、およそ１週間培養した後にフローサイトメトリーによって分析した。あるいは、細胞を、予備刺激ステップ（２２〜２４時間の培養；２３〜２４時間の培養）の間、ｄｍＰＧＥ２に曝露させた。ＧＦＰについて陽性である細胞の百分率が表４に示されている。
【０３３４】
【表４】
2018099124.tif 000005
（実施例７）
ｄｍＰＧＥ２の存在下でレンチウイルスベクターを用いてＨＳＣに形質導入した後のベータサラセミアまたは鎌状赤血球症の調整
動員末梢血は、インフォームドコンセントを行った患者から、承認された治験審査委員会（ＩＲＢ）プロトコールに従って、アフェレーシスによって収集する。フィコール勾配を用いて赤血球を取り出し、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用してＣＤ３４＋選択した後にＣＤ３４富化細胞を得る。細胞を、ヒトＳＣＦ、ＦｌｔＬ、ＴＰＯ、およびＩＬ３を用いて、１ｍＬ当たり細胞およそ４Ｅ６個の濃度で１８〜２４時間にわたって予備刺激する。次いで、細胞に、ヒトβ−グロビンＡ−Ｔ８７Ｑ遺伝子を有するＬｅｎｔｉｇｌｏｂｉｎ  ＧＴＰを感染多重度２５で用い、ＳＣＦ、ＦｌｔＬ、ＴＰＯ、ＩＬ３、硫酸プロタミン、およびｄｍＰＧＥ２の存在下で１８〜２４時間にわたって形質導入する。
【０３３５】
形質導入後に、リリース試験のために細胞の一部を取り出し、残りを凍結保存し、−８０℃で保管する。リリース試験の一部として、次いで、ある個体についての形質導入された細胞を、７日間の培養、ＶＣＮ解析（実施例１）に供して、平均で細胞当たり０．５〜３コピーであること、ならびに形質導入効率が＞５０％であることを確認する。リリース試験が上手く行ったら、患者は、ブスルファンおよびシクロホスファミドを用いた処置を受ける。
【０３３６】
次いで、自己由来ＣＤ３４＋細胞の用量を、１ｋｇ当たり＞３×１０６個のＣＤ３４＋細胞の単一静脈内用量で被験体に静脈内投与する。患者を、毎日、移植ユニット内で有害事象および検査パラメータについて調査して、骨髄の生着をモニターする。
【０３３７】
生着が起こり、患者が安定していれば、患者を退院させ、６カ月間にわたって月に１回、および合計２４カ月間にわたって少なくとも３カ月ごと調査した。評価は、常套的な血液学および化学安全性検査評価ならびに特別な血液検査、骨髄検査、有害事象および併用薬の収集、ならびに特定の疾患特異的な血液パラメータおよび臨床パラメータの評価を含む。
【０３３８】
主要エンドポイントは、Ｌｅｎｔｉｇｌｏｂｉｎで形質導入された細胞注入の安全性および忍容性ならびに自己由来の操作されたＣＤ３４＋細胞が生着するまでの時間である。追加のエンドポイントは、造血細胞および血液細胞における形質導入された遺伝子および遺伝子産物の存在の生物学的尺度および生化学的尺度、輸血の必要性、ならびに２年間の追跡調査期間の過程中の種々の時点で起こった入院および臨床的事象の数を含む。全ての患者を、少なくとも年に１回、移植後合計１５年にわたって、重篤な有害事象、ＲＣＬ検査、および悪性腫瘍が発生する事象における挿入変異誘発検査のための血液細胞の貯蔵について調査する。
【０３３９】
（実施例８）
ｄｍＰＧＥ２の存在下でＨＳＣにレンチウイルスベクターを用いて形質導入した後の副腎白質ジストロフィーの調整
動員末梢血は、インフォームドコンセントを行った患者から、承認された治験審査委員会（ＩＲＢ）プロトコールに従って、アフェレーシスによって収集する。フィコール勾配を用いて赤血球を取り出し、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用してＣＤ３４＋選択した後にＣＤ３４富化細胞を得る。細胞を、ヒトＳＣＦ、ＦｌｔＬ、ＴＰＯ、およびＩＬ３を用いて、１ｍＬ当たり細胞およそ４Ｅ６個の濃度で１８〜２４時間にわたって予備刺激する。次いで、細胞に、ヒトＡＢＣＤ１遺伝子を有するＬｅｎｔｉ−Ｄ  ＧＴＰを感染多重度２５で用い、ＳＣＦ、ＦｌｔＬ、ＴＰＯ、ＩＬ３、硫酸プロタミン、およびｄｍＰＧＥ２の存在下で１８〜２４時間にわたって形質導入する。
【０３４０】
形質導入後に、リリース試験のために細胞の一部を取り出し、残りを凍結保存し、−８０℃で保管する。リリース試験の一部として、次いで、ある個体についての形質導入された細胞を、７日間の培養およびＶＣＮ解析（実施例１）に供して、平均で細胞当たり０．５〜３コピーであること、ならびに形質導入効率が＞５０％であることを確認する。リリース試験が上手く行ったら、患者は、ブスルファンおよびシクロホスファミドを用いた処置を受ける。
【０３４１】
次いで、自己由来ＣＤ３４＋細胞の用量を、１ｋｇ当たり＞３×１０６個のＣＤ３４＋細胞の単一静脈内用量で被験体に静脈内投与する。患者を、毎日、移植ユニット内で有害事象および検査パラメータについて調査して、骨髄の生着をモニターする。
【０３４２】
生着が起こり、患者が安定していれば、患者を退院させ、６カ月間にわたって月に１回、および合計２４カ月間にわたって少なくとも３カ月ごと調査した。評価は、常套的な血液学的検査および化学安全性検査評価ならびに特別な血液検査、骨髄検査、有害事象および併用薬の収集、ならびに特定の疾患特異的な血液パラメータおよび臨床パラメータの評価を含む。
【０３４３】
主要エンドポイントは、Ｌｅｎｔｉ−Ｄで形質導入された細胞注入の安全性および忍容性ならびに自己由来の操作されたＣＤ３４＋細胞が生着するまでの時間である。追加のエンドポイントは、造血細胞および血液細胞における形質導入された遺伝子および遺伝子産物の存在の生物学的尺度および生化学的尺度、脳ＭＲＩおよび認知検査、ならびに２年間の追跡調査期間の過程中の種々の時点で起こった入院および臨床的事象の数を含む。全ての患者を、少なくとも年に１回、移植後合計１５年間にわたって、重篤な有害事象、ＲＣＬ検査、および悪性腫瘍が発生する事象における挿入変異誘発検査のための血液細胞の貯蔵について調査する。
【０３４４】
本発明の開示を読むことにより当業者が認識するように、多くの改変を上記の発明の詳細な説明を踏まえて実施形態に対して行うことができる。一般に、以下の特許請求の範囲において使用される用語は、特許請求の範囲を本明細書および特許請求の範囲に開示されている特定の実施形態に限定するものと解釈されるべきではなく、可能性のある実施形態の全てをそのような特許請求の範囲に権利が与えられる等価物の全範囲と一緒に包含するものと解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は本開示により限定されない。
【図１】
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【配列表】
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