(57)【要約】      （修正有）【課題】ＩＶ型コラーゲンの三量体形成能を評価する方法、ＩＶ型コラーゲンの三量体形成能を促進する化合物をスクリーニングする方法、およびこれらの方法に使用するためのキットの提供。【解決手段】ＩＶ型コラーゲンの三量体形成能を評価する方法であって、（ａ）野生型または変異型のＩＶ型コラーゲンα３（ＩＶ）鎖とスプリット型ルシフェラーゼの一方を含む融合タンパク質；（ｂ）野生型または変異型のＩＶ型コラーゲンα４（ＩＶ）鎖とペプチドタグを含む融合タンパク質；および（ｃ）野生型または変異型のＩＶ型コラーゲンα５（ＩＶ）鎖とスプリット型ルシフェラーゼの他方を含む融合タンパク質；を共発現する細胞を培養し、発光基質を加えてインキュベートし、発光強度に応じてＩＶ型コラーゲンの三量体形成能を評価する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＶ型コラーゲンの三量体形成能を評価する方法であって、
（１）以下（ａ）〜（ｃ）の融合タンパク質：
（ａ）野生型または変異型のＩＶ型コラーゲンα３（ＩＶ）鎖とスプリット型ルシフェラーゼの一方を含む融合タンパク質；
（ｂ）野生型または変異型のＩＶ型コラーゲンα４（ＩＶ）鎖とペプチドタグを含む融合タンパク質；および
（ｃ）野生型または変異型のＩＶ型コラーゲンα５（ＩＶ）鎖とスプリット型ルシフェラーゼの他方を含む融合タンパク質；
を共発現する細胞を培養し；
（２）（１）の培養物に発光基質を加えてインキュベートし；そして
（３）発光強度に応じてＩＶ型コラーゲンの三量体形成能を評価する；
ことを含む、前記方法。
【請求項２】
（ａ）〜（ｃ）の融合タンパク質を共発現する細胞が、
（ａ’）野生型または変異型のＩＶ型コラーゲンα３（ＩＶ）鎖とスプリット型ルシフェラーゼの一方を含む融合タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター；
（ｂ’）野生型または変異型のＩＶ型コラーゲンα４（ＩＶ）鎖とペプチドタグを含む融合タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター；および
（ｃ’）野生型または変異型のＩＶ型コラーゲンα５（ＩＶ）鎖とスプリット型ルシフェラーゼの他方を含む融合タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター；
で細胞をトランスフェクションすることにより得られたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ａ）〜（ｃ）の融合タンパク質が、
（ａ）野生型または変異型のＩＶ型コラーゲンα３（ＩＶ）鎖のＣ末端側にスプリット型ルシフェラーゼの一方を含む融合タンパク質；
（ｂ）野生型または変異型のＩＶ型コラーゲンα４（ＩＶ）鎖のＣ末端側にペプチドタグを含む融合タンパク質；および
（ｃ）野生型または変異型のＩＶ型コラーゲンα５（ＩＶ）鎖のＣ末端側にスプリット型ルシフェラーゼの他方を含む融合タンパク質；
である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
（ａ）〜（ｃ）の融合タンパク質が、
（ａ）野生型または変異型のＩＶ型コラーゲンα３（ＩＶ）鎖のＮ末端側にスプリット型ルシフェラーゼの一方を含む融合タンパク質；
（ｂ）野生型または変異型のＩＶ型コラーゲンα４（ＩＶ）鎖のＣ末端側にペプチドタグを含む融合タンパク質；および
（ｃ）野生型または変異型のＩＶ型コラーゲンα５（ＩＶ）鎖のＮ末端側にスプリット型ルシフェラーゼの他方を含む融合タンパク質；
である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
ペプチドタグが、ＦＬＡＧタグ（配列番号１２）または３×ＦＬＡＧタグ（配列番号１３）である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ＩＶ型コラーゲンの三量体形成能を促進する化合物をスクリーニングする方法であって、
（１）候補化合物の存在下または不在下で、以下（ａ）〜（ｃ）の融合タンパク質：
（ａ）野生型または変異型のＩＶ型コラーゲンα３（ＩＶ）鎖とスプリット型ルシフェラーゼの一方を含む融合タンパク質；
（ｂ）野生型または変異型のＩＶ型コラーゲンα４（ＩＶ）鎖とペプチドタグを含む融合タンパク質；および
（ｃ）野生型または変異型のＩＶ型コラーゲンα５（ＩＶ）鎖とスプリット型ルシフェラーゼの他方を含む融合タンパク質；
を共発現する細胞を培養し；
（２）（１）の培養物に発光基質を加えてインキュベートし；そして
（３）候補化合物の存在下で培養した培養物の発光強度と候補化合物の不在下で培養した培養物の発光強度を比較し；
（４）候補化合物の存在下で培養した培養物の発光強度が、候補化合物の不在下で培養した培養物の発光強度よりも亢進した場合、当該候補化合物をＩＶ型コラーゲンの三量体形成能を促進する化合物として同定する；
ことを含む、前記方法。
【請求項７】
ＩＶ型コラーゲン三量体形成能を促進する化合物の効果を評価する方法であって、
（１）系列希釈された候補化合物の存在下で、以下（ａ）〜（ｃ）の融合タンパク質：
（ａ）野生型または変異型のＩＶ型コラーゲンα３（ＩＶ）鎖とスプリット型ルシフェラーゼの一方を含む融合タンパク質；
（ｂ）野生型または変異型のＩＶ型コラーゲンα４（ＩＶ）鎖とペプチドタグを含む融合タンパク質；および
（ｃ）野生型または変異型のＩＶ型コラーゲンα５（ＩＶ）鎖とスプリット型ルシフェラーゼの他方を含む融合タンパク質；
を共発現する細胞を培養し；
（２）（１）の培養物に発光基質を加えてインキュベートし；そして
（３）候補化合物の濃度に応じた発光強度に基づいて、ＩＶ型コラーゲンの三量体形成能の促進に関する当該候補化合物の濃度依存性を評価する；
ことを含む、前記方法。
【請求項８】
ＩＶ型コラーゲン三量体形成能を促進する化合物の効果を評価する方法であって、
（１）複数の候補化合物それぞれについて、当該候補化合物の存在下で、以下（ａ）〜（ｃ）の融合タンパク質：
（ａ）野生型または変異型のＩＶ型コラーゲンα３（ＩＶ）鎖とスプリット型ルシフェラーゼの一方を含む融合タンパク質；
（ｂ）野生型または変異型のＩＶ型コラーゲンα４（ＩＶ）鎖とペプチドタグを含む融合タンパク質；および
（ｃ）野生型または変異型のＩＶ型コラーゲンα５（ＩＶ）鎖とスプリット型ルシフェラーゼの他方を含む融合タンパク質；
を共発現する細胞を培養し；
（２）（１）の培養物に発光基質を加えてインキュベートし；そして
（３）各候補化合物の存在下での発光強度を測定し、より高い発光強度を示した候補化合物をＩＶ型コラーゲンの三量体形成能の促進効果が高い化合物として評価する；
ことを含む、前記方法。
【請求項９】
ＩＶ型コラーゲンの三量体形成能を評価する、ＩＶ型コラーゲンの三量体形成能を促進する化合物をスクリーニングする、またはアルポート症候群治療薬を評価するためのキットであって、
（ａ’）野生型または変異型のＩＶ型コラーゲンα３（ＩＶ）鎖とスプリット型ルシフェラーゼの一方を含む融合タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター；
（ｂ’）野生型または変異型のＩＶ型コラーゲンα４（ＩＶ）鎖とペプチドタグを含む融合タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター；および
（ｃ’）野生型または変異型のＩＶ型コラーゲンα５（ＩＶ）鎖とスプリット型ルシフェラーゼの他方を含む融合タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター；
を含む、前記キット。
【請求項１０】
ＩＶ型コラーゲンの三量体形成能を評価する、ＩＶ型コラーゲンの三量体形成能を促進する化合物をスクリーニングする、またはアルポート症候群治療薬を評価するためのキットであって、
（ａ）野生型または変異型のＩＶ型コラーゲンα３（ＩＶ）鎖とスプリット型ルシフェラーゼの一方を含む融合タンパク質；
（ｂ）野生型または変異型のＩＶ型コラーゲンα４（ＩＶ）鎖とペプチドタグを含む融合タンパク質；および
（ｃ）野生型または変異型のＩＶ型コラーゲンα５（ＩＶ）鎖とスプリット型ルシフェラーゼの他方を含む融合タンパク質；
を共発現する細胞、を含む、前記キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩＶ型コラーゲンの三量体形成能を評価する方法、ＩＶ型コラーゲンの三量体形成能を促進する化合物をスクリーニングする方法、ＩＶ型コラーゲン三量体形成能を促進する化合物の効果を評価する方法およびこれらの方法に使用するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
アルポート症候群はＩＶ型コラーゲン（α３，α４，α５（ＩＶ））変異による腎糸球体基底膜以上により進行性の腎炎を発症する遺伝性疾患である。過去の臨床的研究では、基底膜上にＩＶ型コラーゲン発現が少しでも認められる患者が軽症であることが（非特許文献１）、基礎研究においては、モデルマウスに対して遺伝的に欠損したα３（ＩＶ）を生後に再発現させることにより病態が改善することが（非特許文献２）報告されており、原因となるα３，α４，α５（ＩＶ）タンパク質そのものを標的とした治療への可能性が期待されている。
【０００３】
また、本発明者らは野生型と変異型α５（ＩＶ）の細胞内安定性には差異はなく、変異体であっても比較的細胞内において安定であることを明らかにしている。これらの結果から、α３，α４，α５（ＩＶ）を標的とした治療には、タンパク質の分解抑制等による安定性の促進ではなく、喪失した三量体の形成の促進・回復が重要であることが示唆された。
【０００４】
一方、ＩＶ型コラーゲンにおけるα３鎖、α４鎖、およびα５鎖の三量体形成を定量的に評価する方法はこれまでに知られてこなかった。また、複合体検出のために免疫沈降法を用いる検出は既に試みられている。しかし、再現性・定量性が低く、三量体形成を促進する化合物スクリーニングに用いることは困難であった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Hashimura, Y., et al., Kidney Int., 2014, 85(5): 1208-1213
【非特許文献２】Lin, X., et al., J. Am. Soc. Nephrol., 2014, 25(4): 687-692
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ＩＶ型コラーゲンの三量体形成能を評価する方法、ＩＶ型コラーゲンの三量体形成能を促進する化合物をスクリーニングする方法、ＩＶ型コラーゲン三量体形成能を促進する化合物の効果を評価する方法、およびこれらの方法に使用するためのキットを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
以上に鑑み、本件の発明者らは、ＩＶ型コラーゲンの三量体形成に焦点を当て、研究を開始した。鋭意検討の結果、ＩＶ型コラーゲンの三量体形成を評価するルシフェラーゼに基づくインビトロのアッセイ系を構築した。当該知見に基づいて、本発明は完成された。
【０００８】
すなわち、一態様において、本発明は以下の通りであってよい。
【０００９】
［１］ＩＶ型コラーゲンの三量体形成能を評価する方法であって、
（１）以下（ａ）〜（ｃ）の融合タンパク質：
（ａ）野生型または変異型のＩＶ型コラーゲンα３（ＩＶ）鎖とスプリット型ルシフェラーゼの一方を含む融合タンパク質；
（ｂ）野生型または変異型のＩＶ型コラーゲンα４（ＩＶ）鎖とペプチドタグを含む融合タンパク質；および
（ｃ）野生型または変異型のＩＶ型コラーゲンα５（ＩＶ）鎖とスプリット型ルシフェラーゼの他方を含む融合タンパク質；
を共発現する細胞を培養し；
（２）（１）の培養物に発光基質を加えてインキュベートし；そして
（３）発光強度に応じてＩＶ型コラーゲンの三量体形成能を評価する；
ことを含む、前記方法。
【００１０】
［２］（ａ）〜（ｃ）の融合タンパク質を共発現する細胞が、
（ａ’）野生型または変異型のＩＶ型コラーゲンα３（ＩＶ）鎖とスプリット型ルシフェラーゼの一方を含む融合タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター；
（ｂ’）野生型または変異型のＩＶ型コラーゲンα４（ＩＶ）鎖とペプチドタグを含む融合タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター；および
（ｃ’）野生型または変異型のＩＶ型コラーゲンα５（ＩＶ）鎖とスプリット型ルシフェラーゼの他方を含む融合タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター；
で細胞をトランスフェクションすることにより得られたものである、上記［１］に記載の方法。
【００１１】
［３］（ａ）〜（ｃ）の融合タンパク質が、
（ａ）野生型または変異型のＩＶ型コラーゲンα３（ＩＶ）鎖のＣ末端側にスプリット型ルシフェラーゼの一方を含む融合タンパク質；
（ｂ）野生型または変異型のＩＶ型コラーゲンα４（ＩＶ）鎖のＣ末端側にペプチドタグを含む融合タンパク質；および
（ｃ）野生型または変異型のＩＶ型コラーゲンα５（ＩＶ）鎖のＣ末端側にスプリット型ルシフェラーゼの他方を含む融合タンパク質；
である、上記［１］または［２］に記載の方法。
【００１２】
［４］（ａ）〜（ｃ）の融合タンパク質が、
（ａ）野生型または変異型のＩＶ型コラーゲンα３（ＩＶ）鎖のＮ末端側にスプリット型ルシフェラーゼの一方を含む融合タンパク質；
（ｂ）野生型または変異型のＩＶ型コラーゲンα４（ＩＶ）鎖のＣ末端側にペプチドタグを含む融合タンパク質；および
（ｃ）野生型または変異型のＩＶ型コラーゲンα５（ＩＶ）鎖のＮ末端側にスプリット型ルシフェラーゼの他方を含む融合タンパク質；
である、上記［１］または［２］に記載の方法。
【００１３】
［５］ペプチドタグが、ＦＬＡＧタグ（配列番号１２）または３×ＦＬＡＧタグ（配列番号１３）である、上記［１］〜［４］のいずれか１項に記載の方法。
【００１４】
［６］ＩＶ型コラーゲンの三量体形成能を促進する化合物をスクリーニングする方法であって、
（１）候補化合物の存在下または不在下で、以下（ａ）〜（ｃ）の融合タンパク質：
（ａ）野生型または変異型のＩＶ型コラーゲンα３（ＩＶ）鎖とスプリット型ルシフェラーゼの一方を含む融合タンパク質；
（ｂ）野生型または変異型のＩＶ型コラーゲンα４（ＩＶ）鎖とペプチドタグを含む融合タンパク質；および
（ｃ）野生型または変異型のＩＶ型コラーゲンα５（ＩＶ）鎖とスプリット型ルシフェラーゼの他方を含む融合タンパク質；
を共発現する細胞を培養し；
（２）（１）の培養物に発光基質を加えてインキュベートし；そして
（３）候補化合物の存在下で培養した培養物の発光強度と候補化合物の不在下で培養した培養物の発光強度を比較し；
（４）候補化合物の存在下で培養した培養物の発光強度が、候補化合物の不在下で培養した培養物の発光強度よりも亢進した場合、当該候補化合物をＩＶ型コラーゲンの三量体形成能を促進する化合物として同定する；
ことを含む、前記方法。
【００１５】
［７］ＩＶ型コラーゲン三量体形成能を促進する化合物の効果を評価する方法であって、
（１）系列希釈された候補化合物の存在下で、以下（ａ）〜（ｃ）の融合タンパク質：
（ａ）野生型または変異型のＩＶ型コラーゲンα３（ＩＶ）鎖とスプリット型ルシフェラーゼの一方を含む融合タンパク質；
（ｂ）野生型または変異型のＩＶ型コラーゲンα４（ＩＶ）鎖とペプチドタグを含む融合タンパク質；および
（ｃ）野生型または変異型のＩＶ型コラーゲンα５（ＩＶ）鎖とスプリット型ルシフェラーゼの他方を含む融合タンパク質；
を共発現する細胞を培養し；
（２）（１）の培養物に発光基質を加えてインキュベートし；そして
（３）候補化合物の濃度に応じた発光強度に基づいて、ＩＶ型コラーゲンの三量体形成能の促進に関する当該候補化合物の濃度依存性を評価する；
ことを含む、前記方法。
【００１６】
［８］ＩＶ型コラーゲン三量体形成能を促進する化合物の効果を評価する方法であって、
（１）複数の候補化合物それぞれについて、当該候補化合物の存在下で、以下（ａ）〜（ｃ）の融合タンパク質：
（ａ）野生型または変異型のＩＶ型コラーゲンα３（ＩＶ）鎖とスプリット型ルシフェラーゼの一方を含む融合タンパク質；
（ｂ）野生型または変異型のＩＶ型コラーゲンα４（ＩＶ）鎖とペプチドタグを含む融合タンパク質；および
（ｃ）野生型または変異型のＩＶ型コラーゲンα５（ＩＶ）鎖とスプリット型ルシフェラーゼの他方を含む融合タンパク質；
を共発現する細胞を培養し；
（２）（１）の培養物に発光基質を加えてインキュベートし；そして
（３）各候補化合物の存在下での発光強度を測定し、より高い発光強度を示した候補化合物をＩＶ型コラーゲンの三量体形成能の促進効果が高い化合物として評価する；
ことを含む、前記方法。
【００１７】
［９］ＩＶ型コラーゲンの三量体形成能を評価する、ＩＶ型コラーゲンの三量体形成能を促進する化合物をスクリーニングする、またはアルポート症候群治療薬を評価するためのキットであって、
（ａ’）野生型または変異型のＩＶ型コラーゲンα３（ＩＶ）鎖とスプリット型ルシフェラーゼの一方を含む融合タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター；
（ｂ’）野生型または変異型のＩＶ型コラーゲンα４（ＩＶ）鎖とペプチドタグを含む融合タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター；および
（ｃ’）野生型または変異型のＩＶ型コラーゲンα５（ＩＶ）鎖とスプリット型ルシフェラーゼの他方を含む融合タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター；
を含む、前記キット。
【００１８】
［１０］ＩＶ型コラーゲンの三量体形成能を評価する、ＩＶ型コラーゲンの三量体形成能を促進する化合物をスクリーニングする、またはアルポート症候群治療薬を評価するためのキットであって、
（ａ）野生型または変異型のＩＶ型コラーゲンα３（ＩＶ）鎖とスプリット型ルシフェラーゼの一方を含む融合タンパク質；
（ｂ）野生型または変異型のＩＶ型コラーゲンα４（ＩＶ）鎖とペプチドタグを含む融合タンパク質；および
（ｃ）野生型または変異型のＩＶ型コラーゲンα５（ＩＶ）鎖とスプリット型ルシフェラーゼの他方を含む融合タンパク質；
を共発現する細胞、を含む、前記キット。
【発明の効果】
【００１９】
本発明のＩＶ型コラーゲンの三量体形成能を評価する方法は、定量性があり、再現性の高い方法である。さらには、ハイスループットスクリーニングへの応用も可能であるため、ＩＶ型コラーゲンの三量体形成能を促進する化合物をスクリーニングするために利用することができる。また、本発明の方法は、ＩＶ型コラーゲン三量体形成能を促進する化合物の効果を評価するために用いることもできる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、スプリット型ルシフェラーゼによるタンパク質−タンパク質間相互作用解析によるＩＶ型コラーゲン三量体検出の模式図である。
【図２】図２は、実施例１のアッセイ系に用いた融合タンパク質の模式図、および当該アッセイ系において野生型ＩＶ型コラーゲンの三量体形成を検出した結果を示すグラフである。グラフ中、α３はα３鎖単独発現細胞の培養上清、α５はα５鎖単独発現細胞の培養上清、α３５はα３鎖およびα５鎖を共発現させた細胞の培養上清、α３４５はα３鎖、α４鎖およびα５鎖を共発現させた細胞の培養上清の結果である。
【図３】図３は、野生型ＩＶ型コラーゲンα４鎖の発現量を変化させたときのＩＶ型コラーゲンの三量体形成量を評価した結果を示すグラフである。グラフ中α３５はα３鎖およびα５鎖を共発現させた細胞の培養上清、α３４５はα３鎖、α４鎖およびα５鎖を共発現させた細胞の培養上清の結果である。α４の上に示された三角のバーは、α４鎖の発現量を模式的に示したものである。
【図４】図４は、ドメイン欠損α５鎖融合タンパク質の模式図、および、ドメイン欠損α５鎖を用いた場合のＩＶ型コラーゲンの三量体形成量を評価した結果を示すグラフである。
【図５】図５は、α３鎖、α４鎖およびα５鎖をそれぞれ単独で発現する細胞、またはそれら３種の細胞を共培養した場合の、培養上清におけるＩＶ型コラーゲンの三量体形成を評価したグラフである。グラフ中、α３はα３鎖単独発現細胞の培養上清、α４はα４鎖単独発現細胞の培養上清、α５はα５鎖単独発現細胞の培養上清、α３α４α５はα３鎖単独発現細胞、α４鎖単独発現細胞およびα５鎖単独発現細胞の共培養物の培養上清、α３４５はα３鎖、α４鎖およびα５鎖を共発現させた細胞の培養上清の結果である。
【図６】図６は、各種α５鎖変異体を用いた場合の三量体形成パターンを示すグラフである。
【図７】図７は、α３鎖およびα５鎖のＮ末端側にスプリット型ルシフェラーゼを融合させた融合タンパク質を用いた場合の評価系の模式図、およびその結果を示すグラフである。グラフ中、α３はα３鎖単独発現細胞の培養上清、α５はα５鎖単独発現細胞の培養上清、α３５はα３鎖およびα５鎖を共発現させた細胞の培養上清、α３４５はα３鎖、α４鎖およびα５鎖を共発現させた細胞の培養上清の結果である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下に本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。本明細書で特段に定義されない限り、本発明に関連して用いられる科学用語及び技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。
【００２２】
ＩＶ型コラーゲンの三量体形成能を評価する方法
本発明は、ＩＶ型コラーゲンの三量体形成能を評価する方法であって、
（１）以下（ａ）〜（ｃ）の融合タンパク質：
（ａ）野生型または変異型のＩＶ型コラーゲンα３（ＩＶ）鎖とスプリット型ルシフェラーゼの一方を含む融合タンパク質；
（ｂ）野生型または変異型のＩＶ型コラーゲンα４（ＩＶ）鎖とペプチドタグを含む融合タンパク質；および
（ｃ）野生型または変異型のＩＶ型コラーゲンα５（ＩＶ）鎖とスプリット型ルシフェラーゼの他方を含む融合タンパク質；
を共発現する細胞を培養し；
（２）（１）の培養物に発光基質を加えてインキュベートし；そして
（３）発光強度に応じてＩＶ型コラーゲンの三量体形成能を評価する；
ことを含む前記方法、に関する。
【００２３】
野生型のＩＶ型コラーゲンα３（ＩＶ）鎖（以下、本明細書においてα３鎖と記載することがある）は、配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質であり、配列番号１の塩基配列によりコードされる。野生型のＩＶ型コラーゲンα４（ＩＶ）鎖（以下、本明細書においてα４鎖と記載することがある）は、配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質であり、配列番号３の塩基配列によりコードされる。野生型のＩＶ型コラーゲンα５（ＩＶ）鎖（以下、本明細書においてα５鎖と記載することがある）は、配列番号６のアミノ酸配列からなるタンパク質であり、配列番号５の塩基配列によりコードされる。
【００２４】
変異型のα３鎖、α４鎖およびα５鎖は、それぞれ、野生型のα３鎖、α４鎖およびα５鎖のアミノ酸配列に対して１又は複数の点変異を有するα３鎖、α４鎖およびα５鎖である。野生型のアミノ酸配列に対する点変異は、アルポート症候群の患者において見出された変異、アルポート症候群が疑われる患者において見出された変異、または本願出願後にアルポート症候群と関連すると同定されたまたは関連が疑われる変異から選択してよい。例えば、原因遺伝子がα５鎖をコードする遺伝子（COL4A5）であるＸ染色体連鎖型のアルポート症候群は、アルポート症候群の約８０％を占めるが、アルポート症候群と関連するα５鎖の変異として、Ｇ１２９Ｅ、Ｇ１５３Ｄ、Ｇ２２７Ｓ、Ｇ３２５Ｒ、Ｇ４２６Ｒ、Ｇ４７５Ｓ、Ｇ５２１Ｄ、Ｇ５７３Ｄ、Ｇ５９４Ｄ、Ｇ５９４Ｓ、Ｇ６２４Ｄ、Ｇ６５０Ｄ、Ｌ６６４Ｎ、Ｇ６７５Ｓ、Ｇ７９６Ｄ、Ｇ７９６Ｒ、Ｇ８６９Ｒ、Ｇ９１１Ｅ、Ｓ９１６Ｇ、Ｇ９５３Ｖ、Ｇ１０３０Ｓ、Ｇ１１０７Ｒ、Ｇ１１４３Ｄ、Ｇ１１７０Ｓ、Ｇ１２２０Ｄ、Ｇ１２４１Ｃ、Ｇ１２４１Ｖ、Ｇ１２４４Ｄ、Ｇ１４４８Ｒ、Ｐ１５１７Ｔ、Ｃ１５６７Ｒ、Ｒ１５６９Ｑ、Ｍ１６０７Ｉ、Ｌ１６４９Ｒ、Ｒ１６８３Ｑ等が知られている。α５鎖のＧ８６９Ｒ変異は、アルポート症候群の患者において最も頻繁に見出される変異であり、好ましい。ここで、点変異は、「Ｘ１ｎＸ２」で表記され、ｎは野生型配列におけるアミノ酸の位置であり、α５鎖については配列番号６のアミノ酸番号に一致する。Ｘ１は野生型の配列のアミノ酸を示し、Ｘ２は変異後の配列のアミノ酸を示す。Ｘ１およびＸ２はいずれも、当業者に周知のアミノ酸の一文字表記で表される。
【００２５】
本明細書において、「１又は複数の点変異を有する」とは、α３鎖、α４鎖またはα５鎖のそれぞれについて、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜５個、または１〜３個の点変異を有することを意味する。
【００２６】
スプリット型ルシフェラーゼとは、適切な部位で２つに分断したルシフェラーゼのＤＮＡ配列によりコードされるルシフェラーゼのタンパク質断片の一対である。これら２つの分断されたタンパク質断片が近接することでルシフェラーゼの活性が回復し、発光基質の発光が回復する現象が知られている。この現象を利用して、会合や多量体形成の観察を行う分子のそれぞれにスプリット型ルシフェラーゼを一対となるように融合させて、ルシフェラーゼによる発光を指標とした結合アッセイを行うことができる。本発明の方法に使用可能なスプリット型ルシフェラーゼに特に制限はないが、例えば、配列番号８のアミノ酸配列を有し配列番号７の塩基配列によりコードされるSmBiT、および配列番号１０のアミノ酸配列を有し配列番号９の塩基配列によりコードされるLgBiTの組合せを好適に使用することができる。SmBiTまたはLgBiTのいずれを、α３鎖またはα５鎖に融合させるかは、特に制限はない。好ましくは、α３鎖にSmBiTを融合しα５鎖にLgBiTを融合してもよい。
【００２７】
スプリット型ルシフェラーゼの一対は、α３鎖またはα５鎖のＣ末端側またはＮ末端側のいずれに融合してもよい。スプリット型ルシフェラーゼの一対を、α３鎖またはα５鎖のＮ末端側に融合させる場合、α３鎖またはα５鎖のシグナル配列の後の領域にスプリット型ルシフェラーゼの一対が挿入されるように融合タンパク質を調製してもよい。この場合、シグナル配列は、α３鎖またはα５鎖のものを用いてもよいし、分泌タンパク質由来のシグナル配列として知られている他の配列に置換してもよい。シグナル配列として利用可能な他の配列の例としては、Ｉｇκリーダー配列（配列番号１１によりコードされる配列）、ＩＬ−６のシグナル配列等が挙げられる。
【００２８】
α４鎖は、ペプチドタグとの融合タンパク質として調製される。ペプチドタグは、当該技術分野において他タンパク質回収や検出を容易にする目的で使用されるタグであれば、特に限定されない。タグの分子量が大きくなると、スプリット型ルシフェラーゼの近接を阻害することが考えられる。この観点から、ペプチドタグの分子量は、１５ｋＤａ以下、１０ｋＤａ以下、５ｋＤａ以下、３ｋＤａ以下であってもよい。例えば、ＦＬＡＧタグ（配列番号１２）または３ｘＦＬＡＧタグ（配列番号１３）をペプチドタグとして好適に使用できる。また、ペプチドタグは、α４鎖のＣ末端側に融合していることが好ましい。
【００２９】
本発明の方法において、（ａ）、（ｂ）、および、（ｃ）の融合タンパク質を共発現する細胞は、（ａ’）野生型または変異型のα３鎖とスプリット型ルシフェラーゼの一方を含む融合タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター、（ｂ’）野生型または変異型のα４鎖とペプチドタグを含む融合タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター、および、（ｃ’）野生型または変異型のα５鎖とスプリット型ルシフェラーゼの他方を含む融合タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター、で細胞をトランスフェクションすることにより得てもよい。
【００３０】
（ａ’）、（ｂ’）および（ｃ’）の発現ベクターは、細胞内に導入された場合に、それぞれ（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の融合タンパク質の発現を可能にするベクターであれば、特に制限はない。発現ベクターの種類は、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の融合タンパク質の融合タンパク質を発現させる細胞の種類に応じて当業者が選択することができる。（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の融合タンパク質をコードする遺伝子の、ベクターへのサブクローニングは、当業者に公知の手法により行うことができる。
【００３１】
細胞の種類は、特に限定されないが、好ましくはヒト由来の細胞、特に好ましくはヒト腎臓細胞、であってよい。例えば、HEK293T細胞を好適に使用できる。
【００３２】
トランスフェクション方法は、発現ベクターの導入により、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の融合タンパク質の一過性発現を可能にするものであれば特に限定されず、当業者に公知の手法により行うことができる。
【００３３】
上記の方法の工程（１）は、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の融合タンパク質を共発現する細胞を培養する工程である。培地および培養条件は、細胞の種類に応じて当業者が適宜選択することができる。利用可能な培地として、例えば、DMEM、MEM、RPMI-1640等が挙げられる。ヒト由来の細胞を用いる場合、血清含有培地を用いることが好ましい。培養条件は、細胞の増殖が可能な条件であれば特に限定されないが、例えば５％ＣＯ２、３７℃であってもよい。培養時間は、２４〜７２時間であることができるが、最後の２４時間はフェノールレッドフリーの培地で培養することが好ましい。
【００３４】
工程（１）の培養により、細胞内で（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の融合タンパク質が発現し、これらの融合タンパク質が三量体形成してＩＶ型コラーゲンを形成すると、細胞外に分泌される。
【００３５】
上記の方法の工程（２）は、工程（１）の培養物に発光基質を加えてインキュベーションを行う工程である。細胞内で形成された三量体のＩＶ型コラーゲンは細胞外に分泌されるため、好ましくは工程（１）の培養物は培養上清である。発光基質は、ルシフェラーゼによる反応により発光を呈するものであれば特に限定されない。インキュベーションは、ルシフェラーゼによる反応が進行する温度であれば特に限定されず、３０℃〜４０℃、好ましくは３７℃で行ってもよい。インキュベーション時間は、三量体の量とルシフェラーゼによる反応により生じる発光強度が比例的に相関する範囲内で行われる限り特に制限はないが、例えば１０分間以内、１５分間以内、２０分間以内であってもよい。
【００３６】
上記の方法の工程（３）は、工程（２）のインキュベーションにより生じた発光強度に応じてＩＶ型コラーゲンの三量体形成能を評価する工程である。発光強度の測定は、ルシフェラーゼ活性の測定として当業者に公知の手法により行うことができる。発光強度が強いほど、用いたα３鎖、α４鎖およびα５鎖の三量体形成能が高いと評価できる。例えば、α３鎖、α４鎖またはα５鎖のいずれかについて変異型を用いた場合、野生型のα３鎖、α４鎖またはα５鎖を用いた場合の発光強度と比較することにより、野生型と比較した三量体形成能を評価することができる。
【００３７】
ＩＶ型コラーゲンの三量体形成能を促進する化合物をスクリーニングする方法
本発明は、ＩＶ型コラーゲンの三量体形成能を促進する化合物をスクリーニングする方法であって、
（１）候補化合物の存在下または不在下で、以下（ａ）〜（ｃ）の融合タンパク質：
（ａ）野生型または変異型のＩＶ型コラーゲンα３（ＩＶ）鎖とスプリット型ルシフェラーゼの一方を含む融合タンパク質；
（ｂ）野生型または変異型のＩＶ型コラーゲンα４（ＩＶ）鎖とペプチドタグを含む融合タンパク質；および
（ｃ）野生型または変異型のＩＶ型コラーゲンα５（ＩＶ）鎖とスプリット型ルシフェラーゼの他方を含む融合タンパク質；
を共発現する細胞を培養し；
（２）（１）の培養物に発光基質を加えてインキュベートし；そして
（３）候補化合物の存在下で培養した培養物の発光強度と候補化合物の不在下で培養した培養物の発光強度を比較し；
（４）候補化合物の存在下で培養した培養物の発光強度が、候補化合物の不在下で培養した培養物の発光強度よりも亢進した場合、当該候補化合物をＩＶ型コラーゲンの三量体形成能を促進する化合物として同定する；
ことを含む前記方法、に関する。
【００３８】
上記スクリーニング方法において、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の融合タンパク質の少なくとも１つは、変異型のα３鎖、α４鎖またはα５鎖を含む。
【００３９】
以下の構成についての説明は、『ＩＶ型コラーゲンの三量体形成能を評価する方法』の項目において上述したとおりである。
・野生型または変異型のα３鎖、α４鎖およびα５鎖
・スプリット型ルシフェラーゼ、
・ペプチドタグ
・（ａ）、（ｂ）、および、（ｃ）の融合タンパク質を共発現する細胞、当該細胞を調製する際に用いる発現ベクター、および当該細胞の調製方法（トランスフェクション方法）
上記のスクリーニング方法の工程（１）は、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の融合タンパク質を共発現する細胞を、候補化合物の存在下または不在下で培養する工程である。培地および培養条件は、候補化合物を添加することを除いて、『ＩＶ型コラーゲンの三量体形成能を評価する方法』の項目において上述したとおりである。
【００４０】
候補化合物は、ＩＶ型コラーゲンの三量体形成能を促進するか否かを検討する対象となる化合物である。候補化合物の濃度は特に限定されないが、培地中に１μＭ〜１００ｍＭ、５μＭ〜５０ｍＭ、７μＭ〜３０ｍＭ、１０μＭ〜１５ｍＭ、の範囲で存在していてもよい。
【００４１】
上記のスクリーニング方法の工程（２）は、『ＩＶ型コラーゲンの三量体形成能を評価する方法』の工程（２）について上述したとおりである。
【００４２】
上記のスクリーニング方法の工程（３）および（４）は、（３）候補化合物の存在下で培養した培養物の発光強度と候補化合物の不在下で培養した培養物の発光強度を比較し、（４）候補化合物の存在下で培養した培養物の発光強度が、候補化合物の不在下で培養した培養物の発光強度よりも亢進した場合、当該候補化合物をＩＶ型コラーゲンの三量体形成能を促進する化合物として同定する工程である。本発明の方法では、発光強度が高いほど、用いたα３鎖、α４鎖およびα５鎖の三量体形成能の促進効果が高いと評価できる。よって、候補化合物の存在下で発光強度が亢進した場合、当該候補化合物は、用いたα３鎖、α４鎖およびα５鎖の三量体形成能を向上させる効果を有する化合物、すなわちＩＶ型コラーゲンの三量体形成能を促進する化合物として同定することができる。
【００４３】
また、本発明のスクリーニング方法は、野生型のα３鎖、α４鎖およびα５鎖を含む融合タンパク質を候補化合物の非存在下で発現させた場合の発光強度と比較することにより、当該候補化合物によりＩＶ型コラーゲンの三量体形成能が促進された結果、どの程度野生型のＩＶ型コラーゲンの三量体形成能に近づけることができるのかについても評価することが可能である。
【００４４】
ＩＶ型コラーゲン三量体形成能を促進する化合物の効果を評価する方法
本発明はＩＶ型コラーゲン三量体形成能を促進する化合物の効果を評価する方法（以下、本発明の評価方法と記載することがある）に関する。
【００４５】
本発明の評価方法に関する第一の態様は、
（１）系列希釈された候補化合物の存在下で、以下（ａ）〜（ｃ）の融合タンパク質：
（ａ）野生型または変異型のＩＶ型コラーゲンα３（ＩＶ）鎖とスプリット型ルシフェラーゼの一方を含む融合タンパク質；
（ｂ）野生型または変異型のＩＶ型コラーゲンα４（ＩＶ）鎖とペプチドタグを含む融合タンパク質；および
（ｃ）野生型または変異型のＩＶ型コラーゲンα５（ＩＶ）鎖とスプリット型ルシフェラーゼの他方を含む融合タンパク質；
を共発現する細胞を培養し；
（２）（１）の培養物に発光基質を加えてインキュベートし；そして
（３）候補化合物の濃度に応じた発光強度に基づいて、ＩＶ型コラーゲンの三量体形成能の促進に関する当該候補化合物の濃度依存性を評価する；
ことを含む、前記方法であってよい。
【００４６】
本発明の評価方法に関する第二の態様は、
（１）複数の候補化合物それぞれについて、当該候補化合物の存在下で、以下（ａ）〜（ｃ）の融合タンパク質：
（ａ）野生型または変異型のＩＶ型コラーゲンα３（ＩＶ）鎖とスプリット型ルシフェラーゼの一方を含む融合タンパク質；
（ｂ）野生型または変異型のＩＶ型コラーゲンα４（ＩＶ）鎖とペプチドタグを含む融合タンパク質；および
（ｃ）野生型または変異型のＩＶ型コラーゲンα５（ＩＶ）鎖とスプリット型ルシフェラーゼの他方を含む融合タンパク質；
を共発現する細胞を培養し；
（２）（１）の培養物に発光基質を加えてインキュベートし；そして
（３）各候補化合物の存在下での発光強度を測定し、より高い発光強度を示した候補化合物をＩＶ型コラーゲンの三量体形成能の促進効果が高い化合物として評価する；
ことを含む、前記方法であってよい。
【００４７】
上記本発明の評価方法方法において、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の融合タンパク質の少なくとも１つは、変異型のα３鎖、α４鎖またはα５鎖を含む。
【００４８】
本発明の評価方法に関して以下の構成についての説明は、『ＩＶ型コラーゲンの三量体形成能を評価する方法』の項目において上述したとおりである。
・野生型または変異型のα３鎖、α４鎖およびα５鎖
・スプリット型ルシフェラーゼ、
・ペプチドタグ
・（ａ）、（ｂ）、および、（ｃ）の融合タンパク質を共発現する細胞、当該細胞を調製する際に用いる発現ベクター、および当該細胞の調製方法（トランスフェクション方法）
本発明の評価方法において、候補化合物はＩＶ型コラーゲンの三量体形成能の促進効果を評価する対象となる化合物である。例えば、本発明のスクリーニング方法により同定された化合物であってもよく、アルポート症候群の治療に用いられる化合物であってもよい。候補化合物の濃度は特に限定されないが、『ＩＶ型コラーゲンの三量体形成能を促進する化合物をスクリーニングする方法』の項目において上述した濃度範囲で存在していてもよい。
【００４９】
本発明の評価方法において、工程（２）は、『ＩＶ型コラーゲンの三量体形成能を評価する方法』の工程（２）について上述したとおりである。
【００５０】
上記評価方法の第一の態様では、工程（１）において治療薬を存在させる濃度を変化させることにより、当該候補化合物によるＩＶ型コラーゲンの三量体形成能の促進効果について濃度依存性を評価することができる。具体的には、工程（３）は、候補化合物の濃度に応じた発光強度に基づいて、ＩＶ型コラーゲンの三量体形成能の促進に関する当該候補化合物の濃度依存性を評価する工程である。本発明の方法では、発光強度が高いほど、用いたα３鎖、α４鎖およびα５鎖の三量体形成能の促進効果が高いと評価できる。候補化合物の濃度と発光強度の相関を評価することで、ＩＶ型コラーゲンの三量体形成能の促進に必要な候補化合物の濃度範囲を評価し、特定することができる。
【００５１】
上記評価方法の第二の態様では、複数の候補化合物について並行して評価することにより、候補化合物間でのＩＶ型コラーゲンの三量体形成能の促進効果を比較することができる。具体的には、工程（３）は、各候補化合物の存在下での発光強度を測定し、より高い発光強度を示した候補化合物をＩＶ型コラーゲンの三量体形成能の促進効果が高い化合物として評価する工程である。各候補化合物について発光強度を比較することにより、各候補化合物についてＩＶ型コラーゲンの三量体形成能の促進効果を相対的に評価することができる。
【００５２】
上記評価方法の第二の態様においてはまた、複数の候補化合物のそれぞれについてさらに系列希釈された試料を用いてもよい。この場合、複数の候補化合物について、候補化合物間でのＩＶ型コラーゲンの三量体形成能の促進効果を濃度依存性とともに比較することができる。
【００５３】
本発明の評価方法に関して、さらに野生型のα３鎖、α４鎖およびα５鎖を含む融合タンパク質を候補化合物の非存在下で発現させた場合の発光強度と比較してもよい。この比較により、候補化合物が存在することで、検討した変異型ＩＶ型コラーゲンについて、どの程度野生型のＩＶ型コラーゲンの三量体形成能に近づけることができるのかについて評価することが可能である。
【００５４】
本発明のスクリーニング方法および評価方法により、ＩＶ型コラーゲンの三量体形成能を促進することが確認された化合物は、アルポート症候群の治療薬として有用な化合物であり得る。
【００５５】
キット
本発明は、ＩＶ型コラーゲンの三量体形成能を評価する、ＩＶ型コラーゲンの三量体形成能を促進する化合物をスクリーニングする、またはＩＶ型コラーゲン三量体形成能を促進する化合物の効果を評価するためのキットであって、
（ａ’）野生型または変異型のＩＶ型コラーゲンα３（ＩＶ）鎖とスプリット型ルシフェラーゼの一方を含む融合タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター；
（ｂ’）野生型または変異型のＩＶ型コラーゲンα４（ＩＶ）鎖とペプチドタグを含む融合タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター；および
（ｃ’）野生型または変異型のＩＶ型コラーゲンα５（ＩＶ）鎖とスプリット型ルシフェラーゼの他方を含む融合タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター；
を含む、前記キットに関する。
【００５６】
本発明はまた、ＩＶ型コラーゲンの三量体形成能を評価する、ＩＶ型コラーゲンの三量体形成能を促進する化合物をスクリーニングする、またはＩＶ型コラーゲン三量体形成能を促進する化合物の効果を評価するためのキットであって、
（ａ）野生型または変異型のＩＶ型コラーゲンα３（ＩＶ）鎖とスプリット型ルシフェラーゼの一方を含む融合タンパク質；
（ｂ）野生型または変異型のＩＶ型コラーゲンα４（ＩＶ）鎖とペプチドタグを含む融合タンパク質；および
（ｃ）野生型または変異型のＩＶ型コラーゲンα５（ＩＶ）鎖とスプリット型ルシフェラーゼの他方を含む融合タンパク質；
を共発現する細胞、を含む、前記キットに関する。
【００５７】
（ａ’）、（ｂ’）および（ｃ’）の発現ベクター、および（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の融合タンパク質を共発現する細胞については、『ＩＶ型コラーゲンの三量体形成能を評価する方法』の項目において上述したとおりである。
【００５８】
本発明のキットは、上記の構成品のすべてを１つのキットに含むものであってもよく、また、本発明の方法（ＩＶ型コラーゲンの三量体形成能を評価する方法、ＩＶ型コラーゲンの三量体形成能を促進する化合物をスクリーニングする方法、またはＩＶ型コラーゲン三量体形成能を促進する化合物の効果を評価する方法）に利用する目的のためのキットであれば、上記の構成品の一部を含まないものであってもよい。上記の構成品の一部を含まないキットである場合、実施者が必要な成分を、当該キットに追加して、本願発明の方法を実施することができる。
【００５９】
本発明のキットは、さらに、培地および／または発光基質を含む追加の構成品を含んでいてもよい。追加の構成品は、１つのキットとして本発明のキットに含まれていてもよく、または本発明のキットとともに使用することを前提とした別のキットとして提供されてもよい。
【００６０】
本発明のキットはまた、本発明の方法を実施するための指示が記載された説明書を含むものであってもよい。当該説明書には、上記『ＩＶ型コラーゲンの三量体形成能を評価する方法』、『ＩＶ型コラーゲンの三量体形成能を促進する化合物をスクリーニングする方法』、『ＩＶ型コラーゲン三量体形成能を促進する化合物の効果を評価する方法』の項目において記載した事項が説明として記載されていてもよい。
【実施例】
【００６１】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００６２】
実施例１：ＩＶ型コラーゲン形成試験
実験材料および実験方法
（１）細胞種
本研究では、HEK293T細胞(Human Embryonic Kidney 293)を使用した。HEK293T細胞は理化学研究所細胞バンクから購入した。
【００６３】
（２）細胞培養方法
培養に用いた器具類はすべてオートクレーブ、あるいは乾熱滅菌による滅菌処理を施し、溶液類の調整には注射用水(大塚蒸留水)あるいはElix純水装置システム（MILLIPORE）によって調整した純水を用いた。また、すべての操作はクリーンベンチ内で無菌的に行った。
【００６４】
（３）培養液
基礎培養液：HEK293T細胞の培養にはDMEM（Wako）を基礎培養液として用いた。
【００６５】
細胞増殖用培養液：基礎培養液に１０％ウシ胎仔血清、および、抗生物質（ペニシリンＧ（１００ユニット／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ））を添加したものを細胞増殖用培養液として用いた。
【００６６】
（４）培養
細胞は、細胞増殖用培養液で、５％ＣＯ２、３７℃下にて静置培養した。
【００６７】
（５）ＤＮＡプラスミドの作成（Ｃ末端側でスプリット型ルシフェラーゼを融合したα３鎖およびα５鎖）
野生型ＩＶ型コラーゲンα３（ＩＶ）鎖をコードする核酸（COL4A3／配列番号１）および 野生型ＩＶ型コラーゲンα５（ＩＶ）鎖をコードする核酸（COL4A5／配列番号５）のそれぞれをnanoBiT plasmid (Promega)へ、野生型 ＩＶ型コラーゲンα４（ＩＶ）鎖をコードする核酸（COL4A4／配列番号３）はpEB Multi Hyg（Wako）へそれぞれサブクローニングした。ここで、サブクローニング後の発現ベクターは、それぞれ、ＩＶ型コラーゲンα３（ＩＶ）鎖（本明細書においてα３鎖と記載することがある）のＣ末端にスプリット型ルシフェラーゼの一方を有する融合タンパク質、ＩＶ型コラーゲンα５（ＩＶ）鎖（本明細書においてα５鎖と記載することがある）のＣ末端にスプリット型ルシフェラーゼの他方を有する融合タンパク質、ＩＶ型コラーゲンα４（ＩＶ）鎖（本明細書においてα４鎖と記載することがある）のＣ末端にFLAGタグを有する融合タンパク質、をコードする核酸を含むようにサブクローニングされた。
【００６８】
各遺伝子とそれを導入したプラスミドの組合せについて以下の表１に示す．
【００６９】
【表１】
2018191603.tif 000002
（６）遺伝子導入法
本実験において各遺伝子を導入するにあたりTransiT-LT1（Mirus）を用い，リポフェクション法を行った。以下にその方法を示す。
【００７０】
まず、１００μＬの無血清培地（Opti-MEM）に適量のTransIT-LT1を加えた。TransIT-LT1はDNA全量：TransIT-LT1溶液の比が１μｇ：３μＬになるように使用した。その後、目的遺伝子（０．５〜２．０μｇ）を加え、混和後１５分反応させた。その後、 サブコンフルエントまで培養した細胞に混合液を滴下し、５％ＣＯ２、３７℃で２４〜４８時間培養した。
【００７１】
（７）ＩＶ型コラーゲン三量体形成試験
HEK293T細胞にＩＶ型コラーゲンのα3-SmBiT（pFC36K SmBiT ベクター）、α4-FLAG（pEB multi Hygベクター）、およびα5-LgBiT（pFC34K LgBiTベクター）を上記（６）のリポフェクション法にて一過性に発現させた。遺伝子導入から２４時間後，細胞を９６ウェルプレート（White flat bottom, Thermo）へ３×１０４細胞／ウェルで再播種した。再播種１２時間後、フェノールレッドフリーの培地（DMEM、１０％ FBS、200mM 2P-AsA（アスコルビン酸２リン酸））へ交換した。最終培地交換２４時間後、培養上清を新たなウェルへ移し、細胞の入ったウェルには新たな培地（DMEM、１０％ FBS、200mM 2P-AsA）を加えた。各ウェルに、発光試薬である NanoGlo Live Cell Assay System（Promega）を加え、１０分間暗所で静置後、発光試薬に添付された説明に従い、発光測定を行った。発光測定は、GloMax Navigator（Promega）にて行った。
【００７２】
また、比較のために、H293T細胞にα3-SmBiT（pFC36K SmBiT ベクター）のみ、α5-LgBiT（pFC35K LgBiTベクター）のみ、または、α3-SmBiT（pFC36K SmBiT ベクター）およびα5-LgBiT（pFC34K LgBiTベクター）、をリポフェクション法にて一過性に発現させたものを準備し、同様に培養し、発光測定した。
【００７３】
結果
ＩＶ型コラーゲンのα3-SmBiT、α4-FLAG、およびα5-LgBiTを発現させた細胞からの培養上清において、ルシフェラーゼ反応による発光が特異的に検出された（図２）。一方、α3-SmBiTのみ、α5-LgBiTのみ、または、α3-SmBiTおよびα5-LgBiTを発現させた細胞からの培養上清については、発光はほとんど検出されなかった。すなわち、細胞内でＩＶ型コラーゲン三量体が形成された結果、細胞外へと分泌されたＩＶ型コラーゲン三量体を検出することができた。この結果は、この評価系によりＩＶ型コラーゲンの三量体形成能の評価が可能であることを示すものである。
【００７４】
また、α4-FLAG（pEB multi Hygベクター）について、トランスフェクションするプラスミドの量を変化させることで、ＩＶ型コラーゲンα４鎖の発現量を変化させたところ、細胞培養上清において、α４鎖量依存的にＩＶ型コラーゲン三量体が増加することが観察された（図３）。
【００７５】
実施例２：ドメイン欠損α５鎖の影響
野生型α５鎖をコードする核酸に代えて、野生型α５鎖のＮＣ１ドメインをコードする核酸（配列番号５の塩基4399〜5073）、または野生型α５鎖のＣＯＬドメインをコードする核酸（配列番号５の塩基124〜4398）を用いて、実施例１と同様に三量体形成能を評価することにより、ドメイン欠損α５鎖の影響を検討した。
【００７６】
野生型ＩＶコラーゲンα５鎖は、Ｎ末端側より、シグナル配列、ＣＯＬドメイン、およびＮＣ１ドメインとで構成される。したがって、上記の核酸を用いることでドメイン欠損型のα５鎖を有する融合タンパク質が生成する。ＮＣ１ドメインのＣ末端にスプリット型ルシフェラーゼを有する融合タンパク質をΔＣＯＬとし、ＣＯＬドメインのＣ末端にスプリット型ルシフェラーゼを有する融合タンパク質をΔＮＣ１とした。
【００７７】
結果を図４に示す。野生型ＩＶ型コラーゲンα５鎖を含む融合タンパク質をα３鎖およびα４鎖とともに発現させた場合は、培養上清（分泌物）において三量体が確認されたのに対し、ドメイン欠損型のα５鎖をα３鎖およびα４鎖とともに発現させた場合は三量体が確認されなかった。したがって、α５鎖についてのドメイン欠損は、三量体形成能が低下させることが示された。
【００７８】
実施例３：単独発現細胞の共培養では三量体は検出されない
実施例１では、HEK293T細胞にＩＶ型コラーゲンのα3-SmBiT、α4-FLAG、およびα5-LgBiTを一つの細胞内で共発現させ、分泌されたＩＶ型コラーゲンの三量体を検出した。
【００７９】
本実施例では、比較のために、α3-SmBiT単独発現細胞、α4-FLAG単独発現細胞、およびα5-LgBiT単独発現細胞を調製し、それら３つの細胞を共培養したものについて、ＩＶ型コラーゲン三量体の形成を評価した。α3-SmBiT単独発現細胞、α4-FLAG単独発現細胞、およびα5-LgBiT単独発現細胞の調製は、HEK293T細胞にＩＶ型コラーゲンのα3-SmBiT（pFC36K SmBiT ベクター）、α4-FLAG（pEB multi Hygベクター）、またはα5-LgBiT（pFC34K LgBiTベクター）を、実施例１の（６）のリポフェクション法にて一過性に発現させることにより行った。ＩＶ型コラーゲン三量体形成試験は、実施例１と同様に行った。
【００８０】
結果を図５に示す。α3-SmBiT、α4-FLAG、およびα5-LgBiTを一つの細胞内で共発現させた場合は、培養上清（分泌物）において三量体が確認されたのに対し、α3-SmBiT単独発現細胞、α4-FLAG単独発現細胞、およびα5-LgBiT単独発現細胞の共培養では三量体はほとんど検出されなかった。この結果は、細胞内で三量体形成しないＩＶ型コラーゲンは細胞外に分泌されないというＩＶ型コラーゲンの細胞内制御機構と一致するものである。
【００８１】
実施例４：α５鎖変異体の三量体形成能の評価
野生型α５鎖をコードする核酸に変えて、各種点変異を導入した変異型α５鎖をコードする核酸を用いて、実施例１と同様の方法によりα3-SmBiT、α4-FLAG、および変異型α5-LgBiTを共発現する細胞を調製した。
【００８２】
本実施例で検討したＩＶコラーゲンα５（ＶＩ）鎖についての点変異は、Ｇ１２９Ｅ、Ｇ１５３Ｄ、Ｇ２２７Ｓ、Ｇ３２５Ｒ、Ｇ４２６Ｒ、Ｇ４７５Ｓ、Ｇ５２１Ｄ、Ｇ５７３Ｄ、Ｇ５９４Ｄ、Ｇ５９４Ｓ、Ｇ６２４Ｄ、Ｇ６５０Ｄ、Ｌ６６４Ｎ、Ｇ６７５Ｓ、Ｇ７９６Ｄ、Ｇ７９６Ｒ、Ｇ８６９Ｒ、Ｇ９１１Ｅ、Ｓ９１６Ｇ、Ｇ９５３Ｖ、Ｇ１０３０Ｓ、Ｇ１１０７Ｒ、Ｇ１１４３Ｄ、Ｇ１１７０Ｓ、Ｇ１２２０Ｄ、Ｇ１２４１Ｃ、Ｇ１２４１Ｖ、Ｇ１２４４Ｄ、Ｇ１４４８Ｒ、Ｐ１５１７Ｔ、Ｃ１５６７Ｒ、Ｒ１５６９Ｑ、Ｍ１６０７Ｉ、Ｌ１６４９Ｒ、Ｒ１６８３Ｑである。ここで、点変異は、「Ｘ１ｎＸ２」で表記する。ｎはα５（ＩＶ）鎖におけるアミノ酸の位置であり、配列番号６のアミノ酸番号に一致する。Ｘ１は野生型の配列のアミノ酸を示し、Ｘ２は変異後の配列のアミノ酸を示す。Ｘ１およびＸ２はいずれも、当業者に周知のアミノ酸の一文字表記で表される。
【００８３】
上記の中でも、Ｇ８６９Ｒは、アルポート症候群の患者において最も頻繁に見出される変異である。また、Ｇ１２４４Ｄは、アルポート症候群の遺伝子異常として報告されているが出現頻度は把握されていない。アルポート症候群の症状を発症している患者Ａにおいて見出された変異である。
【００８４】
結果を図６に示す。アルポート症候群の患者において最も頻繁に見出されるＧ８６９Ｒ変異を有するα５鎖を含む変異型α5-LgBiTを用いた場合に培養上清において検出された三量体の量は、野生型α5-LgBiTを用いた場合と比較して顕著に低下した。また、Ｇ１２４４Ｄ変異を有するα５鎖を含む変異型α5-LgBiTについても、培養上清において検出された三量体の量は、野生型α5-LgBiTを用いた場合と比較して顕著に低下した。Ｇ１２４４Ｄ変異については、患者Ａの症状と矛盾しないものである。さらに、その他の変異についても、変異ごとに、野生型α5-LgBiTと同程度の三量体形成を示すもの、野生型α5-LgBiTよりも低い三量体形成を示すもの、を評価することができた。これらの結果は、この評価系により、ＩＶ型コラーゲン変異体の三量体形成能の評価を定量的に行うことが可能であることを示すものである。
【００８５】
実施例５：Ｎ末端側でスプリット型ルシフェラーゼを融合したα３鎖およびα５鎖
実施例１においては、α３鎖およびα５鎖のＣ末端側にスプリット型ルシフェラーゼを融合させた融合タンパク質を発現させる評価系を構築した。
【００８６】
本実施例においては、α３鎖およびα５鎖のＮ末端側にスプリット型ルシフェラーゼを融合させた融合タンパク質を発現させる評価系を構築した。
【００８７】
α３鎖のＮ末端側にSmBiTを有する融合タンパク質（SmBiT-α３）をコードする核酸を含むＤＮＡプラスミドは、シグナル配列欠損COL4A3（配列番号１の塩基127〜5013）をpFN36K SmBiTベクター（Promega）へサブクローニングして調製した。調製されたＤＮＡプラスミドは、５’末端から順に、Ｉｇκリーダー配列（配列番号１１）、SmBiTをコードする核酸（配列番号７）、シグナル配列欠損COL4A3（配列番号１の塩基127〜5013）を連結した核酸を含み、SmBiT-α３の発現ベクターである。
【００８８】
α５鎖のＮ末端側にLgBiTを有する融合タンパク質（LgBiT-α５）をコードする核酸を含むＤＮＡプラスミドは、シグナル配列欠損COL4A5（配列番号５の塩基124〜5073）をpFN33K LgBiTベクター（Promega）へサブクローニングして調製した。調製されたＤＮＡプラスミドは、５’末端から順に、Ｉｇκリーダー配列（配列番号１１）、LgBiTをコードする核酸（配列番号９）、シグナル配列欠損COL4A5（配列番号５の塩基124〜5073）を連結した核酸を含み、LgBiT-α５の発現ベクターである。
【００８９】
α３鎖およびα５鎖についてのＤＮＡプラスミドを上記のようにして調製したほかは、実施例１と同様に実験を行った。各遺伝子とそれを導入したプラスミドの組合せについて以下の表２に示す。
【００９０】
【表２】
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結果を図７に示す。本実施例の評価系についても、実施例１の評価系と同様に、ＩＶ型コラーゲンの三量体が検出された。この結果は、α３鎖およびα５鎖について、スプリット型ルシフェラーゼはＮ末端側、Ｃ末端側のいずれに融合させてもよいことを示している。
【産業上の利用可能性】
【００９１】
本発明のＩＶ型コラーゲンの三量体形成能を評価する方法は、９６ウェルプレート等で評価することが可能であるので、ハイスループットスクリーニングにより、ＩＶ型コラーゲンの三量体形成促進・安定化化合物を探索可能である。ＩＶ型コラーゲンの三量体形成促進・安定化化合物は、アルポート症候群の治療薬として利用できる可能性があり、医薬開発における強力なツールとなり得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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