(57)【要約】【課題】  固体支持体からタンパク質を細胞に送達する方法およびそのためのアレイを提供する。【解決手段】  （１）タンパク質とカチオン性高分子とを含む複合体を調製するステップと、（２）前記複合体を固体支持体上に固定するステップと、（３）ステップ（２）で得られた前記固体支持体上に細胞を播種するステップとを含む、固体支持体からタンパク質を細胞に送達する方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）タンパク質とカチオン性高分子とを含む複合体を調製するステップと、
（２）前記複合体を固体支持体上に固定するステップと、
（３）ステップ（２）で前記複合体を固定した前記固体支持体上に細胞を播種するステップと
を含む、固体支持体からタンパク質を細胞に送達する方法。
【請求項２】
前記カチオン性高分子がカチオン性脂質である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記タンパク質が酵素である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記酵素が、ヌクレアーゼまたはリコンビナーゼである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
タンパク質とカチオン性高分子とを含む複合体が固体支持体上に固定された、タンパク質を細胞に送達するためのアレイ。
【請求項６】
前記カチオン性高分子がカチオン性脂質である、請求項５に記載のアレイ。
【請求項７】
前記タンパク質が酵素である、請求項５または６に記載のアレイ。
【請求項８】
前記酵素が、ヌクレアーゼまたはリコンビナーゼである、請求項７に記載のアレイ。
【請求項９】
前記複合体が二糖をさらに含む、請求項５〜８のいずれか１項に記載のアレイ。
【請求項１０】
前記複合体が細胞外マトリクスタンパク質をさらに含む、請求項５〜９のいずれか１項に記載のアレイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固体支持体からタンパク質を細胞に送達する方法およびそのためのアレイに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ＭＥＭＳ（Ｍｉｃｒｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏ  Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）技術を用いた細胞チップの開発が注目されている。特に、細胞チップの一種である細胞マイクロアレイチップは、１〜数百個の細胞を数十〜数百ｎｍ間隔で固体支持体上に配列することにより、ハイスループットかつハイコンテントな細胞アッセイを可能とする。そのため、創薬の分野において、細胞マイクロアレイチップの利用による研究開発の効率化およびコストダウンが期待されている。
【０００３】
固体支持体上に固定された細胞に対し、固体支持体と細胞との接着面を介して固相から直接核酸や低分子化合物を送達する方法が、すでに報告されている（特許文献１および２、非特許文献１〜４）。一方、タンパク質については、液相からの導入については報告があるものの（非特許文献５〜７）、固相から送達する方法は現時点で一例も報告されていない。この主な原因としては、（１）タンパク質は核酸と異なり均一な表面電荷を有しないため、細胞への画一的な導入条件を確立することが困難であること、（２）タンパク質は核酸と異なり不安定であり失活しやすいため、乾燥状態での保存が困難であることが挙げられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００７−０８２４０２公報
【特許文献２】特開２００７−２６７６０２公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ziauddin, J. and Sabatini, D. M., Nature, Vol. 411, pp. 107-110 (2001)
【非特許文献２】Yoshikawa, T. et al., J. Control. Release, Vol. 96, pp. 227-232 (2004)
【非特許文献３】Silva, J. M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 101, pp. 6548-6552 (2004)
【非特許文献４】Bailey, S. N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 101, pp. 16144-16149 (2004)
【非特許文献５】Zuris, J. A. et al., Nat. Biotechnol., Vol. 33, pp. 73-80 (2015)
【非特許文献６】Gaj, T. et al., Nat. Methods, Vol. 9, pp. 805-807 (2012)
【非特許文献７】Fu, A. et al., Bioconjug. Chem., Vol. 25, pp. 1602-1608 (2014)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
最近になって、標的遺伝子をノックアウトする技術として、リコンビナーゼ、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９などの酵素を用いたゲノム編集が大きな注目を集めている。ゲノム編集は、上記のような酵素をコードするＤＮＡを細胞に導入し、細胞内で酵素を発現させることにより行うのが一般的である。しかし、細胞に核酸を導入した場合には、導入した核酸が偶発的にゲノムへのインテグレーションを起こすリスクがあり、これにより不必要かつ不本意な遺伝子破壊が起こるという問題がある。その点、タンパク質を直接細胞に導入できれば、上記の問題を回避できる。したがって、固体支持体と細胞との接着面を介して固相から直接タンパク質を細胞に送達できる方法の確立が望まれている。
【０００７】
本発明は、従来技術の諸問題を解消し、固体支持体と細胞との接着面を介して固相から直接タンパク質を細胞に送達する方法を提供することを目的としてなされたものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、鋭意研究の結果、タンパク質とカチオン性高分子とを含む複合体を固体支持体上に固定し、その上に細胞を播種することにより、固相から直接タンパク質を細胞に送達できることを見出した。
【０００９】
すなわち、本発明は、一実施形態によれば、（１）タンパク質とカチオン性高分子とを含む複合体を調製するステップと、（２）前記複合体を固体支持体上に固定するステップと、（３）ステップ（２）で前記複合体を固定した前記固体支持体上に細胞を播種するステップとを含む、固体支持体からタンパク質を細胞に送達する方法を提供するものである。
【００１０】
前記方法において、前記カチオン性高分子はカチオン性脂質であることが好ましい。
【００１１】
前記方法において、前記タンパク質は酵素であることが好ましい。
【００１２】
前記方法において、前記酵素は、ヌクレアーゼまたはリコンビナーゼであることが好ましい。
【００１３】
また、本発明は、一実施形態によれば、タンパク質とカチオン性高分子とを含む複合体が固体支持体上に固定された、タンパク質を細胞に送達するためのアレイを提供するものである。
【００１４】
前記アレイにおいて、前記カチオン性高分子はカチオン性脂質であることが好ましい。
【００１５】
前記アレイにおいて、前記タンパク質は酵素であることが好ましい。
【００１６】
前記アレイにおいて、前記酵素は、ヌクレアーゼまたはリコンビナーゼであることが好ましい。
【００１７】
前記アレイにおいて、前記複合体は二糖をさらに含むことが好ましい。
【００１８】
前記アレイにおいて、前記複合体は細胞外マトリクスタンパク質をさらに含むことが好ましい。
【発明の効果】
【００１９】
本発明に係る方法は、固体支持体と細胞との接着面を介して固相から直接タンパク質を細胞に送達することができる。そのため、タンパク質の発現を待つ必要がなく、高効率での解析が可能となる。また、核酸を導入する際に起こり得る不必要かつ不本意な遺伝子破壊を回避することができる。
【００２０】
また、本発明に係るアレイは、固体支持体と細胞との接着面を介して固相から直接タンパク質を細胞に送達することができる状態での長期保存が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、本発明の方法の一実施の形態を示す概要図である。
【図２】図２は、タンパク質の細胞内への送達機構を示す模式図である。
【図３】図３は、ＣｒｅリコンビナーゼおよびｌｏｘＰレポーター遺伝子の構成を示す図である。
【図４】図４は、Ｃｒｅ−ＬＰＥＩ複合体、Ｃｒｅ−ＭｕｌｔｉＦｅｃｔａｍ複合体およびＣｒｅ−ＬＦ２０００複合体の遺伝子組換え効率を示す図である。
【図５】図５は、Ｃｒｅ−ＬＰＥＩ複合体、Ｃｒｅ−ＭｕｌｔｉＦｅｃｔａｍ複合体およびＣｒｅ−ＬＦ２０００複合体を導入したｌｏｘＰレポーター細胞の顕微鏡観察像（明視野像およびｍＥｍｅｒａｌｄの蛍光像）である。
【図６】図６は、Ｃｒｅ−ＬＦ２０００複合体のスポット上および周辺の細胞の顕微鏡観察像（明視野像および蛍光像の合成画像）である。
【図７】図７は、Ｃｒｅ−ＬＦ２０００複合体アレイ上に播種されたｌｏｘＰレポーター細胞の顕微鏡観察像（位相差（ＰＨ）およびｍＥｍｅｒａｌｄの蛍光（ＦＬ））である。
【図８】図８は、Ｃｒｅ−ＭｕｌｔｉＦｅｃｔａｍ複合体アレイ上に播種されたｌｏｘＰレポーター細胞の顕微鏡観察像（位相差（ＰＨ）およびｍＥｍｅｒａｌｄの蛍光（ＦＬ））である。
【図９】図９は、室温保存されたＣｒｅ−ＬＦ２０００複合体アレイ上に播種されたｌｏｘＰレポーター細胞の顕微鏡観察像（Ｅ２−ＣｒｉｍｓｏｎおよびｍＥｍｅｒａｌｄの蛍光像）である。
【図１０】図１０は、室温保存されたＣｒｅ−ＬＦ２０００複合体アレイ上に播種されたｌｏｘＰレポーター細胞における遺伝子組換え効率を示すグラフである。
【図１１】図１１は、−２０℃保存されたＣｒｅ−ＬＦ２０００複合体アレイ上に播種されたｌｏｘＰレポーター細胞の顕微鏡観察像（Ｅ２−ＣｒｉｍｓｏｎおよびｍＥｍｅｒａｌｄの蛍光像）である。
【図１２】図１２は、−２０℃保存されたＣｒｅ−ＬＦ２０００複合体アレイ上に播種されたｌｏｘＰレポーター細胞における遺伝子組換え効率を示すグラフである。
【図１３】図１３は、β−ｇａｌ−ＬＦ２０００複合体の細胞内活性（倍率）を示す図である。
【図１４】図１４は、β−ｇａｌ−ＬＦ２０００複合体を導入したＨｅＬａ細胞の顕微鏡観察像（Ｘ−ｇａｌ染色像）である。
【図１５】図１５は、β−ｇａｌ−ＬＦ２０００複合体の（ａ）粒径および（ｂ）ゼータ電位の測定結果を示すグラフである。
【図１６】図１６は、β−ｇａｌ−ＬＦ２０００複合体アレイ上に播種されたＨｅＬａ細胞の顕微鏡観察像（Ｘ−ｇａｌ染色像）である。
【図１７】図１７は、β−ｇａｌ−ＬＦ２０００複合体アレイ上に播種されたＨｅＬａ細胞の顕微鏡観察像（Ｘ−ｇａｌ染色像）の拡大画像である。
【図１８】図１８は、ＺＦＮ−ＬＦ２０００複合体を導入したレポーター細胞の顕微鏡観察像（明視野像およびｍＥｍｅｒａｌｄの蛍光像）である。
【図１９】図１９は、ＺＦＮ−ＬＦ２０００複合体アレイ上に播種されたレポーター細胞の顕微鏡観察像（ｍＥｍｅｒａｌｄの蛍光像）である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明を詳細に説明するが、本発明は本明細書中に説明した実施形態に限定されるものではない。
【００２３】
本発明は、第一の実施形態によれば、（１）タンパク質とカチオン性高分子とを含む複合体を調製するステップと、（２）前記複合体を固体支持体上に固定するステップと、（３）ステップ（２）で前記複合体を固定した前記固体支持体上に細胞を播種するステップとを含む、固体支持体からタンパク質を細胞に送達する方法である。
【００２４】
本実施形態の方法では、細胞に導入しようとするタンパク質と、カチオン性高分子とを含む複合体を調製して使用する。
【００２５】
本実施形態における「タンパク質」は、任意のものであってよく、例えば、動物由来、植物由来、微生物由来、ウイルス由来などのタンパク質であってよい。本実施形態において用いることができるタンパク質は、細胞への送達効率の観点から、アニオン性またはカチオン性であることが好ましく、また、分子量が３００ｋＤａ以下であることが好ましい。本実施形態におけるタンパク質は、以下に限定されないが、例えば、ヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、インテグラーゼ、デアミナーゼ、メチルトランスフェラーゼ、メチルシトシンヒドロゲナーゼ、リガーゼ、グリコシラーゼなどの酵素や、抗体、転写因子などのタンパク質であってよい。また、本実施形態におけるタンパク質は、糖やＲＮＡなどと複合体化されたものであってもよい。本実施形態において用いることができるタンパク質は、好ましくはヌクレアーゼまたはリコンビナーゼである。本実施形態における好ましいヌクレアーゼは、例えば、Ｃａｓ９、ｃｐｆ１、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮである。また、本実施形態における好ましいリコンビナーゼは、例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼ、ＦＬＰリコンビナーゼ、セリンリコンビナーゼ、チロシンリコンビナーゼである。
【００２６】
本実施形態におけるタンパク質は、遺伝子工学的手法による生合成により調製することができる。具体的には、目的のタンパク質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、目的のタンパク質を発現させ、精製すればよい。本実施形態におけるタンパク質を発現させる宿主細胞としては、例えば、菌、酵母、哺乳動物細胞などを使用することができる。発現ベクターとしては、大腸菌を宿主細胞とする場合には、例えば、ｐＴ７（シグマアルドリッチ社製）やｐＥＴ（メルクミリポア社製）などの大腸菌発現プラスミドを用いることができ、哺乳動物細胞を宿主細胞とする場合には、例えば、ｐｃＤＮＡ３．１（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）などの動物細胞発現プラスミドや、レトロウイルスやアデノウイルスなどの動物ウイルスベクターなどを用いることができる。形質転換は、リン酸カルシウム共沈殿法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リポフェクション法などの周知の方法により行うことができる。
【００２７】
本実施形態におけるタンパク質は、精製のためのタグがＮ末端および／またはＣ末端に付加されていてもよい。精製のためのタグとしては、例えば、Ｈｉｓタグ、ＧＳＴタグ、ＨＡタグ、ＦＬＡＧタグなどを使用することができる。また、本実施形態におけるタンパク質は、目的に応じて種々の改変がなされていてよいが、例えば多数の正電荷アミノ酸または負電荷アミノ酸を導入するなどの、タンパク質全体に対して過度に正電荷または負電荷を付与するような改変はなされていないことが好ましい。
【００２８】
本実施形態において「カチオン性高分子（ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ）」とは、カチオン性の官能基を有し、生理学的ｐＨにおいて正味の正電荷を有する高分子をいう。本実施形態において用いることができるカチオン性高分子は、カチオン性ポリマー、カチオン性脂質、またはそれらの混合物であってよく、好ましくはカチオン性脂質である。
【００２９】
本実施形態において用いることができる「カチオン性ポリマー」は、核酸のトランスフェクションに用いられる、または用いることができると考えられる任意のものであってよい。ここで、「ポリマー」とは、同一であっても異なってもよい２以上のモノマーが重合された化合物を意味し、したがって、ホモポリマーであってもよいし、コポリマーであってもよい。本実施形態におけるカチオン性ポリマーの重量平均分子量は、好ましくは１，０００〜３００，０００ＭＷである。本実施形態において用いることができるカチオン性ポリマーは、以下に限定されないが、例えば、直鎖状または分岐状のポリアミノ酸、ポリアルキレンイミン、ＰＡＭＡＭデンドリマー、キトサンなどのポリカチオン性多糖類などが挙げられ、これらの１種のみまたは２種以上を混合して用いることができる。本実施形態における好ましいカチオン性ポリマーは、ポリアミノ酸またはポリアルキレンイミンであり、特に好ましくは、直鎖状のポリアミノ酸またはポリアルキレンイミンである。
【００３０】
本実施形態において用いることができるポリアミノ酸は、同種類のアミノ酸残基が重合されたものであってもよいし、異なる種類のアミノ酸残基が重合されたものであってもよい。ポリアミノ酸を構成するアミノ酸残基は、Ｌ体であることが好ましい。ポリアミノ酸の例としては、ポリリジン、ポリオルニチンなどが挙げられる。本実施形態における好ましいポリアミノ酸は、ポリリジンである。
【００３１】
本実施形態において用いることができるポリアルキレンイミンの例としては、ポリエチレンイミン、ポリプロピレンイミン、ポリブチレンイミンなどが挙げられる。本実施形態における好ましいポリアルキレンイミンは、ポリエチレンイミンである。
【００３２】
核酸のトランスフェクションに用いることができるカチオン性ポリマーは市販されており、本実施形態においては、こうした市販品を使用することもできる。市販品としては、例えば、ｊｅｔＰＥＩ（ｐｏｌｙｐｌｕｓ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ社製）などが挙げられる。
【００３３】
本実施形態において用いることができる「カチオン性脂質」は、核酸のトランスフェクションに用いられる、または用いることができると考えられる任意のものであってよい。本実施形態における好ましいカチオン性脂質は、以下に限定されないが、例えば、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム硫酸メチル（ＤＯＴＡＰ）、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２−（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウム（ＤＯＳＰＡ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、５−カルボキシスペルミルグリシンジオクタデシルアミド（ＤＯＧＳ）、３β−［Ν−（Ν’，Ν’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、ジデシルメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）などが挙げられ、これらの１種のみまたは２種以上を混合して用いることができる。
【００３４】
核酸のトランスフェクションに用いることができるカチオン性脂質は市販されており、本実施形態においては、こうした市販品を使用することもできる。市販品としては、例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、ＭｕｌｔｉＦｅｃｔａｍ（プロメガ社製）、ＨｉｌｙＭａｘ（同仁化学研究所社製）、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ（キアゲン社製）などが挙げられる。
【００３５】
本実施形態におけるタンパク質とカチオン性高分子とを含む複合体（以下、「タンパク質−カチオン性高分子複合体」とも表記する）は、タンパク質とカチオン性高分子とを生理的ｐＨ条件下において、例えばＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＢＳ）中で、混合することにより調製することができる。タンパク質とカチオン性高分子との混合比率は、Ｎ／Ｐ比（タンパク質のアニオン電荷に対するカチオン性高分子のカチオン電荷の比）に基づいて決定することができ、例えば、Ｎ／Ｐ比が１〜３、好ましくは１．５〜２．５になるように、タンパク質とカチオン性高分子とを混合することができる。
【００３６】
次いで、タンパク質−カチオン性高分子複合体を、固体支持体上に固定する。本実施形態における固体支持体としては、例えば、シリコンなどの半導体、ガラスなどの無機物、ポリスチレンやポリエチレンテレフタレートなどの高分子物質を主成分とするフィルムなどを使用することができる。固体支持体の形状としては、例えば、スライドガラス、マイクロウェルプレート、細胞培養ディッシュなどが挙げられるが、それらに限定されない。
【００３７】
タンパク質−カチオン性高分子複合体の固体支持体上への固定は、タンパク質−カチオン性高分子複合体溶液を、マイクロスポッティング法、インクジェット法、バブルジェット（登録商標）法などの方法を用いて固体支持体上にスポットし、乾燥させることにより行うことができる。スポットするタンパク質−カチオン性高分子複合体溶液の液量は、好ましくは１〜２，０００ｎＬであり、特に好ましくは５〜３０ｎＬである。スポットされるタンパク質の濃度は、例えば１ｎＭ〜１μＭであり、より好ましくは１００ｎＭ〜１μＭあってよい。固体支持体上に配置されるスポットの数は、特に制限はないが、例えば、１０以上、１００以上、１，０００以上、１０，０００以上などであってよい。スポッターとしては、例えば、インクジェットプリンターやバブルジェット（登録商標）プリンターなどを使用することができる。なお、タンパク質−カチオン性高分子複合体の固体支持体への吸着を改善するために、タンパク質−カチオン性高分子複合体溶液をスポットする前に、固体支持体の表面を酵素プラズマ処理してもよい。
【００３８】
次いで、タンパク質−カチオン性高分子複合体を固定した固体支持体上に、細胞を播種する。本実施形態において使用できる細胞は特に限定されず、目的に応じて任意の細胞を選択することができる。本実施形態において使用できる細胞は、好ましくは動物細胞であり、特に好ましくは、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、非ヒト霊長類、ヒトなどの哺乳動物細胞であり、最も好ましくはヒト細胞である。細胞の種類も特に限定されないが、接着細胞を用いることが好ましい。接着細胞としては、例えば、神経細胞、上皮細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、結合組織細胞、幹細胞、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、腫瘍細胞などが挙げられる。また、本実施形態において使用する細胞は、生体組織から分離した細胞の初代培養細胞または継代培養細胞であってもよいし、株化された培養細胞であってもよい。
【００３９】
本実施形態において、播種される細胞濃度は、細胞の種類に応じて適宜決定することができ、例えば４０，０００個/ｃｍ２の濃度で播種することができる。細胞は、公知の培養方法にしたがって固体支持体上の全体に播種されてもよいし、インクジェットプリンターなどを用いてタンパク質−カチオン性高分子複合体のスポット上にのみ播種されてもよい。細胞を播種した後、好ましくは１２時間以上、特に好ましくは２４時間以上培養することにより、タンパク質−カチオン性高分子複合体が細胞内に送達される。
【００４０】
本実施形態の方法の概略を図１に示す。細胞培養ディッシュなどの固体支持体を用意し（図１Ａ）、その上にタンパク質−カチオン性高分子複合体を固定する（図１Ｂ）。これにより、タンパク質−カチオン性高分子複合体のアレイが調製される（図１Ｃ）。このアレイ上に細胞を播種すると、アレイと細胞との接触界面からタンパク質−カチオン性高分子複合体が細胞に導入される（図１Ｄ）。細胞を培養後、タンパク質の導入による細胞の表現型の変化（例えば生死や分化など）を解析する（図１Ｅ）。
【００４１】
また、本実施形態の方法におけるタンパク質の細胞内への送達機構を図２に示す。タンパク質−カチオン性ポリマー複合体は、エンドサイトーシスにより細胞内のエンドソームに取り込まれ、その後、プロトンスポンジ効果によってエンドソームが破裂することにより、エンドソームから脱出する（図２Ａ）。タンパク質−カチオン性脂質複合体は、エンドサイトーシスにより細胞内のエンドソームに取り込まれ、その後、プロトンスポンジ効果によるエンドソームの破裂および／またはエンドソーム膜との融合により、エンドソームから脱出する（図２Ｂ、Ｃ）。
【００４２】
本発明は、第二の実施形態によれば、タンパク質とカチオン性高分子とを含む複合体が固体支持体上に固定された、タンパク質を細胞に送達するためのアレイである。
【００４３】
本実施形態における「タンパク質」、「カチオン性高分子」、「タンパク質とカチオン性高分子とを含む複合体」および「固体支持体」は、第一の実施形態において定義したものと同様である。本実施形態のアレイは、第一の実施形態と同様の手順により調製することができる。
【００４４】
本実施形態において、タンパク質−カチオン性高分子複合体は、二糖をさらに含むことが好ましい。これにより、タンパク質の活性を維持したまま、アレイを長期間、例えば３０日以上安定的に保存することができる。本実施形態における二糖は、以下に限定されないが、例えば、トレハロース、ショ糖、麦芽糖、乳糖などが挙げられる。好ましくは、本実施形態における二糖は、トレハロースである。また、本実施形態におけるタンパク質−カチオン性高分子複合体は、１種類の二糖を含んでもよいし、２種類以上の二糖を含んでもよい。タンパク質−カチオン性高分子複合体に添加される二糖の濃度は、例えば５〜２０％（ｗ／ｖ）の範囲で適宜選択することができる。
【００４５】
本実施形態において、タンパク質−カチオン性高分子複合体は、細胞外マトリクスタンパク質をさらに含むことが好ましい。細胞外マトリクスタンパク質は、固体支持体への細胞の付着を促進することができるため、固体支持体上に固定された複合体が培地中に拡散するよりも前に、細胞が固体支持体に接着する効率を高めることができる。その結果、タンパク質−カチオン性高分子複合体が細胞に導入される効率を改善することができる。本実施形態における細胞外マトリクスタンパク質は、以下に限定されないが、例えば、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、コラーゲン、ヒアルロン酸、プロテオグリカンなどが挙げられる。また、本実施形態における細胞外マトリクスタンパク質として、公知の細胞接着性モチーフ配列（例えば、ＲＧＤモチーフなど）を含む人工ペプチドを作製して用いてもよい。本実施形態において、これらの細胞外マトリクスタンパク質の１種のみまたは２種以上を混合して用いることができる。本実施形態における細胞外マトリクスタンパク質は、好ましくはフィブロネクチンである。タンパク質−カチオン性高分子複合体に添加される細胞外マトリクスタンパク質の濃度は、例えば０．０１〜０．４％（ｗ／ｖ）の範囲で適宜選択することができる。
【００４６】
第一の実施形態における方法および第二の実施形態におけるアレイは、細胞内にタンパク質を直接導入するため、タンパク質をコードする核酸を細胞に導入した場合のようにタンパク質の発現を待つ必要がなく、高効率での解析が可能となる。同時に、タンパク質をコードする核酸を細胞に導入した場合に起こりうる不必要かつ不本意な遺伝子破壊を避けることができ、有用である。
【実施例】
【００４７】
以下に実施例を挙げ、本発明についてさらに説明する。なお、これらは本発明を何ら限定するものではない。
【００４８】
＜１．ＣｒｅリコンビナーゼおよびｌｏｘＰレポーター細胞の調製＞
（１−１）Ｃｒｅリコンビナーゼ（以下、単に「Ｃｒｅ」とも表記する）の調製
Ｎ末端に精製用のＨｉｓタグ（Ｈｉｓ）および核移行シグナル（ＮＬＳ）を付加したＣｒｅリコンビナーゼ（Ｃｒｅ）（図３（ａ））を、以下の手順により調製した。Ｈｉｓ−ＮＬＳ−Ｃｒｅをコードする遺伝子配列をＴ７プロモーターの下流に組み込んだｐＥＴベクターにより、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換した。カナマイシン含有ＬＢ培地中で前培養した後、０．１ｍＭのＩＰＴＧを添加し、さらに２５℃において６時間の培養を行った。菌体を回収し、ＴＮＧ緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ、５００ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、ｐＨ８．０）に懸濁し、超音波処理により破砕後、Ｎｉ−ＮＴＡ担体（キアゲン社製）に供した。Ｎｉ−ＮＴＡ担体に吸着したＨｉｓ−ＮＬＳ−Ｃｒｅを５００ｍＭイミダゾール／ＴＮＧ緩衝液により溶出した。得られた溶出液をＨＢＳＧ緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、ｐＨ７．４）に対して透析した。その後、既知濃度のＢＳＡとともにＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢ染色することにより、Ｈｉｓ−ＮＬＳ−Ｃｒｅの濃度を決定した。
【００４９】
（１−２）ｌｏｘＰレポーター細胞の調製
Ｃｒｅリコンビナーゼの活性評価のためのｌｏｘＰレポーター細胞（２９３．Ｒ×Ｇ細胞）を、以下の手順により調製した。５’→３’方向に順に、ｌｏｘＰ配列、Ｅ２−Ｃｒｉｍｓｏｎタンパク質コード配列（タカラバイオ社より入手）、ポリＡ配列、ｌｏｘＰ配列、ｍＥｍｅｒａｌｄタンパク質コード配列（Ｖｅｒｋｈｕｓｈａ教授より入手）およびポリＡ配列を配置したレポーター遺伝子を、ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴベクター（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）のＣＭＶプロモーター配列の下流に挿入した。得られたベクターを、ｐＯＧ４４ベクター（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）とともにＦｌｐ−Ｉｎ−２９３細胞（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）にトランスフェクションした。その後、細胞をハイグロマイシン存在下で選択培養することにより、２９３．Ｒ×Ｇ細胞を得た。
【００５０】
２９３．Ｒ×Ｇ細胞は、Ｅ２−Ｃｒｉｍｓｏｎタンパク質を発現するため、赤色蛍光を発する。２９３．Ｒ×Ｇ細胞では、Ｅ２−Ｃｒｉｍｓｏｎ配列の終止コドンよりも下流に位置するｍＥｍｅｒａｌｄタンパク質は発現しない（図３（ｂ）上段）。一方、２９３．Ｒ×Ｇ細胞にＣｒｅリコンビナーゼが導入されると、Ｃｒｅリコンビナーゼが核内に移行し、Ｃｒｅリコンビナーゼによる組換え反応により、２つのｌｏｘＰ配列に挟まれたＥ２−Ｃｒｉｍｓｏｎ−ポリＡがレポーター遺伝子から除去される。その結果、２９３．Ｒ×Ｇ細胞はＥ２−Ｃｒｉｍｓｏｎに代わってｍＥｍｅｒａｌｄを発現するようになり、緑色蛍光を発する２９３．Ｇ細胞へと形質転換する（図３（ｂ）下段）。
【００５１】
＜２．Ｃｒｅ−カチオン性高分子複合体の調製＞
上記（１−１）で調製したＣｒｅリコンビナーゼを用いて、以下の手順によりＣｒｅ−カチオン性高分子複合体を調製した。カチオン性高分子には、カチオン性ポリマーである直鎖ポリエチレンイミン（以下、「ＬＰＥＩ」と記載する）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  社製、分子量：４０，０００）、カチオン性デンドロン脂質であるＭｕｌｔｉＦｅｃｔａｍ（プロメガ社製、分子量：２，０５５）、およびカチオン性脂質であるＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００（以下、「ＬＦ２０００」と記載する）（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いた。
【００５２】
（２−１）Ｃｒｅ−ＬＰＥＩ複合体の調製
２．３μｇのＣｒｅリコンビナーゼと、０．２９μｇ、０．５８μｇ、１．１５μｇ、１．７３μｇ、２．３μｇ、３．４５μｇ、４．６μｇ、５．７５μｇ、６．９μｇ、または１１．５μｇのＬＰＥＩとを、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＢＳ）（５ｍＭのＤ−グルコース、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５ｍＭのＫＣｌ、１３５ｍＭのＮａＣｌ、０．７５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ）に添加し、全液量が２４．５μｌになるようにＨＢＳにより調製し、よく混合した。混合液を室温にて１５分間インキュベートした。これにより、ＬＰＥＩ／Ｃｒｅ混合比（ｗ／ｗ）が０．１２５、０．２５、０．５、０．７５、１、１．５、２、２．５、３、または５のＣｒｅ−ＬＰＥＩ複合体を得た。
【００５３】
（２−２）Ｃｒｅ−ＭｕｌｔｉＦｅｃｔａｍ複合体の調製
ＬＰＥＩに代えてＭｕｌｔｉＦｅｃｔａｍを用いた以外は、上記（２−１）と同様の手順により、ＭｕｌｔｉＦｅｃｔａｍ／Ｃｒｅ混合比（ｗ／ｗ）が０．１２５、０．２５、０．５、０．７５、１、１．５、２、または２．５のＣｒｅ−ＭｕｌｔｉＦｅｃｔａｍ複合体を得た。
【００５４】
（２−３）Ｃｒｅ−ＬＦ２０００複合体の調製
ＬＰＥＩに代えて、０．２６μｌ、０．５３μｌ、１．０５μｌ、１．５８μｌ、２．１μｌ、３．１５μｌ、４．２μｌ、５．２５μｌ、６．３μｌ、または１０．５μｌのＬＦ２０００を用いた以外は、上記（２−１）と同様の手順により、ＬＦ２０００／Ｃｒｅ混合比（μｌ／μｇ）が０．１２５、０．２５、０．５、０．７５、１、１．５、２、２．５、３、または５のＣｒｅ−ＬＦ２０００複合体を得た。
【００５５】
＜３．Ｃｒｅ−カチオン性高分子複合体を用いたＣｒｅの細胞への導入＞
上記２で調製した各Ｃｒｅ−カチオン性高分子複合体に、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を３．５μｌ添加し、混合後、５分間インキュベートした。その後、フィブロネクチン溶液（４ｍｇ／ｍｌ、有限会社ライフ研究所）を７μｌ添加し、混合した。得られた各溶液を、１０μｌ／ウェルずつ９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）の３ウェルに分注した。各ウェルに、２×１０４個の２９３．Ｒ×Ｇ細胞／１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを添加し、よく混合した後、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で２４時間培養した。なお、Ｃｒｅ−カチオン性高分子複合体に代えてＣｒｅを用いた以外は同様の操作を行ったものを陰性対照とした。遺伝子組換え効率は、ｍＥｍｅｒａｌｄの蛍光強度に基づいて評価し、上記陰性対照における遺伝子組換え効率を１として、各複合体による遺伝子組換え効率（倍率）を算出した。
【００５６】
結果を図４および図５に示す。図４は、陰性対照を基準とした各複合体による遺伝子組換え効率（倍率）を示す。Ｃｒｅ−ＬＰＥＩ複合体では、混合比（ｗ／ｗ）＝１〜１．５において高い遺伝子組換え効率が示された（約５倍）。Ｃｒｅ−ＭｕｌｔｉＦｅｃｔａｍ複合体では、混合比（ｗ／ｗ）＝１．５以上において高い遺伝子組換え効率が示された（約９０倍）。Ｃｒｅ−ＬＦ２０００複合体では、混合比（μｌ／μｇ）＝０．５において高い遺伝子組換え効率が示された（約５４０倍）。図５は、細胞の顕微鏡観察像（明視野および蛍光）を示す。ｍＥｍｅｒａｌｄの蛍光は、Ｃｒｅを添加していない２９３．Ｒ×Ｇ細胞においては観察されず（図５（ａ））、Ｃｒｅのみを添加した陰性対照においてもほとんど観察されない（図５（ｂ））。これに対し、Ｃｒｅ−ＬＰＥＩ複合体（混合比（ｗ／ｗ）＝１．５）、Ｃｒｅ−ＭｕｌｔｉＦｅｃｔａｍ複合体（混合比（ｗ／ｗ）＝１．５）、またはＣｒｅ−ＬＦ２０００複合体（混合比（μｌ／μｇ）＝０．５）を添加した場合には、ｍＥｍｅｒａｌｄの蛍光が観察され、また、細胞毒性も低いことが確認された（図５（ｃ）〜（ｅ））。これらの結果から、Ｃｒｅ−カチオン性高分子複合体を用いることにより、活性を維持したＣｒｅリコンビナーゼを細胞に送達できることが示された。また、カチオン性高分子としてカチオン性脂質を用いることにより、より高い効率でＣｒｅリコンビナーゼを細胞に送達できることが示された。
【００５７】
＜４．Ｃｒｅ−ＬＦ２０００複合体アレイからのＣｒｅの細胞への導入＞
上記（２−３）で調製したＣｒｅ−ＬＦ２０００複合体（混合比（μｌ／μｇ）＝０．５）に、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を３．５μｌ添加し、混合後、５分間インキュベートした。その後、フィブロネクチン溶液（４ｍｇ／ｍｌ、有限会社ライフ研究所）を７μｌ添加、混合した。得られた溶液をインクジェットプリンター（ＫＣＳ−ｍｉｎｉ、クボタコンプス社製）を用いて、３５ｍｍ細胞培養ディッシュの中央に５×５のスポットをアレイ状に配置した（１５ｎｌ／スポット）。その後、デシケーター内で３０分間、ディッシュを真空乾燥させた。このディッシュに、８×１０５個の２９３．Ｒ×Ｇ細胞／１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを添加し（２ｍｌ）、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で２４時間培養した。その後、ｍＥｍｅｒａｌｄの蛍光を検出することにより、Ｃｒｅによる遺伝子組換え効率を評価した。
【００５８】
結果を図６に示す。図６（ａ）は、Ｃｒｅ−ＬＦ２０００複合体のスポット上および周辺の細胞の顕微鏡観察像（明視野像および蛍光像の合成画像）を示し、図６（ｂ）は、Ｃｒｅ−ＬＦ２０００複合体のスポット（５×５）上の細胞の顕微鏡観察像（Ｅ２−ＣｒｉｍｓｏｎおよびｍＥｍｅｒａｌｄの蛍光像）を示す。ディッシュに播種された２９３．Ｒ×Ｇ細胞のうち、Ｃｒｅ−ＬＦ２０００複合体のスポット上に播種された細胞からのみｍＥｍｅｒａｌｄの蛍光が観察された。この結果から、Ｃｒｅ−ＬＦ２０００複合体は培地中に拡散せず、固相から直接細胞に送達されていることが示された。
【００５９】
さらに、細胞播種後０〜２４時間の顕微鏡観察像（ｍＥｍｅｒａｌｄの蛍光像）をタイムラプス撮影した結果を図７に示す。この結果から、細胞播種後６時間あたりからＣｒｅによる遺伝子組換えが確認され、１８時間の時点でアレイのドットパターンが認識できる程度の十分な遺伝子組換えが起きていることが確認された。
【００６０】
＜５．Ｃｒｅ−ＭｕｌｔｉＦｅｃｔａｍ複合体アレイからのＣｒｅの細胞への導入＞
Ｃｒｅ−ＬＦ２０００複合体（混合比（μｌ／μｇ）＝０．５）に代えて、Ｃｒｅ−ＭｕｌｔｉＦｅｃｔａｍ複合体（混合比（ｗ／ｗ）＝２）を用いた以外は、上記４と同様の手順によりディッシュの調製および細胞の培養を行い、細胞播種後０〜２４時間の顕微鏡観察像（ｍＥｍｅｒａｌｄの蛍光像）をタイムラプス撮影した。
【００６１】
結果を図８に示す。この結果から、Ｃｒｅ−ＭｕｌｔｉＦｅｃｔａｍ複合体を用いた場合にも、Ｃｒｅ−ＬＦ２０００複合体と同様の時間経過で、Ｃｒｅ−ＬＦ２０００複合体と比較しても遜色ない効率で遺伝子組換えが起きていることが確認された。
【００６２】
＜６．Ｃｒｅ−カチオン性高分子複合体アレイの長期保存性＞
Ｃｒｅ−ＬＦ２０００複合体（混合比（μｌ／μｇ）＝０．５）に、０％、１０％、１５％または２０％トレハロース（ｗ／ｖ）を添加し、トレハロース含有Ｃｒｅ−ＬＦ２０００複合体を調製した。各トレハロース含有Ｃｒｅ−ＬＦ２０００複合体を、上記４と同様の手順によりディッシュにスポットし、アレイを調製した。得られたアレイを真空・遮光した状態で、室温または−２０℃において長期保存した。保存後のアレイに、上記４と同様の手順により細胞を播種し、培養を行い、遺伝子組換え効率を評価した。遺伝子組換え効率の評価は、トレハロースを添加していないＣｒｅ−ＬＦ２０００複合体の０日保存時の遺伝子組換え効率を１００％として行った。
【００６３】
結果を図９〜１２に示す。室温保存の場合、トレハロースを添加していないＣｒｅ−ＬＦ２０００複合体では、１日の保存によって活性が大幅に低下したのに対し、１５％以上のトレハロースを添加したＣｒｅ−ＬＦ２０００複合体では５０％程度の活性が維持された（図９および１０）。また、−２０℃保存の場合には、１５％のトレハロースを添加したＣｒｅ−ＬＦ２０００複合体においては、３０日の保存後でもほとんど活性が低下しないことが確認された（図１１および１２）。これらの結果から、トレハロースの添加がＣｒｅ−カチオン性高分子複合体アレイの保存性を改善できることが示された。
【００６４】
＜７．β−ガラクトシダーゼの細胞への導入＞
（７−１）β−ガラクトシダーゼ−ＬＦ２０００複合体を用いたβ−ガラクトシダーゼの細胞への導入条件の検討
β−ガラクトシダーゼ（以下、単に「β−ｇａｌ」とも表記する）を用いて、カチオン性高分子複合体を調製した。カチオン性高分子には、Ｃｒｅを用いた上記実施例において良好な結果を示したＬＦ２０００を用いた。３．５μｌのＨＢＳに溶解した１８．６μｇのβ−ｇａｌ（β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ、６２０ｕｎｉｔｓ／ｍｇ、和光純薬）と、ＬＦ２０００とを、１１種類の混合比（ＬＦ２０００／β−ｇａｌ（μｌ／μｇ）＝０、０．０１５、０．０２８、０．０５７、０．０９、０．１１３、０．１７、０．２２６、０．２８３、０．３３９および０．５６５）で混合し、全液量が２４．５μｌ（続くステップでフィブロネクチンを添加しない場合には３１．５μｌ）になるようにＨＢＳにより調製し、よく混合した。混合液を室温にて１５分間インキュベートした。その後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭを３．５μｌ添加し、混合後、５分間インキュベートした。その後、フィブロネクチン溶液（４ｍｇ／ｍｌ）を７μｌ添加し、混合した。得られた溶液を１０μｌ／ウェルで、２×１０４個のＨｅＬａ細胞（理研セルバンク）／１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ（１００μｌ／ウェル）が播種された９６ウェルプレートに添加した。３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で２４時間培養した後、β−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いてＸ−ｇａｌ染色を行った。マイクロプレートリーダー（Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴ、ＢｉｏＴｅｋ）を用いた吸収スペクトル測定によりβ−ｇａｌの細胞内活性を評価し、β−ｇａｌのみを添加した場合の活性を１として、各複合体を添加した場合の活性（倍率）を算出した。また、染色された細胞を位相差顕微鏡（ＩＸ８１、オリンパス）により観察した。
【００６５】
結果を図１３および１４に示す。β−ｇａｌのみを添加した場合には、β−ｇａｌ活性を示す細胞がほとんど見られなかったのに対し、β−ｇａｌ−ＬＦ２０００複合体を添加した場合には、フィブロネクチンの有無によらず、β−ｇａｌ活性を示す細胞が有意に増加した。ＬＦ２０００／β−ｇａｌ（μｌ／μｇ）＝０．２８３においてβ−ｇａｌの細胞内活性は最大となった（フィブロネクチン（＋）：約７０倍、フィブロネクチン（−）：約８０倍）。なお、ＬＦ２０００／β−ｇａｌ（μｌ／μｇ）＝０．５６５では細胞毒性が見られたことにより、相対的にβ−ｇａｌの細胞内活性が低下した。
【００６６】
また、フィブロネクチンの添加は、β−ｇａｌの細胞内活性をほとんど低下させない一方で、細胞の接着性を改善した（データは省略）。この結果から、フィブロネクチンの添加は、固体支持体上に固定された複合体を細胞へと直接導入するために極めて有効であることが示唆された。
【００６７】
（７−２）β−ｇａｌ−ＬＦ２０００複合体のサイズおよびゼータ電位の測定
一般的に、細胞膜表面は負電荷を有していることから、正電荷を表面に有する粒子が膜表面に結合しやすい。また、フィブロネクチンなどの細胞外マトリクスタンパク質が粒子のエンドサイトーシスを促進することが知られている。さらに、エンドサイトーシスの効率には粒子のサイズが関連することも知られている。そこで、β−ｇａｌ−ＬＦ２０００複合体の粒径およびゼータ電位に対するＬＦ２０００／β−ｇａｌの混合比の影響について解析した。上記（７−１）と同様の手順により、混合比の異なる４種類のβ−ｇａｌ−ＬＦ２０００複合体（ＬＦ２０００／β−ｇａｌ（μｌ／μｇ）＝０．０５７、０．１１３、０．１７および０．３３９）を調製した。得られた各β−ｇａｌ−ＬＦ２０００複合体混合液（３５μｌ）に蒸留水を９６５μｌ加えて１ｍｌとし、全量を測定用キュベットにロードし、粒径およびゼータ電位を動的光散乱法および電気泳動光散乱法により測定した（ゼータサイザーナノＺＳ、マルバーン）。
【００６８】
結果を図１５に示す。左のバー（白）はフィブロネクチン（−）、右のバー（網掛け）はフィブロネクチン（＋）のβ−ｇａｌ−ＬＦ２０００複合体を示す。フィブロネクチンの添加の有無によらず、ＬＦ２０００／β−ｇａｌ混合比が大きくなるにしたがって、粒径が増大した（図１５（ａ））。また、フィブロネクチンの添加の有無によらず、ＬＦ２０００／β−ｇａｌ混合比が大きくなるにしたがって、ゼータ電位も増大する傾向が見られたが、いずれも負の値を示した。なお、図１３において細胞毒性が見られたＬＦ２０００／β−ｇａｌ（μｌ／μｇ）＝０．５６は、信頼性の高い測定は不可能だったが、測定限界を超えた大きな粒径（１μｍ以上）を有していることが示された（データは省略）。
【００６９】
（７−３）β−ｇａｌ−ＬＦ２０００複合体アレイからのβ−ｇａｌの細胞への導入
次いで、β−ｇａｌ−ＬＦ２０００複合体アレイを作製し、固相から細胞へのβ−ｇａｌ−ＬＦ２０００複合体の導入について試験した。上記（７−１）と同様の手順により調製したβ−ｇａｌ−ＬＦ２０００複合体（ＬＦ２０００／β−ｇａｌ（μｌ／μｇ）＝０．２８）を、上記４と同様の手順により３５ｍｍディッシュにスポットした。このディッシュに、２×１０５個のＨｅＬａ細胞／１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ（２ｍｌ）を添加し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で２４時間培養した。その後、上記（７−１）と同様の手順により、β−ｇａｌの細胞内活性を評価した。
【００７０】
結果を図１６（ａ）に示す。フィブロネクチンの添加の有無によらず、β−ｇａｌ−ＬＦ２０００複合体のスポット上に播種された細胞のみにβ−ｇａｌが導入され、Ｘ−ｇａｌ染色像はアレイのドットパターンを示した。この結果から、β−ｇａｌ−ＬＦ２０００複合体は培地中に拡散せず、固相から直接細胞に送達されていることが示された。また、上記と同様に調製したアレイを真空条件下で１日保存した場合も、細胞にβ−ｇａｌが導入され、活性を示すことが確認された（データは省略）。
【００７１】
次いで、アレイの作製に最適なＬＦ２０００／β−ｇａｌの混合比を検討した。上記（７−１）と同様の手順により、混合比の異なる３種類のβ−ｇａｌ−ＬＦ２０００複合体（ＬＦ２０００／β−ｇａｌ（μｌ／μｇ）＝０．１７、０．２８、および０．５６；いずれもフィブロネクチン（＋））を調製し、上記と同様の手順によりアレイを作製し、β−ｇａｌの細胞への導入および細胞内活性を評価した。
【００７２】
結果を図１６（ｂ）に示す。３種類のβ−ｇａｌ−ＬＦ２０００複合体のいずれを用いたアレイも、ドットパターンが認識できる程度の十分なβ−ｇａｌの細胞への導入が可能であることが確認された。また、驚くべきことに、上記（７−１）では細胞毒性が見られたＬＦ２０００／β−ｇａｌ（μｌ／μｇ）＝０．５６の複合体を用いたアレイも、ほとんど細胞毒性を示さず、良好な結果が得られた。この結果から、固相から直接細胞に複合体を導入することにより、細胞毒性を抑えることができることが示された。
【００７３】
また、ＬＦ２０００／β−ｇａｌ（μｌ／μｇ）＝０．５６の複合体のアレイのスポットの拡大画像を図１７に示す。スポット上の細胞が染色されている一方（図１７（ｂ）、（ｄ））、スポット外の細胞は染色されていないことが確認された（図１７（ｂ）、（ｃ））。また、染色された細胞では、厚みがある中心部が強く染色されており（図１７（ｄ））、このことから、β−ｇａｌは細胞膜表面に存在するのではなく、細胞内に送達されており、かつ、細胞内で機能していることが強く示唆された。
【００７４】
＜８．ジンクフィンガーヌクレアーゼの細胞への導入＞
（８−１）ジンクフィンガーヌクレアーゼの調製
ジンクフィンガーヌクレアーゼ（以下、単に「ＺＦＮ」とも表記する）を、以下の手順により調製した（詳細は、非特許文献６を参照）。Ｎ末端側から順に、Ｈｉｓタグ、核移行シグナル、ヒトＣ−Ｃケモカイン受容体５（ＣＣＲ５）を認識するジンクフィンガードメイン、およびＦｏｋＩ制限酵素を含むＺＦＮをコードする遺伝子配列をＴ７プロモーターの下流に組み込んだｐＥＴベクターにより、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換した。カナマイシン含有ＬＢ培地中で前培養した後、０．１ｍＭのＩＰＴＧを添加し、さらに２５℃において６時間の培養を行った。菌体を回収し、ＴＮＧ緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ、５００ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、ｐＨ８．０）に懸濁し、超音波処理により破砕後、Ｎｉ−ＮＴＡ担体（キアゲン社製）に供した。Ｎｉ−ＮＴＡ担体に吸着したＺＦＮを５００ｍＭイミダゾール／ＴＮＧ緩衝液により溶出した。得られた溶出液をＨＢＳＧ緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、ｐＨ７．４）に対して透析した。その後、既知濃度のＢＳＡとともにＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢ染色することにより、ＺＦＮの濃度を決定した。
【００７５】
（８−２）レポーター細胞の調製
ＺＦＮの活性評価のためのレポーター細胞として、２９３．Ｅ２ｍＥｍｅ（ＺＦＲＲ）ｒａｌｄ細胞を調製した。２９３．Ｅ２ｍＥｍｅ（ＺＦＲＲ）ｒａｌｄ細胞は、Ｆｌｐ−Ｉｎ−２９３細胞（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）のゲノムに、ＺＦＮの標的となるＣＣＲ５をコードする配列と、ｍＥｍｅｒａｌｄ緑色蛍光タンパク質をコードする配列とを挿入することにより作製した。具体的には、ｍＥｍｅｒａｌｄタンパク質コード配列中にＺＦＮ標的配列（５’−ＡＡＧＴＣＣＴＴＴＴＧＣＡＧＴＴＴＡＴＣＡＴＡＡＡＣＴＧＣＡＡＡＡＧＡＡＣＧＧＣ−３’、下線部はＺＦＮ結合配列を示す）を導入した配列と、その上流にＥ２−Ｃｒｉｍｓｏｎタンパク質コード配列を配置したレポーター遺伝子を用いた以外は、上記（１−２）と同様の手順により、２９３．Ｅ２ｍＥｍｅ（ＺＦＲＲ）ｒａｌｄ細胞を得た。
【００７６】
ＺＦＮ標的配列の導入によるｍＥｍｅｒａｌｄタンパク質コード配列のフレームシフト変異のために、２９３．Ｅ２ｍＥｍｅ（ＺＦＲＲ）ｒａｌｄ細胞ではｍＥｍｅｒａｌｄタンパク質は発現せず、緑色蛍光を発しない。しかし、ＺＦＮが細胞内に導入されてゲノム編集が起こると、フレームシフトが解消され、ｍＥｍｅｒａｌｄタンパク質が発現されるようになり、緑色蛍光が観察されるようになる。
【００７７】
（８−３）ＺＦＮ−ＬＦ２０００複合体を用いたＺＦＮの細胞への導入条件の検討
１．３μｌのＨＢＳに溶解した１０．８μｇのＺＦＮと、ＬＦ２０００とを、５種類の混合比（ＬＦ２０００／ＺＦＮ（μｌ／μｇ）＝０、０．０５６、０．１１１、０．２２２および０．３３３）で混合し、全液量が１４μｌになるようにＨＢＳにより調製し、よく混合した。混合液を室温にて１５分間インキュベートした。その後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭを２μｌ添加し、混合後、５分間インキュベートした。その後、フィブロネクチン溶液（４ｍｇ／ｍｌ）を４μｌ添加し、混合した。得られた溶液を１０μｌ／ウェルで、３×１０４個の２９３．Ｅ２ｍＥｍｅ（ＺＦＲＲ）ｒａｌｄ細胞／１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ（１００μｌ／ウェル）が播種された９６ウェルプレートに添加した。３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で２４時間培養した後、ｍＥｍｅｒａｌｄの蛍光に基づき、ＺＦＮによるゲノム編集を検出した。
【００７８】
結果を図１８に示す。ＺＦＮのみを添加した場合には、ｍＥｍｅｒａｌｄの蛍光は検出されなかったのに対し、ＺＦＮ−ＬＦ２０００複合体を添加した場合には、ｍＥｍｅｒａｌｄの蛍光が観察された。また、ＬＦ２０００の比率が高い複合体（ＬＦ２０００／ＺＦＮ（μｌ／μｇ）＝０．２２２および０．３３３）を添加した場合には、細胞毒性が見られた。
【００７９】
（８−４）ＺＦＮ−ＬＦ２０００複合体アレイからのＺＦＮの細胞への導入
次いで、ＺＦＮ−ＬＦ２０００複合体アレイを作製し、固相から細胞へのＺＦＮ−ＬＦ２０００複合体の導入について試験した。上記（８−３）と同様の手順により調製したＺＦＮ−ＬＦ２０００複合体を、上記４と同様の手順により３５ｍｍディッシュにスポットした。このディッシュに、４×１０５個の２９３．Ｅ２ｍＥｍｅ（ＺＦＲＲ）ｒａｌｄ細胞／１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ（２ｍｌ）を添加し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で２４時間培養した。その後、ｍＥｍｅｒａｌｄの蛍光に基づき、ＺＦＮによるゲノム編集を検出した。
【００８０】
結果を図１９に示す。ＬＦ２０００／ＺＦＮ（μｌ／μｇ）＝０．３３３の複合体を用いたアレイにおいて、ｍＥｍｅｒａｌｄを発現する細胞が最も多く確認された。この結果から、ＺＦＮ−ＬＦ２０００複合体が細胞に導入されており、かつ、導入されたＺＦＮが細胞内で機能していることが示された。また、上記と同様に調製したアレイを真空条件下で１日保存した場合も、細胞にＺＦＮが導入され、活性を示すことが確認された（データは省略）。さらに、ＬＦ２０００／ＺＦＮ（μｌ／μｇ）＝０．３３３の複合体は、上記（８−３）では細胞毒性を示したが、ＬＦ２０００／ＺＦＮ（μｌ／μｇ）＝０．３３３の複合体を用いたアレイでは細胞毒性が見られなかった。これらの結果は、ＬＦ２０００／β−ｇａｌ複合体を用いた上記７で得られた結果と同様であり、固相から直接細胞に複合体を導入することにより、細胞毒性を抑えることができることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６（ａ）】
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【図１６（ｂ）】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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