(57)【要約】      （修正有）【課題】創傷治癒、組織増大、臓器修復、および臓器置換に適している、移植可能な組織および臓器の提供。【解決手段】複数の層を含む、生きている、三次元の操作した組織であって、前記組織は、予め形成されたスキャフォールド（足場）がなく、脊椎動物被験体における移植に適しており、および血管チューブではなく、操作した組織の少なくとも１つの層は、筋細胞を含み、残りの層は筋細胞、線維芽細胞、内皮細胞あるいはこれらの組み合わせを含み、複数の層は互いに凝集している、組織。【選択図】図１２
2018008064.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の層を含む、生きている、三次元の操作した組織であって、前記組織は、予め形成されたスキャフォールドがなく、脊椎動物被験体における移植に適しており、および血管チューブではなく、
操作した組織の少なくとも１つの層は、筋細胞を含み、残りの層は筋細胞、線維芽細胞、内皮細胞あるいはこれらの組み合わせを含み、複数の層は互いに凝集していることを特徴とする、組織。
【請求項２】
少なくとも１つの層は、平面の幾何学的形状を作り出すために、互いに対して空間的に配置される、複数の細胞型を含むことを特徴とする、請求項１に記載の組織。
【請求項３】
少なくとも１つの層は、層状の幾何学的形状を作り出すために、少なくとも１つの他の層とは組成的に又は構造的に異なることを特徴とする、請求項１または２に記載の組織。
【請求項４】
少なくとも１つの層は、成形時に、その最小の寸法で少なくとも１００μｍの厚さであることを特徴とする、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の組織。
【請求項５】
組織は、嚢、シート、またはチューブであることを特徴とする、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の組織。
【請求項６】
組織は、バイオプリントされており、バイオプリントの際に予め形成されたスキャフォールドがないことを特徴とする、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の組織。
【請求項７】
組織は、生体適合性のある表面上へのバイオインクの押し出しによってバイオプリントされ、バイオインクは生細胞を含む固体または半固体の組成物であることを特徴とする、請求項６に記載の組織。
【請求項８】
組織は、細胞物質から本質的になることを特徴とする、請求項１乃至７のいずれか１項に記載の組織。
【請求項９】
組織は、細胞によって生成された細胞外マトリックスを含むことを特徴とする、請求項１乃至８のいずれか１項に記載の組織。
【請求項１０】
筋細胞は、平滑筋細胞、骨格筋細胞、または心筋細胞であることを特徴とする、請求項１乃至９のいずれか１項に記載の組織。
【請求項１１】
筋細胞は、筋細胞へと分化することができる幹細胞または前駆細胞に由来することを特徴とする、請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の組織。
【請求項１２】
幹細胞または前駆細胞は、操作した組織の成形の前、間、または後に、筋細胞へと分化されることを特徴とする、請求項１１に記載の組織。
【請求項１３】
組織は、創傷治癒、組織置換、または組織増大に適した、略平面のシートまたはパッチであることを特徴とする、請求項１乃至１２のいずれか１項に記載の組織。
【請求項１４】
複数の層を含む、移植可能な組織を作るための方法であって、前記方法は、
ａ．筋細胞を含むバイオインクを、予め形成されたスキャフォールドがない層へとバイオプリントする工程；
ｂ．筋細胞、線維芽細胞、内皮細胞、またはこれらの組み合わせを含むバイオインクを、予め形成されたスキャフォールドが夫々ない１以上の追加の層へとバイオプリントする工程；および
ｃ．前記ａ．およびｂ．の工程の層を、互いに融合させる工程を含み、
組織は、予め形成されたスキャフォールドがなく、脊椎動物被験体において移植可能であり、血管チューブではないことを特徴とする、方法。
【請求項１５】
バイオプリントは、生体適合性のある表面上へのバイオインクの押し出しによるものであり、バイオインクは細胞を含む固体または半固体の組成物であることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
バイオインクは、押出化合物をさらに含むことを特徴とする、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ａ．およびｂ．の工程でバイオプリントされたバイオインクを、制限物質で制限する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項１４乃至１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
筋細胞は、平滑筋細胞、骨格筋細胞、または心筋細胞であることを特徴とする、請求項１４乃至１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
筋細胞は、前駆細胞から分化されることを特徴とする、請求項１４乃至１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
筋細胞は、組織サンプルから生じることを特徴とする、請求項１４乃至１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
組織サンプルは、吸引脂肪組織であることを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
組織は、嚢またはシートであることを特徴とする、請求項１４乃至２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
組織は、バイオプリンティング時に、約０．１５ｍｍ以上の内径を有するチューブであり、
チューブは、血管バイパス移植または動静脈シャントとして使用するようには意図されていないことを特徴とする、請求項１４乃至２１のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
＜関連出願への相互参照＞
本出願は、２０１１年９月１２日に出願の米国特許第６１／５３３，７６１号、および２０１１年９月１２日に出願の米国特許第６１／５３３，７６６号の利益を主張し、これら両方は、それら全体が引用によって本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
医療産業は、多くの切迫した問題に直面している。２００９年１２月時点で、１０５，３０５人の患者が、臓器移植を必要とする人として、全米臓器配分ネットワーク（ＵＮＯＳ）に登録されていた。２００９年１月から９月の間に、２１，４２３件のみの移植が行われた。毎年、移植が行われる件数よりも多い患者が、ＵＮＯＳリストに加えられ、その結果、移植を待つ患者の数の純増加をもたらしている。例えば、２００８年の初めに、７５，８３４人が腎臓を必要とする人として登録され、その年の終わりに、その数は、８０，９７２人に増大した。１６，５４６件の腎移植がその年に行われたが、３３，００５人の新しい患者がリストに加えられた。腎臓を必要とする人としてＵＮＯＳによって登録された患者の２００８年の移植率は、２０％であった。待ちリストの患者の死亡率は７％であった。
【発明の概要】
【０００３】
移植可能な組織および臓器の緊急の必要性を緩和するための、再生医療および組織工学技術の適用を促進する、材料、ツール、および技術が必要とされている。その上、創傷治癒、組織増大、臓器修復、および臓器置換に適している、移植可能な組織および臓器が必要とされている。したがって、発明者は、本明細書に移植可能な組織、臓器、およびそれらを製造する方法を記載する。
【０００４】
１つの態様では、本明細書には、１つ以上の層を含む、生きている、三次元の操作した組織または臓器が開示され、前記１つ以上の層は、ａ）使用時にスキャフォールドが略ないこと、およびｂ）バイオプリントされること、の１つ以上を特徴とし、前記１つ以上の層は、十分な成熟後の脊椎動物被験体における移植に適しており、但し、操作した組織または臓器の少なくとも１つの層が、筋細胞を含み、操作した組織または臓器が、血管チューブではないことを条件とする。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの層は、平面の幾何学的形状（ｇｅｏｍｅｔｒｙ）を作り出すために、互いに対して空間的に配置される複数の細胞型を含む。さらなる実施形態では、少なくとも１つの層は、成形時に、その最小の寸法で少なくとも１００μｍである。幾つかの実施形態では、組織または臓器は、複数の層を含み、少なくとも１つの層は、層状の幾何学的形状を作り出すために、少なくとも１つの他の層とは組成的に又は構造的に異なる。さらなる実施形態では、少なくとも１つの層は、成形時に、その最小の寸法で少なくとも１００μｍの厚さである。幾つかの実施形態では、組織または臓器は、嚢、シート、またはチューブであり、ここで、前記チューブは血管チューブではない。幾つかの実施形態では、組織または臓器は、使用時に任意の予め形成されたスキャフォールドが略ない。幾つかの実施形態では、組織または臓器は、バイオプリントされる。幾つかの実施形態では、１つ以上の層は細胞外マトリックスを生成する。幾つかの実施形態では、筋細胞は、平滑筋細胞である。幾つかの実施形態では、筋細胞は、骨格筋細胞である。幾つかの実施形態では、筋細胞は、心筋細胞である。幾つかの実施形態では、筋細胞は、筋細胞へと分化することができる幹細胞または前駆細胞に由来する。さらなる実施形態では、幹細胞または前駆細胞は、成形の前に、間、または後に筋細胞へと分化された。幾つかの実施形態では、組織または臓器は、内皮細胞、神経細胞、周細胞、線維芽細胞、組織に特異的な上皮細胞、軟骨細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、骨由来の細胞、軟組織由来の細胞、中皮細胞、組織に特異的な間質細胞、幹細胞、前駆細胞、内胚葉由来の細胞、外胚葉由来の細胞、中胚葉由来の細胞、およびそれらの組み合わせ、から選択される細胞を含む。幾つかの実施形態では、筋細胞以外の細胞は、１つ以上の層の少なくとも１つの表面上で分配された。さらなる実施形態では、筋細胞以外の細胞は、１つ以上の層の少なくとも１つの表面上でバイオプリントされた。幾つかの実施形態では、筋細胞以外の細胞は、１つ以上の層が成形されたときと略同じときに、１つ以上の層の成形後に、１つ以上の層の成熟中に、または１つ以上の層の成熟後に、１つ以上の層上で分配された。幾つかの実施形態では、筋細胞以外の細胞は、約１乃至約２０の細胞の厚さの細胞の層として１つ以上の層上で分配された。幾つかの実施形態では、１つ以上の層は、略平面である。さらなる実施形態では、組織または臓器は、創傷治癒、組織置換または組織増大に適した、筋細胞を含むシートまたはパッチである。幾つかの実施形態では、１つ以上の層は、略管状である。さらなる実施形態では、組織または臓器は、尿管、尿路の導管、��門十二指腸の腸内の導管（ｐｏｒｔｏｄｕｏｄｅｎａｌ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｃｏｎｄｕｉｔ）、卵管、子宮、気管、気管支、リンパ管、尿道、腸、結腸、食道、またはそれらの一部である。幾つかの実施形態では、１つ以上の層は略嚢である。さらなる実施形態では、組織または臓器は、胃、膀胱、子宮、または胆嚢、あるいはそれらの一部である。幾つかの実施形態では、組織または臓器は、尿道、尿路の導管、肛門十二指腸の腸内の導管、尿管、膀胱、卵管、子宮、気管、気管支、リンパ管、食道、胃、胆嚢、腸、および結腸、から成る群から選択される。
【０００５】
別の態様では、本明細書には、組織及び／又は臓器の移植が開示される。
【０００６】
別の態様では、本明細書には、エキソビボでの研究使用のための培養下の組織及び／又は臓器の維持が開示される。
【０００７】
別の態様では、本明細書には、筋細胞を含む層を含む、移植可能な組織または臓器を作るための方法が開示され、前記方法は、筋細胞を含むバイオインクを形態へとバイオプリントする工程、およびバイオインクを凝集性の細胞構造へと融合する工程を含み、但し、組織または臓器は、脊椎動物被験体において移植可能であり、血管チューブではない。幾つかの実施形態では、移植可能な組織または臓器は、使用時に任意の予め形成されたスキャフォールドが略ない。幾つかの実施形態では、筋細胞は、平滑筋細胞である。幾つかの実施形態では、筋細胞は、骨格筋細胞である。幾つかの実施形態では、筋細胞は、心筋細胞である。幾つかの実施形態では、筋細胞は、前駆細胞から分化される。幾つかの実施形態では、筋細胞は、組織サンプルから生じる。さらなる実施形態では、組織サンプルは、吸引脂肪組織である。幾つかの実施形態では、形態は、嚢またはシートである。幾つかの実施形態では、形態は、バイオプリンティング時に約０．１５ｍｍ以上の内径を有するチューブであり、ここで、チューブは、血管バイパス移植または動静脈シャントとして使用するようには意図されていない。幾つかの実施形態では、バイオインクはさらに、内皮細胞、神経細胞、周細胞、線維芽細胞、組織に特異的な上皮細胞、軟骨細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、骨由来の細胞、軟組織由来の細胞、中皮細胞、組織に特異的な間質細胞、幹細胞、前駆細胞、内胚葉由来の細胞、外胚葉由来の細胞、中胚葉由来の細胞、およびそれらの組み合わせ、から選択される細胞を含む。幾つかの実施形態では、方法はさらに、筋細胞以外の細胞をバイオプリントされた形態内へと又は形態上へと、バイオプリンティング、スプレー、塗布、適用、浸漬コーティング、移植、蒔く、注入、または層状化する工程を含む。幾つかの実施形態では、方法はさらに、筋細胞以外の細胞を凝集性の細胞構造内へと又は細胞構造上へと、バイオプリンティング、スプレー、塗布、適用、浸漬コーティング、移植、注入、蒔く、または層状化する工程を含む。
【０００８】
別の態様では、本明細書には、１つ以上の層を含む、生きている、三次元の操作した組織または臓器が開示され、前記１つ以上の層は、ａ）使用時にスキャフォールドが略ないこと、およびｂ）バイオプリントされること、の１つ以上を特徴とし、前記１つ以上の層は、脊椎動物被験体に対して移植の準備ができた状態へと成熟し、前記操作した組織または臓器は、細胞物質から本質的に成り、但し、操作した組織または臓器の少なくとも１つの層が、筋細胞を含み、操作した組織または臓器が、血管チューブではないことを条件とする。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの層は、平面の幾何学的形状を作り出すために、互いに対して空間的に配置される、複数の細胞型を含む。さらなる実施形態では、少なくとも１つの層は、成形時に、その最小の寸法で少なくとも１００μｍの厚さである。幾つかの実施形態では、組織または臓器は、複数の層を含み、少なくとも１つの層は、層状の幾何学的形状を作り出すために、少なくとも１つの他の層とは組成的に又は構造的に異なる。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの層は、成形時に、その最小の寸法で少なくとも１００μｍの厚さである。幾つかの実施形態では、組織または臓器は、嚢、シート、またはチューブであり、ここで、前記チューブは血管チューブではない。幾つかの実施形態では、筋細胞は、平滑筋細胞である。幾つかの実施形態では、筋細胞は、骨格筋細胞である。幾つかの実施形態では、筋細胞は、心筋細胞である。幾つかの実施形態では、組織または臓器はさらに、内皮細胞、神経細胞、周細胞、線維芽細胞、組織に特異的な上皮細胞、軟骨細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、骨由来の細胞、軟組織由来の細胞、中皮細胞、組織に特異的な間質細胞、幹細胞、前駆細胞、内胚葉由来の細胞、外胚葉由来の細胞、中胚葉由来の細胞、およびそれらの組み合わせ、から選択される細胞を含む。幾つかの実施形態では、細胞は、少なくとも１つの層の少なくとも１つの表面上に分配される。さらなる実施形態では、細胞は、少なくとも１つの層の少なくとも１つの表面上でバイオプリントされる。
【０００９】
別の態様では、本明細書には、組織及び／又は臓器の移植が開示される。
【００１０】
別の態様では、本明細書には、エキソビボでの研究使用のための培養下の組織及び／又は臓器の維持が開示される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
本発明の新しい特徴は、特に、添付の特許請求の範囲内に明記される。本発明の特徴及び利点のより良い理解は、本発明の原理が利用される、具体例を明記する後述する詳細な説明を引用することによって、および以下の添付図面によって得られるであろう。
【００１２】
【図１】図１は、平滑筋細胞（ＳＭＣ）から成る、および内皮細胞（ＥＣ）を含有しているバイオインクによって構成された、バイオプリントされた平滑筋のパッチ（例えば、シート）の限定しない例を描写する。本例では、バイオインクは、バイオプリンティング前に円柱状のフォーマットで構成された。細胞型の分布および位置を示すために、様々な組織染色が示される。
【図２】図２は、ＳＭＣ単独から成るバイオインクによって構成された、バイオプリントされた平面の平滑筋のパッチ（例えば、シート）の限定しない例を描写する。本例では、ＳＭＣのバイオインクは、スキャフォールドまたは外因的に加えられた生体材料がなく、円柱状のバイオプリンティングのフォーマットを使用してＮｏｖｏＧｅｎ ＭＭＸバイオプリンター上でバイオプリントされた。本例では、第２細胞型（内皮細胞）は、成形直後にバイオプリントされたＳＭＣのパッチの単面上の薄層としてバイオプリントされた。細胞型の分布および位置を示すために、様々な組織染色が示される。
【図３ａ】図３ａは、ヒト動脈由来のＳＭＣから成るバイオインクから出たバイオプリントされた平面の平滑筋のパッチ（例えば、シート）の限定しない例を描写する。本例では、線維芽細胞を含む外膜に隣接している平滑筋細胞の層の天然の生態を模倣するために、ＳＭＣは、ヒト真皮線維芽細胞（ＨＤＦ）の層の上にプリントされた。本例では、第３細胞型（ヒト動脈由来の内皮細胞）は、バイオプリントされた平滑筋のパッチの上の薄層としてバイオプリントされた。ＨＡＳＭＣは、アルファＳＭＡに対して染色される。
【図３ｂ】図３ｂは、ＮｏｖｏＧｅｎ ＭＭＸバイオプリンター上のバイオプリンティングの直後に示された、平滑筋のパッチ（ＳＭＣのバイオインクから成る）の限定しない例を描写するマクロ画像である。本例では、非接着性のヒドロゲルの制限物質（ＮｏｖｏＧｅｌ（商標））は、構成物がその上でプリントされるベース支持体（ｂａｓｅ ｓｕｐｐｏｒｔ）として、およびバイオプリントされた平滑筋のパッチのまわりの制限窓としても利用された。
【図４ａ】図４ａは、８５：１５の割合で混合された、ヒト動脈由来の内皮細胞と併用してヒト動脈由来のＳＭＣから成る円柱状のバイオインクによって構成された、バイオプリントされた平面の平滑筋のパッチ（例えば、シート）の限定しない例を描写するマクロ画像である。
【図４ｂ】図４ｂは、８５：１５の割合のＳＭＣ：ＥＣから成る円柱状のバイオインクによって構成された、バイオプリントされた平面の平滑筋のパッチ（例えば、シート）の限定しない例を描写する。ＥＣ（内皮細胞）は、内皮細胞の特定のマーカーである、ＣＤ３１に対して免疫染色することによって識別された。
【図５】図５は、非接着性のヒドロゲルの支持構造内でバイオプリントされた、バイオプリントされた平滑筋のシートの限定しない例であり、ここで、バイオプリントされた平滑筋のパッチの上に置かれた制限物質は、バイオプリントされたシートおよび栄養培地の少なくとも幾つかの部分との直接的な接触を可能にするために、格子構造で構成され；また、それを成形するための典型的な工程が描写される。
【図６】図６は、バイオプリントされた平滑筋を含むチューブの限定しない例である。本例では、バイオインクは、左から右に、７５：２５：５、４７．５：４７．５：５、および８５：１０：５の割合で、２つの追加の細胞型（線維芽細胞および内皮細胞）と組み合わされたＳＭＣを含んだ。
【図７】図７は、操作した肝臓組織、この場合、押出化合物（例えば、ＰＦ−１２７）中にカプセル化された細胞から成るバイオインクを使用する連続的な堆積機構を使用してバイオプリントされた、肝臓組織の限定しない例を描写するマクロ画像である。（Ａ）は、単一の機能ユニットの概略図を示し、（Ｂ）は、各層における平面の、碁盤目状の幾何学的形状を有する多層シートを示し、（Ｃ）および（Ｄ）は、培地の適用および押出化合物の溶解の後の構成物を示す。
【図８】図８は、図７のＨ＆Ｅ染色された多層の構成物の顕微鏡写真であり、碁盤目状の幾何学的形状における典型的な「スポーク（ｓｐｏｋｅ）」を描写する。
【図９】図９は、２細胞系（ｔｗｏ−ｃｅｌｌ ｓｙｓｔｅｍ）における起こり得る混合物を例証する線グラフである。
【図１０】図１０は、断面における管状の構成物の概略図である。典型的な命名法は、円柱状のバイオインクユニットの数、その後の、軸のＮｏｖｏＧｅｌ（商標）のシリンダー（Ａ）６／１、（Ｂ）１２／４、（Ｃ）１０／４、および（Ｄ）１２／７の数から成る。
【図１１】図１１は、（Ａ）マクロの全体の形態、（Ｂ）不透明度および平滑面を示す全体の形態の拡大図、および断面の組織構造の顕微鏡写真（下の列）を含む、多型のバイオインクの組成でのバイオプリントされた６／１の管状の構成物を描写する。
【図１２】図１２は、継続的な連続縫合（Ａ）または複数の断続縫合（Ｂ）によって外科的に付けられた、バイオプリントされた組織シートを例証する。
【図１３】図１３は、長期的な維持および成熟のためにマルチウェルの挿入物上へと成形された、バイオプリントされた骨格筋組織を描写する（Ａ）。培養下での３日後および９日後のバイオプリントされた骨格筋組織のＨ＆Ｅ染色（Ｂ、Ｃ）。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、再生医療と組織及び／又は臓器の工学の領域に関する。とりわけ、本発明は、筋細胞を含む少なくとも１つの層を含む組織および臓器に関し、ここで、操作した組織または臓器は、細胞物質から本質的に成り、本発明はまた、それらを製造する方法に関する。本明細書に開示される組織、臓器、および方法の利点は、一例として、筋細胞を含む、随意に層状のシート、チューブ、および嚢の成形を可能にする可撓性の三次元の組織の幾何学的形状を含む。別の利点は、筋細胞以外の１つ以上の細胞型が、層の少なくとも１つの表面上で配され、分配され、及び／又はバイオプリントされることを可能にする可撓性の層状の手法である。これらの利点は、天然の組織組成物および構造を模倣する操作した組織および臓器を結果的にもたらす。
【００１４】
本明細書には、特定の実施形態において、１つ以上の層を含む、生きている、三次元の操作した組織または臓器が開示され、前記１つ以上の層は、ａ）使用時にスキャフォールドが略ないこと、およびｂ）バイオプリントされること、の１つ以上を特徴とし、十分な成熟後の脊椎動物被験体における移植に適しており、但し、操作した組織または臓器の少なくとも１つの層が、筋細胞を含み、操作した組織または臓器が、血管チューブではないことを条件とする。
【００１５】
本明細書にはまた、特定の実施形態において、組織及び／又は臓器の移植が開示される。
【００１６】
本明細書にはまた、特定の実施形態において、筋細胞を含む層を含む、移植可能な組織または臓器を作るための方法が開示され、前記方法は、筋細胞を含むバイオインクを形態へとバイオプリントする工程、およびバイオインクを凝集性の細胞構造へと融合する工程を含み、但し、組織または臓器は、脊椎動物被験体において移植可能であり、血管チューブではないことを条件とする。
【００１７】
本明細書にはまた、特定の実施形態において、１つ以上の層を含む、生きている、三次元の操作した組織または臓器が開示され、前記１つ以上の層は、ａ）使用時にスキャフォールドが略ないこと、およびｂ）バイオプリントされること、の１つ以上を特徴とし、前記１つ以上の層は、脊椎動物被験体に対して移植の準備ができた状態へと成熟し、前記操作した組織または臓器は、細胞物質から本質的に成り、但し、操作した組織または臓器の少なくとも１つの層が、筋細胞を含み、操作した組織または臓器が、血管チューブではないことを条件とする。
【００１８】
本明細書にはまた、特定の実施形態において、組織及び／又は臓器の移植が開示される。
【００１９】
＜特定の定義＞
特に他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明の属する当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。
【００２０】
本明細書及び添付の請求項に使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈がはっきりと特に指示していない限り、複数の言及を含む。したがって、例えば、「核酸」への言及は、１つ以上の核酸、及び／又は本開示などを読むことで当業者に明らかになるであろう本明細書に記載されるタイプの組成物などを含む。本明細書の「または」へのあらゆる言及は、特に他に明記のない限り、「及び／又は」を包含するように意図される。
【００２１】
本明細書で使用されるように「バイオインク」は、複数の細胞を含む、液体、半固体、または固体の組成物を意味する。幾つかの実施形態では、バイオインクは、細胞溶液、細胞集合体、細胞を含むゲル剤、多細胞体、または組織を含む。幾つかの実施形態では、バイオインクは、支持物質をさらに含む。幾つかの実施形態では、バイオインクは、バイオプリンティングを可能にする特異的な生体力学的特性を提供する、非細胞物質をさらに含む。
【００２２】
本明細書で使用されるように、「バイオプリンティング」は、自動化または半自動化した、コンピューター支援の、三次元のプロトタイピング装置（例えば、バイオプリンター）と適合性のある方法を介して、細胞（例えば、細胞溶液、細胞を含むゲル剤、細胞懸濁液、細胞濃縮液（ｃｅｌｌ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ）、多細胞集合体、多細胞体など）の三次元の正確な堆積を利用することを意味する。
【００２３】
本明細書で使用されるように、「血管」は、血管内皮細胞をさらに含み、１００μｍより大きな内径を有し、および相互に位置する（ｉｎｔｅｒｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ）血管グラフト、バイパス血管グラフト、または動静脈の血管シャントとしてインビボでの使用を意図した、平滑筋細胞のチューブを意味する。本明細書で使用されるように、「血管」は、他の臓器または組織の一体的な血管成分（動脈、静脈、小動脈、細静脈、キャピラリー、および微小血管系）を明確には含まない。例えば、膀胱、腸、または食道に関係する血管網は、本明細書に提示されるような「血管」の定義には含まれないであろう。
【００２４】
本明細書で使用されるように、「凝集する（ｃｏｈｅｒｅ）」、「凝集した（ｃｏｈｅｒｅｄ）」、および「凝集（ｃｏｈｅｓｉｏｎ）」は、細胞、細胞集合体、多細胞集合体、及び／又はそれらの層に結合する細胞間接着の特性を指す。前記用語は、「融合する（ｆｕｓｅ）」、「融合した（ｆｕｓｅｄ）」、および「融合（ｆｕｓｉｏｎ）」と交換可能に使用される。本明細書で使用されるように、「細胞外マトリックス」は、細胞によって生成され、細胞から細胞外空間へと輸送されるタンパク質を意味し、ここで、タンパク質は、組織を一緒に保持するための支持体として機能し、引っ張り強度を提供し、及び／又は細胞シグナル伝達を促進する。
【００２５】
本明細書で使用されるように、「移植可能な」は、生体適合性があり、一時的に又は略永続的にのいずれかで、有機体へと挿入または移植可能であるか、あるいは有機体上に付着可能であることを意味する。
【００２６】
本明細書で使用されるように、「層状の」は、ｚ平面で組織の全体厚を増加させるために２つ以上の平面層が組み合わせられる、多層のバイオプリントされた組織を意味する。幾つかの実施形態では、各平面層は、構造及び／又は組成において略類似している。他の実施形態では、各平面層は、構造及び／又は組成において大幅に異なる。
【００２７】
本明細書で使用されるように、「多層の」は、組織の２つ以上の層で構成されていることを意味し、各組織層は、１つ以上の層の厚さである。幾つかの実施形態では、組織の層は、１つずつ堆積される。他の幾つかの実施形態では、複数の層は、同時に堆積される。随意に、各層は、複数の細胞型で構成される。さらに、各層内の複数の細胞型は、随意に、ｘ−ｙ平面（すなわち、横平面）での空間的に定義された構造において互いに相対的に配置される。さらに、ｚ平面（すなわち、縦平面）における層の付加は、幾つかの場合において、空間的に定義された構造がｚ平面で継続されるように、互いに相対的な層内の細胞の制御された空間の位置決めを結果的にもたらす。
【００２８】
本明細書で使用されるように、「臓器」は、共通機能に働かせるために構造ユニットへ連結された組織の集りを意味する。臓器の例は、限定されないが、皮膚、尿道、導管、尿管、膀胱、卵管、子宮、気管、気管支、リンパ管、食道、胃、胆嚢、小腸、大腸、および結腸を含む。
【００２９】
本明細書で使用されるように「平面（ｐｌａｎａｒ）」は、複数のバイオインクの組成物及び／又は空所が、組織層のｘ−ｙ平面内で互いに相対的に、定義されたパターンへと空間的に配置される、多細胞のバイオプリントされた組織の層を意味する。「平面」はまた、組織の「シート」または「パッチ」の形状を記載するために使用されるときの、略平らであることを意味する。
【００３０】
本明細書で使用されるように、「スキャフォールド」は、ポリマースキャフォールドおよび多孔性ヒドロゲルなどの合成のスキャフォールド、予め形成された細胞外マトリックスの層、死細胞の層、および脱細胞化組織などの非合成のスキャフォールド、および操作した組織及び／又は臓器の物理的構造にとって不可欠である、および前記組織及び／又は臓器の損傷／破壊なしで前記組織及び／又は臓器から取り除かれることができない、任意の他の種類の予め形成されたスキャフォールドを指す。さらなる実施形態では、脱細胞化組織のスキャフォールドは、例えば、生きている間に生成したＥＣＭを残して、死滅される又は脱細胞化される細胞層などの、任意の方法における培養細胞によって生じた、脱細胞化した天然組織または脱細胞化した細胞物質を含む。本明細書に使用されるような用語「スキャフォールドがない（ｓｃａｆｆｏｌｄ−ｆｒｅｅ）」は、細胞を含むチューブ、嚢、またはシートが、使用時に（上述されるように）スキャフォールドが略ないことを示唆する。「スキャフォールドがない（ｓｃａｆｆｏｌｄ−ｆｒｅｅ）」は、「スキャフォールドのない（ｓｃａｆｆｏｌｄｌｅｓｓ）」および「予め形成されたスキャフォールドのない（ｆｒｅｅ  ｏｆ  ｐｒｅ−ｆｏｒｍｅｄ  ｓｃａｆｆｏｌｄ）」と交換可能に使用される。
【００３１】
本明細書で使用されるように、「幹細胞」は、効能および自己複製を示す細胞を意味する。幹細胞は、限定されないが、全能細胞、多能性細胞、分化多能性細胞、少能性細胞、分化単能細胞、および前駆細胞を含む。様々な実施形態では、幹細胞は、胚性幹細胞、周産期の幹細胞、成体幹細胞、羊膜の幹細胞、および人工多能性幹細胞である。
【００３２】
本明細書で使用されるように、「被験体」は、任意の個人を意味する。前記用語は、「患者」、「レシピエント」、および「ドナー」と交換可能である。前記用語はどれも、医療専門家（例えば、医師、看護婦、実地看護婦、医師助手、看護士、ホスピス職員、ソーシャルワーカー、および治験担当者など）または科学研究者の監督（常時またはその他）を必要とするものとして解釈されるべきではない。
【００３３】
本明細書で使用されるように、「組織」は、細胞の集合体を意味する。組織の例は、限定されないが、結合組織（例えば、疎性結合組織、強靭結合組織、弾性組織、網様結合組織、および脂肪組織）、筋組織（例えば、骨格筋、平滑筋および心筋）、尿生殖器組織、胃腸組織、肺組織、骨組織、神経組織、および上皮組織（例えば、単層上皮および重層上皮）、内胚葉由来の組織、中胚葉由来の組織、および外胚葉由来の組織を含む。
【００３４】
＜組織工学＞
組織工学は、臓器または組織の増大、修復、または置換を介して組織機能を回復、維持、改善する生物学的代替物の開発に向けて、工学とライフサイエンスの原理を適用し、組み合わせる学際的分野である。典型的な組織工学に対する基本的なアプローチは、生体適合性であり、最終的に生物分解性である環境（例えば、スキャフォールド）へと生細胞を蒔き、その後、前駆細胞の集団が、移植後に標的組織を生成するように、さらに拡大する且つ成熟するように、この構成物をバイオリアクター内で培養することである。生物学的な細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を模倣する適切なスキャフォールドによって、発達中の組織は、インビトロおよびインビボの成熟後の所望の臓器の形態および機能の両方を取り入れる。しかしながら、天然組織のような構造を有する十分に高い細胞密度を達成することは、スキャフォールドの全体にわたる細胞の分布および空間的配置を制御する能力が限定されるため、困難である。これらの限定によって、しばしば結果的に、機械的性質が乏しい及び／又は機能が不十分な組織または臓器がもたらされる。さらなる困難は、スキャフォールドの生物分解、残留ポリマーの捕捉、および製造プロセスの工業上のスケールアップに関係している。スキャフォールドがないアプローチが試みられた。現在のスキャフォールドがないアプローチは、いくつかの制限を受ける：
・各層が、異なる細胞型を含む、多層構造などの複雑な幾何学的構造は、しばしば、天然組織のような結果を再生可能に達成するために、具体的な構造内で細胞型の明確で高分解性の配置を必要とする。
・尺度および幾何学的形状は、拡散及び／又は栄養供給に対する機能的な血管網のための必要条件によって限定される。
・組織の生存能力は、幾つかの場合において、拡散を限定し、栄養に対する細胞のアクセスを制限する制限物質によって損なわれる。
【００３５】
本明細書には、特定の実施形態において、操作した組織および臓器、および成形の方法が開示される。本明細書に開示される組織工学の方法は、以下の利点を有する：
・細胞を含む組織及び／又は臓器を生成することができる。
・再形成する天然組織のような細胞間の相互作用によって、天然組織の、発達、恒常性機能、及び／又は病因内で見られる環境条件を模倣する。
・随意に、広範囲の複雑なトポロジー（例えば、多層構造、セグメント、シート、チューブ、嚢など）を達成する。
・製造の自動化した手段と適合性があり、スケーラブルである。
【００３６】
バイオプリンティングは、組織修復、組織増大、組織置換、および臓器置換に有用な、細胞を含む移植可能な組織を作成する方法を向上させることができる（以下を参照）。
【００３７】
＜バイオプリンティング＞
幾つかの実施形態では、操作した移植可能な組織及び／又は臓器の少なくとも１つの成分は、バイオプリントされた。さらなる実施形態では、操作した移植可能な組織及び／又は臓器は、完全にバイオプリントされた。またさらなる実施形態では、バイオプリントされた構成物は、三次元の送達装置（例えば、バイオプリンター）によって、（例えば、ヒドロゲル及び／又はで多孔質膜で作られた）生体適合性のある表面上に、細胞溶液、細胞懸濁液、細胞を含むゲル剤またはペースト剤、細胞濃縮液、多細胞体（例えば、円柱、楕円体、リボンなど）、および制限物質を含む、細胞の三次元の、自動化した、コンピューター支援の堆積に基づいて、急速なプロトタイピング技術を利用する方法で作られる。本明細書で使用されるように、幾つかの実施形態において、組織及び／又は臓器に言及するために使用されるときの、用語「操作した（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）」は、細胞、細胞溶液、細胞懸濁液、細胞を含むゲル剤またはペースト剤、細胞濃縮液、多細胞集合体、およびそれらの層が、コンピュータースクリプトに従うコンピューター支援のデバイス（例えば、バイオプリンター）によって、三次元構造を形成するために位置付けられる。さらなる実施形態では、コンピュータースクリプトは、例えば、１つ以上のコンピュータープログラム、コンピューターアプリケーション、またはコンピューターモジュールである。またさらなる実施形態において、三次元の組織構造は、初期の形態形成における自己集合現象に類似した細胞または多細胞体のプリンティング後の融合を介して形成される。
【００３８】
手動での配置を含む三次元構造をもたらすために、生体適合性のある表面上に、細胞、多細胞集合体、及び／又はそれらの層を配置する多くの方法が利用可能であるが、バイオプリンターなどの、自動化した、コンピューター支援の機械による位置決めが利点となっている。この技術による細胞または多細胞体の送達の利点は、細胞、多細胞集合体及び／又は様々な組成物を有するそれらの層の、計画された又は予め決められた配向またはパターンを示す構成物をもたらすために、細胞または多細胞体の、急速で、正確で、再生可能な配置を含む。利点はまた、細胞損傷を最小限にしながら、確かな高い細胞密度を含むことである。
【００３９】
幾つかの実施形態では、バイオプリンティングの方法は、連続的及び／又は略連続的である。連続的なバイオプリンティング方法の限定しない例は、バイオインクの貯蔵器に接続された分注チップ（ｄｉｓｐｅｎｓｅ  ｔｉｐ）（例えば、注射器、キャピラリーチューブなど）を介してバイオプリンターからバイオインクを分注することである。さらに限定しない実施形態では、連続的なバイオプリンティング方法は、機能ユニットの繰り返しのパターンでバイオインクを分注することである。様々な実施形態において、繰り返しの機能ユニットは、例えば、円、正方形、長方形、三角形、多角形、および不規則な幾何学的構造を含む、任意の適切な幾何学的構造を有する。さらなる実施形態において、バイオプリントされた機能ユニットの繰り返しのパターンは、層を含み、複数の層は、隣接してバイオプリントされ（例えば、積み重ねられ）、操作した組織または臓器を形成する。様々な実施形態では、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはそれ以上の層は、操作した組織または臓器を形成するために、隣接してバイオプリントされる（例えば、積み重ねられる）。
【００４０】
幾つかの実施形態では、バイオプリントされた機能ユニットは、碁盤目状のパターンで繰り返す。「碁盤目状のパターン」は、平面を重なりや間隙で満たさない図の平面である。図７のＡは、図７のＢで描写される碁盤目状のパターンをもたらすための、随意に繰り返される機能ユニットの例を示す。連続的な及び／又は碁盤目状のバイオプリンティングの利点は、限定しない例として、バイオプリントされた組織の増加した生産性を含む。別の限定しない、典型的な利点は、以前に堆積したバイオインクの要素を有するバイオプリンターを並べる必要性を排除することである。連続的なバイオプリンティングはまた、随意に注射器の機構を使用して、バイオインクの大きな貯蔵器からのより大きな組織のプリンティングを促進する。
【００４１】
幾つかの実施形態では、連続的なバイオプリンティングでの方法は、プリント高さ、ポンプ速度、ロボット速度、またはそれらの組み合わせなどのパラメーターを、独立してまたは互いに相対的に、最適化及び／又は平衡化する工程を含む。一例では、堆積のためのバイオプリンターヘッドの速度は、３ｍｍ／ｓであり、分注の高さは、第１層に関しては０．５ｍｍであり、各々の続く層に関しては、０．４ｍｍ増加した。幾つかの実施形態では、分注の高さは、バイオプリンターの分注チップの直径と略等しい。限定されることなく、適切及び／又は最適な分注の距離によって、結果的に物質が分注針にぴったり付く（ｆｌａｔｔｅｎｉｎｇ）または接着することはない。様々な実施形態では、バイオプリンターの分注チップは、約２０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００μｍ、またはそれ以上の内径を有し、それらにおいてインクリメント（ｉｎｃｒｅｍｅｎｔｓ）を含む。様々な実施形態において、バイオプリンターのバイオインク貯蔵器は、約０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００立方センチメートル、またはそれ以上の容積を有し、それらにおいてインクリメントを含む。幾つかの実施形態では、ポンプ速度は、システムにおける残留圧力の上昇が低いときに、適切及び／又は最適である。幾つかの実施形態では、好都合なポンプ速度は、貯蔵器と分注針の断面積の割合に依存し、割合が大きいと、より低いポンプ速度を必要とする。幾つかの実施形態では、適切な及び／又は最適なプリント速度によって、物質の機械的結着性に影響を与えることなく、一様な線の堆積が可能となる。
【００４２】
本明細書に開示される本発明は、ビジネス方法を含む。幾つかの実施形態において、本明細書に開示される技術および方法の速度およびスケーラビリティは、移植に関する操作した組織及び／又は臓器の作成のために、産業施設及び／又は商業施設を設計し、建築し、かつ経営するために利用される。さらなる実施形態において、操作した組織及び／又は臓器は、組織損傷、組織疾患、及び／又は臓器不全の医学的処置などの、インビボで使用するための、例えば、材料、ツール、およびキットとして、作成、保存、分配、売買、広告、および販売される。他の実施形態では、操作した組織及び／又は臓器は、科学的及び／又は医学的な調査などの、インビボで使用するための、例えば、材料、ツール、およびキットとして、作成、保存、分配、売買、広告、および販売される。さらなる実施形態では、操作した組織及び／又は臓器は、細胞培養環境で維持され、科学的及び／又は医学的な調査で使用される。
【００４３】
＜操作した組織および臓器＞
本明細書には、特定の実施形態において、１つ以上の層を含む、操作した移植可能な組織及び／又は臓器が開示され、ここで、少なくとも１つの層は、筋細胞を含む。幾つかの実施形態では、１つ以上の層は、使用時、バイオプリンティング（本明細書に記載される技術）時、またはその両方の時に、スキャフォールドが略ないことを特徴とする。さらなる実施形態では、１つ以上の層及び／又は操作した組織または臓器は、細胞物質から本質的に成る。幾つかの実施形態では、１つ以上の層は、十分な成熟後の脊椎動物被験体における移植に適している。幾つかの実施形態では、１つ以上の層は、脊椎動物被験体に対して移植の準備ができた状態へと成熟される。
【００４４】
幾つかの実施形態では、操作した組織および臓器は、細胞物質から本質的に成る。様々なさらなる実施形態では、操作した組織および臓器の細胞を含む部分は、構成時に、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５、９９．９、および１００％の細胞物質から成り、それらにおいてインクリメントを含む。他の様々な実施形態では、操作した組織および臓器の細胞を含む部分は、使用時に、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５、９９．９、および１００％の細胞物質から成り、それらにおいてインクリメントを含む。幾つかの実施形態では、操作した組織は、細胞の凝集した及び／又は接着した集合体である。幾つかの実施形態では、細胞構造がない成分は、使用前に取り除かれる。さらなる実施形態では、細胞構造がない成分は、物理的、化学的、または酵素的な手段によって取り除かれる。幾つかの実施形態では、細胞構造がない成分の一部は、使用時に細胞成分に関連付けられたままである。幾つかの実施形態では、細胞構造がない成分は、ヒドロゲル、界面活性剤ポリオール、熱応答性ポリマー、ヒアルロナート、アルギナート、コラーゲン、または他の生体適合性の天然または合成のポリマーを含む群から選択される。
【００４５】
操作した組織は、随意に、任意のヒトまたは哺乳動物の組織を模倣する。典型的な組織は、上皮組織、結合組織、筋組織、神経組織などを含む。幾つかの実施形態では、操作した臓器は、共通機能に働かせるために、構造ユニットへと連結された組織の集りである。臓器は、任意の天然のヒトまたは哺乳動物の臓器を適切に模倣する。典型的な臓器は、限定しない例として、気管、気管支、食道、胃、腸、結腸、胆嚢、子宮、卵管、尿管、膀胱、尿道、リンパ管などや、それらの部分を含む。
【００４６】
幾つかの実施形態では、操作した組織および臓器は、移植可能である。さらなる実施形態では、移植可能な組織および臓器は生体適合性であり、これは、それらが接触する有機体に対する損傷または毒性の危険性を限定することを意味する。幾つかの実施形態では、移植は、組織または臓器を被験体へと挿入または移植することを含む。さらなる実施形態では、挿入及び／又は移植は、外科的に行われる。他の実施形態では、移植は、組織または臓器を被験体に付けることを含む。本明細書に開示される組織および臓器は、様々な持続時間の間適切に移植される。幾つかの実施形態では、組織及び／又は臓器は、限定しない例として、一時的に、半永続的に、および永続的に適切に移植される。幾つかの実施形態では、移植した組織及び／又は臓器は、経時的に吸収される、組み込まれる、または溶解される。他の実施形態では、移植した組織及び／又は臓器は、ある程度の時間、異なる形態を保持する。
【００４７】
操作した組織および臓器は、必要のある任意の脊椎動物被験体における移植に適している。様々な実施形態では、脊椎動物被験体は、限定しない例として、ヒト被験体、脊椎動物の獣医学の被験体（ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ ｓｕｂｊｅｃｔｓ）、および哺乳類（哺乳動物）、鳥類（鳥）、爬虫類（爬虫類動物）、両生類（両生動物）、硬骨魚類（硬骨魚）、軟骨魚類（軟骨魚）、無顎類（あごなし魚）などとして分類される被験体を含む。
【００４８】
様々な実施形態では、操作した組織および臓器は、例えば、創傷治癒、組織修復、組織増大、組織置換、及び／又は臓器置換の必要のある任意の脊椎動物被験体の移植に適している。幾つかの実施形態では、操作した組織は、創傷治癒または組織修復に使用される。例えば、操作したシートは、損傷を受けたヒト皮膚を一時的にまたは永続的に修復するために使用される。幾つかの実施形態では、操作した組織は、組織増大に使用される。例えば、操作したシートは、ヒトの膀胱または胃の筋肉壁の欠損を一時的にまたは永続的に継ぎはぎする（ｐａｔｃｈ）か又は修復するために使用される。幾つかの実施形態では、操作した組織は、組織置換に使用される。例えば、操作したシートまたはチューブは、ヒト小腸のセグメントの壁を一時的にまたは永続的に修復するか置換するために使用される。幾つかの実施形態では、操作した臓器は、臓器置換に使用される。例えば、操作したチューブは、子宮外妊娠によって損傷したヒト卵管を一時的にまたは永続的に置換するために使用される。幾つかの実施形態では、操作した管状構造は、臓器系との新しい接合部を作り出すために使用され、例えば、平滑筋を含むチューブは、特定の疾患状態の廃棄物収集（ｗａｓｔｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）を可能にするために、体壁を介して、胃腸系または腎臓から接合部を拡張するために使用され得る。他の実施形態では、操作した管状構造は、本来先天性である（例えば、短腸症侯群など）、または他の疾患または損傷の結果として生じる、特異疾患を除去するか改善するために、特定の天然組織（例えば、食道、腸、結腸など）の長さを拡張するために使用される。
【００４９】
操作した、移植可能な組織および臓器は、様々な実施形態において、任意の適切な形状である。幾つかの実施形態では、形状は、特定の天然の組織または臓器を模倣するために選択される。
【００５０】
幾つかの実施形態では、筋細胞を含む層または全体的な操作した組織または臓器は、実質的に、シートの形態またはシートを含む形態である。さらなる実施形態では、シートは、限定しない例として、平面の四角形、長方形、多角形、円形、卵形、または不規則な形を含む、さまざまな適切な幾何学的形状を有する、略平面の形態である。バイオプリントされたシートは、広範囲の適切な寸法を有している。幾つかの実施形態では、寸法は、限定しない例として、創傷治癒、組織修復、組織増大、組織置換、および操作した臓器の構成を含む、特定の使用を促進するために選択される。さらなる実施形態では、寸法は、特定の被験体において特定の使用を促進するために選択される。例えば、１つの実施形態では、シートは、特定のヒト被験体の筋を含む組織の特定の欠損を修復するためにバイオプリントされる。
【００５１】
操作した、移植可能な組織および臓器は、様々な実施形態において、任意の適切なサイズである。幾つかの実施形態では、バイオプリンティングを含む臓器、バイオプリントされた操作した組織のサイズは、時間とともに変化する。さらなる実施形態では、バイオプリントした組織または臓器は、例えば、細胞移動、細胞死、細胞接着媒介性の収縮、または収縮の他の形態が原因で、バイオプリンティング後に収縮または縮小する。他の実施形態では、バイオプリントした組織または臓器は、例えば、細胞移動、細胞の成長および増殖、細胞の成熟、または拡大の他の形態が原因で、バイオプリンティング後に成長または拡大する。
【００５２】
幾つかの実施形態では、バイオプリントしたシートは、バイオプリンティング時に少なくとも１５０μｍの厚さである。様々な実施形態では、バイオプリントしたシートは、約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００μｍまたはそれ以上の厚さであり、それらにおいてインクリメントを含む。様々な実施形態では、バイオプリントしたシートは、約５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００μｍ、またはそれ以上の長さ、幅、またはその両方を有することを特徴とし、それらにおいてインクリメントを含む。他の様々な実施形態では、バイオプリントしたシートは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５  ８０  ８５、９０、９５、１００ｍｍ、またはそれ以上の、長さ、幅、またはその両方を有することを特徴とし、それらにおいてインクリメントを含む。他の様々な実施形態では、バイオプリントしたシートは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５  ８０  ８５、９０、９５、１００ｃｍまたはそれ以上の、長さ、幅、またはその両方を有することを特徴とし、それらにおいてインクリメントを含む。例えば、実施例６（および図１）、実施例７（および図２）、実施例９（および図３ａおよび３ｂ）、実施例１０（および図４ａおよび４ｂ）を参照。
【００５３】
幾つかの実施形態では、筋細胞を含む層または全体的な操作した組織または臓器は、実質的に、チューブの形態またはチューブを含む形態である。さらなる実施形態では、チューブは、実質的に、ロールドシートまたは中空のシリンダーである。幾つかの実施形態では、バイオプリントされたチューブは、操作した臓器を構成するために使用される。さらなる実施形態では、バイオプリントしたチューブは、操作した尿管、尿路の導管、卵管、子宮、気管、気管支、リンパ管、尿道、腸、結腸、食道、またはそれらの部分を構成するために使用される。さらなる実施形態では、本明細書に開示されるチューブは、血管または血管チューブではない。バイオプリントしたチューブは、広範囲の適切な寸法を有している。幾つかの実施形態では、寸法は、限定しない例として、創傷治癒、組織修復、組織増大、組織置換、操作した臓器の構成、および臓器置換を含む、特定の使用を促進するために選択される。さらなる実施形態では、寸法は、特定の被験体の特定の使用を促進するために選択される。例えば、１つの実施形態では、チューブは、特定のヒト被験体のリンパ管の特定のセグメントを修復するためにバイオプリントされる。幾つかの実施形態では、バイオプリントしたチューブは、バイオプリンティング時に少なくとも１５０μｍの厚さである管状壁を有することを特徴とする。様々な実施形態では、バイオプリントしたチューブの壁は、約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００μｍまたはそれ以上の厚さであり、それらにおいてインクリメントを含む。幾つかの実施形態では、バイオプリントしたチューブは、バイオプリンティング時に少なくとも約２５０μｍの内径を有することを特徴とする。様々な実施形態では、バイオプリントしたチューブの内径は、約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、６００、７００、８００、９００、１０００μｍ、またはそれ以上であり、それらにおいてインクリメントを含む。他の様々な実施形態では、バイオプリントしたチューブの内径は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ｍｍ、またはそれ以上であり、それらにおいてインクリメントを含む。幾つかの実施形態では、バイオプリントしたチューブの長さは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ｍｍ、またはそれ以上であり、それらにおいてインクリメントを含む。他の実施形態では、バイオプリントしたチューブの長さは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４���２５、２６、２７、２８、２９、３０ｃｍ、またはそれ以上であり、それらにおいてインクリメントを含む。例えば、実施例１３（および図６）を参照。
【００５４】
幾つかの実施形態では、筋細胞を含む層または全体的な操作した組織または臓器は、実質的に、嚢の形態または嚢を含む形態である。さらなる実施形態では、嚢は、実質的に、少なくとも１つの閉鎖端を有するロールドシートまたは中空のシリンダー（例えば、パウチ、カップ、中空、バルーンなど）である。幾つかの実施形態では、嚢は、摂取された物質、胎児（ｆｅｔｕｓ）および関連する流体、体液、または排泄物の抑制を意図した拡張可能な構造であり、入力のための少なくとも１つの開口部および出力のための少なくとも１つの開口部がある。幾つかの実施形態では、バイオプリントした嚢は、既存の臓器または組織を増大させるために使用される。他の実施形態では、バイオプリントした嚢は、既存の臓器または組織を置換するために使用される。さらなる実施形態では、バイオプリントした嚢は、操作した、胃、膀胱、子宮、胆嚢、またはそれらの一部を構成するために使用される。バイオプリントした嚢は、広範囲の適切な寸法を有している。幾つかの実施形態では、寸法は、限定しない例として、創傷治癒、組織修復、組織増大、組織置換、操作した臓器の構成、および臓器置換を含む、特定の使用を促進するために選択される。さらなる実施形態では、寸法は、特定の被験体の特定の使用を促進するために選択される。例えば、１つの実施形態では、嚢は、特定のヒト被験体の膀胱を増大させる又は置換するためにバイオプリントされる。幾つかの実施形態では、バイオプリントした嚢は、バイオプリンティング時に少なくとも１５０μｍの厚さである壁を有することを特徴とする。様々な実施形態では、バイオプリントした嚢の壁は、約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００μｍ、またはそれ以上の厚さであり、それらにおいてインクリメントを含む。
【００５５】
幾つかの実施形態では、移植可能な組織または臓器は、科学的及び／又は医学的な調査に使用される。適切な科学的及び／又は医学的な調査は、インビボおよびインビトロでの調査の両方を含む。さらなる実施形態では、本明細書に記載される、操作した、組織及び／又は臓器は、限定しない例として、疾患モデル、創薬、および薬物スクリーニングを含む、インビトロでの調査のためのものである。
【００５６】
＜細胞＞
本明細書には、幾つかの実施形態において、１つ以上の型の細胞を含む、操作した、移植可能な細胞および臓器が開示される。幾つかの実施形態では、操作した組織および臓器は、筋細胞を含む少なくとも１つの層を含む。それ故、幾つかの実施形態では、細胞は、筋細胞（例えば、平滑筋細胞、骨格筋細胞、心筋細胞）を含む。さらなる実施形態では、筋細胞を含む層はまた、本明細書に記載されるような追加の細胞型、例えば、線維芽細胞、内皮細胞などを含む。幾つかの実施形態では、操作した組織および臓器は、筋細胞を含む層の少なくとも１つの表面上に分配された、筋細胞以外の細胞を含む。さらなる実施形態では、筋細胞を含む層の少なくとも１つの表面上に分配された細胞は、限定しない例として、内皮細胞、神経細胞、周細胞、線維芽細胞、組織に特異的な上皮細胞、軟骨細胞、骨格筋細胞、心細胞、骨由来の細胞、軟組織由来の細胞、中皮細胞、組織に特異的な間質細胞、幹細胞、前駆細胞、およびそれらの組み合わせを含む。
【００５７】
幾つかの実施形態では、任意の脊椎動物細胞は、操作した、移植可能な組織および臓器に含まれることに適している。さらなる実施形態では、細胞は、限定しない例として、収縮細胞または筋細胞（例えば、骨格筋細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、および筋芽細胞）、結合組織細胞（例えば、骨細胞、軟骨細胞、線維芽細胞、および造骨細胞へと分化する細胞、軟骨細胞、またはリンパ組織）、骨髄細胞、内皮細胞、皮膚細胞、上皮細胞、乳房細胞、血管細胞、血液細胞、リンパ細胞、神経細胞、シュワン細胞、胃腸、肝細胞、膵細胞、肺細胞、気管細胞、角膜細胞、尿生殖器細胞、腎細胞、生殖細胞、脂肪細胞、実質細胞、周細胞、中皮細胞、間質細胞、未分化細胞（例えば、胚細胞、幹細胞、および前駆細胞）、内胚葉由来の細胞、中胚葉由来の細胞、外胚葉由来の細胞、およびそれらの組み合わせである。
【００５８】
１つの実施形態では、細胞は、平滑筋細胞である。別の実施形態では、細胞は、少なくとも１つの追加の細胞型と組み合わせた平滑筋細胞である。幾つかの実施形態では、他の細胞型は、線維芽細胞である。幾つかの実施形態では、線維芽細胞は、操作した組織の構造的および生物学的な支持を提供する。さらに別の実施形態では、他の細胞型は、内皮細胞である。幾つかの実施形態では、内皮細胞は、操作した組織の血管化及び／又は微小血管化を促進する。また別の実施形態では、細胞は、平滑筋細胞、線維芽細胞、および内皮細胞である。１つを超える細胞型を含む実施形態では、細胞型は、多くの適切な割合で存在し、それらの例は本明細書に記載される。
【００５９】
幾つかの実施形態では、細胞は、成体の、分化細胞である。さらなる実施形態では、「分化細胞」は、分離時に、例えば、筋細胞、線維芽細胞、または内皮細胞とともに、組織特異的な表現型を有する細胞であり、ここで、組織特異的な表現型（あるいは表現型を示す可能性）は、分離時から使用時まで維持される。他の実施形態では、細胞は、成体の、非分化細胞である。さらなる実施形態では、「非分化細胞」は、例えば、筋細胞、線維芽細胞、または内皮細胞の明確な組織特異的な特性を有さない又は失くした細胞である。幾つかの実施形態では、非分化細胞は、幹細胞を含む。
【００６０】
さらなる実施形態では、「幹細胞」は、効能および自己複製を示す細胞である。幹細胞は、限定されないが、全能細胞、多能性細胞、分化多能細胞、少能性細胞、分化単能細胞、および前駆細胞を含む。様々な実施形態では、幹細胞は、胚性幹細胞、成体幹細胞、羊膜の幹細胞、および人工多能性幹細胞である。他の実施形態では、細胞は、成体の、分化細胞と、成体の、非分化細胞との混合物である。
【００６１】
幾つかの実施形態では、平滑筋細胞は、ヒト平滑筋細胞である。幾つかの実施形態では、適切な平滑筋細胞は、限定しない例として、血管、リンパ管を含む組織、消化管の組織、尿生殖路の組織、脂肪組織、気道の組織、生殖器系の組織、骨髄、および臍帯の組織を含む組織から生じた。幾つかの実施形態では、追加の（非平滑筋）細胞の成分は、対象の標的組織から生じた。他の実施形態では、追加の（非平滑筋）細胞の成分は、対象の標的組織以外の組織から生じた。さらなる実施形態では、細胞の幾つかまたはすべては、哺乳動物の吸引脂肪組織の間質血管細胞群から培養される。実施例１を参照。
【００６２】
様々な実施形態では、細胞の細胞型及び／又はソース（ｓｏｕｒｃｅ）は、具体的な目的または対象に基づいて、選択、構成、処理、または調節される。幾つかの実施形態では、１つ以上の特異的な細胞型は、２つ以上の異なるヒトのドナーに由来する。幾つかの実施形態では、１つ以上の特異的な細胞型は、特定の脊椎動物被験体に由来する。さらなる実施形態では、１つ以上の特異的な細胞型は、特定の哺乳動物被験体に由来する。またさらなる実施形態では、１つ以上の特異的な細胞型は、特定のヒト被験体に由来する。
【００６３】
＜細胞を培養する方法＞
本発明の操作した組織で使用される細胞型は、当該技術分野に既知の任意の方法で適切に培養される。細胞および組織の培養の方法は、当該技術分野で公知であり、例えば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  Ｒ．，  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：  Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  Ｗｉｌｅｙ  （１９８７）に記載され、それらの内容は、そのような情報のための引用によって本明細書に組み込まれる。本発明と併用して適切に使用される、一般的な哺乳動物細胞の培養技術、細胞株、および細胞培養システムも、Ｄｏｙｌｅ，  Ａ．，  Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，  Ｊ．  Ｂ．，  Ｎｅｗｅｌｌ，  Ｄ．  Ｇ．，  （ｅｄｓ．）  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，  Ｗｉｌｅｙ  （１９９８）に記載され、それらの内容は、そのような情報のための引用によって本明細書に組み込まれる。
【００６４】
培養下での哺乳動物細胞のための適切な増殖条件は、当該技術分野に周知である。例えば、実施例１を参照。細胞培養培地は、一般に、必須栄養素を含み、随意に、培養されている細胞タイプに従って選択される、増殖因子、塩、ミネラル、ビタミンなどの、追加の要素を含む。特定の成分は、随意に、細胞の増殖、分化、特異タンパク質の分泌などを高めるために選択される。一般に、標準的な増殖培地は、１１０ｍｇ／Ｌのピルベートおよびグルタミンとともに、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）低グルコースを含み、それらは、当業者に周知の様々な他の標準的な培地のように適切である、１−２０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、子ウシ血清、またはヒト血清、および１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンで補われる。好ましくは、細胞は、細胞の起源の動物の体温で、またはその体温に近い温度で、１−２１％のＯ２および好ましくは３−５％のＣＯ２の大気中で無菌条件下で培養される。例えば、ヒト細胞は、好ましくは、およそ３７℃で培養される。
【００６５】
細胞は、随意に、所望の株にわたって細胞の分化を誘発するために細胞の分化剤によって培養される。例えば、細胞は、随意に、増殖因子、サイトカインなどで培養される。幾つかの実施形態では、用語「増殖因子」は、細胞によって生成され、それ自体に及び／又は様々な他の隣接する又は離れた細胞に影響を与える、タンパク質、ポリペプチド、またはサイトカインを含むポリペプチドの複合体を指す。典型的に、増殖因子は、特異的な型の細胞の増殖及び／又は分化に、発達上で、または多くの生理学的または環境上の刺激に反応してのいずれかで影響を与える。すべてではないが、幾つかの増殖因子は、ホルモンである。典型的な増殖因子は、インスリン、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）を含む線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ＰＤＧＦ−ＡＡおよびＰＤＧＦ−ＡＢを含む血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、形質転換増殖因子アルファ（ＴＧＦ−α）、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３を含む形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、ＩＬ−８などである。増殖因子は、とりわけ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ， Ｄａｒｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， １９８６； Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ２ｄ ｅｄ．， Ｌａｎｚａ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ２０００で議論される。当業者は、本明細書に記載される調整培地中の任意の及び全ての培養由来の増殖因子が本発明の範囲内にあると理解するであろう。
【００６６】
＜バイオインクおよび多細胞集合体＞
本明細書には、特定の実施形態において、１つ以上の層を含む、操作した、移植可能な組織及び／又は臓器が開示され、ここで、少なくとも１つの層は、筋細胞を含む。幾つかの実施形態では、１つ以上の層及び／又は操作した組織または臓器は、細胞物質から本質的に成る。さらなる実施形態では、筋細胞以外の細胞は、１つ以上の層の少なくとも１つの表面上に分配された。幾つかの実施形態では、１つ以上の層は、使用時にスキャフォールドが略ない。幾つかの実施形態では、細胞及び／又は層は、バイオプリンターからバイオインクを堆積させる又は押し出すことによってバイオプリントされる。幾つかの実施形態では、「バイオインク」は、複数の細胞を含む、液体、半固体、または固体の組成物を含む。幾つかの実施形態では、バイオインクは、液体または半固体の細胞溶液、細胞懸濁液、または細胞濃縮液を含む。さらなる実施形態では、細胞溶液、細胞懸濁液、または細胞濃縮液は、液体または半固体（例えば、粘着性）の担体、および複数の細胞を含む。またさらなる実施形態では、担体は、本明細書に記載されるような、適切な細胞栄養培地である。幾つかの実施形態では、バイオインクは、半固体または固体の多細胞の集合体または多細胞体を含む。さらなる実施形態では、バイオインクは、１）結果的にバイオインクをもたらすために、予め決められた割合で複数の細胞または細胞集合体を生体適合性の液体またはゲル剤と混合することによって、および２）所望の細胞密度および粘性を有するバイオインクを生成するために、バイオインクを圧縮する（ｃｏｍｐａｃｔｉｎｇ）ことによって生成される。幾つかの実施形態では、バイオインクの圧縮は、遠心分離、タンジェント流ろ過（「ＴＦＦ」）、またはその組み合わせによって達成される。幾つかの実施形態では、バイオインクの圧縮は、結果的に、押し出し成形できる組成物をもたらし、多細胞の集合体または多細胞体の形成を可能にする。幾つかの実施形態では、「押し出し成形できる」は、ノズルまたはオリフィス（例えば、１つ以上の穴またはチューブ）を通して押し進める（ｆｏｒｃｉｎｇ）（例えば、圧力下で）ことにより形作られることができることを意味する。幾つかの実施形態では、バイオインクの圧縮は、適切な密度まで細胞を育てることから起因する。バイオインクに必要な細胞密度は、使用されている細胞および生成されている組織または臓器に応じて異なる。幾つかの実施形態では、バイオインクの細胞は、凝集及び／又は接着される。幾つかの実施形態では、「凝集する」、「凝集した」、および「凝集」は、細胞、多細胞集合体、多細胞体、及び／又はそれらの層を結合する細胞間の接着特性を指す。さらなる実施形態では、前記用語は、「融合する」、「融合した」、および「融合」と交換可能に使用される。幾つかの実施形態では、バイオインクはさらに、支持材、細胞培養培地（あるいはその補足物）、細胞外マトリックス（あるいはその成分）、細胞接着剤、細胞死抑制剤、抗アポトーシス性薬剤、抗酸化剤、押出化合物、およびそれらの組み合わせを含む。
【００６７】
様々な実施形態では、細胞は、任意の適切な細胞である。さらなる様々な実施形態では、細胞は、脊椎動物細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞、またはそれらの組み合わせである。幾つかの実施形態では、本明細書に開示される方法に使用される細胞の型は、生成されている構成物または組織の型に依存する。幾つかの実施形態では、バイオインクは、１つの型の細胞を含む（「均質な（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ）」または「単型の（ｍｏｎｏｔｙｐｉｃ）」バイオインクとも呼ばれる）。幾つかの実施形態では、バイオインクは、１つを超える型の細胞を含む（「不均質な（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ）」または「多型の（ｐｏｌｙｔｙｐｉｃ）」バイオインクとも呼ばれる）。
【００６８】
様々な実施形態では、バイオインクは、調製される時に、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５、９９．９、および１００％の細胞物質を含み、それらにおいてインクリメントを含む。様々な実施形態では、バイオインクは、バイオプリンティングに使用される時に、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５、９９．９、および１００％の細胞物質を含み、それらにおいてインクリメントを含む。
【００６９】
＜細胞培養培地＞
幾つかの実施形態では、バイオインクは、細胞培養培地を含む。細胞培養培地は、任意の適切な培地である。様々な実施形態では、適切な細胞培養培地は、限定しない例として、ダルベッコ燐酸緩衝生理食塩水、Ｅａｒｌｅ’ｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔｓ、Ｈａｎｋｓ’  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔｓ、Ｔｙｒｏｄｅ’ｓ  Ｓａｌｔｓ、オルシーバー液、Ｇｅｙ’ｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｋｒｅｂ’ｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ、Ｋｒｅｂ’ｓ−Ｒｉｎｇｅｒ  Ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ、Ｐｕｃｋ’ｓ  Ｓａｌｉｎｅ、ダルベッコ変法イーグル培地、ダルベッコ変法イーグル培地／栄養素Ｆ−１２Ｈａｍ、栄養素混合物Ｆ−１０Ｈａｍ（Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１０）、培地１９９、最少必須培地イーグル、ＲＰＭＩ−１６４０培地、Ａｍｅｓ’  Ｍｅｄｉａ、ＢＧＪｂ培地（Ｆｉｔｔｏｎ−Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、Ｃｌｉｃｋ’ｓ培地、ＣＭＲＬ−１０６６培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、Ｇｌａｓｃｏｗ最少必須培地（ＧＭＥＭ）、Ｉｓｃｏｖｅ変法ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、Ｌ−１５培地（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ）、ＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ変法培地、ＮＣＴＣ培地、Ｓｗｉｍ’ｓ  Ｓ−７７培地、Ｗａｙｍｏｕｔｈ培地、Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓ培地Ｅ、あるいはそれらの組み合わせを含む。幾つかの実施形態では、細胞培養培地は、変更されるか又は補足される。幾つかの実施形態では、細胞培養培地はさらに、アルブミン、セレン、トランスフェリン、フェチュイン、砂糖、アミノ酸、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、ホルモン、抗生物質、脂質、脂質担体、シクロデキストリン、多血小板血漿、またはそれらの組み合わせを含む。
【００７０】
＜細胞外マトリックス＞
幾つかの実施形態では、バイオインクはさらに、細胞外マトリックスまたはその誘導体の１つ以上の成分を含む。幾つかの実施形態では、「細胞外マトリックス」は、細胞によって生成され、細胞から細胞外空間へと輸送されるタンパク質を含み、ここで、タンパク質は、組織を一緒に保持するための支持として機能し、引っ張り強度を提供し、及び／又は細胞シグナル伝達を促進する。細胞外マトリックス成分の例は、限定されないが、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ヒアルロナート、エラスチン、およびプロテオグリカンを含む。例えば、多細胞集合体は、幾つかの場合において、様々なＥＣＭタンパク質（例えば、ゼラチン、フィブリノゲン、フィブリン、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、エラスチン、及び／又はプロテオグリカン）を含有する。幾つかの実施形態では、ＥＣＭ成分またはＥＣＭ成分の誘導体は、多細胞集合体を形成するために使用される細胞ペーストに加えられる。さらなる実施形態では、細胞ペーストに加えられたＥＣＭ成分またはＥＣＭ成分の誘導体は、ヒトまたは動物のソースから精製されるか、または当該技術分野に既知の組換え方法によって生成される。あるいは、ＥＣＭ成分またはＥＣＭ成分の誘導体は、細長い細胞体中の細胞によって自然に分泌されるか、または細長い細胞体を作るために使用される細胞は、当該技術分野に公知の任意の適切な方法によって遺伝子操作されることで、１つ以上のＥＣＭ成分またはＥＣＭ成分の誘導体及び／又は１つ以上の細胞接着分子または細胞基質接着分子（例えば、セレクチン、インテグリン、免疫グロブリン、およびアドヘリン（ａｄｈｅｒｉｎｓ））の発現レベルを変化させることができる。幾つかの実施形態では、ＥＣＭ成分またはＥＣＭ成分の誘導体は、多細胞集合体中の細胞の凝集を促進する。例えば、幾つかの実施形態では、ゼラチン及び／又はフィブリノゲンは、細胞ペーストに適切に加えられ、多細胞集合体を形成するために使用される。さらなる実施形態では、フィブリノゲンは、トロンビンの付加によってフィブリンに転換される。
【００７１】
幾つかの実施形態では、バイオインクは、細胞接着を促進する薬剤をさらに含む。
【００７２】
幾つかの実施形態では、バイオインクは、細胞死（例えば、壊死、アポトーシス、または自己貪食）を阻害する薬剤をさらに含む。幾つかの実施形態では、バイオインクは、抗アポトーシス性薬剤をさらに含む。細胞死を阻害する薬剤は、限定されないが、小分子、抗体、ペプチド、ペプチ体（ｐｅｐｔｉｂｏｄｉｅｓ）、またはそれらの組み合わせを含む。幾つかの実施形態では、細胞死を阻害する薬剤は、抗ＴＮＦ薬剤、インターロイキンの活性を阻害する薬剤、インターフェロンの活性を阻害する薬剤、ＧＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）の活性を阻害する薬剤、マクロファージ炎症蛋白の活性を阻害する薬剤、ＴＧＦ−Ｂ（形質転換増殖因子Ｂ）の活性を阻害する薬剤、ＭＭＰ（マトリックスメタロプロテアーゼ）の活性を阻害する薬剤、カスパーゼの活性を阻害する薬剤、ＭＡＰＫ／ＪＮＫシグナル伝達カスケードの活性を阻害する薬剤、Ｓｒｃキナーゼの活性を阻害する薬剤、ＪＡＫ（ヤヌス・キナーゼ）の活性を阻害する薬剤、またはそれらの組み合わせから選択される。幾つかの実施形態では、バイオインクは、抗酸化剤を含む。
【００７３】
＜押出化合物＞
幾つかの実施形態では、バイオインクはさらに、押出化合物（すなわち、バイオインクの押出特性を変更する化合物）を含む。押出化合物の例は、限定されないが、ゲル剤、ヒドロゲル、ペプチドヒドロゲル、アミノ酸ベースのゲル剤、界面活性剤ポリオール（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７またはＰＦ−１２７）、熱応答性ポリマー、ヒアルロナート、アルギナート、細胞外マトリックス成分（およびその誘導体）、コラーゲン、他の生体適合性の天然または合成のポリマー、ナノファイバー、および自己集合性ナノファイバーを含む。
【００７４】
ときにゼリー剤とも呼ばれる、ゲル剤は、様々な方法で定義されてきた。例えば、米国薬局方は、ゲル剤を、液体がしみこんだ小さな無機粒子または大きな有機分子のいずれかで構成されている懸濁液から成る半固体系として定義している。ゲル剤は、単相系または二相系を含む。単相ゲルは、分散した高分子と液体との間に明らかな境界が存在しない方法で、液体全体に均一に分布する有機高分子からなる。幾つかの単相ゲルは、合成高分子（例えば、カルボマー）または天然ゴム（例えば、トラガカント）から調製される。幾つかの実施形態では、単相ゲルは、一般的に水性であるが、アルコールおよび油を用いても作成されるであろう。二相ゲルは、小さな別個の粒子の網目構造からなる。
【００７５】
ゲル剤は、幾つかの場合において、疎水性または親水性であると分類される。特定の実施形態では、疎水性ゲルの基剤は、ポリエチレンを有する液体パラフィン、またはコロイド状シリカでゲル化した脂肪油、またはアルミニウム石鹸または亜鉛石鹸からなる。対称的に、疎水性ゲルの基材は、通常は、水、グリセロール、または適切なゲル化剤（例えば、トラガカント、デンプン、セルロース誘導体、カルボキシビニルポリマー、マグネシウム−アルミニウムシリケート）でゲル化したプロピレングリコールからなる。特定の実施形態では、本明細書に開示する組成物またはデバイスのレオロジーは、プラスチックに似ているか、プラスチックであるか、チキソトロピーであるか、またはダイラタントである。
【００７６】
適切なヒドロゲルは、コラーゲン、ヒアルロナート、フィブリン、アルギナート、アガロース、キトサン、およびそれらの組み合わせに由来するものを含む。他の実施形態では、適切なヒドロゲルは、合成ポリマーである。さらなる実施形態では、適切なヒドロゲルは、ポリ（アクリル酸）およびその誘導体、ポリ（酸化エチレン）およびそのコポリマー、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、およびそれらの組み合わせに由来するものを含む。様々な具体的な実施形態では、制限物質は、ヒドロゲル、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）、アガロース、アルギナート、ゼラチン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）、ヒアルロナン、ポロクサマー、ペプチドヒドロゲル、ポリ（イソプロピルｎ−ポリアクリルアミド）、ポリエチレングリコール・ジアクリラート（ＰＥＧ−ＤＡ）、ヒドロキシエチルメタクリレート、ポリジメチルシロキサン、ポリアクリルアミド、ポリ（乳酸）、シリコン、シルク、あるいはそれらの組み合わせから選択される。
【００７７】
幾つかの実施形態では、ヒドロゲルベースの押出化合物は、（熱応答性のゲル剤または温熱ゲル（ｔｈｅｒｍｏｇｅｌｓ）としても知られる）熱可逆性のゲル剤である。幾つかの実施形態では、適切な熱可逆性のヒドロゲルは、室温で液体ではない。具体的な実施形態では、適切なヒドロゲルのゲル化温度（Ｔｇｅｌ）は、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃であり、それらにおいてインクリメントを含む。特定の実施形態では、適切なヒドロゲルのＴｇｅｌは、約１０℃乃至約４０℃である。さらなる実施形態では、適切なヒドロゲルのＴｇｅｌは、約２０℃乃至約３０℃である。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるバイオインク（例えば、ヒドロゲル、１つ以上の細胞型、他の添加剤などを含む）は、室温で液体ではない。幾つかの実施形態では、適切な熱可逆性のヒドロゲルは、哺乳動物の体温で液体ではない。具体的な実施形態では、適切なヒドロゲルのゲル化温度（Ｔｇｅｌ）は、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４１℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃であり、それらにおいてインクリメントを含む。特定の実施形態では、適切なヒドロゲルのＴｇｅｌは、約２２℃乃至約５２℃である。さらなる実施形態では、適切なヒドロゲルのＴｇｅｌは、約３２℃乃至約４２℃である。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるバイオインク（例えば、ヒドロゲル、１つ以上の細胞型、他の添加剤などを含む）は、哺乳動物の体温で液体ではない。具体的な実施形態では、本明細書に記載されるバイオインクのゲル化温度（Ｔｇｅｌ）は、約１０℃、約１５℃、約２０℃、約２５℃、約３０℃に、約３５℃、約４０℃、約４５℃、約５０℃、約５５℃であり、それらにおいてインクリメントを含む。具体的な実施形態では、本明細書に記載されるバイオインクのＴｇｅｌは、約１０℃乃至約１５℃である。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載されるバイオインクのＴｇｅｌは、約１５℃乃至約２０℃である。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載されるバイオインクのＴｇｅｌは、約２０℃乃至約２５℃である。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載されるバイオインクのＴｇｅｌは、約２５℃乃至約３０℃である。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載されるバイオインクのＴｇｅｌは、約３０℃乃至約３５℃である。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載されるバイオインクのＴｇｅｌは、約３５℃乃至約４０℃である。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載されるバイオインクのＴｇｅｌは、約４０℃乃至約４５℃である。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載されるバイオインクのＴｇｅｌは、約４５℃乃至約５０℃である。
【００７８】
ポリオキシプロピレンおよびポリオキシエチレンで構成されるポリマーは、水溶液に組み込まれると、熱可逆性のゲルを形成する。これらのポリマーは、バイオプリンター機器において維持可能な温度で、液態からゲル状態まで変化する能力を有している。液態からゲル状態の相転移は、ポリマー濃度および溶液中の成分に依存する。
【００７９】
ポロクサマー４０７（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７またはＰＦ‐１２７）は、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーから成る非イオン性界面活性剤である。他のポロクサマーとは、１８８（Ｆ−６８グレード）、２３７（Ｆ−８７グレード）、３３８（Ｆ−１０８グレード）を含む。ポロクサマーの水溶液は、酸、アルカリ、および金属イオンの存在下で安定している。ＰＦ−１２７は、市販で入手可能な、１３，０００の平均分子量を有する、一般式Ｅ１０６ Ｐ７０ Ｅ１０６のポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレントリブロックコポリマーである。前記ポリマーは、ポリマーのゲル化特性を増強する適切な方法によってさらに精製される。前記ポリマーは、親水性を構成する、約７０％のエチレンオキシドを含有している。前記ポリマーは、ポロクサマーＡＢＡ型ブロックコポリマーのシリーズの１つである。ＰＦ−１２７は、良好な可溶化能力を有し、毒性が低く、したがって、適切な押出化合物と考えられる。幾つかの実施形態では、本明細書で示されるヒドロゲルおよびバイオインクの粘度は、記載される任意の手段で測定される。例えば、幾つかの実施形態では、ＬＶＤＶ‐ＩＩ＋ＣＰ  Ｃｏｎｅ  ＰｌａｔｅＶｉｓｃｏｍｅｔｅｒおよびＣｏｎｅ  Ｓｐｉｎｄｌｅ  ＣＰＥ‐４０が、ヒドロゲルおよびバイオインクの粘度を算出するために使用される。他の実施形態では、Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ（スピンドルおよびカップ）の粘度計が、ヒドロゲルおよびバイオインクの粘度を算出するために使用される。幾つかの実施形態では、本明細書で参照する粘度範囲は、室温で測定される。他の実施形態では、本明細書で参照する粘度範囲は、体温（例えば、健康なヒトの平均体温）で測定される。
【００８０】
さらなる実施形態では、ヒドロゲル及び／又はバイオインクは、約５００乃至１，０００，０００センチポアズ、約７５０乃至１，０００，０００センチポアズ；約１０００乃至１，０００，０００センチポアズ；約１０００乃至４００，０００センチポアズ；約２０００乃至１００，０００センチポアズ；約３０００乃至５０，０００センチポアズ；約４０００乃至２５，０００センチポアズ；約５０００乃至２０，０００センチポアズ；あるいは約６０００乃至１５，０００センチポアズの間の粘度を有していることを特徴とする。
【００８１】
幾つかの実施形態では、バイオインクは、連続的なバイオプリンティングに適した細胞および押出化合物を含む。具体的な実施形態では、バイオインクは、約１５００ｍＰａ・ｓの粘度を有する。幾つかの実施形態では、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７および細胞物質の混合物は、連続的なバイオプリンティングに適している。さらなる実施形態では、そのようなバイオインクは、４８時間にわたる冷たい（４℃）リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の連続混合によるＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７の粉末剤を、３０％（ｗ／ｖ）まで溶解することによって調製される。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７はまた、水中で適切に溶解される。細胞は、随意に、標準の無菌の細胞培養技術を使用して、培養される且つ拡張される。幾つかの実施形態では、細胞は、例えば２００ｇでペレットにされ、３０％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−１２７で再懸濁される。さらなる実施形態では、バイオプリンターに付けられたリザーバーへと吸引され、約１０乃至約２５℃のゲル化温度で凝固することを可能にする。バイオプリンティング前のバイオインクのゲル化は随意である。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７を包含するバイオインクを含む、バイオインクは、液体として随意に分注される。
【００８２】
様々な実施形態では、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７の濃度は、適切な粘度及び／又は細胞毒性の特性を有する任意の値である。幾つかの実施形態では、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７の適切な濃度は、バイオプリントされたときにその形状を保持しながら、重さを支える。幾つかの実施形態では、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７の濃度は、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、あるいは約５０％である。幾つかの実施形態では、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７の濃度は、約３０％と約４０％の間、または約３０％と約３５％の間である。
【００８３】
幾つかの実施形態では、バイオインクの細胞構造がない成分（例えば、押出化合物など）は、使用前に取り除かれる。さらなる実施形態では、細胞構造がない成分は、例えば、ヒドロゲル、ペプチドヒドロゲル、アミノ酸ベースのゲル剤、界面活性剤ポリオール、熱応答性ポリマー、ヒアルロナート、アルギナート、コラーゲン、または他の生体適合性の天然または合成のポリマーである。またさらなる実施形態では、細胞構造がない成分は、物理的、化学的、または酵素的な手段によって取り除かれる。幾つかの実施形態では、一部の細胞構造がない成分は、使用時に細胞成分に関連付けられたままである。
【００８４】
幾つかの実施形態では、細胞は、細胞間相互作用を増加させるために予め処理される。例えば、細胞は、随意に、バイオインクを形作る前に、細胞間相互作用を増強するために遠心分離後に遠心管の内部で適切にインキュベートされる。さらなる例として、細胞は、随意に、イオン平衡を調節するものなどの、細胞間相互作用を促進する分子または試薬にさらされる。
【００８５】
＜典型的な細胞の割合＞
幾つかの実施形態では、組織層を構築するために利用されるバイオインクは、多細胞体を含み、これはさらに、筋細胞（例えば、平滑筋細胞、骨格筋細胞、及び／又は心筋細胞）および１つ以上の追加の細胞型を含む。さらなる実施形態では、筋細胞と他の細胞成分の割合は、任意の適切な割合である。またさらなる実施形態では、筋細胞と他の細胞成分の割合は、約９０：１０から約６０：４０までである。特定の実施形態では、多細胞体は、筋細胞および内皮細胞を含み、筋細胞と内皮細胞の割合は、約８５：１５である。別の特定の実施形態では、多細胞体は、筋細胞および内皮細胞を含み、筋細胞と内皮細胞の割合は、約７０：３０である。
【００８６】
幾つかの実施形態では、組織層を構築するために利用されるバイオインクは、多細胞体を含み、これはさらに、筋細胞および線維芽細胞を含む。さらなる実施形態では、筋細胞と線維芽細胞の割合は、任意の適切な割合である。またさらなる実施形態では、筋細胞と線維芽細胞の割合は、約９０：１０から約６０：４０までである。
【００８７】
幾つかの実施形態では、組織層を構築するために利用されるバイオインクは、多細胞体を含み、これはさらに、筋細胞、線維芽細胞、および内皮細胞を含む。さらなる実施形態では、筋細胞、線維芽細胞、および内皮細胞の割合は、任意の適切な割合である。またさらなる実施形態では、筋細胞と内皮細胞と線維芽細胞の割合は、約７０：２５：５である。
【００８８】
＜細胞の自己選別（Ｓｅｌｆ−ｓｏｒｔｉｎｇ）＞
幾つかの実施形態では、構成物または組織を形成するために使用される多細胞集合体は、操作した組織または臓器に含められるすべての細胞型（例えば、筋細胞および１つ以上の追加の細胞型）を含み；このような例では、各細胞型は、操作した組織または臓器を形成するために、（例えば、成熟の間に）適切な位置へと遊走する。他の実施形態では、構造を形成するために使用される多細胞集合体は、操作した組織に含められるすべての細胞型より少ない細胞型を含む。幾つかの実施形態では、各型の細胞は、多細胞集合体または組織の領域または層内に均一に分散される。他の実施形態では、各型の細胞は、多細胞集合体または組織の領域または層内の特定の領域に局在化する。
【００８９】
例えば、適切な割合（例えば、８５：１５、７０：３０など）で平滑筋細胞と内皮細胞を含む、操作した平滑筋のシートの場合には、隣接する、バイオプリントされた、凝集した多型の円柱状のバイオインクユニットは、融合する。成熟中に、内皮細胞は、構成物の周辺にある程度まで局在化し、コラーゲンが形成される。例えば、図１、２、３ａ、および４ｂを参照。さらなる例として、適切な割合（例えば、７０：２５：５など）で平滑筋細胞、線維芽細胞、および内皮細胞を含む、バイオプリントした平滑筋のパッチの場合には、バイオプリントした多型の円柱状のバイオインクユニットは、融合し、内皮細胞は、構成物の周辺にある程度まで局在化する。幾つかの実施形態では、構成物内の細胞型の局在化は、インビボまたはエキソビボの哺乳動物組織の層構造体を模倣する。
【００９０】
幾つかの実施形態では、細胞の選別または自己選別は、細胞の１つ以上の層の適用によって加速されるか、増強されるか、または増大される。例えば、幾つかの実施形態では、平滑筋細胞および他の細胞型（内皮細胞及び／又は線維芽細胞など）を含む、多型のバイオインクによってバイオプリントされた構成物はさらに、構成物の１つ以上の表面上で第２細胞型の層の適用にさらされる。さらなる実施形態では、第２細胞型の層を適用することによって結果的に、多型のバイオインク内の細胞の空間的選別が増大する。
【００９１】
＜予め形成されたスキャフォールド＞
幾つかの実施形態において、本明細書には、任意の予め形成されたスキャフォールドが略ない、操作された、移植可能な組織および臓器が開示される。さらなる実施形態では、「スキャフォールド」は、ポリマースキャフォールドおよび多孔性ヒドロゲルなどの合成のスキャフォールド、予め形成された細胞外マトリックスの層、死細胞の層、および脱細胞化組織などの非合成のスキャフォールド、および操作した組織及び／又は臓器の物理的構造にとって不可欠である、および組織及び／又は臓器から取り除かれることができない、任意の他の種類の予め形成されたスキャフォールドを指す。さらなる実施形態では、脱細胞化組織のスキャフォールドは、例えば、生きている間に生成したＥＣＭを残して、死滅される又は脱細胞化される細胞層などの、任意の方法における培養細胞によって生じた、脱細胞化した天然組織または脱細胞化した細胞物質を含む。
【００９２】
幾つかの実施形態では、操作した、移植可能な組織および臓器は、例えば、組織の形成、組織の任意の層、または組織の形状の形成のために、予め形成されたスキャフォールドを利用しない。限定しない例として、本発明の操作した組織は、ポリマースキャフォールド、予め形成された細胞外マトリックス層、または任意の他のタイプの予め形成されたスキャフォールドなどの、予め形成された、合成のスキャフォールドを利用しない。幾つかの実施形態では、移植可能な組織および臓器は、使用時に任意の予め形成されたスキャフォールドが略ない。さらなる実施形態では、組織および臓器は、使用時に、検知可能な量であるが、微量または取るに足らない量、例えば、全組成物の２．０％未満のスキャフォールドを含む。またさらなる実施形態では、微量または取るに足らない量のスキャフォールドは、組織の長期的な作用に影響を与える又はその主要な生体機能を妨害するには不十分である。追加の実施形態では、スキャフォールド成分は、物理的、化学的、あるいは酵素的な方法によって、プリンティング後に取り除かれ、スキャフォールド成分がない又は略ない操作した組織をもたらす。またさらなる実施形態では、操作した、移植可能な組織および臓器は、量に基づいて、約７０％までの生体適合性のスキャフォールドを含有している。またさらなる実施形態では、操作した、移植可能な組織および臓器は、使用時に、量に基づいて、約５０％までの生体適合のスキャフォールドを含有している。
【００９３】
幾つかの実施形態では、本明細書に開示される、予め形成されたスキャフォールドがない又は略ない、操作した、移植可能な組織および臓器は、スキャフォールド材が第１工程で形成される組織工学の特定の他の方法によって発達されたものとは対照的であり、その後、細胞は、第２工程でスキャフォールド上に蒔かれる。続いて、細胞は、例えば、スキャフォールドの形状を満たす且つとるために増殖する。１つの態様では、本明細書に記載されるバイオプリンティングの方法は、予め形成されたスキャフォールドが略ない、実行可能で有用な組織の生成を可能にする。別の態様では、本発明の細胞は、幾つかの実施形態において、制限物質を使用して、所望の三次元形状で保持される。制限物質は、少なくとも、制限物質が細胞及び／又は組織からの一時的なものであり及び／又は除去可能であるという事実から、スキャフォールドとは異なる。
【００９４】
＜筋細胞を含む層＞
本明細書には、特定の実施形態において、１つ以上の層を含む、操作した、移植可能な組織および臓器が開示され、ここで、操作した組織または臓器の少なくとも１つの層は、筋細胞を含む。幾つかの実施形態では、操作した、移植可能な組織および臓器は、筋の少なくとも１つの層を含む。筋細胞及び／又は筋を含む適切な層は、細胞物質を含む。様々な実施形態では、筋細胞を含む適切な層は、構成時に、約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５、９９．９、および１００％の細胞物質の組成物を有し、それらにおいてインクリメントを含む。他の様々な実施形態では、筋細胞を含む適切な層は、使用時に、約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５、９９．９、および１００％の細胞物質の組成物を有し、それらにおいてインクリメントを含む。幾つかの実施形態では、筋細胞を含む層（複数可）は、三次元の幾何学的形状で融合した細胞要素を含む。さらなる実施形態では、筋細胞を含む層（複数可）は、バイオプリントされた。
【００９５】
幾つかの実施形態では、筋細胞を含む層は、平滑筋を含む。幾つかの実施形態では、筋細胞を含む層は、骨格筋を含む。幾つかの実施形態では、筋細胞を含む層は、心筋を含む。幾つかの実施形態では、筋細胞を含む層（複数可）は、本明細書に記載されるような、（筋細胞に加えて）任意の型の哺乳動物細胞を含む。様々なさらなる実施形態では、層は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７の、１８、１９、２０、またはそれ以上の追加の細胞型を含む．幾つかの実施形態では、操作した組織および臓器は、１以上の特定のヒト被験体に由来する１つ以上の細胞型を含む。様々な実施形態では、操作した組織および臓器は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の特定のヒト被験体に由来する細胞型を含む。他の実施形態では、１つ以上の特異的な細胞型は、特定の脊椎動物被験体に由来する。さらなる実施形態では、１つ以上の特異的な細胞型は、特定の哺乳動物被験体に由来する。またさらなる実施形態では、１つ以上の特異的な細胞型は、特定のヒト被験体に由来する。
【００９６】
幾つかの実施形態では、平滑筋の層は、平滑筋細胞および内皮細胞を含む。実施例３は、ヒト大動脈の平滑筋細胞およびヒト大動脈の内皮細胞から成る円柱状のバイオインクの成形を実証し、一方で、実施例５は、ヒトの吸引脂肪組織の間質血管細胞群から培養された平滑筋細胞および内皮細胞から成るバイオインクの成形を実証する。実施例６は、平滑筋のパッチを形成するために、そのような円柱のバイオプリンティングおよび融合を実証する。他の実施形態では、平滑筋の層は、平滑筋細胞および線維芽細胞を含む。また他の実施形態では、平滑筋の層は、平滑筋細胞、内皮細胞、および線維芽細胞を含む。実施例４は、ヒト大動脈の平滑筋細胞、ヒト真皮線維芽細胞およびヒト大動脈の内皮細胞から成る、多型のバイオインクの成形を実証する。幾つかの実施形態では、平滑筋を層の細胞は、互いに「凝集」または「接着」している。さらなる実施形態では、凝集または付着は、細胞、多細胞集合体、多細胞体、及び／又はそれらの層を結合する細胞間の付着特性を指す。
【００９７】
操作した移植可能な組織および臓器は、任意の適切な数の層を含む。様々な実施形態では、操作した組織および臓器は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５またはそれ以上の層を含む。いくつかの実施形態では、層はバイオプリントされ、多細胞体（例えば、細長い、円柱状またはリボン状体）の配置、パターン、または配向によって定義された配向を有する。さらなる実施形態では、操作した組織または臓器は、１つより多い層を含み、各層は、１つ以上の他の層に対して特定の配向を有することを特徴とする。様々な実施形態では、１つ以上の層は、隣接層に対して回転を含む配向を有し、ここで回転は、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、または１８０度、もしくはそれらにおけるインクリメントである。他の実施形態では、すべての層は、略同様に配向されている。
【００９８】
適切な層は、任意の適切な厚さを有することを特徴とする。様々な実施形態では、適切な層は、構成時に、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００μｍ、またはそれ以上の厚さを有し、それらにおいてインクリメントを含む。他の様々な実施形態では、使用時に、適切な層は、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００μｍまたはそれ以上の厚さを有し、それらにおいてインクリメントを含む。
【００９９】
筋細胞を含む適切な層は、任意の適切な厚さを有することを特徴とする。様々な実施形態では、筋細胞を含む適切な層は、構成時に、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００μｍまたはそれ以上の厚さを有し、それらにおいてインクリメントを含む。他の様々な実施形態では、筋細胞を含む適切な層は、使用時に、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００μｍまたはそれ以上の厚さを有し、それらにおいてインクリメントを含む。
【０１００】
いくつかの実施形態では、筋細胞を含む層は、略シートの形態またはシートを含む形態である。さらなる実施形態では、筋のバイオプリントされたシートは、操作した組織または臓器を構成するように使用される。さらに別の実施形態では、筋のバイオプリントされたシートは、筋肉壁の全部または一部を外科的に構成するように使用される。さらに別の実施形態では、筋のバイオプリントされたシートは、胃腸壁、泌尿器壁、または気道壁の全部または一部を外科的に構成するように使用される。さらに別の実施形態では、筋のバイオプリントされたシートは、膀胱、胃、腸、食道、尿道、子宮、尿管、またはその部分の全てまたは一部を外科的に構成するように使用される。さらに別の実施形態では、筋のバイオプリントされたシートは、膀胱壁、胃壁、腸壁、食道壁、尿道壁、子宮壁、尿管壁、またはその部分の全体または一部を外科的に構成するように使用される。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、筋細胞を含む層は、略チューブの形態またはチューブを含む形態である。さらなる実施形態では、筋のバイオプリントされたチューブは、操作した臓器を構成するように使用される。さらに別の実施形態では、筋のバイオプリントされたチューブは、操作した尿管、尿路の導管、肛門十二指腸の腸内の導管、卵管、子宮、気管、気管支、リンパ管、尿道、腸、結腸、食道、またはその部分を構成するように使用される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されたチューブは血管ではない。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、筋細胞を含む層は、略嚢の形態または嚢を含む形態である。さらなる実施形態では、筋のバイオプリントされた嚢は、操作した臓器を構成するように使用される。さらに別の実施形態では、筋のバイオプリントされた嚢は、操作した胃、膀胱、子宮、胆嚢、またはその部分を構成するように使用される。
【０１０３】
筋細胞以外の細胞
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される操作した移植可能な組織および臓器は、筋細胞を含む少なくとも１つの層を含む。さらなる実施形態では、本明細書に開示される操作した移植可能な組織および臓器は、筋および／または筋細胞を含む少なくとも１つの層を含む。さらに別の実施形態では、本明細書に開示される操作した移植可能な組織および臓器は、平滑筋および／または平滑筋細胞を含む少なくとも１つの層を含む。さらに別の実施形態では、本明細書に開示される操作した移植可能な組織および臓器は、骨格筋および／または骨格筋細胞を含む少なくとも１つの層を含む。さらに別の実施形態では、本明細書に開示される操作した移植可能な組織および臓器は、心筋および／または心筋細胞を含む少なくとも１つの層を含む。さらなる実施形態では、操作した移植可能な組織および臓器は、筋細胞以外の細胞を含む。いくつかの実施形態では、筋細胞以外の細胞が筋細胞を含む層に組み込まれる。様々なさらなる実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはそれ以上の細胞の型が筋細胞を含む層に組み込まれる。いくつかの実施形態では、筋細胞以外の細胞が筋細胞を含む層の少なくとも１つの表面に分配される。様々なさらなる実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはそれ以上の細胞の型が筋細胞を含む層の上に分配される。さらに他の様々な実施形態では、筋細胞以外の細胞が筋細胞を含む層の１、２、３、４以上の表面に分配される。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、筋細胞を含む層の少なくとも１つの表面に分配した細胞は、任意の哺乳動物細胞の型、例えば本明細書に記載のものなどを含む。いくつかの実施形態では、分配された細胞は、１つ以上の特定のヒト被験体に由来する１つ以上の細胞型を含む。様々な実施形態では、分配された細胞は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の特定のヒト被験体に由来する細胞型を含む。他の実施形態では、１つ以上の特定の細胞型は、特定の脊椎動物被験体に由来する。さらなる実施形態では、１つ以上の特定の細胞型は、特定の哺乳動物被験体に由来する。さらに別の実施形態では、１つ以上の特定の細胞型は、特定のヒト被験体に由来する。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、筋細胞以外の細胞が細胞の層として筋の１つ以上の表面上に分配される。さらなる実施形態では、細胞の分配された層は細胞の単層を含む。さらなる実施形態では、単層は集密的である。他の実施形態では、単層は、集密的でない。いくつかの実施形態では、筋細胞以外の細胞は、細胞の１つ以上のシートとして筋の１つ以上の表面上に分配される。様々な実施形態では、細胞のシートは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００の細胞、またはそれ以上の細胞の厚さであり、それらにおいてインクリメントを含む。他の様々な実施形態では、細胞のシートは、約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００μｍ、またはそれ以上の厚さであり、それらにおいてインクリメントを含む。いくつかの実施形態では、筋細胞以外の細胞は、細胞の融合した集合体として筋の１つ以上の表面上に分配される。さらなる実施形態では、融合前に、細胞の集合体は、非限定的な例として、略球形、細長い、略円柱状、リボン状の形状を有する。様々な実施形態では、細胞の融合した集合体は、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００μｍ以上の厚さであり、それらにおいてインクリメントを含む。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、操作した組織および臓器は、筋を含む層の１つ以上の表面上に分配された第２の非筋細胞型を含む。実施例７は、ヒト血管平滑筋細胞の集合体（例えば、シリンダ）をバイオプリントし、続いてＳＭＣ構成物の上面に内皮細胞の層をバイオプリントすることによる平滑筋パッチの構成を立証する。実施例８は、ヒト大動脈平滑筋細胞集合体（例えば、シリンダ）をバイオプリントし、続いて上面に第２の細胞型の層を適用することによる平滑筋パッチの構成を立証する。当該適用は、内皮細胞懸濁液の特異的に位置する液滴をＳＭＣ構成物に堆積させることによって達成される。いくつかの実施形態では、操作した組織および臓器は、平滑筋の層の１つ以上の表面上に分配された第三の細胞型、例えば線維芽細胞を含む。
【０１０７】
実施例９は、第２の細胞型（例えば、線維芽細胞）からなる層上にヒト大動脈平滑筋細胞集合体（例えば、シリンダ）を直接的にバイオプリントし、続いて第３の細胞の層（例えば、内皮細胞）を上面に適用することによる平滑筋パッチの構成を立証する。上部細胞層は、細胞懸濁液の特異的に位置する液滴を平滑筋層の上に堆積によって適用される。実施例９の手順は、凝集平滑筋細胞含む組織、平滑筋細胞の１つの面上の線維芽細胞の層、および平滑筋細胞の対向する面上の内皮細胞の層を結果的にもたらす。
【０１０８】
筋細胞以外の細胞は、任意の適切な技術を介して、筋細胞を含む１つ以上の層内におよび／または上に分配される。適切な堆積技術は、実質的に細胞を損傷することなく、幾分制御されたある量のまたは容積の細胞を送達することができるものを含む。様々な実施形態では、適切な堆積技術は、非限定的な例として、スプレー、インクジェット、塗布、浸漬コーティング、移植、播く、層状化、バイオプリンティング、およびそれらの組み合わせを含む。
【０１０９】
筋細胞以外の細胞は、作製プロセスにおける任意の適切な時点において、筋細胞を含む１つ以上の層に分配される。いくつかの実施形態では、細胞は、筋が作製または構成されたと略同時（例えば、同時に、その直後など）に分配される。他の実施形態では、細胞は、筋の作製または構成に続いて分配される。様々なさらなる実施形態では、細胞は、筋の作製または構成に続いて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０分、またはそれ以上分配され、それらにおいてインクリメントを含む。他の様々な実施形態では、細胞は、筋の作製または構成に続いて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、２４、４８時間、またはそれ以上分配され、それらにおいてインクリメントを含む。さらに他の様々な実施形態では、細胞は、筋の作製または構成に続いて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０日、またはそれ以上分配され、それらにおいてインクリメントを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、筋細胞を含む１つ以上の層の成熟中に分配される。
【０１１０】
方法
いくつかの実施形態では、筋細胞含有層を含む移植可能な組織または臓器を作製する方法が本明細書に開示されている。さらなる実施形態では、方法は、筋細胞を含むバイオインクをある形態にバイオプリントし、当該バイオインクを凝集性細胞構造に融合することを含む。さらに別の実施形態では、移植可能な組織または臓器は、使用時に、予め形成されたスキャフォールドが略ない。様々な実施形態では、筋細胞は、平滑筋細胞、骨格筋細胞、および／または心筋細胞である。いくつかの実施形態では、方法は、予め形成されたスキャフォールドが略ない細胞を含む操作した組織および臓器を生成する。
【０１１１】
筋細胞を含むバイオインクの作製
いくつかの実施形態では、方法は、筋細胞を含むバイオインクを作製することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、筋細胞を含む凝集した多細胞集合体を調製することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、他の細胞型をさらに含む凝集した多細胞集合体を調製することを含む。さらなる実施形態では、方法は、内皮細胞をさらに含む多細胞集合体を調製することを含む。例えば、実施例３および実施例５を参照。いくつかの実施形態では、方法は、線維芽細胞をさらに含む凝集した多細胞集合体を調製することを含む。例えば、実施例４を参照。
【０１１２】
本明細書中に記載の特性を有する多細胞集合体を含むバイオインクを作製するための様々な方法がある。いくつかの実施形態では、多細胞集合体は、複数の生細胞を含むまたは所望の細胞密度および粘度を有する細胞ペーストから作製される。さらなる実施形態では、細胞ペーストは、所望の形状および成熟（例えば、インキュベーション）を介して形成された多細胞体に形作られる。いくつかの実施形態では、多細胞集合体は、略円柱状である。いくつかの実施形態では、多細胞集合体は、略球状である。他の実施形態では、操作した組織は、ある範囲の形状を有する多細胞集合体から構成される。特定の実施形態では、細長い多細胞体が、複数の生細胞を含む細胞ペーストを細長い形状（例えば、円柱）に形作ることによって製造される。さらなる実施形態では、細胞ペーストは、制御された環境においてインキュベートされることにより、細胞が互いに接着および／または凝集することを可能にして細長い多細胞体を形成する。別の特定の実施形態では、多細胞体は、三次元状に細胞ペーストを保持する装置において、複数の生細胞を含む細胞ペーストを形作ることによって製造される。さらなる実施形態では、細胞ペーストは、平らな表面に自身を支持するのに十分な凝集力を有する体（ｂｏｄｙ）を製造するのに十分な時間、三次元状に保持されつつ、制御された環境においてインキュベートされる。
【０１１３】
様々な実施形態では、細胞ペーストは、（Ａ）（１以上の細胞型の）細胞または細胞集合体と、生体適合性ゲルまたは液体、例えば、細胞懸濁液になる細胞培養培地とを（例えば、所定の比率で）混合し、（Ｂ）細胞懸濁液を圧縮して所望の細胞密度および粘度を有する細胞ペーストを製造することによって提供される。様々な実施形態では、圧縮することは、多数の方法によって、例えば細胞培養物から生じた特定の細胞懸濁液を濃縮して、細胞ペーストに必要な所望の細胞濃度（密度）、粘度、および一貫性を実現することによって、実現される。特定の実施形態では、細胞培養物からの比較的希釈した細胞懸濁液は、鋳型で形作ることができる、ペレット内の細胞濃度を達成するように、所定の時間遠心分離される。タンジェント流ろ過（「ＴＦＦ」）は、細胞を濃縮または圧縮する別の適切な方法である。いくつかの実施形態では、化合物は、必要な押出特性を与えるように細胞懸濁液と組み合わされる。適切な化合物は、非限定的な例として、界面活性剤、ポリオール、コラーゲン、ヒドロゲル、マトリゲル（商標）、ナノファイバー、自己集合ナノファイバー、ゼラチン、フィブリノゲン等を含む。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、細胞ペーストは、複数の生細胞と組織培養培地とを混合し、（例えば、遠心分離により）生細胞を圧縮することによって製造される。１つ以上のＥＣＭ成分（またはＥＣＭ成分の誘導体）は、随意に、ＥＣＭ成分（またはＥＣＭ成分の誘導体）を含有する１つ上の生理学的に許容可能な緩衝液中に細胞ペレットを再懸濁することによって含まれ、得られた細胞懸濁液は、細胞ペーストを形成するために再度遠心分離された。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、さらなる処理のために所望される細胞ペーストの細胞密度は、細胞型によって変化する。さらなる実施形態では、細胞間の相互作用は、細胞ペーストの特性を決定付け、異なる細胞型は、細胞密度と細胞間相互作用との間で異なる関連性を有する。さらに別の実施形態では、細胞は、随意に、細胞ペーストを形作る前に、細胞間相互作用を増加させるために前処理された。例えば、細胞は、細胞ペーストを形作る前に、細胞間相互作用を高めるために、遠心分離後に遠心分離チューブ内で随意にインキュベートされる。
【０１１６】
様々な実施形態では、細胞ペーストを形作るために多くの方法が使用される。例えば、特定の実施形態では、所望の形状を実現するために、細胞ペーストが、（例えば、濃縮／圧縮の後）手動で成形またはプレスされる。さらなる例として、細胞ペーストを、器具の内面に適合するように細胞ペーストを形作るマイクロピペット（例えばキャピラリーピペット）のような器具に取り込まれる（例えば、吸引される）。マイクロピペット（例えばキャピラリーピペット）の断面形状は、代替的に円形、正方形、長方形、三角形、または他の非円形の断面形状である。いくつかの実施形態では、細胞ペーストは、プラスチック型、金型またはゲル型といった予め形成された型に堆積することによって形成される。いくつかの実施形態では、遠心鋳造または連続鋳造が細胞ペーストを形作るために使用される。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、略球状の多細胞集合体（単独または細長い細胞体との組み合わせのいずれか）はまた、本明細書に記載される組織および臓器を構築するのに適している。球状集合体は、自己集合、鋳型の使用、および懸滴法（ｈａｎｇｉｎｇ  ｄｒｏｐ  ｍｅｔｈｏｄ）を含む様々な方法により適切に製造される。さらなる実施形態では、略球状の多細胞集合体を製造する方法は、１）所望の細胞密度および粘度を有する複数の予め選択された細胞または細胞集合体を含む細胞ペーストを提供する工程と、２）細胞ペーストを円柱形状に操作する工程と、３）のシリンダーを等しい断片にカット工程と、４）当該断片を旋回シェーカー上で一晩丸くする工程と、５）成熟によって略球状の多細胞集合体を形成する工程とを含む。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、部分的に接着および／または凝集した細胞ペーストは、成形装置（例えばキャピラリーピペット）から第２の成形装置（例えば、鋳型）に転送される。当該第２の成形装置は、栄養素および／または酸素が追加の成熟期間、第２の成形装置内に保持されながら細胞に供給されることを可能にする。細胞に栄養と酸素を供給することを可能にする適切な成形装置の一例は、複数の多細胞集合体（例えば、略同一の多細胞凝集物）を製造するための鋳型である。さらなる例として、このような鋳型は、生体適合性基板を含み、当該基板は、基板への細胞の移動および内方成長に耐性があり、かつ細胞の基板への接着に耐性がある材料からなる。様々な実施形態では、基板は、テフロン（登録商標）（ＰＴＦＥ）、ステンレス鋼、アガロース、ポリエチレングリコール、ガラス、金属、プラスチック、またはゲル材料（例えば、ヒドロゲル）、および類似の材料から適切に作成される。いくつかの実施形態では、鋳型も（例えば、鋳型の上部に組織培養培地を分配することにより）細胞ペーストに組織培養培地を供給するができるように適切に構成される。
【０１１９】
このように、第２の成形装置が使用される実施形態では、部分的に接着および／または凝集した細胞ペーストが、第１の成形装置（例えばキャピラリーピペット）から第２の成形装置（例えば鋳型）に転送される。さらなる実施形態では、部分的に接着および／または凝集した細胞ペーストは、第１の成形装置（例えばキャピラリーピペット）によって鋳型の溝内に転送される。さらに別の実施形態では、制御された環境において鋳型内に保持された細胞ペーストとともに鋳型がインキュベートされることにより、細胞ペースト内の細胞がお互いにさらに接着および／または凝集して多細胞集合体を形成する成熟期間後には、細胞の凝集力は、結果として得られる多細胞集合体が器具（例えば、キャピラリーピペット）を用いて取り上げられることを可能にするのに十分な強さになる。さらに別の実施形態では、キャピラリーピペットは、適切に、多細胞集合体を三次元構成物に自動的に配置するように動作可能なバイオプリンターまたは類似の装置のプリントヘッドの一部である。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、多細胞集合体の断面形状および大きさは、多細胞集合体を作製するために使用される第１の成形装置および随意に第２の成形装置の断面形状および大きさに略対応し、当業者は、上述した適切な断面形状、断面積、直径、長さを有する多細胞集合体を作成するのに適切な断面形状、断面積、直径、および長さを有する適切な成形装置を選択することができる。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、単一工程でバイオインクを成形し、分配することが可能な自動化されたコンピューター支援の三次元プロトタイピングシステムを用いてバイオプリントできるようにバイオインクが調製される。いくつかの実施形態では、単一工程の成形および分配のためのバイオインクの調製は、押出化合物の添加を含む。
【０１２２】
ある形態へのバイオインクのバイオプリンティング
いくつかの実施形態では、方法は、バイオインクをある形態にバイオプリントすること含む。バイオプリンティングは、本明細書に記載される方法である。多くの三次元形態は、バイオプリンティングを介して製造するのに好適でありかつ可能である。様々な実施形態では、適切な形態は、非限定的な例として、シート、チューブ、および嚢を含むが、すべてが本明細書においてさらに記載されている。いくつかの実施形態では、形態は、天然の組織または臓器を、操作した移植可能な組織または臓器と置換、部分的に置換、または増大するのに適切な寸法でバイオプリントされる。さらなる実施形態では、形態は、特定の被験体の特定の組織または臓器を置換、部分的に置換、または増大するのに適切な寸法でバイオプリントされる。
【０１２３】
本明細書に記載されるように、様々な実施形態では、バイオインクは、多くの適切な形状および大きさを有する多細胞集合体を含む。いくつかの実施形態では、多細胞集合体は、細長く、非限定的な例として、円形、楕円形、正方形、三角形、多角形、および不規則な任意のいくつかの適切な断面形状を有する。さらなる実施形態では、多細胞集合体は、細長い円柱状の形態である。いくつかの実施形態では、細長い多細胞集合体は、同様の長さおよび／または直径を有する。他の実施形態では、細長い多細胞集合体は、異なる長さおよび／または直径を有する。いくつかの実施形態では、多細胞集合体は、略球状である。いくつかの実施形態では、操作した組織は、大きさが略類似している略球状の多細胞集合体を含む。他の実施形態では、操作した組織は、異なる大きさを有する略球状の多細胞集合体を含む。いくつかの実施形態では、異なる形状および大きさを有する操作した組織は、様々な形状および大きさを有する多細胞集合体を配置することにより形成される。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、凝集した多細胞集合体は、支持体上に配置される。様々な実施形態では、支持体は、任意の適切な生体適合してなる表面である。さらに別の実施形態では、適切な生体適合してなる表面は、非限定的な例として、ポリマー材料、多孔質膜、プラスチック、ガラス、金属、ヒドロゲル、およびそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、支持体は、非限定的な例として、ヒドロゲル、タンパク質、化学物質、ペプチド、抗体、成長因子、またはそれらの組み合わせを含む生体適合性を含む物質でコーティングされる。一実施形態では、支持体はＮｏｖｏＧｅｌ（商標）でコーティングされる。
【０１２５】
凝集した多細胞集合体の配置が完了すると、いくつかの実施形態では、組織培養培地は、構成物の上部にわたって注がれる。さらなる実施形態では、組織培養培地は、多細胞体間の空間に入り、多細胞体内の細胞を支持する。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、バイオプリントされる形態はシートである。さらなる実施形態では、シートは、非限定的な例として、平面の正方形、長方形、多角形、円形、楕円形、または不規則な形状を含むある範囲の適切な形状を有する実質的な平面な形態である。バイオプリントされたシートは、広範な適切な寸法を有する。いくつかの実施形態では、寸法は、非限定的な例として、創傷治癒、組織修復、組織増大、組織置換、および操作した臓器の構成を含む特定の使用を促進するように選択される。さらなる実施形態では、寸法は、特定の被験体における特定の使用を促進するように選択される。例えば、一実施形態では、シートは、特定のヒト被験体の臓器または組織の筋肉壁内の特定の創傷または欠損を修復するようにバイオプリントされる。いくつかの実施形態では、バイオプリントされたシートは、バイオプリンティング時において、少なくとも１５０μｍの厚さである。様々な実施形態では、バイオプリントされたシートは、約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００μｍまたはそれ以上の厚さを有し、それらにおいてインクリメントを含む。さらなる様々な実施形態では、バイオプリントされたシートは、約５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００μｍまたはそれ以上の長さ、幅、またはその両方を有することを特徴とし、それらにおいてインクリメントを含む。他の様々な実施形態では、バイオプリントされたシートは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００ｍｍまたはそれ以上の長さ、幅、またはその両方を有することを特徴とし、それらにおいてインクリメントを含む。他の様々な実施形態では、バイオプリントされたシートは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００ｃｍまたはそれ以上の長さ、幅、またはその両方を有することを特徴とし、それらにおいてインクリメントを含む。例えば、実施例６（および図１）、実施例７（および図２）、実施例９（および図３ａおよび図３ｂ）、実施例１０（および図４ａおよび図４ｂ）を参照。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、バイオプリントされた形態はチューブである。さらなる実施形態では、チューブは、略ロールドシートまたは中空円柱である。いくつかの実施形態では、バイオプリントされたチューブは、操作した臓器を構成するように使用される。さらなる実施形態では、バイオプリントされたチューブは、操作した尿管、尿路の導管、卵管、子宮、気管、気管支、リンパ管、尿道、腸、結腸、または食道を構成するように使用される。他の実施形態では、バイオプリントされたチューブは、天然の管状組織、例えば食道、小腸、結腸、または尿道の長さを延長するように使用される。他の実施形態では、バイオプリントされたチューブは、例えば、導管またはバイパス、尿路の導管、例えばまたは肛門十二指腸の腸内の導管バイパスとして働く新しい接合部を作成するように使用される。さらなる実施形態では、本明細書に開示されるチューブは血管ではない。バイオプリントされたチューブは、広範囲の適切な寸法を有する。いくつかの実施形態では、寸法は、非限定的な例として、創傷治癒、組織修復、組織増大、組織置換、および操作した臓器の構成を含む特定の使用を促進するように選択される。さらなる実施形態では、寸法は、特定の被験体における特定の使用を促進するように選択される。例えば、一実施形態では、チューブは、特定のヒト被験体のリンパ管の特定のセグメントを修復または置換するようにバイオプリントされる。いくつかの実施形態では、バイオプリントされたチューブは、バイオプリンティング時に少なくとも１５０μｍの厚さである管状壁を有することを特徴とする。様々な実施形態では、バイオプリントされたチューブの壁は、約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００μｍまたはそれ以上の厚さを有し、それらにおいてインクリメントを含む。いくつかの実施形態では、バイオプリントされたチューブは、バイオプリンティング時に少なくとも約２５０μｍの内径を有することを特徴とする。様々な実施形態では、バイオプリントされたチューブの内径は、約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、６００、７００、８００、９００、１０００μｍまたはそれ以上の厚さを有し、それらにおいてインクリメントを含む。他の様々な実施形態では、バイオプリントされたチューブの内径は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ｍｍまたはそれ以上であり、それらにおいてインクリメントを含む。いくつかの実施形態では、バイオプリントされたチューブの長さは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ｍｍまたはそれ以上���あり、それらにおいてインクリメントを含む。他の実施形態では、バイオプリントされたチューブの長さは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ｃｍまたはそれ以上であり、それらにおいてインクリメントを含む。例えば、実施例１３（図６）を参照。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、バイオプリントされた形態は嚢である。さらなる実施形態では、嚢は、少なくとも１つの閉じた端部（例えば、ポーチ、カップ、中空バルーンなど）を有する略ロールドシートまたは中空シリンダーである。いくつかの実施形態では、バイオプリントされた嚢は、筋を含む組織または臓器を増大、修復、または置換するように使用される。さらなる実施形態では、バイオプリントされた嚢は、操作した胃、膀胱、子宮、または胆嚢の全部または一部を構成するように使用される。バイオプリントされた嚢は、広範囲の適切な寸法を有する。いくつかの実施形態では、寸法は、非限定的な例として、創傷治癒、組織修復、組織増大、組織置換、および操作した臓器の構成を含む特定の使用を促進するように選択される。さらなる実施形態では、寸法は、特定の被験体における特定の使用を促進するように選択される。例えば、一実施形態では、嚢は、特定のヒト被験体の膀胱を置換するようにバイオプリントされる。いくつかの実施形態では、バイオプリントされた嚢は、バイオプリンティング時に、少なくとも１５０μｍの厚さである壁を有することを特徴とする。様々な実施形態では、バイオプリントされた嚢の壁は、約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００μｍまたはそれ以上であり、それらにおいてインクリメントを含む。
【０１２９】
バイオインクの融合
いくつかの実施形態では、方法は、バイオインクを凝集細胞構造に融合させる工程を含む。さらなる実施形態では、多細胞凝集物を含むバイオインクの融合は、インキュベーションによって促進される。さらなる実施形態では、インキュベーションは、多細胞凝集物が接着および／または凝集して組織または臓器を形成することを可能にする。いくつかの実施形態では、多細胞集合体は、凝集して細胞培養環境（例えば、ペトリ皿、細胞培養フラスコ、バイオリアクターなど）において組織を形成する。さらなる実施形態では、多細胞集合体は、多細胞集合体に含まれる細胞型の成長を促進するのに適切な条件を有する環境において組織を形成するように凝集する。一実施形態では、多細胞集合体は、接着および／または凝集を促進する因子および／またはイオンを含む細胞培養培地の存在下で、約５％のＣＯ２を含有し、約１％‐２１％のＯ２を含有する加湿雰囲気中で、約３７℃でインキュベートされる。
【０１３０】
インキュベーションは、様々な実施形態では、任意の適切な継続時間を有する。さらなる様々な実施形態では、インキュベーションは、約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０分またはそれ以上の継続時間を有し、それらにおいてインクリメントを含む。さらなる様々な実施形態では、インキュベーションは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、３６、４８時間またはそれ以上の継続時間を有し、それらにおいてインクリメントを含む。さらなる様々な実施形態では、インキュベーションは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０日またはそれ以上の継続時間を有し、それらにおいてインクリメントを含む。いくつかの要因は、非限定的な例として、細胞型、細胞型比、培養条件、および成長因子のような添加剤の存在を含む組織を形成するように多細胞集合体が凝集するのに必要な時間に影響を与える。
【０１３１】
バイオプリントされた形態内へのまたはその上への細胞の適用
いくつかの実施形態では、方法は、バイオプリントされた形態内またはその上に細胞を適用することを含む。多くの方法および技術が、細胞を適用するのに適している。様々なさらなる実施形態では、細胞は、例えば、形態内にまたは形態上にバイオプリント、スプレー、塗布、浸漬コーティング、移植、播く、注入、層状化またはバイオプリントされる。例えば、いくつかの実施形態では、細胞を適用することは、細胞の懸濁液、シート、単層、または融合した集合体を有する筋の構成物の１つ以上の表面をコーティングすることを含む。様々な実施形態では、筋の構成物の１、２、３、４つまたはそれ以上の表面がコーティングされる。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、細胞を適用することは、融合した多細胞集合体の追加の層をバイオプリントすることを含む。他の実施形態では、細胞の層を適用することは、細胞の溶液、懸濁液、または濃縮液をバイオプリント、スプレー、またはインクジェットすることを含む。さらなる実施形態では、適切な細胞懸濁液は、約１×１０４細胞／μＬから約１×１０６細胞／μＬを含む。さらに別の実施形態では、適切な細胞懸濁液は、約１×１０５細胞／μＬ〜約１.５×１０５細胞／μＬを含む。さらなる実施形態では、細胞を適用することは、空間的に分布した液滴として組織構成物の１つ以上の表面上に直接的に細胞懸濁液を分配することを含む。さらに別の実施形態では、細胞を適用することは、スプレーとして組織構成物の１つ以上の表面上に直接的に細胞懸濁液を分配することを含む。細胞の層は、様々な実施形態では、構成プロセスにおいて任意の適切な時点で適用される。いくつかの実施形態では、細胞の１つ以上の層は、バイオプリンティング直後（例えば１０分後）に平滑筋構造の１つ以上の外部表面上に適用される。他の実施形態では、１つ以上の層は、バイオプリンティング後（例えば１０分後）に適用される。さらに他の実施形態では、１つ以上の層が構成物の成熟中に適用される。
【０１３３】
任意の細胞の型が、凝集した多細胞集合体をバイオプリントすることによって適用されるのに適する。さらに、任意の細胞の型、懸濁液、溶液、または濃縮液の液滴として堆積することによって、または懸濁液、溶液、または濃縮液としてスプレーすることによって適用されるのに適する。いくつかの実施形態では、線維芽細胞が、平滑筋構成物の１つ以上の外部表面上に適用される。他の実施形態では、内皮細胞が、平滑筋構成物の１つ以上の外部表面上に適用される。さらなる実施形態では、内皮細胞の層が、平滑筋構成物の１つ以上の外部表面に適用され、線維芽細胞の層が、当該構成物の１つ以上の異なる表面に適用される。
【０１３４】
実施例７は、凝集した平滑筋細胞の集合体でバイオプリントされた平滑筋構成物を立証する。凝集した平滑筋細胞の集合体は、内皮細胞濃縮液（例えば、１‐１.５×１０５細胞／μｌ）からなる第２の細胞型でさらにコーティングされる。実施例７の技術は、ＳＭＣからなる平滑筋構成物を結果としてもたらした。例えば、図２を参照。
【０１３５】
実施例８は、凝集したヒト大動脈平滑筋細胞の集合体でバイオプリントされた平滑筋構成物を立証する。さらに、懸濁液中のヒト大動脈内皮細胞からなる第２の細胞型は、２.５μＬの液滴としてバイオプリントされた平滑筋細胞の層の上にバイオプリンターから分配した。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、方法は、支持体上で細胞の層を培養する工程をさらに含む。このような実施形態では、細胞を適用することは、いくつかの場合において、細胞の既存の層と直接接触している平滑筋構成物の１つ以上の表面に配置することを含む。さらなる実施形態では、構成物は、細胞の培養層または細胞の単層上に直接的にバイオプリントされる。生体適合性の支持体上の任意種類の培養された細胞層が適切である。いくつかの実施形態では、多細胞集合体は、内皮細胞の層の上にバイオプリントされる。他の実施形態では、多細胞集合体は、線維芽細胞の層の上にバイオプリントされる。さらなる実施形態では、細胞の層は、バイオプリントされた構成物の多細胞集合体と接着および／または凝集する。
【０１３７】
実施例９は、実施例８と同様の構成物の構成を実証するが、構成物は、ヒト皮膚線維芽細胞の集密的な単層が予め培養された支持体上にバイオプリントされた。実施例９の技術は、内皮層および線維芽細胞層の両方を含む追加の層を有するＳＭＣからなる平滑筋構成物を結果としてもたらした。例えば、図３ａおよび図３ｂを参照。
【０１３８】
操作した組織の生存能力を向上させるための追加の工程
いくつかの実施形態では、方法は、バイオプリンティング後かつ移植前に、操作した組織または臓器の生存能力を向上させるための工程をさらに含む。さらなる実施形態では、これらの工程は、制限物質の一時的または半永久的な格子を通って組織または臓器と栄養培地との間に直接的な接触を提供することを含む。いくつかの実施形態では、組織は、多孔性または間隙のある材料において制約される。操作した組織の細胞の少なくともいくつかの栄養素への直接的なアクセスは、操作した組織の生存能力を向上させる。
【０１３９】
さらなる実施形態では、操作した組織の生存能力を向上させるための追加のおよび任意の工程は、１）随意に、凝集した多細胞集合体を配置する前に、制限物質のベース層を配置する工程と；２）随意に、制限物質の周囲に配置する工程と；３）定義された幾何学的形状内の組織の細胞をバイオプリントする工程と；４）制限物質における間隙、例えば格子、メッシュ、またはグリッドを導入するパターンにおいて新生組織に重なる制限物質の細長い体（例えば、シリンダ、リボンなど）を配置する工程とを含む。例えば、実施例１２および図５を参照。
【０１４０】
多くの制限物質は、本明細書に記載される方法において使用されるのに適している。いくつかの実施形態では、ヒドロゲルは、以下の１つ以上の有利な特性を有する例示的な制限材料であり：非接着性であり；生体適合性であり；押出可能であり；細胞構造がなく；細胞に支持を提供するのに十分な強度のものであり；水性条件で溶解しないものを含む。いくつかの実施形態では、適切なヒドロゲルは、天然ポリマーである。一実施形態では、制限物質は、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）からなる。さらなる実施形態では、適切なヒドロゲルは、ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ‐１２７、コラーゲン、ヒアルロン酸、フィブリン、アルギン酸塩、それらのアガロース、キトサン、誘導体、またはそれらの組み合わせといった界面活性剤ポリオールに由来するものを含む。他の実施形態では、適切なヒドロゲルは、合成ポリマーである。さらなる実施形態では、適切なヒドロゲルは、ポリ（アクリル酸）およびそれの誘導体、ポリ（エチレンオキシド）およびそれのポリマー、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、およびこれらの組み合わせに由来するものを含む。様々な特定の実施形態では、制限物質は、以下から選択される：ヒドロゲル、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）、アガロース、アルギン酸塩、ゼラチン、マトリゲル（商標）、ヒアルロン酸、ポロキサマー、ペプチドヒドロゲル、ポリ（イソプロピルｎ‐ポリアクリルアミド）、ポリエチレングリコールジアクリレート（ＰＥＧ‐ＤＡ）、ヒドロキシエチルメタクリレート、ポリジメチルシロキサン、ポリアクリルアミド、ポリ（乳酸）、ケイ素、絹、またはこれらの組み合わせを含む。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、パターンに重なる間隙が組織の表面の周りに均一にまたは略均一に分布されている。他の実施形態では、間隙は、不均一に分布しており、ここによって、組織の細胞は、栄養素に非均一に曝露される。非均一な実施形態では、栄養素への異なる（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）アクセスは、組織の１つ以上の特性に影響を与えるように利用される。例えば、いくつかのケースでは、バイオプリントされた組織の１つの表面上の細胞が、バイオプリントされた組織の別の表面上の細胞よりも速く増殖させることが望ましい。いくつかの実施形態では、組織の様々な部分の栄養素に対する露光は、随意に、所望のエンドポイントに向かう組織の発達に影響を与えるように様々な時間で変化する。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、制限物質は、任意の適切な時点で除去され、任意の適切な時点は、バイオプリンティング直後（例えば１０分以内）、バイオプリンティング後（例えば１０分後）、細胞が互いに実質的に凝集される前、細胞が互いに実質的に凝集された後、細胞が細胞外マトリックスを生成する前、細胞が細胞外マトリックスを生成した後、使用の直前などを含むが、これらに限定されない。様々な実施形態では、制限物質は、任意の適切な方法によって除去される。例えば、いくつかの実施形態では、制限物質は、切除され、細胞から引き離され、消化され、または溶解される。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、方法は、１つ以上の側面に、流体流に起因する剪断力を操作した組織にさらす工程を含む。
【０１４４】
特定の例示的な実施形態
特定の実施形態では、少なくとも１つの層を含む操作した組織または臓器が本明細書に開示され、ここでは、操作した組織および臓器は、細胞物質から本質的になり、脊椎動物被験体に移植可能であり、操作した組織または臓器は、血管ではない。いくつかの実施形態では、組織または臓器は、嚢、シートまたはチューブであり、チューブは血管ではない。いくつかの実施形態では、筋の層は、細胞のバイオプリントされた集合体の融合により形成された。さらなる実施形態では、筋の層は、予め形成されたスキャフォールドが略ない。さらに別の実施形態では、筋の層は、予め形成されたスキャフォールドを用いて成形されなかった。いくつかの実施形態では、組織または臓器は、バイオプリンティングに続いて細胞外マトリックスを生成する細胞物質から本質的になる。いくつかの実施形態では、筋の層は、平滑筋であり、バイオプリンティングの時点で少なくとも１５０μｍの厚さである。さらなる実施形態では、平滑筋の層は、バイオプリンティングの時点で少なくとも約２５０μｍである。さらなる実施形態では、平滑筋の層は、バイオプリンティングの時点で少なくとも約５００μｍの厚さである。いくつかの実施形態では、組織または臓器は、内皮細胞、神経細胞、周細胞、線維芽細胞、組織特異的な上皮細胞、軟骨細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、骨由来の細胞、軟組織由来の細胞、中皮細胞、組織特異的な間質細胞、幹細胞、前駆細胞、およびこれらの組み合わせをからなる群から選択される細胞をさらに含む。いくつかの実施形態では、平滑筋細胞以外の細胞は、平滑筋の層の少なくとも１つの表面上に分配される。さらなる実施形態では、平滑筋細胞以外の細胞は、平滑筋の層の少なくとも１つの表面にバイオプリントされた。さらに別の実施形態では、細胞は、内皮細胞、神経細胞、周細胞、線維芽細胞、組織特異的な上皮細胞、軟骨細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、骨由来の細胞、軟組織由来の細胞、中皮細胞、組織特異的な間質細胞、幹細胞、前駆細胞、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、平滑筋細胞以外の細胞は、平滑筋層がバイオプリントされたと略同時に平滑筋層上に分配された。いくつかの実施形態では、平滑筋細胞以外の細胞は、平滑筋層のバイオプリンティングに続いて平滑筋層上に分配された。いくつかの実施形態では、平滑筋細胞以外の細胞は、平滑筋層の成熟中に平滑筋層上に分配された。いくつかの実施形態では、平滑筋細胞以外の細胞は、平滑筋層の成熟に続いて平滑筋層上に分配された。いくつかの実施形態では、平滑筋細胞以外の細胞は、平滑筋層のバイオプリンティングの２４時間後以内に平滑筋層上に分配された。いくつかの実施形態では、平滑筋細胞以外の細胞は、平滑筋層をバイオプリンティングの２４時間後に平滑筋層上に分配された。いくつかの実施形態では、平滑筋細胞以外の細胞は、細胞の１つ以上の層として平滑筋の層上に分配された。いくつかの実施形態では、平滑筋細胞以外の細胞は、厚さ約１００μｍ未満の細胞の層として平滑筋の層上に分配された。他の実施形態では、平滑筋細胞以外の細胞は、厚さ約１００μｍより大きくかつ厚さ約５００μｍ未満細胞の層として平滑筋の層上に分配された。いくつかの実施形態では、線維芽細胞が、平滑筋の層内または上に分配された。いくつかの実施形態では、内皮細胞が、平滑筋の層内または上に分配された。さらなる実施形態では、内皮細胞は、組織特異的である。いくつかの実施形態では、平滑筋の層は、略平面である。さらなる実施形態では、平面は、バイオプリンティングの時点で少なくとも１５０μｍの厚さである。さらに別の実施形態では、組織は、創傷治癒または組織増大のために適切な平滑筋細胞を含むシートまたはパッチである。いくつかの実施形態では、平滑筋の層は、管状である。さらなる実施形態では、チューブは、バイオプリンティングの時点で少なくとも約１５０μｍの内径を有する。さらなる実施形態では、管状壁は、バイオプリンティングの時点、少なくとも１５０μｍの厚さである。さらに別の実施形態では、臓器は、尿管または尿管の一部、尿路の導管または尿路の導管の一部、膀胱または膀胱の一部、卵管または卵管の一部、子宮または子宮の一部、気管や気管の一部、気管支や気管支の一部、リンパ管やリンパ管の一部、尿道または尿道の一部、腸または腸の一部、結腸または結腸の一部、食道または食道の一部である。いくつかの実施形態では、チューブの内径および外径は、対応する天然の組織または臓器の直径と略同様である。いくつかの実施形態では、平滑筋の層は、嚢または嚢の一部を含む。さらなる実施形態では、嚢の壁は、バイオプリンティングの時点で少なくとも１５０μｍの厚さである。さらに別の実施形態では、袋状の臓器は、胃、膀胱、子宮、または胆嚢である。いくつかの実施形態では、嚢の内部および外部寸法は、対応する天然の臓器の寸法と略同様である。いくつかの実施形態では、平滑筋の層は、天然の臓器を、操作した移植可能な臓器と部分的に置換するのに適切な寸法でバイオプリントされた。いくつかの実施形態では、平滑筋の層は、天然の臓器を操作した移植可能な臓器で増大させるのに適切な寸法でバイオプリントされた。いくつかの実施形態では、平滑筋を含むチューブ、シート、または嚢は、バイオプリンティング中に非接着性ヒドロゲル制限物質によって支持された。さらなる実施形態では、非接着性ヒドロゲル制限物質は、バイオプリンティング後に、平滑筋を含むチューブ、シート、または嚢と関連付けられたままであった。さらなる実施形態では、非接着性ヒドロゲル制限物質は、バイオプリンティング後かつインビボで移植前に、ある時点において、平滑筋を含むチューブ、シート、または嚢から解離された。さらなる実施形態では、非接着性ヒドロゲルは、適切な寸法にバイオプリントされた細胞に制限された。さらなる実施形態では、非接着性ヒドロゲル制限物質は、バイオプリントされた細胞の少なくともいくつが栄養培地と接触することを可能にするように構成された。いくつかの実施形態では、細胞は、成体の分化した細胞を含む。他の実施形態では、細胞は、成体非分化細胞を含む。いくつかの実施形態では、平滑筋細胞は、組織特異的である。さらなる実施形態では、平滑筋細胞は、ヒト大動脈平滑筋細胞またはヒト臍静脈平滑筋細胞である。いくつかの実施形態では、平滑筋細胞は、ヒト吸引脂肪組織から誘導される。いくつかの実施形態では、組織または臓器は、ヒト吸引脂���組織から誘導される追加的な非平滑筋細胞型を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、特定の脊椎動物被験体に由来する。いくつかの実施形態では、細胞は、特定の疾患状態を模倣するように選択される。いくつかの実施形態では、組織または臓器は、尿道、尿路の導管、尿管、膀胱、卵管、子宮、気管、気管支、リンパ管、食道、胃、胆嚢、小腸、大腸、および結腸からなる群から選択される。
【０１４５】
特定の実施形態では、操作した組織および／または臓器の脊椎動物被験体における移植が本明細書に開示される。ここでは、組織および臓器は、平滑筋の少なくとも１つの層を含み、組織または臓器は、細胞物質から本質的になり、操作した組織または臓器は、血管ではない。
【０１４６】
特定の実施形態では、平滑筋組織を含む移植可能な組織または臓器を作製する方法が本明細書に開示される。方法は、平滑筋細胞を含むバイオインクを作製する工程と、バイオインクをある形態にバイオプリントする工程と、バイオインクを凝集性細胞構成に融合する工程とを含み、ここで、移植可能な組織または臓器は、血管ではない。いくつかの実施形態では、移植可能な組織または臓器は、予め形成されたスキャフォールドが略ない。いくつかの実施形態では、平滑筋細胞は、哺乳動物被験体の天然の平滑筋組織から単離される。いくつかの実施形態では、平滑筋細胞は、前駆細胞から分化される。いくつかの実施形態では、平滑筋細胞は、組織サンプルから生成される。さらなる実施形態では、組織サンプルは、吸引脂肪組織である。いくつかの実施形態では、形態は、約２時間〜１０日成熟される。さらなる実施形態では、成熟は、４週間までの期間にわたって行われる。いくつかの実施形態では、形態はシートである。他の実施形態では、形態は嚢である。さらに他の実施形態では、形態は、バイオプリンティングの時点で約０.１５ｍｍ以上の内径を有するチューブであり、ここで、チューブは血管ではない。いくつかの実施形態では、バイオインクは、内皮細胞、神経細胞、周細胞、線維芽細胞、組織特異的な上皮細胞、非血管平滑筋細胞、軟骨細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、骨の由来細胞、軟組織由来の細胞、中皮細胞、組織特異的な間質細胞、幹細胞、前駆細胞、およびそれらの組合せからなる群から選択される細胞をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、バイオプリントされた形態内にまたはその上に細胞をバイオプリント、スプレー、塗布、適用、浸漬コーティング、移植、播く、注入、または層状化する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、凝集性細胞構造内にまたはその上に細胞をバイオプリント、スプレー、塗布、適用、浸漬コーティング、移植、注入、播く、または層状化する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、ターゲットとする適用に向けて成熟するようにバイオプリントされた形態を生体力学的または生化学的にコンディショニングする工程を含む。
【０１４７】
特定の実施形態では、移植可能な操作した臓器を製造する際に使用される操作した組織が本明細書に開示されており、ここでは、組織は、平滑筋の少なくとも１つの層を含み、平滑筋の少なくとも１つの層は、三次元形状で融合した細胞要素を含み、組織は、血管ではない。いくつかの実施形態では、平滑筋のうちの少なくとも１層がバイオプリントされた。さらなる実施形態では、組織は、予め形成されたスキャフォールドが略ない。いくつかの実施形態では、三次元形状は、非接着性材料または鋳型によって限定された。いくつかの実施形態では、組織は、内皮細胞、神経細胞、周細胞、線維芽細胞、組織特異的な上皮細胞、非血管平滑筋細胞、軟骨細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、骨由来の組織、軟組織由来細胞、中皮細胞、組織特異的な間質細胞、幹細胞、前駆細胞、およびそれらの組合せからなる群から選択される細胞をさらに含む。いくつかの実施形態では、平滑筋細胞以外の細胞は、平滑筋の層の少なくとも一面に分配される。さらなる実施形態では、平滑筋細胞以外の細胞は平滑筋の層の少なくとも１つの表面上にバイオプリントされる。さらに別の実施形態では、平滑筋細胞以外の細胞は、以下からなる群から選択される：内皮細胞、神経細胞、周細胞、線維芽細胞、組織特異的な上皮細胞、非血管平滑筋細胞、軟骨細胞、骨格筋細胞、心筋細胞骨由来細胞、軟組織由来の細胞、中皮細胞、組織特異的な間質細胞、幹細胞、前駆細胞、およびそれらの組合せ。いくつかの実施形態では、細胞の層は、バイオプリンティングの時点で少なくとも１５０μｍの厚さである。いくつかの実施形態では、組織は、組織培養適合してなる表面に固定される。いくつかの実施形態では、組織は、脊椎動物被験体への移植に適している。特定の実施形態では、三次元の細胞ベースの要素および一時的または取り外し可能な制限を含む操作した組織培養システムが本明細書に開示されている。ここでは、制限物質により、細胞および栄養培地との間の直接接触が可能になる。いくつかの実施形態では、操作した三次元の細胞ベースの要素がバイオプリントされた。さらなる実施形態では、操作した三次元の細胞ベースの要素は、予め形成されたスキャフォールドがない。いくつかの実施形態では、制限物質は、以下の特徴のうちの少なくとも１つを有する：実質的に細胞に接着しない；生体適合性であり；押出可能であり；細胞構造がなく；細胞に支持を提供するのに十分な強度のものであり；水性条件で溶解しない。さらなる実施形態では、制限物質は、プラスチックではなく、ガラスではなく、セラミックではない。いくつかの実施形態では、制限物質は、ヒドロゲルである。さらなる実施形態では、制限物質は、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）である。さらなる実施形態では、制限物質は、アガロース、ポリエチレングリコールジアクリレート（ＰＥＧ‐ＤＡ）、ヒアルロン酸、ゼラチン、ポロキサマー、ヒドロキシエチルメタクリレート、ペプチドヒドロゲル、マトリゲル（商標）、ポリジメチルシロキサン、ケイ素、絹、ポリアクリルアミド、ポリ乳酸、界面活性剤ポリオール、およびアルギン酸塩うちの１つ以上を含む：。いくつかの実施形態では、細胞および／または制限物質のうちの少なくとも１つがバイオプリンターから���し出された。さらなる実施形態では、制限物質には間隙であり、栄養培地は、間隙を介して細胞を接触することができる。さらに別の実施形態では、間隙の幅は、約１００μｍと約３０ｍｍとの間であった。いくつかの実施形態では、間隙は、構造体の周囲に不均一に分布した。ここでは、組織の細胞は、非均一に栄養素に曝露された。いくつかの実施形態では、組織の表面積の少なくとも約１０％が栄養培地と接触するのに適切な間隙に曝露された。いくつかの実施形態では、制限物質は、少なくとも１つの細長い要素として細胞上に重ねられた。さらなる実施形態では、制限物質の細長い要素は、約１００μｍと約１ｍｍとの間の断面の厚さを有した。いくつかの実施形態では、制限物質の細長い要素間に間隙があった。いくつかの実施形態では、バイオプリンターから制限物質を押し出す際に、間隙が細長い要素の間に残った。他の実施形態では、制限物質の少なくとも一部は、システムから除去されて、間隙を提供した。いくつかの実施形態では、制限物質の細長い要素は、略平行であり、間隙は伸長された。いくつかの実施形態では、制限物質の細長い要素は、格子状に配置された。いくつかの実施形態では、制限物質の細長い要素は、支持面に構造を固定する。いくつかの実施形態では、システム、配送に適していた。いくつかの実施形態では、バイオプリントされた細胞は、平滑筋細胞、内皮細胞、線維芽細胞、および上皮細胞のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、栄養培地は、酸素（Ｏ２）、炭素源、窒素源、成長因子、塩、ミネラル、ビタミン、血清、抗生物質、化学物質、タンパク質、核酸、医薬化合物、および抗体のうちの少なくとも１つを含んだ。
【０１４８】
特定の実施形態では、ヒドロゲルによって所定の位置に保持される三次元細胞を含む要素を含む操作した生体組織が本明細書に開示される。ここでは、細胞は、栄養素にアクセスするシリンダーまたはリボン間の間隙をシリンダーまたはリボンとして細胞を含む要素上に分配され、ヒドロゲルは、組織から除去することができる。
【０１４９】
特定の実施形態では、一時的または半永久的な格子を介して組織と栄養培地との間に直接的な接触を提供する工程を含む、操作した組織の生存率を増加させる方法が本明細書に開示される。ここでは、組織は、任意の予め形成されたスキャフォールドがない。いくつかの実施形態では、一時的または半永久的な格子を介して組織と栄養培地との間に直接的な接触を提供する工程は、多孔質または間隙の材料の組織を制限することを含む。さらなる実施形態では、細孔または間隙は、約１００μｍと約３０ｍｍとの間の幅であった。さらなる実施形態では、多孔質または間隙の材料は、ヒドロゲルであったさらに別の実施形態では、多孔質または間隙の材料は、アガロースであった。いくつかの実施形態では、操作した組織の生存率は、エクスビボで増加する。いくつかの実施形態では、操作した組織を含む細胞の少なくとも一部の生存率が延長される。さらなる実施形態では、細胞の生存率は、１日またはそれ以上延長される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの栄養素は、炭素源、窒素源、成長因子、塩、ミネラル、ビタミン、血清、抗生物質、タンパク質、核酸、医薬化合物、および抗体からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの栄養素は、酸素（Ｏ２）である。さらなる実施形態では、多孔質または間隙ヒドロゲルの制限は、異なる露出を有するバイオプリントして細胞を１つ以上の表面上の栄養素に提供するように設計される。
【０１５０】
特定の実施形態では、以下の工程を含む組織培養システムを作製する方法が本明細書に開示される：生体適合性基板上に三次元の細胞を含む要素を確立する工程；三次元の細胞を含む要素に重なる制限物質を分配する工程。ここでは、重なった制限物質により、細胞の少なくとも一部が増殖培地に接触することが可能になる。
【０１５１】
特定の実施形態では、以下の工程を含む組織培養システムの作製する方法が本明細書に開示される：表面に制限物質の周囲を分配する工程；周辺部内の細胞を分配する工程；細胞に重なる制限物質を分配する工程。ここでは、重なった制限物質により、細胞の少なくとも一部が増殖培地に接触することが可能になる。いくつかの実施形態では、制限物質を分配する工程は、バイオプリンティングによって実現される。いくつかの実施形態では、方法は、バイオプリントされた細胞の構成物を成熟させるために適切な培地においてシステムを培養することを含むかまたはさらに含む。
【実施例】
【０１５２】
以下の具体例は、単なる例示であり、いかなる方法においても開示の残りを限定するものではないと解釈されるべきである。さらに詳述することなく、当業者は、本明細書の記載に基づいて本発明を最大限に利用できると考えられる。
【０１５３】
実施例１‐細胞培養
平滑筋細胞
一次ヒト大動脈平滑筋細胞（ＨＡＳＭＣ；ＧＩＢＣＯ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を、３７℃、５％のＣＯ２で、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、０.１ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン、０.２５μｇ／ｍＬのアムホテリシンＢ、０.０１ＭのＨＥＰＥＳ（すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．製，、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、５０ｍｇ／Ｌのプロリン、５０ｍｇ／Ｌのグリシン、２０ｍｇ／Ｌのアラニン、５０ｍｇ／Ｌのアスコルビン酸、および３μｇ／ＬのＣｕＳＯ４（すべてＳｉｇｍａ製、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で補われた低血糖ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）において、維持し、拡大させた。継代４と継代８との間のＨＡＳＭＣの集密的な培養物を、すべての研究において使用した。
【０１５４】
内皮細胞
一次ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ；ＧＩＢＣＯ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を、１０％のＦＢＳ、１μｇ／ｍＬのヒドロコルチゾン、１０ｎｇ／ｍＬのヒト上皮成長因子、３ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞成長因子、１０μｇ／ｍＬのヘパリン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、０.１ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン、および０.２５μｇ／ｍＬのアンホテリシンＢ（すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．製，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で補われた培地１９９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）において、維持し、拡大させた。細胞を、３７℃、５％のＣＯ２で、ゼラチン（ブタ血清から；Ｓｇｉｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）でコーティングした組織培養処理されたフラスコ上で成長させた。継代４と継代８との間のＨＡＥＣの集密的な培養物を、すべての研究において使用した。
【０１５５】
線維芽細胞
一次ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ；ＧＩＢＣＯ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を、３７℃、５％のＣＯ２で、２％のＦＢＳ、１μｇ／ｍＬのヒドロコルチゾン、１０ｎｇ／ｍＬのヒト上皮成長因子、３ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞成長因子、１０μｇ／ｍＬのヘパリン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、および０.１ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン（すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．製，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で補われた培地１９９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）において、維持し、拡大させた。継代４と継代８との間のＨＤＦの集密的な培養物を、すべての研究において使用した。
【０１５６】
ヒト吸引脂肪組織のＳＶＦからのＳＭＣ様の細胞
ＳＭＣ様の細胞を、吸引脂肪組織のコラゲナーゼ消化後に単離した細胞の接着性画分から生成した。この消化は、間質血管細胞分群（ＳＶＦ）として知られる細胞の集団を生成する。ＳＶＦの細胞を、随意に、標準的な組織培養の可塑性かつ接着性のある細胞上に播き、さらに適切な培養条件を介して選択する。脂肪組織の吸引脂肪組織のＳＶＦからのＳＭＣ様の細胞を、３７℃、５％のＣＯ２で、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、０.１ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン、０.２５μｇ／ｍＬのアムホテリシンＢ、０.０１ＭのＨＥＰＥＳ（すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．製，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、５０ｍｇ／Ｌのプロリン、５０ｍｇ／Ｌのグリシン、２０ｍｇ／Ｌのアラニン、５０ｍｇ／Ｌのアスコルビン酸、および３μｇの／ＬのＣｕＳＯ４（すべてＳｇｉｍａ製，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で補われた高グルコースのダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）において、維持し、拡大させた。継代３と継代８との間のＳＶＦ‐ＳＭＣの集密的なサブ培養物を、すべての研究において使用した。
【０１５７】
ヒトの吸引脂肪組織のＳＶＦからのＥＣ
間質の血管画分（ＳＶＦ）からの内皮細胞を、真正な内皮細胞（ＥＣ）の一次分離株を成長させるために共通に使用される増殖培地において維持し、拡大させた。具体的には、ＳＶＦ‐ＥＣを、１０％のＦＢＳ、１μｇ／ｍＬのヒドロコルチゾン、１０ｎｇ／ｍＬのヒト上皮成長因子、３ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞増殖因子、１０μｇ／ｍＬのヘパリン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、および０.１ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシンで補われた培地１９９において維持した。細胞を、３７℃、５％のＣＯ２で組織培養処理されたフラスコ上で増殖させた。継代３と継代８との間のＳＶＦ‐ＥＣの集密的な培養物を、すべての研究において使用した。
【０１５８】
実施例２‐ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）溶液および鋳型
２％および４％の（ｗ／ｖ）のＮｏｖｏＧｅｌ（商標）溶液の調製
ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）（Ｏｒｇａｎｏｖｏ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の１ｇまたは２ｇ（それぞれ２％または４％に対して）を、５０ｍＬのダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中に溶解した。簡潔には、ＤＰＢＳおよびＮｏｖｏＧｅｌ（商標）を、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）が完全に溶解するまで絶えず攪拌しながらホットプレート上で８５℃まで加熱する。ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）溶液を、２５分間、１２５℃で蒸気滅菌により滅菌する。ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）溶液を、温度が６５.５℃より高く維持されている限りは、液体相のままである。この温度未満では、相転移が起こり、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）溶液の粘土が増加し、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）は、固体ゲルを形成する。
【０１５９】
ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）鋳型の作製
ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）鋳型を、１０ｃｍのペトリ皿に合わせたテフロン（登録商標）鋳型を用いて、円柱状のバイオインクのインキュベーションのために作製した。簡潔には、テフロン（登録商標）鋳型を、７０％のエタノール溶液を用い、鋳型を４５分間ＵＶ光に曝露して、予め滅菌した。滅菌した鋳型を、１０ｃｍのペトリ皿（ＶＷＲ  ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ  ＬＬＣ，Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）の上に置き、しっかりと取り付けた。このアセンブリ（テフロン（登録商標）鋳型＋ペトリ皿）を、垂直に維持し、４５ｍＬの予め温められた滅菌２％のＮｏｖｏＧｅｌ（商標）溶液を、テフロン（登録商標）鋳型とペトリ皿の間の空間に注入した。アセンブリを、次いでＮｏｖｏＧｅｌ（商標）の完全なゲル化を可能にするために１時間室温で水平に置いた。ゲル化後、テフロン（登録商標）プリントを除去し、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）鋳型を、ＤＰＢＳを用いて二回洗浄した。次いで、１７.５ｍＬのＨＡＳＭＣ培養培地を、多型の円柱状のバイオインクをインキュベートするＮｏｖｏＧｅｌ（商標）鋳型に添加した。
【０１６０】
実施例３‐ＨＡＳＭＣ‐ＨＡＥＣの多型の円柱状のバイオインクの作製
多型の円柱状のバイオインクを調製するために、ＨＡＳＭＣおよびＨＡＥＣを、個別に収集し、次いで、所定の比率で混合した。簡潔には、培養培地を、集密的な培養フラスコから除去し、細胞を、ＤＰＢＳ（１ｍｌ／５ｃｍ２の成長領域）で洗浄した。細胞を、１０分間、トリプシン（１ｍｌ／１５ｃｍ２の成長領域；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）の存在下においてインキュベーションによって培養フラスコの表面から剥離した。ＨＡＳＭＣを、０.１５％のトリプシンを用いて剥離する一方、ＨＡＥＣを、０.１％のトリプシンを用いて剥離した。インキュベーションに続いて、適切な培養培地をフラスコ（トリプシン体積に対して２倍の体積）に添加した。細胞懸濁液を、６分間、２００ｇで遠心分離し、続いて上澄み液を完全に除去した。細胞ペレットを、それぞれの培養培地中に再懸濁し、血球計を用いて数えた。適切な量のＨＡＳＭＣおよびＨＡＥＣを、１５％のＨＡＥＣ、残り８５％のＨＡＳＭＣ（全細胞集団の％として）を含有する多型の細胞懸濁液を得るために混合した。多型の細胞懸濁液を、５分間、２００ｇで遠心分離し、続いて上澄み液を完全に除去した。多型の細胞ペレットを、６ｍＬのＨＡＳＭＣ培養培地中に再懸濁し、２０ｍＬのガラスバイアル（ＶＷＲ  ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ  ＬＬＣ，Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）に移し、続いて３７℃、５％のＣＯ２で、６０分間、１５０ｒｐｍでオービタルシェーカー上でインキュベートした。これは、細胞が互いに凝集し、細胞間接着を開始することを可能にする。インキュベーション後、細胞懸濁液を、１５ｍＬの遠心チューブに移し、５分間、２００ｇで遠心分離した。上清培地を除去した後、細胞ペレットを、４００μｌのＨＡＳＭＣ培養培地中に再懸濁し、すべての細胞クラスターが破壊されたことを保証するために数回ピペットアップ（ｐｉｐｅｔ  ｕｐ）、ピペットダウン（ｐｉｐｅｔ  ｄｏｗｎ）した。細胞懸濁液を、１５ｍＬの遠心チューブの内部に配置された０.５ｍＬのマイクロチューブ（ＶＷＲ  ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ  ＬＬＣ，Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）に移し、続いて高密度でコンパクトな細胞ペレットを形成するために、４分間、２０００ｇで遠心分離した。上清培地を吸引し、細胞を、長さが５０ｍｍの円柱状のバイオインクが得られるように吸引によってキャピラリーチューブ（ＯＤ１.５ｍｍ，ＩＤ０.５ｍｍ，Ｌ７５ｍｍ；Ｄｒｕｍｍｏｎｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｂｒｏｏｍａｌｌ，ＰＡ）に移した。キャピラリー内部の細胞ペーストを、３７℃、５％のＣＯ２で、２０分間、ＨＡＳＭＣ培地中でインキュベートした。円柱状のバイオインクを、次いで、キャピラリーチューブに供給されたプランジャーを使用して、キャピラリーチューブからＮｏｖｏＧｅｌ（商標）鋳型（例えば実施例２を参照）（ＨＡＳＭＣ培地で被覆された）の溝へ押し出した。円柱状のバイオインクを、３７℃、５％のＣＯ２で２４時間インキュベートした。
【０１６１】
実施例４‐ＨＡＳＭＣ‐ＨＤＦ‐ＨＡＥＣの多型の円柱状のバイオインクの作製
多型の円柱状のバイオインクを調製するために、ＨＡＳＭＣ、ＨＤＦ、およびＨＡＥＣを、個別に収集し、次いで、所定の比率（例えば７０:２５:５のＨＡＳＭＣ：ＨＤＦ：ＨＡＥＣ比）で混合した。簡潔には、培養培地を、集密的な培養フラスコから除去し、細胞を、ＤＰＢＳ（１ｍｌ／１０ｃｍ２の成長領域）で洗浄した。細胞を、１０分間、トリプシン（１ｍｌ／１５ｃｍ２の成長領域；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）の存在下においてインキュベーションによって培養フラスコの表面から剥離した。ＨＡＳＭＣおよびＨＤＦを、０.１５％のトリプシンを用いて剥離する一方、ＨＡＥＣを、０.１％のトリプシンを用いて剥離した。インキュベーションに続いて、適切な培養培地をフラスコ（トリプシン体積に対して２倍の体積）に添加した。細胞懸濁液を、６分間、２００ｇで遠心分離し、続いて上澄み液を完全に除去した。細胞ペレットを、それぞれの培養培地中に再懸濁し、血球計を用いて数えた。適切な量のＨＡＳＭＣ、ＨＤＦおよびＨＡＥＣを、多型の細胞懸濁液を得るために混合した。多型の細胞懸濁液を、５分間、２００ｇで遠心分離し、続いて上澄み液を吸引した。多型の細胞ペレットを、６ｍＬのＨＡＳＭＣ培養培地中に再懸濁し、２０ｍＬのガラスバイアル（ＶＷＲ  ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ  ＬＬＣ，Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）に移し、続いて３７℃、５％のＣＯ２で、６０分間、１５０ｒｐｍでオービタルシェーカー上でインキュベートした。これは、細胞が互いに凝集し、細胞間接着を開始することを可能にする。インキュベーション後、細胞懸濁液を、１５ｍＬの遠心チューブに移し、５分間、２００ｇで遠心分離した。上清培地を除去した後、細胞ペレットを、４００μｌのＨＡＳＭＣ培養培地中に再懸濁し、すべての細胞クラスターが破壊されたことを保証するために数回ピペットアップ（ｐｉｐｅｔ  ｕｐ）、ピペットダウン（ｐｉｐｅｔ  ｄｏｗｎ）した。細胞懸濁液を、１５ｍＬの遠心チューブの内部に配置された０.５ｍＬのマイクロチューブ（ＶＷＲ  ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ  ＬＬＣ，Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）に移し、続いて高密度でコンパクトな細胞ペレットを形成するために、４分間、２０００ｇで遠心分離した。上清培地を吸引し、細胞を、長さが５０ｍｍの円柱状のバイオインクが得られるように吸引によってキャピラリーチューブ（ＯＤ１.２５ｍｍ，ＩＤ０.２６６ｍｍ，Ｌ７５ｍｍ；Ｄｒｕｍｍｏｎｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｂｒｏｏｍａｌｌ，ＰＡ）に移した。キャピラリー内部の細胞ペーストを、３７℃で、５％のＣＯ２で、２０分間、ＨＡＳＭＣ培地中でインキュベートした。円柱状のバイオインクを、次いで、キャピラリーチューブに供給したプランジャーを使用して、キャピラリーチューブからＮｏｖｏＧｅｌ（商標）鋳型（ＨＡＳＭＣ培地で被覆した）の溝へ押し出した。円柱状のバイオインクを、３７℃、５％のＣＯ２で６〜２４時間インキュベートした。
【０１６２】
実施例５‐ＳＶＦ‐ＳＭＣ‐ＳＶＦ‐ＥＣの多型の円柱状のバイオインクの作製
多型の円柱状のバイオインクを調製するために、ＳＶＦ‐ＳＭＣおよびＳＶＦ‐ＥＣを、個別に収集し、次いで、所定の比率で混合した。簡潔には、培養培地を、集密的な培養フラスコから除去し、細胞を、ＤＰＢＳ（１ｍｌ／５ｃｍ２の成長領域）で洗浄した。細胞を、５〜１０分間、ＴｒｙｐＬＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）の存在下においてインキュベーションによって培養フラスコの表面から剥離した。インキュベーションに続いて、適切な培養培地を、酵素活性をクエンチするためにフラスコに添加した。細胞懸濁液を、６分間、２００ｇで遠心分離し、続いて上澄み液を完全に除去した。細胞ペレットを、それぞれの培養培地中に再懸濁し、血球計を用いて数えた。適切な量のＳＶＦ‐ＳＭＣおよびＳＶＦ‐ＥＣを、１５％のＳＶＥ‐ＥＣ、残り８５％のＳＶＦ‐ＳＭＣ（全細胞集団の％として）を含有する多型の細胞懸濁液を得るために混合した。多型の細胞懸濁液を、５分間、２００ｇで遠心分離し、続いて上澄み液を完全に除去した。多型の細胞ペレットを、６ｍＬのＨＡＳＭＣ培養培地中に再懸濁し、２０ｍＬのガラスバイアル（ＶＷＲ  ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ  ＬＬＣ，Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）に移し、続いて３７℃、５％のＣＯ２で、６０分間、１５０ｒｐｍでオービタルシェーカー上でインキュベートした。これは、細胞が互いに凝集し、細胞間接着を開始することを可能にする。インキュベーション後、細胞懸濁液を、１５ｍＬの遠心チューブに移し、５分間、２００ｇで遠心分離した。上清培地を除去した後、細胞ペレットを、４００μｌのＳＶＦ‐ＳＭＣ培養培地中に再懸濁し、すべての細胞クラスターが破壊されたことを保証するために数回ピペットアップ（ｐｉｐｅｔ  ｕｐ）、ピペットダウン（ｐｉｐｅｔ  ｄｏｗｎ）した。細胞懸濁液を、１５ｍＬの遠心チューブの内部に配置された０.５ｍＬのマイクロチューブ（ＶＷＲ  ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ  ＬＬＣ，Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）に移し、続いて高密度でコンパクトな細胞ペレットを形成するために、４分間、２０００ｇで遠心分離した。上清培を吸引し、細胞を、長さが５０ｍｍの円柱状のバイオインクが得られるように吸引によってキャピラリーチューブ（ＯＤ１.２５ｍｍ，ＩＤ０.２６６ｍｍ，Ｌ７５ｍｍ；Ｄｒｕｍｍｏｎｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｂｒｏｏｍａｌｌ，ＰＡ）に移した。キャピラリー内部の細胞ペーストを、３７℃で、５％のＣＯ２で、２０分間、ＳＶＦ‐ＳＭＣ培地中でインキュベートした。円柱状のバイオインクを、次いで、キャピラリーに供給したプランジャーを使用して、キャピラリーチューブからＮｏｖｏＧｅｌ（商標）鋳型（ＳＶＦ‐ＳＭＣ培地で被覆した）の溝へ押し出した。円柱状のバイオインクを、３７℃、５％のＣＯ２で６〜１２時間インキュベートした。
【０１６３】
実施例６‐血管ＳＭＣおよびＥＣの混合物を含む血管壁セグメントのバイオプリンティング
血液血管壁構成物を、ＮｏｖｏＧｅｎ  ＭＭＸ  Ｂｉｏｐｒｉｎｔｅｒ（商標）（Ｏｒｇａｎｏｖｏ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を利用して、１.５ｍＬの２％（ｗ／ｖ）ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）で予め被覆した６ウェル培養プレートのウェル内にバイオプリントした。細胞バイオインクのシリンダーを、ヒト血管平滑筋細胞（ＳＭＣ）およびヒト内皮細胞（ＥＣ）を８５:１５または７０:３０のＳＭＣ：ＥＣ比を有する混合物を用いて調製した。バイオインクのシリンダーを、５００μｍまたは２６６μｍの内径（ＩＤ）のいずれかを有するガラスマイクロキャピラリーチューブ内に細胞ペレット（ＳＭＣ：ＥＣ）を吸引することによって生成した。バイオインクのシリンダーを、次いで、適切な培養培地で被覆したＮｏｖｏＧｅｌ（商標）鋳型内に押し出しした。バイオプリンティングの前に、円柱状のバイオインクを、６〜１８時間保持した。ＳＭＣおよびＥＣの混合物を含有するシリンダーを用いた。これらの実験では、シリンダー内でのＥＣを、ＥＣで被覆し、ＳＭＣが豊富な構造壁を含む構成物になるシリンダーの周囲に選別した。このプロセスは、ＳＭＣからなる壁とＥＣの被覆とを含有する平滑筋構成物の発達をもたらした。構成物を、バイオプリントプロトコルを使用して、培養ウェルの中心にバイオプリントし、培養ウェルを、適切な培養培地で満たし、構成物を、成熟および評価のためにインキュベーターに戻した。バイオプリンティング後、構成物を、適切な量の培養培地（例えば、６ウェルプレートの１ウェルに対して４ｍＬ）で被覆した。要約すると、この実施例は、標準的な大きさのマルチウェル組織培養プレート内に小規模の平滑筋構成物をバイオプリンティングのための血管ＳＭＣおよびＥＣの使用を記載する。得られる平滑筋構成物は、ＥＣの外部層、および主としてＳＭＣからなるまたはＳＭＣのみからなる内壁を特徴とする。
【０１６４】
実施例７‐ＥＣの被覆を用いる、ヒト血管ＳＭＣを含む血管壁セグメントのバイオプリティング
血液血管壁構成物を、ＮｏｖｏＧｅｎ  ＭＭＸ  Ｂｉｏｐｒｉｎｔｅｒ（商標）（Ｏｒｇａｎｏｖｏ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を利用して、１.５ｍＬの２％（ｗ／ｖ）ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）で予め被覆した６ウェル培養プレートのウェル内にバイオプリントした。細胞バイオインクのシリンダーを、ヒト血管平滑筋細胞（ＳＭＣ）用いて調製した。バイオインクのシリンダーを、５００μｍまたは２６６μｍの内径（ＩＤ）のいずれかを有するガラスマイクロキャピラリーチューブ内に細胞ペレット（ＳＭＣ）を吸引することによって生成した。バイオインクのシリンダーを、次いで、適切な培養培地で被覆したＮｏｖｏＧｅｌ（商標）鋳型内に押し出しした。バイオプリンティングの前に、円柱状のバイオインクを、６〜１８時間保持した。ＥＣ‐濃縮物（１‐１.５×１０５細胞／μＬ）を、予めバイオプリントしたＳＭＣ構造の上に直接バイオプリントした。このプロセスは、ＳＭＣからなる壁とＥＣの被覆とを含有する平滑筋構成物の発達をもたらした。構成物を、バイオプリントプロトコルを使用して、培養ウェルの中心にバイオプリントした。バイオプリンティング後、構成物を、適切な量の培養培地（例えば、６ウェルプレートの１ウェルに対して４ｍＬ）で被覆し、成熟および評価のためにインキュベーターに戻した。この実施例は、標準的な大きさのマルチウェル組織培養プレート内に平滑筋構成物をバイオプリンティングのため血管ＳＭＣおよびＥＣの使用を記載する。得られる平滑筋構成物は、ＥＣの外部層、および主としてＳＭＣからなるまたはＳＭＣのみからなる内壁を特徴とする。
【０１６５】
実施例８‐ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）制限を利用する、ＨＡＥＣで層状化したＨＡＳＭＣを含む血管壁セグメントのバイオプリンティング
血管壁を模倣するセグメントを、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）で被覆したウェル内に、またはマルチウェルプレート（例えば６ウェルプレート）のＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）の挿入物の上に直接的に、ＮｏｖｏＧｅｎ  ＭＭＸ  Ｂｉｏｐｒｉｎｔｅｒ（商標）（Ｏｒｇａｎｏｖｏ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）を利用して、バイオプリントした。このプロセスは、以下の３つの段階を含んだ。
【０１６６】
ＨＡＳＭＣシリンダーの調製
ヒト大動脈平滑筋細胞（ＨＡＳＭＣ）の培養物を、トリプシン処理し、次いで、ロータリーシェーカー上で６０分間、振盪した。振盪後、細胞を収集し、遠心分離し、２６６または５００μｍ（ＩＤ）のガラスマイクロキャピラリー内に吸引した。最後に、細胞を、培地で被覆したＮｏｖｏＧｅｌ（商標）プレート内に押し出し、最低６時間インキュベートした。
【０１６７】
ＨＡＥＣで層状化したＨＡＳＭＣパッチのバイオプリンティング
パッチ（例えばセグメント）のバイオプリンティングの直前に、ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）の培養物を、トリプシン処理し、数え、次いで、１×１０６細胞／１０μＬの作業濃度の培地でＨＡＥＣ中に再懸濁した。ＨＡＥＣ懸濁液を、バイオプリントしたパッチを層状化するために利用されるバイオプリンター内に置いた。マルチウェルプレートのウェル内のＮｏｖｏＧｅｌ（商標）ベッド上にプリントする場合には、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）のシリンダーの第１の層をバイオプリントした。次いで、その上に、内部空間が長さ８ｍｍ、幅１.２５ｍｍとなるようにＮｏｖｏＧｅｌ（商標）のロッドを使用してボックスをバイオプリントした。上記のインキュベーション期間の終了時に成熟したＨＡＳＭＣシリンダーをマイクロキャピラリーチューブに再吸引し、ボックス内のプリント用のバイオプリンターに積載した。懸濁液中のＨＡＥＣを、次いで、バイオプリンターによって清潔なマイクロキャピラリー内に吸引し、プリントされたパッチの４隅の近くで、プリントされたＨＡＳＭＣシリンダーの上で４回、分配した。各液滴は、容量２.５μＬであった。構成物を、第３の層のプリントに進む前に１５〜３０分間インキュベートした。最後に、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）のシリンダーの第３の層を第２の層上にプリントし、当該上に格子／メッシュ型構造を作成した。プレートのウェル内部のＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）挿入物上にプリントする場合には、前述したＮｏｖｏＧｅｌ（商標）のロッドの第１の層を削除した。バイオプリントされた構成物を、次いで、適切な細胞培養培地で被覆し、インキュベートした。
【０１６８】
バイオプリントされた構成物の成熟
バイオプリントされた構成物を、１〜７日間インキュベートすることにより、構成物が成熟し、ＨＡＥＣに十分な時間を提供して、ＨＡＳＭＣパッチの上に均一に薄い単分子層を形成することを可能にした。いくつかの実験では、三次元の平滑筋パッチを剪断力（すなわち拍動流）にさらした。
【０１６９】
実施例９‐ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）制限を利用する、ＨＡＥＣで層状化したＨＡＳＭＣを含む血管壁セグメントのＨＤＦａ単層へのバイオプリンティング
平滑筋構成物を、マルチウェルプレート（例えば６ウェルプレート）のＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）の挿入物の上に直接的に、ＮｏｖｏＧｅｎ  ＭＭＸ  Ｂｉｏｐｒｉｎｔｅｒ（商標）（Ｏｒｇａｎｏｖｏ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）を利用して、バイオプリントした。このプロセスは、以下の４つの段階を含んだ。
【０１７０】
Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）膜上へのＨＤＦａの培養
ヒト成体皮膚線維芽細胞（ＨＤＦａ）を、２万細胞／ｃｍ２の密度でＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）膜上に播き、最低６日培養した。これは、細胞が、接着し、成長し、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）膜上の集密的な層になることを可能にした。
【０１７１】
ＨＡＳＭＣシリンダーの調製
ヒト大動脈平滑筋細胞（ＨＡＳＭＣ）の培養物を、トリプシン処理し、ロータリーシェーカー上で６０分間振盪した。振盪後、細胞を収集し、遠心分離し、２６６または５００μｍ（ＩＤ）のガラスマイクロキャピラリー内に吸引した。細胞を、次いで、培地で被覆したＮｏｖｏＧｅｌ（商標）プレート内に押し出し、最低６時間インキュベートした。
【０１７２】
ＨＡＥＣで層状化したＨＡＳＭＣパッチのバイオプリンティング
パッチ（例えばセグメント）のバイオプリンティングの直前に、ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）の培養物を、トリプシン処理し、数え、次いで、１×１０６細胞／１０μＬの作業濃度の培地でＨＡＥＣ培地中に再懸濁した。ＨＡＥＣ懸濁液を、バイオプリントしたパッチを層状化するために利用されるバイオプリンター内に置いた。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）膜上で成長したＨＤＦａを有するマルチウェルプレートにおける培養培地を、完全に吸収し、プレートをバイオプリンターに移した。定義された空間が長さ８ｍｍ、幅１.２５ｍｍとなるようにＮｏｖｏＧｅｌ（商標）のロッドを使用して、膜の上のＨＤＦａの上に直接的にボックスをバイオプリントした。上記のインキュベーション期間の終了時に成熟したＨＡＳＭＣシリンダーをマイクロキャピラリーチューブに再吸引し、ボックス内のプリント用のバイオプリンターに積載した。懸濁液中のＨＡＥＣを、次いで、バイオプリンターによって清潔なマイクロキャピラリーチューブ内に引き込み、プリントされたパッチの４隅の近くで、プリントされたＨＡＳＭＣシリンダーの上で４回分配した。各液滴は、容量２.５μＬであった。構成物を、上部ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）ロッド層のプリントに進む前に１５〜３０分間インキュベートした。最後に、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）のシリンダーの上部層をプリントして、格子／メッシュ型構造を作成した。バイオプリントされた構成物を、次いで、適切な細胞培養培地で被覆し、インキュベートした。
【０１７３】
バイオプリントされた構成物の成熟
バイオプリントされた構成物を、１〜７日間インキュベートすることにより、構成物が成熟し、ＨＡＥＣに十分な時間を提供して、ＨＡＳＭＣパッチの上に均一に薄い単分子層を形成することを可能にした。
【０１７４】
実施例１０‐ＨＡＳＭＣおよびＨＡＥＣの多型のバイオインクを含む平滑筋構成物のバイオプリンティング
平滑筋構成物を、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）で被覆したウェル内のＮｏｖｏＧｅｌ（商標）のベースプレート（大きさ１００ｍｍのペトリ皿）上に、またはマルチウェルプレート（例えば６ウェルプレート）のＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）の挿入物の上に直接的に、ＮｏｖｏＧｅｎ  ＭＭＸ  Ｂｉｏｐｒｉｎｔｅｒ（商標）（Ｏｒｇａｎｏｖｏ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）を利用して、バイオプリントした。このプロセスは、以下の３つの段階を含んだ。
【０１７５】
ＨＡＳＭＣ‐ＨＡＥＣの多型のバイオインクの調製
ヒト大動脈平滑筋細胞（ＨＡＳＭＣ）およびヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）の培養物を、トリプシン処理し、数え、適切な量で混合して、８５:１５または７０:３０の比のいずれかでＨＡＳＭＣ：ＨＡＥＣを含んだシリンダーを得た。多型の細胞懸濁液を、ロータリーシェーカー上で６０分間振盪し、収集し、遠心分離した。細胞を、２６６または５００μｍ（ＩＤ）のガラスマイクロキャピラリー内に引き込み、次いで、培地で被覆したＮｏｖｏＧｅｌ（商標）プレート内に押し出し、最低６時間インキュベートした。
【０１７６】
パッチ／三次元の平滑筋シートのバイオプリンティング
マルチウェルプレートのウェル内のＮｏｖｏＧｅｌ（商標）ベッド上に、またはＮｏｖｏＧｅｌ（商標）のベースプレート（大きさ１００ｍｍのペトリ皿）上にプリントする場合には、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）のシリンダーの第１の層をバイオプリントした。次いで、その上には、内部空間が長さ８ｍｍ、幅１.２５ｍｍとなるようにＮｏｖｏＧｅｌ（商標）のロッドを使用してボックスをバイオプリントした。上記のインキュベーション期間の終了時に成熟した多型の円柱状のバイオインクをマイクロキャピラリーチューブ内に再吸引し、ボックス内のプリント用のバイオプリンターに積載した。最後に、細胞の全体の長さを被覆するかまたは第２の層上に格子／メッシュ型構造を作成する第２の層上にＮｏｖｏＧｅｌ（商標）のシリンダーの第３の層をプリントした。プレートのウェル内部のＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）挿入物上にプリントする場合には、前述したＮｏｖｏＧｅｌ（商標）のロッドの第１の層を削除した。バイオプリントされた構成物を、次いで、適切な細胞培養培地で被覆し、細胞の三次元のパッチを形成するように、押し出したバイオインクの隣接セグメントが融合する間インキュベートした。
【０１７７】
バイオプリントされた構成物の成熟
ＨＡＳＭＣ‐ＨＡＥＣの多型のバイオインクを含むバイオプリントされた構成物を、１〜７日間インキュベートすることにより、構成物が成熟し、ＨＡＥＣに十分な時間を提供して、構成物の周囲に選別することにより、第２の細胞型（この実施例では、内皮細胞）を含む層を有する平滑筋構成物を生じることを可能にした。いくつかの実験では、三次元の平滑筋パッチを、ＨＡＥＣ選別のプロセスを助けるために剪断力（すなわち拍動流）にさらした。
【０１７８】
実施例１１‐ＨＡＳＭＣ、ＨＡＥＣ、およびＨＤＦａの多型の円柱状のバイオインクを含む血管壁セグメントのバイオプリンティング
平滑筋構成物を、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）で被覆したウェル内のＮｏｖｏＧｅｌ（商標）のベースプレート（大きさ１００ｍｍのペトリ皿）上に、またはマルチウェルプレート（例えば６ウェルプレート）のＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）の挿入物の上に直接的に、ＮｏｖｏＧｅｎ  ＭＭＸ  Ｂｉｏｐｒｉｎｔｅｒ（商標）（Ｏｒｇａｎｏｖｏ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）を利用して、バイオプリントした。このプロセスは、以下の３つの段階を含んだ。
【０１７９】
ＨＡＳＭＣ‐ＨＤＦａ‐ＨＡＥＣの多型のバイオインクの調製
ＨＡＳＭＣ、ＨＡＥＣ、およびＨＤＦａの培養物を、トリプシン処理し、数え、適切な量で混合して、７０:１５：１５の比のいずれかでＨＡＳＭＣ：ＨＤＦａ：ＨＡＥＣを含んだ円柱状のバイオインクを得た。多型の細胞懸濁液を、ロータリーシェーカー上で６０分間振盪し、収集し、遠心分離した。細胞を、２６６または５００μｍ（ＩＤ）のガラスマイクロキャピラリー内に引き込み、次いで、培地で被覆したＮｏｖｏＧｅｌ（商標）プレート内に押し出し、最低６時間インキュベートした。
【０１８０】
パッチ／三次元の細胞シートのバイオプリンティング
マルチウェルプレートのウェル内のＮｏｖｏＧｅｌ（商標）ベッド上に、またはＮｏｖｏＧｅｌ（商標）のベースプレート（大きさ１００ｍｍのペトリ皿）上にプリントする場合には、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）のシリンダーの第１の層をバイオプリントした。次いで、その上には、内部空間が長さ８ｍｍ、幅１.２５ｍｍとなるようにＮｏｖｏＧｅｌ（商標）のロッドを使用してボックスをバイオプリントした。上記のインキュベーション期間の終了時に成熟した多型の円柱状のバイオインクをマイクロキャピラリー内に再吸引し、ボックス内のプリント用のバイオプリンターに積載した。最後に、細胞の全体の長さを被覆するかまたは第２の層上に格子／メッシュ型構造を作成する第２の層上にＮｏｖｏＧｅｌ（商標）のシリンダーの第３の層をプリントした。プレートのウェル内部のＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）挿入物上にプリントする場合には、前述したＮｏｖｏＧｅｌ（商標）のロッドの第１の層を削除した。バイオプリントされた構成物を、次いで、適切な細胞培養培地で被覆し、細胞の三次元のパッチを形成するように、細胞のシリンダーの隣接セグメントが融合する間インキュベートした。
【０１８１】
バイオプリントされた構成物の成熟
ＨＡＳＭＣ‐ＨＤＦａ‐ＨＡＥＣの多型のバイオインクを含むバイオプリントされた構成物を、１〜７日間インキュベートすることにより、構成物が成熟し、ＨＡＥＣに十分な時間を提供して、構成物の周囲に選別することにより、他の細胞型（この実施例では、内皮細胞および線維芽細胞）を表す層を有する平滑筋構成物を生じることを可能にした。いくつかの実験では、三次元の平滑筋構成物を、ＨＡＥＣ選別のプロセスを助けるために剪断力（すなわち拍動流）にさらした。
【０１８２】
実施例１２‐培地との直接的な接触を可能にしながら、構成物を空間的に閉じ込めるように使用されるヒドロゲル格子
円柱状のヒドロゲル要素を、三次元の平滑筋構成物の上面の一部を横切ってＮｏｖｏＧｅｎ  ＭＭＸ  Ｂｉｏｐｒｉｎｔｅｒ（商標）をＯｒｇａｎｏｖｏ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を利用して分配した。格子は、バイオプリントされた組織に空間的な制限を提供し、構成物と周囲の培地との直接的な接触を可能にした。第１に、ヒドロゲルベース層を分配した。第２に、ヒドロゲル窓（ｈｙｄｒｏｇｅｌ  ｗｉｎｄｏｗ）を分配して、長さ８ｍｍ、幅１.２５ｍｍの空間を定義した。第３に、平滑筋バイオインクは、ヒドロゲル窓内にバイオプリントして三次元の細胞シートを形成した。第４に、ヒドロゲル格子構造を分配した。様々な実験において、ヒドロゲル要素の大きさは、直径約１００μｍ〜１ｍｍ程度であり、要素間の間隔は、約１００μｍ〜１０ｍｍ程度であった。
【０１８３】
いくつかの実験では、ヒドロゲル要素を、平滑筋のシートの上に、長い、開いているチャネルを作成するために一方向に沿って分配した。他の実験では、ヒドロゲルの要素を、シートの上に、開いている領域の格子状パターンを作成するために複数の方向に分配した。ヒドロゲルを、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）から構成されていた。格子構造は、随意に、構造体を通過し、支持面上に延長されることにより、プリント面に構造体を固定するための追加の材料の適用を可能にする。得られた格子は、構成物を空間的に制限するように使用されるが、細胞構成物のいくつかが周辺の栄養培地との直接的な接触を有することを可能にする。
【０１８４】
実施例１３‐合成ポリマーまたは外因性細胞外マトリックスを使用しない、移植可能なチューブ、シート、および嚢のバイオプリンティング
ヒト平滑筋細胞（ＳＭＣ）を、天然のＳＭＣ組織供給源から培養し、または脂肪組織の間質血管画分（ＳＶＦ）から生成し、バイオインクを生成するように利用した。バイオインクを、球形または円柱状のいずれかの形状で、直径１８０から５００μｍの細胞の自己集合した集合体を含んだ。バイオインクを、ＮｏｖｏＧｅｎ  ＭＭＸ  Ｂｉｏｐｒｉｎｔｅｒ（商標）（Ｏｒｇａｎｏｖｏ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）上に積載し、層ごとに三次元構造物を構成するように使用した。２４〜７２時間以内に、バイオプリントされた構造物を、ＳＭＣからなる安定したチューブまたは厚いシートを生成するように融合した。いくつかの場合において、線維芽細胞、内皮細胞、または上皮細胞を、ＳＭＣとの混合物に組み込まれ、またはバイオプリントされた構成物の特定の層または成分として組み込まれた。いくつかの実験では、内皮細胞または組織特異的な上皮細胞のさらなる細胞層を、プリント後に適用した。いくつかの場合において、バイオプリントされた構成物を、ターゲットとする適用に向けて構成物の特定を促進するために、特定の生体力学的または生化学的条件にさらした。得られた構成物は、ヒトの組織構造を再現し、それらが処理し、固形組織として操作することができる、インサイチュで十分な細胞外マトリックスを生成した。
【０１８５】
実施例１４‐連続堆積と多層、碁盤目状の幾何学的形状とを使用してバイオプリントされた肝組織
操作した肝組織を、連続堆積機構を用いて、ＮｏｖｏＧｅｎ  ＭＭＸ  Ｂｉｏｐｒｉｎｔｅｒ（商標）（Ｏｒｇａｎｏｖｏ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を利用してバイオプリントした。肝組織の三次元構造は、平面の幾何学形状、この場には、六角形で繰り返す機能ユニットに基づいていた。バイオインクは、押出化合物（界面活性剤ポリオール−ＰＦ‐１２７）中にカプセル化された細胞化肝星状細胞および内皮細胞から構成されていた。
【０１８６】
３０％の調製ＰＦ‐１２７
３０％のＰＦ‐１２７溶液（ｗ／ｗ）を、ＰＢＳを用いて作製した。ＰＦ‐１２７粉末を、４℃に維持された磁気撹拌プレートを用いて、冷却されたＰＢＳと混合した。約４８時間で、完全に溶解した。
【０１８７】
細胞の調製およびバイオプリンティング
８２％の星状細胞（ＳＣ）と、１８％のヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）およびヒト成体皮膚線維芽細胞（ＨＤＦａ）とからなる細胞懸濁液を、遠心分離後に、３つの細胞濃度：５０×１０６細胞／ｍＬ、１００×１０６細胞／ｍＬ、および２００×１０６細胞／ｍＬを実現するように、１５ｍＬのチューブ内に分離した。各細胞ペレットを、３０％のＰＦ‐１２７中に再懸濁し、バイオプリンターを用いて３ｃｃのリザーバー内に吸引した。５１０μｍの分配チップを用いて、カプセル化された細胞を、単一の六角形（図７のＡを参照）または六角の碁盤目状の構成（図７のＢを参照）へとＰＤＭＳベース板上にバイオプリントした。各構成物を、約２００μＬの培地を受け、構成物の完全性を評価するために、室温で２０分間インキュベートした。
【０１８８】
多層バイオプリンティング
六角の碁盤目状の実験では、（４）までの連続層をバイオプリントし、より多くの細胞物質が存在するより高い構造を結果的にもたらす。製作後、各構成物を、最初に、構成物の完全性を評価するために、約２００μＬの完全な培地を受けた。構成物を、室温で２０分間インキュベートし、次いで、２０ｍｌの完全培地の中に浸漬した。
【０１８９】
結果
（ＰＦ１２７を溶解する）１０％のウシ胎児血清を含有する増殖培地での培養の１８時間後、バイオプリントされた幾何学的形状内に含まれる細胞を、元の設計の幾何学的パターン形成を保持した組織の無傷なかつ連続したシートを生成するために互いに十分に凝集した（図７のＤを参照）。図８に示されるのは、１０％の中性緩衝ホルマリン内で固定した後の碁盤目状の構成物の単一セグメントのＨ＆Ｅ染色である。細胞は、生存可能であり、無傷であり、かつ元のプリントされた幾何学的形状に限定されることが分かった。
【０１９０】
実施例１５‐多層のバイオプリントされた組織パッチの平面的幾何学形状
バイオインクを、前述されるように、典型的には直径２５０μｍまたは５００μｍの円柱状かつ安定した細胞集合体に形成した。簡潔には、細胞を、典型的な実験室条件下で増殖させ、細胞が７０％‐８０％の集密度に達した場合には、細胞を、ＥＤＴＡなしの０.１％のトリプシンの適用を介して細胞培養面から剥離した。トリプシン処理後、細胞を、血清を含む培地で一度洗浄し、収集し、数え、遠心分離して、大細胞ペレットを形成した。細胞ペレットを、均質（すなわち単型）のバイオインクを生成するためにキャピラリーに吸引しるか、または不均質（すなわち多型）の錯体のバイオインク混合物を得るユーザー定義の細胞混合物（下記の表１を参照）を生成するために再懸濁した。例えば図９を参照。このやり方で作成されたバイオインクのシリンダーは、随意に、管状の構成物をバイオプリントするために直接的に利用される。
【０１９１】
【表１】
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【０１９２】
表１には、細胞組成に基づくバイオインク調製の不完全なリストが提示されている。調製は、随意に、天然の組織構造および／またはバイオプリントされた新組織における細胞の再編成に対処するために様々な割合の単一の細胞型、または異なる細胞型の混合物のいずれかからなる。推定上のバイオインク組成物は、調べられた細胞型のリストと、作成された多数のプロトタイプとを有する組成パーセントとして表される。
【０１９３】
表１に列挙された作業プロトタイプは、随意に、管状構成物の意図されたターゲットとする適用に基づいて、様々な異なる大きさで生成される。例えば、管状構造体のためのいくつかの一般的に利用されるスキーマは、図１０の断面図に示されている。
【０１９４】
図１１は、７０:３０のＳＭＣ：Ｆｉｂからなるバイオインクでバイオプリントされた６／１の作業プロトタイプの管状構成物を実証する。
【０１９５】
様々な細胞混合物の移植可能な管状組織、特に平滑筋細胞（ＳＭＣ）の成分は、体内の多数のターゲット位置において適用される適切な組成物および機能的特性を提供する。いくつかの例示的な適用は、呼吸器の移植片、胃腸の移植片、および泌尿器の移植片を含む。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、移植可能なバイオプリントされたシートを、連続縫合または複数の結節縫合のいずれかで外科的に取り付けられる。図１２を参照。
【０１９７】
実施例１６‐バイオプリントされた骨格筋のパッチ
細胞バイオインクのシリンダーを、筋芽細胞株（Ｃ２Ｃ１２）、ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）、および／またはヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦａ）を用いて調製した。細胞を、特定の細胞型のための標準的な細胞培養の実践に資する主要な文献において典型的に見られる成分からなる培地で、標準的な実験室条件下で増殖した。所望の集密（典型的には６０〜１００％）に達すると、陽イオンを含まないリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄することによって、細胞を、標準的な組織培養プラスチックから遊離し、次いで、０.０５％‐０.１％のトリプシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に曝露した。遊離した細胞を、血清を含む培地中で洗浄し、収集し、数え、適切な比率で組み合わせ、遠心分離によってペレット化した。典型的には、Ｃ２Ｃ１２は、以下の比率で混合した：１００％のＣ２Ｃ１２、９０:１０（Ｃ２Ｃ１２：ＨＡＥＣ）、９０:１０（Ｃ２Ｃ１２：ＨＤＦａ）、または８０:１０:１０（Ｃ２Ｃ１２：ＨＡＥＣ：ＨＤＦａ）。上清を除去し、細胞をフィブリノゲン（２ｍｇ／ｍＬ）中に再懸濁した。細胞混合物を、遠心分離によりペレット化し、上清を、細胞ペレットから除去し、細胞混合物を、所望の直径、典型的には、２５０または５００μｍのガラスキャピラリー内に吸引した。培地中で１５〜２０分間の浸漬後、各キャピラリーの内容物を、線形チャネルを含む非接着性ヒドロゲル鋳型に押し出し、４〜２４時間、培地中でインキュベートした。
【０１９８】
骨格筋の構成物を、次いで、Ｃ２Ｃ１２、ＨＡＥＣおよび／またはＨＤＦａを含む細胞バイオインクのシリンダーを使用して細胞培養ウェル挿入物（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）、ＢＤ）の膜上にバイオプリントした。骨格筋組織セグメントを、１.２５ｍｍ×８.００ｍｍ×０.２５ｍｍ（Ｗ×Ｌ×Ｈ）の初期寸法で製作した。製作に続いて、骨格筋パッチを、完全血清含有細胞培養培地中に浸漬し、成熟のために５％のＣＯ２で補われた標準的な加湿チャンバー内に置いた。バイオプリントされた骨格筋セグメントを、次いで、静的条件下で培養し、またはサイトカインまたは生体力学的シグナルを加えることによって刺激した。バイオプリントされた骨格筋構成物を、９日間まで培養し、細胞組織、細胞外マトリックス産生、細胞生存率、および完全性について評価した。例えば図１３のＡ、ＢおよびＣを参照。
【０１９９】
結果
Ｃ２Ｃ１２、ＨＡＥＣおよび／またはＨＤＦａを含むバイオプリントされた骨格筋組織構成物を、成功裏に作製し、培養物内で維持した。
【０２００】
本発明の好ましい実施形態を図示および説明してきたが、このような実施形態は例としてのみ提供されることが当業者には明らかである。多くの変形、変更、および置換が本発明から逸脱することなく当業者には思いつく。なお、本明細書に記載の本発明の実施形態に対する様々な代替物は、随意に、本発明を実施する際に使用されることが理解されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【外国語明細書】
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