(57)【要約】【課題】炎症を惹起する強い免疫原性を有する内在性核酸を新規に同定し、該核酸の免疫原性を抑制することにより、自己免疫疾患や炎症性疾患の新規な治療手段を提供すること。【解決手段】U11 snRNAのヌクレオチド配列中、連続する15〜30ヌクレオチドの部分配列と相補的な配列を含む、U11 snRNAの機能を抑制する核酸分子。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｕ１１ ｓｎＲＮＡのヌクレオチド配列中、連続する１５〜３０ヌクレオチドの部分配列と相補的な配列を含む、Ｕ１１ ｓｎＲＮＡの機能を抑制する核酸分子。
【請求項２】
前記部分配列が、ステム−ループ３の全部もしくは一部を含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
前記部分配列が、配列番号１で表されるヒトＵ１１  ｓｎＲＮＡのヌクレオチド配列中、ヌクレオチド番号５５〜７４で示される配列もしくはその非ヒト哺乳動物オルソログ又はその遺伝子多型における対応する配列である、請求項２に記載の核酸分子。
【請求項４】
前記部分配列が、ｓｍ結合ドメインの全部もしくは一部を含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項５】
前記部分配列が、配列番号１で表されるヒトＵ１１  ｓｎＲＮＡのヌクレオチド配列中、ヌクレオチド番号８３〜１０１、８４〜１０２もしくは８５〜１０３で示される配列又はその非ヒト哺乳動物オルソログあるいはその遺伝子多型における対応する配列である、請求項４に記載の核酸分子。
【請求項６】
Ｕ１１ ｓｎＲＮＡに対するアンチセンス核酸である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項７】
配列番号２で表されるヌクレオチド配列（但し、該配列中、ＵはＴであってもよい）からなる、請求項６に記載の核酸分子。
【請求項８】
前記アンチセンス核酸がギャップマー型である、請求項６又は７に記載の核酸分子。
【請求項９】
Ｕ１１ ｓｎＲＮＡに対するｓｉＲＮＡである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項１０】
前記ｓｉＲＮＡが、配列番号３〜５のいずれかで表されるヌクレオチド配列（但し、該配列中、ＵはＴであってもよい）と、それに相補的な配列とからなる、請求項９に記載の核酸分子。
【請求項１１】
前記ｓｉＲＮＡが、一方もしくは両方の鎖に３’−オーバーハングを有する、請求項９又は１０に記載の核酸分子。
【請求項１２】
前記部分配列と相補的な配列Ｘａを含むヌクレオチド配列Ｘと、配列Ｘａに相補的な配列Ｙａを含むヌクレオチド配列Ｙとが、リンカーＬを介して、３’から ５’方向にＸ−Ｌ−Ｙの順序で、かつ配列Ｘａと配列Ｙａとが分子内で二重鎖を形成し得る配向で連結された、請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項１３】
前記リンカーＬが、下記式で表されるプロリン誘導体リンカーである、請求項１２に記載の核酸分子。
【化１】
2018191580.tif 000011
【請求項１４】
前記配列Ｘが前記配列Ｘａの５’末端に付加配列Ｘｂを有し、かつ前記配列Ｙが前記配列Ｙａの３’末端に付加配列Ｙｂを有し、配列Ｘｂと配列Ｙｂとが相補的である、請求項１２又は１３に記載の核酸分子。
【請求項１５】
前記配列Ｘが３’−オーバーハングを有する、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項１６】
前記配列Ｘａが、配列番号３〜５のいずれかで表されるヌクレオチド配列（但し、該配列中、ＵはＴであってもよい）である、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の核酸分子を含む、Ｕ１１ ｓｎＲＮＡの機能抑制剤。
【請求項１８】
前記Ｕ１１ ｓｎＲＮＡの機能が、I型インターフェロン及び／又は炎症性サイトカインの発現誘導である、請求項１７に記載の剤。
【請求項１９】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の核酸分子を含む医薬。
【請求項２０】
I型インターフェロン及び／又は炎症性サイトカインの発現亢進が関与する疾患の治療剤である、請求項１９に記載の医薬。
【請求項２１】
前記疾患が、自己免疫疾患又は炎症性疾患である、請求項２０に記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、U11 snRNAの機能を抑制する核酸分子およびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫系は自己と非自己を識別し、病原体を異物として排除することで、生体を守る重要な機構である。免疫系は主に適応免疫系と自然免疫系の二つに大別される。適応免疫系は病原体の分子構造を非常に高い特異性で認識し、強力な応答によって異物の排除を行うとともに、免疫記憶として次の感染に備える細胞群を分化させる。一方、自然免疫系は、比較的低い特異性で病原体のパターン構造を認識し、病原体感染時の初期応答とそれに引き続く適応免疫系活性化への橋渡しを担っている。
【０００３】
近年、病原体成分だけでなく細胞傷害や細胞死等によって細胞外に放出される自己分子（Damage-associated molecular patterns; DAMPs）によってパターン認識受容体（PRR; pattern recognition receptors）経路が活性化されることが明らかになっている。なかでも、核酸は、病原体と宿主に共通の構造を有し、すべての宿主細胞に存在するため、強力かつ多量なDAMPsとして特に注目されている。これまでに免疫原性を有することが報告されている内在性核酸としては、ミトコンドリアDNA、Alu RNA、マイクロRNA、U1 small nuclear RNA（snRNA）等がある。
【０００４】
U1 snRNAは、mRNAのスプライシング（GT-AG型イントロンの切断）を触媒するスプライソソームの主要構成分子であり、細胞あたり約2〜10万個と、単一のrRNAに次いで多く存在する。U1 snRNAをはじめとするsnRNA群とタンパク質との複合体（snRNP）は、自己抗体と結合することでFcγ受容体を介して細胞に取り込まれ、ヒト末梢血単核球より単離したCD14陽性細胞においてTLR7/8とNLRP3を活性化する（非特許文献１）他、U1 snRNA単独でもTLR3、TLR7、NLRP3を活性化することが報告されている（非特許文献１〜３）。しかし、刺激活性の本体がU1 snRNAのみであるかは依然として不明である。さらに、U1 snRNAはメチル化された塩基を含んでいるが、RNAのメチル化はその免疫原性を著しく低下させることから、U1 snRNAが免疫原性RNAとして生理的にどれほど重要であるかは明らかではない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Savarese, E. et al., Blood 107, 3229-3234 (2006).
【非特許文献２】Sadik, C. D. et al., Nucleic Acids Res 37, 5041-5056 (2009)
【非特許文献３】Shin, M. S. et al., J Immunol 188, 4769-4775 (2012)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、炎症を惹起する強い免疫原性を有する内在性核酸を新規に同定し、該核酸の免疫原性を抑制することにより、自己免疫疾患や炎症性疾患の新規な治療手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記の目的を達成すべく、本発明者らは、U1 snRNAと同様、細胞内に多量に含まれるが、U1 snRNAとは異なり、分子内にメチル化修飾を持たないU11 snRNA（AT-AC型イントロンの切断に関与するスプライソソームにおけるU1 snRNAと機能的に等価な構成分子であり、5’スプライス部位を認識する）に着目し、その免疫原性について検討した。具体的には、種々の自己免疫疾患モデル（関節リウマチのモデルであるコラーゲン誘導関節炎（CIA）モデルマウス、全身性エリトマトーデスのモデルであるループス腎炎モデルマウス、BXSB Yaa-マウス）の血清中のU11 snRNAレベルを調べた。その結果、これらの疾患モデルの血清において、対照マウスと比較して、高値のU11 snRNAが検出されることを見出した。また、U11 snRNAがこれら疾患の発症・増悪に関与すると考えられる炎症性サイトカイン遺伝子やI型インターフェロン（IFN）遺伝子の発現を強力に誘導する内在性核酸であることを明らかにした。さらに、本発明者らは、その遺伝子発現誘導能がU11 snRNAの相補配列を有する核酸によって阻害されることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本発明は以下のとおりのものである。
［１］  Ｕ１１ ｓｎＲＮＡのヌクレオチド配列中、連続する１５〜３０ヌクレオチドの部分配列と相補的な配列を含む、Ｕ１１ ｓｎＲＮＡの機能を抑制する核酸分子。
［２］  前記部分配列が、ステム−ループ３の全部もしくは一部を含む、［１］に記載の核酸分子。
［３］  前記部分配列が、配列番号１で表されるヒトＵ１１ ｓｎＲＮＡのヌクレオチド配列中、ヌクレオチド番号５５〜７４で示される配列もしくはその非ヒト哺乳動物オルソログ又はその遺伝子多型における対応する配列である、［２］に記載の核酸分子。
［４］  前記部分配列が、ｓｍ結合ドメインの全部もしくは一部を含む、［１］に記載の核酸分子。
［５］  前記部分配列が、配列番号１で表されるヒトＵ１１ ｓｎＲＮＡのヌクレオチド配列中、ヌクレオチド番号８３〜１０１、８４〜１０２もしくは８５〜１０３で示される配列又はその非ヒト哺乳動物オルソログあるいはその遺伝子多型における対応する配列である、［４］に記載の核酸分子。
［６］  Ｕ１１ ｓｎＲＮＡに対するアンチセンス核酸である、［１］〜［５］のいずれかに記載の核酸分子。
［７］  配列番号２で表されるヌクレオチド配列（但し、該配列中、ＵはＴであってもよい）からなる、［６］に記載の核酸分子。
［８］  前記アンチセンス核酸がギャップマー型である、［６］又は［７］に記載の核酸分子。
［９］  Ｕ１１ ｓｎＲＮＡに対するｓｉＲＮＡである、［１］〜［５］のいずれかに記載の核酸分子。
［１０］  前記ｓｉＲＮＡが、配列番号３〜５のいずれかで表されるヌクレオチド配列（但し、該配列中、ＵはＴであってもよい）と、それに相補的な配列とからなる、［９］に記載の核酸分子。
［１１］  前記ｓｉＲＮＡが、一方もしくは両方の鎖に３’−オーバーハングを有する、［９］又は［１０］に記載の核酸分子。
［１２］  前記部分配列と相補的な配列Ｘａを含むヌクレオチド配列Ｘと、配列Ｘａに相補的な配列Ｙａを含むヌクレオチド配列Ｙとが、リンカーＬを介して、３’から ５’方向にＸ−Ｌ−Ｙの順序で、かつ配列Ｘａと配列Ｙａとが分子内で二重鎖を形成し得る配向で連結された、［１］〜［５］のいずれかに記載の核酸分子。
［１３］  前記リンカーＬが、下記式で表されるプロリン誘導体リンカーである、［１２］に記載の核酸分子。
【０００９】
【化１】
2018191580.tif 000002
【００１０】
［１４］  前記配列Ｘが前記配列Ｘａの５’末端に付加配列Ｘｂを有し、かつ前記配列Ｙが前記配列Ｙａの３’末端に付加配列Ｙｂを有し、配列Ｘｂと配列Ｙｂとが相補的である、［１２］又は［１３］に記載の核酸分子。
［１５］  前記配列Ｘが３’−オーバーハングを有する、［１２］〜［１４］のいずれかに記載の核酸分子。
［１６］  前記配列Ｘａが、配列番号３〜５のいずれかで表されるヌクレオチド配列（但し、該配列中、ＵはＴであってもよい）である、［１２］〜［１５］のいずれかに記載の核酸分子。
［１７］  ［１］〜［１６］のいずれかに記載の核酸分子を含む、Ｕ１１ ｓｎＲＮＡの機能抑制剤。
［１８］  前記Ｕ１１ ｓｎＲＮＡの機能が、I型インターフェロン及び／又は炎症性サイトカインの発現誘導である、［１７］に記載の剤。
［１９］  ［１］〜［１６］のいずれかに記載の核酸分子を含む医薬。
［２０］  I型インターフェロン及び／又は炎症性サイトカインの発現亢進が関与する疾患の治療剤である、［１９］に記載の医薬。
［２１］  前記疾患が、自己免疫疾患又は炎症性疾患である、［２０］に記載の医薬。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の核酸分子によれば、U11 snRNAの機能を抑制することができる。また、本発明の核酸分子を、I型インターフェロン及び／又は炎症性サイトカインの発現亢進が関与する疾患の治療剤として用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図1は、マウス全長U11 snRNAの免疫原性を検証した結果を示す。
【図２】図2は、ヒト細胞におけるU11 snRNAの免疫原性を検証した結果を示す。
【図３】図3は、TLR7欠損マウス由来の脾臓細胞を用いた、U11 snRNAを認識する受容体を検証した結果を示す。
【図４】図4は、ヒトU11 snRNAおよびヒトU1 snRNAの二次構造の模式図である。
【図５】図5は、メチル化修飾を有するまたは有しないU11 snRNAの免疫原性を検証した結果を示す。
【図６】図6は、マウス疾患モデルの血中のU11 snRNA濃度を解析した結果を示す。
【図７】図7は、U11 snRNAに相補的な配列を有するsi RNAおよび一本鎖核酸分子による、U11 snRNAの免疫原性の抑制を検証した結果を示す。
【図８】図8は、U11 snRNAに相補的な配列を有するアンチセンス核酸による、U11 snRNAの免疫原性の抑制を検証した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書で使用する用語は、特に言及しない限り、当該技術分野で通常用いられる意味で用いることができる。
【００１４】
1. U11 snRNAの機能を抑制する核酸分子
本発明は、U11 snRNAのヌクレオチド配列と相補的な配列を含む、U11 snRNAの機能を抑制する核酸分子（以下、「本発明の核酸分子」と記載する場合がある。）を提供する。
【００１５】
ここで、「U11 snRNAの機能」とは、本発明者らが新たに見出した、自己に対する免疫原性、より具体的には、U11 snRNAを発現する自己の細胞が細胞死などを起こすことでU11 snRNAを細胞外に放出した際における、U11 snRNAを認識する免疫系細胞等からのI型IFN及び／又は炎症性サイトカインの発現誘導作用だけでなく、従来公知の機能、例えば、AT-AC型イントロンの切断に関与するスプライソソームにおいて、5’スプライス部位を認識する機能なども包含する意味で用いられる。従って、前記のいずれかの機能を抑制すれば、本発明の核酸分子に包含されるが、好ましくは、本発明の核酸分子としては、免疫原性を減弱させる活性、即ち、I型IFN及び／又は炎症性サイトカインの発現誘導能を抑制する活性を、少なくとも有するものが挙げられる。
【００１６】
本発明の核酸分子は、U11 snRNAの機能を抑制する配列として、U11 snRNAのヌクレオチド配列の全部又は一部と相補的な配列を含む。U11 snRNAのヌクレオチド配列としては、配列番号1で表されるヒトU11 snRNAのヌクレオチド配列（Ensemblデータベースに、Transcript ID: ENST00000602813として登録されている）もしくはその非ヒト哺乳動物オルソログ（例えば、マウスU11 snRNAのヌクレオチド配列は、Ensemblデータベースに、Transcript ID: ENSMUST00000104135として登録されている）、又はその遺伝子多型（例えば、ヒトU11 snRNAの場合はURL: http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/Transcript/Variation_Transcript/Table?db=core;g=ENSG00000270103;r=1:28648600-28648730;t=ENST00000602813、マウスU11 snRNAの場合はURL: http://www.ensembl.org/Mus_musculus/Transcript/Variation_Transcript/Table?db=core;g=ENSMUSG00000077323;r=4:132270080-132270213;t=ENSMUST00000104135の、「Variant table」に「Non coding transcript exon variant」として列挙される遺伝子多型）が挙げられる。本明細書においては、以下、特にことわらない限り、配列番号１で表されるヒトU11 snRNAのヌクレオチド配列に基づいて、ヌクレオチドの位置やヌクレオチド配列の範囲等を記載するが、その場合、その遺伝子多型や非ヒト哺乳動物オルソログにおける対応するヌクレオチドやヌクレオチド配列も、当該記載内容に包含されるものである。
【００１７】
配列番号１
5’- aaaaagggcu ucugucguga guggcacacg uagggcaacu cgauugcucu gcgugcggaa     
ucgacaucaa gagauuucgg aagcauaauu uuuugguauu ugggcagcug gugaucguug
gucccggcgc ccuuu -3’
（以下、特にことわらない限り、ヌクレオチド配列は、左から右に、5’から3’の方向に記載する。）
【００１８】
U11 snRNAの機能を抑制する配列は、U11 snRNAのヌクレオチド配列の全部又は一部と相補的な配列である。ここで、「相補的な配列」とは、標的配列に対して完全相補的な（即ち、ミスマッチなくハイブリダイズする）配列だけでなく、哺乳動物細胞の生理的条件下でU11 snRNAとハブリダイズし得る限り、1ないし数ヌクレオチド（例、1、2、3、4、5ヌクレオチド）のミスマッチを含む配列であってもよい。例えば、U11 snRNA中の標的ヌクレオチド配列の相補鎖配列に対して、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上の同一性を有する配列が挙げられる。
【００１９】
U11 snRNAの機能を抑制する配列が標的とするU11 snRNAのヌクレオチド配列は、本発明の核酸分子がU11 snRNAの機能、特に自己に対する免疫原性を抑制し得る限り特に制限されないが、U11 snRNAへの特異性を考慮すれば、U11 snRNAのヌクレオチド配列中、連続する12ヌクレオチド以上の配列であることが好ましく、連続する15ヌクレオチド以上の配列であることがより好ましい。該標的ヌクレオチド配列の長さの上限も特に制限はないが、合成の容易さ等を考慮すれば、例えば100ヌクレオチド以下、好ましくは50ヌクレオチド以下、より好ましくは30ヌクレオチド以下、さらに好ましくは25ヌクレオチド以下の、連続する部分ヌクレオチド配列である。従って、該標的ヌクレオチド配列は、U11 snRNAのヌクレオチド配列中、好ましくは、連続する15〜30ヌクレオチド、より好ましくは、連続する15〜25ヌクレオチドの部分ヌクレオチド配列であり得る。
【００２０】
U11 snRNAの機能を抑制する配列が標的とする該snRNA中の部分配列（標的部分配列）は、本発明の核酸分子がU11 snRNAの機能、特に自己に対する免疫原性を抑制し得る限り特に制限されないが、本発明の核酸分子が標的にしやすい配列であるという点から、例えば、U11 snRNAの2次構造において相補鎖を形成していない一本鎖部分を含む配列等が挙げられる。具体的には、例えば、ステム−ループ構造のループ部分またはsm結合ドメインを含む配列等が挙げられる。ステム−ループとは、一本鎖のRNAが、（その2次構造において）部分的に相補的な塩基対を形成する構造をもったステム（幹）をもつ一方で、他の部分では塩基対を形成せず一本鎖のループとなっている構造を指す。ステムループとしては、ループが最も長いステム−ループ3に加え、ステム−ループ1、ステム−ループ2、ステム−ループ4が挙げられる。ステム−ループ3とは、配列番号1で表されるヌクレオチド配列中、ヌクレオチド番号56〜79（そのうちループ部分はヌクレオチド番号62〜73）で示される配列である。sm結合ドメインとは、配列番号1で表されるヌクレオチド配列中、ヌクレオチド番号87〜96で示される配列である。該標的部分配列は、好ましくは、ステム−ループ3及びsm結合ドメインの全部又は一部を含む。
【００２１】
U11 snRNAの機能を抑制する配列がステム−ループ3を標的とする場合、標的部分配列としては、ステムループ3中のUまたはGをより多く含む領域の配列が好ましく、例えば、配列番号1で表されるヌクレオチド配列中、ヌクレオチド番号60〜80で示される配列、ヌクレオチド番号55〜74で示される配列等が挙げられる。
【００２２】
また、U11 snRNAの機能を抑制する配列が、sm結合ドメインを標的とする場合、標的部分配列としては、sm結合ドメイン及びそれに隣接するUまたはGをより多く含む領域の配列が好ましく、例えば、配列番号1で表されるヌクレオチド配列中、ヌクレオチド番号83〜101、84〜102又は85〜103で示される配列等が挙げられる。
【００２３】
本発明の核酸分子は、U11 snRNAの機能、特に自己に対する免疫原性を抑制し得る限りRNAであっても、DNAであってもよく、DNA／RNAキメラであってもよい。また、本発明の核酸分子は、U11 snRNAの機能、特に自己に対する免疫原性を抑制し得る限り、二本鎖核酸であっても、一本鎖核酸であってもよい。二本鎖核酸の場合、二本鎖DNA、二本鎖RNA、DNA:RNAハイブリッド、DNA／RNAキメラとDNA、RNA又はDNA／RNAキメラとのハイブリッドのいずれであってもよい。
【００２４】
本発明の核酸分子が二本鎖核酸の場合、一方の鎖はU11 snRNAの機能を抑制する配列、即ち、U11 snRNAのヌクレオチド配列の全部もしくは一部と相補的な配列を含み（以下、U11 snRNAに結合し、その機能を抑制する配列を含む鎖を「ガイド鎖」ともいう）、他方の鎖は、少なくともU11 snRNAの機能を抑制する配列に相補的な配列を含む（以下、U11 snRNAの機能を抑制する配列に相補的な配列を含む鎖を「パッセンジャー鎖」ともいう）。ここで「相補的な配列」とは、U11 snRNAのヌクレオチド配列に対する該snRNAの機能を抑制する配列の相補性について前記したのと同義である。
【００２５】
本発明の核酸分子が一本鎖核酸の場合、上記のガイド鎖のみを有する場合と、ガイド鎖とパッセンジャー鎖とが任意のリンカーを介して連結され、分子内でU11 snRNAの機能を抑制する配列とそれに相補的な配列とがハイブリダイズして二重鎖を形成し得る場合とがある。
【００２６】
本発明の核酸分子の構成単位としては、例えば、リボヌクレオチド残基およびデオキシリボヌクレオチド残基があげられる。これらのヌクレオチド残基は、例えば、修飾されていても非修飾であってもよい。本発明の核酸分子は、例えば、修飾ヌクレオチド残基を含むことによって、ヌクレアーゼ耐性が向上し、安定性の改善が可能である。また、本発明の核酸分子は、例えば、前記ヌクレオチド残基の他に、さらに、非ヌクレオチド残基を含んでもよい。
【００２７】
本発明の核酸分子において、リンカー以外の領域（ガイド鎖やパッセンジャー鎖）の構成単位は、ヌクレオチド残基であることが好ましい。各領域は、例えば、下記（1）〜（3）の残基で構成される。
（1）非修飾ヌクレオチド残基
（2）修飾ヌクレオチド残基
（3）非修飾ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
【００２８】
本発明の核酸分子は、例えば、標識物質で標識化されてもよい。標識物質は、特に制限されず、例えば、蛍光物質、色素、同位体等があげられる。標識物質は、例えば、ピレン、TAMRA、フルオレセイン、Cy3色素、Cy5色素等の蛍光団があげられ、色素としては、例えば、Alexa488等のAlexa色素等があげられる。同位体としては、例えば、安定同位体および放射性同位体があげられる。安定同位体は、例えば、被曝の危険性が少なく、専用の施設も不要であることから取り扱い性に優れ、また、コストも低減できる。また、安定同位体は、例えば、標識した化合物の物性変化がなく、トレーサーとしての性質にも優れる。安定同位体としては、例えば、2H、13C、15N、17O、18O、33S、34Sおよび36Sがあげられる。
【００２９】
ヌクレオチド残基は、構成要素として、糖、塩基およびリン酸を含む。リボヌクレオチド残基は、糖としてリボース残基を有し、塩基として、アデニン（A）、グアニン（G）、シトシン（C）およびウラシル（U）（チミン（T）に置き換えることもできる）を有し、デオキシリボヌクレオチド残基は、糖としてデオキシリボース残基を有し、塩基として、アデニン（dA）、グアニン（dG）、シトシン（dC）およびチミン（dT）（ウラシル（dU）に置き換えることもできる）を有する。
【００３０】
修飾ヌクレオチド残基は、ヌクレオチド残基の構成要素のいずれが修飾されていてもよい。本発明において、「修飾」は、例えば、前記構成要素の置換、付加および／または脱離、前記構成要素における原子および／または官能基の置換、付加および／または脱離であり得る。修飾ヌクレオチド残基は、例えば、天然に存在する修飾ヌクレオチド残基であっても、人工的に修飾したヌクレオチド残基であってもよい。天然由来の修飾ヌクレオチド残基としては、例えば、リンバックら（Limbach et al．、1994、Summary:the modified nucleosides of RNA、Nucleic Acids Res．22:2183〜2196）を参照できる。
【００３１】
ヌクレオチド残基の修飾としては、例えば、リボース−リン酸骨格（以下、リボリン酸骨格）の修飾があげられる。
【００３２】
前記リボリン酸骨格において、例えば、リボース残基を修飾できる。前記リボース残基は、例えば、2’位炭素を修飾でき、具体的には、例えば、2’位炭素に結合する水酸基を、水素原子、フッ素等のハロゲン原子又は-O-アルキル基（例、-O-Me基）、-O-アシル基（例、-O-COMe基）及びアミノ基からなる群より選ばれる原子又は基、好ましくは、水素原子、メトキシ基及びフッ素原子からなる群より選ばれる原子又は基に置換できる。前記2’位炭素の水酸基を水素に置換することで、リボース残基をデオキシリボースに置換できる。前記リボース残基は、例えば、立体異性体に置換でき、例えば、アラビノース残基に置換してもよい。
【００３３】
リボリン酸骨格は、例えば、非リボース残基および／または非リン酸を有する非リボリン酸骨格に置換してもよい。非リボリン酸骨格は、例えば、リボリン酸骨格の非荷電体があげられる。非リボリン酸骨格に置換されたヌクレオチドの代替物としては、例えば、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジン等があげられる。前記代替物は、この他に、例えば、人工核酸モノマー残基があげられる。具体例として、例えば、PNA（ペプチド核酸）、LNA（Locked Nucleic Acid）、ENA（2’-O，4’-C-Ethylenebridged Nucleic Acid）等があげられ、好ましくはPNAである。
【００３４】
リボリン酸骨格において、リン酸基を修飾することもできる。リボリン酸骨格において、糖残基に最も隣接するリン酸基は、αリン酸基と呼ばれる。αリン酸基は、負に荷電し、その電荷は、糖残基に非結合の2つの酸素原子にわたって、均一に分布している。αリン酸基における4つの酸素原子のうち、ヌクレオチド残基間のホスホジエステル結合において、糖残基と非結合である2つの酸素原子は、以下、「非結合（non-linking）酸素」ともいう。他方、ヌクレオチド残基間のホスホジエステル結合において、糖残基と結合している2つの酸素原子は、以下、「結合（linking）酸素」という。αリン酸基は、例えば、非荷電となる修飾、または、非結合酸素における電荷分布が非対称型となる修飾を行うことが好ましい。
【００３５】
リン酸基は、例えば、非結合酸素を置換してもよい。非結合酸素は、例えば、S（硫黄）、Se（セレン）、B（ホウ素）、C（炭素）、H（水素）、N（窒素）およびOR（Rは、アルキル基またはアリール基）のいずれかの原子で置換でき、好ましくは、Sで置換される。非結合酸素は、例えば、両方が置換されていることが好ましく、より好ましくは、両方がSで置換される。このような修飾リン酸基としては、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレネート、ボラノホスフェート、ボラノホスフェートエステル、ホスホネート水素、ホスホロアミデート、アルキルまたはアリールホスホネート、およびホスホトリエステル等があげられ、中でも、前記2つの非結合酸素が両方ともSで置換されているホスホロジチオエートが好ましい。
【００３６】
リン酸基は、例えば、結合酸素を置換してもよい。結合酸素は、例えば、S（硫黄）、C（炭素）およびN（窒素）のいずれかの原子で置換でき、このような修飾リン酸基としては、例えば、Nで置換した架橋ホスホロアミデート、Sで置換した架橋ホスホロチオエート、およびCで置換した架橋メチレンホスホネート等があげられる。結合酸素の置換は、例えば、本発明の核酸分子の5’末端ヌクレオチド残基および3’末端ヌクレオチド残基の少なくとも一方において行うことが好ましく、5'側の場合、Cによる置換が好ましく、3’側の場合、Nによる置換が好ましい。
【００３７】
リン酸基は、例えば、リン非含有のリンカーに置換してもよい。リンカーとしては、例えば、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、エチレンオキサイドリンカー、スルホネート、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、およびメチレンオキシメチルイミノ等があげられ、好ましくは、メチレンカルボニルアミノ基およびメチレンメチルイミノ基が挙げられる。
【００３８】
本発明の核酸分子は、例えば、3’末端および5’末端の少なくとも一方のヌクレオチド残基が修飾されてもよい。当該修飾は前述のとおりであり、好ましくは、末端のリン酸基に行うことが好ましい。リン酸基は全体を修飾してもよいし、リン酸基における1つ以上の原子を修飾してもよい。前者の場合、例えば、リン酸基全体の置換でもよいし、欠失でもよい。
【００３９】
末端のヌクレオチド残基の修飾としては、例えば、他の分子の付加があげられる。他の分子としては、例えば、標識物質、保護基等の機能性分子があげられる。保護基としては、例えば、S（硫黄）、Si（ケイ素）、B（ホウ素）、エステル含有基等があげられる。前記標識物質等の機能性分子は、例えば、本発明の核酸分子の検出等に利用できる。
【００４０】
他の分子は、ヌクレオチド残基のリン酸基に付加してもよいし、スペーサーを介して、リン酸基または糖残基に付加してもよい。スペーサーの末端原子は、例えば、リン酸基の結合酸素、または、糖残基のO、N、SもしくはCに、付加または置換できる。糖残基の結合部位は、例えば、3’位のCもしくは5’位のC、またはこれらに結合する原子が好ましい。スペーサーは、例えば、前記PNA等のヌクレオチド代替物の末端原子に、付加または置換することもできる。
【００４１】
スペーサーは特に制限されず、例えば、-(CH2)n-、-(CH2)nN-、-(CH2)nO-、-(CH2)nS-、O(CH2CH2O)nCH2CH2OH、無塩基糖、アミド、カルボキシ、アミン、オキシアミン、オキシイミン、チオエーテル、ジスルフィド、チオ尿素、スルホンアミド、およびモルホリノ等、ならびに、ビオチン試薬およびフルオレセイン試薬等が挙げられる。前記式において、nは、正の整数であり、n＝3または6が好ましい。
【００４２】
末端に付加する分子は、これらの他に、例えば、色素、インターカレート剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、ソラレン、マイトマイシンC）、ポルフィリン（TPPC4、テキサフィリン、サッフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、EDTA）、親油性担体（例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、1-ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、1，3-ビス-O（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、1，3-プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、O3-（オレオイル）リトコール酸、O3-(オレオイル）コール酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）およびペプチド複合体（例えば、アンテナペディアペプチド、Tatペプチド）、アルキル化剤、リン酸、アミノ、メルカプト、PEG（例えば、PEG-40K）、MPEG、［MPEG］2、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射線標識マーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進剤（例えば、アスピリン、ビタミンE、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン−イミダゾール複合体、テトラアザマクロ環のEu3+複合体）等があげられる。
【００４３】
本発明の核酸分子は、5’末端が、例えば、リン酸基またはリン酸基アナログで修飾されてもよい。リン酸基は、例えば、5’一リン酸（(HO)2(O)P-O-5’）、5’二リン酸（(HO)2(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’）、5’三リン酸（(HO)2(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’）、5’−グアノシンキャップ（7-メチル化または非メチル化、7m-G-O-5’-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’）、5’−アデノシンキャップ（Appp）、任意の修飾または非修飾ヌクレオチドキャップ構造（N-O-5’-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’）、5’一チオリン酸（ホスホロチオエート：(HO)2(S)P-O-5’）、5’ジチオリン酸（ホスホロジチオエート：(HO)(HS)(S)P-O-5’）、5’-ホスホロチオール酸（(HO)2(O)P-S-5’）、硫黄置換の一リン酸、二リン酸および三リン酸（例えば、5’-α-チオ三リン酸、5’-γ-チオ三リン酸等）、5’-ホスホルアミデート（(HO)2(O)P-NH-5’、(HO)(NH2)(O)P-O-5’）、5’−アルキルホスホン酸（例えば、RP(OH)(O)-O-5’、(OH)2(O)P-5’-CH2、Rはアルキル（例えば、メチル、エチル、イソプロピル、プロピル等））、5’-アルキルエーテルホスホン酸（例えば、RP(OH)(O)-O-5’、Rはアルキルエーテル（例えば、メトキシメチル、エトキシメチル等））等があげられる。
【００４４】
ヌクレオチド残基において、塩基は特に制限されない。塩基は、天然の塩基でもよいし、非天然の塩基でもよい。例えば、一般的な塩基、その修飾アナログ等が使用できる。
【００４５】
塩基としては、例えば、アデニンおよびグアニン等のプリン塩基、シトシン、ウラシルおよびチミン等のピリミジン塩基があげられる。前記塩基は、この他に、イノシン、チミン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌバラリン（nubularine）、イソグアニシン（isoguanisine）、ツベルシジン（tubercidine）等があげられる。塩基は、例えば、2-アミノアデニン、6-メチル化プリン等のアルキル誘導体；2-プロピル化プリン等のアルキル誘導体；5-ハロウラシルおよび5-ハロシトシン；5-プロピニルウラシルおよび5-プロピニルシトシン；6-アゾウラシル、6-アゾシトシンおよび6-アゾチミン；5-ウラシル（プソイドウラシル）、4-チオウラシル、5-ハロウラシル、5-（2-アミノプロピル）ウラシル、5-アミノアリルウラシル；8-ハロ化、アミノ化、チオール化、チオアルキル化、ヒドロキシル化および他の8-置換プリン；5-トリフルオロメチル化および他の5-置換ピリミジン；7-メチルグアニン；5-置換ピリミジン；6-アザピリミジン；N-2、N-6、およびO-6置換プリン（2-アミノプロピルアデニンを含む）；5-プロピニルウラシルおよび5-プロピニルシトシン；ジヒドロウラシル；3-デアザ−5-アザシトシン；2-アミノプリン；5-アルキルウラシル；7-アルキルグアニン；5-アルキルシトシン；7-デアザアデニン；N6，N6-ジメチルアデニン；2，6-ジアミノプリン；5-アミノ−アリル−ウラシル；N3-メチルウラシル；置換1，2，4-トリアゾール；2-ピリジノン；5-ニトロインドール；3-ニトロピロール；5-メトキシウラシル；ウラシル−5-オキシ酢酸；5-メトキシカルボニルメチルウラシル；5-メチル-2-チオウラシル；5-メトキシカルボニルメチル-2-チオウラシル；5-メチルアミノメチル-2-チオウラシル；3-（3-アミノ-3-カルボキシプロピル）ウラシル；3-メチルシトシン；5-メチルシトシン；N4-アセチルシトシン；2-チオシトシン；N6-メチルアデニン；N6-イソペンチルアデニン；2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン；N-メチルグアニン；O-アルキル化塩基等であり得る。また、プリンおよびピリミジンには、例えば、米国特許第3,687,808号、「Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering」、858〜859頁、クロシュビッツ ジェー アイ（Kroschwitz J.I.）編、John Wiley & Sons、1990、およびイングリッシュら（Englischら）、Angewandte Chemie、International Edition、1991、30巻、p.613に開示されるものが含まれる。
【００４６】
修飾ヌクレオチド残基は、これらの他に、例えば、塩基を欠失する残基、すなわち、無塩基のリボリン酸骨格を含んでもよい。また、修飾ヌクレオチド残基は、例えば、米国仮出願第60/465,665号（出願日：2003年4月25日）、および国際出願第PCT/US04/07070号（出願日：2004年3月8日）に記載される残基が使用でき、本発明は、これらの文献を援用できる。
【００４７】
本発明の核酸分子の合成方法は、特に制限されず、従来公知の方法が採用できる。前記合成方法は、例えば、遺伝子工学的手法による合成法、化学合成法等があげられる。遺伝子工学的手法は、例えば、インビトロ転写合成法、ベクターを用いる方法、PCRカセットによる方法があげられる。前記ベクターは、特に制限されず、プラスミド等の非ウイルスベクター、ウイルスベクター等があげられる。前記化学合成法は、特に制限されず、例えば、ホスホロアミダイト法およびH-ホスホネート法等があげられる。前記化学合成法は、例えば、市販の自動核酸合成機を使用可能である。前記化学合成法は、一般に、アミダイトが使用される。前記アミダイトは、特に制限されず、市販のアミダイトとして、例えば、RNA Phosphoramidites（2’-O-TBDMSi、商品名、三千里製薬）、ACEアミダイトおよびTOMアミダイト、CEEアミダイト、CEMアミダイト、TEMアミダイト等があげられる。
【００４８】
本発明の核酸分子としては、例えば、U11 snRNAに対するアンチセンス核酸、U11 snRNAに対するsiRNA等が挙げられる。また、本発明の核酸分子としては、ガイド鎖とそれに相補的なパッセンジャー鎖とが、リンカーを介して連結された二重鎖を形成し得る一本鎖核酸分子を挙げることができる。
【００４９】
(1) U11 snRNAに対するアンチセンス核酸
U11 snRNAに対するアンチセンス核酸とは、U11 snRNAのヌクレオチド配列の全部もしくは一部、好ましくは該ヌクレオチド配列中、連続する15〜30ヌクレオチドの部分配列と相補的な配列を含み、U11 snRNA中の標的ヌクレオチド配列と特異的な二重鎖を形成して結合することにより、U11 snRNAの機能、好ましくは該snRNAの免疫原性を抑制する作用を有する核酸をいう。ここで「相補的な配列」とは、前記と同義である。
【００５０】
U11 snRNAに対するアンチセンス核酸の長さは、U11 snRNAの機能を抑制する配列、即ち、該snRNAのヌクレオチド配列の全部もしくは一部と相補的な配列を含む限り特に限定されないが、例えば、10〜100ヌクレオチドであり、好ましくは15〜40ヌクレオチドであり、より好ましくは15〜30ヌクレオチドであり得る。
【００５１】
U11 snRNAに対するアンチセンス核酸は、U11 snRNAの機能を抑制する配列として、前記した該snRNA中のいずれかの標的ヌクレオチド配列に相補的な配列を有するが、好ましい一実施態様においては、U11 snRNAの機能を抑制する配列として、下記のヌクレオチド配列（配列番号2）（但し、該配列中、UはTであってもよい）を含む。
【００５２】
配列番号2： UCUCUUGAUGUCGAUUCCGC
【００５３】
U11 snRNAに対するアンチセンス核酸は、ギャップマー型であってもよい。ギャップマー型のアンチセンス核酸とは、DNAと、その両側に、修飾や架橋が導入された核酸とを有する核酸である。DNA鎖を主鎖として、主鎖に相補的なRNAがヘテロ2本鎖核酸を形成し、RNAは、RNAase Hにより分解される。U11 snRNAに対するギャップマー型のアンチセンス核酸は、例えば、下記の構造を有する。
【００５４】
配列番号42：mU*mC*mU*mC*mU*t*g*a*t*g*t*c*g*a*t*mU*mC*mC*mG*mC*
（「mN」は2’ −OMe−RNA、小文字はDNA、「*」はホスホロチオエート結合を示す。）
【００５５】
糖の2’ 位のO−メチル化により、アンチセンス核酸の安定性が向上し、ターゲットへの結合親和性が増大する。また、ホスホロチオエート結合により、アンチセンス核酸のヌクレアーゼ耐性が高まる。
【００５６】
U11 snRNAに対するアンチセンス核酸の合成方法は、特に限定されず、従来公知の核酸の製造方法が採用できる。合成方法としては、例えば、前記相補的な配列を含む核酸をDNA/RNA自動合成機でそれぞれ合成することにより調製する方法等が挙げられる。また、上記した各種修飾を含むアンチセンス核酸も、従来公知の手法により、化学的に合成することができる。
【００５７】
(2) U11 snRNAに対するsiRNA
U11 snRNAに対するsiRNAとは、U11 snRNAのヌクレオチド配列の一部と相補的な配列を含むガイド鎖と、それに相補的な配列を含むパッセンジャー鎖とからなる二本鎖オリゴＲＮＡであって、RISC複合体に取り込まれ、ガイド鎖中のU11 snRNAに相補的な配列がU11 snRNA中の標的ヌクレオチド配列と二重鎖を形成することで、該snRNAを切断し、U11 snRNAの機能を抑制する核酸をいう。ここで「相補的な配列」とは、前記と同義である。
【００５８】
U11 snRNAに対するsiRNAの長さは、ガイド鎖中に該snRNAのヌクレオチド配列の一部と相補的な配列を含む限り特に限定されないが、標的ヌクレオチド配列は、原則的には15〜50ヌクレオチド、好ましくは19〜30ヌクレオチド、更に好ましくは19〜27ヌクレオチドであり得る。また、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖は、5’または3’末端に、付加的なヌクレオチドを有していてもよい。該付加的ヌクレオチドの長さは、通常2〜4ヌクレオチド程度であり、siRNAの全長として19ヌクレオチド以上である。該付加的ヌクレオチドは、DNAでもRNAでもよいが、DNAを用いると核酸の安定性を向上させることができる場合がある。このような付加的ヌクレオチドの配列としては、例えばug-3’、uu-3’、tg-3’、tt-3’、ggg-3’、guuu-3’、gttt-3’、ttttt-3’、uuuuu-3’などの配列が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５９】
U11 snRNAに対するsiRNAは、U11 snRNAの機能を抑制する配列として、前記した該snRNA中のいずれかの標的ヌクレオチド配列に相補的な配列をガイド鎖中に含むが、好ましい一実施態様においては、U11 snRNAの機能を抑制する配列として、下記のいずれかのヌクレオチド配列（配列番号3〜5）（但し、該配列中、UはTであってもよい）を含むガイド鎖と、それに相補的なパッセンジャー鎖とからなる核酸分子等が挙げられる。
【００６０】
配列番号3：AAAUACCAAAAAAUUAUGC
配列番号4：CAAAUACCAAAAAAUUAUG
配列番号5：CCAAAUACCAAAAAAUUAU
【００６１】
U11 snRNAに対するsiRNAは、一方もしくは両方の鎖に3’ −オーバーハングを有していてもよい。オーバーハングを有する場合、オーバーハングの長さは、特に限定されず、下限が、例えば、1塩基長であり、上限が、例えば、4塩基長、3塩基長であり、範囲が、例えば、1〜4塩基長、1〜3塩基長、1〜2塩基長である。
【００６２】
オーバーハングの配列は、特に限定されず、A、U、G、C、Tのいずれであってもよい。オーバーハングの配列は、例えば、3’ 側から、TT、UU、CU、GC、UA、AA、CC、UG、CG、AU等が例示できる。前記オーバーハングは、例えば、TT、UUとすることで、RNA分解酵素に対する耐性を付加できる。
【００６３】
U11 snRNAに対するsiRNAの合成方法は、特に限定されず、従来公知の核酸の製造方法が採用できる。合成方法としては、例えば、前記相補的な配列を含む核酸およびそれに相補的な配列の核酸をDNA/RNA自動合成機でそれぞれ合成し、適当なアニーリング緩衝液中、約90〜約95℃で約1分程度変性させた後、約30〜約70℃で約1〜約8時間アニーリングさせることにより調製する方法等が挙げられる。また、siRNAの前駆体となるshRNAを合成し、ダイサー（dicer）を用いてこれを切断することにより調製することもできる。siRNAを構成するヌクレオチド残基もまた、安定性、比活性などを向上させるために、上記と同様の修飾を受けていてよい。但し、siRNAの場合、天然型RNA中のすべてのリボヌクレオチド残基を修飾型で置換すると、RNAi活性が失われる場合があるので、RISC複合体が機能できる最小限の修飾ヌクレオチド残基の導入が必要である。
【００６４】
(3) U11 snRNAに対する一本鎖核酸分子
本発明において、「U11 snRNAに対する一本鎖核酸分子」とは、U11 snRNAのヌクレオチド配列の一部と相補的な配列Xaを含むガイド鎖配列Xと、Xaに相補的な配列Yaを含むパッセンジャー鎖配列Yとが、リンカーLを介して、5’ から3’ 方向又は3’ から5’ 方向にX−L−Yの順序で、かつ配列Xaと配列Yaとが分子内で二重鎖を形成し得る配向で連結された、U11 snRNAの機能を抑制する核酸分子をいう。ここで「相補的な配列」とは、前記と同義である。
【００６５】
配列Xaは、U11 snRNAのヌクレオチド配列の全部又は一部と相補的な配列を含む限り特に限定されないが、標的ヌクレオチド配列は、原則的に該snRNAのヌクレオチド配列中、連続する15〜50ヌクレオチド、好ましくは、連続する15〜30ヌクレオチド、より好ましくは、連続する19〜30ヌクレオチド、さらに好ましくは、連続する19〜21ヌクレオチドの部分配列と相補的な配列である。
【００６６】
U11 snRNAに対する一本鎖核酸分子は、U11 snRNAの機能を抑制する配列として、前記した該snRNA中のいずれかの標的ヌクレオチド配列に相補的な配列を、配列Xaとしてガイド鎖配列X中に含むが、好ましい一実施態様においては、配列Xaとして、下記のいずれかのヌクレオチド配列（配列番号3〜5）（但し、該配列中、UはTであってもよい）を含むガイド鎖配列Xと、配列Xaに相補的な配列Yaを含むパッセンジャー鎖配列Yとを含む核酸分子等が挙げられる。
【００６７】
配列番号3：AAAUACCAAAAAAUUAUGC
配列番号4：CAAAUACCAAAAAAUUAUG
配列番号5：CCAAAUACCAAAAAAUUAU
【００６８】
ガイド鎖配列Xは、例えば、配列Xaのみからなってもよいし、さらに付加配列Xbを有してもよい。後者の場合、付加配列XbはU11 snRNAのヌクレオチド配列と相補的であることを要しない。付加配列Xbは、Xaの5’末端もしくは3’末端のいずれに付加されてもよく、両端に付加されてもよい（Xb及びXb’）。好ましくは、XaのリンカーLと連結される側の末端に付加される。配列Xb（Xb’）の長さは、例えば、1〜35ヌクレオチドであり、好ましくは、1〜25ヌクレオチドであり、より好ましくは、1〜11ヌクレオチドであり、特に好ましくは、1、2、3、4、5又は6ヌクレオチドである。
【００６９】
パッセンジャー鎖配列Yは、配列Xaに相補的な配列Yaを含む限り、特に限定されず、例えば、配列Yaのみからなってもよいし、さらに付加配列Ybを有してもよい。後者の場合、付加配列Ybは付加配列Xbと相補的であることを要しないが、相補的であることが望ましく、特に、付加配列Xb及びYbが、それぞれXa及びYaのリンカーLと連結される側の末端に付加される場合、XbとYbとは相補的であることがより望ましい。付加配列Ybは、Yaの5’末端もしくは3’末端のいずれに付加されてもよく、両端に付加されてもよい（Yb及びYb’）。好ましくは、YaのリンカーLと連結される側の末端に付加される。配列Yb（Yb’）の長さは、例えば、1〜35ヌクレオチドであり、好ましくは、1〜25ヌクレオチドであり、より好ましくは、1〜11ヌクレオチドであり、特に好ましくは、1、2、3、4、5又は6ヌクレオチドである。
【００７０】
ガイド鎖配列X及びパッセンジャー鎖配列Yは、リンカーLに連結しない側の末端に、さらにオーバーハングを有してもよい。オーバーハングは、好ましくは、ガイド鎖配列X及びパッセンジャー鎖配列のうち、その5’末端がリンカーLに連結される方の配列の3’末端に付加される。
【００７１】
オーバーハングの長さは、特に限定されず、下限が、例えば、1塩基長であり、上限が、例えば、4塩基長、3塩基長であり、範囲が、例えば、1〜4塩基長、1〜3塩基長、1〜2塩基長である。
【００７２】
オーバーハングの配列は、特に限定されず、A、U、G、C、Tのいずれであってもよい。オーバーハングの配列は、例えば、5’ 側から、TT、UU、CU、GC、UA、AA、CC、UG、CG、AU等が例示できる。オーバーハングは、例えば、TT、UUとすることで、RNA分解酵素に対する耐性を付加できる。
【００７３】
好ましい一実施態様において、U11 snRNAに対する一本鎖核酸分子は、ヌクレオチド配列Xと、ヌクレオチド配列Yとが、リンカーLを介して、3’ から 5’ 方向にX−L−Yの順序で、かつ配列Xaと配列Yaとが分子内で二重鎖を形成し得る配向で連結される。リンカーLは、例えば、ヌクレオチド残基から構成されてもよいし、非ヌクレオチド残基から構成されてもよく、ヌクレオチド残基および非ヌクレオチド残基から構成されてもよい。ヌクレオチド残基としては、リボヌクレオチド残基およびデオキシリボヌクレオチド残基があげられる。
【００７４】
リンカーLがヌクレオチド残基から構成されている場合、一分子内でセンス領域とアンチセンス領域が互いに塩基対合してステム構造を形成し、同時にリンカーLのヌクレオチド配列がループ構造を形成することによって、分子全体としてヘアピン型のステム−ループ構造を形成しており、U11 snRNAに対する一本鎖核酸分子は、shRNA（small hairpin RNAまたはshort hairpin RNA）とも言える。リンカーＬの長さは、特に限定されないが、例えば、配列Xaと配列Yaとが分子内で二重鎖を形成可能な長さであることが好ましい。リンカーLの塩基数は、その下限が、例えば、1塩基、2塩基、3塩基であり、その上限が、例えば、100塩基、80塩基、50塩基である。各リンカー領域の塩基数は、具体例として、例えば、1〜50塩基、1〜30塩基、1〜20塩基、1〜10塩基、1〜7塩基、1〜4塩基等が例示できるが、これには限定されない。リンカーLは、自己アニーリングを生じない構造であることが好ましい。
【００７５】
非ヌクレオチド残基から構成されているリンカーL、又はヌクレオチド残基および非ヌクレオチド残基から構成されているリンカーLは、例えば、下記式（I）で表わされる。
【００７６】
【化２】
2018191580.tif 000003
【００７７】
式（I）中、例えば、
X1およびX2は、それぞれ独立して、H2、O、SまたはNHであり；
Y1およびY2は、それぞれ独立して、単結合、CH2、NH、OまたはSであり；
R3は、環A上のC-3、C-4、C-5またはC-6に結合する水素原子または置換基であり、
L1は、n個の原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH、もしくはSRaで置換されても置換されていなくてもよく、または、
L1は、アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Y1が、NH、OまたはSの場合、Y1に結合するL1の原子は炭素であり、OR1に結合するL1の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
L2は、m個の原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、OH、ORc、NH2、NHRc、NRcRd、SHもしくはSRcで置換されても置換れていなくてもよく、または、
L2は、アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Y2が、NH、OまたはSの場合、Y2に結合するL2の原子は炭素であり、OR2に結合するL2の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ra、Rb、RcおよびRdは、それぞれ独立して、置換基または保護基であり；
lは、1または2であり；
mは、0〜30の範囲の整数であり；
nは、0〜30の範囲の整数であり；
環Aは、環A上のC-2以外の1個の炭素原子が、窒素、酸素、硫黄で置換されてもよく、
環A内に、炭素−炭素二重結合または炭素−窒素二重結合を含んでもよく、
ヌクレオチド配列Xおよびヌクレオチド配列Yは、それぞれ、−OR1−または−OR2−を介して、非ヌクレオチド構造に結合し、
ここで、R1およびR2は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、R1およびR2は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または構造（I）である。
【００７８】
式（I）中、X1およびX2は、例えば、それぞれ独立して、H2、O、SまたはNHである。式（I）中において、X1がH2であるとは、X1が、X1の結合する炭素原子とともに、CH2（メチレン基）を形成することを意味する。X2についても同様である。
【００７９】
式（I）中、Y1およびY2は、それぞれ独立して、単結合、CH2、NH、OまたはSである。
【００８０】
式（I）中、環Aにおいて、lは、1または2である。l=1の場合、環Aは、5員環であり、例えば、ピロリジン骨格である。ピロリジン骨格は、例えば、プロリン骨格、プロリノール骨格等があげられ、これらの二価の構造が例示できる。l=2の場合、環Aは、6員環であり、例えば、ピペリジン骨格である。環Aは、環A上のC-2以外の1個の炭素原子が、窒素、酸素または硫黄で置換されてもよい。また、環Aは、環A内に、炭素−炭素二重結合または炭素−窒素二重結合を含んでもよい。環Aは、例えば、L型およびD型のいずれでもよい。
【００８１】
式（I）中、R3は、環A上のC-3、C-4、C-5またはC-6に結合する水素原子または置換基である。R3が置換基の場合、置換基R3は、1でも複数でも、存在しなくてもよく、複数の場合、同一でも異なってもよい。
【００８２】
置換基R3は、例えば、ハロゲン、OH、OR4、NH2、NHR4、NR4R5、SH、SR4またはオキソ基（=O）等である。
【００８３】
R4およびR5は、例えば、それぞれ独立して、置換基または保護基であり、同一でも異なってもよい。置換基は、例えば、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリールアルキル、シリル、シリルオキシアルキル等があげられる。以下、同様である。置換基R3は、これらの列挙する置換基であってもよい。
【００８４】
保護基は、例えば、反応性の高い官能基を不活性に変換する官能基であり、公知の保護基等があげられる。保護基は、例えば、文献（J. F. W. McOmie, 「Protecting Groups in Organic Chemistry」 Prenum Press, London and New York, 1973）の記載を援用できる。保護基は、特に制限されず、例えば、tert−ブチルジメチルシリル基（TBDMS）、ビス（2-アセトキシエチルオキシ）メチル基（ACE）、トリイソプロピルシリルオキシメチル基（TOM）、1- (2-シアノエトキシ) エチル基（CEE）、2-シアノエトキシメチル基（CEM）およびトリルスルフォニルエトキシメチル基（TEM）、ジメトキシトリチル基（DMTr）等があげられる。R3がOR4の場合、保護基は、特に制限されず、例えば、TBDMS基、ACE基、TOM基、CEE基、CEM基およびTEM基等があげられる。この他にも、シリル含有基もあげられる。以下、同様である。
【００８５】
式（I）中、L1は、n個の原子からなるアルキレン鎖である。アルキレン炭素原子上の水素原子は、例えば、OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH、もしくはSRaで置換されてもよいし、置換されていなくてもよい。または、L1は、アルキレン鎖の1つ以上の炭素原子が酸素原子で置換されたポリエーテル鎖でもよい。ポリエーテル鎖は、例えば、ポリエチレングリコールである。なお、Y1が、NH、OまたはSの場合、Y1に結合するL1の原子は炭素であり、OR1に結合するL1の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接しない。つまり、例えば、Y1がOの場合、その酸素原子とL1の酸素原子は隣接せず、OR1の酸素原子とL1の酸素原子は隣接しない。
【００８６】
式（I）中、L2は、m個の原子からなるアルキレン鎖である。アルキレン炭素原子上の水素原子は、例えば、OH、ORc、NH2、NHRc、NRcRd、SHもしくはSRｃで置換されてもよいし、置換されていなくてもよい。または、L2は、アルキレン鎖の1つ以上の炭素原子が酸素原子で置換されたポリエーテル鎖でもよい。なお、Y2が、NH、OまたはSの場合、Y2に結合するL2の原子は炭素であり、OR2に結合するL2の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接しない。つまり、例えば、Y2がOの場合、その酸素原子とL2の酸素原子は隣接せず、OR2の酸素原子とL2の酸素原子は隣接しない。
【００８７】
L1のnおよびL2のmは、特に制限されず、それぞれ、下限は、例えば、0であり、上限も、特に制限されない。nおよびmは、例えば、非ヌクレオチド構造の所望の長さに応じて、適宜設定できる。nおよびmは、例えば、製造コストおよび収率等の点から、それぞれ、0〜30が好ましく、より好ましくは0〜20であり、さらに好ましくは0〜15である。nとmは、同じでもよいし（n=m）、異なってもよい。n+mは、例えば、0〜30であり、好ましくは0〜20であり、より好ましくは0〜15である。
【００８８】
Ra、Rb、RcおよびRdは、例えば、それぞれ独立して、置換基または保護基である。置換基および保護基は、例えば、前述と同様である。
【００８９】
式（I）において、水素原子は、例えば、それぞれ独立して、Cl、Br、FおよびI等のハロゲンに置換されてもよい。
【００９０】
ヌクレオチド配列Xおよびヌクレオチド配列Yは、例えば、それぞれ、−OR1−または−OR2−を介して、非ヌクレオチド構造に結合する。ここで、R1およびR2は、存在しても存在しなくてもよい。R1およびR2が存在する場合、R1およびR2は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または式（I）の構造である。R1および／またはR2がヌクレオチド残基の場合、リンカーLの構造は、例えば、ヌクレオチド残基R1および／またはR2を除く式（I）の構造からなる非ヌクレオチド残基と、ヌクレオチド残基とから形成される。R1および／またはR2が式（I）の構造の場合、非ヌクレオチド構造は、例えば、式（I）の構造からなる非ヌクレオチド残基が、2つ以上連結された構造となる。式（I）の構造は、例えば、1個、2個、3個または4個含んでもよい。このように、複数含む場合、式（I）の構造は、例えば、直接連結されてもよいし、ヌクレオチド残基を介して結合してもよい。他方、R1およびR2が存在しない場合、非ヌクレオチド構造は、例えば、式（I）の構造からなる非ヌクレオチド残基のみから形成される。
【００９１】
ヌクレオチド配列Xおよびヌクレオチド配列Yと、−OR1−および−OR2−との結合の組合せは、特に制限されず、例えば、以下のいずれかの条件があげられる。
条件（1）
ヌクレオチド配列Xは、−OR2−を介して、ヌクレオチド配列Yは、−OR1−を介して、式（I）の構造と結合する。
条件（2）
ヌクレオチド配列Xは、−OR1−を介して、ヌクレオチド配列Yは、−OR2−を介して、式（I）の構造と結合する。
【００９２】
式（I）の構造は、例えば、下記式（I-1）〜式（I-9）が例示でき、下記式において、nおよびmは、式（I）と同じである。下記式において、qは、0〜10の整数である。
【００９３】
【化３】
2018191580.tif 000004
【００９４】
式（I-1）〜（I-9）において、n、mおよびqは、特に制限されず、前述の通りである。具体例として、式（I-1）において、n=8、式（I-2）において、n=3、式（I-3）において、n=4または8、式（I-4）において、n=7または8、式（I-5）において、n=3およびm=4、式（I-6）において、n=8およびm=4、式（I-7）において、n=8およびm=4、式（I-8）において、n=5およびm=4、式（I-9）において、q=1およびm=4があげられる。式（I-4）の一例（n=8）を、下記式（I-4a）に、式（I-8）の一例（n=5、m=4）を、下記式（I-8a）に示す。
【００９５】
【化４】
2018191580.tif 000005
【００９６】
また、式（I-8）の一例（n=5、m=4）である、下記式で表されるプロリン誘導体リンカーを以下に示す。
【００９７】
【化５】
2018191580.tif 000006
【００９８】
U11 snRNAに対する一本鎖核酸分子としては、例えば、下記の核酸分子を挙げることができる。Lは上記の構造で表されるリンカーである。
【００９９】
配列番号6：
GCAUAAUUUUUUGGUAUUUUUCC - L - GGAAAAAUACCAAAAAAUUAUGCUU
配列番号7：
CAUAAUUUUUUGGUAUUUGUUCC - L - GGAACAAAUACCAAAAAAUUAUGUU
配列番号8：
AUAAUUUUUUGGUAUUUGGUUCC - L - GGAACCAAAUACCAAAAAAUUAUUU
【０１００】
U11 snRNAに対する一本鎖核酸分子の合成方法は、特に限定されず、従来公知の核酸の製造方法が採用できる。合成方法としては、例えば、遺伝子工学的手法による合成法、化学合成法等があげられる。遺伝子工学的手法は、例えば、インビトロ転写合成法、ベクターを用いる方法、PCRカセットによる方法があげられる。ベクターは、特に制限されず、プラスミド等の非ウイルスベクター、ウイルスベクター等があげられる。化学合成法は、特に制限されず、例えば、ホスホロアミダイト法およびH-ホスホネート法等があげられる。化学合成法は、例えば、市販の自動核酸合成機を使用可能である。化学合成法は、一般に、アミダイトが使用される。アミダイトは、特に制限されず、市販のアミダイトとして、例えば、RNA Phosphoramidites（2’ -O-TBDMSi、商品名、三千里製薬）、ACEアミダイトおよびTOMアミダイト、CEEアミダイト、CEMアミダイト、TEMアミダイト等があげられる。
【０１０１】
U11 snRNAに対する一本鎖核酸分子が、天然の非修飾リボヌクレオチド残基のみで構成される場合、該核酸分子の前駆体として、該核酸分子を発現可能な状態でコードするベクターの形態で提供することもできる。該発現ベクターは、U11 snRNAに対する一本鎖核酸分子をコードするDNAを標的細胞内で機能的なプロモーターの制御下に含むことを特徴とし、その他の構成は何ら制限されない。前記DNAを挿入するベクターは特に制限されず、一般的なベクターを使用することができ、例えば、ウイルスベクターおよび非ウイルスベクター等があげられる。非ウイルスベクターとしては、例えば、プラスミドベクターがあげられる。該発現ベクターを、自体公知の遺伝子導入法を用いて、標的細胞（U11 snRNAの認識受容体を発現する哺乳動物細胞）に導入することにより、該細胞内でのU11 snRNAの機能を抑制することができる。
【０１０２】
２．機能抑制剤
本発明の核酸分子は、前述のように、U11 snRNAの機能を抑制することができる。したがって、本発明の核酸分子は、例えば、U11 snRNA の免疫原性の抑制、より具体的には、I型IFN及び／又は炎症性サイトカインの発現誘導作用の抑制のために使用できる。I型IFNとしては、例えば、IFNα、IFNβ等が挙げられる。炎症性サイトカインとしては、例えば、TNFα、IL‐1、IL‐6等が挙げられる。また、本発明の核酸分子は、U11 snRNAにハイブリダイズして特異的に結合することで、U11 snRNAのスプライソソームへの動員を抑制すると考えられるので、従来より公知のU11 snRNAの機能であるAT-AC型スプライシングを抑制するためにも使用することができる。
【０１０３】
３．医薬
本発明の核酸分子は、前述のように、U11 snRNAの機能を抑制することができる。このため、本発明の核酸分子は、例えば、I型IFN及び／又は炎症性サイトカインの発現亢進が関与する疾患の治療剤として使用できる。I型IFNの発現亢進が関与する疾患としては、例えば、自己免疫疾患等が挙げられる。自己免疫疾患としては、例えば、臓器非特異的自己免疫疾患、臓器特異的自己免疫疾患等が挙げられる。臓器非特異的自己免疫疾患としては、例えば、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、円板状エリテマトーデス、多発性筋炎等、臓器特異的自己免疫疾患としては、例えば、慢性甲状腺炎、原発性粘液水腫、甲状腺中毒症、悪性貧血等が挙げられる。炎症性サイトカインの発現亢進が関与する疾患としては、例えば、炎症性疾患が挙げられる。炎症性疾患としては、例えば、関節炎（慢性関節リウマチ、変形性関節炎など）、心筋梗塞、ウイルス性脳炎、乾癬、炎症性腸疾患、肺高血圧、敗血症、II型糖尿病、肝線維症、腎硬化症、子宮内膜症等が挙げられる。本発明において、「治療」は、例えば、前記疾患の予防、疾患の改善、予後の改善の意味を含み、いずれでもよい。
【０１０４】
本発明の医薬は、有効量の本発明の核酸分子を単独で用いてもよいし、任意の担体、例えば医薬上許容される担体とともに、医薬組成物として製剤化することもできる。
【０１０５】
医薬上許容される担体としては、例えば、ショ糖、デンプン等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル等の滑剤、クエン酸、メントール等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリド等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水等の希釈剤、ベースワックス等が挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【０１０６】
本発明の核酸分子の標的細胞内への導入を促進するために、本発明の医薬は更に核酸導入用試薬を含むことができる。本発明はU11 snRNAの免疫原性を抑制する際、細胞外に放出されたU11 snRNAに作用すると考えられるため、免疫原性を抑制する目的で使用する場合においては、本発明の細胞内への輸送する後述の試薬と併用しないことが好ましいが、細胞内のU11 snRNAの機能を阻害する目的で用いる際には細胞内へ本発明を輸送する試薬との併用が好ましい。該核酸導入用試薬としては、アテロコラーゲン；リポソーム；ナノパーティクル；リポフェクチン、リプフェクタミン（lipofectamine）、DOGS（トランスフェクタム）、DOPE、DOTAP、DDAB、DHDEAB、HDEAB、ポリブレン、あるいはポリ（エチレンイミン）(PEI)等の陽イオン性脂質等を用いることが出来る。
【０１０７】
好ましい一実施態様において、本発明の医薬は、本発明の核酸分子がリポソームに封入されてなる医薬組成物であり得る。リポソームは、１以上の脂質二重層により包囲された内相を有する微細閉鎖小胞であり、通常は水溶性物質を内相に、脂溶性物質を脂質二重層内に保持することができる。本明細書において「封入」という場合には、本発明の核酸分子はリポソーム内相に保持されてもよいし、脂質二重層内に保持されてもよい。本発明に用いられるリポソームは単層膜であっても多層膜であってもよく、また、粒子径は、例えば10〜1000nm、好ましくは50〜300nmの範囲で適宜選択できる。標的組織への送達性を考慮すると、粒子径は、例えば200nm以下、好ましくは100nm以下であり得る。
【０１０８】
核酸のような水溶性化合物のリポソームへの封入法としては、リピドフィルム法（ボルテックス法）、逆相蒸発法、界面活性剤除去法、凍結融解法、リモートローディング法等が挙げられるが、これらに限定されず、任意の公知の方法を適宜選択することができる。
【０１０９】
本発明の医薬は、経口的にまたは非経口的に、哺乳動物（例、ヒト、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ウシ、サル）に対して投与することが可能であるが、非経口的に投与するのが望ましい。
【０１１０】
非経口的な投与（例えば、皮下注射、筋肉注射、局所注入、腹腔内投与など）に好適な製剤としては、水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分および医薬上許容される担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解または懸濁すればよい状態で保存することもできる。
非経口的な投与に好適な別の製剤としては、噴霧剤等を挙げることが出来る。
【０１１１】
医薬組成物中の本発明の核酸分子の含有量は、例えば、医薬組成物全体の約0.1ないし100重量%である。
【０１１２】
本発明の医薬の投与量は、投与の目的、投与方法、対象疾患の種類、重篤度、投与対象の状況（性別、年齢、体重など）によって異なるが、例えば、成人に全身投与する場合、通常、本発明の核酸分子の一回投与量として2 nmol/kg以上50 nmol/kg以下、局所投与する場合、1 pmol/kg以上10 nmol/kg以下が望ましい。かかる投与量を1〜10回、より好ましくは5〜10回投与することが望ましい。
【０１１３】
本発明の医薬は、例えば、他の自己免疫疾患又は炎症性疾患治療薬、例えば既に上市されているこれらの疾患に対する治療薬と組み合わせて用いることができる。これらの併用薬剤は、本発明の医薬とともに製剤化して単一の製剤として投与することもできるし、あるいは、本発明の医薬とは別個に製剤化して、本発明の医薬と同一もしくは別ルートで、同時もしくは時間差をおいて投与することもできる。また、これらの併用薬剤の投与量は、該薬剤を単独投与する場合に通常用いられる量であってよく、あるいは通常用いられる量より減量することもできる。
【０１１４】
以下に実施例を示して本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら制限されない。
【実施例】
【０１１５】
材料および方法
（材料）
1. マウス
C57BL/6の遺伝的背景を持つ6-12週齢のTlr3-/-マウス、Tlr7-/-および野生型マウスを用いた。これら遺伝子欠損マウスは、大阪大学の審良静男博士よりご供与頂いた。C57BL/6野生型マウスについて特に記載がないものについては日本クレア社より購入した6-12週齢の個体を用いた。
DBA1（CIAに使用）、DBF1およびDBA/1（ループス腎炎モデルに使用）マウスは、日本チャールズリバー社より購入した6-8週齢の個体を用いた。BXSB/yaa+および−マウス（全身性エリトマトーデスの自然発症モデルマウス）は、日本SLC社より購入したおよそ23週齢前後の病態発症済みの個体を用いた。
【０１１６】
2. RNA
配列番号9：
AAAAAGGGCUUCUGUCGUGAGUGGCACACGCAGGGCAACUCGAUUGCUGUGCGUGCGGAAUCGACAUCAAGAGAUUUCGGAAGCAUAAUUUUUUGGUAAUUGGGCAGCUGGUGAUCGUUGGUCCCGGCCCUU
配列番号1：
aaaaagggcuucugucgugaguggcacacguagggcaacucgauugcucugcgugcggaaucgacaucaagagauuucggaagcauaauuuuuugguauuugggcagcuggugaucguuggucccggcgcccuuu
配列番号10：
A(M)A(M)AAAGGGCUUCUGUCGUGAGUGGCACACGCAGGGCAACUCGA(M)UUGCUGUGCGUGCGGAAUCGACAUCAAGAGAUUUCGGAAGCAUAAUUUUUUGGUAAUUGGGCAGCUGGUGAUCGUUGGUCCCGGCGCCCUU
配列番号11：
A(M)U(M)AC_φ_φ_ACCUGGCAGGGGAGAUACCAUGAUCACGAAGGUGGUUUUCCCAGGGCGAGGCUUAUCCAUUGCA(M)CUCCGGAUGUGCUGACCCCUGCGAUUUCCCCAAAUGCGGGAAACUCGACUGCAUAAUUUGUGGUAGUGGGGGACUGCGUUCGCGCUCUCCCCUGCCACA（φはシュードウリジン）
【０１１７】
3. アンチセンス核酸、siRNAおよび一本鎖核酸分子
U11 snRNAに対するギャップマー型のアンチセンス核酸（配列番号42）、およびネガティブコントロールの核酸分子（配列番号43）の合成は、株式会社ファスマックに委託した。
【０１１８】
4. 培地
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)培地
DMEM (4.5 g/l Glucose) with L-Gln and Sodium Pyruvate, liquid（ナカライテスク社）に、終濃度10%の非働化処理を行ったウシ胎児血清（fetal calf serum; FCS）を、シリンジフィルター（孔径0.2μm, Corning）を通して加えた。
Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI)培地
RPMI medium 1640（ナカライテスク社）に、終濃度100μMのMEM非必須アミノ酸溶液（ナカライテスク社）、100μM MEMピルビン酸ナトリウム溶液（ナカライテスク社）、 50μM 2‐メルカプトエタノール（2‐ME、ナカライテスク社）、およびFCSを、シリンジフィルター（孔径0.2μm、Corning社）を通して加えた。
【０１１９】
(方法)
（Flt3L培養樹状細胞の培養（Flt3-ligand cultured dendritic cells; Flt3L-DC））
マウスの脛骨及び後肢の大腿骨を回収し、両端を解剖用ハサミで切断後、1% FCSおよび2 mM EDTA含有リン酸緩衝液（phosphate buffered saline; PBS）で内腔の骨髄細胞を回収した。回収した骨髄細胞をセルストレイナー（40μm、コーニング）に通した後、1×RBC (red blood cell) lysis buffer（eBioscience社）に懸濁し、室温にて１分間静置し、赤血球を溶血処理した。終濃度100 ng/ml mouse Flt3-ligand（Peprotech社）を添加したRPMI 1640培地で6日間培養した。その間、2日に一回の頻度で培地を交換した。浮遊細胞をFLT3L-DCとして用いた。
【０１２０】
（脾臓細胞の培養と形質細胞用樹状細胞（plasmacytoid DC; pDC）の単離）
マウスの脾臓を摘出し、解剖バサミで切り刻んだ後、Collagenase DおよびDNase Iを含む消化緩衝液中で37℃、30分静置した。浮遊細胞を回収し、1×RBC lysis bufferで赤血球を溶血し、洗浄したものを脾臓細胞として用いた。脾臓細胞をAPC結合抗マウスCD220抗体（clone;RA3-6E2、BD phamagen社）およびPE結合抗マウス/ヒトCD11c抗体（clone; HL3、BD phamagen社）で染色した。BD FACSAria（登録商標）II（BDバイオサイエンス社）によりCD11cint/B220＋細胞をpDCとして分取した。
【０１２１】
（腹腔滲出細胞PECs（peritoneal elucidated cells）の単離）
27G針装着10 mlシリンジを用いて、10 mlの1 mM EDTA/1% FCS含有PBSをマウス腹腔に注入した。マウス腹腔内の液体を撹拌後、回収した。細胞を回収し、洗浄後、得られた細胞をPECsとして用いた。
【０１２２】
（ヒト末梢血からのCD14陽性単球および顆粒球の単離）
健常人ボランティアから30 mLの末梢血を採血した。Lymphoprep（Axis-Shield社）を用いて、標準プロトコールに従い、末梢血を遠心分離して末梢血単核球（peripheral blood mononuclear cell; PBMC）層と顆粒球層を単離した。それぞれを1×RBC lysis bufferに懸濁し、室温にて5分間静置し、赤血球を溶血処理した。
CD14 マイクロビーズおよびMacsカラムLS（共にMiltenyi Biotec社）を用いて、PBMCからCD14陽性細胞を単離し、単球として用いた。
【０１２３】
（DOTAPおよびLipofectamine2000による核酸の導入）
任意の体積の0.5μg/mLのRNAと、カチオン性の脂質DOTAP｛N-[1-(2,3-Dioleoyloxy)propyl]-N, N, N-trimethylammonium methyl-sulfate｝（Roche社）またはLipofectamine2000（Thermo Fisher Scientific 社）とを、Hepes buffered saline(HBS)またはOpti-MEM（Thermo Fisher Scientific 社）に懸濁して室温で5分間静置した。複合体形成のために各溶液をそれぞれ穏やかに混合し、20分室温で静置した。マイクロピペットで複数回、各溶液をそれぞれ緩やかに混合した後、細胞培養液に加えた。
【０１２４】
（遺伝子発現解析）
RNAの調製は、RNAiso plus（タカラバイオ社）を用いて、標準プロトコールに従い行った。相補的DNA（complimentary DNA; cDNA）の調製は、PrimeScript RT reagent with gDNA Eraser（タカラバイオ社）を用いて標準プロトコールに従い行った。
定量的RT-PCR（qRT-PCR）はSYBR Premix Ex Taq（タカラバイオ社）とLightcycler480 (Roche Molecular Biochemicals社)を用いて実施した。終濃度0.5μM のsenseプライマー及びanti-senseプライマー、ならびに反応系体積の20%相当量のcDNA溶液（蒸留滅菌水で20倍に希釈）を加え、PCR反応を行った。95℃ 1分保温の後、95℃ 10秒、57℃ 5秒、72℃ 10秒のサイクル反応を60回以上行った。Glycerinaldehyde-3-phosphate dehydrogenase（Gapdh）mRNAの発現量で目的遺伝子の発現量を補正した値を相対的遺伝子発現量（Relative expression）とした。qRT-PCRに用いたプライマー（Fasmac社）を以下に示す。
【０１２５】
【表１】
2018191580.tif 000007
【０１２６】
【表２】
2018191580.tif 000008
【０１２７】
（Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay; ELISA）
マウスIFN-αおよびマウスIFN-β のELISAにはマウスインターフェロン測定ELISA  Mouse IFN Alpha ELISA/Mouse IFN Beta ELISA（PBL社）を用いた。マウスIL‐1βのELISAにはMouse IL‐1 beta/IL‐1F2 DuoSet ELISA（R&D system社）を用いた。標準プロトコールに従い細胞培養液中のサイトカイン濃度を測定した。
【０１２８】
（マウス尾静脈採血）
マウス尾静脈直上をカミソリで切り、血液を採取した。15分間室温で静置した後、遠心分離し（5000 x g、15分間）、血清を単離した。
【０１２９】
（qRT-PCR法による培養上清および血清中のU11 snRNA相対量の測定）
Nucleospin miRNA plasma（タカラバイオ社）を用いて、液体試料（PBS、培養上清および血清）からRNAを単離した。液体試料50‐250μlに対して350 ngの外部コントロールRNAを加え、PBSにて300μLに希釈したものをサンプルとして用いた。外部コントロールRNAは、green fluorescent protein（GFP）mRNAの塩基番号1062‐1195の134塩基長を試験管内転写により合成したRNAを用いた。試験管内転写はin vitro Transcription T7 Kit (for siRNA Synthesis)（タカラバイオ社）の標準プロトコールに従い、RNAiso plusを用いてRNAを単離後、DEPC処理水に溶解した。使用直前まで−80℃にて保存した。
PrimeScript RT reagent with gDNA Eraser（タカラバイオ社）を用いて、標準プロトコールに従い、単離したRNAからcDNAを調製した。ただしU11 snRNAの逆転写反応において、逆転写プライマーとしてU11 snRNA qRT‐PCR用のanti‐senseプライマーを用い、反応条件を50℃、20分とした。
定量的PCRは遺伝子発現解析と同様に行った。U11 snRNAについては95℃ 1分保温後、95℃ 10秒、61℃ 5秒、72℃ 3秒のサイクル反応を60回以上行った。
【０１３０】
（図の描画および統計解析）
図中では平均値と標準偏差を棒グラフとエラーバーで、あるいは測定値を円および群の中央値と四半分値を黒色線で示した。図の描画にはMicrosoft Excel for Mac 2016及びRを用いた。
R Core Team (2016). R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria.
https://www.R-project.org/.
Aron Eklund (2016). beeswarm: The Bee Swarm Plot, an Alternative to Stripchart. R package version 0.2.3. 
https://CRAN.R-project.org/package=beeswarm
検量線の線形回帰解析および群間の統計解析は、表計算ソフトを用いて群間分散分析にはF検定を、群間の平均値の有意差検定にはStudentのt検定を、多重検定にはdunnett's multiple comparison testを用いた。P値が0.1未満の時、検定された群間上部に示した。0.1以上の際は、群間上部にN.S.(Not Significant)と示した。
【０１３１】
結果
参考例1  U11 snRNAの免疫原性の検証および認識受容体の同定
(1‐1) マウスU11 snRNA全長
U11 snRNAが持つ免疫原性についてさらに検証するため、マウスU11 snRNA全長を合成した。免疫原性の解析には、一本鎖RNAに応答する細胞を含む脾臓細胞およびpDC、ならびに細胞質内核酸受容体発現する細胞であるPECsを用いた。具体的には、以下のとおりに行った。
【０１３２】
終濃度0.0666、0.222、0.666、および2μg/mlのマウス全長U11 snRNAまたはpolyUで、脾臓細胞または脾臓細胞より分取した形質細胞様樹状細胞（pDC）を刺激した。
また、終濃度2μg/mlの核酸をDOTAPまたはLipofectaine2000と複合体を形成させた上で、マウス腹腔滲出細胞（PECs）を刺激した。18時間後に培養上清を回収し、ELISA法によりそれぞれIFN‐β、IFN‐α、IL‐1βの産生量を測定した。（n=3）
統計解析は分散分析F検定に基づきStudent's あるいはWelch's t検定を用いた。多重検定の実施に際し、P値をボンフェローニの方法によって補正し、有意水準*; P < 0.05, **; P < 0.01とした。
【０１３３】
結果を図１に示す。全長U11 snRNAで脾臓細胞（splenocyte）を刺激した場合、典型的なTLR7のリガンドであるpolyUと比して同程度のIFN-βの産生が誘導されることが判明した（図1上）。また、TLR7を高発現し、一本鎖RNAで刺激されるとIFN-αを高産生するpDCを用いて同様の検討を行った。その結果、U11 snRNAは、脾臓細胞の場合と同様にIFN-α産生誘導能を持つことが明らかとなった（図1中央）。一方で、細胞質内に暴露された二本鎖RNAは、インフラマソームを活性化してIL‐1βの成熟化および分泌を促すことが知られている。そこで、U11 snRNAとDOTAPとの複合体でPECsを刺激したところ、IL‐1βの産生は認められなかった（図1下）。しかしながら、核酸の細胞質内への暴露に用いられるカチオン性脂質Lipofectamine2000とU11 snRNAとの複合体でPECsを刺激したところ、二本鎖RNA Polyinosinic-polycytidylic acid（polyIC）（invitrogene社）と比較して僅かだがIL‐1βの産生が認められた（図1下）。
【０１３４】
(1‐2) ヒトU11 snRNA全長
同様に、ヒトU11 snRNA全長の免疫原性を検証した。具体的には、以下のとおりに行った。
【０１３５】
ヒト末梢血単核球から分離したCD14陽性単球を用いて、ヒトU11 snRNA全長の免疫原性を検証した。刺激にはDOTAPを用いた。終濃度1μg/mlのヒトU11snRNA全長とDOTAPとの複合体でCD14陽性単球を刺激した。4時間後にRNAを抽出し、qRT-PCR法によりIl6 mRNAおよびTnf mRNAの発現を解析した。（n=3）
【０１３６】
結果を図2に示す。ヒトU11 snRNA全長も同様に、炎症性サイトカイン遺伝子の発現誘導能を持つことが認められた。
【０１３７】
(2) 受容体の同定
全長U11 snRNAを認識する自然免疫受容体の同定を行った。U11 snRNAは一本鎖RNAであり、TLR7の関与が高いと考えられることから、TLR7欠損マウス由来の脾臓細胞を用いて解析した。具体的には、以下のとおりに行った。
【０１３８】
終濃度1μg/mlのマウス全長U11 snRNAまたはpolyUとDOTAPとの複合体で、TLR7欠損マウスおよび野生型同腹仔から採取した脾臓細胞を刺激した。4、8時間後にRNAを抽出し、qRT-PCR法によりIfnb1 mRNAの発現を解析した。（n=3）
【０１３９】
結果を図3に示す（図中、「WT」は野生型マウス、「tlr7-/-」はTLR7欠損マウスを示す。）。U11 snRNAによるI型IFNの遺伝子発現誘導は、polyUによる刺激の場合と同様に、TLR7欠損脾臓細胞において消失することが判明した。以上の結果から、U11 snRNAは、その免疫原性発揮に際しTLR7に依存的であることが示唆された。
【０１４０】
参考例2  U11 snRNAの免疫原性を担う分子機序の解析
U11 snRNAが修飾塩基を持たないことにより強い免疫原性を持つ可能性について、さらに検討をおこなった。図4にヒトU11 snRNAおよびヒトU1 snRNAの二次構造の模式図を示す。U11 snRNAとU1 snRNAの二次構造は類似しているが、U11 snRNAは5'トリメチル化グアノシンキャップ以外の修飾塩基を有さず、U1 snRNAは5'SS（Splicing site）およびSL（Stem loop）IIに3箇所の2'-O-Me修飾と2箇所のシュードウリジン化修飾を有する。そこで、2'‐O‐Me修飾がU11 snRNAの免疫原性に与える影響を検証するため、U1 snRNAと構造上類似した位置にメチル化修飾を有するU11 snRNAの変異体およびメチル化修飾を再現したU1 snRNAを新規に合成し、脾臓細胞を用いて、その免疫原性を検証した。具体的には、以下のとおりに行った。
【０１４１】
終濃度0.5および1.0μg/mlのマウス全長U11 snRNA、U11 snRNAの変異体、U1 snRNA、またはRNAリガンド（poly Uもしくはpoly C）とDOTAPとの複合体を用いて、マウス脾臓細胞を刺激した。4時間後にRNAを抽出し、qRT-PCR法によりIfnb1 mRNA、Il6 mRNA、およびTnf mRNAの発現を解析した。（n=3）
また、終濃度2μg/mlのRNAとDOTAPとの複合体を用いて、脾臓細胞より分取したpDCを刺激した。18時間後に培養上清を回収し、ELISA法によりそれぞれIFN-αの産生量を測定した。
【０１４２】
結果を図5に示す。メチル化修飾の導入により、U11 snRNAの炎症性サイトカインおよびI型IFN遺伝子の発現誘導能が著明に減弱し、メチル化修飾を有するU1 snRNAと同程度となった。これらの結果より、U11 snRNAが免疫原性を発揮するためには、2'‐O‐Me修飾を受けないことが大きな要因となることが示され、メチル化修飾を有さないU11 snRNAのDAMPsとしての生理的重要性が示唆された。
【０１４３】
参考例3  マウス疾患モデルにおける血清中U11 snRNA量の解析
U11 snRNAが内在性の免疫原性核酸として免疫応答を惹起することが示唆されたので、マウス疾患モデルを用いて、U11 snRNAと病態との関連について検討を行った。マウス疾患モデルとして、マウスRAモデル（collagen-induced arthritis model;CIA）、マウスSLEモデルであるGraft versus host disease (GVHD) lupus腎炎モデル、および自然発症性SLEモデル（BXSB/yaaマウス、Y-linked autoimmune acceleration; yaa）を用いた。これらのマウスについて、疾患を発症した状態において、血中に含まれるU11 snRNA濃度をqRT-PCR法にて解析した。具体的には、以下のとおりに行った。
【０１４４】
mCIAモデルは、2度目のコラーゲン投与2週間後に個体から血清を採取した。対照は感作のないマウスとした。血清よりRNAを抽出し、qRT-PCR法によりU11 snRNA濃度を測定した。
mGVHD lupusモデルは、脾臓細胞投与前、及び投与後4週間後に血清を採取した。血清よりRNAを抽出し、qRT-PCR法によりU11 snRNA濃度を測定した。
オスのyaaマウスは、Y染色体上にYaa（Y-linked autoimmune acceleration）遺伝子変異を有し、加齢とともに自己免疫疾患を自然発症する。yaa+マウスは、B6系統との掛け合わせによりY染色体をB6由来Y染色体に置換したマウスであり、Yaa遺伝子変異を持たず、自己免疫疾患を発症しない。22-24週齢、オスのBXSB/yaa+マウスおよびyaaマウスから採取した血清中のU11 snRNA濃度を、qRT-PCR法にて測定した。
上記の統計解析にはStudentのt検定を用いた。
【０１４５】
結果を図6に示す（図中、P値を群間上部に示す。「N.S.」は「Not significant」を示す。）。マウスRAモデル（CIA : 図6左上）、マウスSLEモデル（図6右上）、および自然発症性SLEモデル（図6左下）のいずれにおいても、それぞれの対照群と比較して、血中に高濃度のU11 snRNAが存在することが示唆された。
【０１４６】
実施例1    U11 snRNAに相補的な配列を有するsi RNAおよび一本鎖核酸分子によるU11 snRNAの免疫原性の抑制
U11 snRNAに相補的な配列を有するsi RNAおよび一本鎖核酸分子を用いて、U11 snRNAによる炎症性サイトカインおよびI型IFN遺伝子の発現誘導能を抑制する方法について検討を行った。U11 snRNはTLR7を介して遺伝子発現の誘導を活性化することから、U11 snRNAの2次構造においてUリッチな領域が一本鎖で存在することが、その免疫原性に重要であると考えられる。そこで、マウスU11 snRNAのsm 領域と相補的な配列を含むsi RNAおよび一本鎖核酸分子を用いて、TLR7のリガンドになり得る領域（sm 領域）を阻害することにより、U11 snRNAの免疫原性が低下するかどうか、検討を行った。用いた6種類の核酸分子を以下に示す。
【０１４７】
【化６】
2018191580.tif 000009
【０１４８】
NI1（配列番号36/ 配列番号37）：
GCAUAAUUUUUUGGUAUUUTT / AAAUACCAAAAAAUUAUGCTT
NI2（配列番号38 / 配列番号39）：
CAUAAUUUUUUGGUAUUUGTT / CAAAUACCAAAAAAUUAUGTT
NI3（配列番号40 / 配列番号41）：
AUAAUUUUUUGGUAUUUGGTT / CCAAAUACCAAAAAAUUAUTT
PH1（配列番号6）：
GCAUAAUUUUUUGGUAUUUUUCC - L - GGAAAAAUACCAAAAAAUUAUGCUU
PH2（配列番号7）：
CAUAAUUUUUUGGUAUUUGUUCC - L - GGAACAAAUACCAAAAAAUUAUGUU
PH3（配列番号8）：
AUAAUUUUUUGGUAUUUGGUUCC - L - GGAACCAAAUACCAAAAAAUUAUUU
Lは、以下の構造で表されるリンカーである。
【０１４９】
【化７】
2018191580.tif 000010
【０１５０】
各核酸分子によるU11 snRNAの免疫原性の抑制の検討は、具体的には、以下のとおりに行った。96穴プレートに、1.25×105細胞/50μL培地/ウェルとなるように脾臓細胞を播種し、U11 snRNA/DOTAP混合液を1.0μg/mlとなるように添加した。U11 snRNA/DOTAP混合液を作成する際に、あらかじめ、U11 snRNAと各核酸分子とのモル比が1 : 1及び1 : 2（U11 snRNA : 核酸分子）となるように各核酸分子添加した。4時間後、細胞を回収し、qRT-PCR法によりIfnb1 mRNA、Il6 mRNAの発現を解析した。
【０１５１】
結果を図7に示す（図中、「+」はU11 snRNAと各核酸分子との質量比が1 : 1の場合、「++」は1 : 2の場合を示す。また、図中、左端の「-」は刺激なし、左から2番目の「-」は核酸分子の添加なしを示す。）。相補的な配列を含む各核酸分子によって、U11snRNAによるI型IFNおよび炎症性サイトカインの誘導が抑制された。
【０１５２】
実施例2  U11 snRNAに相補的な配列を有するアンチセンス核酸によるU11 snRNAの免疫原性の抑制
U11 snRNAに相補的な配列を有するアンチセンス核酸を用いて、U11 snRNAによる炎症性サイトカインおよびI型IFN遺伝子の発現誘導能を抑制する方法について検討を行った。具体的には、以下のとおりに行った。
【０１５３】
ステム−ループ3の配列を一部含む、U11 snRNAに対するギャップマー型のアンチセンス核酸（配列番号42）、およびネガティブコントロールの核酸分子（配列番号43）を合成した。下記配列中、「mN」は2’ -OMe-RNA、小文字はDNA、「*」はホスホロチオエート結合を示す。
【０１５４】
配列番号42：mU*mC*mU*mC*mU*t*g*a*t*g*t*c*g*a*t*mU*mC*mC*mG*mC* 
配列番号43：mU*mC*mA*mC*mC*t*t*c*a*c*c*c*t*c*t*mC*mC*mA*mC*mU*
【０１５５】
FLT3 ligandを使用してマウス骨髄から培養した樹状細胞を in vitroで合成したU11 snRNA(Dotapと混合)で刺激し、IFNb1 mRNAの誘導をqRTPCRによって解析した。
刺激の際にU11 snRNAに対するanti-senseをモル比1:5 (U11 snRNA:アンチセンス)で添加した。
【０１５６】
結果を図8に示す。U11 snRNAに相補的な配列を有するアンチセンス核酸によって、U11 snRNAによるIFNβの誘導が抑制された。
【産業上の利用可能性】
【０１５７】
本発明によれば、U11 snRNAの機能を抑制することができる。また、本発明の核酸分子を、I型IFN及び／又は炎症性サイトカインの発現亢進が関与する疾患の治療剤として用いることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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