(57)【要約】【課題】ナノポアを使用した、ポリヌクレオチドなどのポリマーの光学検出および分析のための、例えば核酸配列を決定するための様々な方法、システムおよびデバイスを提供すること。【解決手段】ある特定のバリエーションでは、ポリヌクレオチドがナノポアを通ってトランスロケーションするときに、混合ＦＲＥＴシグナルを測定するステップと、混合ＦＲＥＴシグナルからポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するステップとを含む、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するための方法およびシステムが提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２０１３年５月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／８２７，５１９号（この内容は、その全体が本明細書に援用される）への優先権の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡ配列決定技術は、例えばＬｅｒｎｅｒら、Ｔｈｅ  Ａｕｋ、１２７巻：４〜１５頁、２０１０年、Ｍｅｔｚｋｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１１巻：３１〜４６頁、２０１０年、Ｈｏｌｔら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１８巻：８３９〜８４６頁、２００８年にあるように、この１０年間にわたって生物科学に変革を起こし、例えばＶｏｅｌｋｅｒｄｉｎｇら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ５５巻：６４１〜６５８頁、２００９年、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｇｅｎｅｓ、１巻：３８〜６９頁、２０１０年、Ｆｒｅｅｍａｎら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９巻：１８１７〜１８２４頁、２００９年、Ｔｕｃｋｅｒら、Ａｍ．  Ｊ．  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔ．、８５巻：１４２〜１５４頁、２００９年にあるように、医療業務の多くの側面に変革を起こす可能性を有する。しかし、そのような可能性を実現するためには、ラン当たりの配列決定のコストの低減、試料調製の簡素化、ラン時間の低減、読み取り長さの増加、データ分析の向上などを含めて、例えばＢａｋｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、７巻：４９５〜４９８頁、２０１０年、Ｋｉｒｃｈｅｒら、Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ、３２巻：５２４−５３６頁、２０１０年、Ｔｕｒｎｅｒら、Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ
ｏｆ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１０巻：２６３〜２８４頁、２００９年にあるような、取り組まねばならない難題が依然として山積している。ナノポアを使用した単分子の配列決定は、これらの難題のいくつかに対して、例えばＭａｉｔｒａら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、３３巻：３４１８〜３４２８頁、２０１２年、Ｖｅｎｋａｔｅｓａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６巻：６１５〜６２４頁、２０１１年のように対処しうるものの、このアプローチには、信頼性のあるナノポアの作製、ＤＮＡトランスロケーション速度の制御、ヌクレオチドの分別、ナノポアセンサーの大型アレイからの電気信号の検出など、例えばＢｒａｎｔｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２６巻（１０号）：１１４６〜１１５３頁、２００８年、Ｖｅｎｋａｔｅｓａｎら（上記に引用済み）などにあるように、それ自体の持つ一連の技術的な困難性がある。
【０００３】
ヌクレオチドの光学検出は、例えばＨｕｂｅｒ、国際特許出願公開ＷＯ  ２０１１／０４０９９６、Ｒｕｓｓｅｌｌ、米国特許第６，５２８，２５８号、Ｐｉｔｔａｒｏ、米国特許出願公開第２００５／００９５５９９号、Ｊｏｙｃｅ、米国特許出願公開第２００６／００１９２５９号、Ｃｈａｎ、米国特許第６，３５５，４２０号、ＭｃＮａｌｌｙら、Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．、１０巻（６号）：２２３７〜２２４４頁、２０１０年などにあるように、ナノポア配列決定の分野の技術的な困難性のいくつかに対し、潜在的な解決策として提案されている。しかし、光学ベースのナノポア配列決定は、適当な作製技法がないこと、およびそのようなシステムの要素がどのように相互に作用するのかという理解がないことを含めて、様々な理由のために実現されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０１１／０４０９９６号
【特許文献２】米国特許第６，５２８，２５８号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００５／００９５５９９号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記の観点から、核酸配列決定などの検体の光学検知および分析を首尾よく行えるようにする利用可能な材料と光学素子の構成があれば、概して、ナノポアセンサー技術および光学ベースのナノポア配列決定などの特定の適用には好都合となる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
マイクロ流体および／またはナノ流体デバイス中のポリヌクレオチドなどのポリマーの光学検出および分析のための様々な方法、例えば、核酸の配列を決定するためにナノポアを使用したものを、本明細書に提供する。
【０００７】
ある特定のバリエーションでは、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する方法は、（ａ）例えば一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドのヌクレオチドが、ナノポアに隣接して位置づけられるＦＲＥＴ対の第１のメンバーの傍を順番に通過するように、ポリヌクレオチドを、ナノポアを通ってトランスロケーションさせるステップであって、該ヌクレオチドが前記ナノポアを出るときに、複数の該ヌクレオチドが、該ＦＲＥＴ対の該第１のメンバーのＦＲＥＴ距離内にあり、かつヌクレオチドの少なくとも一部分が、該ＦＲＥＴ対の第２のメンバーで標識されている、ステップと、（ｂ）該ＦＲＥＴ距離内にある該ＦＲＥＴ対の該第１のメンバーと複数の第２のメンバーとの間でＦＲＥＴが発生して、混合ＦＲＥＴシグナルを生成するように、該ナノポアに隣接する該ＦＲＥＴ対を光線に曝露するステップと、（ｃ）該ポリヌクレオチドが該ナノポアを通ってトランスロケーションするときに、混合ＦＲＥＴシグナルを測定するステップと、（ｄ）該混合ＦＲＥＴシグナルから該ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するステップとを含む。一部の実施形態では、ナノポアは、固相膜に配置され、ＦＲＥＴ対の第１のメンバーは、前記ナノポアに隣接する固相膜に付着している。他の実施形態では、ナノポアは、タンパク質ナノポアであり、ＦＲＥＴ対の第１のメンバーは、タンパク質ナノポアに付着している。
【０００８】
別のバリエーションでは、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する方法は、（ａ）例えば一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドのヌクレオチドが、ナノポアを出るときに、順番にＦＲＥＴゾーンを通って通過するように、ポリヌクレオチドを、出口を有するナノポアを通ってトランスロケーションさせるステップであって、該ＦＲＥＴゾーンが、そのような通過の間に複数の該ヌクレオチドを包囲し、かつ該ヌクレオチドの少なくとも一部分が、ＦＲＥＴ対の少なくとも１つの第２のメンバーで標識され、かつ該ＦＲＥＴ対の少なくとも１つの第１のメンバーが、該ＦＲＥＴゾーン内にある、ステップと、（ｂ）該ＦＲＥＴ対の第１のメンバーと第２のメンバーとの間でＦＲＥＴが発生して、混合ＦＲＥＴシグナルを生成するように、該ＦＲＥＴゾーン内にある該ＦＲＥＴ対の該第１のメンバーおよび該第２のメンバーを光線に曝露するステップと、（ｃ）該ポリヌクレオチドが該ＦＲＥＴゾーンを通って動くときに、混合ＦＲＥＴシグナルを測定するステップと、（ｄ）該混合ＦＲＥＴシグナルから該ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するステップとを含む。
【０００９】
別のバリエーションでは、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する方法は、（ａ）例えば一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチドなどの標識されたヌクレオチドを有するポリヌクレオチドを、特定の寸法に作られたナノポアを通ってトランスロケーションさせ、その結果、ＦＲＥＴ対の第２のメンバーであるヌクレオチド上の標識が、ＦＲＥＴ反応を抑制するように拘束され、かつ該ポリヌクレオチドのヌクレオチドが、該ナノポアを出るときに、順番にＦＲＥＴゾーンを通って通過するステップであって、該ＦＲＥＴゾーンが、そのような通過の間に複数の前記ヌクレオチドを包囲し、かつ該ＦＲＥＴ対の少なくとも１つの第１のメンバーが、該ＦＲＥＴゾーン内にある、ステップと、（ｂ）該第１のメンバーと該第２のメンバーとの間でＦＲＥＴが発生して、混合ＦＲＥＴシグナルを生成するように、該ＦＲＥＴゾーン内にある前記ＦＲＥＴ対の該第１のメンバーおよび該第２のメンバーを光線に曝露するステップと、（ｃ）該ポリヌクレオチドが該ＦＲＥＴゾーンを通って動くときに、混合ＦＲＥＴシグナルを測定するステップと、（ｄ）混合ＦＲＥＴシグナルから該ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するステップとを含む。
【００１０】
様々な方法、システムおよびデバイスが、多数の実践および適用において例示され、そのいくつかは、以下におよび本明細書を通じて要約されている。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する方法であって、
ポリヌクレオチドのヌクレオチドがナノポアに隣接して位置づけられるＦＲＥＴ対の第１のメンバーの傍を順番に通過するように、前記ポリヌクレオチドを、前記ナノポアを通ってトランスロケーションさせるステップであって、前記ヌクレオチドが前記ナノポアを出るときに、複数の前記ヌクレオチドが、前記ＦＲＥＴ対の前記第１のメンバーのＦＲＥＴ距離内にあり、かつ前記ヌクレオチドの少なくとも一部分が、前記ＦＲＥＴ対の第２のメンバーで標識されている、ステップと、
前記ＦＲＥＴ距離内にある前記ＦＲＥＴ対の前記第１のメンバーと複数の第２のメンバーとの間でＦＲＥＴが発生して、混合ＦＲＥＴシグナルを生成するように、前記ナノポアに隣接する前記ＦＲＥＴ対を光線に曝露するステップと、
前記ポリヌクレオチドが前記ナノポアを通ってトランスロケーションするときに、混合ＦＲＥＴシグナルを測定するステップと、
前記混合ＦＲＥＴシグナルから前記ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するステップと
を含む、方法。
（項目２）
前記ナノポアが、固相膜に配置され、前記ＦＲＥＴ対の前記第１のメンバーが、前記ナノポアに隣接する前記固相膜に付着している、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記ナノポアが、タンパク質ナノポアであり、前記ＦＲＥＴ対の前記第１のメンバーが、前記タンパク質ナノポアに付着している、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記ポリヌクレオチドが、一本鎖または二本鎖のポリヌクレオチドである、項目１に記載の方法。
（項目５）
ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する方法であって、
ポリヌクレオチドのヌクレオチドが、ナノポアを出るときに、順番にＦＲＥＴゾーンを通って通過するように、前記ポリヌクレオチドを、出口を有する前記ナノポアを通ってトランスロケーションさせるステップであって、前記ＦＲＥＴゾーンは、そのような通過の間に複数の前記ヌクレオチドを包囲し、かつ前記ヌクレオチドの少なくとも一部分が、ＦＲＥＴ対の少なくとも１つの第２のメンバーで標識され、かつ前記ＦＲＥＴ対の少なくとも１つの第１のメンバーが、前記ＦＲＥＴゾーン内にある、ステップと、
前記ＦＲＥＴ対の第１のメンバーと第２のメンバーとの間でＦＲＥＴが発生して、混合ＦＲＥＴシグナルを生成するように、前記ＦＲＥＴゾーン内にある前記ＦＲＥＴ対の前記第１のメンバーおよび前記第２のメンバーを光線に曝露するステップと、
前記ポリヌクレオチドが前記ＦＲＥＴゾーンを通って動くときに、混合ＦＲＥＴシグナルを測定するステップと、
前記混合ＦＲＥＴシグナルから前記ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するステップと
を含む、方法。
（項目６）
前記ナノポアが、固相膜に配置され、前記ＦＲＥＴ対の前記第１のメンバーが、前記ナノポアに隣接する前記固相膜に付着している、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記ナノポアが、タンパク質ナノポアであり、前記ＦＲＥＴ対の前記第１のメンバーが、前記タンパク質ナノポアに付着している、項目５に記載の方法。
（項目８）
前記ポリヌクレオチドが、一本鎖または二本鎖のポリヌクレオチドである、項目５に記載の方法。
（項目９）
ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する方法であって、
標識されたヌクレオチドを有するポリヌクレオチドを、特定の寸法に作られたナノポアを通ってトランスロケーションさせ、その結果、ＦＲＥＴ対の第２のメンバーである前記ヌクレオチド上の標識が、ＦＲＥＴ反応を抑制するように拘束され、かつ前記ポリヌクレオチドのヌクレオチドが、前記ナノポアを出るときに、順番にＦＲＥＴゾーンを通って通過するステップであって、前記ＦＲＥＴゾーンが、そのような通過の間に複数の前記ヌクレオチドを包囲し、かつ前記ＦＲＥＴ対の少なくとも１つの第１のメンバーが、前記ＦＲＥＴゾーン内にある、ステップと、
前記第１のメンバーと前記第２のメンバーとの間でＦＲＥＴが発生して、混合ＦＲＥＴシグナルを生成するように、前記ＦＲＥＴゾーン内にある前記ＦＲＥＴ対の前記第１のメンバーおよび前記第２のメンバーを光線に曝露するステップと、
前記ポリヌクレオチドが前記ＦＲＥＴゾーンを通って動くときに、混合ＦＲＥＴシグナルを測定するステップと、
前記混合ＦＲＥＴシグナルから前記ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するステップと
を含む、方法。
（項目１０）
前記ナノポアが、固相膜に配置され、前記ＦＲＥＴ対の前記第１のメンバーが、前記ナノポアに隣接する前記固相膜に付着している、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記ナノポアが、タンパク質ナノポアであり、前記ＦＲＥＴ対の前記第１のメンバーが、前記タンパク質ナノポアに付着している、項目９に記載の方法。
（項目１２）
前記ポリヌクレオチドが、一本鎖または二本鎖のポリヌクレオチドである、項目９に記載の方法。
（項目１３）
前記ＦＲＥＴ対の前記第１のメンバーが、ドナーであり、前記ＦＲＥＴ対の前記第２のメンバーが、アクセプターである、項目１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
（項目１４）
前記アクセプターの少なくとも１つが、有機蛍光色素である、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記ドナーの少なくとも１つが、量子ドットである、項目１３に記載の方法。
（項目１６）
ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するためのシステムであって、
第１のチャンバーと第２のチャンバーとの間に流体連通を提供し、かつポリヌクレオチドが通ってトランスロケーションすることができるナノポアであって、前記ナノポアは、前記ポリヌクレオチドのヌクレオチドが、順番に前記ナノポアの出口を通って通過するように、特定の寸法に作られており、そして前記ポリヌクレオチドのヌクレオチドが、ＦＲＥＴ対のメンバーで標識されている場合はいつでも、前記ナノポアの内部のそのようなメンバーと、前記ナノポアの外部のメンバーとの間でＦＲＥＴが抑制されている、ナノポアと、
前記ナノポアの前記出口のＦＲＥＴ距離内に配置された前記ＦＲＥＴ対のメンバーであって、ここで前記ナノポアの前記出口のＦＲＥＴ距離内に配置された前記ＦＲＥＴ対のメンバーは、前記ポリヌクレオチドを標識するメンバーとは異なるメンバーであり、複数のヌクレオチドが、前記ナノポアの前記出口から現れるときに、配置された前記メンバーのＦＲＥＴ距離内を通過する、メンバーと
を含む、システム。
（項目１７）
前記ナノポアが、固相膜に配置され、前記ＦＲＥＴ対の前記第１のメンバーが、前記ナノポアに隣接する前記固相膜に付着している、項目１６に記載のシステム。
（項目１８）
前記ナノポアが、タンパク質ナノポアであり、前記ＦＲＥＴ対の前記第１のメンバーが、前記タンパク質ナノポアに付着している、項目１６に記載のシステム。
（項目１９）
前記ポリヌクレオチドが、一本鎖または二本鎖のポリヌクレオチドである、項目１６に記載のシステム。
（項目２０）
前記ＦＲＥＴ対の配置された前記メンバーが、ドナーであり、前記ポリヌクレオチドを標識している前記メンバーが、アクセプターである、項目１６から１９のいずれか一項に記載のシステム。
（項目２１）
前記アクセプターが、有機蛍光色素である、項目２０に記載のシステム。
（項目２２）
前記ドナーが、量子ドットである、項目２０に記載のシステム。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ】図１Ａは、単一種のアクセプター分子で標識されたポリヌクレオチド検体の場合の、混合ＦＲＥＴシグナルの収集を伴う一実施形態の概略図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、単一種のアクセプター分子で標識された試験ポリヌクレオチドの、混合ＦＲＥＴシグナルのデータを示す図である。
【図１Ｃ】図１Ｃは、２種のアクセプター分子で標識されたポリヌクレオチド検体の場合の、混合ＦＲＥＴシグナルの収集を伴う一実施形態の概略図である。
【図１Ｄ】図１Ｄは、２種のアクセプター分子で標識された試験ポリヌクレオチドの、混合ＦＲＥＴシグナルのデータを示す図である。
【図２−１】図２Ａ〜Ｃは、ハイブリッドバイオセンサーの一実施形態を説明する図である。
【図２−２】図２Ｄは、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを使用した、ＦＲＥＴ対のメンバーの位置づけを伴うデバイスの一実施形態を説明する図である。
【図２−３】図２Ｅは、ハイブリッドナノポアの一実施形態を説明する図であり、ここで固体状態膜（２０１）の表面は、脂質層が接着された（２０３）疎水性層（２０２）を用いて被覆されている。脂質は、挿入されたポアタンパク質を含むギガオーム（ｇｉｇａｏｈｍ）シールを形成する。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本明細書に記載された様々な方法、システムおよびデバイスが、様々な改変および代替の形態に適用しうる一方で、その具体例は、図面中の例によって示されており、詳細に記載されることになる。しかし、その意図は、記載された特定の実施形態に限定されることにはないことを理解されたい。むしろ、その意図は、本発明の精神および範囲にある全ての改変、等価物および代替を網羅することにある。例えば、特定のナノポアの種類および数、特定の標識、ＦＲＥＴ対、検出スキームおよび作製アプローチは、説明のために示されている。しかし、本開示は、この点に限定されることを意図しておらず、それは、本明細書に議論された様々なシステムの態様を実行するために、他の種類のナノポア、配列されたナノポアおよび他の作製技術を利用することができるためであることを理解されたい。ある特定の態様のためのガイダンスは、例えば、Ｃａｏ、Ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ＆  Ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ（Ｉｍｐｅｒｉａｌ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｐｒｅｓｓ、２００４年）、Ｌｅｖｉｎｓｏｎ，  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ、第２版（ＳＰＩＥ  Ｐｒｅｓｓ、２００５年）、ＤｏｅｒｉｎｇおよびＮｉｓｈｉ編、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第２版（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、２００７年）、Ｓａｗｙｅｒら、Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｆｏｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ、第２版（Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、１９９５年）、ＢａｒｄおよびＦａｕｌｋｎｅｒ、Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、第２版（Ｗｉｌｅｙ、２０００年）、Ｌａｋｏｗｉｃｚ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ、第３版（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、２００６年）、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第２版（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、２００８年）などを含めた多くの利用可能な参考文献および当業者に周知の論文に見られ、これらの関連部分は、参照により本明細書に組み入れられている。
【００１３】
本明細書に記載された様々な方法およびシステムは、ポリマー検体などの検体の特性を測定するためのナノポアおよびＦＲＥＴ対の使用に関する。ＦＲＥＴ対は、一般的に、１つまたは複数のＦＲＥＴドナーおよび１つまたは複数のＦＲＥＴアクセプターであり、ここで、各ドナーは、各アクセプターとＦＲＥＴ反応を生じることができる。一態様では、このことは、ＦＲＥＴ対のドナーが、アクセプターの吸収スペクトルに実質的に重複する発光スペクトルを有することを意味する。別の態様では、ドナーおよびアクセプターの遷移双極子は、効率的なエネルギー転移が可能となるような形で整列させなければならない。ある特定のバリエーションの一部は、検出事象の間に複数のＦＲＥＴアクセプターがＦＲＥＴシグナルを生成し、その結果、混合ＦＲＥＴシグナルが収集されるという条件下での、ＦＲＥＴ対の使用に関する認識と理解に基づく。一部の態様では、ある特定のバリエーションの一部はまた、ナノポアのＦＲＥＴ抑制特性の発見および理解と、ナノポアを通ってトランスロケーションしている標識された検体を検出することを可能にするためのこの特性の適用とに基づく。本明細書に記載されたバリエーションが、それによって限定されることを意図しないにも関わらず、ナノポアは、特定の寸法に作られた孔を伴って選択される場合があり、その結果、ＦＲＥＴ対の標識は、ナノポアを通ってトランスロケーションする間に、ＦＲＥＴ相互作用に関与するために正しく位置することはできないことが考えられる。ナノポアの孔内のポリヌクレオチドの標識の双極子は、制限されたナノポア径に基づき、回転自由において拘束される。ナノポアに付着した対応のＦＲＥＴ対の整列を伴う、この双極子整列の減少は、ＦＲＥＴ効率を劇的に制限する。標識されたポリヌクレオチドは、ナノポアを出た後にＦＲＥＴ相互作用に関与しうるが、この時点で、検体（例えばポリヌクレオチド）上のＦＲＥＴアクセプターまたはドナーは、混合ＦＲＥＴ事象を可能にする回転自由を再び得る。
【００１４】
検出される検体の種類、利用されるドナーおよびアクセプターの種類、ナノポア、ドナーおよびアクセプターの物理的な配置、検体をドナーまたはアクセプターによって標識するか否かなどに応じて、広範な実施形態が考慮される。一実施形態では、測定される検体は、アクセプターで標識されたポリマーであり、特にアクセプターで標識されたポリヌクレオチドである。後者の実施形態の１種では、ナノポアを通ってトランスロケーションした時に生成される混合ＦＲＥＴシグナルを測定することによって、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定しうるように、ポリヌクレオチド検体の異なるヌクレオチドを、１種または複数の異なる種類のアクセプターを用いて標識する。別の実施形態では、測定される検体は、ドナーで標識されたポリマーであり、特にドナーで標識されたヌクレオチドである。ポリヌクレオチドの配列は、ナノポアを通ってトランスロケーションした時に混合ＦＲＥＴシグナルを測定することによって、決定される。さらに別の実施形態では、ポリヌクレオチド検体の４種のヌクレオチドのうち少なくとも１種が、ＦＲＥＴ対のメンバーで標識されている。ポリヌクレオチド中の標識されたヌクレオチドの位置は、標識されたポリヌクレオチドを、標識されたナノポアを通ってトランスロケーションさせて、ＦＲＥＴ事象を測定することによって、決定される。同じポリヌクレオチド試料の残りのヌクレオチドを標識し、続いて前記試料を、標識されたナノポアを通ってトランスロケーションさせることによって、ポリヌクレオチドの部分配列を生成する。そのような部分配列は、再度整列させることができ、その結果ポリヌクレオチドの全長配列を生じる。
【００１５】
上記の態様および実施形態のいくつかを、図１Ａに図説する。ポリヌクレオチドなどのポリマー検体（１０００）は、そのモノマーユニットが、ポリマーの一次配列と同じ順番でナノポアを通ってトランスロケーションするように、例えば電気泳動によって、ナノポア（１００２）を通って駆動され、このナノポアは、ポリマー（１０００）のコンフォメーションを拘束する。さらに、上記にふれたように、アクセプターで標識されたモノマーユニットが、ナノポア（１００２）の孔内にある場合は常に、当該アクセプターとそのＦＲＥＴ対のドナー（例えば１０１２）とのＦＲＥＴ相互作用は抑制される。そのような抑制は、典型的には、アクセプターおよびドナーの双極子が好ましくない方向に位置づけられているために、当該アクセプターがドナーのＦＲＥＴ距離内にある場合でさえ、検出可能なＦＲＥＴシグナルが産生されないということを意味する。一方で、アクセプターで標識されたモノマーユニットが、ナノポアの孔からＦＲＥＴゾーン（１００８）の中へ現れるや、直ちに強力なＦＲＥＴシグナルが産生するが［ドナー（１０１２）が近接するため］、その後に、ポリマー（１０００）がトランスロケーションすることによって、ＦＲＥＴゾーン（１００８）からアクセプターが運び出されるため、そのシグナルは、アクセプターとドナーとの距離が増すにつれて、速やかに減少する。ＦＲＥＴゾーン（１００８）は、ナノポア（１００２）の出口（１０１５）に直に隣接した空間領域であり、ナノポア（１００２）を通っておよび離れてトランスロケーションする際の、ドナー（１０１２）と、ポリマー（１０００）に付着しているアクセプター標識とのＦＲＥＴ距離によって画定される。図１Ａには、中黒の丸（１００４）として図示された１種のモノマーユニットのみが標識されており、斑入りの丸（１００６）として図示された残りのモノマーユニットは標識されていない。図示されているように、標識された３つのモノマーユニット（「１」、「２」および「３」と表示）は、ＦＲＥＴゾーン（１００８）にある。ドナー（１０１２）が、励起ビーム（１０１４）によって励起されると、ＦＲＥＴ相互作用（１０１０）が生成し、３つのモノマーユニット上のアクセプターはＦＲＥＴ発光（１０１６）を産生し、その発光は、検出器（１０１８）によって収集されて混合ＦＲＥＴシグナル強度（１０２９）として記録される。モノマーユニット１、２および３上のアクセプター由来のシグナル強度の寄与は、曲線（それぞれ１０３１、１０３２および１０３３）によって図示されており、それらは検出器（１０１８）によって組み合わされて、破線の曲線（１０２２）によって示される混合ＦＲＥＴシグナルを与える。以降に記載する実施例では、図１Ａに相当する実施形態は、シトシンのみが標識されている配列（１０８２）３’−ＡＡＣＧＧＣＣＣＴＴＣＧＡＴＣＴＣＡＴＴＧＡＧＧＡＴＧＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＣＡＡＡＧＧＡＡＧＡ−ＡＣＧＡＧＧＡＴＧＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＧＡＧＡＧＣＡＡＡＧＧＡＡＧＡＡＣＧＡＧＧＡＴＧＡＧＡＧＧ−ＡＧＡＧＴＧＡＧＡＧＣＡＡＡＧＧＡＡＧＡＡ−５’（配列番号１）について、図１Ｂに示されるデータを生じた。図１Ｂでは、標識されたＣの相対的な位置のみが示されており、その結果、データ中の当該位置とピークとの対応を理解することができる。強度のあるピークは、星印によって、（１０８０）にあるもののように示されている。データは、配列（１０８２）の３’側が最初になった配向でのトランスロケーションについて、相対的な混合ＦＲＥＴシグナルの強度に対する時間をプロットしたものである。
【００１６】
例えば、頻度、強度、波長などの種々の特徴を有するシグナルが、種々の種類のモノマーユニットについて生成し、それによって、種々の種類のモノマーユニットを区別することが可能になるように、種々のアクセプター標識が、種々の種類のモノマーユニットに付着している実施形態が提供される。そのような一実施形態では、少なくとも２種の異なるアクセプター標識が使用されて、標的ポリヌクレオチドの異なるヌクレオチドが標識される。そのような実施形態の１つの装置を、図１Ｃに図示する。ポリヌクレオチド（１０７０）は、第１のアクセプターで標識されたシトシン（またはシチジンもしくはデオキシシチジン）（中黒の丸、１０６４）、第２のアクセプターで標識されたチミジンまたはチミン（斜交平行の丸、１０６６）、ならびに標識されていないグアニンおよびアデニン（斑入りの丸、１０６８）を含む。上述のように、ポリヌクレオチド（１０７０）がナノポア（１００２）を通ってトランスロケーションするときに、ヌクレオチドがＦＲＥＴゾーン（１００８）内に出るが、その場で、アクセプター（もし存在すれば）がＦＲＥＴ反応に関与して、ＦＲＥＴ発光（１０６２）を生成する。そのような発光は、利用している異なるアクセプター標識の異なるシグナルの特徴、例えば、二色性ミラーおよび／またはフィルターによって分離することができる波長などに従い、ＦＲＥＴ発光（１０６２）を分離するための既存の光学的な構成成分である検出器（１０６０）によって収集される。その結果、最初に収集した混合ＦＲＥＴシグナルは、異なるアクセプター由来の混合ＦＲＥＴシグナルを表す２種またはそれ超のシグナルに分割されるが、これらは、既存の構成成分（１０７２）によってさらに処理されてもよい。また、以降の実施例にてさらに充実して記載されているのは、図１Ｃに対応する実施形態であり、シトシン（またはシチジンもしくはデオキシシチジン）およびチミジンまたはチミンのみが標識されている配列（１０９２）５’−ＧＣＴＡＴＧＴＧＧＣＧＣＧＧＴＡＴＴＡＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＣＴＧＡＧＡＧＧＡＧＡＧＡＡＧＧＡＧＣＡＡＧＡＡＧＧＡＡＡＴＧＡＧＡＧＣＧＡＧＡＧＧＡＧＡＡＧＡＡＧＧＡＧＧＡＡＧＡＡＧ−３’（配列番号２）について、図１Ｄに示されるデータを生じた。Ｔに付着している第１のアクセプター由来のシグナルが、破線（１０９５）によって示され、Ｃに付着している第１のアクセプター由来のシグナルが、実線（１０９６）によって示されている。図１Ｄでは、標識されたＴおよびＣの位置が、太字（それぞれ１０５１、１０５２、１０５３、１０５４、１０５５および１０５６）として示されている。標識されたＴおよびＣに対応するプロット中の強度のピークは、同じ参照番号によって示されている。データは、配列（１０７０）の３’側が最初になった配向でのトランスロケーションについて、相対的な混合ＦＲＥＴシグナルの強度に対して時間をプロットしたものである。
【００１７】
上記にふれたように、一態様では、方法は、（ａ）例えば一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドのヌクレオチドが、ナノポアに隣接して位置づけられるＦＲＥＴ対の第１のメンバーの傍を順番に通過するように、ポリヌクレオチドを、ナノポアを通ってトランスロケーションさせるステップであって、該ヌクレオチドが該ナノポアを出るときに、複数の該ヌクレオチドが、該ＦＲＥＴ対の該第１のメンバーのＦＲＥＴ距離内にあり、かつヌクレオチドの一部分が、該ＦＲＥＴ対の第２のメンバーで標識されている、ステップと、（ｂ）該ＦＲＥＴ距離内にある該ＦＲＥＴ対の該第１のメンバーと複数の第２のメンバーとの間でＦＲＥＴが発生して、混合ＦＲＥＴシグナルを生成するように、該ナノポアに隣接する該ＦＲＥＴ対を光線に曝露するステップと、（ｃ）該ポリヌクレオチドが該ナノポアを通ってトランスロケーションするときに、混合ＦＲＥＴシグナルを測定するステップと、（ｄ）該混合ＦＲＥＴシグナルから該ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するステップとによって実行されてもよい。一部の実施形態では、ナノポアは、以降にさらに充実して記載されているように、固相膜のポアの内部へ挿入されたタンパク質ナノポアを含む、ハイブリッドナノポアである。ハイブリッドナノポアでは、ＦＲＥＴ対の第１のメンバーは、「クリック」化学などの、例えばＫｏｌｂら、Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．、４巻：２００４〜２０２１頁、２００１年などにあるような既存の連結化学を使用して、タンパク質ナノポアに直接的に付着されているか、あるいは、固相膜に直接的に付着されている。一実施形態では、ＦＲＥＴ対の第１のメンバーは、例えば図２Ｄを参照して議論されているように、直接的または間接的にタンパク質ナノポアに付着されている。別の実施形態ではＦＲＥＴ対の第１のメンバーは、量子ドットなどのドナーである。量子ドットは、典型的には、アクセプター、特に有機色素であるアクセプターよりもはるかに大きく、そのような有機色素は、典型的には、２００から２０００ダルトンの範囲の分子量を有する。それゆえ、ＦＲＥＴを量子ドットドナーと複数標識されたポリマー検体との間で発生させるために、複数のアクセプターが同時に、量子ドットのＦＲＥＴ距離内へ持ち込まれる。そのような状況下では、複数のＦＲＥＴシグナルが、当該シグナルが収集される間にわたる同じ時間内に生成し、それによって混合ＦＲＥＴシグナルが生じる。
【００１８】
ナノポアおよびナノポア配列決定
本明細書に記載の様々な方法、システムおよびデバイスを使用したナノポアは、固体状態のナノポア、タンパク質ナノポア、または固体状態の膜もしくは類似のフレームワークに構成されたタンパク質ナノポアを含むハイブリッドナノポアである。ナノポアの重要な特長は、（ｉ）検体、特にポリマー検体を、順番に検出ゾーンを通って通過するように拘束する点、（ｉｉ）トランスロケーション手段との適合性、すなわち、ナノポアを通って検体を駆動するためのどんな方法も使用される点、および（ｉｉｉ）ナノポアの管腔または孔内で、ＦＲＥＴ対のメンバーに対しＦＲＥＴを抑制する点である。
【００１９】
ナノポアは、以下に限定されないが、窒化ケイ素（Ｓｉ３Ｎ４）、二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）などを含めた種々の材料で作製されうる。ＤＮＡ配列決定などの分析用の適用のためのナノポアの作製および操作は、参照により組み入れられている以下の例示的な参考文献：Ｒｕｓｓｅｌｌ、米国特許第６，５２８，２５８号、Ｆｅｉｅｒ、米国特許第４，１６１，６９０号、Ｌｉｎｇ、米国特許第７，６７８，５６２号、Ｈｕら、米国特許第７，３９７，２３２号、Ｇｏｌｏｖｃｈｅｎｋｏら、米国特許第６，４６４，８４２号、Ｃｈｕら、米国特許第５，７９８，０４２号、Ｓａｕｅｒら、米国特許第７，００１，７９２号、Ｓｕら、米国特許第７，７４４，８１６号、Ｃｈｕｒｃｈら、米国特許第５，７９５，７８２号、Ｂａｙｌｅｙら、米国特許第６，４２６，２３１号、Ａｋｅｓｏｎら、米国特許第７，１８９，５０３号、Ｂａｙｌｅｙら、米国特許第６，９１６，６６５号、Ａｋｅｓｏｎら、米国特許第６，２６７，８７２号、Ｍｅｌｌｅｒら、米国特許出願公開第２００９／００２９４７７号、Ｈｏｗｏｒｋａら、国際特許出願公開ＷＯ２００９／００７７４３、Ｂｒｏｗｎら、国際特許出願公開ＷＯ２０１１／０６７５５９、Ｍｅｌｌｅｒら、国際特許出願公開ＷＯ２００９／０２０６８２、Ｐｏｌｏｎｓｋｙら、国際特許出願公開ＷＯ２００８／０９２７６０、Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｚａａｇら、国際特許出願公開ＷＯ２０１０／００７５３７、Ｙａｎら、Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、５巻（６号）：１１２９〜１１３４頁、２００５年、Ｉｑｂａｌら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２巻：２４３〜２４８頁、２００７年、Ｗａｎｕｎｕら、Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、７巻（６号）：１５８０〜１５８５頁、２００７年、Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２巻：２０９〜２１５頁、２００７年、Ｓｔｏｒｍら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、２巻：５３７〜５４０頁、２００３年、Ｗｕら、  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、２９巻（１３号）：２７５４〜２７５９頁、２００８年、Ｎａｋａｎｅら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、２３巻：２５９２〜２６０１頁、２００２年、Ｚｈｅら、Ｊ．  Ｍｉｃｒｏｍｅｃｈ．  Ｍｉｃｒｏｅｎｇ．、１７巻：３０４〜３１３頁、２００７年、Ｈｅｎｒｉｑｕｅｚら、Ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｔ、１２９巻：４７８〜４８２頁、２００４年、Ｊａｇｔｉａｎｉら、Ｊ．  Ｍｉｃｒｏｍｅｃｈ．
Ｍｉｃｒｏｅｎｇ．、１６巻：１５３０〜１５３９頁、２００６年、Ｎａｋａｎｅら、Ｊ．  Ｐｈｙｓ．  Ｃｏｎｄｅｎｓ．  Ｍａｔｔｅｒ、１５巻、Ｒ１３６５〜Ｒ１３９３、２００３年、ＤｅＢｌｏｉｓら、Ｒｅｖ．  Ｓｃｉ．  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、４１巻（７号）：９０９〜９１６頁、１９７０年、Ｃｌａｒｋｅ  ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、４巻（４号）：２６５〜２７０頁、２００９年、Ｂａｙｌｅｙら、米国特許出願公開第２００３／０２１５８８１号などに開示されている。簡潔に述べると、一態様では、担体、通常は膜を通って、１〜５０ｎｍのチャネルを形成し、それを通ってトランスロケーションするよう、ＤＮＡなどの検体を誘導する。ナノポアを生成する固体状態のアプローチは、堅牢性および耐久性、ならびに、ナノポアのサイズおよび形状を調整する能力、ウエハスケールにナノポアの高密度なアレイを作製する能力、脂質ベースの系に比べて優れた機械的、化学的および熱的な特徴、ならびに電気的または光学的読み取り技法に組み込まれる可能性をもたらす。一方、生物学的なナノポアは、再現性のある狭い孔または管腔を、特に１〜１０ナノメートルの範囲で提供し、また、既存のタンパク質工学の方法によって、ナノポアの物理的および／または化学的特性を調整するための、およびＦＲＥＴドナーやアクセプターなどの基または構成要素を直接的にまたは間接的に付着するための技法を提供する。タンパク質ナノポアは、典型的には、機械的支持について精巧な脂質二重層に頼っており、精密な寸法を有する固体状態のナノポアの作製は、依然として難題である。固体状態のナノポアを生物学的なナノポアと組み合わせることによって、これらの欠点のいくつかは克服される（特に、生物学的なポアタンパク質の精度と固体状態のナノポアの安定性）。光学的な読み取り技法のために、ハイブリッドナノポアは、データ取得を大幅に簡便にする、正確なナノポアの場所を提供する。脂質二重層に挿入されたナノポアタンパク質の横方向の拡散によって、光学検出は難題となる。ハイブリッドナノポアの生物学的な部分は、脂質二重層内の挿入に頼っていないことから、そのようなタンパク質に為される改変の自由度は大幅に増加する。例えば、脂質二重層に自発的に挿入されない、遺伝子工学的に改変されたナノポアタンパク質を、ハイブリッドナノポアのタンパク質構成成分として未だに使用してもよい。量子ドットなどの二重層不安定化剤を、ハイブリッドナノポアのタンパク質構成成分を標識するために使用してもよい。
【００２０】
一実施形態では、１種または複数のポリヌクレオチド検体などの検体を検出するためのデバイスまたはシステムは、以下の要素：（ａ）第１のチャンバーと第２のチャンバーとを隔てており、孔を通って該第１のチャンバーと該第２のチャンバーとを接続する少なくとも１つの開口部を有する、固相膜と、（ｂ）蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対の複数の第２のメンバーが付着されている１つまたは複数の検体が該孔を横切るときはいつでも、複数の第２のメンバーが、該ＦＲＥＴ対の第１のメンバーのＦＲＥＴ距離内を順番に通過するよう拘束されるように、少なくとも１つの開口部に付着された、ＦＲＥＴ対の第１のメンバーとを含む。一部の実施形態では、固相膜は、低いエネルギーのイオンビームを用いて処理され、自家蛍光をブリーチされる。
【００２１】
別の実施形態では、連結された複数のモノマーユニット、例えばヌクレオチドなどを有する複数の検体またはポリマー検体を検出するための、デバイスまたはシステムを提供する。ポリヌクレオチドの配列を決定するためのそのような実施形態は、以下の要素：（ａ）第１のチャンバーと第２のチャンバーとを隔てており、該第１のチャンバーおよび該第２のチャンバーを接続する少なくとも１つの開口部を有し、少なくとも１つの表面に疎水性被覆を有する、固相膜と、（ｂ）該疎水性被覆上に配置してもよい脂質層と、（ｃ）開口部に固定化されており、出口のある孔を有し、該第１のチャンバーと該第２のチャンバーとの間の流体連通が、該タンパク質ナノポアの孔を介してのみ発生するように、脂質二重層と相互作用して、開口部の固相膜によってシールを形成しており、ポリヌクレオチドのヌクレオチドが順番に該孔の該出口を通って通過するように、かつ該ポリヌクレオチドのヌクレオチドがＦＲＥＴ対の第２のメンバーで標識されるときはいつでも、該孔の内部の当該第２のメンバーと該孔の外部の該ＦＲＥＴ対の第１のメンバーとの間でＦＲＥＴが抑制されるように、特定の寸法に作られている、タンパク質ナノポアと、（ｄ）該ポリヌクレオチドのヌクレオチドが孔から現れるときはいつでも、複数の該ヌクレオチドが該ＦＲＥＴ対の該第１のメンバーのＦＲＥＴ距離内にあるように、固相膜またはタンパク質ナノポアに付着された、ＦＲＥＴ対の第１のメンバーとのうち、１種または複数を含んでいてもよい。
【００２２】
一部の実施形態では、脂質層が安定的に接着するように固相膜の表面がそれ自体で十分に疎水性である点において、疎水性被覆は任意のものである。少なくとも１つの開口部は、固相膜の表面に接続または隣接している内部表面もしくは壁を有することになる。一部の実施形態では、少なくとも１つの開口部は、複数の開口部となることになり、その複数の開口部は、開口部の直線的なアレイなどの規則的なアレイとして配置され、その間隔は、利用されるＦＲＥＴ対の数および種類、ならびに使用される光学検出系に一部依存する。それぞれの開口部はある直径を有し、そのため、一部の実施形態では、その中にタンパク質ナノポアが実質的に固定化されている。一部の実施形態では、実質的に固定化されているとは、タンパク質ナノポアが、開口部の壁に対して固相膜の平面において５ｎｍを超えて動かない場合があることを意味する。別の実施形態では、実質的に固定化されているとは、タンパク質ナノポアが、開口部の壁に対して固相膜の平面において５ｎｍを超えて動かない場合があることを意味する。タンパク質ナノポアのそれぞれは、孔または通路または管腔を有し、タンパク質ナノポアを開口部に固定化する場合に、第１のチャンバーと第２のチャンバーとの間の流体連通を可能とする。一般に、孔は、開口部と同軸方向に整列される。疎水性層の１つの機能は、少なくとも１つの開口部の中および／または直接隣接して、脂質を保持するための表面を提供することである。そのような脂質は、次いで、機能的なコンフォメーションで、かつ開口部壁を用いて流体シールを形成する様式で、開口部内のタンパク質ナノポアを配置し固定化することを可能にする。一部の実施例では、そのようなシールはまた、タンパク質ナノポアの周囲の第１のチャンバーと第２のチャンバーの間に電流が通過するのを防止する。一部の実施形態では、荷電している検体は、第１のチャンバー内の電解質溶液中に配置されて、固相膜を横切って電場を設けることによって、タンパク質ナノポア（複数可）の孔（複数可）を通り、第２のチャンバー内の電解質溶液内にトランスロケーションする。製造の利便性のために、一部の実施形態では、疎水性被覆は、固相膜の一表面上および開口部（複数可）の壁（複数可）にあるものとなる。
【００２３】
一部の実施形態では、固相膜は、以降にさらに充実して記載されているように、低いエネルギーのイオンビームを用いて処理され、自家蛍光をブリーチされる。
【００２４】
図２Ａ〜２Ｃは、ハイブリッドバイオセンサーの略図である。２つのチャンバーまたは区画をシス（１０１）およびトランス（１０７）で隔てる固体状態の担体または固相膜（１０３）に、ナノメートルサイズの穴（１０２）を穿つ。一本鎖または二本鎖ＤＮＡなどの荷電しているポリマー（１０５）に付着されたタンパク質バイオセンサー（例えばタンパク質ナノポア）（１０４）を、電気泳動による輸送によって、固体状態のナノ穴に包埋した。図１Ｃでは、タンパク質バイオセンサーは挿入されている。ナノメートルサイズの穴では、その表面は疎水性被覆（１０６）を有し、付着された脂質層（１０９）を有してもよい。ナノポアは２つの側面またはオリフィスを有していてもよい。一方の側は、「シス」側と呼ばれ、（−）負電極または負に荷電した緩衝液／イオンの区画もしくは溶液に面している。他方の側は、「トランス」側と呼ばれ、（＋）電極または正に荷電した緩衝液／イオンの区画もしくは溶液に面している。標識された核酸分子やポリマーなどの生物学的なポリマーは、ナノポアを通って印加された電場によって、ポアを通して引き込み、駆動させることができ、例えば、ナノポアのシス側で入れて、ナノポアのトランス側で出すことができる。
【００２５】
図２Ｄは、固体状態の膜（１０３）に穿たれた開口部の中へ挿入されたタンパク質ナノポア（１０４）を示す。タンパク質ナノポア（１０４）に付着されているのは、オリゴヌクレオチド（１０８）であり、そのオリゴヌクレオチドに、相補的な二次オリゴヌクレオチド（１１１）がハイブリダイズしている。前記二次オリゴヌクレオチド（１１１）は、それに付着されたＦＲＥＴ対（１１０）の１つまたは複数の第１または第２のメンバーを有する。あるいは、ＦＲＥＴ対のメンバーは、タンパク質ナノポアのアミノ酸に直接的に付着されていてもよい。例えば、ヘモリシンのサブユニットを、既存の遺伝子工学的な技法によって改変し、ナノポアの出口に隣接して適当に位置するアミノ酸、例えばスレオニン１２９をシステインにより置換してもよい。例えばＨｅｒｍａｎｓｏｎ（上記に引用）などの既存の連結化学を使用して、ＦＲＥＴ対のオリゴヌクレオチドまたはメンバーが、システインのチオ基を介して付着されてもよい。
【００２６】
一部の実施形態では、ハイブリッドナノポアを、特にポリヌクレオチドの光学ベースのナノポア配列決定のために利用する。そのような実施形態は、固体状態のオリフィスまたは開口部を含み、それに、タンパク質ナノポアなどのタンパク質バイオセンサーが安定的に挿入されている。タンパク質ナノポア（例えばアルファヘモリシン）は、荷電しているポリマー（例えば二本鎖ＤＮＡ）に付着されていてもよく、このポリマーは、印加された電場中で抵抗力の役割を果たし、タンパク質ナノポアを固体状態の膜の開口部内へ導くために使用されうる。一部の実施形態では、固体状態の担体の開口部は、タンパク質よりも僅かに小さいように選択され、それによって、タンパク質が開口部を通ってトランスロケーションするのを防止する。代わりに、タンパク質は、固体状態のオリフィス内へ包埋されることになる。固体状態の担体を改変して、差し込み型タンパク質バイオセンサーの共有結合付着を可能にする活性部位を表面に生成することができ、その結果、安定なハイブリッドバイオセンサーがもたらされる。
【００２７】
バイオセンサー中のポリマー付着部位は、タンパク質工学によって生成させることができ、例えば、ポリマーの特異的な結合を可能にする変異体タンパク質を構築することができる。一例として、システイン残基を、タンパク質の所望の位置に挿入してもよい。システインは、天然に存在するアミノ酸を置き換えるか、追加的なアミノ酸として組み入れることができる。タンパク質の生物学的機能を破綻させないように、注意を払わねばならない。ポリマー（すなわちＤＮＡ）の末端の第１級アミン基を、次いで、ヘテロ二官能性架橋剤（例えばＳＭＣＣ）を使用して活性化させる。続いて、活性化ポリマーを、タンパク質バイオセンサーのシステイン残基に共有結合で付着させる。一部の実施形態では、バイオセンサーへのポリマーの付着は可逆的である。切断可能な架橋を実行することによって、壊れ易い化学結合（例えばＳ−Ｓ結合）を導入して、固体状態の開口部内へバイオセンサーを挿入した後に、荷電しているポリマーを除去してもよい。
【００２８】
当業者にとって、荷電しているポリマーをタンパク質バイオセンサーに共有結合で付着または非共有結合で付着させる方法に用いる多岐にわたる異なるアプローチは、考えうることであり、上記のアプローチが一例としての役割を果たすに過ぎないことは、明らかである。また、当業者は、種々の異なるポリマーを抵抗力として使用することができ、そのようなポリマーとして、以下に限定されないが、一本鎖または二本鎖ＤＮＡ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリ−Ｌ−リジン、線状多糖などが挙げられることを理解することになる。これらのポリマーは、所与のｐＨで負電荷（−）または正電荷（＋）のどちらかを示し、そのため、ポリマー−バイオセンサー複合体を固体状態の開口部の中へ引き込むように、電場の極性が調整される場合があることもまた明らかである。
【００２９】
一部の実施形態では、ドナーフルオロフォアは、タンパク質ナノポアに付着されている。この複合体は、次いで、固体状態のナノ穴を横切って電場を印加することによって、固体状態の開口部またはナノ穴（直径３〜１０ｍｍ）の中へ挿入されてゆき、やがてタンパク質ナノポアは、固体状態のナノ穴の中へ輸送されて、ハイブリッドナノポアを形成する。ハイブリッドナノポアの形成は、（ａ）固体状態のナノ穴の部分的な遮蔽に基づいて、挿入されたタンパク質ナノポアが電流の急落を生じることによって、および（ｂ）ドナーフルオロフォアを光学検出することによって、検証することができる。
【００３０】
安定なハイブリッドナノポアが一本鎖を形成したら、蛍光標識された（またはアクセプターで標識された）ＤＮＡをシスチャンバー［（＋）電極を備えたチャンバー］に添加してもよい。印加された電場は、負に荷電したｓｓＤＮＡを、ハイブリッドナノポアを通してトランスロケーションさせるが、その間に、標識されたヌクレオチドは、ドナーフルオロフォアのすぐ傍に到達する。ある特定のバリエーションでは、二本鎖ＤＮＡを利用してもよい。
【００３１】
固体状態のまたは合成のナノポアは、上記に引用した参考文献に例示されるように、種々の手法で調製されうる。一部の実施形態では、ヘリウムイオン顕微鏡を使用して、例えば参照により本明細書に組み入れられているＹａｎｇら、Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｇｙ、２２巻：２８５３１０頁、２０１１年に開示されているように、種々の材料中の合成ナノポアに穿孔してもよい。自立膜となるように加工された薄膜材料、例えば窒化ケイ素などの１つまたは複数の領域を支持するチップを、ヘリウムイオン顕微鏡（ＨＩＭ）のチャンバーに導入する。ＨＩＭモータ制御を使用して、自立膜をイオンビームの経路内に持ち込み、一方で顕微鏡を低倍率に設定する。焦点および非点補正（ｓｔｉｇｍａｔｉｏｎ）を含めたビームパラメータを、自立膜に隣接する領域に、しかし固体担体上に調整する。パラメータを適正に固定したら、自立膜領域がイオンビームスキャン領域の中心になるようにチップの位置を動かし、ビームをブランクとする。予測されるナノポアパターン全体を含むのに十分であり、のちの光学読み取りに有用となる（すなわち光学倍率、カメラの解像度などに依存する）のに十分な寸法（μｍ単位）に、ＨＩＭ視野を設定する。次いで、全視野を通してピクセル滞留時間でイオンビームを１回ラスタさせて、その結果、膜の自家蛍光の全てまたは多くを除去するのに十分な総イオン線量を得る。次いで、視野を適正値（上記で使用されるよりも小さい）に設定して、単一のナノポアまたはナノポアアレイのどちらかに対して、リソグラフィで画定されたフライス削りを行う。パターンのピクセル滞留時間を設定して、１種または複数の所定の直径のナノポアを得るが、当該径は、試料加工前に較正試料を使用して決定する。この全工程を、単一のチップ上の所望の各領域について、および／またはＨＩＭチャンバー内に導入された各チップについて繰り返す。
【００３２】
一部の実施形態では、固体状態の担体を修飾して、差し込み型タンパク質バイオセンサーの共有結合性付着を可能にする活性部位を、その表面に生成してもよく、また、所与の適用のためにより適するものとする方法で、その表面の特性を改変してもよい。そのような修飾は、共有結合性のものであっても非共有結合性のものであってもよい。共有結合的な表面の修飾には、有機シラン化合物が固体表面のシラノール基に結合する、シリル化（ｓｉｌａｎｉｚａｔｉｏｎ）ステップが含まれる。例えば、アルコキシシランのアルコキシ基を加水分解して、シラノール含有種を形成する。これらのシランの反応は、４つのステップを含む。最初に、不安定基の加水分解が起こる。オリゴマーの縮合がそれに続く。次いで、オリゴマーは、基質の水酸基との水素結合。最後に、乾燥および硬化の間に、担体との共有結合が、同時の脱水を伴って形成される。共有結合で付着させるために、活性側基を持った有機シランを利用してもよい。そのような側基は、以下に限定されないが、いくつか挙げるならば、エポキシ側鎖、アルデヒド、イソシアネート、イソチオシアネート、アジドまたはアルキン（クリック化学）からなる。当業者にとっては、表面にタンパク質を共有結合で付着する複数の手法をとりうることは自明である。例えば、有機シラン上のある特定の側基は、タンパク質が結合することができる前に活性化させる必要がある場合がある（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを用いて活性化された第１級アミンまたはカルボキシル側基）。固体表面にタンパク質を付着する別の手法は、そのタンパク質に付着されているある親和性パートナーと、固体表面に位置している第２の親和性パートナーとを具えることによって、親和性結合を介して達成される。そのような親和性対は、以下に限定されないが、ビオチン−ストレプトアビジン、抗原−抗体ならびにアプタマーおよびその対応する標的分子の群からなる。
【００３３】
一実施形態では、固体状態のナノポアの表面修飾は、該表面を疎水性にする有機シランを用いた処理を含む。そのような有機シランとしては、以下に限定されないが、アルカンシラン（例えばオクタデシルジメチルクロロシラン）、または５個から３０個の炭素のアルカン鎖長を有するフッ化アルカンシランなどの修飾アルカンシランが挙げられる。疎水性表面を、次いで脂質のペンタン中希釈溶液を用いて処理してもよい。溶媒を乾燥して、水溶液中に表面を浸漬した後、脂質は、表面上に自発的に層を形成することになる。固体表面上の脂質の層は、ハイブリッドナノポアの形成のために有効であることが判明する場合がある。固相上の脂質層は、タンパク質と固体状態のナノポアとの間の漏れ電流を低減する場合があり、挿入されたタンパク質ポアの安定性を高める場合がある。低い静電容量の固体担体ならびに前記担体の脂質被覆の組合せによって、ハイブリッドナノポアを通してＤＮＡをトランスロケーションさせることにより生成される電流の変動に基づく電気的な読み取りに、ハイブリッドナノポアシステムが適応されうる。そのようなシステムを用いて電気的な読み取りを達成するために、非修飾ＤＮＡのトランスロケーション速度を低下させる手段を、脂質で被覆されたハイブリッドナノポアと組み合わせなければならない。ポリメラーゼやヘリカーゼなどの分子モータは、ハイブリッドナノポアと組み合わせてもよく、ＤＮＡがハイブリッドナノポアを通るトランスロケーション速度を効率良く低減しうる。表面を被覆するために使用する脂質は、スフィンゴ脂質類、リン脂質類またはステロール類からなる群に由来していてもよい。
【００３４】
生物学的なポリマーまたは分子（例えば、核酸）を配列決定するための方法および／またはシステムは、ポアまたはナノポアに付着している１種または複数種のドナー標識を励起させるステップを含んでよい。生物学的なポリマーを、ポアまたはナノポアを通してトランスロケーションさせることができ、ここで、生物学的なポリマーのモノマーは１種または複数種のアクセプター標識で標識されている。標識されたモノマーが、ポアまたはナノポアを通過する、それから出る、またはそれに入るときに、その後に、モノマーの励起したドナー標識からアクセプター標識にエネルギーが転移し得る。エネルギー転移の結果としてアクセプター標識により放出されたエネルギーは、アクセプター標識により放出されたエネルギーが生物学的なポリマーの単一のまたは特定のモノマー（例えば、ヌクレオチド）に対応し得る、またはそれに関連づけられ得る場合に検出することができる。次に、生物学的なポリマーの配列について、標識されたモノマーを同定することを可能にするモノマーのアクセプター標識により放出されたエネルギーを検出することに基づいて推定または配列決定することができる。ポア、ナノポア、チャネルまたは通路、例えば、イオン浸透性のポア、ナノポア、チャネルまたは通路を、本明細書に記載のシステムおよび方法において利用することができる。
【００３５】
ナノポアは、１種または複数の標識が付着されていてもよい。一部の実施形態では、標識は、フェルスター共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）対のメンバーである。そのような標識は、有機フルオロフォア、化学発光標識、量子ドット、金属ナノ粒子および蛍光タンパク質を含みうる。核酸は、ヌクレオチド当たり別個に１個の標識を持ちうる。ヌクレオチドに付着されている標識は、有機フルオロフォア、化学発光標識、量子ドット、金属ナノ粒子および蛍光タンパク質の群からなる。ポアタンパク質の標識付着部位は、タンパク質工学によって生成され、例えば、標識の特異的な結合を可能にする変異体タンパク質を構築することができる。一例として、システイン残基を、タンパク質の所望の位置に挿入してもよく、当該位置は、標識を付着するために使用されうるチオール（ＳＨ）基を挿入する。システインを、天然に存在するアミノ酸に置き換えるか、追加的なアミノ酸として組み入れることができる。タンパク質の生物学的機能を破綻させないように、注意を払わねばならない。マレイミドによって活性化された標識を、次いでタンパク質ナノポアのチオール残基に共有結合で付着させる。一実施形態では、タンパク質ナノポアへの標識の付着、または核酸上の標識の付着は、可逆的である。切断可能な架橋を実行することによって、壊れ易い化学結合（例えばＳ−Ｓ結合またはｐＨに不安定な結合）を導入して、対応する条件に見合う場合に、標識を除去してもよい。
【００３６】
ナノポアまたはポアは、１種または複数種のドナー標識で標識することができる。例えば、ナノポアのシス側もしくは表面および／またはトランス側もしくは表面を１種または複数種のドナー標識で標識することができる。標識は、ポアまたはナノポアの基部に、またはナノポアもしくはポアを成している別の部分またはモノマーに付着させることができる。標識は、ナノポアがその全体にわたっている膜もしくは担体の一部に、または膜、担体もしくはナノポアに付着しているリンカーもしくは他の分子に付着させることができる。ナノポアまたはポア標識は、ポア標識が、ポアを通してトランスロケーションする生物学的なポリマー、例えば核酸のアクセプター標識の近傍にくることが可能なように、ナノポア、担体または膜の上に位置づける、またはそれに付着させることができる。ドナー標識は、同じまたは異なる放出スペクトルまたは吸収スペクトルを有してよい。ポア構造の標識化は、共有結合または非共有結合による相互作用を介して達成される。
【００３７】
ドナー標識は、核酸がナノポアを通してトランスロケーションすることを害する閉塞を引き起こすことなく、ナノポアの開口部のできるだけ近くに置くことができる。ポア標識は、種々の適切な性質および／または特性を有してよい。例えば、ポア標識は、特定の要件に適う、エネルギーを吸収する性質を有してよい。ポア標識は、例えば約０〜１０００ｎｍまたは約２００〜５００ｎｍにわたる大きな放射エネルギー吸収断面を有してよい。ポア標識は、核酸標識のエネルギー吸収よりも高い特定のエネルギー範囲内の放射を吸収してよい。２つの標識間でエネルギー転移が起こり得る距離を調節するために、ポア標識の吸収エネルギーを核酸標識の吸収エネルギーに対して調節することができる。ポア標識は、少なくとも１０６回または１０９回の励起およびエネルギー転移サイクルに対して安定かつ機能性であってよい。
【００３８】
自家蛍光を低減するための固相膜の処理
一部の実施形態では、微小電気機械システム（ＭＥＭＳ）材料の固相膜を、低エネルギーのイオンビームを用いて処理して、その自家蛍光をブリーチする。典型的には、そのような処理は、表面または表面の近くでＭＥＭＳ材料の物理的な変化を引き起こして、自家蛍光に寄与する構造を破壊または不活化するのに十分な高いエネルギーで、しかし、融解、蒸発、著しい変形およびスパッタリングが起こるような高いエネルギーを用いずに、ＭＥＭＳ材料の表面領域にイオンビームを向けることによって行われる。必要とされる最小のエネルギーは、ビームエネルギーをゼロから始めて次第に増加させてゆき、ビームエネルギーの増加に伴う自家蛍光の減少を測定することによって、材料ごとで容易に決定されうる。本明細書に使用される場合の「自家蛍光」という用語は、「バックグラウンド蛍光」と同義に使用され、ＭＥＭＳ材料の一部分ではない蛍光標識を励起するために選択された光源を用いて励起されると、ＭＥＭＳ材料の表面またはその近くの供給源から発する蛍光を意味する。そのため、ＭＥＭＳ材料の自家蛍光は、光源の周波数に依存する。一態様では、本方法が、可視光領域の周波数ならびに近赤外線から近紫外線の周波数の自家蛍光を低減するように、有機蛍光色素を励起するべく光源の周波数を選択する。ＭＥＭＳ材料は、微小作製が可能な広範な種類の固体を含み、光学検出を使用した分析技法において使用される。例示的なＭＥＭＳ材料は、窒化ケイ素や二酸化ケイ素などのシリコンベースの担体または酸化アルミニウムなどの金属ベースの担体である。一態様では、ＭＥＭＳ材料は、加工されて膜の形態で使用される。一実施形態では、ＭＥＭＳ材料は窒化ケイ素である。広範な種類の集束イオンビームを、そのようなブリーチに利用してもよく、様々なエネルギーでのそのようなビームの産生および適用についてのガイドラインは、Ｎａｔａｓｉら、Ｉｏｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９６年）などの文献および他の文献に見られる。例示的な集束イオンビームとしては、ヘリウムイオンビーム、ネオンイオンビームおよびガリウムイオンビームが挙げられる。一実施形態では、ヘリウムイオンビームを本方法に使用する。ヘリウムイオンビームは、市販のイオンビーム顕微鏡（ＨＩＭ）（例えばＺｅｉｓｓ  Ｏｒｉｏｎ  Ｎａｎｏｆａｂ）を用いて産生することができる。窒化ケイ素などのＭＥＭＳ材料の表面に送達されるエネルギー量または用量は、自己蛍光を減らすために、２ｅ−１０から８ｅ−１０ｎＣ／ｎｍ２の範囲にあってもよい。
【００３９】
ナノポアおよび検体のための標識
一部の実施形態では、ナノポアを、１種または複数の量子ドットを用いて標識してもよい。具体的には、一部の実施形態では、１種または複数の量子ドットを、ナノポアへ付着するか、隣接する（およびナノポアの入口または出口のＦＲＥＴ距離内の）固相支持体に付着して、検体上のアクセプターとのＦＲＥＴ反応におけるドナーとして利用してもよい。そのような量子ドットの使用は、周知されており、参照により本明細書に組み入れられている米国特許第６，２５２，３０３号、第６，８５５，５５１号、第７，２３５，３６１号などの科学文献および特許文献に広く記載されている。
【００４０】
ポア標識として利用することができる量子ドットの１つの例は、水溶液中で合成することができるＣｄＴｅ量子ドットである。ＣｄＴｅ量子ドットは、第一級アミン、チオールなどの求核基またはカルボン酸などの官能基で機能付与させることができる。ＣｄＴｅ量子ドットは、量子ドットを、タンパク質ポアの外側の第一級アミンに共有結合的に連結させるために利用することができるカルボン酸官能基を有するメルカプトプロピオン酸キャップ形成リガンドを含んでよい。架橋反応は、バイオコンジュゲーション（ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）の当業者に公知の標準の架橋試薬（ホモ二官能性の試薬ならびにヘテロ二官能性の試薬）を使用して達成することができる。修飾により、核酸がナノポアを通してトランスロケーションすることが害されない、または実質的に害されないことを確実にするために気をつけることができる。これは、ドナー標識をナノポアに付着させるために使用する、使用架橋剤分子の長さを変動させることによって達成することができる。
【００４１】
天然のアルファ溶血素タンパク質のリジン残基１３１の第一級アミン（Ｓｏｎｇ、Ｌ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７４巻、（１９９６年）：１８５９〜１８６６頁）を使用して、カルボキシ修飾されたＣｄＴｅ量子ドットを、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩／Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（ＥＤＣ／ＮＨＳ）カップリング化学によって共有結合させることができる。あるいは、アミノ酸１２９（スレオニン）をシステインに交換してもよい。天然のアルファヘモリシンタンパク質には他のシステインがないため、新たに挿入したシステインのチオール側基を、他の化学部分を共有結合で付着するために使用してもよい。
【００４２】
１つまたは複数のポア標識をポアタンパク質に付着させるための種々の方法、機構および／または経路を利用することができる。ポアタンパク質は、公知の性質または種々の官能基を有するアミノ酸が天然のタンパク質配列に導入されるように遺伝子操作することができる。天然に存在するタンパク質配列のそのような修飾は、量子ドットをポアタンパク質にバイオコンジュゲーションするために有利であり得る。例えば、システイン残基を導入することにより、直接的に量子ドットを結合させること、例えば、ＣｄＴｅ量子ドットをポアタンパクに結合させることを可能にし得るチオール基が導入されることになる。同様に、リジン残基を導入することにより、量子ドットを結合させるための第一級アミンが導入されることになる。グルタミン酸またはアスパラギン酸を導入することにより、量子ドットを結合させるためのカルボン酸部分が導入されることになる。これらの基は、ホモ二官能性架橋剤分子またはヘテロ二官能性架橋剤分子のいずれかを使用する、量子ドットとのバイオコンジュゲーションのために受け入れられる。ポリヒスチジンの挿入によって、金属ヒスチジンの配位を介してタンパク質ポアへ量子ドットを直接的に結合することが可能になる。バイオコンジュゲーションのための官能基を導入することを目的とする、ポアタンパク質に対するそのような修飾は、当業者に公知である。修飾により、核酸がナノポアを通してトランスロケーションすることが害されない、または実質的に害されないことを確実にするために注意を払うべきである。
【００４３】
ナノポア標識は、前記ナノポアを脂質二重層に挿入する前、またはその後にタンパク質ナノポアに付着させることができる。脂質二重層に挿入する前に標識を付着させる場合、ナノポアの基部を標識し、ポアタンパク質がランダムに標識されることを回避するために注意を払うことができる。これは、ポアタンパク質を、ポア標識の部位特異的な付着を可能にするように遺伝子操作することによって達成することができる（００４７節を参照されたい）。この手法の利点は、標識されたナノポアの大量生産である。あるいは、予め挿入されたナノポアの標識化反応により、ポアタンパク質を遺伝子操作せずに、標識がナノポアの基部（トランス側）に部位特異的に付着すること確実にすることができる。
【００４４】
生物学的なポリマー、例えば、核酸分子または核酸ポリマーを、１種または複数種のアクセプター標識で標識することができる。核酸分子について、核酸分子の４種のヌクレオチドまたは構成要素のそれぞれを、アクセプター標識で標識し、それによって、それぞれの天然に存在するヌクレオチドに対する標識された（例えば、蛍光）対応物を創出することができる。アクセプター標識は、変換される核酸の一部または鎖全体の１つまたは複数のヌクレオチドに付着させることができるエネルギー受容分子の形態であってよい。
【００４５】
種々の方法を利用して、核酸分子または核酸ポリマーのモノマーまたはヌクレオチドを標識することができる。標識されたヌクレオチドは、元の試料を鋳型として使用する新しい核酸の合成中に核酸に組み入れることができる（「合成による標識化」）。例えば、核酸の標識化は、ＰＣＲ、全ゲノム増幅、ローリングサークル増幅、プライマー伸長などによって、または当業者に公知の上記の方法の種々の組み合わせおよび進展によって達成することができる。
【００４６】
核酸の標識化は、標識を有する修飾されたヌクレオチド類似体の存在下で核酸を複製し、それによりその標識が新しく生成する核酸に組み入れられることによって達成することができる。標識化プロセスは、二次的な標識化ステップにおいてエネルギー受容部分に共有結合的に付着させるために使用することができる官能基を有するヌクレオチド類似体を組み入れることによっても達成することできる。そのような複製は、全ゲノム増幅（Ｚｈａｎｇ、Ｌ．ら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８９巻（１９９２年）：５８４７頁）または鎖置換増幅、例えば、ローリングサークル増幅、ニックトランスレーション、転写、逆転写、プライマー伸長およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、縮重オリゴヌクレオチドプライマーＰＣＲ（ＤＯＰ−ＰＣＲ）（Ｔｅｌｅｎｉｕｓ、Ｈ．ら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、１３巻（１９９２年）：７１８〜７２５頁）など、または上記の方法の組み合わせによって実現することができる。
【００４７】
標識は、求核試薬（アミン、チオールなど）などの反応性基を含んでよい。そこで、そのような天然の核酸には存在しない求核試薬を使用して、例えば、ＮＨＳエステル、マレイミド、エポキシ環、イソシアネートなどのアミンまたはチオール反応性化学によって蛍光標識を付着させることができる。そのような求核試薬反応性蛍光色素（すなわちＮＨＳ色素）は、種々の供給源から容易に購入することができる。核酸を小さな求核試薬で標識することの利点は、「合成による標識化」手法を使用したときに、そのような標識されたヌクレオチドが組み入れられる効率が高いことにある。かさのある蛍光標識された核酸構成要素は、重合プロセスの間の標識の立体障害に起因して、新しく合成されるＤＮＡにポリメラーゼによって組み入れられにくい可能性がある。
【００４８】
ＤＮＡは、標識されたヌクレオチドのポリメラーゼ媒介性組み入れを伴わずに、直接化学修飾することができる。修飾の１つの例としては、グアニン塩基をそれらのＮ７位において修飾するシスプラチン含有色素が挙げられる（Ｈｏｅｖｅｌ、Ｔ．ら、Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２７巻（１９９９年）：１０６４〜１０６７頁）。別の例としては、ピリミジンを、Ｃ６位においてヒドロキシルアミンで修飾して６−ヒドロキシルアミノ誘導体を導くことが挙げられる。生じたアミン基は、アミン反応性色素（例えばＮＨＳ−Ｃｙ５）でさらに修飾することができる。さらに別の例は、ポリメラーゼによって容易に組み入れられるアジド修飾またはアルキン修飾されたヌクレオチドである（Ｇｉｅｒｌｉｃｈら、Ｃｈｅｍ．  Ｅｕｒ．  Ｊ．、２００７年、１３巻、９４８６〜０４０４頁）。アルキン修飾またはアジド修飾されたポリヌクレオチドは、その後、よく確立されたクリック化学のプロトコールに従って、アジド修飾またはアルキン修飾されたフルオロフォアで標識される。
【００４９】
核酸分子は、核酸と反応すると、５−ブロモシステイン、８−ブロモアデニンおよび８−ブロモグアニンをもたらすＮ−ブロモスクシンイミドで直接修飾することができる。修飾されたヌクレオチドは、ジアミン求核試薬とさらに反応し得る。次いで、残りの求核試薬をアミン反応性色素（例えばＮＨＳ色素）と反応させることができる（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ  Ｇ．  ｉｎ  ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ、１９９６年、ＩＳＢＮ９７８−０−１２−３４２３３６−８）。
【００５０】
核酸鎖内の１つ、２つ、３つまたは４つのヌクレオチドの組み合わせを、それらの標識された対応物と交換することができる。標識されたヌクレオチドの種々の組み合わせについて平行して配列決定すること、例えば、供給源の核酸またはＤＮＡを、４つの単一標識された試料に加えて、２つの標識されたヌクレオチドの組み合わせで標識して、合計１０個の異なって標識された試料核酸分子または試料ＤＮＡ（Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃ、ＧＡ、ＧＴ、ＧＣ、ＡＴ、ＡＣ、ＴＣ）をもたらすことができる。生じた配列パターンは、冗長な配列読み取りにおいて重複しているヌクレオチド位置に起因して、より正確な配列アラインメントを可能にし得る。
【００５１】
特定のバリエーションにおいて、ポリマー、例えば核酸分子を配列決定するための方法は、膜または膜様構造または他の担体に挿入されるナノポアまたはポアタンパク質（または合成ポア）を提供するステップを含み得る。ポアの基部または他の部分を、１つまたは複数のポア標識で修飾することができる。基部とは、ポアのトランス側を称し得る。場合によって、ポアのシス側および／またはトランス側を、１つまたは複数のポア標識で修飾することができる。分析または配列決定される核酸ポリマーを、標識されたバージョンの核酸ポリマーを作製するための鋳型として使用することができ、それにより、生じたポリマーの４種のヌクレオチドの１つまたは４種のヌクレオチド全てに至るまでが、ヌクレオチドの標識された類似体（複数可）で置き換えられる。標識された核酸ポリマーをナノポアに通すように強いる電場を印加し、一方外部の単色のまたは他の光源を使用してナノポアを照光し、それによってポア標識を励起させることができる。核酸の標識されたヌクレオチドがナノポアを通過する、それから出る、またはそれに入るときに、その後に、またはその前に、ポア標識からヌクレオチド標識にエネルギーが転移し、それにより、より低いエネルギー放射の放出がもたらされる。次いで、ヌクレオチド標識の放射を共焦点顕微鏡装置または他の光学検出システムまたは当業者に公知の、単一分子を検出することができる光学顕微鏡システムによって検出する。そのような検出システムの例としては、これらに限らないが、共焦点顕微鏡、落射蛍光顕微鏡および内部全反射蛍光（ＴＩＲＦ）顕微鏡が挙げられる。標識されたモノマーを有する他のポリマー（例えば、タンパク質および核酸以外のポリマー）も、本明細書に記載の方法に従って配列決定することができる。
【００５２】
エネルギーは、標識されたモノマーがナノポアから出る、それに入る、またはそれを通過するときに、その後に、またはその前に、ポリマーのアクセプターで標識されたモノマー（例えば、ヌクレオチド）のアクセプター標識がドナー標識と相互作用する場合、ポアまたはナノポアのドナー標識（例えば、量子ドット）からポリマー（例えば、核酸）上のアクセプター標識に転移し得る。例えば、ドナー標識とアクセプター標識との間の相互作用またはエネルギー転移が、標識されたモノマーがナノポアを出て、ナノポアチャネルまたは開口の外側のドナー標識の付近または近傍にくるまで起こらないように、ドナー標識は、ナノポアのシス側もしくはトランス側またはシス表面もしくはトランス表面上でナノポアに位置づける、またはそれに付着させることができる。結果として、標識間の相互作用、ドナー標識からアクセプター標識へのエネルギー転移、アクセプター標識からのエネルギーの放出および／またはアクセプター標識からのエネルギーの放出の測定または検出は、ナノポアを通る通路、チャネルまたは開口の外側、例えば、ナノポアのシス側またはトランス側上のシスチャンバーまたはトランスチャンバー内で起こり得る。モノマーのアクセプター標識から放出されたエネルギーを測定または検出することを利用して、モノマーを同定することができる。
【００５３】
ナノポア標識は、標識が目に見え、または露出して標識の励起または照光を助長することができるように、ナノポアの通路、チャネルまたは開口の外側に位置づけることができる。ドナー標識とアクセプター標識との間の相互作用およびエネルギー転移、ならびにエネルギー転移の結果としてのアクセプター標識からのエネルギーの放出は、ナノポアの通路、チャネルまたは開口の外側で起こり得る。これにより、アクセプター標識からのエネルギーまたは光の放出を、例えば、光学的な検出または測定デバイスによって検出または測定することの容易さおよび精度を促進し得る。ドナー標識とアクセプター標識の相互作用はナノポアのチャネル内部で起こってよく、ドナー標識をナノポアのチャネル内に位置づけることができる。
【００５４】
ドナー標識は、種々の様式で、かつ／またはナノポアの種々の部位に付着させることができる。例えば、ドナー標識は、ナノポアの部分またはユニットに直接的に、または間接的に付着させる、または接続することができる。あるいは、ドナー標識は、ナノポアに隣接して位置づけることができる。
【００５５】
ポリマー（例えば、核酸）のアクセプターで標識されたモノマー（例えば、ヌクレオチド）のそれぞれは、ポリマーがトランスロケーションするナノポアまたはチャネルに、もしくはその隣に位置づけられる、または、それに直接もしくは間接的に付着しているドナー標識と逐次的に相互作用し得る。ドナー標識とアクセプター標識との間の相互作用は、ナノポアのチャネルまたは開口の外側で、例えば、アクセプターで標識されたモノマーがナノポアを出た後で、またはモノマーがナノポアに入る前に起こり得る。相互作用は、ナノポアのチャネルまたは開口の内部で、または部分的にその内部で、例えば、アクセプターで標識されたモノマーがナノポアを通過しているとき、それに入ったとき、またはそれから出たときに起こり得る。
【００５６】
核酸の４種のヌクレオチドのうち１つを標識する場合、単一ヌクレオチド標識の放出から生じる時間依存的なシグナルを、核酸配列における標識されたヌクレオチドの位置に対応する配列に変換する。次いで、このプロセスを、４種のヌクレオチドのそれぞれに対して別々の試料中で繰り返し、次いで、４つの部分配列をアラインメントして全体の核酸配列を組み立てる。
【００５７】
多色標識された核酸（ＤＮＡ）配列を分析する場合、核酸分子に存在し得る１種または複数種のドナー標識から４種の別個のアクセプター標識のそれぞれにエネルギーが転移することにより、直接配列を読み取ることを可能にする４種の別個の波長または色の光（それぞれが４種のヌクレオチドの１つに関連づけられる）が放出され得る。
【００５８】
トランスロケーション速度
ナノポアベースの配列決定アプローチに関連する主な障壁は、核酸がナノポアを通って高速でトランスロケーションすることであり（〜５００．０００〜１．０００．０００ヌクレオチド／秒）、記録機器の帯域幅が制限されているために、この高速は、直接的な配列読み取りを可能とはしない。２種の異なるナノポアタンパク質を使用して、核酸のトランスロケーションを遅延させる手法は、最近Ｃｈｅｒｆら［Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２０１４年２月１４日、３０巻（４号）：３４４〜８頁］およびＭａｎｒａｏら［Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２０１２年３月２５日；  ３０巻（４号）：３４９〜５３頁］によって示されており、参照により本明細書に組み入れられている。どちらのグループも、標的の鋳型から相補的な鎖を合成するためにＤＮＡポリメラーゼを使用し、その結果、鋳型ＤＮＡは、ナノポアを通って段階的にトランスロケーションした。それゆえ、核酸ポリメラーゼの合成速度（１０〜５００ヌクレオチド／秒）は、ＤＮＡのトランスロケーション速度を決定し、その速さは直接的な核酸のトランスロケーションよりも大まかには３〜４桁低いことから、単一ヌクレオチドの分析が実現可能になった。しかし、ポリメラーゼに補助されたトランスロケーションは、ポリメラーゼのための結合部位を生成するために著しい試料の調製を要し、核酸合成は、大量にまとめて遮断されざるを得ず、核酸−ポリメラーゼ複合体がナノポアタンパク質によって捕捉される時にのみ開始することができる。このことは、商業的な環境における実施を阻みかねない、相当に複雑な設定をもたらす。さらに、失速した重合などのポリメラーゼ合成反応の変動ならびに核酸からのポリメラーゼの解離が、配列読み取りを妨げ、その結果、高いエラー率と読み取り長の低減とをそれぞれもたらすことがある。本願に記載された光学的ナノポア配列は、ＤＮＡトランスロケーションを遅延させることについて異なる手法を使用する。標的の核酸は、蛍光修飾されたヌクレオチドを組み入れることによって、酵素により複製される。結果として生じる標識された核酸は、名目直径が増えており、そのため、ナノポアを通して引き込む際に、トランスロケーション速度が減少する。光学配列決定のための好適なトランスロケーション速度は、毎秒１〜１０００ヌクレオチドの範囲にあり、さらに好ましい範囲は、毎秒２００〜８００ヌクレオチドであり、最も好ましいトランスロケーション速度は、毎秒２００〜６００ヌクレオチドである。
【００５９】
あるいは、ポリヌクレオチド、特に一本鎖ポリヌクレオチドのトランスロケーション速度は、付加物および／または標識、例えば塩基に付着された有機色素が、ポリヌクレオチドのトランスロケーションを阻害するものの阻止しないように、特定の寸法に作られたナノポアを利用することによって制御されうる。トランスロケーション速度は、標識および／または付加物を所定の密度で付着することによって選択されうる。そのような標識および／または付加物は、例えばヌクレオチド３個ごとなどの規則正しい間隔で付着されていてもよいし、無作為に、または、例えば全てのＣに標識される場合などの擬似的無作為に付着されていてもよい。一部の実施形態では、例えば全てのＡとＣ、もしくは全てのＡとＧ、もしくは全てのＡとＴ、もしくは全てのＣなど、選択された数の異なるヌクレオチドが標識されていてもよく、それらは、平均のトランスロケーション速度をもたらす。そのような平均速度は、未標識のヌクレオチドに付加物を付着することによって低下しうる。付加物としては、既存の化学を使用してヌクレオチドに付着されうる任意の分子が挙げられ、通常は有機分子である。典型的には、付加物は、例えばフルオレセイン、Ｃｙ３などの一般的な有機色素と同じ範囲の分子量である。付加物は、シグナルを生成する、すなわち標識として役割を果たすことができてもできなくともよい。一部の実施形態では、付加物および／または標識は、ヌクレオチドの塩基に付着されている。他の実施形態では、標識および／または付加物は、ポリヌクレオチド中のヌクレオシド間の連結に付着されていてもよい。一態様では、ナノポアを通る一本鎖ポリヌクレオチドのトランスロケーション速度を制御する方法は、ある密度でポリヌクレオチドに付加物を付着させるステップを含み、この一本鎖ポリヌクレオチドのトランスロケーション速度は、付着されている付加物の数が大きいほど、または付着されている付加物の密度に伴って、単調に低下する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの全種類のヌクレオチドが標識されるわけではない。例えば、４つの異なるセットのポリヌクレオチドが生成されてもよく、ここで、各セットのヌクレオチドは、同じ分子（例えば、蛍光有機色素アクセプター）で標識されているが、各セットでは、異なる種類のヌクレオチドが標識されることになる。そのため、セット１では、Ａのみが標識され得、セット２では、Ｃのみが標識され得、セット３では、Ｇのみが標識され得るなど。そのような標識化の後、次いで、４つのセットのポリヌクレオチドは、本明細書に記載した方法およびシステム、ならびに４回の分析にて生成されたデータから決定したポリヌクレオチドのヌクレオチド配列に従って、別個に分析されうる。ポリヌクレオチドのヌクレオチドのいくつかが標識されていない、そのような実施形態および同様の実施形態（例えば２種類の標識が使用される）では、ナノポアを通るトランスロケーション速度は、ポリヌクレオチドに沿った標識の分布によって、影響を受けることになる。トランスロケーション速度におけるそのような可変性を防止するために、いくつかの実施例では、ヌクレオチド配列を決定するシグナルを形成するためのアクセプターまたはドナーで標識されていないヌクレオチドは、シグナルを産生しない付加物を付着することによって修飾されてもよく、このシグナルを産生しない付加物は、トランスロケーション速度に対し、シグナル産生標識と実質的に同じ効果を及ぼす。
【実施例】
【００６０】
本実施例では、ポリヌクレオチドのアクセプターで標識されたヌクレオチドの配列を決定するためのナノポア装置を記載し、この後、本装置は、第１のポリヌクレオチド中のアクセプターで標識されたシトシンの配列を検出するために、かつ第２のポリヌクレオチド中の第１のアクセプターで標識されたチミンまたはチミジンおよび第２のアクセプターで標識されたシトシンの配列を検出するために、使用される。
【００６１】
窒化ケイ素膜中にナノポア（複数可）を形成するためのＨＩＭ穿孔：穿孔工程の前に、酸素プラズマを用いて、３０ｎｍのＳｉ３Ｎ４膜が架かった５０×５０μｍのエッチング窓を持つ３ｍｍのＳｉチップ（Ｐｒｏｔｏｃｈｉｐｓ、ノースカロライナ州）を清浄にする。清浄にしたチップを、ヘリウムイオン顕微鏡（Ｏｒｉｏｎ、Ｚｅｉｓｓ）の真空チャンバー内へ挿入する。挿入後、４＋／−２ｎｍの穴を生じるように較正された曝露時間で、２０μｍの開口部を通して、〜５ｐＡのビーム電流を伴う集束イオン流を用いて、ナノ穴を穿つ。
【００６２】
タンパク質ナノポア：野生型アルファヘモリシンタンパク質のクローン化されたバリアントを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳反応用の鋳型として使用した。結果として生じたモノマーは、終濃度６．２５ｍＭとなるようにデオキシコール酸ナトリウムを段階的に添加し、続いて４℃で１２時間インキュベートすることによって、七量体とした。結果として生じた七量体を、ヘテロ二官能性架橋剤剤［ＳＭＣＣ、スルホスクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート］を使用して、アミン修飾されたオリゴヌクレオチドに付着した。このオリゴヌクレオチドは、３ｋｂのｄｓＤＮＡ断片用のハイブリダイゼーション部位としての役割を果たし、Ｓｉ３Ｎ４膜中の穿たれた穴の内部へタンパク質ナノポアを引き込むための抵抗力として使用される。オリゴヌクレオチド修飾に加えて、マレイミドで活性化された１種または複数の蛍光色素を用いて、タンパク質ナノポアの基部も修飾する。付着されたフルオロフォアは、ＦＲＥＴ反応のドナーまたはアクセプターのどちらかとして役立ち得る。
【００６３】
ハイブリッドナノポア：穴が穿たれたＴＥＭ格子を、９０℃に加熱したピラニア溶液（３：１  硫酸：Ｈ２Ｏ２、体積比）に１５分間沈めることによって、または空気プラズマに５分間おくことによって、清浄にする。広範囲を水ですすいだ後、シスおよびトランスのチャンバーに隔てられたＤｅｒｌｉｎホルダーに、ＴＥＭ格子を取り付ける。ナノポアの光学精査を可能にするカバースリップを用いて、トランスチャンバーをシールした。エタノールを用いて各チャンバーを満たし、ナノポアの湿潤化を促進する。続いて、エタノールを水と交換して、次いで、緩衝化された１Ｍ  ＫＣｌ溶液に交換する。トランスチャンバーでは、緩衝化ＫＣｌが５０％のグリセロールを含有しており、ＴＩＲ（全反射）イメージングを促す。シスおよびトランスのどちらのチャンバーとも、該緩衝溶液に接触し、シスチャンバーにおけるカソード（＋）とトランスチャンバーにおけるアノード（−）とを備えたＡｇ／ＡｇＣｌ電極を保有する。ナノポアタンパク質をＳｉＮ膜のシス側に添加して、電場（２００〜６００ｍＶ）を印加することによって、穿たれたナノ穴へタンパク質ナノポアを差し込んで、ハイブリッドナノポアを形成する。
【００６４】
６００ｍＶで５〜２５分後、通常は穿たれた穴の５０〜７５％に、タンパク質ナノポアが挿入される。ハイブリッドナノポアの形成を、ＡＰＯＮ  ６０×ＴＩＲＦ油浸対物レンズと、タンパク質ナノポアに付着されたフルオロフォアを励起するために使用される５３２ｎｍダイオードレーザーとを備え付けた倒立顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ７１）で確認する。シスチャンバーの緩衝液を交換して、過剰量のナノポアタンパク質を除去した。標識された一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡを、終濃度１０ｎＭとなるようにシスチャンバーに添加する。電場を２００〜４００ｍＶに低減して、ハイブリッドナノポアを通るｓｓＤＮＡのトランスロケーションを促進させる。標識されたＤＮＡは、ナノポアを出るときに、励起されたドナーフルオロフォアのすぐ近傍にある。ＦＲＥＴ反応が起こり、標識されたＤＮＡからの光子放出を生じる。放出された光子を収集し、フィルターをかけ、５００〜５０００Ｈｚのフレーム速度でＯｒｃａ  Ｆｌａｓｈ  ４．０  ｃＭＯＳカメラ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ）を使用してイメージングする。ＩｍａｇｅＪを使用して、生のＴＩＦＦイメージから、ハイブリッドナノポア全体を網羅する５×５ピクセル面積からデータを抽出する。生のトレースを正規化し、ピーク検知アルゴリズムを使用してＦＲＥＴシグナルを特定する。特定されたピークに対し、塩基のコール（ｃａｌｌｉｎｇ）を行う。
【００６５】
以下の１０７ｍｅｒの一本鎖ポリヌクレオチド（配列番号１）の各シトシンを、Ｃｙ５フルオロフォアを用いて標識した。
【００６６】
【化１】
2018099141.tif 000002
標識されたポリヌクレオチドを、３’側が最初になった配向にてハイブリッドナノポアを通ってトランスロケーションさせて、標識されたシトシン由来の混合ＦＲＥＴシグナルを収集した。生データを図１Ｂに示す。ハイブリッドナノポアを通ってトランスロケーションするときに、ＤＮＡのシトシンの数に対応する複数のピークが観察された。驚くことに、３’末端のホモポリマーは完全に分解された。
【００６７】
５’端から２０番目のヌクレオチド位の後に、以下の一本鎖ポリヌクレオチド（配列番号２）の全シトシンおよび全チミジンを、Ｃｙ５およびＡｔｔｏ７００をそれぞれ用いて標識した。
【００６８】
【化２】
2018099141.tif 000003
標識されたポリヌクレオチドを、３’側が最初になった配向にてハイブリッドナノポアを通ってトランスロケーションさせて、標識されたシトシンおよびチミジン由来の混合ＦＲＥＴシグナルを収集した。生データを図１Ｄに示す。この生データトレース中のピークは、鋳型鎖中の標識されたヌクレオチドの位置に類似したパターンを示す。
【００６９】
本開示は、明記された具体的な形態の範囲を限定することを意図するものではないが、本明細書に記載されているバリエーションの代替、修正および等価物を網羅することを意図するものである。さらに、本開示の範囲は、本開示の観点から当業者に自明となりうる他のバリエーションを完全に包含する。本願の発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【００７０】
定義
「ナノポア」とは、所定のまたは認識されうる順番で検体が担体を通って通過すること、およびポリマー検体の場合、所定のまたは認識されうる順番でそのモノマーユニットが担体を通って通過することを可能にする、担体に位置づけられる任意の開口を意味する。後者の場合には、所定のまたは認識されうる順番は、ポリマー中のモノマーユニットの一次配列であってもよい。ナノポアの例としては、タンパク質性のまたはタンパク質ベースのナノポア、合成または固体状態のナノポア、およびタンパク質ナノポアが中に包埋されている固体状態のナノポアを含むハイブリッドナノポアが挙げられる。ナノポアは、例えば１〜１０ｎｍ、もしくは１〜５ｎｍ、もしくは１〜３ｎｍ、または他の様々なサイズの内径を持ちうる。タンパク質ナノポアの例としては、以下に限定されないが、アルファ−ヘモリシン、電位依存性ミトコンドリアポリン（ＶＤＡＣ）、ＯｍｐＦ、ＯｍｐＣ、ＭｓｐＡおよびＬａｍＢ（マルトポリン）が挙げられ、これらは例えばＲｈｅｅ，  Ｍら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２５巻（４号）（２００７年）：１７４−１８１頁、Ｂａｙｌｅｙら（上記に引用）、Ｇｕｎｄｌａｃｈら、米国特許出願公開第２０１２／００５５７９２号などに開示され、参照により本明細書に組み入れられている。単一の核酸分子のトランスロケーションを可能にする任意のタンパク質ポアが利用されうる。ナノポアタンパク質は、ポアの外部の特異的な部位、またはポア形成タンパク質を構成する１種または複数のモノマーユニットの外部の特異的な部位で、標識されていてもよい。ポアタンパク質は、以下に限定されないが、アルファ−ヘモリシン、ＭｓｐＡ、電位依存性ミトコンドリアポリン（ＶＤＡＣ）、炭疽菌ポリン、ＯｍｐＦ、ＯｍｐＣやＬａｍＢ（マルトポリン）などのタンパク質の群から選ばれる。ポアタンパク質の固体状態の穴への組み込みは、荷電しているポリマーがポアタンパク質に付着することによって達成される。電場を印加した後、荷電している複合体は、電気泳動によって固体状態の穴の中へ引き込まれる。合成ナノポアまたは固体状態のナノポアは、様々な形態の固体担体中に作られていてもよく、そのような例としては、以下に限定されないが、シリコーン（例えばＳｉ３Ｎ４、ＳｉＯ２）、金属、酸化金属（例えばＡｌ２Ｏ３）、プラスチック、ガラス、半導体材料、またはそれらの組合せが挙げられる。合成ナノポアは、脂質二層膜中に位置づけられた生物学的なタンパク質ポアよりも安定であってもよい。合成ナノポアはまた、以下に限定されないが、重合したエポキシなどの、適当な担体中に包埋されたカーボンナノチューブを使用することによって作られていてもよい。カーボンナノチューブは、均一でありかつ明確に定義された化学的または構造的な特性を有しうる。様々なサイズのカーボンナノチューブを入手することができ、１ｎｍから数百ｎｍに及ぶ。カーボンナノチューブの表面電荷は、約ゼロであることが公知であり、その結果、ナノポアを通る核酸の電気泳動による輸送が、簡単かつ予測可能になる（Ｉｔｏ，  Ｔ．ら、Ｃｈｅｍ．  Ｃｏｍｍｕｎ．、１２巻（２００３年）：１４８２〜８３頁）。合成ナノポアの担体表面は、化学的に修��されて、タンパク質ポアの共有結合での付着を可能とするか、または表面の特性を光学ナノポア配列決定に適したものとしてもよい。そのような表面修飾は、共有結合的であるか非共有結合的でありうる。大半の共有結合性修飾は、有機シランの沈着を含み、そのための最も一般的なプロトコールは、以下のように記載される：１）水性アルコールからの沈着。これは、シリル化された表面を調製するための最も簡易的な方法である。９５％エタノール−５％水溶液を、酢酸を用いてｐＨ４．５〜５．５に調整する。撹拌しながらシランを添加し、終濃度２％を生じる。加水分解およびシラノール基の形成の後、担体を２〜５分間加える。すすいだ後、エタノール中に少しの間浸漬することによって、過剰の遊離の材料を除く。シラン層の硬化は、摂氏１１０度で５〜１０分間とした。２）蒸気相沈着。乾燥した非プロトン性の条件で化学蒸着によって、シランを担体に適用することができる。これらの方法は、単層の沈着に向く。閉鎖されたチャンバーの設計では、担体が、５ｍｍの蒸気圧を達成するのに十分な温度に加熱される。あるいは、シランの蒸発が観察されるまで、真空を適用することができる。３）スピンオン沈着。スピンオンの適用は、最大限の機能付与と多層の沈着とに向く加水分解条件下、または単層の沈着に向く乾燥条件下で、行うことができる。
【００７１】
「ＦＲＥＴ」または「フェルスターまたは蛍光共鳴エネルギー転移」とは、ドナーからアクセプターフルオロフォアへの非放射性の双極子間エネルギー転移機構を意味する。ＦＲＥＴの効率は、ドナーとアクセプターとの距離、ならびにフルオロフォアの特性に依存しうる（Ｓｔｒｙｅｒ，  Ｌ．、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、４７巻（１９７８年）：８１９〜８４６頁）。「ＦＲＥＴ距離」とは、ＦＲＥＴドナーとＦＲＥＴアクセプターとの距離を意味し、その距離にわたってＦＲＥＴ相互作用が起こり、検出可能なＦＲＥＴシグナルがＦＲＥＴアクセプターによって産生されうる。
【００７２】
「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」は、互換的に使用され、それぞれは、ヌクレオチドモノマーの線状ポリマーを意味する。ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドを構成するモノマーは、ワトソン−クリック型の塩基対合、塩基スタッキング、フーグスティーン型または逆フーグスティーン型の塩基対合などの、モノマー間相互作用の規則的なパターンによって、天然のポリヌクレオチドに特異的に結合することができる。そのようなモノマーおよびそれらのヌクレオチド間の連結は、天然に存在するものであってもよく、その類似体、例えば天然に存在するか天然に存在しない類似体などであってもよい。天然に存在しない類似体としては、ＰＮＡ類、ホスホロチオエートのヌクレオシド間連結、標識（例えば、フルオロフォアまたはハプテン）の付着を可能にする塩基含有連結基などがある。オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの使用が、酵素によるプロセッシング、例えばポリメラーゼによる延長、リガーゼによるライゲーションなどを必要とするときはいつでも、これらの例でのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、任意のまたはいくつかの位置で、ヌクレオシド間連結、糖部分または塩基についてのある特定の類似体を含有することはないことを、当業者は理解することになる。数千のモノマーユニットに対して通常「オリゴヌクレオチド」と呼ばれる場合、ポリヌクレオチドは、典型的には一対から少数のモノマーユニット、例えば５〜４０個のサイズに及ぶ。別段に表示のない限り、また、文脈から自明でない限り、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドが、「ＡＴＧＣＣＴＧ」などの文字の配列（大文字または小文字）によって表されている場合、ヌクレオチドは、左から右へ５’→３’の順であり、「Ａ」はデオキシアデノシンを示し、「Ｃ」はデオキシシチジンを示し、「Ｇ」はデオキシグアノシンを示し、「Ｔ」はチミジンを示し、「Ｉ」はデオキシイノシンを示し、「Ｕ」はウリジンを示すことが理解されよう。別段に言及のない限り、専門用語および原子の付番のしきたりは、ＳｔｒａｃｈａｎおよびＲｅａｄ、Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２巻、（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９９年）に開示されているものに従うことになる。通常、ポリヌクレオチドは、ホスホジエステル結合によって連結された４種の天然のヌクレオチド（例えば、ＤＮＡについてはデオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、またはＲＮＡについてはそれらのリボース相当物）を含むが、非天然のヌクレオチド類似体、例えば修飾された塩基、糖またはヌクレオシド間連結を含んでいてもよい。当業者には、酵素が活性のために特異的なオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド基質（例えば一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖など）の要件を有する場合、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド基質のために適切な組成物の選択は、当業者の知識の十分範囲内であり、特に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、第２版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８９年）や他の参考文献などの論文によるガイダンスがあることは明らかである。同様に、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドは、一本鎖形態または二本鎖形態（すなわちオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドおよびそれぞれの相補体の二重鎖）のどちらかで示されていてもよい。用語が使用されている文脈から、どちらの形態が意図されているのか、または両方の形態が意図されているのか否かは、当業者には明らかである。
【００７３】
「配列の決定」、「配列決定」および「ヌクレオチド配列を決定すること」や、ポリヌクレオチドに関連する他の用語には、ポリヌクレオチドの部分配列ならびに全長配列の情報の決定が含まれる。すなわち、この用語には、４種の天然のヌクレオチドであるＡ、Ｃ、ＧおよびＴの全セットのうちのサブセットの配列が含まれ、例えば、標的ポリヌクレオチドのＡのみおよびＣのみの配列などがある。すなわち、この用語には、標的ポリヌクレオチド内の４種のヌクレオチドのうち１種、２種、３種または全ての正体、順番および位置の決定が含まれる。一部の実施形態では、この用語には、標的ポリヌクレオチド内の４種のヌクレオチドのうち２種、３種または全ての正体、順番および位置の決定が含まれる。一部の実施形態では、配列の決定は、その配列が２進コード、例えば「ｃ−（ｃではない）（ｃではない）ｃ−（ｃではない）−ｃ・・・」を表す「１００１０１・・・」で表されるように、例えば標的ポリヌクレオチド「ｃａｔｃｇｃ・・・」内のシトシンなどの、単一種のヌクレオチドの順番および位置を特定することによって達成されてもよい。一部の実施形態では、この用語は、標的ポリヌクレオチドの指紋として役割を果たす標的ポリヌクレオチドの部分配列、つまり、ポリヌクレオチドのセット内の、例えば細胞によって発現されるあらゆる異なるＲＮＡ配列などの標的ポリヌクレオチドを一意的に特定する部分配列を含む。
【００７４】
本明細書に記載され、例示されている個々のバリエーションおよび実施形態のそれぞれは、容易に、任意の他のバリエーションの特徴から分離すること、またはそれと組み合わせることができる別個の構成成分および特徴を有する。改変を行って特定の状況、材料、組成物、プロセス、プロセスの行為（複数可）またはステップ（複数可）を本発明の目的（複数可）、主旨または範囲に適合させることができる。
【００７５】
本明細書に列挙されている方法では、列挙されている事象を、事象が列挙されている順序で行うだけでなく、論理的に可能性がある任意の順序で行うことができる。さらに、さまざまな値が提供される場合、その範囲の上限と下限の間に入るあらゆる値および任意の他の明示された値、またはその明示された範囲の間に入る値は、本発明の範囲内に包含される。また、記載されている本発明のバリエーションのいかなる任意選択の特徴も、それぞれ独立に、または本明細書に記載の特徴の任意の１つまたは複数と組み合わせて規定し、特許請求することができる。
【００７６】
本明細書で言及した全ての現存する主題（例えば、刊行物、特許、特許出願およびハードウェア）は、その主題が本発明の主題と矛盾する可能性がある場合（その場合、本明細書に存在するものがまさる）を除く限りではその全体が参照により本明細書に組み込まれる。参照された項目は、単に本出願の出願日前のそれらの開示についてのみ提供される。本明細書におけるいずれも、先行発明によって本発明がそのような材料に先行する権利がないことを容認するものであると解釈されるべきではない。
【００７７】
単数形の項目を参照することは、同じ項目が複数存在する可能性を包含する。より詳細には、本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される、単数形、「ａ（１つの）」、「ａｎ（１つの）」、「前記」および「ｔｈｅ（その）」は、文脈によりそうでないことが明確に規定されない限り、複数の指示対象を包含する。特許請求の範囲は、いかなる任意選択の要素も排除するように立案することができることにも留意する。そのように、この記述は、特許請求の範囲の要素の列挙に関連して「単に」、「のみ」などの排他的な用語を使用すること、または、「否定的な」限定を使用することの先行詞としての機能を果たすものとする。別段の定義のない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者に一般に理解されているものと同じ意味を有する。
【００７８】
本開示は、明記された具体的な形態の範囲を限定することを意図するものではないが、本明細書に記載されているバリエーションの代替、修正、異なるバリエーションにおける開示された構成要素の組合せ、および等価物を網羅することを意図するものである。さらに、本開示の範囲は、本開示の観点から当業者に自明となりうる他のバリエーションを完全に包含する。本願の発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図１Ａ】
2018099141.tif 000004
【図１Ｂ】
2018099141.tif 000005
【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【配列表】
2018099141000001.app
【外国語明細書】
2018099141000001.pdf