(57)【要約】      （修正有）【課題】Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）コア抗原に結合する新たな核酸分子及びその用途の提供。【解決手段】下記（ａ）又は（ｂ）のいずれか一方のポリヌクレオチドを含む核酸分子を、ＨＣＶコア抗原に結合する核酸分子とし、ルシフェラーゼ等で標識した核酸分子を用いたＨＣＶコア抗原の検出試薬の提供。（ａ）２つの特定の塩基配列又はその部分配列からなるポリヌクレオチド（ｂ）前記（ａ）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、ＨＣＶコア抗原に結合するポリヌクレオチド【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）または（ｂ）のいずれか一方のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、ＨＣＶコア抗原に結合する核酸分子。
（ａ）配列番号１または２のいずれかの塩基配列または配列番号１または２のいずれかの塩基配列の部分配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、ＨＣＶコア抗原に結合するポリヌクレオチド
【請求項２】
請求項１または２記載の核酸分子を含むことを特徴とする、ＨＣＶコア抗原の検出試薬。
【請求項３】
さらに、標識物質を有し、
前記標識物質が、前記核酸分子に結合されている、請求項２記載の検出試薬。
【請求項４】
前記標識物質が、酵素である、請求項３記載の検出試薬。
【請求項５】
前記酵素が、ルシフェラーゼである、請求項４記載の検出試薬。
【請求項６】
請求項１記載の核酸分子、または請求項２から５のいずれか一項に記載の検出試薬と、試料とを接触させ、前記試料中のＨＣＶコア抗原と、前記核酸分子または前記検出試薬との複合体を形成させる工程、および、
前記複合体を検出する工程を含むことを特徴とする、ＨＣＶコア抗原の検出方法。
【請求項７】
前記検出が、定性分析または定量分析である、請求項６記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＣＶコア抗原に結合する核酸分子およびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ型肝炎は、数十年の病期を経て肝硬変、肝癌へと移行し、肝癌の主な原因になっている。Ｃ型肝炎の検査および治療において、血中にＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）が存在しているか否かを分析することは、極めて重要である。
【０００３】
ウイルスの分析方法として、ウイルスに含まれるタンパク質やその分解物（ペプチド）を抗原とする抗体を使用する方法が知られている。ＨＣＶに関しても、ＨＣＶの構成タンパク質であるＨＣＶコア抗原について、ＥＬＩＳＡ法を用いて分析する方法が報告されている（非特許文献１、２）。
【０００４】
しかし、抗体は、タンパク質であり、安定性に問題があるため、低コストで簡易な検査法に抗体を用いることが難しい。また、電気泳動やニトロセルロース膜へのブロッティング等が必要であり、操作が煩雑である。このため、近年、抗体に代えて、抗原と特異的に結合する核酸分子が注目されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Fabriziら、J  Clin  Microbiol.、2005年、Vol.43、p.414-420
【非特許文献２】Toblerら、Vox  Sang.、2005年、Vol.89、p.201-207
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明の目的は、ＨＣＶコア抗原に結合する新たな核酸分子を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の核酸分子は、下記（ａ）または（ｂ）のいずれか一方のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、ＨＣＶコア抗原に結合する核酸分子である。
（ａ）配列番号１または２のいずれかの塩基配列または配列番号１または２のいずれかの部分配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、ＨＣＶコア抗原に結合するポリヌクレオチド
【０００８】
本発明のＨＣＶコア抗原の検出試薬は、前記本発明の核酸分子を含むことを特徴とする。
【０００９】
本発明のＨＣＶコア抗原の検出方法は、前記本発明の核酸分子、または前記本発明の検出試薬と、試料とを接触させ、前記試料中のＨＣＶコア抗原と、前記核酸分子または前記検出試薬との複合体を形成させる工程、および、
前記複合体を検出する工程を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の核酸分子は、ＨＣＶコア抗原に結合可能である。このため、本発明の核酸分子によれば、例えば、試料中のＨＣＶコア抗原との結合の有無によって、ＨＣＶを検出できる。したがって、本発明の核酸分子は、例えば、医薬の分野等において、例えば、ＨＣＶの検出等に、極めて有用なツールといえる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、本発明の実施例１における、アプタマー１および２の推定二次構造である。
【図２】図２は、本発明の実施例１における、ＨＣＶコア抗原存在下でのゲルシフトアッセイの結果を示す電気泳動写真である。
【図３】図３は、本発明の実施例２における、ＨＣＶコア抗原に対するアプタマー１の結合性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（１）核酸分子
本発明の核酸分子は、前述のように、下記（ａ）または（ｂ）のいずれか一方のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、ＨＣＶコア抗原に結合する核酸分子である。
（ａ）配列番号１または２のいずれかの塩基配列または配列番号１または２のいずれかの塩基配列の部分配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、ＨＣＶコア抗原に結合するポリヌクレオチド
【００１３】
本発明において、ターゲットは、ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）コア抗原である。ＨＣＶコア抗原は、ＨＣＶ粒子を構成する構造タンパク質である。ＨＣＶコア抗原は、例えば、ウイルス膜（エンベロープ）の内側に位置する。本発明の核酸について、例えば、結合能を確認するためのＨＣＶコア抗原として、市販のＨＣＶコア抗原が使用でき、具体例として、PROSPEC社製のＨＣＶコア抗原が例示できる。ＨＣＶコア抗原は、例えば、加熱等による変性が生じていない未変性タンパク質でもよいし、加熱等による変性が生じた変性タンパク質でもよい。
【００１４】
本発明の核酸分子は、前述のように、ＨＣＶコア抗原に結合可能である。本発明において、「ＨＣＶコア抗原に結合する」とは、例えば、ＨＣＶコア抗原に対する結合性を有している、または、ＨＣＶコア抗原に対する結合活性を有しているともいう。本発明の核酸分子とＨＣＶコア抗原との結合は、例えば、表面プラズモン共鳴分子相互作用（ＳＰＲ；Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）解析等により決定できる。前記解析は、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ３０００（商品名、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＵＫ  Ｌｔｄ．）が使用できる。本発明の核酸分子は、ＨＣＶコア抗原に結合することから、例えば、ＨＣＶコア抗原およびＨＣＶの検出に使用できる。
【００１５】
本発明の核酸分子は、ＨＣＶコア抗原に対する結合力を示す解離定数が、例えば、１３．５ｎＭ以下である。
【００１６】
本発明の核酸分子は、ＤＮＡ分子、またはＤＮＡアプタマーともいう。本発明の核酸分子は、例えば、前記（ａ）または（ｂ）のいずれか一方のポリヌクレオチドからなる分子でもよいし、前記ポリヌクレオチドを含む分子でもよい。
【００１７】
前記（ａ）のポリヌクレオチドは、前述のように、前記配列番号１または２のいずれかの塩基配列または前記配列番号１または２のいずれかの塩基配列の部分配列からなるポリヌクレオチドである。前記配列番号１または２のポリヌクレオチドを以下に示す。
【００１８】
ＨＣＶ−Ｎ４０７３２Ｒ８ｍ１（配列番号１）
GGATACCCTGTGAGCCCTGTAAAGCCAGTTGTGGGCGGGTGGGGTTCAGGGGGTGGGAGGGGTCTACTCCGAAGGCAACTGGCTTATG
ＨＣＶ−Ｎ４０７３２Ｒ８ｍ２（配列番号２）
GGATACCCTGTGAGCCCTGTAAAGTTGCCGAGGTGGGTGGGTGGGGATCGGGGGGAGGGTGGGACTACTCCGAAGGCAACTGGCTTATG
【００１９】
前記（ｂ）において、「同一性」は、特に制限されず、例えば、前記（ｂ）のポリヌクレオチドが、ＨＣＶコア抗原に結合する範囲であればよい。前記同一性は、例えば、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である。前記同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等の解析ソフトウェアを用いて、デフォルトのパラメータにより算出できる（以下、同様）。
【００２０】
本発明の核酸分子における前記ポリヌクレオチドは、例えば、下記（ｃ）または（ｄ）のポリヌクレオチドでもよい。この場合、本発明の核酸分子は、例えば、前記（ｃ）または（ｄ）のポリヌクレオチドからなる分子でもよいし、前記ポリヌクレオチドを含む分子でもよい。
（ｃ）前記（ａ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなり、ＨＣＶコア抗原に結合するポリヌクレオチド
（ｄ）前記（ａ）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、ＨＣＶコア抗原に結合するポリヌクレオチド
【００２１】
前記（ｃ）において、「ハイブリダイズするポリヌクレオチド」は、特に制限されず、例えば、前記（ａ）の塩基配列に対して、完全または部分的に相補的なポリヌクレオチドである。前記ハイブリダイズは、例えば、各種ハイブリダイゼーションアッセイにより検出できる。前記ハイブリダイゼーションアッセイは、特に制限されず、例えば、ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  Ｅｄ．）」〔Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９）〕等に記載されている方法を採用することもできる。
【００２２】
前記（ｃ）において、「ストリンジェントな条件」は、例えば、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件、高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、３２℃の条件である。「中ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、４２℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃の条件である。ストリンジェンシーの程度は、当業者であれば、例えば、温度、塩濃度、プローブの濃度および長さ、イオン強度、時間等の条件を適宜選択することで、設定可能である。「ストリンジェントな条件」は、例えば、前述したザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  Ｅｄ．）」〔Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９）〕等に記載の条件を採用することもできる。
【００２３】
前記（ｄ）において、「１もしくは数個」は、例えば、前記（ｄ）のポリヌクレオチドが、ＨＣＶコア抗原に結合する範囲であればよい。前記「１もしくは数個」は、前記（ａ）の塩基配列において、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜７個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個、特に好ましくは１または２個である。
【００２４】
本発明の核酸分子は、例えば、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドの配列を１つ含んでもよいし、前記ポリヌクレオチドの配列を複数含んでもよい。後者の場合、複数のポリヌクレオチドの配列が連結して、一本鎖のポリヌクレオチドを形成していることが好ましい。前記複数のポリヌクレオチドの配列は、例えば、それぞれが直接的に連結してもよいし、リンカーを介して、それぞれが間接的に連結してもよい。前記ポリヌクレオチドの配列は、それぞれの末端において、直接的または間接的に連結していることが好ましい。前記複数のポリヌクレオチドの配列は、例えば、同じでもよいし、異なってもよいが、好ましくは同じである。前記ポリヌクレオチドの配列を複数含む場合、前記配列の数は、特に制限されず、例えば、２以上であり、好ましくは２〜１２であり、より好ましくは２〜６であり、さらに好ましくは２である。
【００２５】
前記リンカーは、例えば、ポリヌクレオチドがあげられ、その構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基があげられる。前記ヌクレオチド残基は、例えば、リボヌクレオチド残基、デオキシリボヌクレオチド残基があげられる。前記リンカーの長さは、特に制限されず、例えば、１〜２４塩基長であり、好ましくは１２〜２４塩基長であり、より好ましくは１６〜２４塩基長であり、さらに好ましくは２０〜２４塩基長である。
【００２６】
本発明の核酸分子において、前記ポリヌクレオチドは、一本鎖ポリヌクレオチドであることが好ましい。前記一本鎖ポリヌクレオチドは、例えば、自己アニーリングによりステム構造およびループ構造を形成可能であることが好ましい。前記ポリヌクレオチドは、例えば、ステムループ構造、インターナルループ構造および／またはバルジ構造等を形成可能であることが好ましい。
【００２７】
本発明の核酸分子は、例えば、二本鎖でもよい。二本鎖の場合、例えば、一方の一本鎖ポリヌクレオチドは、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドであり、他方の一本鎖ポリヌクレオチドは、制限されない。前記他方の一本鎖ポリヌクレオチドは、例えば、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドがあげられる。本発明の核酸分子が二本鎖の場合、例えば、使用に先立って、変性等により、一本鎖ポリヌクレオチドに解離させることが好ましい。また、解離した前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかの一本鎖ポリヌクレオチドは、例えば、前述のように、ステム構造およびループ構造を形成していることが好ましい。
【００２８】
本発明において、「ステム構造およびループ構造を形成可能」とは、例えば、実際にステム構造およびループ構造を形成すること、ならびに、ステム構造およびループ構造が形成されていなくても、条件によってステム構造およびループ構造を形成可能なことも含む。「ステム構造およびループ構造を形成可能」とは、例えば、実験的に確認した場合、および、コンピュータ等のシミュレーションで予測した場合の双方を含む。
【００２９】
本発明の核酸分子の構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基である。前記核酸分子の長さは、特に制限されず、その下限は、例えば、１５塩基長であり、好ましくは７５塩基長または８０塩基長であり、その上限は、例えば、１０００塩基長であり、好ましくは２００塩基長、１００塩基長または９０塩基長である。
【００３０】
前記ヌクレオチド残基は、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基があげられる。本発明の核酸分子は、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基のみから構成されるＤＮＡ、１もしくは数個のリボヌクレオチド残基を含むＤＮＡ等があげられる。後者の場合、「１もしくは数個」は、特に制限されず、例えば、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１〜３個である。本発明において、塩基数および配列数等の個数の数値範囲は、例えば、その範囲に属する正の整数を全て開示するものである。つまり、例えば、「１〜３塩基」との記載は、「１、２、３塩基」の全ての開示を意味する（以下、同様）。
【００３１】
前記ポリヌクレオチドは、例えば、修飾塩基を含んでもよい。前記修飾塩基は、特に制限されず、例えば、天然塩基（非人工塩基）が修飾された塩基があげられ、前記天然塩基と同様の機能を有することが好ましい。前記天然塩基は、特に制限されず、例えば、プリン骨格を有するプリン塩基、ピリミジン骨格を有するピリミジン塩基等があげられる。前記プリン塩基は、特に制限されず、例えば、アデニン（ａ）、グアニン（ｇ）があげられる。前記ピリミジン塩基は、特に制限されず、例えば、シトシン（ｃ）、チミン（ｔ）、ウラシル（ｕ）等があげられる。前記塩基の修飾部位は、特に制限されない。前記塩基がプリン塩基の場合、前記プリン塩基の修飾部位は、例えば、前記プリン骨格の７位および８位があげられる。前記塩基がピリミジン塩基の場合、前記ピリミジン塩基の修飾部位は、例えば、前記ピリミジン骨格の５位および６位があげられる。前記ピリミジン骨格において、４位の炭素に「＝Ｏ」が結合し、５位の炭素に「−ＣＨ３」または「−Ｈ」以外の基が結合している場合、修飾ウラシルまたは修飾チミンということができる。
【００３２】
本発明の核酸分子は、例えば、１もしくは数個の人工核酸モノマー残基を含んでもよい。前記「１もしくは数個」は、特に制限されず、例えば、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１〜８０個、好ましくは１〜７０個、より好ましくは１〜５０個、さらに好ましくは１〜４０個、特に好ましくは１〜３０個、最も好ましくは１〜２１個である。前記人工核酸モノマー残基は、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、ＥＮＡ（２’−Ｏ，４’−Ｃ−Ｅｔｈｙｌｅｎｅｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ）等があげられる。前記モノマー残基における核酸は、例えば、前述と同様である。また、前記ポリヌクレオチドを含む前記核酸分子の全長における前記人工核酸モノマー残基も、特に制限されず、例えば、１〜８０個、１〜５０個、１〜２０個であり、好ましくは、前述の範囲と同様である。
【００３３】
本発明の核酸分子は、例えば、ヌクレアーゼ耐性であることが好ましい。本発明の核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性のため、例えば、前記修飾ヌクレオチド残基および／または前記人工核酸モノマー残基を有することが好ましい。本発明の核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性のため、例えば、５’末端または３’末端に、数１０ｋＤａのＰＥＧ（ポリエチレングリコール）またはデオキシチミジン等が結合してもよい。
【００３４】
本発明の核酸分子は、例えば、さらに付加配列を有してもよい。前記付加配列は、例えば、前記核酸分子の５’末端および３’末端の少なくとも一方に結合していることが好ましく、より好ましくは３’末端である。前記付加配列は、特に制限されない。前記付加配列の長さは、特に制限されず、例えば、１〜２００塩基長であり、好ましくは１〜５０塩基長であり、より好ましくは１〜２５塩基長、さらに好ましくは１８〜２４塩基長である。前記付加配列の構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基であり、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基等があげられる。前記付加配列は、特に制限されず、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基からなるＤＮＡ、リボヌクレオチド残基を含むＤＮＡ等のポリヌクレオチドがあげられる。前記付加配列の具体例として、例えば、ポリｄＴ、ポリｄＡ等があげられる。
【００３５】
本発明の核酸分子は、例えば、担体に固定化して使用できる。前記本発明の核酸分子は、例えば、５’末端および３’末端のいずれかを固定化することができる。本発明の核酸分子を固定化する場合、例えば、前記核酸分子は、前記担体に、直接的に固定化してもよいし、間接的に固定化してもよい。後者の場合、本発明の核酸分子は、例えば、前記付加配列を介して、前記担体に固定化する。前記担体は、例えば、ビーズ、プレート、フィルター、カラム、基板、容器等があげられる。
【００３６】
本発明の核酸分子は、例えば、さらに標識物質を有してもよく、具体的には、前記核酸分子に前記標識物質が結合してもよい。前記標識物質が結合した前記核酸分子は、例えば、本発明の核酸センサということもできる。前記標識物質は、例えば、前記核酸分子の５’末端および３’末端の少なくとも一方に結合させてもよい。前記標識物質による標識化は、例えば、結合でもよいし、化学修飾でもよい。前記標識物質は、特に制限されず、例えば、酵素、蛍光物質、色素、同位体、薬物、毒素および抗生物質等があげられる。前記酵素は、例えば、ルシフェラーゼ、ＳＡ−Ｌｕｃｉａルシフェラーゼ等があげられる。前記蛍光物質は、例えば、ピレン、ＴＡＭＲＡ、フルオレセイン、Ｃｙ３色素、Ｃｙ５色素、ＦＡＭ色素、ローダミン色素、テキサスレッド色素、ＪＯＥ、ＭＡＸ、ＨＥＸ、ＴＹＥ等の蛍光団があげられ、前記色素は、例えば、Ａｌｅｘａ４８８、Ａｌｅｘａ６４７等のＡｌｅｘａ色素等があげられる。前記標識物質は、例えば、前記核酸分子に直接的に連結してもよいし、リンカーを介して、間接的に連結してもよい。前記リンカーは、特に制限されず、例えば、ポリヌクレオチドのリンカー等である。
【００３７】
本発明の核酸分子の製造方法は、特に制限されず、例えば、化学合成を利用した核酸合成方法、遺伝子工学的手法等の公知の方法等により合成できる。
【００３８】
本発明の核酸分子は、前述のように、ＨＣＶコア抗原に結合性を示す。このため、本発明の核酸分子の用途は、ＨＣＶコア抗原への結合性を利用する用途であれば、特に制限されない。本発明の核酸分子は、例えば、ＨＣＶコア抗原に対する抗体に代えて、種々の方法に使用できる。
【００３９】
本発明の核酸分子によれば、ＨＣＶコア抗原を検出できる。ＨＣＶコア抗原の検出方法は、特に制限されず、ＨＣＶコア抗原と前記核酸分子との結合を検出することによって行える。
【００４０】
（２）検出試薬およびキット
本発明の検出試薬は、前述のように、ＨＣＶコア抗原の検出試薬であって、前記本発明の核酸分子を含むことを特徴とする。本発明の検出試薬は、前記本発明の核酸分子を含んでいればよく、その他の構成は何ら制限されない。本発明の検出試薬を使用すれば、前述のように、例えば、ＨＣＶコア抗原の検出等を行うことができる。本発明の検出試薬は、例えば、ＨＣＶコア抗原への結合剤ともいえる。
【００４１】
本発明の検出試薬は、例えば、さらに、標識物質を有し、前記標識物質が、前記核酸分子に結合されてもよい。前記標識物質は、例えば、前記本発明の核酸分子における説明を援用できる。また、本発明の検出試薬は、例えば、担体を有し、前記担体に前記核酸分子が固定化されてもよい。前記担体は、例えば、前記本発明の核酸分子における説明を援用できる。
【００４２】
本発明の検出キットは、前記本発明の核酸分子または前記本発明の検出試薬を含む。本発明の検出キットは、例えば、さらに、その他の構成要素を含んでもよい。前記構成要素は、例えば、前記試料を調製するための緩衝液、使用説明書等があげられる。また、後述する本発明の検出方法に示す、前記核酸分子に標識物質であるルシフェラーゼを結合させた核酸センサと、標識化担体とを用いる方法の場合、本発明の検出キットは、例えば、前記核酸センサと、標識化担体（ＨＣＶコア抗原標識化担体）を含むキットとすることができる。
【００４３】
本発明の検出試薬および検出キットは、例えば、前記本発明の核酸分子の説明を援用でき、また、その使用方法についても、前記本発明の核酸分子および後述する前記本発明の検出方法を援用できる。
【００４４】
（３）検出方法
本発明のＨＣＶコア抗原の検出方法は、前述のように、前記本発明の核酸分子、または前記本発明の検出試薬と、試料とを接触させ、前記試料中のＨＣＶコア抗原と、前記核酸分子または前記検出試薬との複合体を形成させる工程、および、前記複合体を検出する工程を含むことを特徴とする。本発明の検出方法は、前記本発明の核酸分子または前記検出試薬を使用することが特徴であって、その他の工程および条件等は、特に制限されない。以下、本発明の核酸分子の使用を例にあげて説明するが、本発明の核酸分子は、本発明の検出試薬と読み替え可能である。
【００４５】
本発明によれば、前記本発明の核酸分子が、ＨＣＶコア抗原に特異的に結合することから、例えば、ＨＣＶコア抗原と、前記核酸分子または前記検出試薬との結合を検出することによって、試料中のＨＣＶコア抗原を特異的に検出可能である。具体的には、例えば、試料中のＨＣＶコア抗原の量を分析可能であることから、定性分析または定量分析も可能といえる。
【００４６】
本発明において、前記試料は、特に制限されない。前記試料は、例えば、血液があげられる。
【００４７】
前記試料は、例えば、液体試料でもよいし、固体試料でもよい。前記試料は、例えば、前記核酸分子と接触させ易く、取扱いが簡便であることから、液体試料が好ましい。前記固体試料の場合、例えば、溶媒を用いて、混合液、抽出液、溶解液等を調製し、これを使用してもよい。前記溶媒は、特に制限されず、例えば、水、生理食塩水、緩衝液等があげられる。
【００４８】
本発明の検出方法について、本発明の核酸分子として、標識物質で標識化された本発明の核酸センサを使用し、ＨＣＶコア抗原を検出する方法を例にあげて説明する。なお、本発明は、これらの例示には制限されない。
【００４９】
前記検出工程は、例えば、さらに、前記複合体の検出結果に基づいて、前記試料中のＨＣＶコア抗原の有無または量を分析する工程を含む。
【００５０】
前記複合体形成工程において、前記試料と前記核酸分子との接触方法は、特に制限されない。前記試料と前記核酸分子との接触は、例えば、液体中で行われることが好ましい。前記液体は、特に制限されず、例えば、水、生理食塩水、緩衝液等があげられる。
【００５１】
前記複合体形成工程において、前記試料と前記核酸分子との接触条件は、特に制限されない。接触温度は、例えば、４〜３７℃であり、好ましくは１８〜２５℃であり、接触時間は、例えば、１０〜１２０分であり、好ましくは３０〜６０分である。
【００５２】
前記複合体形成工程において、前記核酸分子は、例えば、担体に固定化された固定化核酸分子（固相担体）でもよいし、未固定の遊離した核酸分子でもよい。後者の場合、例えば、容器内で、前記試料と接触させる。前者の場合、前記担体は、特に制限されず、例えば、プレート、フィルター、カラム、基板、ビーズ、容器等があげられ、前記容器は、例えば、マイクロプレート、チューブ等があげられる。前記核酸分子の固定化は、例えば、前述の通りである。
【００５３】
前記検出工程は、前述のように、前記試料中のＨＣＶコア抗原と前記核酸分子との結合を検出する工程である。前記両者の結合の有無を検出することによって、例えば、前記試料中のＨＣＶコア抗原の有無を分析（定性）でき、また、前記両者の結合の程度（結合量）を検出することによって、例えば、前記試料中のＨＣＶコア抗原の量を分析（定量）できる。
【００５４】
ＨＣＶコア抗原と前記核酸分子との結合の検出方法は、特に制限されない。前記方法は、例えば、物質間の結合を検出する従来公知の方法が採用でき、具体例として、前述のＳＰＲ等があげられる。
【００５５】
そして、ＨＣＶコア抗原と前記核酸分子との結合が検出できなかった場合は、前記試料中にＨＣＶコア抗原は存在しないと判断でき、前記結合が検出された場合は、前記試料中にＨＣＶコア抗原が存在すると判断できる。また、予め、ＨＣＶコア抗原の濃度と結合量との相関関係を求めておき、前記相関関係に基づいて、前記結合量から、前記試料中のＨＣＶコア抗原の濃度を分析することもできる。
【００５６】
ＨＣＶコア抗原と前記核酸分子との結合の検出について、一例として、前記核酸分子に標識物質であるルシフェラーゼを結合させた核酸センサと、ＨＣＶコア抗原標識化担体とを用いる方法を、以下に示す。
【００５７】
まず、前記核酸センサと前記試料とを混合する。これにより、前記試料中にＨＣＶコア抗原が存在する場合、前記核酸センサにおける前記核酸分子は、ターゲットであるＨＣＶコア抗原と結合する。他方、前記試料中にＨＣＶコア抗原が存在しない場合、前記核酸センサにおける核酸分子は、ターゲットと未結合の状態となる。
【００５８】
つぎに、前記混合物を、前記ＨＣＶコア抗原標識化担体に接触させた後、前記ＨＣＶコア抗原標識化担体を除去する。前記担体は、例えば、ビーズがあげられる。前記混合物において、前記核酸センサがＨＣＶコア抗原と結合している場合、前記核酸センサにおける前記核酸分子は、前記ＨＣＶコア抗原標識化担体におけるＨＣＶコア抗原とは結合できない。このため、前記ＨＣＶコア抗原標識化担体を除去した画分に対して、ルシフェラーゼの基質を添加して発光反応を行った場合、前記核酸センサにおけるルシフェラーゼの触媒反応によって、発光が生じる。他方、前記混合物において、前記核酸センサがＨＣＶコア抗原と結合していない場合、前記核酸センサにおける前記核酸分子は、前記ＨＣＶコア抗原標識化担体におけるＨＣＶコア抗原と結合する。このため、前記ＨＣＶコア抗原標識化担体の除去により、前記核酸センサも、前記ＨＣＶコア抗原標識化担体に結合した状態で除去されることになる。このため、前記ＨＣＶコア抗原標識化担体を除去した画分に対して、ルシフェラーゼの基質を添加して発光反応を行った場合、前記核酸センサが存在していないことから、ルシフェラーゼの触媒反応による発光は生じない。このため、発光の有無によって、試料中のＨＣＶコア抗原の有無を分析（定性分析）することができる。また、試料中のＨＣＶコア抗原の量と、前記ＨＣＶコア抗原標識化担体を除去した後の前記画分に残存する前記核酸センサの量とは、相関関係を有するため、発光の強弱によって、試料中のＨＣＶコア抗原の量も分析（定量分析）することができる。
【００５９】
本発明によれば、前述のように、ＨＣＶコア抗原を検出できる。また、本発明によれば、ＨＣＶコア抗原の検出により、例えば、間接的に、ＨＣＶの有無を検出することも可能である。
【実施例】
【００６０】
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により制限されない。市販の試薬は、特に示さない限り、それらのプロトコルに基づいて使用した。
【００６１】
［実施例１］
電気泳動によるゲルシフトアッセイを行い、ＨＣＶコア抗原と本発明のアプタマーとの相互作用を解析した。
【００６２】
（１）アプタマー
下記ポリヌクレオチドのアプタマー１および２を、実施例のアプタマーとして合成した。
【００６３】
アプタマー１：ＨＣＶ−Ｎ４０７３２Ｒ８ｍ１（配列番号１）
GGATACCCTGTGAGCCCTGTAAAGCCAGTTGTGGGCGGGTGGGGTTCAGGGGGTGGGAGGGGTCTACTCCGAAGGCAACTGGCTTATG
アプタマー２：ＨＣＶ−Ｎ４０７３２Ｒ８ｍ２（配列番号２）
GGATACCCTGTGAGCCCTGTAAAGTTGCCGAGGTGGGTGGGTGGGGATCGGGGGGAGGGTGGGACTACTCCGAAGGCAACTGGCTTATG
【００６４】
アプタマー１および２の推定二次構造を、それぞれ、図１（Ａ）および（Ｂ）に示す。ただし、これには限定されない。
【００６５】
（２）試料
ＨＣＶコア抗原（PROSPEC社製）を、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、１５分、室温）し、前記分離した上清を、ＳＢ１Ｔバッファーで希釈し、これをＨＣＶコア抗原試料とした。前記ＳＢ１Ｔバッファーの組成は、４０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ、１２５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０とし、ｐＨは、７．５とした。
【００６６】
（３）ゲルシフトアッセイ
【００６７】
前記各アプタマーと前記ＨＣＶコア抗原試料とを混合し、前記混合液を、常温で１時間インキュベートした。この後、前記混合液を、８％ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動に供した。前記電気泳動は、４４．６ｍｍｏｌ／Ｌ  ｂｏｒｉｃ  ａｃｉｄ、５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２を含む４４．６ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液中、４℃、１００Ｖで１００分間行った。各レーンに流すアプタマーおよびＨＣＶコア抗原の量は、それぞれ、２ｐｍｏｌおよび４ｐｍｏｌとした。前記電気泳動後のゲルを染色液（ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｏｌｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｇｅｌ  Ｓｔａｉｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製））を用いて染色した後、ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＸＲＳ＋（Ｂｉｏ  Ｒａｄ社製）で撮影した。
【００６８】
この結果を図２に示す。図２は、ＨＣＶコア抗原存在下でのゲルシフトアッセイの結果を示す電気泳動写真であり、レーン１は、アプタマー１およびＨＣＶコア抗原存在下、レーン２は、アプタマー１存在下、レーン５は、アプタマー２およびＨＣＶコア抗原存在下、レーン６は、アプタマー２存在下での電気泳動の結果を示す。同図において、レーンＭは電気泳動のマーカーである。また、同図において、上側のバンドはアプタマーとＨＣＶコア抗原との複合体を示し、下側のバンドはアプタマー単体を示す。ゲル上の矢印は、ＨＣＶコア抗原と各アプタマーとの結合によって生じた、バンドのシフトを示す。
【００６９】
図２のレーン１および２に示すように、ＨＣＶコア抗原試料の存在下において、アプタマー１のバンドがシフトした。すなわち、アプタマー１は、ＨＣＶコア抗原に結合し、複合体を形成した。また、図２のレーン５および６に示すように、ＨＣＶコア抗原試料の存在下において、アプタマー２のバンドがシフトした。すなわち、アプタマー２は、ＨＣＶコア抗原に結合し、複合体を形成した。
【００７０】
［実施例２］
本発明のアプタマーについて、ＨＣＶコア抗原に対する結合性を、ＳＰＲ解析により確認した。
【００７１】
アプタマーとして、前記アプタマー１を使用し、試料として、前記ＨＣＶコア抗原試料を使用し、結合性の解析を行った。前記結合性の解析には、BIACORE3000（GE  Healthcare社）を、その使用説明書にしたがって使用した。
【００７２】
まず、前記BIACORE3000専用のセンサーチップとして、Sensor  chip  NTA（GE  Healthcare社）を、前記BIACORE3000にセットした。前記センサーチップのフローセルに、３５０ｍＭのＥＤＴＡを流速１０μＬ／ｍｉｎで６０秒間インジェクションし、チップのフローセルに付着したニッケルを洗浄した。さらに、０．５ｍＭのＮｉＣｌ２を流速１０μＬ／ｍｉｎで６０秒間インジェクションし、ニッケルイオンを結合させた。その後、前記ＳＢ１Ｔバッファーを用いて、１００ｎｍｏｌ／ＬのＨＣＶコア抗原をインジェクションし、シグナル強度（ＲＵ：Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｕｎｉｔ）が約５００ＲＵになるように結合させた。続いて、前記チップの前記フローセルに、所定濃度のアプタマー１を、流速３０μＬ／ｍｉｎで６０秒間インジェクションし、引き続き、ＳＢ１Ｔバッファーを１２０秒間流し、シグナル強度を測定した。前記アプタマー１の濃度は、７．８、１５．６、３１．３、６２．５、１２５、および２５０ｎｍｏｌ／Ｌとした。
【００７３】
この結果を図３に示す。図３は、ＨＣＶコア抗原に対するアプタマー１の結合性を示すグラフであり、横軸は、前記試料のインジェクション開始後の経過時間（秒）を示し、縦軸は、シグナル強度（ＲＵ）を示す。図３に示すように、アプタマー１の濃度が増加するにつれて、シグナル強度が増加した。
【００７４】
さらに、前記図３のＳＰＲ解析の結果から、動態パラメータを算出した。この結果、アプタマー１は、ＨＣＶコア抗原に対する解離定数（ＫＤ）が、１３．５ｎｍｏｌ／Ｌ以下であり、優れた結合性であることがわかった。
【００７５】
以上、実施形態および実施例を参照して本願発明を説明したが、本願発明は、上記実施形態および実施例に限定されるものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をできる。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明の核酸分子は、ＨＣＶコア抗原に結合可能である。このため、本発明の核酸分子によれば、例えば、試料中のＨＣＶコア抗原との結合の有無によって、ＨＣＶを検出できる。したがって、本発明の核酸分子は、例えば、医薬の分野等において、例えば、ＨＣＶの検出等に、極めて有用なツールといえる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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