(57)【要約】【課題】本発明は、卵巣明細胞がんの治療剤又は予防剤を評価可能な卵巣明細胞がんモデル動物を作製する方法を提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、ヒト以外の免疫不全動物の腹腔内にヒト由来の卵巣明細胞がん細胞を移植する移植工程と、上記移植工程後に腹水を貯留した上記免疫不全動物の腹水からがん細胞を回収する回収工程と、上記回収工程で得られたがん細胞をクローン化し、がん細胞株を樹立するクローン化工程と、上記クローン化工程で得られた上記細胞株の中から、移植に使用した上記ヒト由来の卵巣明細胞がん細胞と比較して細胞増殖率が１．４倍以上高く、かつ、ＶＥＧＦ産生量が３倍以上高いがん細胞株を選抜する選抜工程と、上記選抜工程で選抜されたされたがん細胞株をヒト以外の免疫不全動物の腹腔内に移植して腹膜播種する膜播種工程と、を備える、卵巣明細胞がんモデル動物の作製方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト以外の免疫不全動物の腹腔内にヒト由来の卵巣明細胞がん細胞を移植する移植工程と、
前記移植工程後に腹水を貯留した前記免疫不全動物の腹水からがん細胞を回収する回収工程と、
前記回収工程で得られたがん細胞をクローン化し、がん細胞株を樹立するクローン化工程と、
前記クローン化工程で得られた前記細胞株の中から、移植に使用した前記ヒト由来の卵巣明細胞がん細胞と比較して細胞増殖率が１．４倍以上高く、かつ、ＶＥＧＦ産生量が３倍以上高いがん細胞株を選抜する選抜工程と、
前記選抜工程で選抜されたされたがん細胞株をヒト以外の免疫不全動物の腹腔内に移植して腹膜播種する膜播種工程と、
を備える、卵巣明細胞がんモデル動物の作製方法。
【請求項２】
前記ヒト由来の卵巣明細胞がん細胞は、ＲＭＧ−Ｉ細胞である、請求項１記載の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、卵巣明細胞がんモデル動物の作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
卵巣がんは、がんが発生する組織の違いにより、卵巣漿液性がん、卵巣粘液性がん、卵巣類内膜がん及び卵巣明細胞がんの４種類に分類され、卵巣明細胞がんは、転移性及び悪性度の高い卵巣がんの１種である。卵巣明細胞がん患者は、欧米においては全卵巣がん患者の８％程度に過ぎないが、日本国内では２４％〜３０％程度存在し、主要な卵巣がんの１種である卵巣漿液性がんに次ぐ頻度を占めている。また、卵巣漿液性がんと比較して、従来から卵巣がんの治療剤として用いられている代表的な抗がん剤が効きにくく、予後不良であることが特徴であり、新しい治療剤及び予防剤の開発が望まれている（非特許文献１）。
【０００３】
卵巣明細胞がんの治療剤及び予防剤の開発には、動物モデルを用いた非臨床試験における評価が必要である。培養したヒト由来の卵巣明細胞がん細胞をヒト以外の免疫不全動物の腹腔内に移植する卵巣明細胞がんモデル動物については、培養したヒト由来の卵巣明細胞がん細胞を溶液中に懸濁した状態で免疫不全マウスの腹腔内に移植するモデル（非特許文献２）の他、一旦免疫不全マウスの皮下組織で生育させた後、卵巣明細胞がんの腫瘍塊を別の個体に再移植するモデル（非特許文献３）又は免疫不全マウスにおいて腹膜転移した腫瘍結節を、別の個体に再移植するモデル（非特許文献４）が報告されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】日本婦人科腫瘍学会  卵巣がん治療ガイドライン（第３版）、金原出版株式会社、２０１０年、第２章
【非特許文献２】Ｈａｓｕｍｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００２年、第６２巻、ｐ．２０１９―２０２３
【非特許文献３】Ｋｉｇｕｃｈｉら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ、１９９８年、第１６巻、ｐ．７５１―７５６
【非特許文献４】Ｋｉｇｕｃｈｉら、Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９８年、第８９巻、ｐ．９２３―９３２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、非特許文献２に記載される、免疫不全マウスを用いた公知の卵巣明細胞がんモデル動物は、移植用のがん細胞の調製に長期間の培養が必要であり、培養の過程でマウス個体における生着能などの生体適合性が失われる可能性が高い。さらに、移植後の腹膜転移性などの腹膜播種発症率や腹水貯留量などの病態の程度の再現性も低く不安定であり、新しい治療剤及び予防剤の開発に用いる動物モデルとしては有用でなかった。また、非特許文献３及び４に記載される、腫瘍塊を別の個体に再移植する場合は、移植用腫瘍塊を得るため、複数の免疫不全マウスを用いて生体内で腫瘍を維持し続ける環境が必要であり、技術的な制約があるのみならず、倫理面での課題もあった。そこで本発明は、卵巣明細胞がんの治療剤及び予防剤を評価可能な卵巣明細胞がんモデル動物の作製方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、クローン化し凍結保存することで安定的に供給可能で、倫理的な課題が解決された単一の性質で高い生体適合性を保持したがん細胞を再び免疫不全動物の腹腔内に移植することにより、優れた腹膜播種発症率、腹膜転移した腫瘍の増大及び腹水貯留を伴うヒト卵巣明細胞がんモデル動物を作製する方法を見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、上記課題を解決するための（１）又は（２）の発明を提供する。
（１）  ヒト以外の免疫不全動物の腹腔内にヒト由来の卵巣明細胞がん細胞を移植する移植工程と、上記移植工程後に腹水を貯留した上記免疫不全動物の腹水からがん細胞を回収する回収工程と、上記回収工程で得られたがん細胞をクローン化し、がん細胞株を樹立するクローン化工程と、上記クローン化工程で得られた上記細胞株の中から、移植に使用した上記ヒト由来の卵巣明細胞がん細胞と比較して細胞増殖率が１．４倍以上高く、かつ、ＶＥＧＦ産生量が３倍以上高いがん細胞株を選抜する選抜工程と、上記選抜工程で選抜されたされたがん細胞株をヒト以外の免疫不全動物の腹腔内に移植して腹膜播種する膜播種工程と、を備える、卵巣明細胞がんモデル動物の作製方法。
（２）  上記ヒト由来の卵巣明細胞がん細胞は、ＲＭＧ−Ｉ細胞である、（１）記載の作製方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の方法により、優れた腹膜播種発症率、腹膜転移した腫瘍の増大及び腹水貯留を伴う卵巣明細胞がんモデル動物を作製することができる。当該卵巣明細胞がんモデル動物を用いることにより、卵巣明細胞がん又は腹膜播種した卵巣明細胞がんの治療剤又は予防剤、若しくは腹膜転移による腹水の治療剤又は予防剤の評価が可能となる。また、卵巣明細胞がんの腹膜転移の発症機構の解明に利用することもできる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ヌードマウスの腹腔内にヒト由来の卵巣明細胞がん細胞であるＲＭＧ−Ｉ細胞を移植後、腹水貯留した個体の腹水からがん細胞を回収し、回収したがん細胞を再度ヌードマウスに移植し、腹膜転移した腫瘍重量及び腹水量を示す図である。
【図２】ヌードマウスの腹腔内にヒト由来の卵巣明細胞がん細胞であるＲＭＧ−Ｉ細胞を移植後、腹水貯留した個体の腹水からがん細胞を回収し、限界希釈法により回収したがん細胞をクローン化して樹立したがん細胞株を再度ヌードマウスに移植し、腹膜転移した腫瘍重量及び貯留した腹水量を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の卵巣明細胞がんモデル動物の作製方法は、ヒト以外の免疫不全動物の腹腔内にヒト由来の卵巣明細胞がん細胞を移植する移植工程と、上記移植工程後に腹水を貯留した上記免疫不全動物の腹水からがん細胞を回収する回収工程と、上記回収工程で得られたがん細胞をクローン化し、がん細胞株を樹立するクローン化工程と、上記クローン化工程で得られた上記細胞株の中から、移植に使用した上記ヒト由来の卵巣明細胞がん細胞と比較して細胞増殖率が１．４倍以上高く、かつ、ＶＥＧＦ産生量が３倍以上高いがん細胞株を選抜する選抜工程と、上記選抜工程で選抜されたされたがん細胞株をヒト以外の免疫不全動物の腹腔内に移植して腹膜播種する膜播種工程と、を備えることを特徴とする。なお、「親株」とは、最初の工程で免疫不全動物に移植するヒト由来の卵巣明細胞がん細胞又はその細胞塊を意味する。
【００１１】
上記の移植工程で用いる親株のヒト由来の卵巣明細胞がんは、例えば、セルバンクにて入手可能な細胞株であるＥＳ−２、ＪＨＯＣ−５、ＪＨＯＣ−７、ＪＨＯＣ−９、ＯＶＩＳＥ、ＯＶＭＡＮＡ、ＯＶＴＯＫＯ、ＲＭＧ−Ｉ、ＲＭＧ−ＩＩ、ＴＯＶ２１Ｇだけでなく、ＨＡＣ−２、ＫＫ、ＫＯＣ−７ｃを挙げることができる。また、新たにヒト卵巣明細胞がん患者より樹立した細胞株、さらには株化していない腫瘍も挙げることができるが、これらに限定されない。セルバンクにて入手可能な細胞株としては、ＲＭＧ−Ｉ細胞が好ましい。
【００１２】
また、上記の卵巣明細胞がんは、腹膜播種発症率や細胞増殖率を高めることを目的として、遺伝子発現ベクター又はウイルスベクターを導入したがん細胞を用いてもよい。遺伝子発現ベクター又はウイルスベクターにコードする遺伝子として、例えば、卵巣明細胞がん細胞で発現する増殖因子やｒａｓ遺伝子などのがん関連遺伝子の他、ｍｉＲＮＡ遺伝子、アンチセンス配列、ｓｈＲＮＡ配列を挿入することができる。
【００１３】
上記のヒト以外の免疫不全動物は、免疫不全マウス又は免疫不全ラットが好ましく、免疫不全マウスがより好ましい。また、免疫不全マウスは、Ｆｏｘｎ１ｎｕマウス（以下、ヌードマウス）、重症免疫不全マウス (以下、ＳＣＩＤマウス)、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス又はＮＯＧマウスがより好ましい。ヌードマウスはＫＳＮマウス又はＢａｌｂ／ｃｎｕマウスが挙げられる。また、ヒト以外の免疫不全動物は雌雄いずれも用いることができるが、雌性が好ましい。また、後述する移植工程におけるヒト以外の免疫不全動物と、膜播種工程におけるヒト以外の免疫不全動物とは、同種同系統であることが好ましいが、同種異系統であってもよく、異種であってもよい。例えば、移植工程ではＳＣＩＤマウスに移植し、膜播種工程では、ヌードマウスを用いてもよい。
【００１４】
上記の腹水からがん細胞を回収する回収工程は、密度勾配遠心法を用いて腹水からがん細胞を分離回収する方法又は標識されたがん細胞に特異的な表面抗原マーカーに対する抗体を用いて磁気ビーズやカラム等でがん細胞を回収する方法が考えられ、密度勾配遠心法を用いて腹水からがん細胞を分離回収する方法が好ましい。回収したがん細胞は、培養器にて一定期間培養にクローン化してがん細胞株を樹立してもよく、回収した直後にクローン化してがん細胞株を樹立してもよい。
【００１５】
上記回収工程では、がん細胞の腹腔内移植から４週間以上経過後に腹水貯留した個体から腹水を得ることができ、腹水貯留の形成に応じて６週間以上又は８週間以上経過後の個体から腹水を採取してもよい。また、複数の個体から得られた腹水からがん細胞を回収してもよく、最も腹水貯留量が多い個体から採取された腹水から、がん細胞を回収してもよい。さらに、腹水貯留量が多い個体、腹水中のがん細胞率が高い個体又は腹膜播種した腫瘍重量が多い個体から選択して回収してもよい。
【００１６】
上記クローン化工程において、上記の腹水から回収されたがん細胞由来のがん細胞株は、限界希釈法により単一クローン細胞を培養してクローン化し、樹立することができる。また、細胞に薬剤耐性遺伝子をトランスフェクションあるいはエレクトロポレーションにより導入し、薬剤耐性を獲得した細胞のコロニーを回収するか、限界希釈法により作製することもできる。得られたがん細胞株は凍結保存することが可能である。
【００１７】
上記選抜工程では、クローン化工程で得られたがん細胞株の中から、親株であるヒト由来の卵巣明細胞がん細胞と比較して、細胞増殖率が１．４倍以上高く、かつ、ＶＥＧＦ産生量が３倍以上高いがん細胞株を選抜している。上記選抜工程で選抜されたされたがん細胞株をヒト以外の免疫不全動物の腹腔内に移植して腹膜播種する膜播種工程を経て、卵巣明細胞がんモデル動物が作製される。
【００１８】
「卵巣明細胞がん」とは、卵巣明細胞腺がんとも言い、卵巣の子宮内膜症から発生すると考えられている。卵巣明細胞がん患者の血清中では、組織因子経路インヒビター２（ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ２：ＴＦＰＩ２）が高値を示すことが２０１６年のＰｌｏｓ  Ｏｎｅ（ＤＯＩ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１６５６０９）に記載されている。
【００１９】
「免疫不全動物」とは免疫細胞の一部あるいはその機能を欠損することを特徴とし、種の異なる細胞に対する免疫反応を惹起しないため、ヒト由来のがん細胞を移植できる。免疫不全動物には、ヌードマウスやＳＣＩＤマウスの他、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス等が含まれる。さらにＩＬ−２受容体γサブユニットを欠損したＮＯＧマウス、Ｒａｇ２欠損マウス及びＲａｇ２欠損／ＩＬ−２受容体γサブユニット欠損マウス等の重度の超不全マウスが含まれる。
【００２０】
「腹膜播種」とは、原発巣を出て腹膜に広がるがん細胞の状態のことを意味し、そのような状態を「腹膜転移」ともいう。腹膜播種の状態では、「癌性腹膜炎」及び「癌性腹水」の併発が認められることがある。また、「癌性腹水」とは、がんの腹膜播種を原因とする腹腔内への血液成分の滲出を意味し、「悪性腹水」又は「腹水」ともいう。
【００２１】
「がん細胞株」とは、単一細胞をクローニングする「クローン化」のプロセス（クローン化工程）を経て樹立した細胞株を意味する。「クローン化」とは、異なる性質を持つ複数の細胞母集団から単一細胞を取得することを意味し、腹水中の様々な性質を有するがん細胞の集団から単一の性質を持つ細胞を選択するために実施する。
【００２２】
「細胞増殖」とは、がん細胞を培養プレート等に播種した後、一定期間経過の細胞数をカウントすることで評価することができ、細胞数を血球計算盤の他、市販の細胞増殖アッセイ試薬を用いて測定できる。その他の細胞増殖アッセイではコロニー形成法、クリスタルバイオレット法、[３Ｈ]チミジン取り込み法、ＭＴＴ法、ＷＳＴ法及びこれらの同様の測定方法の他、エステラーゼ活性やＡＴＰ産生量を指標とした評価方法を利用することができる。がん細胞株の「細胞増殖」の評価は、親株であるヒト由来の卵巣明細胞がん細胞と同じ細胞播種数及び培養期間で培養した後、市販のＭＴＴキットを用いて測定し、比較評価することができる。
【００２３】
「ＶＥＧＦ」とは血管内皮細胞増殖因子ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒの略であり、ＶＥＧＦ−Ａのことを示し、アミノ酸数１６５個のＶＥＧＦ１６５が特に好ましい。がん細胞株のＶＥＧＦ１６５産生量の評価は、市販のＥＬＩＳＡキットを用いて測定することができ、親株であるヒト由来の卵巣明細胞がん細胞と同じ条件で培養した培養上清中のＶＥＧＦ１６５産生量を測定し、比較評価することができる。ＶＥＧＦは、腫瘍周囲の血管に作用し、血管新生を誘導することにより腫瘍の増大を促進させることができる。また、ＶＥＧＦは、血管透過性亢進作用を有し、腹膜播種したがん細胞が周辺の血管内皮細胞に作用し、腹水の貯留を促進させることができる。
【００２４】
本発明の卵巣明細胞がんモデル動物の作製方法は、樹立されたがん細胞株から、親株であるヒト由来の卵巣明細胞がん細胞と比較して細胞増殖率が１．４倍以上高く、かつ、ＶＥＧＦ産生量が３倍以上高いがん細胞株を選抜する選抜工程を経たがん細胞株をヒト以外の免疫不全動物の腹腔内に移植して腹膜播種することを特徴とし、親株の細胞を移植した卵巣明細胞がんモデル動物と比較して、腹膜播種した腫瘍重量及び腹水貯留量の増加が認められることにより確認できる。免疫不全マウスに移植後、４週間以上で腹膜播種が認められ、腹水貯留も認められる。
【００２５】
また、上記の卵巣明細胞がんモデル動物の作製方法は、がん細胞株を培養フラスコにて増殖させ、Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（以下、ＰＢＳ（−））やＨａｎｋ‘ｓｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（以下、ＨＢＳＳ（−））等の水溶液中に懸濁し、０．５×１０６細胞／個体から５×１０７細胞／個体の範囲で免疫不全マウスの腹腔内に移植することにより作製できる。また、０．５×１０６細胞／個体から２×１０７細胞／個体の範囲で免疫不全マウスの腹腔内に移植することが好ましく、１×１０７細胞／個体から２×１０７細胞／個体の範囲がより好ましい。
【００２６】
本発明の卵巣明細胞がんモデル動物の作製方法により作製された卵巣明細胞がんモデル動物は、従来の方法と比べて早期に腹膜播種及び腹水貯留が認められ、腹膜播種発症率も高く、腹膜播種した腫瘍重量及び腹水貯留量の増加を伴うことを特徴とする。従って、本発明の卵巣明細胞がんモデル動物の作製方法により作製された卵巣明細胞がんモデル動物は医薬のスクリーニングに利用できる。このように、有効な治療剤がない卵巣明細胞がん又は卵巣明細胞がんを原因とする腹膜転移がんの治療剤開発に適した特徴を持つため、優れた卵巣明細胞がん治療剤の非臨床における評価モデルとして用いることができる。また、卵巣明細胞がんの腹膜播種による癌性腹水の治療剤の開発にも適した特徴を持つため、癌性腹水治療剤の非臨床における評価モデルとして用いることもできる。
【００２７】
本発明の卵巣明細胞がんモデル動物の作製方法により作製された卵巣明細胞がんモデル動物を用いた評価によって得られた医薬は、卵巣明細胞がんの腹膜播種の治療剤又は予防剤若しくは癌性腹水の治療剤又は予防剤として利用できる。
【００２８】
上記の卵巣明細胞がんモデル動物を用いて、卵巣明細胞がん治療剤、腹膜転移がん治療剤又は癌性腹水治療剤等の薬剤を評価する場合、がん細胞株の移植前、移植と同時、又は移植後のどのタイミングであっても、ヒト以外の免疫不全動物に投与を開始することができる。上記の薬剤は、経口、皮下、皮内、静脈内、腹腔内、経鼻又は経肺で卵巣明細胞がんモデル動物に投与することができる。薬剤の投与間隔及び期間は最適な方法で実施でき、連日投与、隔日投与から週１〜２回投与、隔週投与などから選択することが可能である。
【００２９】
上記の薬剤は、化合物、ペプチド、核酸、糖、脂質、タンパク質、細胞又はこれらの複合体若しくは共有結合体から選択することができる。また、細胞は、遺伝子発現ベクターを導入した遺伝子組換え細胞を投与することもできる。
【００３０】
上記の卵巣明細胞がんモデル動物を用いて得られた、卵巣明細胞がん治療剤、腹膜転移がん治療剤、又は癌性腹水治療剤は、ヒトに対する有用な医薬品として用いることができる。
【実施例】
【００３１】
以下の実施例により、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は、これらによって限定されるものではない。
【００３２】
（参考例１）腹水からがん細胞を回収する回収工程：
ヒト由来の卵巣明細胞がん細胞であるＲＭＧ−Ｉ細胞をヒューマンサイエンス振興財団研究資源バンクから入手し、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＨａｍ’ｓ Ｆ−１２培地で培養した。７週齢の雌性ＫＳＮ／ｓｌｃマウス（日本エスエルシー、５週齢で入荷）の腹腔内に２×１０７細胞を移植した。８週間経過後、腹水貯留した個体から１８Ｇ注射針とシリンジを用いて腹水を採取した。
【００３３】
腹水中のがん細胞は、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ、１９８５年、第５１巻、ｐ２５３−２５８に記載の方法に従い、Ｐｅｒｃｏｌｌ（ＧＥヘルスケア社製）を用いた密度勾配遠心法により分離した。具体的には、まず回収した約４ｍＬの腹水は遠心機（株式会社トミー精工製、ＳＲＸ−２１０、Ｒｏｔｅｒ３７．４）を用いて１８０×ｇ、５分間、４ｏＣの条件で遠心し、沈殿した細胞を１０ｍＬの３０％  Ｐｅｒｃｏｌｌ／ＨＢＳＳ（−）溶液で懸濁した。次に、５０ｍＬ遠沈管（コニカルチューブ）内に下から６０％、５０％及び４０％Ｐｅｒｃｏｌｌ／ＨＢＳＳ（−）溶液（各１０ｍＬ）の３層勾配を形成させ、その上に上記の細胞懸濁液をゆっくり重層した。遠心機（株式会社トミー精工製、ＳＲＸ−２１０、Ｒｏｔｅｒ３７．４）で８００×ｇ、３０分間、４ｏＣで遠心し、がん細胞の分画（最上層）を回収した。
【００３４】
分離した細胞はＨＢＳＳで２回、培地で１回洗浄し、フラスコで培養した。上記のように腹水から分離・回収した細胞をＲＭＧ−ＩＡ（子株）とし、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを添加したＨａｍ’ｓ Ｆ−１２（以下、継代培地）を用いて培養した。２〜４日に一回の頻度で培地を交換した。細胞保存液は、セルバンカー（血清含有タイプ）で懸濁し、セラムチューブに分注して−８０ｏＣ以下のディープフリーザー又は液体窒素内で保管した。
【００３５】
次に、ＲＭＧ−Ｉ細胞又はＲＭＧ−ＩＡ細胞をＫＳＮ／ｓｌｃマウスの腹腔内に移植し、腹水の貯留量等について比較評価した。
【００３６】
フラスコにて培養したＲＭＧ−Ｉ細胞又はＲＭＧ−ＩＡ細胞は、ＰＢＳ（−）で洗浄した後、トリプシン/ＥＤＴＡ溶液を添加して３７ｏＣで５分間インキュベーションして剥がし、培地で懸濁した。細胞懸濁液を５０ｍＬの遠心チューブに回収し、細胞数を計数した。残りの細胞懸濁液を ４ｏＣ／１０００ｒｐｍ／３分間遠心分離（株式会社トミー精工、ＳＲＸ−２１０、Ｒｏｔｅｒ３７．４）し、上清を除去した。沈殿した細胞のペレットをタッピング等でほぐし、氷冷したＨＢＳＳ（−）を添加した。この遠心分離と上清の除去及びＨＢＳＳ（−）の添加の操作を２回繰り返すことにより、細胞を洗浄し、最終的に１ｍＬのＨＢＳＳ（−）に懸濁した。その後、ＨＢＳＳ（−）にて細胞濃度を４×１０７細胞／ｍＬに調製し、調製済の細胞懸濁液とした。この調製済の細胞懸濁液は投与まで氷上で保管した。
【００３７】
上記で調製済の細胞懸濁液を無麻酔下にて７週齢の雌性ＫＳＮ／ｓｌｃマウスの腹腔内に０．５ｍＬ／個体／（２×１０７細胞／個体）投与した（移植０日目、ｄａｙ０）。ＲＭＧ−Ｉ細胞移植群及びＲＭＧ−ＩＡ細胞移植群の例数は、それぞれ５例ずつとした。ＲＭＧ−Ｉ細胞及びＲＭＧ−ＩＡ細胞を移植したマウスについて、３〜８日間に１度程度、マウスの体重、外見及び腹水貯留等を観察した。
【００３８】
移植５週後に腹水貯留量、移植６週後（ｄａｙ４２）に腹腔内の腫瘍重量を評価した。マウスを頸椎脱臼にて安楽死させ、１８Ｇの翼付き注射針を用いて穿刺により腹水を採取した。得られた腹水貯留量及び腫瘍重量の結果を、図１Ａ及び図１Ｂに示す。図１Ａの縦軸は、腹水重量（ｍｇ、平均値±標準誤差）を示す。図１Ｂの縦軸は、腫瘍重量を（ｍｇ、平均値±標準誤差）を示す。図１Ａ及び図１Ｂの横軸の「ＲＭＧ−Ｉ」は、親株のＲＭＧ−Ｉ細胞移植群を示し、「ＲＭＧ−ＩＡ」は、ＲＭＧ−ＩＡ細胞移植群を示す。
【００３９】
その結果、ＲＭＧ−Ｉ細胞移植群では腹水貯留しない個体を認めたが、ＲＭＧ−ＩＡ細胞移植群では全個体に腹水貯留が認められた。また、腹水貯留量では、親株のＲＭＧ−Ｉ細胞移植群と比べてＲＭＧ−Ｉ細胞移植群が高い値を示した（図１Ａ）。さらに、腹水穿刺後に、開腹し、腹膜転移した腫瘍塊を採取したところ、ＲＭＧ−ＩＡ細胞移植群の方が親株のＲＭＧ−Ｉ細胞移植群と比べて腫瘍重量が増加しているのが認められた（図１Ｂ）。これらの結果は、親株のＲＭＧ−Ｉ細胞と比べてＲＭＧ−ＩＡ細胞のマウス個体における生着能などの生体適合性の向上が原因と考えられる。
【００４０】
以上の結果から、親株のＲＭＧ−Ｉ細胞を腹腔内に投与し、腹水貯留した免疫不全マウスより得られた腹水から回収した卵巣明細胞がん細胞を、再度、免疫不全マウスの腹腔内に移植した場合、腹膜播種する腫瘍重量及び腹水貯留量が増加し、腹膜播種発症率も上昇することが明らかになった。
【００４１】
（参考例２）回収工程で得られたがん細胞をクローン化し、がん細胞株を樹立するクローン化工程：
腹水から回収した卵巣明細胞がん細胞のがん細胞株は、限界希釈法により樹立した。具体的には、上記の参考例１において回収したＲＭＧ−ＩＡ細胞をフラスコ内で２回継代した後、参考例１で使用した同じ継代培地を用いて希釈して９６ウェルプレートに０．５細胞/ウェルとなるように播種し、単一の細胞の増殖が認められたウェルをトリプシン/ＥＤＴＡで処理し、細胞を回収して、徐々にスケールアップしながら継代し、７種のがん細胞株を得た。これらがん細胞株は継代培地を用い、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで培養し維持した。７種のがん細胞株について、細胞増殖率及びＶＥＧＦ−Ａ産生量を測定した。
【００４２】
（１）細胞増殖アッセイ
ＲＭＧ−ＩＡ細胞の各がん細胞株の細胞増殖の評価は以下の通り実施した。各がん細胞株を９６ウェルプレートに２．５×１０４細胞／ウェルとなるように播種して６８時間培養し、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ試薬（Ｇ３５８１；Ｐｒｏｍｅｇａ）を２０μＬ／ウェルずつ添加して３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにて６０分間静置した後、プレートリーダーにて吸光度（４９０ｎｍ）を測定した。各がん細胞株の細胞増殖能は、以下の式１を用いてＲＭＧ−Ｉ細胞の吸光度（波長４９０ｎｍ）を１００％とした細胞増殖率（％  ｏｆ  ｃｏｎｔｒｏｌ）として示した。例数は３例（３ウェル）とした。
細胞増殖率（％  ｏｆ  ｃｏｎｔｒｏｌ）＝がん細胞株の吸光度÷ＲＭＧ−Ｉ細胞の吸光度×１００  ・・・式１
【００４３】
その結果を表１に示す。細胞増殖率は（％  ｏｆ  ｃｏｎｔｒｏｌ）で示した（Ｎ＝３、平均値±標準誤差）。表中の「ＲＭＧ−Ｉ」は親株のＲＭＧ−Ｉ細胞を示し、表中の「Ａ１」、「Ｂ１」、「Ｂ２」、「Ｂ４」、「Ｃ２」、「Ｃ５」及び「Ｄ２」はそれぞれのがん細胞株を示す。
【００４４】
【表１】
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【００４５】
がん細胞株Ａ１は親株のＲＭＧ−Ｉ細胞と比較して１２０％程度、がん細胞株Ｂ１及びがん細胞株Ｂ２は親株のＲＭＧ−Ｉ細胞と比較して１４０％程度、がん細胞株Ｃ５は親株のＲＭＧ−Ｉ細胞と比較して１６０％程度に細胞増殖率が上昇することが認められた。一方、がん細胞株Ｂ４、がん細胞株Ｃ２及びがん細胞株Ｄ２の細胞増殖率は、親株のＲＭＧ−Ｉ細胞の細胞増殖率と同等であった。
【００４６】
この結果より、腹水から回収したＲＭＧ−ＩＡ細胞のがん細胞株には、親株のＲＭＧ−Ｉ細胞よりも細胞増殖率の優れた細胞が存在するだけでなく、同等の細胞増殖率を示す細胞が含まれていることが明らかになった。
【００４７】
（２）ＶＥＧＦ−Ａ生産量の定量
各がん細胞株を９６ウェルプレートに１×１０５細胞/ウェルとなるように播種して６８時間培養した。培養上清を回収し、測定までポリプロピレン製９６ウェルプレートに移してシールし、−８０ｏＣ設定の冷凍庫で保管した。培養上清中に分泌されたＶＥＧＦ−Ａ濃度は市販のＥＬＩＳＡキット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、ＢＭＳ２７７）を用い、キット添付の操作プロトコールに従い、測定した。例数は２例（２ウェル）とした。
【００４８】
その結果を表１に示す。培養上清中のＶＥＧＦ−Ａ濃度はｐｇ／ｍＬで示した（Ｎ＝２、平均値）。表中の「ＲＭＧ−Ｉ」は親株のＲＭＧ−Ｉ細胞を示し、表中の「Ａ１」、「Ｂ１」、「Ｂ２」、「Ｂ４」、「Ｃ２」、「Ｃ５」及び「Ｄ２」はそれぞれがん細胞株を示す。
【００４９】
がん細胞株Ａ１、がん細胞株Ｂ１及びがん細胞株Ｂ２は親株のＲＭＧ−Ｉ細胞と比較して３倍以上、がん細胞株Ｃ２は親株のＲＭＧ−Ｉ細胞と比較して２倍以上、がん細胞株Ｃ５及びがん細胞株Ｄ２は親株のＲＭＧ−Ｉ細胞と比較して２倍程度にＶＥＧＦ−Ａ産生量が上昇することが認められた。一方、がん細胞株Ｂ４のＶＥＧＦ−Ａ産生量は、親株のＲＭＧ−Ｉ細胞のＶＥＧＦ−Ａ産生量と同等であった。
【００５０】
この結果より、腹水から回収したＲＭＧ−ＩＡ細胞のがん細胞株には、親株のＲＭＧ−Ｉ細胞よりもＶＥＧＦ−Ａ産生量の優れた細胞が存在するだけでなく、同等のＶＥＧＦ−Ａ産生量を示す細胞が含まれていることが明らかになった。
【００５１】
（実施例１）選抜された細胞増殖率及びＶＥＧＦ−Ａ産生量が高いがん細胞株を移植して腹膜播種された卵巣明細胞がんモデル動物の作製：
参考例２でクローン化したがん細胞株から、細胞増殖率が親株のＲＭＧ−Ｉ細胞と比較して１４０％以上（すなわち１．４倍以上）、かつ、ＶＥＧＦ−Ａ産生量が３倍以上高いがん細胞株Ｂ２を選抜する選抜工程を行った。その後、選抜されたがん細胞株Ｂ２の調製済み細胞懸濁液を調製した。
【００５２】
がん細胞株Ｂ２の調製済み細胞懸濁液は、細胞濃度を３×１０７細胞／ｍＬにした以外は、参考例１に記載された方法と同様の操作を得て調製し、マウスへの投与まで氷上で保管した。膜播種工程として、７週齢の雌性ＫＳＮ／ｓｌｃマウスの腹腔内に対し、無麻酔下にてがん細胞株Ｂ２の調製済み細胞懸濁液を０．５ｍＬ／個体／（１．５×１０７細胞／個体）投与して腹膜播種を行い、実施例１の卵巣明細胞がんモデル動物を８例作製した。
【００５３】
（比較例１）ＶＥＧＦ−Ａ産生量のみが高いがん細胞株を移植した卵巣明細胞がんモデル動物の作製：
参考例２でクローン化したがん細胞株から、親株のＲＭＧ−Ｉ細胞と比較してＶＥＧＦ−Ａ産生量のみが高いがん細胞株として、がん細胞株Ｃ２を選抜する選抜工程を行った。その後、このがん細胞株Ｃ２の調製済み細胞懸濁液を調製した。
【００５４】
がん細胞株Ｃ２の調製済み細胞懸濁液は、細胞濃度を３×１０７細胞／ｍＬにした以外は、参考例１に記載された方法と同様の操作を得て調製し、マウスへの投与まで氷上で保管した。膜播種工程として、７週齢の雌性ＫＳＮ／ｓｌｃマウスの腹腔内に対し、無麻酔下にてがん細胞株Ｃ２の調製済み細胞懸濁液を０．５ｍＬ／個体／（１．５×１０７細胞／個体）投与して腹膜播種を行い、比較例１の卵巣明細胞がんモデル動物を７例作製した。
【００５５】
実施例１の卵巣明細胞がんモデル動物と、比較例１の卵巣明細胞がんモデル動物における移植後の腹膜転移した腫瘍重量及び腹水重量の比較：
実施例１の卵巣明細胞がんモデル動物と比較例１の卵巣明細胞がんモデル動物について、３〜８日間に１度程度、マウスの体重、外見及び腹水貯留等を観察した。
【００５６】
また、実施例１の卵巣明細胞がんモデル動物と比較例１の卵巣明細胞がんモデル動物について、移植５週後に腹水貯留量、移植６週後に腹膜転移した腫瘍重量を評価した。腹水貯留量及び腹膜転移した腫瘍重量の評価は参考例１と同一の方法で実施した。得られた腹水貯留量及び腫瘍重量の結果を、図２Ａ及び図２Ｂに示す。図２Ａの縦軸は、腹水重量（ｍｇ、平均値±標準誤差）を示す。図２Ｂの縦軸は、腫瘍重量を（ｍｇ、平均値±標準誤差）を示す。図２Ａ及び図２Ｂの横軸の「実施例１」は、実施例１の卵巣明細胞がんモデル動物を示し、「比較例１」は、比較例１の卵巣明細胞がんモデル動物を示す。
【００５７】
その結果、いずれのがん細胞株移植群においても全個体に腹水貯留が認められたが、実施例１は、比較例１と比べて２倍以上増加した腹水貯留量を示した（図２Ａ）。腹水穿刺後に、開腹し、腹膜転移した腫瘍塊を採取したところ、実施例１の方が比較例１と比べて腫瘍重量が増加していた（図２Ｂ）。
【００５８】
以上の結果から、腹水から回収した卵巣明細胞がん細胞をクローン化して得られたがん細胞株から、細胞増殖率が１．４倍以上かつＶＥＧＦ−Ａ産生量が３倍以上高いがん細胞株を選抜し、選抜されたがん細胞株を免疫不全マウスの腹腔内に移植して腹膜播種した場合、腹膜播種する腫瘍重量及び腹水貯留量が増加し、腹膜播種発症率も上昇することが明らかになった。
【００５９】
上記の実施例から、本発明の方法により優れた腹膜播種発症率、腹膜転移腫瘍の増大及び腹水貯留を伴うヒト卵巣明細胞がんモデル動物を作製できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明の方法により、卵巣明細胞がんモデル動物を作製することができる。当該モデル動物を用いることにより、卵巣明細胞がん又は腹膜播種した卵巣明細胞がんの治療剤又は予防剤若しくは腹膜転移による腹水の治療剤又は予防剤の評価に利用できる。
【図１】
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【図２】
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