(57)【要約】【課題】ランダムプライマーを用いた核酸増幅反応により簡便に且つ再現性に優れたDNAライブラリーを作製する際に、葉緑体ゲノムに由来したDNA断片の増幅を大幅に削減する。【解決手段】TAAGAGACAGNNで表されるオリゴヌクレオチド群のうち３’末端の２塩基がTG及びTAAGAGACAGNNNで表されるオリゴヌクレオチド群のうち３’末端の３塩基がTGCであるオリゴヌクレオチドを除くオリゴヌクレオチドをランダムプライマーとして含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
TAAGAGACAGNN（配列番号２０６０、NはA、G、C又はTのいずれか）で表されるオリゴヌクレオチド群のうち３’末端の２塩基がTGであるオリゴヌクレオチドを除く１５種類のオリゴヌクレオチド群及びTAAGAGACAGNNN（配列番号２０６１、NはA、G、C又はTのいずれか）で表されるオリゴヌクレオチド群のうち３’末端の３塩基がTGCであるオリゴヌクレオチドを除く６３種類のオリゴヌクレオチド群から選ばれる１又は複数のオリゴヌクレオチドをランダムプライマーとして含む、ランダムプライマーセット。
【請求項２】
上記１５種類のオリゴヌクレオチド群のうち、配列番号２０６０の塩基配列における３’末端の２塩基がGG、GT、AT又はCCであるオリゴヌクレオチドのうち少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含まないことを特徴とする請求項１記載のランダムプライマーセット。
【請求項３】
上記６３種類のオリゴヌクレオチド群のうち、配列番号２０６１の塩基配列における３’末端の３塩基がGGA、GGG、GTG、GTA、ATA又はCCAであるオリゴヌクレオチドのうち少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含まないことを特徴とする請求項１記載のランダムプライマーセット。
【請求項４】
ゲノムDNA及び請求項１〜３いずれか一項記載のランダムプライマーセットのランダムプライマーを高濃度で含む反応液にて核酸増幅反応を行い、ゲノムDNAを鋳型として当該核酸増幅反応により得られたDNA断片を取得する、DNAライブラリーの作製方法。
【請求項５】
上記反応液は４〜２００μＭの上記ランダムプライマーを含むことを特徴とする請求項４記載のDNAライブラリーの作製方法。
【請求項６】
上記反応液は４〜１００μＭの上記ランダムプライマーを含むことを特徴とする請求項４記載のDNAライブラリーの作製方法。
【請求項７】
ゲノムDNA及び請求項１〜３いずれか一項記載のランダムプライマーセットのランダムプライマーを高濃度で含む第1の反応液にて核酸増幅反応を行い、ゲノムDNAを鋳型として当該核酸増幅反応により得られた第1のDNA断片を取得する工程と、
得られた第1のDNA断片と、上記ランダムプライマーにおける少なくとも５’末端側の塩基配列と７０％以上一致する塩基配列を３’末端に含むヌクレオチドをプライマーとして含む第2の反応液にて核酸増幅反応を行い、上記第1のDNA断片に上記ヌクレオチドを連結した第2のDNA断片を取得する工程とを含む、DNAライブラリーの作製方法。
【請求項８】
上記第1の反応液は４〜２００μＭの上記ランダムプライマーを含むことを特徴とする請求項７記載のDNAライブラリーの作製方法。
【請求項９】
上記第1の反応液は４〜１００μＭの上記ランダムプライマーを含むことを特徴とする請求項７記載のDNAライブラリーの作製方法。
【請求項１０】
上記第2のDNA断片を増幅するプライマーが塩基配列決定反応に使用される領域を含む、又は、上記第2のDNA断片を鋳型とした核酸増幅反応若しくは繰り返される核酸増幅反応に使用するプライマーが塩基配列決定反応に使用される領域を含むことを特徴とする請求項７記載のDNAライブラリーの作製方法。
【請求項１１】
請求項４〜１０いずれか一項記載のDNAライブラリーの作製方法により作製されたDNAライブラリー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えばDNAマーカー解析に利用できるDNAライブラリーの作製方法に利用されるランダムプライマーセット及び当該ランダムプライマーセットを用いたDNAライブラリーの作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的にゲノム解析においては、ゲノムに含まれる遺伝情報、例えば塩基配列情報を総合的に解析する。しかし、ゲノム全体の塩基配列を決定する解析には工数及びコストがかかるといった問題がある。また、ゲノムサイズの大きな生物においては、ゲノムの複雑性の問題から塩基配列解析に基づいたゲノム解析には限界がある。
【０００３】
特許文献１には、増幅断片長多型（AFLP）マーカー技術において、アダプタとライゲートした制限酵素処理断片に試料特異的識別子を組み込むこと、制限酵素処理断片の配列の一部のみを決定する方法を開示している。特許文献１に開示された方法では、ゲノムDNAに対する制限酵素処理によってゲノムDNAの複雑性を低減し、制限酵素処理断片の一部を対象として塩基配列を決定することで制限酵素処理断片を十分に同定している。ただし、特許文献１に開示された方法では、ゲノムDNAに対する制限酵素処理やアダプタを用いたライゲーション反応といった工数が必要であり、コストの低減が困難である。
【０００４】
一方、特許文献２には、いわゆるRAPD（Randomly Amplified Polymorphic DNA）法により、米試料から抽出したDNAを適正なプライマー存在下のPCRによって増幅して得られるDNAバンドのうち、食味評価結果と相関の高い識別用DNAマーカーを見いだしたことが開示されている。特許文献２に開示された方法では、特定の配列で限定された複数のSTS（Sequence Tagged Sites）化プライマーを用いることが開示されている。なお、特許文献２に開示された方法では、STS化プライマーを用いて増幅した識別用DNAマーカーを電気泳動により検出している。しかしながら、特許文献２に開示されるようなRAPD法は、PCR増幅の再現性が著しく低く、一般的にDNAマーカー技術として採用することはできない。
【０００５】
また、特許文献３には、ゲノムライブラリーを作製する方法であって、対象のゲノムに比較的よく出現する配列をもとに設計した１種類のプライマーを使用してPCRを行うことにより、ゲノム全領域がほぼ均等に増幅され、その結果、ゲノムライブラリーを作製できることが開示されている。なお、特許文献３には、ランダム配列を含むランダムプライマーを使用してPCRを行うことでゲノムライブラリーを作製できるとの記述があるものの、実際のプロトコル及び実験結果については何ら記載されていない。したがって、特許文献３に記載の方法は、ゲノム出現頻度を特定するためにゲノム塩基配列情報が必要であり、そのための工数及びコストが見込まれる。さらに、特許文献３に記載の方法では、ゲノム全体にわたって増幅を図るためゲノムDNAの複雑性を低減することができないといった問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第５３８９６３８号公報
【特許文献２】特開２００３−７９３７５号公報
【特許文献３】特許第３９７２１０６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ところで、DNAマーカーを利用した遺伝子連鎖解析等のゲノム情報解析には、より簡便に、且つ再現性に優れた方法でDNAライブラリーを作製することが望まれる。上述のように、DNAライブラリーを作製する方法として様々な方法が知られているが、簡便性及び/又は再現性において十分な方法は知られていないのが現状である。そこで、本発明者らは、ランダムプライマーを用いたPCRにおいて、反応液中の当該ランダムプライマーの濃度を所定の範囲に規定するといった非常に簡便な方法により、再現性に優れたDNAライブラリーを作製する系を開発した。
【０００８】
ところが、この系において、特定の配列を有するランダムプライマーを使用した場合に、葉緑体ゲノムに由来するDNA断片が大量に増幅されることが判明した。そこで、本発明は、このような実情に鑑みて、ランダムプライマーを用いた核酸増幅反応により簡便に且つ再現性に優れたDNAライブラリーを作製する際に利用する、葉緑体ゲノムに由来したDNA断片の増幅を大幅に削減できるランダムプライマーセット及び当該ランダムプライマーセットを用いたDNAライブラリーの作製方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、特定の配列を有するランダムプライマーを除いたランダムプライマーセットを使用することで葉緑体ゲノムに由来するDNA断片の増幅を大幅に削減できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１０】
本発明は以下を包含する。
（１）TAAGAGACAGNN（配列番号２０６０、NはA、G、C又はTのいずれか）で表されるオリゴヌクレオチド群のうち３’末端の２塩基がTGであるオリゴヌクレオチドを除く１５種類のオリゴヌクレオチド群及びTAAGAGACAGNNN（配列番号２０６１、NはA、G、C又はTのいずれか）で表されるオリゴヌクレオチド群のうち３’末端の３塩基がTGCであるオリゴヌクレオチドを除く６３種類のオリゴヌクレオチド群から選ばれる１又は複数のオリゴヌクレオチドをランダムプライマーとして含む、ランダムプライマーセット。
（２）上記１５種類のオリゴヌクレオチド群のうち、配列番号２０６０の塩基配列における３’末端の２塩基がGG、GT、AT又はCCであるオリゴヌクレオチドのうち少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含まないことを特徴とする（１）記載のランダムプライマーセット。
（３）上記６３種類のオリゴヌクレオチド群のうち、配列番号２０６１の塩基配列における３’末端の３塩基がGGA、GGG、GTG、GTA、ATA又はCCAであるオリゴヌクレオチドのうち少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含まないことを特徴とする（１）記載のランダムプライマーセット。
（４）ゲノムDNA及び請求項１乃至３いずれか一項記載のランダムプライマーセットのランダムプライマーを高濃度で含む反応液にて核酸増幅反応を行い、ゲノムDNAを鋳型として当該核酸増幅反応により得られたDNA断片を取得する、DNAライブラリーの作製方法。
（５）上記反応液は４〜２００μＭの上記ランダムプライマーを含むことを特徴とする（４）記載のDNAライブラリーの作製方法。
（６）上記反応液は４〜１００μＭの上記ランダムプライマーを含むことを特徴とする（４）記載のDNAライブラリーの作製方法。
（７）ゲノムDNA及び上記（１）乃至（３）いずれか記載のランダムプライマーセットのランダムプライマーを高濃度で含む第1の反応液にて核酸増幅反応を行い、ゲノムDNAを鋳型として当該核酸増幅反応により得られた第1のDNA断片を取得する工程と、得られた第1のDNA断片と、上記ランダムプライマーにおける少なくとも５’末端側の塩基配列と７０％以上一致する塩基配列を３’末端に含むヌクレオチドをプライマーとして含む第2の反応液にて核酸増幅反応を行い、上記第1のDNA断片に上記ヌクレオチドを連結した第2のDNA断片を取得する工程とを含む、DNAライブラリーの作製方法。
（８）上記第1の反応液は４〜２００μＭの上記ランダムプライマーを含むことを特徴とする（７）記載のDNAライブラリーの作製方法。
（９）上記第1の反応液は４〜１００μＭの上記ランダムプライマーを含むことを特徴とする（７）記載のDNAライブラリーの作製方法。
（１０）上記第2のDNA断片を増幅するプライマーが塩基配列決定反応に使用される領域を含む、又は、上記第2のDNA断片を鋳型とした核酸増幅反応若しくは繰り返される核酸増幅反応に使用するプライマーが塩基配列決定反応に使用される領域を含むことを特徴とする（７）記載のDNAライブラリーの作製方法。
（１１）上記（４）乃至（１０）いずれか記載のDNAライブラリーの作製方法により作製されたDNAライブラリー。
【発明の効果】
【００１１】
本発明に係るランダムプライマーセットは、所定の濃度範囲で核酸増幅反応に使用されると、非常に簡便に再現性に優れたDNAライブラリーを作製することができる。このとき、本発明に係るランダムプライマーセットは、特定の塩基配列からなるランダムプライマーを有しないため、当該特定の塩基配列からなるランダムプライマーを有する場合と比較して、葉緑体ゲノム由来のDNA断片の増幅を大幅に抑制することができる。
【００１２】
また、本発明に係るDNAライブラリーの作製方法は、特定の塩基配列からなるランダムプライマーを有しないランダムプライマーセットを使用するため、非常に簡便に再現性に優れたDNAライブラリーであって葉緑体ゲノム由来のDNA断片の料を大幅に抑えたDNAライブラリーを作製することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明に係るDNAライブラリーの作製方法及びDNAライブラリーを利用したゲノムDNA解析方法を示すフローチャートである。
【図２】サトウキビNiF8のDNAを鋳型とし通常条件のPCRにより増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図３】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としアニーリング温度45℃で増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図４】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としアニーリング温度40℃で増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図５】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としアニーリング温度37℃で増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図６】サトウキビNiF8のDNAを鋳型とし酵素量2.5 unitで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図７】サトウキビNiF8のDNAを鋳型とし酵素量12.5 unitで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図８】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としMgCl2濃度2倍で増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図９】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としMgCl2濃度3倍で増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図１０】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としMgCl2濃度4倍で増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図１１】サトウキビNiF8のDNAを鋳型とし8塩基長のランダムプライマーで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図１２】サトウキビNiF8のDNAを鋳型とし9塩基長のランダムプライマーで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図１３】サトウキビNiF8のDNAを鋳型とし11塩基長のランダムプライマーで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図１４】サトウキビNiF8のDNAを鋳型とし12塩基長のランダムプライマーで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図１５】サトウキビNiF8のDNAを鋳型とし14塩基長のランダムプライマーで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図１６】サトウキビNiF8のDNAを鋳型とし16塩基長のランダムプライマーで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図１７】サトウキビNiF8のDNAを鋳型とし18塩基長のランダムプライマーで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図１８】サトウキビNiF8のDNAを鋳型とし20塩基長のランダムプライマーで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図１９】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー濃度2μMで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図２０】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー濃度4μMで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図２１】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー濃度6μMで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（一回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図２２】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー濃度6μMで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（二回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図２３】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー濃度8μMで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（一回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図２４】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー濃度8μMで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（二回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図２５】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー濃度10μMで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（一回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図２６】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー濃度10μMで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（二回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図２７】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー濃度20μMで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（一回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図２８】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー濃度20μMで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（二回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図２９】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー濃度40μMで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（一回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図３０】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー濃度40μMで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（二回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図３１】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー濃度60μMで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（一回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図３２】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー濃度60μMで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（二回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図３３】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー濃度100μMで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（一回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図３４】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー濃度100μMで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（二回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図３５】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー濃度200μMで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（一回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図３６】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー濃度200μMで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（二回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図３７】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー濃度300μMで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（一回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図３８】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー濃度300μMで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（二回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図３９】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー濃度400μMで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（一回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図４０】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー濃度400μMで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（二回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図４１】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー濃度500μMで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（一回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図４２】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー濃度500μMで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（二回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図４３】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー濃度600μMで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図４４】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー濃度700μMで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図４５】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー濃度800μMで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図４６】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー濃度900μMで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図４７】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー濃度1000μMで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図４８】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマーで増幅したDNAライブラリーのMiSeq解析結果を示す特性図である。
【図４９】イネ日本晴のDNAを鋳型としランダムプライマーで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（一回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図５０】イネ日本晴のDNAを鋳型としランダムプライマーで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（二回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図５１】イネ日本晴のDNAを鋳型としランダムプライマーで増幅したDNAライブラリーのMiSeq解析結果を示す特性図である。
【図５２】MiSeqから得られたリードパターンのイネ日本晴ゲノム情報の位置を示す特性図である。
【図５３】ランダムプライマーとイネゲノムのミスマッチ塩基数の度数分布を示す特性図である。
【図５４】マーカーN80521152におけるサトウキビNiF8とNi9、その交雑後代のリード数を示す特性図である。
【図５５】PCRマーカーN80521152におけるサトウキビNiF8とNi9、その交雑後代の電気泳動像を示す写真である。
【図５６】マーカーN80997192におけるサトウキビNiF8とNi9、その交雑後代のリード数を示す特性図である。
【図５７】PCRマーカーN80997192におけるサトウキビNiF8とNi9、その交雑後代の電気泳動像を示す写真である。
【図５８】マーカーN80533142におけるサトウキビNiF8とNi9、その交雑後代のリード数を示す特性図である。
【図５９】PCRマーカーN80533142におけるサトウキビNiF8とNi9、その交雑後代の電気泳動像を示す写真である。
【図６０】マーカーN91552391におけるサトウキビNiF8とNi9、その交雑後代のリード数を示す特性図である。
【図６１】PCRマーカーN91552391におけるサトウキビNiF8とNi9、その交雑後代の電気泳動像を示す写真である。
【図６２】マーカーN91653962におけるサトウキビNiF8とNi9、その交雑後代のリード数を示す特性図である。
【図６３】PCRマーカーN91653962におけるサトウキビNiF8とNi9、その交雑後代の電気泳動像を示す写真である。
【図６４】マーカーN91124801におけるサトウキビNiF8とNi9、その交雑後代のリード数を示す特性図である。
【図６５】PCRマーカーN91124801におけるサトウキビNiF8とNi9、その交雑後代の電気泳動像を示す写真である。
【図６６】サトウキビNiF8のDNAを鋳型とし9塩基長のランダムプライマーで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（一回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図６７】サトウキビNiF8のDNAを鋳型とし9塩基長のランダムプライマーで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（二回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図６８】サトウキビNiF8のDNAを鋳型とし10塩基長のランダムプライマーで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（一回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図６９】サトウキビNiF8のDNAを鋳型とし10塩基長のランダムプライマーで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（二回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図７０】サトウキビNiF8のDNAを鋳型とし11塩基長のランダムプライマーで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（一回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図７１】サトウキビNiF8のDNAを鋳型とし11塩基長のランダムプライマーで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（二回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図７２】サトウキビNiF8のDNAを鋳型とし12塩基長のランダムプライマーで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（一回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図７３】サトウキビNiF8のDNAを鋳型とし12塩基長のランダムプライマーで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（二回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図７４】サトウキビNiF8のDNAを鋳型とし14塩基長のランダムプライマーで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（一回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図７５】サトウキビNiF8のDNAを鋳型とし14塩基長のランダムプライマーで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（二回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図７６】サトウキビNiF8のDNAを鋳型とし16塩基長のランダムプライマーで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（一回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図７７】サトウキビNiF8のDNAを鋳型とし16塩基長のランダムプライマーで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（二回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図７８】サトウキビNiF8のDNAを鋳型とし18塩基長のランダムプライマーで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（一回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図７９】サトウキビNiF8のDNAを鋳型とし18塩基長のランダムプライマーで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（二回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図８０】サトウキビNiF8のDNAを鋳型とし20塩基長のランダムプライマーで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（一回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図８１】サトウキビNiF8のDNAを鋳型とし20塩基長のランダムプライマーで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（二回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図８２】サトウキビNiF8のDNAを鋳型とし、8〜35塩基長のランダムプライマーを0.6〜300μMの濃度範囲で使用して増幅したDNAライブラリーについて再現性を検討した結果を示す特性図である。
【図８３】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー1種で増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（一回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図８４】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー1種で増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（二回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図８５】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー2種で増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（一回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図８６】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー2種で増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（二回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図８７】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー3種で増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（一回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図８８】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー3種で増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（二回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図８９】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー12種で増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（一回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図９０】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー12種で増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（二回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図９１】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー24種で増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（一回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図９２】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー24種で増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（二回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図９３】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー48種で増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（一回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図９４】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー48種で増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（二回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図９５】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー10塩基Bで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（一回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図９６】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー10塩基Bで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（二回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図９７】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー10塩基Cで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（一回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図９８】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー10塩基Cで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（二回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図９９】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー10塩基Dで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（一回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図１００】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー10塩基Dで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（二回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図１０１】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー10塩基Eで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（一回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図１０２】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー10塩基Eで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（二回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図１０３】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー10塩基Fで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（一回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図１０４】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー10塩基Fで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（二回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図１０５】ヒトゲノムDNAを鋳型としランダムプライマー10塩基Aで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（一回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図１０６】ヒトゲノムDNAを鋳型としランダムプライマー10塩基Aで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（二回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図１０７】次世代シーケンス装置に供するDNAライブラリーの作製方法を模式的に示す特性図である。
【図１０８】次世代シーケンス装置に供するDNAライブラリーの作製方法を模式的に示す特性図である。
【図１０９】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー10塩基Gで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（一回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図１１０】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー10塩基Gで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（二回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図１１１】サトウキビNiF8についてランダムプライマー10塩基Gを用いて作製したDNAライブラリーを鋳型とし次世代シーケンサー用プライマーで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（一回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図１１２】サトウキビNiF8についてランダムプライマー10塩基Gを用いて作製したDNAライブラリーを鋳型とし次世代シーケンサー用プライマーで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（二回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図１１３】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー10塩基Gで増幅したDNAライブラリーのMiSeq解析結果を示す特性図である。
【図１１４】イネ日本晴のDNAを鋳型としランダムプライマー12塩基Bで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（一回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図１１５】イネ日本晴のDNAを鋳型としランダムプライマー12塩基Bで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（二回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図１１６】イネ日本晴についてランダムプライマー12塩基Bを用いて作製したDNAライブラリーを鋳型とし次世代シーケンサー用プライマーで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（一回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図１１７】イネ日本晴についてランダムプライマー12塩基Bを用いて作製したDNAライブラリーを鋳型とし次世代シーケンサー用プライマーで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（二回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図１１８】イネ日本晴のDNAを鋳型としランダムプライマー12塩基Bで増幅したDNAライブラリーをMiSeqで解析し得られたリードパターンと、ランダムプライマー配列及びイネ日本晴リファレンス配列の一致率との分布を示す特性図である。
【図１１９】イネ日本晴のDNAを鋳型としランダムプライマー12塩基Bで増幅したDNAライブラリーのMiSeq解析結果を示す特性図である。
【図１２０−１】多くのリードデータがマッピングされた特定領域について、トウモロコシ、イネ、ジャガイモ及びダイズ間で比較した結果を示す特性図である（Region_1_1_Corn：配列番号２１５３、Region_1_1_Oryza：配列番号２１５４、Region_1_1_Potato：配列番号２１５５、Region_1_1_Soybean：配列番号２１５６、Region_2_1_Corn：配列番号２１５７、Region_2_1_Oryza：配列番号２１５８、Region_2_1_Potato：配列番号２１５９、Region_2_1_Soybean：配列番号２１６０）。
【図１２０−２】多くのリードデータがマッピングされた特定領域について、トウモロコシ、イネ、ジャガイモ及びダイズ間で比較した結果を示す特性図である（Region_1_1_Corn：配列番号２１５３、Region_1_1_Oryza：配列番号２１５４、Region_1_1_Potato：配列番号２１５５、Region_1_1_Soybean：配列番号２１５６、Region_2_1_Corn：配列番号２１５７、Region_2_1_Oryza：配列番号２１５８、Region_2_1_Potato：配列番号２１５９、Region_2_1_Soybean：配列番号２１６０）。
【図１２１】多くのリードデータがマッピングされたイネの特定領域について比較した結果を示す特性図である（Region_3_1_Oryza：配列番号２１６１、Region_3_2_Oryza：配列番号２１６２）。
【図１２２】ランダムプライマーセットA〜Fを使用したときに観察される葉緑体ゲノム由来のリードデータ割合を比較して示す特性図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１５】
本発明に係るDNAライブラリーの作製方法では、以下に規定するプライマー群（以下、ランダムプライマーセット）を用い、当該ランダムプライマーセットに含まれるランダムプライマーが高濃度となるように調製した反応液で核酸増幅反応を行い、増幅した核酸断片をDNAライブラリーとするものである。ここで、高濃度とは、通常の核酸増幅反応におけるプライマー濃度と比較して高濃度であることを意味する。すなわち、本発明に係るDNAライブラリー作製方法は、通常の核酸増幅反応におけるプライマー濃度と比較して高濃度のランダムプライマーを使用することに特徴を有している。ここで、反応液に含まれる鋳型としては、DNAライブラリーを作製する対象の生物から調製したゲノムDNAを使用することができる。
【００１６】
なお、本発明に係るDNAライブラリーの作製方法において、対象の生物種には何ら限定されないが、特に、葉緑体ゲノムを有する生物、例えば植物、藻類等を対象とすることができる。すなわち、本発明に係るDNAライブラリーの作製方法によれば、これら葉緑体ゲノムを有する生物、例えば植物、藻類等からDNAライブラリーを作製することができる。
【００１７】
特に、本発明に係るDNAライブラリーの作製方法は、詳細を後述するランダムプライマーセットを使用することで、葉緑体ゲノム由来の核酸断片の増幅を大幅に抑えることができる。すなわち、詳細を後述するランダムプライマーセットを使用することで、核ゲノム由来の核酸残片を多く増幅することができ、主として核ゲノムに関するDNAライブラリーを構築することができる。
【００１８】
また、本DNAライブラリーの作製方法では、ランダムプライマーの濃度を上記のように規定することによって、高い再現性で核酸断片（核酸断片群）を増幅することができる。ここで、再現性とは、同一の鋳型及び同一のランダムプライマーセットを用いて複数回の核酸増幅反応を行った場合に、複数回の核酸増幅反応の間で増幅される核酸断片が一致する程度を意味する。つまり、高い再現性（再現性が高い）とは、同一の鋳型及び同一のランダムプライマーセットを用いて複数回の核酸増幅反応を行った場合に、複数回の核酸増幅反応の間で増幅される核酸断片の一致度が高いことを意味する。
【００１９】
再現性の高低については、例えば、同一の鋳型及び同一のランダムプライマーセットを用いて複数回の核酸増幅反応を行い、各回で得られた増幅断片を電気泳動し得られた蛍光ユニット(Fluorescence Unit: FU)についてスピアマンの順位相関係数を算出し、当該係数に基づいて評価することができる。スピアマンの順位相関係数とは、一般的にρで表され、一例としてはρ＞０．９をもって再現性有りと評価することができる。
【００２０】
〔ランダムプライマー〕
通常、核酸増幅反応を用いて特定のアンプリコンを得るためには、当該アンプリコンに応じてプライマーの塩基配列を設計する。例えば、ゲノムDNA等の鋳型DNAにおけるアンプリコンに対応する位置を挟み込むように一対のプライマーを設計する。この場合、プライマーは、鋳型に含まれる特定の領域にハイブリダイズするように設計されるため「特異的プライマー」と呼称することができる。
【００２１】
これに対して、ランダムプライマーは、特定のアンプリコンを得る目的で設計されるプライマーとは異なり、鋳型DNAにおける特定の領域にハイブリダイズするように設計されるのではなく、ランダムなアンプリコンを得るために設計される。
【００２２】
本発明に係るランダムプライマーセットとは、TAAGAGACAGNN（配列番号２０６０、NはA、G、C又はTのいずれか）で表されるオリゴヌクレオチド群のうち３’末端の２塩基がTGであるオリゴヌクレオチドを除く１５種類のオリゴヌクレオチド群及びTAAGAGACAGNNN（配列番号２０６１、NはA、G、C又はTのいずれか）で表されるオリゴヌクレオチド群のうち３’末端の３塩基がTGCであるオリゴヌクレオチドを除く６３種類のオリゴヌクレオチド群から選ばれる１又は複数のオリゴヌクレオチドをそれぞれランタムプライマーとして含むものである。
【００２３】
言い換えると、本発明に係るランダムプライマーセットとは、５’末端側にTAAGAGACAG（配列番号２０６２）を有するとともに、この塩基配列の３’末端側に任意の２又は３塩基を有するオリゴヌクレオチド群のうち、TAAGAGACAGTG（配列番号２０６３）及びTAAGAGACAGTGC（配列番号２０６４）を除いたオリゴヌクレオチド群から選ばれる１又は複数のオリゴヌクレオチドをそれぞれランタムプライマーとして含むものである。
【００２４】
TAAGAGACAGNN（配列番号２０６０、NはA、G、C又はTのいずれか）で表されるオリゴヌクレオチド群のうち３’末端の２塩基がTGであるオリゴヌクレオチドを除く１５種類のオリゴヌクレオチド群には、下記表１に示すように、配列番号２０６５〜２０７９に示した塩基配列を有する１５種類のオリゴヌクレオチドが含まれる。
【００２５】
【表１】
2018191598.tif 000002
【００２６】
また、TAAGAGACAGNNN（配列番号２０６１、NはA、G、C又はTのいずれか）で表されるオリゴヌクレオチド群のうち３’末端の３塩基がTGCであるオリゴヌクレオチドを除く６３種類のオリゴヌクレオチド群には、下記表２に示すように、配列番号２０８０〜２１４２に示した塩基配列を有する６３種類のオリゴヌクレオチドが含まれる。
【００２７】
【表２】
2018191598.tif 000003
【００２８】
以上のように、ランダムプライマーは、表１に示した１５種類のオリゴヌクレオチド及び表２に示した６３種類のオリゴヌクレオチドの合計７８種類のオリゴヌクレオチドから任意に選ぶことができる。ここで、本発明に係るランダムプライマーセットに含まれるランダムプライマーは、上述した７８種類のオリゴヌクレオチドの全てでも良く、また、７８種類のオリゴヌクレオチドから選ばれる１種類のオリゴヌクレオチド、５種類のオリゴヌクレオチド、１０種類のオリゴヌクレオチド、２０種類のオリゴヌクレオチド、４０種類のオリゴヌクレオチド、６０種類のオリゴヌクレオチドでもよい。これら７８種類のオリゴヌクレオチドのうち如何なる配列のオリゴヌクレオチドを選択するかは特に限定されず任意である。
【００２９】
また、本発明に係るランダムプライマーセットは、表１に示した１５種類のオリゴヌクレオチドをランダムプライマーとして含むか、表１に示した１５種類のオリゴヌクレオチドから選ばれる１〜１４種類のオリゴヌクレオチド、例えば５種類のオリゴヌクレオチド又は１０種類のオリゴヌクレオチドをランダムプライマーとして含むものとしてもよい。
をランダムプライマーとして含むものとしてもよい。
【００３０】
特に、表１に示した１５種類のオリゴヌクレオチドからランダムプライマーを選択する場合、TAAGAGACAGGG（配列番号２０７９）、TAAGAGACAGGT（配列番号２０７７）、TAAGAGACAGAT（配列番号２０６６）又はTAAGAGACAGCC（配列番号２０７４）のうち少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含まないように選択することが好ましい。換言すると、表１に示した１５種類のオリゴヌクレオチドからランダムプライマーを選択する場合、TAAGAGACAGGG（配列番号２０７９）、TAAGAGACAGGT（配列番号２０７７）、TAAGAGACAGAT（配列番号２０６６）及びTAAGAGACAGCC（配列番号２０７４）の４種類のうち、全てを含まないか、３種類を含まないか、２種類を含まないか、１種類を含まないようにランダムプライマーを選択することが好ましい。
【００３１】
さらに、本発明に係るランダムプライマーセットは、表２に示した６３種類のオリゴヌクレオチドをランダムプライマーとして含むか、表２に示した６３種類のオリゴヌクレオチドから選ばれる１〜６２種類のオリゴヌクレオチド、例えば１０種類のオリゴヌクレオチド、２０種類のオリゴヌクレオチド、４０種類のオリゴヌクレオチド又は６０種類のオリゴヌクレオチドをランダムプライマーとして含むものとしてもよい。
【００３２】
特に、表２に示した６３種類のオリゴヌクレオチドからランダムプライマーを選択する場合、TAAGAGACAGGGA（配列番号２１２０）、TAAGAGACAGGGG（配列番号２１２２）、TAAGAGACAGGTG（配列番号２１２６）、TAAGAGACAGGTA（配列番号２１２４）、TAAGAGACAGATA（配列番号２０９２）又はTAAGAGACAGCCA（配列番号２１００）のうち少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含まないように選択することが好ましい。換言すると、表２に示した６３種類のオリゴヌクレオチドからランダムプライマーを選択する場合、TAAGAGACAGGGA（配列番号２１２０）、TAAGAGACAGGGG（配列番号２１２２）、TAAGAGACAGGTG（配列番号２１２６）、TAAGAGACAGGTA（配列番号２１２４）、TAAGAGACAGATA（配列番号２０９２）及びTAAGAGACAGCCA（配列番号２１００）の６種類のうち、全てを含まないか、５種類を含まないか、４種類を含まないか、３種類を含まないか、２種類を含まないか、１種類を含まないようにランダムプライマーを選択することが好ましい。
【００３３】
なお、上述した合計７８種類のオリゴヌクレオチドに共通する５’末端側のTAAGAGACAG（配列番号２０６２）は、次世代シーケンサーに使用するアダプタ配列として使用される配列である。
【００３４】
〔核酸増幅反応〕
本発明に係るDNAライブラリーの作製方法では、上述したランダムプライマー及び鋳型としてのゲノムDNAを用いた核酸増幅反応によって、多数の増幅断片を取得する。特に、核酸増幅反応において、反応液中のランダムプライマーの濃度を、通常の核酸増幅反応におけるプライマー濃度と比較して高濃度とする。これにより、高い再現性を達成しながら多数の増幅断片をゲノムDNAを鋳型として得ることができる。これにより、得られた多数の増幅断片は、遺伝子型判定等に利用できるDNAライブラリーとして使用することが可能となる。
【００３５】
さらに、本発明に係るDNAライブラリーの作製方法では、上述したランダムプライマーセットを使用しているため、ゲノムDNAのうち葉緑体ゲノム由来の核酸断片の増幅を大幅に抑えることができる。このため、本発明に係るDNAライブラリーの作製方法によれば、核ゲノム由来の核酸残片を多く増幅することができ、主として核ゲノムに関するDNAライブラリーを構築することができる。
【００３６】
ここで、核酸増幅反応とは、鋳型となるゲノムDNA、上述したランダムプライマー、DNAポリメラーゼ、基質となるデオキシヌクレオチド三リン酸（dNTP、すなわちdATP、dCTP、dTTP及びdGTPの混合物）及びバッファーからなる反応液で、所定の温度サイクル条件を加えることで増幅断片を合成する反応である。なお、核酸増幅反応には、反応液中に所定濃度のMg2+が必要であり、上述した組成においてバッファーにMgCl2が含まれている。バッファーにMgCl2が含まれていない場合、上記組成に加えてMgCl2が含まれることとなる。
【００３７】
特に核酸増幅反応において、ランダムプライマーの濃度は、ランダムプライマーの塩基長に応じて適宜設定することが好ましい。ここで、ランダムプライマーの塩基長は、異なる塩基長の複数種類のヌクレオチドをランダムプライマーとして使用する場合には、その平均値（単純平均でもよいし、ヌクレオチド量を加味した加重平均でもよい）とすることができる。
【００３８】
具体的には、当該ランダムプライマー濃度を４〜２００μＭとする条件、好ましくは４〜１００μＭとする条件で核酸増幅反応を行う。この条件であれば、核酸増幅反応により、高い再現性を達成しながら多数の増幅断片、特に１００〜５００塩基長の多数の増幅断片を得ることができる。
【００３９】
より具体的には、ランダムプライマーの濃度は、ランダムプライマーが１０〜１４塩基長である場合、ランダムプライマーの塩基長をｙとし、ランダムプライマーの濃度をｘとしたときに、ｙ＞３Ｅ＋０８ｘ−６．９７４且つ１００μＭ以下を満たすことが好ましい。
【００４０】
なお、上述したｙ＞３Ｅ＋０８ｘ−６．９７４の不等式は、後述する実施例で説明するように、ランダムプライマーの長さと濃度との関係を詳細に調べた結果、１００〜５００塩基長の多数のDNA断片を再現性良く増幅できる範囲として算出されたものである。
【００４１】
また、核酸増幅反応において鋳型となるゲノムDNAは、特に限定されないが、反応液の量を５０μｌとしたときに、０．１〜１０００ｎｇとすることが好ましく、１〜５００ｎｇとすることがより好ましく、５〜２００ｎｇとすることが更に好ましく、１０〜１００ｎｇとすることが最も好ましい。鋳型となるゲノムDNAの量をこの範囲とすることで、ランダムプライマーからの増幅反応が阻害されることなく、高い再現性を達成しながら多数の増幅断片を得ることができる。
【００４２】
ゲノムDNAの調製方法は、特に限定されず、従来公知の方法を適用することができる。また、市販されているキットを利用することで、対象の生物種から簡便にゲノムDNAを調製することができる。なお、ゲノムDNAとしては、従来公知の方法や市販のキットにより生物から抽出されたものをそのまま使用しても良いし、生物から抽出したものを精製したものでも良いし、制限酵素処理や超音波処理した後のものを使用しても良い。特に、本発明に係るDNAライブラリーの作製方法では、抽出したゲノムDNAから葉緑体ゲノムを除去する工程は不要であり、葉緑体ゲノム及び核ゲノムを含むゲノムDNAを核酸増幅反応の鋳型として使用できる。これは、上述したランダムプライマーセットを使用することで葉緑体ゲノム由来のDNA断片の増幅を大幅に抑制できるからである。
【００４３】
また、核酸増幅反応においてDNAポリメラーゼとしては、特に限定されず、核酸増幅反応のための温度サイクル条件下でDNAポリメラーゼ活性を有する酵素を使用することができる。具体的には、通常の核酸増幅反応に使用される耐熱性DNAポリメラーゼを使用することができる。例えば、DNAポリメラーゼとしては、Taq DNAポリメラーゼ等の好熱細菌由来DNAポリメラーゼ、KOD DNA ポリメラーゼやPfu DNAポリメラーゼ等の超好熱Archaea由来DNAポリメラーゼを挙げることができる。特に、核酸増幅反応においては、上述したランダムプライマーとともに、DNAポリメラーゼとしてはPfu DNAポリメラーゼを使用することが好ましい。これらDNAポリメラーゼを使用することで、高い再現性を達成しながら多数の増幅断片をより確実に得ることができる。
【００４４】
さらに、核酸増幅反応において、基質となるデオキシヌクレオチド三リン酸（dNTP、すなわちdATP、dCTP、dTTP及びdGTPの混合物）の濃度は、特に限定されないが、５μＭ〜０．６ｍＭとすることができ、１０μＭ〜０．４ｍＭとすることが好ましく、２０μＭ〜０．２ｍＭとすることがより好ましい。基質となるdNTPの濃度をこの範囲とすることで、DNAポリメラーゼによる誤った取り込みによるエラーの発生を防止し、高い再現性を達成しながら多数の増幅断片を得ることができる。
【００４５】
さらに、核酸増幅反応において、バッファーとしては、特に限定されないが、上述のようにMgCl2を含み、例えばTris-HCl（pH8.3）及びKClを含む溶液を挙げることができる。ここで、Mg2+の濃度としては、特に限定されないが、例えば０．１〜４．０ｍＭとすることができ、０．２〜３．０ｍＭとすることが好ましく、０．３〜２．０ｍＭとすることがより好ましく、０．５〜１．５ｍＭとすることが更に好ましい。反応液中のMg2+濃度をこの範囲に設定することで、高い再現性を達成しながら多数の増幅断片を得ることができる。
【００４６】
さらにまた、核酸増幅反応における温度サイクル条件としては、特に限定されず、通常の温度サイクルを採用することができる。具体的に温度サイクルとは、先ず、鋳型のゲノムDNAを一本鎖に乖離するための最初の熱変性温度、その後、「熱変性温度→アニーリング温度→伸長反応温度」を複数回（例えば、２０〜４０回）行い、最後に必要であれば、所定時間伸長反応温度とし、最後に保存のための温度とするサイクルを例示することができる。
【００４７】
熱変性温度としては、例えば９３〜９９℃、好ましくは９５〜９８℃、より好ましくは９７〜９８℃とすることができる。アニーリング温度としては、上述したランダムプライマーのTm値にもよるが、例えば３０〜７０℃、好ましくは３５〜６８℃、より好ましくは３７〜６５℃とすることができる。伸長反応温度としては、例えば７０〜７６℃、好ましくは７１〜７５℃、より好ましくは７２〜７４℃とすることができる。また、保存のための温度としては例えば４℃とすることができる。
【００４８】
また、最初の熱変性は、上述した温度範囲において、例えば５秒〜１０分、好ましくは１０秒〜５分、より好ましくは３０秒〜２分とすることができる。「熱変性温度→アニーリング温度→伸長反応温度」のサイクルにおける熱変性は、上述した温度範囲において、例えば２秒〜５分、好ましくは５秒〜２分、より好ましくは１０秒〜１分とすることができる。「熱変性温度→アニーリング温度→伸長反応温度」のサイクルにおけるアニーリングは、上述した温度範囲において、例えば１秒〜３分、好ましくは３秒〜２分、より好ましくは５秒〜１分とすることができる。「熱変性温度→アニーリング温度→伸長反応温度」のサイクルにおける伸長反応は、上述した温度範囲において、例えば１秒〜３分、好ましくは３秒〜２分、より好ましくは５秒〜１分とすることができる。
【００４９】
また、本発明に係るDNAライブラリーの作製方法としては、ホットスタート法を採用した核酸増幅反応によって増幅断片を取得するものでも良い。ホットスタート法とは、「熱変性温度→アニーリング温度→伸長反応温度」のサイクル前のミスプライミングやプライマーダイマーに由来する非特異増幅を防ぐ方法である。ホットスタート法では、抗DNAポリメラーゼ抗体を結合させたり、化学修飾を行うことで、DNAポリメラーゼ活性を抑制させた状態の酵素を使用する。この状態では、DNAポリメラーゼ活性が抑制され、温度サイクル前の非特異的な反応を防止することができる。ホットスタート法では、最初の温度サイクル時に温度を高く設定することでDNAポリメラーゼ活性が回復し、その後の核酸増幅反応が進行することとなる。
【００５０】
以上のように、上述したランダムプライマーセットを使用し、反応液中のランダムプライマー濃度を４〜２００μＭとして核酸増幅反応を行うことで、ゲノムDNAを鋳型としてランダムプライマーから多数の増幅断片（主として核ゲノム由来）を得ることができる。上述したランダムプライマーセットを使用し、反応液中のランダムプライマー濃度を４〜２００μＭとした場合、非常に再現性の高い核酸増幅反応となる。すなわち、上述した核酸増幅反応によれば、非常に高い再現性を達成しながら多数の増幅断片（主として核ゲノム由来）を得ることができる。したがって、得られた多数の増幅断片は、ゲノムDNA（主として核ゲノム）を対象とした遺伝子解析においてDNAライブラリーとして使用することができる。
【００５１】
また、上述したランダムプライマーセットを使用し、反応液中のランダムプライマー濃度を４〜２００μＭとして核酸増幅反応を行うことで、特に、ゲノムDNA（主として核ゲノム）を鋳型として約１００〜５００塩基長の多数の増幅断片を得ることができる。この約１００〜５００塩基長の多数の増幅断片は、例えば次世代シーケンサーによる塩基配列の大量解析に適したサイズであり、高精度な配列情報を得ることができる。すなわち、本発明によれば、主として核ゲノム由来の約１００〜５００塩基長といったDNA断片を含むDNAライブラリーを作製することができる。
【００５２】
さらに、上述したランダムプライマーセットを使用し、反応液中の当該ランダムプライマー濃度を４〜２００μＭとして核酸増幅反応を行うことで、特に、ゲノムDNA（主として核ゲノム）の全体に亘って均一に増幅断片を得ることができる。言い換えると、当該ランダムプライマーを用いた核酸増幅反応では、ゲノムDNAの所定の領域に偏ってDNA断片が増幅されるのではなく、主として核ゲノム全体に分散してDNA断片が増幅される。すなわち、本発明によれば、主として核ゲノム全体に対して均一なDNAライブラリーを作製することができる。
【００５３】
なお、上述したランダムプライマーセットを使用して核酸増幅反応を行った後、得られた増幅断片に対して制限酵素処理、サイズセレクション処理及びシーケンスキャプチャー処理等を行うことができる。増幅断片に対してこれら制限酵素処理、サイズセレクション処理及びシーケンスキャプチャー処理を行うことで、得られた増幅断片のなかから特定の増幅断片（特定の制限酵素部位を有する断片、特定のサイズ範囲の増幅断片、特定の配列を有する増幅断片）を得ることができる。そして、これら各種処理によって得られた特定の増幅断片をDNAライブラリーとして使用することができる。
【００５４】
〔ゲノムDNA解析方法〕
上述のように作製されたDNAライブラリーを使用することで、遺伝子型解析等のゲノムDNA解析を行うことができる。上述のように、DNAライブラリーは、非常に高い再現性を有しており、次世代シーケンサーに適したサイズを有しており、ゲノム全体に亘って均一性を有している。したがって、DNAライブラリーは、DNAマーカー（遺伝マーカー、遺伝子マーカーとも称される）として使用することができる。ここで、DNAマーカーとは、ゲノムDNA内に存在する特徴的な塩基配列を広く意味する。また、DNAマーカーとしては、特に、遺伝的形質に関連する目印となるゲノム上の塩基配列とすることもできる。DNAマーカー、例えば遺伝子型同定、連鎖地図、遺伝子マッピング、マーカーを利用した選抜工程を含む育種、マーカーを利用した戻し交配、量的形質遺伝子座のマッピング、バルクセグリガント分析、品種識別、又は連鎖不均衡マッピング等に利用することができる。
【００５５】
例えば、次世代シーケンサー等を使用して、上述のように作製されたDNAライブラリーの塩基配列を決定し、得られた塩基配列に基づいてDNAマーカーの存否を確認することができる。
【００５６】
一例としては、得られた塩基配列のリード数からDNAマーカーの存否を確認することができる。ここで、次世代シーケンサーとは、特に限定されないが、第2世代シーケンサーとも呼称され、数千万のDNA断片の塩基配列を同時並行的に決定できる塩基配列決定装置を意味する。次世代シーケンサーにおけるシーケンシング原理としては、特に限定されず、例えばブリッジPCR法とSequencing-by-synthesis法により、フローセル上で目的DNAを増幅させ、合成しながらシーケンシングを行うといった原理、或いは、エマルションPCR法とDNA合成時に放出されるピロリン酸の量を測定することで配列決定を行なうパイロシークエンス法とによりシーケンシングを行うといった原理を挙げることができる。より具体的に、次世代シーケンサーとしては、イルミナ社（Illumina）のMiniSeq、MiSeq、NextSeq、HiSeq及びHiSeq Xシリーズ、ロシュ社のRoche 454 GS FLXシーケンサー等を挙げることができる。
【００５７】
また、他の例としては、上述のように作製されたDNAライブラリーについて得られた塩基配列を参照用の塩基配列と比較することでDNAマーカーの存否を確認することができる。ここで、参照用の塩基配列とは、基準となる既知の配列を意味し、例えば、データベースに格納された既知配列とすることができる。すなわち、所定の生物について、上述のようにDNAライブラリーを作製し、その塩基配列を決定し、DNAライブラリーの塩基配列を参照用の塩基配列と比較する。そして、参照用の塩基配列と相違する塩基配列を、当該所定の生物に関するDNAマーカー（ゲノムDNA内に存在する特徴的な塩基配列）とすることができる。また、特定したDNAマーカーについては、定法に従って更に解析することによって、遺伝的形質（表現型）に関連性を決定することができる。すなわち、上述のように特定したDNAマーカーの中から、表現型に関連するDNAマーカー（選抜マーカーと称する場合もある）を特定することができる。
【００５８】
さらに、他の例としては、上述のように作製されたDNAライブラリーについて得られた塩基配列を、他の生物由来のゲノムDNA又は他の組織由来のゲノムDNAを用いて作製した上記DNAライブラリーの塩基配列と比較することでDNAマーカーの存否を確認することができる。すなわち、２以上の生物又は２つの異なる組織について、それぞれ上述のようにDNAライブラリーを作製し、それらの塩基配列を決定し、DNAライブラリーの塩基配列同士を比較する。そして、DNAライブラリー間で相違する塩基配列を、供試した生物又は組織に関するDNAマーカー（ゲノムDNA内に存在する特徴的な塩基配列）とすることができる。また、特定したDNAマーカーについては、定法に従って更に解析することによって、遺伝的形質（表現型）に関連性を決定することができる。すなわち、上述のように特定したDNAマーカーの中から、表現型に関連するDNAマーカー（選抜マーカーと称する場合もある）を特定することができる。
【００５９】
ところで、得られた塩基配列に基づいて当該DNAマーカーを特異的に増幅する一対のプライマーを設計することもできる。設計した一対のプライマーを使用し、対象の生物から抽出したゲノムDNAを鋳型として核酸増幅反応を行うことで、抽出したゲノムDNAにおけるDNAマーカーの存否を確認することもできる。
【００６０】
或いは、上述のように作製されたDNAライブラリーは、微生物等の多種多様性を調べるメタゲノム解析や腫瘍組織などの体細胞ゲノム変異解析、マイクロアレイを利用した遺伝子型解析、倍数性の判定解析、染色体数の算出解析、染色体の増減解析、染色体の部分的挿入・欠失・複製・転座解析、外来ゲノムの混入解析、親子判別解析、交配種子純度検定解析といった解析に利用することができる。
【００６１】
〔次世代シーケンス技術への応用〕
以上のように、上述したランダムプライマーセットを用いて、反応液中のランダムプライマーを高濃度として核酸増幅反応を行うことで、ゲノムDNAを鋳型として多数の増幅断片を再現性良く得ることができる。得られた増幅断片は、その両末端にランダムプライマーと同じ塩基配列を有するため、当該塩基配列を利用することによって簡便に次世代シーケンス技術に供することができる。
【００６２】
具体的には、先ず、上述のように、ゲノムDNA及び高濃度のランダムプライマーを含む反応液（第1の反応液）にて核酸増幅反応を行い、ゲノムDNAを鋳型として当該核酸増幅反応により多数の増幅断片（第1のDNA断片）を取得する。次に、取得した多数の増幅断片（第1のDNA断片）と、上記ランダムプライマーの塩基配列に基づいて設計したプライマー（次世代シーケンサー用プライマーと称す）とを含む反応液（第2の反応液）にて核酸増幅反応を行う。ここで、次世代シーケンサー用プライマーは、塩基配列決定反応に使用される領域を含むヌクレオチドである。より具体的には、例えば、次世代シーケンサー用プライマーは、その３’末端の塩基配列を、第1のDNA断片の５’末端側の塩基配列と７０％以上一致する塩基配列、好ましくは８０％以上一致する塩基配列、より好ましくは９０％以上一致する塩基配列、更に好ましくは９５％以上一致する塩基配列、更に好ましくは９７％以上一致する塩基配列、最も好ましくは１００％一致する塩基配列とするものであり、次世代シーケンス装置による塩基配列決定反応（シーケンス反応）に必要な領域を有するヌクレオチドとすることができる。
【００６３】
ここで、次世代シーケンサー用プライマーに含まれる「塩基配列決定反応に使用される領域」とは、次世代シーケンサーの種類によって異なるため、特に限定されないが、例えば、次世代シーケンサーがシーケンス用プライマーを使用して塩基配列決定反応を実行する場合、当該シーケンス用プライマーの塩基配列に対して相補的な塩基配列とすることができる。また、次世代シーケンサーが所定のDNAを結合したキャプチャービーズを使用して塩基配列決定反応を実行する場合、「塩基配列決定反応に使用される領域」とは、当該キャプチャービーズに結合したDNAの塩基配列に対して相補的な塩基配列とすることができる。さらに、次世代シーケンサーがナノサイズの孔を有するタンパク質を末端にペアピンループを有するDNA鎖が通過したときの電流変化から配列を読み取るものである場合、「塩基配列決定反応に使用される領域」とは、当該ヘアピンループを形成させる塩基配列に対して相補的な塩基配列とすることができる。
【００６４】
次世代シーケンサー用プライマーの３’末端の塩基配列を上述のように設計することで、次世代シーケンサー用プライマーは第1のDNA断片の３’末端にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができ、第1のDNA断片を鋳型として第2のDNA断片を増幅することができる。ここで、ストリンジェントな条件下とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を意味し、例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual(Third Edition)を参照して適宜決定することができる。具体的には、サザンハイブリダイゼーションの際の温度や溶液に含まれる塩濃度、及びサザンハイブリダイゼーションの洗浄工程の際の温度や溶液に含まれる塩濃度によりストリンジェンシーを設定することができる。より詳細には、ストリンジェントな条件としては、例えば、ナトリウム濃度が25〜500mM、好ましくは25〜300mMであり、温度が42〜68℃、好ましくは42〜65℃である。より具体的には、5×SSC(83mM NaCl、83mMクエン酸ナトリウム)、温度42℃である。
【００６５】
特に、上述したランダムプライマーセットを使用して第1のDNA断片を取得した場合、全てのランダムプライマーに対応するように次世代シーケンサー用プライマーを準備しても良いし、一部のランダムプライマーに対応するように次世代シーケンサー用プライマーを準備しても良い。
【００６６】
特に、本発明に係るランダムプライマーセットが複数種類のランダムプライマーを含む場合、３’末端の数塩基（例えば１〜３塩基程度）以外は共通する塩基配列を有している。このため、得られる多数の第1のDNA断片の５’末端は全て共通する配列を有することとなる。そこで、次世代シーケンサー用プライマーの３’末端の塩基配列を、第1のDNA断片の５’末端側において共通する塩基配列と７０％以上一致、好ましくは８０％以上一致、より好ましくは９０％以上一致、最も好ましくは１００％一致する塩基配列とする。このように次世代シーケンサー用プライマーを設計することによって、全てのランダムプライマーに対応する次世代シーケンサー用プライマーとなる。この次世代シーケンサー用プライマーを使用することによって、第1のDNA断片の全てを鋳型として第2のDNA断片を増幅することができる。
【００６７】
また、同様に、本発明に係るランダムプライマーセットにおいて、複数種類のランダムプライマーの３’末端の２又は３塩基以外は共通する塩基配列からなるが、得られた多数の第1のDNA断片のうち一部を鋳型として第2のDNA断片を得ることもできる。具体的には、次世代シーケンサー用プライマーの３’末端の塩基配列を、第1のDNA断片の５’末端側において共通する塩基配列及びそれに続く１〜３塩基数塩基の配列に対して７０％以上一致、好ましくは８０％以上一致、より好ましくは９０％以上一致、最も好ましくは１００％一致する塩基配列とすることで、一部の第1のDNA断片を鋳型として第2のDNA断片を増幅することができる。
【００６８】
以上のように、次世代シーケンサー用プライマーを用いて増幅された第2のDNA断片は、次世代シーケンサー用プライマーに含まれる次世代シーケンス装置による塩基配列決定反応（シーケンス反応）に必要な領域を有している。シーケンス反応に必要な領域とは、次世代シーケンス装置によって異なるため特に限定されない。例えば、ブリッジPCR法とSequencing-by-synthesis法により、フローセル上で目的DNAを増幅させ、合成しながらシーケンシングを行うといった原理の次世代シーケンス装置に使用する場合、次世代シーケンサー用プライマーは、ブリッジPCRに必要な領域及びSequencing-by-synthesis法に必要な領域を含むこととなる。ブリッジPCRに必要な領域とは、フローセル上に固定されたオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする領域であり、次世代シーケンサー用プライマーの５’末端を含む９塩基長の領域である。また、Sequencing-by-synthesis法に必要な領域とは、シーケンス反応に使用するシーケンスプライマーがハイブリダイズする領域であり、次世代シーケンサー用プライマーの中途部の領域である。
【００６９】
また、次世代シーケンス装置としては、Ion Torrentシーケンス装置を挙げることができる。Ion Torrentシーケンス装置を使用する場合、次世代シーケンサー用プライマーは、５’末端側にいわゆるイオンアダプタを有し、エマルジョンPCRを実施する粒子に結合する。また、Ion Torrentシーケンス装置では、エマルジョンPCRにより増幅したテンプレートでコーティングされた粒子をイオンチップに載置し、シーケンス反応に供する。
【００７０】
なお、次世代シーケンサー用プライマー及び第1のDNAを含む第2の反応液を用いた核酸増幅反応は、特に限定されず、通常の核酸増幅反応の条件を適用することができる。すなわち、上述した〔核酸増幅反応〕の欄に記載したような条件を採用することができる。例えば、第2の反応液は、鋳型となる第1のDNA断片、上述した次世代シーケンサー用プライマー、DNAポリメラーゼ、基質となるデオキシヌクレオチド三リン酸（dNTP、すなわちdATP、dCTP、dTTP及びdGTPの混合物）及びバッファーを含む。
【００７１】
特に次世代シーケンサー用プライマーの濃度としては、０．０１〜５．０μＭとすることができ、０．１〜２．５μＭとすることが好ましく、０．３〜０．７μＭとすることが最も好ましい。
【００７２】
また、核酸増幅反応において鋳型となる第1のDNA断片は、特に限定されないが、反応液の量を５０μｌとしたときに、０．１〜１０００ｎｇとすることが好ましく、１〜５００ｎｇとすることがより好ましく、５〜２００ｎｇとすることが更に好ましく、１０〜１００ｎｇとすることが最も好ましい。
【００７３】
鋳型となる第1のDNA断片の調製方法は、特に限定されず、上述したランダムプライマーセットを用いた核酸増幅反応が終わった後の反応液をそのまま使用しても良いし、当該反応液から第1のDNA断片を精製したものを使用しても良い。
【００７４】
また、核酸増幅反応に使用するDNAポリメラーゼの種類、基質となるデオキシヌクレオチド三リン酸（dNTP、すなわちdATP、dCTP、dTTP及びdGTPの混合物）の濃度、バッファー組成、温度サイクル条件については、上述した〔核酸増幅反応〕の欄に記載したような条件とすることができる。また、次世代シーケンサー用プライマーを用いた核酸増幅反応においても、ホットスタート法を採用しても良いし、核酸増幅反応によって増幅断片を取得するものでも良い。
【００７５】
以上のように、ランダムプライマーセットを用いて取得した第1のDNA断片を鋳型とし、次世代シーケンサー用プライマーを用いて増幅した第2のDNA断片を使用することで、次世代シーケンス装置に適用可能なDNAライブラリーを簡便に作製することができる。
【００７６】
なお、上述した例では、ランダムプライマーセットを用いて取得した第1のDNA断片を鋳型とし、次世代シーケンサー用プライマーを用いて増幅した第2のDNA断片をDNAライブラリーとしたが、本発明の技術範囲はこの例に限定されるものではない。例えば、本発明に係るDNAライブラリーは、ランダムプライマーセットを用いて取得した第1のDNA断片を鋳型として第2のDNA断片を増幅し、更に、当該第2のDNA断片を鋳型として次世代シーケンサー用プライマーを用いて第3のDNA断片を取得し、この第3のDNA断片を次世代シーケンス装置に適用可能なDNAライブラリーとしても良い。
【００７７】
次世代シーケンス装置に適用可能なDNAライブラリーを作製するには、同様に、第2のDNA断片を鋳型とした核酸増幅反応の後、得られたDNA断片を鋳型した核酸増幅反応を繰り返し、最後の核酸増幅反応に次世代シーケンサー用プライマーを用いることで作製することができる。このとき、繰り返される核酸増幅反応の回数は、特に限定されないが、２〜１０回、好ましくは２〜５回、より好ましくは２〜３回である。
【００７８】
以上、本発明に係るランダムプライマーセットによれば、ゲノムDNAを鋳型とした高濃度ランダムプライマーによる核酸増幅反応において葉緑体ゲノム由来のDNA断片の増幅を大幅に抑えることができる。このため、上述のように得られた第2のDNA断片は、主として核ゲノム由来となる。一般に、葉緑体ゲノムは細胞あたりのコピー数が数十から数百と多く、特定の領域が核酸増幅反応によって大量に増幅される可能性が高い。上述したような次世代シーケンサー解析では、特定のアンプリコンが大量に存在すると、塩基配列判別用の計算式（マトリックス）の作成に影響し、塩基配列判別の精度が低下する。また、リードデータの推奨冗長度は、数十程であり、大量の重複データはデータロスにつながる。また、解析した塩基配列データを上述したゲノム解析に利用する場合、葉緑体ゲノムのリードデータは不要である。
【００７９】
本発明に係るランダムプライマーセットによれば、上述のように、次世代シーケンサー解析において、葉緑体ゲノム由来のアンプリコンを低減することができるため、核ゲノムの解析に際し判定精度に優れた解析を行うことができる。
【実施例】
【００８０】
以下、実施例を用いて本発明を更に詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【００８１】
〔実施例１〕
１．フローチャート
本実施例では、図１に示したフローチャートに従って、各種生物種から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、各種ランダムプライマーセットを用いたPCRによりDNAライブラリーを作製した。また、作製したDNAライブラリーを用いて、所謂、次世代シーケンサーを用いた配列解析を行い、得られたリードデータに基づいて遺伝子型を解析した。
【００８２】
２．材料
本実施例では、サトウキビ品種NiF8、Ni9及びその交雑後代22系統、並びにイネ品種日本晴からDNeasy Plant Mini kit(QIAGEN)を用いてゲノムDNAを抽出及び精製し、それぞれNiF8由来のゲノムDNA、Ni9由来のゲノムDNA、交雑後代22系統由来のゲノムDNA、日本晴由来のゲノムDNAとして使用した。また、本実施例では、ヒトDNAについてはタカラバイオよりHuman Genomic DNAを購入し、ヒト由来のゲノムDNAとして使用した。
【００８３】
３．方法
３．１  PCR条件とDNA断片のサイズの関係
３．１．１  ランダムプライマーの設計
ランダムプライマーを設計するにあたり、GC含量を20〜70%の範囲とし、連続塩基数が5以下となる条件を設定した。また、塩基長については、8塩基長、9塩基長、10塩基長、11塩基長、12塩基長、14塩基長、16塩基長、18塩基長、20塩基長、22塩基長、24塩基長、26塩基長、28塩基長、29塩基長、30塩基長及び35塩基長の16種類を設定した。各塩基長について、それぞれ96種類の塩基配列を設計し、96種類のランダムプライマーからなるセットを作製した。なお、10塩基長については、6セット（各セットに96種類のランダムプライマーが含まれる）を設計した（これら6セットを、10塩基A〜10塩基Fと称する）。すなわち、本実施例では、21種類のランダムプライマーセットを作製した。
【００８４】
これら21種類のランダムプライマーセットに含まれるランダムプライマーの塩基配列を表３〜２３に示した。
【００８５】
【表３−１】
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【００８６】
【表３−２】
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【００８７】
【表４−１】
2018191598.tif 000006
【００８８】
【表４−２】
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【００８９】
【表５−１】
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【００９０】
【表５−２】
2018191598.tif 000009
【００９１】
【表６−１】
2018191598.tif 000010
【００９２】
【表６−２】
2018191598.tif 000011
【００９３】
【表７−１】
2018191598.tif 000012
【００９４】
【表７−２】
2018191598.tif 000013
【００９５】
【表８−１】
2018191598.tif 000014
【００９６】
【表８−２】
2018191598.tif 000015
【００９７】
【表９−１】
2018191598.tif 000016
【００９８】
【表９−２】
2018191598.tif 000017
【００９９】
【表１０−１】
2018191598.tif 000018
【０１００】
【表１０−２】
2018191598.tif 000019
【０１０１】
【表１１−１】
2018191598.tif 000020
【０１０２】
【表１１−２】
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【０１０３】
【表１２−１】
2018191598.tif 000022
【０１０４】
【表１２−２】
2018191598.tif 000023
【０１０５】
【表１３−１】
2018191598.tif 000024
【０１０６】
【表１３−２】
2018191598.tif 000025
【０１０７】
【表１４−１】
2018191598.tif 000026
【０１０８】
【表１４−２】
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【０１０９】
【表１５−１】
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【０１１０】
【表１５−２】
2018191598.tif 000029
【０１１１】
【表１６−１】
2018191598.tif 000030
【０１１２】
【表１６−２】
2018191598.tif 000031
【０１１３】
【表１７−１】
2018191598.tif 000032
【０１１４】
【表１７−２】
2018191598.tif 000033
【０１１５】
【表１７−３】
2018191598.tif 000034
【０１１６】
【表１８−１】
2018191598.tif 000035
【０１１７】
【表１８−２】
2018191598.tif 000036
【０１１８】
【表１８−３】
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【０１１９】
【表１９−１】
2018191598.tif 000038
【０１２０】
【表１９−２】
2018191598.tif 000039
【０１２１】
【表１９−３】
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【０１２２】
【表２０−１】
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【０１２３】
【表２０−２】
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【０１２４】
【表２０−３】
2018191598.tif 000043
【０１２５】
【表２１−１】
2018191598.tif 000044
【０１２６】
【表２１−２】
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【０１２７】
【表２１−３】
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【０１２８】
【表２２−１】
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【０１２９】
【表２２−２】
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【０１３０】
【表２２−３】
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【０１３１】
【表２３−１】
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【０１３２】
【表２３−２】
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【０１３３】
【表２３−３】
2018191598.tif 000052
【０１３４】
３．１．２  標準PCR
２．に記載したゲノムDNA(NiF8由来ゲノムDNA:30ng)に最終濃度0.6μMランダムプライマー(10塩基A)、0.2mM dNTP mixture、1.0mM MgCl2及び1.25 unit DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)を加え、最終反応量50μlで反応液を調製した。PCRの温度サイクル条件は、先ず、98℃を2分とし、その後、98℃で10秒間、50℃で15秒間及び72℃で20秒を1サイクルとして30サイクル行った後、4℃で保存する条件とした。なお、本実施例においては、ここで説明した標準PCRを含め、ランダムプライマーを用いたPCRによって得られた多数の核酸断片をDNAライブラリーと称する。
【０１３５】
３．１．３  DNAライブラリーの精製及び電気泳動
３．１．２で得られたDNAライブラリーをMinElute PCR Purification Kit(QIAGEN)で精製後、Agilent 2100バイオアナライザ(Agient Technologies)で電気泳動し、蛍光ユニット(Fluorescence Unit: FU)を得た。
【０１３６】
３．１．４  アニーリング温度の検討
２．に記載したゲノムDNA(NiF8由来ゲノムDNA:30ng)に最終濃度0.6μMランダムプライマー(10塩基A)、0.2mM dNTP mixture、1.0mM MgCl2及び1.25 unit DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)を加え、最終反応量50μlで反応液を調製した。PCRの温度サイクル条件は、先ず、98℃を2分とし、その後、98℃で10秒間、種々のアニーリング温度で15秒間及び72℃で20秒を1サイクルとして30サイクル行った後、4℃で保存する条件とした。なお、本実施例においては、アニーリング温度として37℃、40℃及び45℃を検討した。本実験で得られたDNAライブラリーの精製と電気泳動は３．１．３と同様の方法で行った。
【０１３７】
３．１．５  酵素量の検討
２．に記載したゲノムDNA(NiF8由来ゲノムDNA:30ng)に最終濃度0.6μMランダムプライマー(10塩基A)、0.2mM dNTP mixture、1.0mM MgCl2及び2.5unit又は12.5unitのDNA DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)を加え、最終反応量50μlで反応液を調製した。PCRの温度サイクル条件は、先ず、98℃を2分とし、その後、98℃で10秒間、50℃で15秒間及び72℃で20秒を1サイクルとして30サイクル行った後、4℃で保存する条件とした。本実験で得られたDNAライブラリーの精製と電気泳動は３．１．３と同様の方法で行った。
【０１３８】
３．１．６  MgCl2濃度の検討
２．に記載したゲノムDNA(NiF8由来ゲノムDNA:30ng)に最終濃度0.6μMランダムプライマー(10塩基A)、0.2mM dNTP mixture、所定濃度のMgCl2及び1.25 unit DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)を加え、最終反応量50μlで反応液を調製した。PCRの温度サイクル条件は、先ず、98℃を2分とし、その後、98℃で10秒間、50℃で15秒間及び72℃で20秒を1サイクルとして30サイクル行った後、4℃で保存する条件とした。なお、本実施例においては、MgCl2濃度として、通常の2倍（2.0mM）、3倍（3.0mM）及び4倍（4.0mM）を検討した。本実験で得られたDNAライブラリーの精製と電気泳動は３．１．３と同様の方法で行った。
【０１３９】
３．１．７  ランダムプライマーの塩基長の検討
２．に記載したゲノムDNA(NiF8由来ゲノムDNA:30ng)に最終濃度0.6μMランダムプライマー、0.2mM dNTP mixture、1.0mM MgCl2及び1.25 unit DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)を加え、最終反応量50μlで反応液を調製した。PCRの温度サイクル条件は、先ず、98℃を2分とし、その後、98℃で10秒間、50℃で15秒間及び72℃で20秒を1サイクルとして30サイクル行った後、4℃で保存する条件とした。なお、本実施例においては、ランダムプライマーとして、上述した8塩基長（表９）、9塩基長（表１０）、11塩基長（表１１）、12塩基長（表１２）、14塩基長（表１３）、16塩基長（表１４）、18塩基長（表１５）及び20塩基長（表１６）を検討した。本実験で得られたDNAライブラリーの精製と電気泳動は３．１．３と同様の方法で行った。
【０１４０】
３．１．８  ランダムプライマー濃度の検討
２．に記載したゲノムDNA(NiF8由来ゲノムDNA:30ng)に所定濃度のランダムプライマー(10塩基A)、0.2mM dNTP mixture、1.0mM MgCl2及び1.25 unit DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)を加え、最終反応量50μlで反応液を調製した。PCRの温度サイクル条件は、先ず、98℃を2分とし、その後、98℃で10秒間、50℃で15秒間及び72℃で20秒を1サイクルとして30サイクル行った後、4℃で保存する条件とした。なお、本実施例においては、ランダムプライマー濃度として、2、4、6、8、10、20、40、60、100、200、300、400、500、600、700、800、900及び1000μMを検討した。本実験で得られたDNAライブラリーの精製と電気泳動は３．１．３と同様の方法で行った。また、本実験では、スピアマンの順位相関により反復データの再現性を評価した(ρ＞0.9)。
【０１４１】
３．２  MiSeqによる再現性の確認
３．２．１  DNAライブラリーの作製
２．に記載したゲノムDNA(NiF8由来ゲノムDNA:30ng)に最終濃度60μMランダムプライマー(10塩基A)、0.2mM dNTP mixture、1.0mM MgCl2及び1.25 unit DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)を加え、最終反応量50μlで反応液を調製した。PCRの温度サイクル条件は、先ず、98℃を2分とし、その後、98℃で10秒間、50℃で15秒間及び72℃で20秒を1サイクルとして30サイクル行った後、4℃で保存する条件とした。本実験で得られたDNAライブラリーの精製と電気泳動は３．１．３と同様の方法で行った。
【０１４２】
３．２．２  シーケンスライブラリーの作製
３．２．１で得られたDNAライブラリーから、KAPA Library Preparation Kit(Roche)を用いてMiSeq解析用シーケンスライブラリーを作製した。
【０１４３】
３．２．３  MiSeq解析
MiSeq Reagent Kit V2 500 Cycle(Illumina)を用いて、３．２．２で得られたMiSeq解析用シーケンスライブラリーをリード長100塩基のペアエンド条件のもと解析した。
【０１４４】
３．２．４  リードデータ解析
３．２．３で得られたリードデータから、ランダムプライマーの配列情報を削除し、リードパターンを特定した。そしてリードパターンごとにリード数をカウントし、反復間のリード数を比較し、相関係数で再現性を評価した。
【０１４５】
３．３  イネ品種日本晴の解析
３．３．１  DNAライブラリーの作製
２．に記載したゲノムDNA(日本晴由来ゲノムDNA:30ng)に最終濃度60μMランダムプライマー(10塩基A)、0.2mM dNTP mixture、1.0mM MgCl2及び1.25 unit DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)を加え、最終反応量50μlで反応液を調製した。PCRの温度サイクル条件は、先ず、98℃を2分とし、その後、98℃で10秒間、50℃で15秒間及び72℃で20秒を1サイクルとして30サイクル行った後、4℃で保存する条件とした。本実験で得られたDNAライブラリーの精製と電気泳動は３．１．３と同様の方法で行った。
【０１４６】
３．３．２  シーケンスライブラリー作製、MiSeq解析及びリードデータ解析
日本晴由来ゲノムDNAから作製したDNAライブラリーを用いたシーケンスライブラリーの作製、MiSeq解析及びリードデータ解析は、それぞれ３．２．２、３．２．３及び３．２．４に記載した方法に従った。
【０１４７】
３．３．３  ゲノム均―性の評価
３．３．２で得られたリードパターンについて、日本晴のゲノム情報(NC_008394〜NC_008405)に対してリードパターンをbowtie2にてマッピングし、各リードパターンのゲノム位置を特定した。
【０１４８】
３．３．４  非特異的増幅
３．３．３で特定した各リードパターンの位置情報に基づいて、ランダムプライマーの配列と当該ランダムプライマーがアニールするゲノム上の配列を比較し、ミスマッチ数をカウントした。
【０１４９】
３．４  多型検出及び遺伝子型判別
３．４．１  DNAライブラリーの作製
２．に記載したゲノムDNA(NiF8由来ゲノムDNA、Ni9由来ゲノムDNA、交雑後代由来ゲノムDNA又は日本晴由来ゲノムDNA:30ng)に最終濃度60μMランダムプライマー(10塩基A)、0.2mM dNTP mixture、1.0mM MgCl2及び1.25 unit DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)を加え、最終反応量50μlで反応液を調製した。PCRの温度サイクル条件は、先ず、98℃を2分とし、その後、98℃で10秒間、50℃で15秒間及び72℃で20秒を1サイクルとして30サイクル行った後、4℃で保存する条件とした。本実験で得られたDNAライブラリーの精製と電気泳動は３．１．３と同様の方法で行った。
【０１５０】
３．４．２  HiSeq解析
３．４．１で作製した各DNAライブラリーを、それぞれ1レーン16サンプル及びリード長100塩基のペアエンド条件でタカラバイオヘ解析を委託し、それぞれからリードデータを取得した。
【０１５１】
３．４．３  リードデータ解析
３．４．２で得られたリードデータからランダムプライマーの配列情報を削除し、リードパターンを特定した。そしてリードパターンごとにリード数をカウントした。
【０１５２】
３．４．４  多型検出及び遺伝子型判別
３．４．３の解析の結果として得られたリードパターンのリード数からNiF8及びNi9特有の多型を検出し、そのリードパターンをマーカーとした。また、リード数をもとに交雑後代22系統の遺伝子型を判別した。遺伝子型判別の精度は、交雑後代2系統の反復データでの再現性をもとに評価した。
【０１５３】
３．５  PCRマーカーによる確認実験
３．５．１  プライマーの設計
３．４．４で特定したマーカーのうちNiF8型3マーカー、Ni9型3マーカーの合計6マーカーについて、ペアエンドのマーカー配列情報からプライマーをそれぞれ設計した（表２４）。
【０１５４】
【表２４】
2018191598.tif 000053
【０１５５】
３．５．２  PCR及び電気泳動
TaKaRa Multiplex PCR Assay Kit Ver.2(TAKARA)を用いて、２．に記載したゲノムDNA(NiF8由来ゲノムDNA、Ni9由来ゲノムDNA又は交雑後代由来ゲノムDNA:15ng)を鋳型に、1.25μl Multiplex PCR Enzyme Mix、2 X Multiplex PCR Buffer 12.5μl、３．５．１で設計した0.4μMプライマーを加え、最終反応量25μlで反応液を調製した。PCRの温度サイクル条件は、先ず、94℃で1分とし、その後、94℃で30秒間、60℃で30秒間及び72℃で30秒を1サイクルとして30サイクル行った後、72℃で10分間維持し、その後、4℃で保存する条件とした。増幅したDNA断片は、TapeStation(Agilent Technologies)で電気泳動した。
【０１５６】
３．５．３  遺伝子型データ比較
３．５．２で得られた電気泳動の結果から、バンドの有無によりマーカーの遺伝子型を判別し、マーカーのリード数と比較した。
【０１５７】
３．６  ランダムプライマー濃度と長さの関係
３．６．１  高濃度条件下でのランダムプライマー長の影響
２．に記載したゲノムDNA(NiF8由来ゲノムDNA:30ng)に最終濃度10μMの所定の長さのランダムプライマー、0.2mM dNTP mixture、1.0mM MgCl2及び1.25 unit DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)を加え、最終反応量50μlで反応液を調製した。本実験においては、ランダムプライマーの長さとして、9塩基長（表１０）、10塩基長（表３、10塩基A）、11塩基長（表１１）、12塩基長（表１２）、14塩基長（表１３）、16塩基長（表１４）、18塩基長（表１５）及び20塩基長（表１６）を検討した。PCRの温度サイクル条件は、9塩基長のランダムプライマーを使用する反応系では、先ず、98℃を2分とし、その後、98℃で10秒間、37℃で15秒間及び72℃で20秒を1サイクルとして30サイクル行った後、4℃で保存する条件とした。PCRの温度サイクル条件は、10塩基長以上の長さのランダムプライマーを使用する反応系では、先ず、98℃を2分とし、その後、98℃で10秒間、50℃で15秒間及び72℃で20秒を1サイクルとして30サイクル行った後、4℃で保存する条件とした。本実験で得られたDNAライブラリーの精製と電気泳動は３．１．３と同様の方法で行った。
【０１５８】
３．６．２  ランダムプライマーの濃度と長さの関係
２．に記載したゲノムDNA(NiF8由来ゲノムDNA:30ng)に、所定の長さのランダムプライマーを所定の濃度となるように加え、0.2mM dNTP mixture、1.0mM MgCl2及び1.25 unit DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)を加え、最終反応量50μlで反応液を調製した。本実験においては、ランダムプライマーの長さとして、表３〜２３に示した8塩基長から35塩基長のランダムプライマーを検証し、ランダムプライマーの濃度として0.6〜300μMの範囲を検証した。
【０１５９】
PCRの温度サイクル条件は、8塩基長及び9塩基長のランダムプライマーを使用する反応系では、先ず、98℃を2分とし、その後、98℃で10秒間、37℃で15秒間及び72℃で20秒を1サイクルとして30サイクル行った後、4℃で保存する条件とした。PCRの温度サイクル条件は、10塩基長以上の長さのランダムプライマーを使用する反応系では、先ず、98℃を2分とし、その後、98℃で10秒間、50℃で15秒間及び72℃で20秒を1サイクルとして30サイクル行った後、4℃で保存する条件とした。本実験で得られたDNAライブラリーの精製と電気泳動は３．１．３と同様の方法で行った。また、スピアマンの順位相関により反復データの再現性を評価した(ρ＞0.9)。
【０１６０】
３．７  ランダムプライマー数
２．に記載したゲノムDNA(NiF8由来ゲノムDNA:30ng)に、表３に示した10塩基長からなる96種類のランダムプライマー（10塩基A）から選ばれる1種、2種、3種、12種、24種又は48種のランダムプライマーを最終濃度60μMとなるように加え、0.2mM dNTP mixture、1.0mM MgCl2及び1.25 unit DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)を加え、最終反応量50μlで反応液を調製した。本実験においては、1種、2種、3種、12種、24種又は48種のランダムプライマーとして、表３のNo.1から順にランダムプライマーを選び検証した。PCRの温度サイクル条件は、先ず、98℃を2分とし、その後、98℃で10秒間、50℃で15秒間及び72℃で20秒を1サイクルとして30サイクル行った後、4℃で保存する条件とした。本実験で得られたDNAライブラリーの精製と電気泳動は３．１．３と同様の方法で行った。また、スピアマンの順位相関により反復データの再現性を評価した(ρ＞0.9)。
【０１６１】
３．８  ランダムプライマー配列
２．に記載したゲノムDNA(NiF8由来ゲノムDNA:30ng)に、表４〜８に示したランダムプライマーの5セットから選ばれる1セットを最終濃度60μMとなるように加え、0.2mM dNTP mixture、1.0mM MgCl2及び1.25 unit DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)を加え、最終反応量50μlで反応液を調製した。PCRの温度サイクル条件は、先ず、98℃を2分とし、その後、98℃で10秒間、50℃で15秒間及び72℃で20秒を1サイクルとして30サイクル行った後、4℃で保存する条件とした。本実験で得られたDNAライブラリーの精製と電気泳動は３．１．３と同様の方法で行った。また、スピアマンの順位相関により反復データの再現性を評価した(ρ＞0.9)。
【０１６２】
３．９  ヒト由来ゲノムDNAを用いたDNAライブラリー
２．に記載したゲノムDNA(ヒト由来ゲノムDNA:30ng)に、最終濃度60μMのランダムプライマー（10塩基A）、0.2mM dNTP mixture、1.0mM MgCl2及び1.25 unit DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)を加え、最終反応量50μlで反応液を調製した。PCRの温度サイクル条件は、先ず、98℃を2分とし、その後、98℃で10秒間、50℃で15秒間及び72℃で20秒を1サイクルとして30サイクル行った後、4℃で保存する条件とした。本実験で得られたDNAライブラリーの精製と電気泳動は３．１．３と同様の方法で行った。また、スピアマンの順位相関により反復データの再現性を評価した(ρ＞0.9)。
【０１６３】
４．結果および考察
４．１  PCR条件とDNAライブラリーのサイズの関係
通常のPCR条件に倣って、ランダムプライマーを利用したPCR（上記３．１．２）では、増幅されたDNAライブラリーのサイズは2kbp以上と高分子であり、目的のサイズとする100bp〜500bpには増幅は見られなかった(図２)。100bp〜500bpのDNAライブラリーが得られなかったのは、ランゲムプライマーが500bp以下の領域でプライマーとし機能する確率が低いためと考えられた。目的のサイズである100bp〜500bpのDNAライブラリーを作製するには、再現性良く非特異的増幅を誘発する必要があると考えられた。
【０１６４】
そこで、PCRの特異性に影響すると考えられるアニーリング温度（上記３．１．４）、酵素量（上記３．１．５）、MgCl2濃度（上記３．１．６）、プライマー長（上記３．１．７）及びプライマー濃度（上記３．１．８）とDNAライブラリーサイズの関係について検討した。
【０１６５】
上記３．１．４に記載した実験において、アニーリング温度を45℃としたときの結果を図３、アニーリング温度を40℃としたときの結果を図４、アニーリング温度を37℃としたときの結果を図５に示した。図３〜５に示すように、アニーリング温度を45℃、40℃及び37℃と下げていくと、高分子DNAライブラリーの増幅量は増加するものの、低分子DNAライブラリーの増幅は見られなかった。
【０１６６】
上記３．１．５に記載した実験において、酵素量を2倍としたときの結果を図６、酵素量を10倍にしたときの結果を図７に示した。図６及び７に示すように、酵素量を通常の2倍、10倍に増やしても高分子DNAライブラリーは増加するものの、低分子にDNAライブラリーの増幅は見られなかった。
【０１６７】
上記３．１．６に記載した実験において、MgCl2濃度を通常の2倍としたときの結果を図８、MgCl2濃度を通常の3倍としたときの結果を図９、MgCl2濃度を通常の4倍としたときの結果を図１０に示した。図８〜１０に示すように、MgCl2濃度を通常の2倍、3倍、4倍に増やしても高分子DNAライブラリーの増幅量は変化するものの、低分子DNAライブラリーの増幅は見られなかった。
【０１６８】
上記３．１．７に記載した実験において、ランダムプライマー長を8塩基長、9塩基長、11塩基長、12塩基長、14塩基長、16塩基長、18塩基長及び20塩基長としたときの結果を、それぞれ図１１〜１８に示した。図１１〜１８に示すように、いずれの長さのランダムプライマーを用いたとしても、図２に示した結果（10塩基長のランダムプライマー）と比較して大きな変化は見られなかった。
上記３．１．８に記載した実験の結果を表２５に纏めた。
【０１６９】
【表２５】
2018191598.tif 000054
【０１７０】
図１９〜４７に示すように、10塩基長のランダムプライマーを使用した場合、ランダムプライマー濃度が6μMにおいて1kbpのDNA断片について増幅が見られ、濃度が上昇するにつれDNA断片が低分子化していくことが明らかとなった。また、ランダムプライマー濃度が6〜500μMの場合に再現性について検討した結果、通常の10倍の6μMではρが0.889とやや低いものの、通常の13.3倍に相当する8μM以上の場合、さらに833.3倍に相当する500μMの場合では、いずれもρが0.9以上と高い値を示した。この結果から、ランダムプライマーの濃度を通常のPCR条件よりも大幅に高めることで、高い再現性を達成しながら1kbp以下のDNA断片を増幅できることが明らかとなった。ただし、ランダムプライマーの濃度が500μを超えて高すぎる場合には、所望の大きさのDNA断片の増幅が見られなくなる。したがって、再現性に優れ、且つ低分子のDNA断片を増幅するには、ランダムプライマーの濃度を通常のPCRのときよりも高く、且つ所定の値以下という最適な範囲が存在することが明らかとなった。
【０１７１】
４．２  MiSeqによる再現性の確認
上記３．２で説明したように、DNAライブラリー作製の再現性を確認するため、NiF8から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、ランダムプライマーで増幅したDNAライブラリーについて次世代シーケンサーMiSeqにより解析した結果を図４８に示した。なお、上記３．２．４の結果として47,484個のリードパターンが得られた。反復間でリード数を比較した結果、電気泳動の結果と同様、反復間で相関係数r=0.991と高い相関を示した。以上の結果から、ランダムプライマーにより再現性良くDNAライブラリー作製可能と考えられた。
【０１７２】
４．３  イネ品種日本晴の解析
上記３．３で説明したように、ゲノム情報が公開されているイネ日本晴から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、ランダムプライマーによりDNAライブラリーを作製し、電気泳動した結果を図４９及び５０に示した。図４９及び５０に示した結果から、ρが0.979と非常に高い値を示した。また、MiSeqによりリードデータを解析した結果を図５１に示した。図５１に示した結果から、相関係数rは0.992と非常に高い値を示した。これらの結果より、イネを対象としても、ランダムプライマーを使用することで非常に高い再現性を持ってDNAライブラリーを作製できることが明らかとなった。
【０１７３】
また、上記３．３．３で説明したように、得られたリードパターンを日本晴ゲノム情報にマッピングした結果、6.2 kbpにlヶ所の割合で、ゲノムに偏りなく均―にDNA断片を増幅していることが明らかとなった(図５２)。また、ランダムプライマーの配列とゲノム情報を比較した結果、平均3.6個のミスマッチが存在しており、99.0%のプライマーペアで1個以上のミスマッチが発生していた(図５３)。以上の結果から、ランダムプライマーを利用したDNAライブラリーは、ゲノム全体に亘って均一的に、且つ再現性良く、非特異的増幅により作製されていることが明らかとなった。
【０１７４】
４．４  サトウキビ多型検出及び遺伝子型判別
上記３．４で説明したように、サトウキビNiF8、Ni9、及びその交雑後代22系統を用いて、ランダムプライマーによりDNAライブラリーを作製、次世代シーケンサーHiSeqで解析し、リードデータをもとに両親の多型検出及び交雑後代の遺伝子型を判別した。その結果を表２６に示した。
【０１７５】
【表２６】
2018191598.tif 000055
【０１７６】
表２６に示すように、NiF8型は8,683個のマーカー、Ni9型は11,655個のマーカー、合計で20,338個のマーカーを作製することができた。また、交雑後代での遺伝子型判別の再現性が99.97%と高く、極めて遺伝子型判別精度が高いと考えられた。特に、サトウキビは多倍数性(8x+n)で染色体数も100〜130本と極めて多く、ゲノムサイズが10Gbpとヒトの3倍以上と極めて大きい。したがって、ゲノムDNA全体に亘って遺伝子型判別が極めて困難であるといった現状がある。上述のように、ランダムプライマーを使用することで極めて多数のマーカーを作製することができ、サトウキビについて精度の高い遺伝子型判別が可能となる。
【０１７７】
４．５  PCRマーカーによる確認実験
上記３．５で説明したように、表２２に示したプライマーを用い、NiF8とNi9、その交雑後代22系統についてPCRを行い電気泳動で遺伝子型を判別し、リード数と比較した。NiF8型のマーカーN80521152のリード数及び電気泳動像をそれぞれ図５４及び５５に示した。NiF8型のマーカーN80997192のリード数及び電気泳動像をそれぞれ図５６及び５７に示した。NiF8型のマーカーN80533142のリード数及び電気泳動像をそれぞれ図５８及び５９に示した。Ni9型のマーカーN91552391のリード数及び電気泳動像をそれぞれ図６０及び６１に示した。Ni9型のマーカーN91653962のリード数及び電気泳動像をそれぞれ図６２及び６３に示した。Ni9型のマーカーN91124801のリード数及び電気泳動像をそれぞれ図６４及び６５に示した。
【０１７８】
図５４〜６５に示したように、上記３．５で設計した全てのPCRマーカーの結果も次世代シーケンサーの解析結果と一致したことから、次世代シーケンサーを用いた遺伝子型判別はマーカー技術として利用可能と考えられた。
【０１７９】
４．６  ランダムプライマー濃度と長さの関係
上記３．６．１で説明したように、9塩基長（表１０）、10塩基長（表３、10塩基A）、11塩基長（表１１）、12塩基長（表１２）、14塩基長（表１３）、16塩基長（表１４）、18塩基長（表１５）及び20塩基長（表１６）のランダムプライマーを用いてDNAライブラリーを作製した結果を図６６〜８１に示した。また、表２７にこれらの結果を纏めた。
【０１８０】
【表２７】
2018191598.tif 000056
【０１８１】
図６６〜８１に示すように、通常の13.3倍に相当する10.OμMの高濃度ランダムプライマーを使用した場合、9塩基長〜20塩基長の範囲においては、非常に高い再現性を達成しながら低分子のDNA断片を増幅できることが明らかとなった。特に、ランダムプライマーの塩基長が長くなるほど（特に12塩基長以上）、増幅断片が低分子化する傾向が見られた。なお、9塩基長のランダムプライマーを使用した際は、アニーリング温度を37℃に設定することでDNA断片の増幅量を増やすことができた。
【０１８２】
また、上記３．６．２で説明したように、ランダムプライマーの濃度と長さの関係を明確にするため、ランダムプライマーを8〜35塩基長、ランダムプライマー濃度を0.6〜300μMの範囲でPCRを行い、DNAライブラリーの作製を試みた。結果を表２８に示した。
【０１８３】
【表２８】
2018191598.tif 000057
【０１８４】
表２８に示すように、ランダムプライマーの長さが9〜30塩基長であり、且つランダムプライマーの濃度を4.0〜200μMとすることで、低分子（100〜500塩基）のDNA断片を再現性高く増幅できることが明らかとなった。特に、ランダムプライマーの長さが9〜30塩基長であり、且つランダムプライマーの濃度を4.0〜100μMとすることで、低分子（100〜500塩基）のDNA断片を再現性高く確実に増幅できることが明らかとなった。
【０１８５】
また、表２８に示した結果を更に詳細に検討すると、ランダムプライマーの長さと濃度は、図８２に示すように、特に枠で囲った領域内に調製することが好ましいことが判る。より具体的に、ランダムプライマーの濃度は、ランダムプライマーが9〜10塩基長である場合、40〜60μMとすることが好ましい。ランダムプライマーの濃度は、ランダムプライマーが10〜14塩基長である場合、ランダムプライマーの塩基長をyとし、ランダムプライマーの濃度をxとしたときに、y>3E+08x-6.974且つ100μM以下を満たすことが好ましい。ランダムプライマーの濃度は、ランダムプライマーが14〜18塩基長の場合、4〜100ｍＭとすることが好ましい。ランダムプライマーの濃度は、ランダムプライマーが18〜28塩基長の場合、4μM以上であり、且つy<8E+08x-5.533を満たすことが好ましい。ランダムプライマーの濃度は、ランダムプライマーが28〜29塩基長の場合、4〜10μMとすることが好ましい。なお、これらy>3E+08x-6.974及びy<8E+08x-5.533は、Microsoft Excelの累乗近似に基づいて算出した式である。
【０１８６】
以上のように、ランダムプライマーの塩基長と濃度とを所定の範囲に規定することで、低分子（100〜500塩基）のDNA断片を再現性高く増幅できることが明らかとなった。例えば、次世代シーケンサーにおいては、高分子DNA断片を解析するとデータ精度が著しく低下することが知られている。本実施例に示したように、ランダムプライマーの塩基長と濃度とを所定の範囲に規定することで、次世代シーケンサーの解析に適した分子サイズのDNAライブラリーを再現性良く作製することが可能であり、次世代シーケンサーマーカー解析に適していると言える。
【０１８７】
４．７  ランダムプライマー数
上記３．７で説明したように、1種、2種、3種、12種、24種又は48種のランダムプライマー（濃度は60μM）を用いてDNAライブラリーを作製した結果を図８３〜９４に示した。また、表２９にこれらの結果を纏めた。
【０１８８】
【表２９】
2018191598.tif 000058
【０１８９】
図８３〜９４に示すように、1種、2種、3種、12種、24種又は48種のランダムプライマーのいずれの場合でも、非常に高い再現性を達成しながら低分子のDNA断片を増幅できることが明らかとなった。特に、ランダムプライマーの種類が増えるにつれて、電気泳動像のピークが小さくなり、偏りがなくなる傾向にあることが判る。
【０１９０】
４．８  ランダムプライマー配列
上記３．８で説明したように、表４〜８に示したランダムプライマーのセット（10塩基B、10塩基C、10塩基D、10塩基E及び10塩基F）それぞれを用いてDNAライブラリーを作製した結果を図９５〜１０４に示した。また、表３０にこれらの結果を纏めた。
【０１９１】
【表３０】
2018191598.tif 000059
【０１９２】
図９５〜１０４に示すように、10塩基B、10塩基C、10塩基D、10塩基E及び10塩基Fのいずれのセットを用いた場合でも、非常に高い再現性を達成しながら低分子のDNA断片を増幅できることが明らかとなった。
【０１９３】
４．９  ヒトDNAライブラリー作製
上記３．９で説明したように、ヒト由来ゲノムDNA及び最終濃度60μMのランダムプライマー（10塩基A）を用いてDNAライブラリーを作製した結果を図１０５及び１０６に示した。図１０５は反復実験の一回目の結果を示し、図１０６は反復実験の二回目の結果を示している。図１０５及び１０６に示すように、ヒト由来のゲノムDNAを用いた場合であっても、非常に高い再現性を達成しながら低分子のDNA断片を増幅できることが明らかとなった。
【０１９４】
〔実施例２〕
１．フローチャート
本実施例では、図１０７及び１０８に示した模式図に従って、ゲノムDNAを鋳型とし、ランダムプライマーを用いたPCRにより第1のDNA断片を作製し、続いて、作製した第1のDNA断片を鋳型とし、次世代シーケンサー用プライマーを用いたPCRにより第2のDNA断片を作製し、作製した第2のDNA断片をシーケンサー用ライブラリーとして、所謂、次世代シーケンサーを用いた配列解析を行い、得られたリードデータに基づいて遺伝子型を解析した。
【０１９５】
２．材料
本実施例では、サトウキビ品種NiF8及びイネ品種日本晴からDNeasy Plant Mini kit(QIAGEN)を用いてゲノムDNAを抽出及び精製し、それぞれNiF8由来のゲノムDNA及び日本晴由来のゲノムDNAとして使用した。
【０１９６】
３．方法
３．１  サトウキビNiF8での検討
３．１．１  ランダムプライマーと次世代シーケンサー用プライマーの設計
本例では、ランダムプライマーは、イルミナ社の次世代シーケンサー用のアダプタNextera adapterにおける３’末端の１０塩基をもとに設計した。すなわち、本例ではランダムプライマーとしてGTTACACACG（配列番号2041、10塩基G）を使用した。また、次世代シーケンサー用プライマーは、同様にイルミナ社のNextera adaptorの配列情報をもとに設計した（表３１）。
【０１９７】
【表３１】
2018191598.tif 000060
【０１９８】
３．１．２  DNAライブラリーの作製
上記２．で説明したNiF8由来のゲノムDNA（30 ng）に最終濃度0.2 mM dNTP mixture、1.0 mM MgCl2及び1.25 unit DNA Polymerase（TAKARA、PrimeSTAR）に、60μMランダムプライマー（10塩基G）をそれぞれ加え、最終反応量50μlでPCR（98℃を2分後、98℃を10秒間、50℃を15秒間、72℃を20秒を30サイクル反応後、4℃で保存）によりDNAライブラリー（第1のDNA断片）を作製した。
【０１９９】
３．１．３  精製及び電気泳動
３．１．２のDNAライブラリーをMinElute PCR Purification Kit（QIAGEN）で精製後、Agilent 2100 バイオアナライザ（Agilent Technologies）で電気泳動し、蛍光ユニット（Fluorescence Unit：FU）を得た。また、スピアマンの順位相関により反復データの再現性を評価した（ρ>0.9）。
【０２００】
３．１．４  次世代シーケンサー用のDNAライブラリーの作製
３．１．３で精製した第1のDNA断片（100 ng）に最終濃度0.2 mM dNTP mixture、1.0 mM MgCl2及び1.25 unit DNA Polymerase（TAKARA、PrimeSTAR）に、0.5μMの次世代シーケンサー用プライマーをそれぞれ加え、最終反応量50μlでPCR（95℃を2分後、98℃を15秒間、55℃を15秒間、72℃を20秒を25サイクル反応後、72℃を1分後、4℃で保存）により次世代シーケンサー用のDNAライブラリー（第2のDNA断片）を作製した。次世代シーケンサー用のDNAライブラリーの精製と電気泳動は３．１．３と同様の方法で行った。
【０２０１】
３．１．５  MiSeq解析
３．１．４の次世代シーケンサー用のDNAライブラリー（第2のDNA断片）をMiSeq Reagent Kit V2 500  Cycle（Illumina）を用い、リード長100塩基のペアエンド条件のもとMiSeqで解析した。
【０２０２】
３．１．６  リードデータ解析
３．１．５のリードデータからリードパターンを特定した。そしてリードパターンごとにリード数をカウントし、反復間のリード数を比較し相関係数で再現性を評価した。
【０２０３】
３．２  イネ品種日本晴での検討
３．２．１  ランダムプライマーと次世代シーケンサー用プライマーの設計
本例では、ランダムプライマーは、イルミナ社の次世代シーケンサー用のアダプタNextera adapterにおける３’末端の１０塩基をもとに設計した。すなわち、本例では、ランダムプライマーとして、Nextera adapterにおける３’末端に位置する１０塩基と、当該１０塩基の３’末端に２塩基の任意の配列を付加した全長１２塩基からなる１６種類の塩基配列を設計した（表３２、12塩基B）。
【０２０４】
【表３２】
2018191598.tif 000061
【０２０５】
また、本例では、３．１．１と同様にイルミナ社のNextera adaptorの配列情報をもとに設計した次世代シーケンサー用プライマーを用いた。
【０２０６】
３．２．２  DNAライブラリーの作製
上記２．で説明した日本晴由来のゲノムDNA（30 ng）に最終濃度0.2 mM dNTP mixture、1.0 mM MgCl2及び1.25 unit DNA Polymerase（TAKARA、PrimeSTAR）に、40μMランダムプライマー（12塩基B）をそれぞれ加え、最終反応量50μlでPCR（98℃を2分後、98℃を10秒間、50℃を15秒間、72℃を20秒を30サイクル反応後、4℃で保存）によりDNAライブラリー（第1のDNA断片）を作製した。
【０２０７】
３．２．３  精製及び電気泳動
３．２．２のDNAライブラリーをMinElute PCR Purification Kit（QIAGEN）で精製後、Agilent 2100 バイオアナライザ（Agilent Technologies）で電気泳動し蛍光ユニット（Fluorescence Unit：FU）を得た。また、スピアマンの順位相関により反復データの再現性を評価した（ρ>0.9）。
【０２０８】
３．２．４  次世代シーケンサー用のDNAライブラリーの作製
３．２．３で精製した第1のDNA断片（100ng）に最終濃度0.2 mM dNTP mixture、1.0 mM MgCl2及び1.25 unit DNA Polymerase（TAKARA、PrimeSTAR）に、0.5μMの次世代シーケンサー用プライマーをそれぞれ加え、最終反応量50μlでPCR（95℃を2分後、98℃を15秒間、55℃を15秒間、72℃を20秒を25サイクル反応後、72℃を1分後、4℃で保存）により次世代シーケンサー用のDNAライブラリー（第2のDNA断片）を作製した。次世代シーケンサー用のDNAライブラリーの精製と電気泳動は３．１．３と同様の方法で行った。
【０２０９】
３．２．５  MiSeq解析
３．２．４の次世代シーケンサー用のDNAライブラリー（第2のDNA断片）をMiSeq Reagent Kit V2 500  Cycle（Illumina）を用いリード長100 塩基のペアエンド条件のもとMiSeqで解析した。
【０２１０】
３．２．６  リードデータ解析
３．２．５のリードパターンを日本晴のゲノム情報(NC_008394〜NC_008405)に対してbowtie2にてマッピングし、ランダムプライマーの配列とゲノムDNAとの一致率を確認した。また、３．２．５のリードデータからリードパターンを特定、リードパターンごとにリード数をカウントし、反復間のリード数を比較し相関係数で再現性を評価した。
【０２１１】
４．結果及び考察
４．１  サトウキビNiF8での検討結果
イルミナ社の次世代シーケンサー用のアダプタNextera adaptorにおける３’末端の１０塩基からなるランダムプライマー(10塩基G)を利用し、60μlの高濃度条件でPCRしたときの電気泳動の結果を図１０９及び１１０に示した。図１０９及び１１０に示すように、100bp〜500bpを含む幅広い領域で増幅が見られた（第1のDNA断片）。幅広い領域で増幅が確認できた理由としては、ランダムプライマーと一致するゲノムDNA領域以外においても増幅が見られたためと考えられた。また、反復データ間の順位相関係数が0.957と0.9以上だったことから、増幅パターンに高い再現性が認められた。
【０２１２】
次に、３．１．４で説明したように、次世代シーケンサー用プライマーを用いてPCRを行ったときの電気泳動の結果を図１１１及び１１２に示した。すなわち、次世代シーケンサーのアダプタNextera adaptorを連結させたDNAライブラリー（第2のDNA断片）を作製するため、第1のDNA断片を鋳型としてイルミナ社のNextera adaptor配列からなる次世代シーケンサー用プライマーを利用しPCRを行った。イルミナ社の次世代シーケンサーは、DNAライブラリーに100bp以下の短断片や1kbp以上の長断片が多数含まれる場合、極端に解析精度が落ちる。本実施例で作製した次世代シーケンサー用のDNAライブラリー（第2のDNA断片）は、図１１１及び１１２に示したように、500bp付近をピークとし主に150bp〜1kbpの範囲に分布していたことから、次世代シーケンサー用のDNAライブラリーとして適していると考えられた。また、反復データ間の順位相関係数が0.989と0.9以上だったことから、増幅パターンに高い再現性が認められた。
【０２１３】
また、得られたDNAライブラリー（第2のDNA断片）を次世代シーケンサーMiSeqで解析した結果、3.5Gbp及び3.6Gbpのリードデータが得られた。また、MiSeqのデータ精度を示す>=Q30の値は93.3%及び93.1%であった。メーカー推奨値がリードデータ 3.0Gbp以上および>=Q30 85.0%以上だったことから、本実施例で作製した次世代シーケンサーのDNAライブラリー（第2のDNA断片）は、次世代シーケンサーの解析に利用可能と考えられた。再現性を確認するため、MiSeqで得られた34,613個のリードパターンについて反復間でのリード数を比較した。結果を図１１３に示した。図１１３に示すように、電気泳動の結果と同様、リード数は反復間でr=0.996と高い相関を示した。
【０２１４】
以上で説明したように、イルミナ社の次世代シーケンサー用のアダプタNextera Adaptorの３’末端の１０塩基からなるランダムプライマーを高濃度で利用したPCRでDNAライブラリー（第1のDNA断片）を得た後、Nextera Adaptorの配列からなる次世代シーケンサー用プライマーを利用したPCRにより、簡便かつ再現性良く、多数の断片からなる次世代シーケンサー用のDNAライブラリー（第2のDNA断片）を作製することができた。
【０２１５】
４．２  イネ日本晴での検討結果
イルミナ社の次世代シーケンサー用のアダプタNextera adapterにおける３’末端に位置する１０塩基と、当該１０塩基の３’末端に２塩基の任意の配列を付加した全長１２塩基からなる１６種類のランダムプライマー(12塩基B)を利用し、40μlの高濃度条件でPCRしたときの電気泳動の結果を図１１４及び１１５に示した。図１１４及び１１５に示すように、100bp〜500bpを含む幅広い領域で増幅が見られた(第1のDNA断片)。幅広い領域での増幅が確認できた理由としては、４．１と同様、ランダムプライマーと一致するゲノムDNA領域以外においても増幅したためと考えられた。また、本例でも順位相関係数が0.950と0.9以上だったことから、増幅パターンに高い再現性が認められた。
【０２１６】
次に、３．２．４で説明したように、次世代シーケンサー用プライマーを用いてPCRを行ったときの電気泳動の結果を図１１６及び１１７に示した。すなわち、次世代シーケンサーのアダプタNextera adaptorを連結させたDNAライブラリー（第2のDNA断片）を作製するため、第1のDNA断片を鋳型としてイルミナ社のNextera adaptor配列からなる次世代シーケンサー用プライマーを利用しPCRを行った。その結果、本実施例で作製した次世代シーケンサー用のDNAライブラリー（第2のDNA断片）は、図１１６及び１１７に示したように、300bp付近をピークに主に150bp〜1kbpの範囲に分布していたことから、次世代シーケンサー用のDNAライブラリーに適していると考えられた。また、反復データ間の順位相関係数が0.992と0.9以上だったことから、増幅パターンに高い再現性が認められた。
【０２１７】
また、得られたDNAライブラリー（第2のDNA断片）を次世代シーケンサーMiSeqで解析した結果、4.0Gbp及び3.8Gbpのリードデータが得られた。また、MiSeqのデータ精度を示す>=Q30の値は94.0%及び95.3%であった。この結果から、４．１．１と同様に、本実施例で作製した次世代シーケンサーのDNAライブラリー（第2のDNA断片）は、次世代シーケンサーの解析に利用可能と考えられた。MiSeqで得られた19,849個のリードパターンについて、ランダムプライマー配列とゲノムとの一致率を評価するためランダムプライマー配列と日本晴リファレンス配列を比較した結果を図１１８に示した。図１１８に示すように、ランダムプライマー配列と日本晴リファレンス配列との平均一致率は34.5%であった。特に、ランダムプライマー配列と日本晴リファレンス配列と完全一致するリードパターンが無かったことから、いずれのリードパターンもランダムプライマーと一致しない配列にランダムプライマーが結合し増幅したと考えられた。これは、バイオアナライザの結果と一致する結果と考えられた。リードパターンの再現性を確認するため、反復間でリード数を比較した。結果を図１１９に示した。図１１９に示すように、電気泳動の結果と同様、反復間でr = 0.999と高い相関を示した。
【０２１８】
以上で説明したように、イルミナ社の次世代シーケンサー用のアダプタNextera Adaptorにおける３’末端に位置する１０塩基と、当該１０塩基の３’末端に２塩基の任意の配列を付加した全長１２塩基からなる１６種類のランダムプライマーを高濃度で利用したPCRでDNAライブラリー（第1のDNA断片）を得た後、Nextera Adaptorの配列からなるプライマーを利用したPCRにより、簡便かつ再現性良く、多数の断片からなる次世代シーケンサー用のDNAライブラリー（第2のDNA断片）を作製することができた。
【０２１９】
〔実施例３〕
１．フローチャート
本実施例では、実施例２と同様に、ゲノムDNAを鋳型とし、ランダムプライマーを用いたPCRにより第1のDNA断片を作製し、続いて、作製した第1のDNA断片を鋳型とし、次世代シーケンサー用プライマーを用いたPCRにより第2のDNA断片を作製し、作製した第2のDNA断片をシーケンサー用ライブラリーとして、所謂、次世代シーケンサーを用いた配列解析を行い、得られたリードデータに基づいて遺伝子型を解析した。本実施例では、特に、使用するランダムプライマーによって葉緑体ゲノム由来のDNA断片の増幅を抑制できるか検討した。
【０２２０】
２．材料
本実施例では、イネ品種日本晴からDNeasy Plant Mini kit（QIAGEN）を用いてゲノムDNAを抽出し、精製したものをイネ由来ゲノムDNAとして使用した。また、本実施例では、トウモロコシ、ジャガイモ及びダイズのゲノムDNAをそれぞれコスモバイオ社より購入したものを用いた（それぞれ、品番D1634330、D1634350及びD1634370）。
【０２２１】
３．方法
３．１  ランダムプライマーの設計
ランダムプライマーは、イルミナ社の次世代シーケンサー用のアダプタNextera adapterにおける3’末端の10塩基TAAGAGACAGと、当該10塩基の3’末端に3塩基の任意の配列を付加した全長13塩基からなる64種類の塩基配列を設計した（表３３）。ランダムプライマーセットは64本、63本、60本、40本、20本、10本を調製した（セットA〜F）。また当該10塩基の3’末端に2塩基の任意の配列を付加した全長12塩基からなる16種類の塩基配列を設計した（表３４、セットG）。また、次世代シーケンサー用プライマーは、同様にイルミナ社のNextera adaptorの配列情報をもとに設計した（表３５）。
【０２２２】
【表３３】
2018191598.tif 000062
【０２２３】
【表３４】
2018191598.tif 000063
【０２２４】
【表３５】
2018191598.tif 000064
【０２２５】
３．２  DNAライブラリーの作製
２．のゲノムDNA（15 ng）に最終濃度0.2 mM dNTP mixture、1.0 mM MgCl2及び0.625 unit DNA Polymerase（TAKARA、PrimeSTAR）に、40μMランダムプライマーをそれぞれ加え、最終反応量25μlでPCR（98℃を2分後、98℃を10秒間、50℃を15秒間、72℃を20秒を30サイクル反応後、4℃で保存）によりDNAライブラリー（第1のDNA断片）を作製した。
【０２２６】
３．３  次世代シーケンサー用のDNAライブラリーの作製
３．２で作製したDNAライブラリー（第1のDNA断片）1μlに最終濃度0.2 mM dNTP mixture、1100.0 mM MgCl2及び1.25 unit DNA Polymerase（TAKARA、PrimeSTAR）に、0.25μMの次世代シーケンサー用プライマーをそれぞれ加え、最終反応量50μlでPCR（95℃を2分後、98℃を15秒間、55℃を15秒間、72℃を20秒を25サイクル反応後、72℃を1分後、4℃で保存）により次世代シーケンサー用のDNAライブラリー（第2のDNA断片）を作製した。作製したDNAライブラリーをMinElute PCR Purification Kit（QIAGEN）で精製後、Agilent 2100 バイオアナライザ（Agilent Technologies）で電気泳動し波形を確認した。
【０２２７】
３．４  次世代シーケンサーによる解析
３．３で作製したDNAライブラリー（第2のDNA断片）については、 MiSeq Reagent Kit V2 500 Cycle（Illumina）を用いてリード長100塩基のペアエンド条件のもとMiSeqにより解析した。
【０２２８】
３．５  塩基配列情報の解析
３．４で得られたリードデータは、それぞれの植物の葉緑体ゲノム塩基配列情報（トウモロコシ： NC_001666.2 Zea mays chloroplast, complete genome、イネ： NC_001320.1 Oryza sativa Japonica Group plastid, complete genome、ジャガイモ： NC_008096.2 Solanum tuberosum chloroplast, complete genome、ダイズ： NC_007942.1 Glycine max chloroplast, complete genome）にbowtie2を用いてマッピングし、葉緑体ゲノム由来のリードデータ及びその領域を特定した。
【０２２９】
４．  結果
４．１  葉緑体ゲノム由来リードデータの解析
４．１．１  葉緑体ゲノムへのマッピング
表３３に示したランダムプライマーセットAにより作製したDNAライブラリーをMiSeqにより解析した結果を表３６に示した。
【０２３０】
【表３６】
2018191598.tif 000065
【０２３１】
表３６に示すように、ランダムプライマーセットAを使用することで、トウモロコシ、イネ、ジャガイモ及びダイズについて、それぞれ41万以上のリードデータが得られた。得られたリードデータを各植物の葉緑体ゲノムの塩基配列情報にマッピングした結果、表３６に示すように、9,725〜134,709のリードデータが葉緑体ゲノムにマッピングされた。特に、ジャガイモ及びダイズは、得られたリードデータのうちそれぞれ28.3%及び29.1%が葉緑体ゲノム由来と考えられた。この結果より、ランダムプライマーセットAを使用した場合には、核ゲノムを解析する上でデータロスが大きいと結論付けられた。
【０２３２】
４．１．２   葉緑体ゲノムの特定領域
４．１．１でリードデータが多くマッピングされる葉緑体ゲノムの位置を特定するため、葉緑体ゲノムにマッピングされたリードデータのうち、1%以上がマッピングされた領域を特定領域とした。トウモロコシについて葉緑体ゲノムの特定領域とマッピングされたリード数を纏めた結果を表３７に示し、イネについて葉緑体ゲノムの特定領域とマッピングされたリード数を纏めた結果を表３８に示し、ジャガイモについて葉緑体ゲノムの特定領域とマッピングされたリード数を纏めた結果を表３９に示し、ダイズについて葉緑体ゲノムの特定領域とマッピングされたリード数を纏めた結果を表４０に示した。
【０２３３】
【表３７】
2018191598.tif 000066
【０２３４】
【表３８】
2018191598.tif 000067
【０２３５】
【表３９】
2018191598.tif 000068
【０２３６】
【表４０】
2018191598.tif 000069
【０２３７】
表３７〜４０に示したように、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズでは4つの特定領域、イネでは6つの特定領域が見いだされた。これら特定領域にマッピングされたリードの割合は、葉緑体ゲノムにマッピングされたリードの96.3%〜99.4%と高く、ほとんどのリードがこれらの特定領域に由来すると考えられた。
【０２３８】
表３７〜４０に示した特定町域のうちRegion_1_1及びRegion_2_1について、塩基配列を比較した結果を図１２０−１及び１２０−２に示した。なお、図１２０−１及び１２０−２において、トウモロコシで見いだした特定領域をRegion_1_1_Corn及びRegion_2_1_Cornと記載し、イネで見いだした特定領域をRegion_1_1_Oryza及びRegion_2_1_Oryzaと記載し、ジャガイモで見いだした特定領域をRegion_1_1_Potato及びRegion_2_1_Potetoと記載し、ダイズで見いだした特定領域をRegion_1_1_Soybean及びRegion_2_1_Soybeanと記載した。また、Region_1_1_Cornの塩基配列を配列番号２１５３に示し、Region_1_1_Oryzaの塩基配列を配列番号２１５４に示し、Region_1_1_Potatoの塩基配列を配列番号２１５５に示し、Region_1_1_Soybeanの塩基配列を配列番号２１５６に示し、Region_2_1_Cornの塩基配列を配列番号２１５７に示し、Region_2_1_Oryzaの塩基配列を配列番号２１５８に示し、Region_2_1_Potatoの塩基配列を配列番号２１５９に示し、Region_2_1_Soybeanの塩基配列を配列番号２１６０に示した。
【０２３９】
そして、特定領域の塩基配列を比較した結果、図１２０−１及び１２０−２に示すように、4領域（Region_1_1、Region_1_2、Region_2_1、Region_2_2）は全ての植物で極めて類似しており共通した領域であると考えられた。なお、Region_1_2とRegion_2_2（図１２０−１及び１２０−２中、Rigion_*_2と標記）は、それぞれRegion_1_1とRegion_2_1の領域内に存在しており、Region_1_1とRegion_2_1の相補鎖は類似し、パリンドロームを形成していると考えられた。
【０２４０】
これら4領域の末端配列は大きく3種類に分類することができ、特に領域の110塩基は4領域に共通する配列だった。これらの領域の配列情報から、ランダムプライマーセットAのうち、「TAAGAGACAG」の3’末端に「TGC」、「GGA」、「GGG」又は「GTG」を連結した配列からなるランダムプライマーにより増幅されたと考えられた。特に、なかでも「TAAGAGACAGTGC」は、これらの領域すべての増幅に関わるランダムプライマーと考えられた。
【０２４１】
ところで、イネにおいて見いだされた特定町域のうちRegion_3_1とRegion_3_2を比較した結果を図１２１に示した（それぞれRegion_3_1_Oryza及びRegion_3_2_Oryzaと標記）。Region_3_1_Oryza及びRegion_3_2_Oryzaの塩基配列をそれぞれ配列番号２１６１及び２１６２に示した。図１２１に示すように、Region_3_2はRegion_3_1の内部配列であった。この解析結果より、「TAAGAGACAG」の3’末端に「TGC」、「GTA」、「ATA」又は「CCA」を連結した配列からなるランダムプライマーにより増幅されたと考えられた。
【０２４２】
４．２  ランダムプライマーの選定
４．１．２において解析した結果から、葉緑体ゲノム由来のDNA断片の増幅には、ランダムプライマーセットAのうち「TAAGAGACAGTGC」のランダムプライマーが大きく関与していることが示された。よって、当該「TAAGAGACAGTGC」のランダムプライマーを除く63本、60本、40本、20本、10本からなるランダムプライマー5セットを選定した（表３３、セットB〜F）。
【０２４３】
４．３  選定ランダムプライマーセットの解析
４．２で選定したランダムプライマー5セット（セットB〜F）を用いて、ランダムプライマーセットAを用いた方法と同様にして、トウモロコシ、イネ、ジャガイモ及びダイズを解析した。ランダムプライマーセットBを用いたときの結果を表４１に示し、ランダムプライマーセットCを用いたときの結果を表４２に示し、ランダムプライマーセットDを用いたときの結果を表４３に示し、ランダムプライマーセットEを用いたときの結果を表４４に示し、ランダムプライマーセットFを用いたときの結果を表４５に示した。
【０２４４】
【表４１】
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【０２４５】
【表４２】
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【０２４６】
【表４３】
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【０２４７】
【表４４】
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【０２４８】
【表４５】
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【０２４９】
また、表４１〜４５に示した結果と、表３６に示した結果とを併せて図１２２に示した。その結果、表４１〜４５及び図１２２に示した結果より、TAAGAGACAGTGCを含まないランダムプライマーセットB〜Fを利用することで、葉緑体ゲノムにマッピングされるリードデータの割合が半分以上に減少することがわかった。特に、ランダムプライマーセットAからランダムプライマー「TAAGAGACAGTGC」を1本だけ除いたセットBにおいては、その割合が0.3〜3.3%と大幅に削減された。また、ランダムプライマー10本からなるセットFにおいても、その割合が0.2%〜1.8%と大幅に削減されていた。
【０２５０】
この結果より、本実施例で見いだした葉緑体ゲノムにおける特定領域の配列情報をもとにランダムプライマーを選定することで、葉緑体ゲノム由来のリードデータを大幅に削減できることが示された。
【０２５１】
４．４  ランダムプライマーセットGの解析
また、本実施例では、４．１．２で見いだした特定領域とランダムプライマーの長さとの関係を見るため、12塩基からなるランダムプライマーセットG（表３４）を用いてイネ日本晴ゲノムを解析した。解析結果を表４６に示した。
【０２５２】
【表４６】
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【０２５３】
表４６に示すように、葉緑体ゲノムにマッピングされたリードの97.9%がRegion_3_2を除く5つの領域にマッピングされた。以上の結果から、ランダムプライマーの長さを変化させても、葉緑体ゲノムにマッピングされるリードの多くはこれらの特定領域に由来することが明らかとなった。また、「TAAGAGACAG」の3’末端に「TG」を有するランダムプライマーによりこれらの領域が増幅されたと考えられた。
【０２５４】
５．考察
本実施例で示したように、５’末端にTAAGAGACAGを有するランダムプライマーセットを利用し、次世代シーケンサーから得られるリードデータについて解析したところ、全ての植物種で葉緑体ゲノム由来のリードデータが多く含まれること、植物種によっては得られるリードデータの約3割が葉緑体ゲノム由来であることが示された。次世代シーケンサーによる解析では、その性能がリードデータ量に強く依存しており、目的とするリードデータの歩留りの向上が重要である。通常、核ゲノムを解析する場合、葉緑体ゲノムのリードデータは不要であり、その低減が課題であった。
【０２５５】
本実施例で示したように、葉緑体ゲノムにマッピングされたリードデータの大半は特定の領域に由来することが明らかとなった。そして、本実施例で示したように、特定のランダムプライマーを除いたランダムプライマーセットを利用することで、葉緑体ゲノムの特定領域由来のリードデータを大幅に低減できることが示された。具体的には、特定領域の配列解析に基づいて、「TAAGAGACAGTGC」を除くランダムプライマーセットを5種類選定した。いずれのセットを利用した場合でも葉緑体ゲノム由来のリードデータを半分以上に低減することができ、特に、「TAAGAGACAGTGC」を1本だけ除いたセットBや10本のランダムプライマーからなるセットFにおいて、大幅な低減が確認できた。この結果から、特定領域由来のDNA断片の増幅を回避するランダムプライマーセットの設計により、ランダムプライマーセット内のランダムプライマーの本数に関係なく、葉緑体ゲノム由来のリードデータを大幅に低減できると考えられた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【図７９】
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【図８０】
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【図８１】
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【図８２】
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【図８３】
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【図８４】
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【図８５】
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【図８６】
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【図８７】
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【図８８】
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【図８９】
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【図９０】
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【図９１】
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【図９２】
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【図９３】
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【図９４】
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【図９５】
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【図９６】
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【図９７】
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【図９８】
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【図９９】
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【図１００】
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【図１０１】
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【図１０２】
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【図１０３】
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【図１０４】
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【図１０５】
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【図１０６】
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【図１０７】
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【図１０８】
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【図１０９】
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【図１１０】
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【図１１１】
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【図１１２】
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【図１１３】
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【図１１４】
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【図１１５】
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【図１１６】
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【図１１７】
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【図１１８】
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【図１１９】
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【図１２０−１】
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【図１２０−２】
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【図１２１】
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【図１２２】
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【配列表】
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