(57)【要約】      （修正有）【課題】酸素消費量等の細胞代謝能測定において、細胞が入ったウェルを封止し細胞を隔離して、細胞間の酸素等のコンタミネーションを防止できるマイクロチップの提供。【解決手段】試料に含有される細胞２０１を捕獲する細胞捕獲部１０１と、細胞捕獲部１０１を封止する流体が導入される封止用流路１０３とを有し、前記流体は、細胞代謝関連物質の透過性を実質的に有さないものである、細胞の代謝を測定するためのマイクロチップ。好ましくは、前記流体が鉱物油から選択された１種以上である、マイクロチップ好ましくは、細胞捕獲部１０１の表面が親水性であり、細胞封止用流路の表面が疎水性であるマイクロテープ。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料に含有される細胞を捕獲する細胞捕獲部と、
前記細胞捕獲部を封止する流体が導入される封止用流路と
を有し、
前記流体は、細胞代謝関連物質の透過性を実質的に有さないものである、
細胞の代謝を測定するためのマイクロチップ。
【請求項２】
前記流体は鉱物油から１種類又は複数種類が選択されたものである、請求項１に記載のマイクロチップ。
【請求項３】
前記細胞捕獲部は細胞代謝関連物質の透過性を実質的に有さない材質で形成された、請求項１に記載のマイクロチップ。
【請求項４】
前記細胞捕獲部の表面は親水性である、請求項１に記載のマイクロチップ。
【請求項５】
前記封止用流路の表面は疎水性である、請求項１に記載のマイクロチップ。
【請求項６】
前記封止用流路は、前記細胞捕獲部外の上部、下部及び側部からなる群から選択される面を直接的又は間接的に封止するように形成された、請求項１に記載のマイクロチップ。
【請求項７】
前記細胞捕獲部は細胞引き込み用通路を有する、請求項１に記載のマイクロチップ。
【請求項８】
更に、試料流入部、試料流出部、流体流入部及び流体流出部を有する、請求項１に記載のマイクロチップ。
【請求項９】
前記細胞は単一細胞又は細胞塊である、請求項１に記載のマイクロチップ。
【請求項１０】
細胞の代謝を測定するための装置であって、
試料に含有される細胞を捕獲する細胞捕獲部と、前記細胞捕獲部を封止する流体が導入される封止用流路とを有し、前記流体は細胞代謝関連物質の透過性を実質的に有さないものである、細胞の代謝を測定するためのマイクロチップ、
前記マイクロチップの封止用流路に前記流体を導入する流体導入部、及び
前記マイクロチップの細胞捕獲部に捕獲された細胞の代謝を測定する測定部
を有する、前記装置。
【請求項１１】
細胞の代謝を測定する方法であって、
試料に含有される細胞を捕獲する細胞捕獲部と、前記細胞捕獲部を封止する流体が導入される封止用流路とを有し、前記流体は細胞代謝関連物質の透過性を実質的に有さないものである、細胞の代謝を測定するためのマイクロチップを用い、以下の工程（Ａ）〜（Ｃ）：
（Ａ）前記細胞を細胞捕獲部に捕獲する工程、
（Ｂ）前記封止用流路に流体を導入し、前記細胞捕獲部を封止する工程、及び
（Ｃ）前記細胞の代謝を測定する工程
を含む、前記方法。
【請求項１２】
前記工程（Ｃ）は、酸素透過性及び／又は水素イオンの濃度を測定することにより行う、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記工程（Ａ）で捕獲された細胞に細胞刺激物質を適用する工程を更に含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
細胞の代謝を測定するためのシステムであって、
試料に含有される細胞を捕獲する細胞捕獲部と、前記細胞捕獲部を封止する流体が導入される封止用流路とを有し、前記流体は細胞代謝関連物質の透過性を実質的に有さないものである、細胞の代謝を測定するためのマイクロチップ、前記マイクロチップの封止用流路に前記流体を導入する流体導入部、並びに前記マイクロチップの細胞捕獲部に捕獲された細胞の代謝を測定する測定部を有する、細胞の代謝を測定するための装置部と、
前記流体の流れの制御及び前記測定を前記装置部に実行させるためのプログラムを有する装置制御部と、
前記装置部により得られた測定データを解析する解析部と、
前記測定部により得られた測定データ及び／又は前記解析部により得られた解析結果を表示する表示部と、
を有する前記システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の代謝を測定するためのマイクロチップ、細胞の代謝を測定するための装置、細胞の代謝を測定する方法及び細胞の代謝を測定するためのシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、細胞の代謝や分泌等を測定する技術が開発されている。
例えば、細胞の酸素消費や代謝フラックスを、蛍光プレートリーダーを使って測定するアッセイキットが市販されている。
しかし、市販のアッセイキットは、測定対象が細胞のバルク（数万個の細胞）であり、単一細胞の代謝を測定することができなかった。そこで、単一細胞の代謝を測定できる技術が求められていた。
【０００３】
細胞のバルクが測定対象の場合は、ウェルが大きいため、例えば酸素消費を測定する場合、酸素の拡散やウェル間での酸素の透過等の影響は少なかった。
しかし、単一細胞が測定対象の場合は、ウェルが非常に小さいため、酸素の拡散やウェル間での酸素の糖化等の影響が大きく、単一細胞を十分に隔離しなければ正確な酸素消費データが得られない。
【０００４】
そのような問題を解決するため、各細胞を隔離する方法が開発されており、例えば、ピストンを使った方法がある（非特許文献１、２）。
非特許文献１には、マイクロウェルアレイに単一の生細胞を入れ、シアノアクリレート系接着剤、シリコーンゴム及びホウケイ酸ガラスを用いて封止し、単一の生細胞の酸素消費を測定したことが開示されている。
非特許文献２には、ガラスをエッチングしたマイクロウェルアレイに単一の生細胞を入れ、ピストンを用いて金で作られた酸素バリアでマイクロウェルを封止したことが開示されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】J. Dragavon et. al., “A cellular isolation system for real-time single-cell oxygen consumption monitoring”, [online], J R Soc Interface, 2008 Oct; 5(Suppl 2): S151-159, published online 2008 Jun 2
【非特許文献２】T. W. Molter, et. al., “A New Approach for Measuring Single-Cell Oxygen Consumption Rates”, IEEE Trans Autom Sci Eng., 2008 Jan 1; 5(1): 32-42
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、非特許文献１及び２に開示されたようなピストンを用いると、ピストンの動作の再現性、ピストンが細胞の入った液に接することによる細胞への影響やピストンの次の動作への影響、広範囲でのピストン動作の困難性、ピストンを採用した際の細胞代謝測定システムが大きく複雑になること、ピストン動作時に密封性を確認する必要があること等の問題がある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
そこで、本発明者らは、前記課題解決のため鋭意研究し、細胞捕獲部の周囲に流路を設置して該流路に酸素透過性等の低い流体を流す本技術を開発した。
【０００８】
すなわち、本技術は、
試料に含有される細胞を捕獲する細胞捕獲部と、
前記細胞捕獲部を封止する流体が導入される封止用流路と
を有し、
前記流体は、細胞代謝関連物質の透過性を実質的に有さないものである、
細胞の代謝を測定するためのマイクロチップを提供する。
前記流体は鉱物油から１種類又は複数種類を選択することができる。
前記細胞捕獲部は細胞代謝関連物質の透過性を実質的に有さない材質で形成されていてもよい。
また、前記細胞捕獲部の表面は親水性であり得る。
一方、前記封止用流路の表面は疎水性であり得る。
また、前記封止用流路は、前記細胞捕獲部外の上部、下部及び側部からなる群から選択される面を直接的又は間接的に封止するように形成されていてもよい。
更に、前記細胞捕獲部は細胞引き込み用通路を有してもよい。
また更に、試料流入部、試料流出部、流体流入部及び流体流出部を有してもよい。
なお、前記細胞は単一細胞又は細胞塊でもよい。
【０００９】
また、本技術は、
細胞の代謝を測定するための装置であって、
試料に含有される細胞を捕獲する細胞捕獲部と、前記細胞捕獲部を封止する流体が導入される封止用流路とを有し、前記流体は細胞代謝関連物質の透過性を実質的に有さないものである、細胞の代謝を測定するためのマイクロチップ、
前記マイクロチップの封止用流路に前記流体を導入する流体導入部、及び
前記マイクロチップの細胞捕獲部に捕獲された細胞の代謝を測定する測定部
を有する装置を提供する。
【００１０】
また、本技術は、
細胞の代謝を測定する方法であって、
試料に含有される細胞を捕獲する細胞捕獲部と、前記細胞捕獲部を封止する流体が導入される封止用流路とを有し、前記流体は細胞代謝関連物質の透過性を実質的に有さないものである、細胞の代謝を測定するためのマイクロチップを用い、以下の工程（Ａ）〜（Ｃ）：
（Ａ）前記細胞を細胞捕獲部に捕獲する工程、
（Ｂ）前記封止用流路に流体を導入し、前記細胞捕獲部を封止する工程、及び
（Ｃ）前記細胞の代謝を測定する工程
を含む方法を提供する。
ここで、前記工程（Ｃ）は、酸素及び／又は水素イオンの濃度を測定することにより行うことができる。
また、前記工程（Ａ）で捕獲された細胞に細胞刺激物質を適用する工程を更に含んでもよい。
【００１１】
更に、本技術は、
細胞の代謝を測定するためのシステムであって、
試料に含有される細胞を捕獲する細胞捕獲部と、前記細胞捕獲部を封止する流体が導入される封止用流路とを有し、前記流体は細胞代謝関連物質の透過性を実質的に有さないものである、細胞の代謝を測定するためのマイクロチップ、前記マイクロチップの封止用流路に前記流体を導入する流体導入部、並びに前記マイクロチップの細胞捕獲部に捕獲された細胞の代謝を測定する測定部を有する、細胞の代謝を測定するための装置部と、
前記流体の流れの制御及び前記測定を前記装置部に実行させるためのプログラムを有する装置制御部と、
前記装置部により得られた測定データを解析する解析部と、
前記測定部により得られた測定データ及び／又は前記解析部により得られた解析結果を表示する表示部と、
を有するシステムを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本技術に係るマイクロチップの基本構造を示す図である。
【図２】本技術に係るマイクロチップの実施態様１を示す図である。
【図３】本技術に係るマイクロチップのサイズの例を示す図である。
【図４】本技術に係るマイクロチップの実施態様１を示す図面代用写真である。
【図５】本技術に係るマイクロチップの実施態様１を示す図面代用写真である。
【図６】本技術に係るマイクロチップの実施態様１を示す図面代用写真である。
【図７】本技術に係るマイクロチップの実施態様２を示す図である。
【図８】本技術に係る細胞代謝測定装置を示す図である。
【図９】本技術に係る細胞代謝測定方法の工程を示す図である。
【図１０】本技術に係る細胞代謝測定システムを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本技術を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本技術の代表的な実施形態を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。説明は以下の順序で行う。
１．細胞代謝測定用マイクロチップ
１−１．マイクロチップの構造
１−２．実施態様１
１−３．実施態様２
１−４．マイクロチップの製造方法
２．細胞代謝測定装置
３．細胞代謝測定方法
４．細胞代謝測定システム
【００１４】
＜１．細胞代謝測定用マイクロチップ＞
本技術の細胞の代謝を測定するためのマイクロチップは、樹脂、ガラス、シリコン、金属等の材質で形成される。該材質は、オキソニウムイオン、水素イオン等のイオン透過性、酸素分子や水素分子等の気体透過性、液体透過性、細胞から排出・分泌される物質や細胞に取り込まれる物質等の細胞代謝関連物質の透過性を実質的に有さない材質であることが好ましい。具体的には、加熱により硬化する液状フッ素エラストマー、エチレン−ビニルアルコール共重合体、ポリ塩化ビニリデン、ポリイソブチレン、アクリル系樹脂等が挙げられる。
【００１５】
なお、ここで、「実質的に」とは、オキソニウムイオン、水素イオン等のイオン、酸素分子、水素分子等の気体、液体、細胞から排出・分泌される物質、細胞に取り込まれる物質等の細胞代謝関連物質のウェル間及びマイクロチップ間で拡散する量が、細胞代謝の測定において十分に無視できることをいう。好ましくは、細胞代謝の測定値の10％以内、より好ましくは1％以内である。
あるいは、「実質的に」とは、ウェルのサイズにもよるが、例えば50μm径のウェルが、該ウェル以外の部分であって細胞代謝関連物質が満たされている部分に接しているときに、該ウェルが前記細胞代謝関連物質で満たされるまでの時間が、好ましくは10分以上、より好ましくは60分以上かかることをいう。
【００１６】
また、「細胞代謝関連物質」とは、例えば、イオン、気体及び液体からなる群から選択される物質である。具体的には、オキソニウムイオン、水素イオン、酸素分子、水素分子、水分等が挙げられる。更には、細胞に含有されるあらゆる生体物質、例えば、細胞内粒子、核酸、リボソーム、プロテアソーム、糖類、タンパク質、脂質タンパク質、リポ多糖類、脂質、脂肪酸、糖質タンパク質、タンパク質繊維、ペプチド、ホルモン、薬理学的薬剤、ビタミン、アミノ酸、水分に溶解した分子等も含まれる。
【００１７】
１−１．マイクロチップの構造
本技術のマイクロチップの基本構造を図１に示す。
該マイクロチップは、試料に含有される細胞を捕獲する細胞捕獲部１０１（斜線部分）と、該細胞捕獲部１０１を封止する流体が導入される封止用流路１０３とを有する。図１では、試料等は右上から左下に矢印方向に流れる例を示す。細胞捕獲部１０１は、側壁１０２で囲まれており、内部に細胞２０１が入る。なお、図１では、細胞捕獲部１０１を、正方形を例として表しているが、円形、楕円形、長方形、六角形、八角形、その他の多角形等、種々の形を取り得る。
【００１８】
細胞捕獲部１０１で捕獲する細胞は、天然の単一細胞、単一細胞化処理で得られた細胞、複数の細胞で形成される細胞塊でもよく、あるいは生体組織でもよく、特に限定されない。
例えば、白血球、赤血球、マクロファージ、樹上細胞、好中球、好酸球、好塩基球、巨画球、細胞傷害性T細胞、ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーT細胞、B細胞、肥満細胞、Th2細胞、制御性T細胞等の血液及び免疫系細胞、外分泌上皮細胞、ホルモン分泌細胞、上皮細胞、神経細胞、感覚器官の細胞、幹細胞、脂肪細胞、収縮性細胞、胚細胞、ナース細胞、間質細胞等が挙げられる。
【００１９】
１−２．実施態様１
本技術のマイクロチップの実施態様１を図２に示す。
図２は、波形構造を有するマイクロチップの例を示しており、山部の頂部に凹部を形成し、該凹部は側壁４０２で囲まれて細胞捕獲部１０１（斜線部分）となる。このような波形構造にすることにより、波形頂部の凹部の細胞捕獲部１０１に捕捉された細胞２０１に、他の細胞が接着することを防ぎ、かつ細胞捕獲部１０１近辺に堆積していくことを防ぐ。
【００２０】
捕獲された細胞２０１は、そのまま細胞捕獲部１０１に保持されて、細胞捕獲部１０１内に留まったまま酸素消費量、pHの変化等の細胞代謝を反映する現象が測定される。
【００２１】
細胞捕獲部１０１は、細胞引き込み用通路１０４を有する。また、細胞捕獲部１０１外の上部及び側部（すなわち封止用流路１０３）に試料や、細胞を運ぶシース液、封止用流体等を流せるように、封止用流路１０３が形成される。封止用流路１０３は、天板４０１を設置して形成してもよい。
図２は、試料等が封止用流路１０３を左から右へ矢印方向に流れる例を示す。なお、流れは逆方向でもかまわない。
【００２２】
一方、細胞捕獲部１０１外の下部には、底板４０３が設けられ、底板４０３の上に、細胞引き込み用通路１０４と連結するように外部流路１０５が形成される。外部流路１０５にはバッファーや細胞２０１が捕獲された後の試料、シース液等が流れる。
図２は、バッファーやシース液等が左から右へ矢印方向に流れる例を示す。なお、流れは逆方向でもかまわない。
【００２３】
細胞２０１が細胞捕獲部１０１に効率よく捕獲されるには、封止用流路１０３に流れた細胞含有試料を流し、同時に外部流路１０５にバッファー等を流すことにより、外部流路１０５における流れが細胞引き込み用通路１０４を介して細胞捕獲部１０１に吸引力を生じさせればよい。該吸引力により、試料中の細胞が細胞捕獲部１０１に引き込まれる。細胞２０１が引き込まれた後の試料は、細胞引き込み用通路１０４を通って外部流路１０５に排出される。封止用流路１０３の流れと外部流路１０５の流れは、独立して制御できる。
【００２４】
なお、細胞捕獲部１０１は、例えば細胞２０１が１個入る大きさを有するようにしてもよい。例えば、平均直径10μm程度の細胞であれば、細胞捕獲部１０１の開口部や深さは15〜20μ程度にすればよい。また、細胞塊であれば100μm程度等にするなど、適宜変更できる。
図３に、細胞捕獲部１０１及び細胞引き込み用通路１０４のサイズの例を示す。
【００２５】
図３のサイズに基づいて成形したマイクロチップの横断面の写真を図４に示す。
マイクロチップは、前述した波形構造を有する。天板を有する封止用流路内では、試料の液流が層流となっており、常に封止用流路の中央の流速が流路側面付近より早いという特性がある。そのため、波形頂部の流速が早くなる。よって、波形頂部に細胞捕獲部を設けたことにより、細胞が細胞捕獲部に２個以上入ろうとするダブレットを防ぐことができる。つまり、ダブレットになろうとして２個目の細胞が付着しても波形構造の波形頂部の流速が早いため、中央層流に流されて２個目以降が入りにくくなる。
また、アレイ型マイクロチップの上面の写真を図５及び図６に示す。図６は図５の一部を拡大したものである。ダブレットになっているウェルがわずかにあるものの、ほとんどのウェルには単一細胞が捕獲されている。
【００２６】
なお、細胞捕獲部１０１は、細胞代謝能の測定用センサが組み込まれていてもよい。例えば、細胞捕獲部１０１に入るサイズの測定用センサが壁面等に設置されてもよいし、細胞捕獲部１０１の底面にシート型測定用センサが設置されてもよいし、捕獲部１０１に固定化されていてもよい。あるいは、シース液や試薬等に含有されてもよい。
センサとして、例えば酸素消費量測定用センサ、pHセンサ等が挙げられる。具体的には、燐光の時定数の変化による酸素濃度測定用センサ、水素イオン濃度の変化に従い燐光の時定数が変化するセンサ、酸素濃度及び水素イオン濃度を独立した波長帯（励起又は蛍光波長）で燐光を示すセンサ、又はこれらを組み合わせたものが挙げられる。
【００２７】
細胞捕獲部１０１に細胞２０１が捕獲された後、細胞捕獲部を封止する流体が封止用流路１０３、細胞引き込み用通路１０４、外部流路１０５に導入される。
封止用流体は、オキソニウムイオン、水素イオン等のイオン、酸素分子、水素分子等の気体、液体、例えば、細胞から排出・分泌される物質や、細胞に取り込まれる物質等の細胞代謝関連物質の透過性を実質的に有さないものである。
【００２８】
ここで、「実質的に」とは、オキソニウムイオン、水素イオン等のイオン、酸素分子、水素分子等の気体、液体、細胞から排出・分泌される物質、細胞に取り込まれる物質等の細胞代謝関連物質のウェル間及びマイクロチップ間で拡散する量が、封止用流体が介在したときに、細胞代謝の測定において十分に無視できることをいう。好ましくは、細胞代謝の測定値の10％以内、より好ましくは1％以内である。
あるいは、「実質的に」とは、ウェルや封止用流路、外部流路等のサイズにもよるが、例えば50μm径のウェルが、封止用流体が介在しかつ該ウェル以外の部分であって細胞代謝関連物質が満たされている部分に接しているときに、該ウェルが前記細胞代謝関連物質で満たされるまでの時間が、好ましくは10分以上、より好ましくは60分以上かかることをいう。
【００２９】
封止用流体は、酸素溶解度や拡散定数ができるだけ小さい液体を選択することが好ましい。酸素溶解度又は拡散定数の値が大きい場合は封止機能が十分に働かない。また、酸素分子及び水素イオンの極性の点から、水よりも極性の低い液体が好ましい。
例えば、鉱物油（パラフィン系、ケロシン、炭化水素又は鎖式飽和炭化水素系等）が挙げられる。また、粘度の高い流体では拡散定数が低くなるので、炭化水素又は鎖式飽和炭化水素系の場合、炭化水素が長い方が好ましい。
酸素透過性が低い流体としては、グリセリン、ジエチレングリコール、PEG 400、エチレングリコール、ポリイソブチレン、ポリイソブチレンとポリスチレンとの混合物等が挙げられる。
水素イオンの封止可能な流体としては、極性の無い液体が挙げられ、例えばパラフィン、ポリイソブチレン等である。
【００３０】
また、細胞２０１の代謝能をインビトロで測定するため、細胞捕獲部１０１の温度を制御することも考えられる。そのため、封止用流体は、温度変化によって性質が大きく変わらず、常温常圧で液体であるものが好ましい。かつ、封止用流体は、本技術のマイクロチップの材質や細胞等に影響を与えないことが好ましい。
封止用流体は、１種類選択して用いてもよいし、又は複数種類を選択してもよいし、複数種類を混合して用いてもよい。
【００３１】
更に、封止用流体とマイクロチップ表面との親和性も考慮することが好ましい。
例えば、封止用流体が鉱物油の場合、鉱物油を封止用流路１０３に流したときにマイクロチップ表面が親油性であることが好ましい。
一方、細胞捕獲部１０１には細胞含有試料やシース液を保持しておくので、親水性であることが好ましい。
【００３２】
従って、封止用流路１０３と封止用流路側の側壁４０２の表面には、例えば疎水基があることが好ましい。
一方で、細胞捕獲部１０１の表面には、親水基があることが好ましい。また、細胞引き込み用通路の１０４の表面にも親水基があることが好ましい。
【００３３】
封止用流路１０３と封止用流路側の側壁４０２の表面の親油性は、マイクロチップに採用される材質の樹脂の性質に依ることができる。または、封止用流路１０３と側壁４０２の表面にCnH2n+1基、C6H5基等の疎水基を導入してもよい。
細胞捕獲部１０１の表面を親水性にするには、フッ素ガスと酸素を表面に当てることによるカルボキシル基の導入、フッ素ガスと二酸化硫黄を表面に当てることによるスルホン酸基の導入等で行うことができる。
【００３４】
封止用流体は、封止用流路１０３に流し、細胞捕獲部１０１の側壁４０２の側部及び細胞捕獲部１０１の上部を封止する。よって、細胞捕獲部１０１外の上部の面は封止用流体で覆われて直接的に封止できる。これにより、細胞捕獲部１０１に保持された細胞２０１の細胞代謝能、例えば酸素消費量の測定において酸素不透過性が担保され、測定がより正確に行える。
【００３５】
また、前述したように、細胞引き込み用通路１０４、外部流路１０５にも封止用流体を流せる。よって、細胞捕獲部１０１外の下部の面は、まずマイクロチップの材質により直接的に封止でき、更に外部流路１０５に満たされた封止用流体により間接的に封止できる。細胞捕獲部１０１外の側部は、まずマイクロチップの側壁４０２の材質により直接的に封止でき、更に細胞捕獲部１０１の周囲をとりまく封止用流路１０３に満たされた封止用流体により間接的に封止できる。よって、複数の細胞捕獲部１０１間での酸素等のコンタミネーションを抑えることができる。
【００３６】
１−３．実施態様２
本技術のマイクロチップの実施態様２を図７に示す。
マイクロチップ１は、その内部に、試料流入部５０１、流体流入部５０２、試料流出部５０３、流体流出部５０４を有してもよい。
試料流入部５０１と流体流入部５０２は分けずに兼用してもよいし、試料流出部５０３と流体流出部５０４も分けずに兼用してもよい。
【００３７】
図４は、試料及び流体が右上から左下に矢印方向に流れる例を示す。
試料は、試料流入部から導入し、封止用流路１０３に流れ、細胞捕獲部１０１の上部及び細胞捕獲部１０１内にも流れて、細胞捕獲部１０１に試料中の細胞が捕獲される。
細胞捕獲後、バッファーやシース液、洗浄液等で残余の試料を試料流出部５０３に流してもよい。
【００３８】
次に、封止用流体を流体流入部５０２に導入する。封止用流体は、封止用流路１０３と細胞捕獲部１０１の上部とに流れる。このとき、細胞捕獲部１０１は、細胞及び試料で満たされたまま、細胞捕獲部１０１の上部に封止用流体が導入されることにより封止される。また、封止用流路１０３に封止用流体が導入されることにより、細胞捕獲部１０１の側部が封止用流体で満たされ、細胞捕獲部１０１は、側壁１０２と封止用流体とで封止される。
【００３９】
封止したまま、細胞２０１の細胞代謝能を測定した後、封止用流体をバッファーや試薬等を流すことにより押出し、流体流出部に排出してもよい。
このような操作で、細胞を傷付けることなく細胞に影響を与えることなく、封止及び封止の解除を繰り返し行うことができる。
【００４０】
１−４．マイクロチップの製造方法
本技術の酸素消費量測定用マイクロチップは、例えば以下のように製造できる。
ジメチルポリシロキサン（PDMS）の基板の全体に、エチレン−ビニルアルコール共重合体（EVOH）のフィルムを積層する。その上に、細胞の酸素代謝を測定できるシート型センサを積層する。基板への積層はスピンコーティング等の技術で行うことができる。
【００４１】
次に、積層した基板のエンボス加工によりウェル（細胞捕獲部１０１に該当）を形成する。エンボス加工用の押し型は、所望の形状に加工するように形成できる。例えば、前記実施態様１の波形構造を形成する押し型にできる。また、エンボス加工の条件は、例えば130℃、10kNとすることができる。
【００４２】
細胞代謝能測定時には、押し型を外し、ウェルの底部に積層されたシート型センサを残し、その他の部分のシート型センサを基板から剥がす。これにより、ウェルに細胞が捕捉されたときにシート型センサで酸素消費量を測定できる。
【００４３】
＜２．細胞代謝測定装置＞
本技術の細胞代謝測定装置の例を図８に示す。
細胞代謝測定装置１１は、
試料に含有される細胞を捕獲する細胞捕獲部と、前記細胞捕獲部を封止する流体が導入される封止用流路とを有し、前記流体は細胞代謝関連物質の透過性、特に酸素透過性及び／又は水素透過性を実質的に有さないものである、細胞の代謝を測定するためのマイクロチップ１、
前記マイクロチップの封止用流路に前記流体を導入する流体導入部２、及び
前記マイクロチップの細胞捕獲部に捕獲された細胞の代謝を測定する測定部３
を有する。
【００４４】
マイクロチップ１は、細胞代謝測定装置１１において容易に交換することができる。マイクロチップ１はディスポーザブル又はリサイクル可能にすることができる。
また、マイクロチップ１を設置する装置部分には、生細胞が活動する温度、例えばヒト由来の細胞であれば細胞捕獲部が35〜40℃になるようなヒーターを設置することができる。
【００４５】
流体導入部２は、細胞代謝関連物質等の透過性を実質的に有さない流体をマイクロチップ１内に導入する。流体導入部２は、図４に示した流体流入部５０２と連結している。
そして、流体導入部２は、例えばポンプ等の送液装置を有しており、例えば加圧により封止用流体をマイクロチップ１内に送り込むことができる。
なお、流体導入部２は試料導入部（図示せず）や細胞刺激試薬導入部（図示せず）と兼用としてもよい。
【００４６】
測定部３は、例えば前記酸素消費量を測定できるシート型センサからの信号を受け、細胞代謝能を測定する。測定は経時的に行うことができる。
測定部３の具体例としては、蛍光強度を測定する測定部、個々の細胞捕獲部１０１における燐光の時定数の経時変化を測定する測定部、高速イメージング等を使って一括で複数の細胞捕獲部１０１における燐光の時定数の変化を測定する測定部等が挙げられる。
また、細胞代謝能測定前に、どの細胞捕獲部１０１に細胞が捕獲されたかを画像データを取得する装置（CMOS、CCD等）を含めてもよい。画像データで各々の細胞捕獲部１０１に細胞が捕獲されたことを確認後、細胞代謝能を測定してもよい。
【００４７】
測定後は、測定結果に基づいて所望の細胞を選択し、キャピラリー等で回収することもできる。
または、特定の細胞を認識できるように試薬でマーキングしておき、細胞を全部回収した後、マーキングした細胞のみを選択することもできる。
【００４８】
＜３．細胞代謝測定方法＞
本技術の細胞代謝測定方法は、本技術のマイクロチップを用い、
以下の工程（Ａ）〜（Ｃ）：
（Ａ）前記細胞を細胞捕獲部に捕獲する工程、
（Ｂ）前記封止用流路に流体を導入し、前記細胞捕獲部を封止する工程、及び
（Ｃ）前記細胞の代謝を測定する工程
を含んで行う。
【００４９】
細胞代謝測定方法の工程の例を図１０に示す。
まず、マイクロチップに細胞を含有する試料を導入する。細胞をマイクロチップ内で運ぶためにシース液等を用いてもよい。運ばれた細胞はマイクロチップの細胞捕獲部にて、例えば１個ずつ捕獲される（S101）。捕獲されなかった細胞や余剰の試料は、シース液や洗浄液で洗い流しても、封止用流体で押出してもよい。
【００５０】
ここで、マイクロチップに封止用流体を流し、細胞捕獲部を封止して、最初の細胞代謝能を測定してもよい。それにより、最初の測定結果と、経時後の測定結果や細胞刺激後の測定結果とを比較することができる。
測定項目として、例えば酸素透過性、水素イオンの濃度、pHが挙げられるが、特に限定されない。
【００５１】
次に、封止用流体をバッファーや洗浄液で押出す等してマイクロチップから除去した後、細胞に細胞刺激物質を適用し、細胞を刺激してもよい（S102）。細胞刺激物質として、例えば、糖、アミノ酸、脂肪、酸・アルカリ（pH調整剤）が挙げられる。
【００５２】
細胞を刺激した後、再度マイクロチップの細胞捕獲部を封止用流体で封止し（S103）、細胞代謝能を測定する（S104）。そして、封止用流体をバッファー等で押出して封止を解除する（S105）。S102又はS103からS105を繰り返して測定を複数回又は経時的に行うことができる。
【００５３】
＜４．細胞代謝測定システム＞
本技術の細胞代謝測定システムの例を図１０に示す。
細胞代謝測定システム１０００は、
細胞代謝測定装置１１と、
流体の流れの制御及び測定を、細胞代謝測定装置１１の装置部に実行させるためのプログラムを有する装置制御部１２と、
装置１１にある測定部により得られた測定データを解析する解析部と、
測定部により得られた測定データ及び／又は前記解析部により得られた解析結果を表示する表示部と、
を有する。
【００５４】
細胞代謝測定装置１１は、マイクロチップへの封止用流体、試料、細胞刺激物質の試薬等の導入、それらの流れ、マイクロチップの温度、測定時間の測定条件や装置動作が、装置制御部１２により制御される。装置制御部１２は、例えばコンピュータである。
装置制御部１２はプログラムを搭載しており、プログラムには予め測定条件や装置動作が設定され、該条件に応じて細胞代謝測定装置１１を制御する。
【００５５】
細胞代謝測定装置１１の測定部により測定されたデータは解析部１３に送られ、解析部１３で解析される。解析は、各々の細胞から得られた酸素消費量データやpHデータを組み合わせ、どの細胞がどの程度の細胞代謝能を有しているかを分析することにより行う。解析結果に基づいて所望の細胞を選択するために、所望の細胞捕獲部を特定できる。
また、解析結果を装置制御部１２にフィードバックし、自動的に測定条件や装置動作を変えることもできる。
【００５６】
表示部１４は、細胞代謝測定装置１１の測定部により得られた測定データや解析部１３により得られた解析結果等を表示する。具体的には、コンピュータに備え付けられたディスプレイ、プリントアウト装置等が挙げられる。
【００５７】
なお、本技術は、以下のような構成も採ることができる。
〔１〕  試料に含有される細胞を捕獲する細胞捕獲部と、
前記細胞捕獲部を封止する流体が導入される封止用流路と
を有し、
前記流体は、細胞代謝関連物質の透過性を実質的に有さないものである、
細胞の代謝を測定するためのマイクロチップ。
〔２〕  前記流体は鉱物油から１種類又は複数種類が選択されたものである、〔１〕のマイクロチップ。
〔３〕  前記細胞捕獲部は細胞代謝関連物質の透過性を実質的に有さない材質で形成された、〔１〕又は〔２〕のマイクロチップ。
〔４〕  前記細胞捕獲部の表面は親水性である、〔１〕〜〔３〕のいずれかのマイクロチップ。
〔５〕  前記封止用流路の表面は疎水性である、〔１〕〜〔４〕のいずれかのマイクロチップ。
〔６〕  前記封止用流路は、前記細胞捕獲部外の上部、下部及び側部からなる群から選択される面を直接的又は間接的に封止するように形成された、〔１〕〜〔５〕のいずれかのマイクロチップ。
〔７〕  前記細胞捕獲部は細胞引き込み用通路を有する、〔１〕〜〔６〕のいずれかのマイクロチップ。
〔８〕  更に、試料流入部、試料流出部、流体流入部及び流体流出部を有する、〔１〕〜〔７〕のいずれかのマイクロチップ。
〔９〕  前記細胞は単一細胞又は細胞塊である、〔１〕〜〔８〕のいずれかのマイクロチップ。
〔１０〕  細胞の代謝を測定するための装置であって、
試料に含有される細胞を捕獲する細胞捕獲部と、前記細胞捕獲部を封止する流体が導入される封止用流路とを有し、前記流体は細胞代謝関連物質の透過性を実質的に有さないものである、細胞の代謝を測定するためのマイクロチップ、
前記マイクロチップの封止用流路に前記流体を導入する流体導入部、及び
前記マイクロチップの細胞捕獲部に捕獲された細胞の代謝を測定する測定部
を有する、前記装置。
〔１１〕  細胞の代謝を測定する方法であって、
試料に含有される細胞を捕獲する細胞捕獲部と、前記細胞捕獲部を封止する流体が導入される封止用流路とを有し、前記流体は細胞代謝関連物質の透過性を実質的に有さないものである、細胞の代謝を測定するためのマイクロチップを用い、以下の工程（Ａ）〜（Ｃ）：
（Ａ）前記細胞を細胞捕獲部に捕獲する工程、
（Ｂ）前記封止用流路に流体を導入し、前記細胞捕獲部を封止する工程、及び
（Ｃ）前記細胞の代謝を測定する工程
を含む、前記方法。
〔１２〕  前記工程（Ｃ）は、酸素透過性及び／又は水素イオンの濃度を測定することにより行う、〔１１〕に記載の方法。
〔１３〕  前記工程（Ａ）で捕獲された細胞に細胞刺激物質を適用する工程を更に含む、〔１１〕又は〔１２〕に記載の方法。
〔１４〕  細胞の代謝を測定するためのシステムであって、
試料に含有される細胞を捕獲する細胞捕獲部と、前記細胞捕獲部を封止する流体が導入される封止用流路とを有し、前記流体は細胞代謝関連物質の透過性を実質的に有さないものである、細胞の代謝を測定するためのマイクロチップ、前記マイクロチップの封止用流路に前記流体を導入する流体導入部、並びに前記マイクロチップの細胞捕獲部に捕獲された細胞の代謝を測定する測定部を有する、細胞の代謝を測定するための装置部と、
前記流体の流れの制御及び前記測定を前記装置部に実行させるためのプログラムを有する装置制御部と、
前記装置部により得られた測定データを解析する解析部と、
前記測定部により得られた測定データ及び／又は前記解析部により得られた解析結果を表示する表示部と、
を有する前記システム。
【符号の説明】
【００５８】
１          マイクロチップ
２          流体導入部
３          測定部
１１        細胞代謝測定装置
１２        装置制御部
１３        解析部
１４        表示部
１５        細胞含有試料
１０１      細胞捕獲部
１０２      側壁
１０３      封止用流路
１０４      細胞引き込み用通路
１０５      外部流路
２０１      細胞
４０１      天板
４０２      側壁
４０３      底板
５０１      試料流入部
５０２      流体流入部
５０３      試料流出部
５０４      流体流出部
６０１      基板
６０２      フィルム
６０３      シート型センサ
６０４      押し型
１０００    細胞代謝測定システム
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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