(57)【要約】      （修正有）【課題】呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）ワクチン、及びＲＳＶワクチンを投与するステップを含む被験者におけるＲＳＶに対する免疫応答を誘導する方法の提供。【解決手段】中心的な免疫原性ウイルスの構造タンパク質（Ｆ及びＧタンパク質）の過剰生産者であるヒトＲＳＶ株Ｌ１９（ＨＲＳＶ−Ｌ１９）のワクチン組成物。さらにアジュバントを含む前記ワクチン組成物。アジュバントがナノエマルジョンであって、ナノエマルジョンが約１０００ｎｍ未満の平均直径を有する液滴、１つの水相、少なくとも１種の油、少なくとも１種の界面活性剤及び少なくとも１種の溶媒を含む、前記ワクチン組成物。【選択図】図１
2018008968.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
精製した呼吸器合胞体ウイルス（RSV）株L19（RSV-L19）を含むワクチン組成物。
【請求項２】
RSV-L19ウイルスがウイルス粒子に随伴する融合（F）および糖タンパク質（G）構造タンパク質の過剰生産者である、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項３】
RSV-L19ウイルスが弱毒化ヒト呼吸器合胞体ウイルス（HRSV）株L19である、請求項１または請求項２に記載のワクチン組成物。
【請求項４】
American Type Culture Collection（ATCC）にHRSV-L19として寄託されたヒト呼吸器合胞体ウイルスを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項５】
ワクチン組成物を非経口、経口または鼻腔内投与する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項６】
非経口投与が皮下、腹腔内または筋肉内注入によるものである、請求項５に記載のワクチン組成物。
【請求項７】
さらにアジュバントを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項８】
アジュバントがナノエマルジョンであって、ナノエマルジョンが
(a)約1000nm未満の平均直径を有する液滴；
(b)1つの水相；
(c)少なくとも1種の油；
(d)少なくとも1種の界面活性剤；および
(e)少なくとも1種の溶媒
を含む、請求項７に記載のワクチン組成物。
【請求項９】
ナノエマルジョンおよび／またはナノエマルジョンワクチンが
(a)被験者に全身毒性がない；
(b)投与時に最小限しかまたは全く炎症を起こさない；
(c)これらのいずれかの組み合わせである、請求項８に記載のワクチン組成物。
【請求項１０】
ナノエマルジョンワクチン液滴が約1000nm未満、約950nm未満、約900nm未満、約850nm未満、約800nm未満、約750nm未満、約700nm未満、約650nm未満、約600nm未満、約550nm未満、約500nm未満、約450nm未満、約400nm未満、約350nm未満、約300nm未満、約250nm未満、約200nm未満、約150nm未満、約100nm未満、約50nm超、約70nm超、約125nm超、約125nm超および約600nm未満、ならびにそれらのいずれかの組み合わせから成る群より選択される平均直径を有する、請求項８または請求項９に記載のワクチン組成物。
【請求項１１】
ナノエマルジョンが
(a)水相；
(b)約1％油〜約80％油；
(b)約0.1％有機溶媒〜約50％有機溶媒；および
(c)約0.001％界面活性剤〜約10％界面活性剤
を含む、請求項８〜１０のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項１２】
ナノエマルジョンワクチンが
(a)水相；
(b)約1％油〜約80％油；
(c)約.01％有機溶媒〜約50％有機溶媒；
(d)約0.001％〜約10％の1以上の非イオン界面活性剤；および
(3)カチオン界面活性剤
を含むものである、請求項８〜１１のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項１３】
ワクチンの単一投与後に被験者が抗体陽転を受ける、請求項８〜１２のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項１４】
有機溶媒が
(a)C1-C12アルコール、ジオール、トリオール、ジアルキルリン酸、トリアルキルリン酸、およびそれらの組み合わせから成る群より選択される；
(b)非極性溶媒、極性溶媒、プロトン溶媒、非プロトン溶媒、それらの半合成誘導体、およびそれらの組み合わせから成る群より選択されるアルコールである；
(c)リン酸トリ-n-ブチル、エタノール、メタノール、イソプロピルアルコール、グリセロール、中鎖トリグリセリド、ジエチルエーテル、酢酸エチル、アセトン、ジメチルスルホキシド(DMSO)、酢酸、n-ブタノール、ブチレングリコール、調香用アルコール、イソプロパノール、n-プロパノール、ギ酸、プロピレングリコール、グリセロール、ソルビトール、工業用変性アルコール、トリアセチン、ヘキサン、ベンゼン、トルエン、ジエチルエーテル、クロロホルム、1,4-ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジクロロメタン、アセトン、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ギ酸、それらの半合成誘導体、およびそれらのいずれかの組み合わせから成る群より選択される；ならびに
(d)それらのいずれかの組み合わせである、請求項８〜１３のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項１５】
油が
(a)いずれかの化粧上または製薬上許容される油である；
(b)不揮発性である；
(c)動物油、植物油、天然油、合成油、炭化水素油、シリコーン油、およびそれらの半合成誘導体、から成る群より選択される；
(d)鉱油、スクアレン油、香油、シリコンオイル、精油、水不溶性ビタミン、ステアリン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、パルミチン酸オクチル、パルミチン酸セチル、ベヘン酸トリデシル、アジピン酸ジイソプロピル、セバシン酸ジオクチル、アントラニル酸メチル、オクタン酸セチル、サリチル酸オクチル、ミリスチン酸イソプロピル、ジカプリン酸ネオペンチルグリコール、セトールズ（cetols）、Ceraphyls(登録商標)、オレイン酸デシル、アジピン酸ジイソプロピル、乳酸C12〜15アルキル、乳酸セチル、乳酸ラウリル、ネオペンタン酸イソステアリル、乳酸ミリスチル、ステアロイルステアリン酸イソセチル、ステアロイルステアリン酸オクチルドデシル、炭化水素油、イソパラフィン、液状パラフィン、イソドデカン、ワセリン、アルガン(Argan)油、アブラナ油、チリ(Chile)油、ココナツ油、コーン油、綿実油、アマニ油、グレープ種子油、カラシ油、オリーブ油、ヤシ油、パーム核油、ラッカセイ油、パイン種子油、ポピー種子油、パンプキン種子油、米ぬか油、ベニバナ油、茶油、トリュフ油、植物油、アプリコット(核)油、ホホバ油(simmondsia chinensis種子油)、グレープ種子油、マカダミア油、麦芽油、アーモンド油、ナタネ油、ヒョウタン油、ダイズ油、ゴマ油、へーゼルナッツ油、トウモロコシ油、ヒマワリ油、大麻油、ボア(Bois)油、クキナット(Kuki nut)油、アボカド油、クルミ油、魚油、ベリー油、全てのスパイス油、ジュニパー油、種子油、アーモンド種子油、アニス種子油、セロリ種子油、クミン種子油、ナツメグ種子油、葉油、バジル葉油、ベイ葉油、シナモン葉油、コモンセージ葉油、ユーカリ葉油、レモングラス葉油、メラレウカ葉油、オレガノ葉油、パチュリ葉油、ペパーミント葉油、松葉油、ローズマリー葉油、スペアミント葉油、ティーツリー葉油、タイム葉油、ウインターグリーン葉油、花油、カモミール油、クラリーセージ油、チョウジ油、ゼラニウム花油、ヒソップ花油、ジャスミン花油、ラベンダー花油、マヌカ花油、マーホラム(Marhoram)花油、オレンジ花油、ローズ花油、イランイラン花油、樹皮油、桂皮油、シナモン樹皮油、サッサフラス樹皮油、木油、クスノキ木油、セダーウッド木油、シタン木油、ビャクダン木油、根茎(ショウガ)木油、樹脂油、オリバナム油、ミルラ油、果皮油、ベルガモット果皮油、グレープフルーツ果皮油、レモン果皮油、ライム果皮油、オレンジ果皮油、タンジェリン果皮油、根茎油、吉草油、オレイン酸、リノール酸、オレイルアルコール、イソステアリルアルコール、それらの半合成誘導体、およびそれらのいずれかの組み合わせから成る群より選択される；または
(d)それらのいずれかの組み合わせである、
請求項８〜１４のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項１６】
界面活性剤が
(a)9〜10ユニットのエチレングリコールを含むエトキシ化ノニルフェノール、8ユニットのエチレングリコールを含むエトキシ化ウンデカノール、ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタンモノオレエート、エトキシ化水素化リシン油、ラウリル硫酸ナトリウム、エチレンオキシドとプロピレンオキシドとのジブロック共重合体、エチレンオキシド-プロピレンオキシドブロック共重合体、およびエチレンオキシドとプロピレンオキシドとをベースにした四官能性ブロック共重合体、グリセリルモノエステル、カプリン酸グリセリル、カプリル酸グリセリル、コカ酸グリセリル、エルカ酸グリセリル、ヒドロキシステアリン酸グリセリル、イソステアリン酸グリセリル、ラノリン脂肪酸グリセリル、ラウリン酸グリセリル、リノール酸グリセリル、ミリスチン酸グリセリル、オレイン酸グリセリル、PABAグリセリル、パルミチン酸グリセリル、リシノール酸グリセリル、ステアリン酸グリセリル、チオグリコール酸グリセリル、ジラウリン酸グリセリル、ジオレイン酸グリセリル、ジミリスチン酸グリセリル、ジステアリン酸グリセリル、セスキオレイン酸グリセリル、ステアリン酸乳酸グリセリル、ポリオキシエチレンセチル/ステアリルエーテル、ポリオキシエチレンコレステロールエーテル、ポリオキシエチレンラウレートもしくはジラウレート、ポリオキシエチレンステアレートもしくはジステアレート、ポリオキシエチレン脂肪エーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンミリスチルエーテル、ステロイド、コレステロール、β-シトステロール、ビサボロール、アルコールの脂肪酸エステル、イソプロピルミリステート、Aliphati-イソプロピルn-ブチレート、n-ヘキサン酸イソプロピル、n-デカン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、ミリスチン酸オクチルドデシル、アルコキシル化アルコール、アルコキシル化酸、アルコキシル化アミド、アルコキシル化糖誘導体、天然油およびワックスのアルコキシル化誘導体、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロック共重合体、ノノキシノール-14、PEG-8ラウレート、PEG-6コカミド、PEG-20メチルグルコースセスキステアレート、PEG40ラノリン、PEG-40ヒマシ油、PEG-40硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレン脂肪エーテル、グリセリルジエステル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンミリスチルエーテル、およびポリオキシエチレンラウリルエーテル、ジラウリン酸グリセリル、ジミリスチン酸グリセリル、ジステアリン酸グリセリル、それらの半合成誘導体、またはそれらの混合物から成る群より選択される；
(b)ラウリン酸グリセリル、ミリスチン酸グリセリル、ジラウリン酸グリセリル、ジミリスチン酸グリセリル、それらの半合成誘導体、およびそれらの混合物から成る群より選択される非イオン脂質である；
(c)約2個〜約100個の基のポリオキシエチレン頭部基を有するポリオキシエチレン脂肪エーテルである；
(d)下記の式1：
R5-(OCH2CH2)y-OH  式I
［式中、R5は、炭素原子約6個から約22個までを有する分枝または非分枝のアルキル基であり、yは、約4〜約100であり、好ましくは約10〜約100である］
を有するアルコキシル化アルコールである；
(e)界面活性剤は、ラノリンアルコールのエトキシ化誘導体であるアルコキシ化アルコールである；
(f)非イオンであって、ノノキシノール9、エトキシ化界面活性剤、エトキシ化アルコール、エトキシ化アルキルフェノール、エトキシ化脂肪酸、エトキシ化モノアルコールアミド、エトキシ化ソルビタンエステル、エトキシ化脂肪アミノ、エチレンオキシド-プロピレンオキシド共重合体、ビス(ポリエチレングリコールビス[イミダゾイルカルボニル])、ビス(ポリエチレングリコールビス[イミダゾイルカルボニル])、Brij(登録商標)35、Brij(登録商標)56、Brij(登録商標)72、Brij(登録商標)76、Brij(登録商標)92V、Brij(登録商標)97、Brij(登録商標)、58P、クレモフォール(登録商標)EL、デカエチレングリコールモノドデシルエーテル、N-デカノイル-N-メチルグルカミン、n-デシルα-D-グルコピラノシド、デシルβ-D-マルトピラノシド、n-ドデカノイル-N-メチルグルカミド、n-ドデシルα-D-マルトシド、n-ドデシルβ-D-マルトシド、n-ドデシルβ-D-マルトシド、ヘプタエチレングリコールモノデシルエーテル、ヘプタエチレングリコールモノドデシルエーテル、ヘプタエチレングリコールモノテトラデシルエーテル、n-ヘキサデシルβ-D-マルトシド、ヘキサエチレングリコールモノドデシルエーテル、ヘキサエチレングリコールモノヘキサデシルエーテル、ヘキサエチレングリコールモノオクタデシルエーテル、ヘキサエチレングリコールモノテトラデシルエーテル、Igepal CA-630、Igepal CA-630、メチル-6-O-(N-ヘプチルカルバモイル)-α-D-グルコピラノシド、ノナエチレングリコールモノドデシルエーテル、N-ノナノイル-N-メチルグルカミン、N-ノナノイル-N-メチルグルカミン、オクタエチレングリコールモノデシルエーテル、オクタエチレングリコールモノドデシルエーテル、オクタエチレングリコールモノヘキサデシルエーテル、オクタエチレングリコールモノオクタデシルエーテル、オクタエチレングリコールモノテトラデシルエーテル、オクチル-β-D-グルコピラノシド、ペンタエチレングリコールモノデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノドデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノヘキサデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノヘキシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノオクタデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノオクチルエーテル、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリエチレングリコールエーテルW-1、ポリオキシエチレン10トリデシルエーテル、ポリオキシエチレン100ステアレート、ポリオキシエチレン20イソヘキサデシルエーテル、ポリオキシエチレン20オレイルエーテル、ポリオキシエチレン40ステアレート、ポリオキシエチレン50ステアレート、ポリオキシエチレン8ステアレート、ポリオキシエチレンビス(イミダゾリルカルボニル)、ポリオキシエチレン25プロピレングリコールステアレート、キラヤ樹皮からのサポニン、Span(登録商標)20、Span(登録商標)40、Span(登録商標)60、Span(登録商標)65、Span(登録商標)80、Span(登録商標)85、タージトール15-S-12型、タージトール15-S-30型、タージトール15-S-5型、タージトール15-S-7型、タージトール15-S-9型、タージトールNP-10型、タージトールNP-4型、タージトールNP-40型、タージトールNP-7型、タージトールNP-9、タージトール型、タージトールTMN-10型、タージトールTMN-6型、テトラデシル-β-D-マルトシド、テトラエチレングリコールモノデシルエーテル、テトラエチ��ングリコールモノドデシルエーテル、テトラエチレングリコールモノテトラデシルエーテル、トリエチレングリコールモノデシルエーテル、トリエチレングリコールモノドデシルエーテル、トリエチレングリコールモノヘキサデシルエーテル、トリエチレングリコールモノオクチルエーテル、トリエチレングリコールモノテトラデシルエーテル、TritonCF-21、TritonCF-32、TritonDF-12、TritonDF-16、TritonGR-5M、TritonQS-15、TritonQS-44、TritonX-100、TritonX-102、TritonX-15、TritonX-151、TritonX-200、TritonX-207、Triton(登録商標)X-100、Triton(登録商標)X-114、Triton(登録商標)X-165、Triton(登録商標)X-305、Triton(登録商標)X-405、Triton(登録商標)X-45、Triton(登録商標)X-705-70、TWEEN(登録商標)20、TWEEN(登録商標)21、TWEEN(登録商標)40、TWEEN(登録商標)60、TWEEN(登録商標)61、TWEEN(登録商標)65、TWEEN(登録商標)80、TWEEN(登録商標)81、TWEEN(登録商標)85、チロキサポール、n-ウンデシルβ-D-グルコピラノシド、ポロキサマー101、ポロキサマー105、ポロキサマー108、ポロキサマー122、ポロキサマー123、ポロキサマー124、ポロキサマー181、ポロキサマー182、ポロキサマー183、ポロキサマー184、ポロキサマー185、ポロキサマー188、ポロキサマー212、ポロキサマー215、ポロキサマー217、ポロキサマー231、ポロキサマー234、ポロキサマー235、ポロキサマー237、ポロキサマー238、ポロキサマー282、ポロキサマー284、ポロキサマー288、ポロキサマー331、ポロキサマー333、ポロキサマー334、ポロキサマー335、ポロキサマー338、ポロキサマー401、ポロキサマー402、ポロキサマー403、ポロキサマー407、ポロキサマー105安息香酸塩、およびポロキサマー182二安息香酸塩、それらの半合成誘導体、またはそれらの組み合わせから成る群より選択される；
(g)カチオンであって、四級アンモニウム化合物、塩化アルキルトリメチルアンモニウム化合物、塩化ジアルキルジメチルアンモニウム化合物、カチオンハロゲン含有化合物、例えば、塩化セチルピリジニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンジルジメチルヘキサデシルアンモニウム、塩化ベンジルジメチルテトラデシルアンモニウム、臭化ベンジルドデシルジメチルアンモニウム、ベンジルトリメチルアンモニウムテトラクロロヨウ素酸塩、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム、臭化ドデシルエチルジメチルアンモニウム、臭化ドデシルトリメチルアンモニウム、臭化ドデシルトリメチルアンモニウム、臭化エチルヘキサデシルジメチルアンモニウム、グリニャール試薬T、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、N,N',N'-ポリオキシエチレン(10)-N-タロウ-1,3-ジアミノプロパン、臭化トンゾニウム、臭化トリメチル(テトラデシル)アンモニウム、1,3,5-トリアジン-1,3,5(2H,4H,6H)-トリエタノール、1-デカナミニウム、N-デシル-N,N-ジメチル-クロリド、塩化ジデシルジメチルアンモニウム、塩化2-(2-(p-(ジイソブチル)クレゾスキシ(cresosxy))エトキシ)エチルジメチルベンジルアンモニウム、塩化2-(2-(p-(ジイソブチル)フェノキシ)エトキシ)エチルジメチルベンジルアンモニウム、塩化アルキル1または3ベンジル-1-(2-ヒドロキシエチル)-2-イミダゾリニウム、塩化アルキルビス(2-ヒドロキシエチル)ベンジルアンモニウム、塩化アルキルデメチル(demethyl)ベンジルアンモニウム、塩化アルキルジメチル 3,4-ジクロロベンジルアンモニウム(100％ C12)、塩化アルキルジメチル3,4-ジクロロベンジルアンモニウム(50％ C14、40％ C12、10％ C16)、塩化アルキルジメチル 3,4-ジクロロベンジルアンモニウム(55％ C14、23％ C12、20％ C16)、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム(100％ C14)、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム(100％ C16)、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム(41％ C14、28％ C12)、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム(47％ C12、18％ C14)、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム(55％ C16、20％ C14)、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム(58％ C14、28％ C16)、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム(60％ C14、25％ C12)、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム(61％ C11、23％ C14)、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム(61％ C12、23％ C14)、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム(65％ C12、25％ C14)、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム(67％ C12、24％ C14)、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム(67％ C12、25％ C14)、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム(90％ C14、5％ C12)、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム(93％ C14、4％ C12)、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム(95％ C16、5％ C18)、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム、塩化アルキルジデシルジメチルアンモニウム、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム(C12-16)、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム(C12-18)、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ジアルキルジメチルベンジルアンモニウム、塩化アルキルジメチルジメチベンジル���ンモニウム、臭化アルキルジメチルエチルアンモニウム(90％ C14、5％ C16、5％ C12)、臭化アルキルジメチルエチルアンモニウム(ダイズ油の脂肪酸中としてのアルキル基およびアルケニル基の混合)、塩化アルキルジメチルエチルベンジルアンモニウム、塩化アルキルジメチルエチルベンジルアンモニウム(60％ C14)、塩化アルキルジメチルイソプロピルベンジルアンモニウム(50％ C12、30％ C14、17％ C16、3％ C18)、塩化アルキルトリメチルアンモニウム(58％ C18、40％ C16、1％ C14、1％ C12)、塩化アルキルトリメチルアンモニウム(90％ C18、10％ C16)、塩化アルキルジメチル(エチルベンジル)アンモニウム(C12-18)、塩化ジ-(C8-10)-アルキルジメチルアンモニウム、塩化ジアルキルジメチルアンモニウム、塩化ジアルキルメチルベンジルアンモニウム、塩化ジデシルジメチルアンモニウム、塩化ジイソデシルジメチルアンモニウム、塩化ジオクチルジメチルアンモニウム、塩化ドデシルビス(2-ヒドロキシエチル)オクチル水素アンモニウム、塩化ドデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ドデシルカルバモイルメチルジネチル(dinethyl)ベンジルアンモニウム、塩化ヘプタデシルヒドロキシエチルイミダゾリニウム、ヘキサヒドロ-1,3,5-トリス(2-ヒドロキシエチル)-s-トリアジン、塩化ミリスタルコニウム(および)クアット(Quat) RNIUM 14、塩化N,N-ジメチル-2-ヒドロキシプロピルアンモニウムポリマー、塩化n-テトラデシルジメチルベンジルアンモニウム一水和物、塩化オクチルデシルジメチルアンモニウム、塩化オクチルドデシルジメチルアンモニウム、塩化オクチフェノキシエトキシエチルジメチルベンジルアンモニウム、オキシジエチレンビス(塩化アルキルジメチルアンモニウム)、塩化トリメトキシシリプロピルジメチルオクタデシルアンモニウム、トリメトキシシリルクアット、塩化トリメチルドデシルベンジルアンモニウム、それらの半合成誘導体、およびそれらの組み合わせから成る群より選択される；
(h)アニオン界面活性剤であって、
カルボン酸塩、硫酸塩、スルホン酸塩、リン酸塩、ケノデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸ナトリウム塩、コール酸、ウシまたはヒツジ胆汁、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、デオキシコール酸メチルエステル、ジギトニン、ジギトキシゲニン、N,N-ジメチルドデシルアミンN-オキシド、ドキュセートナトリウム塩、グリコケノデオキシコール酸ナトリウム塩、グリココール酸水和物、合成グリココール酸ナトリウム塩水和物、合成グリコデオキシコール酸一水和物、グリコデオキシコール酸ナトリウム、グリコリトコール酸3-サルフェート二ナトリウム塩、グリコリトコール酸エチルエステル、N-ラウロイルサルコシンナトリウム塩、N-ラウロイルサルコシン溶液、N-ラウロイルサルコシン溶液、ドデシル硫酸リチウム、ドデシル硫酸リチウム、ルゴール溶液、Niaproof 4、Type 4、1-オクタンスルホン酸ナトリウム塩、1-ブタンスルホン酸ナトリウム、1-デカンスルホン酸ナトリウム、1-デカンスルホン酸ナトリウム、1-ドデカンスルホン酸ナトリウム、1-ヘプタンスルホン酸ナトリウム無水物、1-ヘプタンスルホン酸ナトリウム無水物、1-ノナンスルホン酸ナトリウム、1-プロパンスルホン酸ナトリウム一水和物、2-ブロモエタンスルホン酸ナトリウム、コール酸ナトリウム水和物、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム一水和物、ドデシル硫酸ナトリウム、ヘキサンスルホン酸ナトリウム無水物、オクチル硫酸ナトリウム、ペンタンスルホン酸ナトリウム無水物、タウロコール酸ナトリウム、タウロケノデオキシコール酸ナトリウム塩、タウロデオキシコール酸ナトリウム塩一水和物、タウロヒオデオキシコール酸ナトリウム塩水和物、タウロリトコール酸3-硫酸二ナトリウム塩、タウロウルソデオキシコール酸ナトリウム塩、Trizma(登録商標)ドデシル硫酸、TWEEN(登録商標)80、ウルソデオキシコール酸、それらの半合成誘導体、およびそれらの組み合わせから成る群より選択される；
(i)両性イオンであって、N-アルキルベタイン、ラウリルアミンド(amindo)プロピルジメチルベタイン、アルキルジメチルグリシネート(glycinate)、N-アルキルアミノプロピオネート、CHAPS、最小98％(TLC)、CHAPS、Sigma Ultra、最小98％(TLC)、CHAPS、電気泳動用、最小98％(TLC)、CHAPSO、最小98％、CHAPSO、Sigma Ultra、CHAPSO、電気泳動用、3-(デシルジメチルアンモニオ)プロパンスルホネート分子内塩、3-ドデシルジメチルアンモニオ)プロパンスルホネート分子内塩、Sigma Ultra、3-(ドデシルジメチルアンモニオ)プロパンスルホネート分子内塩、3-(N,N-ジメチルミリスチルアンモニオ)プロパンスルホネート、3-(N,N-ジメチルオクタデシルアンモニオ)プロパンスルホネート、3-(N,N-ジメチルオクチルアンモニオ)プロパンスルホネート分子内塩、3-(N,N-ジメチルパルミチルアンモニオ)プロパンスルホネート、それらの半合成誘導体、およびそれらの組み合わせから成る群より選択される；
(j)ポリマーであり、ポリマー界面活性剤は少なくとも1種のポリエチレンオキシド（PEO）側鎖を有するポリ(メチルメタクリレート)主鎖のグラフト共重合体、ポリヒドロキシステアリン酸、アルコキシル化したアルキルフェノールホルムアルデヒド縮合物、脂肪酸疎水性物質を有するポリアルキレングリコール修飾されたポリエステル、ポリエステル、それらの半合成誘導体、またはそれらの組み合わせから成る群より選択される；または
(k)それらのいずれかの組み合わせである、
請求項８〜１５のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項１７】
ナノエマルジョンが
(a)少なくとも1種のカチオン界面活性剤；
(b)塩化セチルピリジニウムであるカチオン界面活性剤；
(c)カチオン界面活性剤の濃度が約5.0％未満でかつ約0.001％超であるカチオン界面活性剤；
(d)カチオン界面活性剤の濃度が約5％未満、約4.5％未満、約4.0％未満、約3.5％未満、約3.0％未満、約2.5％未満、約2.0％未満、約1.5％未満、約1.0％未満、約0.90％未満、約0.80％未満、約0.70％未満、約0.60％未満、約0.50％未満、約0.40％未満、約0.30％未満、約0.20％未満、約0.10％未満、約0.001％超、約0.002％超、約0.003％超、約0.004％超、約0.005％超、約0.006％超、約0.007％超、約0.008％超、約0.009％超、および約0.010％超から成る群より選択されるカチオン界面活性剤；または
(e)それらのいずれかの組み合わせ
である、請求項８〜１６のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項１８】
(a)ナノエマルジョンが少なくとも1種のカチオン界面活性剤と少なくとも1種の非カチオン界面活性剤を含む；
(b)ナノエマルジョンが少なくとも1種のカチオン界面活性剤と少なくとも1種の非カチオン界面活性剤（ここで、非カチオン界面活性剤は非イオン界面活性剤である）を含む；
(c)ナノエマルジョンが少なくとも1種のカチオン界面活性剤と少なくとも1種の非カチオン界面活性剤（ここで、非カチオン界面活性剤はポリソルベート非イオン界面活性剤、ポロキサマー非イオン界面活性剤、またはそれらの組み合わせである）を含む；
(d)ナノエマルジョンが少なくとも1種のカチオン界面活性剤とポリソルベート20、ポリソルベート80、ポロキサマー188、ポロキサマー407、またはそれらの組み合わせである少なくとも1種の非イオン界面活性剤を含む；
(e)ナノエマルジョンが少なくとも1種のカチオン界面活性剤とポリソルベート20、ポリソルベート80、ポロキサマー188、ポロキサマー407、またはそれらの組み合わせである少なくとも1種の非イオン界面活性剤（ここで、非イオン界面活性剤は約0.01％〜約5.0％にて、または約0.1％〜約3％にて存在する）を含む； 
(e)ナノエマルジョンが少なくとも1種のカチオン界面活性剤と少なくとも1種の非カチオン界面活性剤（ここで、非カチオン界面活性剤は非イオン界面活性剤であり、非イオン界面活性剤は 約0.05％〜約10％、約0.05％〜約7.0％、約0.1％〜約7％、または約0.5％〜約4％の濃度で存在する）を含む；
(f)ナノエマルジョンが少なくとも1種のカチオン界面活性剤と少なくとも1種の非イオン界面活性剤（ここで、カチオン界面活性剤は約0.05％〜約2％または約0.01％〜約2％の濃度で存在する）を含む；または
(g)それらのいずれかの組み合わせである、
請求項８〜１７のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項１９】
キトサンを含むものである、請求項８〜１８のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項２０】
グルカンを含むものである、請求項８〜１９のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項２１】
水相がリン酸バッファー生理食塩水（PBS）中に存在する、請求項８〜２０のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項２２】
ヒト呼吸器合胞体ウイルスにより引き起された疾患に対する免疫の増進を誘導する方法であって、被験者に有効量の精製したHRSV-L19ワクチン組成物を投与するステップを含むものである前記方法。
【請求項２３】
被験者がナノエマルジョンワクチンの少なくとも単一投与後に防御免疫応答を生じる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
免疫応答がRSVの1種以上の株に対する保護を与える、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ヒト呼吸器合胞体ウイルス感染に対する免疫を増進する方法であって、被験者にHRSV-L19を含むナノエマルジョン製剤を投与するステップを含むものである前記方法。
【請求項２６】
投与が鼻腔内投与を含むものである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
HRSV-L19をナノエマルジョンにより不活化する、請求項２５または請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
精製し、弱毒化したヒト呼吸器合胞体ウイルス(HRSV)株L19(HRSV-L19)を含むワクチン組成物であって、HRSV-L19がウイルス粒子に随伴する融合(F)および糖タンパク質(G)構造タンパク質の過剰生産者である前記ワクチン組成物。
【請求項２９】
さらに少なくとも1つの弱毒化突然変異を含むウイルスゲノムを含む、請求項２８に記載のワクチン組成物。
【請求項３０】
さらに弱毒化表現型を記すヌクレオチド改変を含む、請求項２９に記載のワクチン組成物。
【請求項３１】
さらに少なくとも1つの製薬上許容される担体または賦形剤を含む、請求項２８〜３０のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は免疫学、特に、構造的融合（F）および糖タンパク質（G）ウイルスタンパク質の過剰生産者であるヒト呼吸器合胞体ウイルス（HRSV）株L19（HRSV-L19）のワクチン組成物、ならびにHRSV-L19のHRSV感染に対するワクチンとしての使用の分野に関する。本出願はさらに、防御免疫応答を誘導しかつワクチン誘導性疾患の増進を回避するための、HRSV-L19のナノエマルジョンとの組み合わせに関する。
【背景技術】
【０００２】
呼吸器合胞体ウイルス（RSV）は世界中の幼児および高齢者における重篤な呼吸器疾患の最大の病因であり、しかもこの病原体に使用可能なワクチンは存在しない。ヒト呼吸器合胞体ウイルス（HRSV）感染は通常、細気管支炎を生じ、しかも先進国における幼児入院の最大の病因である。さらにHRSVは高齢者、移植患者、および慢性閉塞性肺疾患（COPD）患者における主な病原体として記載されることが増加している（参考文献1）。幼児および高齢者集団に対処するための安全かつ免疫原性ワクチンの開発は特別な機会を提供している。
【０００３】
ワクチンを製剤するための従来のウイルス不活化方法、例えば、ホルムアルデヒドによる方法は肺疾患の亢進および死亡率の増加をもたらした。HRSVに対処するためのウイルスワクチン開発の徹底した研究も成功は限られている。HRSVワクチン開発に対する大きな課題のいくつかは、幼児感染、生得免疫の回避、感染防止免疫を誘導する自然感染の不全、およびワクチン増進性疾患の実証が含まれる（参考文献2）。
【０００４】
複数の研究は、ウイルスのホルマリンを用いる不活化とHRSVで感染した時の疾患のワクチン誘導性増進の実証を含んでいる。ホルマリン不活化ワクチンが疾患増進を示したという観察は、増進を阻止するために重要であるゆがめられた（skewed）免疫反応と成熟樹状細胞による初回刺激が防御免疫反応に必須であることを示す。さらに、エピトープのコンフォーメーションを維持するためにFタンパク質をその生来の状態で有することが中和抗体を作製するために必須である（参考文献、3、4、5）。生弱毒化ワクチンの使用は、ワクチンが最小の免疫原性しか無いことが示されているので、成功が限られる（参考文献6）。組換えFタンパク質ワクチンの利用は免疫原性の低下を示し、精製Fタンパク質が構造的に未熟でありかつ中和抗体を放出する適当なバージョンでないことを示した（参考文献7、8）。サブユニットワクチンの使用については、サブユニットワクチンはFタンパク質の非効率かつ不適当な発現により妨げられているので、最適レベルのFタンパク質を有することが適当な免疫応答を誘導するために重要である（参考文献9、10）。Fタンパク質を含有するサブユニットワクチンは、アジュバントを加えても完全に保護せずかつ最適でないという観察（参考文献11）は、ビリオンの生来の状態でのFタンパク質提示がワクチンとしての使用に必須であることを示唆する。
【０００５】
HRSV-L19の開発の生物学的課題と安全性関心事項はHRSVに対する安全でかつ耐久性のワクチンについて他に類を見ない機会を提供している。
【０００６】
ほとんどのワクチンの様に、ヒトにおける大きい効力に関係する大きい免疫原性も求められる。従来の技術で開示された典型的なものは、免疫原性を増加するための組換えタンパク質の使用（例えば、米国特許7,192,595；6,194,546；5,962,298）、ならびにアジュバント、例えば、アルミニウム（米国特許6,861,244）およびムラミルジペプチド（米国特許4,826,687）の組成物への付加である。しかし、貯蔵安定性が改良されかつ投与の容易な高い効力をもつRSVワクチンを開発する必要性はなお存在し、これが本発明のナノエマルジョンの特徴である。
【０００７】
ナノエマルジョンに関する従来の教示は米国特許6,015,832に記載され、これはグラム陽性菌、細菌芽胞、またはグラム陰性菌を不活化する方法に関する。この方法はグラム陽性菌、細菌芽胞、またはグラム陰性菌を細菌不活化（または細菌芽胞不活化）エマルジョンと接触させるステップを含むものである。米国特許6,506,803はエマルジョンを用いてヒトの微生物病原体（例えば、細菌、ウイルス、芽胞、真菌）を殺滅または中和する方法に関する。米国特許6,559,189は、サンプル（ヒト、動物、食品、医療機器など）をナノエマルジョンと接触させるステップを含むものであるサンプルを除染する方法に関する。ナノエマルジョンは、細菌、ウイルス、真菌、原生動物または芽胞と接触させると、病原体を殺滅または無能化する。抗微生物ナノエマルジョンは四級アンモニウム化合物、エタノール／グリセロール／PEGの1つ、および界面活性剤を含む。米国特許6,635,676は2つの異なる組成物およびそのいずれかの組成物を用いてサンプルを処理することによりサンプルを除染する方法に関する。組成物1は細菌、ウイルス、真菌、原生動物、および芽胞に対する抗微生物であるエマルジョンを含む。エマルジョンは油および四級アンモニウム化合物を含む。米国特許7,314,624は免疫原に対する免疫応答を誘導する方法であって、被験者を粘膜表面を介して免疫原およびナノエマルジョンの組み合わせで治療するステップを含むものである前記方法に関する。ナノエマルジョンは油、エタノール、界面活性剤、四級アンモニウム化合物、および蒸留水を含むものである。US-2005-0208083-A1およびUS-2006-0251684-A1は好ましいサイズの液滴を有するナノエマルジョンに関する。US-2007-0054834-A1はハロゲン化四級アンモニウムを含む組成物および前記組成物を感染症状を治療するために用いる方法に関する。四級アンモニウム化合物をエマルジョンの一部分として与えてもよい。最後に、US-2007-0036831-A1は抗炎症剤を含むナノエマルジョンに関する。しかし、これらの参照事例はいずれも本発明の方法、組成物およびキットを教示するものではない。
【０００８】
特に、米国特許7,314,624はナノエマルジョンワクチンを記載している。しかし、この参照事例は、本発明の免疫原を用いてRSVに対うる防御免疫応答を誘導する能力を教示していない。
【０００９】
当技術分野では、有効なRSVワクチンおよび前記ワクチンを作製しかつ用いる方法の必要性が残っている。本発明はこれらの必要性を満たすものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許7,192,595号
【特許文献２】米国特許6,194,546号
【特許文献３】米国特許5,962,298号
【特許文献４】米国特許6,861,244号
【特許文献５】米国特許4,826,687号
【特許文献６】米国特許6,015,832号
【特許文献７】米国特許6,506,803号
【特許文献８】米国特許6,559,189号
【特許文献９】米国特許6,635,676号
【特許文献１０】米国特許7,314,624号
【特許文献１１】US-2005-0208083-A1
【特許文献１２】US-2006-0251684-A1
【特許文献１３】US-2007-0054834-A1
【特許文献１４】US-2007-0036831-A1
【特許文献１５】米国特許7,314,624号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Hacking, D., Hull, J. 2002. Respiratory syncytial virus - virus biology and host response. J. Infection. 45: 18-24.
【非特許文献２】Graham, B. 2011. Biological challenges and technological opportunities for respiratory syncytial virus vaccine development. Immunological Reviews. 239: 149-166.
【非特許文献３】Kruijens D., Schijf, M. 2011. Local innate and adaptive immune responses regulate inflammatory cell influx into the lungs after vaccination with formalin inactivated RSV. Vaccine. 29: 2730-2741.
【非特許文献４】Swanson, K., Settembre, E. 2011. Structural basis for immunization with postfusion respiratory syncytial virus fusion F glycoprotein (RSV F) to elicit high neutralizing antibody titers. PNAS. 108: 9619-9624.
【非特許文献５】McLellan, J., Y Yang. et al., 2011. Structure of the Respiratory Syncytial Virus Fusion glycoprotein in the post-fusion conformation reveals preservation of neutralizing epitopes. J Virology. Epub. 1128/JVI00555-11.
【非特許文献６】Gomez, M., Mufson, M.  et al. 2009. Phase-I study MEDI-534, of a live attenuated intranasal vaccine against respiratory syncytial virus and parainfluenza-3 virus in seropositive children. Ped Infect J. 28: 655-658.
【非特許文献７】Singh, S., Dennis, V. 2007. Immuogenicity and efficacy of recombinant RSV-F vaccine in a mouse model. Vaccine. 25: 6211-6223.
【非特許文献８】Kim, S., J Jang., et al., 2010. Single mucosal immunization of recombinant adenovirus-based vaccine expressing F1 protein fragment induces protective mucosal immunity against respiratory syncytial virus infection. Vaccine. 28: 3801-3808.
【非特許文献９】Nallet, S., Amacker, M. et al. 2009. Respiratory Syncytial Virus subunit vaccine based on a recombinant fusion protein expressed transiently in mammalian cells. 27: 6415-6419.
【非特許文献１０】Huang K., Lawlor, H. 2010. Recombinant respiratory syncytial virus F protein expression is hindered by inefficient nuclear export and mRNA processing. Virus Genes. 40: 212-221.
【非特許文献１１】Langley, J., Sales V., et al. 2009. A dose ranging study of a subunit Respiratory Syncytial Virus subtype A vaccine with and without aluminum phosphate adjuvantation in adults ≧ 65 years of age. Vaccine. 27: 5913-5919.
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、中心的な免疫原性ウイルスの構造タンパク質（FおよびGタンパク質）の過剰生産者であるHRSVウイルス株の単離により、HRSV感染に対する防御免疫応答を誘導する新規手法を提供する。正常なウイルス複製サイクル範囲内の自然な状態で高レベルのFタンパク質を生産するワクチン候補を有することは、十分な量と適当なコンフォーメーションを持つエピトープをさらなる中和抗体の作製と免疫応答の細胞保護手段の誘導のために提示しうるので、免疫原としての利用に有望である。
【００１３】
本発明者らはHRSV-L19を培養することおよびこのウイルス株が通常使われるRSVウイルス株A2と比較するとFおよびGウイルスタンパク質の過剰生産者であることを実証することに成功した。HRSV-L19内に見出された免疫原性FおよびGタンパク質の2倍以上高いレベルは、弱毒化または不活化ウイルスのワクチンとしての使用を可能にする新規の観察である。
【００１４】
本発明は精製した呼吸器合胞体ウイルス（RSV）株L19（RSV-L19）を含むワクチン組成物を包含する。他の実施形態において、RSV-L19ウイルスはウイルス粒子に随伴する融合（F）および糖タンパク質（G）構造タンパク質の過剰生産者である。さらに他の実施形態において、RSV-L19ウイルスは弱毒化ヒト呼吸器合胞体ウイルス（HRSV）株L19である。一実施形態において、ワクチン組成物はAmerican Type Culture Collection（ATCC）にHRSV-L19として受託されたヒト呼吸器合胞体ウイルスを含む。
【００１５】
本発明の他の実施形態においては、免疫原性調製物を調製する方法であって、HRSV-L19を減弱表現型を生じる減弱型突然変異および欠失により遺伝子操作する前記方法が提供される。得られる弱毒化ウイルスを適当な細胞株で培養して収穫する。収穫したウイルスを次いで精製して細胞および血清成分を除去する。精製したウイルスを次いでワクチン組成物用に許容される医薬担体と混合する。従って、記載のものは少なくとも1つの弱毒化突然変異を含むRSV株L19などのRSVウイルスゲノムを含むワクチン組成物である。さらに他の実施形態において、ワクチン組成物は弱毒化表現型を記すヌクレオチド改変を含むRSV株L19などのRSVウイルスゲノムを含むものである。
【００１６】
一実施形態においては、ヒト呼吸器合胞体ウイルス感染に対する免疫を増進する方法であって、被験者にHRSV-L19を含むナノエマルジョン製剤を投与するステップを含むものである前記方法を記載する。本発明の他の実施形態は、ヒト呼吸器合胞体ウイルスに起因する疾患に対する増進した免疫を誘導する方法であって、被験者に有効量の精製HRSV-L19ワクチン組成物を投与するステップを含むものである前記方法に関する。いくつかの実施形態において、被験者はナノエマルジョンワクチンの少なくとも単一投与の後に防御免疫応答を生じうる。さらに、その免疫応答は1以上のRSV株に対する保護を与えるものでありうる。HRSVに対する免疫増進の誘導は最適レベルの抗原の存在に依存する。さらに、抗原の臨界レベルの同定はロバストな免疫応答を与えるために重要である。Fタンパク質レベルが中和抗体の存在と持続およびウイルスチャレンジに対する保護と直接相関のあることの実証は、その自然配向で発現される臨界免疫原性Fタンパク質の最適レベルを生産するウイルス株を有することがワクチン候補としての利用にとって将来性があることを示す。
【００１７】
本発明の一実施形態においては、ウイルス株HRSV-L19を適当な細胞株で培養しかつ収穫することにより、免疫原性調製物を調製する方法が提供される。収穫したウイルスを濃縮しかつ精製して細胞および血清成分を除去する。本発明のさらなる実施形態においては、精製したHRSV-L19を次いでナノエマルジョン製剤で不活化しかつアジュバントを加えて、非感染性でかつ免疫原性のウイルスを提供する。ナノエマルジョンのワクチン候補との単純な混合が粘膜と全身両方の免疫応答を生じることが示された。RSVビリオン粒子のナノエマルジョンとの混合により液滴の油コア中に明確な抗原粒子を生じる。抗原はコア内に組込まれ、これにより抗原はフリーな形になることができて正常な抗原コンフォーメーションを促進する。
【００１８】
本発明の一実施形態において、RSVワクチンはアジュバントを含む。他の実施形態において、前記アジュバントはナノエマルジョンである。ナノエマルジョンは水相、少なくとも1種の油、少なくとも1種の界面活性剤、および少なくとも1種の溶媒を含んでもよい。
【００１９】
本発明の一実施形態において、本発明は被験者においてRSVに対する免疫応答を誘導する方法、組成物およびキットを提供する。その方法は被験者にナノエマルジョンRSVワクチンを投与するステップを含むものであり、前記ステップにおいて、ナノエマルジョンRSVワクチンは約1000nm未満の平均直径を有する液滴を含む。ナノエマルジョンRSVワクチンはさらに水相、少なくとも1種の油、少なくとも1種の界面活性剤、および少なくとも1種の有機溶媒、少なくとも1種のRSV免疫原、および任意に少なくとも1種のキレート剤を含んでもよい。他の実施形態においては、ナノエマルジョンRSVワクチンを、限定されるものでないが、鼻腔内を含む、製薬上許容されるいずれかの方法を介して投与してもよい。さらに本発明の他の実施形態において、ナノエマルジョンRSVワクチンは有機溶媒を含まない。さらに、追加のアジュバントをナノエマルジョンRSVワクチンに加えてもよい。
【００２０】
RSVワクチンは分散液、ゲル、エアロゾル、肺エアロゾル、経鼻エアロゾル、軟膏、クリーム、または固体の投与形態で製剤してもよい。さらに、RSVワクチンをいずれかの製薬上許容される方法、例えば、非経口、経口、または鼻腔内を介して投与してもよい。非経口投与は皮下、腹腔内または筋肉内注入によってもよい。
【００２１】
本発明の他の実施形態において、ナノエマルジョンおよび／またはナノエマルジョンワクチンは被験者の全身毒性がない、投与時に最小限しかまたは全く生じない、またはそれらのいずれかの組み合わせの炎症を生じる。
【００２２】
本発明の一実施形態において、被験者はRSVワクチンの単一投与後に抗体陽転が起こる。
【００２３】
さらに本発明の他の実施形態において、ナノエマルジョンRSVワクチンは、(a)少なくとも1種のカチオン界面活性剤；(b)塩化セチルピリジニウムであるカチオン界面活性剤；(c)カチオン界面活性剤の濃度が約5.0％未満でかつ約0.001％超であるカチオン界面活性剤；(d)カチオン界面活性剤の濃度が約5％未満、約4.5％未満、約4.0％未満、約3.5％未満、約3.0％未満、約2.5％未満、約2.0％未満、約1.5％未満、約1.0％未満、約0.90％未満、約0.80％未満、約0.70％未満、約0.60％未満、約0.50％未満、約0.40％未満、約0.30％未満、約0.20％未満、約0.10％未満、約0.001％超、約0.002％超、約0.003％超、約0.004％超、約0.005％超、約0.006％超、約0.007％超、約0.008％超、約0.009％超、および約0.010％超から成る群より選択されるカチオン界面活性剤；または(e)それらのいずれかの組み合わせを含むものである。
【００２４】
本発明の他の実施形態において、ナノエマルジョンRSVワクチン組成物は
(a)少なくとも1種のカチオン界面活性剤および少なくとも1種の非カチオン界面活性剤；(b)少なくとも1種のカチオン界面活性剤および少なくとも1種の非カチオン界面活性剤（ここで、非カチオン界面活性剤は非イオン界面活性剤である）；(c)少なくとも1種のカチオン界面活性剤および少なくとも1種の非カチオン界面活性剤（ここで、非カチオン界面活性剤はポリソルベート非イオン界面活性剤、ポロキサマー非イオン界面活性剤、またはそれらの組み合わせである）；(d)少なくとも1種のカチオン界面活性剤およびポリソルベート20、ポリソルベート80、ポロキサマー188、ポロキサマー407、またはそれらの組み合わせである少なくとも1種の非イオン界面活性剤；(e)少なくとも1種のカチオン界面活性剤およびポリソルベート20、ポリソルベート80、ポロキサマー188、ポロキサマー407、またはそれらの組み合わせである少なくとも1種の非イオン界面活性剤（ここで、非イオン界面活性剤は約0.01％〜約5.0％にて、または約0.1％〜約3％にて存在する）； (e)少なくとも1種のカチオン界面活性剤および少なくとも1種の非カチオン界面活性剤（ここで、非カチオン界面活性剤は非イオン界面活性剤であり、非イオン界面活性剤は 約0.05％〜約10％、約0.05％〜約7.0％、約0.1％〜約7％、または約0.5％〜約4％の濃度で存在する）；(f)少なくとも1種のカチオン界面活性剤および少なくとも1種の非イオン界面活性剤（ここで、カチオン界面活性剤は約0.05％〜約2％または約0.01％〜約2％の濃度で存在する）；または(g)それらのいずれかの組み合わせを含むものである。
【００２５】
さらに本発明の他の実施形態において、RSVワクチンは低分子量キトサン、中程度の分子量キトサン、高分子量キトサン、グルカン、またはそれらのいずれかの組み合わせを含む。低分子量キトサン、中程度の分子量のキトサン、高分子量キトサン、グルカン、またはそれらのいずれかの組み合わせがナノエマルジョン中に存在してもよい。
【００２６】
以上の一般的な記載および次の図面の簡単な説明と詳細な説明は例示および説明であって、請求項に記載の本発明のさらなる説明を提供することを意図する。他の目的、利点および新規の特徴は、続く本発明の詳細な説明から、当業者には容易に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】L19およびA2のHRSV感染細胞溶解液（SDS処理済み）のSDS PAGEを示す。
【図２】RSV株L19およびRSV株A2のHRSV細胞溶解液（細胞および上清）のSDS-PAGEを示す。
【図３】HRSV株L19および株A2精製ウイルスのSDS-PAGEを示す。
【図４】ウイルス感染後24時間におけるHRSV株L19および株A2のFおよびGタンパク質発現のウェスタンブロットを示す。
【図５】ウイルス感染後4日におけるHRSV株L19および株A2のFおよびGタンパク質発現のウェスタンブロットを示す。
【図６】30μg合計HAを伴うおよび伴わない20％W805ECナノエマルジョンのTEM断面画像。図6Aは添加抗原なしの20％ナノエマルジョンを示す。図6B（右側パネル）は30μgフルゾン(登録商標)と組み合わせた20％ナノエマルジョンを示し、HA抗原が油滴中に位置することを図解している。暗く染色された抗原はナノエマルジョン粒子の外側に位置する。
【図７】ウェスタンブロット評価によるウイルス不活化を示し、各レーンは次を含む：(1)W805EC（レーン1）、(2)W805EC＋0.03％ β(1,3)グルカン（レーン2）、(3)W805EC＋0.3％キトサン（中度の分子量）＋酢酸（レーン3）、(4)W805EC＋0.3％P407（レーン4）、(5)W805EC＋0.3％キトサン（低分子量）＋0.1％酢酸（レーン5）、(6)培地のみ（レーン6）；(7)βPL-不活化ウイルス（レーン7）、および(8)L19陽性対照（レーン9）。
【図８】抗-RSV抗体（抗-G）で実施したウェスタンブロット分析を示す；L19ウイルス4x106 PFU/レーン、2x106 PFU/レーン、および1 x 106 PFU/レーン（示したW805ECと組み合わせて＋/-βPL不活化）。試料は、新しく（図8A）または4℃もしくは室温（RT）にて14日後（図8B）に分析した。MM＝分子量。
【図９】異なるナノエマルジョン製剤で、かつキトサン有りおよび無しでIMワクチン接種したマウスにおけるワクチン接種後3週間の免疫応答（IgG、μg/ml）を示す：(1) RSV株L19 ＋ 2.5％ W805EC ＋ 0.1％低分子量キトサン；(2) RSV株L19 ＋ 5％W805EC；(3) RSV株L19 ＋ 2.5％ W805EC；(4) RSV株L19 ＋ βPL 不活化ウイルス； および (5)ナイーブマウス（ワクチン無し）。
【図１０】コットンラットにおいて2種のナノエマルジョン-アジュバント添加ワクチンを評価するためのワクチン接種スケジュールを示す（実施例10）。評価した2種の製剤はW805ECとW80P1885EC（1：1：5）を含む（下表10および11を参照されたい）。コットンラットは、6.6μg F-ptnを含有するナノエマルジョン-アジュバント添加ワクチンの30μl INの2用量を受給された。それらは23週に5x105 pfu RSV株A2のチャレンジを受けた。動物の半数を第4日に犠牲にし、半数を第8日に犠牲にした。
【図１１】コットンラットにおけるW80P1885ECナノエマルジョン不活化RSVワクチンの免疫原性研究の結果を示す。左パネルにおいてY軸はFタンパク質に対する特異的抗体の終点力価を示し、X軸は週で時間を示す。右パネルにおいてY軸はμg/mlで血清抗体レベルを示し、X軸は週で時間を示す。D4およびD8はチャレンジ後の血清中の抗体レベルを示す。
【図１２】コットンラットにおけるW805ECナノエマルジョン不活化RSVワクチンの免疫原性研究の結果を示す。Y軸はFタンパク質に対する特異的抗体の終点力価を示し、X軸は週で時間を示す。
【図１３】コットンラットにおけるRSV中和の免疫原性を示す。コットンラットの鼻腔内に30μlのワクチンを接種し、4週に追加免疫し、そして週0、4、6、および8に採血した。研究グループは、3.3μg Fタンパク質を含有する1.6x105 PFU RSV株L19（n＝8）または6.6μg Fタンパク質を含有する3.2x105 PFU RSV株L19（n＝8）と混合した20％ W805ECナノエマルジョンを受給する2つのグループ、ならびに、3.3μg Fタンパク質を含有する1.6x105 PFU RSV株L19（n＝8）または6.6μg Fタンパク質を含有する3.2x105 PFU RSV株L19（n＝8）と混合した20％ W80P1885ECナノエマルジョンを受給する2つのグループを含んだ。中和ユニット（NEU）は50％プラーク低下をもたらす最高希釈の逆数を表す。NEU測定は4週（追加免疫後）および6週（追加免疫後2週）に実施した。6週に得た試料はNEU分析を可能にするのに充分な液性免疫応答を発生した。データを95％信頼区間（CI）の幾何平均で表した（図13A）。EUとNEUの間の相関はスピアマンのρ（相関係数）を用いた6週における全動物に対するものである。
【図１４】4日および8日における中和抗体を示す。図14AはRSV株L19と組み合わせたW80P1885ECナノエマルジョンの結果を示し、図14BはRSV株L19と組み合わせたW805ECナノエマルジョンの結果を示す。全てのコットンラットはワクチンRSV株L19に対して高い中和抗体（NU）を実証した。中和抗体はチャレンジ後に堅実に上昇した（Y軸）。8日中和抗体（NU）は4日NUより高かった。ナイーブコットンラットの血清は中和活性を示さなかった。
【図１５】血清抗体の特異的活性を示す。血清抗体の特異的活性（中和ユニット／ELISAユニット）はチャレンジ後4日と比較したときに8日に増加する傾向がある。図15Aは、4日および8日における、RSV株L19と組み合わせたW80P1885ECナノエマルジョンの結果（Y軸のNU/EU）を示す。図15Bは、4日および8日における、RSV株L19と組み合わせたW805ECナノエマルジョンの結果（Y軸のNU/EU）を示す。
【図１６】3用量のRSVL19アジュバント添加ワクチンを与え、次いでRSV株A2でチャレンジしたコットンラットの日4における交差保護を示す。図16AはRSV株L19と組み合わせたW80P1885ECナノエマルジョンの結果を示し、図16BはRSV株L19と組み合わせたW805ECナノエマルジョンの結果を示す。血清中和活性はRSV株L19またはRSV株A2に対して等価のNUを示し、2種のRSV株の間の交差保護を実証する。
【図１７】コットンラットの肺における日4のウイルスのクリアランス（RSV株A2）を示す。ワクチン接種したコットンラット（RSV株L19と組み合わせたW80P1885ECナノエマルジョン、またはRSV株L19と組み合わせたW805ECナノエマルジョンをワクチン接種した）はコットンラットの肺からのRSV株A2チャレンジされたウイルスの完全なクリアランスを示した。ナイーブ動物は＞103pfu RSV株A2／肺1グラムを示した。
【図１８】IMコットンラットワクチン接種およびチャレンジスケジュールを示す。
【図１９】3.3μg Fタンパク質を含有する1.6 x 105 PFU RSV株L19と混合した20％ W805ECナノエマルジョンを用いてIMワクチン接種したコットンラットにおける血清免疫応答を示す。Y軸は、14週間にわたる、チャレンジ後の日4における、およびチャレンジ後の日8における血清IgG、μg/mLを示す。
【図２０】3.3μg Fタンパク質を含有する1.6 x 105 PFU RSV株L19と混合した20％ W805ECナノエマルジョンを用いてIMワクチン接種したコットンラットにおける血清免疫応答を示す。図20Aは14週間にわたる、チャレンジ後の日4における、およびチャレンジ後の日8における終点力価（Y軸）を示す。図20Bはチャレンジ後の日4および日8におけるELISAユニット（Y軸）を示す。
【図２１】IMワクチン接種したコットンラットがナイーブ動物と比較してチャレンジ後の日4にRSVの完全なクリアランスを示したことを示す。コットンラットの肺において日4におけるウイルスのクリアランス（RSV株A2）を示す。IMワクチン接種した（RSV株 L19と組み合わせたW805ECナノエマルジョンを用いてワクチン接種した）コットンラットは、コットンラットの肺からのウイルスをチャレンジしたRSV株A2の完全なクリアランスを示した。ナイーブ動物は103 pfu RSV株A2以上／肺1グラムを示していた。
【図２２】20％W805ECナノエマルジョンアジュバントで不活化した1.7μgFタンパク質を持つL19 RSVウイルスの2x105プラーク形成ユニット（PFU）を含有するRSVワクチンを用いてIMまたはINのどちらかでワクチン接種したマウスについて、8週間にわたる（X軸）抗F抗体の測定（Y軸）を示す。BALB/Cマウス（n＝10/治療群）を週0および4にINまたはIMワクチン接種した。血清を抗F抗体について分析した。
【図２３】RSV特異的サイトカインの測定を示す。RSVワクチン（20％W805ECナノエマルジョンアジュバントで不活化したFタンパク質1.7μgを伴うL19 RSVウイルスの2x105プラーク形成ユニット（PFU）を含有する）を用いて週0および4にBALB/Cマウス（n＝10/arm）にINまたはIMワクチン接種した後、脾臓、頚部および腸リンパ節（LN）からの細胞中のサイトカインを測定した。測定したサイトカインにはIFNg、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、およびIL-17が含まれる。
【図２４】RSVワクチン（20％W805ECナノエマルジョンアジュバントで不活化したFタンパク質の1.7μgを伴うL19 RSVウイルスの2x105プラーク形成ユニット（PFU）を含有する）を用いて週0および4にBALB/Cマウス（n＝10/治療群）にINまたはIMワクチン接種した後の、肺組織中のサイトカインIL-4、IL-13、およびIL-17の測定を示す。IL-4およびIL-13はIM投与後により大きい発現を示し、IL-17はIN投与後により大きい発現を示した。
【図２５】RSVワクチン（20％W805ECナノエマルジョンアジュバントで不活化したFタンパク質の1.7μgを伴うL19 RSVウイルスの2x105プラーク形成ユニット（PFU）を含有する）を用いて週0および4にBALB/Cマウス（n＝10/arm）にINまたはIMワクチン接種した後の、マウスにおける気道抵抗（cm H20/mL/sec）の測定を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明の詳細な説明
本発明はRSV免疫原に対する免疫応答を刺激する方法、組成物およびキットを提供する。本発明者らは驚いたことに、RSV L19ウイルスに感染した細胞はRSV A2ウイルスに感染した細胞と比較して3〜11倍高い量のRSVウイルスタンパク質を生産することを発見した（実施例1）。本発明の一実施形態において、本発明のワクチン中に存在するRSV抗原はRSV L19ウイルス、そしてより好ましくは、精製し、弱毒化したヒト呼吸器合胞体ウイルス（HRSV）株L19（HRSV-L19）を含むヒトRSV L19ウイルスである。さらに本発明の他の実施形態において、RSVウイルスゲノムは、限定されるものでないが、少なくとも1種の弱毒化表現型を示すヌクレオチド改変を含む弱毒化突然変異を含みうる。
【００２９】
RSV L19株はマウスにおいて感染および呼吸器疾患（ERD）の亢進を引き起こすことが見出された。さらに、公開データはナノエマルジョンで製剤するとマウスにおいてERDを誘導せずに保護を与えることを示した。
【００３０】
このRSV株L19単離物は、1967年1月3日にAnn Arbor、Michiganにおいて呼吸器疾患を患うRSV感染した幼児からWI-38細胞中に単離され、SPAFAS初代ニワトリ腎細胞で継代され、次いでSPAFAS初代ニワトリ肺細胞で継代された後に、MRC-5細胞（Herlocher 1999）および次いでHep2細胞（Lukacs 2006）に移されたものである。RSV L19ゲノム（15,191-nt；GenBank 受託番号 FJ614813）のRSV株A2（15,222-nt； GenBank 受託番号 M74568）との比較は、98％のゲノムが同一であることを示す。実施例5を参照されたい。L19とA2の間のコード差はほとんどFおよびG遺伝子にある。2つの株のアミノ酸アラインメントはFタンパク質が14個（97％同一）およびGタンパク質が20個（93％同一）のアミノ酸差を有することを示した。
【００３１】
RSV L19株は動物モデルにおいて、気管内投与による1x105プラーク形成ユニット（PFU）/マウスの接種を用いると、粘液生産の刺激およびIL-13の有意な誘導により、ヒト感染を模倣することが実証されている（Lukacs 2006）。
【００３２】
RSV L19株を選択する理論的根拠：Nanobio社はVero細胞で増殖した3種のウイルス株についてRSV増殖および精製方法を開発しかつ最適化し、そして多重感染（MOI）、PEG6000沈降および超遠心を用いる抗原の精製と濃縮の最適化を確立した。重要でユニークなこととして、RSVL19ウイルス株は他の株より有意に高い収率（およそ10〜30倍以上／PFU）のFタンパク質を生産する。Fタンパク質含量は免疫原性の重要な因子であるらしく、このL19株は現在最もロバストな免疫応答を誘発する。L19株は増殖時間が短く、それ故に製造の観点からより効率的でありうる。3種のウイルス株の比較結果を実施例6、表11に掲げる。
【００３３】
最も重要なことは、以下の実施例11および12に記載の通り、ナノエマルジョンで製剤しかつ鼻腔内（IN）または筋肉内（IM）に投与した全てのRSVワクチンは、防御免疫応答を誘発して免疫化動物の感染を防止した。さらにナノエマルジョンで不活化しかつアジュバントを加えたRSV L19ワクチンは、広く受け入れらるコットンラットモデルにおいて高度に免疫原性である。コットンラットは1回の免疫化後に抗体力価の上昇、および2回目の免疫化後に有意なブースト（およそ10倍の増加）を誘発した。作製された抗体は生ウイルスを中和するのに高度に有効でありかつ中和と抗体力価の間に直線関係が存在する。さらに、コットンラットで作製された抗体は、RSV L19株で免疫化しかつRSV A2株でチャレンジすると交差保護を示した。IMとIN免疫化は両方共に記憶を確立し、この記憶は第2ブーストまたは生ウイルスへの曝露のような抗原への曝露後に呼び起こすかまたは思い起こすことができる。
【００３４】
本方法は被験者にナノエマルジョンRSVワクチンを投与するステップを含み、ここで前記ナノエマルジョンワクチンは約1000nm未満の平均直径を有する液滴を含むものである。ナノエマルジョンRSVワクチンはさらに(a)水相、(b)少なくとも1種の油、(c)少なくとも1種の界面活性剤、(d)少なくとも1種の有機溶媒、(e)少なくとも1種のRSV抗原、および(f)任意に少なくとも1種のキレート剤、またはそれらのいずれかの組み合わせを含むものである。本発明の他の実施形態においては、ナノエマルジョンは有機溶媒を欠く。
【００３５】
一実施形態において、被験者は成人、高齢被験者、若年被験者、幼児、高リスクの被験者、妊娠中の女性、および 免疫無防備状態の被験者から選択される。他の実施形態においては、ナノエマルジョンRSVワクチンを鼻腔内に投与してもよい。
【００３６】
本発明のナノエマルジョン組成物はワクチンアジュバントとして機能する。アジュバントは、(1)抗原（特異的防御免疫応答を刺激する物質）を免疫系に接触させ、生じる免疫の型ならびに免疫応答の質（規模または期間）に影響を与える役割；(2)特定の抗原の毒性を減じる役割；(3)保護応答に必要な抗原の量を減じる役割；(4)保護に必要な投与数を減じる役割；(5)集団の応答の乏しいサブセットの免疫を増強する役割；および／または(7)いくつかのワクチン成分に溶解度を与える役割を果たす。ナノエマルジョンワクチンアジュバントは特に、RSVワクチンのアジュバントとして有用である。
【００３７】
本発明の一実施形態において、RSVワクチンはRSV株のFタンパク質、例えば、限定されるものでないが、RSV株L19のFタンパク質を含むものである。他の実施形態において、RSVワクチンは約0.1μgから約100μgまで、およびそれらの間のいずれかの量のRSV Fタンパク質、例えば、RSV株L19のFタンパク質を含むものである。例えば、前記RSV ワクチンは約0.1μg、約0.2μg、約0.3μg、約0.4μg、約0.5μg、約0.6μg、約0.7μg、約0.8μg、約0.9μg、約1.0μg、約1.1μg、約1.2μg、約1.3μg、約1.4μg、約1.5μg、約1.6μg、約1.7μg、約1.8μg、約1.9μg、約2.0μg、約2.1μg、約2.2μg、約2.3μg、約2.4μg、約2.5μg、約2.6μg、約2.7μg、約2.8μg、約2.9μg、約3.0μg、約3.1μg、約3.2μg、約3.3μg、約3.4μg、約3.5μg、約3.6μg、約3.7μg、約3.8μg、約3.9μg、約4.0μg、約4.1μg、約4.2μg、約4.3μg、約4.4μg、約4.5μg、約4.6μg、約4.7μg、約4.8μg、約4.9μg、約5.0μg、約5.1μg、約5.2μg、約5.3μg、約5.4μg、約5.5μg、約5.6μg、約5.7μg、約5.8μg、約5.9μg、約6.0μg、約6.1μg、約6.2μg、約6.3μg、約6.4μg、約6.5μg、約6.6μg、約6.7μg、約6.8μg、約6.9μg、約7.0μg、約7.5μg、約8.0μg、約8.5μg、約9.0μg、約9.5μg、約10.0μg、約10.5μg、約11.0μg、約11.5μg、約12.0μg、約12.5μg、約13.0μg、約13.5μg、約14.0μg、約14.5μg、約15.0μg、約15.5μg、約16.0μg、約16.5μg、約17.0μg、約17.5μg、約18.0μg、約18.5μg、約19.0μg、約19.5μg、約20.0μg、約21.0μg、約22.0μg、約23.0μg、約24.0μg、約25.0μg、約26.0μg、約27.0μg、約28.0μg、約29.0μg、約30.0μg、約35.0μg、約40.0μg、約45.0μg、約50.0μg、約55.0μg、約60.0μg、約65.0μg、約70.0μg、約75.0μg、約80.0μg、約85.0μg、約90.0μg、約95.0μg、または約100.0μgのRSV Fタンパク質、例えば、RSV株L19のFタンパク質を含んでもよい。
【００３８】
本発明の他の実施形態において、本発明のRSVワクチンは、約1.0 x 105pfu（プラーク形成ユニット）から約1.0 x 108pfuまで、およびそれらの間のいずれかの量のRSVウイルス、例えば、RSV株L19を含むものである。RSVウイルスはナノエマルジョンアジュバントの存在により不活化されている。例えば、RSVワクチンは約1.0 x 105、1.1 x 105、1.2 x 105、1.3 x 105、1.4 x 105、1.5 x 105、1.6 x 105、1.7 x 105、1.8 x 105、1.9 x 105、2.0 x 105、2.1 x 105、2.2 x 105、2.3 x 105、2.4 x 105、2.5 x 105、2.6 x 105、2.7 x 105、2.8 x 105、2.9 x 105、3.0 x 105、3.1 x 105、3.2 x 105、3.3 x 105、3.4 x 105、3.5 x 105、3.6 x 105、3.7 x 105、3.8 x 105、3.9 x 105、4.0 x 105、4.1 x 105、4.2 x 105、4.3 x 105、4.4 x 105、4.5 x 105、4.6 x 105、4.7 x 105、4.8 x 105、4.9 x 105、5.0 x 105、5.5 x 105、6.0 x 105、6.5 x 105、7.0 x 105、7.5 x 105、8.0 x 105、8.5 x 105、9.0 x 105、9.5 x 105、1.0 x 106、1.5 x 106、2.0 x 106、2.5 x 106、3.0 x 106、3.5 x 106、4.0 x 106、4.5 x 106、5.0 x 106、5.5 x 106、6.0 x 106、6.5 x 106、7.0 x 106、7.5 x 106、8.0 x 106、8.5 x 106、9.0 x 106、9.5 x 106、1.0 x 107、1.5 x 107、2.0 x 107、2.5 x 107、3.0 x 107、3.5 x 107、4.0 x 107、4.5 x 107、5.0 x 107、5.5 x 107、6.0 x 107、6.5 x 107、7.0 x 107、7.5 x 107、8.0 x 107、8.5 x 107、9.0 x 107、9.5 x 107、1.0 x 108 pfuのRSVウイルス、例えば、RSV株L19を含んでもよい。
【００３９】
本発明の他の実施形態において、RSV株L19を含む本発明のRSVワクチンは少なくとも1つの他のRSV株に対して交差反応性（または1以上のRSV株に対して交差反応性）である。当業者には公知であるように、1）交差反応性は、ワクチン接種した動物または個人からの血清が、投与したワクチンで使われてない株に対して抗体を生産しうるかを見るELISAの方法を用いて測定しうるし；2）免疫細胞は投与したワクチンでは使われてない株を用いてin vitroで刺激されるとサイトカインを生産しうる。交差保護は、1つの株でワクチン接種した動物の血清中の抗体が、投与されたワクチンで使われてない他のウイルスの感染性を中和しうるときに、in vitroで測定することができる。
【００４０】
例えば、RSV株L19を含む本発明のRSVワクチンは、RSV株 A2（野生型）（ATCC VR-1540P）、RSV株 rA2cp248/404、RSV株 2-20、RSV株 3-12、RSV株 58-104、RSV株ロング（ATCC VR-26）、RSV株 9320（ATCC VR-955）、RSV株 B WV/14617/85（ATCC VR-1400）、RSV株 18537（ATCC VR-1580）、RSV株 A2 cpts-248（ATCC VR-2450）、RSV株 A2 cpts-530/1009（ATCC VR-2451）、RSV株 A2 cpts-530（ATCC VR-2452）、RSV株 A2 cpts-248/955（ATCC VR-2453）、RSV株 A2 cpts-248/404（ATCC VR-2454）、RSV株 A2 cpts-530/1030（ATCC VR-2455）、RSV株サブグループ B cp23 クローン 1A2（ATCC VR-2579）、RSV株サブグループ B、株 B1、およびcp52クローン 2B5（ATCC VR-2542）から成る群より選択される1以上のRSV株に対して交差反応性でありうる。
【００４１】
本発明の他の実施形態において、本発明のRSVワクチンは、RSVワクチンの1または2用量後に防御免疫応答をもたらす。
【００４２】
本発明の他の実施形態において、本発明のRSVワクチンは、ロバストな中和抗体の作製をもたらす。例えば、本発明によるRSVワクチンの1または2用量の投与は2〜106以上の範囲の中和抗体力価をもたらしうる。
【００４３】
ナノエマルジョンはナノメートルサイズの液滴から成る水中油のエマルジョンであって、油-水界面に界面活性剤を伴う。そのサイズの故に、ナノエマルジョン液滴は樹状細胞による飲作用を受け、細胞成熟と免疫系への効率的な抗原提示のきっかけを作る。色々な抗原と混合すると、ナノエマルジョンアジュバントは強い体液性および細胞性TH1-型応答ならびに粘膜の免疫を誘発しかつ上方調節する（Makidon et al., “Pre-Clinical Evaluation of a Novel Nanoemulsion-Based Hepatitis B Mucosal Vaccine,” PLoS ONE. 3(8): 2954; 1-15 (2008);Hamouda et al., "A Novel Nanoemulsion Adjuvant Enhancing The Immune Response from Intranasal Influenza Vaccine in Mice in National Foundation for Infectious Disease," 11th Annual Conference on Vaccine Research. Baltimore, MD (2008); Myc et al., "Development of immune response that protects mice from viral pneumonitis after a single intranasal immunization with influenza A virus and nanoemulsion," Vaccine, 21(25-26):3801-14 (2003); Bielinska et al., "Mucosal Immunization with a Novel Nanoemulsion-Based Recombinant Anthrax Protective Antigen Vaccine Protects against Bacillus anthracis Spore Challenge,” Infect Immun., 75(8): 4020-9 (2007); Bielinska et al., “Nasal Immunization with a Recombinant HIV gp120 および Nanoemulsion Adjuvant Produces Th1 Polarized Responses and Neutralizing Antibodies to Primary HIV Type 1 Isolates," AIDS Research and Human Retroviruses, 24(2): 271-81 (2008); Bielinska et al., "A Novel, Killed-Virus Nasal Vaccinia Virus Vaccine," Clin. Vaccine Immunol., 15(2): 348-58 (2008); Warren et al., "Pharmacological and Toxicological Studies on Cetylpyridinium Chloride, A New Germicide," J. Pharmacol. Exp. Ther., 74:401-8) (1942)）。かかる抗原の例には、アントラキスの保護抗原（PA）（Bielinska et al., Infect. Immun.、75(8)： 4020-9 (2007)）、全ワクシニアウイルス（Bielinska et al.,  Clin. Vaccine Immunol., 15(2)： 348-58 (2008)）またはヒト免疫不全ウイルスのgp120タンパク質（Bielinska et al., AIDS Research and Human Retroviruses. 24(2)： 271-81 (2008)）が含まれる。これらの研究はRSV抗原を含む様々な抗原によるナノエマルジョンアジュバントの広汎な応用を実証する。
【００４４】
本発明のナノエマルジョンRSVワクチンは、いずれかの製薬上許容される方法、例えば、鼻腔内、頬側、舌下、経口、直腸、眼、非経口（静脈内、皮内、筋肉内、皮下、嚢内、腹腔内）、肺、膣内、局部投与、局所投与、乱切り後局所投与、粘膜投与を用いて、エアロゾルを介して、または頬側または経鼻噴霧製剤を介して被験者に投与することができる。さらに、ナノエマルジョンRSVワクチンをいずれかの製薬上許容される投与剤形、例えば、分散液、ゲル、エアロゾル、肺エアロゾル、経鼻エアロゾル、軟膏、クリーム、半固体投与剤形、または懸濁液に製剤することができる。さらに、ナノエマルジョンRSVワクチンは制御放出製剤、徐放性製剤、直接放出製剤、またはそれらのいずれかの組み合わせであってもよい。さらに、ナノエマルジョンRSVワクチンは経皮送達系、例えばパッチであってもよくまたは加圧または空気式デバイス（すなわち「遺伝子銃」）により投与してもよい。
【００４５】
本発明の一実施形態において、ナノエマルジョンRSVワクチンは約1000nm未満の平均直径を有する液滴であって、(a)水相；(b)約1％油〜約80％油；(c)約0.1％〜約50％有機溶媒；(d)約0.001％〜約10％の界面活性剤もしくは洗剤；または(e)それらの組み合わせを有する前記液滴を含むものである。
【００４６】
本発明の他の実施形態において、ナノエマルジョンワクチンは(a)水相；(b)約1％油〜約80％油；(c)約0.1％〜約50％有機溶媒；(d)約0.001％〜約10％の界面活性剤もしくは洗剤；または(e)少なくとも1つのRSV免疫原を含むものである。
【００４７】
本発明の他の実施形態において、ナノエマルジョンワクチンは有機溶媒を欠く。
【００４８】
ナノエマルジョンおよび／またはナノエマルジョンワクチン中に存在する各成分の量は、治療用ナノエマルジョンおよび／またはナノエマルジョンワクチンを意味する。
【００４９】
一実施形態においては、ナノエマルジョンワクチン液滴は約1000nm未満、約950nm未満、約900nm未満、約850nm未満、約800nm未満、約750nm未満、約700nm未満、約650nm未満、約600nm未満、約550nm未満、約500nm未満、約450nm未満、約400nm未満、約350nm未満、約300nm未満、約250nm未満、約200nm未満、約150nm未満、約100nm未満、約50nm超、約70nm超、約125nm超およびそれらのいずれかの組み合わせから成る群より選択される平均直径を有する。
【００５０】
一実施形態において、ナノエマルジョンおよび／またはナノエマルジョンワクチンは塩化セチルピリジニウム（CPC）であるカチオン界面活性剤を含む。CPCのナノエマルジョンRSVワクチン中の濃度は約5.0％未満でかつ約0.001％超であってもよく、またはさらに、約5％未満、約4.5％未満、約4.0％未満、約3.5％未満、約3.0％未満、約2.5％未満、約2.0％未満、約1.5％未満、約1.0％未満、約0.90％未満、約0.80％未満、約0.70％未満、約0.60％未満、約0.50％未満、約0.40％未満、約0.30％未満、約0.20％未満、約0.10％未満、約0.001％超、約0.002％超、約0.003％超、約0.004％超、約0.005％超、約0.006％超、約0.007％超、約0.008％超、約0.009％超、および約0.010％超の濃度を有してもよい。
【００５１】
さらなる実施形態において、ナノエマルジョンRSVワクチンは非イオン界面活性剤、例えば、ポリソルベート界面活性剤を含むものであって、前記界面活性剤はポリソルベート80またはポリソルベート20であってもよく、そして約0.01％〜約5.0％、または約0.1％〜約3％の濃度のポリソルベート80を有してもよい。ナノエマルジョンRSVワクチンはさらに少なくとも1種の保存剤を含むものであってもよい。本発明の他の実施形態において、ナノエマルジョンRSVワクチンはキレート剤を含む。
【００５２】
さらに他の実施形態において、ナノエマルジョンRSVワクチンはさらに免疫モジュレーター、例えばキトサンまたはグルカンを含むものである。
【００５３】
免疫モジュレーターはワクチン組成物中に、限定されるものでないが、約0.001％から約10％まで、およびそれらの間のいずれの量、例えば、約0.01％、約0.02％、約0.03％、約0.04％、約0.05％、約0.06％、約0.07％、約0.08％、約0.09％、約0.1％、約0.2％、約0.3％、約0.4％、約0.5％、約0.6％、約0.7％、約0.8％、約0.9％、約1％、約2％、約3％、約4％、約5％、約6％、約7％、約8％、約9％、または約10％を含むいずれの製薬上許容される量で存在してもよい。
【００５４】
A.定義
本明細書で用いる「約」は当業者であれば理解しうるものであって、文脈に応じてある範囲で変化しうる。その用いられる文脈で当業者に明らかではない語の使用があれば、「約」は、特定の用語のプラス10％またはマイナス10％までを意味する。
【００５５】
本明細書で用いる用語「アジュバント」は抗原（例えば、病原体）に対する免疫応答を増加する薬剤を意味する。本明細書で用いる用語「免疫応答」は、被験者の免疫系が異物と認識する免疫原（すなわち抗原）に対する被験者（例えば、ヒトまたは他の動物）の応答を意味する。免疫応答は細胞介在性免疫応答（免疫系の抗原特異的T細胞と非特異的細胞が介在する応答）と液性免疫応答（血漿、リンパ、および組織液中に存在する抗体が介在する応答）の両方を含む。用語「免疫応答」は免疫原（例えば、病原体）に対する最初の応答ならびに「獲得免疫」の結果である記憶応答を包含する。
【００５６】
本明細書で用いる用語「弱毒化」HRSVは毒性および病原性の低下したウイルス粒子を意味し、動物モデルおよびヒトにおいて臨床疾患を生じないであろう。
【００５７】
用語「キレーター」または「キレート剤」は金属イオンと結合するために利用しうる孤立電子対を持つ原子を1つ以上有する物質を意味する。
【００５８】
本明細書で用いる用語「免疫の増進」は本発明のワクチン投与後における所与の病原体に対する獲得免疫のレベルの増加を、本発明のワクチンを投与しなかった場合の獲得免疫のレベルと比べて意味する。
【００５９】
本明細書で用いる用語「過剰生産者」は標準ウイルス株を越えて少なくとも2倍高いレベルのウイルス構造タンパク質を選択的に生産しうるウイルス株を意味する。好ましい実施形態において、過剰生産者はHRSV-L19が比較しうるA2 HRSV株より相当高いレベルのFおよびGタンパク質を生産するユニークな実証を意味する。
【００６０】
本明細書で用いる用語「免疫原」は被験者における免疫応答を誘発することができる抗原を意味する。好ましい実施形態において、免疫原は本発明のナノエマルジョンと組み合わせて投与すると免疫原（例えば、病原体または病原産物）に対する免疫を誘発する。
【００６１】
本明細書で使用する用語「不活化」HRSVは宿主細胞に感染する能力がなくかつ妥当な動物モデルにおいて非感染性であるビリオン粒子を意味する。
【００６２】
本明細書で使用する用語「鼻腔内で」は本発明の組成物の皮膚の表面ならびに鼻通路の粘膜細胞および組織、例えば、鼻粘膜、副鼻腔、鼻甲介、または鼻通路に並ぶ他組織および細胞への施用を意味する。
【００６３】
本明細書で用いる用語「ナノエマルジョン」には、水に混和しない油相を水相と混合したときに、非極性残基（すなわち長い炭化水素鎖）を水から遠ざけかつ極性頭部基を水へ押しやる、疎水力の結果として形成しうる小さい水中油分散物または液滴、ならびに他の脂質構造が含まれる。これらの他の脂質構造は、限定されるものでないが、単層、少数層、多層脂質小胞、ミセルおよびラメラ相を含む。本発明は、当業者が本明細書に開示した特定の実施形態を解釈するために必要なときに、この区別を理解しうると考えている。
【００６４】
本明細書で用いる用語「製薬上許容される」または「薬理学的に許容される」は、宿主（例えば、動物またはヒト）に投与したときに有害なアレルギー性または有害な免疫学的反応を実質的に生じない組成物を意味する。かかる製剤はいずれかの製薬上許容される投与剤形を含む。かかる製薬上許容される投与剤形の例は、限定されるものでないが、浸漬、噴霧、種子包帯、幹注入物、凍結乾燥投与剤形、噴霧、およびミストを含む。本明細書で用いる用語「製薬上許容される担体」はいずれかおよび全ての溶媒、分散媒質、コーティング、湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）、等張性および吸収遅延剤、崩壊剤（例えば、ポテトスターチまたはグリコールデンプンナトリウム）などを含む。
【００６５】
本明細書で用いる用語「局所（に）」は皮膚の表面ならびに粘膜細胞および組織（例えば、頬側、舌、舌下、咀嚼器、呼吸器または鼻粘膜、鼻甲介および中空器官または身体空洞に並ぶ他の組織および細胞）を意味する。
【００６６】
本明細書で用いる「ウイルス粒子」は成熟ビリオン、部分的ビリオン、空カプシド、欠陥のある妨害粒子、およびウイルスエンベロープを意味する。
【００６７】
B.本発明のナノエマルジョンRSVワクチンの安定性
本発明のナノエマルジョンRSVワクチンは約40℃および約75％相対湿度にて、少なくとも約2日まで、少なくとも約2週間まで、少なくとも約1か月まで、少なくとも約3か月、少なくとも約6か月まで、少なくとも約12か月、少なくとも約18か月まで、少なくとも約2年間、少なくとも約2.5年まで、または少なくとも約3年迄安定でありうる。
【００６８】
本発明の他の実施形態において、本発明のナノエマルジョンRSVワクチンは約25℃および約60％相対湿度にて少なくとも約2日まで、少なくとも約2週間まで、少なくとも約1か月まで、少なくとも約3か月まで、少なくとも約6か月まで、少なくとも約12か月まで、少なくとも約18か月まで、少なくとも約2年間まで、少なくとも約2.5年間まで、または少なくとも約3年間まで、少なくとも約3.5年間まで、少なくとも約4年間まで、少なくとも約4.5年間まで、または少なくとも約5年間までの期間は安定でありうる。
【００６９】
さらに、本発明のナノエマルジョンRSVワクチンは約4℃にて少なくとも約1か月まで、少なくとも約3か月まで、少なくとも約6か月まで、少なくとも約12か月まで、少なくとも約18か月まで、少なくとも約2年間まで、少なくとも約2.5年間まで、少なくとも約3年間まで、少なくとも約3.5年間まで、少なくとも約4年間まで、少なくとも約4.5年間まで、少なくとも約5年間まで、少なくとも約5.5年間まで、少なくとも約6年間まで、少なくとも約6.5年間まで、または少なくとも約7年間までの期間は安定でありうる。
【００７０】
本発明のナノエマルジョンRSVワクチンは約-20℃にて少なくとも約1か月まで、少なくとも約3か月まで、少なくとも約6か月まで、少なくとも約12か月まで、少なくとも約18か月まで、少なくとも約2年間まで、少なくとも約2.5年間まで、少なくとも約3年間まで、少なくとも約3.5年間まで、少なくとも約4年間まで、少なくとも約4.5年間まで、少なくとも約5年間まで、少なくとも約5.5年間まで、少なくとも約6年間まで、少なくとも約6.5年間まで、または少なくとも約7年間までの期間は安定でありうる。
【００７１】
これらの安定性パラメーターはまた、ナノエマルジョンアジュバントおよび／またはナノエマルジョンRSVワクチンにも適用可能である。
【００７２】
C. 免疫応答
被験者の免疫応答は、ナノエマルジョンRSVワクチンの投与後にRSV免疫原に対する抗体の力価および／または存在を定量することにより測定して、免疫原に対する液性免疫応答を評価することができる。抗体陽転は免疫原に対する特定の抗体の発生を意味し、これを用いて防御免疫応答の存在を評価することができる。かかる抗体に基づく検出はしばしばウェスタンブロットまたは 酵素結合免疫吸着（ELISA）アッセイ または赤血球凝集阻害アッセイ（HAI）を用いて検出される。当業者は適当な検出法を容易に選択しかつ用いるであろう。
【００７３】
被験者の免疫応答を決定する他の方法は、細胞免疫応答、例えば、免疫原特異的な細胞応答、例えば、細胞傷害性Tリンパ球または免疫原特異的リンパ球増殖アッセイを介して細胞の免疫応答を決定する方法である。さらに病原体によるチャレンジを用いて、被験者における、または、さらに、動物モデルにおける免疫応答を決定してもよい。当業者は被験者の免疫応答を決定する色々な方法を周知しうるし、本発明はいずれかの特別な方法に限定されるものでない。
【００７４】
D.  ナノエマルジョンRSVワクチン
1.液滴サイズ
本発明のナノエマルジョンRSVワクチンは、約1,000nm未満、約950nm未満、約900nm未満、約850nm未満、約800nm未満、約750nm未満、約700nm未満、約650nm未満、約600nm未満、約550nm未満、約500nm未満、約450nm未満、約400nm未満、約350nm未満、約300nm未満、約250nm未満、約200nm未満、約150nm未満、またはそれらのいずれかの組み合わせの平均直径サイズを有する液滴を含むものである。一実施形態において、液滴は約125nm超でかつ約600nm以下の平均直径サイズを有する。色々な実施形態において、液滴は約50nm超または約70nm超でかつ約125nm以下の平均直径サイズを有する。
【００７５】
2.水相
水相は、限定されるものでないが、水（例えば、H2O、蒸留水、精製水、注射用水、脱イオン水、水道水）および溶液（例えば、リン酸緩衝食塩水（PBS）溶液）を含むいずれの型の水相を含んでもよい。確かな実施形態において、水相は約4〜10、好ましくは約6〜8のpHの水を含む。水は脱イオン水（以下「DiH2O」と記す）であってもよい。いくつかの実施形態において、水相はリン酸緩衝食塩水(PBS)を含む。水相はさらに無菌でかつパイロジェンを含まないものであってもよい。
【００７６】
3.有機溶媒
本発明のナノエマルジョンワクチン中の有機溶媒には、限定されるものでないが、C1〜C12アルコール、ジオール、トリオール、ジアルキルリン酸、トリアルキルリン酸、例えば、トリ-n-ブチルリン酸、それらの半合成誘導体、およびそれらの組み合わせが含まれる。本発明の一態様において、有機溶媒は、非極性溶媒、極性溶媒、プロトン溶媒、または非プロトン溶媒から選択されるアルコールである。
【００７７】
ナノエマルジョンRSVワクチンに好適な有機溶媒には、限定されるものでないが、エタノール、メタノール、イソプロピルアルコール、グリセロール、中鎖トリグリセリド、ジエチルエーテル、酢酸エチル、アセトン、ジメチルスルホキシド（DMSO）、酢酸、n-ブタノール、ブチレングリコール、調香用アルコール、イソプロパノール、n-プロパノール、ギ酸、プロピレングリコール、グリセロール、ソルビトール、工業用変性アルコール、トリアセチン、ヘキサン、ベンゼン、トルエン、ジエチルエーテル、クロロホルム、1,4-ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジクロロメタン、アセトン、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ギ酸、それらの半合成誘導体、およびそれらのいずれかの組み合わせが含まれる。
【００７８】
4.油相
本発明のナノエマルジョンRSVワクチン中の油はいずれの化粧上または製薬上許容される油であってもよい。油は、揮発性または不揮発性であってよく、動物油、植物油、天然油、合成油、炭化水素油、シリコーン油、それらの半合成誘導体、およびそれらの組み合わせから選択されてもよい。
【００７９】
好適な油には、限定されるものでないが、鉱油、スクアレン油、香油、シリコンオイル、精油、水不溶性ビタミン、ステアリン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、パルミチン酸オクチル、パルミチン酸セチル、ベヘン酸トリデシル、アジピン酸ジイソプロピル、セバシン酸ジオクチル、アントラニル酸メチル、オクタン酸セチル、サリチル酸オクチル、ミリスチン酸イソプロピル、ジカプリン酸ネオペンチルグリコール・セトールズ（neopentyl glycol dicarpate cetols）、Ceraphyls(登録商標)、オレイン酸デシル、アジピン酸ジイソプロピル、乳酸C12〜15アルキル、乳酸セチル、乳酸ラウリル、ネオペンタン酸イソステアリル、乳酸ミリスチル、ステアロイルステアリン酸イソセチル、ステアロイルステアリン酸オクチルドデシル、炭化水素油、イソパラフィン、液状パラフィン、イソドデカン、ワセリン、アルガン(Argan)油、アブラナ油、チリ(Chile)油、ココナツ油、コーン油、綿実油、アマニ油、グレープ種子油、カラシ油、オリーブ油、ヤシ油、パーム核油、ラッカセイ油、パイン種子油、ポピー種子油、パンプキン種子油、米ぬか油、ベニバナ油、茶油、トリュフ油、植物油、アプリコット(核)油、ホホバ油(simmondsia chinensis種子油)、グレープ種子油、マカダミア油、麦芽油、アーモンド油、ナタネ油、ヒョウタン油、ダイズ油、ゴマ油、へーゼルナッツ油、トウモロコシ油、ヒマワリ油、大麻油、ボア(Bois)油、クキナット(Kuki nut)油、アボカド油、クルミ油、魚油、ベリー油、全てのスパイス油、ジュニパー油、種子油、アーモンド種子油、アニス種子油、セロリ種子油、クミン種子油、ナツメグ種子油、葉油、バジル葉油、ベイ葉油、シナモン葉油、コモンセージ葉油、ユーカリ葉油、レモングラス葉油、メラレウカ葉油、オレガノ葉油、パチュリ葉油、ペパーミント葉油、松葉油、ローズマリー葉油、スペアミント葉油、ティーツリー葉油、タイム葉油、ウインターグリーン葉油、花油、カモミール油、クラリーセージ油、チョウジ油、ゼラニウム花油、ヒソップ花油、ジャスミン花油、ラベンダー花油、マヌカ花油、マーホラム(Marhoram)花油、オレンジ花油、ローズ花油、イランイラン花油、樹皮油、桂皮油、シナモン樹皮油、サッサフラス樹皮油、木油、クスノキ木油、セダーウッド木油、シタン木油、ビャクダン木油、根茎(ショウガ)木油、樹脂油、オリバナム油、ミルラ油、果皮油、ベルガモット果皮油、グレープフルーツ果皮油、レモン果皮油、ライム果皮油、オレンジ果皮油、タンジェリン果皮油、根茎油、吉草油、オレイン酸、リノール酸、オレイルアルコール、イソステアリルアルコール、それらの半合成誘導体、およびそれらのいずれかの組み合わせが含まれる。
【００８０】
油はさらに揮発性シリコーン成分などのシリコーン成分を含んでもよく、これはシリコーン成分中の唯一の油であってもよく、または他のシリコーンおよび非シリコーン、揮発性および非揮発性油と組み合わせであってもよい。好適なシリコーン成分には、限定されるものでないが、メチルフェニルポリシロキサン、シメチコン、ジメチコン、フェニルトリメチコン(またはその有機修飾されたバージョン)、ポリマーシリコーンのアルキル化誘導体、セチルジメチコン、ラウリルトリメチコン、ポリマーシリコーンのヒドロキシル化誘導体、例えば、ジメチコノール、揮発性シリコーン油、環状および直鎖シリコーン、シクロメチコン、シクロメチコンの誘導体、ヘキサメチルシクロトリシロキサン、オクタメチルシクロテトラシロキサン、デカメチルシクロペンタシロキサン、揮発性直鎖ジメチルポリシロキサン、イソヘキサデカン、イソエイコサン、イソテトラコサン、ポリイソブテン、イソオクタン、イソドデカン、それらの半合成誘導体、およびそれらの組み合わせが含まれる。
【００８１】
揮発性油が有機溶媒であってよく、または他の有機溶媒に加えて揮発性油が存在してもよい。好適な揮発性油には、限定されるものでないが、テルペン、モノテルペン、セスキテルペン、駆風薬、アズレン、メントール、カンファー、ツジョン、チモール、ネロール、リナロール、リモネン、ゲラニオール、ペリリルアルコール、ネロリドール、ファルネソール、イランゲン、ビサボロール、ファルネセン、アスカリドール、ケノポジ油、シトロネラール、シトラール、シトロネロール、カマズレン、セイヨウノコギリソウ、グアイアズレン、カモミール、半合成誘導体、およびそれらの組み合わせが含まれる。
【００８２】
本発明の一態様において、シリコーン成分中の揮発性油は油相中の油と異なる。
【００８３】
5.界面活性剤
本発明中のナノエマルジョンRSVワクチン中の界面活性剤は、製薬上許容されるイオン界面活性剤、製薬上許容される非イオン界面活性剤、製薬上許容されるカチオン界面活性剤、製薬上許容されるアニオン界面活性剤、または製薬上許容される両性イオン界面活性剤であってよい。
【００８４】
例示の有用な界面活性剤は、参照によって特に参照により組み込まれる"Applied Surfactants： Principles and Applications", Tharwat F. Tadros、Copyright 8 2005 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA、Weinheim ISBN： 3-527-30629-3に記載されている。
【００８５】
さらに、界面活性剤は、製薬上許容されるイオンポリマー界面活性剤、製薬上許容される非イオンポリマー界面活性剤、製薬上許容されるカチオンポリマー界面活性剤、製薬上許容されるアニオンポリマー界面活性剤、または製薬上許容される両性イオンポリマー界面活性剤であってよい。ポリマー界面活性剤の例には、限定されるものでないが、複数種（少なくとも1種）のポリエチレンオキシド（PEO）側鎖を有するポリ（メチルメタクリレート）主鎖のグラフト共重合体、ポリヒドロキシステアリン酸、アルコキシル化したアルキルフェノールホルムアルデヒド縮合物、脂肪酸疎水性物質を有するポリアルキレングリコール修飾されているポリエステル、ポリエステル、それらの半合成誘導体、またはそれらの組み合わせが含まれる。
【００８６】
界面活性の薬剤または界面活性剤は、極性またはイオンの親水性部分と結合した、炭素原子8〜18個を含有する非極性疎水性部分（通常、直鎖または分枝鎖の炭化水素またはフッ化炭素鎖）から成る両親媒性分子である。親水性部分は、非イオン、イオン、または両性イオンであってよい。水中において炭化水素鎖は水分子と弱く相互作用し、極性またはイオン性の頭部基は双極子または水分子とイオン-双極子相互作用を介して強く相互作用する。親水基の性質に基づいて、界面活性剤はアニオン、カチオン、両性イオン、非イオン、およびポリマー界面活性剤に分類される。
【００８７】
好適な界面活性剤には、限定されるものでないが、9〜10ユニットのエチレングリコールを含むエトキシ化ノニルフェノール、8ユニットのエチレングリコールを含むエトキシ化ウンデカノール、ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタンモノオレエート、エトキシ化水素化リシン油、ラウリル硫酸ナトリウム、エチレンオキシドとプロピレンオキシドとのジブロック共重合体、エチレンオキシド-プロピレンオキシドブロック共重合体、およびエチレンオキシドとプロピレンオキシドとをベースにした四官能性ブロック共重合体、グリセリルモノエステル、カプリン酸グリセリル、カプリル酸グリセリル、コカ酸グリセリル、エルカ酸グリセリル、ヒドロキシステアリン酸グリセリル、イソステアリン酸グリセリル、ラノリン脂肪酸グリセリル、ラウリン酸グリセリル、リノール酸グリセリル、ミリスチン酸グリセリル、オレイン酸グリセリル、PABAグリセリル、パルミチン酸グリセリル、リシノール酸グリセリル、ステアリン酸グリセリル、チオグリコール酸グリセリル、ジラウリン酸グリセリル、ジオレイン酸グリセリル、ジミリスチン酸グリセリル、ジステアリン酸グリセリル、セスキオレイン酸グリセリル、ステアリン酸乳酸グリセリル、ポリオキシエチレンセチル/ステアリルエーテル、ポリオキシエチレンコレステロールエーテル、ポリオキシエチレンラウレートもしくはジラウレート、ポリオキシエチレンステアレートもしくはジステアレート、ポリオキシエチレン脂肪エーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンミリスチルエーテル、ステロイド、コレステロール、β-シトステロール、ビサボロール、アルコールの脂肪酸エステル、イソプロピルミリステート、アリファチ(Aliphati)-イソプロピルn-ブチレート、n-ヘキサン酸イソプロピル、n-デカン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、ミリスチン酸オクチルドデシル、アルコキシル化アルコール、アルコキシル化酸、アルコキシル化アミド、アルコキシル化糖誘導体、天然油およびワックスのアルコキシル化誘導体、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロック共重合体、ノノキシノール-14、PEG-8ラウレート、PEG-6コカミド、PEG-20メチルグルコースセスキステアレート、PEG40ラノリン、PEG-40ヒマシ油、PEG-40硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレン脂肪エーテル、グリセリルジエステル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンミリスチルエーテル、およびポリオキシエチレンラウリルエーテル、ジラウリン酸グリセリル、ジミリスチン酸グリセリル、ジステアリン酸グリセリル、それらの半合成誘導体、またはそれらの混合物が含まれる。
【００８８】
さらなる好適な界面活性剤には、限定されるものでないが、非イオン脂質、例えば、ラウリン酸グリセリル、ミリスチン酸グリセリル、ジラウリン酸グリセリル、ジミリスチン酸グリセリル、それらの半合成誘導体、およびそれらの混合物が含まれる。
【００８９】
さらなる実施形態において、界面活性剤は、約2〜約100基のポリオキシエチレン頭部基を有するポリオキシエチレン脂肪エーテル、または構造R5-(OCH2CH2)y-OH［式中、R5は、炭素原子約6〜約22個を有する分枝または非分枝のアルキル基であり、yは、約4〜約100であり、好ましくは約10〜約100である］を有するアルコキシル化アルコールである。好ましくは、アルコキシル化アルコールはR5がラウリル基であり、yが23の平均値を有する種である。
【００９０】
異なる一実施形態において、界面活性剤は、ラノリンアルコールのエトキシ化誘導体であるアルコキシ化アルコールである。好ましくは、ラノリンアルコールのエトキシ化誘導体は、平均エトキシ化値が10であるラノリンアルコールのポリエチレングリコールエーテルであるラネス-10である。
【００９１】
非イオン界面活性剤には、限定されるものでないが、エトキシ化界面活性剤、エトキシ化アルコール、エトキシ化アルキルフェノール、エトキシ化脂肪酸、エトキシ化モノアルコールアミド、エトキシ化ソルビタンエステル、エトキシ化脂肪アミノ、エチレンオキシド-プロピレンオキシド共重合体、ビス(ポリエチレングリコールビス[イミダゾイルカルボニル])、ノノキシノール9、ビス(ポリエチレングリコールビス[イミダゾイルカルボニル])、Brij(登録商標) 35、Brij(登録商標) 56、Brij(登録商標) 72、Brij(登録商標) 76、Brij(登録商標) 92V、Brij(登録商標) 97、Brij(登録商標)、58P、クレモフォール(登録商標)EL、デカエチレングリコールモノドデシルエーテル、N-デカノイル-N-メチルグルカミン、n-デシルα-D-グルコピラノシド、デシルβ-D-マルトピラノシド、n-ドデカノイル-N-メチルグルカミド、n-ドデシルα-D-マルトシド、n-ドデシルβ-D-マルトシド、n-ドデシルβ-D-マルトシド、ヘプタエチレングリコールモノデシルエーテル、ヘプタエチレングリコールモノドデシルエーテル、ヘプタエチレングリコールモノテトラデシルエーテル、n-ヘキサデシルβ-D-マルトシド、ヘキサエチレングリコールモノドデシルエーテル、ヘキサエチレングリコールモノヘキサデシルエーテル、ヘキサエチレングリコールモノオクタデシルエーテル、ヘキサエチレングリコールモノテトラデシルエーテル、Igepal CA-630、Igepal CA-630、メチル-6-O-(N-ヘプチルカルバモイル)-α-D-グルコピラノシド、ノナエチレングリコールモノドデシルエーテル、N-ノナノイル-N-メチルグルカミン、N-ノナノイル-N-メチルグルカミン、オクタエチレングリコールモノデシルエーテル、オクタエチレングリコールモノドデシルエーテル、オクタエチレングリコールモノヘキサデシルエーテル、オクタエチレングリコールモノオクタデシルエーテル、オクタエチレングリコールモノテトラデシルエーテル、オクチル-β-D-グルコピラノシド、ペンタエチレングリコールモノデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノドデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノヘキサデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノヘキシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノオクタデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノオクチルエーテル、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリエチレングリコールエーテルW-1、ポリオキシエチレン10トリデシルエーテル、ポリオキシエチレン100ステアレート、ポリオキシエチレン20イソヘキサデシルエーテル、ポリオキシエチレン20オレイルエーテル、ポリオキシエチレン40ステアレート、ポリオキシエチレン50ステアレート、ポリオキシエチレン8ステアレート、ポリオキシエチレンビス(イミダゾリルカルボニル)、ポリオキシエチレン25プロピレングリコールステアレート、キラヤ樹皮からのサポニン、Span(登録商標) 20、Span(登録商標)40、Span(登録商標)60、Span(登録商標)65、Span(登録商標)80、Span(登録商標)85、タージトール15-S-12型、タージトール15-S-30型、タージトール15-S-5型、タージトール15-S-7型、タージトール15-S-9型、タージトールNP-10型、タージトールNP-4型、タージトールNP-40型、タージトールNP-7型、タージトールNP-9、タージトール型、タージトールTMN-10型、タージトールTMN-6型、テトラデシル-β-D-マルトシド、テトラエチレングリコー���モノデシルエーテル、テトラエチレングリコールモノドデシルエーテル、テトラエチレングリコールモノテトラデシルエーテル、トリエチレングリコールモノデシルエーテル、トリエチレングリコールモノドデシルエーテル、トリエチレングリコールモノヘキサデシルエーテル、トリエチレングリコールモノオクチルエーテル、トリエチレングリコールモノテトラデシルエーテル、Triton CF-21、Triton CF-32、Triton DF-12、Triton DF-16、Triton GR-5M、Triton QS-15、Triton QS-44、Triton X-100、Triton X-102、Triton X-15、Triton X-151、Triton X-200、TritonX-207、Triton(登録商標)X-100、Triton(登録商標)X-114、Triton(登録商標)X-165、Triton(登録商標)X-305、Triton(登録商標)X-405、Triton(登録商標)X-45、Triton(登録商標)X-705-70、TWEEN(登録商標)20、TWEEN(登録商標)21、TWEEN(登録商標)40、TWEEN(登録商標)60、TWEEN(登録商標)61、TWEEN(登録商標)65、TWEEN(登録商標)80、TWEEN(登録商標)81、TWEEN(登録商標)85、チロキサポール、n-ウンデシルβ-D-グルコピラノシド、それらの半合成誘導体、またはそれらの組み合わせが含まれる。
【００９２】
さらに、非イオン界面活性剤はポロキサマーであってよい。ポロキサマーはポリオキシエチレンのブロック、次いでポリオキシプロピレンのブロック、次いでポリオキシエチレンのブロックから作られたポリマーである。ポリオキシエチレンおよびポリオキシプロピレンのユニットの平均数はポリマーの番号に基づいて変化する。例えば、最も小さいポリマーであるポロキサマー101は、平均2ユニットのポリオキシエチレンによるブロック、平均16ユニットのポリオキシプロピレンによるブロック、次いで平均2ユニットのポリオキシエチレンによるブロックから成る。ポロキサマーは無色の液およびペーストから白色固体の範囲にある。化粧品およびパーソナルケア製品において、ポロキサマーは皮膚クレンザー、入浴製品、シャンプー、ヘアコンディショナー、うがい液、アイメーキャップ除去剤、ならびに他の皮膚および毛髪製品の製剤に用いられる。ポロキサマーの例には、限定されるものでないが、ポロキサマー101、ポロキサマー105、ポロキサマー108、ポロキサマー122、ポロキサマー123、ポロキサマー124、ポロキサマー181、ポロキサマー182、ポロキサマー183、ポロキサマー184、ポロキサマー185、ポロキサマー188、ポロキサマー212、ポロキサマー215、ポロキサマー217、ポロキサマー231、ポロキサマー234、ポロキサマー235、ポロキサマー237、ポロキサマー238、ポロキサマー282、ポロキサマー284、ポロキサマー288、ポロキサマー331、ポロキサマー333、ポロキサマー334、ポロキサマー335、ポロキサマー338、ポロキサマー401、ポロキサマー402、ポロキサマー403、ポロキサマー407、ポロキサマー105安息香酸塩、およびポロキサマー182二安息香酸塩が含まれる。
【００９３】
好適なカチオン界面活性剤には、限定されるものでないが、四級アンモニウム化合物、塩化アルキルトリメチルアンモニウム化合物、塩化ジアルキルジメチルアンモニウム化合物、カチオンハロゲン含有化合物、例えば、塩化セチルピリジニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンジルジメチルヘキサデシルアンモニウム、塩化ベンジルジメチルテトラデシルアンモニウム、臭化ベンジルドデシルジメチルアンモニウム、ベンジルトリメチルアンモニウムテトラクロロヨウ素酸塩、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム、臭化ドデシルエチルジメチルアンモニウム、臭化ドデシルトリメチルアンモニウム、臭化ドデシルトリメチルアンモニウム、臭化エチルヘキサデシルジメチルアンモニウム、グリニャール試薬T、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、N,N',N'-ポリオキシエチレン(10)-N-タロウ-1,3-ジアミノプロパン、臭化トンゾニウム、臭化トリメチル(テトラデシル)アンモニウム、1,3,5-トリアジン-1,3,5(2H,4H,6H)-トリエタノール、1-デカナミニウム、N-デシル-N,N-ジメチル-クロリド、塩化ジデシルジメチルアンモニウム、塩化2-(2-(p-(ジイソブチル)クレゾスキシ(cresosxy))エトキシ)エチルジメチルベンジルアンモニウム、塩化2-(2-(p-(ジイソブチル)フェノキシ)エトキシ)エチルジメチルベンジルアンモニウム、塩化アルキル1または3ベンジル-1-(2-ヒドロキシエチル)-2-イミダゾリニウム、塩化アルキルビス(2-ヒドロキシエチル)ベンジルアンモニウム、塩化アルキルデメチル(demethyl)ベンジルアンモニウム、塩化アルキルジメチル 3,4-ジクロロベンジルアンモニウム(100％ C12)、塩化アルキルジメチル3,4-ジクロロベンジルアンモニウム(50％ C14、40％ C12、10％ C16)、塩化アルキルジメチル 3,4-ジクロロベンジルアンモニウム(55％ C14、23％ C12、20％ C16)、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム(100％ C14)、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム(100％ C16)、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム(41％ C14、28％ C12)、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム(47％ C12、18％ C14)、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム(55％ C16、20％ C14)、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム(58％ C14、28％ C16)、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム(60％ C14、25％ C12)、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム(61％ C11、23％ C14)、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム(61％ C12、23％ C14)、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム(65％ C12、25％ C14)、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム(67％ C12、24％ C14)、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム(67％ C12、25％ C14)、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム(90％ C14、5％ C12)、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム(93％ C14、4％ C12)、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム(95％ C16、5％ C18)、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム、塩化アルキルジデシルジメチルアンモニウム、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム(C12-16)、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム(C12-18)、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ジアルキルジメチルベンジルアンモニウム、���化アルキルジメチルジメチベンジルアンモニウム、臭化アルキルジメチルエチルアンモニウム(90％ C14、5％ C16、5％ C12)、臭化アルキルジメチルエチルアンモニウム(ダイズ油の脂肪酸中としてのアルキル基およびアルケニル基の混合)、塩化アルキルジメチルエチルベンジルアンモニウム、塩化アルキルジメチルエチルベンジルアンモニウム(60％ C14)、塩化アルキルジメチルイソプロピルベンジルアンモニウム(50％ C12、30％ C14、17％ C16、3％ C18)、塩化アルキルトリメチルアンモニウム(58％ C18、40％ C16、1％ C14、1％ C12)、塩化アルキルトリメチルアンモニウム(90％ C18、10％ C16)、塩化アルキルジメチル(エチルベンジル)アンモニウム(C12-18)、塩化ジ-(C8-10)-アルキルジメチルアンモニウム、塩化ジアルキルジメチルアンモニウム、塩化ジアルキルメチルベンジルアンモニウム、塩化ジデシルジメチルアンモニウム、塩化ジイソデシルジメチルアンモニウム、塩化ジオクチルジメチルアンモニウム、塩化ドデシルビス(2-ヒドロキシエチル)オクチル水素アンモニウム、塩化ドデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ドデシルカルバモイルメチルジネチル(dinethyl)ベンジルアンモニウム、塩化ヘプタデシルヒドロキシエチルイミダゾリニウム、ヘキサヒドロ-1,3,5-トリス(2-ヒドロキシエチル)-s-トリアジン、塩化ミリスタルコニウム(および)クアット(Quat) RNIUM 14、塩化N,N-ジメチル-2-ヒドロキシプロピルアンモニウムポリマー、塩化n-テトラデシルジメチルベンジルアンモニウム一水和物、塩化オクチルデシルジメチルアンモニウム、塩化オクチルドデシルジメチルアンモニウム、塩化オクチフェノキシエトキシエチルジメチルベンジルアンモニウム、オキシジエチレンビス(塩化アルキルジメチルアンモニウム)、塩化トリメトキシシリプロピルジメチルオクタデシルアンモニウム、トリメトキシシリルクアット、塩化トリメチルドデシルベンジルアンモニウム、それらの半合成誘導体、およびそれらの組み合わせが含まれる。
【００９４】
例示のカチオンハロゲン含有化合物には、限定されるものでないが、ハロゲン化セチルピリジニウム、ハロゲン化セチルトリメチルアンモニウム、ハロゲン化セチルジメチルエチルアンモニウム、ハロゲン化セチルジメチルベンジルアンモニウム、ハロゲン化セチルトリブチルホスホニウム、ハロゲン化ドデシルトリメチルアンモニウム、またはハロゲン化テトラデシルトリメチルアンモニウムが含まれる。いくつかの特定の実施形態において、好適なカチオンハロゲン含有化合物には、限定されるものでないが、塩化セチルピリジニウム(CPC)、塩化セチルトリメチルアンモニウム、塩化セチルベンジルジメチルアンモニウム、臭化セチルピリジニウム(CPB)、臭化セチルトリメチルアンモニウム(CTAB)、臭化セチルジメチルエチルアンモニウム、臭化セチルトリブチルホスホニウム、臭化ドデシルトリメチルアンモニウム、および臭化テトラデシルトリメチルアンモニウムが含まれる。特に好ましい実施形態において、カチオンハロゲン含有化合物はCPCであるが、本発明の組成物は、特定のカチオン含有化合物との製剤に限定されるものではない。
【００９５】
好適なアニオン界面活性剤には、限定されるものでないが、カルボン酸塩、硫酸塩、スルホン酸塩、リン酸塩、ケノデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸ナトリウム塩、コール酸、ウシまたはヒツジ胆汁、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、デオキシコール酸メチルエステル、ジギトニン、ジギトキシゲニン、N,N-ジメチルドデシルアミンN-オキシド、ドキュセートナトリウム塩、グリコケノデオキシコール酸ナトリウム塩、グリココール酸水和物、合成グリココール酸ナトリウム塩水和物、合成グリコデオキシコール酸一水和物、グリコデオキシコール酸ナトリウム、グリコリトコール酸3-サルフェート二ナトリウム塩、グリコリトコール酸エチルエステル、N-ラウロイルサルコシンナトリウム塩、N-ラウロイルサルコシン溶液、N-ラウロイルサルコシン溶液、ドデシル硫酸リチウム、ドデシル硫酸リチウム、ルゴール溶液、Niaproof 4、Type 4、1-オクタンスルホン酸ナトリウム塩、1-ブタンスルホン酸ナトリウム、1-デカンスルホン酸ナトリウム、1-デカンスルホン酸ナトリウム、1-ドデカンスルホン酸ナトリウム、1-ヘプタンスルホン酸ナトリウム無水物、1-ヘプタンスルホン酸ナトリウム無水物、1-ノナンスルホン酸ナトリウム、1-プロパンスルホン酸ナトリウム一水和物、2-ブロモエタンスルホン酸ナトリウム、コール酸ナトリウム水和物、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム一水和物、ドデシル硫酸ナトリウム、ヘキサンスルホン酸ナトリウム無水物、オクチル硫酸ナトリウム、ペンタンスルホン酸ナトリウム無水物、タウロコール酸ナトリウム、タウロケノデオキシコール酸ナトリウム塩、タウロデオキシコール酸ナトリウム塩一水和物、タウロヒオデオキシコール酸ナトリウム塩水和物、タウロリトコール酸3-硫酸二ナトリウム塩、タウロウルソデオキシコール酸ナトリウム塩、Trizma(登録商標)ドデシル硫酸、TWEEN(登録商標)80、ウルソデオキシコール酸、それらの半合成誘導体、およびそれらの組み合わせが含まれる。
【００９６】
好適な両性イオン界面活性剤には、限定されるものでないが、N-アルキルベタイン、ラウリルアミンド(amindo)プロピルジメチルベタイン、アルキルジメチルグリシネート(glycinate)、N-アルキルアミノプロピオネート、CHAPS、最小98％(TLC)、CHAPS、Sigma Ultra、最小98％(TLC)、CHAPS、電気泳動用、最小98％(TLC)、CHAPSO、最小98％、CHAPSO、Sigma Ultra、CHAPSO、電気泳動用、3-(デシルジメチルアンモニオ)プロパンスルホネート分子内塩、3-(ドデシルジメチルアンモニオ)プロパンスルホネート分子内塩、Sigma Ultra、3-(ドデシルジメチルアンモニオ)プロパンスルホネート分子内塩、3-(N,N-ジメチルミリスチルアンモニオ)プロパンスルホネート、3-(N,N-ジメチルオクタデシルアンモニオ)プロパンスルホネート、3-(N,N-ジメチルオクチルアンモニオ)プロパンスルホネート分子内塩、3-(N,N-ジメチルパルミチルアンモニオ)プロパンスルホネート、それらの半合成誘導体、およびそれらの組み合わせが含まれる。
【００９７】
いくつかの実施形態において、ナノエマルジョンRSVワクチンはカチオン界面活性剤を含み、カチオン界面活性剤は塩化セチルピリジニウムであってよい。本発明の他の実施形態において、ナノエマルジョンRSVワクチンはカチオン界面活性剤を含み、カチオン界面活性剤の濃度は、約5.0％未満でありかつ約0.001％を超える。本発明のさらに他の一実施形態において、ナノエマルジョンはカチオン界面活性剤を含み、カチオン界面活性剤の濃度は、約5％未満、約4.5％未満、約4.0％未満、約3.5％未満、約3.0％未満、約2.5％未満、約2.0％未満、約1.5％未満、約1.0％未満、約0.90％未満、約0.80％未満、約0.70％未満、約0.60％未満、約0.50％未満、約0.40％未満、約0.30％未満、約0.20％未満、約0.10％未満からなる群から選択される。さらにナノエマルジョンワクチン中のカチオン薬剤の濃度は、約0.002％超、約0.003％超、約0.004％超、約0.005％超、約0.006％超、約0.007％超、約0.008％超、約0.009％超、約0.010％超、または約0.001％超である。一実施形態において、ナノエマルジョン中のカチオン薬剤の濃度は、約5.0％未満であり、約0.001％超である。
【００９８】
本発明の他の実施形態において、ナノエマルジョンワクチンは少なくとも1種のカチオン界面活性剤および少なくとも1種の非カチオン界面活性剤を含んでいる。非カチオン界面活性剤は、非イオン界面活性剤、例えば、ポリソルベート（Tween）、例えば、ポリソルベート80またはポリソルベート20である。一実施形態において、非イオン界面活性剤は約0.01％〜約5.0％の濃度で存在する、または非イオン界面活性剤は約0.1％〜約3％の濃度で存在する。本発明のさらに他の一実施形態において、ナノエマルジョンワクチンは、非イオン界面活性剤と組み合わせて約0.01％から約2％までの濃度で存在するカチオン界面活性剤を含むものである。
【００９９】
6. さらなる成分
本発明のナノエマルジョンRSVワクチンにおける使用に好適なさらなる化合物には、限定されるものでないが、1種または複数の溶媒、例えば、有機リン酸ベースの溶媒、増量剤、着色剤、製薬上許容される賦形剤、保存剤、pH調整剤、バッファー、キレート剤などが含まれる。さらなる化合物を予め乳化したナノエマルジョンワクチン中に混合してもよく、またはさらなる化合物を乳化すべき元の混合物に加えてもよい。ある特定のこれらの実施形態においては、その使用直前に、1種または複数のさらなる化合物を既存のナノエマルジョン組成物中に混合する。
【０１００】
本発明のナノエマルジョンRSVワクチン中の好適な保存剤には、限定されるものでないが、塩化セチルピリジニウム、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロルヘキシジン、イミダゾリジニル尿素、フェノール、ソルビン酸カリウム、安息香酸、ブロノポール、クロロクレゾール、パラベンエステル、フェノキシエタノール、ソルビン酸、α-トコフェロール、アスコルビン酸、アスコルビルパルミテート、ブチルヒドロキシアニソール、ブチルヒドロキシトルエン、アスコルビン酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、クエン酸、エデト酸、それらの半合成誘導体、およびそれらの組み合わせが含まれる。他の好適な保存剤には、限定されるものでないが、ベンジルアルコール、クロルヘキシジン(ビス(p-クロロフェニルジグアニド)ヘキサン)、クロルフェネシン(3-(4-クロロフェノキシ)-プロパン-1,2-ジオール)、カトンCG(メチルおよびメチルクロロイソチアゾリノン)、パラベン(メチル、エチル、プロピル、ブチルヒドロベンゾエート)、フェノキシエタノール(2-フェノキシエタノール)、ソルビン酸（ソルビン酸カリウム、ソルビン酸）、フェノニップ(フェノキシエタノール、メチル、エチル、ブチル、プロピルパラベン)、Phenoroc(フェノキシエタノール0.73％、メチルパラベン0.2％、プロピルパラベン0.07％)、Liquipar油（イソプロピル、イソブチル、ブチルパラベン）、Liquipar PE(70％フェノキシエタノール、30％liquipar油)、Nipaguard MPA（ベンジルアルコール（70％）、メチルおよびプロピルパラベン）、Nipaguard MPS(プロピレングリコール、メチルおよびプロピルパラベン)、Nipasept(メチル、エチル、およびプロピルパラベン)、Nipastat(メチル、ブチル、エチル、およびプロピルパラベン)、Elestab388（プロピレングリコール中のフェノキシエタノール＋クロルフェネシンおよびメチルパラベン）、ならびに、Killitol（7.5％クロルフェネシン、および7.5％メチルパラベン）が含まれる。
【０１０１】
ナノエマルジョンRSVワクチンはさらに、少なくとも1種のpH調節剤を含んでもよい。本発明のナノエマルジョン中の好適なpH調整剤には、限定されるものでないが、ジエタノールアミン、乳酸、モノエタノールアミン、トリエタノールアミン、水酸化ナトリウム、リン酸ナトリウム、それらの半合成誘導体、およびそれらの組み合わせが含まれる。
【０１０２】
さらに、ナノエマルジョンRSVワクチンはキレート剤を含んでもよい。
【０１０３】
本発明の一実施形態において、キレート剤は約0.0005％〜約0.72％の量で存在する。
【０１０４】
キレート剤の例には、限定されるものでないが、エチレンジアミン、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、フィチン酸、ポリリン酸、クエン酸、グルコン酸、酢酸、乳酸、およびジメルカプロールが含まれ、好ましいキレート剤はエチレンジアミン四酢酸である。
【０１０５】
ナノエマルジョンは、バッファー剤、例えば、製薬上許容されるバッファー剤を含みうる。バッファー剤の例には、限定されるものでないが、2-アミノ-2-メチル-1,3-プロパンジオール、≧99.5％（NT）、2-アミノ-2-メチル-1-プロパノール、≧99.0％（GC）、L-(＋)-酒石酸、≧99.5％（T）、ACES、≧99.5％（T）、ADA、≧99.0％（T）、酢酸、≧99.5％（GC/T）、酢酸、発光用、≧99.5％（GC/T）、酢酸アンモニウム溶液、分子生物学用、H2O中約5M、酢酸アンモニウム、発光用、99.0％（T）（乾燥物質に対して計算、T）、重炭酸アンモニウム、≧99.5％（T）、クエン酸二アンモニウム、≧99.0％（T）、ギ酸アンモニウム溶液、H2O中10M、ギ酸アンモニウム、≧99.0％（T）（乾燥物質に対して計算、NT）、シュウ酸アンモニウム一水和物、≧99.5％(RT)、リン酸二アンモニウム、H2O中2.5M、リン酸二アンモニウム、≧99.0％（T）、リン酸一アンモニウム溶液、H2O中2.5M、リン酸一アンモニウム≧99.5％（T）、リン酸水素アンモニウムナトリウム四水和物、≧99.5％（NT）、硫酸アンモニウム溶液、分子生物学用、H2O中3.2M、酒石酸二アンモニウム溶液、H2O中2M(20℃で無色の溶液)、酒石酸二アンモニウム、≧99.5％（T）、BES緩衝食塩水、分子生物学用、2×濃度、BES、≧99.5％（T）、BES、分子生物学用、≧99.5％（T）、BICINEバッファー溶液、分子生物学用、H2O中1M、BICINE≧99.5％（T）、BIS-TRIS、≧99.0％（NT）、重炭酸塩バッファー溶液、>0.1M Na2CO3、>0.2M NaHCO3、ホウ酸、≧99.5％（T）、ホウ酸、分子生物学用、≧99.5％（T）、CAPS、≧99.0％(TLC)、CHES、≧99.5％（T）、酢酸カルシウム水和物、≧99.0％（乾燥物質に対して計算、KT）、炭酸カルシウム、沈降物、≧99.0％（KT）、クエン酸三カルシウム四水和物、≧98.0％（乾燥物質に対して計算、KT）、クエン酸濃縮液、分子生物学用、H2O中1M、クエン酸、無水、≧99.5％（T）、クエン酸、発光用、無水、≧99.5％（T）、ジエタノールアミン、≧99.5％（GC）、EPPS、≧99.0％（T）、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二水和物、分子生物学用、≧99.0％（T）、ギ酸溶液、H2O中1.0M、Gly-Gly-Gly、≧99.0％（NT）、Gly-Gly、≧99.5％（NT）、グリシン、≧99.0％（NT）、グリシン、発光用、≧99.0％（NT）、グリシン、分子生物学用、≧99.0％（NT）、HEPES緩衝食塩水、分子生物学用、2×濃度、HEPES、≧99.5％、HEPES、分子生物学用、≧99.5％（T）、イミダゾール緩衝溶液、H2O中1.0M、イミダゾール、≧99.5％（GC）、イミダゾール、発光用、≧99.5％（GC）、イミダゾール、分子生物学用、≧99.5％（GC）、リポタンパク質リフォールディングバッファー、酢酸リチウム二水和物、≧99.0％（NT）、クエン酸三リチウム四水和物、≧99.5％（NT）、MES水和物、≧99.5％（T）、MES一水和物、発光用、≧99.5％（T）、MES溶液、分子生物学用、H2O中0.5M、MOPS、≧99.5％（T）、MOPS、発光用、≧99.5％（T）、MOPS、分子生物学用、≧99.5％（T）、酢酸マグネシウム溶液、分子生物学用、H2O中約1M、酢酸マグネシウム四水和物、≧99.0％（KT）、クエン酸三マグネシウム九水和物、≧98.0％（乾燥物質に対して計算、KT）、ギ酸マグネシウム溶液、H2O中0.5M、リン酸二マグネシウム三水和物、≧98.0％（KT）、in situハイブリダイゼーション用in situハイブリダイゼーション用中和溶液、分子生物学用、シュウ酸二水和物、≧99.5％(RT)、PIPES、≧99.5％（T）、PIPES、分子生物学用、≧99.5％（T）、リン酸緩衝食塩水、��液(高圧滅菌済み)、リン酸緩衝食塩水、ウエスタンブロッティングにおけるペルオキシダーゼコンジュゲート用洗浄バッファー、10倍濃度、ピペラジン、無水、≧99.0％（T）、D-酒石酸一カリウム、≧99.0％（T）、酢酸カリウム溶液、分子生物学用、酢酸カリウム溶液、分子生物学用、H2O中5M、酢酸カリウム溶液、分子生物学用、H2O中約1M、酢酸カリウム、≧99.0％（NT）、酢酸カリウム、発光用、≧99.0％（NT）、酢酸カリウム、分子生物学用、≧99.0％（NT）、重炭酸カリウム≧99.5％（T）、炭酸カリウム、無水、≧99.0％（T）、塩化カリウム、≧99.5％（AT）、クエン酸一カリウム、≧99.0％(乾燥物質、NT)、クエン酸三カリウム溶液、H2O中1M、ギ酸カリウム溶液、H2O中14M、ギ酸カリウム、≧99.5％（NT）、シュウ酸カリウム一水和物、≧99.0％(RT)、リン酸二カリウム、無水、≧99.0％（T）、リン酸二カリウム、発光用、無水、≧99.0％（T）、リン酸二カリウム、分子生物学用、無水、≧99.0％（T）、リン酸一カリウム、無水、≧99.5％（T）、リン酸一カリウム、分子生物学用、無水、≧99.5％（T）、リン酸三カリウム一水和物、≧95％（T）、フタル酸一カリウム、≧99.5％（T）、酒石酸カリウムナトリウム溶液、H2O中1.5M、酒石酸カリウムナトリウム四水和物、≧99.5％（NT）、四ホウ酸カリウム四水和物、≧99.0％（T）、四シュウ酸カリウム二水和物、≧99.5％(RT)、プロピオン酸溶液、H2O中1.0M、STEバッファー溶液、分子生物学用、pH7.8、STETバッファー溶液、分子生物学用、pH8.0、5,5-ジエチルバルビツール酸ナトリウム、≧99.5％（NT）、酢酸ナトリウム溶液、分子生物学用、H2O中約3M、酢酸ナトリウム三水和物、≧99.5％（NT）、酢酸ナトリウム、無水、≧99.0％（NT）、酢酸ナトリウム、発光用、無水、≧99.0％（NT）、酢酸ナトリウム、分子生物学用、無水、≧99.0％（NT）、重炭酸ナトリウム、≧99.5％（T）、重酒石酸ナトリウム一水和物、≧99.0％（T）、炭酸ナトリウム十水和物、≧99.5％（T）、炭酸ナトリウム、無水、≧99.5％（乾燥物質に対して計算、T）、クエン酸一ナトリウム、無水、≧99.5％（T）、クエン酸三ナトリウム二水和物、≧99.0％（NT）、クエン酸三ナトリウム二水和物、発光用、≧99.0％（NT）、クエン酸三ナトリウム二水和物、分子生物学用、≧99.5％（NT）、ギ酸ナトリウム溶液、H2O中8M、シュウ酸ナトリウム、≧99.5％(RT)、リン酸二ナトリウム二水和物、≧99.0％（T）、リン酸二ナトリウム二水和物、発光用、≧99.0％（T）、リン酸二ナトリウム二水和物、分子生物学用、≧99.0％（T）、リン酸二ナトリウム十二水和物、≧99.0％（T）、リン酸二ナトリウム溶液、H2O中0.5M、リン酸二ナトリウム、無水、≧99.5％（T）、リン酸二ナトリウム、分子生物学用、≧99.5％（T）、リン酸一ナトリウム二水和物、≧99.0％（T）、リン酸一ナトリウム二水和物、分子生物学用、≧99.0％（T）、リン酸一ナトリウム一水和物、分子生物学用、≧99.5％（T）、リン酸一ナトリウム溶液、H2O中5M、ピロリン酸二ナトリウム、≧99.0％（T）、ピロリン酸四ナトリウム十水和物、≧99.5％（T）、酒石酸二ナトリウム、≧99.0％（NT）、酒石酸二ナトリウム溶液、H2O中1.5M(20℃で無色の溶液)、四ホウ酸ナトリウム十水和物、≧99.5％（T）、TAPS≧99.5％（T）、TES≧99.5％(乾燥物質に基づく計算、T)、TMバッファー溶液、分子生物学用、pH7.4、TNTバッファー溶液、分子生物学用、pH8.0、TRISグリシンバッファー溶液、10倍濃度、TRIS酢酸-EDTAバッファー溶液、分子生物学用、TRIS緩衝食塩水、10×濃度、TRISグリシンSDSバッファー溶液、電気泳動用、10倍濃度、TRISリン酸-EDTAバッファー溶液、分子生物学用、濃度、10倍濃度、トリシン、≧99.5％（NT）、トリエタノールアミン、≧99.5％（GC）、トリエチルアミン、≧99.5％（GC）、酢酸トリエチルアンモニウムバッファー、揮発性バッファー、H2O中約1.0M、リン酸トリエチルアンモニウム溶液、揮発性バッファー、H2O中約1.0M、酢酸トリメチルアンモニウム溶液、揮発性バッファー、H2O中約1.0M、リン酸トリメチルアンモニウム溶液、揮発性バッファー、H2O中約1.0M、Tris-EDTAバッファー溶液、分子生物学用、濃度、100×濃度、Tris-EDTAバッファー溶液、分子生物学用、pH7.4、Tris-EDTAバッファー溶液、分子生物学用、pH8.0、Trizma(登録商標)酢酸塩、≧99.0％（NT）、Trizma(登録商標)塩基、≧99.8％（T）、Trizma(登録商標)塩基、≧99.8％（T）、Trizma(登録商標)塩基、発光用、≧99.8％（T）、Trizma(登録商標)塩基、分子生物学用、≧99.8％（T）、Trizma(登録商標)炭酸塩、≧98.5％（T）、Trizma(登録商標)塩酸バッファー溶液、分子生物学用、pH7.2、Trizma(登録商標)塩酸バッファー溶液、分子生物学用、pH7.4、Trizma(登録商標)塩酸バッファー溶液、分子生物学用、pH7.6、Trizma(登録商標)塩酸バッファー溶液、分子生物学用、pH8.0、Trizma(登録商標)塩酸、≧99.0％（AT）、Trizma(登録商標)塩酸、発光用、≧99.0％（AT）、Trizma(登録商標)塩酸、分子生物学用、≧99.0％（AT）、ならびにTrizma(登録商標)マレイン酸塩、≧99.5％（NT）が含まれる。
【０１０６】
ナノエマルジョンRSVワクチンはエマルジョンの形成を助ける1以上の乳化剤を含んでもよい。乳化剤には、油／水界面で凝集して2つの隣接した液滴間の直接接触を阻止する一種の連続膜を形成する化合物が含まれる。本発明の特定の実施形態は、所望の特性を損なうことなく水もしくは他の水相によって所望の濃度に直ぐ希釈しうるナノエマルジョンワクチンを特徴とする。
【０１０７】
7. 免疫モジュレーター
上記の通り、RSVワクチンはさらに1種以上の免疫モジュレーターを含んでもよい。免疫モジュレーターの例には、限定されるものでないが、キトサン、グルカン、エンテロトキシン、核酸（CpGモチーフ）、MF59、ミョウバン、ASO系、などが含まれる。本発明の文脈において、好適な免疫モジュレーターを使用することは当業者の通常の技術の範囲内にある。
【０１０８】
免疫モジュレーターは本発明のワクチン組成物中に、限定されるものでないが、約0.001％〜約10％、および、例えば、約0.01％、約0.02％、約0.03％、約0.04％、約0.05％、約0.06％、約0.07％、約0.08％、約0.09％、約0.1％、約0.2％、約0.3％、約0.4％、約0.5％、約0.6％、約0.7％、約0.8％、約0.9％、約1％、約2％、約3％、約4％、約5％、約6％、約7％、約8％、約9％、または約10％の間のいずれかの量を含むいずれかの製薬上許容される量が存在してもよい。
【０１０９】
E. 医薬組成物
本発明のナノエマルジョンRSVワクチンを、治療有効量のナノエマルジョンRSVワクチンおよび製薬上許容される送達のための製薬上許容される賦形剤を含む医薬組成物に製剤することができる。かかる賦形剤は、当技術分野では公知である。
【０１１０】
表現「治療上有効な量」は、ナノエマルジョンRSVワクチンを含む組成物中の投与された免疫原に関連するRSV病原体により引き起される疾患を予防、治療または改善するのに有効であるナノエマルジョンRSVワクチンの量を意味する。「防御免疫応答」は、その免疫応答が疾患の予防、治療または改善に関連することを意味する。完全な予防は必要でないが、これも本発明に包含される。免疫応答は、本明細書に考察した方法を用いてまたは当業者に公知のいずれかの方法により評価することができる。
【０１１１】
鼻腔内投与は、投与中に同時吸入を伴うまた伴わない鼻経由の投与を含む。かかる投与は典型的には、ナノエマルジョンRSVワクチンを含む組成物による経鼻粘膜、経鼻甲介、または副鼻腔との接触を介して行われる。吸入による投与は、鼻腔内投与を含むものであるか、または経口吸入を含んでもよい。かかる投与はまた、口腔粘膜、気管支粘膜、および他の上皮との接触を含んでもよい。
【０１１２】
医薬品投与の投与剤形の例は本明細書に記載されている。例には、限定されるものでないが、液体、軟膏、クリーム、エマルジョン、ローション、ゲル、生体粘着性ゲル、噴霧、エアロゾル、ペースト、フォーム、日焼け止め、カプセル、ミクロカプセル、懸濁液、膣座薬、粉末、半固体投与剤形などが含まれる。
【０１１３】
医薬品ナノエマルジョンRSVワクチンは、即時放出、徐放、制御放出、遅延放出またはそれらのいずれかの組み合わせで、表皮または真皮中に投与するよう製剤してもよい。いくつかの実施形態において、製剤は浸透促進剤を含んでもよい。好適な浸透促進剤には、限定されるものでないが、アルコール、例えば、エタノール、トリグリセリドおよびアロエ組成物が含まれる。浸透促進剤の量は、製剤の重量値で約0.5％〜約40％を含むものであってよい。
【０１１４】
本発明のナノエマルジョンRSVワクチンは電気泳動送達／電気泳動を利用して施用および／または送達することができる。さらに、本組成物は経皮送達系、例えば、パッチであってもよく、または加圧式もしくは空気力デバイス（すなわち「遺伝子銃」）により投与してもよい。電流の応用を含むかかる方法は当技術分野では周知である。
【０１１５】
投与用の医薬品ナノエマルジョンRSVワクチンは単回投与または複数回投与で施用することができる。
【０１１６】
局所施用であれば、ナノエマルジョンRSVワクチンを密封または半密封にしてもよい。密封または半密封は包帯、ポリオレフィンフィルム、衣料、不浸透性バリヤー、または半不浸透性バリヤーで局所調製物を覆うことによって行うことができる。
【０１１７】
本発明によるナノエマルジョンアジュバント組成物の例は「W805EC」と指定したアジュバントである。W805ECアジュバントの組成物を下表（表1）に示す。W805ECアジュバントの平均液滴サイズは約400nmである。この例示のナノエマルジョンの全成分は認可医薬品向けの認可不活性成分のFDAリストに含まれている。
【表１】
2018008968.tif 000003
【０１１８】
ナノエマルジョンアジュバントは、油、精製水、非イオン洗剤、有機溶媒および界面活性剤、例えば、カチオン界面活性剤の乳化により作ることができる。ナノエマルジョンアジュバントの具体例は「60％W805EC」と指定したものである。60％W805EC-アジュバントは下の表2に示した成分：精製水、USP；ダイズ油、USP；脱水アルコール、USP；(無水エタノール)；ポリソルベート80、NF；ならびに塩化セチルピリジニウム、USP（CPC）から構成される：この例示のナノエマルジョンの全成分は、認可済み医薬品の認可済み不活性成分のFDAリストに含まれている。
【表２】
2018008968.tif 000004
【０１１９】
F. 製造方法
本発明のナノエマルジョンは、古典的なエマルジョン形成技術を用いて形成することができる。例えば、U.S.2004/0043041を参照されたい。例示の一方法においては、比較的高いせん断力の下で（例えば、高い水力および機械力を用いて）油を水相と混合して、約約1％油の平均直径を有する油滴を含むナノエマルジョンを得る。本発明のいくつかの実施形態は、エタノールなどのアルコールを含む油相を有するナノエマルジョンを使用する。油相および水相を、エマルジョンを形成するのに十分なせん断力を生じうるいずれかの装置、例えば、フレンチプレスまたは高せん断ミキサーを用いてブレンドしてもよい（例えば、Admix社、Manchester、N.H.などのFDA認可済み高せん断ミキサーが利用可能である）。かかるエマルジョンを生成する方法は、参照によりその全てが本明細書に組み込まれる米国特許第5,103,497号および同第4,895,452号に記載されている。
【０１２０】
例示の一実施形態において、本発明の方法で用いるナノエマルジョンは、連続水相、例えば、水またはPBS中に分散された不連続油相の油滴を含むものである。本発明のナノエマルジョンは安定であって、長い貯蔵期間の後でも分解しない。本発明の特定のナノエマルジョンは、飲み込んだ場合、吸入した場合、または被験者の皮膚に接触した場合、無毒であり安全である。
【０１２１】
本発明の組成物は大量に生産することができ、かつ広範囲の温度で数ヵ月間安定である。本ナノエマルジョンは半固形クリームから希薄なローションまで、液体までの範囲にわたる生地を有しうるのであって、いずれかの製薬上許容される上記の方法、例えば、手、または点鼻滴／噴霧により局所に施用することができる。
【０１２２】
上記のように、エマルジョンの少なくとも一部分は、限定されるものでないが、単層、多層、および少数層の脂質小胞、ミセルおよびラメラ相を含む脂質構造の形態であってよい。
【０１２３】
本発明は、記載したナノエマルジョンの多くの変形が本発明の方法において有用でありうると意図する。候補ナノエマルジョンが本発明での使用に好適であるかを決定するために、3つの判定基準を解析する。本明細書に記載した方法と標準を用いて候補エマルジョンを試験し、これらが適切であるか否かを容易に決定することができる。第一に、本明細書に記載する方法を用いて所望の成分を調製して、ナノエマルジョンが形成されうるかどうかを確認する。もしナノエマルジョンを形成できなければ、その候補を却下する。第二に、候補ナノエマルジョンは安定なエマルジョンを形成しなければならない。ナノエマルジョンがその意図する使用を可能にするのに十分な期間エマルジョンの形態のままであれば、ナノエマルジョンは安定である。例えば、貯蔵、輸送などをするナノエマルジョンにとって、ナノエマルジョンが数ヵ月間から数年間、エマルジョンの形態のままであることが所望されうる。比較的不安的である典型的なナノエマルジョンは、1日以内にその形態を失う。第三に、候補ナノエマルジョンは、その意図する使用に対して効力を有しなければならない。例えば、本発明のエマルジョンは、RSVウイルスを検出可能なレベルまで殺滅または不能化するか、または防御免疫応答を検出可能なレベルまで誘導しなければならない。本発明のナノエマルジョンは多くの色々なタイプの容器と送達システムで提供することができる。例えば、本発明のいくつかの実施形態においては、ナノエマルジョンをクリーム剤または他の固体もしくは半固形の形態で提供する。本発明のナノエマルジョンをヒドロゲル製剤に組み入れてもよい。
【０１２４】
ナノエマルジョンを任意の好適な容器で（例えば、被験者に、または顧客に）送達することができる。所望の施用に対する1以上の単回使用または複数回使用の用量のナノエマルジョンを提供する好適な容器を用いることができる。本発明のいくつかの実施形態においては、ナノエマルジョンを懸濁液または液体の形態で提供する。かかるナノエマルジョンを、噴霧ボトルおよびいずれかの好適な加圧噴霧デバイスを含むいずれかの好適な容器で送達することができる。かかる噴霧ボトルはナノエマルジョンを鼻腔内にまたは吸入経由で送達するのに好適でありうる。
【０１２５】
これらのナノエマルジョンを含有する容器をさらに、使用のための取扱説明書と共に包装してキットにすることができる。
【０１２６】
本発明を以下の実施例を参照することによってさらに説明するが、以下の実施例は説明のみのために提供されるものである。本発明は実施例に限定されるものではなく、むしろ本明細書に提供される教示から明らかである変形を全て含むものである。限定されるものでないが米国特許を含む、本明細書に参照される公的に入手可能な文書は全て、参照により具体的に組み込まれる。
【実施例】
【０１２７】
［実施例１］
本実施例の目的は、HRSVタンパク質の発現をRSV A2株-対-RSV L19株ならびに細胞溶解液-対-上清について比較することにある。
【０１２８】
材料と方法：全てのサンプルは、HEP-2細胞を同じpfu量のA2またはL19ウイルスに感染させることにより調製した。感染の24時間後に、感染した細胞を次の用量の1つを用いて処理した：
(1)  細胞に随伴するタンパク質をチェックするための細胞溶解液；上清培地を廃棄後、細胞をSDSで処理した。この細胞溶解液を細胞に随伴したFタンパク質の量について試験した。
【０１２９】
(2)  細胞および上清全体のタンパク質；細胞および上清を3回凍結および解凍し、細胞を溶解し、全ての細胞溶解液を用いて細胞と培地中のFタンパク質を試験した。
【０１３０】
感染の4日後、L19およびA2ウイルスをHEP-2感染細胞から抽出し、精製した。
【０１３１】
精製したウイルスをタンパク質含量について比較した。
【０１３２】
結果：規準化したサンプルを、ポリクローナル抗RSV抗体を用いてウェスタンブロットで試験した。FおよびGタンパク質含量をL19とA2株の間で比較した。バンドの密度を、画像捕獲とKodakソフトウエアを用いて比較した。模擬の非感染細胞培養物を対照として調製した。
【０１３３】
結果のデータを図1〜3および表3〜5に詳述した。図1はL19およびA2によるHRSV感染細胞の溶解液（SDS処理済み）のSDS PAGEを示し、図2はL19およびA2によるHRSV感染細胞の溶解液（細胞および上清）のSDS PAGEを示し、そして図3はHRSV L19およびA2精製ウイルスのSDS PAGEを示す。表3はSDS-PAGEからのL19およびA2レベルからの比較しうるHRSV FおよびGタンパク質を示す。表4は感染細胞（溶解液、上清）からの比較しうるHRSV L19およびA2 FおよびGタンパク質を示す。最後に、表5はSDS PAGEからの比較しうるHRSV L19およびA2 FおよびGタンパク質を示す。
【表３】
2018008968.tif 000005
【表４】
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【表５】
2018008968.tif 000007
【０１３４】
総括：RSV L19ウイルス感染細胞はRSV A2ウイルス感染細胞と比較して3〜11倍高い量のRSVウイルスタンパク質を生産する。
【０１３５】
［実施例２］
この実施例の目的は、色々なRSVウイルスの株に様々な感染時間（24時間-対-4日間）感染したHep-2細胞におけるFタンパク質発現を比較することにあった。
【０１３６】
材料と方法：Hep-2細胞をL19またはA2 RSVウイルス（全部で、4フラスコの2セット）に感染させた。
【０１３７】
ウイルス感染後24時間に、Hep-2細胞の第1セットを培養上清と共に、または単独に溶解した。24時間後、ウイルスサンプルを次の通り調製した：
【表６】
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【０１３８】
C＋TCCC＋T＝細胞＋Trisバッファー(培地を捨てて等体積のTrisバッファーで置換した)； 
C＋M＝細胞＋培地(培地を保存した)。
【０１３９】
感染後4日にHep-2細胞の第2セットを培養上清と共にまたは単独で溶解した。サンプルを次の通り調製した：
【表７】
2018008968.tif 000009
【０１４０】
C＋T＝細胞＋Trisバッファー（培地を捨て、等体積のTrisバッファーで置換）；
M＝培地（培地を別に収集した）；
C＋M＝細胞＋培地（保存した培地）。
【０１４１】
各サンプルの7.5μLのいくつかをウェスタンブロット分析にかけた。FおよびGタンパク質バンドの密度を"Carestream Molecular Imaging Software 5.X"を用いて測定した。
【０１４２】
結果：結果を図4に詳述した。これらはウイルス感染後24時間のHRSV L19およびA2 FおよびGタンパク質発現のウェスタンブロットを示す。加えて、下記の表8はウェスタンブロットからのHRSV FおよびGタンパク質の密度分析を示す。
【０１４３】
表8 ウェスタンブロットからのHRSV FおよびGタンパク質バンド密度分析 
【表８】
2018008968.tif 000010
【０１４４】
総括：L19感染細胞においては細胞随伴ウイルス粒子および培地随伴ウイルス粒子が両方とも、RSV A2株に感染した細胞と比較して遥かに高いFタンパク質（平均、約6倍）を発現する。
【０１４５】
さらに、L19感染細胞においては細胞随伴ウイルス粒子と培地随伴ウイルス粒子が両方とも、RSV A2株で感染した細胞と比較して遥かに高いGタンパク質を発現する。
【０１４６】
［実施例３］
本実施例の目的はナノエマルジョンのウイルス抗原との結合を立証する
ことであった。
【０１４７】
材料と方法：透過型電子顕微鏡写真と切片化技法：20mLのナノエマルジョンアジュバントを単独でまたはフルゾン(登録商標)と共に、1％(w/v)四酸化オスミウム溶液を用いて固定した。固定した調製物をヒストゲルと1:10比で混合し、固体塊を形成した。固体混合物を薄い1mmスライスに切片化して、二重蒸留した脱イオン水で漱いだ。切片化サンプルを、二重蒸留した脱イオン水中でDurcupan(登録商標)キット（Fluka、EM #14020）の成分Aの上昇する濃度（30％、50％、70％、90％、100％）で脱水した。これらのサンプルをDurcupan(登録商標)キットの包埋溶液（成分A、B、CおよびDの混合物）中に移した。包埋したサンプルを、75nm厚さに切片化して300メッシュ炭素コーティングした銅グリッドの上に置いた。グリッド上の切片を蒸留および脱イオンした水（pH 7）中の飽和酢酸ウラニルで10分間、次いでクエン酸鉛で5分間、染色した。そのサンプルを計算機制御したコンピュステージ、高解像（2K x 2K）デジタルカメラを備えたPhilips CM-100 TEMにより観察し、X-Stream画像ソフトウエア（SEM Tech Solutions, Inc., North Billerica, MA）を用いてデジタル画像を得た。
【０１４８】
結果：電子顕微鏡写真：20％ W805ECナノエマルジョンのTEM断面は均一な内部コア物質を持つナノエマルジョン液滴を示した。30μgのHAを含有するナノエマルジョンワクチンは油コアの液滴内にフルゾン(登録商標)抗原液滴を表す明確な抗原物質／粒子を示す。抗原はコア内に組込まれ、かつコア物質により囲まれているので、濃密な電子染色から保護される。その結果、コア内に白色の逆染色効果を示す。抗原をコア内に局在することによって、エマルジョン中の抗原感受性タンパク質サブユニットを遮蔽し、抗原を分解から保護しかつ安定性を増進することができる。NE粒子の外側には極くわずかのフルゾン(登録商標)粒子しか存在せず、これらは暗色に染色されている（図6aおよび6b）。
【０１４９】
［実施例４］
本実施例の目的は、マウスにおいて経鼻ワクチン接種を介するいくつかの異なる手法（β-プロピオラクトンおよびW805ECナノエマルジョンを含む）を比較することにあった。
【０１５０】
方法：  抗ウイルスとアジュバント活性の両方をもつ水中油ナノエマルジョンW805ECを、β-プロピオラクトン（β-PL）不活化ウイルス（株L19、2x105 pfu/用量）と比較した。この2種のワクチンをBALB/Cマウスに週0および4に鼻腔内（IN）投与した。マウスから投薬前およびブースト後3週に採血し、Fタンパク質に対する特異的抗体について試験した。
【０１５１】
動物を週8に1x105 pfu RSV L19で鼻内チャレンジし、そして気道過反応性（AHR）、肺サイトカイン、およびPCRを用いるウイルスタンパク質mRNAクリアランスについてチェックした。
【０１５２】
結果：W805ECとβ-PLは両方共にRSVを完全に不活化しかつ免疫応答を誘導した。β-PLワクチンばナノエマルジョン-不活化ワクチンと比較してより高い抗体応答を誘導した（p＝0.006）。ナノエマルジョン-不活化ワクチンをワクチン接種した動物は、しかし、チャレンジ後にRSVのクリアランスがより高く、これはより低い肺中のFおよびG mRNAにより確認された（それぞれ、p＝0.06および0.0004）。さらに、ナノエマルジョン-不活化ワクチンを受けた動物は有意に低いAHRを示した（p＝0.02）。両方のワクチンは、ワクチン非接種の対照と比較して有意なレベルの肺IL-17を誘導した、しかし、有意に高いレベルがナノエマルジョン-不活化ワクチンにより誘導された（p＝0.009）。
【０１５３】
結論：β-PL不活化RSVウイルスワクチンは、RSV感染のマウスモデルにおいて、ウイルスチャレンジ後にAHRを随伴する。対照的に、ナノエマルジョンウイルスの不活化はAHRを生じることなくかつIL-17生産の増加を有意に誘導しかつウイルスのクリアランスを改善した。このことは、RSVに対するワクチン接種が有利になりうる免疫保護の新規経路を示唆する。
【０１５４】
［実施例５］
本実施例の目的はRSVワクチン用のアジュバントとして有用なナノエマルジョンの例を記載することである。
【０１５５】
マウスおよびコットンラットにおいて合計10種のナノエマルジョン製剤を評価した。W805EC単独、6種のW805EC＋ポロキサマー407およびポロキサマー188（P407およびP188）製剤、2種のW805EC＋キトサンおよび1種のW805EC＋グルカン製剤を作製して2週間40℃の加速化条件のもとで安定性を評価した（表1）。全10種のナノエマルジョンは少なくとも2週間40℃にて安定であった。
【表９】
2018008968.tif 000011
【０１５６】
次の製剤を特にコットンラットのIN研究において試験した：(1)製剤1、W805EC（NE80）、次を含有するもの：(a)CPC/Tween 80（比1：6）、および(b)粒子径約500nm（表10）；ならびに、(2)製剤2、W80P1885EC（NE188）、次を含有するもの：(a)CPC/Tween 80/P188（比1：1：5）、(b) 粒子径約300nm、(c)粘膜接着を増強したもの（IN）、および(d)滞留時間を延長したもの（IM）（表 11）。
【表１０】
2018008968.tif 000012
【表１１】
2018008968.tif 000013
【０１５７】
［実施例６］
本実施例の目的は本発明のワクチンに有用であるRSVウイルス株を記載することにある。
【０１５８】
NanoBio社はナノエマルジョン不活化／ナノエマルジョンアジュバント添加RSVワクチンの抗原として試験するために、新規L19 RSV株を得て評価した。この株はマウスにおいて感染および呼吸器疾患（ERD）の増進を引き起こすことが見出されていた。さらに公開データは、これをナノエマルジョンで製剤するとマウスに保護を与え、ERDの誘導がないことを示した。このL19株をAmerican Type Culture Collection (ATCC)から得た野生型A2株と比較した。
【０１５９】
RSV株L19は呼吸器病のRSV感染幼児（Ann Arbor, Michigan、1967年1月3日）のWI-38細胞から単離され、SPAFAS初代ヒナ腎細胞で継代され、次いでSPAFAS初代ヒナ肺細胞で継代され、その後、MRC-5細胞（Herlocher、1999）に、そして次いでHep2細胞に移された（Lukacs、2006）。RSV L19ゲノム（15,191-nt；GenBank 受託番号 FJ614813）のRSV A2株（15,222-nt； GenBank 受託番号 M74568）との比較は98％のゲノムが同一であることを示す。L19とA2の間のコード差のほとんどはFとG遺伝子にある。これら2種の株のアミノ酸アラインメントは、Fタンパク質が14（97％同一）、Gタンパク質が20（93％同一）アミノ酸差を有することを示す。
【０１６０】
RSV L19株は、動物モデルにおいて、気管内投与による1x105プラーク形成ユニット（PFU）／マウスの接種を用いる刺激粘液生産およびIL-13の有意な誘導によりヒト感染を模倣することが実証されている（Lukacs 2006）。
【０１６１】
RSV L19株を選択する理論的根拠：NanoBio社はVero細胞で増殖した3種のウイルス株について最適化したRSV増殖および精製方法を開発し、多重感染（MOI）、PEG6000沈降および超遠心を用いる抗原の精製と濃縮の最適化を確立している。重要かつユニークなこととして、RSV L19ウイルス株は、他の株より有意に高いFタンパク質の収率（PFU当たりおよそ10〜30倍超）を生産する点がユニークである。Fタンパク質含量は免疫原性の重要因子でありうるのであって、L19株は現在最もロバストな免疫応答を誘発する。このL19株は増殖時間が短く、それ故に製造の視点からより効率的でありうる。NanoBio社は、品質管理されたVero細胞株においてL19株の単一プラーク単離およびウイルス精製の後にワクチン用のRSV L19株ウイルスを生産し、マスターウイルスシードバンク（Master Viral Seed Bank）およびワーキングウイルスシードバンク（Working Viral Seed Bank）を確立することを提案する。3種のウイルス株の比較結果を表12に掲げる。
【表１２】
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【０１６２】
［実施例７］
この実施例の目的は色々なナノエマルジョンアジュバントによるRSV L19ウイルス株の不活化を記載することである。
【０１６３】
ナノエマルジョン(1)W805EC、(2)W805EC＋P407、(3)W805EC＋P188、(4)W805EC＋高および低分子量キトサン、および(5)W805EC＋グルカンをRSV L19ウイルス株によって試験し、ウイルス不活化を確認した。
【０１６４】
不活化を20％ナノエマルジョンにより2時間室温にて、そして0.25％βPLにより16時間4℃にて次いで2時間37℃にて実施した。処理したウイルスをHep-2細胞で3回継代し、ウェスタンブロット分析を細胞溶解液で実施して生ウイルスの存在を確認した。図7を参照されたい。特に、図7はウェスタンブロット評価によりウイルス不活化を示す。レーンは次を含有する：（1）W805EC（レーン1）、（2）W805EC＋0.03％ β(1,3)グルカン（レーン2）、(3)W805EC＋0.3％キトサン（中程度の分子量）＋酢酸（レーン3）、(4)W805EC＋0.3％P407（レーン4）、(5)W805EC＋0.3％キトサン（低分子量）＋0.1％酢酸（レーン5）、(6)培地単独（レーン6）、(7)βPL-不活化ウイルス（レーン7）、および(8)L19陽性対照（レーン8）。
【０１６５】
RSV L19は評価したナノエマルジョン製剤によりおよびβPLにより完全に不活化された。図7は、細胞培養でNE処理したウイルスの3連続継代は、ウェスタンブロットでRSV抗体に対してブロットするとウイルス抗原が検出されなかったことを示す。この3つの細胞培養継代試験は、充分確立されかつ容認されたウイルス不活化確認の方法である。注目すべきは、図7の全レーンが濃密なバックグランドバンドを有し、これがウイルスバンドでなくウシ血清アルブミンであることだ。ウイルスタンパク質は陽性対照（レーン8）でだけ検出しうる。
【０１６６】
［実施例８］
この実施例の目的はRSVワクチンの短時間安定性を評価することであった。
【０１６７】
RSV L19ウイルス調製物の標的用量を20％の最終ナノエマルジョン濃度を達成するように製剤した。ワクチンを室温および4℃にて貯蔵した。安定性試験パラメーターは物理的および化学的分析を含んだ（表13）。
【表１３】
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【０１６８】
RSV株L19についての物理的外観、平均粒子径、ゼータ電位およびウェスタンブロット許容判定規準は、W805EC+/-βPL不活化について室温および4℃での貯蔵14日後に適合した。W805EC＋3％P407、W805EC＋0.3％キトサン-LMW、およびW805EC＋0.3％キトサン-MMWを最高7〜8日間試験し、これも安定性を実証した。W805EC/P188（1:1:5）およびW805EC/P188（1:5:1）製剤も生ウイルスRSV A2株をRSV L19株と対比して最高14日間試験した；1:1:5製剤は安定性を実証したが、1:5:1製剤は潜在的凝集を示した（表14）。
【表１４】
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【０１６９】
図8は、日0における（図8A）およびRTまたは4℃にて貯蔵14日後における（図8B）、W805EC+/-βPLで不活化したRSV株L19の、ウェスタンブロットによるGバンド強度の一例を示す。特に、図8は示したW805ECと組み合わせたL19ウイルス4x106 PFU/レーン、2x106 PFU/レーン、および1x106 PFU/レーン+/-βPL不活化を用いて実施したウェスタンブロット分析を示す。試料は新しく（図8A）または4℃もしくは室温（RT）にて14日後（図8B）に分析した
［実施例９］
本実施例の目的はマウスにおけるRSVワクチンの免疫原性を評価することである。
【０１７０】
マウスを表15に示したように筋肉に免疫感作した。マウスは50μlのRSVアジュバント添加アクチンを0週にIMに受けた。マウスから0および3週に採血し、血清抗体を試験した。ナノエマルジョンに寄与したアジュバント活性だけでなく、キトサンを免疫モジュレーターとして用いて免疫応答を増進した。
【表１５】
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【０１７１】
キトサン含有ナノエマルジョンでワクチン接種したマウスは、キトサン非含有ナノエマルジョンと比較すると、ナノエマルジョンアジュバント添加RSVワクチンの単一用量後に、より増進した免疫応答を示した（図9）。特に、図9は、キトサン含有およびキトサン非含有の色々なナノエマルジョン製剤でIMワクチン接種したマウスにおけるワクチン接種後3週における免疫応答（IgG、μg/ml）を示す：(1)RSV株L19＋2.5％W805EC＋0.1％低分子量キトサン； (2)RSV株L19＋5％W805EC；(3)RSV株L19＋2.5％W805EC；(4)RSV株L19＋βPL不活化ウイルス；および(5)ナイーブマウス(無ワクチン)。図9に掲げた結果は、最高レベルのIgGがRSV株L19＋2.5％W805EC＋0.1％低分子量キトサンでワクチン接種したマウスで、次のレベルのIgGがRSV株L19＋2.5％W805ECでワクチン接種したマウスで、続いてのレベルのIgGがRSV株L19＋5％W805ECでワクチン接種したマウスでそれぞれ見出されたことを示す。ワクチン接種したマウスで観察された最低レベルのIgGはRSV株L19＋βPL不活化ウイルスにおいてであった。
【０１７２】
［実施例１０］
本実施例の目的は本発明に記載のRSVワクチンのコットンラットにおける免疫原性を確認することであった。
【０１７３】
コットンラットはRSVワクチンの免疫原性と効力を評価するための容認された動物種である。マウスで作製したデータを用いて2種のナノエマルジョンをコットンラットにおける評価用に選択した。研究した2種の初期製剤にはW805ECおよびW80P1885EC(1：1：5)（上記の表10および11を参照されたい）が含まれる。
【０１７４】
コットンラットは2用量の30μl INのナノエマルジョンアジュバント添加ワクチン（6.6μg F-ptnを含有する）を受けた。コットンラットを週23に5x105 pfu RSV株A2でチャレンジした。動物の半数を日4に犠牲にし、残りの半数を日8に犠牲にした。ワクチン接種スケジュールを図10に掲げた。
【０１７５】
下記の免疫原性データは、RSV-ナノエマルジョンワクチンによるIN免疫化をすると、陽性免疫応答が観察されたことを示す。第2用量を投与すると、抗体力価の速やかなかつ有意な増加が達成された。図11に掲げたデータは、週21に全動物の抗体レベルが週4の第1ブースト投与の短期間後に得た最高値の10分の1であったことを示す。第2のチャレンジ前ブーストの投与は週6（第1ブースト後2週）に達成したレベルとほとんど同一である免疫応答を生じた。両方のナノエマルジョンは、強くかつ有意な免疫応答を誘発する上で等しく効率的であった（図11および12）。（図11と12のY軸はFタンパク質に対する特異的抗体の終点力価または抗体量を示しかつX軸は週で表した時間を示す）。
【０１７６】
ELISAユニット/μg/ml：Fタンパク質に対する特異的抗体の量を、任意の100 EUに割付けられ定義された参照血清との関連でELISAの曲線下面積により計算した。
【０１７７】
［実施例１１］
本実施例の目的は、IN投与後の、本発明によるRSVワクチンの中和抗体に対する効果、ならびに他のRSV抗体に対するRSV株L19を含むRSVワクチンの交差反応性を決定することであった。
【０１７８】
コットンラットに30μlのワクチンを鼻腔内にワクチン接種し、4週にブーストし、そして0、4、6、および 8週に採血した。動物に週23に5x105 pfuのRSV株A2をチャレンジした。研究グループには、3.3μg Fタンパク質を含有する1.6x105 PFU RSV株L19（n＝8）または6.6μg Fタンパク質を含有する3.2x105 PFU RSV株L19（n＝8）のどちらかと混合した20％W805ECナノエマルジョンを受けた2グループ、ならびに3.3μg Fタンパク質を含有する1.6x105 PFU RSV株L19（n＝8）または6.6μg Fタンパク質を含有する3.2x105 PFU L19 RSV（n＝8）のどちらかと混合した20％W80P1885ECナノエマルジョンを受けた2グループ0が含まれた。
【０１７９】
動物の半数を日4に犠牲にし、残りの半数を日8に犠牲にした。個々のコットンラット血清を中和抗体について試験した。中和ユニット（NEU）は50％プラーク低下をもたらす最高希釈の逆数を表す。NEU測定は4週（ブースト前）および6週（ブースト後2週）に実施した。6週に得た試料はNEU分析を可能にするのに充分な液性免疫応答を作製した。データは95％信頼区間（CI）の幾何平均として表した（図13A）。EUとMEUの間の相関は全動物について6週においてスピアマンのrhoを用いた（図13B）。
【０１８０】
具体的に、図13は6週時点における中和抗体力価を示す（図13A）。60％W805ECまたは60％W80P1885ECで不活化した3.2x106PFU RSV株L19を用いてワクチン接種した全動物はロバストな中和抗体を作製したことは特筆すべきことである。EUと中和抗体（NEU）の間には統計的有意な正の相関が存在する（図 13B）。
【０１８１】
中和ユニット（NU）：ウイルスプラークを50％だけ減ずる最高血清希釈の逆数。
【０１８２】
比活性（NU/EU）：ウイルス中和抗体（NU）/EU F-タンパク質抗体（図13B）。
【０１８３】
図 14は日4および日8における中和抗体を示す。図14AはRSV株L19と組み合わせたW80P1885ECナノエマルジョンに対する結果を、図14BはRSV株L19と組み合わせたW805ECナノエマルジョンに対する結果を示す。全てのコットンラットはワクチンRSV株L19に対して高い中和抗体（NU）を示した。中和抗体（Y軸）はチャレンジ後に着実に上昇した。日8の中和ユニット（NU）は日4のNUより高かった。ナイーブコットンラットはその血清がいずれの中和活性も示さなかった。血清中和抗体および比活性はチャレンジ後の日4から日8に増加傾向を示した。
【０１８４】
図15は、血清抗体の比活性（中和ユニット/ELISAユニット）が、チャレンジ後の日4と比較すると日8に増加する傾向にあることを示す。図15Aは、日4と日8におけるRSV株L19（Y軸のNU/EU）と組み合わせたW80P1885ECナノエマルジョンに対する結果を示す。図15Bは、日4と日8におけるRSV株L19 （Y軸のNU/EU）と組み合わせたW805ECナノエマルジョンに対する結果を示す。全てのコットンラットは高い中和活性を実証した（図15）。
【０１８５】
ワクチン接種したコットンラットの血清はチャレンジ後の日4にRSV株A2（RSV株L19に加えて）に対する交差保護を示した（図 16）。特異的に、図16は、3 用量のRSV L19 アジュバント添加ワクチンを受け、次いでRSV株 A2でチャレンジしたコットンラットに対する日4における交差保護を示す。図16AはRSV株L19と組み合わせたW80P1885ECナノエマルジョンに対する結果を示し、そして図16BはRSV株L19と組み合わせたW805EC ナノエマルジョンに対する結果を示す。血清中和活性はRSV株L19またはRSV株A2に対して等価のNUを示し、2種のRSV株の間の交差保護を実証する。ワクチン接種したコットンラットは、ナイーブなコットンラットと比較すると、全てのチャレンジしたRSVウイルスをチャレンジ後の日4にクリアした（図17）。予想されるように日8には、全ての動物がウイルスをクリアした。特異的に、図17は、試験したコットンラットの肺におけるRSV株A2ウイルス力価（PFU/g）の測定により、コットンラットの肺における日4のウイルスクリアランスを示す。ワクチン接種したコットンラット（RSV株L19と組み合わせたW80P1885ECナノエマルジョン、およびRSV株L19と組み合わせたW805ECナノエマルジョンでワクチン接種した）は、RSV株 A2チャレンジウイルスのコットンラットの肺からの完全なクリアランスを示した。対照的にナイーブ動物は肺で>103 pfu RSV株A2/g（検出限界は2.1x101 pfu/gであった)を示す。
【０１８６】
［実施例１２］
本実施例の目的は、本発明によるRSVワクチンのコットンラットにおける筋肉内ワクチン接種を評価することであった。
【０１８７】
コットンラットに、図18に示したスケジュールに従ってIMワクチン接種した。動物は3.3μg F-タンパク質を含有するRSVアジュバント添加RSVワクチン（3.3μg Fタンパク質を含有する1.6x105 PFU RSV株L19と混合した20％W805ECナノエマルジョン）の50μlを受けた。コットンラットはRSVに対して特異的な免疫応答を生じた。抗体レベルは、第2ブーストが週14に投与されるまで減少した。チャレンジ後に、わずかな抗体レベルの増加があった（図19および20）。特に、図19はワクチン接種したコットンラットにおける血清免疫応答を示す。Y軸は、14週間にわたる、チャレンジ後の日4およびチャレンジ後の日8におけるIgG、μg/mLを示す。図20はワクチン接種コットンラットの血清免疫応答を示す。図20Aは14週間にわたる、チャレンジ後の日4およびチャレンジ後の日8における終点力価（Y軸）を示す。図20Bは14週間にわたる、チャレンジ後の日4およびチャレンジ後の日8におけるELISAユニット（Y軸）を示す。
【０１８８】
IM免疫化の効力はRSVの生A2株（ヒトで疾患を引き起こす株である）でこの動物にチャレンジすることにより評価した。RSV L19 ナノエマルジョンアジュバント添加ワクチンのブースター免疫化後の2週に、用量5x105 pfuのRSV株A2を動物に投与した。ナイーブな整合した年齢のグループにもチャレンジした。各グループの動物の半数をチャレンジ後4日に犠牲にしたが、その時点において最高ウイルス負荷がコットンラットの肺に示された。他の半数は第8日に犠牲にした。
【０１８９】
ウイルスの クリアランス：  肺培養の示した結果によると、チャレンジ後の4日に全てのワクチン接種した動物はその肺にウイルスが存在しなかったが、ナイーブ動物は肺組織に103pfu RSV株A2/gウイルスの負荷を有した（図21）。具体的に、図21は、試験したコットンラットの肺中のRSV株 A2 ウイルスの力価（PFU/g）の測定によるコットンラットの肺の日4におけるウイルスクリアランスを示す。ワクチン接種したコットンラット（RSV株L19と組み合わせたW805ECナノエマルジョンによりワクチン接種した）は、RSV株 A2チャレンジしたウイルスのコットンラットの肺からの完全なクリアランスを示した。対照的に、ナイーブ動物は103 pfu RSV株A2/g肺（検出限界は2.1 x 101 pfu/gである）以上のウイルス負荷を示した。
【０１９０】
コットンラット総括：ナノエマルジョンに製剤してINまたはIM投与した全てのRSVワクチンは、免疫化した動物の感染を予防する防御免疫応答を誘発した。さらに、ナノエマルジョン不活化しかつアジュバント添加RSV L19ワクチンは、全世界で受け入れられるコットンラットモデルにおいて高度に免疫原性である。コットンラットは1回の免疫化後に抗体力価の上昇および第2の免疫化後に著しいブースト（およそ10倍増加）を誘発した。作製された抗体は生ウイルスを中和するのに高度に有効であり、中和と抗体力価の間には直線関係が存在する。さらに、コットンラットで作製された抗体は、RSV L19株で免疫化しRSV A2株でチャレンジすると交差保護を示した。IMとIN両方の免疫化は記憶を確立し、その記憶は第2ブーストまたは生ウイルスへの曝露としての抗原への曝露後に呼び起こすかまたは思い出すことができる。
【０１９１】
［実施例１３］
本実施例の目的は、W805ECナノエマルジョンアジュバント添加RSVワクチンの鼻腔内（IN）-対-筋肉内（IM）投与を比較することである。
【０１９２】
方法：1.7μgのFタンパク質を伴うL19 RSVウイルスの2x105プラーク形成ユニット（PFU）を含有するRSVワクチンを、20％W805ECナノエマルジョンアジュバントで不活化した。BALB/Cマウス（n＝10/治療群）を週0および4に、INまたはIMでワクチン接種した。血清を抗F抗体について分析した（図22）。脾臓、頚部および腸リンパ節(LN)から得た細胞をRSV特異的サイトカインについて分析した（図23）。マウスを口咽頭部に5x105 PFU L19を8週にチャレンジした。気道過敏性をプレチスモグラフィにより試験した。サイトカインのmRNA、ウイルスタンパク質、および組織病理学を評価するために、肺をチャレンジ後の日8に分析した。
【０１９３】
結果：  IM ワクチン接種したマウスはチャレンジ後にIN ワクチン接種したマウスと比較して、より高い抗F抗体（GM 396 [95％ CI、240〜652]-対-2 [95％ CI、0〜91]）を有し（図22）、かつより多いIL-4およびIL-13（p<0.05）を作製した（図23）。対照的に、脾細胞、頚部リンパ節（LN）および腸リンパ節（LN）からのIL-17は、IN-対-IMワクチン接種後の比がより高かった（GM：それぞれ、57対1、119対3および51対4 pg/mL、p<0.05）（図23）。図24はINまたはIMワクチン接種後の肺組織におけるサイトカインIL-4、IL-13、およびIL-17の測定値を示す。IL-4とIL-13はIM投与後により高い量で発現され、IL-17についてはIN投与後により大きい発現を示した。チャレンジすると、両方の免疫化経路はFとGタンパク質のクリアランスをもたらしたが、気道抵抗は組織病理学の確証によるとIMグループにおいてより高かった（p＝0.03）（図25）。肺のIL-4およびIL-13は気道過敏症と強い正の相関（それぞれ、r＝0.89； p＝0.001 および r＝0.8； p＝0.007）を有した。肺のIL-17はIN（p＝0.008）ワクチン接種したマウスでだけ発生し、気道過敏症と強い負の相関（r＝-0.81 p＝0.007）を有した。
【０１９４】
結論：IMワクチン接種と比較して、新規のナノエマルジョンアジュバントW805ECによるINワクチン接種は高いIL-17生産と強い相関のある、より少ない気道過敏症をもたらした。粘膜ワクチン接種により作製されるIL-17はRSV感染における気道過敏症低下の重要なマーカーでありうる。
【０１９５】
様々な改変と変法が本発明の精神と範囲から逸脱することなく本発明の方法および組成物においてなすことができるのは当業者に明らかでありうる。従って、本発明は、本発明の改変と変法が添付せる請求項およびその同等体の範囲内にあることを条件として、前記改変と変法を含むものであることを意図している。
【０１９６】
本明細書に引用した参考文献
2018008968.tif 000018
2018008968.tif 000019
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【外国語明細書】
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