(57)【要約】      （修正有）【課題】近視の治療に対して有用な医薬組成物、及び方法の提供。【解決手段】２種の抗軟骨形成剤、前記抗軟骨形成剤の一方が抗ムスカリン剤、更に具体的にはアトロピンで、約０．００１〜約１重量％、好まくは約０．００５〜約０．０５重量％のアトロピンであり、及び／又は前記抗軟骨形成剤のもう一方が、非ステロイド性抗炎症薬、更に具体的にはケトロラク、ジクロフェナク、インドメタシン、インドメタシン、ブロムフェナク、フノルルビプロフェン又はそれらの組合せであり、好ましくは約０．０５〜約１重量％のケトロラク又は約０．０１〜約０．２重量％のジクロエナクを含む医薬組成物。該医薬組成物の投与により、強膜の軟骨形成を低減させ、目の軟骨形成蛋白質を低減させ、炎症で誘発された軟骨形成を低減させ、及び近視を治療する方法。【選択図】図１
2018008991.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２種の抗軟骨形成剤を含む医薬組成物。
【請求項２】
前記２種の抗軟骨形成剤のうちの一方が抗ムスカリン剤である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記抗ムスカリン剤がアトロピンである、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記抗ムスカリン剤が約０．００１％から約１％重量のアトロピンを含む、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記抗ムスカリン剤が約０．００５％から約０．０５％重量のアトロピンを含む、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記２種の抗軟骨形成剤のうちの一方が非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記非ステロイド性抗炎症薬がケトロラク、ジクロフェナク、インドメタシン、ブロムフェナク、ネパフェナク、フルルビプロフェン又はそれらの組合せから選ばれる、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記非ステロイド性抗炎症薬が約０．０５％から約１％重量のケトロラクを含む、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記非ステロイド性抗炎症薬が約０．０１％から約０．２％重量のジクロフェナクを含む、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
近視を治療する方法であって、１つ又は複数の抗軟骨形成剤の有効量を近視個体に投与する工程を含む、方法。
【請求項１１】
当該抗軟骨形成剤が非ステロイド性抗炎症薬である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記非ステロイド性抗炎症薬がケトロラク、ジクロフェナク、インドメタシン、ブロムフェナク、ネパフェナク、フルルビプロフェン又はそれらの組合せから選ばれる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記非ステロイド性抗炎症薬が約０．０５％から約１％重量のケトロラクを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記非ステロイド性抗炎症薬が約０．０１％から約０．２％重量のジクロフェナクを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
当該抗軟骨形成剤が抗ムスカリン剤である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗ムスカリン剤がアトロピンである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗ムスカリン剤が約０．００１％から約１％重量のアトロピンを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗ムスカリン剤が約０．００５％から約０．０５％重量のアトロピンを含む、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１３年５月６日に出願された米国特許出願第６１／８１９，７０９号の利益を主張し、その内容全体を参照により本明細書中に援用される。
【０００２】
本発明は、近視を治療し、目の軟骨形成蛋白質、強膜の軟骨形成及び炎症で誘発された軟骨形成を抑制させるための医薬組成物と方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
近視は、眼の漸次伸長と眼部組織の引き伸ばしに起因する疾患である。それは重大な公共健康問題であり、米国人口の約２５％に影響を及ぼしており、いくつかのアジア国家では影響される人口が８０％にまで達すると見積もられる。強度近視の黄斑病変は、既に白内障、緑内障、網膜剥離、近視性網膜変性、視覚障害、及び治療できない失明の主要原因となっていた。
【０００４】
光学性とレーザー外科の矯正技術は、既に近視眼の屈折状態を変えるために用いられた。しかしながら、これらの治療法は、眼の異常伸長を対処できないので、強度近視患者の病理的変化を治療することができなくなってしまう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
近視に対し、より有効かつ安全な治療が依然として要望されている。本発明は、この要望を扱うものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本明細書には、２種の抗軟骨形成剤を含む医薬組成物が提供された。前記医薬組成物は、近視を治療し、１つ又は複数の軟骨形成蛋白質を低減させ、及び強膜の軟骨形成を低減させるために有効である。
【０００７】
非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）の有効量を必要とする個体に投与することを含む近視を治療するための方法、及びそれによる近視の治療が提供された。一実施例において、近視を治療するための方法は、さらに抗ムスカリン剤の有効量を投与することを含む。
【０００８】
本明細書には、１つ又は複数の抗軟骨形成剤の有効量を必要とする個体に投与することを含む１つ又は複数の目の軟骨形成蛋白質を低減させるための方法、及びその１つ又は複数の目の軟骨形成蛋白質の低減も提供された。
【０００９】
本明細書には、１つ又は複数の抗軟骨形成剤の有効量を必要とする個体に投与することを含む強膜の軟骨形成を低減させるための方法、及びその強膜の軟骨形成の低減も提供された。
【００１０】
本明細書には、１つ又は複数の抗軟骨形成剤の有効量を必要とする個体に投与することを含む炎症で誘発された軟骨形成を低減させるための方法、及びその個体内の炎症で誘発された軟骨形成の低減も提供された。
【００１１】
本発明は、添付の図面と併せて以下の詳細な説明を読むと、明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】近視のメカニズムを模式的に示す図である。
【図２】トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）の治療有無による強膜幹／前駆細胞（ＳＳＰＣｓ）でのβ−ａｃｔｉｎ発現の正規化されたアルファ平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）とＩＩ型コラーゲン（Ｃｏｌ２）ｍＲＮＡのレベルを示す棒グラフである。データは、デルタ−デルタＣｔ法で測定した対照群サンプルに対する倍率変化として表される。バー、ＳＤ。＊が統計的有意性を意味する。
【図３】形態剥奪性近視（ＦＤＭ）を患うマウスの強膜でのα−ＳＭＡとＣｏｌ２の発現を示す画像の集合である。コマＡは、ＦＤＭ眼での強膜のＣｏｌ２とα−ＳＭＡ発現レベルが増加したことを示すウエスタンブロット法の写真である。コマＢは、密度測定分析の棒グラフであり、ＦＤＭ眼での強膜のＣｏｌ２と強膜のα−ＳＭＡのレベルが対照群の眼よりも明らかに高いことを示す。
【図４】ＦＤＭ眼のＲＰＥ−脈絡膜複合体でのＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２とＴＧＦ−β３ｍＲＮＡ発現のレベルが対照群の眼よりも明らかに高いことを示す棒グラフである。
【図５】図５Ａ（ウエスタンブロット分析）と図５Ｂ（棒グラフ）は、アトロピン、ケトロラク、ジクロフェナクの有無により、１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β２で治療したヒトのＳＳＰＣでのＣｏｌ２とα−ＳＭＡの発現プロファイルを示す。
【図６】アトロピン眼薬水、及びアトロピンとケトロラクとを組合せた眼薬水で治療した１１名の近視個体での近視進行速度（毎年のジオプトリー変化）を示す棒グラフである。
【図７】治療を受けなかった近視個体に対して、ケトロラクで３ヶ月治療した近視進行速度を示す棒グラフである。
【図８】図８Ａは、形態剥奪性近視（ＦＤＭ）マウスの脈絡膜でのＧＡＤＰＨ発現の正規化されたインターロイキン−６（ＩＬ−６）ｍＲＮＡのレベルが対照群マウスよりも高いことを示す棒グラフである。図８Ｂは、脈絡膜内での腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）のレベルは、対照群マウスに比べてＦＤＭマウスでのレベルが高いことを示す棒グラフである。ＴＮＦ−α発現がケトロラク眼薬水によって抑制される。
【図９】図９Ａは、ＴＧＦ−β２（Ｔ２）の存在下にて、ＳＳＰＣでのα−ＳＭＡ発現に対する、アトロピン（Ａ）、ケトロラク（Ｘ１）、及びアトロピンとケトロラクとを含む医薬組成物の抑制効果を示す棒グラフである。アトロピンとケトロラクとを含む医薬組成物が、α−ＳＭＡの抑制上、相乗効果を有する。図９Ｂは、ＴＧＦ−β２（Ｔ２）の存在下にて、ＳＳＰＣでのＣｏｌ２発現に対する、アトロピン（Ａ）、ケトロラク（Ｘ１）、及びアトロピンとケトロラクとを含む医薬組成物の抑制効果を示す棒グラフである。アトロピンとケトロラクとを含む医薬組成物が、Ｃｏｌ２の抑制上、相乗効果を有する。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（定義）
上文と公開全文中で使用される場合、下記の用語は、別段の定めがない限り、以下の意味を有するものであると理解されるべきである。
【００１４】
本文中で用いられる場合、単数形である「１つ（ａ、ａｎ）」及び「前記（ｔｈｅ）」とは、文脈が明らかに別の意味を示さない限り、複数の言及を含む。
【００１５】
本文中で用いられた「有効量」は、少なくとも近視の一つの症状を治療又は改善するのに十分な量であり、若しくは１つ又は複数の目の軟骨形成蛋白質、強膜の軟骨形成又は炎症で誘発された軟骨形成を低減させる抗軟骨形成剤の投与量を含む。
【００１６】
本文中で用いられる用語である「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」とは、緩和用途又はその結果を意味し、及び／又は近視進行及び／又は近視化指数の発展を減速又は抑制させることを意味する。
【００１７】
用語「低減（ｒｅｄｕｃｅ）」は、目の軟骨形成蛋白質の形成、強膜の軟骨形成、炎症で誘発された軟骨形成又は近視進行、或いは近視化を減速させること、若しくは既に形成された目の軟骨形成蛋白質を分解させることを含む。
【００１８】
本発明の治療剤の薬学上受容可能な塩は、アルカリ金属（例えばナトリウムとカリウム ）、アルカリ土類金属（例えばカルシウムとマグネシウム）、アンモニウム及びＮＸ４＋（その中、ＸはＣ１−Ｃ４のアルキル基である）などの好適な塩基性基から誘導された塩類を含む。アミン基の薬学上受容可能な塩は、酒石酸、脂肪族、環状脂肪族、芳香族、複素環などの有機カルボン酸の塩類を含み、例えば蟻酸、グルクロン酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、ピルビン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、安息香酸、アントラニル酸、メシル酸、サリチル酸、ヒドロキシ安息香酸、フェニル酢酸、マンデル酸、エンボン酸（パモ酸）、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、パントテン酸、トルエンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、スルファニル酸、ステアリン酸、アルギン酸、ヒドロキシブチル酸、シクロヘキシルアミノスルホン酸、ガラクタル酸とガラクツロン酸及びその類似物、フマル酸及び琥珀酸などの例が挙げられる有機酸のカルボン酸とスルホン酸クラスを含み、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、イセチオン酸、ベンゼンスルホン酸及びｐ−トルエンスルホン酸などの有機スルホン酸を含み、かつ塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、炭酸、硫酸、スルファミン酸とリン酸及びその類似物などの無機酸を含む。化合物の薬学上受容可能な塩類は、当該化合物の陰イオンと、Ｎａ＋、ＮＨ４＋又はＮＸ４＋（その中、Ｘは例えばＣ１−Ｃ４のアルキル基である）、Ｃａ＋＋、Ｌｉ＋、Ｍｇ＋＋又はＫ＋及び亜鉛などの好適な陽イオンとからなるヒドロキシ基を有し、或いは1級、２級と３級アミン、環状アミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン（Ｎ−メチルグルカミン）とプロカイン及び類似物から作製される有機塩類を有する。全てこれらの塩類は、慣習的手段で対応の化合物から、例えば適切な酸又は塩を遊離形の化合物と反応することによって調製される。
【００１９】
本文中で用いられる用語である「近視」とは、光線が眼に射し込んで網膜上に収束せずに網膜の前面で収束してしまう１つ又は複数の眼の屈折誤差に関連する状況を意味する。用語「近視」は本文中で用いられる場合、各種程度（０から−３ジオプトリーの軽度近視、−３から−５ジオプトリーの中度近視、及び−５より低い強度近視）、及び様々な病因と原因の近視の類型と亜型を含み、既知又は未知に関わらず、単純な近視、変性近視と形態剥奪性近視を含むが、この限りではない。
【００２０】
本文中で用いられる用語である「ジオプトリー」とは、レンズを校正するように、網膜上に集光させて正常化視覚で測定するために、どのぐらいの光線を湾曲させる必要があるかを含む。平行光線を１メートルの収束点に湾曲させることができるレンズの力を１ジオプトリー（１．００Ｄ）という。２ジオプトリーのレンズは、光線を０．５メートル離れる点に収束させることができる。
【００２１】
本文中で用いられる用語である「個体」とは、典型的に上記の方法を受けた人又は動物を意味する。個体は、既知又は疑似の近視疾患の患者と理解されるべきであるが、既知又は疑似の近視疾患を患わない個体、例えば研究個体も、用語「個体」の範疇に含まれる場合もある。
【００２２】
全ての数量は、ここに「約」で修飾されるものと理解される。
【００２３】
（医薬組成物）
ここで、近視を治療し、目の軟骨形成蛋白質を低減させ、強膜の軟骨形成を低減させ、又は炎症で誘発された軟骨形成を減少させる医薬組成物を提供する。医薬組成物は、２種の抗軟骨形成剤の組合せを含み、理想的には、前記組合せによる優勢的な相乗作用が見られる。
【００２４】
抗軟骨形成剤は、軟骨形成の過程を低減又は減速させる任意の剤である。一実施例において、医薬組成物における抗軟骨形成剤がＮＳＡＩＤである。別の実施例において、医薬組成物における抗軟骨形成剤が抗ムスカリン剤である。抗軟骨形成剤の非限定的な例としては、リンパ系エンハンサー−結合因子−１の発現を調節するｍｉｃｒｏＲＮＡであるｍｉＲ−４４９ａ（Ｓ パイク氏等，ｍｉＲ−４４９ａのリンパ系エンハンサー−結合因子−１の直接標的化によるヒトの間葉系幹細胞の軟骨形成への調節，幹細胞開発研究；２１（１８）：３２９８−３０８，２０１２年（Ｓ Ｐａｉｋ，ｅｔ ａｌ．，ｍｉＲ−４４９ａ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ  ｈｕｍａｎ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｄｉｒｅｃｔ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｅｎｈａｎｃｅｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ−１，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ；２１（１８）：３２９８−３０８，２０１２））、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤であるバルプロ酸（ＦＨ パラディ氏等，器官形成期中期のマウスにおけるバルプロ酸曝露による四肢の軟骨形成と骨形成への阻害，毒性科学；１３１（１）：２３４−４１，２０１３年（ＦＨ Ｐａｒａｄｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｔｏｖａｌｐｒｏｉｃ ａｃｉｄ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ  ｍｉｄ−ｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ｍｏｕｓｅ ｌｉｍｂｓ，Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｓｃｉ；１３１（１）：２３４−４１，２０１３））、ニコチン（ｎｉｃｏｔｉｎｅ）（Ｙトウ氏等，＜ニコチン誘発のＩＧＦ−１信号経路のダウンレギュレーションによる軟骨形成遅延で胎児ラット内の成長板軟骨細胞のマトリックス合成への抑制＞，毒性学と応用薬理学；２６９（１）：２５−３３，２０１３年，（Ｙ Ｄｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎｉｃｏｔｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｅｓｉｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＩＧＦ−１ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ｔｏ ｉｎｈｉｂｉｔ ｍａｔｒｉｘ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｇｒｏｗｔｈ ｐｌａｔｅ ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｆｅｔａｌ ｒａｔｓ，Ｔｏｘｉｃｏｌ Ａｐｐｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ；２６９（１）：２５−３３，２０１３））、ｂＧＦＧ又は副甲状腺ホルモン様ペプチド（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ ｈｏｒｍｏｎｅ−ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅ，ＰＴＨｒＰ）（Ｓ・ワイス氏等，＜増殖因子とＰＴＨｒＰによるヒトの間葉系幹細胞の早期と晩期の軟骨細胞分化上での衝撃＞，細胞生理学定期刊行物；２２３（１）：８４−９３，２０１０年（Ｓ Ｗｅｉｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ＰＴＨｒＰ ｏｎ ｅａｒｌｙ ａｎｄ ｌａｔｅ ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ  ｈｕｍａｎ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ；２２３（１）：８４−９３，２０１０）、ロイシン酸の制限薬剤（ＭＳ・金，＜ロイシン酸制限で依存と非依存ｍＴＯＲ信号の両方のメカニズムによる軟骨細胞増殖と分化への抑制＞，米国定期刊行物−生理内分泌���と代謝；２９６（６）：Ｅ１３７４−８２ ，２００９年，（ＭＳ Ｋｉｍ，Ｌｅｕｃｉｎｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｂｏｔｈ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｄ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｆ  ｍＴＯＲ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ；２９６（６）：Ｅ１３７４−８２，２００９））、１７β−エストラジオール（Ｅｓｔｒａｄｉｏｌ）（Ｓ・伏見氏等，＜１７β−エストラジオールでゼブラフィッシュ胚の頭蓋骨発育における軟骨形成への抑制＞，水産毒性学定期刊行物；９５（４）：２９２−８，２００９年（Ｓ．Ｆｕｓｈｉｍｉ ｅｔ ａｌ．，１７ｂｅｔａ−Ｅｓｔｒａｄｉｏｌ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ  ｔｈｅ ｓｋｕｌｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ ｅｍｂｒｙｏｓ，Ａｑｕａｔ Ｔｏｘｉｃｏｌ；９５（４）：２９２−８，２００９））、ベルシカン（ｖｅｒｓｉｃａｎ）（Ｙ・楊氏等，＜ベルシカンのＧ３ドメインで類表皮増殖因子モチーフ経由の間葉の軟骨形成への抑制＞，生物化学定期刊行物；２７３（４９）：３３０５４−６３，１９９８年（Ｙ Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｇ３ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｖｅｒｓｉｃａｎ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｅｓｉｓ ｖｉａ ｔｈｅ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ｌｉｋｅ ｍｏｔｉｆｓ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ；２７３（４９）：３３０５４−６３，１９９８））、ＳＢ２０３５８０（ｐ３８ＭＡＲＫの特異的抑制剤，Ｄ・金氏等，＜カドヘリン−７の時間的発現と機能における変化で試験管内のニワトリ肢間葉細胞の軟骨形成の期間中の細胞移動と凝縮への抑制＞，細胞生理学定期刊行物；２２１（１）：１６１−７０，２００９年，（Ｄ Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｔｅｍｐｏｒａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｄｈｅｒｉｎ−７ ｉｎｈｉｂｉｔ ｃｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｃｈｉｃｋ ｌｉｍｂ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ； ２２１（１）：１６１−７０，２００９））、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）（ＧＳＫ−３βの抑制剤，Ｄ・金氏等，２００９年（Ｄ Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２００９））又はその類似物を含む。
【００２５】
一実施例において、医薬組成物は、少なく１つのＮＳＡＩＤと、少なく１つの抗ムスカリン剤とを含む。
【００２６】
特定の実施例において、本発明に用いられるＮＳＡＩＤは、非選択性シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）抑制剤、その誘導体、塩類と構造類似体であってもよく、即ち、ＣＯＸ−１とＣＯＸ−２蛋白質の両方を抑制させる化合物である。非選択性ＣＯＸ抑制剤の非制限的範例は、サリチル酸誘導体（例えばアスピリン、サリチル酸ナトリウム、トリサルチル酸コリンマグネシウム、サルサレート、ジフルニサル、スルファサラジンとオルサラジン）と、インドールとインデン酢酸類（例えばインドメタシンとスリンダク）と、ヘテロアリール酢酸類（例えばトルメチン、ジクロフェナクとケトロラク）と、アリールプロピオン酸類（例えばイブプロフェン、ナプロキセン、フルルビプロフェン、ケトプロフェン、フェノプロフェンとオキサプロジン）と、アントラニル酸（フェナム酸類）（例えばメフェナム酸とメクロフェナム酸）と、エノール酸類（例えばオキシカム類、ピロキシカムとメロキシカム）と、アルカノン類（例えばナブメトン）とを含む。
【００２７】
特定の実施例において、本発明に用いられるＮＳＡＩＤは、選択性ＣＯＸ−２抑制剤、その誘導体、塩類と構造類似体であってもよい。選択性ＣＯＸ−２抑制剤の非制限的範例は、ジアリール基置換のフラノン類（例えばロフェコキシブ）と、ジアリール基置換的ピラゾール類（例えばセレコキシブ）と、インドール酢酸類（例えばエトドラク）と、スルホンアニリド類（例えばニメスリド）とを含む。選択性ＣＯＸ−２抑制剤の更なる範例は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，４４０，９６３とＷＯ２００４／０５４５６０に公開され、その内容全体を本明細書中で参考として援用される。
【００２８】
本発明に用いられる好適なＮＳＡＩＤは、ケトロラク、ジクロフェナク、インドメタシン、ブロムフェナク、ネパフェナクとフルルビプロフェンを含むが、この限りではない。
【００２９】
抗ムスカリン剤の範例は、アトロピン、ホマトロピン、スコポラミン、その誘導体、塩類と構造類似体を含むが、この限りではない。
【００３０】
抗ムスカリン剤は、視朦、光恐怖症等の副作用を引き起こすおそれがある。これらの副作用は、比較的低い投与量の抗ムスカリン剤を施すことで軽減でき、１つ又は複数の抗軟骨形成剤と結合することによって所望の治療効果が達成される。抗ムスカリン剤（例えばアトロピン）とＮＳＡＩＤ（例えばケトロラク）の組合せを含有する医薬組成物から観察される相乗作用により、近視の有効治療が提供され、その中、各別の抗軟骨形成剤が単剤療法に使用される時、１個ひいては全ての抗軟骨形成剤の比較的低い投与量では、治療効果が不十分になる。
【００３１】
本文で提供される実施例の方法によって投与される医薬組成物は、容易に薬物上受容可能な担体と定式化、調製又は投与される。このような製剤は、様々な技術によって調製される。このような技術は、医薬組成物の活性成分（ＮＳＡＩＤ又は抗ムスカリン剤など）を、好適な担体と結合することを含む。一実施例において、医薬組成物は、医薬組成物の活性成分を、液体担体と、固体担体と、若しくは両方と結合することによって調製される。
【００３２】
医薬組成物は、水相懸濁液、乳化油、油中水型乳剤と水中油中水型乳剤に投与され、或いはクリーム剤、ゲル、リポソーム（中性、アニオン性又はカチオン性）、脂質ナノ球体又は微小球、中性の、アニオン性又はカチオン性重合体ナノ粒子又は微粒子、部位特異的エマルジョン、長期滞留エマルジョン、粘着性エマルジョン、ミクロエマルジョン、ナノエマルジョン、微小球、ナノ球体、ナノ粒子とミニポンプを含む担体に投与されるが、この限りではない、また、アニオン性、中性の又はカチオン性多糖と、アニオン性、中性の又はカチオン性重合体又は共重合体とを含む医薬組成物の持続性放出を許容し得る様々な天然又は合成重合体と一緒に投与され、組成物の吐出口付近に植え込まれるミニポンプ又は重合体が必要である。本文で提供される医薬組成物は、抗酸化物質、緩衝剤、静菌剤、懸濁剤、増ちょう剤、防腐剤、共溶剤と増粘剤又はその他の治療成分を選択的に含んでもよい。担体とその他の治療成分は、その他の組成成分と適合する意味上では受容可能であるべきで、かつその受容者に対して害をなさないことである。眼科製剤に対して好適な防腐剤は、ベンザルコニウムクロリド、チメロサール、クロロブタノール、メチルパラベン、プロピルパラベン、フェニルエチルアルコール、エデト酸二ナトリウム、ソルビン酸、オナマーＭ又はその他の当業者既知の薬剤を含む。一実施例において、０．００４％から０．０２％レベルの防腐剤が採用される。
【００３３】
非水担体の投与について、ここで提供される医薬組成物の活性成分は、鉱物油と、又は限定されないが、ジグリセリド、トリグリセリド、リン脂質、脂質、油及びその混合物などの中性油と乳化してもよく、その中、油は、多価不飽和及び飽和脂肪酸の適切な混合物を含む。範例としては、大豆油、菜種油、パーム油、オリーブ油とｍｙｇｌｙｏｌを含むが、この限りではなく、その中、脂肪酸炭素の数は１２と２２との間にあり、かつその中の前記脂肪酸は飽和であってもよく、不飽和であってもよい。また、荷電した脂質又はリン脂質を中性油中に懸濁することができる。好適なリン脂質は、マクロファージ上の個体を標的とするホスファチジルセリンであるが、この限りではない。ここで提供される医薬組成物は、選択的に既知技術を使用することができ、水を媒介として作製されてもよく、乳剤に作製されてもよい。
【００３４】
医薬組成物が有効量投与されることで、目の軟骨形成蛋白質を低下させ、強膜の軟骨形成を減少させ、軟骨形成が誘発する癌又は投与が誘発する近視のヒトを含む動物内の治療反応を減少させる。投与される医薬組成物の投与量は、治療される状況の深刻さ、特定処方、及び受容者の体重と一般的な状況及び投与規則のようなその他の臨床要素に左右されて決定されるものである。一実施例において、投与される医薬組成物の量は、約０．００１％から約１％重量のアトロピンに対応する。別の実施例において、投与される医薬組成物の量は、約０．００５％、０．０１％、０．０１５％、０．０２％、０．０２５％、０．０３％、０．０３５％、０．０４％、０．０４５％、０．０５％、０．０５５％、０．０６％、０．０６５％、０．０７％、０．０７５％、０．０８％、０．０８５％、０．０９％、０．０９５％、０．１％重量のアトロピンに対応し、又は０．００１％と１％との間に０．００１％ずつ増量する如何なるパーセントに対応する。別の実施例において、投与される医薬組成物の量は、約０．０５％から約１％重量のケトロラクに対応する。別の実施例において、投与される医薬組成物の量は、約０．１％、０．２％、０．２５％、０．３％、０．３５％、０．４％、０．４５％、０．５％、０．５５％、０．６％、０．６５％、０．７％、０．７５％、０．８％、０．８５％、０．９％、０．９５％重量のケトロラクに対応し、又は０．０１％ずつ増量する如何なるパーセントに対応する。別の実施例において、投与される医薬組成物の量は、約０．５％重量のケトロラクに対応する。別の実施例において、投与される医薬組成物の量は、約０．０１％、０．０２５％、０．０５％、０．１％、０．１５％から約０．２％重量のジクロフェナクに対応し、又は０．０１％ずつ増量する如何なるパーセントに対応する。ここで提供される医薬組成物の有効投与量は、動物モードにおいてその体外活性と体内活性を比較することによって決定される。マウス及びその他の動物から、ヒト内の有効投与量への外挿法に用いられる方法が当該分野に既知であり、例えばＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，９３８，９４９を参照し、それを本明細書中で参考として援用される。
【００３５】
ここで提供される方法によれば、医薬組成物は、注射（例えば皮下、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮内、ガラス体内）、皮膚的、経皮的、経真皮的（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、経口（例えば錠剤、丸薬、薬液、食用フィルムストリップ）、植込式浸透圧ポンプ、坐剤、エアゾールスプレー、局所、関節内、眼、鼻吸収、肺吸収、皮膚への圧入及び電気穿孔法を含むが、この限りではない如何なる様々な経路により伝達される。一実施例において、本発明の医薬組成物は、好適な眼科用器具内の溶液として投与される。
【００３６】
目の局所的投与に用いられる医薬組成物の形成において、前記組合せは、ｐＨ４．５から８．０、例えば約６．９の水中に、０．００１％から約０．００５％重量のアトロピンと０．１％から約０．５％重量のケトロラクとを含む水溶液である。溶液を１日1回、１滴を眼に点眼して局所的投薬することを推奨する。
【００３７】
治療する疾患に適合する時間サイクルの全期間にわたって、医薬組成物は、単剤療法又は多剤併用療法を行うように投与される。医薬組成物は、例えば少なくとも３ヶ月、少なくとも１年、又は近視の症状と兆候が解消するまでのサイクルの全期間にわたって、１日1回、１日２回、１日３回、２日１回、３日１回又は１週１回などの好適な期間ごとに投与される。
【００３８】
（強膜の軟骨形成を低減させるための方法）
目の軟骨形成蛋白質及び／又は目の炎症マーカーのダウンレギュレーションで強膜の軟骨形成を低下させる。
【００３９】
一実施例において、１つ又は複数の抗軟骨形成剤、或いはここに記述する医薬組成物の有効量の使用は、必要とする個体内での１つ又は複数の目の軟骨形成蛋白質の量を変化又は低下させることができる。
【００４０】
目の軟骨形成蛋白質の一実例がＴＧＦ−βである。一実施例において、ＴＧＦ−βはＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２とＴＧＦ−β３からなる群から選ばれ、いずれも主に脈絡膜内に位置する。目の軟骨形成蛋白質の別の範例がα−ＳＭＡである。目の軟骨形成蛋白質の別の範例がＣｏｌ２である。α−ＳＭＡとＣｏｌ２は主に強膜内に位置する。
【００４１】
別の実施例において、本発明は、必要とする個体内に炎症で誘発された軟骨形成を低減させるための１つ又は複数の抗軟骨形成剤、或いはここに記述する医薬組成物の有効量の使用を提供する。強膜の軟骨形成を誘発する炎症マーカーは、ＩＬ−６とＴＮＦ−αを含むが、この限りではない。
【００４２】
別の実施例において、本発明は、必要とする個体内に強膜の軟骨形成を低減させるための１つ又は複数の抗軟骨形成剤を提供し、或いはここに記述する医薬組成物を必要とする個体内に有効量使用する。
【００４３】
抗軟骨形成剤は、併用して又は非併用で投与される。
【００４４】
（近視の深刻さを治療又は低減する方法）
特定理論に束縛されるものではないが、眼の炎症マーカーと目の軟骨形成蛋白質は、ＴＧＦ−β、α−ＳＭＡ及びＣｏｌ２などの発現プロファイルによって、強膜の軟骨形成と近視に関連すると考えられる。限定されない例として、図１は、近視発展のメカニズムを示し、その中、脈絡膜内にＴＧＦ−βと炎症マーカー（ＩＬ−６とＴＮＦ−αなど）のレベルが増加することで、強膜内のα−ＳＭＡとＣｏｌ２の形成及び強膜の軟骨形成が引き起こされる。強膜は、引き続き膜再成形と延長に伴って、近視の悪化が進んでいく。
【００４５】
本発明は、近視の深刻さを治療又は低減させるための方法を提供し、それは有効量の１つ又は複数の的抗軟骨形成剤、或いはここに記述する医薬組成物を、近視治療を必要とする近視個体に投与することによる方法である。抗軟骨形成剤は、併用して又は非併用で投薬される。この方法は、研究方法及び使用も含み、個体内の近視進行程度を抑制させる体外と体内の治療方法を含む。
【００４６】
一実施例において、近視を治療するための方法は、抗ムスカリン剤に対して副作用が現れる近視個体を鑑別すると共に、有効量のＮＳＡＩＤで当該個体を治療し、また抗ムスカリン剤なし、又は低投与量の抗ムスカリン剤（例えばアトロピンの０．０５％）で当該個体を治療する。
【００４７】
本発明の実施例は、下記の範例によっても説明され、それは如何なる形式でもその範疇に何らかの制限を加えると解釈されるべきではない。下記の範例に述べる研究において、別途説明されない限り、慣習的手順に従うべきである。いくつの手順は、説明の目的で下文に記述する。
【００４８】
（範例に用いられる材料と方法の記述）
マウス：下記の範例において、Ｃ５７ＢＬ／６野生型雄性マウス（ジャクソン実験室（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ））を使用する。全ての手順は、機構ＩＡＣＵＣによって承認された協定及び眼科と視覚研究における動物の使用に関するＡＲＶＯ声明（Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌｓ ｉｎ Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ ａｎｄ  Ｖｉｓｕａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）に従って実行される。
【００４９】
強膜幹細胞／前駆細胞（ＳＳＰＣｓ）の分離と培養：
前述の通り、ＣＬ・蔡氏等（ＣＬ Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ）が記述する（＜ネズミの強膜での多能性幹細胞／前駆細胞の同定＞，調査眼科と視覚科学定期刊行物；５２：５４８１−５４８７，２０１１年，（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ／ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｍｕｒｉｎｅ ｓｃｌｅｒａ．Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ５２：５４８１−５４８７，２０１１））のように、ＳＳＰＣｓが分離かつ培養される。簡単に言えば、マウス由来の強膜を取得し、かつ解剖顕微鏡下に強膜を、リンバス（ｌｉｍｂｕｓ）と視神経円板（ｏｐｔｉｃ ｄｉｓｃ）とから慎重に切り離す。網膜と脈絡膜組織が除去された後、強膜組織を小切れに切り分け、かつ１．５ｍｇ／ｍｌ第１型コラゲナーゼ（ワージントン・バイオケミカル社，レイクウッド，米国（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｌａｋｅｗｏｏｄ，ＵＳＡ））と、２ｍｇ／ｍｌの中性ディスパーゼ（ｄｉｓｐａｓｅ）（ロシュ製薬会社，バーゼル，スイス（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））とにより、ＰＢＳ中にて、摂氏３７℃下で１時間分解して個々の細胞を放出させる。個々の細胞は、α−ＭＥＭ（インビトロゲン社，カールスバド，米国（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＵＳＡ））内にて、２０％多選択（ｌｏｔ−ｓｅｌｅｃｔｅｄ）ＦＢＳ（イクイテク・バイオ，カービル，米国（Ｅｑｕｉｔｅｃｈ−Ｂｉｏ，Ｋｅｒｒｖｉｌｌｅ，ＵＳＡ））、グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシンと１００ｍＭ２−メルカプトエタノール（インビトロゲン社）の補助により、５％ＣＯ２にて、摂氏３７℃下で８から１０日間培養した。
【００５０】
ＴＧＦ−β処置：
異なる濃度のＴＧＦ−βをＳＳＰＣｓの１２ウェルプレート内に加える。２４時間後、ＳＳＰＣｓの形態画像を記録する。さらなる分析をするために、総ＲＮＡを抽出する。免疫蛍光法測定に用いられるチャンバースライド（ｃｈａｍｂｅｒ ｓｌｉｄｅ）の培養は、同一条件下で実行される。
【００５１】
軟骨細胞分化の誘導：
半合流点において、ペレットを取得するために、２ｍｌ成長培養基内に２×１０５個細胞のアリコートを１０分間、５００ｇ遠心沈殿させるように、ＳＳＰＣｓがトリプシン処理され、かつ計数された。ペレットは、３７℃、５％より低いＣＯ２下で培養した。１２から２４時間の培養期間において、細胞が管壁に付着せずに本質的に球状の集合体に形成された。培養基に１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β２が加わって、培養基を２から３日ごとに交換する。４週目にペレットが収集された。その後、前記ペレットをＰＢＳ中で２回洗浄して、室温下で４％パラホルムアルデヒドに３時間固定し、パラフィン包埋のために準備した。免疫組織化学法に用いられる８μｍ厚さの切片を取得した。
【００５２】
免疫組織化学と免疫蛍光研究：
α−ＳＭＡ蛋白質とＣｏｌ２の軟骨形成期間での存在を証明するための免疫組織化学と免疫蛍光研究が行われた。免疫組織化学により、パラフィン切片を、２０％ブロッキング用ヤギ血清（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｇｏａｔ ｓｅｒｕｍ）によって３０分間処置し、それから一次抗体によって３７℃で一晩培養し、この一次抗体は、１：２００に希釈するウサギＩｇＧ抗ＳＭＡｍＡｂ（アブカム社，テメキュラ，カリフォルニア州（Ａｂｃａｍ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ））と、１：１００に希釈するマウスのＩｇＧ２ａ抗II型コラーゲン（ａｎｔｉ−ｔｙｐｅ ＩＩ ｃｏｌｌａｇｅｎ）ｍＡｂｂ（アブカム社，テメキュラ，カリフォルニア州）である。前記切片は、それから１：２００にするホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−結合した二次抗体（サンタクルーズバイオテクノロジー社，サンタクルーズ，カリフォルニア州（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ））によって１時間処置した。前記ＤＡＢ試剤（ジアミノベンジジン四塩酸塩，ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）を引き続いて使用して免疫活性を検出する。免疫蛍光により、クリオスタット切片と、再水和パラフィン切片とをブロッキング用血清によって処置し、一次抗体で培養し、対応のフルオレセイン・イソチオシアネート−結合した二次抗体と反応させ、最後に蛍光顕微鏡で評価した。
【００５３】
リアルタイムＰＣＲ：
製造業者のプロトコルにより、Ｔｒｉｚｏｌ（インビトロゲン社，カールスバド，カリフォルニア州）を使用してそれぞれの眼のＳＳＰＣｓ又は脈絡膜組織由来の総ＲＮＡを単離した。製造業者の指示に従い、定量のＲＴ−ＰＣＲ分析は、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ付きのｉＳｃｒｉｐｔ Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲキット（バイオ・ラッド，ヘラクレス，米国（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＵＳＡ））をＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７９００ ＨＴ配列検出システム（アプライドバイオシステムズ社，フォスターシティ，米国（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＵＳＡ））に使用して行われた。実験に用いられたプライマーは次の通りである：α−ＳＭＡ（順方向プライマー：５′−ＡＴＧＣＣＴＣＴＧＧＡＣＧＴＡＣＡＡＣＴＧ−３′，逆方向プライマー：５′−ＣＧＧＣＡＧＴＡＧＴＣＡＣＧＡＡＧＧＡＡＴ−３′）、Ｃｏｌ２（順方向プライマー：５′−ＧＴＣＣＴＴＣＴＧＧＣＣＣＴＡＧＡＧＧＴ−３′，逆方向プライマー：５′−ＴＧＴＴＴＣＴＣＣＴＧＡＧＣＧＴＣＣＡ−３′）、β−ａｃｔｉｎ（順方向プライマー：５′−ＣＡＴＴＧＣＴＧＡＣＡＧＧＡＴＧＣＡＧＡ−３′，逆方向プライマー：５′− ＣＴＧＡＴＣＣＡＣＡＴＣＴＧＣＴＧＧＡＡ−３′）およびグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，ＧＡＰＤＨ）（順方向プライマー：５′−ＡＡＣＴＴＴＧＧＣＡＴＴＧＴＧＧＡＡＧＧ−３′，逆方向プライマー：５′−ＡＣＡＣＡＴＴＧＧＧＧＧＴＡＧＧＡＡＣＡ−３′）。ＧＡＰＤＨとβ−ａｃｔｉｎを対照群とした。対照群ジーンのＣｔ値は、α−ＳＭＡとＣｏｌ２のそれらから減算して半定量分析を提供し、かつ処置なしに対する倍率変化を評価した。
【００５４】
マウスの剥奪性近視：
実験当日（出生後日数［Ｐ］２１〜２４）に、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスがケタミン（ｋｅｔａｍｉｎｅ）（９０ｍｇ／ｋｇ）と、キシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）との腹腔内注射によって麻酔され、ディフューザアイパッチ（ｄｉｆｆｕｓｅｒ ｅｙｅ ｐａｔｃｈ）が右眼の周囲の皮膚に縫合された一方、左眼を対照群とした。半球状プラスチックのディフューザアイパッチは、０．５ｍＬＰＣＲプラスチック管のキャップで作製された。マウスは、温暖パッド上に完全に動き回れるまでに回復され、かつ監視された。剥奪性近視のマウスは、透明のプラスチックケージ内に安置され、１２時間光照射（２００±１５ ｌｕｘ水平照度）と１２時間暗所とのサイクルで２１日間続けた。形態剥奪性近視誘発の前と後、スペクトルドメインの光干渉断層撮影は、目の生物測定に用いられた。
【００５５】
ウエスタンブロット分析：
強膜由来の総蛋白質は、ＲＩＰＡ蛋白質抽出緩衝剤を使用して抽出された。強膜組織の均質化後、サンプルを遠心分離して上澄液を収集した。各サンプルの蛋白質濃度は、ＢＣＡＴＭ蛋白質定量キット（バイオ・ラッド）を使用して測定した。強膜の蛋白質サンプルを正規化し、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに電気泳動し、それからポリビニルデンフルオロエチレン転写メンブレン（Ｉｍｍｕｎ−Ｂｌｏｔ（登録商標） ＰＶＤＦ Ｍｅｍｂｒａｎｅ，バイオ・ラッド）に２１Ｖで１時間転写した。メンブレンは、５％ドライミルクと０．１％ツイーンを含むＰＢＳに室温下で１時間阻害し、それから一次抗体によって４℃で一晩培養した。メンブレンを洗浄して、１：１０，０００にするヤギ抗マウス、又は抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）に結合したホースラディッシュペルオキシダーゼによって室温下で１時間培養して、再び洗浄した。メンブレンは、試剤Ｌｕｍｉｇｅｎ ＴＭＡ−６（ＧＥ ヘルスケア イギリス リミテッド，バッキンガムシャー，イギリス（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＵＫ ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ））によって化学発光され、画像は、ＬＡＳ−４０００撮像システム（富士フイルム，東京，日本（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ））によって捕捉された。蛋白質バンドは、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して定量化された。
【００５６】
（統計分析）
体外研究について、統計的有意性は、ＡＮＯＶＡ検定とボンフェローニ事後比較検定（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ ｐｏｓｔ ｈｏｃ ｔｅｓｔ）によって算出される。体内研究について、統計的有意性は、平方偏差分析（対応のある標本ｔ検定（ｔｈｅ ｐａｉｒｅｄ ｔ−ｔｅｓｔ））によって算出される。統計的有意性としては、ｐ値が０．０５より小さいと定義される。
（実施例）
【実施例１】
【００５７】
（ＴＧＦ−β処置後のＳＳＰＣの形態変化）
ＴＧＦ−β処置後のＳＳＰＣの形態変化の体外研究が行われた。ＳＳＰＣは、前述のように、ＴＧＦ−β２処置（０．１−１０ｎｇ／ｍｌ）で２４時間培養した。顕微鏡研究により、ＴＧＦ−β２処置なし、又は低濃度（０．１ｎｇ／ｍｌ）のＴＧＦ−β２処置では、多数のＳＳＰＣｓが薄い紡錘形状で、拡幅表現型が示されたことを示す。ほかに、ＳＳＰＣｓの細胞骨格線維が目立たなかった。より高い濃度のＴＧＦ−β２（１から１０ｎｇ／ｍｌ）の曝露において、ＳＳＰＣｓが幅広くなると共に、目立つ細胞骨格線維を有する。免疫蛍光顕微鏡により、１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β２で処置した後、α−ＳＭＡ陽性のＳＳＰＣｓ（目立つ細胞内のα−ＳＭＡ線維染色を有する）の数量が増加することを示した。
【実施例２】
【００５８】
（α−ＳＭＡとＣｏｌ２発現に対するＴＧＦ−β処置の効果）
ＳＳＰＣとＳＳＰＣ的３−Ｄペレットを使用してα−ＳＭＡとＣｏｌ２発現に対するＴＧＦ−β処置の効果の体外研究を実行する。ＳＳＰＣとＳＳＰＣ的３−Ｄペレットは、前述のように、ＴＧＦ−β２の様々な濃度によって処置される。
【００５９】
０．１から１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β２で２４時間処置後、α−ＳＭＡとＣｏｌ２ジーン発現に何かの変化があるかどうかを決定するために、総ｍＲＮＡを分析する。図２は、定量のＲＴ−ＰＣＲ分析を使用して投与量に依存するＴＧＦ−β２処置後のα−ＳＭＡとＣｏｌ２ジーン発現に統計的に顕著な増加を示す（それぞれｐ＜０．０００１及び＝０．０１１とする）。
【００６０】
ＳＳＰＣのペレットは、対照群の培養基に４週間培養し、かつ培養基は、１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β２（ＴＭ−ペレット）を含有する。組織学的分析により、最多数のＳＳＰＣがＴＭ−ペレット内の中間基質組織を囲む中央周辺と周辺領域に位置したことを示した。免疫組織化学分析により、Ｃｏｌ２がＴＭ−ペレットの中央周辺領域である局所に発現された一方、α−ＳＭＡが特に中央周辺領域と周辺領域のＴＭ−ペレット内により広範に発現されたことを示した。反対に、Ｃｏｌ２とα−ＳＭＡの発現が対照群よりも少ない。
【実施例３】
【００６１】
（ＦＤＭマウスの強膜内でのＣｏｌ２とα−ＳＭＡの発現）
ＦＤＭマウスを使用して強膜内でのＣｏｌ２とα−ＳＭＡの発現を評価する体内研究が評価された。ＦＤＭは、前述のように、マウスの右眼内に導入され、かつ左眼を対照群とした。各マウスの両眼の間に眼軸長の差は、開始時に著しくなかった（ｐ＝０．３７８）。２１日目、形態剥奪性眼は、眼軸長３０５５±３９μｍの近視を有し、その眼軸長は対側の対照群の眼よりも著しく長い（３０１５±４０μｍ，ｐ＜０．００１）。
【００６２】
図３は、視覚剥奪の２１日後、ウエスタンブロット分析を使用してＦＤＭ眼の強膜内、Ｃｏｌ２とα−ＳＭＡの発現がより高いことを示す。図３Ａブロック及びＢブロックが、ＦＤＭ眼内でのＣｏｌ２とα−ＳＭＡの発現が同じマウスの対側の対照群の眼（Ｃｏｌ２に対するｐ＝０．０２１、かつα−ＳＭＡに対するｐ＝０．０４２）よりも明らかに高いことを示す。免疫染色には、ＦＤＭ眼内の強膜領域でのＣｏｌ２の発現が対照群の眼内よりも高い一方、対照群の眼に比べてα−ＳＭＡの発現がＦＤＭ眼内の強膜領域（脈絡膜に近接する側）と脈絡膜領域の方が大きい。
【実施例４】
【００６３】
（ＦＤＭマウスの脈絡膜内でのＴＧＦ−βｍＲＮＡの発現）
ＦＤＭマウスを使用して、脈絡膜内でのＴＧＦ−βの発現を評価する体内研究を実行する。ＦＤＭは、前述のようにマウスに導入される。
【００６４】
ＦＤＭマウスの脈絡膜内でのＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２とＴＧＦ−β３ｍＲＮＡの相対発現が対側の対照群の脈絡膜よりも明らかに高い（２．９８、４．４４と３．８６の倍率変化は、それぞれがｐ＝０．０４２、０．０４５と０．０４１、図４）。
【実施例５】
【００６５】
（Ｃｏｌ２とα−ＳＭＡ発現に対する抗ムスカリン剤とＮＳＡＩＤの効果）
ヒトのＳＳＰＣを使用して抗ムスカリン剤とＮＳＡＩＤによるＣｏｌ２とα−ＳＭＡ発現に対する効果を検証する体内研究を実行する。ＳＳＰＣｓは、前述のように、１ｍＭアトロピン、５ｍＭケトロラクと１ｍＭジクロフェナクで、ＴＧＦ−β２（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下にて、処置される。
【００６６】
図５Ａブロック及び図５Ｂブロックは、ＴＧＦ−β２の存在下にて、Ｃｏｌ２とα−ＳＭＡの発現がアトロピン、ケトロラクとジクロフェナクによって抑制される。
【実施例６】
【００６７】
（抗ムスカリン剤とＮＳＡＩＤとを含有する医薬組成物で治療する近視個体）
アトロピン、及びアトロピンとケトロラクとを含む医薬組成物を使用して、１１名の近視患者の臨床研究を行う。
【００６８】
１１名の近視患者に、アトロピンを少なくとも１年受け、そのアトロピンの投与量範囲は、単位投与量当り（約０．０５から０．５ｍｌ）に０．００５％から１％重量のアトロピンである。各影響された眼に夜に１滴（約０．０５から０．５ｍｌ）のアトロピン眼薬水が与えられた。アトロピンの治療期間に、これらの１１名の近視患者の平均近視進行速度が−０．９ジオプトリー／年まで低下した。
【００６９】
その後、これらの１１名の近視患者に、アトロピンとケトロラクとを含有する医薬組成物を少なくとも３ヶ月受けた。アトロピンの投与量範囲は、単位投与量当り（約０．０５から０．５ｍｌ）に約０．００５％から約１％重量のアトロピンであり、ケトロラクの投与量範囲は、単位投与量当り（０．５ｍｌ）に約０．２５％から約０．５％重量のケトロラクである。各影響された眼に夜に１滴（約０．０５から０．５ｍｌ）のアトロピンとケトロラクとを組合せた眼薬水が与えられた。アトロピンとケトロラクとを組合せた治療期間に、これらの１１名の近視患者の平均近視進行速度が−０．３８ジオプトリー／年まで低下した（図６）。
【実施例７】
【００７０】
（ＮＳＡＩＤで治療する近視個体）
近視患者は、アトロピンの副作用に耐えなくてもよく、かつ与えられるＮＳＡＩＤでその方の近視を治療する。ケトロラクの投与量が単位投与量当り（約０．０５から０．５ｍｌ）に約０．５％重量のケトロラクで、かつ影響された眼に夜に１滴（約０．０５から０．５ｍｌ）のケトロラク眼薬水が与えられる。
【００７１】
この患者の平均近視進行速度としては、如何なる治療も受けていなければ、右眼が毎年−０．７８ジオプトリーで、左眼が毎年−０．９１ジオプトリーである。ＮＳＡＩＤで３ヶ月治療した後、両眼はいずれも近視進行が見られない（図７）。
【実施例８】
【００７２】
（ＦＤＭマウスの脈絡膜内の炎症マーカーの発現）
ＦＤＭマウスを使用して、脈絡膜内での炎症マーカーの発現を評定する体内研究を評価する。ＦＤＭが前述のように、マウスの右眼かつ左眼に導入されて対照群とした。
【００７３】
図８Ａは、リアルタイムＰＣＲにより、ＩＬ−６がＦＤＭ眼の脈絡膜内でのレベルが対照群の眼よりも高いことを示している。図８Ｂは、リアルタイムＰＣＲにより、ＴＮＦ−αがＦＤＭ眼の脈絡膜内でのレベルが対照群の眼よりも高いことを示している。ＴＮＦ−αのレベルは、ケトロラク眼薬水をＦＤＭ眼に毎日１滴ずつ投与することによって抑制される。
【実施例９】
【００７４】
（アトロピンとケトロラクとを含有する医薬組成物でＳＳＰＣに対して処置することによるα−ＳＭＡとＣｏｌ２の低下）
ＳＳＰＣを使用して、アトロピンとケトロラクとを含有する医薬組成物が、α−ＳＭＡとＣｏｌ２発現に対する効果の体内研究を実行する。ＳＳＰＣｓが１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β２で処置されることを前述のようにする。
【００７５】
図９Ａは、ＴＧＦ−β２（Ｔ２）の存在下にて、α−ＳＭＡの発現が増加するが、ＴＧＦ−β２（Ｔ２）の存在下にて、０．５ｍＭアトロピン（Ａ）、０．２５ｍＭのケトロラク（Ｘ１）、及びアトロピンとケトロラクとを含有する医薬組成物があれば、α−ＳＭＡの発現が低下することを示している。
【００７６】
図９Ｂは、ＴＧＦ−β２（Ｔ２）の存在下にて、Ｃｏｌ２の発現が増加するが、ＴＧＦ−β２（Ｔ２）の存在下にて、０．５ｍＭアトロピン（Ａ）、０．２５ｍＭのケトロラク（Ｘ１）、及びアトロピンとケトロラクとを含有する医薬組成物があれば、Ｃｏｌ２の発現が低下することを示している。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
結果は、アトロピンとケトロラクとを含有する医薬組成物が、α−ＳＭＡとＣｏｌ２の低下に対して相乗効果を有することを示している。
【図１】
2018008991.tif 000003
【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
2018008991.tif 000009
【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年9月1日(2017.9.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
０．００１％から１％重量のアトロピン；および
０．０１％から１％重量の非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）を含み、
前記非ステロイド性抗炎症薬がジクロフェナク、インドメタシン、ブロムフェナク、ネパフェナク、フルルビプロフェンまたはそれらの組合せから選ばれる、近視治療用医薬組成物。
【請求項２】
前記アトロピンが約０．００５％から約０．０５％重量のアトロピンである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記非ステロイド性抗炎症薬が約０．０１％から約０．２％重量のジクロフェナクを含む、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
近視個体における近視を治療する医薬組成物を製造するための非ステロイド性抗炎症薬の有効量の使用。
【請求項５】
前記非ステロイド性抗炎症薬がケトロラク、ジクロフェナク、インドメタシン、ブロムフェナク、ネパフェナク、フルルビプロフェンまたはそれらの組合せから選ばれる、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記前記非ステロイド性抗炎症薬が約０．０５％から約１％重量のケトロラクである、請求項４または５に記載の使用。
【請求項７】
前記非ステロイド性抗炎症薬が約０．０１％から約０．２％重量のジクロフェナクを含む、請求項４に記載の使用。
【請求項８】
アトロピンをさらに含む、請求項４に記載の使用。
【請求項９】
前記アトロピンが約０．００１％から約１％重量のアトロピンである、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
前記アトロピンが約０．００５％から約０．０５％重量のアトロピンである、請求項８に記載の使用。
【請求項１１】
個体における軟骨形成を減少させる医薬組成物を製造するための非ステロイド性抗炎症薬の有効量の使用。
【請求項１２】
前記非ステロイド性抗炎症薬がケトロラク、ジクロフェナク、インドメタシン、ブロムフェナク、ネパフェナク、フルルビプロフェンまたはそれらの組合せから選ばれる、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
個体における軟骨形成を減少させる医薬組成物を製造するためのアトロピンの有効量の使用。
【外国語明細書】
2018008991000001.pdf
2018008991000002.pdf
2018008991000003.pdf
2018008991000004.pdf