(57)【要約】【課題】本発明は、大腸癌を迅速かつ正確に検出することが可能なマーカーを提供すること等を課題とする。また、本発明は、大腸癌を治療及び／又は予防するための医薬組成物を提供すること等を課題とする。【解決手段】本発明は、融合遺伝子又は該融合遺伝子によりコードされるポリペプチドからなる大腸癌検出用マーカー、該大腸癌検出用マーカーを検出することを含む大腸癌の罹患の有無又は大腸癌の罹患可能性の判別を補助する方法、並びに該融合遺伝子の発現阻害剤又はキナーゼ阻害剤を含む大腸癌を治療及び／又はするための医薬組成物等に関する。【選択図】図１
2018191568.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（i）〜（v）：
（i）任意の遺伝子とINSR遺伝子の融合遺伝子、
（ii）RUFY1遺伝子又はNCOA4遺伝子とRET遺伝子の融合遺伝子、
（iii）KANK1遺伝子又はEML4遺伝子とNTRK3遺伝子の融合遺伝子、
（iv）ARMC10遺伝子、AKAP9遺伝子、AGAP3遺伝子、又はTRIM24遺伝子とBRAF遺伝子の融合遺伝子、及び
（v）LMNA遺伝子又はTPM3遺伝子とNTRK1遺伝子の融合遺伝子、
からなる群より選択される融合遺伝子、又は該融合遺伝子によりコードされるポリペプチドからなる大腸癌検出用マーカー。
【請求項２】
前記INSR遺伝子、RUFY1遺伝子、NCOA4遺伝子、RET遺伝子、KANK1遺伝子、EML4遺伝子、NTRK3遺伝子、AMRC10遺伝子、AKAP9遺伝子、AGAP3遺伝子、TRIM24遺伝子、BRAF遺伝子、LMNA遺伝子、TPM3遺伝子、及びNTRK1遺伝子が、それぞれ配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、及び30で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、請求項１に記載のマーカー。
【請求項３】
（i）に記載の任意の遺伝子が、配列番号32で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするSLC12A2遺伝子である、請求項１又は２に記載のマーカー。
【請求項４】
（i）に記載の融合遺伝子が、INSR遺伝子由来のキナーゼドメインを含むポリペプチドをコードし、
（ii）に記載の融合遺伝子が、RUFY1遺伝子のコイルドコイルドメイン若しくはその一部又はNCOA4遺伝子由来のコイルドコイルドメイン、及びRET遺伝子由来のキナーゼドメインを含むポリペプチドをコードし、
（iii）に記載の融合遺伝子が、KANK1遺伝子又はEML4遺伝子由来のコイルドコイルドメイン、及びNTRK3遺伝子由来のキナーゼドメインを含むポリペプチドをコードし、
（iv）に記載の融合遺伝子が、（a）ARMC10遺伝子由来のARMドメイン、AKAP9遺伝子由来のコイルドコイルドメイン、AGAP3遺伝子由来のPHドメイン、又はTRIM24遺伝子由来のRINGドメイン、及び（b）BRAF遺伝子由来のキナーゼドメインを含むポリペプチドをコードし、
（v）LMNA遺伝子又はTPM3遺伝子由来のコイルドコイルドメインの一部及びNTRK1遺伝子由来のキナーゼドメインを含むポリペプチドをコードする、請求項１〜３のいずれか一項に記載のマーカー。
【請求項５】
（i）において、INSR遺伝子由来のキナーゼドメインが配列番号2の1011〜1286位のアミノ酸配列を含み、
（ii）において、RUFY1遺伝子由来のコイルドコイルドメイン若しくはその一部が配列番号4の321〜374位及び／又は405〜553位のアミノ酸配列を含み、NCOA4遺伝子由来のコイルドコイルドメインが配列番号6の1〜200位のアミノ酸配列を含み、RET遺伝子由来のキナーゼドメインが配列番号8の724〜1016位のアミノ酸配列を含み、
（iii）において、KANK1遺伝子由来のコイルドコイルドメインが配列番号10の258〜316位、361〜395位、及び446〜500位のアミノ酸配列の少なくとも一つを含み、EML4遺伝子由来のコイルドコイルドメインが配列番号12の17〜51位のアミノ酸配列を含み、NTRK3遺伝子由来のキナーゼドメインが配列番号14の538〜825位のアミノ酸配列を含み、
（iv）において、ARMC10遺伝子由来のARMドメインが配列番号16の55〜140位のアミノ酸配列を含み、AKAP9遺伝子由来のコイルドコイルドメインが配列番号18の164〜914位のアミノ酸配列、944〜1022位のアミノ酸配列、1100〜1185位のアミノ酸配列、1253〜1280位のアミノ酸配列、1336〜1392位のアミノ酸配列、1434〜1459位のアミノ酸配列、1585〜1659位のアミノ酸配列、1857〜2455位のアミノ酸配列、2544〜2561位のアミノ酸配列、2603〜2776位のアミノ酸配列、3065〜3092位のアミノ酸配列、3124〜3470位のアミノ酸配列、及び3587〜3689位のアミノ酸配列の少なくとも一つを含み、AGAP3遺伝子由来のPHドメインが配列番号20の404〜465位のアミノ酸配列を含み、TRIM24遺伝子由来のRINGドメインが配列番号22の56〜82位のアミノ酸配列を含み、BRAF遺伝子由来のキナーゼドメインが配列番号24の457〜717位のアミノ酸配列を含み、
（v）において、LMNA遺伝子由来のコイルドコイルドメインが配列番号26の34〜218位及び／又は243〜383位のアミノ酸配列を含み、TPM3遺伝子由来のコイルドコイルドメインの一部が配列番号28の1〜211位のアミノ酸配列を含み、NTRK1遺伝子由来のキナーゼドメインが配列番号30の510〜781位のアミノ酸配列を含む、
請求項４に記載のマーカー。
【請求項６】
任意の遺伝子とINSR遺伝子の融合遺伝子が、配列番号34で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、
RUFY1遺伝子又はNCOA4遺伝子とRET遺伝子の融合遺伝子が、それぞれ配列番号36又は38で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、
KANK1遺伝子又はEML4遺伝子とNTRK3遺伝子の融合遺伝子が、それぞれ配列番号40又は42で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、
ARMC10遺伝子、AKAP9遺伝子、AGAP3遺伝子、又はTRIM24遺伝子とBRAF遺伝子の融合遺伝子が、それぞれ配列番号44、46、48、又は50で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、
LMNA遺伝子又はTPM3遺伝子とNTRK1遺伝子の融合遺伝子が、それぞれ配列番号52又は54で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、請求項５に記載のマーカー。
【請求項７】
大腸癌が、マイクロサテライト不安定性大腸癌である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のマーカー。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のマーカーを検出するための、プライマーセット、プローブ、アプタマー、若しくは抗体、又はこれらの少なくとも一つを含むキット。
【請求項９】
被検体から得られたサンプルにおいて、請求項１〜７のいずれか一項に記載のマーカーを検出する工程を含む、大腸癌の罹患の有無又は大腸癌の罹患可能性の判別を補助する方法。
【請求項１０】
以下の（i）〜（v）：
（i）任意の遺伝子とINSR遺伝子の融合遺伝子、
（ii）RUFY1遺伝子又はNCOA4遺伝子とRET遺伝子の融合遺伝子、
（iii）KANK1遺伝子又はEML4遺伝子とNTRK3遺伝子の融合遺伝子、
（iv）ARMC10遺伝子、AKAP9遺伝子、AGAP3遺伝子、又はTRIM24遺伝子とBRAF遺伝子の融合遺伝子、及び
（v）LMNA遺伝子又はTPM3遺伝子とNTRK1遺伝子の融合遺伝子、
からなる群より選択される融合遺伝子の少なくとも一つを有する被験体の大腸癌を治療するための、前記融合遺伝子の発現阻害剤又はキナーゼ阻害剤を含む医薬組成物であって、
被験体が（i）に記載の融合遺伝子を有する場合、キナーゼ阻害剤はINSR阻害剤であり、
被験体が（ii）に記載の融合遺伝子の少なくとも一つを有する場合、キナーゼ阻害剤はRET阻害剤であり、
被験体が（iii）に記載の融合遺伝子の少なくとも一つを有する場合、キナーゼ阻害剤はNTRK3阻害剤であり、
被験体が（iv）に記載の融合遺伝子の少なくとも一つを有する場合、キナーゼ阻害剤はBRAF阻害剤であり、
被験体が（v）に記載の融合遺伝子の少なくとも一つを有する場合、キナーゼ阻害剤はNTRK1阻害剤である、
前記医薬組成物。
【請求項１１】
前記INSR遺伝子、RUFY1遺伝子、NCOA4遺伝子、RET遺伝子、KANK1遺伝子、EML4遺伝子、NTRK3遺伝子、AMRC10遺伝子、AKAP9遺伝子、AGAP3遺伝子、TRIM24遺伝子、BRAF遺伝子、LMNA遺伝子、TPM3遺伝子、及びNTRK1遺伝子が、それぞれ配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、及び30で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
（i）に記載の任意の遺伝子がSLC12A2遺伝子であり、SLC12A2遺伝子が配列番号32で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、請求項１０又は１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記融合遺伝子の発現阻害剤がRNAi分子であるか、又はキナーゼ阻害剤が、アプタマー、中和抗体、及び低分子化合物からなる群より選択される少なくとも1種の薬剤である、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
配列番号34、36、及び46のいずれかで示されるアミノ酸配列、
配列番号34、36、及び46のいずれかで示されるアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は
配列番号34、36、及び46のいずれかで示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／若しくは置換されたアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項１５】
請求項１４に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大腸癌検出用マーカー、該大腸癌検出用マーカーを検出するための手段、大腸癌の罹患の有無又は大腸癌の罹患可能性の判別を補助する方法、並びに大腸癌を治療及び／又は予防するための医薬組成物等に関する。
【背景技術】
【０００２】
大腸は、ヒトにおいて約1.6mの長さを有する消化管であり、盲腸、直腸、及び結腸の3つの部位に大別される。大腸は、細菌による食物繊維の発酵及び水分の吸収等の機能を担う重要な器官である。日本において大腸癌の患者数は近年増加傾向にあり、2014年時点で大腸癌の患者数は約25万人以上であると推定されており、死亡者数も多いことから大腸癌の迅速かつ正確な検出法、及び効果的な治療方法が切望されている。
【０００３】
大腸癌の主な検査法の一つとして、腫瘍に起因して便中に混入する血液を検出する便潜血反応検査がある。この方法では、血液中に存在するヘモグロビンに対するモノクローナル抗体を利用して、便中に存在する血液の有無を調べる。また、大腸癌の検出には、CEA及びCA19-9等の血中マーカーを用いる方法が報告されている（非特許文献１）。しかしながら、便潜血反応検査及び上記血中マーカーのいずれも、大腸癌の検出感度及び特異性の点で十分と言えるものではなかった。
【０００４】
また、大腸癌のうち約10%が、マイクロサテライトの反復配列に変異が生じているマイクロサテライト不安定性（MSI-H）大腸癌に分類される。マイクロサテライト不安定性大腸癌（MSI-H CRC）は、大腸癌をはじめとする癌の発症リスクを高める遺伝性疾患であるリンチ症候群（LS）と関連しており（非特許文献2）、予後や薬剤感受性等が他の大腸癌と異なることから、その迅速な検出できる方法が求められている。通常、MSIは、PCR法を用いたマイクロサテライトマーカー（BAT25、BAT26、D2S123、D5S346、及びD17S250等）によって検出することができるが（非特許文献3）、この方法は、迅速性の点で十分と言えるものではなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Sisik A. et al., Asian Pac. J. Cancer Prev., 2013, 14(7), pp. 4289-94.
【非特許文献２】Lynch HT. et al., Nat. Rev. Cancer, 2015, pp. 181-194.
【非特許文献３】Boland CR. et al., Cancer Res., 1998, 58, pp. 5248-5257.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、大腸癌を迅速かつ正確に検出することが可能なマーカーを提供すること等を課題とする。また、本発明は、大腸癌を治療及び／又は予防するための医薬組成物を提供すること等を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、大腸癌の検出に用い得る新規な融合遺伝子を見出した。また、当該融合遺伝子を有する細胞に対しキナーゼ阻害剤を加えると過剰な細胞増殖が抑制されることを見出し、本願発明を完成させた。したがって、本発明は以下の態様を包含する。
（１）以下の（i）〜（v）：
（i）任意の遺伝子とINSR遺伝子の融合遺伝子、
（ii）RUFY1遺伝子又はNCOA4遺伝子とRET遺伝子の融合遺伝子、
（iii）KANK1遺伝子又はEML4遺伝子とNTRK3遺伝子の融合遺伝子、
（iv）ARMC10遺伝子、AKAP9遺伝子、AGAP3遺伝子、又はTRIM24遺伝子とBRAF遺伝子の融合遺伝子、及び
（v）LMNA遺伝子又はTPM3遺伝子とNTRK1遺伝子の融合遺伝子、
からなる群より選択される融合遺伝子、又は該融合遺伝子によりコードされるポリペプチドからなる大腸癌検出用マーカー。
（２）前記INSR遺伝子、RUFY1遺伝子、NCOA4遺伝子、RET遺伝子、KANK1遺伝子、EML4遺伝子、NTRK3遺伝子、AMRC10遺伝子、AKAP9遺伝子、AGAP3遺伝子、TRIM24遺伝子、BRAF遺伝子、LMNA遺伝子、TPM3遺伝子、及びNTRK1遺伝子が、それぞれ配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、及び30で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、（１）に記載のマーカー。
（３）（i）に記載の任意の遺伝子が、配列番号32で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするSLC12A2遺伝子である、（１）又は（２）に記載のマーカー。
（４）（i）に記載の融合遺伝子が、INSR遺伝子由来のキナーゼドメインを含むポリペプチドをコードし、
（ii）に記載の融合遺伝子が、RUFY1遺伝子のコイルドコイルドメイン若しくはその一部又はNCOA4遺伝子由来のコイルドコイルドメイン、及びRET遺伝子由来のキナーゼドメインを含むポリペプチドをコードし、
（iii）に記載の融合遺伝子が、KANK1遺伝子又はEML4遺伝子由来のコイルドコイルドメイン、及びNTRK3遺伝子由来のキナーゼドメインを含むポリペプチドをコードし、
（iv）に記載の融合遺伝子が、（a）ARMC10遺伝子由来のARMドメイン、AKAP9遺伝子由来のコイルドコイルドメイン、AGAP3遺伝子由来のPHドメイン、又はTRIM24遺伝子由来のRINGドメイン、及び（b）BRAF遺伝子由来のキナーゼドメインを含むポリペプチドをコードし、
（v）LMNA遺伝子又はTPM3遺伝子由来のコイルドコイルドメインの一部及びNTRK1遺伝子由来のキナーゼドメインを含むポリペプチドをコードする、（１）〜（３）のいずれかに記載のマーカー。
（５）（i）において、INSR遺伝子由来のキナーゼドメインが配列番号2の1011〜1286位のアミノ酸配列を含み、
（ii）において、RUFY1遺伝子由来のコイルドコイルドメイン若しくはその一部が配列番号4の321〜374位及び／又は405〜553位のアミノ酸配列を含み、NCOA4遺伝子由来のコイルドコイルドメインが配列番号6の1〜200位のアミノ酸配列を含み、RET遺伝子由来のキナーゼドメインが配列番号8の724〜1016位のアミノ酸配列を含み、
（iii）において、KANK1遺伝子由来のコイルドコイルドメインが配列番号10の258〜316位、361〜395位、及び446〜500位のアミノ酸配列の少なくとも一つを含み、EML4遺伝子由来のコイルドコイルドメインが配列番号12の17〜51位のアミノ酸配列を含み、NTRK3遺伝子由来のキナーゼドメインが配列番号14の538〜825位のアミノ酸配列を含み、
（iv）において、ARMC10遺伝子由来のARMドメインが配列番号16の55〜140位のアミノ酸配列を含み、AKAP9遺伝子由来のコイルドコイルドメインが配列番号18の164〜914位のアミノ酸配列、944〜1022位のアミノ酸配列、1100〜1185位のアミノ酸配列、1253〜1280位のアミノ酸配列、1336〜1392位のアミノ酸配列、1434〜1459位のアミノ酸配列、1585〜1659位のアミノ酸配列、1857〜2455位のアミノ酸配列、2544〜2561位のアミノ酸配列、2603〜2776位のアミノ酸配列、3065〜3092位のアミノ酸配列、3124〜3470位のアミノ酸配列、及び3587〜3689位のアミノ酸配列の少なくとも一つを含み、AGAP3遺伝子由来のPHドメインが配列番号20の404〜465位のアミノ酸配列を含み、TRIM24遺伝子由来のRINGドメインが配列番号22の56〜82位のアミノ酸配列を含み、BRAF遺伝子由来のキナーゼドメインが配列番号24の457〜717位のアミノ酸配列を含み、
（v）において、LMNA遺伝子由来のコイルドコイルドメインが配列番号26の34〜218位及び／又は243〜383位のアミノ酸配列を含み、TPM3遺伝子由来のコイルドコイルドメインの一部が配列番号28の1〜211位のアミノ酸配列を含み、NTRK1遺伝子由来のキナーゼドメインが配列番号30の510〜781位のアミノ酸配列を含む、
（４）に記載のマーカー。
（６）任意の遺伝子とINSR遺伝子の融合遺伝子が、配列番号34で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、
RUFY1遺伝子又はNCOA4遺伝子とRET遺伝子の融合遺伝子が、それぞれ配列番号36又は38で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、
KANK1遺伝子又はEML4遺伝子とNTRK3遺伝子の融合遺伝子が、それぞれ配列番号40又は42で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、
ARMC10遺伝子、AKAP9遺伝子、AGAP3遺伝子、又はTRIM24遺伝子とBRAF遺伝子の融合遺伝子が、それぞれ配列番号44、46、48、又は50で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、
LMNA遺伝子又はTPM3遺伝子とNTRK1遺伝子の融合遺伝子が、それぞれ配列番号52又は54で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、（５）に記載のマーカー。
（７）大腸癌が、マイクロサテライト不安定性大腸癌である、（１）〜（６）のいずれかに記載のマーカー。
（８）（１）〜（７）のいずれかに記載のマーカーを検出するための、プライマーセット、プローブ、アプタマー、若しくは抗体、又はこれらの少なくとも一つを含むキット。
（９）被検体から得られたサンプルにおいて、（１）〜（７）のいずれかに記載のマーカーを検出する工程を含む、大腸癌の罹患の有無又は大腸癌の罹患可能性の判別を補助する方法。
（１０）以下の（i）〜（v）：
（i）任意の遺伝子とINSR遺伝子の融合遺伝子、
（ii）RUFY1遺伝子又はNCOA4遺伝子とRET遺伝子の融合遺伝子、
（iii）KANK1遺伝子又はEML4遺伝子とNTRK3遺伝子の融合遺伝子、
（iv）ARMC10遺伝子、AKAP9遺伝子、AGAP3遺伝子、又はTRIM24遺伝子とBRAF遺伝子の融合遺伝子、及び
（v）LMNA遺伝子又はTPM3遺伝子とNTRK1遺伝子の融合遺伝子、
からなる群より選択される融合遺伝子の少なくとも一つを有する被験体の大腸癌を治療するための、前記融合遺伝子の発現阻害剤又はキナーゼ阻害剤を含む医薬組成物であって、
被験体が（i）に記載の融合遺伝子を有する場合、キナーゼ阻害剤はINSR阻害剤であり、
被験体が（ii）に記載の融合遺伝子の少なくとも一つを有する場合、キナーゼ阻害剤はRET阻害剤であり、
被験体が（iii）に記載の融合遺伝子の少なくとも一つを有する場合、キナーゼ阻害剤はNTRK3阻害剤であり、
被験体が（iv）に記載の融合遺伝子の少なくとも一つを有する場合、キナーゼ阻害剤はBRAF阻害剤であり、
被験体が（v）に記載の融合遺伝子の少なくとも一つを有する場合、キナーゼ阻害剤はNTRK1阻害剤である、
前記医薬組成物。
（１１）前記INSR遺伝子、RUFY1遺伝子、NCOA4遺伝子、RET遺伝子、KANK1遺伝子、EML4遺伝子、NTRK3遺伝子、AMRC10遺伝子、AKAP9遺伝子、AGAP3遺伝子、TRIM24遺伝子、BRAF遺伝子、LMNA遺伝子、TPM3遺伝子、及びNTRK1遺伝子が、それぞれ配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、及び30で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、（１０）に記載の医薬組成物。
（１２）（i）に記載の任意の遺伝子がSLC12A2遺伝子であり、SLC12A2遺伝子が配列番号32で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、（１０）又は（１１）に記載の医薬組成物。
（１３）前記融合遺伝子の発現阻害剤がRNAi分子であるか、又はキナーゼ阻害剤が、アプタマー、中和抗体、及び低分子化合物からなる群より選択される少なくとも1種の薬剤である、（１０）〜（１２）のいずれかに記載の医薬組成物。
（１４）配列番号34、36、及び46のいずれかで示されるアミノ酸配列、
配列番号34、36、及び46のいずれかで示されるアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は
配列番号34、36、及び46のいずれかで示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／若しくは置換されたアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
（１５）（１４）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、大腸癌を迅速かつ正確に検出することが可能なマーカー等が提供される。また、本発明により、大腸癌を効果的に治療及び／又は予防するための医薬組成物等が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図1は、本願明細書の実施例で見出された融合遺伝子によってコードされるポリペプチドの模式図を示す。融合ポリペプチド中、N末端側のポリペプチドを白色で、C末端側のポリペプチドをドットで示し、各ポリペプチド中のドメインを斜線で示した。図中、SLC12A2-INSRはSLC12A2遺伝子とINSR遺伝子の融合遺伝子によってコードされるポリペプチドを示す。RUFY1-RET及びNCOA4-RETは、それぞれRUFY1遺伝子又はNCOA4とRET遺伝子の融合遺伝子によってコードされるポリペプチドを示す。LMNA-NTRK1及びTPM3-NTRK1は、それぞれLMNA遺伝子又はTPM3遺伝子とNTRK1遺伝子の融合遺伝子によってコードされるポリペプチドを示す。EML4-NTRK3及びKANK1-NTRK3は、それぞれEML4遺伝子又はKANK1遺伝子とNTRK3遺伝子の融合遺伝子によってコードされるポリペプチドを示す。AMRC10-BRAF、AGAP3-BRAF、TRIM24-BRAF、及びAKAP9-BRAFは、それぞれAMRC10遺伝子、AGAP3遺伝子、TRIM24遺伝子、又はAKAP9遺伝子とBRAF遺伝子の融合遺伝子によってコードされるポリペプチドを示す。ポリペプチドの下に示した数字は、融合ポリペプチドを構成する各ポリペプチドの野生型ポリペプチドにおけるアミノ酸位置を指す。CCはコイルドコイルドメインを、ARMはARMドメインを、PHはPHドメインを、キナーゼはタンパク質キナーゼドメインを指す。なお、融合遺伝子によってコードされるポリペプチドには複数のCCドメインを有するものもあるが、図中では便宜的にこれらを一つのCCドメインで示した。
【図２】図2は、実施例で見出された融合ポリペプチドの3T3形質転換アッセイの結果を示す図である。融合遺伝子の表記については図1に準ずる。
【図３】図3は、実施例で見出された融合ポリペプチドを発現させた細胞にキナーゼ阻害剤を添加した際の細胞密度を示す図である。融合遺伝子の表記については図1に準ずる。各融合ポリペプチド中のキナーゼを阻害する薬剤を添加することによって、融合ポリペプチドを発現する3T3細胞の細胞密度が濃度依存的に低減した。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
＜大腸癌検出用マーカー＞
一態様において、本発明は大腸癌検出用マーカーに関する。「大腸癌検出用マーカー」とは、大腸癌を検出するための指標となるバイオマーカーを意味する。被検体由来のサンプル中における大腸癌検出用マーカーの存在を検出することで、その被検体における大腸癌傷害の罹患の有無又は大腸癌の罹患可能性を判別することができる。本明細書において、「被験体」の生物種は、限定しないが、好ましくは哺乳動物、例えばヒト及びチンパンジー等の霊長類、ラット及びマウス等の実験動物、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、及びヤギ等の家畜動物、並びにイヌ及びネコ等の愛玩動物、好ましくはヒトである。
【００１１】
本発明のマーカーによって検出され得る大腸癌は、盲腸癌、結腸癌、及び直腸癌のいずれであってもよい。また、大腸癌は、マイクロサテライト不安定性（MSI-H）大腸癌であってよい。本明細書において、「マイクロサテライト不安定性大腸癌（microsatellite instability-high colorectal cancer：MSI-CRC）」は、ゲノム上の1〜5塩基の反復単位（マイクロサテライト）の長さに変異（マイクロサテライト不安定性：MSI）を有する大腸癌を意味する（Virginia Pinol, JAMA., 2005, 293(16), pp.1986-1994）。一実施形態において、マイクロサテライト不安定性は、BAT25又はBAT426、好ましくはBAT25及びBAT426の両方においてMSIを示す状態として定義される。BAT25及びBAT426は、MSIのマーカーとして汎用されているモノヌクレオチドリピートである。マイクロサテライト不安定性大腸癌は、MMR（mismatch repair:ミスマッチリペア）遺伝子に変異を有するLS（Lynch syndrome：リンチ症候群）サブタイプ、MLH1（mutL homolog 1）遺伝子のプロモーターがメチル化の頻度が高い（例えば、β値＞0.2％）MM（MLH1 methylated：MLH1 メチル化）サブタイプ、MMR遺伝子に変異を有さず、かつMLH1遺伝子のプロモーターもメチル化の頻度も低いLL（Lynch-like：リンチ様）サブタイプにさらに分類され得る。
【００１２】
本発明の大腸癌検出用マーカーは、（i）任意の遺伝子とINSR遺伝子の融合遺伝子、（ii）RUFY1遺伝子又はNCOA4遺伝子とRET遺伝子の融合遺伝子、（iii）KANK1遺伝子又はEML4遺伝子とNTRK3遺伝子の融合遺伝子、（iv）ARMC10遺伝子、AKAP9遺伝子、AGAP3遺伝子、又はTRIM24遺伝子とBRAF遺伝子の融合遺伝子、及び（v）LMNA遺伝子又はTPM3遺伝子とNTRK1遺伝子の融合遺伝子からなる群より選択される融合遺伝子、又は該融合遺伝子によりコードされるポリペプチドからなる。融合遺伝子は、好ましくは上記（i）〜（iii）からなる群より選択され、より好ましくは（i）に記載の融合遺伝子である。
【００１３】
本発明の大腸癌検出用マーカーを構成する融合遺伝子は、原則として、癌化能を有する。癌化能の有無は、本分野で公知の方法により特定することができ、例えば融合遺伝子を適当な細胞（例えば哺乳動物細胞）に導入して増殖させ、フォーカス形成の有無を観察することによって、例えば接触阻害の喪失及び／又は足場非依存的増殖能の獲得を観察することによって決定することができる。癌化能の有無の測定法の詳細については、例えば本明細書の実施例を参照されたい。
【００１４】
本発明の大腸癌検出用マーカーを構成する融合遺伝子、及び融合遺伝子中に含まれる各遺伝子について以下詳細に説明する。
【００１５】
（i）任意の遺伝子とINSR遺伝子の融合遺伝子
一実施形態において、本発明の大腸癌検出用マーカーは、任意の遺伝子とINSR（insulin receptor）遺伝子の融合遺伝子、又は該融合遺伝子によりコードされるポリペプチドからなる。ここで、任意の遺伝子はINSR遺伝子との融合により癌化能を有する融合遺伝子を生じる限り限定しないが、好ましくはSLC12A2（Solute carrier family 12 member 2）遺伝子である。
【００１６】
本明細書において、SLC12A2遺伝子は、好ましくは配列番号31で示されるヒトSLC12A2遺伝子の塩基配列又はその機能的に等価な塩基配列を含むポリヌクレオチドであってよい。また、SLC12A2遺伝子によってコードされるポリペプチドは、配列番号32で示されるヒトSLC12A2タンパク質のアミノ酸配列又はその機能的に等価なアミノ酸配列を含むポリペプチドであってよい。
【００１７】
本明細書において、ある塩基配列と「機能的に等価な塩基配列」とは、その元の塩基配列と同等の生物学的機能を有する塩基配列をいい、例えばその元の塩基配列に対して、例えば80%以上、好ましくは90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、若しくは99%以上の同一性を有する塩基配列、又はその元の塩基配列において1若しくは複数個の塩基が付加、欠失、及び／若しくは置換された塩基配列であってよい。同様に、あるアミノ酸配列と「機能的に等価なアミノ酸配列」とは、その元のアミノ酸配列と同等の生物学的機能を有するアミノ酸配列をいい、例えばその元のアミノ酸配列に対して、例えば80%以上、好ましくは90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、若しくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又はその元のアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／若しくは置換されたアミノ酸配列であってよい。
【００１８】
本明細書において、塩基配列及びアミノ酸配列に関する同一性の値は、複数の配列間の同一性を演算するソフトウェア（例えば、FASTA、DANASYS、及びBLAST）を用いてデフォルトの設定で算出した値を示す。同一性の決定方法の詳細については、例えばAltschul et al., Nuc. Acids. Res. 25, 3389-3402, 1977及びAltschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410, 1990を参照されたい。また、本明細書において、「１若しくは複数個」の範囲は、1から10個、好ましくは1から7個、さらに好ましくは1から5個、特に好ましくは1から3個、あるいは1個又は2個である。
【００１９】
本明細書において、INSR遺伝子は、好ましくは配列番号1で示されるヒトINSR遺伝子の塩基配列又はその機能的に等価な塩基配列を含むポリヌクレオチドであってよい。また、INSR遺伝子によってコードされるポリペプチドは、配列番号2で示されるヒトINSRタンパク質のアミノ酸配列又はその機能的に等価なアミノ酸配列を含むポリペプチドであってよい。
【００２０】
任意の遺伝子とINSR遺伝子の融合遺伝子の融合形態は、癌化能を有する限り限定しないが、SLC12A2遺伝子等の任意の遺伝子によってコードされるポリペプチドのN末端側の配列をN末端側に含み、INSR遺伝子によってコードされるポリペプチドのC末端側の配列をC末端側に含むポリペプチドをコードするものが好ましい。好ましくは、該融合遺伝子は、INSR遺伝子（によってコードされるポリペプチド）由来のキナーゼドメインを含むポリペプチドをコードする。INSR遺伝子由来のキナーゼドメインは、配列番号2の1011〜1286位のアミノ酸配列、又はその機能的に等価なアミノ酸配列を含む。
【００２１】
任意の遺伝子とINSR遺伝子の融合遺伝子は、好ましくは、配列番号33で示されるヒトSLC12A2遺伝子とヒトINSR遺伝子の融合遺伝子の塩基配列、又はその機能的に等価な塩基配列を含むポリヌクレオチドであってよい。任意の遺伝子とINSR遺伝子の融合遺伝子によってコードされるポリペプチドは、配列番号34で示されるアミノ酸配列、又はその機能的に等価なアミノ酸配列を含むポリペプチドであってよい。
【００２２】
例えば、配列番号1、31、又は33で示される塩基配列に機能的に等価な塩基配列は、それぞれ配列番号1、31、又は33で示される塩基配列に対して、例えば80%以上、好ましくは90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、若しくは99%以上の同一性を有する塩基配列、又は配列番号1、31、又は33で示される塩基配列において1若しくは複数個の塩基が付加、欠失、及び／若しくは置換された塩基配列であってよい。また、配列番号2、32、又は34で示されるアミノ酸配列に機能的に等価なアミノ酸配列は、それぞれ配列番号2、32、又は34で示されるアミノ酸配列に対して、例えば80%以上、好ましくは90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、若しくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号2、32、又は34で示されるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／若しくは置換されたアミノ酸配列であってよい。同様に、配列番号2の1011〜1286位のアミノ酸配列に機能的に等価なアミノ酸配列は、配列番号2の1011〜1286位のアミノ酸配列に対して、例えば80%以上、好ましくは90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、若しくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号2の1011〜1286位のアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／若しくは置換されたアミノ酸配列であってよい。
【００２３】
（ii）RUFY1遺伝子又はNCOA4遺伝子とRET遺伝子の融合遺伝子
一実施形態において、本発明の大腸癌検出用マーカーは、RUFY1（RUN and FYVE domain containing 1）遺伝子とRET（又はRET proto-oncogene）遺伝子の融合遺伝子、若しくはNCOA4（nuclear receptor coactivator 4）遺伝子とRET遺伝子の融合遺伝子、又は該融合遺伝子によりコードされるポリペプチドからなる。
【００２４】
本明細書において、RUFY1遺伝子は、好ましくは配列番号3で示されるヒトRUFY1遺伝子の塩基配列又はその機能的に等価な塩基配列を含むポリヌクレオチドであってよい。また、RUFY1遺伝子によってコードされるポリペプチドは、配列番号4で示されるヒトSLC12A2タンパク質のアミノ酸配列又はその機能的に等価なアミノ酸配列を含むポリペプチドであってよい。
【００２５】
本明細書において、NCOA4遺伝子は、好ましくは配列番号5で示されるヒトNCOA4遺伝子の塩基配列又はその機能的に等価な塩基配列を含むポリヌクレオチドであってよい。また、NCOA4遺伝子によってコードされるポリペプチドは、配列番号6で示されるヒトNCOA4タンパク質のアミノ酸配列又はその機能的に等価なアミノ酸配列を含むポリペプチドであってよい。
【００２６】
本明細書において、RET遺伝子は、好ましくは配列番号7で示されるヒトRET遺伝子の塩基配列又はその機能的に等価な塩基配列を含むポリヌクレオチドであってよい。また、RET遺伝子によってコードされるポリペプチドは、配列番号8で示されるヒトRETタンパク質のアミノ酸配列又はその機能的に等価なアミノ酸配列を含むポリペプチドであってよい。
【００２７】
RUFY1遺伝子又はNCOA4遺伝子とRET遺伝子の融合遺伝子の融合形態は、癌化能を有する限り限定しないが、RUFY1遺伝子又はNCOA4遺伝子によってコードされるポリペプチドのN末端側の配列をN末端側に含み、RET遺伝子によってコードされるポリペプチドのC末端側の配列をC末端側に含むポリペプチドをコードするものが好ましい。
【００２８】
該融合遺伝子は、好ましくは、RUFY1遺伝子によってコードされるポリペプチド由来のコイルドコイルドメイン若しくはその一部又はNCOA4遺伝子によってコードされるポリペプチド由来のコイルドコイルドメイン、及びRET遺伝子によってコードされるポリペプチド由来のキナーゼドメインを含むポリペプチドをコードする。RUFY1遺伝子由来のコイルドコイルドメイン若しくはその一部は、例えば配列番号4の321〜374位のアミノ酸配列及び405〜553位のアミノ酸配列の少なくとも一つ、又はその機能的に等価なアミノ酸配列を含む。NCOA4遺伝子由来のコイルドコイルドメインは、例えば配列番号6の1〜200位のアミノ酸配列、又はその機能的に等価なアミノ酸配列を含む。RET遺伝子由来のキナーゼドメインは、例えば配列番号8の724〜1016位のアミノ酸配列、又はその機能的に等価なアミノ酸配列を含む。
【００２９】
RUFY1遺伝子とRET遺伝子の融合遺伝子は、好ましくは、配列番号35で示されるヒトRUFY1遺伝子とヒトRET遺伝子の融合遺伝子の塩基配列、又はその機能的に等価な塩基配列を含むポリヌクレオチドであってよい。RUFY1遺伝子とRET遺伝子の融合遺伝子によってコードされるポリペプチドは、配列番号36で示されるアミノ酸配列、又はその機能的に等価なアミノ酸配列を含むポリペプチドであってよい。
【００３０】
また、NCOA4遺伝子とRET遺伝子の融合遺伝子は、好ましくは、配列番号37で示されるヒトNCOA4遺伝子とヒトRET遺伝子の融合遺伝子の塩基配列、又はその機能的に等価な塩基配列を含むポリヌクレオチドであってよい。NCOA4遺伝子とRET遺伝子の融合遺伝子によってコードされるポリペプチドは、配列番号38で示されるアミノ酸配列、又はその機能的に等価なアミノ酸配列を含むポリペプチドであってよい。
【００３１】
例えば、配列番号3、5、7、35又は37で示される塩基配列に機能的に等価な塩基配列は、それぞれ配列番号3、5、7、35又は37で示される塩基配列に対して、例えば80%以上、好ましくは90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、若しくは99%以上の同一性を有する塩基配列、又は配列番号3、5、7、35又は37で示される塩基配列において1若しくは複数個の塩基が付加、欠失、及び／若しくは置換された塩基配列であってよい。また、配列番号4、6、8、36、又は38で示されるアミノ酸配列に機能的に等価なアミノ酸配列は、それぞれ配列番号4、6、8、36、又は38で示されるアミノ酸配列に対して、例えば80%以上、好ましくは90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、若しくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号4、6、8、36、又は38で示されるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／若しくは置換されたアミノ酸配列であってよい。
【００３２】
同様に、配列番号4の321〜374位のアミノ酸配列、配列番号4の405〜553位のアミノ酸配列、配列番号6の1〜200位のアミノ酸配列、又は配列番号8の724〜1016位のアミノ酸配列に機能的に等価なアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号4の321〜374位のアミノ酸配列、配列番号4の405〜553位のアミノ酸配列、配列番号6の1〜200位のアミノ酸配列、又は配列番号8の724〜1016位のアミノ酸配列に対して、例えば80%以上、好ましくは90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、若しくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号4の321〜374位のアミノ酸配列、配列番号4の405〜553位のアミノ酸配列、配列番号6の1〜200位のアミノ酸配列、又は配列番号8の724〜1016位のアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／若しくは置換されたアミノ酸配列であってよい。
【００３３】
（iii）KANK1遺伝子又はEML4遺伝子とNTRK3遺伝子の融合遺伝子
一実施形態において、本発明の大腸癌検出用マーカーは、KANK1（KN motif and ankyrin repeat domains 1）遺伝子とNTRK3（neurotrophic receptor tyrosine kinase 3）遺伝子の融合遺伝子、若しくはEML4（echinoderm microtubule associated protein like 4）遺伝子とNTRK3遺伝子の融合遺伝子、又は該融合遺伝子によりコードされるポリペプチドからなる。
【００３４】
本明細書において、KANK1遺伝子は、好ましくは配列番号9で示されるヒトKANK1遺伝子の塩基配列、又はその機能的に等価な塩基配列を含むポリヌクレオチドであってよい。また、KANK1遺伝子によってコードされるポリペプチドは、配列番号10で示されるヒトKANK1タンパク質のアミノ酸配列、又はその機能的に等価なアミノ酸配列を含むポリペプチドであってよい。
【００３５】
本明細書において、EML4遺伝子は、好ましくは配列番号11で示されるヒトEML4遺伝子の塩基配列、又はその機能的に等価な塩基配列を含むポリヌクレオチドであってよい。また、EML4遺伝子によってコードされるポリペプチドは、配列番号12で示されるヒトEML4タンパク質のアミノ酸配列、又はその機能的に等価なアミノ酸配列を含むポリペプチドであってよい。
【００３６】
本明細書において、NTRK3遺伝子は、好ましくは配列番号13で示されるヒトNTRK3遺伝子の塩基配列、配列番号13で示される塩基配列に対して、例えば80%以上、好ましくは90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、若しくは99%以上の同一性を有する塩基配列、又はその機能的に等価な塩基配列を含むポリヌクレオチドであってよい。また、NTRK3遺伝子によってコードされるポリペプチドは、配列番号14で示されるヒトNTRK3タンパク質のアミノ酸配列、又はその機能的に等価なアミノ酸配列を含むポリペプチドであってよい。
【００３７】
融合遺伝子の融合形態は、癌化能を有する限り限定しないが、KANK1遺伝子又はEML4遺伝子によってコードされるポリペプチドのN末端側の配列をN末端側に含み、NTRK3遺伝子によってコードされるポリペプチドのC末端側の配列をC末端側に含むポリペプチドをコードするものが好ましい。
【００３８】
融合遺伝子は、好ましくはKANK1遺伝子によってコードされるポリペプチド又はEML4遺伝子によってコードされるポリペプチド由来のコイルドコイルドメイン、及びNTRK3遺伝子由来のキナーゼドメインを含むポリペプチドをコードする。KANK1遺伝子由来のコイルドコイルドメインは、例えば配列番号10の258〜316位、361〜395位、及び446〜500位のアミノ酸配列の少なくとも一つ、又はその機能的に等価なアミノ酸配列を含む。EML4遺伝子由来のコイルドコイルドメインは、例えば配列番号12の17〜51位のアミノ酸配列、又はその機能的に等価なアミノ酸配列を含む。また、NTRK3遺伝子由来のキナーゼドメインは、例えば配列番号14の538〜825位のアミノ酸配列、又はその機能的に等価なアミノ酸配列を含む。
【００３９】
KANK1遺伝子とNTRK3遺伝子の融合遺伝子は、好ましくは、配列番号39で示されるヒトKANK1遺伝子とヒトNTRK3遺伝子の融合遺伝子の塩基配列、又はその機能的に等価な塩基配列を含むポリヌクレオチドであってよい。また、KANK1遺伝子とNTRK3遺伝子の融合遺伝子によってコードされるポリペプチドは、配列番号40で示されるアミノ酸配列、又はその機能的に等価なアミノ酸配列を含むポリペプチドであってよい。
【００４０】
EML4遺伝子とNTRK3遺伝子の融合遺伝子は、好ましくは、配列番号41で示されるヒトEML4遺伝子とヒトNTRK3遺伝子の融合遺伝子の塩基配列、又はその機能的に等価な塩基配列を含むポリヌクレオチドであってよい。EML4遺伝子とNTRK3遺伝子の融合遺伝子によってコードされるポリペプチドは、配列番号42で示されるアミノ酸配列、又はその機能的に等価なアミノ酸配列を含むポリペプチドであってよい。
【００４１】
例えば、配列番号9、11、13、39又は41で示される塩基配列に機能的に等価な塩基配列は、それぞれ配列番号9、11、13、39又は41で示される塩基配列に対して、例えば80%以上、好ましくは90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、若しくは99%以上の同一性を有する塩基配列、又は配列番号9、11、13、39又は41で示される塩基配列において1若しくは複数個の塩基が付加、欠失、及び／若しくは置換された塩基配列であってよい。また、配列番号10、12、14、40、又は42で示されるアミノ酸配列に機能的に等価なアミノ酸配列は、それぞれ配列番号10、12、14、40、又は42で示されるアミノ酸配列に対して、例えば80%以上、好ましくは90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、若しくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号10、12、14、40、又は42で示されるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／若しくは置換されたアミノ酸配列であってよい。
【００４２】
同様に、配列番号10の258〜316位のアミノ酸配列、配列番号10の361〜395位のアミノ酸配列、配列番号10の446〜500位のアミノ酸配列、配列番号12の17〜51位のアミノ酸配列、又は配列番号14の538〜825位のアミノ酸配列に機能的に等価なアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号10の258〜316位のアミノ酸配列、配列番号10の361〜395位のアミノ酸配列、配列番号10の446〜500位のアミノ酸配列、配列番号12の17〜51位のアミノ酸配列、又は配列番号14の538〜825位のアミノ酸配列に対して、例えば80%以上、好ましくは90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、若しくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号10の258〜316位のアミノ酸配列、配列番号10の361〜395位のアミノ酸配列、配列番号10の446〜500位のアミノ酸配列、配列番号12の17〜51位のアミノ酸配列、又は配列番号14の538〜825位のアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／若しくは置換されたアミノ酸配列であってよい。
【００４３】
（iv）ARMC10遺伝子、AKAP9遺伝子、AGAP3遺伝子、又はTRIM24遺伝子とBRAF遺伝子の融合遺伝子
一実施形態において、本発明の大腸癌検出用マーカーは、ARMC10（armadillo repeat containing10）遺伝子、AKAP9（A-kinase anchoring protein 9）遺伝子、AGAP3（ArfGAP with GTPase domain, ankyrin repeat and PH domain 3）遺伝子、及びTRIM24（tripartite motif containing 24）遺伝子からなる群より選択される遺伝子とBRAF（B-Raf proto-oncogene, serine/threonine kinase）遺伝子の融合遺伝子、又は該融合遺伝子によりコードされるポリペプチドからなる。
【００４４】
本明細書において、ARMC10遺伝子は、好ましくは配列番号15で示されるヒトARMC10遺伝子の塩基配列、又はその機能的に等価な塩基配列を含むポリヌクレオチドであってよい。また、ARMC10遺伝子によってコードされるポリペプチドは、配列番号16で示されるヒトARMC10タンパク質のアミノ酸配列、又はその機能的に等価なアミノ酸配列を含むポリペプチドであってよい。
【００４５】
本明細書において、AKAP9遺伝子は、好ましくは配列番号17で示されるヒトAKAP9遺伝子の塩基配列、又はその機能的に等価な塩基配列を含むポリヌクレオチドであってよい。また、AKAP9遺伝子によってコードされるポリペプチドは、配列番号18で示されるヒトAKAP9タンパク質のアミノ酸配列、又はその機能的に等価なアミノ酸配列を含むポリペプチドであってよい。
【００４６】
本明細書において、AGAP3遺伝子は、好ましくは配列番号19で示されるヒトAGAP3遺伝子の塩基配列、又はその機能的に等価な塩基配列を含むポリヌクレオチドであってよい。また、AGAP3遺伝子によってコードされるポリペプチドは、配列番号20で示されるヒトAGAP3タンパク質のアミノ酸配列、又はその機能的に等価なアミノ酸配列を含むポリペプチドであってよい。
【００４７】
本明細書において、TRIM24遺伝子は、好ましくは配列番号21で示されるヒトTRIM24遺伝子の塩基配列、又はその機能的に等価な塩基配列を含むポリヌクレオチドであってよい。また、TRIM24遺伝子によってコードされるポリペプチドは、配列番号22で示されるヒトTRIM24タンパク質のアミノ酸配列、又はその機能的に等価なアミノ酸配列を含むポリペプチドであってよい。
【００４８】
本明細書において、BRAF遺伝子は、好ましくは配列番号23で示されるヒトBRAF遺伝子の塩基配列、又はその機能的に等価な塩基配列を含むポリヌクレオチドであってよい。また、BRAF遺伝子によってコードされるポリペプチドは、配列番号24で示されるヒトBRAFタンパク質のアミノ酸配列、又はその機能的に等価なアミノ酸配列を含むポリペプチドであってよい。
【００４９】
融合遺伝子の融合形態は、癌化能を有する限り限定しないが、ARMC10遺伝子、AKAP9遺伝子、AGAP3遺伝子、及びTRIM24遺伝子からなる群より選択される遺伝子によってコードされるポリペプチドのN末端側の配列をN末端側に含み、BRAF遺伝子によってコードされるポリペプチドのC末端側の配列をC末端側に含むポリペプチドをコードするものが好ましい。
【００５０】
融合遺伝子は、好ましくは（a）ARMC10遺伝子によってコードされるポリペプチド由来のARM（Armadillo）ドメイン、AKAP9遺伝子によってコードされるポリペプチド由来のコイルドコイルドメイン、AGAP3遺伝子によってコードされるポリペプチド由来のPH（Pleckstrin-homology）ドメイン、又はTRIM24遺伝子によってコードされるポリペプチド由来のRING（Really Interesting New Gene）ドメイン、及び（b）BRAF遺伝子によってコードされるポリペプチド由来のキナーゼドメインを含むポリペプチドをコードする。
【００５１】
ARMC10遺伝子由来のARMドメインは、例えば配列番号16の55〜140位のアミノ酸配列、又はその機能的に等価なアミノ酸配列を含む。AKAP9遺伝子由来のコイルドコイルドメインは、例えば配列番号18の164〜914位のアミノ酸配列、944〜1022位のアミノ酸配列、1100〜1185位のアミノ酸配列、1253〜1280位のアミノ酸配列、1336〜1392位のアミノ酸配列、1434〜1459位のアミノ酸配列、1585〜1659位のアミノ酸配列、1857〜2455位のアミノ酸配列、2544〜2561位のアミノ酸配列、2603〜2776位のアミノ酸配列、3065〜3092位のアミノ酸配列、3124〜3470位のアミノ酸配列、及び3587〜3689位のアミノ酸配列の少なくとも一つ、又はその機能的に等価なアミノ酸配列を含む。AGAP3遺伝子由来のPHドメインは、例えば配列番号20の404〜465位のアミノ酸配列、又はその機能的に等価なアミノ酸配列を含む。TRIM24遺伝子由来のRINGドメインは、例えば配列番号22の56〜82位のアミノ酸配列、又はその機能的に等価なアミノ酸配列を含む。また、BRAF遺伝子由来のキナーゼドメインは、例えば配列番号24の457〜717位のアミノ酸配列、又はその機能的に等価なアミノ酸配列を含む。
【００５２】
ARMC10遺伝子とBRAF遺伝子の融合遺伝子は、好ましくは、配列番号43で示されるヒトARMC10遺伝子とヒトBRAF遺伝子の融合遺伝子の塩基配列、又はその機能的に等価な塩基配列を含むポリヌクレオチドであってよい。また、ARMC10遺伝子とBRAF遺伝子の融合遺伝子によってコードされるポリペプチドは、配列番号44で示されるアミノ酸配列、又はその機能的に等価なアミノ酸配列を含むポリペプチドであってよい。
【００５３】
AKAP9遺伝子とBRAF遺伝子の融合遺伝子は、好ましくは、配列番号45で示されるヒトAKAP9遺伝子とヒトBRAF遺伝子の融合遺伝子の塩基配列、又はその機能的に等価な塩基配列を含むポリヌクレオチドであってよい。また、AKAP9遺伝子とBRAF遺伝子の融合遺伝子によってコードされるポリペプチドは、配列番号46で示されるアミノ酸配列、又はその機能的に等価なアミノ酸配列を含むポリペプチドであってよい。
【００５４】
AGAP3遺伝子とBRAF遺伝子の融合遺伝子は、好ましくは、配列番号47で示されるヒトAGAP3遺伝子とヒトBRAF遺伝子の融合遺伝子の塩基配列、又はその機能的に等価な塩基配列を含むポリヌクレオチドであってよい。また、AGAP3遺伝子とBRAF遺伝子の融合遺伝子によってコードされるポリペプチドは、配列番号48で示されるアミノ酸配列、又はその機能的に等価なアミノ酸配列を含むポリペプチドであってよい。
【００５５】
TRIM24遺伝子とBRAF遺伝子の融合遺伝子は、好ましくは、配列番号49で示されるヒトTRIM24遺伝子とヒトBRAF遺伝子の融合遺伝子の塩基配列、又はその機能的に等価な塩基配列を含むポリヌクレオチドであってよい。また、TRIM24遺伝子とBRAF遺伝子の融合遺伝子によってコードされるポリペプチドは、配列番号50で示されるアミノ酸配列、又はその機能的に等価なアミノ酸配列を含むポリペプチドであってよい。
【００５６】
例えば、配列番号15、17、19、21、23、43、45、47又は49で示される塩基配列に機能的に等価な塩基配列は、それぞれ配列番号15、17、19、21、23、43、45、47又は49で示される塩基配列に対して、例えば80%以上、好ましくは90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、若しくは99%以上の同一性を有する塩基配列、又は配列番号15、17、19、21、23、43、45、47又は49で示される塩基配列において1若しくは複数個の塩基が付加、欠失、及び／若しくは置換された塩基配列であってよい。また、配列番号16、18、20、22、24、44、46、48、又は50で示されるアミノ酸配列に機能的に等価なアミノ酸配列は、それぞれ配列番号16、18、20、22、24、44、46、48、又は50で示されるアミノ酸配列に対して、例えば80%以上、好ましくは90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、若しくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号16、18、20、22、24、44、46、48、又は50で示されるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／若しくは置換されたアミノ酸配列であってよい。
【００５７】
同様に、配列番号16の55〜140位のアミノ酸配列、配列番号18の164〜914位のアミノ酸配列、944〜1022位のアミノ酸配列、1100〜1185位のアミノ酸配列、1253〜1280位のアミノ酸配列、1336〜1392位のアミノ酸配列、1434〜1459位のアミノ酸配列、1585〜1659位のアミノ酸配列、1857〜2455位のアミノ酸配列、2544〜2561位のアミノ酸配列、2603〜2776位のアミノ酸配列、3065〜3092位のアミノ酸配列、3124〜3470位のアミノ酸配列、及び3587〜3689位のアミノ酸配列、配列番号20の404〜465位のアミノ酸配列、配列番号22の56〜82位のアミノ酸配列、配列番号24の457〜717位のアミノ酸配列に機能的に等価なアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号16の55〜140位のアミノ酸配列、配列番号18の164〜914位のアミノ酸配列、944〜1022位のアミノ酸配列、1100〜1185位のアミノ酸配列、1253〜1280位のアミノ酸配列、1336〜1392位のアミノ酸配列、1434〜1459位のアミノ酸配列、1585〜1659位のアミノ酸配列、1857〜2455位のアミノ酸配列、2544〜2561位のアミノ酸配列、2603〜2776位のアミノ酸配列、3065〜3092位のアミノ酸配列、3124〜3470位のアミノ酸配列、及び3587〜3689位のアミノ酸配列、配列番号20の404〜465位のアミノ酸配列、配列番号22の56〜82位のアミノ酸配列、配列番号24の457〜717位のアミノ酸配列に対して、例えば80%以上、好ましくは90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、若しくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号16の55〜140位のアミノ酸配列、配列番号18の164〜914位のアミノ酸配列、944〜1022位のアミノ酸配列、1100〜1185位のアミノ酸配列、1253〜1280位のアミノ酸配列、1336〜1392位のアミノ酸配列、1434〜1459位のアミノ酸配列、1585〜1659位のアミノ酸配列、1857〜2455位のアミノ酸配列、2544〜2561位のアミノ酸配列、2603〜2776位のアミノ酸配列、3065〜3092位のアミノ酸配列、3124〜3470位のアミノ酸配列、及び3587〜3689位のアミノ酸配列、配列番号20の404〜465位のアミノ酸配列、配列番号22の56〜82位のアミノ酸配列、配列番号24の457〜717位のアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／若しくは置換されたアミノ酸配列であってよい。
【００５８】
（v）LMNA遺伝子又はTPM3遺伝子とNTRK1遺伝子の融合遺伝子
一実施形態において、本発明の大腸癌検出用マーカーは、LMNA（lamin A/C）遺伝子とNTRK1（neurotrophic receptor tyrosine kinase 1）遺伝子の融合遺伝子、若しくはTPM3（tropomyosin 3）遺伝子とNTRK1遺伝子の融合遺伝子、又は該融合遺伝子によりコードされるポリペプチドからなる。
【００５９】
本明細書において、LMNA遺伝子は、好ましくは配列番号25で示されるヒトLMNA遺伝子の塩基配列、又はその機能的に等価な塩基配列を含むポリヌクレオチドであってよい。また、LMNA遺伝子によってコードされるタンパク質は、配列番号26で示されるヒトLMNAタンパク質のアミノ酸配列、又はその機能的に等価なアミノ酸配列を含むポリペプチドであってよい。
【００６０】
本明細書において、TPM3遺伝子は、好ましくは配列番号27で示されるヒトTPM3遺伝子の塩基配列、又はその機能的に等価な塩基配列を含むポリヌクレオチドであってよい。また、TPM3遺伝子によってコードされるタンパク質は、配列番号28で示されるヒトTPM3タンパク質のアミノ酸配列、又はその機能的に等価なアミノ酸配列を含むポリペプチドであってよい。
【００６１】
本明細書において、NTRK1遺伝子は、好ましくは配列番号29で示されるヒトNTRK1遺伝子の塩基配列、配列番号29で示される塩基配列に対して、例えば80%以上、好ましくは90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、若しくは99%以上の同一性を有する塩基配列、又はその機能的に等価な塩基配列を含むポリヌクレオチドであってよい。また、NTRK1遺伝子によってコードされるタンパク質は、配列番号30で示されるヒトNTRK1タンパク質のアミノ酸配列、又はその機能的に等価なアミノ酸配列を含むポリペプチドであってよい。
【００６２】
融合遺伝子は、癌化能を有する限り限定しないが、LMNA遺伝子又はTPM3遺伝子によってコードされるタンパク質のN末端側の配列をN末端側に含み、NTRK1遺伝子によってコードされるタンパク質のC末端側の配列をC末端側に含むポリペプチドをコードするものが好ましい。
【００６３】
融合遺伝子は、好ましくはLMNA遺伝子によってコードされるタンパク質又はTPM3遺伝子によってコードされるタンパク質由来のコイルドコイルドメインの一部、及びNTRK1遺伝子由来のキナーゼドメインを含むポリペプチドをコードする。
【００６４】
LMNA遺伝子由来のコイルドコイルドメインは、例えば配列番号26の34〜218位のアミノ酸配列及び243〜383位のアミノ酸配列の少なくとも一つ、又はその機能的に等価なアミノ酸配列を含む。TPM3遺伝子由来のコイルドコイルドメインの一部は、例えば配列番号28の1〜211位のアミノ酸配列、又はその機能的に等価なアミノ酸配列を含む。また、NTRK1遺伝子由来のキナーゼドメインは、例えば配列番号30の510〜781位のアミノ酸配列、又はその機能的に等価なアミノ酸配列を含む。
【００６５】
LMNA遺伝子とNTRK1遺伝子の融合遺伝子は、好ましくは、配列番号51で示されるヒトLMNA遺伝子とヒトNTRK1遺伝子の融合遺伝子の塩基配列、又はその機能的に等価な塩基配列を含むポリヌクレオチドであってよい。また、LMNA遺伝子とNTRK1遺伝子の融合遺伝子によってコードされるタンパク質は、配列番号52で示されるアミノ酸配列、又はその機能的に等価なアミノ酸配列を含むポリペプチドであってよい。
【００６６】
TPM3遺伝子とNTRK1遺伝子の融合遺伝子は、好ましくは、配列番号53で示されるヒトTPM3遺伝子とヒトNTRK1遺伝子の融合遺伝子の塩基配列、又はその機能的に等価な塩基配列を含むポリヌクレオチドであってよい。また、TPM3遺伝子とNTRK1遺伝子の融合遺伝子によってコードされるタンパク質は、配列番号54で示されるアミノ酸配列、又はその機能的に等価なアミノ酸配列を含むポリペプチドであってよい。
【００６７】
例えば、配列番号25、27、29、51又は53で示される塩基配列に機能的に等価な塩基配列は、それぞれ配列番号25、27、29、51又は53で示される塩基配列に対して、例えば80%以上、好ましくは90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、若しくは99%以上の同一性を有する塩基配列、又は配列番号25、27、29、51又は53で示される塩基配列において1若しくは複数個の塩基が付加、欠失、及び／若しくは置換された塩基配列であってよい。また、配列番号26、28、30、52、又は54で示されるアミノ酸配列に機能的に等価なアミノ酸配列は、それぞれ配列番号26、28、30、52、又は54で示されるアミノ酸配列に対して、例えば80%以上、好ましくは90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、若しくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号26、28、30、52、又は54で示されるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／若しくは置換されたアミノ酸配列であってよい。
【００６８】
同様に、配列番号26の34〜218位のアミノ酸配列、配列番号26の243〜383位のアミノ酸配列、配列番号28の1〜211位のアミノ酸配列、又は配列番号30の510〜781位のアミノ酸配列に機能的に等価なアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号26の34〜218位のアミノ酸配列、配列番号26の243〜383位のアミノ酸配列、配列番号28の1〜211位のアミノ酸配列、又は配列番号30の510〜781位のアミノ酸配列に対して、例えば80%以上、好ましくは90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、若しくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号26の34〜218位のアミノ酸配列、配列番号26の243〜383位のアミノ酸配列、配列番号28の1〜211位のアミノ酸配列、又は配列番号30の510〜781位のアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／若しくは置換されたアミノ酸配列であってよい。
【００６９】
本発明の大腸癌検出用マーカーを検出することにより、大腸癌、例えばマイクロサテライト不安定性大腸癌（MSI-H CRC）の検体における大腸癌傷害の罹患の有無又は大腸癌の罹患可能性を判別することができる。MSI-H CRCでは染色体が比較的安定であり、融合遺伝子の存在比率はそれほど高くないと考えられていたことから、上記融合遺伝子を構成するポリヌクレオチド又は該ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドをMSI-H CRCの検出に用い得ることは驚くべきことであった。
【００７０】
本発明の大腸癌検出用マーカーは単独で用いてもよいし、複数組み合わせて用いて用いてもよい。また、本発明の大腸癌検出用マーカーは、他の既存の大腸癌検出用マーカー、例えばCEA遺伝子、CA19-9遺伝子、若しくはNCC-ST-439遺伝子又はこれらによってコードされるタンパク質と組み合わせて用いてもよい。さらに、本発明の大腸癌検出用マーカーは、便潜血反応検査等の他の大腸癌検出方法と組み合わせて用いてもよい。他のマーカーとの組み合わせや他の方法との組み合わせによって、大腸癌の検出精度を高めることができる。
【００７１】
＜マーカーを検出するための手段及びキット＞
一態様において、本発明は、本明細書に記載の大腸癌検出用マーカーを検出するための手段、例えばプライマーセット、プローブ、アプタマー、若しくは抗体、又はこれらのいずれかを少なくとも一つ含むキットに関する。これらは、上記マーカーに応じて、当業者であれば容易に設計することができる。
【００７２】
１．プライマーセット
プライマーセットは、上記の各大腸癌検出用マーカー、特に各マーカーのタンパク質又は遺伝子の変異部分を特異的に検出できるものであれば特に限定しないが、例えば、上記マーカーがSLC12A2遺伝子とINSR遺伝子の融合遺伝子である場合、
フォワードプライマーが配列番号33の連続する14〜30塩基、例えば16〜28塩基、好ましくは18〜26塩基を含むヌクレオチドからなり、リバースプライマーが配列番号33の配列の相補的な配列の連続する14〜30塩基、例えば16〜28塩基、好ましくは18〜26塩基を含むヌクレオチドからなるか、又は
フォワードプライマーが配列番号33の相補的な配列からなる核酸にストリンジェントな条件でハイブリダイズする14〜30塩基、例えば16〜28塩基、好ましくは18〜26塩基の配列を含むヌクレオチドからなり、リバースプライマーが配列番号33の配列からなる核酸にストリンジェントな条件でハイブリダイズする14〜30塩基、例えば16〜28塩基、好ましくは18〜26塩基の配列を含むヌクレオチドからなる、
フォワードプライマー及びリバースプライマーを含む。
【００７３】
本明細書において、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を意味する。ストリンジェントな条件は、公知のハイブリダイゼーション法の条件を利用することができる。例えばGreen and Sambrook, Molecular Cloning, 4th Ed (2012), Cold Spring Harbor Laboratory Press を参照して適宜決定すればよい。具体的には、ハイブリダイゼーション法温度や溶液に含まれる塩濃度、及びハイブリダイゼーション法の洗浄工程における温度や溶液に含まれる塩濃度によりストリンジェントな条件を設定すればよい。より詳細なストリンジェントな条件としては、例えば、ナトリウム濃度が25〜500mM、好ましくは25〜300mMであり、温度が42〜68℃、好ましくは42〜65℃が挙げられる。より具体的には、5×SSC (83mM NaCl、83mMクエン酸ナトリウム)、温度42℃が挙げられる。
【００７４】
マーカーがRUFY1遺伝子又はNCOA4遺伝子とRET遺伝子の融合遺伝子である場合にはそれぞれ配列番号35又は37で示される塩基配列に基づいて、同様にプライマーセットを設計することができる。マーカーがKANK1遺伝子又はEML4遺伝子とNTRK3遺伝子の融合遺伝子である場合にはそれぞれ配列番号39又は41で示される塩基配列に基づいて、同様にプライマーセットを設計することができる。マーカーがARMC10遺伝子、AKAP9遺伝子、AGAP3遺伝子、又はTRIM24遺伝子とBRAF遺伝子の融合遺伝子である場合にはそれぞれ配列番号43、45、47、又は49で示される塩基配列に基づいて、同様にプライマーセットを設計することができる。マーカーがLMNA遺伝子又はTPM3遺伝子とNTRK1遺伝子の融合遺伝子である場合にはそれぞれ配列番号51又は53で示される塩基配列に基づいて、同様にプライマーセットを設計することができる。
【００７５】
２．プローブ
上記マーカーを検出するためのプローブは、上記マーカー、特に上記マーカーのタンパク質又は遺伝子の変異部分を検出できるものであれば特に限定しない。例えば、マーカーがSLC12A2遺伝子とINSR遺伝子の融合遺伝子である場合、プローブは、
配列番号33の連続する少なくとも14、例えば20、好ましくは30の塩基配列又はその相補的な配列からなるポリヌクレオチド、
配列番号33の連続する少なくとも14、例えば20、好ましくは30の塩基配列又はその相補的な配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド
であってよい。
【００７６】
マーカーがRUFY1遺伝子又はNCOA4遺伝子とRET遺伝子の融合遺伝子である場合にはそれぞれ配列番号35又は37で示される塩基配列に基づいて、同様にプローブを設計することができる。マーカーがKANK1遺伝子又はEML4遺伝子とNTRK3遺伝子の融合遺伝子である場合にはそれぞれ配列番号39又は41で示される塩基配列に基づいて、同様にプローブを設計することができる。マーカーがARMC10遺伝子、AKAP9遺伝子、AGAP3遺伝子、又はTRIM24遺伝子とBRAF遺伝子の融合遺伝子である場合にはそれぞれ配列番号43、45、47、又は49で示される塩基配列に基づいて、同様にプローブを設計することができる。マーカーがLMNA遺伝子又はTPM3遺伝子とNTRK1遺伝子の融合遺伝子である場合にはそれぞれ配列番号51又は53で示される塩基配列に基づいて、同様にプローブを設計することができる。
【００７７】
プライマー及びプローブは、当業者に知られる公知の方法により調製することができ、限定されるものではないが、例えば化学合成法によって調製することができる。
【００７８】
３．アプタマー
上記マーカーに対するアプタマーは、公知の方法、例えばSELEX（systematic evolution of ligands by exponential enrichment）法等により作製することができる。SELEX法とは、ランダム配列領域とその両末端にプライマー結合領域を有する核酸分子で構成されるプールから標的分子に結合した核酸分子を選択し、回収後に増幅した後、次のラウンドの核酸プールにするという一連のサイクルを数〜数十ラウンド繰り返して、標的分子に対してより結合力の強い核酸を選択する方法である（例えば、Tuerk C, Gold L (1990) Science 249(4968):505-510を参照されたい）。
【００７９】
４．抗体
上記マーカーと特異的に結合する抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体、及び合成抗体のいずれであってもよい。「ポリクローナル抗体」とは、同一抗原の異なるエピトープを認識して結合する複数種の免疫グロブリン群をいう。ポリクローナル抗体は、標的分子を抗原として動物に免疫後、その動物の血清から得ることができる。「モノクローナル抗体」とは、単一免疫グロブリンのクローン群をいう。モノクローナル抗体は、例えば、免疫を行った動物から抗体を産生するB細胞を単離し、これをミエローマがん細胞と融合したハイブリドーマを用いて作製することができる。本明細書において「組換え抗体」は、キメラ抗体及びヒト化抗体等の異なる動物由来の抗体のアミノ酸配列を組み合わせて作製される抗体を意味する。また、本明細書において「合成抗体」とは、化学的方法又は組換えDNA法によって合成した抗体を意味し、一本鎖Fv（scFv ：single chain Fragment oｆ variable region）、ダイアボディ（diabody）、トリアボディ（triabody）又はテトラボディ(tetrabody)等が挙げられる。
【００８０】
上記プライマーセット、プローブ、アプタマー、若しくは抗体は、本明細書に記載のマーカーを構成する融合遺伝子又は融合ポリペプチドの融合部分を検出するものを単独で用いてもよい。あるいは、非融合部分を検出するものを複数組み合わせて用いて、本明細書に記載のマーカーを検出することもできる。
【００８１】
一実施形態において、本発明は、本明細書に記載の大腸癌検出用マーカーを検出するための手段を含むキットに関する。本発明のキットは、上記プライマーセット、プローブ、アプタマー、又は抗体に加えて、例えば、バッファー、酵素、及び使用説明書等の少なくとも一つを含んでもよい。
【００８２】
＜大腸癌の罹患の判別方法＞
一態様において、本発明は、大腸癌の罹患の有無又は大腸癌の罹患可能性の判別を補助する方法に関する。本態様において罹患判別される大腸癌は、盲腸癌、結腸癌、及び直腸癌のいずれであってもよい。
【００８３】
本方法は、被験体から得られたサンプルにおいて、本明細書に記載の大腸癌検出用マーカーを検出する工程（検出工程）を含む。大腸癌検出用マーカーを検出する工程は、公知の遺伝子解析法（例えば遺伝子検出法として常用されるPCR法、RT-PCR法、Real-time PCR法、LCR(Ligase chain reaction)、LAMP(Loop-mediated isothermal amplification)法、マイクロアレイ法、ノーザンハイブリダイゼーション法、ドットブロット法、fluorescent in situ hybridization（FISH）法、及び次世代シークエンサーによる解析等）に従って実施することができる。例えば、被験体由来のサンプルから抽出された核酸、例えばmRNA等を用いて、適当なプライマーを用いる遺伝子増幅技術、又は適当なプローブを用いるハイブリダイゼーション技術等を利用する。検出工程は、限定しないが例えばマーカーを検出するための上記手段、例えばプライマーセット、プローブ、アプタマー、若しくは抗体、又はこれらのいずれかを含むキットを用いて検出してもよい。
【００８４】
また、本方法は、検出工程に加えて、本明細書に記載の大腸癌検出用マーカーが検出された場合に、被験者が大腸癌に罹患しているか又は大腸癌の罹患可能性が高いと決定する工程（決定工程）を、任意の工程として含む。
【００８５】
本明細書において、「サンプル」とは、本発明の方法に供される生体試料を意味する。本発明において使用可能なサンプルとしては、限定するものではないが、例えば生体から単離した細胞又は組織が挙げられる。組織の例として、大腸癌の病変部位、例えば盲腸、結腸、及び直腸が挙げられ、例えばこれらの組織の生検サンプルを用いることができる。
【００８６】
本発明の大腸癌の罹患の判別方法は、他の方法（例えば、レントゲン撮影及び内視鏡検査等）と組み合わせて用いることができる。他の疾患の判別方法又は診断方法と組み合わせることで、本発明の判別方法の精度をさらに高めることができる。
【００８７】
＜医薬組成物並びに治療及び／又は予防方法＞
一態様において、本発明は、被験体における大腸癌を治療及び／又は予防するための医薬組成物に関する。本発明の医薬組成物は、本明細書に記載の融合遺伝子の発現阻害剤又はキナーゼ阻害剤を有効成分として含む。
【００８８】
一態様において、本発明は、本明細書に記載の融合遺伝子の発現阻害剤又はキナーゼ阻害剤、又は上記医薬組成物を被験体に投与することを含む、被験体における大腸癌を治療及び／又は予防するための方法に関する。
【００８９】
本発明の医薬組成物又は大腸癌の治療及び／又は予防方法は、（i）任意の遺伝子とINSR遺伝子の融合遺伝子、（ii）RUFY1遺伝子又はNCOA4遺伝子とRET遺伝子の融合遺伝子、（iii）KANK1遺伝子又はEML4遺伝子とNTRK3遺伝子の融合遺伝子、（iv）ARMC10遺伝子、AKAP9遺伝子、AGAP3遺伝子、又はTRIM24遺伝子とBRAF遺伝子の融合遺伝子、及び（v）LMNA遺伝子又はTPM3遺伝子とNTRK1遺伝子の融合遺伝子、からなる群から選択される融合遺伝子の少なくとも一つを有する被験体に対して適用される。（i）〜（v）に記載の各遺伝子及び各融合遺伝子については、上記＜大腸癌検出用マーカー＞において記載した通りであるから記載を省略する。
【００９０】
本発明の医薬組成物に含まれ得る、また本発明の大腸癌の治療及び／又は予防方法において用い得る融合遺伝子の発現阻害剤又はキナーゼ阻害剤について以下に記載する。
【００９１】
本明細書に記載の融合遺伝子の発現阻害剤は、RNAi分子であってよい。本明細書において「RNAi分子」とは、生体内においてRNAi（RNA干渉：RNA inteference）を誘導し、標的とする遺伝子転写産物の分解を介してその遺伝子の発現を抑制（サイレンシング）することができるRNA分子をいう（Fire A. et al．，1998，Nature，391, 806-811）。RNAi分子の例として、siRNA又はshRNAが挙げられる。本明細書において、「siRNA」（低分子干渉RNA:small interference RNA）とは、標的遺伝子の一部に相当する塩基配列を有するセンス鎖（パッセンジャー鎖）、及びそのアンチセンス鎖（ガイド鎖）からなる小分子二本鎖RNAである。本明細書において「shRNA」（short hairpin RNA）とは、適当な配列を有する短いスペーサー配列によって上記のsiRNA又は成熟型二本鎖miRNAのセンス鎖及びアンチセンス鎖が連結された一本鎖RNAをいう。つまり、shRNAは、一分子内でセンス領域とアンチセンス領域が互いに塩基対合してステム構造を形成し、同時に前記スペーサー配列がループ構造を形成することによって、分子全体としてヘアピン型のステム−ループ構造を形成している。融合遺伝子に対するsiRNA若しくはshRNAは、融合遺伝子の配列に基づいて、当業者であれば適宜設計することができる。RNAi分子は、ベクターに導入して被験者に投与することが好ましい。
【００９２】
被験体が（i）に記載の融合遺伝子を有する場合、キナーゼ阻害剤はINSR遺伝子によってコードされるタンパク質に由来するキナーゼの阻害剤（「INSR阻害剤」とも記載する）であり、（ii）に記載の融合遺伝子を有する場合、キナーゼ阻害剤はRET遺伝子によってコードされるタンパク質に由来するキナーゼの阻害剤（「RET阻害剤」とも記載する）であり、（iii）に記載の融合遺伝子を有する場合、キナーゼ阻害剤はNTRK3遺伝子によってコードされるタンパク質に由来するキナーゼの阻害剤（「NTRK3阻害剤」とも記載する）であり、（iv）に記載の融合遺伝子を有する場合、キナーゼ阻害剤はBRAF遺伝子によってコードされるタンパク質に由来するキナーゼの阻害剤（「BRAF阻害剤」とも記載する）であり、（v）に記載の融合遺伝子を有する場合、キナーゼ阻害剤はNTRK1遺伝子によってコードされるタンパク質に由来するキナーゼの阻害剤（「NTRK1阻害剤」とも記載する）である。キナーゼ阻害剤は、アプタマー、中和抗体、及び低分子化合物からなる群より選択される少なくとも1種の薬剤であってよい。アプタマー及び（中和）抗体の調製方法については、上記＜マーカーを検出するための手段＞において記載した方法に準ずる。以下、キナーゼ阻害剤として用い得る低分子化合物を例示する。
【００９３】
INSR阻害剤の例としてlinsitinib（リンシチニブ）、NT157、GSK1838705A、NVP-AEW541、BMS-754807、GSK1904529A、NVP-ADW742、BMS-536924、BI 885578、及びTyrphostin（チロホスチン）が挙げられる。
【００９４】
RET阻害剤の例として、regorafenib（レゴラフェニブ）、vandetanib（バンデタニブ）、Lenvatinib（レンバチニブ）、Danusertib（ダヌセルチブ）、Alectinib（アレクチニブ）、TG101209、SML1435、TG101348(Fedratinib（フェドラチニブ)、3-（4-イソプロピルベンジリデニル）インドリン-2-オン）、Carbozantinib（カルボザンチニブ）、及びML 786 二塩酸塩が挙げられる。
【００９５】
NTRK3阻害剤の例として、entrectinib（エントレクチニブ）、GNF-5837、MK-5108 (VX-689)、Tepotinib（テポチニブ）、LOXO-101、MK-2461、Danusertib（ダヌセルチブ）、BMS-777607、BMS-754807、PF-03814735、SNS-314 メシレート、AG-1478 (Tyrphostin AG-1478)、CEP-751、Lestaurtinib（レスタウルチニブ）（CEP-701）、DS-6051b、crizotinib（クリゾチニブ）、PLX7486、Dovitinib（ドビチニブ）(TKI-258, CHIR-258)が挙げられる。
【００９６】
BRAF阻害剤の例として、trametinib（トラメチニブ）、selumetinib（セルメチニブ）、PD0325901、U0126-EtOH、PD184352 (CI-1040)、PD98059、BIX 02189、Pimasertib（ビマセルチブ）、BIX 02188、TAK-733、AZD8330、Binimetinib（ビニメチニブ）、PD318088、Honokiol（ホノキオール）、SL-327、RDEA119、GDC-0623、Cobimetinib（コビメチニブ）、BI-847325、refametinib（レファメチニブ）、PLX8394、PLX7904、vemurafenib（ベムラフェニブ）、AZ 628、Dabrafenib（ダブラフェニブ）、RO5126766、CEP-32496、sorafenib（ソラフェニブ）、PLX-4720、MLN2480、GDC-0879、RAF265 (CHIR-265)、GW5074、SB590885、TAK-632、Encorafenib（エンコラフェニブ）(LGX818)、及びLY3009120が挙げられる。
【００９７】
NTRK1阻害剤の例として、entrectinib、GNF-5837、MK-5108 (VX-689、Tepotini（テポチニ）、LOXO-101、MK-246、Danusertib、BMS-77760、BMS-75480、PF-0381473、SNS-314 メシレート、GW441756、AG-1478 (Tyrphostin AG-1478)、CEP-751、Lestaurtinib（CEP-701）、DS-6051b、crizotinib、PLX7486、及びDovitinib (TKI-258, CHIR-258)が挙げられる。
【００９８】
本発明の医薬組成物は、上記有効成分を2以上含んでもよいし、また他の有効成分を含んでもよい。
【００９９】
本発明の医薬組成物は、原則として当該分野で公知の方法で製剤化することが可能である。例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences（Merck Publishing Co．，Easton，Pa．）に記載の方法を用いて製剤化できる。具体的な製剤化の方法は、投与方法によって異なる。投与方法は、経口投与と非経口投与に大別され、投与方法は適宜選択することができる。
【０１００】
本発明の医薬組成物を経口投与する場合、製薬上許容可能な担体を添加してもよい。「製薬上許容可能な担体」とは、薬剤の製剤化や生体への適用を容易にし、その有効成分の作用を阻害又は抑制しない範囲で添加される物質をいう。例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、充填剤、乳化剤、流動添加調節剤又は潤滑沢剤が挙げられる。
【０１０１】
「賦形剤」としては、例えば、単糖、二糖類、シクロデキストリン及び多糖類のような糖（具体的には、限定はしないが、グルコース、スクロース、ラクトース、ラフィノース、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、デキストリン、マルトデキストリン、デンプン及びセルロースを含む）、金属塩（例えば、リン酸ナトリウム若しくはリン酸カルシウム、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム）、クエン酸、酒石酸、グリシン、低、中、高分子量のポリエチレングリコール（PEG）、プルロニック、あるいはそれらの組み合わせが挙げられる。
【０１０２】
「結合剤」としては、例えば、トウモロコシ、コムギ、コメ、若しくはジャガイモのデンプンを用いたデンプン糊、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム及び／又はポリビニルピロリドン等が挙げられる。
【０１０３】
「崩壊剤」としては、例えば、前記デンプンや、カルボキシメチルデンプン、架橋ポリビニルピロリドン、アガー、アルギン酸若しくはアルギン酸ナトリウム又はそれらの塩が挙げられる。
【０１０４】
「充填剤」としては、例えば、前記糖及び／又はリン酸カルシウム（例えば、リン酸三カルシウム、若しくはリン酸水素カルシウム）が挙げられる。
【０１０５】
「乳化剤」としては、例えば、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステルが挙げられる。
【０１０６】
「流動添加調節剤」及び「滑沢剤」としては、例えば、ケイ酸塩、タルク、ステアリン酸塩又はポリエチレングリコールが挙げられる。
【０１０７】
経口剤の剤形としては、例えば、固形剤（錠剤、丸剤、舌下剤、カプセル剤、ドロップ剤を含む）、顆粒剤、粉剤、散剤、液剤等を挙げることができる。さらに固形剤は、必要に応じ、当該分野で公知の剤皮を施した剤形、例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶錠、フィルムコーティング錠、二重錠、多層錠とすることができる。剤形の具体的な形状、大きさについては、いずれもそれぞれの剤形において当該分野で公知の剤形の範囲内にあればよく、特に限定はしない。
【０１０８】
本発明の医薬組成物を非経口投与する場合、その具体例としては、注射による投与が挙げられる。本発明の医薬組成物を注射で投与する場合、製薬上許容可能な溶媒と混合し、必要に応じて製薬上許容可能な担体を加えた懸濁液剤として調製することができる。
【０１０９】
「製薬上許容可能な溶媒」は、水若しくはそれ以外の薬学的に許容し得る水溶液、又は油性液のいずれであってもよい。水溶液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助剤を含む等張液が挙げられる。補助剤としては、例えば、D-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、及び塩化ナトリウム、並びに低濃度の非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート80（TM）、HCO-60）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等が挙げられる。油性液としては、ゴマ油、大豆油が挙げられ、溶解補助剤として例えば安息香酸ベンジル又はベンジルアルコールと併用することもできる。また、緩衝剤、例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えば、ベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。
【０１１０】
注射剤は、製薬上許容される賦形剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、pH調節剤等と適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化すればよい。
【０１１１】
注射は、例えば、血管内注射、リンパ管内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等が挙げられ、全身投与である血管内注射又はリンパ管内注射等の循環器内投与が好ましいが、リンパ腫へ直接的に投与する局所投与であってもよい。
【０１１２】
本発明の医薬組成物における有効成分の含有量は、原則1回の投与でその有効成分が標的部位に達し得る量、かつそれを適用する被験体に対して有害な副作用をほとんど又は全く付与しない量であればよい。このような含有量は、疾患の進行度、有効成分の種類、医薬組成物の剤形及び投与方法等によって異なるが、当業者によって適宜定められる。
【０１１３】
＜融合遺伝子又は融合ポリペプチド＞
一態様において、本発明は、SLC12A2遺伝子とINSR遺伝子の融合遺伝子、RUFY1遺伝子とRET遺伝子の融合遺伝子、AKAP9遺伝子とBRAF遺伝子の融合遺伝子、又は該融合遺伝子によりコードされる癌化能を有するポリペプチドに関する。
【０１１４】
本発明の融合遺伝子は、例えば配列番号33、35、又は45で示される塩基配列、配列番号33、35、又は45で示される塩基配列に対して、例えば80%以上、好ましくは90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、若しくは99%以上の同一性を有する塩基配列、又は配列番号33、35、又は45で示される塩基配列において1若しくは複数個の塩基が付加、欠失、及び／若しくは置換された塩基配列を含む。
【０１１５】
また、本発明の融合遺伝子によりコードされるポリペプチドは、配列番号34、36、及び46のいずれかで示されるアミノ酸配列、配列番号34、36、及び46のいずれかで示されるアミノ酸配列に対して、例えば80%以上、好ましくは90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、若しくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号34、36、及び46のいずれかで示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／若しくは置換されたアミノ酸配列を含む、ポリペプチドをコードする。
【実施例】
【０１１６】
＜材料と方法＞
材料
CRC（大腸癌）患者から外科的に切除した腫瘍を、インフォームドコンセントを得た上で分析した。コントロールとして、腫瘍の近傍の正常腸粘膜を使用した。なお、本実験は、東京大学及び帝京大学の倫理委員会の承認を受けてなされた。
【０１１７】
トランスクリプトーム
全RNAを、RNeasy Mini Kit（Qiagen, Hilden, Germany）を用い、RNA Bee Reagent（Tel-Test Inc., Friendswood, TX）で抽出し、DNaseI（Qiagen）で処理した。RNA integrityを、Bioanalyzer（Agilent Technologies）又はTapeStation（Agilent Technologies）を用いて調べた。高いRNA integrity numberを有するRNAを、polyA選択RNAから相補DNA（cDNA）を調製し、NEBNext Ultra Directional RNA Library Prep Kit（New England BioLabs, Ipswich, MA）を用いるRNA-seqに供した。低いRNA integrity numberを有するRNAは、ランダムプライマーを用いて相補DNA（cDNA）を調製し、TruSeq RNA Access Library Prep Kit（illumina）を用いるRNA-seqに供した。調製したRNA-seqライブラリーを、両端から120bpのNGSシーケンシングに供した。融合遺伝子は、deFuse pipeline（https://bitbucket.org/dranew/defuse）及びSTAR（https://github.com/alexdobin/STAR）によって検出した。
【０１１８】
融合遺伝子のクローニング
野生型タンパク質、及び融合タンパク質のcDNAを、RNAサンプルからの逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）により増幅し、pMXsレトロウイルスベクター（Cell Biolabs）にライゲーションした。全てのcDNAの配列を、サンガーシーケンシングにより確認した。
【０１１９】
3T3形質転換アッセイ
ヒト胚性腎（HEK）293T細胞及びマウス3T3線維芽細胞をAmerican Type Culture Collectionより入手し、10％ウシ胎児血清（FBS）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）-F12（いずれもInvitrogen）で維持した。上記pMXsベクターをエコトロピックパッケージングプラスミド（Takara Bio）と共に、トランスフェクションによってHEK293T細胞に導入し、感染性のウイルス粒子を得た。フォーカス形成アッセイでは、3T3細胞をエコトロピックな組換えレトロウイルスに感染させ、5％仔ウシ血清を補充したダルベッコ改変イーグル培地-F12（いずれもInvitrogen）で培養した。
【０１２０】
キナーゼ阻害剤
キナーゼ阻害剤（Lintinib、Regorafenib、Entrectinib、及びPLX7904）は、Selleck Chemicalsから入手した。
【０１２１】
統計解析
数値は中央値及び範囲により示した。群間の数値の比較は、ノンパラメトリックなアプローチ（Wilcoxon rank-sum test）を用いて実施した。異なる群におけるカテゴリー変数の分布の比較は、Fisher's exact testにより実施した。
【０１２２】
＜結果＞
MSI-H CRCにおける発癌変異
東京大学腫瘍外科及び帝京大学外科で1998年〜2016年の間に処置された患者から、2836の外科的に切除された腸癌又は腺腫標本を得た。2836の腫瘍のうち、合計162の腫瘍（161の腺癌及び1の腺腫）が、MSI-H（microsatellite instability-high：マイクロサテライト不安定性。本実施例ではBAT25及びBAT426の両方においてMSIを示す状態として定義する）であった。本実施例では、MSI-H CRCをマイクロサテライト低不安定性CRCと明確に区別するために、この厳密な基準を適用した。
【０１２３】
転写活性な変異アレルを同定するために、RNA-seq解析を行った、MSI-H CRC（マイクロサテライト不安定性大腸癌）では染色体が比較的安定であることから、融合遺伝子の存在比率はそれほど高くないと考えられた。しかしながら、予想に反し、poly-A捕捉RNA-seq（n=94）又はランダムプライマー（n=17）によるRNA-seqによる解析によって、融合キナーゼをコードする転写物が111の腫瘍（33のLS/LL腫瘍、72のMM腫瘍、サブタイプ不明の6の腫瘍）のうち、11のMM腫瘍で見出された。興味深いことに、融合キナーゼは、KRAS変異及びBRAF変異とは互いに排他的であった。検出された融合遺伝子によってコードされるタンパク質の模式図を図1に、検出された融合遺伝子の配列情報を以下の表1に示す。
【０１２４】
【表１】
2018191568.tif 000003
【０１２５】
新規な融合遺伝子であるSLC12A2-INSRを含む全ての融合遺伝子について、融合転写物の発現を逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）により確認した（データ示さず）。また、SLC12A2-INSRを含む8つの融合遺伝子について、ロングレンジPCRによりゲノム上の融合点を特定した（データ示さず）。
【０１２６】
続いて、融合遺伝子を細胞に導入し、3T3形質転換アッセイを行ったところ、図に示した各融合遺伝子について腫瘍形成能を有することを確認した（図2）。
【０１２７】
さらに、これらの融合遺伝子によってコードされるタンパク質に含まれる各キナーゼの活性を阻害する阻害剤は、濃度依存的に融合タンパク質を発現する3T3細胞の悪性形質転換を低減した（図3）。なお、比較のためにウイルス由来の癌遺伝子であるv-rasについても同様の試験を行った。これらのデータは、キナーゼ阻害剤が、融合タンパク質が原因となる腫瘍の治療剤となり得ることを示唆している。
【０１２８】
MSS CRCにおける発癌融合遺伝子
MSS CRC（microsatellite stable colorectal caner：マイクロサテライト安定性大腸癌）も発癌性の融合遺伝子を有するか調べるために、The Cancer Genome Atlas（TCGA：癌ゲノムアトラス）のMSSデータセット由来のRNA-seqデータを分析した。26のペアエンドRNA-seqデータ及び181のシングルリードRNA-seqデータ（サンプルあたりの中央値36213120リード、76 bp長）が利用可能であった。解析の結果、MSS CRCのデータセット由来のRNA-seqデータではチロシンキナーゼに関する発癌性融合遺伝子は1つも検出されなかった。一方でMSI大腸癌を同様の条件（分析の条件を調整するため、上記MSI-H CRCのRNA-seqデータから無作為に選択したサンプルあたり36メガリードを76bp長に縮小し、分析に供した）で解析したところ、11の融合遺伝子のうち10が見出された。これらのデータは、チロシンキナーゼに関する発癌性融合遺伝子は、MSI-CRC、特にMMサブタイプにおいて、MSS CRCより高頻度であったことを示唆している。
【産業上の利用可能性】
【０１２９】
本発明により、大腸癌を迅速かつ正確に検出することが可能なマーカーが提供される。また、本発明により、大腸癌を効果的に治療及び／又は予防するための医薬組成物が提供される。大腸癌の患者数及び大腸癌による死亡者数は非常に多いため、本発明が有する産業上の意義は大きい。
【図１】
2018191568.tif 000004
【図２】
2018191568.tif 000005
【図３】
2018191568.tif 000006
【配列表】
2018191568000001.app