(57)【要約】【課題】テロメラーゼ阻害剤を用いて細胞増殖性障害を処置するための診断マーカーの提供。【解決手段】テロメラーゼ阻害化合物による処置から利益を受けると思われる、細胞増殖性障害と診断された個体を同定する方法を、本明細書において提供する。さらに、これらの個体を、テロメラーゼ阻害化合物で処置する方法を、本明細書において提供する。該方法は、前記個体由来のがん細胞中のテロメアの平均相対的長さに基づいて、前記処置から利益を受けると思われる個体を同定するステップを含む。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、テロメラーゼ阻害剤はイメテルスタットである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２０１２年１１月３０日に出願された米国仮特許出願第６１／７３２，２６３号、２０１３年３月１３日に出願された米国仮特許出願第６１／７８０，８５１号、２０１３年３月１３日に出願された米国特許出願第１３／８０２，０３５号、２０１３年３月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／７９８，４７８号、および２０１３年４月５日に出願された米国仮特許出願第６１／８０９，２２８号への優先権（これらの開示は、その全体が参考として本明細書に援用される）を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、テロメラーゼ阻害化合物による処置から利益を得ると思われる、がんを有する、またはがんを有する疑いのある個体を同定する方法およびこれらの個体を処置する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
がんは、世界的な死亡の主因である。化学療法の分野における顕著な進歩にもかかわらず、がんの最も高頻度な型の多くは、依然として化学療法的介入に抵抗したままである。
【０００４】
テロメアは、真核生物の線状染色体の末端に存在する反復性核酸配列である。テロメア配列は、テロメア結合タンパク質と一緒になって、染色体に安定性をもたらす。テロメアは概して、その生物に特有のテロメラーゼ酵素により定められるリピート配列単位を有する短いタンデムリピートから構成される。テロメアリピート配列は、さまざまな生物に関して知られている。ヒトテロメアリピート配列単位は（ＴＴＡＧＧＧ）ｎである。二本鎖リピート配列に加えて、一部のテロメアの３’末端は一本鎖領域を含み、ヒトの一本鎖領域は、Ｇリッチ鎖に位置する。
【０００５】
テロメラーゼは、テロメアＤＮＡを合成するリボタンパク質である。ＤＮＡポリメラーゼは線状二本鎖ＤＮＡの末端を複製できないので、テロメラーゼの不在下では、テロメアは徐々に短くなる。テロメアの段階的な短縮は、最終的に細胞周期の停止または細胞死につながる。ヒトにおいて、出生前の正常な体細胞におけるテロメラーゼの抑制、出生時および生涯を通じた初期のテロメアの長さ、および前駆細胞または幹細胞におけるテロメラーゼ発現の強い制御のため、細胞においてテロメアの長さに依存した死が発生する。ヒトは、「完全長」のテロメアで生まれる。テロメラーゼは体組織において下方制御されるので、この下方制御が、細胞年齢および暦年齢によりテロメアＤＮＡの喪失につながる。したがって、テロメアは、細胞分裂時計（ｍｉｔｏｔｉｃ  ｃｌｏｃｋ）として作用し、正常なヒト細胞において有限の分裂能力をもたらす。短いテロメアは、幹細胞の増殖能力を損なう。例えば、表皮幹細胞における短いテロメアは、皮膚および毛髪の成長を損なう。
【０００６】
がん細胞は概して、細胞分裂のラウンドの繰り返しを受け、安定であるが正常細胞より短いテロメアを有する。テロメラーゼの活性化は、大部分のがん細胞にとって無限に複製するために必要であり、腫瘍成長および転移を可能にする（Ｋｉｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：２０１１−２０１５；Ｓｈａｙ  ＪＷおよびＷｒｉｇｈｔ  ＷＥ．、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２６：８６７−７４（２００５））。したがって、テロメラーゼの阻害は、広範囲の固形腫瘍タイプおよび血液悪性腫瘍に対する有望な処置戦略とみなされる（Ｈａｒｌｅｙ  ＣＢ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ、８：１６７−１７９（２００８））。
【０００７】
残念ながら、多くのがん患者は、細胞毒性作用物質または標的療法（例えば、テロメラーゼ阻害剤）から利益を得ていないが、それらの毒性作用に曝露されたままである。これらの理由により、これらの治療薬による処置に順調に応答すると思われるがん患者を同定する新規な方法が、至急必要である。
本明細書を通して、さまざまな特許、特許出願および他のタイプの刊行物（例えば雑誌論文）が参照される。本明細書に引用されたすべての特許、特許出願および刊行物の開示は、すべての目的のために、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｋｉｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：２０１１−２０１５
【非特許文献２】Ｓｈａｙ  ＪＷおよびＷｒｉｇｈｔ  ＷＥ．、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２６：８６７−７４（２００５）
【非特許文献３】Ｈａｒｌｅｙ  ＣＢ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ、８：１６７−１７９（２００８）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本明細書において提供される発明は、とりわけ、テロメラーゼ阻害剤療法による処置から利益を得ると思われる個体を同定する方法およびこれら個体の処置方法を開示する。
【００１０】
したがって、一態様において、テロメラーゼ阻害剤による処置から利益を得ると思われる、がんを有すると診断された、またはがんを有する疑いのある個体を選択する方法であって、個体由来の生体試料中に存在するがん細胞におけるテロメア核酸の相対的長さを分析することによって、相対的テロメア長を決定するステップ；および個体由来の生体試料中に存在するがん細胞における平均相対的テロメア長が、１以上の公知の標準から決定された相対的テロメア長範囲の５０パーセンタイル以下である事が決定される場合、テロメラーゼ阻害剤による処置から利益を得ると思われる個体を選択するステップ、を含む方法を本明細書において提供する。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、テロメラーゼ阻害剤はオリゴヌクレオチドを含む。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、テロメラーゼのＲＮＡ成分に相補的である。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、１０−２０塩基対の長さである。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、配列ＴＡＧＧＧＴＴＡＧＡＣＡＡ（配列番号３）を含む。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＮ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデートヌクレオシド間結合を含む。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、Ｎ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデートヌクレオシド間結合を含む。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの５’および／または３’末端に連結された脂質部分を含む。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、脂質部分は、オリゴヌクレオチドの５’および／または３’末端に、リンカーによって連結される。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、リンカーは、グリセロールまたはアミノグリセロールリンカーである。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、脂質部分は、パルミトイル（Ｃ１６）部分である。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、テロメラーゼ阻害剤は、イメテルスタット（Ｉｍｅｔｅｌｓｔａｔ）である。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、がんは、小細胞肺がん、乳がん、前立腺がんまたは血液がんである。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、テロメラーゼ阻害剤の投与は、がん細胞の増殖および／または腫瘍成長の減少をもたらす。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、テロメラーゼ阻害剤の投与は、個体における無増悪生存の上昇をもたらす。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、テロメラーゼ阻害剤は、薬学的に許容され得る賦形剤と一緒に投与される。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、テロメラーゼ阻害剤は、経口、静脈内、皮下、筋肉内、局所、腹腔内、鼻腔内、吸入、腫瘍内または眼球内の投与のために製剤化される。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、治療有効量のテロメラーゼ阻害剤の投与は、１以上のがん細胞とテロメラーゼ阻害剤とを接触させるステップを含む。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、治療有効量のテロメラーゼ阻害剤の投与は、細胞増殖の減少、アポトーシスの増加または細胞の老化の１以上をもたらす。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、本方法は、治療有効量の１以上の追加のがん治療薬を、個体に投与するステップをさらに含む。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、平均テロメア長は、ｑＰＣＲ、ｔｅｌｏ−ＦＩＳＨまたはサザンブロットにより決定される。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、個体はヒトである。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、前記１以上の公知の標準は、特徴付けられた細胞系である。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、細胞系は、Ｍ１４Ｍｅｌ−細胞、Ａ５４９細胞、ＳＫ−Ｍｅｌ−５細胞およびＯｖｃａｒ−５細胞からなる群から選択される。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、特徴付けられた細胞系は、本明細書に開示の実施形態のいずれかの生体試料のタイプを代表する細胞系から選択される。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、特徴付けられた細胞系は、非小細胞肺がん細胞系、肝細胞細胞系または卵巣細胞系である。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、前記１以上の公知の標準は、複数の個体由来の複数の天然腫瘍から確立されたテロメア長範囲である。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、複数の天然腫瘍由来の前記がん細胞は、個体由来の生体試料中に存在するがん細胞と同じタイプである。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、生体試料中に存在するがん細胞におけるテロメア長は、テロメア長範囲の４０パーセンタイル、３５パーセンタイル、３０パーセンタイル、２５パーセンタイル、２０パーセンタイル、１５パーセンタイル、１０パーセンタイル、５パーセンタイルの範囲であること、またはテロメア長範囲より短いことが決定される。
【００１１】
別の態様において、がんを有すると診断された、またはがんを有する疑いのある個体を処置する方法であって、個体由来の生体試料中に存在するがん細胞におけるテロメア核酸の相対的長さを分析することによって相対的テロメア長を決定するステップ；個体由来の生体試料中に存在するがん細胞における平均相対的テロメア長が、１以上の公知の標準から決定された相対的テロメア長範囲の５０パーセンタイル以下である事が決定される場合、テロメラーゼ阻害剤による処置から利益を得ると思われる個体を選択するステップ；ならびに治療有効量のテロメラーゼ阻害剤を個体に投与するステップ、を含む方法を本明細書において提供する。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、テロメラーゼ阻害剤はオリゴヌクレオチドを含む。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、テロメラーゼのＲＮＡ成分に相補的である。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、１０−２０塩基対の長さである。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、配列ＴＡＧＧＧＴＴＡＧＡＣＡＡ（配列番号３）を含む。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＮ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデートヌクレオシド間結合を含む。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、Ｎ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデートヌクレオシド間結合を含む。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの５’および／または３’末端に連結された脂質部分を含む。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、脂質部分は、オリゴヌクレオチドの５’および／または３’末端にリンカーによって連結される。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、リンカーは、グリセロールまたはアミノグリセロールリンカーである。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、脂質部分は、パルミトイル（Ｃ１６）部分である。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、テロメラーゼ阻害剤はイメテルスタットである。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、がんは、小細胞肺がん、乳がん、前立腺がんまたは血液がんである。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、テロメラーゼ阻害剤の投与は、がん細胞の増殖および／または腫瘍成長の減少をもたらす。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、テロメラーゼ阻害剤の投与は、個体における無増悪生存の上昇をもたらす。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、テロメラーゼ阻害剤は、薬学的に許容され得る賦形剤と一緒に投与される。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、テロメラーゼ阻害剤は、経口、静脈内、皮下、筋肉内、局所、腹腔内、鼻腔内、吸入、腫瘍内または眼球内の投与のために製剤化される。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、治療有効量のテロメラーゼ阻害剤の投与は、１以上のがん細胞とテロメラーゼ阻害剤とを接触させるステップを含む。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、治療有効量のテロメラーゼ阻害剤の投与は、細胞増殖の減少、アポトーシスの増加または細胞の老化の１以上をもたらす。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、本方法は、治療有効量の１以上の追加のがん治療薬を、個体に投与するステップをさらに含む。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、平均テロメア長は、ｑＰＣＲ、ｔｅｌｏ−ＦＩＳＨまたはサザンブロットにより決定される。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、個体はヒトである。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、前記１以上の公知の標準は、特徴付けられた細胞系である。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、細胞系は、Ｍ１４Ｍｅｌ−細胞、Ａ５４９細胞、ＳＫ−Ｍｅｌ−５細胞およびＯｖｃａｒ−５細胞からなる群から選択される。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、特徴付けられた細胞系は、本明細書に開示の実施形態のいずれかの生体試料のタイプを代表する細胞系から選択される。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、特徴付けられた細胞系は、非小細胞肺がん細胞系、肝細胞細胞系または卵巣細胞系である。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、前記１以上の公知の標準は、複数の個体由来の複数の天然腫瘍から確立されたテロメア長範囲である。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、複数の天然腫瘍由来の前記がん細胞は、個体由来の生体試料中に存在するがん細胞と同じタイプである。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、生体試料中に存在するがん細胞におけるテロメア長は、テロメア長範囲の４０パーセンタイル、３５パーセンタイル、３０パーセンタイル、２５パーセンタイル、２０パーセンタイル、１５パーセンタイル、１０パーセンタイル、５パーセンタイルの範囲であること、またはテロメア長範囲より短いことが決定される。
【００１２】
さらに他の態様において、がんを有すると診断された、またはがんを有する疑いのある個体を処置する方法であって、個体由来の生体試料中に存在するがん細胞における平均相対的テロメア長が、１以上の公知の標準から決定された相対テロメア長範囲の５０パーセンタイル以下であることが決定された場合、治療有効量のテロメラーゼ阻害剤を個体に投与するステップ、を含む方法を、本明細書において提供する。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、テロメラーゼ阻害剤はオリゴヌクレオチドを含む。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、テロメラーゼのＲＮＡ成分に相補的である。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、１０−２０塩基対の長さである。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、配列ＴＡＧＧＧＴＴＡＧＡＣＡＡ（配列番号３）を含む。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＮ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデートヌクレオシド間結合を含む。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、Ｎ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデートヌクレオシド間結合を含む。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの５’および／または３’末端に連結された脂質部分を含む。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、脂質部分は、オリゴヌクレオチドの５’および／または３’末端にリンカーによって連結される。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、リンカーは、グリセロールまたはアミノグリセロールリンカーである。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、脂質部分は、パルミトイル（Ｃ１６）部分である。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、テロメラーゼ阻害剤はイメテルスタットである。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、がんは、小細胞肺がん、乳がん、前立腺がんまたは血液がんである。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、テロメラーゼ阻害剤の投与は、がん細胞の増殖および／または腫瘍成長の減少をもたらす。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、テロメラーゼ阻害剤の投与は、個体における無増悪生存の上昇をもたらす。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、テロメラーゼ阻害剤は、薬学的に許容され得る賦形剤と一緒に投与される。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、テロメラーゼ阻害剤は、経口、静脈内、皮下、筋肉内、局所、腹腔内、鼻腔内、吸入、腫瘍内または眼球内の投与のために製剤化される。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、治療有効量のテロメラーゼ阻害剤の投与は、１以上のがん細胞とテロメラーゼ阻害剤とを接触させるステップを含む。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、治療有効量のテロメラーゼ阻害剤の投与は、細胞増殖の減少、アポトーシスの増加または細胞の老化の１以上をもたらす。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、本方法は、治療有効量の１以上の追加のがん治療薬を、個体に投与するステップをさらに含む。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、平均テロメア長は、ｑＰＣＲ、ｔｅｌｏ−ＦＩＳＨまたはサザンブロットにより決定される。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、個体はヒトである。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、前記１以上の公知の標準は、特徴付けられた細胞系である。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、細胞系は、Ｍ１４Ｍｅｌ−細胞、Ａ５４９細胞、ＳＫ−Ｍｅｌ−５細胞およびＯｖｃａｒ−５細胞からなる群から選択される。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、特徴付けられた細胞系は、本明細書に開示の実施形態のいずれかの生体試料のタイプを代表する細胞系から選択される。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、特徴付けられた細胞系は、非小細胞肺がん細胞系、肝細胞細胞系または卵巣細胞系である。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、前記１以上の公知の標準は、複数の個体由来の複数の天然腫瘍から確立されたテロメア長範囲である。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、複数の天然腫瘍由来の前記がん細胞は、個体由来の生体試料中に存在するがん細胞と同じタイプである。本明細書に開示の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、生体試料中に存在するがん細胞におけるテロメア長は、テロメア長範囲の４０パーセンタイル、３５パーセンタイル、３０パーセンタイル、２５パーセンタイル、２０パーセンタイル、１５パーセンタイル、１０パーセンタイル、５パーセンタイルの範囲であること、またはテロメア長範囲より短いことが決定される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】図１Ａは、実施例２に示された定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を使用して決定された平均テロメア長に基づく、イメテルスタットの非小細胞（ＮＳＣ）肺がん第ＩＩ相（ＣＰ１４Ｂ−０１２）試験の短いテロメアサブグループ（３３パーセンタイル）の無増悪生存（ＰＦＳ）分析を表す図である。
【００１４】
【図１Ｂ】図１Ｂは、実施例２に示された定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を使用して決定された平均テロメア長に基づく、イメテルスタットの非小細胞（ＮＳＣ）肺がん第ＩＩ相（ＣＰ１４Ｂ−０１２）試験の中程度−長いテロメアサブグループ（相対的テロメア長のより長い６７％）の無増悪生存（ＰＦＳ）分析を表す図である。
【００１５】
【図２】図２は、相対的テロメア長の最も短い２５パーセンタイルを有する、イメテルスタットの非小細胞（ＮＳＣ）肺がん第ＩＩ相（ＣＰ１４Ｂ−０１２）試験のイメテルスタットによる処置アームにおける１５人の患者からのデータの無増悪生存（ＰＦＳ）分析を表す図である。これらの患者の個別のテロメア長の分析は、テロメア蛍光インサイツハイブリダイゼーション（Ｔｅｌｏ−ＦＩＳＨ）を使用して実施した。
【００１６】
【図３Ａ】図３Ａは、サザンブロットにより決定された、ヒトホルマリン固定・パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）腫瘍細胞系、Ｍ１４Ｍｅｌ、ＯＶＣＡＲ−８、Ａ５４９、ＳＫ−Ｍｅｌ−５、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ４３５、ＯＶＣＡＲ−５、Ａ４９８およびＣＡＫＩ−１における末端制限酵素切断断片（ＴＲＦ）長を表す図である。
【００１７】
【図３Ｂ】図３Ｂは、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により決定された、ヒトホルマリン固定・パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）腫瘍細胞系、Ｍ１４Ｍｅｌ、ＯＶＣＡＲ−８、Ａ５４９、ＳＫ−Ｍｅｌ−５、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ４３５、ＯＶＣＡＲ−５、Ａ４９８およびＣａｋｉ−１における平均Ｔ／Ｓ比を表す図である。
【００１８】
【図４Ａ】図４Ａは、サザンブロットにより決定された、ヒトホルマリン固定・パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）腫瘍細胞系、Ｍ１４Ｍｅｌ、ＯＶＣＡＲ−８、Ａ５４９、ＳＫ−Ｍｅｌ−５、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ４３５、ＯＶＣＡＲ−５、Ａ４９８およびＣＡＫＩ−１における末端制限酵素切断断片（ＴＲＦ）長を表す図である。
【００１９】
【図４Ｂ】図４Ｂは、ヒト細胞系、Ｍ１４Ｍｅｌ、Ａ５４９、ＳＫ−Ｍｅｌ−５およびＯＶＣＡＲ−５（ＯＶ５）に関するＴｅｌｏ−ＦＩＳＨの結果を表す図である。
【００２０】
【図５】図５は、患者のテロメア長パーセンタイルに対してプロットされたイメテルスタットの非小細胞（ＮＳＣ）肺がん第ＩＩ相（ＣＰ１４Ｂ−０１２）試験由来の、患者に関する無増悪生存（ＰＦＳ）ハザード比（ＨＲ）を表す図であり、相対的テロメア長は、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により決定された。
【００２１】
【図６】図６は、患者のテロメア長のパーセンタイルに対してプロットされた、イメテルスタットの非小細胞（ＮＳＣ）肺がん第ＩＩ相（ＣＰ１４Ｂ−０１２）試験由来の、患者に関する無増悪生存（ＰＦＳ）ハザード比（ＨＲ）を表し、相対的テロメア長は、テロメア蛍光インサイツハイブリダイゼーション（Ｔｅｌｏ−ＦＩＳＨ）により決定された。
【００２２】
【図７】図７は、前向きテロメア蛍光インサイツハイブリダイゼーション（Ｔｅｌｏ−ＦＩＳＨ）アッセイを使用して決定された相対的テロメア長に基づく、イメテルスタットの非小細胞肺がん第ＩＩ相（ＣＰ１４Ｂ−０１２）試験の１１４人すべての患者に関する無増悪生存（ＰＦＳ）分析を表す図である。
【００２３】
【図８Ａ】図８Ａは、前向きＴｅｌｏ−ＦＩＳＨアッセイを使用して決定された相対的テロメア長に基づく、イメテルスタットの非小細胞肺がん第ＩＩ相（ＣＰ１４Ｂ−０１２）試験の短いテロメアサブグループ（Ｎ＝２０）の無増悪生存（ＰＦＳ）分析を表す図である。
【００２４】
【図８Ｂ】図８Ｂは、前向きＴｅｌｏ−ＦＩＳＨアッセイを使用して決定された相対的テロメア長に基づく、イメテルスタットの非小細胞肺がん第ＩＩ相（ＣＰ１４Ｂ−０１２）試験の中程度−長いテロメアサブグループ（Ｎ＝３９）の無増悪生存（ＰＦＳ）分析を表す図である。
【００２５】
【図９】図９は、前向きＴｅｌｏ−ＦＩＳＨアッセイを使用して決定された相対的テロメア長に基づく、イメテルスタットの非小細胞肺がん第ＩＩ相（ＣＰ１４Ｂ−０１２）試験におけるすべての患者（Ｎ＝１１４）に関する全生存（ＯＳ）分析を表す図である。
【００２６】
【図１０Ａ】図１０Ａは、前向きＴｅｌｏ−ＦＩＳＨアッセイを使用して決定された相対的テロメア長に基づく、イメテルスタットの非小細胞肺がん第ＩＩ相（ＣＰ１４Ｂ−０１２）試験における短いテロメアサブグループ（Ｎ＝２０）に関する全生存（ＯＳ）分析を表す図である。
【００２７】
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、前向きＴｅｌｏ−ＦＩＳＨアッセイを使用して決定された相対的テロメア長に基づく、イメテルスタットの非小細胞肺がん第ＩＩ相（ＣＰ１４Ｂ−０１２）試験における中程度−長いテロメアサブグループ（Ｎ＝３９）に関する全生存（ＯＳ）分析を表す図である。
【００２８】
【図１１Ａ】図１１Ａは、実施例４に示された定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を使用して決定された平均テロメア長に基づく、イメテルスタットの非小細胞（ＮＳＣ）肺がん第ＩＩ相（ＣＰ１４Ｂ−０１２）試験の短いテロメアサブグループ（３３パーセンタイル）の無増悪生存（ＰＦＳ）分析を表す図である。
【００２９】
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、実施例４に示された定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を使用して決定された平均テロメア長に基づく、イメテルスタットの非小細胞（ＮＳＣ）肺がん第ＩＩ相（ＣＰ１４Ｂ−０１２）試験の中程度−長いテロメアサブグループ（相対的テロメア長のより長い６７％）の無増悪生存（ＰＦＳ）分析を表す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明は、とりわけ、テロメラーゼ阻害化合物による処置から利益を得ると思われる、細胞増殖性障害を有する疑いのある、または有すると診断された個体を同定する方法およびこれら個体の処置方法を提供する。がん細胞におけるテロメア長は、腫瘍によって異なり得る。本発明者らは、短いテロメア長を有するがん細胞が、長いテロメア長を有するがん細胞と比較して、テロメラーゼ阻害化合物（例えばイメテルスタット）による処置に対してより応答性であることを観察した。したがって、テロメラーゼ阻害剤による処置から利益を得ると思われる、がんを有すると診断された、またはがんを有する疑いのある個体を選択する方法を、本明細書において提供する。さらに、個体由来の生体試料中に存在するがん細胞における平均相対的テロメア長が、１以上の公知の標準から決定された相対的テロメア長範囲の５０パーセンタイル以下であると決定された場合、がんを有すると診断された、またはがんを有する疑いのある個体を、テロメラーゼ阻害剤により処置する方法を、本明細書において提供する。
Ｉ．一般技術
【００３１】
本発明の実践は、特に他のことが示されない限り、核酸化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学における従来技術を用い、これらは当業者には周知である。このような技術は、文献、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌ、２００１）、（本明細書において、併せて「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」と称される）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７、２００１までの捕捉を含む）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ、（Ｍｕｌｌｉｓら編、１９９４）に十分に説明されている。核酸は、周知の化学合成技術によりインビトロで合成することができ、これら技術は、例えば、Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ（１９８２）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．４７：４１１−４１８；Ａｄａｍｓ（１９８３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０５：６６１；Ｂｅｌｏｕｓｏｖ（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．５  ２５：３４４０−３４４４；Ｆｒｅｎｋｅｌ（１９９５）Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１９：３７３−３８０；Ｂｌｏｍｍｅｒｓ（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３３：７８８６−７８９６；Ｎａｒａｎｇ（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０；Ｂｒｏｗｎ（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９；Ｂｅａｕｃａｇｅ（１９８１）Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．２２：１８５９；ＫｏｍｂｅｒｇおよびＢａｋｅｒ、ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、第２版（Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、１９９２）；Ｓｃｈｅｉｔ、Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｓ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８０）；ＵｈｌｍａｎｎおよびＰｅｙｍａｎ、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、９０：５４３−５８４、１９９０に記載されている。
ＩＩ．定義
【００３２】
「ヌクレオシド」という用語は、下記に表された一般構造を有する部分を指し、式中、Ｂは核酸塩基を表し、２’炭素が下記のように置換されていてもよい。オリゴマーまたはポリマーに組み込まれる場合、３’炭素は、酸素または窒素原子にさらに連結される。
【化１】
2018099127.tif 000002
【００３３】
この構造は、２’−デオキシおよび２’−ヒドロキシル（すなわち、デオキシリボースおよびリボース）型ならびに類似体を含む。あまり一般的ではないが、５’−ＮＨ基が、５’−酸素と置換されてもよい。ヌクレオシドに関する言及において、「類似体」は、修飾核酸塩基部分（下記の「核酸塩基」の定義を参照されたい）および／または修飾糖部分（例えば、２’−フルオロ糖）を有する合成ヌクレオシド、ならびにさらなる類似体を含む。このような類似体は、通常、結合特性、例えば安定性、特異性などに影響を及ぼすためにデザインされる。ヌクレオシドという用語は、２’−デオキシおよび２’−ヒドロキシ型を含む天然ヌクレオシド、例えば、ＫｏｍｂｅｒｇおよびＢａｋｅｒ、ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、第２版（Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、１９９２）に記載されたヌクレオシドならびに類似体を含む。ヌクレオシドに関する言及において、「類似体」は、例えば、Ｓｃｈｅｉｔ、Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｓ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８０）により一般的に記載された、修飾核酸塩基部分（下記の「核酸塩基」の定義を参照されたい）および／または修飾糖部分を有する合成ヌクレオシドを含む。このような類似体は、結合特性、例えば安定性、特異性などを強化するためにデザインされた合成ヌクレオシドを含み、例えば、ＵｈｌｍａｎｎおよびＰｅｙｍａｎ、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ９０：５４３−５８４、１９９０に開示されている）。このようなヌクレオシドを含有するオリゴヌクレオチドは、通常合成ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間結合を含有し、それ自体が「類似体」と称され得る。
【００３４】
「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」は、リボースおよび／またはデオキシリボースのヌクレオシドサブユニットの、約２から約２００の間の連続サブユニットを有するポリマーまたはオリゴマーを指す。ヌクレオシドサブユニットは、さまざまなサブユニット間結合により接合されることがあり、このようなサブユニット間結合は、限定するものではないが、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、Ｐ３’→Ｎ５’ホスホルアミデート、Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート、Ｎ３→Ｐ５’チオホスホルアミデートおよびホスホロチオエート結合を含む。この用語は、糖（例えば、２’置換）、塩基（上記の「ヌクレオシド」の定義を参照されたい）ならびに３’および５’の末端への当業者に公知の修飾を有するオリゴマーまたはポリマーもまた含む。オリゴヌクレオチド部分が複数のサブユニット間結合を含む実施形態において、各結合は、同じ化学的構造を使用して形成されてもよく、または結合化学構造の混合を使用してもよい。オリゴヌクレオチドが、文字配列、例えば「ＡＴＧＵＣＣＴＧ」により表される場合、ヌクレオチドは、左から右に５’→３’の順であると理解される。この様式のオリゴヌクレオチドの塩基配列の表現は、オリゴヌクレオチドにおけるヌクレオシド間サブユニットのいずれかの特定のタイプの使用を意味するものではない。
【００３５】
「核酸塩基」は、（ｉ）天然のＤＮＡおよびＲＮＡ核酸塩基（ウラシル、チミン、アデニン、グアニンおよびシトシン）、（ｉｉ）修飾された核酸塩基または核酸塩基類似体（例えば、５−メチルシトシン、５−ブロモウラシルまたはイノシン）ならびに（ｉｉｉ）核酸塩基類似体を含む。核酸塩基類似体は、その分子構造が、通常のＤＮＡまたはＲＮＡの塩基の構造を模倣した化合物である。
【００３６】
「脂質」という用語は、有機溶媒には可溶性であるが、水には可溶であるとしてもほんのわずかである物質を包含するように、本明細書において広範囲に使用される。脂質という用語は、限定するものではないが、炭化水素、油、脂肪（例えば、脂肪酸およびグリセリド）、ステロール、ステロイドおよびこれらの化合物の誘導体型を含む。いくつかの実施形態において、脂質は、脂肪酸およびこれらの誘導体、炭化水素およびこれらの誘導体ならびにステロール、例えばコレステロールである。脂肪酸は普通、直鎖中に偶数個の炭素原子（通常１２−２４個の炭素）を含有し、飽和していても、または不飽和であってもよく、さまざまな置換基を含有しても、または含有するように修飾されていてもよい。簡潔にするために、「脂肪酸」という用語はまた、脂肪酸誘導体、例えば脂肪またはエステルを包含する。いくつかの実施形態において、「脂質」という用語は、脂質および親水性部分の両方を含有する両親媒性化合物もまた含む。
【００３７】
本明細書において使用する場合、「テロメア核酸」という用語は、哺乳動物のテロメア配列をコードする、二本鎖または一本鎖の核酸上の核酸配列を意味する。ヒトにおいて、テロメアリピート配列は、一方の鎖においてＴＴＡＧＧＧであり、他方の鎖においてＣＣＣＴＡＡである。
【００３８】
「テロメラーゼ阻害剤」は、哺乳動物細胞においてテロメラーゼ逆転写酵素の活性を減少させることまたは阻害することが可能な化合物である。このような阻害剤は、本明細書に記載のような低分子化合物、または本明細書に記載のようなオリゴヌクレオチドを含むｈＴＲ鋳型阻害剤であってよい。一態様において、テロメラーゼ阻害剤はイメテルスタットである。
【００３９】
「ｈＴＲ鋳型阻害剤」は、ヒトテロメラーゼのＲＮＡ成分の鋳型領域（本明細書において配列番号１のヌクレオチド３０−６７に及ぶ領域）を遮断し、それによって酵素の活性を阻害する化合物である。ｈＴＲ鋳型阻害剤は、通常、この領域にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、本明細書の配列番号１のヌクレオチドの４６−５６に及ぶ配列５’−ＣＵＡＡＣＣＣＵＡＡＣ−３’（配列番号２）を有するこの領域のより特定の部分とハイブリダイズするために有効な配列を含む。
【００４０】
化合物の存在下での細胞の増殖が、該化合物の不在下で観察される細胞の増殖より低い場合に、化合物は、「細胞の増殖を阻害する」と言われる。すなわち、細胞の増殖は、該化合物の存在下で遅延されるか、または停止されるかのいずれかである。がんの細胞増殖の阻害は、例えば、細胞の数もしくは細胞の拡大速度の減少、腫瘍量もしくは腫瘍成長速度の減少、または処置される対象の生存率の上昇により証明される。
【００４１】
「ヌクレアーゼ耐性結合」を有するオリゴヌクレオチドは、その骨格が、体内の一般的な細胞外および細胞内のヌクレアーゼによる非ハイブリダイズ型またはハイブリダイズ型のヌクレアーゼ切断に実質的に耐性であるサブユニット結合を有するオリゴヌクレオチドを指し、すなわち、オリゴヌクレオチドは、曝露される体内における正常なヌクレアーゼ条件下で、ヌクレアーゼによる切断が殆ど示されない、または全く示されない。下記のＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート（ＮＰ）またはＮ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデート（ＮＰＳ）結合は、ヌクレアーゼ耐性である。
【００４２】
「個体」は、哺乳動物、例えば任意の一般的実験室モデル生物であってよい。哺乳動物としては、限定するものではないが、ヒト、非ヒト霊長類、家畜、競技用動物、ペット、マウス、ラットおよび他のげっ歯類が挙げられる。いくつかの実施形態において、個体はヒトである。
【００４３】
本明細書において使用する場合「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」（およびこれらの文法的変形、例えば「処置する（ｔｒｅａｔ）」または「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、臨床病理学の過程の間に、処置される個体または細胞の自然経過を改変するためにデザインされた臨床的介入を指す。処置の望ましい効果としては、限定するものではないが、疾患進行の速度の低下、疾患状態の改善もしくは緩和、および予後の寛解もしくは改善が挙げられる。
【００４４】
本明細書において使用する場合、「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」は、個体において疾患または疾患に関連する症状の発症または再発に関する予防を提供することを含む。個体は、疾患にかかりやすい、疾患に陥りやすい、または疾患発症のリスクを有する可能性があるが、未だ疾患と診断されていない。
【００４５】
「有効量」または「治療有効量」は、所望の治療効果を生み出すために有効な、単回用量または一連の用量の一部のいずれかとして哺乳動物対象に投与される治療用化合物、例えばテロメラーゼ阻害剤の量を指す。
【００４６】
「生体試料」は、個体から得られる組織、血液、リンパ液または脳脊髄液の試料である。生体試料は、個体からがん性腫瘍を除去する間に得られた試料であってもよい。生体試料は、新鮮な組織またはホルマリン固定・パラフィン包埋組織または凍結組織を含んでよい。
【００４７】
本明細書において使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、特に他のことが示されない限り、複数への言及を含む。
【００４８】
本明細書に記載の発明の態様および実施形態は、態様および実施形態を「含む」、「からなる」、「から本質的になる」を含むことが理解される。
【００４９】
本明細書を通して示される個々の最大数値の限定は、個々のより低い数値限定を、このようなより低い数値限定が本明細書に明示的に記載されたかのように含むことが意図される。本明細書を通して示される個々の最小数値の限定は、個々のより高い数値限定を、このようなより高い数値限定が本明細書に明示的に記載されたかのように含む。本明細書を通して示される個々の数値範囲は、このようなより広い数値範囲内に収まる、個々のより狭い数値範囲を、このようなより狭い数値範囲が本明細書に明示的にすべて記載されたかのように含む。
ＩＩＩ．テロメラーゼ阻害化合物
【００５０】
テロメラーゼは、（ヒトにおいて配列５’−ＴＴＡＧＧＧ−３’を有する）テロメアリピート配列の染色体末端への付加を触媒するリボ核タンパク質である。例えば、Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ、１９９２、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：１１３−１２９を参照されたい。この酵素は、大部分のがん細胞において発現されるが、成熟体細胞では発現されない。テロメアＤＮＡの喪失は、細胞老化の誘発において役割を果たし得る；Ｈａｒｌｅｙ、１９９１、Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２５６：２７１−２８２を参照されたい。皮膚、結合組織、脂肪、乳房、肺、胃、膵臓、卵巣、子宮頸部、子宮、腎臓、膀胱、結腸、前立腺、中枢神経系（ＣＮＳ）、網膜のがんおよび血液腫瘍（例えば、骨髄腫、白血病およびリンパ腫）由来の細胞を含む、さまざまながん細胞は、テロメラーゼ−陽性であることが示されている。テロメラーゼの標的化は、悪性細胞と正常細胞とを高度に識別して、分裂細胞を無差別に標的化する化学療法レジメンに伴い得る有害副作用の多くを回避する処置の提供において有効であり得る。
【００５１】
今日までに同定されたテロメラーゼの阻害剤は、オリゴヌクレオチド（例えば、ヌクレアーゼ耐性結合を有するオリゴヌクレオチド）および低分子化合物を含む。テロメラーゼ阻害化合物に関するさらなる情報は、米国特許第７，９９８，９３８号に見出すことができ、当該特許の開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
Ａ．低分子化合物
【００５２】
テロメラーゼの低分子阻害剤としては、例えば、ＢＲＡＣＯ１９（（９−（４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）フェニルアミノ）−３，６−ビス（３−ピロロジノプロピオンアミド）アクリジン（Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６１（５）：１１５４−６２、２００２を参照されたい）；ＤＯＤＣ（ジエチルオキサジカルボシアニン）およびテロメスタチンが挙げられる。これらの化合物は、Ｇ−ｑｕａｄ安定剤として作用でき、Ｇ−ｑｕａｄ安定剤は、テロメラーゼのＲＮＡ成分中の不活性なＧ−ｑｕａｄ構造の形成を促進する。テロメラーゼの他の低分子阻害剤としては、ＢＩＢＲ１５３２（２−［（Ｅ）−３−ナフテン−２−イルブタ−２−エノイルアミノ］安息香酸）（Ｗａｒｄ＆Ａｕｔｅｘｉｅｒ、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６８：７７９−７８６、２００５；さらにＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（１８）：１５５６６−７２、２００２を参照されたい）；ＡＺＴおよび他のヌクレオシド類似体、例えばｄｄＧおよびａｒａ−Ｇ（例えば、米国特許第５，６９５，９３２号および第６，３６８，７８９号を参照されたい）および特定のチオピリジン、ベンゾ［ｂ］チオフェンならびにピリド［ｂ］チオフェン誘導体（Ｇａｅｔａら、米国特許第５，７６７，２７８号、第５，７７０，６１３号、第、５，８６３，９３６号、第５，６５６，６３８号および第５，７６０，０６２号に記載）が挙げられ、当該特許の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。別の例は、３−クロロベンゾ［ｂ］チオフェン−２−カルボキシ−２’−［（２，５−ジクロロフェニルアミノ）チア］ヒドラジン（米国特許第５，７６０，０６２号に記載）であり、当該特許は参照により本明細書に組み込まれる。
Ｂ．オリゴヌクレオチド系テロメラーゼ阻害剤：配列および組成物
【００５３】
ヒトテロメラーゼのタンパク質およびＲＮＡ成分の両方をコードする遺伝子はクローン化され、配列決定されている（米国特許第６，２６１，８３６号および第５，５８３，０１６号をそれぞれ参照されたい、当該特許は両方とも参照により本明細書に組み込まれる）。オリゴヌクレオチドは、テロメラーゼタンパク質成分（そのヒト型は、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素またはｈＴＥＲＴとして公知である）をコードするｍＲＮＡまたはテロメラーゼホロ酵素のＲＮＡ成分（そのヒト型は、ヒトテロメラーゼＲＮＡまたはｈＴＲとして公知である）に対して標的化され得る。
【００５４】
ヒトテロメラーゼのＲＮＡ成分（ｈＴＲ）のヌクレオチド配列は、下記の配列リスト（配列番号１）に５’→３’の方向で示される。配列は、リボヌクレオチドに関する標準的略字を使用して示される；当業者は、配列がさらに、ｃＤＮＡの配列を表すことを理解し、ｃＤＮＡ配列中ではリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドにより置き換えられ、ウリジン（Ｕ）がチミジン（Ｔ）で置き換えられることを理解する。。ＲＮＡ成分の鋳型配列は、ヌクレオチド４６−５６（５’−ＣＵＡＡＣＣＣＵＡＡＣ−３’）（配列番号２）により定義される領域内に位置し、この配列は、約１と２／３のテロメアリピート単位からなるテロメア配列に相補的である。鋳型領域は、テロメラーゼが染色体の末端に付加させるテロメアリピートの配列を特定するために機能し、テロメラーゼ酵素の活性に必須である（例えば、Ｃｈｅｎら、Ｃｅｌｌ  １００：５０３−５１４、２０００；Ｋｉｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８（１４）：７９８２−７９８７、２００１を参照されたい）。ｍＲＮＡを阻害する、または破壊を引き起こす、アンチセンス、リボザイムまたは低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）作用物質のデザインは周知であり（例えば、Ｌｅｂｅｄｅｖａ，Ｉら、Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ、４１巻：４０３−４１９、２００１年４月；Ｍａｃｅｊａｋ，Ｄら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７３巻（９）：７７４５−７７５１、１９９９年９月およびＺｅｎｇ，Ｙ．ら、ＰＮＡＳ  １００巻（１７）ｐ．９７７９−９７８４、２００３年８月１９日を参照されたい）、このような作用物質は、ｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡを標的とするようにデザインされ、それによって標的細胞、例えばがん細胞中のｈＴＥＲＴタンパク質の産生を阻害することができる（例えば、米国特許第６，４４４，６５０号および第６，３３１，３９９号を参照されたい）。
【００５５】
ｈＴＲ（すなわち、酵素のＲＮＡ成分）を標的とするオリゴヌクレオチドは、ｈＴＲとｈＴＥＲＴタンパク質との相互作用を遮断する、またはそれ以外では干渉することによってテロメラーゼ酵素活性の阻害剤として作用し、この相互作用は、テロメラーゼ機能に必要である（例えば、Ｖｉｌｌｅｐｏｎｔｅａｕら、米国特許第６，５４８，２９８号を参照されたい）。
【００５６】
ｈＴＲの好ましい標的領域は、配列番号１（ＧＧＧＵＵＧＣＧＧＡＧＧＧＵＧＧＧＣＣＵＧＧＧＡＧＧＧＧＵＧＧＵＧＧＣＣＡＵＵＵＵＵＵＧＵＣＵＡＡＣＣＣＵＡＡＣＵＧＡＧＡＡＧＧＧＣＧＵＡＧＧＣＧＣＣＧＵＧＣＵＵＵＵＧＣＵＣＣＣＣＧＣＧＣＧＣＵＧＵＵＵＵＵＣＵＣＧＣＵＧＡＣＵＵＵＣＡＧＣＧＧＧＣＧＧＡＡＡＡＧＣＣＵＣＧＧＣＣＵＧＣＣＧＣＣＵＵＣＣＡＣＣＧＵＵＣＡＵＵＣＵＡＧＡＧＣＡＡＡＣＡＡＡＡＡＡＵＧＵＣＡＧＣＵＧＣＵＧＧＣＣＣＧＵＵＣＧＣＣＵＣＣＣＧＧＧＧＡＣＣＵＧＣＧＧＣＧＧＧＵＣＧＣＣＵＧＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＡＣＣＣＣＧＣＣＵＧＧＡＧＣＣＧＣＧＧＵＣＧＧＣＣＣＧＧＧＧＣＵＵＣＵＣＣＧＧＡＧＧＣＡＣＣＣＡＣＵＧＣＣＡＣＣＧＣＧＡＡＧＡＧＵＵＧＧＧＣＵＣＵＧＵＣＡＧＣＣＧＣＧＧＧＵＣＵＣＵＣＧＧＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＧＡＧＧＵＵＣＡＣＣＧＵＵＵＣＡＧＧＣＣＧＣＡＧＧＡＡＧＡＧＧＡＡＣＧＧＡＧＣＧＡＧＵＣＣＣＧＣＣＧＣＧＧＣＧＣＧＡＵＵＣＣＣＵＧＡＧＣＵＧＵＧＧＧＡＣＧＵＧＣＡＣＣＣＡＧＧＡＣＵＣＧＧＣＵＣＡＣＡＣＡＵＧＣＡＧＵＵＣＧＣＵＵＵＣＣＵＧＵＵＧＧＵＧＧＧＧＧＧＡＡＣＧＣＣＧＡＵＣＧＵＧＣＧＣＡＵＣＣＧＵＣＡＣＣＣＣＵＣＧＣＣＧＧＣＡＧＵＧＧＧＧＧＣＵＵＧＵＧＡＡＣＣＣＣＣＡＡＡＣＣＵＧＡＣＵＧＡＣＵＧＧＧＣＣＡＧＵＧＵＧＣＵ）のヌクレオチド３０−６７に及ぶ鋳型領域である。この領域を標的とするオリゴヌクレオチドは、本明細書において「ｈＴＲ鋳型阻害剤」と称される（例えば、Ｈｅｒｂｅｒｔら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ２１（４）：６３８−４２（２００２）を参照されたい）。好ましくは、このようなオリゴヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチド４６−５６に及ぶ配列５’−ＣＵＡＡＣＣＣＵＡＡＣ−３’（配列番号２）を有する１１−ヌクレオチド領域の一部分に相補的またはほぼ相補的な配列を含む。
【００５７】
別の好ましい標的領域は、ｈＴＲのヌクレオチド１３７−１７９に及ぶ領域である（Ｐｒｕｚａｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３０：５５９−５６８、２００２を参照されたい）。この領域内において、１４１−１５３に及ぶ配列は好ましい標的である。ＰＣＴ公開ＷＯ９８／２８４４２号は、テロメラーゼを阻害する少なくとも７ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドの使用を記載しており、このオリゴヌクレオチドは、ｈＴＲのヌクレオチド１３７−１９６、２９０−３１９および３５０−３８０を含む、鋳型領域の外側のｈＴＲ配列のアクセス可能な部分に相補的にデザインされる。
【００５８】
ｈＴＲ配列を標的とする治療用オリゴヌクレオチドの領域は、好ましくは、対応するｈＴＲ配列に正確に相補的である。場合により不一致は容認されるが、不一致は、得られたオリゴヌクレオチド接合体の特異性および活性を低下させると予測される。特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドの塩基配列は、したがって、ｈＴＲ標的に正確に相補的な少なくとも５ヌクレオチドの配列を含むように選択され、テロメラーゼ阻害の強化は、相補的配列の長さの増加、例えば、ｈＴＲ標的に正確に相補的な少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１３または少なくとも１５ヌクレオチドが用いられた場合に得ることができる。他の実施形態において、オリゴヌクレオチドの配列は、ｈＴＲ標的配列に正確に相補的な、少なくとも５から２０、少なくとも８から２０、少なくとも１０から２０または少なくとも１０から１５ヌクレオチドの配列を含む。
【００５９】
最適なテロメラーゼ阻害活性は、オリゴヌクレオチドの完全長が、ｈＴＲ標的配列に相補的であるように選択される場合に得ることができる。しかし、オリゴヌクレオチドの完全長が、必ずしも標的配列に正確に相補的である必要はなく、オリゴヌクレオチド配列は、標的配列に相補的でない領域を含んでもよい。このような領域は、例えば、他の特性を化合物にもたらすために付加され得、例えば、精製を容易にする配列が付加され得る。または、オリゴヌクレオチドは、ｈＴＲ標的配列に相補的な配列の多重反復を含んでもよい。
【００６０】
オリゴヌクレオチドが、標的配列に相補的でない領域を含む場合、このような領域は、通常５’または３’末端の一方または両方に位置する。ヒトテロメラーゼＲＮＡ（ｈＴＲ）を標的とする例示的配列は、下記を含む：
【００６１】
オリゴヌクレオチド中のヌクレオシド間結合は、利用可能なオリゴヌクレオチドの化学構造、例えば、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、Ｐ３’→Ｎ５’ホスホルアミデート、Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート、Ｎ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデートおよびホスホロチオエートのいずれかを含み得る。通常、必ずしも必要ではないが、オリゴヌクレオチド内のヌクレオシド間結合のすべては同じタイプのものであるが、オリゴヌクレオチド成分は、異なる結合の混合を使用して合成することもできる。
【００６２】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート（ＮＰ）またはＮ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデート（ＮＰＳ）結合を有し、この結合は、構造：３’−（−ＮＨ−−Ｐ（＝Ｏ）（−−ＸＲ）−−Ｏ−）−５’（式中、ＸはＯまたはＳであり、Ｒは、水素、アルキルおよびアリールからなる群から選択される）、ならびにＸＲがＯＨまたはＳＨである場合、その薬学的に許容され得る塩により表すことができる。他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、すべてＮＰを含み、いくつかの実施形態において、すべてＮＰＳ結合を含む。
【００６３】
一実施形態において、ｈＴＲ鋳型阻害剤オリゴヌクレオチドの配列は、上記の配列番号１のヌクレオチド４２−５４に相補的な配列である。この配列（ＴＡＧＧＧＴＴＡＧＡＣＡＡ；配列番号３）およびＮ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデート（ＮＰＳ）結合を有するオリゴヌクレオチドは、本明細書においてＧＲＮ１６３として指定されている。例えば、Ａｓａｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６３：３９３１−３９３９（２００３）およびＧｒｙａｚｎｏｖら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ２２（５−８）：５７７−８１（２００３）を参照されたい。
【００６４】
単独で投与されるオリゴヌクレオチドＧＲＮ１６３は、類表皮癌腫、乳房上皮、腎細胞癌腫、腎腺癌腫、膵臓、脳、結腸、前立腺、白血病、リンパ腫、骨髄腫、表皮、子宮頸部、卵巣および肝臓のがん細胞を含む、細胞培養においてインビトロで阻害活性を示した。
【００６５】
オリゴヌクレオチドＧＲＮ１６３はさらに試験され、卵巣がんならびに小細胞および非小細胞両方の肺がんを含むさまざまな動物腫瘍モデルにおいて、治療的に有効であることが示された（例えば、米国特許第７，９９８，９３８号を参照されたく、当該特許の開示は参照により組み込まれる）。
Ｃ．脂質−オリゴヌクレオチド接合体
【００６６】
いくつかの態様において、本明細書に開示のオリゴヌクレオチド系テロメラーゼ阻害剤は、少なくとも１つの共有結合された脂質基を含む（米国特許公開第２００５／０１１３３２５号を参照されたく、当該特許は参照により本明細書に組み込まれる）。この修飾は、より優れた細胞取り組み特性を提供し、それにより、非修飾型と比較してより少量の接合されたオリゴヌクレオチドを使用して、同等の生物学的効果を得ることができる。ヒト治療設定に適用する場合、これは、毒性リスクの低減およびコスト削減と解釈することができる。
【００６７】
脂質基Ｌは通常、脂肪族炭化水素または脂肪酸（炭化水素および脂肪酸の誘導体を含む）であり、例としては、１４−２０の炭素を有する飽和直鎖化合物、例えば、ミリスチン（テトラデカン）酸、パルミチン（ヘキサデカン）酸およびステアリン（オクタデカン）酸ならびにこれらの対応する脂肪族炭化水素型、テトラデカン、ヘキサデカンおよびオクタデカンである。採用可能な他の適切な脂質基の例は、ステロール、例えばコレステロールおよび置換された脂肪酸および炭化水素、特にこれらの基のポリフッ素化型である。脂質基Ｌの範囲は、誘導体、例えば、アミン、アミド、エステルおよびカルバミン酸誘導体を含む。誘導体のタイプは、多くの場合、下記に例示するように、オリゴヌクレオチドに結合する様式により決定される。
【化２】
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【００６８】
一例示的構造において、脂質部分は、ＮＰＳ−結合オリゴヌクレオチドの５’チオホスフェート基にアミノグリセロールリンカーを介して接合された、（パルミチン酸に由来する）パルミトイルアミドである。ＧＲＮ１６３に対して示された配列を有する、（下記に示された）この様式で接合されたＮＰＳオリゴヌクレオチドは、本明細書においてＧＲＮ１６３Ｌ（イメテルスタット）と名付けられる。第２の例示的構造において、パルミトイルアミドなどの脂質は、ＮＰＳオリゴヌクレオチドの末端３’アミノ基を介して接合される。
Ｄ．医薬組成物
【００６９】
本発明のいくつかの態様において、医薬品として用いる場合、本明細書に開示のテロメラーゼ阻害化合物は、薬学的に許容され得る賦形剤またはキャリアと一緒に製剤化され、医薬組成物に製剤化することができる。
【００７０】
医薬品として用いる場合、テロメラーゼ阻害化合物は、医薬組成物の形態で投与することができる。これらの化合物は、経口、直腸内、経皮、皮下、静脈内、筋肉内および鼻腔内を含む様々な経路により投与することができる。これらの化合物は、注射可能組成物および経口組成物の両方として有効である。このような組成物は、医薬分野において周知の様式で調製でき、少なくとも１種の活性化合物を含む。経口組成物として用いる場合、本明細書に開示のテロメラーゼ阻害化合物は、薬学的に許容され得る保護剤により胃の酸消化から保護される。
【００７１】
本発明は、有効成分としてテロメラーゼ阻害化合物を、１つ以上の薬学的に許容され得る賦形剤またはキャリアと共に含有する医薬組成物もまた含む。本発明の組成物の製造において、有効成分は、普通、賦形剤もしくはキャリアと混合されるか、賦形剤もしくはキャリアにより希釈されるか、または賦形剤もしくはキャリア内に封入され、これらは、カプセル、小袋、紙または他の容器の形態であり得る。賦形剤またはキャリアが希釈剤として機能する場合、希釈剤は固体、半固体または液体材料であってよく、これらは、有効成分のためのビヒクル、キャリアまたは媒体として作用する。したがって、組成物は、錠剤、丸薬、散剤、口内錠、小袋、カシェ剤、エリキシル剤、懸濁液、エマルジョン、溶液、シロップ、エアロゾル（固体として、または液体媒体中の）、例えば１０重量％までの活性化合物を含有する軟膏、軟および硬ゼラチンカプセル、坐薬、滅菌注射溶液および滅菌包装済み散剤の形態であってよい。
【００７２】
製剤の調製において、他の原料と組み合わせる前に、活性凍結乾燥化合物を粉砕して、適切な粒径を提供する必要があり得る。活性化合物が実質的に不溶性である場合、活性化合物は通常、２００メッシュ未満の粒径に粉砕される。活性化合物が実質的に水溶性である場合、粒径は通常、製剤中で実質的に均一な分布を提供するように、例えば約４０メッシュに、粉砕によって調整される。
【００７３】
適切な賦形剤またはキャリアのいくつかの例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、トラガカント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、滅菌水、シロップおよびメチルセルロースが挙げられる。製剤は、滑沢剤、例えば、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよび鉱物油；湿潤剤；乳化剤および懸濁剤；保存剤、例えば、メチル−およびプロピルヒドロキシ−ベンゾエート；甘味料；ならびに香味剤をさらに含んでもよい。本発明の組成物は、当分野において公知の手順を用いることによって、患者への投与後に有効成分の即時性、持続性または遅延性の放出を提供するように製剤化することができる。
【００７４】
組成物は、単位剤形で製剤化することができ、各投薬量は、約５ｍｇから約１００ｍｇ以上、例えば、約１ｍｇから約５ｍｇ、１ｍｇから約１０ｍｇ、約１ｍｇから約２０ｍｇ、約１ｍｇから約３０ｍｇ、約１ｍｇから約４０ｍｇ、約１ｍｇから約５０ｍｇ、約１ｍｇから約６０ｍｇ、約１ｍｇから約７０ｍｇ、約１ｍｇから約８０ｍｇまたは約１ｍｇから約９０ｍｇ、これらの値の間の任意の範囲（これらの値を含む）を含むいずれかの範囲の有効成分を含有する。「単位剤形」という用語は、個体に対して単位投薬量として適切な、物理的に個別の単位を指し、各単位は、所望の治療効果を生み出すように計算された活性材料の所定の量を、適切な薬学的賦形剤またはキャリアと共に含有する。
【００７５】
テロメラーゼ阻害化合物は、広範な投薬量範囲にわたって有効であり、概して、治療有効量で投与される。しかし、テロメラーゼ阻害化合物の実際の投与量は、処置される病態、選択される投与の経路、投与される実際の化合物、個別の患者の年齢、体重および応答、患者の症状の重症度などを含む関連する状況を考慮して、医師により決定されることは理解されるものと思われる。
【００７６】
固体組成物、例えば錠剤の調製に関して、主要な有効成分であるテロメラーゼ阻害化合物は、薬学的賦形剤またはキャリアと混合され、本発明の化合物の均質な混合物を含有する固体プレ製剤組成物を形成する。これらのプレ製剤組成物が均質であるという場合、組成物が、同等に有効な単位剤形、例えば錠剤、丸薬およびカプセルに容易に小分けされ得るように、有効成分が、組成物の間に均一に分散されることを意味する。
【００７７】
本発明の錠剤または丸薬は、コーティングまたは調合して、持続性作用の有利性をもたらす剤形を提供し、テロメラーゼ阻害化合物を胃における酸加水分解から保護することができる。例えば、錠剤または丸薬は、内部投薬成分および外部投薬成分を含み、後者が、前者の周りを包み込む形態であってよい。２つの成分は、胃における崩壊に抵抗するように機能する腸溶性層であって、内部成分を無傷で十二指腸内へ通過させ得る、または内部成分の放出を遅延させ得るように機能する腸溶性層により分離することができる。さまざまな材料が、このような腸溶性の層またはコーティングに使用でき、このような材料は、多数のポリマー酸およびポリマー酸と、シェラック、セチルアルコールおよび酢酸セルロースなどの材料との混合物を含む。
【００７８】
本発明の新規な組成物が、経口投与または注射による投与のために組み込まれ得る液体形態としては、水溶液、適切に香味付けされたシロップ、水性または油性懸濁液、および食用油、例えばコーン油、綿実油、ゴマ油、ココナッツ油またはピーナッツ油を含む、香味付けされたエマルジョンならびにエリキシル剤および同様の薬学的ビヒクルが挙げられる。
【００７９】
吸入またはガス注入用組成物としては、薬学的に許容され得る水性または有機溶媒中の溶液および懸濁液、またはこれらの混合物、ならびに散剤が挙げられる。液体または固体組成物は、上記のように適切な薬学的に許容され得る賦形剤を含有し得る。組成物は、局所または全身効果のために、経口または経鼻の呼吸経路により投与され得る。薬学的に許容され得る溶媒中の組成物は、不活性ガスの使用により噴霧可能である。噴霧された溶液は、噴霧装置から直接吸入することができる、または噴霧装置をフェイスマスクテントもしくは断続的陽圧人工呼吸器に取り付けることができる。溶液、懸濁液または散剤組成物は、適切な様式で製剤を送達する装置から経口的または経鼻的に投与することもできる。ＩＶ．発明の方法
【００８０】
いくつかの態様において、テロメラーゼ阻害剤による処置から利益を得ると思われる、がんを有すると診断された、またはがんを有する疑いのある個体を選択する方法が、本明細書において提供される。これらの方法は、個体由来の生体試料中に存在するがん細胞における、テロメアの平均相対的長さの決定に基づく。個体由来の生体試料中に存在するがん細胞における平均テロメア長が、１以上の公知の標準から決定された相対的テロメア長範囲の５０パーセンタイル以下である事が決定される場合、その場合に、がんを有すると診断された、またはがんを有する疑いのある個体は、テロメラーゼ阻害剤（例えば、本明細書において提供されるテロメラーゼ阻害剤のいずれか）による処置から利益を得ると思われる。他の態様において、個体由来の生体試料中に存在するがん細胞における平均相対的テロメア長が、１以上の公知の基準から決定された相対的テロメア長範囲の５０パーセンタイル以下である事が決定される場合、本明細書に開示のテロメラーゼ阻害化合物は、細胞増殖性障害（例えばがん）の処置および／または予防に使用することができる。
Ａ．細胞増殖性障害 
【００８１】
「増殖性障害」は、細胞が、正常な組織成長より急速に増殖する任意の細胞性障害である。したがって、「増殖細胞」は、正常細胞より急速に増殖している細胞である。増殖性障害としては、限定するものではないが、新生物が挙げられる。「新生物」は、異常な組織成長であり、概して、細胞増殖により正常な組織成長より急速に成長する、性質の異なる塊を形成する。新生物は、正常組織との構造的構成および機能的協調の部分的または全体的喪失を示す。これらは、３つの主要なタイプに大まかに分類することができる。上皮構造から発生する悪性新生物は癌腫と呼ばれ、結合組織、例えば筋肉、軟骨、脂肪または骨から生じる悪性新生物は肉腫と呼ばれ、免疫系の成分を含む造血（ｈｅｍａｔｏｐｏｅｔｉｃ）構造（血液細胞の形成に関係する構造）に影響を及ぼす悪性腫瘍は白血病およびリンパ腫と呼ばれる。腫瘍は、がん疾患の新生物成長である。本明細書において使用する場合、新生物はまた、「腫瘍」とも称され、造血性新生物ならびに固形新生物を包含することが意図される。他の増殖性障害としては、限定するものではないが、神経線維腫症が挙げられる。
【００８２】
本明細書において提供される（例えば組成物中の）テロメラーゼ阻害化合物は、テロメア長の異常調節に関連する疾患状態の調節に有用である。いくつかの実施形態において、細胞増殖性障害は、テロメラーゼの発現もしくは活性または細胞成長または両方の増加に関係する。いくつかの実施形態において、細胞増殖はがんである。
【００８３】
本明細書に記載の方法は、固形腫瘍（例えば進行期固形腫瘍）の処置にも有用である。いくつかの実施形態において、例えば、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ、例えば進行期ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ、例えば、進行期ＳＣＬＣ）ならびに肺における進行期悪性固形腫瘍を含む肺がんを処置する方法を提供する。いくつかの実施形態において、卵巣がん、頭頸部がん、胃悪性腫瘍、例えば胃がん、胃腸がん、例えば上部胃腸がん、胆嚢がん、膀胱がん、神経膠芽腫、肉腫、例えば、骨肉腫、ユーイング肉腫および髄膜肉腫、黒色腫（転移性黒色腫および悪性黒色腫を含む）、結腸直腸がんおよび膵臓がんのいずれかを処置する方法を提供する。
【００８４】
いくつかの実施形態において、本方法は、下記：皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、白血病、濾胞性リンパ腫、ホジキンリンパ腫および急性骨髄性白血病の１つ以上の処置に有用である。
【００８５】
いくつかの実施形態において、疾患は、下記：基底細胞癌腫、髄芽細胞腫、神経膠芽腫、多発性骨髄腫、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病、膵臓がん、肺がん（小細胞肺がんおよび非小細胞肺がん）、食道がん、胃がん、胆道（ｂｉｌｌａｒｙ）がん、前立腺がん、肝臓がん、肝細胞がん、胃腸がん、胃がん、胆嚢がん、卵巣がんおよび膀胱がんのいずれか１つのがんである。いくつかの実施形態において、がんは、膵管腺癌腫、結腸腺癌腫および卵巣嚢胞腺癌腫からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、がんは膵管腺癌腫である。いくつかの実施形態において、がんは、潅流が不十分および／または血管新生が不十分な腫瘍である。
【００８６】
いくつかの実施形態において、がんは、例えば、膵臓腺癌腫、膵臓腺扁平上皮癌腫、膵臓扁平上皮細胞癌腫および膵臓巨大細胞癌腫を含む膵臓がんである。いくつかの実施形態において、膵臓がんは膵外分泌がんである。いくつかの実施形態において、膵臓がんは膵内分泌がん（例えば、膵島細胞癌腫）である。いくつかの実施形態において、膵臓がんは進行期転移性膵臓がんである。
【００８７】
本発明の方法により処置可能ながんの他の例としては、限定するものではないが、副腎皮質癌腫、特発性骨髄様化生、ＡＩＤＳ関連がん（例えば、ＡＩＤＳ関連リンパ腫）、肛門がん、虫垂がん、星状細胞腫（例えば、小脳および大脳）、基底細胞癌腫、胆管がん（例えば、肝臓外）、膀胱がん、骨がん、（骨肉腫および悪性線維性組織球腫）、脳腫瘍（例えば、神経膠腫、脳幹神経膠腫、小脳もしくは大脳星状細胞腫（例えば、毛様細胞性星状細胞腫、びまん性星状細胞腫、未分化（悪性）星状細胞腫）、悪性神経膠腫、上衣腫、乏突起膠腫（ｏｌｉｇｏｄｅｎｇｌｉｏｍａ）、髄膜腫、髄膜肉腫、頭蓋咽頭腫、血管芽腫（ｈａｅｍａｎｇｉｏｂｌａｓｔｏｍａｓ）、髄芽細胞腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、視経路および視床下部の神経膠腫および神経膠芽腫）、乳がん、気管支腺腫／カルチノイド、カルチノイド腫瘍（例えば、胃腸カルチノイド腫瘍）、不明の原発性癌腫、中枢神経系リンパ腫、子宮頸部がん、結腸がん、結腸直腸がん、慢性骨髄増殖性障害、子宮内膜がん（例えば子宮がん）、上衣腫、食道がん、腫瘍のユーイングファミリー、眼がん（例えば、眼球内黒色腫および網膜芽細胞腫）、胆嚢がん、胃（胃部）がん、胃腸カルチノイド腫瘍、胃腸間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、胚細胞腫瘍、（例えば、頭蓋外、性腺外、卵巣）、妊娠性絨毛腫瘍、頭部および頸部がん、肝細胞（肝臓）がん（例えば、肝臓癌腫および肝細胞がん）、下咽頭がん、膵島細胞癌腫（膵臓内分泌腺部）、喉頭がん、喉頭がん、白血病、口唇および口腔がん、口腔がん、肝臓がん、肺がん（例えば、肺の小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺の腺癌腫および肺の扁平癌腫）、リンパ系新生物（例えば、リンパ腫）、髄芽細胞腫、卵巣がん、中皮腫、転移性扁平頸部がん、口腔がん、多発性内分泌腺腫症候群、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性疾患、鼻腔および副鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経芽細胞腫、神経内分泌がん、中咽頭がん、卵巣がん（例えば、卵巣上皮がん、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍）、膵臓がん、副甲状腺がん、陰茎がん、腹膜のがん、咽頭がん、褐色細胞腫、松果体芽細胞腫およびテント上原始神経外胚葉性腫瘍、下垂体腫瘍、胸膜肺芽腫、リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫（小神経膠細胞腫）、肺リンパ管筋腫症、直腸がん、腎臓がん、腎盂および尿管がん（移行細胞がん）、横紋筋肉腫、唾液腺がん、皮膚がん（例えば、非黒色腫（例えば、扁平上皮細胞癌腫）、黒色腫，およびメルケル細胞癌腫）、小腸がん、扁平上皮細胞がん、精巣がん、咽喉がん、胸腺種および胸腺癌腫、甲状腺がん、結節性硬化症、尿道がん、膣がん、外陰部がん、ウィルムス腫瘍および移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）、母斑症に関係する異常な血管増殖、浮腫（例えば、脳腫瘍に関係する浮腫）ならびにメーグス症候群が挙げられる。
【００８８】
いくつかの実施形態において、がんは固形腫瘍（例えば進行期固形腫瘍）である。固形腫瘍としては、限定するものではないが、肉腫および癌腫、例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、カポシ肉腫、軟部組織肉腫、子宮肉腫、滑膜種（ｕｔｅｒｉｎｅ
ｓａｃｒｏｎｏｍａｓｙｎｏｖｉｏｍａ）、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、髄膜肉腫、結腸癌腫、膵臓がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、扁平上皮細胞癌腫、基底細胞癌腫、腺癌腫、汗腺癌腫、皮脂腺癌腫、乳頭癌腫、乳頭腺癌腫、嚢胞腺癌腫、髄様癌腫、気管支原性癌腫、腎細胞癌腫（例えば、腺癌腫、腎明細胞癌腫、乳頭状腎細胞癌腫、嫌色素性腎細胞癌腫、集合管腎細胞癌腫（ｃｏｌｌｅｃｔｉｎｇ  ｄｕｃｔ
ｒｅｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、顆粒細胞型腎細胞癌腫、混合顆粒細胞型腎細胞癌腫、腎血管筋脂肪腫または紡錘細胞型腎細胞癌腫（ｓｐｉｎｄｌｅ  ｒｅｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）を含む）、肝細胞がん、胆管癌腫、絨毛癌腫、精上皮腫、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸部がん、精巣腫瘍、肺癌腫、小細胞肺癌腫、膀胱癌腫、上皮癌腫、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）、黒色腫、神経芽細胞腫ならびに網膜芽細胞腫が挙げられる。
【００８９】
いくつかの実施形態において、リンパ系新生物（例えば、リンパ腫）は、Ｂ細胞新生物である。Ｂ細胞新生物の例としては、限定するものではないが、前駆Ｂ細胞新生物（例えば、前駆Ｂ−リンパ芽球性白血病／リンパ腫）および末梢Ｂ細胞新生物（例えば、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病／前リンパ球性白血病／小リンパ球性リンパ腫（小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ）、リンパ形質細胞性リンパ腫／免疫細胞腫、マントル細胞（ｍａｎｔｅｌ  ｃｅｌｌ）リンパ腫、濾胞中心リンパ腫、濾胞性リンパ腫（例えば、細胞診グレード：Ｉ（小細胞型）、ＩＩ（小細胞および大細胞の混合型）、ＩＩＩ（大細胞型）および／またはサブタイプ：びまん性および優位型の小細胞型）、低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、中悪性度／濾胞性ＮＨＬ、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（例えば、節外性（例えば、ＭＡＬＴ−タイプ＋／−単球様Ｂ細胞）および／または節内性（例えば、＋／−単球様Ｂ細胞））、脾辺縁帯リンパ腫（例えば、＋／−有毛リンパ球（ｖｉｌｌｏｕｓ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ））、有毛細胞白血病、形質細胞腫／形質細胞性骨髄腫（例えば、骨髄腫および多発性骨髄腫）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（例えば、縦隔（胸腺）原発Ｂ細胞リンパ腫）、中悪性度びまん性ＮＨＬ、バーキットリンパ腫、高悪性度Ｂ細胞リンパ腫、バーキット様、高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度小型非切れ込み細胞核細胞性ＮＨＬ、巨大腫瘤病変ＮＨＬ、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、およびワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症）が挙げられる。
【００９０】
いくつかの実施形態において、リンパ系新生物（例えば、リンパ腫）は、Ｔ細胞および／または推定ＮＫ細胞新生物である。Ｔ細胞および／または推定ＮＫ細胞新生物の例としては、限定するものではないが、前駆Ｔ細胞新生物（前駆Ｔ−リンパ芽球性リンパ腫／白血病）および末梢Ｔ細胞およびＮＫ細胞新生物（例えば、Ｔ細胞慢性リンパ球性白血病／前リンパ球性白血病および大顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＬ）（例えばＴ細胞型および／またはＮＫ細胞型）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（例えば、菌状息肉腫／セザリー症候群）、分類不能原発性Ｔ細胞リンパ腫（例えば、細胞学的カテゴリー（例えば、中細胞型、中細胞−大細胞混合型）、大細胞型、リンパ類上皮細胞（ｌｙｍｐｈｏｅｐｉｔｈｅｌｏｉｄ  ｃｅｌｌ）、サブタイプ肝脾γδＴ細胞リンパ腫、および皮下脂肪織炎（ｐａｎｎｉｃｕｌｉｔｉｃ）Ｔ細胞リンパ腫）、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＬＤ）、血管中心性リンパ腫、腸Ｔ細胞リンパ腫（例えば、＋／−腸疾患関連性）、成人Ｔ細胞リンパ腫／白血病（ＡＴＬ）、未分化大細胞型リンパ腫（ＡＬＣＬ）（例えば、ＣＤ３０＋、Ｔ細胞型およびヌル細胞型）、未分化大細胞型リンパ腫およびホジキンリンパ腫）が挙げられる。
【００９１】
いくつかの実施形態において、リンパ系新生物（例えば、リンパ腫）は、ホジキン病である。例えば、ホジキン病は、リンパ球優位型、結節性硬化症、混合細胞型、リンパ球減少型および／またはリンパ球豊富型であってよい。
【００９２】
いくつかの実施形態において、がんは白血病である。いくつかの実施形態において、白血病は慢性白血病である。慢性白血病の例としては、限定するものではないが、慢性骨髄球性Ｉ（顆粒球性）白血病、慢性骨髄性および慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）が挙げられる。いくつかの実施形態において、白血病は急性白血病である。急性白血病の例としては、限定するものではないが、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病、急性リンパ球性白血病および急性骨髄球性白血病（例えば、骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性および赤白血病）が挙げられる。
【００９３】
いくつかの実施形態において、がんは、液性腫瘍または形質細胞腫である。形質細胞腫としては、限定するものではないが、骨髄腫が挙げられる。骨髄腫としては、限定するものではないが、骨髄外形質細胞腫、孤立性骨髄腫および多発性骨髄腫が挙げられる。いくつかの実施形態において、形質細胞腫は多発性骨髄腫である。
【００９４】
いくつかの実施形態において、がんは多発性骨髄腫である。多発性骨髄腫の例としては、限定するものではないが、ＩｇＧ多発性骨髄腫、ＩｇＡ多発性骨髄腫、ＩｇＤ多発性骨髄腫、ＩｇＥ多発性骨髄腫および非分泌性多発性骨髄腫が挙げられる。いくつかの実施形態において、多発性骨髄腫はＩｇＧ多発性骨髄腫である。いくつかの実施形態において、多発性骨髄腫はＩｇＡ多発性骨髄腫である。いくつかの実施形態において、多発性骨髄腫は、くすぶり型または無痛性多発性骨髄腫である。いくつかの実施形態において、多発性骨髄腫は、進行性多発性骨髄腫である。いくつかの実施形態において、多発性骨髄腫は、薬物、例えば、限定するものではないが、ボルテゾミブ、デキサメタゾン（Ｄｅｘ−），ドキソルビシン（Ｄｏｘ−）およびメルファラン（ＬＲ）に耐性であり得る。
Ｂ．テロメラーゼ阻害剤処置から利益を得ると思われる個体を選択する方法
【００９５】
テロメラーゼ阻害剤による処置から利益を得ると思われる、がんを有すると診断された、またはがんを有する疑いのある個体を選択する方法を、本明細書において提供する。テロメア長は、個体由来の生体試料中に存在するがん細胞におけるテロメアヌクレオチドの長さを分析することによって決定される。「利益」とは、本発明のテロメラーゼ阻害化合物による処置を受けたことがある患者において、受けたことが無い患者と比較して、このような個体を評価するために使用される、少なくとも１つの臨床的または生物学的なスコア（例えば、限定するものではないが無増悪生存）、値、尺度の重症度または発生に、陽性または有益な差が存在することを意味する。
１．生体試料の獲得
【００９６】
細胞増殖性障害（例えばがん）を有すると診断された、またはこのような障害を有する疑いのある個体由来の生体試料は、さまざまな方法で得ることができる。例えば、生体試料は、皮下に到達可能な腫瘍であり得る固形腫瘍または生検もしくは外科切除により到達可能な任意の他のタイプのがん性固形腫瘍から得ることができる。生体試料は、限定するものではないが、穿刺生検またはコア生検または微細針吸引を含む、当分野において公知の任意の方法により得ることができる。さらに、生体試料は、テロメア長が決定される前に、固定され、パラフィン包埋され、新鮮であり、または凍結されてもよい。いくつかの実施形態において、生体試料は、ホルマリン固定およびその後パラフィンに包埋される。いくつかの実施形態において、個体は、血液由来がん（すなわち、血液がん、例えば、限定するものではないが、白血病、リンパ腫など）を有する、または有する疑いがある。この場合、生体試料は、個体の血液から得ることができる。
２．生体試料におけるテロメア長の測定
【００９７】
生体試料中の細胞からテロメア長を決定するための、本明細書に開示の方法に従った数多くの方法が当分野において利用可能である。
【００９８】
一態様において、テロメア長は、末端制限酵素切断断片（ＴＲＦ）の平均の長さを測定することによって決定することができる。ＴＲＦは、テロメア配列内の核酸を切断しない制限酵素による、ゲノムＤＮＡの完全な消化からもたらされる断片の長さ、概して平均の長さとして定義される。通常、ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ内で頻繁に切断するが、テロメア配列内では切断しない制限酵素により消化される。通常、制限酵素は、４つの塩基認識配列（例えば、ＡｌｕＩ、ＨｉｎｆＩ、ＲｓａＩおよびＳａｕ３Ａ１）を有し、単独または組み合わせのいずれかで使用される。得られた末端制限酵素切断断片は、テロメアリピートおよびサブテロメアＤＮＡの両方を含有する。本明細書において使用する場合、サブテロメアＤＮＡは、テロメア配列のタンデムリピートに隣接するＤＮＡ配列であり、可変的なテロメア様配列が散在するテロメアリピート配列を含有する。消化されたＤＮＡは、電気泳動により分離され、支持体、例えば膜にブロットされる。テロメア配列を含む断片は、プローブ、すなわち標識されたリピート配列を、膜にハイブリダイズすることによって検出される。テロメア含有断片の可視化において、末端制限酵素切断断片の平均長が計算され得る（Ｈａｒｌｅｙ，Ｃ．Ｂ．ら、Ｎａｔｕｒｅ．３４５（６２７４）：４５８−６０（１９９０）、参照により本明細書に組み込まれる）。サザンブロットによるＴＲＦの推定は、細胞または組織中のテロメア長の分布を示し、したがってすべての細胞の平均テロメア長を示す。
【００９９】
本明細書に記載のさまざまな方法に関して、高度、中程度および軽度のストリンジェンシー条件を含むさまざまなハイブリダイゼーション条件が使用され得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（２００２年に最新化）を参照されたい；参照により明細書に組み込まれる）。ストリンジェンシー条件は、配列依存性であり、プローブもしくはプライマーの長さ、不一致の数、Ｇ／Ｃ含量およびイオン強度を含む状況の違いで異なるものである。核酸のハイブリダイゼーションのガイドは、Ｔｉｊｓｓｅｎ、Ｐ．「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ａｓｓａｙｓ，」Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ、第２４巻、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９９３）において提供される。概して、ストリンジェントな条件は、プローブもしくはプライマーの５０％が標的核酸と平衡してハイブリダイズされる、確定した温度における、確定した溶液条件下の特定のハイブリッドの熱溶融点（すなわち、Ｔｍ）より約５−１０℃低く選択される。ストリンジェンシーの程度は、概して、ハイブリダイゼーション温度とＴｍとの差により決定されるので、ストリンジェンシーの特定の程度は、Ｔｍとの温度差が維持される限り、ハイブリダイゼーションの溶液条件の変化に関わらず、維持され得る。ハイブリダイゼーション条件はまた、核酸骨格のタイプ（例えば、リボ核酸骨格またはペプチド核酸の骨格）により変動してよい。
【０１００】
別の態様において、テロメア長は、フローサイトメトリーにより測定可能である（Ｈｕｌｔｄｉｎ，Ｍ．ら、Ｎｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６：３６５１−３６５６（１９９８）；Ｒｕｆｅｒ，Ｎ．ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：７４３−７４７（１９９８）を参照されたい；参照により本明細書に組み込まれる）。フローサイトメトリー法は、ＦＩＳＨ技術の変形である。出発材料が組織である場合、一般に機械的分離および／またはプロテアーゼによる処理により細胞懸濁液が作られる。細胞は、固定液により固定され、蛍光標識により標識されたテロメア配列特異的プローブ、好ましくはＰＮＡプローブとハイブリダイズされる。ハイブリダイゼーション後、細胞は洗浄され、その後、ＦＡＣＳにより分析される。蛍光シグナルは、バックグラウンドの蛍光を適切に差し引いた後で、Ｇｏ／Ｇ１の細胞に関して測定される。この技術は、多数の試料に関するテロメア長の迅速な推定に適切である。ＴＲＦと同様に、テロメア長は、細胞内のテロメアの平均の長さである。
【０１０１】
他の態様において、生体試料の細胞由来テロメアの平均の長さは、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）またはテロメア蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ｔｅｌｏ−ＦＩＳＨ）によって決定される。
ａ．ホルマリン固定・パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料におけるｑＰＣＲ
【０１０２】
いくつかの態様において、テロメア長は、ホルマリン固定・パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）生体試料から抽出されたＤＮＡから、ｑＰＣＲを使用して決定される。
【０１０３】
ｑＰＣＲにおいて、ＤＮＡ結合色素は、すべての二本鎖ＤＮＡに結合し、色素の蛍光をもたらす。ＰＣＲ反応の間のＤＮＡ産物の増加は、蛍光強度の増加をもたらし、ＰＣＲ反応の各サイクルにおいて測定される。このことにより、ＤＮＡ濃度の定量が可能になる。反応の対数期の間に存在するＤＮＡの相対濃度は、蛍光レベルを、片対数目盛においてＰＣＲサイクル数に対してプロットすることによって決定される。バックグラウンドより高い蛍光検出のための閾値が決定される。試料由来の蛍光が閾値と交差するサイクルは、サイクル閾値（Ｃｔ）と呼ばれる。ＤＮＡの量は、対数期の間のサイクルごとに理論的には倍増するので、ＤＮＡの相対量を計算することができる。ベースラインは、蛍光シグナルが殆ど変化しない、ＰＣＲの初回サイクルである。
【０１０４】
閾値は、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓソフトウェアにより自動的に決定され、またはマニュアルで設定され、リアルタイムアッセイにおいてＣｔの決定に使用されるΔＲｎのレベルである。このレベルは、ベースラインより上に設定され、増幅曲線の対数増殖領域内であるように十分に低い。閾値は、増幅プロットとのその交差点がＣｔを定義するラインである。Ｃｔは、蛍光が閾値を通り過ぎる、部分サイクル数である。試料の閾値サイクルは、参照試料の閾値サイクルを、テロメアポリメラーゼ連鎖反応の閾値サイクルから差し引くことによって決定される（ΔＣｔ試料＝Ｃｔテロメア−Ｃｔ参照）。ポリメラーゼ連鎖反応はまた、参照として単一コピー数遺伝子を対象とするプライマーによっても行われ、単一コピー数遺伝子に関する閾値サイクルを決定する。テロメアポリメラーゼ連鎖反応との単一コピー遺伝子の平均サイクル数の差が、テロメア長を決定する（ΔＣｔ＝Ｃｔテロメア−Ｃｔ単一コピー遺伝子）。
【０１０５】
テロメア核酸は、ホルマリン固定・パラフィン包埋生体試料から、穏やかな抽出方法を使用して抽出することができる。例えば、試料は、洗浄剤、超音波処理、エレクトロポレーション、変性剤などを使用して処理し、細胞を破壊することができる。標的核酸は、必要に応じて精製することができる。核酸を単離するためのカラムを使用しない穏やかな抽出方法は、これらの方法が、最終核酸調製品において核酸のより小さい断片を保持する（小型ＤＮＡ断片がＦＦＰＥ試料中に見出され、これらはカラム抽出の間に喪失され得る）ので、有益であることが見出されている。いくつかの実施形態において、該抽出方法は、少なくとも５０ｂｐ、少なくとも６０ｂｐ、少なくとも７０ｂｐ、少なくとも８０ｂｐであるテロメア標的核酸断片の大部分を保持する。一実施形態において、該抽出方法は、６０ｂｐ未満、７０ｂｐ未満、８０ｂｐ未満、９０ｂｐ未満、１００ｂｐ未満、１１０ｂｐ未満である核酸断片を保持する。一実施形態において、穏やかなＤＮＡ抽出方法は、ＤＮＡ断片単離のためにカラムを使用しない。一実施形態において、該核酸抽出方法は、ＢｉｏＣｈａｉｎ  ＦＦＰＥ  Ｔｉｓｓｕｅ  ＤＮＡ抽出キットである。
【０１０６】
一実施形態において、ＦＦＰＥ試料は、ＤＮＡ抽出の前に脱パラフィン可能である。別の実施形態において、ＤＮＡは、ＦＦＰＥ試料から、ＦＦＰＥ試料の事前脱パラフィンをせずに抽出することができる。この実施形態において、パラフィンは、ＦＦＰＥ試料から除去されない。一実施形態において、抽出された核酸は、少なくとも８８℃、８９℃、９０℃、９１℃、９２℃、９３℃、９４℃、９５℃、９６℃、９７℃に、少なくとも１分、５分、１０分、２０分、３０分、４０分、５０分、６０分、７０分、８０分間加熱される。
【０１０７】
ＤＮＡの抽出後、ＤＮＡは、蛍光色素（例えば、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）により標識される。いくつかの実施形態において、ＤＮＡは、約０．０４×、０．０６×、０．０８×、０．１×、０．１５×、０．２×、０．２５×、０．３×、０．３５×、０．４×、０．４５×、０．５×、０．５５×、０．６０×、０．６５×、０．７０×、０．７５×、０．８×、０．９×、１．０×または１．１×、（これらの数を含む）これらの数の間の任意の値を含む、これらのいずれかのＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ色素により標識される。ＤＮＡの標識後、ポリメラーゼ連鎖反応が、ホルマリン固定・パラフィン生体試料（実質的に相補的な第１および第２の鎖を含む）から抽出された標的単一コピー核酸、第１の単一コピー遺伝子プライマー（第１の単一コピー遺伝子プライマーは、（ｉ）標的単一コピー遺伝子核酸の第１の鎖とのハイブリダイズ、および（ｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼによる伸長によって伸長された単一コピー遺伝子プライマーの形成が可能である）ならびに第２の単一コピー遺伝子プライマー（第２の単一コピー遺伝子プライマーは、（ｉ）伸長された第１の単一コピー遺伝子プライマーおよび／または標的ＤＮＡとのハイブリダイズ、ならびに（ｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼによる伸長が可能である）を使用して行われ、変性および伸長のサイクルにポリメラーゼ連鎖反応が進行させられ、閾値ＰＣＲシグナルが通り過ぎる複製サイクルを同定する。
【０１０８】
テロメア配列は、３段階でポリメラーゼ連鎖反応により増幅される。第１段階は、ＤＮＡポリメラーゼが活性化されるのに十分な条件下で実施される。第２段階は、増幅の後続サイクルのための鋳型として機能するＰＣＲ産物が生み出されるのに十分な条件下で実施される。一実施形態において、第２段階のサイクル数は、２から８サイクル、または３から６サイクルまたは３から５サイクルである。一実施形態において、解離温度は、９０℃から９８℃、または９２℃から９７℃または９４℃から９６℃の範囲で、１０秒から２０秒の期間である。一実施形態において、会合温度は、４５℃から６０℃、４９℃から５８℃、５０℃から５５℃の範囲で、５秒から２０秒の期間である。第３段階は、鋳型が増幅されるのに十分な条件下で実施される。一実施形態において、第３段階のサイクル数は、２０から４０サイクルまたは２５から３５サイクルである。一実施形態において、解離温度は、９０℃から９８℃、または９２℃から９７℃または９４℃から９６℃の範囲で、１０秒から２０秒の期間である。一実施形態において、会合温度は、４５℃から７０℃、４９℃から６８℃、５０℃から６０℃の範囲で、５秒から２０秒の期間である。
【０１０９】
一実施形態において、単一コピー遺伝子増幅ｑＰＣＲは、第２のプレートで実施されるテロメア増幅ｑＰＣＲと比較して、異なるプレートにおいて異なる条件下で実施される。別の実施形態において、単一コピー遺伝子増幅ｑＰＣＲは、第１のウェルにおいて実施され、テロメア増幅ｑＰＣＲは、同じプレートにおいて同じ条件下で、第２のウェルにおいて実施される。ｑＰＣＲテロメア分析は、同じ患者の腫瘍由来の１、２またはそれ以上の組織試料から実施することができる。
【０１１０】
一実施形態において、ＰＣＲ反応における単一コピー遺伝子アンプリコンのサイズは、テロメアＰＣＲ反応のアンプリコンのサイズと同様である。一実施形態において、第１および第２のプライマーの伸長により作製された単一遺伝子アンプリコンは、約５０から１００ヌクレオチド、６０から９０ヌクレオチド、７０から８０ヌクレオチドである。
【０１１１】
テロメア長は、単一遺伝子コピー定量的ＰＣＲの閾値サイクルを、テロメア定量的ポリメラーゼ連鎖反応の閾値サイクルから差し引くことによって決定される（ΔＣｔ試料＝Ｃｔテロメア−Ｃｔ単一コピー遺伝子）−単一コピー遺伝子とテロメアポリメラーゼ連鎖反応との平均サイクル数の差がテロメア長を決定する（ΔＣｔ＝Ｃｔテロメア−Ｃｔｔ単一コピー遺伝子）。テロメア長は、個体について決定され、個体の集団において観察されたテロメア長または参照個体に対するテロメア長と相関する。一実施形態において、個体の集団は、被験個体の年齢と一致する年齢にされる。ヒトに関しては、年齢一致集団は、個体年齢の約１０歳以内または５歳以内または１歳以内である。別の実施形態において、個体集団は、がん細胞のタイプ（例えば、限定するものではないが、肺がん、前立腺がん、白血病など）に従って合わせられる。
【０１１２】
テロメア長は、単一コピー遺伝子産物により正規化されたテロメア産物として表される。言い換えれば、試料の相対的テロメア長は、テロメアリピートのコピー数と単一遺伝子コピー数とのその比において、実験試料と参照ＤＮＡ試料とがその係数分だけ異なっている係数である。各実験試料中のテロメアリピートの量は、ＰＣＲ増幅の対数期の間に、所与の量のテロメアＰＣＲ産物を作製するために必要なＰＣＲのサイクル数に関して同等の実験試料および参照試料を作製する、任意に選択された参照ＤＮＡ試料の希釈レベルとして測定される。同様に、各実験試料中の単一コピー遺伝子の相対量は、ＰＣＲの対数期の間に、所与の量の単一コピー遺伝子ＰＣＲ産物を作製するために必要なＰＣＲのサイクル数に関して、参照ＤＮＡ試料を実験試料と一致させるために必要な参照ＤＮＡ試料の希釈レベルとして表される。
【０１１３】
一実施形態において、各実験試料に関して、希釈係数の比は、相対的テロメア対単一コピー遺伝子（Ｔ／Ｓ）の比である。したがって、未知のＤＮＡが、テロメアリピートコピー数対単一コピー数のその比において参照ＤＮＡと同一である場合、Ｔ／Ｓ＝１である。（所与の研究において実験試料のすべてと比較される）参照ＤＮＡ試料は、単一の個体に由来してもよく、または複数の個体由来のプールされた試料であってもよく、または公知の長さのテロメアを有する１以上の細胞系に由来してもよい。参照個体またはプールされた試料または細胞系のＴ／Ｓ比と比較した一個体のＴ／Ｓ比は、該個体由来のＤＮＡの相対的テロメア長に対応する。一実施形態において、細胞系は、Ｍ１４Ｍｅｌ細胞、Ａ５４９細胞、ＳＫ−Ｍｅｌ−５細胞およびＯｖｃａｒ−５細胞からなる群から選択される。
【０１１４】
別の実施形態において、各実験試料に関して、希釈係数の比は、単一コピー遺伝子対相対的テロメアの比のｌｏｇ２である（ｌｏｇ２Ｓ／Ｔ）。（所与の研究において実験試料のすべてと比較される）参照ＤＮＡ試料は、単一の個体に由来してもよく、または複数の個体由来のプールされた試料であってもよく、または公知の長さのテロメアを有する１以上の細胞系に由来してもよい。参照個体またはプールされた試料または細胞系のｌｏｇ２Ｓ／Ｔ比と比較した一個体のｌｏｇ２Ｓ／Ｔ比は、該個体由来のＤＮＡの相対的テロメア長に対応する。一実施形態において、細胞系は、Ｍ１４Ｍｅｌ細胞、Ａ５４９細胞、ＳＫ−Ｍｅｌ−５細胞およびＯｖｃａｒ−５細胞からなる群から選択される。
【０１１５】
個体および集団の測定されたテロメア長の相関は、さまざまな統計的方法、例えば、コックス比例ハザード回帰モデル、カプラン・マイヤー生存分布推定、ペト・ウィルコクソン検定、最尤分析、重回帰分析などを含む生存分析により検査される。
【０１１６】
本明細書に記載のｑＰＣＲ法はまた、テロメラーゼ阻害剤（例えば、本明細書に開示のテロメラーゼ阻害剤のいずれか）による処置に対する個体の反応を測定するためにも使用できる。処置時間にわたって相対的テロメア長が固形腫瘍において短縮される速度が測定され、テロメラーゼ阻害剤に対する個体の反応が決定される。
【０１１７】
加えて、さまざまな薬剤をＰＣＲ反応に加えて、最適なハイブリダイゼーション、増幅および検出を容易にすることができる。これらは、塩、バッファー、中性タンパク質、洗浄剤などを含む。他の作用物質、例えばプロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗微生物作用物質などを加えて、反応の効率を改善することができる。
【０１１８】
ｑＰＣＲによるテロメア長の評価に関するさらなる情報は、米国特許出願公開第２００６／０２１０９８０号、第２０１０／０１５１４７７号および第２０１１／０２０７１２８号ならびに国際特許出願公開第ＷＯ２０１０／０７５４１３号および第ＷＯ２０１２／０１３５１２５号に見出すことができ、当該特許の個々の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
ｂ．テロメア蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ｔｅｌｏ−ＦＩＳＨ）
【０１１９】
いくつかの態様において、テロメア長は、ｔｅｌｏ−ＦＩＳＨを使用して決定される。この方法において、細胞は固定され、蛍光標識、例えば、Ｃｙ−３、フルオレセイン、ローダミンなどと接合されたプローブとハイブリダイズされる。この方法のためのプローブは、テロメア配列と特異的にハイブリダイズするようにデザインされたオリゴヌクレオチドである。概して、プローブは、８またはそれ以上のヌクレオチド長、例えば１２−２０またはそれ以上のヌクレオチド長である。一態様において、プローブは、天然ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドである。一態様において、プローブはペプチド核酸であり、ペプチド核酸は類似の天然配列より高いＴｍを有し、したがって、よりストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の使用が可能になる。細胞は、薬剤、例えばコルセミドにより処理され、分裂中期において細胞周期の停止が誘導され、ハイブリダイゼーションおよび分析のための分裂中期染色体を提供することができる。いくつかの実施形態において、細胞内ＤＮＡはまた、蛍光色素の４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）によっても染色され得る。
【０１２０】
無傷の分裂中期染色体のデジタル画像が得られ、テロメアとハイブリダイズされたプローブの蛍光強度が定量される。これにより、細胞における平均テロメア長に加えて、個別の染色体のテロメア長の測定が可能になり、サブテロメアＤＮＡの存在に関係する問題が回避される（Ｚｊｉｌｍａｎｓ，Ｊ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：７４２３−７４２８（１９９７）；Ｂｌａｓｃｏ，Ｍ．Ａ．ら、Ｃｅｌｌ
９１：２５−３４（１９９７）；参照により組み込まれる）。蛍光シグナルの強度は、テロメアの長さと相関し、より明るい蛍光シグナルは、より長いテロメアを示す。
【０１２１】
いくつかの態様において、ソフトウェア（例えば、ＩＮ  Ｃｅｌｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ  Ｔｏｏｌｂｏｘ  １．９、ＧＥ  Ｃｏｒｐ．）を利用して、生体試料から得られたｔｅｌｏ−ＦＩＳＨに供される細胞由来の平均テロメア長が定量される。一実施形態において、該ソフトウェアを使用して、（ｉ）ＤＡＰＩ染色の位置に基づき決定される細胞の核、および（ｉｉ）テロメアの周り、に１以上の線が引かれる。核およびテロメアのそれぞれがひとたび囲まれると、該ソフトウェアは、細胞中の個別のテロメアそれぞれの強度を計算でき、それによって、生体試料に由来する細胞に関する平均テロメア長を決定することができる。いくつかの実施形態において、テロメア長は、以下：
１．３７６×ｌｏｇ２（強度）−６．２１５×√（面積）［方程式１］
の方程式を使用して計算され、式中、「強度」は、テロメアの強度として定義され、「面積」は、その周りにひかれた線により画定されたテロメアの面積として定義される。
【０１２２】
別の実施形態において、各実験試料に関して、方程式１を使用して計算された値は、単一個体から、または複数の個体由来のプールされた試料から、または公知の長さのテロメアを有する１以上の細胞系から計算された値に対して正規化される。参照個体またはプールされた試料または細胞系から方程式１を使用して計算された値と比較した、方程式１を使用して計算された値は、個体由来のＤＮＡの相対的テロメア長に対応する。一実施形態において、細胞系は、Ｍ１４Ｍｅｌ細胞、Ａ５４９細胞、ＳＫ−Ｍｅｌ−５細胞およびＯｖｃａｒ−５細胞からなる群から選択される。
【０１２３】
個体および集団の測定されたテロメア長の相関は、さまざまな統計的方法、例えば、コックス比例ハザード回帰モデル、カプラン・マイヤー生存分布推定、ペト・ウィルコクソン検定、最尤分析、重回帰分析などを含む生存分析により検査される。
３．テロメラーゼ阻害剤による処置から利益を得ると思われる、がんを有すると診断された、またはがんを有する疑いのある個体の選択
【０１２４】
いくつかの態様において、テロメラーゼ阻害剤による処置から利益を得ると思われる、がんを有すると診断された、またはがんを有する疑いのある個体を選択する方法であって、個体由来の生体試料中に存在するがん細胞におけるテロメア核酸の相対的長さを分析することによって、相対的テロメア長を決定するステップ；および個体由来の生体試料中に存在するがん細胞における平均相対的テロメア長が、１以上の公知の基準から決定された相対的テロメア長範囲の５０パーセンタイル以下である事が決定される場合、テロメラーゼ阻害剤による処置から利益を得ると思われる個体を選択するステップ、を含む方法を本明細書において提供する。いくつかの実施形態において、テロメラーゼ阻害剤はオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、テロメラーゼ阻害剤はイメテルスタットである。別の実施形態において、がんは、小細胞肺がん、乳がん、前立腺がんまたは血液がんである。さらに他の実施形態において、個体はヒトである。
【０１２５】
本明細書に記載の方法のいずれかを含む任意の方法を使用して、個体における相対的テロメア長を決定することができる。一実施形態において、テロメア核酸の相対的長さは、ホルマリン固定・パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）生体試料から抽出されたＤＮＡからｑＰＣＲを使用して決定される。この方法を使用する場合、「相対的テロメア長」という語句は、（ｉ）相対的テロメア対単一コピー遺伝子（Ｔ／Ｓ）の比または（ｉｉ）単一コピー遺伝子対相対的テロメアの比のｌｏｇ２として定義される（ｌｏｇ２Ｓ／Ｔ）。いくつかの実施形態において、前記１以上の公知の標準は、特徴付けられた細胞系である。「特徴付けられた細胞系」は、該細胞系の細胞のテロメア核酸の相対的長さは公知であり、比較的一定であることを意味する。特徴付けられた細胞系の限定されない例としては、Ｍ１４Ｍｅｌ細胞、Ａ５４９細胞、ＳＫ−Ｍｅｌ−５細胞およびＯｖｃａｒ−５細胞が挙げられる。別の実施形態において、特徴付けられた細胞系は、個体由来の生体試料を代表する細胞系から選択される。これらの細胞系の限定されない例としては、非小細胞肺がん細胞系、肝細胞細胞系または卵巣細胞系を挙げることができる。さらに他の実施形態において、前記１以上の基準は、複数の個体由来の複数の天然腫瘍から確立されたテロメア長範囲である。一実施形態において、複数の天然腫瘍由来のがん細胞は、個体由来の生体試料中に存在するがん細胞と同じタイプであってよい。いくつかの実施形態において、生体試料中に存在するがん細胞におけるテロメア長は、これらの数の間の任意のパーセンタイル（これらの数を含む）を含むテロメア長範囲の４５パーセンタイル、４０パーセンタイル、３５パーセンタイル、３０パーセンタイル、２５パーセンタイル、２０パーセンタイル、１５パーセンタイル、１０パーセンタイル、５パーセンタイルのいずれかの範囲であること、またはテロメア長範囲より短いこと、が決定される。
【０１２６】
さらに他の実施形態において、テロメア核酸の相対的長さは、ホルマリン固定・パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）生体試料から抽出されたＤＮＡから、ｑＰＣＲを使用して決定され、「相対的テロメア長」という語句は、単一コピー遺伝子対相対的テロメアの比のｌｏｇ２として定義される（ｌｏｇ２Ｓ／Ｔ）。いくつかの実施形態において、ｌｏｇ２Ｓ／Ｔ比は、約０、−０．１、−−０．２、−０．３、−０．４、−０．５、−０．６、−０．７、−０．８、−０．９、−１．０、−１．１、−１．２、−１．３、−１．４、−１．５、−１．６、−１．７、−１．８、−１．９、−２．０またはそれ未満のいずれかより低い。
【０１２７】
別の実施形態において、テロメア核酸の相対的長さは、ｔｅｌｏ−ＦＩＳＨを使用して決定される。この方法を使用する場合、「相対的テロメア長」という語句は、上記の方法で方程式１を使用して決定される値として定義される。いくつかの実施形態において、前記１以上の公知の標準は、特徴付けられた細胞系である。「特徴付けられた細胞系」は、該細胞系の細胞の相対テロメア核酸は公知であり、比較的一定であることを意味する。特徴付けられた細胞系の限定されない例としては、Ｍ１４Ｍｅｌ細胞、Ａ５４９細胞、ＳＫ−Ｍｅｌ−５細胞およびＯｖｃａｒ−５細胞が挙げられる。別の実施形態において、特徴付けられた細胞系は、個体由来の生体試料を代表する細胞系から選択される。これらの細胞系の限定されない例としては、非小細胞肺がん細胞系、肝細胞細胞系または卵巣細胞系を挙げることができる。さらに他の実施形態において、前記１以上の公知の基準は、複数の個体由来の複数の天然腫瘍から確立されたテロメア長範囲である。一実施形態において、複数の天然腫瘍由来のがん細胞は、個体由来の生体試料中に存在するがん細胞と同じタイプであってよい。いくつかの実施形態において、生体試料中に存在するがん細胞におけるテロメア長は、これらの数の間の任意のパーセンタイル（これらの数を含む）を含むテロメア長範囲の４５パーセンタイル、４０パーセンタイル、３５パーセンタイル、３０パーセンタイル、２５パーセンタイル、２０パーセンタイル、１５パーセンタイル、１０パーセンタイル、５パーセンタイルのいずれかの範囲であること、またはテロメア長範囲より短いことが決定される。他の実施形態において、上記の方法で方程式１を使用して決定された相対的テロメア長は、これらの値の間の任意の数（これらの値を含む）を含む、約０、−０．１、−−０．２、−０．３、−０．４、−０．５、−０．６、−０．７、−０．８、−０．９、−１．０、−１．５、−２．０、−２．５、−３．０、−３．５、−４．０、−４．５、−５．０、−５．５、−６．０、−６．５、−７．０、−７．５、−８．０、−８．５、−９．０、−９．５、−１０．０またはそれ未満のいずれかより低い。Ｃ．テロメラーゼ阻害剤を使用して、細胞増殖性障害を処置する方法
【０１２８】
いくつかの態様において、本発明は、上記に詳述されたような細胞増殖性障害（例えばがん）に関係する症状または病態（能力低下、機能障害）を阻害する方法を対象とする。したがって、病態のすべての作用が完全に予防または回復される必要はないが、現在開示の方法の効果は患者の顕著な治療利益に及ぶと思われる。したがって、治療利益は、細胞増殖性障害（例えばがん）からもたらされる特定の病態の完全な予防または治癒である必要はないが、むしろ、細胞増殖性障害からもたらされる症状の低減または予防、このような症状の発症の（量的または質的のいずれかの）低減または予防、このような症状の重症度またはこれらの生理学的影響の低減、および／または細胞増殖性障害症状を経験後の個体の回復の強化を含む結果を包含し得る。
【０１２９】
特に、本発明の組成物（例えば、本明細書に開示のテロメラーゼ阻害化合物のいずれか）は、個体に投与された場合、細胞増殖性障害（例えばがん）に関係する症状または病態の１以上を処置または予防でき、および／またはこの障害の症状またはこの障害に関係する病態を低減または緩和することができる。したがって、細胞増殖性障害（例えばがん）からもたらされる影響または症状からの個体の保護は、障害の影響の発症および／または重症度の予防または低減と、障害の影響が既に発症したもしくは発症し始めた患者の処置との両方を含む。有益な効果は、当業者および／または患者の処置に当たる訓練された臨床医により容易に評価され得る。好ましくは、本発明の方法により処置されたことのある患者において、本発明の方法により処置されたことのない患者と比較して、このような患者を評価するために使用される、少なくとも１つの臨床的または生物学的なスコア、値または尺度の重症度または発症に陽性または有益な差が存在する。
【０１３０】
本方法は、「アジュバント状況（ａｄｊｕｖａｎｔ  ｓｅｔｔｉｎｇ）」において実践することができる。「アジュバント状況」は、個体が、増殖性疾患、特にがんの病歴を有し、一般的に（必ずではないが）、限定するものではないが、外科手術（例えば外科切除）、放射線療法および化学療法を含む療法に応答していた臨床状況を指す。しかし、増殖性疾患（例えばがん）のこれらの病歴のため、これらの個体は、疾患発症のリスクがあるとみなされる。「アジュバント状況」における処置または投与は、処置の後続の様式を指す。リスクの程度（すなわち、アジュバント状況にある個体が「高リスク」または「低リスク」とみなされる場合）は、いくつかの要因、もっとも普通には、最初に処置された時の疾患の程度に依存する。
【０１３１】
本明細書に提供される方法は、「ネオアジュバント状況」においても実践することができる、すなわち、一次療法／原因療法の前に実施できる方法で実践することができる。いくつかの実施形態において、個体は既に処置を受けたことがある。いくつかの実施形態において、個体はまだ処置されたことが無い。いくつかの実施形態において、処置は第１選択療法である。
【０１３２】
したがって、いくつかの態様において、がんを有すると診断された、またはがんを有する疑いのある個体を処置する方法であって、個体由来の生体試料中に存在するがん細胞におけるテロメア核酸の相対的長さを分析することによって、相対的テロメア長を決定するステップ；個体由来の生体試料中に存在するがん細胞における平均相対的テロメア長が、１以上の公知の標準から決定された相対的テロメア長範囲の５０パーセンタイル以下である事が決定される場合、テロメラーゼ阻害剤による処置から利益を得ると思われる個体を選択するステップ；および治療有効量のテロメラーゼ阻害剤を個体に投与するステップ、を含む方法を本明細書において提供する。いくつかの実施形態において、テロメラーゼ阻害剤はオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、テロメラーゼ阻害剤はイメテルスタットである。別の実施形態において、がんは、小細胞肺がん、乳がん、前立腺がんまたは血液がんである。さらに他の実施形態において、個体はヒトである。
【０１３３】
他の態様において、がんを有すると診断された、またはがんを有する疑いのある個体を処置する方法であって、個体由来の生体試料中に存在するがん細胞における平均相対的テロメア長が、１以上の公知の標準から決定された相対的テロメア長範囲の５０パーセンタイル以下である事が決定される場合、治療有効量のテロメラーゼ阻害剤を個体に投与するステップ、を含む方法を本明細書において提供する。いくつかの実施形態において、テロメラーゼ阻害剤はイメテルスタットである。別の実施形態において、がんは、小細胞肺がん、乳がん、前立腺がんまたは血液がんである。さらに他の実施形態において、個体はヒトである。
【０１３４】
本明細書に記載の方法のいずれかを含む任意の方法を使用して、個体における相対的テロメア長を決定することができる。一実施形態において、テロメア核酸の相対的長さは、ホルマリン固定・パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）生体試料から抽出されたＤＮＡからｑＰＣＲを使用して決定される。この方法を使用する場合、「相対的テロメア長」という語句は、（ｉ）相対的テロメア対単一コピー遺伝子（Ｔ／Ｓ）の比または（ｉｉ）単一コピー遺伝子対相対的テロメアの比のｌｏｇ２として定義される（ｌｏｇ２Ｓ／Ｔ）。いくつかの実施形態において、前記１以上の公知の標準は、特徴付けられた細胞系である。「特徴付けられた細胞系」は、該細胞系の細胞のテロメア核酸の相対的長さは公知であり、比較的一定であることを意味する。特徴付けられた細胞系の限定されない例としては、Ｍ１４Ｍｅｌ細胞、Ａ５４９細胞、ＳＫ−Ｍｅｌ−５細胞およびＯｖｃａｒ−５細胞が挙げられる。別の実施形態において、特徴付けられた細胞系は、個体由来の生体試料を代表する細胞系から選択される。これらの細胞系の限定されない例としては、非小細胞肺がん細胞系、肝細胞細胞系または卵巣細胞系を挙げることができる。さらに他の実施形態において、前記１以上の基準は、複数の個体由来の複数の天然腫瘍から確立されたテロメア長範囲である。一実施形態において、複数の天然腫瘍由来のがん細胞は、個体由来の生体試料中に存在するがん細胞と同じタイプであってよい。いくつかの実施形態において、生体試料中に存在するがん細胞におけるテロメア長は、これらの数の間の任意のパーセンタイル（これらの数を含む）を含むテロメア長範囲の４５パーセンタイル、４０パーセンタイル、３５パーセンタイル、３０パーセンタイル、２５パーセンタイル、２０パーセンタイル、１５パーセンタイル、１０パーセンタイル、５パーセンタイルのいずれかの範囲であること、またはテロメア長範囲より短いこと、が決定される。
【０１３５】
別の実施形態において、テロメア核酸の相対的長さは、ｔｅｌｏ−ＦＩＳＨを使用して決定される。この方法を使用する場合、「相対的テロメア長」という語句は、上記の方法で方程式１を使用して決定される値として定義される。いくつかの実施形態において、前記１以上の公知の標準は、特徴付けられた細胞系である。特徴付けられた細胞系の限定されない例としては、Ｍ１４Ｍｅｌ細胞、Ａ５４９細胞、ＳＫ−Ｍｅｌ−５細胞およびＯｖｃａｒ−５細胞が挙げられる。別の実施形態において、特徴付けられた細胞系は、個体由来の生体試料を代表する細胞系から選択される。これらの細胞系の限定されない例としては、非小細胞肺がん細胞系、肝細胞細胞系または卵巣細胞系を挙げることができる。さらに他の実施形態において、前記１以上の公知の標準は、複数の個体由来の複数の天然腫瘍から確立されたテロメア長範囲である。一実施形態において、複数の天然腫瘍由来のがん細胞は、個体由来の生体試料中に存在するがん細胞と同じタイプであってよい。いくつかの実施形態において、生体試料中に存在するがん細胞におけるテロメア長は、これらの数の間の任意のパーセンタイル（これらの数を含む）を含むテロメア長範囲の４５パーセンタイル、４０パーセンタイル、３５パーセンタイル、３０パーセンタイル、２５パーセンタイル、２０パーセンタイル、１５パーセンタイル、１０パーセンタイル、５パーセンタイルのいずれかの範囲であること、またはテロメア長範囲より短いこと以下、が決定される。
Ｄ．テロメラーゼ阻害剤の投与
【０１３６】
いくつかの実施形態において、テロメラーゼ阻害剤（例えば、本明細書に開示のテロメラーゼ阻害化合物のいずれか）は、注射の形態で投与される。注射は、該化合物と、水性の注射可能な賦形剤またはキャリアとを組み合わせて含むことができる。適切な水性の注射可能な賦形剤またはキャリアの限定されない例は、当業者に周知であり、これらおよび該製剤の製剤化方法は、Ａｌｆｏｎｓｏ  ＡＲ：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１７版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ  Ｐａ．、１９８５などの標準的参考文献に見出すことができる。適切な水性の注射可能な賦形剤またはキャリアとしては、水、食塩水溶液、デキストロース水溶液などが挙げられ、場合により、溶解強化剤、例えば、１０％マンニトールまたは他の糖、１０％グリシンまたは他のアミノ酸を含有する。組成物は皮下、腹腔内または静脈内に注射可能である。
【０１３７】
いくつかの実施形態において、静脈内投与が使用され、静脈内投与は、数分から１時間以上、例えば１５分ほどの期間にわたる、連続静脈内注入であってよい。投与量は、テロメラーゼ阻害剤のタイプ、単位投薬量のサイズ、賦形剤もしくはキャリアの種類、および当業者に周知の他の要因に依存して、大きく変動する。テロメラーゼ阻害剤は、例えば、約０．００１％から約１０％（ｗ／ｗ）、約０．０１％から約１％、約０．１％から約０．８％またはこれらの任意の範囲を含むことができ、残りは、賦形剤（複数可）またはキャリア（複数可）を含む。
【０１３８】
経口投与に関しては、テロメラーゼ阻害剤は、薬学的に許容され得る賦形剤またはキャリア、例えば、結合剤、増量剤、滑沢剤、崩壊剤または湿潤剤と共に、例えば、従来の手段により調製された錠剤またはカプセルの形態をとることができる。経口投与のための液体調製品は、例えば、溶液、シロップまたは懸濁液の形態をとることができ、またはこれらは、使用前に水または他の適切なビヒクルにより構成するための乾燥製品として提供することができる。このような液体調製品は、薬学的に許容され得る添加剤、例えば、懸濁剤（例えばソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化食用脂肪）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア・ゴム）；非水性ビヒクル（例えば、アチオンド油（ａｔｉｏｎｄ  ｏｉｌ）、油性エステル、エチルアルコールまたは分画された植物油）；ならびに保存料（例えば、メチルまたはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）と共に、従来の手段により調製することができる。調製品はまた、緩衝塩、香味剤または着色剤を、適宜含有してよい。
【０１３９】
いくつかの実施形態において、テロメラーゼ阻害剤は、適切な噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素またはこれらの組み合わせを含み得る、エアゾールスプレーまたは噴霧器を介して吸入により投与され得る。限定されない１つの例において、加圧エアゾールのための投薬単位は、計量バルブを介して送達され得る。別の実施形態において、例えば、ゼラチンのカプセルおよびカートリッジが吸入器において使用でき、化合物と適切な粉末基剤、例えば、デンプンまたはラクトースとの粉末化ミックスを含有するように製剤化することができる。
【０１４０】
いくつかの実施形態において、組成物（例えば医薬組成物）中のテロメラーゼ阻害剤の量は、下記の範囲：約０．５から約５ｍｇ、約５から約１０ｍｇ、約１０から約１５ｍｇ、約１５から約２０ｍｇ、約２０から約２５ｍｇ、約２０から約５０ｍｇ、約２５から約５０ｍｇ、約５０から約７５ｍｇ、約５０から約１００ｍｇ、約７５から約１００ｍｇ、約１００から約１２５ｍｇ、約１２５から約１５０ｍｇ、約１５０から約１７５ｍｇ、約１７５から約２００ｍｇ、約２００から約２２５ｍｇ、約２２５から約２５０ｍｇ、約２５０から約３００ｍｇ、約３００から約３５０ｍｇ、約３５０から約４００ｍｇ、約４００から約４５０ｍｇ、または約４５０から約５００ｍｇのいずれかに含まれる。いくつかの実施形態において、有効量の医薬組成物（例えば、単位剤形）中のテロメラーゼ阻害剤の量は、約５ｍｇから約５００ｍｇの範囲内、例えば、約３０ｍｇから約３００ｍｇまたは約５０ｍｇから約２００ｍｇである。いくつかの実施形態において、医薬組成物中のテロメラーゼ阻害剤の濃度は、希薄（約０．１ｍｇ／ｍｌ）または濃厚（約１００ｍｇ／ｍｌ）であり、例えば、約０．１から約５０ｍｇ／ｍｌ、約０．１から約２０ｍｇ／ｍｌ、約１から約１０ｍｇ／ｍｌ、約２ｍｇ／ｍｌから約８ｍｇ／ｍｌ、約４から約６ｍｇ／ｍｌ、約５ｍｇ／ｍｌのいずれかを含む。いくつかの実施形態において、テロメラーゼ阻害剤の濃度は、少なくとも約０．５ｍｇ／ｍｌ、１．３ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、６ｍｇ／ｍｌ、７ｍｇ／ｍｌ、８ｍｇ／ｍｌ、９ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌ、または５０ｍｇ／ｍｌのいずれかである。
【０１４１】
医薬組成物中のテロメラーゼ阻害剤の例示的有効量としては、限定するものではないが、少なくとも約２５ｍｇ／ｍ２、３０ｍｇ／ｍ２、５０ｍｇ／ｍ２、６０ｍｇ／ｍ２、７５ｍｇ／ｍ２、８０ｍｇ／ｍ２、９０ｍｇ／ｍ２、１００ｍｇ／ｍ２、１２０ｍｇ／ｍ２、１２５ｍｇ／ｍ２、１５０ｍｇ／ｍ２、１６０ｍｇ／ｍ２、１７５ｍｇ／ｍ２、１８０ｍｇ／ｍ２、２００ｍｇ／ｍ２、２１０ｍｇ／ｍ２、２２０ｍｇ／ｍ２、２５０ｍｇ／ｍ２、２６０ｍｇ／ｍ２、３００ｍｇ／ｍ２、３５０ｍｇ／ｍ２、４００ｍｇ／ｍ２、５００ｍｇ／ｍ２、５４０ｍｇ／ｍ２、７５０ｍｇ／ｍ２、１０００ｍｇ／ｍ２または１０８０ｍｇ／ｍ２のいずれかが挙げられる。さまざまな実施形態において、医薬組成物は、約３５０ｍｇ／ｍ２、３００ｍｇ／ｍ２、２５０ｍｇ／ｍ２、２００ｍｇ／ｍ２、１５０ｍｇ／ｍ２、１２０ｍｇ／ｍ２、１００ｍｇ／ｍ２、９０ｍｇ／ｍ２、５０ｍｇ／ｍ２または３０ｍｇ／ｍ２のいずれかより少ないテロメラーゼ阻害剤を含む。いくつかの実施形態において、テロメラーゼ阻害剤の量／投与は、約２５ｍｇ／ｍ２、２２ｍｇ／ｍ２、２０ｍｇ／ｍ２、１８ｍｇ／ｍ２、１５ｍｇ／ｍ２、１４ｍｇ／ｍ２、１３ｍｇ／ｍ２、１２ｍｇ／ｍ２、１１ｍｇ／ｍ２、１０ｍｇ／ｍ２、９ｍｇ／ｍ２、８ｍｇ／ｍ２、７ｍｇ／ｍ２、６ｍｇ／ｍ２、５ｍｇ／ｍ２、４ｍｇ／ｍ２、３ｍｇ／ｍ２、２ｍｇ／ｍ２または１ｍｇ／ｍ２のいずれかより少ない。いくつかの実施形態において、医薬組成物中のテロメラーゼ阻害剤の有効量は、下記の範囲：約１から約５ｍｇ／ｍ２、約５から約１０ｍｇ／ｍ２、約１０から約２５ｍｇ／ｍ２、約２５から約５０ｍｇ／ｍ２、約５０から約７５ｍｇ／ｍ２、約７５から約１００ｍｇ／ｍ２、約１００から約１２５ｍｇ／ｍ２、約１２５から約１５０ｍｇ／ｍ２、約１５０から約１７５ｍｇ／ｍ２、約１７５から約２００ｍｇ／ｍ２、約２００から約２２５ｍｇ／ｍ２、約２２５から約２５０ｍｇ／ｍ２、約２５０から約３００ｍｇ／ｍ２、約３００から約３５０ｍｇ／ｍ２または約３５０から約４００ｍｇ／ｍ２のいずれかに含まれる。いくつかの実施形態において、医薬組成物中のテロメラーゼ阻害剤の有効量は、約５から約３００ｍｇ／ｍ２、例えば、約２０から約３００ｍｇ／ｍ２、約５０から約２５０ｍｇ／ｍ２、約１００から約１５０ｍｇ／ｍ２、約１２０ｍｇ／ｍ２、約１３０ｍｇ／ｍ２、または約１４０ｍｇ／ｍ２または約２６０ｍｇ／ｍ２である。
【０１４２】
上記の態様のいずれかのいくつかの実施形態において、医薬組成物中のテロメラーゼ阻害剤の有効量は、少なくとも約１ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、３．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、６．５ｍｇ／ｋｇ、７．５ｍｇ／ｋｇ、９．４ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇまたは２０ｍｇ／ｋｇのいずれかを含む。さまざまな実施形態において、医薬組成物中のテロメラーゼ阻害剤の有効量は、約３５０ｍｇ／ｋｇ、３００ｍｇ／ｋｇ、２５０ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇ、１５０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、９．４ｍｇ／ｋｇ、７．５ｍｇ／ｋｇ、６．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、３．５ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇのいずれかより少ないテロメラーゼ阻害剤を含む。
【０１４３】
医薬組成物（例えば、本明細書に開示のテロメラーゼ阻害剤のいずれかを含有する医薬組成物）の例示的投薬頻度としては、限定するものではないが、毎日、１日おき、週に２回、週に３回、休止なしで毎週、４週に３回毎週、３週に１回、２週に１回、３週に２回毎週が挙げられる。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、約２週に１回、３週に１回、４週に１回、６週に１回または８週に１回投与される。いくつかの実施形態において、組成物は、週に少なくとも約１×、２×、３×、４×、５×、６×または７×（すなわち毎日）または１日に３回、１日に２回のいずれかで投与される。いくつかの実施形態において、個々の投与の間の間隔は、約６ヶ月、３ヶ月、１ヶ月、２０日、１５日、１２日、１０日、９日、８日、７日、６日、５日、４日、３日、２日または１日のいずれかより短い。いくつかの実施形態において、個々の投与の間の間隔は、約１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、８ヶ月または１２ヶ月のいずれかより長い。いくつかの実施形態において、投薬スケジュールに休止は無い。いくつかの実施形態において、個々の投与の間の間隔は、約１週間以下である。
【０１４４】
医薬組成物の投与は、長期間、例えば、約１ヶ月から約７年までにわたって延長することができる。いくつかの実施形態において、組成物は、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１８、２４、３０、３６、４８、６０、７２または８４ヶ月のいずれかの期間にわたって投与される。
【実施例】
【０１４５】
（実施例１）
オリゴヌクレオチドＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート（ＮＰ）またはＮ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデート（ＮＰＳ）の調製および脂質接合体
本実施例は、脂質接合オリゴヌクレオチドＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート（ＮＰ）またはＮ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデート（ＮＰＳ）の合成方法を示す。
材料および方法
出発化合物
【０１４６】
これらの化合物は、例えば、ＭｃＣｕｒｄｙら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３８：２０７−２１０（１９９７）またはＰｏｎｇｒａｃｚ＆Ｇｒｙａｚｎｏｖ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４９：７６６１−７６６４（１９９９）に記載のように調製することができる。出発３’−アミノヌクレオシドモノマーは、Ｎｅｌｓｏｎら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６２：７２７８−７２８７（１９９７）に記載のように、またはＧｒｙａｚｎｏｖら、米国特許出願公開第２００６／０００９６３６号に記載の方法により調製することができる。
脂質の結合
【０１４７】
さまざまな合成の取り組みを使用して、選択された結合の特性に依存して、脂質部分Ｌをオリゴヌクレオチドに接合することができる；例えば、Ｍｉｓｈｒａら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １２６４：２２９−２３７（１９９５）、Ｓｈｅａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：３７７７−３７８３（１９９５）またはＲｕｍｐら、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．９：３４１−３４９（１９９５）を参照されたい。通常、接合は、オリゴヌクレオチド末端の適切な官能基の使用を介して達成される。例えば、ＮＰおよびＮＰＳオリゴヌクレオチドの３’−末端に存在する３’−アミノ基は、適切なカップリング触媒を使用して、カルボン酸、酸の塩化物、無水物および活性エステルと反応して、アミド結合を形成し得る。チオール基もまた、官能基として適切である（Ｋｕｐｉｈａｒら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．９：１２４１−１２４７（２００１）を参照されたい）。異なる鎖長のさまざまなアミノ−およびチオール−官能化修飾剤が、市販品としてオリゴヌクレオチド合成に利用可能である。
【０１４８】
脂質基をＮＰまたはＮＰＳオリゴヌクレオチドの末端に結合する特定の取り組みは、米国特許出願公開第２００５／０１１３３２５号に記載の取り組みを含み、当該特許はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。上記のアミド結合に加えて、例えば、脂質は、脂質のホスホルアミダイト誘導体を使用してオリゴヌクレオチド鎖に結合させ、脂質とオリゴヌクレオチドとをつなぐホスホルアミデートまたはチオホスホルアミデート結合を生み出すこともできる。完全に保護された支持体結合オリゴヌクレオチドの遊離の３’−アミノはまた、適切な脂質アルデヒドと反応させ、その後、シアノ水素化ホウ素ナトリウムにより還元して、アミン結合を作り出すこともできる。
【０１４９】
脂質と５’末端との結合に関しては、米国特許出願公開第２００５／０１１３３２５号にも記載のように、オリゴヌクレオチドは、修飾された、脂質含有固体支持体を使用して合成することができる。３’−アミノ−１，２−プロパンジオールと脂肪酸アシル塩化物（ＲＣ（Ｏ）Ｃｌ）との反応、次いで、第１級アルコールのジメトキシトリチル化および第２級アルコールのスクシニル化により中間体が提供され、この中間体はその後、遊離のスクシニルカルボキシル基を介して、固体支持体につなげられる。修飾された支持体の例を下記に示し、式中Ｓは長鎖アルキルアミンＣＰＧ支持体を表し、Ｒは脂質を表す。
【化３】
2018099127.tif 000004
【０１５０】
この手順は、次いで、例えば、Ｐｏｎｇｒａｃｚ＆Ｇｒｙａｚｎｏｖ（１９９９）に記載のように、−ＯＤＭＴ基の脱保護およびホスフィチル化から出発する５’から３’方向へのオリゴヌクレオチドの合成が続く。これは、例えば、固体支持体からの切断後に、下記の構造を作り出すために有効である。
【化４】
2018099127.tif 000005
【０１５１】
−Ｒが−（ＣＨ２）１４ＣＨ３（パルミトイル）である場合、上記の構造は、本明細書においてＧＲＮ１６３Ｌ（イメテルスタット）と名付けられる。
ＦｌａｓｈＰｌａｔｅ（商標）アッセイ
【０１５２】
このアッセイは、基本的にＡｓａｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６３：３９３１−３９３９（２００３）に記載のように実施した。簡潔に言うと、このアッセイは、ＴＴＡＧＧＧテロメアリピートのビオチン化テロメラーゼ基質プライマーへの付加を測定することによって、テロメラーゼ活性を検出および／または測定する。ビオチン化産物を、ストレプトアビジン・コーティング・マイクロタイタープレートに捕捉し、３３Ｐで標識された、３．５テロメアリピートに相補的なオリゴヌクレオチドプローブを、テロメラーゼ産物の測定に使用する。未結合のプローブを洗浄により除去し、捕捉されたテロメラーゼ産物にアニーリングするプローブの量を、シンチレーション計数により決定する。
（実施例２）
イメテルスタットのＮＳＣ第ＩＩ相（ＣＰ１４Ｂ−０１２）試験由来のホルマリン固定・パラフィン包埋試料におけるｑＰＣＲ
【０１５３】
この実施例は、ＦＦＰＥ  ＮＳＣ第ＩＩ相（ＣＰ１４Ｂ−０１２）試験組織試料の相対的テロメア長を決定するための、定量的ポリメラーゼ連鎖反応の性能を実証する。
材料および方法
臨床試験のデザイン
【０１５４】
ＮＳＣ第ＩＩ相（ＣＰ１４Ｂ−０１２）試験の目的は、４サイクルのプラチナ系療法を用いた療法の後で進行していない、進行期の非小細胞肺がんを有する患者のための維持療法として、イメテルスタット（ＧＲＮ１６３Ｌ）の有効性および安全性を評価することであった。参加者を、２：１比でイメテルスタット＋標準ケア対標準ケア単独にランダム化した。ベバシズマブを導入化学療法と共に与えられた参加者には、本研究においてベバシズマブを与え続けた。
【０１５５】
第１の評価基準は、ランダム化から疾患進行の確認または死のいずれか早い方までの時間として定義される、無増悪生存であり、これは、ＲＥＣＩＳＴ（固形腫瘍における応答評価基準（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｉｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｔｕｍｏｒｓ））に従って治験責任医師の評価により決定された。第２の評価基準は、客観的反応、原因を問わない死亡までの時間ならびに（有害事象の発生、特徴および重症度、検査所見の異常およびバイタルサインにより評価された）安全性および忍容性であった。
【０１５６】
患者を２つのアームに分割した。実験アームにおいて、患者は、イメテルスタット＋標準ケア（ベバシズマブまたは観察）を受けた。具体的には、９．４ｍｇ／ｋｇのイメテルスタット（ＧＲＮ１６３Ｌ）を、２時間かけてＩＶ注入で、各２１日サイクルの１日目および８日目に疾患進行まで患者に与えた。投与した場合、ベバシズマブは、各２１日サイクルの１日目に、ＦＤＡ承認ベバシズマブパッケージの挿入物に従った投薬量および期間で与えた。
【０１５７】
対照アームにおいて、患者は、ベバシズマブまたは観察を受けた。投与した場合、ベバシズマブは、各２１日サイクルの１日目に、ＦＤＡ承認ベバシズマブパッケージの挿入物に従った投薬量および期間で与えた。
【０１５８】
試料を、ＮＳＣ第ＩＩ相（ＣＰ１４Ｂ−０１２）試験に登録した１１６人の患者のうち６１人から得、このうち５７人が、無増悪生存（ＰＦＳ）分析に使用される評価可能なアッセイ結果をもたらした。
ホルマリン固定およびパラフィン包埋
【０１５９】
ホルマリン固定およびパラフィン包埋試料を、ＨｉｓｔｏＧｅｌ  Ｋｉｔ（カタログ番号Ｒ９０４０１２：Ｒｉｃｈａｒｄ  Ａｌｌｅｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒの子会社、Ｋａｌａｍａｚｏｏ、ＭＩ）を使用して調製した。細胞を８０−９０％集密まで培養した。細胞ペレット（１０６／ペレット）をまず、５０±５℃において溶かした２００−５００μＬのＨｉｓｔｏＧｅｌと穏やかに混合し、その後、氷上で固化するまで冷却した。固化後、試料を急速に遠心脱水して、残留する液体を除去した。１０ｍＬの４％ホルマリンをゲル化したペレットに加え、細胞ペレットを、４８時間、室温において固定した。固定された細胞ペレットを、次いで、Ｈｉｓｔｏ−Ｔｅｃ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡの標準的組織学的技術を使用して包埋し、次いで、−８０℃において凍結させた。
ＤＮＡの抽出
【０１６０】
ＮＳＣＬＣ第ＩＩ相試験試料のゲノムＤＮＡを、ＦＦＰＥ  ＤＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、ＢｉｏＣｈａｉｎ（ＢｉｏＣｈａｉｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、カタログ番号Ｋ５０１９１００、Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ）製を使用して、製造業者の取り扱い説明書に従って、ＦＦＰＥ処理試料から単離した。組織を、１７０μＬのキットバッファーおよび３０μＬのプロテイナーゼＫと混合した。混合物を５６℃において１時間インキュベートし、次いで、温度を、９０℃に６０分間、その後、９８℃に２分間上昇させ、氷上に２分間配置した。混合物を、１４，０００ｒｐｍにおいて１０分間４℃で遠心分離して、上清を得た。ＤＮＡ濃度を、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ  Ｐｉｃｏ  Ｇｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｐ７５８９、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）により決定した。上清中のＤＮＡの濃度を、０．１ｎｇ／μＬにＨ２Ｏで調整した。
定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）
【０１６１】
全ての定量的ＰＣＲ反応は、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７９００  ＨＴ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ）を使用して実施した。２回のＰＣＲを各試料に関して行い、一方は、テロメア（Ｔ）増幅に関するサイクル閾値（Ｃｔ）値を決定するためであり、他方は、単一コピー遺伝子（酸性リボソームリンタンパク質（ａｃｉｄｉｃ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ）Ｐ、３６Ｂ４）の増幅に関するＣｔ値の決定のためである。
【０１６２】
テロメア増幅のためのプライマー配列は、Ｔｅｌｇ  ５’−ＡＣＡ  ＣＴＡ  ＡＧＧ  ＴＴＴ  ＧＧＧ  ＴＴＴ  ＧＧＧ  ＴＴＴ  ＧＧＧ  ＴＴＴ  ＧＧＧ  ＴＴＡ  ＧＴＧ  Ｔ  （配列番号４）およびＴｅｌｃ  ５’−ＴＧＴ  ＴＡＧ  ＧＴＡ  ＴＣＣ  ＣＴＡ  ＴＣＣ  ＣＴＡ  ＴＣＣ  ＣＴＡ  ＴＣＣ  ＣＴＡ  ＴＣＣ  ＣＴＡ  ＡＣＡ（配列番号５）（Ｃａｗｔｈｏｎ、２００９）であり；３６Ｂ４ｕのためのプライマー配列は、：５’−ＣＡＧ  ＣＡＡ  ＧＴＧ  ＧＧＡ  ＡＧＧ  ＴＧＴ  ＡＡＴ  ＣＣ（配列番号６）および３６Ｂ４ｄ：５’−ＣＣＣ  ＡＴＴ  ＣＴＡ  ＴＣＡ  ＴＣＡ  ＴＣＡ  ＡＣＧ  ＧＧＴ  ＡＣＡ  Ａ（配列番号７）（Ｃａｗｔｈｏｎ、２００２）であった。
【０１６３】
テロメア増幅のための各ＰＣＲ反応は、１ｎｇ／１０μＬの試料（０．１ｎｇ／μＬ）と、１．２５ＵのＨｏｔｓｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｔａｑ  ポリメラーゼ（ＢｉｏＣｈａｉｎ）、１５０ｎＭの６−ＲＯＸ蛍光色素、０．０４×ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ  核酸染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ）、５０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２ｍＭの各デオキシヌクレオシド三リン酸（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、５ｍＭのジチオスレイトール、１％ジメチルスルホキシドおよび１５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０ならびにプライマー対ＴｅｌｇおよびＴｅｌｃ（両方とも９００ｎＭ）を含有する、４０μＬのＰＣＲ混合物とを使用して行った。高濃度のプライマーは、多重アニーリング部位を可能にするので、ＦＦＰＥ  ＤＮＡを使用する場合、プライマー濃度が高い方がテロメアＤＮＡには好ましい。
【０１６４】
テロメア配列を、３段階で増幅させた。第１段階：９５℃において１０分間、Ｈｏｔｓｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｔａｑ  ポリメラーゼ（ＢｉｏＣｈａｉｎ）の活性化；第２段階：１５秒９５℃、１０秒５０℃を５サイクル、その後の増幅サイクルのための鋳型として機能するＰＣＲ産物の生成。第２段階のアニーリング温度は、４９℃から５８℃の範囲であってよい。第３段階：１５秒９５℃、１５秒６０℃および６０℃におけるシグナル獲得を２５サイクル。全実行時間は７０分であった。
【０１６５】
単一コピー３６Ｂ４遺伝子の増幅は、Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して下記：１０分９５℃、Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）中のＤＮＡポリメラーゼの活性化、次いで、１５秒９５℃、１分５８℃および５８℃におけるシグナル獲得を４０サイクル、のように実施した。３６Ｂ４の増幅は、１ｎｇ／１０μＬの試料（０．１ｎｇ／μＬ）、４０μＬのＰｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ）およびプライマー対３６Ｂ４ｄ（３００ｎＭ）および３６Ｂ４ｕ（３００ｎＭ）を使用して実施した。
【０１６６】
第２段階のテロメア配列ＰＣＲのためのサイクル数は、各ＰＣＲ反応において１ｎｇのＤＮＡを使用する場合、適切なΔＣｔ値（ΔＣｔ試料＝Ｃｔテロメア−Ｃｔ参照）を得るために５サイクルに修正した。１ｎｇ−１０ｎｇのＤＮＡ／反応は、再現性研究において＞９４％のＰＣＲ効率を有した。単一コピー遺伝子のＰＣＲのためのサイクル数は、十分な単一コピー遺伝子ＰＣＲ産物を生成するために、テロメアＰＣＲのためのサイクル数より９サイクル多いことが必要である。
【０１６７】
単一コピー遺伝子とテロメアとの平均サイクル数の差（Ｃｔ３６Ｂ４−ＣｔテロメアまたはΔＣｔ）は、試料の間で９．２０８から１４．５００の範囲であった。
【０１６８】
ＦＦＰＥ試料由来のゲノムＤＮＡにおけるＤＮＡの架橋および断片化は、特有の課題、特に、長い、反復性テロメア配列の増幅をもたらすが、同じ試料における酸性リボソームリンタンパク質Ｐのための（この文献において３６Ｂ４と名付けられた）単一コピー遺伝子の７６ｂｐ断片の増幅は、多くの場合影響を受けない。この問題を解決するために、いくつかのＰＣＲ条件、すなわち、ＰＣＲプライマーの選択、ＰＣＲ反応バッファー条件および熱サイクリング条件を改変してテロメアアンプリコンのサイズを短縮し、ＰＣＲ増幅の効率を改善するという目的を達成した。
結果
【０１６９】
サザンブロットにより決定されたヒト腫瘍細胞系における平均テロメア長は、ｑＰＣＲ（アッセイ基準）により得られた結果と相関する（図３Ａおよび３Ｂ）。
【０１７０】
ｑＰＣＲにより得られたテロメア長サブグループにおける無増悪生存の分析は、イメテルスタットにより処置された、短いテロメアを有する患者が、中程度−長いテロメアを有する患者より、対照と比較した応答性が有意に高かったことを示した（図１Ａおよび１Ｂ）。
【０１７１】
５７試料のうち１９（３３％）が、短いテロメアを有した（図１Ａ）。これらに関して、無増悪生存分析により以下のことが示された：対照イベント／Ｎは７／８であり、イメテルスタットイベント／Ｎは８／１１であった（図１Ａ）；対照中央値（９５％ＣＩ）は１．４８（１．１８、２．７６）であり、イメテルスタット中央値（９５％ＣＩ）は４．０５（１．２５、ＮＡ）であった（図１Ａ）；ログランク  Ｐ値は０．０４２であり、ハザード比（９５％ＣＩ）は０．３２（０．１、１．０２）であった（図１Ａ）。
【０１７２】
５７試料のうち３８（６７％）が、中程度−長いテロメアを有した（図１Ｂ）。これらに関して、無増悪生存分析により以下のことが示された：対照イベント／Ｎは８／１２であり、イメテルスタットイベント／Ｎは２１／２６であった（図１Ｂ）；対照中央値（９５％ＣＩ）は２．７（１．０９、３．５９）であり、イメテルスタット中央値（９５％ＣＩ）は２．８（１．５１、４．１８）であった（図１Ｂ）；ログランク  Ｐ値は０．６２３であり、ハザード比（９５％ＣＩ）は０．８３（０．３６、１．８９）であった（図１Ｂ）。
【０１７３】
処置効果は、非線形様式で上昇し、腫瘍のテロメア長は減少した（図５）。
（実施例３）
ＮＳＣ第ＩＩ相（ＣＰ１４Ｂ）試験由来のホルマリン固定・パラフィン包埋試料におけるＴｅｌｏ−ＦＩＳＨ
【０１７４】
試料は、上記のＮＳＣ第ＩＩ相（ＣＰ１４Ｂ−０１２）試験に登録した１１６人の患者のうち６１人から得た。これらの６１人の患者試料のうち、５９が、ＰＦＳ分析に使用される、評価可能なＴｅｌｏ−ＦＩＳＨアッセイ結果をもたらした。各アッセイは、スライドグラスの６つの領域（「視野」）から、７から１４５４５の間のｆｏｃｉに関するデータを生み出した。面積および蛍光強度を、各ｆｏｃｉに関して記録した。
材料および方法
【０１７５】
未染色のＦＦＰＥ組織スライド（５μｍの厚みの組織切片）を、日常の組織学的方法により調製した。組織スライドを６５℃において６分間、予備加熱してパラフィンを溶かし、その後スライドラックに装填した。装填されたスライドラックを、染色タンク中の１００ｍＬのキシレンに３分間、２回（３分×２）浸漬して、パラフィンを除去した。
【０１７６】
次いで、スライドを、段階的な一連のエタノール：１００％ＥｔＯＨ、（３分×２）、９５％ＥｔＯＨ（３分×２）および７０％ＥｔＯＨ（３分×２）を介して３分間の漸増で水和させた。このエタノール浸漬後、スライドを、脱イオン水に３分間浸漬させ、１％Ｔｗｅｅｎ−２０洗浄剤を含む脱イオン水にさらに３分間浸漬させた。
【０１７７】
スライドを、水に短時間少し浸し、Ｔｗｅｅｎ−２０を洗い流し、その後、ブロットして、Ｖｅｃｔｏｒ社の標的アンマスキング溶液（Ｈ２Ｏに１００倍希釈）を含有する１００ｍＬの１×クエン酸バッファーのタンクに浸漬した。タンク全体を予備加熱（沸騰）スチーマーに配置し、３５分間蒸気を当て、その後スチーマーから取り外して、少なくとも３０分間、室温において冷却した。スライドを、次に脱イオン水に３分間浸漬し、その後、７０％エタノールに２回、９５％エタノールに２回浸漬して、風乾させた。
【０１７８】
ハイブリダイゼーションプローブを、下記の試薬および体積を使用して調製した：
【化５】
2018099127.tif 000006
【０１７９】
１０ｕｇ／ｍＬのＰＮＡテロメアプローブＴｅｌＣ−Ｃｙ３（ＰＮＡ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．）ＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡ（配列番号８）ストックを、ハイブリダイゼーションバッファーで適切な希釈係数（例えば５×）で希釈した。３０−５０μＬの希釈されたＰＮＡプローブを標本に加え、その後、カバースリップを、気泡を導入することなく載せた。スライドを、スライドインキュベーターの表面に、６分間、８４℃において配置し、テロメアＤＮＡを変性させた。
【０１８０】
スライドを、暗い密閉された容器に移し、２時間、室温においてハイブリダイズさせた。容器は、水または湿ったキムワイプを加えて湿らせ、乾燥を防いだ。
【０１８１】
ＰＮＡテロメアプローブのための洗浄バッファーを、下記の試薬および体積を使用して調製した：
【化６】
2018099127.tif 000007
【０１８２】
カバースリップを取り外した後で、スライドを、ＰＮＡ洗浄バッファーで１５分間２回  （１５分×２）、穏やかに撹拌しながら室温において洗浄した。次に、スライドの水分を切り、１ｕｇ／ｍｌのＤＡＰＩ溶液（５ｍｇ／ｍＬのＤＡＰＩストック溶液の水による１：５０００希釈；例えば、１００ｍＬのＨ２Ｏ中２０μＬの５ｍｇ／ｍＬ  ＤＡＰＩストック）で５分間、核を対比染色した。
【０１８３】
スライドを、次に蒸留水で３分間４回（３分×４）洗浄し、水分を切り、風乾させた。カバースリップを、抗退色封入剤溶液（ａｎｔｉ−ｆａｄｅ  ｍｏｕｎｔｉｎｇ  ｍｅｄｉａ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を使用して、気泡を避けながらスライド上に載せた。カバースリップを載せたスライドを、一晩暗所に維持し、スライドを光から保護し、その後顕微鏡下で検査した。染色したスライドをＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ２０００（ＧＥ
Ｃｏｒｐ．）の下でスクリーニングし、ＤＡＰＩ（核）およびＣｙ３（テロメア）の蛍光シグナル強度および蛍光シグナル面積を収集した。
【０１８４】
ＩＮ  Ｃｅｌｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ  Ｔｏｏｌｂｏｘ  １．９（ＧＥ  Ｃｏｒｐ．）を利用して、生体試料から得られた細胞に由来する平均テロメア長を定量し、ｔｅｌｏ−ＦＩＳＨに供した。このソフトウェアを使用して、ＤＡＰＩ染色の位置に基づき細胞核のまわり、およびテロメア特異的蛍光の位置に基づき細胞テロメアの周りに線を引いた。ひとたび核およびテロメアそれぞれが囲まれると、ソフトウェアが、細胞中の各個別のテロメアの強度および面積を計算して、方程式１：
１．３７６×ｌｏｇ２（強度）−６．２１５×√（面積）［方程式１］
に従って、生体試料に由来する細胞に関する平均テロメア長を決定した。
初期結果
【０１８５】
サザンブロットにより決定されたヒト腫瘍細胞系におけるテロメア長は、Ｔｅｌｏ−ＦＩＳＨにより得られた結果（アッセイ基準）と相関する（図４Ａおよび４Ｂ）。
【０１８６】
Ｔｅｌｏ−ＦＩＳＨ  ＩＮ  Ｃｅｌｌ−Ｑｕａｒｔｉｌｅ  Ｓｐｌｉｔにより得られたテロメア長サブグループにおける無増悪生存の分析により、広い面積および低強度（すなわち、強度と面積の比が低い）が、イメテルスタットのより優れた有効性と関係することが示された（図２）。
【０１８７】
無増悪生存分析により以下のことが示された：イベント／Ｎは９／１５であった；対照中央値（９５％ＣＩ）は１．１８（１．０９、ＮＡ）であり、イメテルスタット中央値（９５％ＣＩ）は４．７（１．４１、ＮＡ）であった（図２）；ログランクＰ値は０．０４４であり、ハザード比は（９５％ＣＩ）は０．２６（０．０６、１．１）であった（図２）。
【０１８８】
イメテルスタットにより処置された患者における無増悪生存のＴｅｌｏ−ＦＩＳＨ多変数予測は、下記のデータをもたらした：
【化７】
2018099127.tif 000008
【０１８９】
多変数モデルによるＰＦＳリスクの四分位分割（低強度／面積の比）：
【化８】
2018099127.tif 000009
【０１９０】
処置効果は非線形様式で増加し、腫瘍テロメア長は減少する（図６）。
後期結果
【０１９１】
患者集団のさらなる分析を、後期時点において実施した。この後期データを、図７から１０に表す。
【０１９２】
図７は、全ての患者に関する無増悪生存分析（Ｎ＝１１４全患者、９２人が無増悪生存イベントおよび２．６ヶ月の追跡期間中央値）を示し、一方、図８Ａおよび８Ｂは、それぞれ、短いテロメアおよび中程度−長いテロメアを有する患者に関する無増悪生存分析を示す。短いテロメアを有する患者に関して、前向きＴｅｌｏ−ＦＩＳＨアッセイが無増悪生存の予測としてあてはまった（図８Ａ）。
【０１９３】
全ての患者に関する全生存率分析（１１４人の全患者、６６人が全生存イベントおよび１０．５ヶ月の追跡期間中央値）を図９に示し、図９は、対照と比較した、イメテルスタットを与えられた患者に関する全生存利益への傾向を実証している。短いテロメアを有する患者に関する全生存分析を、図１０Ａに示し、一方、中程度−長いテロメアを有する患者に関する全生存分析を図１０Ｂに示す。
（実施例４）
イメテルスタットのＮＳＣ第ＩＩ相（ＣＰ１４Ｂ−０１２）試験由来のホルマリン固定・パラフィン包埋試料におけるｑＰＣＲ
【０１９４】
この実施例は、ＦＦＰＥ  ＮＳＣ第ＩＩ相（ＣＰ１４Ｂ−０１２）試験組織試料の相対的テロメア長決定のための、第２の定量的ポリメラーゼ連鎖反応の性能を実証する。
【０１９５】
この実施例は、ｑＰＣＲプロトコルに下記の変更を加え、実施例２の手順のすべてに従った。
定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）
【０１９６】
すべての定量的ＰＣＲ反応を、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７９００  ＨＴ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ）を使用して実施した。１回のＰＣＲを行った。
【０１９７】
テロメア増幅のためのプライマー配列は、Ｔｅｌｇ  ５’−ＡＣＡ  ＣＴＡ  ＡＧＧ  ＴＴＴ  ＧＧＧ  ＴＴＴ  ＧＧＧ  ＴＴＴ  ＧＧＧ  ＴＴＴ  ＧＧＧ  ＴＴＡ  ＧＴＧ  Ｔ（配列番号４）およびＴｅｌｃ  ５’−ＴＧＴ  ＴＡＧ  ＧＴＡ  ＴＣＣ  ＣＴＡ  ＴＣＣ  ＣＴＡ  ＴＣＣ  ＣＴＡ  ＴＣＣ  ＣＴＡ  ＴＣＣ  ＣＴＡ  ＡＣＡ（配列番号５）  （Ｃａｗｔｈｏｎ、２００９）であり、３６Ｂ４ｕのためのプライマー配列は：５’−ＣＡＧ  ＣＡＡ  ＧＴＧ  ＧＧＡ  ＡＧＧ  ＴＧＴ  ＡＡＴ  ＣＣ（配列番号６）および３６Ｂ４ｄ：５’−ＣＣＣ  ＡＴＴ  ＣＴＡ  ＴＣＡ  ＴＣＡ  ＴＣＡ  ＡＣＧ  ＧＧＴ  ＡＣＡ  Ａ（配列番号７）（Ｃａｗｔｈｏｎ、２００２）であった。
【０１９８】
ＤＮＡ標準もまた、アッセイ／プレートの対照として使用した。テロメア長二本鎖鋳型のためのＤＮＡ標準の配列は、５’−ＴＴＡ  ＧＧＧ  ＴＴＡ  ＧＧＧ  ＴＴＡ  ＧＧＧ  ＴＴＡ  ＧＧＧ  ＴＴＡ  ＧＧＧ  ＴＴＡ  ＧＧＧ  ＴＴＡ  ＧＧＧ  ＴＴＡ  ＧＧＧ  ＴＴＡ  ＧＧＧ  ＴＴＡ  ＧＧＧ  ＴＴＡ  ＧＧＧ  ＴＴＡ  ＧＧＧ  ＴＴＡ  ＧＧＧ  ＴＴＡ  ＧＧＧ−３’（配列番号９）であり、単一コピー遺伝子二本鎖鋳型のための配列は、：５’−ＣＴＴ  ＴＴＣ  ＡＧＣ  ＡＡＧ  ＴＧＧ  ＧＡＡ  ＧＧＴ  ＧＴＡ  ＡＴＣ  ＣＧＴ  ＣＴＣ  ＣＡＣ  ＡＧＡ  ＣＡＡ  ＧＧＣ  ＣＡＧ  ＧＡＣ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＧＴＡ  ＣＣＣ  ＧＴＴ  ＧＡＴ  ＧＡＴ  ＡＧＡ  ＡＴＧ  ＧＧＧ  ＴＡＣ−３’  （配列番号１０）であった（両方ともＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手）。
【０１９９】
ＦＦＰＥ試料またはオリゴヌクレオチドテロメア標準由来のＤＮＡにおけるテロメア増幅のための個々のＰＣＲ反応を、１ｎｇ／１０μＬの試料（０．１ｎｇ／μＬ）と、１．２５ＵのＨｏｔｓｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｔａｑ  ポリメラーゼ（ＢｉｏＣｈａｉｎ）、１５０ｎＭの６−ＲＯＸ蛍光色素、０．４×ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  ｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ）、５０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２ｍＭの各デオキシヌクレオシド三リン酸（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、５ｍＭのジチオスレイトール、１％のジメチルスルホキシドおよび１５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０ならびにプライマー対ＴｅｌｇおよびＴｅｌｃ（両方とも９００ｎＭ）を含有する４０μＬのＰＣＲ混合物とを使用して行った。高濃度のプライマーは多重アニーリング部位を可能にするので、ＦＦＰＥ  ＤＮＡを使用する場合、プライマー濃度が高い方がテロメアＤＮＡには好ましい。
【０２００】
単一コピー３６Ｂ４遺伝子標準およびＦＦＰＥ試料中の単一コピー遺伝子の増幅を、Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して実施した。３６Ｂ４の増幅を、１ｎｇ／１０μＬの試料（０．１ｎｇ／μＬ）、４０μＬのＰｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ）およびプライマー対３６Ｂ４ｄ（３００ｎＭ）および３６Ｂ４ｕ（３００ｎＭ）を使用して行った。
【０２０１】
テロメア配列の増幅のためのＦＦＰＥ試料由来ＤＮＡおよび単一コピー遺伝子の増幅のためのＦＦＰＥ試料由来ＤＮＡを、プレート上の別々のウェルに配置した。テロメア配列の増幅のためのＤＮＡ標準および単一コピー３６Ｂ４遺伝子の増幅のためのＤＮＡ標準を同じプレート上の別々のウェルに配置し、すべてを３段階で増幅させた：第１段階：９５℃において１０分間、ＤＮＡ  Ｔａｑポリメラーゼの活性化；第２段階：１５秒９５℃、１０秒５０℃を３サイクル、その後の増幅サイクルのための鋳型として機能するＰＣＲ産物の生成。第３段階：１５秒９５℃、１５秒６０℃および６０℃におけるシグナル獲得を３５サイクル。全実行時間は９０分であった。
【０２０２】
各ＰＣＲ反応において１０ｎｇのＦＦＰＥ試料ＤＮＡを使用する場合、適切なΔＣｔ値（ΔＣｔ試料＝Ｃｔテロメア−Ｃｔ参照）を得るための第２段階のサイクル数は３サイクルであった。１ｎｇ−１０ｎｇのＦＦＰＥ試料ＤＮＡ／反応は、再現性研究において＞９４％のＰＣＲ効率を有した。
結果
【０２０３】
後ろ向きｑＰＣＲにより得られたテロメア長サブグループにおける無増悪生存の分析は、イメテルスタットにより処置された、短いテロメアを有する患者が、中程度−長いテロメアを有する患者より、対照と比較した応答性が有意に高かったことを示した（図１１Ａおよび１１Ｂ）。
【０２０４】
５２試料のうちの１８（３５％）は、短いテロメアを有した（図１１Ａ）。これらに関して、無増悪生存分析により以下のことが示された：イベント／Ｎは１３／１８であった（図１１Ａ）；対照中央値（９５％ＣＩ）は２．５７（１．１８、ＮＡ）であり、イメテルスタット中央値（９５％ＣＩ）は１．９１（１．２２、ＮＡ）であった（図１１Ａ）；ログランク  Ｐ値は０．３２５であり、ハザード比（９５％ＣＩ）は０．５５（０．１７、１．８４）であった（図１１Ａ）。
【０２０５】
５２試料のうち３４（６５％）は、中程度−長いテロメアを有した（図１１Ｂ）。これらに関して、無増悪生存分析により以下のことが示された：イベント／Ｎは２６／３４であった（図１１Ｂ）；対照中央値（９５％ＣＩ）は２．６６（０．９２、ＮＡ）であり、イメテルスタット中央値（９５％ＣＩ）は３．０３（１．５８、４．４７）（図１１Ｂ）であった；ログランク  Ｐ値は０．３０９であり、ハザード比（９５％ＣＩ）は０．６５（０．２７、１．５６）であった（図１１Ｂ）。
【０２０６】
実施例は、本発明を単に例示する意図のものであり、したがって本発明を限定するものとみなすべきでは決してなく、上述の本発明の態様および実施形態を詳細に記載するものである。前述の実施例および詳細な説明は、例示の目的で提示されており、限定の目的ではない。本明細書に引用されたすべての刊行物、特許出願および特許は、個々の個別の刊行物、特許出願または特許が、具体的かつ個別に参照により組み込まれることが示された場合と同様に、本明細書に参照により組み込まれる。特に、本明細書に引用されたすべての刊行物は、本発明に関連して使用され得る組成物および方法論の記載および開示の目的で、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。前述の発明は、明確な理解のために、実例としていくらか詳細に記載されているが、当業者には、本発明の教示を考慮して、添付の特許請求の範囲の意図または範囲から逸脱することなく、特定の変更および変形が可能であることは容易に理解されると思われる。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
テロメラーゼ阻害剤による処置から利益を得ると思われる、がんを有すると診断された、またはがんを有する疑いのある個体を選択する方法であって、
ａ．該個体由来の生体試料中に存在するがん細胞におけるテロメア核酸の相対的長さを分析することによって、相対的テロメア長を決定するステップ；および
ｂ．該個体由来の生体試料中に存在する該がん細胞における平均相対的テロメア長が、１以上の公知の標準から決定された相対的テロメア長範囲の５０パーセンタイル以下である事が決定される場合、テロメラーゼ阻害剤による処置から利益を得ると思われる個体を選択するステップ、
を含む方法。
（項目２）
がんを有すると診断された、またはがんを有する疑いのある個体を処置する方法であって、
ａ．該個体由来の生体試料中に存在するがん細胞におけるテロメア核酸の相対的長さを分析することによって相対的テロメア長を決定するステップ；
ｂ．該個体由来の生体試料中に存在する該がん細胞における平均相対的テロメア長が、１以上の公知の標準から決定された相対的テロメア長範囲の５０パーセンタイル以下である事が決定される場合、テロメラーゼ阻害剤による処置から利益を得ると思われる個体を選択するステップ；ならびに
ｃ．治療有効量の該テロメラーゼ阻害剤を該個体に投与するステップ、を含む方法。
（項目３）
がんを有すると診断された、またはがんを有する疑いのある個体を処置する方法であって、該個体由来の生体試料中に存在するがん細胞における平均相対的テロメア長が、１以上の公知の標準から決定された相対テロメア長範囲の５０パーセンタイル以下であることが決定されている場合、治療有効量のテロメラーゼ阻害剤を該個体に投与するステップ、を含む方法。
（項目４）
前記テロメラーゼ阻害剤がオリゴヌクレオチドを含む、項目２に記載の方法。
（項目５）
前記オリゴヌクレオチドが、テロメラーゼのＲＮＡ成分に相補的である、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記オリゴヌクレオチドが１０−２０塩基対の長さであり、少なくとも１つのＮ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデートヌクレオシド間結合を含む、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記テロメラーゼ阻害剤が、イメテルスタット（Ｉｍｅｔｅｌｓｔａｔ）である、項目５に記載の方法。
（項目８）
前記がんが固形腫瘍である、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記がんが、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、膀胱がん、上部胃腸がん、胃がん、胆嚢がん、卵巣がん、神経膠芽腫、肉腫または血液がんである、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記テロメラーゼ阻害剤が、薬学的に許容され得る賦形剤と一緒に投与される、項目２に記載の方法。
（項目１１）
治療有効量の１以上の追加のがん治療作用物質を、前記個体に投与するステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１２）
平均テロメア長が、ｑＰＣＲ、ｔｅｌｏ−ＦＩＳＨまたはサザンブロットにより決定される、項目１に記載の方法。
（項目１３）
前記個体がヒトである、項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記１以上の公知の標準が、特徴付けられた細胞系である、項目１に記載の方法。
（項目１５）
前記細胞系が、Ｍ１４細胞、Ａ５４９細胞、ＳＫ−５細胞およびＯｖｃａｒ５細胞からなる群から選択される、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記特徴付けられた細胞系が、項目１に記載の生体試料のタイプを代表する細胞系から選択される、項目１４に記載の方法。
（項目１７）
前記特徴付けられた細胞系が、非小細胞肺がん細胞系、肝細胞細胞系または卵巣細胞系である、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記１以上の公知の標準が、複数の個体由来の複数の天然腫瘍から確立されたテロメア長範囲である、項目１に記載の方法。
（項目１９）
複数の天然腫瘍由来の前記がん細胞が、前記個体由来の前記生体試料中に存在する前記がん細胞と同じタイプである、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記生体試料中に存在する前記がん細胞における前記テロメア長が、前記テロメア長範囲の４０パーセンタイル、３５パーセンタイル、３０パーセンタイル、２５パーセンタイル、２０パーセンタイル、１５パーセンタイル、１０パーセンタイル、５パーセンタイルの範囲であること、または該テロメア長範囲より短いことが決定される、項目１に記載の方法。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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