(57)【要約】【課題】投与により生体内で抗酸化物質を増加させることができる抗酸化誘導剤を提供する。【解決手段】本発明は、２−アミノ酪酸を有効成分とする抗酸化誘導剤である。これによって、投与により体内で抗酸化物質を合成亢進させることで酸化ストレスに対して保護的な作用をもたらすことができる。また、２−アミノ酪酸は化学修飾を要することなく容易に細胞内に取り込まれるため、抗酸化物質の細胞内濃度を容易に上昇させることができる。さらに、２−アミノ酪酸は生体内に存在する物質であるため、副作用のおそれが非常に少ない。【選択図】図１５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
２−アミノ酪酸、その誘導体および塩からなる群から選ばれる物質を有効成分とする抗酸化誘導剤。
【請求項２】
酸化ストレスを起因とする疾患の治療薬である、請求項１に記載の抗酸化誘導剤。
【請求項３】
前記疾患が、主治療薬によって引き起こされる副作用である、請求項２に記載の抗酸化誘導剤。
【請求項４】
前記主治療薬が抗がん剤である、請求項３に記載の抗酸化誘導剤。
【請求項５】
前記主治療薬の副作用予防療法薬である、請求項３または４のいずれか１項に記載の抗酸化誘導剤。
【請求項６】
前記疾患が心筋障害である、請求項２から５のいずれか１項に記載の抗酸化誘導剤。
【請求項７】
活性型ＡＭＰＫの発現に起因する抗酸化物質を生じさせる、請求項１から６のいずれか１項に記載の抗酸化誘導剤。
【請求項８】
前記抗酸化物質がグルタチオンである、請求項７に記載の抗酸化誘導剤。
【請求項９】
経口投与剤である、請求項１から８のいずれか１項に記載の抗酸化誘導剤。
【請求項１０】
酸化ストレスを起因とする症状を予防または緩和するための食品組成物または化粧料組成物である、請求項１および７から９のいずれか１項に記載の抗酸化誘導剤。
【請求項１１】
２−アミノ酪酸、その誘導体および塩からなる群から選ばれる物質を有効成分とする抗酸化誘導剤を非ヒト動物に投与する工程と、
前記非ヒト動物に主治療薬候補物質を投与する工程と、
前記非ヒト動物において前記主治療薬候補物質による酸化ストレス起因の副作用の程度を評価する工程と、を含む、抗酸化誘導剤を併用する主治療薬のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗酸化物質を体内で増加させることができる抗酸化誘導剤に関する。より具体的には、本発明は、抗酸化誘導剤および抗酸化誘導剤を併用する主治療薬のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体が酸化ストレスに応答し恒常性を維持するシステムにおいて、還元型グルタチオン（ＧＳＨ）は中心的な役割を担う。ＧＳＨは、γ−グルタミルシステインシンテターゼ（ＧＣＳ）とグルタチオンシンテターゼ（ＧＳ）とによる逐次反応によって生合成される。酸化ストレスはＧＳＨの生合成系を活性化し、消費が増加したＧＳＨを代償することが知られている。また、グルタチオン製剤は、保険適用医薬品として販売されている。
【０００３】
特開２００７−１９２７４６号公報（特許文献１）およびJournal of Biological Chemistry vol.281, no.24, pp. 16768-16776（非特許文献１）では、肝臓内のＧＳＨの濃度変動に応じて血中で変動するバイオマーカーとして、ＧＳＨの類似体であるオフタルミン酸が記載されており、オフタルミン酸が、ＧＳＨの枯渇によってＧＣＳが活性化されたときに、基質２−アミノ酪酸（２−ＡＢ）から合成されたことが記載されている。
【０００４】
また、Circulation 2014; 130: A11964（非特許文献２）では、２−ＡＢの濃度が心房中隔欠損患者において健常者よりも高く、かつ、当該患者のカテーテル閉塞処置後においては健常者と同程度に低下することが記載されており、２−ＡＢがＧＳＨ生合成反応の副生成物であること、心筋細胞への酸化ストレスにより産生が誘導されるため心筋の酸化還元状態を反映することが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００７−１９２７４６号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Journal of Biological Chemistry vol.281, no.24, pp.16768-16776
【非特許文献２】Circulation 2014; 130: A11964
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
グルタチオン製剤は保険適用医薬品として認可されているものの、細胞膜を透過することができない。そのため、細胞内ＧＳＨ濃度を上昇させるまでには至らず、薬効は低い。また、生体内でＧＳＨを増加させることができる物質は知られていない。
【０００８】
２−ＡＢについては、酸化ストレスマーカーであるオフタルミン酸の基質になること、および２−ＡＢがＧＳＨ生合成反応の副生成物であることが知られていても、その代謝調節機構は知られていない。
【０００９】
以上に鑑み、本発明の目的は、投与により生体内で抗酸化物質を増加させることができる抗酸化誘導剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、驚くべきことに２−ＡＢが細胞内の抗酸化物質の合成を亢進させ、酸化ストレスによる細胞障害に対し保護的に作用するという知見を見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は、以下の発明を包含する。
【００１１】
（１）
本発明は、２−アミノ酪酸、その誘導体および塩からなる群から選ばれる物質（２−ＡＢ等）を有効成分とする抗酸化誘導剤である。
【００１２】
これによって、投与により体内で抗酸化物質を合成亢進させることで酸化ストレスに対して保護的な作用を生じさせることができる。また、２−アミノ酪酸は化学修飾を要することなく容易に細胞内に取り込まれるため、抗酸化物質の細胞内濃度を容易に上昇させることができる。さらに、２−アミノ酪酸は生体内に存在する物質であるため、副作用のおそれが非常に少ない。
【００１３】
（２）
上記（１）の抗酸化誘導剤は、酸化ストレスを起因とする疾患の治療薬であってよい。
【００１４】
これによって、酸化ストレスを起因とする疾患を治療または予防することができる。
【００１５】
（３）
上記（２）の抗酸化誘導剤は、酸化ストレスを起因とする疾患が、主治療薬によって引き起こされる副作用であってよい。
【００１６】
これによって、主治療薬と併用することで主治療薬の副作用を緩和することができる。
【００１７】
（４）
上記（３）の抗酸化誘導剤は、主治療薬が抗がん剤であってよい。
【００１８】
これによって、抗がん剤と併用することで抗がん剤の副作用を緩和することができる。
【００１９】
（５）
上記（３）または（４）のいずれかの抗酸化誘導剤は、主治療薬の副作用予防治療薬であってよい。
【００２０】
これによって、主治療薬による副作用をより効果的に予防することができる。
【００２１】
（６）
上記（２）から（５）のいずれかの抗酸化誘導剤は、疾患が心筋障害であってよい。
【００２２】
これによって、酸化ストレスを起因とする心筋障害を予防または治療することができる。
【００２３】
（７）
上記（１）から（６）のいずれかの抗酸化誘導剤は、活性型ＡＭＰＫ（アデノシン5'-一リン酸（AMP）−活性化プロテインキナーゼ）の発現に起因する抗酸化物質を生じさせてよい。
【００２４】
このように、２−ＡＢ等がＡＭＰＫを活性化することで、ＡＭＰＫの下流にある抗酸化物質を合成亢進することができる。
【００２５】
（８）
上記（７）の抗酸化物質はグルタチオン（還元型グルタチオン）であってよい。
【００２６】
このように、２−ＡＢ等がＡＭＰＫを活性化することで、ＡＭＰＫの下流にあるグルタチオンを合成亢進することができる。
【００２７】
（９）
上記（１）から（８）のいずれかの抗酸化誘導剤は、経口投与剤であってよい。
【００２８】
これによって、投与時の負担を最低限にとどめることができる。
【００２９】
（１０）
上位（１）および（７）から（９）のいずれかの抗酸化誘導剤は、酸化ストレスを起因とする疾患を予防または緩和するための食品組成物または化粧料組成物であってよい。
【００３０】
これによって、栄養補助食品または医薬部外品として簡易に使用することができる。
【００３１】
（１１）
本発明の主治療薬のスクリーニング方法は、
２−アミノ酪酸、その誘導体および塩からなる群から選ばれる物質を有効成分とする抗酸化誘導剤を非ヒト動物に投与する工程と、
当該非ヒト動物に主治療薬候補物質を投与する工程と、
当該非ヒト動物において当該主治療薬候補物質による酸化ストレス起因の副作用の程度を評価する工程と、を含む。
【００３２】
これによって、抗酸化誘導剤を併用する主治療薬の前臨床試験を行うことができる。
【発明の効果】
【００３３】
本発明によって、投与により生体内で抗酸化物質を増加させることができる抗酸化誘導剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】２−ＡＢが副産物として生じるシステインの生合成経路を示す。
【図２】細胞内への２−ＡＢ取り込みを行った実施例１において、細胞内の２−ＡＢ濃度をコントロール（２−ＡＢ非添加系）と比較した結果を示す。
【図３】実施例１において、細胞内のＧＳＨ濃度をコントロール（２−ＡＢ非添加系）と比較した結果を示す。
【図４】実施例１において、２−ＡＢが添加された（＋）細胞内の、ＡＭＰＫ、酵素ＡＣＣ、およびＡＣＣの７９番目のセリン残基がリン酸化されたｐ−ＡＣＣ  Ｓ７９のウェスタンブロット結果を、コントロール（−）とともに示す。
【図５】酸化ストレスを与えた細胞へ２−ＡＢを添加した実施例２において、細胞の数を調べた結果をコントロール（−；２−ＡＢ非添加系）とともに示す。
【図６】マウスへの２−ＡＢの投与を行った実施例３において、２−ＡＢを摂取したマウスの体重を測った結果をコントロール（２−ＡＢ非摂取、水を飲水投与）とともに示す。
【図７】実施例３において、血漿中の２−ＡＢの測定結果をコントロールとともに示す。
【図８】実施例３において、心臓中の２−ＡＢの測定結果をコントロールとともに示す。
【図９】実施例３において、２−ＡＢを摂取したマウスの血漿中の酸化状態比（ＧＳＳＧ／ＧＳＨ）をコントロールとともに示す。
【図１０】実施例３において、２−ＡＢを摂取したマウスの心臓中のＧＳＨ濃度をコントロールとともに示す。
【図１１】病態モデルマウスへの２−ＡＢの投与を行った実施例４において、２−ＡＢを摂取した病態モデルマウスの左室内径短縮率（ＦＳ）を、コントロール（２−ＡＢ非摂取、水を飲水投与、ドキソルビシン非投与）および水投与群（２−ＡＢ非摂取、水を飲水投与、ドキソルビシン投与）とともに示す。
【図１２】実施例４において、２−ＡＢを摂取した病態モデルマウスの体重を測った結果をコントロール（２−ＡＢ非摂取、水を飲水投与）とともに示す。
【図１３】実施例４において、２−ＡＢを摂取した病態モデルマウスの血漿中の２−ＡＢ濃度の測定結果を、コントロールとともに示す。
【図１４】実施例４において、２−ＡＢを摂取した病態モデルマウスの心臓中のＧＳＨ濃度の測定結果を、コントロールとともに示す。
【図１５】実施例４において、２−ＡＢを摂取した病態モデルマウスの心臓中のＧＳＨ濃度の測定結果を、コントロールとともに示す。
【図１６】ＧＳＨの合成亢進にかかる前処置の日数の検討を行った実施例５において、前処置の日数とＧＳＨ濃度との関係を、コントロールとともに示す。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
［１．有効成分］
本発明の抗酸化誘導剤の有効成分は、下記式（I）に示す２−アミノ酪酸（２−ＡＢ）、その誘導体および塩からなる群から選ばれる物質（これらをまとめて「２−ＡＢ等」と記載する場合がある）である。
【００３６】
【化１】
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【００３７】
２−ＡＢは、システインに類似した構造を有する。２−ＡＢはシステインの生合成経路（図１）における副産物から生じる。図１に示すように、システインがシスタチオニン（Cystathionine）から生合成されるときに、２−オキソ酪酸（2-oxobytyric acid）も同時に生成し、２−オキソ酪酸からアスパラギン酸アミノ基転移酵素（AST）のようなアミノ転移酵素を介したアミノ基転移反応を経由して２−ＡＢが生じる。
【００３８】
２−オキソ酪酸から２−ＡＢへのアミノ基転移反応による生合成は、細胞内で起こる。このことは、２−オキソ酪酸をエチルエステル化して細胞内へ取り込ませた系を人工的に構築し、当該系において２−ＡＢが生成したこと、および、当該系においてＡＳＴ阻害剤（アミノオキシ酢酸）を用いた場合に２−オキソ酪酸の細胞内取り込みには影響がない一方で２−ＡＢの生成が抑制されたことをもって本発明者らにより確認されている。
【００３９】
２−ＡＢは、心筋細胞および培地のいずれにおいても、過酸化水素により引き起こされた酸化ストレス環境下で増加する。酸化ストレス環境はまた、ＧＳＨ濃度も代償的に上昇させる。一方で、血液中のＧＳＨ濃度の測定は一般的な方法では困難である。このため、２−ＡＢは酸化ストレス下におけるＧＳＨの動向を反映する血中バイオマーカーとして、酸化ストレスの臨床評価に有用である。
【００４０】
２−ＡＢは、バイオマーカーとしてだけでなく、生体への投与によって細胞内でＧＳＨ濃度上昇を誘導し酸化ストレスに対し保護的に作用せしめる有効成分として用いられる。  本発明の抗酸化誘導剤において、有効成分は、化学修飾を受けていない上記式（Ｉ）で示される２−ＡＢそのものであってよい。２−ＡＢは、上述の２−オキソ酪酸とは異なり、エステル化などの化学修飾を必要とせず、アミノ酸トランスポータ等の細胞膜貫通型輸送担体を経由して細胞内へ容易に取り込まれる。
【００４１】
２−ＡＢの誘導体は、２−ＡＢによる抗酸化誘導効果を損なわないことを条件として、２−ＡＢ分子が、カルボキシル基および主鎖の少なくともいずれかにおいて、何らかの原子団と共有結合した物質である。原子団としては、エステル基（たとえば、メチルエステル、エチルエステルなどの脂肪族エステル、芳香族エステルなど）のような官能基などが挙げられる。
【００４２】
２−ＡＢの塩は、２−ＡＢによる抗酸化誘導効果を損なわないことを条件として、金属塩（たとえば、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩など）、アミン塩（トリエチルアミン塩、ベンジルアミン塩など）などを構成した物質である。
【００４３】
本発明の抗酸化誘導剤は、有効成分である２−ＡＢ等が生体内のＡＭＰＫを活性化することにより抗酸化能を誘導する。ＡＭＰＫが活性化すると、たとえば、細胞内のＮＡＤＰＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）量が増加すること、およびＮＡＤＰＨはＧＳＳＧ（酸化型グルタチオン）をＧＳＨ（還元型グルタチオン）へと変換させることが知られている。ＧＳＨは、抗酸化能力だけでなく解毒作用も有している点からも好ましい。しかしながら２−ＡＢ等が誘導する抗酸化能はＧＳＨに起因するものに限定されず、活性化されたＡＭＰＫの下流に存在する抗酸化物質であればどのような物質に起因してもよい。
【００４４】
［２．抗酸化誘導剤］
［２−１．治療薬］
本発明の抗酸化誘導剤は、たとえば、酸化ストレスを起因とする疾患の治療薬として用いてよい。
酸化ストレスとは、内因性または外因性の活性酸素種（スーパーオキシド、ヒドロキシラジカル、過酸化水素、次亜塩素酸、一酸化窒素など）の過剰産生により生体が当該活性酸素種を十分処理できなくなるストレス状態をいう。酸化ストレスは様々な疾患の発症に深く関与している。具体的には癌、動脈硬化症、虚血性心疾患（狭心症、心筋梗塞など）、心不全、呼吸器疾患（肺気腫、気管支喘息など）、生活習慣病（メタボリックシンドローム、糖尿病、高血圧など）、消化器疾患（逆流性食道炎、胃潰瘍、炎症性腸疾患）など、肝疾患（アルコール性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎など）、腎疾患（腎不全、糸球体腎炎など）、自己免疫疾患（膠原病、関節リウマチなど）、神経疾患（アルツハイマー病、脳梗塞、パーキンソン病など）、眼疾患（白内障、ドライアイなど）、耳鼻咽喉疾患（口内炎、花粉症など）、統合失調症、慢性疲労症候群など多岐にわたる。したがって本発明の抗酸化治療薬は、これらの疾患の治療薬として用いてよい。
【００４５】
本発明の抗酸化誘導剤の一態様である治療薬は、すでに生じている酸化ストレス起因の疾患を治療する（治癒または軽快させる）ために用いられるものであってもよいし、予想される酸化ストレス起因の疾患の発生を予防するために用いられるものであってもよい。
【００４６】
本発明の抗酸化誘導剤の一態様である治療薬は、主治療薬と併用されてもよい。この場合、当該治療薬は、主治療薬によって引き起こされる副作用を予防または治療するために用いられるものであってよい。主治療薬としては特に限定されず、副作用として上記の疾患を引き起こし得るものであればよい。
主治療薬の具体例としては、抗がん剤、解熱鎮痛剤などが挙げられる。
抗がん剤としては、ドキソルビシン、シスプラチン、ビンブラスチン、マイトマイシンC、カンプトテシンなどが挙げられ、その副作用としては、倦怠感、吐き気、食欲低下、うつ症状、骨髄抑制（白血球減少、貧血、血小板減少など）、消化管障害（口内炎、下痢など）、皮膚障害（脱毛、爪の変化など）、心筋障害、腎障害、肺障害、末梢神経障害などが挙げられる。
解熱鎮痛剤としては、ジクロフェナクナトリウム、ロキソフェナクナトリウム、アセトアミノフェン、アスピリンなどが挙げられ、その副作用としては、肝障害、腎障害、消化管障害（びらん性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍など）、スティーブンス・ジョンソン症候群などが挙げられる。
【００４７】
本発明の抗酸化誘導剤の一態様である治療薬は、主治療薬による酸化ストレスを起因とする副作用を予防することを目的とした副作用予防治療医薬として用いることができる。
【００４８】
治療薬としての本発明の抗酸化誘導剤は、有効成分に加えて、２−ＡＢによる抗酸化誘導効果を損なわないことを条件として、１種類又は２種類以上の薬学的に許容される添加物を含んでよい。当該添加物としては、医薬品添加剤として用いられるものであれば特に限定されず、たとえば、希釈剤（たとえば、溶媒および賦形剤が挙げられる）、結合剤、滑剤、流動促進剤、可塑剤、崩壊剤、緩衝剤、安定化剤などが挙げられる。
【００４９】
治療薬としての本発明の抗酸化誘導剤の具体的態様は、投与態様に応じて適宜選択することができるため、液体であってもよいし固体であってもよい。なお、投与態様としては、経口投与および非経口投与（たとえば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与髄腔内投与）を問わないが、２−ＡＢが経口投与でも抗酸化物質を増加させることができることから、投与時の負担を考慮すると経口投与が好ましい場合がある。投与は、複数日に亘って毎日行うことが好ましい。たとえば、抗酸化誘導作用をより良好に得るために、７日以上、好ましくは１４日以上に亘って毎日投与することができる。
【００５０】
治療薬としての本発明の抗酸化誘導剤が主治療薬の副作用予防治療薬である場合は、主治療薬の投与に先だって前処置薬として投与することが好ましい。たとえば、主治療薬の副作用をより良好に抑制するために、主治療薬の投与の７日以上、好ましくは１４日以上先だって前処置薬として投与することができる。さらに、主治療薬が投与された後も、少なくとも副作用の影響が出ると予想される間は引き続いて本発明の抗酸化誘導剤を毎日投与することが好ましい。
【００５１】
［２−２．食品組成物および化粧料組成物］
本発明の抗酸化誘導剤は、酸化ストレスを起因とする症状を予防または緩和するための食品組成物（抗酸化誘導用食品組成物）または化粧料組成物（抗酸化誘導用化粧料組成物）として用いてもよい。酸化ストレスを起因とする症状としては特に限定されないが、上述の酸化ストレスを起因とする疾患ほど重篤でなくてよく、たとえば、筋肉疲労、精神疲労、老化などが挙げられる。
【００５２】
抗酸化誘導用食品組成物は、有効成分に加えて、２−ＡＢによる抗酸化誘導効果を損なわないことを条件として、１種類又は２種類以上の食品学的に許容される成分を含んでよい。当該成分としては、上述の治療薬に用いられる添加剤に加え、香料、甘味料、着色料などが挙げられる。より具体的には、食品組成物は、飲料、菓子、乳製品、調味料、サプリメントなどの従来の食品組成物の態様の栄養補助食品であってよい。
【００５３】
抗酸化誘導用化粧料組成物、有効成分に加えて、２−ＡＢによる抗酸化誘導効果を損なわないことを条件として、１種類又は２種類以上の化粧学的に許容される成分を含んでよい。当該成分としては、溶剤、界面活性剤、滑沢剤、安定剤、着色料、保存料などが挙げられる。より具体的には、化粧料組成物は、肌用化粧料、髪用化粧料などの従来の化粧料の医薬部外品であってよい。
【００５４】
［２−３．有効成分の含有量および摂取量］
本発明の抗酸化誘導剤中の有効成分の含有量は、治療薬としての投与もしくは食品組成物としての摂取または化粧料組成物としての塗布の量・回数・方法、誘導目的とする抗酸化能、および生体の年齢・体重などにより異なりうるが、抗酸化誘導剤が液体として調製される場合は１ｍＭ以上１０ｍＭ以下、好ましくは１ｍＭ以上５ｍＭ以下、抗酸化誘導剤が固体として調製される場合は１ｍｍｏｌ／ｇ以上１０ｍｍｏｌ／ｇ以下、好ましくは２ｍｍｏｌ／ｇ以上５ｍｍｏｌ／ｇ以下であってよい。また、本発明の抗酸化誘導剤に含まれる有効成分の成人１日あたりの摂取量は、体重１ｋｇあたり１ｍｍｏｌ以上１０ｍｍｏｌ以下、好ましくは２ｍｍｏｌ以上５ｍｍｏｌ以下であってよい。
【００５５】
［３．スクリーニング方法］
本発明の抗酸化誘導剤は、主治療薬候補のスクリーニングに用いてよい。本発明のスクリーニング方法においては、上述の抗酸化誘導剤を非ヒト動物に投与する工程と；当該非ヒト動物に主治療薬候補物質を投与する工程と；当該非ヒト動物において当該主治療薬候補物質による酸化ストレスに起因する副作用の程度を評価する工程と、を含む。
【００５６】
非ヒト動物は、ヒトを除く動物であれば特に限定されず、たとえば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギなどの実験用動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジなどの家畜、サル、チンパンジーなどの霊長類が挙げられる。
【００５７】
主治療薬候補物質は、酸化ストレスを起因とする副作用を生じさせるものである。たとえば、抗がん剤などの治療薬の候補物質であってよい。
【００５８】
抗酸化誘導剤の投与方法については特に限定されず、既に述べたように経口投与および非経口投与を問わないが、自由飲水による経口投与を行うことで、投与時の動物へのストレスを極力排除することが好ましい。有効成分の含有量は、既に述べたとおりとなるように調製してよい。好ましくは、１ｍＭ以上、より好ましくは１０ｍＭ以上であってよい。
【００５９】
また、抗酸化誘導剤の投与は、主治療薬候補物質の投与に先だって行うことが好ましい。具体的には、たとえば２日以上前、好ましくは７日以上前から毎日投与することができる。抗酸化誘導剤の全投与期間は、少なくとも主治療薬候補物質の副作用の影響が予想される期間であることが好ましく、具体的には主治療薬候補物質によって異なりうるが、抗酸化誘導効果を良好に得るためには、たとえば７日以上、好ましくは１０日以上であることが好ましい。
【００６０】
酸化ストレスに起因する副作用の程度は、公知の測定方法によって評価することができる。一例として心筋障害発症の程度を調べるためには、たとえば心臓の収縮力の指標である左部内径短縮率を算出することができる。これによって、抗酸化誘導剤を併用する当該候補物質が治療薬として安全か否かを決定することができる。
また、副作用の程度を評価する際に、抗酸化誘導剤を投与せず主治療薬候補物質のみを投与した群を比較対象として、副作用の程度に有意差があるかどうかを調べてもよい。この結果、有意差があれば、当該候補物質が、抗酸化誘導剤の併用有効性がある治療薬となりうることを決定することができる。
【実施例】
【００６１】
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に制限されるものではない。なお、図面において、「*」はスチューデントの両側ｔ検定によるｐ値が０．０５未満、「**」はｐ値が０．０１未満、「***」はｐ値が０．０００１未満であることを示す。また、以下の実施例において、２−ＡＢとしてＤＬ−２−アミノ酪酸を用いた。
【００６２】
［実施例１：細胞への２−ＡＢの取り込みとＧＳＨの合成亢進］
１体積％のＦＢＳ（ウシ胎児血清）を含むＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）培地において、Ｈ９ｃ２細胞を２４時間培養した後、５ｍＭの２−ＡＢを含有する１体積％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地に交換し、３０分インキュベートした。
【００６３】
細胞内の２−ＡＢおよびＧＳＨの濃度測定を行った。２−ＡＢの濃度測定においては、細胞から水溶性代謝物を抽出した後にＧＣ−ＭＳ（ガスクロマトグラフィー−質量分析計）を用いた。
ＧＳＨ濃度測定においては、市販のキット（ケイマンケミカル社製）を用い、そのプロトコルに従った。
【００６４】
細胞内２−ＡＢ濃度および細胞内ＧＳＨ濃度をコントロール（２−ＡＢ非添加系）と比較した結果をそれぞれ図２および図３に示す。図２が示すように、２−ＡＢはメチルエステル化などの特別な修飾を行っていないにもかかわらず細胞に取り込まれた。また、図３が示すように、２−ＡＢは細胞内のＧＳＨ量を増加させた。
【００６５】
図４に、２−ＡＢが添加された（＋）細胞内の、ＡＭＰＫ、ＡＣＣ（アセチル-CoAカルボキシラーゼ）、およびＡＣＣの７９番目のセリン残基がリン酸化されたｐ−ＡＣＣ  Ｓ７９のウェスタンブロット結果を、コントロール（−）とともに示す。活性化型ＡＭＰＫはＡＣＣをリン酸化させることが分かっている。図４に示すように、リン酸化されていないＡＣＣの量には変化がないこと、およびＡＭＰＫの発現量に変化がないにもかかわらず、ＡＣＣのリン酸化が亢進していることから、２−ＡＢがＡＭＰＫを活性化していることが分かった。
【００６６】
［実施例２：酸化ストレスを与えた細胞への２−ＡＢ添加と細胞死抑制］
実施例１と同様に細胞へ２−ＡＢを取り込んだ後、過酸化水素水を培地に添加することによって細胞に酸化ストレスを与えた。なお、本実施例では、２−ＡＢの濃度としては５ｍＭの場合と１ｍＭの場合との両方について実験を行った。
【００６７】
細胞の数を調べた結果を、コントロール（−；２−ＡＢ非添加系）とともに図５（縦軸が細胞の数に対応）に示す。図５が示すように、コントロールでは過酸化水素による酸化ストレスを受けて細胞死が確認された一方、２−ＡＢを添加した系では当該細胞死が抑制されたことが示された。
したがって、予め２−ＡＢを細胞に添加することにより、酸化ストレスに対して保護的な作用をもたらすことが示された。
【００６８】
［実施例３：動物への２−ＡＢの投与および組織への取り込み、ならびにＧＳＨの合成亢進］
１ケージあたり４匹または５匹で飼育したマウス（C57BL/6Jオスマウス）に、１ｍＭの２−ＡＢ水溶液または１０ｍＭの２−ＡＢ水溶液を７日間飲水投与した。
【００６９】
２−ＡＢを摂取したマウスの体重を測った結果をコントロール（２−ＡＢ非摂取、水を飲水投与）とともに図６に示す。縦軸は各群（ｎ＝５（コントロール）、ｎ＝５（１ｍＭ）およびｎ＝４（１０ｍＭ））の平均値を示す。図６が示すように、２−ＡＢの摂取による体重への影響は見られなかった。
【００７０】
２−ＡＢを摂取したマウスの血漿中の２−ＡＢ濃度および心臓中の２−ＡＢ濃度を測定した。
血漿および心臓の２−ＡＢ測定においては、血漿または心臓から抽出した代謝産物をGCMS-QP2010 Ultra（島津製作所製）を用いて２−ＡＢ量の測定を行った。２−イソプロピルリンゴ酸を内部標準とした選択イオンモニタリングによりデータを得た。
【００７１】
血漿中の２−ＡＢの測定結果を、コントロールとともに図７に示し、心臓中の２−ＡＢの測定結果を、コントロールとともに図８に示す。図７および図８が示すように、２−ＡＢの投与量に応じて血漿中および心臓中の２−ＡＢ量が増加した。
【００７２】
２−ＡＢを摂取したマウスの血漿中のＧＳＨ濃度および心臓中（心筋細胞中）のＧＳＨ濃度を測定した。
血漿中のＧＳＨ濃度測定においては、液体クロマトグラフィ−タンデム質量分析（SCIEX社製 Qtrap(R) 6500）を用いた。血漿中のＧＳＨは、１０ｍＭの２−ＡＢ投与群ではコントロールの３．６倍に上昇した。一方、酸化型グルタチオンＧＳＳＧは投与した２−ＡＢの濃度に応じて上昇した。そこで、酸化状態比（ＧＳＳＧ／ＧＳＨ）を算出することで、酸化状態を評価した。その結果を図９に示す。図９が示すように、１０ｍＭの２−ＡＢ投与群では酸化状態比がコントロールの０．４倍に減少しており、酸化状態が緩和されていることが示唆された。
心臓中のＧＳＨ濃度測定においては、市販のキット（ケイマンケミカル社製）を用い、そのプロトコルに従った。その結果を図１０に示す。図１０が示すように、２−ＡＢ投与群の心臓中でＧＳＨが増加していることが分かった。
【００７３】
［実施例４：病態モデル動物への２−ＡＢの投与および組織への取り込み、ならびにＧＳＨの合成亢進］
本実施例では、ドキソルビシンの副作用として酸化ストレスが原因となる心筋障害を２−ＡＢ投与によって緩和されるかどうかについて実験した。
１ケージあたり４匹または５匹で飼育したマウス（C57BL/6Jオスマウス）に１０ｍＭの２−ＡＢ水溶液を２２日間飲水投与し続けた。一方、２−ＡＢ飲水投与１４日目に１０ｍｇ／ｋｇのドキソルビシンを腹腔内投与した。
【００７４】
２−ＡＢを摂取したマウス（２−ＡＢ飲水投与２０日目、ドキソルビシン投与後６日目）のエコー検査を行い、心筋の収縮力を示す左室内径短縮率（ＦＳ）を算出した。その結果を、コントロール（２−ＡＢ非摂取、水を飲水投与、ドキソルビシン非投与）および水投与群（２−ＡＢ非摂取、水を飲水投与、ドキソルビシン投与）とともに図１１に示す。図１１が示すように、ドキソルビシンを腹腔内投与すると心機能が７０％に低下するが、２−ＡＢを摂取させておくと心機能の低下が軽減された。
【００７５】
２−ＡＢを摂取したマウス（２−ＡＢ飲水投与２２日目、ドキソルビシン投与後８日目）の体重を測った結果をコントロール（２−ＡＢ非摂取、水を飲水投与）とともに図１２に示す。縦軸は各群（ｎ＝１０（コントロール）、ｎ＝１０（１０ｍＭ））の平均値を示す。図１２が示すように、２−ＡＢの摂取による体重への影響は見られなかった。
【００７６】
２−ＡＢを摂取したマウス（２−ＡＢ飲水投与２２日目、ドキソルビシン投与後８日目）の血漿中の２−ＡＢ濃度および心臓中の２−ＡＢ濃度を測定した。
【００７７】
血漿中の２−ＡＢの測定結果を、コントロールとともに図１３に示し、心臓中の２−ＡＢの測定結果を、コントロールとともに図１４に示す。図１３および図１４が示すように、２−ＡＢの投与により血漿中および心臓中の２−ＡＢ量が増加した。
【００７８】
２−ＡＢを摂取したマウスの心臓中のＧＳＨ濃度を測定した。その結果をコントロールとともに図１５に示す。図１５が示すように、２−ＡＢ投与群の心臓中でＧＳＨが増加していることが分かった。
【００７９】
［実施例５：ＧＳＨの合成亢進にかかる前処置の日数の検討］
２−ＡＢを投与してから血漿中のＧＳＨ上昇が認められる日数を調べた結果を図１６に示す。図１６が示すように、本実施例の系において、血漿中のＧＳＨ量を増加させるためには少なくとも７日間２−ＡＢを摂取させておく必要があることが分かった。
【００８０】
本発明の好ましい実施形態は上記の通りであるが、本発明は、上述の実施形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨から逸脱することのない様々な変形がなされる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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