(57)【要約】【課題】本発明は、腸球菌の増殖を抑え、Ｂ群連鎖球菌の選択的に検出することができるＢ群連鎖球菌選択増菌用培地を提供する。【解決手段】本発明は、培地に腸球菌特異的バクテリオファージを加えることで、腸球菌の増殖を抑えて、Ｂ群連鎖球菌を選択的に増殖させる方法、および、腸球菌特異的に感染するバクテリオファージを含有する、Ｂ群連鎖球菌選択的増菌用培地を課題の解決手段とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
腸球菌特異的に感染するバクテリオファージを含有する、Ｂ群連鎖球菌選択的増菌用培地。
【請求項２】
前記腸球菌がEnterococcus faecalisであることを特徴とする請求項１に記載の培地。
【請求項３】
配列番号１、配列番号２および配列番号３で表される塩基配列からなる遺伝子を有するバクテリオファージの、少なくとも１または複数を含有することを特徴とする請求項１または２に記載の培地。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれかに記載の培地に検体を接種して培養する工程を含む、Ｂ群連鎖球菌の検出方法。
【請求項５】
配列番号１または２で表される塩基配列からなる遺伝子を有する、Ｂ群連鎖球菌検出用バクテリオファージ。
【請求項６】
腸球菌特異的に感染するバクテリオファージを含むことを特徴とする、Ｂ群連鎖球菌検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｂ群連鎖球菌検出用のＢ群連鎖球菌選択的増菌用培地に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｂ群連鎖球菌（Group B Streptococcus; GBS）は、膣や腸管に常在する菌で、β溶血性を示す。Ｂ群連鎖球菌は、垂直感染による新生児の髄膜炎、敗血症および肺炎などの主たる起因菌である。妊婦の膣内保菌率は、15〜30 %程度で、1,000分娩に１回程度発症し、発症率は高くないものの、発症した新生児の約10 %が死亡し、命を取り留めた場合でも後遺症が残ることも少なくない。
新生児のＢ群連鎖球菌による感染および疾患の発症を防止するために、妊娠35〜37週の妊婦に対して、スクリーニング検査が実施されている。
【０００３】
Ｂ群連鎖球菌の検出方法には、直接検体をＢ群連鎖球菌培地に塗布し細菌を検出する方法、また、増菌培養培地で増菌し、その後、Ｂ群連鎖球菌培地に塗布し細菌を検出する方法がある。増菌培養を行う方が、目的とする細菌の検出感度が向上するため一般的である。さらに、培養されたＢ群連鎖球菌は生化学的試験あるいは質量分析法により細菌同定を行い、確定診断を行う。他方、PCR法により高感度に検出する方法も開発されている。LAMP法やPCR法などの遺伝子検査法は（例えば、特許文献１など）検出感度は優れているが、検出に要するプライマー、試薬および装置などが高額である。それゆえ、現在でも選択培地を使用する検出方法が主流である。
Ｂ群連鎖球菌の増菌培地には、Granada培地やTodd-Hewitt培地などが使用されている。中でもGranada培地は、Ｂ群連鎖球菌選択性を持たせ、赤色のカルテノイド色素産生性を指標とし、Ｂ群連鎖球菌の存在を確認することが可能である（非特許文献１）。しかしながら、Ｂ群連鎖球菌の約10 %程度がカルテノイド色素非産生株であることが報告されているため（非特許文献２）Granada培地の使用では検出漏れの生じる可能性があり、また、抗菌薬を添加したTodd-Hewitt培地では他の常在菌が生育する可能性があった。
最近、Ｂ群連鎖球菌の検出をより効率よく高感度に行うために、Granada培地の問題点を改良した培地、Todd-Hewitt培地に抗菌薬を添加した培地などがいくつか報告されている。その他、蛍光性の遊離性基を有するβ−グルクロニダーゼ基質を培地に添加することで、カルテノイド色素の産生能の有無にかかわらず、Ｂ群連鎖球菌の存在を蛍光の発光を指標にして、検出できることが報告されている（特許文献２）。また、培地の組成は公開されていないが、各社からCarrot Broth、LIM  Broth、Granada Biphasic brothなどが販売されている。
【０００４】
種々の選択培地が開発されているなか、Ｂ群連鎖球菌の検査サンプル中に膣常在菌である腸球菌（特に、Enterococcus faecalis）が存在し、その腸球菌の中にβ溶血性を示すものがあることが報告された（非特許文献３）。従来の選択培地では、腸球菌の増殖を100 %阻害することは難しいため、腸球菌の混入によるＢ群連鎖球菌の検出精度の低下が問題となっていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】De La Rosaら, J Clin Microbiol. 18:779-785, 1983
【非特許文献２】Nickmansら, J Clin Microbiol. 50:1132-1133, 2012
【非特許文献３】Saviniら, Diagn Microbiol Infect Dis. 82:32-33, 2015
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開2010-284090
【特許文献２】特開2014-183802
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記事情に鑑み、本発明者らは、腸球菌の増殖を抑え、Ｂ群連鎖球菌を選択的に検出することができるＢ群連鎖球菌（以下、「GBS」と略記する場合もある）選択的増菌用培地の提供を解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明者らは、既存の選択培地では増殖を抑制できなかった腸球菌に対し、バクテリオファージの特異的溶菌活性を応用し、GBS検査の精度を低下させる腸球菌の増殖を抑制するＢ群連鎖球菌選択的増菌用培地の開発に成功した。
GBS検査は、一般に、検査器具（例えば、綿棒など）で膣の入り口付近と肛門の周囲をこすって得た検体を培養し、GBSの増殖の有無を確認することによって行われている。しかし、検体の中には、膣や腸管の常在菌である腸球菌が含まれていることが多く、この腸球菌が増殖することで、検査精度の低下が引き起こされる。発明者らは、腸球菌特異的に感染するバクテリオファージ（「腸球菌特異的バクテリオファージ」ともいう）を複数採取し、これらをGBS検査用の選択培地に添加して検体の培養を行ったところ、GBSの増殖には影響を与えずに、腸球菌の増殖を抑制することに成功した。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（６）である。
（１）腸球菌特異的に感染するバクテリオファージを含有する、Ｂ群連鎖球菌選択的増菌用培地。
（２）前記腸球菌がEnterococcus faecalisであることを特徴とする上記（１）に記載の培地。
（３）配列番号１、配列番号２および配列番号３で表される塩基配列からなる遺伝子を有するバクテリオファージの、少なくとも１または複数を含有することを特徴とする上記（１）または（２）に記載の培地。
（４）上記（１）ないし（３）のいずれかに記載の培地に検体を接種して培養する工程を含む、Ｂ群連鎖球菌の検出方法。
（５）配列番号１または２で表される塩基配列からなる遺伝子を有する、Ｂ群連鎖球菌検出用バクテリオファージ。
（６）腸球菌特異的に感染するバクテリオファージを含むことを特徴とする、Ｂ群連鎖球菌検出用キット。
【発明の効果】
【００１０】
本発明にかかる培地を使用することにより、腸球菌の増殖を抑制することが可能となり、精度および感度の高いGBS検査を行うことができる。
【００１１】
腸球菌特異的に感染するバクテリオファージの調製は比較的安価に行えるため、低コストで選択培地を調製することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】腸球菌特異的バクテリオファージを含む培地中で腸球菌およびGBSを培養し、その生育に対する影響を調べた結果である。Ａは、ファージの存在下および非存在下で培養し、GBSの生菌数を調べた結果である。ＢおよびＣは、ファージの存在下（Ｂ）および非存在下（Ｃ）で培養を行い、GBSおよび腸球菌の生菌数を調べた結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の第１の実施形態は、腸球菌特異的に感染するバクテリオファージを含有する、Ｂ群連鎖球菌選択的増菌用培地である。
ここで、腸球菌とは、哺乳類の腸管内等に常在する菌のうち、球菌の形態をとるもののことである。腸球菌としては、例えば、Enterococcus faecalis、Enterococcus faecium、Enterococcus avium、Enterococcus casseliflavus、Enterococcus gallinarum、Enterococcus flavescensなどが知られているが、GBS検査で特に問題となるのは、Enterococcus faecalisである。
腸球菌特異的に感染するバクテリオファージは、腸球菌を溶菌させる能力があればいずれのものであってもよく、常法に従って分離し、その感染特異性および腸球菌の溶菌能を決定することができる。
より具体的には、腸球菌特異的バクテリオファージは、次のようにして分離、同定することができる。河川などから環境水を採取し、0.45μm程度のフィルターで濾過滅菌後、２重寒天培地法で濾過環境水を宿主菌の腸球菌と培養する。一晩37℃で培養後、出現したプラークを分離する。プラークの分離は最低３回行う。分離したファージが腸球菌特異的バクテリオファージかどうかは、腸球菌種に感染することができ、かつ、他の菌に感染できないことを指標として確認することができる。詳細については、例えば、Wommack KE, Williamson KE, Helton RR, Bench SR, Winget DM. Methods for the isolation of viruses from environmental samples. Methods Mol Biol. 2009;501:3-14およびVan Twest R, Kropinski AM. Bacteriophage enrichment from water and soil. Methods Mol Biol. 2009;501:15-21などを参照のこと。
【００１４】
また、分離、同定した腸球菌特異的バクテリオファージの遺伝子解析は、当業者において容易に行うことができ、例えば、Uchiyama J, Rashel M, Takemura I, Wakiguchi H, Matsuzaki S. In silico and in vivo evaluation of candidate therapeutic bacteriophage φEF24C against Enterococcus faecalis infections. Applied and Environmental Microbiology, 74(13), 4149-4163, 2008に報告されている方法に準じて行うことができる。
本発明者らは、これまでに膣スワブから採取、同定した４１株の腸球菌特異的ファージから選択した、３株および９株の腸球菌特異的バクテリオファージを培地に添加し、GBSおよび腸球菌の増殖に対する影響を調べたところ、GBSの増殖には影響を与えることなく、腸球菌の増殖が効果的に抑制されることを確認した。
【００１５】
本発明の第１の実施形態で使用可能な腸球菌特異的バクテリオファージは、河川などの環境水から容易に採取することができ、例えば、配列番号１、配列番号２および配列番号３で表される塩基配列からなる遺伝子を有するファージを挙げることができるが、もちろんこれらのファージに限定されるものではない。
培地に加えるファージは、１または複数種のファージを添加してよく、限定はしないが、例えば、１〜１０種類、２〜７種類程度を添加してもよい。また、培地に加えるファージの量（複数のファージを加える場合は総量）は、当業者であれば、予備的な実験により容易に決定することができる。例えば、1.0 × 107 cfu/mLの腸球菌に対し、1.0 × 103 pfu/mL以上、より好ましくは1.0 × 107 pfu/mL以上である（すなわち、腸球菌1 cfu/mLに対し、ファージが1.0 × 10-4 pfu/mL〜1.0 pfu/mL程度）。
【００１６】
腸球菌特異的バクテリオファージを添加する培地としては、特に限定はしないが、抗菌剤を含有し、GBSを選択的に増殖させる培地が好ましい。このような培地の組成としては、例えば、ペプトン、スターチ、グルコース、イーストエキストラクト、緩衝剤（例えば、Tricine、MOPSなど）、塩類（リン酸水素二ナトリウム、ピルピン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、）などを適宜組み合わせ、これに抗菌剤（ナリジクス酸（Nalidixic Acid）、コリスチン硫酸塩（Colistin Sulfate）、メトトレキサート（Methotrexate）、クリスタルバイオレット（Crystal violet）、メトロニダゾール（Metronidazole））を添加したものを使用することができる。より具体的には、LIM培地（Todd Hewitt Broth、Yeast Extractに抗菌剤であるNalidixic Acid、Colistin Sulfateを添加したもの）やGranada培地（BactoTM Proteose Peptone #3, (Difco) BD、Starch、Glucose、MOPS、Disodium hydrogen phosphate、Sodium pyruvate、Magnesium sulfateに抗菌剤であるMethotrexate、Crystal violet、Colistin sulfate、Metronidazoleを添加したもの）を挙げることができる。
GBSを選択的に増殖させる培地、培地の組成物および抗菌剤は市販されているものを使用することができる。
また、培地の形状は、液体培地、流動培地または固形培地など、いずれの形状であってもよい。好ましくは、液体培地や流動培地の形状が望ましい。
【００１７】
本発明の第２の実施形態は、腸球菌特異的に感染するバクテリオファージを含有するＢ群連鎖球菌増菌用培地に、検体を接種して培養する工程を含む、Ｂ群連鎖球菌の検出方法である。
腸球菌特異的に感染するバクテリオファージを含有する培地中では、腸球菌の増殖が抑制されるため、GBSが選択的に増殖する。その結果、当該培地で菌の増殖が認められれば、検体中にGBSが存在する可能性が高いと判断することができる。なお、培養条件は当業者において、適宜容易に選択することができる（例えば、30〜40℃、好ましくは、37℃前後で、数時間〜数十時間など）。
本発明の第１の実施形態にかかるＢ群連鎖球菌増菌用検出培地の基礎となる培地は、上述の既知の増菌用培地・GBS選択培地を使用することができる。例えば、基礎となる増菌用培地・GBS選択培地として、Granada培地を使用した場合、GBSが特異的に増殖する。平板培地の場合は、赤色のコロニーが生じる。これを指標にして、検体中のGBSの有無を判断することができる。
また、本発明の第２の実施形態には、イムノクロマト法やPCR法などを用いて、増殖した菌がGBSであることをさらに確認する工程が含まれていてもよい。
【００１８】
本発明の第３の実施形態は、少なくとも腸球菌特異的に感染するバクテリオファージを含むことを特徴とするＢ群連鎖球菌検出用キットである。バクテリオファージは、例えば、凍結乾燥、凍結または液体の各状態で供給することができる。当該キットには、バクテリオファージの他、基礎となる培地、または基礎となる培地の構成成分、限定はしないが、例えば、ペプトン、スターチ、グルコース、イーストエキストラクト、緩衝剤（例えば、Tricine、MOPSなど）、塩類（リン酸水素二ナトリウム、ピルピン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム）、抗菌剤（ナリジクス酸（Nalidixic Acid）、コリスチン硫酸塩（Colistin Sulfate）、メトトレキサート（Methotrexate）、クリスタルバイオレット（Crystal violet）、メトロニダゾール（Metronidazole））などが含まれていてもよい。
【００１９】
本明細書において引用されたすべての文献の開示内容は、全体として明細書に参照により組み込まれる。また、本明細書全体において、単数形の「a」、「an」、および「the」の単語が含まれる場合、文脈から明らかにそうでないことが示されていない限り、単数のみならず複数のものを含むものとする。
以下に実施例を示してさらに本発明の説明を行うが、実施例は、あくまでも本発明の実施形態の例示にすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００２０】
１．腸球菌特異的バクテリオファージの宿主域の検討
膣スワブから分離、同定した４１株の腸球菌特異的バクテリオファージから９株を選択し、ヒト膣分泌液から分離、同定した３０株の腸球菌（E. faecalis）に対する感染性を調べた。その結果を表１に示す。
各ファージよって宿主域は異なるが、例えば、φEF17Hは、単独でE. faecalis ３０株の約80 %を溶菌する能力を有することが分かった。以上のことから、腸球菌特異的バクテリオファージを１または複数用いることで、種々のE. faecalisを有効に溶菌可能であることが示唆された。
なお、ファージの感染性と腸球菌の遺伝型には関連性は見られず、本ファージが膣由来の腸球菌に幅広く感染し、生育抑制を行えることを示唆している。
【表１】
2018099080.tif 000002
【００２１】
２．腸球菌特異的バクテリオファージの各種腸球菌に対する生育抑制効果の検討
表１に示すファージ株を用いて、３０株の腸球菌（E. faecalis）に対する生育抑制効果を調べた。
まず、φEF17H、φM1EF22およびφEF24Cを表２に示す濃度で、Granada培地（Proteose Peptone No.3 25.0 g/L, Soluble  Starch 14.0 g/L, Glucose 2.5 g/L, Pyruvic Acid Sodium Salt 1.0 g/L, Cysteine Hydrochloride 0.1 g/L, Magnesium Sulfate 0.3 g/L, MOPS 11.0 g/L, Disodium Hydrogen Phosphate 10.7 g/L, Crystal Violet 0.0005 g/L, Colistin 10 mg/L, Metronidazole 10 mg/L, Nalidixic acid 15 mg/L, pH 7.4 ± 0.2）に添加し、そこに、３０株の腸球菌（E. faecalis）を各々1.0 × 107 cfu/mLで植菌し、37℃で培養した。菌の濁度は、吸光度計（miniphoto518R, タイテック株式会社、埼玉、日本）を使用し、経時的に吸光度660 nmで測定した。
24時間程度培養した後、腸球菌がほとんど生育しなかった場合を「静菌的作用」、ファージを添加した培養液と比較して中程度に生育を抑制できた場合（例えば、培養後8時間程度まではほとんど生育しなかったがその後徐々に生育した）を「抑制作用」、菌の生育をほとんど抑制しなかった場合を「効果なし」として表２にまとめた。実験は3回行いその平均値を示した。
【表２】
2018099080.tif 000003
φEF17H、φM1EF22およびφEF24Cの総濃度を1.0 × 103 pfu/mLとした場合に、用いた腸球菌の約75％が有効にその生育が抑制され、1.0 × 107 pfu/mLとすると腸球菌の約87％の生育を抑制することが分かった。
φEF17H、φM1EF22およびφEF24Cの各遺伝子配列は、配列番号１、配列番号２および配列番号３で示される配列である。なお、φEF24Cの遺伝子配列はすでに公知である（GeneBank Accession no.: NC_009904、またUchiyama J, Rashel M, Takemura I, Wakiguchi H, Matsuzaki S. In silico and in vivo evaluation of candidate therapeutic bacteriophage φEF24C against Enterococcus faecalis infections. Applied and Environmental Microbiology, 74(13), 4149-4163, 2008も参照のこと）。
【００２２】
次に、φEF17H、φM1EF2およびφEF28を使用した結果を表３に、表１に示す９株全てを使用した結果を表４に示す。
【表３】
2018099080.tif 000004
【００２３】
【表４】
2018099080.tif 000005
これらの結果から、腸球菌が1.0 × 107 cfu/mL程度存在する場合、1.0 × 103 pfu/mL（総濃度）程度の複数種のファージを添加して培養すると、腸球菌の株によらず、効果的にその生育を抑制することが明らかになった。
【００２４】
３．腸球菌特異的バクテリオファージを含む培地中での腸球菌およびGBSの生育
細菌には、膣から分離された腸球菌EF8株およびGBS2株を使用した。GBS2株はリファンピシン10μg/mL混入させたTSB寒天培地で培養し、リファンピシン耐性GBS2株を取得した。GBS2株はリファンピシン20μg/mLでもTSB培地と変わらず生育可能である。一方、腸球菌はリファンピシン20μg/mL混入TSB培地ではほとんど生育しない。
細菌培養培地には、Tryptic Soy Broth (TSB ; Becton Dickinson and Company, San Diego, CA, USA)、Granada培地（上記を参照のこと）、EF培地（日水製薬株式会社、東京、日本）を使用した。培地器材、試薬およびリファンピシンは、ナカライテスク（京都、日本）から購入した。培養はすべて37℃で行った。
【００２５】
はじめに、腸球菌EF8株およびリファンピシン耐性GBS2株をTSB液体培地10 mLで吸光度0.4くらいになるように培養した（約3-4時間37℃で培養； 菌濃度は約108-109 cfu/mL）。菌の濁度は、吸光度計（miniphoto518R, タイテック株式会社、埼玉、日本）を使用し吸光度660 nmで測定した。腸球菌を107 cfu/mL、リファンピシン耐性GBS2株を 108 cfu/mLとなるようにTSB培地で希釈し、腸球菌EF8を100 μL、リファンピシン耐性GBS2株を100μLを10mLのGranada培地に添加した。
【００２６】
各ファージ液（ファージ濃度1.0 ×107  pfu/mL）100μL（計300μL）あるいはTSB培地300μL（コントロール）を加えた。培養0、6、12、18、24時間後に、TSB、リファンピシン（20μg/mL）添加TSB寒天培地およびEF培地を使用し、生菌数測定を行った。TSB寒天培地は総生菌数測定、EF培地は腸球菌EF8株の生菌数測定（GBSは、EF培地では生育しない）、リファンピシン添加TSB寒天培地はリファンピシン耐性GBS2株の生菌数測定（腸球菌 EF8株は生育しない）に利用した。ファージのみを接種した試験管も準備し、24時間培養後、TSB寒天培地を用いて菌が発育していないことを確認した。
【００２７】
図１に結果を示す。TSB寒天培地を使用した生菌数測定結果から、ここで用いたファージはGBSの生育には影響を与えないことが確認された（図１Ａ）。
腸球菌特異的バクテリオファージを添加していない培地では、腸球菌がGBSを上回る勢いで生育をしたのに対し（図１Ｃ）、ファージを添加した培地においては、GBSの生育には影響を与えることなく、腸球菌の生育を著しく抑制することが分かった（図１Ｂ）。
従って、腸球菌特異的バクテリオファージを添加した培地中で検体を培養することで、腸球菌の生育を効果的に抑制し、GBSを選択的に生育させることができ、GBS検査の精度を上げることが可能となる。表１に示す９種のファージを使用した場合も同様の結果が得られた。
【産業上の利用可能性】
【００２８】
本発明により、GBS検査の精度を上げることができ、GBSによって引き起こされる新生児の重症感染症の早期治療の開始が可能となり、予防医学の分野の発展に大いに貢献することが期待される。
【図１】
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【配列表】
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