(57)【要約】【課題】本発明は、大腸菌のペリプラズムを利用した、蛍光タンパク質または化合物のスクリーニング方法、並びにこれらの方法に用いることができる大腸菌およびベクターを提供する。【解決手段】大腸菌のペリプラズムに蛍光タンパク質を発現させることが可能であること、およびペリプラズムで化合物と蛍光タンパク質とを接触させ、蛍光強度を測定する。好ましくは、固形培地上でペリプラズムに蛍光タンパク質を発現させた大腸菌にコロニーを形成させ、および、より好ましくは、大腸菌コロニーを蛍光顕微鏡で観察して蛍光強度を測定する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
化合物依存性に蛍光強度を変化させる蛍光インジケーターのスクリーニング方法であって、
（Ａ）蛍光インジケーターまたはその改変体にペリプラズム移行シグナル配列を連結させたタンパク質を発現可能に含むタンパク質発現ベクターを大腸菌に形質転換することと、
（Ｂ）蛍光インジケーターまたはその改変体がペリプラズムに発現した大腸菌と前記化合物とを接触させることと、
（Ｃ）化合物依存的に蛍光強度を変化させる蛍光インジケーターまたはその改変体を発現する大腸菌を選択することと
を含む、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
前記（Ｂ）が、固形培地上で大腸菌コロニーと化合物とを接触させることにより実施される、方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、
前記（Ｃ）が、固形培地上の大腸菌コロニーが発する蛍光を共焦点顕微鏡で観察することにより行われる、方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、
（Ｄ）ピックアップされた大腸菌コロニーに含まれるタンパク質発現ベクターを精製し、蛍光インジケーターをコードする遺伝子の配列を決定することをさらに含む、方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法であって、前記（Ａ）の前に、
（Ｚ）化合物依存性に蛍光強度を変化させる蛍光インジケーターのアミノ酸を改変すること
を実施し、
（Ａ）では、蛍光インジケーターとして、（Ｚ）において改変された蛍光インジケーターを用いる、方法。
【請求項６】
化合物が、イノシトール三リン酸またはカルシウムイオンである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
化合物依存性に蛍光強度を変化させる蛍光インジケーターが、イオンインジケーターまたはその改変体である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
大腸菌が変異型ＬＰＳを有する大腸菌である、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
蛍光インジケーターの蛍光強度を増強する化合物のスクリーニング方法であって、
（α）蛍光インジケーターにペリプラズム移行シグナル配列を連結させたタンパク質を発現可能に含むタンパク質発現ベクターを大腸菌に形質転換することと、
（β）前記タンパク質をペリプラズムに発現した大腸菌と被験化合物とを接触させることと、
（γ）蛍光インジケーターの蛍光強度を変化させる被験化合物を選択することと
を含む、方法。
【請求項１０】
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）または生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）を利用して、２つのタンパク質の相互作用を変化させる化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）相互作用によりＦＲＥＴまたはＢＲＥＴを生じる２つのタンパク質それぞれにペリプラズム移行シグナル配列を付加することと、
（ｂ）２つのタンパク質をペリプラズムに発現する大腸菌を得ることと、
（ｃ）大腸菌と被験化合物とを接触させることと、
を含み、
接触により、ＦＲＥＴまたはＢＲＥＴのアクセプタータンパク質の蛍光強度に変化が生じた場合には、被験化合物は、２つのタンパク質の相互作用を変化させるものであることが示される、方法。
【請求項１１】
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を利用して、タンパク質のコンフォメーションを変化させる化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ’）分子内でＦＲＥＴを生じる蛍光インジケーターにペリプラズム移行シグナル配列が連結されたタンパク質を発現可能に含むタンパク質発現ベクターを大腸菌に形質転換することと、
（ｂ’）得られたタンパク質をペリプラズムに発現する大腸菌と被験化合物とを接触させることと、
を含み、
接触により、ＦＲＥＴ効率に変化が生じた場合には、被験化合物は、タンパク質のコンフォメーションを変化させるものであることが示される、方法。
【請求項１２】
請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法であって、
前記大腸菌と被験化合物とを接触させることが、固形培地上で大腸菌コロニーと化合物とを接触させることにより実施される、方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、前記大腸菌コロニーが、共焦点顕微鏡で観察される、方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法であって、大腸菌が変異型ＬＰＳを有する大腸菌である、方法。
【請求項１５】
化合物依存性に蛍光強度を変化させる蛍光インジケーターをペリプラズムに発現する、組換え大腸菌。
【請求項１６】
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）または生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）を生じる２つのタンパク質をペリプラズムに発現する、組換え大腸菌。
【請求項１７】
蛍光強度を変化させる化合物を検出またはスクリーニングすることに用いるための、請求項１５に記載の組換え大腸菌を含む、組成物。
【請求項１８】
ＦＲＥＴ効率を変化させる化合物を検出またはスクリーニングすることに用いるための、請求項１６に記載の組換え大腸菌を含む、組成物。
【請求項１９】
大腸菌のペリプラズムに蛍光インジケーターを発現させ、蛍光強度を変化させる化合物を検出またはスクリーニングすることに用いるための組成物であって、ペリプラズム移行シグナル配列と蛍光インジケーターとの連結タンパク質をコードする核酸を発現可能に含むタンパク質発現ベクターを含む、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大腸菌のペリプラズムを利用した、蛍光タンパク質または化合物のスクリーニング方法、並びにこれらの方法に用いることができる大腸菌およびベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
蛍光分子は、生体の反応や物質の存在を可視化する重要なツールである。従って、蛍光分子の開発は、生体の反応や物質の存在を可視化する新しいツールの開発として重要である。従来から、蛍光分子の改変と有用な蛍光分子のスクリーニングにより実施されてきた。
【０００３】
ＴｏｒＡタグを付加したタンパク質は、大腸菌においてＴａｔ経路によりペリプラズムに移行することが知られている（非特許文献１）。そして、ペリプラズムを利用して、蛍光タンパク質を有するインジケーターが開発されている（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】C.M. Barrett, N. Ray, J.D. Thomas, C. Robinson, A. Bolhuis, Biochem Biophys Res Commun, 304 (2003) 279-284.
【非特許文献２】Y. Zhao, S. Araki, J. Wu, T. Teramoto, Y.F. Chang, M. Nakano, A.S. Abdelfattah, M. Fujiwara, T. Ishihara, T. Nagai, R.E. Campbell, Science, 333 (2011) 1888-1891
【発明の概要】
【０００５】
本発明者らは、より効率のよいスクリーニング手法があれば開発速度を大きく前進させると考えた。
【０００６】
本発明は、大腸菌のペリプラズムを利用した、蛍光インジケーターまたは化合物のスクリーニング方法、並びにこれらの方法に用いることができる大腸菌およびベクターを提供する。
【０００７】
本発明者らは、大腸菌のペリプラズムに蛍光インジケーターを効率的かつ安定して発現させることが可能であれば、大腸菌を利用した最適な蛍光インジケーターを簡便に探索できることを着想した。また同様に、開発された蛍光インジケーターを大腸菌のペリプラズムに効率的かつ安定して発現させることが可能になれば、大腸菌のペリプラズム内での蛍光インジケーターと候補物質を接触させて、当該インジケーターと強く結合する化合物を探索することが可能になることを見出した。
その一例として、本発明者らは特に、ペリプラズムでイノシトール１，４，５−三リン酸（ＩＰ3）と蛍光インジケーターとを接触させることができ、ＩＰ3応答性蛍光インジケーターの開発（特に、スクリーニング）に有利であることを見出した。
本発明者らはまた、固形培地上でペリプラズムに蛍光インジケーターを発現させた大腸菌にコロニーを形成させ、大腸菌を観察するのに共焦点顕微鏡が特に適していることを見出した。本発明者らはまた、大腸菌株Ｔｏｐ１０は、Long-TorAシグナル配列を有するタンパク質を極めて効率良くペリプラズムに移行させることができ、大腸菌株ＪＭ１０９株は、Short-TorAシグナル配列を有するタンパク質を極めて効率良くペリプラズムに移行させることができることを見出した。本発明者らはまた、変異型ＬＰＳ大腸菌株ＨＯ１４１ではLong-TorAシグナル配列を有するタンパク質を極めて効率良くペリプラズムに移行させることができることを見出した。本発明者らはさらに、大腸菌のペリプラズム内で蛍光インジケーターと疎水性化合物を接触させる場合には、Long-TorAシグナル配列を有するタンパク質を変異型ＬＰＳ大腸菌に導入することで、当該タンパク質と疎水性化合物の接触の評価に最適であることを見出した。本発明はこれらの知見に基づき、創作された発明である。
【０００８】
すなわち、本発明によれば以下の発明が提供される。
（１）化合物依存性に蛍光強度を変化させる蛍光インジケーターのスクリーニング方法であって、
（Ａ）蛍光インジケーターまたはその改変体にペリプラズム移行シグナル配列(具体的にはＴｏｒＡシグナル配列)を連結させたタンパク質を発現可能に含むタンパク質発現ベクターを大腸菌に形質転換することと、
（Ｂ）蛍光インジケーターまたはその改変体がペリプラズムに発現した大腸菌と前記化合物とを接触させることと、
（Ｃ）化合物依存的に蛍光強度を変化させる蛍光インジケーターまたはその改変体を発現する大腸菌を選択することと
を含む、方法。
（２）上記（１）に記載の方法であって、
前記（Ｂ）が、固形培地上で大腸菌コロニーと化合物とを接触させることにより実施される、方法。
（３）上記（２）に記載の方法であって、
前記（Ｃ）が、固形培地上の大腸菌コロニーが発する蛍光を共焦点顕微鏡で観察することにより行われる、方法。
（４）上記（３）に記載の方法であって、
（Ｄ）ピックアップされた大腸菌コロニーに含まれるタンパク質発現ベクターを精製し、蛍光インジケーターをコードする遺伝子の配列を決定することをさらに含む、方法。
（５）上記（１）〜（４）のいずれかに記載の方法であって、前記（Ａ）の前に、
（Ｚ）化合物依存性に蛍光強度を変化させる蛍光インジケーターのアミノ酸を改変すること
を実施し、
（Ａ）では、蛍光インジケーターとして、（Ｚ）において改変された蛍光インジケーターを用いる、方法。
（６）化合物が、イノシトール１，４，５−三リン酸またはカルシウムイオンである、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）化合物依存性に蛍光強度を変化させる蛍光インジケーターが、イオンインジケーターまたはその改変体である、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（８）大腸菌が変異型ＬＰＳを有する大腸菌である、上記（１）〜（７）のいずれかに記載の方法。
（９）蛍光インジケーターの蛍光強度を増強する化合物のスクリーニング方法であって、
（α）蛍光インジケーターにペリプラズム移行シグナル配列(具体的にはＴｏｒＡシグナル配列)を連結させたタンパク質を発現可能に含むタンパク質発現ベクターを大腸菌に形質転換することと、
（β）前記タンパク質をペリプラズムに発現した大腸菌と被験化合物とを接触させることと、
（γ）蛍光インジケーターの蛍光強度を変化させる被験化合物を選択することと
を含む、方法。
（１０）蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）または生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）を利用して、２つのタンパク質の相互作用を変化させる化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）相互作用によりＦＲＥＴまたはＢＲＥＴを生じる２つのタンパク質それぞれにペリプラズム移行シグナル配列(具体的にはＴｏｒＡシグナル配列)を付加することと、
（ｂ）２つのタンパク質をペリプラズムに発現する大腸菌を得ることと、
（ｃ）大腸菌と被験化合物とを接触させることと、
を含み、
接触により、ＦＲＥＴまたはＢＲＥＴのアクセプタータンパク質の蛍光強度に変化が生じた場合には、被験化合物は、２つのタンパク質の相互作用を変化させるものであることが示される、方法。
（１１）蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を利用して、タンパク質のコンフォメーションを変化させる化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ’）分子内でＦＲＥＴを生じる蛍光インジケーターにペリプラズム移行シグナル配列(具体的にはＴｏｒＡシグナル配列)が連結されたタンパク質を発現可能に含むタンパク質発現ベクターを大腸菌に形質転換することと、
（ｂ’）得られたタンパク質をペリプラズムに発現する大腸菌と被験化合物とを接触させることと、
を含み、
接触により、ＦＲＥＴ効率に変化が生じた場合には、被験化合物は、タンパク質のコンフォメーションを変化させるものであることが示される、方法。
（１２）上記（９）〜（１１）のいずれかに記載の方法であって、
前記大腸菌と被験化合物とを接触させることが、固形培地上で大腸菌コロニーと化合物とを接触させることにより実施される、方法。
（１３）上記（１２）に記載の方法であって、
前記大腸菌コロニーが、共焦点顕微鏡で観察される、方法。
（１４）、上記（１３）に記載の方法であって、大腸菌が変異型ＬＰＳを有する大腸菌である、方法。
（１５）化合物依存性に蛍光強度を変化させる蛍光インジケーターをペリプラズムに発現する、組換え大腸菌。
（１６）蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）または生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）を生じる２つのタンパク質をペリプラズムに発現する、組換え大腸菌。
（１７）蛍光強度を変化させる化合物を検出またはスクリーニングすることに用いるための、上記（１５）に記載の組換え大腸菌を含む、組成物。
（１８）ＦＲＥＴ効率を変化させる化合物を検出またはスクリーニングすることに用いるための、上記（１６）に記載の組換え大腸菌を含む、組成物。
（１９）大腸菌のペリプラズムに蛍光インジケーターを発現させ、蛍光強度を変化させる化合物を検出またはスクリーニングすることに用いるための組成物であって、ペリプラズム移行シグナル配列(具体的にはＴｏｒＡシグナル配列)と蛍光インジケーターとの連結タンパク質をコードする核酸を発現可能に含むタンパク質発現ベクターを含む、組成物。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、大腸菌の外膜および内膜の構造を示す。図１はまた、ペリプラズム移行シグナル配列(具体的にはＴｏｒＡシグナル配列)を有する蛍光インジケーターと外膜を透過する低分子量化合物がペリプラズムで接触することを示す。
【図２Ａ】図２Ａは、大腸菌株、発現ベクター、およびTorAシグナルの種類の組合せとペリプラズムでのタンパク質の発現量との関係を示す。図２Ａ中、「Ｃ」はカルシウムイオン存在下条件であることを示し、「Ｅ」はＥＧＴＡ存在下条件であることを示す。図２Ａ中、「Ｓｈｏｒｔ」は、Short-TorAシグナルを付加することを示し、「Ｌｏｎｇ」は、Long-TorAシグナルを付加することを示す。図２Ａ中、「Ｔｏｐ１０」は大腸菌Ｔｏｐ１０株を示し、「ＪＭ１０９」は、大腸菌株ＪＭ１０９（ＤＥ３）を示し、「ＢＬ２１」は大腸菌株ＢＬ２１（ＣＤ３）を示し、「Ｃｏｄｏｎ」は、大腸菌株ＢＬ２１コドンプラスを示す。図２Ａ中、ｐＢＡＤおよびｐＲＳＥＴは、用いたベクターの種類を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＨＯ１４１株における，発現ベクター、およびTorAシグナルの種類の組合せとペリプラズムでのタンパク質の発現量との関係を示す。図２Ａ中、「Ｃ」はカルシウムイオン存在下条件であることを示し、「Ｅ」はＥＧＴＡ存在下条件であることを示す。図２Ａ中、「Ｓｈｏｒｔ」は、Short-TorAシグナルを付加することを示し、「Ｌｏｎｇ」は、Long-TorAシグナルを付加することを示す。図２Ａ中、ｐＢＡＤおよびｐＲＳＥＴは、用いたベクターの種類を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、寒天培地上での大腸菌コロニーの観察スキームを示す。図３Ａはカルシウムイオンインジケーターを観察する場合の図であり、カルシウムイオンの添加とＥＧＴＡの添加により、カルシウムイオン依存的な蛍光を観察する系を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、観察装置の違いによる検出感度の違いを示す。図中、ＬＡＳおよびＳＺＸはそれぞれ実施例で用いた観察システムである、蛍光イメージ解析装置ＬＡＳ３０００および蛍光ステレオ顕微鏡ＳＺＸ１６をそれぞれ示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、図３Ａのスキームにおいてカルシウム添加後の蛍光強度とＥＧＴＡ添加後の蛍光強度の比を示す。
【図４】図４は、ＩＰ3が外膜を透過してペリプラズムに到達することを示す。図４のパネルＡは、ＩＰ3が外膜を透過してペリプラズムに到達し、ペリプラズムでＩＰ3結合体であるｍＣｈｅｒｒｙ−ｍ４９と結合することを示す。図４のパネルＢは、ＩＰ3が外膜を透過してペリプラズムに到達し、ペリプラズムでＩＲＩＳと結合することを示す。図４のパネルＣは、ＩＰ3がペリプラズムでＩＲＩＳと結合し、ＩＲＩＳの蛍光スペクトルを変化させることを示す。
【図５】図５は、蛍光インジケーターをコードする遺伝子に変異を導入して改変体を作製し、これをスクリーニングするシステムの概要を示す。蛍光遺伝子にランダムな変異を導入する。次いで、ＴｏｒＡシグナルを付加するベクターに導入して、大腸菌へ形質転換する。さらに寒天培地上で大腸菌にコロニーを形成させて、観察し（化合物依存性の蛍光インジケーターの場合は化合物を添加してもよい）、有用なコロニーを取得して導入された遺伝子を解析する。
【図６Ａ】図６Ａは、大腸菌のペリプラズムにおいて、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を用いたタンパク質の相互作用を増強する化合物または遮断する化合物を同定する方法の概略を示す図である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、大腸菌のペリプラズムにおいて、ＸとＹとが相互作用すると蛍光を発する分子を用いて、タンパク質の相互作用を増強する化合物または遮断する化合物を同定する方法の概略を示す図である。
【図７】図７は、共焦点顕微鏡とそれ以外の観察システムとの相違を示す図である。
【図８】図８は、ｐＲＳＥＴ発現ベクターに図６Ａで用いる２つのタンパク質を組込んだベクターの一例を示す。
【発明の具体的な説明】
【００１０】
本明細書では、「大腸菌」とは、学名Escherichia coli（E. coli）を有するグラム陰性細菌である。大腸菌は、遺伝子を組込んでタンパク質の発現に用いられる他、遺伝子を大腸菌内で複製可能なプラスミドに組込んで増幅させることや、クローニングすることに用いられている。
【００１１】
本明細書では、「ペリプラズム」とは、グラム陰性細菌において細胞膜と細胞外膜との間に囲まれた領域を言う。本明細書では、細胞外膜を単に外膜と呼ぶ。本明細書では、細胞膜を内膜と呼ぶことがある。大腸菌の外膜は、低分子量化合物に対して透過性を有し、特に分子量６００ダルトン以下の化合物に対する透過性に優れている。
【００１２】
本明細書では、「コンピテントセル」とは、DNAに対する膜透過性を向上させた大腸菌を意味する。コンピテントセルは、例えば、対数増殖期の大腸菌を二価イオン（例えばカルシウムイオン）の存在下で冷却することにより作成することができる。コンピテントセルは、DNA導入時にヒートショックを与えてDNAの取込み効率をさらに向上させることがある。
【００１３】
本明細書では、「TorA」とは、E. coliのTorAタンパク質（すなわち、トリメチルアミン−Ｎ−オキシドレダクターゼ）を意味する。本明細書では、「TorAシグナル配列」とは、表１の配列番号１若しくは２またはその一部に代表される、連結したタンパク質をペリプラズムに移行させるTorAのシグナル配列またはTorA由来のシグナル配列を意味する。TorA由来のシグナル配列は、TorAのシグナル配列と８０％以上若しくは９０％以上の配列同一性を有し、ペリプラズム移行シグナルとして機能する配列、または改変されたTorAのシグナル配列である。
【００１４】
本明細書では、「蛍光共鳴エネルギー移動」（ＦＲＥＴ）とは、第一の蛍光タンパク質の蛍光の波長と第二の蛍光タンパク質の励起光の波長のスペクトルが重なり合う場合に、前記２つの蛍光タンパク質が近接すると、第一の蛍光タンパク質を励起したときに、第一の蛍光タンパク質が吸収したエネルギーが、第二の蛍光タンパク質の励起のためのエネルギーとして用いられ、第二の蛍光タンパク質の蛍光が発するという現象である。このとき第一の蛍光タンパク質をドナータンパク質（供与体）といい、第二の蛍光タンパク質をアクセプタータンパク質（受容体）という。ドナータンパク質とアクセプタータンパク質との距離が１０ｎｍ以下程度になったときにＦＲＥＴ効率が顕著に向上すると考えられている。
ＦＲＥＴは、タンパク質間相互作用の変化の解析手法として当業者に周知である。具体的には、ＦＲＥＴでは、タンパク質Ａにドナータンパク質を連結し、タンパク質Ｂにアクセプタータンパク質を連結して、タンパク質ＡとＢとの相互作用を検出することができる。ＦＲＥＴは、分子内のドメイン間の相対的位置関係の変化の解析手法としても用いられている。例えば、ドメインＡにドナータンパク質を連結し、ドメインＢにアクセプタータンパク質を連結して、タンパク質のコンフォメーションが変化すると、ドナータンパク質とアクセプタータンパク質との距離が変動し、ＦＲＥＴ効率に変化を生じさせることができることが知られている。
【００１５】
本明細書では、「生物発光共鳴エネルギー移動」（ＢＲＥＴ）とは、ＦＲＥＴにおいて供与体として第１の蛍光タンパク質の代わりに生物発光タンパク質を用いて、ドナータンパク質とアクセプタータンパク質とが近接すると、ドナータンパク質が生物発光しようとするときにそのエネルギーがアクセプタータンパク質の励起のためのエネルギーとして用いられ、ドナーの代わりにアクセプタータンパク質の蛍光が発するという現象である。生物発光タンパク質としては、ルシフェラーゼが挙げられる。
【００１６】
本明細書では、「遮断」または「遮断する」とは、タンパク質の相互作用に関して用いられる場合、相互作用を阻害する、弱める、減少させる、または消失させることを意味する。
【００１７】
本明細書では、「コンフォメーション」とは、タンパク質が取り得る立体形状を意味する。コンフォメーション変化とは、タンパク質の立体形状の変化、すなわち構造変化を意味する。
【００１８】
本明細書では、「大腸菌コロニー」とは、大腸菌を適切な希釈倍率で希釈した溶液を塗布した固形培地上で形成される集団を意味する。コロニーは、単一クローンからなる。適切な希釈倍率が不明な場合には、当業者であれば希釈系列、例えば１０倍の希釈系列を作製して適切な希釈倍率を決定することができる。
【００１９】
本明細書では、「固形培地」とは、液体培地に対する意味で用いられ、固化させた培地をいう。固形培地は、通常、液体培地に寒天を加えて固化させて調製することができる。大腸菌の培地は、当業者であれば適宜調製することができる。大腸菌の培地は、例えば、ペプトン、牛肉エキスまたは酵母エキス、塩、およびグルコースなどの成分を含み得る。培地は、必要に応じて、抗生物質を含み得、耐性遺伝子を有するプラスミドを含む大腸菌の選択のために用いられ得る。
【００２０】
本明細書では、「改変」は、遺伝的にタンパク質を改変することを意味する。改変は、アミノ酸配列の変更により行われ得る。アミノ酸配列の変更は、アミノ酸の置換、付加、削除、若しくは挿入またはその組合せでなされ得る。例えば、アミノ酸の改変は、１〜数アミノ酸の置換、付加、削除、若しくは挿入またはその組合せでなされ得る。アミノ酸の改変は、タンパク質の一定のストレッチ（例えば、タンパク質ドメイン）の移植または交換により行ってもよい。
【００２１】
本明細書では、「蛍光タンパク質」とは、特定の波長を有する光で励起することにより、蛍光を発するタンパク質を意味する。通常は、蛍光は励起光よりも長い波長を有する。励起光と蛍光を区別するためにダイクロイックミラーが用いられる。ダイクロイックミラーは、特定波長の光を反射するが、それ以外の波長の光を透過する性質を有する。
【００２２】
本明細書では、「発現」または「発現する」とは、タンパク質をコードする遺伝子からタンパク質が産生されることを意味する。
【００２３】
本明細書では、「ベクター」とは、遺伝子組換えに用いられる核酸分子を言う。本明細書では、大腸菌に遺伝子導入することが念頭に置かれるため、ベクターは、大腸菌で自己複製可能な複製起点を有し、形質転換した大腸菌を選択するための耐性遺伝子を有し、外来遺伝子を導入するための挿入部位（例えば、マルチクローニングサイト）を有する。
本明細書では、「タンパク質発現ベクター」とは、大腸菌内でタンパク質を発現させることに用いるベクターを意味する。タンパク質発現ベクターは、通常、大腸菌においてタンパク質を発現させるためのプロモーターおよびポリＡ付加配列を有する。タンパク質発現ベクターとしては、プラスミドがよく用いられている。タンパク質発現ベクターで２つのタンパク質を発現させるときには、２つのタンパク質を２つのｍＲＮＡにモノシストロニックに発現させてもよいし、２つのタンパク質を１つのｍＲＮＡにポリシストロニックに発現させてもよい。ポリシストロニックに発現させる場合には、２つのタンパク質をコードする領域の間にリボソームエントリーサイト（ＩＲＥＳ）を導入することができる。
【００２４】
本明細書では、「蛍光インジケーター」とは、蛍光タンパク質であり、ＦＲＥＴまたはＢＲＥＴ（生物発光共鳴エネルギー移動）の効果を有する二つのタンパク質ドメインの間に、特定の化合物またはタンパク質との結合することでコンフォメーション変化を起こすタンパク質またはその機能的断片を有する融合タンパク質を意味する。蛍光インジケーターは、特定の化合物またはタンパク質との接触により、ＦＲＥＴまたはＢＲＥＴの効果によって蛍光強度の変化を示す。この変化の有無から、蛍光インジケーター中のタンパク質が、特定の化合物またはタンパク質との接触によってコンフォメーション変化を起こすか否かを評価するツールとして利用できる。このような評価は、物質の有無を評価するセンサー、研究試薬の探索、疾患の治療薬の探索などに応用され得る。
【００２５】
本発明者らは、タンパク質発現ベクターを用いて蛍光インジケーターをペリプラズムで発現させると、外膜外からペリプラズムに透過できる分子との相互作用を利用して、分子のスクリーニングや、蛍光インジケーターのスクリーニングが可能となることを見出した。
本発明者らはまた、ペリプラズム移行シグナル（具体的にはTorAシグナル配列）を付加した蛍光インジケーターを発現する大腸菌コロニーの観察に共焦点顕微鏡が適していることを見出した。
【００２６】
本発明者らはこれらの知見から、化合物依存的に蛍光を発する蛍光インジケーターの開発を促進することができる以下の発明を考案した。具体的には、蛍光インジケーターを改変し、複数の蛍光インジケーターの改変体を得、それぞれにペリプラズム移行シグナル（具体的にはTorAシグナル配列）を付加して、タンパク質発現ベクターに発現可能に導入し、大腸菌に形質転換することができる。形質転換された大腸菌は、通常、１つの大腸菌に１つのプラスミドしか導入されないので、これを固形培地に塗布してコロニーを形成させると、コロニーは１つのプラスミドだけをプラスミドとして有する大腸菌からなる。化合物と大腸菌とを接触させると、化合物はペリプラズムに到達し、ペリプラズムに到達した化合物は、蛍光インジケーター改変体とペリプラズム中で反応し、蛍光インジケーター改変体の蛍光強度を変化させる。化合物依存的な蛍光強度の最も好ましい変化を示す改変体を含むコロニー（上述の通り、単一の改変体しか含まない）を増殖させて、改変体の核酸配列やアミノ酸配列を決定することが可能となる。
ここで、大腸菌コロニーは、例えば、アルコール滅菌や加熱滅菌した白金耳や楊子等でつついて、液体培地に懸濁することができ、その後培養することで、単一クローンからなる大腸菌をさらに増殖させることができる。例えば、好ましい性質を示す大腸菌コロニーを増殖させて、その後、その好ましい性質の原因となっているタンパク質をコードするＤＮＡをクローニングしたり、配列を決定したりすることができる。あるいは、コロニーはアルコール滅菌や加熱滅菌した白金耳や楊子等でつついて、これをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）反応の反応液に直接懸濁して、その好ましい性質の原因となっているタンパク質をコードするＤＮＡを増幅し、配列決定することもできる。
【００２７】
このように、コロニーを直接観察する手法は、その後の解析が簡便であるが故に有利である。固形培地上の大腸菌コロニーの観察に共焦点顕微鏡が特に適しているから、これを用い、好ましい蛍光特性を有するコロニーを特定し、コロニーが有するベクター中の蛍光インジケーターの配列を解析することが容易にできる。
【００２８】
この発明は、ＦＲＥＴを利用した２分子間の相互作用の変化の検出の系にも適用できると考え、さらに２分子間の相互作用を変化させる化合物のスクリーニング方法を考案した。この発明はまた、２分子間の相互作用の変化を分割した蛍光タンパク質を用いて検出する系にも適用できると考え、２分子間の相互作用を変化させる化合物のスクリーニング方法を考案した。
【００２９】
本発明の一側面によれば、化合物依存性に蛍光強度を変化させる蛍光インジケーターのスクリーニング方法であって、
（Ａ）蛍光インジケーターまたはその改変体にペリプラズム移行シグナル配列を連結させたタンパク質を発現可能に含むタンパク質発現ベクターを大腸菌に形質転換することと、
（Ｂ）蛍光インジケーターまたはその改変体がペリプラズムに発現した大腸菌と前記化合物とを接触させることと、
（Ｃ）化合物依存的に蛍光強度を変化させる蛍光インジケーターまたはその改変体を発現する大腸菌を選択することと、｛ここで好ましくは、蛍光インジケーターからの蛍光は共焦点顕微鏡を用いて観察する｝
を含む、方法が提供される。
【００３０】
以下では、上記（Ａ）〜（Ｃ）について説明する。
【００３１】
（Ａ）について
化合物依存性に蛍光強度を変化させる蛍光インジケーターとは、特定の化合物との結合および解離に応じて蛍光強度を変化させる蛍光インジケーターであり、いわゆるケミカルセンサーやイオンセンサーとして用いられる蛍光インジケーターを含む。本明細書では、「蛍光強度を変化させる」には、蛍光波長スペクトルを変化させること（例えば、蛍光波長が変化すること）が含まれる。
化合物依存性に蛍光強度を変化させる蛍光インジケーターは、様々なものが開発されており、例えば、カメレオン（cameleon）、ペリカム（pericam）、ジーカンプ（GCaMP）、ＣａＴＭ、Ｃａｓｅ１２、Ｆｌｕｏ−４、Ｒｈｏｄ−３、およびゲッコー（GECO）などのカルシウムイオン依存性に蛍光強度を変化させる蛍光インジケーターが挙げられる。
化合物依存性に蛍光強度を変化させる蛍光インジケーターとしては、鉄イオン、ナトリウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、ｐＨ、および膜電位に応答性の蛍光インジケーターなどのイオン依存性に蛍光強度を変化させる蛍光インジケーターが膨大に開発されており、用いることができる。イオン依存性に蛍光強度を変化させる蛍光インジケーターは、当該イオン存在下での蛍光強度と非存在下での蛍光強度を比較して同定することができる。イオン非存在下の環境は、例えば、イオン添加前の環境としてもよいし、キレート剤存在下の環境としてもよい。ある一態様では、イオン存在下で蛍光強度を測定し、キレート剤を添加して蛍光強度を測定して蛍光強度を両者間で比較してもよい。
また、化合物依存性に蛍光強度を変化させる蛍光インジケーターとしては、一酸化炭素や活性酸素種応答性に蛍光強度を変化させる蛍光インジケーターも多数知られており、用いることができる。化合物依存性に蛍光強度を変化させる蛍光インジケーターとしては、イノシトール１，４，５−三リン酸（ＩＰ3）依存性に蛍光強度を変化させる蛍光インジケーター、例えば、ＩＲＩＳおよびＬＩＢＲＡが挙げられ、本発明で用いられ得る。
【００３２】
上記（Ａ）では、化合物依存性に蛍光強度を変化させる蛍光インジケーターを新規に設計して蛍光インジケーターの候補を作製し、これを蛍光インジケーターとしてペリプラズム移行シグナル配列(具体的にはＴｏｒＡシグナル配列、ｐｅｌＢシグナル配列、ｍａｌＥシグナル配列)と連結させて用いることができるし、あるいは、既存の化合物依存性に蛍光強度を変化させる蛍光インジケーターを改変することにより、改変体を作製して、これを用いてもよい。
ＴｏｒＡシグナル配列と蛍光インジケーターとの連結は、コドンのフレームがずれないようにこれらをコードする核酸を連結（インフレームで連結）することにより可能となる。ＴｏｒＡシグナル配列と蛍光インジケーターとの連結は、ＦＬＡＧタグやＨｉｓタグなどのタグをタンパク質に付加するのと同様に行うことができ、当業者に周知である。
【００３３】
上記（Ａ）では、連結タンパク質を発現可能に含むタンパク質発現ベクターは、連結タンパク質をプロモーターに作動可能に連結して作製することができる。プロモーターは、大腸菌においてタンパク質を発現できるプロモーターとすることができ、例えば、ｌａｃプロモーターなどのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導可能なプロモーター、ｃａｓＡなどのコールドショックで誘導可能なプロモーター、ａｒａＢＡＤなどのアラビノースで誘導可能なプロモーター、およびＴ７プロモーターなどのウイルスのプロモーターが挙げられ、本発明で用いることができる。
【００３４】
発現ベクターの大腸菌への形質転換は、当業者に周知の方法で実施することができる。例えば、コンピテントセルと発現ベクターとを混合して行うことができる。混合時には、４０〜４２℃程度のヒートショックを加えてもよい。
【００３５】
大腸菌は、特に限定されないが、タンパク質発現に大腸菌を用いることができる。例えば、大腸菌としては、ＢＬ２１株、ＪＭ１０９株、Ｔｏｐ１０株、およびＪＥ１０１１株が挙げられる。
大腸菌としてはまた、これらの染色体ＤＮＡにλＤＥ３遺伝子が組込まれたＢＬ２１（ＤＥ３）、ＪＭ１０９（ＤＥ３）、Ｔｏｐ１０（ＤＥ３）、およびＪＥ１０１１（ＤＥ３）などのλＤＥ３遺伝子を有する大腸菌株が挙げられる。λＤＥ３遺伝子上には、ｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下にＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子が配置されており、ＩＰＴＧによりＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを誘導することができる。従ってこの系では目的遺伝子をＴ７プロモーターの制御下に作動可能に連結しておくと、ＩＰＴＧにより目的遺伝子を発現させることができる。
大腸菌としてはまた、リポ多糖（ＬＰＳ）に変異を有する大腸菌を用いることができる。ＬＰＳの変異としてはＬＰＳ構造の一部が欠落したものであって疎水性化合物への感受性が高くなった大腸菌が好ましく、例えば、ＪＥ１０１１株由来で樹立されたＨＯ１４１（Osada and Beppu, Agric. Biol. Chem., 1985）が挙げられる。
大腸菌としてはさらに、λＤＥ３遺伝子を有する大腸菌株にはさらにＴ７リゾチーム遺伝子を有するプラスミドｐＬｙｓＳを導入した大腸菌、例えば、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＪＭ１０９（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｔｏｐ１０（ＤＥ３ｐＬｙｓＳ）、およびＪＥ１０１１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳを用いることができる。Ｔ７リゾチームは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼに結合して転写を抑制するため、非誘導時に目的タンパク質の発現レベルを低下させることができる。
【００３６】
（Ａ）において、大腸菌株Ｔｏｐ１０とLong-TorAシグナル配列との組合せ、大腸菌株ＪＭ１０９株とShort-TorAシグナル配列との組合せ、および大腸菌株ＨＯ１４１株とLong-TorAシグナル配列との組合せが、有利に用いられ得る。｛本発明では、大腸菌株Ｔｏｐ１０とLong-TorAシグナル配列との組合せ、大腸菌株ＪＭ１０９株とShort-TorAシグナル配列との組合せ、および大腸菌株ＨＯ１４１株とLong-TorAシグナル配列との組合せからなる群から選択される組合せの、上記方法を実施するための使用が提供される。｝
【００３７】
（Ｂ）について
（Ｂ）では、液体培地または固形培地で培養した大腸菌を用いることができる。これらの大腸菌では、ＴｏｒＡシグナル配列によりｔａｔ経路が機能し、蛍光インジケーターまたはその改変体は、大腸菌のペリプラズムに蓄積する。蛍光インジケーターが依存する化合物を接触させると、蛍光インジケーターと当該化合物は、ペリプラズムにおいて反応する。
化合物は、低分子量（例えば、６００ダルトン以下、５００ダルトン以下、または４００ダルトン以下）であると外膜を透過して外部からペリプラズムに浸透しやすい。従って、化合物は、低分子量であることが好ましい。
化合物は、蛍光インジケーターにおいてその蛍光強度を変化させる化合物とすることができる。好ましい態様では、（Ｂ）において、蛍光は共焦点顕微鏡で観察することができる。
固形培地で培養した大腸菌を共焦点顕微鏡で観察する場合には、固形培地は、共焦点顕微鏡の対物レンズの作動距離（ＷＤ）が培地の厚みよりも大きいもの（例えば、３ｍｍ以上、４ｍｍ以上、または５ｍｍ以上）を用い、固形培地は、薄く（例えば、１〜３ｍｍ）して用いることができる。
【００３８】
大腸菌を固形培地で培養すると、大腸菌は培地上でコロニーを形成する。コロニーは単一のクローンからなる。大腸菌コロニーは、アルコール滅菌や加熱滅菌した白金耳や楊子等でつついて、液体培地に懸濁することができ、このようにすることで単一クローンからなる大腸菌をさらに増殖させることができる。例えば、好ましい性質を示す大腸菌コロニーを増殖させて、その後、その好ましい性質の原因となっているタンパク質をコードするＤＮＡをクローニングしたり、配列を決定したりすることができる。
ある好ましい態様では、例えば、（Ａ）において、化合物依存性に蛍光強度を変化させる様々な蛍光インジケーター候補が導入されたタンパク質発現ベクターのプールを得て、これを大腸菌に形質転換して固形培地上で培養すると、コロニー毎に異なる蛍光インジケーター候補を発現し得る。
例えば、大腸菌を液体培地で培養する場合には、１つの培地で１種の大腸菌を培養することができる。
ある好ましい態様では、例えば、（Ａ）と（Ｂ）の間で、第一の発現ベクターで形質転換した大腸菌を固形培地の一領域に播種し、別の第二の発現ベクターで形質転換した大腸菌を固形培地の別の一領域に播種することを含んでいてもよい。
【００３９】
（Ｃ）について
（Ｃ）では、（Ｂ）で化合物と化合物依存性に蛍光強度を変化させる蛍光インジケーター候補分子や化合物依存性に蛍光強度を変化させる蛍光インジケーターの改変体とを接触させた場合に、蛍光強度が変化する大腸菌を選択する。
例えば、（Ａ）において、化合物依存性に蛍光強度を変化させる様々な蛍光インジケーター候補が導入されたタンパク質発現ベクターのプールを得て、これを大腸菌に形質転換して固形培地上で培養すると、蛍光強度が化合物依存的に大きく変化するコロニーから変化しないコロニーまで様々なコロニーが得られる。所望のコロニー（例えば、蛍光強度が化合物依存的に大きく変化するコロニー）を選択することができる。コロニーは、共焦点顕微鏡を用いて観察することができる。
大腸菌コロニーは、例えば、アルコール滅菌や加熱滅菌した白金耳や楊子等でつついて、液体培地に懸濁することができ、その後培養することで、単一クローンからなる大腸菌をさらに増殖させることができる。例えば、好ましい性質を示す大腸コロニーを増殖させて、その後、その好ましい性質の原因となっているタンパク質をコードするＤＮＡをクローニングしたり、配列を決定したりすることができる。
例えば、（Ｂ）において大腸菌を液体培地で培養する場合は、蛍光強度が化合物依存的に大きく変化する大腸菌を含む培地から変化しない大腸菌を含む培地までの様々な培養物が得られる。好ましい性質を示す大腸菌を含む培養物を十分に増殖させて、その好ましい性質の原因となっているタンパク質をコードするＤＮＡをクローニングしたり、配列を決定したりすることができる。
【００４０】
このようにすることで、化合物依存性に蛍光強度を変化させる蛍光インジケーターをスクリーニングすることができる。また、必要に応じて、その蛍光インジケーターのアミノ酸配列またはそれをコードする核酸配列を得ることができる。
【００４１】
本発明のある態様では、（Ａ）において、大腸菌株Ｔｏｐ１０とLong-TorAシグナル配列との組合せ、および大腸菌株ＪＭ１０９株とShort-TorAシグナル配列との組合せが、有利に用いられ、（Ｂ）において、固形培地に形成させた大腸菌コロニーを共焦点顕微鏡を用いて観察することができる。
【００４２】
本発明の別の側面では、蛍光インジケーターの蛍光強度を増強する化合物のスクリーニング方法であって、
（α）蛍光インジケーターにペリプラズム移行シグナル配列(具体的にはＴｏｒＡシグナル配列)を連結させたタンパク質を発現可能に含むタンパク質発現ベクターを大腸菌に形質転換することと、
（β）前記タンパク質をペリプラズムに発現した大腸菌と被験化合物とを接触させることと、
（γ）蛍光インジケーターの蛍光強度を変化させる被験化合物を選択することと｛ここで好ましくは、蛍光インジケーターからの蛍光は共焦点顕微鏡を用いて観察する｝
を含む、方法が提供される。
【００４３】
（α）では、（Ａ）で説明したのと同じ、蛍光インジケーター、タンパク質発現ベクターおよび大腸菌を用いることができる。
【００４４】
（β）では、（Ｂ）で説明した化合物を被験化合物として用いることができる。通常は、液体培地で培養および接触が行われるが、固形培地上で形成させたコロニーと被験化合物とを接触させることにより行ってもよい。コロニーは、共焦点顕微鏡を用いて観察することができる。
【００４５】
（γ）では、蛍光インジケーターの蛍光強度を変化させる被験化合物を選択することができる。
【００４６】
本発明のある態様では、（α）において、大腸菌株Ｔｏｐ１０とLong-TorAシグナル配列との組合せ、および大腸菌株ＪＭ１０９株とShort-TorAシグナル配列との組合せが、有利に用いられ、（β）において、固形培地に形成させた大腸菌コロニーを共焦点顕微鏡を用いて観察することができる。
【００４７】
本発明の別の側面では、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）または生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）を利用して、２つのタンパク質の相互作用を変化させる化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）相互作用する任意の二つのタンパク質それぞれにＦＲＥＴまたはＢＲＥＴのドナータンパク質およびアクセプタータンパク質を連結させたタンパク質に対し、それぞれにペリプラズム移行シグナル配列(具体的にはＴｏｒＡシグナル配列)をさらに付加して融合タンパク質を得ることと、
（ｂ）２つの融合タンパク質をペリプラズムに発現する大腸菌を得ることと、
（ｃ）大腸菌と被験化合物とを接触させることと｛ここで好ましくは、蛍光タンパク質からの蛍光は共焦点顕微鏡を用いて観察する｝、
を含み、
接触により、ＦＲＥＴまたはＢＲＥＴのドナータンパク質およびアクセプタータンパク質の蛍光強度に変化が生じた場合には、被験化合物は、２つのタンパク質の相互作用を変化させるものであることが示される、方法が提供される。
【００４８】
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を利用して、２つのタンパク質の相互作用を評価することが広く一般的に行われている。ＦＲＥＴでは、タンパク質Ａにドナータンパク質を連結し、タンパク質Ｂにアクセプタータンパク質を連結して、ドナータンパク質を励起し、アクセプタータンパク質の蛍光を測定することにより、タンパク質ＡとＢとの相互作用の有無および程度を評価することができる。
【００４９】
（ａ）について
本発明では、タンパク質Ａにドナータンパク質を連結し、タンパク質Ｂにアクセプタータンパク質を連結して、ドナータンパク質を励起し（ＦＲＥＴ）、またはドナータンパク質を発光させ（ＢＲＥＴ）、アクセプタータンパク質の蛍光を測定することにより、タンパク質ＡとＢとの相互作用を評価することができる。
【００５０】
それぞれの連結タンパク質に、ＴｏｒＡシグナル配列を付加して、（Ａ）と同じように発現ベクターに発現可能に組込み、得られたベクターを大腸菌に形質転換することができる。２つの連結タンパク質は、同一の大腸菌細胞内に発現するように形質転換することができればよい。２つの連結タンパク質は、１つのタンパク質発現ベクターにポリシストロニックに組込まれていてもよいし、モノシストロニックに組込まれていてもよい。２つの連結タンパク質は、２つのタンパク質発現ベクターにそれぞれ別々に発現可能に組込まれていてもよい。ある態様では、２つの連結タンパク質は、１つのタンパク質発現ベクターにポリシストロニックに組込まれ得る。例えば、図８に示されるように、ＴｏｒＡシグナル−ドナータンパク質−タンパク質ＡとTorAシグナル−アクセプタータンパク質−タンパク質Ｂとを一つのベクターに組込むことができる。
【００５１】
ＦＲＥＴを生じる蛍光タンパク質の組合せとしては、特に限定されないが例えば、シアン蛍光タンパク質と黄色又は赤色蛍光タンパク質との組合せ、または、緑色又は黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）と赤色蛍光タンパク質の組合せ（例えばＣｌｏｖｅｒとｍＲｕｂｙ２との組合せ）が用いられ得る。上記組合せにおいて、ＹＦＰの代わりに、ＶｅｎｕｓおよびＹｐｅｔなどのＹＦＰ改変体を用いることもできる。
ＢＲＥＴを生じる生物発光タンパク質と蛍光タンパク質の組合せとしては、特に限定されないが例えば、ルシフェラーゼと緑色、赤色、青色若しくは黄色蛍光タンパク質またはこれらの機能的改変体との組合せが挙げられる。
【００５２】
（ａ）では、大腸菌株Ｔｏｐ１０とLong-TorAシグナル配列との組合せ、大腸菌株ＪＭ１０９株とShort-TorAシグナル配列との組合せ、および大腸菌株ＨＯ１４１株とLong-TorAシグナル配列との組合せが、有利に用いられ得る。｛本発明では、大腸菌株Ｔｏｐ１０とLong-TorAシグナル配列との組合せ、大腸菌株ＪＭ１０９株とShort-TorAシグナル配列との組合せ、および大腸菌株ＨＯ１４１株とLong-TorAシグナル配列との組合せからなる群から選択される組合せの、上記方法を実施するための使用が提供される。｝
【００５３】
（ｂ）について
２つの連結タンパク質がペリプラズムに発現することは、顕微鏡で蛍光を観察することにより確認しうる。
【００５４】
（ｃ）について
（ｃ）では、（Ｂ）で説明した化合物を被験化合物として用いることができる。通常は、液体培地で培養および接触が行われるが、固形培地上で形成させたコロニーと被験化合物とを接触させることにより行ってもよい。コロニーは、共焦点顕微鏡を用いて観察することができる。
【００５５】
ＦＲＥＴまたはＢＲＥＴの検出は、当業者に周知の方法により行うことができる。ＦＲＥＴは、ドナータンパク質を励起して得られる蛍光スペクトルを被験化合物の添加前後で比較することにより検出することができる。ＢＲＥＴは、ドナータンパク質に対する基質を添加して得られる蛍光スペクトルを被験化合物の添加前後で比較することにより検出することができる。ＦＲＥＴまたはＢＲＥＴはまた、ドナータンパク質を励起またはその基質を添加して得られる蛍光の強度を被験化合物の添加前後で比較することにより検出することができる。
【００５６】
２つの連結タンパク質が、化合物非存在下で相互作用するものである場合には、その相互作用をさらに強化する被験化合物（ＦＲＥＴ効率またはＢＲＥＴ効率が増大する）、またはその相互作用を遮断する（ＦＲＥＴ効率またはＢＲＥＴ効率が減少する）被験化合物を得ることができる。
【００５７】
２つの連結タンパク質が、化合物非存在下では相互作用しないものである場合は、相互作用を発生させる被験化合物（ＦＲＥＴ効率またはＢＲＥＴ効率が増大する）を得ることができる。
【００５８】
本発明のある態様では、（ａ）において、大腸菌株Ｔｏｐ１０とLong-TorAシグナル配列との組合せ、大腸菌株ＪＭ１０９株とShort-TorAシグナル配列との組合せ、および大腸菌株ＨＯ１４１株とLong-TorAシグナル配列との組合せが、有利に用いられ、（ｂ）において、固形培地に形成させた大腸菌コロニーを共焦点顕微鏡を用いて観察することができる。
【００５９】
本発明の別の側面では、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）または生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）を利用して、タンパク質のコンフォメーションを変化させる化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ’）分子内でＦＲＥＴまたはＢＲＥＴを生じる蛍光インジケーターにペリプラズム移行シグナル配列(具体的にはＴｏｒＡシグナル配列)が連結されたタンパク質を発現可能に含むタンパク質発現ベクターを大腸菌に形質転換することと、
（ｂ’）得られたタンパク質をペリプラズムに発現する大腸菌と被験化合物とを接触させることと、
を含み、
接触により、ＦＲＥＴ効率またはＢＲＥＴ効率に変化が生じた場合には、被験化合物は、タンパク質のコンフォメーションを変化させるものであることが示される、方法｛ここで好ましくは、蛍光インジケーターからの蛍光は共焦点顕微鏡を用いて観察する｝が提供される。
【００６０】
（ａ’）について
分子内でＦＲＥＴまたはＢＲＥＴを生じる蛍光インジケーターはそれぞれ、１分子型ＦＲＥＴバイオセンサーまたは１分子型ＢＲＥＴバイオセンサーと呼ばれている。１分子型ＦＲＥＴバイオセンサーは、ドナー蛍光タンパク質と、アクセプター蛍光タンパク質と、センサータンパク質と、リガンドタンパク質、およびセンサータンパク質とリガンドタンパク質とを連結するリンカーとが連結した融合タンパク質であり得る。１分子型ＢＲＥＴバイオセンサーは、ドナー発光タンパク質と、アクセプター蛍光タンパク質と、センサータンパク質と、リガンドタンパク質、およびセンサータンパク質とリガンドタンパク質とを連結するリンカーとが連結した融合タンパク質であり得る。
センサータンパク質は、リガンドタンパク質と相互作用することが知られているタンパク質であるか、あるいは、何らかの条件下でリガンドタンパク質と相互作用することが知られているタンパク質であり得る。
１分子型ＦＲＥＴバイオセンサーでは、センサータンパク質部分とリガンドタンパク質部分とが相互作用すると、相互作用依存的にドナー蛍光タンパク質と、アクセプター蛍光タンパク質とが近接し、ＦＲＥＴを生じる構成となっている。
１分子型ＦＲＥＴは、上記（ａ）において、タンパク質Ａとドナータンパク質との連結タンパク質と、タンパク質Ｂとアクセプタータンパク質との連結タンパク質とを、リンカーで連結することにより得ることができる。
【００６１】
リンカーは、可動能の高いペプチドで構成され得、例えば、グリシンとセリンとアラニンとからなる群から選択される少なくとも１つ、２つまたは３つを含む、ペプチドとするとよいことが知られている。
【００６２】
１分子型ＦＲＥＴバイオセンサーの例としては、特に限定されないが、ＩＲＩＳ、Ｒａｉｃｈｕ−Ｒａｓ、Ｐｒｉｎ−ｃ−Ｒａｆ、カメレオン、ＴＮ−ＸＬなどのバイオセンサーが挙げられる。
【００６３】
本発明のある態様では、（ａ’）において、大腸菌株Ｔｏｐ１０とLong-TorAシグナル配列との組合せ、大腸菌株ＪＭ１０９株とShort-TorAシグナル配列、およびおよび大腸菌株ＨＯ１４１株とLong-TorAシグナル配列との組合せとの組合せが、有利に用いられ得る。｛本発明では、大腸菌株Ｔｏｐ１０とLong-TorAシグナル配列との組合せ、大腸菌株ＪＭ１０９株とShort-TorAシグナル配列との組合せ、および大腸菌株ＨＯ１４１株とLong-TorAシグナル配列との組合せからなる群から選択される組合せの、上記方法を実施するための使用が提供される。｝
【００６４】
（ｂ’）について
（Ｂ）で説明した化合物を被験化合物として用いることができる。通常は、液体培地で培養および接触が行われるが、固形培地上で形成させたコロニーと被験化合物とを接触させることにより行ってもよい。コロニーは、共焦点顕微鏡を用いて観察することができる。
【００６５】
本発明の別の側面では、化合物依存性に蛍光強度を変化させる蛍光インジケーターをペリプラズムに発現する、組換え大腸菌が提供される。このような大腸菌は、上記（Ａ）に説明されるように、蛍光インジケーターにＴｏｒＡシグナル配列を連結させたタンパク質を発現可能に含むタンパク質発現ベクターを大腸菌に形質転換することにより得ることができる。
【００６６】
本発明の別の側面では、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を生じる２つのタンパク質をペリプラズムに発現する、組換え大腸菌が提供される。このような大腸菌は、上記（ａ）および（ｂ）に説明されるように、タンパク質Ａにドナータンパク質を連結したタンパク質と、タンパク質Ａと相互作用するタンパク質Ｂにアクセプタータンパク質を連結したタンパク質をコードする核酸をそれぞれ調製し、ＴｏｒＡシグナル配列を付加して、（Ａ）と同じように発現ベクターに発現可能に組込み、得られたベクターを大腸菌に形質転換することができる。
このような大腸菌は、蛍光強度を変化させる化合物を検出またはスクリーニングすることに用いることができる。従って、本発明では、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を生じる２つのタンパク質をペリプラズムに発現する、組換え大腸菌を含む組成物であって、蛍光強度を変化させる化合物を検出またはスクリーニングすることに用いるための組成物が提供される。
【００６７】
２つの連結タンパク質は、同一の大腸菌細胞内に発現するように形質転換することができればよい。２つの連結タンパク質は、１つのタンパク質発現ベクターにポリシストロニックに組込まれていてもよいし、モノシストロニックに組込まれていてもよい。２つの連結タンパク質は、２つのタンパク質発現ベクターにそれぞれ別々に発現可能に組込まれていてもよい。ある態様では、２つの連結タンパク質は、１つのタンパク質発現ベクターにポリシストロニックに組込まれ得る。
このような大腸菌は、ＦＲＥＴ効率またはＢＲＥＴ効率を変化させる化合物を検出またはスクリーニングすることに用いることができる。従って、本発明では、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）または生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）を生じる２つのタンパク質をペリプラズムに発現する、組換え大腸菌を含む組成物であって、ＦＲＥＴ効率またはＢＲＥＴを変化させる化合物を検出またはスクリーニングすることに用いるための組成物が提供される。
【００６８】
本発明のある態様では、（ａ’）において、大腸菌株Ｔｏｐ１０とLong-TorAシグナル配列との組合せ、大腸菌株ＪＭ１０９株とShort-TorAシグナル配列との組合せ、および大腸菌株ＨＯ１４１株とLong-TorAシグナル配列との組合せが、有利に用いられ、（ｂ’）において、固形培地に形成させた大腸菌コロニーを共焦点顕微鏡を用いて観察することができる。
【００６９】
本発明の別の側面では、大腸菌のペリプラズムに蛍光インジケーターを発現させ、蛍光強度を変化させる化合物を検出またはスクリーニングすることに用いるための組成物であって、ペリプラズム移行シグナル配列(具体的にはＴｏｒＡシグナル配列)と蛍光インジケーターとの連結タンパク質をコードする核酸を発現可能に含むタンパク質発現ベクターを含む、組成物が提供される。
ペリプラズム移行シグナル配列(具体的にはＴｏｒＡシグナル配列)と蛍光インジケーターとの連結タンパク質をコードする核酸を発現可能に含むタンパク質発現ベクターは、上記（Ａ）または（ａ）に記載されるように作製することができる。
【００７０】
下記実施例に示されるように大腸菌株Ｔｏｐ１０は、Long-TorAシグナル配列を有するタンパク質を極めて効率良くペリプラズムに移行させることができた。また、大腸菌株ＪＭ１０９株は、Short-TorAシグナル配列を有するタンパク質を極めて効率良くペリプラズムに移行させることができた。従って、上記全ての発明において、特に限定されないが、大腸菌株Ｔｏｐ１０とLong-TorAシグナル配列との組合せ、大腸菌株ＪＭ１０９株とShort-TorAシグナル配列との組合せ、および大腸菌株ＨＯ１４１株とLong-TorAシグナル配列との組合せが、有利に用いられ得る。｛本発明では、大腸菌株Ｔｏｐ１０とLong-TorAシグナル配列との組合せ、大腸菌株ＪＭ１０９株とShort-TorAシグナル配列との組合せ、および大腸菌株ＨＯ１４１株とLong-TorAシグナル配列との組合せからなる群から選択される組合せの、上記方法を実施するための使用が提供される。｝
【００７１】
本発明のある態様では、図６Ｂに示されるように、相互作用する２つのタンパク質ＸおよびＹに対してそれぞれ、蛍光タンパク質の一部を連結させ、ＸとＹとが結合すると、蛍光タンパク質が再構成されて蛍光を発する系を用いることもできる。この態様は、ＦＲＥＴ（図６Ａ）においてドナータンパク質とアクセプタータンパク質を、再構成されると蛍光タンパク質になる蛍光タンパク質の一部に置き換えた態様であると言える。この態様では、例えば、ＧＦＰを用いることができる。ＧＦＰのアミノ酸番号１〜１９３（ＧＦＰ１−９）と、ＧＦＰのアミノ酸番号１９４−２１２（ＧＦＰ１０）と、ＧＦＰのアミノ酸番号２１３−２３３）とを断片に分け、ＧＦＰ１０とＧＦＰ１１にそれぞれＸとＹとを連結させると、ＧＦＰ１−９の存在下で、ＧＦＰ１０−ＸとＧＦＰ１１−Ｙとが会合してＧＦＰを再構成し、蛍光を発するようになる（Cabantous et al., Scientific Reports 3, article number :2854, 2013）。
【００７２】
また、下記実施例に示されるように、大腸菌のペリプラズムは、共焦点顕微鏡を用いて観察したときに顕著に良好に蛍光を検出することができる。従って、上記全ての発明において、特に限定されないが、大腸菌のペリプラズムに発現した蛍光インジケーターの蛍光は共焦点顕微鏡を用いて、有利に検出されうる。
共焦点顕微鏡を用いる場合、固形培地上を複数の領域に区画し、それぞれの区画において異なる大腸菌コロニーを観察することができる。これにより、１つの固形培地上で複数の大腸菌の観察が可能となり、スクリーニングが高速化される。
【実施例】
【００７３】
実施例１：大腸菌ペリプラズムにおける蛍光インジケーターの発現モデル
本実施例では、大腸菌のペリプラズムに蛍光インジケーターを発現させたモデルを作製した。
【００７４】
大腸菌としては、Ｔｏｐ１０株、ＪＭ１０９（ＤＥ３）株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株、およびＢＬ２１コドンプラス株を用いた。
【００７５】
（１）蛍光インジケーター発現ベクターの調製
蛍光インジケーターをペリプラズムに移行させるシグナルとしては、表１に示されるＴｏｒＡシグナル配列（Short TorAまたはLong TorA）を用いた。
【００７６】
【表１】
2018191565.tif 000002
表中、下線は、Short-TorAとLong-TorAとの配列の相違箇所に付されている。
【００７７】
表１のＴｏｒＡシグナル配列（Short TorA）は、大腸菌株ＤＨ５αのゲノムＤＮＡを鋳型として下記プライマーを用いてＰＣＲ法で増幅して得た。
プライマーセット１
Fw: 5'-ATCCCATGGGTATGGCGAATAACGATCTCTTTCAG-3'（配列番号３）
Rv: 5'-ATCGCTAGCCATACCATGATGATGATGATGATGAGACGCCGCTTGCGCCGCAGTCGC-3'（配列番号４）
プライマーセット２
Fw: 5'-GGAATTAACATATGGGTATGGCGAATAACGATC-3'（配列番号５）
Rv: 5'-ATCGCTAGCCATACCATGATGATGATGATGATGAGACGCCGCTTGCGCCGCAGTCGC-3'（配列番号６）
【００７８】
プライマーセット１によるPCR産物を制限酵素NcoIとNheIとで切断し、断片をpBAD/His-Aベクター（Invitrogen, USA）のNcoI-NheI切断部位に挿入した。得られたベクターをpBAD-Short-TorAと命名した。
【００７９】
次に、プライマーセット２によるPCR産物を制限酵素NcoIとNheIとで切断し、断片をpRSETAベクター（Invitrogen, USA）のNcoI-NheI切断部位に挿入した。得られたベクターをpRSET-Short-TorAと命名した。
【００８０】
Long-TorAは、pBAD-TorAを鋳型としてプライマーセット３を用いたPCRによって得た。
プライマーセット３
Fw: 5'-GCGATGCCATGGGTTTAAAGAGGAGAAAGGTCATGAACAATAACGATCTCTTTCAGGCATC-3'（配列番号７）
Rv: 5'-CTACCATCGGCGCTACGGCG-3'（配列番号８）
得られたPCR産物をNcoIとEcoRIで切断し、断片をpBAD/His-AベクターのNcoI-EcoRI切断部位に挿入した。得られたベクターをpBAD-Long-TorAと命名した。
【００８１】
次に、pBAD-Long-TorAを鋳型として、プライマーセット４を用いたPCRによって得られた産物をNheIとEcoRIとで切断し、pRSETAベクターのNheI-EcoRI切断部位に導入して、pRSET-Long-TorAを得た。
プライマーセット４
Fw: 5'-GGAATTAACATATGGTTTAAAGAGGAGAAAGGTC-3'（配列番号９）
Rv: 5'-CTACCATCGGCGCTACGGCG-3'（配列番号１０）
【００８２】
上記で得られたpBAD-Long-TorA、pBAD-Short-TorA、pRSET-Long-TorAおよびpRSET-Short-TorAそれぞれに、GCaMP6sを導入した。GCaMP6sは、pGP-CMV-GCaMP6s（Addgene, USA）を鋳型とし、プライマーセット５を用いたPCRによる産物として得た。
プライマーセット５
Fw: 5'-CACCAAAATCAACGGGACTTTCC-3'
Rv: 5'-ATCGAATTCTCACTTCGCTGTCATCATTTG-3'
得られたPCR産物をNheIとEcoRIとで切断し、pBAD-Long-TorA、pBAD-Short-TorA、pRSET-Long-TorAおよびpRSET-Short-TorAのNheI-EcoRI切断部位に導入して、TorAシグナル配列が付加されたGCaMP6s発現ベクターをそれぞれ得た。得られた発現ベクターをそれぞれLong-TorA GCaMP6s/pBAD、Short-TorA GCaMP6s/pBAD、Long-TorA GCaMP6s/pRSET、Short-TorA GCaMP6s/pRSETと命名した。
【００８３】
（２）蛍光インジケーターの発現
Ｔｏｐ１０株、ＪＭ１０９（ＤＥ３）株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株、およびＢＬ２１コドンプラス株に得られた発現ベクターそれぞれを形質転換した。pRSETベースの発現ベクターを形質転換した大腸菌は、発現誘導剤を用いずにアンピシリンを含むＬＢプレート上で培養し、Long-TorA GCaMP6sとShort-TorA GCaMP6sを発現させた。pBADベースのベクターを形質転換した大腸菌は、Ｌ−アラビノース（０．０４％）存在下でアンピシリンを含むＬＢプレート上で培養し、Long-TorA GCaMP6sとShort-TorA GCaMP6sを発現させた。
【００８４】
プレートから大腸菌コロニーを選択し、２ｍＭ塩化カルシウム水溶液または２ｍＭエチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）水溶液に懸濁し、その後、大腸菌一つ一つについてGCaMP6sからの蛍光を１００×油浸対物レンズ（UPlanSAPO NA1.42）、４７３ｎｍレーザーダイオードレーザー、ダイクロイックミラー（４０５／４７３）、冷却ＧａＡｓｐ−増光管（ＰＭＴ）を装着した共焦点顕微鏡FV1200（Olympus, Japan）を用いて観察した。
すなわち、実施例１では、大腸菌株４種×プラスミド２種×カルシウム添加またはＥＧＴＡ添加の全ての組合せ（１６通り）を実施した。
【００８５】
結果は、図２に示される通りであった。図２に示されるように、いずれのＴｏｒＡシグナルを付加した場合でも、蛍光が観察され、また、“Ｃ”（カルシウム添加）における蛍光強度が“Ｅ”（ＥＧＴＡ添加）における蛍光強度よりも高いことから、ペリプラズムでＧＣａＭＰ６ｓ蛍光インジケーターが発現し、蛍光を発したことが明らかとなった。なお、ＴｏｒＡシグナルを付加しないＧＣａＭＰ６ｓ蛍光インジケーターによる蛍光は、本測定系では検出限界以下であった。
【００８６】
図２Ａに示されるように、大腸菌株Ｔｏｐ１０にLong-TorAシグナルを付加したタンパク質を発現した場合に蛍光強度が特に高く、カルシウム水溶液中で蛍光強度が991.8 ± 251.8 (n = 13)であり、ＥＧＴＡ水溶液中で蛍光強度が201.5 ± 19.9 (n = 10)であり、蛍光強度比は、4.9であった。また、大腸菌株ＪＭ１０９（ＤＥ３）株にShort-TorAシグナルを付加したタンパク質を発現した場合に蛍光強度が特に高く、カルシウム水溶液中で蛍光強度が1305.5 ± 226.8 (n = 12)であり、ＥＧＴＡ水溶液中で蛍光強度192.3 ± 42.6 (n = 12)であり、蛍光強度比は、6.8であった。
その他の組合せでは、検出が困難である場合はあったものの、いずれの場合でもペリプラズムへのＧＣａＭＰ６ｓの移行が確認された。
次に、疎水性化合物への感受性が高い変異型ＬＰＳ大腸菌株ＨＯ１４１（Osada and Beppu, Agric. Biol. Chem., 1985）を用いて、上述と同様の実験を行い、蛍光強度を測定した。その結果、大腸菌株ＨＯ１４１では、Long-TorAシグナルを付加したタンパク質を発現した場合に蛍光強度が高く、特にpBADを骨格とするベクターで発現させたときに非常に高い蛍光強度を示すことが確認された（図２Ｂ）。
【００８７】
実施例２：測定方法の比較と検証
本実施例では、３つの測定系の検出力の比較を行った。
【００８８】
１０ｃｍディッシュに６ｍＬの寒天培地を加え、３ｍｍ以下の厚みを有する固形寒天培地を調製した。実施例１に記載の通りに大腸菌株ＪＭ１０９（ＤＥ３）にShort-TorAシグナルを付加したＧＣａＭＰ６ｓを導入し、得られた大腸菌を作成した固形寒天培地に播種した。コロニーが得られたら、コロニーを蛍光イメージ解析装置ＬＡＳ３０００（FUJIFILM, Japan）、蛍光ステレオ顕微鏡ＳＺＸ１６（Olympus, Japan）および共焦点顕微鏡ＦＶ１２００（Olympus, Japan）を用いて観察し、得られた像を比較した。
観察は、図３Ａに示されるスキームに従って行った。まず、コロニーを未処理状態で蛍光観察し（処理前）、次いでカルシウムイオンを添加してＧＣａＭＰ６ｓの蛍光を活性化させて蛍光を観察し（Ｃａ2+添加）、さらにＥＧＴＡを添加してＧＣａＭＰ６ｓの蛍光を不活性化させて蛍光を観察した（ＥＧＴＡ添加）。いずれの場合も、蛍光の観察は、カルシウムイオンまたはＥＧＴＡ水溶液の添加から１分後に行った。
ＬＡＳ３０００は、青色ＬＥＤ（４６０ｎｍ）、エミッションフィルター（Ｙ５１５Ｄｉ）およびスーパーＣＣＤを備え、露光時間は２秒とし、イメージリーダーＬＡＳ３０００ソフトウェアで画像を取得した。
ＳＺＸ１６は、０．５×対物レンズ（SDF PLAPO 0.5XPF, WD 70.5 mm, NA0.075）、0.7. GFPHQフィルターユニット（Ex:BP460-480, Em:BA495-540）、冷却ＣＣＤカメラORCA-R2（HAMAMATSU, Japan）およびキセノンランプを備えた。露光時間は２秒とし、cellSens Dimension software（Olympus, Japan）を用いて画像を取得した。
ＦＶ１２００は、１．２５×対物レンズ（PLAPON NA0.04, WD = 5 mm, FN26.5）、４７３ｎｍレーザーダイオードレーザー、ダイクロイックミラー（４０５／４７３）、冷却ＧａＡｓｐ−増光管を備えた。ピンホールサイズは８０μｍとした。アガープレート上の大腸菌コロニーを観察するため、Olympusによるカスタムメイドのアダプターを顕微鏡に装着して観察した。スキャンスピードは、４μｓ／ピクセルとした。蛍光シグナルは、標準的なＰＭＴ（Ex: 473 nm, step width = 2 nm, range = 495〜575 nm）を用いて検出した。画像は、FLUOVIEW software (Olympus, Japan)を用いて取得した。
画像解析は、MetaMorph (Molecular devices, USA), ImageJ, Igor Pro (WaveMetrics)等を用いて行った。
【００８９】
結果は、図３Ｂに示される通りであった。図３Ｂに示されるように、ＬＡＳ３０００およびＳＺＸ１６で観察したイメージはぼやけて見えた。これに対して、共焦点顕微鏡像によれば、明確なイメージが観察された（図３Ｂ）。
【００９０】
蛍光比（Ca2+/EGTA）を求めたところ、図３Ｃに示されるように、共焦点顕微鏡を用いた場合に蛍光比が非常に良好であり、シグナルノイズ比（Ｓ／Ｎ比）は3.81±0.51（n=16）であった。
【００９１】
実施例３：低分子量化合物のペリプラズムでの検出
本実施例では、大腸菌の外膜（outer membrane）からペリプラズムに低分子量化合物が透過するかを確認した。具体的には、本実施例では、４２０ダルトンのイノシトール三リン酸（ＩＰ3）が外膜を透過してペリプラズムに到達することを確認した。
【００９２】
大腸菌株ＪＭ１０９（ＤＥ３）にmCherry-m49/pRSET-TorAまたはmCherry-m30/pRSET-TorAを形質転換し、ＬＢ培地で１８℃で５〜６日培養し、mCherry-m49またはmCherry-m30をペリプラズムに発現させた。mCherry-m49は、ＩＰ3に対するＫｄ値が０．０９２ｎＭであり、ＩＰ3に極めて高い親和性を有する。mCherry-m30は、陰性対照である。
【００９３】
［Ｈ3］−ＩＰ3（PerkinElmer Life Sciences, USA）を最終濃度４．８ｎＭとなるように上記大腸菌を含む培養液に添加し、４℃で１０分間インキュベートしてから培養液を遠心分離して大腸菌を回収した。細胞をＰＢＳで洗浄し、大腸菌に取り込まれなかったＩＰ3を除去した。その後、大腸菌を懸濁緩衝液（50 mM Tris-HCl (pH8.0), 10 mM EDTA and 100 μg/ml RNaseA）と溶解緩衝液（200 mM NaOH and 1% SDS）とで溶解して分析した。ＩＰ3の検出は、トリチウムのカウントにより行った。
【００９４】
結果は図４に示される通りであった。図４のパネルＡに示されるように、mCherry-m49を発現させた大腸菌では、ＩＰ3が大腸菌の溶解液から検出された（126.0 ± 47.8 dpm, n = 3）。また、mCherry-m30を発現させた大腸菌では、ＩＰ3が大腸菌の溶解液から検出されなかった。この結果は、ペリプラズムでmCherry-m49がＩＰ3を捕捉し、ＩＰ3を大腸菌内に留めたことを示す。すなわち、ＩＰ3は大腸菌の外膜を透過してペリプラズムに到達し得ることが明らかである。
【００９５】
実施例５：ペリプラズムでのＦＲＥＴの検出
本実施例では、ＩＰ3と結合すると蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を示すＩＲＩＳ蛍光プローブを用いてペリプラズムで低分子量化合物の存在をＦＲＥＴで検出するモデル系を構築した。
【００９６】
ＩＲＩＳは、２つの蛍光タンパク質ＶｅｎｕｓおよびＥＣＦＰとがＩ型ＩＰ3受容体で連結された蛍光タンパク質であり、ＩＰ3非存在下では、ＥＣＦＰを励起するとＦＲＥＴが生じてＶｅｎｕｓの５２５ｎｍの蛍光を生じるが、ＩＰ3存在下では、ＦＲＥＴが起こらずＶｅｎｕｓからの蛍光が弱くなる性質を有しており、ＩＰ3の検出や濃度測定に用い得る。
本実施例では、T. Matu-ura et al., J Cell Biol., 173: 755-765, 2006に記載されたＩＲＩＳ−１とそのドミナントネガティブ変異体（ＩＲＩＳ−Ｄｍｕｔ）を用いてペリプラズムでのＩＰ3の検出を試みた。
【００９７】
TorAシグナル付加ＩＲＩＳ−１を大腸菌株ＪＭ１０９（ＤＥ３）に形質転換し、上記の通りにＦＶ１２００共焦点顕微鏡を用いて観察した。次いで、１０μＭのＩＰ3またはＩＰ4処理をして、１分後に蛍光を測定した。ＩＲＩＳの蛍光は、４４０ｎｍレーザーダイオードレーザー、ダイクロイックミラー（ＤＭ４０５−４４０を用いて観察された。
共焦点顕微鏡には、２つのＰＭＴを設置して、１つの検出波長を４８０〜５１１ｎｍとし、もう１つの検出波長を５１１〜６１１ｎｍとした。スキャンスピードは、４μｓ／ピクセルとした。蛍光スペクトルの測定をする際には、標準的ＰＭＴ（Ex: 440 nm, step width = 2 nm, range = 475〜546 nm）を用いた。画像は、FLUOVIEW software (Olympus, Japan)を用いて取得した。ＥＣＦＰの蛍光シグナルとＶｅｎｕｓの蛍光シグナルの比を、ＩＰ3の添加の前後で比較した。
【００９８】
結果は、図４のパネルＢに示される通りであった。図４のパネルＢに示されるように、ＩＰ3の添加により、ＥＣＦＰの蛍光シグナルとＶｅｎｕｓの蛍光シグナルの比が、増大することが分かった。すなわち、ＩＲＩＳがペリプラズムにおいてＩＰ3と結合し、ＦＲＥＴが減少したことが示された。一方で、Ｄｍｕｔでは、変化は見られなかった。
【００９９】
また、蛍光スペクトルを解析したところ、図４のパネルＣに示されるように、ＩＰ3の添加により、Ｖｅｎｕｓの蛍光が大きく減少することが示された。
【０１００】
実施例３および４からは、蛍光インジケーターを改良して、所望の性質を有するＩＰ3のセンサーを開発することにこのシステムが活用できることが示唆された。
【図１】
2018191565.tif 000003
【図２Ａ】
2018191565.tif 000004
【図２Ｂ】
2018191565.tif 000005
【図３Ａ】
2018191565.tif 000006
【図３Ｂ】
2018191565.tif 000007
【図３Ｃ】
2018191565.tif 000008
【図４】
2018191565.tif 000009
【図５】
2018191565.tif 000010
【図６Ａ】
2018191565.tif 000011
【図６Ｂ】
2018191565.tif 000012
【図７】
2018191565.tif 000013
【図８】
2018191565.tif 000014
【配列表】
2018191565000001.app