(57)【要約】      （修正有）【課題】対象の免疫系を制御すること、免疫障害を治療すること、腸管障害を治療すること、腸管微生物叢を改善すること、対象の自然免疫系を制御すること、対象の適応免疫系を制御すること、対象における食欲を制御すること、Ｔｒｅｇ及び免疫寛容を促進すること、対象における腸の健康を促進すること、及び／又は対象における免疫ホメオスタシスを維持することに使用するための細菌種の提供。【解決手段】ロゼブリア・ホミニスに属する細菌株、又は該細菌株を含む医薬組成物、プロバイオティクス組成物、飼料、食品、栄養補助食品若しくは食品添加物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬に使用するための、受託番号ＮＣＩＭＢ  １４０２９として寄託された株と少なくとも７０％のＤＮＡ−ＤＮＡ相同性を有する、又は受託番号ＮＣＩＭＢ  １４０２９として寄託された株と少なくとも９９．５％の１６Ｓ  ｒＲＮＡ同一性を有する細菌株。
【請求項２】
受託番号ＮＣＩＭＢ  １４０２９として寄託された株と少なくとも７０％のＤＮＡ−ＤＮＡ相同性を有する、又は受託番号ＮＣＩＭＢ  １４０２９として寄託された株と少なくとも９９．５％の１６Ｓ  ｒＲＮＡ同一性を有する細菌株、及び薬学的に許容される賦形剤、担体若しくは希釈剤を含む医薬組成物。
【請求項３】
受託番号ＮＣＩＭＢ  １４０２９として寄託された株と少なくとも７０％のＤＮＡ−ＤＮＡ相同性を有する、又は受託番号ＮＣＩＭＢ  １４０２９として寄託された株と少なくとも９９．５％の１６Ｓ  ｒＲＮＡ同一性を有する細菌株、及び栄養学的に許容される賦形剤、担体若しくは希釈剤を含む栄養補助剤。
【請求項４】
受託番号ＮＣＩＭＢ  １４０２９として寄託された株と少なくとも７０％のＤＮＡ−ＤＮＡ相同性を有する、又は受託番号ＮＣＩＭＢ  １４０２９として寄託された株と少なくとも９９．５％の１６Ｓ  ｒＲＮＡ同一性を有する細菌株を含む、プロバイオティクス組成物、飼料、食品、栄養補助食品若しくは食品添加物。
【請求項５】
細菌株が、受託番号ＮＣＩＭＢ  １４０２９として寄託された株と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％のＤＮＡ−ＤＮＡ相同性を有するか；又は
前記細菌株が、受託番号ＮＣＩＭＢ  １４０２９として寄託された株と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％のＤＮＡ−ＤＮＡ相同性を有し、かつ受託番号ＮＣＩＭＢ  １４０２９として寄託された株と少なくとも９９．５％の１６Ｓ  ｒＲＮＡ同一性を有するか；又は
前記細菌株が、受託番号ＮＣＩＭＢ  １４０２９として寄託された株である、
請求項１に記載の使用のための細菌株、又は請求項２〜４のいずれかに記載の医薬組成物、栄養補助剤、プロバイオティクス組成物、飼料、食品、栄養補助食品若しくは食品添加物。
【請求項６】
細菌株が、単一の３，５９２，１２５−ｂｐの染色体、４個のリボソームオペロン、６６個のＲＮＡ及び３，２７３個の予測タンパク質からなるゲノムを有する、
請求項１に記載の使用のための細菌株、又は請求項２〜４のいずれかに記載の医薬組成物、栄養補助剤、プロバイオティクス組成物、飼料、食品、栄養補助食品若しくは食品添加物。
【請求項７】
細菌株が、凍結乾燥細菌群の形態である、
請求項１に記載の使用のための細菌株、又は請求項２〜４のいずれかに記載の医薬組成物、栄養補助剤、プロバイオティクス組成物、飼料、食品、栄養補助食品若しくは食品添加物。
【請求項８】
対象の免疫系を制御するのに使用するためである、請求項１又は５に記載の使用のための細菌株。
【請求項９】
免疫系の制御が、対象の適応免疫系の制御、又は対象の自然免疫系の制御である、請求項８に記載の使用のための細菌株。
【請求項１０】
炎症性障害、免疫障害及び腸障害から選択される障害を治療するのに使用するためであり、
前記障害が、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、大腸炎、クローン病及び潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸障害（ＩＢＤ）、嚢炎、機能性消化不良、機能性便秘、機能性下痢（抗生物質に関連した下痢、旅行者の下痢及び小児下痢を含む）、機能性腹痛、機能性腹部膨満、心窩部痛症候群、食後愁訴症候群、胃食道逆流症（ＧＥＲＤ）；糖尿病、関節炎、多発性硬化症及び乾癬アレルギーなどの自己免疫疾患；アトピー性皮膚炎等のアトピー性疾患、壊死性腸炎、他の感染症、セリアック病、及び鼻炎；並びにそれらの組合せから選択される、
請求項１又は５に記載の使用のための細菌株。
【請求項１１】
対象における腸管微生物叢を改善するのに使用するため、対象における腸の健康を促進するのに使用するため、制御性Ｔ細胞及び免疫寛容機構を促進するのに使用するため、又は対象における免疫ホメオスタシスを維持するのに使用するためである、請求項１又は５に記載の使用のための細菌株。
【請求項１２】
（ｉ）少なくとも１つの動員又は走化性遺伝子の誘導及び／又は発現を制御する、より好ましくはＭｏｂＡ及びＭｏｂＬから選択される遺伝子の発現を上方制御する；又は
（ii）ＦｌａＡ１、Ｆｌａ２、ＦｌａＡ３及びＦｌａＢから選択される少なくとも１つの遺伝子を制御する；又は
（iii）アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、電子伝達フラビンタンパク質βサブユニット、電子伝達フラビンタンパク質αサブユニットのうちの少なくとも１つの発現を制御する；又は
（iv）Ａｇｔ、Ｃａｒｔｐｔ、Ｃｃｋ、Ｃｘｃｌ１２及びＧｃｇから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を下方制御する；又は
（ｖ）回腸又は結腸において少なくとも１つの免疫応答遺伝子を活性化させる；又は
（vi）Ｔ細胞制御に関連する遺伝子の誘導及び／又は発現を制御することにより適応免疫応答を活性化させる；又は
（vii）上行結腸においてＬｙ６ｇ６ｃ及びＬｙ６ｇ６ｅから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を上方制御する;又は
（viii）Ｔｌｒ５、Ｔｌｒ１、Ｖｎｎ１、Ｄｅｆｂ３７、Ｐｌａ２ｇ、Ｍｕｃ１６、Ｉｔｌｎ、Ｓｐｒｒ１ａ、Ｃｌｄｎ４、Ｐｍｐ２２、Ｃｒｂ３、Ｍａｇｉ３、Ｍａｒｖｅｌｄ３、Ｍｐｐ７、Ｄｅｆｃｒ２０、Ｐｃｇｆ２、Ｌｔｂｐ４、Ｉｇｓｆ８及びＴｃｆｅ２ａから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を制御する；
請求項１、又は５〜１１のいずれかに記載の使用のための細菌株。
【請求項１３】
対象が、哺乳動物、好ましくはヒトである、請求項１又は５〜１２のいずれかに記載の使用のための細菌株。
【請求項１４】
組成物が、経口投与に適応している、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
細菌株を、薬学的に許容される賦形剤、担体若しくは希釈剤、又は栄養学的に許容される賦形剤、担体若しくは希釈剤と混合することを含む、請求項２に記載の医薬組成物若しくは請求項３に記載の栄養補助剤を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌種ロゼブリア・ホミニス（Roseburia hominis）及びその様々な栄養学
的及び治療的使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
子宮内で最初は無菌と考えられているヒトの腸管は、出生後すぐに多種多様の母体及び環境の微生物に晒される。腸内でのその後の定着及び遷移事象は、生後１年間、動的なままであり、その後、微生物叢は成体様になり、比較的安定になる（Spor, A., Koren, O.,
& Ley, R. (2011) Unravelling the effects of the environment and host genotype on the gut microbiome. Nat. Rev. Microbiol. 9: 279-290）。ヒトの腸内微生物叢は、
２つの主要な細菌門、バクテロイデス門（Bacteroidetes）及びファーミキューテス門（Firmicutes）に本質的に属する５００超の異なるフィロタイプ（系統型）を含有する（Eckburg,P. B., Bik, E. M., Bernstein, C. N., Purdom, E., Dethlefsen, L., Sargent, M.,Gill, S. R., Nelson, K. E., & Relman, D. A. (2005) Diversity of the human intestinal microbial flora. Science 308: 1635-1638）。ヒトの腸の細菌の定着に起因する首尾良い共生関係が、多種多様の代謝、構造、防御機能及び他の有益な機能をもたらしている。定着した腸の増強した代謝活性により、他では消化しにくい食事成分が、放出された副産物によって分解され、宿主のための重要な栄養源となることが確保される。同様に、腸内微生物叢の免疫学的重要性は十分に認識されており、免疫系が損傷した無菌動物において、片利共生細菌の導入後に、損傷した免疫系が機能的に再構成されることが例証されている（Macpherson, A. J., Hunziker, L., McCoy, K., & Lamarre, A. (2001)IgA
responses in the intestinal mucosa against pathogenic and non-pathogenicmicroorganisms. Microbes. Infect. 3: 1021-1035、Macpherson,A. J., Martinic, M. M., & Harris, N. (2002) The functions of mucosal Tcells in containing the indigenous commensal flora of the intestine. Cell Mol.Life Sci. 59: 2088-2096、Mazmanian, S. K., Liu, C. H.,Tzianabos, A. O., & Kasper, D. L. (2005) An immunomodulatory molecule ofsymbiotic bacteria directs maturation of the host immune system. Cell 122:107-118）。
【０００３】
微生物定着それ自体に影響を受ける分泌腸内ＩｇＡの産生（Chung, H. & Kasper, D.L. (2010) Microbiota-stimulated immune mechanisms to maintain gut homeostasis.Curr. Opin. Immunol. 22: 455-460、Macpherson, A. J. (2006)IgA adaptation to the presence of commensal bacteria in the intestine. Curr.Top. Microbiol. Immunol. 308: 117-136）とは際だって対照的に、Ｔ細胞発生及び分化は特定の片利共生微生物の定
着を必要とするように見える。クロストリジウム属種（Clostridium species）、特に胞
子形成セグメント細菌（ＳＦＢ，segmented filamentous bacteria）は、腸内Ｔｈ１、Ｔｈ１７及びＴｒｅｇの成熟のための主要な駆動因子であるように見える（Gaboriau-Routhiau, V., Rakotobe, S., Lecuyer, E., Mulder, I., Lan,A., Bridonneau, C., Rochet,
V., Pisi, A., De, P. M., Brandi, G. et al. (2009) The key role of segmented filamentous bacteria in the coordinated maturation of gut helper T cell responses. Immunity. 31: 677-689、Ivanov, I. I.,Atarashi, K., Manel, N., Brodie, E. L., Shima, T., Karaoz, U., Wei, D.,Goldfarb, K. C., Santee, C. A., Lynch, S. V. et al. (2009) Induction ofintestinal Th17 cells by segmented filamentous bacteria. Cell 139: 485-498）。しかしながら、最近の研究により、現在、改変されたシェドラー叢（Schaedler flora）の腸内細菌を含む他の腸内細菌は、Ｔｒｅｇのデノボ（de novo）生成を誘導できるのに対して、バクテロイデス・フラジリス（Bacteroides fragilis）による単独定着は、Ｔｒｅｇの増殖を促進することにより無菌マウスにおいてＴｈ１／Ｔｈ２不均衡を修正できることが示されている（Mazmanian, S. K., Liu, C. H., Tzianabos, A. O., & Kasper, D. L.(2005) An immunomodulatory molecule of symbiotic bacteria directs maturation ofthe host immune system. Cell 122: 107-118、Geuking, M.B.,
Cahenzli, J., Lawson, M. A., Ng, D. C., Slack, E., Hapfelmeier, S., McCoy, K.D., & Macpherson, A. J. (2011) Intestinal Bacterial Colonization Induces Mutualistic Regulatory T Cell Responses. Immunity）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Spor, A., Koren, O., & Ley, R. (2011)Unravelling the effects of the environment and host genotype on the gutmicrobiome. Nat. Rev. Microbiol. 9: 279-290
【非特許文献２】Eckburg, P. B., Bik, E. M., Bernstein, C. N.,Purdom, E., Dethlefsen, L., Sargent, M., Gill, S. R., Nelson, K. E., &Relman, D. A. (2005) Diversity of the human intestinal microbial flora. Science308: 1635-1638
【非特許文献３】Macpherson, A. J., Hunziker, L., McCoy, K.,& Lamarre, A. (2001) IgA responses in the intestinal mucosa against pathogenic and non-pathogenic microorganisms. Microbes. Infect. 3: 1021-1035
【非特許文献４】Macpherson, A. J., Martinic, M. M., &Harris, N. (2002) The functions of mucosal T cells in containing the indigenouscommensal flora of theintestine. Cell Mol. Life Sci. 59: 2088-2096
【非特許文献５】Mazmanian, S. K., Liu, C. H., Tzianabos, A.O., & Kasper, D.L. (2005) An immunomodulatory molecule of symbiotic bacteria directs maturationof the host immune system. Cell 122: 107-118
【非特許文献６】Chung, H. & Kasper, D. L. (2010)Microbiota-stimulated immune mechanisms to maintain gut homeostasis. Curr.Opin. Immunol. 22: 455-460
【非特許文献７】Macpherson, A. J. (2006) IgA adaptation tothe presence of commensal bacteria in the intestine. Curr. Top. Microbiol.Immunol. 308: 117-136
【非特許文献８】Gaboriau-Routhiau, V., Rakotobe, S., Lecuyer,E., Mulder, I., Lan, A., Bridonneau, C., Rochet, V., Pisi, A., De, P. M.,Brandi, G. et al. (2009) The key role of segmented filamentous bacteria in the coordinated maturation of gut helper T cell responses. Immunity. 31: 677-689
【非特許文献９】Ivanov, I. I., Atarashi, K., Manel, N.,Brodie, E. L., Shima, T., Karaoz, U., Wei, D., Goldfarb, K. C., Santee, C. A.,Lynch, S. V. et al. (2009) Induction of intestinal Th17 cells by segmented filamentous bacteria. Cell139: 485-498
【非特許文献１０】Geuking, M. B., Cahenzli, J., Lawson, M. A.,Ng, D. C., Slack, E., Hapfelmeier, S., McCoy, K. D., & Macpherson, A. J.(2011) Intestinal Bacterial Colonization Induces Mutualistic Regulatory T CellResponses. Immunity
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、腸内の代謝活性を調節し、及び／又は免疫制御プロセスにおける役割を果たすことができる他の内在する腸内細菌を解明することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、ファーミキューテス門（Firmicutes phylum）のメンバーである細菌種ロゼ
ブリア・ホミニスの活性に重点を置いている。出願人による研究は、この細菌種が、腸内の免疫制御及び代謝活性において重要な役割を果たすこと、並びに食欲及び満腹遺伝子に
対する効果を有することを実証している。マウスの腸への定着及び適応に関与する細菌遺伝子、並びにこの細菌による定着に応答する宿主遺伝子の役割は以下により詳細に記載されている。
【０００７】
本発明の態様は、好ましい実施形態と共に、添付の特許請求の範囲に記載されている。
【０００８】
本発明の第１の態様は、対象の免疫系を制御（regulating）するのに使用するための細菌種ロゼブリア・ホミニスに関する。
【０００９】
本発明の別の態様は、炎症性障害（disorder）、免疫障害及び腸障害から選択される障害を治療するのに使用するための細菌種ロゼブリア・ホミニスに関する。
【００１０】
本発明の別の態様は、免疫ホメオスタシスを修復することにより腸の健康を促進するのに使用するための細菌種ロゼブリア・ホミニスに関する。
【００１１】
本発明の別の態様は、対象における腸管微生物叢を改善するのに使用するための細菌種ロゼブリア・ホミニスに関する。
【００１２】
本発明の別の態様は、対象の自然免疫系を制御するのに使用するための細菌種ロゼブリア・ホミニスに関する。
【００１３】
本発明の別の態様は、対象の適応免疫系を制御するのに使用するための細菌種ロゼブリア・ホミニスに関する。
【００１４】
本発明の別の態様は、対象のＴｒｅｇ及び免疫寛容を促進するのに使用するための細菌種ロゼブリア・ホミニスに関する。
【００１５】
本発明の別の態様は、対象における食欲を制御するのに使用するための細菌種ロゼブリア・ホミニスに関する。
【００１６】
本発明の別の態様は、対象の免疫系を制御するための薬剤の調製における細菌種ロゼブリア・ホミニスの使用に関する。
【００１７】
本発明の別の態様は、対象における炎症性障害、免疫障害及び腸管障害から選択される障害を治療するための栄養補助剤又は薬剤の調製における細菌種ロゼブリア・ホミニスの使用に関する。
【００１８】
本発明の別の態様は、対象における腸管微生物叢を改善するための栄養補助剤又は薬剤の調製における細菌種ロゼブリア・ホミニスの使用に関する。
【００１９】
本発明の別の態様は、対象の自然免疫系を制御するための栄養補助剤又は薬剤の調製における細菌種ロゼブリア・ホミニスの使用に関する。
【００２０】
本発明の別の態様は、対象の適応免疫系を制御するための栄養補助剤又は薬剤の調製における細菌種ロゼブリア・ホミニスの使用に関する。
【００２１】
本発明の別の態様は、対象における食欲を制御するための栄養補助剤又は薬剤の調製における細菌種ロゼブリア・ホミニスの使用に関する。
【００２２】
本発明の別の態様は、栄養学的又は薬学的に有効な量の細菌種ロゼブリア・ホミニスを
対象に投与することを含む、対象における炎症性障害、免疫障害及び腸管障害から選択される障害を治療する方法に関する。
【００２３】
本発明の別の態様は、細菌種ロゼブリア・ホミニスを含む組成物を対象に投与することを含む、対象における腸管微生物叢を改善する方法に関する。
【００２４】
本発明の別の態様は、細菌種ロゼブリア・ホミニスを含む組成物を対象に投与することを含む、対象の自然免疫系を制御する方法に関する。
【００２５】
本発明の別の態様は、細菌種ロゼブリア・ホミニスを含む組成物を対象に投与することを含む、対象の適応免疫系を制御する方法に関する。
【００２６】
本発明の別の態様は、細菌種ロゼブリア・ホミニスを含む組成物を対象に投与することを含む、対象における食欲を制御する方法に関する。
【００２７】
本発明の別の態様は、医薬に使用するための細菌種ロゼブリア・ホミニスに関する。
【００２８】
本発明の別の態様は、細菌種ロゼブリア・ホミニスと、薬学的に許容される賦形剤、担体又は希釈剤とを含む医薬組成物に関する。
【００２９】
本発明の別の態様は、細菌種ロゼブリア・ホミニスと、栄養学的に許容される賦形剤、担体又は希釈剤とを含む栄養補助剤に関する。
【００３０】
本発明の別の態様は、細菌種ロゼブリア・ホミニスを含むプロバイオティクス組成物に関する。
【００３１】
本発明の別の態様は、細菌種ロゼブリア・ホミニスを含む、飼料、食品、栄養補助剤、栄養補助食品又は食品添加物に関する。
【００３２】
本発明の別の態様は、細菌種ロゼブリア・ホミニスを、薬学的に許容される賦形剤、担体又は希釈剤と混合することを含む、本発明に係る医薬組成物を製造する方法に関する。
【００３３】
本発明の別の態様は、細菌種ロゼブリア・ホミニスを、栄養学的に許容される賦形剤、担体又は希釈剤と混合することを含む、本発明に係る栄養補助剤を製造する方法に関する。
【００３４】
本発明の別の態様は、対象における免疫ホメオスタシスを維持するのに使用するための細菌種ロゼブリア・ホミニスに関する。
【００３５】
発明の詳細な説明
上述のように、本発明の一態様は、
・免疫障害を治療すること、
・腸管障害を治療すること、
・腸管微生物叢を改善すること、
・対象の自然免疫系を制御すること、
・対象の適応免疫系を制御すること、
・Ｔｒｅｇ及び免疫寛容を促進すること、
・対象における食欲を制御すること、
・対象における腸の健康を促進すること、及び／又は
・対象における免疫ホメオスタシスを維持すること
のうちの１又は２以上に使用するためのロゼブリア・ホミニスに関する。
【００３６】
ロゼブリア・ホミニス
最近、ファーミキューテス門内の系統発生的クラスターXIVａの片利共生腸内嫌気性菌
と記載されている、ロゼブリア・ホミニスは、ヒトの腸内の細菌の優勢な群に属しており、また、主要なブチレート産生因子でもある（Duncan, S. H., Aminov, R. I., Scott, K. P., Louis, P., Stanton, T.B., & Flint, H. J. (2006) Proposal of Roseburia faecis sp. nov., Roseburiahominis sp. nov. and Roseburia inulinivorans sp. nov., based on isolates from human faeces. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 56: 2437-2441）。本出願人は、この細菌についての完全なゲノム配列及び注釈を解明している。さらなる研究により、Ｒ．ホミニスが単独定着した無菌マウスにおける細菌及び宿主トランスクリプトーム応答の両方が調べられた。マウスの腸への定着及び適応に関与する細菌遺伝子、並びにこの細菌による定着に応答する宿主遺伝子の役割が本明細書に記載されている。
【００３７】
出願人による実験により、ロゼブリア・ホミニスの活性が非常に特異的であることが示されている。研究により、ロゼブリア属種の重要なゲノムは非常に異なり、種々の機能性を表すことが示されている。実際に、実験により、細菌種ロゼブリア・インテスチナリス（Roseburia intestinalis）、ロゼブリア・ホミニス及びユーバクテリウム・レクタレ（Eubacterium rectale）（これらの全てはブチレート産生細菌である）を含む、クロスト
リジウムクラスターXIVａ由来の細菌は、驚くべきことに、腸細胞に対して非常に異なる
、明確な効果を誘導することが示されている。
【００３８】
１つの好ましい実施形態において、細菌種は、受託番号ＮＣＩＭＢ  １４０２９Ｔ  ロゼブリア・ホミニスＡ２−１８３Ｔ（ＤＳＭ＝１６８３９Ｔ）として、Rowett Research Institute of Nutrition and Health, University ofAberdeen, Greenburn Road, Aberdeen, AB21 9SB, Scotland, UKの代理として、２００４年１０月２１日に、NCIMB Ltd社、Ferguson Building, CraibstoneEstate, Bucksburn, Aberdeen, UK, AB21 9YAにおけるNationalCollections of Industrial, Food and Marine Bacteria（ＮＣＩＭＢ）にてブダペスト条約に従って寄託された株である。
【００３９】
細菌種は、好ましくは、（Duncan, S. H., Aminov, R. I., Scott, K.P., Louis, P.,
Stanton, T. B., & Flint, H. J. (2006) Proposal of Roseburia faecis sp.nov., Roseburia hominis sp. nov. and Roseburia inulinivorans sp. nov., based onisolates
from human faeces. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 56: 2437-2441）に記載されているロゼブリア・ホミニスである。
【００４０】
１つの好ましい実施形態において、細菌種は、生細菌群、凍結乾燥細菌群、生育不能細菌群、又はそれらの細胞成分の形態である。好ましくは、細菌種が生育不能細菌調製物（preparation）の形態である場合、それは熱殺菌された細菌、放射線照射された細菌及び
溶解細菌から選択される。
【００４１】
１つの好ましい実施形態において、細菌種は、生細菌又はその細胞成分の形態である。
【００４２】
１つの好ましい実施形態において、細菌種は単離形態である。本明細書で使用する場合、「単離した」という用語は、その天然環境から単離したことを意味する。
【００４３】
１つの好ましい実施形態において、細菌種は生物学的に純粋な形態である。本明細書で使用する場合、「生物学的に純粋」という用語は、実質的に他の生物種を含まない実験室培養を指す。好ましくは、細菌種は単一生物種の培養形態である。
【００４４】
本発明はまた、本明細書に記載されている細菌種又は株の変異体の使用を包含する。本明細書で使用する場合、「変異体」という用語は、参照株のポリヌクレオチド配列と少なくとも９３％の相同性、好ましくは少なくとも９６％の相同性、より好ましくは９８％の相同性を有する誘導された細菌株を含むが、別様では、細菌ゲノムにおける他の配列における変異を含む。変異体は、本発明の株の遺伝物質の変化を推測する又は他の分子による本発明の株の遺伝物質の組換えを推測する遺伝子操作技術により得られ得る。典型的に、このような変異株を得るために、当業者は、ＵＶ照射又は変異原性化学産物に対する曝露などの標準的な変異誘発技術を使用できる。
【００４５】
本明細書で使用する場合、「変異」という用語は、親配列と少なくとも５０％の相同性を維持しながら、親ヌクレオチド又はアミノ酸配列内へ導入される遺伝子修飾を含む、当業者に公知である欠失、挿入、トランスバージョン、及び他の修飾を含む少なくとも単一塩基変化を含む自然又は誘導された変異を含む。好ましくは、１又は２以上の変異を含む配列は、親配列と少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくはさらに８５％の相同性を有する。本明細書で使用する場合、配列「相同性」は当業者に公知の標準的な技術を使用して決定できる。例えば、相同性は、http)://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/において公表されているオンラインの相同性アルゴリズム「ＢＬＡＳＴ」プ
ログラムを使用して決定できる。
【００４６】
本発明はまた、本明細書に記載されている細菌種又は株のホモログの使用を包含する。本明細書で使用する場合、「ホモログ」という用語は、親細菌株のヌクレオチド配列とある程度の配列同一性又は配列相同性（以下、「相同配列」と称する）を有するヌクレオチド配列を有する細菌株を指す。ここで、「相同」という用語は、対象ヌクレオチド配列とある特定の相同性を有する実体を意味する。ここで、「相同性」という用語は、「同一性」と等しくてもよい。
【００４７】
本発明に関連して、相同配列は、親細菌株のヌクレオチド配列（対象配列）と少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５又は９０％同一であり得、好ましくは少なくとも９５％、９７％、９８％又は９９％同一であり得るヌクレオチド配列を含むと考えられる。
【００４８】
相同性比較は、目視により、又はさらに通常には、容易に入手可能な配列比較プログラムを用いて行われてもよい。これらの市販のコンピュータプログラムは、２以上の配列間の相同性％を算出できる。
【００４９】
相同性％は、連続する配列にわたって算出することができ、すなわち、１つの配列を他の配列とアラインさせ、１つの配列中の各アミノ酸を他の配列中の対応するアミノ酸と、１つの残基を一度に、直接比較する。これは、「アンギャップト（ungapped）」アラインメントと呼ばれる。典型的には、このようなアンギャップトアラインメントは、比較的少ない数の残基にわたってのみ実施される。
【００５０】
これは、非常に簡単で一貫した方法であるが、例えば、別様では同一である配列対において、１つの挿入又は欠失のために、後続アミノ酸残基がアラインメントから外され、したがって全体的なアラインメントを実施する場合に相同性％が大きく減少する可能性があることを考慮していない。
【００５１】
したがって、最大相同性％の算出には、ギャップペナルティーを考慮して、最適アラインメントの生成がまず必要である。そのようなアラインメントを実施するために適したコンピュータプログラムは、Vector NTI（Invitrogen Corp.社）である。配列比較を実施できるソフトウェアの例としては、これらに限定されるものではないが、例えば、ＢＬＡＳ
Ｔパッケージ（Ausubel et al 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed - Chapter 18を参照）、ＢＬＡＳＴ２（FEMS MicrobiolLett 1999 174(2): 247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177(1): 187-8を参照）、ＦＡＳＴＡ（Altschul et al 1990 J. Mol. Biol. 403-410）及びＡｌｉｇｎＸが挙げられる。少なくともＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ２及びＦＡＳＴＡは、オフライン及びオンライン検索用に入手可能である（Ausubel et al 1999, pages 7-58から7-60を参照）。好ましくは、ヌクレオチド配列に関する同一性の程度は、少なくとも２０個の連続するヌクレオチドにわたって、好ましくは少なくとも３０個の連続するヌクレオチドにわたって、好ましくは少なくとも４０個の連続するヌクレオチドにわたって、好ましくは少なくとも５０個の連続するヌクレオチドにわたって、好ましくは少なくとも６０個の連続するヌクレオチドにわたって、好ましくは少なくとも１００個の連続するヌクレオチドにわたって決定される。好ましくは、ヌクレオチド配列に関する同一性の程度は配列全体にわたって決定され得る。
【００５２】
表現型の特徴に基づいた細菌の従来の同定は一般に、遺伝子型法に基づいた同定ほど正確ではない。細菌１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列の比較は、好ましい遺伝子技術として浮上してきており、ＢＬＡＳＴ（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）を使用した既
知の細菌ＤＮＡ配列との配列の比較により新規株を同定することができる。１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列は細菌において普遍的であるので、関係が多くの異なる細菌にわたって測定され得る。一般に、１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列の比較により、種及び亜種レベルを含む、複数レベルで株を分類することに加えて、細菌の全ての主要な門にわたる属レベルにおける生物間の区別が可能となる。１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列は多数の株について決定されている。ヌクレオチド配列の最大のデータバンクであるGenBankは、２０００万超の寄託さ
れた配列を有し、そのうちの９０，０００超が１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のものである。このことは、多くの以前に寄託された配列が存在し、それらの配列に対して未知の株の配列が比較できることを意味する。
【００５３】
本明細書で使用する場合、「１６Ｓ  ｒＲＮＡ同一性」という用語は、既知の細菌株との同一性パーセントを指す。１つの好ましい実施形態において、細菌株は上記の受託番号として寄託された株と少なくとも９９．５％の１６Ｓ  ｒＲＮＡ同一性を有する。
【００５４】
本発明はまた、上述の寄託株から得られ得る変異株を包含し、株は、上記の受託番号として寄託された株と少なくとも７０％のＤＮＡ−ＤＮＡ相同性及び／又は少なくとも９９．５％の１６Ｓ  ＲＮＡ同一性を示す。
【００５５】
本発明に関連して、「ＤＮＡ−ＤＮＡ相同性」という用語は、ＤＮＡの２つ以上の別々の鎖がそれらのヌクレオチド配列に基づいて互いにどれくらい密接に関連するかを指す。典型的に、これはそれらの同一性％に関して測定される。１つの好ましい実施形態において、細菌株は、上記の受託番号として寄託された株と少なくとも７０％のＤＮＡ−ＤＮＡ相同性を有する。
【００５６】
１つの非常に好ましい実施形態において、細菌株は、上記の受託番号として寄託された株と少なくとも７０％のＤＮＡ−ＤＮＡ相同性及び少なくとも９９．５％の１６Ｓ  ｒＲＮＡ同一性を有する。
【００５７】
治療用途
本発明の別の態様は、医薬に使用するための細菌種Ｒ．ホミニスに関する。
【００５８】
より特に、細菌種ロゼブリア・ホミニスは、対象における炎症性障害、免疫障害及び腸管障害から選択される障害を治療するのに使用するためである。
【００５９】
本明細書で使用する場合、「薬剤」という用語は、ヒト医学及び獣医学におけるヒト及び動物の両方での使用のための薬剤を包含する。さらに、本明細書で使用する場合、「薬剤」という用語は、治療効果及び／又は有益な効果を与える、任意の物質を意味する。本明細書で使用する場合、「薬剤」という用語は、必ずしも販売承認を必要とする物質に限定されることはないが、化粧品、機能性食品、食品（例えば、飼料及び飲料を含む）、プロバイオティクス培養物、栄養補助剤及び自然治療薬に使用され得る物質を含んでもよい。さらに、本明細書で使用する場合、「薬剤」という用語は、動物飼料、例えば家畜飼料及び／又はペットフードに組み込むように設計される製品を包含する。
【００６０】
本発明の１つの好ましい実施形態において、障害は、過敏性腸症候群（ＩＢＳ，irritable bowelsyndrome）、大腸炎、クローン病及び潰瘍性大腸炎を含む、炎症性腸障害（ＩＢＤ，inflammatorybowel disorder）、嚢炎、機能性消化不良、機能性便秘、機能性下
痢（抗生物質に関連した下痢、旅行者の下痢及び小児下痢を含む）、機能性腹痛、機能性腹部膨満、心窩部痛症候群、食後愁訴症候群、胃食道逆流症（ＧＥＲＤ，gastrointestinal reflux disease）：糖尿病、関節炎、多発性硬化症及び乾癬アレルギーなどの自己免
疫疾患（disease）：アトピー性疾患、例えば、アトピー性皮膚炎：壊死性腸炎、他の感
染症、並びにそれらの組合せから選択される。
【００６１】
１つの特に好ましい実施形態において、障害は炎症性障害である。好ましくは、炎症誘発性遺伝子の発現は宿主対象において下方制御される。これらの研究のさらなる詳細は以下に提示されている。
【００６２】
より好ましくは、炎症性障害は大腸炎、さらにより好ましくは、クローン病、潰瘍性大腸炎又は嚢炎である。
【００６３】
１つの特に好ましい実施形態において、腸管障害はＩＢＳである。ＩＢＳの正確な病態生理は依然として解明されていない。最近の研究により、ＩＢＳ患者における粘膜炎症及び腸管微生物叢の変化並びに腸管感染症との疾患相関が説明されている。
【００６４】
１つの特に好ましい実施形態において、腸管障害はＩＢＤである。好ましくは、障壁遺伝子の発現は宿主対象において高められる。これらの研究のさらなる詳細は以下に提示されている。
【００６５】
１つの特に好ましい実施形態において、腸管障害はクローン病である。
【００６６】
１つの特に好ましい実施形態において、障害は免疫障害である。好ましくは、免疫障害は、潰瘍性大腸炎、嚢炎：関節リウマチ、乾癬、多発性硬化症を含む他の自己免疫性状態：セリアック病、アトピー性皮膚炎及び鼻炎を含むアレルギーを含む他の自己免疫性状態から選択される。
【００６７】
１つの実施形態において、細菌種ロゼブリア・ホミニスは対象の免疫系を制御するのに使用するためである。細菌種による免疫制御は非常に種特異的であることが知られている（Gaboriau-Routhiau, V., Rakotobe, S., Lecuyer, E., Mulder, I., Lan,A., Bridonneau, C., Rochet, V., Pisi, A., De, P. M., Brandi, G. et al. (2009)The key role of segmented filamentous bacteria in the coordinated maturation of gut helper T cell responses. Immunity. 31: 677-689）。特に、クラスターXIVａ及びVI細菌の免疫制御効果は非常に複雑であり、ブチレート産生とは無関係である（Sokol H., et al, PNAS, October 28, 2008, Vol 105, No 43, 16731-16736）。
【００６８】
１つの好ましい実施形態において、対象の自然免疫系が調節される。
【００６９】
別の好ましい実施形態において、対象の適応免疫系が免疫制御に対して調節される（及び免疫活性化ではなく、したがって炎症を軽減させる）。
【００７０】
本発明の別の態様は、対象における腸管微生物叢を改善するための細菌種ロゼブリア・ホミニスに関する。
【００７１】
腸管微生物叢とは、宿主動物の消化管に生存している微生物を指す。これらの微生物は、多種多様の代謝、構造、防御及び他の有益な機能を実施する。本明細書で使用する場合、「腸管微生物叢を改善する」とは、宿主の腸管に存在する微生物の数及び／若しくは種類の増加、並びに／又はそれらの代謝、構造、防御及び他の有益な機能に関する前記微生物の活性の増加を指す。
【００７２】
好ましくは、ロゼブリア・ホミニスは、結腸及び／又は回腸、より好ましくは結腸に定着する。
【００７３】
１つの好ましい実施形態において、ロゼブリア・ホミニスは、少なくとも１つの動員又は走化性遺伝子の発現を制御する。
【００７４】
より好ましくは、ロゼブリア・ホミニスは、少なくとも１つの動員又は走化性遺伝子の発現を上方制御する。より好ましくはさらに、動員又は走化性遺伝子はＭｏｂＡ及びＭｏｂＬから選択される。
【００７５】
別の好ましい実施形態において、ロゼブリア・ホミニスは、ＦｌａＡ１、ＦｌａＡ２、Ｆｌａ３及びＦｌａＢから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を制御する。
【００７６】
ＦＬＡ型タンパク質に対する特異的血清抗体は炎症性腸疾患に存在する。したがって、１つの好ましい実施形態において、ロゼブリア・ホミニスは炎症性腸疾患を治療するのに使用するためである。
【００７７】
別の好ましい実施形態において、ロゼブリア・ホミニスは、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、電子伝達フラビンタンパク質ベータサブユニット、及び電子伝達フラビンタンパク質アルファサブユニットのうちの１又は２以上の発現を制御する。
【００７８】
本発明の別の態様は、対象の自然免疫系を制御するための細菌種ロゼブリア・ホミニスに関する。
【００７９】
本明細書で使用する場合、非特異的免疫系としても知られている、「自然免疫系」という用語は、非特異的様式で他の生物による感染症に対する即時の防御を宿主に提供する細胞及び機構を含む。このことは、先天性系の細胞が、一般的な様式で病原体を認識し、応答するが、適応免疫系と異なり、それは長期にわたる又は防御免疫を宿主に与えないことを意味する。
【００８０】
本明細書で使用する場合、「自然免疫系を制御する」という用語は、自然免疫系の活性を誘導すること、及び／又は活性のベースラインレベルに対して活性のレベルを増加させ、それにより免疫ホメオスタシスが促進することを意味する。
【００８１】
上皮バリア、デフェンシン、ケモカイン及びサイトカインなどの自然免疫ペプチドの損失、又は欠損ＴＬＲシグナル伝達のいずれかに起因して、自然免疫機能の損失又は制御不
全は、腸を含むいくつかの身体器官における炎症性疾患の高い危険性に関連する。このような疾患は炎症性腸疾患を含む。したがって、１つの非常に好ましい実施形態において、ロゼブリア・ホミニスは炎症性腸疾患を治療するのに使用するためである。
【００８２】
１つの好ましい実施形態において、ロゼブリア・ホミニスは、Ｔｌｒ５、Ｔｌｒ１、Ｖｎｎ１、Ｄｅｆｂ３７、Ｐｌａ２ｇ、Ｍｕｃ１６、Ｉｔｌｎ、Ｓｐｒｒ１ａ、Ｃｌｄｎ４、Ｐｍｐ２２、Ｃｒｂ３、Ｍａｇｉ３、Ｍａｒｖｅｌｄ３、Ｍｐｐ７、Ｄｅｆｃｒ２０、Ｐｃｇｆ２、Ｌｔｂｐ４、Ｉｇｓｆ８及びＴｃｆｅ２ａから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を制御する。これらの遺伝子の多くは腸障壁遺伝子及び抗菌剤であり、それ故、腸内病原体の侵襲性を軽減させ、また生きている病原体の数を減少させるように作用する。
【００８３】
本発明の別の態様は対象の適応免疫系を制御するための細菌種ロゼブリア・ホミニスに関する。
【００８４】
本明細書で使用する場合、他に「特異的免疫系」としても知られている、「適応免疫系」という用語は、病原体の成長を取り除く又は防ぐ、非常に特殊化した全身性細胞及びプロセスを指す。適応免疫応答は、（免疫を生成するために）特異的病原体を認識し、記憶し、病原体と遭遇するごとに、より強力な攻撃を開始する能力を有する脊椎動物免疫系を提供する。
【００８５】
本明細書で使用する場合、「適応免疫系を制御する」という用語は、適応免疫系の活性を誘導すること、及び／又は活性のベースラインレベルに対して活性のレベルを増加させることにより免疫ホメオスタシス機構を促進することを意味する。好ましくは、適応免疫系は免疫制御に対して調節される（及び免疫活性化ではなく、したがって炎症を軽減させる）。
【００８６】
特にＴ細胞の機能に関する適応免疫系に関連する欠陥及び障害は、多くの炎症性及び自己免疫疾患に関連する。Ｔｈ１、Ｔｈ２及びＴｈ１７に関連するＴ細胞応答はアトピー性、炎症性及び自己免疫疾患に関連する。制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞群を向上又は増加させる療法は、過剰なＴｈ１、Ｔｈ２及びＴｈ１７細胞応答により引き起こされる疾患の制御に重要である。
【００８７】
１つの好ましい実施形態において、ロゼブリア・ホミニスは結腸又は回腸において少なくとも１つの免疫応答遺伝子を活性化させる。
【００８８】
１つの好ましい実施形態において、ロゼブリア・ホミニスは、より好ましくは結腸におけるＴ細胞制御に関連する遺伝子の発現を調節することにより適応免疫系を制御する。より好ましくは、ロゼブリア・ホミニスは制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を誘導する。Ｔｒｅｇの数の増加は、炎症、自己免疫及びアレルギー／アトピー性疾患を引き起こすＴｈ１、Ｔｈ１７及びＴｈ２などの他のエフェクターＴ細胞の作用に対抗する。それ故、Ｒ．ホミニスのこの特性は、Ｔｅｆｆ／Ｔｒｅｇ細胞平衡が失われる多くの疾患、例えばクローン病及び潰瘍性大腸炎に対処するために利用され得る。
【００８９】
１つの特に好ましい実施形態において、ロゼブリア・ホミニスは、上行結腸においてＬｙ６ｇ６ｃ及びＬｙ６ｇ６ｅから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を上方制御する。Ｌｙ６ｇ６ｃ及びｌｙ６ｇ６ｅの枯渇は、腸及び気道の両方の感染症の危険性を増加させ、好中球減少などの疾患に関連する。したがって、１つの好ましい実施形態において、ロゼブリア・ホミニスは好中球減少を治療するのに使用するためである。
【００９０】
本発明の別の態様は、対象における免疫ホメオスタシスを維持するのに使用するための細菌種ロゼブリア・ホミニスに関する。本明細書で使用する場合、「免疫ホメオスタシスを維持する」とは、状態の変化に応答する経口免疫寛容又は免疫安定性を維持するための身体の免疫系の自己制御を指す。経口免疫寛容とは、健康な腸における食物及び片利共生細菌に対する正常な免疫応答を指す。それらは、セリアック病並びにクローン病及び潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患において損失される。したがって、１つの特に好ましい実施形態において、ロゼブリア・ホミニスは、セリアック病並びにクローン病及び潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患を治療するのに使用するためである。
【００９１】
本発明の別の態様は、対象における食欲を制御するのに使用するための細菌種ロゼブリア・ホミニスに関する。
【００９２】
本明細書で使用する場合、「食欲を制御する」とは、宿主が食物を食べることの欲求を調節する（すなわち向上又は低下させる）能力を指す。好ましくは、ロゼブリア・ホミニスは食欲の抑制に関連する遺伝子の発現を下方制御することにより宿主の食欲に刺激作用を与える。好ましくは、ロゼブリア・ホミニスは、Ａｇｔ、Ｃａｒｔｐｔ、Ｃｃｋ、Ｃｘｃｌ１２及びＧｃｇから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を下方制御する。より好ましくは、ロゼブリア・ホミニスは満腹ホルモンＣｃｋ及びＧｃｇの発現を下方制御する。
【００９３】
本発明に係る細菌種はまた、予防用途に使用されてもよい。予防用途において、本発明に係る細菌種又は組成物は、疾患を発生する危険性を少なくとも部分的に減少させるのに十分な量で、特定の疾患に罹りやすい又はそうでなければ特定の疾患の危険性がある患者に投与される。そのような量は、「予防有効用量」であると定義される。正確な量は患者の健康状態及び体重などの複数の患者に特異的な要因に依存する。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
本発明は以下の図面によりさらに説明される。
【図１】上行結腸内のＲ．ホミニスの存在度及び局在を示す図である。（Ａ）Ａ２−１８３ＦＩＳＨプローブを使用して、宿主上皮との細菌の密接な関連を示すＲ．ホミニスが定着したマウスの上行結腸。原寸×６３０倍。（Ｂ）Ｒ．ホミニス特異的プライマーを使用したＰＣＲは、定着後、糞便ＤＮＡにおいて強い陽性シグナルを示したが、ＧＦ動物の糞便はいかなる細菌の存在についても陰性であった。（Ｃ）Ｒ．ホミニス／ｍｇ糞便の定着レベルを示すリアルタイムＰＣＲ分析。
【図２】Ｒ．ホミニスゲノムの配列及び注釈を示す図である。（Ａ）プライマーにより標的とされた領域において示されたＰＣＲ実験の位置を有するＲ．ホミニス環状ゲノムマップ。外側のトラック０で開始する、ゲノムマップにおけるトラックは、番号付けした目盛りにより示される、トラック０−（青）リアルタイムＰＣＲ実験、トラック１−（淡い青）フォワードＣＤＳ、トラック２−（淡い青）リバースＣＤＳ、トラック３−（青）ｒＲＮＡ、トラック４−（緑）ｔＲＮＡ、トラック５−（赤）リアルタイムＰＣＲにより標的とされたＳＴＳマーキング領域、グラフ１−ＧＣ含量、グラフ２−ＧＣバイアスである。（Ｂ）Ｒ．ホミニスゲノムの機能注釈。
【図３】コロニー形成及びマウスの腸への適応後にＲ．ホミニスにおいて発現量に差のある転写産物を確認する図である。（Ａ）細菌ＲＮＡはマウスの盲腸内容物から単離し、ｃＤＮＡ合成の間、ｄＣＴＰ−Ｃｙ３又はｄＣＴＰ−Ｃｙ５のいずれかで標識し、ダイスワップを組み込んだマイクロアレイスライドにハイブリダイズした。２を超える倍率変化及びＰ値が０．０５未満である場合、データは有意であるとみなした。５０個の発現量に差のある遺伝子（インビボ対インビトロ）がマイクロアレイ分析により明らかにされた。（Ｂ）コンジュゲーション／動員転移に関与する遺伝子のリアルタイムＰＣＲ検証。（Ｃ）運動性及び走化性に関与する遺伝子のリアルタイムＰＣＲ検証。（Ｄ）１４日において親和性精製したＦｌａ２抗体で免疫染色した上行腸内容物のウェスタンブロット（レーン１：ラダー、レーン２〜６：動物１〜５からの腸内容物、レーン７〜８：空、レーン９〜１０：Ｒ．ホミニスバイオマス（陽性対照））。鞭毛（黒色矢印）を示すＲ．ホミニスの写真及び（Ｅ）ブチレート代謝に関与する遺伝子のリアルタイムＰＣＲ検証。（Ｆ）ヒト腸管上皮細胞に対するインビトロ曝露の間のＲ．ホミニス転写産物のリアルタイムＰＣＲ分析。リアルタイムＰＣＲ結果は３回測定の平均であり、＊Ｐ値が０．０５未満、＊＊Ｐ値が０．０１未満、＊＊＊Ｐ値が０．００１未満である。
【図４】Ｒ．ホミニスによる単独会合（mono-association）後のマウスの腸において発現量に差のある転写産物を確認する図である。（Ａ）ＧＦに対する発現量に差のある遺伝子Ｒ．ホミニスが定着したマウスのAffymetrixマイクロアレイ分析。棒グラフは１４及び２８日後に高及び低発現させた遺伝子の数を表す。（Ｂ）１４日及び２８日におけるＧＦマウスとＲ．ホミニスが定着したマウスとの間の機能的重要性を有する、発現量に差のある遺伝子から生成したヒートマップ。列は個々のアレイを表し、行は所望の特異的遺伝子を表す。Ｚ値は、平均から離れた、標準偏差における距離の尺度を示す。各遺伝子についての相対値は色の強さにより示され、緑は高発現を示し、赤は低発現を示す。（Ｃ）Ｒ．ホミニスが定着したマウスとＧＦマウスとの有意な差異が示されている遺伝子のリアルタイムＰＣＲ検証。リアルタイムＰＣＲ結果は３回測定の平均であり、＊Ｐ値が０．０５未満、＊＊Ｐ値が０．０１未満、＊＊＊Ｐ値が０．００１未満である。
【図５】結腸内のＴ細胞マーカーの発現及び局在を示す図である。ＧＦマウス及びＲ．ホミニスで処置したマウスの固有層における抗Ｌｙ６Ｇ（Ａ）、抗ＣＤ３（Ｂ）及び抗ＣＤ１１ｂ（Ｃ）で標識した固有層細胞の免疫蛍光及び分析。＊Ｐ値が０．０５未満である。
【図６】大腸炎の実験モデルにおけるＲ．ホミニスの抗炎症作用を示す図である。１４週の間、１週に３回、ＩＬ−１０ＫＯマウスに投与した。（Ａ）未処置のＩＬ−１０ＫＯマウスは野生型マウスと比較して全ての遺伝子がかなり向上したのに対して、示差的遺伝子発現はＲ．ホミニスで処置した動物において低かった。リアルタイムＰＣＲ結果は３回測定の平均であり、＊Ｐ値が０．０５未満、＊＊Ｐ値が０．０１未満、＊＊＊Ｐ値が０．００１未満である。（Ｂ）研究の終わりにおける未処置のＩＬ−１０ＫＯ及びＲ．ホミニスで処置したＩＬ−１０ＫＯ動物の体重。（Ｃ）ＩＬ−１０ＫＯ及びＲ．ホミニスで処置したＩＬ−１０ＫＯ動物の上行結腸（ヘマトキシリン／エオシン染色）。原寸×１００倍。
【図７】ＩＬ−１０、ＩＬ−１７及びＩＦＮ−γのｍＲＮＡレベルのリアルタイムＰＣＲ分析を示す図である。リアルタイムＰＣＲはＴ細胞マーカーを測定するために上行結腸組織で実施した。リアルタイムＰＣＲ結果は３回測定の平均であり、＊Ｐ値が０．０５未満、＊＊Ｐ値が０．０１未満である。
【図８】体重組成に基づいたＲ．ホミニスによるＧＦマウスの単独会合の効果を示す図である。乾燥体重及び体脂質分析を実施した。（Ａ）Ｒ．ホミニスが会合したマウスの乾燥屠体重量はＧＦ動物と比較して有意に重かった。（Ｂ）さらなる体脂質分析は、総体脂肪蓄積もまた、１４日においてＲ．ホミニスで処置した動物において有意に高いことを示した。
【図９】クラスターXIVａ（ファーミキューテス門）、すなわちロゼブリア・ホミニス、Ｅ．レクタレ及びロゼブリア・インテスチナリス由来の細菌の３つの株についての遺伝子発現データの比較を示す図である。
【図１０】ロゼブリア・ホミニスは、強力な抗炎症活性を有するＮＦ−κＢシグナル伝達の負の制御因子である、Ａ２０を誘導するのに対して、他の細菌株は効果がないことを示す図である。ロゼブリア・ホミニスのフラジェリン部分（Ｒ．ホミニスのＦＬＡ１）もまた、関連する細菌であるユーバクテリウム・レクタレのものと異なりＡ２０を誘導する。より詳細に、図１０は、対照と比較した、Ｅ．レクタレ、Ｒ．ホミニスについてのＡ２０、Ｅ．レクタレのＦＬＡ、Ｒ．ホミニスのＦＬＡ１、ＥＡＶ９、ＳＶ１４００のＦＬＡの誘導倍率（fold-induction）を示す。
【図１１】各サブカテゴリーにおける機能的サブシステム及び遺伝子の数を示す、ＲＡＳＴにより決定した場合のＲ．ホミニスＡ２−１８３についてのサブシステムカテゴリー分布を示す図である。
【図１２】各サブカテゴリーにおける機能的サブシステム及び遺伝子の数を示す、ＲＡＳＴにより決定した場合のＲ．イヌリニボランス（inulinivorans）ＤＳＭ  １６８４１Ａ２−１８３についてのサブシステムカテゴリー分布を示す図である。
【図１３】各サブカテゴリーにおける機能的サブシステム及び遺伝子の数を示す、ＲＡＳＴにより決定した場合のＲ．インテスチナリスＬ１−８２についてのサブシステムカテゴリー分布を示す図である。
【図１４】各サブカテゴリーにおける機能的サブシステム及び遺伝子の数を示す、ＲＡＳＴにより決定した場合のＲ．インテスチナリスＭ５０／１についてのサブシステムカテゴリー分布を示す図である。
【図１５】各サブカテゴリーにおける機能的サブシステム及び遺伝子の数を示す、ＲＡＳＴにより決定した場合のユーバクテリウム・レクタレＡＴＣＣ  ３３６５６についてのサブシステムカテゴリー分布を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００９５】
Ｒ．ホミニスは結腸に優先的に定着する
健康な成体のＣ３Ｈ／ＨｅＮ無菌（ＧＦ）マウスに、連続した日で３回、Ｒ．ホミニスを強制飼養により接種した。酸素曝露から細菌を保護するために３％アスコルビン酸及び２％システインを含有する接種培地を使用して首尾良い定着を達成した。蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）による腸組織の分析により、Ｒ．ホミニスが回腸及び結腸の両方に定着したが、結腸においてより多くの数が見出されたことが明らかになった。細菌はまた、結腸粘膜に密接に関連することが見出された（図１Ａ）。定着をさらに検証し、１×１０１０細菌／ｇ糞便に近似した数を用いてＲ．ホミニス特異的プライマーを使用してＰＣＲにより定量した（図１Ｂ及び１Ｃ）。任意の細菌の存在についてＧＦ動物の糞便は陰性であると試験した。
【００９６】
Ｒ．ホミニスゲノムは宿主相互作用を促進する固有の遺伝子を有することを示す
Ｒ．ホミニスＡ２−１８３の完全なゲノム配列を解明し（図２Ａ、それを単一の３，５９２，１２５ｂｐ染色体により表す（図２Ｂ）。ＲＡＳＴプラットフォームを使用したゲノムの自動化及び手動注釈により、４個のリボソームオペロン、６６個のＲＮＡ及び３，２７３個の予測タンパク質の存在が明らかになった。遺伝子の最大の群は、炭水化物代謝に関与するタンパク質をコードする、サブシステムカテゴリー炭水化物（２７１個の遺伝子）、続いてタンパク質代謝（１９７）並びにアミノ酸及び誘導体（１７５）に属した（図２Ｂ）。他の重要な機能的カテゴリーは運動性及び走化性（４９）並びに休眠及び胞子形成（１２）を含んでいた。比較ゲノム分析により、完全な細菌ゲノムの中でゲノム構造及び機能に関して最も近い近縁種が、ユーバクテリウム・レクタレであると確立され（Mahowald, M. A., Rey, F. E., Seedorf, H., Turnbaugh, P. J., Fulton,R. S., Wollam,
A., Shah, N., Wang, C., Magrini, V., Wilson, R. K. et al. (2009) Characterizing
a model human gut microbiota composed of members of its two dominant bacterial phyla. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 106: 5859-5864）、このことは、これらの生物の近い分類上の関連性を考慮すると驚くことではない（Duncan, S. H., Aminov, R. I., Scott, K. P., Louis, P., Stanton, T.B., & Flint, H. J. (2006) Proposal of Roseburia faecis sp. nov., Roseburiahominis sp. nov. and Roseburia inulinivorans sp. nov., based on isolates from human faeces. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 56:2437-2441、Aminov, R. I., Walker, A. W., Duncan, S. H.,Harmsen, H. J., Welling, G. W., & Flint, H. J. (2006) Molecular diversity,cultivation, and improved detection by fluorescent in situ hybridization of adominant group of human gut bacteria related to Roseburia spp. or Eubacterium rectale. Appl. Environ. Microbiol. 72: 6371-6376）。１，０９５個の遺伝子を有するこれらの２つのゲノムの比較再構成により、それらは遺伝子の約２５％が異なることが示された。特に、これらの差異は宿主との相互作用についての重要な機能をコードする遺伝子を包含した。例えば、IV型線毛アセンブリタンパク質ＰｉｌＢ及びＰｉｌＣをコードする運動性及び走化性遺伝子はＥ．レクタレに存在したが、Ｒ．ホミニスには存在しなかったのに対して、鞭毛基底小体棒タンパク質ＦｌｇＣ、鞭毛フック基底小体（hook-basal body）複合体タンパク質ＦｌｉＥ、フ
ラジェリンタンパク質ＦｌａＢ及び鞭毛モータースイッチタンパク質ＦｌｉＧはＲ．ホミニスに固有であった。２つの細菌ゲノムはまた、４２個の炭水化物遺伝子が異なり、それらの相違する栄養所要量を反映する。
【００９７】
Ｒ．ホミニスは動員及び走化性遺伝子を上方制御することにより腸内環境に応答する
宿主及び食事の関連に応答してＲ．ホミニスにより発現量に差のある遺伝子を決定するために、小さな挿入サイズのシークエンシングライブラリーから６，０００個のＰＣＲ断片を使用してマイクロアレイを構築した。その後、図２Ｂに示すようにＲ．ホミニスゲノムの特定の領域において集まる４２個の発現量に差のある遺伝子でリアルタイムＰＣＲ検証を実施した。腸内環境と食事成分との間の作用を区別するために、４つの異なる実験条件：（ｉ）インビボで、単独会合したマウスの盲腸から；（ii）インビトロで、培養培地中で成長させた細菌から；（iii）インビトロで、食事成分の存在下で成長させた細菌か
ら；及び（iv）コンフルエントなＣａｃｏ−２及びＨＴ−２９細胞の表面上でインキュベートした細菌から細菌ＲＮＡを単離した。
【００９８】
５０個の発現量に差のある遺伝子を確認した（インビボ対インビトロ）（図３Ａ）。最も驚くべき発見は、コンジュゲーション／動員転移に関与する遺伝子、ｍｏｂＡ様及びｍｏｂＬ様遺伝子のインビボでの非常に高い上方制御であった（図３Ｂ）。転写研究におけるこのような遺伝子の存在は、確認可能な遺伝子が、サブシステムカテゴリー特徴におけるファージ、プロファージ、転移因子及びプラスミドに割り当てられなかったので、驚くべきことであった。遺伝子検出及び割り当てのこの差異はサブシステムカテゴリー注釈の認識された制限に起因するようである。食事成分の刺激作用はほとんど示されず、腸内環境自体が遺伝子水平伝播に関与する遺伝子の主要な誘導因子であることを示唆している。
【００９９】
他の腸内環境により誘導されるサブシステムは、膜輸送、特にマグネシウム輸送、並びに運動性及び複数のメチル基受容走化性タンパク質及び鞭毛オペロンの遺伝子を含む走化性を含んだ（図３Ｃ）。Ｒ．ホミニスは、複数のフラジェリン遺伝子ｆｌａＡ１、ｆｌａＡ２、ｆｌａＡ３、及びｆｌａＢを保有し、興味深いことにマウス腸内環境における成長は、Ｒ．ホミニス特異的フラジェリン抗体を使用してインビボで定着したマウスから単離した細菌のウェスタンブロッティングにより見られるようにこの細菌におけるフラジェリン発現を促進した（図３Ｄ）。これは、ファーミキューテス門のある特定のサブセットのみがインビボで鞭毛を産生することを示す以前の報告と一致する（Turnbaugh, P. J., Backhed, F., Fulton, L., & Gordon, J. I.(2008) Diet-induced obesity is linked to marked but reversible alterations inthe mouse distal gut microbiome. Cell Host.
Microbe 3: 213-223）。
【０１００】
驚くことではないが、腸内環境内のＲ．ホミニスにおける異化代謝遺伝子の発現は大部分、食事成分による影響を受けた（図３Ｅ）。関与する遺伝子は、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ及びホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ［ＡＴＰ］を含んだ。これらの遺伝子の制御は大部分、食事により駆動されたが、後の試料採取点において宿主作用もまた明白であった。予想外に、宿主環境は、粘膜プロテオグリカンの炭水化物鎖に一般的である、グルクロン酸塩などの宿主により駆動される物質の代謝に関与する一部の遺伝子を下方制御した。
【０１０１】
Ｒ．ホミニストランスクリプトームに対する宿主適応の作用をさらに調べるために、ヒト腸管上皮細胞（Ｃａｃｏ−２及びＨＴ−２９）のインビトロ刺激を実施した。このことにより、マウス腸への適応により誘導されたコンジュゲーション／動員転移遺伝子ｍｏｂＡ／ｍｏｂＬタンパク質１もまた、両方の細胞株において増加したことが示された（図３Ｆ）。インビボでのデータと一致して、フラジェリン遺伝子ＭｏｔＡはＣａｃｏ−２細胞内で上方制御された。ブチレート代謝に関与する遺伝子は、Ｃａｃｏ−２細胞に見られる下方制御及びＨＴ−２９細胞における上方制御に関して、２つの細胞株の間の差異を示した。
【０１０２】
Ｒ．ホミニスは主に結腸内のＴ細胞経路に影響を与える
Ｒ．ホミニスによるＧＦマウスの定着は結腸内で最高であった増加した腸遺伝子発現と相関した（図４Ａ）。示差的発現は、定着後、２８日において最も顕著であり、１５９個の遺伝子が上方制御され、１４３個の遺伝子が下方制御された。１４日に回腸内で発現量に差のある遺伝子の数は上行結腸に類似しており、７９個の遺伝子が上方制御され、１１９個の遺伝子が下方制御された。回腸内の示差的発現は２８日において非常に低く、低い定着レベルと一致した。トランスクリプトーム応答は、ヒートマップ分析による有意な転写産物の明確な分離により示されるように、２回の時点で異なった（図４Ｂ）。Affymetrixデータの陽性リアルタイムＰＣＲ検証を図４Ｃに示す。
【０１０３】
回腸及び上行結腸内で１４日に影響を受けた経路の大部分を、細胞分化、細胞周期制御及び組織修復のカテゴリーに分類した。重要なことに、免疫応答は上行結腸内で２８日に誘導された主要経路の群であった。このカテゴリーにおける３６個の顕著に影響を受けた経路は大部分、Ｔ細胞機能に関与し、ＩＬ−１０シグナル伝達経路、Ｔヘルパー細胞におけるＩＣＯＳ経路及びＣＴＬＡ−４によるＴ細胞機能の制御を含んだ。これらの経路に関与する遺伝子は上方制御及び下方制御の両方を示したので、これらの経路はＲ．ホミニスの存在により顕著に影響を受けるが、Ｔ細胞分化に対する正確な正味の機能的効果はさらなる調査を必要とする。しかしながら、ＩＬ−１０、ＣＤ３ε及びＩＬ−１３の増強並びにＩＦＮ−γの発現の変化はリアルタイムＰＣＲにより確認され（図７）、Ｒ．ホミニス定着がＴｒｅｇ及びＴｈ２細胞分化経路に有利に働き得ることを示唆している。遺伝子オントロジー分析を適用して、示差的に制御された遺伝子の機能分類に関するさらなる情報を得た。「アクチン重合」（ＧＯ：００３００４１）（Ａｒｐｃ３、Ｃａｐｇ、Ｃｄｃ４２ｅｐ５及びＲｈｏｃ）についてのＧＯプロセスは、Ｒ．ホミニスが定着したマウスにおいて結腸内で２８日に上方制御された（図８）。免疫シナプスにおけるアクチン重合はＴ細胞活性化及びエフェクター機能に必要とされる。遺伝子導入はリアルタイムＰＣＲによりさらに確認された（図４Ｃ）。全体で、このデータは、Ｒ．ホミニスが、Ｔ細胞制御に陽性に影響を与えることにより結腸内で適応免疫応答を活発にもたらすことを示す。
【０１０４】
これらの結果に関連するのは、上行結腸内のＬｙ６ファミリーのメンバーの誘導であった。特に、Ｌｙ６ｇ６ｃのＧＰＩアンカー遺伝子産物は、２８日において２５倍上方制御され、関連遺伝子Ｌｙ６ｇ６ｅは２倍上方制御された。ほとんどの造血細胞は、好中球及び形質細胞様樹状細胞を含むＬｙ６ファミリーの１又は２以上のメンバーを表す。さらに、Ｔ細胞活性化、分化及び成熟におけるＬｙ６の可能性のある役割が提案されている（Mallya, M., Campbell, R. D., & Aguado, B. (2006)Characterization of the five novel Ly-6 superfamily members encoded in the MHC,and detection of cells expressing
their potential ligands. Protein Sci. 15: 2244-2256）。
【０１０５】
免疫細胞化学により、Ｒ．ホミニスが定着したマウスにおいてＬｙ６Ｇ＋、ＣＤ１１ｂ＋及びＣＤ３＋細胞の存在の増加が確認された（図５）。主にＴｒｅｇ応答が優位であるＴ細胞経路を示すデータと一致して、Ｒ．ホミニスを接種したマウスの結腸内で二重陽性
ＣＤ３＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞が統計的に有意に増加した。明確に、単一細菌種としてのＲ．ホミニスの定着は、特にそれらのマウスの結腸内でＣＤ３＋ＦｏｘＰ３＋細胞群の有意な増加を誘導した。
【０１０６】
Ｒ．ホミニスは回腸及び結腸の両方において自然免疫応答遺伝子を調節し、ＩＬ１０ＫＯマウスにおいて大腸炎を軽減する
自然免疫及び腸障壁機能に関与する遺伝子は、上行結腸内のＲ．ホミニスの存在により顕著に誘導された。ＧＯプロセス「自然免疫応答」（ＧＯ：００４５０８７）は上方制御され、ＴＬＲ関連遺伝子Ｔｌｒ５、Ｔｌｒ１及びＶｎｎ１を含んでいた。Ｔｌｒ５の上方制御は、特に、腸内定着の間、鞭毛遺伝子の対応する誘導及びＲ．ホミニスにおけるフラジェリンタンパク質の存在から、興味深く、他の自然及び適応免疫応答を媒介する際のこの自然シグナル伝達経路についての役割を推測することができる。ＴＬＲ５シグナル伝達とＣＤ４＋Ｔ細胞応答との間の関連が、最近、鞭毛虫病原体について実証されている（Letran, S. E., Lee, S. J., Atif, S. M., Flores-Langarica, A.,Uematsu, S., Akira, S., Cunningham, A. F., & McSorley, S. J. (2011)TLR5-deficient mice lack basal inflammatory and metabolic defects but exhibit impaired CD4 T cell responses to a
flagellated pathogen. J Immunol. 186: 5406-5412）。同様に、バクテロイデス・フラジリス、Ｔｒｅｇ増殖及び免疫ホメオスタシスの定着を促進する際のＴＬＲ２の役割が示されている（Round, J. L., Lee, S. M., Li, J., Tran, G., Jabri, B., Chatila, T.A., & Mazmanian, S. K. (2011) The Toll-like receptor 2 pathway establishes colonization by a commensal of the human microbiota. Science 332: 974-977）。
【０１０７】
Ｒ．ホミニスにより結腸内で影響を受けた他の自然免疫遺伝子には、抗微生物ペプチドＤｅｆｂ３７、Ｐｌａ２ｇ３、Ｍｕｃ１６及びＩｔｌｎ並びに腸障壁機能遺伝子Ｓｐｒｒ１ａ、Ｃｌｄｎ４、Ｐｍｐ２２、Ｃｒｂ３及びＭａｇｉ３が含まれた。Ｒ．ホミニスに応答して回腸内で上方制御を示す自然免疫遺伝子には、Ｄｅｆｃｒ２０、Ｐｃｇｆ２、Ｌｔｂｐ４、Ｉｇｓｆ８及びＴｃｆｅ２ａが含まれた。興味深いことに、Ｐｃｇｆ２は、異なるサイトカイン、ケモカイン、及びケモカイン受容体の発現を負に制御し、この片利共生細菌に応答する腸組織内の炎症応答を制御するのに重要な役割を果たし得る。興味深いことに、我々はまた、Ｒ．ホミニスによるＮＦ−κＢ経路（ＧＯ：００４３１２４）の負の制御を示し、それは、Ｂ．セタイオタオミクロン（thetaiotaomicron）（Kelly, D., Campbell, J.I., King, T. P., Grant, G., Jansson, E. A., Coutts, A. G., Pettersson,
S., & Conway, S. (2004) Commensal anaerobic gut bacteria attenuate inflammation
by regulating nuclear-cytoplasmic shuttling of PPAR-gamma and RelA. Nat.Immunol. 5: 104-112）と同様に、この炎症カスケードを下方制御することにより免疫ホメオスタシスに寄与し得る。
【０１０８】
ＩＬ−１０ノックアウトマウスモデルを使用して、単独会合マウスにおける炎症経路の制御及びＴｒｅｇ誘導に対する正の効果に起因する、Ｒ．ホミニスの治療有効性を試験した。１４週の期間の間、２０日齢における離乳から１週間に３回、マウスに投与した（約５０μｌ、１０１０ＣＦＵ）。炎症誘発性バイオマーカーのパネルの遺伝子発現により、未処置のＩＬ−１０ＫＯマウスが、野生型マウスと比較して、４〜４９倍の範囲の遺伝子を誘導し、全ての調査した遺伝子をかなり増加させたことが示された（図６Ａ）。炎症誘発性遺伝子誘導は未処置のマウスと比較してＲ．ホミニス処置マウスにおいて有意に低く、Ｒ．ホミニスの経口投与の強力な治療有益性を示す。Ｒ．ホミニス処置した動物の体重もまた、未処置の動物と比較して研究の終わりに重くなり、この効果は雄において統計的に有意であった（図６Ｂ）。最後に、組織学的分析により、未処置のＩＬ−１０ＫＯの上行結腸における重度の炎症の存在が示されたのに対して、Ｒ．ホミニス処置した動物は、結腸粘膜が比較的健常に見えた。
【０１０９】
Ｒ．ホミニス定着は満腹遺伝子及び身体組成に影響を与える
単独会合したマウスにおけるＲ．ホミニスの顕著な代謝作用もまた明らかであった。ＧＯプロセス「食物に対する応答の負の制御」（ＧＯ：００３２０９６）、「食欲の負の制御」（ＧＯ：００３２０９９）、及び「カテコールアミン分泌の制御」（ＧＯ：００５０４３３）は、Ｒ．ホミニスによる定着後、上行結腸において全て下方制御された。このデータにより、Ｒ．ホミニスが宿主の食欲に対して刺激作用を与えることが推測される。これらのプロセスに関与する遺伝子は、Ａｇｔ、Ｃａｒｔｐｔ、Ｃｃｋ及びＣｘｃｌ１２であり、２〜１２倍の範囲の倍率変化であった。特に、Ｃｃｋは空腹抑制剤として消化及び満腹において主要な役割を果たす。Ｇｃｇもまた、この腸部位において下方制御を示した。
【０１１０】
これらの遺伝子変化が、食物摂取及び身体組成に関連する生理的関連性を有するかどうかを確立するために、乾燥屠体重量及び組成分析を実施した。興味深いことに、Ｒ．ホミニスが会合したマウスの乾燥屠体重量はＧＦ動物と比較して有意に重く、差異は１４日で最も確認可能であった。さらなる体脂質分析は、総体脂肪蓄積もまた、１４日においてＲ．ホミニスで処置した動物において有意に高いことを示した。これらの見解は、食事発酵を介するエネルギー収集におけるファーミキューテス門の役割を明らかにしている最近のデータと一致しているが、また、腸内細菌が脳−腸軸及び食欲制御ホルモンを実際に調節できるという考えも支持している。
【０１１１】
考察
宿主微生物共生の長期の共進化は腸内の機能的に重要な細菌種の選択を引き起こしているようであり、それらのほとんどは他の生態系において高度に表れない。現在、特に粘膜免疫系の発達に関連する腸管機能に対する微生物群の個々のメンバーの寄与に関する制限された情報が存在する。
【０１１２】
大腸菌（E. coli）（ＨＡ１０７）に基づいた可逆的定着モデルを使用した最近の研究
により、ＩｇＡに対する免疫誘導作用のために、生細菌が１０８ＣＦＵ／グラムの含量に近い数で必要とされることが実証されている（Hapfelmeier, S., Lawson, M. A., Slack,
E., Kirundi, J. K., Stoel, M., Heikenwalder, M., Cahenzli, J., Velykoredko, Y.,
Balmer, M. L., Endt, K. et al. (2010) Reversible microbial colonization of germ-free mice reveals the dynamics of IgA immune responses. Science 328:1705-1709
）。最近、ＳＦＢ及びバクテロイデス・フラジリスの特定の機能が、Ｔ細胞生態に対するそれらの個々の寄与を定義するためにマウスの腸において調べられており、これらの細菌の両方は、Ｔｒｅｇ及びＴｈ１７細胞の強力な誘導因子であることが示されている（Mazmanian, S. K., Liu, C. H., Tzianabos, A. O., & Kasper, D. L.(2005) An immunomodulatory molecule of symbiotic bacteria directs maturation ofthe host immune system. Cell 122: 107-118、Gaboriau-Routhiau,V., Rakotobe, S., Lecuyer, E., Mulder,
I., Lan, A., Bridonneau, C., Rochet, V., Pisi, A., De, P. M., Brandi, G. et al.
(2009) The key role of segmented filamentous bacteria in the coordinated maturation of gut helper T cell responses. Immunity. 31: 677-689、Ivanov, I. I., Atarashi, K., Manel, N., Brodie, E. L., Shima, T.,Karaoz, U., Wei, D., Goldfarb, K. C., Santee, C. A., Lynch, S. V. et al. (2009)Induction of intestinal Th17 cells by segmented filamentous bacteria. Cell 139: 485-498）。クラスターXIVａファーミキューテス門の個々のメンバーの効果は以前に報告されていないが、Ｔ細胞分化にも影響を与える、ＡＳＦにおけるそれらの存在は認められている（Geuking, M. B., Cahenzli, J., Lawson, M. A., Ng, D. C., Slack, E.,Hapfelmeier, S., McCoy, K. D., & Macpherson, A. J. (2011) IntestinalBacterial Colonization Induces Mutualistic Regulatory T Cell Responses.Immunity）。
【０１１３】
出願人は、本明細書において、ファーミキューテス門のメンバーである、嫌気性細菌、Ｒ．ホミニスによる無菌マウスの腸の最初の成功した単独会合を実証している。ロゼブリア様の細菌の極度の酸素感受性は、機能的特徴付けを実施することを困難にする、厳格な嫌気性培養技術を必要とする。出願人は、無菌マウスにおけるＲ．ホミニスの安定な単独定着を確立し、その代謝機構、生理、及び共生特性を明らかにするための完全な注釈ゲノム配列を生成した。定着後のＲ．ホミニスの転写応答は、宿主腸内環境及び食事の両方に起因し得ることが見出された。宿主により引き起こされる作用は、単独会合後のＲ．ホミニスの応答より優位であった。それらには、遺伝子導入、膜輸送、走化性及び運動性サブシステムが含まれた。動員転移に関与する遺伝子の強力な上方制御により、腸内環境が、腸内微生物叢のメンバーの間の水平遺伝子交換に非常に寄与するという考えが支持される。したがって、この環境は、腸内生態系内の細菌生存、定着及び機能に重要な遺伝子の伝播を加速し得る。
【０１１４】
宿主定着における運動性及び鞭毛装置の役割は病原菌について十分に詳しく述べられているが、片利共生細菌における鞭毛タンパク質の役割についてはほとんど知られていない。インビボでの実験により、フラジェリン遺伝子の発現に対する宿主腸管環境の刺激作用が明らかになった。フラジェリンシグナルは宿主ＴＬＲ５受容体（Hayashi, F., Smith, K. D., Ozinsky, A., Hawn, T. R., Yi, E. C.,Goodlett, D. R., Eng, J. K., Akira, S., Underhill, D. M., & Aderem, A.(2001) The innate immune response to bacterial flagellin is mediated byToll-like receptor 5. Nature 410: 1099-1103）により認識され、多くの病原性フラジェリン構造は、強力な炎症誘発性応答を誘導する（Hayashi,
F., Smith, K. D., Ozinsky, A., Hawn, T. R., Yi, E. C., Goodlett, D. R., Eng, J.
K., Akira, S., Underhill, D. M., & Aderem, A. (2001) The innate immuneresponse
to bacterial flagellin is mediated by Toll-like receptor 5. Nature 410:1099-1103）。ＴＬＲ５の欠失により、マウスにおいて自然発生する大腸炎が生じるので（Vijay-Kumar,M., Sanders, C. J., Taylor, R. T., Kumar, A., Aitken, J. D., Sitaraman, S. V.,Neish, A. S., Uematsu, S., Akira, S., Williams, I. R. et al. (2007) Deletion ofTLR5 results in spontaneous colitis in mice. J Clin. Invest 117: 3909-3921）、内在する有鞭毛片利共生生物に応答するＴＬＲ５を介するシグナル伝達はホメオスタシスに重要であり得る。したがって、インビボでのＲ．ホミニスフラジェリンの発現の増強は潜在的に興味深いものである。他の研究により、大腸菌フラジェリン変異体が、場合により、ＴＬＲ５シグナル伝達による先天性認識の非存在に起因して、野生型有鞭毛株より定着の利点を有することが示されている（De, P. M., Gaboriau-Routhiau, V., Rainteau, D., Rakotobe, S.,Taddei, F., & Cerf-Bensussan, N. (2011) Trade-off between bile resistance and nutritional competence drives Escherichia coli diversification in the mousegut. PLoS Genet. 7: e1002107、Giraud, A., Arous, S., De,P. M., Gaboriau-Routhiau, V., Bambou, J. C., Rakotobe, S., Lindner, A. B.,Taddei, F., & Cerf-Bensussan, N. (2008) Dissecting the genetic components of adaptation of Escherichia coli to the mouse gut. PLoS Genet. 4: e2）。出願人は、ある特定のファーミキューテス門に関して、フラジェリンの上方制御が腸内定着に対する自然な応答であることを示している。Ｒ．ホミニスフラジェリンタンパク質はインビボで発現したままであり、顕性炎症及び制御表現型のＴ細胞の増殖の非存在下で、持続した定着と相関する。それ故、ＴＬＲ５を介する片利共生フラジェリン構造は、直接的な免疫寛容応答に役立ち得る。Ｒ．ホミニスのＴＬＲ５ＫＯ及びフラジェリン変異体に基づいたさらなるデータにより、免疫ホメオスタシスに関連する片利共生フラジェリンの重要性がさらに明らかにされるが、ＩＬ−１０ＫＯマウスにおいてＲ．ホミニスの観察された防御効果はこの仮説を支持するが、ブチレートなどの他のシグナル伝達部分もまた、免疫制御に寄与し得る。
【０１１５】
マウス結腸内の腸障壁機能及び自然免疫を促進する際のＲ．ホミニスについての明確な役割は確立されていた。密着結合、ギャップ結合及び接着結合は、細菌移行を上皮下層に
制限するように作用する（Werth, M., Walentin, K., Aue, A.,Schonheit, J., Wuebken, A., Pode-Shakked, N., Vilianovitch, L., Erdmann, B.,Dekel, B., Bader, M. et al. (2010) The transcription factor grainyhead-like 2regulates the molecular composition of the epithelial apical junctionalcomplex. Development 137: 3835-3845）。クローン病及び潰瘍性大腸炎の両方は、障壁機能及び密着結合完全性の損失により特徴付けられる。興味深いことに、ＩＢＤにおける腸内微生物叢の腸内毒素症はファーミキューテス門の減少と関連する（Spor, A., Koren, O., & Ley, R. (2011) Unravelling the effects ofthe environment and host genotype on the gut microbiome. Nat. Rev. Microbiol.9: 279-290、Qin, J., Li, R., Raes, J., Arumugam, M.,Burgdorf, K. S.,
Manichanh, C., Nielsen, T., Pons, N., Levenez, F., Yamada, T. et al. (2010) Ahuman gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing.Nature 464: 59-65）。Ｒ．ホミニスが障壁遺伝子の発現を活発に増強するという観察は、ＩＢＤ患者におけるそれらの損失が機能的に有意であり得ることを示唆している。密着結合複合体の活性化は単にＲ．ホミニスの優位性だけでなく、バクテロイデス・セタイオタオミクロン（Bacteroides thetaiotaomicron）及びラクトバチラス・アシドフィラス（Lactobacillus acidophilus）などの他の片利共生生物もまた、粘膜障壁機能を増強し（Hooper, L. V., Wong, M. H., Thelin, A., Hansson, L., Falk, P. G.,& Gordon, J. I. (2001) Molecular analysis of commensal host-microbialrelationships in the intestine. Science 291: 881-884、Ukena,S. N., Singh, A., Dringenberg, U., Engelhardt, R., Seidler, U., Hansen, W.,Bleich, A., Bruder, D., Franzke, A., Rogler, G. et al. (2007) ProbioticEscherichia coli Nissle 1917 inhibits leaky gut by enhancing mucosal integrity.PLoS. One. 2: e1308）、ヒトＩＢＤにおけるこれらの細菌とのプロバ
イオティクス機会を推測する。
【０１１６】
腸免疫系に対するＲ．ホミニスの効果は興味深いものであった。最も強力な効果が上行結腸において認められ、Ｌｙ６ｇ６ｃなどの遺伝子は強力に上方制御され、Ｔ細胞活性化及びエフェクター機能に関与する、Ｔ細胞制御及び分化並びに免疫シナプスにおけるアクチン重合に関与する経路も同様である。Ｒ．ホミニス定着に応答するＴｒｅｇ遺伝子の発現は非常に強力ではないが、最も影響を受けるＴ細胞経路は、ＩＬ−１０、ＩＣＯＳ及びＣＴＬＡ−４に関連するものを含み、それらは全てＴｒｅｇ分化を支持することに関与する。重要なことに、出願人はこれらのマウスの結腸においてＣＤ３＋ＦｏｘＰ３＋細胞の有意な増加を実証できた。これらの見解はＴｒｅｇ分化を引き起こす他のクロストリジウム属種での最近のデータを補完する。明らかに、Ｒ．ホミニスは粘膜Ｔ細胞増殖を促進でき、Ｔ細胞分化に影響を与える。
【０１１７】
特にＲ．ホミニスによる単独定着後２８日に、回腸と比較して結腸において強力な免疫効果が認められることは興味深いことであった。１４日におけるトランスクリプトームデータにより、一部の免疫プライミングがこの時点にて回腸で開始され得ることが示唆される。２８日における上行結腸内の異なるＴ細胞サブセットに対する効果は、したがって、回腸から腸間膜リンパ節、腸間膜リンパ節から結腸までの細胞の輸送及びホーミングを反映し得る。
【０１１８】
Ｒ．ホミニス定着の興味深いさらなる生物学的効果は、食物に対する応答及び食欲の制御に影響を与える遺伝子の制御であった。特に、満腹ホルモンＣｃｋ及びＧｃｇは有意に減少した。食物摂取に対するＣｃｋの効果は迷走神経求心性経路を介して媒介される。これは主要な神経経路であり、その神経経路により、摂取した栄養素に関する情報が中枢神経系に到達して腸機能及び採食行動の両方に影響を与える。Ｃｃｋは、食欲及び採食を刺激する分子の発現を低下させ、採食を阻害する分子の発現を上昇させ、食欲を減退させるように迷走神経系に作用する（Ｎｐｙ２ｒ及びＣａｒｔｐｔの両方は現在の研究において２倍下方制御された）。Ｃｃｋ、Ｇｃｇ及び片利共生細菌の間の関連は今まで報告されて
いないが、脂肪酸及びタンパク質の両方はＣｃｋ及びＧｃｇの強力な誘導因子である（Geraedts, M. C.,Troost, F. J., Tinnemans, R., Soderholm, J. D., Brummer, R. J., & Saris, W. H. (2010) Release of satiety hormones in response to specific dietary proteins is different between human and murine small intestinal mucosa. Ann.Nutr. Metab 56: 308-313）。Ｒ．ホミニスは６個未満の炭素の脂肪族末端を有するブチレートなどの短鎖脂肪酸を産生し、この代謝活性は、より長い鎖の脂肪酸と共に観察された血漿Ｃｃｋに対する刺激作用を減少することが報告されている（McLaughlin, J., Grazia, L. M., Jones, M. N., D'Amato, M., Dockray,G. J., & Thompson, D. G. (1999) Fatty acid chain length determines cholecystokinin secretion and effect on human gastric motility.Gastroenterology 116: 46-53）。興味深いことに、屠体重量分析により、体重及び脂質含量の両方が実際に、Ｒ．ホミニスと共に有意に増加し、従来の無菌マウスにおいて観察された体重増加と一致したことが明らかにされた （Turnbaugh, P. J., Ley, R. E., Mahowald, M. A., Magrini, V., Mardis,E. R., & Gordon, J. I. (2006) An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. 
Nature 444: 1027-1031）。Ｃｃｋ及びＧｃｇの関与が以前に報告されていないので、このことが、現在の研究において見られる満腹ホルモンの減少の直接的効果であるかどうかは依然として不明である。しかしながら、部分的にＳＣＦＡの放出を介する、微生物叢定着と食事からのエネルギー収集との間の関連が以前に示されていることを認識することは重要である（Tremaroli, V., Kovatcheva-Datchary, P., & Backhed, F. (2010) A role for the gut `microbiota in energy harvesting? Gut 59: 1589-1590）。Ｒ．ホミニスが主要なブチレート産生因子であることを考慮すると、この機構はまた、Ｒ．ホミニス処置後に観察される代謝効率に寄与するようである。
【０１１９】
要約すれば、Ｒ．ホミニスによるマウスの腸の単独会合は、この腸に適応した細菌の細菌膜輸送、走化性及び運動性の変化と一致した強力な双方向性遺伝子発現事象並びに宿主の自然及び適応免疫系の同時活性化を誘導した。この代謝的に活性な細菌はまた、定着したマウスにおける体重増加の増強と相関する食欲及び満腹遺伝子に対して重要な効果を与えた。
【０１２０】
組成物
本発明の別の態様は、上記の細菌種及び薬学的に許容される賦形剤、担体又は希釈剤を含む組成物に関する。適切な賦形剤、希釈剤、担体は以下に記載されている。
【０１２１】
組成物は任意の組成物であってもよいが、好ましくは、経口、経腸又は直腸内に投与される組成物である。例えば、組成物は食用組成物であってもよい。「食用」とは、ヒト又は動物の消費のために承認されている物質を意味する。
【０１２２】
本発明の別の態様は、上記の細菌種を含むプロバイオティクス組成物に関する。
【０１２３】
本明細書で使用する場合、「プロバイオティクス」という用語は、宿主の健康又は健康な状態に対する有益な効果を有する微生物細胞の微生物細胞調製物又は成分を意味する（Salminen S, Ouwehand A. Benno Y. et al "Probiotics: how should they be defined" Trends Food Sci. Technol. 1999:10 107-10）。
【０１２４】
好ましくは、プロバイオティクス組成物は、代謝的に活性、すなわち生きた及び／若しくは凍結乾燥した、又は生育不能な熱殺菌された、放射線照射された、若しくは溶解したプロバイオティクス細菌の経口投与可能な組成物である。プロバイオティクス組成物は他の成分を含有してもよい。本発明のプロバイオティクス組成物は、経口的に、すなわち錠剤、カプセル剤又は粉末剤の形態で投与されてもよい。Ｒ．ホミニスは嫌気性菌であるので、カプセル化された製品がＲ．ホミニスに好ましい。他の成分（例えば、ビタミンＣな
ど）が脱酸素剤として含まれてもよい。それらのようなプロバイオティクス基質はインビボで定着及び生存を向上させる。或いは、本発明のプロバイオティクス組成物は、乳若しくは乳清ベースの発酵乳製品などの食品又は栄養製品として、又は医薬製品として経口投与されてもよい。
【０１２５】
プロバイオティクス細菌の適切な１日用量は、約１×１０３〜約１×１０１１コロニー形成単位（ＣＦＵ）、より好ましくは約１×１０７〜約１×１０１０ＣＦＵ、より好ましくは約１×１０６〜約１×１０１０ＣＦＵである。
【０１２６】
１つの好ましい実施形態において、組成物は、組成物の重量に対して、約１×１０６〜約１×１０１１ＣＦＵ／ｇ、好ましくは約１×１０８〜約１×１０１０ＣＦＵ／ｇの量で、活性成分として細菌種及び／又はその細胞成分を含有する。用量は１ｇ、３ｇ、５ｇ及び１０ｇであってもよい。
【０１２７】
典型的に、プロバイオティクスは、少なくとも１つの適切なプレバイオティクス化合物と場合によっては、組み合わされてもよい。プレバイオティクスは、通常、オリゴ糖若しくは多糖などの消化されない炭水化物、又は上部消化管内で分解若しくは吸収されない糖アルコールである。公知のプレバイオティクスには、イヌリン及びトランスガラクトオリゴ糖などの市販製品が含まれる。
【０１２８】
好ましくは、本発明の組成物は、組成物の全重量に対して、約１〜約３０重量％、好ましくは５〜２０重量％の量でプレバイオティクスを含む。好ましい炭水化物は、フラクトオリゴ糖（又はＦＯＳ，fructo-oligosaccharide）、短鎖フラクトオリゴ糖、イヌリン、イソマルトオリゴ糖、ペクチン、キシロオリゴ糖（又はＸＯＳ，xylo-oligosaccharide）、キトサンオリゴ糖（又はＣＯＳ，chitosan-oligosaccharide）、ベータ−グルカン、アラブルガム（arable gum）修飾及び難消化性デンプン、ポリデキストロース、Ｄ−タガトース、アカシア繊維、イナゴマメ、オートムギ及び柑橘類繊維から選択される。特に好ましいプレバイオティクスは、短鎖フラクトオリゴ糖（以下、簡単にＦＯＳｓ−ｃ．ｃと示す）であり、前記ＦＯＳｓ−ｃ．ｃは消化されない炭水化物であり、一般に甜菜糖の変換により得られ、３個のグルコース分子が結合するサッカロース分子を含む。
【０１２９】
飼料／製品
本発明のさらなる態様は、上記に定義した細菌種を含有する食品、栄養補助食品、機能性食品、栄養製剤、飲料及び薬剤、並びにそれらの使用に関する。
【０１３０】
１つの好ましい実施形態において、組成物は、さらに少なくとも１つの他の種類の他の食品等級細菌を含み、その食品等級細菌は好ましくは、乳酸菌、ビフィズス菌、プロピオニバクテリウム及びそれらの混合物からなる群から選択される。
【０１３１】
本発明の１つの態様は、上記に定義した細菌種を含む食品に関する。「食品」という用語は、固体、ゼリー状又は液体であり得る全ての消費可能な製品を含むことを意図する。適切な食品には、例えば、機能的食品、食品組成物、ペットフード、家畜飼料、健康食品、飼料などが含まれてもよい。１つの好ましい実施形態において、食品は健康食品である。
【０１３２】
本明細書で使用する場合、「機能的食品」という用語は、栄養学的効果を提供できるだけでなく、さらなる有益な効果を消費者に送達もできる食品を意味する。したがって、機能的食品は、食品に純粋な栄養学的効果以外に特別の機能的、例えば医学的又は生理的有益性を与える、それらに組み込まれる構成要素又は成分（本明細書に記載したものなど）を有する通常の食品である。
【０１３３】
本発明に適用可能な特別な食品の例には、乳ベースの製品、食べられる状態になっているデザート、例えば乳又は水で再構成するための粉末、チョコレートミルク飲料、麦芽飲料、食べられる状態になっているディッシュ、ヒト用のインスタントディッシュ若しくは飲料又はペット若しくは家畜を対象とした完全若しくは部分的な食事を表す食品組成物が含まれる。
【０１３４】
１つの好ましい実施形態において、本発明に係る組成物は、ヒト、ペット又は家畜を対象とした食品である。組成物は、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ及びトリからなる群から選択される動物を対象としてもよい。好ましい実施形態において、組成物は、成体種、特にヒトの成体を対象とした食品である。
【０１３５】
本発明において、「乳ベースの製品」とは、様々な脂肪含量を有する任意の液体又は半固体の乳又は乳清ベースの製品を意味する。乳ベースの製品は、例えば、牛乳、山羊乳、羊乳、スキムミルク、全乳、粉ミルク及びいかなる加工もせずに乳清から再結合されたミルク、又はヨーグルト、凝固した乳、凝乳、酸乳、酸全乳、バターミルク及び他の酸乳製品などの加工製品であってもよい。別の重要な群には、乳清飲料、発酵乳、コンデンスミルク、乳児用又は幼児用ミルク、フレーバーミルク、アイスクリーム、スイーツなどのミルクを含有する食品などの乳飲料が含まれる。
【０１３６】
本発明の他の態様は、上記に定義した細菌種を含む飼料又は動物飼料に関する。
【０１３７】
本発明の組成物は、本明細書中で栄養補助食品若しくは栄養補助剤又は食品添加物とも称される、補助栄養食品であってもよく、又はそれらに追加されてもよい。したがって、本発明の別の態様は、本発明に係る１又は２以上の細菌株を含む栄養補助食品又は食品添加物に関する。
【０１３８】
本発明に係る細菌種及びプロバイオティクス組成物はまた、特に早期離乳期間及び成長肥育期間において動物栄養（例えばブタの栄養）に使用されてもよい。プロバイオティクスは、免疫機能を増強させ、感染病を減少させ、予防し、有益に微生物叢組成物を変化させ、例えば、飼料転換効率の増加により、動物の成長及び能力を向上させることが予想される。
【０１３９】
希釈剤、賦形剤及び担体
上述のように、本発明はまた、上記に定義した細菌種を含む、組成物、より好ましくは医薬組成物又は栄養補助剤、及びそれらの使用に関する。細菌種は一般に、特にヒトの療法のために、薬学的又は栄養学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤と共に混合物で投与される。医薬組成物はヒト医学及び獣医学におけるヒト又は動物の使用のためであってもよい。
【０１４０】
本明細書に記載されている医薬組成物の様々な異なる形態についてのこのような適切な賦形剤の例は、A Wade and PJ Weller編、「Handbook of Pharmaceutical Excipients,2nd Edition, (1994)に見出され得る。
【０１４１】
治療的使用のために許容される担体又は希釈剤は、薬剤分野において周知であり、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985)に記載されている。
【０１４２】
適切な担体の例には、ラクトース、デンプン、グルコース、メチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、マンニトール、ソルビトールなどが含まれる。適切な希釈剤の例に
は、エタノール、グリセロール及び水が含まれる。
【０１４３】
医薬担体、賦形剤又は希釈剤の選択は、目的とする投与経路及び標準的な薬務に関して選択されてもよい。医薬組成物は、担体、賦形剤又は希釈剤、任意の適切な結合剤（複数も含む）、潤滑剤（複数も含む）、懸濁化剤（複数も含む）、コーティング剤（複数も含む）、可溶化剤（複数も含む）として含んでもよいか、又はそれらに加えて含んでもよい。
【０１４４】
適切な結合剤の例には、デンプン、ゼラチン、グルコースなどの天然糖、無水ラクトース、フリーフローラクトース、ベータ−ラクロース、コーンシロップ、アカシア、トラガカント又はアルギン酸ナトリウムなどの天然及び合成ゴム、カルボキシメチルセルロース並びにポリエチレングリコールが含まれる。
【０１４５】
適切な潤滑剤の例には、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどが含まれる。
【０１４６】
保存料、安定剤、染料及びさらに香味料が、医薬組成物中に提供されてもよい。保存料の例には、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸及びｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルが含まれる。酸化防止剤及び懸濁化剤もまた、使用されてもよい。
【０１４７】
栄養学的に許容される担体、希釈剤及び賦形剤には、ヒト又は動物の消費に適しており、食品産業において標準物として使用されるものが含まれる。典型的な栄養学的に許容される担体、希釈剤及び賦形剤は、当業者によく知られている。
【０１４８】
投与
本発明の組成物は、経口、直腸、膣、非経口、筋肉内、腹腔内、動脈内、髄腔内、気管支内、皮下、皮内、静脈内、経鼻、口腔又は舌下の投与経路に適応されてもよい。好ましくは、本発明の組成物は、経口、直腸、膣、非経口、経鼻、口腔又は舌下の投与経路に適応される。
【０１４９】
経口投与に関して、特定の使用は、圧縮錠剤、丸薬、錠剤、ゲル剤（gellule）、点滴
剤、及びカプセル剤から構成される。
【０１５０】
他の投与形態は、静脈内、動脈内、髄腔内、皮下、皮内、腹腔内又は筋肉内に注射され得る液剤又は乳剤を含み、それらは無菌又は滅菌可能な溶液から調製される。本発明の医薬組成物はまた、坐剤、ペッサリー、懸濁剤、乳剤、ローション、軟膏、クリーム、ゲル、スプレー、液剤又は粉剤の形態であってもよい。
【０１５１】
経皮投与の代替手段は皮膚用パッチ剤の使用による。例えば、有効成分が、ポリエチレングリコール又は流動パラフィンの水性乳剤からなるクリーム内に組み込まれてもよい。細菌株はまた、必要とされ得る場合、このような安定剤及び保存料と一緒に白ろう又は白軟パラフィン基からなる軟膏内に組み込まれてもよい。
【０１５２】
組成物は、単位剤形、すなわち単位用量、又は単位用量の複数回若しくは副単位を含有する別個の部分の形態で製剤化されてもよい。
【０１５３】
投薬量
当業者は、過度の実験をせずに対象に投与するために即時の組成物の１つの適当な用量を容易に決定できる。典型的に、医師は個々の患者に最も適した実際の投薬量を決定し、
それは、利用される特定の細菌株の活性、代謝的安定性及びその株の作用の長さ、年齢、体重、全体的な健康、性別、食事、投与様式及び時間、排泄速度、薬物併用、特定の状態の重症度、並びに個々の受けている療法を含む様々な要因に依存する。本明細書に開示される投薬量は平均の場合の例である。もちろん、より高い又はより低い投薬量範囲が有益である個々の事例が存在してもよく、それらは本発明の範囲内である。
【０１５４】
ヒトにおける通常の有効な１日用量は、約１×１０３〜約１×１０１１、より好ましくは約１×１０７〜約１×１０１１、さらにより好ましくは約１×１０６〜約１×１０１０ＣＦＵである。
【０１５５】
組合せ
特に好ましい実施形態において、本発明の組成物は１又は２以上の他の活性剤と併用して投与される。このような場合、本発明の組成物は、１又は２以上の他の活性剤と連続、同時又は順次に投与されてもよい。
【０１５６】
本発明は以下の非限定的な実施例によりさらに記載される。
［実施例］
【０１５７】
材料及び方法
細菌成長条件
Ｒ．ホミニスＡ２−１８３Ｔ（＝ＤＳＭ  １６８３９Ｔ＝ＮＣＩＭＢ  １４０２９Ｔ）を、合成ＹＣＦＡ又は複合Ｍ２ＧＳＣ培地上で嫌気的に成長させた。培養物をHungateチ
ューブ内に凍結ストックから接種し、３７℃にて一晩インキュベートした。次いで、３７℃にて８０％Ｎ２、１０％ＣＯ２、及び１０％Ｈ２下でMACS-MG-1000嫌気性ワークステーション（Don WhitleyScientific社）において４８時間、Ｍ２ＧＳＣ寒天プレート上で細菌を成長させた。０．５％（ｗ／ｖ）のブタ胃III型由来のムチン（mucin from porcine stomach typeIII）（Sigma-Aldrich社）をＹＣＦＡ培地に添加することによりムチンの
効果を調べた。
【０１５８】
無菌マウスの定着のために、３７℃にて一晩、Ｒ．ホミニスをＹＣＦＡ培地中で成長させた。培養物を遠心沈殿し、２％システイン（ｗ／ｖ、Sigma-Aldrich社）及び３％アス
コルビン酸（ｗ／ｖ、Sigma-Aldrich社）を補った１ｍＬのＹＣＦＡ培地中にペレットを
再懸濁した。
【０１５９】
動物実験
Jouy-en-Josas（ANAXEM plateform、Institut Micalis社、INRA、Jouy-en-Josas、France）にてＩＮＲＡノトバイオート齧歯動物飼育室において無菌動物実験を実施した。全ての動物実験は地域の倫理委員会による承認を得た。１８匹の無菌Ｃ３Ｈ／ＨｅＮオスマウスを対照（Ｎ＝８）及び処置（Ｎ＝１０）群に割り当て、プラスチック隔離飼育器内に個々に収容した。滅菌した市販飼料（R03-40、UAR社）をマウスに自由に採食させた。０日
目に、処置群の動物に１００μＬのＲ．ホミニス培養物を強制飼養により与え、一方で、対照動物に１００μＬのＹＣＦＡ培地を与えた。１４及び２８日目に、４匹の対照動物及び５匹のＲ．ホミニスで処置した動物を屠殺した。Rowett Institute of Nutrition and Health（Aberdeen、Scotland、UK）にてＣ５７／ＢＬ６  ＩＬ−１０ＫＯ実験を実施した。野生型マウス（Ｎ＝８）、ＩＬ−１０ＫＯ（Ｎ＝１２）及びＩＬ−１０ＫＯ＋Ｒ．ホミニス（Ｎ＝１１）を実験の着手から１４週で分析した。簡潔に述べると、１０９ｃｆｕ／日にて週に３回、Ｒ．ホミニスを投与した。
【０１６０】
回腸、上行結腸及び下行結腸を４つの等しい部分に分け、RNAlater（Ambion社）、中性緩衝ホルマリン（Sigma-Aldrich社）又は液体窒素に移した。全盲腸及び横行結腸をRNAla
terに移した。病理組織もまた、ＩＬ−１０ＫＯマウスにおいて評価した。
【０１６１】
組織培養実験
他に指定しない限り、全ての細胞培養試薬はSigma-Aldrich社により供給された。加熱
不活性化したウシ胎仔血清（Gibco社）、ペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリ
シンＢ及びＬ−グルタミンを補った１．５ｍＬのＤＭＥＭ（高グルコース、ＨＥＰＥＳ）培地中の２×１０５  Ｃａｃｏ−２又はＨＴ２９細胞を、６ウェルのトランスウェルプレート（Corning社）の上側区画内に播種した。下側区画は３．０ｍＬの同じ培地を含有し
た。コンフルエンス後、３日まで、５％ＣＯ２雰囲気中で３７℃にて細胞をインキュベートし、ハンクス液で洗浄して抗生物質及びＦＣＳを除去し、抗生物質を含まずに２４時間、Ｌ−グルタミン、亜セレン酸ナトリウム及びトランスフェリンを補ったＤＭＥＭ中で逓減させた。次いで、トランスウェル挿入物を、３７℃にて嫌気性ワークステーション内の嫌気性培養ボックスに移した。各挿入物の上側区画を嫌気性ＤＭＥＭ細胞培地で充填し、一方、下側区画を含酸素ＤＭＥＭで充填した。
【０１６２】
Ｒ．ホミニスＡ２−１８３培地を、５分間、３，５００×ｇでの遠心分離により対数期にて収集した。ペレットを洗浄し、０．８ｍＬの嫌気性ＤＭＥＭ中に再懸濁した。１００マイクロリットルの細菌懸濁液（１０８ＣＦＵ／ｍＬ）を実験ウェルに加えた。対照ウェルに、細菌細胞を含まない同量の培地を与えた。さらなる対照は、Ｃａｃｏ−２又はＨＴ２９細胞を含まずにインキュベートした細菌細胞を含んだ。
【０１６３】
２時間及び４時間のインキュベーション後に細菌及び真核細胞を収集した。非接着及び接着細菌の両方を吸引し、RNAlater中に保存した。ＹＣＦＡプレート上に蒔くことによりＲ．ホミニス細胞の生存能力を試験した。Ｃａｃｏ−２細胞又はＨＴ−２９細胞をウェルから収集し、また、RNAlater中に保存した。
【０１６４】
Ｒ．ホミニスライブラリー構築
小サイズのライブラリー構築及びパイロシークエンスのためにＲ．ホミニス染色体ＤＮＡを、UltraClean（商標）Microbial DNA Isolation Kit（Mo BioLaboratories Inc社）を使用して単離し、フォスミドライブラリーのために高分子量ＤＮＡを、WizardGenomic
DNA Purificationキット（Promega社）を使用して単離した。ＤＮＡ完全性をゲル電気泳動により検査した。
【０１６５】
Nebulizerキット（Invitrogen社）を使用してＤＮＡを機械的に剪断し、ゲル電気泳動
により断片化した。所望のサイズのＤＮＡ断片をゲルから切り取り、Wizard（登録商標）SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega社）を使用して精製した。DNA Terminator End Repair Kit（Lucigen社）を用いて末端修復を行った。CloneSmart（登録商標）LCAmpキット（Lucigen社）を使用して１．５〜３．５ｋｂ断片をクローニングし、pJAZZ（登録商標）-OCベクター（Lucigen社）を使用して４〜８ｋｂのライブラリーを構築した。CopyControl（商標）Fosmid Library Production Kit（Epicentre Biotechnologies社）を使用
してフォスミドライブラリーを構築した。自動化コロニーピッカー（BioRobotics BioPick、Genomic Solutions社）を使用してコロニーをピッキングし、１０％グリセロール及び対応する抗生物質を補った７０μＬの２×ＬＢ培地を含有する３８４ウェルマイクロタイタープレート内に保管した。３７℃にて一晩、振盪しながら細胞を成長させ、−８０℃にて保存した。
【０１６６】
シークエンシング、アセンブリ、及び注釈
小サイズのライブラリーのシークエンシングのための鋳型を、１μＬのクローンバイオマス並びにｐＳＭＡＲＴ−ＬＣＡｍｐのクローニング部位を囲むプライマーＳＬ１及びＳＲ２を使用してＰＣＲにより生成した。Multiscreen PCR Clean-upフィルタプレート（Mi
llipore社）を使用してＰＣＲ産物を精製した。Wizard（登録商標）SV 96 Plasmid DNA Purification System（Promega社）を使用してpJAZZ（登録商標）-OCクローン由来の組換
えＤＮＡを単離した。FosmidMAX（商標）DNAPurification Kit（Epicentre社）を使用してフォスミドＤＮＡを単離した。異なる挿入サイズを有するＲ．ホミニスＷＧＳライブラリー由来のＤＮＡ断片の末端読み取りを、CEQ8000（Beckman Coulter社）及びABI 3770（Applied Biosystems社）ＤＮＡシークエンサーを使用して得た。Ｒ．ホミニス由来のゲノムＤＮＡもまた、454 GS20（454 Life Sciences社）及び454 FLXシークエンサー（Roche
社）を使用してシークエンスした。Sanger及び454データを、ＭＩＲＡバージョン３（http://chevreux.org/projects_mira.html、（Chevreux,B., Wetter, T., & Suhai, S. (1999) Genome sequence assembly using tracesignals and additional sequence information. Computer Science and Biology:Proceedings of the German Conference on Bioinformatics (GCB) 99: 45-56）を用いてアセンブルした。ＲＡＳＴ注釈パイプライン（http://rast.nmpdr.org、（Aziz, R. K., Bartels,D., Best, A. A., DeJongh, M., Disz,
T., Edwards, R. A., Formsma, K., Gerdes, S., Glass, E. M., Kubal, M. et al.(2008) The RAST Server: rapid annotations using subsystems technology. BMCGenomics
9: 75））を、ゲノムの自動及び手動注釈のため並びに比較ゲノム分析のために使用した。Ｒ．ホミニスＡ２−１８３の注釈ゲノム配列を、受託番号ＣＰ００３０４０としてGenBankに提出した。
【０１６７】
マイクロアレイ分析
細菌マイクロアレイ
RNeasyミニキットを使用してマウス盲腸内容物から細菌ＲＮＡを単離し、MICROBEnrich（商標）キット（Ambion社）、MICROBExpress（商標）細菌ｍＲＮＡ濃縮キット（Ambion
社）、及びMessageAmp（商標）II-細菌ＲＮＡ増幅キット（Applied Biosystems社）を用
いてさらに処理した。ｃＤＮＡ合成（CyScribe First strand cDNA標識キット、Amersham社）の間、ｄＣＴＰ−Ｃｙ３又はｄＣＴＰ−Ｃｙ５のいずれかでＲＮＡを標識した。CyScribe GFX精製キット（Amersham社）を使用して標識した産物を精製した。ＲＡ８ライブラリーにおける６０００個のクローンから増幅させたＰＣＲ産物を、MicroGrid II TAS（BioRobotics社）を使用してアミノシランでコーティングした顕微鏡スライド（Corning社）上で２連にて配列させた。ハウスキーピング遺伝子ｒｐｏＤ及びｇｙｒＡの増幅させた断片を対照としてアレイ上に無作為に分配した。マイクロアレイハイブリダイゼーションを、GeneTACハイブリダイゼーションステーション（Genomic Solutions社）において実施した。色素標識を第２のハイブリダイゼーションのために取り換え、別のＲＮＡ精製もまた標識し、再現性を確実にするため、及び統計的に有意な結果を得るために２回ハイブリダイズした。各比較について、増幅させたクローンごとに合計で１２個のハイブリダイズスポットのために、合計で４枚のスライドをハイブリダイズした。GeneTac Integrator version 3.0.1ソフトウェアと共にGeneTACLS IV（Genomic Solutions社）を使用して２つのチャネルにおいて蛍光を測定した。スポット強度を対数変換し（log-transformed）、Ｌ
ｏｅｓｓ正規化を適用して、プローブ標識とハイブリダイゼーション効率との差異を取り除いた。示差的発現を試験するために対数比の値で１サンプルのｔ検定を使用した。２を超える倍率変化及びＰ値が０．０５未満である場合、データは有意であるとみなした。
【０１６８】
マウスマイクロアレイ分析
回腸及び上行結腸組織をRNAlaterから取り除き、Trizol（Invitrogen社）中に溶解した。標準的なクロロホルム／イソプロパノールステップを使用してＲＮＡを単離した。Rnase-free DNase I（Qiagen社）消化ステップを含む、RNeasyキット（Qiagen社）を用いて全ＲＮＡをさらに精製した。Agilent 2100 Bioanalyzer（AgilentTechnologies社）を使用してＲＮＡ完全性を決定した。One-Cycle TargetLabeling Kit（Affymetrix社）を使用
して全ＲＮＡを処理してビオチン標識ｃＲＮＡにした。GeneChip Fluidics Station 450
（Affymetrix社）上でのGeneChip MouseGenome Array（Affymetrix社）とのハイブリダ
イゼーションを、Institute of Medical Sciences Microarray CoreFacility（University of Aberdeen、UK）にて実施した。Affymetrix GeneChip Scanner 3000（Affymetrix社）を用いてチップを走査した。Gene Chip OperatingSoftware（ＧＣＯＳ）（Affymetrix社）を使用して画質分析を実施した。自由に利用可能なソフトウェアパッケージＲ（http://www.r-project.org）及びBioconductor（http://www.bioconductor.org）を用いてさ
らなるデータ分析を実施した。Bioconductorパッケージlimmaにより提供される、調整し
た（moderated）Ｆ検定を使用して、示差的発現を試験した。Benjamini及びHochbergの偽発見法を使用してＰ値が０．０５未満の場合、データは有意であるとみなした。２回の時点の各々について別々に統計的解析を実施した。全ての発現量に差のある遺伝子（Ｐ値が０．０５未満）をMetaCore解析ソフトウェア（GeneGo社、St Joseph、MI）にインポート
して経路マップを生成した。知識ベースの標準経路及び内因性代謝経路を使用して統合経路のエンリッチメント解析を実施した。関連する統合経路の順位付けは、超幾何分布を使用して算出したｐ値に基づいた。Ｐ値は、偶然にマップ内のある特定の数の遺伝子と一致する入力リストからの所与の数の遺伝子の可能性を表し、マップ上の全ての遺伝子の完全なセット内のマップ内の遺伝子の数に対する実験における遺伝子の数とみなす。
【０１６９】
ＤＡＶＩＤ（http://david.abcc.ncifcrf.gov）、オリジナルのウェブアクセス可能な
プログラムの拡張バージョンを使用してデータの遺伝子オントロジー（ＧＯ，Gene Ontology）に基づいた機能的解釈を実施した（Dennis, G., Jr., Sherman, B. T., Hosack, D.
A., Yang, J., Gao, W., Lane, H. C., & Lempicki, R. A. (2003) DAVID:Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery. Genome Biol.4: 3）。有意に異なる転写産物（Ｐ値が０．０５未満）を、ＧＯカテゴリー「生物学的プロセス」に割り当てて、特定のＧＯタームについて有意に高めた遺伝子発現のパターンを掘り出した。
【０１７０】
マイクロアレイデータは、National Center for BiotechnologyInformation（ＮＣＢ
Ｉ）Gene Expression Omnibus（受託番号ＧＳＥ２５５４４；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）に提出した。
【０１７１】
ＲＴ−ＰＣＲ分析
細菌ＰＣＲプライマーはオンラインツールPrimer3Plus（Untergasser, A., Nijveen, H., Rao, X., Bisseling, T., Geurts, R.,& Leunissen, J. A. (2007) Primer3Plus, an
enhanced web interface to Primer3. Nucleic Acids Res. 35: W71-W74）を使用して設計し、及びSigma-Aldrich社から購入した。Power SYBR Green PCRMaster Mix（Applied Biosystems社）を備えた7500 Fast Real-Time PCR System（AppliedBiosystems社）を使用してリアルタイムＰＣＲ分析を実施した。以下のようにＰＣＲを実施した：１０分間９５℃にて１サイクル、続いて１５秒間９５℃及び１分間６０℃にて４０サイクル、解離ステップで終了する。全ての試料は３回測定で実施した。試料間のその低い変動に起因して正規化するための参照遺伝子としてＧｙｒＡを使用した。
【０１７２】
宿主遺伝子発現のために、回腸及び上行結腸から単離した２μｇの全真核ＲＮＡを、ランダムプライマーと共にHighCapacity cDNA Reverse Transcription Kit（AppliedBiosystems社）を使用してｃＤＮＡに逆転写した。QuantiFast SYBR Green PCRKit（Qiagen
社）及びQuantiTect Primer Assays（Qiagen社）と共に7500 Fast Real-Time PCR System（AppliedBiosystems社）を使用してリアルタイムＰＣＲ分析を実施した。ＰＣＲサイクル条件は以下の通りであった：５分間９５℃にて１サイクル、続いて１０秒間９５℃にて及び３０秒間６０℃にて４０サイクル、解離ステップで終了する。全ての試料は３回測定で実施した。試料間のその低い変動のために正規化のための参照遺伝子としてＨｐｒｔを選択した。Ｐ値が０．０５未満の有意なカットオフで不等分散を可能にするスチューデントｔ検定によりベース２を用いて対数目盛り上で全てのＲＴ−ＰＣＲデータを分析した。差異を逆変換して倍率変化を算出した。
【０１７３】
ウェスタンブロット
ロゼブリア・ホミニスＦｌａ２に対する免疫精製したウサギポリクローナル抗体を（Duck, L. W.,Walter, M. R., Novak, J., Kelly, D., Tomasi, M., Cong, Y., & Elson, C. O.(2007) Isolation of flagellated bacteria implicated in Crohn's disease.Inflamm. Bowel. Dis. 13: 1191-1201）に記載されているように産生した。簡潔に述べると
、メスのニュージーランド白ウサギを完全フロインドアジュバント中の合成ペプチドで免疫化し、数回追加免疫した。Ｒ．ホミニスｆｌａ２について、ペプチド２６１〜２７５（C-AQYNDDAKSVLEILK-COOH）及びペプチド５８〜７１（C-GLNKASRNSQDGIS-CONH2）を使用した。免疫化後、ペプチドを１ｍＬの活性化したセファロースビーズにカップリングすることにより調製したイムノアフィニティーカラム上で抗体を精製した。
【０１７４】
ウェスタンブロットのために、上行結腸の腸内容物を、８Ｍの尿素を含有するlaemmli
緩衝液中に懸濁した。Ｒ．ホミニスバイオマス（陽性対照）を同じ緩衝液中に希釈した。３０μＬの各試料を、NuPAGE（登録商標）Novex（登録商標）４〜１２％Bis-Trisゲル（Invitrogen社）のウェルに負荷し、電気泳動し、続いてWesternBreeze Chemiluminescent Immunodetection System（Invitrogen社）を使用してさらに処理した。Ｆｌａ２抗体を抗体希釈剤中で１：１０００に希釈し、アルカリホスファターゼがコンジュゲートした抗ウサギと共に４℃にて一晩、続いて室温にて１時間インキュベートした。Fuji LAS3000画像システムを使用して検出を達成した。
【０１７５】
乾燥体重及び体脂質分析
取り出したマウスの屠体を秤量し、一定重量に凍結乾燥し、次いで分析のために粉砕した。以前に記載されている（Olivera,L., Canul, R. R., Pereira-Pacheco, F., Cockburn, J., Soldani, F., McKenzie, N.H., Duncan, M., Olvera-Novoa, M. A., & Grant, G. (2003) Nutritional and physiological responses of young growing rats to diets containing raw cowpea seed meal, protein isolate (globulins), or starch. JAgric. Food Chem. 51: 319-325）ようにクロロホルム／メタノール（２：１ｖ／ｖ）を用いた抽出（１：１００ｗ／ｖ）により脂質含量を決定した。
【０１７６】
ＦＩＳＨ分析
一般的な細菌プローブＥｕｂ３３８及び新たに設計したＲ．ホミニスＡ２−１８３−特異的プローブを使用して腸組織切片においてＦＩＳＨ分析を実施した。
【０１７７】
中性緩衝ホルマリン中で固定した組織をTechnovit 8100（Heraeus Kulzer社）内に包埋した。回転式ミクロトーム（Leica社/Reichert Autocut）を使用して２ミクロンの切片を切断した。３個の切片を、組織内に１００μｍ、２００μｍ及び３００μｍにてスライドごとに取り、動物当たり９個の切片を得た。
【０１７８】
５０％（ｖ／ｖ）、８０％及び９６％エタノール中での連続インキュベーションによりスライドを脱水し、室温にて乾燥させた。使用した１６Ｓ  ｒＲＮＡ  ＦＩＳＨプローブは一般的な細菌プローブＥｕｂ３３８（GCTGCCTCCCGTAGGAGT;Cy3）及び新たに設計したＲ．ホミニスＡ２−１８３−特異的プローブ（GTACATTACATACTCTGTCAGTG;FITC）であり、これを、腸管細菌単離株のパネルに対する特異性について広範囲に試験した。１００μＬのハイブリダイゼーション緩衝液中の１０マイクロリットルプローブ（３０ｎｇ／μＬ）を脱水した試料に適用し、プローブ特異的温度にてインキュベートした。３０分間５０℃にて洗浄緩衝液中でスライドを洗浄し、氷冷水中に浸して、残留洗浄緩衝液を取り除き、圧縮空気流下で乾燥させた。４’６−ジアミジノ−２−フェニリンドール（ＤＡＰＩ、Vector Laboratories Inc社）を用いて対比染色を実施し、退色を防ぐためにスライドに蛍光
用のVectashield Mounting Medium（VectorLaboratories Inc社）を載せた。Leica DM R
BE蛍光顕微鏡（Leitz GMBH社）を使用して細菌を可視化し、Penguin 600CLカメラ（Pixera社）及びViewfinder 3.0ソフトウェア（Studio Lite社）を用いて写真を撮った。Apochromaticsシステム（Leica社）を使用して高倍率画像（６３倍）を読み出した。
【０１７９】
免疫蛍光
Ｔ細胞マーカーの免疫局在を連続的な低温切開片（８μｍ）において検査した。切片を、−２０℃にて３０分間、予め冷やしたメタノール（全て１：５０にてLy6G FITC、CD3 FITC、CD11b FITC（BD Biosciences社））中で固定したか、又はCD3 FITC（１：１００、BD Biosciences社）で二重標識したＦｏｘＰ３（１：５００、Abcam社）のために、室温にて２分間、１％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中で、続いてＰＢＳ中の０．０１％Triton X中で３分間固定した。全ての切片を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の１０％の関連する免疫前血清を含有する１０％ＢＳＡ（Sigma社）で遮断した。メタノールで固定した組織を
、室温にて１時間、一次抗体とインキュベートした。ＰＦＡで固定した切片を、４℃にて一晩、抗体とインキュベートした。Alexaヤギ抗ウサギ５９４（１：１０００、Molecular
Probes社）を使用してＦｏｘＰ３を可視化した。切片をＤＡＰＩで反対側を標識し、Vectashield（Vector Laboratories社）を載せた。陽性細胞の定量化のために、上記の画像
化ソフトウェア及び顕微鏡設定を使用して、各マウス切片から最低で５つの視野を検査した。
【０１８０】
組織構造
常に撹拌しながら、カルノア固定液（６０％（ｖ／ｖ）エタノール、３０％（ｖ／ｖ）クロロホルム及び１０％（ｖ／ｖ）氷酢酸）中で室温にて３時間、組織試料を固定した。試料を７０％エタノールに移し、横断面切片化のために方向付けるまで室温にて保存し、製造業者の指示書に従ってTechnovit 8100（Heraeus Kulzer社）を使用して低温硬化した樹脂中に包埋した。包埋した組織を、Technovit 3040（Heraeus Kulzer社）を使用してHistoblocs上に載せた。ガラスナイフ（TAAB LaboratoriesEquipment Ltd.社）を装着した回転式ミクロトーム（Leica Autocut）を使用して４ミクロンの切片を切断した。標準的
なヘマトキシリン／エオシン法を使用して組織切片を染色し、×１０及び×２０対物レンズを備えたZeissAxioskop顕微鏡を用いて検査した。QImagingカメラ及びImage Pro Plusソフトウェアを使用して画像を撮った。
【０１８１】
ロゼブリアに関連する種及び株のゲノムの比較
出願人は、単一の３，５９２，１２５−ｂｐの染色体により表される、Ｒ．ホミニスＡ２−１８３の完全ゲノム配列を生成した。ＲＡＳＴプラットフォームを使用したゲノムの自動化及び手動注釈により、４個のリボソームオペロン、６６個のＲＮＡ及び３，２７３個の予測タンパク質の存在が明らかになった。Ｒ．ホミニスＡ２−１８３、Ｒ．イヌリニボランスＤＳＭ  １６８４１、Ｒ．インテスチナリスＬ１−８２、Ｒ．インテスチナリスＭ５０／１及びユーバクテリウム・レクタレＡＴＣＣ  ３３６５６についてのサブシステムカテゴリー分布をそれぞれ図１１〜１５に示す。
【０１８２】
この情報は、各々の機能的サブシステムにおける遺伝子の数（丸括弧に提示する）の差異を示す。これらの遺伝子は、各々の個々の細菌に対する宿主応答の媒介において非常に重要である。重要なことに、これらの遺伝子は、数及び機能の両方において、様々な株の間で異なる。その結果を以下にまとめる。
【０１８３】
Ｒ．ホミニスＡ２−１８３
細胞壁及び被膜（５７）
膜輸送（２４）
運動性及び走化性（４９）
制御及び細胞シグナル伝達（１６）
休眠及び胞子形成（１２）
炭水化物（２７１）
【０１８４】
Ｅ．レクタレＡＴＣＣ  ３３６５６
細胞壁及び被膜（４１）
膜輸送（１３）
運動性及び走化性（１６）
制御及び細胞シグナル伝達（９）
休眠及び胞子形成（６）
炭水化物（１７２）
【０１８５】
Ｒ．インテスチナリスＬ１−８２
細胞壁及び被膜（３５）
膜輸送（３６）
運動性及び走化性（１５）
制御及び細胞シグナル伝達（１０）
休眠及び胞子形成（１７）
【０１８６】
Ｒ．インテスチナリスＭ５０／１
細胞壁及び被膜（２８）
膜輸送（３７）
運動性及び走化性（１７）
制御及び細胞シグナル伝達（１０）
休眠及び胞子形成（１７）
炭水化物（２０１）
【０１８７】
Ｒ．イヌリノボランス（inulinovorans）ＤＳＭ  １６８４１
細胞壁及び被膜（６９）
膜輸送（２６）
運動性及び走化性（１４）
制御及び細胞シグナル伝達（９）
休眠及び胞子形成（１７）
炭水化物（１６０）
【０１８８】
コンティグ１に見出される３０００を超える遺伝子の配列同一性パーセントは、Ｒ．ホミニスの細菌ゲノムとＥ．レクタレ、Ｒ．インテスチナリス及びＲ．イヌリニボランスの細菌との間の差異を強調する
種々のロゼブリア種と、Ｒ．ホミニスに最も近い近縁種である関連種ユーバクテリウム・レクタレのゲノム間の比較を行った。
【０１８９】
Ｒ．ホミニス参照ゲノム５８５３９４．１２
Ｅ．レクタレゲノムＡＴＣＣ３３６５５６  ５１５６１９．３
Ｒ．インテスチナリスＬ１−８２１６６４８６．４
Ｒ．インテスチナリスＭ５０／１１６６４８６．５
Ｒ．イヌリノボランスＤＳＭ１６８４１  ６２２３１２．３
【０１９０】
種々のロゼブリアゲノム間の潜在的な遺伝子の同一性パーセントは０％〜約９０％の配列同一性の範囲である。多くの遺伝子は仮説に基づき、株の間で異なる。多数の遺伝子は、他のロゼブリア種のゲノムに存在しないＲ．ホミニスゲノムに存在する。
【０１９１】
ロゼブリア・ホミニスは、他のロゼブリア種の他のゲノムに見出されない９２４個の遺伝子（０％同一性）を有し、そのゲノムのほぼ２５％がＲ．ホミニスに固有であることを示す。また、他の遺伝子間の低い相同性（１０〜７０％未満）により、多くの他の遺伝子の機能もまた、異なるようであることが示される。
【０１９２】
その情報は、これらの細菌がゲノム及び機能的観点から非常に異なり、一般に、全ての細菌に見出される原核生物ＤＮＡの保存された部分である保存遺伝子１６Ｓリボソーム遺伝子に基づく、それらの系統発生的関連性以外で分類できないという有力な証拠を提供する。１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列は、細菌系統発生及び分類学研究（共有遺伝子マーカー）のために使用される。
【０１９３】
宿主応答及び免疫に関連する機能は細菌株特異的である
図９は、クラスターXIVａ（ファーミキューテス門）、すなわち、ロゼブリア・ホミニ
ス、Ｅ．レクタレ及びロゼブリア・インテスチナリス由来の細菌の３つの株についての遺伝子発現データの比較を示す。そのデータは、ヒト上皮細胞に対する曝露後、系統発生的に関連する細菌株により発現させた固有の遺伝子の数を示す。５６，０００個の遺伝子を含有するAffymetrixヒトマイクロアレイを使用することにより遺伝子発現を決定した。この差異はそれらのそれぞれのゲノムの差異を反映する。［これらの実験は、マウスマイクロアレイを使用して本明細書のいずれかの場所に記載されているものと同様であるが、特定のヒトマイクロアレイを使用した。GeneChip（登録商標）Human Genome U133 Plus 2.0
Arrayは、第１の最も包括的な全ヒトゲノム発現アレイである。Affymetrix GeneChip（
登録商標）Human Genome U133 Plus 2.0 Array（HG-U133 Plus 2.0）マイクロアレイは、４７，０００個超の転写産物及びバリアントを含む１，３００，０００個の固有のオリゴヌクレオチドの特徴を含み、同様にそれは、約３９，０００個の最適に特徴付けられたヒト遺伝子を表す。異なる片利共生細菌により誘導されるシグナル伝達応答を評価するために使用される細胞株には、ヒト結腸細胞株Ｃａｃｏ−２細胞及びＨＴ−２９細胞並びにサルモネラ・エンテリティディス（Salmonella enteritidis）、腸内病原体に対して比較されるＲ．ホミニス、Ｅ．レクタレ及びＲ．インテスチナリスを含む細菌が含まれる。
【０１９４】
クラスターXIVａ細菌の機能差−Ｒ．ホミニスとＥ．レクタレとの間の比較
図１０は、ロゼブリア・ホミニスが、強力な抗炎症活性を有するＮＦ−κＢシグナル伝達の陰性制御因子であるＡ２０を誘導するが、他の細菌株は効果を有さないことを示す。ロゼブリア・ホミニスのフラジェリン部分もまた、関連細菌である、ユーバクテリウム・レクタレのものとは異なり、Ａ２０を誘導する。
【０１９５】
他に指定しない限り、細胞培養試薬はSigma-Aldrich社により供給された。１０％ウシ
胎仔血清（ＦＢＳ，Foetal Bovine Serum）（Gibco社、UK）、２００ｍＭのＬ−グルタミン及び１％の抗生物質／抗真菌薬を補ったダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ，Dulbecco's Modified Eagle Medium）中で培養したＣａｃｏ−２（ＥＣＡＣＣカタログ番号８６０１０２００２）及びＨＴ２９（ＡＴＣＣ）細胞株を、６ウェルトランスウェルプレート（Corning社）中に播種した。コンフルエンス後、３日まで、５％ＣＯ２雰囲気中で３
７℃にて細胞をインキュベートし、ハンクス液で洗浄して抗生物質及びＦＣＳを取り除き、抗生物質を含まずに２４時間、Ｌ−グルタミン、亜セレン酸ナトリウム及びトランスフェリンを補ったＤＭＥＭ中で逓減させた。次いでトランスウェル挿入物を、３７℃にて嫌気性ワークステーション内の嫌気性培養ボックスに移した。各挿入物の上側区画を嫌気性ＤＭＥＭ細胞培地で充填し、一方、下側区画を含酸素ＤＭＥＭで充填した。
【０１９６】
標準的なＹＣＦＡ及びＭ２培養培地中のロゼブリア・ホミニスＡ２−１８３及びＥ．レクタレＡＴＣＣ３３６５５６並びにＬＢ培養液中で培養したサルモネラ・エンテリク血清型エンテリティディス（Salmonella enteric serovar enteritidis）を、５分間、３，５
００ｘｇでの遠心分離により対数期にて収集した。ペレットを洗浄し、嫌気性ＤＭＥＭ中に再懸濁した。１００マイクロリットルの細菌懸濁液（１０８ＣＦＵ／ｍＬ）を実験ウェルに加えた。対照ウェルに、細菌細胞を含まない同量の培地を与えた。さらなる対照は、Ｃａｃｏ−２又はＨＴ２９細胞を含まずにインキュベートした細菌細胞を含んだ。
【０１９７】
２時間及び４時間のインキュベーション後に細菌及び真核細胞を収集した。非接着及び接着細菌の両方を吸引し、RNAlater中に保存した。Ｃａｃｏ−２細胞又はＨＴ−２９細胞をウェルから収集し、また、RNAlater中に保存した。
【０１９８】
Ａ２０ルシフェラーゼ遺伝子発現を決定するためのルシフェラーゼアッセイ
Fugene（登録商標）６トランスフェクション試薬（Roche社、UK）を、Ａ２０プロモー
ターｐＬｕｃ−Ａ２０及びｐＬｕｃ−Ａ２０Δ  ＮＦ−κＢ（Ａ２０プロモーター領域における３個のヌクレオチドにおいて変異した）の制御下のルシフェラーゼレポーター遺伝子並びにＡ２０プロモーターｐＣＡＧＧＳ−ＧＦＰ＼Ａ２０及びｐＬｕｃ−ＧＬ２＼ＮＦ−κＢの制御下のＧＦＰレポーター遺伝子を保有するプラスミドによるＨＴ２９細胞のトランスフェクションのために使用した。４８時間後、生細菌Ｒ．ホミニス、Ｅ．レクタレ及びＳ．エンテリティディス並びに組換えフラジェリン；Ｓ．エンテリティディス及びＲ．ホミニス（Ｆｌａ１）（１００ｎｇ／ｍｌ）を用いて、９、１２及び２４時間、細胞を刺激した。適当なベクター内にクローニングし、大腸菌ＪＭ１０９、ＢＬ２１及びＲｏｓｅｔｔａ中で発現させた完全長配列を使用して組換えフラジェリンを生成した。Dual-Glo（登録商標）ルシフェラーゼアッセイシステム（Promega社、UK）及びEnvision 2102 Multilabel Readerを使用してルシフェラーゼ（ホタル−ｆ−Ｌｕｃ及びウミシイタケ−ｒ−Ｌｕｃ）活性を決定した。ウミシイタケ対照に対する正規化により相対ルシフェラーゼレポーター活性を得た。
【０１９９】
本発明の記載されている態様の種々の修飾及び変更は、本発明の範囲及び精神から逸脱せずに当業者に自明であろう。本発明は特定の好ましい実施形態に関連して記載されているが、請求されている本発明はそのような特定の実施形態に過度に制限されるべきではないことは理解されるべきである。実際に、関連分野の当業者に明らかである、本発明を実施する記載されている様式の種々の修飾は、以下の特許請求の範囲の範囲内であることを意図する。
【０２００】
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【図１】
2018099126.tif 000002
【図２−１】
2018099126.tif 000003
【図２−２】
2018099126.tif 000004
【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年4月2日(2018.4.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
受託番号ＮＣＩＭＢ  １４０２９として寄託された株と少なくとも７０％のＤＮＡ−ＤＮＡ相同性を有する細菌株、又は
受託番号ＮＣＩＭＢ  １４０２９として寄託された株と少なくとも９９．５％の１６Ｓ  ｒＲＮＡ同一性を有する細菌株
を含む医薬。
【請求項２】
受託番号ＮＣＩＭＢ  １４０２９として寄託された株と少なくとも７０％のＤＮＡ−ＤＮＡ相同性を有する細菌株、又は
受託番号ＮＣＩＭＢ  １４０２９として寄託された株と少なくとも９９．５％の１６Ｓ  ｒＲＮＡ同一性を有する細菌株と、
薬学的に許容される賦形剤、担体又は希釈剤と
を含む医薬組成物。
【請求項３】
受託番号ＮＣＩＭＢ  １４０２９として寄託された株と少なくとも７０％のＤＮＡ−ＤＮＡ相同性を有する細菌株、又は
受託番号ＮＣＩＭＢ  １４０２９として寄託された株と少なくとも９９．５％の１６Ｓ  ｒＲＮＡ同一性を有する細菌株と、
栄養学的に許容される賦形剤、担体又は希釈剤と
を含む栄養補助剤。
【請求項４】
受託番号ＮＣＩＭＢ  １４０２９として寄託された株と少なくとも７０％のＤＮＡ−ＤＮＡ相同性を有する細菌株、又は
受託番号ＮＣＩＭＢ  １４０２９として寄託された株と少なくとも９９．５％の１６Ｓ  ｒＲＮＡ同一性を有する細菌株
を含む、プロバイオティクス組成物、飼料、食品、栄養補助食品、若しくは食品添加物。
【請求項５】
細菌株が、
受託番号ＮＣＩＭＢ  １４０２９として寄託された株と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％のＤＮＡ−ＤＮＡ相同性を有するか；
受託番号ＮＣＩＭＢ  １４０２９として寄託された株と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％のＤＮＡ−ＤＮＡ相同性を有し、かつ受託番号ＮＣＩＭＢ  １４０２９として寄託された株と少なくとも９９．５％の１６Ｓ  ｒＲＮＡ同一性を有するか；又は
受託番号ＮＣＩＭＢ  １４０２９として寄託された株である、
請求項１に記載の医薬、請求項２に記載の医薬組成物、請求項３に記載の栄養補助剤、又は請求項４に記載のプロバイオティクス組成物、飼料、食品、栄養補助食品、若しくは食品添加物。
【請求項６】
細菌株が、単一の３，５９２，１２５−ｂｐの染色体、４個のリボソームオペロン、６６個のＲＮＡ及び３，２７３個の予測タンパク質からなるゲノムを有する、
請求項１に記載の医薬、請求項２に記載の医薬組成物、請求項３に記載の栄養補助剤、又は請求項４に記載のプロバイオティクス組成物、飼料、食品、栄養補助食品、若しくは食品添加物。
【請求項７】
細菌株が、凍結乾燥細菌群の形態である、
請求項１に記載の医薬、請求項２に記載の医薬組成物、請求項３に記載の栄養補助剤、又は請求項４に記載のプロバイオティクス組成物、飼料、食品、栄養補助食品、若しくは食品添加物。
【請求項８】
対象の免疫系を制御するのに使用するための、請求項１又は５に記載の医薬。
【請求項９】
免疫系の制御が、対象の適応免疫系の制御、又は対象の自然免疫系の制御である、請求項８に記載の医薬。
【請求項１０】
炎症性障害、免疫障害及び腸障害から選択される障害を治療するのに使用するための、請求項１又は５に記載の医薬であって、
前記障害が、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、大腸炎、炎症性腸障害（ＩＢＤ）、嚢炎、機能性消化不良、機能性便秘、機能性下痢、機能性腹痛、機能性腹部膨満、心窩部痛症候群、食後愁訴症候群、胃食道逆流症（ＧＥＲＤ）、自己免疫疾患、アトピー性疾患、壊死性腸炎、他の感染症、セリアック病、及び鼻炎、並びにそれらの組合せから選択される、
前記医薬。
【請求項１１】
ＩＢＤが、クローン病又は潰瘍性大腸であり、
機能性下痢が、抗生物質に関連した下痢、旅行者の下痢、又は小児下痢であり、
自己免疫疾患が、糖尿病、関節炎、多発性硬化症、又は乾癬であり、
アトピー性疾患が、アトピー性皮膚炎である、
請求項１０に記載の医薬。
【請求項１２】
対象における腸管微生物叢を改善するのに使用するための、
対象における腸の健康を促進するのに使用するための、
制御性Ｔ細胞及び免疫寛容機構を促進するのに使用するための、又は
対象における免疫ホメオスタシスを維持するのに使用するための、
請求項１又は５に記載の医薬。
【請求項１３】
（ｉ）少なくとも１つの動員又は走化性遺伝子の誘導及び／又は発現を制御する；
（ii）ＦｌａＡ１、Ｆｌａ２、ＦｌａＡ３、及びＦｌａＢから選択される少なくとも１つの遺伝子を制御する；
（iii）アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、電子伝達フラビンタンパク質βサブユニット、及び電子伝達フラビンタンパク質αサブユニットのうちの少なくとも１つの発現を制御する；
（iv）Ａｇｔ、Ｃａｒｔｐｔ、Ｃｃｋ、Ｃｘｃｌ１２、及びＧｃｇから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を下方制御する；又は
（ｖ）回腸又は結腸において少なくとも１つの免疫応答遺伝子を活性化させる；
（vi）Ｔ細胞制御に関連する遺伝子の誘導及び／又は発現を制御することにより適応免疫応答を活性化させる；
（vii）上行結腸においてＬｙ６ｇ６ｃ及びＬｙ６ｇ６ｅから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を上方制御する;又は
（viii）Ｔｌｒ５、Ｔｌｒ１、Ｖｎｎ１、Ｄｅｆｂ３７、Ｐｌａ２ｇ、Ｍｕｃ１６、Ｉｔｌｎ、Ｓｐｒｒ１ａ、Ｃｌｄｎ４、Ｐｍｐ２２、Ｃｒｂ３、Ｍａｇｉ３、Ｍａｒｖｅｌｄ３、Ｍｐｐ７、Ｄｅｆｃｒ２０、Ｐｃｇｆ２、Ｌｔｂｐ４、Ｉｇｓｆ８及びＴｃｆｅ２ａから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を制御する；
請求項１及び５〜１２のいずれかに記載の医薬。
【請求項１４】
少なくとも１つの動員又は走化性遺伝子の誘導及び／又は発現の制御が、ＭｏｂＡ及びＭｏｂＬから選択される遺伝子の発現の上方制御である、請求項１３に記載の医薬。
【請求項１５】
対象が、哺乳動物である、請求項１及び５〜１４のいずれかに記載の医薬。
【請求項１６】
哺乳動物が、ヒトである、請求項１５に記載の医薬。
【請求項１７】
経口投与される、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
受託番号ＮＣＩＭＢ  １４０２９として寄託された株と少なくとも７０％のＤＮＡ−ＤＮＡ相同性を有する細菌株、又は
受託番号ＮＣＩＭＢ  １４０２９として寄託された株と少なくとも９９．５％の１６Ｓ  ｒＲＮＡ同一性を有する細菌株を、薬学的に許容される賦形剤、担体若しくは希釈剤、又は栄養学的に許容される賦形剤、担体若しくは希釈剤と混合することを含む、請求項２に記載の医薬組成物若しくは請求項３に記載の栄養補助剤を製造する方法。
【請求項１９】
ａ）受託番号ＮＣＩＭＢ  １４０２９として寄託された株の１６Ｓ  ｒＲＮＡと、少なくとも９９．５％の配列同一性を有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ、又は
ｂ）受託番号ＮＣＩＭＢ  １４０２９として寄託された株のゲノムＤＮＡと、少なくとも９５％の配列同一性を有するゲノムＤＮＡ
を有する細菌株を含む、食欲の制御剤。
【請求項２０】
食欲の制御が、食欲の向上である、請求項１９に記載の剤。
【請求項２１】
ａ）受託番号ＮＣＩＭＢ  １４０２９として寄託された株の１６Ｓ  ｒＲＮＡと、少なくとも９９．５％の配列同一性を有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ、又は
ｂ）受託番号ＮＣＩＭＢ  １４０２９として寄託された株のゲノムＤＮＡと、少なくとも９５％の配列同一性を有するゲノムＤＮＡ
を有する細菌株を含む、体重の増強剤。
【請求項２２】
株が、ロゼブリア・ホミニス種の株である、請求項１９〜２１のいずれかに記載の剤。
【請求項２３】
食欲の抑制に関連する遺伝子の発現を下方制御する、請求項１９〜２２のいずれかに記載の剤。
【請求項２４】
食欲の抑制に関連する遺伝子が、Ａｇｔ、Ｃａｒｔｐｔ、Ｃｃｋ、Ｃｘｃｌ１２、Ｎｐｙ２ｒ及びＧｃｇから選択される少なくとも１つの遺伝子である、請求項２３に記載の剤。
【請求項２５】
結腸又は回腸における免疫応答遺伝子の少なくとも１つを活性化させる、請求項１９〜２４のいずれかに記載の剤。
【請求項２６】
Ｔ細胞制御に関連する遺伝子の誘導及び／又は発現を制御することにより、適応免疫応答を活性化させる、請求項１９〜２５のいずれかに記載の剤。
【請求項２７】
上行結腸においてＬｙ６ｇ６ｃ及びＬｙ６ｇ６ｅから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を上方制御する、請求項１９〜２６のいずれかに記載の剤。
【請求項２８】
Ｔｌｒ５、Ｔｌｒ１、Ｖｎｎ１、Ｄｅｆｂ３７、Ｐｌａ２ｇ、Ｍｕｃ１６、Ｉｔｌｎ、Ｓｐｒｒ１ａ、Ｃｌｄｎ４、Ｐｍｐ２２、Ｃｒｂ３、Ｍａｇｉ３、Ｍａｒｖｅｌｄ３、Ｍｐｐ７、Ｄｅｆｃｒ２０、Ｐｃｇｆ２、Ｌｔｂｐ４、Ｉｇｓｆ８及びＴｃｆｅ２ａから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を制御する、請求項１９〜２７のいずれかに記載の剤。