(57)【要約】【課題】酵母の増殖を促進でき、雑菌の混入および増殖を抑制できる培地を提供する。【解決手段】無機窒素源ならびに有機酸およびその塩の少なくとも一方を含み、ｐＨが２．５以上４．０未満である、酵母培養用培地。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
無機窒素源ならびに有機酸およびその塩の少なくとも一方を含み、ｐＨが２．５以上４．０未満である、酵母培養用培地。
【請求項２】
前記有機酸およびその塩がフマル酸、フマル酸水素ナトリウムおよび酢酸からなる群から選択される、請求項１に記載の酵母培養用培地。
【請求項３】
前記有機酸がフマル酸である、請求項２に記載の酵母培養用培地。
【請求項４】
前記有機酸およびその塩の配合量が、酵母培養用培地全量に対して、０．０５〜０．４０ｗ／ｖ％である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の酵母培養用培地。
【請求項５】
前記無機窒素源が硝酸塩、アンモニウム塩、亜硝酸塩、アンモニアおよび尿素からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の酵母培養用培地。
【請求項６】
前記無機窒素源が硝酸ナトリウム、硝酸カルシウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウムおよび塩化アンモニウムからなる群から選択される、請求項５に記載の酵母培養用培地。
【請求項７】
前記酵母が、ｐＨ２．５以上４．０未満の環境下で増殖できる酵母である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の酵母培養用培地。
【請求項８】
前記酵母が、ヤロウィア属、キャンディダ属、ピキア属、ハンセヌラ属、サッカロマイセス属、クルイベロマイセス属、およびトリコスポロン属からなる群から選択される酵母である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の酵母培養用培地。
【請求項９】
前記酵母が、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である、請求項８に記載の酵母培養用培地。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の酵母培養用培地で酵母を培養することを有する、酵母の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵母培養用培地ならびにそれを用いた酵母の培養方法および増殖方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵母は、発酵食品、アルコール、有機酸などの製造に利用されている。さらに、油脂分解能を有する酵母は、グリーストラップなどにおいて、排水中の油脂を分解するために利用されている。
【０００３】
厨房や食品工場からの排水には、多くの油分が含まれており、これらの油分を集積し上層部に浮上した油分を分離して破棄するためにグリーストラップが設けられている。しかしながら、グリーストラップ内で集積した油分が固形化し、グリーストラップの水面にスカム（油の塊）として残留したり、グリーストラップの内壁面や配管内部に集積・付着して配管を閉塞したりすることがある。このとき、集積した油分は、酸化・腐敗して、悪臭・害虫の発生原因となることがある。また、集積した油分を放置すると、グリーストラップの油分除去能力が低下し、下水や河川に油分を流出させてしまう。そのため、グリーストラップ内で油分が集積した場合、専門の業者に依頼してバキューム処理や高圧洗浄処理などで油分の除去を行う必要があるためコストがかかってしまう。
【０００４】
そこで、グリーストラップにおいて、効率よく油分を低減するため、油脂分解能を有する酵母を用いる方法が検討されている。例えば、特許文献１には、グリーストラップ内における油分の低減効果に優れたヤロウィア・リポリティカが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１５−１９２６１１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
酵母の培養では、栄養が豊富な培地であるＹＭ培地やＹＰＤ培地などが通常使用されている。ここで、特許文献１に記載の酵母をＹＭ培地やＹＰＤ培地などで培養すると、最大生菌数まで増殖するのに長時間（例えば７２時間程度）を要する。そのため、より短時間で酵母を増殖させる技術が望まれていた。
【０００７】
また、グリーストラップにおいて酵母を使用する場合、定期的に酵母の添加を必要とすることがある。そのため、増殖した酵母の生菌数を減少させずに維持させることが求められる。しかし、ＹＭ培地やＹＰＤ培地などで培養すると、時間の経過とともに酵母だけではなく、雑菌が混入して増殖するという問題がある。
【０００８】
したがって、本発明は、上記事情を鑑みてなされたものであり、酵母の増殖を促進でき、雑菌の混入および増殖を抑制できる培地を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、鋭意研究を行った。その結果、無機窒素源ならびに有機酸およびその塩の少なくとも一方を含み、ｐＨが２．５以上４．０未満である、酵母培養用培地によって上記課題が解決されることを見出し、本発明の完成に至った。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、酵母の増殖を促進でき、雑菌の混入および増殖を抑制できる培地が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例および比較例において、生菌数の変化を調べた結果を示すグラフである。
【図２】実施例および比較例において、雑菌の混入率の変化を調べた結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の実施の形態を説明する。なお、本発明は、以下の実施の形態のみには限定されない。
【００１３】
また、本明細書において、範囲を示す「Ｘ〜Ｙ」は「Ｘ以上Ｙ以下」を意味し、「重量」と「質量」、「重量％」と「質量％」及び「重量部」と「質量部」は同義語として扱う。また、特記しない限り、操作および物性等の測定は室温（２０〜２５℃）／相対湿度４０〜５０％ＲＨの条件で測定する。
【００１４】
＜酵母培養用培地＞
本発明の一形態によれば、無機窒素源ならびに有機酸およびその塩の少なくとも一方を含み、ｐＨが２．５以上４．０未満である、酵母培養用培地が提供される。かかる構成により、酵母の増殖を促進でき、雑菌の混入および増殖を抑制できる。
【００１５】
（無機窒素源）
本発明の酵母培養用培地は、必須の成分として、無機窒素源を含む。
【００１６】
一般的に、酵母の培養に使用される培地としては、ＹＭ培地、ＹＰＤ培地などが挙げられる。これらの培地を用いて酵母を培養すると、最大生菌数まで増殖する時間が長くなる（例えば７２時間程度）という問題がある。本発明者らは、培地の窒素源として、無機窒素源を用いることで、酵母の増殖を促進できることを見出した。酵母が窒素源として利用しやすい硝酸塩、アンモニウム塩などを優先的に取り込むことにより、増殖が促進されると考えられる。
【００１７】
無機窒素源としては、硝酸ナトリウム、硝酸カルシウムなどの硝酸塩；硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムなどのアンモニウム塩；亜硝酸ナトリウムなどの亜硝酸塩；アンモニア；尿素などが例示できる。無機窒素源としては、１種または２種以上選択して使用することができる。これらのうち、無機窒素源は、酵母の増殖を促進できるとの観点から、好ましくは硝酸ナトリウム、硝酸カルシウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウムおよび塩化アンモニウムからなる群から選択され、より好ましくは硝酸ナトリウム、硝酸カルシウムおよび硝酸アンモニウムからなる群から選択され、さらに好ましくは硝酸ナトリウムである。無機窒素源として硝酸ナトリウムを用いることにより、他の無機窒素源よりも最大生菌数を増加させることができる。
【００１８】
無機窒素源の配合量は、酵母培養用培地全量に対して、例えば０．０１〜１．０ｗ／ｖ％であり、好ましくは０．１〜０．５ｗ／ｖ％である。
【００１９】
（有機酸およびその塩）
本発明の酵母培養用培地は、必須の成分として、有機酸およびその塩の少なくとも一方を含む。有機酸およびその塩の少なくとも一方を用いることで、雑菌の混入や増殖を抑制することができる。
【００２０】
有機酸およびその塩としては、フマル酸、フマル酸水素ナトリウム、酢酸、乳酸、コハク酸、グルコン酸、ピルピン酸、クエン酸などが例示できる。有機酸およびその塩としては、１種または２種以上選択して使用することができる。有機酸およびその塩は、雑菌の混入抑制の観点から、好ましくはフマル酸、フマル酸水素ナトリウム、および酢酸からなる群から選択され、より好ましくはフマル酸およびフマル酸水素ナトリウムから選択され、さらに好ましくはフマル酸である。有機酸としてフマル酸を用いることにより、他の有機酸よりも配合量を少なくしても、雑菌の混入や増殖を抑制することができる。
【００２１】
有機酸およびその塩の配合量は、酵母培養用培地全量に対して、例えば０．０１〜２．０ｗ／ｖ％である。有機酸としてフマル酸を用いる場合、フマル酸の配合量は、酵母培養用培地全量に対して、好ましくは０．０５〜０．４０ｗ／ｖ％であり、より好ましくは０．０５ｗ／ｖ％超０．４０ｗ／ｖ％以下であり、さらに好ましくは０．０８〜０．２０ｗ／ｖ％である。
【００２２】
（その他の栄養素）
本発明の酵母培養用培地は、上記無機窒素源ならびに有機酸およびその塩の少なくとも一方に加え、必要に応じて適宜炭素源、有機窒素源およびミネラルを含むことができる。
【００２３】
炭素源としては、グルコース、フラクトース、セロビオース、ラフィノース、キシロース、マルトース、ガラクトース、ソルボース、グルコサミン、リボース、アラビノース、ラムノース、スクロース、トレハロース、α−メチル−Ｄ−グルコシド、サリシン、メリビオース、ラクトース、メレジトース、イヌリン、エリスリトール、グルシトール、マンニトール、ガラクチトール、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、デンプン、デンプン加水分解物、糖蜜、廃糖蜜等の糖類、麦、米等の天然物、グリセロール、メタノール、エタノール等のアルコール類、ヘキサデカン等の炭化水素などが挙げられる。これらの炭素源は、培養する酵母による資化性を考慮して適宜選択される。また、上記炭素源を１種または２種以上選択して使用することができる。
【００２４】
有機窒素源としては、酵母エキス、麦エキス、肉エキス、魚肉エキス、ペプトン、ポリペプトン、麦芽エキス、大豆加水分解物、大豆粉末、カゼイン、ミルクカゼイン、カザミノ酸、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸等の各種アミノ酸、コーンスティープリカー、その他の動物、植物、微生物の加水分解物などが挙げられる。これらの有機窒素源は、培養する酵母による資化性を考慮して適宜選択される。また、上記有機炭素源を１種または２種以上選択して使用することができる。
【００２５】
ミネラルとしては、リン、硫黄、カリウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、ナトリウム、コバルト、銅、亜鉛、ニッケルなどが挙げられる。これらのミネラルは、培養する酵母による資化性を考慮して適宜選択される。また、上記ミネラルを１種または２種以上選択して使用することができる。
【００２６】
（ｐＨ）
本発明の酵母培養用培地は、ｐＨが２．５以上４．０未満である。ｐＨが２．５未満であると、酵母を効率よく増殖することができない。ｐＨが４．０以上であると、雑菌が混入して増殖するおそれがあるため好ましくない。ｐＨは、好ましくは２．５〜３．５でありであり、より好ましくは２．５〜３．０である。酵母培養用培地のｐＨは、ｐＨメータを用いて、測定できる。
【００２７】
本発明の酵母培養用培地は、有機酸およびその塩の少なくとも一方を含むため、有機酸およびその塩の配合量によって培地のｐＨを調整することができる。
【００２８】
（酵母）
本発明の酵母培養用培地で培養される酵母としては、ｐＨ２．５以上４．０未満の環境下で増殖できる酵母であれば、特に制限されないが、好ましくはヤロウィア属、キャンディダ属、ピキア属、ハンセヌラ属、サッカロマイセス属、クルイベロマイセス属、およびトリコスポロン属などが挙げられる。
【００２９】
酵母の具体例としては、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、ヤロウィア  スピーシーズ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｓｐ．）、キャンディダ・ファマタ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｆａｍａｔａ）、キャンディダ・ボンビコーラ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）、キャンディダ・シリンドラセア（Ｃａｎｄｉｄａ  ｃｙｌｉｎｄｏｒａｃｅａ）、キャンディダ・ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ）、キャンディダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）、キャンディダ・インターメディア（Ｃａｎｄｉｄａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、キャンディダ・パラリポリティカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、キャンディダ・アンタークティカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）、キャンディダ  スピーシーズ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐ．）、ピキア・ファリノサ（Ｐｉｃｈｉａ  ｆａｒｉｎｏｓａ）、ピキア・クルイベリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、ピキア・カナデンシス（Ｐｉｃｈｉａ  ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）、ピキア・フェルメンタンス（Ｐｉｃｈｉａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、ピキア・ハプロフィラ（Ｐｉｃｈｉａ  ｈａｐｌｏｐｈｉｌａ）、ピキア・メンブランアエファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｎｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）、ピキア・ロダネンシス（Ｐｉｃｈｉａ  ｒｈｏｄａｎｅｎｓｉｓ）、ハンセヌラ・アノマラ（Ｈａｎｓｅｎｕｒａ  ａｎｏｍａｌａ）、ハンセヌラ・ビムンダリス（Ｈａｎｓｅｎｕｒａ  ｂｉｍｕｎｄａｌｉｓ）、ハンセヌラ・カプスラタ（Ｈａｎｓｅｎｕｒａ  ｃａｐｓｕｌａｔａ）、ハンセヌラ・シフェリイ（Ｈａｎｓｅｎｕｒａ  ｃｉｆｅｒｒｉｉ）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、サッカロマイセス・バヤヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｙａｎｕｓ）、サッカロマイセス・フェルメンタティ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ）、サッカロマイセス・ノルベンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）、サッカロマイセス・オビフォルミス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）、クルイベロマイセス・マルキシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、クルイベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、トリコスポロン・ブラシカエ（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、トリコスポロン・キャピタタス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｃａｐｉｔａｔｕｓ）、トリコスポロン・クタネウム（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｃｕｔａｎｅｕｍ）、トリコスポロン・ファーメンタンス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、トリコスポロン・ネオファーメンタンス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｎｅｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、トリコスポロン・プルランス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）、トリコスポロンスピーシーズ（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｓｐ．）等が挙げられる。
【００３０】
本発明の酵母培養用培地では、これらの酵母のうち、ヤロウィア属の酵母の増殖をより促進することができる。ヤロウィア属の酵母としては、ヤロウィア・リポリティカ  ＡＴＣＣ４８４３６、ヤロウィア・リポリティカ  ＮＢＲＣ１５４８、ヤロウィア・リポリティカ  ＬＭ０２−０１１（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０１８１３）、ヤロウィア・リポリティカ  ＮＢＲＣ０７４６、ヤロウィア・リポリティカ  ＮＢＲＣ１２０９のようなヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、ヤロウィア  ＹＨ−０１のようなヤロウィア  スピーシーズ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｓｐ．）等が例示できるが、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）がより好ましく、ヤロウィア・リポリティカ  ＬＭ０２−０１１（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０１８１３）が更に好ましい。
【００３１】
上述の酵母は、ＡＴＣＣ、ＮＢＲＣ、ＤＳＭＺ等のカルチャーコレクションから入手可能である。
【００３２】
（酵母培養用培地の調製方法）
本発明の酵母培養用培地は、液体培地でも固体培地でも用いることができる。酵母を増殖させるとの観点から、本発明の酵母培養用培地は、液体培地であることが好ましい。
【００３３】
培地の調製方法は、特に制限されず、従来公知の方法を用いることができる。例えば、無機窒素源、有機酸およびその塩、ならびに必要に応じて有機窒素源、炭素源およびミネラルを水に溶解することで調製することができる。酵母培養用培地のｐＨを調製する必要がある場合、ｐＨ調整剤として、上記有機酸およびその塩を用いることが好ましい。また、上記有機酸以外の酸やアルカリを用いることもできる。酸やアルカリとしては、特に制限されないが、塩酸、硝酸、硫酸、酢酸などの酸や、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどのアルカリが用いられる。また、必要に応じて消泡剤を添加してもよい。
【００３４】
＜酵母の培養方法および増殖方法＞
本発明の一実施形態では、上記酵母培養用培地で酵母を培養することを有する、酵母の培養方法が提供される。
【００３５】
本発明に係る酵母の培養は、通常の方法によって行うことができる。酵母の種類によって、好気的条件下または嫌気的条件下で培養する。前者の場合には、酵母の培養は、振とうあるいは通気撹拌などによって行われる。また、酵母を連続的にまたはバッチで培養してもよい。培養条件は、適宜選択され、本発明に係る酵母が増殖できる条件であれば特に制限されず、培養する酵母の種類に応じて適宜選択されうる。また、酵母培養培地に添加する菌体量についても、特に制限されず、適宜調整することができる。
【００３６】
培養温度は、通常１５〜５０℃であり、好ましくは２５〜４０℃である。
【００３７】
培養時間は、特に制限されず、培養条件、培養後の酵母の使用形態などによって異なる。
【００３８】
本発明の酵母培養用培地で酵母を培養する場合、様々な形態の酵母を用いることができる。例えば、酵母は、培養液中に懸濁された状態、培養液から固形分として回収された状態、乾燥された状態、担体に固定化された状態などでありうる。
【００３９】
培養液から固形分として回収した酵母を使用する場合、回収方法は当業者に公知のいずれの手段をも採用できる。例えば、上述の方法により培養した酵母の培養液を、遠心分離やろ過などにより固液分離し、固形分を回収して得ることができる。この固形分を乾燥（例えば、凍結乾燥）すれば、乾燥された状態の酵母を得ることができる。
【００４０】
担体に固定化された状態の酵母を使用する場合、酵母を固定化する担体としては、酵母を固定化することができるものであれば特に制限されず、一般的に微生物を固定化するのに使用される担体が同様にしてあるいは適宜修飾されて使用される。例えば、アルギン酸、ポリビニールアルコール、ゲランガム、アガロース、セルロース、デキストラン等のゲル状物質に包括固定する方法や、ガラス、活性炭、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、木材、シリカゲル等の表面に吸着固定する方法などが使用できる。
【００４１】
また、酵母を担体に固定化する方法もまた特に制限されず、一般的な微生物の固定化方法が同様にしてあるいは適宜修飾されて使用される。例えば、酵母の培養液を担体に流し込むことによる固定化法、アスピレーターを用いて担体を減圧下におき、酵母の培養液を担体に流し込むことによる固定化法、および酵母の培養液を滅菌した培地と担体との混合物に流し込み、振とう培養し、上記混合物から取り出した担体を自然乾燥する方法などが挙げられる。
【００４２】
本発明の好ましい形態において、保存中の酵母の生存性の観点から、酵母は、生菌製剤の形態で使用される。酵母としては、上記酵母を用いることができる。上記酵母を用いる場合、生菌製剤は、多孔質担体上に形成された酵母含有層を含み、前記酵母含有層が、乾燥菌体として１重量部の前記酵母に対して、０．８重量部以上１．５重量部未満のトレハロース、０．０１〜５重量部の乳タンパク質、０．０３〜１０重量部のアミノ酸、および０．０２〜１０重量部の金属塩を含むものである。トレハロースが、酵母含有層中に、乾燥菌体として１重量部の前記酵母に対して、０．８重量部以上含まれることで、製剤化をする際の酵母の生存率を向上させることができ、また、１．５重量部未満含まれることで、生菌製剤の保存期間中の酵母の生存率の低下を防止することができる。酵母の製剤化の際の生存率と保存期間中の生存率とのさらなる好適なバランスの観点から、酵母含有層のトレハロース含有量は、乾燥菌体換算で１重量部の酵母に対して、好ましくは０．９重量部を超えて１．５重量部未満であり、より好ましくは１重量部以上１．４重量部以下である。
【００４３】
なお、トレハロース以外の二糖類、たとえばスクロース、ラクトース、マルトース等のトレハロース以外の二糖類を、１種単独でまたは２種以上を混合して、トレハロースと併用してもよい。この場合、トレハロース以外の二糖類の含有量は、乾燥菌体として１重量部の無芽胞菌に対して、例えば０．０１質量部以上０．８質量部未満であり、好ましくは０．１質量部以上０．５質量部以下である。
【００４４】
酵母含有層中の乳タンパク質としては特に制限されず、従来公知の各種の乳タンパク質を含む材料を用いることができる。全脂粉乳のような乳脂肪分の多い原料を用いることもできるが、グリーストラップで使用するような油脂分解用生菌製剤を製造する場合は、製剤中の油分は少ない方が好ましいので、例えば、好ましい具体例としては、カゼイン、カゼインナトリウム、ホエイ、濃縮ホエイ、ホエイタンパク質濃縮物（ＷＰＣ）、ホエイタンパク質分離物（ＷＰＩ）、ホエイパウダー、スキムミルク、乳タンパク濃縮物（ＭＰＣ）、脱脂粉乳、α−ラクトアルブミン、β−ラクトグロブリン等が例示でき、これらを１種単独でまたは２種以上を混合して用いることができる。乳タンパク質が、酵母含有層中に、乾燥菌体として１重量部の前記酵母に対して、０．０１〜５重量部、好ましくは０．０２〜１重量部、より好ましくは０．０５〜０．５重量部含まれることで、製剤化をする際の酵母の生存率を向上させることができる。
【００４５】
酵母含有層中のアミノ酸は、例えばグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、リジン、セリン、スレオニン、メチオニン、トリプトファン、ヒスチジン、アルギン、プロリン、チロシン、およびこれらの誘導体が例示できる。アミノ酸の誘導体としては、アミノ酸の塩（例えば、カリウム塩、ナトリウム塩）、エステル体、水和物、溶媒和物等が例示できる。上記のアミノ酸は、１種を単独で、または２種以上を混合して用いることができる。アミノ酸が、酵母含有層中に、乾燥菌体として１重量部の前記酵母に対して、０．０３〜１０重量部、好ましくは０．１〜５重量部、より好ましくは０．１〜３重量部含まれることで、製剤化をする際の酵母の生存率を向上させることができる。なお、油分分解層中に２種以上のアミノ酸が含まれる場合、上記数値は、２種以上の合計量を示す。
【００４６】
酵母含有層中の金属塩は、例えばナトリウム（Ｎａ）、カリウム（Ｋ）、マグネシウム（Ｍｇ）、カルシウム（Ｃａ）、マンガン（Ｍｎ）、鉄（Ｆｅ）、ニッケル（Ｎｉ）、亜鉛（Ｚｎ）、銅（Ｃｕ）などの金属元素の、硫酸塩、亜硫酸塩、次亜硫酸塩、過硫酸塩、チオ硫酸塩、炭酸塩、リン酸塩、ピロリン酸、塩酸塩、硝酸塩、亜硝酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、ハロゲン化物（たとえば、フッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物）等が例示できるが、これらに限定されない。金属塩は、より具体的には、例えば、硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、次亜硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、過硫酸ナトリウム、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸三ナトリウム、酢酸ナトリウム、硝酸ナトリウム、亜硝酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、シュウ酸ナトリウム、塩化ナトリウム、硫酸カリウム、亜硫酸カリウム、次亜硫酸カリウム、チオ硫酸カリウム、炭酸カリウム、過硫酸カリウム、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、リン酸三カリウム、酢酸カリウム、硝酸カリウム、亜硝酸カリウム、酢酸カリウム、クエン酸カリウム、シュウ酸カリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、亜硫酸マグネシウム、チオ硫酸マグネシウム、炭酸マグネシウム、第一リン酸マグネシウム、第二リン酸マグネシウム、第三リン酸マグネシウム、ピロリン酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、亜硝酸マグネシウム、酢酸マグネシウム、クエン酸マグネシウム、シュウ酸マグネシウム、塩化マグネシウム、硫酸カルシウム、亜硫酸カルシウム、チオ硫酸カルシウム、炭酸カルシウム、硝酸カルシウム、亜硝酸カルシウム、酢酸カルシウム、クエン酸カルシウム、シュウ酸カルシウム、塩化カルシウム等が例示できる。上記の金属塩は、１種を単独で、または２種以上を混合して用いることができる。金属塩が、酵母含有層中に、乾燥菌体として１重量部の前記酵母に対して、０．０２〜１０重量部、好ましくは０．０５〜１．５重量部、より好ましくは０．１〜１重量部含まれることで、生菌製剤の保存期間中の酵母の生存率の低下を防止することができる。なお、酵母含有層が２種以上の金属塩を含む場合、上記数値は、２種以上の合計量を示す。
【００４７】
保存期間中における酵母の生存率が特に優れるという観点から、金属塩が、Ｎａ、Ｋ、ＭｇおよびＣａからなる群から選択される元素の、硫酸塩、炭酸塩、リン酸塩、またはそれらの組み合わせであることが好ましく、Ｍｇおよび／またはＣａの硫酸塩であることがより好ましい。なお、上記の「金属塩」には、金属塩の水和物や溶媒和物も含まれる。
【００４８】
酵母含有層には、上記の各成分のほか、任意に、例えばグルコース、フルクトース等の単糖類；スクロース、ラクトース、マルトース等のトレハロース以外の二糖類；シクロデキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、結晶セルロース、コーンスターチ等の多糖類；大豆タンパク等のタンパク質；大豆ペプチド、ゼラチン、ペプトン、トリプトン等のタンパク加水分解物やペプチド；大豆油、菜種油、パーム油、ゴマ油、オリーブ油等の油脂；アスコルビン酸やその塩、トコフェロール等のビタミン類；ポリグリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル等の界面活性剤；ポリエチエレングリコール、グリセリンなどが含まれてもよい。
【００４９】
生菌製剤に用いられうる多孔質担体の材料としては、特に制限されるものではないが、例えば、珪藻土、パーライト、バーミキュライト、タルク、クレー、ゼオライト、ベントナイト、カオリン、炭酸カルシウム、活性白土、二酸化チタン、珪砂、軽石、活性炭、カーボンブラック、グラファイト、ポリ乳酸、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル等が例示できるが、これらに限定されない。多孔質担体の材料は、製剤化をする際の酵母の生存率の観点から、好ましくは珪藻土である。
【００５０】
なお、上記生菌製剤に用いられうる多孔質担体における「多孔質」とは、担体の表面に多数の小さな気泡状の空隙を有する状態をいう。好ましくは、多孔質担体の嵩密度（タッピング嵩密度）が０．０１〜２ｇ／ｍｌである。上記のような嵩密度の多孔質担体を用いることにより、製剤化工程後の酵母の生存率をより一層向上できる。多孔質担体の嵩密度は、より好ましくは０．０５〜１．５ｇ／ｍｌであり、更に好ましくは０．２〜１ｇ／ｍｌである。なお、上記の嵩密度は、タッピング嵩密度測定法により測定した値である。
【００５１】
製剤化をする際の酵母の生存率の観点から、担体は、平均粒径（直径、体積基準）が１〜３００μｍの粒子状であることが好ましく、平均粒径（直径、体積基準）が１０〜２００μｍの粒子状であることがより好ましく、３０〜１５０μｍであることが更に好ましい。なお、担体の粒径は、レーザー回折法にて測定した値である。
【００５２】
生菌製剤は、上記生菌製剤に用いられうる多孔質担体に対して、噴霧液を噴霧して製剤化することができる。前記噴霧液は、上述した酵母とトレハロース、乳タンパク質、アミノ酸、金属塩および必要に応じてその他の成分とを、水に添加し、必要に応じて撹拌して調製することができる。噴霧液の調製に用いる水としては、例えば水道水、蒸留水、イオン交換水、純水、超純水など、いずれを使用してもよいが、不純物の少ない蒸留水、イオン交換水、純水、または超純水を用いることが好ましい。メタノール、エタノール、プロパノール等の低級アルコールや、アセトンなどの極性溶媒を、適宜水に添加した混合液を用いてもよい。
【００５３】
上記生菌製剤に用いられうる多孔質担体への噴霧液の噴霧は、例えば流動層造粒機を用いて行うことができる。流動層造粒法により製剤化することにより、酵母含有層を比較的低温で多孔質担体上に形成することができる。このため、製剤化をする際の生存率の向上の観点から有利である。また、流動層造粒法により製剤化することにより、上記の酵母含有層を均一に多孔質担体上に形成することができる、という点においても有利である。
【００５４】
多孔質担体に対する噴霧液の噴霧量は任意に設定でき、特に制限されるものではないが、１重量部の多孔質担体に対して、噴霧液の固形分として、例えば、０．１〜１０重量部となる割合であり、好ましくは０．５〜２重量部となる割合である。
【００５５】
噴霧液は、通常は５０〜３００ｇ／分程度の速度で多孔質担体へ噴霧される。
【００５６】
流動層造粒法により製剤化する場合は、温風の温度は酵母の耐熱性等を考慮して適宜設定すればよいが、例えば、入口温度３０〜６０℃であり、好ましくは３５〜５０℃である。流動層の温度も酵母の耐熱性等を考慮して適宜設定すればよいが、例えば、温度３０〜６０℃であり、好ましくは３５〜５０℃である。噴霧後、噴霧液を噴霧した多孔質担体を流動層造粒機内でそのまま乾燥してもよいし、別途乾燥機で乾燥してもよい。
【００５７】
粉末化した生菌製剤は、用途に応じて、公知のコーティング剤で表面の一部または全部を被覆してもよい。また、滑沢剤（例えば、タルク、マイカ、シリカ、ステアリン酸マグネシウム）、乾燥剤（酸化カルシウム、シリカゲル）、フィラーなどの粉末を、任意の割合で生菌製剤と混合し、混合製剤としてもよい。また、所望の粒度となるように製剤を粉砕したり、分級をしたりしてもよい。
【００５８】
保存期間中の酵母の生存率の観点から、製剤化後の生菌製剤の水分含量は、３〜８重量％であることが好ましく、４．５〜７．５重量％であることがより好ましい。
【００５９】
本発明の酵母培養用培地を用いることにより、酵母が最大生菌数まで増殖する時間を短くすることができる。例えば、後述する実施例に記載の方法で培養した場合、従来使用されているＹＭ培地では、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）が最大生菌数まで増殖するまでに７２時間程度必要とする。一方、本発明の酵母培養用培地を用いることで、２４〜３２時間程度培養すれば、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）を最大生菌数まで増殖させることができる。
【００６０】
また、本発明の酵母培養用培地では、雑菌の混入および増殖を抑制することができるため、厳密な無菌操作を行わなくてもよい。例えば、酵母培養用培地の調製後、酵母培養用培地をオートクレーブなどを用いて滅菌処理せずに、酵母を培養してもよい。また、クリーンベンチなどの無菌操作をするための装置を使用しなくてもよい。さらに、雑菌の混入および増殖を抑制できるため、酵母が最大生菌数となった後、そのまま培養を継続しても、最大生菌数を長時間（例えば、１２〜７２時間以上）減少させることなく、ほぼ維持することができる。
【００６１】
上述のとおり、本発明の酵母培養用培地は、従来の培地に比べて、酵母を短時間で増殖させることができる。そのため、本発明の一実施形態では、上記酵母培養用培地で酵母を培養することを有する、酵母の増殖を促進する方法が提供される。
【実施例】
【００６２】
本発明の効果を、以下の実施例および比較例を用いて説明する。ただし、本発明の技術的範囲が以下の実施例のみに制限されるわけではない。
【００６３】
（酵母培養用培地の調製）
下記表１の組成となるように、各成分を蒸留水に溶解し、実施例１〜５の酵母培養用培地およびＹＭ培地（比較例）を調製した。ＹＭ培地のｐＨは、塩酸を用いて調整した。なお、実施例１〜５の酵母培養用培地のｐＨは、調整していない。また、表１中の「−」は、配合していないことを示す。
【００６４】
下記表１において、消泡剤は、Ｂ−３１７Ｆ（株式会社ＡＤＥＫＡ製）を使用した。
【００６５】
【表１】
2018170996.tif 000002
【００６６】
（生菌製剤の調製）
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＬＭ０２−０１１株（平成２６年３月６日付で、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託されており、その受託番号は、ＮＩＴＥ  Ｐ−０１８１３である。）を下記の液体培地に接種して、ジャーファーメンターにて３０℃で４８時間（撹拌速度：３００ｒｐｍ）培養し、培養液を得た。
【００６７】
液体培地の作製方法：終濃度が０．１８％（ｗ／ｖ）ポリペプトン、０．１２％（ｗ／ｖ）肉エキス、０．０７％（ｗ／ｖ）ＮａＨＣＯ３、０．００５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、０．００２％（ｗ／ｖ）ＫＣｌ、０．００２％（ｗ／ｖ）ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．００３％（ｗ／ｖ））ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏとなるように純水に溶解した。塩酸にてｐＨ５に調整後、オートクレーブ滅菌したものを液体培地とした。
【００６８】
得られた培養液を１０分間遠心分離（×１０，０００ｇ）し、菌体を回収した。得られた菌体に対して酵母を１１重量％、トレハロースを１４重量％、スキムミルクを３重量％（乳タンパク質としては１重量％）、グリシンを３重量％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを１重量％、ＣａＳＯ４・２Ｈ２Ｏを１質量％となるように蒸留水に添加し、混合して噴霧液を調製した。なお、乳タンパク質としては、固形分中にタンパク質を３５重量％、乳糖を５２重量％の割合で含むスキムミルクを用いた。
【００６９】
流動層造粒機（ＦＡ−ＬＡＢ−１、株式会社パウレック社）に３００ｇの珪藻土（平均粒径７５μｍ、嵩密度０．３２ｇ／ｍｌ、ラヂオライト（登録商標）♯３０００、昭和化学工業株式会社）をセットした。珪藻土に対して、１０７７ｇの上記噴霧液を１４３ｇ／分の速度で噴霧するとともに、４０℃の温風を送風して内容物を流動させた状態で乾燥させた。噴霧後、引き続いて流動層造粒機内で４０℃の温風を４０分間送風して、造粒物を乾燥させた。これにより、生菌製剤を得た。生菌製剤の水分含量は５．５重量％であった。
【００７０】
（生菌製剤における生菌数の算出）
生菌製剤１ｇあたりの生菌数を以下の方法により算出した。実施例および比較例において、実施例および比較例を実施する前（４８時間以内）に算出した生菌数を用いた。なお、生菌製剤の保存は、遮光ガラスバイアル瓶内に封入し、２３℃で行った。
【００７１】
生菌製剤を、１００倍量の蒸留水中で２５℃で１分間撹拌して段階希釈し、得られた希釈液を寒天培地（組成：上記液体培地に、終濃度２０重量％となるように寒天を添加したもの）の表面に塗布した。菌を３０℃で４８時間培養した後、寒天培地上に形成されたコロニー数を計測した。コロニー数から、製剤１ｇ当たりの生菌数を算出した。
【００７２】
（酵母の培養）
以下の方法により、酵母を培養した。
（１）１Ｌのトールビーカーに上記の酵母培養用培地またはＹＭ培地を５００ｍＬ分注した。
（２）（１）のトールビーカーに上記調製した生菌製剤を１５ｍｇ（酵母：８．５×１０７ＣＦＵ／Ｌ）添加した。
（３）生菌製剤を添加した後、（２）のトールビーカーを３０℃、９６時間で好気培養して、培養液を得た。
【００７３】
（酵母の生菌数の算出および雑菌の混入率の算出）
実施例１〜５および比較例において、培養開始から１２時間ごとに培養液をサンプリングし、蒸留水で段階希釈し、寒天で固化させたブイヨン培地の表面に塗布した。塗布後３０℃で４８時間培養して、培地上に形成されたＬＭ０２−０１１株および雑菌のコロニー数を計測した。ＬＭ０２−０１１株の生菌数は、ＬＭ０２−０１１株のコロニー数から培養液１Ｌ当たりの生菌数を算出した。結果を図１に示す。また、雑菌の混入率は、以下の式を用いて算出した。結果を図２に示す。
【００７４】
【数１】
2018170996.tif 000003
【００７５】
なお、ＬＭ０２−０１１株のコロニー形態は、クリーム色、円形のドーム状であり、雑菌のコロニーとは明確に見分けることが可能である。
【００７６】
図１および図２に示すように、実施例１〜５では、比較例と比べて、硝酸塩を用いることにより、ＬＭ０２−０１１株の増殖速度を向上できることが分かる。また、フマル酸を用いることにより、雑菌の混入を７２時間以上抑制できることが分かる。
【００７７】
実施例１では、実施例２および３と比べて、無機窒素源として硝酸ナトリウムを用いることにより、酵母の最大生菌数をより増加できることが分かる。
【図１】
2018170996.tif 000004
【図２】
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