(57)【要約】【課題】マイコウイルスを保持する感染菌を効率良く増殖させて、感染を拡大する。【解決手段】白紋羽病防除剤は、キサンタンガムおよびグァーガムのうちの少なくともいずれか一方と、マイコウイルスの感染により弱毒化した白紋羽病菌である感染菌と、を含む。【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
白紋羽病防除剤であって、
キサンタンガムおよびグァーガムのうちの少なくともいずれか一方と、
マイコウイルスの感染により弱毒化した白紋羽病菌である感染菌と、
を含む白紋羽病防除剤。
【請求項２】
請求項１に記載の白紋羽病防除剤であって、さらに、
でんぷんおよびアスパラギンを含む白紋羽病防除剤。
【請求項３】
請求項２に記載の白紋羽病防除剤であって、さらに、
キサンタンガムとは異なるバクテリアセルロースを含む白紋羽病防除剤。
【請求項４】
請求項３に記載の白紋羽病防除剤であって、
前記キサンタンガムとは異なるバクテリアセルロースは、発酵セルロースである
白紋羽病防除剤。
【請求項５】
請求項１から請求項４までのいずれか一項に記載の白紋羽病防除剤であって、
前記白紋羽病防除剤は、２価の金属元素を含むアルギン酸塩を主成分とする膜に覆われた粒子状に成形されていることを特徴とする
白紋羽病防除剤。
【請求項６】
白紋羽病防除剤の製造方法であって、
キサンタンガムおよびグァーガムのうちの少なくともいずれか一方を含む液体培地に、マイコウイルスの感染により弱毒化した白紋羽病菌である感染菌を接種する第１の工程と、
前記第１の工程の後に、前記感染菌を前記液体培地中で培養する第２の工程と、
培養後の前記感染菌および前記液体培地と共にアルギン酸またはアルギン酸塩を含む第１の混合液を、２価の金属元素を含む乳酸塩、２価の金属元素を含む硫酸塩、および２価の金属元素を含む塩化物から選択される少なくともいずれかの化合物の溶液に滴下して、前記感染菌および前記液体培地を含む粒子を形成する第３の工程と、
を備える、白紋羽病防除剤の製造方法。
【請求項７】
白紋羽病防除剤の製造方法であって、
キサンタンガムおよびグァーガムのうちの少なくともいずれか一方を含む液体培地に、マイコウイルスの感染により弱毒化した白紋羽病菌である感染菌を接種する第１の工程と、
前記感染菌を接種した前記液体培地と共にアルギン酸またはアルギン酸塩を含む第２の混合液を、２価の金属元素を含む乳酸塩、２価の金属元素を含む硫酸塩、および２価の金属元素を含む塩化物から選択される少なくともいずれかの化合物の溶液に滴下して、前記感染菌および前記液体培地を含む粒子を形成する第４の工程と、
前記粒子を培養する第５の工程と、
を備える、白紋羽病防除剤の製造方法。
【請求項８】
請求項６または７に記載の白紋羽病防除剤の製造方法であって、
前記液体培地は、さらに、でんぷんおよびアスパラギンを含む
白紋羽病防除剤の製造方法。
【請求項９】
請求項８に記載の白紋羽病防除剤の製造方法であって、
前記液体培地は、さらに、キサンタンガムとは異なるバクテリアセルロースを含む
白紋羽病防除剤の製造方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の白紋羽病防除剤の製造方法であって、
前記キサンタンガムとは異なるバクテリアセルロースは、発酵セルロースである
白紋羽病防除剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、白紋羽病防除剤、およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リンゴ、ナシ、桃、梅、ブドウを含む果樹や花木など、多種の植物に感染する病原菌として、白紋羽病菌（Rosellinia necatrix）が知られている。白紋羽病菌は糸状菌の一種であり、白紋羽病菌が感染した植物は、根が腐敗して、最終的には枯死する。圃場内の植物の一部が白紋羽病菌に一旦感染すると、圃場内で白紋羽病菌の感染が拡大し、甚大な被害をもたらす場合がある。
【０００３】
白紋羽病菌の駆除方法として、従来、殺菌剤や温水による処理が知られている。しかしながらこれらの方法は、効果の持続性が限定的であり、環境への負荷やコストが大きいという問題を有している。
【０００４】
近年、白紋羽病菌にマイコウイルスを感染させて病原性を抑える方法が検討されている。この方法は、白紋羽病菌に感染するウイルスであって、白紋羽病菌の病原性を低下させる（弱毒化能を有する）マイコウイルスを用いる。このような弱毒化能を有するマイコウイルスを白紋羽病菌に感染させることにより白紋羽病菌を弱毒化し、白紋羽病菌に感染した植物における白紋羽病の進行を抑えようとするものである。本願明細書では、弱毒化能を有するマイコウイルスを、単にマイコウイルスとも呼ぶ。また、このようなマイコウイルスが感染した白紋羽病菌を、単に感染菌とも呼ぶ。
【０００５】
ここで、マイコウイルスは、一般に、細胞外から宿主細胞内へと浸入することがないといわれている。このようなマイコウイルスを白紋羽病菌に伝播させる方法としては、例えば、菌糸融合による水平伝播が知られている。また、白紋羽病菌にマイコウイルスを人為的に感染させて感染菌（弱毒化菌）を作製する方法としては、例えば、プロトプラスト化した白紋羽病菌にマイコウイルス粒子を取り込ませる方法が知られている。
【０００６】
また、マイコウイルスの感染菌を用いて白紋羽病を防除する方法としては、従来、例えば、感染菌を寒天培地や木片等の支持体に接種して、感染菌を接種した支持体を土壌に散布等する方法や、感染菌をアルギニン酸溶液等に懸濁してアルギニンペレットの形態にして土壌に散布等する方法等が、提案されている（例えば、特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１３−２５５４６０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
マイコウイルスの感染菌を用いて白紋羽病の防除を行なうためには、防除の対象となる圃場の土壌内に感染菌を配置するために、充分量の感染菌を用意することが望まれる。さらに、感染菌を土壌内に配置した後に、土壌内に配置した感染菌から土壌内の他の白紋羽病菌へと、マイコウイルスが効率良く伝播されることが望まれる。
【０００９】
土壌内への配置に先立って充分量の感染菌を用意するためには、感染菌からマイコウイルスを失わせることなく、効率良く感染菌を増殖させる必要がある。また、感染菌から、土壌内の他の白紋羽病菌へとマイコウイルスを伝播させるためには、土壌内に感染菌を配置したときに、感染菌が感染力を失うことなく土壌内で生存できる必要がある。そのため、マイコウイルスを安定して保持しつつ増殖能を有する感染菌を含有し、土中において感染菌から非感染菌へのマイコウイルスの感染拡大の場を提供する白紋羽病防除剤が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、上述の課題の少なくとも一部を解決するためになされたものであり、以下の形態として実現することが可能である。
【００１１】
（１）本発明の一形態によれば、白紋羽病防除剤が提供される。白紋羽病防除剤は、キサンタンガムおよびグァーガムのうちの少なくともいずれか一方と、マイコウイルスの感染により弱毒化した白紋羽病菌である感染菌と、を含む。この白紋羽病防除剤によれば、白紋羽病防除の対象となる土中において、感染菌におけるマイコウイルスの欠落を抑えつつ効率良く感染菌を増殖させて、感染を拡大させることができ、白紋羽病を防除する性能を高めることができる。また、このような白紋羽病防除剤は、単純な組成（比較的少ない限定的な種類の成分）であって、高純度で一定の品質のものが容易に入手可能な成分の組み合わせによって構成されている。そのため、マイコウイルスの欠落を抑えつつ効率良く感染菌を増殖させて白紋羽病を防除する効果を、安定して再現性よく得ることができる。特に、感染菌以外の成分は、食品として用いることができる材料によって構成することができたため、白紋羽病防除剤を果樹園などの圃場の土壌中に配置して用いても、高い安全性を確保することができる。
【００１２】
（２）上記形態の白紋羽病防除剤は、さらに、でんぷんおよびアスパラギンを含むこととしてもよい。この形態の白紋羽病防除剤によれば、感染菌の増殖能とウイルス保持能とをさらに向上させることができる。
【００１３】
（３）上記形態の白紋羽病防除剤は、さらに、キサンタンガムとは異なるバクテリアセルロースを含むこととしてもよい。この形態の白紋羽病防除剤によれば、感染菌の増殖能をさらに向上させることができる。
【００１４】
（４）上記形態の白紋羽病防除剤において、前記キサンタンガムとは異なるバクテリアセルロースは、発酵セルロースであることとしてもよい。この形態の白紋羽病防除剤によれば、白紋羽病防除剤における各成分の分散性を向上させると共に、個々の白紋羽病防除剤を均質化することができる。
【００１５】
（５）上記形態の白紋羽病防除剤は、２価の金属元素を含むアルギン酸塩を主成分とする膜に覆われた粒子状に成形されていることとしてもよい。この形態の白紋羽病防除剤によれば、白紋羽病防除剤が含有する既述した成分を含む培地中で感染菌を増殖させた後に、感染菌を含む培地ごと製剤することが容易になるため、製造工程を簡素化することができる。また、このような粒子状の白紋羽病防除剤は、運搬や保存の際の取扱いが容易となり、長期保存性を高めることもできる。さらに、上記粒子状の白紋羽病防除剤は、白紋羽病防除の対象となる土壌中に配置したときに、土壌中で、感染菌と培地とが混在する状態を、より長く維持することができる。そのため、感染菌が増殖しつつ、周囲の非感染菌に感染拡大する場としての機能を、より長く果たすことができる。
【００１６】
本発明は、白紋羽病防除剤以外の種々の形態で実現することも可能である。例えば、白紋羽病防除剤の製造方法、白紋羽病の防除方法、あるいは、弱毒化ウイルスが感染した白紋羽病用培地等の形態で実現することができる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の白紋羽病防除剤によれば、白紋羽病防除の対象となる土中において、感染菌におけるマイコウイルスの欠落を抑えつつ効率良く感染菌を増殖させて、感染を拡大させることができ、白紋羽病を防除する性能を高めることができる。また、このような白紋羽病防除剤は、単純な組成（比較的少ない限定的な種類の成分）であって、高純度で一定の品質のものが容易に入手可能な成分の組み合わせによって構成されている。そのため、マイコウイルスの欠落を抑えつつ効率良く感染菌を増殖させて白紋羽病を防除する効果を、安定して再現性よく得ることができる。特に、感染菌以外の成分は、食品として用いることができる材料によって構成することができため、白紋羽病防除剤を果樹園などの圃場の土壌中に配置して用いても、高い安全性を確保することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】粒状の白紋羽病防除剤の第１の製造方法を示すフローチャートである。
【図２】第１の製造方法を表わす説明図である。
【図３】粒状の白紋羽病防除剤の第２の製造方法を示すフローチャートである。
【図４】第２の製造方法を表わす説明図である。
【図５】糖とアミノ酸の組み合わせの効果を調べた結果を示す説明図である。
【図６】各サンプルにおける培地組成を表わす説明図である。
【図７】サンプル１〜７の相対菌量を比較した結果を示す図である。
【図８】サンプル１〜７の相対ウイルス量を比較した結果を示す図である。
【図９】サンプル８〜１４の相対菌量を比較した結果を示す図である。
【図１０】サンプル８〜１４の相対ウイルス量を比較した結果を示す図である。
【図１１】サンプル１５〜２１の相対菌量を比較した結果を示す図である。
【図１２】サンプル１５〜２１の相対ウイルス量を比較した結果を示す図である。
【図１３】サンプル１５〜２１の相対ウイルス量を比較した結果を示す図である。
【図１４】粒製剤をシャーレ上で培養した結果を示す説明図である。
【図１５】各粒製剤における相対ウイルス量を比較した結果を示す図である。
【図１６】各粒製剤における相対ウイルス量を比較した結果を示す図である。
【図１７】各粒製剤における相対ウイルス量を比較した結果を示す図である。
【図１８】各粒製剤における相対ウイルス量を比較した結果を示す図である。
【図１９Ａ】栽培期間の終了後の苗木の様子を示す写真である。
【図１９Ｂ】栽培期間の終了後の苗木の様子を示す写真である。
【図１９Ｃ】栽培期間の終了後の苗木の様子を示す写真である。
【図１９Ｄ】栽培期間の終了後の苗木の様子を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
Ａ．白紋羽病防除剤の組成：
本発明の実施形態としての白紋羽病防除剤は、キサンタンガムおよびグァーガムのうちの少なくともいずれか一方と、マイコウイルスの感染により弱毒化した白紋羽病菌である感染菌と、を含む。
【００２０】
白紋羽病菌は、Rosellinia属に属する菌である。本実施形態の白紋羽病防除剤において、マイコウイルスの感染により弱毒化した白紋羽病菌である感染菌以外の成分、具体的には、キサンタンガムおよびグァーガムのうちの少なくともいずれか一方は、感染菌を培養するための栄養源である。すなわち、キサンタンガムおよびグァーガムのうちの少なくともいずれか一方は、白紋羽病防除剤に含まれる上記した感染菌が増殖する際に利用される培地を構成する。本実施形態の白紋羽病防除剤に含まれる上記培地は、感染菌に対して、ウイルスを保持したままで増殖させる機能を有する。そして、本実施形態の白紋羽病防除剤を例えば土壌中に配置したときには、白紋羽病防除剤に含まれる上記培地は、土壌中で感染菌から非感染菌（マイコウイルスが感染していない白紋羽病菌）へとマイコウイルスが感染する場を提供する。
【００２１】
Rosellinia属に属する菌のうち、白紋羽病菌としてはR.necatrixおよびR.compactaが知られるが、本実施形態の白紋羽病防除剤では、白紋羽病菌として、特に、R.necatrixを用いることが望ましい。本実施形態の白紋羽病防除剤では、R.necatrixに属する白紋羽病菌であれば、いずれの菌株であっても支障無く採用することができる。白紋羽病菌は、白紋羽病に感染した感染樹から分離した菌株を利用してもよく、あるいは、白紋羽病菌として寄託された菌株を入手して利用してもよい。
【００２２】
白紋羽病防菌に感染するマイコウイルスには、種々のものがあるが、本実施形態で用いるマイコウイルスは、白紋羽病菌に感染したときに、この白紋羽病菌を弱毒化する（非病原性あるいは低病原性にする）ことができるウイルスであればよい。白紋羽病菌がマイコウイルスに感染している場合には、このような菌体からマイコウイルスを分離することができる。白紋羽病菌からマイコウイルスを分離する方法の例については、後に説明する。白紋羽病菌から分離したマイコウイルスが弱毒化能を有するか否かは、例えば、当該マイコウイルスが感染した菌を作製し、植物の苗に感染させて、非感染菌を用いた場合の結果を比較すればよい。感染菌を感染させた苗の枯死率が、非感染菌を感染させた苗の枯死率に比べて有意に低下する場合には、評価対象のマイコウイルスは、弱毒化能を有すると判定することができる。本実施形態で用いるマイコウイルスは、弱毒化能を有するマイコウイルスが感染していることが知られている白紋羽病菌から分離することもできる。
【００２３】
弱毒化した白紋羽病菌（感染菌）は、非感染菌に対して既述したマイコウイルスを導入することにより得ることができる。非感染菌に対するマイコウイルスの導入は、例えば、周知のプロトプラスト法を用いることができる。
【００２４】
本発明の実施形態としての白紋羽病防除剤は、既述したように、感染菌を培養するための培地の成分として、キサンタンガムおよびグァーガムのうちの少なくともいずれか一方を含む。白紋羽病防除剤に含有される培地成分が、キサンタンガムおよびグァーガムのうちの少なくともいずれか一方を含むことで、白紋羽病菌（感染菌）の増殖能とウイルス保持能（白紋羽病菌がウイルスを保持する状態を維持させつつ白紋羽病菌を培養する能力）とを向上させることができる。特に、白紋羽病菌（感染菌）の長期培養性能（より長期間にわたって、感染菌を増殖させつつ培養する能力）を向上させることができる。また、白紋羽病防除剤を例えば圃場の土壌内に配置して、土壌内の他の白紋羽病菌にマイコウイルスを感染させて白紋羽病を防除する際に、マイコウイルスの感染源となる白紋羽病防除剤内の感染菌の増殖能を高めることができる。
【００２５】
キサンタンガムおよびグァーガムは、アミロース系の主鎖、すなわち、αグルコースがα−１，４グリコシド結合によって重合した主鎖と、セルロース系の側鎖、すなわち、βグルコースがβ−１，４グリコシド結合によって重合した側鎖と、を有する。白紋羽病菌は、自然状態で植物に感染する際には、植物体を構成するセルロース系の多糖類を糖源として利用する。また、白紋羽病防除剤を製造するために白紋羽病菌を人為的に培養する際には、一般にはアミロース系の多糖類が糖源として用いられる。白紋羽病防除剤に含まれる白紋羽病菌（感染菌）は、人為的な培養を経ることにより、セルロース系の多糖類とアミロース系の多糖類の双方を利用しやすい状態になっていると考えられるため、上記のような構造を有するキサンタンガムやグァーガムを培地中に含むことにより、感染菌の増殖能を高めることができると考えられる。
【００２６】
また、白紋羽病防除剤がキサンタンガムおよびグァーガムのうちの少なくともいずれか一方を含むことにより、白紋羽病防除剤内に含まれる感染菌を、セルロース誘導がかかってセルラーゼが分泌される状態にすることができる。そのため、このような白紋羽病防除剤を例えば圃場の土壌内に配置すると、土壌内に配置された白紋羽病防除剤内の感染菌は、周囲の植物体を構成するセルロースを直ちに利用して、良好に増殖することが可能になる。そのため、白紋羽病防除剤を土壌内に配置した後の白紋羽病防除剤内の感染菌の増殖能を高めることができる。
【００２７】
また、本実施形態のように、白紋羽病防除剤が、キサンタンガムおよびグァーガムのうちの少なくともいずれか一方を含み、アミロース系の構造およびセルロース系の構造を有する長鎖の糖を糖源として含有する場合には、感染菌は、糖源として単糖類や二糖類のように分子量の小さい糖類を用いる場合に比べて増殖に時間を要するようになる。その結果、白紋羽病防除剤に含まれる感染菌の細胞分裂の速度が、よりゆっくりになり、分裂後の各々の細胞にマイコウイルスが移行する確率が高まる。そのため、ウイルス保持能が、より向上すると考えられる。
【００２８】
キサンタンガムおよびグァーガムのうちの少なくともいずれか一方は、白紋羽病防除剤内に含まれるだけでなく、白紋羽病防除剤の製造工程において、白紋羽病菌（感染菌）を増殖させるための培地中に含まれることが望ましい。製造工程で用いる培地中に、キサンタンガムおよびグァーガムのうちの少なくともいずれか一方が含まれることにより、白紋羽病防除剤の製造工程において、白紋羽病防除剤に含有させる白紋羽病菌（感染菌）を効率良く増殖させることができ、得られる白紋羽病防除剤の防除性能を高めることができる。また、製造工程において、当該培地を用いて感染菌を培養した後に、培地ごと感染菌を製剤することで、キサンタンガムおよびグァーガムのうちの少なくともいずれか一方を含む白紋羽病防除剤を容易に得ることができる。
【００２９】
本発明の実施形態としての白紋羽病防除剤は、感染菌を培養するための培地の成分として、さらに、でんぷんとアスパラギンとを含むこととしてもよい。本願発明者等は、本願発明に先立つ予備的な実験において、白紋羽病菌（感染菌）における糖源として各種糖類を比較すると共に、アミノ酸源として各種アミノ酸を比較した。このように、白紋羽病菌における糖源およびアミノ酸源の嗜好性について調べた結果、白紋羽病菌（感染菌）は、糖源としてはでんぷんに嗜好性を示し、アミノ酸源としてはアスパラギンに嗜好性を示すとの知見を得た。上記のように白紋羽病菌がでんぷんおよびアスパラギンに嗜好性を示すことにより、白紋羽病防除剤は、感染菌の糖源として少なくともでんぷんを含み、感染菌のアミノ酸源として少なくともアスパラギンを含むことにより、感染菌の増殖能（感染菌を増殖させる能力）を高めることができる。すなわち、白紋羽病防除剤を例えば圃場の土壌内に配置して、土壌内の他の白紋羽病菌にマイコウイルスを感染させて白紋羽病を防除する際に、マイコウイルスの感染源となる白紋羽病防除剤内の感染菌の増殖能を高めることが可能になる。ただし、本発明の実施形態における白紋羽病防除剤において、でんぷんおよびアスパラギンは、必須ではない。
【００３０】
でんぷんおよびアスパラギンは、白紋羽病防除剤内に含まれるだけでなく、白紋羽病防除剤の製造工程において、白紋羽病菌（感染菌）を増殖させるための培地中に含まれることが望ましい。製造工程で用いる培地中にでんぷんおよびアスパラギンが含まれることにより、白紋羽病防除剤の製造工程において、白紋羽病防除剤に含有させる白紋羽病菌（感染菌）を効率良く増殖させることができ、得られる白紋羽病防除剤の防除性能を高めることができる。また、製造工程において、当該培地を用いて感染菌を培養した後に、培地ごと感染菌を製剤することで、でんぷんおよびアスパラギンを含む白紋羽病防除剤を容易に得ることができる。
【００３１】
本発明の実施形態としての白紋羽病防除剤は、培地成分として、さらに、カルボキシメチルセルロースナトリウムを含むこととしてもよい。このような構成とすることで、白紋羽病菌（感染菌）の増殖能とウイルス保持能とをさらに向上させることができる。ガルボキシメチルセルロースナトリウムは、ウイルス保持能を高める機能を有するが、白紋羽病菌（感染菌）の増殖には抑制的に働く場合がある。白紋羽病防除剤が、感染菌の増殖能を高める働きを有するキサンタンガムおよびグァーガムのうちの少なくともいずれか一方に加えて、さらに、カルボキシメチルセルロースナトリウムを含有することにより、白紋羽病菌や、これに感染するウイルスの種類にかかわらず、感染菌の増殖能とウイルス保持能とを両立させ、双方を向上させることができると考えられる。ただし、カルボキシメチルセルロースナトリウムは必須ではない。
【００３２】
本発明の実施形態としての白紋羽病防除剤は、培地成分として、さらに、キサンタンガムとは異なるバクテリアセルロースを含むこととしてもよい。このような構成とすることで、白紋羽病菌（感染菌）の増殖能をさらに向上させることができる。ただし、キサンタンガムとは異なるバクテリアセルロースは必須ではない。
【００３３】
キサンタンガムとは異なるバクテリアセルロースとしては、例えば、発酵セルロース、ジェランガム（真正細菌のシュードモナス・エロディア（Pseudomonas elodea）由来）、ウェランガム（グラム陰性細菌のアルカリゲネス（Alcaligenes）由来）、カードラン（アグロバクテリウム（Agrobacterium）やアルカリゲネス（Alcaligenes）由来）、およびプルラン（黒酵母（Aureobasidium pullulans）由来）を挙げることができる。
【００３４】
白紋羽病防除剤が、キサンタンガムとは異なるバクテリアセルロースをさらに含有することで、白紋羽病菌（感染菌）にとって利用しやすい栄養、すなわち、植物体を構成するセルロースよりも分子量が小さく分解して代謝に供することが容易な栄養源が増えるため、白紋羽病防除剤における感染菌の増殖能を向上することができる。また、βグルコースがβ−１，４グリコシド結合によって重合したセルロース系の構造を有する栄養源が増えることで、白紋羽病防除剤内に含まれる感染菌を、セルロース誘導がかかってセルラーゼが分泌される状態にすることがより容易になる。そのため、白紋羽病防除剤を土壌内に配置した後の白紋羽病防除剤内の感染菌の増殖能を高めることができる。
【００３５】
カルボキシメチルセルロースナトリウム、および、キサンタンガムとは異なるバクテリアセルロースは、白紋羽病防除剤内に含まれるだけでなく、白紋羽病防除剤の製造工程において、白紋羽病菌（感染菌）を増殖させるための培地中に含まれることが望ましい。製造工程で用いる培地中に、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および、キサンタンガムとは異なるバクテリアセルロースが含まれることにより、白紋羽病防除剤の製造工程において、白紋羽病防除剤に含有させる白紋羽病菌（感染菌）において、マイコウイルスが感染する状態を維持しつつ、感染菌を効率良く増殖させることができる。そのため、得られる白紋羽病防除剤の防除性能を高めることができる。また、製造工程において、当該培地を用いて感染菌を培養した後に、培地ごと感染菌を製剤することで、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および、キサンタンガムとは異なるバクテリアセルロースを含む白紋羽病防除剤を、容易に得ることができる。
【００３６】
カルボキシメチルセルロースナトリウムと共に用いる上記したバクテリアセルロースとしては、特に発酵セルロースが望ましい。発酵セルロースは、酢酸菌の一種であるAcetobacter xylinum が生産するバクテリアセルロースであり、特に繊維質が細かく、繊維同士が緻密に絡み合う形態を有する。そして、液中に分散させると、三次元網目構造の微粒子の状態で均一に分散する性質を有しており、液中の他の成分の分散性を向上させることができる。そのため、バクテリアセルロースとして発酵セルロースを用いることで、培地中における各成分の分散性を向上させることができる。また、培地中における各成分の分散性を向上させることができるため、製造工程において、当該培地を用いて感染菌を培養した後に、培地ごと感染菌を製剤する場合には、得られた個々の白紋羽病防除剤を均質化できる効果が得られる。
【００３７】
Ｂ．白紋羽病防除剤の製造方法：
白紋羽病防除剤としては、種々の態様を採用可能であるが、以下では、白紋羽病防除剤の製造方法の一例として、粒状の白紋羽病防除剤の製造方法について説明する。
【００３８】
（Ｂ−１）第１の製造方法：
図１は、粒状の白紋羽病防除剤の第１の製造方法を示すフローチャートであり、図２は、この第１の製造方法を表わす説明図である。図１および図２に示す第１の製造方法に基づいて白紋羽病防除剤を製造する際には、まず、液体培地に感染菌を接種する（ステップＳ１００）。ステップＳ１００は、第１の工程とも呼ぶ。
【００３９】
用いる感染菌としては、例えば、凍結保存した感染菌を解凍した後、ポテトデキストロース寒天培地（potato dextrose agar：ＰＤＡ）を用いて培養した感染菌を用いればよい。ステップＳ１００における液体培地に感染菌を接種する動作は、例えば、上記した感染菌を培養したＰＤＡ培地のコルクボーラー片を、液体培地に投入することにより行なうことができる。あるいは、上記した感染菌を含むコルクボーラー片を、一旦、滅菌した蒸留水中で破砕して菌液を調整し、この菌液を液体培地に滴下することにより行なうこととしてもよい。図２では、菌液を液体培地に滴下する様子を示している。
【００４０】
ステップＳ１００で用いる液体培地としては、キサンタンガムおよびグァーガムのうちの少なくともいずれか一方を含有する液体培地を用いればよい。上記液体培地は、でんぷんおよびアスパラギンを、さらに含有していてもよい。また、上記液体培地は、カルボキシメチルセルロースナトリウムを、さらに含有していてもよい。また、上記液体培地は、キサンタンガムとは異なるバクテリアセルロースを、さらに含有していてもよい。
【００４１】
ステップＳ１００で用いる液体培地において、キサンタンガムおよびグァーガムの濃度は、培地成分としてキサンタンガムおよびグァーガムのうちの少なくともいずれか一方を加える効果を高める観点から、キサンタンガムおよびグァーガムの合計で、培地を構成する水（蒸留水）１００ｇ中、０．０３３ｇ以上とすることが望ましく、０．０９１ｇ以上とすることがより望ましい。また、キサンタンガムおよびグァーガムの濃度は、キサンタンガムおよびグァーガムを添加することに起因する培地の粘性の高まりを抑える観点から、キサンタンガムおよびグァーガムの合計で、培地を構成する水（蒸留水）１００ｇ中、２．０ｇ以下とすることが望ましい。
【００４２】
ステップＳ１００で用いる液体培地が、さらにでんぷんを含有する場合には、でんぷんの濃度は、糖源としてでんぷんを加える効果を高める観点から、培地を構成する水（蒸留水）１００ｇ中、０．０１ｇ以上とすることが望ましく、２．０ｇ以上とすることがより望ましい。また、でんぷんの濃度は、培地中におけるでんぷんの沈降を抑える観点から、培地を構成する水（蒸留水）１００ｇ中、６．０ｇ以下とすることが望ましく、４．０ｇ以下とすることがより望ましい。
【００４３】
ステップＳ１００で用いる液体培地が、さらにアスパラギンを含有する場合には、アスパラギンの濃度は、アミノ酸源としてアスパラギンを加える効果を高める観点から、培地を構成する水（蒸留水）１００ｇ中、０．００７２ｇ以上とすることが望ましく、０．０１ｇ以上とすることがより望ましい。また、アスパラギンの濃度は、アスパラギンに起因する感染菌の増殖の抑制を抑える観点から、培地を構成する水（蒸留水）１００ｇ中、２．０ｇ以下とすることが望ましく、１．８ｇ以下とすることがより望ましい。
【００４４】
ステップＳ１００で用いる液体培地が、さらにカルボキシメチルセルロースナトリウムを含有する場合には、液体培地中のカルボキシメチルセルロースナトリウムの濃度は、培地成分としてカルボキシメチルセルロースナトリウムを加える効果を高める観点から、培地を構成する水（蒸留水）１００ｇ中、０．０１７ｇ以上とすることが望ましく、０．０４８ｇ以上とすることがより望ましい。また、カルボキシメチルセルロースナトリウムの濃度は、カルボキシメチルセルロースナトリウムを添加することに起因する培地の粘性の高まりを抑える観点から、培地を構成する水（蒸留水）１００ｇ中、０．１７ｇ以下とすることが望ましい。
【００４５】
ステップＳ１００で用いる液体培地が、さらにキサンタンガムとは異なるバクテリアセルロースを含有する場合には、液体培地中の上記バクテリアセルロースの濃度は、培地成分として上記バクテリアセルロースを加える効果を高める観点から、培地を構成する水（蒸留水）１００ｇ中、０．０５ｇ以上とすることが望ましく、０．１４ｇ以上とすることがより望ましい。また、キサンタンガムとは異なるバクテリアセルロースの濃度は、上記バクテリアセルロースを添加することに起因する培地の粘性の高まりを抑える観点から、培地を構成する水（蒸留水）１００ｇ中、０．５０ｇ以下とすることが望ましい。
【００４６】
ステップＳ１００で液体培地に感染菌を接種すると、次に、感染菌を、接種した液体培地中で培養する（ステップＳ１１０）。これにより、培養後の感染菌と液体培地とを含む培養液が得られる。ステップＳ１１０は、第２の工程とも呼ぶ。
【００４７】
白紋羽病菌は、光の照射により増殖が抑制される性質を有するため、ステップＳ１１０は、遮光培養とすることが望ましい。ただし、遮光は必須ではない。また、ステップＳ１１０における培養温度は、２０〜３０℃とすることができ、２３〜２７℃とすることが好ましく、２５℃がより好ましい。また、ステップＳ１１０における培養は、振盪培養とすることが好ましい。
【００４８】
ステップＳ１１０の培養を行なうことで、感染菌は、液体培地中に含まれる各成分を消費しつつ増殖する。そのため、ステップＳ１１０の培養が終了した後の液体培地は、培養開始前の液体培地と比べて、各成分の濃度が変化しているが、いずれの液体培地も、既述した各成分を含有する。そこで、培養後において感染菌を含む培地も、培養前と同様に単に液体培地とも呼ぶ。
【００４９】
ステップＳ１１０の培養の後、ステップＳ１１０で得られた培養液を用いて粒子を形成して（ステップＳ１２０）、白紋羽病防除剤を完成する。具体的には、培養後の感染菌および液体培地と共にアルギン酸またはアルギン酸塩を含む第１の混合液を、２価の金属元素を含む乳酸塩、２価の金属元素を含む硫酸塩、および２価の金属元素を含む塩化物から選択される少なくともいずれかの化合物の溶液に滴下して、培養液を含む粒子を形成する。このように、アルギン酸またはアルギン酸塩を含有する第１の混合液を、上記２価の金属元素を含む溶液に滴下することで、２価の金属元素を含むアルギン酸塩を主成分とする膜によって培養液が覆われた粒子を作製することができる。ステップＳ１２０は、第３の工程とも呼ぶ。なお、得られる粒子の大きさは、滴下する第１の混合液の液滴の量により調整することができる。粒子の大きさは、例えば２〜１０ｍｍとすることができる。滴下の動作の容易化の観点から、粒子の大きさは５〜６ｍｍとすることが望ましい。
【００５０】
第１の混合液が含むアルギン酸またはアルギン酸塩としては、アルギン酸ナトリウムあるいはアルギン酸アンモニウムを用いることが望ましい。菌増殖に対する影響を抑える観点からは、アルギン酸アンモニウムがより望ましい。第１の混合液は、ステップＳ１２０において、培養後の感染菌および液体培地を含む培養液に、アルギン酸またはアルギン酸塩を加えることによって作製してもよい。あるいは、ステップＳ１００において液体培地中で感染菌を培養する際に、アルギン酸またはアルギン酸塩を予め液体培地に加える場合には、ステップＳ１１０で得られる培養液を、第１の混合液とすることができる。このようにすれば、ステップＳ１２０において、アルギン酸またはアルギン酸塩を加えるための特別な工程を行なう必要が無い。
【００５１】
第１の混合液が含むアルギン酸またはアルギン酸塩の濃度は、粒子の形成を十分に行なう観点から、３１．３μＭ以上とすることが望ましく、４７．０μＭ以上とすることがより望ましい。また、第１の混合液が含むアルギン酸またはアルギン酸塩の濃度は、アルギン酸またはアルギン酸塩を加えることに起因する菌量の低下を抑える観点から、６２．６μＭ以下とすることが望ましい。具体的には、アルギン酸ナトリウムを、ステップＳ１００で用いる液体培地に予め混合する場合には、液体培地中のアルギン酸ナトリウムの濃度は、培地を構成する水（蒸留水）１００ｇ中、０．５０ｇ以上とすることが望ましく、０．７５ｇ以上とすることがより望ましい。また、アルギン酸ナトリウムの濃度は、培地を構成する水（蒸留水）１００ｇ中、４．０ｇ以下とすることが望ましく、１．０ｇ以下とすることがより望ましい。
【００５２】
ステップＳ１２０で第１の混合液を滴下する溶液に含まれる２価の金属元素は、例えば、カルシウム（Ｃａ）、マグネシウム（Ｍｇ）、および亜鉛（Ｚｎ）から選択される金属元素とすることができ、カルシウム（Ｃａ）が特に好ましい。上記２価の金属元素としてカルシウム（Ｃａ）を用いる場合には、ステップＳ１２０では、アルギン酸カルシウムを主成分とする膜によって培養液が覆われた粒子を作製することができる。ステップＳ１２０で第１の混合液を滴下する溶液を、乳酸カルシウム溶液とする場合には、溶液中の乳酸カルシウムの濃度は、例えば、１．０ｗｔ％〜８．０ｗｔ％とすることができる。
【００５３】
（Ｂ−２）第２の製造方法：
図３は、粒状の白紋羽病防除剤の第２の製造方法を示すフローチャートであり、図４は、この第２の製造方法を表わす説明図である。第１の製造方法では、感染菌を液体培地中で培養した後に粒状に成形したが、第２の製造方法では、感染菌を液体培地に接種して粒状に成形し、その後、培養を行なう点が異なる。図３および図４に示す第２の製造方法に基づいて白紋羽病防除剤を製造する際には、まず、液体培地に感染菌を接種する（ステップＳ１００）。このステップＳ１００は、第１の製造方法におけるステップＳ１００と同じ工程であるため、詳しい説明は省略する。
【００５４】
ステップＳ１００で液体培地に感染菌を接種すると、次に、感染菌を接種した液体培地を混和して混合液とし、混合液を用いて粒子を形成する（ステップＳ２１０）。具体的には、感染菌を接種した液体培地と共にアルギン酸またはアルギン酸塩を含む第２の混合液を、２価の金属元素を含む乳酸塩、２価の金属元素を含む硫酸塩、および２価の金属元素を含む塩化物から選択される少なくともいずれかの化合物の溶液に滴下して、感染菌および液体培地を含む粒子を形成する。このように、アルギン酸またはアルギン酸塩を含有する第２の混合液を、２価の金属元素を含む溶液に滴下することで、２価の金属元素を含むアルギン酸塩を主成分とする膜によって、感染菌を接種した液体培地が覆われた粒子を作製することができる。ステップＳ２１０は、第４の工程とも呼ぶ。
【００５５】
第２の混合液が含むアルギン酸またはアルギン酸塩としては、第１の製造方法と同様に、アルギン酸ナトリウムまたはアルギン酸アンモニウムを用いることが望ましい。アルギン酸またはアルギン酸塩の添加は、ステップＳ１００において、液体培地に感染菌を接種する際に同時に行なえばよく、これにより、混合の工程を簡素化できる。あるいは、液体培地に感染菌を接種した後に、さらに、アルギン酸またはアルギン酸塩を添加して、第２の混合液を調製してもよい。
【００５６】
例えば、アルギン酸またはアルギン酸塩としてアルギン酸ナトリウムを用いる場合に、第２の混合液におけるアルギン酸塩としてアルギン酸ナトリウムの濃度は、第１の製造方法においてステップＳ１００で用いる液体培地に予め混合する場合の濃度として示した範囲とすることができる。また、ステップＳ２１０で第２の混合液を滴下する溶液に含まれる２価の金属元素は、第１の製造方法と同様の元素を用いることができる。
【００５７】
ステップＳ２１０で、感染菌と液体培地とを含む第２の混合液を粒状に成形すると、得られた粒子を培養し（ステップＳ２２０）、白紋羽病防除剤を完成する。ステップＳ２２０の培養工程により、粒子内部で感染菌が増殖し、増殖した感染菌と、既述した培地成分を含有する液体培地と、を含む白紋羽病防除剤が得られる。ステップＳ２２０は、第５の工程とも呼ぶ。
【００５８】
白紋羽病菌は、光の照射により増殖が抑制される性質を有するため、ステップＳ２２０は、遮光培養とすることが望ましい。ただし、遮光は必須ではない。また、ステップＳ２２０における培養温度は、２０〜３０℃とすることができ、２３〜２７℃とすることが好ましく、２５℃がより好ましい。ステップＳ２２０における培養は、例えば、ステップＳ２１０で得た粒子を、滅菌した蒸留水中に浸漬して静置すればよい。
【００５９】
以上のように構成された本実施形態の白紋羽病防除剤によれば、感染菌と共に培地成分として、キサンタンガムおよびグァーガムのうちの少なくともいずれか一方を含む。そのため、白紋羽病防除の対象となる土中において、感染菌におけるマイコウイルスの欠落を抑えつつ効率良く感染菌を増殖させて、感染を拡大させることができ、白紋羽病を防除する性能を高めることができる。
【００６０】
また、本実施形態の白紋羽病防除剤を製造する際に、既述した成分を含む培地中で感染菌を増殖させ、その後、感染菌を含む培地ごと白紋羽病防除剤の製造に供するならば、製剤に先立って、感染菌を、マイコウイルスの欠落を抑えつつ効率良く増殖させることができる。そして、充分量の感染菌と共に、マイコウイルスの欠落を抑えつつ感染菌を増殖できる培地成分を含む白紋羽病防除剤を、簡便な工程により容易に作製することが可能になる。
【００６１】
また、本実施形態の白紋羽病防除剤は、キサンタンガムおよびグァーガムのうちの少なくともいずれか一方（あるいはさらに、でんぷん、アスパラギン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、あるいはバクテリアセルロース）のように、単純な組成（比較的少ない限定的な種類の成分）であって、高純度で一定の品質のものが容易に入手可能な成分の組み合わせによって、培地成分が構成されている。そのため、真菌の培地として一般的に用いられるポテトデキストロース培地のように、含有する成分が多種であって、成分組成を均一化し難い植物体等を原料とする必要が無い。その結果、このような培地を用いることで、マイコウイルスの欠落を抑えつつ効率良く感染菌を増殖させて白紋羽病を防除する効果を、安定して再現性よく得ることができる。
【００６２】
特に、本実施形態の白紋羽病防除剤は、感染菌以外の培地部分は、食品として用いることができる材料によって構成することができる。そのため、白紋羽病防除剤を、果樹園などの圃場の土壌中に配置して用いても、高い安全性を確保することができる。
【００６３】
白紋羽病防除剤を、既述したように、２価の金属元素を含むアルギン酸塩を主成分とする膜に覆われた粒子状にする場合には、既述した成分を含む培地中で感染菌を増殖させた後に、感染菌を含む培地ごと製剤することが容易になるため望ましい。特に、このような粒子状の白紋羽病防除剤（単に、粒製剤とも呼ぶ）は、運搬や保存の際の取扱いが容易であり、望ましい。また、上記粒子状の白紋羽病防除剤は、長期保存性にも優れる。例えば、上記粒製剤を滅菌した蒸留水中に浸漬して冷蔵保存（例えば４℃）すれば、粒製剤中の感染菌は、１年以上にわたって、ウイルスを保持した状態で増殖能を保って生存することができる。
【００６４】
さらに、上記粒子状の白紋羽病防除剤は、２価の金属元素を含むアルギン酸塩を主成分とする膜内に、感染菌および培地が封入されているため、白紋羽病防除の対象となる土壌中に配置したときに、土壌中で、感染菌と培地とが混在する状態を、より長く維持することが可能になる。そのため、土壌中で、感染菌が増殖しつつ、周囲の非感染菌に感染拡大する場としての機能を、より長く果たすことができる。特に、白紋羽病防除剤が含む培地中に、発酵セルロースを加える場合には、得られる粒製剤がより硬くなる。そのため、粒製剤の取扱いがより容易になると共に、土壌中で粒製剤の状態を維持できる期間が長くなるため望ましい。
【００６５】
Ｃ．変形例：
・変形例１：
上記実施形態では、白紋羽病防除剤を粒子状の粒製剤とする例を示したが、粒製剤以外の種々の態様を採用することができる。例えば、白紋羽病防除剤の製造工程で用いる白紋羽病菌（感染菌）を増殖させるための培地として既述した液体培地を用いて、感染菌を培養して増殖させ、得られた感染菌を、培養液ごと支持体に接種して、白紋羽病防除剤とする態様を採用できる。
【００６６】
用いる支持体としては、例えば、木片や、ウレタンスポンジを採用することができる。白紋羽病菌の増殖および感染拡大を妨げない支持体を用いることが望ましい。支持体に感染菌を接種するために用いる培養液は、例えば、既述した第１の製造方法におけるステップＳ１１０で得た培養液を用いればよい。感染菌を培養液ごと支持体に接種する場合には、例えば、支持体を培養液中に投入して支持体に培養液を含浸させてもよく、あるいは、支持体に培養液を滴下して、支持体に培養液をしみ込ませてもよい。
【実施例】
【００６７】
＜白紋羽病菌（非感染菌）の入手＞
国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構遺伝資源センターより、白紋羽病菌（非感染菌）として、Rosellinia necatrix 属に属するＷ９７株（ＭＡＦＦ番号：６２５１１６）の配布を受けた。
【００６８】
＜白紋羽病菌（感染菌）の入手＞
国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構遺伝資源センターより、白紋羽病菌（感染菌）として、Rosellinia necatrix 属に属するＷ７７９株（ＭＡＦＦ番号：３２８１９５）およびＷ１０３２株（ＭＡＦＦ番号：６４５０２４）の配布を受けた。Ｗ７７９株は、マイコウイルスとして、メガビルナウイルスの１種である Rosellinia necatrix megabirunavirus 1（ＲｎＭＢＶ１）が感染することにより弱毒化された菌である。以後の説明では、上記マイコウイルスが感染していることを明示するために、Ｗ７７９株を、Ｗ７７９（ＲｎＭＢＶ１）とも表記する。Ｗ１０３２株は、マイコウイルスとして、メガビルナウイルスとは異なるウイルスであるＹｎＶ１およびＹｋＶ１が混合感染することにより弱毒化された菌である。以後の説明では、上記マイコウイルスが感染していることを明示するために、Ｗ１０３２株を、Ｗ１０３２（ＹｎＶ１＋ＹｋＶ１）とも表記する。
【００６９】
＜ウイルスの分離＞
感染菌であるＷ７７９株から、マイコウイルスであるＲｎＭＢＶ１を分離した。マイコウイルスの分離は、Chiba S. et. al. J. Virol. 2009, 83(24), p.12801-12812 に記載の方法に基づいて行なった。マイコウイルスの分離工程の概要を以下に示す。
【００７０】
まず、感染菌の培養液を濾過して、感染菌を回収した。回収した感染菌を液体窒素を用いて冷凍して粉砕し、メルカプトエタノール入リン酸バッファで懸濁した後、四塩化炭素で処理して、ウイルスを含む上清を得た。この上清を、超遠心分離し、得られたペレットをリン酸バッファに懸濁した。その後、ＰＥＧ溶液（１％  ＮａＣｌ、６−８％  ＰＥＧ６０００）を加えて攪拌して超遠心分離し、得られたペレットをリン酸バッファにて再懸濁した。その後、ショ糖密度勾配超遠心法によりマイコウイルスを回収した。回収したウイルスは、０．０５Ｍリン酸バッファへの懸濁、遠心分離、０．０５Ｍリン酸バッファへの再懸濁を行なって、感染菌を作製するために用いるウイルス液とした。
【００７１】
＜感染菌の作製＞
上記のように感染菌Ｗ７７９株から分離したマイコウイルスＲｎＭＢＶ１を、非感染菌であるＷ９７株に感染させて、感染菌を得た。以後の説明では、非感染菌Ｗ９７株に、マイコウイルスであるＲｎＭＢＶ１を感染させた感染菌を、Ｗ９７＋ＲｎＭＢＶ１とも表記する。
【００７２】
非感染菌Ｗ９７株へのマイコウイルスＲｎＭＢＶ１の感染は、周知のプロトプラスト法により行なった。プロトプラスト法によるウイルス感染工程の概要を以下に示す。
【００７３】
液体培地中で非感染菌Ｗ９７株を培養した培養液を遠心分離し、非感染菌をペレットとして回収した。回収した非感染菌を、細胞壁溶解酵素を含む溶液で懸濁し、２０℃で振盪しながら酵素反応を進行させた。顕微鏡でプロトプラストが形成されていることを確認後、ステンレスメッシュで不要な菌を除去し、遠心分理により、プロトプラストをペレットとして回収した。その後、得られたペレットについて、上記細胞壁溶解酵素を含む溶液での懸濁と遠心分離の操作を繰り返し行なった。得られたペレットをＭＭＣバッファ（マンニトール、マレイン酸、および塩化カルシウムを含む緩衝液）に懸濁し、プロトプラスト液を得た。
【００７４】
得られたプロトプラスト液とウイルス液とを混合し、氷上で静置し、さらにＰＥＧ溶液を加えて混合し、２０℃にて遮光して２０分間静置した。その後、ポテトデキストロース液体培地にグルコースを加えた培地を加えて混合し、２５℃にて遮光して７日間静置培養した。このようにして得られた菌液を、寒天培地に接種して、遮光下で培養してコロニーを得た。コロニーを形成する菌をＲＴ−ＰＣＲ法によりチェックして、マイコウイルスＲｎＭＢＶ１が導入されていることを確認した。
【００７５】
＜菌の準備＞
配布を受けた感染菌および非感染菌、並びに作製した感染菌は、直径５．５ｍｍのコルクボーラー片の形態にて、−８０℃にて貯蔵した。使用に先立って、凍結した上記コルクボーラー片を２５℃のウォーターバスにて解凍し、ポテトデキストロース寒天培地（ＰＤＡ培地、ベクトン・ディッキンソンアンドカンパニー社製）上に載置して、２５℃にて培養した。そして、５〜７日おきに継代を繰り返した。継代の際には、直径５．５ｍｍのコルクボーラーで菌片を抜き取り、新しいＰＤＡ培地に移した。また、継代時と同様のコルクボーラー片を、後述する使用に供した。
【００７６】
＜糖およびアミノ酸の嗜好性の検討のための予備実験＞
予備実験において、白紋羽病菌（感染菌）の糖およびアミノ酸の嗜好性を検討した。白紋羽病菌（感染菌）としては、Ｗ９７＋ＲｎＭＢＶ１を用いた。糖およびアミノ酸の嗜好性を検討するための以下の予備実験では、水１００ｍＬに対して１．５ｇの寒天を含む寒天培地（固形培地）を用いた。
【００７７】
糖の嗜好性を検討する際には、上記寒天培地において、グルコース、スクロース、およびでんぷんのいずれかを添加した３種の培地を用意し、各々の培地に上記感染菌を接種し、菌の増殖能を調べた。糖およびアミノ酸の嗜好性を検討する予備実験では、培地中の糖の濃度は、いずれも水１００ｍＬに対して３．１２ｇとした。その結果、でんぷんにおいて最も強い増殖能が認められた（データ示さず）。
【００７８】
アミノ酸の嗜好性を検討する際には、上記寒天培地において、アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、およびアルギニン（Ａｒｇ）のいずれかを添加した４種類の培地を用意し、各々の培地に上記感染菌を接種し、菌の増殖能を調べた。糖およびアミノ酸の嗜好性を検討する予備実験では、培地中のアミノ酸の濃度は、いずれも水１００ｍＬに対して０．３６ｇとした。その結果、アスパラギンにおいて最も強い増殖能が認められた（データ示さず）。なお、子嚢菌である白紋羽病など、真菌類を培養する際には、一般に、ＰＤＡ培地が広く用いられている。上記４種類のアミノ酸は、馬鈴薯に多く含まれるアミノ酸として知られる上位４種のアミノ酸である。
【００７９】
図５は、糖とアミノ酸の組み合わせの効果を、寒天培地を用いて調べた結果を示す説明図である。ここでは、寒天のみを含む培地（コントロール）と、寒天に加えてアスパラギンを含む培地と、寒天に加えてでんぷんを含む培地と、寒天に加えてアスパラギンとでんぷんの双方を含む培地と、を用いた。各々の寒天培地上に、Ｗ９７＋ＲｎＭＢＶ１の既述したコルクボーラー片を載置し、２５℃で培養した。図５では、培養開始後４日目と７日目に、寒天培地上で伸展する菌糸コロニーの径を測定した結果（単位はｍｍ）を示す。菌糸コロニーの径は、菌糸コロニーの中心を通る最長径を測定した。図５に示すように、培地成分としてアスパラギンとでんぷんとを組み合わせることにより、感染菌の増殖を促進する性能が向上することが確認された。
【００８０】
＜培地成分の検討＞
図６は、培地組成と、感染菌の増殖能およびウイルス保持能と、の関係を調べるために用いた各サンプルにおける培地組成を表わす説明図である。感染菌としては、Ｗ９７＋ＲｎＭＢＶ１（サンプル１〜７）、Ｗ７７９（ＲｎＭＢＶ１）（サンプル８〜１４）、およびＷ１０３２（ＹｎＶ１＋ＹｋＶ１）（サンプル１５〜２１）の３種類を用いた。図６では、培地中の各成分の濃度を、蒸留水１００ｍＬ当たりの重量（ｇ）によって示している。培地成分の検討の際には、液体培地を用いた。サンプル１〜２１のうち、培地中に、キサンタンガムあるいはグァーガムに加えて、でんぷんおよびアスパラギンを含むサンプル５〜７，１２〜１４，１９〜２１が、実施例に相当する。なお、図６に組成を示した培地を調整する際に、キサンタンガム（三栄源エフ・エフ・アイ株式会社製）、グァーガム（三栄源エフ・エフ・アイ株式会社製）、およびカルボキシメチルセルロースナトリウム（米山薬品工業株式会社製）については、食品グレードのものを使用した。
【００８１】
（感染菌の菌液の調整）
既述した３種類の感染菌について、＜菌の準備＞で説明したように継代培養し、培地成分の検討に用いるためのコルクボーラー片を得た。そして、３種類の感染菌の各々について、コルクボーラー片から菌液を調整した。すなわち、滅菌蒸留水２０ｍＬにコルクボーラー片２個を加え、エースホモジナイザーＡＭ−７（株式会社日本精機製作所製）を用いて感染菌を破砕し、菌液を得た。破砕条件は、５，０００ｒｐｍで３０秒、インターバル１０秒、３，０００ｒｐｍで５秒、インターバル１０秒、３，０００ｒｐｍとした。
【００８２】
（感染菌の培養）
各々のサンプルについて、図６に示した組成の液体培地１．０ｍＬを、２．０ｍＬチューブに分注し、液体培地を分注した各チューブに、サンプルに応じた菌種の菌液を５０μＬずつ加え、ピペッティングで混和した。その後、各サンプルを、クールインキュベータＣＮ−２５Ｃ（三菱電機エンジニアリング株式会社製）を用いて２５℃にて培養した。Ｗ９７＋ＲｎＭＢＶ１（サンプル１〜７）およびＷ１０３２（ＹｎＶ１＋ＹｋＶ１）（サンプル１５〜２１）は７日間培養し、Ｗ７７９（ＲｎＭＢＶ１）（サンプル８〜１４）は４日間培養した。上記した培養日数は、感染菌の増殖の程度に基づいて設定した。
【００８３】
（感染菌からの核酸の抽出）
培養後の各サンプルを、遠心分離（１４，０００ｒｐｍ、５分間、２０℃）した。上清を除去した後、チューブ内にジルコニアビーズおよび抽出バッファ（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ，２０ｍＭ  ＮａＣｌ，４ｍＭ  ＥＤＴＡ，２％  ＳＤＳ，ｐＨ８．０）１ｍＬを加え、菌体ペレットを破砕した。ジルコニアビーズは、直径１．０−１．２５ｍｍのビーズ（サンゴバン株式会社製、ＥＲ１２０５−Ｎ）と直径７．０ｍｍのビーズ（株式会社バイオメディカルサイエンス製）とを混合して用いた。粉砕は、ディスラプタージェニー（サイエンティフィックインダストリーズ社製）を用いて、３，０００ｒｐｍ、１０分間行なった。
【００８４】
得られた粉砕液を−８０℃で冷凍した後に直ちに解凍し、５分間遠心して消泡した。その後、０．８０ｍＬのフェノール・クロロホルム溶液を加えてシェイクした。遠心分離（１４，０００ｒｐｍ、１５分間）の後、ＤＮＡが抽出された上清０．５ｍＬを１．５ｍＬチューブに移し、イソプロピルアルコール０．５ｍＬを加えて混和した。−８０℃にて３０分間冷却後、遠心分離（１４，０００ｒｐｍ、５分間、４℃）して、上清を破棄し、得られたペレットを０．７ｍＬの７０％エタノールを用いてリンスした。上記ペレットを室温にて１時間乾燥させた後、０．１ｍＬの滅菌蒸留水で懸濁し、感染菌の核酸の抽出液とした。なお、この感染菌の核酸抽出液は、白紋羽病菌のゲノムＤＮＡと共に、マイコウイルスのゲノムＲＮＡが抽出されたものである。感染菌の核酸抽出液は、使用までは−８０℃で保存した。
【００８５】
（菌量の評価方法）
リアルタイムＰＣＲ装置（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製のＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓは登録商標）を用いて、定量ＰＣＲを行なった。定量ＰＣＲの際の反応液は、感染菌の核酸抽出液１．５μＬ、Fast SYBR Green master mix（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、Fast SYBRは登録商標）７．５μＬ、フォワードプライマー０．６μＬ、リバースプライマー０．６μＬ、滅菌蒸留水４．８μＬを混合して調整した。上記フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含むプライマーセットは、用いた白紋羽病菌（Rosellinia necatrix）のゲノム配列に基づいて、特異的なプライマーセットとして設計し、合成したものである。このような定量ＰＣＲを行なうことにより、各サンプル中の感染菌のゲノムＤＮＡ量を定量することができ、定量した感染菌のゲノムＤＮＡ量を、感染菌量として評価した。感染菌の菌量は、［感染菌の培養］で説明した培養を行なう前の感染菌量を１としたときの相対値である相対菌量として求めた。
【００８６】
（ウイルス量の評価方法）
感染菌内のマイコウイルス量の測定に先立って、各サンプルについて、感染菌の核酸抽出液を逆転写反応に供し、核酸抽出液中のウイルスＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成した。逆転写反応は、バイオ・ラッド社製のＴ１００サーマルサイクラー（Ｔ１００は登録商標）を用いて、２５℃で１０分間、５０℃で１０分間、８５℃で５分間行なった。逆転写反応の反応液は、感染菌の核酸抽出液２．５μＬに、逆転写酵素液である SuperScript IV VILO Master Mix(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、SuperScriptは登録商標）２．５μＬを加えて調整した。
【００８７】
逆転写反応後のｃＤＮＡを含む液を、定量ＰＣＲに供した。用いた装置および反応液の調整方法は、菌量の評価のための定量ＰＣＲと同様である。ウイルス量を定量する際に用いたプライマーセットは、定量の対象となるウイルスのゲノム配列に基づいて、特異的なプライマーセットとして設計し、合成したものである。このような定量ＰＣＲを行なうことにより、各サンプル中の感染菌中のウイルスＲＮＡ量を定量することができ、定量した感染菌中のウイルスＲＮＡ量を、ウイルス量として評価した。感染菌中のウイルス量は、［感染菌の培養］で説明した培養を行なう前の感染菌に含まれるウイルス量を１としたときの相対値である相対ウイルス量として求めた。
【００８８】
図７〜図１３は、相対菌量および相対ウイルス量を調べた結果を示す説明図である。図７は、感染菌Ｗ９７＋ＲｎＭＢＶ１について培地組成を変更したサンプル１〜７の相対菌量を比較した結果を示す。図８は、感染菌Ｗ９７＋ＲｎＭＢＶ１について培地組成を変更したサンプル１〜７の相対ウイルス量を比較した結果を示す。図９は、感染菌Ｗ７７９（ＲｎＭＢＶ１）について培地組成を変更したサンプル８〜１４の相対菌量を比較した結果を示す。図１０は、感染菌Ｗ７７９（ＲｎＭＢＶ１）について培地組成を変更したサンプル８〜１４の相対ウイルス量を比較した結果を示す。 図１１は、感染菌Ｗ１０３２（ＹｎＶ１＋ＹｋＶ１）について培地組成を変更したサンプル１５〜２１の相対菌量を比較した結果を示す。図１２は、感染菌Ｗ１０３２（ＹｎＶ１＋ＹｋＶ１）について培地組成を変更したサンプル１５〜２１の、ＹｎＶ１に関する相対ウイルス量を比較した結果を示す。図１３は、感染菌Ｗ１０３２（ＹｎＶ１＋ＹｋＶ１）について培地組成を変更したサンプル１５〜２１の、ＹｋＶ１に関する相対ウイルス量を比較した結果を示す。
【００８９】
図７と図８、図９と図１０、図１１と図１２および図１３とを比較して分かるように、培地成分としてでんぷんとアスパラギンとを含むサンプル(サンプル１，８，１５）は、相対ウイルス量が多くウイルス保持能に優れるが、相対菌量が少なく感染菌の増殖能が低かった。上記サンプル(サンプル１，８，１５）の相対菌量は、培地成分としてでんぷんのみを含むサンプル（サンプル２，９，１６）よりも少なかった。これに対し、培地成分として、でんぷんとアスパラギンに加えて、さらにキサンタンガムあるいはグァーガムを含むサンプル（サンプル５〜７，１２〜１４，１９〜２１）は、相対菌量（感染菌の増殖能）および相対ウイルス量（ウイルス保持能）のいずれも良好な結果が得られた。また、培地成分として、でんぷん、アスパラギン、キサンタンガムあるいはグァーガムに加えて、さらにカルボキシメチルセルロースナトリウムおよび発酵セルロースを加えることで、相対菌量（感染菌の増殖能）および相対ウイルス量（ウイルス保持能）がより向上した（サンプル６，１３，２０）。
【００９０】
上記のように、培地性能の評価は、相対菌量と相対ウイルス量の双方に基づいている。マイコウイルスを感染拡大させるためには、非感染菌への感染の機会を増やすために、感染菌量が多いことが重要であると考えられる。また、感染の効率を高めるためには、感染菌が有するウイルス量が多いことが望ましいと考えられる。
【００９１】
なお、図６に示すサンプル中、サンプル１，２，８，９，１５，１６は、寒天を含んでいる。これらのサンプルでは、既述した＜糖およびアミノ酸の嗜好性の検討のための予備実験＞において、寒天培地を用いたことを踏まえて、培地が固まらない濃度で寒天を加えたものである。その後の予備実験により、当該濃度の寒天は、感染菌の増殖およびウイルス保持に影響を与えないことが確認されたため、培地組成を簡素化するために、他のサンプルにおいては寒天を加えていない。
【００９２】
＜粒製剤の評価＞
図６に示したサンプル１〜２１について、既述した第１の製造方法（図１および図２）および第２の方法（図３および図４）に基づいて粒製剤を作製し、感染菌の増殖能およびウイルス保持能を評価した。
【００９３】
（粒製剤の作製）
第１の製造方法において、ステップＳ１００では、図６に示した組成の液体培地に、既述した各々の感染菌のコルクボーラー片を投入することにより、感染菌を接種した。液体培地は、接種に先立ってハンドミキサーにて十分に攪拌した後に滅菌した。コルクボーラー片は、液体培地１０ｍＬ当たり１個の割合で加えた。なお、このとき、各液体培地には、さらに、水１００ｍＬに対してアルギン酸アンモニウム（株式会社キミカ製）１ｇと、着色のためのリコピン（三栄源エフ・エフ・アイ株式会社製）０．５ｍＬを加えた。液体培地へのリコピンの添加が、感染菌の増殖やウイルス保持に対して殆ど影響しないことは、予備的な実験により確認した（データ示さず）。第１の方法のステップＳ１１０では、２５℃にて７日間、遮光条件下で振盪培養した。ステップＳ１２０では、５％の乳酸カルシウム（白石カルシウム株式会社製、食品グレード）の水溶液中に、培養後の液を滴下して、粒製剤を作製した。得られた粒製剤は、滅菌蒸留水でリンスした後、滅菌蒸留水に浸漬して、使用まで４℃で保存した。
【００９４】
第２の方法においてステップＳ１００では、図６に示した組成の液体培地に、予め滅菌蒸留水中でコルクボーラー片を破砕して得た菌液を接種して混合した。各液体培地の準備、および液体培地に加えるコルクボーラー片の量は、上記した第１の製造方法と同様である。ステップＳ２１０では、感染菌を接種した上記液体培地を、ステップＳ１２０と同様の乳酸カルシウム水溶液中に滴下して、粒状化した。ステップＳ２２０では、ステップＳ２１０で得られた粒子を滅菌蒸留水に浸漬し、２５℃にて７日間、遮光培養した。得られた粒製剤は、滅菌蒸留水でリンスした後、滅菌蒸留水に浸漬して、使用まで４℃で保存した。
【００９５】
（感染菌の増殖能）
図１４は、第１の製造方法および第２の製造方法で製造した粒製剤を滅菌したシャーレ上に載置し、２５℃にて１４日間培養した結果を示す説明図である。シャーレ上に直接粒製剤を配置しているため、図１４に示す感染菌の増殖は、粒製剤が含有する培地成分のみを利用している。図１４に示すように、第１の製造方法により製造した場合（以下、製粒前培養とも呼ぶ）、および、第２の製造方法により製造した場合（以下、製粒後培養とも呼ぶ）のいずれであっても、粒製剤中の感染菌は高い増殖能を維持していることが確認された。なお、図１４では、サンプル５，６，１２，１３，１９，２０の結果のみを示すが、サンプル７，１４，２１においても、同様の結果が得られた（データ示さず）。
【００９６】
（ウイルス保持能）
製粒前培養あるいは製粒後培養により製造した粒製剤について、マイコウイルスの量を定量し、ウイルス保持能を評価した。マイコウイルスの定量は、以下のようにして行なった。まず、２．０ｍＬチューブに、各々の粒製剤１個と、ジルコニアビーズと、抽出バッファ（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ，２０ｍＭ  ＮａＣｌ，４ｍＭＥＤＴＡ，２％  ＳＤＳ，ｐＨ８．０）１ｍＬとを加え、粒製剤を破砕した。ジルコニアビーズは、直径１．０−１．２５ｍｍのビーズ（サンゴバン株式会社製、ＥＲ１２０５−Ｎ）と直径７．０ｍｍのビーズ（株式会社バイオメディカルサイエンス製）とを混合して用いた。粉砕は、ディスラプタージェニー（サイエンティフィックインダストリーズ社製）を用いて、３，０００ｒｐｍ、１０分間行なった。
【００９７】
得られた粉砕液を−８０℃で冷凍した後に直ちに解凍し、５分間遠心により消泡した。その後、０．８０ｍＬのフェノール・クロロホルム溶液を加えてシェイクした。遠心分離（１４，０００ｒｐｍ、１５分間）の後、ＤＮＡが抽出された上清０．５ｍＬを１．５ｍＬチューブに移し、イソプロピルアルコール０．５ｍＬを加えて混和した。−８０℃にて３０分間冷却後、遠心分離（１４，０００ｒｐｍ、５分間、４℃）して、上清を破棄し、得られたペレットを０．７ｍＬの７０％エタノールを用いてリンスした。上記ペレットを室温にて１時間乾燥させた後、０．１ｍＬの滅菌蒸留水で懸濁し、感染菌の核酸の抽出液とした。なお、この感染菌の核酸抽出液は、白紋羽病菌のゲノムＤＮＡと共に、マイコウイルスのＲＮＡが抽出されたものである。感染菌の核酸抽出液は、使用までは−８０℃で保存した。得られた核酸抽出液中のウイルス量の測定方法は、既述した＜培地成分の検討＞における［ウイルス量の評価方法］に記載したとおりである。
【００９８】
図１５〜図１８は、各粒製剤における相対ウイルス量を比較した結果を示す説明図である。図１５は、製粒前培養により製造したサンプル５，６，１２，１３の粒製剤の結果を示し、図１６は、製粒後培養により製造したサンプル５，６，１２，１３の粒製剤の結果を示す。図１７は、製粒前培養により製造したサンプル１９，２０の各々について、ＹｎＶ１に関する相対ウイルス量と、ＹｋＶ１に関する相対ウイルス量とを、それぞれ調べた結果を示す。図１８は、製粒後培養により製造したサンプル１９，２０の各々について、ＹｎＶ１に関する相対ウイルス量と、ＹｋＶ１に関する相対ウイルス量とを、それぞれ調べた結果を示す。図１５〜図１８に示すように、各サンプルについて、３個の粒製剤について相対ウイルス量を測定した（ｎ＝３）。なお、感染菌中のウイルス量は、培養の工程を行なうことなく製粒した粒子を用いて測定したウイルス量を１としたときの相対値である相対ウイルス量として求めた。
【００９９】
図１５〜図１８に示すように、いずれの実施例のサンプルにおいても、相対ウイルス量は高い値を示した。そのため、製粒前培養、製粒後培養のいずれであっても、白紋羽病防除剤を、アルギン酸カルシウムを主成分とする膜に覆われた粒製剤とすることで、高いウイルス保持能を維持できると考えられる。なお、実施例に相当するサンプル７，１４，２１においても、同様の相対ウイルス量が測定された（データ示さず）。
【０１００】
また、サンプル６の製粒前培養の粒製剤について、滅菌蒸留水に浸漬した状態で、４℃にて１年間保存した。その後、粒製剤を寒天培地上で２５℃にて培養し、増殖した感染菌をＲＴ−ＰＣＲ法によりチェックして、感染菌がマイコウイルスを保持した状態で増殖能を有することを確認した（データ示さず）。
【０１０１】
＜でんぷんおよびアスパラギンが必須ではないことの確認＞
培地中にでんぷんおよびアスパラギンを含有しないサンプルを作製して、既述したサンプルと比較した。具体的には、サンプル２２として、蒸留水（純水）１００ｍＬ当たり１．０ｇのキサンタンガムのみを含有する液体培地を用いると共に、感染菌としてＷ９７＋ＲｎＭＢＶ１を用いたサンプルを作製した。このサンプル２２を用いて、既述したサンプル５と同様の方法で感染菌の培養を行ない（培養は７日間）、既述した方法により、菌量およびウイルス量を評価した。その結果、菌量およびウイルス量共に、キサンタンガムに加えてでんぷんおよびアスパラギンを培地中に含むサンプル５と、同等の結果が得られた。以上より、感染菌の増殖能とウイルス保持能を向上させる観点から、でんぷんとアスパラギンの有無による差は比較的小さく、セルロース系の多糖類およびアミロース系の多糖類の利用を容易にするキサンタンガムやグァーガムの寄与が極めて大きいと考えられる。そのため、でんぷんおよびアスパラギンは必須ではないと考えられる。
【０１０２】
＜白紋羽病防除効果の確認＞
サンプル６の製粒前培養の粒製剤を用いて、白紋羽病の防除効果を確認した。白紋羽病の防除効果の確認は、以下の試験例１〜試験例４の結果を比較することにより行なった。
【０１０３】
試験例１：（白紋羽病菌感染枝＋粒製剤）
サンプル６の粒製剤２５ｇを、白紋羽病菌（Ｗ９７）に感染したナシの感染枝と共にポット内の土中に配置した。上記感染枝は、ナシ枝を白紋羽病菌（Ｗ９７）と共に培養して、菌叢を生育させたものである。感染枝を配置した後、リンゴの台木として用いられるマルバカイドウ苗を当該ポットに植え、その後４２日間栽培した。
試験例２：（白紋羽病菌感染枝のみ）
粒製剤を土中に配置しなかったこと以外は、試験例１と同様にして、マルバカイドウ苗を栽培した。
試験例３：（白紋羽病菌感染枝＋培地粒）
粒製剤に代えて、感染菌を有することなくサンプル６と同様の培地のみを有する培地粒を用いたこと以外は、試験例１と同様にして、マルバカイドウ苗を栽培した。
試験例４：（粒製剤のみ）
白紋羽病菌（Ｗ９７）に感染した感染枝を土中に配置しなかったこと以外は、試験例１と同様にして、マルバカイドウ苗を栽培した。
【０１０４】
図１９Ａ〜図１９Ｄは、それぞれ、栽培期間終了後の、試験例１〜４のマルバカイドウ苗の様子を示す写真である。図１９Ｂに示す試験例２、および図１９Ｃに示す試験例３では、苗が枯死した。これに対し、図１９Ａに示すサンプル６の粒製剤を用いた試験例１では、図１９Ｄに示す白紋羽病菌感染枝を配置しなかった試験例４と同様に、苗は枯死しなかった。
【０１０５】
本発明は、上述の実施形態や実施例、変形例に限られるものではなく、その趣旨を逸脱しない範囲において種々の構成で実現することができる。例えば、発明の概要の欄に記載した各形態中の技術的特徴に対応する実施形態、実施例、変形例中の技術的特徴は、上述の課題の一部又は全部を解決するために、あるいは、上述の効果の一部又は全部を達成するために、適宜、差し替えや、組み合わせを行うことが可能である。また、その技術的特徴が本明細書中に必須なものとして説明されていなければ、適宜、削除することが可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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