(57)【要約】【課題】電極表面に結合する抗体の量を調節しつつ、非特異的修飾を抑制することができ、さらに抗体の配向性を向上することのできるバイオセンサ用電極の表面修飾方法の提供。【解決手段】電極表面に、アミノ基とヒドロキシ基とを有する混合自己組織化単分子膜を形成する工程、抗体のカルボキシ末端をスクシンイミド化する工程、ならびに、スクシンイミド化した前記抗体を前記混合自己組織化単分子膜に適用し、抗体を固定する工程を含むバイオセンサ用電極の表面修飾方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
電極表面に、アミノ基とヒドロキシ基とを有する混合自己組織化単分子膜を形成する工程、
抗体のカルボキシ末端をスクシンイミド化する工程、ならびに
スクシンイミド化した前記抗体を前記混合自己組織化単分子膜に適用し、抗体を固定する工程
を含むバイオセンサ用電極の表面修飾方法。
【請求項２】
電極表面に、カルボキシ基を有する自己組織化単分子膜を形成し、該カルボキシ基をスクシンイミド化し、ついでジアミンおよびアルカノールアミンで処理することによりアミノ基とヒドロキシ基とを有する混合自己組織化単分子膜を形成する請求項１記載のバイオセンサ用電極の表面修飾方法。
【請求項３】
電極表面に、カルボキシ基とヒドロキシ基とを有する混合自己組織化単分子膜を形成し、該カルボキシ基をスクシンイミド化し、ついでジアミンで処理することによりアミノ基とヒドロキシ基とを有する混合自己組織化単分子膜を形成する請求項１記載のバイオセンサ用電極の表面修飾方法。
【請求項４】
抗体が、免疫グロブリン、またはそのＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）2もしくはＦａｂ’である請求項１〜３のいずれか１項に記載のバイオセンサ用電極の表面修飾方法。
【請求項５】
バイオセンサが電気化学測定を用いるものである請求項１〜４のいずれか１項に記載のバイオセンサ用電極の表面修飾方法。
【請求項６】
電気化学測定が、インピーダンス測定である請求項５記載のバイオセンサ用電極の表面修飾方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオセンサ用電極表面の表面修飾方法に関する。特に電気化学測定に用いることのできるバイオセンサ電極の表面修飾方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
様々な分野において、血液などの体液、食品、工場排水などの検査試料から試料中に含まれるペプチドやタンパク質といった生体物質、細胞、微生物などを、酵素反応や抗原抗体反応などを用いて検出・測定するためのセンサが種々開発されている。
【０００３】
例えば、抗原抗体反応を用いる表面プラズモン共鳴法を利用したセンサでは、通常センサチップ上に抗体を固定した抗原認識表面を作製し、フローセルと呼ばれる微小な流路に測定試料を添加し、チップ上で生じた抗原抗体反応による重量変化を屈折率の変化として光学的に測定する。特許文献１では、このようなバイオセンサに用いられる抗原認識表面の製造方法として、カルボジイミド法を用いて基板表面上のカルボキシ基をスクシンイミド化し、抗体のアミノ酸側鎖のアミノ基とアミド結合を形成させることにより抗体を固定し、ついで、未反応のスクシンイミド基をエタノールアミンで不活性化する方法が用いられている。
【０００４】
一方、カルボジイミド法を用いて基板表面のカルボキシ基と抗体のアミノ酸側鎖のアミノ基と縮合反応させることにより抗体を固定する方法では、担体の表面上での抗体分子の結合様式や配向を十分に整えることが難しく、極端な場合には分子認識に必須の抗原結合部位が利用できない形での固定化が生じる可能性がある。この問題に対し、特許文献２では、アフィニティーカラムに用いる目的で、リジンおよびシステインを含まないよう変異させた特定のプロテインＡやプロテインＧなどの抗体のＦｃドメインと特異的に結合するタンパク質を、特定の配向で基板に結合し、介在タンパク質として使用することにより、イムノグロブリンＧタンパク質を配向を制御して固定化する方法を開示している。
【０００５】
また、免疫グロブリンを固定する場合、そのカルボキシ末端を用いて担体の表面上のアミノ基とアミド結合により結合することにより、抗原認識部位のコンフォメーションが保たれ、固定化抗体の配向性が向上することも知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１３−１７７３３７号公報
【特許文献２】特開２０１２−０１２３３４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特許文献１や特許文献２では、抗体の固定量は、特に制御されておらず、その用途からも抗体をより多く結合しようとするものであると考えられるが、インピーダンス測定やサイクリックボルタンメトリーなどの電気化学測定を用いる場合には、電極表面に抗体が過度に結合すると、その後の抗原の検出におけるインピーダンス等の変化率が小さくなり、測定精度が低下する問題があった。
【０００８】
また、抗体を機能的に配向性を向上させて固定化することは電気化学測定においても感度が向上し望ましいことであるが、特許文献２の方法では、担体上に結合させる物質が介在タンパク質等を含めて全体として分子量の大きなものとなる。このため、抗原抗体反応を用いて抗原を測定する手段として、インピーダンス測定などの電気化学測定を用いる場合には、インピーダンスが大きくなり、ノイズの影響を受けやすくなるという問題があった。また、製造工程も複雑になり、小型で安価なセンサチップの製造には応用し難いものである。
【０００９】
さらに、抗体密度を小さくするため、作用させる抗体濃度を低くすると、特許文献１では未反応の活性末端が増加し、不活性化処理の前に加水分解して電極表面にカルボキシ基を生じ、非特異的吸着が増加して十分な検出精度が得られないという問題があった。また抗体の固定にアミノ基表面を用いる場合には、未反応のアミノ基に非特異的吸着が生じないよう、ＢＳＡやカゼインなどでブロックするが、これも電気化学インピーダンス測定では、表面を分子量の大きい物質で覆うとインピーダンスが大きくなるため、ノイズの影響を受けやすくなるという問題があった。
【００１０】
そこで、本発明は、電極表面に結合する抗体の量を所望のものとし、非特異的修飾を抑制することができ、さらに抗体の配向性を向上することのできるバイオセンサ用電極の表面修飾方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記目的を達成するため、表面にアミノ基とヒドロキシ基とを有する混合自己組織化単分子膜のアミノ基と、抗体のカルボキシ基末端とをカルボジイミド法を用いて縮合させることにより、電極表面に結合する抗体の量を所望のものとし、非特異的修飾を抑制することができ、かつコンフォメーションを維持して抗体を固定することができることを見出し、本発明を完成した。
【００１２】
すなわち、本発明は、
［１］電極表面に、アミノ基とヒドロキシ基とを有する混合自己組織化単分子膜を形成する工程、抗体のカルボキシ末端をスクシンイミド化する工程、ならびにスクシンイミド化した前記抗体を前記混合自己組織化単分子膜に適用し、抗体を固定する工程を含むバイオセンサ用電極の表面修飾方法、
［２］電極表面に、カルボキシ基を有する自己組織化単分子膜を形成し、該カルボキシ基をスクシンイミド化し、ついでジアミンおよびアルカノールアミンで処理することによりアミノ基とヒドロキシ基とを有する混合自己組織化単分子膜を形成する上記［１］記載の表面修飾方法、
［３］電極表面に、カルボキシ基とヒドロキシ基とを有する混合自己組織化単分子膜を形成し、該カルボキシ基をスクシンイミド化し、ついでジアミンで処理することによりアミノ基とヒドロキシ基とを有する混合自己組織化単分子膜を形成する上記［１］記載の表面修飾方法、
［４］抗体が、免疫グロブリン、またはそのＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）2もしくはＦａｂ’である上記［１］〜［３］のいずれかに記載の表面修飾方法、
［５］バイオセンサが電気化学測定を用いるものである上記［１］〜［４］のいずれかに記載の表面修飾方法、ならびに、
［６］電気化学測定が、インピーダンス測定である上記［５］記載の表面修飾方法、
に関する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のバイオセンサ用電極の表面修飾方法によれば、電極表面に結合する抗体の量を所望のものとし、非特異的修飾を抑制することができ、さらに抗体の配向性を向上することのできる電極表面を提供することができ、これにより、バイオセンサの測定手段としてインピーダンス測定などの電気化学測定を利用することが可能となる。
【００１４】
また、電極表面を覆う高分子量の物質を抗体を固定する介在物質や、非特異的吸着を防ぐためのブロッキング等として用いる必要がないため、ノイズの影響を低く抑えることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明のバイオセンサ用電極の表面修飾方法を説明するフローチャートである。
【図２】本発明のバイオセンサ用電極の表面修飾方法の一例の説明図である。
【図３】本発明のバイオセンサ用電極の表面修飾方法の別の一例の説明図である。
【図４】本発明のバイオセンサ用電極の表面修飾方法のまた別の一例の説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明のバイオセンサ用電極の表面修飾方法について、添付の図１〜４を参照して説明するが、本発明はこれらの形態に限定されるものではなく、以下に説明する部材、材料等は、本発明の趣旨の範囲内で種々改変することができるものである。また、図面において、同一符号は同等あるいは同一のものを示す。図１には本発明の表面修飾方法を説明するフローチャートを、図２〜４には本発明の具体的な態様の説明図をそれぞれ示している。特に図２〜４は本発明の理解を助けるための説明図であり、各構成要素間の大きさや位置関係、分子中のアルキル鎖の鎖長などは便宜上のものであり、実態を反映したものではない。
【００１７】
本発明のバイオセンサ用電極の表面修飾方法においては、まず、図１のフローチャートのＳ１工程に示すように、電極１表面に、アミノ基とヒドロキシ基とを有する自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）２を形成し、他方で図１のフローチャートのＳ２工程に示すように、抗体３のカルボキシ末端をカルボジイミド法によりスクシンイミド化する（図２参照）。次いで、図１のフローチャートのＳ３工程に示すように、この活性化された抗体３をＳＡＭ表面のアミノ基と反応させ、アミド結合により抗体を固定する（図２参照）ことを特徴とする。
【００１８】
電極１は、電気化学測定に用いることができるものであれば、特に限定されるものではないが、チオール基やジスルフィド基を介して形成されるＳＡＭを用いる場合には、硫黄が金属、特に貴金属に対して高い吸着性と高配向性を有するため、金、白金、銀および銅からなる群から選択することが好ましく、特に金または白金がより好ましい。なかでも、金は、化学的に不活性であり、信号の発生効率が良く、チオール基の吸着力が極めて強いことから特に好ましい。また、電極としては、ガラス基板などに金属薄膜が積層されているものなどを用いることもできる。
【００１９】
ＳＡＭ２は、基板を有機分子を含む溶液に浸漬または有機分子を含む蒸気中に置くことにより、有機分子の官能基、例えばチオール基が基板表面に化学吸着され、自発的に該基板表面に形成される高密度かつ高配向な単分子膜を意味する。具体的には、アルキルチオールやジスルフィド化合物からなるＳＡＭや、固定基としてチオールを有し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を配向させたＳＡＭ、ベンゼン環を有するＳＡＭ、炭素鎖長の異なるアルキルチオール類を混合したＳＡＭなどが挙げられる。これらＳＡＭ構成分子は、基板に化学吸着される官能基とは別に、ＳＡＭ表面に特性を持たせるための官能基を有することができる。例えば、本発明においては、基板に化学吸着される官能基と反対の末端にアミノ基を有するＳＡＭ構成分子とヒドロキシ基を有するＳＡＭ構成分子とを用いることで、特別な工程を経ることなくＳＡＭ表面にアミノ基とヒドロキシ基とを有するＳＡＭを形成することができる。また、もちろん、他の官能基を有するＳＡＭ構成分子によりＳＡＭを構成した後、その官能基をアミノ基とヒドロキシ基とに変換することにより形成することもできる。例えば、電極表面に、カルボキシ基を有するＳＡＭを形成し、該カルボキシ基をスクシンイミド化し、ついでジアミンおよびアルカノールアミンで処理することによりアミノ基とヒドロキシ基とを有する混合ＳＡＭを形成する方法や、電極表面に、カルボキシ基とヒドロキシ基とを有する混合ＳＡＭを形成し、該カルボキシ基をスクシンイミド化し、ついでジアミンで処理することによりアミノ基とヒドロキシ基とを有する混合ＳＡＭを形成する方法が挙げられる。
【００２０】
ＳＡＭ構成分子としては、官能基を末端に有するアルキルチオールを好適に用いることができる。官能基を末端に有するアルキルチオールのアルキル部分の炭素数は、適宜選択することが可能である。具体的には、末端にアミノ基、ヒドロキシ基またはカルボキシ基を有する、ヘキシルチオール、ヘプチルチオール、オクチルチオール、ノニルチオール、デカンチオール、ウンデカンチオール、ドデカンチオール、トリデカンチオール、テトラデカンチオール、ペンタデカンチオール、ヘキサデカンチオール、およびそれら各々に対応する、２分子がＳ−Ｓ結合したジスルフィドなどが挙げられる。これらは単独で用いても良く、また２種以上併用しても良い。
【００２１】
アミノ基とヒドロキシ基を有する混合ＳＡＭの形成工程の一つの具体例として、電極表面に、カルボキシ基を有するＳＡＭを形成し、該カルボキシ基をスクシンイミド化し、ついでジアミンおよびアルカノールアミンで処理することによりアミノ基とヒドロキシ基とを有する混合ＳＡＭを形成する工程（Ｓ１ａ工程）を説明する（図３参照）。図３に示すように、まず、電極上にカルボキシ基を有するＳＡＭ構成分子によりＳＡＭを形成する。その後、カルボキシ基をスクシンイミド化により活性化し、そこにジアミンおよびアルカノールアミンを反応させることで、表面にアミノ基とヒドロキシル基とを有する混合ＳＡＭが得られる。この方法においては、単一のＳＡＭ構成分子からＳＡＭを形成することが可能であるため、ＳＡＭの形成がスムーズで、高い配向性を有する均質なＳＡＭを形成することができる。また、使用するジアミンおよびアルカノールアミンの比率を調整することにより、ＳＡＭ表面に形成されるアミノ基の密度をコントロールすることができ、結果として固定する抗体の密度を所望のものとすることができる。さらに未反応のアミノ基が残らないようにアミノ基の密度や抗体の濃度を調整することにより、未反応のアミノ基のブロック処理が不要となり、またその他のＳＡＭ表面は非特異的吸着が少ないヒドロキシ基であるため、非特異的吸着を抑制することができる。なお、図３においてＳ２工程およびＳ３工程の処理は図２と同じであるため省略している。
【００２２】
アミノ基とヒドロキシ基を有する混合ＳＡＭの形成工程の別の具体例として、電極表面に、カルボキシ基とヒドロキシ基とを有する混合ＳＡＭを形成し、該カルボキシ基をスクシンイミド化し、ついでジアミンで処理することによりアミノ基とヒドロキシ基とを有する混合ＳＡＭを形成する工程（Ｓ１ｂ工程）を説明する（図４参照）。図４に示すように、まず、電極上にヒドロキシ基を有するＳＡＭ構成分子とカルボキシ基を有するＳＡＭ構成分子とを用い、混合ＳＡＭを形成する。その後、カルボキシ基をスクシンイミド化により活性化し、そこにジアミンを反応させることで、表面にアミノ基とヒドロキシル基とを有する混合ＳＡＭが得られる。この方法においては、アルキルチオールのアルキル部分の炭素数が同じであるＳＡＭ構成分子を用いて均質な膜を形成しつつ、使用するジアミンの長さ分はアミノ基がＳＡＭ表面から突出するため、抗体がコンフォメーションを保ったまま結合しやすく、配向性をより向上させることができる。また、この方法においても使用するヒドロキシ基を有するＳＡＭ構成分子と、カルボキシ基を有するＳＡＭ構成分子との比率を調整することにより、ＳＡＭ表面に形成されるアミノ基の密度をコントロールすることができ、結果として固定する抗体の密度を所望のものとすることができる。なお、図４においてＳ２工程およびＳ３工程の処理は図２と同じであるため省略している。
【００２３】
Ｓ１ａ工程およびＳ１ｂ工程におけるＳＡＭ表面のカルボキシ末端のスクシンイミド化は、カルボジイミド法などのカルボキシ基とアミノ基とのアミド結合形成のための活性中間体を得るためのものである。具体的には、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドやその塩酸塩（ＥＤＣ）、ジシクロヘキシルカルボジイミドなどと共に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）やその水溶性類似体であるスルホＮＨＳを作用させ、カルボキシ末端をスクシンイミド化して比較的安定な活性中間体を得ることができる。
【００２４】
ジアミンとしては、アルカン骨格の両端にアミノ基を有する化合物であれば特に限定されるものではないが、エチレンジアミン、プトレシン、カダベリンおよびヘキサメチレンジアミンなどが挙げられ、エチレンジアミンを好適に使用することができる。
【００２５】
アルカノールアミンとしては、アルカン骨格にヒドロキシ基とアミノ基を有する化合物であれば特に限定されるものではないが、メタノールアミン、エタノールアミン、プロパノールアミンなどが挙げられ、エタノールアミンを好適に使用することができる。
【００２６】
Ｓ２工程では抗体のカルボキシ末端をスクシンイミド化するが、この工程はＳ１ａ工程およびＳ１ｂ工程と同様に行うことができるため、説明を省略する。本発明においては、Ｓ１工程とＳ２工程はいずれを先に行ってもよく、並行して実施することも可能である。
【００２７】
次に、このスクシンイミド化された抗体をＳＡＭ表面のアミノ基と反応させ、抗体をそのカルボキシ末端でＳＡＭ表面に固定する。抗体の固定化部位がカルボキシ末端に特定されるため、抗原認識部位への抗体の固定化の影響を抑えることができ、また、抗体の配向性も向上させることができる。本発明の方法では、ＳＡＭ表面におけるアミノ基の量を調整することにより、固定化される抗体の量を所望のものとしつつ、その他の官能基はヒドロキシ基としているため、非特異的吸着による測定精度の低下を防ぐことができる。
【００２８】
電極表面に結合させる抗体としては、アミド結合により固定化できるものであれば特に限定されるものではないが、免疫グロブリン、またはそのＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）2もしくはＦａｂ’などが挙げられ、免疫グロブリンとしては、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥなどが好適に使用できる。また、ＩｇＡやＩｇＭについてもモノマー単位のものや、そのＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）2もしくはＦａｂ’などを用いることができる。本来のコンフォメーションを維持することができるという本発明の効果の点からは、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥを好適に使用することができる。さらに、抗体としては、目的とする抗原と結合する能力を有するものであれば、特に限定されるものではなく、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体などを使用することができ、これらは、公知の方法により産生することもできるが、市販のものを用いることもできる。
【００２９】
本発明の表面修飾方法においては、Ｓ１工程、Ｓ１ａ工程、Ｓ１ｂ工程、Ｓ２工程およびＳ３工程の各工程の後にそれぞれ洗浄工程を設けることができる。
【００３０】
本発明の表面修飾方法により抗体を固定化した電極は、当該抗体に結合する試料中の抗原を測定するためのバイオセンサの作用電極として使用することができる。とりわけ、測定対象である抗原の結合による電気化学的変化を検出しやすいことから、インピーダンス法、サイクリックボルタンメトリー法などの電気化学的測定方法により行う測定に好適に使用することができる。
【００３１】
また、本発明の表面修飾方法により得られる電極は、非特異的吸着を生じにくいことから、試料として、体液、血液、唾液などを用いることができる。また、測定対象とする抗原は、特に限定されるものではないが、コルチゾールなどが挙げられる。
【符号の説明】
【００３２】
１    電極
２    ＳＡＭ
３    抗体
【図１】
2018081028.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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