(57)【要約】【課題】  本発明の課題は、短時間での細胞剥離を可能にする細胞培養基材の表面処理剤として有用なブロック共重合体を提供すること。【解決手段】  下記（Ａ）および（Ｂ）および（Ｃ）のブロックを含むブロック共重合体により前記課題を解決する。（Ａ）水に対する下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）が０℃〜５０℃の範囲にある温度応答性重合体ブロック。（Ｂ）０℃〜５０℃の範囲にＬＣＳＴを持たない、ＨＬＢ値（グリフィン法）が９以上２０未満の範囲にある親水性重合体ブロック。（Ｃ）０℃〜５０℃の範囲にＬＣＳＴを持たない、ＨＬＢ値（グリフィン法）が０以上９未満の範囲にある疎水性重合体ブロック。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）のブロックを含むブロック共重合体。
（Ａ）水に対する下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）が０℃〜５０℃の範囲にある温度応答性重合体ブロック。
（Ｂ）０℃〜５０℃の範囲にＬＣＳＴを持たない、ＨＬＢ値（グリフィン法）が９以上２０以下の範囲にある親水性重合体ブロック。
（Ｃ）０℃〜５０℃の範囲にＬＣＳＴを持たない、ＨＬＢ値（グリフィン法）が０以上９未満の範囲にある疎水性重合体ブロック。
【請求項２】
ブロック（Ａ）が下記一般式（１）
【化１】
2018087316.tif 000036
（式中、Ｒ２は水素原子またはメチル基であり、Ｒ３およびＲ４は各々独立して、水素原子、炭素数１〜６の炭化水素基、炭素数１もしくは２のアルキルオキシ基で置換されていてもよい炭素数２〜４の炭化水素基、フッ素で置換されていてもよい炭素数２〜４の炭化水素基、フルフリル基またはテトラヒドロフルフリル基であり、Ｒ３とＲ４は互いに結合してピロリジン環、ピペリジン環またはモルホリン環を形成してもよい。）
で表される繰り返し単位の内、少なくとも１種類の繰り返し単位を含む重合体であることを特徴とする、請求項１に記載のブロック共重合体。
【請求項３】
ブロック（Ａ）が下記一般式（２）
【化２】
2018087316.tif 000037
（式中、Ｒ５は水素原子またはメチル基であり、Ｒ６は水素原子または炭素数１〜６の炭化水素基であり、ｒは１〜１０の整数である。）
で表される繰り返し単位の内、少なくとも１種類の繰り返し単位を含む重合体であることを特徴とする、請求項１に記載のブロック共重合体。
【請求項４】
ブロック（Ａ）が下記一般式（３）
【化３】
2018087316.tif 000038
（式中、Ｒ７は水素原子またはメチル基であり、Ｒ８は炭素数１〜６の炭化水素基である。）
で表される繰り返し単位の内、少なくとも１種類の繰り返し単位を含む重合体であることを特徴とする、請求項１に記載のブロック共重合体。
【請求項５】
ブロック（Ｂ）が下記一般式（４）
【化４】
2018087316.tif 000039
（式中、Ｒ９は水素原子又はメチル基であり、Ｒ１０は炭素数１〜１０のアルキレン基であり、Ｒ１１は炭素数１〜４の２価の炭化水素基である。Ｒ１２、Ｒ１３、及びＲ１４は、互いに独立して、水素原子、メチル基、またはエチル基である。Ａ１はエステル結合、アミド結合、ウレタン結合、及びエーテル結合からなる群から選択される２価の結合である。）
で表される繰り返し単位の内、少なくとも１種類の繰り返し単位を含む重合体であることを特徴とする、請求項１〜４の何れか１項に記載のブロック共重合体。
【請求項６】
ブロック（Ｂ）が下記一般式（５）
【化５】
2018087316.tif 000040
（式中、Ｒ１５は水素原子またはメチル基である。Ｒ１６は−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｉ−（ＣＨ２Ｏ）ｊ−（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）ｋ−Ｒ１７（式中、Ｒ１７は水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基であり、ｉは１〜３０の整数であり、ｊおよびｋは各々独立して、０〜３０の整数である。）である。）
で表される繰り返し単位の内、少なくとも１種類の繰り返し単位を含む重合体であることを特徴とする、請求項１〜４の何れか１項に記載のブロック共重合体。
【請求項７】
ブロック（Ｂ）が下記一般式（６）
【化６】
2018087316.tif 000041
（式中、Ｒ１９は水素原子またはメチル基であり、Ｒ２０は炭素数１〜１０のアルキレン基であり、Ｒ２１は炭素数１〜４のアルキレン基である。Ｒ２２及びＲ２３は、各々独立して、水素原子または炭素数１〜４の炭化水素基である。Ａ２は、エステル結合、アミド結合、ウレタン結合、及びエーテル結合からなる群から選択される２価の結合であり、Ｘはスルホン酸基、カルボキシル基、またはリン酸基である。）
で表される繰り返し単位の内、少なくとも１種類の繰り返し単位を含む重合体であることを特徴とする、請求項１〜４の何れか１項に記載のブロック共重合体。
【請求項８】
ブロック（Ｂ）が下記一般式（７）
【化７】
2018087316.tif 000042
（式中、Ｒ２４、Ｒ２５、およびＲ２６は各々独立して水素原子またはメチル基である。）
で表される繰り返し単位の内、少なくとも１種類の繰り返し単位を含む重合体であることを特徴とする、請求項１〜４の何れか１項に記載のブロック共重合体。
【請求項９】
ブロック（Ｂ）が下記一般式（８）
【化８】
2018087316.tif 000043
（式中、Ｒ２８は水素原子またはメチル基であり、Ｒ２９は炭素数２〜７のアルキレン基であり、Ｒ３０及びＲ３１は互いに独立して、水素原子、メチル基、またはエチル基である。Ａ３はエステル結合、アミド結合、ウレタン結合、及びエーテル結合からなる群から選択される２価の結合である。）
で表される繰り返し単位の内、少なくとも１種類の繰り返し単位を含む重合体であることを特徴とする、請求項１〜４の何れか１項に記載のブロック共重合体。
【請求項１０】
ブロック（Ｂ）が下記一般式（９）
【化９】
2018087316.tif 000044
（式中、Ｒ２８は水素原子またはメチル基であり、Ｒ２９は炭素数２〜７のアルキレン基であり、Ｒ３０及びＲ３１は互いに独立して、水素原子、メチル基、またはエチル基である。Ｒ３２は、炭素数１〜４の炭化水素基、水酸基または炭素数１〜２のアルキルオキシ基で置換されていてもよい炭素数２〜４の炭化水素基である。Ａ３はエステル結合、アミド結合、ウレタン結合、及びエーテル結合からなる群から選択される２価の結合である。Ｘ−はハロゲン化物イオン、水酸化物イオン、酢酸イオンである。）
で表される繰り返し単位の内、少なくとも１種類の繰り返し単位を含む重合体であることを特徴とする、請求項１〜４の何れか１項に記載のブロック共重合体。
【請求項１１】
ブロック（Ｃ）が下記一般式（１０）
【化１０】
2018087316.tif 000045
（式中、Ｒ３３は水素原子またはメチル基であり、Ｙは水素原子、塩素原子、アセトキシ基、ニトリル基、または炭素数６〜３０の芳香族炭化水素基である。）
で表される繰り返し単位の内、少なくとも１種類の繰り返し単位を含む重合体であることを特徴とする、請求項１〜１０の何れか１項に記載のブロック共重合体。
【請求項１２】
ブロック（Ｃ）が下記一般式（１１）
【化１１】
2018087316.tif 000046
（式中、Ｒ３４は水素原子またはメチル基であり、Ｒ３５は炭素数１〜３０の炭化水素基であり、Ｚはエステル結合、アミド結合、ウレタン結合、及びエーテル結合からなる群から選択される２価の結合である。）
で表される繰り返し単位の内、少なくとも１種類の繰り返し単位を含む重合体あることを特徴とする、請求項１〜１０の何れか１項に記載のブロック共重合体。
【請求項１３】
ブロック共重合体を構成するブロック（Ａ）、ブロック（Ｂ）およびブロック（Ｃ）の合計に対する各ブロックのｍｏｌ％が、以下の（ａ）から（ｃ）であることを特徴とする、請求項１〜１２の何れか１項に記載のブロック共重合体。
（ａ）ブロック（Ａ）の比率が２５ｍｏｌ％から８５ｍｏｌ％
（ｂ）ブロック（Ｂ）の比率が２ｍｏｌ％から５０ｍｏｌ％
（ｃ）ブロック（Ｃ）の比率が１０ｍｏｌ％から７０ｍｏｌ％
【請求項１４】
ブロック共重合体の数平均分子量（Ｍｎ）が３，０００以上１，０００，０００以下であることを特徴とする、請求項１〜１３の何れか１項に記載のブロック共重合体。
【請求項１５】
前記ブロック（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）の間の１つ以上にスペーサーを介した結合を有しており、前記スペーサーの少なくとも１つが下記一般式（１２）および（１３）
【化１２】
2018087316.tif 000047
【化１３】
2018087316.tif 000048
（式中、Ｒ１は水素原子または炭素数１〜２０の炭化水素基である。）
で表される２価の結合の内、少なくとも１種類の結合を含む２価の結合であることを特徴とする、請求項１〜１４の何れか１項に記載のブロック共重合体。
【請求項１６】
以下の工程（１）から（３）を含む、請求項１〜１５の何れか１項に記載のブロック共重合体の製造方法：
（１）請求項１に記載の（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）のブロックのうち、何れか１種類のブロックを製造する工程、
（２）請求項１に記載の（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）のブロックのうち、工程（１）で製造したブロックを除く１種類のブロックと、工程（１）で製造したブロックを含むブロック重合体とが結合した、部分ブロック共重合体を製造する工程、
（３）請求項１に記載の（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）のブロックのうち、工程（２）で製造した部分ブロック共重合体を含むブロック共重合体を構成しない１種類のブロックと、工程（２）で製造した部分ブロック共重合体とが結合した、ブロック共重合体を製造する工程。
【請求項１７】
請求項１〜１５の何れか１項に記載のブロック共重合体を含むことを特徴とする、基材用表面処理剤。
【請求項１８】
請求項１７に記載の表面処理剤を基材に塗布されてなる膜。
【請求項１９】
請求項１８に記載の膜で表面を被覆した細胞培養用基材。
【請求項２０】
請求項１９に記載の細胞培養基材を用いて、請求項１に記載の温度応答性重合体ブロックのＬＣＳＴより高い温度で細胞を培養し、細胞増殖後に温度をＬＣＳＴより低くして増殖細胞を基材から剥離することを特徴とする細胞培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、短時間での細胞剥離を可能にする細胞培養基材の表面処理剤として有用なブロック共重合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞培養は生化学的な現象の理解や有用物質の産生などに用いられ、また近年、幹細胞の発見や培養技術の進歩により、再生医療を始めとする細胞を用いた治療に大きな注目が寄せられている。
【０００３】
哺乳類由来の細胞の多くは接着性を有しており、体内においてはコラーゲン、フィブロネクチン、ラミニンなどの生体高分子に接着し、増殖・分化することが知られている。同様に、細胞培養においても接着性を有する細胞の多くは、何らかの基材に接着させて培養する必要がある。従来、基材としては表面処理したガラスあるいは高分子が用いられていた。例えば、ポリスチレンにγ線照射あるいはシリコーンコーティングを行なった基材がある。また、コラーゲンやフィブロネクチンのような生体高分子を表面に塗布した基材も用いられる。
【０００４】
一般的に、前記の接着性を有する動物細胞の継代培養では、基材上で増殖した細胞をタンパク質分解酵素で処理して基材から剥離させたのち、新しい基材に播種する操作が行われている。タンパク質分解酵素は細胞表面にあるタンパク質を分解し、細胞と基材の間の結合および細胞間の結合を切る役目を担っている。一方、タンパク質分解酵素は細胞の生存率に大きな影響を与えることが知られており、タンパク質分解酵素を用いずに細胞を基材から分離する手法は細胞にダメージを与えない方法として重要である。再生医療においても同様に、基材などの体外で培養した細胞にダメージを与えずに細胞を基材から分離し、生体内に戻すことが求められており、タンパク質分解酵素を用いずに基材から分離する方法が求められている。
【０００５】
上記問題を解決するために、温度応答性ポリマーを基材表面に被覆した細胞培養基材が特許文献１に開示されている。このような基材によれば、周囲環境の温度降下による温度応答性ポリマーのゾル転移で基材表面の接着力を弱めて、細胞を剥離させ、回収することができる。通常、哺乳類由来の細胞は、体温である３７℃付近で培養することが多く、培養終了後、体温以下で細胞を剥離できる基材が必要となる。
【０００６】
文献２および３には、水中におけるゾル転移温度［下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）］が体温以下の範囲にある温度応答性ポリマーとして、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＬＣＳＴ＝３２℃）、ポリ（Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド）（ＬＣＳＴ＝２１℃）、ポリ（Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド）（ＬＣＳＴ＝３２℃）、ポリ（Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド）（ＬＣＳＴ＝約３５℃）、ポリ（Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド）（ＬＣＳＴ＝約２８℃）、ポリ（Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド）（ＬＣＳＴ＝約３５℃）、及びポリ（Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド）（ＬＣＳＴ＝３２℃）等が記載されている（特許文献２および３）。
【０００７】
上記温度応答性ポリマーを細胞培養基材に用いる場合、下限臨界溶解温度以下に細胞培養基材の温度を下げる必要があるが、その時間によっては同時に細胞を低温化してしまう。細胞の低温化は細胞の活性低下を及ぼすため、冷却時間の短縮が必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開平２−２１１８６５号公報
【特許文献２】特開平３−２６６９８０号公報
【特許文献３】特開平５−２４４９３８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、短時間での細胞剥離を可能にする細胞培養基材の表面処理剤として有用なブロック共重合体およびそれを用いた表面処理剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、以上の点を鑑み、鋭意研究を重ねた結果、温度応答性重合体および親水性重合体および疎水性重合体を含むブロック共重合体を基材上に被覆し成膜することで、短時間での細胞剥離を可能にすることを見出し、本発明を完成した。
【００１１】
すなわち本発明は、以下の［１］から［１９］に記載した態様を包含する。
【００１２】
［１］下記（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）のブロックを含むブロック共重合体。
（Ａ）水に対する下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）が０℃〜５０℃の範囲にある温度応答性重合体ブロック。
（Ｂ）０℃〜５０℃の範囲にＬＣＳＴを持たない、ＨＬＢ値（グリフィン法）が９以上２０以下の範囲にある親水性重合体ブロック。
（Ｃ）０℃〜５０℃の範囲にＬＣＳＴを持たない、ＨＬＢ値（グリフィン法）が０以上９未満の範囲にある疎水性重合体ブロック。
【００１３】
［２］ブロック（Ａ）が下記一般式（１）
【００１４】
【化１】
2018087316.tif 000002
【００１５】
（式中、Ｒ２は水素原子又はメチル基であり、Ｒ３およびＲ４は各々独立して、水素原子、炭素数１〜６の炭化水素基、炭素数１もしくは２のアルキルオキシ基で置換されていてもよい炭素数２〜４の炭化水素基、フッ素で置換されていてもよい炭素数２〜４の炭化水素基、フルフリル基またはテトラヒドロフルフリル基であり、Ｒ３とＲ４は互いに結合してピロリジン環、ピペリジン環またはモルホリン環を形成してもよい。）
で表される繰り返し単位の内、少なくとも１種類の繰り返し単位を含む重合体であることを特徴とする、前記［１］に記載のブロック共重合体。
【００１６】
［３］ブロック（Ａ）が下記一般式（２）
【００１７】
【化２】
2018087316.tif 000003
【００１８】
（式中、Ｒ５は水素原子またはメチル基であり、Ｒ６は水素原子または炭素数１〜６の炭化水素基であり、ｒは１〜１０の整数である。）
で表される繰り返し単位の内、少なくとも１種類の繰り返し単位を含む重合体であることを特徴とする、前記［１］に記載のブロック共重合体。
【００１９】
［４］ブロック（Ａ）が下記一般式（３）
【００２０】
【化３】
2018087316.tif 000004
【００２１】
（式中、Ｒ７は水素原子またはメチル基であり、Ｒ８は炭素数１〜６の炭化水素基である。）
で表される繰り返し単位の内、少なくとも１種類の繰り返し単位を含む重合体であることを特徴とする、前記［１］に記載のブロック共重合体。
【００２２】
［５］ブロック（Ｂ）が下記一般式（４）
【００２３】
【化４】
2018087316.tif 000005
【００２４】
（式中、Ｒ９は水素原子又はメチル基であり、Ｒ１０は炭素数１〜１０のアルキレン基であり、Ｒ１１は炭素数１〜４の２価の炭化水素基である。Ｒ１２、Ｒ１３、及びＲ１４は、互いに独立して、水素原子、メチル基、またはエチル基である。Ａ１はエステル結合、アミド結合、ウレタン結合、及びエーテル結合からなる群から選択される２価の結合である。）
で表される繰り返し単位の内、少なくとも１種類の繰り返し単位を含む重合体であることを特徴とする、前記［１］〜［４］の何れかに記載のブロック共重合体。
【００２５】
［６］ブロック（Ｂ）が下記一般式（５）
【００２６】
【化５】
2018087316.tif 000006
【００２７】
（式中、Ｒ１５は水素原子またはメチル基である。Ｒ１６は−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｉ−（ＣＨ２Ｏ）ｊ−（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）ｋ−Ｒ１７（式中、Ｒ１７は水素原子または炭素数１〜１０のアルキル基であり、ｉは１〜３０の整数であり、ｊおよびｋは各々独立して、０〜３０の整数である。）である。）
で表される繰り返し単位の内、少なくとも１種類の繰り返し単位を含む重合体であることを特徴とする、前記［１］〜［４］の何れかに記載のブロック共重合体。
【００２８】
［７］ブロック（Ｂ）が下記一般式（６）
【００２９】
【化６】
2018087316.tif 000007
【００３０】
（式中、Ｒ１９は水素原子またはメチル基であり、Ｒ２０は炭素数１〜１０のアルキレン基であり、Ｒ２１は炭素数１〜４のアルキレン基である。Ｒ２２及びＲ２３は、各々独立して、水素原子または炭素数１〜４の炭化水素基である。Ａ２は、エステル結合、アミド結合、ウレタン結合、及びエーテル結合からなる群から選択される２価の結合であり、Ｘはスルホン酸基、カルボキシル基、またはリン酸基である。）
で表される繰り返し単位の内、少なくとも１種類の繰り返し単位を含む重合体であることを特徴とする、前記［１］〜［４］の何れかに記載のブロック共重合体。
【００３１】
［８］ブロック（Ｂ）が下記一般式（７）
【００３２】
【化７】
2018087316.tif 000008
【００３３】
（式中、Ｒ２４、Ｒ２５、およびＲ２６は各々独立して水素原子またはメチル基である。）
で表される繰り返し単位の内、少なくとも１種類の繰り返し単位を含む重合体であることを特徴とする、前記［１］〜［４］の何れかに記載のブロック共重合体。
【００３４】
［９］ブロック（Ｂ）が下記一般式（８）
【００３５】
【化８】
2018087316.tif 000009
【００３６】
（式中、Ｒ２８は水素原子またはメチル基であり、Ｒ２９は炭素数２〜７のアルキレン基であり、Ｒ３０及びＲ３１は互いに独立して、水素原子、メチル基、またはエチル基である。Ａ３はエステル結合、アミド結合、ウレタン結合、及びエーテル結合からなる群から選択される２価の結合である。）
で表される繰り返し単位の内、少なくとも１種類の繰り返し単位を含む重合体であることを特徴とする、前記［１］〜［４］の何れかに記載のブロック共重合体。
【００３７】
［１０］ブロック（Ｂ）が下記一般式（９）
【００３８】
【化９】
2018087316.tif 000010
【００３９】
（式中、Ｒ２８は水素原子またはメチル基であり、Ｒ２９は炭素数２〜７のアルキレン基であり、Ｒ３０及びＲ３１は互いに独立して、水素原子、メチル基、またはエチル基である。Ｒ３２は、炭素数１〜４の炭化水素基、水酸基または炭素数１〜２のアルキルオキシ基で置換されていてもよい炭素数２〜４の炭化水素基である。Ａ３はエステル結合、アミド結合、ウレタン結合、及びエーテル結合からなる群から選択される２価の結合である。Ｘ−はハロゲン化物イオン、水酸化物イオン、酢酸イオンである。）
で表される繰り返し単位の内、少なくとも１種類の繰り返し単位を含む重合体であることを特徴とする、前記［１］〜［４］の何れかに記載のブロック共重合体。
【００４０】
［１１］ブロック（Ｃ）が下記一般式（１０）
【００４１】
【化１０】
2018087316.tif 000011
【００４２】
（式中、Ｒ３３は水素原子またはメチル基であり、Ｙは水素原子、塩素原子、アセトキシ基、ニトリル基、または炭素数６〜３０の芳香族炭化水素基である。）
で表される繰り返し単位の内、少なくとも１種類の繰り返し単位を含む重合体であることを特徴とする、前記［１］〜［１０］の何れかに記載のブロック共重合体。
【００４３】
［１２］ブロック（Ｃ）が下記一般式（１１）
【００４４】
【化１１】
2018087316.tif 000012
【００４５】
（式中、Ｒ３４は水素原子またはメチル基であり、Ｒ３５は炭素数１〜３０の炭化水素基であり、Ｚはエステル結合、アミド結合、ウレタン結合、及びエーテル結合からなる群から選択される２価の結合である。）
で表される繰り返し単位の内、少なくとも１種類の繰り返し単位を含む重合体あることを特徴とする、前記［１］〜［１０］の何れかに記載のブロック共重合体。
【００４６】
［１３］ブロック共重合体を構成するブロック（Ａ）、ブロック（Ｂ）およびブロック（Ｃ）の合計に対する各ブロックのｍｏｌ％が、以下の（ａ）から（ｃ）であることを特徴とする、前記［１］〜［１２］の何れかに記載のブロック共重合体。
（ａ）ブロック（Ａ）の比率が２５ｍｏｌ％から８５ｍｏｌ％
（ｂ）ブロック（Ｂ）の比率が２ｍｏｌ％から５０ｍｏｌ％
（ｃ）ブロック（Ｃ）の比率が１０ｍｏｌ％から７０ｍｏｌ％
［１４］ブロック共重合体の数平均分子量（Ｍｎ）が３，０００以上１，０００，０００以下であることを特徴とする、前記［１］〜［１３］の何れかに記載のブロック共重合体。
【００４７】
［１５］前記ブロック（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）の間の１つ以上にスペーサーを介した結合を有しており、前記スペーサーの少なくとも１つが下記一般式（１２）および（１３）
【００４８】
【化１２】
2018087316.tif 000013
【００４９】
【化１３】
2018087316.tif 000014
【００５０】
（式中、Ｒ１は水素原子または炭素数１〜２０の炭化水素基である。）
で表される２価の結合の内、少なくとも１種類の結合を含む２価の結合であることを特徴とする、前記［１］〜［１４］の何れかに記載のブロック共重合体。
【００５１】
［１６］以下の工程（１）から（３）を含む、前記［１］〜［１５］の何れかに記載のブロック共重合体の製造方法：
（１）前記［１］に記載の（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）のブロックのうち、何れか１種類のブロックを製造する工程、
（２）前記［１］に記載の（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）のブロックのうち、工程（１）で製造したブロックを除く１種類のブロックと、工程（１）で製造したブロックを含むブロック重合体とが結合した、部分ブロック共重合体を製造する工程、
（３）前記［１］に記載の（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）のブロックのうち、工程（２）で製造した部分ブロック共重合体を含むブロック共重合体を構成しない１種類のブロックと、工程（２）で製造した部分ブロック共重合体とが結合した、ブロック共重合体を製造する工程。
【００５２】
［１７］前記［１］〜［１５］の何れかに記載のブロック共重合体を含むことを特徴とする、基材用表面処理剤。
【００５３】
［１８］前記［１７］に記載の表面処理剤を基材に塗布されてなる膜。
【００５４】
［１９］前記［１８］に記載の膜で表面を被覆した細胞培養用基材。
【００５５】
［２０］前記［１９］に記載の細胞培養基材を用いて、前記［１］に記載の温度応答性重合体ブロックのＬＣＳＴより高い温度で細胞を培養し、細胞増殖後に温度をＬＣＳＴより低くして増殖細胞を基材から剥離することを特徴とする細胞培養方法。
【発明の効果】
【００５６】
温度応答性重合体ブロックと親水性重合体ブロックと疎水性重合体ブロックを含む、本発明のブロック共重合体から得られる膜を細胞培養基材に被覆すれば、細胞培養後、温度降下による基材表面の親水化が促進され、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮することができる。これによって、細胞培養後、冷却処理を施しても、細胞にダメージを与えることなく、短時間で細胞を回収できる細胞培養基材が得られるようになる。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
以下、本発明を実施するための形態（以下、単に「本実施の形態」という。）について詳細に説明する。以下の本実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明を以下の内容に限定する趣旨ではない。本発明は、その趣旨の範囲内で適宜に変形して実施できる。
【００５８】
１．ブロック共重合体
本発明のブロック共重合体は、以下の（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）のブロックを含むブロック共重合体である。
（Ａ）水に対する下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）が０℃〜５０℃の範囲にある温度応答性重合体ブロック。
（Ｂ）０℃〜５０℃の範囲にＬＣＳＴを持たない、ＨＬＢ値（グリフィン法）が９以上２０未満の範囲にある親水性重合体ブロック。
（Ｃ）０℃〜５０℃の範囲にＬＣＳＴを持たない、ＨＬＢ値（グリフィン法）が０以上９未満の範囲にある疎水性重合体ブロック。
【００５９】
以下に本発明におけるブロック（Ａ）、ブロック（Ｂ）およびブロック（Ｃ）の詳細を説明する。なお、「重合体」とは、「共重合体」（ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ）および「単独重合体」（ｈｏｍｏｐｏｌｙｍｅｒ）を含む。即ち、ブロック（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）の各々を構成する繰り返し単位は、それぞれ１種類であってもよく、２種類以上であってもよい。
【００６０】
本発明におけるブロック（Ａ）はＬＣＳＴが０℃〜５０℃の範囲にある温度応答性重合体ブロックである。ここで、ＬＣＳＴとは下限臨界溶解温度（Ｌｏｗｅｒ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：ＬＣＳＴ）であり、この温度よりも低い温度では高分子が水に溶解して透明の溶液になるが、この温度よりも高い温度では不溶化して白濁するか沈殿が生じ、相分離する温度である。
【００６１】
後述する方法により作製した、本発明のブロック共重合体を含む細胞培養基材を用いて細胞を培養した場合、ＬＣＳＴが０℃未満であれば細胞にダメージを与えることなく剥離することが困難となり、５０℃を超えれば体温付近で細胞を接着できなくなり、細胞培養が困難となることから、ブロック（Ａ）のＬＣＳＴは０℃〜５０℃の範囲にある必要がある。体温である３７℃付近で細胞接着性を付与すると共に、温度降下で細胞を剥離し、ダメージを与えることなく細胞を回収する点で、ブロック（Ａ）のＬＣＳＴは１０℃〜４０℃の範囲にあることが好ましく、２０℃〜３５℃の範囲にあることがさらに好ましい。
【００６２】
本発明のブロック共重合体を構成するブロック（Ａ）は、ＬＣＳＴが０℃〜５０℃の範囲にある重合体ブロックであれば特に制限は無いが、ブロック（Ａ）を構成する繰り返し単位としては、下記一般式（１）〜（３）の何れかで表される繰り返し単位が好ましい。ブロック（Ａ）は１種類の繰り返し単位から成っていてもよく、２種類以上の繰り返し単位から成っていてもよい。
【００６３】
【化１４】
2018087316.tif 000015
【００６４】
式中、Ｒ２は水素原子又はメチル基であり、ＬＣＳＴを０℃〜５０℃の範囲にする点で、水素原子が好ましい。
【００６５】
Ｒ３およびＲ４は各々独立して、水素原子、炭素数１〜６の炭化水素基、炭素数１から２のアルキルオキシ基で置換されていてもよい炭素数２〜４の炭化水素基、フッ素で置換されていてもよい炭素数２〜４の炭化水素基、フルフリル基またはテトラヒドロフルフリル基であり、Ｒ３とＲ４は互いに結合してピロリジン環、ピペリジン環もしくはモルホリン環を形成してもよい。前述の炭素数１〜６の炭化水素基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ヘキシル基、イソヘキシル基を例示できる。また、前述の炭素数１から２のアルキルオキシ基で置換されていてもよい炭素数２〜４の炭化水素基として、メトキシエチル基、エトキシエチル基、メトキシプロピル基、エトキシプロピル基、メトキシブチル基、エトキシブチル基を例示することができる。さらに、前述のフッ素で置換されていてもよい炭素数２〜６の炭化水素基としては、２−フルオロエチル基、２，２−ジフルオロエチル基、２，２，２−トリフルオロエチル基、３，３，３−トリフルオロプロピル基、２，２，３，３，３−ペンタフルオロプロピル基、２，２，３，３，４，４，４−ヘプタフルオロブチル基などを例示することができる。これらの中では、ＬＣＳＴを０℃〜５０℃の範囲にする点で、炭素数１〜６の炭化水素基を用いることが好ましく、ｎ−プロピル基、イソプロピル基を用いることがより好ましい。
【００６６】
本発明における一般式（１）で表される繰り返し単位としては、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド、Ｎ−シクロプロピルメタクリルアミド、Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド、Ｎ−エトキシエチルメタクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド、１−（１−オキソ−２−プロペニル）ピロリジン、１−（１−オキソ−２−メチル−２−プロペニル）ピロリジン、１−（１−オキソ−２−プロペニル）ピペリジン、１−（１−オキソ−２−メチル−２−プロペニル）ピペリジン、４−（１−オキソ−２−プロペニル）モルホリン、および４−（１−オキソ−２−メチル−２−プロペニル）モルホリンから選択されるモノマーを重合して生成する繰り返し単位を例示できる。ＬＣＳＴを１０℃〜４０℃の範囲にする点で、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド、Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミドを重合して生成する繰り返し単位であることが好ましく、ＬＣＳＴを２０℃〜３５℃の範囲にする点で、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド、Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミドから選択されるモノマーを重合して生成する繰り返し単位であることがより好ましい。
【００６７】
【化１５】
2018087316.tif 000016
【００６８】
式中、Ｒ５は水素原子またはメチル基を表し、ＬＣＳＴを０℃〜５０℃の範囲にするために、水素原子が用いられる。Ｒ６は、水素原子または炭素数１〜６の炭化水素基であり、炭素数１〜６の炭化水素基として、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ヘキシル基、イソヘキシル基を例示できるが、ＬＣＳＴを０℃〜５０℃の範囲にする点で、炭素数１〜３の炭化水素基を用いることが好ましい。ｒは１〜１０の整数であり、ＬＣＳＴを０℃〜５０℃の範囲にする点で、１〜３の整数が好ましい。本発明における一般式（２）で表される繰り返し単位としては、ＬＣＳＴを１０℃〜４０℃の範囲にするために、２−エトキシエチルビニルエーテルを重合して生成する繰り返し単位であることが好ましい。
【００６９】
【化１６】
2018087316.tif 000017
【００７０】
式中、Ｒ７は水素原子またはメチル基を表し、ＬＣＳＴを０℃〜５０℃の範囲にする点で、水素原子を用いることが好ましい。Ｒ８は炭素数１〜６の炭化水素基を表し、炭素数１〜６の炭化水素基としてメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ヘキシル基、イソヘキシル基を例示できるが、ＬＣＳＴを０℃〜５０℃の範囲にする点で、メチル基、エチル基を用いることが好ましい。本発明における一般式（３）で表される繰り返し単位としては、ＬＣＳＴを１０℃〜４０℃の範囲にする点で、メチルビニルエーテルを重合して生成する繰り返し単位であることが好ましい。
【００７１】
本発明のブロック共重合体を構成するブロック（Ａ）の構成単位としては、前記一般式（１）から一般式（３）の何れかで表される繰り返し単位の中では、温度降下による細胞の剥離性が良好である点で、一般式（１）で表される繰り返し単位であることが好ましい。
【００７２】
本発明におけるブロック（Ｂ）は、０℃〜５０℃の範囲にＬＣＳＴを持たない、ＨＬＢ値が９以上２０以下の親水性重合体のブロックである。
【００７３】
本明細書において、ＨＬＢ値（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｅ−Ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ  Ｂａｌａｎｃｅ：ＨＬＢ）とは、Ｗ．Ｃ．Ｇｒｉｆｆｉｎ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ，  １，  ３１１（１９４９）．に記載の、水と油への親和性の程度を表す値であり、０から２０までの値を取り、０に近いほど疎水性が高く、２０に近いほど親水性が高くなる。計算式によりＨＬＢ値を算出方法として、アトラス法、グリフィン法、デイビス法、川上法があるが、本明細書においては、グリフィン法により算出した値を使用し、本発明のブロック共重合体を構成する各ブロックの繰り返し単位中の親水部の式量と繰り返し単位の総式量を元に、下記の計算式により算出した。
【００７４】
ＨＬＢ値＝２０×（繰り返し単位中の親水部の式量）÷（繰り返し単位の総式量）
前述の、各ブロックの繰り返し単位中の親水部の定義として、スルホン部（−ＳＯ３−）、ホスホノ基部（−ＰＯ３−）、カルボキシル基部（−ＣＯＯＨ）、エステル部（−ＣＯＯ−）、アミド部（−ＣＯＮＨ−）、イミド部（−ＣＯＮ−）、アルデヒド基部（−ＣＨＯ）、カルボニル基部（−ＣＯ−）、ヒドロキシル基部（−ＯＨ）、アミノ基部（−ＮＨ２）、アセチル基部（−ＣＯＣＨ３）、エチレンアミン部（−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ−）、エチレンオキシ部（−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−）、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、アンモニウムイオン、ハロゲン化物イオン、酢酸イオンを例示することができる。
【００７５】
繰り返し単位中の親水部の算出では、親水部を構成する原子が、他の親水部を構成する原子として重複してはならない。繰り返し単位中のＨＬＢ値の算出例を以下に記載した。例えば、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（分子量：２９５．２７）の場合、親水部は、エステル部が１部、ホスホノ基部が１部およびエチレンアミン部が１部であり、親水部の分子量は１８１．０４であるから、ＨＬＢ値は１２．３である。２−ジメチルアミノエチルメタクリレート（分子量：１５７．１１）の場合、親水部は、エステル部が１部およびエチレンアミン部が１部であり、親水部の分子量は８６．０７であるから、ＨＬＢ値は１１．０である。メチルメタクリレート（分子量：１００．１２）の場合、親水部は、エステル部が１部であり、親水部の分子量は４４．０１であるから、ＨＬＢ値は８．８である。ｎ−ブチルメタクリレート（分子量：１４２．２０）の場合、親水部は、エステル部が１部であり、親水部の分子量は４４．０１であるから、ＨＬＢ値は６．２である。
【００７６】
さらに、本発明のブロック共重合体を構成する各ブロックが、異なるモノマー（モノマー１、モノマー２・・・）からなる共重合体である場合は、それぞれのモノマーが重合して生成する繰り返し単位の共重合体中の比率（ｍｏｌ％）を分析し、下記の計算式で算出することができる。
【００７７】
ＨＬＢ値＝ＨＬＢ値１×比率１＋ＨＬＢ値２×比率２＋・・・・
ここで、ＨＬＢ値１はモノマー１が重合して生成する重合体のＨＬＢ値であり、組成１はモノマー１が重合して生成する繰り返し単位の共重合体中の比率（ｍｏｌ％）であり、ＨＬＢ値２はモノマー２が重合して生成する重合体のＨＬＢ値であり、組成２はモノマー２が重合して生成する繰り返し単位の共重合体中の比率（ｍｏｌ％）である。
【００７８】
またブロック（Ｂ）は，ＨＬＢ値が９以上２０未満であれば疎水性のモノマーを含んでよく，例えば上記親水性基を含むモノマーとアルキル（メタ）アクリレートやスチレン誘導体からなる共重合体を例示することができる。
【００７９】
本発明におけるブロック（Ｂ）は、ＨＬＢ値が９未満である場合は、疎水性が高くなるため細胞剥離に必要な冷却時間が長くなり、結果として細胞の活性低下を招くことから、ＨＬＢ値が９以上２０未満の範囲である必要がある。一方、ＨＬＢ値が２０に近づくと親水性が高くなり細胞が接着しづらくなることから、本発明におけるブロック（Ｂ）のＨＬＢ値は９以上１９未満であることが好ましく、９以上１７未満であることがより好ましい。
【００８０】
本発明のブロック共重合体を構成するブロック（Ｂ）は、ＨＬＢ値が９以上２０以下にある重合体ブロックであれば特に制限は無いが、ブロック（Ｂ）を構成する繰り返し単位としては、下記一般式（４）〜（９）の何れかで表される繰り返し単位が好ましい。ブロック（Ｂ）は１種類の繰り返し単位から成っていてもよく、２種類以上の繰り返し単位から成っていてもよい。
【００８１】
【化１７】
2018087316.tif 000018
【００８２】
式中、Ｒ９は水素原子又はメチル基である。Ｒ１０は、炭素数１〜１０のアルキレン基であり、細胞接着性を制御できる点および細胞剥離に必要な冷却時間を短縮する点で、炭素数１〜６のアルキレン基であることが好ましい。このようなアルキレン基として、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基、ペンタメチレン基、ヘキサメチレン基などが例示され、エチレン基であることがより好ましい。また、Ｒ１０は、細胞接着性を制御できる点および細胞剥離に必要な冷却時間を短縮する点で（ポリ）オキシエチレン基が好ましい。
【００８３】
Ｒ１１は、炭素数１〜４の２価の炭化水素基であり、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮する点で、炭素数１〜４のアルキレン基、例えばメチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基であることが好ましく、エチレン基であることがより好ましい。Ｒ１２、Ｒ１３、及びＲ１４は、互いに独立して、水素原子、メチル基、又はエチル基であり、細胞接着性を制御できる点および細胞剥離に必要な冷却時間を短縮する点で、Ｒ１２、Ｒ１３、及びＲ１４が同時に、水素原子又はメチル基であることが好ましく、同時にメチル基であることがより好ましい。Ａ１はエステル結合、アミド結合、ウレタン結合、及びエーテル結合からなる群から選択される２価の結合であり、細胞接着性を制御できる点および細胞剥離に必要な冷却時間を短縮する点で、エステル結合、アミド結合であることが好ましく、エステル結合がより好ましい。
【００８４】
本発明における一般式（４）で表される繰り返し単位としては、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、２−アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、３−（メタ）アクリロイルオキシプロピルホスホリルコリン、４−（メタ）アクリロイルオキシブチルホスホリルコリン、６−（メタ）アクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン、１０−（メタ）アクリロイルオキシデシルホスホリルコリン、ω−（メタ）アクリロイル（ポリ）オキシエチレンホスホリルコリン、２−アクリルアミドエチルホスホリルコリン、３−アクリルアミドプロピルホスホリルコリン、４−アクリルアミドブチルホスホリルコリン、６−アクリルアミドヘキシルホスホリルコリン、１０−アクリルアミドデシルホスホリルコリン、およびω−（メタ）アクリルアミド（ポリ）オキシエチレンホスホリルコリンから選択されるモノマーを重合して生成する繰り返し単位を例示できる。これらの繰返し単位の中では、細胞接着性を制御できる点および細胞剥離に必要な冷却時間を短縮する点で、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンを重合して生成する繰り返し単位であることが好ましい。
【００８５】
【化１８】
2018087316.tif 000019
【００８６】
式中、Ｒ１５は水素原子またはメチル基である。Ｒ１６は、炭素数１〜３のアルキレン基を含む（ポリ）オキシアルキレン基であり、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｉ−（ＣＨ２Ｏ）ｊ−（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）ｋ−Ｒ１７（式中、Ｒ１７は水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、フルフリル基、テトラヒドロフルフリル基であり、ｉは１〜３０の整数であり、ｊおよびｋは０〜３０の整数である。）で表される。
【００８７】
本発明における一般式（５）で表される繰り返し単位としては、ポリエチレングリコールメタクリレート、２−ヒドロキシエチルアクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシメチルアクリレート、ヒドロキシメチルメタクリレート、２−メトキシエチルアクリレート、２−メトキシエチルメタクリレート、フルフリルアクリレート、フルフリルメタクリレート、テトラヒドロフルフリルアクリレートおよびテトラヒドロフルフリルメタクリレートから選択されるモノマーを重合して生成する繰り返し単位を例示できる。これらの繰返し単位の中では、細胞接着性を制御できる点および細胞剥離に必要な冷却時間を短縮する点で、ポリエチレングリコールメタクリレート、２−メトキシエチルアクリレートまたはテトラヒドロフルフリルアクリレートを重合して生成する繰り返し単位であることが好ましい。
【００８８】
【化１９】
2018087316.tif 000020
【００８９】
式中、Ｒ１９は水素原子またはメチル基である。Ｒ２０は、炭素数１〜１０のアルキレン基であり、細胞接着性を制御できる点および細胞剥離に必要な冷却時間を短縮する点で、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基、ペンタメチレン基、ヘキサメチレン基等の炭素数１〜６のアルキレン基であることが好ましく、エチレン基、プロピレン基であることがより好ましい。
【００９０】
Ｒ２１は、炭素数１〜４のアルキレン基であり、細胞接着性を制御できる点および細胞剥離に必要な冷却時間を短縮する点で、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基等のアルキレン基であることが好ましく、エチレン基、プロピレン基であることがより好ましい。Ｒ２２及びＲ２３は、各々独立して、水素原子又は炭素数１〜４の炭化水素基であり、細胞接着性を制御できる点および細胞剥離に必要な冷却時間を短縮する点で、Ｒ２２及びＲ２３が同時に水素原子またはメチル基であることが好ましく、同時にメチル基であることがより好ましい。
【００９１】
Ａ２は、エステル結合、アミド結合、ウレタン結合、及びエーテル結合からなる群から選択される２価の結合であり、細胞接着性を制御できる点および細胞剥離に必要な冷却時間を短縮する点で、エステル結合、アミド結合であることが好ましく、エステル結合であることがより好ましい。また、Ｘはスルホン酸基、カルボキシル基、若しくは、リン酸基であることが好ましい。
【００９２】
本発明における一般式（６）で表される繰り返し単位としては、ジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（カルボキシラトメチル）アミニウム、ジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（２−カルボキシラトエチル）アミニウム、ジメチル（２−アクリロイルオキシエチル）（２−カルボキシラトエチル）アミニウム、ジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（３−カルボキシラトプロピル）アミニウム、ジメチル（２−アクリロイルオキシエチル）（３−カルボキシラトプロピル）アミニウム、ジメチル（３−メタクリロイルアミノプロピル）（３−スルホナトプロピル）アミニウム、ジメチル（３−メタクリロイルアミノプロピル）（４−スルホナトブチル）アミニウム、ジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（２−スルホナトエチル）アミニウム、ジメチル（２−アクリロイルオキシエチル）（２−スルホナトエチル）アミニウム、ジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（３−スルホナトプロピル）アミニウム、ジメチル（２−アクリロイルオキシエチル）（３−スルホナトプロピル）アミニウム、ジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（２−ホスホナトエチル）アミニウム、ジメチル（２−アクリロイルオキシエチル）（２−ホスホナトエチル）アミニウム、ジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（３−ホスホナトプロピル）アミニウム、およびジメチル（２−アクリロイルオキシエチル）（３−ホスホナトプロピル）アミニウムから選択されるモノマーを重合して生成する繰り返し単位を例示できるが、細胞接着性を制御できる点および細胞剥離に必要な冷却時間を短縮する点で、ジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（カルボキシラトメチル）アミニウム、ジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（２−カルボキシラトエチル）アミニウム、ジメチル（３−メタクリロイルアミノプロピル）（３−スルホナトプロピル）アミニウム、ジメチル（３−メタクリロイルアミノプロピル）（４−スルホナトブチル）アミニウムまたはジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（２−スルホナトエチル）アミニウムを重合して生成する繰り返し単位であることが好ましい。
【００９３】
【化２０】
2018087316.tif 000021
【００９４】
式中、Ｒ２４は水素原子またはメチル基である。Ｒ２５、Ｒ２６は各々独立して水素原子又はメチル基である。
【００９５】
本発明における一般式（７）で表される繰り返し単位としては、アクリルアミドまたはＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドを重合して生成する繰り返し単位を用いることができる。
【００９６】
【化２１】
2018087316.tif 000022
【００９７】
式中、Ｒ２８は水素原子又はメチル基であり、細胞接着性を制御できる点および細胞剥離に必要な冷却時間を短縮する点で、メチル基を用いることが好ましい。Ｒ２９は、炭素数２〜７のアルキレン基であり、細胞接着性を制御できる点および細胞剥離に必要な冷却時間を短縮する点で、炭素数２〜４のアルキレン基であることが好ましく、エチレン基であることがより好ましい。Ｒ３０及びＲ３１は、互いに独立して、水素原子、メチル基、エチル基であり、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮する点で、Ｒ３０及びＲ３１が同時に、水素原子又はメチル基であることが好ましく、同時にメチル基であることがより好ましい。Ａ３はエステル結合、アミド結合、ウレタン結合、及びエーテル結合からなる群から選択される２価の結合であり、細胞接着性を制御できる点および細胞剥離に必要な冷却時間を短縮する点で、エステル結合、アミド結合であることが好ましく、エステル結合であることがより好ましい。
【００９８】
本発明における一般式（８）で表される繰り返し単位としては、アミノエチル（メタ）アクリレート、２−ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、２−ジエチルアミノエチル（メタ）アクリレート、３−アミノプロピル（メタ）アクリレート、３−ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリレート、３−ジエチルアミノプロピル（メタ）アクリレート、（メタ）アクリルアミドエチルアミン、ジメチル［（メタ）アクリルアミドエチル］アミン、ジエチル［（メタ）アクリルアミドエチル］アミン、３−（メタ）アクリルアミドプロピルアミン、ジメチル［３−（メタ）アクリルアミドプロピル］アミン、およびジエチル［３−（メタ）アクリルアミドプロピル］アミンをモノマーとして重合して生成する繰り返し単位を例示できるが、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮する点で、２−ジメチルアミノメチル（メタ）アクリレート、２−ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、ジメチル［（メタ）アクリルアミドメチル］アミン、またはジメチル［（メタ）アクリルアミドエチル］アミンを重合して生成する繰り返し単位であることが好ましい。
【００９９】
【化２２】
2018087316.tif 000023
【０１００】
式中、Ｒ２８は水素原子又はメチル基であり、細胞接着性を制御できる点および細胞剥離に必要な冷却時間を短縮する点で、メチル基を用いることが好ましい。Ｒ２９は、炭素数２〜７のアルキレン基であり、細胞接着性を制御できる点および細胞剥離に必要な冷却時間を短縮する点で、炭素数２〜４のアルキレン基であることが好ましく、エチレン基であることがより好ましい。Ｒ３０及びＲ３１は、互いに独立して、水素原子、メチル基、エチル基であり、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮する点で、Ｒ３０及びＲ３１が同時に、水素原子又はメチル基であることが好ましく、同時にメチル基であることがより好ましい。Ｒ３２は、炭素数１〜４の炭化水素基、水酸基または炭素数１〜２のアルキルオキシ基で置換されていてもよい炭素数２〜４の炭化水素基であり、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮する点で、メチル基、エチル基、水酸基またはメトキシ基で置換されていてもよいエチレン基であることが好ましい。Ａ３はエステル結合、アミド結合、ウレタン結合、及びエーテル結合からなる群から選択される２価の結合であり、細胞接着性を制御できる点および細胞剥離に必要な冷却時間を短縮する点で、エステル結合、アミド結合であることが好ましく、エステル結合であることがより好ましい。Ｘ−はハロゲン化物イオン、水酸化物イオン、酢酸イオンであり、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮する点で、ハロゲン化物イオン、水酸化物イオンであることが好ましい。
【０１０１】
本発明における一般式（９）で表される繰り返し単位としては、トリメチル−２−メタクロイルオキシエチルアンモニウムクロリド、トリメチル−２−メタクロイルオキシエチルアンモニウムブロミド、トリメチル−３−メタクロイルオキシプロピルアンモニウムクロリド、トリメチル−３−メタクロイルオキシエチルアンモニウムブロミドをモノマーとして重合して生成する繰り返し単位や、２−ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、２−ジエチルアミノエチル（メタ）アクリレート、３−ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリレート、３−ジエチルアミノプロピル（メタ）アクリレート、ジメチル［（メタ）アクリルアミドエチル］アミン、ジエチル［（メタ）アクリルアミドエチル］アミン、ジメチル［３−（メタ）アクリルアミドプロピル］アミン、ジエチル［３−（メタ）アクリルアミドプロピル］アミンをモノマーとして重合して生成する繰り返し単位と、炭素数１〜４のハロゲン化アルキル、エチレンオキシド、プロピレンオキシド、１，２−ブチレンオキシド、２−クロロエチルメチルエーテルとを反応させて生成する繰り返し単位を例示できる。これらの繰り返し単位の中では、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮する点および合成が容易な点で、２−ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、３−ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリレート、ジメチル［（メタ）アクリルアミドエチル］アミン、ジメチル［３−（メタ）アクリルアミドプロピル］アミン、をモノマーとして重合して生成する繰り返し単位と、炭素数１〜４のハロゲン化アルキル、エチレンオキシド、プロピレンオキシド、１，２−ブチレンオキシド、２−クロロエチルメチルエーテルとを反応させて生成する繰り返し単位であることが好ましい。
【０１０２】
本発明のブロック共重合体を構成するブロック（Ｂ）として、前記一般式（４）から一般式（９）の何れかで表される繰り返し単位の中では、細胞接着性を制御できる点および細胞剥離に必要な冷却時間を短縮する点で、一般式（４）、一般式（５）、一般式（６）、または一般式（８）で表される繰り返し単位が好ましく、細胞接着性に優れる点で、一般式（５）または一般式（８）で表される繰り返し単位であることがより好ましい。
【０１０３】
本発明におけるブロック（Ｃ）は、０℃〜５０℃の範囲にＬＣＳＴを持たない、ＨＬＢ値が０以上９未満の疎水性重合体ブロックである。ブロック（Ｃ）は、本発明のブロック共重合体の基材への接着に寄与するブロックである。なお、本明細書におけるＨＬＢ値は前述のとおりである。
【０１０４】
本発明におけるブロック（Ｃ）のＨＬＢ値が９以上である場合は、基材に塗布した場合に水中で剥離しやすく安定な膜を得ることができない。従って、本発明におけるブロック（Ｃ）のＨＬＢ値は０以上９未満の範囲にある必要があり、基材に塗布した場合に水中で剥離しない安定な膜が得られる点で、０以上８以下の範囲に有ることが好ましく、０以上７以下の範囲にあることがより好ましい。
【０１０５】
また、本発明におけるブロック（Ｃ）は、ＨＬＢ値が０以上９未満の範囲にあれば、前述の親水性部を含むモノマーを含んでよく、例えば、前述の親水部を含むモノマーと、アルキル（メタ）アクリレートやスチレン誘導体との共重合体を例示することができる。
【０１０６】
本発明のブロック共重合体を構成するブロック（Ｃ）は、ＨＬＢ値が０以上９未満にある重合体ブロックであれば特に制限は無いが、ブロック（Ｃ）を構成する繰り返し単位としては、下記一般式（１０）または（１１）で表される繰り返し単位が好ましい。ブロック（Ｃ）は１種類の繰り返し単位から成っていてもよく、２種類以上の繰り返し単位から成っていてもよい。
【０１０７】
【化２３】
2018087316.tif 000024
【０１０８】
式中、Ｒ３３は水素原子またはメチル基である。Ｙは水素原子、塩素原子、アセトキシ基、ニトリル基、炭素数６〜３０の芳香族炭化水素基を例示することができ、水中で剥離しない安定な膜を得る点で、水素原子、塩素原子、炭素数６〜３０の芳香族炭化水素基を用いることが好ましい。炭素数６〜３０の芳香族炭化水素基としてはフェニル基、１−ナフタレン基、２−ナフタレン基、９−アントラセン基、１−ピレン基およびその誘導体を例示することができる。
【０１０９】
本発明における一般式（１０）で表される繰り返し単位としては、エチレン、塩化ビニル、酢酸ビニル、アクリロニトリル、スチレン、１−ビニルナフタレン、２−ビニルナフタレン、９−ビニルアントラセン、および１−ビニルピレンから選択されるモノマーを重合して生成する繰り返し単位を例示できる。これらの中では、基材に塗布した場合の接着性の点で、スチレン、１−ビニルナフタレン、２−ビニルナフタレン、９−ビニルアントラセン、１−ビニルピレンを重合して生成する繰り返し単位であることが好ましく、スチレンを重合して生成する繰り返し単位であることがより好ましい。
【０１１０】
【化２４】
2018087316.tif 000025
【０１１１】
式中、Ｒ３４は水素原子またはメチル基である。Ｒ３５は炭素数１〜３０の炭化水素基であり、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ヘキシル基、イソヘキシル基、ｎ−オクチル基、ｎ−デシル基、ｎ−ドデシル基、ｎ−ヘキサデシル基、ｎ−オクタデシル基などを例示することができる。水中で剥離しない安定な膜を得る点で、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ヘキシル基、イソヘキシル基、ｎ−オクチル基、ｎ−デシル基、ｎ−ドデシル基、ｎ−ヘキサデシル基、ｎ−オクタデシル基が用いられることが好ましい。
【０１１２】
Ｚは、エステル結合、アミド結合、ウレタン結合、及びエーテル結合からなる群から選択される２価の結合であり、水中で剥離しない安定な膜を得る点で、エステル結合、アミド結合であることが好ましく、エステル結合であることがより好ましい。
【０１１３】
本発明における一般式（１１）で表される繰り返し単位としては、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ｎ−プロピル（メタ）アクリレート、イソプロピル（メタ）アクリレート、ｎ−ブチル（メタ）アクリレート、イソブチル（メタ）アクリレート、ｔｅｒｔ−ブチル（メタ）アクリレート、ｎ−ペンチル（メタ）アクリレート、ｎ−ヘキシル（メタ）アクリレート、ｎ−オクチル（メタ）アクリレート、ｎ−デシル（メタ）アクリレート、ｎ−ウンデシル（メタ）アクリレート、ｎ−ドデシル（メタ）アクリレート、ｎ−テトラデシル（メタ）アクリレート、ｎ−ヘキサデシル（メタ）アクリレート、ｎ−オクタデシル（メタ）アクリレート、ｎ−エイコシル（メタ）アクリレートなどの（メタ）アクリレート化合物、Ｎ−ｎ−オクチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−ｎ−デシル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−ｎ−ドデシル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−ｎ−ヘキサデシル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−ｎ−オクタデシル（メタ）アクリルアミドなどの（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ−ビニル−ｎ−オクチルアミド、Ｎ−ビニル−ｎ−デシルアミド、Ｎ−ビニル−ｎ−ドデシルアミド、Ｎ−ビニル−ｎ−ヘキサデシルアミドなどのＮ−ビニルアミド化合物から選択されるモノマーを重合して生成する繰り返し単位を例示できる。これらの中では、水中で剥離しない安定な膜を得る点で、エチル（メタ）アクリレート、ｎ−プロピル（メタ）アクリレート、ｎ−ブチル（メタ）アクリレート、ｎ−ペンチル（メタ）アクリレート、ｎ−ヘキシル（メタ）アクリレート、ｎ−ヘプチル（メタ）アクリレート、ｎ−オクチル（メタ）アクリレート、ｎ−トリデシル（メタ）アクリレートなどの（メタ）アクリレート化合物を重合して生成する繰り返し単位であることが好ましい。
【０１１４】
さらに、本発明におけるブロック（Ｃ）としては、上記以外にも、Ｎ−シクロヘキシルマレイミド、Ｎ−フェニルマレイミドなどのＮ−アルキルマレイミド化合物、フマル酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル、フマル酸ジ−ｎ−ブチルなどのフマル酸ジエステル化合物、Ｎ−ビニルイミダゾール、Ｎ−ビニルカルバゾールなどから選ばれる少なくとも１つのモノマーを含む重合体を用いることができる。
【０１１５】
本発明のブロック共重合体を構成するブロック（Ａ）、ブロック（Ｂ）およびブロック（Ｃ）の各ブロックは、直接結合していてもよいし、低分子のスペーサーを介して結合していてもよい。スペーサーの原子数は、前述の本発明の効果を損なわない限り特に制限はなく、２原子から３０原子であることが好ましい。また、スペーサーの構造も本発明の効果を損なわない限り特に制限はなく、直鎖状、分岐状、環状のいずれであってもよく、例えば、ブロック間の結合の少なくとも１つが下記一般式（１２）および一般式（１３）で表される２価の結合の内、少なくとも１種類の結合を含む２価の結合であってもよい。
【０１１６】
【化２５】
2018087316.tif 000026
【０１１７】
【化２６】
2018087316.tif 000027
【０１１８】
式中、Ｒ１は水素原子または炭素数１〜２０の炭化水素基であり、炭素数１〜２０の炭化水素基としてはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｎ−ヘキシル基、ｎ−オクチル基を例示することができるが、各ブロック間の結合が安定である点で、Ｒ１は水素原子であることが好ましい。
【０１１９】
本発明のブロック共重合体を構成するブロック（Ａ）、ブロック（Ｂ）およびブロック（Ｃ）の配列順に特に制限はなく、（Ａ）−（Ｂ）−（Ｃ）、（Ａ）−（Ｃ）−（Ｂ）、（Ｂ）−（Ａ）−（Ｃ）を例示することができる。また、本発明のブロック共重合体は、各ブロック（Ａ），（Ｂ）および（Ｃ）を２回以上含んでいてもよく、各ブロックはランダムに配列されていてもよい。例えば、（Ａ）−（Ｂ）−（Ａ）−（Ｃ）、（Ａ）−（Ｂ）−（Ｃ）−（Ａ）なども許容される。
【０１２０】
また、本発明のブロック共重合体は、ブロック共重合体を構成するブロック（Ａ）、ブロック（Ｂ）およびブロック（Ｃ）以外に他の重合体ブロック（Ｘ）を含んでいてもよく、その場合の具体的な配列順としては、（Ａ）−（Ｂ）−（Ｃ）−（Ｘ）、（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−（Ｃ）、（Ａ）−（Ｃ）−（Ｂ）−（Ｘ）、（Ａ）−（Ｃ）−（Ｘ）−（Ｂ）、（Ａ）−（Ｘ）−（Ｂ）−（Ｃ）、（Ａ）−（Ｘ）−（Ｃ）−（Ｂ）、（Ｂ）−（Ａ）−（Ｃ）−（Ｘ）、（Ｂ）−（Ａ）−（Ｘ）−（Ｃ）、（Ｂ）−（Ｃ）−（Ａ）−（Ｘ）、（Ｂ）−（Ｘ）−（Ａ）−（Ｃ）、（Ｃ）−（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）、（Ｃ）−（Ｂ）−（Ａ）−（Ｘ）を例示することができる。ここで、重合体ブロック（Ｘ）は、前述の本発明の効果を損なわない限り、本発明におけるブロック（Ａ）、ブロック（Ｂ）、ブロック（Ｃ）の何れかであってもよく、これら以外のブロック、例えば、ＬＣＳＴが５０℃を超える温度応答性ブロックや、０℃〜５０℃の範囲にＬＣＳＴを持つ、ＨＬＢ値（グリフィン法）が９以上２０以下の範囲にある親水性重合体ブロックや、０℃〜５０℃の範囲にＬＣＳＴを持つ、ＨＬＢ値（グリフィン法）が０以上９未満の範囲にある疎水性重合体ブロックであってもよい。これらの配列の中では、細胞剥離に必要な冷却時間が短縮できる点で、温度応答性重合体ブロックであるブロック（Ａ）と親水性重合体ブロックであるブロック（Ｂ）が連続していない配列、すなわち、（Ａ）−（Ｃ）−（Ｂ）、（Ａ）−（Ｃ）−（Ｂ）−（Ｘ）、（Ａ）−（Ｃ）−（Ｘ）−（Ｂ）、（Ａ）−（Ｘ）−（Ｂ）−（Ｃ）、（Ａ）−（Ｘ）−（Ｃ）−（Ｂ）、（Ｂ）−（Ｃ）−（Ａ）−（Ｘ）、（Ｂ）−（Ｘ）−（Ａ）−（Ｃ）が好ましく、（Ａ）−（Ｃ）−（Ｂ）、（Ａ）−（Ｃ）−（Ｂ）−（Ｘ）、（Ｂ）−（Ｃ）−（Ａ）−（Ｘ）であることがより好ましい。  本明細書における、「部分共重合体」との用語は、必須のブロック（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）のうちいずれか１種が欠けている共重合体をいう。例えば、（Ａ）−（Ｂ）、（Ａ）−（Ｃ）、（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）、（Ａ）−（Ｘ）−（Ｃ）などが該当する。
【０１２１】
本発明のブロック共重合体を構成するブロック（Ａ）、ブロック（Ｂ）およびブロック（Ｃ）の合計に対するブロック（Ａ）の比率は、１〜９０ｍｏｌ％であれば特に制限はないが、本発明のブロック共重合体を含む表面処理剤で基材を被覆した細胞培養基材に細胞接着性を付与すると共に、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮する点で、２５〜８５ｍｏｌ％であることが好ましく、４５〜６５ｍｏｌ％であることがより好ましい。前述の全繰り返し単位に対するブロック（Ａ）の比率が１ｍｏｌ％未満であれば細胞接着性が低下し、９０ｍｏｌ％を超えれば細胞剥離に必要な冷却時間が長くなる。
【０１２２】
本発明のブロック共重合体を構成するブロック（Ａ）、ブロック（Ｂ）およびブロック（Ｃ）の合計に対するブロック（Ｂ）の比率は、１〜９０ｍｏｌ％であれば特に制限はないが、本発明のブロック共重合体を含む表面処理剤で基材を被覆した細胞培養基材に細胞接着性を付与すると共に、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮する点で、２〜５０ｍｏｌ％であることが好ましく、５〜３０ｍｏｌ％であることがより好ましい。前述の全繰り返し単位に対するブロック（Ｂ）の比率が１ｍｏｌ％未満であれば細胞剥離に必要な冷却時間が長くなり、９０ｍｏｌ％を超えれば細胞接着性が低下する。
【０１２３】
本発明のブロック共重合体を構成するブロック（Ａ）、ブロック（Ｂ）およびブロック（Ｃ）の合計に対するブロック（Ｃ）の比率は、１〜９０ｍｏｌ％であれば特に制限はないが、本発明のブロック共重合体を含む表面処理剤で基材を被覆する場合に、基材への接着性を付与すると共に、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮する点で、１０〜７０ｍｏｌ％であることが好ましく、２０〜５０ｍｏｌ％であることがより好ましい。前述の全繰り返し単位に対するブロック（Ｃ）の比率が１ｍｏｌ％未満であれば基材への接着性が低下し、冷却時にブロック共重合体が培地中に溶出する。９０ｍｏｌ％を超えれば細胞剥離に必要な冷却時間が長くなる。
【０１２４】
本発明のブロック共重合体を構成するブロック（Ａ）、ブロック（Ｂ）およびブロック（Ｃ）の各ブロックの比率は、前述の全繰り返し単位に対する各ブロックの比率の範囲内であれば特に制限はないが、前述の細胞培養基材への細胞接着性の付与と細胞剥離に必要な冷却時間を短縮する点で、ブロック（Ａ）とブロック（Ｂ）の比率は０．５：１から５０：１の範囲にあることが好ましく、１．５：１から１５：１の範囲にあることがより好ましい。また、本発明のブロック共重合体の基材への接着性の付与と細胞剥離に必要な冷却時間を短縮する点で、ブロック（Ａ）とブロック（Ｃ）の比率は０．２５：１から１０：１の範囲にあることが好ましく、０．５：１から５：１の範囲にあることがより好ましい。さらに、前述の細胞培養基材への細胞接着性および本発明のブロック共重合体の基材への接着性の付与と、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮する点で、ブロック（Ｂ）とブロック（Ｃ）の比率は０．０１：１から５：１の範囲にあることが好ましく、０．１：１から２：１の範囲にあることがより好ましい。
【０１２５】
本発明のブロック共重合体の数平均分子量（Ｍｎ）は３，０００以上１，０００，０００以下の範囲にあり、好ましくは４，０００以上５００，０００以下、さらに好ましくは５，０００以上２００，０００以下である。３，０００未満の場合は細胞培養基材に被覆しても細胞培養中に基材から培地中に溶出してしまう。また、１，０００，０００を越える場合は溶液粘度が高くなり、細胞培養基材への被覆が困難になる。
【０１２６】
本発明のブロック共重合体は、以下の工程（１）から（３）を含む工程からなる方法により製造することができる。
【０１２７】
（１）本発明におけるブロック（Ａ）、ブロック（Ｂ）、ブロック（Ｃ）のうち、何れか１種類のブロックを製造する工程、
（２）本発明におけるブロック（Ａ）、ブロック（Ｂ）、ブロック（Ｃ）のうち、工程（１）で製造したブロックを除く１種類のブロックと、工程（１）で製造したブロックを含むブロック重合体とが結合した、部分ブロック共重合体を製造する工程、
（３）本発明におけるブロック（Ａ）、ブロック（Ｂ）、ブロック（Ｃ）のうち、工程（２）で製造した部分ブロック共重合体を含むブロック共重合体を構成しない１種類のブロックと、工程（２）で製造した部分ブロック共重合体とが結合した、ブロック共重合体を製造する工程。
【０１２８】
本発明のブロック共重合体を構成する各ブロックは、異なる種類のモノマーとのブロック共重合が行える点で、リビングカチオン重合やリビングアニオン重合やリビングラジカル重合などのリビング重合により製造されることが好ましい。これらのリビング重合の中では、重合反応の制御が容易である点でリビングラジカル重合を用いることが好ましく、例えば、株式会社エヌ・ティー・エス発行、“ラジカル重合ハンドブック”、ｐ．１６１〜２２５（２０１０）に記載のリビングラジカル重合技術を用いて製造することがより好ましい。リビングラジカル重合技術としては、原子移動ラジカル重合法（ＡＴＲＰ）、可逆的付加開裂連鎖移動重合法（ＲＡＦＴ）、ニトロキシドを介した重合法（ＮＭＰ）などを例示することができるが、これらの中では、汎用性が高く、細胞毒性を示す金属を使用しなくてもよい点でＲＡＦＴ重合により製造することが好ましい。
【０１２９】
本発明のブロック共重合体の具体的な製造方法としては、ブロック（Ａ）を生成するモノマーを重合した後、ブロック（Ｂ）を生成するモノマーを重合し、次いで、ブロック（Ｃ）を生成するモノマーを重合する方法（Ａ−Ｂ−Ｃ）、ブロック（Ａ）を生成するモノマーを重合した後、ブロック（Ｃ）を生成するモノマーを重合し、次いで、ブロック（Ｂ）を生成するモノマーを重合する方法（Ａ−Ｃ−Ｂ）、ブロック（Ｂ）を生成するモノマーを重合した後、ブロック（Ａ）を生成するモノマーを重合し、次いで、ブロック（Ｃ）を生成するモノマーを重合する方法（Ｂ−Ａ−Ｃ）、ブロック（Ｂ）を生成するモノマーを重合した後、ブロック（Ｃ）を生成するモノマーを重合し、次いで、ブロック（Ａ）を生成するモノマーを重合する方法（Ｂ−Ｃ−Ａ）、ブロック（Ｃ）を生成するモノマーを重合した後、ブロック（Ａ）を生成するモノマーを重合し、次いで、ブロック（Ｂ）を生成するモノマーを重合する方法（Ｃ−Ａ−Ｂ）、ブロック（Ｃ）を生成するモノマーを重合した後、ブロック（Ｂ）を生成するモノマーを重合し、次いで、ブロック（Ａ）を生成するモノマーを重合する方法（Ｃ−Ｂ−Ａ）を例示することができる。
【０１３０】
また、前述したとおり、本発明のブロック共重合体は、本発明のブロック共重合体を構成するブロック（Ａ）、ブロック（Ｂ）、ブロック（Ｃ）以外に他のブロック（Ｘ）を含んでいてもよく、その場合の具体的な製造方法としては、ブロック（Ａ）を生成するモノマーを重合した後、ブロック（Ｂ）を生成するモノマーを重合し、次いで、ブロック（Ｃ）を生成するモノマーを重合し、さらに、ブロック（Ｘ）を生成するモノマーを重合する方法（Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｘ）、ブロック（Ａ）を生成するモノマーを重合した後、ブロック（Ｂ）を生成するモノマーを重合し、次いで、ブロック（Ｘ）を生成するモノマーを重合し、さらに、ブロック（Ｃ）を生成するモノマーを重合する方法（Ａ−Ｂ−Ｘ−Ｃ）、ブロック（Ａ）を生成するモノマーを重合した後、ブロック（Ｃ）を生成するモノマーを重合し、次いで、ブロック（Ｂ）を生成するモノマーを重合し、さらに、ブロック（Ｘ）を生成するモノマーを重合する方法（Ａ−Ｃ−Ｂ−Ｘ）、ブロック（Ａ）を生成するモノマーを重合した後、ブロック（Ｃ）を生成するモノマーを重合し、次いで、ブロック（Ｘ）を生成するモノマーを重合し、さらに、ブロック（Ｂ）を生成するモノマーを重合する方法（Ａ−Ｃ−Ｘ−Ｂ）、ブロック（Ａ）を生成するモノマーを重合した後、ブロック（Ｘ）を生成するモノマーを重合し、次いで、ブロック（Ｂ）を生成するモノマーを重合し、さらに、ブロック（Ｃ）を生成するモノマーを重合する方法（Ａ−Ｘ−Ｂ−Ｃ）、ブロック（Ａ）を生成するモノマーを重合した後、ブロック（Ｘ）を生成するモノマーを重合し、次いで、ブロック（Ｃ）を生成するモノマーを重合し、さらに、ブロック（Ｂ）を生成するモノマーを重合する方法（Ａ−Ｘ−Ｃ−Ｂ）、ブロック（Ｂ）を生成するモノマーを重合した後、ブロック（Ａ）を生成するモノマーを重合し、次いで、ブロック（Ｃ）を生成するモノマーを重合し、さらに、ブロック（Ｘ）を生成するモノマーを重合する方法（Ｂ−Ａ−Ｃ−Ｘ）、ブロック（Ｂ）を生成するモノマーを重合した後、ブロック（Ａ）を生成するモノマーを重合し、次いで、ブロック（Ｘ）を生成するモノマーを重合し、さらに、ブロック（Ｃ）を生成するモノマーを重合する方法（Ｂ−Ａ−Ｘ−Ｃ）、ブロック（Ｂ）を生成するモノマーを重合した後、ブロック（Ｃ）を生成するモノマーを重合し、次いで、ブロック（Ａ）を生成するモノマーを重合し、さらに、ブロック（Ｘ）を生成するモノマーを重合する方法（Ｂ−Ｃ−Ａ−Ｘ）、ブロック（Ｂ）を生成するモノマーを重合した後、ブロック（Ｃ）を生成するモノマーを重合し、次いで、ブロック（Ｘ）を生成するモノマーを重合し、さらに、ブロック（Ａ）を生成するモノマーを重合する方法（Ｂ−Ｃ−Ｘ−Ａ）、ブロック（Ｂ）を生成するモノマーを重合した後、ブロック（Ｘ）を生成するモノマーを重合し、次いで、ブロック（Ａ）を生成するモノマーを重合し、さらに、ブロック（Ｃ）を生成するモノマーを重合する方法（Ｂ−Ｘ−Ａ−Ｃ）、ブロック（Ｂ）を生成するモノマーを重合した後、ブロック（Ｘ）を生成するモノマーを重合し、次いで、ブロック（Ｃ）を生成するモノマーを重合し、さらに、ブロック（Ａ）を生成するモノマーを重合する方法（Ｂ−Ｘ−Ｃ−Ａ）、ブロック（Ｃ）を生成するモノマーを重合した後、ブロック（Ａ）を生成するモノマーを重合し、次いで、ブロック（Ｂ）を生成するモノマーを重合し、未反応モノマーを除いた後、ブロック（Ｘ）を生成するモノマーを重合する方法（Ｃ−Ａ−Ｂ−Ｘ）、ブロック（Ｃ）を生成するモノマーを重合した後、ブロック（Ａ）を生成するモノマーを重合し、次いで、ブロック（Ｘ）を生成するモノマーを重合し、さらに、ブロック（Ｂ）を生成するモノマーを重合する方法（Ｃ−Ａ−Ｘ−Ｂ）、ブロック（Ｃ）を生成するモノマーを重合した後、ブロック（Ｂ）を生成するモノマーを重合し、次いで、ブロック（Ａ）を生成するモノマーを重合し、さらに、ブロック（Ｘ）を生成するモノマーを重合する方法（Ｃ−Ｂ−Ａ−Ｘ）、ブロック（Ｃ）を生成するモノマーを重合した後、ブロック（Ｂ）を生成するモノマーを重合し、次いで、ブロック（Ｘ）を生成するモノマーを重合し、さらに、ブロック（Ａ）を生成するモノマーを重合する方法（Ｃ−Ｂ−Ｘ−Ａ）、ブロック（Ｃ）を生成するモノマーを重合した後、ブロック（Ｘ）を生成するモノマーを重合し、次いで、ブロック（Ａ）を生成するモノマーを重合し、さらに、ブロック（Ｂ）を生成するモノマーを重合する方法（Ｃ−Ｘ−Ａ−Ｂ）、ブロック（Ｃ）を生成するモノマーを重合した後、ブロック（Ｘ）を生成するモノマーを重合し、次いで、ブロック（Ｂ）を生成するモノマーを重合し、さらに、ブロック（Ａ）を生成するモノマーを重合する方法（Ｃ−Ｘ−Ｂ−Ａ）、ブロック（Ｘ）を生成するモノマーを重合した後、ブロック（Ａ）を生成するモノマーを重合し、次いで、ブロック（Ｂ）を生成するモノマーを重合し、さらに、ブロック（Ｃ）を生成するモノマーを重合する方法（Ｘ−Ａ−Ｂ−Ｃ）、ブロック（Ｘ）を生成するモノマーを重合した後、ブロック（Ａ）を生成するモノマーを重合し、次いで、ブロック（Ｃ）を生成するモノマーを重合し、さらに、ブロック（Ｂ）を生成するモノマーを重合する方法（Ｘ−Ａ−Ｃ−Ｂ）、ブロック（Ｘ）を生成するモノマーを重合した後、ブロック（Ｂ）を生成するモノマーを重合し、次いで、ブロック（Ａ）を生成するモノマーを重合し、さらに、ブロック（Ｃ）を生成するモノマーを重合する方法（Ｘ−Ｂ−Ａ−Ｃ）、ブロック（Ｘ）を生成するモノマーを重合した後、ブロック（Ｂ）を生成するモノマーを重合し、次いで、ブロック（Ｃ）を生成するモノマーを重合し、さらに、ブロック（Ａ）を生成するモノマーを重合する方法（Ｘ−Ｂ−Ｃ−Ａ）、ブロック（Ｘ）を生成するモノマーを重合した後、ブロック（ＸＣを生成するモノマーを重合し、次いで、ブロック（Ａ）を生成するモノマーを重合し、さらに、ブロック（Ｂ）を生成するモノマーを重合する方法（Ｘ−Ｃ−Ａ−Ｂ）、ブロック（Ｘ）を生成するモノマーを重合した後、ブロック（Ｃ）を生成するモノマーを重合し、次いで、ブロック（Ｂ）を生成するモノマーを重合し、さらに、ブロック（Ａ）を生成するモノマーを重合する方法（Ｘ−Ｃ−Ｂ−Ａ）を例示することができる。
【０１３１】
前述の、本発明のブロック共重合体の製造における中間段階の各ブロックの製造においては、各ブロックを生成するモノマーの重合が終了した段階で、反応溶液の一部を採取して１Ｈ−ＮＭＲなどにより未反応モノマーの残量を測定し、未反応モノマーの残存量に応じて、生成した各ブロックを精製してもよく、精製せずに次のブロックを生成するモノマーの重合に使用してもよい。例えば、中間段階の各ブロックを生成するための重合が終了した段階での未反応モノマーの残存量が多く、未反応モノマーが次のブロックを生成するための重合に悪影響を与えると考えられる場合には、重合により生成したブロックを溶媒抽出や再沈殿、再結晶など、高分子の精製方法として公知の方法により精製することが好ましい。具体的には、未反応モノマー残存量が、モノマー仕込み量の２０％以上の場合、前述の方法により重合により生成したブロックを精製することが好ましい。
【０１３２】
一方、中間段階の各ブロックを生成するための重合が終了した段階での未反応モノマーの残存量が少なく、次のブロックを生成するための重合に悪影響を与えないと考えられる場合には、重合により生成したブロックを精製せずに、次のブロックを生成するモノマーの重合に使用してもよい。具体的には、未反応モノマー残存量が、モノマー仕込み量の２０％未満、好ましくは１５％未満の場合、重合により生成したブロックを精製せずに、次のブロックを生成するモノマーの重合に使用してもよい。
【０１３３】
目的とする本発明のブロック共重合体の製造を終えた段階では、残存する未反応モノマーを除くため、前述の溶媒抽出や再沈殿、再結晶など、高分子の精製方法として公知の方法により、本発明のブロック共重合体を精製することが好ましい。
【０１３４】
さらに、本発明のブロック共重合体の製造方法としては、例えば、Ａ．  Ｍｉｃｈａｅｌ，  Ｊ．  Ｐｒａｋｔ．  Ｃｈｅｍ．  ４８，  ９４（１８９３）、Ｒ．  Ｈｕｉｓｇｅｎ，  ｉｎ  １，３−Ｄｉｐｏｌａｒ  Ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉ−ｏｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ｅｄ．  ｂｙ  Ａ．  Ｐａｄｗａ，  Ｗｉｌｅｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｖｏｌ．  １，  １−１７６（１９８４）、Ｃ．  Ｗ．  Ｔｏｒｎｏｅ，  Ｃ．  Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，  Ｍ．  Ｍｅｌｄａｌ，  Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．  ６７，  ３０５７−３０６２、Ｖ．  Ｖ．  Ｒｏｓｔｏｖｔｓｅｖ，  Ｌ．  Ｇ．  Ｇｒｅｅｎ，  Ｖ．  Ｖ．  Ｆｏｋｉｎ，  Ｋ．  Ｂ．  Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ，  Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．，  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  ４１，  ２５９６−２５９９（２００２）に記載の、クリック反応を用いることもできる。
【０１３５】
クリック反応を用いた本発明のブロック共重合体の具体的な製造方法としては、例えば、前述のＲＡＦＴ重合によりブロック共重合体を製造する場合、ブロック（Ｂ）を生成するモノマーを重合して末端にアルキニル基（またはアジド基）を有するブロック（Ｂ）を合成し、さらにブロック（Ａ）を生成するモノマーを重合して、ブロック（Ｂ）側の末端にアルキニル基（またはアジド基）を有する部分ブロック体を合成した後、末端にアジド基（またはアルキニル基）を有するブロック（Ｃ）を反応させる方法（（Ａ−Ｂ）＋Ｃ）、ブロック（Ｂ）を生成するモノマーを重合して末端にアルキニル基（またはアジド基）を有するブロック（Ｂ）を合成し、さらにブロック（Ｃ）を生成するモノマーを重合して、ブロック（Ｂ）側の末端にアルキニル基（またはアジド基）を有する部分ブロック体を合成した後、末端にアジド基（またはアルキニル基）を有するブロック（Ａ）を反応させる方法（Ａ＋（Ｂ−Ｃ））、ブロック（Ｃ）を生成するモノマーを重合して末端にアルキニル基（またはアジド基）を有するブロック（Ｃ）を合成し、さらにブロック（Ａ）を生成するモノマーを重合して、ブロック（Ｃ）側の末端にアルキニル基（またはアジド基）を有する部分ブロック体を合成した後、末端にアジド基（またはアルキニル基）を有するブロック（Ｂ）を反応させる方法（（Ａ−Ｃ）＋Ｂ）、ブロック（Ｃ）を生成するモノマーを重合して末端にアルキニル基（またはアジド基）を有するブロック（Ｃ）を合成し、さらにブロック（Ｂ）を生成するモノマーを重合して、ブロック（Ｃ）側の末端にアルキニル基（またはアジド基）を有する部分ブロック体を合成した後、末端にアジド基（またはアルキニル基）を有するブロック（Ａ）を反応させる方法（Ａ＋（Ｃ−Ｂ））、ブロック（Ａ）を生成するモノマーを重合して末端にアルキニル基（またはアジド基）を有するブロック（Ａ）を合成し、さらにブロック（Ｂ）を生成するモノマーを重合して、ブロック（Ａ）側の末端にアルキニル基（またはアジド基）を有する部分ブロック体を合成した後、末端にアジド基（またはアルキニル基）を有するブロック（Ｃ）を反応させる方法（（Ｂ−Ａ）＋Ｃ）、ブロック（Ａ）を生成するモノマーを重合して末端にアルキニル基（またはアジド基）を有するブロック（Ａ）を合成し、さらにブロック（Ｃ）を生成するモノマーを重合して、ブロック（Ａ）側の末端にアルキニル基（またはアジド基）を有する部分ブロック体を合成した後、末端にアジド基（またはアルキニル基）を有するブロック（Ｂ）を反応させる方法（Ｂ＋（Ａ−Ｃ））、ブロック（Ｃ）を生成するモノマーを重合して末端にアルキニル基（またはアジド基）を有するブロック（Ｃ）を合成し、さらにブロック（Ｂ）を生成するモノマーを重合して、ブロック（Ｃ）側の末端にアルキニル基（またはアジド基）を有する部分ブロック体を合成した後、末端にアジド基（またはアルキニル基）を有するブロック（Ａ）を反応させる方法（（Ｂ−Ｃ）＋Ａ）、ブロック（Ｃ）を生成するモノマーを重合して末端にアルキニル基（またはアジド基）を有するブロック（Ｃ）を合成し、さらにブロック（Ａ）を生成するモノマーを重合して、ブロック（Ｃ）側の末端にアルキニル基（またはアジド基）を有する部分ブロック体を合成した後、末端にアジド基（またはアルキニル基）を有するブロック（Ｂ）を反応させる方法（Ｂ＋（Ｃ−Ａ））、ブロック（Ａ）を生成するモノマーを重合して末端にアルキニル基（またはアジド基）を有するブロック（Ａ）を合成し、さらにブロック（Ｃ）を生成するモノマーを重合して、ブロック（Ａ）側の末端にアルキニル基（またはアジド基）を有する部分ブロック体を合成した後、末端にアジド基（またはアルキニル基）を有するブロック（Ｂ）を反応させる方法（（Ｃ−Ａ）＋Ｂ）、ブロック（Ａ）を生成するモノマーを重合して末端にアルキニル基（またはアジド基）を有するブロック（Ａ）を合成し、さらにブロック（Ｂ）を生成するモノマーを重合して、ブロック（Ａ）側の末端にアルキニル基（またはアジド基）を有する部分ブロック体を合成した後、末端にアジド基（またはアルキニル基）を有するブロック（Ｃ）を反応させる方法（Ｃ＋（Ａ−Ｂ））、ブロック（Ｂ）を生成するモノマーを重合して末端にアルキニル基（またはアジド基）を有するブロック（Ｂ）を合成し、さらにブロック（Ｃ）を生成するモノマーを重合して、ブロック（Ｂ）側の末端にアルキニル基（またはアジド基）を有する部分ブロック体を合成した後、末端にアジド基（またはアルキニル基）を有するブロック（Ａ）を反応させる方法（（Ｃ−Ｂ）＋Ａ）、ブロック（Ｂ）を生成するモノマーを重合して末端にアルキニル基（またはアジド基）を有するブロック（Ｂ）を合成し、さらにブロック（Ａ）を生成するモノマーを重合して、ブロック（Ｂ）側の末端にアルキニル基（またはアジド基）を有する部分ブロック体を合成した後、末端にアジド基（またはアルキニル基）を有するブロック（Ｃ）を反応させる方法（Ｃ＋（Ｂ−Ａ））などを例示することができる。
【０１３６】
前述のクリック反応を用いた本発明のブロック共重合体の製造においては、モノマーの重合により生成したブロックを用い、クリック反応により本発明のブロック共重合体を製造することから、クリック反応時の副反応を抑制する点で、各ブロックを生成するモノマーの重合が終了した段階で、生成した各ブロックを精製することが好ましい。
【０１３７】
また、前述のクリック反応を用いて本発明のブロック共重合体を製造した場合には、本発明のブロック共重合体中の各ブロック間の少なくとも一つに、前述の一般式（１）または（２）に示した２価の結合が導入される。
【０１３８】
２．表面処理剤
本発明の基材用表面処理剤は、本発明のブロック共重合体を含むものである。本発明の表面処理剤の用途に特に制限はないが、好ましくは、シャーレ、マルチウェルプレート、フラスコ、マイクロキャリアなどの細胞培養基材用の表面処理剤である。
【０１３９】
本発明の表面処理剤は、基材に塗布するだけで表面処理を行うことができるものである。本発明の表面処理剤は、本発明のブロック共重合体以外に、本発明のブロック共重合体を溶解することができる溶媒を含むものであってもよい。本発明のブロック共重合体を溶解できる溶剤に特に制限はないが、基材に塗布した際に基材を溶解することがなく、さらに、基材に塗布後に蒸発して残留しない点で、水や炭素数１〜３のアルコール系溶媒が好ましく、残留しても培養細胞に及ぼす影響が小さい点で、エタノール、または、水とエタノールの混合溶媒が特に好ましい。本発明の表面処理剤は、通常、溶液状のものであるが、上記の溶媒で溶解可能な粉末状であってもよい。
【０１４０】
本発明の表面処理剤の対象基材に特に制限はないが、前記ブロック共重合体は疎水性相互作用で基材に接着することから、好ましくは各種疎水性ポリマー材料が用いられる。疎水性ポリマー材料としては、例えば、ポリメタクリル酸メチル等のアクリル系ポリマー、ポリジメチルシロキサン等の各種シリコーンゴム、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート等が挙げられる。また、金属基材、セラミックス基材あるいはガラス基材にシランカップリング剤で表面処理したものも用いることができる。
【０１４１】
また、基材の形状は、特に制限はないが、例えば、板状、ビーズ状および繊維状の形状のほか、板状の基材に設けられた穴や溝や突起なども挙げられる。本発明の表面処理剤を基材に塗布する方法としては、例えば、はけ塗り、ディップコーティング、スピンコーティング、バーコーティング、流し塗り、スプレー塗装、ロール塗装、エアーナイフコーティング、ブレードコーティングなど通常知られている各種の方法を用いることが可能である。
【０１４２】
３．膜
本発明の膜は、本発明の表面処理剤を各種基材に塗布した後、乾燥することによって得られる膜である。本発明のブロック共重合体中にブロック（Ｃ）を含むことで細胞培養基材に対して接着性を有するとともに、本発明のブロック共重合体中にブロック（Ａ）を含むことで、細胞培養温度である３７℃以上では膜表面は疎水性を示すことによりタンパク質などの付着を可能とし、細胞の接着培養が可能となる。さらに、細胞培養後に、温度降下させることで、膜表面が親水性に変化し、細胞剥離を促すことができ、本発明のブロック共重合体中にブロック（Ｂ）を含むことで、剥離に必要な冷却時間を短縮することが可能になる。
【０１４３】
本発明の膜の厚さは１ｎｍ以上１０μｍ以下であり、好ましくは１０ｎｍ以上５μｍ以下であり、より好ましくは３０ｎｍ以上５００ｎｍ以下であり、さらに好ましくは５０ｎｍ以上２００ｎｍ以下である。１ｎｍ未満の場合は細胞培養基材に被覆した時に細胞剥離に必要な冷却時間が長くなってしまう。１０μｍを越える場合は細胞培養基材に被覆した時に細胞の接着性が低下する。
【０１４４】
４．細胞培養用基材および細胞培養基材を用いた細胞培養方法
本発明の細胞培養用基材は、本発明の膜で基材表面を被覆した細胞培養用基材である。本発明の細胞培養基材による細胞培養は、培養基材の表面に被覆されたブロック共重合体のＬＣＳＴよりも高い温度で行われるが、ヒト由来細胞を用いる場合は、高い培養効率を得ることを目的にヒトの体温付近で行うことが好ましく、３５〜３９℃の温度範囲で行うことがより好ましく、３６〜３８℃の温度範囲で行うことがさらに好ましい。その他の培養条件は特に制限されず、当分野において通常行われる条件下で培養を行ってよい。例えば、培地としては、ウシ胎児血清等の血清が添加されているものでもよいし、無血清培地でもよい。
【０１４５】
培養後、増殖した細胞を細胞培養基材から剥離するには、周囲の温度を本発明のブロック共重合体を構成するブロック（Ａ）のＬＣＳＴよりも低い温度、好ましくはＬＣＳＴより１０℃低い温度以下に変化させるだけでよい。ＬＣＳＴ以下に冷却することによる細胞培養基材からの細胞剥離は、細胞を培養していた培養液中においても、その他の培地或いはリン酸緩衝液中においても可能であり、目的に応じて選択することができる。その際、増殖細胞を効果的にかつ容易に剥離させるため、細胞培養基材を軽くたたいたり、揺らしたり、更にはピペット等を使用して培地を撹拌するなどしてもよい。
【０１４６】
本発明の細胞培養基材を用いることによって、好ましくは培養した細胞が冷却のみで最大径５μｍ〜３００μｍの大きさで剥離することができる。さらに好ましくは冷却のみで単一細胞の形状で剥離することができる。剥離細胞の大きさ、形状は、ブロック共重合体の組成および分子量、細胞培養基材の構造、細胞培養基材の製造方法、細胞培養方法、培養される細胞の種類を選択することによって調整できる。例えば、ブロック共重合体の中のブロック（Ｂ）の比率を上げること、細胞培養基材の製造方法によってブロック共重合体の厚さを増加させること、培養基材表面の凹凸を増加させることによって、細胞凝集塊の大きさを小さくでき、さらに単一細胞で剥離することができる。
【０１４７】
本発明の細胞培養基材を用いて培養される細胞としては、温度降下による刺激付与前の細胞培養基材の表面に接着可能なものであれば特に制限されるものではない。例えば、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞、ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞、ヒト肺由来繊維芽細胞、ヒト皮膚繊維芽細胞、チャイニーズハムスター卵巣由来ＣＨＯ細胞、マウス結合組織Ｌ９２９細胞、ヒト胎児腎臓由来細胞ＨＥＫ２９３細胞、ヒト子宮頸癌由来ＨｅＬａ細胞等の種々の培養細胞株に加え、例えば生体内の各組織、臓器を構成する上皮細胞や内皮細胞、収縮性を示す骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、神経系を構成するニューロン細胞、グリア細胞、繊維芽細胞、生体の代謝に関与する肝実質細胞、肝非実質細胞や脂肪細胞、分化能を有する細胞として、種々の組織に存在する幹細胞、さらにはそれらから分化誘導した細胞等を用いることができる。これら以外でも、血液、リンパ液、髄液、喀痰、尿又は便に含まれる細胞（生細胞）や、体内あるいは環境中に存在する微生物、ウイルス、原虫等を例示できる。
【実施例】
【０１４８】
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明はこれら実施例により何ら制限されるものではない。なお、断りのない限り、試薬は市販品を用いた。
【０１４９】
＜ブロック共重合体の組成＞  
核磁気共鳴測定装置（日本電子製、商品名ＪＮＭ−ＥＣＺ４００Ｓ／Ｌ１）を用いたプロトン核磁気共鳴分光（１Ｈ−ＮＭＲ）スペクトル分析より求めた。
【０１５０】
＜ブロック共重合体の分子量、分子量分布＞
重量平均分子量（Ｍｗ）、数平均分子量（Ｍｎ）および分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）は、ゲル・パーミエーション・クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって測定した。ＧＰＣ装置は東ソー（株）製  ＨＬＣ−８３２０ＧＰＣを用い、カラムは東ソー製  ＴＳＫｇｅｌ  Ｓｕｐｅｒ  ＡＷＭ−Ｈを２本用い、カラム温度を４０℃に設定し、溶離液は１０ｍＭトリフルオロ酢酸ナトリウムを含む１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノールまたは１０ｍＭ臭化リチウムを含むＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを用いて測定した。測定試料は１．０ｍｇ／ｍＬで調製して測定した。分子量の検量線は、分子量既知のポリメタクリル酸メチル（ポリマーラボラトリーズ製）を用いた。
【０１５１】
＜基材表面の対水接触角＞
水中、４０℃および２０℃での気泡接触角（θ）（°）を測定し、４０℃および２０℃の対水接触角（１８０−θ）（°）を算出した。θは協和界面科学（株）製接触角計ＤＭ３００を用いて、水中、３μＬの気泡の接触角を測定した。４０℃および２０℃の対水接触角の差が大きいほど、温度応答性、即ち温度変化により細胞を剥離させる能力が高いといえる。
【０１５２】
実施例１
［重合体ブロック（Ｂ）の合成］
試験管に２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン１．５０ｇ（５．１ｍｍｏｌ）、ＲＡＦＴ剤として４−シアノ−４−［（ドデシルスルフォニルチオカルボニル）スルフォニル］ペンタノイックアシッド２５．３ｍｇ（６３μｍｏｌ）、開始剤としてアゾビスイソブチロニトリル１ｍｇ（６μｍｏｌ）を加え、１，４−ジオキサン／エタノール＝１：１混合溶液１０．２ｍＬに溶解した。窒素バブリングを３０分行った後、６５℃で１８時間反応させた。反応後、反応溶液をアセトン：メタノール＝２０：１混合溶液２００ｍＬに注ぎ込み、析出した黄色固体をろ過し、１日減圧乾燥し、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンの重合体（重合体ブロック（Ｂ））を得た。２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン重合体ブロック（Ｂ）の繰り返し単位の親水部式量は炭素５個、水素８個、窒素１個、酸素６個、リン１個の合計（２０９．１）であり、繰り返し単位総式量は２９５．３であり、ＨＬＢ値（グリフィン法）は１４であった。
［部分ブロック共重合体の合成］
試験管に上記重合体ブロック（Ｂ）１．５０ｇ、ｎ−ブチルメタクリレート１．７１ｇ（１２．０ｍｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル２ｍｇ（１３μｍｏｌ）を加え、１，４−ジオキサン／エタノール＝１：１混合溶液１２ｍＬに溶解した。窒素バブリングを３０分行った後、６５℃で２４時間反応させた。反応後、反応溶液をヘキサン３００ｍＬに注ぎ込み、析出した淡黄色固体をろ過し、１日減圧乾燥して、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン重合体ブロック（Ｂ）とｎ−ブチルメタクリレート重合体ブロック（Ｃ）からなる部分ブロック共重合体を得た。ｎ−ブチルメタクリレート重合体ブロック（Ｃ）の繰り返し単位の親水部式量は炭素１個、酸素２個の合計（４４．０）であり、繰り返し単位総式量は１４２．２であり、ＨＬＢ値（グリフィン法）は６であった。
［ブロック共重合体の合成］
試験管に上記部分ブロック共重合体０．７５ｇ、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド０．９３ｇ（８．２ｍｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル０．３ｍｇ（２μｍｏｌ）を加え、１，４−ジオキサン／エタノール＝１：１混合溶液８．２ｍＬに溶解した。窒素バブリングを３０分行った後、６５℃で２４時間反応させた。反応後、反応溶液をヘキサン２００ｍＬに注ぎ込み、析出した白色固体をろ過し、１日減圧乾燥して、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン重合体ブロック（Ｂ）とｎ−ブチルメタクリレート重合体ブロック（Ｃ）とＮ−イソプロピルアクリルアミド重合体ブロック（Ａ）からなるブロック共重合体を得た。得られたブロック共重合体の組成、ＭｎおよびＭｗ／Ｍｎを表１に示す。
［表面処理剤の調製］
上記ブロック共重合体０．０１ｇをエタノール４．９９ｇに溶解し、ブロック共重合体の０．２ｗｔ％エタノール溶液を作製した。さらに、０．２ｗｔ％エタノール溶液１ｍＬとエタノール９ｍＬを混合し、０．０２ｗｔ％の表面処理剤を調製した。
［膜評価］
コーニング社製細胞培養用ポリスチレン製６ウェルプレートの各ウェルに、得られた表面処理剤を０．２ｍＬずつ加え、室温で乾燥した。さらに、減圧乾燥を６時間行い、表面に２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン重合体ブロック（Ｂ）とｎ−ブチルメタクリレート重合体ブロック（Ｃ）とＮ−イソプロピルアクリルアミド重合体ブロック（Ａ）からなるブロック共重合体からなる膜が導入された細胞培養基材を調製した。膜の厚さは５０ｎｍであった。４０℃および２０℃での対水接触角を表１に示す。２０℃での対水接触角は４０℃での対水接触角よりも低く、４０°未満であり、高い親水性を示した。
［細胞培養評価および剥離評価］
上記にて製造した、表面に２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン重合体ブロック（Ｂ）とｎ−ブチルメタクリレート重合体ブロック（Ｃ）とＮ−イソプロピルアクリルアミド重合体ブロック（Ａ）からなるブロック共重合体からなる膜が導入された細胞培養基材を用い、マウス結合組織Ｌ９２９細胞（１００個／ｍｍ２）を、３７℃、ＣＯ２濃度５％で培養した。培養液は１０ｖｏｌ％ウシ胎児血清を含むダルベッコ・フォークト変法イーグル最小必須培地（１０ｖｏｌ％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ）を用いた。細胞増殖が確認され、培養細胞が基材の１００％を覆うまで培養したところで、１０×１０倍の顕微鏡で細胞数を確認した。基材を１０℃に冷却後、アスピレーターで剥離した細胞を除去し、再度１０×１０倍の顕微鏡で細胞数を確認した。１５分冷却することで細胞は１００％剥離した。
【０１５３】
参考例１
［表面処理剤の合成］
実施例１［部分ブロック共重合体の合成］で合成した２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン重合体ブロック（Ｂ）とｎ−ブチルメタクリレート重合体ブロック（Ｃ）からなる部分ブロック共重合体をブロック共重合体の代わりに用いたこと以外は実施例１［表面処理剤の調製］と同様の方法で合成を行い、０．０２ｗｔ％の表面処理剤を調製した。
［膜評価］
上記表面処理剤を用いたこと以外は実施例１［膜評価］に記載の方法と同様の方法で細胞培養基材の調製を行い、表面に２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン重合体ブロック（Ｂ）とｎ−ブチルメタクリレート重合体ブロック（Ｃ）からなる部分ブロック共重合体からなる膜が導入された細胞培養基材を調製した。膜の厚さは５０ｎｍであった。４０℃および２０℃で対水接触角評価したが、同等の接触角（１５°）で、何れも高い親水性を示し、温度応答性を示さなかった。
［細胞培養評価］
上記にて製造した表面に２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン重合体ブロック（Ｂ）とｎ−ブチルメタクリレート重合体ブロック（Ｃ）からなる部分ブロック共重合体が導入された細胞培養基材を用いたこと以外は、実施例１［細胞培養評価および剥離評価］と同様の細胞培養評価を５日間行ったが、細胞は基材に接着せず、増殖は確認できなかった。
【０１５４】
実施例２
［細胞培養評価および剥離評価］
実施例１［膜評価］で製造した、表面に２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン重合体ブロック（Ｂ）とｎ−ブチルメタクリレート重合体ブロック（Ｃ）とＮ−イソプロピルアクリルアミド重合体ブロック（Ａ）からなるブロック共重合体からなる膜が導入された細胞培養基材を用い、マウス結合組織Ｌ９２９細胞（１００個／ｍｍ２）の代わりにチャイニーズハムスター卵巣由来ＣＨＯ細胞（１００個／ｍｍ２）を用い、培養液として１０ｖｏｌ％ＦＢＳ／ＤＭＥＭの代わりに１０ｖｏｌ％ＦＢＳ／Ｈａｍ‘ｓ  Ｆ―１２を用いたこと以外は、実施例１［細胞培養評価および剥離評価］と同様の評価を行い、細胞増殖が確認された。また、培養細胞が基材の１００％を覆うまで培養した後、基材を１０℃に冷却することによって、１５分で細胞は７０％剥離した。
【０１５５】
参考例２
［細胞培養評価］
参考例１［膜評価］で製造した、表面に２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン重合体ブロック（Ｂ）とｎ−ブチルメタクリレート重合体ブロック（Ｃ）からなる部分ブロック共重合体からなる膜が導入された細胞培養基材を用い、マウス結合組織Ｌ９２９細胞（１００個／ｍｍ２）の代わりにチャイニーズハムスター卵巣由来ＣＨＯ細胞（１００個／ｍｍ２）を用い、培養液として１０ｖｏｌ％ＦＢＳ／ＤＭＥＭの代わりに１０ｖｏｌ％ＦＢＳ／Ｈａｍ‘ｓ  Ｆ―１２を用いたこと以外は、実施例１［細胞培養評価および剥離評価］と同様の細胞培養評価を５日間行ったが、細胞は基材に接着せず、増殖は確認できなかった。
【０１５６】
実施例３
［重合体ブロック（Ｂ）の合成］
４−シアノ−４−［（ドデシルスルフォニルチオカルボニル）スルフォニル］ペンタノイックアシッドを４３ｍｇ（１０６μｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル１．７ｍｇ（１０μｍｏｌ）を用い、１４時間反応させたこと以外は、実施例１［重合体ブロック（Ｂ）の合成］と同じ方法で合成を行い、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンの重合体（重合体ブロック（Ｂ））を得た。
［部分ブロック共重合体の合成］
上記重合体ブロック（Ｂ）１．０ｇ、ｎ−ブチルメタクリレート２．４０ｇ（１６．９ｍｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル２．５ｍｇ（１５μｍｏｌ）、１，４−ジオキサン／エタノール＝１：１混合溶液１７ｍＬを用い、３０時間反応させたこと以外は、実施例１［部分ブロック共重合体の合成］と同じ方法で合成を行い、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン重合体ブロック（Ｂ）とｎ−ブチルメタクリレート重合体ブロック（Ｃ）からなる部分ブロック共重合体を得た。
［ブロック共重合体の合成］
上記重合体部分ブロック０．５０ｇ、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド０．６２ｇ（５．５ｍｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル０．２ｍｇ（１μｍｏｌ）、１，４−ジオキサン／エタノール＝１：１混合溶液５．５ｍＬを用いたこと以外は、実施例１［ブロック共重合体の合成］と同じ方法で合成を行い、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン重合体ブロック（Ｂ）とｎ−ブチルメタクリレート重合体ブロック（Ｃ）とＮ−イソプロピルアクリルアミド重合体ブロック（Ａ）からなるブロック共重合体を得た。得られたブロック共重合体の組成、ＭｎおよびＭｗ／Ｍｎを表１に示す。
［表面処理剤の調製］
上記ブロック共重合体を用いたこと以外は実施例１［表面処理剤の合成］と同様の方法で調製を行い、表面処理剤を調製した。
［膜評価］
上記表面処理剤を用いたこと以外は実施例１［膜評価］に記載の方法と同様の方法で細胞培養基材の調製を行い、表面に２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン重合体ブロック（Ｂ）とｎ−ブチルメタクリレート重合体ブロック（Ｃ）とＮ−イソプロピルアクリルアミド重合体ブロック（Ａ）からなるブロック共重合体からなる膜が導入された細胞培養基材を調製した。膜の厚さは１００ｎｍであった。４０℃および２０℃での対水接触角を表１に示す。２０℃での対水接触角は４０℃での対水接触角よりも低く、４０°未満であり、高い親水性を示した。
［細胞培養評価および剥離評価］
上記にて製造した表面に２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン重合体ブロック（Ｂ）とｎ−ブチルメタクリレート重合体ブロック（Ｃ）とＮ−イソプロピルアクリルアミド重合体ブロック（Ａ）からなるブロック共重合体が導入された細胞培養基材を用いたこと以外は、実施例１［細胞培養評価および剥離評価］と同様の評価を行い、細胞増殖が確認された。また、培養細胞が基材の１００％を覆うまで培養した後、基材を１０℃に冷却することによって、１５分で細胞は１００％剥離した。
【０１５７】
参考例３
［表面処理剤の合成］
実施例３［部分ブロック共重合体の合成］で合成した２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン重合体ブロック（Ｂ）とｎ−ブチルメタクリレート重合体ブロック（Ｃ）からなる部分ブロック共重合体をブロック共重合体の代わりに用いたこと以外は実施例１［表面処理剤の調製］と同様の方法で調製を行い、０．０２ｗｔ％の表面処理剤を調製した。
［膜評価］
上記表面処理剤を用いたこと以外は実施例１［膜評価］に記載の方法と同様の方法で細胞培養基材の調製を行い、表面に２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン重合体ブロック（Ｂ）とｎ−ブチルメタクリレート重合体ブロック（Ｃ）からなる部分ブロック共重合体からなる膜が導入された細胞培養基材を調製した。膜の厚さは５０ｎｍであった。４０℃および２０℃で対水接触角評価したが、同等の接触角（２３°）で、何れも高い親水性を示し、温度応答性を示さなかった。
［細胞培養評価］
上記にて製造した表面に２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン重合体ブロック（Ｂ）とｎ−ブチルメタクリレート重合体ブロック（Ｃ）からなる部分ブロック共重合体が導入された細胞培養基材を用いたこと以外は、実施例１［細胞培養評価および剥離評価］と同様の細胞培養評価を５日間行ったが、細胞は基材に接着せず、増殖は確認できなかった。
【０１５８】
実施例４
［細胞培養評価および剥離評価］
実施例３［膜評価］で製造した表面に温度応答性膜が導入された細胞培養基材を用い、マウス結合組織Ｌ９２９細胞（１００個／ｍｍ２）の代わりにチャイニーズハムスター卵巣由来ＣＨＯ細胞（１００個／ｍｍ２）を用い、培養液として１０ｖｏｌ％ＦＢＳ／ＤＭＥＭの代わりに１０ｖｏｌ％ＦＢＳ／Ｈａｍ‘ｓ  Ｆ―１２を用いたこと以外は、実施例１［細胞培養評価および剥離評価］と同様の評価を行い、細胞増殖が確認された。また、培養細胞が基材の１００％を覆うまで培養した後、基材を１０℃に冷却することによって、１５分で細胞は７０％剥離した。
【０１５９】
参考例４
［細胞培養評価］
参考例３［膜評価］で製造した表面に２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン重合体ブロック（Ｂ）とｎ−ブチルメタクリレート重合体ブロック（Ｂ）からなる部分ブロック共重合体が導入された細胞培養基材を用い、マウス結合組織Ｌ９２９細胞（１００個／ｍｍ２）の代わりにチャイニーズハムスター卵巣由来ＣＨＯ細胞（１００個／ｍｍ２）を用い、培養液として１０ｖｏｌ％ＦＢＳ／ＤＭＥＭの代わりに１０ｖｏｌ％ＦＢＳ／Ｈａｍ‘ｓ  Ｆ―１２を用いたこと以外は、実施例１［細胞培養評価および剥離評価］と同様の細胞培養評価を５日間行ったが、細胞は基材に接着せず、増殖は確認できなかった。
【０１６０】
実施例５（クリック反応で製造）
［末端アルキニル基を有するｎ−ブチルメタクリレート重合体ブロックの合成］
三方コックを備えた２００ｍＬ試験管に、４−シアノペンタン酸ジチオベンゾエートのプロパルギルエステル体０．５７ｇ（１．８ｍｍｏｌ）、ｎ−ブチルメタクリレート１２．８０ｇ（９０ｍｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル６０ｍｇ（０．３６ｍｍｏｌ）を加え、次いで１，４−ジオキサン４５ｍＬ、エタノール４５ｍＬを加えて溶解させた。試験管を液体窒素に浸して凍結し、真空ポンプで減圧脱気を行い、室温に戻した。この操作を３回繰り返し、試験管内の溶存酸素を除去した。試験管を６５℃に昇温し、６５℃で２４時間重合した。反応終了後、反応溶媒をロータリーエバポレーターにて減圧留去し、反応液を濃縮した。濃縮液をメタノール３００ｍＬに注ぎ、底に付着した赤色油状物質を回収した。メタノール１００ｍＬで２回洗浄し、得られた油状物質を真空乾燥したところ、末端アルキニル基を有するｎ−ブチルメタクリレート重合体ブロック（Ｃ）１２．１１ｇを得た。ＧＰＣを用いて、得られたポリマーの数平均分子量（Ｍｎ）および分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）を求めたところ、Ｍｎ＝６８５０、Ｍｗ／Ｍｎ＝１．１４であった。
［末端アルキニル基を有する部分ブロック共重合体の合成］
三方コックを備えた３００ｍＬ試験管に、末端アルキニル基を有するｎ−ブチルメタクリレート重合体ブロック（Ｃ）５．９５ｇ（０．７ｍｍｏｌ）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド１５．８４ｇ（１４０ｍｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル１１．５ｍｇ（０．０７ｍｍｏｌ）を加え、次いで、１，４−ジオキサン１４０ｍＬを加えて溶解させた。試験管を液体窒素に浸して凍結し、真空ポンプで減圧脱気を行い、室温に戻した。この操作を３回繰り返し、試験管内の溶存酸素を除去した。試験管を６５℃に昇温し、６５℃で４３時間重合した。反応終了後、反応溶媒をロータリーエバポレーターにて減圧留去し、反応液を濃縮した。濃縮液をヘキサン１０００ｍＬに注ぎ、赤色沈殿物を回収した。ヘキサン５００ｍＬで２回洗浄し、得られた赤色物を真空乾燥したところ、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド重合体ブロック（Ａ）とｎ−ブチルメタクリレート重合体ブロック（Ｃ）からなる末端アルキニル基を有する部分ブロック共重合体１５．２６ｇを得た。ＧＰＣを用いて、得られたポリマーの数平均分子量（Ｍｎ）および分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）を求めたところ、Ｍｎ＝２１４００、Ｍｗ／Ｍｎ＝１．２０であった。
［末端アジド基を有する重合体ブロック（Ｂ）の合成］
三方コックを備えた２００ｍＬ試験管に、４−シアノペンタン酸ジチオベンゾエートの３−アジドプロピルエステル体０．２０ｇ（０．５７ｍｍｏｌ）、ポリエチレングリコールメタクリレート（ｉ＝４．５，  ｊ＝０，  Ｒ１６＝メチル基）（Ａｌｄｒｉｃｈ製、Ｍｎ＝３００）１２．０１ｇ（４０ｍｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル１８．８ｍｇ（０．１１ｍｍｏｌ）を加え、次いで、１，４−ジオキサン２８ｍＬを加えて溶解させた。試験管を液体窒素に浸して凍結し、真空ポンプで減圧脱気を行い、室温に戻した。この操作を３回繰り返し、試験管内の溶存酸素を除去した。試験管を６５℃に昇温し、６５℃で２．５時間重合した。反応終了後、反応溶媒をロータリーエバポレーターにて減圧留去し、反応液を濃縮した。濃縮液をヘキサン５００ｍＬに注ぎ、底に付着した赤色油状物を回収した。ヘキサン３００ｍＬで２回洗浄し、得られた赤色油状物を真空乾燥したところ、末端アジド基を有するポリエチレングリコールメタクリレート重合体ブロック（Ｂ）５．５０ｇを得た。ＧＰＣを用いて、得られたポリマーの数平均分子量（Ｍｎ）および分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）を求めたところ、Ｍｎ＝１１４００、Ｍｗ／Ｍｎ＝１．１４であった。ポリエチレングリコールメタクリレート重合体ブロック（Ｂ）の繰り返し単位中の親水部の式量は炭素１０個、水素１８個、酸素６．５個の合計（２４２．２）であり、繰り返し単位の総式量は２９８．４であり、ＨＬＢ値（グリフィン法）は１６であった。
［ブロック共重合体の合成］
三方コックを備えた５０ｍＬ試験管に、前記Ｎ−イソプロピルアクリルアミド重合体ブロック（Ａ）とｎ−ブチルメタクリレート重合体ブロック（Ｃ）からなる末端アルキニル基を有する部分ブロック共重合体０．５０ｇ、上記末端アジド基を有するポリエチレングリコールメタクリレート重合体ブロック（Ｂ）０．９４ｇを加え、窒素置換を行った。窒素バブリングを行ったＤＭＦ９ｍＬを加え溶解させた。臭化銅（Ｉ）３８ｍｇ、２，２’−ビピリジル８４ｍｇ、ＤＭＦ１ｍＬで別途調製した溶液を窒素気流下で試験管に加え、室温で４８時間反応させた。反応終了後、三方コックを取り外し、空気に触れさせて銅触媒を失活させた。反応液を活性アルミナを詰めたカラムに通して銅触媒を取り除き、その溶液をロータリーエバポレーターで濃縮した。濃縮液を純水５０ｍＬにゆっくり注ぎ、析出した固形分を遠心分離（３０００ｒｐｍ×３分）により回収した。得られた固形分をメタノール２ｍＬ溶解させ、再度純水５０ｍＬにゆっくり注ぎ、析出した固形分を遠心分離（３０００ｒｐｍ×３分）により回収した。真空乾燥により、ポリエチレングリコールメタクリレート重合体ブロック（Ｂ）とｎ−ブチルメタクリレート重合体ブロック（Ｃ）とＮ−イソプロピルアクリルアミド重合体ブロック（Ａ）からなるブロック共重合体０．２７ｇを得た。得られたブロック共重合体の組成、ＭｎおよびＭｗ／Ｍｎを表１に示す。
［表面処理剤の調製］
上記ブロック共重合体を用いたこと以外は実施例１［表面処理剤の調製］と同様の方法で調製を行い、表面処理剤を調製した。
［膜評価］
上記表面処理剤を用いたこと以外は実施例１［膜評価］に記載の方法と同様の方法で細胞培養基材の調製を行い、表面にポリエチレングリコールメタクリレート重合体ブロック（Ｂ）とｎ−ブチルメタクリレート重合体ブロック（Ｃ）とＮ−イソプロピルアクリルアミド重合体ブロック（Ａ）からなるブロック共重合体が導入された細胞培養基材を調製した。膜の厚さは９５ｎｍであった。４０℃および２０℃での対水接触角を表１に示す。２０℃での対水接触角は４０℃での対水接触角よりも低く、４０°未満であり、高い親水性を示した。
［細胞培養評価および剥離評価］
上記にて製造した表面にポリエチレングリコールメタクリレート重合体ブロック（Ｂ）とｎ−ブチルメタクリレート重合体ブロック（Ｃ）とＮ−イソプロピルアクリルアミド重合体ブロック（Ａ）からなるブロック共重合体が導入された細胞培養基材を用いたこと以外は、実施例１［細胞培養評価および剥離評価］と同様の評価を行い、細胞増殖が確認された。また、培養細胞が基材の１００％を覆うまで培養した後、基材を１０℃に冷却することによって、１５分で細胞は１００％剥離した。
【０１６１】
実施例６（クリック反応で製造）
［末端アジド基を有する重合体ブロック（Ｂ）の合成］
三方コックを備えた２００ｍＬ試験管に、４−シアノペンタン酸ジチオベンゾエートの３−アジドプロピルエステル体０．２０ｇ（０．５７ｍｍｏｌ）、２−ジメチルアミノエチルメタクリレート６．２８ｇ（４０ｍｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル１８．８ｍｇ（０．１１ｍｍｏｌ）を加え、次いで、１，４−ジオキサン２８ｍＬを加えて溶解させた。試験管を液体窒素に浸して凍結し、真空ポンプで減圧脱気を行い、室温に戻した。この操作を３回繰り返し、試験管内の溶存酸素を除去した。試験管を６５℃に昇温し、６５℃で８時間重合した。反応終了後、反応溶媒をロータリーエバポレーターにて減圧留去し、反応液を濃縮した。濃縮液をヘキサン４００ｍＬ注ぎ、底に付着した赤色油状物を回収した。ヘキサン３００ｍＬで２回洗浄し、得られた赤色油状物を真空乾燥したところ、末端アジド基を有する２−ジメチルアミノエチルメタクリレート重合体ブロック（Ｂ）３．７１ｇを得た。ＧＰＣを用いて、得られたポリマーの数平均分子量（Ｍｎ）および分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）を求めたところ、Ｍｎ＝７０００、Ｍｗ／Ｍｎ＝１．１２であった。２−ジメチルアミノエチルメタクリレート重合体ブロック（Ｂ）の繰り返し単位の親水部式量は炭素３個、水素４個、窒素１個、酸素２個の合計（８６．１）であり、繰り返し単位総式量は１５７．２であり、ＨＬＢ値（グリフィン法）は１１であった。
［ブロック共重合体の合成］
末端アジド基を有するポリエチレングリコールメタクリレート重合体ブロック（Ｂ）０．９４ｇの代わりに上記末端アジド基を有する２−ジメチルアミノエチルメタクリレート重合体ブロック（Ｂ）０．６０ｇを用いたこと以外は実施例５［ブロック共重合体の合成］と同様の方法で合成を行い、２−ジメチルアミノエチルメタクリレート重合体ブロック（Ｂ）とｎ−ブチルメタクリレート重合体ブロック（Ｃ）とＮ−イソプロピルアクリルアミド重合体ブロック（Ａ）からなるブロック共重合体０．２０ｇを得た。得られたブロック共重合体の組成、ＭｎおよびＭｗ／Ｍｎを表１に示す。
［表面処理剤の調製］
上記ブロック共重合体を用いたこと以外は実施例１［表面処理剤の調製］と同様の方法で調製を行い、表面処理剤を調製した。
［膜評価］
上記表面処理剤を用いたこと以外は実施例１［膜評価］に記載の方法と同様の方法で細胞培養基材の調製を行い、表面に２−ジメチルアミノエチルメタクリレート重合体ブロック（Ｂ）とｎ−ブチルメタクリレート重合体ブロック（Ｃ）とＮ−イソプロピルアクリルアミド重合体ブロック（Ａ）からなるブロック共重合体が導入された細胞培養基材を調製した。膜の厚さは８０ｎｍであった。４０℃および２０℃での対水接触角を表１に示す。２０℃での対水接触角は４０℃での対水接触角よりも低く、４０°未満であり、高い親水性を示した。
［細胞培養評価および剥離評価］
上記にて製造した表面に２−ジメチルアミノエチルメタクリレート重合体ブロック（Ｂ）とｎ−ブチルメタクリレート重合体ブロック（Ｃ）とＮ−イソプロピルアクリルアミド重合体ブロック（Ａ）からなるブロック共重合体が導入された細胞培養基材を用いたこと以外は、実施例１［細胞培養評価および剥離評価］と同様の評価を行い、細胞増殖が確認された。また、培養細胞が基材の１００％を覆うまで培養した後、基材を１０℃に冷却することによって、１５分で細胞は１００％剥離した。
【０１６２】
実施例７（クリック反応で製造）
［末端アジド基を有する重合体ブロック（Ｂ）の合成］
三方コックを備えた２００ｍＬ試験管に、４−シアノペンタン酸ジチオベンゾエートの３−アジドプロピルエステル体０．２０ｇ（０．５７ｍｍｏｌ）、２−メトキシエチルアクリレート５．２０ｇ（４０ｍｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル１８．８ｍｇ（０．１１ｍｍｏｌ）を加え、次いで、１，４−ジオキサン２８ｍＬを加えて溶解させた。試験管を液体窒素に浸して凍結し、真空ポンプで減圧脱気を行い、室温に戻した。この操作を３回繰り返し、試験管内の溶存酸素を除去した。試験管を６５℃に昇温し、６５℃で９時間重合した。反応終了後、反応溶媒をロータリーエバポレーターにて減圧留去し、反応液を濃縮した。濃縮液をヘキサン６００ｍＬ注ぎ、底に付着した赤色油状物を回収した。ヘキサン３００ｍＬで２回洗浄し、得られた赤色油状物を真空乾燥したところ、末端アジド基を有するメトキシエチルアクリレート重合体ブロック（Ｂ）２．４８ｇを得た。ＧＰＣを用いて、得られたポリマーの数平均分子量（Ｍｎ）および分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）を求めたところ、Ｍｎ＝８１００、Ｍｗ／Ｍｎ＝１．０９であった。２−メトキシエチルアクリレート重合体ブロック（Ｂ）の繰り返し単位の親水部式量は炭素３個、水素４個、酸素３個の合計（８８．１）であり、繰り返し単位総式量は１３０．１であり、ＨＬＢ値（グリフィン法）は１４であった。
［ブロック共重合体の合成］
末端アジド基を有するポリエチレングリコールメタクリレート重合体ブロック（Ｂ）０．９４ｇの代わりに上記末端アジド基を有する２−メトキシエチルアクリレート重合体ブロック（Ｂ）０．６６ｇを用いたこと以外は実施例５［ブロック共重合体の合成］と同様の方法で合成を行い、２−メトキシエチルアクリレート重合体ブロック（Ｂ）とｎ−ブチルメタクリレート重合体ブロック（Ｃ）とＮ−イソプロピルアクリルアミド重合体ブロック（Ａ）からなるブロック共重合体０．２３ｇを得た。得られたブロック共重合体の組成、ＭｎおよびＭｗ／Ｍｎを表１に示す。
［表面処理剤の調製］
上記ブロック共重合体を用いたこと以外は実施例１［表面処理剤の調製］と同様の方法で調製を行い、表面処理剤を調製した。
［膜評価］
上記表面処理剤を用いたこと以外は実施例１［膜評価］に記載の方法と同様の方法で細胞培養基材の調製を行い、表面に２−メトキシエチルアクリレート重合体ブロック（Ｂ）とｎ−ブチルメタクリレート重合体ブロック（Ｃ）とＮ−イソプロピルアクリルアミド重合体ブロック（Ａ）からなるブロック共重合体が導入された細胞培養基材を調製した。膜の厚さは４８ｎｍであった。４０℃および２０℃での対水接触角を表１に示す。２０℃での対水接触角は４０℃での対水接触角よりも低く、４０°未満であり、高い親水性を示した。
［細胞培養評価および剥離評価］
上記にて製造した表面に２−メトキシエチルアクリレート重合体ブロック（Ｂ）とｎ−ブチルメタクリレート重合体ブロック（Ｃ）とＮ−イソプロピルアクリルアミド重合体ブロック（Ａ）からなるブロック共重合体が導入された細胞培養基材を用いたこと以外は、実施例１［細胞培養評価および剥離評価］と同様の評価を行い、細胞増殖が確認された。また、培養細胞が基材の１００％を覆うまで培養した後、基材を１０℃に冷却することによって、１５分で細胞は８０％剥離した。
【０１６３】
実施例８（クリック反応で製造）
［末端アルキニル基を有するスチレン重合体ブロックの合成］
三方コックを備えた２００ｍＬ試験管に、２−ブロモイソ酪酸のプロパルギルエステル体０．１０ｇ（０．４９ｍｍｏｌ）、スチレン９．３７ｇ（９０ｍｍｏｌ）、２，２‘−ビピリジル９４ｍｇ（０．６ｍｍｏｌ）、塩化銅（Ｉ）２５ｍｇ（０．２５ｍｍｏｌ）、アスコルビン酸２５ｍｇ（０．１３ｍｍｏｌ）を加え、次いで１，４−ジオキサン９０ｍＬを加えて溶解させた。試験管を液体窒素に浸して凍結し、真空ポンプで減圧脱気を行い、室温に戻した。この操作を３回繰り返し、試験管内の溶存酸素を除去した。試験管を６５℃に昇温し、６５℃で２４時間重合した。反応終了後、反応溶媒をロータリーエバポレーターにて減圧留去し、反応液を濃縮した。濃縮液をメタノール３００ｍＬに注ぎ、底に付着した油状物質を回収した。メタノール１００ｍＬで２回洗浄し、得られた油状物質を真空乾燥したところ、末端アルキニル基を有するスチレン重合体ブロック（Ｃ）を得た。ＧＰＣを用いて、得られたポリマーの数平均分子量（Ｍｎ）および分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）を求めたところ、Ｍｎ＝１９，０００、Ｍｗ／Ｍｎ＝１．１４であった。スチレン重合体ブロック（Ｃ）の繰り返し単位の親水部は存在せず、ＨＬＢ値（グリフィン法）は０であった。
［末端アルキニル基を有する部分ブロック共重合体の合成］
三方コックを備えた３００ｍＬ試験管に、末端アルキニル基を有するスチレン重合体ブロック（Ｃ）６．０ｇ、２−エトキシエチルビニルエーテル８．７ｇ（７５ｍｍｏｌ）、２，２‘−ビピリジル９４ｍｇ（０．６ｍｍｏｌ）、塩化銅（Ｉ）２５ｍｇ（０．２５ｍｍｏｌ）、アスコルビン酸２５ｍｇ（０．１３ｍｍｏｌ）を加え、次いで、イソプロピルアルコール２７ｍＬ、水６３ｍＬを加えて溶解させた。試験管を液体窒素に浸して凍結し、真空ポンプで減圧脱気を行い、室温に戻した。この操作を３回繰り返し、試験管内の溶存酸素を除去した。試験管を６５℃に昇温し、６５℃で４３時間重合した。反応終了後、反応溶媒をロータリーエバポレーターにて減圧留去し、反応液を濃縮した。濃縮液をメタノール１０００ｍＬに注ぎ、沈殿物を回収した。メタノール５００ｍＬで２回洗浄し、得られた沈殿物を真空乾燥し、２−エトキシエチルビニルエーテル重合体ブロック（Ａ）とスチレン重合体ブロック（Ｃ）からなる末端アルキニル基を有する部分ブロック共重合体を得た。ＧＰＣを用いて、得られたポリマーの数平均分子量（Ｍｎ）および分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）を求めたところ、Ｍｎ＝５５，０００、Ｍｗ／Ｍｎ＝１．２０であった。
［末端アジド基を有する重合体ブロック（Ｂ）の合成］
三方コックを備えた２００ｍＬ試験管に、４−シアノペンタン酸ジチオベンゾエートの３−アジドプロピルエステル体０．２０ｇ（０．５７ｍｍｏｌ）、ジメチル（３−メタクリロイルアミノプロピル）（３−スルホナトプロピル）アミニウム１１．１ｇ（４０ｍｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル１８．８ｍｇ（０．１１ｍｍｏｌ）を加え、次いで、１，４−ジオキサン２８ｍＬを加えて溶解させた。試験管を液体窒素に浸して凍結し、真空ポンプで減圧脱気を行い、室温に戻した。この操作を３回繰り返し、試験管内の溶存酸素を除去した。試験管を６５℃に昇温し、６５℃で９時間重合した。反応終了後、反応溶媒をロータリーエバポレーターにて減圧留去し、反応液を濃縮した。濃縮液をヘキサン６００ｍＬに注ぎ、底に付着した赤色油状物を回収した。ヘキサン３００ｍＬで２回洗浄し、得られた赤色油状物を真空乾燥したところ、末端アジド基を有するジメチル（３−メタクリロイルアミノプロピル）（３−スルホナトプロピル）アミニウム重合体ブロック（Ｂ）２．４８ｇを得た。ＧＰＣを用いて、得られたポリマーの数平均分子量（Ｍｎ）および分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）を求めたところ、Ｍｎ＝１７，３００、Ｍｗ／Ｍｎ＝１．０９であった。ジメチル（３−メタクリロイルアミノプロピル）（３−スルホナトプロピル）アミニウム重合体ブロック（Ｂ）の繰り返し単位の親水部式量は炭素３個、水素５個、窒素２個、酸素４個、硫黄１個の合計（１６５．１）であり、繰り返し単位総式量は２９２．４であり、ＨＬＢ値（グリフィン法）は１１であった。
［ブロック共重合体の合成］
三方コックを備えた５０ｍＬ試験管に、２−エトキシエチルビニルエーテル重合体ブロック（Ａ）とスチレン重合体ブロック（Ｃ）（ＨＬＢ値（グリフィン法）＝０）からなる末端アルキニル基を有する部分ブロック共重合体０．５０ｇ、上記末端アジド基を有するジメチル（３−メタクリロイルアミノプロピル）（３−スルホナトプロピル）アミニウム重合体ブロック（Ｂ）０．９４ｇを加え、窒素置換を行った。窒素バブリングを行ったＤＭＦ９ｍＬを加え溶解させた。臭化銅（Ｉ）３８ｍｇ、２，２’−ビピリジル８４ｍｇ、ＤＭＦ１ｍＬで別途調製した溶液を窒素気流下で試験管に加え、室温で４８時間反応させた。反応終了後、三方コックを取り外し、空気に触れさせて銅触媒を失活させた。反応液を活性アルミナを詰めたカラムに通して銅触媒を取り除き、その溶液をロータリーエバポレーターで濃縮した。濃縮液を純水５０ｍＬにゆっくり注ぎ、析出した固形分を遠心分離（３０００ｒｐｍ×３分）により回収した。得られた固形分をメタノール２ｍＬに溶解させ、再度純水５０ｍＬにゆっくり注ぎ、析出した固形分を遠心分離（３０００ｒｐｍ×３分）により回収した。真空乾燥により、ジメチル（３−メタクリロイルアミノプロピル）（３−スルホナトプロピル）アミニウム重合体ブロック（Ｂ）とスチレン重合体ブロック（Ｃ）と２−エトキシエチルビニルエーテル重合体ブロック（Ａ）からなるブロック共重合体０．２７ｇを得た。得られたブロック共重合体の組成、ＭｎおよびＭｗ／Ｍｎを表１に示す。
［表面処理剤の調製］
上記ブロック共重合体を用いたこと以外は実施例１［表面処理剤の調製］と同様の方法で調製を行い、表面処理剤を調製した。［膜評価］
上記表面処理剤を用いたこと以外は実施例１［膜評価］に記載の方法と同様の方法で細胞培養基材の調製を行い、表面にジメチル（３−メタクリロイルアミノプロピル）（３−スルホナトプロピル）アミニウム重合体ブロック（Ｂ）とスチレン重合体ブロック（Ｃ）と２−エトキシエチルビニルエーテル重合体ブロック（Ａ）からなるブロック共重合体が導入された細胞培養基材を調製した。膜の厚さは４５ｎｍであった。４０℃および２０℃での対水接触角を表１に示す。２０℃での対水接触角は４０℃での対水接触角よりも低く、４０°未満であり、高い親水性を示した。
［細胞培養評価および剥離評価］
上記にて製造した表面にジメチル（３−メタクリロイルアミノプロピル）（３−スルホナトプロピル）アミニウム重合体ブロック（Ｂ）とスチレン重合体ブロック（Ｃ）と２−エトキシエチルビニルエーテル重合体ブロック（Ａ）からなるブロック共重合体が導入された細胞培養基材を用いたこと以外は、実施例１［細胞培養評価および剥離評価］と同様の評価を行い、細胞増殖が確認された。また、培養細胞が基材の１００％を覆うまで培養した後、基材を１０℃に冷却することによって、１５分で細胞は７２％剥離した。
【０１６４】
実施例９（クリック反応で製造）
［末端アルキニル基を有する部分ブロック共重合体の合成］
２−エトキシエチルビニルエーテル８．７ｇ（７５ｍｍｏｌ）の代わりにメチルビニルエーテル４．４ｇ（７５ｍｍｏｌ）を用いたこと以外は、実施例８［末端アルキニル基を有する部分ブロック共重合体の合成］と同様の方法で合成を行い、メチルビニルエーテル重合体ブロック（Ａ）とスチレン重合体ブロック（Ｃ）からなる末端アルキニル基を有する部分ブロック共重合体を得た。ＧＰＣを用いて、得られたポリマーの数平均分子量（Ｍｎ）および分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）を求めたところ、Ｍｎ＝５１，０００、Ｍｗ／Ｍｎ＝１．２０であった。
［ブロック共重合体の合成］
２−エトキシエチルビニルエーテル重合体ブロック（Ａ）とスチレン重合体ブロック（Ｃ）からなる末端アルキニル基を有する部分ブロック共重合体０．５０ｇの代わりにメチルビニルエーテル重合体ブロック（Ａ）とスチレン重合体ブロック（Ｃ）からなる末端アルキニル基を有する部分ブロック共重合体０．４５ｇ、を用いたこと以外は実施例８［ブロック共重合体の合成］と同様の方法で合成を行い、ジメチル（３−メタクリロイルアミノプロピル）（３−スルホナトプロピル）アミニウム重合体ブロック（Ｂ）とスチレン重合体ブロック（Ｃ）とメチルビニルエーテル重合体ブロック（Ａ）からなるブロック共重合体０．２０ｇを得た。得られたブロック共重合体の組成、ＭｎおよびＭｗ／Ｍｎを表１に示す。
［表面処理剤の調製］
上記ブロック共重合体を用いたこと以外は実施例１［表面処理剤の調製］と同様の方法で調製を行い、表面処理剤を調製した。
［膜評価］
上記表面処理剤を用いたこと以外は実施例１［膜評価］に記載の方法と同様の方法で細胞培養基材の調製を行い、表面にジメチル（３−メタクリロイルアミノプロピル）（３−スルホナトプロピル）アミニウム重合体ブロック（Ｂ）とスチレン重合体ブロック（Ｃ）とメチルビニルエーテル重合体ブロック（Ａ）からなるブロック共重合体が導入された細胞培養基材を調製した。膜の厚さは４５ｎｍであった。４０℃および２０℃での対水接触角を表１に示す。２０℃での対水接触角は４０℃での対水接触角よりも低く、４０°未満であり、高い親水性を示した。
［細胞培養評価および剥離評価］
上記にて製造した表面にジメチル（３−メタクリロイルアミノプロピル）（３−スルホナトプロピル）アミニウム重合体ブロック（Ｂ）とスチレン重合体ブロック（Ｃ）とメチルビニルエーテル重合体ブロック（Ａ）からなるブロック共重合体が導入された細胞培養基材を用いたこと以外は、実施例１［細胞培養評価および剥離評価］と同様の評価を行い、細胞増殖が確認された。また、培養細胞が基材の１００％を覆うまで培養した後、基材を１０℃に冷却することによって、１５分で細胞は７３％剥離した。
【０１６５】
比較例１
［膜評価］
セルシード（株）製ＵｐＣｅｌｌ（Ｒ）３５ｍｍφディッシュの、４０℃および２０℃での対水接触角を表１に示す。２０℃での対水接触角は４０°よりも高く、本発明の培養基材よりも２０℃での親水性が低いことが分かった。
［細胞培養評価および剥離評価］
上述のセルシード（株）製ＵｐＣｅｌｌ（Ｒ）３５ｍｍφディッシュを用いたこと以外は、実施例１［細胞培養評価および剥離評価］と同様の評価を行い、細胞増殖が確認され、細胞増殖後の細胞剥離評価では、３分冷却することで細胞は３０％剥離した。また１５分冷却することで細胞は６５％剥離した。
【０１６６】
比較例２
［重合体ブロック（Ｃ）の合成］
１００ｍＬの２口ナス型フラスコにｎ−ブチルメタクリレート２．２４０ｇ、ＲＡＦＴ剤として４−シアノ−４−［（ドデシルスルフォニルチオカルボニル）スルフォニル］ペンタノイックアシッド０．０７３ｇ、アゾビスイソブチルニトリル０．００４ｇを加え、１，４−ジオキサン１０ｍＬに溶解した。窒素バブリングを３０分行った後、６５℃で１２時間反応させた。反応後、メタノールで再沈し、ｎ−ブチルメタクリレートの重合体ブロック（Ｃ）を得た。
［部分ブロック共重合体の合成］
１００ｍＬの２口ナス型フラスコにｎ−ブチルメタクリレートの重合体ブロック（Ｃ）１．２００ｇ、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド１．２１０ｇ、アゾビスイソブチルニトリル０．００４ｇを加え、１，４−ジオキサン／エタノール＝１：２混合溶液１５ｍＬに溶解した。窒素バブリングを３０分行った後、６５℃で１２時間反応させた。反応後、純水で再沈し、ｎ−ブチルメタクリレート重合体ブロック（Ｃ）とＮ−イソプロピルアクリルアミド重合体ブロック（Ａ）からなる部分ブロック共重合体を得た。
［表面処理剤の調製］
上記部分ブロック共重合体を用いたこと以外は実施例１［表面処理剤の調製］と同様の方法で調製を行い、表面処理剤を調製した。
［膜評価］
上記表面処理剤を用いたこと以外は実施例１［膜評価］に記載の方法と同様の方法で細胞培養基材の調製を行い、表面にｎ−ブチルメタクリレート重合体ブロック（Ｃ）とＮ−イソプロピルアクリルアミド重合体ブロック（Ａ）からなる部分ブロック共重合体が導入された細胞培養基材を調製した。膜の厚さは１００ｎｍであった。４０℃および２０℃での対水接触角を表１に示す。２０℃での対水接触角は４０°よりも高く、本発明の培養基材よりも２０℃での親水性が低いことが分かった。
［細胞培養評価および剥離評価］
上記にて製造した表面に温度応答性膜が導入された細胞培養基材を用いたこと以外は、実施例１［細胞培養評価および剥離評価］と同様の評価を行い、細胞増殖が確認され、細胞増殖後の細胞剥離評価では、３分冷却することで細胞は２４％剥離した。また１５分冷却することで細胞は６０％剥離した。
【０１６７】
比較例３
［表面処理剤の調製］
実施例５［末端アルキニル基を有する部分ブロック共重合体の合成］で合成した部分ブロック共重合体を用いたこと以外は実施例１［表面処理剤の調製］と同様の方法で調製を行い、表面処理剤を調製した。
［膜評価］
上記表面処理剤を用いたこと以外は実施例１［膜評価］に記載の方法と同様の方法で細胞培養基材の調製を行い、表面にｎ−ブチルメタクリレート重合体ブロック（Ｃ）とＮ−イソプロピルアクリルアミド重合体ブロック（Ａ）からなる部分ブロック共重合体が導入された細胞培養基材を調製した。膜の厚さは８０ｎｍであった。４０℃および２０℃での対水接触角を表１に示す。２０℃での対水接触角は４０°よりも高く、本発明の培養基材よりも２０℃での親水性が低いことが分かった。
［細胞培養評価および剥離評価］
上記にて製造した表面に温度応答性膜が導入された細胞培養基材を用いたこと以外は、実施例１［細胞培養評価および剥離評価］と同様の評価を行い、細胞増殖が確認され、細胞増殖後の細胞剥離評価では、３分冷却することで細胞は２６％剥離した。また１５分冷却することで細胞は６３％剥離した。
【０１６８】
比較例４
［膜評価］
コーニング社製細胞培養表面処理３５ｍｍφディッシュの、４０℃および２０℃での対水接触角を表１に示す。４０℃および２０℃は同等の接触角（４８°）を示し、温度応答性を示さなかった。
［細胞培養評価および剥離評価］
上述のコーニング製の細胞培養表面処理φ３５ｍｍディッシュを用いたこと以外は、実施例１［細胞培養評価および剥離評価］と同様の評価を行い、細胞増殖が確認されたが、細胞増殖後の細胞剥離評価では、１５分冷却しても細胞は全く剥離しなかった。
【０１６９】
実施例１０
［重合体ブロック（Ｂ）の合成］
三方コックを備えた１００ｍＬ試験管に２−ジメチルアミノエチルメタクリレート２．４ｇ（１６．０ｍｍｏｌ）、ＲＡＦＴ剤として４−シアノ−４−［（ドデシルスルフォニルチオカルボニル）スルフォニル］ペンタノイックアシッド１０８ｍｇ（２６７μｍｏｌ）、開始剤としてアゾビスイソブチロニトリル８．８ｍｇ（５３μｍｏｌ）を加え、１，４−ジオキサン１０ｍＬに溶解した。アルゴンバブリングを１０分行った後、６５℃で２９時間反応させた。反応後、反応溶液の一部を採取し１Ｈ−ＮＭＲを測定した結果、２−ジメチルアミノエチルメタクリレート仕込み量の９３％が重合していることを確認し、２−ジメチルアミノエチルメタクリレートの重合体（重合体ブロック（Ｂ））を合成できた。
［部分ブロック共重合体の合成］
上記で得られた反応溶液に、１，４−ジオキサン１０ｍＬ、ｎ−ブチルメタクリレート２．４ｇ（１６．９ｍｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル８．８ｍｇ（５３μｍｏｌ）を加え、アルゴンバブリングを１０分行った後、６５℃で２５時間反応させた。反応後、反応溶液の一部を採取し１Ｈ−ＮＭＲを測定した結果、ｎ−ブチルメタクリレート仕込み量の９２％が重合していることを確認し、２−ジメチルアミノエチルメタクリレート重合体ブロック（Ｂ）とｎ−ブチルメタクリレート重合体ブロック（Ｃ）からなる部分ブロック共重合体を合成できた。
［ブロック共重合体の合成］
上記で得られた反応溶液に、１，４−ジオキサン２０ｍＬ、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド４．８ｇ（４２．４ｍｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル８．８ｍｇ（５３μｍｏｌ）を加え、アルゴンバブリングを１０分行った後、６５℃で４５時間反応させた。反応後、反応溶液の一部を採取し１Ｈ−ＮＭＲを測定した結果、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド仕込み量の９９％が重合していることを確認できた。反応溶液を蒸留水３００ｍＬに注ぎ込み、析出した白色固体をろ過した。得られた白色固体をクロロホルム３００ｍＬに溶解し、得られた溶液に無水硫酸マグネシウムを５ｇ添加し、室温で３０分間撹拌した。得られた懸濁液をろ過して硫酸マグネシウムを除いた後、エバポレーターを用いて、減圧下でろ液からクロロホルムを留去し、３０ｍＬまで濃縮した。得られた濃縮溶液をヘキサン３００ｍＬに注ぎ込み、析出した白色固体をろ過した。得られた白色固体を減圧下、８０℃で、６時間乾燥し、白色パウダーとして、２−ジメチルアミノエチルメタクリレート重合体ブロック（Ｂ）とｎ−ブチルメタクリレート重合体ブロック（Ｃ）とＮ−イソプロピルアクリルアミド重合体ブロック（Ａ）からなるブロック共重合体５．８ｇを得た。得られたブロック共重合体の組成、ＭｎおよびＭｗ／Ｍｎを表２に示す。
［表面処理剤の調製］
上記ブロック共重合体１５０ｍｇをエタノール２９．８５ｇに溶解し、０．５ｗｔ％の表面処理剤を調製した。
［膜評価］
ＩＷＡＫＩ組織培養用１００ｍｍφディッシュに、得られた表面処理剤を１ｍＬずつ加え、室温で５分間放置した後、加えた表面処理剤をパスツールピペットで回収した。室温で１時間放置しディッシュ表面を乾燥させた後、さらに、７０℃に設定したオーブンで１時間加熱し、表面に２−ジメチルアミノエチルメタクリレート重合体ブロック（Ｂ）とｎ−ブチルメタクリレート重合体ブロック（Ｃ）とＮ−イソプロピルアクリルアミド重合体ブロック（Ａ）からなるブロック共重合体からなる膜が導入された細胞培養基材を調製した。膜の厚さは１０ｎｍであった。４０℃および２０℃での対水接触角を表２に示す。２０℃での対水接触角は４０℃での対水接触角よりも低く、４０°未満であり、高い親水性を示した。
［細胞培養評価および剥離評価］
上記にて調製した、表面に２−ジメチルアミノエチルメタクリレート重合体ブロック（Ｂ）とｎ−ブチルメタクリレート重合体ブロック（Ｃ）とＮ−イソプロピルアクリルアミド重合体ブロック（Ａ）からなるブロック共重合体からなる膜が導入された細胞培養基材を用い、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ロンザ社、ＰＴ−２５０１）（１００個／ｍｍ２）を、３７℃、ＣＯ２濃度５％で培養した。培地および添加因子はロンザ社ＰＴ−３００１キットを用いた。細胞増殖が確認され、培養細胞が基材の１００％を覆うまで培養したところで、１０×１０倍の顕微鏡で細胞数を確認した。基材を１０℃に冷却後、アスピレーターで剥離した細胞を除去し、再度１０×１０倍の顕微鏡で細胞数を確認した。１５分冷却することで細胞は単一細胞の形状で１００％剥離した。
【０１７０】
実施例１１
［重合体ブロック（Ｂ）の合成］
２−ジメチルアミノエチルメタクリレート１．２ｇ（７．８ｍｍｏｌ）、４−シアノ−４−［（ドデシルスルフォニルチオカルボニル）スルフォニル］ペンタノイックアシッド５０ｍｇ（１２３μｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル１．７ｍｇ（１０μｍｏｌ）を用い、２５時間反応させたこと以外は、実施例１０［重合体ブロック（Ｂ）の合成］と同様の方法で合成を行い、１Ｈ−ＮＭＲで２−ジメチルアミノエチルメタクリレート仕込み量の８６％が重合していることを確認し、２−ジメチルアミノエチルメタクリレートの重合体（重合体ブロック（Ｂ））を合成できた。
［部分ブロック共重合体の合成］
ｎ−ブチルメタクリレート３．７ｇ（２６ｍｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル１．８ｍｇ（１１μｍｏｌ）を用い、２１時間反応させこと以外は、実施例１０［部分ブロック共重合体の合成］と同様の方法で合成を行い、１Ｈ−ＮＭＲでｎ−ブチルメタクリレート仕込み量の９５％が重合していることを確認し、２−ジメチルアミノエチルメタクリレート重合体ブロック（Ｂ）とｎ−ブチルメタクリレート重合体ブロック（Ｃ）からなる部分ブロック共重合体を合成できた。
［ブロック共重合体の合成］
Ｎ−イソプロピルアクリルアミド４．９ｇ（４３ｍｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル２ｍｇ（１２μｍｏｌ）を用い、４２時間反応させたこと以外は、実施例１０［ブロック共重合体の合成］と同様の方法で合成を行い、１Ｈ−ＮＭＲでＮ−イソプロピルアクリルアミド仕込み量の５４％が重合していることを確認できた。得られた反応溶液を実施例１０［ブロック共重合体の合成］に記載の方法と同様の方法で処理し、白色パウダーとして、２−ジメチルアミノエチルメタクリレート重合体ブロック（Ｂ）とｎ−ブチルメタクリレート重合体ブロック（Ｃ）とＮ−イソプロピルアクリルアミド重合体ブロック（Ａ）からなるブロック共重合体４．４ｇを得た。得られたブロック共重合体の組成、ＭｎおよびＭｗ／Ｍｎを表２に示す。
［表面処理剤の調製］
上記ブロック共重合体を用いたこと以外は実施例１０［表面処理剤の調製］と同様の方法で調製を行い、０．５ｗｔ％の表面処理剤を調製した。
［膜評価］
上記表面処理剤を用いたこと以外は実施例１０［膜評価］に記載の方法で細胞培養基材を調製した。膜の厚さは１０ｎｍであった。４０℃および２０℃での対水接触角を表２に示す。２０℃での対水接触角は４０℃での対水接触角よりも低く、４０°未満であり、高い親水性を示した。
［細胞培養評価および剥離評価］
上記にて合成した細胞培養基材を用いたこと以外は実施例１０［細胞培養評価および剥離評価］と同様の方法で評価した。細胞増殖が確認され、培養細胞が基材の１００％を覆うまで培養したところで、１０×１０倍の顕微鏡で細胞数を確認した。基材を１０℃に冷却後、アスピレーターで剥離した細胞を除去し、再度１０×１０倍の顕微鏡で細胞数を確認した。１５分冷却することで細胞は単一細胞の形状で１００％剥離した。
【０１７１】
実施例１２
［細胞培養評価および剥離評価］
実施例１１［膜評価］で合成した、表面に２−ジメチルアミノエチルメタクリレート重合体ブロック（Ｂ）とｎ−ブチルメタクリレート重合体ブロック（Ｃ）とＮ−イソプロピルアクリルアミド重合体ブロック（Ａ）からなるブロック共重合体からなる膜が導入された細胞培養基材を用い、ヒト前駆脂肪細胞（東洋紡（株）、ＣＡ８０２ｓ０５ａ）（１００個／ｍｍ２）を、３７℃、ＣＯ２濃度５％で培養した。培地はヒト前駆脂肪細胞増殖培地（東洋紡（株）、ＣＡ８１１Ｋ５００）を用いた。細胞増殖が確認され、培養細胞が基材の１００％を覆うまで培養したところで、１０×１０倍の顕微鏡で細胞数を確認した。基材を１０℃に冷却後、アスピレーターで剥離した細胞を除去し、再度１０×１０倍の顕微鏡で細胞数を確認した。１５分冷却することで細胞はシート状で１００％剥離した。
【０１７２】
実施例１３
［重合体ブロック（Ｂ）の合成］
三方コックを備えた１００ｍＬ試験管に２−ジメチルアミノエチルメタクリレート０．２７ｇ（１．７ｍｍｏｌ）、ｎ−ブチルメタクリレート０．１６ｇ（１．１ｍｍｏｌ）、ＲＡＦＴ剤として４−シアノ−４−［（ドデシルスルフォニルチオカルボニル）スルフォニル］ペンタノイックアシッド５５ｍｇ（１３５μｍｏｌ）、開始剤としてアゾビスイソブチロニトリル４．４ｍｇ（２７μｍｏｌ）を加え、１，４−ジオキサン１５ｍＬに溶解した。アルゴンバブリングを１０分行った後、６５℃で４０時間反応させた。反応後、反応溶液の一部を採取し１Ｈ−ＮＭＲを測定した結果、２−ジメチルアミノエチルメタクリレート仕込み量の９７％、ｎ−ブチルメタクリレート仕込み量の９８％が重合していることを確認し、２−ジメチルアミノエチルメタクリレートとｎ−ブチルメタクリレートの共重合体（２−ジメチルアミノエチルメタクリレート：６０．１ｍｏｌ％、ｎ−ブチルメタクリレート３９．９ｍｏｌ％）（共重合体ブロック（Ｂ））を合成できた。得られた共重合体ブロック（Ｂ）のＨＬＢ値は９．０であった。
［部分ブロック共重合体の合成］
上記で得られた共重合体ブロック（Ｂ）の反応溶液に、１，４−ジオキサン５ｍＬ、２−ジメチルアミノエチルメタクリレート０．７５ｇ（４．８ｍｍｏｌ）、ｎ−ブチルメタクリレート２．８９ｇ（２０．３ｍｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル４．４ｍｇ（２７μｍｏｌ）を加え、アルゴンバブリングを１０分行った後、６５℃で４０時間反応させた。反応後、反応溶液の一部を採取し１Ｈ−ＮＭＲを測定した結果、２−ジメチルアミノエチルメタクリレート仕込み量の９７％、ｎ−ブチルメタクリレート仕込み量の９８％が重合していることを確認し、前記共重合体ブロック（Ｂ）に２−ジメチルアミノエチルメタクリレートとｎ−ブチルメタクリレートの共重合体（共重合体ブロック（Ｃ））（２−ジメチルアミノエチルメタクリレート：１９ｍｏｌ％、ｎ−ブチルメタクリレート８１ｍｏｌ％）が結合した部分ブロック共重合体を合成できた。得られた共重合体ブロック（Ｃ）のＨＬＢ値は７．０であった。
［ブロック共重合体の合成］
上記で得られた部分ブロック共重合体反応溶液に、１，４−ジオキサン１５ｍＬ、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド３．１ｇ（２７ｍｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル４．４ｍｇ（２７μｍｏｌ）を加え、アルゴンバブリングを１０分行った後、６５℃で７２時間反応させた。反応後、反応溶液の一部を採取し１Ｈ−ＮＭＲを測定した結果、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド仕込み量の９９％が重合していることを確認できた。反応溶液を蒸留水３００ｍＬに注ぎ込み、析出した白色固体をろ過した。得られた白色固体をクロロホルム３００ｍＬに溶解し、得られた溶液に無水硫酸マグネシウムを５ｇ添加し、室温で３０分間撹拌した。得られた懸濁液をろ過して硫酸マグネシウムを除いた後、エバポレーターを用いて、減圧下でろ液からクロロホルムを留去し、３０ｍＬまで濃縮した。得られた濃縮溶液をヘキサン３００ｍＬに注ぎ込み、析出した白色固体をろ過した。得られた白色固体を減圧下、８０℃で、６時間乾燥し、白色パウダーとして、２−ジメチルアミノエチルメタクリレートとｎ−ブチルメタクリレートの共重合体ブロック（Ｂ）と２−ジメチルアミノエチルメタクリレートとｎ−ブチルメタクリレートの共重合体ブロック（Ｃ）とＮ−イソプロピルアクリルアミド重合体ブロック（Ａ）からなるブロック共重合体３．５ｇを得た。得られたブロック共重合体の組成、ＭｎおよびＭｗ／Ｍｎを表２に示す。
［表面処理剤の調製］
上記ブロック共重合体３０ｍｇをエタノール３０ｇに溶解し、０．１ｗｔ％の表面処理剤を調製した。
［膜評価］
ＩＷＡＫＩ組織培養用１００ｍｍφディッシュに、得られた表面処理剤を２ｍＬ加え、室温で５分間放置した後、乾燥していない余分な表面処理剤をパスツールピペットで回収した。室温で１時間放置しディッシュ表面を乾燥させた後、さらに、７０℃に設定したオーブンで１時間加熱し、表面に２−ジメチルアミノエチルメタクリレートとｎ−ブチルメタクリレートの共重合体ブロック（Ｂ）と２−ジメチルアミノエチルメタクリレートとｎ−ブチルメタクリレートの共重合体ブロック（Ｃ）とＮ−イソプロピルアクリルアミド重合体ブロック（Ａ）からなるブロック共重合体からなる膜が導入された細胞培養基材を調製した。膜の厚さは１０ｎｍであった。４０℃および２０℃での対水接触角を表２に示す。２０℃での対水接触角は４０℃での対水接触角よりも低く、４０°未満であり、高い親水性を示した。
［細胞培養評価および剥離評価］
上記にて調製した、表面に２−ジメチルアミノエチルメタクリレートとｎ−ブチルメタクリレートの共重合体ブロック（Ｂ）と２−ジメチルアミノエチルメタクリレートとｎ−ブチルメタクリレートの共重合体ブロック（Ｃ）とＮ−イソプロピルアクリルアミド重合体ブロック（Ａ）からなるブロック共重合体からなる膜が導入された細胞培養基材を用い、ヒト胎児肺由来正常二倍体線維芽細胞（ＪＣＲＢ細胞バンク、ＴＩＧ−３−２０）（１００個／ｍｍ２）を、３７℃、ＣＯ２濃度５％で培養した。培養液は１０ｖｏｌ％ウシ胎児血清を含むイーグル最小必須培地（１０ｖｏｌ％ＦＢＳ／ＥＭＥＭ）を用いた。細胞増殖が確認され、培養細胞が基材の１００％を覆うまで培養したところで、１０×１０倍の顕微鏡で細胞数を確認した。基材を１０℃に冷却後、アスピレーターで剥離した細胞を除去し、再度１０×１０倍の顕微鏡で細胞数を確認した。１５分冷却することで細胞はシート状で１００％剥離した。
【０１７３】
実施例１４
［重合体ブロック（Ｂ）の合成］
２−ジメチルアミノエチルメタクリレート１．１ｇ（７．０ｍｍｏｌ）、ｎ−ブチルメタクリレート０．５８ｇ（４．１ｍｍｏｌ）を用いたこと以外は実施例１３［重合体ブロック（Ｂ）の合成］と同様の方法で合成した。反応後、反応溶液の一部を採取し１Ｈ−ＮＭＲを測定した結果、２−ジメチルアミノエチルメタクリレート仕込み量の９７％、ｎ−ブチルメタクリレート仕込み量の９８％が重合していることを確認し、２−ジメチルアミノエチルメタクリレートとｎ−ブチルメタクリレートの共重合体（２−ジメチルアミノエチルメタクリレート：６２．９ｍｏｌ％、ｎ−ブチルメタクリレート３７．１ｍｏｌ％）（共重合体ブロック（Ｂ））を合成できた。得られた重合体ブロック（Ｂ）のＨＬＢ値は９．２であった。
［部分ブロック共重合体の合成］
上記で得られた反応溶液、ｎ−ブチルメタクリレート２．３７ｇ（１６．７ｍｍｏｌ）を用い、２−ジメチルアミノエチルメタクリレートを添加しなかったこと以外は実施例１３［部分ブロック共重合体の合成］と同様の方法で合成した。反応後、反応溶液の一部を採取し１Ｈ−ＮＭＲを測定した結果、ｎ−ブチルメタクリレート仕込み量の９８％が重合していることを確認し、前記共重合体ブロック（Ｂ）にｎ−ブチルメタクリレートの重合体（重合体ブロック（Ｃ））（ｎ−ブチルメタクリレート１００ｍｏｌ％）が結合した部分ブロック共重合体を合成できた。
［ブロック共重合体の合成］
上記で得られた反応溶液を用いたこと以外は実施例１３［ブロック共重合体の合成］と同様の方法で合成した。反応後、反応溶液の一部を採取し１Ｈ−ＮＭＲを測定した結果、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド仕込み量の９９％が重合していることを確認できた。得られた反応溶液を実施例１３［ブロック共重合体の合成］と同様の方法で処理し、白色パウダーとして、２−ジメチルアミノエチルメタクリレートとｎ−ブチルメタクリレートの共重合体ブロック（Ｂ）とｎ−ブチルメタクリレート重合体ブロック（Ｃ）とＮ−イソプロピルアクリルアミド重合体ブロック（Ａ）からなるブロック共重合体３．０ｇを得た。得られたブロック共重合体の組成、ＭｎおよびＭｗ／Ｍｎを表２に示す。
［表面処理剤の調製］
上記ブロック共重合体を用いたこと以外は実施例１３［表面処理剤の調製］と同様の方法で調製を行い、０．１ｗｔ％の表面処理剤を調製した。
［膜評価］
上記表面処理剤を用いたこと以外は実施例１３［膜評価］に記載の方法で調製を行い、表面に２−ジメチルアミノエチルメタクリレートとｎ−ブチルメタクリレートの共重合体ブロック（Ｂ）とｎ−ブチルメタクリレート重合体ブロック（Ｃ）とＮ−イソプロピルアクリルアミド重合体ブロック（Ａ）からなるブロック共重合体からなる膜が導入された細胞培養基材を調製した。膜の厚さは１０ｎｍであった。４０℃および２０℃での対水接触角を表２に示す。２０℃での対水接触角は４０℃での対水接触角よりも低く、４０°未満であり、高い親水性を示した。
［細胞培養評価および剥離評価］
上記にて調製した細胞培養基材を用いたこと以外は実施例１３［細胞培養評価および剥離評価］と同様の方法で評価した。細胞増殖が確認され、培養細胞が基材の１００％を覆うまで培養したところで、１０×１０倍の顕微鏡で細胞数を確認した。基材を１０℃に冷却後、アスピレーターで剥離した細胞を除去し、再度１０×１０倍の顕微鏡で細胞数を確認した。１５分冷却することで細胞はシート状で１００％剥離した。
【０１７４】
実施例１５
［重合体ブロック（Ｂ）の合成］
三方コックを備えた１００ｍＬ試験官に２−ジメチルアミノエチルメタクリレート０．９４ｇ（６．０ｍｍｏｌ）、メチルメタクリレート０．９０ｇ（９．０ｍｍｏｌ）、ＲＡＦＴ剤として４−シアノ−４−［（ドデシルスルフォニルチオカルボニル）スルフォニル］ペンタノイックアシッド５５ｍｇ（１３５μｍｏｌ）、開始剤としてアゾビスイソブチロニトリル４．４ｍｇ（２７μｍｏｌ）を加え、１，４−ジオキサン１０ｍＬに溶解した。アルゴンバブリングを１０分行った後、６５℃で４０時間反応させた。反応後、反応溶液の一部を採取し１Ｈ−ＮＭＲを測定した結果、２−ジメチルアミノエチルメタクリレート仕込み量の９６％、メチルメタクリレート仕込み量の９７％が重合していることを確認し、２−ジメチルアミノエチルメタクリレートとメチルメタクリレートの共重合体（２−ジメチルアミノエチルメタクリレート：３９．８ｍｏｌ％、メチルメタクリレート：６０．２ｍｏｌ％）（共重合体ブロック（Ｂ））を合成できた。メチルメタクリレートが重合して生成する繰り返し単位の親水部式量は炭素１個と酸素２個の合計（４４．０）であり、繰り返し単位総式量１００．１であり、ＨＬＢ値（グリフィン法）は９であった。得られた重合体ブロック（Ｂ）のＨＬＢ値（グリフィン法）は１０であった。
［部分ブロック共重合体の合成］
上記で得られた反応溶液に、１，４−ジオキサン１０ｍＬ、ｎ−ブチルメタクリレート１．７１（１２．０ｍｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル４．４ｍｇ（２７μｍｏｌ）を加え、アルゴンバブリングを１０分行った後、６５℃で４０時間反応させた。反応後、反応溶液の一部を採取し１Ｈ−ＮＭＲを測定した結果、ｎ−ブチルメタクリレート仕込み量の９８％が重合していることを確認し、前記共重合体ブロック（Ｂ）にｎ−ブチルメタクリレート重合体（重合体ブロック（Ｃ））が結合した部分ブロック共重合体を合成できた。
［ブロック共重合体の合成］
上記で得られた反応溶液を用いたこと以外は実施例１３［ブロック共重合体の合成］と同様の方法で合成した。反応後、反応溶液の一部を採取し１Ｈ−ＮＭＲを測定した結果、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド仕込み量の９９％が重合していることを確認できた。得られた反応溶液を実施例１３［ブロック共重合体の合成］と同様の方法で処理し、白色パウダーとして、２−ジメチルアミノエチルメタクリレートとメチルメタクリレートの共重合体ブロック（Ｂ）とｎ−ブチルメタクリレート重合体ブロック（Ｃ）とＮ−イソプロピルアクリルアミド重合体ブロック（Ａ）からなるブロック共重合体３．５ｇを得た。得られたブロック共重合体の組成、ＭｎおよびＭｗ／Ｍｎを表２に示す。
［表面処理剤の調製］
上記ブロック共重合体を用いたこと以外は実施例１３［表面処理剤の調製］と同様の方法で調製を行い、０．１ｗｔ％の表面処理剤を調製した。
［膜評価］
上記表面処理剤を用いたこと以外は実施例１３［膜評価］に記載の方法で調製を行い、表面に、２−ジメチルアミノエチルメタクリレートとメチルメタクリレートの共重合体ブロック（Ｂ）とｎ−ブチルメタクリレート重合体ブロック（Ｃ）とＮ−イソプロピルアクリルアミド重合体ブロック（Ａ）からなるブロック共重合体からなる膜が導入された細胞培養基材を調製した。膜の厚さは１１ｎｍであった。４０℃および２０℃での対水接触角を表２に示す。２０℃での対水接触角は４０℃での対水接触角よりも低く、４０°未満であり、高い親水性を示した。
［細胞培養評価および剥離評価］
上記にて調製した細胞培養基材を用いたこと以外は実施例１３［細胞培養評価および剥離評価］と同様の方法で評価した。細胞増殖が確認され、培養細胞が基材の１００％を覆うまで培養したところで、１０×１０倍の顕微鏡で細胞数を確認した。１５分冷却すると細胞はシート状で１００％剥離した。
【０１７５】
実施例１６
［重合体ブロック（Ｂ）の合成］
三方コックを備えた１００ｍＬ試験官に２−メトキシエチルアクリレート０．７０ｇ（５．４ｍｍｏｌ）、ＲＡＦＴ剤として４−シアノ−４−［（ドデシルスルフォニルチオカルボニル）スルフォニル］ペンタノイックアシッド５５ｍｇ（１３５μｍｏｌ）、開始剤としてアゾビスイソブチロニトリル４．４ｍｇ（２７μｍｏｌ）を加え、１，４−ジオキサン５ｍＬに溶解した。アルゴンバブリングを１０分行った後、６５℃で４０時間反応させた。反応後、反応溶液の一部を採取し１Ｈ−ＮＭＲを測定した結果、２−メトキシエチルアクリレート仕込み量の９９％が重合していることを確認し、２−メトキシエチルアクリレートの重合体（重合体ブロック（Ｂ））を合成できた。２−メトキシエチルアクリレート重合体ブロック（Ｂ）の繰り返し単位の親水部式量は炭素３個と水素４個と酸素３個の合計（８８．１）であり、繰り返し単位総式量１３０．１であり、ＨＬＢ値（グリフィン法）は１４であった。
［部分ブロック共重合体の合成］
上記で得られた反応溶液に、１，４−ジオキサン１５ｍＬ、ｎ−ブチルメタクリレート２．７６ｇ（１９．４ｍｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル４．４ｍｇ（２７μｍｏｌ）を加え、アルゴンバブリングを１０分行った後、６５℃で４０時間反応させた。反応後、反応溶液の一部を採取し１Ｈ−ＮＭＲを測定した結果、ｎ−ブチルメタクリレート仕込み量の９８％が重合していることを確認し、前記重合体ブロック（Ｂ）にｎ−ブチルメタクリレート重合体（重合体ブロック（Ｃ））が結合した部分ブロック共重合体を合成できた。
［ブロック共重合体の合成］
上記で得られた反応溶液を用い、１，４−ジオキサン１０ｍＬ、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド３．３０ｇ（２９．２ｍｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル４．４ｍｇ（２７μｍｏｌ）を加えたこと以外は実施例１３［ブロック共重合体の合成］と同様の方法で合成した。反応後、反応溶液の一部を採取し１Ｈ−ＮＭＲを測定した結果、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド仕込み量の９９％が重合していることを確認できた。得られた反応溶液を実施例１３［ブロック共重合体の合成］と同様の方法で処理し、白色パウダーとして、２−メトキシエチルアクリレート重合体ブロック（Ｂ）とｎ−ブチルメタクリレート重合体ブロック（Ｃ）とＮ−イソプロピルアクリルアミド重合体ブロック（Ａ）からなるブロック共重合体３．５ｇを得た。得られたブロック共重合体の組成、ＭｎおよびＭｗ／Ｍｎを表２に示す。
［表面処理剤の調製］
上記ブロック共重合体を用いたこと以外は実施例１３［表面処理剤の調製］と同様の方法で調製を行い、０．１ｗｔ％の表面処理剤を調製した。
［膜評価］
上記表面処理剤を用いたこと以外は実施例１３［膜評価］に記載の方法で調製を行い、表面に、２−メトキシエチルアクリレート重合体ブロック（Ｂ）とｎ−ブチルメタクリレート重合体ブロック（Ｃ）とＮ−イソプロピルアクリルアミド重合体ブロック（Ａ）からなるブロック共重合体からなる膜が導入された細胞培養基材を調製した。膜の厚さは１１ｎｍであった。４０℃および２０℃での対水接触角を表２に示す。２０℃での対水接触角は４０℃での対水接触角よりも低く、４０°未満であり、高い親水性を示した。
［細胞培養評価および剥離評価］
上記にて調製した細胞培養基材を用いたこと以外は実施例１３［細胞培養評価および剥離評価］と同様の方法で評価した。細胞増殖が確認され、培養細胞が基材の１００％を覆うまで培養したところで、１０×１０倍の顕微鏡で細胞数を確認した。１５分冷却すると細胞はシート状で１００％剥離した。
【０１７６】
実施例１７
［重合体ブロック（Ｂ）の合成］
三方コックを備えた１００ｍＬ試験官に２−メトキシエチルアクリレート０．７０ｇ（５．４ｍｍｏｌ）、ｎ−ブチルメタクリレート１．１５ｇ（８．１ｍｍｏｌ）、ＲＡＦＴ剤として４−シアノ−４−［（ドデシルスルフォニルチオカルボニル）スルフォニル］ペンタノイックアシッド５５ｍｇ（１３５μｍｏｌ）、開始剤としてアゾビスイソブチロニトリル４．４ｍｇ（２７μｍｏｌ）を加え、１，４−ジオキサン５ｍＬに溶解した。アルゴンバブリングを１０分行った後、６５℃で４０時間反応させた。反応後、反応溶液の一部を採取し１Ｈ−ＮＭＲを測定した結果、２−メトキシエチルアクリレート仕込み量の９９％、ｎ−ブチルメタクリレート仕込み量の９８％が重合していることを確認し、２−メトキシエチルアクリレートとｎ−ブチルメタクリレートの共重合体（２−メトキシエチルアクリレート：４０．３ｍｏｌ％、ｎ−ブチルメタクリレート５９．７ｍｏｌ％）（共重合体ブロック（Ｂ））を合成できた。得られた重合体ブロック（Ｂ）のＨＬＢ値は９．１であった。
［部分ブロック共重合体の合成］
上記で得られた反応溶液に、１，４−ジオキサン１５ｍＬ、ｎ−ブチルメタクリレート１．６１ｇ（１１．３ｍｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル４．４ｍｇ（２７μｍｏｌ）を加え、アルゴンバブリングを１０分行った後、６５℃で４０時間反応させた。反応後、反応溶液の一部を採取し１Ｈ−ＮＭＲを測定した結果、ｎ−ブチルメタクリレート仕込み量の９８％が重合していることを確認し、前記共重合体ブロック（Ｂ）にｎ−ブチルメタクリレート重合体（重合体ブロック（Ｃ））が結合した部分ブロック共重合体を合成できた。
［ブロック共重合体の合成］
上記で得られた反応溶液を用いたこと以外は実施例１６［ブロック共重合体の合成］と同様の方法で合成した。反応後、反応溶液の一部を採取し１Ｈ−ＮＭＲを測定した結果、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド仕込み量の９９％が重合していることを確認できた。得られた反応溶液を実施例１３［ブロック共重合体の合成］と同様の方法で処理し、白色パウダーとして、２−メトキシエチルアクリレートとｎ−ブチルメタクリレートの共重合体ブロック（Ｂ）とｎ−ブチルメタクリレート重合体ブロック（Ｃ）とＮ−イソプロピルアクリルアミド重合体ブロック（Ａ）からなるブロック共重合体３．５ｇを得た。得られたブロック共重合体の組成、ＭｎおよびＭｗ／Ｍｎを表２に示す。
［表面処理剤の調製］
上記ブロック共重合体を用いたこと以外は実施例１３［表面処理剤の調製］と同様の方法で調製を行い、０．１ｗｔ％の表面処理剤を調製した。
［膜評価］
上記表面処理剤を用いたこと以外は実施例１３［膜評価］に記載の方法で調製を行い、表面に、２−メトキシエチルアクリレートとｎ−ブチルメタクリレートの共重合体ブロック（Ｂ）とｎ−ブチルメタクリレート重合体ブロック（Ｃ）とＮ−イソプロピルアクリルアミド重合体ブロック（Ａ）からなるブロック共重合体からなる膜が導入された細胞培養基材を調製した。膜の厚さは１１ｎｍであった。４０℃および２０℃での対水接触角を表２に示す。２０℃での対水接触角は４０℃での対水接触角よりも低く、４０°未満であり、高い親水性を示した。
［細胞培養評価および剥離評価］
上記にて調製した細胞培養基材を用いたこと以外は実施例１３［細胞培養評価および剥離評価］と同様の方法で評価した。細胞増殖が確認され、培養細胞が基材の１００％を覆うまで培養したところで、１０×１０倍の顕微鏡で細胞数を確認した。１５分冷却すると細胞はシート状で１００％剥離した。
実施例１８
［重合体ブロック（Ｃ）の合成］
三方コックを備えた１００ｍＬ試験管にｎ−ブチルメタクリレート３．７ｇ（２５．８ｍｍｏｌ）、ＲＡＦＴ剤として４−シアノ−４−［（ドデシルスルフォニルチオカルボニル）スルフォニル］ペンタノイックアシッド１０８ｍｇ（２６７μｍｏｌ）、開始剤としてアゾビスイソブチロニトリル８．８ｍｇ（５３μｍｏｌ）を加え、１，４−ジオキサン１０ｍＬに溶解した。アルゴンバブリングを１０分行った後、６５℃で３０時間反応させた。反応後、反応溶液の一部を採取し１Ｈ−ＮＭＲを測定した結果、ｎ−ブチルメタクリレート仕込み量の９５％が重合していることを確認し、ｎ−ブチルメタクリレートの重合体（重合体ブロック（Ｃ））を合成できた。
［部分ブロック共重合体の合成］
上記で得られた反応溶液に、１，４−ジオキサン１０ｍＬ、２−ジメチルアミノエチルメタクリレート２．７ｇ（１７．２ｍｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル８．８ｍｇ（５３μｍｏｌ）を加え、アルゴンバブリングを１０分行った後、６５℃で３０時間反応させた。反応後、反応溶液の一部を採取し１Ｈ−ＮＭＲを測定した結果、２−ジメチルアミノエチルメタクリレート仕込み量の９６％が重合していることを確認し、ｎ−ブチルメタクリレート重合体ブロック（Ｃ）と２−ジメチルアミノエチルメタクリレート重合体ブロック（Ｂ）からなる部分ブロック共重合体を合成できた。
［ブロック共重合体の合成］
上記で得られた反応溶液に、１，４−ジオキサン２０ｍＬ、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド４．８ｇ（４２．４ｍｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル８．８ｍｇ（５３μｍｏｌ）を加え、アルゴンバブリングを１０分行った後、６５℃で４５時間反応させた。反応後、反応溶液の一部を採取し１Ｈ−ＮＭＲを測定した結果、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド仕込み量の９９％が重合していることを確認できた。反応溶液を蒸留水３００ｍＬに注ぎ込み、析出した白色固体をろ過した。得られた白色固体をクロロホルム３００ｍＬに溶解し、得られた溶液に無水硫酸マグネシウムを５ｇ添加し、室温で３０分間撹拌した。得られた懸濁液をろ過して硫酸マグネシウムを除いた後、エバポレーターを用いて、減圧下でろ液からクロロホルムを留去し、３０ｍＬまで濃縮した。得られた濃縮溶液をヘキサン３００ｍＬに注ぎ込み、析出した白色固体をろ過した。得られた白色固体を減圧下、８０℃で、６時間乾燥し、白色パウダーとして、ｎ−ブチルメタクリレート重合体ブロック（Ｃ）と２−ジメチルアミノエチルメタクリレート重合体ブロック（Ｂ）とＮ−イソプロピルアクリルアミド重合体ブロック（Ａ）からなるブロック共重合体６．０ｇを得た。得られたブロック共重合体の組成、ＭｎおよびＭｗ／Ｍｎを表２に示す。
［表面処理剤の調製］
上記ブロック共重合体を用いたこと以外は実施例１３［表面処理剤の調製］と同様の方法で調製を行い、０．１ｗｔ％の表面処理剤を調製した。
［膜評価］
上記表面処理剤を用いたこと以外は実施例１３［膜評価］に記載の方法で調製を行い、表面にｎ−ブチルメタクリレート重合体ブロック（Ｃ）と２−ジメチルアミノエチルメタクリレート重合体ブロック（Ｂ）とＮ−イソプロピルアクリルアミド重合体ブロック（Ａ）からなるブロック共重合体からなる膜が導入された細胞培養基材を調製した。膜の厚さは１０ｎｍであった。４０℃および２０℃での対水接触角を表２に示す。２０℃での対水接触角は４０℃での対水接触角よりも低く、４０°未満であり、高い親水性を示した。
［細胞培養評価および剥離評価］
上記にて調製した細胞培養基材を用いたこと以外は実施例１３［細胞培養評価および剥離評価］と同様の方法で評価した。細胞増殖が確認され、培養細胞が基材の１００％を覆うまで培養したところで、１０×１０倍の顕微鏡で細胞数を確認した。基材を１０℃に冷却後、アスピレーターで剥離した細胞を除去し、再度１０×１０倍の顕微鏡で細胞数を確認した。１５分冷却することで細胞はシート状で１００％剥離した。
【０１７７】
比較例５
［細胞培養評価および剥離評価］
比較例２［膜評価］で調製した、表面にｎ−ブチルメタクリレート重合体ブロック（Ｃ）とＮ−イソプロピルアクリルアミド重合体ブロック（Ａ）からなる部分ブロック共重合体が導入された細胞培養基材を用いたこと以外は、実施例１０［細胞培養評価および剥離評価］と同様の方法で評価した。細胞増殖が確認され、培養細胞が基材の１００％を覆うまで培養したところで、１０×１０倍の顕微鏡で細胞数を確認した。基材を１０℃に冷却後、アスピレーターで剥離した細胞を除去し、再度１０×１０倍の顕微鏡で細胞数を確認した。１時間冷却しても細胞は剥離しなかった。
【０１７８】
比較例６
［細胞培養評価および剥離評価］
比較例２［膜評価］で調製した、表面にｎ−ブチルメタクリレート重合体ブロック（Ｃ）とＮ−イソプロピルアクリルアミド重合体ブロック（Ａ）からなる部分ブロック共重合体が導入された細胞培養基材を用いたこと以外は、実施例１２［細胞培養評価および剥離評価］と同様の方法で評価した。細胞増殖が確認され、培養細胞が基材の１００％を覆うまで培養したところで、１０×１０倍の顕微鏡で細胞数を確認した。基材を１０℃に冷却後、アスピレーターで剥離した細胞を除去し、再度１０×１０倍の顕微鏡で細胞数を確認した。１時間冷却しても細胞は剥離しなかった。
【０１７９】
比較例７
［細胞培養評価および剥離評価］
比較例１［膜評価］で評価したセルシード（株）製ＵｐＣｅｌｌ（Ｒ）３５ｍｍφディッシュを用いたこと以外は、実施例１２［細胞培養評価および剥離評価］と同様の方法で評価した。細胞増殖が確認され、培養細胞が基材の１００％を覆うまで培養したところで、１０×１０倍の顕微鏡で細胞数を確認した。基材を１０℃に冷却後、アスピレーターで剥離した細胞を除去し、再度１０×１０倍の顕微鏡で細胞数を確認した。１時間冷却しても細胞は剥離しなかった。
【０１８０】
比較例８
比較例４［膜評価］で評価したコーニング社製細胞培養表面処理３５ｍｍφディッシュを用いたこと以外は実施例１０［細胞培養評価および剥離評価］と同様の方法で評価した。細胞増殖が確認され、培養細胞が基材の１００％を覆うまで培養したところで、１０×１０倍の顕微鏡で細胞数を確認した。基材を１０℃に冷却後、アスピレーターで剥離した細胞を除去し、再度１０×１０倍の顕微鏡で細胞数を確認した。１時間冷却しても細胞は剥離しなかった。
【０１８１】
比較例９
［膜評価］
ＩＷＡＫＩ組織培養用１００ｍｍφディッシュの、４０℃および２０℃での対水接触角を表３に示す。４０℃および２０℃は同等の接触角（５７°）を示し、温度応答性を示さなかった。
［細胞培養評価および剥離評価］
上述のＩＷＡＫＩ組織培養用ディッシュ（Φ９ｃｍ）を用いたこと以外は、実施例１２［細胞培養評価および剥離評価］と同様の評価を行った。細胞増殖が確認され、培養細胞が基材の１００％を覆うまで培養したところで、１０×１０倍の顕微鏡で細胞数を確認した。基材を１０℃に冷却後、アスピレーターで剥離した細胞を除去し、再度１０×１０倍の顕微鏡で細胞数を確認した。１時間冷却しても細胞は剥離しなかった。
【０１８２】
比較例１０
［重合体ブロックの合成］
試験管に２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン１．００ｇ（３．３９ｍｍｏｌ）、ｎ−ブチルメタクリレート１．１２ｇ（７．８８ｍｍｏｌ）、４−シアノ−４−［（ドデシルスルフォニルチオカルボニル）スルフォニル］ペンタノイックアシッド２４ｍｇ（５９μｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル１ｍｇ（６μｍｏｌ）を加え、１，４−ジオキサン／エタノール＝１：１混合溶液２０ｍＬに溶解した。窒素バブリングを１５分行った後、６５℃で１８時間反応させた。反応後、反応溶液をジエチルエーテル５００ｍＬに注ぎ込み、析出した白色固体をろ過、乾燥して、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとｎ−ブチルメタクリレートの共重合体ブロックを得た。
［ブロック共重合体の合成］
試験管に上記共重合体ブロック１．００ｇ、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド１．２０ｇ（１０．６ｍｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル６ｍｇ（３７μｍｏｌ）を加え、１，４−ジオキサン／エタノール＝１：１混合溶液２０ｍＬに溶解した。窒素バブリングを１５分行った後、６５℃で１８時間反応させた。反応後、反応溶液をジエチルエーテル５００ｍＬに注ぎ込み、析出した白色固体をろ過、乾燥して、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとｎ−ブチルメタクリレートの共重合体ブロックとＮ−イソプロピルアクリルアミド重合体ブロックからなるブロック共重合体を得た。得られたブロック共重合体の各繰り返し単位の比率は、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンが重合して生成する繰り返し単位が１２ｍｏｌ％、ｎ−ブチルメタクリレートが重合して生成する繰り返し単位が２５ｍｏｌ％、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドが重合して生成する繰り返し単位が６３ｍｏｌ％であり、実施例１で合成したブロック共重合体とほぼ同一の比率であった。得られたブロック共重合体のＭｎおよびＭｗ／Ｍｎを表３に示す。
［表面処理剤の調製］
上記ブロック共重合体を用いたこと以外は実施例１［表面処理剤の調製］と同様の方法で調製を行い、表面処理剤を調製した。
［膜評価］
上記表面処理剤を用いたこと以外は実施例１［膜評価］に記載の方法と同様の方法で細胞培養基材の調製を行い、表面に２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとｎ−ブチルメタクリレートの共重合体ブロックとＮ−イソプロピルアクリルアミド重合体ブロックからなるブロック共重合体からなる膜が導入された細胞培養基材を調製した。膜の厚さは１００ｎｍであった。４０℃および２０℃での対水接触角を表３に示す。２０℃での対水接触角は４０℃での対水接触角よりも低く温度応答性を示したが、２０℃での対水接触角は４０°以上であった。
［細胞培養評価および剥離評価］
上記にて製造した表面に２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとｎ−ブチルメタクリレートの共重合体ブロックとＮ−イソプロピルアクリルアミド重合体ブロックからなるブロック共重合体が導入された細胞培養基材を用い、マウス結合組織Ｌ９２９細胞（１００個／ｍｍ２）の代わりにチャイニーズハムスター卵巣由来ＣＨＯ細胞（１００個／ｍｍ２）を用い、培養液として１０ｖｏｌ％ＦＢＳ／ＤＭＥＭの代わりに１０ｖｏｌ％ＦＢＳ／Ｈａｍ‘ｓ  Ｆ―１２を用いたこと以外は、実施例１［細胞培養評価および剥離評価］と同様の評価を行い、細胞増殖が確認された。また、培養細胞が基材の１００％を覆うまで培養した後、基材を１０℃に冷却することによって、１５分で細胞は１０％剥離した。
【０１８３】
比較例１１
［共重合体の合成］
試験管に２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン１．００ｇ（３．３９ｍｍｏｌ）、ｎ−ブチルメタクリレート１．１２ｇ（７．８８ｍｍｏｌ）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド２．００ｇ（１７．７ｍｍｏｌ）、４−シアノ−４−［（ドデシルスルフォニルチオカルボニル）スルフォニル］ペンタノイックアシッド２４ｍｇ（５９μｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル１．９ｍｇ（１２μｍｏｌ）を加え、１，４−ジオキサン／エタノール＝１：１混合溶液４０ｍＬに溶解した。窒素バブリングを１５分行った後、６５℃で１８時間反応させた。反応後、反応溶液をジエチルエーテル５００ｍＬに注ぎ込み、析出した白色固体をろ過、乾燥して、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとｎ−ブチルメタクリレートとＮ−イソプロピルアクリルアミドの共重合体を得た。得られた共重合体の各繰り返し単位の比率は、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンが重合して生成する繰り返し単位が１１ｍｏｌ％、ｎ−ブチルメタクリレートが重合して生成する繰り返し単位が２６ｍｏｌ％、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドが重合して生成する繰り返し単位が６３ｍｏｌ％あり、実施例１で合成したブロック共重合体とほぼ同一の比率であった。得られたブロック共重合体のＭｎおよびＭｗ／Ｍｎを表３に示す。
［表面処理剤の調製］
上記共重合体を用いたこと以外は実施例１［表面処理剤の調製］と同様の方法で調製を行い、表面処理剤を調製した。
［膜評価］
上記表面処理剤を用いたこと以外は実施例１［膜評価］に記載の方法と同様の方法で細胞培養基材の調製を行い、表面に２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとｎ−ブチルメタクリレートとＮ−イソプロピルアクリルアミドの共重合体からなる膜が導入された細胞培養基材を調製した。膜の厚さは１００ｎｍであった。４０℃および２０℃での対水接触角を表３に示す。４０℃および２０℃は同等の接触角を示し、温度応答性を示さなかった。
［細胞培養評価および剥離評価］
上記にて製造した表面に２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとｎ−ブチルメタクリレートの共重合体ブロックとＮ−イソプロピルアクリルアミド重合体ブロックからなるブロック共重合体が導入された細胞培養基材を用い、マウス結合組織Ｌ９２９細胞（１００個／ｍｍ２）の代わりにチャイニーズハムスター卵巣由来ＣＨＯ細胞（１００個／ｍｍ２）を用い、培養液として１０ｖｏｌ％ＦＢＳ／ＤＭＥＭの代わりに１０ｖｏｌ％ＦＢＳ／Ｈａｍ‘ｓ  Ｆ―１２を用いたこと以外は、実施例１［細胞培養評価および剥離評価］と同様の評価を行い、細胞増殖が確認された。また、培養細胞が基材の１００％を覆うまで培養した後、基材を１０℃に冷却したが、１５分経過しても細胞は全く剥離しなかった。
【０１８４】
比較例１２
比較例４［膜評価］で評価したコーニング社製細胞培養表面処理３５ｍｍφディッシュを用い、マウス結合組織Ｌ９２９細胞（１００個／ｍｍ２）の代わりにチャイニーズハムスター卵巣由来ＣＨＯ細胞（１００個／ｍｍ２）を用い、培養液として１０ｖｏｌ％ＦＢＳ／ＤＭＥＭの代わりに１０ｖｏｌ％ＦＢＳ／Ｈａｍ‘ｓ  Ｆ―１２を用いたこと以外は、実施例１［細胞培養評価および剥離評価］と同様の評価を行い、細胞増殖が確認された。また、培養細胞が基材の１００％を覆うまで培養した後、基材を１０℃に冷却したが、１５分経過しても細胞は全く剥離しなかった。
【０１８５】
比較例１３
比較例９［膜評価］で評価したＩＷＡＫＩ組織培養用１００ｍｍφディッシュを用いたこと以外は、実施例１３［細胞培養評価および剥離評価］と同様の評価を行い、細胞増殖が確認された。また、培養細胞が基材の１００％を覆うまで培養した後、基材を１０℃に冷却したが、１５分経過しても細胞は全く剥離しなかった。
【０１８６】
比較例１４
［部分ブロック共重合体の合成］
実施例１０［重合体ブロック（Ｂ）の合成］で得られた反応溶液に、１，４−ジオキサン２０ｍＬ、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド４．８ｇ（４２．４ｍｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル８．８ｍｇ（５３μｍｏｌ）を加え、アルゴンバブリングを１０分行った後、６５℃で４５時間反応させた。反応後、反応溶液の一部を採取し１Ｈ−ＮＭＲを測定した結果、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド仕込み量の９８％が重合していることを確認した。反応溶液を蒸留水３００ｍＬに注ぎ込み、析出した白色固体をろ過した。得られた白色固体をクロロホルム３００ｍＬに溶解し、得られた溶液に無水硫酸マグネシウムを５ｇ添加し、室温で３０分間撹拌した。得られた懸濁液をろ過して硫酸マグネシウムを除いた後、エバポレーターを用いて、減圧下でろ液からクロロホルムを留去し、３０ｍＬまで濃縮した。得られた濃縮溶液をヘキサン３００ｍＬに注ぎ込み、析出した白色固体をろ過した。得られた白色固体を減圧下、８０℃で、６時間乾燥し、白色パウダーとして、２−ジメチルアミノエチルメタクリレート重合体ブロック（Ｂ）とＮ−イソプロピルアクリルアミド重合体ブロック（Ａ）からなるブロック共重合体５．８ｇを得た。得られたブロック共重合体の組成、ＭｎおよびＭｗ／Ｍｎを表３に示す。
［表面処理剤の調製］
上記部分ブロック共重合体を用いたこと以外は実施例１０［表面処理剤の調製］と同様の方法で調製を行い、０．５ｗｔ％の表面処理剤を調製した。
［膜評価］
上記表面処理剤を用いたこと以外は実施例１０［膜評価］に記載の方法で細胞培養基材を調製した。膜の厚さは１０ｎｍであった。４０℃および２０℃での対水接触角を表３に示す。４０℃および２０℃は同等の接触角（５７°）を示し温度応答性を示さず、比較例９［膜評価］で評価したＩＷＡＫＩ組織培養用１００ｍｍφディッシュと同等であったことから、ブロック共重合体が水中に溶出していることがわかった。
【０１８７】
前述の実施例および比較例で合成したブロック共重合体の種類、各ブロックの組成比、ＭｎおよびＭｗ／Ｍｎ、対水接触角を表１〜３に示した。また、前述の実施例、参考例および比較例における細胞培養評価の結果を表４〜８に示した。
【０１８８】
【表１】
2018087316.tif 000028
【０１８９】
【表２】
2018087316.tif 000029
【０１９０】
【表３】
2018087316.tif 000030
【０１９１】
【表４】
2018087316.tif 000031
【０１９２】
【表５】
2018087316.tif 000032
【０１９３】
【表６】
2018087316.tif 000033
【０１９４】
【表７】
2018087316.tif 000034
【０１９５】
【表８】
2018087316.tif 000035
【手続補正書】
【提出日】平成29年12月26日(2017.12.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１５】
前記ブロック（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）の間の１つ以上にスペーサーを介した結合を有しており、前記スペーサーを介した結合の少なくとも１つが下記一般式（１２）および（１３）
【化１２】
2018087316.tif 000049
【化１３】
2018087316.tif 000050
（式中、Ｒ１は水素原子または炭素数１〜２０の炭化水素基である。）
で表される２価の結合の内、少なくとも１種類の結合を含む２価の結合であることを特徴とする、請求項１〜１４の何れか１項に記載のブロック共重合体。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
［１５］前記ブロック（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）の間の１つ以上にスペーサーを介した結合を有しており、前記スペーサーを介した結合の少なくとも１つが下記一般式（１２）および（１３）
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４７】
本発明の細胞培養基材を用いて培養される細胞としては、温度降下による刺激付与前の細胞培養基材の表面に接着可能なものであれば特に制限されるものではない。例えば、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞、ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞、ヒト肺由来線維芽細胞、ヒト皮膚線維芽細胞、チャイニーズハムスター卵巣由来ＣＨＯ細胞、マウス結合組織Ｌ９２９細胞、ヒト胎児腎臓由来細胞ＨＥＫ２９３細胞、ヒト子宮頸癌由来ＨｅＬａ細胞等の種々の培養細胞株に加え、例えば生体内の各組織、臓器を構成する上皮細胞や内皮細胞、収縮性を示す骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、神経系を構成するニューロン細胞、グリア細胞、線維芽細胞、生体の代謝に関与する肝実質細胞、肝非実質細胞や脂肪細胞、分化能を有する細胞として、種々の組織に存在する幹細胞、さらにはそれらから分化誘導した細胞等を用いることができる。これら以外でも、血液、リンパ液、髄液、喀痰、尿又は便に含まれる細胞（生細胞）や、体内あるいは環境中に存在する微生物、ウイルス、原虫等を例示できる。