(57)【要約】【課題】匂い物質に対して優れた検出感度を発揮する、昆虫の嗅覚受容体と嗅覚受容体共受容体とから形成される嗅覚受容体複合体を提供すること。【解決手段】本発明の嗅覚受容体複合体は、ミツバチ科に属さない昆虫の嗅覚受容体と、ミツバチ科昆虫の嗅覚受容体共受容体とから形成される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミツバチ科に属さない昆虫の嗅覚受容体と、ミツバチ科昆虫の嗅覚受容体共受容体とから形成される、嗅覚受容体複合体。
【請求項２】
前記嗅覚受容体が、カ科昆虫、カイコガ科昆虫、及びショウジョウバエ科昆虫からなる群から選択される昆虫の嗅覚受容体である、請求項１に記載の嗅覚受容体複合体。
【請求項３】
前記嗅覚受容体が、１−オクテン−３−オール、ベンズアルデヒド、２，４，５−トリメチルチアゾール、ｃｉｓ−ジャスモン、及びペンチルアセテートからなる群から選択される化合物をリガンドとする嗅覚受容体である、請求項１又は２に記載の嗅覚受容体複合体。
【請求項４】
前記嗅覚受容体が、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ）のＯＲ８若しくはＯＲ１０、ガンビエハマダラカ（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｇａｍｂｉａｅ）のＯＲ１０若しくはＯＲ２８、カイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）のＯＲ５６、又はキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）のＯＲ４７ａ、或いは、これらのうちいずれかの嗅覚受容体全体のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する嗅覚受容体であり、
前記嗅覚受容体共受容体が、セイヨウミツバチ（Ａｐｉｓ  ｍｅｌｌｉｆｅｒａ）又はその近縁種昆虫の嗅覚受容体共受容体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の嗅覚受容体複合体。
【請求項５】
前記嗅覚受容体が、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ）のＯＲ８若しくはＯＲ１０、ガンビエハマダラカ（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｇａｍｂｉａｅ）のＯＲ１０若しくはＯＲ２８、カイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）のＯＲ５６、又はキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）のＯＲ４７ａ、或いは、これらのうちいずれかの嗅覚受容体全体のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する嗅覚受容体であり、
前記嗅覚受容体共受容体が、配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、昆虫嗅覚受容体と共役して陽イオンを細胞内へ流入させる能力を有するタンパク質である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の嗅覚受容体複合体。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の嗅覚受容体複合体を発現する細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、嗅覚受容体複合体、具体的には、昆虫由来の嗅覚受容体と別の昆虫由来の嗅覚受容体共受容体とから形成される嗅覚受容体複合体、及びそれを発現する細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、揮発性化学物質（匂い物質）を測定する様々な技術が知られている。このような技術は、癌診断等の診断・ヘルスケア分野、人探索、麻薬等の検出等の防災・セキュリティ分野、有害物質の検出等の環境分野等への応用が期待されている。
【０００３】
匂い物質の検出には犬や線虫等の生物を利用することがある。しかしながら、生物を利用する方法は高感度に匂い物質を検知できるものの、体調や個体によってバラツキがあるため安定性に欠け、また、集中力の持続時間に限界があるため長時間の利用が難しいといった側面もあった。
【０００４】
そのため、生物そのものではなく、生物が備える嗅覚機能が注目されている。特に昆虫の嗅覚機能は匂い物質の認識特異性が高いとされており、嗅覚センサー等への利用が模索されている。昆虫の嗅覚器には、匂い物質を認識する嗅覚受容体（ｏｄｏｒａｎｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、以下「ＯＲ」という場合もある。）と嗅覚受容体共受容体（ｏｄｏｒａｎｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｏ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ、以下「ＯＲＣＯ」又は「共受容体」という場合もある。）とが形成した嗅覚受容体複合体が存在しており、匂い物質により活性化されると、上記複合体がイオンチャネル活性を示し、それにより匂い物質が検知される（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｕ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｋａｕｐｐ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ  １１（２０１０），ｐ１８８−２００
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、匂い物質を現場で検出しようとする場合、その濃度は非常に低い場合がある。そのため、匂い物質を検出するために用いられる嗅覚センサーは、高感度であることが求められる。
【０００７】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、匂い物質に対して優れた検出感度を発揮する、昆虫の嗅覚受容体と嗅覚受容体共受容体とから形成される昆虫嗅覚受容体複合体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ミツバチ科昆虫の嗅覚受容体共受容体とミツバチ科に属さない昆虫の嗅覚受容体とから形成される複合体によれば、上記嗅覚受容体と同種の昆虫の嗅覚受容体共受容体と上記嗅覚受容体とから形成される嗅覚受容体複合体よりも、匂い物質に対する検出感度に優れることを見出した。本発明は、これらの知見に基づくものである。
【０００９】
すなわち、本発明は、例えば、以下の［１］〜［６］に関する。
［１］ミツバチ科に属さない昆虫の嗅覚受容体と、ミツバチ科昆虫の嗅覚受容体共受容体とから形成される、嗅覚受容体複合体。
［２］嗅覚受容体が、カ科昆虫、カイコガ科昆虫、及びショウジョウバエ科昆虫からなる群から選択される昆虫の嗅覚受容体である、［１］に記載の嗅覚受容体複合体。
［３］嗅覚受容体が、１−オクテン−３−オール、ベンズアルデヒド、２，４，５−トリメチルチアゾール、ｃｉｓ−ジャスモン、及びペンチルアセテートからなる群から選択される化合物をリガンドとする嗅覚受容体である、［１］又は［２］に記載の嗅覚受容体複合体。
［４］嗅覚受容体が、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ）のＯＲ８若しくはＯＲ１０、ガンビエハマダラカ（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｇａｍｂｉａｅ）のＯＲ１０若しくはＯＲ２８、カイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）のＯＲ５６、又はキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）のＯＲ４７ａ、或いは、これらのうちいずれかの嗅覚受容体全体のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する嗅覚受容体であり、嗅覚受容体共受容体が、セイヨウミツバチ（Ａｐｉｓ  ｍｅｌｌｉｆｅｒａ）又はその近縁種昆虫の嗅覚受容体共受容体である、［１］〜［３］のいずれかに記載の嗅覚受容体複合体。
［５］嗅覚受容体が、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ）のＯＲ８若しくはＯＲ１０、ガンビエハマダラカ（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｇａｍｂｉａｅ）のＯＲ１０若しくはＯＲ２８、カイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）のＯＲ５６、又はキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）のＯＲ４７ａ、或いは、これらのうちいずれかの嗅覚受容体全体のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する嗅覚受容体であり、嗅覚受容体共受容体が、配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、昆虫嗅覚受容体と共役して陽イオンを細胞内へ流入させる能力を有するタンパク質である、［１］〜［３］のいずれかに記載の嗅覚受容体複合体。
［６］［１］〜［５］のいずれかに記載の嗅覚受容体複合体を発現する細胞。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、匂い物質に対して優れた検出感度を発揮する、昆虫の嗅覚受容体と嗅覚受容体共受容体とから形成される嗅覚受容体複合体を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ＡａＯＲ８とＡａＯＲＣＯとの複合体を発現する細胞、及びＡａＯＲ８とＡｍＯＲＣＯとの複合体を発現する細胞に対し、１−オクテン−３−オールを添加した際の発光量の相対値を示す。
【図２】ＡａＯＲ１０とＡａＯＲＣＯとの複合体を発現する細胞、及びＡａＯＲ１０とＡｍＯＲＣＯとの複合体を発現する細胞に対し、ベンズアルデヒドを添加した際の発光量の相対値を示す。
【図３】ＡｇＯＲ１０とＡｇＯＲＣＯとの複合体を発現する細胞、及びＡｇＯＲ１０とＡｍＯＲＣＯとの複合体を発現する細胞に対し、ベンズアルデヒドを添加した際の発光量の相対値を示す。
【図４】ＡｇＯＲ２８とＡｇＯＲＣＯとの複合体を発現する細胞、及びＡｇＯＲ２８とＡｍＯＲＣＯとの複合体を発現する細胞に対し、２，４，５−トリメチルチアゾールを添加した際の発光量の相対値を示す。
【図５】ＢｍＯＲ５６とＢｍＯＲＣＯとの複合体を発現する細胞、及びＢｍＯＲ５６とＡｍＯＲＣＯとの複合体を発現する細胞に対し、ｃｉｓ−ジャスモンを添加した際の発光量の相対値を示す。
【図６】ＤｍＯＲ４７ａとＤｍＯＲＣＯとの複合体を発現する細胞、及びＤｍＯＲ４７ａとＡｍＯＲＣＯとの複合体を発現する細胞に対し、ペンチルアセテートを添加した際の発光量の相対値を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を実施するための形態（以下、「本実施形態」という。）について詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施形態に限定されるものではない。
【００１３】
昆虫の嗅覚受容体複合体は、嗅覚受容体と嗅覚受容体共受容体とがヘテロ複合体を形成したものである。昆虫の嗅覚受容体は、７回膜貫通構造を有するＧタンパク質共役型受容体の一種であり、その匂い物質の認識特異性が高い。いくつかの匂い物質特異的な嗅覚受容体が知られている。一方、昆虫の嗅覚受容体共受容体は、嗅覚受容体と同様に７回膜貫通構造を有する膜タンパク質であるものの、それ自身は匂い物質を認識せず、嗅覚受容体とヘテロ複合体を形成して機能する。Ｏｒｃｏファミリーとして知られている上記嗅覚受容体共受容体は、比較的高い相同性で全ての昆虫に保存されている。嗅覚受容体複合体は、匂い物質で活性化されるイオンチャンネル活性が備わっており、活性化されるとナトリウムイオン（Ｎａ＋）、カルシウムイオン（Ｃａ２＋）等の陽イオンを細胞内に流入させる。
【００１４】
本実施形態の嗅覚受容体複合体は、ミツバチ科に属さない昆虫の嗅覚受容体と、ミツバチ科昆虫の嗅覚受容体共受容体とから形成される。
【００１５】
ミツバチ科に属さない昆虫の嗅覚受容体としては、例えば、カ科昆虫、カイコガ科昆虫、及びショウジョウバエ科昆虫からなる群から選択される昆虫の嗅覚受容体が挙げられる。カ科の昆虫としては、例えば、ガンビエハマダラカ（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｇａｍｂｉａｅ）、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ）、ネッタイイエカ（Ｃｕｌｅｘ  ｑｕｉｎｑｕｅｆａｓｃｉａｔｕｓ）等が挙げられる。カイコガ科の昆虫としては、例えば、カイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）、クワコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍａｎｄａｒｉｎａ）、イチジクカサン（Ｔｒｉｌｏｃｈａ  ｖａｒｉａｎｓ）等が挙げられる。ショウジョウバエ科の昆虫としては、例えば、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、ウスグロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｐｓｅｕｄｏｏｂｓｃｕｒａ）、クロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｖｉｒｉｌｌｉｓ）等が挙げられる。
【００１６】
嗅覚受容体の種類は、標的とするリガンドに応じて適宜選択することができる。嗅覚受容体は、１−オクテン−３−オール、ベンズアルデヒド、２，４，５−トリメチルチアゾール、ｃｉｓ−ジャスモン、及びペンチルアセテートからなる群から選択される化合物をリガンドとする嗅覚受容体であってもよい。嗅覚受容体は、具体的には、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ）のＯＲ８若しくはＯＲ１０、ガンビエハマダラカ（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｇａｍｂｉａｅ）のＯＲ１０若しくはＯＲ２８、カイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）のＯＲ５６、又はキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）のＯＲ４７ａであってもよい。嗅覚受容体は、上記いずれかの嗅覚受容体全体のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する嗅覚受容体であってもよく、９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する嗅覚受容体であってもよく、９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する嗅覚受容体であってもよく、９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する嗅覚受容体であってもよい。上記いずれかの嗅覚受容体全体のアミノ酸配列と比較した場合に同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を有する嗅覚受容体であれば、アミノ酸配列を比較した元の嗅覚受容体と同程度のリガンド特異性及び検出感度が得られる傾向にある。
【００１７】
ミツバチ科昆虫に由来する嗅覚受容体共受容体としては、例えば、セイヨウミツバチ（Ａｐｉｓ  ｍｅｌｌｉｆｅｒａ）、ヒメミツバチ（Ａｐｉｓ  ｆｌｏｒｅａ）、オオミツバチ（Ａｐｉｓ  ｄｏｒｓａｔａ）、セイヨウオオマルハナバチ（Ｂｏｍｂｕｓ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）等のミツバチ科昆虫に由来するものが挙げられる。ミツバチ科の嗅覚受容体共受容体とミツバチ科に属さない昆虫の嗅覚受容体と組み合わせた複合体によれば、上記嗅覚受容体と同種の昆虫の嗅覚受容体共受容体と上記嗅覚受容体とから形成される嗅覚受容体複合体よりも、匂い物質に対する検出感度に優れるものとなる。
【００１８】
嗅覚受容体共受容体は、セイヨウミツバチ又はその近縁種に由来する嗅覚受容体共受容体であってもよい。本明細書において「セイヨウミツバチの近縁種」とは、ミツバチ族（Ａｐｉｎｉ）のハチ、又は、シタバチ族（Ｅｕｇｌｏｓｓｉｎｉ）、マルハナバチ族  ｂｕｍｂｌｅ  ｂｅｅ（Ｂｏｍｂｉｎｉ）、もしくは、ハリナシバチ族  ｓｔｉｎｇｌｅｓｓ  ｂｅｅ（Ｍｅｌｉｐｏｎｉｎｉ）のハチである。これらの族のハチは、後脚脛節の外側に花粉かご  ｃｏｒｂｉｃｕｌａ（ｐｏｌｌｅｎ  ｂａｓｋｅｔ）を有する。セイヨウミツバチの近縁種としては、例えば、ミツバチ族に属するヒメミツバチ、及びオオミツバチ；並びに、マルハナバチ族に属するセイヨウオオマルハナバチ等が挙げられる。このような近縁種の嗅覚受容体共受容体であれば、セイヨウミツバチの嗅覚受容体共受容体とのアミノ酸配列同一性が高く、同等の機能を備える傾向にある。
【００１９】
嗅覚受容体共受容体は、セイヨウミツバチの嗅覚受容体共受容体のアミノ酸配列（配列番号１に記載のアミノ酸配列）と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、昆虫嗅覚受容体と共役して陽イオンを細胞内へ流入させる能力を有するタンパク質であってもよく、９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、昆虫嗅覚受容体と共役して陽イオンを細胞内へ流入させる能力を有するタンパク質であってもよく、９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、昆虫嗅覚受容体と共役して陽イオンを細胞内へ流入させる能力を有するタンパク質であってもよく、９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、昆虫嗅覚受容体と共役して陽イオンを細胞内へ流入させる能力を有するタンパク質であってもよい。配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、昆虫嗅覚受容体と共役して陽イオンを細胞内へ流入させる能力を有するタンパク質であれば、セイヨウミツバチの嗅覚受容体共受容体と同様に、ミツバチ科に属さない昆虫の嗅覚受容体と組み合わせて複合体を形成させることで、上記嗅覚受容体と同種の昆虫の嗅覚受容体共受容体と上記嗅覚受容体とから形成される嗅覚受容体複合体よりも、匂い物質に対する検出感度に優れるものとなる傾向にある。
【００２０】
配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、昆虫嗅覚受容体と共役して陽イオンを細胞内へ流入させる能力を有するタンパク質としては、例えば、ヒメミツバチの嗅覚受容体共受容体（同一性９９％）、オオミツバチの嗅覚受容体共受容体（同一性９８％）、セイヨウオオマルハナバチの嗅覚受容体共受容体（同一性９１％）等が挙げられる。
【００２１】
本実施形態の嗅覚受容体複合体は、嗅覚受容体と嗅覚受容体共受容体とが１：１の割合で相互作用して複合体を形成している。嗅覚受容体及び嗅覚受容体共受容体は、それぞれ１つずつから複合体が形成されてもよく、それぞれ２つずつから複合体が形成されてもよく、それぞれ４つずつから複合体が形成されてもよい。
【００２２】
本実施形態の嗅覚受容体複合体は、嗅覚受容体及び嗅覚受容体共受容体を同じ細胞の細胞膜に同時に発現させ、場合によって精製する方法、又は、嗅覚受容体及び嗅覚受容体共受容体をそれぞれ別の細胞で発現させ、精製した後に混合する方法等により調製することができる。嗅覚受容体及び嗅覚受容体共受容体を細胞で発現させる方法は、特に限定されるものではなく公知の方法を用いることができる。このような方法としては、例えば、上記嗅覚受容体をコードするＤＮＡを組み入れた発現用プラスミドと、上記嗅覚受容体共受容体をコードするＤＮＡを組み入れた発現用プラスミドとを細胞に導入してこれらを発現させる方法がある。この際、上記嗅覚受容体をコードするＤＮＡを組み入れた発現用プラスミドと、上記嗅覚受容体共受容体をコードするＤＮＡを組み入れた発現用プラスミドとを同じ細胞に導入することで、嗅覚受容体複合体として直接調製することもできる。細胞に各種プラスミドが導入されたことは、ＰＣＲ等の方法により確認することができる。細胞で発現させた嗅覚受容体、嗅覚受容体共受容体、又は嗅覚受容体複合体は、細胞膜を可溶化した後、各種精製用カラムに供することにより精製することができる。
【００２３】
本実施形態の嗅覚受容体複合体によれば、当該複合体を構成する嗅覚受容体と同種の昆虫の嗅覚受容体共受容体と上記嗅覚受容体とから形成される嗅覚受容体複合体よりも匂い物質に対する検出感度に優れる。このような特性を有する嗅覚受容体複合体は、より低濃度の匂い物質を検出することができる嗅覚センサーとして有用である。
【００２４】
本実施形態の細胞は、上記嗅覚受容体複合体を発現する。すなわち、本実施形態の細胞は、その細胞内において、ミツバチ科に属さない昆虫の嗅覚受容体とミツバチ科昆虫の嗅覚共受容体とを発現し、それにより細胞膜上において本実施形態の嗅覚受容体複合体を発現する。
【００２５】
本実施形態の細胞は、嗅覚受容体複合体の調製方法と同様に、嗅覚受容体をコードするＤＮＡを組み入れた発現用プラスミドと、嗅覚受容体共受容体をコードするＤＮＡを組み入れた発現用プラスミドとを同じ細胞に導入することで調製することができる。発現プラスミドを導入する細胞としては、発現プラスミドの種類に応じて適宜選択することができる。細胞としては、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ１２等の大腸菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＭＩ１１４等のバチルス属細菌、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＡＨ２２等の酵母、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  由来の  Ｓｆ細胞系もしくはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ由来のＨｉｇｈＦｉｖｅ細胞系等の昆虫細胞、ＣＯＳ７細胞等の動物細胞等を挙げることができる。動物細胞としては、好ましくは、哺乳動物由来の培養細胞、具体的には、ＣＯＳ７細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＰＣ１２細胞、Ｎ１Ｅ−１１５細胞、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞等が挙げられる。
【実施例】
【００２６】
以下、実施例に基づき本発明を具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００２７】
本実施例に記載の昆虫は以下のとおりである。
ガンビエハマダラカ（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｇａｍｂｉａｅ：以下、「ハマダラカ」又は「Ａｇ」という場合もある。）
ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ：以下、「シマカ」又は「Ａａ」という場合もある。）
キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ：以下、「ショウジョウバエ」又は「Ｄｍ」という場合もある。）
セイヨウミツバチ（Ａｐｉｓ  ｍｅｌｌｉｆｅｒａ：以下、「ミツバチ」又は「Ａｍ」という場合もある。）
カイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ：以下、「カイコガ」又は「Ｂｍ」という場合もある。）
【００２８】
＜共受容体の発現プラスミドの作製＞
ハマダラカ共受容体（以下、ＡｇＯＲＣＯという場合もある。）の発現プラスミド
ガンビエハマダラカ（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｇａｍｂｉａｅ）Ｋｉｓｕｍ系統又はＧ３系統の頭部を液体窒素で凍結させた後、ＴＲＩｚｏｌ（インビトロジェン社製）を加えて液体窒素存在下で乳鉢と乳棒を用いて破砕した。得られた破砕物から、ＴＲＩｚｏｌ試薬に添付の説明書に従いＲＮＡを抽出した。抽出されたＲＮＡを、ＲＮＡ精製キット（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ；ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、当該キットに添付された説明書に従って精製した。得られたＴｏｔａｌ  ＲＮＡを鋳型にし、Ｓｕｐｅｒ  Ｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ逆転写酵素（インビトロジェン社製）を添加し、５５℃で５０分間、次いで７５℃で１５分間保温することにより逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを得た。得られたｃＤＮＡ1μＬを鋳型に用い、１０μＭのフォワードプライマーＡｇＯｒｃｏ−５’（5’-caccatgcaagtccagccgaccaagtacgtcggcct；配列番号２）１μＬ、１０μＭのリバースプライマーＡｇＯｒｃｏ−３’（5’-ttacttcagctgcaccagcaccatgaagt；配列番号３）１μＬ及びＫＯＤ  ＰｌｕｓＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）１μＬを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、（１）９４℃、５分間、（２）９８℃、１０秒間、（３）６０℃、３０秒間、（４）６８℃、１．５分間で行い、（２）〜（４）の工程は３５サイクル繰り返し行った。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動した後、当該ゲル上で検出された約１．４ｋｂのＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡをｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクター（インビトロジェン社製）へ導入し、ｐＥＮＴＲ−ＡｇＯｒｃｏと名付けたプラスミドを得た。４μＬのｐＥＮＴＲ−ＡｇＯｒｃｏ、１μＬのｐｃＤＮＡ６．２Ｖ５−ＤＥＳＴ及び２μＬのＬＲクロナーゼＩＩ（インビトロジェン社製）を混合して室温で１時間保持した。得られた混合物を大腸菌へ導入し培養することにより、ｐｃＤＮＡ６．２−ＡｇＯｒｃｏと名付けた発現プラスミドを得た。発現プラスミドｐｃＤＮＡ６．２−ＡｇＯｒｃｏの塩基配列をＤＮＡシーケンサーにより解析したところ、配列番号４で示される塩基配列を含有することが判った。配列番号４で示される塩基配列は配列番号５で示されるアミノ酸配列をコードする。
【００２９】
ショウジョウバエ共受容体（以下、ＤｍＯＲＣＯという場合もある。）の発現プラスミド
ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）成虫ＲＮＡ（ＴＡＫＡＲＡ社製）を鋳型に用いて、Ｓｕｐｅｒ  Ｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ逆転写酵素（インビトロジェン社製）を添加し、５５℃で５０分間、次いで７５℃で１５分間保温することにより逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを得た。得られたｃＤＮＡ１μＬを鋳型に用い、１０μＭのフォワードプライマーＤｍＯｒｃｏ−５’（5’-caccatgacaacctcgatgcagccgagcaagt；配列番号６）１μＬ、１０μＭのリバースプライマーＤｍＯｒｃｏ−３’（5’-ttacttgagctgcaccagcaccataaagt；配列番号７）１μＬ及びＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  ｎｅｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）１μＬを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、（１）９４℃、２分間、（２）９８℃、１０秒間、（３）６８℃、１．５分間で行い、（２）〜（３）の工程は３５サイクル繰り返し行った。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動した後、当該ゲル上で検出された約１．５ｋｂのＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡをｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクター（インビトロジェン社製）へ導入し、ｐＥＮＴＲ−ＤｍＯｒｃｏと名付けたプラスミドを得た。４μＬのｐＥＮＴＲ−ＤｍＯｒｃｏ、１μＬのｐｃＤＮＡ６．２Ｖ５−ＤＥＳＴ及び２μＬのＬＲクロナーゼＩＩ（インビトロジェン社製）を混合して室温で１時間保持した。得られた混合物を大腸菌へ導入し培養することにより、ｐｃＤＮＡ６．２−ＤｍＯｒｃｏと名付けた発現プラスミドを得た。発現プラスミドｐｃＤＮＡ６．２−ＤｍＯｒｃｏの塩基配列をＤＮＡシーケンサーにより解析したところ、配列番号８で示される塩基配列を含有することが判った。配列番号８で示される塩基配列は配列番号９で示されるアミノ酸配列をコードする。
【００３０】
シマカ共受容体（以下、ＡａＯＲＣＯという場合もある。）の発現プラスミド
ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ）の頭部を液体窒素で凍結させた後、ＴＲＩｚｏｌ（インビトロジェン社製）を加えて液体窒素存在下で乳鉢と乳棒を用いて破砕した。得られた破砕物から、ＴＲＩｚｏｌ試薬に添付の説明書に従いＲＮＡを抽出した。抽出されたＲＮＡを、ＲＮＡ精製キット（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ；ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、当該キットに添付された説明書に従って精製した。得られたＴｏｔａｌ  ＲＮＡを鋳型にし、Ｓｕｐｅｒ  Ｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ逆転写酵素（インビトロジェン社製）を添加し、５５℃で５０分間、次いで７５℃で１５分間保温することにより逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを得た。得られたｃＤＮＡ１μＬを鋳型に用い、１０μＭのフォワードプライマーＡａＯｒｃｏ−５’（5’-tggaattctgcagatcaccatgaacgtccaaccgacaaagtacc；配列番号１０）１μＬ、１０μＭのリバースプライマーＡａＯｒｃｏ−３’（5’-gccactgtgctggatttatttcaactgcaccaacacc；配列番号１１）１μＬ及びＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  ｎｅｏＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）１μＬを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、（１）９４℃、２分間、（２）９８℃、１０秒間、（３）６３℃、３０秒間、（４）６８℃、１．５分間で行い、（２）〜（４）の工程は３５サイクル繰り返し行った。得られたＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＶで消化されたｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）にＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ社製）を使用して連結した。その後、これを大腸菌へ導入して培養することにより、ｐｃＤＮＡ３．１−ＡａＯｒｃｏと名付けた発現プラスミドを得た。発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ＡａＯｒｃｏの塩基配列をＤＮＡシーケンサーにより解析したところ、配列番号１２で示される塩基配列を含有することが判った。配列番号１２で示される塩基配列は配列番号１３で示されるアミノ酸配列をコードする。
【００３１】
ミツバチ共受容体（以下、ＡｍＯＲＣＯという場合もある。）の発現プラスミド
いずれか一方のＤＮＡ鎖に配列番号１４で示される塩基配列を有する二本鎖ＤＮＡを合成した。得られたＤＮＡ１００ｎｇを鋳型に用い、１０μＭのフォワードプライマーＡｍＯｒｃｏ−５’（5’-tggaattctgcagatcaccatgaagttcaagcaacaagggctaa；配列番号１５）１μＬ、１０μＭのリバースプライマーＡｍＯｒｃｏ−３’（5’-gccactgtgctggattcacttcagttgcaccaacaccatgaa；配列番号１６）１μＬ及びＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  ｎｅｏＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）１μＬを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、（１）９４℃、２分間、（２）９８℃、１０秒間、（３）６３℃、３０秒間、（４）６８℃、１．５分間で行い、（２）〜（４）の工程は３５サイクル繰り返し行った。得られたＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＶで消化されたｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）にＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ社製）を使用して連結した。その後、これを大腸菌へ導入して培養することにより、ｐｃＤＮＡ３．１−ＡｍＯｒｃｏと名付けた発現プラスミドを得た。発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ＡｍＯｒｃｏの塩基配列をＤＮＡシーケンサーにより解析したところ、配列番号１４で示される塩基配列を含有することが判った。配列番号１４で示される塩基配列は配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする。
【００３２】
カイコガ共受容体（以下、ＢｍＯＲＣＯという場合もある。）の発現プラスミド
いずれか一方のＤＮＡ鎖に配列番号１７で示される塩基配列を有する二本鎖ＤＮＡを合成した。得られたＤＮＡ１００ｎｇを鋳型に用い、１０μＭのフォワードプライマーＢｍＯｒｃｏ−５’（5’-tggaattctgcagatcaccatgatgaccaaggtcaagacgcagggcct；配列番号１８）１μＬ、１０μＭのリバースプライマーＢｍＯｒｃｏ−３’（5’-gccactgtgctggatctacttcagttggatcaacaccatga；配列番号１９）１μＬ及びＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  ｎｅｏＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）１μＬを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、（１）９４℃、２分間、（２）９８℃、１０秒間、（３）６３℃、３０秒間、（４）６８℃、１．５分間で行い、（２）〜（４）の工程は３５サイクル繰り返し行った。得られたＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＶで消化されたｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）に、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ社製）を使用して連結した。その後、これを大腸菌へ導入して培養することにより、ｐｃＤＮＡ３．１−ＢｍＯｒｃｏと名付けた発現プラスミドを得た。発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ＢｍＯｒｃｏの塩基配列をＤＮＡシーケンサーにより解析したところ、配列番号１７で示される塩基配列を含有することが判った。配列番号１７で示される塩基配列は配列番号２０で示されるアミノ酸配列をコードする。
【００３３】
＜嗅覚受容体の発現プラスミドの作製＞
シマカ嗅覚受容体ＯＲ８（以下、ＡａＯＲ８という場合もある。）の発現プラスミド
上記方法により調製されたシマカ頭部由来のｃＤＮＡ１μＬを鋳型に用い、１０μＭのフォワードプライマーＡａＯＲ８−５’（5’-tggaattctgcagatcaccatgaacgacctggtgaagtttgagt；配列番号２１）１μＬ、１０μＭのリバースプライマーＡａＯＲ８−３’（5’-gccactgtgctggattcacttctgacttggttcatagatggt；配列番号２２）１μＬ及びＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  ｎｅｏＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）１μＬを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、（１）９４℃、２分間、（２）９８℃、１０秒間、（３）６８℃、１分間で行い、（２）〜（４）の工程は３０サイクル繰り返し行った。得られたＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＶで消化されたｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）にＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ社製）を使用して連結した。その後、これを大腸菌へ導入して培養することにより、ｐｃＤＮＡ３．１−ＡａＯＲ８と名付けた発現プラスミドを得た。発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ＡａＯＲ８の塩基配列をＤＮＡシーケンサーにより解析したところ、配列番号２３で示される塩基配列を含有することが判った。配列番号２３で示される塩基配列は配列番号２４で示されるアミノ酸配列をコードする。
【００３４】
シマカ嗅覚受容体ＯＲ１０（以下、ＡａＯＲ１０という場合もある。）の発現プラスミド
上記方法により調製されたシマカ頭部由来のｃＤＮＡ１μＬを鋳型に用い、１０μＭのフォワードプライマーＡａＯＲ１０−５’（5’-tggaattctgcagatcaccatggcaagcattcttgattgcccg；配列番号２５）１μＬ、１０μＭのリバースプライマーＡａＯＲ１０−３’（5’-gccactgtgctggatttaattataaacccgacgcagcag；配列番号２６）１μＬ及びＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  ｎｅｏＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）１μＬを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、（１）９４℃、２分間、（２）９８℃、１０秒間、（３）６３℃、３０秒間、（４）６８℃、１．５分間で行い、（２）〜（４）の工程は３５サイクル繰り返し行った。得られたＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＶで消化されたｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）にＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ社製）を使用して連結した。その後、これを大腸菌へ導入して培養することにより、ｐｃＤＮＡ３．１−ＡａＯＲ１０と名付けた発現プラスミドを得た。発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ＡａＯＲ１０の塩基配列をＤＮＡシーケンサーにより解析したところ、配列番号２７で示される塩基配列を含有することが判った。配列番号２７で示される塩基配列は配列番号２８で示されるアミノ酸配列をコードする。
【００３５】
ハマダラカ嗅覚受容体ＯＲ１０（以下、ＡｇＯＲ１０という場合もある。）の発現プラスミド
上記方法により調製されたハマダラカ頭部由来のｃＤＮＡ１μＬを鋳型に用い、１０μＭのフォワードプライマーＡｇＯＲ１０−５’（5’-caccatggaggtcctcaactgtccgctact；配列番号２９）１μＬ、１０μＭのリバースプライマーＡｇＯＲ１０−３’（5’-ttaattgtaaactcttctcagaagcgtaa；配列番号３０）１μＬ及びＫＯＤ  ＰｌｕｓＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）１μＬを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、（１）９４℃、５分間、（２）９８℃、１０秒間、（３）６０℃、３０秒間、（４）６８℃、１．５分間で行い、（２）〜（４）の工程は３５サイクル繰り返し行った。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動した後、当該ゲル上で検出された約１．１ｋｂのＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡをｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクター（インビトロジェン社製）へ導入し、ｐＥＮＴＲ−ＡｇＯＲ１０と名付けたプラスミドを得た。４μＬのｐＥＮＴＲ−ＡｇＯＲ１０、１μＬのｐｃＤＮＡ６．２Ｖ５−ＤＥＳＴ及び２μＬのＬＲクロナーゼＩＩ（インビトロジェン社製）を混合して室温で１時間保持した。得られた混合物を大腸菌へ導入し培養することにより、ｐｃＤＮＡ６．２−ＡｇＯＲ１０と名付けた発現プラスミドを得た。発現プラスミドｐｃＤＮＡ６．２−ＡｇＯＲ１０の塩基配列をＤＮＡシーケンサーにより解析したところ、配列番号３１で示される塩基配列を含有することが判った。配列番号３１で示される塩基配列は配列番号３２で示されるアミノ酸配列をコードする。
【００３６】
ハマダラカ嗅覚受容体ＯＲ２８（以下、ＡｇＯＲ２８という場合もある。）の発現プラスミド
上記方法により調製されたハマダラカ頭部由来のｃＤＮＡ１μＬを鋳型に用い、
１０μＭのフォワードプライマーＡｇＯＲ２８−５’（5’-caccatggcccgtttggtactgcacgaggt；配列番号３３）１μＬ、１０μＭのリバースプライマーＡｇＯＲ２８−３’（5’-ttattgctgattgatggtttgcagtaagg；配列番号３４）１μＬ及びＫＯＤ  ＰｌｕｓＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）１μＬを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、（１）９４℃、５分間、（２）９８℃、１０秒間、（３）６０℃、３０秒間、（４）６８℃、１．５分間で行い、（２）〜（４）の工程は３５サイクル繰り返し行った。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動した後、当該ゲル上で検出された約１．３ｋｂのＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡをｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクター（インビトロジェン社製）へ導入し、ｐＥＮＴＲ−ＡｇＯＲ２８と名付けたプラスミドを得た。４μＬのｐＥＮＴＲ−ＡｇＯＲ１０、１μＬのｐｃＤＮＡ６．２Ｖ５−ＤＥＳＴ及び２μＬのＬＲクロナーゼＩＩ（インビトロジェン社製）を混合して室温で１時間保持した。得られた混合物を大腸菌へ導入し培養することにより、ｐｃＤＮＡ６．２−ＡｇＯＲ２８と名付けた発現プラスミドを得た。発現プラスミドｐｃＤＮＡ６．２−ＡｇＯＲ２８の塩基配列をＤＮＡシーケンサーにより解析したところ、配列番号３５で示される塩基配列を含有することが判った。配列番号３５で示される塩基配列は配列番号３６で示されるアミノ酸配列をコードする。
【００３７】
カイコガ嗅覚受容体ＯＲ５６（以下、ＢｍＯＲ５６という場合もある。）の発現プラスミド
いずれか一方のＤＮＡ鎖に配列番号３７で示される塩基配列を有する二本鎖ＤＮＡを合成した。配列番号３７で示される塩基配列を有する二本鎖ＤＮＡ１００ｎｇを鋳型に用いて、１０μＭのフォワードプライマーＢｍＯＲ５６−５’（5’-tggaattctgcagatcaccatgaagctcctggagaagctag；配列番号３８）１μＬ、１０μＭのリバースプライマーＢｍＯＲ５６−３’（5’-gccactgtgctggattcatgttttattcatttgcgactgac；配列番号３９）１μＬ及びＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  ｎｅｏＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）１μＬを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、（１）９４℃、２分間、（２）９８℃、１０秒間、（３）６３℃、３０秒間、（４）６８℃、１．５分間で行い、（２）〜（４）の工程は３５サイクル繰り返し行った。得られたＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＶで消化されたｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）に、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ社製）を使用して連結した。その後、これを大腸菌へ導入して培養することにより、ｐｃＤＮＡ３．１−ＢｍＯＲ５６と名付けた発現プラスミドを得た。発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ＢｍＯＲ５６の塩基配列をＤＮＡシーケンサーにより解析したところ、配列番号３７で示される塩基配列を含有することが判った。配列番号３７で示される塩基配列は配列番号４０で示されるアミノ酸配列をコードする。
【００３８】
ショウジョウバエ嗅覚受容体ＯＲ４７ａ（以下、ＤｍＯＲ４７ａという場合もある。）の発現プラスミド
上記方法により調製されたショウジョウバエ由来のｃＤＮＡ１μＬを鋳型に用い、１０μＭのフォワードプライマーＤｍＯＲ４７ａ−５’（5’-caccatggacagttttctgcaagtacagaaga；配列番号４１）１μＬ、１０μＭのリバースプライマーＤｍＯＲ４７ａ−３’（5’-ttaggagaatgatctcagcattgtgatgta；配列番号４２）１μＬ及びＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  ｎｅｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）１μＬを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、（１）９４℃、２分間、（２）９８℃、１０秒間、（３）６８℃、１．５分間で行い、（２）〜（３）の工程は３５サイクル繰り返し行った。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動した後、当該ゲル上で検出された約１．５ｋｂのＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡをｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクター（インビトロジェン社製）へクローニングし、ｐＥＮＴＲ−ＤｍＯＲ４７ａと名付けたプラスミドを得た。４μＬのｐＥＮＴＲ−ＤｍＯＲ４７ａ、１μＬのｐｃＤＮＡ６．２Ｖ５−ＤＥＳＴ及び２μＬのＬＲクロナーゼＩＩ（インビトロジェン社製）を混合して室温で１時間保持した。得られた混合物を大腸菌へ導入し培養することにより、ｐｃＤＮＡ６．２−ＤｍＯＲ４７ａと名付けた発現プラスミドを得た。発現プラスミドｐｃＤＮＡ６．２−ＤｍＯＲ４７ａの塩基配列をＤＮＡシーケンサーにより解析したところ、配列番号４３で示される塩基配列を含有することが判った。配列番号４３で示される塩基配列は配列番号４４で示されるアミノ酸配列をコードする。
【００３９】
＜イクオリン（Ａｅｑｕｏｒｉｎ）発現プラスミドの作製＞
Ａｅｑｕｏｒｉｎをコードする配列番号４５で示される塩基配列がｐＭＤ１９ベクターにクローニングされたプラスミド（ｐＭＤ１９−ＡＥＱ）５０ｎｇを鋳型に用い、１０μＭのフォワードプライマーＡＥＱ−５’（5’-caccatgacaagcaaacaatactc；配列番号４６）１μＬ、１０μＭのリバースプライマーＡＥＱ−３’（5’-ttaggggacagctccaccgtag；配列番号４７）１μＬ及びＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  ｎｅｏＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）１μＬを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、（１）９５℃、３分間、（２）９５℃、３０秒間、（３）６０℃、３０秒間、（４）６８℃、１分間で行い、（２）〜（４）の工程は３５サイクル繰り返し行った。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動した後、当該ゲル上で検出された約６００ｂｐのＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡをｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクター（インビトロジェン社製）へ導入し、ｐＥＮＴＲ−ＡＥＱと名付けたプラスミドを得た。配列番号４５で示される塩基配列は配列番号４８で示されるアミノ酸配列をコードする。４μＬのｐＥＮＴＲ−ＡＥＱ、１μＬのｐｃＤＮＡ６．２Ｖ５−ＤＥＳＴ及び２μＬのＬＲクロナーゼＩＩ（インビトロジェン社製）を混合し室温で１時間保持した。得られた混合物を大腸菌へ導入し増幅することにより、ｐｃＤＮＡ６．２−ＡＥＱと名付けたプラスミドを得た。プラスミドｐｃＤＮＡ６．２−ＡＥＱ１００ｎｇを鋳型に用い、１０μＭのフォワードプライマーＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＡＥＱ−５’（5’-gtggcggccgctcgaggccaccatgacaagcaaacaatactc；配列番号４９）１μＬ、１０μＭのリバースプライマーＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＡＥＱ−３’（5’-gccctctagactcgagttaggggacagctccaccgtag；配列番号５０）１μＬ及びＫＯＤ  ｎｅｏ  Ｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）１μＬを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、（１）９５℃、３分間、（２）９５℃、３０秒間、（３）６０℃、３０秒間、（４）６８℃、１分間で行い、（２）〜（４）の工程は３５サイクル繰り返し行った。得られたＤＮＡをアガロースゲル電気泳動した後、当該ゲル上で検出された約６００ｂｐのＤＮＡを回収してこれをインサートＤＮＡ１とした。ｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）をＸｈｏＩで消化したものをベクターとして用い、これに上記インサートＤＮＡ１をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ社製）を用いて連結した。その後、これを大腸菌へ導入し培養することによりｐｃＤＮＡ３．１−ＡＥＱと名付けたプラスミドを得た。ｐｃＤＮＡ６．２−ＡＥＱ５０ｎｇを鋳型に用い、１０μＭのフォワードプライマーＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＡＥＱ−５’（5’-gtggcggccgctcgaggccaccatgacaagcaaacaatactc；配列番号５１）１μＬ、１０μＭのリバースプライマーＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＡＥＱ−３’（5’-gccctctagactcgagttaggggacagctccaccgtag；配列番号５２）１μＬ及びＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  ｎｅｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）１μＬを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、（１）９５℃、３分間、（２）９５℃、３０秒間、（３）６０℃、３０秒間、（４）６８℃、１分間で行い、（２）〜（４）の工程は３５サイクル繰り返し行った。得られたＤＮＡをアガロースゲル電気泳動した後、当該ゲル上で検出された約６００ｂｐのＤＮＡを回収してこれをインサー���ＤＮＡ２とした。ｐｃＤＮＡ３．１（ｈｙｇｒｏ）（インビトロジェン社製）をＸｈｏＩで消化したものをベクターとして用い、これに上記インサートＤＮＡ２をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ社製）を用いて連結した後、大腸菌へ導入し培養することによりｐｃＤＮＡ３．１（ｈｙｇｒｏ）−ＡＥＱと名付けた発現プラスミドを得た。
【００４０】
＜発現プラスミドの細胞への導入＞
ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入）を１０ｃｍシャーレに３×１０６ｃｅｌｌｓ／シャーレで播種し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地（ナカライテスク社製）中で、３７℃、５％ＣＯ２条件下にて約２４時間培養した。作製したいずれかの共受容体発現プラスミド３μｇと、作製したいずれかの嗅覚受容体発現プラスミド１．５μｇと、Ａｅｑｕｏｒｉｎ発現プラスミド８μｇとを、１２．５μＬのＰｌｕｓ試薬及び３１．２５μＬのリポフェクトアミンＬＴＸ（インビトロジェン社製）と混合し、３０分間保持した。その後、この混合液を上記細胞にトランスフェクションした。トランスフェクション開始４時間後に９６ｗｅｌｌプレートに９×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地（ナカライテスク社製）中で、３７℃、５％ＣＯ２条件下にて約２４時間培養した。これにより、共受容体発現プラスミド、嗅覚受容体発現プラスミド及びＡｅｑｕｏｒｉｎ発現プラスミドが導入されたトランジェントな形質転換細胞を得た。
【００４１】
＜活性測定＞
イクオリンはカルシウムイオンと結合すると活性化されてセレンテラジン等の基質を酸化して発光する。したがって、イクオリンを発現する細胞の細胞内カルシウムイオン濃度の上昇は直接、発光量の増大として現れることになるため、被検物質の添加により嗅覚受容体複合体がイオンチャネルとして機能しているかどうかを発光量の変化から測定することができる。
上記形質転換細胞の培養液を除去してＡｓｓａｙ  ｂｕｆｆｅｒ（０．５μＭセレンテラジンｈ（プロメガ社製）及び０．３％のＢＳＡを含むＨａｎｋｓ−ＨＥＰＥＳ（２０  ｍＭ  ｐＨ  ７．４））に置換し、更に４時間、室温で静置した。次いで、Ｆｌｅｘｓｔａｔｉｏｎ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いて、嗅覚受容体に対応する被検物質を細胞の培養液中に添加するとともに細胞の発光量を測定した。対照物質としてジメチルスルホキシドを添加した細胞での発光量を１とし、被検物質を添加した細胞の発光量を相対値として算出した。
【００４２】
（実施例１）
嗅覚受容体ＡａＯＲ８の発現プラスミド、
共受容体ＡａＯＲＣＯ又はＡｍＯＲＣＯのいずれかの発現プラスミド、及び
Ａｅｑｕｏｒｉｎ発現プラスミド
を有する細胞を用いて、上述のように発光量を測定した。被検物質としては１−オクテン−３−オールを用い、１０−４Ｍ、１０−５Ｍ、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、又は１０−９Ｍの濃度で培養液に添加した。その結果を図１に示す。シマカのＡａＯＲ８とＡａＯＲＣＯとの複合体を発現する細胞よりも、シマカＡａＯＲ８とミツバチＡｍＯＲＣＯとの複合体を発現する細胞の方が、１−オクテン−３−オールに対して、強く応答することが示された。
【００４３】
（実施例２）
嗅覚受容体ＡａＯＲ１０の発現プラスミド、
共受容体ＡａＯＲＣＯ又はＡｍＯＲＣＯのいずれかの発現プラスミド、及び
Ａｅｑｕｏｒｉｎ発現プラスミド
を有する細胞を用いて、上述のように発光量を測定した。被検物質としてはベンズアルデヒドを用い、１０−３Ｍ、１０−４Ｍ、１０−５Ｍ、１０−６Ｍ、又は１０−７Ｍの濃度で培養液に添加した。その結果を図２に示す。シマカのＡａＯＲ１０とＡａＯＲＣＯとの複合体を発現する細胞よりも、シマカＡａＯＲ１０とミツバチＡｍＯＲＣＯとの複合体を発現する細胞の方が、ベンズアルデヒドに対して、強く応答することが示された。
【００４４】
（実施例３）
嗅覚受容体ＡｇＯＲ１０の発現プラスミド、
共受容体ＡｇＯＲＣＯ又はＡｍＯＲＣＯのいずれかの発現プラスミド、及び
Ａｅｑｕｏｒｉｎ発現プラスミド
を有する細胞を用いて、上述のように発光量を測定した。被検物質としてはベンズアルデヒドを用い、１０−３Ｍ、１０−４Ｍ、１０−５Ｍ、１０−６Ｍ、又は１０−７Ｍの濃度で培養液に添加した。その結果を図３に示す。ハマダラカのＡｇＯＲ１０とＡｇＯＲＣＯとの複合体を発現する細胞よりも、ハマダラカＡｇＯＲ１０とミツバチＡｍＯＲＣＯとの複合体を発現する細胞の方が、ベンズアルデヒドに対して、強く応答することが示された。
【００４５】
（実施例４）
嗅覚受容体ＡｇＯＲ２８の発現プラスミド、
共受容体ＡｇＯＲＣＯ又はＡｍＯＲＣＯのいずれかの発現プラスミド、及び
Ａｅｑｕｏｒｉｎ発現プラスミド
を有する細胞を用いて、上述のように発光量を測定した。被検物質としては２，４，５−トリメチルチアゾールを用い、１０−３Ｍ、１０−４Ｍ、１０−５Ｍ、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、又は１０−８Ｍの濃度で培養液に添加した。その結果を図４に示す。ハマダラカのＡｇＯＲ２８とＡｇＯＲＣＯとの複合体を発現する細胞よりも、ハマダラカＡｇＯＲ２８とミツバチＡｍＯＲＣＯとの複合体を発現する細胞の方が、２，４，５−トリメチルチアゾールに対して、強く応答することが示された。
【００４６】
（実施例５）
嗅覚受容体ＢｍＯＲ５６の発現プラスミド、
共受容体ＢｍＯＲＣＯ又はＡｍＯＲＣＯのいずれかの発現プラスミド、及び
Ａｅｑｕｏｒｉｎ発現プラスミド
を有する細胞を用いて、上述のように発光量を測定した。被検物質としてはｃｉｓ−ジャスモンを用い、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ又は１０−１０Ｍの濃度で培養液に添加した。その結果を図５に示す。カイコガのＢｍＯＲ５６とＢｍＯＲＣＯとの複合体を発現する細胞よりも、カイコガＢｍＯＲ５６とミツバチＡｍＯＲＣＯとの複合体を発現する細胞の方が、ｃｉｓ−ジャスモンに対して、強く応答することが示された。
【００４７】
（実施例６）
嗅覚受容体ＤｍＯＲ４７ａの発現プラスミド、
共受容体ＤｍＯＲＣＯ又はＡｍＯＲＣＯのいずれかの発現プラスミド、及び
Ａｅｑｕｏｒｉｎ発現プラスミド
を有する細胞を用いて、上述のように発光量を測定した。被検物質としてはペンチルアセテートを用い、１０−４Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、又は５×１０−７Ｍの濃度で培養液に添加した。その結果を図６に示す。ショウジョウバエのＤｍＯＲ４７ａとＤｍＯＲＣＯとの複合体を発現する細胞よりも、ショウジョウバエＤｍＯＲ４７ａとミツバチＡｍＯＲＣＯとの複合体を発現する細胞の方が、ペンチルアセテートに対して、強く応答することが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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