(57)【要約】【課題】    本発明は、優れた抗菌活性、エンドトキン中和活性、及び創傷治癒活性を有し、長期間処方しても安全性に優れる組成物及びその用途を提供することを目的とする。  また、本発明は、優れた抗菌活性、エンドトキシン中和活性、及び創傷治癒活性を有し、長期間処方しても安全性に優れるペプチドを提供することを目的とする。【解決手段】    以下の（Ａ）〜（Ｂ）のペプチドのいずれかを有効成分として含有することを特徴とする生理活性を有する組成物が、優れた抗菌活性、エンドトキシン中和活性、及び創傷治癒活性を有する。（Ａ）配列番号１３〜２４で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（Ｂ）配列番号１３〜２４で表されるアミノ酸配列において１個〜３個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるペプチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（Ａ）〜（Ｂ）のペプチドのいずれかを有効成分として含有することを特徴とする生理活性を有する組成物。
（Ａ）配列番号１３〜２４で表されるアミノ酸配列からなるペプチド
（Ｂ）配列番号１３〜２４で表されるアミノ酸配列において１個〜３個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるペプチド
【請求項２】
生理活性が、抗菌活性、エンドトキシン中和活性及び創傷治癒活性のうち１つ以上である、請求項１記載の生理活性を有する組成物。
【請求項３】
以下の（Ａ）〜（Ｂ）のペプチドのいずれかを有効成分とする生理活性剤。
（Ａ）配列番号１３〜２４で表されるアミノ酸配列からなるペプチド
（Ｂ）配列番号１３〜２４で表されるアミノ酸配列において１個〜３個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるペプチド
【請求項４】
生理活性剤が、抗菌剤、エンドトキシン中和剤及び創傷治癒剤のうち１つ以上である、請求項３記載の生理活性剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生理活性を有する組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
人は、加齢とともに発音、咀嚼、嚥下、唾液分泌などの口腔機能が低下する。なかでも唾液分泌が低下すると、歯周病や口内炎、齲蝕（虫歯）、口臭といった口腔疾患が増大する。また、皮膚の疾患や傷害によって皮膚のバリア機能や保湿機能が低下する。更に、乳幼児や高齢者の免疫機能は低いため、病原菌に感染しやすい。これらの機能の低下は、国民の健康の維持と増進にとって重大な課題である。
【０００３】
これまで、口腔ケア用品等に添加される抗菌成分又は殺菌成分としては、エタノール等の有機溶剤や抗生物質などが提案されている（例えば、特許文献１参照）。しかしながら、前記有機溶剤を用いた口腔ケア用品は、体質的に受け入れられないという問題、乳幼児には使用できないという問題があり、前記抗生物質を用いた口腔ケア用品では、長期間使用により耐性菌が出現するという問題がある。
【０００４】
一方、動物、植物、昆虫、微生物等の様々な生物には、外界からの病原微生物の侵入に対して自己防御するための自己生体防御機構が本来備っており、多糖分解酵素や溶菌酵素などのタンパク質やアミノ酸が約１０個〜約５０個程度からなる抗菌ペプチドを生物自らが産生している。これらの抗菌成分は、前記抗生物質と比較して広範囲な抗菌活性を有し、耐性菌を生じさせにくいという特性を有することから、口腔用抗菌剤としての利用が期待されている。
【０００５】
生物由来の抗菌剤として、例えば、イネ由来の抗菌タンパク質であるオリザシスタチンが知られている。しかしながら、オリザシスタチンは、歯周病原因菌（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ等）のジンジパインを阻害することが知られているものの、その菌体に対して直接抗菌活性を示すものではない。
イネゲノム中にはディフェンシンなど既知の抗菌タンパク質のホモログが存在するが、イネの生体防御に対する寄与は不明である。
【０００６】
本発明者らは、イネ種子に由来し、歯周病の治療や予防に有効な、歯周病菌のプロテアーゼに対する阻害活性を有するペプチドを報告している（例えば、特許文献２参照）。
【０００７】
しかしながら、未だ、生物由来であって、菌体に対して強い抗菌作用を有し、且つ、エンドトキシン中和活性、創傷治癒活性のような生理活性を有する組成物の開発が望まれているのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００７−８４４７１号公報
【特許文献２】特許第４９８２９０８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、優れた抗菌活性、エンドトキシン中和活性及び創傷治癒活性のうち１つ以上を有し、長期間処方しても安全性に優れる組成物及びその用途を提供することを目的とする。
また、本発明は、優れた抗菌活性、エンドトキシン中和活性及び創傷治癒活性のうち１つ以上を有し、長期間処方しても安全性に優れるペプチドを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、以下の（Ａ）〜（Ｂ）のペプチドのいずれかを有効成分として含有することを特徴とする生理活性を有する組成物が、優れた抗菌活性、エンドトキシン中和活性、及び創傷治癒活性を有することを見出し本発明を完成させた。
（Ａ）配列番号１３〜２４で表されるアミノ酸配列からなるペプチド
（Ｂ）配列番号１３〜２４で表されるアミノ酸配列において１個〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるペプチド。
【００１１】
すなわち本発明は、
（１）以下の（Ａ）〜（Ｂ）のペプチドのいずれかを有効成分として含有することを特徴とする生理活性を有する組成物。
（Ａ）配列番号１３〜２４で表されるアミノ酸配列からなるペプチド
（Ｂ）配列番号１３〜２４で表されるアミノ酸配列において１個〜３個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるペプチド、
（２）生理活性が、抗菌活性、エンドトキシン中和活性及び創傷治癒活性のうち１つ以上である、（１）記載の生理活性を有する組成物、
（３）以下の（Ａ）〜（Ｂ）のペプチドのいずれかを有効成分とする生理活性剤。
（Ａ）配列番号１３〜２４で表されるアミノ酸配列からなるペプチド
（Ｂ）配列番号１３〜２４で表されるアミノ酸配列において１個〜３個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるペプチド、
（４）生理活性剤が、抗菌剤、エンドトキシン中和剤及び創傷治癒剤のうち１つ以上である、（３）記載の生理活性剤、
である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、従来における前記諸問題を解決することができ、優れた抗菌活性、エンドトキシン中和活性、及び創傷治癒活性のうち１つ以上を有し、長期間処方しても安全性に優れる生理活性を有する組成物、及びその用途を提供することができる。
また、本発明によれば、従来における前記諸問題を解決することができ、優れた抗菌活性、エンドトキシン中和活性、及び創傷治癒活性を有し、長期間処方しても安全性に優れるペプチドを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】納豆抽出物の等電点電気泳動による分画した結果を示すグラフである。
【図２】納豆抽出物の等電点電気泳動による分画したフラクションの抗菌活性を測定した結果を示すグラフである。
【図３】合成したペプチドのエンドトキシン中和活性を測定した結果を示すグラフである。
【図４−１】合成したペプチド（配列番号１３〜１８）の管腔形成促進活性を測定した結果を示すグラフと顕微鏡観察した細胞の写真を示す図である。
【図４−２】合成したペプチド（配列番号１９〜２４）の管腔形成促進活性を測定した結果を示すグラフと顕微鏡観察した細胞の写真を示す図である。
【図４−３】管腔形成促進活性を示すLL-37（配列番号２５）を添加したときの顕微鏡観察した細胞の写真を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
（生理活性を有する組成物）
本発明の生理活性を有する組成物は、以下の（Ａ）〜（Ｂ）のペプチドのいずれかを有効成分として含有することからなる。
（Ａ）配列番号１３〜２４で表されるアミノ酸配列からなるペプチド
（Ｂ）配列番号１３〜２４で表されるアミノ酸配列において１個〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるペプチド
【００１５】
本発明でいう生理活性とは、抗菌活性、エンドトキシン中和活性または創傷治癒活性をいう。
本発明の抗菌活性としては、例えば、歯周病の原因となるグラム陰性細菌（Ｐ． ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ  ＡＴＣＣ  ３３２７７）に対する抗菌活性、う蝕（虫歯）の原因となるグラム陽性菌（Ｓ． ｍｕｔａｎｓ  ＪＣＭ  ５７０５）に対する抗菌活性、にきび（アクネ）の原因となるグラム陽性菌（Ｐ． ａｃｎｅｓ  ＪＣＭ  ６４７３）に対する抗菌活性、日和見感染症の原因となる真菌（Ｃ． ａｌｂｉｃａｎｓ  ＮＢＲＣ  １３８５）に対する抗菌活性が挙げられる。
本発明のエンドトキシン中和活性は、カブトガニ血球抽出物を用いたリムルステストにおいて、エンドトキシンが引き起こす反応を阻害する活性が挙げられる。
本発明の創傷治癒活性としては、例えば、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞の管腔形成促進作用に基づくものが挙げられる。
【００１６】
（ペプチド）
前記ペプチドは、配列番号１３〜２４で表されるアミノ酸配列からなるペプチドに限定されず、抗菌活性、エンドトキシン中和活性、及び創傷治癒活性の生理活性を有する限り、配列番号１３〜２４で表されるアミノ酸配列において１個〜３個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであってもよい。
配列番号１３〜２４で表されるアミノ酸配列からなるペプチドは、例えば、納豆より得ることができるし、また、化学合成により得ることもできる。
配列番号１３〜２４表されるアミノ酸配列からなるペプチドを表３に示す。これらのペプチドは、抗菌活性、エンドトキシン中和活性及び創傷治癒活性のうち１つ以上の活性を有する。
これらのペプチドの中でも、配列番号１３、１４、１６、１７、１８、２１、２２で表されるアミノ酸配列からなるペプチドが、エンドトキシン中和活性及び創傷治癒活性を有するため好ましく、さらに、配列番号１４、１７、１８、２１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドが抗菌活性、エンドトキシン中和活性及び創傷治癒活性を有するためより好ましい。
なお、配列番号１５は、エンドトキシン中和活性を有し、配列番号１９、２０、２３、２４は創傷治癒活性を有する。
【００１７】
「１個〜３個のアミノ酸が欠失、置換又は付加された」とは、部位特異的変異法等の公知の変異ペプチド作製法により欠失、置換又は付加できる程度の数（好ましくは１〜２個、より好ましくは１個）のアミノ酸が欠失、置換又は付加されることを意味する。このような変異ポリペプチドは、公知の変異ポリペプチド作製法により人為的に導入された変異を有するポリペプチドに限定されるものではなく、天然に存在するタンパク質から単離精製したものであってもよい。タンパク質のアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、当該タンパク質の構造又は機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、本技術分野において周知である。更に、人為的に改変させるだけでなく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造又は機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。好ましい変異体は、保存性又は非保存性アミノ酸置換、欠失、若しくは付加を有する。より好ましくは、保存性置換、欠失、又は付加であり、特に好ましくは、保存性置換である。
【００１８】
（その他の成分）
その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、添加剤、補助剤、水などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
前記生理活性を有する組成物中の前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、本発明の効果を損なわない範囲内で、目的に応じて適宜選択することができる。
【００１９】
前記生理活性を有する組成物の用途としては、例えば、抗菌剤、エンドトキシン中和剤、創傷治癒剤などが好適に挙げられる。
【００２０】
（飲食品、医薬品、医薬部外品、化粧品又は飼料）
本発明の飲食品、医薬品、医薬部外品、化粧品又は飼料は、前記生理活性を有する組成物を含有してなる。
【実施例】
【００２１】
以下に実施例を記載することで本発明を説明するが、本発明の技術思想がこれらの例示によって限定されるものではない。尚、例中の部及び％は特に断らない限り重量基準を意味するものとする。
【００２２】
（実施例１）納豆由来ペプチドの調製と精製およびペプチドの同定
１．納豆由来ペプチドの調製
1パックの市販納豆（90 g）に250 mLの超純水を加え、乳鉢ですりつぶした。納豆断片を遠心分離(3,500 rpm, 15分間)することによって除去し、ペプチドを含む上澄液を得た。得られた上澄液を凍結乾燥し、保存した。凍結乾燥物を超純粋で溶解し、5倍量の冷却したエタノールを加えて、4℃で20分間撹拌した。その後、遠心分離(3,500rpm, 15分間)することによって生成した沈殿物を除去し、ペプチドを含む上澄液を得た。次に、その上澄液に含まれるエタノールを、ロータリーエバポレターを用いて、除去し、得られたサンプルを凍結乾燥し、保存した。サンプルを溶解した後、Spectra/Por（登録商標）Dialysis Membrane, MWCO: 500~1,000 (131096, Spectrum Laboratories, Inc.) を用いて、透析を行うことによって、遊離アミノ酸などの低分子成分を除去した。この透析液をアシストチューブに回収し、凍結乾燥した。
【００２３】
２．等電点電気泳動による納豆抽出物由来ペプチドの分画
前記のようにして調製した200 mgの納豆抽出物を、分取用等電点電気泳動装置（Rotofor（登録商標）170-2950、Bio-Rad)を用いて20のフラクションに分画した。すなわち、200 mgの加水分解物を50 mLの超純水に溶解して、サンプル溶液とした。分離は12Wにて150分間行った。電気泳動泳動が終了した後、各フラクションを回収し、pHを測定した後、−80 ℃において凍結し、凍結乾燥機を用いて凍結乾燥し、回収された重量を測定した。
納豆抽出物を等電点電気泳動により分画した結果を図１に示した。
【００２４】
３．逆相クロマトグラフィーによる納豆抽出物由来ペプチドの精製
逆相クロマトグラフィーは、ポンプ(LC-10ATvp：島津製作所)、オンラインデガッサー(DGU-12A：島津製作所)、カラムオーブン(CTO-10Avp：島津製作所)、検出器(SPD- 10AVvp：島津製作所)、フラクションコレクター(FRC-10A：島津製作所)、システムコントローラー(SCL-10Avp：島津製作所)を連結した高速液体クロマトグラフィー装置を使用した。クロマトグラフィー操作とデータ解析にはソフトウェア（LabSolutions、島津製作所)を用いた。分離カラムはCAPCELL PAK C-18（カラム：直径10mm×長さ150 mm、粒子径 5 ?m, SHISEIDO: 90603）およびInertsil WP300 C8（カラム：直径10×長さ150 mm, 粒子径5 ?m, GL Science Inc.: 5020-85735）を用いた。溶出液はアセトニトリル（1.00030.4000: メルク）、トリフルオロ酢酸（34833-92: ナカライテスク）および超純水を使用し、調製した。溶出液Aとして0.1 % トリフルオロ酢酸(v/v)、及び溶出液Bとして0.1 % トリフルオロ酢酸を含む 80 %  (v/v)アセトニトリルを用いた。
溶出液Bの濃度を、初期濃度0 %から毎分1 %の速度で直線的に高めて、70分後に
70 %となるように、さらに70~90分の間は100 %となるようにタイムプログラムを設定し、溶出した。流速は2.0 mL/minとして、溶出開始7分後から30秒ごとに溶出液を分取し、波長210 nmにおける吸光度を測定し、ピークを検出した。各ピーク画分は、−80 ℃において凍結し、凍結乾燥した。
各ピークのフラクションを再度、同じ分離カラムを用いて、精製し、単一ピークを得た。
【００２５】
４．マトリックス支援レーザ脱離イオン化飛行時間型質量分析計（MALDI-TOF/MS）を用いた納豆抽出物由来ペプチドの同定
ペプチドの質量（MS）解析を行うために、マトリックスとしてα-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid [HCCA]（#201344: Bruker Daltonics）、キャリブレーション試薬としてPeptide calibration standard II（#222570: Bruker Daltonics）を使用した。500 ?Lの TA溶液（100 %アセトニトリル：0.1 % トリフルオロ酢酸 = 1：2 [v/v]の割合で混合した緩衝液）にHCCAを耳かき１杯程度混ぜた後、10分間の超音波処理によって溶解させ、HCCA飽和溶液（マトリックス溶液）を調製した。調製したマトリックス溶液を9,000×gにて10分間遠心分離し、MS用サンプルチューブ(Eppendorf)内において、2 mL の80 % アセトニトリルで溶解した1 ?Lのサンプル溶液と4 ?Lのマトリックス溶液の上澄液を混合した。調製した5 ?Lのマトリックス混合サンプルのうち1 ?Lを MTP 384 target ground steel TF (#209519、Bruker Daltonics)にスポットし、乾燥するまで静置した。また、分子量のキャリブレーションのため、キャリブレーション試薬をサンプルと同様に調製して、スポットした。
スポットしたサンプルおよびキャリブレーション試薬が乾燥した後、Auto Flex-III（登録商標）(Bruker Daltonics) を用いてMALDI-TOF/MSおよびMS/MS解析を行った。MS-Rangeはm/z 800~43,000の範囲で調節し、検出器の電位は1300~1800 Vとして走査した。得られたMSまたはMS/MSのスペクトルは、処理ソフトflexAnalysis（登録商標）  (Bruker Daltonics)およびbiotools（登録商標） (Bruker Daltonics)を用いてデータを処理した後、解析ソフトMascot searchTM (Matrix Science Ltd.)を用いて、NCBIのデータベース (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/fasta.shtml) と照合し、候補ペプチドの検索を行った。このとき、サンプルの消化酵素として特定の酵素を選択しない”none”を選択して検索した。
同定できた納豆抽出物中のペプチドを表１-１から表１-４に示した。
【００２６】
（表１-１）画分No.16  から同定したペプチド
2018052851.tif 000002
【００２７】
（表１-２）画分No.17から同定したペプチド
2018052851.tif 000003
【００２８】
（表１-３）画分No.18から同定したペプチド    
2018052851.tif 000004
【００２９】
（表１-４）画分No.19から同定したペプチド
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【００３０】
（実施例２）納豆抽出物由来フラクションと同定したペプチドの抗菌活性
１．抗菌試験
等電点電気泳動によって分画した各フラクションまたは表１-１から表１-４に示すフラクションに含まれる同定したペプチドを培地に添加し、表２に示す被験菌に対する抗菌活性を測定した。
【００３１】
（表２）被験菌として使用した疾病に関連する微生物
2018052851.tif 000006
【００３２】
グラム陰性細菌（Ｐ． ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ  ＡＴＣＣ  ３３２７７）は、変法ＧＡＭ培地（１Ｌ中、ペプトン５．０ｇ、ダイズペプトン３．０ｇ、プロテオーゼペプトン５．０ｇ、消化血清末１０．０ｇ、酵母エキス末２．５ｇ、肉エキス末２．２ｇ、肝臓エキス末１．２ｇ、ブドウ糖０．５ｇ、溶性デンプン５．０ｇ、Ｌ−トリプトファン０．２ｇ、Ｌ−システイン塩酸塩０．３ｇ、チオグリコール酸ナトリウム０．３ｇ、Ｌ−アルギニン１．０ｇ、ビタミンＫ１０．００５ｇ、ヘミン０．０１ｇ、リン酸二水素カリウム２．５ｇ、塩化ナトリウム３．０ｇ、ｐＨ７．３）を用いて絶対嫌気条件下、３７℃で４８時間静置培養した。
グラム陽性細菌（Ｓ． ｍｕｔａｎｓ  ＪＣＭ  ５７０５）は、ＢＨＩ培地（１Ｌ中、豚脳エキス末４．０ｇ、豚ハートエキス末４．０ｇ、ペプトン１７．５ｇ、ブドウ糖２．０ｇ、塩化ナトリウム５．０ｇ、リン酸水素二ナトリウム２．５ｇ、ｐＨ７．２）を用いて、通性嫌気条件下、３７℃で６時間静置培養した。
グラム陽性細菌（Ｐ． ａｃｎｅｓ  ＪＣＭ  ６４７３）は、ＧＡＭ培地（１Ｌ中、ペプトン１０．０ｇ、ダイズペプトン３．０ｇ、プロテオーゼペプトン１０．０ｇ、消化血清末１３．５ｇ、酵母エキス５．０ｇ、肉エキス２．２ｇ、肝臓エキス１．２ｇ、ブドウ糖３．０ｇ、リン酸二水素カリウム２．５ｇ、塩化ナトリウム３．０ｇ、溶性デンプン５．０ｇ、Ｌ−システイン塩酸塩０．３ｇ、チオグリコール酸ナトリウム０．３ｇ、ｐＨ７．１）を用いて、通性嫌気条件下、３７℃で２４時間静置培養した。
真菌（Ｃ． ａｌｂｉｃａｎｓ  ＮＢＲＣ  １３８５）は、ＹＭ培地（１Ｌ中、グルコース１０．０ｇ、ペプトン５．０ｇ、酵母エキス３．０ｇ、麦芽エキス１．０ｇ、ｐＨ６．２）を用いて、通性嫌気条件下、２５℃で２４時間静置培養した。
被験菌に対する抗菌活性試験は、以下の手順で行った。被験菌の培養に用いたものと同じ培地に、８０μＬの各被験菌の培養液を播種した後、所定の温度に設定したインキュベーターに入れて所定の時間培養した。その後、新たな培地に植え継いで、さらに所定の時間培養した。得られた前培養液を段階希釈することでＯＤ６５０＝５．０×１０−５の種菌液を調製した。
【００３３】
次に、リザーバーを用意して、各レーンに３００μＬの１．３３倍濃度の培地、１００μＬの各ペプチド溶液（等電点電気泳動によって分画した各フラクションの濃度は1.5ｍｇ／ｍＬに調節した。また化学合成したペプチドの濃度は、100μＭ、200μＭまたは300μＭに調節した。）、１００μＬの前記種菌液を添加してよく混合した。
コントロールとブランクには、ペプチド溶液の代わりに同量の滅菌水を添加し、更にブランクには種菌液の代わりに１倍濃度の各培地を同量添加した。ペプチド溶液を添加したもの、コントロール及びブランクのそれぞれを９６ウェル培養プレート（＃３５９５、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）のウェルに１００μＬずつ分注し、前記各被験菌の培養条件と同じ条件で培養を行った。
【００３４】
２．抗菌活性の評価方法
各ペプチドの抗菌活性は、生菌に由来するＡＴＰを定量することによって評価した。
生菌に由来するＡＴＰの定量は、ＢａｃＴｉｔｅｒ・Ｇｌｏ（登録商標） Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いたルシフェリン−ルシフェラーゼ発光法により行った。以下のように微生物からＡＴＰを抽出し、ＡＴＰ量に応じた発光強度から微生物量を測定した。
具体的には、まず、培養プレートの各ウェルに分注した１００μＬ被験菌培養液に対して１０μＬのルシフェールＡＴＰ消去試薬（キッコーマン株式会社製）を添加し、１０分間撹拌することによって生菌体外に存在するＡＴＰを分解消去させてサンプルとした。
次に、あらかじめ９６穴プレート（ＯｐｔｉＰｌａｔｅ−９６、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）の各ウェルに分注した５０μＬのＡＴＰ発光試薬に対して、前記サンプルを５０μＬ添加した。各ウェルの生菌に由来するＡＴＰ発光強度（発光波長５６０ｎｍ）を、マイクロプレートリーダー１４２０（Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ  Ａｒｖｏ（登録商標）ＭＸ、 ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を用い、Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｌｉｇｈｔ  Ｕｎｉｔ（ＲＬＵ）として測定した。１サンプルについて３回測定を行い、測定は、各菌の対数増殖初期において行った。抗菌活性は、抗菌成分を含まないコントロールのＲＬＵを１００％とし、それぞれの濃度のおけるＲＬＵから増殖率を求め、各ペプチドの増殖阻害率を算出した。
【００３５】
３．同定したペプチドの化学合成
各フラクションに含まれる同定した納豆抽出物中のペプチドのうち、表３に示す１２種類のペプチド(配列番号１３〜２４)を化学合成した。各ペプチドは、株式会社医学生物学研究所に委託して、合成した。
【００３６】
（表３）同定した納豆抽出物ペプチドのうち化学合成したペプチド
2018052851.tif 000007
【００３７】
表３中、配列番号１３〜１５のペプチド配列は、納豆抽出物由来フラクションの画分Ｎｏ16に含まれる。また、配列番号１６〜１８は納豆抽出物由来フラクションの画分Ｎｏ17に含まれる。また、配列番号１９〜２２は納豆抽出物由来フラクションの画分Ｎｏ18に含まれる。また、配列番号２３〜２４は納豆抽出物由来フラクションの画分Ｎｏ19に含まれる。
【００３８】
化学合成した１２種類のペプチドについて、納豆抽出物由来フラクションと同様に抗菌活性を測定した。
【００３９】
（各フラクションの抗菌活性の測定結果）
前記のように等電点電気泳動によって分画した各フラクションの抗菌活性を図２に示した。
分画したサンプルからは、等電点が高いフラクションに抗菌活性を検出した。
すなわち、Ｎｏ．１６及びＮｏ．１７のフラクションはＰ． ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ  ＡＴＣＣ  ３３２７７に対して、またＮｏ．１８及びＮｏ．２０のフラクションはＰ． ａｃｎｅｓ  ＪＣＭ  ６４７３に対して強い抗菌活性を示した。また、いずれのフラクションも、グラム陽性菌のＳ．  ｍｕｔａｎｓ  ＪＣＭ  ５７０５及び日和見感染真菌のＣ． ａｌｂｉｃａｎｓ  ＮＢＲＣ  １３８５に対して、抗菌活性を示さなかった。
【００４０】
（合成したペプチドの抗菌活性）
１２種類の化学合成した納豆抽出物中のペプチドの抗菌活性を表４に示した。
【００４１】
（表４）化学合成したペプチドの抗菌活性
2018052851.tif 000008
【００４２】
表４から明らかなように、前記の同定したペプチドのうち化学合成した３種類のペプチド（配列番号１４、１７及び１８）は、いずれもＰ． ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ  ＡＴＣＣ  ３３２７７に対して抗菌活性を示した。
また、配列番号１７のペプチドは、グラム陽性菌のＰ． ａｃｎｅｓ  ＪＣＭ  ６４７３及び真菌のＣ． ａｌｂｉｃａｎｓ  ＮＢＲＣ  １３８５に対しても、抗菌活性を示した。さらに配列番号２１のペプチドは、Ｓ． ｍｕｔａｎｓ  ＪＣＭ  ５７０５及び真菌のＣ． ａｌｂｉｃａｎｓ  ＮＢＲＣ  １３８５に対して、抗菌活性を示した。
【００４３】
（実施例３）化学合成したペプチドのエンドトキシン中和活性
「エンドスペシーＥＳ−５０Ｍセット」（生化学工業株式会社製）及び「エンドトキシン標準品ＣＳＥ−Ｌセット」（生化学工業株式会社製）を用いてエンドトキシン中和活性を評価した。
１２種類の化学合成したペプチドを用いた。９６ウェルプレート（＃３５９５  マルチプルウェルプレート（平底）、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）の各ウェルにエンドトキシン標準品（０．１０ＥＵ／ｍＬ）２５μＬ及びペプチド溶液（最終濃度0.1 μＭ, 0.5μＭ、及び１μＭ）を加えて、３７℃にて３０分間又は３５分間振盪しながらインキュベーションした。次に、５０μＬの前記セットに含まれていたＬＡＬ試薬を各ウェルに添加し、３７℃で１０分間振盪しながらインキュベーションした。その後、マイクロプレートリーダー（２０３０  Ａｒｖｏ  Ｘ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を用いて、波長４０５ｎｍの吸光度を測定した。ペプチド溶液の代わりに蒸留水（エンドトキシンフリー）を添加したものをコントロールとし、コントロール（０μＭ）の吸光度を１００％とした時の相対値をエンドトキシン中和活性とした。
【００４４】
１２種類の化学合成したペプチドのエンドトキシン中和の結果を図３に示した。図３から明らかなように、配列番号１３, １４, １５, １６, １７, １８, ２１及び２２の８種類のペプチドは濃度依存的にエンドトキシンを中和することが示された。特に、配列番号２１の中和活性は、0.5μＭにおいてエンドトキシンの反応を８０％以上抑制したことから、医療用の抗菌薬であり、0.1μＭにおいて約50％の中和活性を示すポリミキシンＢ（Ｐ１００４−１、Ｓｉｇｍａ社製）に匹敵する活性を有していた。
【００４５】
（実施例４）化学合成したペプチドの創傷治癒活性
１．創傷治癒活性の測定
ペプチドの創傷治癒作用を、ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈血管内皮細胞、倉敷紡績株式会社製、ＫＥ−４１０９）の管腔形成促進作用に基づいて評価した。
９６穴プレート（＃３５９５，Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）を用いて、ＨＵＶＥＣを３日間〜４日間コンフルエントな状態になるまで培養した後、ＨＥＰＥＳ緩衝液（倉敷紡績株式会社製、ＨＫ−３３２０）を用いて洗浄し、不純物を取り除いた。次に、トリプシン／ＥＤＴＡ（倉敷紡績株式会社製、ＨＫ−３１２０）で３分間処理し、剥がれてきたＨＵＶＥＣを回収し、トリプシン中和液（倉敷紡績株式会社製、ＨＫ−３２２０）に添加した。この細胞懸濁液を８００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上澄液を除去し、ＨｕＭｅｄｉａ−ＥＧ２（倉敷紡績株式会社製、ＫＥ−２１５０Ｓ）を加えて細胞濃度を２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整した。得られた細胞懸濁液と各ペプチドとを１：１の割合で混合した。
本実験では、ヒト由来の創傷治癒作用を有する生体防御ペプチドとして知られているＬＬ−３７（LLGDF FRKSK EKIGK EFKRI VQRIK DFLRN LVPRTDS：（配列番号 ２５）／株式会社ペプチド研究所製、４４４５−ｓ）をポジティブコントロールとして用いて、化学合成したペプチドの管腔形成促進作用と比較した。なお、ＬＬ−３７がヒト由来の創傷治癒作用を有する生体防御ペプチドであることは、例えば、１）  Ｍ．Ｃａｒｒｅｔｅｒｏ，  Ｍ．  Ｊ．Ｅｓｃａｍｅｚ，  Ｍ．Ｇａｒｃ?ａ，  Ｂ．Ｄｕａｒｔｅ，  Ａ．Ｈｏｌｇｕｉｎ，  Ｌ．Ｒｅｔａｍｏｓａ，  Ｊ．Ｌ．Ｊｏｒｃａｎｏ，  Ｍ．ｄｅｌ  Ｒｉｏ，  ａｎｄ  Ｆ．  Ｌａｒｃｈｅｒ：  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ  ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃａｔｈｅｌｉｃｉｄｉｎ  ＬＬ−３７．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，  （２００８）  Ｖｏｌ．１２８，  ｐｐ．２３３−２３６．、２）  Ｒ．  Ｒａｍｏｓ，  Ｊ．Ｐ．Ｓｉｌｖａ，  Ａ．Ｃ．Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ，  Ｒ  Ｃｏｓｔａ，  Ｌ．Ｇｕａｒｄａｏ，  Ｆ．Ｓｃｈｍｉｔｔ，  Ｒ．Ｓｏａｒｅｓ，  Ｍ．Ｖｉｌａｎｏｖａ，  Ｌ．Ｄｏｍｉｎｇｕｅｓ，  ａｎｄ  Ｍ．Ｇａｍａ：  Ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ＬＬ３７．  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，  （２０１１）  Ｖｏｌ．３２，  ｐｐ．１４６９−１４７６．などに記載されている。
【００４６】
２．化学合成したペプチドの創傷治癒作用
マトリゲル（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｅｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、３５４２３４）は常温では固まり、４℃で液体状態になるため、はじめに４０μＬのマトリゲルを氷上で９６穴プレート（＃３５９５，Ｃｏｒｉｎｉｇ社製）に添加した。添加したマトリゲルを３７℃で３０分間インキュベートした後、予め準備しておいた細胞懸濁液と各ペプチド、又はＬＬ−３７との混合液（１００μＬ）を添加し、１５時間培養した。
マトリゲル内でＨＵＶＥＣが形成した管腔構造を、顕微鏡を用いて４０倍の倍率で観察し、写真撮影を行った。また、得られた画像から３００×４００ｐｉｘｅｌの範囲を抽出し、形成された管腔構造をした細胞の長さの合計値を測定し、各ペプチドの創傷治癒作用を評価した。
【００４７】
各ペプチド及びＬＬ−３７のＨＵＶＥＣに対する管腔形成促進作用を図４-１から図４-３に示す。また、１０μＭのペプチドを添加した実験において、顕微鏡観察した細胞の写真を、それぞれ示す。顕微鏡観察の結果から、１０μＭのペプチドを添加したときに、無添加の場合に比べて細胞の増殖が促進され、１０μＭのＬＬ−３７を添加したときと同じように、管腔構造をした細胞の長さが増加していることがわかった。細胞の長さを定量した結果、１２種類のうち１１種類のペプチド（配列番号１３, １４, １６, １７, １８, １９, ２０, ２１, ２２, ２３及び２４）は、ＬＬ−３７と同じ濃度範囲において管腔形成促進作用を示し、その作用は濃度に依存していた。特に、２種類のペプチド（配列番号１９及び２１）は、ＬＬ−３７に比べて、ＨＵＶＥＣの管腔形成促進作用が強いことがわかった。したがって、１１種類のペプチド（配列番号１３, １４, １６, １７, １８, １９, ２０, ２１,２２, ２３及び２４）は、管腔形成促進作用を示し、創傷治癒活性を有することがわかった。
【００４８】
（実施例５）化学合成したペプチドの溶血活性
緬羊脱繊維無菌血液（０１０２−１、株式会社日本バイオテスト研究所製、以下「赤血球」とも称する）を用いて、前記ペプチドの溶血活性を試験した。
マイクロチューブ中にて、４０μｌの赤血球を９６０μｌの生理的食塩を含むリン酸緩衝液（ＰＢＳ：ｐＨ７．２）に４体積％になるように懸濁して懸濁液とした。前記懸濁液を５，０００ｒｐｍにて、５分間遠心分離した後、上澄液を除き、新たに９６０μＬのＰＢＳを加えて赤血球を再懸濁した。この操作を３回繰り返した後、得られた赤血球をサンプルとして用いた。任意の濃度に希釈された前記ペプチド溶液、又は０．１質量％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（５９５−１３１３５、和光純薬工業株式会社製）を９６穴プレート（＃３５９５、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）の各ウェルに５０μｌずつ分注した。次に、４体積％の赤血球懸濁液を各ウェルに５０μＬずつ分注した後、３７℃にて１時間インキュベーションした。その後、４，０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離を行った。遠心分離によって得られた５０μＬの上澄液を、あらかじめ５０μＬのＰＢＳ又は水を分注しておいたウェルに添加した。マイクロプレートリーダー（２０３０  ＡｒｖｏＴＭ  Ｘ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を用いて、各ウェルの４０５ｎｍにおける吸光を測定した。前記ペプチドを添加しないときの吸光度を０％、及び前記ペプチドの代わりに０．１質量％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を添加したときの吸光度を１００％として、次の式を用いて溶血活性を評価した。
溶血活性（％）＝（Ａｐｅｐｔｉｄｅ−Ａ０）×１００／（ＡＴｒｉｔｏｎＸ−１００−Ａ０）
ここで、Ａ０は無添加のときの吸光度、Ａｐｅｐｔｉｄｅは各ペプチドを添加したときの吸光度、及びＡＴｒｉｔｏｎＸ−１００は０．１質量％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を添加したときの吸光度をそれぞれ示す。
【００４９】
結果を表５に示した。
強い抗菌活性を有するが、同時に強い溶血活性を持つハチ毒中の抗菌ペプチドであるＭｅｌｉｔｔｉｎ（５１１−９７５３１、Ｓｅｒｖａ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ社製）は、１０μＭにおいて９４％の溶血活性を示した。一方、化学合成した１２種類のペプチドは、５００μＭの濃度において溶血率が1％以下であり、ほとんど溶血活性を示さなかった。したがって、１２種類のペプチドは、抗菌活性、抗炎症活性、及び創傷治癒を示す濃度範囲において、溶血活性を示さないことがわかった。
【００５０】
（表５）化学合成したペプチドの溶血活性
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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