(57)【要約】      （修正有）【課題】結合活性及びエフェクター活性の高い抗ポドプラニン抗体の提供。【解決手段】可変領域にげっ歯類由来のＣＤＲを有し、定常領域がヒト由来であるヒトキメラ又はヒト化抗ポドプラニンモノクローナル抗体であって、軽鎖定常領域にヒトλ鎖の定常領域を有するヒトキメラ又はヒト化抗ポドプラニンモノクローナル抗体。抗体と薬物とを結合させてなる抗体薬物複合体。薬物が、抗がん剤、腎臓病治療剤、ラジオアイソトープである抗体薬物複合体【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
可変領域にげっ歯類由来のＣＤＲを有し、定常領域がヒト由来であるヒトキメラ又はヒト化抗ポドプラニンモノクローナル抗体であって、軽鎖定常領域にヒトλ鎖の定常領域を有するヒトキメラ又はヒト化抗ポドプラニンモノクローナル抗体。
【請求項２】
前記ヒトλ鎖の定常領域のアミノ酸配列が、配列番号１に示すアミノ酸配列、配列番号１に示すアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号１に示すアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列である請求項１記載の抗体。
【請求項３】
可変領域に下記ａ）〜ｆ）に示すポリペプチドを含む請求項１又は２記載の抗体。
ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列、配列番号２に示すアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号２に示すアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸配列の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、
ｂ）配列番号３に示すアミノ酸配列、配列番号３に示すアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号３に示すアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸配列の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、
ｃ）配列番号４に示すアミノ酸配列、配列番号４に示すアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号４に示すアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸配列の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３、
ｄ）配列番号５に示すアミノ酸配列、配列番号５に示すアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号５に示すアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸配列の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、
ｅ）配列番号６に示すアミノ酸配列、配列番号６に示すアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号６に示すアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸配列の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、
ｆ）配列番号７に示すアミノ酸配列、配列番号７に示すアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号７に示すアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸配列の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載の抗体と薬物とを結合させてなる抗体薬物複合体。
【請求項５】
薬物が、抗がん剤である請求項４記載の抗体薬物複合体。
【請求項６】
薬物が、腎臓病治療剤である請求項４記載の抗体薬物複合体。
【請求項７】
薬物が、ラジオアイソトープである請求項４記載の抗体薬物複合体。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項記載の抗体又は抗体薬物複合体を含有する医薬組成物。
【請求項９】
請求項１〜３、５及び７のいずれか１項記載の抗体又は抗体薬物複合体を含有する抗がん薬組成物である請求項８記載の医薬組成物。
【請求項１０】
請求項６又は７記載の抗体薬物複合体を含有する腎臓病治療薬組成物である請求項８記載の医薬組成物。
【請求項１１】
請求項７記載の抗体薬物複合体を含有するがん診断薬組成物である請求項８記載の医薬組成物。
【請求項１２】
請求項７記載の抗体薬物複合体を含有する腎臓病診断薬組成物である請求項８記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新たな抗ポドプラニン抗体及び抗体薬物複合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ムチン型糖タンパク質ポドプラニン（Ｐｏｄｏｐｌａｎｉｎ）は、血小板凝集因子及び癌転移促進因子として知られている。また、ポドプラニンは、脳腫瘍、中皮腫、精巣腫瘍、卵巣がん、各種扁平上皮がん（口腔がん、咽頭がん、食道がん、肺癌、皮膚がん、子宮頸がん）などに高発現していることも知られている。これらの観点から、本発明者らは、これらのがんに対する治療薬を開発すべく、ラット抗ポドプラニンモノクローナル抗体ＮＺ−１抗体（ＮＺ−１）を作製した（非特許文献１）。ＮＺ−１は、ポドプラニンが高発現する肺がん、食道がん、脳腫瘍、悪性中皮腫などのがん細胞に対し、ＡＤＣＣ／ＣＤＣ活性による抗腫瘍効果をもたらすだけでなく、ポドプラニンとそのレセプターのＣＬＥＣ−２との結合を阻害し、がん転移を抑制する。さらに、本発明者らは、ラットＮＺ−１抗体のヒトキメラ型抗体ＮＺ−８抗体（ＮＺ−８）を作製している（特許文献１）。ＮＺ−８は常法に従いκ鎖を用いて作製した抗ポドプラニン抗体ＮＺ−１のヒトキメラ型抗体（ヒトＩｇＧ1,ｋａｐｐａ）であるが、ＡＤＣＣ／ＣＤＣ活性を測定したところ、ＮＺ−１と比べ結合活性が減少したにも関わらず、予想を遥かに上回るＡＤＣＣ／ＣＤＣ活性を示した。さらにｉｎ  ｖｉｖｏにおいても、非常に高い抗腫瘍活性を示した（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第２０１１／０４０５６５号
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｋａｔｏ  Ｙ．，Ｋａｎｅｋｏ  ＭＫ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３４９：１３０１−１３０７，２００６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、前記ＮＺ−８は、強いＡＤＣＣ／ＣＤＣ活性を有するものの結合活性が十分とは言えなかった。
従って、本発明の課題は、結合活性及びエフェクター活性の高い抗ポドプラニン抗体及び抗体薬物複合体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
そこで本発明者は、より結合活性及びエフェクター活性の高い抗ポドプラニン抗体を作製すべく種々検討したところ、通常ヒトキメラ化抗体の作製には使用しないヒトλ鎖の定常領域を軽鎖定常領域として導入することにより、全く意外にも、κ鎖を用いたヒトキメラ型抗ポドプラニン抗体（ＮＺ−８）と比較して高い結合活性と高いエフェクター活性を有し、高い抗腫瘍活性を有すること、また、この抗体は予想外にも腎糸球体上皮細胞表面に発現するポドプラニンに結合して腎臓に高集積することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、次の〔１〕〜〔１５〕を提供するものである。
【０００８】
〔１〕可変領域にげっ歯類由来のＣＤＲを有し、定常領域がヒト由来であるヒトキメラ又はヒト化抗ポドプラニンモノクローナル抗体であって、軽鎖定常領域にヒトλ鎖の定常領域を有するヒトキメラ又はヒト化抗ポドプラニンモノクローナル抗体。
〔２〕前記ヒトλ鎖の定常領域のアミノ酸配列が、配列番号１に示すアミノ酸配列、配列番号１に示すアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号１に示すアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列である〔１〕記載の抗体。
〔３〕可変領域に下記ａ）〜ｆ）に示すポリペプチドを含む〔１〕又は〔２〕記載の抗体。
ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列、配列番号２に示すアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号２に示すアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸配列の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、
ｂ）配列番号３に示すアミノ酸配列、配列番号３に示すアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号３に示すアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸配列の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、
ｃ）配列番号４に示すアミノ酸配列、配列番号４に示すアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号４に示すアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸配列の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３、
ｄ）配列番号５に示すアミノ酸配列、配列番号５に示すアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号５に示すアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸配列の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、
ｅ）配列番号６に示すアミノ酸配列、配列番号６に示すアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号６に示すアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸配列の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、
ｆ）配列番号７に示すアミノ酸配列、配列番号７に示すアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号７に示すアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸配列の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３。
〔４〕〔１〕〜〔３〕のいずれか１項記載の抗体と薬物とを結合させてなる抗体薬物複合体。
〔５〕薬物が、抗がん剤である〔４〕記載の抗体薬物複合体。
〔６〕薬物が、腎臓病治療剤である〔４〕記載の抗体薬物複合体。
〔７〕薬物が、ラジオアイソトープである〔４〕記載の抗体薬物複合体。
〔８〕〔１〕〜〔７〕のいずれか１項記載の抗体又は抗体薬物複合体を含有する医薬組成物。
〔９〕〔１〕〜〔３〕、〔５〕及び〔７〕のいずれか１項記載の抗体又は抗体薬物複合体を含有する抗がん薬組成物である〔８〕記載の医薬組成物。
〔１０〕〔６〕又は〔７〕記載の抗体薬物複合体を含有する腎臓病治療薬組成物である〔８〕記載の医薬組成物。
〔１１〕〔７〕記載の抗体薬物複合体を含有するがん診断薬組成物である〔８〕記載の医薬組成物。
〔１２〕〔７〕記載の抗体薬物複合体を含有する腎臓病診断薬組成物である〔８〕記載の医薬組成物。
〔１３〕がん治療に使用するための〔１〕〜〔３〕、〔５〕及び〔７〕のいずれか１項記載の抗体又は抗体薬物複合体。
〔１４〕がん治療薬製造のための、〔１〕〜〔３〕、〔５〕及び〔７〕のいずれか１項記載の抗体又は抗体薬物複合体の使用。
〔１５〕〔１〕〜〔３〕、〔５〕及び〔７〕のいずれか１項記載の抗体又は抗体薬物複合体の有効量を投与することを特徴とするがんの治療方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、結合活性及びエフェクター活性の高い抗ポドプラニン抗体を提供することができる。本発明の抗ポドプラニン抗体は、ポドプラニンを発現する腫瘍の治療に用いることができる。
また、本発明によれば、抗ポドプラニン抗体に薬物を結合させた抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を提供することができる。本発明のＡＤＣは、ポドプラニンを発現する腫瘍の治療又は診断に用いることができ、又は腎臓病の治療又は診断に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ポドプラニンに対するＮＺ−１、ＮＺ−８及びＮＺ−１２の反応性をフローサイトメトリーで確認した結果を示す。
【図２】ポドプラニンに対するＮＺ−１、ＮＺ−８及びＮＺ−１２のアフィニティーをＥＬＩＳＡで確認した結果を示す。
【図３】ポドプラニンに対するＮＺ−１、ＮＺ−８及びＮＺ−１２のアフィニティーをフローサイトメトリーで確認した結果を示す。
【図４】コントロールのヒトＩｇＧ、ＮＺ−１、ＮＺ−８及びＮＺ−１２のＡＤＣＣ活性の測定結果を示す。
【図５】コントロールのヒトＩｇＧ、ＮＺ−１、ＮＺ−８及びＮＺ−１２のＣＤＣ活性の測定結果を示す。
【図６】ＮＺ−１２のＡＤＣＣを介した抗腫瘍活性を確認した担癌マウスの解剖写真を示す。
【図７】担癌マウスにおけるＮＺ−１２のＡＤＣＣを介した抗腫瘍活性を調べた結果を示す。
【図８】111Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ＮＺ−１２の担癌マウスにおける体内分布を調べた結果を示す。
【図９】111Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ＮＺ−１２をカニクイザルに投与して経時的に得たプラナー画像を示す。
【図１０】111Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ＮＺ−１２をカニクイザルに投与して各臓器の％ＩＤの経時変化を算出した結果を示す。
【図１１】カニクイザルへ投与した111Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ＮＺ−１２の腎臓への集積が糸球体への特異的結合であることを確認するため、オートラジオグラフィー及びヘマトキシリンエオジン染色を行った結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明のヒトキメラ又はヒト化抗ポドプラニンモノクローナル抗体は、可変領域にげっ歯類由来のＣＤＲを有し、定常領域がヒト由来であって、軽鎖定常領域にヒトλ鎖の定常領域を有する。ヒトキメラ又はヒト化抗体作製時の定常領域には、通常ヒトκ鎖が用いられるが、本発明ではヒトλ鎖の定常領域を用いる。軽鎖定常領域にヒトλ鎖の定常領域を用いることにより、結合活性やエフェクター活性が顕著に高くなることは全く予想外であった。
【００１２】
本発明抗体の軽鎖定常領域は、ヒトλ鎖の定常領域であればよいが、当該ヒトλ鎖の定常領域としては、そのアミノ酸配列が、配列番号１に示すアミノ酸配列、配列番号１に示すアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号１に示すアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列であるのが好ましく、配列番号１に示すアミノ酸配列がより好ましい。
上記アミノ酸配列の同一性は、６０％以上であるが、７０％以上が好ましく、８０％以上がより好ましく、９０％以上がさらに好ましく、９５％以上がさらに好ましい。また、上記のアミノ酸配列の欠失、置換若しくは付加の数は、１〜５個が好ましく、１〜４個がより好ましく、１〜３個がさらに好ましく、１〜２個がさらに好ましい。
【００１３】
本発明抗体の軽鎖定常領域以外の定常領域は、ヒト由来であれば特に限定されない。例えば、重鎖定常領域は、ヒト由来であれば特に限定されない。
【００１４】
本発明抗体の可変領域のＣＤＲは、げっ歯類由来であり、ラット又はマウス由来がより好ましく、ラット由来がさらに好ましい。具体的には下記ａ）〜ｆ）に示す重鎖ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３及び軽鎖ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３を有するのが好ましく、ＮＺ−１及びＮＺ−８と同一であるのがより好ましい。
【００１５】
ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列、配列番号２に示すアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号２に示すアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸配列の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、
ｂ）配列番号３に示すアミノ酸配列、配列番号３に示すアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号３に示すアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸配列の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、
ｃ）配列番号４に示すアミノ酸配列、配列番号４に示すアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号４に示すアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸配列の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３、
ｄ）配列番号５に示すアミノ酸配列、配列番号５に示すアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号５に示すアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸配列の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、
ｅ）配列番号６に示すアミノ酸配列、配列番号６に示すアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号６に示すアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸配列の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、
ｆ）配列番号７に示すアミノ酸配列、配列番号７に示すアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号７に示すアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸配列の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３。
【００１６】
上記ａ）〜ｆ）において、アミノ酸配列の同一性は、６０％以上であるが、７０％以上が好ましく、８０％以上がより好ましく、９０％以上がさらに好ましく、９５％以上がさらに好ましい。また、上記のアミノ酸配列の欠失、置換若しくは付加の数は、１〜５個が好ましく、１〜４個がより好ましく、１〜３個がさらに好ましく、１〜２個がさらに好ましい。
【００１７】
「アミノ酸」とは、その最も広い意味で用いられ、天然のアミノ酸のみならずアミノ酸変異体及び誘導体といったような非天然アミノ酸を含む。当業者であれば、この広い定義を考慮して、本明細書におけるアミノ酸として、例えば、天然タンパク原性Ｌ−アミノ酸；Ｄ−アミノ酸；アミノ酸変異体及び誘導体などの化学修飾されたアミノ酸；ノルロイシン、β−アラニン、オルニチンなどの天然非タンパク原性アミノ酸；及びアミノ酸の特徴である当業界で公知の特性を有する化学的に合成された化合物などが挙げられることを理解するであろう。非天然アミノ酸の例として、α−メチルアミノ酸（α−メチルアラニンなど）、Ｄ−アミノ酸、ヒスチジン様アミノ酸（２−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジン及びα−メチル−ヒスチジンなど）、側鎖に余分のメチレンを有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸）及び側鎖中のカルボン酸官能基アミノ酸がスルホン酸基で置換されるアミノ酸（システイン酸など）が挙げられる。
【００１８】
「ポリペプチド」とは、アミノ酸がペプチド結合によって連なった分子を意味し、天然又は人工のタンパク質、タンパク質断片を含む。
【００１９】
配列番号１〜７のいずれかに示されるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有するアミノ酸配列からなる軽鎖定常領域又はＣＤＲや、配列番号１〜７のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖定常領域又はＣＤＲは、部位特異的変異導入法、ランダム変異導入法、チェーンシャフリング法、ＣＤＲウォーキング法などの公知の方法を用いて作製され得る。これらの方法によれば、ファージディスプレイ法によってＣＤＲに種々の変異を有する抗体又は抗体断片をファージ表面に提示させ、抗原を使用してスクリーニングすることにより、より親和性が成熟したＣＤＲを得られることが当業者によく知られている（例えば、Wu et al., PNAS, 95:6037-6042(1998); Schier, R. et al., J. Mol. Bio. 263:551-567(1996); Schier, R. et al., J. Mol. Biol. 255:28-43(1996); Yang, W.P. et al., J. Mol. Biol., 254:392-403(1995)。）。
【００２０】
本発明の抗体は、モノクローナル抗体の組み換え抗体である。
また、本発明の抗ポドプラニン抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥのいずれのアイソタイプであってもよいが、好ましくはＩｇＧ、より好ましくはＩｇＧ１である。
【００２１】
本発明の抗ポドプラニン抗体は、ヒトキメラ抗体又はヒト化抗体のほか、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）2断片等の低分子抗体も含むが、ヒトλ鎖由来の軽鎖定常領域を有する限りこれらに限定されない。
【００２２】
「低分子抗体」とは、抗体の断片又は抗体の断片に任意の分子を結合させたものであって、もとの抗体と同じエピトープを認識するものを意味する。具体的には、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１領域からなるＦａｂ；２つのＦａｂがヒンジ領域でジスルフィド結合によって連結されているＦ（ａｂ’）2；ＶＬ及びＶＨからなるＦｖ；ＶＬ及びＶＨを人工のポリペプチドリンカーで連結した一本鎖抗体であるｓｃＦｖ；ｄｉａｂｏｄｙ型、ｓｃＤｂ型、ｔａｎｄｅｍ  ｓｃＦｖ型、ロイシンジッパー型などの二重特異性抗体等が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の抗ポドプラニン抗体として好ましい低分子抗体は、ヒトλ鎖由来の軽鎖定常領域、上記重鎖ＣＤＲ１〜３及び軽鎖ＣＤＲ１〜３を含む低分子抗体である。
【００２３】
本明細書における「抗体」には、糖鎖付加等の修飾が加えられたものも含まれる。かかる抗体としては、例えば、Ｆｃ領域に１以上のＮ−結合型糖鎖が結合し、該Ｎ−結合型糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない抗体が挙げられる。
例えばＩｇＧ抗体のＦｃ領域には、Ｎ−結合型糖鎖の結合部位が２ヶ所存在し、この部位に複合型糖鎖が結合している。Ｎ−結合型糖鎖とは、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ配列のＡｓｎに結合する糖鎖をいい、共通した構造Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2―Ａｓｎを有する。非還元末端の２つのマンノース（Ｍａｎ）に結合する糖鎖の種類により、高マンノース型、混成型、及び複合型等に分類される。
Ｎ−結合型糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）にはフコースが結合しうるが、このフコースが結合していない場合、結合している場合に比較してＡＤＣＣ活性が著しく上昇することが知られている。このことは例えば、国際公開第２００２／０３１１４０号パンフレットに記載されており、その開示は全体として参照により本明細書に組み込まれる。
ＡＤＣＣ活性が著しく向上することにより、抗体を医薬として用いる場合に投与量を少なくすることができるので、副作用を軽減させることが可能であると共に、治療費も低減させることができる。
【００２４】
本発明の抗ポドプラニンモノクローナル抗体は、後記実施例に示すように、結合活性及びエフェクター活性が著しく高く、抗がん薬の有効成分として有用である。
【００２５】
本発明のヒトキメラ抗ポドプラニン抗体は、例えばＮＺ−１のＶＨ領域をコードするＤＮＡをＰＣＲで増幅し、ヒトＩｇＧ１のＣＨ１、ヒンジ領域、ＣＨ２及びＣＨ３領域をコードするＤＮＡを保持したベクターに組み込む。ＮＺ−１の軽鎖は、ＮＺ−１のＶＬ領域をコードするＤＮＡをＰＣＲで増幅し、ヒトＩｇＧのλ鎖のＣＬ領域をコードするＤＮＡを保持したベクターに組み込む。得られたＮＺ−１のＶＨ領域を有するベクターとＨＺ−１のＶＬ領域を有するベクターとをＣＨＯ細胞等に形質導入して、軽質転換細胞を選択すればよい。
また、本発明のヒト化抗ポドプラニン抗体は、例えばＮＺ−１の重鎖ＣＤＲ１〜３及び軽鎖ＣＤＲ１〜３と、ヒト抗体のフレームワーク領域を連結するように設計したＤＮＡを、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成した後、ヒト抗体定常領域をコードするＤＮＡと連結して上述のヒトキメラ抗ポドプラニン抗体と同様に得ることができる。
【００２６】
本発明はまた、上述した本発明の抗ポドプラニン抗体に薬物を結合させた抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を含む。ここで薬物は、ターゲットに対して活性を示す物質又は体外から検出可能なシグナルを発する物質を意味し、ポドプラニンの高発現部位にデリバリーされ、そこで活性を示す又はそこからシグナルを発することで効果を発揮する。
【００２７】
ＡＤＣとする場合、抗ポドプラニン抗体は、抗原への結合性を失わない限り抗体断片（フラグメント）等の低分子抗体であっても良い。この場合、抗ポドプラニン抗体はデリバリー抗体として機能を有する限りエフェクター活性に必要なＦｃ領域は不要だからである。抗体断片の具体的な例としては、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２等を挙げることができる。
【００２８】
薬物としては、疾患の治療又は診断に供されるあらゆる物質が挙げられる。このような物質としては、例えば、腫瘍の治療又は診断に供される物質が想定され、具体的には、抗がん剤、ラジオアイソトープを挙げることができるがこれらに限定されない。
【００２９】
抗がん剤としては、アルキル化剤、代謝拮抗剤、微小管阻害剤、抗生物質抗がん剤、トポイソメラーゼ阻害剤、白金製剤、分子標的薬、ホルモン剤または生物製剤などが挙げられる。アルキル化剤としては、シクロホスファミドなどのナイトロジェンマスタード系抗癌剤、ラニムスチンなどのニトロソウレア系抗癌剤、ダカルバジンなどが挙げられる。代謝拮抗剤としては、５−ＦＵ、ユーエフティ、カルモフール、カペシタビン、テガフール、ＴＳ−１、ゲムシタビンおよびシタラビンなどが挙げられる。微小管阻害剤としては、ビンクリスチンなどのアルカロイド系抗癌剤、ドセタキセルおよびパクリタキセルなどのタキサン系抗がん剤が挙げられる。抗生物質抗がん剤としては、マイトマイシンＣ、ドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシンおよびブレオマイシンなどが挙げられる。トポイソメラーゼ阻害剤としては、トポイソメラーゼＩ阻害作用を有するイリノテカンおよびノギテカン、トポイソメラーゼＩＩ阻害作用を有するエトポシドが挙げられる。白金製剤としては、シスプラチン、パラプラチン、ネダプラチンおよびオキサリプラチンなどが挙げられる。分子標的薬としては、トラスツズマブ、リツキシマブ、イマチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、ボルテゾミブ、スニチニブ、ソラフェニブ、クリゾチニブおよびレゴラフェニブなどが挙げられる。ホルモン剤としては、デキサメタゾン、フィナステリドおよびタモキシフェンなどが挙げられる。生物製剤としては、インターフェロンα、βおよびγならびにインターロイキン２などが挙げられる。
【００３０】
ラジオアイソトープとしては、診断目的に利用されるガンマ線放出核種またはポジトロン放出核種、治療目的に利用されるアルファ線放出核種またはベータ線放出核種が挙げられる。ガンマ線放出核種またはポジトロン放出核種としては、18Ｆ、99mＴｃ、111Ｉｎ、113mＩｎ、114mＩｎ、67Ｇａ、68Ｇａ、82Ｒｂ、86Ｙ、87Ｙ、152Ｔｂ、155Ｔｂ、201Ｔｌ、51Ｃｒ、52Ｆｅ、57Ｃｏ、58Ｃｏ、60Ｃｏ、82Ｓｒ、85Ｓｒ、197Ｈｇ、44Ｓｃ、62Ｃｕ、64Ｃｕ、89Ｚｒなどが挙げられる。アルファ線放出核種またはベータ線放出核種としては、90Ｙ、114mＩｎ、117mＳｎ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、64Ｃｕ、67Ｃｕ、59Ｆｅ、89Ｓｒ、198Ａｕ、203Ｈｇ、212Ｐｂ、165Ｄｙ、103Ｒｕ、149Ｔｂ、161Ｔｂ、212Ｂｉ、166Ｈｏ、165Ｅｒ、153Ｓｍ、177Ｌｕ、213Ｂｉ、223Ｒａ、225Ａｃ、227Ｔｈなどが挙げられる。
【００３１】
これらのラジオアイソトープを本発明の抗ポドプラニン抗体に結合させるには、該抗体に金属キレート試薬を反応させ、これにラジオアイソトープを反応させて錯体とするのが好ましい。このようにして得られた修飾抗体は、ラジオアイソトープが金属キレート試薬を介して抗ポドプラニン抗体に結合している。
【００３２】
このような錯体形成に用いられる金属キレート試薬の例としては、例えば（１）８−ヒドロキシキノリン、８−アセトキシキノリン、８−ヒドロキシキナルジン、硫酸オキシキノリン、Ｏ−アセチルオキシン、Ｏ−ベンゾイルオキシン、Ｏ−ｐ−ニトロベンゾイルオキシン、キノリン骨格を有するキノロン系化合物であるノルフロキサシン、オフロキサシン、エノキサシン、シプロフロキサシン、ロメフロキサシン、トスフロキサシン、フレロキサシン、スパルフロキサシン等のキノリン誘導体；（２）クロラニル酸、アルミノン、チオ尿素、ピロガロール、クペロン、ビスムチオール（ＩＩ）、ガロイル没食子酸、チオリド、２−メルカプトベンゾチアゾール、テトラフェニルアルソニウムクロライド等の化合物；（３）エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）およびこれらに類似した骨格を有するジヒドロキシエチルグリシン、ジアミノプロパノール四酢酸、エチレンジアミン二酢酸、エチレンジアミン二プロピオン酸塩酸塩、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸、エチレンジアミンテトラキス（メチレンホスホン酸）、グリコールエーテルジアミン四酢酸、ヘキサメチレンジアミン四酢酸、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸、イミノ二酢酸、ジアミノプロパン四酢酸、ニトリロ三酢酸、ニトリロ三プロピオン酸、ニトリロトリス（メチレンスルホン酸）三ナトリウム塩、トリエチレンテトラミン六酢酸、メチルＤＴＰＡ、シクロヘキシルＤＴＰＡ、アミノベンジルＥＤＴＡ、イソチオシアノベンジルＥＤＴＡ、イソチオシアノベンジルＤＴＰＡ、メチルイソチオシアノベンジルＤＴＰＡ、シクロヘキシルイソチオシアノベンジルＤＴＰＡ、マレイミドプロピルアミドベンジルＥＤＴＡ、マレイミドペンチルアミドベンジルＥＤＴＡ、マレイミドデシルアミドベンジルＥＤＴＡ、マレイミドペンチルアミドベンジルＤＴＰＡ、マレイミドデシルアミドベンジルＥＤＴＡ、マレイミドデシルアミドベンジルＤＴＰＡ；（４）１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）、１，４，７−トリアザシクロノナン−１，４，７−三酢酸（ＮＯＴＡ）、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−１，４，８，１１−四酢酸（ＴＥＴＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン（Ｃｙｃｌｅｎ）、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン（Ｃｙｃｌａｍ）、イソチオシアノベンジルＤＯＴＡ、イソチオシアノベンジルＮＯＴＡ等が挙げられる。
【００３３】
これらの金属キレート試薬のうち、イソチオシアノベンジルＤＯＴＡ、メチルイソチオシアノベンジルＤＴＰＡ、シクロヘキシルイソチオシアノベンジルＤＴＰＡが金属キレートの容易な抗体への導入反応、標識率、錯体の安定性等の点で好ましい。
【００３４】
抗ポドプラニン抗体へのラジオアイソトープの結合は、常法に従って行うことができる。例えば抗ポドプラニン抗体に金属キレート試薬を反応させ、予め標識前駆体を調製しておき、次いでラジオアイソトープを反応させることにより行うことができる。
【００３５】
また、本発明の好ましいＡＤＣとしては、腎臓病に対するＡＤＣが挙げられる。ヒトの腎臓へのデリバリーを可能とする抗体はこれまでに例がなく、ヒトポドプラニンは腎糸球体上皮細胞表面に発現することは知られていたが、抗体は高分子であるため、ポドプラニンへ到達することはないと考えられていた。ところが、実施例に示すとおり本発明のヒトキメラ型抗ポドプラニン抗体が予想に反して腎臓に高集積することが明らかとなり、腎臓病に対するＡＤＣとしての可能性が示された。すなわち、本発明の抗ポドプラニン抗体に薬物を結合させた抗体薬物複合体は、腎臓への特異的集積を示し、腎臓病治療薬又は腎臓病診断薬の有効成分として有用である。
【００３６】
対象となる腎臓病としては、腎癌はもちろん、腎炎、ネフローゼ症候群、巣状糸球体硬化症、腎症、腎アミロイドーシス、リポ蛋白糸球体症、アルポート症候群、菲薄基底膜病、薬剤性腎障害、腎不全が挙げられ、抗がん剤、腎臓病治療剤であるステロイド剤、免疫抑制剤若しくはＰＡＩ−１阻害剤、又はラジオアイソトープなどを抗体と結合させてＡＤＣとして使用することができる。
【００３７】
本発明の抗体の活性は、以下の方法で測定することができる。
【００３８】
（１）結合活性
抗体の結合活性は公知の方法、例えば、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、ＥＩＡ（酵素免疫測定法）、ＲＩＡ（放射免疫測定法）、蛍光抗体法、ＦＡＣＳ法等で、測定することができる。
（２）ＡＤＣＣ活性
ＡＤＣＣ活性とは、標的細胞の細胞表面抗原に本発明の抗体が結合した際、そのＦｃ部分にＦｃγ受容体保有細胞（エフェクター細胞）がＦｃγ受容体を介して結合し、標的細胞に障害を与える活性を意味する。
ＡＤＣＣ活性は、ポドプラニンを発現している標的細胞とエフェクター細胞と本発明の抗体を混合し、ＡＤＣＣの程度を測定することによって知ることができる。エフェクター細胞としては、例えば、マウス脾細胞、ヒト末梢血や骨髄から分離した単球核を利用することができる。標的細胞としては、例えばポドプラニン陽性中皮腫細胞やポドプラニン陽性膠芽腫細胞を用いることができる。標的細胞をあらかじめ51Ｃｒ等で標識し、これに本発明の抗体を加えてインキュベーションし、その後標的細胞に対して適切な比のエフェクター細胞を加えてインキュベーションを行う。インキュベーション後、上清を採取し、上清中の上記標識をカウントすることにより、測定することが可能である。
（３）ＣＤＣ活性
ＣＤＣ活性とは、補体系による細胞障害活性を意味する。
ＣＤＣ活性は、ＡＤＣＣ活性の試験において、エフェクター細胞に代えて補体を用いることにより測定することができる。
（４）腫瘍増殖抑制活性
腫瘍増殖抑制活性は、腫瘍モデル動物を利用して測定することができる。例えば、マウスの皮下に腫瘍を移植し、本発明の抗体を投与する。非投与群と投与群における腫瘍組織の体積を比較することにより、腫瘍増殖抑制効果を測定することができる。
なお、本発明の腫瘍増殖抑制活性は、個々の細胞の増殖を抑制する結果生じるものであっても、細胞死を誘導する結果生じるものであってもよい。
【００３９】
本発明の医薬組成物は、本発明の抗体、および薬学的に許容できる担体や添加物を含む。
【００４０】
担体及び添加物の例として、水、食塩水、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、デキストロース、グリセロール、エタノール等薬学的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ぺクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、界面活性剤、ゲンチジン酸、アスコルビン酸、ベンジルアルコールα−チオグリセロール等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００４１】
本発明の医薬組成物は、様々な形態、例えば、液剤（例えば注射剤）、分散剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、粉末剤、坐剤などとすることができる。好ましい態様は、注射剤であり、非経口（例えば、静脈内、経皮、腹腔内、筋内）で投与することが好ましい。
【００４２】
本発明の医薬組成物は、ポドプラニンが関連する疾患、例えば、腫瘍、血栓症、動脈硬化症等の治療に有効である。
上述のとおり、ポドプラニンはＣＬＥＣ−２に結合することにより血小板凝集を起こすことが示唆されている。また、ポドプラニンの血小板上受容体であるＣＬＥＣ−２が血栓症／動脈硬化症に関連すること、具体的には、ＣＬＥＣ−２欠損血小板はｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏのいずれにおいても凝集能に劣ること、及び、ＣＬＥＣ−２欠損は出血時間を延長させ、閉塞性動脈血栓形成を防ぐことが報告されている（May, F. et al., Blood prepublished online July 29 2009; doi:10.1182/blood-2009-05-222273）。
さらに動脈硬化病変においてポドプラニンが高発現していることが知られている。本発明の医薬組成物が血栓症や動脈硬化症の治療に有効であることが強く示唆される。
一方、ポドプラニンが関連する腫瘍としては、脳腫瘍、中皮腫、精巣腫瘍、卵巣がん、及び扁平上皮がん等が挙げられる。ここで、扁平上皮がんには、口腔がん、咽頭がん、喉頭がん、食道がん、肺癌、皮膚がん、子宮頸がんが含まれるがこれらに限定されない。
【００４３】
本発明は、本発明の抗体又は抗体薬物複合体を治療有効量投与することを含むポドプラニンが関連する疾患又は腎臓病の治療方法も包含する。
本明細書において、治療有効量とは、治療する疾患の一つ又は複数の症状が、それによりある程度緩和される作用物質の量を意味する。抗がん剤の場合、腫瘍サイズの低下；腫瘍の転移の阻害（遅延又は停止）；腫瘍増殖の阻害（遅延又は停止）、及びがんと関連する一つ又は複数の症状の緩和、の少なくとも１つを示す量を意味する。
具体的には、本発明の抗体又は抗体薬物複合体の投与量は、例えば、０．０２５〜５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１〜５０ｍｇ／ｋｇであり、より好ましくは０．１〜２５ｍｇ／ｋｇ、さらに好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ又は０．１〜３ｍｇ／ｋｇとすることができるが、これに限定されない。
また、本発明の抗体薬物複合体の薬物が治療目的に利用されるラジオアイソトープである場合の投与量は、例えば、成人への一回の投与について、放射能量が１８．５ＭＢｑから７４００ＭＢｑとなるような量とすることができる。
【００４４】
また、本発明は、本発明の抗体薬物複合体を診断有効量投与することを含むポドプラニンが関与する疾患又は腎臓病の診断方法も包含する。
本明細書において、診断有効量とは、診断する疾患の状態を判断するのに必要な作用物質の量を意味する。がん診断剤の場合、腫瘍の有無；腫瘍のステージング；抗がん剤の適用の判断；抗がん剤の治療効果予測；抗がん剤の治療効果判定、の少なくとも１つを示す量を意味する。
具体的には、本発明の抗体薬物複合体の薬物が診断目的に利用されるラジオアイソトープである場合の投与量は、例えば、成人への一回の投与について、放射能量が１１１ＭＢｑから７４０ＭＢｑとなるような量とすることができる。
【００４５】
上述のとおり、ポドプラニンは特定の腫瘍細胞において高発現している。従って、本発明の抗体薬物複合体は、がん、特に脳腫瘍、中皮腫、精巣腫瘍、卵巣がん、及び各種扁平上皮がん（口腔がん、咽頭がん、喉頭がん、食道がん、肺癌、皮膚がん、子宮頸がん）などポドプラニンが高発現するがんの診断に有用である。
また、本発明の抗体薬物複合体は、動脈硬化の診断にも有用である。
動脈硬化病変については、早期病変のうちマクロファージ浸出性の病変においてポドプラニンの高発現が観察された。マクロファージ浸出性病変は進行病変になりやすいことが知られていることから、ポドプラニンを検出することによる診断方法によって、進行病変になりやすい動脈硬化の早期発見が期待される。
以上より、本発明は、本発明の抗体薬物複合体を含むがん又は動脈硬化の診断薬、がん又は動脈硬化の診断のための抗体の使用、本発明の抗体を用いるがん又は動脈硬化の診断方法をも包含する。
【実施例】
【００４６】
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。
１．ヒトキメラ型ＮＺ−１抗体（ＮＺ−１２）の作製
ヒトキメラ型ＮＺ−１抗体（ＮＺ−１２）を作製するために、ＮＺ−１のＶＨ領域をコードするＤＮＡをＰＣＲで増幅し、ヒトＩｇＧ１のＣＨ１、ヒンジ領域、ＣＨ２及びＣＨ３領域をコードするＤＮＡを保持したｐｃＤＮＡ３．３ベクターに組み込んだ（ｐｃＤＮＡ３．３−ｈＩｇＧ１／ＮＺ−１Ｈ）。ＮＺ−１のＶＨ領域はｐｃＤＮＡ３／ＮＺ-１Ｈプラスミドを鋳型として、以下のプライマーにより増幅した。
【００４７】
NZ-1VH-Fprimer：TCCTCACCATGGACTTCAGG（配列番号１２）
NZ-1VH-Rprimer：TTCAGCTGAGGAGACTGTGA（配列番号１３）
【００４８】
ＮＺ−１２Ｈ鎖発現ベクターとして、ｐｃＤＮＡ３．３−ｈＩｇＧ１／ＮＺ−１Ｈプラスミドを鋳型として以下のプライマーにより増幅したＯＲＦをｐＣＡＧｎｅｏベクターに組み込んだ。
【００４９】
HindIII-NZ-1HS2: ccaagcttCACCATGGACTTCAGGCTCA（配列番号１４）
hIgG1CH3-R1-NtoI: aatgcggccgcTCATTTACCCGGAGACAGGGAG（配列番号１５）
【００５０】
ＮＺ−１のＬ鎖は、ＮＺ−１のＶＬ領域をコードするＤＮＡをＰＣＲで増幅し、ヒトＩｇＧのｌａｍｂｄａ鎖のＣＬ領域をコードするＤＮＡを保持したｐＣＡＧベクターに組み込んだ（ｐＣＡＧ−ｈＩｇＣＬ／ＮＺ−１Ｌ）。ＮＺ−１のＶＬ領域をコードするＤＮＡは、ｐｃＤＮＡ３／ＮＺ−１Ｌプラスミドを鋳型として、以下のプライマーにより増幅した。
【００５１】
HindIII-NZ-1L.S：ccaAAGCTTACCATGACATGGACTCTACT（配列番号１６）
NZ-1L.VL-AS.BamHI：ggtggatccTAGGACAGTGAGCTTGGTTCC（配列番号１７）
【００５２】
ｐＣＡＧｎｅｏ／ＮＺ−１２Ｈ（Ｇ４１８）とｐＣＡＧｚｅｏ−ｈＩｇＣＬ／ＮＺ−１ＬＶＬ（ｚｅｏｓｉｎ）それぞれ１μｇを混合し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ  ＬＴＸ  ｋｉｔの方法に従って、ＣＨＯ細胞１×１０5（６ウェルプレートの１ウェルに相当）に形質導入した。２４時間後からＺｅｏｃｉｎ  ５００μｇ／ｍＬ、Ｇ４１８  １ｍｇ／ｍＬ入りの培地で形質導入細胞の選択をした。ＬＮ３１９細胞、Ｈ２２６細胞、ＰＣ−１０細胞に対して、選択細胞の培養上清の反応性をフローサイトメトリーにて確認した。
【００５３】
ヒトキメラ型抗体の高発現株を、無血清培地（インビトロジェン社）を用いて培養し、培養上清を回収した。培養上清をプロテインＧカラム（ＧＥヘルスケア社）に通し、ヒトキメラ型ＮＺ−１抗体（ＮＺ−１２）を精製した。ＮＺ−１２は、配列番号８で示すアミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号９で示すアミノ酸配列からなる軽鎖で構成されている。重鎖をコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号１０に、軽鎖をコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号１１に示す。重鎖は、ラットＮＺ−１抗体のＶＨ領域と、ヒトＩｇＧ１に由来するＣＨ１、ヒンジ領域、ＣＨ２、ＣＨ３からなる。軽鎖は、ラットＮＺ−１抗体のＶＬ領域と、ヒトｌａｍｂｄａ鎖に由来するＣＬとからなる。
【００５４】
２．ポドプラニンに対するＮＺ−1抗体、ＮＺ−８抗体及びＮＺ−１２抗体の反応性
ＮＺ−１２がポドプラニンに対して反応を示すことを確認するとともに、ＮＺ−１及びＮＺ−８と比較した。ＬＮ３１９細胞、Ｈ２２６細胞、ＰＣ−１０細胞に対して、各抗体（１μｇ／ｍＬ）の反応性をフローサイトメトリーにて確認した結果を図１に示す。ＮＺ−１２の反応性は、すべての細胞に対し、ＮＺ−８よりも良好であることがわかった。
【００５５】
３．ＥＬＩＳＡによるアフィニティーの算出
９６ウェルプレートにヒトポドプラニンの合成ペプチド（３８〜５１アミノ酸：１μｇ／ｍＬ）を固相化し、Ｓｕｐｅｒ−Ｂｌｏｃｋ／ＰＢＳ（サーモフィッシャー社）でブロッキング後、ＮＺ−１、ＮＺ−８、ＮＺ−１２の希釈系列（１５０ｐｇ／ｍＬ〜２．５μｇ／ｍＬ）を反応させた。１／１０００倍希釈した二次抗体（抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰおよび抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ：ダコ社）を反応させ、ＴＭＢ−Ｕｌｔｒａ（サーモフィッシャー社）で発色した。ＯＤ６５５をプレートリーダーで計測し、Ｐｒｉｓｍを使ってＫD値を算出した。
結果は図２の通りである。ＮＺ−１、ＮＺ−８及びＮＺ−１２のＫDは、それぞれ３．６８８×１０-10、１．７２７×１０-8及び５．９５２×１０-10であった。ＮＺ−１２のアフィニティーはＮＺ−８のアフィニティーよりもかなり高く（約２９倍）、ＮＺ−１のアフィニティーに近い結果が得られた。このことより、オリジナルのラット抗体に対しそのヒトキメラ型抗体にｌａｍｂｄａ鎖を使うことにより、高い活性のヒトキメラ型抗体が作製できることが明らかとなった。
【００５６】
４．フローサイトメトリー法によるアフィニティーの算出
ヒト膠芽腫細胞（ＬＮ３１９：２×１０5）に対し、ＮＺ−１、ＮＺ−８、ＮＺ−１２抗体の希釈系列（０．０２〜１００μｇ／ｍＬ）を反応させた。１／１０００倍希釈した二次抗体（抗マウスＩｇＧ−Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ及び抗ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣ：ライフテクノロジー社）を反応させ、ＥＣ８００（ソニー社）で蛍光強度を測定した。Ｐｒｉｓｍを使ってＫD値を算出した。
結果は図３の通りである。ＮＺ−１、ＮＺ−８及びＮＺ−１２のＫDは、それぞれ１．２３５×１０-9、７．３１×１０-7及び８．５３６×１０-9であった。ＮＺ−１２のアフィニティーはＮＺ−８のアフィニティーよりもかなり高く（約８６倍）、ＮＺ−１抗体のアフィニティーに近い結果が得られた。このことより、オリジナルのラット抗体に対しそのヒトキメラ型抗体にｌａｍｂｄａ鎖を使うことにより、高い活性のヒトキメラ型抗体が作製できることが明らかとなった。
【００５７】
５．ＡＤＣＣ活性の測定
比重遠心法にて分離した健常人末梢血単核球（ＭＮＣ）の浮遊液を作成し、１×１０6個／ｗｅｌｌになるようにＭＮＣを、丸底９６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに加えた。ヒト膠芽腫細胞（ＬＮ３１９、Ｄ３９７）、ヒト悪性中皮腫細胞（ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＮＣＩ−Ｈ２９０／ｈＰＤＰＮ）、ヒト肺がん細胞（ＰＣ−１０）は０．１μＣｉのＮａ51ＣｒＯ4にてラベルし、２回洗浄後、１×１０4個／ｗｅｌｌでＭＮＣと混合した。さらに、コントロールのヒトＩｇＧ、ＮＺ−１、ＮＺ−８、ＮＺ−１２を最終濃度が１μｇ／ｍＬとなるように添加した。以上の実験で、Ｅｆｆｅｃｔｏｒ／Ｔａｒｇｅｔ比は、１００となり、最終溶液量は２００μＬ／ｗｅｌｌとなる。実験はｔｒｉｐｌｉｃａｔｅで行った。３７℃のＣＯ2インキュベーターにて６時間培養後、上清を１００μＬ回収し、γカウンターにて放射活性をカウントした。ラベル下腫瘍細胞をｍｅｄｉｕｍのみで培養したｗｅｌｌの活性をｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｒｅｌｅａｓｅとし、１％ＳＤＳで培養したｗｅｌｌの活性をｍａｘｉｍｕｍ  ｒｅｌｅａｓｅとした。細胞障害活性（％）は、以下の式にて計算した。
【００５８】
【数１】
2018168068.tif 000002
【００５９】
結果を図４に示す。ポドプラニン陽性ヒト腫瘍細胞に対して、ＮＺ−１２がＮＺ−８よりもはるかに高いＡＤＣＣ活性を有することが示された。ＮＺ−１２でこのように活性が顕著に高くなることは当業者が予測し得ないことであった。
【００６０】
６．ＣＤＣ活性の測定
ヒト膠芽腫細胞（ＬＮ３１９、Ｄ３９７）ヒト悪性中皮腫細胞（ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＮＣＩ−Ｈ２９０／ｈＰＤＰＮ)、ヒト肺がん細胞（ＰＣ−１０）を０．１μＣｉのＮａ51ＣｒＯ4にてラベルし、２回洗浄後、１×１０4個／ｗｅｌｌで丸底９６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに加えた。コントロールのヒトＩｇＧ、ＮＺ−１、ＮＺ−８、ＮＺ−１２を最終濃度が１μｇ／ｍＬとなるように添加し、そこにウサギ補体を最終的に４倍希釈となるように添加した。最終溶液量は２００μｌ／ｗｅｌｌとした。３７℃のＣＯ2インキュベーターにて６時間培養後、上清を１００μＬ回収し、γカウンターにて放射活性をカウントした。腫瘍細胞をｍｅｄｉｕｍのみで培養したｗｅｌｌの活性をｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｒｅｌｅａｓｅとし、１％ＳＤＳで培養したｗｅｌｌの活性をｍａｘｉｍｕｍ  ｒｅｌｅａｓｅとした。細胞障害活性（％）は、以下の式にて計算した。
【００６１】
【数２】
2018168068.tif 000003
【００６２】
結果を図５に示す。ＮＺ−８、ＮＺ−１２のいずれも、ポドプラニン陽性ヒト腫瘍細胞に対してＣＤＣ活性を有することが示された。特にＮＺ−１２は、ＮＺ−８に比較して、著しく高いＣＤＣ活性を示すことが確認された。ＮＺ−１２で活性がこのように顕著に高くなることは当業者が予測し得ないことであった。
【００６３】
７．抗腫瘍活性（ｉｎ  ｖｉｖｏ）
ヒト悪性中皮腫細胞（ＮＣＩ−Ｈ２９０／ｈＰＤＰＮ)１×１０6個を胸腔内に播種した悪性中皮腫同所移植ＳＣＩＤマウス（６週齢、♂）に対してコントロールのヒトＩｇＧもしくはＮＺ−１２（１００μｇ）を１週間に２回、２週間の腹腔内投与を行った。同時に、ＣＤ５６マイクロビーズを用いた磁気細胞分離法により健常人ＭＮＣから採取したヒトＮＫ細胞（５×１０5個）もしくはコントロールのＰＢＳを１週間に１回、２週間胸腔内に投与した。腫瘍移植３週間後に解剖を行い、胸腔内腫瘍重量及び胸水量の測定を行った。
【００６４】
解剖の結果を図６に、胸腔内腫瘍重量及び胸水量の測定結果を図７に示す。肉眼的所見からも腫瘍の減少が明らかなとおり、ＮＺ−１２とヒトＮＫ細胞の投与によって、コントロール及びそれぞれの単独投与と比較して胸腔内腫瘍重量及び胸水産生が抑制されることが示された。ＮＺ−１２はｉｎ  ｖｉｖｏにおいてもＡＤＣＣ活性を介した抗腫瘍活性を有することが明らかとなった。
【００６５】
８．111Ｉｎ標識ＮＺ−１２の作製
ＮＺ−１２へのＤＯＴＡの結合
ＮＺ−１２を緩衝液（５０ｍＭ  Ｂｉｃｉｎｅ−ＮａＯＨ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．６）に溶解し、抗体濃度を１０ｍｇ／ｍＬに調整した。一方で、イソチオシアノベンジルＤＯＴＡ（Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ社製  Ｂ−２０５）を、ＤＭＳＯに１４ｍｇ／ｍＬの濃度になるように溶解した。抗体とＤＯＴＡのモル比が１：４（仕込比１：４）となるように混合、撹拌し、２５℃で１７時間静置した。反応終了後、遠心式フィルター（アミコンウルトラ、メルクミリポア社製  ＵＦＣ５０３０９６）で後述する標識緩衝液を用いて濃縮、精製した。
【００６６】
111Ｉｎ標識ＮＺ−１２の調製
精製したＮＺ−１２を５ｍｇ／ｍＬとなるように標識緩衝液（０．２５Ｍ  酢酸ナトリウム  ｐＨ５．５）に溶解し、111ＩｎＣｌ3溶液（ＭＤＳ  Ｎｏｒｄｉｏｎ社製）、０．０５ｍＭ  塩酸及びＮＺ−１２溶液を加えて４５℃、１５分インキュベートした。なお、反応液中の抗体濃度は３．２ｍｇ／ｍＬとなるように調整した。標識反応液の一部をサンプリングし、薄層クロマトグラフィー（Ｂｉｏｄｅｘ社製、１５０−７７１−２）を用いて標識率を確認した。展開溶媒は１０ｍＭ  ＤＴＰＡを含む生理食塩水とし、クロマトスキャナーを用いて測定した。標識率が９５％以上のときに後の実験に使用した。
【００６７】
９．担癌マウスにおける体内分布
ポドプラニン発現細胞であるＡＣＣ−ＭＥＳＯ４を１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地中で培養し、ＳＣＩＤマウス（メス、６週齢、日本クレア）の右大腿部皮下に４×１０6個／マウスとなるように移植し平均腫瘍体積が２９０ｍｍ3になるまで飼育した。次に、ＡＣＣ−ＭＥＳＯ４移植マウスに111Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ＮＺ−１２を１ＭＢｑ／匹となるよう静脈内投与した。投与後１、２、３、４日が経過した時点で屠殺、解剖を行って組織および腫瘍を摘出し、組織および腫瘍の重量を測定した後にγカウンターにより計数率を測定し、以下の式により％ＩＤ／ｇを算出した。
【００６８】
【数３】
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【００６９】
結果を図８に示す。111Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ＮＺ−１２は経時的に腫瘍集積が高まり、投与後４日で２６％ＩＤ／ｇと高い集積を示した。また、投与後２日では他の正常組織より高い集積を示した。
【００７０】
１０．カニクイザルにおける体内分布
カニクイザル（オス、３歳、ハムリー）に111Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ＮＺ−１２を１３７ＭＢｑ静脈内投与した。投与後１時間、１日、２日、３日、６日にシンチカメラにより全身プラナー撮像を実施して、臓器の放射能分布を測定した。また、プラナー画像から各組織計数率を抽出し、以下の式により％ＩＤを算出した。なお、サルの上部に１０％ＩＤ標準溶液を置き、同時に撮像した。
【００７１】
【数４】
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【００７２】
図９の上段左から順に投与後１時間、１日、２日、３日、６日に得られた画像を、下段にこれらに関心領域（ＲＯＩ）を設定した画像を示す。また、図１０に各組織の％ＩＤを示す。
【００７３】
腎臓への集積が顕著に見られ、右左合わせて最大１８．２％ＩＤ（２４時間後）となった。また、肝臓への集積は２４時間後で１１．９％ＩＤであった。なお、担癌マウスにおける投与後２４時間の％ＩＤは腎臓で１．８７％ＩＤ、肝臓で１４．４％ＩＤであった。マウスとカニクイザルで肝臓の分布に大きな違いはないが、腎臓では大きな違いが見られる。これはポドプラニンのアミノ酸配列が種によって異なるためと考えられ、よりヒトに近いカニクイザルでの集積はヒトでの集積を示唆する。
【００７４】
投与後６日の撮像終了後に動物を解剖し、腎臓の切片オートラジオグラフィー及びヘマトキシリンエオジン染色を行った。その結果を図１１に示す。なお、図上の点は糸球体の位置を示す。
【００７５】
腎臓では糸球体に高度の集積が見られ、それ以外の領域への集積はほとんど検出されなかった。ポドプラニンは腎糸球体上皮細胞表面に発現しており、111Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ＮＺ−１２の腎集積はポドプラニンへの特異的な結合であると考えられた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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