(57)【要約】【課題】タンパク質の非特異吸着が低減され、耐アルカリ性及び耐久性に優れ、かつ、カラムとして用いた時の通液性等のカラム特性に優れる分離材を提供すること。【解決手段】本発明は、多孔質ポリマー粒子と、該多孔質ポリマー粒子の表面の少なくとも一部を被覆する被覆層と、を備え、被覆層が、水酸基を有する架橋高分子を含み、該水架橋高分子に親水性モノマーがグラフトされている、分離材に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
多孔質ポリマー粒子と、前記多孔質ポリマー粒子の表面の少なくとも一部を被覆する被覆層と、を備え、
前記被覆層が、水酸基を有する架橋高分子を含み、前記架橋高分子に親水性モノマーがグラフトされている、分離材。
【請求項２】
前記親水性モノマーが、水酸基を有する（メタ）アクリレート化合物である、請求項１記載の分離材。
【請求項３】
前記多孔質ポリマー粒子が、スチレン系モノマーに由来する構造単位を有するポリマーを含む、請求項１又は２記載の分離材。
【請求項４】
前記水酸基を有する架橋高分子が、多糖類又はその変性体由来の架橋高分子である、請求項１〜３いずれか一項に記載の分離材。
【請求項５】
前記水酸基を有する架橋高分子が、アガロース、デキストラン又はプルラン由来の架橋高分子である、請求項１〜４いずれか一項に記載の分離材。
【請求項６】
平均粒径が１０〜３００μｍであり、モード細孔径が０．０５〜０．６μｍである、請求項１〜５いずれか一項に記載の分離材。
【請求項７】
空隙率が４０〜７０体積％である、請求項１〜６いずれか一項に記載の分離材。
【請求項８】
比表面積が２０ｍ２／ｇ以上である、請求項１〜７いずれか一項に記載の分離材。
【請求項９】
粒径の変動係数が５〜１５％である、請求項１〜８いずれか一項に記載の分離材。
【請求項１０】
前記多孔質ポリマー粒子の１ｇ当たり３０〜５００ｍｇの前記水酸基を有する架橋高分子を含む被覆層を備える、請求項１〜９いずれか一項に記載の分離材。
【請求項１１】
当該分離材が充填されたカラムに、該カラムの圧力が０．３ＭＰａとなるように水を通液させたときに、水の通液速度が８００ｃｍ／ｈ以上である、請求項１〜１０いずれか一項に記載の分離材。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の分離材を備えるカラム。
【請求項１３】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の分離材の製造方法であって、
多孔質ポリマー粒子の表面に水酸基を有する高分子を吸着させ、当該高分子を架橋する工程と、
架橋された前記高分子に、原子移動ラジカル重合の開始基を導入する工程と、
前記開始基に対して、親水性モノマーをグラフトさせる工程と、を備える、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分離材及びカラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、タンパク質に代表される生体高分子を分離精製する場合、一般的には、多孔質型の合成高分子を母体とするイオン交換体、親水性天然高分子の架橋ゲルを母体とするイオン交換体等が用いられている。多孔質型の合成高分子を母体とするイオン交換体の場合、塩濃度による体積変化が小さいため、カラムに充填してクロマトグラフィーで用いると、通液時の耐圧性に優れる傾向にある。しかし、このイオン交換体を、タンパク質等の分離に用いると、疎水的相互作用に基づく不可逆吸着等の非特異吸着が起きるため、ピークの非対称化が発生する、又は、疎水的相互作用でイオン交換体に吸着されたタンパク質が吸着されたまま回収できないという問題点がある。
【０００３】
一方、デキストラン、アガロース等の多糖に代表される親水性天然高分子の架橋ゲルを母体とするイオン交換体の場合、タンパク質の非特異吸着がほとんどないという利点がある。ところが、このイオン交換体は、水溶液中で著しく膨潤し、溶液のイオン強度による体積変化、及び、遊離酸形と負荷形との体積変化が大きく、機械的強度も充分ではないという欠点を有する。特に、架橋ゲルをクロマトグラフィーで使用する場合、通液時の圧力損失が大きく、通液によりゲルが圧密化するといった欠点がある。
【０００４】
親水性天然高分子の架橋ゲルの欠点を克服するため、例えば、多孔性高分子の細孔内に天然高分子ゲル等のゲルを保持した複合体が、ペプチド合成の分野で知られている（例えば、特許文献１参照）。このような複合体を用いることにより、反応性物質の負荷係数を高め、高収率の合成が可能となる。また、硬質な合成高分子物質でゲルを包囲するため、カラムベッドの形態で使用しても、容積変化がなく、カラムを通過するフロースルーの圧力が変化しないという利点を有する。
【０００５】
セライト等の無機多孔質体にデキストラン、セルロースといった多糖等のキセロゲルを保持させた分離材が知られている（例えば、特許文献２及び３参照）。このゲルには収着性能を付加するために、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基等が付与されており、ヘモグロビンの除去に用いられる。このような分離材は、カラムでの通液性が良好である。
【０００６】
マクロネットワーク構造のコポリマーの細孔を、モノマーから合成した架橋共重合体のゲルで埋めたハイブリッドコポリマーのイオン交換体が知られている（例えば、特許文献４参照）。架橋共重合体ゲルは、架橋度が低い場合、圧力損失、体積変化等の問題があるが、ハイブリッドコポリマーにすることで通液特性が改善され、圧力損失が少なく、イオン交換容量が向上し、リーク挙動が改善される。
【０００７】
また、有機合成ポリマー基体の細孔内に巨大網目構造を有する親水性天然高分子の架橋ゲルを充填した複合化充填材が提案されている（（例えば、特許文献５及び６参照）。さらに、メタクリル酸グリシジルとアクリル架橋モノマーにより構成される多孔質粒子を合成する技術が知られている（例えば、特許文献７参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第４９６５２８９号明細書
【特許文献２】米国特許第４３３５０１７号明細書
【特許文献３】米国特許第４３３６１６１号明細書
【特許文献４】米国特許第３９６６４８９号明細書
【特許文献５】特開平１−２５４２４７号公報
【特許文献６】米国特許第５１１４５７７号明細書
【特許文献７】特開２００９−２４４０６７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、従来の分離材は、タンパク質の非特異吸着を低減し、耐アルカリ性及び耐久性に優れ、かつ、カラムとして用いたときの通液性等のカラム特性に優れるという全ての特性を充分なレベルで兼ね備えるものではない。
【００１０】
そこで、本発明は、タンパク質の非特異吸着が低減され、耐アルカリ性及び耐久性に優れ、カラムとして用いた時の通液性等のカラム特性に優れる分離材、該分離材の製造方法及び該分離材を備えるカラムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、下記［１］〜［１３］に記載の分離材、分離材の製造方法及び分離材を備えるカラムを提供する。
［１］多孔質ポリマー粒子と、該多孔質ポリマー粒子の表面の少なくとも一部を被覆する被覆層とを備え、被覆層が、水酸基を有する架橋高分子を含み、該架橋高分子に親水性モノマーがグラフトされている分離材。
［２］親水性モノマーが水酸基を有する（メタ）アクリレート化合物である、［１］記載の分離材。
［３］多孔質ポリマー粒子がスチレン系モノマーに由来する構造単位を有するポリマーを含む、［１］又は［２］に記載の分離材。
［４］水酸基を有する架橋高分子が、多糖類又はその変性体由来の架橋高分子である、［１］〜［３］のいずれかに記載の分離材。
［５］水酸基を有する架橋高分子が、アガロース、デキストラン又はプルラン由来の架橋高分子である、［１］〜［４］のいずれかに記載の分離材。
［６］平均粒径が１０〜３００μｍであり、モード細孔径が０．０５〜０．６μｍである、［１］〜［５］のいずれかに記載の分離材。
［７］空隙率が４０〜７０体積％である、［１］〜［６］のいずれかに記載の分離材。
［８］比表面積が２０ｍ２／ｇ以上である、［１］〜［７］のいずれかに記載の分離材。
［９］変動係数が５〜１５％である、［１］〜［８］のいずれかに記載の分離材。
［１０］多孔質ポリマー粒子の１ｇ当たり３０〜５００ｍｇの水酸基を有する架橋高分子を含む被覆層を備える、［１］〜［９］のいずれかに記載の分離材。
［１１］分離材が充填されたカラムに、該カラムの圧力が０．３ＭＰａとなるように水を通液させたときに、水の通液速度が８００ｃｍ／ｈ以上である、［１］〜［１０］のいずれかに記載の分離材。
［１２］［１］〜［１１］のいずれかに記載の分離材を備えるカラム。
［１３］［１］〜［１１］のいずれかに記載の分離材の製造方法であって、多孔質ポリマー粒子の表面に水酸基を有する高分子を吸着させ、当該高分子を架橋する工程と、架橋された高分子に、原子移動ラジカル重合の開始基を導入する工程と、開始基に対して親水性モノマーをグラフトさせる工程と、を備える方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、タンパク質の非特異吸着が低減され、耐アルカリ性及び耐久性に優れ、カラムとして用いた時の通液性等のカラム特性に優れる分離材、該分離材の製造方法及び該分離材を備えるカラムを提供することが可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の詳細な説明するが、本発明はこれらの実施形態に何ら限定されるものではない。
【００１４】
＜分離材＞
本実施形態の分離材は、多孔質ポリマー粒子と、該多孔質ポリマー粒子の表面の少なくとも一部を被覆する被覆層とを備え、被覆層は、水酸基を有する架橋高分子を含み、該架橋高分子に親水性モノマーがグラフトされている。なお、本明細書中、「多孔質ポリマー粒子の表面」とは、多孔質ポリマー粒子の外側の表面のみでなく、多孔質ポリマー粒子の内部における細孔の表面を含むものとする。また、本明細書中（メタ）アクリル酸とは、アクリル酸又はメタクリル酸を意味し、（メタ）アクリレート等の類似の表現においても同様である。
【００１５】
本実施形態の分離材は、多孔質ポリマー粒子の表面に水酸基を有する高分子を吸着させ、当該高分子を架橋する工程と、架橋された高分子に、原子移動ラジカル重合の開始基を導入する工程と、開始基に対して親水性モノマーをグラフトさせる工程とを備える製造方法により作製することができる。
【００１６】
［多孔質ポリマー粒子］
本実施形態に係る多孔質ポリマー粒子は、多孔化剤含むモノマーを硬化させた粒子であり、例えば、従来の懸濁重合、乳化重合等により合成することができる。モノマーとしては、特に限定されないが、例えば、スチレン系モノマーを使用することができる。すなわち、多孔質ポリマー粒子は、スチレン系モノマーに由来する構造単位を有するポリマーを含むことができる。具体的なモノマーとしては、以下のような多官能性モノマー、単官能性モノマー等が挙げられる。
【００１７】
多官能性モノマーとしては、例えば、ジビニルベンゼン、ジビニルビフェニル、ジビニルナフタレン、ジビニルフェナントレン等のジビニル化合物が挙げられる。これらの多官能性モノマーは、１種単独で又は２種以上組み合わせて用いることができる。上記の中でも、耐久性、耐酸性及び耐アルカリ性の観点より、モノマーがジビニルベンゼンを含有することが好ましい。
【００１８】
単官能性モノマーとしては、例えば、スチレン、ｏ−メチルスチレン、ｍ−メチルスチレン、ｐ−メチルスチレン、α−メチルスチレン、ｏ−エチルスチレン、ｍ−エチルスチレン、ｐ−エチルスチレン、２，４−ジメチルスチレン、ｐ−ｎ−ブチルスチレン、ｐ−ｔ−ブチルスチレン、ｐ−ｎ−ヘキシルスチレン、ｐ−ｎ−オクチルスチレン、ｐ−ｎ−ノニルスチレン、ｐ−ｎ−デシルスチレン、ｐ−ｎ−ドデシルスチレン、ｐ−メトキシスチレン、ｐ−フェニルスチレン、ｐ−クロロスチレン、３，４−ジクロロスチレン等のスチレン及びその誘導体が挙げられる。これらの単官能性モノマーは、１種単独で又は２種以上組み合わせて用いることができる。上記の中でも、耐酸性及び耐アルカリ性に優れるという観点から、スチレンを使用することが好ましい。また、カルボキシル基、アミノ基、水酸基、アルデヒド基等の官能基を有するスチレン誘導体も使用することができる。
【００１９】
多孔質化剤としては、重合時に相分離を促し、粒子の多孔質化を促進する有機溶媒である脂肪族又は芳香族の炭化水素類、エステル類、ケトン類、エーテル類、アルコール類等が挙げられる。多孔質化剤として、例えば、トルエン、キシレン、シクロヘキサン、オクタン、酢酸ブチル、フタル酸ジブチル、メチルエチルケトン、ジブチルエーテル、１−ヘキサノール、２−オクタノール、デカノール、ラウリルアルコール及びシクロヘキサノールが挙げられる。これらの多孔質化剤は、１種単独で又は２種以上組み合わせて用いることができる。
【００２０】
上記多孔質化剤は、モノマー全質量に対して０〜２００質量％使用できる。多孔質化剤の量によって、多孔質ポリマー粒子の空隙率をコントロールできる。さらに、多孔質化剤の種類によって、多孔質ポリマー粒子の細孔の大きさ及び形状をコントロールすることができる。
【００２１】
溶媒として使用する水を多孔質化剤とすることもできる。水を多孔質化剤とする場合は、モノマーに油溶性界面活性剤を溶解させ、水を吸収することによって、粒子を多孔質化することが可能となる。
【００２２】
多孔質化に使用される油溶性界面活性剤としては、分岐Ｃ１６〜Ｃ２４脂肪酸、鎖状不飽和Ｃ１６〜Ｃ２２脂肪酸又は鎖状飽和Ｃ１２〜Ｃ１４脂肪酸のソルビタンモノエステル、例えば、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノミリステート又はヤシ脂肪酸から誘導されるソルビタンモノエステル；分岐Ｃ１６〜Ｃ２４脂肪酸、鎖状不飽和Ｃ１６〜Ｃ２２脂肪酸又は鎖状飽和Ｃ１２〜Ｃ１４脂肪酸のジグリセロールモノエステル、例えば、ジグリセロールモノオレエート（例えば、Ｃ１８：１（炭素数１８個、二重結合数１個）脂肪酸のジグリセロールモノエステル）、ジグリセロールモノミリステート、ジグリセロールモノイソステアレート又はヤシ脂肪酸のジグリセロールモノエステル；分岐Ｃ１６〜Ｃ２４アルコール（例えば、ゲルベアルコール）、鎖状不飽和Ｃ１６〜Ｃ２２アルコール又は鎖状飽和Ｃ１２〜Ｃ１４アルコール（例えば、ヤシ脂肪アルコール）のジグリセロールモノ脂肪族エーテル；及びこれらの混合物が挙げられる。
【００２３】
これらのうち、ソルビタンモノラウレート（例えば、ＳＰＡＮ（スパン、登録商標）２０、純度が好ましくは約４０％を超える、より好ましくは約５０％を超える、更に好ましくは約７０％を超えるソルビタンモノラウレート）、ソルビタンモノオレエート（例えば、ＳＰＡＮ（スパン、登録商標）８０、純度が好ましくは約４０％を超える、より好ましくは約５０％を超える、更に好ましくは約７０％を超えるソルビタンモノオレエート）、ジグリセロールモノオレエート（例えば、純度が好ましくは約４０％を超える、より好ましくは約５０％を超える、更に好ましくは約７０％を超えるジグリセロールモノオレエート）、ジグリセロールモノイソステアレート（例えば、純度が好ましくは約４０％を超える、より好ましくは約５０％を超える、更に好ましくは約７０％を超えるジグリセロールモノイソステアレート）、ジグリセロールモノミリステート（純度が好ましくは約４０％を超える、より好ましくは約５０％を超える、更に好ましくは約７０％を超えるソルビタンモノミリステート）、ジグリセロールのココイル（例えば、ラウリル基、ミリストイル基等）エーテル、又は、これらの混合物が好ましい。
【００２４】
これらの油溶性界面活性剤は、モノマー全質量に対して、５〜８０質量％の範囲で用いることが好ましい。油溶性界面活性剤の含有量が５質量％以上であると、水滴の安定性が充分となることから、大きな単一孔を形成し易くなる。また、油溶性界面活性剤の含有量が８０質量％以下であると、重合後に多孔質ポリマー粒子が形状をより保持し易くなる。
【００２５】
重合反応に用いられる水性媒体としては、水、水と水溶性溶媒（例えば、低級アルコール）との混合媒体等が挙げられる。水性媒体には、界面活性剤が含まれていてもよい。界面活性剤としては、アニオン系、カチオン系、ノニオン系及び両性イオン系の界面活性剤のうち、いずれも用いることができる。
【００２６】
アニオン系界面活性剤としては、例えば、オレイン酸ナトリウム、ヒマシ油カリ等の脂肪酸油、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸アンモニウム等のアルキル硫酸エステル塩、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム等のアルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキルナフタレンスルホン酸塩、アルカンスルホン酸塩、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム等のジアルキルスルホコハク酸塩、アルケルニルコハク酸塩（ジカリウム塩）、アルキルリン酸エステル塩、ナフタレンスルホン酸ホルマリン縮合物、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム等のポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩及びポリオキシエチレンアルキル硫酸エステル塩が挙げられる。
【００２７】
カチオン系界面活性剤としては、例えば、ラウリルアミンアセテート、ステアリルアミンアセテート等のアルキルアミン塩、ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド等の第四級アンモニウム塩が挙げられる。
【００２８】
ノニオン系界面活性剤としては、例えば、ポリエチレングリコールアルキルエーテル類、ポリエチレングリコールアルキルアリールエーテル類、ポリエチレングリコールエステル類、ポリエチレングリコールソルビタンエステル類、ポリアルキレングリコールアルキルアミン又はアミド類等の炭化水素系ノニオン界面活性剤、シリコンのポリエチレンオキサイド付加物類、ポリプロピレンオキサイド付加物類等のポリエーテル変性シリコン系ノニオン界面活性剤、パーフルオロアルキルグリコール類等のフッ素系ノニオン界面活性剤が挙げられる。
【００２９】
両性イオン系界面活性剤としては、例えば、ラウリルジメチルアミンオキサイド等の炭化水素界面活性剤、リン酸エステル系界面活性剤及び亜リン酸エステル系界面活性剤が挙げられる。
【００３０】
界面活性剤は、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。上記界面活性剤の中でも、モノマー重合時の分散安定性の観点から、アニオン系界面活性剤が好ましい。
【００３１】
必要に応じて添加される重合開始剤としては、例えば、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウロイル、オルソクロロ過酸化ベンゾイル、オルソメトキシ過酸化ベンゾイル、３，５，５−トリメチルヘキサノイルパーオキサイド、ｔｅｒｔ−ブチルパーオキシ−２−エチルヘキサノエート、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルパーオキサイド等の有機過酸化物；２，２’−アゾビスイソブチロニトリル、１，１’−アゾビスシクロヘキサンカルボニトリル、２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）等のアゾ系化合物が挙げられる。重合開始剤は、モノマー１００質量部に対して、０．１〜７．０質量部の範囲で使用することができる。
【００３２】
重合温度は、モノマー及び重合開始剤の種類に応じて、適宜選択することができる。重合温度は、２５〜１１０℃が好ましく、５０〜１００℃がより好ましい。
【００３３】
多孔質ポリマー粒子の合成において、粒子の分散安定性を向上させるために、高分子分散安定剤を用いてもよい。
【００３４】
高分子分散安定剤としては、例えば、ポリビニルアルコール、ポリカルボン酸、セルロース類（ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース等）、ポリビニルピロリドンが挙げられ、トリポリリン酸ナトリウム等の無機系水溶性高分子化合物も併用することができる。これらのうち、ポリビニルアルコール又はポリビニルピロリドンが好ましい。高分子分散安定剤の添加量は、モノマー１００質量部に対して１〜１０質量部が好ましい。
【００３５】
モノマーが単独で重合することを抑えるために、亜硝酸塩類、亜硫酸塩類、ハイドロキノン類、アスコルビン酸類、水溶性ビタミンＢ類、クエン酸、ポリフェノール類等の水溶性の重合禁止剤を用いてもよい。
【００３６】
多孔質ポリマー粒子の平均粒径は、好ましくは３００μｍ以下、より好ましくは１５０μｍ以下、更に好ましくは１００μｍ以下である。また、多孔質ポリマー粒子の平均粒径は、通液性の向上の観点から、好ましくは１０μｍ以上、より好ましくは３０μｍ以上、更に好ましくは５０μｍ以上である。
【００３７】
多孔質ポリマー粒子の粒径の変動係数（Ｃ．Ｖ．）は、通液性の向上の観点から、３〜１５％であることが好ましく、５〜１５％であることがより好ましく、５〜１０％であることが更に好ましい。Ｃ．Ｖ．を低減する方法としては、マイクロプロセスサーバー（日立製作所）等の乳化装置により単分散化することが挙げられる。
【００３８】
多孔質ポリマー粒子又は分離材の平均粒径及び粒径のＣ．Ｖ．は、以下の測定法により求めることができる。
１）粒子を、超音波分散装置を使用して水（界面活性剤等の分散剤を含む）に分散させ、１質量％の多孔質ポリマー粒子を含む分散液を調製する。
２）粒度分布計（シスメックスフロー、シスメックス株式会社製）を用いて、上記分散液中の粒子約１万個の画像により平均粒径及び粒径のＣ．Ｖ．を測定する。
【００３９】
多孔質ポリマー粒子の細孔容積は、多孔質ポリマー粒子の全体積基準で３０体積％以上７０体積％以下であることが好ましく、４０体積％以上７０体積％以下であることがより好ましい。多孔質ポリマー粒子は、細孔径が０．１μｍ以上０．５μｍ未満である細孔、すなわちマクロポアー（マクロ孔）を有することが好ましい。多孔質ポリマー粒子の細孔径として、より好ましくは、０．２μｍ以上０．５μｍ未満である。細孔径が０．１μｍ以上であると、細孔内に物質が入り易くなる傾向にあり、細孔径が０．５μｍ未満であると、比表面積が充分なものになる。これらは上述の多孔質化剤により調整可能である。
【００４０】
多孔質ポリマー粒子の比表面積は、３０ｍ２／ｇ以上であることが好ましい。より高い実用性の観点から、比表面積は３５ｍ２／ｇ以上であることがより好ましく、４０ｍ２／ｇ以上であることが更に好ましい。比表面積が３０ｍ２／ｇ以上であると、分離する物質の吸着量が大きくなる傾向にある。
【００４１】
［被覆層］
本実施形態に係る被覆層は、水酸基を有する架橋高分子を含む。水酸基を有する架橋高分子には、親水性モノマーがグラフトされている。すなわち、被覆層は、架橋高分子に結合した親水性モノマーに基づくグラフト鎖を有している。水酸基を有する架橋高分子で多孔質ポリマー粒子を被覆することによりカラム圧の上昇を抑制することができると共に、タンパク質の非特異吸着を抑制することが可能となる上、分離材のタンパク質吸着量を、天然高分子を用いた場合と同等又はそれ以上とすることが可能となる。また、親水性モノマーに基づくグラフト鎖を有することで、粒子の親水性を保ったまま被覆材に高い運動性を付与することが可能となる。
【００４２】
（水酸基を有する架橋高分子）
水酸基を有する架橋高分子は、１分子中に２個以上の水酸基を有することが好ましく、親水性高分子であることがより好ましい。水酸基を有する架橋高分子は、水酸基を有する高分子を架橋したものである。水酸基を有する高分子としては、例えば、多糖類又はその変性体、及び、ポリビニルアルコール又はその変性体高分子が挙げられる。多糖類としては、例えば、アガロース、デキストラン、プルラン、セルロース及びキトサンが挙げられる。水酸基を有する高分子として、例えば、平均分子量１万以上の高分子を使用できる。水酸基を有する架橋高分子は、多糖類又はその変性体由来の架橋高分子であることが好ましい。水酸基を有する架橋高分子は、アガロース、デキストラン又はプルラン由来の架橋高分子であってもよい。
【００４３】
水酸基を有する高分子は、界面吸着能を向上させる観点から、疎水基を導入した変性体であることが好ましい。疎水基としては、例えば、炭素数１〜６のアルキル基及び炭素数６〜１０のアリール基が挙げられる。炭素数１〜６のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基及びプロピル基が挙げられる。炭素数６〜１０のアリール基としては、例えば、フェニル基及びナフチル基が挙げられる。疎水性基は、水酸基と反応する官能基（例えば、エポキシ基）及び疎水基を有する化合物（例えば、グリシジルフェニルエーテル）を、水酸基を有する高分子と従来公知の方法で反応させることにより、導入することができる。
【００４４】
疎水性基を導入した水酸基を有する高分子の変性体における疎水性基の含有量は、粒子表面に吸着するための疎水的相互作用力の保持と、タンパク質の非特異吸着の抑制のバランスとから、５〜３０質量％であることが好ましく、１０〜２０質量％であることがより好ましく、１２〜１７質量％であることがと更に好ましい。
【００４５】
（被覆層の形成方法）
本実施形態に係る被覆層は、例えば、多孔質ポリマー粒子の表面に水酸基を有する高分子を吸着させた後、当該高分子を架橋して、多孔質ポリマー粒子の表面に水酸基を有する架橋高分子の層を形成し、次いで、当該架橋高分子に、原子移動ラジカル重合の開始基を導入した後、開始基に対して親水性モノマーをグラフトする方法により形成できる。以下、被覆層を形成する方法の具体例について説明する。
【００４６】
まず、水酸基を有する高分子の溶液を多孔質ポリマー粒子表面に吸着させる。水酸基を有する高分子の溶液の溶媒としては、水酸基を有する高分子を溶解することのできるものであれば、特に限定されないが、水が最も一般的である。溶媒に溶解させる高分子の濃度は、５〜２０（ｍｇ／ｍＬ）が好ましい。
【００４７】
この溶液を、多孔質ポリマー粒子に含浸させる。含浸方法は、水酸基を有する高分子の溶液に多孔質ポリマー粒子を加えて一定時間放置する。含浸時間は多孔質体の表面状態によっても変わるが、通常一昼夜含浸すれば高分子濃度が多孔質体の内部で外部濃度と平衡状態となる。その後、水、アルコール等の溶媒で洗浄し、未吸着分の水酸基を有する高分子を除去する。
【００４８】
（架橋処理）
次いで、架橋剤を加えて多孔質ポリマー粒子表面に吸着された水酸基を有する高分子を架橋反応させて、架橋体を形成する。このとき、架橋体は、水酸基を有する３次元架橋網目構造を有する。
【００４９】
架橋剤としては、例えば、エピクロルヒドリン等のエピハロヒドリン、グルタルアルデヒド等のジアルデヒド化合物、メチレンジイソシアネート等のジイソシアネート化合物、エチレングリコールジグリシジルエーテル等のグリシジル化合物などのような水酸基に活性な官能基を２個以上有する化合物が挙げられる。また、水酸基を有する高分子としてキトサンのようなアミノ基を有する化合物を使用する場合には、ジクロロオクタンのようなジハライド化合物も架橋剤として使用できる。
【００５０】
この架橋反応には通常触媒が用いられる。該触媒は架橋剤の種類に合わせて適宜従来公知のものを用いることができるが、例えば、架橋剤がエピクロルヒドリン等の場合には水酸化ナトリウム等のアルカリが有効であり、ジアルデヒド化合物の場合には塩酸等の鉱酸が有効である。
【００５１】
架橋剤による架橋反応は、通常、分離材を適当な媒体中に分散、懸濁させた系に架橋剤を添加することによって行われる。架橋剤の添加量は、水酸基を有する高分子として多糖類を使用した場合、単糖類の１単位を１モルとすると、それに対して０．１〜１００モル倍の範囲内で、分離材の性能に応じて選定することができる。一般に、架橋剤の添加量を少なくすると、被覆層が多孔質ポリマー粒子から剥離し易くなる傾向にある。また、架橋剤の添加量が過剰で、かつ、水酸基を有する高分子との反応率が高い場合、原料の水酸基を有する高分子の特性が損なわれる傾向にある。
【００５２】
触媒の使用量としては、架橋剤の種類により異なるが、通常、水酸基を有する高分子として多糖類を使用する場合に、多糖類を形成する単糖類の１単位を１モルとすると、これに対して０．０１〜１０モル倍の範囲、好ましくは０．１〜５モル倍で使用される。
【００５３】
例えば、該架橋反応条件を温度条件とした場合、反応系の温度を上げ、その温度が反応温度に達すれば架橋反応が生起する。
【００５４】
水酸基を有する高分子の溶液等を含浸させた多孔質ポリマー粒子を分散、懸濁させる媒体としては、含浸させた高分子溶液から高分子、架橋剤等を抽出してしまうことなく、かつ、架橋反応に不活性なものである必要がある。媒体の具体例としては、水、アルコール等が挙げられる。
【００５５】
架橋反応は、通常、５〜９０℃の範囲の温度で、１〜１０時間かけて行う。好ましくは、３０〜９０℃の範囲の温度である。
【００５６】
架橋反応終了後、生成した粒子を濾別し、次いでメタノール、エタノール等の親水性有機溶媒で洗浄し、未反応の高分子、懸濁用媒体等を除去すれば、多孔質ポリマー粒子の表面の少なくとも一部が、水酸基を有する高分子を含む被覆層により被覆された分離材が得られる。
【００５７】
本実施形態の分離材は、多孔質ポリマー粒子の１ｇ当たり３０〜５００ｍｇの水酸基を有する架橋高分子を含む被覆層を備えると好ましい。該架橋高分子の被覆量は、多孔質ポリマー粒子の１ｇ当たり１００〜４５０ｍｇであることがより好ましく、２００〜４００ｍｇであることが更に好ましい。架橋高分子の被覆量が多孔質ポリマー粒子１ｇに対して５００ｍｇ以下であると、被覆層を薄膜とすることができ、カラムとして用いたときの通液性がより向上する傾向にある。また、架橋高分子の被覆量が多孔質ポリマー粒子１ｇに対して３０ｍｇ以上であると、タンパク質吸着量がより高まる傾向にある。水酸基を有する架橋高分子の被覆量は、熱分解の重量減少等で測定することができる。
【００５８】
（ＡＴＲＰ開始基の導入）
水酸基を有する架橋高分子により被覆された多孔質ポリマー粒子には、ＡＴＲＰ（原子移動ラジカル重合）の開始基を表面上の水酸基を変換して導入することができる。ＡＴＲＰ開始基の導入により、水酸基に親水性モノマーをグラフトすることが可能となる。ＡＴＲＰ開始基の導入方法として、例えば、ハロゲン化アルキル化合物を用いる方法が挙げられる。
【００５９】
ハロゲン化アルキル化合物は、臭化物又は塩化物であることが好ましい。ハロゲン化アルキル化合物としては、例えば、２−ブロモブチリルブロミド等のハロゲン化アルキルを有する化合物が挙げられる。
【００６０】
ＡＴＲＰ開始基の導入は、粒子表面の水酸基に行われるので、粒子をろ過等により水切りした後、有機溶媒中に浸漬し、所定濃度のアミン存在下中にハロゲン化アルキルを添加して反応させる。この反応の反応温度は、ハロゲン化アルキル添加時は０℃にて行い、その後は室温にて１２〜２４時間行うことが好ましい。
【００６１】
（親水性モノマーのグラフト）
次いで、ＡＴＲＰ開始基を導入した粒子に親水性モノマーを反応させる。通常、モノマーの反応は、ＡＴＲＰ開始基に行われるので、粒子をろ過等により水切りした後、有機溶媒中に浸漬し、所定濃度となるようにハロゲン化銅、トリスジメチルアミノエチルアミン、アスコルビン酸及び親水性モノマーを添加して不活性ガス下で反応させる。この反応温度は２０〜４０℃で、１２〜２４時間行うことが好ましい。
【００６２】
親水性モノマーとしては、親水性の（メタ）アクリレート化合物を用いることができる。親水性が向上する観点から、水酸基を有する（メタ）アクリレート化合物が好ましい。水酸基を有する（メタ）アクリレート化合物としては、例えば、ヒドロキシエチルメクリレート、グリセリンモノメタクリレート、ポリエチレングリコールモノメタクリレート等のメタクリレート；及びヒドロキシエチルアクリレート、グリセリンモノアクリレート、ポリエチレングリコールモノアクリレート等のアクリレートが挙げられる。
【００６３】
親水性モノマーのグラフト量は、多孔質ポリマー粒子の１ｇ当たり１０〜５００ｍｇであることが好ましく、２０〜４５０ｍｇであることがより好ましく、３０〜４３０ｍｇであることが更に好ましい。グラフト量が多孔質ポリマー粒子１ｇに対して５００ｍｇ以下であると、細孔がグラフト鎖により埋没しない傾向にある。また、グラフト量が多孔質ポリマー粒子１ｇに対して１０ｍｇ以上であると、圧縮弾性率が向上しタンパク質吸着量も向上する傾向にある。グラフト量は熱分解の重量減少等で測定することができる。
【００６４】
（イオン交換基の導入）
上記被覆層を備える分離材は、イオン交換基、リガンド（プロテインＡ）等を表面上の水酸基等を介して導入することにより、イオン交換精製、アフィニティ精製等に使用することができる。イオン交換基の導入方法として、例えば、ハロゲン化アルキル化合物を用いる方法が挙げられる。
【００６５】
ハロゲン化アルキル化合物としては、モノハロゲノ酢酸、モノハロゲノプロピオン酸等のモノハロゲノカルボン酸及びそのナトリウム塩、ジエチルアミノエチルクロライド等のハロゲン化アルキル基を少なくとも１つ有する１級、２級又は３級アミン、ハロゲン化アルキル基を有する４級アンモニウムの塩酸塩などが挙げられる。これらのハロゲン化アルキル化合物は、臭化物又は塩化物であることが好ましい。ハロゲン化アルキル化合物の使用量としては、イオン交換基を付与する分離材の全質量に対して０．２質量％以上であることが好ましい。
【００６６】
イオン交換基の導入には、反応を促進させるために、有機溶媒を用いることが有効である。有機溶媒としては、例えば、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、イソブタノール、１−ペンタノール、イソペンタノール等のアルコール類が挙げられる。
【００６７】
通常、イオン交換基の導入は、分離材表面の水酸基に行われるので、湿潤状態の粒子を、ろ過等により水切りした後、所定濃度のアルカリ性水溶液に浸漬し、一定時間放置した後、水−有機溶媒混合系で、上記ハロゲン化アルキル化合物を添加して反応させる。この反応は温度４０〜９０℃で、０．５〜１２時間行うことが好ましい。上記の反応で使用されるハロゲン化アルキル化合物の種類により、付与されるイオン交換基が決定される。
【００６８】
イオン交換基として、弱塩基性基であるアミノ基を導入する方法としては、上記ハロゲン化アルキル化合物のうち、アルキル基のうちの少なくとも１つがハロゲン化アルキル基で置換されている、モノ−、ジ−又はトリ−アルキルアミン、モノ−、ジ−又はトリ−アルカノールアミン、モノ−アルキル−モノ−アルカノールアミン、ジ−アルキル−モノ−アルカノールアミン、モノ−アルキル−ジ−アルカノールアミン等を反応させる方法が挙げられる。これらのハロゲン化アルキル化合物の使用量としては、分離材の全質量に対して０．２質量％以上であることが好ましい。反応条件は、４０〜９０℃で、０．５〜１２時間であることが好ましい。
【００６９】
イオン交換基として、強塩基性基の４級アンモニウム基を導入する方法としては、まず、３級アミノ基を導入し、該３級アミノ基にエピクロルヒドリン等のハロゲン化アルキル化合物を反応させ、４級アンモニウム基に変換させる方法が挙げられる。また、４級アンモニウムの塩酸塩等を分離材に反応させてもよい。
【００７０】
イオン交換基として、弱酸性基であるカルボキシ基を導入する方法としては、上記ハロゲン化アルキル化合物として、モノハロゲノ酢酸、モノハロゲノプロピオン酸等のモノハロゲノカルボン酸又はそのナトリウム塩を反応させる方法が挙げられる。これらハロゲン化アルキル化合物の使用量は、イオン交換基を導入する分離材の全質量に対して０．２質量％以上であることが好ましい。
【００７１】
イオン交換基として、強酸性基であるスルホン酸基の導入方法としては、分離材に対してエピクロロヒドリン等のグリシジル化合物を反応させ、亜硫酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム等の亜硫酸塩又は重亜硫酸塩の飽和水溶液に分離材を添加する方法が挙げられる。反応条件は、３０〜９０℃で１〜１０時間であることが好ましい。
【００７２】
一方、イオン交換基の導入方法として、アルカリ性雰囲気下で、分離材に１，３−プロパンスルトンを反応させる方法も挙げられる。１，３−プロパンスルトンは、分離材の全質量に対して０．４質量％以上使用することが好ましい。反応条件は、０〜９０℃で０．５〜１２時間であることが好ましい。
【００７３】
本実施形態の分離材の平均粒径は、１０〜３００μｍであることが好ましく、分取用又は工業用のクロマトグラフィーでの使用には、カラム内圧の極端な増加を避けるために、１０〜１００μｍであることがより好ましく、５０〜１００μｍであることが更に好ましい。
【００７４】
分離材は、モード細孔径が０．０５〜０．６μｍである細孔、すなわちマクロポアー（マクロ孔）を有することが好ましい。モード細孔径は、好ましくは、０．１〜０．５μｍである。細孔径が０．０５μｍ以上であると、細孔内に物質が入り易くなる傾向にあり、細孔径が０．６μｍ以下であると、比表面積が充分なものになる。
【００７５】
分離材の比表面積は、２０ｍ２／ｇ以上であることが好ましい。より高い実用性の観点から、比表面積は２５ｍ２／ｇ以上であることがより好ましい。比表面積が２０ｍ２／ｇ以上であると、分離する物質の吸着量が大きくなる傾向にある。分離材の比表面積の上限値は、１０００ｍ２／ｇ以下とすることができる。
【００７６】
分離材の空隙率は、４０〜７０体積％であることが好ましい。空隙率がこの範囲にあると、タンパク質吸着量を多くすることができる。
【００７７】
本実施形態に係る分離材又は多孔質ポリマー粒子のモード細孔径、比表面積及び空隙率は、水銀圧入測定装置（オートポア：株式会社島津製作所製）にて測定した値であり、以下のようにして測定する。試料約０．０５ｇを、標準５ｍＬ粉体用セル（ステム容積０．４ｍＬ）に加え、初期圧２１ｋＰａ（約３ｐｓｉａ、細孔直径約６０μｍ相当）の条件で測定する。水銀パラメータは、装置デフォルトの水銀接触角１３０°、水銀表面張力４８５ｄｙｎｅｓ／ｃｍに設定する。また、細孔径０．１〜３μｍの範囲に限定してそれぞれの値を算出する。
【００７８】
分離材のモード細孔径、比表面積等は、多孔質ポリマー粒子の原料、多孔質化剤、水酸基を有する高分子等を適宜選択することによって、調整することができる。
【００７９】
本実施形態の分離材の５％圧縮変形弾性率は、以下のようにして算出することができる。
微小圧縮試験機（Ｆｉｓｈｅｒ製）を用いて、室温（２５℃）条件にて荷重負荷速度１ｍＮ／秒で、四角柱の平滑な端面（５０μｍ×５０μｍ）により分離材を５０ｍＮまで圧縮したときの荷重及び圧縮変位を測定する。得られた測定値から、分離材が５％圧縮変形したときの圧縮弾性率（５％Ｋ値）を下記式により求めることができる。また、上記測定中の変位量が最も大きく変化する点の荷重を破壊強度（ｍＮ）とする。
５％Ｋ値（ＭＰａ）＝（３／２１／２）・Ｆ・Ｓ−３／２・Ｒ−１／２
５％Ｋ値（ＭＰａ）＝（３／２１／２）・Ｆ・Ｓ−３／２・Ｒ−１／２
Ｆ：分離材が５％圧縮変形したときの荷重（ｍＮ）
Ｓ：分離材が５％圧縮変形したときの圧縮変位（ｍｍ）
Ｒ：分離材の半径（ｍｍ）
【００８０】
分離材を５％圧縮変形したときの圧縮弾性率（５％Ｋ値）は、１００〜１０００ＭＰａであることが好ましく、１５０〜１０００ＭＰａであることがより好ましく、１７０〜１０００ＭＰａであることが更に好ましい。圧縮弾性率が１００ＭＰａ以上であると、分離材の剛直性が高くなり、カラム内で液を流した際に変形し難くなり、カラム圧が高くなり難くなる。
【００８１】
本実施形態の分離材は、タンパク質を静電的相互作用による分離、アフィニティ精製に用いるのに好適である。例えば、タンパク質を含む混合溶液の中に本実施形態の分離材を添加し、静電的相互作用によりタンパク質だけを分離材に吸着させた後、該分離材を溶液からろ別し、塩濃度の高い水溶液中に添加すれば、分離材に吸着しているタンパク質を容易に脱離、回収できる。また、本実施形態の分離材は、カラムクロマトグラフィーにおいて、使用することも可能である。
【００８２】
本実施形態の分離材を用いて分離できる生体高分子としては、水溶性物質が好ましい。具体的には、血清アルブミン、免疫グロブリン等の血液タンパク質などのタンパク質、生体中に存在する酵素、バイオテクノロジーにより生産されるタンパク質生理活性物質、ＤＮＡ、生理活性をするペプチド等の生体高分子などであり、好ましくは分子量が２００万以下、より好ましくは５０万以下である。また、公知の方法に従い、タンパク質の等電点、イオン化状態等によって、分離材の性質、条件等を選ぶ必要がある。公知の方法としては、例えば、特開昭６０−１６９４２７号公報等に記載の方法が挙げられる。
【００８３】
本実施形態の分離材は、多孔質ポリマー粒子上の被覆層を架橋処理後、分離材の表面にイオン交換基、プロテインＡを導入することにより、タンパク質等の生体高分子の分離において、天然高分子からなる粒子又は合成ポリマーからなる粒子のそれぞれの利点を有する。特に本実施形態の分離材における多孔質ポリマー粒子は、上述の方法で得られるものであるため、耐久性及び耐アルカリ性を有する。また、本実施形態の分離材は、タンパク質の非特異吸着を低減し、タンパク質の吸脱着が起こり易い傾向にある。さらに、本実施形態の分離材は、同一流速下でのタンパク質等の吸着量（動的吸着量）が大きい傾向にある。
【００８４】
本明細書における通液速度とは、φ７．８×３００ｍｍのステンレスカラムに本実施形態の分離材を充填し、液を通した際の通液速度を表す。本実施形態の分離材は、カラムに充填した場合、カラムの圧力が０．３ＭＰａとなるように水を通液させたときに、水の通液速度が８００ｃｍ／ｈ以上であることが好ましい。カラムクロマトグラフィーでタンパク質の分離を行う場合、タンパク質溶液等の通液速度としては、一般に４００ｃｍ／ｈ以下の範囲であるが、本実施形態の分離材を使用した場合は、通常のタンパク質分離用の分離材よりも速い通液速度８００ｃｍ／ｈ以上で使用することができる。
【００８５】
なお、本実施形態では、イオン交換基を導入する形態の分離材について説明したが、イオン交換基を導入しなくても分離材として用いることができる。このような分離材は、例えば、ゲルろ過クロマトグラフィーに利用することができる。
【実施例】
【００８６】
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００８７】
（多孔質ポリマー粒子）
５００ｍＬの三口フラスコに、純度９６％のジビニルベンゼン（新日鉄住金化学株式会社製、商品名「ＤＶＢ９６０」）１６ｇ、ヘキサノール１６ｇ、ジエチルベンゼン１６ｇ及び過酸化ベンゾイル０．６４ｇを、０．５質量％のポリビニルアルコール水溶液に加え、マイクロプロセスサーバーを使用して乳化後、得られた乳化液をフラスコに移し、８０℃のウォーターバスで加熱しながら、攪拌機を用いて約８時間撹拌をした。得られた粒子をろ過後、アセトンで洗浄し、多孔質ポリマー粒子を得た。得られた多孔質ポリマー粒子の粒径をフロー型粒径測定装置で測定し、平均粒径及び粒径のＣ．Ｖ．値（変動係数）を算出した。結果を表１に示す。
【００８８】
（変性アガロース）
２質量％のアガロース水溶液４８０ｍＬに、水酸化ナトリウム０．９８ｇ及びグリシジルフェニルエーテル４．９０ｇを添加し、６０℃で６時間反応させ、アガロースにフェニル基を導入した。得られた変性アガロースをイソプロピルアルコールで再沈殿させ、洗浄した。変性アガロースの疎水性基含有量を下記方法により算出したところ、１４．２％であった。
【００８９】
乾燥状態の粉末アガロース（変性されていないアガロース）と、揮発分０．１質量％未満まで乾燥させた疎水性基導入アガロースとを、それぞれ７０℃の純水に溶解させ、０．０５質量％の水溶液サを調製した。分光光度計により各水溶液の２６９ｎｍの吸光度を測定して濃度を求めることで、下記式より疎水性基含有量を算出した。
・疎水性基含有量（％）＝（ＣＡＧ／（ＣＨＡＧ＋ＣＡＧ））×１００
・ＣＡＧ：変性アガロース構成単位の濃度（ｍｍｏｌ／Ｌ）＝Ａ／εＧＰＥ×１０００
・ＣＨＡＧ：変性されていないアガロース構成単位の濃度（ｍｍｏｌ／Ｌ）＝［変性されてないアガロース構成単位の濃度（ｇ／Ｌ）／アガロース構成単位（３０６ｇ／ｍｏｌ）］×１０００
・Ａ：変性アガロースの真の吸光度＝変性アガロースの吸光度−変性されていないアガロースの吸収
・εＧＰＥ：グリシジルフェニルエーテルの吸光係数＝１３７２（Ｌ／（ｍｏｌ・ｃｍ））
・変性されてないアガロース構成単位の濃度（ｇ／Ｌ）＝変性アガロースのサンプル濃度（質量％）×１０−変性されているアガロース構成単位の濃度（ｇ／Ｌ）
・変性されていないアガロースの吸収＝変性されてないアガロースの吸光度×［変性アガロースのサンプル濃度（ｍｍｏｌ／Ｌ）／変性されてないアガロースのサンプル濃度（ｍｍｏｌ／Ｌ）］
・変性アガロース成単位の濃度（ｇ／Ｌ）＝（ＣＡＧ×変性アガロース構成単位（４５６ｇ／ｍｏｌ））／１０００
【００９０】
［実施例１］
＜被覆層の形成＞
２０ｍｇ／ｍＬの変性アガロース水溶液に、多孔質ポリマー粒子を７０ｍＬ／粒子ｇの濃度で投入し、５５℃で２４時間攪拌して、多孔質ポリマー粒子に変性アガロースを吸着させた後、ろ過を行い、熱水で洗浄した。
【００９１】
（架橋処理）
多孔質ポリマー粒子に吸着した変性アガロースは次のようにして架橋した。変性アガロースが吸着した粒子１０ｇを０．４Ｍ水酸化ナトリウム水溶液に分散させ、０．０４Ｍエピクロロヒドリンを添加し、８時間室温にて攪拌した。その後、２質量％のドデシル硫酸ナトリウム水溶液の熱水で洗浄後、純水で洗浄した。得られた粒子を乾燥後、熱重量分析により水酸基を有する架橋高分子の被覆量を測定した。
【００９２】
（ＡＴＲＰ開始基の導入）
水酸基を有する架橋高分子で被覆された粒子へのＡＴＲＰ開始基の導入は次のように行った。ドデシル硫酸ナトリウム水溶液で洗浄した粒子２ｇを、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド２５０ｍＬに分散させ、トリエチルアミン１．１ｇを添加した分散液を氷浴に浸し、２−ブロモブチリルブロミド２．５ｇを５０ｍＬのＤＭＦに溶解させた溶液を添加した。添加後は、２４時間室温にて攪拌した後、純水で洗浄を行い、次いでアセトンで洗浄して、ＡＴＲＰ開始基を導入した粒子を得た。
【００９３】
（親水性モノマーのグラフト）
ＡＴＲＰ開始基を導入した粒子２ｇをメタノール５０ｍＬに分散させ、３．１ｇのアスコルビン酸を添加して溶液ａを調製した。また、グリセリンモノメタクリレート（ＧＬＭ）６０ｇ、二臭化銅８ｍｇ及びトリスジメチルアミノエチルアミン１６ｍｇをメタノール１５０ｍＬに添加して溶液ｂを調製した。溶液ａ及びｂに窒素ガスのバブリングを１５分間行った後、溶液ａ及びｂを混合して２４時間攪拌した。その後、純水で洗浄を行い、親水性モノマーがグラフトされた分離材の水懸濁液を得た。得られた粒子を乾燥後、熱重量分析により親水性モノマーのグラフト量を測定した。
【００９４】
（タンパク質の非特異吸着評価）
親水性モノマーがグラフトされた粒子０．２ｇをＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ、Ｍｗ６６０００）濃度２４ｍｇ／ｍＬのＴｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）２０ｍＬに投入し、２４時間室温で攪拌を行った後、遠心分離で上澄みをとり、分光光度計でろ液のＢＳＡ濃度より、粒子に吸着したＢＳＡ量を算出した。ＢＳＡの濃度は分光光度計により２８０ｎｍの吸光度から確認した。また、ＢＳＡの替わりにインスリン（Ｍｗ５８００）を使用して同様の評価を行った。非特異吸着量が１０ｍｇ／ｍＬ以下を「○」、１０ｍｇ／ｍＬ超を「×」とした。結果を表３に示す。
【００９５】
＜イオン交換基の導入＞
上記水懸濁液をろ過して回収した分離材（乾燥質量２０ｇ）を５Ｍの水酸化ナトリウム水溶液２００ｍＬに投入し、室温で１時間放置した。別途、ジエチルアミノエチルクロライド塩酸塩の所定量（６０ｇ）を２００ｍＬ添加し、水溶液の温度を７０℃まで上げ、撹拌しながら８時間反応させた。反応終了後、濾過、水／エタノール（体積比５／１）で３回洗浄し、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基をイオン交換基として有するＤＥＡＥ変性分離材を得た。得られたＤＥＡＥ変性分離材のモード細孔径及び比表面積は、水銀圧入法にて測定した。結果を表２に示す。
【００９６】
＜イオン交換基容量の測定＞
得られた粒子のイオン交換基容量を以下のように測定した。５ｍＬ容量の粒子を０．１Ｎ水酸化ナトリウム２０ｍＬに１時間浸漬し、室温で攪拌した。その後、溶液のｐＨが７以下となるように水で洗浄を行った。得られた粒子を０．１Ｎ塩酸１０ｍＬに浸漬し、１時間攪拌させた。粒子をろ過後、塩酸水溶液を中和滴定することにより粒子のイオン交換基容量を測定した。結果を表３に示す。
【００９７】
（５％圧縮変形弾性率）
得られたＤＥＡＥ変性分離材の５％圧縮変形弾性率を上述の方法で測定した。結果を表３に示す。
【００９８】
（カラム特性）
得られたＤＥＡＥ変性分離材を濃度３０質量％のスラリー（溶媒：メタノール）としてφ７．８×３００ｍｍのステンレスカラムに１５分かけて充填した。その後、カラムに流速を変えながら水を流し、流速とカラム圧との関係を測定し、０．３ＭＰａ時の通液速度（線流速）を測定した。結果を表２に示す。
また、動的吸着量は以下のようにして測定した。２０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）をカラムに１０カラム容量流した。その後、ＢＳＡ濃度２ｍｇ／ｍＬの２０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−塩酸緩衝液を流し、ＵＶ測定によりカラム出口でのＢＳＡ濃度を測定した。カラム入口と出口のＢＳＡ濃度が一致するまで液を流し、５カラム容量分の１Ｍ  ＮａＣｌ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液で希釈した。１０％ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈにおける動的吸着量を以下の式を用いて算出した。結果を表３に示す。
ｑ１０＝ｃｆＦ（ｔ１０−ｔ０）／ＶＢ
ｑ１０：１０％ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈにおける動的吸着量（ｍｇ／ｍＬ  ｗｅｔ  ｒｅｓｉｎ）
ｃｆ：注入しているＢＳＡ濃度
Ｆ：流速（ｍＬ／ｍｉｎ）
ＶＢ：ベッド体積（ｍＬ）
ｔ１０：１０％ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈにおける時間（ｍｉｎ）
ｔ０：ＢＳＡ注入開始時間（ｍｉｎ）
【００９９】
（耐アルカリ性評価）
得られたＤＥＡＥ変性分離材を０．５Ｍの水酸化ナトリウム水溶液中で２４ｈ攪拌し、Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄後、カラムに上記条件にて充填した。ＢＳＡの１０％ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈ動的吸着量を測定し、アルカリ処理前の動的吸着量と比較した。動的吸着合量の減少が３％未満である場合を「○」、３〜２０％を「△」、２０％超を「×」とした。結果を表３に示す。
【０１００】
（耐久性評価）
８００ｃｍ／ｈの流速で水をカラムに流し、カラム圧を測定後、３０００ｃｍ／ｈに流速を上昇させ、１ｈ通液させた。再度８００ｃｍ／ｈにカラム圧を下げた際に、カラム圧が初期値（３０００ｃｍ／ｈに流速を上げる前）より１０％以上上昇した場合を「×」、１０％未満である場合を「○」とした。結果を表３に示す。
【０１０１】
［実施例２］
ＡＴＲＰ開始基を導入する工程で、トリエチルアミン８２０ｍｇ及び２−ブロモブチリルブロミド１．９ｇを使用した以外は、実施例１と同様の処理を行い、ＤＥＡＥ変性分離材を作製して、実施例１と同様に評価を行った。
【０１０２】
［実施例３］）
ＡＴＲＰ開始基を導入する工程で、トリエチルアミン２７０ｍｇ及び２−ブロモブチリルブロミド０．６３ｇを使用した以外は、実施例１と同様の処理を行い、ＤＥＡＥ変性分離材を作製して、実施例１と同様に評価を行った。
【０１０３】
［実施例４］
ＡＴＲＰ開始基の導入工程で、トリエチルアミン２７０ｍｇ及び２−ブロモブチリルブロミド０．６３ｇを使用し、親水性モノマーをグラフトする工程で、ＧＬＭに替えてヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）を使用した以外は、実施例１と同様の処理を行い、ＤＥＡＥ変性分離材を作製して、実施例１と同様に評価を行った。
【０１０４】
［比較例１］
ＡＴＲＰ開始基を導入する工程及び親水性モノマーのグラフト工程を行わずにイオン交換基を導入する工程を行った以外は、実施例１と同様の処理を行い、ＤＥＡＥ変性分離材を作製して、実施例１と同様に評価を行った。
【０１０５】
［比較例２］
親水性モノマーのグラフト工程で、ＧＬＭに替えてフェニルメタクリレート（ＰＭＡ）を使用した以外は、実施例１と同様の処理を行い、ＤＥＡＥ変性分離材を作製して、実施例１と同様に評価を行った。
【０１０６】
［比較例３］
市販のアガロース粒子（ＧＥヘルスケア社製、商品名「Ｃａｐｔｏ  ＤＥＡＥ」）を分離材として使用して、実施例１と同様に評価を行った。
【０１０７】
【表１】
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【０１０８】
【表２】
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【０１０９】
【表３】
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【０１１０】
実施例の分離材は、非特異吸着は少なく、０．３ＭＰａ時の通液速度が速く、動的吸着量も高い値を保つことがわかった。また、実施例の分離材は、親水性モノマーに基づくグラフト鎖を有することで、アミノ基量、動的吸着量が向上することが確認できた。さらに、実施例の分離材は、耐アルカリ性及び耐久性に充分に優れることがわかった。