(57)【要約】【課題】タンパク質のリフォールディングの効率が良く、良好な収率でタンパク質を製造できる技術を提供する。【解決手段】一般式（１）で示される環状ポリエーテルエステル（Ａ）を含むタンパク質製造用薬剤である。一般式（１）中、Ｒ１は水素原子の少なくとも１つがハロゲノ基、アセチル基、アルコキシ基又はフェノキシ基で置換されていてもよい炭素数２〜２１の２価の炭化水素基であり、Ｒ２は炭素数２〜８の２価の炭化水素基であり、ｍは１〜３の整数であり、ｎは１〜３０の整数であり、ｍ個あるＲ１は同じであっても異なっていてもよく、ｍ×ｎ個あるＲ２は同じであっても異なっていてもよい。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）で表される環状ポリエーテルエステル（Ａ）を含むタンパク質製造用薬剤。
【化１】
2018052840.tif 000005
［式中、Ｒ１は水素原子の少なくとも１つがハロゲノ基、アセチル基、アルコキシ基又はフェノキシ基で置換されていてもよい炭素数２〜２１の２価の炭化水素基であり、Ｒ２は炭素数２〜８の２価の炭化水素基であり、ｍは１〜３の整数であり、ｎは１〜３０の整数であり、ｍ個あるＲ１は同じであっても異なっていてもよく、ｍ×ｎ個あるＲ２は同じであっても異なっていてもよい。］
【請求項２】
一般式（１）におけるＲ１が炭素数３〜１６の直鎖又は分岐アルキレン基であり、Ｒ２が炭素数２〜４のアルキレン基である請求項１に記載のタンパク質製造用薬剤。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のタンパク質製造用薬剤を含む水溶液中でタンパク質のリフォールディングを行う工程を含むタンパク質の製造方法。
【請求項４】
前記水溶液に含まれる環状ポリエーテルエステル（Ａ）の濃度が水溶液の合計重量に基づいて０．０１〜１重量％である請求項３に記載のタンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質製造用薬剤及びそれを用いたタンパク質の製造方法に関する。さらに詳しくはアンフォールディングされたタンパク質を活性のあるタンパク質構造へと巻き戻す工程で用いられるタンパク質製造用薬剤及びそれを用いたタンパク質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子工学の発展により、さまざまなタンパク質が大量に調製され、医薬品製造や食品加工、臨床診断等の多岐にわたる産業に利用されている。なかでも、ベクター技術の開発によって、大腸菌や酵母の菌体等の組換え体の体内で標的とするタンパク質を大量に発現させる技術が開発され、少ない資源で簡単に標的とするタンパク質の生産を再現性良く実行できるようになってきた。
しかし、組換え体で発現させたタンパク質の多くは立体構造に秩序が無く、高次構造が制御されていないため、不活性な封入体と呼ばれる小粒子顆粒を形成することが多い。このため、大腸菌による生産プロセスでは、封入体を解きほぐし（アンフォールディング）、高次構造を整えた後、秩序だった立体構造を持つタンパク質に変換する操作（リフォーディング）が必要である。
【０００３】
例えば、尿素及び塩酸グアニジン等の変性剤を用いて封入体をアンフォールディングした後、使用した変性剤を希釈透析法等で取り除くことでリフォールディングする方法が知られている。しかし、変性剤を取り除いただけでは、封入体への巻き戻りが生じる再凝集反応も進行するためにリフォールディングの効率が高くない。そのため、巻き戻しを抑制するために特定構造のグルカンデンドリマーを用いる方法（特許文献１）が知られている。
【０００４】
しかしながら、特許文献１に記載の方法でも、タンパク質の再凝集を抑制する効果が十分ではないために、リフォールディングの効率とタンパク質の収量が十分ではないという課題があった。
【特許文献１】特開２０１６−８８８６２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、リフォールディングの効率が良く、良好な収率でタンパク質を製造できる技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、前記の目的を達成すべく検討を行った結果、本発明に到達した。すなわち、本発明は、一般式（１）で表される環状ポリエーテルエステル（Ａ）を含むタンパク質製造用薬剤、及びタンパク質製造用薬剤の水溶液中でタンパク質のリフォールディングを行う工程を含むタンパク質の製造方法である。
【０００７】
【化１】
2018052840.tif 000002
【０００８】
一般式（１）中、Ｒ１は水素原子の少なくとも１つがハロゲノ基、アセチル基、アルコキシ基又はフェノキシ基で置換されていてもよい炭素数２〜２１の２価の炭化水素基であり、Ｒ２は炭素数２〜８の２価の炭化水素基であり、ｍは１〜３の整数であり、ｎは１〜３０の整数であり、ｍ個あるＲ１は同じであっても異なっていてもよく、ｍ×ｎ個あるＲ２は同じであっても異なっていてもよい。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のタンパク質製造用薬剤は、アンフォールディングしたタンパク質の再凝集を効率よく抑制できる。本発明のリフォールディング添加剤を用いたタンパク質の製造方法は、リフォールディングの効率が高く、タンパク質を収量良く得ることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明のタンパク質製造用薬剤は、上記一般式（１）で表される環状ポリエーテルエステル（Ａ）を含む。
【００１１】
本発明のタンパク質製造用薬剤は、立体構造が制御されたタンパク質の製造にもちいることができ、例えば、大腸菌等の組換え体で発現させた後、アンフォールディングしたタンパク質をリフォールディングする工程で用いることができる。本発明のタンパク質製造用薬剤をタンパク質のリフォールディングに用いる場合、リフォーディングするタンパク質としては、タンパク質は分子内にジスルフィド結合を含むタンパク質（Ｐ１）と分子内にジスルフィド結合を含まないタンパク質（Ｐ２）が挙げられる。
分子内にジスルフィド結合を含むタンパク質（Ｐ１）としては、リゾチーム、βラクトグロブリン、アルカリ性フォスファターゼ、リボヌクレアーゼ、トリプシン、キモトリプシン、インターフェロン、インスリン、ナトリウム利尿ペプチド及び抗体等が挙げられる。
分子内にジスルフィド結合を含まないタンパク質（Ｐ２）として、リパーゼ、ホスホリパーゼ及び２〜１０個のアミノ酸で構成されたペプチド等が挙げられる。
これらのうち、本発明の効果が顕著である点から、分子内にＳ−Ｓ結合を含むタンパク質（Ｐ１）が好ましく、タンパク質分子内にＳ−Ｓ結合を１個〜１０個（好ましくは２個〜４個）有するリゾチーム（４個）、βラクトグロブリン（２〜３個）、トリプシン（２個）等が更に好ましい。
分子内のＳ−Ｓ結合の個数はタンパク質の凝集に大きく関与し、一般的にＳ−Ｓ結合の数が多いほどタンパク質は凝集しやすいため、リフォールディングの際の本発明のタンパク質製造用薬剤の効果が顕著になる。
【００１２】
本発明のタンパク質製造用薬剤をタンパク質のリフォーディングに用いる場合、リフォールディングの対象とするタンパク質の分子量は１，０００〜３００，０００であり、リフォールディングのしやすさの観点から好ましくは１０，０００〜２５０，０００である。ここで分子量とはＳＤＳゲル電気泳動法によって推定された分子量を指す。
一般に分子量の大きさとリフォールディングのしにくさには相関があり、分子量の大きなタンパク（分子量１０，０００以上程度）になるとリフォールディングが著しく困難になるとされている。本発明のタンパク質製造用薬剤はリフォールディング効果が優れるので、分子量１０，０００以上の高分子量タンパク質に対しても有効である。
【００１３】
本発明のタンパク質製造用薬剤が含む環状ポリエーテルエステル（Ａ）である上記一般式（１）において、Ｒ１は水素原子の少なくとも１つがハロゲノ基、アセチル基、アルコキシ基又はフェノキシ基で置換されていてもよい炭素数２〜２１の炭化水素基である。
【００１４】
炭素数２〜２１の炭化水素基としては、炭素数２〜２１のアルキレン基、炭素数２〜２１のアルケニレン基、炭素数６〜２１のアリーレン基及び炭素数７〜２１のアラルキレン基等が挙げられる。
【００１５】
炭素数２〜２１のアルキレン基としては、炭素数２〜２１の直鎖アルキレン基（エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、ペンタメチレン基及びｎ−ヘンイコサニレン基）及び炭素数３〜２１の分岐アルキレン基（１−メチルエチレン基、２−メチルエチレン基、１−エチルエチレン基、２−エチルエチレン基、１−メチルトリメチレン基、２−メチルトリメチレン基、１，１−ジメチルトリメチレン基、１−ｎ−ブチルトリメチレン基、１−ｎ−ヘキシルトリメチレン基、１−ｎ−プロピルトリメチレン基、１−ｎ−ヘプチルトリメチレン基、１−ｎ−オクチルトリメチレン基、１−ｎ−ヘプチルテトラメチレン基及び１−ｎ−オクチルエチレン基等）及び炭素数４〜２１のシクロアルキレン基（シクロブチレン基、シクロペンチレン基、２−メチルシクロペンチレン基、シクロヘキシレン基、１，３−ジメチルシクロヘキシレン基、シクロヘプチレン基、１−エチルシクロペンチレン基、シクロオクチレン基、シクロノニレン基、シクロデシレン基、シクロウンデシレン基、シクロドデシレン基、シクロトリデレン基、シクロテトラデシレン基、シクロペンタデシレン基、シクロヘキサデシレン基、シクロヘプタデシレン基、シクロオクタデシレン基、シクロノナデシレン基、シクロエイコシレン基、ノルボルニレン基、ジシクロペンチレン基、イソプロピリデンジシクロヘキシレン基及びシクロヘキサンジメチレン基等）等が挙げられる。
【００１６】
炭素数２〜２１のアルケニレン基としては、炭素数２〜２１の直鎖アルケニレン基（エテニレン基、プロペニレン基及びヘンイコセニレン基等）及び炭素数３〜２１の分岐アルケニレン基（１−エチルエテニレン基、１，２−ジメチルエテニレン基、１−ブチルエテニレン基、１−ヘキシルエテニレン基及び１−オクチルエテニレン基等）等が挙げられる。
【００１７】
炭素数６〜２１のアリーレン基としては、ｏ−、ｐ−又はｍ−フェニレン基、２，４−ナフチレン基、ビフェニレン基、ターフェニレン基、アントリレン基、フェナントリレン基、フルオレニレン基、ピレニレン基及び基等が挙げられる。
【００１８】
炭素数７〜２１のアラルキレン基としては、フェニルメチレン基、ジフェニルメチン基、１−フェニルエチレン基、ｏ−フェニレンエチル基及びナフチルメチレン基等が挙げられる。
【００１９】
これらの基の有する水素原子の少なくとも１つがハロゲノ基、アセチル基、アルコキシ基又はフェノキシ基で置換された基としては、１−ブロモ−トリメチレン基、１−アセチル−トリメチレン基、１−メトキシ−トリメチレン基及び１−フェノキシ−トリメチレン基等が挙げられる。
【００２０】
これらのうち、Ｒ１としては、好ましくは炭素数３〜１６の直鎖又は分岐アルキレン基であり、エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、ペンタメチレン基、テトラデカメチレン基、メチルエチレン基、１−ｎ−プロピルトリメチレン基、１−ｎ−ヘプチルトリメチレン基、１−ｎ−オクチルトリメチレン基、１−ｎ−ヘプチルテトラメチレン基、１−ｎ−ヘキシルトリメチレン基、１−ｎ−ヘキシルテトラメチレン基、１−ｎ−ウンデシルトリメチレン基及び１−ｎ−ウンデシルテトラメチレン基がさらに好ましい。
【００２１】
一般式（１）において、Ｒ２は通常炭素数２〜８の２価の炭化水素基である。炭素数２〜８の２価の炭化水素基のうち好ましいものとしては、フェニルエチレン基、炭素数２〜４のアルキレン基が挙げられ、さらに好ましくは炭素数２〜４の直鎖アルキレン基（エチレン基、プロピレン基及びブチレン基等）及び炭素数３又は４の分岐アルキレン基（メチルエチレン基、エチルエチレン基、メチルプロピレン基及び２−メチルプロピレン等）が挙げられ、特に好ましくは炭素数２〜４の直鎖アルキレン基及び炭素数３〜４の分岐アルキレン基であり、最も好ましくはエチレン基及びプロピレン基である。
【００２２】
上記一般式（１）において、ｍは［Ｒ１ＣＯ（ＯＲ２）ｎＯ］で表される単位の繰り返し数を意味し、ｎは（ＯＲ２）で表されるオキシアルキレン基の付加モル数を意味する。
ｍは１〜３の整数であり、好ましくは１である。
ｎは１〜３０の整数であり、環状ポリエーテルエステル（Ａ）のオキシアルキレン基の付加モル数（ｎ）は、除去対象に応じて調整することができるが、リフォールディング効率等の観点から、好ましくは５〜２０の整数である。
なお、ｍが２又は３である場合、ｍ個あるＲ１は同じであっても異なっていてもよく、同じであることが好ましい。また、ｍが２若しくは３、及び／又はｎが２以上の整数である場合、ｍ×ｎ個あるＲ２は同じであっても異なっていてもよく、同じであることが好ましい。
【００２３】
ｍ×ｎ個あるＲ２の組成は、Ｐｏｌｙｍ. Ｃｈｅｍ., ２０１４， ５, ６９０５．に記載のマトリックス支援レーザー脱離イオン化法による飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳともいう）により測定分析することができる。
【００２４】
本発明のタンパク質製造用薬剤に含まれる環状ポリエーテルエステル（Ａ）としては、ｍが１〜３であれば、一般式（１）においてｎで表されるオキシアルキレン基の付加モル数が特定の値である環状ポリエーテルエステル（Ａ）を用いてもよく、ｎの値が異なる複数の環状ポリエーテルエステル（Ａ）を併用してもよい。
一般式（１）においてｎで表されるオキシアルキレン基の付加モル数の値（ｎ）が異なる複数の環状ポリエーテルエステル（Ａ）を併用する場合、使用する環状ポリエーテルエステル（Ａ）のオキシアルキレン基の付加モル数の値と比率は、対象のタンパク質の種類等に応じて調整することができる。
【００２５】
上記一般式（１）中のｍの値とｎの値の調整は、後述のアルコキシル化反応において用いる活性水素含有基を有さないラクトンと炭素数２〜８のアルキレンオキサイドとの比率の調整及びアルキレンオキサイドの付加方法を変えること等で行うことができる。
なお、後述の合成方法等で得られる環状ポリエーテルエステルは、異なるｍと異なるｎを有する環状ポリエーテルエステルの混合物であるが、混合物中に含まれる特定のｎを有する環状ポリエーテルエステル（Ａ）の含有量は、アルキレンオキサイドの付加方法を変えることで調整することができ、例えば活性水素含有基を有さないラクトンに反応するアルキレンオキサイドを段階的に反応すると特定の値のｎを有する環状ポリエーテルエステル（Ａ）の含有量を増やすことができる。
なお、環状ポリエーテルエステル（Ａ）のｍの値、及びｎの値は、Ｐｏｌｙｍ. Ｃｈｅｍ., ２０１４， ５, ６９０５．に記載のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにより分析し、確認することが出来る。
【００２６】
本発明のタンパク質製造用薬剤に含まれる環状ポリエーテルエステル（Ａ）の数平均分子量（以下、Ｍｎと略記する）は、本発明のタンパク質製造用薬剤が対象とするタンパク質の種類に応じて調整することができるが、タンパク質のリフォールディング効率等の観点から２００〜４０００が好ましく、環状ポリエーテルエステル（Ａ）のＭｎはオキシアルキレン基の付加モル数を調整すること等によって好ましい範囲にすることができる。
【００２７】
環状ポリエーテルエステル（Ａ）のＭｎは、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（以下、ＧＰＣと略記）を用いて以下の条件で測定することができる。
・装置：「Ｗａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ２６９５」［Ｗａｔｅｒｓ社製］
・カラム：「Ｇｕａｒｄｃｏｌｕｍｎ  Ｓｕｐｅｒ  Ｈ−Ｌ」（１本）、「ＴＳＫｇｅｌ  ＳｕｐｅｒＨ２０００、ＴＳＫｇｅｌ  ＳｕｐｅｒＨ３０００、ＴＳＫｇｅｌ  ＳｕｐｅｒＨ４０００を各１本連結したもの」［いずれも東ソー（株）製］
・試料溶液：０．２５重量％のテトラヒドロフラン溶液
・溶液注入量：１０μＬ
・流量：０．６ｍＬ／分
・測定温度：４０℃
・検出装置：屈折率検出器
・基準物質：標準ポリエチレングリコール
【００２８】
本発明のタンパク質製造用薬剤に用いる環状ポリエーテルエステル（Ａ）として、好ましいものとしては、Ｒ１がテトラデカメチレン基であり、Ｒ２がエチレン基及びプロピレン基であり、ｍが１〜３、ｎが５〜１５である環状ポリエーテルエステルが挙げられる。
【００２９】
本発明のタンパク質製造用薬剤に用いる環状ポリエーテルエステル（Ａ）は、活性水素含有基を有さないラクトンと炭素数２〜８のアルキレンオキサイドとを用いて、前記の活性水素含有基を有さないラクトンのオキシカルボニル基が有するカルボニルと酸素原子との間にオキシアルキレン基を挿入する反応（アルコキシル化反応ともいう）を行うことで得ることができる。前記のアルコキシル化反応は、活性水素含有基を有さないラクトンと炭素数２〜８のアルキレンオキサイドとを、アルキレンオキサイドの開環付加反応及びアルコキシル化反応等に用いられる触媒をアルコキシル化反応の触媒として用いて行ってもよい。
なお、前記活性水素含有基はアルキレンオキサイドが開環付加し得る官能基を意味し、水酸基、カルボキシル基、メルカプト基及びアミノ基等が挙げられる。
【００３０】
前記のアルコキシル化反応では、アルコキシル化反応で生成した一般式（１）で表される環状ポリエーテルエステル（Ａ）に対して、さらに他の一般式（１）で表される環状ポリエーテルエステルが挿入付加する副反応がおこる。
そのため、前記のアルコキシル化反応で得られた反応生成物には、一般式（１）においてｍ＝１である環状ポリエーテルエステル（Ａ）の他に、一般式（１）において［Ｒ１ＣＯ（ＯＲ２）ｎＯ］で表される単位を一分子中に２個有する環状ポリエーテルエステル（すなわちｍ＝２）及び／又は３個有する環状ポリエーテルエステル（すなわちｍ＝３）を含み、反応生成物は、一般式（１）において［Ｒ１ＣＯ（ＯＲ２）ｎＯ］で表される単位を１〜３個有する環状ポリエーテルエステルを主成分とするポリエーテル組成物となり、そのうち、ｍが１である環状ポリエーテルエステル（Ａ）とｍが２である環状ポリエーテルエステル（Ａ）とｍが３である環状ポリエーテルエステル（Ａ）の重量比率は、概ね６：３：１である。
なお、反応生成物に含まれる環状ポリエーテルの組成は、Ｐｏｌｙｍ. Ｃｈｅｍ., ２０１４， ５, ６９０５．に記載のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにより分析し、確認することが出来る。
【００３１】
前記のアルコキシル化反応の反応生成物［すなわち、環状ポリエーテルエステル（Ａ）を含む混合物］を、さらにゲル透過法及びシリカゲルカラムクロマトグラフィー等の公知の方法により分画、精製を行うことで特定のｍとｎを有する環状ポリエーテルエステル（Ａ）を得ることができる。なお、本発明のタンパク質製造用薬剤に含まれる環状ポリエーテルエステル（Ａ）としては、前記のアルコキシル化反応の反応生成物をそのまま用いても、反応生成物を分画、精製して得られた環状ポリエーテルエステル（Ａ）を用いてもよい。
【００３２】
環状ポリエーテルエステル（Ａ）を得るために用いる活性水素含有基を有さないラクトンとしては、１つの水酸基と１つのカルボキシル基とを有し、前記の１つの水酸基と１つのカルボキシル基とを除く他の活性水素含有基を有していない炭素数４〜２２のモノヒドロキシカルボン酸について水酸基とカルボキシル基とを分子内脱水することで得られる環状エステルを用いることができる。分子内脱水してラクトンを合成する方法としては、公知の方法で加熱脱水する方法、Ｊ．Ｓ．Ｎｉｍｉｔｚ，Ｒ．Ｈ．Ｗｏｌｌｅｍｂｅｒｇ，Ｔｅｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．１９７８，１９，３５２３に記載方法、及びリパーゼ等の酵素を用いる方法の公知の合成方法を用いることができる。
【００３３】
１つの水酸基と１つのカルボキシル基とを除く他の活性水素含有基を有していない炭素数４〜２２のモノヒドロキシカルボン酸としては、炭素数４〜２２の直鎖ヒドロキシカルボン酸（３−ヒドロキシプロパン酸、４−ヒドロキシ酪酸、５−ヒドロキシペンタン酸、６−ヒドロキシヘキサン酸、１５−ヒドロキシペンタデカン酸、１６−ヒドロキシヘキサデカン酸及び４−ヒドロキシ−２−ブテン酸等）及び炭素数３〜２２の分岐ヒドロキシカルボン酸（３−ヒドロキシブタン酸、５−ヒドロキシトリデカン酸、２−メチレン−４−ヒドロキシ酪酸、４−フェニル−４−ヒドロキシ酪酸、２，２−ジメチル−４−ヒドロキシ酪酸、４−ヘキシル−４−ヒドロキシ酪酸及び４−ヒドロキシ−２−メチル−２−ブテン酸等）等が挙げられる。
【００３４】
活性水素含有基を有さないラクトンとしては、前記の炭素数４〜２２のヒドロキシカルボン酸の炭素原子に結合した水素原子のうち、少なくとも１つの水素原子がハロゲノ基、アセチル基、アルコキシ基又はフェノキシ基で置換されたヒドロキシカルボン酸が分子内脱水した構造を有するラクトンも用いることもできる。
前記の炭素数４〜２２のモノヒドロキシカルボン酸のうち、炭素原子に結合した水素原子の少なくとも１つがハロゲノ基で置換されたヒドロキシカルボン酸としては、２−ブロモ−４−ヒドロキシ酪酸等が挙げられ、アセチル基で置換されたヒドロキシカルボン酸としては、２−アセチル−４−ヒドロキシブタン酸等が挙げられ、アルコキシ基で置換されたヒドロキシカルボン酸としては、２−メトキシ−４−ヒドロキシ酪酸等が挙げられ、フェノキシ基で置換されたヒドロキシカルボン酸としては、２−フェニル−４−ヒドロキシ酪酸等が挙げられる。
【００３５】
活性水素含有基を有さないラクトンとして、好ましいものとしては、β−ラクトン（β−プロピオラクトン、β−ブチロラクトン等）、γ−ラクトン（γ−ブチロラクトン等）、δ−ラクトン（δ−バレロラクトン等）、ε−ラクトン（ε−カプロラクトン等）、長鎖アルキル基を有するラクトン（γ−エナントラクトン、γ−ウンデカノラクトン、γ−ドデカラクトン及びδ-ドデカノラクトン等）、大環状ラクトン（１５−ペンタデカノラクトン）及び芳香族ラクトン（３，４−ジヒドロクマリン）等が挙げられる。
これらのラクトンは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００３６】
アルコキシル化反応に用いる炭素数２〜８のアルキレンオキサイド（以下、ＡＯと略記する場合がある）としては、エチレンオキサイド、１，２−プロピレンオキサイド、オキセタン、１，２−、１，３−、１，４−又は２，３−ブチレンオキサイド及びスチレンオキサイド等が挙げられ、炭素数２〜３のアルキレンオキサイド（エチレンオキサイド、１，２−プロピレンオキサイド及びオキセタン）が好ましく、エチレンオキサイド及び１，２−プロピレンオキサイドがさらに好ましい。
アルキレンオキサイドは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。２種以上を併用する場合、その結合形式はランダムであっても、ブロックであっても、その両方であってもよい。
アルキレンオキサイドとして２種以上を併用する場合、得られる環状ポリエーテルエステル（Ａ）は、一般式（１）においてｎ個あるＲ２として、使用したアルキレンオキサイドの種類に対応した異なる種類のＲ２を有する環状ポリエーテルエステルである。
【００３７】
前記のアルコキシル化反応は、金属（ホウ素、錫、ニッケル、亜鉛及びアルミニウム等）のハロゲン化物、無機酸（硫酸及びリン酸等）、アルカリ金属（リチウム、ナトリウム、カリウム及びセシウム等）の水酸化物、アミン化合物（ジエチルアミン及びトリエチルアミン等）、特開２０００−３５４７６３号公報に記載された酸化物複合体及びその焼成物並びに層状複水酸化物等を用いて行うことができる。
なお、層状複水酸化物とは、２価の金属（Ｍｇ、Ｆｅ、Ｚｎ、Ｃａ、Ｌｉ、Ｎｉ、Ｃｏ及びＣｕ等）と３価の金属（Ａｌ、Ｆｅ及びＭｎ等）の水酸化物とが複合して積層構造を形成した無機の層状化合物を意味し、通常、一般式が［Ｍ２＋１−ａＭ３＋ａ（ＯＨ）２］［（Ａｎ−）ａ／ｎ・ｍＨ２Ｏ］［ここで、Ｍ２＋は２価の金属、Ｍ３＋は３価の金属、Ａｎ−はｎ価の陰イオン（ＨＣＯ３−、ＰＯ４３−、ＳＯ４２−、Ｃｌ−、ＮＯ２−及びＮＯ３−等）、ｍ＞０である。］で表さる化合物であり、ハイドロタルサイト、モツコレアイト、マナセイト、スティッヒタイト、パイロアウライト、タコバイト、イヤードライト及びメイキセネライト等が含まれる。これらの層状複水酸化物は、粘土鉱物として知られており、天然に産する鉱物に含まれたものであっても、合成によって得られたものであってもよく、そのまま用いてもこれを４００〜９５０℃（好ましくは４００〜７００℃）で焼成したものを用いてよい。
【００３８】
アルコキシル化反応に用いることができる層状複水酸化物として市場から入手できるものとしては、一般式（２）で示される層状複水酸化物が挙げられ、キョーワード５００（Ｍｇ６Ａｌ２（ＯＨ）１６ＣＯ３・４Ｈ２Ｏ）（協和化学工業株式会社製、「キョーワード」は同社の登録商標である。以下、「キョーワード」を含む名称の製品について同じ。）、キョーワード１０００（Ｍｇ４．５Ａｌ２（ＯＨ）１３ＣＯ３・３．５Ｈ２Ｏ）等が挙げられる。  
【００３９】
【化２】
2018052840.tif 000003
【００４０】
一般式（２）中、ｘ及びｙは０＜ｘ≦０．５、０＜ｙ≦１．０である。
【００４１】
本発明のタンパク質製造用薬剤に含まれる環状ポリエーテルエステル（Ａ）の重量は、タンパク質のリフォールディング効率等の観点から、タンパク質製造用薬剤の合計重量に基づいて０．１〜１００重量％であることが好ましい。
【００４２】
本発明のタンパク質製造用薬剤は、取り扱い性等の観点から、さらに水及び／又は有機溶剤に希釈して用いることができる。
本発明のタンパク質製造用薬剤を希釈する水としては、水道水、蒸留水、イオン交換水、純水等が挙げられ、なかでも、貯蔵安定性の点から、イオン交換水が好ましい。
【００４３】
本発明のタンパク質製造用薬剤を有機溶剤で希釈する場合、有機溶剤としては環状ポリエーテルエステル（Ａ）を溶解又は分散することができ、環境に無害な有機溶剤を制限無く用いることができ、なかでもアルコール（メタノール及びイソプロパノール等）が好ましい。
【００４４】
本発明のタンパク質製造用薬剤は、必要により、さらに公知のその他の成分、例えば特開２０１４−１２２３３１号公報及び特開２０１６−３７５２５号公報等に記載のその他の界面活性剤（非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤及び両性界面活性剤等）等を含有してもよい。
【００４５】
本発明のタンパク質製造用薬剤をタンパク質のリフォールディングに用いる場合、本発明のタンパク質製造用薬剤はリフォールディングする対象のタンパク質が含まれる溶液中（好ましくは水溶液）に溶解して用いることができる。
【００４６】
本発明のタンパク質製造用薬剤が優れた効果を奏する理由は明らかではないが、環状の空間を有する嵩高い構造を有することから、従来の方法に比べて優れたタンパク質の再凝集を抑制する効果を奏すると考えられる。
【００４７】
本発明のタンパク質の製造方法は、前記のタンパク質製造用薬剤を含む水溶液中で対象となるタンパク質のリフォールディングを行う工程（以下、リフォールディング工程と記載する）を含む。
【００４８】
リフォールディング工程は、前記タンパク質製造用薬剤を含む水溶液中でリフォールディングする対象のタンパク質であるアンフォールディングされたタンパク質を撹拌・混合することで行うことができ、その後さらに、リフォールディングをより充分に進めるために必要により一定時間静置することも含まれる。
アンフォールディングされたタンパク質と前記タンパク質製造用薬剤を撹拌・混合する際には、目視で不均一部分が無くなるまで撹拌混合することが好ましい。さらに一定時間静置する場合の静置時間は特に限定されないが、１〜５０時間で行うことができる。またリフォールディング工程での温度は、特に限定されないが、４〜３０℃で行うことができる。
【００４９】
前記のリフォールディング工程において用いる水溶液に含まれる環状ポリエーテルエステル（Ａ）の濃度は、水溶液の合計重量に基づいて、０．０１〜１重量％であることが好ましい。
【００５０】
本発明の製造方法におけるリフォールディング工程において用いる水溶液には、必要に応じて塩（塩化ナトリウム、塩化アンモニウム及び塩化カリウム等）、及び緩衝剤（トリスバッファー及びＨＥＰＥＳバッファー等）等を含有させることもできる。
【００５１】
リフォールディング工程においてリフォールディングの対象とするタンパク質は、分子内にＳ−Ｓ結合を含むタンパク質（例えばリゾチームなど）である場合が本発明の効果が顕著であるので好ましい。その場合リフォールディングされるものは塩酸グアニジンまたは尿素と共に、さらに２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、シスチン、チオフェノール等の還元剤を加えてアンフォールディングされたタンパク質である。
【００５２】
本発明の製造方法において用いるタンパク質は分子内にジスルフィド結合を含むタンパク質（Ｐ１）と分子内にジスルフィド結合を含まないタンパク質（Ｐ２）に分類できる。
分子内にジスルフィド結合を含むタンパク質（Ｐ１）として、リゾチーム、βラクトグロブリン、アルカリ性フォスファターゼ、リボヌクレアーゼ、トリプシン、キモトリプシン、インターフェロン、インスリン、ナトリウム利尿ペプチド及び抗体等が挙げられる。
分子内にジスルフィド結合を含まないタンパク質（Ｐ２）として、リパーゼ、ホスホリパーゼ及び２〜１０個のアミノ酸で構成されたペプチド等が挙げられる。
これらのうち、本発明の製造方法においてリフォールディングの対象となるタンパク質としては、本発明の効果が顕著である点から、分子内にＳ−Ｓ結合を含むタンパク質（Ｐ１）が好ましい。分子内のＳ−Ｓ結合の個数はタンパク質の凝集に大きく関与し、一般的に個数が大きいほど凝集しやすい。本発明の対象となるタンパク質分子内のＳ−Ｓ結合の数は１個〜１０個が好ましく、さらに好ましくは２個〜４個である。具体的にはリゾチーム（４個）、βラクトグロブリン（２〜３個）、トリプシン（２個）等が挙げられる。
【００５３】
本発明の製造方法において用いるタンパク質の分子量は１，０００〜３００，０００であり、リフォールディングのしやすさの観点から好ましくは１０，０００〜２５０，０００である。ここで分子量とはＳＤＳゲル電気泳動法によって推定された分子量を指す。
一般に分子量の大きさとリフォールディングのしにくさには相関があり、分子量の大きなタンパク（分子量１０，０００以上程度）になるとリフォールディングが著しく困難になるとされている。本発明のリフォールディング方法はリフォールディング効果が優れるので、分子量１０，０００以上の高分子量タンパク質に対しても非常に有効な方法となる。
【００５４】
本発明のリフォールディング工程において、さらにｐＨ調整剤（Ｄ）、タンパク質安定化剤（Ｅ）を使用してもよい。
【００５５】
ｐＨ調整剤（Ｄ）としては、Ｔｒｉｓ（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノエタンスルホン酸）、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸）などが挙げられる。
また、リフォールディング工程はｐＨ７〜８で行われることが好ましく、ｐＨ調整剤（Ｄ）を水溶液に必要量添加することで調整することができ、使用量は水の種類、タンパク質の種類及び濃度等に応じて調整することができる。
【００５６】
タンパク質安定化剤（Ｅ）としては、ポリオール、金属イオン及びキレート試薬などが挙げられる。ポリオールとしてはグリセリン、ブドウ糖、ショ糖、エチレングリコール、ソルビトール及びマンニトールなどが挙げられ、金属イオンとしてはマグネシウムイオン、マンガンイオン及びカルシウムイオンなどの２価金属イオンが挙げら、キレート試薬としてはエチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）及びグリコールエーテルジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−４酢酸（ＥＧＴＡ）などが挙げられる。
タンパク質安定化剤（Ｅ）の使用量は、タンパク質の種類及び濃度等に応じて調整することができる。
【００５７】
本発明の製造方法におけるリフォールディング工程において用いる水溶液に含まれるアンフォールディングされたタンパク質の系中の濃度は、０．２〜３０ｍｇ／ｍＬが好ましく、さらに好ましくは０．２〜２０ｍｇ／ｍＬ、特に好ましくは０．２５〜５ｍｇ／ｍＬである。０．２ｍｇ／ｍＬ以上であればタンパク質の生産効率の観点から好ましく、３０ｍｇ／ｍＬ以下であれば系内の粘度が高くなりすぎることが少ないため生産効率が低下しないので好ましい。
【００５８】
本発明の製造方法において得られるタンパク質は、前記の製造用薬剤を使用して得られるため、リフォールディング工程中の凝集が少なく、収率が著しく向上する。
【００５９】
本発明のタンパク質の産生方法としては、例えば、以下のような順序の工程による産生方法が挙げられる。
（１）タンパク質の培養工程：大腸菌などのタンパク質生産体に酵素又は組み換えタンパク質を培養させる。
（２）溶菌工程：溶菌剤などの使用によってタンパク質生産体内のインクルージョンボディを取り出す。
（３）アンフォールディング工程：インクルージョンボディ懸濁液（例えば１０ｍｇタンパク質／ｍＬ）に０．５モル／Ｌ以上のアンフォールディング剤及び２０ミリモル／Ｌ以下の還元剤を加え軽くかきまぜ室温で数時間放置する。
（４）リフォールディング工程：アンフォールディングされたタンパク質溶液に、（Ｉ）又は（ＩＩ）を加えて軽くかき混ぜ、室温で１晩放置しリフォールディングを行う。
（５）分離・取り出し工程：懸濁液から目的とするリフォールディングされたタンパク質をカラムクロマトグラフィーなどによって分離して取り出す。
【００６０】
上記の（１）のタンパク質の培養工程におけるタンパク質生産体としては、以下の細菌細胞、エシェリヒア属菌及びバチルス属菌などが挙げられる。
細菌細胞としては、連鎖球菌属（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）、ブドウ球菌属（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）、エシェリヒア属菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ストレプトミセス属菌（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）及びバチルス属菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞、真菌細胞：例えば酵母細胞及びアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）細胞、昆虫細胞：例えばドロソフィラＳ２（ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａＳ２）、スポドプテラＳｆ９（ＳｐｏｄｏｐｔｅｒａＳｆ９）細胞、動物細胞：例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、Ｈｅｌａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、２９３及びボウズ（Ｂｏｗｓ）メラノーマ細胞、並びに植物細胞等が挙げられる。
エシェリヒア属菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２ＤＨ１〔プロシージング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）６０巻、１６０頁（１９６８年）を参照〕、ＪＭ１０３〔ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）９巻、３０９頁（１９８１年）を参照〕、ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）１２０巻、５１７頁（１９７８年）を参照〕、ＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）４１巻、４５９頁（１９６９年）を参照〕、Ｃ６００〔ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）３９巻、４４０頁（１９５４年）を参照〕、ＭＭ２９４〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２１７巻、１１１０頁（１９６８年）を参照〕などが挙げられる。
バチルス属菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）としては、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４〔ジーン、２４巻、２５５頁（１９８３年）を参照〕、２０７−２１〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）９５巻、８７頁（１９８４年）を参照〕などが挙げられる。
【００６１】
組み換えタンパク質の培養方法として、目的タンパク質をコードするｃＤＮＡを含有する発現ベクターは、以下の方法で製造することができる。
（ｉ）目的タンパク産生細胞からメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分離し、該ｍＲＮＡから単鎖のｃＤＮＡを、次に二重鎖ＤＮＡを合成し、該相補ＤＮＡをファージまたはプラスミドに組み込む。
（ｉｉ）得られた組み換えファージ又はプラスミドで宿主を形質転換し、培養後、目的タンパクの一部をコードするＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション、あるいは抗体を用いたイムノアッセイ法により目的とするＤＮＡを含有するファージあるいはプラスミドを単離する。
（ｉｉｉ）その組み換えＤＮＡから目的とするクローン化ＤＮＡを切りだし、該クローン化ＤＮＡ又はその一部を発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することによって製造することができる。
その後、さらに適当な方法により、宿主を発現ベクターで形質転換し培養する。培養は通常１５〜４３℃で３〜２４時間行い、必要により通気、攪拌を加えることもできる。
【００６２】
前記の溶菌工程における溶菌方法としては、超音波による物理的破砕、リゾチーム等の溶菌酵素による処理、界面活性剤等の溶菌剤による処理などのいずれもが使用でき、生産性の観点から溶菌剤による処理が好ましく、有用タンパクを変性させないといった観点から特に特開２００６−３２０３１３号公報記載の溶菌剤による処理が好ましい。
【００６３】
本発明の製造方法でリフォールディングしたタンパク質の分離・取り出し工程におけるカラムクロマトグラフィーに使用される充填剤としてはシリカ、デキストラン、アガロース、セルロース、アクリルアミド、ビニルポリマーなどが挙げられ、市販品ではＳｅｐｈａｄｅｘシリーズ、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌシリーズ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅシリーズ（以上、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、Ｂｉｏ−Ｇｅｌシリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）等があり入手可能である。
【実施例】
【００６４】
以下、実施例により本発明をさらに説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
なお、実施例中の部は重量部を示す。
【００６５】
＜製造例１：アンフォールディング溶液の調製＞
塩酸グアニジンの濃度が６モル／Ｌ、ジチオスレイトールの濃度が１０ミリモル／Ｌ、塩化ナトリウムの濃度が１５０ミリモル／Ｌ、トリス緩衝液（ｐＨ＝８）の濃度が５０ミリモル／Ｌ、エチレンジアミン４酢酸ナトリウムの濃度が１ミリモル／Ｌとなるように滅菌水で混合溶解し、アンフォールディング溶液を調製した。
【００６６】
＜実施例１＞
撹拌装置及び温度調節機能の付いたステンレス製のオートクレーブに、１５−ペンタデカノラクトン２４０部（１モル）、「キョーワード５００」［協和化学工業（株）製：Ｍｇ６  Ａｌ２  （ＯＨ）１６  ＣＯ３  ・４Ｈ２  Ｏ］２４．２部（０．０４モル）及び過塩素酸アルミニウム九水和物１部（０．００２モル）を入れて密閉した後、減圧下で１６０℃にて３時間加熱し、脱水処理した。次いで１８０℃まで昇温し、１８０℃でゲージ圧が１〜５ｋｇｆ／ｃｍ２  の範囲に入るように調整しながらエチレンオキサイド（以下、ＥＯと略記する）８８部（２モル）をオートクレーブ内に導入した。ＥＯ全量を導入した後、圧力が０．１３ｋｇｆ／ｃｍ２Ｇになるまで撹拌を継続した。その後、水酸化カリウム０．３部を追加して、さらにＥＯ１７６部（４モル）を１８０℃でゲージ圧が１〜５ｋｇｆ／ｃｍ２  となるように導入した。ＥＯ全量を導入した後、圧力が０．１３ｋｇｆ／ｃｍ２Ｇになるまで撹拌を継続して１５−ペンタデカノラクトンとＥＯとの反応を行った。ＥＯの付加反応に要した合計時間は８時間であった。その後、ＥＯの付加反応で得られた反応混合物から触媒をろ別して、本発明のタンパク質製造用薬剤である環状ポリエーテルエステル組成物（Ａ１）を得た。
得られた環状ポリエーテルエステル組成物（Ａ１）についてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによる分析を行った。
環状ポリエーテルエステル組成物（Ａ１）は、ｍが１〜３であり、ｎが１〜３０である一般式（１）で表される環状ポリエーテルエステル（Ａ１−１）を合計して９０重量％含む環状ポリエーテルエステルの混合物であり、環状ポリエーテルエステル（Ａ１−１）のｎの平均値（すなわちＥＯの平均付加モル数）は６であり、環状ポリエーテルエステル（Ａ１−１）のうち、ｎが５〜１０である環状ポリエーテルエステルの合計重量が、環状ポリエーテルエステル（Ａ１−１）の合計重量に対して８５重量％であった。
【００６７】
＜実施例２＞
撹拌装置及び温度調節機能の付いたステンレス製のオートクレーブに、１５−ペンタデカノラクトン２４０部（１モル）、「キョーワード５００」２４．２部（０．０４モル）、及び過塩素酸アルミニウム九水和物１部（０．００２モル）を入れて密閉した後、減圧下で１６０℃にて３時間加熱し、脱水処理した。次いで１５０℃に温調し、１５０℃でゲージ圧が１〜３ｋｇｆ／ｃｍ２Ｇとなるように調整しながらプロピレンオキサイド（以下、ＰＯと略記する）６１部（１．０５モル）をオートクレーブ内に導入した。ＰＯ全量を導入した後、圧力が０．１３ｋｇｆ／ｃｍ２Ｇになるまで撹拌を継続して１５−ペンタデカノラクトンとＰＯとの反応を行った。ＰＯの付加反応に要した時間は１２時間であった。次いで１８０℃に温調し、１８０℃でゲージ圧が１〜３ｋｇｆ／ｃｍ２  となるように調整しながらＥＯ２２０部（５モル）をオートクレーブ内に導入した。ＥＯ全量を導入した後、さらに圧力が０．１３ｋｇｆ／ｃｍ２Ｇになるまで撹拌を継続してＥＯの反応を行った。ＥＯの付加反応に要した時間は７時間であった。ＥＯの付加反応を終えて得られた反応混合物から触媒をろ別し、本発明のタンパク質製造用薬剤である環状ポリエーテルエステル組成物（Ａ２）を得た。
得られた環状ポリエーテルエステル組成物（Ａ２）についてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによる分析を行った。
環状ポリエーテルエステル組成物（Ａ２）は、ｍが１〜３であり、ｎがそれぞれ１〜３０である前記の一般式（１）で表される環状ポリエーテルエステル（Ａ２−１）を合計して９０重量％含む混合物であり、環状ポリエーテルエステル組成物（Ａ２）に含まれる環状ポリエーテルエステル（Ａ２）のｎの平均値は６であり、そのうちＰＯの平均付加モル数は１であり、ＥＯの平均付加モル数は５であり、環状ポリエーテルエステル（Ａ２−１）のうち、ｎが５〜１０である一般式（１）で表される環状ポリエーテルエステルの合計重量が、環状ポリエーテルエステル（Ａ２−１）の合計重量に対して９０重量％であった。
【００６８】
＜実施例３＞
撹拌装置及び温度調節機能の付いたステンレス製のオートクレーブに、１５−ペンタデカノラクトン２４０部（１モル）、及び「キョーワード５００」〔協和化学工業（株）製：Ｍｇ６  Ａｌ２  （ＯＨ）１６  ＣＯ３  ・４Ｈ２  Ｏ〕２４．２部（０．０４モル）を入れて密閉した後、減圧下で１６０℃にて３時間加熱し、脱水処理した。次いで１８０℃に温調し、１８０℃でゲージ圧が１〜５ｋｇｆ／ｃｍ２  の範囲に入るように調整しながらＥＯ２６４部（６モル）をオートクレーブ内に導入した。ＥＯ全量を投入した後、圧力が０．１３ｋｇｆ／ｃｍ２Ｇになるまで撹拌を継続して１５−ペンタデカノラクトンとＥＯとの反応を行った。ＥＯの付加反応に要した時間は１０時間であった。その後、ＥＯの付加反応で得られた反応混合物から触媒をろ別して、本発明のタンパク質製造用薬剤である環状ポリエーテルエステル組成物（Ａ３）を得た。
得られた環状ポリエーテルエステル組成物（Ａ３）についてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによる分析を行った。
環状ポリエーテルエステル組成物（Ａ３）は、ｍが１〜３であり、ｎがそれぞれ１〜３０である前記の一般式（１）で表される環状ポリエーテルエステル（Ａ３−１）を合計して８５重量％含む混合物であり、環状ポリエーテルエステル（Ａ３−１）のｎの平均値（すなわちＥＯの平均付加モル数）は６であり、環状ポリエーテルエステル（Ａ３−１）のうち、ｎが５〜１０である環状ポリエーテルエステルの合計重量は環状ポリエーテルエステル（Ａ３−１）の合計重量に対して２８重量％であった。
【００６９】
＜実施例４＞ 撹拌装置及び温度調節機能の付いたステンレス製のオートクレーブに、１５−ペンタデカノラクトン２４０部（１モル）、「キョーワード５００」［協和化学工業（株）製：Ｍｇ６  Ａｌ２  （ＯＨ）１６  ＣＯ３  ・４Ｈ２  Ｏ］２４．２部（０．０４モル）及び過塩素酸アルミニウム九水和物１部（０．００２モル）を入れて密閉した後、減圧下で１６０℃にて３時間加熱し、脱水処理した。次いで１８０℃まで昇温し、１８０℃でゲージ圧が１〜５ｋｇｆ／ｃｍ２の範囲に入るように調整しながらエチレンオキサイド（以下、ＥＯと略記する）８８部（２モル）をオートクレーブ内に導入した。ＥＯ全量を導入した後、圧力が０．１３ｋｇｆ／ｃｍ２Ｇになるまで撹拌を継続した。その後、水酸化カリウム０．３部を追加して、更にＥＯ３５２部（８モル）を１８０℃でゲージ圧が１〜５ｋｇｆ／ｃｍ２となるように導入した。ＥＯ全量を導入した後、圧力が０．１３ｋｇｆ／ｃｍ２Ｇになるまで撹拌を継続して１５−ペンタデカノラクトンとＥＯとの反応を行った。ＥＯの付加反応に要した合計時間は８時間であった。その後、ＥＯの付加反応で得られた反応混合物から触媒をろ別して、本発明のタンパク質製造用薬剤である環状ポリエーテルエステル組成物（Ａ４）を得た。
得られた環状ポリエーテルエステル組成物（Ａ４）についてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによる分析を行った。
環状ポリエーテルエステル組成物（Ａ４）は、ｍが１〜３であり、ｎが１〜３０である一般式（１）で表される環状ポリエーテルエステル（Ａ４−１）を合計して９０重量％含む環状ポリエーテルエステルの混合物であり、環状ポリエーテルエステル（Ａ４−１）のｎの平均値（すなわちＥＯの平均付加モル数）は１０であり、環状ポリエーテルエステル（Ａ４−１）のうち、ｎが８〜１３である環状ポリエーテルエステルの合計重量が、環状ポリエーテルエステル（Ａ４−１）の合計重量に対して８５重量％であった。
【００７０】
＜実施例５＞ 撹拌装置及び温度調節機能の付いたステンレス製のオートクレーブに、１５−ペンタデカノラクトン２４０部（１モル）、「キョーワード５００」［協和化学工業（株）製：Ｍｇ６  Ａｌ２  （ＯＨ）１６  ＣＯ３  ・４Ｈ２  Ｏ］２４．２部（０．０４モル）及び過塩素酸アルミニウム九水和物１部（０．００２モル）を入れて密閉した後、減圧下で１６０℃にて３時間加熱し、脱水処理した。次いで１８０℃まで昇温し、１８０℃でゲージ圧が１〜５ｋｇｆ／ｃｍ２の範囲に入るように調整しながらエチレンオキサイド（以下、ＥＯと略記する）１２３２部（２モル）をオートクレーブ内に導入した。ＥＯ全量を導入した後、圧力が０．１３ｋｇｆ／ｃｍ２Ｇになるまで撹拌を継続した。その後、水酸化カリウム０．３部を追加して、更にＥＯ３５２部（２８モル）を１８０℃でゲージ圧が１〜５ｋｇｆ／ｃｍ２となるように導入した。ＥＯ全量を導入した後、圧力が０．１３ｋｇｆ／ｃｍ２Ｇになるまで撹拌を継続して１５−ペンタデカノラクトンとＥＯとの反応を行った。ＥＯの付加反応に要した合計時間は８時間であった。その後、ＥＯの付加反応で得られた反応混合物から触媒をろ別して、本発明のタンパク質製造用薬剤である環状ポリエーテルエステル組成物（Ａ５）を得た。
得られた環状ポリエーテルエステル組成物（Ａ５）についてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによる分析を行った。
環状ポリエーテルエステル組成物（Ａ５）は、ｍが１〜３であり、ｎが１〜３０である一般式（１）で表される環状ポリエーテルエステル（Ａ５−１）を合計して９０重量％含む環状ポリエーテルエステルの混合物であり、環状ポリエーテルエステル（Ａ５−１）のｎの平均値（すなわちＥＯの平均付加モル数）は３０であり、環状ポリエーテルエステル（Ａ５−１）のうち、ｎが２８〜３３である環状ポリエーテルエステルの合計重量が、環状ポリエーテルエステル（Ａ５−１）の合計重量に対して８５重量％であった。
【００７１】
＜実施例６〜１２、比較例１＞
（リフォールディング工程用水溶液の調製）
２０ｍＬ容の滅菌済みバイアル瓶中で、リン酸水素ナトリウムの濃度が１．０モル／Ｌ、ソルビタンモノオレエートＥＯ付加物（「ＴＷＥＥＮ８０」：和光純薬製）の濃度が０．１０重量％、トリス緩衝液（ｐＨ＝８）の濃度が５０ミリモル／Ｌとなるように滅菌水で混合溶解し、さらに実施例１〜５で得られた本発明のタンパク質製造用薬剤（Ａ１）〜（Ａ５）、及びタンパク質製造用薬剤（Ａ’１）（特開２０１６−８８８６２号公報の実施例１に記載のＣ１２ＧＤ）をそれぞれ表１に記載の濃度で含む水溶液となるように均一混合し、リフォールディング工程用水溶液（Ｒ１〜Ｒ７、Ｒ’１）を調製した。
【００７２】
（アンフォールディングとリフォールディング工程）
１．５ｍＬ容の滅菌済みエッペンドルフチューブに、２ｍｇのリゾチーム（「塩化リゾチーム」ナカライテスク社製：以下、同様のものを使用）及び製造例１で調整したアンフォールディング溶液を１ｍＬ加えて、４℃で１２時間放置しリゾチームをアンフォールディングした。
このアンフォールディングされたタンパク質を含む溶液０．２５ｍＬのそれぞれに、実施例６〜１２、及び比較例１で調整したリフォールディング工程用水溶液（Ｒ１）〜（Ｒ７）、及び（Ｒ’１）を０．７５ｍＬ加えて、１０℃で１２時間放置してリフォールディングを行った。
【００７３】
（タンパク質の凝集防止率の測定）
実施例６〜１２及び比較例１でフォールディング後に得られたタンパク質を含む水溶液が入ったエッペンドルフチューブをそれぞれ遠心分離器（ＴＯＭＹ社製「ＰＭＣ−０６０」）で３０００ｒｐｍで１０分遠心し、得られた上澄みの２８０ｎｍにおける吸光度（Ｌ）を紫外可視分光光度計（島津製作所製、ＵＶ−２５５０）で測定した。また、製造例１に示したアンフォールディング液でリゾチームをアンフォールディングしたアンフォールディング液の２８０ｎｍにおける吸光度（Ｌ’）を以下の計算式を用いて測定し、結果を表１に記載した。なお、凝集防止率は値が大きい程、タンパク質の凝集が防止できており、タンパク質製造用薬剤として優れていることを示す。
凝集防止率（％）＝（Ｌ’×１）／（Ｌ×０．２５）×１００
【００７４】
（リゾチームの酵素活性収率の測定）
１０ｍｌの滅菌済み試験管に０．５重量％濃度の枯草菌溶液を３ｍｌ入れ、実施例６〜１２及び比較例１でフォールディング後に得られたタンパク質を含む水溶液を１０μｌマイクロピペットで加えて軽くかき混ぜた。タンパク質を加えた直後の４５０ｎｍにおける吸光度（Ｌ０）を紫外可視分光光度計（島津製作所製、ＵＶ−２５５０）で測定し、さらに（Ｌ０）を測定して５分後に５分後の吸光度（Ｌ５）を測定し、Ａ０とＡ５の差を算出して５分間の吸光度変化量（ＤＬ）とした。
さらに実施例６〜１２及び比較例１でフォールディング後に得られたタンパク質を含む水溶液に含まれるリゾチームの濃度と同じ濃度でリゾチームを含み、他に添加剤を加えないブランクのリゾチーム水溶液を調製し、上記と同様に、４５０ｎｍにおける５分間の吸光度変化（ＤＬｂ）を算出し、前記の吸光度変化量（ＤＬ）と吸光度変化（ＤＬｂ）とから、リフォールディング後の酵素の活性収率（酵素活性収率）を以下の式を用いて算出し、結果を表１に記載した。
酵素活性収率（％）＝（ＤＬ／ＤＬｂ）  ×１００
【００７５】
【表１】
2018052840.tif 000004
本発明のタンパク質製造用薬剤及びタンパク質の製造方法を用いると、有用な各種のタンパク質を凝集させること無く高収率で、かつ効率よく産生することができる。本発明のタンパク質産生方法で得られるタンパク質としては、酵素、組み換えタンパク質などが挙げられる。