(57)【要約】【課題】動物細胞培養用培地およびそれを用いる方法【解決手段】  大麦を原料とする焼酎を製造する際に副成する大麦焼酎蒸溜残液を、精密ろ過して得られた清澄な液体を添加した血清培地または無血清培地で動物細胞を培養すると、細胞増殖率を高めることができた。大麦焼酎蒸溜残液という発酵食品由来であるため動物由来の汚染物の混入の不安もなく、無血清培地に添加した場合には、動物細胞から産生された有用物質の安全性も確保できるという利点を有する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
大麦焼酎蒸溜残液からのろ過液を含むことを特徴とする動物細胞培養用培地。
【請求項２】
ろ過液が、清澄なろ過液である、請求項１に記載の動物細胞培養用培地。
【請求項３】
ろ過液が、ろ過液の濃縮物の形態である、請求項１または２に記載の動物細胞培養用培地。
【請求項４】
ろ過液が、合成吸着剤吸着成分の形態である、請求項１または２に記載の動物細胞培養用培地。
【請求項５】
ろ過液が、合成吸着剤吸着成分のうち、１０容量％エタノール溶出画分の形態である、請求項４に記載の動物細胞培養用培地。
【請求項６】
合成吸着剤が、芳香族系、芳香族系修飾型、またはメタクリル系の合成吸着剤である、請求項４または５に記載の動物細胞培養用培地。
【請求項７】
無血清培地である、請求項１ないし６のいずれかに記載の動物細胞培養用培地。
【請求項８】
動物細胞が外来遺伝子の導入された形質転換細胞である、請求項１ないし７のいずれかに記載の動物細胞培養用培地。
【請求項９】
動物細胞が哺乳動物細胞である、請求項１ないし８のいずれかに記載の動物細胞培養用培地。
【請求項１０】
哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞である、請求項９に記載の動物細胞培養用培地。
【請求項１１】
哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項９に記載の動物細胞培養用培地。
【請求項１２】
請求項１ないし１１のいずれかに記載の動物細胞培養用培地中で動物細胞を培養することを特徴とする動物細胞の培養方法。
【請求項１３】
請求項１ないし１１のいずれかに記載の動物細胞培養用培地中で動物細胞の増殖を促進することを特徴とする動物細胞の増殖を促進する方法。
【請求項１４】
請求項１ないし１１のいずれかに記載の動物細胞培養用培地中で動物細胞を培養し、動物細胞から産生される有用物質を培地から単離することを特徴とする有用物質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物細胞培養用血清または無血清培地、当該培地を用いて動物細胞を培養する方法または動物細胞の増殖を促進する方法、および当該培地での動物細胞の培養により有用物質を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
動物細胞、特に哺乳動物細胞を培養する際に効率的に細胞増殖を行わせる必要がある。有用物質であるタンパク質の遺伝子を導入した形質転換宿主細胞として、いくつかの哺乳動物由来の細胞が利用されており、現在広く利用されている動物細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）があり、抗体等の有用物質の産生細胞として利用されている。
また、形質転換宿主細胞以外にも幹細胞等の再生医療に用いる細胞の増殖効率を高めることは、再生医療分野での重要な課題である。
【０００３】
動物細胞の増殖率を高めるために、増殖促進因子として血清や血清から分離したタンパク質成分が用いられてきたが、近年、血清中に混入する汚染物質、例えばウイルス、マイコプラズマ、病原性プリオンなどを排除するために、無血清培地での細胞増殖を誘起または促進させる成分の開発が進められており、例えば、大豆蛋白質加水分解物と酵母抽出物を含むもの（特許文献１）やβ−コングリシニン濃縮物の加水分解物（特許文献２）が提案されている。
【０００４】
一方、大麦を原料とする焼酎を製造する際に副成する大麦焼酎蒸溜残液からは、精製する工程で生じる特定の画分を含む乳酸菌培養用培地（特許文献３）や、経口摂取による抗酸化作用（特許文献４）、血圧降下作用（特許文献５）等の生理活性作用を有する画分が報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第３９３４８７７号明細書
【特許文献２】特許第５７１２４９０号明細書
【特許文献３】特許第３５２７６１１号明細書
【特許文献４】特許第４６９４０９９号明細書
【特許文献５】特許第４５８４６１１号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、動物細胞培養用血清または無血清培地を提供すること、ならびに、その培地を用いる動物細胞の培養方法、動物細胞の増殖を促進する方法、および動物細胞から産生される有用物質を製造する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、大麦を原料とする焼酎を製造する際に副成する大麦焼酎蒸溜残液を、精密ろ過して得られた清澄な液体を添加した血清培地または無血清培地で動物細胞を培養すると、細胞増殖率を高めることができることを見出し、本発明を完成させるに至った。また、大麦焼酎蒸溜残液からの清澄なろ過液中の動物細胞の増殖率を高めることのできる有効成分は、その清澄なろ過液をさらに芳香族系、芳香族系修飾型、またはメタクリル系の合成吸着剤を用いる処理で吸着される成分中に多く含まれていること、特に、吸着される成分のうち１０容量％エタノール溶出液で溶出される画分中に最も多く含まれることを見出した。
【０００８】
本発明は,以下の技術的事項から構成される。
（１）大麦焼酎蒸溜残液からのろ過液を含むことを特徴とする動物細胞培養用培地。
（２）ろ過液が、清澄なろ過液である、上記（１）に記載の動物細胞培養用培地。
（３）ろ過液が、ろ過液の濃縮物の形態である、上記（１）または（２）に記載の動物細胞培養用培地。
（４）ろ過液が、合成吸着剤吸着成分の形態である、上記（１）または（２）に記載の動物細胞培養用培地。
（５）ろ過液が、合成吸着剤吸着成分のうち、１０容量％エタノール溶出画分の形態である、上記（４）に記載の動物細胞培養用培地。
（６）合成吸着剤が、芳香族系、芳香族系修飾型、またはメタクリル系の合成吸着剤である、上記（４）または（５）に記載の動物細胞培養用培地。
（７）無血清培地である、上記（１）ないし（６）のいずれかに記載の動物細胞培養用培地。
（８）動物細胞が外来遺伝子の導入された形質転換細胞である、上記（１）ないし（７）のいずれかに記載の動物細胞培養用培地。
（９）動物細胞が哺乳動物細胞である、上記（１）ないし（８）のいずれかに記載の動物細胞培養用培地。
（１０）哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞である、上記（９）に記載の動物細胞培養用培地。
（１１）哺乳動物細胞がヒト細胞である、上記（９）に記載の動物細胞培養用培地。
【０００９】
（１２）上記（１）ないし（１１）のいずれかに記載の動物細胞培養用培地中で動物細胞を培養することを特徴とする動物細胞の培養方法。
（１３）上記（１）ないし（１１）のいずれかに記載の動物細胞培養用培地中で動物細胞の増殖を促進することを特徴とする動物細胞の増殖を促進する方法。
（１４）上記（１）ないし（１１）のいずれかに記載の動物細胞培養用培地中で動物細胞を培養し、動物細胞から産生される有用物質を培地から単離することを特徴とする有用物質の製造方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、細胞培養用の非動物性の増殖因子を含む動物細胞培養用血清または無血清培地を提供することができる。また、その培地を用いる動物細胞の培養方法、動物細胞の増殖を促進する方法、および動物細胞から産生される有用物質を製造する方法を提供することができる。
より詳細には、本発明によれば、大麦焼酎蒸溜残液を精密ろ過して得られた清澄な液体を動物細胞培養用培地に添加することにより、動物細胞の増殖率を高めることができ、特に、抗体等の有用物質を産生するＣＨＯ細胞等の形質転換細胞であれば、有用物質の産生能が向上する。さらに、その清澄な液体の合成吸着剤で吸着される成分、特にその吸着成分のうち１０容量％エタノール溶出液で溶出される画分を用いれば、より効率よく動物細胞の増殖率を高めることができる。
【００１１】
動物細胞培養用の非動物性の増殖因子として、今まで酵母、大豆、小麦、エンドウ豆、綿実由来のものが知られているが、大麦由来のものはなかった。大麦焼酎蒸溜残液という発酵食品由来であるため動物由来の汚染物の混入の不安もなく、無血清培地に添加した場合には、動物細胞から産生された有用物質の安全性も確保できる。また、再生医療用の幹細胞の増殖における活用も期待できる。
従来は産業廃棄物とされていたものを有効利用することによる資源循環の側面からも、非常に有益である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明のウシ血清含有培地での接着培養における抗体産生細胞増殖に及ぼす効果を示す図。
【図２】本発明の無血清含有培地での浮遊培養における抗体産生細胞増殖に及ぼす効果を示す図
【図３】本発明のウシ血清含有培地での接着培養におけるヒト細胞増殖に及ぼす効果を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明における大麦焼酎蒸留残液は、代表的には歩留まり６０乃至７０％の精白大麦を原料として大麦麹及び蒸麦を製造し、得られた大麦麹及び蒸麦中に含まれるでんぷんを該大麦麹の麹により糖化し、それらを酵母によるアルコール発酵に付して焼酎熟成もろみを得、得られた焼酎熟成もろみを減圧蒸留または常圧蒸留等の単式蒸留装置を用いて蒸留する際に蒸留残渣として副生する大麦焼酎の蒸留残液である。
【００１４】
この大麦焼酎蒸留残液から固液分離により液体分を得る。原料大麦または大麦麹由来の水不溶性の発酵残渣等を除去するためであり、固液分離はスクリュープレス方式やローラープレス方式、あるいはろ過圧搾式の固液分離機を用いて行うことができる。固液分離後の液体が清澄でない場合には、さらに各種の遠心分離機、ケイソウ土ろ過装置、セラミックろ過装置、ろ過圧搾機等を用いて清澄なろ過液を得る。
【００１５】
この清澄なろ過液の濃度を高めるために濃縮してもよい。濃縮方法は公知のいずれの方法ででき、例えば、減圧濃縮装置や真空蒸発装置を用いて行うことができる。濃縮物はそのまま用いることもできるが、通常、殺菌し乾燥させて乾燥粉末の状態で利用する。殺菌は加熱殺菌が好ましく、乾燥はディスク型ドライヤー、ドラム型ドライヤー、スプレー式ドライヤー等の乾燥機や凍結乾燥機を用いて乾燥させる。
【００１６】
本発明では、清澄なろ過液をさらに合成吸着剤を用いる吸着処理に付して吸着成分を得てもよい。合成吸着剤としては、芳香族系、芳香族系修飾型、あるいはメタクリル系の合成吸着剤を用いることができ、好適な例としては、ダウ・ケミカル社製のアンバーライトＦＰＸ６６、三菱化学社製のセパビーズＳＰ８５０、及び同三菱化学社製のダイヤイオンＨＰ２０等が挙げられる。
【００１７】
合成吸着剤吸着成分を、その後１０容量％エタノール溶出液、２０容量％エタノール溶出液、４０容量％エタノール溶出液、６０容量％エタノール溶出液の順に順次溶出させて、それぞれ得られた溶出画分を濃縮して乾燥し、これを本発明で用いる溶出画分の形態という。本発明で用いる合成吸着剤吸着成分として、上記４つの溶出画分の形態のいずれも用いることもできるが、特に、１０容量％エタノール溶出液による溶出画分に動物細胞の増殖率を高める成分が多く含まれている。これらの合成吸着剤吸着成分は、大麦焼酎蒸溜残液からのろ過液の濃縮物と同様に、通常、殺菌し乾燥して利用する。
【００１８】
このようにして得られた大麦焼酎蒸溜残液からの清澄なろ過液、その濃縮物、あるいは、清澄なろ過液の合成吸着剤吸着成分を動物細胞培養用培地に添加することにより、本発明の動物細胞培養用培地を製造することができる。添加する基礎培地は、血清含有培地であってもよく、無血清培地であってもよい。好ましい基礎培地は動物細胞の種類によって異なり、それぞれに適した市販の培地を用いることもできる。添加量は、培養する動物細胞によって異なるが、動物細胞培養用培地当たり濃縮物を乾燥物として約０．２重量％までの濃度で用いるとよい。
【００１９】
本発明の培地で培養することができる動物細胞の種類は特に限定されない。動物細胞としては、具体的にＣＨＯ細胞、ＨＥＬＡ細胞、ｂａｂｙ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｋｉｄｎｅｙ（ＢＨＫ）、ハイブリドーマ、幹細胞などのヒト、マウスなどの哺乳動物細胞や昆虫細胞が挙げられる。動物細胞が抗体等の有用物質を産生する形質転換細胞である場合には、動物細胞の増殖効率が高められることにより、同時に動物細胞による有用物質の産生も促進される。動物細胞から産生される産生される有用物質としては、抗体、酵素、ホルモン、サイトカイン（インターフェロン、インターロイキン、造血因子、血液凝固因子、プラスミノーゲン活性化因子、腫瘍壊死因子、コロニー刺激因子、成長因子）などの生理活性物質が例示される。
【００２０】
培養に際し、例えばＣＨＯ細胞を培養する場合には、培地中に当初細胞密度１〜５×１０５細胞／ｍｌ、好ましくは、２〜４×１０５細胞／ｍｌで播種し、３７℃、５％ＣＯ２の雰囲気下で培養を行うとよい。当初細胞密度は、接着培養か浮遊培養かにより、また動物細胞の種類により異なる。
【００２１】
以下の実施例に供する目的で大麦焼酎の製造を行った。原料としては、大麦（７０％精白）を用いた。
［大麦焼酎及び大麦焼酎蒸留残液の製造］
大麦を４０重量％吸水させ４０分間蒸した後、４０℃まで放冷し、大麦トンあたり１ｋｇの種麹（白麹菌）を接種し、３８℃、ＲＨ９５％で２４時間、３２℃、ＲＨ９２％で２０時間保持することにより、大麦麹を製造した。１次仕込みでは、この大麦麹（大麦として３トン）に、水３．６ｋＬ及び酵母として焼酎酵母の培養菌体１ｋｇ（湿重量）を加えて１次もろみを得、得られた１次もろみを５日間の発酵（１段目の発酵）に付した。次いで、２次仕込みでは、上記１段目の発酵を終えた１次もろみに、水１１．４ｋＬと蒸麦（大麦として７トン）を加えて１１日間の発酵（２段目の発酵）に付した。発酵温度は１次仕込み、２次仕込みとも２５℃ とした。上記２段目の発酵を終えた２次もろみを常法により単式蒸留に付し、大麦焼酎１０ｋＬと大麦焼酎蒸留残液１５ｋＬを得た。該大麦焼酎蒸留残液を以下の実施例に用いた。
以下に、本発明を実施例に基づいて詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例１】
【００２２】
大麦焼酎製造の蒸留工程で得られた前記大麦焼酎蒸留残液１０ｋＬをスクリュープレス方式の固液分離機（（株）Ｖｅｔｔｅｒ製）で固液分離し、得られた液体分をさらにセラミックろ過機（日本ポール（株）製）を用いて精密ろ過し、約６ｋＬの清澄液を得た。この清澄液を真空蒸発装置（（株）大川原製作所製）を用いて約１／１０に濃縮して濃縮物を得た。
【００２３】
清澄液の２００ｍＬを、三菱化学社製の合成吸着剤ダイヤイオンＨＰ２０を充填したカラム（樹脂容量１００ｍＬ）に接触させ、当該カラムから溶出される合成吸着剤非吸着画分とカラムに吸着する合成吸着剤吸着成分とに分離した。カラムに脱イオン水６００ｍＬを接触させて洗浄した後、該カラムに１０容量％エタノールを２００ｍＬ通液して溶離液を回収し、続いて２０容量％エタノールを２００ｍＬ通液して溶離液を回収し、続いて４０容量％エタノールを２００ｍＬ通液して溶離液を回収し、続いて６０容量％エタノールを２００ｍＬ通液して溶離液を回収し、これらをエバポレーターで濃縮した後に凍結乾燥し、粉末を作製した。これらを、Ｐ１０（１０％エタノール溶出画分）、Ｐ２０（２０％エタノール溶出画分）、Ｐ４０（４０％エタノール溶出画分）、Ｐ６０（６０％エタノール溶出画分）とした。同様に、上記大麦焼酎蒸溜残液からの清澄液の濃縮物と上記合成吸着剤非吸着画分も、エバポレーターで濃縮してＸ（濃縮物）、ＸＳ（非吸着画分濃縮物）とした。
【実施例２】
【００２４】
本発明のウシ血清含有培地を使用して、接着培養による抗体産生ＣＨＯ細胞の増殖促進について試験した。
（１）細胞
細胞は、抗体を産生する市販のＣＨＯ細胞を用いた。ＣＨＯ  ＤＰ１２ ｃｌｏｎｅ＃１９３４ [ＣＨＯ  ＤＰ１２ ｃｌｏｎｅ＃１９３４  ａｌＬ８．９２  ＮＢ  ２８６０５／１４] （ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ１２４４５5（登録商標）)であり、この細胞は抗ヒトＩＬ−８抗体を産生する。
（２）基礎培地
培地は、ＣＨＯ  ＤＰ１２細胞用培地、すなわちＤｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ'ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ(Ｄ−ＭＥＭ)に２００ｎＭ  ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ(Ｗａｋｏ)、０．００２ｍｇ／ｍｌ  ｒｅｃｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｓｕｌｉｎ(Ｗａｋｏ)、０．１％Ｔｒａｃｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  Ａ（Ｃｅｌｌｇｒｏ）、０．１％Ｔｒａｃｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  Ｂ（Ｃｅｌｌｇｒｏ）、１０％非働化ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ(ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ)となるように加えた培地を用いた。
【００２５】
（３）培養方法
３７℃、５％ＣＯ２下でコンフルエントになるまで培養した細胞(１０ｍＬ培地／１０ｍｍφシャーレ(Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ製)の培地吸引後、トリプシンを５ｍＬ添加して細胞を剥離し、５０ｍＬの培地に播種してから、９６穴平底マイクロプレート(ＦＡＬＣＯＮ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ製)に１００μＬ／ｗｅｌｌずつ播種した。３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。
培養２日目に、１０％添加で１０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、１０００μｇ／ｍｌのそれぞれの濃度となるよう予め調製したＸ、ＸＳ、Ｐ１０、Ｐ２０、Ｐ４０、Ｐ６０のそれぞれについて０．２μｍのフィルターで滅菌し、添加した。対照区には、０．２μｍのフィルターでろ過した蒸留水を、１０μＬ添加した。
【００２６】
（４）測定方法
Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８(株式会社 同仁化学研究所)を１０μＬ添加して２ｈ反応させマルチプレートリーダー(ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＥｎＳｐｉｒｅ  ２３００  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｒｅａｄｅｒ)を用いて４５０ｎｍ(参照波長６００ｎｍ)で吸光度を測定し、予め作成した検量線から細胞数を算出した。実験は３連で行った。
統計的有意差の評価はＴｕｋｅｙの多重比較検定を行い、有意水準を５％未満とした。
【００２７】
（５）結果
ＣＨＯ  ＤＰ１２細胞用培地において、３．３×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で細胞を播種し、最高点に達する培養4日目の結果を図１に示す。Ｘ（濃縮物）、ＸＳ（非吸着画分濃縮物）、Ｐ１０、およびＰ２０の添加により、対照（Ｃｏｎｔｒｏｌ）に比べて明らかに細胞増殖を促進した。特に、１０００μｇ／ｍｌの添加で、Ｘ（濃縮物）では対照の約１.６倍、Ｐ１０では対照の約１．９倍の細胞数となった。
【実施例３】
【００２８】
本発明のＰ１０を添加した無血清含有培地を使用して、浮遊培養による抗体産生ＣＨＯ細胞の増殖促進について試験した。
（１）細胞
細胞は抗ヒトＩＬ−８抗体を産生するＣＨＯ細胞である、実施例２と同じＣＨＯ  ＤＰ１２ ｃｌｏｎｅ＃１９３４を用いた。
（２）基礎培地
基礎培地は、Ｂａｌａｎ  ＣＤ  ＣＨＯ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ａ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）とし、実施例２で細胞増殖効果の高かったＰ１０を添加剤として用いた。
【００２９】
（３）培養方法
−８０℃の冷凍ストックから起こした細胞を、基礎培地に１０〜２０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように播種し、６０ｍｍφシャーレ(Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ製)に５ｍＬずつ分注し、３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。
１０％添加で１０００μｇ／ｍｌの濃度となるように予め調製したＰ１０を、０．２μｍのフィルターで滅菌して０．５ｍＬ添加して、３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。対照区には、０．２μｍのフィルターでろ過した蒸留水を、０．５ｍＬ添加した。
（４）測定方法
細胞数の測定は培養液を適宜希釈して、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８(株式会社 同仁化学研究所)を１０％添加して２時間反応させ、マルチプレートリーダー(ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＥｎＳｐｉｒｅ  ２３００  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｒｅａｄｅｒ)を用いて４５０ｎｍ(参照波長６００ｎｍ)で吸光度を測定し、予め作成した検量線から細胞数を算出した。
抗体量は、ＢＥＴＨＹＬ製 ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ測定キットを用い、サンドイッチＥＬＩＳＡ法で測定した。これらの実験は3連で行った。
【００３０】
（５）結果
統計的有意差の評価はＴｕｋｅｙの多重比較検定を行い、有意水準を5％未満とした。結果を図２に示す。無血清培地にＰ１０を添加することにより、浮遊培養における抗体産生ＣＨＯ細胞の増殖と抗体産生が有意に亢進されることが確認された。
【実施例４】
【００３１】
本発明のウシ血清含有培地を使用して、接着培養によるヒト細胞の増殖促進について試験した。
（１）細胞
細胞は、ヒト細胞株であるＨＥＫ２９３細胞を用いた。ＨＥＫ２９３細胞はヒト胎児腎細胞をアデノウィルスのＥ１遺伝子で形質転換して樹立された細胞株である。
（２）基礎培地
培地は、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ'ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ(Ｄ−ＭＥＭ)に、１０％非働化ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ(ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ)となるように加えた培地を用いた。
【００３２】
（３）培養方法
３７℃、５％ＣＯ２下でコンフルエントになるまで培養した細胞(１０ｍＬ培地／１０ｍｍφシャーレ(Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ製)の培地吸引後、トリプシンを５ｍＬ添加して細胞を剥離し、５０ｍＬの培地に播種してから、９６穴平底マイクロプレート(ＦＡＬＣＯＮ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ製)に１００μＬ／ｗｅｌｌずつ播種した。３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。
ＸおよびＸＳは、１０％添加で２０μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、２０００μｇ／ｍｌのそれぞれの濃度となるよう予め調製し、Ｐ１０、Ｐ２０、Ｐ４０、Ｐ６０は、１０％添加で１０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、１０００μｇ／ｍｌのそれぞれの濃度となるよう予め調製したものを、０．２μｍのフィルターで滅菌し、添加した。対照区には、０．２μｍのフィルターでろ過した蒸留水を、１０μＬ添加した。
【００３３】
（４）測定方法
Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８(株式会社 同仁化学研究所)を１０μＬ添加して２ｈ反応させマルチプレートリーダー(ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＥｎＳｐｉｒｅ  ２３００  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｒｅａｄｅｒ)を用いて４５０ｎｍ(参照波長６００ｎｍ)で吸光度を測定し、予め作成した検量線から細胞数を算出した。実験は３連で行った。
統計的有意差の評価はＴｕｋｅｙの多重比較検定を行い、有意水準を５％未満とした。
【００３４】
（５）結果
１．６×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で細胞を播種して培養した結果、細胞数が最高点に達する培養4日目の結果を図３に示す。Ｘ（濃縮物）、ＸＳ（非吸着画分濃縮物）、Ｐ１０、Ｐ２０、Ｐ４０、Ｐ６０の全ての添加により、対照（Ｃｏｎｔｒｏｌ）に比べて明らかに細胞増殖を促進した。特に、１０００μｇ／ｍｌの添加で、Ｐ１０では対照の約１.８倍、Ｐ４０では対照の約１．７倍の細胞数となった。
【００３５】
動物細胞培養に関しては、増殖促進因子として血清が用いられてきたが、医療分野で用いるにあたっては、動物由来のウイルスやマイコプラズマの汚染のリスクがあるため、完全合成培地や非動物性の増殖因子を含む培地への移行が進んでいる。
細胞培養用の非動物性の増殖因子としては酵母、大豆、小麦、エンドウ豆、綿実などのペプトンが用いられるが、大麦由来のものはなく、選択肢が広がることは今後の医療・医薬用培開発の発展に大きく寄与するものであると考えられる。また、従来は産業廃棄物とされていたものを有効利用することによる資源循環の側面からも、非常に有益であると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明によれば、大麦を原料とする焼酎を製造する際に副成する大麦焼酎蒸溜残液を、精密ろ過して得られた清澄な液体を添加した血清培地または無血清培地で動物細胞を培養すると、細胞増殖率を高めることができた。大麦焼酎蒸溜残液という発酵食品由来であるため動物由来の汚染物の混入の不安もなく、無血清培地に添加した場合には、動物細胞から産生された有用物質の安全性も確保できる。また、再生医療用の幹細胞の増殖における活用も期待でき、産業廃棄物の有効活用という視点からも有益である。
【図１】
2018183081.tif 000003
【図２】
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【図３】
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