(57)【要約】【課題】本発明は、従来技術の治療用細胞である骨髄ＭＳＣやＡＳＣ等に比べ、優れた血流改善作用を示す血管再生療法用細胞であって、かつ移植に必要な十分量を取得することが容易であり、安定した品質の前記血管再生療法用細胞を提供することを課題とする。【解決手段】ヒトＤＦＡＴが高い血管新生能を有するのみならず、継代培養後の増殖能が高く移植に必要な細胞数を容易に獲得できること、および形質転換も起こらないことを見出し、これにより初めてヒトＤＦＡＴがヒトの血管再生治療にも有効であることを明らかにし本発明を完成した。すなわち、本発明は、ヒト脱分化脂肪細胞（ヒトＤＦＡＴ）を有効成分とする血流改善剤を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト脱分化脂肪細胞（ヒトＤＦＡＴ）を有効成分とする血流改善剤。
【請求項２】
ヒト脱分化脂肪細胞（ヒトＤＦＡＴ）を有効成分とする血管新生促進剤。
【請求項３】
ヒト脱分化脂肪細胞（ヒトＤＦＡＴ）を有効成分とする虚血性疾患治療剤。
【請求項４】
虚血性疾患が末梢動脈疾患（ＰＡＤ）または虚血性心筋症である、請求項３に記載の虚血性疾患治療剤。
【請求項５】
ヒト脱分化脂肪細胞（ヒトＤＦＡＴ）が、１〜４代継代培養されたヒト脱分化脂肪細胞（ヒトＤＦＡＴ）である、請求項１〜４のいずれかに記載の剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管再生療法用組成物に関する。特に脱分化脂肪細胞（ｄｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ｆａｔ  ｃｅｌｌ：  ＤＦＡＴ）を有効成分とする血管再生療法用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、薬物療法や外科的療法が適応とならない難治性末梢動脈疾患（以下、単にＰＡＤということがある）に対して、（ｉ）自己骨髄単核球を虚血筋肉内投与することによる血管新生療法が行われ、その有効性が確認されてきた（ＴＡＣＴスタディ）。その後、（ｉｉ）Ｇ−ＣＳＦ動員末梢血単核球、（ｉｉｉ）脂肪組織由来ｓｔｒｏｍａｌ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｆｒａｃｔｉｏｎ  （ＳＶＦ）細胞、（ｉｖ）末梢血単核球、（ｖ）Ｇ−ＣＳＦ動員ＣＤ３４陽性細胞、（ｖｉ）骨髄由来ＣＤ１３３陽性細胞、（ｖｉｉ）培養骨髄間葉系幹細胞（ＭＳＣ）（ｖｉｉｉ）培養脂肪組織由来幹細胞（ＡＳＣ）など多くの自己細胞を用いた同様の血管新生療法が行われている。
上記（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）のうち、（ｉ）〜（ｖｉ）の細胞は培養を行わないが、必要な細胞数を得るために多量の組織採取が必要となり患者に与える侵襲性が高い。このため採取に伴う侵襲性が比較的低い（ｉｖ）を除いて治療回数は通常１回のみに限られる。
また、（ｉ）〜（ｉｖ）の細胞は、雑多な細胞集団であるため、移植効果や安全性が一定ではない。
また、（ｖ）、（ｖｉ）の細胞は、幹細胞マーカー抗体を利用して選別操作を行うことにより細胞の均一性を高めることができるが、抗体選別に伴う煩雑性や調製効率の低下、調製コストが高くなるといった問題がある。
（ｖｉｉ）の細胞は骨髄液を数１０ｍｌ採取し、付着培養し増殖させてから使用し、（ｖｉｉｉ）の細胞は、脂肪組織を酵素処理し、（ｖｉｉ）と同様に付着培養し増殖させてから使用するため、（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）の細胞は共に、比較的少量の組織から大量調製が可能であるというメリットがあるが、成体組織に微量に存在する幹細胞を培養・増殖させる方法であるため、他細胞の混入が避けられず、治療に必要な細胞数を得るために継代培養を何回か繰り返す必要がある。治療回数は通常１回のみである。また増殖能など細胞の性能に個体差があり、年齢・基礎疾患による影響を受けやすいというデメリットがある。
（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）の細胞に共通していえることは、治療コストがかかる割に、性能に個体差があり、必要細胞数が得られない症例や治療不応例（ｎｏｎ−ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）が存在すること、患者に対する侵襲性を考慮すると通常１回の治療にとどまること、である。現時点で、これらの細胞を用いた難治性末梢動脈疾患（ＰＡＤ）に対する臨床試験は多数行われているが、プラセボ・コントロール試験で有意な効果を示した細胞はまだない。
また、このほかにも、ラットの脂肪組織由来前駆細胞やラットの脂肪組織由来間葉系幹細胞が血管新生に有効であることが開示されている（特許文献１，２）。
本発明者らは、マウス等のヒト以外の動物の脂肪組織由来の成熟脂肪細胞の脱分化を誘導することで前駆脂肪細胞として脱分化脂肪細胞（ＤＦＡＴ）を樹立することに初めて成功し（特許文献３）、ＤＦＡＴを分化誘導することにより、骨芽細胞、筋芽細胞、軟骨細胞、神経細胞等の機能を獲得できることを示してきた（特許文献４）。
また、本発明者らは、マウスおよびラットのＤＦＡＴが血管新生能を有することについても明らかにしてきた（非特許文献１〜３）。しかし、マウスやラットのＤＦＡＴでは継代培養後の増殖能が低いことから移植に必要な数まで増やすことが困難であったこと、および継代培養により形質転換（不死化）が起こることから造腫瘍性の可能性が高まり安全に移植できないこと、などの理由からこれをヒトに対して同様に適用した場合、ヒトＤＦＡＴにおいても同様の現象が起こり、治療には適さないと考えられてきた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】ＷＯ２００６／１１２３９０パンフレット
【特許文献２】特開２０１２−２０５９２７号公報
【特許文献３】特許第５０５５６１１号公報
【特許文献４】特許第５０５５６１３号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Jumabay M, et al. Journal of Molecular and Cellular Cardiology 47:565-575, 2009
【非特許文献２】Soejima K et al. Journal of Plastic Surgery and Hand Surgery 49: 25-31, 2015
【非特許文献３】Nobusue H et al. Cell and Tissue Research 332:435-446, 2008
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、従来技術の治療用細胞である骨髄ＭＳＣやＡＳＣ等に比べ、優れた血流改善作用を示す血管再生療法用細胞であって、かつ移植に必要な十分量を取得することが容易であり、安定した品質の前記血管再生療法用細胞を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
マウスやラットのＤＦＡＴは血管新生能はあっても、上述の理由により、実際の治療には適さないことからヒトＤＦＡＴについても同様であろうと考えられてきたところ、本発明者らは意外にも、ヒトＤＦＡＴが高い血管新生能を有するのみならず、マウスやラットのＤＦＡＴとは異なり、継代培養後の増殖能が高く移植に必要な細胞数を容易に獲得できること、および形質転換も起こらないことを見出し、これにより初めてヒトの血管再生治療にも有効であることを明らかにした。
すなわち、本発明は以下の構成を有する。
（１）ヒト脱分化脂肪細胞（ヒトＤＦＡＴ）を有効成分とする血流改善剤。
（２）ヒト脱分化脂肪細胞（ヒトＤＦＡＴ）を有効成分とする血管新生促進剤。
（３）ヒト脱分化脂肪細胞（ヒトＤＦＡＴ）を有効成分とする虚血性疾患治療剤。
（４）虚血性疾患が末梢動脈疾患（ＰＡＤ）または虚血性心筋症である、前記（３）に記載の虚血性疾患治療剤。
（５）ヒト脱分化脂肪細胞（ヒトＤＦＡＴ）が、継代培養されたヒト脱分化脂肪細胞（ヒトＤＦＡＴ）である、前記（１）〜（４）のいずれかに記載の剤。
【発明の効果】
【０００７】
本発明は、ヒト成熟脂肪細胞から調製されるヒト脱分化脂肪細胞（ヒトＤＦＡＴ）が、優れた血管新生能を有し、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）などの虚血性疾患に対する細胞治療の有効な細胞ソースとなり得ることを明らかにした。したがって、本発明は、以下の効果を有する。
（１）大規模な細胞調製施設や、増殖因子、純度を高めるための抗体選別などが必要ない。また短い培養期間で大量調整が可能であるため、調製コストが低くおさえることができる。
（２）採取が容易な少量の脂肪組織から純度の高い再生医療用ドナー細胞を効率よく採取でき、得られた細胞は高い血管新生能を有する。
（３）一回の組織採取により複数回の治療が可能となり、ドナー年齢や基礎疾患に影響されずに一定の有効性を示す治療が可能となる。
（４）既存の細胞ソースと異なり、ＰＡＤに対して長期有効性を示すことが可能である。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】ヒトＤＦＡＴの核型解析結果を示す。（Ａ）ギムザ染色による染色体構造の写真。（Ｂ）染色体数の測定結果を示す表。
【図２】プロモーター領域ＤＮＡメチル化を検討した癌関連遺伝子リストを示す。
【図３】ヒトＤＦＡＴ培養上清中に分泌されるサイトカインの網羅的解析結果を示す。
【図４】ヒトＤＦＡＴ（ｈＤＦＡＴ）、ヒトＡＳＣ（ｈＡＳＣ）、ヒト前駆脂肪細胞（ｈＰｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅ）、ヒト線維芽細胞（ｈＦｉｂｒｏｂｌａｓｔ）、ヒト骨髄ＭＳＣ（ｈＢＭ−ＭＳＣ）培養上清中の分泌サイトカイン（ＨＧＦ、ＳＤＦ−１、ＭＣＰ−１、ＩＬ−６、ＶＥＧＦ、Ｌｅｐｔｉｎ）の定量結果を示す。かっこ内の数値はドナー年齢を示す。
【図５】ヒトＤＦＡＴ培養上清の血管新生能の検討結果を示す。（Ａ）ヒトＤＦＡＴ培養上清による血管内皮細胞の増殖を示す写真。（Ｂ）ヒトＤＦＡＴ培養上清およびヒト骨髄ＭＭＣ培養上清によりウェル中に形成された血管管腔の長さの合計（総管腔長）及び面積の合計（総管腔面積）を示すグラフ。
【図６】ドナー年齢の違いによるヒトＤＦＡＴ培養上清の血管新生能の検討結果を示す。ドナーは、２歳男性（ｈ−ＤＦＡＴ２ｙＭ）、２９歳男性（ｈ−ＤＦＡＴ２９ｙＭ）、５６歳女性（ｈ−ｄＦＡＴ５６ｙＦ）、７５歳女性（ｈ−ＤＦＡＴ７５ｙＦ）、８２歳女性（ｈ−ＤＦＡＴ８２ｙＦ）である。
【図７】同一ドナー由来のヒトＤＦＡＴ培養上清（ｈＤＦＡＴ）とヒトＡＳＣ培養上清（ｈＡＳＣ）の血管新生能の比較検討結果を示す。（Ａ）組織学的観察結果を示す写真。（Ｂ）ウェル中に形成された血管管腔の長さの合計（総管腔長）、面積の合計（総管腔面積）、分枝の数の合計(総管腔分枝数）、接合部の数の合計（総管腔接合部数）についてそれぞれ示すグラフ。
【図８】免疫不全マウス下肢虚血モデルにおけるヒトＤＦＡＴ移植の効果を示す。（Ａ）レーザードップラー血流計による移植０日目と２８日目におけるマウス下肢部の血流の程度を示す写真。「１」と記載された赤い線で囲った部分は虚血肢を示し、「２」と記載された白い線で囲った部分は健側肢を示す。（Ｂ）移植０日目、７日目、１４日目、２１日目、２８日目におけるマウス健側肢に対する虚血肢の虚血率を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
（ヒトＤＦＡＴ）
本発明におけるヒトＤＦＡＴの調整方法は、たとえば、本発明者らによってなされた特開２０００−８３６５６号公報を参考にしておこなうとよい。すなわち、ヒトの皮下または内臓などの脂肪組織をコラゲナーゼ処理したのち、口径１００〜２００μｍのメッシュでフィルトレーションすることにより単胞性脂肪細胞のみからなる単一の画分を採取する。それらの単胞性脂肪細胞を天井培養して産生される線維芽細胞様脂肪細胞を継代培養することによってヒト脱分化脂肪細胞（ヒトＤＦＡＴ）を得ることができる。また、上記天井培養以外の方法によっても、成熟脂肪細胞を培養することにより、成熟脂肪細胞を起源とする脂肪滴を有さない細胞を調整する方法等によりヒトＤＦＡＴを得ることができる。
ヒトＤＦＡＴであることの確認は、例えば、以下のようなヒトＤＦＡＴ特有の性質を有するかどうかにより判断することができる。
ヒトＤＦＡＴはプラスチックへの付着性を有し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、平滑筋細胞への多分化能を示す。また、細胞表面抗原として、ＣＤ１３，ＣＤ２９，ＣＤ４４，ＣＤ４９ｄ，ＣＤ７３，ＣＤ９０，ＣＤ１０５陽性、ＣＤ１１ｂ，ＣＤ１４，ＣＤ３４，ＣＤ４５，ＣＤ１９，ＨＬＡ−ＤＲ陰性であり、国際細胞治療学会（ＩＳＣＴ）が定めたＭＳＣの最小基準を満たす。また、ヒトＤＦＡＴはリポプロテインリパーゼ、ＧＬＵＴ４といった成熟脂肪細胞のマーカー遺伝子の発現が消失している一方、ＰＰＡＲg，ＲＵＮＸ２，ＳＯＸ９といった脂肪、骨、軟骨の初期分化マーカー遺伝子が発現している。さらに、ヒトＤＦＡＴは高い細胞増殖能を有し、細胞倍加時間は第２継代細胞で約６５時間、第１０継代で約４８時間であった。第５継代以後は多分化能が低下するため、第１継代〜第４継代で使用することが望ましい。
ヒトＤＦＡＴは１０ｍｌの吸引脂肪または１ｇの脂肪組織より上記調整方法により、約２週間の初代培養で１０８の細胞が得られる。これは培養ＡＳＣの約２５倍の調製効率である。従って、２−３回継代培養することにより１０９オーダーの細胞を得ることが可能である。１回の細胞治療に用いる細胞数は約１０８個であるため、１回（約１０ｍｌ）の脂肪組織採取で、得られた細胞を小分けして凍結保存すれば、約１０回治療が可能であることがわかる。
また、ヒトＤＦＡＴは初代培養から均質な細胞が得られる。初代培養ＡＳＣは平滑筋細胞（１８．６％）、血管内皮細胞（２．７％）、単球（１３．３％）の混入があるが、初代培養ヒトＤＦＡＴのこれらの細胞の混入率は０．１％以下と非常に低いものであった。
また、ヒトＤＦＡＴはドナー年齢や基礎疾患に影響されず、調製可能であることも明らかになった。これらの特性は、治療用細胞としての性能の個体差をなくし、治療不応例を減らすこと（治療用細胞の標準化）に寄与すると考えられる。
さらには、実施例にて後述する下肢虚血モデル動物への移植実験において、ヒトＤＦＡＴは、末梢血単核球や線維芽細胞より有意に高い血流改善効果を示した。
【００１０】
（血管新生）
本発明において血管新生とは、既存の血管より新しい血管が形成される現象をいい、虚血性疾患における側副血行路の形成のほか、胎生期における生理的な血管発達、さらには癌や糖尿病性網膜症などの病的状態でも起こる。動脈硬化や血栓などにより血管が閉塞し、局所組織が血流障害に陥った状態において、生理活性物質や細胞などを用いて人為的に血管新生を誘導することを特に治療的血管新生または血管再生と呼ぶ。本明細書において、血管新生、血管再生は特に断らない限り同義で用いられる。
血管再生（または治療的血管新生）のより具体的な例としては、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）や狭心症、心筋梗塞などの虚血性疾患患者における血流改善が挙げられる。血管再生能を有する細胞の性能は、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ−Ａ、ＦＧＦ−２、ＳＤＦ−１、ｌｅｐｔｉｎなどの血管新生促成因子の発現量・分泌量や、血管構成細胞である血管内皮細胞やペリサイトへの分化能などにより確認することができる。
【００１１】
本発明のヒトＤＦＡＴを使用した血管再生に係る治療方法としては、例えば、患者自身から調製したDFAT（自家ＤＦＡＴ）を複数のバイアルに入れ液体窒素タンクに凍結保存しておき。これを定期的に解凍して、虚血部位（筋肉）に注射することにより血流改善を図る方法が挙げられる。
また、外科手術などで破棄される脂肪組織を利用した他家移植用ＤＦＡＴ細胞バンクの構築も可能である。この場合は、何らかの理由で自家ＤＦＡＴが調製できない患者に対し、ＨＬＡフルマッチした凍結保存DFATを解凍し、患者の虚血部位に注射するといった治療モデルが想定される。
【００１２】
本発明は、本発明のヒトＤＦＡＴを有効成分とする、血管を再生し虚血による障害組織を修復させる薬剤に関する。
本発明の薬剤は、ヒトＤＦＡＴそのものでもよいし、保存剤や安定剤等の製剤上許容しうる担体を添加してもよい。製剤上許容しうるとは、それ自体は上記の活性を有さない材料であって、上記の薬剤とともに投与可能な製剤上許容される材料を意味する。
【００１３】
本発明において、「投与する」とは、非経口的に投与することが含まれる。非経口的な投与としては、注射剤という形での投与を挙げることができ、注射剤としては、皮下注射剤、筋肉注射剤、あるいは腹腔内注射剤等を挙げることができる。注射剤を投与する方法としては、ヒト体内の一部分（臓器等の一組織）を標的として局所的に投与を行っても良いし、血管内に投与することにより、生物体全体に本発明の細胞を循環させてもよい。また、複数箇所の標的に同時に投与を行ってもよい。また、本発明の細胞を、処置を施したい領域に局所的に投与することもできる。例えば、手術中の局所注入、カテーテルの使用により投与することも可能である。
注射剤を調整する場合、必要により、ｐＨ 調製剤、緩衝剤、安定化剤、保存剤等を添加し、常法により、皮下、筋肉内、静脈内注射剤とする。
【００１４】
投与量は、患者の年齢、性別、体重および症状、治療効果、投与方法、処理時間、あるいは該細胞に含有される活性成分の種類などにより異なり、特に制限されるものではない。本発明の細胞は、少なくとも1つの既知の化学療法剤と共に薬学的組成物の一部として投与されてもよい。一つの態様において、本発明の細胞および既知の化学療法剤は、実質的に同時に投与されてもよい。
また、ヒトより摘出されたヒトの一部分に本発明の細胞を投与し、摘出を行ったヒトまたは他のヒトに、該ヒトの一部分を戻すことも可能である。
【実施例】
【００１５】
[実施例１]ヒトＤＦＡＴの形質解析
（１）核型解析
（１−１）試験方法
（ｉ）ヒトＤＦＡＴの調整
本発明者らによってなされた特開２０００−８３６５６号公報を参考にして行った。すなわち、ドナーであるヒトの皮下脂肪組織をコラゲナーゼ処理したのち、口径１００〜２００  μｍのメッシュでフィルトレーションすることにより単胞性脂肪細胞のみからなる単一の画分を採取した。それらの単胞性脂肪細胞を天井培養して産生される線維芽細胞様脂肪細胞を継代培養することによってヒト脱分化脂肪細胞（ヒトＤＦＡＴ）を調製した。ドナー対象者は、日本大学医学部附属病院  形成外科、整形外科、小児外科にて外科手術を受けた１０歳から８２歳の患者である。ヒトＤＦＡＴの調整方法は以下の試験例において同じである。
（ｉｉ）（ｉ）により得られた培養ヒトＤＦＡＴ（ｎ＝３）をコルセミド処理し染色体標本を作製し、染色体数の測定およびギムザ染色による染色体構造の観察を行った。
（１−２）試験結果
５０細胞分の染色体数を測定した結果、すべての細胞において、染色体数は、正常ヒト染色体数である４６であった（図１（Ｂ））。また、ギムザ染色では顕著な染色体構造の異常は観察されなかった（図１（Ａ））。他の２細胞株でも同様の結果が得られた。
【００１６】
（２）ＣＧＨマイクロアレイ
（２−１）試験方法
ヒト成熟脂肪細胞およびそこから実施例１の方法により調製したヒトＤＦＡＴ（ｎ＝３）からゲノムＤＮＡを抽出し、ヒト成熟脂肪細胞とヒトＤＦＡＴのゲノムのコピー数の変化をＣＧＨマイクロアレイ（Ａｇｉｌｅｎｔ社）を用いて解析した。
（２−２）試験結果
上記培養前後におけるゲノムＤＮＡのコピー数の増幅はほとんど認められず、ＤＦＡＴのゲノムコピー数のプロファイルは成熟脂肪細胞とほぼ一致していた（図示せず）。成熟脂肪細胞の脱分化によりＤＦＡＴが産生される過程でゲノムコピー数がほとんど変化しないことが明らかになった。
【００１７】
（３）ＤＮＡメチル化解析（ＭａｓｓＡＲＲＡＹ法）
（３−１）試験方法
ヒト成熟脂肪細胞およびヒトＤＦＡＴ（ｎ＝３）からゲノムＤＮＡを抽出し、既知の癌関連遺伝子（計９６遺伝子）のプロモーター領域ＣｐＧアイランドにおけるＤＮＡメチル化修飾をＭａｓｓＡＲＲＡＹ法（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ社）を用いて網羅的に解析した（図３）。
（３−２）試験結果  
成熟脂肪細胞とＤＦＡＴとの間には、癌関連遺伝子のプロモーター領域ＣｐＧのメチル化プロファイルは非常に類似しており、脱分化に伴う特徴的なメチル化変動は検討した遺伝子群（９２遺伝子ＣｐＧ）の中では全く確認されなかった。
【００１８】
（４）テロメラーゼ活性測定
（４−１）試験方法
市販されているテロメラーゼ測定キット（ＴｅｌｏＴＡＧＡＡ  Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ＰＣＲ  ＥＬＩＳＡｐｌｕｓ、ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）を用いて、異なった年齢から調整した培養ヒトＤＦＡＴ（ｎ＝３、細胞数：２×１０５）より細胞抽出液を採取し、テロメラーゼ活性を測定した。
（４−２）試験結果
キット内の内部スタンダードとコントロールテンプレートを用いてテロメラーゼ反応産物量を定量した結果、測定したすべての培養ヒトＤＦＡＴにおいてテロメラーゼ活性は検出されなかった。この結果により、癌細胞で高頻度に見られる既知の異常所見（染色体数の異常、ゲノムコピー数の異常、癌関連遺伝子のメチル化異常、テロメラーゼ活性の亢進）がヒトＤＦＡＴでは認められず、細胞の安全性を示す重要な所見が得られた。
【００１９】
［実施例２］ヒトＤＦＡＴの血管新生能の検討
１．ＤＦＡＴ分泌サイトカインの解析
（１）発現サイトカインのプロテインアレイ解析
（１−１）試験方法
（ｉ）ヒトＡＳＣの調整方法
実施例１と同様にして得られたヒトＤＦＡＴの沈降分画（間質血管分画  ｓｔｒｏｍａｌ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｆｒａｃｔｉｏｎ：  ＳＶＦ）からＳＶＦ細胞を採取し、培養フラスコ内で約２週間付着培養を行い、ヒトＡＳＣを調製した。ヒトＡＳＣの調整方法は以下の試験例において同じである。
（ｉｉｉ）第２〜第４継代のそれぞれの細胞がコンフルエントに到達した時点で、培地を５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）含有ＤＭＥＭ培地５ｍｌに交換し、さらに７２時間培養した。
その後培養ヒトＤＦＡＴ，ヒトＡＳＣより培養上清を採取し、０．４５ｍｍフィルターで濾過後、プロテインアレイ法にて発現、分泌するサイトカインを検出した。
（１−２）試験結果
ヒトＤＦＡＴからＴＩＭＰ−１，ＴＩＭＰ−２，ＩＬ−６，ＩＬ−８，ＭＣＰ−１などの種々のサイトカイン群の分泌が確認された（図３）。
【００２０】
（２）発現サイトカインのＥＬＩＳＡ法による定量
（２−１）試験方法
培養ヒトＤＦＡＴ（各ドナーにつきｎ＝３），ヒトＡＳＣ（ヒトＤＦＡＴと同一ドナー由来、各ドナーにつきｎ＝３），ヒト前駆脂肪細胞（ｈＰｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅ），ヒト骨髄ＭＳＣ（ｈＢＭ−ＭＳＣ），ヒト線維芽細胞（ｈＦｉｂｒｏｂｌａｓｔ）より培養上清を採取し、プロテインアレイで分泌が確認されたサイトカインを中心に培養上清中の濃度をＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。検討対象サイトカインとしてＨＧＦ，ＶＥＧＦ，ｂＦＧＦ，ＳＤＦ−１，ＩＬ−６，ＩＬ−８，ＭＣＰ−１，Ｌｅｐｔｉｎ，ＩＧＦ−１，ＴＧＦβ１を測定した。各細胞の調整方法を以下に示す。測定は、各ドナーにつき３つの検体を調整して（ｎ＝３）測定し、得られた３つのデータの平均値と標準偏差を求めた。
（ｉ）ヒト前駆脂肪細胞（ｈＰｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅ）
ＤＳファーマメディカル株式会社より購入したヒト前駆脂肪細胞を解凍、洗浄し、付着培養して調製した。培地は、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを用いた。ヒト前駆脂肪細胞の調整方法は以下の試験例において同じである。
（ｉｉ）ヒト骨髄ＭＳＣ（ｈＢＭ−ＭＳＣ）
市販されている初代培養細胞（Ｌｏｎｚａ社）を解凍、洗浄し、付着培養して調製した。培地は、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを用いた。ヒト骨髄ＭＳＣの調整方法は以下の試験例において同じである。
（２−２）試験結果  
ヒトＤＦＡＴからはＨＧＦ，ＶＥＧＦ，ＳＤＦ−１，ＩＬ−６，ＩＬ−８，ＭＣＰ−１，ｌｅｐｔｉｎが高発現（１−１０ｎｇ／ｍｌ）していることが確認された。特に、ＨＧＦおよびＳＤＦ−１はｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅ，ヒトＡＳＣ，ヒト骨髄ＭＳＣに比べて特徴的に発現が高いことが明らかになった。（図４）。
【００２１】
２．ヒトＤＦＡＴ培養上清のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける血管新生能
（１）ヒトＤＦＡＴとヒト骨髄ＭＳＣ（ｈＢＭ−ＭＳＣ）の比較
（１−１）試験方法
血管新生キット（ＫＺ−１０００，ＫＵＲＡＢＯ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を用いて、ヒトＤＦＡＴ培養上清のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける血管新生能を検討した。本キットは２４ウェルプレートにあらかじめヒト線維芽細胞とヒト血管内皮細胞が共培養され、専用の血管新生培地で培養することで血管内皮細胞の管腔形成が誘導されるデザインである。これに被検物質を含むサンプル培地を加えて培養することで、管腔形成能に差が生じる。血管新生能の測定は本キットのプロトコールに従って管腔形成を誘導し、マウス抗ヒトＣＤ３１抗体を用いた免疫染色により管腔形成を可視可した。ＤＦＡＴ培養上清やヒト骨髄ＭＳＣ培養上清は上記の方法で調整し、付属の血管新生培地に１：１で混合してサンプル培地とした。
（１−２）試験結果  
ヒトＤＦＡＴの培養上清は血管内皮細胞の増殖、管腔形成を著明に促進した。ＤＦＡＴの血管新生能は、骨髄ＭＳＣと同等またはそれ以上であった（図５）。
【００２２】
（２）ドナー年齢の違いによる比較
（２−１）試験方法
ドナー年齢の違いによるＤＦＡＴ培養上清の血管新生能について検討した。ポジテイブコントロールとしてＶＥＧＦ−Ａ（１０ｎｇ／ｍｌ  Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。
（ｉ）ドナー年齢および性別
２歳男性、２９歳女性、５６歳女性、７５歳女性、８２歳女性の５人である。
（２−２）試験結果  
高齢ドナー（７５歳、８２歳）由来のヒトＤＦＡＴ培養上清が、若年者と比較しても同等の血管新生能を有することが明らかになった（図６）。すなわち、ヒトＤＦＡＴ培養上清の血管内皮細胞の管腔形成能に年齢による違いはなかった。
【００２３】
（３）ヒトＤＦＡＴとＡＳＣ（同一ドナー由来）の比較
（３−１）試験方法
同一ドナーに由来するヒトＤＦＡＴとヒトＡＳＣの血管新生能の比較検討を行った。ヒトＤＦＡＴとヒトＡＳＣの調整方法は、実施例１に同じである。
（３−２）試験結果
ヒトＤＦＡＴ培養上清はヒトＡＳＣ培養上清と比較して管腔長、管腔面積、分枝数および接合部数などが有意に高値を示した（図７）。
【００２４】
［実施例３］免疫不全マウス下肢虚血モデルにおけるヒトＤＦＡＴ移植実験
１．ヒトＤＦＡＴのモデルマウスの筋肉内への移植
（１）試験方法
免疫不全（ＳＣＩＤ）マウス下肢虚血モデル（日本クレア株式会社、ｎ＝２０）に対し、虚血作成６時間後にヒトＤＦＡＴ（１ｘ１０５）を虚血筋肉内に移植し、レーザードップラー血流計による血流測定および組織学的検討を行った。そして生理食塩水を投与するコントロール群、ヒト末梢血単核球を移植する群との比較検討を行った。
（ｉ）ヒト末梢血単核球の調整方法
健常人の血液から血球分離溶液Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（コスモバイオ株式会社製）を用いた比重遠心法により調整した。
（２）試験結果  
ＤＦＡＴ移植群ではコントロール群に比べ、移植３週後より有意に血流改善が認められた。また、ＤＦＡＴ移植した虚血組織では血管密度が有意に増加していた。ＤＦＡＴ移植による血流改善効果は、ヒト末梢血単核球移植に比べても優れていることが明らかになった（図８）。
【００２５】
２．蛍光ラベルしたヒトＤＦＡＴのモデルマウス組織への移植
（１）試験方法
ＳＣＩＤマウス下肢虚血モデル（ｎ＝１６）に対し、ＱＴｒａｃｋｅｒ（商品名、Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）にて蛍光ラベルしたヒトＤＦＡＴ（１ｘ１０５）を左側虚血組織および右側健常組織内に移植し、移植２日、７日、１５日、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、６ヶ月後に２匹ずつ両則筋組織および肺、肝臓、腎臓、脾臓、腎臓を採取し、肉眼的、組織学的に移植細胞の局在、分布、腫瘍形成の有無について検討を行った。組織学的なヒトＤＦＡＴの同定はＱＴｒａｃｋｅｒによる蛍光および抗ＨＬＡ抗体（市販）による免疫染色で行った。
（２）試験結果  
虚血組織内では移植１ヶ月、正常筋組織では移植１５日後までは移植部位を中心にＤＦＡＴが検出された。一方、虚血組織内では移植２ヶ月、正常筋組織では移植１ヶ月後からは移植したＤＦＡＴはほとんど検出されなくなり、その後も検討した全ての組織において、細胞の増殖性変化や腫瘍形成などの有害事象は認められなかった。
【産業上の利用可能性】
【００２６】
本発明によれば、ヒト成熟脂肪細胞から調製されるヒト脱分化脂肪細胞（ヒトＤＦＡＴ）を利用することで、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）などの虚血性疾患に対する細胞治療方法を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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