(57)【要約】      （修正有）【課題】テトラスパニン-2（TSPAN2)を利用した糖尿病の予防又は治療用組成物と糖尿病治療剤スクリーニング方法の提供。【解決手段】TSPAN2タンパク質の発現又は活性抑制剤を有効成分として含む糖尿病の予防又は治療用薬学的組成物と（ａ）試験物質をTSPAN2遺伝子を発現する細胞に接触させる段階；（ｂ）前記細胞と試験物質を接触していない対照群細胞においてTSPAN2遺伝子発現水準を測定する段階；及び（ｃ）対照群細胞と比較してTSPAN2遺伝子発現水準を減少させる試験物質を糖尿病治療剤候補物質に選別する段階を含む糖尿病治療剤スクリーニング方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
テトラスパニン-2（TSPAN2）タンパク質の発現又は活性抑制剤を有効成分として含む糖尿病の予防又は治療用薬学的組成物。
【請求項２】
前記糖尿病は第１型糖尿病、第２型糖尿病及び妊娠性糖尿病からなる群より選ばれたことを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記TSPAN2タンパク質は配列番号１乃至配列番号３からなる群より選ばれたいずれか一つの配列で表示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項４】
前記TSPAN2タンパク質発現抑制剤はTSPAN2 mRNAに相補的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド(antisense oligonucleotide)、siRNA、shRNA、miRNA、ribozyme、DNAzyme及びPNA(protein nucleic acid)からなる群より選ばれたいずれか一つであることを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項５】
前記TSPAN2 mRNAは配列番号４乃至配列番号６からなる群より選ばれた、いずれか一つの配列で表示される塩基配列を含むことを特徴とする請求項４記載の組成物。
【請求項６】
前記TSPAN2 mRNAに相補的に結合するsiRNAは配列番号７乃至配列番号33からなる群より選ばれたいずれか一つの配列で表示される塩基配列を含むことを特徴とする請求項４記載の組成物。
【請求項７】
前記TSPAN2タンパク質活性抑制剤はTSPAN2タンパク質に特異的に結合する化合物、ペプチド、ペプチド類似体(mimeties)、アプタマー、抗体、天然抽出物及び合成化合物からなる群より選ばれたいずれか一つであることを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項８】
（ａ）試験物質をTSPAN2遺伝子を発現する細胞に接触させる段階；
（ｂ）前記細胞と試験物質を接触していない対照群細胞においてTSPAN2遺伝子発現水準を測定する段階；及び
（ｃ）対照群細胞と比較してTSPAN2遺伝子発現水準を減少させる試験物質を糖尿病治療剤候補物質に選別する段階を含む糖尿病治療剤スクリーニング方法。
【請求項９】
前記TSPAN2遺伝子を発現する細胞は膵臓β細胞(pancreatic βcell)又は膵臓β細胞から由来した細胞であることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記TSPAN2遺伝子発現水準の測定はTSPAN2 mRNA又はタンパク質発現水準を測定することを特徴とする請求項８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、テトラスパニン-2を利用した糖尿病の予防又は治療用組成物と糖尿病治療剤スクリーニング方法に関するもので、より詳細にはテトラスパニン-2(TSPAN2)タンパク質の発現又は活性抑制剤を有効成分として含む糖尿病の予防又は治療用薬学的組成物と、（ａ）試験物質をTSPAN2遺伝子を発現する細胞に接触させる段階；（ｂ）前記細胞と試験物質を接触していない対照群細胞においてTSPAN2遺伝子発現水準を測定する段階；及び（ｃ）対照群細胞と比べてTSPAN2遺伝子発現水準を減少させる試験物質を糖尿病治療剤候補物質に選別する段階を含む糖尿病治療剤スクリーニング方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
糖尿においてグルコース毒性は、β-細胞の細胞死滅を引き起こし、膵臓を含む多様な臓器システムに影響を及ぼす。しかしながら、基本的なメカニズムは完全に知られてはいない。β-細胞の障碍及び損傷したインシュリン生産は糖尿の典型的な特徴であるが(Xu,G et al.,Nat.Med.19,1141-1146.2013)、糖尿病の急速な拡散にも拘らず、β細胞の細胞死滅を引き起こすグルコース毒性の正確な分子的メカニズムは依然として知られていなかった(Chen,J et al.,Diabetes 57,938-944.2008)。
【０００３】
テトラスパニン(tetraspanin)は４個の膜貫通(transmembrane)ドメインで構成された膜タンパク質であって、殆ど全ての動物細胞から発見される。さらに、テトラスパニンは細胞成長、接着及び分化を含む根本的な細胞学的過程に関連されている(Todd,S.C et al.,Biochim.Biophys.Acta.1399,101-104,1998;Maecker,H.T et al.,FASEB J．11，428-442,1997)。テトラスパニンのファミリーメンバーは高度に保存されたアミノ酸配列を有する傾向がある(Hemler,M.E et al.,J.Cell Biol.155,1103-1107.2001)。しかしながら、テトラスパニン-2の機能及び発現に対して未だに本格的な研究がなされていない。
【０００４】
細胞死滅は特化された細胞内信号伝達が活性化されて細胞を消滅させることで、体内で自然的に起こる過程である。これは組織で細胞個体数を維持するための恒常性メカニズムでもある。不適切な細胞死滅は根本的に虚血性損傷、自己免疫疾患及び多くの種類のガンのような代謝性ストレス、神経退行性疾患、グルコース毒性を含む多様な病理現象から共通的に現れる(Elmore,S et al.,Toxicol.Pathol.35,495-516.2007)。c-JunプロモーターにC-Junとβ-catenin/TCF4の結合はJNK活性に依存する。そこで、この複合体の一つの役割は細胞維持、増殖、分化、細胞死滅に関与することであって、この信号の下向調節はガン発生に寄与する(Saadeddin,A et al.,Mol.Cancer Res.7,1189-1196.2009)。JNKは脊椎動物の腸胚形成(gastrulation)で収斂する拡張運動を調節するために、Wnt代謝過程に作用する(Yamanaka,H et al.,EMBO Rep.3,69-75.2002)。さらに、JNKは核内のβ-catenin蓄積を抑制し、Xenopus胚芽で軸形成を調節する（Liao,G et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103,16313-16318.2006）。β-cateninは細胞内で前躯細胞死滅機能を有しているBCL2に媒介されたＸタンパク質(Bax)を抑制することにより、腎臓上皮細胞の生存を向上させる（Wang,Z et al.,J.Am.Soc.Naphrol.20,1919-1928.2009)。
【０００５】
グルコース毒性がβ細胞の機能障碍と細胞死滅に及ぼす効果は詳しく研究されたにも拘らず、グルコース毒性の正確な分子的メカニズムは明らかにされていない。JNK/β-catenin信号伝達系の調節により、グルコース毒性で誘導された膵臓β細胞の細胞死滅は理解されないまま残っている。これにより、膵臓β細胞の細胞死滅においてTSPAN2に連関されたJNK/β-catenin信号伝達系の役割を究明して糖尿病の病理現象に対する理解を高めて新たなメカニズムの糖尿病治療剤候補を発掘する必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
これに、本発明者らは、TSPAN2が膵臓β細胞において高血糖条件でJNKリン酸化を増加させ、β-cateninの核内移動を抑制することにより、caspase-3による細胞死滅を促進させる機能があることを確認して本願発明を完成した。
【０００７】
従って、本発明の目的は、
テトラスパニン-2(TSPAN2)タンパク質の発現又は活性抑制剤を有効成分として含む糖尿病の予防又は治療用薬学的組成物を提供することである。
【０００８】
本発明の他の目的は、
（ａ）試験物質をTSPAN2遺伝子を発現する細胞に接触させる段階；
（ｂ）前記細胞と試験物質を接触していない対照群細胞でTSPAN2遺伝子発現水準を測定する段階；及び
（ｃ）対照群細胞と比べてTSPAN2遺伝子発現水準を減少させる試験物質を糖尿病治療剤候補物質に選別する段階を含む糖尿病治療剤スクリーニング方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記のような目的を達成するため、本発明は
テトラスパニン-2タンパク質の発現又は活性抑制剤を有効成分として含む糖尿病の予防又は治療用薬学的組成物を提供する。
【００１０】
本発明の他の目的を達成するため、本発明は、
（ａ）試験物質をTSPAN2遺伝子を発現する細胞に接触させる段階；
（ｂ）前記細胞と試験物質を接触しない対照群細胞でTSPAN2遺伝子発現水準を測定する段階；及び
（ｃ）対照群細胞と比べてTSPAN2遺伝子発現水準を減少させる試験物質を糖尿病治療剤候補物質に選別する段階を含む糖尿病治療剤スクリーニング方法を提供する。
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１２】
本発明はテトラスパニン-2タンパク質の発現又は活性抑制剤を有効成分として含む糖尿病の予防又は治療用薬学的組成物を提供する。
【００１３】
本発明で“治療”とは、疾患の発生又は再発抑制、症状の悪化、疾病の直接又は間接的な病理学的結果の減少、疾病進行速度の減少、疾病状態の改善、好転、緩和又は改善された予後を意味する。本発明で使用される用語“予防”とは、疾患の発病を抑制するか又は進行を遅延させる全ての行為を意味する。
【００１４】
“タンパク質”は“ポリペプチド”又は“ペプチド”と亙換性あるように使用され、例えば、自然状態のタンパク質から一般的に発見されるようにアミノ酸残基の重合体を意味する。
【００１５】
本発明で“ポリヌクレオチド”又は“核酸”は単一又は二重筋の形態でなされたデオキシリボ核酸(deoxyribonucleic acid, DNA)又はリボ核酸(ribonucleic acid, RNA)を意味する。他に制限が無い限り、自然的に生成されるヌクレオチドと類似した方法により核酸に混成化される自然的ヌクレオチドの公知のアナログも含まれる。一般的に、DNAはアデニン(adenine,A)、グアニン(guanine,G)、シトシン(cytosine,C)、チミン(thymine,T)等４種の塩基で構成されており、DNAはチミンの代わりにウラシル(Uracil,U)を有している。核酸二重筋においてＡはＴ又はＵ、ＣはＧ塩基と水素結合をなすが、このような塩基の関係を“相補的(comlementary)”と称す。
【００１６】
一方、“mRNA(messenger DNA又は伝令RNA)”はタンパク質合成過程で特定遺伝子の塩基配列の遺伝情報リボソム(ribosome)に伝達してポリペプチド合成（タンパク質翻訳、translation)の青写真の役割をするRNAである。遺伝子を鋳型にして、単一筋のmRNAが転写(transcription)過程を通じて合成される。
【００１７】
本発明で治療又は予防の対象である“糖尿病”は膵臓のβ細胞から生成されるインシュリンホルモン不足又はインシュリン抵抗性の異常と、さらには、このような２種の全ての欠陥により発生する高血糖を特徴とする代謝障碍症候群である。このような糖尿病はインシュリン依存型糖尿病(IDDM, 第１型)とインシュリン抵抗及びインシュリン分泌損傷により発生するインシュリン非依存型糖尿病(NIDDM, 第２型)に区分できる。第１型と第２型糖尿病全てから心臓疾患、腸疾患、眼科疾患、神経疾患、脳卒中などのような多様な合併症が発生するが、これは長時間血糖とインシュリン水準が上昇して慢性神経疾患と心血管疾患が発生するようになり、短時間の低血糖と高血糖反応により、急性合併症を引き起こすことになる。糖尿病は高血糖が慢性に持続されながら、糖質代謝ばかりでなく脂質及びタンパク質代謝障碍も共に引き起こす。その病態は多様であり、直接高血糖に起因するものに、網膜、腎臓、神経、心血管系などで糖尿病性末梢神経障碍、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、糖尿病性白内障、角膜症、糖尿病性動脈硬化性などがある。
【００１８】
糖尿病を引き起こし、深化させる重要な病理現象の一つは高血糖による膵臓β細胞の死滅である。本発明者らは、血糖が高くなった状態で膵臓を始め、多様な臓器に影響を及ぼすグルコース毒性において、テトラスパニン-2がヒトの膵臓β細胞において、JNK/β-catenin信号体系を調節して細胞死滅を促進する役割をすることを糾明した。従って、テトラスパニン-2タンパク質の発現又は活性を抑制することにより、グルコース毒性による膵臓、特にβ細胞の死滅を防止して糖尿病の発生又は進行を抑制できることを理解できる。これにより、本発明における糖尿病はグルコース毒性により誘発される糖尿病又は深化又は進行された糖尿病であればその対象になることができ、より具体的には第１型糖尿病、第２型糖尿病及び妊娠性糖尿病からなる群より選ばれたものでもある。
【００１９】
前記“テトラスパニン-2”はtransmembrane 4 superfamily又はtetraspanin familyに属するタンパク質で、特徴的な４個の疎水性ドメインを有する膜タンパク質であって、細胞発達、活性化、成長及び運動性に重要な役割を担う。ヒトのテトラスパニン-2は染色体1p13.2に位置して、約８個のエキソンつでなされている。NET3,TSN2,TSPAN2,TSPAN-2などとも知られており、３個の主要な同形(isoform)が知られている。
【００２０】
本発明におけるTSPAN2タンパク質は哺乳類から由来したものでもあって、好ましくはヒトから由来したものである。最も好ましくは本発明におけるTSPAN2タンパク質は配列番号１で表示されるヒトのTSPAN2 isoform 1(NP-005716.2)。配列番号２で表示されるヒトのTSPAN2 isoform 2(NP-001295244.1)。さらに、配列番号３で表示されるヒトのTSPAN2 isoform 3(NP-001295245.1)の中で選ばれたいずれか一つのアミノ酸配列を含むことを特徴とする（括弧内はNCBI Genbank accession number)。
【００２１】
前記TSPAN2タンパク質の発現抑制剤はTSPAN2 mRNAに相補的に結合するアンティセンスオリゴヌクレオチド(antisense oligonucleotide)、siRNA，shRNA，miRNA、ribozyme,DNAzyme及びPNA(protein nucleic acid)からなる群より選ばれたいずれか一つでもある。さらに、前記TSPAN2 mRNAは最も好ましくは配列番号４で表示されるヒトのTSPAN2 mRNA transcript variant 1(NM-005725.5)、配列番号５で表示されるヒトのTSPAN2 mRNA transcript variant 2(NM-001308315.1)、さらに、配列番号６で表示されるヒトのTSPAN2 mRNA transcript variant 3(NM-001308316.1)の中で選ばれたいずれか一つの塩基配列を含むことである（括弧内はNCBI Genbank accession number)。前記のヒトのTSPAN2 mRNA transcript variantなどのcoding region(exon)などの特徴事項は括弧内に記載されたGenbank accession numberでNCBIデータベースを検索して出て来る配列情報から確認される。
【００２２】
さらに、本発明に伴うTSPAN2タンパク質発現抑制剤は好ましくは、TSPAN2 mRNAに相補的に結合してmRNAの分解を誘発するsiRNAでもある。前記TSPAN2に対するsiRNAは具体的には、配列番号７乃至配列番号33からなる群より選ばれるいずれか一つの塩基配列を含むことでもある。
【００２３】
前記“siRNA(small interfering RNA又はshort interfering RNA又はsilencing RNA)”は細胞内に人為的に導入されて特定遺伝子mRNAの分解を誘導してタンパク質翻訳が起らないようにすることにより、遺伝子発現を抑制するRNA干渉現象を引き起こす短い二重筋のRNAである。siRNAは通常、標的mRNAの特定部位に相補的な20乃至25個のヌクレオチドで構成されている。細胞内でsiRNAの二重筋の内、標的mRNAに相補的な筋(antisense strand)がRISC(RNA-induced silencing complex)タンパク質複合体と結合して標的mRNAに結合して、RISC複合体内のargonauteタンパク質が標的mRNAを切断して分解させるか、又はタンパク質翻訳に重要なタンパク質とリボソムがmRNAと結合することを抑制する等の機作により特定遺伝子の発現を抑制する。
【００２４】
本発明によるsiRNAはオリゴヌクレオチドの生体内安定性向上、核酸分解酵素抵抗性付与及び非特異的免疫反応減少のための多様な変形を加えたものでもある。前記オリゴヌクレオチドの変形は一つ以上のヌクレオチド内の糖構造の2'炭素位置でOH基が-CH3（メチル）、-OCH3(methoxy)、-NH2、-F、-0-2-メトキシエチル、-0-プロピル、-O-2-メチルチオエチル、-0-3-アミノプロピル、-0-3-ジメチルアミノプロピル、-O-N-メチルアセトアミド又は-0-ジメチルアミドオキシエチルへの置換による変形；ヌクレオチド内糖構造内の酸素が硫黄に置換された変形；又はヌクレオチド結合のホスホロチオエート(phosphorothioate)又はボラノホスフェート(boranophosphate)、メチルホスホナート(methyl phosphonate)結合への変形から選ばれた一つ以上の変形が組合わされて使用することができ、PNA(peptide nucleic acid)、LNA(locked nucleic acid)又はUNA(unlocked nucleic acid)形態への変形も使用可能である。
【００２５】
前記TSPAN2タンパク質活性抑制剤はTSPAN2タンパク質に特異的に結合する化合物、ペプチド、ペプチド類似体(mimetics)、アプタマー、抗体、天然抽出物及び合成化合物からなる群より選ばれたいずれか一つでもある。
【００２６】
本発明に伴う薬学的組成物は糖尿病治療の為、薬学的に許容される担体と共に、当業界に公知の方法により投与経路によって多様に剤形化できる。前記担体には全ての種類の溶媒、分散媒質、水中油又は油中水エマルジョン、水性組成物、リポソム、マイクロビード及びミクロゾームが含まれる。
【００２７】
前記本発明に伴う薬学的組成物は薬学的に有効な量、つまり糖尿病を予防するか又は症状を緩和して治療に十分な量で患者に投与できる。例えば、一般的な１日の投与量では約0.01乃至1000mg/kgの範囲で投与することができて、好ましくは、約１乃至100mg/kgの範囲で投与することがでる。本発明の薬学的組成物は好ましい投与量範囲内で１回又は数回に分割投与することがでる。さらに、本発明に伴う薬学的組成物の投与量は投与経路、投与対象、年齢、性別、体重、個人差及び疾病状態によって通常の技術者が適切に選択できる。
【００２８】
投与経路は経口的又は非経口的に投与できる。非経口的な投与方法には、これに制限はされないが、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、境膜内、心臓内、経皮、皮下、腹腔内、鼻孔内、腸管、局所、舌下又は直腸内投与でもある。
【００２９】
本発明の薬学的組成物を経口投与する場合、適合した経口投与用担体と共に当業界に公知の方法により、粉末、顆粒、錠剤、丸剤、糖衣錠剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、懸濁液、ウェファーなどの形態で剤形化できる。適合した担体の例には、ラクトース、デキストロス、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、及びマルチトールなどを含む糖類と、トウモロコシでん粉、小麦でん粉、お米でん粉及びジャガ芋でん粉どを含むでん粉類、セルロース、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース及びヒドロキシプロピルメチルセルロースなどを含むセルロース類、ゼラチン、ポリビニルピロリドンなどのような充填剤が含まれる。さらに、場合によっては、架橋結合ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸又はナトリウムアルギナートなどを崩解剤として添加できる。さらには、前記薬学的組成物は抗凝集剤、潤滑剤、香料、乳化剤及び防腐剤などを追加して含むことができる。
【００３０】
さらに、非経口的に投与する場合、本発明の薬学的組成物は適合した非経口用担体と共に注射剤、経口投与剤及び鼻孔吸込み剤の形態で当業界に公知の方法により剤形化できる。前記注射剤の場合には必ず滅菌しなければならず、バクテリア及び眞菌真菌のような微生物の汚染から保護されなければならない。注射剤の場合、適合した担体の例には、これに限定はされないが、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコール等）、これら混合物及び／又は植物油を含む溶媒又は分散媒質でもある。より好ましくは、適合した担体にはハンクス溶液、リンゲル溶液、トリエタノールアミンが含まれたPBS(phosphate buffered saline)又は注射用滅菌水、10% エタノール、40% プロピレングリコール及び5% デキストロースのような等張溶液などを使用できる。前記注射剤を微生物汚染から保護するためには、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどのような多様な抗菌剤及び抗眞菌剤を追加して含むことができる。さらに、前記注射剤は殆どの場合、糖又はナトリウムクロライドのような等張化剤を追加して含むことができる。
【００３１】
経皮投与剤の場合、軟膏剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、外用液剤、パスター剤、リニメント剤、エアロゾル剤どの形態が含まれる。前記にて“経皮投与”とは、薬学的組成物を局所的に皮膚に投与して薬学的組成物に含有された有効な量の活性成分が皮膚内伝達されることを意味する。例えば、本発明の薬学的組成物を注射型の剤形に製造してこれを30ケージの細い注射針で皮膚を軽く短刺(prick)するか、又は皮膚に直接的に塗布する方法によりで投与することができる。これらの剤形は製薬化学に一般的に、公知の処方箋の文献(Remington's Pharmaceutical Science,15th Edition,1976,Mack Publishing Company,Easton,Pennsylvania)に記述されている。
【００３２】
吸込み投与剤の場合、本発明により使用される化合物は適合した推進剤、例えば、ジクロロフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロメタン、二酸化炭素又は他の適合した気体を使用し、加圧パック又は煙霧機からエアロゾルスプレー形態で便利に伝達できる。加圧エアロゾルの場合、投薬単位は計量された量を伝達するバルブを提供して決定できる。例えば、吸い込み器又は取入れ器に使用されるゼラチンカプセル及びカートリッジは化合物及びラクトース又は澱粉のような適合した粉末基剤の粉末混合物を含有するように剤形化することができる。
【００３３】
その他の薬学的に許容される担体には下記の文献に記載されているものを参考にできる(Remington's Pharmaceutical Science,19th ed.,Mack Publishing Company,Easton,PA,1995)。
【００３４】
本発明に伴う薬学的組成物は一つ以上の緩衝剤（例えば、食塩水又はPBS)、カーボハイトレートー（例えば、グルコース、マンノス、スクロース又はデキストラン）、抗酸化剤、静菌剤、キレート化剤（例えば、EDTA又はグルタチオン）、アジュバント（例えば、アルミニウムヒドロキサイド）、懸濁剤、濃厚剤及び／又は保存剤を追加して含むことができる。
【００３５】
さらに、本発明の薬学的組成物は哺乳動物に投与された後、活性成分の迅速、遅速又は遅延された放出を提供できるように当業界に公知の方法を使用して剤形化することができる。
【００３６】
さらに、本発明の薬学的組成物は単独で投与するか、又は膵臓細胞を保護して糖尿病治療の効果がある公知の化合物と併用して投与できる。
【００３７】
さらに、本発明は
（ａ）試験物質をTSPAN2遺伝子を発現する細胞に接触させる段階；
（ｂ）前記細胞と試験物質を接触していない対照群細胞においてTSPAN2遺伝子発現水準を測定する段階；及び
（ｃ）対照群細胞と比べてTSPAN2遺伝子発現水準を減少させる試験物質を糖尿病治療剤候補物質に選別する段階を含む糖尿病治療剤スクリーニング方法を提供する。
【００３８】
前記（ａ）段階は分析の対象である試験物質がTSPAN2遺伝子の発現を抑制する活性があるかを確認するため、TSPAN2遺伝子を発現する細胞に接触させる段階である。
【００３９】
本発明の方法において、“接触”とは、一般的な意味であって、２個以上の製剤（例えば、２個のポリペプチド）を結合させるか、又は製剤と細胞（例えば、タンパク質と細胞）を結合させることを意味する。接触は試験管内で起り得る。例えば、試験管又は他のコンテナーにおいて２個以上の製剤を結合させるか、又は試験製剤と細胞又は細胞溶解物と試験製剤を結合させることである。さらに、接触は細胞又はインシチュー(in situ)で起ることもある。例えば、２個のポリペプチドを符号化する再組合わせポリヌクレオチドを細胞内で共同発現させることにより、細胞又は細胞溶解物において２個のポリペプチドを接触させることである。さらに、テストしようとするタンパク質が固定状の表面に配列されたタンパク質チップ又はタンパク質アレイを利用することもできる。
【００４０】
さらに、本発明の方法において“試験物質”とは、試験製剤又は製剤と互換可能に使用できるもので、任意の物質、分子、元素、化合物、実在物(entity)又はこれらの組合わせを含む。例えば、タンパク質、ポリペプチド、低分子有機化合物、多糖類、ポリヌクレオチドなどを含む。さらに、自然産物、合成化合物又は化学化合物又は２個以上の物質の組合わせでもある。
【００４１】
より具体的に本発明の方法でスクリーニングできる試験製剤は、ポリペプチド、ベータターン誘導体(beta-turn mimetics)、多糖類、燐脂質、ホルモン、プロスタグランジン、ステロイド、芳香族化合物、ヘテロサイクリック化合物、ベンゾジアゼピン、オリゴメリックＮ置換グリシン(oligomeric N-substituted glycines)、オリゴカルバメート、糖類、脂肪酸、ピューリン、ピリミジン又はこれらの誘導体、構造的アナログ又はこれらの組合わせを含む。試験製剤は合成物質又は天然物質でもある。前記試験製剤は合成又は自然化合物のライブラリーを含む広範囲で多様な出処から得られる。組み合わせライブラリーはステップバイステップ方式で合成できる多様な種類の化合物に生産できる。多数の組み合わせライブラリーの化合物はESR(encoded synthetic libraries)方法(WO 95/12608,WO93/06121,WO94/08051,WO95/395503及びWO95/30642)により製造することができる。ペプチドライブラリーはファージディスプレー方法(WO91/18980)により製造できる。バクテリア、黴、植物及び動物抽出物形態の自然化合物のライブラリーは産業的な出処から得られるか、又はフィールドで収集することができる。公知の薬理学的製剤が構造的アナログを製造する為、アシル化、アルキル化、エステル化反応、アミド化反応のように指示又は無作為な化学的数式に適用できる。
【００４２】
前記試験製剤は自然的に生成されるタンパク質又はこれの断片でもある。このような試験製剤は自然出処、例えば、細胞又は組織溶解物から収得できる。ポリペプチド製剤のライブラリーは例えば、通常的な方法により生成されか、又は産業的に入手できるcDNAライブラリーから収得できる。前記試験製剤はペプチド、例えば、約5〜30個、好ましくは約5〜20個、より好ましくは約7〜15個のアミノ酸を有するペプチドでもある。前記ペプチドは自然的に生成されるタンパク質、ランダムペプチド又は“バイアス(biased)”ランダムペプチドの切断物でもある。さらに、前記試験製剤は核酸でもある。核酸試験製剤は自然的に生成される核酸、ランダム核酸、又は“バイアス”ランダム核酸でもある。例えば、原核又は眞核ゲノムの伝達物を上記記載と類似するように使用することができる。
【００４３】
さらに、前記試験製剤は小分子(small molecule;例えば、約1,000Da以下の分子量を有する分子）でもある。小分子の調節製剤をスクリーニングするための方法には、好ましくは高速分析アッセイ(high throughput assay)が適用できる。多くのアッセイが前記スクリーニングに有用である(Shultz, Bioorg. Med. Chem. Lett., 8:2409-2414, 1998; Weller, Mol. Drivers., 3:61-70, 1997; Fernandes, Curr. Opin. Chem. Biol., 2:597-603, 1998; and Sittampalam, Curr. Opin. Chem. Biol., 1:384-91, 1997）。
【００４４】
本明細書で“発現”とは、細胞からタンパク質又は核酸が生成されることを意味する。前記TSPAN2を発現する細胞はTSPAN2を内在的に発現する細胞でもあり、TSPAN2をコードするポリヌクレオチドを含む再組み合わせ発現ベクターで形質転換されて、TSPAN2を過発現する細胞でもある。好ましくは前記TSPAN2遺伝子を発現する細胞は膵臓β細胞又は膵臓β細胞から由来した細胞でもある。本発明者らは、TSPAN2を内在的に発現する細胞として、ヒトの膵臓β細胞から由来したRNAKT-15細胞株を使用したことがある。
【００４５】
前記（ｂ）段階は試験物質を接触させたTSPAN2を発現する細胞と試験物質を接触させていないTSPAN2を発現する細胞からTSPAN2の遺伝子発現水準を測定する段階である。
【００４６】
前記TSPAN2の遺伝子発現水準を測定する方法は、TSPAN2のmRNA又はタンパク質水準を測定して実施できる。
mRNA発現の測定は当業界で通常的な発現水準確認方法を制限無く使用することができて、分析方法の例には逆転写重合体連鎖反応(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)、競争的RT-PCR(competitive RT-PCR)、実時間RT-PCR(real-time RT−PCR)、RNase保護分析法(RNase protection assay, RPA)、ノーザンブロッティング、(northern blotting)、DNAマイクロアロイチップ(microarray chip)、RNA塩基配列分析などがあるがこれらに限定されない。
【００４７】
さらに、タンパク質の発現水準測定方法は、当業界に公知の方法は制限なく使用することができ、その例にはウエスタンブロッティング(western blotting)、ドトブロッティング(dot blotting)、酵素免疫分析法(enzyme-linked immunosorbent assay)、放射能免疫分析法(RIA)、放射免疫拡散法、オオクテロニ免疫拡散法、ロケット免疫電気泳動、免疫組織化学染色、免疫沈殿法、補体固定分析法、流細胞分析法(FACS)又はタンパク質チップ方法などがあるが、これらに限定されるのではない。
【００４８】
前記（ｃ）段階は対照群細胞と比べてTSPAN2遺伝子の発現水準を減少させる試験物質を糖尿病治療剤候補物質に選別する段階である。
【００４９】
本発明者らが究明した通り、TSPAN2は高血糖状態で膵臓β細胞の細胞死滅を促進する役割をする。従って、TSPAN2の遺伝子の発現水準を減少させる試験物質はTSPAN2のタンパク質水準及びタンパク質の活性水準を落して膵臓β細胞からグルコース毒性で誘発される細胞死滅を防止して、従って、これにより誘発される糖尿病を遅延又は症状を緩和できることが分る。
【発明の効果】
【００５０】
従って、本発明はテトラスパニンー２(TSPAN2)タンパク質の発現又は活性抑制剤を有効成分として含む糖尿病の予防又は治療用薬学的組成物と、TSPAN2遺伝子発現水準を減少させる試験物質を糖尿病治療剤候補物質に選別する糖尿病治療剤スクリーニング方法を提供する。TSPAN2膵臓β細胞において高血糖条件でJNKリン酸化を増加させ、β-cateninの核内移動を抑制することにより、caspase-3による細胞死滅を促進させる役割をする。逆にTSPAN2の発現を抑制するなどでTSPAN2の活性を下げると、高血糖による細胞死滅を抑制して膵臓β細胞を保護する効果がある。このような機作を基にTSPAN2の発現又は活性を抑制する製剤をスクリーニングして抗糖尿病候補物質を選別することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】図１はグルコース刺戟に反応する遺伝子を確認するためのmicroarrayを利用したgene ontology分析結果を示す。NG又はHG条件で48時間培養したRNAKT-15細胞において２倍上向調節(図１A)又は下向調節(図１B)された遺伝子のリストはgene ontology分析のためのDAVIDで製作した。
【図２】図２は細胞死滅関連遺伝子とグルコース刺戟に反応する階層的クラスタリング(hierarchial clustering)分析結果を示す。赤色と緑色は発現水準が２倍以上変化した遺伝子を示す。
【図３】図３はNG又はHG条件下で培養したRNAKT-15細胞においてTSPAN2の発現水準を確認するmicroarray結果(図３A)、タンパク質の発現水準を確認するウエスタンブロット(図３B)とmRNA発現水準を確認するRT-PCR結果(図３C)を示す。
【図４】図４はNG又はHG条件下で培養したRNAKT-15細胞のAnnexinV染色結果(図４A)とcaspase-3、cleaved caspase-3、Baxのタンパク質水準の変化(図４B)、さらに、ウエスタンブロット結果(図４C)を示す。図４のＢで“＊＊＊”表示は統計的に有意な差を示す。
【図５】図５はHG条件又はTSPAN2を過発現させたRNAKT-15細胞においてp-JNK、JNK、caspase-3、cleaved caspase-3、Bcl-2、t-Bid、Bax、PARP、cleaved PARP、β-cateninのタンパク質の水準を確認するウエスタンブロット(図５A)とタンパク質の発現水準比較(図５B)を示す。図５のＢで“＊＊＊”表示は統計的に有意な差を示す。
【図６】図６はHG条件又はTSPAN2の発現をsiRNAで抑制させたRNAKT-15細胞においてE-cadtherin、TSPAN2、β-catenin、n-β-catenin、Baxのタンパク質の水準を確認するウエスタンブロット(図６A)とタンパク質の発現水準比較(図６B)を示す。図６のＢで“＊＊＊”表示は統計的に有意な差を示す。
【図７】図７はHG条件でRNAKT-15細胞においてβ-cateninの核内移動にDKK1が及ぼす影響を確認する蛍光顕微鏡写真である。si-DKK1はDKK1の発現を抑制するためのsiRNAである。青色はDAP1、緑色はβ-cateninタンパク質を示す。
【図８】図８はHG又はSP600125条件におけるRNAKT-15細胞においてDKK1、p-JNK、JNKのタンパク質発現水準を確認するウエスタンブロット(図８A)とタンパク質発現水準比較(図８B)を示す。図８のＢで“＊＊＊”表示は統計的に有意な差を示す。
【図９】図９はTSPAN2がβ-cateninの核内移動に及ぼす影響を確認するための実験であって、HG、TSPAN2過発現、又はHGとsi-DKK1処理したRNAKT-15細胞においてnuclearβ-catenin(N-β-catenin)、全体β-catenin、p-Akt、Aktのタンパク質水準を確認するウエスタンブロット(図９A)とタンパク質の発現水準比較(図９B)を示す。図９のＢで“＊＊＊”表示は統計的に有意な差を示す。
【図１０】図10はTSPAN2がJNK/β-cateninに及ぼす影響を確認するための実験であって、HG、si-TSPAN2、SP600125、si-β-catenin処理条件の多様な組合わせで刺戟したRNAKT-15細胞におけるE-cadherin、p-β-catenin、n-β-catenin、TSPAN2、p-JNK、JNK、Baxのタンパク質水準を確認するウエスタンブロット(図10A)とタンパク質発現水準比較(図10B)を示す。図10のＢで“＊＊＊”表示は統計的に有意な差を示す。
【図１１】図11はNG又はHG条件、さらに、HG条件でsi-TSPAN2で１日又は２日間TSPAN2の発現を抑制したRNAKT-15細胞において細胞死滅を確認するためのPI染色の流細胞分析結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
以下、本発明を詳細に説明する。
ただし、下記実施例は本発明を例示するのみであり、本発明の内容は下記実施例に限定されない。
【００５３】
<実験方法>
細胞培養
ヒトの膵臓β細胞株のRNAKT-15細胞をカチョン大学で得た。5mMグルコース、10% FBS、1% ベニシリンーストレプトマイシン、10mMニコチナマイド(nicotinamide)、10μMトログリタゾン(troglitazone)及び16.7μM硫酸亜鉛を含有するDMEMを利用して、37℃、5% CO2条件で培養した。48時間33mMグルコースを処理してグルコース毒性(glucose toxicity)を誘導した。その後10μMJNK抑制剤を48時間処理した。
【００５４】
マイクロアレイ分析
ヒトの全体遺伝体マイクロアレイは転写プロファイル分析のため使用される。対照群及び試験RNAに対して製造社指針に従い、Low RNAキット（LOW RNA Onput Linear Amplification kit, Agilent）を使用して標的RNAプロブ及びhybridizationの合成を実施した。簡略に各サンプルから抽出した1μg total RNAをT7プロモータープライマーミクス(promoter primer mix)と混合した後、10分間65℃で反応させた。5×first stand buffer、0.1M DTT,10mM dNTP mix,RNase-OutからなるcDNAマスタミクスを反応混合物に追加後、40℃で２時間反応させた。dsDNA合成は15分間65℃で反応させて終了した。２時間40℃で反応させて、dsDNA反応サンプルに転写マスターミクスを添加してdsDNA転写を実施した。増幅標識されたcDNAを製造社の指針に従いcRNA Cleanup Module(Agilent)を使用して精製し、標識されたcRNAはND-100スペクトロメータを使用して定量した。cRNAに10×blocking agentと25×fragmentation bufferを添加した後、30分間60℃で反応して断片化させた。断片化されたcRNAは2×混成化バッファーに再分散し、マイクロアレイに直接ピペッティングで集積した。Agilet Hybridization Oven(Agilent)を使用して65℃で17時間アレイを混合した。製造社の指針に従い混合されたマイクロアレイを洗浄して、前記に記載された通り、蛍光イメージを定量化及び標準化した。マイクロアレイのデータはGene Expression Omnibus database(GEO assession number GSE76189)に提出した。
【００５５】
データの分析
混合されたイメージはAgilent DNA microarray scannerを使用してスキャンして、Feature Extraction softwareを使用して定量した。遺伝子発現水準の変化のデータ標準化及び決定はGene-SpringGX7.3(Agilent)を使用して実施した。簡単に標準化された数値の平均は標準化された対照群チャンネル頻度(normalized signal channel intensity)の平均で標準化された信号チャンネル頻度（normalized control channel intensity)の平均を分けることで計算した。遺伝子の機能的注釈はGeneSpringGX 7.3と共に、Gene Ontology Consortiumdata(http://www.geneontology.org/index.shtml)を使用し、遺伝子分類はBioCarta(http://www.biocarta.com/)、GenMAPP(http://www.genmapp.org/)、DAVID(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)、及びMedline databases(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)に登録された事項を基盤にした。
【００５６】
遺伝子オントロジー関連ネットワーク分析
細胞死滅信号、ontology関連した相互作用ネットワークを含むタンパク質と区別して調節された遺伝子らの生物学的機能を検査するため、Ingenuity pathway analysis(http://www.ingenuity.com)を使用して生物情報学遺伝子ネットワーク分析を実施した。Ingenuity pathway 分析は定期的にアップデートされる“ingenuity pathway knowledgebase”を基盤にタンパク質相互作用ネットワークを提供する。そのネットワークは相当に連結されたネットワークを生成するための目的と可能な入力表現プロファイルから多くのタンパク質を含むものと最適化されている。
【００５７】
流細胞分析とAnnexin V染色
細胞死滅を検出するため、annexin V-FLUOS染色キット(Roche)で染色してannexin Vとpropidium iodide(PI)を分析した。48時間正常グルコース(normal glucose, NG, 15mM)と高濃度グルコース(high glucose, HG, 33mM)を処理した細胞をPBSで２回洗浄後収得した。収得した細胞懸濁液を２分間2000gで遠心分離し、15分間室温で0.2mg/ml annexin V蛍光又は1.4mg/mlのPIを処理した。Annexin V検出するための530/30nm band passフィルターと共に488nm刺戟でMoFIo Astrios流細胞分析機で分析した。データはSummit 6.0プログラムを利用して分析した。
【００５８】
細胞核分画
RNAKT-15細胞を２日間HG培地で培養して準備した。細胞を収得して2ml homogenization buffer A(25mM Tris pH7.5,2mM EDTA,0.5mM EGTA,1mM DTT,タンパク質分解酵素抑制剤、1mM PMSF及び0.02% Triton X-100)を添加した後、乳棒と15ml Dounce homogenizerを使用して15回均質化し、3分間100,000gで遠心分離した。上層部細胞質断片を新しいチューブに移して、500μl homogenization buffer B(1% Triton X-100を含有するhomogenization buffer A)をペレットに添加した。ソニーケーションでペレットを再分散し、30分間4℃で培養した。細胞質及び核断片のタンパク質構成物をBCA assay kitを使用して定量後ウエスタンブロット法で分析した。
【００５９】
ウエスタンブロット分析
細胞をprotease inhibitor cocktailを含むRIPA buffer(50mM Tris-HCl,150mM NaCl,1% Nonidet P-40,0.5% sodium deoxycholate,0.1% SDS) を利用して溶解した。細胞溶解物のタンパク質構成物はBCA-protein assay kit(Roche Diagnostics)で定量後、同量のタンパク質を含有する細胞溶解物をSDS-PAGEで分離した。その後、Immobilon NC membranesでタンパク質を移動させた。5% skim milk又は5% BSA(Bovine Serum Albumin)を含むTBSとTween 20溶液で１時間ブロッキングした。TSPAN2(1:1000;Abnova)、GAPDH(1:5000;Santa Cruz Biotechnology)、E-cadherin(1:1000;Cell Signaling Technology)、caspase-3(1:800;Cell Signaling)、 b-catenin(1:1000; Santa Cruz), phosphorylated(p) b-catenin(Ser33/37/Thr41, 1:200; Cell Signaling), JNK(1:1000; Santa Cruz), phosphorylated JNK(p-JNK; 1:500; Santa Cruz), truncated Bid(t-Bid; 1:1000; Santa Cruz), poly(adenosine diphosphate-ribose) polymerase(PARP; 1:2000; SantaCruz), Bax(1:1000 ; Abcam), Akt(1:1000; Cell Signaling), phosphorylated Akt(p-Akt; 1:500; Cell Signaling), B-cell CLL/lymphoma 2(Bcl-2; 1:6000; Cell Signaling), Dickkopf-1(Dkk1; 1:500; Cell Signaling)に対する抗体とプロブを4℃で一夜反応させて、１時間peroxidaseが結合された２次抗体を反応させた。メンブレンをTBSとTween 20で５分ずつ３回洗浄し、chemiluminescence system(Thermo Fisher Scientific)を使用してChemiDoc MP system(Bio-rad)でバンドを観察した。Image Jプログラムを利用してバンドの強さを測定した。
【００６０】
プラスミド、RNA干渉、定量的RT-PCT
TSPAN2プラスミド構成キットは、GenScriptで購入した。一般的な発現ベクターとしてpcDNA 3.1(Invitrogen)を使用し、siRNAはST Pharmで購入した。TSPAN2 siRNAの塩基配列は本明細書における配列目録の配列番号７乃至配列番号33に記載されいる通りである。Dkk1 siRNAの塩基配列は本明細書の配列目録の配列番号34乃至配列番号43に記載されいる通りである。製造社の指針に従いLipofectamine RNAiMAX reagent(Thermo Fisher Scientific)を使用してRNAKT-15細胞にsiRNAで形質転換させた。RT-PCRはNG培地とHG培地で培養した細胞のmRNAの相対的な量を比べるために実施した。製造社の指針に従いSuperscript III reverse transcriptase(Thermo Fisher Scientific)を使用して20μlの総量でRTを実施した。その次に4μlの最終RT product mixでPCR増幅させた。標準としてはGAPDHを使用し、使用したプライマー対の配列は本明細書配列番号目録に記載された通りである。
【００６１】
免疫蛍光染色法
12ウェルプレートにスリーブを入れて、RNAKT-15細胞を4×104 cells/wellの濃度で接種した。24時間後、対照群細胞には48時間の間、高濃度グルコース(HG, 33mM)を処理した。TSPAN2 siRNA(25μg)を処理した細胞は24時間培養した後で、高濃度グルコース(HG, 33mM)を48時間処理した。細胞をPBSで洗浄した後、4% ホルムアルデヒドで15分間固定させた。15分間0.1% Triton X-100を処理した後、3% BSAで１時間ブロッキングした。細胞に１次抗体であるβ-catenin monoclonal purified mouse IgG1(Abnova)を3% BSA溶液1:100に希釈して4℃で一夜反応させた。その後、PBSで５分ずつ５回洗浄した後、暗所に２次抗体FITC anti-mouseを3% BSAに1:200に希釈して１時間反応させた。カバースリーブの細胞のイメージはC-Apochromat 403/1.2 water immersion lens(488nm argon laser/505-550nm detection range)が設けられた共焦点顕微鏡(LSM710; Carl Zeiss GmbH)で獲得した。データはZEN 2009 Light Editionプログラム(Carl Zeiss)を利用して分析した。
【００６２】
統計分析
全ての結果は、最小３回の独立的な実験の平均±標準偏差(means±SD)で表示した。統計的有意性はPrism 5.0プログラム(GraphPad Software)のStudent's t-testで検証し、p≦0.05を統計的有意性の基準にした。
【００６３】
<実施例１>
グルコース濃度に伴う遺伝子の発現量差異
グルコース濃度によって、発現水準が変化する遺伝子を同定するために、マイクロアレイ実験を実施した。
RNAKT-15細胞をそれぞれ正常グルコース(NG)又は高濃度グルコース(HG)の条件で二日間培養してマイクロアレイ方法を通じて遺伝子発現の変化を確認した。
【００６４】
その結果、図１に示した通り、高濃度グルコースを処理したRNAKT-15細胞において、発現水準が上向調節された遺伝子と下向調節された遺伝子が観察された。上向調節された遺伝子らの順位は下記の通りである：炭水化物代謝(carbohydrate metabolism)>細胞周期(cell cycle)>対照群(control)>細胞死滅過程(apoptotic processes)>活性酸素種に対する反応(response to reactive oxygen species)、下向調節された遺伝子らの順位は下記の通りである：細胞内タンパク質輸送(intracellular protein trafficking)>細胞周期(cell cycle)>細胞接着ー媒介信号(cell adheston-mediated signaling)>細胞周期調節(cell cycle control)>活性酸素種に対する反応(response to reactive oxygen species >apoptotic process)。
【００６５】
潜在的に細胞死滅に関連した遺伝子らを分析するため、細胞死滅とNGと比べてHGにおいて２倍以上増加した遺伝子間の連関性を別途分析した(図２)。階層的クルスタリン(hierarchical clustering)で導出された交差点は図２のリストに記載された通りである。さらにはグルコースに反応する遺伝子らの信号伝達体系を分析した結果、細胞死滅関連遺伝子らの発現水準もグルコースにより調節されるものと示された(data not shown)。マイクロアレイ分析はTSPAN2の発現がHG条件で３倍以上増加し、信号伝達ネットワーク分析はTSPAN2が細胞死滅に関連した可能性を提示した。
【００６６】
<実施例２>
高濃度グルコースがTSPAN2発現及び細胞死滅に及ぼす影響
グルコース毒性により誘発される膵臓β細胞の細胞死滅にTSPAN2が及ぼす役割を調べて見た。
【００６７】
<２−１> 高濃度グルコースがTSPAN2発現に及ぼす影響
高濃度グルコースが細胞においてTSPAN2発現に及ぼす影響を確認した。
【００６８】
RNAKT-15細胞をそれぞれ正常グルコース(NG)又は高濃度グルコース(HG)の条件で二日間培養して、細胞からRNAを抽出してマイクロアレイを利用して転写プロファイリングをした。マイクロアレイ実験は３回繰返して行い、データを分析した。さらに、遺伝子発現を分析するために、RNAKT-15細胞を二日間正常グルコース又は高濃度グルコース培地でそれぞれ培養した後、細胞溶解物でanti-TSPAN2抗体を使用してウエスタンブロットを実施した。TSPAN2 mRNAの発現量を測するためにRT-PCRを実施した。
【００６９】
その結果、図３に示した通り、TSPAN2の発現量が高濃度グルコース条件で持続的に増加するものと示された。高濃度グルコースの条件でTSPAN2タンパク質の発現量は３倍にまで上昇してmRNAの発現量は４倍にまで増加するものと示された。
【００７０】
<２−２> TSPAN2が細胞死滅に及ぼす影響
TSPAN2と細胞死滅の連関性を調べた。
RNAKT-15細胞をそれぞれ正常グルコース(NG)又は高濃度グルコース(HG)の条件で二日間培養した。以降、annexin V染色して細胞を顕微鏡で観察した。
【００７１】
その結果、図４に示した通り、高濃度グルコースにおいて培養した細胞の場合、細胞死滅が増加するものと示され、細胞死滅に重要なBaxとcleaved caspase ３が増加するものと示された。これを通じてTSPAN2は転写水準において高濃度グルコースにより発現が誘導されたことを確認できた。さらに、高濃度グルコースにより細胞死滅が増加することからTSPAN2の発現量が増加すると細胞死滅に影響を及ぼすことを確認することができた。
【００７２】
<実施例３>
TSPAN2の発現量がBax発現量に及ぼす影響
高濃度グルコースによりTSPAN2の発現量が増加する細胞信号機作を調べて見た。TSPAN2の水準の増加が細胞信号伝達系に及ぼす影響を確認した。
【００７３】
RNAKT-15細胞をそれぞれ正常グルコース(NG)又は高濃度グルコース(HG)の条件で二日間培養してTSPAN2を過発現するプラスミドに形質転換した。前記細胞溶解物を利用してウエスタンブロット分析を行った。
【００７４】
その結果、図５に示した通り、高濃度グルコースからp-JNK,Bax,t-Bid及び切断されたPARPの増加が示された。さらに、正常濃度グルコースにおいてTSPAN2を過発現させた場合にも同一にp-JNK,Bax,t-Bid及び切断されたPARPが増加するものと示された。反面、高濃度グルコースと正常グルコースにおいてTSPAN2を発現させた場合、Bcl-2とPARPの発現は減少するものと示された。これを通じて高濃度グルコースはグルコース毒性で誘発される細胞死滅を誘導して、TSPAN2の過発現がこれと類似した効果を示すことを確認することができた。
【００７５】
さらに、TSPAN2の過発現がグルコース毒性で誘発される細胞死滅に及ぼす影響を確認するために、高濃度グルコース条件でTSPAN2 siRNAでTSPAN2の発現を抑制してBaxの発現量を測定した。
【００７６】
さらに、図６に示した通り、TSPAN2 siRNAはTSPAN2タンパク質の発現を効率的に抑制した。高濃度グルコースはBaxタンパク質の発現量を増加させる反面、TSPAN2はBaxの発現量を減少させるものと示された。これを通じて、TSPAN2の発現は高濃度グルコース条件下でBax発現水準の減少に寄与することを分かった。さらには、TSPAN2発現抑制により核内β-cateninが増加することも確認することができた。
【００７７】
<実施例４>
JNKがβ-cateninに及ぼす影響
β-catenin信号調節においてJNKの潜在的な役割を調べた。
【００７８】
RNAKT-15細胞を培養してJNKとDKKに対するsiRNAで形質転換させた後、JNK抑制剤であるSP600125を処理した。12ウェルプレートに培養したRNAKT-15細胞にβ-cateninが抗体を反応させてDAPIで染色した後、共焦点顕微鏡で観察した。さらに、RNAKT-15細胞をそれぞれ正常グルコース(NG)又は高濃度グルコース(HG)の条件で二日間培養して収得した後、ウエスタンブロットを実施した。
【００７９】
その結果、図８と図９に示した通り、JNK抑制剤(SP600125)を処理したRNAKT-15細胞においてDkk1の発現水準を減少するものと表れ、HG条件でDkk1 siRNAを処理した場合、β-cateninタンパク質とp-cateninタンパク質とp-Aktの発現水準は増加させるものと示された。これと類似してHG条件でβ-cateninの核内移動は抑制された反面、Dkk1 siRNAを処理した細胞では細胞質と核内でβ-cateninを全て増加させるものと観察された(図7)。さらに、HGで誘導されたp-JNKはp-β-cateninとDkk1を増加させ、さらに、Dkk1 siRNAはβ-cateninの核内移動を促進させた(図7)。以上の結果は、TSPAN2がJNK-DKK1の信号伝達経路を調節することにより、β-catenin核内移動を効果的に弱化させることを示した。
【００８０】
<実施例５>
TSPAN2がJNKを通じてBaxを活性化する機作
TSPAN2がJNK信号伝達系において機能的に連結されているか否かを調べるためにHG条件でJNK信号伝達系の変化を確認した。
【００８１】
HG条件でp-JNKが増加するものと観察された（図８）。
【００８２】
引続き、siRNAでTSPAN2の発現を抑制して機能喪失分析(loss of function)を実施した。
【００８３】
TSPAN2 siRNAはp-JNKを抑制し、選択的なJNK抑制剤(SP600125)はJNKとBaxの活性を抑制した。免疫ブロット条件結果（図10）を通じてRNAKT-15細胞においてp-JNKタンパク質が減少することを再確認し、TSPAN2を過発現させることによりp-JNKタンパク質で媒介されたBaxの増加がより向上されるものと示された。さらに、β-catenin  siRNAは核内β-cateninがを大幅に減少させ、Baxは増加させた反面、JNK抑制剤(SP600125)は核内β-catenin水準を増加させてBaxを減少させた（図10）。これはβ-catenin信号伝達はRNAKT-15細胞においてBaxを抑制することにより、膵臓β細胞生存を促進させるものであることを示す。以上の結果は、高濃度グルコース条件でTSPAN2が過発現されると、p-JNK水準とp-JNKに緩和された核内β-catenin移動が増加してBaxが上向調節されることを示す。
【００８４】
<実施例６>
TSPAN2とJNK/β-catenin信号伝達系
前記での実施例の結果はHG条件てJNKのリン酸化が増加してHGがJNKを活性化させることをを示唆した。TSPAN2の発現もHG条件で増加するので、JNKがBaxの発現に及ぼす影響を調べた。
細胞をmock処理するか又はTSPAN2 siRNA又はβ-catenin siRNAに形質転換した。以降、細胞にmock処理するか又はJNK抑制剤(SP600125)を処理して、細胞溶解物でウエスタンブロットを実施した。
【００８５】
その結果、siRNAによるTSPAN2の発現抑制又はSP600125処理がJNK活性を抑制し、Baxの発現水準も類似した傾向で減少した。このような結果はJNKの活性化がBaxの発現に関連されていることを提示した。さらには、核内β-catenin水準はsiRNAを利用したTSPAN2の発現抑制又はJNK抑制剤により増加した。以上の結果はJNKによるβ-catenin信号伝達系の抑制はBaxを活性化させることを示す（図10）。
【００８６】
<実施例７>
グルコース毒性で誘導される細胞死滅におけるTSPAN2の役割
高濃度グルコース刺戟がRNAKT-15細胞の細胞死滅を誘導するので、TSPAN2が細胞死滅に及ぼす役割を調査した。
【００８７】
HG条件はTSPAN2の発現を著しく刺戟してp-JNKを過度に生成されるようにして、その結果、核内β-catenin水準と転写活性を減少させた。JNKによるβ-catenin信号伝達の抑制は細胞死滅を抑制するBcl-2と逆相関関係にあるJNK/β-catenin信号伝達系を調節して、細胞死滅を促進するBaxタンパク質の水準を増加させた。最終的にcaspase3を活性化して核内PARPが分解されるようにして、RNAKT-15細胞の細胞死滅を誘導するようになる。それのみならず、β-cateninの核内移動を抑制するTSPAN2をsiRNAを利用して発現を抑制すると、HGで誘導される細胞死滅を効果的に防止できた（図11）。従って、TSPAN2はRNAKT-15細胞において細胞死滅を促進する役割をしてグルコース毒性による細胞死滅に大きく関与する。
【産業上の利用可能性】
【００８８】
以上説明した通り、本発明の組成物とスクリーニング方法は高血糖条件でJNKとβ-cateninを通じて膵臓β細胞の細胞死滅を促進するTSPAN2の役割を利用してTSPAN2タンパク質の発現又は活性を抑制する全く新たな作用機作の糖尿病の治療剤の開発に有用に利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
2018052908000001.app
【外国語明細書】
2018052908000001.pdf