(57)【要約】      （修正有）【課題】より実用的な唾液中の脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の測定方法を提供する。【解決手段】被験個体から採取した唾液を凍結しないで０℃以上３０℃以下に維持する準備工程と、準備工程後に、唾液中の脳由来神経栄養因子の濃度を測定する測定工程とを備える。準備工程は、唾液を０℃以上３０℃以下の温度で１６８時間以内維持する工程である。測定工程は、抗脳由来神経栄養因子抗体を用いる抗原抗体反応を実施する工程である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
唾液中の脳由来神経栄養因子の測定方法であって、
被験個体から採取した唾液を凍結しないで０℃以上３０℃以下に維持する準備工程と、
前記準備工程後に、前記唾液中の脳由来神経栄養因子の濃度を測定する測定工程と、
を備える、方法。
【請求項２】
前記準備工程は、前記唾液を１５℃以上３０℃以下の温度で維持する工程である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記準備工程は、前記唾液を前記温度で１６８時間以内維持する工程である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記準備工程は、前記唾液を前記温度で１２時間以上維持する工程である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記測定工程は、抗脳由来神経栄養因子抗体を用いる抗原抗体反応を実施する工程である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記測定工程は、酵素結合免疫吸着法を実施する工程である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記測定工程は、脳由来神経栄養因子２００ｐｇ／ｍｌ以下の濃度における標準曲線の回帰式の決定係数が０．９９以上である測定方法によって前記脳由来神経栄養因子を測定する工程である、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
脳由来神経栄養因子を測定するための唾液の準備方法であって、
前記脳由来神経栄養因子の測定に先立って、被験個体から採取した唾液を凍結することなく０℃以上３０℃以下で維持する準備工程、を備える、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書は、唾液中の脳由来の神経栄養因子の測定方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）は、標的となる細胞表面上の受容体（ＴｒｋＢ）に結合して、神経細胞の生存・成長・シナプスの機能亢進などの神経細胞の成長を調節するタンパク質である。ＢＤＮＦは、ニューロンの成長に関連しており、その欠損や低下は重篤な疾患に関与すると推測されている。例えば、アルツハイマー病の患者の脳組織において低下していることも報告されている。また、血液中のＢＤＮＦは、認知症やうつ病のマーカーとしても期待されている。
【０００３】
血中のＢＤＮＦの測定は、抗ＢＤＮＦ抗体を用いたＥＬＩＳＡなどが用いられている（特許文献１）
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００６−３００８４４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、より簡易に、より日常的に又はより非侵襲的にＢＤＮＦを測定するには、例えば、唾液中のＢＤＮＦを測定することが望まれる。しかしながら、疾患マーカーとして期待されるＢＤＮＦは、その低値により疾患の診断や疾患の予兆の指標となるものである。また、唾液においては、血液中のＢＤＮＦよりも一層低値であることが予想される。したがって、唾液等の非血液生体由来試料を検査対象とするときには、検出感度がより高くまた精度の高い測定方法の確立が望まれる。
【０００６】
本明細書は、より実用的な唾液中のＢＤＮＦの測定方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、唾液を検査対象としてＢＤＮＦを測定するのにあたって、種々検討したところ、唾液におけるＢＤＮＦの測定に適した方法を見出した。本明細書の開示によれば、以下の手段が提供される。
【０００８】
（１）唾液中ＢＤＮＦの測定方法であって、
被験個体から採取した唾液を凍結しないで０℃以上３０℃以下に維持する準備工程と、
前記準備工程後に、前記唾液中のＢＤＮＦの濃度を測定する測定工程と、
を備える、方法。
（２）前記準備工程は、前記唾液を１０℃以上３０℃以下の温度で維持する工程である、（１）に記載の方法。
（３）前記準備工程は、前記唾液を前記温度で１６８時間以内維持する工程である、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）前記準備工程は、前記唾液を前記温度で１２時間以上維持する工程である、（３）に記載の方法。
（５）前記測定工程は、抗ＢＤＮＦ抗体を用いる抗原抗体反応を実施する工程である、（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）前記測定工程は、酵素結合免疫吸着法を実施する工程である、（５）に記載の方法。
（７）前記測定工程は、ＢＤＮＦ２００ｐｇ／ｍｌ以下の濃度における標準曲線の回帰式の相関係数が０．９９以上である測定方法によって前記脳由来神経栄養因子を測定する工程である、（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）唾液中のＢＤＮＦを測定するための唾液の準備方法であって、
前記脳由来神経栄養因子の測定に先立って、被験個体から採取した唾液を凍結することなく０℃以上３０℃以下維持する準備工程、を備える、方法。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】唾液の採取方法と凍結の有無とＢＤＮＦ測定値との関係を示す図である。
【図２】唾液の保管温度とＢＤＮＦ測定値との関係を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本明細書の開示は、唾液中のＢＤＮＦの測定方法に関する。本明細書に開示される唾液中のＢＤＮＦの測定方法（以下、本測定方法ともいう。）によれば、唾液中のＢＤＮＦの検出性、例えば、ＢＤＮＦが本来的に有するその特異的抗体との反応性を損なわないで維持することができる。
【００１１】
また、唾液中のＢＤＮＦ濃度は血中濃度よりも低い傾向がある。本測定方法によれば、凍結及び解凍によるＢＤＮＦの変性を回避して低濃度のＢＤＮＦであっても確実に測定できる。
【００１２】
また、ＢＤＮＦはその体内循環量の低下が疾患や障害と関連付けられる可能性が高い。本測定方法によれば、凍結及び解凍による操作誤差やタンパク質変性を回避して簡易に高精度、かつ高い正確性で唾液中のＢＤＮＦを測定できる。
【００１３】
また、こうした準備工程後にＢＤＮＦを測定する工程を備えていることから、ＢＤＮＦの測定のための検体を簡易に採取できるとともに、ＢＤＮＦの測定するタイミングを自在に設定することができる。このため、検体の回収から測定を効率化、簡素化することができるほか、検体を提供する提供者やその管理者であってもＢＤＮＦを容易に測定できるようになる。
【００１４】
本測定方法によれば、ＢＤＮＦの低濃度領域、２００ｐｇ／ｍｌ以下において、高い正確性と精度でＢＤＮＦを測定できる。
【００１５】
以上のことから、本測定方法によれば、ＢＤＮＦを日常的に測定しモニタリングすることが容易となる。
【００１６】
以下、本測定方法等の実施形態について詳細に説明する。
【００１７】
（唾液中のＢＤＮＦの測定方法）
本測定方法は、被験個体から採取した唾液を凍結しないで０℃以上３０℃以下に維持する準備工程と、前記準備工程後に、前記唾液中の脳ＢＤＮＦの濃度を測定する測定工程と、を備えることができる。
【００１８】
本明細書において、被験個体とは、唾液を採取できる哺乳動物の個体をいう。例えば、ヒトのほか、イヌ、ネコ、サル等の愛玩動物や、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ等の家畜動物等の哺乳動物が挙げられる。
【００１９】
本明細書において、唾液とは、唾液腺から口腔内に分泌される分泌液である。唾液の採取方法は、特に限定するものではないが、直接、チューブ等の採取容器に垂れ流すようにしたり、ストロー状の流し込むようにしたりして採取する方法（直接法）のほか、コットンや他のポリマーで形成したスポンジを口腔内に一定時間含ませた後、容器に収容する等の方法（含浸法）を適宜採用することができる。なお、スポンジに含浸した唾液は、遠心分離や圧搾等の固液分離方法にて、唾液のみを分離することができる。検体としての唾液は、含浸法による場合、検体としての唾液は、スポンジに含浸した状態であってもよいし、固液分離後の唾液であってもよい。
【００２０】
なお、唾液の採取に際して、必要に応じて採取前の経口摂取制限や、行動制限等を設けることができる。
【００２１】
本明細書において測定対象とするＢＤＮＦは、成熟型のＢＤＮＦのほかＢＤＮＦ前駆体であってもよい。ヒトＢＤＮＦ及びヒトＢＤＮＦ前駆体は、ぞれぞれ既にタンパク質として精製されアミノ酸配列も決定されている。ＢＤＮＦのアミノ酸配列は、哺乳動物官において種差がないとされている。ＢＤＮＦ及びＢＤＮＦ前駆体に対するポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体は、適宜、商業的に入手可能である。
【００２２】
（準備工程）
本測定方法における準備工程は、採取した唾液を冷凍することなく、ＢＤＮＦの抗体反応性を低下させない温度で維持する工程とすることができる。冷凍を回避しつつＢＤＮＦ抗体反応性を低下させない温度で維持することで冷凍によるＢＤＮＦの抗体との反応性の低下を回避して、ＢＤＮＦの測定精度や正確性を確保することができる。
【００２３】
本明細書において、唾液を冷凍することなく、ということは、如何なる手順によるかに関わらず唾液を冷凍することなく、ということを意味している。なお、唾液を冷凍するとは、冷却により唾液を凍結することをいう。唾液の冷凍は、特に限定するものではないが、例えば、概して−１０℃以下、典型的には−２０℃程度の温度に唾液を維持することで行うことができる。
【００２４】
準備工程は、唾液の採取、すなわち、被験個体から排出された時点から、ＢＤＮＦの測定準備にまで至る期間中に実施することができる。ＢＤＮＦの測定準備とは、例えば、ＢＤＮＦの測定用の溶液の調製する操作が挙げられる。
【００２５】
準備工程は、どのような形態で実施されてもよい。特に限定するものではないが、例えば、採取された唾液の入った容器を、外部からある程度断熱されるか内部の温度制御が可能な保存容器、保存コンテナ又はボックス（回収用）、保存庫又は保存室に収容する、温度維持装置に配置する等により実施できる。また、準備工程は、ＢＤＮＦ測定前の唾液の所定温度での測定待機工程として実施してもよい。
【００２６】
また、準備工程は、採取後の唾液が収容された容器を、いわゆる流通業者によって輸送される状態を含むことができる。すなわち、輸送状態である工程も、冷凍することなく一定温度範囲に唾液を維持することで準備工程として実施できる。
【００２７】
準備工程において唾液の維持すべき温度は、３０℃以下であることが好ましい。３０℃以下であれば、ＢＤＮＦの変性や分解等による反応性の低下を回避できる。また例えば、２５℃以下であり、また例えば、２０℃以下であり、また例えば、１５℃以下である。また、唾液の維持すべき温度の下限は、冷凍を回避できる温度であって、例えば、０℃以上とすることができ、また、２℃以上としてもよく、さらに４℃以上としてもよい。また例えば、５℃以上とすることができる。また例えば、１０℃以上とすることができる。
【００２８】
本測定方法の準備工程では、例えば、唾液を０℃以上３０℃以下、また例えば、５℃以上２０℃以下、さらに例えば、１０℃以上１５℃以下、維持することができる。
【００２９】
準備工程は、唾液を上記した状態で唾液を１６８時間以内維持することが好ましい。１６８時間を超えると測定値に影響が出る可能性があるからである。かかる準備工程は、１４４時間以内であってもよいし、１２０時間以内であってもよいし、９６時間以内でもよいし、７２時間以内でもよい。準備工程は、また例えば、１時間以上であってもよい。１時間未満であると、採取から測定までの十分な時間でない場合もあるからである。かかる準備工程は、２時間以上でもよいし、６時間以上でもよいし、８時間以上でもよいし、１２時間以上でもよいし、１８時間以上でもよいし、２４時間以上であってもよい。また、例えば、３６時間以上でもよいし、４８時間以上でもよいし、６０時間以上でもよいし、７２時間以上でもよい。
【００３０】
準備工程は、典型的には、１２時間以上２４時間以内、１２時間以上３６時間以内、１２時間以上４８時間以内、２４時間以上４８時間以内、２４時間以上７２時間以内、２４時間以上９６時間以内、２４時間以上１２０時間以内で実施することができる。
【００３１】
このように、冷凍することなく一定状態に唾液を維持した後ＢＤＮＦを測定できることにより、ＢＤＮＦの測定の効率化が可能となるほか、ＢＤＮＦの検体としての唾液を家庭や職場などの日常的に居住する任意の場所で採取して、例えば、適当な回収ポイントや適当な流通手段を介して、特定場所で集中的にＢＤＮＦを測定することに好適である。
【００３２】
また、冷凍することなく一定状態に唾液を維持した後ＢＤＮＦを測定できることにより、ヒトなどの被験個体自身、あるいは動物などの被験個体の管理者が、ＢＤＮＦを測定するのにも都合がよい。すなわち、冷凍及び解凍に伴う時間や操作を排除するとともに、当該操作に伴う誤差やタンパク質の変性に基づく誤差を排除することができる。また、ＢＤＮＦ測定を一括してあるいは任意のタイミングで実施できるようになるからである。
【００３３】
（測定工程）
測定工程は、唾液中のＢＤＮＦを測定できる方法であれば特に限定するものではないが、例えば、抗ＢＤＮＦ抗体を用いる抗原抗体反応を実施することによりＢＤＮＦを測定することができる。特異性、簡易性等の観点から他の方法より有利だからである。
【００３４】
抗ＢＤＮＦ抗体は、ＢＤＮＦを抗原として反応する抗体をいう。抗ＢＤＮＦ抗体は、例えば、ＢＤＮＦを抗原として用いて免疫化学的に又は遺伝子工学的に製造された抗体である。かかる抗体は、好ましくはＢＤＮＦ又はproＢＤＮＦに結合する能力があればよいが、好ましくはこれらに特異的に結合する能力を有する。抗ＢＤＮＦ抗体は、例えば、ポリクローナル抗体であってもよいし、モノクローナル抗体であってもよい。
【００３５】
抗ＢＤＮＦ抗体は、標識化された形態で用いられてもよい。標識化抗ＢＤＮＦ抗体は、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素などの酵素、デルフィニウム等の蛍光標識、放射性同位元素標識、着色されたビーズ、金コロイド粒子等の公知の各種の標識を結合させた抗ＢＤＮＦ抗体など、こうした標識を介して抗原であるＢＤＮＦを検出できる抗体が挙げられる。
【００３６】
また、標識化抗ＢＤＮＦ抗体は、こうした標識となる要素を直接備えていなくてもよく、ビオチンや２，４−ジニトロフェノール等など、特異的な結合を介して標識と結合可能な物質を結合させた抗ＢＤＮＦ抗体であってもよい。例えば、ビオチン修飾抗ＢＤＮＦ抗体や、４−ジニトロフェノール修飾抗ＢＤＮＦ抗体が挙げられる。このような抗ＢＤＮＦ抗体には、例えば、標識化したアビジンや標識化した抗２，３−ジニトロフェノール抗体を結合させることで、これらを介して抗原であるＢＤＮＦを検出することができる。こうした各種の標識による抗体の修飾や各種の標識を用いた抗原等の検出は当業者において周知であり、当業者であれば、周知の情報に基づいてこれらを適宜入手しあるいは調製することができる。
【００３７】
測定工程は、各種方法で実施することができる。例えば、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）で実施することができる。その場合、例えば、以下の工程でＢＤＮＦを測定することができる。
【００３８】
（１）抗ＢＤＮＦ抗体を固定化した固相体を準備し、
（２）検体である唾液を前記固相体表面に供給し（それにより固相体上の抗ＢＤＮＦ抗体と接触させ）、
（３）必要に応じて固相体表面を洗浄し、
（４）標識化（酵素修飾）抗ＢＤＮＦ抗体（抗体ａ）、ビオチン又はＤＮＦで修飾された抗ＢＤＮＦ抗体（抗体ｂ）を固相体表面に供給し
（５）抗体ａの標識に基づき、ＢＤＮＦ量を測定する、
抗体ｂに結合する標識化アビジン又は標識化抗ＤＮＦ抗体を供給を経てこれらの標識に基づきＢＤＮＦを測定する。
【００３９】
固相体としては、こうした抗原抗体反応を酵素などの標識を用いた反応が可能であればその材料や形状は特に限定するものではない。例えば、ポリスチレン、ナイロン、ガラス、シリコンラバー等の各種材料で形成され、ウェルを備えるアレイ、平板状アレイ、ビーズ、チューブ等、特にその形状等に関し限定されない固相体を用いることができる。
【００４０】
また、測定工程は、免疫クロマトグラフィーの形態で実施することもできる。免疫クロマトグラフィーは、唾液中のＢＤＮＦを溶解する展開溶媒を、当該展開溶媒がキャピラリー現象によって浸透可能な多孔質性の固相体であって、抗ＢＤＮＦ抗体を固定化したＢＤＮＦ捕捉領域を備える固相体の一部に供給し展開させて前記捕捉領域に到達させて、前記捕捉領域において抗ＢＤＮＦ抗体に結合したＢＤＮＦを検出するものである。
【００４１】
なお、検体である唾液は、展開溶媒に含めてもよいし、固相体の一部に保持させて展開溶媒により展開させるようにしてもよい。また、ＢＤＮＦを検出するための標識化抗ＢＤＮＦ抗体は展開溶媒に含めてもよいし、展開後に固相担体に供給してもよいし、固相体上の捕捉領域よりも手前（すなわち、固定化領域よりも展開開始点により近い部位）に固定化しておいてもよい。なお、免疫クロマトグラフィーの場合においては、標識は、酵素を用いることも可能であるが、金コロイド粒子や着色粒子などを用いることもできる。標識として酵素を用いる場合には、さらに、ビオチン化抗ＢＤＮＦ抗体、ＤＮＦ化抗ＢＤＮＦ抗体を用い、さらに標識化アビジンや標識化抗ＤＮＦ抗体を適宜適用する。
【００４２】
測定工程で用いるＢＤＮＦ測定方法の検出感度については特に限定するものではないが、検体たる唾液中のＢＤＮＦ２００ｐｇ／ｍｌ以下の濃度における標準曲線の回帰式の決定係数が０．９９以上であることが好ましい。かかるＢＤＮＦ濃度領域においてこうした相関を有する測定方法であると、高い精度と正確性で唾液中のＢＤＮＦを測定することができる。
【００４３】
ＢＤＮＦの測定にあたっては、商業的に種々のキットが提供されている。また、ＢＤＮＦの測定にあたっては、抗ＢＤＮＦ抗体のほか、ビオチン化抗ＢＤＮＦ抗体、標識化アビジン、酵素標識とその基質、抗原抗体反応促進剤など、入手又は調製可能な試薬について適宜選択することができる。
【００４４】
（ＢＤＮＦを測定するための唾液の準備方法）
本明細書に開示される、ＢＤＮＦを測定するための唾液の準備方法（以下、本準備方法ともいう。）は、ＢＤＮＦの測定に先立って、被験個体から採取した唾液を凍結することなく０℃以上３０℃以下に維持する準備工程、を備えることができる。こうした方法によると、凍結及び解凍に伴う操作やこうした操作に伴うタンパク質の変性による誤差を回避して、凍結するよりも高精度で正確性の高いＢＤＮＦの測定が可能となる。また、かかる準備工程を伴うことにより、唾液採取から唾液中のＢＤＮＦの測定までの間、唾液を待機させることができる。このため、唾液について効率的なＢＤＮＦ測定の実施が可能となる。また、採取した唾液を、回収して集約してＢＤＮＦ測定を実施するのにも都合がよい。
【００４５】
本準備方法の準備工程において唾液を維持する温度は、本測定方法における準備工程において示した温度の各種態様を適用することができる。
【実施例】
【００４６】
以下、本明細書の開示を具現化した実施例について説明するが、以下の実施例は本明細書の開示を限定するものではない。
【実施例１】
【００４７】
（唾液検体の測定前の準備の検討１）
唾液の採取方法と前処理方法に関して検討を行った。唾液をマイクロチューブに吐出する方法と、吐出した唾液を一度−２０℃で凍結させる方法、サリベット（Sarstedt社製）で採取する方法、サリベットで採取した唾液を一度−２０℃で凍結させる方法を比較した。それぞれの検体はＢＤＮＦ測定前に１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を測定に供した。なお、サリベットを採取したときは、スポンジに含浸させた唾液を遠心分離（１５００〜３０００ｇで２分程度）して清澄唾液を採取してＢＤＮＦ測定及び凍結に供した。
【００４８】
これら４種の試料中のＢＤＮＦの測定は、アゾポリマーをコーティングしたガラス基板に抗ＢＤＮＦ抗体をスポットした抗ＢＤＮＦ抗体チップを準備し、この抗体チップに、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で段階希釈した標品（１．６ｐｇ／ｍｌ、４．１ｐｇ／ｍｌ、１０．２ｐｇ／ｍｌ、２５．６ｐｇ／ｍｌ、６４ｐｇ／ｍｌ、１６０ｐｇ／ｍｌ、４００ｐｇ／ｍｌ、１０００ｐｇ／ｍｌ、２５００ｐｇ／ｍｌ）と、上記した各種上清を０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳで２倍希釈した唾液検体と、を抗体チップにスポットし、室温で２時間反応させた。コントロールとしては、血清を用いた。この抗体チップをＴＰＢＳ（トリスリン酸緩衝生理食塩水）で５分間洗浄し、洗浄液を捨て、更にＴＰＢＳで１０分間洗浄した後に、ＰＢＳでリンスし遠心機により脱水した。ビオチン化抗ＢＤＮＦ抗体を０．５％ＢＳＡ／ＴＰＢＳで希釈し、抗体チップにスポットし、室温で１時間反応させた。さらに、この抗体チップをＴＰＢＳで５分間洗浄し、洗浄液を捨て、更にＴＰＢＳで１０分間洗浄し、遠心機により脱水した。アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）標識ストレプトアビジンを０．５％ＢＳＡ／ＴＰＢＳで希釈し、当該液に抗体チップを浸漬し、室温で１時間振とうした。抗体チップをＴＰＢＳで５分間洗浄し、洗浄液を捨て更にＴＰＢＳで１０分間洗浄した後に、ＰＢＳでリンスし遠心機により脱水した。発光基質としてジオキセタンを抗体チップにアプライし、シールした後に発光検出器にて３０分間検出を行った。検量線から唾液のＢＤＮＦ濃度を算出した。なお、このとき得られた標準曲線は、１６０ｐｇ／ｍｌ以下において、その回帰式の決定係数（Ｒ2）は、０．９９であった。結果を図１に示す。
【００４９】
図１に示すように、常温保管では吐出とサリベットの検出値に差が見られなかったが、凍結保管では、それぞれ３０％、１０％ＢＤＮＦの測定値が減少していた。このように、「凍結及び解凍は、検体の採取方法によっても相違する」ことがわかり、また、凍結を回避することが、測定値の精度及び正確性に有効であることがわかった。
【００５０】
（唾液検体の測定前の準備の検討２）
次いで、唾液の保存温度に関して検討を行った。サリベットで採取した唾液を室温（常温）と３７℃で保管し、ＢＤＮＦの変動を評価した。ＢＤＮＦの測定方法は、先と同様とした。結果を図２に示す。
【００５１】
図２に示すように、常温保管においては、初発と比較して最大２割程度検出値が上昇した後に１割増程度に落ち着いて推移した。３７℃保管においては、初発と比較して７日後に４割程度にまで検出値が低下した。これらの結果から、唾液の保管は７日間（１６８時間）までは、常温程度の場合減少が見られない事が分かった。
【図１】
2018081055.tif 000002
【図２】
2018081055.tif 000003