(57)【要約】【課題】低用量でより短期間に腸内細菌叢の構成比率を調整できる腸内細菌叢構成比率調整剤を提供する。【解決手段】腸内細菌叢構成比率調整剤は、γ−オリザノールと、前記γ−オリザノールを内包する生体適合性粒子と、を含む。好ましくは、前記生体適合性粒子は、ポリラクチドグリコライド共重合体を含む。また、腸内細菌叢構成比率調整剤は、腸内細菌叢におけるＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓ／Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓの比を減少させる、こととしてもよい。【選択図】図１６
2018052896.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
γ−オリザノールと、
前記γ−オリザノールを内包する生体適合性粒子と、
を含む腸内細菌叢構成比率調整剤。
【請求項２】
前記生体適合性粒子は、
ポリラクチドグリコライド共重合体を含む、
請求項１に記載の腸内細菌叢構成比率調整剤。
【請求項３】
腸内細菌叢におけるＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓ／Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓの比を減少させる、
請求項１又は２に記載の腸内細菌叢構成比率調整剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腸内細菌叢構成比率調整剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
腸内細菌叢は、腸内フローラとも言われ、腸内の細菌が構成する体内の生態系である。腸内細菌叢は、腸管上皮を介して宿主と相互作用している。腸内細菌叢が便秘、下痢、感染症、アレルギー疾患、炎症性腸疾患、肥満及び糖尿病等の種々の疾患に関係することが明らかになっている。例えば、非特許文献１に記載のように、ヒトの肥満時には、腸内細菌叢でＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓに属する細菌の構成比率が低く、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ（ファーミキューテス門）に属する細菌の構成比率が高いことが知られている。体重の減少に伴って、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ（バクテロイデテス門）に属する細菌の構成比率が高まり、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓに属する細菌の構成比率が低下する。このため、腸内細菌叢に関連する疾患を予防又は治療するために、腸内細菌叢を構成する細菌の構成比率を調整することが試みられている。
【０００３】
例えば、特許文献１には、イネ科植物抽出物であるアルキルレゾルシノールが腸内フローラ調整能を有することが記載されている。高脂肪高ショ糖食に０．５質量％のアルキルレゾルシノールを添加することで、マウスの腸内フローラにおけるＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ等の相対的細菌数を、高脂肪高ショ糖食の継続的な摂取前の健常時における相対的細菌数に近づけることができる。
【０００４】
また、特許文献２には、サラシア属植物、桑葉及びギムネマの抽出物を含む腸内細菌叢構成比率調整剤が開示されている。１日当たり１０〜４０ｍｇ／ｋｇの用量で該抽出物をマウスに投与することで、腸内細菌叢のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ／Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓの比率を増加させることができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１５−２１８１３０号公報
【特許文献２】特開２０１０−２８５４２５号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｐｅｔｅｒ  Ｊ．Ｔｕｒｎｂａｕｇｈ、外５名、「Ａｎ  ｏｂｅｓｉｔｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｇｕｔ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ  ｗｉｔｈ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ｆｏｒ  ｅｎｅｒｇｙ  ｈａｒｖｅｓｔ」、Ｎａｔｕｒｅ、２００６年、４４４、ｐ．１０２７−１０３１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記特許文献１のアルキルレゾルシノールは、マウスにおいてＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ等の相対的細菌数を、健常時の相対的細菌数に近づけるのに１０週間といった長い期間を要している。一方、上記特許文献２の腸内細菌叢構成比率調整剤の場合、１週間の投与で腸内細菌叢のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ／Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓの比率を増加させる効果が得られるが、１日の用量が比較的多い。
【０００８】
本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、低用量でより短期間に腸内細菌叢の構成比率を調整できる腸内細菌叢構成比率調整剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、玄米に含まれる生理活性物質であるγ−オリザノールに着目し、腸内細菌叢に対するγ−オリザノールの影響を鋭意研究し、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明の第１の観点に係る腸内細菌叢構成比率調整剤は、
γ−オリザノールと、
前記γ−オリザノールを内包する生体適合性粒子と、
を含む。 
【００１１】
この場合、前記生体適合性粒子は、
ポリラクチドグリコライド共重合体を含む、
こととしてもよい。
【００１２】
また、上記本発明の第１の観点に係る腸内細菌叢構成比率調整剤は、
腸内細菌叢におけるＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓ／Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓの比を減少させる、
こととしてもよい。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、低用量でより短期間に腸内細菌叢の構成比率を調整できる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】色素の生体内分布を示す図である。（Ａ）は色素原体の生体内分布を示す。（Ｂ）はナノ粒子に内包させた色素の生体内分布を示す。
【図２】実施例３に係るマウスの体重及び血中グルコース濃度の経時変化並びに血漿中のインスリン濃度を示す図である。（Ａ）はγ−オリザノール原体を投与したマウスの体重の経時変化を示す図である。（Ｂ）はナノ粒子に内包させたγ−オリザノール（γ−オリザノールナノ粒子）を投与したマウスの体重の経時変化を示す図である。（Ｃ）はγ−オリザノール原体を投与したマウスの血中グルコース濃度の経時変化を示す図である。（Ｄ）はγ−オリザノールナノ粒子を投与したマウスの血中グルコース濃度の経時変化を示す図である。（Ｅ）はγ−オリザノール原体又はγ−オリザノールナノ粒子を投与したマウスの血漿中のインスリン濃度を示す図である。
【図３】実施例４に係るマウスの血中グルコース濃度の経時変化を示す図である。（Ａ）はγ−オリザノール原体を投与したマウスの血中グルコース濃度の経時変化を示す図である。（Ｂ）は（Ａ）から求めた曲線下面積（ＡＵＣ）を示す図である。（Ｃ）はγ−オリザノールナノ粒子を投与したマウスの血中グルコース濃度の経時変化を示す図である。（Ｄ）は（Ｃ）から求めたＡＵＣを示す図である。
【図４】実施例４に係るマウスの膵島におけるＥＲストレスマーカー遺伝子のｍＲＮＡの発現量を示す図である。（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）は、それぞれＣｈｏｐ、ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  ｒｅｓｉｄｅｎｔ  ＤＮＡＪ  ４（ＥＲｄｊ４）及びＸ−ｂｏｘ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １（Ｘｂｐ１ｓ）の発現量を示す図である。
【図５】実施例４に係る免疫組織化学分析の結果を示す図である。（Ａ）は標本の画像を示す図である。（Ｂ）は膵島の平均サイズを示す図である。（Ｃ）は膵島の全領域に対するインスリン陽性領域の割合を示す図である。（Ｄ）は膵島の全領域に対するグルカゴン陽性領域の割合を示す図である。（Ｅ）は膵島の全領域に対するクリーブドカスパーゼ−３陽性領域の割合を示す図である。
【図６】実施例５に係るマウスの血中グルコース濃度の経時変化を示す図である。（Ａ）はγ−オリザノール原体を投与したマウスの血中グルコース濃度の経時変化を示す図である。（Ｂ）は（Ａ）から求めたＡＵＣを示す図である。（Ｃ）はγ−オリザノールナノ粒子を投与したマウスの血中グルコース濃度の経時変化を示す図である。（Ｄ）は（Ｃ）から求めたＡＵＣを示す図である。
【図７】実施例５に係るマウスの肝臓におけるＥＲストレスマーカー遺伝子のｍＲＮＡの発現量を示す図である。（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）は、それぞれＣｈｏｐ、ＥＲｄｊ４及びＸｂｐ１ｓの発現量を示す図である。
【図８】実施例５に係るマウスの肝臓における糖新生遺伝子のｍＲＮＡの発現量を示す図である。（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）は、それぞれペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γコアクチベーター−１α（ＰＧＣ１α）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（Ｐｅｐｃｋ）及びグルコース６−ホスファターゼ（Ｇ６Ｐａｓｅ）の発現量を示す図である。
【図９】実施例５に係るマウスの腸間膜脂肪における炎症性遺伝子のｍＲＮＡの発現量を示す図である。（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）は、それぞれ腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα）、インターロイキン−６（ＩＬ６）及び単球走化性タンパク質−１（Ｍｃｐ１）の発現量を示す図である。
【図１０】実施例５に係るマウスの腸間膜脂肪におけるＥＲストレスマーカー遺伝子のｍＲＮＡの発現量を示す図である。（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）は、それぞれＣｈｏｐ、ＥＲｄｊ４及びＸｂｐ１ｓの発現量を示す図である。
【図１１】実施例５に係るマウスの腸間膜脂肪におけるペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（ＰＰＡＲｇ２）のｍＲＮＡの発現量を示す図である。
【図１２】実施例５に係るマウスにおけるトリグリセリドの濃度を示す図である。（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）は、それぞれ血漿中のトリグリセリドの濃度、肝臓におけるトリグリセリドの濃度及び糞便中のトリグリセリドの濃度を示す図である。
【図１３】実施例５に係るマウスにおける総コレステロールの濃度を示す図である。（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）は、それぞれ血漿中の総コレステロールの濃度、肝臓における総コレステロールの濃度及び糞便中の総コレステロールの濃度を示す図である。
【図１４】実施例５に係るマウスの肝臓における脂肪酸合成に関連する遺伝子のｍＲＮＡの発現量を示す図である。（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）は、それぞれアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ１）、脂肪酸合成酵素（Ｆａｓ）、ステロール受容体エレメント結合タンパク質−１ｃ（Ｓｒｅｂｐ１ｃ）及びペルオキシソーム増殖因子活性化受容体−α（Ｐｐａｒａ）の発現量を示す図である。
【図１５】実施例５に係るマウスの肝臓におけるコレステロール合成に関連する遺伝子のｍＲＮＡの発現量を示す図である。（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）は、それぞれステロール受容体エレメント結合タンパク質−２（Ｓｒｅｂｐ２）、低比重リポタンパク受容体（Ｌｄｌｒ）、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル（ＨＭＧ）−ＣｏＡシンターゼ（Ｈｍｇｃｓ）及びＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素（Ｈｍｇｃｒ）の発現量を示す図である。
【図１６】実施例７に係る腸内細菌叢構成比率の解析の結果を示す図である。（Ａ）は腸内細菌叢を構成する細菌の種類を示す図である。（Ｂ）細菌の門の相対存在量を示す図である。（Ｃ）は腸内細菌叢におけるＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓ／Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓの比を示す図である。
【図１７】実施例７に係るマウスの短鎖脂肪酸濃度の血中濃度を示す図である。（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）は、それぞれ酢酸、プロピオン酸、ｎ−酪酸及びｎ−バレリアン酸の血中濃度を示す図である。
【図１８】実施例８に係るマウスの高脂肪食への嗜好性を示す図である。
【図１９】実施例８に係るマウスの視床下部におけるＥＲストレスマーカー遺伝子のｍＲＮＡの発現量を示す図である。（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）は、それぞれＣｈｏｐ、ＥＲｄｊ４及びＸｂｐ１ｓの発現量を示す図である。
【図２０】実施例８に係るマウスの視床下部における炎症性遺伝子のｍＲＮＡの発現量を示す図である。（Ａ）及び（Ｂ）は、それぞれＴＮＦα及びＭｃｐ１の発現量を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明に係る実施の形態について説明する。
（実施の形態）
本発明の実施の形態について説明する。本実施の形態に係る腸内細菌叢構成比率調整剤は、γ−オリザノールと、生体適合性粒子と、を含む。γ−オリザノールは、米糠等の脂質に含有される生理活性物質である。γ−オリザノールは、主に米糠油や米胚芽油より抽出することができる。また、市販のγ−オリザノールを利用することもできる。
【００１６】
腸管からの吸収効率及び体内滞留時間の延長等、γ−オリザノールの体内動態を改善するために、γ−オリザノールは、上記生体適合性粒子に内包されている。生体適合性粒子は、例えばポリマーから製造することができる。本実施の形態で用いられるポリマーとしては、生体への刺激や毒性が低く、かつ投与後分解して代謝される生体適合性を備える生体適合性ポリマーが好ましい。
【００１７】
生体適合性ポリマーは、生体適合性ポリエステルから製造することができる。生体適合性ポリエステルは、例えば、Ｄ，Ｌ−ラクチド、Ｄ−ラクチド、Ｌ−ラクチド、Ｄ，Ｌ−乳酸、Ｄ−乳酸、Ｌ−乳酸、グリコリド、グリコール酸、ε−カプロラクトン、ε−ヒドロキシヘキサン酸、γ−ブチロラクトン、γ−ヒドロキシ酪酸、δ−バレロラクトン、δ−ヒドロキシ吉草酸、ヒドロキシ酪酸及びリンゴ酸等から選択される１種又はそれ以上のモノマーを重合することにより合成されるポリエステルである。
【００１８】
好ましくは、生体適合性ポリマーとして、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸・グリコール酸共重合体、又は乳酸・アスパラギン酸共重合体が用いられる。好適には、生体適合性粒子は、生体適合性ポリマーとして、ポリラクチドグリコライド共重合体（ＰＬＧＡ）又はポリエチレングリコール／キトサン修飾−ＰＬＧＡ（ＰＥＧ／ＣＳ−ＰＬＧＡ）を含む。
【００１９】
ＰＬＧＡは、例えば１：９９〜９９：１、好ましくは３：１の割合で、乳酸又はラクチドとグリコール酸又はグリコライドとからなるコポリマーである。ＰＬＧＡは、任意のモノマーから一般的な方法で合成してもよいし、市販のものを使用してもよい。市販のＰＬＧＡとしては、例えばＰＬＧＡ７５２０（乳酸：グリコール酸＝７５：２５、平均重量分子量２０，０００、和光純薬工業社製）が挙げられる。乳酸及びグリコール酸の含有量が２５重量％〜６５重量％であるＰＬＧＡは非晶質であり、アセトン等の有機溶媒に可溶である点で好ましい。
【００２０】
生体適合性粒子は、食品に添加可能な乳化剤を主成分とするものであってもよい。乳化剤は、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニールピロリドン、レシチン、サポニン類、ステロール類、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル及びポリソルベートが挙げられる。なお、乳化剤は、１種類に限定されず、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。
【００２１】
生体適合性粒子の粒径は、１０００ｎｍ未満で、例えば２．５〜９００ｎｍ、より好ましくは２５〜５００ｎｍ、さらに好ましくは５０〜３００ｎｍ、最も好ましくは１００〜２５０ｎｍである。生体適合性粒子の粒径は、ふるい分け法、沈降法、顕微鏡法、光散乱法、レーザー回折・散乱法、電気的抵抗試験、透過型電子顕微鏡による観察及び走査型電子顕微鏡による観察等で測定できる。粒径は公知の粒度分布計で測定してもよい。粒径は、測定方法に応じて、ストーク相当径、円相当径及び球相当径で表すことができる。また、粒径は、複数の粒子を測定対象として、平均で表した平均粒径、体積平均粒径及び面積平均粒径等であってもよい。また、粒径は、レーザー回折・散乱法等の測定に基づく個数分布等から算出される平均粒径であってもよい。
【００２２】
具体的には、粒子の集団の全体積を１００％として累積カーブを求めたとき、その累積カーブが５０％となる点の粒径である５０％径（Ｄ５０）を粒径としてもよい。累積カーブ及びＤ５０は、市販の粒度分布計を用いて求めることができる。粒度分布計としては、例えば、ＮＩＫＫＩＳＯ  Ｎａｎｏｔｒａｃ  Ｗａｖｅ−ＥＸ１５０（日機装社製）が挙げられる。
【００２３】
ＰＬＧＡを含む生体適合性粒子は、腸管（小腸）の粘膜層、腸管壁、腎臓及び脾臓に停留しやすい。該生体適合性粒子は、内包するγ−オリザノールを腸、腎臓及び脾臓等で持続して放出するのでγ−オリザノールの効率的な輸送に好適である。また、上記生体適合性粒子の製造には、ＰＬＧＡのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾体を用いてもよい。ＰＬＧＡの表面をＰＥＧで修飾すると、血中安定性が向上する点で好ましい。
【００２４】
γ−オリザノールを内包する生体適合性粒子の製造方法としては、公知の任意の製造方法を採用できる。例えば、生体適合性粒子は、水中エマルジョン法で製造できる。水中エマルジョン法では、生体適合性ポリマーが溶解する良溶媒と、生体適合性ポリマーが溶解しない貧溶媒の２種類の溶媒を用いる。良溶媒には、生体適合性ポリマーが溶解し、かつ貧溶媒へ混和する有機溶媒を用いる。良溶媒及び貧溶媒の種類は、特に限定されない。
【００２５】
貧溶媒としては、水が挙げられ、水に界面活性剤を添加してもよい。例えば、界面活性剤としては、ポリビニルアルコール水溶液が好ましい。ポリビニルアルコール以外の界面活性剤としては、レシチン、ヒドロキシメチルセルロース及びヒドロキシプロピルセルロース等が挙げられる。なお、ポリビニルアルコールが残存している場合は、溶媒留去の後に、遠心分離等によりポリビニルアルコールを除去してもよい。
【００２６】
良溶媒としては、低沸点かつ難水溶性の有機溶媒であるハロゲン化アルカン類、アセトン、メタノール、エタノール、エチルアセテート、ジエチルエーテル、シクロヘキサン、ベンゼン及びトルエン等が挙げられる。好ましくは、例えば環境や人体に対する悪影響が少ないアセトンのみ又はアセトンとエタノールとの混合液が用いられる。
【００２７】
水中エマルジョン法では、まず、良溶媒中に生体適合性ポリマーを溶解後、生体適合性ポリマーが析出しないように、γ−オリザノール溶解液を良溶媒中へ添加し混合する。生体適合性ポリマーとγ−オリザノールとを含む混合液を、攪拌下で貧溶媒中に滴下すると、混合液中の良溶媒が貧溶媒中へ急速に拡散移行する。その結果、貧溶媒中で良溶媒の乳化が起き、良溶媒のエマルジョン滴が形成される。
【００２８】
さらに良溶媒と貧溶媒の相互拡散により、エマルジョン内から有機溶媒が貧溶媒へと継続的に拡散するため、エマルジョン滴内の生体適合性ポリマー及びγ−オリザノールの溶解度が低下する。最終的には、γ−オリザノールを内包した球形結晶粒子の生体適合性粒子が生成する。その後、良溶媒である有機溶媒を遠心分離又は減圧留去し、生体適合性粒子粉末を得る。得られた粉末は、そのまま、又は必要に応じて凍結乾燥等により再分散可能な凝集粒子に複合化される。得られた生体適合性粒子におけるγ−オリザノールの含量は、例えば０．１〜９９重量％、０．１〜３０重量％、１〜１０重量％、又は３〜５重量％である。
【００２９】
なお、生体適合性粒子内部へのγ−オリザノールの含量を高めるため、貧溶媒にカチオン性高分子を添加してもよい。カチオン性高分子としては、キトサン及びキトサン誘導体、セルロースに複数のカチオン基を結合させたカチオン化セルロース並びにポリエチレンイミン、ポリビニルアミン及びポリアリルアミン等のポリアミノ化合物等が挙げられる。
【００３０】
γ−オリザノールを内包する生体適合性粒子は、水中エマルジョン法の他、強制薄膜式マイクロリアクターを用いて製造してもよい。強制薄膜式マイクロリアクターを用いる場合、まず、互いに対向して配設され、少なくとも一方が他方に対して相対的に回転する処理用面間に、上述の良溶媒と貧溶媒とを導入する。これにより形成される薄膜流体中で、良溶媒と貧溶媒とを混合し、γ−オリザノールを内包する生体適合性粒子を、薄膜流体中に析出させる。強制薄膜式マイクロリアクターとしては、好ましくはＵＬＲＥＡ  ＳＳ−１１（エム・テクニック社製）が用いられる。
【００３１】
本実施の形態に係る腸内細菌叢構成比率調整剤の医薬用途における投与経路は特に限定されない。上記生体適合性粒子は、腸管での吸収効率が高いことから、腸内細菌叢構成比率調整剤は経口投与剤として用いられるのが好ましい。このとき、腸内細菌叢構成比率調整剤は、例えば、薬理的に許容される担体と配合された合剤であってもよい。薬理的に許容される担体は、製剤素材として用いられる各種の有機担体物質又は無機担体物質である。薬理的に許容される担体は、例えば、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤及び崩壊剤、又は液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤及び無痛化剤等として腸内細菌叢構成比率調整剤に配合される。また、必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤及び甘味剤等の添加物を用いることもできる。
【００３２】
本実施の形態に係る腸内細菌叢構成比率調整剤は、既知の方法で製造され、有効成分として０．１％〜９９％、１％〜５０％、好ましくは１〜２０％（％は重量％）の生体適合性粒子を含む。
【００３３】
本実施の形態に係る腸内細菌叢構成比率調整剤の投与量は、対象の性別、年齢、体重及び症状等によって適宜決定される。当該腸内細菌叢構成比率調整剤は、γ−オリザノールが有効量となるように投与される。有効量とは、所望の結果を得るために必要なγ−オリザノールの量であり、治療又は処置する状態の進行の遅延、阻害、予防、逆転又は治癒をもたらすのに必要な量である。
【００３４】
当該腸内細菌叢構成比率調整剤の投与量は、典型的には、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ〜２００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．２ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇであり、１日に１回、又はそれ以上に分割して投与することができる。腸内細菌叢構成比率調整剤を分割して投与する場合、該腸内細菌叢構成比率調整剤は、好ましくは１日に１〜４回投与される。また、腸内細菌叢構成比率調整剤は、毎日、隔日、１週間に１回、隔週及び１ヶ月に１回等の様々な投与頻度で投与してもよい。好ましくは、投与頻度は、医師等により容易に決定される。なお、必要に応じて、上記の範囲外の量を用いることもできる。
【００３５】
本実施の形態に係る腸内細菌叢構成比率調整剤は、下記実施例７に示すように、１日当たり０．０１又は０．１μｇ／ｇ体重といった低用量で４週間投与することで、腸内細菌叢の構成比率を調整することができる。特に、腸内細菌叢構成比率調整剤は、肥満に関連して上昇する腸内細菌叢におけるＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓ／Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓの比を減少させることができる。
【００３６】
以上詳細に説明したように、本実施の形態に係る腸内細菌叢構成比率調整剤は、低用量でより短期間に腸内細菌叢の構成比率を調整できる。
【００３７】
なお、他の実施の形態では、γ−オリザノールを内包する生体適合性粒子を含む、腸内細菌叢構成比率調整用食品添加物が提供される。また、γ−オリザノールを内包する生体適合性粒子を食品に添加することで、細菌叢構成比率調整用食品が提供される。当該食品は、例えば、機能性食品、機能性表示食品、特定保健用食品及び栄養機能性食品等として摂取（飲食）される。
【００３８】
食品における上記生体適合性粒子の含量は特に限定されない。例えば、上記生体適合性粒子は、食品に対して、９０重量％、８０重量％、７０重量％、６０重量％、５０重量％、４０重量％、３０重量％、２０重量％、１０重量％、５重量％、３重量％、２重量％、１重量％又は０．１重量％含まれる。
【００３９】
また、γ−オリザノールを内包する生体適合性粒子は、実施例５に示すように、肝臓におけるＰＧＣ１α、Ｐｅｐｃｋ及びＧ６Ｐａｓｅの発現、並びに脂肪組織におけるＰＰＡＲｇ２の発現を抑制する。したがって、別の実施の形態では、γ−オリザノールを内包する生体適合性粒子は、ＰＧＣ１α発現抑制剤、Ｐｅｐｃｋ発現抑制剤、Ｇ６Ｐａｓｅ発現抑制剤及びＰＰＡＲｇ２発現抑制剤として用いることができる。
【００４０】
また、γ−オリザノールを内包する生体適合性粒子は、実施例５に示すように、肝臓におけるＡＣＣ１、Ｆａｓ、Ｓｒｅｂｐ１ｃ、Ｐｐａｒａ、Ｓｒｅｂｐ２、Ｌｄｌｒ、Ｈｍｇｃｓ及びＨｍｇｃｒを抑制する。したがって、別の実施の形態では、γ−オリザノールを内包する生体適合性粒子は、ＡＣＣ１発現抑制剤、Ｆａｓ発現抑制剤、Ｓｒｅｂｐ１ｃ発現抑制剤、Ｐｐａｒａ発現抑制剤、Ｓｒｅｂｐ２発現抑制剤、Ｌｄｌｒ発現抑制剤、Ｈｍｇｃｓ発現抑制剤及びＨｍｇｃｒ発現抑制剤として用いることができる。
【００４１】
別の実施の形態では、γ−オリザノールを内包する上記生体適合性粒子を患者に投与することにより、該患者の腸内細菌叢の構成比率を調整する方法が提供される。
【実施例】
【００４２】
以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【００４３】
（実施例１  γ−オリザノールナノ粒子の調製）
以下の実施例で使用するγ−オリザノールを内包するＰＬＧＡ粒子を、水中エマルジョン法で作製した。２ｇのＰＬＧＡ（ＰＬＧＡ７５２０、乳酸：グリコール酸＝７５：２５、平均重量分子量２０，０００、和光純薬工業社製）と０．１ｇのγ−オリザノール（和光純薬工業社製）とを、アセトン４０ｍＬ及びエタノール２０ｍＬの混合溶媒に溶解しポリマー溶液とした。これを４０℃、４００ｒｐｍで攪拌した０．５重量％ポリビニルアルコール溶液（ゴーセノール（商標）ＥＧ５０、日本合成化学工業社製）１２０ｍＬ中に一定速度（４ｍＬ／分）で滴下し、γ−オリザノールナノ粒子懸濁液を得た。続いて減圧下４０℃、１００ｒｐｍで攪拌を続けながら、混合溶媒を留去した。約２時間の混合溶媒留去後、懸濁液をフィルターろ過（目開き３２μｍ）し、ろ液を一晩凍結乾燥し、γ−オリザノールナノ粒子の乾燥粉末を得た。
【００４４】
γ−オリザノールナノ粒子の平均粒径は、γ−オリザノールナノ粒子を蒸留水に懸濁した試料について、Ｍｉｃｒｏｔｒａｃｋ  ＵＰＡ１５０（日機装社製）を用いた光散乱法で計測した。また、γ−オリザノールナノ粒子のゼータ電位を測定するために、ミリＱ水で５ｍｇ／ｍＬのγ−オリザノールナノ粒子溶液を調製し、３０秒間ボルテックスミキサーで撹拌し、１０分間、超音波で処理した。得られた試料のゼータ電位を、Ｎａｎｏｔｒａｃ  Ｗａｖｅ−ＵＺ１５２（日機装社製）を用いて測定した。
【００４５】
γ−オリザノールナノ粒子と同様に、インドシアニングリーン（以下「ＩＣＧ」とする、第一三共社製）又はフルオレセインイソチオシアネート（以下「ＦＩＴＣ」とする、ＦＩＴＣ−Ｉ  ３４３−０３６６４、同仁化学研究所製）を内包するナノ粒子を調製した。ＩＣＧナノ粒子及びＦＩＴＣナノ粒子についても、γ−オリザノールナノ粒子と同様に、平均粒径を求めた。
【００４６】
（結果）
γ−オリザノールナノ粒子に関して、平均粒径は２１４．８±４．３ｎｍ、ＰＬＧＡに対するγ−オリザノールの含量は平均して３.０重量％であった。γ−オリザノールナノ粒子のゼータ電位は、−１９．４±１．５ｍＶであった。ＩＣＧナノ粒子の平均粒径は３５４ｎｍ、ＰＬＧＡに対するＩＣＧの含量は３．４重量％であった。ＦＩＴＣナノ粒子の平均粒径は２０５ｎｍ、ＰＬＧＡに対するＦＩＴＣの含量は３．５重量％であった。
【００４７】
（実施例２  ＰＬＧＡナノ粒子の体内動態の評価）
経口投与したＰＬＧＡナノ粒子のマウスにおける組織分布を評価した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（オリエンタルバイオサービス社製）に水に懸濁したＩＣＧ又はＩＣＧナノ粒子（濃度１４７ｍｇ／ｍＬ）を、ガベージニードルを用いて胃に３ｍｇ／個体で投与した。投与後１．５時間、３時間、１日、２日、３日及び４日に、分子イメージング装置であるＦＭＴ４０００  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）で非侵襲的にマウスを撮影した（励起波長：７４５ｍ、検出波長７７０〜８００ｎｍ）。
【００４８】
（結果）
図１（Ａ）に示すように、ＩＣＧは投与１日後に最も検出され、２日以内に速やかに減少した。一方、ＩＣＧナノ粒子の場合、図１（Ｂ）に示すように、ＩＣＧ原体と比較して投与１日後に多くのＩＣＧが検出され、より長く生体内に停留した。ＩＣＧナノ粒子によって、ＩＣＧが腸、腎臓及び脾臓に主に分布した。
【００４９】
（実施例３  γ−オリザノールナノ粒子の体重及び血糖値に対する効果）
ｏｂ／ｏｂマウス（雄、５週齢、Ｌｅｐｏｂ／Ｌｅｐｏｂ、日本チャールズリバー社製）及びｏｂ／＋マウス（雄、５週齢、Ｌｅｐｏｂ／＋、日本チャールズリバー社製）を、２４℃で１２時間／１２時間の明暗サイクル下で飼育した。マウスには飼料及び水を自由摂取させた。４週間に渡って、水に懸濁したγ−オリザノールナノ粒子を、γ−オリザノールの投与量が１日当たり０．０１又は０．１μｇ／ｇ体重となるように毎日ガベージニードルを用いてマウスの胃に投与した。
【００５０】
対照として、γ−オリザノール原体（和光純薬工業社製）を０．５％メチルセルロース溶液（和光純薬工業社製）に３２．０重量％で懸濁し、得られた懸濁液を、γ−オリザノール原体の投与量が１日当たり３２０μｇ／ｇ体重となるようにガベージニードルを用いてマウスの胃に毎日投与した。なお、各実験では、γ−オリザノールナノ粒子及びγ−オリザノール原体の溶媒（それぞれ原体−ｖｅｈｉｃｌｅ及びナノ粒子−ｖｅｈｉｃｌｅ）もそれぞれ同様にマウスに投与した。
【００５１】
所定の時点におけるマウスの体重及び血中グルコース濃度を測定した。血中グルコース濃度は、尾静脈から採取した全血を対象として、簡易血糖測定器（メディセーフ（登録商標）ミニ、テルモ社製）を用いて測定した。さらに、投与開始から４週後の血中のインスリン濃度を、インスリン測定キット（森永生化学研究所製）を用いてＥＬＩＳＡ法で決定した。また、投与期間中のマウスの摂食量を定量した。
【００５２】
（結果）
図２（Ａ）及び（Ｂ）は、それぞれγ−オリザノール原体及びγ−オリザノールナノ粒子を投与したマウスの体重の経時変化を示す（ｎ＝８）。γ−オリザノール原体及びγ−オリザノールナノ粒子ともにｏｂ／ｏｂマウスの体重増加に影響を及ぼさなかった。
【００５３】
図２（Ｃ）及び（Ｄ）は、それぞれγ−オリザノール原体及びγ−オリザノールナノ粒子を投与したマウスの血中グルコース濃度の経時変化を示す（ｎ＝８）。γ−オリザノール原体は、ｏｂ／ｏｂマウスの血中グルコース濃度に影響を及ぼさなかった。一方、γ−オリザノールナノ粒子は、ｖｅｈｉｃｌｅと比較して、ｏｂ／ｏｂマウスの血中グルコース濃度を有意に低下させた。
【００５４】
図２（Ｅ）は、血漿中のインスリン濃度を示す（ｎ＝８）。γ−オリザノール原体は、ｏｂ／ｏｂマウスのインスリン濃度に影響を及ぼさなかったが、γ−オリザノールナノ粒子は、インスリン濃度を有意に減少させた。なお、γ−オリザノール原体及びγ−オリザノールナノ粒子を投与したマウス間で摂食量に有意な違いは見られなかった。
【００５５】
（実施例４  γ−オリザノールナノ粒子のグルコース代謝に対する効果）
耐糖能を評価するために、経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）を行った。実施例３と同様にγ−オリザノールナノ粒子等を２週間に渡って投与したマウスを１８時間絶食させた後、０．７５ｇ／ｋｇのブドウ糖をマウスに経口投与し、投与後２時間までの間で所定の時間に血中グルコース濃度を測定した。
【００５６】
経口ブドウ糖負荷試験での膵島におけるＥＲストレスを評価するために、ＥＲストレスマーカー遺伝子であるＣｈｏｐ、ＥＲｄｊ４及びＸｂｐ１ｓの発現量を、定量リアルタイムＰＣＲ法で解析した。まず、膵島を、公知の方法に従って、コラゲナーゼ消化（Ｌｉｂｅｒａｓｅ  ＴＬ、ロシュ・ダイアグノスティックス社製）によってマウスから単離し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（商標）勾配（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ  １０７７、シグマ−アルドリッチ社製）で精製した。
【００５７】
単離した膵島中の全ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ（商標）  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ライフテクノロジーズ社製）を用いたフェノール・クロロホルム法で抽出し、ｉＳｃｒｉｐｔ（商標）  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（バイオラッド社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。次に、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（商標）  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍｓ及びＦａｓｔ  ＳＹＢＲ（商標）  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ライフテクノロジーズ社製）を用いて、合成したｃＤＮＡよりＥＲストレスマーカー遺伝子の発現量を解析した。なお、発現量は、１８Ｓ  ｒＲＮＡで正規化した。Ｃｈｏｐのフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列を、それぞれ配列番号１、２に示す。ＥＲｄｊ４のフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列を、それぞれ配列番号３、４に示す。Ｘｂｐ１ｓのフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列を、それぞれ配列番号５、６に示す。１８Ｓ  ｒＲＮＡのフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列を、それぞれ配列番号７、８に示す。
【００５８】
免疫組織化学分析のために、マウスから採取した膵臓を４％パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋し、薄片化し、標本を作製した。標本をヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）で染色し、抗インスリン抗体（Ａ０６５４、ダコ社製）、抗グルカゴン抗体（Ａ０５６５、ダコ社製）及び抗クリーブドカスパーゼ−３抗体（９６６１、セルシグナリングテクノロジー社製）を用いて免疫染色した。膵島の平均サイズ並びに膵島の全領域に対するインスリン、グルカゴン及びクリーブドカスパーゼ−３の陽性領域の各比は、各群（ｎ＝３）で１０８〜１４４個の膵島に基づいてＰｈｏｔｏｓｈｏｐ（Ａｄｏｂｅ社製）を用いて算出した。
【００５９】
（結果）
ＯＧＴＴでは、図３（Ａ）及び図３（Ｂ）に示すように、γ−オリザノール原体を投与したマウスの血中グルコース濃度は、ｖｅｈｉｃｌｅと大きな差はなかった（ｎ＝８）。一方、γ−オリザノールナノ粒子を投与したマウスでは、図３（Ｃ）及び図３（Ｄ）に示すように、ｖｅｈｉｃｌｅと比較して血中グルコース濃度が有意に低下した（ｎ＝８）。
【００６０】
Ｃｈｏｐ、ＥＲｄｊ４及びＸｂｐ１ｓの発現量については、それぞれ図４（Ａ）〜（Ｃ）に示すように、γ−オリザノール原体を投与したマウスでは、ｖｅｈｉｃｌｅに対して有意な変化は見られなかったが、γ−オリザノールナノ粒子を投与したマウスにおいて、発現量が有意に低下した。
【００６１】
免疫組織化学分析の結果として、４００倍に拡大して撮像した標本を図５（Ａ）に示す（スケールバーは２０μｍ）。図５（Ｂ）に示すように、ｏｂ／ｏｂマウスの膵島肥大がγ−オリザノールナノ粒子の投与によって抑制された（ｎ＝３）。また、γ−オリザノールナノ粒子の投与によって、図５（Ｃ）に示すように、膵島におけるインスリン陽性領域が増加し、図５（Ｄ）及び（Ｅ）に示すようにグルカゴン及びクリーブドカスパーゼ−３の陽性領域がいずれも減少した（ｎ＝３）。このため、γ−オリザノールナノ粒子は、膵島の機能を顕著に改善させることが示された。
【００６２】
（実施例５  γ−オリザノールナノ粒子のインスリン感受性に対する効果）
インスリン感受性を評価するために、インスリン耐性試験（ＩＴＴ）を行った。実施例３と同様にγ−オリザノールナノ粒子等を３週間に渡って投与したマウスを４時間絶食させた後、インスリン（０．５ユニット／ｋｇ体重、イーライリリー社製）をマウスの腹腔内に注射した。インスリン投与後２時間までの間で所定の時間に血中グルコース濃度を測定した。
【００６３】
肝臓におけるインスリン抵抗性を評価するために、上記実施例４と同様に、単離した肝臓からフェノール・クロロホルム法で抽出した全ＲＮＡを用いてｃＤＮＡを合成し、上記ＥＲストレスマーカー遺伝子に加え、糖新生遺伝子としてＰＧＣ１α、Ｐｅｐｃｋ及びＧ６Ｐａｓｅのマウスの肝臓におけるｍＲＮＡの発現量を、定量リアルタイムＰＣＲ法で分析した。ＰＧＣ１αのフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列を、それぞれ配列番号９、１０に示す。Ｐｅｐｃｋのフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列を、それぞれ配列番号１１、１２に示す。Ｇ６Ｐａｓｅのフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列を、それぞれ配列番号１３、１４に示す。
【００６４】
脂肪組織において、高脂肪食に起因するＥＲストレス及び炎症がインスリン抵抗性の促進に重要な役割を果たすことが知られている。そこで、上記実施例４と同様に、単離した腸間膜脂肪からフェノール・クロロホルム法で抽出した全ＲＮＡを用いてｃＤＮＡを合成し、上記ＥＲストレスマーカー遺伝子に加え、炎症性遺伝子としてＴＮＦα、ＩＬ６、Ｍｃｐ１及びＰＰＡＲｇ２のマウスの腸間膜脂肪におけるｍＲＮＡの発現量を、定量リアルタイムＰＣＲ法で分析した。
【００６５】
ＴＮＦαのフォワードプライマー、リバースプライマー及びプローブの塩基配列を、それぞれ配列番号１５、１６、１７に示す。ＩＬ６のフォワードプライマー、リバースプライマー及びプローブの塩基配列を、それぞれ配列番号１８、１９、２０に示す。Ｍｃｐ１のフォワードプライマー、リバースプライマー及びプローブの塩基配列を、それぞれ配列番号２１、２２、２３に示す。ＰＰＡＲｇ２のフォワードプライマー、リバースプライマー及びプローブの塩基配列を、それぞれ配列番号２４、２５、２６に示す。なお、本実施例及び以下で用いるプローブは、５’末端をＦＡＭで、３’末端をＴＡＭＲＡで標識した。
【００６６】
肝臓においてＥＲストレスで誘導されるインスリン抵抗性は、脂質生成を過剰にし、脂質代謝異常を引き起こす。マウスの脂質代謝を評価するために、実施例３と同様にγ−オリザノールナノ粒子等を４週間に渡ってマウスに投与し、血漿、肝臓組織及び糞便中のトリグリセリド及び総コレステロールの量を測定した。血漿は、γ−オリザノールナノ粒子等を投与開始から４週後の安楽死時に採取した。マウスの糞便は、安楽死させる前の１週間、採取し、乾燥させた。糞便及び肝臓組織から総脂質をＦｏｌｃｈ法により抽出した。トリグリセリド及び総コレステロールの濃度は、それぞれトリグリセリドＥ−テストキット（和光純薬工業社製）及び総コレステロールＥ−テストキット（和光純薬工業社製）を用いて測定した。
【００６７】
Ｏｉｌ  ｒｅｄ  Ｏ染色のために、マウスの肝臓組織をＯＣＴ化合物で凍結させた。浮遊している肝臓の部分を０．３％  Ｏｉｌ  ｒｅｄ  Ｏ溶液（シグマ−アルドリッチ社製）で染色し、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ（シグマ−アルドリッチ社製）を用いて標本にした。次にスライドに対してヘマトキシリン対比染色を行った。
【００６８】
肝臓における新たな脂肪酸合成又はコレステロール合成に関連する遺伝子の発現量を調べるために、マウスの肝臓におけるＡＣＣ１、Ｆａｓ、Ｓｒｅｂｐ１ｃ、Ｐｐａｒａ、Ｓｒｅｂｐ２、Ｌｄｌｒ、Ｈｍｇｃｓ及びＨｍｇｃｒのｍＲＮＡの発現量を、定量リアルタイムＰＣＲ法で分析した。
【００６９】
ＡＣＣ１のフォワードプライマー、リバースプライマー及びプローブの塩基配列を、それぞれ配列番号２７、２８、２９に示す。Ｆａｓのフォワードプライマー、リバースプライマー及びプローブの塩基配列を、それぞれ配列番号３０、３１、３２に示す。Ｓｒｅｂｐ１ｃのフォワードプライマー、リバースプライマー及びプローブの塩基配列を、それぞれ配列番号３３、３４、３５に示す。Ｐｐａｒａのフォワードプライマー、リバースプライマー及びプローブの塩基配列を、それぞれ配列番号３６、３７、３８に示す。Ｓｒｅｂｐ２のフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列を、それぞれ配列番号３９、４０に示す。Ｌｄｌｒのフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列を、それぞれ配列番号４１、４２に示す。Ｈｍｇｃｓのフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列を、それぞれ配列番号４３、４４に示す。Ｈｍｇｃｒのフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列を、それぞれ配列番号４５、４６に示す。
【００７０】
（結果）
ＩＴＴでは、図６（Ａ）及び図６（Ｂ）に示すように、γ−オリザノール原体を投与したマウスの血中グルコース濃度は、ｖｅｈｉｃｌｅと大きな差はなかった（ｎ＝８）。γ−オリザノールナノ粒子を投与したマウスでは、図６（Ｃ）及び図６（Ｄ）に示すように、ｖｅｈｉｃｌｅと比較して血中グルコース濃度が有意に低下した（ｎ＝８）。
【００７１】
ｏｂ／ｏｂマウスの肝臓におけるＣｈｏｐ、ＥＲｄｊ４及びＸｂｐ１ｓの発現量は、ｏｂ／＋マウスと比較して高かった。図７（Ａ）〜（Ｃ）に示すように、肝臓におけるＣｈｏｐ、ＥＲｄｊ４及びＸｂｐ１ｓの発現量は、γ−オリザノールナノ粒子を投与したマウスにおいて有意に低下したが、γ−オリザノール原体はＣｈｏｐ、ＥＲｄｊ４及びＸｂｐ１ｓの発現量に影響しなかった（ｎ＝８）。肝臓におけるＰＧＣ１α、Ｐｅｐｃｋ及びＧ６Ｐａｓｅの発現量についても、図８（Ａ）〜（Ｃ）に示すように、γ−オリザノールナノ粒子を投与したマウスにおいて有意に低下した（ｎ＝８）。
【００７２】
ｏｂ／ｏｂマウスの腸間膜脂肪におけるＴＮＦα、ＩＬ６及びＭｃｐ１の発現量は、図９（Ａ）〜（Ｃ）に示すように、γ−オリザノール原体を投与したマウスでもγ−オリザノールナノ粒子を投与したマウスでも低下した（ｎ＝８）。同様に、Ｃｈｏｐ、ＥＲｄｊ４及びＸｂｐ１ｓは、図１０（Ａ）〜（Ｃ）に示すように、γ−オリザノール原体を投与したマウス及びγ−オリザノールナノ粒子を投与したマウス両方で低下した（ｎ＝８）。また、図１１に示すように、γ−オリザノールナノ粒子はＰＰＡＲｇ２の発現量を低下させたが、γ−オリザノール原体はＰＰＡＲｇ２の発現量に影響しなかった（ｎ＝８）。
【００７３】
図１２（Ａ）及び図１３（Ａ）に示すように、γ−オリザノール原体は血漿中のトリグリセリド及び総コレステロールの濃度に影響しなかったが、γ−オリザノールナノ粒子は、血漿中のトリグリセリド及び総コレステロールの濃度を顕著に低下させた（ｎ＝８）。また、図１２（Ｂ）及び図１３（Ｂ）に示すように、γ−オリザノールナノ粒子は、肝臓組織におけるトリグリセリドの濃度を有意に低下させ、総コレステロールの濃度も低下させた（ｎ＝８）。この結果は、Ｏｉｌ  ｒｅｄ  Ｏ染色においてナノ粒子−ｖｅｈｉｃｌｅを投与したマウスの肝臓組織が、γ−オリザノールナノ粒子（１日当たり０．１μｇ／ｇ体重）を投与したマウスの肝臓組織より赤色に染色される部分が大きいことでも支持されていた。
【００７４】
一方、図１２（Ｃ）及び図１３（Ｃ）に示すように、γ−オリザノールナノ粒子は、０．０１μｇ／ｇ体重では、糞便中のトリグリセリドの濃度にほとんど影響を及ぼさず、糞便中の総コレステロールの濃度には、０．１μｇ／ｇ体重でもほとんど影響しなかった（ｎ＝８）。以上のデータから、γ−オリザノールナノ粒子は肝臓における脂質合成を抑制するが、脂質の吸収にはほとんど影響しないことが示された。
【００７５】
肝臓における新たな脂肪酸合成に関連する各遺伝子の発現量を図１４（Ａ）〜（Ｄ）に、コレステロール合成に関連する各遺伝子の発現量を図１５（Ａ）〜（Ｄ）に示す（ｎ＝８）。γ−オリザノール原体はこれらの遺伝子の発現量に影響しなかったが、γ−オリザノールナノ粒子はこれらの遺伝子の発現量を有意に抑制した。
【００７６】
（実施例６  マイクロアレイ解析）
γ−オリザノールナノ粒子の影響をさらに調べるために、上記実施例３の各群から３匹ずつ選択したマウスの肝臓における遺伝子発現プロファイルをＤＮＡマイクロアレイで解析した。肝臓の全ＲＮＡを、アガロースゲル電気泳動で質的に、紫外分光測定で量的に評価した。ＤＮＡマイクロアレイ分析はアフィメトリクス社の説明書に従って実行した。蛍光シグナル強度は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（商標）  ＧｅｅｎＣｈｉｐ（商標）  Ｓｃａｎｎｅｒ  ３０００  ７Ｇで測定した。アレイイメージを各プローブの強度の値に変換するために、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｃｏｍｍａｎｄ  Ｃｏｎｓｏｌｅソフトウェアを用いた。すべてのマイクロアレイのデータをＭｉｎｉｍｕｍ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ａｂｏｕｔ  ａ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ（ＭＩＡＭＥ）のフォーマットに準拠させ、ＭＩＡＭＥ準拠のデータベースに保存した。
【００７７】
遺伝子発現プロファイルのデータは、Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｆｒｅｅ  Ｗｅｉｇｈｔｅｄ（ＤＦＷ）法で定量化し、ｒａｎｋ  ｐｒｏｄｕｃｔ法を用いて群間で比較した。さらに、オンラインのソフトウェアであるＤＡＶＩＤ（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｆｏｒ  Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ，Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を用いて、同定されたプローブセットに対応する遺伝子の遺伝子オントロジー（ＧＯ）を決定した。
【００７８】
（結果）
γ−オリザノール原体を投与した群において、発現が増加した８２個のプローブセット及び発現が減少した１００個のプローブセットが、ｖｅｈｉｃｌｅに対してＦＤＲ値が０．０５を超えたものとして同定された。一方、γ−オリザノールナノ粒子を投与した群では、発現が増加した１３４個のプローブセット及び発現が減少した８１個のプローブセットが、ｖｅｈｉｃｌｅに対してＦＤＲ値が０．０５を超えたものとして同定された。なお、発現増加及び発現減少のプローブセットでは、それぞれわずか１９個及び８個のプローブセットがγ−オリザノール原体を投与した群とγ−オリザノールナノ粒子を投与した群とで重複していた。
【００７９】
ＧＯ解析の結果、γ−オリザノール原体によって発現が顕著に増加したＧＯは、脂質代謝プロセス（ＧＯ：０００６６２９）及びモノカルボン酸代謝プロセス（ＧＯ：００２７８７）等であった。一方、γ−オリザノールナノ粒子によって発現が顕著に増加したＧＯは、脂質代謝プロセス（ＧＯ：０００６６２９）であった。これにより、γ−オリザノールは、本来、肝臓における脂質代謝異常を改善するが、ＰＬＧＡでナノ粒子化することで、異なる機序で脂質代謝のさらなる影響を及ぼしていることが示唆された。
【００８０】
（実施例７  腸内細菌叢構成比率の解析及び末梢血における短鎖脂肪酸濃度の測定）
実施例３と同様に、γ−オリザノールナノ粒子等を４週間に渡って投与したマウスの糞便から微生物のＤＮＡを、ＱＩＡａｍｐ  Ｆａｓｔ  ＤＮＡ  Ｓｔｏｏｌ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアジェン社製）を用いて抽出し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｍｉｓｅｑ  ｐｌａｔｆｏｒｍ（イルミナ社製）を用いて１６ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のＶ３−Ｖ４領域を増幅し、塩基配列を決定し、分析した。ＣＤ−ＨＩＴ−ＯＴＵ（Ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ  Ｕｎｉｔ）を用いて、アンプリコン読み取りを９７％の同一性でＯＴＵに分類した。系統発生学的な系列をＲｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒで割り当て、ＰｙＮＡＳＴアルゴリズムでアライメントを行い、ＱＩＩＭＥを用いたＦａｓｔＴｒｅｅ法で全系統樹を演算した。選択したＯＴＵの系統樹をＭＥＧＡ  ５．０を用いた近隣結合法で計算した。
【００８１】
上記実施例３の各群を構成するマウスの血漿１００μＬに、内部標準として２ｎｍｏｌのエチル酪酸を含む水１０μＬを添加した。この血漿試料を酸性２−ＮＰＨ・ＨＣｌを用いた誘導体化法で処理した。得られたヒドラジドの混合物に、４ｍＬの１／３０Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６．４）−０．５Ｍ塩酸（体積比が３．８：０．４）を添加することで中和し、長鎖脂肪酸ヒドラジド及び妨害物質を除去するために、５ｍＬのｎ−ヘキサンで洗浄した。続いて、水層を３ｍＬ分取した。短鎖脂肪酸のヒドラジドを４ｍＬのジエチルエーテルで抽出した。エーテル層を３ｍＬの１／３０Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６．４）で洗浄し、室温の窒素流で蒸発させた。残渣を５０μＬのメタノールに溶解させ、液体クロマトグラフ−タンデム型質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）の試料とした。
【００８２】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ装置に５〜１０μＬの試料を注入した。クロマトグラフ分離にはＯＤＳカラムを使用し、２種類の移動相で、陰イオンのエレクトロスプレー法でイオン化を行い、多重反応モニタリングを用いた。
【００８３】
（結果）
図１６（Ａ）に示すように、ｏｂ／＋マウスとｏｂ／ｏｂマウスとの間で、腸内細菌叢の多様性にほとんど違いはなかった。また、γ−オリザノール原体及びγ−オリザノールナノ粒子ともに腸内細菌叢の多様性に影響しなかった。Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ／Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓの比は、図１６（Ｂ）及び（Ｃ）に示すように、ｏｂ／ｏｂマウスで明らかに増加した。γ−オリザノール原体は、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ／Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓの比にほとんど影響しなかったが、γ−オリザノールナノ粒子は、濃度依存的にＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓ／Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓの比を減少させた。
【００８４】
図１７（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）は、それぞれ短鎖脂肪酸である酢酸、プロピオン酸、ｎ−酪酸及びｎ−バレリアン酸の血中濃度を示す。γ−オリザノール原体を投与しても、酢酸、プロピオン酸、ｎ−酪酸及びｎ−バレリアン酸の血中濃度にほとんど影響はなかったが、γ−オリザノールナノ粒子を投与すると、プロピオン酸及びｎ−バレリアン酸の血中濃度が上昇した。
【００８５】
（実施例８  食物脂肪に対する嗜好性への影響の評価）
γ−オリザノールナノ粒子による摂食行動への影響を調べるために、普通食（脂肪としてエネルギーの１０％）及び高脂肪食（脂肪としてエネルギーの４５％）を自由に摂食できる状態でマウスを飼育した場合の食物消費について検討した。普通食及び高脂肪食は、ペレット状で、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ社製である。マウスには、４週間に渡って、１日当たり０．１μｇ／ｇ体重のγ−オリザノールナノ粒子又は０．１μｇ／ｇ体重のＦＩＴＣナノ粒子を、ガベージニードルを用いて胃に投与した。普通食及び高脂肪食の摂食量を毎週計測し、食物脂肪に対する嗜好性の変化を評価した。高脂肪食嗜好性は、（高脂肪食の摂食量／総摂食量）×１００（％）で求めた。
【００８６】
視床下部におけるＥＲストレスマーカー遺伝子及び炎症性遺伝子の発現への影響を評価するために、上記実施例４と同様に、単離した視床下部からフェノール・クロロホルム法で抽出した全ＲＮＡを用いてｃＤＮＡを合成し、Ｃｈｏｐ、ＥＲｄｊ４、Ｘｂｐ１ｓ、ＴＮＦα及びＭｃｐ１のｍＲＮＡの発現量を、定量リアルタイムＰＣＲ法で分析した。
【００８７】
マウスの視床下部の遺伝子発現プロファイルを調べるために、上記実施例２の各群から３匹ずつ選択したマウスの視床下部について、上記実施例５と同様にＤＮＡマイクロアレイで分析した。
【００８８】
（結果）
図１８に示すように、ｖｅｈｉｃｌｅは、高脂肪食に強い嗜好性を示したが、γ−オリザノールナノ粒子を投与することで、高脂肪食への嗜好性が顕著に抑制された（ｎ＝４）。なお、ｖｅｈｉｃｌｅとγ−オリザノールナノ粒子投与群とで、総摂食量に違いはなかった。
【００８９】
図１９に示すように、γ−オリザノールナノ粒子を投与することで、視床下部におけるＥＲストレスマーカー遺伝子のｍＲＮＡの発現量が顕著に低下していた（ｎ＝８）。図２０に示すように、視床下部における炎症性遺伝子についても同様に、γ−オリザノールナノ粒子の投与によって、それぞれｍＲＮＡの発現量が有意に低下していた（ｎ＝８）。これにより、γ−オリザノールナノ粒子は、視床下部のＥＲストレスを抑制することで、マウスの高脂肪食への嗜好性を抑制することが示された。
【００９０】
ＤＮＡマイクロアレイの結果、γ−オリザノール原体を投与した群において、発現が増加した７７個のプローブセット及び発現が減少した１７３個のプローブセットが、ｖｅｈｉｃｌｅに対してＦＤＲ値が０．０５を超えたものとして同定された。一方、γ−オリザノールナノ粒子を投与した群では、発現が増加した１０９個のプローブセット及び発現減少の３３６個のプローブセットが、ｖｅｈｉｃｌｅに対してＦＤＲ値が０．０５を超えたものとして同定された。なお、発現増加及び発現減少のプローブセットでは、それぞれわずか５個及び２２個のプローブセットがγ−オリザノール原体を投与した群とγ−オリザノールナノ粒子を投与した群とで重複していた。
【００９１】
ＧＯ解析の結果、γ−オリザノール原体によって発現が顕著に増加したＧＯは、高分子代謝プロセスの正の制御（ＧＯ：００１０６０４）、器官形態形成（ＧＯ：０００９８８７）、神経系の発達（ＧＯ：０００７３９９）、有機物への応答（ＧＯ：００１００３３）、細胞発達（ＧＯ：００４８４６８）及び細胞の代謝プロセスの正の制御（ＧＯ：００３１３２５）等であった。一方、γ−オリザノールナノ粒子によって発現が顕著に増加したＧＯは、生物学的プロセスの正の制御（ＧＯ：００４８５１８）、骨発達（ＧＯ：００６０３４８）、生物学的プロセスの負の制御（ＧＯ：００４８５１９）、多細胞生物プロセスの制御（ＧＯ：００５１２３９）、神経堤細胞の発達（ＧＯ：００１４０３２）、有機物への応答（ＧＯ：００１００３３）、管発達（ＧＯ：００３５２９５）、神経系の発達（ＧＯ：０００７３９９）、器官形態形成（ＧＯ：０００９８８７）及び骨化（ＧＯ：０００１５０３）であった。いくつかの遺伝子はγ−オリザノール原体とγ−オリザノールナノ粒子との間で逆に制御されていたことは、ＰＬＧＡを用いたナノ化によって視床下部を介した異なる機序におけるγ−オリザノールナノ粒子の機能が示唆された。
【００９２】
本発明は、本発明の広義の精神と範囲を逸脱することなく、様々な実施の形態及び変形が可能とされるものである。また、上述した実施の形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。すなわち、本発明の範囲は、実施の形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内及びそれと同等の発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。
【産業上の利用可能性】
【００９３】
本発明は、腸内細菌叢を構成する細菌の構成比率に起因する疾患に対する医薬又は機能性食品等に好適である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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