(57)【要約】      （修正有）【課題】試料中に含まれる標的粒子を、標識したそれぞれの蛍光物質由来の蛍光をより正確かつ迅速に検出する方法を提供する。【解決手段】標的粒子を、最大蛍光波長が互いに異なる３以上の蛍光物質で標識する工程と、前記標的粒子に励起光を照射する工程と、前記標的粒子に標識した前記蛍光物質由来の蛍光を、マルチバンドパスフィルタを通して、デジタルカラーカメラで測定する工程と、を含む前記標的粒子の測定方法であって、最大蛍光波長が最も短い蛍光物質の最大蛍光波長が、前記マルチバンドパスフィルタの最も短波長側の透過帯の下限よりも短いことを特徴とする測定方法。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的粒子を、最大蛍光波長が互いに異なる３以上の蛍光物質で標識する工程と、
前記標的粒子に励起光を照射する工程と、
前記標的粒子に標識した前記蛍光物質由来の蛍光を、マルチバンドパスフィルタを通して、デジタルカラーカメラで測定する工程と、
を含む前記標的粒子の測定方法であって、
最大蛍光波長が最も短い蛍光物質の最大蛍光波長が、前記マルチバンドパスフィルタの最も短波長側の透過帯の下限よりも短いことを特徴とする測定方法。
【請求項２】
前記標的粒子が細胞であって、細胞核を染色するのに、蛍光スペクトルの最大蛍光波長が短波長側から数えて２番目以降となる蛍光物質を用いることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は試料中に含まれる標的粒子を、最大蛍光波長が互いに異なる複数の蛍光物質を用いて検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液試料、組織懸濁液、培養液などの試料中に含まれる細胞の特徴や細胞種を推定しようとする際、細胞の小器官に特異的に結合する物質で染色することで標識し、当該標識された部位やその強度（標識具合）によって、前記細胞を推定することが通常行なわれる。例えば、テトラメチルローダミンメチルエステル（ＴＭＲＭ）はミトコンドリアに特異的に結合することから細胞内にミドコンドリアが存在しているかを知ることができる。また、ミトコンドリアは真核細胞に特徴的に見られる小器官であることから、ＴＭＲＭによって染色（標識）される細胞は、真核細胞であると推定できる。さらに、試料中に含まれる細胞を複数の特徴から推定しようとする際は、当該複数の特徴に対応した複数の物質で細胞を染色（標識）し、当該標識した物質の局在位置や強度に基づき前記特徴を検出することで前記細胞を推定する。
【０００３】
試料中に含まれる細胞の推定を標識具合に基づき行なう際、当該細胞に特異的に結合可能な蛍光物質を用いて標識し、標識した前記蛍光物質由来の蛍光強度を測定することで標識具合を判断する蛍光観察法が多く用いられる。蛍光観察法は外乱光による影響を抑えられるため、より正確な測定が可能である。試料中に含まれる細胞を複数の特徴に基づき蛍光観察法で推定しようとする際は、当該複数の特徴に対応した複数の蛍光物質を用いて標識し、当該蛍光物質由来の蛍光強度測定を、前記蛍光物質の蛍光スペクトルに対応した光学系に一つずつ順次切り替えて行なうことが多い。本方法は、標識したそれぞれの蛍光物質の標識具合を高い正確性で測定できる一方、同一の細胞に対し複数の光学系による測定または単一の光学系による複数回の測定が必要となり、測定時間が長くなる問題があった。
【０００４】
蛍光観察法において測定時間の短縮化が図れる方法の一例として、細胞に標識した複数の蛍光物質に由来する蛍光強度を、マルチバンドパスフィルタ（透過、遮光の範囲が複数からなる光学フィルタ）とデジタルカラーカメラを用いて測定する方法が挙げられる。本方法は、複数の蛍光物質の染色具合を同時に測定できるため、測定時間を短縮できる。しかしながら、蛍光検出の際、標識した特定の蛍光物質由来の蛍光の一部が、標識した別の蛍光物質由来の蛍光として検出（蛍光の漏れ込み）してしまい、蛍光測定の正確性が低下する問題があった。通常、デジタルカラーカメラはヒトの眼が認識できる範囲である４００ｎｍから７００ｎｍ付近に感度を有するよう設計される一方、標識に用いる蛍光物質の蛍光スペクトルは幅広いため、マルチバンドパスフィルタおよびデジタルカラーカメラを複数（特に３以上）の蛍光物質の蛍光スペクトルに対応させようとしても、前述した蛍光の漏れこみが発生し得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、標的粒子を標識したそれぞれの蛍光物質由来の蛍光を、より正確かつ迅速に検出する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、マルチバンドパスフィルタの最も短波長側の透過帯の下限よりも最大蛍光波長が短い蛍光物質を使用することで、他の透過帯への漏洩を低減できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は
標的粒子を、最大蛍光波長が互いに異なる３以上の蛍光物質で標識する工程と、
前記標的粒子に励起光を照射する工程と、
前記標的粒子に標識した前記蛍光物質由来の蛍光を、マルチバンドパスフィルタを通して、デジタルカラーカメラで測定する工程と、
を含む前記標的粒子の測定方法であって、
最大蛍光波長が最も短い蛍光物質の最大蛍光波長が、前記マルチバンドパスフィルタの最も短波長側の透過帯の下限よりも短いことを特徴とする測定方法である。
【０００８】
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００９】
本発明において標的粒子とは、細胞、ウイルス、オルガネラ、小胞等の蛍光物質によって標識可能な生体材料が挙げられる。標的粒子が前述した生体材料からなる粒子である場合、標的粒子を含む試料の一例としては、全血、希釈血液、血清、血漿、臍帯血、成分採血液、髄液、尿、唾液、精液、糞便、痰、羊水、腹水、腹腔洗浄液などの生体試料や、肝臓、肺、脾臓、腎臓、皮膚、腫瘍、リンパ節などの組織の一片を懸濁させた組織懸濁液や、前記生体試料又は前記組織懸濁液より分離して得られる、前記生体試料又は前記組織由来の細胞を含む画分や、あらかじめ単離した細胞の培養液等が挙げられる。このうち生体試料又は組織由来の細胞を含む画分の一例として、生体試料や組織懸濁液を密度勾配形成用媒体の上に重層後、密度勾配遠心することで得られる画分が挙げられる。
【００１０】
標的粒子を含む溶液が全血、希釈血液、血清、血漿、臍帯血、成分採血液などの血液試料である場合における、標的粒子の一例としては、血液循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）などの腫瘍細胞、循環血液内皮細胞（ＣＥＣ）、循環血管内皮細胞（ＣＥＰ）、循環胎児細胞（ＣＦＣ）、抗原特異的Ｔ細胞などの各種幹細胞が挙げられる。なお、本明細書における血液試料は、全血、血清、血漿、臍帯血、成分採血液といった血液検体に限らず、当該血液検体を生理食塩水などで希釈した試料や、当該血液検体より分離して得られる、前記血液検体由来の細胞を含む画分も、血液試料に含まれる。
【００１１】
本発明において、標的粒子の標識に用いる蛍光物質は、互いに異なる最大蛍光波長を有した物質である限り、特に限定はない。本発明における標的粒子への蛍光物質の標識態様の例として、試料中に含まれる単一の標的粒子を、最大蛍光波長が互いに異なる蛍光物質（例えば、最大蛍光波長Ａの蛍光物質、最大蛍光波長Ｂの蛍光物質および最大蛍光波長Ｃの蛍光物質の３種類）で標識する態様や、試料中に含まれる標的粒子が複数種類（例えば、標的粒子Ａ、標的粒子Ｂおよび標的粒子Ｃの３種類）あり、各標的粒子に対して最大蛍光波長が互いに異なる蛍光物質を標識（例えば、標的粒子Ａに対して最大蛍光波長Ａの蛍光物質、標的粒子Ｂに対して最大蛍光波長Ｂの蛍光物質、標的粒子Ｃに対して最大蛍光波長Ｃの蛍光物質）を標識する態様、が挙げられる。なお前記最大蛍光波長Ａ（またはＢ、Ｃ）の蛍光物質は最大蛍光波長が一致または概ね一致（例えば、最大蛍光波長の差が５ｎｍ以内）していればそれぞれ複数種類併用してもよい。
【００１２】
本発明において「標的粒子を蛍光物質で標識」とは、標的粒子と蛍光物質とを物理的、化学的に結合させることをいう。標識方法に特に限定はなく、例えば、標的粒子を蛍光色素で直接染色することにより標識してもよく、標的粒子と当該標的特有の物質に対する蛍光物質標識抗体とを抗原抗体反応で結合させることで標識してもよく、標的粒子と当該特有の物質に対する抗体（一次抗体）とを抗原抗体反応で結合させた後、当該一次抗体に対する蛍光物質標識抗体（二次抗体）とを抗原抗体反応で結合させることで標識してもよい。
【００１３】
本発明では標的粒子に標識した前記蛍光物質由来の蛍光をマルチバンドパスフィルタを通して、デジタルカラーカメラで測定する。マルチバンドパスフィルタは複数の透過帯を有するバンドパスフィルタであり、蛍光物質それぞれの蛍光スペクトルに対応した透過帯を有したフィルタであれば、市販品の中から適宜選択すればよい。なお、本明細書において「蛍光スペクトルに対応した透過帯」とは、必ずしも蛍光物質の最大蛍光波長がマルチバンドパスフィルタの透過帯に含まれなくてもよく、蛍光物質の最大蛍光波長における蛍光強度の８０％以上（好ましくは９０％以上）の蛍光強度を示す波長がマルチバンドパスフィルタの透過帯に含まれていればよい。具体例として、透過帯が４２５ｎｍから４６５ｎｍのマルチバンドパスフィルタの場合、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４０５の最大蛍光波長４２１ｎｍは前記透過帯に含まれない。しかしながら、前記透過帯は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４０５の最大蛍光波長における蛍光強度の８０％以上の蛍光強度を示す波長（４０５ｎｍから４３５ｎｍ、図１および５参照）には含まれるため、前記マルチバンドパスフィルタはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４０５の蛍光スペクトルに対応した透過帯を有するフィルタといえる。
【００１４】
また、デジタルカラーカメラは、光の強度を電気信号に変換するセンサーを持ち、波長帯ごとにそれぞれの像を得ることができる機器である。センサーの素子として代表的なものに、電荷結合素子（Ｃｈａｒｇｅ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｄｅｖｉｃｅｓ：ＣＣＤ）と、相補型金属酸化膜半導体（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  Ｍｅｔａｌ  Ｏｘｉｄｅ  Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ：ＣＭＯＳ）等があるが、本発明ではどのような素子であってもよい。多くのデジタルカラーカメラは光の三原色である青、緑、赤に対応するように作られるが、本発明でいうデジタルカラーカメラはこれに限定されず、２または４以上の波長帯の像を得るものであってもよい。波長帯ごとに分ける代表的な方法として単板式、三板式がある。単板式は、１つのセンサー上で受光素子ごとに分担する波長帯を割り当てる方式である。三板式は、ダイクロイックミラー等によって光学的に分解した後、それぞれのセンサーで波長帯ごとの像を得る方式である。本発明は単板式、三板式どちらであってもよく、またこれらに限られず波長帯ごとに分けて受光するものであればどのようなものであってもよい。
【００１５】
本発明は、最大蛍光波長が最も短い蛍光物質の最大蛍光波長が、マルチバンドパスフィルタの最も短波長側の透過帯の下限よりも短いことを特徴とする。換言すれば、マルチバンドパスフィルタが有する透過帯のうち、最大蛍光波長が最も短い蛍光物質の蛍光スペクトルに対応した透過帯が、前記蛍光物質の最大蛍光波長より長波長側であることを特徴としている。なお、前記透過帯以外の透過帯については、当該透過帯に対応する蛍光スペクトルを有した蛍光物質における最大蛍光波長に含まれていてもよい。
【００１６】
標的粒子が細胞の場合、その核を標識する蛍光物質として青色蛍光物質であるＤＡＰＩ（４’，６−ＤｉＡｍｉｄｉｎｏ−２−ＰｈｅｎｙｌＩｎｄｏｌｅ）が多く用いられる。しかしながら、この物質の最大蛍光波長は４６１ｎｍと青色蛍光物質としては比較的、長波長側にある。そのため、ＤＡＰＩと緑色蛍光物質（例えば、最大蛍光波長が５２３ｎｍであるＳＹＴＯＸ  Ｇｒｅｅｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製））とで少なくとも標識した細胞を、それぞれの蛍光スペクトルに対応した透過帯を有するマルチバンドパスフィルタを通して検出しようとした場合、前記緑色蛍光物質の蛍光スペクトルに対応した透過帯を通過した蛍光の中に、ＤＡＰＩ由来の蛍光が多く漏れ込む。例えば、青色蛍光物質がＤＡＰＩであり、マルチバンドパスフィルタの透過帯が波長４２５ｎｍから４６５ｎｍ（以下、チャネルＡと表記）および波長５００ｎｍから５６５ｎｍ（以下、チャネルＢと表記）である場合、チャネルＢからの蛍光には、チャネルＡからの蛍光量の５０％量に相当するＤＡＰＩ由来の蛍光が漏れ込む。そこで、青色蛍光物質をチャネルＡより短波長側に最大蛍光波長を有するＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４０５（最大蛍光波長：４２１ｎｍ）に変更することで、チャネルＢへの漏れ込み量をチャネルＡからの蛍光量の約５％量まで低減できる。
【００１７】
なお、標的粒子を細胞とし、細胞への標識が少なくとも細胞核への標識を含み、細胞への標識物質が少なくとも青色蛍光物質（例えば、最大蛍光波長４００ｎｍから５００ｎｍの蛍光物質）及び緑色蛍光物質（例えば、最大蛍光波長５００ｎｍから５５０ｎｍの蛍光物質）又は赤色蛍光物質（例えば、最大蛍光波長６００ｎｍから６５０ｎｍの蛍光物質）を含み、マルチバンドパスフィルタが少なくとも前記青色蛍光物質の蛍光スペクトルに対応した透過帯及び前記緑色蛍光物質又は前記赤色蛍光物質の蛍光スペクトルに対応した透過帯を互いに重ならないよう有している場合、細胞核への標識物質は緑色蛍光物質又は赤色蛍光物質とすると好ましい。前述した通り、細胞核への標識物質として知られている青色蛍光物質の最大蛍光波長は長波長側（具体的には４５０ｎｍ以上）にあり、本発明の方法を適用すべくマルチバンドパスフィルタの透過帯を前記最大蛍光波長より長波長側に設定すると、長波長側（緑色／赤色側）の検出領域が狭くなり、多色検出が困難となるからである。細胞核へ標識可能な緑色蛍光物質又は赤色蛍光物質の一例として、最大蛍光波長が５２３ｎｍであるＳＹＴＯＸ  Ｇｒｅｅｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）が挙げられる。なお、ＳＹＴＯＸ  Ｇｒｅｅｎは半値全幅が狭く、本発明の方法で用いる細胞核標識物質として好ましい態様である。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により、長波長側に隣接する透過帯への蛍光の漏れ込みを低減でき、最大蛍光波長が互いに異なる複数の蛍光物質で標識した標的粒子の迅速、高感度な測定が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】蛍光物質（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４０５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０）の蛍光スペクトル。
【図２】実施例で用いたマルチバンドパスフィルタの分光特性。
【図３】実施例で用いたカラーカメラ（ＣＭＯＳ）の分光感度曲線。
【図４】Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４０５またはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０による標識で得られた蛍光像（青チャネル（波長：４２５ｎｍから４６５ｎｍ）、緑チャネル（波長：５００ｎｍから５６５ｎｍ）および緑チャネル／青チャネル）。なお図中白四角で囲った範囲が蛍光強度比（緑チャネル／青チャネル）の算出に用いた領域である。
【図５】蛍光物質（ＳＹＴＯＸ  Ｇｒｅｅｎ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４０５）の蛍光スペクトル。
【図６】実施例で得られた蛍光像(元々は青緑赤３色からなる画像で、合成して１色にした画像である)。
【図７】図６の画像データを色分解（青チャネル）した画像である。
【図８】図６の画像データを色分解（緑チャネル）した画像である。
【図９】図６の画像データを色分解（赤チャネル）した画像である。
【実施例】
【００２０】
以下、実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００２１】
（蛍光物質の違いによる蛍光の漏れ込みの影響）
（１−１）がん細胞株ＰＣ−９を培養ディッシュで培養し、培養したがん細胞を４％パラホルムアルデヒド溶液による固定処理およびエタノールによる膜透過処理を行った後、一次抗体としてＡｎｔｉ−Ｐａｎ  ＣＫ（サイトケラチン）抗体（マウス由来、自家製）を、二次抗体としてＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４０５標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ａｂｃａｍ製）又はＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を、それぞれ用いて細胞質内のＣＫに対し蛍光物質を標識した。なお、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４０５の最大蛍光波長は４２１ｎｍであり、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０の最大蛍光波長は４４２ｎｍである（本実施例で用いた蛍光物質の蛍光スペクトルを図１に示す）。
【００２２】
（１−２）蛍光物質を標識したがん細胞に対し励起光（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４０５で標識した細胞は波長４０１ｎｍを含む光、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０で標識した細胞は波長３４６ｎｍを含む光）を照射し、得られた蛍光を蛍光顕微鏡（オリンパス製ＩＸ８３）で検出し、マルチバンドパスフィルタ（透過帯：４２５ｎｍから４６５ｎｍ（以下、青チャネルとも表記）、５００ｎｍから５６５ｎｍ（以下、緑チャネルとも表記）および６１０ｎｍから６８５ｎｍ（以下、赤チャネルとも表記）、Ｓｅｍｒｏｃｋ製、分光特性を図２に示す）を通して、カラーカメラ（ＩｍａｇｉｎｇＳｏｕｒｃｅ製ＤＦＫ２３ＵＸ２３６、本カメラに備えるＣＭＯＳ（ソニー製ＩＭＸ２３６）の分光感度曲線を図３に示す）で撮像した。
【００２３】
（１−３）青チャネルの蛍光像および緑チャネルの蛍光像（図４）中、細胞質部分の特定領域（図４の四角で囲った領域）における青チャネルの蛍光輝度に対する緑チャネルでの蛍光輝度の比（緑チャネルでの蛍光輝度／青チャネルの蛍光輝度）を算出し、緑チャネルへの蛍光の漏れ込みを評価した。
【００２４】
蛍光強度比を算出した結果、蛍光物質としてＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４０５を用いたときは０．３５８±０．０１４１となり、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０を用いたときは０．３８４±０．０９７３（範囲は標準偏差）となり、蛍光物質としてＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４０５を用いることで、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０を用いたときよりも緑チャネルへの蛍光の漏れ込みが抑えられていることがわかる。
【００２５】
以上の結果から、青チャネル（波長：４２５ｎｍから４６５ｎｍ）での蛍光検出に用いる蛍光色素として、最大蛍光波長が当該チャネルの透過帯よりも低波長側にあるＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４０５（最大蛍光波長：４２１ｎｍ）を用いるのが好ましいことがわかる。
【００２６】
（３種類の蛍光物質を用いたがん細胞の蛍光検出）
（２−１）がん細胞株ＰＣ−９を培養ディッシュで培養し、培養したがん細胞を４％パラホルムアルデヒド溶液による固定処理およびエタノールによる膜透過処理を行なった後、細胞核、核膜、細胞質内のＣＫに対し、それぞれ以下に示す方法で蛍光物質を標識した。なお、本実施例で用いた蛍光物質の蛍光スペクトルを図５に示す。
細胞核：ＳＹＴＯＸ  Ｇｒｅｅｎ（最大蛍光波長：５２３ｎｍ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）による染色
核膜：一次抗体Ａｎｔｉ−ＳＵＮ２抗体（ウサギ由来、Ｓｉｇｍａ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ製）を添加後、二次抗体Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３（最大蛍光波長：６３３ｎｍ）標識抗ウサギ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を添加することで標識
細胞質（ＣＫ）：一次抗体Ａｎｔｉ−Ｐａｎ  ＣＫ（サイトケラチン）抗体（マウス由来、自家製）を添加後、二次抗体Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４０５標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ａｂｃａｍ製）を添加することで標識
（２−２）（１−２）と同様の蛍光顕微鏡、マルチバンドパスフィルタおよびカラーカメラを用いて、蛍光像を取得した。
【００２７】
取得した蛍光像を図６に示す。また図６の画像から、マルチバンドパスフィルタの各透過帯（各チャネル）毎に色分解した画像を図７（青チャネル、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４０５による蛍光像に相当）、図８（緑チャネル、ＳＹＴＯＸ  Ｇｒｅｅｎによる蛍光像に相当）および図９（赤チャネル、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３による蛍光像に相当）に示す。図６の結果より、がん細胞の細胞核、核膜および細胞質（ＣＫ）がそれぞれの蛍光物質によって染色されていることが確認できた。また、色分解した画像（図７から図９）から、各チャネル（各蛍光色素）の染色具合を確認できた。
【００２８】
なお、本結果から、緑チャネル（波長：５００ｎｍから５６５ｎｍ）および赤チャネル（波長：６１０ｎｍから６８５ｎｍ）での蛍光検出用蛍光色素については、その最大蛍光波長が当該チャネル（透過帯）内であっても問題ないことがわかる（ＳＹＴＯＸ  Ｇｒｅｅｎの最大蛍光波長：５２３ｎｍ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３の最大蛍光波長：６３３ｎｍ）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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