(57)【要約】【課題】  熱や酸に対する安定性が向上したＦｃＲｎ、当該ＦｃＲｎの製造方法、当該ＦｃＲｎを用いた抗体吸着剤、および当該吸着剤を用いた抗体の分離方法を提供すること。【解決手段】  ヒトＦｃＲｎα鎖の細胞外領域および／またはヒトＦｃＲｎβ鎖のβ２ミクログロブリン領域中の特定位置にあるアミノ酸残基を他の特定のアミノ酸に置換することで前記課題を解決する。【選択図】  図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち２４番目のアラニンから２９７番目のセリンまでのアミノ酸残基および配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち２１番目のイソロイシンから１１９番目のメチオニンまでのアミノ酸残基を含み、ただし当該アミノ酸残基において以下の（１）から（３９）のうち少なくともいずれか１つの変異を有する、Ｆｃ結合性タンパク質：
（１）配列番号１の４９番目のバリンがアラニンに置換される変異、
（２）配列番号１の６２番目のアスパラギンがスレオニンに置換される変異、
（３）配列番号１の７１番目のシステインがアルギニンに置換される変異、
（４）配列番号１の７８番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換される変異、
（５）配列番号１の７９番目のグルタミンがヒスチジンに置換される変異、
（６）配列番号１の８０番目のバリンがアスパラギン酸に置換される変異、
（７）配列番号１の９６番目のリジンがグルタミン酸に置換される変異、
（８）配列番号１の１０３番目のリジンがグルタミン酸に置換される変異、
（９）配列番号１の１２５番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換される変異、
（１０）配列番号１の１２７番目のセリンがプロリンに置換される変異、
（１１）配列番号１の１５１番目のグリシンがアスパラギン酸に置換される変異、
（１２）配列番号１の１７２番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換される変異、
（１３）配列番号１の１７３番目のリジンがグルタミン酸に置換される変異、
（１４）配列番号１の１８０番目のフェニルアラニンがチロシンに置換される変異、
（１５）配列番号１の１９２番目のアルギニンがロイシンに置換される変異、
（１６）配列番号１の１９３番目のグリシンがアスパラギン酸に置換される変異、
（１７）配列番号１の１９６番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換される変異、
（１８）配列番号１の２０６番目のアルギニンがシステインに置換される変異、
（１９）配列番号１の２１０番目のアルギニンがシステインに置換される変異、
（２０）配列番号１の２１９番目のロイシンがヒスチジンに置換される変異、
（２１）配列番号１の２２０番目のスレオニンがアラニンに置換される変異、
（２２）配列番号１の２２６番目のフェニルアラニンがセリンに置換される変異、
（２３）配列番号１の２３２番目のグルタミンがロイシンに置換される変異、
（２４）配列番号１の２３３番目のロイシンがプロリンに置換される変異、
（２５）配列番号１の２５５番目のグリシンがセリンに置換される変異、
（２６）配列番号１の２５６番目のセリンがプロリンに置換される変異、
（２７）配列番号１の２６１番目のセリンがプロリンに置換される変異、
（２８）配列番号１の２６２番目のセリンがシステインに置換される変異、
（２９）配列番号１の２６３番目のロイシンがプロリンに置換される変異、
（３０）配列番号１の２６６番目のリジンがグルタミン酸またはアルギニンに置換される変異、
（３１）配列番号１の２６７番目のセリンがプロリンに置換される変異、
（３２）配列番号１の２７３番目のチロシンがヒスチジンに置換される変異、
（３３）配列番号１の２８２番目のロイシンがヒスチジンに置換される変異、
（３４）配列番号１の２８６番目のロイシンがヒスチジンに置換される変異、
（３５）配列番号１の２９５番目のリジンがグルタミン酸に置換される変異
（３６）配列番号２の３２番目のアルギニンがヒスチジンに置換される変異、
（３７）配列番号２の４２番目のフェニルアラニンがイソロイシンまたはチロシンに置換される変異、
（３８）配列番号２の６８番目のリジンがグルタミン酸に置換される変異、
（３９）配列番号２の８７番目のチロシンがヒスチジンに置換される変異。
【請求項２】
配列番号３に記載の配列からなるアミノ酸残基を含み、ただし当該アミノ酸残基において以下の（１）から（４５）のうち少なくともいずれか１つの変異を有する、請求項１に記載のＦｃ結合性タンパク質：
（１）配列番号３の１５２番目のバリンがアラニンに置換される変異、
（２）配列番号３の１６５番目のアスパラギンがスレオニンに置換される変異、
（３）配列番号３の１７４番目のシステインがアルギニンに置換される変異、
（４）配列番号３の１８１番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換される変異、
（５）配列番号３の１８２番目のグルタミンがヒスチジンに置換される変異、
（６）配列番号３の１８３番目のバリンがアスパラギン酸に置換される変異、
（７）配列番号３の１９９番目のリジンがグルタミン酸に置換される変異、
（８）配列番号３の２０６番目のリジンがグルタミン酸に置換される変異、
（９）配列番号３の２２８番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換される変異、
（１０）配列番号３の２３０番目のセリンがプロリンに置換される変異、
（１１）配列番号３の２５４番目のグリシンがアスパラギン酸に置換される変異、
（１２）配列番号３の２７５番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換される変異、
（１３）配列番号３の２７６番目のリジンがグルタミン酸に置換される変異、
（１４）配列番号３の２８３番目のフェニルアラニンがチロシンに置換される変異、
（１５）配列番号３の２９５番目のアルギニンがロイシンに置換される変異、
（１６）配列番号３の２９６番目のグリシンがアスパラギン酸に置換される変異、
（１７）配列番号３の２９９番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換される変異、
（１８）配列番号３の３０９番目のアルギニンがシステインに置換される変異、
（１９）配列番号３の３１３番目のアルギニンがシステインに置換される変異、
（２０）配列番号３の３２２番目のロイシンがヒスチジンに置換される変異、
（２１）配列番号３の３２３番目のスレオニンがアラニンに置換される変異、（２２）配列番号３の３２９番目のフェニルアラニンがセリンに置換される変異、
（２３）配列番号３の３３５番目のグルタミンがロイシンに置換される変異、
（２４）配列番号３の３３６番目のロイシンがプロリンに置換される変異、
（２５）配列番号３の３５８番目のグリシンがセリンに置換される変異、
（２６）配列番号３の３５９番目のセリンがプロリンに置換される変異、
（２７）配列番号３の３６４番目のセリンがプロリンに置換される変異、
（２８）配列番号３の３６５番目のセリンがシステインに置換される変異、
（２９）配列番号３の３６６番目のロイシンがプロリンに置換される変異、
（３０）配列番号３の３６９番目のリジンがグルタミン酸またはアルギニンに置換される変異、
（３１）配列番号３の３７０番目のセリンがプロリンに置換される変異、
（３２）配列番号３の３７６番目のチロシンがヒスチジンに置換される変異、
（３３）配列番号３の３８５番目のロイシンがヒスチジンに置換される変異、
（３４）配列番号３の３８９番目のロイシンがヒスチジンに置換される変異、
（３５）配列番号３の３９８番目のリジンがグルタミン酸に置換される変異、
（３６）配列番号３の１４番目のアルギニンがヒスチジンに置換される変異、
（３７）配列番号３の２４番目のフェニルアラニンがイソロイシンまたはチロシンに置換される変異、
（３８）配列番号３の５０番目のリジンがグルタミン酸に置換される変異、
（３９）配列番号３の６９番目のチロシンがヒスチジンに置換される変異、
（４０）配列番号３の１０７番目のグリシンがアスパラギン酸に置換される変異、
（４１）配列番号３の１１４番目のグリシンがアスパラギン酸に置換される変異、
（４２）配列番号３の１１７番目のグリシンがセリンに置換される変異、
（４３）配列番号３の１２３番目のグリシンがセリンまたはアスパラギン酸に置換される変異、
（４４）配列番号３の１２５番目のグリシンがアスパラギン酸に置換される変異、
（４５）配列番号３の１２６番目のセリンがアスパラギンに置換される変異。
【請求項３】
少なくとも以下に示す４つの変異を有する、請求項２に記載のＦｃ結合性タンパク質：
（３）配列番号３の１７４番目のシステインがアルギニンに置換される変異、
（４）配列番号３の１８１番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換される変異、
（１５）配列番号３の２９５番目のアルギニンがロイシンに置換される変異、
（２３）配列番号３の３３５番目のグルタミンがロイシンに置換される変異。
【請求項４】
以下の変異をさらに有する、請求項３に記載のＦｃ結合性タンパク質：
（１１）配列番号３の２５４番目のグリシンがアスパラギン酸に置換される変異。
【請求項５】
以下の変異をさらに有する、請求項４に記載のＦｃ結合性タンパク質：
（１７）配列番号３の２９９番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換される変異。
【請求項６】
以下の変異をさらに有する、請求項５に記載のＦｃ結合性タンパク質：
（３５）配列番号３の３９８番目のリジンがグルタミン酸に置換される変異。
【請求項７】
以下に示す変異のうち少なくとも１つをさらに有する、請求項６に記載のＦｃ結合性タンパク質：
（１）配列番号３の１５２番目のバリンがアラニンに置換される変異、
（１２）配列番号３の２７５番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換される変異、
（１９）配列番号３の３１３番目のアルギニンがシステインに置換される変異、
（２６）配列番号３の３５９番目のセリンがプロリンに置換される変異。
【請求項８】
配列番号５から７のいずれか一項に記載の配列からなるアミノ酸残基を含む、請求項３に記載のＦｃ結合性タンパク質。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか一項に記載のＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項９に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載の発現ベクターで宿主を形質転換して得られる形質転換体。
【請求項１２】
宿主が大腸菌である、請求項１１に記載の形質転換体。
【請求項１３】
（Ａ）請求項１１または１２に記載の形質転換体を培養することによりＦｃ結合性タンパク質を発現させる工程、および
（Ｂ）発現されたＦｃ結合性タンパク質を培養物から回収する工程、
を含む、Ｆｃ結合性タンパク質の製造方法。
【請求項１４】
請求項１から８のいずれか一項に記載のＦｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化して得られる吸着剤。
【請求項１５】
請求項１４に記載の吸着剤に、抗体を含む溶液を接触させる工程を含む、抗体の分離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫グロブリンに親和性のあるＦｃ結合性タンパク質に関する。より詳しくは、熱または酸に対する安定性が野生型よりも向上したヒト新生児（ｎｅｏｎａｔａｌ）Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）、当該レセプターをコードするポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドを利用したヒトＦｃＲｎの製造方法、および当該レセプターを不溶性担体に固定化して得られる抗体吸着剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｆｃレセプターは、免疫グロブリン分子のＦｃ領域に結合する一群の分子である。個々の分子は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する認識ドメインによって、単一の、または同じグループの免疫グロブリンイソタイプをＦｃレセプター上の認識ドメインによって認識している。これによって、免疫応答においてどのアクセサリー細胞が動因されるかが決まってくる。Ｆｃレセプターは、さらにいくつかのサブタイプに分類することができ、ＩｇＧ（免疫グロブリンＧ）に対するレセプターであるＦｃγレセプター、ＩｇＥのＦｃ領域に結合するＦｃεレセプター、ＩｇＡのＦｃ領域に結合するＦｃαレセプター等がある。また各レセプターは更に細かく分類されており、Ｆｃγレセプターは、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩｂの存在が報告されている（非特許文献１）。
【０００３】
一方、ヒト新生児Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）は免疫グロブリンスーパーファミリーに属するヒトＦｃγレセプターとは異なる、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ関連分子であり、重鎖（α鎖）と、β２ミクログロブリン（β鎖）により構成されている（非特許文献２）。ＦｃＲｎはＩｇＧのリサイクリング機構に関与しており、ＩｇＧの分解を抑制する働きをもつ。また、ＦｃＲｎはｐＨ依存的にＩｇＧと結合し、ｐＨ６．５以下で結合する（非特許文献３）。
【０００４】
ヒトＦｃＲｎのα鎖のアミノ酸配列（配列番号１）は、ＵｎｉＰｒｏｔ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：Ｐ５５８９９）などの公的データベースに公表されている。また、β鎖のアミノ酸配列（配列番号２）は、ＵｎｉＰｒｏｔ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：Ｐ６１７６９）に公表されている。また、ヒトＦｃＲｎの構造上の機能ドメイン、細胞膜を貫通するためのシグナルペプチド配列、細胞膜貫通領域の位置についても同様に公表されている。図１にヒトＦｃＲｎのα鎖、図２にβ鎖の構造略図を示す。なお、図１中のアミノ酸番号は配列番号１に記載のアミノ酸番号に対応する。すなわち、配列番号１中の１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２３番目のグリシン（Ｇｌｙ）までがシグナル配列（Ｓ）、２４番目のアラニン（Ａｌａ）から２９７番目のセリン（Ｓｅｒ）までが細胞外領域（ＥＣ）、２９８番目のバリン（Ｖａｌ）から３２１番目のトリプトファン（Ｔｒｐ）までが細胞膜貫通領域（ＴＭ）および３２２番目のアルギニン（Ａｒｇ）から３６５番目のアラニン（Ａｌａ）までが細胞内領域（Ｃ）とされている。また、図２中のアミノ酸番号は配列番号２に記載のアミノ酸番号に対応する。すなわち、配列番号１中の１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２０番目のアラニン（Ａｌａ）までがシグナル配列（Ｓ）、２１番目のイソロイシン（Ｉｌｅ）から１１９番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがβ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｔａｋａｉ．Ｔ．，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２８，３１８−３２６，２００５
【非特許文献２】Ｎ．Ｅ．Ｓｉｍｉｓｔｅｒ等，Ｎａｔｕｒｅ，３３７，１８４−１８７，１９８９
【非特許文献３】Ｍ．Ｒａｇｈａｖａｎ等，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３４，１４６４９−１４６５７，１９９５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、特に熱や酸に対する安定性が向上したＦｃＲｎ、および当該ＦｃＲｎの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意検討した結果、ヒトＦｃＲｎにおける安定性向上に関与するアミノ酸残基を特定し、当該アミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換した変異体が、熱または酸に対して優れた安定性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本願は以下の＜１＞から＜１５＞に記載の態様を包含する：
＜１＞  配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち２４番目のアラニンから２９７番目のセリンまでのアミノ酸残基および配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち２１番目のイソロイシンから１１９番目のメチオニンまでのアミノ酸残基を含み、ただし当該アミノ酸残基において以下の（１）から（３９）のうち少なくともいずれか１つの変異を有する、Ｆｃ結合性タンパク質：
（１）配列番号１の４９番目のバリンがアラニンに置換される変異、
（２）配列番号１の６２番目のアスパラギンがスレオニンに置換される変異、
（３）配列番号１の７１番目のシステインがアルギニンに置換される変異、
（４）配列番号１の７８番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換される変異、
（５）配列番号１の７９番目のグルタミンがヒスチジンに置換される変異、
（６）配列番号１の８０番目のバリンがアスパラギン酸に置換される変異、
（７）配列番号１の９６番目のリジンがグルタミン酸に置換される変異、
（８）配列番号１の１０３番目のリジンがグルタミン酸に置換される変異、
（９）配列番号１の１２５番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換される変異、
（１０）配列番号１の１２７番目のセリンがプロリンに置換される変異、
（１１）配列番号１の１５１番目のグリシンがアスパラギン酸に置換される変異、
（１２）配列番号１の１７２番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換される変異、
（１３）配列番号１の１７３番目のリジンがグルタミン酸に置換される変異、
（１４）配列番号１の１８０番目のフェニルアラニンがチロシンに置換される変異、
（１５）配列番号１の１９２番目のアルギニンがロイシンに置換される変異、
（１６）配列番号１の１９３番目のグリシンがアスパラギン酸に置換される変異、
（１７）配列番号１の１９６番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換される変異、
（１８）配列番号１の２０６番目のアルギニンがシステインに置換される変異、
（１９）配列番号１の２１０番目のアルギニンがシステインに置換される変異、
（２０）配列番号１の２１９番目のロイシンがヒスチジンに置換される変異、
（２１）配列番号１の２２０番目のスレオニンがアラニンに置換される変異、
（２２）配列番号１の２２６番目のフェニルアラニンがセリンに置換される変異、
（２３）配列番号１の２３２番目のグルタミンがロイシンに置換される変異、
（２４）配列番号１の２３３番目のロイシンがプロリンに置換される変異、
（２５）配列番号１の２５５番目のグリシンがセリンに置換される変異、
（２６）配列番号１の２５６番目のセリンがプロリンに置換される変異、
（２７）配列番号１の２６１番目のセリンがプロリンに置換される変異、
（２８）配列番号１の２６２番目のセリンがシステインに置換される変異、
（２９）配列番号１の２６３番目のロイシンがプロリンに置換される変異、
（３０）配列番号１の２６６番目のリジンがグルタミン酸またはアルギニンに置換される変異、
（３１）配列番号１の２６７番目のセリンがプロリンに置換される変異、
（３２）配列番号１の２７３番目のチロシンがヒスチジンに置換される変異、
（３３）配列番号１の２８２番目のロイシンがヒスチジンに置換される変異、
（３４）配列番号１の２８６番目のロイシンがヒスチジンに置換される変異、
（３５）配列番号１の２９５番目のリジンがグルタミン酸に置換される変異
（３６）配列番号２の３２番目のアルギニンがヒスチジンに置換される変異、
（３７）配列番号２の４２番目のフェニルアラニンがイソロイシンまたはチロシンに置換される変異、
（３８）配列番号２の６８番目のリジンがグルタミン酸に置換される変異、
（３９）配列番号２の８７番目のチロシンがヒスチジンに置換される変異。
＜２＞  配列番号３に記載の配列からなるアミノ酸残基を含み、ただし当該アミノ酸残基において以下の（１）から（４５）のうち少なくともいずれか１つの変異を有する、請求項１に記載のＦｃ結合性タンパク質：
（１）配列番号３の１５２番目のバリンがアラニンに置換される変異、
（２）配列番号３の１６５番目のアスパラギンがスレオニンに置換される変異、
（３）配列番号３の１７４番目のシステインがアルギニンに置換される変異、
（４）配列番号３の１８１番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換される変異、
（５）配列番号３の１８２番目のグルタミンがヒスチジンに置換される変異、
（６）配列番号３の１８３番目のバリンがアスパラギン酸に置換される変異、
（７）配列番号３の１９９番目のリジンがグルタミン酸に置換される変異、
（８）配列番号３の２０６番目のリジンがグルタミン酸に置換される変異、
（９）配列番号３の２２８番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換される変異、
（１０）配列番号３の２３０番目のセリンがプロリンに置換される変異、
（１１）配列番号３の２５４番目のグリシンがアスパラギン酸に置換される変異、
（１２）配列番号３の２７５番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換される変異、
（１３）配列番号３の２７６番目のリジンがグルタミン酸に置換される変異、
（１４）配列番号３の２８３番目のフェニルアラニンがチロシンに置換される変異、
（１５）配列番号３の２９５番目のアルギニンがロイシンに置換される変異、
（１６）配列番号３の２９６番目のグリシンがアスパラギン酸に置換される変異、
（１７）配列番号３の２９９番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換される変異、
（１８）配列番号３の３０９番目のアルギニンがシステインに置換される変異、
（１９）配列番号３の３１３番目のアルギニンがシステインに置換される変異、
（２０）配列番号３の３２２番目のロイシンがヒスチジンに置換される変異、
（２１）配列番号３の３２３番目のスレオニンがアラニンに置換される変異、
（２２）配列番号３の３２９番目のフェニルアラニンがセリンに置換される変異、
（２３）配列番号３の３３５番目のグルタミンがロイシンに置換される変異、
（２４）配列番号３の３３６番目のロイシンがプロリンに置換される変異、
（２５）配列番号３の３５８番目のグリシンがセリンに置換される変異、
（２６）配列番号３の３５９番目のセリンがプロリンに置換される変異、
（２７）配列番号３の３６４番目のセリンがプロリンに置換される変異、
（２８）配列番号３の３６５番目のセリンがシステインに置換される変異、
（２９）配列番号３の３６６番目のロイシンがプロリンに置換される変異、
（３０）配列番号３の３６９番目のリジンがグルタミン酸またはアルギニンに置換される変異、
（３１）配列番号３の３７０番目のセリンがプロリンに置換される変異、
（３２）配列番号３の３７６番目のチロシンがヒスチジンに置換される変異、
（３３）配列番号３の３８５番目のロイシンがヒスチジンに置換される変異、
（３４）配列番号３の３８９番目のロイシンがヒスチジンに置換される変異、
（３５）配列番号３の３９８番目のリジンがグルタミン酸に置換される変異、
（３６）配列番号３の１４番目のアルギニンがヒスチジンに置換される変異、
（３７）配列番号３の２４番目のフェニルアラニンがイソロイシンまたはチロシンに置換される変異、
（３８）配列番号３の５０番目のリジンがグルタミン酸に置換される変異、
（３９）配列番号３の６９番目のチロシンがヒスチジンに置換される変異、
（４０）配列番号３の１０７番目のグリシンがアスパラギン酸に置換される変異、
（４１）配列番号３の１１４番目のグリシンがアスパラギン酸に置換される変異、
（４２）配列番号３の１１７番目のグリシンがセリンに置換される変異、
（４３）配列番号３の１２３番目のグリシンがセリンまたはアスパラギン酸に置換される変異、
（４４）配列番号３の１２５番目のグリシンがアスパラギン酸に置換される変異、
（４５）配列番号３の１２６番目のセリンがアスパラギンに置換される変異。
＜３＞  少なくとも以下に示す４つの変異を有する、＜２＞に記載のＦｃ結合性タンパク質：
（３）配列番号３の１７４番目のシステインがアルギニンに置換される変異、
（４）配列番号３の１８１番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換される変異、
（１５）配列番号３の２９５番目のアルギニンがロイシンに置換される変異、
（２３）配列番号３の３３５番目のグルタミンがロイシンに置換される変異。
＜４＞  以下の変異をさらに有する、＜３＞に記載のＦｃ結合性タンパク質：
（１１）配列番号３の２５４番目のグリシンがアスパラギン酸に置換される変異。
＜５＞  以下の変異をさらに有する、＜４＞に記載のＦｃ結合性タンパク質：
（１７）配列番号３の２９９番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換される変異。
＜６＞  以下の変異をさらに有する、＜５＞に記載のＦｃ結合性タンパク質：
（３５）配列番号３の３９８番目のリジンがグルタミン酸に置換される変異。
＜７＞  以下に示す変異のうち少なくとも１つをさらに有する、＜６＞に記載のＦｃ結合性タンパク質：
（１）配列番号３の１５２番目のバリンがアラニンに置換される変異、
（１２）配列番号３の２７５番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換される変異、
（１９）配列番号３の３１３番目のアルギニンがシステインに置換される変異、
（２６）配列番号３の３５９番目のセリンがプロリンに置換される変異。
＜８＞  配列番号５から７のいずれかに記載の配列からなるアミノ酸残基を含む、＜３＞に記載のＦｃ結合性タンパク質。
＜９＞  ＜１＞から＜８＞のいずれかに記載のＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
＜１０＞  ＜９＞に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
＜１１＞  ＜１０＞に記載の発現ベクターで宿主を形質転換して得られる形質転換体。
＜１２＞  宿主が大腸菌である、＜１１＞に記載の形質転換体。
＜１３＞  （Ａ）＜１１＞または＜１２＞に記載の形質転換体を培養することによりＦｃ結合性タンパク質を発現させる工程、および
（Ｂ）発現されたＦｃ結合性タンパク質を培養物から回収する工程、
を含む、Ｆｃ結合性タンパク質の製造方法。
＜１４＞  ＜１＞から＜８＞のいずれかに記載のＦｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化して得られる吸着剤。
＜１５＞  ＜１４＞に記載の吸着剤に、抗体を含む溶液を接触させる工程を含む、抗体の分離方法。
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１０】
本発明のＦｃ結合性タンパク質は、以下の（Ｉ）および（ＩＩ）に示すアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基において特定位置のアミノ酸置換が生じた、抗体のＦｃ領域に結合性を持つタンパク質である。
（Ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるヒトＦｃＲｎα鎖の細胞外領域（図１のＥＣの領域）に相当する、２４番目のアラニンから２９７番目のセリンまでのアミノ酸残基
（ＩＩ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるヒトＦｃＲｎβ鎖のβ２ミクログロブリン領域（図２のＢ２Ｍの領域）に相当する、２１番目のイソロイシンから１１９番目のメチオニンまでのアミノ酸残基
したがって、本発明のＦｃ結合性タンパク質は、ヒトＦｃＲｎα鎖の細胞外領域（図１のＥＣ領域）やヒトＦｃＲｎβ鎖のβ２ミクログロブリン領域（図２のＢ２Ｍの領域）のＮ末端側にあるシグナルペプチド領域（図１および図２のＳの領域）の全てまたは一部を含んでもよいし、ヒトＦｃＲｎα鎖の細胞外領域（図１のＥＣ領域）のＣ末端側にある細胞膜貫通領域（図１のＴＭの領域）および細胞外領域（図１のＣの領域）の全てまたは一部を含んでもよい。
【００１１】
本明細書において、前記（Ｉ）および前記（ＩＩ）に示すアミノ酸残基を少なくとも含むＦｃ結合性タンパク質とは、当該タンパク質のアミノ酸配列に前記（Ｉ）に示すアミノ酸配列および前記（ＩＩ）に示すアミノ酸配列が少なくとも含まれていればよく、前記（Ｉ）に示すアミノ酸残基と前記（ＩＩ）に示すアミノ酸残基とが直結した態様であってもよく、ＧＳリンカー（ＧＧＧＳの繰り返し配列からなるリンカー）など公知のリンカーを介して結合した態様であってもよい。
【００１２】
本明細書では、「野生型ＦｃＲｎ」とは天然に存在するＦｃＲｎに限らず、前記（Ｉ）および前記（ＩＩ）に示すアミノ酸残基を少なくとも含むＦｃＲｎであって、前記（Ｉ）および前記（ＩＩ）に示すアミノ酸残基中に変異（アミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加）を有さないＦｃＲｎを包含する。具体的には、前記（Ｉ）および前記（ＩＩ）に示すアミノ酸残基が、リンカー配列を介して結合したアミノ酸配列（例えば配列番号３）を含むＦｃＲｎ等が挙げられる。
【００１３】
前記（Ｉ）および前記（ＩＩ）に示すアミノ酸残基を少なくとも含むＦｃ結合性タンパク質の好ましい態様として、配列番号３に記載の配列からなるアミノ酸残基を含むＦｃ結合性タンパク質があげられる。配列番号３のうち、３番目のイソロイシンから１０１番目のメチオニンまでの領域がヒトＦｃＲｎβ鎖のβ２ミクログロブリン領域（配列番号２の２１番目のイソロイシンから１１９番目のメチオニンまでの領域）に相当し、１０２番目のグリシンから１２６番目のセリンまでの領域がＧＳリンカーであり、１２７番目のアラニンから４００番目のセリンまでの領域がヒトＦｃＲｎα鎖の細胞外領域（配列番号１の２４番目のアラニンから２９７番目のセリンまでの領域）に相当する。
【００１４】
前記特定位置のアミノ酸置換は、具体的には前記（Ｉ）および前記（ＩＩ）に示すアミノ酸残基を少なくとも含むＦｃ結合性タンパク質が配列番号３に記載の配列からなるＦｃ結合性タンパク質の場合、Ａｒｇ１４Ｈｉｓ（この表記は、配列番号３の１４番目のアルギニンがヒスチジンに置換されていることを表す、以下同様）、Ｐｈｅ２４Ｉｌｅ、Ｐｈｅ２４Ｔｙｒ、Ｌｙｓ５０Ｇｌｕ、Ｔｙｒ６９Ｈｉｓ、Ｇｌｙ１０７Ａｓｐ、Ｇｌｙ１１４Ａｓｐ、Ｇｌｙ１１７Ｓｅｒ、Ｇｌｙ１２３Ｓｅｒ、Ｇｌｙ１２３Ａｓｐ、Ｇｌｙ１２５Ａｓｐ、Ｓｅｒ１２６Ａｓｎ、Ｖａｌ１５２Ａｌａ、Ａｓｎ１６５Ｔｈｒ、Ｃｙｓ１７４Ａｒｇ、Ａｓｎ１８１Ａｓｐ、Ｇｌｎ１８２Ｈｉｓ、Ｖａｌ１８３Ａｓｐ、Ｌｙｓ１９９Ｇｌｕ、Ｌｙｓ２０６Ｇｌｕ、Ａｓｎ２２８Ａｓｐ、Ｓｅｒ２３０Ｐｒｏ、Ｇｌｙ２５４Ａｓｐ、Ａｓｎ２７５Ａｓｐ、Ｌｙｓ２７６Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２８３Ｔｙｒ、Ａｒｇ２９５Ｌｅｕ、Ｇｌｙ２９６Ａｓｐ、Ａｓｎ２９９Ａｓｐ、Ａｒｇ３０９Ｃｙｓ、Ａｒｇ３１３Ｃｙｓ、Ｌｅｕ３２２Ｈｉｓ、Ｔｈｒ３２３Ａｌａ、Ｐｈｅ３２９Ｓｅｒ、Ｇｌｎ３３５Ｌｅｕ、Ｌｅｕ３３６Ｐｒｏ、Ｇｌｙ３５８Ｓｅｒ、Ｓｅｒ３５９Ｐｒｏ、Ｓｅｒ３６４Ｐｒｏ、Ｓｅｒ３６５Ｃｙｓ、Ｌｅｕ３６６Ｐｒｏ、Ｌｙｓ３６９Ｇｌｕ、Ｌｙｓ３６９Ａｒｇ、Ｓｅｒ３７０Ｐｒｏ、Ｔｙｒ３７６Ｈｉｓ、Ｌｅｕ３８５Ｈｉｓ、Ｌｅｕ３８９Ｈｉｓ、Ｌｙｓ３９８Ｇｌｕのうち、少なくともいずれか１つの置換である。なお前記アミノ酸置換の配列番号１および２におけるアミノ酸残基位置を表１に示す。
【００１５】
【表１】
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【００１６】
アミノ酸置換を行なうことで本発明のＦｃ結合性タンパク質を作製する際、前記特定位置以外のアミノ酸残基については、抗体結合活性を有する限り前述したアミノ酸以外のアミノ酸に置換してもよい。その一例として、両アミノ酸の物理的性質および／または化学的性質またはそのどちらかが類似したアミノ酸間で置換する保守的置換があげられる。保守的置換は、Ｆｃ結合性タンパク質に限らず一般に、置換が生じているものと置換が生じていないものとの間でタンパク質の機能が維持されることが当業者において知られている。保守的置換の一例としては、グリシンとアラニン間、アスパラギン酸とグルタミン酸間、セリンとプロリン間、またはグルタミン酸とアラニン間に生じる置換があげられる（タンパク質の構造と機能，メディカル・サイエンス・インターナショナル社，９，２００５）。
【００１７】
本発明のＦｃ結合性タンパク質において、置換するアミノ酸の数に特に制限はない。一例として、以下の（ａ）から（ｃ）に示すＦｃ結合性タンパク質があげられる。これらのＦｃ結合性タンパク質は熱または酸に対する安定性が向上する点で好ましい。
（ａ）配列番号３に記載の配列からなるアミノ酸残基を含み、ただし当該アミノ酸残基においてＣｙｓ１７４Ａｒｇ、Ａｓｎ１８１Ａｓｐ、Ａｒｇ２９５ＬｅｕおよびＧｌｎ３３５Ｌｅｕの置換が生じたＦｃ結合性タンパク質（配列番号５に記載の配列からなるアミノ酸残基を含むＦｃ結合性タンパク質）。
（ｂ）配列番号３に記載の配列からなるアミノ酸残基を含み、ただし当該アミノ酸残基においてＣｙｓ１７４Ａｒｇ、Ａｓｎ１８１Ａｓｐ、Ｇｌｙ２５４Ａｓｐ、Ａｒｇ２９５Ｌｅｕ、Ａｓｎ２９９Ａｓｐ、Ｇｌｎ３３５ＬｅｕおよびＬｙｓ３９８Ｇｌｕの置換が生じたＦｃ結合性タンパク質（配列番号６に記載の配列からなるアミノ酸残基を含むＦｃ結合性タンパク質）。
（ｃ）配列番号３に記載の配列からなるアミノ酸残基を含み、ただし当該アミノ酸残基においてＶａｌ１５２Ａｌａ、Ｃｙｓ１７４Ａｒｇ、Ａｓｎ１８１Ａｓｐ、Ｇｌｙ２５４Ａｓｐ、Ａｒｇ２９５Ｌｅｕ、Ａｓｎ２９９Ａｓｐ、Ｇｌｎ３３５ＬｅｕおよびＬｙｓ３９８Ｇｌｕの置換が生じたＦｃ結合性タンパク質（配列番号７に記載の配列からなるアミノ酸残基を含むＦｃ結合性タンパク質）。
【００１８】
本発明のＦｃ結合性タンパク質は、そのＮ末端側またはＣ末端側に、夾雑物質存在下の溶液から分離する際に有用なオリゴペプチドをさらに付加してもよい。前記オリゴペプチドとしては、ポリヒスチジン、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸等があげられる。また本発明のＦｃ結合性タンパク質をクロマトグラフィー用の支持体等の固相に固定化する際に有用な、システインを含むオリゴペプチドを、本発明のＦｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側にさらに付加してもよい。Ｆｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に付加するオリゴペプチドの長さは、本発明のＦｃ結合性タンパク質のＩｇＧ結合性や安定性を損なわない限り特に制限はなく、該オリゴペプチドを構成するペプチドの数は例えば２個以上、好ましくは４個以上、より好ましくは６個以上であってよい。また、２０個以下であってよく、好ましくは１５個以下であってよく、より好ましくは１０個以下であってよい。前記オリゴペプチドを本発明のＦｃ結合性タンパク質に付加させる際は、前記オリゴペプチドをコードするポリヌクレオチドを作製後、当業者に周知の方法を用いて遺伝子工学的にＦｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に付加させてもよいし、化学的に合成した前記オリゴペプチドを本発明のＦｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に化学的に結合させて付加させてもよい。さらに本発明のＦｃ結合性タンパク質のＮ末端側には、宿主での効率的な発現を促すためのシグナルペプチドを付加してもよい。宿主が大腸菌の場合における前記シグナルペプチドの例としては、ＰｅｌＢ、ＤｓｂＡ、ＭａｌＥ（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｎｏ．Ｐ０ＡＥＸ９に記載のアミノ酸配列のうち１番目から２６番目までの領域）、ＴｏｒＴ等のペリプラズムにタンパク質を分泌させるシグナルペプチドを例示することができる（特開２０１１−０９７８９８号公報）。
【００１９】
本発明のポリヌクレオチドの作製方法の一例として、
（ｉ）本発明のＦｃ結合性タンパク質のアミノ酸配列からヌクレオチド配列に変換し、当該ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを人工的に合成する方法や、
（ｉｉ）Ｆｃ結合性タンパク質の全体または部分配列を含むポリヌクレオチドを直接人工的に、またはＦｃ結合性タンパク質のｃＤＮＡ等からＰＣＲ法等のＤＮＡ増幅法を用いて調製し、調製した当該ポリヌクレオチドを適当な方法で連結する方法、が例示できる。
前記（ｉ）の方法において、アミノ酸配列からヌクレオチド配列に変換する際、形質転換させる宿主におけるコドンの使用頻度を考慮して変換するのが好ましい。一例として、宿主が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の場合は、アルギニン（Ａｒｇ）ではＡＧＡ／ＡＧＧ／ＣＧＧ／ＣＧＡが、イソロイシン（Ｉｌｅ）ではＡＴＡが、ロイシン（Ｌｅｕ）ではＣＴＡが、グリシン（Ｇｌｙ）ではＧＧＡが、プロリン（Ｐｒｏ）ではＣＣＣが、それぞれ使用頻度が少ないため（いわゆるレアコドンであるため）、それらのコドンを避けるように変換すればよい。コドンの使用頻度の解析は公的データベース（例えば、かずさＤＮＡ研究所のホームページにあるＣｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅなど）を利用することによっても可能である。本発明のポリヌクレオチドは、α鎖、β鎖をそれぞれ発現させてもよく、α鎖とβ鎖をリンカーで結合させてもよい。後者の例として、ＧＳリンカーを介してヒトＦｃＲｎのα鎖とβ鎖とが結合したＦｃ結合性タンパク質である配列番号３に記載の配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドである、配列番号４に記載の配列からなるポリヌクレオチドがあげられる。
【００２０】
本発明のポリヌクレオチドへ変異を導入する場合、エラープローンＰＣＲ法を用いることができる。エラープローンＰＣＲ法における反応条件は、Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドに所望の変異を導入できる条件であれば特に限定はなく、例えば、基質である４種類のデオキシヌクレオチド（ｄＡＴＰ／ｄＴＴＰ／ｄＣＴＰ／ｄＧＴＰ）の濃度を不均一にし、ＭｎＣｌ２を０．０１から１０ｍＭ（好ましくは０．１から１ｍＭ）の濃度でＰＣＲ反応液に添加してＰＣＲを行なうことで、ポリヌクレオチドに変異を導入することができる。またエラープローンＰＣＲ法以外の変異導入方法としては、Ｆｃ結合性タンパク質の全体または部分配列を含むポリヌクレオチドに、変異原となる薬剤を接触・作用させたり、紫外線を照射したりして、ポリヌクレオチドに変異を導入して作製する方法があげられる。当該方法において変異原として使用する薬剤としては、ヒドロキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、亜硝酸、亜硫酸、ヒドラジン等、当業者が通常用いる変異原性薬剤を用いればよい。
【００２１】
本発明のＦｃ結合性タンパク質を発現させる宿主には特に制限はなく、一例として、動物細胞（ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＣＯＳ細胞等）、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｔｏｓｐｏｒｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ等）、昆虫細胞（Ｓｆ９、Ｓｆ２１等）、大腸菌（ＪＭ１０９株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株、Ｗ３１１０株等）や枯草菌があげられる。なお動物細胞や大腸菌を宿主として用いると生産性の面で好ましく、大腸菌を宿主として用いるとさらに好ましい。
【００２２】
本発明のポリヌクレオチドを用いて宿主を形質転換する場合、本発明のポリヌクレオチドそのものを用いてもよいが、発現ベクター（例えば、原核細胞や真核細胞の形質転換に通常用いるバクテリオファージ、コスミドやプラスミド等）の適切な位置に本発明のポリヌクレオチドを挿入したものを用いると、より好ましい。なお当該発現ベクターは、形質転換する宿主内で安定に存在し複製できるものであれば特に制限はなく、大腸菌を宿主とする場合は、ｐＥＴプラスミドベクター、ｐＵＣプラスミドベクター、ｐＴｒｃプラスミドベクター、ｐＣＤＦプラスミドベクター、ｐＢＢＲプラスミドベクターを例示することができる。また前記適切な位置とは、発現ベクターの複製機能、所望の抗生物質マーカー、伝達性に関わる領域を破壊しない位置を意味する。前記発現ベクターに本発明のポリヌクレオチドを挿入する際は、発現に必要なプロモーター等の機能性ポリヌクレオチドに連結される状態で挿入すると好ましい。当該プロモーターの例として、宿主が大腸菌の場合は、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｌｐｐプロモーター、さらにはλファージのλＰＬプロモーター、λＰＲプロモーターがあげられ、宿主が動物細胞の場合は、ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧプロモーターがあげられる。
【００２３】
前記方法により作製した、本発明のポリヌクレオチドを挿入した発現ベクター（以下、本発明の発現ベクターとする）を用いて宿主を形質転換するには、当業者が通常用いる方法で行なえばよい。例えば、宿主としてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する微生物（大腸菌ＪＭ１０９株、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株、大腸菌Ｗ３１１０株等）を選択する場合には、公知の文献（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，２５６，１９９２）に記載の方法等により形質転換すればよい。なお宿主が動物細胞である場合にはエレクトロポレーションやリポフェクションを用いればよい。前述した方法で形質転換して得られた形質転換体は、適切な方法でスクリーニングすることにより、本発明のＦｃ結合性タンパク質を発現可能な形質転換体（以下、本発明の形質転換体とする）を取得することができる。
【００２４】
本発明の形質転換体から本発明の発現ベクターを調製するには、形質転換に用いた宿主に適した方法で、本発明の形質転換体から本発明の発現ベクターを抽出し調製すればよい。
例えば、本発明の形質転換体の宿主が大腸菌の場合、形質転換体を培養して得られる培養物からアルカリ抽出法またはＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（キアゲン製）等の市販の抽出キットを用いて調製すればよい。
【００２５】
本発明の形質転換体を培養し、得られた培養物から本発明のＦｃ結合性タンパク質を回収することで、本発明のＦｃ結合性タンパク質を製造することができる。なお本明細書において培養物とは、培養された本発明の形質転換体の細胞そのもののほか、培養に用いた培地も含まれる。本発明のタンパク質製造方法で用いる形質転換体は、対象宿主の培養に適した培地で培養すればよく、宿主が大腸菌の場合は、必要な栄養源を補ったＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）培地が好ましい培地の一例としてあげられる。なお、本発明の発現ベクターの導入の有無により本発明の形質転換体を選択的に増殖させるために、培地に当該ベクターに含まれる薬剤耐性遺伝子に対応した薬剤を添加して培養すると好ましい。例えば、当該ベクターがカナマイシン耐性遺伝子を含んでいる場合は、培地にカナマイシンを添加すればよい。また培地には、炭素、窒素および無機塩供給源の他に、適当な栄養源を添加してもよく、所望により、グルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレートおよびジチオスレイトールからなる群から選択される一種類以上の還元剤を含んでもよい。さらにグリシン等の前記形質転換体から培養液へのタンパク質分泌を促す試薬を添加してもよく、具体的には、宿主が大腸菌の場合、培地に対してグリシンを２％（ｗ／ｖ）以下で添加すると好ましい。培養温度は宿主が大腸菌の場合、一般に１０℃から４０℃、好ましくは２０℃から３７℃、より好ましくは２５℃前後であるが、発現させるタンパク質の特性により選択すればよい。培地のｐＨは宿主が大腸菌の場合、ｐＨ６．８からｐＨ７．４、好ましくはｐＨ７．０前後である。また本発明のベクターに誘導性のプロモーターが含まれている場合は、本発明のＦｃ結合性タンパク質が良好に発現できるような条件下で誘導をかけると好ましい。誘導剤としてはＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を例示することができる。宿主が大腸菌の場合、培養液の濁度（６００ｎｍにおける吸光度）を測定し、約０．５から１．０となったときに適当量のＩＰＴＧを添加後、引き続き培養することで、Ｆｃ結合性タンパク質の発現を誘導することができる。ＩＰＴＧの添加濃度は０．００５から１．０ｍＭの範囲から適宜選択すればよいが、０．０１から０．５ｍＭの範囲が好ましい。ＩＰＴＧ誘導に関する種々の条件は当該技術分野において周知の条件で行なえばよい。
【００２６】
本発明の形質転換体を培養して得られた培養物から本発明のＦｃ結合性タンパク質を回収するには、本発明の形質転換体における本発明のＦｃ結合性タンパク質の発現形態に適した方法で、当該培養物から分離／精製して本発明のＦｃ結合性タンパク質を回収すればよい。例えば、培養上清に発現する場合は菌体を遠心分離操作によって分離し、得られる培養上清から本発明のＦｃ結合性タンパク質を精製すればよい。また、細胞内（ペリプラズムを含む）に発現する場合には、遠心分離操作により菌体を集めた後、酵素処理剤や界面活性剤等を添加したり、超音波やフレンチプレス等を用いて菌体を破砕して本発明のＦｃ結合性タンパク質を抽出した後、精製すればよい。本発明のＦｃ結合性タンパク質を精製するには、当該技術分野において公知の方法を用いればよく、一例として液体クロマトグラフィーを用いた分離／精製があげられる。液体クロマトグラフィーには、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等があり、これらのクロマトグラフィーを組み合わせて精製操作を行なうことにより、本発明のＦｃ結合性タンパク質を高純度に調製することができる。
【００２７】
得られた本発明のＦｃ結合性タンパク質のＩｇＧに対する結合活性を測定する方法としては、例えばＩｇＧに対する結合活性をＥｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ（以下、ＥＬＩＳＡと表記）法や表面プラズモン共鳴法などを用いて測定すればよい。結合活性の測定に使用するＩｇＧは、ヒトＩｇＧが好ましく、ヒトＩｇＧ１やヒトＩｇＧ３が特に好ましい。
【００２８】
本発明のＦｃ結合性タンパク質を不溶性担体に結合させることで、本発明の吸着剤を製造することができる。前記不溶性担体には特に限定はなく、アガロース、アルギネート（アルギン酸塩）、カラゲナン、キチン、セルロース、デキストリン、デキストラン、デンプン等の多糖質を原料とした担体や、ポリビニルアルコール、ポリメタクレート、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリウレタン等の合成高分子を原料とした担体や、シリカなどのセラミックスを原料とした担体が例示できる。中でも、多糖質を原料とした担体や合成高分子を原料とした担体が不溶性担体として好ましい。前記好ましい担体の一例として、トヨパール（東ソー製）等の水酸基を導入したポリメタクリレートゲル、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥヘルスケア製）等のアガロースゲル、セルファイン（ＪＮＣ製）等のセルロースゲルがあげられる。不溶性担体の形状については特に限定はなく、粒状物または非粒状物、多孔性または非多孔性、いずれであってもよい。
【００２９】
Ｆｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化するには、不溶性担体にＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）活性化エステル基、エポキシ基、カルボキシル基、マレイミド基、ハロアセチル基、トレシル基、ホルミル基、ハロアセトアミド等の活性基を付与し、当該活性基を介してヒトＦｃ結合性タンパク質と不溶性担体とを共有結合させることで固定化すればよい。活性基を付与した担体は市販の担体をそのまま用いてもよいし、適切な反応条件で担体表面に活性基を導入して調製してもよい。活性基を付与した市販の担体としてはＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＡＦ−Ｅｐｏｘｙ−６５０Ｍ、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＡＦ−Ｔｒｅｓｙｌ−６５０Ｍ（いずれも東ソー製）、ＨｉＴｒａｐ  ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＨＰ  Ｃｏｌｕｍｎｓ、ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、Ｅｐｏｘｙ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６Ｂ（いずれもＧＥヘルスケア製）、ＳｕｌｆｏＬｉｎｋ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｒｅｓｉｎ（サーモサイエンティフィック製）が例示できる。
【００３０】
一方、担体表面に活性基を導入する方法としては、担体表面に存在する水酸基やエポキシ基、カルボキシル基、アミノ基等に対して２個以上の活性部位を有する化合物の一方を反応させる方法が例示できる。当該化合物の一例のうち、担体表面の水酸基やアミノ基にエポキシ基を導入する化合物としては、エピクロロヒドリン、エタンジオールジグリシジルエーテル、ブタンジオールジグリシジルエーテル、ヘキサンジオールジグリシジルエーテルが例示できる。前記化合物により担体表面にエポキシ基を導入した後、担体表面にカルボキシル基を導入する化合物としては、２−メルカプト酢酸、３−メルカプトプロピオン酸、４−メルカプト酪酸、６−メルカプト酪酸、グリシン、３−アミノプロピオン酸、４−アミノ酪酸、６−アミノヘキサン酸を例示できる。
【００３１】
担体表面に存在する水酸基やエポキシ基、カルボキシル基、アミノ基にマレイミド基を導入する化合物としては、Ｎ−（ε−マレイミドカプロン酸）ヒドラジド、Ｎ−（ε−マレイミドプロピオン酸）ヒドラジド、４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル）酢酸ヒドラジド、２−アミノマレイミド、３−アミノマレイミド、４−アミノマレイミド、６−アミノマレイミド、１−（４−アミノフェニル）マレイミド、１−（３−アミノフェニル）マレイミド、４−（マレイミド）フェニルイソシアナート、２−マレイミド酢酸、３−マレイミドプロピオン酸、４−マレイミド酪酸、６−マレイミドヘキサン酸、（Ｎ−［α―マレイミドアセトキシ］）スクシンイミドエステル、（ｍ−マレイミドベンゾイル）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、（スクシンイミジル−４−［マレイミドメチル］）シクロヘキサンー１−カルボニル−［６−アミノヘキサン酸］、（スクシンイミジル−４−［マレイミドメチル］）シクロヘキサンー１−カルボン酸、（ｐ−マレイミドベンゾイル）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、（ｍ−マレイミドベンゾイル）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを例示できる。
【００３２】
担体表面に存在する水酸基やアミノ基にハロアセチル基を導入する化合物としては、クロロ酢酸、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、クロロ酢酸クロリド、ブロモ酢酸クロリド、ブロモ酢酸ブロミド、クロロ酢酸無水物、ブロモ酢酸無水物、ヨード酢酸無水物、２−（ヨードアセトアミド）酢酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、３−（ブロモアセトアミド）プロピオン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、４−（ヨードアセチル）アミノ安息香酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを例示できる。なお担体表面に存在する水酸基やアミノ基にω−アルケニルアルカングリシジルエーテルを反応させた後、ハロゲン化剤でω−アルケニル部位をハロゲン化し活性化する方法も例示できる。ω−アルケニルアルカングリシジルエーテルとしては、アリルグリシジルエーテル、３−ブテニルグリシジルエーテル、４−ペンテニルグリシジルエーテルを例示でき、ハロゲン化剤としてはＮ−クロロスクシンイミド、Ｎ−ブロモスクシンイミド、Ｎ−ヨードスクシンイミドを例示できる。
【００３３】
担体表面に活性基を導入する方法の別の例として、担体表面に存在するカルボキシル基に対して縮合剤と添加剤を用いて活性化基を導入する方法がある。縮合剤としては１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、ジシクロヘキシルカルボジアミド、カルボニルジイミダゾールを例示できる。また添加剤としてはＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）、４−ニトロフェノール、１−ヒドロキシベンズトリアゾールを例示できる。
【００３４】
本発明のＦｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化する際用いる緩衝液としては、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、ＭＥＳ（２−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）緩衝液、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液を例示できる。固定化させるときの反応温度は、５℃から５０℃までの温度範囲の中から活性基の反応性や本発明のＦｃ結合性タンパク質の安定性を考慮の上、適宜設定すればよく、好ましくは１０℃から３５℃の範囲である。
【００３５】
本発明のＦｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化して得られる本発明の吸着剤を用いて、抗体を分離するには、例えば、本発明の吸着剤を充填したカラムに抗体を含む緩衝液をポンプ等の送液手段を用いて添加し、抗体を含む緩衝液を本発明の吸着剤に接触させることで、抗体を本発明の吸着剤に特異的に吸着させた後、適切な溶出液をカラムに添加することで、抗体を溶出すればよい。なお、抗体を含む緩衝液をカラムに添加する前に、適切な緩衝液を用いてカラムを平衡化すると、抗体をより高純度に分離できるため好ましい。緩衝液としてはリン酸緩衝液等、無機塩を成分とした緩衝液を例示することができる。なお緩衝液のｐＨは、ｐＨ３〜１０であってよく、好ましくはｐＨ４〜８、より好ましくはｐＨ５〜６である。本発明の吸着剤に吸着した、抗体を溶出させるには、抗体とリガンド（本発明のＦｃ結合性タンパク質）との相互作用を弱めればよく、具体的には、緩衝液によるｐＨ変化、カウンターペプチド、温度変化、塩濃度変化が例示できる。本発明の吸着剤に吸着した、抗体を溶出させるための溶出液の具体例として、本発明の吸着剤に抗体を吸着させる際に用いた溶液よりも酸性側の緩衝液や中性付近のｐＨを有する緩衝液があげられる。緩衝液の種類としては酸性側に緩衝能を有するクエン酸緩衝液、グリシン塩酸緩衝液、酢酸緩衝液や、中性付近のｐＨで緩衝能を有するリン酸緩衝液、ＨＥＰＳＥ緩衝液、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を例示できる。緩衝液のｐＨは、抗体が有する機能を損なわない範囲で設定すればよく、好ましくはｐＨ２．５〜６．０、より好ましくはｐＨ３．０〜５．０、さらに好ましくはｐＨ３．３〜４．０であり、または、中性付近のｐＨでは、好ましくはｐＨ６．０〜１０．０、より好ましくはｐＨ７．０〜９．０、さらにより好ましくはｐＨ７．５〜８．５である。
【００３６】
なお抗体を含む溶液から、本発明の吸着剤を用いて前記抗体を分離する際、前記抗体が有するアミノ酸配列等の構造の違いにより、抗体の溶出位置（溶出フラクション）が異なる。従って、本発明の吸着剤を用いて抗体を分離することで、抗体が有する構造の違いを識別することができる。識別可能な構造に特に限定はなく、一例として、ＣＨＯ細胞等の動物由来の細胞や、ピキア酵母やサッカロミセス酵母等の酵母を宿主として抗体を発現させたときの構造の違いによる分離にも利用できる。
【００３７】
なお本発明の吸着剤により抗体の構造の違いを識別できると前述したが、当該吸着剤に用いるＦｃ結合性タンパク質として、ＦｃＲｎ以外のＦｃレセプター（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩｂ）を用いた場合でも同様に構造の違いを識別できる。ＦｃＲｎは血液中の抗体リサイクリング機構に寄与し、抗体の分解抑制を担っており、血液中で分解されにくい抗体、即ち血液中で長時間効果を持続可能な抗体との親和性が高い。従って、ＦｃＲｎをＦｃレセプターとして用いた抗体の分離方法は、効果が長時間持続するような抗体の分析・分取・精製に好適である。
【発明の効果】
【００３８】
本発明のＦｃ結合性タンパク質は、ヒトＦｃＲｎα鎖の細胞外領域および／またはヒトＦｃＲｎβ鎖のβ２ミクログロブリン領域中の特定位置におけるアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換したタンパク質である。本発明のＦｃ結合性タンパク質は野生型のヒトＦｃＲｎと比較し熱および酸に対する安定性が向上している。Ｆｃ結合性タンパク質をアフィニティー担体として用いて抗体の分離を行う場合、目的抗体の吸脱着やカラムの洗浄・再生のためにＦｃ結合性タンパク質は酸性の溶出液に晒されるため、酸に対する安定性が向上することで、安定的な分離を長期間保証できる。また、Ｆｃ結合性タンパク質を工業的に生産する場合、Ｆｃ結合性タンパク質をコードする塩基配列を含む発現ベクターを大腸菌に形質転換して生産する方法が効率がよいが、該生産方法を用いた培養時や抽出精製時のＦｃ結合性タンパク質の安定性を考慮した場合、Ｆｃ結合性タンパク質の失活や変性が抑制されることが望ましい。従って、耐熱性が向上したことで本発明のＦｃ結合性タンパク質は大腸菌を用いた生産方法に適応可能である。そのため、本発明のＦｃ結合性タンパク質はイムノグロブリンを分離するための吸着剤のリガンドとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】ヒトＦｃＲｎのα鎖の概略図である。図中の数字は配列番号１に記載のアミノ酸配列の番号を示している。図中のＳはシグナル配列、ＥＣは細胞外領域、ＴＭは細胞膜貫通領域、Ｃは細胞内領域を示している。
【図２】ヒトＦｃＲｎのβ鎖の概略図である。図中の数字は配列番号２に記載のアミノ酸配列の番号を示している。図中のＳはシグナル配列、Ｂ２Ｍはβ２ミクログロブリンを示している。
【図３】実施例１で得られた形質転換体で発現させたヒトＦｃＲｎのヒトＩｇＧへの結合性を示した図である。
【図４】実施例１４でＦｃ結合性タンパク質固定化分離剤にて分離したモノクローナル抗体の分離パターンを表した図である。
【実施例】
【００４０】
以下、本発明をさらに詳細に説明するために実施例を示すが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００４１】
実施例１  ヒトＦｃＲｎ発現ベクターの作製（大腸菌型コドン）
（１）配列番号１に記載のヒトＦｃＲｎのα鎖のアミノ酸配列のうち２４番目のアラニンから２９７番目のセリンまでのアミノ酸配列、および配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるヒトＦｃＲｎのβ鎖のアミノ酸配列のうち２１番目のイソロイシンから１１９番目のメチオニンまでのアミノ酸配列を基に、ＤＮＡｗｏｒｋｓ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３０，ｅ４３，２００２）を用いて、コドンをヒト型から大腸菌型に変換し、当該変換したヌクレオチド配列の間にＧＳリンカーをコードするヌクレオチド配列を挿入することで、配列番号４に記載のヌクレオチド配列を設計した。
（２）設計したヌクレオチド配列（配列番号４）の５’末端側にＮｃｏＩ認識配列（ＣＣＡＴＧＧ）を、３’末端側にＨｉｎｄＩＩＩ認識配列（ＡＡＧＣＴＴ）を、それぞれ付加した配列からなるポリヌクレオチドを人工的に合成した。
（３）（２）で合成したポリヌクレオチドを制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、当該ライゲーション産物を用いて大腸菌ＢＬ２１株（ＤＥ３）を形質転換した。
（４）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンンを含むＬＢ培地にて培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（キアゲン製）を用いて、野生型Ｆｃ結合性タンパク質であるヒトＦｃＲｎの発現ベクターｐＥＴ−ｅＦｃＲｎを抽出した。
（５）（４）で作製した発現ベクターｐＥＴ−ｅＦｃＲｎのうち、ＦｃＲｎをコードするポリヌクレオチドおよびその周辺の領域について、チェーンターミネータ法に基づくＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  ｒｅａｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３７００  ＤＮＡ  ａｎａｌｙｚｅｒ（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）にてヌクレオチド配列を解析した。なお当該解析の際、配列番号８（５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ−３’）または配列番号９（５’−ＴＡＴＧＣＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＧ−３’）に記載のオリゴヌクレオチドをシークエンス用プライマーとして使用した。
【００４２】
発現ベクターｐＥＴ−ｅＦｃＲｎで発現されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号１０に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１１に、それぞれ示す。なお配列番号１０において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のリジン（Ｌｙｓ）から３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）までがリンカー配列であり、３４番目のイソロイシン（Ｉｌｅ）から１３２番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがヒトＦｃＲｎβ鎖のβ２ミクログロブリン領域（配列番号２の２１番目から１１９番目までの領域）であり、１３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から１５７番目のセリン（Ｓｅｒ）までがＧＳリンカー配列であり、１５８番目のアラニン（Ａｌａ）から４３１番目のセリン（Ｓｅｒ）までが、ヒトＦｃＲｎα鎖の細胞外領域（配列番号１の２４番目から２９７番目までの領域）であり、４３２番目から４３７番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。
【００４３】
実施例２  ヒトＦｃＲｎの抗体結合確認
（１）実施例１で得られた、発現ベクターｐＥＴ−ｅＦｃＲｎで形質転換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む４ｍＬの２ＹＴ液体培地（ペプトン１６ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ）に接種後、３７℃で一晩、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。
（２）５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加した１５ｍＬの２ＹＴ液体培地に（１）の前培養液を１５０μＬ接種し、３７℃で好気的に振とう培養を行なった。
（３）培養開始１５０分後、終濃度０ｍＭ／０．１ｍＭとなるようＩＰＴＧを添加し、２０℃で４時間、好気的に振とう培養した。
（４）培養終了後、遠心分離により集菌し、超音波発生機（トミー精工製）を用いて、可溶分画中のタンパク質抽出液を調製した。
（５）（４）で調製したタンパク質抽出液に含まれるヒトＦｃＲｎの抗体結合活性を、下記に示すＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。
（５−１）ヒト抗体であるガンマグロブリン製剤（化学及血清療法研究所製）を、９６穴マイクロプレートのウェルに１０μｇ／ｗｅｌｌ固定化した（４℃で１８時間）。固定化終了後、２％（ｗ／ｖ）のＳＫＩＭ  ＭＩＬＫ（Ｂｅｃｔｏｎ，  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ製）、および１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含んだリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）によりブロッキングした。
（５−２）洗浄緩衝液（１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含んだリン酸緩衝液（ｐＨ６．０））で洗浄後、（４）で調製したヒトＦｃＲｎを含む溶液を固定化ガンマグロブリンと反応させた（３０℃で１時間）。
（５−３）反応終了後、前記洗浄緩衝液で洗浄し、ブロッキング溶液で１００ｎｇ／ｍＬに希釈したＡｎｔｉ−６Ｈｉｓ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）を
１００μＬ／ｗｅｌｌで添加した。
（５−４）３０℃で１時間反応させ、前記洗浄緩衝液で洗浄した後、ＴＭＢ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加した。１Ｍのリン酸を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加することで発色を止め、マイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ製）にて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００４４】
（４）で調製したヒトＦｃＲｎを含む溶液を添加したときの、抗体結合活性に相当する吸光度（４５０ｎｍ）の関係をまとめた図を図３に示す。なお図３においてｐＥＴＭａｌＥは、ＦｃＲｎの遺伝子を挿入していないプラスミドを同様に培養、抽出したもの（ネガティブコントロール）である。ＦｃＲｎ遺伝子を挿入していない場合と比較して、挿入している方が吸光度が増加していることから、ヒトＦｃＲｎが活性状態で発現していることがわかる。
【００４５】
実施例３  Ｆｃ結合性タンパク質への変異導入およびライブラリーの作製
実施例１で作製したＦｃ結合性タンパク質発現ベクターｐＥＴ−ｅＦｃＲｎのうち、Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド部分に、エラープローンＰＣＲによりランダムに変異導入を施した。
（１）鋳型として実施例１で作製したｐＥＴ−ｅＦｃＲｎを用いてエラープローンＰＣＲを行なった。エラープローンＰＣＲは、表２に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９５℃で２分間熱処理し、９５℃で３０秒間の第１ステップ、６０℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３５サイクル行ない、最後に７２℃で７分間熱処理することで行なった。前記エラープローンＰＣＲによりＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドに良好に変異が導入され、その平均変異導入率は０．２％であった。
【００４６】
【表２】
2018183087.tif 000004
【００４７】
（２）（１）で得られたＰＣＲ産物を精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ同制限酵素で消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションした。
（３）ライゲーション反応終了後、反応液をエレクトロポレーション法により大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢプレート培地で培養（３７℃で１８時間）後、プレート上に形成したコロニーをランダム変異体ライブラリーとした。
【００４８】
実施例４  熱安定化Ｆｃ結合性タンパク質のスクリーニング
（１）実施例３で作製したランダム変異体ライブラリー（形質転換体）を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２ＹＴ液体培地（ペプトン１６ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ）２００μＬに接種し、９６穴ディープウェルプレートを用いて、３０℃で一晩振とう培養した。
（２）培養後、５μＬの培養液を５００μＬの０．０５ｍＭのＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、０．３％（ｗ／ｖ）のグリシンおよび５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２ＹＴ液体培地に植え継ぎ、９６穴ディープウェルプレートを用いて、さらに２０℃で一晩振とう培養した。
（３）培養後、遠心操作によって得られた培養上清を１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で２倍に希釈した。希釈した溶液を４０℃で１０分間熱処理を行なった。
（４）（３）の熱処理を行なったときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性と、（３）の熱処理を行なわなかったときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性を、それぞれ実施例２（５）に記載したＥＬＩＳＡ法にて測定し、熱処理を行なった時のＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性を、熱処理を行なわなかったときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性で除することで、残存活性を算出した。
（５）（４）の方法で約２７００株の形質転換体を評価し、その中から野生型（アミノ酸置換のない）Ｆｃ結合性タンパク質と比較して熱安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質を発現する形質転換体を選択した。前記選択した形質転換体を培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（キアゲン製）を用いて発現ベクターを調製した。
（６）得られた発現ベクターに挿入されたＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド領域の配列を実施例１（５）の記載と同様の方法によりヌクレオチド配列を解析し、アミノ酸の変異箇所を特定した。
【００４９】
（５）で選択した形質転換体が発現するＦｃ結合性タンパク質の、野生型（アミノ酸置換のない）Ｆｃ結合性タンパク質に対するアミノ酸置換位置および熱処理後の残存活性（％）をまとめたものを表３に示す。配列番号３に記載のアミノ酸配列において、
Ｐｈｅ２４Ｉｌｅ（この表記は、配列番号３の２４番目のフェニルアラニンがイソロイシンに置換されていることを表す、以下同様）、Ｐｈｅ２４Ｔｙｒ、Ｇｌｙ１１４Ａｓｐ、Ｇｌｙ１１７Ｓｅｒ、Ｇｌｙ１２３Ｓｅｒ、Ｇｌｙ１２３Ａｓｐ、Ｃｙｓ１７４Ａｒｇ、Ａｓｎ１８１Ａｓｐ、Ｖａｌ１８３Ａｓｐ、Ｌｙｓ１９９Ｇｌｕ、Ａｓｎ２２８Ａｓｐ、Ａｓｎ２７５Ａｓｐ、Ｐｈｅ２８３Ｔｙｒ、Ａｒｇ２９５Ｌｅｕ、Ａｒｇ３０９Ｃｙｓ、Ｌｅｕ３２２Ｈｉｓ、Ｔｈｒ３２３Ａｌａ、Ｐｈｅ３２９Ｓｅｒ、Ｇｌｎ３３５Ｌｅｕ、Ｓｅｒ３６５Ｃｙｓ、Ｌｅｕ３６６Ｐｒｏ、Ｔｙｒ３７６Ｈｉｓ、Ｌｅｕ３８５Ｈｉｓ、Ｌｅｕ３８９Ｈｉｓのいずれかのアミノ酸置換が少なくとも１つ生じたＦｃ結合性タンパク質は、野生型のＦｃ結合性タンパク質と比較し熱安定性が向上しているといえる。
【００５０】
なお前記アミノ酸置換のうち、Ｐｈｅ２４ＩｌｅおよびＰｈｅ２４Ｔｙｒの置換は配列番号２の４２番目のアミノ酸残基における置換に、Ｃｙｓ１７４Ａｒｇの置換は配列番号１の７１番目のアミノ酸残基における置換に、Ａｓｎ１８１Ａｓｐの置換は配列番号１の７８番目のアミノ酸残基における置換に、Ｖａｌ１８３Ａｓｐの置換は配列番号１の８０番目のアミノ酸残基における置換に、Ｌｙｓ１９９Ｇｌｕの置換は配列番号１の９６番目のアミノ酸残基における置換に、Ａｓｎ２２８Ａｓｐの置換は配列番号１の１２５番目のアミノ酸残基における置換に、Ａｓｎ２７５Ａｓｐの置換は配列番号１の１７２番目のアミノ酸残基における置換に、Ｐｈｅ２８３Ｔｙｒの置換は配列番号１の１８０番目のアミノ酸残基における置換に、Ａｒｇ２９５Ｌｅｕの置換は配列番号１の１９２番目のアミノ酸残基における置換に、Ａｒｇ３０９Ｃｙｓの置換は配列番号１の２０６番目のアミノ酸残基における置換に、Ｌｅｕ３２２Ｈｉｓの置換は配列番号１の２１９番目のアミノ酸残基における置換に、Ｔｈｒ３２３Ａｌａの置換は配列番号１の２２０番目のアミノ酸残基における置換に、Ｐｈｅ３２９Ｓｅｒの置換は配列番号１の２２６番目のアミノ酸残基における置換に、Ｇｌｎ３３５Ｌｅｕの置換は配列番号１の２３２番目のアミノ酸残基における置換に、Ｓｅｒ３６５Ｃｙｓの置換は配列番号１の２６２番目のアミノ酸残基における置換に、Ｌｅｕ３６６Ｐｒｏの置換は配列番号１の２６３番目のアミノ酸残基における置換に、Ｔｙｒ３７６Ｈｉｓの置換は配列番号１の２７３番目のアミノ酸残基における置換に、Ｌｅｕ３８５Ｈｉｓの置換は配列番号１の２８２番目のアミノ酸残基における置換に、Ｌｅｕ３８９Ｈｉｓの置換は配列番号１の２８６番目のアミノ酸残基における置換に、それぞれ相当する。
【００５１】
【表３】
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【００５２】
表３に示す、アミノ酸置換されたＦｃ結合性タンパク質のうち、最も残存活性の高い、Ａｓｎ１８１Ａｓｐのアミノ酸置換が生じたＦｃ結合性タンパク質をＦｃＲｎ＿ｍ１と命名し、ＦｃＲｎ＿ｍ１をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターをｐＥＴ−ＦｃＲｎ＿ｍ１と命名した。ＦｃＲｎ＿ｍ１のアミノ酸配列を配列番号１２に、ＦｃＲｎ＿ｍ１をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１３に示す。
【００５３】
実施例５  アミノ酸置換Ｆｃ結合性タンパク質の作製
実施例４で判明した、Ｆｃ結合性タンパク質の熱安定性向上に関与するアミノ酸置換を集積することで、さらなる安定性向上を図った。置換アミノ酸の集積は、主にＰＣＲを用いて行ない、以下の（ａ）から（ｃ）に示す３種類のＦｃ結合性タンパク質を作製した。
（ａ）ＦｃＲｎ＿ｍ１に対し、さらにＣｙｓ１７４Ａｒｇのアミノ酸置換を行なったＦｃＲｎ＿ｍ２
（ｂ）ＦｃＲｎ＿ｍ２に対し、さらにＡｒｇ２９５Ｌｅｕのアミノ酸置換を行なったＦｃＲｎ＿ｍ３
（ｃ）ＦｃＲｎ＿ｍ３に対し、さらにＧｌｎ３３５Ｌｅｕのアミノ酸置換を行なったＦｃＲｎ＿ｍ４
以下、各Ｆｃ結合性タンパク質の作製方法を詳細に説明する。
【００５４】
（ａ）ＦｃＲｎ＿ｍ２
実施例４で明らかになった、熱安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｃｙｓ１７４ＡｒｇおよびＡｓｎ１８１Ａｓｐを選択し、それらの置換を野生型のＦｃ結合性タンパク質に集積したＦｃＲｎ＿ｍ２を作製した。具体的には、ＦｃＲｎ＿ｍ１をコードするポリヌクレオチドに対してＣｙｓ１７４Ａｒｇを生じさせる変異導入を行なうことにより、ＦｃＲｎ＿ｍ２を作製した。
（ａ−１）実施例４で取得した、ｐＥＴ−ＦｃＲｎ＿ｍ１を鋳型としてＰＣＲを実施した。当該ＰＣＲにおけるプライマーは、配列番号８および配列番号１４（５’−ＣＡＣＧＣＡＣＣＧＣＧＴＧＧＴＴＣＴＧＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。ＰＣＲは、表４に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９８℃で５分間熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃で７分間熱処理することで行なった。増幅したＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動に供し、そのゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（キアゲン製）を用いて精製した。精製したＰＣＲ産物をｍ２Ｆとした。
【００５５】
【表４】
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【００５６】
（ａ−２）実施例４で取得した、ｐＥＴ−ＦｃＲｎ＿ｍ１を鋳型とし、配列番号９および配列番号１５（５’−ＧＣＡＧＡＡＣＣＡＣＧＣＧＧＴＧＣＧＴＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ−１）と同様に行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ２Ｒとした。
（ａ−３）（ａ−１）および（ａ−２）で得られた２種類のＰＣＲ産物（ｍ２Ｆ、ｍ２Ｒ）を混合し、表５に示す組成の反応液を調製した。当該反応液を９８℃で５分間熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を５サイクル行なうＰＣＲを行ない、ｍ２Ｆとｍ２Ｒを連結したＰＣＲ産物ｍ２ｐを得た。
【００５７】
【表５】
2018183087.tif 000007
【００５８】
（ａ−４）（ａ−３）で得られたＰＣＲ産物ｍ２ｐを鋳型とし、配列番号８および配列番号９に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲを行なった。ＰＣＲは、表６に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９８℃で５分間熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。これによりＦｃＲｎ＿ｍ１に１箇所アミノ酸置換を導入したＦｃＲｎ＿ｍ２をコードするポリヌクレオチドを作製した。
【００５９】
【表６】
2018183087.tif 000008
【００６０】
（ａ−５）（ａ−４）で得られたポリヌクレオチドを精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ａ−６）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した。回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出することで、野生型Ｆｃ結合性タンパク質に対して２箇所アミノ酸置換したポリペプチドである、ＦｃＲｎ＿ｍ２をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴ−ＦｃＲｎ＿ｍ２を得た。
（ａ−７）ｐＥＴ−ＦｃＲｎ＿ｍ２のヌクレオチド配列の解析を、実施例１（５）と同様の方法で行なった。
【００６１】
作製したＦｃＲｎ＿ｍ２のアミノ酸配列を配列番号１６に、前記ＦｃＲｎ＿ｍ２をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１７に示す。
【００６２】
（ｂ）ＦｃＲｎ＿ｍ３
実施例４で明らかになったＦｃ結合性タンパク質の安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｃｙｓ１７４Ａｒｇ、Ａｓｎ１８１ＡｓｐおよびＡｒｇ２９５Ｌｅｕを選択し、それらの置換を野生型のＦｃ結合性タンパク質に集積したＦｃＲｎ＿ｍ３を作製した。具体的には、ＦｃＲｎ＿ｍ２をコードするポリヌクレオチドに対してＡｒｇ２９５Ｌｅｕを生じさせる変異導入を行なうことにより、ＦｃＲｎ＿ｍ３を作製した。
（ｂ−１）ｐＥＴ−ＦｃＲｎ＿ｍ２を鋳型として、また、プライマーとして配列番号８および配列番号１８（５’−ＣＡＣＧＡＣＣＡＡＧＴＴＣＧＡＧＡＴＧＴＴＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた他は（ａ−１）と同様の方法でＰＣＲ産物ｍ３Ｆを得た。
（ｂ−２）ｐＥＴ−ＦｃＲｎ＿ｍ２を鋳型として、また、プライマーとして配列番号９および配列番号１９（５’−ＧＡＡＣＡＴＣＴＣＧＡＡＣＴＴＧＧＴＣＧＴＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた他は（ａ−２）と同様の方法でＰＣＲ産物ｍ３Ｒを得た。
（ｂ−３）（ｂ−１）および（ｂ−２）により得られた２種類のＰＣＲ産物（ｍ３Ｆ、ｍ３Ｒ）を混合後、（ａ−３）と同様の方法にてＰＣＲを行ない、ｍ３Ｆとｍ３Ｒを連結した。得られたＰＣＲ産物をｍ３ｐとした。
（ｂ−４）（ｂ−３）で得られたＰＣＲ産物ｍ３ｐを鋳型とし、配列番号８および配列番号９に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、（ａ−４）と同様の方法でＰＣＲを行なった。これによりＦｃＲｎ＿ｍ３をコードするポリヌクレオチドを作製した。
（ｂ−５）（ｂ−４）で得られたポリヌクレオチドを精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ｂ−６）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した。回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出することで、野生型Ｆｃ結合性タンパク質に対して３箇所アミノ酸置換したポリペプチドである、ＦｃＲｎ＿ｍ３をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴ−ＦｃＲｎ＿ｍ３を得た。
（ｂ−７）ｐＥＴ−ＦｃＲｎ＿ｍ３のヌクレオチド配列の解析を、実施例１（５）と同様の方法で行なった。
【００６３】
作製したＦｃＲｎ＿ｍ３のアミノ酸配列を配列番号２０に、前記ＦｃＲｎ＿ｍ３をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号２１に示す。
【００６４】
（ｃ）ＦｃＲｎ＿ｍ４
実施例４で明らかになったＦｃ結合性タンパク質の安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｃｙｓ１７４Ａｒｇ、Ａｓｎ１８１Ａｓｐ、Ａｒｇ２９５ＬｅｕおよびＧｌｎ３３５Ｌｅｕを選択し、それらの置換を野生型のＦｃ結合性タンパク質に集積したＦｃＲｎ＿ｍ４を作製した。具体的には、（ｂ）で作製したＦｃＲｎ＿ｍ３をコードするポリヌクレオチドに対してＧｌｎ３３５Ｌｅｕを生じさせる変異導入を行なうことにより、ＦｃＲｎ＿ｍ４を作製した。
（ｃ−１）（ｂ）で作製した、ｐＥＴ−ＦｃＲｎ＿ｍ３を鋳型とし、配列番号８および配列番号２２（５’−ＧＣＧＣＡＧＣＡＧＧＡＧＴＴＣＴＧＧＡＧＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ−１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ４Ｆとした。
（ｃ−２）（ｂ）で作製したｐＥＴ−ＦｃＲｎ＿ｍ３を鋳型とし、配列番号９および配列番号２３（５’−ＣＣＴＣＣＡＧＡＡＣＴＣＣＴＧＣＴＧＣＧＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ−２）と同様の方法でＰＣＲを行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ４Ｒとした。
（ｃ−３）（ｃ−１）および（ｃ−２）で得られた２種類のＰＣＲ産物（ｍ４Ｆ、ｍ４Ｒ）を混合後、（ａ−３）と同様の方法にてＰＣＲを行ない、ｍ４Ｆとｍ４Ｒを連結した。得られたＰＣＲ産物をｍ４ｐとした。
（ｃ−４）（ｃ−３）で得られたＰＣＲ産物ｍ４ｐを鋳型とし、配列番号８および配列番号９に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、（ａ−４）と同様の方法でＰＣＲを行なった。これによりＦｃＲｎ＿ｍ４をコードするポリヌクレオチドを作製した。
（ｃ−５）（ｃ−４）で得られたポリヌクレオチドを精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ｃ−６）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した。回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出することで、野生型Ｆｃ結合性タンパク質に対して４箇所アミノ酸置換したポリペプチドである、ＦｃＲｎ＿ｍ４をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴ−ＦｃＲｎ＿ｍ４を得た。
（ｃ−７）ｐＥＴ−ＦｃＲｎ＿ｍ４のヌクレオチド配列の解析を、実施例１（５）と同様の方法で行なった。
【００６５】
作製したＦｃＲｎ＿ｍ４のアミノ酸配列を配列番号５に、前記ＦｃＲｎ＿ｍ４をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号２４に示す。
【００６６】
実施例６  ＦｃＲｎ＿ｍ４への変異導入およびライブラリーの作製
実施例５（ｃ）で作製したＦｃＲｎ＿ｍ４をコードするポリヌクレオチド部分に、エラープローンＰＣＲによりランダムに変異導入を施した。
（１）鋳型として実施例５（ｃ）で作製した発現ベクターｐＥＴ−ＦｃＲｎ＿ｍ４を用いてエラープローンＰＣＲを行なった。エラープローンＰＣＲは、鋳型にｐＥＴ−ＦｃＲｎ＿ｍ４を用いた以外は表２に示す組成と同様の反応液を調製後、当該反応液を９５℃で２分間熱処理し、９５℃で３０秒間の第１ステップ、６０℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３５サイクル行ない、最後に７２℃で７分間熱処理することで行なった。この反応によりＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドに良好に変異が導入された。
（２）（１）で得られたＰＣＲ産物を精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ同制限酵素で消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションした。
（３）ライゲーション反応終了後、反応液をエレクトロポレーション法により大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢプレート培地で培養後、プレート上に形成したコロニーをランダム変異ライブラリーとした。
【００６７】
実施例７  熱安定化Ｆｃ結合性タンパク質のスクリーニング
（１）実施例６で作製したランダム変異ライブラリーを、熱処理を４５℃、１０分間の条件で実施した他は実施例４（１）から（５）に記載の方法と同様にスクリーニングを実施し、安定性の向上したＦｃ結合性タンパク質をコードする発現ベクターを取得した。
（２）得られた発現ベクターに挿入されたＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド領域の配列を実施例１（５）に記載の方法によりヌクレオチド配列を解析し、アミノ酸の変異箇所を特定した。
【００６８】
（１）で選択した形質転換体が発現するＦｃ結合性タンパク質の、ＦｃＲｎ＿ｍ４に対するアミノ酸置換位置および熱処理後の残存活性（％）をまとめたものを表７に示す。配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち、当該アミノ酸残基において、Ａｒｇ１４Ｈｉｓ、Ｌｙｓ５０Ｇｌｕ、Ｔｙｒ６９Ｈｉｓ、Ｇｌｙ１０７Ａｓｐ、Ｇｌｙ１２５Ａｓｐ、Ｓｅｒ１２６Ａｓｎ、Ａｓｎ１６５Ｔｈｒ、Ｇｌｎ１８２Ｈｉｓ、Ｌｙｓ２０６Ｇｌｕ、Ｓｅｒ２３０Ｐｒｏ、Ｇｌｙ２５４Ａｓｐ、Ｌｙｓ２７６Ｇｌｕ、Ｇｌｙ２９６Ａｓｐ、Ａｓｎ２９９Ａｓｐ、Ｌｅｕ３３６Ｐｒｏ、Ｇｌｙ３５８Ｓｅｒ、Ｓｅｒ３６４Ｐｒｏ、Ｌｙｓ３６９Ｇｌｕ、Ｌｙｓ３６９Ａｒｇ、Ｓｅｒ３７０ＰｒｏおよびＬｙｓ３９８Ｇｌｕのいずれかのアミノ酸置換が少なくとも１つ生じているＦｃ結合性タンパク質は、ＦｃＲｎ＿ｍ４と比較し熱安定性が向上しているといえる。
【００６９】
なお前記アミノ酸置換のうち、Ａｒｇ１４Ｈｉｓの置換は配列番号２の３２番目のアミノ酸残基における置換に、Ｌｙｓ５０Ｇｌｕの置換は配列番号２の６８番目のアミノ酸残基における置換に、Ｔｙｒ６９Ｈｉｓの置換は配列番号２の８７番目のアミノ酸残基における置換に、Ａｓｎ１６５Ｔｈｒの置換は配列番号１の６２番目のアミノ酸残基における置換に、Ｇｌｎ１８２Ｈｉｓの置換は配列番号１の７９番目のアミノ酸残基における置換に、Ｌｙｓ２０６Ｇｌｕの置換は配列番号１の１０３番目のアミノ酸残基における置換に、Ｓｅｒ２３０Ｐｒｏの置換は配列番号１の１２７番目のアミノ酸残基における置換に、Ｇｌｙ２５４Ａｓｐの置換は配列番号１の１５１番目のアミノ酸残基における置換に、Ｌｙｓ２７６Ｇｌｕの置換は配列番号１の１７３番目のアミノ酸残基における置換に、Ｇｌｙ２９６Ａｓｐの置換は配列番号１の１９３番目のアミノ酸残基における置換に、Ａｓｎ２９９Ａｓｐの置換は配列番号１の１９６番目のアミノ酸残基における置換に、Ｌｅｕ３３６Ｐｒｏの置換は配列番号１の２３３番目のアミノ酸残基における置換に、Ｇｌｙ３５８Ｓｅｒの置換は配列番号１の２５５番目のアミノ酸残基における置換に、Ｓｅｒ３６４Ｐｒｏの置換は配列番号１の２６１番目のアミノ酸残基における置換に、Ｌｙｓ３６９ＧｌｕおよびＬｙｓ３６９Ａｒｇの置換は配列番号１の２６６番目のアミノ酸残基における置換に、Ｓｅｒ３７０Ｐｒｏの置換は配列番号１の２６７番目のアミノ酸残基における置換に、Ｌｙｓ３９８Ｇｌｕの置換は配列番号１の２９５番目のアミノ酸残基における置換に、それぞれ相当する。
【００７０】
【表７】
2018183087.tif 000009
【００７１】
表７に示す、ＦｃＲｎ＿ｍ４からアミノ酸置換されたＦｃ結合性タンパク質のうち、Ｇｌｙ２５４Ａｓｐのアミノ酸置換が生じたＦｃ結合性タンパク質をＦｃＲｎ＿ｍ５と命名し、ＦｃＲｎ＿ｍ５をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターをｐＥＴ−ＦｃＲｎ＿ｍ５と命名した。ＦｃＲｎ＿ｍ５のアミノ酸配列を配列番号２５に、ＦｃＲｎ＿ｍ５をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号２６に示す。
【００７２】
実施例８  改良Ｆｃ結合性タンパク質の作製
実施例７で判明した、Ｆｃ結合性タンパク質の熱安定性向上に関与するアミノ酸置換を集積することで、さらなる安定性向上を図った。置換アミノ酸の集積は、主にＰＣＲを用いて行ない、以下の（ａ）から（ｂ）に示す２種類のＦｃ結合性タンパク質を作製した。
（ａ）ＦｃＲｎ＿ｍ５に対し、さらにＡｓｎ２９９Ａｓｐのアミノ酸置換を行なったＦｃＲｎ＿ｍ６
（ｂ）ＦｃＲｎ＿ｍ６に対し、さらにＬｙｓ３９８Ｇｌｕのアミノ酸置換を行なったＦｃＲｎ＿ｍ７
以下、各Ｆｃ結合性タンパク質の作製方法を詳細に説明する。
【００７３】
以下、各改良Ｆｃ結合性タンパク質の作製方法を詳細に説明する。
【００７４】
（ａ）ＦｃＲｎ＿ｍ６
実施例７で明らかとなった、熱安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｇｌｙ２５４ＡｓｐおよびＡｓｎ２９９Ａｓｐを選択し、それらの置換をＦｃＲｎ＿ｍ４（実施例５）に集積したＦｃＲｎ＿ｍ６を作製した。具体的には、ＦｃＲｎ＿ｍ５をコードするポリヌクレオチドに対して、Ａｓｎ２９９Ａｓｐを生じさせる変異導入を行なうことにより、ＦｃＲｎ＿ｍ６を作製した。
（ａ−１）実施例７で取得した、ｐＥＴ−ＦｃＲｎ＿ｍ５を鋳型としてＰＣＲを実施した。当該ＰＣＲにおけるプライマーは、配列番号８および配列番号２７（５’−ＣＣＴＴＣＣＡＴＴＣＧＡＧＧＴＣＡＣＣＡＣＧＡＣＣＡＡＧＴＴ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。ＰＣＲは、表５に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９８℃で５分間熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃で５分間熱処理することで行なった。増幅したＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動に供し、そのゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（キアゲン製）を用いて精製した。精製したＰＣＲ産物をｍ６Ｆとした。
（ａ−２）実施例７で取得した、ｐＥＴ−ＦｃＲｎ＿ｍ５を鋳型とし、配列番号２８（５’−ＡＡＣＴＴＧＧＴＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＴＣＧＡＡＴＧＧＡＡＧＧ−３’）および配列番号９に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ−１）と同様に行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ６Ｒとした。
（ａ−３）（ａ−１）および（ａ−２）で得られた２種類のＰＣＲ産物（ｍ６Ｆ、ｍ６Ｒ）を混合し、表６に示す組成の反応液を調製した。当該反応液を９８℃で５分間熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を５サイクル行なうＰＣＲを行ない、ｍ６Ｆとｍ６Ｒを連結したＰＣＲ産物ｍ６ｐを得た。
（ａ−４）（ａ−３）で得られたＰＣＲ産物ｍ６ｐを鋳型とし、配列番号８および配列番号９に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲを行なった。ＰＣＲは、表７に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９８℃で５分間熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。これによりＦｃＲｎ＿ｍ５に１箇所アミノ酸置換を導入したＦｃＲｎ＿ｍ６をコードするポリヌクレオチドを作製した。
（ａ−５）（ａ−４）で得られたポリヌクレオチドを制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ａ−６）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した。回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出することで、ＦｃＲｎ＿ｍ５に対して１箇所（野生型Ｆｃ結合性タンパク質に対して６箇所）アミノ酸置換したポリペプチドである、ＦｃＲｎ＿ｍ６をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴ−ＦｃＲｎ＿ｍ６を得た。
（ａ−７）ｐＥＴ−ＦｃＲｎ＿ｍ６のヌクレオチド配列の解析を、実施例１（５）と同様の方法で行なった。
【００７５】
作製したＦｃＲｎ＿ｍ６のアミノ酸配列を配列番号２９に、前記ＦｃＲｎ＿ｍ６をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号３０に示す。
【００７６】
（ｂ）ＦｃＲｎ＿ｍ７
実施例７で明らかとなった、熱安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｇｌｙ２５４Ａｓｐ、Ａｓｎ２９９ＡｓｐおよびＬｙｓ３９８Ｇｌｕを選択し、それらの置換をＦｃＲｎ＿ｍ４（実施例５）に集積したＦｃＲｎ＿ｍ７を作製した。具体的には、ＦｃＲｎ＿ｍ６をコードするポリヌクレオチドに対して、Ｌｙｓ３９８Ｇｌｕを生じさせる変異導入を行なうことにより、ＦｃＲｎ＿ｍ７を作製した。
（ｂ−１）（ａ）で作製した、ｐＥＴ−ＦｃＲｎ＿ｍ６を鋳型とし、配列番号８および配列番号３１（５’−ＡＴＧＡＧＡＡＧＡＴＴＣＧＧＣＡＧＧＧＧＡＴＴ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ−１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ７Ｆとした。
（ｂ−２）（ａ）で作製したｐＥＴ−ＦｃＲ８を鋳型とし、配列番号２３および配列番号３２（５’−ＡＡＴＣＣＣＣＴＧＣＣＧＡＡＴＣＴＴＣＴＣＡＴ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ−１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ７Ｒとした。
（ｂ−３）（ｂ−１）および（ｂ−２）で得られた２種類のＰＣＲ産物（ｍ７Ｆ、ｍ７Ｒ）を混合後、（ａ−３）と同様の方法にてＰＣＲを行ない、ｍ７Ｆとｍ７Ｒを連結した。得られたＰＣＲ産物をｍ７ｐとした。
（ｂ−４）（ｂ−３）で得られたＰＣＲ産物ｍ７ｐを鋳型とし、配列番号８および配列番号９に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、（ａ−４）と同様の方法でＰＣＲを行なった。これによりＦｃＲｎ＿ｍ７をコードするポリヌクレオチドを作製した。
（ｂ−５）（ｂ−４）で得られたポリヌクレオチドを精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ｂ−６）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した。回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出することで、ＦｃＲｎ＿ｍ５に対して２箇所（野生型Ｆｃ結合性タンパク質に対して７箇所）アミノ酸置換したポリペプチドである、ＦｃＲｎ＿ｍ７をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴ−ＦｃＲｎ＿ｍ７を得た。
（ｂ−７）ｐＥＴ−ＦｃＲｎ＿ｍ７のヌクレオチド配列の解析を、実施例１（５）と同様の方法で行なった。
【００７７】
作製したＦｃＲｎ＿ｍ７のアミノ酸配列を配列番号６に、前記ＦｃＲｎ＿ｍ７をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号３３に示す。
【００７８】
実施例９  ＦｃＲｎ＿ｍ７への変異導入およびライブラリーの作製
実施例８（ｂ）で作製したＦｃＲｎ＿ｍ７をコードするポリヌクレオチド部分に、エラープローンＰＣＲによりランダムに変異導入を施した。
（１）鋳型として実施例８（ｂ）で作製した発現ベクターｐＥＴ−ＦｃＲｎ＿ｍ７を用いてエラープローンＰＣＲを行なった。エラープローンＰＣＲは、鋳型にｐＥＴ−ＦｃＲｎ＿ｍ７を用いた以外は表２に示す組成と同様の反応液を調製後、当該反応液を９５℃で２分間熱処理し、９５℃で３０秒間の第１ステップ、６０℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３５サイクル行ない、最後に７２℃で７分間熱処理することで行なった。この反応によりＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドに良好に変異が導入された。
（２）（１）で得られたＰＣＲ産物を精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ同制限酵素で消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションした。
（３）ライゲーション反応終了後、反応液をエレクトロポレーション法により大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢプレート培地で培養後、プレート上に形成したコロニーをランダム変異ライブラリーとした。
【００７９】
実施例１０  熱安定化Ｆｃ結合性タンパク質のスクリーニング
（１）実施例９で作製したランダム変異ライブラリーを、熱処理を５２℃、３０分間の条件で実施した他は実施例４（１）から（５）に記載の方法と同様にスクリーニングを実施し、安定性の向上したＦｃ結合性タンパク質をコードする発現ベクターを取得した。
（２）得られた発現ベクターに挿入されたＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド領域の配列を実施例１（５）に記載の方法によりヌクレオチド配列を解析し、アミノ酸の変異箇所を特定した。
【００８０】
（１）で選択した形質転換体が発現するＦｃ結合性タンパク質の、ＦｃＲｎ＿ｍ７に対するアミノ酸置換位置および熱処理後の残存活性（％）をまとめたものを表８に示す。配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち、当該アミノ酸残基において、Ｖａｌ１５２Ａｌａ、Ａｓｎ２７５Ａｓｐ、Ａｒｇ３１３ＣｙｓおよびＳｅｒ３５９Ｐｒｏのいずれかのアミノ酸置換が少なくとも１つ生じているＦｃ結合性タンパク質は、ＦｃＲｎ＿ｍ７と比較し熱安定性が向上しているといえる。
【００８１】
なお前記アミノ酸置換のうち、Ｖａｌ１５２Ａｌａの置換は配列番号１の４９番目のアミノ酸残基における置換に、Ａｓｎ２７５Ａｓｐの置換は配列番号１の１７２番目のアミノ酸残基における置換に、Ａｒｇ３１３Ｃｙｓの置換は配列番号１の２１０番目のアミノ酸残基における置換に、Ｓｅｒ３５９Ｐｒｏの置換は配列番号１の２５６番目のアミノ酸残基における置換に、それぞれ相当する。
【００８２】
【表８】
2018183087.tif 000010
【００８３】
表８に示した、ＦｃＲｎ＿ｍ７からアミノ酸置換されたＦｃ結合性タンパク質のうち、Ｖａｌ１５２Ａｌａのアミノ酸置換が生じたＦｃ結合性タンパク質をＦｃＲｎ＿ｍ８と命名し、ＦｃＲｎ＿ｍ８をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターをｐＥＴ−ＦｃＲｎ＿ｍ８と命名した。ＦｃＲｎ＿ｍ８のアミノ酸配列を配列番号７に、ＦｃＲｎ＿ｍ８をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号３４に示す。
【００８４】
実施例１１  Ｆｃ結合性タンパク質の酸安定性評価
（１）野生型ＦｃＲｎ（配列番号３）、ＦｃＲｎ＿ｍ４（配列番号５）、ＦｃＲｎ＿ｍ７（配列番号６）およびＦｃＲｎ＿ｍ８（配列番号７）を発現する形質転換体を、それぞれ５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む３ｍＬの２ＹＴ液体培地に接種し、３７℃で一晩、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。
（２）５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加した２０ｍＬの２ＹＴ液体培地（ペプトン１６ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ）に前培養液を２００μＬ接種し、３７℃で好気的に振とう培養を行なった。
（３）培養開始１．５時間後、培養温度を２０℃に変更して３０分間振とう培養した。その後、終濃度０．０１ｍＭとなるようＩＰＴＧを添加し、引き続き２０℃で一晩、好気的に振とう培養した。
（４）培養終了後、遠心分離により集菌し、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（タカラバイオ製）を用いてタンパク質抽出液を調製した。
（５）（４）で調製したタンパク質抽出液中の野生型ＦｃＲｎ、ＦｃＲｎ＿ｍ４、ＦｃＲｎ＿ｍ７およびＦｃＲｎ＿ｍ８の抗体結合活性を、実施例２（５）に記載のＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。この時、市販のＦｃＲｎおよびβ２ミクログロブリンのヘテロダイマー（コスモバイオ製：ＣＩ０１）を用いて検量線を作製し、濃度測定を行なった。
（６）各Ｆｃ結合性タンパク質の濃度が３０μｇ／ｍＬになるよう純水で希釈後、前記希釈した溶液１００μＬと０．１Ｍのグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）２００μＬとを混合し、３０℃で１５分間静置した。
（７）グリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）による酸処理を行なった後のタンパク質の抗体結合活性と、前記酸処理を行なわなかったときのタンパク質の抗体結合活性を、実施例２（５）に記載のＥＬＩＳＡ法によって測定した。その後、酸処理を行なった場合の抗体結合活性を、酸処理を行なわなかったときの抗体結合活性で除することで、残存活性を算出した。
【００８５】
結果を表９に示す。今回評価したアミノ酸置換を行なったＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｎ＿ｍ４、ＦｃＲｎ＿ｍ７およびＦｃＲｎ＿ｍ８）は、野生型ＦｃＲｎと比較し残存活性が高かった。このことから、当該改良Ｆｃ結合性タンパク質の酸安定性が野生型に比べて向上していることが確認された。
【００８６】
【表９】
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【００８７】
実施例１２  システインタグを付加したＦｃＲｎ＿ｍ７（ＦｃＲｎ＿ｍ７Ｃｙｓ）の作製
（１）実施例８（ｂ）で作製したｐＥＴ−ＦｃＲｎ＿ｍ７を鋳型としてＰＣＲを実施した。当該ＰＣＲにおけるプライマーは、配列番号８および配列番号３５（５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＴＣＣＧＣＡＧＧＴＡＴＣＧＴＴＧＣＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＡＧＡＴＴＣＧＧＣＡＧＧＧＧＡＴＴＣＧＡＧＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。ＰＣＲは、表４に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９８℃で５分熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。
（２）（１）で得られたポリヌクレオチドを精製し、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、当該ライゲーション産物を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（３）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地にて培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（キアゲン製）を用いて、発現ベクターｐＥＴ−ＦｃＲｎ＿ｍ７Ｃｙｓを抽出した。
（４）ｐＥＴ−ＦｃＲｎ＿ｍ７Ｃｙｓのヌクレオチド配列の解析を、実施例１（５）と同様の方法で行なった。発現ベクターｐＥＴ−ＦｃＲｎ＿ｍ７Ｃｙｓで発現されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号３６に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号３７にそれぞれ示す。
【００８８】
実施例１３  ＦｃＲｎ＿ｍ７Ｃｙｓの調製
（１）実施例１２で作製したＦｃＲｎ＿ｍ７Ｃｙｓを発現する形質転換体を２Ｌのバッフルフラスコに入った５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む４００ｍＬの２ＹＴ液体培地（ペプトン１６ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ）に接種し、３７℃で一晩、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。
（２）グルコース１０ｇ／Ｌ、酵母エキス２０ｇ／Ｌ、リン酸三ナトリウム十二水和物３ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム十二水和物９ｇ／Ｌ、塩化アンモニウム１ｇ／Ｌおよび硫酸カナマイシン５０ｍｇ／Ｌを含む液体培地１．８Ｌに、（１）の培養液１８０ｍＬを接種し、３Ｌ発酵槽（バイオット製）を用いて本培養を行なった。温度３０℃、ｐＨ６．９から７．１、通気量１ＶＶＭ、溶存酸素濃度３０％飽和濃度の条件に設定し、本培養を開始した。ｐＨの制御には酸として５０％（ｗ／ｖ）リン酸、アルカリとして１４％（ｗ／ｖ）アンモニア水をそれぞれ使用し、溶存酸素の制御は撹拌速度を変化させることで制御し、撹拌回転数は下限５００ｒｐｍ、上限１０００ｒｐｍに設定した。培養開始後、グルコース濃度が測定できなくなった時点で、流加培地（グルコース２４８．９ｇ／Ｌ、酵母エキス８３．３ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物７．２ｇ／Ｌ）を溶存酸素（ＤＯ）により制御しながら加えた。
（３）菌体量の目安として６００ｎｍの吸光度（ＯＤ６００ｎｍ）が約１５０に達したところで培養温度を２５℃に下げ、設定温度に到達したことを確認した後、終濃度が０．５ｍＭになるようＩＰＴＧを添加し、引き続き２５℃で培養を継続した。
（４）培養開始から約４８時間後に培養を停止し、培養液を４℃で８０００ｒｐｍ、２０分間の遠心分離により菌体を回収した。
（５）回収した菌体を２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に５ｍＬ／１ｇ（菌体）となるように懸濁し、超音波発生装置（インソネーター２０１Ｍ（商品名）、久保田商事製）を用いて、４℃で約１０分間、約１５０Ｗの出力で菌体を破砕した。菌体破砕液は４℃で２０分間、８０００ｒｐｍの遠心分離を２回行ない、上清を回収した。
（６）（５）で得られた上清を、あらかじめ１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化したＩｇＧセファロース（ＧＥヘルスケア製）９０ｍＬを充填したＸＫ２６／２０カラムカラム（ＧＥヘルスケア製）にアプライした。平衡化に用いた緩衝液で洗浄後、０．１Ｍのグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）で溶出した。なお溶出液は、溶出液量の１／４量の１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を加えることでｐＨを中性付近に戻した。
【００８９】
前記精製により、高純度のＦｃＲｎ＿ｍ７Ｃｙｓを約１０ｍｇ得た。
【００９０】
実施例１４  ＦｃＲｎ＿ｍ７Ｃｙｓ固定化ゲルの作製と抗体分離
（１）２ｍＬの分離剤用親水性ビニルポリマー（東ソー製：トヨパール）の表面の水酸基をヨードアセチル基で活性化後、実施例１３で調製したＦｃＲｎ＿ｍ７Ｃｙｓを４ｍｇ反応させることにより、ＦｃＲｎ＿ｍ７Ｃｙｓ固定化ゲルを得た。
（２）（１）で調製したＦｃＲｎ＿ｍ７Ｃｙｓ固定化ゲル０．５ｍＬをφ４．６ｍｍ×７５ｍｍのステンレスカラムに充填した。
（３）ＦｃＲｎ＿ｍ７Ｃｙｓ固定化ゲルを充填したカラムをＨＰＬＣ装置に接続し、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５．８）で平衡化した。
（４）１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５．８）で０．５ｍｇ／ｍＬに希釈したモノクローナル抗体（リツキシマブ：全薬工業製リツキサン、トラスツズマブおよびベバシズマブ）を流速０．６ｍＬ／ｍｉｎにて０．０１ｍＬアプライした。
（５）流速０．６ｍＬ／ｍｉｎのまま１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５．８）の平衡化緩衝液で１０分洗浄後、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）によるｐＨグラジエント溶出（３０分で１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）が１００％となるグラジエント）で吸着したモノクローナル抗体を溶出した。
【００９１】
結果（溶出パターン）を図４に示す。抗体の種類によってＦｃＲｎ＿ｍ７と相互作用する程度が異なるため、溶出ピークは抗体毎に異なった形状となった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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