(57)【要約】【課題】本発明は、免疫チェックポイント遺伝子に特異的に結合し、細胞死を誘導する、腫瘍特異的集積性を有する新規アルキル化剤を提供する。【解決手段】免疫チェックポイント分子をコードする遺伝子に特異的に結合するポリアミドにアルキル化剤を結合させた複合体、当該複合体を含む免疫チェックポイント分子をコードする遺伝子特異的アルキル化剤、及び当該複合体を含む医薬組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫チェックポイント分子又はその関連分子をコードする遺伝子領域に特異的に結合するＤＮＡ結合化合物と、アルキル化剤との複合体。
【請求項２】
複合体が腫瘍及び腫瘍周囲微小環境に集積し、腫瘍において特異的に免疫チェックポイント分子又はその関連分子を抑制する、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
免疫チェックポイント分子が、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＰＤ−Ｌ２、及びＣＤ２８からなる群から選択され、免疫チェックポイント分子に関連する分子が、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＩＦＮγ、ＩＦＮ−Ｉ、ＩＤＯ、ＫＩＲ２ＤＬ−１、ＫＩＲ２ＤＬ−２、ＫＩＲ２ＤＬ−３、ＫＩＲ２ＤＳ−１、ＫＩＲ２ＤＡ−２、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、ＴＩＭ−３、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７ＲＰ１、ＩＣＯＳ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＶＥＭ、ＢＴＬＡ、ＣＤ１３７、ＣＤ７０、ＯＸ４０、ＣＤ４０、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ７０Ｌ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＧＡＬ９、Ａ２ｅＲ、ＴＧＦβ、ＩＬ１、ＩＬ６、ＩＬ１０、ＩＬ１２及びＩＬ１８、並びに遺伝子データベースに登録される免疫関連分子からなる群から選択される少なくとも１つ以上である、請求項１又は２に記載の複合体。
【請求項４】
ＤＮＡ結合化合物がＢｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ（架橋化核酸）、Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ（ＬＮＡ）、ＰＮＡ、ピロール・イミダゾールポリアミド（ＰＩＰ）、ピロール・イミダゾールポリアミド（ＰＩＰ）修飾物、ＤＮＡ結合蛋白質、及びＤＮＡ結合蛋白質複合体からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項５】
アルキル化剤が、ＤＮＡの特定の塩基配列に対して、アルキル化能を有する官能基を有する化合物である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項６】
アルキル化剤がｓｅｃｏＣＢＩである、請求項５に記載の複合体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の複合体を含む、免疫チェックポイント分子叉はその関連分子をコードする遺伝子特異的アルキル化剤。
【請求項８】
下式で表される請求項１に記載の複合体。
【化１】
2018052930.tif 000013
【請求項９】
下式で表される請求項１に記載の複合体。
【化２】
2018052930.tif 000014
【請求項１０】
下式で表される請求項１に記載の複合体。
【化３】
2018052930.tif 000015
【請求項１１】
請求項８〜１０のいずれか１項に記載の複合体を含む免疫チェックポイント分子をコードする遺伝子領域に結合するアルキル化剤。
【請求項１２】
請求項１〜６及び８〜１０のいずれか１項に記載の複合体を含む医薬組成物。
【請求項１３】
医薬組成物が抗がん剤である、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１〜６及び８〜１０のいずれか１項に記載の複合体を含むキット。
【請求項１５】
請求項１〜６及び８〜１０のいずれか１項に記載の複合体を含む研究試薬キット。
【請求項１６】
請求項１〜６及び８〜１０のいずれか１項に記載の複合体を含む治療用キット。
【請求項１７】
（１）免疫チェックポイント分子又はその関連分子をコードする遺伝子に特異的に結合するようにＤＮＡ結合化合物を設計する工程、
（２）設計した前記ＤＮＡ結合化合物とアルキル化剤とを結合させる工程を含む、
免疫チェックポイント分子又はその関連分子をコードする遺伝子を特異的にアルキル化する複合体の製造方法。
【請求項１８】
免疫チェックポイント分子が、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＰＤ−Ｌ２、及びＣＤ２８からなる群から選択され、免疫チェックポイント分子に関連する分子が、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＩＦＮγ、ＩＦＮ−Ｉ、ＩＤＯ、ＫＩＲ２ＤＬ−１、ＫＩＲ２ＤＬ−２、ＫＩＲ２ＤＬ−３、ＫＩＲ２ＤＳ−１、ＫＩＲ２ＤＡ−２、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、ＴＩＭ−３、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７ＲＰ１、ＩＣＯＳ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＶＥＭ、ＢＴＬＡ、ＣＤ１３７、ＣＤ７０、ＯＸ４０、ＣＤ４０、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ７０Ｌ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＧＡＬ９、Ａ２ｅＲ、ＴＧＦβ、ＩＬ１、ＩＬ６、ＩＬ１０、ＩＬ１２及びＩＬ１８、並びに遺伝子データベースに登録される免疫関連分子からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１７に記載の製造方法。
【請求項１９】
ＤＮＡ結合化合物がＢｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ（架橋化核酸）、Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ（ＬＮＡ）、ＰＮＡ、ピロール・イミダゾールポリアミド（ＰＩＰ）、ピロール・イミダゾールポリアミド（ＰＩＰ）修飾物、ＤＮＡ結合蛋白質、及びＤＮＡ結合蛋白質複合体からなる群から選択される、請求項１７又は１８に記載の製造方法。
【請求項２０】
アルキル化剤が、ＤＮＡの特定の塩基配列に対して、アルキル化能を有する官能基を有する化合物である、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の複合体の製造方法。
【請求項２１】
アルキル化剤がｓｅｃｏＣＢＩである、請求項２０に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫チェックポイント遺伝子を標的にアルキル化する新規アルキル化剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫チェックポイント分子を標的にした分子標的治療が広く開発され（The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Drew M. PardollNATURE REVIEWS CANCER 12;252-264 2012）、がんの免疫治療が注目を集めている。今まで固形がん治療において長期の緩解維持が出来る分子標的治療薬を開発することは困難であったが、免疫チェックポイント分子を標的に阻害する抗体薬は、予後不良であった固形腫瘍の長期緩解を得る画期的な治療法として血液腫瘍を含む様々ながんに対し臨床応用がなされている(Immune checkpoint blockade: a common denominator approach to cancer therapy. Topalian SL, Drake CG, Pardoll DM. Cancer Cell. 2015 Apr 13;27(4):450-61.）。
【０００３】
免疫チェックポイント分子としてＰｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ １ (ＰＤ−１)とｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｌｉｇａｎｄ １（ＰＤ-Ｌ１）、ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ ４ （ＣＴＬＡ−４）が、腫瘍免疫を単独若しくは複合して抑制する事で、腫瘍特異的T細胞免疫応答を回復させる事は、様々ながん種の抗腫瘍免疫治療法として確立されつつある。特に抗ＰＤ−１及び抗ＰＤ−Ｌ１、抗ＣＴＬＡ−４抗体を複合して治療することで有意に治療成績が向上することも実験動物や臨床データから示唆されるとともに、放射線治療や一般的な化学療法との併用についても死細胞からの刺激がマクロファージ等へ作用し治療成績を向上させることが解明されてきている（Cell. 2016 Apr 7;165(2):272-5. Combination Cancer Therapies with Immune Checkpoint Blockade: Convergence on Interferon Signaling. Minn AJ, Wherry EJ）。実際、免疫チェックポイント阻害剤同士の併用が実際の臨床試験で有意に効果を上げることも報告されている（Postow MA, et al. Nivolumab and ipilimumab versus ipilimumab in untreated melanoma. N Engl J Med. 2015;372:2006-17.）。さらにＰＤ−1が腫瘍で高発現し腫瘍増殖にも関与し、ＰＤ−1を過剰発現する腫瘍にはその抑制が直接がん細胞増殖抑制としての治療効果を生み出す知見も得られている（Kleffel et al., Cell 162, 1242-1256 2015.）。
【０００４】
一方、免疫チェックポイント阻害剤、抗ＰＤ−１及び抗ＰＤ−Ｌ１、抗ＣＴＬＡ−４抗体薬は全身投与であり、様々な臓器、組織細胞に対する自己免疫を誘発するなどの重篤な副作用が認められる可能性があることが問題視されている（Nat Rev Rheumatol. 2016 Aug 19. doi: 10.1038/nrrheum.2016.131. Immune checkpoints and rheumatic diseases: what can cancer immunotherapy teach us? van der Vlist M, Kuball J, Radstake TR, Meyaard L）。また薬剤が非常に高価であること、治療できる腫瘍が限定されている可能性があること等の問題も指摘されている（Importance of immunopharmacogenomics in cancer treatment: Patient selection and monitoring for immune checkpoint antibodies. Choudhury N, Nakamura Y. Cancer Sci. 2016 Feb;107(2):107-15.）。つまり、効果が認められない症例が多いことも問題と考えられ（Webster RM. The immune checkpoint inhibitors: where are we now? Nat Rev Drug Discov. 2014;13(12):883-4.）、肺線維症やI型糖尿病のような致死性の自己免疫疾患などの重篤な副作用が問題となっている。このため腫瘍及びその周囲の微小環境で特異的に免疫チェックポイント阻害を行う治療薬が求められている。
【０００５】
ピロール・イミダゾールポリアミド（ＰＩＰ）は抗生物質デスタマイシンをモチーフとして開発された人工小分子であり、２本鎖ＤＮＡのマイナーグルーブへ配列特異的に結合することが報告されており、ＰＩＰによる標的配列の遺伝子の発現抑制に関する研究は、多く報告されている。さらにマウスを用いた動物実験により腎障害に対する薬剤や抗がん剤、角膜外傷、肥厚性瘢痕、骨疾患等に対する治療薬としての研究も進められている。また近年では、ｉＰＳ細胞の研究の一環として京都大学のｉＰＳ細胞プロジェクトであるｉＣｅＭｓの研究においてもＰＩＰによるｉＰＳ細胞誘導の研究が行われている。ＰＩＰは、様々な研究成果が期待されている有機小分子である。
【０００６】
ＰＩＰの特徴として、（１）任意の遺伝子配列をターゲットとして設計することが可能、（２）ＤＮＡに対する結合能が転写因子よりも強い、（３）ベクターやドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）無しに細胞の核に取り込まれること、（４）核酸分解酵素に分解されず、細胞や生体内で安定であり、尿胆汁より未分解物として排泄される、（５）Ｎ及びＣ末端を容易に修飾することが可能であり、様々な機能性小分子との複合体の形成が可能であること等が挙げられる。
【０００７】
ＰＩＰは、Ｐｙ／ＩｍペアがＣＧ、Ｐｙ／ＰｙペアがＡＴ又はＴＡ、Ｉｍ／ＰｙペアがＧＣを認識し、これにより様々な任意の二重鎖ＤＮＡに配列特異的に結合することが可能である。標的遺伝子に結合したＰＩＰは、転写因子のＤＮＡへの結合を阻害し、特定の遺伝子発現を抑制する遺伝子スイッチとして研究されている。またアルキル化剤等との複合化合物により、特定の遺伝子変異を標的にした治療薬としての開発も試みられている。
【０００８】
本発明者は、配列認識特異性の高いＰＩＰ構造を利用して、アルキル化官能基とＰＩＰとの複合体を合成し、ＤＮＡの特定塩基配列をアルキル化するインドール誘導体（特許文献２）、ヒストン修飾制御剤とＰＩＰとの複合体を合成し、標的遺伝子特異的ヒストン修飾制御剤に係る発明（特許文献１）及びドライバー遺伝子変異を標的にした治療薬の開発（特許文献３）をそれぞれ完成することに成功していた。しかし、ＰＩＰを用いるというコンセプトを基にして、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、及びＣＴＬＡ−４といった免疫チェックポイントに関連する分子の発現を同時に腫瘍特異的に抑制する（がんが免疫機構から回避する仕組みを抑制する）薬剤を合成し、実際に腫瘍抑制効果が得られるということはいまだに報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ２０１０／００１９３３号
【特許文献２】国際公開第ＷＯ２００５／０８７７６２号
【特許文献３】国際公開第ＷＯ２０１５／０５３４１３号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上述のとおり、免疫チェックポイントに関与する３つの分子の責任遺伝子や関連する分子を複合的に抑制し、放射線や化学療法での細胞死による免疫活性化を促進する。さらにこれらの反応が、がん及びがん周囲微小環境で特異的に生じる。そのような複合免疫チェックポイント抑制治療薬が求められていた。そこで、本発明は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、及びＣＴＬＡ−４の遺伝子を標的にアルキル化し、発現を抑制するとともにがん細胞死を直接誘導し、さらに薬剤が腫瘍に集積することで、腫瘍周囲でより効果的に免疫チェックポイント遺伝子発現を抑制し、他の臓器には作用を最小限に抑える新規アルキル化剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、及びＣＴＬＡ−４の３遺伝子に特異的に結合するピロール・イミダゾールポリアミド（ＰＩＰ）ＣＣＣ０７−０１を設計し、設計したＰＩＰにアルキル反応部位を結合させた化合物を合成し、免疫チェックポイント分子の遺伝子を特異的に認識して結合し、アルキル化する新規化合物を合成することに成功し、さらに新規化合物が効率的にＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、及びＣＴＬＡ−４遺伝子の発現を抑制し、腫瘍細胞に細胞死を誘導することを確認し、化合物の物質特性から腫瘍細胞への取り込みとマウス移植腫瘍への集積性を示唆する所見が得られたため本発明の完成に至った。
【００１２】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）免疫チェックポイント分子又はその関連分子をコードする遺伝子領域に特異的に結合するＤＮＡ結合化合物と、アルキル化剤との複合体。
（２）複合体が腫瘍及び腫瘍周囲微小環境に集積し、腫瘍において特異的に免疫チェックポイント分子又はその関連分子を抑制する、（１）に記載の複合体。
（３）免疫チェックポイント分子が、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＰＤ−Ｌ２、及びＣＤ２８からなる群から選択され、免疫チェックポイント分子に関連する分子が、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＩＦＮγ、ＩＦＮ−Ｉ、ＩＤＯ、ＫＩＲ２ＤＬ−１、ＫＩＲ２ＤＬ−２、ＫＩＲ２ＤＬ−３、ＫＩＲ２ＤＳ−１、ＫＩＲ２ＤＡ−２、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、ＴＩＭ−３、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７ＲＰ１、ＩＣＯＳ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＶＥＭ、ＢＴＬＡ、ＣＤ１３７、ＣＤ７０、ＯＸ４０、ＣＤ４０、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ７０Ｌ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＧＡＬ９、Ａ２ｅＲ、ＴＧＦβ、ＩＬ1、ＩＬ６、ＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＬ１８、並びに遺伝子データベースに登録される免疫関連分子からなる群から選択される少なくとも１つ以上である、（１）又は（２）に記載の複合体。
（４）ＤＮＡ結合化合物がＢｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ（架橋化核酸）、Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ（ＬＮＡ）、ＰＮＡ、ピロール・イミダゾールポリアミド（ＰＩＰ）、ピロール・イミダゾールポリアミド（ＰＩＰ）修飾物、ＤＮＡ結合蛋白質、及びＤＮＡ結合蛋白質複合体からなる群から選択される（１）〜（３）のいずれか１つに記載の複合体。
（５）アルキル化剤が、ＤＮＡの特定の塩基配列に対して、アルキル化能を有する官能基を有する化合物である、（１）〜（４）のいずれか１つに記載の複合体。
（６）アルキル化剤がｓｅｃｏＣＢＩである、（５）に記載の複合体。
（７）（１）〜（６）のいずれか１つに記載の複合体を含む、免疫チェックポイント分子又はその関連分子をコードする遺伝子特異的アルキル化剤。
【００１３】
（８）下式で表される（１）に記載の複合体。
【化１】
2018052930.tif 000002
【００１４】
（９）下式で表される（１）に記載の複合体。
【化２】
2018052930.tif 000003
【００１５】
（１０）下式で表される（１）に記載の複合体。
【化３】
2018052930.tif 000004
【００１６】
（１１）（８）〜（１０）のいずれかに記載の複合体を含む免疫チェックポイント分子をコードする遺伝子領域に結合するアルキル化剤。
（１２）（８）〜（１０）のいずれかに記載の複合体を含むＰＤ−１分子遺伝子に対するアルキル化剤。
（１３）（８）〜（１０）のいずれかに記載の複合体を含むＰＤ−Ｌ１分子遺伝子に対するアルキル化剤。
（１４）（８）〜（１０）のいずれかに記載の複合体を含むＣＴＬＡ−４分子遺伝子に対するアルキル化剤。
（１５）（８）〜（１０）のいずれかに記載の複合体を含むＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４分子遺伝子の２つ以上の遺伝子領域に結合できるアルキル化剤。
（１６）（１）〜（６）、（８）〜（１０）のいずれか１つに記載の複合体を含む医薬組成物。
（１７）医薬組成物が抗がん剤である（１６）に記載の医薬組成物。
（１８）（１）〜（６）、（８）〜（１０）のいずれか１つに記載の複合体を含むキット。
（１９）（１）〜（６）、（８）〜（１０）のいずれか１つに記載の複合体を含む研究試薬キット。
（２０）（１）〜（６）、（８）〜（１０）のいずれか１つに記載の複合体を含む治療用キット。
（２１）(1)免疫チェックポイント分子又はその関連分子をコードする遺伝子に特異的に結合するようにＤＮＡ結合化合物を設計する工程、
(2)設計したＤＮＡ結合化合物とアルキル化剤とを結合させる工程を含む、
免疫チェックポイント分子又はその関連分子をコードする遺伝子を特異的にアルキル化する複合体の製造方法。
（２２）遺伝子領域がエクソン又はイントロン、及びプロモータ若しくは３プライム転写領域である、（２１）に記載の製造方法。
（２３）免疫チェックポイント分子が、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＰＤ−Ｌ２、及びＣＤ２８、並びに免疫応答に関与する遺伝子から選ばれる少なくとも１つか、あるいは複合した２つ以上の分子であるからなる群から選ばれる少なくとも１つである、（２１）又は（２２）に記載の製造方法。
（２４）ＤＮＡ結合化合物がＢｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ（架橋化核酸）、Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ（ＬＮＡ）、ＰＮＡ、ピロール・イミダゾールポリアミド（ＰＩＰ）、ピロール・イミダゾールポリアミド（ＰＩＰ）修飾物又はＤＮＡ結合蛋白質、及びＤＮＡ結合蛋白質複合体からなる群から選択される、（２１）〜（２３）のいずれか１つに記載の製造方法。
（２５）アルキル化剤が、ＤＮＡの特定の塩基配列に対して、アルキル化能を有する官能基を有する化合物である、（２１）〜（２４）のいずれか１つに記載の製造方法。
（２６）アルキル化剤がｓｅｃｏＣＢＩである、（２５）に記載の製造方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、免疫チェックポイント分子の遺伝子領域を特異的に腫瘍細胞及び周囲微小環境においてアルキル化するための複合体が提供される。本発明の好ましい態様によれば、本発明の複合体は、医薬組成物又は抗がん剤として用いることができる。本発明の別の好ましい態様によれば、本発明の複合体は、免疫チェックポイント分子遺伝子を特異的にアルキル化する化合物である。本発明の別の好ましい態様によれば、腫瘍で特異的に免疫関連遺伝子をアルキル化し、発現を抑制する化合物である。
【００１８】
本発明により、免疫チェックポイント分子の遺伝子に特異的に結合するポリアミドを付加するという方法論が、腫瘍特異的な様々な蛋白質を免疫細胞が認識する新規抗がん剤の創出にとって極めて有効なアプローチの１つであることが明らかとなった。具体的には、塩基配列特異的に結合する有機小分子であるＰＩＰにアルキル化剤であるＣＢＩを付加し、ＤＮＡとの強い結合力を有し、少量でも効果的に遺伝子発現を抑制する抗免疫チェックポイント分子の発現阻害治療薬を開発することが可能となった。この効果は、アルキル化によるＤＮＡ損傷が細胞死シグナルを誘導し、腫瘍細胞内の腫瘍特異的な抗原蛋白質を放出することで、通常腫瘍免疫が誘引されないがん細胞を含めて腫瘍免疫の活性化を誘導できるためと考えられる。
【００１９】
つまり、本発明は、免疫チェックポイント分子のゲノム配列に送達する技術を提供するものであり、この技術を応用すると免疫チェックポイント分子の共通配列や免疫チェックポイント分子遺伝子だけではなく、がん特異的な様々ながん関連遺伝子に対して変異配列を特異的に認識できる治療薬を次々にデザイン・合成することも可能とするものである。そして、抗体−薬物複合体（ＡＤＣ：antibody-drug conjugate）技術と同様の考え方も適用でき、合成も容易であるため幅広い用途に応用できる。
【００２０】
本発明の複合体は、免疫チェックポイント分子遺伝子を発現する細胞株に対し、細胞死を誘導する濃度と同様、あるいはより低濃度で特異的に免疫チェックポイント分子の発現を抑制し、さらに抗がん活性を示し（ナノモルから細胞増殖抑制を生じる）、自動合成が可能であり、腫瘍への集積性・蓄積性が高く、核内に局在するといった優れた効果を有している。そのため、本発明の複合体は、臨床上問題となっている臓器組織細胞に対する自己免疫疾患を回避したうえで腫瘍及び腫瘍周囲微小環境に集積し、腫瘍において特異的に強い免疫チェックポイント分子阻害薬を提供するだけでなく、免疫チェックポイント分子を複合的に標的とした治療薬として、新たな画期的治療薬の開発を可能とするものである。今後、本発明の複合体は、臨床試験開始に向けた開発研究（物性試験、安全性試験、薬物動態、ＧＭＰでの大量合成）の推進が期待されている。また、本発明の方法を応用すれば、同様若しくは相加的・相乗的な効果を奏するさらなる画期的な治療薬の開発が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ＰＤ−１遺伝子の構造及び化合物との結合位置を示す図である。
【図２】ＰＤ−Ｌ１遺伝子の構造及び化合物との結合位置を示す図である。
【図３】ＣＴＬＡ−４遺伝子の構造及び化合物との結合位置を示す図である。
【図４−１】免疫チェックポイント分子ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４の３つの遺伝子領域に結合しアルキル化するＰＩＰ薬物複合体の合成に係るＨＰＬＣ（図４−１Ａ）とＬＣ−ＭＳ(図４−１Ｂ）のクロマトグラムを示す図である。
【図４−２】ＩＣ５０を算出したWSTアッセイの結果を示す図である。
【図５】免疫チェックポイント分子ＰＤ−１発現細胞株におけるＰＩＰ薬物複合体投与によるＰＤ−１遺伝子の発現抑制の確認実験の結果を示す図である。図５Ａはアガロース電気泳動像を示し、図５ＢはＲｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲによる定量結果を示す。
【図６】免疫チェックポイント分子ＰＤ−Ｌ１発現細胞株におけるＰＩＰ薬物複合体投与によるＰＤ−Ｌ１遺伝子の発現抑制の確認実験の結果を示す図である。図６Ａは電気泳動像を示し、図６ＢはＲｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲによる定量結果を示す。
【図７】免疫チェックポイント分子ＣＴＬＡ−４発現細胞株におけるＰＩＰ薬物複合体投与によるＣＴＬＡ−４遺伝子の発現抑制の確認実験の結果を示す図である。図７Ａはアガロース電気泳動像を示し、図７ＢはＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞における発現の定量結果を示し、図７ＣはＡ２０５８細胞における発現の定量結果を示す。
【図８】ＷＳＴアッセイによりＰＩＰ薬物複合体及びＣＢＩアルキル化剤処理後のヒト大腸がん細胞株ＳＷ４８０及びＲＫＯ細胞の細胞増殖測定を行って、ＩＣ５０（５０％阻害濃度）を測定した図である。図８ＡはＣＣＣ０７−０１の結果を示し、図８ＢはＣＢＩの結果を示す。
【図９】ｌｏｇ−Ｐ値の異なるＦＩＴＣラベルしたＰＩＰを投与２時間後の培養腫瘍細胞への取り込みを観察した図である。
【図１０】ｌｏｇ−Ｐ値の異なるＦＩＴＣラベルしたＰＩＰをマウス静脈内に投与７２時間後の腫瘍組織蓄積と貯留及び正常臓器からの排泄を観察した図である。
【図１１】６種類のＰＩポリアミド（Ｉｍ００−Ｉｍ０５）の構造を示す図である。
【図１２】４種類の化合物(酢酸エチル、ベンゾニトリル、アセトフェノン、インドール)の保持時間とｌｏｇ−Ｐの値から求めた検量線を示す図である。
【図１３】２種類の化合物（Ｉｎｄｏｌｅ及びＣｕｒｃｕｍｉｎ）の保持時間とｌｏｇ−Ｐの値から求めた検量線を示す図である。
【図１４】ヒト腫瘍を移植したマウスにＣＣＣ０７−０１を投与したときの腫瘍体積の推移を示す図である。
【図１５】ヒト腫瘍を移植したマウスにＣＣＣ０７−０１を投与したときの脾臓中の細胞障害性T細胞とTregの比を示す図である。
【図１６】ＣＣＣ０７−０３の構造式を示す図である。
【図１７】ＣＣＣ０７−０３のＨＰＬＣ解析データを示す図である。
【図１８】ＣＣＣ０７−０３のＬＣ−ＭＣ解析データを示す図である。
【図１９】ＣＣＣ０７−０４の構造式を示す図である。
【図２０】ＣＣＣ０７−０４のＨＰＬＣ解析データを示す図である。
【図２１】ＣＣＣ０７−０４のＬＣ−ＭＣ解析データを示す図である。
【図２２】ＰＤ−Ｌ１を発現するＲＫＯ細胞におけるＣＣＣ０７−０３投与後の発現の定量結果を示す図である。図２２Ａは６時間後、図２２Ｂは２４時間後、図２２Ｃは４８時間後の結果を示す。
【図２３】ＣＴＬＡ−４を発現するＡ２０５８細胞におけるＣＣＣ０７−０３投与後の発現の定量結果を示す図である。図２３Ａは６時間後、図２３Ｂは２４時間後の結果を示す。
【図２４】ＣＴＬＡ−４を発現するＡ２０５８細胞におけるＣＣＣ０７−０４投与後の発現の定量結果を示す図である。
【図２５】Ｐｄ-ｌ１を発現するＢ１６Ｆ１マウス細胞におけるＣＣＣ０７−０４投与後の発現の定量結果を示す図である。
【図２６】がん細胞を移植したヌードマウスの腫瘍へのＰＩポリアミド化合物の集積性を示す図である。
【図２７】がん細胞を移植したヌードマウスの腫瘍へのＰＩポリアミド化合物の集積性を示す蛍光染色像を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明を詳細に説明する。なお、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。
本発明は、免疫チェックポイント分子及びその関連分子をコードする遺伝子領域に特異的に結合するＤＮＡ結合化合物と、アルキル化剤との複合体である。
免疫チェックポイント分子及び関連分子の遺伝子領域に特異的に結合するＤＮＡ結合化合物としては、ＰＩＰ（ピロール・イミダゾールポリアミド）構造を有する化合物が挙げられる。
【００２３】
配列認識特異性の高いＰＩＰ構造を用いて遺伝子配列特異的なアルキル化剤を合成できることは既知であるが、このコンセプトを元にして薬剤として免疫チェックポイント分子阻害に応用できるかは不明であった。また、ＰＩＰにアルキル化剤をコンジュゲートさせた化合物により、標的配列を持つ遺伝子の発現を抑制できることは報告されていたが、実際に免疫チェックポイント分子を複合的に標的として薬剤を合成し、腫瘍抑制効果が得られるという事実は未だに不明であった。本発明者は、アルキル化剤がＤＮＡ損傷を誘導し、そのことで細胞死を誘導すること、腫瘍の増殖を促進するＰＤ−１を抑制するメカニズムが働くこと、及びがん細胞によりがん細胞内の腫瘍抗原が放出されること、さらに腫瘍内に化合物が集積し、持続的に腫瘍及び周囲微小環境において免疫チェックポイント分子を複合的に抑制することにより効果的に免疫チェックポイントの阻害を腫瘍微小環境に誘導し、がん免疫治療による抗腫瘍効果を最大化するとともに、全身の臓器や組織細胞での免疫チェックポイント阻害効果を低下させることで、治療上の問題となっているI型糖尿病や甲状腺機能低下などの自己免疫疾患の発生を抑制できると仮説を立てた。
【００２４】
この仮説に基づきＰＩＰ薬剤複合体を合成し、免疫チェックポイント分子ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４をそれぞれ高発現するがん細胞株で遺伝子発現への影響を観察したところ、それぞれの免疫チェックポイント分子の遺伝子発現を極めて低濃度で特異的に転写抑制していることも確認できた。さらに細胞死が誘導できること及び培養細胞に効果的に取り込まれ、マウスに移植されたヒト大腸がん腫瘍に効果的に集積することが予測されたことより、ＰＩＰ薬剤複合体である本発明の化合物ＣＣＣ０７−０１は、免疫チェックポイント分子を複合的に抑制すること、そして、抗がん特性を得ることが出来る抗がん剤となりうることを見出した。
【００２５】
以上の結果から、配列特異的な遺伝子認識ポリアミド化合物を合成できること、さらにＤＮＡのアルキル化を誘導できる薬剤との複合体コンジュゲートを合成する方法を使えば、免疫チェックポイント分子を複合的に標的にした抗がん剤を合成できることが明らかになった。
【００２６】
生物には、体内に侵入した病原体やがん細胞のように体内に侵入若しくは発生した細胞や有機体を非自己として認識し排除する仕組みがあり、これを免疫と呼ぶ。がん細胞は、がん細胞を攻撃する細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）などにより非自己として認識され、死滅され、排除される。このＣＴＬの活性を下げるためのレセプター蛋白質とリガンド蛋白質が細胞表面に存在し、免疫反応を抑制する仕組みがあり、これが「免疫チェックポイント」である。がん細胞が非自己として認識されるには、免疫細胞に認識される新たな抗原の提示が必要であり、がん細胞では、遺伝子変異が蓄積されること、特異的な遺伝子発現が誘導されることなどにより所謂がん抗原が提示され、非自己として認識される。
【００２７】
この免疫チェックポイントを阻害すればがん細胞に対する免疫抑制が解除され、ＣＴＬ活性が活性化され、がん細胞を死滅させることができることが、マウスのcytotoxic T lymphocyte antigen 4 （ＣＴＬＡ−４）の阻害の研究で証明され（Leach, D.R., Krummel, M.F., and Allison, J.P. (1996). Enhancement of antitumor immunity by CTLA-4 blockade. Science 271, 1734-1736.）、その阻害剤はヒトでの悪性黒色腫に対する臨床試験でも有効であることが証明され、薬剤承認を得ている（Hodi, F.S., O’Day, S.J., McDermott, D.F., Weber, R.W., Sosman, J.A., Haanen, J.B., Gonzalez, R., Robert, C., Schadendorf, D., Hassel, J.C., et al. (2010). Improved survival with ipilimumab in patients with metastatic melanoma.N. Engl. J. Med. 363, 711-723.）。さらに、免疫チェックポイント分子に対する抗体薬などの阻害剤が開発され臨床応用がすでに開始され、さらにＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＩＦＮγ、ＩＦＮ−Ｉ、ＩＤＯ、ＫＩＲ２ＤＬ−１、ＫＩＲ２ＤＬ−２、ＫＩＲ２ＤＬ−３、ＫＩＲ２ＤＳ−１、ＫＩＲ２ＤＡ−２、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、ＴＩＭ−３、ＶＩＳＴＡなどの免疫チェックポイントパスウェイを標的として阻害する化合物等が開発され、臨床非臨床で試験されている（Immune checkpoint blockade: a common denominator approach to cancer therapy. Topalian SL, Drake CG, Pardoll DM. Cancer Cell. 2015 Apr 13;27(4):450-61.）。その他Ｂ７ＲＰ１、ＩＣＯＳ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＶＥＭ、ＢＴＬＡ、ＣＤ１３７、ＣＤ７０、ＯＸ４０、ＣＤ４０、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ７０Ｌ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＧＡＬ９、Ａ２ｅＲ、ＴＧＦβ、ＩＬ1、ＩＬ６、ＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＬ１８などの免疫チェックポイント関連分子も研究が進められている（The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Drew M. Pardoll Nature Reviews Cancer 12;252-264 2012）。
【００２８】
免疫チェックポイント分子とは、がん細胞及びがん細胞周囲の微小環境にある免疫細胞でＣＴＬ活性の調節を行うレセプター蛋白質やリガンド蛋白質のことを指す。免疫チェックポイント分子には、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＰＤ−Ｌ２、及びＣＤ２８があり、さらに免疫チェックポイント分子に関連する分子としてＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＩＦＮγ、ＩＦＮ−Ｉ、ＩＤＯ、ＫＩＲ２ＤＬ−１、ＫＩＲ２ＤＬ−２、ＫＩＲ２ＤＬ−３、ＫＩＲ２ＤＳ−１、ＫＩＲ２ＤＡ−２、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、ＴＩＭ−３、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７ＲＰ１、ＩＣＯＳ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＶＥＭ、ＢＴＬＡ、ＣＤ１３７、ＣＤ７０、ＯＸ４０、ＣＤ４０、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ７０Ｌ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＧＡＬ９、Ａ２ｅＲ、ＴＧＦβ、ＩＬ1、ＩＬ６、ＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＬ１８、並びに遺伝子データベースに登録される免疫関連分子が挙げられる。これらの分子は、がん細胞に対する免疫抑制を解除するための標的としてがん治療薬の研究が行われている。
【００２９】
ＰＤ−１及びＣＴＬＡ−４の併用療法が悪性黒色腫に対する第３相臨床試験で、ニボルマブ（抗ＰＤ−１抗体）+イピリムマブ（抗ＣＴＬＡ−４抗体）併用群の奏効率（ＯＲＲ）は６０％で、イピリムマブ（抗ＣＴＬＡ−４項体）単独群では１１％奏効率（ＯＲＲ）と併用群で有意に改善が見られ、この併用療法が承認された。腎臓がんや肺非小細胞がんでもこの治療での臨床試験が行われ、さらにＣＴＬＡ−４とＰＤ−Ｌ１の阻害の併用やＰＤ−１とＬＡＧ−３若しくはＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１阻害の併用療法の臨床試験が試みられている。免疫チェックポイント分子の複合阻害、特にＰＤ−１，ＰＤ−Ｌ１パスウェイとＣＴＬＡ−４パスウェイの併用の効果が現在最も注目され、様々な臨床試験が行われている(Combined ImmuneCheckpointBlockade Charles G.Drak Seminars in Oncology, 42(4) 656-662 2015. Combination Cancer Therapies with Immune Checkpoint Blockade: Convergence on Interferon Signaling. Minn AJ, Wherry EJ Cell. 165(2):272-5 2016.)。
【００３０】
免疫チェックポイント阻害剤の効果が認められる症例と認められない症例があることから効果を得られる症例の解析、さらに理論上、動物実験や臨床試験で相加、相乗効果が得られる併用治療法の解析から、免疫チェックポイント阻害を利用した最適ながん治療法の開発の可能性が提唱されている。免疫チェックポイント阻害による抗がん治療には、がん抗原分子の存在と腫瘍抗原特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞、I型ＩＦＮ，ＩＦＮ−γ産生細胞の増強、ＣＤ４陽性制御性Ｔ細胞の抑制シグナルを負に制御する機序が求められる。腫瘍細胞の細胞死の誘導や腫瘍抗原によるワクチン投与が腫瘍特異的抗原の提示を増強する。例えば、放射線や抗がん剤治療はＤＮＡ損傷から細胞死を誘導し、腫瘍免疫を活性化させる。死細胞がＭＨＣクラスI物質を放出し、ＣＤ８陽性Ｔ細胞が刺激されること、腫瘍関連マクロファージからI型ＩＦＮが分泌されること等により、抗腫瘍免疫が活性化される。このことにより免疫チェックポイント阻害剤の抗腫瘍作用を増強するものと考えられる（Combination Cancer Therapies with Immune Checkpoint Blockade: Convergence on Interferon Signaling. Minn AJ, Wherry EJ Cell. 165(2):272-5 2016、Radiation and checkpoint blockade immunotherapy: radiosensitisation and potential mechanisms of synergy. Andrew B Sharabi, Michael Lim, Theodore L DeWeese, Charles G DrakeLancet Oncology 2015 16: e498-509）。
【００３１】
免疫チェックポイントの阻害は、ヒトに元来備わっている免疫機構を利用した免疫治療によりがんを排除するものであり副作用が少ない治療法として期待されていた。実際には臨床試験の結果からは進行がんに対する奏効率が高く、重篤な副作用の頻度を大きく超えることから副作用があるものの薬剤承認が得られている。副作用として自己免疫によると考えられる有害事象（肺毒性、膵毒性、胃腸毒性、肝毒性、内分泌毒性、皮膚毒性、腎毒性、神経毒性など）が生じる。特に膵内分泌毒性によるI型糖尿病は、急性に発症し致死性となることや間質性肺炎・甲状腺機能低下など注意を有する副作用が一定頻度で認められている。抗体薬は全身性に投与され全身の免疫チェックポイント分子をもつ免疫系細胞に作用するため、上記の臓器においても免疫チェックポイントが抑制されることにより自己組織に対する免疫反応が活性化され、正常臓器細胞が攻撃され、臓器や内分泌細胞に毒性が認められたと考えられている。
【００３２】
腫瘍組織に特異的に薬剤を送達させることは例えば抗体薬剤複合体（ＡＤＣ）や光力学療法（ＰＤＴ）で使用されるフォトフィリンやレザフィリンなどの薬剤で既に試みられており、腫瘍集積させ薬剤を細胞内に送達させるか、あるいは薬剤が徐々に腫瘍細胞内に蓄積し、正常組織から十分に排泄された後に薬剤を活性化させ腫瘍細胞に細胞死を誘導する治療法として既に広く臨床に使用されている。薬剤を腫瘍に集積させることができれば、他の正常臓器や組織に対する自己免疫の誘導を最小限とした上で腫瘍免疫を活性化させることができると考えられ、免疫チェックポイント抑制が自己組織に対する免疫反応を活性化することによる臓器毒性の副作用を軽減できるものと考えられる。
【００３３】
ＰＤ−１遺伝子は、ＰＤ−１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ １）分子をコーディングしており、Ｔ細胞の細胞死誘導時に発現が増強される遺伝子として１９９２年に単離・同定された。ＰＤ−１欠損マウスで自己免疫が発症することからＰＤ−１シグナルをブロックすることで、がんを攻撃できる可能性を示し、さらにがんがＰＤ−Ｌ１を過剰発現し、免疫抑制をしていること、担がんマウスにＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１抗体を投与することで抗腫瘍活性が得られたことより、ＰＤ−１パスウェイが腫瘍免疫の抑制にも重要であることが判明した。その後、２０１４年７月には国内外で初めてＰＤ−１抗体が悪性黒色腫の治療薬として承認された。ＰＤ−１抗体治療単独の奏効率は２０〜３０％であったが、がん腫によってはＣＴＬＡ−４抗体との併用治療で、奏効率は５０〜６０％と劇的に向上した。またＰＤ−１も一部のがんで過剰に発現することで、がんの増殖に関与し、その抑制で腫瘍増殖が抑えられることも報告され、免疫以外の経路でがんの増殖に寄与している（Kleffel et al., Cell 162, 1242-1256 2015.）。しかし、なぜ残りの患者はＰＤ−１抗体治療に不応答なのか、奏効率を向上させる併用療法については、まだ判っていないことが多い。図１は、ＰＤ−１遺伝子のゲノム構造を示す。
【００３４】
ＰＤ−Ｌ１遺伝子は、ＰＤ−１の主なリガンドで、いくつかのがんで過剰発現しており、腫瘍免疫を負に制御し、腫瘍の免疫からの回避を促している。ＰＤ−１のリガンドとしてはＰＤ−Ｌ２も知られるが、ＰＤ−Ｌ２は腫瘍免疫を正に制御することも知られており、免疫チェックポイント阻害剤としては、抗ＰＤ−Ｌ１抗体が広く試みられ、２０１６年局所進行性若しくは転移性の尿路上皮性がんで承認された。ただグレード３以上の副作用として感染症、自己免疫病的な症状（肺炎、肝炎、腸炎、甲状腺炎、副腎不全、膵炎、発疹・皮膚炎など）が５０％に認められており、やはり正常の臓器での副作用が問題となっている。また、ＰＤ−Ｌ１を標的にした抗体治療薬であるが、ＰＤ−Ｌ１の発現との有意な相関は認められず、ＰＤ−Ｌ１の発現が見られない症例でも奏効している。図２に、ＰＤ−Ｌ１遺伝子のゲノム構造を示す。
【００３５】
ＣＴＬＡ−４遺伝子は、活性化Ｔ細胞あるいは抑制性Ｔ細胞Ｔｒｅｇに多く発現する細胞表面分子で、ＣＴＬＡ−４は負の補助刺激受容体で正の補助刺激受容体CD28と類似し、リガンド（ＣＤ８０やＣＤ８６）を共有する。ＣＴＬＡ−４は、自己免疫機能を抑える分子であり、腫瘍抗原特異的なＴ細胞の増殖・活性化と抑制性Ｔ細胞Ｔｒｅｇの減少により、腫瘍免疫も負に制御する。２０１１年に世界最初の免疫チェックポイント阻害剤、抗ＣＴＬＡ−４抗体が悪性黒色腫において米国ＦＤＡから承認された。その後、抗ＰＤ−１抗体との併用により、奏効率が劇的に向上することが報告されている。ただし、ＰＤ−１パスウェイの阻害と同様、免疫に関連した副作用として主に皮膚（皮膚炎／そう痒症）、消化管（下痢／大腸炎）、肝臓（肝機能値異常／肝炎）、内分泌腺（下垂体炎、副腎異常、甲状腺異常など）、神経系（末梢性ニューロパチーなど）及びその他の臓器（間質性肺炎/ブドウ膜炎/上強膜炎/ 腎炎など）が投与中若しくは投与中止後にも発生することが問題となっている。図３に、ＣＴＬＡ−４遺伝子のゲノム構造を示す。
【００３６】
現在までに、免疫チェックポイント分子を複合的に抑制し、しかも腫瘍周辺で特異的に抑制でき、腫瘍細胞死を誘導できる有効な薬剤が開発されていないのが現状である。
本発明の複合体の構成要素である免疫チェックポイント遺伝子認識ポリアミドは、免疫チェックポイント遺伝子の配列を認識するように設計されたポリアミドである。「免疫チェックポイント遺伝子を認識する」とは、免疫チェックポイント遺伝子の塩基配列及び／又はその近傍に免疫チェックポイント遺伝子認識ポリアミドが結合等(例えば水素結合又は架橋形成（クロスリンキング)による結合等)することを意味する。免疫チェックポイント遺伝子認識化合物としては、ピロール・イミダゾールポリアミド（ＰＩＰ）（環状、ヘアピン構造、ヘアピン構造をつなげたタンデム型を含むＰＩＰ化合物）、Peptide Nucleic Acid（ＰＮＡ）、Bridged Nucleic Acid（架橋化核酸）、Locked Nucleic Acid（ＬＮＡ）、ジンクフィンガー等のＤＮＡ結合蛋白質やそのキメラ蛋白質、ガイドＲＮＡ蛋白質複合体等のＤＮＡ結合化合物を挙げることができる。さらには、ＤＮＡに対する結合能力を維持又は向上するように修飾したＰＩＰ修飾物も含まれる。ＰＩＰ修飾物としては、例えば、ＰＩＰのγ−アミノ酪酸のα位又はβ位にアミンを付加した修飾物、Ｎ−α−Ｎ−γ−アミノ酪酸、Ｎ−β−Ｎ−γ−アミノ酪酸の置換された側鎖を有する修飾物、また前記修飾物をフルオレセインイソチオシアネート (ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ；  ＦＩＴＣ）やビオチン等の分子で修飾した修飾物、ＰＩＰのＮ末端をＦＩＴＣやビオチン等の分子で修飾した修飾物、Ｃ末端がイソフタル酸等の分子で修飾した修飾物等が挙げられる。
【００３７】
ピロール・イミダゾールポリアミド（ＰＩＰ）（ＰＩポリアミドともいう）は、Ｎ−メチルピロール単位（Ｐｙ）とＮ−メチルイミダゾール単位（Ｉｍ）とγ−アミノ酪酸部分とを含むポリアミドであり、ＰｙとＩｍとγ−アミノ酪酸部分とは互いにアミド結合（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）で連結される（Trauger et al,Nature,382,559-61(1996)；White et al,Chem.Biol.,4,569-78(1997)；及びDervan,Bioorg.Med.Chem.,9,2215-35(2001)）。ＰＩＰは、γ−アミノ酪酸部分がリンカー（γ−リンカー）となって全体が折りたたまれてＵ字型のコンフォメーション（へアピン型）をとる。Ｕ字型のコンフォメーションにおいては、リンカーを挟んでＰｙとＩｍとを含む２本の鎖が並列に並ぶ。この２本の鎖の間のＰｙとＩｍの対が特定の組み合わせ（Ｐｙ／Ｉｍ対、Ｉｍ／Ｐｙ対、Ｐｙ／Ｐｙ対、又はＩｍ／Ｉｍ対）のときに、ＤＮＡ中の特定の塩基対に高い親和性で結合することができる。例えば、Ｐｙ／Ｉｍ対はＣ−Ｇ塩基対に結合することができ、Ｉｍ／Ｐｙ対はＧ−Ｃ塩基対に結合することができる。また、Ｐｙ／Ｐｙ対はＡ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対の両方に結合することができる（White et al,Chem.Biol.,4,569-78(1997)；Dervan:Bioorg.Med.Chem.,9,2215-35(2001)）。また、ＰＩＰには、他に３−ヒドロキシピロール（Ｈｐ）、又はβアラニンが含まれていてもよい。Ｈｐについては、Ｈｐ／Ｐｙ対はＴ−Ａ塩基対に結合することができる（White et al,Nature,391,468-71(1998)）。また、γ−リンカーについてはアミノ基を持つＮ−α−Ｎ−γ−アミノ酪酸及びＮ−β−Ｎ−γ−アミノ酪酸のような側鎖をもち、またこれらがＦＩＴＣやビオチン等の分子で修飾されていてもよい。またＰＩＰのＮ末端はアセチル基だけでなくＦＩＴＣやビオチン等の分子が修飾されていてもよい。βアラニン／βアラニンについては、Ｔ−Ａ塩基対若しくはＡ−Ｔ塩基対に結合することができる。よって、標的のＤＮＡ配列に合わせてＰｙとＩｍの対の組み合わせ等を変更することにより、標的遺伝子の調節領域を認識するＰＩＰを設計することができる。ＰＩＰの設計方法及び製造方法は公知である（例えば、特許第３０４５７０６号公報、特開２００１−１３６９７４号公報及び国際公開第ＷＯ０３／０００６８３号）。
【００３８】
ＰＩＰは、遺伝子配列を認識できることより、例えば、図１に示すように、Ｈｕｍａｎ  Ｄｅｃ．２０１３（ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８）ＡｓｓｅｍｂｌｙにおいてＰＤ−１イントロン１の染色体２番 （ｑ３７）: ２４１８５５９３２から２４１８５５９４０に位置するＴＧＡＧＧＴＣＡＴ配列及びＰＤ−１エクソン５の染色体２番 （ｑ３７）: ２４１８５１２５７から２４１８５１２６５に位置するＴＧＴＧＧＡＣＴＡ配列を認識させるために、グアニン、シトシンを認識するイミダゾール、ピロールのペア及び、アデニン、チミンを認識するピロールとβアラニンのペアを用いてポリアミドを設計することとした。また、インドール基をピロール基とアルキル化剤であるｓｅｃｏＣＢＩ間に配置することで、構造解析上、アデニンのＮ３にアルキル化部位が近接し、良好な角度が得られよう合成することとした。また、ＰＤ−１の転写テンプレートＤＮＡにアルキル化が生じるよう配慮し設計を行った。このように塩基置換をＰＩＰの塩基認識能若しくはｓｅｃｏＣＢＩのアデニンの認識能を利用することで様々な免疫チェックポイント関連遺伝子の配列をも認識できる化合物を合成することで抗腫瘍効果を得ることも期待できるものと考えられる。
【００３９】
Ｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ（架橋化核酸）又はＬｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ（ＬＮＡ）は標的遺伝子の調節領域を認識するように配列認識させ、ＲＮＡの２’位酸素原子と４’位炭素原子間をメチレン鎖にて架橋した２’、４’−ＢＮＡ又はＲＮＡの２’位酸素原子と４’位炭素原子間をエチレン鎖にて架橋した２’、４’−ＥＮＡ(Ｅｔｈｙｌｅｎｅ‐Ｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ）として合成することができる。ＬＮＡはＰｒｏｌｉｇｏ社からも入手可能である。
【００４０】
すなわち、本発明の複合体のＤＮＡ結合化合物は、Ｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ（架橋化核酸）、Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ（ＬＮＡ）、ＰＮＡ、ピロール・イミダゾールポリアミド（ＰＩＰ）、ピロール・イミダゾールポリアミド（ＰＩＰ）修飾物、ＤＮＡ結合蛋白質、及びＤＮＡ結合蛋白質複合体からなる群から選択される。
ＰＩＰは脂溶性が高いほど、腫瘍集積性が高く好ましい。ＰＩＰのｌｏｇ−Ｐ(オクタノール/水分配係数)が高いほど、脂溶性が高い。
【００４１】
アルキル化剤とはＤＮＡをアルキル化する官能基を有する化合物を含むものである。アルキル化剤としては、ＤＮＡ中に存在する特定の塩基配列に対して、アルキル化能と配列認識能を兼ね備えた化合物を含むものであればどのようなものでもよく特に制限されるものではない。例えば、国際公開第ＷＯ２０１０／００１９３３号に記載の官能基を含む化合物を用いることができる。アルキル化剤は、ＤＮＡのグアニンＮ−７位やアデニンＮ−３位にアルキル基を導入し、付加体形成やグアニン同士、アデニン同士等の架橋反応を引き起こす。架橋反応を生じた二本鎖ＤＮＡや付加体形成した二本鎖ＤＮＡは修復機構によって修復することが困難であり、結果としてＤＮＡの転写及び複製が出来なくなり、細胞増殖の停止やアポトーシスによる細胞死が誘導されることになる。ＤＮＡ結合蛋白質にはジンクフィンガー等の結合蛋白質、ＴＡＬＥＮ（ターレン、ＴＡＬＥ  Ｎｕｃｌｅａｓｅ）のようなキメラ蛋白質及びガイド核酸を利用したクリスパー（ＣＲＩＳＰＲ）のような複合蛋白質が含まれる。
【００４２】
アルキル化剤の例として、ｓｅｃｏＣＢＩ（１−クロロメチル−５−ヒドロキシ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール）が挙げられる。ｓｅｃｏＣＢＩ（１−クロロメチル−５−ヒドロキシ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール）は、下式で表される化合物である。ｓｅｃｏＣＢＩはＤＮＡをアルキル化する公知の化合物の１つであり、ＤＮＡ塩基の副溝側のアデニンを特異的にアルキル化する。ｓｅｃｏＣＢＩは、公知の文献に記載の方法によって合成できる（(a)Boger,D.L.;Yun,W.Y.;Teegarden,B.R.J.Org.Chem.1992,57,2873.(b)Boger,D.L.;McKie,J.A.J.Org.Chem.1995,60,1271.(c)Boger,D.L.;Ishizaki,T.;Kitos,P.A.;Suntornwat,O.J.Org.Chem.1990,55,5823.）。
【００４３】
【化４】
2018052930.tif 000005
【００４４】
本発明の複合体は上記ポリアミドと上記アルキル化剤とを結合すること等により合成することができる。合成方法は公知の方法によって行うことができる（J.Am.Chem.SOC.1995,117,2479-2490）。「結合」は、直接でもよいし、リンカーを介してもよい。リンカーとしては、アルキル化剤の作用を妨げず、かつ免疫チェックポイント関連遺伝子の認識を妨げないものであれば特に限定されず、例えば、アミド結合、ホスホジスルフィド結合、エステル結合、配位結合、エーテル結合等を例示することができる。具体的には、例えば、国際公開第ＷＯ２００５／０８７７６２号に記載のインドールリンカーが挙げられ、この場合本発明の複合体は、ピロール・イミダゾールポリアミドの末端にインドールリンカーを介してアルキル化剤を結合させた複合体である。
【００４５】
本発明のＤＮＡ結合化合物とアルキル化剤との複合体は、免疫チェックポイント関連遺伝子特異的アルキル化剤として用いることができる。該アルキル化剤は、免疫チェックポイント分子をコードする遺伝子を複合的に標的とし、免疫チェックポイント分子をコードする遺伝子領域に結合し特異的にアルキル化する。すなわち、上記の免疫チェックポイント分子をコードする遺伝子の複数を標的とし得る。
【００４６】
本発明の複合体を含むアルキル化剤は、使用目的に応じ、本発明の複合体に加えて、担体や添加物を含むものであってもよい。このような担体及び添加物として、水、酢酸、有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、界面活性剤等が挙げられる。本発明の複合体の使用量は、使用目的に応じて適宜調節することができる。
【００４７】
本発明の複合体として、以下のものが例示できる。該複合体は、ピロール・イミダゾールポリアミドの末端にインドールリンカーを介してｓｅｃｏＣＢＩを結合させた複合体である。該複合体を、ＣＣＣ０７−０１と呼ぶ。化学式はＣ９０Ｈ９３ＣlＮ３０Ｏ１６で表され、分子量は1884.71である。
【００４８】
【化５】
2018052930.tif 000006
ＣＣＣ０７−００１
【００４９】
さらに、本発明の化合物として、以下の２つの化合物が例示できる。該複合体は、ピロール・イミダゾールポリアミドの末端にインドールリンカーを介してｓｅｃｏＣＢＩを結合させた複合体である。該複合体を、ＣＣＣ０７−０３及びＣＣＣ０７−０４と呼ぶ。ＣＣＣ０７−０３の化学式はＣ８９Ｈ９２ＣlＮ３1Ｏ１６で表され、分子量は1887.331であり、ＣＣＣ０７−０４の化学式はＣ８９Ｈ９２ＣlＮ３1Ｏ１６で表され、分子量は1887.331である。
【００５０】
【化６】
2018052930.tif 000007
ＣＣＣ０７−００３
【００５１】
【化７】
2018052930.tif 000008
ＣＣＣ０７−００４
【００５２】
本発明の医薬組成物は、上記複合体を含む組成物である。当該医薬組成物を生体内に投与することにより、種々の疾患を治療及び予防をすることができる。本発明の医薬組成物は、二本鎖ＤＮＡを生体制御に利用するあらゆる生物、特に哺乳動物（例、ヒト、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル等）の疾患を対象にすることができる。本発明の医薬組成物の対象疾患は、遺伝子の変異を伴う疾患、例えば、がん、神経疾患／精神性疾患、生活習慣病、睡眠障害、皮膚科、眼科、又は耳鼻科領域の局所症状の強い疾患及び感染症、アレルギー性疾患、細胞老化が関与する疾患、老化、並びに消化器疾患等が挙げられる。対象疾患のうちがんとしては、例えば、皮膚がん（悪性黒色腫、基底細胞皮膚がん等）脳腫瘍、頭頚部がん、食道がん、舌がん、肺がん、乳がん、膵がん、胃がん、小腸又は十二指腸のがん、大腸がん（結腸がん、直腸がん）、膀胱がん、腎がん、肝がん、前立腺がん、子宮がん、卵巣がん、甲状腺がん、胆嚢がん、咽頭がん、肉腫（例えば、骨肉腫、軟骨肉腫、カポジ肉腫、筋肉腫、血管肉腫、線維肉腫等）、白血病（例えば、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）及び急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、リンパ腫、多発性骨髄腫（ＭＭ）等）、小児固形腫瘍（脳腫瘍、神経芽腫、肝芽腫、腎芽腫、ユーイング肉腫等）、網膜芽腫及びメラノーマ等を挙げることができる。生活習慣病としては、特に限定されず、例えば、高血圧、糖尿病等を挙げることができる。皮膚科、眼科、又は耳鼻科領域の局所症状の強い疾患及び感染症としては、例えば、乾癬、慢性皮膚炎、副鼻腔炎、緑内障、網膜変性症等を挙げることができる。アレルギー性疾患としては、アトピー性皮膚炎、花粉症等を挙げることができる。細胞老化が関与する疾患としては、例えば、皮膚の皺、たるみ、色素沈着等を挙げることができる。神経疾患／精神性疾患としては、例えば、そう、うつ、統合失調、自閉症、双極性障害、アルツハイマー病、睡眠障害、痴呆等を挙げることができる。
【００５３】
本発明の医薬組成物の好ましい対象疾患は、免疫チェックポイントが関与する全ての疾患が含まれる。免疫チェックポイント分子ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４及びその関連遺伝子に由来する全ての疾患も含まれる。例えば、悪性黒色腫、大腸がん、膵臓がん、結腸直腸がん、甲状腺がん、肺がん、頭頚部がん、食道がん、舌がん、肺がん、乳がん、膵がん、胃がん、子宮内膜がん、骨髄異形成症候群、甲状腺及び結腸の腺腫、神経芽腫等である。本発明の医薬組成物は、正常細胞ではなく、腫瘍細胞により効果的に作用して、アルキル化によってＤＮＡの架橋形成を促進し、ＤＮＡ損傷による細胞死メカニズムを誘導し、さらに免疫チェックポイント遺伝子の発現を抑制し、細胞増殖を阻害すること及び自己免疫を活性化させることによって疾患原因細胞を死滅させ、疾患の治療及び予防をすることができる。
【００５４】
本発明の医薬組成物は、経口投与及び非経口投与のいずれの剤形でもよい。これらの剤形は常法にしたがって製剤化することができ、医薬的に許容される担体や添加物を含むものであってもよい。このような担体及び添加物として、水、酢酸、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤等が挙げられる。
【００５５】
上記添加物は、本発明の医薬組成物の剤型に応じて上記の中から単独で又は適宜組み合わせから選ばれる。剤形としては、経口投与の場合は、錠剤、カプセル剤、細粒剤、粉末剤、顆粒剤、液剤、シロップ剤、噴霧剤、塗布剤、点眼剤、外用剤等として、又は適当な剤型により投与が可能である。非経口投与の場合は、注射剤型等が挙げられる。注射剤型の場合は、例えば点滴等の静脈内注射、皮下注射、腹腔内注射、腫瘍内注射等により全身又は局部的に投与することができる。
【００５６】
例えば、注射用製剤として使用する場合、本発明の医薬組成物を溶剤（例えば生理食塩水、緩衝液、ブドウ糖溶液、０．１％酢酸等）に溶解し、これに適当な添加剤（ヒト血清アルブミン、ＰＥＧ、マンノース修飾デンドリマー、シクロデキストリン結合体等）を加えたものを使用することができる。あるいは、使用前に溶解する剤形とするために凍結乾燥したものであってもよい。凍結乾燥用賦形剤としては、例えば、マンニトール、ブドウ糖等の糖アルコールや糖類を使用することができる。
【００５７】
本発明の医薬組成物又は本発明の化合物の投与量は、年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なる。投与量は、例えば成人（６０ｋｇ）の場合、１日当たり０．０１〜１０００ｍｇ、好ましくは０．１〜１００ｍｇ、より好ましくは１〜３０ｍｇである。投与方法は、患者の年齢、症状により適宜選択する。投与は、例えば数日間隔に１回、１日当たり、１回又は２〜４回に分けてもよい。
【００５８】
本発明の医薬組成物は、抗がん剤として用いることができる。対象になるがんの種類は、例えば、大腸がん、膵臓がん、結腸直腸がん、甲状腺がん、肺がん、頚部がん、子宮内膜がん、骨髄異形成症候群、甲状腺及び結腸の腺腫、神経芽腫等であるが、これに限定されることはなく、免疫チェックポイント遺伝子ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４に由来する腫瘍免疫を抑制しているがん若しくは免疫チェックポイント関連遺伝子により腫瘍免疫を抑制しているがんが対象である。本発明の抗がん剤は、上述の医薬組成物、アルキル化剤と同様に使用目的に応じて担体や組成物を含んでもよい。
【００５９】
本発明はキットも包含し、該キットは、本発明の化合物の他、医薬的に許容される担体や添加物、試薬類、補助剤、専用容器、その他の必要なアクセサリー、説明書等を含むものである。本発明のキットは、がん治療用キット、研究試薬キットとしても使用することができる。
【実施例】
【００６０】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００６１】
[実施例１］  ＰＩＰ化合物ＣＣＣ０７−０１の合成及び効果の確認
１．概要
免疫チェックポイント阻害は、現在、局所進行性及び転移性のがんにも効果が見られ、化学療法や放射線療法、ワクチン療法により相加・相乗効果があると考えられている画期的な治療法である。現在、免疫チェックポイント阻害抗体薬の奏効率を改善するため複合的に阻害すること及び副作用を軽減するため局所で作用させることさらに医療経済学的にも安価に製造できる剤形にすることが求められている。本実施例では、免疫チェックポイント阻害を複合的に行うためにＤＮＡ塩基の副溝側のアデニンを特異的にアルキル化するｓｅｃｏＣＢＩを縮合させることでＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１及びＣＴＬＡ−４遺伝子の共通塩基配列を特異的に認識するＰＩＰ−Ｉｎｄｏｌ−ｓｅｃｏＣＢＩ（ＣＣＣ０７−０１）を合成した。この化合物及び類似体を用いて、（１）ＰＤ−１の発現抑制実験、（２）ＰＤ−Ｌ１の発現抑制実験、（３）ＣＴＬＡ−４の発現抑制実験、（４）がん細胞の細胞死誘導の実験、（５）細胞への取り込み実験、（６）がん細胞を移植したヌードマウスの腫瘍への集積性の実験を行った。
【００６２】
本化合物ＣＣＣ０７−０１は、免疫チェックポイント分子遺伝子ＰＤ−１，ＰＤ−Ｌ１若しくはＣＴＬＡ−４を発現するがん細胞株においてそれぞれの遺伝子を発現するがん細胞株において低濃度で発現を抑制した。また、濃度依存的に腫瘍増殖抑制能を有し、細胞死を誘導した。ＰＩＰ化合物のｌｏｇ―Ｐ値が１．４以上でｌｏｇ−Ｐ値依存的に腫瘍培養細胞へ取り込みが向上することが見いだされ、マウス移植腫瘍組織及びその周囲細胞への蓄積・貯留が促進され、正常臓器では化合物が２４時間で排泄されているが腫瘍には７２時間後も集積していることがｌｏｇ−Ｐ値の高い化合物で確認された。本研究の化合物ＣＣＣ０７−０１もｌｏｇ−Ｐ値が３．１であり、in vitro、in vivoで腫瘍細胞及び腫瘍周囲組織への蓄積が予測された。
【００６３】
これらの結果から、本化合物は免疫チェックポイント遺伝子の塩基配列を特異的にアルキル化し、遺伝子の発現を選択的に阻害し、免疫チェックポイント遺伝子のがん細胞及びがん周囲微小環境において抑制し、さらに細胞死を誘導することで、腫瘍免疫を活性化するとともに腫瘍の免疫抑制機構を阻害できるものと考えられる。さらに腫瘍及び腫瘍微小環境で主に免疫チェックポイントが抑制されることは、正常臓器に対する自己免疫を最小限にすることも期待でき、免疫チェックポイント阻害剤が抱える副作用の問題点も克服できる、腫瘍特異的に免疫チェックポイント遺伝子を複合的に認識する新規抗がん剤として極めて有望であり、様々ながんに対する有効な抗がんアプローチの１つであることを示唆するものである。
【００６４】
化合物のデザイン
ＰＩＰ化合物は、ＰＤ−１及びＰＤ―Ｌ１、ＣＴＬＡ−４の遺伝子配列に共通で結合する９塩基の配列を、Ｈｕｍａｎ Ｄｅｃ. ２０１３ （ＧＲＣｈ３８/ｈｇ３８） Ａｓｓｅｍｂｌｙから検索し、決定した。ＰＤ−１では図１のようにイントロン１の染色体２番 （ｑ３７）: ２４１８５５９３２から２４１８５５９４０に位置するＴＧＡＧＧＴＣＡＴ配列及びエクソン５の染色体２番（ｑ３７）:２４１８５１２５７から２４１８５１２６５に位置するＴＧＴＧＧＡＣＴＡ配列を認識する。ＰＤ−Ｌ１では図２のようにイントロン１の染色体９番（ｐ２４）:５４５１６５９から５４５１６６７に位置するＴＧＴＧＧＴＣＴＴ配列及び同イントロン１の染色体９番（ｐ２４）:５４５４８３５から５４５４８４３に位置するＴＧＴＧＧＴＣＡＡ配列とエクソン６の染色体９番（ｐ２４）５４６８３３７から５４６８３４５に位置するＴＧＡＧＧＴＣＴＴ配列を認識する。ＣＴＬＡ−４では図３のようにイントロン２のＣｈｒ２ （ｑ３３）：２０３８７１０３５から２０３８７１０４３に位置するＴＧＴＧＧＡＣＡＴ配列及び３プライムノンコーディングのＣｈｒ２（ｑ３３）：２０３８７３５６９から２０３８７３５７７のＴＧＡＧＧＴＣＡＴ配列を認識する。上記ＷＧＷＧＧＷＣＷＷを認識するために、グアニン、シトシンを認識するイミダゾール、ピロールのペア及び、アデニン、チミンを認識するピロールとβアラニンのペアを用いてポリアミドを設計した。
【００６５】
化合物の合成
本発明の化合物の作製方法は以下のとおりである。カルボン酸末端を持つＰＩＰをＮＭＰ１００μＬに溶解し、ｉＰｒ２ＮＥｔ（０．５μＬ、２．８６μｍｏｌ）とＰｙＢＯＰ（１．０ｍｇ、１．９５μｍｏｌ）を加えた。反応溶液を撹拌しながら室温で２時間反応させた後、１−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステルの活性体が出来ているかをＨＰＬＣで確認した。確認後、ＮＨ２−インドールｓｅｃｏ−ＣＢＩ（０．６ｍｇ、１．５８μｍｏｌ）を反応容器に加え、室温、窒素雰囲気下で一晩撹拌した。反応後、反応物はＨＰＬＣにより精製し（０．１％ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮ、３０−７５％リニアグラジエント、０〜３０分間）、凍結乾燥により目的化合物であるポリアミドＣＣＣ０７−０１が白い粉末で得られた（ＬＣ−ＭＳ ｍ／ｅ  Ｃ９０Ｈ９３ＣｌＮ３０Ｏ１６  ［Ｍ＋Ｈ］＋ 計算値:１８８５．７１、実測値:１８８６．４０  ［Ｍ＋２Ｈ］２＋  計算値：９４３．８６、実測値９４３．７５）。
【００６６】
ＰＤ−１、ＰＤ-Ｌ１、ＣＴＬＡ−４遺伝子を発現する細胞を同定するため以下の２９種類のヒト細胞株でテストした。ＨＥＫ２９３（胎児腎細胞）、ＨｅＬａ（子宮頸がん細胞）、ＬＳ１８０（大腸がん細胞）、ＨＴ−２９（大腸がん細胞）、ＳＷ４８０（大腸がん細胞）、ＨＣＴ１１６（大腸がん細胞）、ＰＡＮＣ−１（膵臓がん細胞）、ＧＰ２ｄ（大腸がん細胞）、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２（膵臓がん細胞）、ＬＵ９９（肺がん細胞）、ＣＷ−２（大腸がん細胞）、ＣＯＬＯ−３２０（大腸がん細胞）、Ｔ８４（大腸がん細胞）、ＳＫ−ＬＵ−１（肺がん細胞）、ＡｓＰＣ−１（膵臓がん細胞）、ＳＫ−ＭＥＳ−１（肺がん細胞）、ＳＨＰ−７７（肺がん細胞）、ＰＣ−９（肺がん細胞）、ＰＫ−４５Ｈ（膵臓がん細胞）、ＬＳ５１３（膵臓がん細胞）、ＰＫ−１（膵臓がん細胞）、ＰＫ−５９（膵臓がん細胞）、ＮＣＩ−Ｈ４４１（肺がん細胞）、Ｔ３Ｍ−１０（肺がん細胞）、ＳＷ１４６３（大腸がん細胞）、ＲＫＯ（大腸がん細胞）、Ａ３７５（悪性黒色腫細胞）、Ａ５４９（肺がん細胞）、Ａ２０５８（悪性黒色腫細胞）を１２穴プレートで４８時間培養して、細胞を集めてＲＮＡを抽出した。前記抽出にはＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ）を用いた。次に、抽出した前記ＲＮＡをテンプレートにＳｕｐｅｒ  Ｓｃｒｉｐｔ  ＶＩＬＯ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）に従って逆転写用のｃＤＮＡを調製した。前記ｃＤＮＡをテンプレートにＰＤ−１、ＰＤ-Ｌ１、ＣＴＬＡ−４及びコントロールＧＡＰＤＨのプライマーを用いＰＣＲを行った。ＰＤ−１のＰＣＲ条件は９５℃で２分間の変性反応後、９５℃で３０秒、５６℃で３０秒、７２℃で３０秒を３５サイクル、最後に７２℃で５分間の伸長反応を行った。ＰＤ−Ｌ１のＰＣＲ条件は、９５℃で２分間の変性反応後、９５℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で３０秒を２５サイクル、最後に７２℃で５分間の伸長反応を行った。ＣＴＬＡ−４のＰＣＲ条件は、９５℃で２分間の変性反応後、９５℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で３０秒を３５サイクル、最後に７２℃で５分間の伸長反応を行った。ＧＡＰＤＨのＰＣＲ条件は、９５℃で２分間の変性反応後、９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒を２０サイクル、最後に７２℃で５分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ産物は２％アガロースゲルで電気泳動分析を行った。ＰＣＲ産物量はエチジウムブロマイドで染色した写真によって算出した。
ＰＣＲには下記のプライマーセットを使用した。
【００６７】
ＰＣＲに用いたｐｒｉｍｅｒ
ＰＤ−１検出用として、ＰＤ−１Ｆ：ＣＴＧ ＧＧＣ ＧＧＴ ＧＣＴ ＡＣＡ ＡＣＴ（配列番号１５）とＰＤ−１Ｒ：ＡＣＧ ＡＡＧ ＣＴＣ ＴＣＣ ＧＡＴ ＧＴＧ ＴＴ（配列番号１６）を用い、ＰＤ−Ｌ１検出用としてＰＤ−Ｌ１−Ｆ２：ＴＧＧ ＣＡＴ ＴＴＧ ＣＴＧ ＡＡＣ ＧＣＡ ＴＴＴ（配列番号１７）とＰＤ−Ｌ１−Ｒ２：ＴＧＣ ＡＧＣ ＣＡＧ ＧＴＣ ＴＡＡ ＴＴＧ ＴＴＴ Ｔ（配列番号１８）を用い、ＣＴＬＡ−４検出用 （ＲＴ−ＰＣＲ用）としてＣＴＬＡ−４Ｆ：ＣＴＣ ＡＧＣ ＴＧＡ ＡＣＣ ＴＧＧ ＣＴＡ ＣＣ（配列番号１９）とＣＴＬＡ−４Ｒ：ＡＧＴ ＧＧＣ ＴＴＴ ＧＣＣ ＴＧＧ ＡＧＡ Ｔ（配列番号２０）を用い、コントロールとしてＧＡＰＤＨ−Ｆ：ＣＧＡ ＣＣＡ ＣＴＴ ＴＧＴ ＣＡＡ ＧＣＴ ＣＡ（配列番号２１）とＧＡＰＤＨ−Ｒ：ＡＧＧ ＧＧＴ ＣＴＡ ＣＡＴ ＧＧＣ ＡＡＣ ＴＧ（配列番号２２）を用いた。
【００６８】
実験結果を表１に発現を＋発現無しを−として示す。ＰＤ−１は、ＬＳ１８０、ＳＷ４８０、ＧＰ２ｄ、ＰＣ−９、ＬＳ５１３、ＰＫ−１、ＰＫ−５９、ＮＣＩ−Ｈ４４１、Ｔ３Ｍ−１０、ＳＷ１４６３で発現し、ＰＤ−Ｌ１は、ＳＫ−ＭＥＳ−１、ＰＣ−９、ＰＫ−４５Ｈ、ＰＫ−１、ＰＫ−５９、ＮＣＩ−Ｈ４４１、Ｔ３Ｍ−１０、ＳＷ１４６３、ＲＫＯで発現し、ＣＴＬＡ−４は、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２、Ａ３７５、Ａ２０５８で発現していた。
【００６９】
【表１】
2018052930.tif 000009
【００７０】
２．種々の細胞に対する投与２４時間後の細胞毒性試験と５０％阻害濃度（IC50）の測定実験
前述の細胞株よりＰＤ−１を発現する細胞として大腸がん細胞株ＳＷ４８０、ＰＤ-Ｌ１を発現する細胞として大腸がん細胞株ＲＫＯ、ＣＴＬＡ−４を発現する細胞として悪性黒色腫細胞株Ａ２０５８及び膵臓がん細胞株ＭＩＡ  ＰａＣａ−２を用いた。各々３０００個の細胞/ウェルになるように９６穴マイクロプレートの１ウェル毎に細胞を播き、一晩培養した。翌日、０．１、１、１０、３０、１００、３００、１０００ｎＭ（１μＭ）の濃度のＣＣＣ０７−０１で各細胞を２４時間処理した。その後、Ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ−８を用いて、ＷＳＴ−８試薬を１ウェルごと添加し、２時間反応させた後、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの波長で比色分析法によって細胞数を計算した。細部数の計算方法は、１）Ｍｅｄｉｕｍのみの平均値をだす、２）各ウェルからＭｅｄｉｕｍの平均値を引く、３）ＤＭＳＯの平均値をだす、４）Ｍｅｄｉｕｍの平均値を引いた値をＤＭＳＯの平均値で割る×１００、５）各処理区の平均値と標準偏差をだし、グラフ作成を行った。ＩＣ５０計算式は、ＩＣ５０＝１０（ＬＯＧ（Ａ／Ｂ）×（５０−Ｃ）／（Ｄ−Ｃ）＋ＬＯＧ（Ｂ）において、Ａ：５０％を挟む高い濃度、Ｂ：５０％を挟む低い濃度、Ｃ：Ｂでの阻害率、Ｄ：Ａでの阻害率を示す）を用いた。
実験に用いた細胞は、ＲＫＯ（大腸がん）、ＳＷ４８０（大腸がん）、Ａ２０５８（悪性黒色腫）、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２（膵臓がん）である。
【００７１】
実験結果と各細胞のＩＣ５０とそれぞれの細胞でのＰＤ−１、ＰＤ-Ｌ１、ＣＴＬＡ−４の発現を表２に示した。ＣＣＣ０７−０１に対するＩＣ５０について、ＲＫＯ、Ａ２０５８、ＳＷ４８０は低濃度で細胞毒性を示し、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２はやや高いがナノモルレンジで細胞毒性を示した。ＭＩＡ  ＰａＣａ−２はＣＴＬＡ−４のみを発現しているが、その発現は同様にＣＴＬＡ−４のみを発現しているＡ２０５８よりも少なかった。実験結果を図４−１、図４−２及び表２に示した。図４−１ＡはＨＰＬＣのクロマトグラムを示し、図４−１ＢはＬＣ−ＭＳのクロマトグラムを示す。また、図４−２ＡはＡ２０５８とＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞に対するＣＣＣ０７−０１（０．１ｎＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、３０ｎＭ、１００ｎＭ、３００ｎＭおよび１μＭ）投与後２４時間のＷＳＴアッセイによる細胞毒性試験の結果を示す。濃度依存性に細胞生存率の低下がみられる。図４−２ＢはＳＷ４８０とＲＫＯ細胞での同様のＷＳＴアッセイでの同様の結果を示す。
【００７２】
【表２】
2018052930.tif 000010
【００７３】
３．種々のがん細胞に対するＰＤ−１の発現抑制実験
Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲによる定量的遺伝子発現解析
ＳＷ４８０細胞を６穴プレートで培養した。翌日、細胞を０、１、１０、１００nMのＣＣＣ０７−０１で６時間処理し、細胞を集めてｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。前記抽出にはＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ, ＣＡ）を用いた。次に、抽出した前記ＲＮＡをテンプレートにＳｕｐｅｒ  Ｓｃｒｉｐｔ  ＶＩＬＯ  ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）に従って逆転写し、ｃＤＮＡを調製した。前記のｃＤＮＡをテンプレートに以下の条件でＲＴ−ＰＣＲを行った。ＰＤ−１については、９５℃でｄｅｎａｔｕｒｅののち、９５℃３０秒、５６℃３０秒、７２℃３０秒を３３ｃｙｃｌｅ行い、７２℃５分伸長反応を行った。また、ｃｏｎｔｒｏｌとして、ＧＡＰＤＨのＲＴ−ＰＣＲを同ｃＤＮＡを用いて行った。ＧＡＰＤＨについては、９５℃でｄｅｎａｔｕｒｅののち、９５℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃３０秒を２２ｃｙｃｌｅ行い、７２℃５分伸長反応を行った。
【００７４】
ＲＴ−ＰＣＲ後、その産物を２％アガロースで電気泳動し、エチジウムブロマイド染色した。さらに、ｑＰＣＲを行った。ｑＰＣＲの条件は、Ｈｏｌｄｉｎｇ ｓｔａｇｅ９５℃  １０ｍｉｎ、Ｃｙｃｌｉｎｇ ｓｔａｇｅ９５℃  １５ｓｅｃ、６０℃  1ｍｉｎ、Ｍｅｌｔ Ｃｕｒｖｅ ｓｔａｇｅ９５℃  １５ｓｅｃ、６０℃  1ｍｉｎ、９５℃  １５ｓｅｃとした。ＧＡＰＤＨをｃｏｎｔｒｏｌとして、相対的発現量を定量した。
ＰＣＲには上記のｐｒｉｍｅｒ ｓｅｔを用いた。
【００７５】
実験結果を図５に示す。図５Ａは電気泳動像を示し、図５ＢはＲｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲによる定量結果を示す。図に示すように、ＰＤ−１の発現はＰＩＰｏｌｙａｍｉｄｅ ＣＣＣ０７−０１の投与濃度依存的に低下し、１００ｎＭで顕著に低下した。 
【００７６】
４．ＰＤ−Ｌ１の発現抑制実験
Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲによる定量的遺伝子発現解析
ＲＫＯ細胞を６穴プレートで培養した。翌日、細胞を０、１、１０、１００ｎＭのＣＣＣ０７−０１で２４時間処理し、細胞を集めてｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。前記抽出にはＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ, ＣＡ）を用いた。次に、抽出した前記ＲＮＡをテンプレートにＳｕｐｅｒ  Ｓｃｒｉｐｔ  ＶＩＬＯ  ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）に従って逆転写し、ｃＤＮＡを調製した。前記のｃＤＮＡをテンプレートに以下の条件でＲＴ−ＰＣＲを行った。ＰＤ−Ｌ１については、９５℃でｄｅｎａｔｕｒｅののち、９５℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃３０秒を２５ｃｙｃｌｅ行い、７２℃５分伸長反応を行った。また、ｃｏｎｔｒｏｌとして、ＧＡＰＤＨのＲＴ−ＰＣＲを同ｃＤＮＡを用いて行った。ＧＡＰＤＨについては、９５℃でｄｅｎａｔｕｒｅののち、９５℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃３０秒を２２ｃｙｃｌｅ行い、７２℃５分伸長反応を行った。
【００７７】
ＲＴ−ＰＣＲ後、その産物を２％アガロースで電気泳動後、エチジウムブロマイド染色した。さらに、ｑＰＣＲを行った。ｑＰＣＲの条件は、Ｈｏｌｄｉｎｇ ｓｔａｇｅ９５℃  １０ｍｉｎ、Ｃｙｃｌｉｎｇ ｓｔａｇｅ９５℃  １５ｓｅｃ、６０℃  1ｍｉｎ、Ｍｅｌｔ Ｃｕｒｖｅ ｓｔａｇｅ９５℃  １５ｓｅｃ、６０℃  1ｍｉｎ、９５℃  １５ｓｅｃとした。ＧＡＰＤＨをｃｏｎｔｒｏｌとして、相対的発現量を定量した。
ＰＣＲには上記のｐｒｉｍｅｒ ｓｅｔを用いた。
【００７８】
実験結果を図６に示す。図６Ａは電気泳動像を示し、図６ＢはＲｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲによる定量結果を示す。図に示すように、ＰＤ−Ｌ１の発現はＣＣＣ０７−０１の濃度に準じて低下し１０ｎＭで顕著な低下が見られた。   
【００７９】
５．ＣＴＬＡ−４の発現抑制実験
ＲＴ−ＰＣＲによる半定量的遺伝子発現解析
Ａ２０５８、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞を各々６穴プレートで培養した。翌日、細胞を０、１、１０ｎＭのＣＣＣ０７−０１で24時間処理し、細胞を集めてｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。前期抽出にはＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ, ＣＡ）を用いた。次に、抽出した前記ＲＮＡをテンプレートにＳｕｐｅｒ  Ｓｃｒｉｐｔ  ＶＩＬＯ  ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）に従って逆転写し、ｃＤＮＡを調製した。前記のｃＤＮＡをテンプレートに以下の条件でＲＴ−ＰＣＲを行った。まず９５℃で２分ｄｅｎａｔｕｒｅののち、９５℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃３０秒を３３ｃｙｃｌｅ行い、７２℃５分伸張反応を行った。また、ｃｏｎｔｒｏｌとして、ＧＡＰＤＨのＲＴ−ＰＣＲを同ｃＤＮＡを用い行った。９５℃で２分ｄｅｎａｔｕｒｅの後、９５℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃３０秒を２２ｃｙｃｌｅ行い、７２℃５分伸長反応を行った。ＰＣＲ後、その産物を２％アガロースで電気泳動後、エチジウムブロマイド染色し、ＧＡＰＤＨのバンドをコントロールとして、ＣＴＬＡ−４のＰＣＲ産物のバンドの濃度をＩｍａｇｅ Ｊによって算定し、各PIPの濃度におけるＰＣＲ産物の濃度の比較を行うことにより、定量した。
ＰＣＲにはｐｒｉｍｅｒ ｓｅｔ配列番号１９、２０、２１、２２を用いた。
【００８０】
結果を図７に示す。図７Ａは電気泳動像を示し、図７ＢはＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞における発現の定量結果を示し、図７ＣはＡ２０５８細胞における発現の定量結果を示す。図に示すように、ＣＴＬＡ−４の発現は、２０５８細胞でＣＣＣ０７−０１の濃度に準じて低下し１０ｎＭで顕著な低下が見られ、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２でも同様であった。
【００８１】
６．投与４８時間後のＣＢＩとの細胞毒性と５０％阻害濃度（ＩＣ５０）比較実験
前述の細胞株、ＰＤ−１を発現する細胞として大腸がんＳＷ４８０、ＰＤ-Ｌ１を発現する細胞として大腸がんＲＫＯを用い、本ＰＩＰ薬物複合体化合物ＣＣＣ０７−０１の薬物複合体として用いたアルキル化剤ＣＢＩとの毒性及びＩＣ５０の比較実験を行った。各々３０００個の細胞/ウェルになるように９６穴マイクロプレートの１ウェル毎に細胞を播き、一晩培養した。翌日、０．１、１、１０、３０、１００、３００、１０００ｎＭ（１μＭ）の濃度のＰＩＰ−ＣＢＩ複合体（ＣＣＣ０７−０１）若しくはＣＢＩで各細胞を４８時間処理した。その後、Ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ−８を用いて、ＷＳＴ−８試薬を１ウェルごと添加し、２時間反応させた後、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの波長で比色分析法によって細胞数を計算した。細部数の計算方法は、１）Ｍｅｄｉｕｍのみの平均値をだす、２）各ウェルからｍｅｄｉｕｍの平均値を引く、３）ＤＭＳＯの平均値をだす、４）Ｍｅｄｉｕｍ引いた値をＤＭＳＯの平均値で割る×１００、５）各処理区の平均値と標準偏差をだし、グラフ作成を行った。ＩＣ５０計算式は、ＩＣ５０＝１０（ＬＯＧ（Ａ／Ｂ）×（５０−Ｃ）／（Ｄ−Ｃ）＋ＬＯＧ（Ｂ）において、Ａ：５０％を挟む高い濃度、Ｂ：５０％を挟む低い濃度、Ｃ：Ｂでの阻害率、Ｄ：Ａでの阻害率を示す）を用いた。
【００８２】
実験結果を図８に示した。各細胞へのＣＣＣ０７−０１若しくはＣＢＩ投与後の細胞毒性をグラフに示した。図８ＡはＣＣＣ０７−０１の結果を示し（４８時間）、図８ＢはＣＢＩの結果を示す（４８時間）。図に示すように、ＣＣＣ０７−０１はＣＢＩと同等のＩＣ５０を示し、ＳＷ４８０細胞で其々１１ｎＭと１０ｎＭ、ＲＫＯで４ｎＭと３ｎＭであった。
【００８３】
７．細胞への取り込み実験
ＳＷ４８０及びＬＳ１８０を１×１０５ｃｅｌｌｓ/ｗｅｌｌで播き１晩インキュベートし、Ｉｍ００−Ｉｍ０５をそれぞれ１μMの濃度で２時間処理した（Ｉｍ００−Ｉｍ０５については、後記の「９．化合物のｌｏｇＰ値の測定実験」を参照のこと。Ｉｍ００、Ｉｍ０１、Ｉｍ０２、Ｉｍ０３、Ｉｍ０４、Ｉｍ０５の順で脂溶性が高い。）。また、コントロールとして、ＦＩＴＣ及びＤＭＳＯ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）を用いたメタノールで３０分、細胞の固定を行いＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤを用いて封入を行った。その後各サンプルの蛍光画像をコンフォーカル顕微鏡によって観察した。
【００８４】
細胞の取り込み
実験結果を図９に示す。図９にはＤＡＰＩ染色の結果、ＦＩＴＣ染色の結果及びマージした結果を示す。図９はＩｍ００、Ｉｍ０１、Ｉｍ０２、Ｉｍ０３、Ｉｍ０４、Ｉｍ０５の順で細胞が強くＦＩＴＣで染色されていることを示している。図に示すように、がん細胞への取り込みはどちらの細胞株においても脂溶性が高いＰＩポリアミドの方が水溶性のＰＩポリアミドと比較して高くＰＩポリアミドが水溶性になるにつれて取り込みが悪くなる傾向を示した。
【００８５】
８．がん細胞を移植したヌードマウスの腫瘍への集積性の実験
ＳＷ４８０及びＬＳ１８０をそれぞれ５×１０６個、３×１０６個をヌードマウス（ＢＡＬＢ/ｃ ｎｕ/ｎｕ）の皮下に移植した。移植後、腫瘍形成が確認できたところでＩｍ００−Ｉｍ０５を尾静脈から１．０ｍｇ／ｋｇの濃度で投与した。投与後７２時間後にマウスの剖検を行い腫瘍断片、及び正常臓器の蛍光をin vivoイメージングを用いて観察した。実験結果を図１０に示す。図１０中「Ｂｒｉｇｈｔ ｆｉｅｌｄ」には、マウスから採取した１:腫瘍（Ｔｕｍｏｒ）、２:肝臓（Ｌｉｖｅｒ）、３：腎臓（Ｋｉｄｎｅｙ）、４:心臓（ｈｅａｒｔ）、５:脾臓（Ｓｐｌｅｅｎ）、６:肺（Ｌｕｎｇ）、７:脳（Ｂｒａｉｎ）の位置が示されており、「ＦＩＴＣ」はＦＩＴＣ染色を示す。図１０はＩｍ００、Ｉｍ０１、Ｉｍ０２、Ｉｍ０３、Ｉｍ０４、Ｉｍ０５の順で腫瘍細胞が強くＦＩＴＣで染色されていることを示している。図に示すように、細胞の取り込みと同様にＰＩポリアミドの脂溶性が高いものの方が腫瘍への取り込みが高く、ＳＷ４８０の異種移植モデルにおいては水溶性のＰＩポリアミドの腫瘍への取り込みはｉｎ ｖｉｖｏイメージングでは観察されなかった。
【００８６】
９．化合物のｌｏｇ−Ｐ値の測定実験
ｌｏｇ−Ｐの計算方法
ＨＰＬＣ法を用いてＦＩＴＣを付加した６種類のＰＩポリアミド（Ｉｍ００−Ｉｍ０５）のｌｏｇ−Ｐ(オクタノール/水分配係数)を分析した。Ｉｍ００−Ｉｍ０５の構造を図１１に示す。図１１中、「β」はβアラニンを示し、「Ｄｐ」はＮ，Ｎ−ジメチル−１，３−プロパンジアミンを示す。また、それぞれの構造を示す図の左端には、リンカーが存在し全体がＵ字型のコンフォメーションをとっている。ＨＰＬＣのアイソクラティック溶出を用いて０．１％酢酸水（７５％）とアセトニトリル（２５％）の混合溶媒下でｌｏｇ−Ｐが既知の４種類の化合物(酢酸エチル、ベンゾニトリル、アセトフェノン、インドール)の保持時間（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅ）を測定した。これらの化合物の保持時間とｌｏｇ−Ｐの値から検量線を求めた。検量線を図１２に示す。Ｉｍ００−Ｉｍ０５の６種類のＰＩポリアミドについてＨＰＬＣを用いて上記と同条件での保持時間を調べ検量線からそれぞれのｌｏｇ−Ｐを算出した。算出した値を表３に示す。この結果から、ｌｏｇ−Ｐ値が高い、即ち脂溶性の高いポリアミドは腫瘍集積性が高い事が示唆された。
【００８７】
【表３】
2018052930.tif 000011
【００８８】
さらに、ＨＰＬＣ法を用いてポリアミドのｌｏｇ−Ｐ(オクタノール/水分配係数)を分析した。ＨＰＬＣのアイソクラティック溶出を用いて、０．１％酢酸水とアセトニトリルの混合溶媒の条件下でｌｏｇ−Ｐの値が既知である２種類の化合物(化合物の名前)とポリアミドの保持時間を測定した。２種類の化合物（Ｉｎｄｏｌｅ及びＣｕｒｃｕｍｉｎ）の保持時間とｌｏｇ−Ｐの値から検量線を求め、その式からポリアミドのｌｏｇ−Ｐの値を算出した。
【００８９】
検量線を図１３に示し、保持時間（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅ)及びｌｏｇ−Ｐを表４に示す。ＣＣＣ０７−０１のｌｏｇ−Ｐ値は３以上を示し、脂溶性が高い事が判った。このことから、腫瘍への集積性が高い事が推察された。
【００９０】
【表４】
2018052930.tif 000012
【００９１】
[実施例２］
ヒトＰＢＭＣ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｂｉｏｓｅｒｖｉｃｅｓ社）を１×１０７個ＮＳＧマウス（ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩ／２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ：日本チャールス・リバー株式会社）の静脈内に移植しヒト化ＮＳＧマウスを作製した。ＰＢＭＣ移植１週間後、ＲＫＯ細胞（ＡＴＣＣ）１×１０７個をヒト化ＮＳＧマウス皮下に移植した。移植後、腫瘍の形成が確認できた時点でＣＣＣ０７−０１を２．３若しくは９．２ｍｇ／ｋｇ静脈内投与した。経時的に腫瘍径を測定し、式=(長径×短径２)／２より腫瘍体積（ｍｍ３）を算出した。ＣＣＣ０７−０１投与1週間後、脾臓を採取し、２％ＦＢＳ／ＰＢＳ中でほぐして細胞懸濁液を調製した。蛍光標識された抗ヒトＣＤ４抗体、抗ヒトＣＤ８抗体及び抗ヒトＦｏｘｐ３抗体を用いて脾細胞を染色し、フローサイトメーターを用いて細胞障害性Ｔ細胞（ＣＤ８陽性細胞）及び制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ：ＣＤ４陽性、Ｆｏｘｐ３陽性細胞）数を解析した。統計処理はＭａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定を行い、有意水準をＰ＜０．０５とした。
【００９２】
実験結果を図１４及び図１５に示した。図１４は腫瘍体積の推移を、図１５は脾臓中の細胞障害性Ｔ細胞とＴｒｅｇの比を示す。ＣＣＣ０７−０１は用量依存的にＲＫＯ皮下移植腫瘍の増殖を抑制した。ＣＣＣ０７−０１ ２．３及び９．２ｍｇ／ｋｇ投与群におけるＴ／Ｃ（％）はそれぞれ５６．０、４１．５であった。また、Ｖｅｈｉｃｌｅ投与群、ＣＣＣ０７−０１ ２．３及び９．２ mg/kg投与群の脾臓中ＣＤ８陽性細胞／Ｔｒｅｇ比はそれぞれ８７．９、１１６．５、３２３．２であり、９．２ｍｇ／ｋｇ投与群においてＣＤ８陽性細胞／Ｔｒｅｇ比の有意な上昇が見られたことから、ＣＣＣ０７−０１が抗腫瘍免疫反応を活性化する可能性が示された。
【００９３】
[実施例３]  ＰＩＰ化合物ＣＣＣ０７−０３及びＣＣＣ０７−０４の合成及び効果の確認
追加して合成した化合物のデザイン
ＰＩＰ化合物ＣＣＣ０７−０３は、主にＰＤ―Ｌ１及びＣＴＬＡ−４の遺伝子配列に共通で結合する９塩基の配列を、Ｈｕｍａｎ Ｆｅｂ. ２００９ （ＧＲＣｈ３７/ｈｇ１９） Ａｓｓｅｍｂｌｙから検索し、決定した。ＣＣＣ０７−０３はＰＤ−１のイントロン１の染色体２番 （ｑ３７）: ２４２７９６０９６から２４２７９６１０４に位置するＴＧＧＴＴＧＣＣＡ配列を認識する。ＰＤ−Ｌ１ではイントロン１の染色体９番（ｐ２４）: ５４５５６２６から５４５５６３４に位置するＴＧＧＡＡＧＣＣＴ配列及びイントロン３の染色体９番（ｐ２４）: ５４５９３６５から５４５９３７３に位置するＴＧＧＡＡＧＣＣＡ配列，イントロン５の染色体９番（ｐ２４）:５４６６８０３から５４６６７９５に位置するＴＧＧＡＴＧＣＣＡ配列とエクソン７の染色体９番（ｐ２４）５４６８６５７から５４６８６６５に位置するＴＧＧＡＡＴＣＣＡ配列を認識する。ＣＴＬＡ−４ではエクソン１の染色体２番（ｑ３３）２０４７３２７１７から２０４７３２７０９に位置するＴＧＧＴＡＧＣＣＡ配列及びイントロン２の染色体２番（ｑ３３）：２０４７３５７９１から２０３８７１０４３に位置するＴＧＧＴＡＧＣＣＴ配列を認識する。上記ＷＧＧＷＷＧＣＣＷを認識するために、グアニン、シトシンを認識するイミダゾール、ピロールのペア及び、アデニン、チミンを認識するピロールとβアラニンのペアを用いてポリアミドを設計した。
【００９４】
ＰＩＰ化合物ＣＣＣ０７−０４は、ヒトではなくマウスのＰｄ−１（Ｐｄｃｄ１），Ｐｄ―ｌ１（Ｃｄ２７４）及びＣｔｌａ４遺伝子配列に共通で結合する９塩基の配列を、Ｍｏｕｓｅ Ｄｅｃ. ２０１１ （ＧＲＣｍ３８/mm１０） Ａｓｓｅｍｂｌｙから検索し、決定した。ＣＣＣ０７−０４はマウスＰｄ−１のイントロン１の染色体１番 （ｑＤ）: ９４０４８５２０から９４０４８５２８に位置するＡＣＣＡＡＧＣＣＡ配列と同イントロン１の９４０４４２７２から９４０４４２８０に位置するＴＣＣＴＡＧＣＣＡ配列を認識する。Ｐｄ−ｌ１ではエクソン１の染色体１９番（ｐＣ１）: ２９３６８１３２から２９３６８１２４に位置するＡＣＣＡＴＧＣＣＡ配列を認識する。Ｃｔｌａ−４ではエクソン４の３プライム非翻訳領域の染色体１番（ｑＣ２）６０９１５４０６から６０９１５３９８に位置するＴＣＣＡＡＧＣＣＡ配列を認識する。上記ＷＧＧＷＷＧＣＣＷを認識するために、グアニン、シトシンを認識するイミダゾール、ピロールのペア及び、アデニン、チミンを認識するピロールとβアラニンのペアを用いてポリアミドを設計した。
【００９５】
化合物の合成
本発明の化合物の作製方法は以下のとおりである。カルボン酸末端を持つＰＩＰをＮＭＰ１００μＬに溶解し、ｉＰｒ２ＮＥｔ（０．５μＬ、２．８６μｍｏｌ）とＰｙＢＯＰ（１．０ｍｇ、１．９５μｍｏｌ）を加えた。反応溶液を撹拌しながら室温で２時間反応させた後、１−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステルの活性体が出来ているかをＨＰＬＣで確認した。確認後、ＮＨ２−インドールｓｅｃｏ−ＣＢＩ（０．６ｍｇ、１．５８μｍｏｌ）を反応容器に加え、室温、窒素雰囲気下で一晩撹拌した。反応後、反応物はＨＰＬＣにより精製し（０．１％ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮ、３０−７５％リニアグラジエント、０〜３０分間）、凍結乾燥により目的化合物であるポリアミドＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１が白い粉末で得られた（ＬＣ−ＭＳ ｍ／ｚ  Ｃ９０Ｈ９３ＣｌＮ３０Ｏ１６  ［Ｍ＋Ｈ］＋ 計算値:１８８５．７１、実測値:１８８６．４０  ［Ｍ＋２Ｈ］２＋  計算値：９４３．８６、実測値９４３．７５）。
【００９６】
図１６にＣＣＣ０７−０３の構造式を、図１７にＨＰＬＣ解析データを、図１８にＬＣ−ＭＣ解析データを示す。また、図１９にＣＣＣ０７−０４の構造式を、図２０にＨＰＬＣ解析データを、図２１にＬＣ−ＭＣ解析データを示す。
【００９７】
ＰＣＲに用いたヒト遺伝子  ｐｒｉｍｅｒ
ＰＤ−１検出用として、ＰＤ−１Ｆ：ＣＴＧ ＧＧＣ ＧＧＴ ＧＣＴ ＡＣＡ ＡＣＴ（配列番号１５）とＰＤ−１Ｒ：ＡＣＧ ＡＡＧ ＣＴＣ ＴＣＣ ＧＡＴ ＧＴＧ ＴＴ（配列番号１６）を用い、ＰＤ−Ｌ１検出用としてＰＤ−Ｌ１−Ｆ２：ＴＧＧ ＣＡＴ ＴＴＧ ＣＴＧ ＡＡＣ ＧＣＡ ＴＴＴ（配列番号１７）とＰＤ−Ｌ１−Ｒ２：ＴＧＣ ＡＧＣ ＣＡＧ ＧＴＣ ＴＡＡ ＴＴＧ ＴＴＴ Ｔ（配列番号１８）を用い、ＣＴＬＡ−４検出用 （ＲＴ−ＰＣＲ用）としてＣＴＬＡ−４Ｆ：ＣＴＣ ＡＧＣ ＴＧＡ ＡＣＣ ＴＧＧ ＣＴＡ ＣＣ（配列番号１９）とＣＴＬＡ−４Ｒ：ＡＧＴ ＧＧＣ ＴＴＴ ＧＣＣ ＴＧＧ ＡＧＡ Ｔ（配列番号２０）を用い、コントロールとしてＧＡＰＤＨ−Ｆ：ＣＧＡ ＣＣＡ ＣＴＴ ＴＧＴ ＣＡＡ ＧＣＴ ＣＡ（配列番号２１）とＧＡＰＤＨ−Ｒ：ＡＧＧ ＧＧＴ ＣＴＡ ＣＡＴ ＧＧＣ ＡＡＣ ＴＧ（配列番号２２）を用いた。
【００９８】
Ｒｅａｌｔｉｍｅ  ＰＣＲによる２遺伝子発現抑制実験
ＰＤ−Ｌ１の発現抑制実験
ＲＫＯ細胞１ｘ１０５個/穴を６穴プレートで培養した。翌日に、細胞を０、５、５０、５００ｎＭのＣＣＣ０７−０３で６時間、２４時間、４８時間処理し、細胞を回収してｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。前記抽出にはＡｌｌＰｒｅｐ ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ (ＱＩＡＧＥＮ, ＣＡ)を用いた。次に抽出した前記ＲＮＡをテンプレートにＳｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ ＶＩＬＯＴＭ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ (Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ, ＣＡ)を用いて逆転写を行いｃＤＮＡを調整し、ｑＰＣＲを行った。ｑＰＣＲの条件はＨｏｌｄｉｎｇ ｓｔａｇｅ ５０℃ ２ｍｉｎ、 ９５℃ １０ｍｉｎ、Ｃｙｃｌｉｎｇ  ｓｔａｇｅ（４０ ｃｙｃｌｅ）９５℃ １５ｓｅｃ、６０℃ １ｍｉｎ、Ｍｅｌｔ Ｃｕｒｖｅ Ｓｔａｇｅ ９５℃ １５ｓｅｃ、６０℃ １ｍｉｎ、９５℃ ３０ ｓｅｃ、６０℃ １５ｓｅｃとした。ＧＡＰＤＨをｃｏｎｔｒｏｌとして、相対的発現量を定量した。ＰＤ−Ｌ１のＰＣＲには以下のｐｒｉｍｅｒ ｓｅｔを用いた。
Ｐｒｉｍｅｒｓ
ＰＤ−Ｌ１
Ｆｏｒｗａｒｄ: ＴＧＧ ＣＡＴ ＴＴＧ ＣＴＧ ＡＡＣ ＧＣＡ ＴＴＴ (配列番号１７)
Ｒｅｖｅｒｓｅ： ＴＧＣ ＡＧＣ ＣＡＧ ＧＴＣ ＴＡＡ ＴＴＧ ＴＴＴ Ｔ (配列番号１８)
ＧＡＰＤＨ
Ｆｏｒｗａｒｄ: ＣＧＡ ＣＣＡ ＣＴＴ ＴＧＴ ＣＡＡ ＧＣＴ ＣＡ (配列番号２１)
Ｒｅｖｅｒｓｅ: ＡＧＧ ＧＧＴ ＣＴＡ ＣＡＴ ＧＧＣ ＡＡＣ ＴＧ (配列番号２２)
【００９９】
ＰＤ−Ｌ１を発現するＲＫＯ細胞におけるＣＣＣ０７−０３投与後の発現の定量結果を図２２Ａ、Ｂ、Ｃに示す。図２２Ａに示すように、ＰＤ−Ｌ１の発現は、６時間ではコントロールに比べ５００ｎＭで減少傾向が、図２２Ｂに示すように、投与後２４時間ではＲＫＯ細胞でＣＣＣ０７−０３の５０ｎＭ濃度の投与で統計学的に有意にＰＤ−Ｌ１の発現が減少していた。図２２Ｃに示すように、投与後４８時間ではＲＫＯ細胞でＣＣＣ０７−０３の濃度に準じてＰＤ−Ｌ１の発現が低下していた。
【０１００】
ＣＴＬＡ４の発現抑制実験
Ａ２０５８細胞１ｘ１０５ 個/穴を６穴プレートで培養した。翌日に、細胞を０、５、５０、５００ｎＭのＣＣＣ０７−０３で６時間、２４時間、４８時間処理し、細胞を回収してｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。前記抽出にはＡｌｌＰｒｅｐ ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ (ＱＩＡＧＥＮ, ＣＡ)を用いた。次に抽出した前記ＲＮＡをテンプレートにＳｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ ＶＩＬＯＴＭ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ (Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ, ＣＡ)を用いて逆転写を行いｃＤＮＡを調整し、ｑＰＣＲを行った。ｑＰＣＲの条件はＨｏｌｄｉｎｇ ｓｔａｇｅ ５０℃ ２ｍｉｎ、９５℃ １０ｍｉｎ、Ｃｙｃｌｉｎｇ ｓｔａｇｅ （４０ ｃｙｃｌｅ）９５℃ １５ｓｅｃ、６０℃ １ｍｉｎ、Ｍｅｌｔ Ｃｕｒｖｅ Ｓｔａｇｅ ９５℃ １５ｓｅｃ、６０℃ １ｍｉｎ、９５℃ ３０ｓｅｃ、６０℃ １５ｓｅｃとした。ＧＡＰＤＨ(Ｐｒｉｍｅｒ 配列番号２１、２２)をｃｏｎｔｒｏｌとして、相対的発現量を定量した。ＣＴＬＡ４のＰＣＲには以下のｐｒｉｍｅｒ ｓｅｔを用いた。
Ｐｒｉｍｅｒｓ
Ｆｏｒｗａｒｄ: ＣＴＣ ＡＧＣ ＴＧＡ ＡＣＣ ＴＧＧ ＣＴＡ ＣＣ (配列番号１９)
Ｒｅｖｅｒｓｅ: ＡＧＴ ＧＧＣ ＴＴＴ ＧＣＣ ＴＧＧ ＡＧＡ Ｔ (配列番号２０)
【０１０１】
ＣＴＬＡ−４を発現するＡ２０５８細胞におけるＣＣＣ０７−０３投与後の発現の定量結果を図２３Ａ、Ｂに示す。図２３Ａに示すように、ＣＴＬＡ−４の発現は、６時間ではコントロールに比べ上昇しているが、図２３Ｂに示すように、投与後２４時間ではＡ２０５８細胞でＣＣＣ０７−０３の濃度に準じて低下し５００ｎＭの濃度で２４時間では顕著に減少していた。
【０１０２】
陰性コントロールポリアミドでのＣＴＬＡ４発現抑制の検討
Ａ２０５８細胞１ｘ１０５ 個/穴を６穴プレートで培養した。翌日に、細胞を０、５、５０、５００ｎＭのＣＣＣ０７−０４で６時間、２４時間、４８時間処理し、細胞を回収してｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。前記抽出にはＡｌｌＰｒｅｐ ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ （ＱＩＡＧＥＮ， ＣＡ）を用いた。次に抽出した前記RNAをテンプレートにＳｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ ＶＩＬＯＴＭ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， ＣＡ）を用いて逆転写を行いｃＤＮＡを調整し、ｑＰＣＲを行った。ｑＰＣＲの条件はＨｏｌｄｉｎｇ ｓｔａｇｅ ５０℃ ２ｍｉｎ、95℃ 10min、Ｃｙｃｌｉｎｇ ｓｔａｇｅ （４０ｃｙｃｌｅ）９５℃ １５ｓｅｃ、６０℃ １ｍｉｎ、Ｍｅｌｔ Ｃｕｒｖｅ Ｓｔａｇｅ ９５℃ １５ｓｅｃ、６０℃ １ｍｉｎ、９５℃ ３０ｓｅｃ、６０℃ １５ｓｅｃとした。ＧＡＰＤＨ（Ｐｒｉｍｅｒ配列番号２１、２２)をｃｏｎｔｒｏｌとして、相対的発現量を定量した。ＣＴＬＡ４のＰＣＲには以下のｐｒｉｍｅｒ ｓｅｔを用いた。
Ｐｒｉｍｅｒｓ
Ｆｏｒｗａｒｄ: ＣＴＣ ＡＧＣ ＴＧＡ ＡＣＣ ＴＧＧ ＣＴＡ ＣＣ (配列番号１９)
Ｒｅｖｅｒｓｅ: ＡＧＴ ＧＧＣ ＴＴＴ ＧＣＣ ＴＧＧ ＡＧＡ Ｔ (配列番号２０)
ＣＴＬＡ−４を発現するＡ２０５８細胞におけるＣＣＣ０７−０４投与後の発現の定量結果を図２４に示す。図２４に示すように、ＣＴＬＡ−４の発現は、６時間ではコントロールに比べ上昇しているが、投与後２４時間以降は細胞がすべて浮遊し、細胞死が誘導されていると考えられ測定ができなかった。
【０１０３】
マウスPｄ-ｌ1の発現抑制実験
Ｂ１６Ｆ１細胞１ｘ１０５ 個/穴を６穴プレートで培養した。翌日に、細胞を０、１００、２００、３００、４００、５００ｎＭのＣＣＣ０７−０４で６時間、２４時間、４８時間処理し、細胞を回収してｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。前記抽出にはＡｌｌ Ｐｒｅｐ ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ (ＱＩＡＧＥＮ, ＣＡ)を用いた。次に抽出した前記ＲＮＡをテンプレートにＳｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ ＶＩＬＯＴＭ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ (Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ, ＣＡ)を用いて逆転写を行いｃＤＮＡを調整し、ｑＰＣＲを行った。ｑＰＣＲの条件はＨｏｌｄｉｎｇ ｓｔａｇｅ ５０℃ ２ｍｉｎ、 ９５℃ １０ｍｉｎ、Ｃｙｃｌｉｎｇ ｓｔａｇｅ（４０ ｃｙｃｌｅ）９５℃ １５ｓｅｃ、６０℃ １ｍｉｎ、Ｍｅｌｔ Ｃｕｒｖｅ Ｓｔａｇｅ ９５℃ １５ｓｅｃ、６０℃ １ｍｉｎ、９５℃ ３０ｓｅｃ、６０℃ １５ｓｅｃとした。β―ｔｕｂｕｌｉｎをｃｏｎｔｒｏｌとして、相対的発現量を定量した。Ｐｄ−ｌ１のＰＣＲには以下のｐｒｉｍｅｒ ｓｅｔを用いた。
Ｐｒｉｍｅｒｓ
Ｐｄ−ｌ１
Ｆｏｒｗａｒｄ: ＴＧＣ ＴＧＣ ＡＴＡ ＡＴＣ ＡＧＣ ＴＡＣ ＧＧ (配列番号２３)
Ｒｅｖｅｒｓｅ: ＧＣＴ ＧＧＴ ＣＡＣ ＡＴＴ ＧＡＧ ＡＡＧ ＣＡ (配列番号２４)
β―ｔｕｂｕｌｉｎ
Ｆｏｒｗａｒｄ: ＧＣＣ ＡＣＴ ＡＣＡ ＣＣＡ ＴＴＧ ＧＣＡ ＡＧ （配列番号２５）
Ｒｅｖｅｒｓｅ :ＧＴＧ ＧＡＡ ＡＡＣ ＣＡＡ ＧＡＡ ＧＣＣ ＣＴ （配列番号２６）
【０１０４】
Ｐｄ-ｌ１を発現するＢ１６Ｆ１マウス細胞におけるＣＣＣ０７−０４投与後の発現の定量結果を図２５に示す。図２５に示すように、Ｐｄ―ｌ１の発現は、投与６時間後にＢ１６Ｆ１細胞でＣＣＣ０７−０４の濃度に準じてＰｄ―ｌ１の発現が統計学的に有意に低下していた。Ｂ１６Ｆ１マウス細胞はＣＣＣ０７−０４投与で２４時間以降では細胞がすべて浮遊し、細胞死が誘導されていると考えられ測定ができなかった。
【０１０５】
ＣＣＣ０７−０４は、ヒトのサロゲートとしてマウスのＰｄ−１、Ｐｄ−ｌ１、Ｃｔｌａ４を認識する化合物としてデザイン合成されたが、上記Ｐｄ−ｌ１の発現抑制は確認されたが、Ｐｄ−１やＣｔｌａ４については、高発現するマウス細胞株を解析できていないため、Ｐｄ−１やＣｔｌａ４に対する効果は未だ不明であるが、少なくともＰｄ−ｌ１の発現をマウス細胞株で抑制し、ヒト細胞株ではＰｄ−１、Ｐｄ−ｌ１、Ｃｔｌａ４の発現抑制を確認できていない。
【０１０６】
[実施例４]  がん細胞を移植したヌードマウスの腫瘍への長期集積性の実験
ＬＳ１８０ヒト大腸がん細胞３×１０６個をヌードマウス（ＢＡＬＢ/ｃ ｎｕ/ｎｕ）の皮下に移植した。移植後、腫瘍形成を確認後に腫瘍直径が１ｃｍに達した時点でＦＩＴＣで蛍光ラベルされたＩｍ０１、Ｉｍ０３、Ｉｍ０５をそれぞれ３匹の腫瘍移植マウスの尾静脈から１．０ｍｇ／ｋｇの濃度で投与した。投与直前０時間、投与後２，４，６，１２時間及び１，２，３，４，５，６，７，８，９日にin vivoイメージングを用いて、皮下移植腫瘍部の蛍光強度及び非移植部の蛍光強度を測定し、その比を測定、投与２時間後に蛍光強度が最大であったため、この蛍光強度を１００として、パーセントでそれぞれの投与後時間の蛍光強度を測定した。それぞれの蛍光化合物ごとにそれぞれの投与経過後の時間での３匹のマウスの平均値とＳＤ値を図２６に折れ線グラフで示す。さらに、投与後９日、（２１６時間後）にマウスの剖検を行い腫瘍断片、及び主要正常臓器（肝臓、腎臓、肺、心臓、脾臓、脳）組織の凍結切片を作成し、蛍光をコンフォーカル顕微鏡で４００倍に拡大し観察した。観察にあたっては、ＤＡＰＩ染色を事前に行い、細胞内の核を蛍光染色し、核内の蛍光と蛍光ラベルしたＰＩポリアミド化合物が共在しているかをそれぞれの蛍光観察と観察像の統合画像を作成し比較した。実験結果（ＬＳ１８０ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ マウスにおける Ｉｍ０１投与後 ９ 日（２１６時間）の組織割面のホタル光の観察 (４００倍)）を図２７に示す。
【０１０７】
結果
脂溶性の高いＩｍ０１では投与９日でも腫瘍内に化合物が貯留していると考えられる蛍光強度が腫瘍部で強く認められた。Ｉｍ０３では、腫瘍内貯留を示す高い腫瘍部の蛍光強度が認められたが、投与９日目でほぼバックグランドのレベルに蛍光強度は低下した。Ｉｍ０５では、腫瘍内貯留を示す高い腫瘍部の蛍光強度が認められたが、投与４日目でほぼバックグランドのレベルに蛍光強度は低下した。このようにポリアミド化合物は、腫瘍内に取込まれ、集積し、長期に貯留する性質が見られ、特に脂溶性の高いポリアミド化合物で腫瘍の貯留性が高いことが観察された。
【０１０８】
さらに蛍光の長期貯留が認められたＩｍ０１投与マウスを９日目に安楽死させ、腫瘍及び主要臓器での蛍光強度を観察したところ、細胞核内に強い蛍光強度を示し、特に腫瘍部で強い蛍光が核に一致して見られた。主要臓器では、肝臓及び脾臓に弱い傾向が核内に認められ、腎臓にもさらに弱いが傾向が核内に観察された。
【０１０９】
上記の観察結果より、脂溶性ポリアミド化合物は、腫瘍内に取込まれ、集積し、長期に貯留する性質があることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１１０】
本発明の複合体は、抗がん剤等の医薬組成物の有効成分として用いることができる。
【配列表フリーテキスト】
【０１１１】
配列番号１５〜２６  プライマー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【配列表】
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