(57)【要約】【課題】生体試料に対してクロマトグラフ質量分析を行うことにより得られるデータの質を総合的に評価する。【解決手段】本発明では、生体試料及び標準試料の各々に安定同位体試薬を少なくとも１種添加して分析用生体試料及び分析用標準試料を準備し、複数の分析用生体試料からなる一組の分析用生体試料のデータを用いて生体試料の質を評価する。また、一組の分析用試料の分析の前後に行われる、分析用標準試料のデータを用いて各組の分析用試料の前処理及び／又は分析の質を評価し、一組の分析用試料の分析の前後に行われる、装置評価用試料のデータに基づいて一組の分析用試料の分析に用いられたクロマトグラム又は質量分析計の異常を評価する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の各成分をクロマトグラフにより時間方向に分離した後に、質量分析計により各成分由来のイオンを質量電荷比に応じて分離して検出するクロマトグラフ質量分析方法において、
a)複数の生体試料の各々に、生体試料に含まれる所定の生体内代謝産物を同位体で標識した安定同位体試薬を少なくとも１種添加し、クロマトグラフ質量分析のための所定の前処理を行うことにより、複数の分析用生体試料を準備する第１準備工程と、
b)標準試料に前記分析用生体試料に添加されたものと同じ安定同位体試薬を添加し、前記生体試料と同じ前処理を行うことにより分析用標準試料を準備する第２準備工程と、
c)前記複数の分析用生体試料を一組として、まとめて分析する第１分析工程と、
d)前記複数の分析用生体試料の分析の前及び後に、前記分析用標準試料を分析する第２分析工程と、
e)前記分析用標準試料と前記複数の分析用生体試料をそれぞれ分析することにより得られたデータに基づいて作成されるマススペクトルから、前記分析用標準試料と各分析用生体試料に含まれる前記安定同位体試薬に対応するピーク強度を求めるとともに、複数の分析用生体試料に含まれる前記安定同位体試薬のうち少なくとも１種に対応するピーク強度の中央値又は平均値を求め、各分析用生体試料に含まれる前記安定同位体試薬に対応するピーク強度が、前記中央値又は前記平均値を中心とする所定範囲内にあるか否かに基づき、各生体試料の質及び前記第１準備工程を評価する第１評価工程と、
f)前記複数の分析用生体試料の分析の前及び後に、前記分析用標準試料を分析することにより得られたデータに基づいて作成されるマススペクトルにより、前記前処理の質及び／又は分析の質を評価する第２評価工程と、
を備える、クロマトグラフ質量分析方法。
【請求項２】
試料中の各成分をクロマトグラフにより時間方向に分離した後に、質量分析計により各成分由来のイオンを質量電荷比に応じて分離して検出するクロマトグラフ質量分析方法において、
a)複数の生体試料の各々に、生体試料に含まれる所定の生体内代謝産物を同位体で標識した安定同位体試薬を少なくとも１種添加し、クロマトグラフ質量分析のための所定の前処理を行うことにより、複数の分析用生体試料を準備する第１準備工程と、
b)標準試料に前記分析用生体試料に添加されたものと同じ安定同位体試薬を添加し、前記生体試料と同じ前処理を行うことにより分析用標準試料を準備する第２準備工程と、
c)前記複数の分析用生体試料を一組として、まとめて分析する第１分析工程と、
d)前記複数の分析用生体試料の分析の前及び後に、前記分析用標準試料を分析する第２分析工程と、
e)前記複数の分析用生体試料をそれぞれ分析することにより得られたデータに基づいて作成されるマススペクトルに、各分析用生体試料に含まれる前記安定同位体試薬に対応するイオンのピークが現れているか否かに基づき、各生体試料の質を評価する第１評価工程と
f)前記複数の分析用生体試料の分析の前及び後に、前記分析用標準試料を分析することにより得られたデータに基づいて作成されるマススペクトルにより、前記前処理の質及び／又は分析の質を評価する第２評価工程と、
を備える、クロマトグラフ質量分析方法。
【請求項３】
請求項１に記載のクロマトグラフ質量分析方法において、
前記第１準備工程では、さらに、前記複数の生体試料の各々に、生体内に含まれない内部標準試薬を添加し、
前記第１評価工程では、前記分析用標準試料と前記複数の分析用生体試料をそれぞれ分析することにより得られたデータに基づいて作成されるマススペクトルから、前記分析用標準試料と各分析用生体試料に含まれる前記内部標準試薬又は前記安定同位体試薬に対応するピーク強度を求めるとともに、複数の分析用生体試料に含まれる前記内部標準試薬又は前記安定同位体試薬の少なくとも１種に対応するピーク強度の中央値又は平均値を求め、各分析用生体試料に含まれる前記内部標準試薬又前記安定同位体試薬に対応するピーク強度が、前記中央値又は前記平均値を中心とする所定範囲内にあるか否かに基づき、各生体試料の質及び前記第１準備工程を評価する、
クロマトグラフ質量分析方法。
【請求項４】
請求項２に記載のクロマトグラフ質量分析方法において、
前記第１準備工程では、さらに、前記複数の生体試料の各々に、生体内に含まれない内部標準試薬を添加し、
前記第１評価工程では、前記複数の分析用生体試料をそれぞれ分析することにより得られたデータに基づいて作成されるマススペクトルに、各分析用生体試料に含まれる前記内部標準試料又は前記安定同位体試薬に対応するイオンのピークが現れているか否かに基づき、各生体試料の質を評価する、クロマトグラフ質量分析方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のクロマトグラフ質量分析方法において、
前記安定同位体試薬が、１３Ｃ３-乳酸、１３Ｃ２-シュウ酸、２Ｈ３-サルコシン、２Ｈ８-バリン、１３Ｃ３-ジヒドロキシアセトン、２Ｈ１０-イソロイシン、１３Ｃ４-フマル酸、１３Ｃ４-リンゴ酸、２Ｈ３-アスパラギン酸、１３Ｃ５-グルタミン酸、１３Ｃ６-４−ヒドロキシ安息香酸、２Ｈ３-ラウリン酸、１３Ｃ５-リボース、１３Ｃ２-タウリン、２Ｈ４-クエン酸、２Ｈ７-オルニチン、１３Ｃ６-チロシン、１３Ｃ6-dopa、２Ｈ６-キヌレニン、２Ｈ８-シスタミン、１３Ｃ１１-トリプトファン、２Ｈ３-２−ヒドロキシ酪酸のうちの少なくとも１種である、クロマトグラフ質量分析方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のクロマトグラフ質量分析方法において、さらに、
前記複数の分析用生体試料の分析の前及び後に装置評価用試料を分析する第３分析工程と、
前記複数の分析用生体試料の分析の前及び後に前記装置評価用試料を分析することにより得られたデータに基づいて作成されるマスクロマトグラム又はマススペクトルにより、分析に用いられたクロマトグラフ又は質量分析計の異常を評価する第３評価工程と  
を備える、クロマトグラフ質量分析方法。
【請求項７】
請求項６に記載のクロマトグラフ質量分析方法において、
前記装置評価用試料が、炭素数が７〜３３のノルマルアルカンから選択される複数種のノルマルアルカンを含み、
前記第第３評価工程が、前記複数の分析用生体試料の分析の前及び後に前記装置評価用試料を分析することにより得られたデータに基づいて作成されるクロマトグラムから前記ノルマルアルカンの保持時間を求め、これら保持時間を比較することにより前記クロマトグラフのカラムの異常を評価する、クロマトグラフ質量分析方法。
【請求項８】
請求項６に記載のクロマトグラフ質量分析方法において、
前記装置評価用試料が、オクタフルオロナフタレン溶液を含み、
前記第３工程が、前記複数の分析用生体試料の分析の前及び後に前記装置評価用試料を分析することにより得られたデータに基づいて作成される、前記オクタフルオロナフタレンに対応する質量電荷比のマスクロマトグラムを比較することにより、前記質量分析計の異常を評価する、クロマトグラフ質量分析方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載のクロマトグラフ質量分析方法において、
前記分析用生体試料及び前記分析用標準試料が、前記安定同位体試薬として、１３Ｃ６-４−ヒドロキシ安息香酸を含む、クロマトグラフ質量分析方法。
【請求項１０】
試料中の各成分を時間方向に分離するクロマトグラフと、該クロマトグラフにより時間方向に分離された成分由来のイオンを質量電荷比に応じて分離して検出する質量分析計とを組み合わせたクロマトグラフ質量分析装置において、
a)複数の生体試料に、該生体試料に含まれる所定の生体内代謝産物を同位体で標識した安定同位体試薬を少なくとも１種添加し、クロマトグラフ質量分析のための所定の前処理を行うことにより準備された複数の分析用生体試料を一組としてまとめて分析する手順と、標準試料に、前記分析用生体試料に添加されたものと同じ安定同位体試薬を添加し、前記分析用生体試料と同じ前処理を行うことにより準備された分析用標準試料を、前記複数の分析用生体試料の分析の前及び後に分析する手順とからなる分析メソッドファイルを記憶するメソッドファイル記憶部と、
b)前記メソッドファイル記憶部に記憶されている前記分析メソッドファイル中の手順に従い分析を実行する分析実行部と、
c)前記質量分析計により得られたデータに基づいてマスクロマトグラム及びマススペクトルを作成するグラフ作成部と、
d)前記グラフ作成部によって作成された、前記分析用標準試料と複数の分析用生体試料のマススペクトルから、分析用標準試料と各分析用生体試料に含まれる前記安定同位体試薬に対応するピーク強度を求めるとともに、複数の分析用生体試料に含まれる前記安定同位体試薬の少なくとも１種に対応するピーク強度の中央値又は平均値を求め、各分析用生体試料に含まれる前記安定同位体試薬に対応するピーク強度が、前記中央値又は前記平均値を中心とする所定範囲内にあるか否かに基づき、生体試料の質、及び前記分析実行部が実行する前記複数の分析用生体試料の分析を評価する第１評価部と、
e)前記グラフ作成部によって作成された、前記複数の分析用生体試料の分析の前及び後に分析された前記分析用標準試料のマススペクトルから、前記前処理の質及び／又は分析の質を評価する第２評価部と、
を備える、クロマトグラフ質量分析装置。
【請求項１１】
試料中の各成分を時間方向に分離するクロマトグラフと、該クロマトグラフにより時間方向に分離された成分由来のイオンを質量電荷比に応じて分離して検出する質量分析計とを組み合わせたクロマトグラフ質量分析装置において、
a)複数の生体試料に、該生体試料に含まれる所定の生体内代謝産物を同位体で標識した安定同位体試薬を少なくとも１種添加し、クロマトグラフ質量分析のための所定の前処理を行うことにより準備された複数の分析用生体試料を一組としてまとめて分析する手順と、標準試料に、前記分析用生体試料に添加されたものと同じ安定同位体試薬を添加し、前記分析用生体試料と同じ前処理を行うことにより準備された分析用標準試料を、前記複数の分析用生体試料の分析の前及び後に分析する手順とからなる分析メソッドファイルを記憶するメソッドファイル記憶部と、
b)前記メソッドファイル記憶部に記憶されている前記分析メソッドファイル中の手順に従い分析を実行する分析実行部と、
c)前記質量分析計により得られたデータに基づいてマスクロマトグラム及びマススペクトルを作成するグラフ作成部と、
d)前記グラフ作成部によって作成された、前記複数の分析用生体試料のマススペクトルから、各分析用生体試料に含まれる前記安定同位体試薬に対応するイオンのピークが検出されているか否かに基づき、各生体試料の質を評価する第１評価部と
e)前記グラフ作成部によって作成された、前記複数の分析用生体試料の分析の前及び後に分析された前記分析用標準試料のマススペクトルから、前記前処理及び／又は分析の質を評価する第２評価部と
を備える、クロマトグラフ質量分析装置。
【請求項１２】
前記複数の分析用生体試料が、複数の生体試料に、生体内に含まれない内部標準試薬と前記安定同位体試薬の少なくとも１種を添加し、クロマトグラフ質量分析のための所定の前処理を行うことにより準備されたものであることを特徴とする請求項１０又は１１に記載のクロマトグラフ質量分析装置。
【請求項１３】
前記安定同位体試薬が、１３Ｃ３-乳酸、１３Ｃ２-シュウ酸、２Ｈ３-サルコシン、２Ｈ８-バリン、１３Ｃ３-ジヒドロキシアセトン、２Ｈ１０-イソロイシン、１３Ｃ４-フマル酸、１３Ｃ４-リンゴ酸、２Ｈ３-アスパラギン酸、１３Ｃ５-グルタミン酸、１３Ｃ６-４−ヒドロキシ安息香酸、２Ｈ３-ラウリン酸、１３Ｃ５-リボース、１３Ｃ２-タウリン、２Ｈ４-クエン酸、２Ｈ７-オルニチン、１３Ｃ６-チロシン、１３Ｃ6-dopa、２Ｈ６-キヌレニン、２Ｈ８-シスタミン、１３Ｃ１１-トリプトファン、２Ｈ３-２−ヒドロキシ酪酸のうちの少なくとも１種である、請求項１０〜１２のいずれかに記載のクロマトグラフ質量分析装置。
【請求項１４】
前記分析メソッドファイルが、前記複数の分析用生体試料の分析の前及び後に装置評価用試料を分析する手順を含み、
前記グラフ作成部によって作成された、前記複数の分析用生体試料の分析の前及び後に分析された前記装置評価用試料のマスクロマトグラム又はマススペクトルから、分析に用いられたクロマトグラフ又は質量分析計の異常を評価する第３評価部を、さらに備えることを特徴とする請求項１０〜１３のいずれかに記載のクロマトグラフ質量分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ガスクロマトグラフィ又は液体クロマトグラフィ等のクロマトグラフィと質量分析を組み合わせたクロマトグラフ質量分析の方法及び装置に関し、さらに詳しくは、健常者とがん患者といった複数のグループの被検者から採取された生体試料（血液や尿、唾液等）のデータ間の差異を調べる差異分析に用いられるデータの収集に好適なクロマトグラフ質量分析方法及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
ガスクロマトグラフィ又は液体クロマトグラフィ等のクロマトグラフィと質量分析を組み合わせたクロマトグラフ質量分析は、医療や医薬品、食品、環境など様々な分野において広く利用されている。クロマトグラフ質量分析で得られたデータの解析手法には種々のものがあるが、その一つとして、二つ又はそれ以上の複数のグループのデータ間の差異を調べる差異解析がある。差異解析の具体的な例としては、健常者には見られず、がん患者でのみ見られる特異的なタンパク質（即ち、当該がん疾患のバイオマーカ）の発見を目的として、健常者から採取した生体試料のクロマトグラム及びマススペクトルには存在せず、がん患者から採取した生体試料のクロマトグラム及びマススペクトルに存在するピークを探索するような解析処理が挙げられる。
【０００３】
クロマトグラフ質量分析装置を用いたバイオマーカーの探索は例えば次のような手順で行われる。まず、被検者（健常者又は患者）から採取した生体試料に含まれる一つ又は複数のタンパク質を消化酵素によって複数のペプチドに分解し、ペプチド混合物を得る。次に、そのペプチド混合物を液体クロマトグラフに導入し、各ペプチドをそれぞれの保持時間（Retention Time）に応じて分離する。こうして保持時間に応じて分離されたペプチドが含まれる試料を質量分析装置により測定し、ペプチド由来のイオンの信号強度が反映されたデータを収集する。
【０００４】
或るペプチド由来のピークは、そのペプチドに対応する保持時間（ＲＴ）で且つそのペプチドに対応する質量電荷比m/zに現れる。即ち、或るペプチド由来のピークの出現位置は（ＲＴ，m/z）の座標、又はそれらを要素とする２次元べクトルで表される。したがって、そのペプチドが或る健常者又はがん患者のグループに存在するか否かを調べるには、そのペプチドに対応する（ＲＴ，m/z）にピークが存在するか否かを調べればよい。
【０００５】
ところで、バイオマーカーの探索に用いられる生体試料は、病院や診療所等の医療機関において被検者から採取されたものであるが、全ての機関において全く同じ手順、条件、品質で試料の採取及び測定を行うことは困難である。また、医療機関において被検者から採取された生体試料は、しばらくの間保管された後、或る程度の数が揃った時点で一括して測定される場合があり、このような場合には、生体試料によって保管温度や保管時間が異なることになる。そのため、同じ物質由来のピークであっても、そうした採取・測定の手順、条件、及び品質や、保管温度、保管時間等のばらつきによって、保持時間のずれや或る質量電荷比における信号強度の差異となって現れ、これを健常者と患者の間にみられる差異であると誤って判定してしまう可能性がある。
【０００６】
これに対して、例えば特許文献１には、生体内代謝の解析のために用いられる生体試料に含まれる成分のうち、分析条件や保管時間、保管温度等の影響を受けやすい物質を指標として生体試料の質を評価することが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表2016-510414号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
特許文献１に記載されている方法を採用すれば、質が低下していると評価された生体試料の測定データを、差異解析の対象データから排除することができるため、分析条件や保管時間、保管温度等のばらつき等によって現れる差異を、健常者と患者の間にみられる差異であると誤って判定してしまうことを防止することができる。
【０００９】
ところが、生体試料に対してクロマトグラフ質量分析を行うことにより得られるデータ（つまり、保持時間と質量電荷比）に影響を及ぼす要因には、上述した要因以外に、生体試料の採取に用いられる器具や装置や生体試料のクロマトグラフ質量分析に用いられる装置の性能や該装置の動作不良といった要因も含まれるところ、特許文献１の方法にはこのような要因による影響が考慮されていない。
【００１０】
さらに、生体試料は、被検者の年齢や性別、種別、遺伝等を要因とする個体差が大きく、該生体試料に含まれる成分によっては、同じグループであってもそのデータに揺らぎが生じる場合がある。複数のグループを隔てる境界がこのような揺らぎの影響を受けないようにするためには、同じグループ内で、試料自体（被検者）の個体差による揺らぎの範囲を大幅に越えるような変動が生じた場合には、これを排除する必要があるが、特許文献１に記載された方法では、生体試料自体の個体差による揺らぎと、それ以外の要因による変動を区別することは難しい。
【００１１】
本発明が解決しようとする課題は、生体試料に対してクロマトグラフ質量分析を行うことにより得られるデータの質を総合的に評価することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題を解決するために成された本発明の第１態様に係るクロマトグラフ質量分析方法は、試料中の各成分をクロマトグラフにより時間方向に分離した後に、質量分析計により各成分由来のイオンを質量電荷比に応じて分離して検出する方法であって、
a)複数の生体試料の各々に、該生体試料に含まれる所定の生体内代謝産物を同位体で標識した安定同位体試薬を少なくとも１種添加し、クロマトグラフ質量分析のための所定の前処理を行うことにより、複数の分析用生体試料を準備する第１準備工程と、
b)標準試料に前記分析用生体試料に添加されたものと同じ安定同位体試薬を添加し、前記生体試料と同じ前処理を行うことにより分析用標準試料を準備する第２準備工程と、
c)前記複数の分析用生体試料を一組として、まとめて分析する第１分析工程と、
d)前記複数の分析用生体試料の分析の前及び後に、前記分析用標準試料を分析する第２分析工程と、
e)前記分析用標準試料と前記複数の分析用生体試料をそれぞれ分析することにより得られたデータに基づいて作成されるマススペクトルから、前記分析用標準試料と各分析用生体試料に含まれる前記安定同位体試薬に対応するピーク強度を求めるとともに、複数の分析用生体試料に含まれる前記安定同位体試薬のうち少なくとも１種に対応するピーク強度の中央値又は平均値を求め、各分析用生体試料に含まれる前記安定同位体試薬に対応するピーク強度が、前記中央値又は前記平均値を中心とする所定範囲内にあるか否かに基づき、各生体試料の質及び前記第１準備工程を評価する第１評価工程と、
f)前記複数の分析用生体試料の分析の前及び後に、前記分析用標準試料を分析することにより得られたデータに基づいて作成されるマススペクトルにより、前記前処理の質及び／又は分析の質を評価する第２評価工程と
を備えることを特徴とする。
【００１３】
また、上記課題を解決するために成された本発明の第２態様に係るクロマトグラフ質量分析方法は、試料中の各成分をクロマトグラフにより時間方向に分離した後に、質量分析計により各成分由来のイオンを質量電荷比に応じて分離して検出する方法であって、
a)複数の生体試料の各々に、該生体試料に含まれる所定の生体内代謝産物を同位体で標識した安定同位体試薬を少なくとも１種添加し、クロマトグラフ質量分析のための所定の前処理を行うことにより、複数の分析用生体試料を準備する第１準備工程と、
b)標準試料に前記分析用生体試料に添加されたものと同じ安定同位体試薬を添加し、前記生体試料と同じ前処理を行うことにより分析用標準試料を準備する第２準備工程と、
c)前記複数の分析用生体試料を一組として、まとめて分析する第１分析工程と、
d)前記複数の分析用生体試料の分析の前及び後に、前記分析用標準試料を分析する第２分析工程と、
e)前記複数の分析用生体試料をそれぞれ分析することにより得られたデータに基づいて作成されるマススペクトルに、各分析用生体試料に含まれる前記安定同位体試薬に対応するイオンのピークが現れているか否かに基づき、各生体試料の質を評価する第１評価工程と、
f)前記複数の分析用生体試料の分析の前及び後に、前記分析用標準試料を分析することにより得られたデータに基づいて作成されるマススペクトルにより、前記前処理の質及び／又は分析の質を評価する第２評価工程と
を備えることを特徴とする。
【００１４】
ここで、クロマトグラフは、例えばガスクロマトグラフや液体クロマトグラフである。
また、質量分析計は、一般的なシングルタイプの質量分析計のほか、トリプル四重極型質量分析計、Ｑ−ＴＯＦ型質量分析計、ＴＯＦ−ＴＯＦ型質量分析計、イオントラップ質量分析計、イオントラップ飛行時間型質量分析計などを用いることができる。トリプル四重極型質量分析計、Ｑ−ＴＯＦ型質量分析計、ＴＯＦ−ＴＯＦ型質量分析計、イオントラップ質量分析計、イオントラップ飛行時間型質量分析計などは、分析対象物以外の夾雑物を多く含む試料であっても高感度な分析が可能であり、分析安定性が向上するため、本発明に係るクロマトグラフ質量分析方法に用いられる装置として好適である。
【００１５】
また、標準試料とは、生体試料に含まれる複数種の成分が、それらの含有量が標準的な値となるように調整された試料である。生体試料が血漿や血清の場合、市販されているものを使用することができる。
【００１６】
本発明に係る質量分析方法において、安定同位体試薬とは、生体試料に含まれる生体内代謝産物として知られている物質を構成するいくつかの原子をその原子の安定同位体元素で置き換えたものをいう。安定同位体試薬としては、１３Ｃ３-乳酸、１３Ｃ２-シュウ酸、２Ｈ３-サルコシン、２Ｈ８-バリン、１３Ｃ３-ジヒドロキシアセトン、２Ｈ１０-イソロイシン、１３Ｃ４-フマル酸、１３Ｃ４-リンゴ酸、２Ｈ３-アスパラギン酸、１３Ｃ５-グルタミン酸、１３Ｃ６-４−ヒドロキシ安息香酸、２Ｈ３-ラウリン酸、１３Ｃ５-リボース、１３Ｃ２-タウリン、２Ｈ４-クエン酸、２Ｈ７-オルニチン、１３Ｃ６-チロシン、１３Ｃ6-dopa、２Ｈ６-キヌレニン、２Ｈ８-シスタミン、１３Ｃ１１-トリプトファン、２Ｈ３-２−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。生体試料に添加する安定同位体試薬は１種類でも良く複数種類でも良い。添加する安定同位体試薬の種類や数は、分析対象となる生体試料の種類、該生体試料に含まれる生体内代謝産物のうち解析対象となる生体内代謝産物の種類や数に応じて決定される。生体内代謝産物は、被検者から生体試料を採取する際に行われる様々な処理（例えば生体試料が血清や血漿の場合は抗凝結剤の混合、遠心分離、冷蔵保存等）、及びクロマトグラフ質量分析のための前処理（除タンパク質処理、オキシム化等）の条件や手順等の違いによって、その含有量が変動し易い。本発明においては、このような安定同位体試薬を少なくとも１種、添加された分析用生体試料を複数準備し、これら複数の分析用生体試料を一組としてまとめて分析する。「まとめて分析する」とは、複数の分析用生体試料を並行して分析する場合、連続的に分析する場合のいずれの場合をも含む。一組の分析用生体試料は、同じグループに属する被検者から採取された複数の生体試料から構成されていても良く、異なるグループに属する被検者から採取された複数の生体試料から構成されていても良い。
【００１７】
さらに、本発明においては、一組の分析用生体試料をまとめて分析する前、及び分析した後のそれぞれにおいて、前記分析用生体試料に添加されたものと同じ安定同位体試薬が添加された分析用標準試料、及び装置評価用試料を分析する。つまり、本発明では、前記分析用標準試料及び前記装置評価用試料の分析、一組の生体試料の分析、前記分析用標準試料及び前記装置評価用試料の分析、から成る一連の処理が連続して実行される。ただし、複数の分析用生体試料から成る組が複数あり、これら複数組の分析用生体試料を連続して分析する場合は、或る一組の生体試料の分析と、次の一組の生体試料の分析の間に、前記分析用標準試料及び前記装置評価用試料の分析を１回だけ行うようにしても良い。この場合、前記分析用標準試料及び前記装置評価用試料の分析は、或る一組の生体試料の分析からみると「後の分析」となり、次の一組の生体試料からみると「前の分析」となる。また、複数の分析用生体試料から成る組が複数あり、これら複数組の分析用生体試料を連続して分析する場合は、最初の組の生体試料の分析の前と、最後の組の生体試料の分析の後に、前記分析用標準試料及び前記装置評価用試料の分析を１回だけ行うようにしても良い。この場合、最初の組の生体試料の分析の「前」と最後の組の生体試料の分析の「後」の前記分析用標準試料及び前記装置評価用試料の分析は、全ての組の生体試料の分析からみてそれぞれ「前の分析」と「後の分析」となる。
【００１８】
本発明の第１態様に係るクロマトグラフ質量分析方法においては、前記分析用標準試料と前記一組の分析用生体試料をまとめて分析することにより得られた各データに基づきマススペクトルを作成し、該マススペクトルから、前記分析用標準試料と各分析用生体試料に含まれる前記安定同位体試薬に対応するピーク強度を求める。生体試料は個体差が大きく、同じグループの被検者から採取されたものであっても、それら分析のデータには所定の範囲の揺らぎが生じる。そこで、本発明の第１態様では、第１評価工程において、一組の分析用生体試料の各々のデータから求められた安定同位体試薬に対応するピーク強度の値が、一組の分析用生体試料の安定同位体試薬に対応するピーク強度の中央値又は平均値を中心とする所定範囲から外れている場合は、その生体試料自身、或いはその生体試料に対して行われた処理及び前処理等に問題があり、個体差の揺らぎの範囲を超えるような大きな変動が生じる可能性がある（つまり、生体試料の質、及び／又は上述した第１準備工程の質が低い）と評価する。
【００１９】
また、そもそも生体試料に問題がある場合には、その生体試料に対応する分析用生体試料のマススペクトルに現れるはずのピーク（つまり分析用生体試料に含まれ安定同位体試薬に対応するイオンのピーク）が現れない。そこで、本発明の第２態様では第１評価工程において、前記複数の分析用生体試料をまとめて分析することにより得られた各データに基づき該分析用生体試料のマススペクトルを作成し、該マススペクトルに、各分析用生体試料に含まれる前記安定同位体試薬に対応するイオンのピークが現れているか否かに基づき、各生体試料の質を評価する。
【００２０】
なお、本発明の第１態様及び第２態様においては、分析用生体試料の各々に、生体内に含まれない内部標準試薬が含まれていても良い。
この構成においては、本発明の第１態様では、第１評価工程において、一組の分析用生体試料の各々のデータから求められた安定同位体試薬に対応するピーク強度の値が、一組の分析用生体試料の内部標準試薬又は安定同位体試薬に対応するピーク強度の中央値又は平均値を中心とする所定範囲から外れている場合は、その生体試料自身、或いはその生体試料に対して行われた処理及び前処理等に問題があり、個体差の揺らぎの範囲を超えるような大きな変動が生じる可能性がある（つまり、生体試料の質、及び／又は上述した第１準備工程の質が低い）と評価する。また、第２態様では、第１評価工程において、前記複数の分析用生体試料をまとめて分析することにより得られた各データに基づき該分析用生体試料のマススペクトルを作成し、該マススペクトルに、各分析用生体試料に含まれる前記内部標準試薬又は前記安定同位体試薬に対応するイオンのピークが現れているか否かに基づき、各生体試料の質を評価する。
【００２１】
また、本発明の第１態様及び第２態様のいずれにおいても、第２評価工程では、一組の分析用生体試料の分析の前及び後に前記分析用標準試料を分析することにより得られたデータに基づいて作成されるマススペクトルから、前処理の質及び／又は分析の質を評価する。
【００２２】
さらに、本発明においては、複数の分析用生体試料の分析の前及び後に装置評価用試料を分析する第３分析工程と、前記複数の分析用生体試料の分析の前及び後に装置評価用試料を分析することにより得られたデータに基づいて作成されるマスクロマトグラム又はマススペクトルにより、分析に用いられたクロマトグラフ又は質量分析計の異常を評価する第３評価工程を備えると良い。分析用生体試料は、分析用標準試料と同じ前処理が行われているため、前処理の質が低いと評価された場合、或いはクロマトグラフ又は質量分析計に異常があると評価された場合は、一組の生体試料のデータに問題があると推測することができる。
【００２３】
本発明においては、前記分析用生体試料及び前記分析用標準試料には、前記安定同位体試薬として、１３Ｃ６-４−ヒドロキシ安息香酸が添加されていることが好ましい。１３Ｃ６-４−ヒドロキシ安息香酸は、生体試料の状態に影響を受けにくいため、安定同位体試薬に対応するピーク強度から前処理の異常を感度良く評価することができる。
【００２４】
また、一組の分析用生体試料の分析の前後に分析された分析用標準試料のデータに基づいて作成されるマススペクトルを比較し、両マススペクトルに所定以上の差異が見られる場合は、前処理の手順や条件、質に問題があると評価することができる。
【００２５】
さらに、一組の分析用生体試料の分析の前後に装置評価用試料を分析し、これにより得られたデータに基づいて作成されるマスクロマトグラム又はマススペクトルを比較することにより、クロマトグラフ又は質量分析計の異常を評価することができる。ここで、装置評価用試料としては、炭素数が７〜３３のノルマルアルカンから選択される複数種を含む溶液、又はオクタフルオロナフタレン溶液を含む溶液を採用することができる。前者を用いることにより、クロマトグラフのカラムの異常を評価することができ、後者を用いることにより、質量分析計の異常を評価することができる。
【００２６】
また、本発明の対象にはクロマトグラフ質量分析装置が含まれる。
すなわち、本発明の第１態様に係る質量分析装置は、試料中の各成分を時間方向に分離するクロマトグラフと、該クロマトグラフにより時間方向に分離された成分由来のイオンを質量電荷比に応じて分離して検出する質量分析計とを組み合わせたクロマトグラフ質量分析装置であって、
a)複数の生体試料の各々に、該生体試料に含まれる所定の生体内代謝産物を同位体で標識した安定同位体試薬を少なくとも１種添加し、クロマトグラフ質量分析のための所定の前処理を行うことにより準備された複数の分析用生体試料を一組としてまとめて分析する手順と、標準試料に、前記分析用生体試料に添加されたものと同じ安定同位体試薬を添加し、前記分析用生体試料と同じ前処理を行うことにより準備された分析用標準試料を、前記複数の分析用生体試料の分析の前及び後に分析する手順と、前記複数の分析用生体試料の分析の前及び後に装置評価用試料を分析する手順とからなる分析メソッドファイルを記憶するメソッドファイル記憶部と、
b)前記メソッドファイル記憶部に記憶されている前記分析メソッドファイル中の手順に従い分析を実行する分析実行部と、
c)前記質量分析計により得られたデータに基づいてマスクロマトグラム及びマススペクトルを作成するグラフ作成部と、
d)前記グラフ作成部によって作成された、前記分析用標準試料と前記複数の分析用生体試料のマススペクトルから、前記分析用標準試料と各分析用生体試料に含まれる前記安定同位体試薬に対応するピーク強度を求めるとともに、複数の分析用生体試料に含まれる前記安定同位体試薬の少なくとも１種に対応するピーク強度の中央値又は平均値を求め、各分析用生体試料に含まれる前記安定同位体試薬に対応するピーク強度が、前記中央値又は前記平均値を中心とする所定範囲内にあるか否かに基づき、生体試料の質、及び前記分析実行部が実行する前記複数の分析用生体試料の分析を評価する第１評価部と、
e)前記グラフ作成部によって作成された、前記複数の分析用生体試料の分析の前及び後に分析された前記分析用標準試料のマススペクトルを比較することにより、前記前処理及び／又は分析の質を評価する第２評価部とを備えることを特徴としている。
【００２７】
また、本発明の第２態様に係る質量分析装置は、試料中の各成分を時間方向に分離するクロマトグラフと、該クロマトグラフにより時間方向に分離された成分由来のイオンを質量電荷比に応じて分離して検出する質量分析計とを組み合わせたクロマトグラフ質量分析装置であって、
a)複数の生体試料に、該生体試料に含まれる所定の生体内代謝産物を同位体で標識した安定同位体試薬を少なくとも１種添加し、クロマトグラフ質量分析のための所定の前処理を行うことにより準備された複数の分析用生体試料を一組としてまとめて分析する手順と、標準試料に、前記分析用生体試料に添加されたものと同じ安定同位体試薬を添加し、前記分析用生体試料と同じ前処理を行うことにより準備された分析用標準試料を、前記複数の分析用生体試料の分析の前及び後に分析する手順と、前記複数の分析用生体試料の分析の前及び後に装置評価用試料を分析する手順とからなる分析メソッドファイルを記憶するメソッドファイル記憶部と、
b)前記メソッドファイル記憶部に記憶されている前記分析メソッドファイル中の手順に従い分析を実行する分析実行部と、
c)前記質量分析計により得られたデータに基づいてマスクロマトグラム及びマススペクトルを作成するグラフ作成部と、
d)前記グラフ作成部によって作成された、前記複数の分析用生体試料のマススペクトルから、各分析用生体試料に含まれる前記安定同位体試薬に対応するイオンのピークが検出されているか否かに基づき、各生体試料の質を評価する第１評価部と
e)前記グラフ作成部によって作成された、前記複数の分析用生体試料の分析の前及び後に分析された前記分析用標準試料のマススペクトルから、前記前処理の質及び／又は分析の質を評価する第２評価部とを備えることを特徴としている。
【発明の効果】
【００２８】
上述したように、本発明では、生体試料及び標準試料の各々に安定同位体試薬の少なくとも１種を添加して分析用生体試料及び分析用標準試料を準備し、複数の分析用生体試料からなる一組の分析用生体試料のデータを用いて生体試料の質を評価し、一組の分析用試料の分析の前後に行われる、分析用標準試料のデータを用いて各組の分析用試料の前処理及び／又は分析の質を評価するようにしたため、生体試料に対してクロマトグラフ質量分析を行うことにより得られるデータの質を総合的に評価することができる。また、複数の分析用試料の分析の前後に装置用評価試料を分析するようにすれば、該装置評価用試料の分析データに基づいて作成されるマスクロマトグラム又はマススペクトルにより分析に用いられたクロマトグラフ又は質量分析計の異常を評価することができ、より一層、生体試料に対してクロマトグラフ質量分析を行うことにより得られるデータの質を総合的に評価することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本発明の一実施形態に係るガスクロマトグラフ質量分析装置の概略構成図。
【図２】表示部の表示画面の一例を示す図。
【図３】各バッチの分析スケジュールの一例を示す図。
【図４】本発明の実施例において用いられた、検体数及びその内訳を示す図。
【図５】分析用標準血漿の分析結果に基づき作成されたマスクロマトグラムから得られた、安定同位体試薬である１３Ｃ６-４−ヒドロキシ安息香酸及び内部標準である２ＩＰＭＡのピーク面積比を示すグラフ。
【図６】分析用血漿の分析結果に基づき作成されたマスクロマトグラムから得られた、安定同位体試薬である１３Ｃ６-４−ヒドロキシ安息香酸及び内部標準である２ＩＰＭＡのピーク面積比を示すグラフ。
【図７】本発明の実施例に用いられた検体数及びその内訳と、質が高いと評価された検体数及びその内訳を示す図。
【図８Ａ】質が高いと評価された検体のデータから求められた各検体に含まれる６４成分の面積比を示す図（その１）。
【図８Ｂ】質が高いと評価された検体のデータから求められた各検体に含まれる６４成分の面積比を示す図（その２）。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明に係るクロマトグラフ質量分析方法及び装置を適用したガスクロマトグラフ質量分析方法及び装置の一実施形態について、添付図面を参照して説明する。
図１に示すように、本実施形態に係るガスクロマトグラフ質量分析装置（ＧＣ−ＭＳ）は、試料気化室１０、インジェクタ１１、カラム１２、及びカラム１２を内装するカラムオーブン１３を含むＧＣ部１と、イオン源２０、四重極マスフィルタ２１、及びイオン検出器２２を含むＭＳ部２と、を備え、イオン検出器２２による検出信号がアナログデジタル変換器（ＡＤＣ）３でデジタルデータに変換されてデータ処理部４に入力される。
【００３１】
ＧＣ部１においては、ヘリウム等のキャリアガスが一定流量で試料気化室１０を経てカラム１２に供給される。図示しない制御部の指示により所定のタイミングでインジェクタ１１から試料気化室１０に微量の試料が注入されると、該試料は瞬時に気化し、キャリアガス流に乗ってカラム１２に導入される。そして、カラムオーブン１３により温調されたカラム１２を通過する間に、試料に含まれる各種成分は分離され、時間的にずれてカラム１２の出口から流出する。
【００３２】
カラム１２から流出する試料ガスはＭＳ部２においてイオン源２０に導入され、試料ガスに含まれる成分分子は例えば電子イオン化法によりイオン化される。生成されたイオンは四重極マスフィルタ２１に導入され、四重極マスフィルタ２１に印加される電圧に応じた特定の質量電荷比m/zを持つイオンのみが選択的に通過してイオン検出器２２に到達する。図示しない四重極駆動部は四重極マスフィルタ２１への印加電圧を所定電圧範囲で繰り返し走査することで、所定の質量電荷比範囲に亘る質量走査を行う。これにより、ＭＳ部２では、時間経過に伴って順次導入される試料ガスに対し所定の質量電荷比範囲のスキャン測定が実行され、ＡＤＣ３を通してデータ処理部４には、質量電荷比、時間、信号強度をディメンジョンとするデータが入力される。
【００３３】
データ処理部４は、機能ブロックとして、データ収集部４１、成分抽出部４２、成分記憶部４３、グラフ作成部４４、評価処理部４５、結果表示処理部４６等を備える。グラフ作成部４４は、質量電荷比、時間、信号強度をディメンジョンとするデータに基づきマススペクトル及びマスクロマトグラムを作成する。データ処理部４には、実測データ記憶部５、分析情報記憶部６、入力部７、及び表示部８が接続されている。
【００３４】
分析情報記憶部６は、メソッドファイルを記憶するメソッドファイル記憶部６１と、バッチファイルを記憶するバッチファイル記憶部６２と、試料に含まれる全ての目的成分について、保持時間、標準マススペクトル、特徴的な質量電荷比（例えば定量イオン及び確認イオンの質量電荷比）、試料の質等を評価するために用いられる情報（安定同位体試薬由来の検出イオンや、装置評価用試料に含まれる基準化合物由来の検出イオン等の質量電荷比及び／又は保持時間、試料や装置自身を評価するためのパスピーク強度閾値など）が格納された評価情報記憶部６３と、分析結果データベース６４と、評価結果データベース６５等を備えている。
【００３５】
バッチファイル記憶部６２に記憶されているバッチファイルは、連続的に実行される複数の試料の分析について該試料が収容されたバイアルのＩＤと分析に適用するメソッドファイルとが記述されたファイルから成る。バッチファイルは、これに記述される、バイアルのＩＤやメソッドファイルの種類等をユーザが入力部６を介して入力することにより図示しない制御部が作成するようにしても良く、分析に供される試料が収容されたバイアルがＧＣ−ＭＳにセットされると、該バイアルに付与されたＩＤが読み取られ、制御部が自動的に作成するようにしても良い。後述するように、本実施形態に係るＧＣ−ＭＳでは、１又は２種類の装置評価用試料、１個の標準生体試料、複数の生体試料の分析を１バッチとして、これら複数の試料を連続的に実行する。メソッドファイルには、分析に用いられるＧＣ部１の試料気化室１０の温度、カラムオーブン１３の温度、カラム１２の径及び長さ、固定相の種類及び粒子径、移動相の種類及び流量、ＭＳ部２のイオン源２０の温度、イオン検出器２２の種類、質量電荷比の範囲、等が含まれる。
【００３６】
データ収集部４１は、分析の実行に伴って上述したように入力されるデータを収集して実測データ記憶部５に格納する。測定終了後に、入力部７を介してデータ評価処理（目的の定量処理）の実行の指示を受けると、評価処理部４５は実測データ記憶部５から装置評価用試料、標準試料、生体試料の実測データを読み出すとともに、評価情報記憶部６３からデータの評価に関する情報を読み出し、各バッチの分析データに基づいて、後述する特徴的な評価処理を実行する。評価処理部４５が、本発明の第１〜第３評価部に相当する。また、結果表示処理部４５はその評価処理の結果を評価結果データベース６５に格納するとともに該評価結果を表示部８に表示する。成分抽出部４２は、生体試料に含まれる目的成分について、定量イオン又は確認イオンの質量電荷比におけるマスクロマトグラムに基づいて、該成分の定量を行い、結果表示処理部４６はその定量分析結果を表示部８に表示する。
【００３７】
図２は表示部８の表示画面の一例を示している。表示画面８１には、各試料（検体）のＩＤ、装置評価用試料に基づく評価結果、安定同位体試薬のピーク面積等を記述したテーブル８２、各試料のデータに基づき作成されたグラフ８３が表示される。
【００３８】
データ処理部４及び図示しない制御部の実体はパーソナルコンピュータ又はそれよりも高性能なコンピュータであり、該コンピュータに予めインストールされた専用の制御・処理ソフトウェアをコンピュータ上で動作させることにより、データ処理部４の各機能を実現するものとすることができる。また、実測データ記憶部５や分析情報記憶部６は、コンピュータに内蔵された又は接続されたハードウェアによるものでなくてよく、例えばインターネット等を介してアクセス可能であるコンピュータシステム上に存在する、つまりはクラウドコンピューティングにおける記憶装置などを利用してもよい。
【００３９】
次に、本実施例のＧＣ−ＭＳにおける特徴的な動作を説明する。ここでは、大腸がんのバイオマーカーの探索のための差異解析に用いられるデータの取得を目的とした、生体試料（血漿）の分析を例に挙げて説明する。
【００４０】
＜１  生体試料の準備＞
＜１．１  生体試料の採取場所＞
大腸がん患者の血漿：国立がん研究センター中央病院（東京都中央区）
健常者の血漿：国立がん研究センター社会と健康研究センター（旧がん予防・検診研究センター）（東京都中央区）
【００４１】
＜１．２  健常者の条件＞
適格条件：（１）４０歳以上、（２）大腸内視鏡の結果、異常がみられなかったこと。
除外基準：（１）大腸ポリープ、大腸がん、炎症性腸疾患（ＩＢＤ：Inflammatory Bowel Disease）のいずれか１又は複数の既往歴があること、（２）過去１０年以内に大腸がん以外の進行がんの既往歴があること、（３）血縁者に家族性大腸がん患者がいること、（４）不完全内視鏡症例であること。
＜１．３  大腸がん患者の条件＞
病理診断等によってステージ０からステージ２までの大腸がんであることが判明していること。
【００４２】
＜１．４  分析用血漿の調製＞
大腸がん患者の血漿：被検者から採取した血液にEDTA-2Naを加え、15-30分間室温で放置した後、4℃で冷蔵した。その後、採血から24時間以内に遠心分離（10分間、3000rpm）して、血漿を得た。
健常者の血漿：被検者から採取した血液にEDTA-2Naを加え、30分程室温で放置した後、4℃で冷蔵した。その後、採血から１〜６時間以内に遠心分離（10分間、3000rpm）して、血漿を得た。
大腸がん患者及び健常者のそれぞれから得られた血漿に対して、以下の２２種の安定同位体試薬のうちの１種又は複数種を最適量添加するとともに、内部標準として0.5mg/mLの2−イソプロピルリンゴ酸溶液（２ＩＰＭＡ）を添加して、分析用血漿（本発明の分析用生体試料に相当）を調製した。
安定同位体試薬：１３Ｃ３-乳酸、１３Ｃ２-シュウ酸、２Ｈ３-サルコシン、２Ｈ８-バリン、１３Ｃ３-ジヒドロキシアセトン、２Ｈ１０-イソロイシン、１３Ｃ４-フマル酸、１３Ｃ４-リンゴ酸、２Ｈ３-アスパラギン酸、１３Ｃ５-グルタミン酸、１３Ｃ６-４−ヒドロキシ安息香酸、２Ｈ３-ラウリン酸、１３Ｃ５-リボース、１３Ｃ２-タウリン、２Ｈ４-クエン酸、２Ｈ７-オルニチン、１３Ｃ６-チロシン、１３Ｃ6-dopa、２Ｈ６-キヌレニン、２Ｈ８-シスタミン、１３Ｃ１１-トリプトファン、２Ｈ３-２−ヒドロキシ酪酸
また、市販の標準血漿（コージンバイオ株式会社）に対しても、分析用血漿に添加した安定同位体試薬と同じものを最適量添加して分析用標準血漿（本発明の分析用標準試料に相当）を調製した。
【００４３】
＜１．５  分析用血漿、及び分析用標準血漿の前処理＞
分析用血漿及び分析用標準血漿に対して、メタノール抽出による除タンパク質処理、上清の濃縮乾固処理、ピリジンに溶解した20mg/mLのメチルヒドロキシアミン塩酸塩によるオキシム化処理を行った。
【００４４】
＜２  ＧＣ−ＭＳによる分析＞
図３に分析スケジュールを示す。図３において、「nアルカン」は、炭素数が７〜３３の２７種のノルマルアルカンを含む混合溶液を示し、「ＯＦＮ」は100pg/μLのオクタフルオロナフタレン溶液を示す。これらは本発明の装置評価用試料に相当する。また、「ＱＣ」は２２種の安定同位体試薬が添加された分析用標準血漿を示す。図３に示すように、nアルカン、ＯＦＮ、ＱＣ、及び複数の分析用血漿からなる４種の試料を順次分析するとともに、４種の試料の分析サイクルを１バッチとして、複数バッチの分析を繰り返し行った。４種の試料の一連の分析は、バッチファイル記憶部６２に記憶されているバッチファイルに記述されているメソッドファイルに従って行われた。
【００４５】
＜３  評価基準＞
評価処理部４５は、各バッチの分析結果に基づき作成されるマススペクトル及びマスクロマトグラフから、以下に示す評価基準に従って一組の分析用血漿のデータの質を評価した。
＜３．１  分析用血漿のデータの除外基準＞
（１）一組の分析用血漿の各々の分析結果に基づき作成されたマススペクトルにおいて、所定の内部標準試薬（例えば２-イソプロピルリンゴ酸）、１種又は複数種の安定同位体試薬（例えば、１３Ｃ６-４−ヒドロキシ安息香酸）に対応するイオンのピーク強度が、一組の分析用血漿のデータのうち中央の４個のデータの平均値の±５０％の範囲から外れていること。
（２）一組の分析用血漿の各々の分析結果に基づき作成されたマススペクトルにおいて、分析用血漿に添加されている安定同位体試薬に対応するイオンのピークが検出されないこと。
（３）１バッチの分析が途中で停止したこと。
（４）或るバッチの一組の分析用血漿の分析の前及び後に行われた、分析用標準血漿の分析結果に基づき作成されたマスクロマトグラフから求められる安定同位体試薬のピーク強度が所定の範囲からはずれていること。
（５）或るバッチの一組の分析用血漿の分析の前及び後に行われた、nアルカンの分析結果に基づき作成されたマスクロマトグラフから求められる、炭素数が同じnアルカンの保持時間の差が１．５秒以上あること。
（６）或るバッチの一組の分析用血漿の分析の前及び後に行われた、ＯＦＮの分析結果に基づき作成される、所定の保持時間のマススペクトルに現れるピーク強度が所定の範囲からはずれていること。
【００４６】
一組の分析用血漿のデータの中に（１）、（２）の条件を満たすデータある場合は、その分析用血漿のデータを解析対象データから除外する。一方、（３）〜（６）の条件を満たす場合は、一組の分析用血漿のデータ全てを解析対象データから除外する。
【実施例】
【００４７】
次に、７２９人の被検者から採取した血漿を、上述した方法で調製することにより得られた分析用血漿のデータの、大腸がん患者と健常者の間の差異解析を行うために、各データを評価した結果について以下に説明する。図４に示すように、７２９人の被検者の内訳は、大腸がん患者：３６５人（ステージ０：９５人、ステージ１：１３５人、ステージ２：１３５人）、健常者：３６４人から成る。また、７２９人の被検者から採取された血漿とともに分析を行った標準血漿の数（ＱＣ数）は、６９である。
【００４８】
表１に、７２９個の分析用血漿のバッチ構成及び分析スケジュールを示す。表１には、分析用血漿（検体）及び分析用標準血漿（ＱＣ）のみ示しているが、１つのバッチ分析には、装置評価用試料（nアルカン、ＯＦＮ）の分析が含まれる。例えばステージ２の大腸がん患者１３５人分の分析用血漿は、健常者１３５人分の析用血漿と合わせて２７組に分け、これら２７組の分析用血漿を、それぞれ装置評価用試料（nアルカン、ＯＦＮ）、分析用標準血漿（ＱＣ）とともにバッチ分析した。
【表１】
2018169377.tif 000003
【００４９】
図５（ａ）及び（ｂ）に、７３個の分析用標準血漿の分析結果に基づき作成されたマスクロマトグラムから得られた、安定同位体試薬である１３Ｃ６-４−ヒドロキシ安息香酸及び内部標準である２ＩＰＭＡのピーク面積比を示す。また、図６（ａ）及び（ｂ）に、７２９個の分析用血漿の分析結果に基づき作成されたマスクロマトグラムから得られた、１３Ｃ６-４−ヒドロキシ安息香酸及び２ＩＰＭＡのピーク面積比を示す。図５及び図６において、横軸は試料の測定順を示す数値を、縦軸は面積比を表している。
【００５０】
図５及び図６に示す結果は、一連の分析動作の途中で、以下の（１）〜（５）に示すＧＣ−ＭＳの動作不良が生じたときに得られた結果である。図６（ｂ）に、ＧＣ−ＭＳに動作不良が生じたタイミングを示す。
（１）セプタム・インサートの劣化、
（２）セプタム・インサートの交換直後の分析、
（３）２ＩＰＭＡの再調整
（４）アルゴンガスの欠乏
（５）真空中断後の分析。  
図５及び図６から、いずれの動作不良によっても検出結果（面積比）が変動し、且つ、分析用標準血漿及び分析用血漿の検出結果に同じような変動をもたらすことが分かる。また、（４）の動作不良の場合は、検出不能となることが分かる。
【００５１】
図７に、表１に示すバッチ分析の結果と上述した評価基準に基づいて、分析用血漿の質を評価した結果を示す。図７において、スラッシュ（／）の右側の数字が検体数、左側の数字は、質が高いと評価された検体数を示す。例えば、ステージ０の分析用血漿は、１９０検体のうち１５３検体は質が高いと評価され、３７検体は質が低いと評価されたことを示す。
【００５２】
本実施例では、質が高いと評価された検体（分析用血漿）のデータのみを用いて、大腸がんと健常者の間の差異解析を行った。差異解析には、分析用血漿に含まれる６４の成分の量を用いた。図８に、１バッチ分のデータの例を示す。図８において、成分の末尾に（SI比）と記載されているものは、その成分と同じ構造を持つ、検体に含まれる安定同位体試薬で補正された数値であることを示しており、それ以外の成分は内部標準で補正された数値であることを示している。生体試料の評価のために該生体試料に添加された安定同位体試薬は、生体試料に含まれる生体内代謝産物を同位体で標識したものであり、その含有量が既知であるため、安定同位体試薬の検出値を使って、該安定同位体試薬と同じ構造を持つ成分の検出値の補正に利用することができる。
【００５３】
なお、本発明は上記した実施形態に限定されるものでなく、本発明の趣旨の範囲内において適宜の変更、変形が可能である。
例えば上記実施形態では、上述した２２種の安定同位体試薬を全て生体試料（血漿）に添加して分析用生体試料としたが、これら２２種の安定同位体試薬の少なくとも１種を添加しても良く、また、上述した安定同位体試薬以外の試薬を添加しても良い。さらに、安定同位体試薬は上記実施形態で用いた２２種に限定されるものではなく、測定対象となる生体試料の種類に応じた適宜の生体内代謝産物（すなわち、生体試料に含まれる生体内代謝産物や該生体内代謝産物と特性が類似した物質）を同位体で標識したものを、安定同位体試薬として用いることができる。また、生体試料には、少なくとも、解析対象となる生体内代謝産物の数の安定同位体試薬が添加されていればよい。この場合、生体試料に含まれる生体内代謝産物のうちの２種が解析対象となる場合は、それら２種の生体内代謝産物、又はそれら２種の生体内代謝産物と特性が類似した２種の物質を同位体で標識したものを、安定同位体試薬を生体試料に添加して分析用生体試料とする。
【００５４】
さらに、解析対象となる生体内代謝産物が３種類である場合でも、それら３種の生体内代謝産物の特定が類似する場合は、１種類の安定同位体試薬を生体試料に添加して分析用生体試料としても良い。
【符号の説明】
【００５５】
１…ＧＣ部
１２…カラム
２…ＭＳ部
２０…イオン源
２１…四重極マスフィルタ
２２…イオン検出器
３…Ａ／Ｄ変換器
４…データ処理部
４１…データ収集部
４２…成分抽出部
４３…成分記憶部
４４…グラフ作成部
４５…評価処理部
４６…結果表示処理部
５…実測データ記憶部
６…分析情報記憶部
６１…メソッドファイル記憶部
６２…バッチファイル記憶部
６３…評価情報記憶部
６４…分析結果データベース
６５…評価結果データベース
７…入力部
８…表示部
【図１】
2018169377.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2018169377.tif 000010
【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
2018169377.tif 000012