(57)【要約】【課題】アルツハイマー病（AD）を診断するためのインビトロ方法を提供すること。【解決手段】a) 脳脊髄液（CSF）のサンプル中のメルカプトアルブミン（HMA）の含有量を決定する工程；及びb) 決定した含有量を、健康な対象のCSF中のHMAの含有量と比較する工程を含む、アルツハイマー病（AD）を診断するためのインビトロ方法を提供することにより、上記課題を解決する。HMA含有量が健康な対象のそれよりも少ない場合、そのことによりADが示される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
a) 脳脊髄液（CSF）のサンプル中のメルカプトアルブミン（HMA）の含有量を決定する工程；及び
b) a)で決定した含有量を、健康な対象のCSF中のHMAの含有量と比較する工程
を含む、アルツハイマー病（AD）を診断するためのインビトロ方法。
【請求項２】
工程b)において、工程a)で決定したHMA含有量が、健康な対象のそれよりも少ない場合、そのことによりADが示されることを特徴とする、請求項１に記載のインビトロ診断方法。
【請求項３】
工程b)において、工程a)で決定したHMA含有量が、健康な対象のそれよりも少ない場合、患者がADと診断されることを特徴とする、請求項２に記載のインビトロ診断方法。
【請求項４】
HMA含有量のカットオフ値が37%であり、前記値未満の場合にADを示しているとみなされる及び/又はADの診断につながることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載のインビトロ診断方法。
【請求項５】
サンプルがヒトに由来することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載のインビトロ診断方法。
【請求項６】
前記ヒトが成人であることを特徴とする、請求項５に記載のインビトロ診断方法。
【請求項７】
a) 患者由来の脳脊髄液（CSF）のサンプル中及び血液又は血漿のサンプル中のメルカプトアルブミン（HMA）の含有量を決定する工程；
b) 工程a)で決定したCSFのサンプル中のHMAの含有量と血液又は血漿のサンプル中のHMAの含有量との差又は比を決定する工程；及び
c) 工程b)で決定した差又は比を、健康な対象における対応する差又は比と比較する工程
を含む、アルツハイマー病（AD）を診断するためのインビトロ方法。
【請求項８】
工程b)において、工程a)で決定したCSFのサンプル中のHMAの含有量と血液又は血漿のサンプル中のHMAの含有量との差が、血漿中のHMA/CSF中のHMAの値の比（HMA血漿/HMA CSF）の形式で決定されることを特徴とする、請求項７に記載のインビトロ診断方法。
【請求項９】
本発明の方法の工程c)において、工程b)で決定した差が健康な対象のそれよりも大きい場合、そのことによりADが示されることを特徴とする、請求項７に記載のインビトロ診断方法。
【請求項１０】
本発明の方法の工程c)において、工程b)で決定した差が健康な対象のそれよりも大きい場合、患者がADと診断されることを特徴とする、請求項９に記載のインビトロ診断方法。
【請求項１１】
（HMA血漿/HMA CSF）比のカットオフ値が1.1であり、前記値より上の場合にADを示しているとみなされる及び/又はADの診断につながることを特徴とする、請求項７〜１０のいずれか一項に記載のインビトロ診断方法。
【請求項１２】
血液又は血漿のサンプルが血漿のサンプルであることを特徴とする、請求項７〜１０のいずれか一項に記載のインビトロ診断方法。
【請求項１３】
サンプルがヒトに由来することを特徴とする、請求項７〜１０のいずれか一項に記載のインビトロ診断方法。
【請求項１４】
前記ヒトが成人であることを特徴とする、請求項１３に記載のインビトロ診断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、臨床診断の分野に関し、特に、脳脊髄液（CSF）中のアルブミンの酸化還元状態、特に遊離チオール基の形態のシステインCys-34を含有する還元型のアルブミンである、メルカプトアルブミン（HMA）の含有量の決定に基づく、アルツハイマー病（AD）を診断するためのインビトロ方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ADは、進行性の神経変性疾患であり、典型的には、神経が死に、脳の様々な領域が委縮することに伴う、短期記憶及び他の知能（例えば高次認知能）の喪失を特徴とする。この疾患は、診断からおよそ10年間の平均持続期間を有することが多いが、前記持続期間は、診断時の疾患の重症度に正比例して変動し得る。
【０００３】
ADは、認知症の最も一般的な形態である；ADは治療不能かつ末期的であり、65歳より上の年齢の人により高い頻度で発生するが、まれな症例においては、40代という早さで発症することもある。
【０００４】
一般的に、初期症状は、新しい記憶を獲得することができないことであるが、これは加齢又はストレスに関連する挙動と混同されがちである。ADが疑われる場合、患者が生きているうちに利用可能な臨床診断手法は、現在まで、National Institute of Neurological Disorders and Stroke-Alzheimer's Disease and Related Disorders Association（国立神経障害・脳卒中研究所-アルツハイマー病・関連障害協会）（NINCDS-ADRDA）により確立された指針及び基準（McKhann et al., 1984）に基づいており、これは主に神経生理学的検査の結果、患者の家族及び友人からの報告、及び全般的な神経学的評価による臨床的見解に基づく。神経学的試験には、脳の画像の試験（神経イメージング）も含めることができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Peters T. J.: All About Albumin; Biochemistry, Genetics, and Medical Applications. Academic Press, San Diego, 1996
【非特許文献２】Edward J. Thompson, 2005, The roster of CSF proteins, PROTEINS OF THE CEREBROSPINAL FLUID: Analysis and Interpretation in the Diagnosis and Treatment of Neurological Disease, 2nd Ed. London, UK: Elsevier Academic Press.: 13-31
【非特許文献３】Otagiri M., Chuang V.T. Pharmaceutically important pre- and posttranslational modifications on human serum albumin. Biol Pharm Bull 2009; 32:527-534
【非特許文献４】Oettl K., et al. Oxidative damage of albumin in advanced liver disease. Biochim Biophys. Acta 2008; 1782: 469-473
【非特許文献５】Oettl K. and Marsche G. Redox State of Human Serum Albumin in Terms of Cysteine-34 in Health and Disease. Methods Enzymol. 2010; 474:181-95
【非特許文献６】Oettl K. et al. Oxidative albumin damage in chronic liver failure: relation to albumin binding capacity; liver dysfunction and survival. J Hepatol, 2013, 59:978-983
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
死後の患者の脳の組織学的解析を別にすれば、現在のところADの確定的診断方法は無い。
【０００７】
しかしながら、ヒトアルブミンが、非グリコシル化された66-kDaのタンパク質であることが知られている。ヒトアルブミンは量的に血液血漿中で最も重要なタンパク質であり、正常血漿中におけるその濃度は35〜50 g/lの間であり、全血漿タンパク質の最大60%を構成する（Peters T. J.: All About Albumin; Biochemistry, Genetics, and Medical Applications. Academic Press, San Diego, 1996）。同様に、また、アルブミンは、CSF中に最も豊富にあるタンパク質でもあり、全タンパク質のおよそ67%を構成し、濃度はおよそ200 mg/Lである（Edward J. Thompson, 2005, The roster of CSF proteins, PROTEINS OF THE CEREBROSPINAL FLUID: Analysis and Interpretation in the Diagnosis and Treatment of Neurological Disease, 2nd Ed. London, UK: Elsevier Academic Press.: 13-31）。
【０００８】
ヒトアルブミンの構造は、585アミノ酸のポリぺプチド、およそ67%のアルファヘリックスから成り、ベータシートを有さない（Otagiri M., Chuang V.T. Pharmaceutically important pre- and posttranslational modifications on human serum albumin. Biol Pharm Bull 2009; 32:527-534）。ヒトアルブミンは、6個のメチオニン残基及び35個のシステイン残基を含有し、後者は17個のジスルフィド結合の形成に関与している。Cys-34は、分子全体で唯一の遊離システインである。ヒトアルブミンは、複数のリガンドに結合する能力及びラジカル捕捉特性（どちらもその構造に密接に関係している）のおかげで、特異的な抗酸化機能を有する。
【０００９】
アルブミンの酸化には多くのとり得る（可能な）形があるが、Cys-34は、酸化/還元に特に感受性が高い部位である。したがって、Cys-34の観点からアルブミンの酸化還元状態を述べるのが一般的に妥当である。アルブミンのクロマトグラフィー分離を用いると、Cys-34の酸化還元状態に応じて3つの画分が得られる（Peters, 1996、上で引用）：
(i) 遊離チオール基の形態のシステインを有する還元形態、ヒトメルカプトアルブミン（HMA）と称される；
(ii) チオール基を含有する低分子化合物、主にシステイン又はシステイニル-グリシンと共にジスルフィド結合を形成しているが、ホモシステイン及びグルタチオンと一緒になっている場合もある、システインを有する酸化形態、ヒト非メルカプトアルブミン-1（HNA1）と称される；及び
(iii) スルフィン酸又はスルホン酸としてのシステインを有する、最も酸化された形態、ヒト非メルカプトアルブミン-2（HNA2）と称される。
【００１０】
健康で健全なヒトでは、血漿中の総アルブミンのおよそ61〜69%がHMAの形態をとり、27〜35%がHNA1の形態をとり、3〜5%がHNA2の形態をとる（Oettl K., et al. Oxidative damage of albumin in advanced liver disease. Biochim Biophys. Acta 2008; 1782: 469-473; Oettl K. and Marsche G. Redox State of Human Serum Albumin in Terms of Cysteine-34 in Health and Disease. Methods Enzymol. 2010; 474:181-95; 及びOettl K. et al. Oxidative albumin damage in chronic liver failure: relation to albumin binding capacity; liver dysfunction and survival. J Hepatol, 2013, 59:978-983）。一般的に、HMA及びHNA1の酸化は可逆的である一方、HNA2の酸化は不可逆的な過程であると考えられている。
【００１１】
アルブミンは、様々な構造的改変を受ける可能性があるが、それは、その形状が改変され、それによってその結合特性及び酸化還元状態が改変されることを意味している（Oettl, K. et al., 2010、上で引用）。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、生きているうちにADと診断された患者において、脳脊髄液（CSF）中の還元型のアルブミン（HMA）の含有量が、同等の年齢範囲の健康な対照の対象よりもはるかに低いという驚くべき発見に基づく。同様に同等の年齢範囲の健康な対照の対象と比較した場合、血液血漿中のHMAの含有量についてはこの現象は観察されなかった。よって、生きているうちにADと診断された患者において、CSF中と血漿中とのHMAレベルの差又は比が、同等の年齢範囲の健康な対照の対象における同じ差と比較して増加していることが発見されたということもいえる。したがって、上述の2つのマーカー、すなわちCSF中のHMAの含有量、及びCSF中と血漿中とのHMAのレベルの差又は比は、ADを診断するのに有用である。
【００１３】
上述のとおり、ADの確定的診断検査は、死亡後に行われなければならず、したがって生きている患者での診断は、神経学的検査の結果、患者の家族及び友人からの報告、及び全般的な神経学的評価による臨床的見解に基づく。したがって、本発明の検査は、客観的で、定量化可能であり、解釈が容易であり、信頼でき、異なる診断施設で再現可能であり、比較的安価であり、また一部の神経心理学的検査で見られるような、患者の教育レベル等の文化的側面の影響を受けない、診断ツールを示す。
【００１４】
本願明細書で用いられる「健康な対象」及びその複数形は、ADに罹患していない対象を指す。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、対照（上で規定した健康な対象）及びADの患者由来の血漿及びCSFのサンプルについて得られた、HMAのピーク高さ（パーセンテージとして）による、HMAの量を示す。縦座標軸（「y」軸）は、HMAのピーク高さ（パーセンテージとして）を示し、横座標軸（「x」軸）は、群（左側に健康な対照、及び右側にAD患者）を示す。加えて、群の各々について、CSFサンプルについて得られた結果を左側に示し、血漿サンプルについて得られた結果を右側に示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
したがって、第一の態様において、本発明は、以下の工程：
a) 患者由来の脳脊髄液（CSF）のサンプル中のメルカプトアルブミン（HMA）の含有量を決定する工程；及び
b) a)で決定した含有量を、健康な対象のCSF中のHMAの含有量と比較する工程
を含む、アルツハイマー病（AD）を診断するためのインビトロ方法に関する。
【００１７】
好ましい実施態様において、本発明の工程b)において、工程a)で決定したHMA含有量が、健康な対象のそれよりも少ない場合、そのことによりADが示される；好ましくは患者がADと診断される。
【００１８】
好ましい実施態様において、上述の患者及び健康な対象の両方が、ヒトであり、好ましくは成人である。
【００１９】
別の好ましい実施態様において、CSF中のHMAの含有量は、Oettl K., 2010（上記参照）により記述される方法論に基づき、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、及びそれぞれ280 nm及び340 nmの励起及び発光波長を用いた蛍光検出（FLD）により測定される。HMAは、対応するクロマトグラムにおいて得られた関連するピークの高さを考慮することにより、定量化される。
【００２０】
カットオフ値は、敏感度及び特異度のパーセンテージを最大値（それぞれ91%及び100%）に調節した後にROC曲線を計算することにより決定され、その値未満では工程a)で測定したHMA含有量が患者においてADを示しているとみなされる及び/又はADの診断につながるが、これは好ましくは37% (w/v)である。
【００２１】
第二の実施態様において、本発明は：
a) 患者由来の脳脊髄液（CSF）のサンプル中及び血液又は血漿のサンプル中のメルカプトアルブミン（HMA）の含有量を決定する工程；
b) 工程a)で決定したCSFのサンプル中のHMAの含有量と血液又は血漿のサンプル中のHMAの含有量との差又は比を決定する工程；及び
c) 工程b)で決定した差又は比を、健康な対象の対応する差又は比と比較する工程
を含む、アルツハイマー病（AD）を診断するためのインビトロ方法に関する。
【００２２】
この第二の実施態様による方法の工程b)において、決定される差は：工程a)で決定したCSFのサンプル中のHMAの含有量と血液又は血漿のサンプル中のHMAの含有量との差；又は工程a)で決定した血液又は血漿のサンプル中のHMAの含有量とCSFのサンプル中のHMAの含有量との差であることが想定される。好ましい実施態様において、工程b)において、工程a)で決定したCSFのサンプル中のHMAの含有量と血液又は血漿のサンプル中のHMAの含有量との差は、比（血漿中のHMAの値/CSF中のHMAの値）の形式で決定される。
【００２３】
工程b)において、差が、工程a)で決定したCSFのサンプル中のHMAの含有量と血液又は血漿のサンプル中のHMAの含有量との間で決定されるとき、好ましい実施態様において、本発明の方法の工程c)において、工程b)で決定した差、例えば血漿中のHMAの値/CSF中のHMAの値の比（HMA血漿/HMA CSF）が、健康な対象のそれよりも大きい場合、そのことによりADが示される；より好ましくは、患者がADと診断される。決定した差が何か他のものである場合、当業者は、（例えば、健康な対照における差の対応する値との比較に関して）本発明の方法への必要な適応操作を行う。
【００２４】
加えて、及び好ましくは、血液又は血漿のサンプルは、血漿のサンプルである。
【００２５】
好ましい実施態様において、上述の患者及び健康な対象の両方が、ヒトであり、好ましくは成人である。
【００２６】
別の好ましい実施態様において、CSF中のHMAの含有量は、Oettl K., 2010（上記参照）により記述される方法論に基づき、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、及びそれぞれ280 nm及び340 nmの励起及び発光波長を用いた蛍光検出（FLD）により測定される。HMAは、対応するクロマトグラムにおいて得られた関連するピークの高さを考慮することにより、定量化される。
【００２７】
カットオフ値は、敏感度及び特異度のパーセンテージを最大値（100%）に調節した後にROC曲線を計算することにより決定され、その値から、工程b)で決定した差、例えば血漿中のHMAの値/CSF中のHMAの値の比（HMA血漿/HMA CSF）が、患者においてADを示している及び/又はADの診断につながるとみなされるが、これは好ましくは1.1である。
【００２８】
理解を助けるために、例として示す添付の図面を参照して、及び例示的だが非限定的な実施例を参照して、本発明を以下により詳細に説明する。
【００２９】
AD患者のCSF中のHMAの含有量が、健康な患者のCSF中のHMAの含有量よりも少ない場合、Cys-34の酸化還元状態によるアルブミンの残りの2つの画分、すなわちHNA1及び/又はHNA2の含有量にも影響が及ぼされ、これらもADを示す役割を果たすことができることは、当業者には明らかである。
【実施例】
【００３０】
実施例１．CSF中のHMAの含有量又は前記含有量と血漿中のHMAの含有量との差を測定することによる、アルツハイマー病の診断の試験
【００３１】
治療用アルブミンを用いて処置されており、軽度〜中程度のADと診断されていた、42名の患者での、多施設、無作為化、盲検、対照を設定した（比較）試験という背景において、本試験を行って、CSF中のHMAの含有量、及び前記含有量と血漿中のHMAの含有量との差を分析した。
【００３２】
このために、上述の患者の、CSF中（N=34）及び血漿中（N=37）の両方において、並びに健康な対象のCSF中（N=16）及び血漿中（N=37）において、ベースラインサンプル中のHMAの含有量を測定した（臨床試験の開始前）。上述のサンプルは、全症例において、CSFの場合は腰椎穿刺により、及び血漿サンプルの場合は採血してその後血漿を分離して取り出すことにより得られ、その目的のために確立された標準的な医療手順に常に従った。
【００３３】
上述のCSF及び血漿のサンプルは、抽出後直ちに分注して-70℃以下の温度で冷凍した。HMAの含有量の分析前に、サンプルを室温で解凍し、血漿サンプルの場合には、アルブミン濃度を免疫比濁法又は他の何らかの同等の方法により決定した。CSFサンプルではHMA含有量を直接測定したが、一方で血漿サンプルは、pH 6.87のリン酸緩衝液中10 mg/mL未満の濃度まで希釈した。次に、酸化型のアルブミンを上述のとおりHPLC-FLDにより分析した。
【００３４】
得られた結果を図１に要約する。前記図から観察されるとおり、ADの患者は、健康な対象と比較してCSF中のHMAの含有量の大幅な減少を示すが、一方で血漿中では減少はそれよりも少し小さい。上記から、CSF中のHMAの含有量の診断可能性だけでなく、前記含有量と血漿中のHMAの含有量との差の診断可能性についても、推論をすることができる。
【００３５】
AD患者に関して、CSF中のHMAの含有量について得られた中央値は9.6%であるが、一方で血漿中の含有量の中央値は54.1%であり、（HMA血漿/HMA CSF）比は5.64である。しかしながら、健康な対象については、CSF中のHMAの含有量の中央値は77.4%であり、血漿中のそれは65.6%であり、（HMA血漿/HMA CSF）比は0.85である。
【図１】
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【外国語明細書】
2018081095000001.pdf