(57)【要約】【課題】細胞の生存率を算出し、算出された細胞の生存率が信頼できるか否かを判定することが可能な細胞生存率判定装置を提供する。【解決手段】  細胞集団が発する自家蛍光のピーク強度を与えるピーク波長と、自家蛍光のピーク強度を与える励起光のピーク波長と、に基づき、細胞集団における細胞の生存率を算出する生存率算出部３０１と、自家蛍光のピーク波長の単位時間あたりのシフト量及びシフト方向と、励起光のピーク波長の単位時間あたりのシフト量及びシフト方向と、に基づき、算出された細胞の生存率が信頼できるか否かを判定する判定部３０２と、を備える、細胞生存率判定装置。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞集団が発する自家蛍光のピーク強度を与えるピーク波長と、前記自家蛍光のピーク強度を与える励起光のピーク波長と、に基づき、前記細胞集団における細胞の生存率を算出する生存率算出部と、
前記自家蛍光のピーク波長の単位時間あたりのシフト量及びシフト方向と、前記励起光のピーク波長の単位時間あたりのシフト量及びシフト方向と、に基づき、前記算出された細胞の生存率が信頼できるか否かを判定する判定部と、
を備える、細胞生存率判定装置。
【請求項２】
前記判定部が、前記自家蛍光の波長及び前記励起光の波長を座標成分とする座標系において、前記自家蛍光のピーク波長の単位時間あたりのシフト量及びシフト方向を表すベクトルと、前記励起光のピーク波長の単位時間あたりのシフト量及びシフト方向を表すベクトルと、の和のベクトルを算出する、請求項１に記載の細胞生存率判定装置。
【請求項３】
前記和のベクトルの大きさが所定の閾値以上であり、前記和のベクトルの方向が所定の範囲内である場合、前記判定部が、前記算出された細胞の生存率を信頼できると判定する、請求項２に記載の細胞生存率判定装置。
【請求項４】
前記和のベクトルの大きさが所定の閾値以上であり、前記和のベクトルの方向が所定の範囲外である場合、前記判定部が、前記算出された細胞の生存率が信頼できないと判定する、請求項２に記載の細胞生存率判定装置。
【請求項５】
前記細胞集団のそれぞれの細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項１から４のいずれか１項に記載の細胞生存率判定装置。
【請求項６】
細胞集団のそれぞれの細胞が発する第１波長帯域の自家蛍光の強度、第２波長帯域の自家蛍光の強度、及び前記細胞集団のそれぞれの細胞で生じる散乱光の強度から選択される少なくとも第１及び第２光強度に基づき、前記細胞集団における細胞の生存率を算出する生存率算出部と、
前記第１光強度の単位時間あたりの変化量及び変化方向と、前記第２光強度の変化量及び変化方向と、に基づき、前記算出された細胞の生存率が信頼できるか否かを判定する判定部と、
を備える、細胞生存率判定装置。
【請求項７】
前記判定部が、前記第１光強度及び前記第２光強度を座標成分とする座標系において、前記第１光強度の単位時間あたりの変化量及び変化方向を表すベクトルと、前記第２光強度の単位時間あたりの変化量及び変化方向を表すベクトルと、の和のベクトルを算出する、請求項６に記載の細胞生存率判定装置。
【請求項８】
前記和のベクトルの大きさが所定の閾値以上であり、前記和のベクトルの方向が所定の範囲内である場合、前記判定部が、前記算出された細胞の生存率を信頼できると判定する、請求項７に記載の細胞生存率判定装置。
【請求項９】
前記和のベクトルの大きさが所定の閾値以上であり、前記和のベクトルの方向が所定の範囲外である場合、前記判定部が、前記算出された細胞の生存率が信頼できないと判定する、請求項７に記載の細胞生存率判定装置。
【請求項１０】
前記細胞集団のそれぞれの細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項６から９のいずれか１項に記載の細胞生存率判定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞培養技術に関し、細胞生存率判定装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオプロセスや細胞培養の分野において、細胞培養の条件を制御するため、及び細胞培養の停止時期を判断するため等に、培養細胞の生死を判定して、生存率が測定される。細胞の生死を判定する方法としては、細胞内の核酸に蛍光色素を結合させ、励起された蛍光の強度により細胞の生死を判定する方法（例えば、特許文献１参照。）が提案されている。また、死細胞の細胞膜を透過し、死細胞の細胞質を青く染色するトリパンブルー染色により、細胞の生死を判定する方法も知られている。
【０００３】
しかし、染色試薬は高価であり、かつ、細胞を染色する工程は煩雑である。また、染色試薬は、人体にとって有害であることが多い。そのため、染色試薬は、管理されて保管される必要がある。また、染色試薬で染色された細胞を、引き続き培養することは困難であり、廃液の処理にも注意する必要がある。ここで、細胞は、自家蛍光を発する（例えば、非特許文献１、２参照。）。そこで、染色試薬を用いることなく、細胞が発する自家蛍光に基づいて、細胞の生死を判定する方法が提案されている（例えば、特許文献２参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第２５９２１１４号公報
【特許文献２】特許第４８６８８７９号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Saskia M. Faassenら、「Fluorescence Spectroscopy and Chemometric Modeling for Bioprocess Monitoring」、Sensors、2015、15、10271-10291
【非特許文献２】M J Millerら、「Evaluation of the BioVigilant IMD-A, A novel optical spectroscopy technology for the continuous and real-time environmental monitoring of viable and nonviable particles. PartI. Review of the Technology and comparative studies with conventional methods」、PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology、2009、vol 63 (3)、245-258
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特許文献２に開示された方法では、細胞の自家蛍光の強度変化により、細胞の生死状態を判定している。しかし、本発明者の知見によれば、細胞の自家蛍光の強度は、細胞の生死状態以外の要因でも変化しうる。そのため、細胞の生死状態以外の要因で細胞の自家蛍光の強度が変化した場合、細胞の生死状態に変化がなかったにもかかわらず、細胞の生死状態に変化が生じたと誤って判定する可能性がある。そこで、本発明は、細胞の生存率を算出し、算出された細胞の生存率が信頼できるか否かを判定することが可能な細胞生存率判定装置及び細胞生存率判定方法を提供することを目的の一つとする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の第１態様によれば、細胞集団が発する自家蛍光のピーク強度を与えるピーク波長と、自家蛍光のピーク強度を与える励起光のピーク波長と、に基づき、細胞集団における細胞の生存率を算出する生存率算出部と、自家蛍光のピーク波長の単位時間あたりのシフト量及びシフト方向と、励起光のピーク波長の単位時間あたりのシフト量及びシフト方向と、に基づき、算出された細胞の生存率が信頼できるか否かを判定する判定部と、を備える、細胞生存率判定装置が提供される。
【０００８】
上記の第１態様に係る細胞生存率判定装置において、判定部が、自家蛍光の波長及び励起光の波長を座標成分とする座標系において、自家蛍光のピーク波長の単位時間あたりのシフト量及びシフト方向を表すベクトルと、励起光のピーク波長の単位時間あたりのシフト量及びシフト方向を表すベクトルと、の和のベクトルを算出してもよい。
【０００９】
上記の第１態様に係る細胞生存率判定装置において、和のベクトルの大きさが所定の閾値以上であり、和のベクトルの方向が所定の範囲内である場合、判定部が、算出された細胞の生存率を信頼できると判定してもよい。
【００１０】
上記の第１態様に係る細胞生存率判定装置において、和のベクトルの大きさが所定の閾値以上であり、和のベクトルの方向が所定の範囲外である場合、判定部が、算出された細胞の生存率が信頼できないと判定してもよい。
【００１１】
上記の第１態様に係る細胞生存率判定装置において、細胞集団が浮遊培養されていてもよい。
【００１２】
上記の第１態様に係る細胞生存率判定装置において、細胞集団のそれぞれの細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞であってもよい。
【００１３】
本発明の第２態様によれば、細胞集団のそれぞれの細胞が発する第１波長帯域の自家蛍光の強度、第２波長帯域の自家蛍光の強度、及び細胞集団のそれぞれの細胞で生じる散乱光の強度から選択される少なくとも第１及び第２光強度に基づき、細胞集団における細胞の生存率を算出する生存率算出部と、第１光強度の単位時間あたりの変化量及び変化方向と、第２光強度の変化量及び変化方向と、に基づき、算出された細胞の生存率が信頼できるか否かを判定する判定部と、を備える、細胞生存率判定装置が提供される。
【００１４】
上記の第２態様に係る細胞生存率判定装置において、第１波長帯域の自家蛍光の強度、第２波長帯域の自家蛍光の強度、及び散乱光の強度の３つの光強度が選択されてもよい。
【００１５】
上記の第２態様に係る細胞生存率判定装置において、判定部が、第１光強度及び第２光強度を座標成分とする座標系において、第１光強度の単位時間あたりの変化量及び変化方向を表すベクトルと、第２光強度の単位時間あたりの変化量及び変化方向を表すベクトルと、の和のベクトルを算出してもよい。
【００１６】
上記の第２態様に係る細胞生存率判定装置において、和のベクトルの大きさが所定の閾値以上であり、和のベクトルの方向が所定の範囲内である場合、判定部が、算出された細胞の生存率を信頼できると判定してもよい。
【００１７】
上記の第２態様に係る細胞生存率判定装置において、和のベクトルの大きさが所定の閾値以上であり、和のベクトルの方向が所定の範囲外である場合、判定部が、算出された細胞の生存率が信頼できないと判定してもよい。
【００１８】
上記の第２態様に係る細胞生存率判定装置において、細胞集団が浮遊培養されていてもよい。
【００１９】
上記の第２態様に係る細胞生存率判定装置において、細胞集団のそれぞれの細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞であってもよい。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、細胞の生存率を算出し、算出された細胞の生存率が信頼できるか否かを判定することが可能な細胞生存率判定装置及び細胞生存率判定方法を提供可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】第１実施形態に係る細胞生存率判定装置の模式図である。
【図２】第１実施形態に係る細胞生存率判定装置の模式図である。
【図３】第１実施形態に係る細胞の自家蛍光のピーク波長と励起光のピーク波長の関係を示す模式的なグラフである。
【図４】第２実施形態に係る細胞の第１波長帯域自家蛍光の強度と、第２波長帯域自家蛍光の強度と、散乱光の強度と、の関係を示す模式的なグラフである。
【図５】第３実施形態に係る細胞生存率判定装置の模式図である。
【図６】第３実施形態に係る細胞生存率判定装置の模式図である。
【図７】実施例１に係る培養日数と細胞の生存率との関係を示す表である。
【図８】実施例１に係る細胞の培養日数ごとの励起蛍光マトリックスである。
【図９】実施例１に係る主成分分析の結果を示すグラフである。
【図１０】実施例１に係る細胞の培養日数と、自家蛍光及び散乱光の強度と、の関係を示すグラフである。
【図１１】実施例２に係る大腸菌由来のＮＡＤＨの高分子画分の励起蛍光マトリックスである。
【図１２】実施例２に係る大腸菌由来のＮＡＤＨの低分子画分の励起蛍光マトリックスである。
【図１３】実施例２に係る表皮ブドウ球菌由来のＮＡＤＨの高分子画分の励起蛍光マトリックスである。
【図１４】実施例２に係る表皮ブドウ球菌由来のＮＡＤＨの低分子画分の励起蛍光マトリックスである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下に本発明の実施形態を説明する。以下の図面の記載において、同一又は類似の部分には同一又は類似の符号で表している。ただし、図面は模式的なものである。したがって、具体的な寸法等は以下の説明を照らし合わせて判断するべきものである。また、図面相互間においても互いの寸法の関係や比率が異なる部分が含まれていることはもちろんである。
【００２３】
なお、この開示の一部をなす記述及び図面はこの発明を限定するものであると理解するべきではない。この開示から当業者には様々な代替実施の形態、実施例及び運用技術が明らかになるはずである。したがって、本発明はここでは記載していない様々な実施形態等も包含するということを理解すべきである。
【００２４】
（第１実施形態）
第１実施形態に係る細胞生存率判定装置は、図１及び図２に示すように、細胞集団が発する自家蛍光のピーク強度を与えるピーク波長と、自家蛍光のピーク強度を与える励起光のピーク波長と、に基づき、細胞集団における細胞の生存率を算出する生存率算出部３０１と、自家蛍光のピーク波長の単位時間あたりのシフト量及びシフト方向と、励起光のピーク波長の単位時間あたりのシフト量及びシフト方向と、に基づき、算出された細胞の生存率が信頼できるか否かを判定する判定部３０２と、を備える。生存率算出部３０１及び判定部３０２は、例えば、演算処理装置３００に含まれる。ここで、単位時間とは、例えば２４時間であるが、一定時間であれば、特に限定されず、２４時間より短い時間であってもよいし、２４時間より長い時間であってもよい。
【００２５】
細胞は、例えば浮遊培養されている細胞である。浮遊培養においては、細胞を培養器の底面に接着させず、球状の細胞を培養液の中に浮遊させた状態で増殖させる。細胞は、接着培養された細胞であってもよい。細胞は、あらゆる種類の細胞を含む。細胞の一例としては、抗体産生細胞が挙げられる。抗体産生細胞の例としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が挙げられる。ＣＨＯ細胞は、株化したＣＨＯ細胞を含む。また、ＣＨＯ細胞は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞や、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）欠損ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞等の亜種を含む。
【００２６】
本発明者が見出した知見によれば、自家蛍光のピーク波長と、励起光のピーク波長と、細胞集団における細胞の生存率と、の関係は、予め取得することが可能である。例えば、細胞の培養を開始してから、毎日、細胞を含む溶液における、自家蛍光のピーク波長と、励起光のピーク波長と、を測定し、かつ、細胞を含む溶液における死細胞又は生細胞の割合を、トリパンブルー染色等の既知の方法で測定する。これにより、自家蛍光のピーク波長と、励起光のピーク波長と、細胞集団における細胞の生存率と、の関係が取得される。当該関係は、例えば、自家蛍光のピーク波長及び励起光のピーク波長を独立変数とし、細胞集団における細胞の生存率を従属変数とする関数で与えられる。
【００２７】
生存率算出部３０１は、細胞集団が発する自家蛍光のピーク波長の測定値と、自家蛍光のピーク波長に対応する励起光のピーク波長の測定値と、を取得する。細胞集団が発する自家蛍光のピーク波長の測定値と、励起光のピーク波長の測定値と、は、励起光の波長を走査しながら自家蛍光のスペクトルを測定することにより得られる。なお、励起光の波長を走査しながら得られる自家蛍光のスペクトルは、励起蛍光マトリックス（ＥＥＭ）とも呼ばれる。生存率算出部３０１は、他の測定装置から、測定済みの細胞集団が発する自家蛍光のピーク波長の測定値と、自家蛍光のピーク波長に対応する励起光のピーク波長の測定値と、を取得してもよい。さらに、生存率算出部３０１は、予め取得された自家蛍光のピーク波長と、励起光のピーク波長と、細胞集団における細胞の生存率と、の関係と、自家蛍光のピーク波長及び励起光のピーク波長の測定値と、を用いて、細胞集団における細胞の生存率を算出する。
【００２８】
判定部３０２は、細胞集団が発する自家蛍光のピーク波長の測定値の時系列データを取得する。また、判定部３０２は、自家蛍光のピーク波長に対応する励起光のピーク波長の測定値の時系列データを取得する。細胞集団が発する自家蛍光のピーク波長の測定値の時系列データと、自家蛍光のピーク波長に対応する励起光のピーク波長の測定値の時系列データと、は、励起光の波長を走査しながら自家蛍光のスペクトルを測定することを、継時的に繰り返し行うことにより得られる。
【００２９】
判定部３０２は、自家蛍光の波長及び励起光の波長を座標成分とする座標系において、自家蛍光のピーク波長の単位時間あたりのシフト量及びシフト方向を表すベクトルと、励起光のピーク波長の単位時間あたりのシフト量及びシフト方向を表すベクトルと、の和のベクトルを算出する。
【００３０】
ここで、本発明者が見出した知見によれば、図３に示すように、細胞集団の培養初期において、生細胞が死細胞よりも優位に多く、細胞の生存率が高い場合は、所定の単位時間における自家蛍光のピーク波長のシフト量と、励起光のピーク波長のシフト量と、は、ともに小さい傾向にある。また、所定の単位時間における自家蛍光のピーク波長のシフト方向と、励起光のピーク波長のシフト方向と、は、ともにランダムになる傾向にある。
【００３１】
しかし、細胞の培養日数が経過し、細胞集団における死細胞の割合が増加すると、所定の単位時間における自家蛍光のピーク波長のシフト量と、励起光のピーク波長のシフト量と、は、ともに大きくなる傾向にある。また、所定の単位時間における自家蛍光のピーク波長のシフト方向と、励起光のピーク波長のシフト方向と、は、ともに一定になる傾向にある。具体的には、自家蛍光のピーク波長と、励起光のピーク波長と、は、長波長側にシフトする傾向にある。
【００３２】
そのため、細胞集団における死細胞の割合が増加すると、単位時間における自家蛍光のピーク波長のシフト量及びシフト方向で表されるベクトルと、単位時間における励起光のピーク波長のシフト量及びシフト方向で表されるベクトルと、の和のベクトルの大きさが所定の閾値より大きくなり、また、当該和のベクトルの方向が、所定の範囲内に入る傾向にある。
【００３３】
和のベクトルの大きさの所定の閾値は、例えば、細胞集団において死細胞の割合が増加した時の和のベクトルの大きさを予め測定することにより設定される。また、和のベクトルの方向の所定の範囲は、細胞集団において死細胞の割合が増加した時の和のベクトルの方向を予め測定することにより設定される。これらの閾値は、例えば、主成分分析、部分的最小二乗法（ＰＬＳ）、及び判別分析により設定されてもよい。
【００３４】
単位時間における和のベクトルの大きさが所定の閾値より大きくなったにもかかわらず、当該和のベクトルの方向が、所定の範囲内に入らなかった場合は、細胞集団における死細胞の割合の増加以外の要因で、自家蛍光のピーク波長及び励起光のピーク波長の少なくとも一方がシフトしたと考えられる。細胞の割合の増加以外の要因としては、他の蛍光粒子の混入や、バックグランド光の強度の変化等が挙げられる。
【００３５】
したがって、図１に示す判定部３０２は、単位時間における和のベクトルの大きさが所定の閾値以上であり、単位時間における和のベクトルの方向が所定の範囲内である場合、生存率算出部３０１で算出された細胞の生存率を信頼できると判定する。また、判定部３０２は、単位時間における和のベクトルの大きさが所定の閾値以上であり、単位時間における和のベクトルの方向が所定の範囲外である場合、生存率算出部３０１で算出された細胞の生存率が信頼できないと判定する。
【００３６】
判定部３０２は、異常検出アルゴリズムを用いて、判定をしてもよい。例えば、異常検出アルゴリズムの例としては、１クラスサポートベクターマシン、外れ値検出（ＬＯＦ：Ｌｏｃａｌ  Ｏｕｔｌｉｅｒ  Ｆａｃｔｏｒ）、マハラノビス距離、及びニューラルネットワークに基づいていてもよい。
【００３７】
演算処理装置３００には、例えば、データ記憶装置４０１が接続されている。データ記憶装置４０１は、上記のように予め取得された自家蛍光のピーク波長と、励起光のピーク波長と、細胞集団における細胞の生存率と、の関係を保存する。また、データ記憶装置４０１は、和のベクトルの大きさ所定の閾値を保存する。さらに、データ記憶装置４０１は、和のベクトルの方向の所定の範囲を保存する。
【００３８】
演算処理装置３００には、例えば、一時記憶装置４０２、信号出力装置４０３、信号入力装置４０４、信号送受信装置４０５、及び表示装置４０６等が接続されていてもよい。一時記憶装置４０２は、演算処理装置３００の演算過程における情報を一時的に記憶する。信号出力装置４０３は、演算処理装置３００が演算した信号を出力する。信号入力装置４０４は、演算処理装置が演算する信号を入力する。信号送受信装置４０５は、外部の装置と信号の送受信をする。表示装置４０６は、演算処理装置３００の処理過程における情報、及び処理結果の情報を表示する。
【００３９】
以上説明した第１実施形態に係る細胞生存率判定装置によれば、個々の細胞の生死を判定せずとも、細胞集団における自家蛍光のピーク波長と、励起光のピーク波長と、を測定することにより、細胞集団における細胞の生存率を計測することが可能である。さらに、第１実施形態に係る細胞生存率判定装置によれば、算出された細胞の生存率が信頼できるか否かを判定することが可能である。
【００４０】
例えば、抗体医薬品生産などバイオプロセスにおいては、抗体産生細胞の生存率に基づいて、抗体産生細胞の培養をいつ停止するかを決定することが、細胞の抗体生産効率を最大化するために重要である。第１実施形態に係る細胞生存率判定装置を用いれば、信頼できると判定された細胞の生存率に基づいて、抗体産生細胞の培養の停止時期を決定することが可能である。
【００４１】
（第２実施形態）
第２実施形態に係る細胞生存率判定装置においては、図１に示す生存率算出部３０１は、細胞集団のそれぞれの細胞が発する第１波長帯域の自家蛍光の強度、第１波長帯域とは異なる第２波長帯域の自家蛍光の強度、及び細胞集団のそれぞれの細胞で生じる散乱光の強度から選択される少なくとも第１及び第２光強度に基づき、細胞集団における細胞の生存率を算出する。判定部３０２は、第１光強度の単位時間あたりの変化量及び変化方向と、第２光強度の単位時間あたりの変化量及び変化方向と、に基づき、算出された細胞の生存率が信頼できるか否かを判定する。
【００４２】
本発明者が見出した知見によれば、少なくとも第１及び第２光強度と、細胞集団における細胞の生存率と、の関係は、予め取得することが可能である。例えば、細胞の培養を開始してから、毎日、細胞を含む溶液における、少なくとも第１及び第２光強度を測定し、かつ、細胞を含む溶液における死細胞又は生細胞の割合を、トリパンブルー染色等の既知の方法で測定する。これにより、少なくとも第１及び第２光強度と、細胞集団における細胞の生存率と、の関係が取得される。当該関係は、例えば、少なくとも第１及び第２光強度を独立変数とし、細胞集団における細胞の生存率を従属変数とする関数で与えられる。
【００４３】
以下においては、細胞集団のそれぞれの細胞が発する第１波長帯域の自家蛍光の強度、第２波長帯域の自家蛍光の強度、及び細胞集団のそれぞれの細胞で生じる散乱光の強度の全てが選択された例を説明する。
【００４４】
生存率算出部３０１は、細胞集団のそれぞれの細胞が発する第１波長帯域の自家蛍光の強度の測定値と、第２波長帯域の自家蛍光の強度の測定値と、細胞集団のそれぞれの細胞で生じる散乱光の強度の測定値と、を取得する。第１波長帯域の自家蛍光の強度、第２波長帯域の自家蛍光の強度、及び散乱光の強度は、細胞集団の個々の細胞に、励起光を照射することにより測定される。励起光の波長は、例えば３４０ｎｍ以上４１０ｎｍ以下であるが、これに限定されない。
【００４５】
さらに、生存率算出部３０１は、予め取得された第１波長帯域の自家蛍光の強度、第２波長帯域の自家蛍光の強度、及び散乱光の強度の関係と、第１波長帯域の自家蛍光の強度の測定値と、第２波長帯域の自家蛍光の強度の測定値と、散乱光の強度の測定値と、を用いて、細胞集団における細胞の生存率を算出する。
【００４６】
判定部３０２は、細胞集団のそれぞれの細胞が発する第１波長帯域の自家蛍光の強度の測定値の時系列データと、第２波長帯域の自家蛍光の強度の測定値の時系列データと、細胞集団のそれぞれの細胞で生じる散乱光の強度の測定値の時系列データと、を取得する。これらの時系列データは、細胞集団の個々の細胞に、励起光を照射して第１波長帯域の自家蛍光の強度、第２波長帯域の自家蛍光の強度、及び散乱光の強度を測定することを、継時的に繰り返し行うことにより得られる。
【００４７】
判定部３０２は、第１波長帯域の自家蛍光の強度、第２波長帯域の自家蛍光の強度、及び散乱光の強度を座標成分とする座標系において、第１波長帯域の自家蛍光の強度の単位時間あたりの変化量及び変化方向を表すベクトルと、第２波長帯域の自家蛍光の強度の単位時間あたりの変化量及び変化方向を表すベクトルと、散乱光の強度の単位時間あたりの変化量及び変化方向を表すベクトルと、の和のベクトルを算出する。
【００４８】
ここで、本発明者が見出した知見によれば、図４に示すように、細胞集団の培養初期において、生細胞が死細胞よりも優位に多く、細胞の生存率が高い場合は、所定の単位時間における第１波長帯域の自家蛍光の強度の変化量、第２波長帯域の自家蛍光の強度の変化量、及び散乱光の強度の変化量は、ともに小さい傾向にある。また、所定の単位時間における第１波長帯域の自家蛍光の強度の変化方向、第２波長帯域の自家蛍光の強度の変化方向、及び散乱光の強度の変化方向は、ともにランダムになる傾向にある。
【００４９】
しかし、細胞の培養日数が経過し、細胞集団における死細胞の割合が増加すると、所定の単位時間における第１波長帯域の自家蛍光の強度の変化量、第２波長帯域の自家蛍光の強度の変化量、及び散乱光の強度の変化量は、ともに大きくなる傾向にある。また、所定の単位時間における第１波長帯域の自家蛍光の強度の変化方向、第２波長帯域の自家蛍光の強度の変化方向、及び散乱光の強度の変化方向は、ともに一定になる傾向にある。
【００５０】
そのため、細胞集団における死細胞の割合が増加すると、単位時間における第１波長帯域の自家蛍光の強度の変化量及び変化方向を表すベクトルと、単位時間における第２波長帯域の自家蛍光の強度の変化量及び変化方向を表すベクトルと、単位時間における散乱光の強度の変化量及び変化方向を表すベクトルと、の和のベクトルの大きさが所定の閾値より大きくなり、また、当該和のベクトルの方向が、所定の範囲内に入る傾向にある。
【００５１】
和のベクトルの大きさの所定の閾値は、例えば、細胞集団において死細胞の割合が増加した時の和のベクトルの大きさを予め測定することにより設定される。また、和のベクトルの方向の所定の範囲は、細胞集団において死細胞の割合が増加した時の和のベクトルの方向を予め測定することにより設定される。
【００５２】
単位時間における和のベクトルの大きさが所定の閾値より大きくなったにもかかわらず、当該和のベクトルの方向が、所定の範囲内に入らなかった場合は、細胞集団における死細胞の割合の増加以外の要因で、第１波長帯域の自家蛍光の強度、第２波長帯域の自家蛍光の強度、及び散乱光の強度の少なくとも一つが変化したと考えられる。細胞の割合の増加以外の要因としては、細胞における代謝による自家蛍光の強度変化、他の蛍光粒子の混入や、バックグランド光の強度の変化等が挙げられる。
【００５３】
したがって、図１に示す判定部３０２は、単位時間における和のベクトルの大きさが所定の閾値以上であり、単位時間における和のベクトルの方向が所定の範囲内である場合、生存率算出部３０１で算出された細胞の生存率を信頼できると判定する。また、判定部３０２は、単位時間における和のベクトルの大きさが所定の閾値以上であり、単位時間における和のベクトルの方向が所定の範囲外である場合、生存率算出部３０１で算出された細胞の生存率が信頼できないと判定する。
【００５４】
演算処理装置３００には、例えば、データ記憶装置４０１が接続されている。データ記憶装置４０１は、上記のように予め取得された少なくとも第１及び第２光強度と、細胞集団における細胞の生存率と、の関係を保存する。また、データ記憶装置４０１は、和のベクトルの大きさ所定の閾値を保存する。さらに、データ記憶装置４０１は、和のベクトルの方向の所定の範囲を保存する。
【００５５】
第２実施形態に係る細胞生存率判定装置のその他の構成要素は、第１実施形態と同様である。第２実施形態に係る細胞生存率判定装置によっても、算出された細胞の生存率が信頼できるか否かを判定することが可能である。
【００５６】
（第３実施形態）
第３実施形態に係る細胞生存率判定装置は、図５及び図６に示すように、光学式粒子検出装置５００をさらに備える。光学式粒子検出装置５００は、例えば、細胞を含む溶液が流れる取り外し可能な流路５０１と、流路５０１に接続された、取り外し可能な測定セル５０２と、測定セル５０２内に測定光を照射する照射器５０３と、測定光を照射された測定セル５０２内で生じた散乱光及び蛍光の強度を測定する光測定器５０４と、を備える。
【００５７】
送液装置５０５によって、流路５０１に、細胞を含む溶液が流される。送液装置５０５は、送液制御部５０６によって制御され、溶液の流量等を設定する。流路５０１は、光学式粒子検出装置５００から取り外し可能である。取り外された流路５０１は、洗浄されてもよいし、新しい清浄な流路５０１と交換されてもよい。測定セル５０２は、測定光及び散乱光が透過可能な透明部材からなる。測定セル５０２の材料としては、石英ガラスが挙げられるが、これに限定されない。測定セル５０２は、光学式粒子検出装置５００から取り外し可能である。取り外された測定セル５０２は、洗浄されてもよいし、新しい清浄な測定セル５０２と交換されてもよい。
【００５８】
流路５０１及び測定セル５０２が清浄でない場合、前回測定した細胞が流路５０１及び測定セル５０２に残存し、その後の測定に影響を及ぼす可能性がある。これに対し、第３実施形態に係る流路５０１及び測定セル５０２は、光学式粒子検出装置５００から取り外し可能であるため、流路５０１及び測定セル５０２を清浄にすることが容易である。
【００５９】
照射器５０３は、例えば、レーザー光源と、レーザー光源の制御装置と、を備える。照射器５０３は、測定セル５０２内に、例えばレーザー光である測定光を照射する。測定セル５０２内に焦点を結ぶよう、レンズを配置してもよい。測定セル５０２内の細胞に測定光が照射されると、細胞においてミー散乱光が生じる。また、細胞が自家蛍光を発する。光測定器５０４は、細胞で生じた散乱光及び細胞が発した自家蛍光の強度を測定する。光測定器５０４で測定された散乱光及び自家蛍光の強度は、信号送受信装置４０５等を介して生存率算出部３０１に送られる。
【００６０】
第３実施形態に係る細胞生存率判定装置の他の構成要素は、第２実施形態と同様であるため、説明は省略する。
【００６１】
［実施例１］
Ｌ−グルタミン（終濃度６ｍｍｏｌ／Ｌ）、Ａｎｔｉ−Ｃｌｕｍｐｉｎｇ  Ａｇｅｎｔ（終濃度１％）を添加した培地（ＣＤ  ＯｐｔｉＣＨＯ、登録商標、タンパク質不含有、動物由来成分不含有、インビトロジェン製）を用意した。当該培地で、トラスツズマブを産生するＣＨＯ−Ｋ１細胞を、３７℃、５％ＣＯ2で浮遊培養した。浮遊培養開始後、定期的に細胞を含む培地をサンプリングした。
【００６２】
サンプリングした培地に含まれる細胞をトリパンブルーで染色し、セルカウンターを用いて、総細胞数と、染色細胞数と、を計数した。染色された細胞は、死細胞と判定した。判定結果より、細胞の生存率を算出した。その結果、図７に示すように、培養８日目以降に、細胞の生存率が急激に低下した。
【００６３】
また、サンプリングした培地を遠心し、沈殿した細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁した。この懸濁液を、蛍光分光光度計（ＦＰ−８５００、日本分光製）で分析し、励起蛍光マトリックス（ＥＥＭ）を得た。ＥＥＭは、励起光の波長、自家蛍光の波長、及び自家蛍光の強度の３次元マトリックスである。なお、分析の際には、散乱による迷光を除去する目的で、３８５ｎｍよりも長い波長の光を透過させるフィルターを蛍光検出器に使用した。
【００６４】
得られたＥＥＭを図８に示す。ＥＥＭを分析したところ、細胞の生存率が高かった培養７日目までは、自家蛍光のピーク波長は４５０ｎｍ付近であり、自家蛍光のピーク波長に対応する励起光のピーク波長は３４０ｎｍ付近であった。しかし、細胞の生存率が約半分に低下した培養８日目からは、自家蛍光のピーク波長は４６０ｎｍ付近にシフトし、自家蛍光のピーク波長に対応する励起光のピーク波長は３６０ｎｍ付近にシフトした。
【００６５】
図８に示したＥＥＭを主成分分析したところ、図９に示すように、培養８日目及び培養９日目のＥＥＭは、培養０日目から７日目のＥＥＭから離間していた。
【００６６】
また、ＥＥＭの測定と並行して、サンプリングした培地を、所定の倍率で希釈し、粒子検出装置（ＩＭＤ−Ｗ、アズビル製）を用いて、培地に含まれる細胞のそれぞれにレーザー光を照射し、細胞のそれぞれで生じるミー散乱光の強度、並びに細胞が発した青色帯域及び緑色帯域の自家蛍光の強度を測定した。
【００６７】
粒子検出装置で得られた散乱光、並びに青色帯域及び緑色帯域の自家蛍光の強度の３次元グラフを図１０に示す。培養０日目から培養５日目までは、散乱光、並びに青色帯域及び緑色帯域の自家蛍光の強度の計測値を座標成分とする座標の変動は、所定の範囲内であった。しかし、生存率が低下し始めた培養６日目から、計測値の座標は、青色帯域及び緑色帯域の自家蛍光の強度のそれぞれが大きくなる方向にシフトし、散乱光の強度が小さくなる方向にシフトした。これは、強度のピークにおける自家蛍光の波長が、粒子検出装置の蛍光検出器の検出波長帯域に向かってシフトしたこと、及び細胞の生存率の低下に伴い、検出される小粒子が増加したことを反映していると考えられる。
【００６８】
［実施例２］
細胞及び微生物が有する還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）は、励起光を照射されると、自家蛍光を発する。タンパク質に結合しているＮＡＤＨと、遊離しているＮＡＤＨと、は、異なる蛍光スペクトルを示すとの報告がある（例えば、Z. Longら、「The real-time quantification of autofluorescence spectrum shape for the monitoring of mitochondrial metabolism」、J. Biophotonics、8、No. 3、247-257 (2015)参照。）。
【００６９】
ここで、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ、ＡＴＣＣ１３７０６）を用意し、３００ｍＬ三角フラスコ内の１００ｍＬのＴＳＢ培地中、３２℃で一夜、好気条件下で大腸菌を培養した。その後、ＰＢＳバッファーで大腸菌を集菌し、洗浄した。再度、大腸菌をＰＢＳバッファーに懸濁し、大腸菌を超音波で破砕し、破砕液を得た。破砕液を５０００ｒｐｍで１０分間遠心し、デブリを除去した。遠心された破砕液の上清を１３００ｒｐｍで３０分間遠心し、さらに上清を１３００ｒｐｍで３０分間遠心し、得られた上清を大腸菌の抽出液として得た。
【００７０】
得られた抽出液をＰＢＳバッファーで平衡化したゲルろ過カラム（ＰＤ−１０、ＧＥヘルスケア）でろ過し、分子量が５０００以上のＮＡＤＨの高分子量画分と、分子量が１０００以下のＮＡＤＨの低分子量画分を得た。ＮＡＤＨの高分子量画分は、タンパク質と結合しているＮＡＤＨであり、ＮＡＤＨの低分子量画分は、遊離しているＮＡＤＨであると考えられる。
【００７１】
図１１に示す大腸菌由来のタンパク質と結合しているＮＡＤＨを蛍光分光光度計（ＦＰ−８５００、日本分光製）で分析し、得られたＥＥＭを分析したところ、自家蛍光のピーク波長は４３０ｎｍ、励起光のピーク波長は３４０ｎｍであった。これに対し、図１２に示す大腸菌由来の遊離しているＮＡＤＨのＥＥＭを分析したところ、自家蛍光のピーク波長は４５０ｎｍ、励起光のピーク波長は３５５ｎｍであった。したがって、大腸菌由来のＮＡＤＨにおいて、遊離しているＮＡＤＨが増加するほど、自家蛍光のピーク波長及び励起光のピーク波長は、長波長側にシフトすることが示唆された。
【００７２】
また、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、ＡＴＣＣ１２２２８）を用意し、３００ｍＬ三角フラスコ内の１００ｍＬのＴＳＢ培地中、３２℃で一夜、好気条件下で表皮ブドウ球菌を培養した。その後、ＰＢＳバッファーで表皮ブドウ球菌を集菌し、洗浄した。再度、表皮ブドウ球菌をＰＢＳバッファーに懸濁し、表皮ブドウ球菌を破砕キット（ＯｍｎｉＬｙｓｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｋｉｔ、登録商標、クラレモントバイオソリューションズ）で破砕し、分子量が５０００以上のＮＡＤＨの高分子量画分と、分子量が１０００以下のＮＡＤＨの低分子量画分を得た。上述したように、ＮＡＤＨの高分子量画分は、タンパク質と結合しているＮＡＤＨであり、ＮＡＤＨの低分子量画分は、遊離しているＮＡＤＨであると考えられる。
【００７３】
図１３に示す表皮ブドウ球菌由来のタンパク質と結合しているＮＡＤＨを蛍光分光光度計（ＦＰ−８５００、日本分光製）で分析し、得られたＥＥＭを分析したところ、自家蛍光のピーク波長は４３５ｎｍ、励起光のピーク波長は３３５ｎｍであった。これに対し、図１４に示す表皮ブドウ球菌由来の遊離しているＮＡＤＨのＥＥＭを分析したところ、自家蛍光のピーク波長は４４５ｎｍ、励起光のピーク波長は３６５ｎｍであった。したがって、表皮ブドウ球菌由来のＮＡＤＨにおいても、遊離しているＮＡＤＨが増加するほど、自家蛍光のピーク波長及び励起光のピーク波長は、長波長側にシフトすることが示唆された。
【００７４】
実施例１の図８に示したように、細胞の培養日数が進み、死細胞の割合が増加すると、自家蛍光のピーク波長及び励起光のピーク波長は、長波長側にシフトした（なお、図８において細胞は破砕されていない）。これは、図１１から図１４に示した結果から、酸素不足により、ＮＡＤＨが結合する酸化還元酵素の反応が停滞し、遊離ＮＡＤＨが増加したためと考えられる。したがって、自家蛍光のピーク波長及び励起光のピーク波長が長波長側にシフトしたことは、ＮＡＤＨ依存型酸化還元酵素反応の停滞を伴う細胞死を反映していることが示された。
【００７５】
従来、バイオプロセスにおいては、酵素移動容量係数が計算されることがある。酵素移動容量係数の値が大きいほど、培養槽の酵素供給能力が高いことを示している。培養槽のスケールアップの場合は、酸素移動容量係数が変化しないように、スケールアップ条件を検討している。これに対し、実施形態に係る細胞生存率判定装置を用いれば、酵素欠乏による細胞死を検出できるため、酵素移動容量係数の値を計算することなく、スケールアップを判断することが可能である。
【符号の説明】
【００７６】
３００・・・演算処理装置、３０１・・・生存率算出部、３０２・・・判定部、４０１・・・データ記憶装置、４０２・・・一時記憶装置、４０３・・・信号出力装置、４０４・・・信号入力装置、４０５・・・信号送受信装置、４０６・・・表示装置、５００・・・光学式粒子検出装置、５０１・・・流路、５０２・・・測定セル、５０３・・・照射器、５０４・・・光測定器、５０５・・・送液装置、５０６・・・送液制御部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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