(57)【要約】      （修正有）【課題】プロテインキナーゼＣのイプシロンアイソフォームを活性化する方法の提供。【解決手段】プロテインキナーゼＣのイプシロンアイソフォームを、少なくとも１つの二重結合がシクロプロパン環／基によって置換されたｃｉｓ−ポリ不飽和脂肪酸エステル又はｃｉｓ−ポリ不飽和脂肪アルコールである有効量の化合物に接触させることを含む方法。【選択図】図７ｂ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテインキナーゼＣのイプシロンアイソフォームを活性化する方法であって、前記プロテインキナーゼＣの前記イプシロンアイソフォームを、少なくとも１つの二重結合がシクロプロパン環／基によって置換されたｃｉｓ−ポリ不飽和脂肪酸エステル又はｃｉｓ−ポリ不飽和脂肪アルコールである有効量の化合物に接触させることを含んだ方法。
【請求項２】
全ての前記二重結合がシクロプロパン環／基によって置換されている請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記脂肪酸は、CH3(CH2)4(CH=CHCH2)x(CH2)yCOOH 又は CH3CH2(CH=CHCH2)x(CH2)yCOOHの構造を有しており、Ｘは２〜６であり、Ｙは２〜６である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ポリ不飽和脂肪酸は、アラキドン酸、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸、リノール酸、γ−リノール酸、α−リノレン酸、エイコサテトラエン酸、アドレン酸、又はこれらの誘導体である請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記化合物は、シクロプロパン化されたｃｉｓ−ポリ不飽和脂肪酸エステルである請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記化合物は、シクロプロパン化されたドコサヘキサエン酸メチルエステル（ＢＲ−１１１）、エイコサペンタエン酸メチルエステル（ＢＲ−１１４）、又は、シクロプロパン化されたアラキドン酸メチルエステル（ＢＲ−１１５）である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記エステルは脂肪酸アルコールエステルである請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記アルコールは脂肪族アルコールである請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記脂肪族アルコールはグリセロールである請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記化合物は、シクロプロパン化されたｃｉｓ−ポリ不飽和脂肪アルコールである請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記化合物は、リノレイックアルコールジシクロプロパン（ＢＲ−１０５）又はリノレニルアルコールトリシクロプロパン（ＢＲ−１０４）である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記化合物の濃度は、約５ｎＭ〜約１０μＭの範囲内にある請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
プロテインキナーゼＣのイプシロンアイソフォームを活性化する方法であって、前記プロテインキナーゼＣの前記イプシロンアイソフォームを、二重結合がシクロプロパン環／基によって置換された、ｃｉｓ−モノ不飽和脂肪酸、ｃｉｓ−モノ不飽和脂肪酸エステル、又はｃｉｓ−モノ不飽和脂肪アルコールである有効量の化合物に接触させることを含んだ方法。
【請求項１４】
前記脂肪酸は、CH3(CH2)xCH=CH(CH2)yCOOHの構造を有しており、Ｘ及びＹは３〜１１の奇数である請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ｃｉｓ−モノ不飽和脂肪酸又は脂肪アルコールは、オレイン酸、エライジン酸、エライジックアルコール、オレイルアルコール、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、ベルノリン酸、及び、１−モノリノレイル ｒａｃ−グリセロールである請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記化合物は、エライジックアルコールシクロプロパン（ＢＲ−１０６）、エライジン酸シクロプロパン（ＢＲ−１０７）、オレイルアルコールシクロプロパン（ＢＲ−１０８）、又は、ベルノリン酸メチルエステルシクロプロパン（ＢＲ−１０９）である請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記化合物の濃度は、約５ｎＭ〜約１０μＭの範囲内にある請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
プロテインキナーゼＣのイプシロンアイソフォームを選択的に活性化する方法であって、前記プロテインキナーゼＣの前記イプシロンアイソフォームを、少なくとも１つの二重結合がエポキシ基によって置換されたｃｉｓ−ポリ不飽和脂肪酸又はその誘導体である有効量の化合物に接触させることを含んだ方法。
【請求項１９】
全ての前記二重結合が前記エポキシ基によって置換されている請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記脂肪酸は、CH3(CH2)4(CH=CHCH2)x(CH2)yCOOH 又は CH3CH2(CH=CHCH2)x(CH2)yCOOHの構造を有しており、Ｘは２〜６であり、Ｙは２〜６である請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記ポリ不飽和脂肪酸は、アラキドン酸、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸、リノール酸、リノレン酸、又はこれらの誘導体である請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記化合物は、エポキシ化されたｃｉｓ−ポリ不飽和脂肪酸エステルである請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記エステルは脂肪酸アルコールエステルである請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記アルコールは脂肪族アルコールである請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記脂肪族アルコールはグリセロールである請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記化合物は、エポキシ化されたｃｉｓ−ポリ不飽和脂肪アルコールである請求項１８に記載の方法。
【請求項２７】
前記化合物は、エポキシ化されたドコサヘキサエン酸メチルエステルである請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
前記化合物の濃度は、約５ｎＭ〜約１０μＭの範囲内にある請求項１８に記載の方法。
【請求項２９】
前記化合物は、前記イプシロンアイソフォームのプロテインキナーゼＣを、アルファアイソフォームのプロテインキナーゼＣに対して又は前記イプシロンアイソフォームのプロテインキナーゼＣが前記化合物に接触していない場合と比較して、少なくとも２倍活性化する請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記化合物は、前記イプシロンアイソフォームのプロテインキナーゼＣを、アルファアイソフォームのプロテインキナーゼＣに対して又は前記イプシロンアイソフォームのプロテインキナーゼＣが前記化合物に接触していない場合と比較して、少なくとも２倍活性化する請求項１３に記載の方法。
【請求項３１】
前記化合物は、前記イプシロンアイソフォームのプロテインキナーゼＣを、アルファアイソフォームのプロテインキナーゼＣに対して又は前記イプシロンアイソフォームのプロテインキナーゼＣが前記化合物に接触していない場合と比較して、少なくとも２倍活性化する請求項１８に記載の方法。
【請求項３２】
必要としている対象の神経変性を減少させる方法であって、それを必要としている対象に、神経変性を減少させるために有効な量の、少なくとも１つの二重結合がシクロプロパン環／基によって置換されたｃｉｓ−ポリ不飽和脂肪酸エステル又はｃｉｓ−ポリ不飽和脂肪アルコールである化合物を投与することを含んだ方法。
【請求項３３】
全ての前記二重結合がシクロプロパン環／基によって置換されている請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記脂肪酸は、CH3(CH2)4(CH=CHCH2)x(CH2)yCOOH 又は CH3CH2(CH=CHCH2)x(CH2)yCOOHの構造を有しており、Ｘは２〜６であり、Ｙは２〜６である請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記ポリ不飽和脂肪酸は、アラキドン酸、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸、リノール酸、γ−リノール酸、α−リノレン酸、エイコサテトラエン酸、アドレン酸、又はこれらの誘導体である請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記化合物は、シクロプロパン化されたｃｉｓ−ポリ不飽和脂肪酸エステルである請求項２３に記載の方法。
【請求項３７】
前記化合物は、シクロプロパン化されたドコサヘキサエン酸メチルエステル（ＢＲ−１１１）、エイコサペンタエン酸メチルエステル（ＢＲ−１１４）、又は、シクロプロパン化されたアラキドン酸メチルエステル（ＢＲ−１１５）である請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記化合物は、シクロプロパン化されたｃｉｓ−ポリ不飽和脂肪アルコールである請求項３２に記載の方法。
【請求項３９】
前記化合物は、リノレイックアルコールジシクロプロパン（ＢＲ−１０５）又はリノレニルアルコールトリシクロプロパン（ＢＲ−１０４）である請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
必要としている対象の神経変性を減少させる方法であって、それを必要としている対象に、神経変性を減少させるために有効な量の、二重結合がシクロプロパン環／基によって置換された、ｃｉｓ−モノ不飽和脂肪酸、ｃｉｓ−モノ不飽和脂肪酸エステル、又はｃｉｓ−モノ不飽和脂肪アルコールである化合物を投与することを含んだ方法。
【請求項４１】
前記脂肪酸は、CH3(CH2)xCH=CH(CH2)yCOOHの構造を有しており、Ｘ及びＹは３〜１１の奇数である請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記ｃｉｓ−モノ不飽和脂肪酸又は脂肪アルコールは、オレイン酸、エライジン酸、エライジックアルコール、オレイルアルコール、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、ベルノリン酸、及び、１−モノリノレイル ｒａｃ−グリセロールである請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記化合物は、エライジックアルコールシクロプロパン（ＢＲ−１０６）、エライジン酸シクロプロパン（ＢＲ−１０７）、オレイルアルコールシクロプロパン（ＢＲ−１０８）、又は、ベルノリン酸メチルエステルシクロプロパン（ＢＲ−１０９）である請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
必要としている対象の神経変性を減少させる方法であって、それを必要としている対象に、神経変性を減少させるために有効な量の、少なくとも１つの二重結合がエポキシ基によって置換されたｃｉｓ−ポリ不飽和脂肪酸又はその誘導体である化合物を投与することを含んだ方法。
【請求項４５】
全ての前記二重結合が前記エポキシ基によって置換されている請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記脂肪酸は、CH3(CH2)4(CH=CHCH2)x(CH2)yCOOH 又は CH3CH2(CH=CHCH2)x(CH2)yCOOHの構造を有しており、Ｘは２〜６であり、Ｙは２〜６である請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記ポリ不飽和脂肪酸は、アラキドン酸、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸、リノール酸、リノレン酸、又はこれらの誘導体である請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
前記化合物は、エポキシ化されたｃｉｓ−ポリ不飽和脂肪酸エステルである請求項４４に記載の方法。
【請求項４９】
前記化合物は、エポキシ化されたｃｉｓ−ポリ不飽和脂肪アルコールである請求項４４に記載の方法。
【請求項５０】
前記化合物は、エポキシ化されたドコサヘキサエン酸メチルエステルである請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
シクロプロパン化されたドコサヘキサエン酸メチルエステル（ＢＲ−１１１）、エイコサペンタエン酸メチルエステル（ＢＲ−１１４）、シクロプロパン化されたアラキドン酸メチルエステル（ＢＲ−１１５）、リノレイックアルコールジシクロプロパン（ＢＲ−１０５）、リノレニルアルコールトリシクロプロパン（ＢＲ−１０４）、エライジックアルコールシクロプロパン（ＢＲ−１０６）、エライジン酸シクロプロパン（ＢＲ−１０７）、オレイルアルコールシクロプロパン（ＢＲ−１０８）、若しくは、ベルノリン酸メチルエステルシクロプロパン（ＢＲ−１０９）、又は、これらの組み合わせと、
薬学的に許容されるキャリアとを含有した組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の概要】
【０００１】
この出願は、２００８年７月２８日に出願された米国仮特許出願第６１／０８４１７２号からの優先権の利益を主張し、その開示の全体は、参照によってここに組み込まれる。
【０００２】
本発明は、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）のアイソフォームを活性化するための組成物及び方法に関する。本発明は、神経変性疾患の低減並びにアルツハイマー病及び脳卒中を含む神経病の治療のための方法をも提供する。
【０００３】
アルツハイマー病、脳卒中、及び、抑うつ障害におけるＰＫＣアクティベータ  アルツハイマー病（ＡＤ）は、記憶及び認知機能の進行的減退を特徴とする神経変性疾患である。ＡＤに伴った認知症は、アルツハイマー病での用法では、アルツハイマー型老人性認知症（ＳＤＡＴ）と呼ばれている。ＡＤは、臨床的には、記憶、認知、推論、判断及び感情の安定性の進行的な喪失を特徴としており、これらは、次第に深い精神崩壊に導き、最終的には死をもたらす。ＡＤの有り得るメカニズムについては多数の仮説が存在するが、ひとつの中心的な理論は、毒性のベータアミロイド（Ａβ）の過剰な形成及び蓄積が、直接又は間接に種々の細胞活動に影響し、神経へのダメージ及び細胞死をもたらすというものである。Selkoe, Neuron. 1991; 6(4): 487-98 1991; Selkoe, J Clin Invest. 2002;110 (10):1375-81。
【０００４】
ＡＤは、臨床的な兆候の始まりから死に至るまで約８〜１５年の平均期間を有する進行性の疾患である。ＡＤは、７番目に多い医学的な死因であると信じられており、米国において約５００万人を冒している。罹患者数は、２０３０年までに７７０万人に至ると予測されている。６５歳を上回る年齢の８人に１人、即ち人口の１３％が、ＡＤを有している（Alzheimer’s Association 2008 Alzheimer’s Disease Facts and Figures）。ＡＤは、現在、全世界で約１５００万人（全ての人種及び民族を含む）を冒しており、人口に占める高齢者の相対的な増加に起因して、その罹患者数は、次の２０〜３０年間に亘って増加しそうである。ＡＤは、現状では不治である。
【０００５】
プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）は、プロテインキナーゼの最も大きな遺伝子ファミリーの１つである。ＰＫＣ、ＰＫＣβ１、ＰＫＣβＩＩ、ＰＫＣδ、ＰＫＣε、及びＰＫＣγなどの幾つかのＰＫＣアイソザイムが、脳内で発現されている。ＰＫＣは、本来はサイトゾリックなタンパク質であるが、刺激によって、膜へと移行する。ＰＫＣは、アルツハイマー病に関連する多数の生化学的プロセスに関わっていることが示されている。ＰＫＣの活性化は、学習及び記憶増強にも決定的な役割を有しており、ＰＫＣアクティベータは、記憶及び学習を増強させることが示されている。Sun and Alkon, Eur J Pharmacol. 2005;512:43-51; Alkon et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2005;102:16432-16437。ＰＫＣの活性化は、ラットの海馬におけるシナプス形成を誘起することが示されており、神経変性状態におけるＰＫＣによる抗アポトーシス及びシナプス形成の可能性を示唆している。Sun and Alkon, Proc Natl Acad Sci USA. 2008; 105(36): 13620-13625。ＰＫＣアクティベータの１種であるブリオスタチン−１を用いた虚血後／低酸素症の治療は、虚血に誘起されたシナプス形成、神経栄養活性、並びに、空間的学習及び記憶の欠陥を、効果的に救った。Sun and Alkon, Proc Natl Acad Sci USA. 2008。この効果は、シナプスタンパク質スピノフィリン及びシナプトフィジンのレベルの増加、並びに、シナプス形態の構造的変化を伴っている。Hongpaisan and Alkon, Proc Natl Acad Sci USA. 2007;104:19571-19576。長期的な連想記憶のためのブリオスタチン誘起シナプス形成も、ＰＫＣ活性化によって制御される。Hongpaisan and Alkon, PNAS 2007。ＰＫＣは、ニューロトロフィンの生産も活性化する。神経栄養因子、特には脳由来の神経栄養因子（ＢＤＮＦ）及び神経成長因子（ＮＧＦ）は、損傷したニューロン及びシナプスの修復及び再成長を開始させる主要な成長因子である。幾つかのＰＫＣアイソフォーム、特にはＰＫＣε及びＰＫＣαの活性化は、お
そらくは神経栄養因子の生産の増大により、神経の損傷に対して対抗する。Weinreb et al., FASEB Journal. 2004;18:1471-1473。ＰＫＣアクティベータは、チロシンヒドロキシラーゼの発現を誘起し、ニューロンの生存及び神経突起の生長を誘起することも報告されている。Du and Iacovitti, J. Neurochem. 1997; 68: 564-69; Hongpaisan and Alkon, PNAS 2007; Lallemend et al., J. Cell Sci. 2005; 118: 4511-25。
【０００６】
ＡＤは、タウの過剰リン酸化によっても特徴付けられている。タウは、主に脳内で発現され、そこで、ニューロン、アストロサイト及びオリゴデンドロサイト中の微小管の配向及び安定性を制御している。ＡＤでは、正常な可溶性タウが、不溶性の、対となった螺旋状のフィラメントへと変換される。これは、タウにおける翻訳後の変化、主には、多数のプロテインキナーゼによるタウの過剰リン酸化に関連している。幾つかの研究は、合成Ａβは、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３（ＧＳＫ−３）の活性化を通じて、タウのリン酸化を促進することを示している。Wang et al., Journal of Neurochemistry. 2006; 98(4): 1167-1175。ＰＫＣの活性化は、ＧＳＫ−３βの阻害を通じて、ラットの第１海馬ニューロンを、Ａβに媒介された神経毒症状から保護することが示されている。Garrido et al., FASEB J. 2002: 1982。
【０００７】
ＰＫＣは、ＴＮＦ−アルファ変換酵素（ＴＡＣＥ；ＡＤＡＭ１７としても知られている）をも活性化する。この酵素は、膜に結合したアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）を、可溶性ＡＰＰ−α又はｓＡＰＰαとして知られている非病原性の可溶性の形態に、タンパク質分解によって変換することに関わっている。Alkon et al., Trends in Pharmacological Sciences. 2007; 28(2): 51-60; Hurtado et al., Neuropharmacology. 2001; 40(8): 1094-1102。これらのｓＡＰＰα生成酵素は、一般的に、アルファ−セクレターゼと呼ばれている。ＰＫＣによるＴＡＣＥの活性化は、ベータ−セクレターゼ酵素（ＢＡＣＥ）によるＡＰＰの開裂によって生産される病原性Ａβの細胞レベルも減少させる。これは、ＴＡＣＥの開裂サイトがＡＰＰのＡβドメイン内にあるという事実に起因していると思われる。ＰＫＣεの過剰発現は、Ａβを分解するエンドセリン変換酵素（ＥＣＥ）の活性を選択的に増加させることが示されている。Choi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006; 103(21): 8215-8220。加えて、ｎＭ以下の濃度の、共にＰＫＣアクティベータであるブリオスタチン及び効能のある合成類縁体（ピコログ）は、ＴＡＣＥの増加による非アミロイド生成性経路を刺激する原因となり、生成される毒性Ａβの量を低減させることが見出された。Khan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009; 34(2):332-9。
【０００８】
Ａβレベルの減少は、アルツハイマー病における主要な治療目標である。ＰＫＣアクティベータによるＡβ生成の阻害は、共通の基質ＡＰＰに対するＴＡＣＥとＢＡＣＥとの競合に起因しているかもしれないと推測されている。
【０００９】
ＰＫＣを媒介とするα−セクレターゼの活性化という戦略は、ＡＤにおける３つの同方向の有益な結果：ｓＡＰＰ−αの生成を増大させて、Ａβを減少させること；ＰＫＣを媒介とした下流の基質のリン酸化を介して記憶を促進すること；及び、ＧＳＫ−３βの阻害を通じてタウのリン酸化を減少させることについて、利点を有している。
【００１０】
ＡＤ患者は、既に、ＰＫＣの主要な下流基質であるＥｒｋ１／２のＰＫＣα／εを媒介としたリン酸化のレベルを減らしている。Khan and Alkon, Proc Natl Acad Sci USA. 2006;103:13203-13207。加えて、正常なフィブロブラストへのＡβの適用は、ＰＫＣ活性を低減させる。これは、Ａβが直接的にＰＫＣα／εを下方制御するためである。ＰＫＣアクティベータ、特にはＰＫＣα／εに特異的なＰＫＣアクティベータは、Ａβの効果を打ち消し、Ａβに誘起された変化を逆転又は阻害させるであろう。
【００１１】
脳卒中は、米国における障害及び死亡の主要な要因であるが、限られた治療オプションしか存在しない。幾つかのＰＫＣアイソフォームは、脳卒中の後の虚血症及び再かん流障害を媒介する中心的な役割を有していることが示されている。実験的な脳卒中モデル、マウスジェネティクス、並びに、選択的なペプチド阻害剤及び活性化剤についての研究は、ＰＫＣεは耐虚血性の誘起及び障害の抑止に関わっており、他方、ＰＫＣδ及びγは損傷に影響を与えることを実証している。Takayoshi et al., Stroke. 2007; 38(2):375-380; 及び Bright et al., Stroke. 2005;36: 2781。ＰＫＣεの虚血保護効果の１つの有り得るメカニズムは、ＰＫＣεが、アデノシン誘起のミトコンドリアＡＴＰ感応性カリウムチャネルを媒介することによって、ＥＲＫ活性を介してミトコンドリアの機能を維持するというものである。他の有り得るメカニズムは、ＰＫＣεがＣＯＸ−２誘起を介して神経保護効果を引き出すというものである。Kim et al., Neuroscience. 2007; 145(3): 931-941。ＣＯＸ−２活性の生成物であるプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）は、脳虚血症における神経保護をもたらす。上述した通り、ＰＫＣアクティベータの１種であるブリオスタチン−１を用いた虚血後／低酸素症の治療は、虚血に誘起されたシナプス形成、神経栄養活性、並びに、空間的学習及び記憶の欠陥を、効果的に救った。Sun and Alkon, Proc Natl Acad Sci USA. 2008; 105(36): 13620-13625。
【００１２】
循環Ａβタンパク質は、急性の虚血発作の患者において高められることが示されている。循環Ａβ１−４０のレベルは、虚血発作の患者において、コントロールと比較して著しく上昇した。Lee et al., Journal of Neural Transmission. 2005; 112(10): 1371-79。ＡＤ患者において、次第に蓄積していく血管Ａβと、細動脈及び前頭皮質の壁厚の増大との間に、強い正の相関があることも示されており、このことは、細動脈レベルにおいて連続的に進行するＡβに付随した血管障害が収縮期間及び脳血流の自己調節能を害し、下流の毛細血管を障害に対して脆弱にすることを示唆している。Stopa et al., Stroke. 2008;39:814。
【００１３】
加えて、脳卒中の幾つかの形態、例えば、コンゴレッド親和性アミロイド血管障害（ＣＡＡ）としても知られている脳アミロイド血管障害に付随したものは、Ａβが原因である。この疾患は、ＡＤにおいて見出されるのと同じＡβデポジットが脳の軟髄膜壁及び脳皮質血管の表面に蓄積する血管障害の一形態である。アミロイド沈着は、これらの血管を障害にかかりやすくし、脳出血のリスクを増加させる。ＣＡＡは、一過性の虚血発作、くも膜下出血、ダウン症候群、放射後の壊死、多発性硬化症、白質脳症、海綿状脳症、及び拳闘家認知症にも関わっている。
【００１４】
ＰＫＣα及びεは、ＡＤ、脳卒中及び抑うつ障害における上述した有益な効果を顕在化させる最も重要なＰＫＣアイソフォームであることが、証拠によって示唆されている。ＰＫＣαのアンチセンス阻害は、ｓＡＰＰαの分泌をブロックすることが示されており、ＰＫＣεは、Ａβの生成を最も効果的に抑制するアイソザイムである。Racci et al., Mol. Psychiatry. 2003; 8:209-216; 及び Zhu et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001; 285: 997-1006。それゆえ、アイソフォームに特異的なＰＫＣアクティベータは、潜在的な抗アルツハイマー薬として大いに望まれている。特異的なアクティベータは、ブリオスタチンなどのより低い特異性を示す化合物より好ましい。ＰＫＣδ又はβの非特異的な活性化は、不所望の副作用を生み出す可能性があるためである。
【００１５】
更には、ＰＫＣεは、脳以外の全ての通常組織においても、非常に低いレベルで発現されている。Mischak et al., J. Biol. Chem. 1993; 268: 6090-6096; Van Kolen et al., J. Neurochem. 2008;104:1-13。シナプス前神経線維におけるＰＫＣｅの高い存在量は、神経突起の生長又は神経伝達物質の放出における役割を示唆している。Shirai et al., FEBS J. 2008; 275: 3988-3994。したがって、特異的なＰＫＣεアクティベータの効果は、脳に大きく制限され、不所望の末梢副作用は生じないであろう。
【００１６】
ＰＫＣアクティベータとしてのＰＵＦＡｓ
アラキドン酸（図１参照）などの幾つかのＰＵＦＡは、長年に亘って、天然のＰＫＣアクティベータとして知られている。ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）も既知のＰＫＣアクティベータであり、Ａβ並びに脳を閉塞させるプラーク及びＡＤで示唆されるもつれに関連したタウタンパク質の蓄積を遅くすることが最近示されている。Sahlin et al., Eur J Neurosci. 2007; 26(4):882-9。
【００１７】
Ｋａｎｎｏらは、新たに合成された、ｃｉｓ−二重結合のかわりにシクロプロパン環を有したリノール酸である８−［２−（２−ペンチル−シクロプロピルメチル）−シクロプロピル］−オクタン酸（ＤＣＰ−ＬＡ）のプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）活性への効果を記述している。Journal of Lipid Research. 2007; 47: 1146-1156。ＤＣＰ−ＬＡは、他のＰＫＣアイソザイムに対して７倍以上の効能でＰＫＣεを活性化した。これは、ＰＣＰ−ＬＡがＰＫＣεに対して非常に特異的であることを示唆している。この化合物は、グルタミン酸末端又はニューロン上におけるシナプス前アセチルコリン受容体の活性を高めることにより、海馬におけるシナプス伝達をも促進した。しかしながら、ＤＣＰ−ＬＡは、最大限の効果を生み出すために、比較的高い濃度を必要とする。
【００１８】
ＮｉｓｈｉｚａｋｉらのＷＯ２００２／５０１１３は、シクロプロパン環を有したカルボン酸化合物及びそれらの対応する塩であって、ＬＴＰなどのシナプス伝達の相乗作用のため及び認知促進薬又は認知症の治療薬として使用するためのものを開示している。これらの合成例は、エステルの調製を開示しているが、その実験結果は、遊離酸の使用を教示している。その理由は、出発物質である脂肪酸のカルボン酸基がシモンズ−スミス反応に使用されるジエチル亜鉛と反応するだろうからである。メチルエステルは保護基としての役割を果たし、加水分解によって除去されてもよく、必要に応じてそのまま残されてもよい。
【００１９】
従来技術についての警告には、上述した効果を達成するために高い濃度の投与が必要であること、ＰＫＣアイソフォームの非特異的な活性化、又は、未修飾ＰＵＦＡｓの脂肪組織及び他の器官への早い代謝及び隔離（そこでは、未修飾ＰＵＦＡｓはトリグリセリド及びカイロミクロンへと取り込まれる）が含まれる。J Pharmacobiodyn. 1988;11(4):251-61。加えて、未修飾のＰＵＦＡｓの使用は、無数の有害な副作用を有し得る。例えば、アラキドン酸は、潜在的な炎症誘起効果を有しているプロスタグランジン、トロンボキサン、及びロイコトリエンの生化学的な前駆体である。このことは、病理が炎症を含み易いアルツハイマー病の治療にとって、望ましくないであろう。他の必須の脂肪酸も、一酸化窒素シグナリングの促進、抗炎症効果、及び、コレステロールの整合性に干渉するであろうＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼの阻害を含む、他の生物学的効果を有しているかもしれない。
【００２０】
ＡＤ及び脳卒中の双方を治療するための現存のオプションが限られているため、神経保護をもたらすＰＫＣアイソフォームのみを選択的に活性化できる新しい治療法が必要とされている。
【００２１】
ＰＵＦＡｓ及びＭＵＦＡｓと病気
オメガ−３ ＰＵＦＡｓが、臨床的うつ病、双極性障害、人格障害、統合失調症、及び注意欠陥障害などの他の気分障害に有益で有り得ることが、ますます多数の研究によって示唆されている。 Ross et al., Lipids Health Dis. 2007; 18;6:21。オメガ−３脂肪酸、特にはドコサヘキサエン及びエイコサペンタエン酸、並びに、オメガ−６脂肪酸に対するオメガ−３脂肪酸の健康的なバランスと、うつのリスクの低減とを結びつける多数の証拠が存在している。Logan et al., Lipids Health Dis. 2004; 3: 25。うつで入院している患者の臨床的研究において、オメガ−３脂肪酸のレベルがはっきりと低いことが見出され、オメガ−３脂肪酸に対するオメガ−６脂肪酸の比率が特に高かった。最近の研究は、重いうつ障害を有した患者の眼窩前頭皮質中において、ドコサヘキサエン酸の選択的な欠乏が存在していることを見出した。McNamara et al. Biol Psychiatry. 2007;62(1):17-24。幾つかの研究は、双極性障害を有した対象は、オメガ−３脂肪酸のレベルがより低いことも示している。近年の幾つかの研究において、双極性障害を有した大人及び子供の双方において、オメガ−３脂肪酸が、プラセボと比べて、うつに対してより有効であることが示された。Osher and Belmaker, CNS Neurosci Ther. 2009;15(2):128-33; Turnbull et al., Arch Psychiatr Nurs. 2008;22(5):305-11。
【００２２】
広範囲の研究は、オメガ−３脂肪酸が、炎症を低減させ、心臓病、癌、炎症性大腸炎及びリウマチ関節炎などの慢性病に関連したリスクファクターを妨げる助けをすることも示している。Calder et al., Biofactors. 2009;35(3):266-72; Psota et al., Am J Cardiol. 2006;98(4A):3i-18i; Wendel et al., Anticancer Agents Med Chem. 2009;9(4):457-70。
【００２３】
モノ不飽和脂肪酸もまた、障害に有益であることが示されている。タイプ２糖尿病の医学栄養療法のための低脂肪食の代替としてＭＵＦＡ食を用いることについて、良い科学的なサポートが存在している。Ros, American Journal of Clinical Nutrition. 2003; 78(3): 617S-625S。高不飽和脂肪酸食は、プラズマコレステロール及びトリアシルグリセロール濃度の双方を低減させる。Kris-Etherton et al., Am J Clin Nutr. 1999 Dec;70(6):1009-15。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、本発明において使用が企図される分子の構造（ＢＲ−１０１〜ＢＲ−１１８）を示している。
【図２】図２は、ＢＲ−１０１（ＤＣＰ−ＬＡ）及び活性がより低い２つの誘導体（ＣＲ−１０２及びＢＲ−１０３）によるｉｎ ｖｉｔｒｏでのＰＫＣεの活性化の結果を示している。
【図３】図３は、種々の濃度のＢＲ−１１１（ＤＨＡ−ＣＰ６メチルエステル）；ＢＲ−１１４（ＥＰＡ−ＣＰ５メチルエステル；及びＢＲ−１１５（ＡＡ−ＣＰ４メチルエステル）を用いたＰＫＣεの活性化を示している。
【図４】図４は、他のシクロプロパン化及びエポキシ化された脂肪酸メチルエステル：シクロプロパン化されたリノレンアルコール（ＢＲ−１０４）；シクロプロパン化されたリノレイルアルコール（ＢＲ−１０５）；エポキシステアリン酸（ＢＲ−１１６）；ベルノリン酸メチルエステル（ＢＲ−１１７）；及びシクロプロパン化されたベルノリン酸メチルエステル（ＢＲ−１０９）を用いたＰＫＣεの活性化を示している。
【図５】図５は、ラットの海馬ニューロンＨ１９−７／ＩＧＦ−ＩＲ中における、種々の濃度のブリオスタチンによるＰＫＣ活性化の時間推移を示している。
【図６】図６は、ブリオスタチン及びＤＣＰ−ＬＡによるラット海馬の第１ニューロン中におけるＰＫＣ活性化の時間推移を示している。
【図７ａ】図７ａは、ＰＫＣアクティベータであるブリオスタチン、ＢＲ−１０１（ＤＣＰ−ＬＡ）又はＢＲ−１１１（ＤＨＡ−ＣＰ６）にさらされたニューロ２ａ（Ｎ２Ａ）細胞中における細胞内Ａβレベルの減少を描いている。
【図７ｂ】図７ｂは、ＰＫＣアクティベータであるブリオスタチン、ＢＲ−１０１（ＤＣＰ−ＬＡ）又はＢＲ−１１１（ＤＨＡ−ＣＰ６）にさらされたニューロ２ａ（Ｎ２Ａ）細胞中における分泌されたＡβレベルの減少を描いている。
【図８】図８は、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞中での対外から適用されたＡβの分解におけるＢＲ−１１１（ＤＨＡ−ＣＰ６）（０．１〜１０μＭ）の効果を示している。
【図９】図９は、ヒトＡＰＰＳｗｅ／ＰＳ１Ｄｗｐ用いてトランスフェクトされたＮ２ａ神経芽細胞中における、ＰＫＣアクティベータであるブリオスタチン、ＢＲ−１０１（ＤＣＰ−ＬＡ）又はＢＲ−１１１（ＤＨＡ−ＣＰ６）のＴＡＣＥ活性への効果（９ａ）；ラットの皮質第１ニューロン中におけるＴＡＣＥ活性への種々の濃度のブリオスタチンの効果（９ｂ）；及び、ラットの皮質第１ニューロン中におけるＴＡＣＥ活性への種々の濃度のＢＲ−１１１（ＤＨＡ−ＣＰ６）の効果（９ｃ）を描いている。
【図１０】図１０は、ＰＫＣアクティベータであるブリオスタチン（０．２７ｎＭ）、ＢＲ−１０１（ＤＣＰ−ＬＡ）（１μＭ）、ＢＲ−１１１（ＤＨＡ−ＣＰ６）（１μＭ）、又はエタノールによるＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞中でのエンドセリン変換酵素（ＥＣＥ）の活性化を示している。
【図１１】図１１は、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞の細胞生存に対するＢＲ−１０１（ＤＣＰ−ＬＡ）及びＢＲ−１１１（ＤＨＡ−ＣＰ６）（１−１００μＭ）の効果（ａ）、及び、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞の細胞増殖に対するＢＲ−１０１（ＤＣＰ−ＬＡ）及びＢＲ−１１１（ＤＨＡ−ＣＰ６）（１−１００μＭ）の効果（ｂ）を描いている。
【００２５】
本発明は、ポリ不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）又はモノ不飽和脂肪酸（ＭＵＦＡ）のある誘導体を用いたＰＫＣεの活性化のための方法を提供する。これら化合物は、ｎＭ濃度でＰＫＣεを活性化し、このことは、これら化合物を、ＡＤ、脳卒中、及びＰＫＣεが神経を保護する他の神経病の治療のための素晴らしい候補としている。
【００２６】
定義
「脂肪酸」は、約４〜３０の炭素原子を含んだ枝分かれしていない脂肪鎖を有したカルボン酸である；殆んどの長鎖脂肪酸は１０〜２４の炭素を含んでいる。脂肪酸は、飽和でも不飽和でもあり得る。飽和脂肪酸は、鎖に沿って二重結合又は他の官能基を含んでいない。不飽和脂肪酸は、鎖に沿って、１つ又は２つ以上のアルケニル官能基、即ち二重結合を含んでいる。用語「ポリ不飽和脂肪酸」又は「ＰＵＦＡ」は、２つ以上の二重結合を含んだ脂肪酸を意味している。３つのクラスのＰＵＦＡｓ、即ち、オメガ−３ ＰＵＦＡｓ、オメガ−６ ＰＵＦＡｓ、及びオメガ−９ ＰＵＦＡｓが存在する。オメガ−３ ＰＵＦＡｓでは、第１の二重結合が、鎖の末端の炭素（オメガ炭素）から３炭素離れた位置に見出される。オメガ−６ ＰＵＦＡｓでは、第１の二重結合が、オメガ炭素から６炭素離れた位置に見出され、オメガ−９ ＰＵＦＡｓでは、第１の二重結合が、オメガ炭素から９炭素離れた位置にある。
【００２７】
ＰＵＦＡｓは、「ポリエノイック脂肪酸」とも呼ばれる。ここでは、用語ＰＵＦＡは、天然及び合成脂肪酸の双方を包含する。ＰＵＦＡｓの主な供給源は、海洋魚及び脂肪種子作物由来の植物油（vegetable oil）であるが、商業的に発展した植物油（plant oil）は、典型的には、リノール酸及びリノレン酸（１８：３デルタ９，１２，１５）に限られている。
【００２８】
「ｃｉｓ−ＰＵＦＡ」は、隣接する炭素原子が二重結合の同じ側にあるものである。
【００２９】
略号Ｘ：Ｙは、Ｘ個の炭素原子とＹ個の二重結合を有したアシル基を意味している。たとえば、リノール酸は、１８：２と略されるであろう。
【００３０】
「メチレン中断ポリエン」は、単一のメチレン基によって互いから隔てられた２つ又は３つ以上のｃｉｓ−二重結合を有するＰＵＦＡを表す。
【００３１】
「非メチレン中断ポリエン」又は「ポリメチレン中断脂肪酸」は、２つ以上のメチレン基によって互いから隔てられた２つ又は３つ以上のｃｉｓ−二重結合を有するＰＵＦＡを表す。
【００３２】
「モノ不飽和脂肪酸」（ＭＵＦＡ）は、脂肪酸鎖中に単一の二重結合を有し、残りの鎖中の全炭素原子が単結合で結合している脂肪酸である。代表的なＭＵＦＡｓには、オレイン酸、ミリストレイン酸及びパルミトレイン酸が含まれる。
【００３３】
「ｃｉｓ−モノ不飽和脂肪酸」は、隣接する水素原子が二重結合の同じ側にあるものを意味している。
【００３４】
共役リノール酸（９−ｃｉｓ，１１−ｔｒａｎｓ−オクタデカジエン酸）などの共役脂肪酸は、共役ジエン、即ち、隣接した炭素上に２つの二重結合を有している。幾つかの証拠は、共役リノール酸が抗癌活性を有していることを示唆している。
【００３５】
代表的なＰＵＦＡｓには、リノール酸（９，１２−オクタデカジエン酸）；γ−リノレン酸（ＧＬＡ；６，９，１２−オクタデカトリエン酸）：α−リノレン酸（９，１２，１５−オクタデカトリエン酸）；アラキドン酸（５，８，１１，１４−エイコサテトラエン酸）；エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ；５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタエン酸）；ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ；７，１０，１３，１６，１９−ドコサペンタエン酸）；ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ；４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸）；及びステアリドン酸（６，９，１２，１５−オクタデカテトラエン酸）が含まれる。
【００３６】
ここでは、用語「シクロプロパン」は、Ｃ３Ｈ６の分子式を有するシクロアルカン分子であって、互いに結合して環を形成した３つの炭素原子を有し、これら炭素原子の各々が２つの水素原子を保持しているものを表す。
【００３７】
「エポキシド」は、３つの環原子を有する環状エステルを表す。
【００３８】
ここでは、「ＰＵＦＡ誘導体」は、ＰＵＦＡ又はそのアルコール若しくはエステルであって、二重結合の少なくとも１つがシクロプロパン化又はエポキシ化されたものを表す。
【００３９】
ここでは、「ＭＵＦＡ誘導体」は、ＭＵＦＡ又はそのアルコール若しくはエステルであって、二重結合がシクロプロパン化又はエポキシ化されたものを表す。
【００４０】
ＰＫＣεの「選択的活性化」は、本発明のＰＵＦＡ誘導体化合物が、ＰＫＣεを、他の全てのＰＫＣアイソザイムより検出可能な程度に高く活性化することを意味している。具体的な態様では、ＰＵＦＡ誘導体は、例えば、以下で記述されるＰＫＣ活性化アッセイを用いた測定において、他のＰＫＣアイソザイムより、ＰＫＣεを、少なくとも１倍、２倍又は５倍活性化させる。活性化されると、プロテインキナーゼＣ酵素は、ＲＡＣＫタンパク質（活性化されたプロテインキナーゼＣタンパク質に対する膜結合レセプタ）によって、原形質膜へと移行する。一般的に、活性化されると、プロテインキナーゼＣ酵素は、ＲＡＣＫタンパク質によって、原形質膜へと移行する。ＰＫＣ活性化の他の徴候には、特異的なＣ末端セリン／スレオニン残基におけるホスファチジルイノシトールトリホスフェート依存キナーゼ（ＰＤＫ１）によるリン酸化及び少なくとも２つの更なるリン酸化、及び／又は、ＰＫＣファミリーの各酵素中の良く保存された配列の自己リン酸化が含まれる。ＰＫＣの活性化は、Sun and Alkon, Recent Patents CNS Drug Discov. 2006;1(2):147-56に記載されている。
【００４１】
「神経変性」は、ニューロンの死を含む、ニューロンの構造又は機能の進行性の喪失を表す。
【００４２】
本発明の目的に対して、「神経病」は、ＡＰＰのβアミロイド生成プロセスに関連したあらゆる中央神経系（ＣＮＳ）又は末梢神経系（ＰＮＳ）の病気を表す。これは、ニューロンの喪失、ニューロンの分解、ニューロンの脱髄、グリオーシス（即ちアストログリオーシス）、又は、異常タンパク質若しくはトキシン（Ａβなど）のニューロンでの若しくはニューロン外での蓄積を含むがこれらに限定されないニューロン細胞又は膠細胞の欠陥をもたらすかもしれない。
【００４３】
代表的な神経病の１つは、ＡＤである。他の代表的な神経病は、脳アミロイド血管障害としても参照されるコンゴレッド親和性アミロイド血管障害（ＣＡＡ）である。
【００４４】
用語「アルツハイマー病」又は「ＡＤ」は、Ａβデポジションが最終的には中央神経系の細胞中に至るであろう全ての状態を表す。１つの非限定的な態様では、Ａβ、特にはＡβ１−４２ペプチドが、ＡＰＰのβアミロイド生成代謝から形成される。ＡＤは、家族性の発現において遺伝性であるかもしれず、散発的であるかもしれない。ここでは、ＡＤは、家族性、散発性、並びに、表現型の発現に基づいたこれらの中間物及びサブグループを含んでいる。
【００４５】
他の神経病は、ダウン症候群（ＤＳ）である。ＤＳの患者は、（３０歳代又は４０歳代において、）ＡＤの特徴的な病変である、脳アミロイド（Ａβ）プラーク及び神経原線維のもつれ（ＮＦＴｓ）を必ず発現する。最近の研究は、Ａβ４２が、ダウン症候群の脳にデポジットされるこのタンパク質の最初期の形態であり、１２歳の若さの対象にも見られるかもしれず、可溶性のＡβは、妊娠２１週目において、ＤＳの対象の脳において検出可能であることが示されており、これらは、Ａβプラークの形成よりずっと早い。Gyure et al., Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 2000; 125:. 489-492。
【００４６】
ここでは、用語「対象」は、哺乳動物を含んでいる。
【００４７】
「薬学的に許容される」という語は、対象に投与されたときに、生理学的に耐えられ且つ典型的には有害反応をもたらさない分子及び組成物を表す。好ましくは、ここでは、用語「薬学的に許容される」は、国又は州政府の規制局に承認されているか、又は、米国薬局方、若しくは、一般的に認識されている、動物、特にはヒトへの使用のための他の薬局方にリストされていることを意味している。「薬学的に許容されるキャリア」は、活性成分が組み合わされてもよく且つこの組み合わせによって活性成分が対象に投与可能となる化学組成物を意味しており、化合物と共に投与される、希釈剤、アジュバント、添加剤又は賦形剤を表し得る。
【００４８】
用語「治療のために有効な投与量」又は「有効量」は、検出可能な治療上の応答をもたらす治療剤の量を表す。治療上の応答は、使用者（例えば臨床医）が治療の有効な応答であると認識するであろう如何なる応答であってもよく、例えば、症状及び代用の臨床指標の改善が含まれる。それゆえ、治療上の応答は、一般的には、ＡＤなどの病気又は状態の１つ以上の症状の改善又は阻害であるだろう。検出可能な治療上の応答には、症状又は病気が防がれたか、始まりが遅められたか、又は、治療剤によって弱められたという所見も含まれる。
【００４９】
用語「約」及び「およそ」は、測定の所定の性質又は精度において、測定された量の許容できる誤差の度合を一般的に意味しているとする。典型的で代表的な誤差の度合は、所定の値又は値の範囲の２０％以内であり、好ましくは１０％以内であり、より好ましくは５％以内である。或いは、特に生物学的な系では、用語「約」及び「およそ」は、所定の値と同じオーダーの大きさの範囲内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内の値を意味していてもよい。ここで与えられる数値は、他の記載がない限り、近似値である。即ち、用語「約」又は「およそ」は、明示的に述べられていなくても、そのように推測され得る。
【００５０】
本発明は、ＰＵＦＡｓ又はＭＵＦＡｓのシクロプロパン化又はエポキシ化された誘導体であって、１つの、複数の、又は全ての二重結合がシクロプロパン基又はエポキシド基によって置換されたものの使用を含んでいる。末端の官能基は、遊離のカルボン酸であってもよく、脂肪族又は芳香族アルコールとのメチルエステル、エチルエステル、又は他のアルキルエステルであってもよい。このアルコールは、明確に、グリセロール及びその誘導体をも含んでいる。グリセロール誘導体は、生物学的に重要である、なぜなら、脂肪酸は、グリセロールに共役して、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、又はホスファチジン酸の形態で、最も頻繁に見出されるからである。例えば、トリアシルグリセロールは、脂肪酸のカルボキシル基がグリセロールの３つ全ての炭素のヒドロキシル基とエステル化したものであり、トリアシルグリセロール又はトリグリセリドと呼ばれる。
【００５１】
カルボン酸をエステル化する目的は、負圧を除去することにより、血脳関門を通過する輸送を促進することにある。アルコール基の目的もまた、血脳関門を通過する輸送を促進することにある。
【００５２】
一態様では、本発明において使用される化合物の基礎をなす脂肪酸は、以下の構造を有するポリ不飽和脂肪酸である：
CH3(CH2)4(CH=CHCH2)x(CH2)yCOOH
ここで、Ｘは２〜６であり、Ｙは２〜６であり、メチレン又はポリメチレン中断ポリエンを含んでいる。代表的なポリ不飽和脂肪酸は、以下の構造を有している、リノール酸、γ−リノール、アラキドン酸、及びアドレン酸である：
リノール                CH3(CH2)4(CH=CHCH2)2(CH2)6COOH
γ−リノール            CH3(CH2)4(CH=CHCH2)3(CH2)3COOH
アラキドン              CH3(CH2)4(CH=CHCH2)4(CH2)2COOH
アドレン                CH3(CH2)4(CH=CHCH2)4(CH2)4COOH
これらは、オメガ−６ ＰＵＦＡｓである。
【００５３】
他の態様では、本発明において使用される化合物の基礎をなす脂肪酸は、以下の構造を有するポリ不飽和脂肪酸である：
CH3CH2(CH=CHCH2)x(CH2)yCOOH
ここで、Ｘは２〜６であり、Ｙは２〜６であり、メチレン又はポリメチレン中断ポリエンを含んでいる。代表的なポリ不飽和脂肪酸は、以下の構造を有している、α−リノレン酸、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸、エイコサテトラエン酸である：
α−リノレン            CH3CH2(CH=CHCH2)3(CH2)6COOH
エイコサテトラエン      CH3CH2(CH=CHCH2)4(CH2)5COOH
エイコサペンタエン      CH3CH2(CH=CHCH2)5(CH2)2COOH
ドコサヘキサエン        CH3CH2(CH=CHCH2)6(CH2)2COOH
これらは、オメガ−３ ＰＵＦＡｓとして知られている。
【００５４】
具体的な態様において、本発明の化合物は、ヒドロキシル基がアルコキシ基で置換され且つ少なくとも１つの二重結合がシクロプロパン化されたｃｉｓ−ＰＵＦＡのエステルである。この態様の出発材料は、以下の構造を有している：
CH3(CH2)4(CH=CHCH2)x(CH2)yCOOR 又は CH3CH2(CH=CHCH2)x(CH2)yCOOR
ここで、Ｒは、アルコール由来のアルキル基であり、このアルコールには、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、グリセロール、マニトール、及びソルビトールを含むがこれらに限定されないモノハイドリック及びポリハイドリックアルコールが含まれる。
【００５５】
更なる態様において、化合物は、少なくとも３つのシクロプロパン化された二重結合を含んでいる。
【００５６】
他の態様において、本発明において使用される化合物の基礎をなす脂肪酸は、以下の構造を有するモノ不飽和脂肪酸である：
CH3(CH2)xCH=CH(CH2)yCOOH
ここで、Ｘ及びＹは、３〜１１の奇数である。
【００５７】
本発明において使用される化合物の基礎となり得る代表的なモノ不飽和脂肪酸には、オレイン酸、エライジン酸、トウハク酸、カプロレン酸、ラウロレイン酸、リンデル酸、ミリストレイン酸、パルミトオレイン酸、バクセン酸、ガドレイン酸、エルカ酸、及びペトロセリン酸などのｃｉｓ−又はｔｒａｎｓ−モノ不飽和脂肪酸が含まれる。
【００５８】
本発明に係るエステルは、モノエステル又はポリエステルを意味している。脂肪酸のエステルには、メチル、プロピル、及びブチルエステル、並びに、プロピレングリコールなどのより複雑なアルコールから得られるエステルが含まれる。非限定的な態様において、Ｒ’は、直鎖状であっても分岐鎖状であってもよく、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、及びテトラデシルを含んでいる。エステルは、脂肪酸が脂肪アルコールにエステル結合で結合することにより形成されてもよい。
【００５９】
エステルは、脂肪族アルコールエステルを含むがこれに限定されないアルコールエステルであり得る。一態様において、アルコールエステルは、グリセロールエステルである。脂肪酸のグリセロールエステルは、グリセロール脂肪酸エステル、グリセロール酢酸脂肪酸エステル、グリセロール乳酸脂肪酸エステル、グリセロールクエン酸脂肪酸エステル、グリセロールコハク酸脂肪酸エステル、グリセロールジアセチル酒石酸脂肪酸エステル、グリセロール酢酸エステル、ポリグリセロール脂肪酸エステル、及び、ポリグリセロールが縮合されたリシノール酸エステルを含んでいる。
【００６０】
他の具体的な態様において、化合物は、少なくとも１つの二重結合がシクロプロパン化されたｃｉｓ−ＰＵＦＡのアルコールである。更なる態様では、化合物は、少なくとも３つのシクロプロパン化された二重結合を含んだｃｉｓ−ＰＵＦＡのアルコールである。これら化合物は、リノレイックアルコールジシクロプロパン（ＢＲ−１０５）又はリノレニックアルコールトリシクロプロパン（ＢＲ−１０４）を含むが、これらに限定されない。この態様では、Ｒ’は、直鎖又は分岐鎖アルコール又はフェノール性アルコールであり得る。
【００６１】
他の態様において、本発明の化合物は、少なくとも１つの二重結合がエポキシ基で置換されたｃｉｓ−ポリ不飽和脂肪酸又はその誘導体である。更なる態様では、化合物は、少なくとも３つのエポキシ化された二重結合を含んでいる。
【００６２】
具体的な態様において、化合物は、ｃｉｓ−ＰＵＦＡのエポキシ化されたエステルであり、脂肪族アルコールエステルを含むがこれに限定されない。エステルは、先にシクロプロパン化されたＰＵＦＡｓについて記載したのと同じエステルであり得る。更なる態様では、上記アルコールは、グリセロールなどの脂肪族アルコールエステルである。
【００６３】
他の具体的な態様では、化合物は、リノレイックアルコールジシクロプロパン又はリノレニックアルコールトリシクロプロパンなどの、エポキシ化されたｃｉｓ−ポリ不飽和脂肪酸である。上記アルコールは、先にシクロプロパン化されたＰＵＦＡｓについて記載したのと同じであり得る。
【００６４】
他の態様では、上記化合物には、オレイン酸、エライジン酸、エライジックアルコール、オレイルアルコール、及び１−モノリノレイル ｒａｃ−グリセロールなどのｃｉｓ−モノ不飽和脂肪酸（ｃｉｓ−モノエノイック酸）由来のシクロプロパン化又はエポキシ化された脂質を含まれる。代表的な化合物には、エライジックアルコールシクロプロパン（ＢＲ−１０６）、エライジン酸シクロプロパン（ＢＲ−１０７）及びオレイルアルコールシクロプロパン（ＢＲ−１０８）が含まれる。
【００６５】
更なる態様は、１つ又は２つ以上のエポキシ残基を含んだｃｉｓ−モノ不飽和脂肪酸若しくは不飽和脂肪酸、脂肪酸エステル、又は脂肪酸アルコール由来のシクロプロパン化された脂質が含まれ、例えば、ベルノリン酸メチルエステルシクロプロパン（例えばＢＲ−１０９）が挙げられる。
【００６６】
具体的な態様では、本発明で使用されるシクロプロパン化された化合物の基礎を形成するＰＵＦＡｓには、アラキドン酸（ＡＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及びエイコサペンタエン酸（ＲＰＡ）が含まれるが、これらに限定されない。本発明の方法における使用のための代表的な化合物には、ドコサヘキサエン酸メチルエステルヘキサシクロプロパン（ＢＲ−１１１）；エイコサペンタエン酸メチルエステルペンタシクロプロパン（ＢＲ−１１４）；及び、アラキドン酸メチルエステルテトラシクロプロパン（ＢＲ−１１５）が含まれる。
【００６７】
更に具体的な態様では、上記化合物は、以下の構造を有する、ドコサヘキサエン酸のシクロプロパン化されたＰＵＦＡ誘導体である。
【化１】
2018168170.tif 000003
【００６８】
ここで、Ｒは、水素原子又はアルキル基である。具体的な態様では、Ｒは、ＣＨ３（ＢＲ−１１１、又はＤＨＡ−ＣＢ６メチルエステル、又はメチル−３−（２−（（２−（（２−（（２−（（２−（（２−エチルシクロプロピル）メチル）シクロプロピル）メチル）シクロプロピル）メチル）−シクロプロピル）メチル）シクロプロピル）メチル）シクロプロピル）プロパネート）である。
【００６９】
他の具体的な態様では、ＰＵＦＡ誘導体は、以下の構造を有している：
【化２】
2018168170.tif 000004
【００７０】
この化合物は、ＢＲ−１１４（ＥＰＡ−ＣＰ５、又はメチル ４−（２（（２−（（２−（（２−エチルシクロプロピル）メチル）シクロプロピル）メチル）シクロプロピル）メチル）シクロプロピル）メチル）−シクロプロピル）ブタノエート メチルエステル）である。
【００７１】
更に別の具体的な態様では、ＰＵＦＡ誘導体は、以下の構造を有している：
【化３】
2018168170.tif 000005
【００７２】
この化合物は、ＢＲ−１１５（ＡＡ−ＣＰ４、又はメチル ４−（２−（（２−（（２−（（−ペンチルシクロプロピル）メチル）シクロプロピル）メチル）シクロプロピル）メチル）シクロプロピル）ブタノエート メチルエステル）である。
【００７３】
別の具体的な態様では、ＰＵＦＡ誘導体は、以下の構造を有している：
【化４】
2018168170.tif 000006
【００７４】
ここで、Ｒは、Ｈ又はアルキルエステルである。具体的な態様では、ＲはＣＨ３である。
【００７５】
本発明での使用が予期される天然のシクロプロパン化若しくはエポキシ化されたＭＵＦＡｓ、又はそれらのエステル若しくはアルコール誘導体には、マルベニン酸、ベルノリン酸、及びステルクリン酸が含まれる。代表的な化合物は、ベルノリン酸メチルエステル（ＢＲ−１１７）である。
【００７６】
合成方法
脂肪酸並びにそのエステル及びアルコールは、魚油、亜麻仁油、大豆、菜種油、又は藻類などの天然資源からの精製により入手又は製造することもでき、微生物酵素合成と化学合成との組み合わせを用いて合成することもできる。一例として、脂肪酸メチルエステルは、精製された／可食のタイプの油のトリグリセリドの、メタノール及び均一系アルカリ触媒を用いたトランスエステル化によって製造され得る。
【００７７】
炭化水素中の二重結合のシクロプロパン化の方法もよく知られている。一例として、改良シモンズ−スミス反応は、二重結合をシクロプロパンに変換する標準的な方法である。Tanaka and Nishizaki, Bioorg. Med. Chem. Let. 2003; 13: 1037-1040; Kawabata and Nishimura, J. Tetrahedron. 1967; 24: 53-58; 及び Denmark and Edwards, J. Org Chem. 1991; 56: 6974。この反応では、ヨウ化メチレン−ジエチル亜鉛などの金属カルベノイドを用いたアルケンの処理が、アルケンのシクロプロパン化をもたらす。Ito et al., Organic Syntheses. 1988; 6:327も参照のこと。メチルエステルのシクロプロパン化も、触媒としての白金（ＩＩ）アセテートの存在下、ジアゾメタンを用いることにより達成できる。Gangadhar et al., Journal of the American Oil Chemists’ Society. 1988; 65 (4): 601-606。
【００７８】
エポキシ化の方法もよく知られており、典型的には、有機溶媒中での脂肪酸とジオキシランとの反応を含んでいる。Sonnet et al., Journal of the American Oil Chemists’ Society. 1995; 72(2):199-204。一例として、ＰＵＦＡ二重結合のエポキシ化は、ジメチルジオキシラン（ＤＭＤ）をエポキシ化剤として用いて達成される。Grabovskiy et al., Helvetica Chimica Acta. 2006;  89(10): 2243-53。
【００７９】
治療方法
本発明は、ここで開示されるＰＵＦＡ誘導体を用いて、ＡＤ及び脳卒中などの病原性Ａβに関連した神経病を治療することを企図している。本発明は、ここで開示されるＰＵＦＡ誘導体を用いて、病原性Ａβに関連した神経病を予防することも企図している。特定のメカニズムに限定されるわけではないが、ＰＫＣεの選択的な活性化は、Ａβの生成の付随した減少を伴ったＴＡＣＥ活性の増大をもたらすかもしれない。しかしながら、これは、繊維芽細胞などの非ニューロン細胞中で主に起こっているようである。ＰＫＣεの活性化は、更に、ＡＤにおける病原性タウタンパク質の過剰リン酸化を減少させるかもしれない。ＰＫＣεの活性化は、更に、ＡＤ又はそれに引き続いた脳卒中において、シナプス生成を誘起するか又はアポトーシスを妨げるかもしれない。ＰＫＣεの活性化は、更に、ＧＳＫ−３βの阻害を通じて、Ａβを媒介とした神経毒から、ラットのニューロンを保護するかもしれない。ＰＫＣεアクティベータは、更に、ＡβのＰＫＣα／εを減少させる効果を和らげて、Ａβに誘起された変化を逆転又は妨害するかもしれない。他のあり得る作用メカニズムは、エンドセリン変換酵素などのＡβ分解酵素の活性化である。実施例に示された実験の結果は、これが作用メカニズムかもしれないと示唆している。
【００８０】
更に他のメカニズムは、ＰＫＣに共役されたＭ１及びＭ３ムスカリン受容体の刺激によるものであるかもしれず、この刺激は、ＴＡＣＥによる非アミロイド生成ＡＰＰのプロセシングを増大させると報告されている。Rossner et al., Prog. Neurobiol. 1998; 56: 541-569。ムスカリンアゴニストは、３ｘ−トランスジェニックＡＤマウスを認知欠陥から救い、部分的にはＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７非アミロイド生成性経路を活性化することにより、Ａβ及びタウ病理を減少させる。Caccamo et al., Neuron. 2006; 49:671-682。ムスカリン受容体シグナリングは、ＰＫＣに密接に結びついている。ムスカリン受容体ｍＲＮＡは、ＰＫＣによって制御され、Ｍ１ムスカリン受容体の活性化によりもたらされるニューロンの分化は、ＰＫＣによって媒介される。Barnes et al., Life Sci. 1997; 60:1015-1021;  Vandemark et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 2009; 329(2): 532-42。
【００８１】
本発明の方法による治療が企図されている他の障害には、うつ障害、双極性障害、統合失調症、リウマチ関節炎、癌、心臓血管病、タイプ２糖尿病、並びに、背景において言及されたものを含むがこれらに限定されないＰＵＦＡｓ又はＭＵＦＡｓが有益であることが示されている他のあらゆる障害が含まれる。
【００８２】
調剤及び投与
ＰＵＦＡ誘導体は、血脳関門を通過することを可能にするであろうあらゆるルートによる投与のために有用な投薬単位で製造されてよい。原形質からのＰＵＦＡｓは、脳中へと通過できることが実証されている。Rapoport et al., J. Lipid Res. 2001. 42: 678-685。代表的なルートには、経口、非経口、経粘膜、経鼻、吸入、又は経皮ルートが含まれる。非経口ルートには、静脈内、細動脈内、筋肉内、皮内、皮下、腹腔内、脳室内、髄腔内、及び頭蓋内投与が含まれる。
【００８３】
本発明の化合物は、慣用的な方法にしたがって調剤され得る。ＰＵＦＡ誘導体化合物は、標準的な処方で対象に提供されることができ、賦形剤、潤滑剤、希釈剤、香味剤、着色剤、及び崩壊剤などの薬学的に許容される全ての添加剤を含んでいてもよい。標準的な処方は、技術水準においてよく知られている。例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 20th edition, Mack Publishing Company, 2000を参照のこと。
【００８４】
一態様では、化合物は、固体の経口投薬型で処方される。例えばＰＵＦＡの経口投与のためには、医薬組成物は、結合剤（例えば、ゼラチン化されたトウモロコシでんぷん、ポリビニルピロリドン、若しくはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；フィラー（例えば、ラクトース、微結晶セルロース、若しくはリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、若しくはシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモでんぷん若しくはでんぷんグルコレートナトリウム）；又は、湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの薬学的に許容される補形薬を用いた慣用的な手段で調製された錠剤又はカプセルの形態をとってもよい。錠剤は、技術水準でよく知られている方法によりコートされていてもよい。経口投与のための液体製剤は、例えば、溶液、シロップ、又は懸濁液の形態であってもよく、使用前に水又は他の適切な賦形剤を用いて構成される乾燥製品として提示されてもよい。このような液体製剤は、懸濁化剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、又は水素化された可食脂肪）；エマルジョン化剤（例えば、レシチン又はアカシア）；非水溶性賦形剤（例えば、アーモンド油、油状エステル、エチルアルコール、又は分画された植物油）；及び保存料（メチル若しくはプロピルｐ−ヒドロキシベンゾエート、又はソルビン酸）などの薬学的に許容される添加剤を用いた慣用的な方法により調製されてもよい。これら製剤は、適切な場合には、バッファー塩、香味剤、着色剤、及び甘味剤を更に含んでいてもよい。
【００８５】
一例として、薬剤Ｏｍａｃｏｒ（登録商標）は、オメガ−３ ＰＵＦＡｓのエチルエステルの濃縮された配合（combination）を含んでいる。薬剤のラベルによると、各１ｇのカプセルは、少なくとも９００ｍｇのオメガ−３脂肪酸のエチルエステル、主にはＥＰＡ（４６５ｍｇ）及びＤＨＡ（３７５ｍｇ）を含んでいる。Ｏｍａｃｏｒ（登録商標）は、淡い黄色の油で満たされた透明の柔らかいゼラチンカプセル（１ｇ）として、１日に最大４回投与される。本発明のＰＵＦＡ化合物を投与するために類似の組成物が使用され得るが、本発明は、より少ない投薬量でのＰＵＦＡ誘導体の使用を企図している。ＰＵＦＡｓの安定なワックス−エステル製剤は、ｎ−３ ＰＵＦＡでエンリッチされた化学当量のエチルエステル及び長鎖アルコール（１８−２２炭素原子）のトランスエステル化によっても記載されている。Goretta et al., Lebensmittel-Wissenschaft und-Technologie. 2002; 35(5): 458-65。
【００８６】
他の態様では、ＰＵＦＡ化合物は、非経口投与用に処方される。上記化合物は、注入によって、例えばボーラス注入又は持続注入によって、非経口投与用に処方されてもよい。注入のための処方は、単位投薬型で、例えば、アンプル又は反復投与コンテナ中で、添加された保存料と共に提示されてもよい。組成物は、懸濁液、溶液、分散液、又は、油性若しくは水性の賦形剤中でのエマルジョンなどの形態をとっていてもよく、懸濁剤、安定剤、及び／又は分散剤などの処方剤を含んでいてもよい。
【００８７】
具体的な態様では、本発明のＰＵＦＡ誘導体は、疎水性キャリアと共に投与される。疎水性キャリアには、包摂錯体、ディスパージョン（ミセル、マイクロエマルジョン及びエマルジョンなど）、並びにリポソームが含まれる。代表的な疎水性キャリアは、包摂錯体、ミセル、及びリポソームである。これらの処方は、技術水準において知られている（Remington’s: The Science and Practice of Pharmacy 20th ed., ed. Gennaro, Lippincott: Philadelphia, PA 2003）。本発明のＰＵＦＡ誘導体は、疎水性キャリア中に、例えば、キャリア全体の少なくとも１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、又は９０重量％の濃度で組み込まれてもよい。加えて、例えば調剤を安定化するために、疎水性キャリア又は溶液中に、他の化合物が含められてもよい。
【００８８】
上述した処方に加えて、ＰＵＦＡ誘導体は、デポ製剤として処方されてもよい。このような長時間作用する調剤は、埋め込み（例えば皮下若しくは筋肉内）によって、又は、筋肉内注入によって投与されてもよい。それゆえ、例えば、化合物は、適切な高分子若しくは疎水性材料（例えば、許容される油中でのエマルジョン）又はイオン交換樹脂と共に処方されてもよく、難溶性の塩などの難溶性誘導体として処方されてもよい。
【００８９】
他の態様では、ＰＵＦＡ誘導体は、ベシクルで、特には、ミセル、リポソーム、又は、Ａｌｋｏｎらの米国特許出願第１１／６４８，８０８号に記載されている人工ＬＤＬ粒子で運搬されることができる。
【００９０】
投薬量は、１日当たり、１ｍｇ〜１０ｇ、好ましくは１０ｍｇ〜１ｇ、非常に好ましくは２５０ｍｇ〜５００ｍｇの化合物が届けられるように、適宜調製されてもよい。局所的な投与又は非経口処方のために調製するときには、それらは、最終的な調剤の０．０１〜６０重量％、好ましくは０．１〜３０重量％、非常に好ましくは１〜１０重量％を含んだ処方で作製されてもよい。最適な１日当たりの投薬量は、技術水準で知られている方法に決定され、患者の年齢や臨床的に関連する他のファクターによって影響されるであろう。
【００９１】
複合薬治療
ＰＵＦＡ化合物は、ＡＤ又はＡβに関連した他の神経病の患者を治療するために、この障害を治療するために用いられる他の薬剤と組み合わせて使用され得る。ＡＤの治療のために米国で認可されている代表的な薬剤には、Ａｒｉｃｅｐｒ（登録商標）（ドネペジル）、Ｅｘｅｌｏｎ（登録商標）（リバスチグミン）、Ｒｅｍｉｎｙｌ（登録商標）（ガランタミン）などのコリンステラーゼ阻害剤、及び、Ｎａｍｅｎｄａ（登録商標）（メマンチン）などのＮＭＤＡ受容体アンタゴニストが含まれるが、これらに限定されない。他の潜在的な治療剤には、プロテアーゼ阻害剤（例えば、米国特許第５，８６３，９０２号及び５，８７２，１０１号参照）；例えば、米国特許第７，０１１，９０１；６，４９５，５４０；６，６１０，７３４；６，６３２，８１２；６，７１３，４７６；及び６，７３７，４２０号に記載されているものなどのＡβ生成の阻害剤；米国特許第６，３０３，５６７及び６，６８９，７５２号に記載されているＡβ凝集のモジュレーター；並びに、米国特許第６，９８２，２６４；７，０３４，１８２；７，０３０，２３９に開示されているものなどのＢＡＣＥ阻害剤が含まれる。脳卒中の治療のために使用される代表的な薬剤には、アスピリン、組織プラスミノゲンアクティベータなどの抗血小板医薬、又は、他の凝血剤が含まれる。
【００９２】
特別の態様では、本発明は、ベンゾラクタムマクロサイクリックラクトンを含むがこれに限定されない他のＰＫＣアクティベータを用いた複合薬治療を企図している。ブリオスタチン−１は、ＰＫＣを調節し、ＡＰＰのＴＡＣＥによる非アミロイド生成性経路への開裂の増大をもたらすことが示されているマクロサイクリックラクトンである。ブリオスタチンは、ウミウシHermissenda crassicornisの記憶反復の持続を５００％以上増大させることができ、また、ラットにおける学習速度を劇的に増大させることができた。米国特許出願第１０／９１９，１１０号; Kurzirian et al., Biological Bulletin. 2006; 210(3): 201-14; Sun and Alkon, European Journal of Pharmacology. 2005;512(1): 43-51を参照のこと。他の限定されないＰＫＣアクティベータは、Ａｌｋｉｎらの係属中の米国特許出願第１２／０６８，７４２号に記載されている。
【００９３】
例えば内因性ＴＡＣＥ阻害剤の阻害又は内因性ＴＡＣＥアクティベータの増大によって、ＴＡＣＥを間接的に増大させる薬剤との組み合わせ。ＰＫＣを直接的に活性化するための代替アプローチは、内因性アクティベータであるジアセチルグリセロールのレベルを増大させることである。６−（２−（４−［（４−フルオロフェニル）フェニルメチレン］−１−ピペリジニル）エチル）−７−ｍエチル−５Ｈ−チアゾロ［３，２−ａ］ピリミジン−５−オン（Ｒ５９０２２）、及び、［３−［２−［４−（ｂｉｓ−（４−フルオロフェニル）メチレン］ピペリジン−１−イル）エチル］−２，３−ジヒドロ−２−チオキソ−４（１Ｈ）−キナゾリノン（Ｒ５９９４９）などのジアシルグリセロールキナーゼ阻害剤は、内因性リガンドであるジアシルグリセロールのレベルを向上させ、これにより、ＰＫＣの活性化をもたらす。Meinhardt et al. (2002) Anti-Cancer Drugs 13: 725。
【００９４】
更に他の態様は、ＢＡＣＥ阻害剤との複合治療である。ＢＡＣＥ阻害剤は既知であり、ＣｏＭｅｎｔｉｓ社によって所有され、ヒト臨床試験でポジティブな結果を示しているＣＴＳ−２１１６６を含んでいる。他のＢＡＣＥ阻害剤は、国際公開パンフレット第２００７／０１９０８０号、及び、Baxter et al., Med. Chem. 2007; 50(18): 4261-4264に記載されている。
【００９５】
複合治療で使用される化合物は、適合性がある場合には、本発明のＰＵＦＡ化合物と同じ処方で投与されることができ、別個の処方で投与されることもできる。
【００９６】
治療の評価
本発明のＰＵＦＡ誘導体を用いた治療の評価は、病気の症状又は代用の臨床指標の改善の評価によって為され得る。例えば、治療されたＡＤ対象の記憶又は認知能力の改善は、病原性Ａβの蓄積の低減が存在することを示唆するかもしれない。認知フェノタイプには、健忘症、失語症、失行症、及び失認症が含まれるが、これらには限定されない。精神医学的な症状には、人格変化、うつ、幻覚及び妄想が含まれるが、これらには限定されない。限定されない一例として、the Diagnostic and Statistical Manual of Mental disorders, 4th Edition (DSM-IV-TR) (the American Psychiatric Associationにより発行)は、アルツハイマー型の認知症についての基準を含んでいる。
【００９７】
ＡＤの表現型の顕在は、Ａβプラークの直接（イメージング）又は間接（生化学的）検出などの身体的なものであってもよい。Ａβのin vivoイメージングは、放射性ヨウ化フラボン誘導体を撮像剤として用いること（Ono et al., J Med Chem. 2005;48(23):7253-60）により、及び、脳血関門を通過してＡβプラークに結合することが示された、４０残基の放射性ヨウ化Ａペプチド（１２５Ｉ−ＰＵＴ−Ａ １−４０を産出する）に共役したプトレシンなどのアミロイド結合色素を用いて、達成することができる。Wengenack et al., Nature Biotechnology. 2000; 18(8): 868-72。Ａβのイメージングは、スチルベン［１１Ｃ］ＳＢ−１３及びベンゾチアゾール［１１Ｃ］６−ＯＨ−ＢＴＡ−１（［１１Ｃ］ＰＩＢとしても知られている）を用いても示されている。Verhoeff et al., Am J Geriatr Psychiatry. 2004; 12:584-595。
【００９８】
末梢血液中におけるＡβ（１−４０）の定量は、リニアイオントラップ中のタンデム型マススペクトロメトリーと組み合わされた高速液体クロマトグラフィーを用いて実証されている。Du et al., J Biomol Tech. 2005;16(4):356-63。アルツハイマー患者の脳脊髄液中における単一Ａβタンパク質の凝集体の蛍光相関スペクトロスコピーによる検出も記載されている。Pitschke et al., Nature Medicine. 1998; 4: 832-834。米国特許第５，５９３，８４６号は、可溶性Ａβを検出するための方法を記載している。抗体を用いたＡβペプチド及び終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ）の間接的な検出も記載されている。最後に、発色性基質を用いた脳脊髄液中のＢＡＣＥ−１活性の増大の生化学的な検出もまた、ＡＤの診断的又は兆候的な指標として前提されている。Verheijen et al., Clin Chem. 2006; 52:1168-1174。
【００９９】
ＡＤ評価の今日的な基準には、初期の進行性で重大な一過性記憶喪失に加えて、ＡＤの１つ又は２つ以上の異常バイオマーカー（生物学的インディケータ）、例えば、ＭＲＩ上で示される側頭葉の萎縮（衰弱）；脳脊髄液中におけるＡβタンパク質濃度の異常；脳のＰＥＴスキャン上における、グルコース代謝の減少を示す特徴的なパターン；及び近親家族内に関連した遺伝子変異が含まれる。
【０１００】
実施例
例１：脂肪酸メチルエステル、シクロプロパン化された脂肪酸メチルエステルの合成  シクロプロパン化された脂肪酸の合成。ポリ不飽和脂肪酸のメチルエステルは、クロロヨウ化メタン及びジエチル亜鉛を用いた改良シモンズ−スミス反応を用いてシクロプロパン化された（Tanaka et al., Bioorg. Med. Chem. Let. 2003; 13: 1037-40; Furukawa et al., Tetrahedron. 1967; 53-58; Denmark et al., J. Org. Chem. 1991; 56: 6974-81）。全ての装置が６０℃で１時間に亘ってベークされ、乾燥窒素を含んだ炎を用いて乾燥された。スターラーと温度計とを備えた１００ｍｌの３口丸底フラスコは、氷−ドライアイス混合物で包囲され、２５ｍｌのジクロロメタン中の１．２５ｇ（４．２４ｍｍｏｌ）リノール酸メチルエステル又はドコサヘキサエン酸メチルエステルで満たされ、Ｎ２でバブリングされた。ヘキサン中のジエチル亜鉛の１Ｍ溶液（５１ｍｌ、５４．９４ｍｍｏｌ）が、２４インチ２０ゲージの注射針を用いて嫌気的に加えられ、−５℃に冷却された。定常的に攪拌しながら、ジヨウ化メタン（８．２ｍｌ、１０１．８８ｍｍｏｌ）又は塩化ヨウ化メタン（ＣｌＣＨ２Ｉ）が、１秒に１滴の割合で滴下された。滴下速度は、反応混合物を２℃未満に保持するために、必要に応じて減らされた。反応混合物は、反応の途中で濁り、不溶性の白色亜鉛生成物が遊離された。フラスコは密封され、混合物は１時間反応させられ、その後、２時間かけて次第に室温へと戻された。
【０１０１】
フード内での爆発性残留物の形成を防ぐため、ジエチル亜鉛は、蒸発除去されなかった。混合物は、過剰のジエチル亜鉛を全て分解させるため、攪拌下、１００ｍｌの水中にゆっくりと注がれた。エタンが放出された。混合物は、ガラスの遠心機チューブ中で５０００ｒｐｍの速度で遠心分離され、上方の水層が除去された。白色の沈殿物がＣＨ２Ｃｌ２を用いて抽出され、有機層と合わされた。有機層は水により洗浄され、遠心分離された。生成物は、１％の酢酸エチルを加えたヘキサンを用いたシリカゲルＧ ＴＬＣで分析され、ヘキサン中の次第に増大する１−１０％の濃度の酢酸エチルを用いたシリカゲルクロマトグラフィーによって精製され、窒素下でエバポレートされて、メチルエステルが無色の油として残された。
【０１０２】
シモンズ−スミス反応は、出発原料の立体化学を保持する。Furukawa et al., Tetrahedron. 1967; 53-58。ドコサヘキサエン酸メチルエステルは、ＤＨＡ−ＣＰ６に、９０〜９５％の収率で変換された。生成物は、無色の油であり、エタノール中で２０２ｎｍに単一のピークを有し、Ｉ２とは反応しなかった。ＩＲスペクトラムは、３０７０ｃｍ−１と１４５０ｃｍ−１とに、シクロプロパン環の吸収を示した。同じ条件で、エイコサペンタエン酸メチルエステルがＥＰＡ−ＣＰ５へと変換され、アラキドン酸メチルエステルがＡＡ−ＣＰ４へと変換された。リノール酸メチルエステルは、ＤＣＰ−ＬＡメチルエステルへと変換され、既知のサンプルと同一であった。
【０１０３】
メチルエステルの加水分解。メチルエステル（０．１５ｇ）が、１ｍＬの１Ｎ ＬｉＯＨ及び１ｍｌのジオキサンに溶解された。ジオキサン及びメタノールが、それが均質になるまで加えられ、溶液が６０゜で終夜攪拌された。生成物がＣＨ２Ｃｌ２で抽出され、遠心分離された。水層及び白色の界面が水で再抽出され、白色層が形成されなくなるまで洗浄された。生成物はＮ２下でエバボレートされ、シリカゲル上のクロマトグラフィーを用いて精製された。生成物である無色の油は、ヘキサン中の２０％酢酸エチルに溶出された。その純度は、１０％酢酸エチル／ヘキサン中でのＴＬＣ及び２０５ｎｍにおけるＵＶ検出を用いたＣ１８ＲＰ−ＨＰＬＣによってチェックされた。
【０１０４】
エポキシ基は、慣用的な方法により、例えば、ｍ−クロロ過安息香酸又はｔ−ブチルヒドロペルオキシドを用いた適切なアルケンの酸化により導入することができる。
【０１０５】
他の合成された化合物には、図１に示したものが含まれる（ＢＲ−１０１〜ＢＲ−１１８）。
【０１０６】
例２：精製されたＰＫＣεのドコサヘキサエン酸を用いた活性化
プロテインキナーゼＣアッセイ。組み換えＰＫＣ（１ｎｇのアルファ又はイプシロンアイソフォーム）は、１０μＭのヒストン、５ｍＭのＣａＣｌ２、１．２μｇ／μｌのホスファチジル−Ｌ−セリン、０．１８μｇ／μｌの１，２−ジオクタノイル−ｓｎ−グリセロール（ＤＡＧ）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．８ｍＭのＥＤＴＡ、４ｍＭのＥＧＴＡ、４％のグリセロール、８μｇ／ｍｌのアプロチニン、８μｇ／ｍｌのロイペプチン、及び２ｍＭのベンズアミジンの存在下、ＢＲ−１０１（ＤＣＰ−ＬＡ）と混合された。
【０１０７】
培養混合物は、１０マイクロリットルの総量で、３７℃で１５分に亘って保温された。反応は、反応混合物を、１×２ｃｍ片のリン酸セルロース紙（Ｗｈａｔｍａｎ Ｐ８１）上にスポットし、直ちに０．５％のＨ３ＰＯ４中で１時間に亘って２回洗浄することによって終了させた。リン酸セルロース片は、シンチレーションカウンタ中でカウントされた。幾つかの実験では、ホスファチジルセリン、ジアシルグリセロール、及び／又はカルシウムが除去された。
【０１０８】
ＤＨＡメチルエステルは、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＥ）から購入された。ＰＫＣアイソザイムは、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入された。精製ＰＫＣεは、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから購入された。
【０１０９】
結果
精製されたＰＫＣεを用いたＰＫＣ測定は、試験された最小の濃度（１０ｎＭ）において、化合物ＢＲ−１０１が、ＰＫＣεの２．７５倍の活性化をもたらすことを示した（図２）。ＰＫＣαは、影響されなかった（データは示していない）。化合物ＢＲ−１０２は、活性化されていないＰＫＣεに対して約１．７５倍のＰＫＣεの活性化を選択的にもたらした。ＰＫＣεの活性化におけるこれら化合物の低濃度での有効性は、それらが優れた治療候補であるだろうことを示唆している。
【０１１０】
例３：他のＰＫＣアクティベータを用いた精製又は細胞ＰＫＣεの活性化
材料。培地は、Ｋ−Ｄ Ｍｅｄｉｃａｌ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ）又はＩｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から入手された。Ａβ１−４２は、Ａｎａｓｐｅｃ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）から購入された。ポリ不飽和脂肪酸メチルエステルは、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩから入手された。他の薬品は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手された。ＰＫＣアイソザイムは、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手された。精製ＰＫＣεは、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから購入された。
【０１１１】
細胞培養。ラット海馬Ｈ１９−７／ＩＧＦ−ＩＲ細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）は、ポリ−Ｌ−リシンでコートされたプレート上に置かれ、ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ中、３５℃で、約５０％の被覆が得られるまで、数日に亘って成長させられた。細胞は、培地を１０ｎｇ／ｍｌの塩基性繊維芽細胞成長因子を含んだ５ｍｌのＮ２培地（３９℃）に置き換えることによりニューロン表現型への分化を誘起され、３７℃でＴ−７５フラスコ中で成長させられた。ヒトＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞（ＡＴＣＣ）は、４５％Ｆ１２Ｋ／４５％ＭＥＭ／１０％ＦＣＳ中で培養された。マウスＮ２Ａ神経芽細胞は、グルタミンを含まないＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ中で培養された。１８日目の胚からのラット海馬ニューロン。
【０１１２】
Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットの脳は、０．５ｍＭのグルタミンと２５μＭのグルタメート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を含んだＢ−２７ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ媒体中の、ポリ−Ｄ−リシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）でコートされた１２又は９６ウェルプレート上に置かれ、グルタメートを含んでいない培地中で３日間に亘って培養された。ニューロン細胞は、３７℃に保持された培養機中で、５％のＣＯ２下、１４日間に亘って成長させられた。
【０１１３】
培養された細胞に関する全ての実験は、他の言及がない限り、３回分実行された。全てのデータポイントは、平均値±ＳＥで表示されている。ＢＲ−１０１（ＤＣＰ−ＬＡ）は、全ての実験において遊離酸として使用された。他方、ＢＲ−１１１（ＤＨＡ−ＣＰ６）、ＢＲ−１１４（ＥＰＡ−ＣＰ５）、及びＢＲ−１１６（ＡＡ−ＣＰ４）は、メチルエステルとして使用された。
【０１１４】
プロテインキナーゼＣアッセイ。ラットの海馬細胞が培養され、０．２ｍｌ均質化バッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、５０ｍＭのＮａＦ、１μｇ／ｍｌのロイペプチン、及び、０．１ｍＭのＰＭＳＦ）中に掻き落とされ、Ｍａｒｓｏｎｉｘマイクロプローブソニケータ中でのソニケーション（５秒、１０Ｗ）によって均質化された。ＰＫＣを測定するため、１０μｌの細胞ホモジェネート又は精製されたＰＫＣアイソザイム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから購入）が、１０μＭのヒストン、４．８９ｍＭのＣａＣｌ２、１．２μｇ／μｌのホスファチジル−Ｌ−セリン、０．１８μｇ／μｌの１，２−ジオクタノイル−ｓｎ−グリセロール、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．８ｍＭのＥＤＴＡ、４ｍＭのＥＧＴＡ、４％のグリセロール、８μｇ／ｍｌのアプロチニン、８μｇ／ｍｌのロイペプチン、及び２ｍＭのベンズアミジン中、３７℃で１５分間に亘って保温された。０．５μＣｉ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰが添加され、３２Ｐ−リン酸化タンパク質の形成が、上述したリン酸化セルロース上での吸収によって測定された。Nelson and Alkon, J. Neurochemistry. 1995; 65: 2350-57。ＢＲ−１０１（ＤＣＰ−ＬＡ）及び類似化合物による活性化の測定については、ＰＫＣ活性化は、Ｋａｎｎｏらによって記載されているように、ジアセチルグリセロール及びホスファチジルセリンの非存在下で測定され、ＰＫＣδ、ε、η及びμは、Kanno et al., J. Lipid Res. 2006; 47: 1146-50に記載されているように、添加ＥＧＴＡ及びＣａＣｌ２の非存在下で測定された。高いＣａ２＋はＰＫＣホスファチジルセリン結合サイトと相互作用して活性化を阻害するため、低濃度のＣａ２＋が使用された。ブリオスタチンによる活性化の測定については、他の言及がない限り、１，２−ジアセチルグリセロールは省略された。
【０１１５】
結果及び考察
それらのＰＫＣアイソザイム特異性を決定するために、新規化合物は、精製されたＰＫＣと共に５分間に亘って前保温され、ＰＫＣ活性は、放射分析的に測定された。上記例２に示した通り、ＢＲ−１０１（ＤＣＰ−ＬＡ）は、１０ｎＭにおいてＰＫＣイプシロンの有効なアクティベータであったが、他のＰＫＣアイソフォームに対しては、比較的小さな効果を有している（データは示していない）。より高い濃度のＢＲ−１０１（ＤＣＰ−ＬＡ）は、ＰＫＣδ（約１−１００μＭ）を部分的に阻害し、ＰＫＣγ（５０−１００μＭ）を活性化した（データは示していない）。
【０１１６】
それぞれがドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸、及びアラキドン酸のシクロプロパン化された誘導体であるＢＲ−１１１（ＤＨＡ−ＣＰ６）、ＢＲ−１１４（ＥＰＡ−ＣＰ５）、及びＢＲ−１１５（ＡＡ−ＣＰ４）は、精製されたＰＫＣεを同程度活性化した（図３）。ＰＫＣを活性化するために必要な濃度は、ＢＲ−１０１（ＤＣＰ−ＬＡ）より約１００倍低く、より高い親和性を示唆している。シクロプロパン化されたリノレニル及びリノレイルアルコール（ＢＲ−１０４及びＢＲ−１０５）、エポキシステアリン酸（ＢＲ−１１６）、並びに、ベルノリン酸メチルエステル（ＢＲ−１１７）は、ＰＫＣに対して、殆んど又は全く効果を有さなかった。シクロプロパン化されたベルノリン酸メチルエステル（ＢＲ−１０９）は、１μＭより高い濃度で、ＰＫＣεを阻害した（図４）。
【０１１７】
ブリオスタチン、グニジマクリン及びフォルボールエステルを含む、ジアシルグリセロール結合サイトに結合するＰＫＣアクティベータは、ＰＫＣ活性の過渡的な活性化と、その後の長期の下方制御とをもたらす。Nelson et al., Trends in Biochem. Sci. 2009; 34: 136-45。これは、培養されたラット海馬細胞において確認されている。ラットＨ１９−７／ＩＧＦ−ＩＲ細胞を（０．０４ｎＭ及び０．２ｎＭの）ブリオスタチンと共に培養すると、３０分間続く２倍の活性化をもたらし、その後、２４時間でベースラインに戻る２０％の下方制御をもたらした（データは示していない）。対照的に、ＤＣＰ−ＬＡにさらされたＰＫＣは、少なくとも５時間に亘って高められた（図５）。この持続的な活性化は、第１ニューロンでのみ観察された。
【０１１８】
ブリオスタチンは、フォルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）より高いＰＫＣへの親和性を有しているが（ＥＣ５０＝１．３５ｎＭ ｖｓ．１０ｎＭ）、ブリオスタチンは、ＰＫＣの下方制御にあたっては、ＰＭＡよりずっと低い有効性しか有していない。ＰＫＣ活性は、８ｈにおいて、フォルビノールエステルによって強く下方制御されるが、ブチオスタチンで処理された細胞中でのＰＫＣは、ベースライン上及びその付近である（データは示していない）。この差異は、da Cruz e Silva et al. J. Neurochem. 2009: 108: 319-30によって報告された、ＰｄＢｕによって生成されるＡβの増大を説明するかもしれない。これらの研究者は、培養されたＣＯＳ細胞に、８時間に亘って１μＭのＰｄＢｕを適用し、Ａβの増大を観察した。この増大は、フォルビノールエステルによるＰＫＣの下方制御に帰せられており、これらの結果と整合している。下方制御は、ＤＣＰ−ＬＡ及び関連化合物については、測定できなかった。
【０１１９】
例４：Ａβの生成及び分解に対するＰＫＣアクティベータの効果
細胞培養。細胞培養は、先に例３で記載したのと同様にして行われた。
【０１２０】
Ａβ測定及び細胞生存アッセイ。Ａβは、Ａβ１−４２ヒト蛍光分析ＥＬＩＳＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、製造者の説明書に従って測定された。結果は、Ｂｉｏｔｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ ＨＴ マイクロプレートリーダー中で測定された。ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ及びＣｙＱｕａｎｔ ＮＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は、製造者の説明書に従った。
【０１２１】
結果及び考察
ＰＫＣεの活性化のＡβ生成への効果を測定するため、我々は、多量のＡβを生成する、ヒトＡＰＰＳｗｅ／ＰＳ１Ｄでトランスフェクトされたマウスニューロ２ａ（Ｎ２ａ）神経芽細胞を用いた。Petanceska et al., J. Neurochem. 1996; 74: 1878-84。これら細胞を２４時間に亘って種々の濃度のＰＫＣアクティベータ：ブリオスタチン、ＢＲ−１０１（ＤＣＰ−ＬＡ）、及びＢＲ−１１１（ＤＨＡ−ＣＰ６）と共に培養すると、細胞内（図７ａ）及び分泌（図７ｂ）Ａβの双方のレベルが大幅に減少した。ジアシルグリセロール結合差異とへの結合によりＰＫＣを活性化するブリオスタチンでは、阻害は二相性であり、２０ｎＭ以上の濃度では、正味の効果をもたらさなかった。これは、このクラスのＰＫＣアクティベータの、高濃度で使用された場合にＰＫＣを下方制御するという能力によって説明されるかもしれない。対照的に、ＰＫＣのホスファチジルセリンサイトに結合するＢＲ−１０１（ＤＣＰ−ＬＡ）及びＢＲ−１１１（ＤＨＡ−ＣＰ６）は、１０〜１００μＭの濃度まで単調に増大する阻害を示し、より高い濃度でも下方制御の徴候を示さなかった。
【０１２２】
ＰＫＣアクティベータによるＡβのレベルの減少がＡβ合成の阻害によるものかＡβ分解の活性化によるものかを決定するために、我々は、ＢＲ−１１１（ＤＨＡ−ＣＰ６）（０．０１〜１０μＭ）と低濃度（１００ｎＭ）の外因性モノメリックＡβ−４２とを、培養されたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞へと適用した。この濃度のＡβは、測定可能な毒性又は細胞死をもたらすには低すぎる。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞は微量のＡβしか生成しないため、この実験は、ＰＫＣアクティベータのＡβ分解を促進させる能力の有効なテストであった。２４時間後、殆んどのＡβは細胞中に取り込まれ、培地中におけるＡβ濃度は検出不能であった。０．０１〜１０μＭのＤＨＡ−ＣＰ６のこれら細胞への添加は、Ａβの細胞内レベルを４５−６３％減少させた。これは、ＰＫＣεアクティベータが、外因性Ａβの分解速度を増大させたことを示している（図８）。
【０１２３】
ＤＨＡ−ＣＰ６、ブリオスタチン、及びＤＣＰ−ＬＡは、ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ及びＣｙＱｕａｎｔ着色によって測定された細胞生存又は細胞増殖に影響を有さなかった（図１１ａ及びｂ）。このことは、Ａβ生成の低減は、細胞増殖又は細胞生存の変化によってもたらされたものでないことを示している。
【０１２４】
例５：ＰＫＣアクティベータのＴＡＣＥ活性への効果
ＴＡＣＥアッセイ。ＴＡＣＥは、５μｌの細胞ホモジェネート、３μｌのバッファ（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ７．４＋２５ｍＭのＮａＣｌ＋４％のグリセロール）、及び１μｌの１００μＭ ＴＡＣＥ基質ＩＶ（Ａβｚ−ＬＡＱＡＶＲＳＳＳＲ−ＤＰａ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を、１．５ｍｌのポリプロピレン遠心機チューブ中で、３７゜で２０分間に亘って保温することによって測定された（Jin et al., Anal. Biochem. 2002; 302: 269-75）。反応は、４℃まで冷却することによって停止された。サンプルは、１ｍｌに希釈され、蛍光（ｅｘ＝３２０ｎｍ，ｅｍ＝４２０ｎｍ）が、Ｓｐｅｘ Ｆｌｕｏｒｏｌｏｇ ２ 分光蛍光計で素早く測定された。
【０１２５】
結果及び考察
以前の研究者は、フォルボール１２−ミリステート１３−アセテートなどのＰＫＣアクティベータは、ｓＡＰＰαの増大及びＡβの減少に関連したＴＡＣＥ活性の大きな増大をもたらし、ＴＡＣＥとＢＡＣＥ１とがＡＰＰ基質の利用可能性について競合していること、及び、ＰＫＣアクティベータがこの競合をＴＡＣＥに有利にシフトさせることを示唆していることを報告した。Buxbaum et al., J. Biol. Chem. 1998; 273: 27765-67; Etcheberrigaray et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006: 103:8215-20。しかしながら、これらの初期研究の多くは、繊維芽細胞及び他の非ニューロン細胞のタイプで行われたものであり、これら細胞のタイプは、ＰＫＣアクティベータに対して、ニューロンとは異なった応答をするようである。例えば、Ｅｔｃｈｅｂｅｒｒｉｇａｒａｙらは、１０ｐＭ〜１００ｐＭのブリオスタチンによるヒト繊維芽細胞におけるＰＫＣの活性化がα−セクレターゼ活性の初期速度を、それぞれ１６倍及び１３２倍に増大させることを見出した（Etcheberrigaray et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006）。しかしながら、ヒトＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞、Ｎ２ａマウス神経芽細胞（図９ａ）、及びラット海馬由来の第１ニューロン（図９ｂ及びｃ）中では、ＰＫＣアクティベータであるブリオスタチン、ＢＲ−１０１（ＤＣＰ−ＬＡ）及び／又はＢＲ−１１１（ＤＨＡ−ＣＰ６）は、ＴＡＣＥ活性の小さな増大しかもらさなかった。このことは、ＰＫＣアクティベータによるニューロン中のＡβレベルの如何なる低減も、ＴＡＣＥの活性化以外の他のメカニズムを原因としているに違いないことを示唆している。
【０１２６】
例６：ＰＫＣアクティベータのエンドセリン変換酵素活性への効果
ＥＣＥアッセイ。ＳＨ−Ｓ７５７神経芽細胞が、ブリオスタチン（０．２７ｎＭ）、ＢＲ−１０１（ＤＣＰ−ＬＡ）（１μＭ）、及びＢＲ−１１１（ＤＨＡ−ＣＰ６）（１μＭ）と共に培養された。エンドセリン変換酵素（ＥＣＥ）が、Johnson and Ahn, Anal. Biochem. 2000; 286: 112-118の方法を用いて、蛍光分析的に測定された。細胞ホモジェネート（２０μｌ）のサンプルが、５０ｍＭのＭＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ６．０、０．０１％のＣ１２Ｅ１０（ポリオキシエチレン−１０−ラウリルエーテル）、及び１５μＭのＭｃａＢＫ２（７−メトキシクマリン−４−アセチル［Ａｌａ７−（２，４−ジニトロフェニル）Ｌｙｓ９］−ブラジキニン トリフルオロ酢酸塩）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中で培養された。３７℃で６０分後、トリフルオロ酢酸を０．５％まで加えることにより、反応がクエンチされた。サンプルが水で１．４ｍｌまで希釈され、ｅｘ＝３３４ｎｍ、ｅｍ＝３９８ｎｍにおいて、蛍光が測定された。
【０１２７】
結果と考察
Ａβは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、インスリン分解酵素（インスリシン）、ネプリシン、及びＥＣＥを含む多数の酵素によって分解され得る。ＰＫＣεの過剰発現はＥＣＥを活性化することが報告されている（Choi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006; 103: 8215-20）ため、我々は、ＰＫＣアクティベータのＥＣＥへの効果を調べた。ブリオスタチン、ＢＲ−１０１（ＤＣＰ−ＬＡ）及びＢＲ−１１１（ＤＨＡ−ＣＰ６）は、全て、ＥＣＥ活性の持続的な増大をもたらした（図１０）。ＥＣＥはジアセチルグリセロール結合Ｃ１ドメインを有さないため、このことは、ブリオスタチンによる活性化が、ＥＣＥの直接的な活性化によるものではなく、ＥＣＥ又はＥＣＥを活性化する中間体のＰＫＣによるリン酸化に起因していたに違いないことを示唆している。この結果は、ＰＫＣアクティベータによるＥＣＥの間接的な活性化が、患者におけるＡβのレベルを低減させる有用な手段となり得ることも示唆している。
【０１２８】
本発明のＰＵＦＡ誘導体などのＰＫＣεを特異的に活性化する化合物の利点は、フォルビノールエステル及び類似の１，２−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）アナログと比べてより低い下方制御をもたらすことにある。ＤＡＧに基づいたアクティベータへのＰＫＣの二相的な応答は、ＰＫＣアクティベータが、ある時点ではＡβレベルを減少させるが他の時点ではそれを増大させるかもしれないことを意味している。da Cruz e Silva et al., J. Neurochem. 2009; 108: 319-330。意図とは逆の効果を避けるためには、注意深い投薬及び注意深い患者のモニタリングが必要であろう。この新しいクラスのＰＫＣアクティベータは、ＰＫＣを下方制御する能力が比較的低いために、この問題は回避され得る。
【０１２９】
特許、特許出願、刊行物、製品の記載及びプロトコルは、この出願の全体に亘って引用されている。これらの開示内容は、その全体が、あらゆる目的について、参照によって、ここに組み込まれている。
【図１】
2018168170.tif 000007
【図２】
2018168170.tif 000008
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2018168170.tif 000017
【図１１】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年7月10日(2018.7.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテインキナーゼＣのイプシロンアイソフォームを活性化する方法であって、前記プロテインキナーゼＣの前記イプシロンアイソフォームを、少なくとも１つの二重結合がシクロプロパン環／基によって置換されたｃｉｓ−ポリ不飽和脂肪酸エステル又はｃｉｓ−ポリ不飽和脂肪アルコールである有効量の化合物に接触させることを含んだ方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２９】
特許、特許出願、刊行物、製品の記載及びプロトコルは、この出願の全体に亘って引用されている。これらの開示内容は、その全体が、あらゆる目的について、参照によって、ここに組み込まれている。
以下に、本願の出願当初の請求項を実施の態様として付記する。
［１］  プロテインキナーゼＣのイプシロンアイソフォームを活性化する方法であって、前記プロテインキナーゼＣの前記イプシロンアイソフォームを、少なくとも１つの二重結合がシクロプロパン環／基によって置換されたｃｉｓ−ポリ不飽和脂肪酸エステル又はｃｉｓ−ポリ不飽和脂肪アルコールである有効量の化合物に接触させることを含んだ方法。
［２］  全ての前記二重結合がシクロプロパン環／基によって置換されている［１］に記載の方法。
［３］  前記脂肪酸は、CH3(CH2)4(CH=CHCH2)x(CH2)yCOOH 又は CH3CH2(CH=CHCH2)x(CH2)yCOOHの構造を有しており、Ｘは２〜６であり、Ｙは２〜６である［１］に記載の方法。
［４］  前記ポリ不飽和脂肪酸は、アラキドン酸、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸、リノール酸、γ−リノール酸、α−リノレン酸、エイコサテトラエン酸、アドレン酸、又はこれらの誘導体である［１］に記載の方法。
［５］  前記化合物は、シクロプロパン化されたｃｉｓ−ポリ不飽和脂肪酸エステルである［１］に記載の方法。
［６］  前記化合物は、シクロプロパン化されたドコサヘキサエン酸メチルエステル（ＢＲ−１１１）、エイコサペンタエン酸メチルエステル（ＢＲ−１１４）、又は、シクロプロパン化されたアラキドン酸メチルエステル（ＢＲ−１１５）である［５］に記載の方法。
［７］  前記エステルは脂肪酸アルコールエステルである［５］に記載の方法。
［８］  前記アルコールは脂肪族アルコールである［７］に記載の方法。
［９］  前記脂肪族アルコールはグリセロールである［８］に記載の方法。
［１０］  前記化合物は、シクロプロパン化されたｃｉｓ−ポリ不飽和脂肪アルコールである［１］に記載の方法。
［１１］  前記化合物は、リノレイックアルコールジシクロプロパン（ＢＲ−１０５）又はリノレニルアルコールトリシクロプロパン（ＢＲ−１０４）である［１０］に記載の方法。
［１２］  前記化合物の濃度は、約５ｎＭ〜約１０μＭの範囲内にある［１］に記載の方法。
［１３］  プロテインキナーゼＣのイプシロンアイソフォームを活性化する方法であって、前記プロテインキナーゼＣの前記イプシロンアイソフォームを、二重結合がシクロプロパン環／基によって置換された、ｃｉｓ−モノ不飽和脂肪酸、ｃｉｓ−モノ不飽和脂肪酸エステル、又はｃｉｓ−モノ不飽和脂肪アルコールである有効量の化合物に接触させることを含んだ方法。
［１４］  前記脂肪酸は、CH3(CH2)xCH=CH(CH2)yCOOHの構造を有しており、Ｘ及びＹは３〜１１の奇数である［１３］に記載の方法。
［１５］  前記ｃｉｓ−モノ不飽和脂肪酸又は脂肪アルコールは、オレイン酸、エライジン酸、エライジックアルコール、オレイルアルコール、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、ベルノリン酸、及び、１−モノリノレイル ｒａｃ−グリセロールである［１４］に記載の方法。
［１６］  前記化合物は、エライジックアルコールシクロプロパン（ＢＲ−１０６）、エライジン酸シクロプロパン（ＢＲ−１０７）、オレイルアルコールシクロプロパン（ＢＲ−１０８）、又は、ベルノリン酸メチルエステルシクロプロパン（ＢＲ−１０９）である［１５］に記載の方法。
［１７］  前記化合物の濃度は、約５ｎＭ〜約１０μＭの範囲内にある［１３］に記載の方法。
［１８］  プロテインキナーゼＣのイプシロンアイソフォームを選択的に活性化する方法であって、前記プロテインキナーゼＣの前記イプシロンアイソフォームを、少なくとも１つの二重結合がエポキシ基によって置換されたｃｉｓ−ポリ不飽和脂肪酸又はその誘導体である有効量の化合物に接触させることを含んだ方法。
［１９］  全ての前記二重結合が前記エポキシ基によって置換されている［１８］に記載の方法。
［２０］  前記脂肪酸は、CH3(CH2)4(CH=CHCH2)x(CH2)yCOOH 又はCH3CH2(CH=CHCH2)x(CH2)yCOOHの構造を有しており、Ｘは２〜６であり、Ｙは２〜６である［１８］に記載の方法。
［２１］  前記ポリ不飽和脂肪酸は、アラキドン酸、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸、リノール酸、リノレン酸、又はこれらの誘導体である［１８］に記載の方法。
［２２］  前記化合物は、エポキシ化されたｃｉｓ−ポリ不飽和脂肪酸エステルである［１８］に記載の方法。
［２３］  前記エステルは脂肪酸アルコールエステルである［２２］に記載の方法。
［２４］  前記アルコールは脂肪族アルコールである［２３］に記載の方法。
［２５］  前記脂肪族アルコールはグリセロールである［２４］に記載の方法。
［２６］  前記化合物は、エポキシ化されたｃｉｓ−ポリ不飽和脂肪アルコールである［１８］に記載の方法。
［２７］  前記化合物は、エポキシ化されたドコサヘキサエン酸メチルエステルである［２２］に記載の方法。
［２８］  前記化合物の濃度は、約５ｎＭ〜約１０μＭの範囲内にある［１８］に記載の方法。
［２９］  前記化合物は、前記イプシロンアイソフォームのプロテインキナーゼＣを、アルファアイソフォームのプロテインキナーゼＣに対して又は前記イプシロンアイソフォームのプロテインキナーゼＣが前記化合物に接触していない場合と比較して、少なくとも２倍活性化する［１］に記載の方法。
［３０］  前記化合物は、前記イプシロンアイソフォームのプロテインキナーゼＣを、アルファアイソフォームのプロテインキナーゼＣに対して又は前記イプシロンアイソフォームのプロテインキナーゼＣが前記化合物に接触していない場合と比較して、少なくとも２倍活性化する［１３］に記載の方法。
［３１］  前記化合物は、前記イプシロンアイソフォームのプロテインキナーゼＣを、アルファアイソフォームのプロテインキナーゼＣに対して又は前記イプシロンアイソフォームのプロテインキナーゼＣが前記化合物に接触していない場合と比較して、少なくとも２倍活性化する［１８］に記載の方法。
［３２］  必要としている対象の神経変性を減少させる方法であって、それを必要としている対象に、神経変性を減少させるために有効な量の、少なくとも１つの二重結合がシクロプロパン環／基によって置換されたｃｉｓ−ポリ不飽和脂肪酸エステル又はｃｉｓ−ポリ不飽和脂肪アルコールである化合物を投与することを含んだ方法。
［３３］  全ての前記二重結合がシクロプロパン環／基によって置換されている［３２］に記載の方法。
［３４］  前記脂肪酸は、CH3(CH2)4(CH=CHCH2)x(CH2)yCOOH 又は CH3CH2(CH=CHCH2)x(CH2)yCOOHの構造を有しており、Ｘは２〜６であり、Ｙは２〜６である［３２］に記載の方法。
［３５］  前記ポリ不飽和脂肪酸は、アラキドン酸、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸、リノール酸、γ−リノール酸、α−リノレン酸、エイコサテトラエン酸、アドレン酸、又はこれらの誘導体である［３２］に記載の方法。
［３６］  前記化合物は、シクロプロパン化されたｃｉｓ−ポリ不飽和脂肪酸エステルである［２３］に記載の方法。
［３７］  前記化合物は、シクロプロパン化されたドコサヘキサエン酸メチルエステル（ＢＲ−１１１）、エイコサペンタエン酸メチルエステル（ＢＲ−１１４）、又は、シクロプロパン化されたアラキドン酸メチルエステル（ＢＲ−１１５）である［３６］に記載の方法。
［３８］  前記化合物は、シクロプロパン化されたｃｉｓ−ポリ不飽和脂肪アルコールである［３２］に記載の方法。
［３９］  前記化合物は、リノレイックアルコールジシクロプロパン（ＢＲ−１０５）又はリノレニルアルコールトリシクロプロパン（ＢＲ−１０４）である［３８］に記載の方法。
［４０］  必要としている対象の神経変性を減少させる方法であって、それを必要としている対象に、神経変性を減少させるために有効な量の、二重結合がシクロプロパン環／基によって置換された、ｃｉｓ−モノ不飽和脂肪酸、ｃｉｓ−モノ不飽和脂肪酸エステル、又はｃｉｓ−モノ不飽和脂肪アルコールである化合物を投与することを含んだ方法。
［４１］  前記脂肪酸は、CH3(CH2)xCH=CH(CH2)yCOOHの構造を有しており、Ｘ及びＹは３〜１１の奇数である［４０］に記載の方法。
［４２］  前記ｃｉｓ−モノ不飽和脂肪酸又は脂肪アルコールは、オレイン酸、エライジン酸、エライジックアルコール、オレイルアルコール、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、ベルノリン酸、及び、１−モノリノレイル ｒａｃ−グリセロールである［４０］に記載の方法。
［４３］  前記化合物は、エライジックアルコールシクロプロパン（ＢＲ−１０６）、エライジン酸シクロプロパン（ＢＲ−１０７）、オレイルアルコールシクロプロパン（ＢＲ−１０８）、又は、ベルノリン酸メチルエステルシクロプロパン（ＢＲ−１０９）である［４０］に記載の方法。
［４４］  必要としている対象の神経変性を減少させる方法であって、それを必要としている対象に、神経変性を減少させるために有効な量の、少なくとも１つの二重結合がエポキシ基によって置換されたｃｉｓ−ポリ不飽和脂肪酸又はその誘導体である化合物を投与することを含んだ方法。
［４５］  全ての前記二重結合が前記エポキシ基によって置換されている［４４］に記載の方法。
［４６］  前記脂肪酸は、CH3(CH2)4(CH=CHCH2)x(CH2)yCOOH 又は CH3CH2(CH=CHCH2)x(CH2)yCOOHの構造を有しており、Ｘは２〜６であり、Ｙは２〜６である［４４］に記載の方法。
［４７］  前記ポリ不飽和脂肪酸は、アラキドン酸、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸、リノール酸、リノレン酸、又はこれらの誘導体である［４４］に記載の方法。
［４８］  前記化合物は、エポキシ化されたｃｉｓ−ポリ不飽和脂肪酸エステルである［４４］に記載の方法。
［４９］  前記化合物は、エポキシ化されたｃｉｓ−ポリ不飽和脂肪アルコールである［４４］に記載の方法。
［５０］  前記化合物は、エポキシ化されたドコサヘキサエン酸メチルエステルである［４８］に記載の方法。
［５１］  シクロプロパン化されたドコサヘキサエン酸メチルエステル（ＢＲ−１１１）、エイコサペンタエン酸メチルエステル（ＢＲ−１１４）、シクロプロパン化されたアラキドン酸メチルエステル（ＢＲ−１１５）、リノレイックアルコールジシクロプロパン（ＢＲ−１０５）、リノレニルアルコールトリシクロプロパン（ＢＲ−１０４）、エライジックアルコールシクロプロパン（ＢＲ−１０６）、エライジン酸シクロプロパン（ＢＲ−１０７）、オレイルアルコールシクロプロパン（ＢＲ−１０８）、若しくは、ベルノリン酸メチルエステルシクロプロパン（ＢＲ−１０９）、又は、これらの組み合わせと、
薬学的に許容されるキャリアとを含有した組成物。
【外国語明細書】
2018168170000001.pdf