(57)【要約】      （修正有）【課題】エボラウイルス感染を予防又は治療するために有用な薬剤の提供。【解決手段】樹状コアと、前記樹状コアの末端に直接またはスペーサーを介して結合された４〜８個の抗原ペプチドを含む多重抗原ペプチドであって、スペーサーを介して結合された抗原ペプチドが、特定の３２のアミノ酸からなる配列中の、連続する７〜１５アミノ酸からなるペプチド又は前記ペプチドのアミノ酸のうち１〜３個が置換されたペプチドである、多重抗原ペプチド、並びに、該多重抗原ペプチドを含む免疫誘導剤。【選択図】図４
2018052837.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
樹状コアと、前記樹状コアの末端に直接またはスペーサーを介して結合された４〜８個の抗原ペプチドを含む多重抗原ペプチドであって、スペーサーを介して結合された抗原ペプチドが配列番号１のアミノ酸配列中の連続する７〜１５アミノ酸からなるペプチド又は前記ペプチドのアミノ酸のうち１〜３個が置換されたペプチドである、多重抗原ペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドが、配列番号８〜１２のアミノ酸配列中の連続する７〜１５アミノ酸からなるペプチド又は前記ペプチドのアミノ酸のうち１〜３個が置換されたペプチドである、請求項１に記載の多重抗原ペプチド。
【請求項３】
前記ペプチドが、配列番号２、配列番号３もしくは配列番号４のアミノ酸配列中の連続する７〜１５アミノ酸からなるペプチド又は前記ペプチドのアミノ酸のうち１〜３個が置換されたペプチドである、請求項１に記載の多重抗原ペプチド。
【請求項４】
前記ペプチドが配列番号５のアミノ酸配列中の連続する７〜１１アミノ酸からなるペプチド、配列番号３２のアミノ酸配列中の連続する７又は８アミノ酸からなるペプチドもしくは配列番号６のアミノ酸配列中の連続する７〜９アミノ酸からなるペプチド、又は前記ペプチドのアミノ酸のうち１〜３個が置換されたペプチドである、請求項１又は３に記載の多重抗原ペプチド。
【請求項５】
前記スペーサーを介して結合された抗原ペプチドがすべて同一のペプチドである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の多重抗原ペプチド。
【請求項６】
前記樹状コアが、複数のリジン残基を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の多重抗原ペプチド。
【請求項７】
前記樹状コアが、システイン残基をさらに含む、請求項６に記載の多重抗原ペプチド。
【請求項８】
前記スペーサーがポリオキシアルキレン鎖を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の多重抗原ペプチド。
【請求項９】
前記多重抗原ペプチドが、下記の式Ｉ
【化１】
2018052837.tif 000019
［式中、Ｒは、
【化２】
2018052837.tif 000020
である。］
によって表されることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の多重抗原ペプチド。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の１種又は少なくとも２種の多重抗原ペプチドを有効成分として含有する、免疫誘導剤。
【請求項１１】
インターフェロンγ産生能を有するアジュバントをさらに含む、請求項１０に記載の免疫誘導剤。
【請求項１２】
前記アジュバントがα−ガラクトシルセラミド又はその類縁体である、請求項１１に記載の免疫誘導剤。
【請求項１３】
哺乳動物においてエボラウイルス感染を治療又は予防するために使用される、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の免疫誘導剤。
【請求項１４】
製薬的に許容可能な担体を含む、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の免疫誘導剤。
【請求項１５】
請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の免疫誘導剤を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物においてエボラウイルス感染を治療又は予防するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エボラウイルス感染を予防又は治療するための、多重抗原ペプチド（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ；  ＭＡＰ）、該ＭＡＰを含む免疫誘導剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
エボラウイルスは、マイナス１本鎖ＲＮＡウイルスであり、フィロウイルス科エボラウイルス属に分類される。このウイルスは、ヒトなどの霊長類に重篤なエボラ出血熱を引き起こし、その致死率は極めて高い。
【０００３】
国立感染症研究所（東京、日本）が公表する情報によると、当該ウイルスは、対象の血液等の体液を介して、粘膜や傷口から体内に侵入し、初めに単球／マクロファージおよび樹状細胞等で増殖した後、全身の血管内皮細胞や臓器の実質細胞に感染が広がり、そこでもウイルスが増殖することで細胞の機能障害、ひいては全身の各臓器の機能的障害を引き起こす。エボラウイルスが感染したマクロファージからは様々なサイトカイン等が大量に放出され、血液凝固系の破綻、血漿漏出、多臓器不全などが起こる可能性が指摘されている。エボラウイルス属には、進化系統的に異なる５種が知られている：ザイールエボラウイルス（Ｚａｉｒｅ  ｅｂｏｌａｖｉｒｕｓ）、スーダンエボラウイルス（Ｓｕｄａｎ  ｅｂｏｌａｖｉｒｕｓ）、レストンエボラウイルス（Ｒｅｓｔｏｎ  ｅｂｏｌａｖｉｒｕｓ）、タイフォレストエボラウイルス（Ｔａi  ｆｏｒｅｓｔ  ｅｂｏｌａｖｉｒｕｓ）、ブンジブギョウイルス（Ｂｕｎｄｉｂｕｇｙｏ  ｖｉｒｕｓ）。
【０００４】
幾つかの研究によれば、エボラウイルスの膜貫通糖タンパク質（ＧＰ）に対する特異的抗体を非ヒト霊長類に投与したところ、エボラウイルス感染の防御に成功している。実際にヒトへの応用において治療用抗体として特徴が明らかになったもの全てがＧＰに対する特異的抗体である。
【０００５】
エボラウイルスに対するペプチドワクチンの例は少なく、例えばエボラウイルスのＧＰと実質的に同一の抗原性を有する人工ポリペプチド（特許文献１）、エボラウイルス由来の特定のアミノ酸配列を含み、９〜１１アミノ酸の長さを有する、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１に拘束されたエボラウイルスワクチンとして有用なペプチドを結合したリポソーム（特許文献２）などが報告されている。また、これまでザイールエボラウイルスについて、ウイルス侵入に重要な残基は、エボラウイルスＧＰタンパク質のＬｙｓ１１４，  Ｌｙｓ１１５，  Ｌｙｓ１４０，  Ｇｌｙ１４３，  Ｐｒｏ１４６及びＣｙｓ１４７であり、また受容体結合に関係する残基は、Ｐｈｅ８８，  Ｉｌｅ１１３，  Ｐｒｏ１１６，  Ａｓｐ１１７，  Ｇｌｙ１１８，  Ｓｅｒ１１９，  Ｇｌｕ１２０，  Ａｒｇ１３６，  Ｔｙｒ１３７，  Ｖａｌ１３８，  Ｈｉｓ１３９，  Ｖａｌ１４１，  Ｓｅｒ１４２，  Ｔｈｒ１４４，  Ｇｌｙ１４５，  Ａｒｇ１７２及びＧｌｙ１７３であること（例えば、非特許文献１）が報告されてきた。しかしながら、エボラウイルスに対する有効なペプチドワクチンは未だ開発されていない。
【０００６】
加えて、上記の各エボラウイルス種間ではＧＰの抗原性が異なるため、汎用的な（広域な交差反応性を示す）治療抗体の開発は困難を極めており、ワクチン開発においても同様である。非特許文献２では、ＧＰ、マトリックスタンパク質ＶＰ４０及び核タンパク質ＮＰを発現するための各プラスミドを等量でＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入し、その培養上清から精製されたウイルス様粒子を１５週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスに免疫して、汎用的なエボラウイルス治療用抗体を得ることに成功した。しかしながら、変異を獲得して抗体認識を逃れるウイルス株に対しては効果を失うため、再び変異株に対しても効果を有する同様の抗体を得ることが難しい状況である。
【０００７】
近年では合成ペプチドワクチンの開発が盛んに行われるようになった。そのなかで特に、多重抗原ペプチド（ＭＡＰ）が注目されている。ＭＡＰペプチドは、例えばアミノ酸の一つである複数のリジン（Ｌｙｓ）および、場合により、システイン（Ｃｙｓ）を含む結合体をコアとし、Ｌｙｓの場合そのαアミノ基とεアミノ基に、あるいは、Ｃｙｓの場合、スルフヒドリル基にペプチド（細胞が認識する抗原の一部分）を結合させることによって得ることができる。
【０００８】
例えば、特許文献３には、肺炎双球菌に対してＭＡＰを使用している。具体的には、肺炎双球菌の抗原のペプチドから２箇所を選定し、この２種類のペプチドを交互に、合計４つのペプチドを有するＭＡＰ−４構造を作ったことが記載されている。その他、ＭＡＰの作製に関しては、特許文献４、特許文献５、非特許文献３〜５にも記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００６−２６５１９７号公報
【特許文献２】特開２０１４−００５２０５号公報
【特許文献３】特開２０１１−５７６９１号公報
【特許文献４】国際公開ＷＯ１９９３／０２２３４３Ａ１
【特許文献５】国際公開ＷＯ２０１５／１９０５５５Ａ１
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｊ．Ｅ．  Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｅ．Ｏ．  Ｓａｐｈｉｒｅ，  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｖｉｒｏｌ．  ２００９，  ４（６）：６２１-６３５
【非特許文献２】Ｗａｋａｋｏ  Ｆｕｒｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ２０１６，  ６：２０５１４−２０５２３
【非特許文献３】Ｍｙｒｏｎ  Ｃｈｒｉｓｔｏｄｏｕｌｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｅ．  Ｈｅｃｋｅｌｓ，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １９９４，  １４０：２９５１−２９６０
【非特許文献４】Ｍａｎｊｕ  Ｂ．  Ｊｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２００１，  ６９：４８８４−４８９０
【非特許文献５】Ｊｏｎ  Ｏｓｃｈｅｒｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｇｙ  ２００９，  ７７：３３８０−３３８８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、エボラウイルス由来のペプチドを用いてエボラウイルス感染を予防又は治療するための汎用的な免疫誘導剤（例えばワクチン）を提供することである。
【００１２】
上記の背景技術の欄に記載したように、複数種に渡って効果を有する汎用的なエボラウイルスに対するワクチン開発が望まれており、とりわけ変異株に対しても対応可能となる実用可能な免疫誘導剤が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を行った。各種のエボラウイルスのＧＰのアミノ酸配列から特定の部分を汎用的な抗原ペプチドとして最適であることを見出し、当該抗原ペプチドを複数有する多重抗原ペプチドを開発したところ、当該ペプチドに対するＩｇＧ抗体の産生が確認され、ワクチンとしても使用可能な免疫誘導剤に関する本発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち、本発明は以下の特徴を有する。
（１）樹状コアと、該樹状コアの末端に直接またはスペーサーを介して結合された４〜８個の抗原ペプチドを含む多重抗原ペプチドであって、スペーサーを介して結合された抗原ペプチドが配列番号１のアミノ酸配列中の連続する７〜１５アミノ酸からなるペプチド又は前記ペプチドのアミノ酸のうち１〜３個が置換されたペプチドである、多重抗原ペプチド。
（２）上記ペプチドが、配列番号８〜１２のアミノ酸配列中の連続する７〜１５アミノ酸からなるペプチド又は該ペプチドのアミノ酸のうち１〜３個が置換されたペプチドである、上記（１）に記載の多重抗原ペプチド。
（３）上記ペプチドが、配列番号２、配列番号３もしくは配列番号４のアミノ酸配列中の連続する７〜１５アミノ酸からなるペプチド又は該ペプチドのアミノ酸のうち１〜３個が置換されたペプチドである、上記（１）に記載の多重抗原ペプチド。
（４）上記ペプチドが配列番号５のアミノ酸配列中の連続する７〜１１アミノ酸からなるペプチド、配列番号３２のアミノ酸配列中の連続する７又は８アミノ酸からなるペプチドもしくは配列番号６のアミノ酸配列中の連続する７〜９アミノ酸からなるペプチド、又は該ペプチドのアミノ酸のうち１〜３個が置換されたペプチドである、上記（１）又は（３）に記載の多重抗原ペプチド。
（５）上記スペーサーを介して結合された抗原ペプチドがすべて同一のペプチドである、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の多重抗原ペプチド。
（６）上記樹状コアが、複数のリジン残基を含む、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の多重抗原ペプチド。
（７）上記樹状コアが、システイン残基をさらに含む、上記（６）に記載の多重抗原ペプチド。
（８）上記スペーサーがポリオキシアルキレン鎖を含む、上記（１）〜（７）のいずれかに記載の多重抗原ペプチド。
（９）上記多重抗原ペプチドが、下記の式Ｉ
【化１】
2018052837.tif 000003
［式中、Ｒは、
【化２】
2018052837.tif 000004
である。］
によって表されることを特徴とする、上記（１）〜（８）のいずれかに記載の多重抗原ペプチド。
（１０）上記（１）〜（９）のいずれかに記載の１種又は少なくとも２種の多重抗原ペプチドを有効成分として含有する、免疫誘導剤。
（１１）インターフェロンγ産生能を有するアジュバントをさらに含む、上記（１０）に記載の免疫誘導剤。
（１２）前記アジュバントがα−ガラクトシルセラミド又はその類縁体である、上記（１１）に記載の免疫誘導剤。
（１３）哺乳動物においてエボラウイルス感染を治療又は予防するために使用される、上記（１０）〜（１２）のいずれかに記載の免疫誘導剤。
（１４）製薬的に許容可能な担体を含む、上記（１０）〜（１３）のいずれかに記載の免疫誘導剤。
（１５）上記（１０）〜（１４）のいずれかに記載の免疫誘導剤を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物においてエボラウイルス感染を治療又は予防するための方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、エボラウイルスの表面糖タンパク質（ＧＰ）由来の特定領域のペプチドを樹状コアに結合して製造された多重抗原ペプチド（ＭＡＰ）が、哺乳動物においてＩｇＧ抗体価を上昇させ、ワクチンとして機能しうるという効果を有する。従来、エボラウイルス感染に対する有効な予防法又は治療法がなかったことを考慮するならば、本発明の効果は優れたものであるといえる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】この図は、ＭＡＰ−４、ＭＡＰ−８などのＭＡＰ構造を示す。
【図２】この図は、マウスにエボラ１ＭＡＰ４を静脈内投与したときのエボラ１に対するＩｇＧ抗体価の測定結果を示す。
【図３】この図は、マウスにエボラ１ＭＡＰ４を腹腔内投与したときのエボラ１に対するＩｇＭ抗体価の測定結果を示す。
【図４】この図は、マウスにエボラ１ＭＡＰ４及びエボラ２ＭＡＰ４を同時に（混合して）腹腔内投与したときのエボラ１及びエボラ２に対するＩｇＧ抗体価の測定結果を示す。
【図５】この図は、マウスにエボラ１ＭＡＰ４及びエボラ２ＭＡＰ４を同時に（混合して）腹腔内投与したときのエボラ１及びエボラ２に対するＩｇＭ抗体価の測定結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明をさらに詳細に説明する。
１．多重抗原ペプチド
本発明は、第１の態様により、樹状コアと、該樹状コアの末端に直接またはスペーサーを介して結合された４〜８個の抗原ペプチドを含む多重抗原ペプチドであって、スペーサーを介して結合された抗原ペプチドが配列番号１のアミノ酸配列中の連続する７〜１５アミノ酸からなるペプチド又は前記ペプチドのアミノ酸のうち１〜３個が置換されたペプチドである、多重抗原ペプチドを提供する。
【００１８】
本明細書中で使用する「多重抗原ペプチド」（ＭＡＰ）は、樹状高分子（すなわち、デンドリマー）構造を有する樹状コアと、当該コアの樹状末端に直接又はスペーサーを介して結合した複数個の同種又は異種のエボラウイルス表面糖タンパク質由来のペプチドとを含む高分子物質である。
【００１９】
本明細書で使用する「前記ペプチドのアミノ酸のうち１〜３個が置換されたペプチド」とは、上記抗原ペプチド内のアミノ酸と置換するアミノ酸が、システイン（Ｃｙｓ）以外の任意のアミノ酸であり、好ましくは被置換アミノ酸と類似の化学的性質（疎水性、極性、陽イオン性、陰イオン性、電気的中性など）もしくは構造的性質（分枝構造、芳香族性など）をもつアミノ酸であるペプチドをいう。
【００２０】
樹状コアは、上記のエボラウイルス表面糖タンパク質由来のペプチド（以下、便宜的に「抗原ペプチド」とも呼ぶ）を複数個、好ましくは４〜８個を結合するための樹状の支持コアである。樹状コアは、通常知られる構造であってよく、樹状ポリマーは少なくとも２個の官能基をもつコア分子から発生する２またはそれ以上の同一の枝を基礎とするものを好適に選択すればよい。当該樹状コアは樹状ポリマーとも呼ばれ、例えば米国特許第４，２８９，８７２号、米国特許第４，５１５，９２０号等に記載された構造体が挙げられるがこれらに限定されず、製造上の簡便さなどから好ましくは複数のリジン残基（Ｋ）を含むペプチドである。当該リジン残基を含むペプチドは、さらにシステイン残基（Ｃ）を含んでもよい。例えば、３個のリジン残基（Ｋ）からなるＫ−Ｋ−Ｋ構造の場合、各末端のリジン残基（Ｋ）のα−アミノ基側とε−アミノ基側にそれぞれ１個の上記抗原ペプチドを結合することができる。この場合、最高４個の抗原ペプチドを結合することができる。また、リジン残基（Ｋ）には、そのα−カルボキシル基を介してスペーサーペプチドを結合してもよい。スペーサーペプチドは、好ましくは２個以上１０個以下のアミノ酸残基からなるペプチドであり、例えばＫ−Ｋ−Ｃ、Ｋ−βＡ−Ｃ（ここで、βＡはβ−アラニン残基を表し、Ｃはシステイン残基を表す。）などを挙げることができる。スペーサーペプチドのＮ末端のアミノ酸残基には、例えばリジン残基（Ｋ）であれば、そのα−アミノ基を介して上記と同様の最高４個の抗原ペプチドを結合したＫ−Ｋ−Ｋ−構造を連結することができる。この場合、作製されるＭＡＰは最高８個の抗原ペプチドを有する。
【００２１】
本発明によれば、上記抗原ペプチドは、エボラウイルスの糖タンパク質に由来する。
エボラウイルスには、当該ウイルス感染が発生した地域により、ザイールエボラウイルス（Ｚａｉｒｅ  ｅｂｏｌａｖｉｒｕｓ）、スーダンエボラウイルス（Ｓｕｄａｎ  ｅｂｏｌａｖｉｒｕｓ）、レストンエボラウイルス（Ｒｅｓｔｏｎ  ｅｂｏｌａｖｉｒｕｓ）、タイフォレストエボラウイルス（Ｔａi  ｆｏｒｅｓｔ  ｅｂｏｌａｖｉｒｕｓ）、ブンジブギョウイルス（Ｂｕｎｄｉｂｕｇｙｏ  ｖｉｒｕｓ）が報告されており、上記例示のエボラウイルス由来の糖タンパク質のアミノ酸配列は、例えば米国ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＫＲ５３４５２６（Ｚａｉｒｅ  ｅｂｏｌａｖｉｒｕｓ）、ＦＪ９６８７９４（Ｓｕｄａｎ  ｅｂｏｌａｖｉｒｕｓ）、ＮＣ＿００４１６１（Ｒｅｓｔｏｎ  ｅｂｏｌａｖｉｒｕｓ）、ＦＪ２１７１６２（Ｔａi  ｆｏｒｅｓｔ  ｅｂｏｌａｖｉｒｕｓ）、ＫＲ０６３６７３（Ｂｕｎｄｉｂｕｇｙｏ  ｅｂｏｌａｖｉｒｕｓ）などに記載されている配列である。
【００２２】
例えばＺａｉｒｅ  ｅｂｏｌａｖｉｒｕｓゲノムの糖タンパク質遺伝子（ＫＲ５３４５２６）のヌクレオチド番号５９００．．８３０５は、ｓｐｉｋｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ（配列番号７）をコードしている。また、この配列に対応する他の種のエボラウイルス由来の糖タンパク質のアミノ酸配列及びそれをコードするヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＦＪ９６８７９４、ＮＣ＿００４１６１、ＦＪ２１７１６２、ＫＲ０６３６７３などに記載されている配列である。
配列番号７：
ＭＧＶＴＧＩＬＱＬＰＲＤＲＦＫＲＴＳＦＦＬＷＶＩＩＬＦＱＲＴＦＳＩＰＬＧＶＩＨＮＳＴＬＱＶＳＤＶＤＫＬＶＣＲＤＫＬＳＳＴＮＱＬＲＳＶＧＬＮＬＥＧＮＧＶＡＴＤＶＰＳＶＴＫＲＷＧＦＲＳＧＶＰＰＫＶＶＮＹＥＡＧＥＷＡＥＮＣＹＮＬＥＩＫＫＰＤＧＳＥＣＬＰＡＡＰＤＧＩＲＧＦＰＲＣＲＹＶＨＫＶＳＧＴＧＰＣＡＧＤＦＡＦＨＫＥＧＡＦＦＬＹＤＲＬＡＳＴＶＩＹＲＧＴＴＦＡＥＧＶＶＡＦＬＩＬＰＱＡＫＫＤＦＦＳＳＨＰＬＲＥＰＶＮＡＴＥＤＰＳＳＧＹＹＳＴＴＩＲＹＱＡＴＧＦＧＴＮＥＡＥＹＬＦＥＶＤＮＬＴＹＶＱＬＥＳＲＦＴＰＱＦＬＬＱＬＮＥＴＩＹＡＳＧＫＲＳＮＴＴＧＫＬＩＷＫＶＮＰＥＩＤＴＴＩＧＥＷＡＦＷＥＴＫＫＮＬＴＲＫＩＲＳＥＥＬＳＦＴＡＶＳＮＧＰＫＮＩＳＧＱＳＰＡＲＴＳＳＤＰＥＴＮＴＴＮＥＤＨＫＩＭＡＳＥＮＳＳＡＭＶＱＶＨＳＱＧＲＫＡＡＶＳＨＬＴＴＬＡＴＩＳＴＳＰＱＰＰＴＴＫＴＧＰＤＮＳＴＨＮＴＰＶＹＫＬＤＩＳＥＡＴＱＶＧＱＨＨＲＲＡＤＮＤＳＴＡＳＤＴＰＰＡＴＴＡＡＧＰＬＫＡＥＮＴＮＴＳＫＳＡＤＳＬＤＬＡＴＴＴＳＰＱＮＹＳＥＴＡＧＮＮＮＴＨＨＱＤＴＧＥＥＳＡＳＳＧＫＬＧＬＩＴＮＴＩＡＧＶＡＧＬＩＴＧＧＲＲＴＲＲＥＶＩＶＮＡＱＰＫＣＮＰＮＬＨＹＷＴＴＱＤＥＧＡＡＩＧＬＡＷＩＰＹＦＧＰＡＡＥＧＩＹＴＥＧＬＭＨＮＱＤＧＬＩＣＧＬＲＱＬＡＮＥＴＴＱＡＬＱＬＦＬＲＡＴＴＥＬＲＴＦＳＩＬＮＲＫＡＩＤＦＬＬＱＲＷＧＧＴＣＨＩＬＧＰＤＣＣＩＥＰＨＤＷＴＫＮＩＴＤＫＩＤＱＩＩＨＤＦＶＤＫＴＬＰＤＱＧＤＮＤＮＷＷＴＧＷＲＱＷＩＰＡＧＩＧＶＴＧＶＩＩＡＶＩＡＬＦＣＩＣＫＦＶＦ
配列番号７のアミノ酸配列中のアミノ酸番号１１０〜１４７の配列、すなわちＮＬＥＩＫＫＰＤＧＳＥＣＬＰＡＡＰＤＧＩＲＧＦＰＲＣＲＹＶＨＫＶＳＧＴＧＰＣ（配列番号８）は、配列番号１のアミノ酸配列：
ＮＬ（Ｘａａ  ＝  Ｅ，  Ａ，  ｏｒ  Ｄ）ＩＫＫ（Ｘａａ  ＝  Ｐ，  Ｓ，  Ｖ，  ｏｒ  Ａ）ＤＧＳＥＣＬＰ（Ｘａａ  ＝  Ａ，  Ｐ，  Ｌ，  ｏｒ  Ｅ）（Ｘａａ  ＝  Ａ  ｏｒ  Ｐ）Ｐ（Ｘａａ  ＝  Ｄ  ｏｒ  Ｅ）Ｇ（Ｘａａ  ＝  Ｉ  ｏｒ  Ｖ）Ｒ（Ｘａａ  ＝  Ｇ  ｏｒ  Ｄ）ＦＰＲＣＲＹＶＨＫ（Ｘａａ  ＝  Ｖ  ｏｒ  Ａ）（Ｘａａ  ＝  Ｓ  ｏｒ  Ｑ）ＧＴＧＰＣ
の一つの例である。配列番号１のアミノ酸配列の他の例は、次の配列番号９〜１２によって表されるアミノ酸配列である。
【００２３】
配列番号９：
ＮＬＥＩＫＫＰＤＧＳＥＣＬＰＰＰＰＤＧＶＲＧＦＰＲＣＲＹＶＨＫＡＱＧＴＧＰＣ
配列番号１０：
ＮＬＥＩＫＫＳＤＧＳＥＣＬＰＬＰＰＤＧＶＲＧＦＰＲＣＲＹＶＨＫＶＱＧＴＧＰＣ
配列番号１１：
ＮＬＡＩＫＫＶＤＧＳＥＣＬＰＥＡＰＥＧＶＲＤＦＰＲＣＲＹＶＨＫＶＳＧＴＧＰＣ
配列番号１２：
ＮＬＤＩＫＫＡＤＧＳＥＣＬＰＥＡＰＥＧＶＲＧＦＰＲＣＲＹＶＨＫＶＳＧＴＧＰＣ
【００２４】
エボラウイルスは、エボラウイルスＧＰ遺伝子のＲＮＡ編集によって３種の糖タンパク質、すなわち、ｎｏｎ−ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  （ｓＧＰ）、ｓｍａｌｌ  ｎｏｎ−ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  （ｓｓＧＰ）、及び膜貫通糖タンパク質ＧＰを生成する。膜貫通糖タンパク質ＧＰは、ホモ３量体スパイクを形成し、標的細胞受容体への結合との細胞膜とウイルスエンベロープとの膜融合（ウイルス侵入）を担うため、当該ウイルスのライフサイクルおよび病原性発現にとって重要である。エボラウイルスの３種の糖タンパク質のうち非構造かつ可溶性（すなわち分泌型）糖タンパク質であるｓＧＰ及びｓｓＧＰがウイルスの病原性に重要な役割をもつか否かについてはよく分かっていないが、膜貫通糖タンパク質ＧＰは、ｓＧＰ及びｓｓＧＰのＮ末端側のアミノ酸配列（この配列は配列番号１のアミノ酸配列を含む。）と同じ配列を有している。エボラウイルス粒子表面糖タンパク質である３量体ＧＰは、当該ウイルスのライフサイクルにとって重要であり、ウイルスの株間の病原性の違いに関与している。
本発明の多重抗原ペプチドは、エボラウイルスＧＰタンパク質のなかで配列番号１のアミノ酸配列に注目し、３種の糖タンパク質のいずれも共有する配列番号１のアミノ酸配列（例えば配列番号８〜１２のアミノ酸配列）中の連続する７〜１５アミノ酸からなるペプチドまたは前記ペプチドの１〜３アミノ酸が置換されたペプチドを抗原ペプチドとして含み、同種又は異種、好ましくは同種、の複数の抗原ペプチドが、上記の樹状コアと結合されたとき、エボラウイルス感染に対するワクチンとしても使用しうる免疫誘導剤を提供することができる。
【００２５】
本発明の抗原ペプチドのさらなる具体例は、以下のとおりであるが、それらのペプチドに限定されない。
【００２６】
第１の例は、配列番号２、１３〜１７のアミノ酸配列（配列番号７のアミノ酸配列のアミノ酸番号１１０〜１２６に相当する配列）中の連続する７〜１５アミノ酸、好ましくは連続する９〜１２アミノ酸からなるペプチドである。
【００２７】
配列番号２：
ＮＬ（Ｘａａ  ＝  Ｅ，  Ａ  ｏｒ  Ｄ）ＩＫＫ（Ｘａａ  ＝  Ｐ，  Ｓ，  Ｖ  ｏｒ  Ａ）ＤＧＳＥＣＬＰ（Ｘａａ  ＝  Ａ，  Ｐ，  Ｌ  ｏｒ  Ｅ）（Ｘａａ  ＝  Ａ  ｏｒ  Ｐ）Ｐ
配列番号１３：
ＮＬＥＩＫＫＰＤＧＳＥＣＬＰＡＡＰ
配列番号１４：
ＮＬＥＩＫＫＰＤＧＳＥＣＬＰＰＰＰ
配列番号１５：
ＮＬＥＩＫＫＳＤＧＳＥＣＬＰＬＰＰ
配列番号１６：
ＮＬＡＩＫＫＶＤＧＳＥＣＬＰＥＡＰ
配列番号１７：
ＮＬＤＩＫＫＡＤＧＳＥＣＬＰＥＡＰ
【００２８】
第２の例は、配列番号３、１８〜２２のアミノ酸配列（配列番号７のアミノ酸配列のアミノ酸番号１２６〜１４３に相当する配列）中の連続する７〜１５アミノ酸、好ましくは連続する９〜１２アミノ酸からなるペプチドである。
【００２９】
配列番号３：
Ｐ（Ｘａａ  ＝  Ｄ  ｏｒ  Ｅ）Ｇ（Ｘａａ  ＝  Ｉ  ｏｒ  Ｖ）Ｒ（Ｘａａ  ＝  Ｇ  ｏｒ  Ｄ）ＦＰＲＣＲＹＶＨＫ（Ｘａａ  ＝  Ｖ  ｏｒ  Ａ）  （Ｘａａ  ＝  Ｓ  ｏｒ  Ｑ）Ｇ
配列番号１８：
ＰＤＧＩＲＧＦＰＲＣＲＹＶＨＫＶＳＧ
配列番号１９：
ＰＤＧＶＲＧＦＰＲＣＲＹＶＨＫＡＱＧ
配列番号２０：
ＰＤＧＶＲＧＦＰＲＣＲＹＶＨＫＶＱＧ
配列番号２１：
ＰＥＧＶＲＤＦＰＲＣＲＹＶＨＫＶＳＧ
配列番号２２
ＰＥＧＶＲＧＦＰＲＣＲＹＶＨＫＶＳＧ
【００３０】
第３の例は、配列番号４、２３〜２７のアミノ酸配列（配列番号７のアミノ酸配列のアミノ酸番号１３０〜１４７に相当する配列）中の連続する７〜１５アミノ酸、好ましくは連続する９〜１２アミノ酸からなるペプチドである。
【００３１】
配列番号４：
Ｒ（Ｘａａ  ＝  Ｇ  ｏｒ  Ｄ）ＦＰＲＣＲＹＶＨＫ（Ｘａａ  ＝  Ｖ  ｏｒ  Ａ）（Ｘａａ  ＝  Ｓ  ｏｒ  Ｑ）ＧＴＧＰＣ
配列番号２３：
ＲＧＦＰＲＣＲＹＶＨＫＶＳＧＴＧＰＣ
配列番号２４：
ＲＧＦＰＲＣＲＹＶＨＫＡＱＧＴＧＰＣ
配列番号２５：
ＲＧＦＰＲＣＲＹＶＨＫＶＱＧＴＧＰＣ
配列番号２６：
ＲＤＦＰＲＣＲＹＶＨＫＶＳＧＴＧＰＣ
配列番号２７：
ＲＧＦＰＲＣＲＹＶＨＫＶＳＧＴＧＰＣ
【００３２】
第４の例は、配列番号５、２８〜３１のアミノ酸配列（配列番号７のアミノ酸配列のアミノ酸番号１１３〜１２３に相当する配列）中の連続する７〜１１アミノ酸からなるペプチドである。
【００３３】
配列番号５
ＩＫＫ（Ｘａａ  ＝  Ｐ，  Ｓ，  Ｖ  ｏｒ  Ａ）ＤＧＳＥＣＬＰ
配列番号２８：
ＩＫＫＰＤＧＳＥＣＬＰ
配列番号２９：
ＩＫＫＳＤＧＳＥＣＬＰ
配列番号３０：
ＩＫＫＶＤＧＳＥＣＬＰ
配列番号３１：
ＩＫＫＡＤＧＳＥＣＬＰ
【００３４】
第５の例は、配列番号６のアミノ酸配列（配列番号７のアミノ酸配列のアミノ酸番号１３２〜１４０に相当する配列）中の連続する７〜９アミノ酸からなるペプチドである。
【００３５】
配列番号６：
ＦＰＲＣＲＹＶＨＫ
【００３６】
第６の例は、配列番号３２〜３６のアミノ酸配列（配列番号７のアミノ酸配列のアミノ酸番号１２６〜１３３に相当する配列）中の連続する７〜８アミノ酸からなるペプチドである。
【００３７】
配列番号３２：
Ｐ（Ｘａａ  ＝  Ｄ  ｏｒ  Ｅ）Ｇ（Ｘａａ  ＝  Ｉ  ｏｒ  Ｖ）Ｒ（Ｘａａ  ＝  Ｇ  ｏｒ  Ｄ）ＦＰ  
配列番号３３：
ＰＤＧＩＲＧＦＰ
配列番号３４：
ＰＤＧＶＲＧＦＰ
配列番号３５：
ＰＥＧＶＲＤＦＰ
配列番号３６：
ＰＥＧＶＲＧＦＰ
【００３８】
本発明はまた、配列番号１、２、３及び４のアミノ酸配列のペプチドからなる群から選択される抗原ペプチド、並びに、配列番号５、６、８〜３６のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる抗原ペプチドも提供する。
【００３９】
本発明の多重抗原ペプチド（ＭＡＰ）を構成する抗原ペプチドは、上記樹状コアの末端に直接またはスペーサーを介して結合され、好ましくは樹状コアの各末端に１個ずつ共有結合される。例えば、官能化された固相レジンに官能化された樹状コアを結合し、この樹状末端の反応性官能基に抗原ペプチドの反応性官能基を結合反応することができる（Ｗ．  ｋｏｗａｌｃｚｙｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｐｅｐ．  Ｓｃｉ．  ２０１１，  １７：  ２４７−２５１）。この場合、抗原ペプチドは、所定のアミノ酸配列に基づいて自動ペプチド合成機等を用いて合成するなど、公知の技術によって合成することができる（例えばＪ．Ｍ．  Ｓｔｅｗａｒｔ  ａｎｄ  Ｊ．Ｄ．  Ｙｏｕｎｇ，  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ２ｎｄ  ｅｄ．，  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  １９８４，  Ｇ．Ｂ．  Ｆｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ｉｎ  Ｇ．Ａ．  Ｇｒａｎｔ  （ｅｄ）：  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：  Ａ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ，  Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ，  １９９２）。或いは、公知のＤＮＡ組換え技術を用いて作製してもよい（例えばＭ．Ｒ．  Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｖｏｌ．  １  ａｎｄ  Ｖｏｌ．  ２，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈｏｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ｆｏｕｒｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  ２０１２）。
【００４０】
本発明のＭＡＰは、抗原ペプチドを複数個、好ましくは２〜１６個、より好ましくは４〜８個を含み、抗原ペプチドは同種又は異種であってよく、好ましくは同種である。本明細書では、「同種の抗原ペプチド」とは、エピトープとして同じ性質を持つペプチドであって、高い同一性を有するペプチドを含む意味である。「高い同一性を有するペプチド」とは、複数の抗原ペプチドのうち任意の一つの抗原ペプチドを基準として、１〜３アミノ酸、好ましくは１もしくは２アミノ酸、より好ましくは１アミノ酸の置換を有するペプチドである。抗原ペプチド内のアミノ酸と置換するアミノ酸は、システイン（Ｃｙｓ）以外の任意のアミノ酸であり、好ましくは被置換アミノ酸と類似の化学的性質（疎水性、極性、陽イオン性、陰イオン性、電気的中性など）もしくは構造的性質（分枝構造、芳香族性など）をもつアミノ酸である。またここで、「エピトープとして同じ性質」とは、目的の標的タンパク質もしくはポリペプチドと結合可能な、かつウイルスに対し免疫誘導可能なＩｇＧ抗体の産生をインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で誘導できるという性質をいう。抗原ペプチドが異種（すなわち、「同種」ではない。）である場合には、異なる抗原ペプチドの各々は少なくとも１つ上記樹状コアに結合されている。
【００４１】
本明細書中で使用する「多重抗原ペプチドを投与する対象」（以下、便宜的に被験体ともいう）には、ヒト、家畜動物（例えばウシ、ブタ、ラクダ、等）、愛玩動物（例えばイヌ、ネコ、等）、競争用動物（例えば、ウマ、等）、動物園で飼育される観賞用動物などの哺乳動物が含まれ、好ましくは、ヒトである。
【００４２】
本発明のＭＡＰは被験体の体内でクラススイッチされた抗体産生を誘導する。本発明によって産生される抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥであり、好ましくはＩｇＧである。一般的に、体内に異物が侵入した場合には最初の約１週間以内にＢ２Ｂ細胞からＩｇＭ抗体が産生されて初期の生体内防御が機能するが、ＩｇＭは半減期が短く１週間から１０日間程度で血中のその抗体価は低下する。ＩｇＭ産生に遅れて次第にその異物に反応するＴ細胞が体内で活性化されることにより、ＩｇＧ抗体が産生されて液性免疫による防御が強化されるようになる。ＩｇＧはいったん産生されるとその半減期が長く、数週間から数カ月以上血中の抗体価は持続する。
【００４３】
また、別の態様において、本発明のＭＡＰは自然免疫系Ｂ細胞（Ｂ１ Ｂ細胞）を刺激してIｇＭをＢ２Ｂ細胞産生の場合よりも長期に産生することができる。本発明のＭＡＰの投与によって上昇したIｇＭは、例えば１４日以上、好ましくは２１日間以上、血中でのＩｇＭ上昇が確認される。
【００４４】
本発明のＭＡＰは、例えば図１に示すような構造を有するが、とりわけＭＡＰ−４およびＭＡＰ−８に示されるような４〜８個の抗原ペプチド、好ましくは同一の抗原ペプチド、を含む樹状構造を有する。具体的には、次のような式ＩのＭＡＰ−４構造であるが、この構造に限定されない。
【００４５】
式ＩのＭＡＰ：
【化３】
2018052837.tif 000005
［式中、Ｒは、
【化４】
2018052837.tif 000006
である。］
【００４６】
２．多重抗原ペプチド（ＭＡＰ）の製造
本発明のＭＡＰは、例えば以下の工程（１）〜（４）：
（１）反応性官能基を有する樹状コアを用意する工程、
（２）反応性官能基を有する複数の同種又は異種の上記抗原ペプチドを用意する工程、
（３）樹状コアの反応性官能基と上記の各抗原ペプチドの反応性官能基を結合反応して多重抗原ペプチドを作製する工程、および
（４）多重抗原ペプチドを回収する工程
を含む方法によって作製されうる。
【００４７】
樹状コアは、上で説明したように、複数個の同種又は異種、好ましくは同種、の上記抗原ペプチド、好ましくは４〜８個の同種の（好ましくは同一の）抗原ペプチドを結合するための樹状の支持コアである。樹状コアは、通常知られる構造であってよく、複数のリジン残基（Ｋ）を含むのがよく、および、さらにシステイン残基（Ｃ）を含んでもよい。図１に、本発明のＭＡＰの構造（好ましくはＭＡＰ−４およびＭＡＰ−８のような構造）を例示するように、４〜８個の抗原ペプチド以外の部分を形成するのが樹状コアである。樹状コアは、ＭＡＰ−４の場合、例えばＫ−Ｋ−Ｋ配列を含むのがよいし、また、ＭＡＰ−８の場合、例えばＫ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ配列を含むのがよい。これらの配列の中央のＫには、通常、スペーサーペプチドが結合する。スペーサーペプチドは、好ましくは２個以上のアミノ酸残基からなるペプチドであり、例えばＫ−Ｋ−Ｃ、Ｋ−βＡ−Ｃ（ここで、βＡはβ−アラニン残基を表す。）などであるが、これらに限定されないものとする。中央のＫ以外の左右のＫまたはＫ−Ｋには、Ｋ１個あたり２個の抗原ペプチドが結合するように設計される。また、樹状コアとペプチドとの間にはスペーサーを配置してもよい。スペーサーは、ポリオキシアルキレン鎖（例えばポリオキシエチレン鎖又はポリオキシプロピレン鎖）を含む水親和性の高い基であるのが好ましい。ポリオキシアルキレン鎖のオキシアルキレン単位の繰り返し数は、２以上、好ましくは２〜５０、より好ましくは３〜３０である。
【００４８】
樹状コアの末端には、抗原ペプチドと結合するための適切な官能基を有することができる。官能基は、タンパク質の修飾に使用可能な官能基であればよく、例えば、アミノ基、スルフヒドリル基、アセチレン基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル基などである。
【００４９】
一方の抗原ペプチドの側の官能基は、樹状コアの末端官能基と結合反応しうる任意の官能基であり、例えばアミノ基に対するＮ−ヒドロキシスクシンイミジル基、スルフヒドリル基に対するスルフヒドリル基またはカルボキシル基、アセチレン基に対するアジド基、などである。抗原ペプチドは、上で説明したとおりである。
【００５０】
本発明の実施形態により、Ｋ−Ｋ−Ｋ配列を有する樹状コアは、末端官能基がアセチレン基を有する下記の構造：
【化５】
2018052837.tif 000007
を有する。
【００５１】
上記構造のアセチレン基と反応する抗原ペプチドの末端官能基はアジド基である。この場合の結合反応は、下記のヒュスゲン反応である。
【００５２】
【化６】
2018052837.tif 000008
【００５３】
この反応は、アルキンとアジドを一価の銅イオンを触媒とし結合させる反応であり、反応生成物は安定で副反応がほとんど無いとされ、クリックケミストリーとして注目されている。銅イオン触媒溶液は、硫酸銅・５水和物水溶液とアスコルビン酸を用いて調製しうる。
【００５４】
ＭＡＰを回収する工程では、該ペプチドを精製する。ペプチドの回収の手法は、一般的なタンパク質またはポリペプチドの精製法でよく、例えばゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などのクロマトグラフィーを単独でまたは組み合わせて行われうる。目的物の同定は、核磁気共鳴スペクトル分析法ＮＭＲ、マススペクトル分析法、アミノ酸分析法などによって行うことができる。
【００５５】
３．免疫誘導剤
本発明はさらに上記の１種又は少なくとも２種の多重抗原ペプチド（ＭＡＰ）を含む免疫誘導剤を提供する。本発明の免疫誘導剤は、ＩｇＧ抗体、或いはＩｇＧ抗体及びＩｇＭ抗体の産生を誘導する製剤である。
【００５６】
本発明の免疫誘導剤は、医薬組成物として、エボラウイルス感染に対するＩｇＧ抗体産生を誘導することにより、該感染の予防又は治療もしくは改善のために用いることができ、「ワクチン」としても使用することができる。
【００５７】
本発明の免疫誘導剤は、医薬組成物として、エボラウイルス感染に対するＩｇＭ抗体産生を長期にわたって持続させることにより、非感染者においては当該感染の予防することができる。また、長期に渡るＩｇＭ抗体の産生よって、感染者においては非感染者への感染伝播防止に用いることができる。
【００５８】
本発明のＭＡＰのヒトでの有効量は、非限定的に、１回投与量としてＭＡＰ−４では約０．０５〜２．５μｇ／ｋｇ体重から１ｍｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、ＭＡＰ−８では、０．５〜２５．０μｇ／ｋｇ体重から１ｍｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ体重である。ここで、投与量は、ヒトを含む被験体の体重、年齢、性別、症状、重症度、投与方法などによって適宜変更しうるものとする。
【００５９】
本発明の免疫誘導剤の形態は、例えば溶液剤、懸濁剤、錠剤、注射剤、顆粒剤、乳化剤などであり、賦形剤、希釈剤、結合剤、香味剤、界面活性化剤などの添加剤を適宜含むことができる。アジュバントは投与対象においてインターフェロンγの産生が確認される限りにおいて基本的に必要ないが、必要に応じて添加してもよい。
【００６０】
本発明の免疫誘導剤はアジュバントを含んでもよい。アジュバントは、所望する抗体のアイソタイプによって適宜選択される。例えば、ＩｇＧを優位に産生させる場合では、アジュバントはインターフェロンγ産生を優位に誘導する物質である。インターフェロンγ産生を誘導する物質は特に限定されないが、例えば、α‐ガラクトシルセラミド、α‐ガラクトシルセラミド類縁体、細菌のオリゴヌクレオチドであるＣｐＧなどが挙げられる。α‐ガラクトシルセラミド類縁体としては、例えば国際公開ＷＯ２００７／０９９９９９号（米国特許８１６３７０５号）、国際公開ＷＯ２００９／１１９６９２号（米国特許８５５１９５９号）、国際公開ＷＯ２００８／１０２８８８号（米国特許８２９９２２３号）、国際公開ＷＯ２０１０／０３００１２号（米国特許８５８０７５１号）、国際公開ＷＯ２０１１／０９６５３６号（米国特許８８５３１７３号）、国際公開ＷＯ２０１３／１６２０１６号（米国公開番号２０１５−０１５２１２８）に記載された化合物が挙げられるが、これらに限定されない。また、アジュバントと同様に本発明の免疫誘導剤のＩｇＧ抗体誘導の効果を高めるために、インターフェロンγを含んでもよい。
【００６１】
本発明の免疫誘導剤は、医薬組成物として、エボラウイルス感染の予防、感染拡大防止または治療のために使用することができる。
【００６２】
したがって、本発明はさらに、上記のＭＡＰまたは上記の免疫誘導剤を被験体に投与することを含む、上記疾患の予防または治療方法を提供する。この方法では、抗体の産生は、ＩｇＧ抗体の産生を含み、ＩｇＭ抗体の産生も含みうる。本発明の方法における抗体の産生は、エボラウイルス感染の治療、予防または感染拡大防止の目的で行うことができる。
【００６３】
投与経路は、静脈内投与、経粘膜投与、腹腔内投与、直腸内投与、皮下投与、筋肉内投与、経口投与などであるが、これらに限定されない。
【００６４】
本発明の免疫誘導剤は、製薬的に許容可能な担体をさらに含んで製剤化されていてもよい。
【００６５】
「製薬的に許容可能な」とは、医薬業界で通常使用される意味を有し、場合により、ヒトに投与された場合にアレルギー反応または同様の有害反応を生じさせない分子的実体物質または組成物等の使用が可能であることを表す。タンパク質を活性成分として含む水性組成物の調製は当技術分野で十分に理解されている。典型的に、そのような組成物は、注射剤として、液体溶液または懸濁液として調製され、注射前の液体中での溶解または懸濁に好適な固体剤形を調製することもできる。調製物は乳化することもできる。
【００６６】
「担体」には、任意およびすべての溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張（ｉｓｏｔｏｎｉｃ）および吸収遅延剤、バッファー、担体溶液、懸濁液、コロイド、などが含まれる。担体としては、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸塩のバッファー；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０アミノ酸残基未満）ポリペプチド；タンパク質（例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン）；疎水性ポリマー（例えばポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシン）；グルコース、マンノース又はデキストランを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又は非イオン性界面活性剤（例えば、ポリオキシアルキレン系）といった例も挙げられる。医薬活性物質のためのそのような媒体および物質の使用は当技術分野で周知である。任意の慣用の媒体または物質が活性成分と不適合である場合を除き、治療用組成物でのその使用が想定される。補助活性成分を組成物に組み入れることもできる。
【００６７】
本発明の免疫誘導剤は、製剤に使用される各種の界面活性剤を使用してもよい。界面活性剤の種類は特に限定されず、ノニオン系界面活性剤、カチオン系界面活性剤、アニオン系界面活性剤、または両性界面活性剤等が挙げられ、中でもノニオン系界面活性剤が好ましい。ノニオン系界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレンモノアルキルエーテル、またはポリオキシエチレンモノアリールエーテル等のポリオキシアルキレン系ノニオン界面活性剤；多価アルコール（例えばソルビタン、ソルビトール）の高級脂肪酸エステル；および多価アルコールの高級脂肪酸エステルにエチレンオキシドを重合付加させたもの；等が挙げられる。
【００６８】
本発明の免疫誘導剤は、１つまたは複数の追加成分をさらに含むことができ、限定されないがそのような追加成分として懸濁剤、安定化剤、または分散剤が挙げられる。また、本発明の免疫誘導剤の安定化のための処置として、ＭＡＰの等電点を下げて代謝安定性を向上させることができる。具体的には、酸性アミノ酸（例えばアスパラギン、グルタミン酸）、および／またはデオキシヌクレオチド（例えばＧｐＣオリゴヌクレオチド、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）をさらに免疫誘導剤に含ませることでもよい。一つの態様として、酸性アミノ酸および／またはデオキシオリゴヌクレオチドを本発明のＭＡＰに直接結合させることでもよい。
【実施例】
【００６９】
本発明を以下の実施例によってさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例によって制限されないものとする。
【００７０】
［実施例１］
＜多重抗原ペプチド（ＭＡＰ）の構造＞
ＭＡＰの構造について下記のものを使用した。
【化７】
2018052837.tif 000009
［式中、Ｒは、
【００７１】
【化８】
2018052837.tif 000010
である。］
【００７２】
エボラウイルスの糖タンパク質由来の４種のペプチド、すなわちＩＫＫＡＤＧＳＥＣＬＰ（配列番号３１）、ＩＫＫＡＤＧＳＥＣ（Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＨ）ＬＰ（配列番号３７）、ＦＰＲＣＲＹＶＨＫ（配列番号６）及びＦＰＲＣ（Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＨ）ＲＹＶＨＫ（配列番号３８）を選択し、ＭＡＰ作製のための抗原ペプチドとして使用した。
【００７３】
＜エボラ１ＭＡＰ４の合成＞
１．略語表
・ＮＨ２−ＳＡＬ−Ｔｒｔ（２−Ｃｌ）−  Ｒｅｓｉｎ：  Ｒｉｎｋ−Ｂｅｒｎａｔｏｗｉｔｚ−ａｍｉｄｅ  Ｂａｒｌｏｓ  Ｒｅｓｉｎ（渡辺化学工業株式会社）  
・Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ：Ｎ−α，Ｎ−ε−Ｂｉｓ（９−ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ（渡辺化学工業株式会社）
・Ｂｏｃ−Ｐｒａ−ＯＨ：Ｎ−Ｂｏｃ−Ｌ−ｐｒｏｐａｒｇｙｌｇｌｙｃｉｎｅ（東京化成工業株式会社）
・Ｎ３−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ：１１−Ａｚｉｄｏ−３，６，９−ｔｒｉｏｘａｕｎｄｅｃａｎｏｉｃ  Ａｃｉｄ（東京化成工業株式会社）
・Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＴｒｔＡ−ＰＥＧ−  Ｒｅｓｉｎ：  Ｎ−α−（９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）−Ｌ−ｐｒｏｌｉｎｅ  ｔｒｉｔｙｌｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ  ｒｅｓｉｎ  （渡辺化学工業株式会社）
・Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ：  Ｎ−α−（９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）  −Ｌ−ａｌａｎｉｎｅ（渡辺化学工業株式会社）
・Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ：  Ｎ−α−（９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）−Ｓ−ｔｒｉｔｙｌ−Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｅ（渡辺化学工業株式会社）
・Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ：  Ｎ−α−（９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）−Ｌ−ａｓｐａｒｔｉｃ  ａｃｉｄ  β−ｔ−ｂｕｔｙｌ  ｅｓｔｅｒ（渡辺化学工業株式会社）
・Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ：  Ｎ−α−（９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）−Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ  γ−ｔ−ｂｕｔｙｌ  ｅｓｔｅｒ（渡辺化学工業株式会社）
・Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ：  Ｎ−α−（９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）−ｇｌｙｃｉｎｅ（渡辺化学工業株式会社）
・Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ：  Ｎ−α−（９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）−Ｌ−ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ（渡辺化学工業株式会社）
・Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ：  Ｎ−α−（９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）−Ｎ−ε−（ｔ−ｂｕｔｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ（渡辺化学工業株式会社）
・Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ：  Ｎ−α−（９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）−Ｌ−ｌｅｕｃｉｎｅ（渡辺化学工業株式会社）
・Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ：  Ｎ−α−（９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）−Ｌ−ｐｒｏｌｉｎｅ（渡辺化学工業株式会社）
・Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ：  Ｎ−α−（９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）−Ｏ−（ｔ−ｂｕｔｙｌ）−Ｌ−ｓｅｒｉｎｅ（渡辺化学工業株式会社）
・Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｎｐｙｓ）−ＯＨ：  Ｎ−α−（ｔ−Ｂｕｔｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）−Ｓ−（３−ｎｉｔｒｏ−２−ｐｙｒｉｄｉｎｅｓｕｌｆｅｎｙｌ）−Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｅ  （国産化学）
・ＨＡＴＵ：Ｏ−（７−ａｚａ−１Ｈ−ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌ−１−ｙｌ）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｕｒｏｎｉｕｍ  ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）
・ＤＩＥＡ：  Ｎ，Ｎ−Ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ（和光純薬・ペプチド合成用）
・ＤＭＦ：  Ｎ，Ｎ−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ（関東化学・ペプチド合成用）
・ＴＦＡ：  ２，２，２−Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ（和光純薬）
・ＴＩＰＳ：  Ｔｒｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｓｉｌａｎｅ（渡辺化学工業株式会社）
・Ｔｈｉｏａｎｉｓｏｌｅ（渡辺化学工業株式会社）
・ｍ−Ｃｒｅｓｏｌ（東京化成）
・ＤＣＭ：  Ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ（関東化学）
・ＡＣＮ：  ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ（関東化学・ＨＰＬＣ用）
・α−ＣＨＣＡ：α−Ｃｙａｎｏ−４−ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｉｃ  Ａｃｉｄ
・分取カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｐｒｏ  Ｃ１８，  ２０ｍｍ（Ｉ．Ｄ．）  Ｘ  ２５０ｍｍ（Ｌｅｎｇｔｈ），  粒子径５μｍ，  細孔径１２μｍ（ＹＭＣ）
・分析カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｐｒｏ  Ｃ１８，  ４．６ｍｍ（Ｉ．Ｄ．）  Ｘ  ２５０ｍｍ（Ｌｅｎｇｔｈ），  粒子径５μｍ，  細孔径１２μｍ（ＹＭＣ）
・ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＡＳＳ：  Ｍａｔｒｉｘ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  Ｏｆ  Ｆｌｉｇｈｔ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ
・Ｄ．Ｗ．：  ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ    ｗａｔｅｒ
・硫酸銅五水和物（関東化学）
・アスコルビン酸（関東化学）
【００７４】
２．ＭＡＰコアの合成
ＭＡＰ４を例としてＭＡＰコアの合成法を以下に記載する。
ＭＡＰコア合成は通常のＦｍｏｃ固相合成法を用い、全ての工程を手動にて行った。具体的にはＮＨ２−ＳＡＬ−Ｔｒｔ（２−Ｃｌ）−  Ｒｅｓｉｎ  １ｍｍｏｌ分を固相担体として以下の手順で合成した。
【００７５】
【表１】
2018052837.tif 000011
【００７６】
合成終了後、固相０．１ｍｍｏｌに対しＤ．Ｗ．（ｍｌ）：ＴＩＰＳ（ｍｌ）：ＴＦＡ（ｍｌ）の比が１．５：１．５：３０となるように加え、１．５時間撹拌し、切出と脱保護を行った。切出後は、ろ過により溶液を回収しこれを減圧濃縮後、少量の水を加え凍結乾燥した。凍結乾燥後、０．１％ＴＦＡとＡＣＮを溶出液に用いた逆相ＨＰＬＣにて以下の条件で精製を行った。
【００７７】
精製条件：
・溶出液Ａ：  ０．１％ＴＦＡ，  溶出液Ｂ：  ０．１％ＴＦＡ  ＡＣＮ
・平衡化：溶出液Ａ  １００％，  １０ｍＬ／ｍｉｎ，  １０ｍｉｎ
・溶出：溶出液Ａ  １００％→溶出液Ａ  ７０％／溶出液Ｂ  ３０％，  １０ｍＬ／ｍｉｎ，  ３０ｍｉｎリニアグラジエント
【００７８】
精製物はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＡＳＳを用いた質量分析（下記の条件）にて目的物の確認を行った。
【００７９】
質量分析条件：
・マトリックス溶液：１０ｍｇ／ｍＬ  α−ＣＨＣＡ  ｉｎ  ０．１％ＴＦＡ  ５０％ＣＡＮ水溶液
・サンプル：ＨＰＬＣ溶出液もしくは０．１％ＴＦＡ  ５０％ＡＣＮ水溶液（概ね１ｍｇ／ｍＬ  ペプチド）
・マトリックス溶液とサンプルを１：１で混合しプレート上で混晶を形成した
【００８０】
３．抗原ペプチド合成
抗原ペプチド合成もＭＡＰコア合成と同様にＦｍｏｃ固相合成法を用いて行った。
具体的にはＦｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＴｒｔＡ−ＰＥＧ−  Ｒｅｓｉｎ  ０．４ｍｍｏｌ分を固相担体として用い、最初にレジンをＤＭＦで膨潤し、２０％ピペリジンでＦｍｏｃ基を脱保護した。以降は以下の手順で合成した。
【００８１】
抗原ペプチドの配列はＮ３−ＩＫＫＡＤＧＳＥＣＬＰ−ＯＨでありＣ末端からＮ末端に向かいペプチドを伸長した。
【００８２】
【表２】
2018052837.tif 000012
【００８３】
合成終了後、固相１ｍｍｏｌに対しチオアニソール（ｍｌ）：ｍ−クレゾール（ｍｌ）：ＴＩＰＳ（ｍｌ）：ＴＦＡ（ｍｌ）＝３．６：１：０．６：２５を加え１．５時間撹拌し切出と脱保護を行った。切出後は、ろ過により溶液を回収しこれを減圧濃縮し、さらにエーテルを加え沈殿を回収し未精製ペプチドを得た。未精製ペプチドは０．１％ＴＦＡとＡＣＮを溶出液に用いた逆相ＨＰＬＣにて以下の条件で精製を行った。
【００８４】
精製条件：
・溶出液Ａ：  ０．１％ＴＦＡ，  溶出液Ｂ：  ０．１％ＴＦＡ  ＡＣＮ
・平衡化：溶出液Ａ  ９０％／溶出液Ｂ  １０％，  １０ｍＬ／ｍｉｎ，  １０ｍｉｎ
・溶出：溶出液Ａ  ９０％／溶出液Ｂ  １０％→溶出液Ａ  ５０％／溶出液Ｂ  ５０％，  １０ｍＬ／ｍｉｎ，  ３０ｍｉｎリニアグラジエント
【００８５】
ＨＰＬＣ  分析条件：
・溶出液Ａ：  ０．１％ＴＦＡ，  溶出液Ｂ：  ０．１％ＴＦＡ  ＡＣＮ
・平衡化：溶出液Ａ  ９５％／溶出液Ｂ  ５％，  １０ｍＬ／ｍｉｎ，  １０ｍｉｎ
・溶出：溶出液Ａ  ９０％／溶出液Ｂ  １０％→溶出液Ａ  ４０％／溶出液Ｂ  ６０％，  １０ｍＬ／ｍｉｎ，  ３０ｍｉｎリニアグラジエント
【００８６】
精製物はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＡＳＳを用いた質量分析（上記と同じ条件）にて目的物の確認を行った。
【００８７】
精製が終了した抗原ペプチド１５５ｍｇ（１１３μｍｏｌ）をＤＭＳＯ  １ｍＬ  に溶解し、ＢＯＣ−Ｃｙｓ（Ｎｐｙｓ）−ＯＨ  ８５ｍｇ（２２６μｍｏｌ）を加えジスルフィドを形成し  配列中のＣｙｓ残基側鎖のＳＨ基を保護した。この反応後もＨＰＬＣにて上記と同様に精製し凍結乾燥を行い抗原ペプチドとした。
【００８８】
４．ＭＡＰ−ペプチドの合成
ＭＡＰコアと抗原ペプチドはヒュスゲン反応を利用し結合させた。すなわち、ＭＡＰコア中のアルキンをＣｕ＋で活性化し抗原ペプチドＮ末端のアジド基と反応させトリアゾールにより結合させた。具体的な工程を以下に記載する。
【００８９】
（工程１）ＭＡＰコアと抗原ペプチドを０．１％ＴＦＡ水溶液に溶解した。このとき混合比は、ＭＡＰコア１５ｍｇ（１９μｍｏｌ）：抗原ペプチド１１４ｍｇ（７１μｍｏｌ）とし、これらを８Ｍ尿素水溶液２ｍｌに溶解した（ペプチド溶液）。
【００９０】
（工程２）硫酸銅・５水和物水溶液とアスコルビン酸水溶液の調製を次のように行った。硫酸銅・５水和物５０ｍｇ（２００μｍｏｌ）を１ｍｌのＤ．Ｗ．に溶解した（硫酸銅水溶液）。また、アスコルビン酸  １７６ｍｇ  （１ｍｍｏｌ）を１ｍｌのＤ．Ｗ．に溶解した（アスコルビン酸水溶液）。次に、硫酸銅水溶液とアスコルビン酸水溶液を全量混和した（Ｃｕ＋溶液）。
【００９１】
（工程３）次にヒュスゲン反応を行なった。具体的には、ペプチド溶液２ｍｌとＣｕ＋溶液０．３５ｍｌを混和し、室温で数時間反応した。
【００９２】
（工程４）反応物を０．１％ＴＦＡとＡＣＮを溶出液に用いた逆相ＨＰＬＣにて抗原ペプチド付近に出たピークをすべて分取し凍結乾燥した（８７ｍｇ回収）。
【００９３】
（工程５）上で得た凍結乾燥物試料８７ｍｇを１／１５Ｍ  リン酸緩衝液（Ｋ／Ｎａ２、ｐＨ７．２）１ｍＬに溶解し、４％炭酸水素ナトリウム溶液でｐＨを中性とした。この溶液にジチオスレイトール３４ｍｇ（２２０μｍｏｌ）を加え室温で還元し、逆相ＨＰＬＣにて目的物を精製した。精製条件は、上記抗原ペプチドの精製と同様である。
【００９４】
（工程６）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＡＳＳを用いた質量分析（条件は上と同じ）によって目的物の確認を行った。また、ＨＰＬＣ分析によって純度を検定した。ＨＰＬＣ純度検定条件は、上記抗原ペプチドの場合と同様であった。
【００９５】
５．合成結果
合成結果は以下の通りであった。
【００９６】
【表３】
2018052837.tif 000013
【００９７】
【表４】
2018052837.tif 000014
【００９８】
＜エボラ２ＭＡＰ４の合成＞
１．略語表
・ＮＨ２−ＳＡＬ−Ｔｒｔ（２−Ｃｌ）−  Ｒｅｓｉｎ：  Ｒｉｎｋ−Ｂｅｒｎａｔｏｗｉｔｚ−ａｍｉｄｅ  Ｂａｒｌｏｓ  Ｒｅｓｉｎ  （渡辺化学工業株式会社）  
・Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ：Ｎ−α，Ｎ−ε−Ｂｉｓ（９−ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ（渡辺化学工業株式会社）
・Ｂｏｃ−Ｐｒａ−ＯＨ：Ｎ−Ｂｏｃ−Ｌ−ｐｒｏｐａｒｇｙｌｇｌｙｃｉｎｅ（東京化成工業株式会社）
・Ｎ３−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ：１１−Ａｚｉｄｏ−３，６，９−ｔｒｉｏｘａｕｎｄｅｃａｎｏｉｃ  Ａｃｉｄ（東京化成工業株式会社）
・Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｌｋｏ−ＰＥＧ  ｒｅｓｉｎ：Ｎ−α−（９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）−Ｎ−ε−（ｔ−ｂｕｔｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ  ｐ−ｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ  ｒｅｓｉｎ（渡辺化学工業株式会社）
・Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ：Ｎ−α−（９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）−Ｓ−ｔｒｉｔｙｌ−Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｅ（渡辺化学工業株式会社）
・Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ：Ｎ−α−（９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）−Ｌ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ（渡辺化学工業株式会社）
・Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ：Ｎ−α−（９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）−Ｎ−τ−ｔｒｉｔｙｌ−Ｌ−ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ（渡辺化学工業株式会社）
・Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ：Ｎ−（９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）−Ｌ−ｐｒｏｌｉｎｅ（渡辺化学工業株式会社）
・Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ：Ｎ−α−（９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）−Ｎ−ω−（２，２，４，６，７−ｐｅｎｔａｍｅｔｈｙｌｄｉｈｙｄｒｏｂｅｎｚｏｆｕｒａｎ−５−ｓｕｌｆｏｎｙｌ）−Ｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅ（渡辺化学工業株式会社）
・Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ：Ｎ−α−（９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）−Ｌ−ｖａｌｉｎｅ（渡辺化学工業株式会社）
・Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ：Ｎ−α−（９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）−Ｏ−（ｔ−ｂｕｔｙｌ）−Ｌ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ（渡辺化学工業株式会社）
・Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｎｐｙｓ）−ＯＨ：  Ｎ−α−（ｔ−Ｂｕｔｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）−Ｓ−（３−ｎｉｔｒｏ−２−ｐｙｒｉｄｉｎｅｓｕｌｆｅｎｙｌ）−Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｅ（国産化学）
・ＨＡＴＵ：Ｏ−（７−ａｚａ−１Ｈ−ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌ−１−ｙｌ）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｕｒｏｎｉｕｍ  ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）
・ＤＩＥＡ：  Ｎ，Ｎ−Ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ（和光純薬・ペプチド合成用）
・ＤＭＦ：  Ｎ，Ｎ−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ（関東化学・ペプチド合成用）
・ＴＦＡ：  ２，２，２−Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ（和光純薬）
・ＴＩＰＳ：  Ｔｒｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｓｉｌａｎｅ（渡辺化学工業株式会社）
・Ｔｈｉｏａｎｉｓｏｌｅ（渡辺化学工業株式会社）
・ｍ−Ｃｒｅｓｏｌ（東京化成）
・ＤＣＭ：  Ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ（関東化学）
・ＡＣＮ：  ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ（関東化学・ＨＰＬＣ用）
・α−ＣＨＣＡ：α−Ｃｙａｎｏ−４−ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｉｃ  Ａｃｉｄ
・分取カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｐｒｏ  Ｃ１８，  ２０ｍｍ（Ｉ．Ｄ．）  Ｘ  ２５０ｍｍ（Ｌｅｎｇｔｈ），  粒子径５μｍ，  細孔径１２μｍ（ＹＭＣ）
・分析カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｐｒｏ  Ｃ１８，  ４．６ｍｍ（Ｉ．Ｄ．）  Ｘ  ２５０ｍｍ（Ｌｅｎｇｔｈ），  粒子径５μｍ，  細孔径１２μｍ（ＹＭＣ）
・ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＡＳＳ：  Ｍａｔｒｉｘ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  Ｏｆ  Ｆｌｉｇｈｔ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ
・Ｄ．Ｗ．：  ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ    ｗａｔｅｒ
・硫酸銅五水和物（関東化学）
・アスコルビン酸（関東化学）
【００９９】
２．ＭＡＰコアの合成
ＭＡＰ４を例としてＭＡＰコアの合成法を以下に記載する。
ＭＡＰコア合成は、通常のＦｍｏｃ固相合成法を用い、全ての工程を手動にて行った。具体的にはＮＨ２−ＳＡＬ−Ｔｒｔ（２−Ｃｌ）−  Ｒｅｓｉｎ  １ｍｍｏｌ分を固相担体として以下の手順で合成した。
【０１００】
【表５】
2018052837.tif 000015
【０１０１】
合成終了後、固相０．１ｍｍｏｌに対しＤ．Ｗ．（ｍｌ）：ＴＩＰＳ（ｍｌ）：ＴＦＡ（ｍｌ）の比が１．５：１．５：３０となるように加え、１．５時間撹拌し、切出と脱保護を行った。切出後は、ろ過により溶液を回収しこれを減圧濃縮後、少量の水を加え凍結乾燥した。凍結乾燥後、０．１％ＴＦＡとＡＣＮを溶出液に用いた逆相ＨＰＬＣにて以下の条件で精製を行った。
【０１０２】
精製条件：
・溶出液Ａ：  ０．１％ＴＦＡ，  溶出液Ｂ：  ０．１％ＴＦＡ  ＡＣＮ
・平衡化：溶出液Ａ  １００％，  １０ｍＬ／ｍｉｎ，  １０ｍｉｎ
・溶出：溶出液Ａ  １００％→溶出液Ａ  ７０％／溶出液Ｂ  ３０％，  １０ｍＬ／ｍｉｎ，  ３０ｍｉｎリニアグラジエント
【０１０３】
精製物はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＡＳＳを用いた質量分析（下記の条件）にて目的物の確認を行った。
【０１０４】
質量分析条件：
・マトリックス溶液：１０ｍｇ／ｍＬ  α−ＣＨＣＡ  ｉｎ  ０．１％ＴＦＡ  ５０％ＣＡＮ水溶液
・サンプル：ＨＰＬＣ溶出液もしくは０．１％ＴＦＡ  ５０％ＡＣＮ水溶液（概ね１ｍｇ／ｍＬ  ペプチド）
・マトリックス溶液とサンプルを１：１で混合しプレート上で混晶を形成した
【０１０５】
３．抗原ペプチド合成
抗原ペプチド合成もＭＡＰコア合成と同様にＦｍｏｃ固相合成法を用いて行った。
具体的にはＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｌｋｏ−ＰＥＧ−  Ｒｅｓｉｎ  ０．４ｍｍｏｌ分を固相担体として用い、最初にレジンをＤＭＦで膨潤し、２０％ピペリジンでＦｍｏｃ基を脱保護した。以降は以下の手順で合成した。抗原ペプチドの配列はＮ３−ＰＥＧ−ＦＰＲＣＲＹＶＨＫ−ＯＨでありＣ末端からＮ末端に向かいペプチドを伸長した。
【０１０６】
【表６】
2018052837.tif 000016
【０１０７】
合成終了後、固相１ｍｍｏｌに対しチオアニソール（ｍｌ）：ｍ−クレゾール（ｍｌ）：ＴＩＰＳ（ｍｌ）：ＴＦＡ（ｍｌ）＝３．６：１：０．６：２５を加え、１．５時間撹拌し、切出と脱保護を行った。切出後は、ろ過により溶液を回収し、これを減圧濃縮した。さらにエーテルを加え、沈殿を回収し、未精製ペプチドを得た。未精製ペプチドは０．１％ＴＦＡとＡＣＮを溶出液に用いた逆相ＨＰＬＣにて以下の条件で精製を行った。
【０１０８】
精製条件：
・溶出液Ａ：  ０．１％ＴＦＡ，  溶出液Ｂ：  ０．１％ＴＦＡ  ＡＣＮ
・平衡化：溶出液Ａ  ９０％／溶出液Ｂ  １０％，  １０ｍＬ／ｍｉｎ，  １０ｍｉｎ
・溶出：溶出液Ａ  ９０％／溶出液Ｂ  １０％→溶出液Ａ  ５０％／溶出液Ｂ  ５０％，  １０ｍＬ／ｍｉｎ，  ３０ｍｉｎリニアグラジエント
【０１０９】
ＨＰＬＣ  分析条件：
・溶出液Ａ：  ０．１％ＴＦＡ，  溶出液Ｂ：  ０．１％ＴＦＡ  ＡＣＮ
・平衡化：溶出液Ａ  ９０％／溶出液Ｂ  ９０％，  １０ｍＬ／ｍｉｎ，  １０ｍｉｎ
・溶出：溶出液Ａ  ９０％／溶出液Ｂ  １０％→溶出液Ａ  ４０％／溶出液Ｂ  ６０％，  １０ｍＬ／ｍｉｎ，  ３０ｍｉｎリニアグラジエント
【０１１０】
精製物は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＡＳＳを用いた質量分析（上記と同じ条件）にて目的物の確認を行った。
【０１１１】
精製が終了した抗原ペプチド３７０ｍｇ（２６０μｍｏｌ）をＤＭＳＯ  ２ｍＬ  に溶解し、ＢＯＣ−Ｃｙｓ（Ｎｐｙｓ）−ＯＨ  ２２０ｍｇ（５８６μｍｏｌ）を加えジスルフィドを形成し、  配列中のＣｙｓ残基側鎖のＳＨ基を保護した。この反応後もＨＰＬＣにて上記と同様に精製し凍結乾燥を行い抗原ペプチドとした。
【０１１２】
４．ＭＡＰ−ペプチドの合成
ＭＡＰコアと抗原ペプチドはヒュスゲン反応を利用して結合させた。すなわち、ＭＡＰコア中のアルキンをＣｕ＋で活性化し抗原ペプチドＮ末端のアジド基と反応させ、トリアゾールにより結合させた。具体的な工程を以下に記載する。
【０１１３】
（工程１）ＭＡＰコアと抗原ペプチドを０．１％ＴＦＡ水溶液に溶解した。このとき混合比は、ＭＡＰコア４０ｍｇ（５１μｍｏｌ）：抗原ペプチド３２０ｍｇ（１９５μｍｏｌ）とし、これらを８Ｍ尿素水溶液２ｍｌに溶解した（ペプチド溶液）。
【０１１４】
（工程２）硫酸銅・５水和物水溶液とアスコルビン酸水溶液の調製を次のように行った。硫酸銅・５水和物２５０ｍｇ（５００μｍｏｌ）を１ｍｌのＤ．Ｗ．に溶解した（硫酸銅水溶液）。また、アスコルビン酸  ４４０ｍｇ  （２．５ｍｍｏｌ）を１ｍｌのＤ．Ｗ．に溶解した（アスコルビン酸水溶液）。次に、硫酸銅水溶液とアスコルビン酸水溶液を全量混和した（Ｃｕ＋溶液）。
【０１１５】
（工程３）次にヒュスゲン反応を行なった。具体的には、ペプチド溶液２ｍｌとＣｕ＋溶液１ｍｌを混和し、室温で数時間反応した。
【０１１６】
（工程４）反応物を０．１％ＴＦＡとＡＣＮを溶出液に用いた逆相ＨＰＬＣにて抗原ペプチド付近に出たピークをすべて分取し凍結乾燥した（２７３ｍｇ回収）。
【０１１７】
（工程５）上で得た凍結乾燥物試料２７３ｍｇを１／１５Ｍ  リン酸緩衝液（Ｋ／Ｎａ２）  ｐＨ７．２  １ｍＬに溶解し、４％炭酸水素ナトリウム溶液で  ｐＨを中性とした。この溶液にジチオスレイトール６８ｍｇ（４４０μｍｏｌ）を加え室温で還元し、逆相ＨＰＬＣにて目的物を精製した。精製条件は、上記抗原ペプチドの精製と同様である。
【０１１８】
（工程６）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＡＳＳを用いた質量分析（条件は上と同じ）によって目的物の確認を行った。また、ＨＰＬＣ分析によって純度を検定した。ＨＰＬＣ純度検定条件は、上記抗原ペプチドの場合と同様であった。
【０１１９】
５．合成結果
合成結果は以下の通りであった。
【０１２０】
【表７】
2018052837.tif 000017
【０１２１】
【表８】
2018052837.tif 000018
【０１２２】
［実施例２］
＜エボラ１ＭＡＰ４又はエボラ２ＭＡＰ４投与手順＞
（１）試験Ａ
エボラ１ＭＡＰ４又はエボラ２ＭＡＰ４（「エボラ−ＭＡＰ４」という）の投与量（１０％マウス血清中１００μｇ、１０μｇ、１μｇ）を変えてマウス１群、２群及び３群を設定した。また、血清添加群の対照として生理食塩水中１００μｇのエボラ−ＭＡＰ４を投与するマウス４群を設置した。マウスは、ＢＡＬＢ／ｃＡＪｃ（日本クレア）マウス（８週齢、雌）であり、各群５匹からなった。
【０１２３】
上記１群〜４群のマウスに、初回（０日）のみα−ガラクトシルセラミド（２μｇ）とエボラ−ＭＡＰ４を静脈内投与し、その後１日目、３日目、７日目、１４日目にエボラ−ＭＡＰ４のみを投与し、初回投与３日前、初回投与後１日、７日、１４日、２１日にイソフルラン麻酔下で眼窩採血し、血清中の抗ＭＡＰ抗体の濃度を測定した。
【０１２４】
（２）試験Ｂ
Ｂａｌｂ／ｃマウスにエボラ１ＭＡＰ４を２％ＤＭＳＯ−１％マウス血清入り生理食塩水に溶解したものを腹腔内注射した。投与量は、Ｂａｌｂ／ｃマウスあたり１００μｇ／１００μＬ／マウス／回投与とした。ＭＡＰ投与方法は、５日間毎日１日１回連日投与し（合計５回投与）、初回投与日から７日目、１４日目に投与した。α−ガラクトシルセラミド投与は、初回のみＭＡＰ４とともに腹腔内投与し、用量は２μｇ／マウスとした。投与前、投与後で眼窩静脈叢から採血し、血清中の抗ＭＡＰ抗体の濃度を測定した。
【０１２５】
（３）試験Ｃ
ＢＤＦ１マウスにエボラ１ＭＡＰ４及びエボラ２ＭＡＰ４の混合物を２％ＤＭＳＯ−ＰＢＳに溶解したものを腹腔内注射した。用量は、マウスあたりＭＡＰ４総量として２００μｇ／１００μＬ／マウス／回投与とした。ＭＡＰ投与方法は、５日間毎日１日１回連日投与し（合計５回投与）、初回投与日から７日目、１４日目に投与した。α−ガラクトシルセラミド投与は、初回のみＭＡＰ４とともに腹腔内投与し、用量は２μｇ／マウスとした。投与前、投与後で眼窩静脈叢から採血し、血清中の抗ＭＡＰ抗体の濃度を測定した。
【０１２６】
＜エボラ−ＭＡＰ４のマウス血清中抗体価の測定法＞
抗体ＭＡＰ抗体の測定には、エボラ１又はエボラ２のペプチドに牛血清アルブミン（ＢＳＡ）とＦＬＡＧを結合したものをＥＬＩＳＡプレートに固相化し、その後１００倍希釈した血清を添加し、３７℃で１時間インキュベートした後、それぞれペルオキシダーゼ標識された抗ＩｇＭ抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社）、抗ＩｇＧ抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社）、抗ＩｇＧ１抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社）、抗ＩｇＧ２ａ抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社）、抗ＩｇＧ３抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社）をメーカー推奨濃度で加え、ペルオキシダーゼによる基質分解後の発色をプレートリーダーを用いて測定し、血清中抗体価を測定した。
【０１２７】
また、エボラ１又はエボラ２のペプチドに牛血清アルブミン（ＢＳＡ）とＦＬＡＧを結合したものをＥＬＩＳＡプレートに固相化し、血清の代わりに抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体（Ｃｌｏｎｅ：  Ｍ２マウスＩｇＧ１、シグマアルドリッチ社）を各種濃度に希釈して添加し、抗ＭＡＰ抗体価測定と同様にして測定することで、抗ＭＡＰ抗体価の定量化のための標準曲線とした。この標準曲線から、抗ＭＡＰ抗体のおおよその血清中抗体濃度を算出した。
【０１２８】
＜試験Ａの結果＞
血清中の抗ＭＡＰ抗体の濃度を測定した結果を、図２に示した。
図２から、エボラ１ＭＡＰ４の静脈内投与では、１００μｇ投与群でのみＩｇＧ上昇が認められた。
【０１２９】
しかし、エボラ２ＭＡＰ４の静脈内投与では、ＩｇＧ及びＩｇＭ上昇は認められなかった。
【０１３０】
＜試験Ｂの結果＞
血清中の抗ＭＡＰ抗体の濃度を測定した結果を、図３に示した。
図３から、エボラ１ＭＡＰ４の腹腔内投与では、ＩｇＭが明らかに上昇したマウスが１匹、軽度上昇したマウスが２匹認められたが、ＩｇＧ上昇は認められなかった。
【０１３１】
＜試験Ｃの結果＞
血清中の抗ＭＡＰ抗体の濃度を測定した結果を、図４（ＩｇＧ価）及び図５（ＩｇＭ価）に示した。
【０１３２】
図４から、エボラ１ＭＡＰ４及びエボラ２ＭＡＰ４混合投与における、エボラ１及びエボラ２に対するＩｇＧ価を測定した結果、エボラ１には５匹中２匹で、エボラ２でも５匹中２匹でＩｇＧ上昇が認められた。測定したエボラ１−ＩｇＧ濃度は、１０〜２０ｎｇ／ｍＬであった。
【０１３３】
図５から、エボラ１及びエボラ２に対するＩｇＭ価が明らかに上昇したマウスが２匹、軽度に上昇したマウスが２匹認められた。
【産業上の利用可能性】
【０１３４】
本発明は、実用的な治療法又はワクチンがないエボラウイルス感染に対する免疫誘導剤を提供するものであり、実施例に示すように多重抗原ペプチドによってＩｇＧ抗体の誘導を可能にしたことはエボラウイルスに対する免疫誘導によるワクチンとしての可能性を示した。このことは致死性の高いエボラウイルス感染に対する予防及び治療のために産業上有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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