(57)【要約】【課題】炎症関連病態を伴う非アルコール性脂肪肝疾患に特異的であるとともに実用的かつ簡便に測定可能なバイオマーカーを提供する。【解決手段】本発明の炎症性関連病態を伴う非アルコール性脂肪性肝疾患のバイオマーカーは、体液中のアドレン酸及びドコサペンタエン酸の少なくともいずれかからなる。アドレン酸及びドコサペンタエン酸は、炎症関連病態を有するＮＡＦＬＤにおいて、正常肝臓及びＮＡＦＬＤの単純脂肪肝に比べて有意に高値を示すため、炎症関連病態を伴う非アルコール性脂肪性肝疾患に特異的なバイオマーカーとして有用である。また、アドレン酸及びドコサペンタエン酸は単純な構造の多価不飽和脂肪酸であるため検出が容易であり、実用性及び簡便性に優れる。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
体液中のアドレン酸及びドコサペンタエン酸の少なくともいずれかからなる、炎症関連病態を伴う非アルコール性脂肪性肝疾患のバイオマーカー。
【請求項２】
前記体液が、血清、血漿又は血液である、請求項１に記載の炎症性関連病態を伴う非アルコール性脂肪性肝疾患のバイオマーカー。
【請求項３】
被験者に由来する体液試料中のアドレン酸及びドコサペンタエン酸の少なくともいずれかの濃度の測定値を得る工程と、
前記測定値を基準量と比較する工程と、
を含む、炎症性関連病態を伴う非アルコール性脂肪性肝疾患を分析する方法。
【請求項４】
前記被験者が肝臓の画像診断を受けていない、請求項３に記載の炎症性関連病態を伴う非アルコール性脂肪性肝疾患を分析する方法。
【請求項５】
前記測定値を液体クロマトグラフィー質量分析によって得る、請求項３または４に記載の炎症性関連病態を伴う非アルコール性脂肪性肝疾患を分析する方法。
【請求項６】
前記基準量が炎症関連病態の程度に応じ複数設定されている、請求項３から５のいずれか１項に記載の炎症性関連病態を伴う非アルコール性脂肪性肝疾患を分析する方法。
【請求項７】
アドレン酸及びドコサペンタエン酸の少なくともいずれかの修飾体又は同位体標識体を内部標準物質として含む、炎症性関連病態を伴う非アルコール性脂肪性肝疾患の診断用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、炎症性関連病態を伴う非アルコール性脂肪性肝疾患の診断技術に関する。具体的には、本発明は、炎症性関連病態を伴う非アルコール性脂肪性肝疾患のバイオマーカー、炎症性関連病態を伴う非アルコール性脂肪性肝疾患を分析する方法、及び炎症性関連病態を伴う非アルコール性脂肪性肝疾患の診断用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
脂肪肝つまり非アルコール性脂肪性肝疾患（nonalcoholic fatty liver disease；ＮＡＦＬＤ）は先進国において高頻度にみられる慢性肝疾患であり、食生活の欧米化、運動不足などにより、日本では、成人健康診受診者の20〜30%がＮＡＦＬＤと診断される。ＮＡＦＬＤには、単純脂肪肝と非アルコール性脂肪肝炎（nonalcoholic steatohepatitis；ＮＡＳＨ）との２つの病態が含まれる。
【０００３】
ＮＡＳＨは、成人の数％が罹患していると推定されている。単純性脂肪肝が比較的良性の疾患とされていることに対し、ＮＡＳＨは、組織学的に慢性炎症や線維化を伴う病態であり、長期の経過で肝硬変、肝不全、および肝細胞がんへの進展がみられることから、重大な健康問題を孕んでいる。それにも拘わらず、ＮＡＳＨは自覚症状がないため、健康診断で脂肪肝が発見されても放置される場合が多い。
【０００４】
ＮＡＳＨの検査で最も実用されているバイオマーカーは、アラニンアミノ基転移酵素ＡＬＴ及びアスパラギン酸アミノ基転移酵素ＡＳＴである。ＡＬＴ及びＡＳＴは、肝細胞の破壊又は細胞膜の透過性亢進の際に血中濃度が上昇することから、肝臓における炎症の指標とされている。臨床的には、画像診断でＮＡＦＬＤと診断された患者に対する血液検査でＡＬＴ及びＡＳＴの測定が行われることで、ＮＡＦＬＤ患者からＮＡＳＨ疑いを診断する手法がとられている。
【０００５】
他にも、ＮＡＳＨを検出することができると報告されているマーカーとして、非特許文献１（HEPATOLOGY 2015;62:1433-1443）に、フコシル化ハプトグロビンとMac-2結合タンパク質との組み合わせが開示されており、特許文献１（国際公開第２０１０／０３２４５８号）に、インターαトリプシンインヒビター重鎖Ｈ４前駆体、そのタンパク断片及びペプチド断片が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２０１０／０３２４５８号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】HEPATOLOGY 2015;62:1433-1443
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ＮＡＳＨのバイオマーカーとして実用されているＡＬＴ及びＡＳＴは、それ自体、ＮＡＦＬＤであるか否かに関わらず、肝臓に炎症反応があれば血中濃度が上昇する。したがって、ＡＬＴ及びＡＳＴは、ＮＡＦＬＤとして予めスクリーニングされた群からＮＡＳＨ疑いを診断することはできるものの、ＮＡＦＬＤのほかに非ＮＡＦＬＤも含む群からはＮＡＳＨ疑いのみを診断することはできない。つまり、ＮＡＳＨに特異的なバイオマーカーではない。したがって、ＡＬＴ及びＡＳＴを用いてＮＡＳＨ疑いを診断するには、予め、画像診断によりＮＡＦＬＤであることの診断を行う必要がある。
【０００９】
非特許文献１に記載されたフコシル化ハプトグロビンとMac-2結合タンパク質との組み合わせも、ＮＡＦＬＤ群からＮＡＳＨ疑いを診断することはできるものの、ＮＡＦＬＤおよび非ＮＡＦＬＤを含む群からＮＡＳＨ疑いのみを診断できるとはいえない。つまり、ＮＡＳＨに特異的なバイオマーカーであるとはいえない。
【００１０】
特許文献１に記載されたインターαトリプシンインヒビター重鎖Ｈ４前駆体、そのタンパク断片及びペプチド断片は、ＮＡＦＬＤ群からＮＡＳＨ疑いを診断することはできるものの、ＮＡＳＨでないＮＡＦＬＤにおいても血中濃度が上昇する。つまり、ＮＡＳＨに特異的なバイオマーカーではない。
【００１１】
さらに、フコシル化ハプトグロビンとMac-2結合タンパク質との組み合わせ、及び、インターαトリプシンインヒビター重鎖Ｈ４前駆体、そのタンパク断片及びペプチド断片のいずれおいて、サンドイッチＥＬＩＳＡのためのモノクローナル抗体及びハイブリドーマ並びに標準タンパク質のリコンビナントタンパク質の安定供給化という点を考慮すると、実用性の問題をはらんでいる。さらに、これらのようにバイオマーカーの本体がタンパク質である場合は、特定微量タンパク質の高感度定量が必要となる点で、本来的な簡便性の乏しさの問題もある。
【００１２】
そこで本発明の目的は、上記の問題に鑑み、炎症関連病態を伴う非アルコール性脂肪性肝疾患に特異的であるとともに実用的かつ簡便に測定可能なバイオマーカーを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は鋭意検討の結果、炎症関連病態を伴うＮＡＦＬＤにおいて、正常肝臓及びＮＡＦＬＤの単純脂肪肝に比べ、特定の多価不飽和脂肪酸が有意に高値を示すことを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は、炎症性関連病態を伴う非アルコール性脂肪性肝疾患のバイオマーカー、炎症性関連病態を伴う非アルコール性脂肪性肝疾患を分析する方法、及び炎症性関連病態を伴う非アルコール性脂肪性肝疾患の診断用キットを含む。
【００１４】
（１）
本発明の炎症性関連病態を伴う非アルコール性脂肪性肝疾患のバイオマーカーは、体液中のアドレン酸及びドコサペンタエン酸の少なくともいずれかからなる。
【００１５】
アドレン酸及びドコサペンタエン酸は、炎症関連病態を伴うＮＡＦＬＤにおいて、正常肝臓及びＮＡＦＬＤの単純脂肪肝に比べて有意に高値を示すため、炎症性関連病態を伴う非アルコール性脂肪性肝疾患特異的なバイオマーカーとして有用である。また、アドレン酸及びドコサペンタエン酸は単純な構造の多価不飽和脂肪酸であるため検出が容易であり、実用性及び簡便性に優れる。
【００１６】
（２）
上記（１）の炎症性関連病態を伴う非アルコール性脂肪性肝疾患のバイオマーカーは、体液が、血清、血漿又は血液であってよい。
【００１７】
これによって、血液検査で簡便に炎症性関連病態を伴う非アルコール性脂肪性肝疾患を検出することができる。
【００１８】
（３）
本発明の炎症性関連病態を伴う非アルコール性脂肪性肝疾患を分析する方法は、被験者に由来する体液試料中のアドレン酸及びドコサペンタエン酸の少なくともいずれかの濃度の測定値を得る工程と、得られた測定値を基準量と比較する工程と、を含む。
【００１９】
これによって、アドレン酸及びドコサペンタエン酸の少なくともいずれかの測定値が基準量より高値であった場合に、被験者について炎症性関連病態を伴う非アルコール性脂肪性肝疾患の疑いと診断することができる。
【００２０】
（４）
上記（３）の炎症性関連病態を伴う非アルコール性脂肪性肝疾患を分析する方法は、被験者が肝臓の画像診断を受けていないものであってよい。
【００２１】
本発明のバイオマーカーは、炎症性関連病態を伴う非アルコール性脂肪性肝疾患特異的であるため、予め画像診断でＮＡＦＬＤをスクリーニングすることなく、炎症性関連病態を伴う非アルコール性脂肪性肝疾患の疑いを診断することができる。
【００２２】
（５）
上記（３）または（４）の炎症性関連病態を伴う非アルコール性脂肪性肝疾患を分析する方法は、測定値を液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）によって得てよい。
【００２３】
本発明のバイオマーカーは比較的単純な構造を有する脂肪酸であるため、簡便な測定系で感度良く検出することができる。
【００２４】
（６）
上記（３）から（５）のいずれかの炎症性関連病態を伴う非アルコール性脂肪性肝疾患を分析する方法は、基準量が、炎症関連病態の程度に応じ複数設定されていてよい。
【００２５】
これによって、ＮＡＦＬＤにおける炎症関連病態の程度を判断することができる。
【００２６】
（７）
本発明の炎症性関連病態を伴う非アルコール性脂肪性肝疾患の診断用キットは、アドレン酸及びドコサペンタエン酸の少なくともいずれかの修飾体又は同位体標識体を内部標準物質として含む。
【００２７】
これによって、本発明のバイオマーカーを簡便な測定系で感度良く検出することができる。
【発明の効果】
【００２８】
本発明によれば、炎症性関連病態を伴う非アルコール性脂肪性肝疾患に特異的であるとともに実用的かつ簡便に測定可能なバイオマーカーが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】実施例１におけるヒト検体の分類を示す。
【図２】分類されたヒト検体におけるアドレン酸の相対量を示す。
【図３】分類されたヒト検体におけるドコサペンタエン酸の相対量を示す。
【図４】正常餌食マウス（B6, SD）、正常餌食db/dbマウス（db/db, SD）及びコリン欠乏高脂肪餌食db/db/マウス（db/db, CDAHFD）の、肝臓及び血漿における遊離脂肪酸の相対量を示す。
【図５】正常餌食db/dbマウス（db/db, SD）及びコリン欠乏高脂肪餌食db/db/マウス（db/db, CDAHFD）の、肝臓におけるElongase 2（ELOVL2）及びElongase 5（ELOVL5）の相対発現量を示す。
【図６】アドレン酸（ADA）が、ＴＮＦαにより惹起される炎症誘発性及び繊維化誘発性のケモカイン遺伝子の発現レベルを亢進したことを示す。
【図７】アドレン酸（ADA）が、ＩＬ１βにより惹起される炎症誘発性及び繊維化誘発性のケモカイン遺伝子の発現レベルを亢進したことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
［１．炎症性関連病態を伴う非アルコール性脂肪性肝疾患のバイオマーカー］
［１−１．バイオマーカーの本体］
本発明のバイオマーカーは、炎症関連病態を伴う非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を有しているか否かを診断するために使用されるものであり、具体的には、体液中に含まれるアドレン酸（Adrenic Acid (22:4n6)：7,10,13,16-Docosatetraenoic acid）及びドコサペンタエン酸（Osbond acid（22:5n6）：all-cis-4,7,10,13,16-Docosapentaenoic acid）の少なくともいずれかの遊離脂肪酸からなる。アドレン酸及びドコサペンタエン酸のうち、炎症関連病態を伴うＮＡＦＬＤに対し特異性がより高い点で、アドレン酸が好ましい。
【００３１】
［１−２．炎症性関連病態を伴う非アルコール性脂肪肝疾患］
アドレン酸及びドコサペンタエン酸は、炎症関連病態を伴うＮＡＦＬＤを有する被験者において高発現し、ＮＡＦＬＤであっても炎症関連病態を伴わない単純性脂肪肝の被検者と非ＮＡＦＬＤの被検者（炎症関連病態を有しているか否かを問わない）とにおいては高発現しない。ここで、炎症関連病態とは、組織学的に、炎症細胞浸潤、肝細胞変性(マロリー体又はバルーミング)、及び繊維化の少なくともいずれかを発現している病態をいい、炎症関連病態を伴う非アルコール性脂肪性肝疾患には、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）が含まれる。一方、ＮＡＦＬＤの中でも炎症関連病態を有しない病態（単純性脂肪肝）では、組織学的に脂肪滴の沈着を発現しているが上記の病態のいずれも発現していない。
【００３２】
［１−３．体液］
本発明においては、バイオマーカーの検出対象となる検体として体液を使用する。検体として使用される体液の種類については特に制限されないが、血清、血漿、血液（全血）、尿、髄液、関節液、リンパ液、羊水、腹水、胸水、乳汁、胆汁、各種組織液等が挙げられる。これらの体液の中でも、簡便性及び診断精度の観点から、好ましくは、血清、血漿、血液が挙げられる。これらの体液の検体は、必要に応じて処理され、後述の炎症性関連病態を伴う非アルコール性脂肪性肝疾患を分析する方法で分析対象となる体液試料として用意される。
【００３３】
［２．炎症性関連病態を伴う非アルコール性脂肪性肝疾患を分析する方法］
［２−１．分析目的］
本発明のバイオマーカーであるアドレン酸及びドコサペンタエン酸は、ＮＡＦＬＤであっても炎症関連病態を伴わない単純性脂肪肝の被検者及び非ＮＡＦＬＤの被検者（炎症関連病態を有しているか否かを問わない）に比べ、炎症関連病態を伴うＮＡＦＬＤの被験者の体液中での量が多いため、炎症関連病態を伴うＮＡＦＬＤの有無の診断に利用される。また、本発明のバイオマーカーは、炎症関連病態の程度が大きいほど体液中での量が大きくなる相関を有しているため、ＮＡＦＬＤの炎症関連病態の程度（進行度又は寛解度）の診断にも利用される。したがって、本発明の炎症関連病態を伴うＮＡＦＬＤを分析する方法は、炎症関連病態を伴うＮＡＦＬＤの有無の診断、及びＮＡＦＬＤの炎症関連病態の程度の診断に利用される。
【００３４】
［２−２．分析方法］
本発明の炎症関連病態を伴うＮＡＦＬＤを分析する方法では、被験者に由来する体液試料中のアドレン酸及びドコサペンタエン酸の少なくともいずれかの濃度の測定値を得る工程と、得られた測定値を基準量と比較する工程と、を含む。
【００３５】
［２−３．被験者］
本発明の炎症関連病態を伴うＮＡＦＬＤを分析する方法の対象となる被験者は、炎症関連病態を伴うＮＡＦＬＤについて診断が必要とされている者であれば特に限定されない。
本発明における被検者の例としては、ＮＡＦＬＤであるか否かの診断を受けていない者が挙げられる。本発明のバイオマーカーは、炎症性関連病態を伴う非アルコール性脂肪性肝疾患に対して特異的であるため、被検者は、事前にＮＡＦＬＤについての画像診断を受けていなくてもよい。無論、本発明は、画像診断により予めＮＡＦＬＤについての確定診断を受けたものを被験者として特別除外するものではない。
本発明者における被検者の他の例としては、ＮＡＦＬＤであることの確定診断を受け、且つ、炎症関連病態への進展経過の観察中である者が挙げられる。これらの場合、本発明によって炎症関連病態を伴うＮＡＦＬＤが陽性と判断されれば、適切な治療を早期に開始することができる。本発明のバイオマーカーの量は炎症関連病態の程度に相関するため、バイオマーカーの検出量に応じて適切な治療方針を選択することができる。
【００３６】
本発明における被検者のさらなる他の例としては、炎症関連病態を伴うＮＡＦＬＤの疑い診断又は確定診断を受け、且つ、治療経過の観察中である者が挙げられる。治療には、食事療法、薬物療法及び手術療法のいずれも含む。本発明のバイオマーカーの量は炎症関連病態の程度に相関するため、バイオマーカーの検出量に応じて治療効果（寛解度）を見極め以後の治療方針を選択することができる。
【００３７】
なお、本発明の炎症関連病態を伴うＮＡＦＬＤを分析する方法の対象となる被験者は、ヒトに限定されるものではない。被験者の例として、イヌ、ネコ、マウス、ラット、マウス、ウサギ、その他家畜等の非ヒト哺乳動物が挙げられるが、好ましくはヒトが挙げられる。
【００３８】
［２−４．測定］
バイオマーカーの測定方法としては特に限定されず、遊離脂肪酸を測定することができる方法を特に限定することなく選択することができる。具体的には、バイオマーカーとなる脂肪酸を分離し定量する方法が挙げられる。分離には、液体クロマトグラフィー、及びガスクロマトグラフィー等が挙げられる。定量には、供役酵素反応を利用し脂肪酸から生じさせた過酸化水素を比色プローブ又は蛍光プローブと反応させる比色法又は蛍光法、及び質量分析法等が挙げられるが、本発明のバイオマーカーは比較的単純な構造の脂肪酸であるため、直接的に質量分析で定量することが好ましい。測定の簡便性及び感度を考慮すると、液体クロマトグラフィー質量分析法によって測定することが好ましい。
【００３９】
［２−５．基準量との比較］
本発明のバイオマーカーの測定値は、基準量と比較される。基準量は、炎症関連病態を伴うＮＡＦＬＤの判断基準となる量である。本発明における基準値は、アドレン酸及びドコサペンタエン酸それぞれについて、予め設定することができる。また、基準値は、識別すべき群それぞれに属する者に由来する体液中のバイオマーカー測定値の蓄積データに基づいて設定することができる。
【００４０】
［２−５−１．炎症関連病態を伴うＮＡＦＬＤの陰性群と陽性群とを識別する基準量］
本発明のバイオマーカーは、炎症関連病態を伴うＮＡＦＬＤを有しない被験者の群（ＮＡＬＤであっても炎症関連病態を有しない単純性脂肪肝の被検者と、非ＮＡＦＬＤの被検者（炎症関連病態を有しているか否かを問わない）とを含む群）に比べ、炎症関連病態を伴うＮＡＦＬＤを有する被験者の群において体液中の量が有意に多くなる。従って、基準量をそれら群間のカットオフ値として設定することで、炎症関連病態を伴うＮＡＦＬＤを有するか否かを有効に識別することができる。
【００４１】
基準量の設定の例として、例えば、炎症反応に相関する他のバイオマーカーで設定されるカットオフ値に基づいて決定することができる。具体的には、他のバイオマーカーがカットオフ値を示す体液試料中の本発明のバイオマーカー量を、基準量として設定することができる。他のバイオマーカーとしては、アラニンアミノ基転移酵素（ＡＬＴ）及びアスパラギン酸アミノ基転移酵素（ＡＳＴ）が挙げられる。
より具体的には、例えば、被検者が男性の場合はＡＬＴ量が３０IU/L、女性の場合は２０IU/Lとなる場合の本発明のバイオマーカーの量を基準量とし、当該基準値未満であればＮＡＦＬＤの炎症関連病態が陰性、当該基準量以上であればＮＡＦＬＤの炎症関連病態が陽性と判断することができる。
【００４２】
基準量の設定の他の例として、たとえば、特異度が６０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上であって、感度が３０％以上、好ましくは５０％以上、さらに好ましくは６０％以上であるカットオフ値の中から当業者が適宜決定することができる。たとえば、ＲＯＣ曲線（受信者動作特性曲線；Receiver Operating Characteristic Curve)分析などに基づいて決定することができる。
【００４３】
一例として、ＮＡＦＬＤの炎症関連病態を有するか否かの基準値は、正常肝の被検者由来の体液試料中の量を１．００とした場合、アドレン酸の場合で例えば１．６５以上１．９５以下、好ましくは１．７５以上１．８５以下（一例として１．７８）、ドコサペンタエン酸の場合で例えば１．４０以上１．７０以下、好ましくは１．５０以上１．６０以下（一例として１．５５）に設定することができる。この基準値は、血清、血漿、血液に適用されることが好ましい。
【００４４】
［２−５−２．ＮＡＦＬＤの炎症関連病態の程度を識別する基準量］
本発明においては、基準量は、炎症関連病態の程度に応じて複数設定されてよい。具体的には、上述の炎症関連病態を伴うＮＡＦＬＤを有しない被験者の群（陰性群）と炎症関連病態を伴うＮＡＦＬＤを有する被験者の群（陽性群）とを識別する基準量に加えて、陽性群の中でも、たとえば低度炎症関連病態群（低度群）と高度炎症関連病態群（高度群）とを識別する基準量を設定することができる。程度群と高度群との設定は、病態の深刻度の違いまたは治療方針の違いなどに基づくことができる。したがって、病態の深刻度の違いまたは治療方針の違いなどによっては、低度群、中度群、高度群というように、さらに群が細分化されてもよい。
【００４５】
陽性群の中で炎症関連病態の程度を識別する基準量も、上述の陰性群と陽性群とを識別する基準量と同様にして設定することができる。
たとえば、ＡＬＴの量に基づいて設定する場合、被検者が男性の場合はＡＬＴ量が６０IU/L、女性の場合は４０IU/Lとなる場合の本発明のバイオマーカーの量を基準量とし、当該基準値未満であればＮＡＦＬＤの炎症関連病態が低度、当該基準量以上であればＮＡＦＬＤの炎症関連病態が高度と判断することができる。
【００４６】
［３．炎症性関連病態を伴う非アルコール性脂肪性肝疾患の診断用キット］
本発明の炎症性関連病態を伴う非アルコール性脂肪肝疾患の診断用キットは、上述の炎症性関連病態を伴う非アルコール性脂肪性肝疾患を分析する方法を実施することができるものであり、特に、液体クロマトグラフィー質量分析による本発明のバイオマーカーの測定を容易にする。
【００４７】
［３−１．内部標準］
本発明のキットには、本発明のバイオマーカーであるアドレン酸及びドコサペンタエン酸の少なくともいずれかのバイオマーカー分子を測定するための内部標準が含まれていればよい。内部標準は、バイオマーカー分子の修飾体または同位体標識体であればよい。
【００４８】
バイオマーカー分子の修飾体としては、バイオマーカー分子と反応せず、バイオマーカー分子と保持が近い（好ましくはバイオマーカー分子より保持が大きいこと）ものが適宜選択される。本明細書においては、修飾体に後述の同位体標識体は含まれない。バイオマーカー分子の修飾体としては、バイオマーカー分子を構成する少なくともいずれかの水素原子が修飾基で置換されているもの、バイオマーカー分子を構成する不飽和結合への付加により修飾基が結合しているもの、バイオマーカー分子を構成する脂肪酸の脂肪酸エステルが挙げられる。バイオマーカー分子の修飾体が有する修飾基としては、ハロゲン基（具体的には、ブロモ基、クロロ基など）等が挙げられる。
【００４９】
バイオマーカー分子の同位体標識体は、バイオマーカー分子を構成する元素の少なくともいずれかがその同位体標識元素で置換されていればよい。同位体標識元素は、重炭素13Ｃであってもよいし重水素2Ｈであってもよい。内部標準は、質量分析における分析簡易性の点で、バイオマーカー分子との分子量差がたとえば１以上１０以下、好ましくは３以上７以下となるように構成することができる。
【００５０】
［３−２．他のアイテム］
本発明のキットには、上述の内部標準のほか、本発明の炎症性関連病態を伴う非アルコール性脂肪性肝疾患を分析する方法を実施するために用いられる以下の他のアイテムから選択される１種または複数種がさらに含まれていてよい。
【００５１】
他のアイテムの例としては、被験者から採取した体液検体から分析試料を調製する処理に用いられる試薬、たとえば抽出バッファーが挙げられる。この抽出バッファーに、上述の内部標準が含まれていてもよい。
【００５２】
他のアイテムの他の例として、液体クロマトグラフィー質量分析に用いられうる器具及び試薬も挙げられる。たとえば、カラム及び移動相が挙げられる。カラムは、逆相カラムであってよい。移動相は、グラジエント溶離のために組成が異なる２種以上の溶媒または緩衝液が含まれていてよい。
【００５３】
他のアイテムのさらなる他の例として、炎症性関連病態を伴う非アルコール性脂肪性肝疾患の分析を容易にするための、ＮＡＦＬＤの炎症関連病態の陰性群と陽性群とを識別する基準量、及び当該基準量とＮＡＦＬＤの炎症関連病態の程度を識別する基準量とを示した診断基準書が挙げられる。
【実施例】
【００５４】
以下の実施例におけるすべての動物実験は、動物実験委員会の承認のもと、神戸大学動物実験実施規則に基づき実施された。ヒトの血液サンプルの使用は、神戸大学大学院医学研究科の倫理委員会及びその関連病院による承認のもと、神戸大学病院のガイドラインに基づき実施された。また、インフォームドコンセントはすべてのヒト被験者から得た。
【００５５】
［実施例１］
（１）ヒト検体
図１に示すように、ヒト検体を分類した。２０１６年４月から９月に、ホテルオークラ神戸クリニックで健康診断を受けＮＡＦＬＤ（非アルコール性脂肪性肝）と診断された３０名の患者から、一晩絶食の後、静脈血を採取した。超音波検査で正常肝と診断された１０名の健常者（具体的には、ＢＭＩ＜２３ｋｇ／ｍ2、肝機能正常、代謝パラメータ正常）からも血液試料を採取した。全ての被験者は、健康診断において臨床的、血液学的、生化学的および血清学的に評価がされた。脂肪酸の分析のため、採血検体から血漿が調製され−８０℃で保存された。
【００５６】
ＮＡＦＬＤの診断は、右葉後部の低透過率による高輝度肝（高エコー）、並びに不鮮明な冠静脈及び横隔膜の所見に基づいた。正常肝の診断は、腎皮質と同程度またはそれよりわずかに高輝度の均一組織、並びに鮮明な肝静脈及び横隔膜の所見に基づいた。超音波検査（USG）には、Siemens ACUSON S1000（Siemens, USA）が用いられ、別途、胃腸病の認定医による診察が行われた。すべての被検者は、アルコール歴が無く（２０ｇ／日未満）、催奇形性薬品摂取、ウイルス性肝炎、自己免疫性疾患、悪性腫瘍、肝胆道疾患、その他の慢性肝疾患を有していなかった。
【００５７】
被検者は、ＡＬＴレベルに基づいて３つのグループに分けられた。具体的には、以下のグループに分けられた。
グループ１：ＡＬＴ＜３０IU/L（男），ＡＬＴ＜２０IU/L（女）
グループ２：３０≦ＡＬＴ＜６０IU/L（男），２０≦ＡＬＴ＜４０IU/L（女）
グループ３：ＡＬＴ≧６０IU/L（男），ＡＬＴ≧４０IU/L（女）
【００５８】
（２）液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ／ＭＳ）によるバイオマーカー測定
脂肪類をＬＣ／ＭＳにより分析した。血漿サンプル（１０μＬ）に、８０μＬのメタノールと１０μＬの内部標準とを加え、ボルテックスした。次に、サンプルを１０分氷冷した。遠心分離（１６，０００ｇ、４℃、５分）を行った後、上清２５μＬを回収し、分析用バイアルに移した。ＬＣ／ＭＳ分析は、Ｎｅｘｅｒａ ＬＣシステムとＬＣＭＳ−８０４０トリプル四重極型質量分析装置（島津製作所、日本）とを組み合わせて行った。脂肪種は、オクタデシルシリル化シリカゲルカラム（Inertsustain C18, １００×２．１ｍｍ、３μｍ、ＧＬサイエンス、日本）とガードカラム（１０×３ｍｍ、５μｍ）とを用いて分離した。それぞれの脂肪種に由来するカーブの下にピークエリアが検出され、内部標準によって正規化された。
【００５９】
（３）統計的分析
統計学的有意差は、スチューデントのｔテスト又は一元配置分散分析（one-way ANOVA, SPSS version 22; SPSS, Inc. Chicago, IL, USA）を用いて分析された。ヒト脂肪サンプルでは、群の平均の比較は、一元配置分散分析とacross group比較のためのTukey ＨＳＤテストとによって行われた。ANOVAの線形対比分析は、群平均における線形トレンドを試験するために行われた。ｐ値またはｐ値トレンドが０．０５未満であれば、統計学的に有意であると認定した。
【００６０】
（４）結果
被験者の臨床データを表１に示す。ＮＡＦＬＤの被検者は全体的に、正常肝被検者よりも年配であり、ＢＭＩが比較的高く、より脂質異常であった。しかし、ＮＡＦＬＤの被検者の間では、肝機能と同様に、年齢、ＢＭＩ値、脂肪及び糖質パラメータに関して有意な差はなかった。表１のデータは、Ｍｅａｎ（平均値）±ＳＥＭ（標準誤差）によって示している。
【００６１】
【表１】
2018169277.tif 000003
【００６２】
ANOVA分析によると、パルミチン酸（palmitic acid (16:0)）、ステアリン酸（stearic acid (18:0)）、アラキドン酸（arachidic acid (20:0)）、エルカ酸（erucic acid (22:1n9)）、エイコサジエン酸（eicosadienoic acid (20:2n6)）、アドレン酸（adrenic acid (22:4n6)）、ドコサペンタエン酸（docosapentaenoic acid (22:5n6)）、ステアリドン酸（stearidonic acid (18:4n3)）、エイコサペンタエン酸（eicosapentaenoic acid (20:5n3)）、及びドコサヘキサエン酸（docosahexaenoic acid (22:6n3)）の血漿中の平均値は、グループ間で有意な差が見られた。これらの脂肪酸のうち、アラキドン酸(20:0)及びエルカ酸(22:1n9)以外は、グループ間で有意に正の傾向を示した。エルカ酸(22:1n9)は、ＡＬＴレベルの上昇に伴い減少する傾向を示したが、線形トレンドのｐ値が０．０５７であり、所定の有意レベル０．０５に届かなかった。
【００６３】
【表２】
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【００６４】
さらなる解析によると、アドレン酸(22:4n6)及びドコサペンタエン酸(22:5n6)のみが、正常肝との比較、及びＮＡＦＬＤのグループ１又はグループ２との比較において、グループ３で有意に高値を示した。アドレン酸とドコサペンタエン酸とをＳＥＭで比較すると、グループ間の誤差がより小さいアドレン酸は、個人差がより小さくＮＡＦＬＤの炎症関連病態に対してより特異的である点で好ましい。
【００６５】
このように、ＮＡＦＬＤ被験者におけるアドレン酸及びドコサペンタエン酸とＡＬＴレベルとの相関が確認されたことで、アドレン酸及びドコサペタエン酸のレベル上昇と肝炎との関係を確認した（図２及び図３参照）。さらに、これらのグループ間の線形トレンドが統計的有意であることが示された。全体として、これらの知見は後述の実施例２で示すvitroでの試験結果を反映している。
【００６６】
［実施例２］
（１）コリン欠乏高脂肪餌食マウスの血漿及び肝臓組織の採取
６週齢のオスのdb/dbマウスをランダムに５匹ずつ２つの群に分け、一方の群には3,449kcal/kgの通常餌（ＳＤ; CE-2, CLEA Japan Inc, 日本）、他方の群には5,200kcal/kgのコリン欠乏高脂肪餌（ＣＤＡＨＦＤ; #A06071313, Research Diet Inc, New Brunswick, 米国）を４週間与えた。さらにコントロールとして、同週齢の雄のC57BL/6J(B6)マウスに通常餌を４週間与えた。その後、それぞれのマウスから血液試料（ヘパリン処理して遠心した上清血漿、-80℃で保存）及び肝臓組織（ホルマリン固定組織）を採取した。体重及び肝臓の重さは、通常餌食db/dbマウスに比べコリン欠乏高脂肪餌食db/dbマウスで有意に上昇した。
【００６７】
（２）肝臓組織の組織学的所見
ホルマリン固定肝臓組織をパラフィン包埋し、切片をstandard hematoxylin and eosin (H&E)（細胞を染色）又はPicrosirius Red Dtain Kit (Polyscience Inc、米国)（繊維化組織を染色）で染色して観察した。通常餌食db/db/マウスでは炎症反応は観察されなかったが、コリン欠乏高脂肪餌食db/dbマウスでは、炎症細胞の浸潤、バルーミング、及び繊維化が観察された。
【００６８】
（３）血漿及び肝臓組織中の成分定量
ホルマリン固定肝臓組織をホモジナイズしクロロホルム−メタノールで抽出した。水溶性画分を除去し、クロロホルム画分を濃縮してトリグリセリドを定量した。
一方、血漿中のアラニン転移酵素（ＡＬＴ）及び総コレステロールを定量した。
その結果、血漿中のＡＬＴレベル及び総コレステロールレベル、肝臓中のトリグリセリドのレベルは、通常餌食db/dbマウスに比べコリン欠乏高脂肪餌食db/dbマウスで有意に上昇した。
【００６９】
同様に、肝臓組織及び血漿におけるリン脂質（ホスファチジルコリンＰＣ、ホスファチジルエタノールアミンＰＥ、リゾホスファチジルコリンＬＰＣ、リゾホスファチジルエタノールアミンＬＰＥ、遊離脂肪酸ＦＦＡ、アシルカルチニンＡＣ）も定量した。表３及び表４に、定量結果を通常餌食db/dbマウスとコリン欠乏高脂肪餌食db/dbマウスとを比較して示す。Foldは、通常餌食db/dbマウスにおける各脂質の存在量を１とした場合の相対値である。表３に示すように、肝臓組織の遊離のアドレン酸（FFA 22:4n6）及びアドレン酸構造を含むリン脂質（LPC 22:4(sn-1)、PC 20:1/20:3_18:0/22:4）のレベルが通常餌食db/dbマウスに比べコリン欠乏高脂肪餌食db/dbマウスで高値を示した。さらに、表４に示すように、血漿中の遊離のアドレン酸（FFA 22:4n6）及びアドレン酸構造を含むリン脂質（PC 20:1/20:3_18:0/22:4、LPC 22:4(sn-1)、LPC 22:4(sn-2)）のレベルが通常餌食db/dbマウスに比べコリン欠乏高脂肪餌食db/dbマウスで有意に（ｐ＜０．００１）高値を示した。
【００７０】
【表３】
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【００７１】
【表４】
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【００７２】
アドレン酸22:4n6は、組織非特異性の炎症誘発性マーカーとしてよく知られているアラキドン酸20:4n6と同様にオメガ６不飽和脂肪酸である。図４に示すように、アドレン酸22:4n6は、アラキドン酸20:4n6よりも、通常餌食db/dbマウスに比べたコリン欠乏高脂肪餌食db/dbマウスでの上昇率が高かった（肝臓組織ではアドレン酸22:4n6が８．６倍上昇に対しアラキドン酸20:4n6が１．６倍上昇、血漿ではアドレン酸22:4n6が５．３倍上昇に対しアラキドン酸20:4n6が２．２倍上昇）。
【００７３】
さらに、マウス肝臓組織からTRIzo1試薬（Invitrogen、日本）を用いてTotal RNAを抽出し、UVスペクトロメーター（ND-1000, NanoDrop、米国）を用いて定量した。抽出した1μgのＲＮＡをRT2 First Strand Kit（Qiagen、米国）で処理し、混入したゲノムＤＮＡを除去した。7500リアルタイムＰＣＲシステム及びPower SYBR Green Reagent（Applied Biosystems）を用いて定量リアルタイムＰＣＲを行った（50℃2分、95℃10分、95℃15分を45サイクル、及び60℃1分）。融解曲線分析によって増幅産物を確認し、mRNAの発現レベルはマウスGAPHDH又はヒトβアクチンに対してノーマライズした。相対発現量は2-ΔΔCt法を用いて分析した。
このような定量リアルタイムＰＣＲにより、アラキドン酸20:4n6からアドレン酸22:4n6を生じさせる酵素ELOVL2及びELOVL5のmRNAレベルを測定した。その結果を図５に示す。図５に示すように、ELOVL2及びELOVL5のレベルは、通常餌食db/dbマウスに比べてコリン欠乏高脂肪餌食db/dbマウスで有意に上昇した。したがって、これらの酵素の発現亢進により体内でアドレン酸合成が亢進されることが示された。
【００７４】
（４）ヒト肝がん由来細胞株HepG2細胞中の成分定量
ヒト肝がん由来細胞株HepG2細胞をRPMI1640培地(10v/v%FBS)で培養した。培養したHepG2細胞を６ウェルプレートの各ウェルに106 cells /well播種した。細胞は洗浄して培地をアドレン酸／ＢＳＡ複合体を含む無血漿培地に交換して一晩インキュベートした。コントロール細胞はＢＳＡのみを含む無血漿培地で一晩インキュベートした。その後細胞を、リコンビナントヒトＴＮＦα（培地中10ng/mL）又はＩＬ１β（培地中5ng/mL）で処理しさらに５時間培養した。
マウス肝臓細胞と同様に、培養ヒト細胞からも同様に定量リアルタイムＰＣＲを行った。
【００７５】
その結果を図６及び図７に示す。図６に示すように、予めアドレン酸ADAで処理した後にリコンビナントヒトＴＮＦαで処理した場合（rhTNFα+ADA 0.5mM）の方が、アドレン酸ADA非処理の場合（rhTNFα 10ng/ml）に比べて、ＴＮＦα、ＩＬ８、ＭＩＰ１β及びＭＣＰ１のmRNAレベルが上昇した。また、図７に示すように、予めアドレン酸ADAで処理した後にリコンビナントヒトＩＬ１βで処理した場合（rhIL1β+ADA 0.5mM）の方が、アドレン酸ADA非処理の場合（rhIL1β 5ng/ml）に比べて、ＴＮＦα、ＩＬ８、ＭＩＰ１β及びＴＧＦβ１のmRNAレベルが上昇した。したがって、アドレン酸が、ＴＮＦα及びＩＬ１βが惹起する炎症反応を亢進させることが示された。
【００７６】
本発明の好ましい実施形態は上記の通りであるが、本発明はそれらのみに限定されるものではなく、本発明の趣旨から逸脱することのない様々な実施形態が他になされる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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