(57)【要約】【課題】本発明が解決しようとする課題は、従来技術に比べて、イリシコリンＡ及びアスコクロリン並びにそれらの誘導体を高収量で生産することができることから、工業的規模でのイリシコリンＡ及びアスコクロリンなどのイソプレノイドの製造を可能にする、イソプレノイドの製造方法を提供することにある。【解決手段】上記課題は、アスコクロリン生合成遺伝子によって形質転換された形質転換体を用いて、イリシコリンＡ及びアスコクロリンなどのイソプレノイドを得る工程を含む、イリシコリンＡ及びアスコクロリンなどのイソプレノイドの製造方法によって解決される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（１）〜（５）のいずれかの塩基配列であって、イリシコリンＡのエポキシ化反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、遺伝子ａｓｃＦ。
（１）配列表の配列番号５に記載の塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（２）配列番号５に記載の塩基配列からなる遺伝子と９０％以上の同一性を有する塩基配列
（３）イリシコリンＡのエポキシ化反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列
（４）配列番号１２に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列
（５）配列番号１２に記載のアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列
【請求項２】
下記（１）〜（５）のいずれかの塩基配列であって、イリシコリンＡエポキシドの環化反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、遺伝子ａｓｃＧ。
（１）配列表の配列番号６に記載の塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（２）配列番号６に記載の塩基配列からなる遺伝子と９０％以上の同一性を有する塩基配列
（３）イリシコリンＡエポキシドの環化反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列
（４）配列番号１３に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列
（５）配列番号１３に記載のアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列
【請求項３】
下記（１）〜（５）のいずれかの塩基配列であって、イリシコリンＡからＡｓｃＦタンパク質及びＡｓｃＧタンパク質の反応によって生成した化合物の脱水素化によりアスコクロリンを生成する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、遺伝子ａｓｃＨ。
（１）配列表の配列番号７に記載の塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（２）配列番号７に記載の塩基配列からなる遺伝子と９０％以上の同一性を有する塩基配列
（３）イリシコリンＡからＡｓｃＦタンパク質及びＡｓｃＧタンパク質の反応によって生成した化合物の脱水素化によりアスコクロリンを生成する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列
（４）配列番号１４に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列
（５）配列番号１４に記載のアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列
【請求項４】
下記（１）〜（５）のいずれかの塩基配列であって、ＬＬ−Ｚ１２７２βからイリシコリンＡを生成する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、遺伝子ａｓｃＥ。
（１）配列表の配列番号４に記載の塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（２）配列番号４に記載の塩基配列からなる遺伝子と９０％以上の同一性を有する塩基配列
（３）ＬＬ−Ｚ１２７２βからイリシコリンＡを生成する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列
（４）配列番号１１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列
（５）配列番号１１に記載のアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列
【請求項５】
下記（１）〜（５）のいずれかの塩基配列であって、アセチルＣｏＡからｏ−オルセリン酸を生成する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、遺伝子ａｓｃＤ。
（１）配列表の配列番号３に記載の塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（２）配列番号３に記載の塩基配列からなる遺伝子と９０％以上の同一性を有する塩基配列
（３）アセチルＣｏＡからｏ−オルセリン酸を生成する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列
（４）配列番号１０に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列
（５）配列番号１０に記載のアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列
【請求項６】
下記（１）〜（５）のいずれかの塩基配列であって、ｏ−オルセリン酸からイリシコリン酸Ｂを生成する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、遺伝子ａｓｃＢ。
（１）配列表の配列番号１に記載の塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（２）配列番号１に記載の塩基配列からなる遺伝子と９０％以上の同一性を有する塩基配列
（３）ｏ−オルセリン酸からイリシコリン酸Ｂを生成する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列
（４）配列番号８に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列
（５）配列番号８に記載のアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列
【請求項７】
下記（１）〜（５）のいずれかの塩基配列であって、イリシコリン酸ＢからＬＬ−Ｚ１２７２βを生成する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、遺伝子ａｓｃＣ。
（１）配列表の配列番号２に記載の塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（２）配列番号２に記載の塩基配列からなる遺伝子と９０％以上の同一性を有する塩基配列
（３）イリシコリン酸ＢからＬＬ−Ｚ１２７２βを生成する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列
（４）配列番号９に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列
（５）配列番号９に記載のアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列
【請求項８】
請求項１〜７に記載の遺伝子ａｓｃＦ、ａｓｃＧ、ａｓｃＨ、ａｓｃＥ、ａｓｃＤ、ａｓｃＢ及びａｓｃＣのいずれか１つの遺伝子又はこれらの組み合わせの遺伝子が挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を発現する、形質転換体（ただし、ヒトを除く）。
【請求項９】
請求項８に記載の形質転換体を用いて、イリシコリンＡを得る工程を含む、イリシコリンＡの製造方法。
【請求項１０】
請求項８に記載の形質転換体を用いて、アスコクロリンを得る工程を含む、アスコクロリンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イリシコリンＡ及びアスコクロリンを合成するための遺伝子並びに該遺伝子を利用したアスコクロリン及びイリシコリンＡの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
人口が密集した地域が点在する日本国を含む先進国及び開発途上国においては、ウイルスや原虫などによる感染症がたびたび問題となる。また、２型糖尿病、高コレステロール血症、癌及びこれらの疾患に起因する合併症などの生活習慣病は、医療費の増大及び労働力の低下などを招き、とりわけ日本国では深刻な問題となっている。
【０００３】
そこで、これらの疾患の治療や予防に対して有効とされる物質の開発が望まれている。そのような物質の一つとして、イソプレノイド系の生理活性物質であるアスコクロリン及びアスコフラノンが知られている。アスコクロリン及びアスコフラノンは、電子伝達系を阻害して細胞内ＡＴＰ濃度を低下することにより、例えば、ツエツエバエによって媒介される原虫トリパノソーマによる原虫感染症であるアフリカ睡眠病の治療や予防に際して有望視されている（例えば、特許文献１を参照）。
【０００４】
アフリカ睡眠病に罹患すると、感染初期に原虫が血流中で増殖する。慢性期に入ると中枢神経が侵されて、精神錯乱や全身の痙攣などの症状を呈し、最終的には嗜眠状態に陥って死に至る。アフリカ睡眠病によるアフリカでの死者は、年間１万人以上であり、潜在的に感染のリスクがある人口は７，０００万人以上といわれている。現在のところ、アフリカ睡眠病に対してワクチンによる予防方法はなく、その治療は薬剤療法に頼っている。しかし、アフリカ睡眠病に対して効果的な治療薬は副作用が強いなどの問題点がある。
【０００５】
そこで、アスコクロリンやアスコフラノンにより、トリパノソーマの電子伝達系を特異的に阻害することによる、アフリカ睡眠病の予防や治療が期待されている。原虫は哺乳類体内に侵入すると、主にグリコソーム内の解糖系でＡＴＰ合成を行い、これにはトリパノソーム・オルターネイティブ・オキシダーゼ（ＴＡＯ）が触媒するＮＡＤ＋の再生が必要であるところ、アスコクロリンやアスコフラノンはこのＴＡＯの働きを阻害する。感染した哺乳類はＴＡＯと同様の酵素を有していないことから、トリパノソーマを特異的に駆除することが可能となる。なお、特にアスコフラノン及びその誘導体は非常に低濃度であってもＴＡＯを阻害することが報告されている。
【０００６】
また、アスコクロリン、アスコフラノン及びそれらの誘導体には、抗腫瘍活性、血糖低下作用、血中脂質低下作用、糖化阻害作用、抗酸化作用などが存在することが知られている（例えば、特許文献２を参照）。さらに、アスコクロリンやアスコフラノンの生合成経路の中間体にあるイリシコリンＡ（ＬＬ−Ｚ１２７２α）もまた、高い抗原虫剤（特許文献３）や、免疫抑制剤、リウマチ治療剤、抗癌剤、拒絶反応治療薬、抗ウイルス薬、抗Ｈ．ピロリ薬および糖尿病治療薬等（特許文献４）の、新たな医薬品の有効成分として期待されている。さらに、イリシコリンＡはアスコクロリンやアスコフラノンのみならず他のイソプレノイド系化合物の生合成の中間体としても知られており、それらの原料としても有用な化合物である。
【０００７】
アスコフラノン及びアスコクロリンの製造方法としては、アスコキタ属（Ａｓｃｏｃｈｙｔａ）糸状菌を培養し、菌糸中に蓄積したアスコフラノンを分離採取する方法が知られている（例えば、特許文献５及び６を参照）。なお、アスコフラノンの生産株として知られていたアスコキタ・ビシア（Ａｓｃｏｃｈｙｔａ ｖｉｃｉａｅ）は、正しくは、アクレモニウム・スクレロティゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｓｃｌｅｒｏｔｉｇｅｎｕｍ）であることが非特許文献１によって報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開平０９−１６５３３２号公報
【特許文献２】特開２００６−２１３６４４号公報
【特許文献３】国際公開第２０１２／０６０３８７号
【特許文献４】国際公開第２０１３／１８０１４０号
【特許文献５】特公昭５６−２５３１０号公報
【特許文献６】特公昭４５−９８３２号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｊ Ａｎｔｉｂｉｏｔ （Ｔｏｋｙｏ）.  ２０１６ Ｎｏｖ ２.  Ｒｅ−ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｓｃｏｆｕｒａｎｏｎｅ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｆｕｎｇｕｓ Ａｓｃｏｃｈｙｔａ ｖｉｃｉａｅ ａｓ Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｓｃｌｅｒｏｔｉｇｅｎｕｍ.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
特許文献６に記載の方法のような、アスコクロリンを生産することが知られている糸状菌を用いる方法によれば、アスコクロリンの収率は使用する糸状菌に大きく依存することになる。しかし、これまでに知られている微生物におけるアスコクロリンの含有量は工業生産としては少ないこと、また、生産量が少しの培養条件の違いで大きく異なってくることから、既存の方法では大量のアスコクロリンの安定生産が実現できないという課題がある。また、イリシコリンＡに至っては、大量に得るための製造方法についてこれまでに知られていない。
【００１１】
例えば、アスコクロリンやその中間体であるイリシコリンＡの大量生産を実現するためには、アスコクロリンやイリシコリンＡを高濃度で安定的に生産する野生株を単離又は育種することや生物工学技術を駆使してアスコクロリンやイリシコリンＡの生合成に関与する遺伝子を挿入した形質転換株を構築することが考えられる。しかし、アスコクロリンやイリシコリンＡを高濃度で安定的に生産する野生株についてはこれまでにほとんど知られておらず、さらにアスコクロリンやイリシコリンＡの生合成経路については不明な部分が依然として多い。
【００１２】
また、アスコクロリン、イリシコリンＡの生合成遺伝子についても、未だ不明な部分が多い。
【００１３】
したがって、本発明が解決しようとする課題は、従来技術に比べて、イリシコリンＡ及びアスコクロリン並びにそれらの誘導体を高収量で安定生産することができることから、工業的規模でのイリシコリンＡ及びアスコクロリンなどのイソプレノイドの製造を可能にする、イソプレノイドの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を積み重ねた結果、糸状菌の一種であるアクレモニウム・スクレロティゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｓｃｌｅｒｏｔｉｇｅｎｕｍ）において、イリシコリンＡ及びアスコクロリンの生合成に関与する反応を触媒する酵素をコードする遺伝子群を特定することに成功した。
【００１５】
次に、本発明者らは、上記遺伝子群にコードされるタンパク質を過剰発現するためのＤＮＡコンストラクトを作製し、次いで得られたＤＮＡコンストラクトを宿主生物として、糸状菌の一種であるアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属微生物に導入して形質転換することによって、上記遺伝子群にコードされるタンパク質を過剰発現する形質転換糸状菌を作製することに成功した。
【００１６】
上記形質転換糸状菌は、通常の糸状菌を培養する方法に準じて培養することができ、その増殖速度などについても宿主生物と格別相違がないものであった。これらのことより、上記形質転換糸状菌を用いればイリシコリンＡ及びアスコクロリンを生産し得ることがわかった。また、アクレモニウム・スクレロティゲナム（Ａ. ｓｃｌｅｒｏｔｉｇｅｎｕｍ）のような元々イリシコリンＡやアスコクロリンを生産するような株に対し、上記遺伝子群にコードされるタンパク質を強制発現するようなＤＮＡコンストラクトを作製し、次いで得られたＤＮＡコンストラクトを導入することで、上記遺伝子群の酵素性能を強化した形質転換体を用いればイリシコリンＡ及びアスコクロリンを安定的に大量生産することが考えられる。本発明はこのような成功例や知見に基づいて完成するに至った発明である。
【００１７】
したがって、本発明の一態様によれば、下記の遺伝子、形質転換体及び製造方法が提供される。
［１］下記（１）〜（５）のいずれかの塩基配列であって、イリシコリンＡのエポキシ化反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、遺伝子ａｓｃＦ。
（１）配列表の配列番号５に記載の塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（２）配列番号５に記載の塩基配列からなる遺伝子と６０％以上の同一性を有する塩基配列
（３）イリシコリンＡのエポキシ化反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列
（４）配列番号１２又は３３に記載のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列
（５）配列番号１２又は３３に記載のアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列
［２］下記（１）〜（５）のいずれかの塩基配列であって、イリシコリンＡエポキシドの環化反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、遺伝子ａｓｃＧ。
（１）配列表の配列番号６に記載の塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（２）配列番号６に記載の塩基配列からなる遺伝子と６０％以上の同一性を有する塩基配列
（３）イリシコリンＡエポキシドの環化反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列
（４）配列番号１３又は３４に記載のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列
（５）配列番号１３又は３４に記載のアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列
［３］下記（１）〜（５）のいずれかの塩基配列であって、イリシコリンＡからＡｓｃＦタンパク質及びＡｓｃＧタンパク質の反応によって生成した化合物の脱水素化によりアスコクロリンを生成する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、遺伝子ａｓｃＨ。
（１）配列表の配列番号７に記載の塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（２）配列番号７に記載の塩基配列からなる遺伝子と６０％以上の同一性を有する塩基配列
（３）イリシコリンＡからＡｓｃＦタンパク質及びＡｓｃＧタンパク質の反応によって生成した化合物の脱水素化によりアスコクロリンを生成する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列
（４）配列番号１４又は３５に記載のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列
（５）配列番号１４又は３５に記載のアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列
［４］下記（１）〜（５）のいずれかの塩基配列であって、ＬＬ−Ｚ１２７２βからイリシコリンＡを生成する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、遺伝子ａｓｃＥ。
（１）配列表の配列番号４に記載の塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（２）配列番号４に記載の塩基配列からなる遺伝子と６０％以上の同一性を有する塩基配列
（３）ＬＬ−Ｚ１２７２βからイリシコリンＡを生成する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列
（４）配列番号１１、３２又は４０に記載のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列
（５）配列番号１１、３２又は４０に記載のアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列
［５］下記（１）〜（５）のいずれかの塩基配列であって、アセチルＣｏＡからｏ−オルセリン酸を生成する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、遺伝子ａｓｃＤ。
（１）配列表の配列番号３に記載の塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（２）配列番号３に記載の塩基配列からなる遺伝子と６０％以上の同一性を有する塩基配列
（３）アセチルＣｏＡからｏ−オルセリン酸を生成する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列
（４）配列番号１０、３１又は３９に記載のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列
（５）配列番号１０、３１又は３９に記載のアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列
［６］下記（１）〜（５）のいずれかの塩基配列であって、ｏ−オルセリン酸からイリシコリン酸Ｂを生成する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、遺伝子ａｓｃＢ。
（１）配列表の配列番号１に記載の塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（２）配列番号１に記載の塩基配列からなる遺伝子と６０％以上の同一性を有する塩基配列
（３）ｏ−オルセリン酸からイリシコリン酸Ｂを生成する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列
（４）配列番号８、２９又は３７に記載のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列
（５）配列番号８、２９又は３７に記載のアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列
［７］下記（１）〜（５）のいずれかの塩基配列であって、イリシコリン酸ＢからＬＬ−Ｚ１２７２βを生成する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、遺伝子ａｓｃＣ。
（１）配列表の配列番号２に記載の塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（２）配列番号２に記載の塩基配列からなる遺伝子と６０％以上の同一性を有する塩基配列
（３）イリシコリン酸ＢからＬＬ−Ｚ１２７２βを生成する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列
（４）配列番号９、３０又は３８に記載のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列
（５）配列番号９、３０又は３８に記載のアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列
［８］上記［１］〜［７］に記載の遺伝子ａｓｃＦ、ａｓｃＧ、ａｓｃＨ、ａｓｃＥ、ａｓｃＤ、ａｓｃＢ及びａｓｃＣのいずれか１つの遺伝子又はこれらの組み合わせの遺伝子が挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を発現する、形質転換体（ただし、ヒトを除く）。
［９］上記［８］に記載の形質転換体を用いて、イリシコリンＡを得る工程を含む、イリシコリンＡの製造方法。
［１０］上記［８］に記載の形質転換体を用いて、アスコクロリンを得る工程を含む、アスコクロリンの製造方法。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、高収量のイリシコリンＡ及びアスコクロリンなどのイソプレノイドを製造することができる。その結果、本発明によれば、工業的規模で、イリシコリンＡ及びアスコクロリンなどのイソプレノイドを製造することが期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、トランスクリプトーム解析により予測されたアスコクロリン生合成遺伝子クラスターを示した図である。
【図２】図２は、後述する実施例に記載されているとおりの、Ａｓ−ＤＢＣＥ株抽出物及びイリシコリンＡ標準品のＨＰＬＣ解析結果を示した図である。
【図３】図３は、後述する実施例に記載されているとおりの、Ａｓ−ＤＢＣＥ株、Ａｓ−ＤＢＣＥＦ株、Ａｓ−ＤＢＣＥＦＧ株及びＡｓ−ＤＢＣＥＦＧＨ株のそれぞれの抽出物のＨＰＬＣ解析結果を示した図である。
【図４Ａ】図４Ａは、後述する実施例に記載されているとおりの、野生株反応液及びＡｓ−Ｆ反応液をそれぞれ用いた場合の反応物のＬＣ／ＭＳ解析結果を示した図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、後述する実施例に記載されているとおりの、Ａｓ−Ｆ反応液及びＡｓ−ＦＧ反応液をそれぞれ用いた場合の反応物のＬＣ／ＭＳ解析結果を示した図である。
【図５】図５は、後述する実施例に記載されているとおりの、Ａｓ−ＦＧ反応液及びＡｓ−ＦＧＨ反応液をそれぞれ用いた場合の反応物のＬＣ／ＭＳ解析結果を示した図である。
【図６】図６は、イリシコリンＡ及びアスコクロリンの反応系における、各酵素反応と反応物との関係を示したスキーム図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明の一態様である遺伝子、形質転換体、ノックアウト生物及び製造方法の詳細について説明するが、本発明の技術的範囲は本項目の事項によってのみに限定されるものではなく、本発明はその目的を達成する限りにおいて種々の態様をとり得る。
【００２１】
（イソプレノイド）
本明細書における「イソプレノイド」は、通常知られているとおりのイソプレンを構成単位とする化合物であれば特に限定されず、例えば、イリシコリン酸Ｂ、イリシコリン酸Ａ、ＬＬ−Ｚ１２７２β、イリシコリンＡ（ＬＬ−Ｚ１２７２α）、イリシコリンＡエポキシド、イリシコリンＣ、アスコクロリン、アスコフラノン及びこれらの誘導体などが挙げられる。ただし、本明細書では、主として、アスコフラノン、イリシコリンＡ及びアスコクロリン並びにこれらの誘導体のことを「イソプレノイド」とよぶ場合がある。
【００２２】
（酵素（１）乃至（７）のアミノ酸配列）
本発明の一態様の遺伝子ａｓｃＢは、ｏ−オルセリン酸からイリシコリン酸Ｂを生成する反応を触媒する活性を有する酵素（以下、「酵素（１）」ともよぶ。）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。
【００２３】
本発明の一態様の遺伝子ａｓｃＣは、イリシコリン酸ＢからＬＬ−Ｚ１２７２βを生成する反応を触媒する活性を有する酵素（以下、「酵素（２）」ともよぶ。）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。
【００２４】
本発明の一態様の遺伝子ａｓｃＤは、アセチルＣｏＡからｏ−オルセリン酸を生成する反応を触媒する活性を有する酵素（以下、「酵素（３）」ともよぶ。）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。
【００２５】
本発明の一態様の遺伝子ａｓｃＥは、ＬＬ−Ｚ１２７２β からイリシコリンＡを生成する反応を触媒する活性を有する酵素（以下、「酵素（４）」ともよぶ。）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。
【００２６】
本発明の一態様の遺伝子ａｓｃＦは、イリシコリンＡのエポキシ化反応を触媒する活性を有する酵素（以下、「酵素（５）」ともよぶ。）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。
【００２７】
本発明の一態様の遺伝子ａｓｃＧは、イリシコリンＡエポキシドの環化反応を触媒する活性を有する酵素（以下、「酵素（６）」ともよぶ。）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。
【００２８】
本発明の一態様の遺伝子ａｓｃＨは、イリシコリンＡからＡｓｃＦタンパク質及びＡｓｃＧタンパク質の反応によって生成した化合物の脱水素化によりアスコクロリンを生成する反応を触媒する活性を有する酵素（以下、「酵素（７）」ともよぶ。）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。
【００２９】
本発明の技術的範囲はいかなる憶測や推論に拘泥されるわけではないが、酵素（１）はプレニル・トランスフェラーゼと同様の機能を有し；酵素（２）はオキシドリダクターゼと同様の機能を有し；酵素（３）はポリケチド・シンターゼと同様の機能を有し；酵素（４）はハロゲナーゼと同様の機能を有し；酵素（５）はエポキシダーゼとしてのｐ４５０／ｐ４５０リダクターゼと同様の機能を有し；酵素（６）はテルペン・サイクラーゼと同様の機能を有し；酵素（７）はデヒドロゲナーゼとしてのｐ４５０と同様の機能を有する蓋然性がある。
【００３０】
酵素（１）乃至（７）は、上記した酵素活性を有するものであれば、アミノ酸配列については特に限定されない。
【００３１】
例えば、上記した酵素活性を有する酵素（１）の一態様として配列番号８、２９及び３７に示すアミノ酸配列があり；上記した酵素活性を有する酵素（２）の一態様として配列番号９、３０及び３８に示すアミノ酸配列があり；上記した酵素活性を有する酵素（３）の一態様として配列番号１０、３１及び３９に示すアミノ酸配列があり；上記した酵素活性を有する酵素（４）の一態様として配列番号１１、３２及び４０に示すアミノ酸配列があり；上記した酵素活性を有する酵素（５）の一態様として配列番号１２及び３３に示すアミノ酸配列があり；上記した酵素活性する酵素（６）の一態様として配列番号１３及び３４に示すアミノ酸配列があり；上記した酵素活性を有する酵素（７）の一態様として配列番号１４及び３５に示すアミノ酸配列がある。
【００３２】
配列番号８〜１４に示すアミノ酸配列を有する酵素は、すべてアクレモニウム属糸状菌に由来するものであり、本発明者らによりそれぞれＡｓｃＢ、ＡｓｃＣ、ＡｓｃＤ、ＡｓｃＥ、ＡｓｃＦ、ＡｓｃＧ及びＡｓｃＨタンパク質と名付けられる。また、これらの酵素をコードする遺伝子の塩基配列は配列番号１〜７に示す塩基配列である。
【００３３】
配列番号２９〜３５に示すアミノ酸配列を有する酵素は、すべてネオネクトリア・ディティシマ（Ｎｅｏｎｅｃｒｔｒｉａ ｄｉｔｉｓｓｉｍａ）に由来するものであり、本発明者らによりそれぞれＡｓｃＢ（配列番号２９）、ＡｓｃＣ（配列番号３０）、ＡｓｃＤ（配列番号３１）、ＡｓｃＥ（配列番号３２）、ＡｓｃＦ（配列番号３３）、ＡｓｃＧ（配列番号３４）及びＡｓｃＨ（配列番号３５）タンパク質と名付けられる。
【００３４】
配列番号３７〜４０に示すアミノ酸配列を有する酵素は、すべてトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）に由来するものであり、本発明者らによりそれぞれＡｓｃＢ（配列番号３７）、ＡｓｃＣ（配列番号３８）、ＡｓｃＤ（配列番号３９）、ＡｓｃＥ（配列番号４０）と名付けられる。
【００３５】
ＡｓｃＢ、ＡｓｃＣ、ＡｓｃＤ、ＡｓｃＥ、ＡｓｃＦ、ＡｓｃＧ及びＡｓｃＨタンパク質は、アクレモニウム属、ネオネクトリア属又はトリコデルマ属の染色体ＤＮＡ上に存在するこれらの酵素をコードする遺伝子によってコードされるものである。このような由来生物の染色体ＤＮＡ上に存在する遺伝子及び該遺伝子によってコードされるタンパク質や酵素を、それぞれ「野生型遺伝子」及び「野生型タンパク質」や「野生型酵素」と本明細書ではよぶ場合がある。
【００３６】
酵素（１）乃至（７）のアミノ酸配列は、それぞれ上記した酵素（１）乃至（７）の酵素活性を有するものであれば、野生型酵素が有するアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加などを有するアミノ酸配列からなるものであってもよい。ここで、アミノ酸配列の「１から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加」における「１から数個」の範囲は特に限定されないが、例えば、アミノ酸配列におけるアミノ酸数１００個を一単位とすれば、該一単位あたり、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個程度、より好ましくは１、２、３、４又は５個程度を意味する。また、「アミノ酸の欠失」とは配列中のアミノ酸残基の欠落又は消失を意味し、「アミノ酸の置換」は配列中のアミノ酸残基が別のアミノ酸残基に置き換えられていることを意味し、「アミノ酸の付加」とは配列中に新たなアミノ酸残基が挿入するように付け加えられていることを意味する。
【００３７】
「１から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加」の具体的な態様としては、１から数個のアミノ酸が別の化学的に類似したアミノ酸で置き換えられた態様がある。例えば、ある疎水性アミノ酸を別の疎水性アミノ酸に置換する場合、ある極性アミノ酸を同じ電荷を有する別の極性アミノ酸に置換する場合などを挙げることができる。このような化学的に類似したアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において知られている。具体例を挙げると、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ塩基性アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ酸性アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
【００３８】
野生型酵素が有するアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加などを有するアミノ酸配列としては、野生型酵素が有するアミノ酸配列と一定以上の配列同一性を有するアミノ酸配列が挙げられ、例えば、野生型酵素が有するアミノ酸配列と６０％以上、好ましくは６５％以上、好ましくは７０％以上、好ましくは７５％以上、好ましくは８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。
【００３９】
（酵素（１）乃至（７）をコードする遺伝子）
遺伝子ａｓｃＢ、ａｓｃＣ、ａｓｃＤ、ａｓｃＥ、ａｓｃＦ、ａｓｃＧ及びａｓｃＨ（以下、これらを総称して「酵素（１）乃至（７）をコードする遺伝子」とよぶ場合がある。）は、上記した酵素活性を有する酵素（１）乃至（７）が有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むものであれば特に限定されない。酵素（１）乃至（７）をコードする遺伝子が形質転換体内で発現することにより酵素（１）乃至（７）が生産される。本明細書における「遺伝子の発現」とは、転写や翻訳などを介して、遺伝子によってコードされる酵素が本来の触媒活性を有する態様で生産されることを意味する。また、「遺伝子の発現」には、遺伝子の高発現、すなわち、遺伝子が挿入されたことにより、宿主生物が本来発現する量を超えて、該遺伝子によってコードされる酵素が生産されることを包含する。
【００４０】
酵素（１）乃至（７）をコードする遺伝子は、宿主生物に導入された際に、該遺伝子の転写後にスプライシングを経由して酵素（１）乃至（７）を生成し得る遺伝子であっても、該遺伝子の転写後にスプライシングを経由せずに酵素（１）乃至（７）を生成し得る遺伝子であっても、どちらでもよい。
【００４１】
酵素（１）乃至（７）をコードする遺伝子は、由来生物が本来保有する遺伝子（すなわち、野生型遺伝子）と完全に同一でなくともよく、上記した酵素活性を有する酵素をコードする遺伝子である限り、野生型遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡであってもよい。
【００４２】
本明細書における「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、野生型遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡをプローブとして使用し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、サザンブロットハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味する。
【００４３】
本明細書における「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリッドのシグナルが非特異的なハイブリッドのシグナルと明確に識別される条件であり、使用するハイブリダイゼーションの系と、プローブの種類、配列及び長さによって異なる。そのような条件は、ハイブリダイゼーションの温度を変えること、洗浄の温度及び塩濃度を変えることにより決定可能である。例えば、非特異的なハイブリッドのシグナルまで強く検出されてしまう場合には、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を上げるとともに、必要により洗浄の塩濃度を下げることにより特異性を上げることができる。また、特異的なハイブリッドのシグナルも検出されない場合には、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を下げるとともに、必要により洗浄の塩濃度を上げることにより、ハイブリッドを安定化させることができる。
【００４４】
ストリンジェントな条件の具体例としては、例えば、プローブとしてＤＮＡプローブを用い、ハイブリダイゼーションは、５×ＳＳＣ、１．０％（ｗ／ｖ）  核酸ハイブリダイゼーション用ブロッキング試薬（ベーリンガ・マンハイム社製）、０．１％（ｗ／ｖ）  Ｎ−ラウロイルサルコシン、０．０２％（ｗ／ｖ）  ＳＤＳを用い、一晩（８〜１６時間程度）で行う。洗浄は、０．１〜０．５×ＳＳＣ、０．１％（ｗ／ｖ）  ＳＤＳ、好ましくは０．１×ＳＳＣ  、０．１％（ｗ／ｖ）  ＳＤＳを用い、１５分間、２回行う。ハイブリダイゼーション及び洗浄を行う温度は６５℃以上、好ましくは６８℃以上である。
【００４５】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡとしては、例えば、コロニー若しくはプラーク由来の野生型遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ又は該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションすることによって得られるＤＮＡや０．５〜２．０ＭのＮａＣｌ存在下にて、４０〜７５℃でハイブリダイゼーションを実施した後、好ましくは０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下にて、６５℃でハイブリダイゼーションを実施した後、０．１〜１×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣ溶液は、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡなどを挙げることができる。プローブの調製やハイブリダイゼーションの方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ−Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．，１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １−３８，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９８７−１９９７（以下、これらの文献を「参考技術文献」ともよぶ。）などに記載されている方法に準じて実施することができる。なお、当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度や温度などの条件に加えて、その他のプローブ濃度、プローブ長さ、反応時間などの諸条件を加味して、野生型遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡを得るための条件を適宜設定することができる。
【００４６】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡとしては、プローブとして使用する野生型遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡの塩基配列と一定以上の配列同一性を有するＤＮＡが挙げられ、例えば、野生型遺伝子の塩基配列と６０％以上、好ましくは６５％以上、好ましくは７０％以上、好ましくは７５％以上、好ましくは８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列同一性を有するＤＮＡが挙げられる。
【００４７】
野生型遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列としては、例えば、塩基配列における塩基数５００個を一単位とすれば、野生型遺伝子の塩基配列において、該一単位あたり、１から数個、好ましくは１から２００個、より好ましくは１から１７５個、より好ましくは１から１５０個、より好ましくは１から１２５個、より好ましくは１から１００個、より好ましくは１から７５個、より好ましくは１から５０個、より好ましくは１から３０個、さらに好ましくは１から２０個、なおさらに好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の塩基の欠失、置換、付加などを有する塩基配列を含む。ここで、「塩基の欠失」とは配列中の塩基に欠落又は消失があることを意味し、「塩基の置換」は配列中の塩基が別の塩基に置き換えられていることを意味し、「塩基の付加」とは新たな塩基が挿入するように付け加えられていることを意味する。
【００４８】
野生型遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によってコードされる酵素は、野生型遺伝子の塩基配列によってコードされる酵素が有するアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加などを有するアミノ酸配列を有する酵素である蓋然性があるが、野生型遺伝子の塩基配列によってコードされる酵素と同じ酵素活性を有するものである。
【００４９】
また、酵素（１）乃至（７）をコードする遺伝子は、１つのアミノ酸に対応するコドンが数種類あることを利用して、野生型遺伝子がコードする酵素が有するアミノ酸配列と同一又は近似するアミノ酸配列をコードする塩基配列であって、野生型遺伝子と異なる塩基配列を含むものであってもよい。このような野生型遺伝子の塩基配列に対してコドン改変が施された塩基配列としては、例えば、配列番号１５〜１８及び２２〜２４に記載の塩基配列などが挙げられる。コドン改変が施された塩基配列としては、例えば、宿主生物において発現し易いようにコドン改変が施された塩基配列であることが好ましい。
【００５０】
（配列同一性を算出するための手段）
塩基配列やアミノ酸配列の配列同一性を求める方法は特に限定されないが、例えば、通常知られている方法を利用して、野生型遺伝子や野生型遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列と対象となる塩基配列やアミノ酸配列とをアラインメントし、両者の配列の一致率を算出するためのプログラムを用いることにより求められる。
【００５１】
２つのアミノ酸配列や塩基配列における一致率を算出するためのプログラムとしては、例えば、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズム（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４−２２６８、１９９０；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ９０：５８７３−５８７７、１９９３）が知られており、このアルゴリズムを用いたＢＬＡＳＴプログラムがＡｌｔｓｃｈｕｌなどによって開発されている（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０、１９９０）。さらに、ＢＬＡＳＴより感度よく配列同一性を決定するプログラムであるＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴも知られている（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：３３８９−３４０２、１９９７）。したがって、当業者は例えば上記のプログラムを利用して、与えられた配列に対し、高い配列同一性を示す配列をデータベース中から検索することができる。これらは、例えば、米国Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのインターネット上のウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）において利用可能である。
【００５２】
上記の各方法は、データベース中から配列同一性を示す配列を検索するために通常的に用いられ得るが、個別の配列の配列同一性を決定する手段としては、Ｇｅｎｅｔｙｘネットワーク版  ｖｅｒｓｉｏｎ  １２．０．１（ゼネティックス社製）のホモロジー解析を用いることもできる。この方法は、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２７：１４３５−１４４１、１９８５）に基づくものである。塩基配列の配列同一性を解析する際は、可能であればタンパク質をコードしている領域（ＣＤＳ又はＯＲＦ）を用いる。
【００５３】
（酵素（１）乃至（７）をコードする遺伝子の由来）
酵素（１）乃至（７）をコードする遺伝子は、例えば、イリシコリンＡ、アスコクロリンなどのイソプレノイドの生産能がある生物種や酵素（１）乃至（７）の発現が見られる生物種などに由来する。酵素（１）乃至（７）の酵素をコードする遺伝子の由来生物としては、例えば、微生物などが挙げられる。微生物の中でも糸状菌はアスコクロリン生産能があることが知られている菌種が多いことから好ましい。アスコクロリン生産能を有する糸状菌の具体例としては、アクレモニウム属糸状菌、トリコデルマ属糸状菌、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）糸状菌、シリンドロカルポン属（Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃａｒｐｏｎ）糸状菌、バーティシリウム属（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）糸状菌、ネクトリア属（Ｎｅｃｔｒｉａ）糸状菌などが挙げられ、より具体的にはアクレモニウム・スクレロティゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｓｃｌｅｒｏｔｉｇｅｎｕｍ）などが挙げられる。
【００５４】
上記のとおり、酵素（１）乃至（７）をコードする遺伝子の由来生物は特に限定されないが、形質転換体において発現される酵素（１）乃至（７）は、宿主生物の生育条件によって不活化せず、活性を示すことが好ましい。そこで、酵素（１）乃至（７）をコードする遺伝子の由来生物は、酵素（１）乃至（７）をコードする遺伝子を挿入することによって形質転換すべき宿主生物と生育条件が近似する微生物であることが好ましい。
【００５５】
（遺伝子工学的手法による酵素（１）乃至（７）をコードする遺伝子のクローニング）
酵素（１）乃至（７）をコードする遺伝子は、適当な公知の各種ベクター中に挿入することができる。さらに、このベクターを適当な公知の宿主生物に導入して、酵素（１）乃至（７）をコードする遺伝子を含む組換えベクター（組換え体ＤＮＡ）が導入された形質転換体を作製できる。酵素（１）乃至（７）をコードする遺伝子の取得方法や、酵素（１）乃至（７）をコードする遺伝子の塩基配列、酵素（１）乃至（７）のアミノ酸配列情報の取得方法、各種ベクターの製造方法や形質転換体の作製方法などは、当業者にとって適宜選択することができる。また、本明細書では、形質転換や形質転換体にはそれぞれ形質導入や形質導入体を包含する。酵素（１）乃至（７）をコードする遺伝子のクローニングの一例を非限定的に後述する。
【００５６】
酵素（１）乃至（７）をコードする遺伝子をクローニングするには、通常一般的に用いられている遺伝子のクローニング方法を適宜用いることができる。例えば、酵素（１）乃至（７）の生産能を有する微生物や種々の細胞から、常法、例えば、参考技術文献に記載の方法により、染色体ＤＮＡやｍＲＮＡを抽出することができる。抽出したｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成することができる。このようにして得られた染色体ＤＮＡやｃＤＮＡを用いて、染色体ＤＮＡやｃＤＮＡのライブラリーを作製することができる。
【００５７】
例えば、酵素（１）乃至（７）をコードする遺伝子は、該遺伝子を有する由来生物の染色体ＤＮＡやｃＤＮＡを鋳型としたクローニングにより得ることができる。酵素（１）乃至（７）をコードする遺伝子の由来生物は上記したとおりのものであり、具体的な例としては、アクレモニウム・スクレロティゲナムなどを挙げることができる。例えば、アクレモニウム・スクレロティゲナムを培養し、得られた菌体から水分を取り除き、液体窒素中で冷却しながら乳鉢などを用いて物理的に磨砕することにより細かい粉末状の菌体片とし、該菌体片から通常の方法により染色体ＤＮＡ画分を抽出する。染色体ＤＮＡ抽出操作には、ＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）などの市販の染色体ＤＮＡ抽出キットが利用できる。
【００５８】
次いで、前記染色体ＤＮＡを鋳型として、５’末端配列及び３’末端配列に相補的な合成プライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（以下、「ＰＣＲ」と表記する）を行うことにより、ＤＮＡを増幅する。プライマーとしては、該遺伝子を含むＤＮＡ断片の増幅が可能であれば特に限定されない。別の方法として、５’ＲＡＣＥ法や３’ＲＡＣＥ法などの適当なＰＣＲにより、目的の遺伝子断片を含むＤＮＡを増幅させ、これらを連結させて全長の目的遺伝子を含むＤＮＡを得ることができる。
【００５９】
また、酵素（１）乃至（７）をコードする遺伝子を取得する方法は特に限定されず、遺伝子工学的手法によらなくとも、例えば、化学合成法を用いて酵素（１）乃至（７）をコードする遺伝子を構築することが可能である。
【００６０】
ＰＣＲにより増幅された増幅産物や化学合成した遺伝子における塩基配列の確認は、例えば、次のように行うことができる。まず、配列を確認したいＤＮＡを通常の方法に準じて適当なベクターに挿入して組換え体ＤＮＡを作製する。ベクターへのクローニングには、ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）などの市販のキット；ｐＵＣ１９（タカラバイオ社製）、ｐＵＣ１８（タカラバイオ社製）、ｐＢＲ３２２（タカラバイオ社製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ＋（ストラタジーン社製）、ｐＹＥＳ２／ＣＴ（インビトロジェン社製）などの市販のプラスミドベクターＤＮＡ；λＥＭＢＬ３（ストラタジーン社製）などの市販のバクテリオファージベクターＤＮＡが使用できる。該組換え体ＤＮＡを用いて、宿主生物、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、好ましくは大腸菌  ＪＭ１０９株（タカラバイオ社製）や大腸菌  ＤＨ５α株（タカラバイオ社製）を形質転換する。得られた形質転換体に含まれる組換え体ＤＮＡを、ＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）などを用いて精製する。
【００６１】
該組換え体ＤＮＡに挿入されている各遺伝子の塩基配列の決定は、ジデオキシ法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１０１、２０−７８、１９８３）などにより行う。塩基配列の決定の際に使用する配列解析装置は特に限定されないが、例えば、Ｌｉ−ＣＯＲ  ＭＯＤＥＬ  ４２００Ｌシークエンサー（アロカ社製）、３７０ＤＮＡシークエンスシステム（パーキンエルマー社製）、ＣＥＱ２０００ＸＬ  ＤＮＡアナリシスシステム（ベックマン社製）などが挙げられる。そして、決定された塩基配列を元に、翻訳されるタンパク質、すなわち、酵素（１）乃至（７）のアミノ酸配列を知り得る。
【００６２】
（酵素（１）乃至（７）をコードする遺伝子を含む組換えベクターの構築）
酵素（１）乃至（７）をコードする遺伝子を含む組換えベクター（組換え体ＤＮＡ）は、酵素（１）乃至（７）をコードする遺伝子のいずれかを含むＰＣＲ増幅産物と各種ベクターとを、酵素（１）乃至（７）をコードする遺伝子の発現が可能な形で結合することにより構築することができる。例えば、適当な制限酵素で酵素（１）乃至（７）をコードする遺伝子のいずれかを含むＤＮＡ断片を切り出し、該ＤＮＡ断片を適当な制限酵素で切断したプラスミドと連結することにより構築することができる。または、プラスミドと相同的な配列を両末端に付加した該遺伝子を含むＤＮＡ断片と、インバースＰＣＲにより増幅したプラスミド由来のＤＮＡ断片とを、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（クロンテック社製）などの市販の組換えベクター作製キットを用いて連結させることにより得ることができる。
【００６３】
（形質転換体の作製方法）
形質転換体の作製方法は特に限定されず、例えば、常法に従って、酵素（１）乃至（７）をコードする遺伝子が発現する態様で宿主生物に挿入する方法などが挙げられる。具体的には、酵素（１）乃至（７）をコードする遺伝子のいずれかを発現誘導プロモーター及びターミネーターの間に挿入したＤＮＡコンストラクトを作製し、次いで酵素（１）乃至（７）をコードする遺伝子を含むＤＮＡコンストラクトで宿主生物を形質転換することにより、酵素（１）乃至（７）をコードする遺伝子を過剰発現する形質転換体が得られる。本明細書では、宿主生物を形質転換するために作製された、発現誘導プロモーター−酵素（１）乃至（７）をコードする遺伝子−ターミネーターからなるＤＮＡ断片及び該ＤＮＡ断片を含む組換えベクターをＤＮＡコンストラクトと総称してよぶ。
【００６４】
酵素（１）乃至（７）をコードする遺伝子が発現する態様で宿主生物に挿入する方法は特に限定されないが、例えば、相同組換えを利用することにより宿主生物の染色体上に直接的に挿入する手法；プラスミドベクター上に連結することにより宿主生物内に導入する手法などが挙げられる。
【００６５】
相同組換えを利用する方法では、染色体上の組換え部位の上流領域及び下流領域と相同な配列の間に、ＤＮＡコンストラクトを連結し、宿主生物のゲノム中に挿入することができる。高発現プロモーターは特に限定されないが、例えば、翻訳伸長因子であるＴＥＦ１遺伝子（ｔｅｆ１）のプロモーター領域、α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙ）のプロモーター領域、アルカリプロテアーゼ遺伝子（ａｌｐ）プロモーター領域、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｐｄ）プロモーター領域などが挙げられる。
【００６６】
ベクターを利用する方法では、ＤＮＡコンストラクトを、常法により、宿主生物の形質転換に用いられるプラスミドベクターに組み込み、対応する宿主生物を常法により形質転換することができる。
【００６７】
そのような、好適なベクター−宿主系としては、宿主生物中で酵素（１）乃至（７）を生産させ得る系であれば特に限定されず、例えば、ｐＵＣ１９及び糸状菌の系、ｐＳＴＡ１４（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１８、９９−１０４、１９８９）及び糸状菌の系などが挙げられる。
【００６８】
ＤＮＡコンストラクトは宿主生物の染色体に導入して用いることが好ましいが、この他の方法として、自律複製型のベクター（Ｏｚｅｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９，１１３３ （１９９５））にＤＮＡコンストラクトを組み込むことにより、染色体に導入しない形で用いることもできる。
【００６９】
ＤＮＡコンストラクトには、形質転換された細胞を選択することを可能にするためのマーカー遺伝子が含まれていてもよい。マーカー遺伝子は特に限定されず、例えば、ｐｙｒＧ、ｎｉａＤ、ａｄｅＡのような、宿主生物の栄養要求性を相補する遺伝子；ピリチアミン、ハイグロマイシンＢ、オリゴマイシンなどの薬剤に対する薬剤耐性遺伝子などが挙げられる。また、ＤＮＡコンストラクトは、宿主生物中で酵素（１）乃至（７）をコードする遺伝子を過剰発現することを可能にするプロモーター、ターミネーターその他の制御配列（例えば、エンハンサー、ポリアデニル化配列など）を含むことが好ましい。プロモーターは特に限定されないが、適当な発現誘導プロモーターや構成的プロモーターが挙げられ、例えば、ｔｅｆ１プロモーター、ａｌｐプロモーター、ａｍｙプロモーター、ｇｐｄプロモーターなどが挙げられる。ターミネーターもまた特に限定されないが、例えば、ａｌｐターミネーター、ａｍｙターミネーター、ｔｅｆ１ターミネーターなどが挙げられる。
【００７０】
ＤＮＡコンストラクトにおいて、酵素（１）乃至（７）をコードする遺伝子の発現制御配列は、挿入する酵素（１）乃至（７）をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片が、発現制御機能を有している配列を含む場合は必ずしも必要ではない。また、共形質転換法により形質転換を行う場合には、ＤＮＡコンストラクトはマーカー遺伝子を有しなくてもよい場合がある。
【００７１】
ＤＮＡコンストラクトには精製のためのタグをつけることができる。例えば、酵素（１）乃至（７）をコードする遺伝子の上流又は下流に適宜リンカー配列を接続し、ヒスチジンをコードする塩基配列を６コドン以上接続することにより、ニッケルカラムを用いた精製を可能にすることができる。
【００７２】
ＤＮＡコンストラクトにはマーカーリサイクリングに必要な相同配列が含まれていてもよい。例えばｐｙｒＧマーカーは、ｐｙｒＧマーカーの下流に挿入部位（５’相同組み換え領域）の上流の配列と相同な配列を付加すること、又はｐｙｒＧマーカーの上流に挿入部位（３’相同組み換え領域）の下流の配列と相同な配列を付加することで、５−フルオロオロチン酸（５ＦＯＡ）を含んだ培地上でｐｙｒＧマーカーを脱落させることが可能となる。マーカーリサイクリングに適した該相同配列の長さは０．５ｋｂ以上が好ましい。
【００７３】
ＤＮＡコンストラクトの一態様は、例えば、ｐＵＣ１９のマルチクローニングサイトにあるＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｉｔｅに、ｔｅｆ１遺伝子プロモーター、酵素（１）乃至（７）をコードする遺伝子、ａｌｐ遺伝子ターミネーター及びｐｙｒＧマーカー遺伝子を連結させたＤＮＡコンストラクトである。
【００７４】
相同組み換えにより遺伝子を挿入する場合のＤＮＡコンストラクトの一態様は、５’相同組み換え配列、ｔｅｆ１遺伝子プロモーター、酵素（１）乃至（７）をコードする遺伝子、ａｌｐ遺伝子ターミネーター及びｐｙｒＧマーカー遺伝子、３’相同組み換え配列を連結させたＤＮＡコンストラクトである。
【００７５】
相同組み換えにより遺伝子を挿入し、かつ、マーカーをリサイクルする場合のＤＮＡコンストラクトの一態様は、５’相同組み換え配列、ｔｅｆ１遺伝子プロモーター、酵素（１）乃至（７）をコードする遺伝子、ａｌｐ遺伝子ターミネーター、マーカーリサイクリング用相同配列、ｐｙｒＧマーカー遺伝子、３’相同組み換え配列を連結させたＤＮＡコンストラクトである。
【００７６】
宿主生物が糸状菌である場合、糸状菌への形質転換方法としては、当業者に知られる方法を適宜選択することができ、例えば、宿主生物のプロトプラストを調製した後に、ポリエチレングリコール及び塩化カルシウムを用いるプロトプラストＰＥＧ法（例えば、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１８、９９−１０４、１９８９、特開２００７−２２２０５５号公報などを参照）を用いることができる。形質転換体を再生させるための培地は、用いる宿主生物と形質転換マーカー遺伝子とに応じて適切なものを用いる。例えば、宿主生物としてアスペルギルス・オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ソーヤ（Ａ．ｓｏｊａｅ）を用い、形質転換マーカー遺伝子としてｐｙｒＧ遺伝子を用いた場合は、形質転換体の再生は、例えば、０．５％寒天及び１．２Ｍソルビトールを含むＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ最少培地（ディフコ社製）で行うことができる。
【００７７】
また、例えば、形質転換体を得るために、相同組換えを利用して、宿主生物が本来染色体上に有する酵素（１）乃至（７）をコードする遺伝子のプロモーターをｔｅｆ１などの高発現プロモーターへ置換してもよい。この際も、高発現プロモーターに加えて、ｐｙｒＧなどの形質転換マーカー遺伝子を挿入することが好ましい。例えば、この目的のために、特開２０１１−２３９６８１号公報に記載の実施例や図１を参照して、酵素（１）乃至（７）をコードする遺伝子の上流領域−形質転換マーカー遺伝子−高発現プロモーター−酵素（１）乃至（７）をコードする遺伝子の全部又は部分からなる形質転換用カセットなどが利用できる。この場合、酵素（１）乃至（７）をコードする遺伝子の上流領域及び酵素（１）乃至（７）をコードする遺伝子の全部又は部分が相同組換えのために利用される。酵素（１）乃至（７）をコードする遺伝子の全部又は部分は、開始コドンから途中の領域を含むものが使用できる。相同組換えに適した領域の長さは０．５ｋｂ以上あることが好ましい。
【００７８】
形質転換体が作製されたことの確認は、酵素（１）乃至（７）の酵素活性が認められる条件下で形質転換体を培養し、次いで培養後に得られた培養物における目的産物、例えば、アスコクロリンやイリシコリンＡなどが検出されること、又は検出された目的産物の量が、同じ条件下で培養した宿主生物の培養物における目的産物の量よりも多いことを確認することにより行うことができる。
【００７９】
また、形質転換体が作製されたことの確認は、形質転換体から染色体ＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてＰＣＲを行い、形質転換が起きた場合に増幅が可能なＰＣＲ産物が生じることを確認することにより行ってもよい。この場合、例えば、用いたプロモーターの塩基配列に対するフォワードプライマーと、形質転換マーカー遺伝子の塩基配列に対するリバースプライマーとの組み合わせでＰＣＲを行い、想定の長さの産物が生じることを確認する。
【００８０】
相同組み換えにより形質転換を行う場合には、用いた上流側の相同領域より上流に位置するフォワードプライマーと、用いた下流側の相同領域より下流に位置するリバースプライマーとの組み合わせでＰＣＲを行い、相同組み換えが起きた場合に想定される長さの産物が生じることを確認することが好ましい。
【００８１】
（宿主生物）
宿主生物としては、酵素（１）乃至（７）をコードする遺伝子を含むＤＮＡコンストラクトによる形質転換により、酵素（１）乃至（７）を生産することができる生物であれば特に限定されず、例えば、微生物や植物などが挙げられ、微生物としては、アスペルギルス属微生物、アクレモニウム属微生物、ネオネクトリア属微生物、フザリウム属微生物、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属微生物、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属微生物、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属微生物、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属微生物、ジゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属微生物、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｕｍａ）属微生物、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属微生物、クモノスカビ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属微生物、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属微生物、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属微生物、ネオサルトリア（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ）属微生物、ビッソクラミス（Ｂｙｓｓｏｃｈｌａｍｙｓ）属微生物、タラロミセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属微生物、アジェロミセス（Ａｊｅｌｌｏｍｙｃｅｓ）属微生物、パラコッシディオイデス（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）属微生物、アンシノカルプス（Ｕｎｃｉｎｏｃａｒｐｕｓ）属微生物、コッシディオイデス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）属微生物、アルフロデルマ（Ａｒｔｈｒｏｄｅｒｍａ）属微生物、トリコフィトン（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ）属微生物、エクソフィラ（Ｅｘｏｐｈｉａｌａ）属微生物、カプロニア（Ｃａｐｒｏｎｉａ）属微生物、クラドフィアロフォラ（Ｃｌａｄｏｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ）属微生物、マクロホミナ（Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ）属微生物、レプトスファエリア（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ）属微生物、ビポラリス（Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ）属微生物、ドチストローマ（Ｄｏｔｈｉｓｔｒｏｍａ）属微生物、ピレノフォラ（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ）属微生物、ネオフシコッカム（Ｎｅｏｆｕｓｉｃｏｃｃｕｍ）属微生物、セトスファエリア（Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ）属微生物、バウドイニア（Ｂａｕｄｏｉｎｉａ）属微生物、ガエウマノミセス（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ）属微生物、マルッソニナ（Ｍａｒｓｓｏｎｉｎａ）属微生物、スファエルリナ（Ｓｐｈａｅｒｕｌｉｎａ）属微生物、スクレロチニア（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ）属微生物、マグナポルセ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）属微生物、ヴェルチシリウム（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）属微生物、シュードセルコスポラ（Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ）属微生物、コレトトリカム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）属微生物、オフィオストーマ（Ｏｐｈｉｏｓｔｏｍａ）属微生物、メタルヒジウム（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ）属微生物、スポロスリックス（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ）属微生物、ソルダリア（Ｓｏｒｄａｒｉａ）属微生物、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）属植物などが挙げられ、微生物及び植物が好ましい。イリシコリンＡ、アスコクロリン、アスコフラノンなどのイソプレノイドの生産能が認められる糸状菌や酵素（１）乃至（７）をコードする遺伝子をゲノムＤＮＡ上に有する糸状菌であってもよい。ただし、どのような場合であっても、宿主生物からヒトは除かれる。
【００８２】
糸状菌の中では、安全性や培養の容易性を加味すれば、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・タマリ（Ａ．ｔａｍａｒｉｉ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・ウサミ（Ａ．ｕｓａｍｉ）、アスペルギルス・カワチ（Ａ．ｋａｗａｃｈｉｉ）、アスペルギルス・サイトイ（Ａ．ｓａｉｔｏｉ）などのアスペルギルス属微生物などが好ましい。
【００８３】
（酵素（１）乃至（７）をコードする遺伝子の具体例）
アクレモニウム・スクレロティゲナム由来の酵素（１）乃至（７）をコードする遺伝子としては、例えば、配列番号１〜７に記載の塩基配列をそれぞれ有する遺伝子ａｓｃＢ、ａｓｃＣ、ａｓｃＤ、ａｓｃＥ、ａｓｃＦ、ａｓｃＧ及びａｓｃＨが挙げられる。なお、ＡｓｃＢ、ＡｓｃＣ、ＡｓｃＤ、ＡｓｃＥ、ＡｓｃＦ、ＡｓｃＧ及びＡｓｃＨタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号８〜１４として示す。
【００８４】
アクレモニウム・スクレロティゲナム及びアクレモニウム・スクレロティゲナム以外の生物から酵素（１）乃至（７）をコードする遺伝子を得る方法は特に限定されないが、例えば、遺伝子ａｓｃＢ、ａｓｃＣ、ａｓｃＤ、ａｓｃＥ、ａｓｃＦ、ａｓｃＧ及びａｓｃＨの塩基配列（配列番号１〜７）に基づいて、対象生物のゲノムＤＮＡをＢＬＡＳＴ相同性検索して、遺伝子ａｓｃＢ、ａｓｃＣ、ａｓｃＤ、ａｓｃＥ、ａｓｃＦ、ａｓｃＧ及びａｓｃＨの塩基配列と配列同一性の高い塩基配列を有する遺伝子を特定することにより得ることができる。また、対象生物の総タンパク質を基に、ＡｓｃＢ、ＡｓｃＣ、ＡｓｃＤ、ＡｓｃＥ、ＡｓｃＦ、ＡｓｃＧ及びＡｓｃＨタンパク質のアミノ酸配列（配列番号８〜１４）と配列同一性の高いアミノ酸配列を有するタンパク質を特定し、該タンパク質をコードする遺伝子を特定することにより得ることができる。例えば、アクレモニウム・スクレロティゲナム由来のＡｓｃＢ、ＡｓｃＣ、ＡｓｃＤ、ＡｓｃＥ、ＡｓｃＦ、ＡｓｃＧ及びＡｓｃＨタンパク質のアミノ酸配列と配列同一性の高いアミノ酸配列としては、ネオネクトリア属由来の配列番号２９〜３５のアミノ酸配列；アクレモニウム・スクレロティゲナム由来のＡｓｃＢ、ＡｓｃＣ、ＡｓｃＤ及びＡｓｃＥタンパク質のアミノ酸配列と配列同一性の高いアミノ酸配列としては、トリコデルマ由来の配列番号３７〜４０のアミノ酸配列などが挙げられる。
【００８５】
アクレモニウム・スクレロティゲナムから得られた酵素（１）乃至（７）をコードする遺伝子、又は酵素（１）乃至（７）と配列同一性を有する酵素をコードする遺伝子を、宿主生物としてアスペルギルス属微生物やアクレモニウム属微生物等の任意の宿主細胞に導入して形質転換することができる。
【００８６】
（形質転換体）
形質転換体の一態様は、糸状菌や植物などを宿主生物として、遺伝子ａｓｃＤ、ａｓｃＢ、ａｓｃＣ、ａｓｃＥ、ａｓｃＦ、ａｓｃＧ及びａｓｃＨのいずれか一つ、又はこれらの組み合わせが挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を発現するように形質転換した形質転換体（以下、「形質転換体（１）」ともよぶ。）である。宿主生物が、アクレモニウム・スクレロティゲナムなどのアスコクロリンやアスコフラノンの産生能が認められる生物である場合は、挿入された遺伝子は恒常的に強制発現若しくは内在性の発現よりも高発現にすること、又は細胞増殖後の培養後期で条件発現させることが望ましい。このような形質転換体は、発現したＡｓｃＤ、ＡｓｃＢ、ＡｓｃＣ、ＡｓｃＥ、ＡｓｃＦ、ＡｓｃＧ及び／又はＡｓｃＨの作用によって宿主生物では生産しない、又は生産したとしても微量であるイリシコリンＡ又はアスコクロリンを検出可能以上に生産することができる。
【００８７】
形質転換体の別の一態様は、糸状菌や植物などを宿主生物として、遺伝子ａｓｃＤ、ａｓｃＢ、ａｓｃＣ、ａｓｃＥ、ａｓｃＦ、ａｓｃＧ及びａｓｃＨのすべて又は一部を含む、野生型由来生合成遺伝子クラスター遺伝子（ＯＲＦ以外のプロモーター配列等も含む。）、及び、該生合成遺伝子クラスターの転写を制御する転写因子を高発現又は低発現するように設計されたＤＮＡコンストラクトが挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を発現するように形質転換した形質転換体（以下、「形質転換体（２）」ともよぶ。）である。宿主生物が、アクレモニウム・スクレロティゲナムなどのアスコクロリンやアスコフラノンの産生能が認められる生物である場合は、挿入された遺伝子は恒常的に強制発現若しくは内在性の発現よりも高発現にすること、又は細胞増殖後の培養後期で条件発現させることが望ましい。このような形質転換体は、発現量の変化した転写因子の作用によって、宿主生物又は形質転換体に適した条件で培養又は生育することにより、宿主生物では生産しない、又は生産したとしても微量であるイリシコリンＡ又はアスコクロリンを検出可能以上に生産することができる。
【００８８】
（製造方法）
本発明の一態様の製造方法は、形質転換体（１）又は形質転換体（２）を宿主細胞に適した条件で培養することにより、イリシコリンＡ又はアスコクロリンを得る工程を少なくとも含む、イリシコリンＡ又はアスコクロリンの製造方法である。
【００８９】
本発明の別の一態様の製造方法は、ＬＬ−Ｚ１２７２βやイリシコリンＡ（ＬＬ−Ｚ１２７２α）等のイリシコリンＡやアスコクロリンの前駆体を、形質転換体（１）又は形質転換体（２）に作用させてイリシコリンＡ又はアスコクロリンを得る工程を少なくとも含む、イリシコリンＡ又はアスコクロリンの製造方法である。例えば、イリシコリンＡを形質転換体に作用させる方法は、イリシコリンＡと形質転換体とが接触して、形質転換体が有する酵素によってアスコクロリンが生産できる方法であれば特に限定されないが、例えば、イリシコリンＡを含有し、かつ、形質転換体の生育に適した培地を用いて、形質転換体の生育に適した培養条件下で形質転換体を培養することによって、アスコクロリンを製造する方法などが挙げられる。培養方法は特に限定されず、例えば、宿主生物が糸状菌である場合は、通気又は非通気条件下で行う固体培養法や液体培養法などが挙げられる。
【００９０】
本発明の別の一態様の製造方法は、ＬＬ−Ｚ１２７２βやイリシコリンＡ（ＬＬ−Ｚ１２７２α）等のイリシコリンＡやアスコクロリンの前駆体を、形質転換体（１）又は形質転換体（２）より抽出した酵素を作用させて、イリシコリンＡ又はアスコクロリンを得る工程を少なくとも含む、イリシコリンＡ又はアスコクロリンの製造方法である。
【００９１】
以下では、主として宿主生物や野生型生物が糸状菌である場合の製造方法について記載するが、本発明の各態様の製造方法は下記記載に限定されない。
【００９２】
培地は、宿主生物や野生型生物（以下では、これらを総称して「宿主生物等」ともよぶ。）を培養する通常の培地、すなわち炭素源、窒素源、無機物、その他の栄養素を適切な割合で含有するものであれば、合成培地及び天然培地のいずれでも使用できる。宿主生物等がアスペルギルス属微生物である場合は、後述する実施例に記載があるようなＧＰＹ培地などを利用することができるが、特に限定されない。
【００９３】
形質転換体やノックアウト生物（以下では、これらを総称して「形質転換体等」ともよぶ。）の培養条件は、当業者により通常知られる宿主生物等の培養条件を採用すればよく、例えば、宿主生物等が糸状菌である場合、培地の初発ｐＨは５〜１０に調整し、培養温度は２０〜４０℃、培養時間は数時間〜数日間、好ましくは１〜７日間、より好ましくは２〜４日間など、適宜設定することができる。培養手段は特に限定されず、通気撹拌深部培養、振盪培養、静地培養などを採用することができるが、溶存酸素が十分になるような条件で培養することが好ましい。例えば、アスペルギルス属微生物を培養する場合の培地及び培養条件の一例として、後述する実施例に記載があるＧＰＹ培地を用いた、３０℃、１６０ｒｐｍでの３〜５日間の振盪培養が挙げられる。
【００９４】
培養終了後に培養物からアスコクロリン、イリシコリンＡなどの目的産物を抽出する方法は特に限定されない。抽出には、培養物から濾過、遠心分離などの操作により回収した菌体をそのまま用いてもよく、回収した後に乾燥した菌体やさらに粉砕した菌体を用いてもよい。菌体の乾燥方法は特に限定されず、例えば、凍結乾燥、天日乾燥、熱風乾燥、真空乾燥、通気乾燥、減圧乾燥などが挙げられる。
【００９５】
抽出溶媒は目的産物が溶解するものであれば特に限定されず、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトンなどの有機溶媒；これらの有機溶媒と水とを混合させた含水有機溶媒；水、温水及び熱水などが挙げられる。溶媒を加えた後、適宜、菌体破砕処理を加えながら目的産物を抽出する。
【００９６】
また、上記加温処理に代えて、例えば、超音波破砕機、フレンチプレス、ダイノミル、乳鉢などの破壊手段を用いて菌体を破壊する方法；ヤタラーゼなどの細胞壁溶解酵素を用いて菌体細胞壁を溶解する方法；ＳＤＳ、トリトンＸ−１００などの界面活性剤を用いて菌体を溶解する方法などの菌体破砕処理に供してもよい。これらの方法は単独又は組み合わせて使用することができる。
【００９７】
得られた抽出液は、遠心分離、フィルターろ過、限外ろ過、ゲルろ過、溶解度差による分離、溶媒抽出、クロマトグラフィー（吸着クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなど）、結晶化、活性炭処理、膜処理などの精製処理に供することにより目的産物を精製することができる。
【００９８】
定性的分析又は定量的分析は、ＬＣ−ＭＳ、ＬＣ−ＩＣＰ−ＭＳ、ＭＳ／ＭＳなどにより行うことができる。これらの分析の条件は当業者であれば適宜選択することができ、例えば、後述する実施例に記載がある条件で実施できる。
【００９９】
本発明の各態様の製造方法では、本発明の課題を解決し得る限り、上記した工程の前段若しくは後段又は工程中に、種々の工程や操作を加入することができる。
【０１００】
（用途）
本発明の一態様の遺伝子、形質転換体、ノックアウト生物及び製造方法を利用して得られたアスコクロリン、イリシコリンＡなどのイソプレノイドは、抗原虫活性、抗腫瘍活性、血糖低下作用、血中脂質低下作用、糖化阻害作用、抗酸化作用など種々の生理活性を有することが期待できる機能性生体物質であるとともに、その特徴を活かして、医薬品、医薬部外品などやこれらの製品を製造するための原料として利用可能である。
【０１０１】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではなく、本発明の課題を解決し得る限り、本発明は種々の態様をとることができる。
【実施例】
【０１０２】
（アスコクロリン生合成遺伝子の探索）
アスコフラノン産生菌であるアクレモニウム・スクレロティゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｓｃｌｅｒｏｔｉｇｅｎｕｍ  Ｆ−１３９２株；Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．７０：３０４−３０７（２０１６）参照）を用いて、アスコフラノンの産生量が４００倍以上異なる２つの培養サンプルを取得した。
【０１０３】
それらのサンプルから、５０〜１００ｍｇの菌体を回収し、ＴＲＩｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて、標準プロトコールに従って全ＲＮＡを回収した。
【０１０４】
回収した全ＲＮＡから、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ｍＲＮＡ  ＤＩＲＥＣＴ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いてｍＲＮＡを単離し、トランスクリプトームライブラリー（ｃＤＮＡライブラリー）をＩｏｎ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ−ｓｅｑ  Ｋｉｔ  ｖ２（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて構築した。
【０１０５】
なお、全ＲＮＡ、ｍＲＮＡ及びｃＤＮＡの品質及びトランスクリプトームライブラリーの濃度測定は、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＲＮＡ  ６０００  ｐｉｃｏ  ｋｉｔ及びＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００  ｂｉｏａｎａｌｉｚｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ（ともにＡｇｉｌｅｎ社製）を用いて確認した。
【０１０６】
得られたｃＤＮＡライブラリーのＲＮＡシーケンス解析をＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のシステムを用いて以下のように行った。
【０１０７】
得られたｃＤＮＡライブラリーをそれぞれ２０ｐｍｏｌ／Ｌに希釈し、Ｉｏｎ  ＯｎｅＴｏｕｃｈ  ２を用いてエマルジョンＰＣＲによってライブラリーの増幅を行った。増幅したライブラリーは、Ｉｏｎ  ＯｎｅＴｏｕｃｈ  ＥＳを用いて濃縮し、Ｉｏｎ  ＰＧＭ  ｓｙｓｔｅｍによってＲＮＡシーケンス解析を行った。Ｉｏｎ  ＯｎｅＴｏｕｃｈ  ２にはＩｏｎ  ＰＧＭ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＯＴ２  ２００  Ｋｉｔを用い、Ｉｏｎ  ＰＧＭにはＩｏｎ  ＰＧＭ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ２００  Ｋｉｔ  ｖ２を用いた。
【０１０８】
ＲＮＡシーケンスにはＩｏｎ  ＰＧＭ  Ｉｏｎ  ３１６  ｖ２チップを使用した。得られたシーケンス情報をアクレモニウム・スクレロティゲナムのゲノム配列データベースにマッピングし、２つのサンプル間における遺伝子の発現量の違いを解析した。
【０１０９】
マッピングされたｃＤＮＡのリード数をそれぞれの遺伝子の長さで補正した値（ＲＰＫＭ: ｒｅａｄｓ  ｐｅｒ  ｋｉｌｏｂａｓｅ  ｏｆ  ｅｘｏｎ  ｐｅｒ  ｍｉｌｌｉｏｎ  ｍａｐｐｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅａｄｓ）を基に、高生産サンプルと低生産サンプルとの間の発現倍率を計算した。
【０１１０】
高生産サンプルの遺伝子のうち、低生産サンプルのものと比較して３００倍以上の倍率で高発現している遺伝子の探索を行った結果、２遺伝子以上が連続しており、３００倍以上の倍率で高発現している遺伝子が集中した唯一の領域を見出すことができた。これがアスコフラノン生合成遺伝子クラスターであると予測し、３００倍以上の倍率で高発現していた遺伝子をａｓｃＡ〜Ｈと名付けた（図１を参照）。
【０１１１】
また、それぞれの遺伝子のコードするタンパク質について、ｂｌａｓｔ検索やＰｆａｍによるドメイン検索を行った結果、ＡｓｃＡ〜Ｈは表１のような機能を持つことが予測された。このうち、ＡｓｃＡは、転写因子であると考えられたため、アスコフラノンの生合成には遺伝子ａｓｃＢ〜Ｈ（配列番号１〜７）がコードするＡｓｃＢ〜Ｈタンパク質（配列番号８〜１４）が関与すると予想された。
【０１１２】
【表１】
2018183134.tif 000003
【０１１３】
（ＡｓｃＤ、ＡｓｃＢ、ＡｓｃＣ及びＡｓｃＥ発現形質転換体の作製）
麹菌アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ ＮＲＲＣ４２３９株）のｐｙｒＧ破壊株／ｋｕ７０破壊株に、麹菌発現用にコドンを改変した配列番号１５〜１８の遺伝子ａｓｃＢ、ａｓｃＣ、ａｓｃＤ及びａｓｃＥのいずれかを含む発現カセットを導入した。
【０１１４】
具体的には、各ａｓｃ遺伝子を発現させるための発現カセットとして、翻訳伸長因子遺伝子ｔｅｆ１のプロモーター配列であるＰｔｅｆ（ｔｅｆ１遺伝子の上流７４８ｂｐ、配列番号１９）をプロモーターとして用い、及びアルカリプロテアーゼ遺伝子ａｌｐのターミネーター配列であるＴａｌｐ（ａｌｐ遺伝子の下流８００ｂｐ、配列番号２０）をターミネーターとして用いた。また、選択マーカーとしてはウラシル／ウリジン要求性を相補する形質転換マーカー遺伝子ｐｙｒＧ（上流４０７ｂｐ、コード領域８９６ｂｐ及び下流５,３５ｂｐを含む１，８３８ｂｐ、配列番号２１）を用いた。
【０１１５】
例えば、ユーンらの文献（Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ. ２００９ Ｍａｒ;８２（４）:６９１−７０１. ｄｏｉ: １０．１００７／ｓ００２５３−００８−１８１５−５. Ｅｐｕｂ ２００８ Ｄｅｃ ２４.  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｑｕｉｎｔｕｐｌｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｇｅｎｅ ｄｉｓｒｕｐｔａｎｔ ｆｏｒ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ.）で報告されているように、形質転換に用いるＤＮＡ中に遺伝子挿入位置（相同組み換え領域）の上流又は下流の配列と相同な配列が含まれている場合、５−フルオロオロチン酸（５ＦＯＡ）を含む培地上でｐｙｒＧマーカーを脱落させることができ、何度もｐｙｒＧマーカーを使用すること（マーカーリサイクリング）が可能となる。よって、５’相同組み換え配列（５’ａｒｍ）、Ｐｔｅｆ、ａｓｃ遺伝子、Ｔａｌｐ、マーカーリサイクリング用相同配列（下流遺伝子との相同配列；ｌｏｏｐ ｏｕｔ ｒｅｇｉｏｎ）、ｐｙｒＧ、３’相同組み換え配列（３’ａｒｍ）の順に連結したものを形質転換用ＤＮＡとして用いることでｐｙｒＧのマーカーリサイクルを行い、各ａｃ遺伝子の発現カセットをアスペルギルス・ソーヤの染色体上へａｓｃＤ、ａｓｃＢ、ａｓｃＣ、ａｓｃＥの順に挿入した。
【０１１６】
また、それぞれのＤＮＡの連結にはＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（クロンテック社製）を使用した。例えば、Ｐｔｅｆと遺伝子ａｓｃＤとを連結させる場合には、Ｐｔｅｆは配列番号２５及び２６のプライマーを、ａｓｃＤは配列番号２７及び２８のプライマーを用いてＰＣＲ反応によりそれぞれのＤＮＡ断片を増幅させた。このとき、遺伝子ａｓｃＤ用のフォワードプライマーには、５’末端にＰｔｅｆと相同な配列が１５ｂｐ付加されているため、Ｉｎ  ｆｕｓｉｏｎ反応により、Ｐｔｅｆと遺伝子ａｓｃＤとの連結が可能となる。
【０１１７】
以上のようにして調製した５’ａｒｍ−Ｐｔｅｆ−ａｓｃＤ−Ｔａｌｐ−ｌｏｏｐ ｏｕｔ ｒｅｇｉｏｎ−ｐｙｒＧ−３’ａｒｍ、５’ａｒｍ−Ｐｔｅｆ−ａｓｃＢ−Ｔａｌｐ−ｌｏｏｐ ｏｕｔ ｒｅｇｉｏｎ−ｐｙｒＧ−３’ａｒｍ、５’ａｒｍ−Ｐｔｅｆ−ａｓｃＣ−Ｔａｌｐ−ｌｏｏｐ ｏｕｔ ｒｅｇｉｏｎ−ｐｙｒＧ−３’ａｒｍ、５’ａｒｍ−Ｐｔｅｆ−ａｓｃＥ−Ｔａｌｐ−ｌｏｏｐ ｏｕｔ ｒｅｇｉｏｎ−ｐｙｒＧ−３’ａｒｍの形質転換用ＤＮＡを用いて、アスペルギルス・ソーヤ  ＮＲＲＣ４２３９株のｐｙｒＧ破壊株／ｋｕ７０破壊株を形質転換することで、遺伝子ａｓｃＤ、ａｓｃＢ、ａｓｃＣ、及びａｓｃＥのいずれかを含む発現カセットのそれぞれを順に１コピーずつ導入したＡｓ−Ｄ株、Ａｓ−ＤＢ株、Ａｓ−ＤＢＣ株及びＡｓ−ＤＢＣＥ株を取得した。
【０１１８】
次に、１％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌを添加したＧＰＹ培地（２％（ｗ／ｖ）グルコース、１％
（ｗ／ｖ）ポリペプトン、０．５％（ｗ／ｖ）酵母エキス、０．５％（ｗ／ｖ）リン酸２水素１カリウム、０．０５％（ｗ／ｖ）硫酸マグネシウム・７水和物）にＡｓ−Ｄ株、Ａｓ−ＤＢ株、Ａｓ−ＤＢＣ株及びＡｓ−ＤＢＣＥ株を植菌し、３０℃で４日間培養した。培養後の菌体を濾紙上に回収した後、吸引濾過により水分を取り除いた。
【０１１９】
回収した菌体をアセトンに１晩浸漬し、フィルター処理することでＡｓ−ＤＢＣＥ株のアセトン抽出物を取得した。得られたアセトン抽出物を濃縮乾固し、メタノールに溶解した後、ＨＰＬＣ解析及びＭＳ解析（ネガティブモード）を行ったところ、Ａｓ−Ｄ株では宿主株（ＮＢＲＣ４２３９株）では見られなかった新たなピークがｏ−オルセリン酸の標準品と同じ溶出位置に確認された。また、Ａｓ−ＤＢ株ではＡｓ−Ｄ株では見られなかった新たなピークが確認され、ＭＳ解析の結果、該ピークのｍ／ｚ値はイリシコリン酸Ｂに相当する３７１であることがわかった。また、Ａｓ−ＤＢＣ株ではＡｓ−ＤＢ株では見られなかった新たなピークが確認され、ＭＳ解析の結果、該ピークのｍ／ｚ値はＬ−Ｚ１２７２βに相当する３５５であることがわかった。さらに、Ａｓ−ＤＢＣＥ株ではＡｓ−ＤＢＣ株では見られなかった新たなピークがわずかながら確認され、該ピークはイリシコリンＡ（ｉｌｉｃｉｃｏｌｉｎ  Ａ）標準品と同じ溶出位置に見られた（図２を参照）。
【０１２０】
なお、図２のＨＰＬＣは、メタノール：水：酢酸（４５０：５０：１０）を移動相（１ｍｌ／ｍｉｎ）とし、粒子径３μｍ、４．６ｍｍ×１００ｍｍのＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−１００Ｖ（ＴＯＳＯＨ社製）のＯＤＳカラムを用いて実施した。
【０１２１】
さらに、特願２０１６−２０９１７８号明細書に記載のｐｙｒＧ３遺伝子（配列番号４４）を用いて、遺伝子ａｓｃＤ、ａｓｃＢ、ａｓｃＣ及びａｓｃＥをそれぞれ多コピーで導入したＡｓ−ＤＢＣＥ−ｍｕｌｔｉ−ｃｏｐｙ株では、イリシコリンＡが多く蓄積していることがわかった（図２を参照）。なお、ｐｙｒＧ３遺伝子は、糸状菌において、任意の遺伝子を多コピーで染色体に組み込むための、ｐｙｒＧ内のプロモーター領域を改変し、発現量を低下させた選択マーカー遺伝子である。
【０１２２】
また、ＬＣ／ＭＳ解析により、該ピークの化合物がイリシコリンＡ標準品と同じｍ／ｚ値３８９（ｎｅｇａｔｉｖｅモード）を示すこと、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ解析においてもイリシコリンＡ標準品と同様のピークパターンを示したことから、発現したＡｓｃＤ、ＡｓｃＢ、ＡｓｃＣ及びＡｓｃＥタンパク質によって、イリシコリンＡが生合成されていることがわかった。なお、図２中で、約７分の溶出位置で見えているピークは、Ａｓ−ＤＢＣ株で確認されたピークと溶出位置が一致しており、ＭＳ解析の結果、ＬＬ−Ｚ１２７２βのｍ／ｚ値と一致していることがわかった。
【０１２３】
（ＡｓｃＤ、ＡｓｃＢ、ＡｓｃＣ、ＡｓｃＥ、ＡｓｃＦ、ＡｓｃＧ及びＡｓｃＨ発現形質転換体の作製）
Ａｓ−ＤＢＣＥ株と同様にして、麹菌発現用にコドンを改変した配列番号２２〜２４の遺伝子ａｓｃＦ、ａｓｃＧ及びａｓｃＨのいずれかを含む発現カセットを順次導入することで、ＡｓｃＦ発現カセットを導入したＡｓ−ＤＢＣＥＦ株；ＡｓｃＦ及びＡｓｃＧの発現カセットを導入したＡｓ−ＤＢＣＥＦＧ株；及び、ＡｓｃＦ、ＡｓｃＧ及びＡｓｃＨの発現カセットを導入したＡｓ−ＤＢＣＥＦＧＨ株を作製した。これらの株を上記と同様にして培養し、ＨＰＬＣ解析を行った。
【０１２４】
なお、ＨＰＬＣは、アセトニトリル＋０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸をＡ液、水＋０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸をＢ液とし、Ａ液４０〜１００％（５０ｍｉｎ）のグラジエント条件下で、流速０．２５ｍｌ/ｍｉｎで、Ｌ−ｃｏｌｕｍｎ２  ＯＤＳ（粒子径３μｍ、２．１ｍｍ×１００ｍｍ；化学物質評価研究機構社製）のＯＤＳカラムを用いて解析を行った。
【０１２５】
図３に示すとおり、Ａｓ−ＤＢＣＥＦ株ではＡｓ−ＤＢＣＥ株では見られなかった新たなピークが確認された。また、Ａｓ−ＤＢＣＥＦＧ株ではＡｓ−ＤＢＣＥＦ株では見られなかった新たなピークが確認された。さらに、Ａｓ−ＤＢＣＥＦＧＨ株ではＡｓ−ＤＢＣＥＦＧ株では見られなかった新たなピークが確認された。
【０１２６】
このことから、イリシコリンＡ以降は、ＡｓｃＦ、ＡｓｃＧ及びＡｓｃＨタンパク質が順次作用して反応が進むことがわかった。
【０１２７】
（粗酵素液を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ解析）
アスペルギルス・ソーヤ  ＮＲＲＣ４２３９株のｐｙｒＧ破壊株に対し、麹菌発現用にコドンを改変した配列番号２２〜２４の遺伝子ａｓｃＦ、ａｓｃＧ及びａｓｃＨの発現カセットのいずれかを多コピーで導入したＡｓ−Ｆ株、Ａｓ−Ｇ株及びＡｓ−Ｈ株を作製した。これらの株の作製にあたっては、Ｐｔｅｆ−ａｓｃ遺伝子−Ｔａｌｐ−ｐｙｒＧ３をｐＵＣ１９に挿入したプラスミドＤＮＡを形質転換用ＤＮＡとして用いた。
【０１２８】
アスペルギルス・ソーヤ  ＮＲＲＣ４２３９株（野生株）、Ａｓ−Ｆ株、Ａｓ−Ｇ株及びＡｓ−Ｈ株のそれぞれをＧＰＹ培地で１日培養し、培養後の菌体の水分を取り除いた後、液体窒素で凍結させ、マルチビーズショッカーで菌体を破砕した。粉砕した菌体に、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）を加えることで野生株、Ａｓ−Ｆ株、Ａｓ−Ｇ株及びＡｓ−Ｈ株の粗酵素液を抽出した。
【０１２９】
得られた粗酵素液（菌体５〜１０ｍｇ分）を用いて以下の反応液（１）〜（４）を調製した：
（１）野生株反応液：野生株の粗酵素液、イリシコリンＡの標準品、１ｍＭ  ＮＡＤＰＨ、１ｍＭ  ＮＡＤＨ、１ｍＭ  ＡＴＰ及び３ｍＭ  ＭｇＣｌ２の混合液
（２）Ａｓ−Ｆ反応液：Ａｓ−Ｆ株の粗酵素液、イリシコリンＡの標準品、１ｍＭ  ＮＡＤＰＨ、１ｍＭ  ＮＡＤＨ、１ｍＭ  ＡＴＰ及び３ｍＭ  ＭｇＣｌ２の混合液
（３）Ａｓ−ＦＧ反応液：Ａｓ−Ｆ株の粗酵素液、Ａｓ−Ｇ株の粗酵素液、イリシコリンＡの標準品、１ｍＭ  ＮＡＤＰＨ、１ｍＭ  ＮＡＤＨ、１ｍＭ  ＡＴＰ及び３ｍＭ  ＭｇＣｌ２の混合液
（４）Ａｓ−ＦＧＨ反応液：Ａｓ−Ｆ株の粗酵素液、Ａｓ−Ｇ株の粗酵素液、Ａｓ−Ｈ株の粗酵素液、イリシコリンＡの標準品、１ｍＭ  ＮＡＤＰＨ、１ｍＭ  ＮＡＤＨ、１ｍＭ  ＡＴＰ及び３ｍＭ  ＭｇＣｌ２の混合液
【０１３０】
上記反応液（１）〜（４）をそれぞれ室温で一晩反応させた。次いで、それぞれの反応液に対して、酢酸エチルで抽出を行い、得られた抽出物を濃縮乾固した後に、ＬＣ／ＭＳ解析を行った。
【０１３１】
ＬＣ解析は、Ｌ−ｃｏｌｕｍｎ２  ＯＤＳ（粒子径３μｍ、２．１ｍｍ×１００ｍｍ；化学物質評価研究機構社製）のカラムを用いて、アセトニトリル＋０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸をＡ液、水＋０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸をＢ液とし、Ａ液４０％〜１００％（５０ｍｉｎ）のグラジエント条件下、流速０．２５ｍｌ／ｍｉｎで行い、ＭＳ解析はｎｅｇａｔｉｖｅモードで行った。
【０１３２】
その結果、図４Ａに示すとおり、Ａｓ−Ｆ反応液ではｍ／ｚ値４２３において野生株反応液では見えなかった新たなピークが確認された。また、図４Ｂに示すとおり、Ａｓ−ＦＧ反応液ではｍ／ｚ値４０５においてＡｓ−Ｆ反応液では見られなかった新たなピークが確認された。さらに、図５に示すとおり、Ａｓ−ＦＧＨ反応液ではｍ／ｚ値４０３においてＡｓ−ＦＧ反応液やＡｓ−ＦＧ反応液では見られなかった新たなピークが確認された。また、Ａｓ−ＦＧＨ反応液で確認されたピークはアスコクロリン標準品のピークと溶出時間が一致し、さらにアスコクロリンのｍ／ｚ値は４０３であることから、これらの結果よりイリシコリンＡからＡｓｃＦ、ＡｓｃＧ及びＡｓｃＨタンパク質が順次作用することによりアスコクロリンが生合成されることがわかった。
【０１３３】
以上のように、アスコフラノン生合成に関与すると予測した遺伝子クラスターは、アスコクロリンの生合成遺伝子クラスターであることがわかった。予想されるアスコクロリンの生合成スキームを図６に示す。図６に示すとおり、アスコクロリンの生合成経路は、アスコフラノンの生合成経路とは、一部重複があるものの、全く別異なものであることがわかった。このことより、アスコクロリンの生合成遺伝子クラスターを導入した形質転換体により生産されるものは、アスコクロリンであってアスコフラノンではないことがわかった。
【０１３４】
（内在性エポキシドヒドロラーゼ遺伝子破壊株の解析）
上記のｉｎ  ｖｉｔｒｏ解析により、Ａｓ−Ｆ反応液ではｍ／ｚ値４２３のピークが確認されたため、アスペルギルス・ソーヤ  ＮＲＲＣ４２３９株で発現させたＡｓｃＦの粗酵素液による反応生成物はジヒドロキシ化されたイリシコリンＡ（図６参照）であることが予測された。しかしながらホソノらの文献（Ｊ Ａｎｔｉｂｉｏｔ （Ｔｏｋｙｏ）. ２００９ Ｏｃｔ;６２（１０）:５７１−４.）によると、アクレモニウム属微生物において、イリシコリンＡエポキシド（ｍ／ｚ値４０５）が蓄積していることが明らかとなっており、よって本来のＡｓｃＦ反応生成物はイリシコリンＡエポキシドであると考えられた。つまり、アスペルギルス・ソーヤ  ＮＲＲＣ４２３９株では、内在性のエポキシドヒドロラーゼによってイリシコリンＡエポキシドが開環し、ジヒドロキシル化されたイリシコリンＡが生成している可能性が考えられた。そこで、Ａｓ−ＤＢＣＥＦ株において、アスペルギルス・ソーヤ由来のエポキシドヒドロラーゼをコードすると予測される遺伝子のうち、最も発現量の高いエポキシドヒドロラーゼ遺伝子（配列番号３６）を欠損させたＡｓ−ＤＢＣＥＦ−ΔＥＨ株を作製した。Ａｓ−ＤＢＣＥＦ−ΔＥＨ株を上記と同様に培養し、ＨＰＬＣ解析を行ったところ、Ａｓ−ＤＢＣＥＦ株では見られなかった新たなピークが確認された。また、ＭＳ解析により、該ピークはエポキシド化合物に相当するｍ／ｚ値を有していることがわかった。よって、ＡｓｃＦはイリシコリンＡのエポキシ化反応を触媒することがわかった。  
【０１３５】
（トリコデルマ・リーゼイ由来ＡｓｃＣの機能解析）
アクレモニウム・スクレロティゲナム由来の配列番号８〜１１のＡｓｃＢ〜Ｅのアミノ酸配列を基に、Ｂｌａｓｔ検索した結果、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）においても配列番号３７〜４０のＡｓｃＢ〜Ｅホモログ（配列同一性はそれぞれ４７％、５３％、５２％、６６％）を有しており、さらにこれらをコードするａｓｃＢ〜Ｅ遺伝子はゲノム上で隣接していることがわかった。このことから、配列番号３７〜４０もまたイリシコリンＡの生合成酵素であることが予測された。そこで、ＮＩＴＥより購入したトリコデルマ・リーゼイＮＢＲＣ３１３２９株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号４１及び４２のプライマーを用いてＰＣＲ反応を行うことで、配列番号４３のａｓｃＣ遺伝子（Ｔｒ−ａｓｃＣ）をクローニングした。なお、配列番号４３のＴｒ−ａｓｃＣ遺伝子はイントロンを含んでいる塩基配列であるが、イントロン予測の結果、配列番号３８のＡｓｃＣタンパク質をコードしていると考えられた。
【０１３６】
クローニングしたＴｒ−ａｓｃＣを上記と同様にして連結することで、５’ａｒｍ−Ｐｔｅｆ−Ｔｒ−ａｓｃＣ−Ｔａｌｐ−ｐｙｒＧ−３’ａｒｍの形質転換用ＤＮＡを調製した。次に、上記で作製したアクレモニウム由来のａｓｃＤ遺伝子及びａｓｃＢ遺伝子が挿入されたＡｓ−ＤＢ株のｐｙｒＧマーカーをリサイクリングした株に対し、形質転換用ＤＮＡの５’ａｒｍ−Ｐｔｅｆ−Ｔｒ−ａｓｃＣ−Ｔａｌｐ−ｐｙｒＧ−３’ａｒｍを用いて形質転換することで、アクレモニウム由来のａｓｃＤ及びａｓｃＢ、さらにトリコデルマ由来のａｓｃＣを含む発現カセットのそれぞれを１コピーずつ導入したＡｓ−ＤＢ−Ｔｒ−Ｃ株を取得した。
【０１３７】
次に、ＧＰＹ培地（２％（ｗ／ｖ）グルコース、１％（ｗ／ｖ）ポリペプトン、０．５％（ｗ／ｖ）酵母エキス、０．５％（ｗ／ｖ）リン酸２水素１カリウム、０．０５％（ｗ／ｖ）硫酸マグネシウム・７水和物）にＡｓ−ＤＢ−Ｔｒ−Ｃ株を植菌し、３０℃で４日間培養した。培養後の菌体を濾紙上に回収した後、吸引濾過により水分を取り除いた。
【０１３８】
回収した菌体をアセトンに１晩浸漬し、フィルター処理することでＡｓ−ＤＢ−Ｔｒ−Ｃ株のアセトン抽出物を取得した。得られたアセトン抽出物を濃縮乾固し、メタノールに溶解した後、ＨＰＬＣ解析を行ったところ、Ａｓ−ＤＢ−Ｔｒ−Ｃ株では、Ａｓ−ＤＢＣ株のｍ／ｚ値のＬ−Ｚ１２７２βに相当する３５５のピークと同じ溶出位置に、新たなピークが検出された。このことから、予測どおり配列番号４３のＴｒ−ａｓｃＣ遺伝子はアクレモニウム由来のａｓｃＣ遺伝子と同じ機能を有していることがわかり、よってトリコデルマ由来の配列番号３７〜４０はイリシコリンＡの生合成酵素であると考えられた。さらに、ネオネクトリア・ディティシマ（Ｎｅｏｎｅｃｒｔｒｉａ ｄｉｔｉｓｓｉｍａ）由来の配列番号２９〜３５のＡｓｃＢ〜Ｈも、アクレモニウム由来のＡｓｃＢ〜Ｈとの同一性はすべて６０％以上であり、且つそれぞれのコード遺伝子はゲノム上で隣接していることから、該酵素群はアスコクロリン生合成酵素であると考えられた。
【０１３９】
配列表に記載の配列は、以下のとおりである：
［配列番号１］ａｓｃＢ
［配列番号２］ａｓｃＣ
［配列番号３］ａｓｃＤ
［配列番号４］ａｓｃＥ
［配列番号５］ａｓｃＦ
［配列番号６］ａｓｃＧ
［配列番号７］ａｓｃＨ
［配列番号８］ＡｓｃＢタンパク質
［配列番号９］ＡｓｃＣタンパク質
［配列番号１０］ＡｓｃＤタンパク質
［配列番号１１］ＡｓｃＥタンパク質
［配列番号１２］ＡｓｃＦタンパク質
［配列番号１３］ＡｓｃＧタンパク質
［配列番号１４］ＡｓｃＨタンパク質
［配列番号１５］コドン改変ａｓｃＢ
［配列番号１６］コドン改変ａｓｃＣ
［配列番号１７］コドン改変ａｓｃＤ
［配列番号１８］コドン改変ａｓｃＥ
［配列番号１９］Ｐｔｅｆ
［配列番号２０］Ｔａｌｐ
［配列番号２１］ｐｙｒＧ
［配列番号２２］コドン改変ａｓｃＦ
［配列番号２３］コドン改変ａｓｃＧ
［配列番号２４］コドン改変ａｓｃＨ
［配列番号２５］Ｐｔｅｆ−Ｆｗ
［配列番号２６］Ｐｔｅｆ−Ｒｖ
［配列番号２７］ａｓｃＤ−Ｆｗ
［配列番号２８］ａｓｃＤ−Ｒｖ
［配列番号２９］ＡｓｃＢタンパク質
［配列番号３０］ＡｓｃＣタンパク質
［配列番号３１］ＡｓｃＤタンパク質
［配列番号３２］ＡｓｃＥタンパク質
［配列番号３３］ＡｓｃＦタンパク質
［配列番号３４］ＡｓｃＧタンパク質
［配列番号３５］ＡｓｃＨタンパク質
［配列番号３６］Ａ．ｓｏｊａｅ由来エポキシドヒドロラーゼ遺伝子
［配列番号３７］ＡｓｃＢタンパク質
［配列番号３８］ＡｓｃＣタンパク質
［配列番号３９］ＡｓｃＤタンパク質
［配列番号４０］ＡｓｃＥタンパク質
［配列番号４１］Ｔｒ−ａｓｃＣ−Ｆｗ
［配列番号４２］Ｔｒ−ａｓｃＣ−Ｒｖ
［配列番号４３］Ｔｒ−ａｓｃＣ
［配列番号４４］ｐｙｒＧ３
【産業上の利用可能性】
【０１４０】
本発明の一態様である遺伝子、形質転換体、ノックアウト生物及び製造方法は、イリシコリンＡ及びアスコクロリンを大量に製造するために利用することができる。したがって、本発明は、イリシコリンＡ及びアスコクロリンを工業的規模で製造するために利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
2018183134.tif 000009
【図６】
2018183134.tif 000010
【配列表】
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