(57)【要約】【課題】卵殻膜含有粉末または微粉末を含む腸内フローラ改善剤を提供する。【解決手段】卵殻膜含有粉末、特に体積平均粒子径が６μｍ以下、または体積最大粒子径が２０μｍ以下の卵殻膜含有微粉末を含む腸内フローラ改善剤。この腸内フローラ改善剤を含む製剤は、食品添加物、飲食品、サプリメント、医薬品等の様々な用途、形態で利用することができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
卵殻膜含有粉末を有効成分とする腸内フローラ改善剤。
【請求項２】
卵殻膜含有粉末が、体積最大粒子径および／または体積平均粒子径が１００μｍより小さい卵殻膜含有微粉末である、請求項１に記載の腸内フローラ改善剤。
【請求項３】
卵殻膜含有粉末が、体積平均粒子径が６μｍ以下、または体積最大粒子径が２０μｍ以下の卵殻膜含有微粉末である、請求項１または２に記載の腸内フローラ改善剤。
【請求項４】
経口投与される製剤である、請求項１ないし３のいずれかに記載の腸内フローラ改善剤。
【請求項５】
食品添加剤、飲食品、サプリメントまたは医薬品である、請求項１ないし４のいずれかに記載の腸内フローラ改善剤。
【請求項６】
製剤が錠剤である、請求項４に記載の腸内フローラ改善剤。
【請求項７】
卵殻膜含有粉末の一日摂取量が１０〜４８，０００ｍｇである、請求項１ないし６のいずれかに記載の腸内フローラ改善剤。
【請求項８】
腸内フローラ改善が、腸内において、吸収されずに腸内に残った成分が腸内細菌の多様性を増加させ、かつ病原性細菌の数を減少させることによる、請求項１ないし７のいずれかに記載の腸内フローラ改善剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、卵殻膜含有粉末もしくは微粉末を含有する腸内フローラ改善剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
卵殻膜は、鶏卵などの鳥類の卵の卵殻の内側にある膜で、内外２枚からなり、外卵殻膜は卵殻内面に密着し、内卵殻膜は卵白を包んでおり、抗菌性を有し、発生中の胚を感染から保護している。卵殻膜は、Ｉ型、Ｖ型およびＸ型コラーゲン、グルコサミン、デスモシンおよびヒアルロン酸を主成分とした強靭な繊維性のタンパク質等からなる網目状の構造を有し、これらのタンパク質はシステインを含むものが多く、酸、アルカリ、プロテアーゼに対して比較的安定で、水に不溶性である。以前は食品産業の廃棄物として利用されていなかったが、皮膚の再生を促進する効果や、特に胎児性コラーゲンと呼ばれるIII型コラーゲンの生成を促進する効果が発見されてから、化粧品や栄養剤としての開発が進められ、実用化されている。
【０００３】
たとえば、卵殻膜成分の消化吸収効率を高めるために、体積平均粒子径が６μｍ以下または体積最大粒子径が２０μｍ（８００メッシュ）以下となるように、卵殻膜粉末をジェットミルを用いて粉砕し微粉末化する（特許文献１）ことが提案された。また、不溶性の卵殻膜を水に可溶性にするため、タンパク質を加水分解した加水分解卵殻膜を、取扱性、保存安定性の向上のために乾燥粉末化すること（特許文献２）、さらに、アルカリ性である加水分解卵殻膜粉末をｐＨ３〜６にして、保存安定性、安全性を高めること（特許文献３）が提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１３−２１６６５２号公報
【特許文献２】特許第５１７９８４７号明細書
【特許文献３】特開２０１６−９８２０６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、安全性が高く、食品添加剤、飲食品、サプリメント、医薬品として日常的に簡便な方法で利用することのでき、単一素材で生体を良好な状態に改善または維持できる腸内フローラ改善剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
卵殻膜または加水分解卵殻膜は、美肌化、皮膚再生、育毛発毛促進、脱毛防止などの作用の他に、肩凝りの解消、食欲増進、疲労回復等の日常的な健康増進、健康維持に有効であるとされている。また、体内で消化吸収されやすくするために、卵殻膜含有微粉末（特許文献１）及び加水分解卵殻膜粉末（特許文献２、３）とすることが知られている。
【０００７】
本発明者らは、卵殻膜含有粉末、微粉末は、約５４％が消化吸収されずに腸内に残り、その残った成分が腸内細菌のうちの悪玉菌の増殖を防止し、腸内フローラを改善することを初めて見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
本発明は,以下の技術的事項から構成される。
（１）卵殻膜含有粉末を有効成分とする腸内フローラ改善剤。
（２）卵殻膜含有粉末が、体積最大粒子径および／または体積平均粒子径が１００μｍより小さい卵殻膜含有微粉末である、（１）に記載の腸内フローラ改善剤。
（３）体積平均粒子径が６μｍ以下、または体積最大粒子径が２０μｍ以下の卵殻膜含有微粉末である、（１）または（２）に記載の腸内フローラ改善剤。
（４）経口投与される製剤である、（１）ないし（３）のいずれかに記載の腸内フローラ改善剤。
（５）食品添加剤、飲食品、サプリメントまたは医薬品である、（１）ないし（４）のいずれかに記載の腸内フローラ改善剤。
（６）製剤が錠剤である、（４）に記載の腸内フローラ改善剤。
（７） 卵殻膜含有粉末の一日摂取量が１０〜４８，０００ｍｇである、（１）ないし（６）のいずれかに記載の腸内フローラ改善剤。
（８）腸内フローラ改善が、腸内において、吸収されずに腸内に残った成分が腸内細菌の多様性を増加させ、かつ病原性細菌の数を減少させることによる、（１）ないし（７）のいずれかに記載の腸内フローラ改善剤。
【発明の効果】
【０００９】
ヒトの腸内には、数百種の腸内細菌が約１００兆個以上バランスよく生息しており、善玉菌、悪玉菌、および日和見菌が腸内において互いにバランスを保ちながら、一種の生態系（腸内フローラ）を形成している。この腸内フローラのバランスが崩れると、悪玉菌の増加等による腸内に有害な物質が蓄積されて、便秘、下痢症状、免疫機能の低下のみならず、血液中に吸収された有害物質により、心臓、肝臓および腎臓に負担を与え、老化を促進したり、癌の原因にもなることが知られている。
【００１０】
卵殻膜含有微粉末は、ラットを用いた実験で約５４％が消化吸収されずに腸内に残り、その残った成分が腸内細菌のうちの悪玉菌の増殖を防止し、腸内フローラを改善することが見出された。本発明によれば、食品添加剤、飲食品、サプリメント、医薬品等のさまざまな用途で、日常的に簡単に摂取できる腸内フローラ改善剤を提供することができる。本発明の腸内フローラ改善剤は、刺激性がなく、様々な形態で種々の成分と併用することができ、錠剤化も簡単に行うことができる。さらなる全身効果を得るために、栄養、美容成分と併用することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ＤＳＳで大腸炎を誘発したマウスに、卵殻膜含有微粉末サプリメントを摂取させた後の細菌メタゲノム解析の結果：腸内細菌プロファイル
【図２】ＤＳＳで大腸炎を誘発したマウスに、卵殻膜含有微粉末サプリメントを摂取させた後の細菌メタゲノム解析の結果：腸内細菌種の豊富さ
【図３】ＤＳＳで大腸炎を誘発したマウスに、卵殻膜含有微粉末サプリメントを摂取させた後の細菌メタゲノム解析の結果：腸内細菌の存在比
【図４】マウスを用いた加水分解卵殻膜粉末サプリメントの経口摂取実験による１７日後の結果。リアルタイムＰＣＲによるIII型コラーゲン遺伝子の皮膚における発現量を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
ヒトの腸内には、数百種の腸内細菌が約１００兆個以上バランスよく生息しており、例えば乳酸菌、ビフィズス菌のような有用菌（善玉菌）、例えば大腸菌、クロストリジウム菌のような有害菌（悪玉菌）、および日和見菌が腸内において互いにバランスを保ちながら、一種の生態系（腸内フローラ）を形成している。この腸内フローラのバランスが、老化、ストレス、疾病、環境変化、食生活の変化により崩れると、悪玉菌の増加等により腸内に有害な物質が蓄積されて、便秘、下痢症状、免疫機能の低下のみならず、血液中に吸収された有害物質により、心臓、肝臓および腎臓に負担を与え、老化を促進したり、癌の原因にもなることがあることが知られている。
【００１３】
本発明の腸内フローラ改善剤は、卵殻膜含有粉末を有効成分とするものであり、ラットを用いた実験では、摂取した卵殻膜含有微粉末の４６％が消化吸収され、残りは吸収されずに腸内に残った。この残った成分が腸内細菌の多様性を増加させ、かつ大腸菌のような病原性細菌の数を減少させ、腸内フローラを改善できることを、実施例１で示す。
【００１４】
本発明で使用される卵殻膜は、陸生の卵生動物すべての卵、特に鳥類の卵の卵殻の内側にある膜であればいずれも使用できる。特に鶏卵の卵殻膜が、入手の容易性、コストの点から好ましい。
【００１５】
本発明で使用される卵殻膜含有粉末は、少なくとも卵殻膜を含む粉末であれば特に制限はなく、粉末とは粒子サイズにかかわらず、あらゆる粉体をいう。剥離された卵殻膜または卵殻に卵殻膜が付着した状態の原料を使用して、公知のいずれの方法で粉末化してもよい。また、市販の卵殻膜含有粉末を用いてもよい。
【００１６】
本発明で使用される卵殻膜含有微粉末は、粉末のうち、体積最大粒子径および／または体積平均粒子径が概ね１００μｍより小さいものをいう。本願明細書において、粉末または微粉末の「体積平均粒子径」、「体積最大粒子径」は、レーザー回折式粒度分布測定機（株式会社セイシン製、ＬＭＳ−３０）を用いて測定した値を意味する。粒子径の測定に際しては、卵殻膜含有微粉末を界面活性剤を用いて水に分散させた測定試料を用いる。また、「体積平均粒子径」とは、粒度分布における小粒径側からの累積値が５０％における粒子径を意味する。
【００１７】
本発明で使用される卵殻膜含有微粉末として、特に体積平均粒子径が６μｍ以下、または体積最大粒子径が２０μｍ以下のものが、消化吸収効率の点から好ましい。市販の卵殻膜含有粉末等の卵殻膜含有原料を、ガス中で相互に衝突させるジェットミルを用いる微粉砕工程により製造することが好ましい。
【００１８】
ヒトの皮膚は表面にある上皮層とその下の結合組織性の真皮層からなっており、真皮層を構成するタンパク質は主としてコラーゲンであり、他にエラスチン、アルブミン、グロブリン、ムチンよりなっている。真皮層を構成するコラーゲンは、主としてα１（Ｉ）型コラーゲンおよびα１(III）型コラーゲン（以下、「III型コラーゲン」という。）であり、Ｉ型コラーゲンは主として皮膚の構造維持、III型コラーゲンは主として皮膚の柔軟性の付与とそれぞれ異なる機能を果たしている。
【００１９】
皮膚におけるI型コラーゲンとIII型コラーゲンの割合は、加齢に伴って変化する。III型コラーゲンは胎児性コラーゲンとも呼ばれるように、胎児のときに最も多く、胎児の皮膚ではIII型コラーゲンの方が多いが、１０代から減りはじめ、そのまま減少していくので、皮膚におけるIII型コラーゲンの割合を増加することができれば、加齢による皮膚の老化を止め、皮膚をなめらかでしっとりさせることができる。また、III型コラーゲンは皮膚以外にも、血管、肺、肝臓等の結合組織中に含まれている。
【００２０】
卵殻膜含有微粉末は、約４６％が消化吸収され、吸収され血液中に取り込まれたアミノ酸成分により、皮膚におけるIII型コラーゲンの生成を促進するだけでなく、血管でもIII型コラーゲンの生成を促進して血管全体の弾性を増すことができ、肝臓でも線維化を抑制することができる。
【００２１】
本発明の製剤は、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤などの経口用製剤とすることができる。刺激性がないために剤型に特に制限はなく、種々の剤型の経口用製剤を製造するための各種成分および製造法は、サプリメント、医薬品等の製造分野で公知な成分から適宜選択することができる。特に、保存、流通に適し、服用時に変形、崩壊が生じず、経口で簡単に服用できる観点から、錠剤に用いることが好ましい。
【００２２】
本発明の錠剤に含まれる卵殻膜含有粉末の含有量は、特に制限されないが、粒子への造粒と打錠が円滑に行え、かつ錠剤を摂取した際の腸内フローラ改善効果の観点から、錠剤の全重量に対して５〜４０重量％の割合、より好ましくは１０〜３５重量％の割合で含有するのが好ましい。含有量を５重量％以上とすることにより、多量の錠剤を摂取する必要がなくなり、一方、３５重量％以下とすることにより造粒および打錠が容易となり、錠剤を製造しやすくなる。
【００２３】
本実施形態の錠剤には、錠剤を形成するための各種の添加剤として、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、その他の栄養素等を添加することができる。
賦形剤としては、公知の賦形剤が適宜使用できるが、化工澱粉および乳糖の少なくとも１種を、賦形性の観点から卵殻膜成分の重量に対して０．３〜３倍用いることが好ましく、１〜２．５倍であることがより好ましい。化工澱粉としては、焙焼デキストリンなどのデキストリン、酸化澱粉、低粘性変性澱粉などの１種または２種以上を用いることができる。賦形剤として化工澱粉と乳糖を併用する場合は、使用割合（重量比）が、１：５〜５：１であることが好ましい。
結合剤としては、公知の結合剤が適宜使用できるが、たとえば、デンプン糊、アラビアゴム糊、ヒドロキシプロピルセルロースなどが挙げられる。
崩壊剤としては、公知の崩壊剤が適宜使用できるが、たとえば、セルロース類などを用いることができる。
滑沢剤としては、公知の滑沢剤が適宜使用できるが、たとえば、ステアリン酸マグネシウム、ショ糖脂肪酸エステル、ワックス類、タルク、ビタミンＣなどが挙げられる。
【００２４】
また、本実施形態の錠剤は、錠剤の硬度を高くして、変形や傷つきを防止し、取扱性を向上させるため、硬度向上剤として卵殻カルシウムを含有することが好ましい。卵殻カルシウムは、鶏卵などの鳥類の卵の殻を粉砕・乾燥した微粉末であり、錠剤に含まれる卵殻カルシウムの含有量は、好ましくは０．１〜２０重量％、より好ましくは０．５〜１５重量％である。
さらに、本実施形態の錠剤は、錠剤中に含まれる成分の変質や分解を防止し、かつ、錠剤表面の耐傷つき性を向上させるため、コーティング皮膜で覆うことが好ましい。コーティング皮膜は、公知のコーティング皮膜が適宜使用できるが、たとえば、商品名「セラック」（岐阜セラック株式会社製）を用いることができる。本実施形態の錠剤は、糖衣で覆われていてもよく、着色してもよく、着色後に艶出し処理を施してもよい。
【００２５】
本実施形態の錠剤の大きさは特に制限されないが、一般には直径が約７〜１０ｍｍ程度の円形や楕円形とするのが、取扱性、服用のし易さから好ましい。錠剤の１個の重さは、約３５０〜６００ｍｇ程度であり、卵殻膜含有粉末が好ましくは約１０〜２４０ｍｇ、より好ましは約２０〜１５０ｍｇ含まれるようにする。卵殻膜成分が約１０〜２４０ｍｇの量で含有されるとすれば、成人では当錠剤を１日当たり１〜２００個（１日当たりの卵殻膜含有粉末で１０〜４８，０００ｍｇ）摂取することができる。
【００２６】
本実施形態の錠剤は、卵殻膜含有粉末を少なくとも含む打錠用原料を用いて、公知の錠剤製造方法により製造することができる。たとえば、打錠用原料を打錠して裸錠を形成する打錠工程を経て、必要に応じて、造粒工程、保護コーティング工程、糖衣コーティング工程等を行い、さらに着色、艶出しを行ってもよい。
【００２７】
また、本発明の腸内フローラ改善剤としての医薬品の有効投与量は、治療もしくは予防すべき症状の程度、投与対象の状態（年齢、性別を含む）、剤型などによって異なる。このような医薬品のヒト（体重６０ｋｇの成人）に対する経口投与量は、卵殻膜含有粉末に換算して、好ましくは１日当たり１〜１００，０００ｍｇである。たとえば、有効投与量は、１日当たり卵殻膜含有粉末を合計で１０〜４８，０００ｍｇとすることができ、好ましくは、２０〜３，５００ｍｇとすることができる。本発明の卵殻膜含有粉末は、安全性が高く副作用の心配がないので、他の成分を適切に選択する限りにおいて、摂取量または適用量が上記の範囲を超えても問題はない。
【００２８】
さらに、本発明の製剤は、菓子類、飲料、健康食品、保存食品、加工食品などの食品添加剤とすることができる。ここで、「医薬品」および「飲食品」の対象はヒトに限定されるのもではなく、ペットや家畜のような哺乳動物用の医薬品および飼料も包含する。また、「飲食品」の概念には、通常の飲食品の他、経腸栄養食品、栄養機能食品、機能性表示食品、特定保健用食品などが包含される。
【００２９】
以下に、本発明を実施例に基づいて詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例１】
【００３０】
[卵殻膜含有微粉末の腸内フローラ改善機能および腸炎改善機能]
（１）卵殻膜含有微粉末の製造
卵殻膜含有粉末サンプルとして、商品名「ＥＭパウダー３００」（キユーピー株式会社製）をジェットミルで微粉砕したものを用いた。ジェットミルとしては、シングルトラックジェットミル（株式会社セイシン製、ＦＳ−４）を用いて、風量：１．２ｍ３／ｍｉｎ、動力：１１ｋｗにて、体積最大粒子径が８００メッシュ（目開きで約２０μｍ）程度となるまで粉砕を実施した。レーザー回折式粒度分布測定機（株式会社セイシン製、ＬＭＳ−３０）を用いて粉砕後の粒径を測定したところ、体積最大粒子径は１９．６μｍ、体積平均粒子径は５．８μｍ（以下、「８００メッシュ微粉末」という。）であった。
【００３１】
（２）実験動物
７週齢のオスC57BL6/Jマウスを購入し３日間順応させた後、平均体重が等しくなるように３つの群（ｎ＝８）に分けた。７日間、対照AIN-93G基礎常用飼料（ＤＳＳ群）または８％の卵殻膜８００メッシュ微粉末を補強した飼料（Ｄ−ＥＳＭ８群）のどちらかを給餌した。その後９日間、両群に以前と同じ実験用飼料を与えながら、１．５％（Ｗ/Ｖ）のデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）（分子量40KDa；MP Biomedicals,Irvine,CA）を含む飲料水を与えて、大腸炎を誘発させた。通常の対照マウス（ＣＯＮ群）には、実験の全過程において、AIN-93G基礎常用飼料と通常の飲料水を与えた。
８％の卵殻膜８００メッシュ微粉末補強飼料は、カロリーとタンパク質バランスを維持するために、コーンスターチとカゼインで調節した。病気活性指数（disease activity index:DAI）は、マウスの体重、便の硬さ、血便の３つのスコアを用いて、ＤＳＳ水を与えた日以降毎日モニターした。
【００３２】
（３）盲腸の細菌メタゲノム解析
メタゲノムＤＮＡを、QIAamp Stool Minキット(Qiagen,Hilden,Germany)を用いて、マウスの盲腸の内容物から抽出した。16S  rRNA遺伝子の可変領域３と４を増幅するために、（５’−ＣＣＴＡＣＧＧＧＮＧＧＣＷＧＣＡＧ−３’）と（５’−ＣＡＧＧＡＣＴＡＣＨＶＧＧＧＴＡＴＣＴＡＡＴＣＣ−３’）のプライマーを用いて増幅した。増幅物の長さが２５０bp以上で平均qualityスコアが３０以上のＤＮＡ配列について配列決定した。
代表的な配列をGreengenes OTUデータベースにしたがって、Ribosomal Database Project(RDP)分類を用いて分類した。
セグメント細菌と数種の病原性細菌の変化を検出するために、定量的リアルタイムＰＣＲを行った。
【００３３】
（４）細菌メタゲノム解析の結果
細菌門レベルの解析によれば、３つの実験群（Ｄ−ＥＳＭ８、ＤＳＳ、ＣＯＮ）の間で、最も広く行き渡っている３つの細菌門の相対量が著しく異なっていた。図１に示すように、Bacteriodetesは、ＣＯＮ群での６７．０％から、ＤＳＳ群では３４．６％に減少し、Ｄ−ＥＳＭ８群では５５．２％に回復した。 Firmicutesは、ＣＯＮ群での２６．５％から、ＤＳＳ群では１３．７％に減少し、Ｄ−ＥＳＭ８群では１８．６％に回復した。 Proteobacteriaは、ＣＯＮ群での０．９％から、ＤＳＳ群では４０．２％に増加し、Ｄ−ＥＳＭ８群では８．０％に回復した。
次に、α多様性、β多様性の２つの分類を評価した。α多様性解析により、ＤＳＳ群のマウスは３つの群のうちで細菌種の豊富さが最も低かった（図２）。
ヒトにおける炎症性腸疾患やマウスにおけるＤＳＳ誘発大腸炎を含む疾病状態に相関して、腸内の細菌種が減少することから、この結果は予想どおりであったが、意外なことに、卵殻膜摂取により細菌種の豊富さはＣＯＮ群と同程度にまで回復した。
【００３４】
図３の上段に示すように、腸炎のマーカーおよびヒト炎症性腸疾患とマウス大腸炎の酸化ストレスのマーカーである増加したEnterobacteriaceaeは、ＣＯＮ群と比べて炎症性のＤＳＳ群（Proteobacteria門が全細菌の３９％）で極めて頻繁に検出された。反対に、Enterobacteriaceaeは、Ｄ−ＥＳＭ８群（約６％）では極めてまれに検出された。同様に、ＤＳＳ投与によりEnterococcaceaeの数が増加したが、卵殻膜微粉末の補給によってほぼ通常レベルまで下げられた。
短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）のような腸内細菌の代謝産物は大腸細胞の第一エネルギー源であり、宿主の遺伝子発現に直接影響を及ぼすことが考えられるので、ＳＣＦＡ産生菌の存在を評価した（図３の下段）。炎症性腸疾患で減少することが分かっているRuminococcaceae科やPorphyromonadaceae科などのＳＣＦＡ産生菌がＤＳＳ群では減少していたが、卵殻膜摂取により、これらは改善した。
【００３５】
（５）まとめ
上記（４）の結果から、卵殻膜含有微粉末の摂取により、腸内細菌の多様性を増加させるだけでなく、大腸菌のような病原性細菌の絶対数を減少させ、セグメント化された糸状菌の異常繁殖を抑制することが示された。
このように、卵殻膜含有微粉末の摂取により、腸内菌共生バランス失調症、腸内毒素症を改善し、腸内フローラを改善することが示された。
【実施例２】
【００３６】
[卵殻膜含有微粉末および加水分解卵殻膜粉末のIII型コラーゲン生成促進機能]
卵殻膜８００メッシュ微粉末と加水分解卵殻膜粉末のそれぞれを、１日１回、１７日間マウスに経口摂取させて、サプリメント経口摂取実験を行った。加水分解卵殻膜粉末としてｐＨが３〜６である加水分解卵殻膜粉末（特許文献３）を用いた。
【００３７】
８週齢のヘアレスマウスに対して、加水分解卵殻膜粉末をMediGelに混合し、サプリメントとして１日１回、１７日間、動物の活動期に自主的に摂取させた。ヒト１日摂取量の１／２、１倍、２倍換算の量を与え（各々ｎ＝６）、また、卵殻膜８００メッシュ微粉末をヒト１日摂取量の１倍換算の量として同様に摂取させた（ｎ＝６）。対照として、サプリメントを与えないヘアレスマウスを用いた。１７日後のそれぞれのマウスの皮膚と肝臓におけるIII型コラーゲン遺伝子発現を定量的リアルタイムＰＣＲで調べた。
【００３８】
定量的リアルタイムＰＣＲ解析は、以下のように行った。
各マウスから背部皮膚および肝臓サンプルを採取し、液体窒素中で粉砕した。全皮膚組織または全肝臓組織のホモジナイス後、総ＲＮＡを単離し、商品名「Takara PrimeScript RT reagent kit」を用いてｃＤＮＡ合成を行った。リアルタイムＰＣＲ法は商品名「SYBR Premix Ex TaqTM II(Takara) on Thermal Cycler Dice Real Time System」(Takara)を用いて行った。プライマーとしてＣｏｌ３ａ１（III型コラーゲン）をコードする遺伝子の増幅用に設計されたプライマーを用いた。内部標準として、ハウスキーピング遺伝子であるグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ｍＲＮＡを同様に増幅した。ＰＣＲサイクルは、最初の変性を９５℃で３０秒、４０サイクル（９５℃で５秒の変性、６０℃で１分のアニーリングおよび伸長反応）行った。
【００３９】
皮膚におけるIII型コラーゲン遺伝子の発現量を図４に示す。
経口で加水分解卵殻膜粉末を摂取したマウスの背部皮膚において、III型コラーゲンをコードする遺伝子の発現が量依存的に上昇する（ｐ＝０．０８）ことが示された。経口で卵殻膜８００メッシュ微粉末を摂取したマウスよりも効果的に、III型コラーゲンをコードする遺伝子の発現を上昇させた。
【００４０】
肝臓における、加水分解卵殻膜粉末を摂取したマウスのIII型コラーゲン遺伝子の発現量については、サプリメントとしてヒトが摂取する１倍換算の量を与えたマウスでは、対照群と変化がなかったが、２倍換算量を与えた場合に、III型コラーゲン遺伝子の発現が有意（ｐ＝０．００７）に上昇した。肝臓におけるIII型コラーゲン遺伝子の発現の上昇により、肝臓線維化抑制および血管の環境改善効果が期待される。
【実施例３】
【００４１】
[錠剤の製造]
実施例２で使用した卵殻膜８００メッシュ微粉末を２０．０重量部、商品名「ワキシａ」（日食株式会社製）１０．０重量部、商品名「パインファイバー」（松谷化学株式会社製）２０．０重量部、乳糖（メグレ社製）２５．９重量部、卵殻カルシウム  商品名「カルホープ」（キユーピー株式会社製）１０．０重量部、β−カロチン５．０重量部、ビタミンＢ２  ０．０５重量部、ビタミンＥ０．０５重量部、およびナイアシン２．０重量部を、Ｖ型混合機を用いて混合することにより、原料混合物を調製した。この原料混合物９３重量部に対して、エチルアルコール１５重量部を混合し、得られた混合物を湿式造粒装置を用いて造粒してから、温度５０℃で約１６時間乾燥して、打錠用の顆粒を製造した。
【００４２】
打錠用の顆粒１００重量部に対して、ビタミンＣを９重量部およびショ糖脂肪酸エステルを１重量部の割合で混合し、得られた混合物を打錠装置を使用して、１粒が２００ｍｇの裸錠を製造した。裸錠の表面に、コーティング装置を使用して商品名「セラック」（岐阜セラック株式会社製）の水溶液を塗布し、温度４０℃で２時間乾燥して保護コーティングされた錠剤を得た。十分に乾燥させた保護コーティングされた錠剤の表面に、糖衣被覆装置を使用して、糖衣用ペーストＡ（グラニュー糖７０重量部、アラビアガム３重量部、ゼラチン４重量部、卵殻カルシウム３重量部および水６５重量部を混合したペースト）を被覆した後、温度４０℃で約４時間乾燥した。その後、糖衣用ペーストＡを水で希釈した糖衣用ペーストＢを糖衣被覆装置を使用して被覆した後、温度４０℃で４時間乾燥し、糖衣コーティング錠を得た。
【００４３】
糖衣コーティング錠の表面に、商品名「ＳＲレッドＫ３」（三栄源社製）を含む着色料を塗布した後、４０〜５０℃で乾燥して、赤色に着色した錠剤を製造し、その表面にカルナウバロウを用いて艶出しを行った。これにより得られた錠剤１個の重量は４００ｍｇであり、錠剤１個当たり卵殻膜微粉末を約４０ｍｇの割合で含有していた。艶出し処理を行った錠剤を選別して不良品を除き、製品検査後に計量し、乾燥剤を同封した二重袋で包装した。錠剤は十分な硬度および形状保形性を有しており、選別、検査、包装時に変形したり、崩壊するとはなく、取扱性に優れていた。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明によれば、刺激性がなく、様々な形態で種々の成分と併用することができる、卵殻膜含有粉末または微粉末を含む腸内フローラ改善剤を提供することができる。この製剤は、食品添加物、飲食品、サプリメント、医薬品等の様々な用途、形態で利用することができ、日常的に簡単に摂取することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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