(57)【要約】【課題】濃縮などの前処理を行うことなく、簡便な操作で高感度で微生物等の検出対象の検出を行うことができるマイクロ流体チップ等を提供する。【解決手段】各々の容量が２．２（ａＬ）以上１０００（ｆＬ）以下であり、多段に配置された第１マイクロチャンバ１０ａ及び第２マイクロチャンバ１０ｂを備えるマイクロ流体チップ１であり、第１マイクロチャンバ１０ａ及び第２マイクロチャンバ１０ｂは、平面視において重なり合っている。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
各々の容量が２．２（ａＬ）以上１０００（ｆＬ）以下であり、多段に配置された第１マイクロチャンバ及び第２マイクロチャンバを備え、
前記第１マイクロチャンバ及び前記第２マイクロチャンバは、平面視において重なり合っている、
マイクロ流体チップ。
【請求項２】
前記第１マイクロチャンバ及び前記第２マイクロチャンバの各々は、水平方向に複数配置されており、
水平方向に隣り合う前記第１マイクロチャンバの間及び水平方向に隣り合う前記第２マイクロチャンバの間には、励起光を吸収する樹脂部が形成されている、
請求項１記載のマイクロ流体チップ。
【請求項３】
前記第１マイクロチャンバ及び前記第２マイクロチャンバの各々は、水平方向に複数配置されており、
水平方向に隣り合う前記第１マイクロチャンバの間及び水平方向に隣り合う前記第２マイクロチャンバの間には、蛍光を吸収する樹脂部が形成されている、
請求項１に記載のマイクロ流体チップ。
【請求項４】
前記第１マイクロチャンバと前記第２マイクロチャンバとは、流路によって連通している、
請求項１〜３のいずれか１項に記載のマイクロ流体チップ。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のマイクロ流体チップと、
微生物を含む検液が導入された前記マイクロ流体チップに特定波長の励起光を照射するための光源部と、
前記マイクロ流体チップに導入された検液に含まれる微生物の蛍光を受光する受光部と、
前記受光部で受光した蛍光の光量を検出する検出部とを備える、
微生物検出装置。
【請求項６】
各々の容量が２．２（ａＬ）以上１０００（ｆＬ）以下であり、多段に配置され、かつ、平面視において重なり合うように配置された第１マイクロチャンバ及び第２マイクロチャンバを備えるマイクロ流体チップを用いた微生物検出方法であって、
前記マイクロ流体チップに親水性の検液を導入した後、疎水性の封止材を導入し、その後、前記マイクロ流体チップに励起光を照射する、
微生物検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロ流体チップ、微生物検出装置及び微生物検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
食品工場又は医療施設などでは、衛生的な環境であることを確認するために、細菌やウイルスの存在を検出するための検査が行われている。このため、従来から、細菌やウイルスなどの微生物を検出する様々な方法が提案されている。
【０００３】
このような微生物を検出する方法としては、主に培養法が用いられている。培養法は、微生物の増幅を利用したものであり、活動を行っている細菌等を高感度に検出することができる方法である。しかし、培養法は、微生物を培養するのに時間がかかったり、専門的な装置や技術が必要になったりする。
【０００４】
微生物を検出するその他の方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）を用いた核酸増幅法も知られている。核酸増幅法は、培養法と比べて大幅に検査工程を高速化及び簡略化することができるという利点があるが、核酸増幅法でも専門的な装置や技術が必要になる。
【０００５】
その他にも、微生物のエネルギー物質であるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ：ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｓｐｈａｔｅ）を用いて微生物を検査する方法が知られている。この方法は、数十秒（例えば３０秒程度）と高速に検査を行うことができるものの、ＡＴＰはエネルギー物質であることから、微生物と汚れとを区別することが難しい。つまり、ＡＴＰを抽出したとしても、それが微生物に由来するものであるのか、汚れに由来するものであるのかを区別することが難しい。
【０００６】
ところで、フェムトリットルのマイクロチャンバを用いて生体物質やウイルス粒子などを検出する方法が提案されている（例えば、特許文献１、２）。この方法は、非常に低容量の検液で検査を行うので、検出対象を含む検液が少量であっても高感度で検出対象の検出を行うことができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００４−３０９４０５号公報
【特許文献２】国際公開第２０１２／１２１３１０号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
特許文献１、２に開示された従来の方法では、検出対象となる微生物を高感度で検出するために、容量がフェムトリットルのマイクロチャンバを用いており、その分検出に用いる検液量が少なくなる。このため、適切な感度で検査を行うために、事前に検液を濃縮するといった前処理が必要になる。検査前に濃縮などの前処理を行うと、検査全体として時間を要するだけではなく、濃縮にはビーズや遠心分離器などの装置が必要になる。このような装置を操作するには、熟練が必要であったり多くの工程や器具が必要になったりする。
【０００９】
本発明は、このような問題を解決するためになされたものであり、濃縮などの前処理を行うことなく、簡便な操作により高感度で微生物等の検出対象の検出を行うことができるマイクロ流体チップ、微生物検出装置及び微生物検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的を達成するために、本発明に係るマイクロ流体チップの一態様は、各々の容量が２．２（ａＬ）以上１０００（ｆＬ）以下であり、多段に配置された第１マイクロチャンバ及び第２マイクロチャンバを備え、前記第１マイクロチャンバ及び前記第２マイクロチャンバは、平面視において重なり合っている。
【００１１】
また、本発明に係る微生物検出装置の一態様は、上記のマイクロ流体チップと、微生物を含む検液が導入された前記マイクロ流体チップに特定波長の励起光を照射するための光源部と、前記マイクロ流体チップに導入された検液に含まれる微生物の蛍光を受光する受光部と、前記受光部で受光した蛍光の光量を検出する検出部とを備える。
【００１２】
また、本発明に係る微生物検出方法の一態様は、各々の容量が２．２（ａＬ）以上１０００（ｆＬ）以下であり、多段に配置され、かつ、平面視において重なり合うように配置された第１マイクロチャンバ及び第２マイクロチャンバを備えるマイクロ流体チップを用いた微生物検出方法であって、前記マイクロ流体チップに親水性の検液を導入した後、疎水性の封止材を導入し、その後、前記マイクロ流体チップに励起光を照射する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、濃縮などの前処理を行うことなく、簡便な操作により高感度で微生物等の検出対象の検出を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】実施の形態１に係るマイクロ流体チップを模式的に示す平面図である。
【図２】図１のII−II線におけるマイクロ流体チップの部分拡大断面図である。
【図３】実施の形態１に係る微生物検出方法において、マイクロ流体チップに検体を充填させたときの様子を示す図である。
【図４】実施の形態１に係る微生物検出方法において、マイクロ流体チップに封止材を導入するときの様子を示す図である。
【図５】実施の形態１に係る微生物検出方法において、マイクロ流体チップに検体を充填させたときの様子を示す図である。
【図６】実施の形態１に係る微生物検出方法において、マイクロ流体チップに励起光を照射して蛍光を受光するときの様子を示す図である。
【図７】実施の形態１に係る微生物検出装置の構成を模式的に示す図である。
【図８】実施の形態１に係る微生物検出方法における測定結果のイメージ図である。
【図９】実施の形態１に係る微生物検出方法における測定結果のイメージ図である。
【図１０】実施の形態２に係るマイクロ流体チップの部分拡大断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の実施の形態について、図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施の形態は、いずれも本発明の好ましい一具体例を示すものである。したがって、以下の実施の形態で示される、数値、形状、材料、構成要素、構成要素の配置位置及び接続形態、並びに、ステップ及びステップの順序などは、一例であって本発明を限定する主旨ではない。よって、以下の実施の形態における構成要素のうち、本発明の最上位概念を示す独立請求項に記載されていない構成要素については、任意の構成要素として説明される。
【００１６】
なお、各図は、模式図であり、必ずしも厳密に図示されたものではない。また、各図において、実質的に同一の構成に対しては同一の符号を付しており、重複する説明は省略又は簡略化する。
【００１７】
（実施の形態１）
［マイクロ流体チップ］
まず、実施の形態に係るマイクロ流体チップ１について、図１及び図２を用いて説明する。図１は、実施の形態１に係るマイクロ流体チップ１を模式的に示す平面図である。図２は、図１のII−II線における同マイクロ流体チップ１の部分拡大断面図である。
【００１８】
マイクロ流体チップ１は、検液（検体原液）に含まれる検出対象（検査対象）を検出するために用いられるデバイスである。検出対象は、例えば、細菌、ウイルス又は組織細胞などである。
【００１９】
図１及び図２に示すように、マイクロ流体チップ１は、各々の容量が２．２（ａＬ：アトリットル）以上１０００（ｆＬ：フェムトリットル）以下の複数のマイクロチャンバ１０（チャンバ部）を有する。各マイクロチャンバ１０は、検液が閉じ込められるキャビティである。
【００２０】
各マイクロチャンバ１０の形状は任意であるが、検液に含まれる微生物（検出対象）が内部に閉じ込めることができる程度の大きさが必要である。一例として、各マイクロチャンバ１０の内部空間領域の形状は、直径が５μｍで高さが４μｍの円柱状である。なお、本実施の形態において、マイクロ流体チップ１に形成された複数のマイクロチャンバ１０は、全て同じ形状及び大きさである。
【００２１】
また、各マイクロチャンバ１０の表面は、親水性であるとよい。マイクロチャンバ１０の表面を親水性にすることで、気泡が混濁することなく検液をマイクロチャンバ１０内に容易に閉じ込めることができる。なお、マイクロチャンバ１０の表面を親水性にする方法としては、例えば、マイクロチャンバ１０の表面に対してＵＶオゾン等を用いた親水処理等の表面処理がある。
【００２２】
本実施の形態におけるマイクロ流体チップ１は、マイクロチャンバ１０が積層された構成となっており、一層目に配置された第１マイクロチャンバ１０ａと、二層目に配置された第２マイクロチャンバ１０ｂと、三層目に配置された第３マイクロチャンバ１０ｃとを有する。つまり、第１マイクロチャンバ１０ａ、第２マイクロチャンバ１０ｂ及び第３マイクロチャンバ１０ｃは、互いに多段に配置されている。
【００２３】
また、一層目の第１マイクロチャンバ１０ａと、二層目の第２マイクロチャンバ１０ｂと、三層目の第３マイクロチャンバ１０ｃとは、平面視において重なり合っている。本実施の形態では、第１マイクロチャンバ１０ａと、第２マイクロチャンバ１０ｂ及び第３マイクロチャンバ１０ｃは、平面視したときの形状及び大きさが同じであるので、平面視した場合に開口の輪郭線が丁度一致するように重なっている。
【００２４】
図２に示すように、第１マイクロチャンバ１０ａ、第２マイクロチャンバ１０ｂ及び第３マイクロチャンバ１０ｃの各々は、水平方向に複数配置されている。つまり、第１マイクロチャンバ１０ａ、第２マイクロチャンバ１０ｂ及び第３マイクロチャンバ１０ｃの各々は、各層において複数形成されている。また、図１に示すように、本実施の形態において、第１マイクロチャンバ１０ａ、第２マイクロチャンバ１０ｂ及び第３マイクロチャンバ１０ｃの各々は、二次元的にアレイ状に複数配置されており、水平方向の一方向だけではなく、この水平方向に直交する他の水平方向にも複数配置されている。
【００２５】
なお、図１に示すように、本実施の形態では、第１マイクロチャンバ１０ａ、第２マイクロチャンバ１０ｂ及び第３マイクロチャンバ１０ｃの各々は、高密度化（省スペース化）のために、平面視した場合に千鳥状に配列されているが、これに限るものではなく、例えばマトリクス状等の任意の二次元配列にすることができる。
【００２６】
図２に示すように、各マイクロチャンバ１０は隔壁２０によって区画されている。つまり、マイクロチャンバ１０は隔壁２０の開口部であり、各層において水平方向に隣り合う２つのマイクロチャンバ１０の間には隔壁２０が存在している。
【００２７】
具体的には、一層目の第１マイクロチャンバ１０ａは、一層目に形成された第１隔壁２０ａによって複数に区画されている。つまり、水平方向に隣り合う２つの第１マイクロチャンバ１０ａの間には、第１隔壁２０ａが形成されている。
【００２８】
また、二層目の第２マイクロチャンバ１０ｂは、二層目に形成された第２隔壁２０ｂによって複数に区画されている。つまり、水平方向に隣り合う２つの第２マイクロチャンバ１０ｂの間には、第２隔壁２０ｂが形成されている。
【００２９】
また、三層目の第３マイクロチャンバ１０ｃは、三層目に形成された第３隔壁２０ｃによって複数に区画されている。つまり、水平方向に隣り合う２つの第３マイクロチャンバ１０ｃの間には、第３隔壁２０ｃが形成されている。
【００３０】
本実施の形態において、隔壁２０（第１隔壁２０ａ、第２隔壁２０ｂ及び第３隔壁２０ｃ）は、樹脂材料からなる樹脂部である。隔壁２０を構成する樹脂材料は、自家蛍光性が低くて透明度が高く、また、加工性の良い高分子材料であるとよい。このような樹脂材料としては、例えば、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）、ＣＯＰ（シクロオレフィンポリマー）、アモルファスフッ素樹脂（例えば旭硝子株式会社製の「サイトップ」）などが挙げられる。なお、樹脂材料をパターニングして所定形状の隔壁２０に形成することによって所定形状のマイクロチャンバ１０を形成することができる。具体的には、隔壁２０に開口部を形成することによってマイクロチャンバ１０を形成することができる。したがって、隔壁２０の形状を調整することによって、各マイクロチャンバ１０の形状、すなわち各マイクロチャンバ１０の容積を調整することができる。
【００３１】
また、隔壁２０は、所定の機能を有する材料、例えば所定の波長の光を吸収する材料を含んでいてもよい。
【００３２】
例えば、隔壁２０は、検液に含まれる微生物を検出する際にマイクロ流体チップ１に照射する励起光を吸収する材料を含んでいるとよい。具体的には、励起光が波長３６６ｎｍの紫外線である場合、隔壁２０に、励起光を吸収する材料として紫外線吸収剤（例えば、株式会社ＡＤＥKＡ製のアデカスタブＬＡシリーズのＬＡ−Ｆ７０）を混ぜるとよい。
【００３３】
また、隔壁２０を構成する樹脂材料は、検液に含まれる微生物を検出する際にマイクロ流体チップ１に照射する励起光によって微生物から発する蛍光を吸収する材料を含んでいてもよい。例えば、波長３６６ｎｍの励起光により微生物が波長４５２ｎｍの蛍光を発する場合、隔壁２０に、蛍光を吸収する材料として可視光吸収剤（例えば、山田化学工業株式会社製のＦＤＢ−００５）を混ぜるとよい。
【００３４】
なお、隔壁２０には、紫外線吸収剤及び可視光吸収剤の両方を含んでいてもよい。また、第１隔壁２０ａ、第２隔壁２０ｂ及び第３隔壁２０ｃの各々は、各層において、一体的に形成された一体物でもよいが、複数の部材の集合物であってもよい。また、隔壁２０を構成する材料は、樹脂材料に限るものではなく、マイクロチャンバ１０（開口部）を形成することができる材料であれば、任意の材料を用いることができる。
【００３５】
また、各層における複数のマイクロチャンバ１０は、各層の隔壁２０で区画されているが、各層に形成された流路３０によって空間的に互いに繋がっている。具体的には、一層目に存在する全ての第１マイクロチャンバ１０ａは、第１流路３０ａによって繋がっている。また、二層目に存在する全ての第２マイクロチャンバ１０ｂは、第２流路３０ｂによって繋がっている。また、三層目に存在する全ての第３マイクロチャンバ１０ｃは、第３流路３０ｃによって繋がっている。
【００３６】
各層における流路３０（第１流路３０ａ、第２流路３０ｂ、第３流路３０ｃ）は、各層における複数のマイクロチャンバ１０の上方を連通するように水平方向に広がるように形成されている。
【００３７】
本実施の形態において、各層における流路３０は、水平方向の両端の各々で互いに繋がっている。つまり、第１流路３０ａ、第２流路３０ｂ及び第３流路３０ｃは、水平方向の両端の各々で互いに空間的に繋がっている。
【００３８】
また、マイクロ流体チップ１は、第１基板４１と、第２基板４２と、第３基板４３と、第４基板４４とを備える。マイクロ流体チップ１は、第１基板４１と第２基板４２と第３基板４３とによって外郭（筐体）が構成されており、その内部に第４基板４４が配置された構造となっている。
【００３９】
第１基板４１、第２基板４２、第３基板４３及び第４基板４４としては、検液に含まれる微生物を検出する際にマイクロ流体チップ１に照射する励起光に対する吸収が限り無く小さくかつ透明度の高い基板を用いるとよく、例えば、石英ガラス又は珪酸ガラスなどのガラス基板を用いることができる。なお、第１基板４１、第２基板４２、第３基板４３及び第４基板４４の材料は、ガラス材料に限るものではなく、必要とされる特性を持つものであれば、樹脂材料等、ガラス以外の材料であってもよい。また、第１基板４１、第２基板４２、第３基板４３及び第４基板４４を構成する材料に、所定の機能を有する材料、例えば所定の波長の光を吸収する材料を混ぜてもよい。
【００４０】
第１基板４１は、マイクロ流体チップ１の上板（蓋板）を構成する上面部材の一例である。第１基板４１には、マイクロ流体チップ１に液体を導入するための液導入部５１が形成されている。
【００４１】
液導入部５１は、流路３０（第１流路３０ａ、第２流路３０ｂ、第３流路３０ｃ）と連通している。したがって、液導入部５１から導入された液体は、流路３０に流入する。液導入部５１には、例えば、微生物（検出対象）を含む検液及びマイクロチャンバ１０を封止するための封止液が導入される。
【００４２】
液導入部５１は、例えば直径が６μｍ〜３．５ｍｍ程度の円形の貫通孔（液導入口）である。液導入部５１の開口の形状や大きさは、マイクロ流体チップ１に液体を導入するためのマイクロピペット又はスポイトの外形に対応したものであればよい。
【００４３】
第２基板４２は、マイクロ流体チップ１の下板（底板）を構成する下面部材の一例である。第２基板４２には、マイクロ流体チップ１に導入した液体を排出するための液排出部５２が形成されている。
【００４４】
液排出部５２は、流路３０（第１流路３０ａ、第２流路３０ｂ、第３流路３０ｃ）と連通している。したがって、マイクロ流体チップ１に導入された液体は、流路３０を通って液排出部５２からマイクロ流体チップ１の外部に排出される。
【００４５】
液排出部５２は、例えば直径が６μｍ〜３．５ｍｍ程度の円形の貫通孔（液排出口）である。液排出部５２の形状及び大きさは、液導入部５１と同じであってもよいし、異なっていてもよい。
【００４６】
また、本実施の形態において、第２基板４２には、第１マイクロチャンバ１０ａ及び第１隔壁２０ａが形成されている。つまり、マイクロ流体チップ１の一層目は、第１基板４１、第１マイクロチャンバ１０ａ及び第１隔壁２０ａによって構成されている。
【００４７】
第３基板４３は、マイクロ流体チップ１の側板を構成する側面部材の一例である。本実施の形態では、４つの第３基板４３が用いられている。４つの第３基板４３は、額縁状となるように組み合わされ、かつ各々が第１基板４１と第２基板４２との間に縦置きで配置される。つまり、各第３基板４３は、第１基板４１及び第２基板４２の各々と垂直となる状態で、第１基板４１と第２基板４２との間に配置されている。
【００４８】
また、第３基板４３は、マイクロ流体チップ１の外面を構成するだけではなく、第１基板４１と第２基板４２との間に所定の空間を形成するためのスペーサとしても機能する。第１基板４１と第２基板４２との間の距離（第３基板４３の幅）は、例えば１０μｍ〜２００μｍである。
【００４９】
第４基板４４は、マイクロ流体チップ１の中板を構成し、第１基板４１と第２基板４２との間に横置きで配置される。つまり、第４基板４４は、第１基板４１及び第２基板４２と平行となる状態で、第１基板４１と第２基板４２との間に配置されている。本実施の形態では、２つの第４基板４４が配置されている。
【００５０】
第４基板４４には、二層目以上のマイクロチャンバ１０及び隔壁２０が形成される。つまり、マイクロチャンバ１０が形成された隔壁２０と第４基板４４とは中間部材を構成している。本実施の形態では、２つの第４基板４４が積層して配置されており、下側の第４基板４４には、二層目の第２隔壁２０ｂが形成され、上側の第４基板４４には三層目の第３隔壁２０ｃが形成されている。このように、マイクロ流体チップ１の二層目は、第４基板４４、第２マイクロチャンバ１０ｂ及び第２隔壁２０ｂによって構成され、マイクロ流体チップ１の三層目は、第４基板４４、第３マイクロチャンバ１０ｃ及び第３隔壁２０ｃによって構成されている。
【００５１】
なお、第４基板４４及び隔壁２０からなる中間部材は、フォトリソグラフィー又はナノインプリントなどで作製することができるし、射出成形によって形成した隔壁２０を第４基板４４に貼り合わせることでも作製することができる。また、マイクロ流体チップ１全体が樹脂材料によって構成されている場合は、マイクロ流体チップ１全体を射出成形によって作製してもよい。
【００５２】
［微生物検出方法］
次に、マイクロ流体チップ１を用いた微生物検出方法について、図３〜図６を用いて説明する。図３〜図６は、実施の形態１に係る微生物検出方法を説明するための図である。
【００５３】
まず、図３に示すように、微生物等の検出対象１０１が含まれる検液１００をマイクロ流体チップ１に導入する。具体的には、マイクロピペット又はスポイト等を用いて、蛍光を示す検出対象１０１と検出対象が含む酵素の基質が含まれる検液１００を液導入部５１からマイクロ流体チップ１の内部に注入する。この時は検出対象と基質が混合された時から反応が始まり、時間が経過するとバックグラウンドノイズが上昇する原因となる。そのため、調整後はすみやかに次の操作に映ることが好ましい。本実施の形態において、検液１００は、水性である。
【００５４】
液導入部５１から注入された検液１００は、液排出部５２に向かって流路３０（第１流路３０ａ、第２流路３０ｂ、第３流路３０ｃ）内を送液する。これにより、マイクロ流体チップ１の内部空間全体が検液１００によって満たされる。つまり、検液１００が流路３０を送液することで、流路３０に繋がっている各層のマイクロチャンバ１０の内部が検液１００で満たされる。このとき、図３に示すように、いくつかのマイクロチャンバ１０には、検液１００に含まれる検出対象１０１が捕捉される。
【００５５】
次に、図４に示すように、液状の封止材２００（封止液）をマイクロ流体チップ１に導入する。具体的には、マイクロ流体チップ１に検液１００を導入した後、マイクロピペット又はスポイト等を用いて、封止オイル等の封止材２００を液導入部５１からマイクロ流体チップ１の内部に注入する。本実施の形態において、封止材２００は、疎水性である。
【００５６】
液導入部５１から注入された封止材２００は、液排出部５２に向かって流路３０（第１流路３０ａ、第２流路３０ｂ、第３流路３０ｃ）内を送液する。このとき、封止材２００が流路３０を送液することで、流路３０に存在する検液１００が封止材２００に置き換わる。これにより、図５に示すように、各マイクロチャンバ１０は封止材２００で封止される。つまり、マイクロ流体チップ１内のマイクロチャンバ１０のみに検液１００が封入されて反応部（チャンバ部）が形成される。なお、余剰の検液１００及び封止材２００は、液排出部５２からマイクロ流体チップ１の外部に排出される。
【００５７】
このようにして形成された反応部は、マイクロチャンバ１０ごとに独立して封止される。つまり、各マイクロチャンバ１０の内部の検液１００が他のマイクロチャンバ１０に流出したり、各マイクロチャンバ１０の内部に他のマイクロチャンバ１０から検液１００が流入したりすることはない。
【００５８】
このようにマイクロチャンバ１０内に検液１００が残留するのは、マイクロチャンバ１０を構成する部材の表面張力、及び、封止材２００と検液１００の比重の違いによるためである。
【００５９】
次に、封止材２００を導入した後は、図６に示すように、光源部２によってマイクロ流体チップ１に特定波長の励起光を照射する。このとき、検出対象１０１は励起光によって励起されて蛍光を発すること。したがって、検出対象１０１が捕捉されたマイクロチャンバ１０のみが蛍光発光することになる。この蛍光を受光部３で受光することで、マイクロ流体チップ１に存在する検出対象１０１を検出することができる。
【００６０】
マイクロ流体チップ１に存在する検出対象１０１は、例えば、図７に示す微生物検出装置３００を用いて検出することができる。
【００６１】
図７に示すように、微生物検出装置３００は、マイクロ流体チップ１と、光源部２と、受光部３と、検出部４とを備える。
【００６２】
光源部２は、検出対象１０１（微生物）を含む検液が導入されたマイクロ流体チップ１に特定波長の励起光を照射するための励起光源を有する。光源部２の励起光源は、例えば、ＬＥＤ、レーザダイオード（ＬＤ）又は各種ランプである。励起光の波長については、検出対象１０１に応じて適時変更可能である。
【００６３】
受光部３は、マイクロ流体チップに導入された検液に含まれる検出対象１０１（微生物）の蛍光を受光する。受光部３は、イメージセンサ等の受光素子である。受光部３としてイメージセンサを用いることにより、マイクロ流体チップ１の各マイクロチャンバ１０から発生する蛍光を可視化して、蛍光を示すマイクロチャンバ１０の個数を容易にカウントすることができる。
【００６４】
検出部４は、受光部３で受光した蛍光の蛍光量（強度）を検出する。検出部４は、ＣＰＵ等の演算装置である。受光部３で受光した蛍光の蛍光量をもとに検出部４で演算することによって、マイクロ流体チップ１における検出対象１０１の濃度を検出することができる。
【００６５】
また、微生物検出装置３００は、光学系として、さらに、光源部２から出射する励起光を集光又はコリメートするレンズ５と、光源部２から出射した励起光を反射しかつマイクロ流体チップ１からの蛍光を透過するダイクロイックミラー６と、光源部２から出射する励起光及びマイクロ流体チップ１からの蛍光以外の波長の光を除去するフィルタ７と、マイクロ流体チップ１からの蛍光を受光部３に集光するレンズ８とを備える。
【００６６】
このように構成される微生物検出装置３００では、光源部２から出射した励起光は、レンズ５で平行化され、ダイクロイックミラー６で反射してフィルタ７を通ってマイクロ流体チップ１に入射する。
【００６７】
マイクロ流体チップ１では、マイクロチャンバ１０に捕捉された検出対象１０１が励起光によって励起されて蛍光発光する。マイクロ流体チップ１からの蛍光は、ダイクロイックミラー６を透過してレンズ８で集光されて受光部３に入射する。受光部３で受光された蛍光は電気信号に変換されて検出部４に伝送される。
【００６８】
ここで、マイクロ流体チップ１のマイクロチャンバ１０に捕捉された検出対象１０１の具体的な検出方法について、図６を参照して説明する。
【００６９】
本実施の形態では、各マイクロチャンバ１０の検液量が一定で同じであるため、マイクロチャンバ１０の個数からマイクロ流体チップ１全体の検液量（全検液量）を計算することができ、蛍光を示すマイクロチャンバ１０の個数と全検液量とから検出対象１０１の濃度を算出することができる。
【００７０】
そして、図６に示すように、本実施の形態におけるマイクロ流体チップ１では、マイクロチャンバ１０が積層されて多段になっているので、積層方向（鉛直方向）のマイクロチャンバ１０の列に含まれる検出対象１０１の個数に応じた蛍光量が受光部３で受光される。
【００７１】
具体的には、図８に示すように、ある位置における積層方向のマイクロチャンバ１０の列に１つの検出対象１０１が含まれている場合、１つ分の検出対象１０１の蛍光を示す強度（蛍光量）が受光部で受光される。また、別の位置における積層方向のマイクロチャンバ１０の列に２つの検出対象１０１が含まれている場合、２つ分の検出対象１０１の蛍光を示す強度（蛍光量）が受光部で受光される。つまり、受光部３で受光する蛍光量に応じて、積層方向の列ごとに検出対象１０１が含まれるマイクロチャンバ１０の個数を測定することができる。
【００７２】
このため、図９に示すように、受光部３で受光した蛍光量から判定できる積層方向に含まれる検出対象１０１の個数と、平面視でのマイクロチャンバ１０の個数とを積算することで、マイクロ流体チップ１に投入した全検液に含まれる検出対象１０１の濃度を算出することができる。
【００７３】
なお、図８及び図９は、測定結果のイメージを示している。図８において、横軸は、マイクロ流体チップ１を平面視したときに水平方向に並んだマイクロチャンバ１０の位置を示している。また、図８において、縦軸は、各マイクロチャンバ１０の位置で受光された蛍光の強度を示しており、「１」は、１つ分の検出対象１０１の蛍光の強度を、「２」は、２つ分の検出対象１０１の蛍光の強度を表している。
【００７４】
また、図９において、横軸は、積層方向に含まれる検出対象１０１の蛍光の強度（つまり、検出対象１０１の個数）を示しており、例えば、Ｉ１は、１つ分の検出対象１０１の蛍光の強度（検出対象１０１が１個）を、Ｉ２は、２つ分の検出対象１０１の蛍光の強度（検出対象１０１が２個）を、Ｉ３は、３つ分の検出対象１０１の蛍光の強度（検出対象１０１が３個）を示している。また、図９において、縦軸は、各蛍光の強度ごとのマイクロチャンバ１０の個数を示している。したがって、マイクロ流体チップ１に投入した全検液に含まれる検出対象１０１の全数Ｎは、Ｎ＝ｎ１×Ｉ１＋ｎ２×Ｉ２＋ｎ３×Ｉ３・・・の数式で算出することができる。
【００７５】
［実験例］
以下、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）を検出対象として検出したときの実験例について説明する。
【００７６】
本実験例では、大腸菌が１０００００ＣＦＵ／ｍｌとなるように調整した検液を用いて、以下の３つの検出方法によって大腸菌を検出し、比較した。
【００７７】
検出方法１：本実施の形態におけるマイクロ流体チップ１を用いて、以下の要領にて上記検出方法で行った。
【００７８】
検出方法２：培養法（ペトリフィルム培地  大腸菌測定用ＳＥＣプレート（３Ｍジャパン株式会社製））。説明書に記載されている方法で行った（希釈は行った）。
【００７９】
検出方法３：特定酵素基質法（ＩＤＥＸＸ  Ｃｏｌｉｌｅｒｔ  検査キット（ＩＤＥＸＸ社製）。説明書に記載されている方法で行った。
【００８０】
検出方法１では、酵素基質ＭＵＧ（４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−グルクロニド）が大腸菌に存在する酵素β−グルクロニダーゼにより、紫外線により蛍光を示す４−メチルウンベリフェロンに分解される反応を用いた。
【００８１】
５ｍｌの検体を５ｍｌの試薬ＭＵＧ（３．０×１０−４ｍｏｌ／Ｌ）と反応させて１０ｍｌの検液１００を調整した。
【００８２】
この検液１００を１０秒以内にマイクロ流体チップ１の液導入部５１から導入し、さらに封止材２００としてフッ素系不活性液体（フロリナートｆｃ−４０（３Ｍジャパン株式会社製））を導入し、マイクロチャンバ１０に検液１００を封止した。
【００８３】
なお、マイクロ流体チップ１におけるマイクロチャンバ１０は各層５０００００個ずつの４層構造（マイクロチャンバ１０の総数は２００００００個）とし、各マイクロチャンバ１０のサイズはφ６μｍ×高さ５μｍとした。したがって、検液１００をマイクロチャンバ１０に封止した後の全体としての検液量は約２８３ｎｌである。また、封止材２００でマイクロチャンバ１０に検液１００を封止した後、反応が安定するまで３分間静置させた。
【００８４】
その後、微生物検出装置３００を用いて、光源部２によって波長３６６ｎｍの紫外線を励起光としてマイクロ流体チップ１を照射し、マイクロ流体チップ１からの蛍光（約４５０ｎｍ付近）を受光部３で受光し、検出部４にて大腸菌の濃度を算出した。
【００８５】
具体的には、積層方向に１つ分のマイクロチャンバ１０の蛍光を示す強度の点が３０個、積層方向に２つ分のマイクロチャンバ１０の蛍光を示す強度の点が２個、算出された。これにより、マイクロチャンバ１０の蛍光を示す点が３４箇所存在していたことが分かる。つまり、検出対象１０１である大腸菌を含むマイクロチャンバ１０の個数は３４個であった。この結果に基づいて大腸菌の濃度を算出したところ、検出方法１では、大腸菌の濃度が１２００００ＣＦＵ／ｍｌであった。
【００８６】
一方、検出方法２で検出したところ、大腸菌の濃度が９００００ＣＦＵ／ｍｌであった。
【００８７】
また、検出方法３で検出したところ、蛍光が見られ、大腸菌が存在することは確認できた。
【００８８】
このように、検出方法１、２では、大腸菌の濃度（菌数）を測定することができたが、検出方法３では、大腸菌の有無のみしか確認することができなかった。
【００８９】
また、検出方法２、３では、２４時間の測定時間が必要であったのに対して、検出方法１では、５分程度で測定を行うことができた。さらに、検出方法２、３では培養のために恒温槽が必要であったのに対して、検出方法１では、そのような特別な器具は不要であった。
【００９０】
検出方法１において大腸菌の濃度が検出方法２よりも大きくなったのは、検出方法２では検出不可能な増殖能を持たない大腸菌も検出したためであると考えられる。
【００９１】
［まとめ］
以上、本実施の形態におけるマイクロ流体チップ１によれば、各々の容量が２．２（ａＬ）以上１０００（ｆＬ）以下であり、多段に配置された第１マイクロチャンバ１０ａ及び第２マイクロチャンバ１０ｂを備え、第１マイクロチャンバ１０ａ及び第２マイクロチャンバ１０ｂは、平面視において重なり合っている。
【００９２】
このように、マイクロ流体チップ１の中にマイクロチャンバ１０を積層することで、平面視における単位面積あたりのマイクロチャンバ１０の個数を多くすることができる。これにより、マイクロチャンバ１０が一層のみのものと比べてマイクロ流体チップ１内の検液量を増やすことができる。したがって、濃縮などの前処理を行うことなく、簡便な操作により高感度で微生物等の検出対象１０１の検出を行うことができる。
【００９３】
また、本実施の形態におけるマイクロ流体チップ１において、第１マイクロチャンバ１０ａ及び第２マイクロチャンバ１０ｂの各々は、水平方向に複数配置されており、水平方向に隣り合う第１マイクロチャンバ１０ａの間及び水平方向に隣り合う第２マイクロチャンバ１０ｂの間には、励起光を吸収する樹脂部として隔壁２０が形成されている。
【００９４】
これにより、マイクロチャンバ１０の積層方向に対して斜め方向に入射する励起光を樹脂部（隔壁２０）で遮光することができる。したがって、検出対象１０１に入射する励起光の強度を均一にすることができるので、低ノイズで検出対象１０１を検出することができる。
【００９５】
また、本実施の形態におけるマイクロ流体チップ１において、第１マイクロチャンバ１０ａ及び第２マイクロチャンバ１０ｂの各々は、水平方向に複数配置されており、水平方向に隣り合う第１マイクロチャンバ１０ａの間及び水平方向に隣り合う第２マイクロチャンバ１０ｂの間には、蛍光を吸収する樹脂部として隔壁２０が形成されている。
【００９６】
これにより、マイクロチャンバ１０から当該マイクロチャンバ１０の積層方向に対して斜め方向に向かって出射する蛍光を樹脂部（隔壁２０）で遮光することができる。したがって、検出対象１０１からの蛍光を各マイクロチャンバ１０ごとに精度よく分離することができるので、低ノイズで検出対象１０１を検出することができる。
【００９７】
また、本実施の形態におけるマイクロ流体チップ１において、第１マイクロチャンバ１０ａと第２マイクロチャンバ１０ｂとは、流路３０によって連通している。具体的には、全てのマイクロチャンバ１０が流路３０によって連通している。
【００９８】
これにより、検液１００の導入を一括に行うことができるので、複数回に分けて検液１００を導入する必要がなくなる。このため、さらに簡便な操作で検出対象１０１を検出することができる。
【００９９】
また、本実施の形態における微生物検出装置３００は、マイクロ流体チップ１と、検出対象１０１（微生物）が導入されたマイクロ流体チップ１に特定波長の励起光を照射するための光源部２と、マイクロ流体チップ１に導入された検出対象１０１の蛍光を受光する受光部３と、受光部３で受光した蛍光の光量を検出する検出部４とを備える。
【０１００】
これにより、簡便な操作により高感度で検出対象１０１の検出を行うことができる。
【０１０１】
また、本実施の形態における微生物検出装置３００では、レンズ５等の光学系を用いているので、検出系の焦点を積層されたマイクロチャンバ１０に合わせることができる。これにより、低ノイズでの測定が可能となる。
【０１０２】
また、本実施の形態における微生物検出方法は、マイクロ流体チップ１を用いた方法であって、マイクロ流体チップ１に親水性の検液１００を導入した後、疎水性の封止材２００を導入し、その後、マイクロ流体チップ１に励起光を照射している。
【０１０３】
これにより、マイクロ流体チップ１のマイクロチャンバ１０を封止材２００で封止することができるので、簡便な操作により高感度で検出対象１０１の検出を行うことができる。
【０１０４】
（実施の形態２）
次に、実施の形態２について、図１０を用いて説明する。図１０は、実施の形態２で用いられるマイクロ流体チップ１Ａの部分拡大断面図である。
【０１０５】
実施の形態１におけるマイクロ流体チップ１では、第１マイクロチャンバ１０ａと第２マイクロチャンバ１０ｂと第３マイクロチャンバ１０ｃとが流路３０によって並列的に連通していたが、本実施の形態におけるマイクロ流体チップ１Ａでは、第１マイクロチャンバ１０ａと第２マイクロチャンバ１０ｂと第３マイクロチャンバ１０ｃとが流路３０によって直列的に連通している。
【０１０６】
つまり、第１マイクロチャンバ１０ａ、第２マイクロチャンバ１０ｂ及び第３マイクロチャンバ１０ｃは、この順で連通している。これにより、図１０に示される矢印のように、液導入部５１から導入された検液は、第１マイクロチャンバ１０ａ、第２マイクロチャンバ１０ｂ及び第３マイクロチャンバ１０ｃをこの順で通って液排出部５２から排出される。
【０１０７】
以上、本実施の形態におけるマイクロ流体チップ１Ａでは、実施の形態１におけるマイクロ流体チップ１と同様に、第１マイクロチャンバ１０ａ及び第２マイクロチャンバ１０ｂは、多段に配置され、かつ、平面視において重なり合っている。
【０１０８】
これにより、実施の形態１と同様に、濃縮などの前処理を行うことなく、簡便な操作により高感度で微生物等の検出対象１０１の検出を行うことができる。
【０１０９】
また、本実施の形態にけるマイクロ流体チップ１Ａでは、第１マイクロチャンバ１０ａと第２マイクロチャンバ１０ｂとが流路によって直列的に連通している。
【０１１０】
これにより、マイクロチャンバ１０に精度よく検出対象１０１を捕捉して封止することができる。
【０１１１】
（変形例）
以上、本発明に係るマイクロ流体チップ、微生物検出方法及び微生物検出装置について、実施の形態に基づいて説明したが、本発明は、上記実施の形態に限定されるものではない。
【０１１２】
例えば、上記実施の形態１、２において、マイクロチャンバ１０の段数は３段（３層）としたが、これに限るものではなく、２段であってもよいし、４段以上であってもよい。この場合、マイクロチャンバ１０の段数は、中間部材（隔壁２０が形成された第４基板４４）の数を増減させることで調整することができる。
【０１１３】
また、上記実施の形態１、２では、検出対象１０１として、細菌、ウイルス又は組織細胞などとしたが、これに限るものではない。例えば、検出対象１０１としては、その他の生体物質又は毒素等であってもよい。また、検出対象１０１が生体物質である場合は、生体物質に特異的に吸着する抗体を利用してもよい。このような抗体はマイクロチャンバ１０の表面に修飾してもよいし、ビーズ等の表面に抗体を修飾したものを用いてもよい。
【０１１４】
その他、上記実施の形態に対して当業者が思いつく各種変形を施して得られる形態や、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で実施の形態における構成要素及び機能を任意に組み合わせることで実現される形態も本発明に含まれる。
【符号の説明】
【０１１５】
１、１Ａ  マイクロ流体チップ
２  光源部
３  受光部
４  検出部
１０  マイクロチャンバ
１０ａ  第１マイクロチャンバ
１０ｂ  第２マイクロチャンバ
２０  隔壁
３０  流路
１００  検液
２００  封止材
３００  微生物検出装置
【図１】
2018031631.tif 000003
【図２】
2018031631.tif 000004
【図３】
2018031631.tif 000005
【図４】
2018031631.tif 000006
【図５】
2018031631.tif 000007
【図６】
2018031631.tif 000008
【図７】
2018031631.tif 000009
【図８】
2018031631.tif 000010
【図９】
2018031631.tif 000011
【図１０】
2018031631.tif 000012