(57)【要約】      （修正有）【課題】ナノスケール構造体の反応を変えられた周囲条件に対して少なくとも１個のナノスケール構造体が、すばやく、繰り返してさえ、測定される方法を提供する。【解決手段】以下のステップを含む方法による。蛍光マーカによって異なる位置で個別的な構造体をマークする（１）ステップ、個別的な構造体を試料内の位置が既知である個別的な位置決め補助に連結する（２）ステップ、励起光によって蛍光マーカを励起し、励起光の強度分布が局所的最小値を有するステップ、局所的最小値を、寸法が励起光の波長での回折限界値より大きくないそれぞれの位置決め補助の位置のまわりの至近距離範囲内の異なる位置に配置する（３）ステップ、個別的な蛍光マーカに対してかつ最小値の異なる位置に対して別々に試料から放出される蛍光を記録する（４）ステップ、および記録される蛍光の強度から試料内の個別的な蛍光マーカの位置を確定する（５）ステップ。【選択図】図１
2018169387.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料（１３）内の複数のナノスケール構造体を空間的に測定する方法であって、前記方法が以下のステップ、すなわち：
−蛍光マーカ（８、９）によって異なる位置で前記個別的な構造体をマークする（１）ステップ、
−蛍光の光（４２）の放出のために励起光（２５）によって前記蛍光マーカ（８、９）を励起するステップであって、
−前記励起光（２５）の強度分布（２４）
−または前記蛍光マーカ（８、９）によって前記蛍光の光の放出に関する影響を有する更なる光の強度分布（４８）のどちらかが、
前記試料（１３）内の異なる位置に配置される局所的最小値（２６）を備えるステップ、
−前記試料（１３）から放出される蛍光の光（４２）を
−前記個別的な蛍光マーカ（８、９）に対しておよび
−前記最小値（２６）の前記異なる位置（２０、２１、２２、２３）に対して
両方とも別々に記録する（４）ステップ、ならびに
−前記最小値（２６）の前記異なる位置（２０、２１、２２、２３）に対する前記それぞれの蛍光マーカ（８、９）に対して記録される前記蛍光の光（４２）の強度から前記試料（１３）内の前記個別的な蛍光マーカ（８、９）の位置を確定する（５）ステップを含み、
−前記個別的な構造体（７）を前記試料（１３）内の位置が、
−既知のまたは
−個別的な位置決め補助（１２）によって反射される光から連結する（２）ステップの後で確定される、
前記位置決め補助（１２）に連結する更なるステップ（２）を前記方法が含み、ならびに、
−前記励起ステップが、前記局所的最小値（２６）を前記それぞれの位置決め補助の位置（１９）のまわりの至近距離範囲（１８）内の前記異なる位置（２０、２１、２２、２３）に配置する（３）ステップであって、前記至近距離範囲（１８）の寸法が、前記励起光（２５）の波長および前記蛍光の光（４２）の波長での回折限界値より大きくないステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記至近距離範囲（１８）の前記寸法が、前記励起光（２５）の波長および前記蛍光の光（４２）の波長での前記回折限界値の半分または四半分より大きくないことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記個別的な蛍光マーカ（８、９）の位置が、前記最小値（２６）の
４ｎ個以下、３ｎ個以下、あるいは２ｎ個以下の異なる位置（２０、２１、２２、２３）に対して、記録される前記蛍光の光（４２）の強度から確定され、ｎが前記試料（１３）内の前記個別的な蛍光マーカ（８、９）の位置が確定される空間方向の数であることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記試料（１３）内の前記個別的な蛍光マーカ（８、９）の位置を確定する（５）ステップが、局所的極値を備える空間関数を前記最小値（２６）の前記異なる位置（２０、２１、２２、２３）に対する前記それぞれの蛍光マーカ（８、９）に対して記録される前記蛍光の光の強度に適合するステップを含むことを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、前記局所的極値を備える前記空間関数が、
−前記光反射位置決め補助（１２）の少なくとも１個または
−前記蛍光マーカ（８、９）の少なくとも１個または
−更なる蛍光マーカを
前記最小値（２６）でスキャンし、かつスキャン中に時間的分解能によって前記試料（１３）から反射される前記光または前記試料（１３）から放出される前記蛍光の光（４２）を記録する（４）ことによって確定されることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１または２に記載の方法であって、前記個別的な構造体（７）が異なる位置でマークされる前記蛍光マーカ（８、９）が、
−前記蛍光マーカ（８、９）の励起スペクトルおよび発光スペクトルから選ばれるスペクトル特性の異なる蛍光マーカ（８、９）、および
−それらが蛍光の光（４２）の放出のために励起光（２５）によって励起可能である活性状態およびそれらが少なくとも同じ励起光（２５）によって、蛍光の光（４２）の放出のために励起可能でない不活性状態を有し、およびそれらの活性状態とそれらの不活性状態との間をスイッチ光によって移動可能である蛍光マーカ（８、９）から選ばれることを特徴とする方法。
【請求項７】
前記位置決め補助の位置（１９）が、前記至近距離範囲（１８）内に前記最小値（２６）を配置するために使用される手段以外の前記試料（１３）に関して前記最小値（２６）の相対的移動のための他の手段によって前記最小値（２６）で接近されることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
前記位置決め補助の位置（１９）が前記試料（１３）の定点（２９）に対して固定され、および前記位置決め補助の位置（１９）が前記試料（１３）の前記定点（２９）に対して接近されることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項１または２に記載の方法であって、前記位置決め補助の位置（１９）が、
−前記励起光（２５）の波長および前記蛍光の光（４２）の波長での前記回折限界値の二倍より小さくない最小距離で、かつ
−周期的パターン、六角形パターンおよび正方形パターンから選ばれる前記試料（１３）内の所定のパターンで配置されることを特徴とする方法。
【請求項１０】
前記試料（１３）内の前記位置決め補助（１２）が、前記構造体（７）が免疫反応経由で連結される固定連結部位（１１）であることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項１１】
前記位置決め補助（１２）が、金粒子（１４）、銀粒子および量子ドットから選ばれる光反射実体を備えることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項１２】
前記構造体（７）が等しい構造体（７）を含み、および前記等しい構造体（７）が前記試料（１３）の異なる領域内の異なる周囲条件にさらされることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１または２に記載の方法であって、前記試料（１３）内の前記個別的な蛍光マーカ（８、９）の位置が、少なくとも２つの時点に対して記録される前記蛍光の光（４２）の強度からこれらの少なくとも２つの異なる時点に対して確定され、そして、
−前記構造体（７）が、前記少なくとも２つの時点で異なる周囲条件にさらされるか、または
−前記少なくとも２つの時点が、前記構造体（７）がさらされる前記周囲条件の変更を継承することを特徴とする方法。
【請求項１４】
試料（１３）内の複数のナノスケール構造体を空間的に測定するための装置であって、前記構造体（７）の各々が、前記試料（１３）内の位置が既知であるかまたは位置決め補助（１２）によって反射される光から確定される前記位置決め補助（１２）に連結され、前記装置が、
−前記試料（１３）のための試料ホルダ（３４）、
−前記試料ホルダ（３４）上へ向けられる対物レンズ（３６）、
−光源（３７）であって
−前記対物レンズ（３６）によって焦点を合わせられる励起光（２５）の強度分布が局所的最小値（２６）を備えるように前記対物レンズ（３６）に前記励起光（２５）を連結するか
−または励起光（２５）および前記対物レンズ（３６）によって焦点を合わせられる更なる光の強度分布が局所的最小値（２６）を備えるように前記対物レンズ（３６）に前記蛍光マーカ（８、９）による前記蛍光の光（４２）の放出に関する影響を有する前記更なる光を連結する光源（３７）、
−前記試料ホルダ（３４）に関して前記最小値の位置（２０、２１、２２、２３）を移動するように構成されるスキャナ（４０）、
−前記最小値（２６）の前記異なる位置（２０、２１、２２、２３）に対して前記試料（１３）から別々に放出される蛍光の光（４２）を記録するように構成される検出器（４５）、
−前記最小値（２６）の前記異なる位置（２０、２１、２２、２３）に対する前記それぞれの蛍光マーカ（８、９）に対して記録される前記蛍光の光（４２）の強度から前記試料（１３）内の個別的な蛍光マーカ（８、９）の位置を確定するように構成される評価ユニット（４４）、ならびに
−前記局所的最小値（２６）を前記それぞれの位置決め補助の位置（１９）のまわりの至近距離範囲（１８）内の異なる位置（２０、２１、２２、２３）に配置する（３）ように構成され、前記至近距離範囲（１８）の寸法が前記励起光（２５）の波長および前記蛍光の光（４２）の波長での回折限界値より大きくないコントローラを備えることを特徴とする装置。
【請求項１５】
試料（１３）内のナノスケール構造体を空間的に測定する方法であって、前記方法が以下のステップ、すなわち：
−蛍光マーカ（８、９）によって異なる位置で前記構造体をマークする（１）ステップ、
−蛍光阻害光（４６）の強度分布（４８）の局所的最小値のそれぞれの位置で蛍光の光（４２）の放出のために励起光（２５）によって前記蛍光マーカ（８、９）を励起する（３）ステップであって、前記局所的最小値（２６）が、寸法が前記励起光（２５）の波長および前記蛍光の光（４２）の波長での回折限界値より大きくない前記試料（１３）内の至近距離範囲（１８）内の異なる位置に配置されるステップ、
−前記個別的な蛍光マーカ（８、９）に対しておよび前記最小値（２６）の前記異なる位置（２０、２１、２２、２３）に対して前記試料（１３）から放出される前記蛍光の光（４２）を別々に記録する（４）ステップ、ならびに
−前記最小値（２６）の前記異なる位置（２０、２１、２２、２３）に対する前記それぞれの蛍光マーカ（８、９）に対して記録される前記蛍光の光（４２）の強度から前記試料（１３）内の前記個別的な蛍光マーカ（８、９）の位置を確定する（５）ステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項１６】
前記励起光（２５）の強度分布（２４）が、前記蛍光阻害光（４６）の前記強度分布（４８）の前記局所的最小値のそれぞれの位置で最大値を有することを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１５または１６に記載の方法であって、前記至近距離範囲（１８）の寸法が、
−前記励起光（２５）の波長および前記蛍光の光（４２）の波長での回折限界値の半分または四半分より大きくなく、かつ
−前記局所的最小値（２６）までのその距離にわたって前記それぞれの蛍光マーカ（８、９）によって放出される前記蛍光の光（４２）の強度の分布（５０）の半分最大値での全幅または半分最大値での前記全幅の半分または四半分より大きくないことを特徴とする方法。
【請求項１８】
前記個別的な蛍光マーカ（８、９）の位置が、前記最小値（２６）の４ｎ個以下、３ｎ個以下、あるいは２ｎ個以下の異なる位置（２０、２１、２２、２３）に対して記録される蛍光の光（４２）の強度から確定され、ｎが前記試料（１３）内の前記個別的な蛍光マーカ（８、９）の位置が確定される空間方向の数であることを特徴とする請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記試料（１３）内の前記個別的な蛍光マーカ（８、９）の位置を確定する（５）ステップが、局所的最大値を備える空間関数を前記最小値（２６）の前記異なる位置（２０、２１、２２、２３）に対する前記それぞれの蛍光マーカ（８、９）に対して記録される前記蛍光の光（４２）の強度に適合するステップを含むことを特徴とする請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、前記局所的最大値を備える前記空間関数が、
−前記最小値（２６）で前記蛍光マーカ（８、９）のまたは更なる蛍光マーカの少なくとも１個をスキャンし、かつスキャン中に時間的分解能によって前記試料（１３）から放出される前記蛍光の光（４２）を記録する（４）下で、かつ
−加えて、前記励起光（２５）の最大値だけで前記少なくとも１個または前記更なる蛍光マーカ（８、９）をスキャンし、かつスキャン中に時間的分解能によって前記試料（１３）から放出される前記蛍光の光（４２）を記録する（４）下で確定されることを特徴とする方法。
【請求項２１】
励起、記録（４）、および確定（５）のステップが、前記蛍光阻害光（４６）の増大された強度で少なくとも一度繰り返されることを特徴とする請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１５または１６に記載の方法であって、前記構造体（７）が異なる位置でマークされる前記蛍光マーカ（８、９）が、
−前記蛍光マーカ（８、９）の励起スペクトルおよび発光スペクトルから選ばれるスペクトル特性の異なる蛍光マーカ（８、９）、および
−それらが蛍光の光（４２）の放出のために励起光（２５）によって励起可能である活性状態およびそれらが少なくとも同じ励起光（２５）によって蛍光の光（４２）の放出のために励起可能でない不活性状態を有する、かつそれらの活性状態とそれらの不活性状態との間をスイッチ光によって移動可能である蛍光マーカ（８、９）から選ばれることを特徴とする方法。
【請求項２３】
請求項１５または１６に記載の方法であって、
−前記蛍光マーカ（８、９）の一部が、前記蛍光マーカ（８、９）の活性状態から前記蛍光マーカ（８、９）の不活性状態にスイッチ光によってスイッチされるか、または
−前記蛍光マーカ（８、９）の一部が、前記蛍光マーカ（８、９）の不活性状態から前記蛍光マーカ（８、９）の活性状態にスイッチ光によってスイッチされるという点で、
前記蛍光マーカ（８、９）が、前記個別的な蛍光マーカ（８、９）に対して前記試料（１３）から放出される前記蛍光の光（４２）を別々に記録する（４）前に個々に区別されることを特徴とする方法。
【請求項２４】
請求項１５または１６に記載の方法であって、
−前記蛍光マーカ（８、９）が前記試料（１３）内で移動可能であり、かつ異なる位置で前記構造体（７）に個々に付着する蛍光マーカ（８、９）から選ばれ、
−前記蛍光マーカ（８、９）が、それらが前記構造体（７）に順々に個々に付着するような濃度で、および空間分布で前記試料（１３）に追加され、ならびに
−そこにおいて、
−前記構造体に付着する際に前記蛍光マーカ（８、９）が、それらが前記励起光（２５）によって蛍光の光の放出のために励起可能でない不活性状態から、それらが前記励起光（２５）によって蛍光の光（４２）の放出のために励起可能である活性状態に移されるか、または
−前記蛍光マーカ（８、９）が、一時的にだけ前記構造体（７）に付着するか、または
−前記蛍光マーカ（８、９）が、前記励起光（２５）および前記蛍光阻害光（４６）の長期間の影響の下で暗状態に永続的に移されることを特徴とする方法。
【請求項２５】
請求項１５または１６に記載の方法であって、加えて、次のステップ、すなわち：
−蛍光の光（４２）の放出のために励起光（２５）によって前記蛍光マーカ（８、９）を励起するステップであって、前記励起光（２５）の前記強度分布（２４）が、前記試料（１３）内の異なる位置に配置される別の局所的最小値（２６）を有するステップ、
−前記個別的な蛍光マーカ（８、９）および前記励起光（２５）の前記強度分布（２４）の前記他の最小値の異なる位置（２０、２１、２２、２３）に対して別々に前記試料（１３）から放出される前記蛍光の光（４２）を記録する（４）ステップ、ならびに
−前記励起光（２５）の前記強度分布（２４）の前記他の最小値（２６）の前記異なる位置（２０、２１、２２、２３）に対する前記それぞれの蛍光マーカ（８、９）に対して記録される前記蛍光の光（４２）の強度から前記試料（１３）内の前記個別的な蛍光マーカ（８、９）の位置を確定する（５）ステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項２６】
前記試料（１３）から前記個別的な蛍光マーカ（８、９）によって放出される前記蛍光の光（４２）の相補的強度分布が、一方では、前記蛍光阻害光（４６）の前記強度分布（４８）の前記最小値の前記異なる位置（２０、２１、２２、２３）にわたって生じ、かつ他方、前記励起光（２５）の前記強度分布（２４）の前記他の最小値（２６）の前記異なる位置（２０、２１、２２、２３）にわたって、前記試料（１３）内の前記個別的な蛍光マーカ（８、９）の位置を確定する（５）際に比較されることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
請求項２５に記載の方法であって、
−前記蛍光阻害光（４６）の前記強度分布（４８）の前記最小値（２６）の前記異なる位置（２０、２１、２２、２３）に対する前記それぞれの蛍光マーカ（８、９）に対して記録される前記蛍光の光（４２）の強度から確定される前記試料（１３）内の前記個別的な蛍光マーカ（８、９）の位置が、その後前記励起光（２５）の前記強度分布（２４）の前記他の最小値（２６）が配置される位置を定める際に考慮されるか、または
−前記励起光（２５）の前記強度分布（２４）の前記他の最小値（２６）の前記異なる位置（２０、２１、２２、２３）に対する前記それぞれの蛍光マーカ（８、９）に対して記録される前記蛍光の光（４２）の強度から確定される前記試料（１３）内の前記個別的な蛍光マーカ（８、９）の位置が、その後前記蛍光阻害光（４６）の前記強度分布（４８）の前記最小値（２６）が配置される位置を定める際に考慮されることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料内の少なくとも１個のナノスケール構造体を空間的に測定する方法に、およびこの種の方法を実施するための装置に関する。
【０００２】
詳しくは、この方法は蛍光マーカによって異なる位置で少なくとも１個のナノスケール構造体をマークするステップ、蛍光の光の放出のために励起光によって蛍光マーカを励起するステップ、試料から放出される蛍光の光を記録するステップ、および蛍光の光の記録された強度から試料内の個別的な蛍光マーカの位置を確定するステップを含む。
【０００３】
さらに、本発明は、試料内の個別的な蛍光マーカの位置の確定が、励起光の波長でのおよび蛍光の光の波長での回折限界値を越えた精度で行われる方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
試料内の個々に区別された蛍光マーカの位置が、励起光の波長でのおよび蛍光の光の波長での回折限界値を越えた精度で確定される、試料内の少なくとも１個のナノスケール構造体を空間的に測定する方法が、ＭＩＮＦＬＵＸ顕微鏡法として既知である、（非特許文献１）を参照のこと。ＭＩＮＦＬＵＸ顕微鏡法では、個々に区別された蛍光マーカの位置が、励起光の強度分布のゼロ点が、個々に区別された蛍光マーカの推定された位置のまわりの測定領域の中心に、および測定領域の境界で中心のまわりに均一に分布する３つの位置に配置されるという点で確定される。ゼロ点のこれらの全体的な４つの位置で、それぞれの蛍光マーカからの蛍光の光の強度が、別々に測定され、および個々に区別された蛍光マーカの位置が、ゼロ点の異なる位置に対して別々に記録されるそれぞれの蛍光マーカからの蛍光の光の強度から確定される。いずれにせよそれぞれの蛍光マーカの求められている位置にまたがるがゼロ点の４つの位置がより隙間がなく配置されればされるほど、一層正確に蛍光マーカの位置が蛍光の光のわずか数個の光子から確定されることができ、それがゼロ点の位置の各々に対して記録される。
【０００５】
いわゆる薬物スクリーニング、および複数の物質が、それらが他の物質または生物体に関して特定の特性を備えた物質を含むかどうか調査される他の方法において、物質が、他の物質とまたは対象物のいくつかの複製と数回、各々接触し、および他の物質または対象物の得られる反応が、監視される。いくつかの同一の対が統計学的に有意の結果を得るのに必要であるので、および他方、物質が異なる他の物質または異なる生物体に関してたいてい所望の特性を示すはずであるので、監視されるべき反応の全体的な数は、一般的に調査されるべき物質の複数の数に達する。通常、この種の大きな数の反応を系統的に確認することは、面倒である。しばしば、分子レベルの反応は、さらに分析反応を用いてだけ確認されることができる。反応動態力学を監視することは、したがってしばしば全く可能でない。
【０００６】
（特許文献１）が、蛍光マーカによってマークされる試料の構造体を空間的に高分解能画像形成する方法を開示し、そこにおいて試料が、ＳＴＥＤ蛍光顕微鏡法における様に、試料から放出されてかつ検出される蛍光の光が、刺激光のゼロ点の領域に割り当てられることができる、試料の領域の境界を決めるために励起光におよび蛍光阻害光としての刺激光にさらされる。ゼロ点に隣接するその強度最大の領域内の刺激光の高強度から蛍光マーカを保護するために、試料は、加えて、強度分布が刺激光のゼロ点と一致する局所的最小値を有する励起阻害光にさらされる。この励起阻害光は、とりわけ励起阻害光の最小値の外側の切り替え可能蛍光マーカを、それらが蛍光の光の放出のために励起光によって励起されることができない不活性状態にスイッチを切るスイッチオフ光であることができる。とりわけ、蛍光マーカはそれらが高分解能ＲＥＳＯＬＦＴ蛍光顕微鏡法で使用されるので、切り替え可能蛍光染料であることができる。
【０００７】
（特許文献２）が、蛍光マーカによってマークされる試料の構造体を空間的に高分解能画像形成する方法を開示し、それはまたＳＴＥＤ蛍光顕微鏡法の一方法であり、そこにおいて試料から放出されてかつ記録される蛍光の光が割り当てられることができる試料の領域を減少する蛍光阻害光が刺激光のゼロ点の領域に限られているので、励起光の他に試料が刺激光にさらされる。ゼロ点に隣接する強度最大の領域内の刺激光の高強度および光化学的漂白の結果として生じる危険性から蛍光マーカを保護するために、ゼロ点は、寸法がこれらの強度最大の距離より有意に小さい試料内の至近距離範囲内にだけ配置される。加えて、試料は、至近距離範囲の外側で、至近距離範囲の外側の切り替え可能蛍光マーカを、それらが励起光を用いて蛍光の光の放出のために励起可能でない不活性状態にスイッチを切るスイッチオフ光にさらされることができる。とりわけ、これらの蛍光マーカはそれらが高分解能ＲＥＳＯＬＦＴ蛍光顕微鏡法で使用されるので、切り替え可能蛍光マーカであることができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際特許第２０１４／１０８４５５号
【特許文献２】独国特許出願公開第１０２０１６１１７０９６号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｂａｌｚａｒｏｔｔｉ  Ｆ、Ｅｉｌｅｒｓ  Ｙ、Ｇｗｏｓｃｈ  ＫＣ、Ｇｙｎｎａ  ＡＨ，  Ｗｅｓｔｐｈａｌ  Ｖ、Ｓｔｅｆａｎｉ  ＦＤ、Ｅｌｆ  Ｊ、Ｈｅｌｌ  ＳＷ：「最小光子束による蛍光分子のナノメータ分解能画像形成および追跡」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３５５；  ２０１６年１２月２２日オンライン公表
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
例えば、変えられた周囲条件が、調査されるべき物質の１つを追加することに起因する薬物スクリーニングの状況で要求されるので、ナノスケール構造体の反応を変えられた周囲条件に対して記録するために少なくとも１個のナノスケール構造体が、すばやく、繰り返してさえ、測定されることができる方法の必要性がなおある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、試料内の複数のナノスケール構造体を空間的に測定する方法に関する。この方法は、次のステップ、すなわち：蛍光マーカによって異なる位置で個別的な構造体をマークするステップ、蛍光の光の放出のために励起光によって蛍光マーカを励起するステップであって、励起光の強度分布、または蛍光マーカによる蛍光の光の放出に関する影響を有する更なる光の強度分布のいずれかが、試料内の異なる位置に配置される局所的最小値を備えるステップ、個別的な蛍光マーカに対して、かつ最小値の異なる位置に対して別々に試料から放出される蛍光の光を記録するステップ、および最小値の異なる位置に対するそれぞれの蛍光マーカに対して記録される蛍光の光の強度から試料内の個別的な蛍光マーカの位置を確定するステップを含む。この方法は、個別的な構造体を、試料内の位置が既知であるか、または位置決め補助によって反射される光からの連結のステップの後に確定される個別的な位置決め補助に連結する更なるステップを含む。更に、励起ステップが局所的最小値を、それぞれの位置決め補助の位置のまわりの至近距離範囲内の異なる位置に配置するステップを含み、至近距離範囲の寸法は励起光の波長および蛍光の光の波長での回折限界値より大きくない。
【００１２】
本発明は、また、試料内の複数のナノスケール構造体を空間的に測定するための装置に関し、そこにおいて構造体の各々が、試料内の位置が既知であるかまたは位置決め補助によって反射される光から確定される位置決め補助に連結される。この装置が、試料のための試料ホルダ、試料ホルダ上へ向けられる対物レンズ、光源であって、対物レンズによって焦点を合わせられる励起光の強度分布が局所的最小値を備えるように対物レンズに励起光を連結するか、または励起光および対物レンズによって焦点を合わせられる更なる光の強度分布が局所的最小値を備えるように、蛍光マーカによって蛍光の光の放出に関する影響を有する更なる光を対物レンズに連結する光源、試料ホルダに関して最小値の位置を移動するように構成されるスキャナ、最小値の異なる位置に対して別々に試料から放出される蛍光の光を記録するように構成される検出器、最小値の異なる位置に対するそれぞれの蛍光マーカに対して記録される蛍光の光の強度から試料内の個別的な蛍光マーカの位置を確定するように構成される評価ユニット、ならびに局所的最小値をそれぞれの位置決め補助の位置のまわりの至近距離範囲内の異なる位置に配置するように構成され、至近距離範囲の寸法が励起光の波長および蛍光の光の波長での回折限界値より大きくないコントローラを備える。
【００１３】
本発明は、また、試料内のナノスケール構造体を空間的に測定する方法に関する。この方法が、蛍光マーカによって異なる位置で構造体をマークするステップ、蛍光阻害光の強度分布の局所的最小値のそれぞれの位置で蛍光の光の放出のために励起光によって蛍光マーカを励起するステップであって、局所的最小値が、寸法が励起光の波長および蛍光の光の波長での回折限界値より大きくない試料内の至近距離範囲内の異なる位置に配置されるステップ、個別的な蛍光マーカに対しておよび最小値の異なる位置に対して試料から放出される蛍光の光を別々に記録するステップ、ならびに最小値の異なる位置に対するそれぞれの蛍光マーカに対して記録される蛍光の光の強度から試料内の個別的な蛍光マーカの位置を確定するステップを含む。
【００１４】
本発明の他の特徴および利点は、以下の図および詳細な説明の検討の際に当業者に明白になる。全てのこの種の追加特徴および利点が、請求項に記載の、本発明の範囲内で本願明細書に含まれることを目的とされる。
【００１５】
本発明は、以下の図を参照してよりよく理解されることができる。図内の構成要素が、必ずしも一定の比率であるというわけではなく、その代わりに本発明の原理を明確に例示することに重点が置かれている。図において、同様な参照番号はいくつかの図の全体にわたって対応する部分を指定する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明に従う方法の一実施態様の流れ図である。
【図２】ナノスケール構造体を位置決め補助に連結するステップおよび追加される物質に対するナノスケール構造体の反応を図式的に示す。
【図３】本発明に従う方法のＭＩＮＦＬＵＸ実施態様において位置決め補助に関する励起光の強度分布の最小値の位置決めを説明する。
【図４】平面図でおよび最小値を通しての断面図で本発明に従う方法のＭＩＮＦＬＵＸ実施態様における励起光の強度分布を例示する。
【図５】正方形パターンで配置される位置決め補助を備えた試料を示す。
【図６】本発明に従う方法を実行するための装置を図式的に示す。
【図７】最小値を通しての断面図で本発明に従う方法の更なる一実施態様における励起光のおよび蛍光阻害光の強度分布を例示する；ならびに、
【図８】図７に従う強度分布をまた使用して本発明に従う方法の別の態様の一実施態様の流れ図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
試料内の複数のナノスケール構造体を空間的に測定する本発明に従う方法が、マーク、連結、励起、配置、記録および確定の部分的に重なり合うステップを含む。
【００１８】
ナノスケール構造体が本発明に従う方法で測定されることは、これらの構造体が、最大２００ｎｍでの、しばしば最大１００ｎｍでの、および多くの場合最大５０ｎｍまたはわずか３０ｎｍでのナノスケールの寸法を有することを意味する。
【００１９】
マークのステップでは、個別的な構造体が蛍光マーカによって異なる位置でマークされる。これは、本発明に従って測定される各構造体が、異なる位置で構造体に付着される少なくとも２個の蛍光マーカによってマークされることを意味する。構造体をとりわけすばやく測定するために、各構造体がマークされる蛍光マーカの数が、意図的に少ないように保たれることができ、およびそれは例えば、１０個以下または５個に限られることができる。好ましくは、全ての等しい構造体が等しい数の蛍光マーカによって等しい位置でマークされる。異なる位置で構造体に付着される蛍光マーカは、等しいかまたは異なることができる。
【００２０】
連結のステップでは、個別的な構造体が、個別的な位置決め補助に連結される。これは、本発明に従う方法に従って測定される各構造体が１個の位置決め補助に連結されることを意味する。位置決め補助が試料の製作または準備において意図的にこれらの位置に配置されたので、または試料内のそれらの定位置が連結のステップの前に、何らかの方法ですでに確定されたので、これらの位置決め補助は、試料内の位置がすでに既知である位置決め補助である。代わりとしてまたは加えて、試料内の位置決め補助の位置が、連続的に、およびしたがってさらに連結のステップの後でさえ、位置決め補助によって反射される光から確定されることができる。上述したそれらの最大寸法によって、ナノスケール構造体は、それらの末端の一つに連結される場合、それぞれの位置決め補助の位置から、基本的に２００ｎｍ、１００ｎｍ、５０ｎｍまたは３０ｎｍを超えて、および好ましい中心連結によって、基本的に１００ｎｍ、５０ｎｍ、２５ｎｍまたは１５ｎｍを超えて延在しない。
【００２１】
励起ステップでは、測定されるべき構造体がマークされる蛍光マーカが、蛍光の光の放出のために励起光によって励起される。ここで、励起光の強度分布、または蛍光マーカによる蛍光の光の放出に関する影響を有する更なる光の強度分布が、励起ステップにおいて試料内の異なる位置に配置される局所的最小値を有する。局所的最小値は、励起光の強度または更なる光の強度が実際にゼロまで下がる、それぞれの強度分布の真のゼロ点であることができる。いずれにせよ、励起光のまたは更なる光の低く残っている強度だけが局所的最小値に要求される。構造体が本発明に従う方法で測定される全ての空間方向において、局所的最小値は、それぞれの強度分布の最大値によって境界を決められる。
【００２２】
特別な方法で励起するステップを実行する配置ステップでは、局所的最小値が、それぞれの位置決め補助の既知の位置のまわりの至近距離範囲内の異なる位置に配置される。この至近距離範囲の寸法は、励起光の波長および蛍光の光の波長での回折限界値より大きくない。たとえ試料内の個別的な位置決め補助の位置が固定されてかつ一般に既知であるとしても、局所的最小値でこれらの位置またはそれらのまわりに延在する至近距離範囲に接近することが、位置決め補助によって反射される光を用いて支えられるかまたは完全に制御されさえする。
【００２３】
記録ステップでは、試料から放出される蛍光の光が、個別的な蛍光マーカに対して、かつ試料内の最小値の異なる位置に対して別々に記録される。したがって、記録された蛍光の光は特定の蛍光マーカにかつ試料内の最小値の特定の位置にそれぞれ割り当てられることができる。
【００２４】
したがって、確定ステップでは、それぞれの蛍光マーカから蛍光の光のほんの少数の光子に基づいて最小値の異なる位置に対するそれぞれの蛍光マーカに対して記録される蛍光の光の強度から試料内の個別的な蛍光マーカの位置を確定することが、可能である。
【００２５】
数蛍光マーカによってだけマークされる構造体を測定することは、構造体での蛍光マーカの位置の間の距離を測定することをとりわけ意味する。
【００２６】
本発明に従う方法において、位置決め補助の位置は最初から既知であるか、または蛍光マーカからの蛍光の光の光子の放出を必要とせずに確定されるので、位置決め補助の位置のまわりの至近距離範囲は励起光のまたは更なる光の強度分布の最小値で系統的に接近されることができる。したがって、本発明に従う方法において、個々の構造体が、個別的な蛍光マーカの位置についての以前の知識を使用して蛍光マーカを用いて測定される。関連する構造体を位置決め補助に連結することに起因して、各構造体およびしたがってまたその上に依存する蛍光マーカは位置決め補助の直ぐ近傍にある。したがって、この位置決め補助のまわりの至近距離範囲が励起光または更なる光の光強度分布の最小値で接近される時、この最小値はすでにそれぞれの蛍光マーカに近い。位置決め補助の位置が、より正確に分かればわかるほど、それぞれの蛍光マーカの位置を確定するために励起光または更なる光の光強度分布の最小値が、異なる位置に配置される至近距離範囲はより小さくなる。
【００２７】
本発明によれば、至近距離範囲の寸法は、励起光の波長および蛍光の光の波長での回折限界値より大きくなく、および至近距離範囲は局所的最小値を至近距離範囲内の異なる位置に配置することによってスキャンされる、すなわち、蛍光マーカの位置が至近距離範囲の寸法の一部分の空間的分解能で確定されることができるように、至近距離範囲が分割される。好ましくは、局所的最小値がそれぞれの位置決め補助の位置のまわりの異なる位置に配置される至近距離範囲の寸法は、半分より大きくなく、かつ励起光の波長および蛍光の光の波長での回折限界値の四半分より大きくないことが、より好ましくさえある。これは、それぞれの位置決め補助の位置が既知であるかまたはさらにより高精度で確定されなければならないことを意味する。
【００２８】
本発明に従う方法において、励起、記録および確定のステップは、局所的最小値を備える光の向上された強度でおよび、好ましくは、至近距離範囲の、対応してより小さい寸法で少なくとも一度繰り返されることができる。より小さい至近距離範囲が、強度分布が局所的最小値を有する励起光のまたは更なる光の従来の強度によって確定されるそれぞれの蛍光マーカの位置のまわりに配置されることができる。このようにして、位置確定の精度が反復して向上されることができる。
【００２９】
励起光の強度分布が局所的最小値を有する本発明に従う方法の実施態様が、既知のＭＩＮＦＬＵＸ顕微鏡法の一実施態様として実現されることができる。蛍光マーカによる蛍光の光の放出に関する影響を有する更なる光の強度分布が局所的最小値を有する本発明に従う方法の他の実施態様において、励起光の強度分布が、更なる光の強度分布の局所的最小値のそれぞれの位置で最大値を有することができ、および更なる光が蛍光マーカによる蛍光の光の放出を阻害する蛍光阻害光であることができる。本発明に従う方法のこの実施態様において、励起光および蛍光阻害光は、それらがまたＲＥＳＯＬＦＴでおよびとりわけＳＴＥＤ顕微鏡法で使用されるので、したがってこの種の強度分布によって重畳される。本発明に従う方法のこの実施態様において、しかしながら蛍光の光が、局所的最小値の領域にある蛍光マーカからだけ生じることができることだけが使用されるのではない。その代わりに、局所的最小値の位置までのその位置の距離へのそれぞれの蛍光マーカに対して記録される蛍光の光の強度の依存性もまた、最小値のいくつかの位置に対して記録される蛍光の光の強度からとりわけ高精度でその位置を確定するために使用される。対応して、更なる光の強度分布が局所的最小値を有する本発明の方法のこの変形例においてさえ、局所的最小値は試料内のこの種の低い数の位置に配置されることができ、および記録された蛍光の光の強度の評価は、ＭＩＮＦＬＵＸ顕微鏡法におけるものと同じ原理に従うことができる。しかしながら、ＭＩＮＦＬＵＸ顕微鏡法では蛍光マーカからの蛍光の光の強度は、局所的最小値の位置までのその位置の距離を増加することによって増大するが、一方、更なる光が蛍光阻害光である本発明に従う方法の実施態様では、それは距離の増加と共に減少するという差異が残る。
【００３０】
励起光の強度分布が局所的最小値を有する本発明に従う方法の実施態様では、個々に区別された蛍光マーカは、最小光量にだけさらされてかつしたがって最小程度にだけ光化学的に応力を加えられる。強度分布がゼロ点を有する更なる光が蛍光阻害光である実施態様では、ゼロ点に隣接する蛍光阻害光の強度最大値は、近傍の他の蛍光マーカによって放出される蛍光の光が位置確定を妨げることを有利には阻害する。
【００３１】
本発明に従う方法を実施する際に、局所的最小値が至近距離範囲の寸法と比較して、非常に高い空間的分解能でそれぞれの蛍光マーカの位置を確定するためにそれぞれの位置決め補助の位置のまわりの至近距離範囲内の多くの異なる位置に配置されることを必要としないことが分かった。対応して、本発明に従う方法では、個別的な蛍光マーカの位置は、ｎ個以下、３ｎ個以下、あるいは２ｎ個以下の異なる位置に対して記録される蛍光の光の強度から、一般的に確定される。ここで、ｎは試料内の個別的な蛍光マーカの位置が確定される空間方向の数である。
【００３２】
試料内の個別的な蛍光マーカの位置を確定することは、最小値の異なる位置に対するそれぞれの蛍光マーカに対して記録される蛍光の光の強度に局所的極値を有する空間関数を適合することをとりわけ含むことができる。励起光の強度分布が局所的最小値を有する本発明に従う方法の実施態様において、空間関数の局所的極値がまた、局所的最小値である。強度分布がゼロ点を有する更なる光が蛍光阻害光である実施態様では、空間関数の局所的極値はしかしながら局所的最大値である。
【００３３】
理想的には局所的極値を有する空間関数は、励起光または更なる光の強度分布の局所的最小値までその距離をこえてそれぞれの蛍光マーカから蛍光の光の強度と同じ進路を有する。したがって、光反射位置決め補助の少なくとも１個または直接蛍光マーカの少なくとも１個または更なる類似の蛍光マーカが、最小値でスキャンされることができ、一方反射される光または試料から放出される蛍光の光が、局所的極値を有する空間関数を確定するために時間的分解能によって記録される。ここで、スキャンは、局所的最小値がそれぞれの至近距離範囲内の局所的最小値の少ない位置と比較して大きな数の小さいステップでシフトされることを意味する。光反射位置決め補助の少なくとも１個をスキャンする際に、試料内のその位置、およびしたがってそれぞれの至近距離範囲の中心もまた確定されることができる。
【００３４】
それぞれの構造体がマークされる個別的な蛍光マーカに対して別々に試料から放出される蛍光の光を記録することが可能であるために、異なる蛍光マーカによって放出される蛍光の光が、分離可能でなければならない。本願明細書において、いくつかの蛍光マーカが、それらがより近くてかつ概して蛍光の光の波長での回折限界値より互いに非常に近いように同じナノスケール構造体に各々付着されるので、蛍光の光をそれが試料から放出されるところからに基づいて異なる蛍光マーカから分離することは、可能でない。したがって、個別的な蛍光マーカからの蛍光の光に関する他の区別オプションが、存在するかまたはもたらされなければならない。
【００３５】
個別的な構造体が異なる位置でマークされる蛍光マーカが、それらのスペクトル特性の異なる蛍光マーカから選ばれる場合、それぞれの構造体での個別的な蛍光マーカが異なる波長の励起光によって選択的に励起されることができるか、またはそれらによって放出される蛍光の光が波長選択的方法で検出されることができる。更に、蛍光マーカは、それらが蛍光の光の放出のための励起光によって励起されることができる活性状態、およびそれらが―少なくとも同じ励起光によって―蛍光の光の放出のために励起されることができない不活性状態を有する、およびそれらの活性状態とそれらの不活性状態との間で移動されることができる、蛍光マーカから選ばれることができる。次に、励起光による励起に続く記録された蛍光の光がそれからだけ生じることができるように―選択的にまたは移動確率に基づいて―１個の蛍光マーカだけがそれぞれその活性状態に残されるかまたはその活性状態にもたらされる。移動確率に基づく手順において、それは繰り返し、同じ蛍光マーカがその活性状態に入るということであることができる。増えつづける繰り返しによって、これはしかしながらますますありそうもなくなる。
【００３６】
とりわけ、蛍光マーカはしたがって、それらの励起スペクトルおよびそれらの発光スペクトルの少なくとも１つで異なるか、またはそれらの活性状態からそれらの不活性状態にスイッチ光によってスイッチされることができるそれらの蛍光マーカから選ばれることができる。スイッチ光は、全体として励起光または蛍光マーカによる蛍光の光の放出に関する影響を有する更なる光と同じ波長を有することができる。
【００３７】
本発明に従う方法の実用的な実現において、位置決め補助の位置、すなわち至近距離範囲は、至近距離範囲内の最小値の位置でない、試料に関する最小値の相対的移動のための他の手段によって接近されることができる。これは、より大きな距離を越えて最小値をシフトするためにではなく、試料内の最小値を正確に位置決めするために適切である至近距離範囲内の最小値の高精度位置決めのための手段を使用することを可能にする。これらのより大きな距離は、位置決め補助の位置に接近するための手段によって適用されることができる。とりわけ、位置決め補助の位置に接近するための手段は、励起光を試料に焦点を合わせる対物レンズに関して試料全体を移動することができ、一方、最小値は対物レンズに関してビームを偏向させるビーム偏光手段によってそれぞれの至近距離範囲内でシフトされる。
【００３８】
本発明に従う方法において、位置決め補助の位置は、試料内でおよびしたがって試料の固定点に関して好ましくは固定され、および位置決め補助の位置、すなわち個別的な至近距離範囲は試料の固定点に対して接近される。
【００３９】
有利には、構造体は、位置決め補助へのそれらの連結に起因して、既知の位置にまたは蛍光マーカに応力を加えずに確定されることができる位置にただもたらされるだけでなく、しかし構造体はまた定められた方法で、すなわち例えばそれぞれの試料の主拡張部分の平面と平行して向けられる。この配向性はとりわけ、局所的最小値が試料内の異なる位置に配置される方向または平面内にまたはそれと平行に、蛍光マーカの距離または構造体が蛍光マーカによってマークされる異なる位置の距離が配置されるように、試料に関して構造体を向ける目的を有する。したがって、これらの距離、更にはこれらの距離の変更が、個別的な蛍光マーカの位置を確定することによってとりわけ容易に記録される。たとえ位置決め補助に連結される構造体のこの種の意図的な配向性が可能でないとしても、位置決め補助に連結される構造体が試料内で固定配向性を有することがしばしば達成されることができる。次いで、蛍光マーカの位置の最初の確定の後、構造体のうちどちらが、蛍光マーカによってマークされるそれらの領域の距離が試料の主拡張部分の平面に走るように向けられるかがチェックされることができる。例えば、変えられた周囲条件に対する構造体の反応を記録するために蛍光マーカの位置の確定を繰り返し実行する際に、本発明の方法はその後要求された配向性を持つそれらの構造体に制限されることができ、一方、この配向性を持たない他の構造体はもはや考慮されない。これは、構造体の反応に関する有意な情報を変えられた周囲条件に対してすばやく記録するためにとりわけ適切である。
【００４０】
更に、位置決め補助の位置が励起光および蛍光の光の波長での回折限界値の少なくとも二倍長である最小距離に配置されることが好まれる。次に、試料から出てくる蛍光の光が、光学手段によって個別的な至近距離範囲におよびしたがって測定されるべき個別的なナノスケール構造体に別々に割り当てられることができる。位置決め補助の位置が、それらが例えば、試料内に所定のパターンで配置されるという点で自発的に定められる場合、励起光の波長および蛍光の光の波長での回折限界値の二倍の前記最小距離が、直接維持されるべきである。しかしながら、位置決め補助が試料内でランダムに分布する場合、それらの距離が励起光の波長および蛍光の光の波長での回折限界値の二倍より小さくない、低密度の位置決め補助を用いて配慮されなければならない。概して、これは励起光の波長および蛍光の光の波長での回折限界値の二倍の相互値より非常に小さい密度を要求する。代わりとしてまたは加えて、位置決め補助が、それらの間にある距離に対してチェックされることができる。次いで、位置が互いに関してあまりに近いと認められる位置決め補助、およびそれに対して連結されるナノスケール構造体は、本発明に従う方法を更に実行する時無視されることができる。
【００４１】
位置決め補助の位置が試料内に所定のパターンで配置される場合、所定のパターンがとりわけ周期的なものから、およびより具体的には六角形および正方形パターンから選ばれることができる。次に本発明に従う方法を実行する時接近されるべき至近距離範囲もまた、この種の周期的、六角形または正方形パターンで配置される。六角形のパターンでは、励起光の波長および蛍光の光の波長での回折限界値の二倍の最小距離を維持する位置決め補助の密度が、最大化される。
【００４２】
蛍光マーカによる蛍光の光の放出に関する影響を有する更なる光の強度分布が、蛍光阻害光であってかつ局所的最小値を有する、および励起光の強度分布が更なる光の強度分布の局所的最小値のそれぞれの位置で最大値を有する、本発明に従う方法の実施態様を用いてである限りにおいて、ＲＥＳＯＬＦＴにおけるおよびとりわけＳＴＥＤ顕微鏡法におけるような類似の手順が開示され、これは、複数のナノスケール構造体を空間的に測定するステップ、個別的な構造体を個別的な位置決め補助に連結するステップおよび局所的最小値を異なる位置に、とりわけそれぞれの位置決め補助の位置のまわりの至近距離範囲内に配置するステップに独立である本発明の別の態様である。
【００４３】
この他の態様において、本発明は、目的によって個々に区別された蛍光マーカの位置が確定され、その目的に対して蛍光マーカが、最初はしばしば個々に区別され、および概して局所的最大値を備える関数に適合することによって、局所的最小値の低い数の異なる位置に対して記録される蛍光の光の強度が、評価されるという点でＲＥＳＯＬＦＴおよびＳＴＥＤ顕微鏡法とは異なる。ここで、適合された関数の局所的最大値の位置が試料内の蛍光マーカの位置に対して調査されるものとしてとられることができる。ＭＩＮＦＬＵＸ顕微鏡法での対応する手順と比較すると、本発明のこの他の態様は、ゼロ点に隣接する強度最大の蛍光阻害光が、周囲内に配置される他の蛍光マーカによって放出される蛍光の光が、位置確定を妨げることを有利には阻害する利点を有する。更に、本発明のこの他の態様はここで開示される本発明に従う方法の全ての更なる特徴を備えるかもまたは備えないかもしれない。
【００４４】
本発明のこの他の態様において、励起光の強度分布は、ゼロ点のそれぞれの位置または蛍光阻害光の強度分布の局所的最小値で好ましくは最大値を有する。したがって、励起光はたとえその最大値が、回折限界値に起因して、それらが局所的最小値に対して可能であるより、かつそれらが本発明に従う方法での局所的最小値に対して規則正しく実現されるより大きな寸法を有するとしても蛍光阻害光の強度分布の局所的最小値の領域に集中される。
【００４５】
本発明のこの他の態様において、蛍光阻害光は、とりわけＳＴＥＤ、または記録されることができる蛍光の光をそれらが放出することができる前に、誘導放出のためにそれらを刺激することによって励起光によって励起される蛍光マーカの励起を止める刺激光であることができる。本発明のこの他の態様において、しかしながら、蛍光の光が蛍光阻害光の局所的最小値の領域にある蛍光マーカからだけ生じることができることが利用されるだけではない。その代わりに、局所的最小値の位置までのその位置の距離へのそれぞれの蛍光マーカに対して記録される蛍光の光の強度の依存性は、また、最小値のいくつかの位置に対して記録される蛍光の光の強度からとりわけ高精度でその位置を確定する際にも使用される。本発明のこの他の態様において、最小値が、試料内の少ない位置として対応して配置されることができ、および記録された蛍光の光の強度の評価はＭＩＮＦＬＵＸ顕微鏡法におけるものと基本的に同じ原理に従って行われることができる。有意差として、ＭＩＮＦＬＵＸ顕微鏡法ではそれぞれの蛍光マーカからの蛍光の光の強度は、局所的最小値の位置までのその位置の距離の増加と共に増大するが、一方、それは本発明に従う方法では減少することが、しかしながら残る。
【００４６】
本発明のこの他の態様が、ＲＥＳＯＬＦＴとおよびとりわけＳＴＥＤ顕微鏡法と部分的に重なる限りにおいて、それは、それにもかかわらずまた、意図的に、蛍光マーカがしばしば最初は個々に区別されなければならない目的のために個々に区別された蛍光マーカの位置が確定される点で、および局所的最小値の少ない異なる位置だけに対して記録された蛍光の光の強度が、位置確定のために評価される点でＲＥＳＯＬＦＴおよびＳＴＥＤ顕微鏡法とは異なる：この位置確定は、概して、局所的最大値を備える関数に適合することを含む。適合された関数の局所的最大値の位置は、試料内の蛍光マーカの位置としてとられることができる。
【００４７】
ＭＩＮＦＬＵＸ顕微鏡法における手続きと比較すると、本発明のこの他の態様は、そのゼロ点に隣接する蛍光阻害光の強度最大値に起因して、周囲内に位置づけられる蛍光マーカによって放出される何の蛍光の光も、位置確定を妨げない利点を有する。
【００４８】
本発明のこの他の態様の一実施態様において、個別的な蛍光マーカの位置が、加えて、ＭＩＮＦＬＵＸ顕微鏡法によって確定される。これは、加えて、以下の諸ステップが実行されることを意味する：蛍光の光の放出のために励起光によって蛍光マーカを励起するステップであって、励起光の強度分布が試料内の異なる位置に配置される局所的最小値を有するステップ、個別的な蛍光マーカに対しておよび励起光の強度分布の最小値の異なる位置に対して別々に試料から放出される蛍光の光を記録するステップ、ならびに励起光の強度分布の最小値の異なる位置に対するそれぞれの蛍光マーカに対して確定される蛍光の光の強度から試料内の個別的な蛍光マーカの位置を確定するステップ。
【００４９】
本発明の他の態様のこの実施態様の追加ステップにおいて、以前にまたはその後蛍光阻害光の強度分布の最小値でと同様に励起光の強度分布の最小値で同じ位置に接近することが可能である。これは、しかしながら単にオプションである。
【００５０】
本発明の他の態様のこの実施態様の追加ステップにおいて、個々に区別された蛍光マーカは、最小光量にだけさらされてかつしたがって最小限にだけ光化学的に応力を加えられる。
【００５１】
更に、本発明の他の態様のこの実施態様において、試料から個別的な蛍光マーカによって放出される蛍光の光の相補的強度進路、それが一方では、蛍光阻害光の強度分布の最小値の異なる位置をこえる結果になりおよび、他方、試料内の励起光の強度分布の最小値の異なる位置をこえる結果になり、試料内の個別的な蛍光マーカの位置を確定する際に互いに比較されることができる。両方の相補的強度進路の考慮によって、それらが別々にだけ評価される場合、試料内のそれぞれの蛍光マーカの位置は、２つの強度進路に基づくよりも、より高精度で確定されることができる。
【００５２】
更に、本発明の他の態様のこの実施態様において、試料内の個別的な蛍光マーカの位置が、蛍光阻害光の強度分布の最小値の異なる位置に対するそれぞれの蛍光マーカに対して記録される蛍光の光の強度から確定され、その後励起光の強度分布の残りの最小値が配置される、位置を定める際に考慮されることができ、逆もまた同様である。向上する精度によって個別的な蛍光マーカの位置を反復して確定する際に、ＳＴＥＤ群とＭＩＮＦＬＵＸ群との間を段階的に変更することができる。
【００５３】
励起光または蛍光マーカによる蛍光の光の放出に関する影響を有する更なる光の強度分布が局所的最小値を有する、本発明に従う方法の全ての態様において、（特許文献１）から既知の局所的最小値に隣接する最大値の領域内の高強度から現在測定されてない蛍光マーカを保護する概念が、改変形態で適用されることができる。とりわけ、それぞれの至近距離範囲内に局所的最小値を配置する前に、追加スイッチオフ光が、それが至近距離範囲に隣接する試料の部分的領域内で切り替え可能蛍光マーカを不活性状態にスイッチオフするような強度分布で試料に向けられる。したがって、蛍光マーカはそこで不活性状態にスイッチされ、ここで励起光または更なる光の最大値が現れ、およびここで、この保護手段なしで、蛍光マーカが、励起光または更なる光の高強度によって応力を加えられ、およびここからそれらが、現在の測定に影響を及ぼす蛍光の光だけを放出する。試料内のナノスケール構造体の絶対密度はその時、各ナノスケール構造体の測定がその隣接したナノスケール構造体に必ずしも光化学的に応力を加えることなく、かつナノスケール構造体からの蛍光の光が現在の測定を妨げることなくとりわけ高くなることができる。
【００５４】
本発明に従う方法の実際的な適用において、位置決め補助は、試料内に固定され、かつ試料内に所定のパターンで配置されることができる構造体に対する連結部位であることができる。とりわけ、構造体は免疫反応経由で連結部位に連結されることができる。ここで本発明に従う方法の適用の前に、最初は、追加蛍光マーカは蛍光の光が連結部位の位置を確定するために使用されることができる連結部位に連結されることができる。ここで、更なる蛍光マーカからの蛍光の光の非常に多くの光子が、非常に高い精度で連結部位の位置を確定するために使用されることができる。その後、ナノスケール構造体が本発明に従う方法の次に続く適用で連結される時、位置が既知である連結部位から、これらの更なる蛍光マーカが放出されることができる。
【００５５】
しかしながら、それらの位置が知られる前にナノスケール構造体が位置決め補助に連結される場合、ナノスケール構造体で蛍光マーカから蛍光の光を使用しなければならないことなく位置決め補助の位置を確定する可能性が、もたらされるべきである。このために、位置決め補助は、位置決め補助の位置がそれを用いて高精度で確定されることができる光を反射する金粒子または銀粒子または量子ドットを備えることができる。
【００５６】
本発明に従う方法の一実施態様において、測定されたナノスケール構造体は、等しいか、またはいくつかの等しい構造体を少なくとも含む。これらの等しい構造体は、ナノスケール構造体に関する周囲条件の影響を測定するために試料の異なる領域内の異なる周囲条件にさらされることができる。とりわけ、ナノスケール構造体での蛍光マーカの結果として生じる空間距離または相対的配置が、測定されることができる。
【００５７】
更に、例えば、変えられた周囲条件または、それに加えて、これらの反応の原動力に対する構造体の反応を測定するために、試料内の個別的な蛍光マーカの位置が、少なくとも２つの時点に対して記録される蛍光の光の強度からこれらの少なくとも２つの異なる時点に対して確定されることができる。このために、構造体はこれらの少なくとも２つの時点で異なる周囲条件にさらされることができるか、またはこの少なくとも２つの時点が周囲条件のこの種の変更に従うことができる。
【００５８】
最後に記述された本発明に従う方法の実施態様は、変えられた周囲条件が、調査されるべき物質の１つを追加することによって調節される薬物スクリーニングを実施することをとりわけ可能にする。それぞれの物質の追加に対する構造体の反応が、本発明に従う構造体の反復測定によって直接記録される。ナノスケール構造体で分析反応を実施する何の必要性も、ない。更に、本発明に従うこの種の薬物スクリーニングで費やされる調査されるべき物質の量は、わずかである。理論的には、ナノスケール構造体の１個への物質の各々の単一分子の追加で十分である。対応して、少ない量だけで利用可能な物質さえ、本発明に従う薬物スクリーニングで調べられることができる。
【００５９】
既知のＰＡＩＮＴ（ナノスケールトポグラフィでの画像形成のための点集積）概念によって示唆される本発明に従う方法の一実施態様において、蛍光マーカが、試料の中で移動可能であり、かつ異なる位置で構造体に個々に付着する蛍光マーカから選ばれる。これらの蛍光マーカは、それらが順々に個々に構造体に付着されるような濃度で、および空間分布で試料に追加される。それらが構造体に付着される時、それらの位置が本発明に従って確定される。したがって、本発明のこの実施態様において、蛍光マーカの同じ個別化が、ＰＡＩＮＴ概念の場合のように使用される。対応して、ＰＡＩＮＴ概念に対して既知であるこの個別化の全ての変形が、また、本発明に従う方法のこの実施態様で使用されることができる。したがって、蛍光マーカは、それらが蛍光の光の放出のために励起光によって励起可能でない不活性状態からそれらが蛍光の光の放出のために励起光によって励起可能である活性状態に移されることができる。この移動は、構造体への蛍光マーカの付着に起因することができる。代わりとしてまたは加えて、蛍光マーカが、一時的にだけ、またはそれらは永続的に、または少なくとも、それらが励起光および蛍光阻害光のうち少なくとも１つの長時間の影響に起因するそれぞれのナノスケール構造体の更なる測定を妨げない暗状態へ移されるような長い時間の間、構造体に付着することができる。
【００６０】
試料内の複数のナノスケール構造体を空間的に測定するための本発明に従う装置が、試料内の位置が既知であるかまたは位置決め補助によって反射される光から確定可能である位置決め補助に構造体の各々が連結され、以下の構成要素を備える：
−試料のための試料ホルダ、
−試料ホルダに向いている対物レンズ、
−対物レンズを用いてまたは同時に焦点を合わせられた更なる光を用いて焦点を合わせられる励起光の強度分布が局所的最小値を有するように、励起光および蛍光マーカによる蛍光の光の放出に関する影響を有する任意選択の更なる光を対物レンズに連結する光源、
−試料ホルダに関して最小値の位置をシフトするように構成されるスキャニングユニット、
−最小値の異なる位置に対して別々に試料から放出される蛍光の光を記録するように構成される検出器、
−最小値の異なる位置に対するそれぞれの蛍光マーカに対して記録される蛍光の光の強度から試料内の個別的な蛍光マーカの位置を確定するように構成される評価ユニット、および
−本発明に従う方法を自動的に実行するためのコントローラ。
【００６１】
次に図をより詳細に参照すると、流れ図で図１内に描かれる本発明に従う方法が、蛍光マーカによって異なる位置でナノスケール構造体をマークするステップ１で始める。これは、ナノスケール構造体の各々が、選ばれる少なくとも２個の各々に、および等しい構造体の場合にはまた、１個の蛍光マーカによって等しい位置にマークされることを意味する。それぞれの構造体の異なる位置に付着される蛍光マーカは、活性状態および不活性状態をそれらが有し、それらの間でそれらが移されることができる場合、同一であることができるか、またはそれらが蛍光の光の放出および励起に続いてそれらによって放出される蛍光の光に対して励起可能である励起光の少なくとも１つに関してそれらのスペクトル特性でそれらが異なる。
【００６２】
ナノスケール構造体を位置決め補助に連結するステップ２が、マークのステップ１の次のステップとして図１内に示される。構造体を位置決め補助に連結するステップ２は、しかしながら構造体をマークするステップ１に先行することができる。更に、マーク１および連結２のステップが同時に実施されるかもしれない。いずれにせよ、マーク１および連結２のステップの後、ナノスケール構造体は、各々数回マークされ、かつ個別的な位置決め補助に個々に連結されて存在する。本願明細書において、試料内の位置決め補助の位置は、それらが固定されていることを意味する既知であるか、またはそれらが例えば金粒子または銀粒子または量子ドットを含むので、位置決め補助によって反射される光からそれらが確定可能である。位置決め補助の位置のこの確定は、したがって蛍光の光の励起および放出によって蛍光マーカに応力を加えずに行われることができる。それらの実際の位置が常に確定可能な限り、位置決め補助が試料内で固定されず、試料内で移動することができることもまた可能である。試料内の位置決め補助の非固定位置によって、しかしながら、特定の位置決め補助におよびしたがってそれに対して連結される構造体に確かに常に個別的な構造体での蛍光マーカから生じる蛍光の光を割り当てることが可能であるように試料内の位置決め補助の距離が励起光および蛍光の光の波長での回折限界値の二倍より小さくならないことを確実にするのがより困難になる。
【００６３】
それぞれの位置決め補助の至近距離範囲内の異なる位置に光の強度分布の局所的最小値を配置するステップ３において、光の強度分布が、とりわけ励起光の１つであることができる。この強度分布の局所的最小値がそれぞれの位置決め補助の至近距離範囲内に配置される場合、それらの活性状態にある、かつ励起光を用いて励起されることができる蛍光マーカが、蛍光の光を放出する。本願明細書において、蛍光の光の強度は強度分布の局所的最小値までのそれぞれの蛍光マーカの距離に依存する。放出された蛍光の光を記録するステップ４が、蛍光の光が蛍光マーカの各々に対して別々に記録されるように実行される場合、異なる蛍光マーカからの蛍光の光が異なる波長に起因して分離されることができるか、または蛍光マーカの１個だけが、一度に活性であるので、最小値の異なる位置に対して記録されるそれぞれの蛍光マーカからの蛍光の光の強度から個別的な蛍光マーカの位置を確定する５ことが可能である。本願明細書において、記録される蛍光の光の光子の等しい数による、確定ステップ５の精度は局所的最小値の位置がすでに蛍光マーカの位置にどれくらい近いかに依存する。配置ステップ３で局所的最小値の位置が、連結された構造体およびそれに対して付着される蛍光マーカもまた位置づけられる、それぞれの位置決め補助の至近距離範囲内に配置されるという点で、蛍光マーカの位置を確定するステップ５の相対的精度は、この至近距離範囲の大きさに依存する。
【００６４】
位置決め補助の位置が、例えば少なくとも±４０ｎｍまたは±２０ｎｍまたは±１０ｎｍまたは±５ｎｍのように、非常に正確に知られる場合、およびそれらが同じ程度の位置決め補助の位置に最大距離を有するように、構造体を位置決め補助に連結するステップ２が実行される場合、最小値の位置が配置されるそれぞれの位置決め補助の至近距離範囲は、対応して小さく維持されることができる。それぞれの構造体がマークされる全ての蛍光マーカの位置が確定された場合、互いに関する蛍光マーカの相対位置、すなわち、それらの距離は特に興味があり、それぞれの構造体が測定される。この測定は、構造体の周囲条件を変えるステップ６の後でまたはその間に繰り返されることができる。ここで、試料内の全ての構造体の周囲条件が、同じ方法で変えられることができる。このようにして、例えば、周囲条件の同じ変更に対する異なるナノスケール構造体の反応が、記録されることができる。代わりとして、周囲条件を変えるステップ６は、試料の異なる領域でおよびしたがって、例えば、同じ構造体に対して異なる方法で異なって実行されることができる。例えば、物質に対する構造体の異なる反応を記録するために同じ構造体に対して試料の異なる領域内に異なる物質が追加されることができる。これは、例えば、薬物スクリーニングで実行されることができる。試料内の構造体が等しいかまたは異なるかにかかわらず独立に、配置３、記録４および確定５ステップを実行することによる構造体の新規の測定が、構造体の周囲条件を変えるステップ６に続く。
【００６５】
図２  （ａ）は、それぞれ、蛍光マーカ８または９によってその２つの末端の各々でマークされるナノスケール構造体７の一例を非常に図式的に示す。蛍光マーカ８および９は、異なって描かれる。すでに説明されたように、それらが活性状態と不活性状態との間で移動可能な場合、蛍光マーカもまた、等しくなることができる。これは、例えば、スイッチ光を繰り返し印加することによって一度だけ１個の蛍光マーカ８および一度だけ残りの蛍光マーカ９が活性になるスイッチ状態が達成されるようにそれらの活性状態または不活性状態に移動確率に従って蛍光マーカ８および９を移す追加スイッチ光を用いて達成されることができる。更に、中心連結点１０が構造体７に形成される。連結点１０は、位置決め補助１２の対応する連結部位１１への連結のために設計されている。
【００６６】
図２（ｂ）は、試料１３の残りに関して固定される、ここで連結部位１１だけから成る位置決め補助１２の連結部位１１に連結される連結点１０を示す。
【００６７】
図２（ｃ）は、他方、連結部位１１の他に、金粒子１４を含む位置決め補助１２に、連結点１０経由で連結される構造体７を示す。金粒子１４によって反射される光を用いて、それぞれの試料内の位置決め補助１２の交換位置さえ、励起光による励起および蛍光の光の放出によって蛍光マーカ８および９に応力を加えずに確定可能である。
【００６８】
図２（ｄ）は、構造体７の変えられた周囲条件の一例として物質１５の影響に起因して変えられる図２（ｃ）に従う位置決め補助１２に連結される構造体７を示す。とりわけ、それに対して付着される蛍光マーカ８および９の距離が縮小されるように、変更が構造体７の末端を共に折りたたむことから成る。したがって、物質１５に対する構造体７の反応は、蛍光マーカ８と９との間の距離を測定することによって直接記録されることができる。
【００６９】
図３は、その２つの末端の間の距離に対して直角の観察方向での位置決め補助１２を備えた構造体７を示し、図２（ｄ）に従って縮小された距離１６の他に、図２（ｃ）に従って引き伸ばされた構造体７による開始距離１７もまた、描かれる。更に、位置決め補助１２の既知のまたは前もって確定された位置１９のまわりの至近距離範囲１８が、図３内に描かれる。４つの異なる位置２０−２３でそれぞれの活性蛍光マーカ８、９を励起するための励起光の強度分布の局所的最小値が、この至近距離範囲内に配置され、位置２０は位置決め補助１２の位置１９と一致し、および位置２１−２３は位置１９、２０のまわりに円で等距離に配置される。各位置２０−２３に対して、それぞれの蛍光マーカ８、９からの蛍光の光が、別々に記録される。次に、至近距離範囲内のそれぞれの蛍光マーカ８、９の位置が、記録された蛍光の光の強度から非常に正確に確定されることができる。確定の精度は、至近距離範囲の寸法に、すなわち図３と比較して半分だけの大きさであることができるその直径に依存する。これはしかしながら、位置決め補助１２の位置１９が極端な精度で知られてかつ構造体７の中心と実際に一致することを要求する。ここで生じる不正確および変形を補うために、それが理想的な境界条件の下で必要に見えるより大きな至近距離範囲１８が、選ばれなければならない。
【００７０】
図４は、図３の観察方向による平面図（ａ）での、および局所的最小値２６を通してそれに対して直角に走る断面図（ｂ）での中心局所的最小値２６を有する励起光２５の強度分布２４を示す。局所的最小値２６は、強度分布の最大値２７によって全ての側で取り囲まれる。局所的最小値２６では、励起光２５の強度は理想的にはゼロまで下がる。最小値２６への増加する距離と共に、強度Ｉは、最初はそれがリング形状の最大値２７でその最大値に到達する前に二次元的に増大する。本発明に従う方法では、それぞれの蛍光マーカによって放出されてかつ記録される蛍光の光の強度が、最小値２６までの蛍光マーカの距離に関する肯定的な結論を可能にするように、強度Ｉが二次元的に増大する最小値２６のすぐまわりの領域が、この強度分布２４で使用される。それぞれの至近距離範囲内の最小値２６のいくつかの位置に対して確定される複数のこの種の距離から、蛍光マーカの正確な位置がしたがって、例えば三角測量によって、またはさらによりよくは局所的最小値を有する関数を最小値の個別的な位置に対して記録される蛍光の光の強度に適合することによって確定されることができる。
【００７１】
最小値の個別的な位置に対して記録される蛍光の光の強度に適合されるべき局所的最小値を有する空間関数が、局所的最小値２６までのそれぞれの蛍光マーカの距離への蛍光の光の強度の依存性を記述する。対応して、この関数は同じまたは類似の蛍光マーカまたは同じ有効断面積の光反射位置決め補助をさえスキャンすることによって確定されることができる。ここで、スキャンは、二次元関数の進路を確定するために、局所的最小値２６が、例えば少なくとも５ｘ５ステップまたは１０ｘ１０ステップのような小さいステップで実際にシフトされることを意味する。
【００７２】
図５は、本発明に従う方法の薬物スクリーニング実施態様を実施するための試料１３を示す。試料１３は、その外側周囲２８で試料１３を試料ホルダに配置するための定点２９を有する。それらの位置１９で、複数の位置決め補助１２が定点２９に関して方形パターンで配置される。各位置決め補助１２は、試料１３の凹部またはいわゆる穴部３０内に位置づけられる。線３１および列３２でそれに応じて配置される穴部３０は、試料１３内のそれぞれの穴部３０内の位置決め補助１２に連結される構造体に、物質を選択的に追加することを可能にする。したがって、異なる物質に対する等しいまたは等しくない構造体の反応が、記録されることができる。このために、構造体が、物質を追加する前に、かつ後に、かつ任意選択でさらにその間に、本発明に従う方法に従って測定され、図４に従う強度分布２４の最小値２６の位置が、位置決め補助のそれぞれの位置１９のまわりの至近距離範囲１８内に各々直接配置される。したがって、それぞれの構造体の反応が高速で、蛍光マーカあたり放出される低い数の光子で、かつそれにもかかわらず高精度で記録されることができる。
【００７３】
図６は、本発明に従う方法を実施するための装置３３を示す。装置３３は、試料１３のための試料ホルダ３４を備え、それによって試料１３が装置３３の更なる基部固定構成要素に関してそれを配置するために基部３５に関して移動可能である。この位置決めは、それぞれの位置決め補助のまわりのそれぞれの至近距離範囲１８に接近するためにとりわけ役に立つ。とりわけ、位置決めは対物レンズ３６によって試料に焦点を合わせられる励起光２５の強度分布に関して実行される。励起光２５は、対物レンズ３６を用いて焦点合せする際に図４に従う強度分布が試料１３内に調節されるように光源３７によって供給される。このために、光源３７、その上レーザー３８が、例えばいわゆるｅａｓｙＳＴＥＤ波長板の形のようなビーム整形手段３９を備える。また、スキャナに指定されるスキャニングユニット４０が、それぞれの至近距離範囲１８内で試料内の最小値２６をシフトするために設けられる。光源３７とスキャニングユニット４０との間に配置される二色性ビーム分割器４１が、共焦点検出器４５の方へ試料１３からの蛍光の光４２を出力結合する。コントローラ４３が、とりわけ薬物スクリーニングにおいて、本発明に従う方法を自動的に実行するために装置３３を制御する。ここで、装置３３はまた、個別的な穴部３０に異なる物質を追加するために図６内に描かれない追加装置を備えることもできる。コントローラ４３は、最小値の異なる位置に対するそれぞれの蛍光マーカに対して記録される蛍光の光の強度から試料内の個別的な蛍光マーカの位置を確定する評価ユニット４４を含む。
【００７４】
図７は、励起光２５の強度分布２４が局所的最小値２６でなく、しかし蛍光阻害光４６の形の更なる光４９の強度分布４８を有する本発明に従う方法の更なる一実施態様を例示する。ここで、強度最大値２７によって取り囲まれる強度分布４８の最小値２６は、強度分布２４の局所的最大値４７に関して同心円状に配置される。これは、局所的最小値２６までのその距離にわたってそれぞれの蛍光マーカによって放出される蛍光の光４２の空間的に限られた強度分布５０に帰着する。図７内に描かれる強度分布５０は、最大値２７での蛍光阻害光４６の極めて高い強度による強度分布４８から生じる。換言すれば、図７内の強度分布４８は、強く縮小されたスケールで描かれている。強度分布５０を使用して、蛍光の光４２を放出する個々に区別された蛍光マーカの位置上の局所的最小値２６の異なる位置に対して記録される蛍光の光４２から結論を出すことが、可能である。このために、強度分布５０を再現する際に局所的最大値を有する空間関数が、記録された蛍光の光の強度に適合されることができる。空間関数は、また、それぞれの蛍光マーカまたは類似の蛍光マーカまたは局所的最小値２６と同じ有効断面積の位置決め補助をスキャンし、かつ試料から放出される蛍光の光４２を記録することによって確定されることができる。
【００７５】
流れ図で図８内に描かれる本発明に従う方法の別の態様において、図７内に例示する同じ強度分布２４および４８が、使用される。この他の態様において、本発明に従う方法は、蛍光マーカによって異なる位置で少なくとも１個のナノスケール構造体をマークするステップ１０１で始める。これは、この少なくとも１個のナノスケール構造体が１個の蛍光マーカによって少なくとも２つの選ばれた位置の各々でマークされることを意味する。それらが移されることができる活性状態および不活性状態をそれらが有する場合、この少なくとも１個の構造体の異なる位置に付着される蛍光マーカは同一であることができるか、または、それらは蛍光の光の放出のためにそれらが励起可能である励起光および励起に続いてそれらによって放出される蛍光の光のうち少なくとも１つに関してそれらのスペクトル特性が異なる。
【００７６】
この少なくとも１個のナノスケール構造体を位置決め補助に連結するステップ１０２が、マーク１０１のステップに続くステップとして図８内に示される。この少なくとも１個の構造体を位置決め補助に連結するステップ１０２は、しかしながら構造体をマークするステップ１０１に先行することができる。更に、マーク１０１および連結１０２のステップが同時に実施されるかもしれない。いっそう更に、連結１０２のステップは本発明に従う方法のこの別の態様で回避されさえすることができる。連結のステップ１０２が実行される場合、マーク１０１および連結１０２のステップの後、この少なくとも１個の構造体が数回マークされてかつ位置決め補助に連結される。試料内の位置決め補助の位置は、それが固定されていることを意味する既知であるか、またはそれが、例えば、金粒子または銀粒子または量子ドットから選ばれる光反射粒子を含むので位置決め補助によって反射される光からそれが確定可能であることができる。位置決め補助の位置の確定は、したがって蛍光の光の励起および放出によって蛍光マーカに応力を加えずに行われることができる。
【００７７】
蛍光の光の放出のために励起光によって蛍光マーカを励起するステップ１０３において蛍光阻害光の強度分布の局所的最小値を位置決め補助の至近距離範囲内の異なる位置に配置すると共に、励起光２５の強度分布２４が、蛍光阻害光４６の強度分布４８の局所的最小値のそれぞれの位置で最大値を有することができる。蛍光阻害光の強度分布の局所的最小値および励起光の強度分布の最大値がそれぞれの位置決め補助の至近距離範囲内に共に配置される場合、それらの活性状態にあるかつ励起光によって励起されることができる蛍光マーカが、蛍光の光を放出する。ここで、蛍光の光の強度は蛍光阻害光の強度分布の局所的最小値までのそれぞれの蛍光マーカの距離に依存する。
【００７８】
蛍光の光が蛍光マーカの各々に対して別々に記録されるように、放出された蛍光の光を記録するステップ１０４が実行される場合、異なる蛍光マーカからの蛍光の光が異なる波長に起因して分離されることができるので、または蛍光マーカの１つだけが活性であるので、最小値の異なる位置に対するそれぞれの蛍光マーカからの蛍光の光の強度から個別的な蛍光マーカの位置を確定する１０５ことが可能である。記録される同じ数の蛍光の光の光子によって、確定のステップ１０５の精度は、局所的最小値の位置がすでにそれぞれの蛍光マーカの位置にどれくらい近くにあるかに依存する。励起ステップ１０３での局所的最小値の位置が、連結された構造体および付着された蛍光マーカがさらに位置づけられる位置決め補助の至近距離範囲内に配置されるという点で、蛍光マーカの位置を確定する１０５際の相対的精度は、この至近距離範囲の寸法に依存する。
【００７９】
位置決め補助の位置が非常に正確に知られる場合、およびそれが同じ程度の位置決め補助の位置に最大距離を有するように、この少なくとも１個の構造体を位置決め補助に連結するステップ１０２が実行される場合、最小値の位置が配置されるそれぞれの位置決め補助の至近距離範囲は、対応して小さくなることができる。この少なくとも１個の構造体がマークされる全ての蛍光マーカの位置が確定された場合、それぞれの構造体が測定される。この測定は、本発明に従う方法のこの他の態様における任意選択のステップであるこの少なくとも１個の構造体の周囲条件を変えるステップ１０６の後でまたはその間に繰り返されることができる。
【００８０】
多くの変形例および変更が、本発明の主旨および原則から実質的に逸脱することなく本発明の好ましい実施態様に対してなされることができる。全てのこの種の変更および変形例は、以下の請求項によって定められるように、本発明の範囲内で本願明細書に含まれることを目的とされる。
【符号の説明】
【００８１】
７  ナノスケール構造体
８  蛍光マーカ
９  蛍光マーカ
１０  中心連結点
１１  連結部位
１２  位置決め補助
１３  試料
１４  金粒子
１５  物質
１６  縮小された距離
１７  開始距離
１８  至近距離範囲
１９、２０−２３  位置
２４  強度分布
２５  励起光
２６  局所的最小値
２７  最大値
２８  外側周囲
２９  定点
３０  穴部
３１  線
３２  列
３３  装置
３４  試料ホルダ
３５  基部
３６  対物レンズ
３７  光源
３８  レーザー
３９  ビーム整形手段
４０  スキャニングユニット
４１  二色性ビーム分割器
４２  蛍光の光
４３  コントローラ
４４  評価ユニット
４５  共焦点検出器
４６  蛍光阻害光
４７  局所的最大値
４８  強度分布
４９  更なる光
５０  強度分布
Ｉ  強度
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2018169387.tif 000009
【図８】
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【外国語明細書】
2018169387000001.pdf