(57)【要約】      （修正有）【課題】変異体クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａおよび／または変異体クロストリジウム・ディフィシル毒素Ｂが含まれる免疫原性組成物の提供。【解決手段】哺乳類において、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａに対する免疫応答を誘導するための、精製しホルムアルデヒドに接触させられたクロストリジウム・ディフィシル毒素Ａおよび薬学的に許容可能なキャリヤーを含む組成物の使用であって、ホルムアルデヒドに接触させられたクロストリジウム・ディフィシル毒素Ａが、疎水性相互作用クロマトグラフィーによって精製され、ホルムアルデヒドと接触させることによって生産され、０．００１から０．０１％のホルムアルデヒドをさらに含む、組成物の使用。【選択図】図２５
2018052938.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類において、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａに対する免疫応答を誘導するための、精製したクロストリジウム・ディフィシル毒素Ａを含む組成物の使用であって、組成物が４週間に３回投与される、使用。
【請求項２】
誘導される免疫応答が中和抗体を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
精製したクロストリジウム・ディフィシル毒素Ａが凍結乾燥されている、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
組成物が水酸化アルミニウムをさらに含む、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
組成物がリン酸ナトリウムをさらに含む、請求項１に記載の使用。
【請求項６】
組成物がリン酸カリウムをさらに含む、請求項１に記載の使用。
【請求項７】
組成物がホルムアルデヒドをさらに含む、請求項１に記載の使用。
【請求項８】
組成物がポリソルベート８０をさらに含む、請求項１に記載の使用。
【請求項９】
組成物がヒスチジンをさらに含む、請求項１に記載の使用。
【請求項１０】
組成物がスクロースをさらに含む、請求項１に記載の使用。
【請求項１１】
哺乳類において、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａに対する免疫応答を誘導するための、精製し架橋されているクロストリジウム・ディフィシル毒素Ａおよび薬学的に許容可能なキャリヤーを含む組成物の使用であって、前記架橋されているクロストリジウム・ディフィシル毒素Ａが、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーによって精製され、架橋剤と接触させることによって生産される、前記組成物の使用。
【請求項１２】
架橋剤がホルムアルデヒドである、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａがホルムアルデヒドと１から７日間接触させられる、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
接触が、最大６日間である、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
接触が、約２５℃で行わる、請求項１１に記載の使用。
【請求項１６】
組成物が０．００１から０．０１％のホルムアルデヒドをさらに含む、請求項１２に記載の使用。
【請求項１７】
イオン交換クロマトグラフィーが陰イオン交換クロマトグラフィーである、請求項１１に記載の使用。
【請求項１８】
イオン交換クロマトグラフィーが陽イオン交換クロマトグラフィーである、請求項１１に記載の使用。
【請求項１９】
組成物が水酸化アルミニウムをさらに含む、請求項１１に記載の使用。
【請求項２０】
組成物がリン酸ナトリウムをさらに含む、請求項１１に記載の使用。
【請求項２１】
組成物がリン酸カリウムをさらに含む、請求項１１に記載の使用。
【請求項２２】
組成物がポリソルベート８０をさらに含む、請求項１に記載の使用。
【請求項２３】
組成物がヒスチジンをさらに含む、請求項１１に記載の使用。
【請求項２４】
組成物がスクロースをさらに含む、請求項１１に記載の使用。
【請求項２５】
哺乳類において、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａに対する免疫応答を誘導するための、精製しホルムアルデヒドに接触させられたクロストリジウム・ディフィシル毒素Ａおよび薬学的に許容可能なキャリヤーを含む組成物の使用であって、前記ホルムアルデヒドに接触させられたクロストリジウム・ディフィシル毒素Ａが、疎水性相互作用クロマトグラフィーによって精製され、ホルムアルデヒドと接触させることによって生産され、０．００１から０．０１％のホルムアルデヒドをさらに含む、前記組成物の使用。
【請求項２６】
クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａがホルムアルデヒドと１から７日間接触させられる、請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
接触が、最大６日間である、請求項２５に記載の使用。
【請求項２８】
接触が、約２５℃で行わる、請求項２５に記載の使用。
【請求項２９】
ホルムアルデヒドとの接触前に、前記毒素がイオン交換クロマトグラフィーでさらに精製される、請求項２５に記載の使用。
【請求項３０】
ホルムアルデヒドとの接触前に、前記毒素が疎水性相互作用クロマトグラフィーおよび陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製される、請求項２５に記載の使用。
【請求項３１】
組成物が水酸化アルミニウムをさらに含む、請求項２５に記載の使用。
【請求項３２】
組成物がリン酸ナトリウムをさらに含む、請求項２５に記載の使用。
【請求項３３】
組成物がリン酸カリウムをさらに含む、請求項２５に記載の使用。
【請求項３４】
組成物がポリソルベート８０をさらに含む、請求項２５に記載の使用。
【請求項３５】
組成物がヒスチジンをさらに含む、請求項２５に記載の使用。
【請求項３６】
組成物がスクロースをさらに含む、請求項２５に記載の使用。
【請求項３７】
免疫応答が、毒素タイプ０を含むクロストリジウム・ディフィシル毒素Ａに対するものである、請求項２５に記載の使用。
【請求項３８】
免疫応答が、毒素タイプＩを含むクロストリジウム・ディフィシル毒素Ａに対するものである、請求項２５に記載の使用。
【請求項３９】
免疫応答が、毒素タイプＩＩＩを含むクロストリジウム・ディフィシル毒素Ａに対するものである、請求項２５に記載の使用。
【請求項４０】
免疫応答が、毒素タイプＩＶを含むクロストリジウム・ディフィシル毒素Ａに対するものである、請求項２５に記載の使用。
【請求項４１】
免疫応答が、毒素タイプＶを含むクロストリジウム・ディフィシル毒素Ａに対するものである、請求項２５に記載の使用。
【請求項４２】
免疫応答が、毒素タイプＶＩＩＩを含むクロストリジウム・ディフィシル毒素Ａに対するものである、請求項２５に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１１年４月２２に出願された米国仮特許出願第６１／４７８，４７４号
、および２０１１年４月２５日に出願された米国仮特許出願第６１／４７８，８９９号の
利益を主張する。前記の出願の全内容は参照により本明細書にそのまま援用される。
【０００２】
本発明は、変異体クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆ
ｆｉｃｉｌｅ）毒素に関する組成物およびその方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ディフィシル）は、ヒトにおける胃腸疾患と関
係しているグラム陽性嫌気性細菌である。Ｃ．ディフィシルのコロニー形成は、通常は結
腸において天然の腸管内菌叢が抗生物質による処置により減少した場合に起こる。感染は
、グルコシル化毒素である毒素Ａおよび毒素Ｂ（それぞれ３０８および２７０ｋＤａ）の
分泌により抗生物質関連下痢および時として偽膜性大腸炎につながる可能性があり、それ
はＣ．ディフィシルの主な病毒性因子である。
【０００４】
毒素Ａおよび毒素Ｂは、１９ｋｂの病原性遺伝子座（ＰａＬｏｃ）内でそれぞれ遺伝子
ｔｃｄＡおよびｔｃｄＢによりコードされている。Ｃ．ディフィシルの非病原性株は、代
わりの１１５塩基対の配列により置き換えられたこの遺伝子座を有する。
【０００５】
毒素Ａおよび毒素Ｂは両方とも強力な細胞毒である。これらのタンパク質は、Ｒｈｏ／
Ｒａｃ／Ｒａｓファミリーの低分子量ＧＴＰアーゼを不活性化する相同性のグルコシルト
ランスフェラーゼである。結果として起こるシグナル伝達の崩壊は、細胞間結合の喪失、
アクチン細胞骨格の調節不全、および／またはアポトーシスを引き起こし、結果としてク
ロストリジウム・ディフィシル感染（ＣＤＩ）と関係する重度の分泌性下痢をもたらす。
【０００６】
過去１０年で、病院、養護ホーム、および他の長期療養施設におけるＣ．ディフィシル
の大流行の数および重症度は劇的に増大した。この増大における重要な要因には、高病毒
性（ｈｙｐｅｒｖｉｒｕｌｅｎｔ）病原性株の出現、増大した抗生物質の使用、向上した
検出法、および健康管理施設における空気伝染性の芽胞への曝露の増大が含まれる。
【０００７】
メトロニダゾールおよびバンコマイシンは、Ｃ．ディフィシル関連疾患（ＣＤＡＤ）の
抗生物質処置に関するケアの現在受け入れられている標準である。しかし、そのような処
置を受ける患者の約２０％はＣＤＩの第１エピソードの後に感染の再発を経験し、それら
の患者の約５０％に至るまでが追加の再発に苦しむ。再発の処置は非常に重要な課題であ
り、再発の大部分は通常は前のエピソードの１ヶ月以内に起こる。
【０００８】
従って、Ｃ．ディフィシルに向けられた免疫原性および／または療法組成物ならびにそ
の方法に関する必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００９】
これらのおよび他の目的が本明細書における発明により提供される。
１側面において、本発明は、変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ａが含まれる免疫原性組成物
に関する。その変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ａには、対応する野生型のＣ．ディフィシル
毒素Ａと比較して少なくとも１個の変異を有するグルコシルトランスフェラーゼドメイン
および少なくとも１個の変異を有するシステインプロテアーゼドメインが含まれる。１態
様において、その変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ａの少なくとも１個のアミノ酸が化学的に
架橋されている。
【００１０】
１側面において、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４で示されるアミノ酸配列が含まれる
単離されたポリペプチドに関し、ここで１位のメチオニン残基は場合により存在せず、こ
こでそのポリペプチドには１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイ
ミド（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）により化学的に修飾され
た少なくとも１個のアミノ酸側鎖が含まれる。
【００１１】
１態様において、その変異体Ｃ．ディフィシル毒素の少なくとも１個のアミノ酸が化学
的に架橋されている。
１態様において、その少なくとも１個のアミノ酸はホルムアルデヒド、１−エチル−３
−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、Ｎ−ヒドロキシスクシネ
ート、またはＥＤＣおよびＮＨＳの組み合わせにより化学的に架橋される。
【００１２】
１態様において、その免疫原性組成物はそれぞれの抗毒素中和抗体またはその結合断片
により認識される。
１態様において、その免疫原性組成物は、対応する野生型のＣ．ディフィシル毒素と比
較して減少した細胞毒性を示す。
【００１３】
別の側面において、本発明は変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ａが含まれる免疫原性組成物
に関し、それには対応する野生型のＣ．ディフィシル毒素Ａと比較して２８５位および２
８７位においてアミノ酸置換を有するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９を有するグルコシルトラ
ンスフェラーゼドメインならびに１５８位においてアミノ酸置換を有するＳＥＱ  ＩＤ  
ＮＯ：３２を有するシステインプロテアーゼドメインが含まれ、ここでその変異体Ｃ．デ
ィフィシル毒素Ａの少なくとも１個のアミノ酸が化学的に架橋されている。
【００１４】
さらなる側面において、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４が含まれる変異体Ｃ．ディフ
ィシル毒素Ａが含まれる免疫原性組成物に関し、ここでその変異体Ｃ．ディフィシル毒素
Ａの少なくとも１個のアミノ酸が化学的に架橋されている。
【００１５】
さらに別の側面において、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：
５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８
が含まれる免疫原性組成物に関する。
【００１６】
１側面において、本発明は変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ｂが含まれる免疫原性組成物に
関する。その変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ｂには、対応する野生型のＣ．ディフィシル毒
素Ｂと比較して少なくとも１個の変異を有するグルコシルトランスフェラーゼドメインお
よび少なくとも１個の変異を有するシステインプロテアーゼドメインが含まれる。
【００１７】
別の側面において、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６で示されるアミノ酸配列が含まれ
る単離されたポリペプチドに関し、ここで１位のメチオニン残基は場合により存在せず、
ここでそのポリペプチドには１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジ
イミド（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）により化学的に修飾さ
れたアミノ酸側鎖が含まれる。
【００１８】
別の側面において、本発明は変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ｂが含まれる免疫原性組成物
に関し、それには対応する野生型のＣ．ディフィシル毒素Ｂと比較して２８６位および２
８８位においてアミノ酸置換を有するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１を有するグルコシルトラ
ンスフェラーゼドメインならびに１５５位においてアミノ酸置換を有するＳＥＱ  ＩＤ  
ＮＯ：３３を有するシステインプロテアーゼドメインが含まれ、ここでその変異体Ｃ．デ
ィフィシル毒素Ｂの少なくとも１個のアミノ酸が化学的に架橋されている。
【００１９】
さらなる側面において、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６が含まれる変異体Ｃ．ディフ
ィシル毒素Ｂが含まれる免疫原性組成物に関し、ここでその変異体Ｃ．ディフィシル毒素
Ｂの少なくとも１個のアミノ酸が化学的に架橋されている。
【００２０】
１側面において、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４が含まれる変異体Ｃ．ディフィシル
毒素ＡおよびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６が含まれる変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ｂが含まれ
る免疫原性組成物に関し、ここでその変異体Ｃ．ディフィシル毒素のそれぞれの少なくと
も１個のアミノ酸が化学的に架橋されている。
【００２１】
さらなる側面において、本発明は前述の変異体Ｃ．ディフィシル毒素のいずれかをコー
ドするポリヌクレオチドが含まれる組み換え細胞またはその子孫に関し、ここでその細胞
は毒素をコードする内在性のポリヌクレオチドを欠いている。
【００２２】
別の側面において、本発明は、変異体Ｃ．ディフィシル毒素が含まれる免疫原性組成物
に特異的な抗体またはその抗体結合断片に関する。
１側面において、本発明は、哺乳類においてＣ．ディフィシル感染症を処置する方法に
関する。その方法には、その哺乳類にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４が含まれる変異体Ｃ．ディ
フィシル毒素ＡおよびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６が含まれる変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ｂ
が含まれる免疫原性組成物を投与することが含まれ、ここでその変異体Ｃ．ディフィシル
毒素のそれぞれの少なくとも１個のアミノ酸がホルムアルデヒドにより架橋されている。
【００２３】
別の側面において、その哺乳類においてＣ．ディフィシル感染症を処置する方法には、
その哺乳類にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４が含まれる変異体Ｃ．ディフィシル毒素ＡおよびＳ
ＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６が含まれる変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ｂが含まれる免疫原性組成
物を投与することが含まれ、ここでその変異体Ｃ．ディフィシル毒素のそれぞれの少なく
とも１個のアミノ酸が１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
および／またはＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）により架橋されている。
【００２４】
１側面において、本発明は哺乳類においてＣ．ディフィシル感染症に対する免疫応答を
誘導する方法に関する。その方法には、その哺乳類にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４が含まれる
変異体Ｃ．ディフィシル毒素ＡおよびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６が含まれる変異体Ｃ．ディ
フィシル毒素Ｂが含まれる免疫原性組成物を投与することが含まれ、ここでその変異体Ｃ
．ディフィシル毒素のそれぞれの少なくとも１個のアミノ酸がホルムアルデヒドにより架
橋されている。
【００２５】
別の側面において、哺乳類においてＣ．ディフィシル感染症に対する免疫応答を誘導す
る方法には、その哺乳類にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４が含まれる変異体Ｃ．ディフィシル毒
素ＡおよびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６が含まれる変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ｂが含まれる
免疫原性組成物を投与することが含まれ、ここでその変異体Ｃ．ディフィシル毒素のそれ
ぞれの少なくとも１個のアミノ酸が１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カ
ルボジイミドおよび／またはＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）により架橋されて
いる。
【００２６】
１態様において、その処置の方法または免疫応答を誘導する方法は、それを必要とする
哺乳類においてである。
１態様において、その処置の方法または免疫応答を誘導する方法には、再発性Ｃ．ディ
フィシル感染症を有していた哺乳類が含まれる。
【００２７】
１態様において、その処置の方法または免疫応答を誘導する方法には、その組成物を非
経口投与することが含まれる。
１態様において、その処置の方法または免疫応答を誘導する方法には、さらにアジュバ
ントが含まれる免疫原性組成物が含まれる。
【００２８】
１態様において、そのアジュバントには水酸化アルミニウムゲルおよびＣｐＧオリゴヌ
クレオチドが含まれる。別の態様において、そのアジュバントにはＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ
が含まれる。
【００２９】
１態様において、その単離されたポリペプチドには、グリシンにより化学的に修飾され
ているそのポリペプチドのアスパラギン酸残基の少なくとも１個の側鎖またはそのポリペ
プチドのグルタミン酸残基の少なくとも１個の側鎖が含まれる。
【００３０】
１態様において、その単離されたポリペプチドには、そのポリペプチドのアスパラギン
酸残基の側鎖およびそのポリペプチドのリシン残基の側鎖の間の少なくとも１個の架橋；
ならびにそのポリペプチドのグルタミン酸残基の側鎖およびそのポリペプチドのリシン残
基の側鎖の間の少なくとも１個の架橋が含まれる。
【００３１】
１態様において、その単離されたポリペプチドには、そのポリペプチドの少なくとも１
個のリシン残基の側鎖に連結されたベータ−アラニン部分が含まれる。
１態様において、その単離されたポリペプチドには、そのポリペプチドのアスパラギン
酸残基の側鎖に、またはそのポリペプチドのグルタミン酸残基の側鎖に連結されたグリシ
ン部分が含まれる。
【００３２】
１態様において、その単離されたポリペプチドにはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４で示される
アミノ酸配列が含まれ、ここで１位のメチオニン残基は場合により存在せず、ここでその
ポリペプチドの少なくとも１個のリシン残基の側鎖はベータ−アラニン部分に連結されて
いる。
【００３３】
１態様において、その単離されたポリペプチドにはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６で示される
アミノ酸配列が含まれ、ここで１位のメチオニン残基は場合により存在せず、ここでその
ポリペプチドの少なくとも１個のリシン残基の側鎖はベータ−アラニン部分に連結されて
いる。
【００３４】
１態様において、その単離されたポリペプチドには、アスパラギン酸残基の側鎖に、ま
たはグルタミン酸残基の側鎖に連結された、そのポリペプチドの第２のリシン残基の側鎖
が含まれる。
【００３５】
１態様において、その単離されたポリペプチドには、グリシン部分に連結されたそのポ
リペプチドのアスパラギン酸残基の側鎖またはグルタミン酸残基の側鎖が含まれる。
１態様において、その単離されたポリペプチドは少なくとも約１００μｇ／ｍｌのＥＣ
５０を有する。
【００３６】
１側面において、その免疫原性組成物にはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４で示されるアミノ酸
配列を有する単離されたポリペプチド（ここで１位のメチオニン残基は場合により存在し
ない）およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６で示されるアミノ酸配列を有する単離されたポリペ
プチド（ここで１位のメチオニン残基は場合により存在しない）が含まれ、ここでそのポ
リペプチドは１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ
）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）により化学的に修飾された少なくとも
１個のアミノ酸側鎖を有する。
【００３７】
１態様において、そのポリペプチドには以下のいずれかの少なくとも１つが含まれる：
ａ）ａ）そのポリペプチドのリシン残基の側鎖に連結された少なくとも１個のベータ−ア
ラニン部分；ｂ）そのポリペプチドのリシン残基の側鎖およびアスパラギン酸残基の側鎖
の間の少なくとも１個の架橋；ならびにｃ）そのポリペプチドのリシン残基の側鎖および
グルタミン酸残基の側鎖の間の少なくとも１個の架橋。
【００３８】
１態様において、その単離されたポリペプチドは少なくとも約１００μｇ／ｍｌのＥＣ
５０を有する。
１側面において、その免疫原性組成物にはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４で示されるアミノ酸
配列を有する単離されたポリペプチド（ここで１位のメチオニン残基は場合により存在し
ない）およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６で示されるアミノ酸配列を有する単離されたポリペ
プチド（ここで１位のメチオニン残基は場合により存在しない）が含まれ、ａ）ここでＳ
ＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の少なくとも１個のリシン残基の側鎖はベータ−アラニン部分に連
結されており、そしてｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６の少なくとも１個のリシン残基の側鎖
はベータ−アラニン部分に連結されている。
【００３９】
１態様において、その免疫原性組成物には、アスパラギン酸残基の側鎖に、またはグル
タミン酸残基の側鎖に連結されているＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の第２のリシン残基の側鎖
が含まれ、ここでＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６の第２のリシン残基はアスパラギン酸残基の側
鎖に、またはグルタミン酸残基の側鎖に連結されている。
【００４０】
１態様において、その免疫原性組成物には、グリシン部分に連結されているＳＥＱ  Ｉ
Ｄ  ＮＯ：４で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドのアスパラギン酸残基の側鎖
またはグルタミン酸残基の側鎖が含まれ、ここで１位のメチオニン残基は場合により存在
しない。
【００４１】
１態様において、その免疫原性組成物には、グリシン部分に連結されているＳＥＱ  Ｉ
Ｄ  ＮＯ：６で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドのアスパラギン酸残基の側鎖
またはグルタミン酸残基の側鎖が含まれ、ここで１位のメチオニン残基は場合により存在
しない。
【００４２】
１態様において、その単離されたポリペプチドは少なくとも約１００μｇ／ｍｌのＥＣ
５０を有する。
１側面において、そのその免疫原性組成物には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４で示される
アミノ酸配列を有する単離されたポリペプチドおよびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６で示され
るアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチドが含まれ、ここでそれぞれのポリペプチ
ドには以下：ａ）そのポリペプチドのアスパラギン酸残基の側鎖およびそのポリペプチド
のリシン酸残基の側鎖の間の少なくとも１個の架橋；ｂ）そのポリペプチドのグルタミン
酸残基の側鎖およびそのポリペプチドのリシン酸残基の側鎖の間の少なくとも１個の架橋
；ｃ）そのポリペプチドの少なくとも１個のリシン残基の側鎖に連結されたベータ−アラ
ニン部分；ならびにｄ）そのポリペプチドの少なくとも１個のアスパラギン酸残基の側鎖
に、またはそのポリペプチドの少なくとも１個のグルタミン酸残基の側鎖に連結されたグ
リシン部分が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１：ＣＬＵＳＴＡＬＷアラインメント、初期設定のパラメーターを用いた、株６３０、ＶＰＩ１０４６３、Ｒ２０２９１、ＣＤ１９６からの野生型Ｃ．ディフィシル毒素Ａ、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４を有する変異体毒素Ａの配列アラインメント。
【図２】図２：ＣＬＵＳＴＡＬＷアラインメント、初期設定のパラメーターを用いた、株６３０、ＶＰＩ１０４６３、Ｒ２０２９１、ＣＤ１９６からの野生型Ｃ．ディフィシル毒素Ｂ、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６を有する変異体毒素Ｂの配列アラインメント。
【図３】図３：野生型毒素陰性Ｃ．ディフィシル株の同定を示すグラフ。１３のＣ．ディフィシル株の培養液を毒素Ａに関するＥＬＩＳＡにより試験した。図説されているように、７つの株が毒素Ａを発現しており、６つの株（株１３５１、３２３２、７３２２、５０３６、４８１１およびＶＰＩ  １１１８６）は発現していなかった。
【図４】図４ＡおよびＢ：三重変異体Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、二重変異体Ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、および三重変異体Ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）はＵＤＰ−１４Ｃ−グルコースを用いるインビトログルコシル化アッセイにおいてＲａｃ１またはＲｈｏＡ  ＧＴＰアーゼをグルコシル化せず；一方で１０μｇ〜１ｎｇの野生型毒素ＢはＲａｃ１をグルコシル化することを説明するＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果。
【図５】図５：野生型毒素ＡおよびＢ（それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１および２）の切断された断片の観察と比較した、変異体毒素ＡおよびＢ（それぞれＳＥＱ  ＩＤＮＯ：４および６）におけるシステインプロテアーゼ活性の抑止（ａｂｒｏｇａｔｉｏｎ）を示すウェスタンブロット。実施例１３参照。
【図６】図６：三重変異体毒素ＡおよびＢ（それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４および６）はＩＭＲ−９０細胞におけるインビトロ細胞毒性アッセイにより高濃度（例えば約１００μｇ／ｍｌ）で試験した際に残存する細胞毒性を示すことを示すグラフ。
【図７】図７：三重変異体毒素Ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）および七重変異体毒素Ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）に関してＥＣ５０値が類似していることを示すグラフ。
【図８】図８：ＡＴＰレベル（ＲＬＵ）を三重変異体ＴｃｄＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）（上のパネル）および三重変異体ＴｃｄＢ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）（下のパネル）の増大する濃度に対してプロットした、インビトロ細胞毒性試験からの結果を表すグラフ。変異体毒素ＡおよびＢの残存する細胞毒性は、変異体毒素Ａに特異的な中和抗体（上のパネル−ｐＡｂ  ＡおよびｍＡｂ  Ａ３−２５＋Ａ６０−２２）および変異体毒素Ｂに特異的な中和抗体（下のパネル−ｐＡｂ  Ｂ）により完全に抑止され得る。
【図９】図９：処理の７２時間後におけるＩＭＲ−９０細胞の形態の画像。パネルＡはモック処理した対照細胞を示す。パネルＢはホルマリンで不活性化した変異体ＴｃｄＢ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）による処理後の細胞の形態を示す。パネルＣはＥＤＣで不活性化した変異体ＴｃｄＢ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）による処理後の細胞の形態を示す。パネルＤは野生型毒素Ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）による処理後の細胞の形態を示す。パネルＥは三重変異体ＴｃｄＢ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）による処理後の細胞の形態を示す。類似の結果がＴｃｄＡ処理に関して観察された。
【図１０】図１０：実施例２５（試験ｍｕＣｄｉｆｆ２０１０−０６）で記述されるような中和抗体の力価を示すグラフ。
【図１１】図１１：実施例２６（試験ｍｕＣｄｉｆｆ２０１０−０７）で記述されるような中和抗体の力価を示すグラフ。
【図１２】図１２：実施例２７（試験ｈａｍＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ２０１０−０２）で記述されるようなハムスターにおける４回の免疫処置後の毒素ＡおよびＢに対する中和抗体応答を示すグラフ。
【図１３】図１３：実施例２７（試験ｈａｍＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ２０１０−０２）で記述されるような、ハムスターにおける化学的に不活性化された遺伝子変異体毒素およびＬｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌトキソイドによるワクチン接種後の中和抗体応答を示すグラフ。
【図１４】図１４：実施例２８（試験ｈａｍＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ２０１０−０２、続き）で記述される、免疫処置されていない対照と比較した３つの免疫処置されたハムスターの群に関する生存曲線。
【図１５】図１５：実施例２９で記述されるような、ハムスターにおけるＣ．ディフィシル変異体毒素の異なる配合物に対する相対的中和抗体応答を示すグラフ（試験ｈａｍＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ２０１０−０３）。
【図１６Ａ】図１６Ａ〜Ｂ：実施例３０で記述されるような、カニクイザル・マカク（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  ｍａｃａｑｕｅｓ）における化学的に不活性化された遺伝子変異体毒素ＡおよびＢ（それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４および６）に対する強い相対的中和抗体応答を示すグラフ。
【図１６Ｂ】図１６Ａ〜Ｂ：実施例３０で記述されるような、カニクイザル・マカク（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  ｍａｃａｑｕｅｓ）における化学的に不活性化された遺伝子変異体毒素ＡおよびＢ（それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４および６）に対する強い相対的中和抗体応答を示すグラフ。
【図１７】図１７：Ａ３−２５  ｍＡｂ  ＩｇＥの軽（ＶＬ）および重（ＨＬ）鎖の可変領域のアミノ酸配列。シグナルペプチドは強調され；ＣＤＲはイタリック体にされて下線が引かれ；定常領域は太字にされて下線が引かれている（完全な配列は示されていない）。
【図１８】図１８：細胞生存度の指標として（相対光単位−ＲＬＵにより定量化される）ＡＴＰレベルを用いる毒素中和アッセイにおける個々の毒素Ａモノクローナル抗体の力価測定を示すグラフ。毒素（４×ＥＣ５０）対照と比較して、ｍＡｂ  Ａ８０−２９、Ａ６５−３３、Ａ６０−２２およびＡ３−２５は濃度と共に増大する毒素Ａへの中和作用を有していたが、陽性ウサギ抗毒素Ａ対照のレベルまでではなかった。ｍＡｂ  Ａ５０−１０、Ａ５６−３３、およびＡ５８−４６は毒素Ａを中和しなかった。細胞のみの対照は１〜１．５×１０６ＲＬＵであった。
【図１９】図１９：毒素Ｂ  ｍＡｂの８個のエピトープの群のＢｉａＣｏｒｅによるマッピング。
【図２０Ａ】図２０Ａ〜Ｃ：毒素Ａ  ｍＡｂの組み合わせの相乗的中和活性：異なる希釈度の中和抗体Ａ６０−２２、Ａ６５−３３、およびＡ８０−２９の、増大する濃度のＡ３−２５  ｍＡｂへの添加は、その希釈度に関わらず毒素Ａの中和を相乗的に増大させた。毒素Ａのみ（４×ＥＣ５０）の対照のＲＬＵが図説されており（０．３×１０６未満）、図２０Ｂおよび図２０Ｃで示されているグラフにおいて表されているように、細胞のみの対照は２〜２．５×１０６ＲＬＵであった。
【図２０Ｂ】図２０Ａ〜Ｃ：毒素Ａ  ｍＡｂの組み合わせの相乗的中和活性：異なる希釈度の中和抗体Ａ６０−２２、Ａ６５−３３、およびＡ８０−２９の、増大する濃度のＡ３−２５  ｍＡｂへの添加は、その希釈度に関わらず毒素Ａの中和を相乗的に増大させた。毒素Ａのみ（４×ＥＣ５０）の対照のＲＬＵが図説されており（０．３×１０６未満）、図２０Ｂおよび図２０Ｃで示されているグラフにおいて表されているように、細胞のみの対照は２〜２．５×１０６ＲＬＵであった。
【図２０Ｃ】図２０Ａ〜Ｃ：毒素Ａ  ｍＡｂの組み合わせの相乗的中和活性：異なる希釈度の中和抗体Ａ６０−２２、Ａ６５−３３、およびＡ８０−２９の、増大する濃度のＡ３−２５  ｍＡｂへの添加は、その希釈度に関わらず毒素Ａの中和を相乗的に増大させた。毒素Ａのみ（４×ＥＣ５０）の対照のＲＬＵが図説されており（０．３×１０６未満）、図２０Ｂおよび図２０Ｃで示されているグラフにおいて表されているように、細胞のみの対照は２〜２．５×１０６ＲＬＵであった。
【図２１Ａ】図２１：毒素Ｂ  ｍＡｂの相乗的中和活性：ｍＡｂ  ８−２６、Ｂ６０−２およびＢ５９−３による毒素Ｂの中和を図２１Ａにおいて図説する。毒素Ｂの中和は、Ｂ８−２６をＢ５９−３の希釈物と組み合わせた後に相乗的に増大する（図２１Ｂ）。
【図２１Ｂ】図２１：毒素Ｂ  ｍＡｂの相乗的中和活性：ｍＡｂ  ８−２６、Ｂ６０−２およびＢ５９−３による毒素Ｂの中和を図２１Ａにおいて図説する。毒素Ｂの中和は、Ｂ８−２６をＢ５９−３の希釈物と組み合わせた後に相乗的に増大する（図２１Ｂ）。
【図２２】図２２：Ｒａｃ１  ＧＴＰアーゼの発現は遺伝子変異体毒素Ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）抽出物において２４時間から９６時間まで低減しているが、野生型毒素Ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）で処理した抽出物では低減していないことを示すウェスタンブロット。そのブロットは、Ｒａｃ１が毒素Ｂで処理した抽出物においてグルコシル化されているが、遺伝子変異体毒素Ｂで処理した抽出物ではグルコシル化されていないことも示している。
【図２３Ａ】図２３Ａ〜Ｋ：ＡＴＰレベル（ＲＬＵ）をＣ．ディフィシル培養液およびハムスター血清のプール（■）；それぞれの株からの粗製の毒素（培養回収物）およびハムスター血清のプール（●）；精製された毒素（Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓから得た市販の毒素）およびハムスター血清のプール（▲）；粗製の毒素（▼）、対照；ならびに精製された毒素（◆）、対照の増大する濃度に対してプロットした、インビトロ細胞毒性試験からの結果を表すグラフ。それぞれの株からの毒素を４×ＥＣ５０値で細胞に添加した。図２３は、変異体ＴｃｄＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）および変異体ＴｃｄＢ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）（ここでその変異体毒素は例えば本明細書で記述される実施例２９、表１５に従ってＥＤＣにより不活性化された）が含まれる免疫原性組成物が、少なくとも以下の１６種類の異なるＣ．ディフィシルのＣＤＣ株からの毒素に対してそれぞれの毒素のみの対照と比較して中和活性を示す中和抗体を誘導したことを示す：２００７８８６（図２３Ａ）；２００６０１７（図２３Ｂ）；２００７０７０（図２３Ｃ）；２００７３０２（図２３Ｄ）；２００７８３８（図２３Ｅ）；２００７８８６（図２３Ｆ）；２００９２９２（図２３Ｇ）；２００４０１３（図２３Ｈ）；２００９１４１（図２３Ｉ）；２００５０２２（図２３Ｊ）；２００６３７６（図２３Ｋ）。
【図２３Ｂ】図２３Ａ〜Ｋ：ＡＴＰレベル（ＲＬＵ）をＣ．ディフィシル培養液およびハムスター血清のプール（■）；それぞれの株からの粗製の毒素（培養回収物）およびハムスター血清のプール（●）；精製された毒素（Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓから得た市販の毒素）およびハムスター血清のプール（▲）；粗製の毒素（▼）、対照；ならびに精製された毒素（◆）、対照の増大する濃度に対してプロットした、インビトロ細胞毒性試験からの結果を表すグラフ。それぞれの株からの毒素を４×ＥＣ５０値で細胞に添加した。図２３は、変異体ＴｃｄＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）および変異体ＴｃｄＢ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）（ここでその変異体毒素は例えば本明細書で記述される実施例２９、表１５に従ってＥＤＣにより不活性化された）が含まれる免疫原性組成物が、少なくとも以下の１６種類の異なるＣ．ディフィシルのＣＤＣ株からの毒素に対してそれぞれの毒素のみの対照と比較して中和活性を示す中和抗体を誘導したことを示す：２００７８８６（図２３Ａ）；２００６０１７（図２３Ｂ）；２００７０７０（図２３Ｃ）；２００７３０２（図２３Ｄ）；２００７８３８（図２３Ｅ）；２００７８８６（図２３Ｆ）；２００９２９２（図２３Ｇ）；２００４０１３（図２３Ｈ）；２００９１４１（図２３Ｉ）；２００５０２２（図２３Ｊ）；２００６３７６（図２３Ｋ）。
【図２３Ｃ】図２３Ａ〜Ｋ：ＡＴＰレベル（ＲＬＵ）をＣ．ディフィシル培養液およびハムスター血清のプール（■）；それぞれの株からの粗製の毒素（培養回収物）およびハムスター血清のプール（●）；精製された毒素（Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓから得た市販の毒素）およびハムスター血清のプール（▲）；粗製の毒素（▼）、対照；ならびに精製された毒素（◆）、対照の増大する濃度に対してプロットした、インビトロ細胞毒性試験からの結果を表すグラフ。それぞれの株からの毒素を４×ＥＣ５０値で細胞に添加した。図２３は、変異体ＴｃｄＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）および変異体ＴｃｄＢ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）（ここでその変異体毒素は例えば本明細書で記述される実施例２９、表１５に従ってＥＤＣにより不活性化された）が含まれる免疫原性組成物が、少なくとも以下の１６種類の異なるＣ．ディフィシルのＣＤＣ株からの毒素に対してそれぞれの毒素のみの対照と比較して中和活性を示す中和抗体を誘導したことを示す：２００７８８６（図２３Ａ）；２００６０１７（図２３Ｂ）；２００７０７０（図２３Ｃ）；２００７３０２（図２３Ｄ）；２００７８３８（図２３Ｅ）；２００７８８６（図２３Ｆ）；２００９２９２（図２３Ｇ）；２００４０１３（図２３Ｈ）；２００９１４１（図２３Ｉ）；２００５０２２（図２３Ｊ）；２００６３７６（図２３Ｋ）。
【図２３Ｄ】図２３Ａ〜Ｋ：ＡＴＰレベル（ＲＬＵ）をＣ．ディフィシル培養液およびハムスター血清のプール（■）；それぞれの株からの粗製の毒素（培養回収物）およびハムスター血清のプール（●）；精製された毒素（Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓから得た市販の毒素）およびハムスター血清のプール（▲）；粗製の毒素（▼）、対照；ならびに精製された毒素（◆）、対照の増大する濃度に対してプロットした、インビトロ細胞毒性試験からの結果を表すグラフ。それぞれの株からの毒素を４×ＥＣ５０値で細胞に添加した。図２３は、変異体ＴｃｄＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）および変異体ＴｃｄＢ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）（ここでその変異体毒素は例えば本明細書で記述される実施例２９、表１５に従ってＥＤＣにより不活性化された）が含まれる免疫原性組成物が、少なくとも以下の１６種類の異なるＣ．ディフィシルのＣＤＣ株からの毒素に対してそれぞれの毒素のみの対照と比較して中和活性を示す中和抗体を誘導したことを示す：２００７８８６（図２３Ａ）；２００６０１７（図２３Ｂ）；２００７０７０（図２３Ｃ）；２００７３０２（図２３Ｄ）；２００７８３８（図２３Ｅ）；２００７８８６（図２３Ｆ）；２００９２９２（図２３Ｇ）；２００４０１３（図２３Ｈ）；２００９１４１（図２３Ｉ）；２００５０２２（図２３Ｊ）；２００６３７６（図２３Ｋ）。
【図２３Ｅ】図２３Ａ〜Ｋ：ＡＴＰレベル（ＲＬＵ）をＣ．ディフィシル培養液およびハムスター血清のプール（■）；それぞれの株からの粗製の毒素（培養回収物）およびハムスター血清のプール（●）；精製された毒素（Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓから得た市販の毒素）およびハムスター血清のプール（▲）；粗製の毒素（▼）、対照；ならびに精製された毒素（◆）、対照の増大する濃度に対してプロットした、インビトロ細胞毒性試験からの結果を表すグラフ。それぞれの株からの毒素を４×ＥＣ５０値で細胞に添加した。図２３は、変異体ＴｃｄＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）および変異体ＴｃｄＢ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）（ここでその変異体毒素は例えば本明細書で記述される実施例２９、表１５に従ってＥＤＣにより不活性化された）が含まれる免疫原性組成物が、少なくとも以下の１６種類の異なるＣ．ディフィシルのＣＤＣ株からの毒素に対してそれぞれの毒素のみの対照と比較して中和活性を示す中和抗体を誘導したことを示す：２００７８８６（図２３Ａ）；２００６０１７（図２３Ｂ）；２００７０７０（図２３Ｃ）；２００７３０２（図２３Ｄ）；２００７８３８（図２３Ｅ）；２００７８８６（図２３Ｆ）；２００９２９２（図２３Ｇ）；２００４０１３（図２３Ｈ）；２００９１４１（図２３Ｉ）；２００５０２２（図２３Ｊ）；２００６３７６（図２３Ｋ）。
【図２３Ｆ】図２３Ａ〜Ｋ：ＡＴＰレベル（ＲＬＵ）をＣ．ディフィシル培養液およびハムスター血清のプール（■）；それぞれの株からの粗製の毒素（培養回収物）およびハムスター血清のプール（●）；精製された毒素（Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓから得た市販の毒素）およびハムスター血清のプール（▲）；粗製の毒素（▼）、対照；ならびに精製された毒素（◆）、対照の増大する濃度に対してプロットした、インビトロ細胞毒性試験からの結果を表すグラフ。それぞれの株からの毒素を４×ＥＣ５０値で細胞に添加した。図２３は、変異体ＴｃｄＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）および変異体ＴｃｄＢ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）（ここでその変異体毒素は例えば本明細書で記述される実施例２９、表１５に従ってＥＤＣにより不活性化された）が含まれる免疫原性組成物が、少なくとも以下の１６種類の異なるＣ．ディフィシルのＣＤＣ株からの毒素に対してそれぞれの毒素のみの対照と比較して中和活性を示す中和抗体を誘導したことを示す：２００７８８６（図２３Ａ）；２００６０１７（図２３Ｂ）；２００７０７０（図２３Ｃ）；２００７３０２（図２３Ｄ）；２００７８３８（図２３Ｅ）；２００７８８６（図２３Ｆ）；２００９２９２（図２３Ｇ）；２００４０１３（図２３Ｈ）；２００９１４１（図２３Ｉ）；２００５０２２（図２３Ｊ）；２００６３７６（図２３Ｋ）。
【図２３Ｇ】図２３Ａ〜Ｋ：ＡＴＰレベル（ＲＬＵ）をＣ．ディフィシル培養液およびハムスター血清のプール（■）；それぞれの株からの粗製の毒素（培養回収物）およびハムスター血清のプール（●）；精製された毒素（Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓから得た市販の毒素）およびハムスター血清のプール（▲）；粗製の毒素（▼）、対照；ならびに精製された毒素（◆）、対照の増大する濃度に対してプロットした、インビトロ細胞毒性試験からの結果を表すグラフ。それぞれの株からの毒素を４×ＥＣ５０値で細胞に添加した。図２３は、変異体ＴｃｄＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）および変異体ＴｃｄＢ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）（ここでその変異体毒素は例えば本明細書で記述される実施例２９、表１５に従ってＥＤＣにより不活性化された）が含まれる免疫原性組成物が、少なくとも以下の１６種類の異なるＣ．ディフィシルのＣＤＣ株からの毒素に対してそれぞれの毒素のみの対照と比較して中和活性を示す中和抗体を誘導したことを示す：２００７８８６（図２３Ａ）；２００６０１７（図２３Ｂ）；２００７０７０（図２３Ｃ）；２００７３０２（図２３Ｄ）；２００７８３８（図２３Ｅ）；２００７８８６（図２３Ｆ）；２００９２９２（図２３Ｇ）；２００４０１３（図２３Ｈ）；２００９１４１（図２３Ｉ）；２００５０２２（図２３Ｊ）；２００６３７６（図２３Ｋ）。
【図２３Ｈ】図２３Ａ〜Ｋ：ＡＴＰレベル（ＲＬＵ）をＣ．ディフィシル培養液およびハムスター血清のプール（■）；それぞれの株からの粗製の毒素（培養回収物）およびハムスター血清のプール（●）；精製された毒素（Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓから得た市販の毒素）およびハムスター血清のプール（▲）；粗製の毒素（▼）、対照；ならびに精製された毒素（◆）、対照の増大する濃度に対してプロットした、インビトロ細胞毒性試験からの結果を表すグラフ。それぞれの株からの毒素を４×ＥＣ５０値で細胞に添加した。図２３は、変異体ＴｃｄＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）および変異体ＴｃｄＢ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）（ここでその変異体毒素は例えば本明細書で記述される実施例２９、表１５に従ってＥＤＣにより不活性化された）が含まれる免疫原性組成物が、少なくとも以下の１６種類の異なるＣ．ディフィシルのＣＤＣ株からの毒素に対してそれぞれの毒素のみの対照と比較して中和活性を示す中和抗体を誘導したことを示す：２００７８８６（図２３Ａ）；２００６０１７（図２３Ｂ）；２００７０７０（図２３Ｃ）；２００７３０２（図２３Ｄ）；２００７８３８（図２３Ｅ）；２００７８８６（図２３Ｆ）；２００９２９２（図２３Ｇ）；２００４０１３（図２３Ｈ）；２００９１４１（図２３Ｉ）；２００５０２２（図２３Ｊ）；２００６３７６（図２３Ｋ）。
【図２３Ｉ】図２３Ａ〜Ｋ：ＡＴＰレベル（ＲＬＵ）をＣ．ディフィシル培養液およびハムスター血清のプール（■）；それぞれの株からの粗製の毒素（培養回収物）およびハムスター血清のプール（●）；精製された毒素（Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓから得た市販の毒素）およびハムスター血清のプール（▲）；粗製の毒素（▼）、対照；ならびに精製された毒素（◆）、対照の増大する濃度に対してプロットした、インビトロ細胞毒性試験からの結果を表すグラフ。それぞれの株からの毒素を４×ＥＣ５０値で細胞に添加した。図２３は、変異体ＴｃｄＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）および変異体ＴｃｄＢ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）（ここでその変異体毒素は例えば本明細書で記述される実施例２９、表１５に従ってＥＤＣにより不活性化された）が含まれる免疫原性組成物が、少なくとも以下の１６種類の異なるＣ．ディフィシルのＣＤＣ株からの毒素に対してそれぞれの毒素のみの対照と比較して中和活性を示す中和抗体を誘導したことを示す：２００７８８６（図２３Ａ）；２００６０１７（図２３Ｂ）；２００７０７０（図２３Ｃ）；２００７３０２（図２３Ｄ）；２００７８３８（図２３Ｅ）；２００７８８６（図２３Ｆ）；２００９２９２（図２３Ｇ）；２００４０１３（図２３Ｈ）；２００９１４１（図２３Ｉ）；２００５０２２（図２３Ｊ）；２００６３７６（図２３Ｋ）。
【図２３Ｊ】図２３Ａ〜Ｋ：ＡＴＰレベル（ＲＬＵ）をＣ．ディフィシル培養液およびハムスター血清のプール（■）；それぞれの株からの粗製の毒素（培養回収物）およびハムスター血清のプール（●）；精製された毒素（Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓから得た市販の毒素）およびハムスター血清のプール（▲）；粗製の毒素（▼）、対照；ならびに精製された毒素（◆）、対照の増大する濃度に対してプロットした、インビトロ細胞毒性試験からの結果を表すグラフ。それぞれの株からの毒素を４×ＥＣ５０値で細胞に添加した。図２３は、変異体ＴｃｄＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）および変異体ＴｃｄＢ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）（ここでその変異体毒素は例えば本明細書で記述される実施例２９、表１５に従ってＥＤＣにより不活性化された）が含まれる免疫原性組成物が、少なくとも以下の１６種類の異なるＣ．ディフィシルのＣＤＣ株からの毒素に対してそれぞれの毒素のみの対照と比較して中和活性を示す中和抗体を誘導したことを示す：２００７８８６（図２３Ａ）；２００６０１７（図２３Ｂ）；２００７０７０（図２３Ｃ）；２００７３０２（図２３Ｄ）；２００７８３８（図２３Ｅ）；２００７８８６（図２３Ｆ）；２００９２９２（図２３Ｇ）；２００４０１３（図２３Ｈ）；２００９１４１（図２３Ｉ）；２００５０２２（図２３Ｊ）；２００６３７６（図２３Ｋ）。
【図２３Ｋ】図２３Ａ〜Ｋ：ＡＴＰレベル（ＲＬＵ）をＣ．ディフィシル培養液およびハムスター血清のプール（■）；それぞれの株からの粗製の毒素（培養回収物）およびハムスター血清のプール（●）；精製された毒素（Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓから得た市販の毒素）およびハムスター血清のプール（▲）；粗製の毒素（▼）、対照；ならびに精製された毒素（◆）、対照の増大する濃度に対してプロットした、インビトロ細胞毒性試験からの結果を表すグラフ。それぞれの株からの毒素を４×ＥＣ５０値で細胞に添加した。図２３は、変異体ＴｃｄＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）および変異体ＴｃｄＢ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）（ここでその変異体毒素は例えば本明細書で記述される実施例２９、表１５に従ってＥＤＣにより不活性化された）が含まれる免疫原性組成物が、少なくとも以下の１６種類の異なるＣ．ディフィシルのＣＤＣ株からの毒素に対してそれぞれの毒素のみの対照と比較して中和活性を示す中和抗体を誘導したことを示す：２００７８８６（図２３Ａ）；２００６０１７（図２３Ｂ）；２００７０７０（図２３Ｃ）；２００７３０２（図２３Ｄ）；２００７８３８（図２３Ｅ）；２００７８８６（図２３Ｆ）；２００９２９２（図２３Ｇ）；２００４０１３（図２３Ｈ）；２００９１４１（図２３Ｉ）；２００５０２２（図２３Ｊ）；２００６３７６（図２３Ｋ）。
【図２４】図２４：結果として少なくとも３種類の可能性のあるタイプの修飾：架橋、グリシン付加体、およびベータ−アラニン付加体をもたらす、変異体Ｃ．ディフィシル毒素の典型的なＥＤＣ／ＮＨＳ不活性化の図説。パネルＡは架橋を図説する。三重変異体毒素のカルボキシル残基がＥＤＣおよびＮＨＳの付加により活性化される。その活性化されたエステルが第１級アミンと反応して安定なアミド結合を形成し、結果として分子内および分子間架橋をもたらす。パネルＢはグリシン付加体の形成を図説する。不活性化後、残存する活性化されたエステルはグリシンが付加されて安定なアミド結合を形成することにより急冷される（ｑｕｅｎｃｈｅｄ）。パネルＣはベータ−アラニン付加体の形成を図説する。３モルのＮＨＳが１モルのＥＤＣと反応して活性化されたベータ−アラニンを形成することができる。次いでこれが第１級アミンと反応して安定なアミド結合を形成する。
【図２５】図２５：結果として以下のタイプの修飾：（Ａ）架橋、（Ｂ）グリシン付加体、および（Ｃ）ベータ−アラニン付加体の少なくとも１種類をもたらす、変異体Ｃ．ディフィシル毒素の典型的なＥＤＣ／ＮＨＳ不活性化の図説。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
配列の簡潔な記述
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１は、野生型Ｃ．ディフィシル６３０毒素Ａ（ＴｃｄＡ）に関す
るアミノ酸配列を示す。
【００４５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２は、野生型Ｃ．ディフィシル６３０毒素Ｂ（ＴｃｄＢ）に関す
るアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と比較して２８５および２８７位
において変異を有する変異体ＴｃｄＡに関するアミノ酸配列を示す。
【００４６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と比較して２８５、２８７、およ
び７００位において変異を有する変異体ＴｃｄＡに関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と比較して２８６および２８８位
において変異を有する変異体ＴｃｄＢに関するアミノ酸配列を示す。
【００４７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と比較して２８６、２８８、およ
び６９８位において変異を有する変異体ＴｃｄＢに関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と比較して２６９、２７２、２８
５、２８７、４６０、４６２、および７００位において変異を有する変異体ＴｃｄＡに関
するアミノ酸配列を示す。
【００４８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と比較して２７０、２７３、２８
６、２８８、４６１、４６３、および６９８位において変異を有する変異体ＴｃｄＢに関
するアミノ酸配列を示す。
【００４９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９は、野生型Ｃ．ディフィシル６３０毒素Ａ（ＴｃｄＡ）をコー
ドするＤＮＡ配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０は、野生型Ｃ．ディフィシル６３０毒素Ｂ（ＴｃｄＢ）をコ
ードするＤＮＡ配列を示す。
【００５０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３をコードするＤＮＡ配列を示す
。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４をコードするＤＮＡ配列を示す
。
【００５１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５をコードするＤＮＡ配列を示す
。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６をコードするＤＮＡ配列を示す
。
【００５２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５は、野生型Ｃ．ディフィシルＲ２０２９１  ＴｃｄＡに関す
るアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５をコードするＤＮＡ配列を示
す。
【００５３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７は、野生型Ｃ．ディフィシルＣＤ１９６  ＴｃｄＡに関する
アミノ酸配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７をコードするＤＮＡ配列を示
す。
【００５４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９は、野生型Ｃ．ディフィシルＶＰＩ１０４６３  ＴｃｄＡに
関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９をコードするＤＮＡ配列を示
す。
【００５５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１は、野生型Ｃ．ディフィシルＲ２０２９１  ＴｃｄＢに関す
るアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１をコードするＤＮＡ配列を示
す。
【００５６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３は、野生型Ｃ．ディフィシルＣＤ１９６  ＴｃｄＢに関する
アミノ酸配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３をコードするＤＮＡ配列を示
す。
【００５７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５は、野生型Ｃ．ディフィシルＶＰＩ１０４６３  ＴｃｄＢに
関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５をコードするＤＮＡ配列を示
す。
【００５８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７は、野生型Ｃ．ディフィシルＶＰＩ１０４６３の病原性遺伝
子座のＤＮＡ配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の残基１０１〜２９３に関する
アミノ酸配列を示す。
【００５９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の残基１〜５４２に関するアミ
ノ酸配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の残基１０１〜２９３に関する
アミノ酸配列を示す。
【００６０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の残基１〜５４３に関するアミ
ノ酸配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の残基５４３〜８０９に関する
アミノ酸配列を示す。
【００６１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の残基５４４〜７６７に関する
アミノ酸配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４は変異体ＴｃｄＡに関するアミノ酸配列を示し、ここで残基
１０１、２６９、２７２、２８５、２８７、４６０、４６２、５４１、５４２、５４３、
５８９、６５５、および７００はあらゆるアミノ酸であることができる。
【００６２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５は変異体ＴｃｄＢに関するアミノ酸配列を示し、ここで１０
２、２７０、２７３、２８６、２８８、３８４、４６１、４６３、５２０、５４３、５４
４、５８７、６００、６５３、６９８、および７５１はあらゆるアミノ酸であることがで
きる。
【００６３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡの中和抗体（Ａ３−２５  ｍ
Ａｂ）の可変軽鎖に関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡの中和抗体（Ａ３−２５  ｍ
Ａｂ）の可変重鎖に関するアミノ酸配列を示す。
【００６４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡの中和抗体（Ａ３−２５  ｍ
Ａｂ）の可変軽鎖のＣＤＲ１に関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡの中和抗体（Ａ３−２５  ｍ
Ａｂ）の可変軽鎖のＣＤＲ２に関するアミノ酸配列を示す。
【００６５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡの中和抗体（Ａ３−２５  ｍ
Ａｂ）の可変軽鎖のＣＤＲ３に関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡの中和抗体（Ａ３−２５  ｍ
Ａｂ）の可変重鎖のＣＤＲ１に関するアミノ酸配列を示す。
【００６６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡの中和抗体（Ａ３−２５  ｍ
Ａｂ）の可変重鎖のＣＤＲ２に関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡの中和抗体（Ａ３−２５  ｍ
Ａｂ）の可変重鎖のＣＤＲ３に関するアミノ酸配列を示す。
【００６７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３をコードするＤＮＡ配列を示す
。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４をコードするＤＮＡ配列を示す
。
【００６８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５をコードするＤＮＡ配列を示す
。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６をコードするＤＮＡ配列を示す
。
【００６９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８は、免疫刺激オリゴヌクレオチドＯＤＮ  ＣｐＧ  ２４５５
５のヌクレオチド配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ８−２６  ｍＡ
ｂ）の可変重鎖に関するアミノ酸配列を示す。
【００７０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ８−２６  ｍＡ
ｂ）の可変重鎖のシグナルペプチドに関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ８−２６  ｍＡ
ｂ）の可変重鎖のＣＤＲ１に関するアミノ酸配列を示す。
【００７１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ８−２６  ｍＡ
ｂ）の可変重鎖のＣＤＲ２に関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ８−２６  ｍＡ
ｂ）の可変重鎖のＣＤＲ３に関するアミノ酸配列を示す。
【００７２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ８−２６  ｍＡ
ｂ）の可変重鎖の定常領域に関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ８−２６  ｍＡ
ｂ）の可変軽鎖に関するアミノ酸配列を示す。
【００７３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ８−２６  ｍＡ
ｂ）の可変軽鎖のシグナルペプチドに関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ８−２６  ｍＡ
ｂ）の可変軽鎖のＣＤＲ１に関するアミノ酸配列を示す。
【００７４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ８−２６  ｍＡ
ｂ）の可変軽鎖のＣＤＲ２に関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ８−２６  ｍＡ
ｂ）の可変軽鎖のＣＤＲ３に関するアミノ酸配列を示す。
【００７５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ５９−３  ｍＡ
ｂ）の可変重鎖に関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ５９−３  ｍＡ
ｂ）の可変重鎖のシグナルペプチドに関するアミノ酸配列を示す。
【００７６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ５９−３  ｍＡ
ｂ）の可変重鎖のＣＤＲ１に関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ５９−３  ｍＡ
ｂ）の可変重鎖のＣＤＲ２に関するアミノ酸配列を示す。
【００７７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ５９−３  ｍＡ
ｂ）の可変重鎖のＣＤＲ３に関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ５９−３  ｍＡ
ｂ）の可変重鎖の定常領域に関するアミノ酸配列を示す。
【００７８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ５９−３  ｍＡ
ｂ）の可変軽鎖に関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ５９−３  ｍＡ
ｂ）の可変軽鎖のシグナルペプチドに関するアミノ酸配列を示す。
【００７９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ５９−３  ｍＡ
ｂ）の可変軽鎖のＣＤＲ１に関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ５９−３  ｍＡ
ｂ）の可変軽鎖のＣＤＲ２に関するアミノ酸配列を示す。
【００８０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ５９−３  ｍＡ
ｂ）の可変軽鎖のＣＤＲ３に関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ９−３０  ｍＡ
ｂ）の可変重鎖に関するアミノ酸配列を示す。
【００８１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ９−３０  ｍＡ
ｂ）の可変重鎖のシグナルペプチドに関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ９−３０  ｍＡ
ｂ）の可変重鎖のＣＤＲ１に関するアミノ酸配列を示す。
【００８２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ９−３０  ｍＡ
ｂ）の可変重鎖のＣＤＲ２に関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７５は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ９−３０  ｍＡ
ｂ）の可変重鎖のＣＤＲ３に関するアミノ酸配列を示す。
【００８３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ９−３０  ｍＡ
ｂ）の可変重鎖の定常領域に関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ９−３０  ｍＡ
ｂ）の可変軽鎖に関するアミノ酸配列を示す。
【００８４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ９−３０  ｍＡ
ｂ）の可変軽鎖のシグナルペプチドに関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ９−３０  ｍＡ
ｂ）の可変軽鎖のＣＤＲ１に関するアミノ酸配列を示す。
【００８５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８０は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ９−３０  ｍＡ
ｂ）の可変軽鎖のＣＤＲ２に関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８１は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ９−３０  ｍＡ
ｂ）の可変軽鎖のＣＤＲ３に関するアミノ酸配列を示す。
【００８６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８２は変異体ＴｃｄＢに関するアミノ酸配列を示し、ここで１０
２、２７０、２７３、２８６、２８８、３８４、４６１、４６３、５２０、５４３、５４
４、５８７、６００、６５３、６９８、および７５１位の残基はあらゆるアミノ酸である
ことができる。
【００８７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と比較して２６９、２７２、２
８５、２８７、４６０、４６２、および７００位において変異を有する変異体ＴｃｄＡに
関するアミノ酸配列を示し、ここで１位のメチオニンは存在しない。
【００８８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と比較して２８５、２８７、お
よび７００位において変異を有する変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ａに関するアミノ酸配列
を示し、ここで１位のメチオニンは存在しない。
【００８９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８５は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と比較して２７０、２７３、２
８６、２８８、４６１、４６３、および６９８位において変異を有する変異体Ｃ．ディフ
ィシル毒素Ｂに関するアミノ酸配列を示し、ここで１位のメチオニンは存在しない。
【００９０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と比較して２８６、２８８、お
よび６９８位において変異を有する変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ｂに関するアミノ酸配列
を示し、ここで１位のメチオニンは存在しない。
【００９１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８７は野生型Ｃ．ディフィシル２００４０１３  ＴｃｄＡに関す
るアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８８は野生型Ｃ．ディフィシル２００４１１１  ＴｃｄＡに関す
るアミノ酸配列を示す。
【００９２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８９は野生型Ｃ．ディフィシル２００４１１８  ＴｃｄＡに関す
るアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９０は野生型Ｃ．ディフィシル２００４２０５  ＴｃｄＡに関す
るアミノ酸配列を示す。
【００９３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９１は野生型Ｃ．ディフィシル２００４２０６  ＴｃｄＡに関す
るアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９２は野生型Ｃ．ディフィシル２００５０２２  ＴｃｄＡに関す
るアミノ酸配列を示す。
【００９４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９３は野生型Ｃ．ディフィシル２００５０８８  ＴｃｄＡに関す
るアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９４は野生型Ｃ．ディフィシル２００５２８３  ＴｃｄＡに関す
るアミノ酸配列を示す。
【００９５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９５は野生型Ｃ．ディフィシル２００５３２５  ＴｃｄＡに関す
るアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９６は野生型Ｃ．ディフィシル２００５３５９  ＴｃｄＡに関す
るアミノ酸配列を示す。
【００９６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９７は野生型Ｃ．ディフィシル２００６０１７  ＴｃｄＡに関す
るアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９８は野生型Ｃ．ディフィシル２００７０７０  ＴｃｄＡに関す
るアミノ酸配列を示す。
【００９７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９９は野生型Ｃ．ディフィシル２００７２１７  ＴｃｄＡに関す
るアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１００は野生型Ｃ．ディフィシル２００７３０２  ＴｃｄＡに関
するアミノ酸配列を示す。
【００９８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０１は野生型Ｃ．ディフィシル２００７８１６  ＴｃｄＡに関
するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０２は野生型Ｃ．ディフィシル２００７８３８  ＴｃｄＡに関
するアミノ酸配列を示す。
【００９９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３は野生型Ｃ．ディフィシル２００７８５８  ＴｃｄＡに関
するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０４は野生型Ｃ．ディフィシル２００７８８６  ＴｃｄＡに関
するアミノ酸配列を示す。
【０１００】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０５は野生型Ｃ．ディフィシル２００８２２２  ＴｃｄＡに関
するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０６は野生型Ｃ．ディフィシル２００９０７８  ＴｃｄＡに関
するアミノ酸配列を示す。
【０１０１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０７は野生型Ｃ．ディフィシル２００９０８７  ＴｃｄＡに関
するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０８は野生型Ｃ．ディフィシル２００９１４１  ＴｃｄＡに関
するアミノ酸配列を示す。
【０１０２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０９は野生型Ｃ．ディフィシル２００９２９２  ＴｃｄＡに関
するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１０は野生型Ｃ．ディフィシル２００４０１３  ＴｃｄＢに関
するアミノ酸配列を示す。
【０１０３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１１は野生型Ｃ．ディフィシル２００４１１１  ＴｃｄＢに関
するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１２は野生型Ｃ．ディフィシル２００４１１８  ＴｃｄＢに関
するアミノ酸配列を示す。
【０１０４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１３は野生型Ｃ．ディフィシル２００４２０５  ＴｃｄＢに関
するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１４は野生型Ｃ．ディフィシル２００４２０６  ＴｃｄＢに関
するアミノ酸配列を示す。
【０１０５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１５は野生型Ｃ．ディフィシル２００５０２２  ＴｃｄＢに関
するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１６は野生型Ｃ．ディフィシル２００５０８８  ＴｃｄＢに関
するアミノ酸配列を示す。
【０１０６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１７は野生型Ｃ．ディフィシル２００５２８３  ＴｃｄＢに関
するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１８は野生型Ｃ．ディフィシル２００５３２５  ＴｃｄＢに関
するアミノ酸配列を示す。
【０１０７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１９は野生型Ｃ．ディフィシル２００５３５９  ＴｃｄＢに関
するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０は野生型Ｃ．ディフィシル２００６０１７  ＴｃｄＢに関
するアミノ酸配列を示す。
【０１０８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２１は野生型Ｃ．ディフィシル２００６３７６  ＴｃｄＢに関
するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２２は野生型Ｃ．ディフィシル２００７０７０  ＴｃｄＢに関
するアミノ酸配列を示す。
【０１０９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３は野生型Ｃ．ディフィシル２００７２１７  ＴｃｄＢに関
するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２４は野生型Ｃ．ディフィシル２００７３０２  ＴｃｄＢに関
するアミノ酸配列を示す。
【０１１０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２５は野生型Ｃ．ディフィシル２００７８１６  ＴｃｄＢに関
するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２６は野生型Ｃ．ディフィシル２００７８３８  ＴｃｄＢに関
するアミノ酸配列を示す。
【０１１１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２７は野生型Ｃ．ディフィシル２００７８５８  ＴｃｄＢに関
するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２８は野生型Ｃ．ディフィシル２００７８８６  ＴｃｄＢに関
するアミノ酸配列を示す。
【０１１２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２９は野生型Ｃ．ディフィシル２００８２２２  ＴｃｄＢに関
するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３０は野生型Ｃ．ディフィシル２００９０７８  ＴｃｄＢに関
するアミノ酸配列を示す。
【０１１３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３１は野生型Ｃ．ディフィシル２００９０８７  ＴｃｄＢに関
するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３２は野生型Ｃ．ディフィシル２００９１４１  ＴｃｄＢに関
するアミノ酸配列を示す。
【０１１４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３は野生型Ｃ．ディフィシル２００９２９２  ＴｃｄＢに関
するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３４は野生型Ｃ．ディフィシル０１４  ＴｃｄＡに関するアミ
ノ酸配列を示す。
【０１１５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３５は野生型Ｃ．ディフィシル０１５  ＴｃｄＡに関するアミ
ノ酸配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３６は野生型Ｃ．ディフィシル０２０  ＴｃｄＡに関するアミ
ノ酸配列を示す。
【０１１６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３７は野生型Ｃ．ディフィシル０２３  ＴｃｄＡに関するアミ
ノ酸配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３８は野生型Ｃ．ディフィシル０２７  ＴｃｄＡに関するアミ
ノ酸配列を示す。
【０１１７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３９は野生型Ｃ．ディフィシル０２９  ＴｃｄＡに関するアミ
ノ酸配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４０は野生型Ｃ．ディフィシル０４６  ＴｃｄＡに関するアミ
ノ酸配列を示す。
【０１１８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４１は野生型Ｃ．ディフィシル０１４  ＴｃｄＢに関するアミ
ノ酸配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４２は野生型Ｃ．ディフィシル０１５  ＴｃｄＢに関するアミ
ノ酸配列を示す。
【０１１９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４３は野生型Ｃ．ディフィシル０２０  ＴｃｄＢに関するアミ
ノ酸配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４４は野生型Ｃ．ディフィシル０２３  ＴｃｄＢに関するアミ
ノ酸配列を示す。
【０１２０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４５は野生型Ｃ．ディフィシル０２７  ＴｃｄＢに関するアミ
ノ酸配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４６は野生型Ｃ．ディフィシル０２９  ＴｃｄＢに関するアミ
ノ酸配列を示す。
【０１２１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４７は野生型Ｃ．ディフィシル０４６  ＴｃｄＢに関するアミ
ノ酸配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４８は野生型Ｃ．ディフィシル００１  ＴｃｄＡに関するアミ
ノ酸配列を示す。
【０１２２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４９は野生型Ｃ．ディフィシル００２  ＴｃｄＡに関するアミ
ノ酸配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５０は野生型Ｃ．ディフィシル００３  ＴｃｄＡに関するアミ
ノ酸配列を示す。
【０１２３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５１は野生型Ｃ．ディフィシル００４  ＴｃｄＡに関するアミ
ノ酸配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５２は野生型Ｃ．ディフィシル０７０  ＴｃｄＡに関するアミ
ノ酸配列を示す。
【０１２４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５３は野生型Ｃ．ディフィシル０７５  ＴｃｄＡに関するアミ
ノ酸配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５４は野生型Ｃ．ディフィシル０７７  ＴｃｄＡに関するアミ
ノ酸配列を示す。
【０１２５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５５は野生型Ｃ．ディフィシル０８１  ＴｃｄＡに関するアミ
ノ酸配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５６は野生型Ｃ．ディフィシル１１７  ＴｃｄＡに関するアミ
ノ酸配列を示す。
【０１２６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５７は野生型Ｃ．ディフィシル１３１  ＴｃｄＡに関するアミ
ノ酸配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５８は野生型Ｃ．ディフィシル００１  ＴｃｄＢに関するアミ
ノ酸配列を示す。
【０１２７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５９は野生型Ｃ．ディフィシル００２  ＴｃｄＢに関するアミ
ノ酸配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６０は野生型Ｃ．ディフィシル００３  ＴｃｄＢに関するアミ
ノ酸配列を示す。
【０１２８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６１は野生型Ｃ．ディフィシル００４  ＴｃｄＢに関するアミ
ノ酸配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６２は野生型Ｃ．ディフィシル０７０  ＴｃｄＢに関するアミ
ノ酸配列を示す。
【０１２９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６３は野生型Ｃ．ディフィシル０７５  ＴｃｄＢに関するアミ
ノ酸配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６４は野生型Ｃ．ディフィシル０７７  ＴｃｄＢに関するアミ
ノ酸配列を示す。
【０１３０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６５は野生型Ｃ．ディフィシル０８１  ＴｃｄＢに関するアミ
ノ酸配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６６は野生型Ｃ．ディフィシル１１７  ＴｃｄＢに関するアミ
ノ酸配列を示す。
【０１３１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６７は野生型Ｃ．ディフィシル１３１  ＴｃｄＢに関するアミ
ノ酸配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６８は野生型Ｃ．ディフィシル０５３  ＴｃｄＡに関するアミ
ノ酸配列を示す。
【０１３２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６９は野生型Ｃ．ディフィシル０７８  ＴｃｄＡに関するアミ
ノ酸配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７０は野生型Ｃ．ディフィシル０８７  ＴｃｄＡに関するアミ
ノ酸配列を示す。
【０１３３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７１は野生型Ｃ．ディフィシル０９５  ＴｃｄＡに関するアミ
ノ酸配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７２は野生型Ｃ．ディフィシル１２６  ＴｃｄＡに関するアミ
ノ酸配列を示す。
【０１３４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７３は野生型Ｃ．ディフィシル０５３  ＴｃｄＢに関するアミ
ノ酸配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７４は野生型Ｃ．ディフィシル０７８  ＴｃｄＢに関するアミ
ノ酸配列を示す。
【０１３５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７５は野生型Ｃ．ディフィシル０８７  ＴｃｄＢに関するアミ
ノ酸配列を示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７６は野生型Ｃ．ディフィシル０９５  ＴｃｄＢに関するアミ
ノ酸配列を示す。
【０１３６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７７は野生型Ｃ．ディフィシル１２６  ＴｃｄＢに関するアミ
ノ酸配列を示す。
本発明者らは、驚くべきことに、数ある中でも、変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ａおよび
毒素Ｂならびにその方法を発見した。その変異体は、部分的に、免疫原性であり、且つそ
れぞれの毒素の野生型の形態と比較して低減した細胞毒性を示すことを特徴とする。本発
明は、その免疫原性部分、その生物学的均等物、および前記のもののいずれかをコードす
る核酸配列が含まれる単離されたポリヌクレオチドにも関する。
【０１３７】
本明細書で記述される免疫原性組成物は意外にもＣ．ディフィシル毒素に対する新規の
中和抗体を誘発する能力を示し、それらはＣ．ディフィシルの攻撃に対する能動的および
／または受動的防御を与える能力を有する可能性がある。その新規の抗体は、毒素Ａおよ
び毒素Ｂの様々なエピトープに対して向けられている。本発明者らはさらに、その中和モ
ノクローナル抗体の少なくとも２種類の組み合わせは毒素Ａおよび毒素Ｂのそれぞれのイ
ンビトロでの中和において意外にも相乗作用を示し得ることを発見した。
【０１３８】
本明細書で記述される本発明の組成物は、哺乳類において、その組成物を投与されなか
った哺乳類と比較して、Ｃ．ディフィシル感染症、Ｃ．ディフィシル関連疾患（ＣＤＡＤ
）、症候群、病気、症状、および／またはそれらの合併症を処置する、予防する、それら
の危険性を低下させる、それらの発生率を低下させる、それらの重症度を低下させる、お
よび／またはそれらの発症を遅らせるために用いることができる。
【０１３９】
さらに、本発明者らは、その変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ａおよび毒素Ｂを安定して発
現することができる組み換え無芽胞性Ｃ．ディフィシル細胞ならびにその同じものを生成
するための新規の方法を発見した。
【０１４０】
免疫原性組成物
１側面において、本発明は変異体Ｃ．ディフィシル毒素が含まれる免疫原性組成物に関
する。その変異体Ｃ．ディフィシル毒素には、対応する野生型Ｃ．ディフィシル毒素と比
較してグルコシルトランスフェラーゼドメインにおいて少なくとも１個の変異およびシス
テインプロテアーゼドメインにおいて少なくとも１個の変異を有するアミノ酸配列が含ま
れる。
【０１４１】
用語“野生型”は、本明細書で用いられる際、天然にある形態を指す。例えば、野生型
のポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然の源から単離することができ、人の
操作により意図的に改変されていない、生物中に存在する配列である。本発明は、前記の
もののいずれかをコードする核酸配列が含まれる単離されたポリヌクレオチドにも関する
。加えて、本発明は、哺乳類において、その組成物を投与されなかった哺乳類と比較して
、Ｃ．ディフィシル感染症、Ｃ．ディフィシル関連疾患、症候群、病気、症状、および／
またはそれらの合併症を処置する、予防する、それらの危険性を低下させる、それらの重
症度を低下させる、それらの発生率を低下させる、および／またはそれらの発症を遅らせ
るための前記の組成物のいずれかの使用、ならびに前記の組成物を調製するための方法に
関する。
【０１４２】
本明細書で用いられる際、“免疫原性組成物”または“免疫原”は、その組成物が投与
された哺乳類において免疫応答を誘発する組成物を指す。
“免疫応答”は、受容患者におけるＣ．ディフィシル毒素に対して向けられた有益な体
液性（抗体に媒介される）および／または細胞性（抗原特異的Ｔ細胞またはそれらの分泌
産物により媒介される）応答の発現を指す。免疫応答は、体液性、細胞性、または両方で
あってよい。
【０１４３】
その免疫応答は、免疫原性組成物、免疫原の投与により誘導される能動的な応答である
ことができる。あるいは、その免疫応答は抗体または抗原刺激された（ｐｒｉｍｅｄ）Ｔ
細胞の投与により誘導される受動的な応答であることができる。
【０１４４】
体液性（抗体に媒介される）免疫応答の存在は、例えば当該技術で既知の細胞に基づく
アッセイ、例えば中和抗体アッセイ、ＥＬＩＳＡ等により決定することができる。
細胞性免疫応答は、典型的にはクラスＩまたはクラスＩＩ  ＭＨＣ分子と会合したポリ
ペプチドエピトープを提示して抗原特異的ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞および／またはＣＤ８
＋細胞傷害性Ｔ細胞を活性化することにより誘発される。その応答には、単球、マクロフ
ァージ、ＮＫ細胞、好塩基球、樹状細胞、星状細胞、小神経膠細胞、好酸球または先天免
疫の他の構成要素も含まれ得る。細胞に媒介される免疫学的応答の存在は、当該技術で既
知の増殖アッセイ（ＣＤ４＋Ｔ細胞）またはＣＴＬ（細胞傷害性Ｔリンパ球）アッセイに
より決定することができる。
【０１４５】
１態様において、免疫原性組成物はワクチン組成物である。本明細書で用いられる際、
“ワクチン組成物”は、その組成物が投与された哺乳類において免疫応答を誘発する組成
物である。そのワクチン組成物は、免疫された哺乳類をその後の免疫因子または免疫学的
に交差反応性の因子による負荷に対して保護することができる。保護は、同じ条件下でワ
クチン接種していない哺乳類と比較した場合に症状または感染における低減に関して完全
または部分的であり得る。
【０１４６】
本明細書で記述される免疫原性組成物は交差反応性であり、それはその組成物が由来す
る株と異なる別のＣ．ディフィシル株により産生される毒素に対して有効な免疫応答（例
えば体液性免疫応答）を誘発することができる特徴を有することを意味する。例えば、本
明細書で記述される（例えばＣ．ディフィシル６３０に由来する）免疫原性組成物は、Ｃ
．ディフィシルの多数の株により産生される毒素（例えばＣ．ディフィシルＲ２０２９１
およびＶＰＩ１０４６３により産生される毒素）に結合することができる交差反応性抗体
を誘発することができる。例えば実施例３７を参照。交差反応性は細菌性免疫原の交差防
御能力を示しており、逆もまた同様である。
【０１４７】
用語“交差防御”は、本明細書で用いられる際、免疫原性組成物により誘導される免疫
応答の、同じ属の異なる細菌株または種による感染を予防する、または弱める能力を指す
。例えば、本明細書で記述される（例えばＣ．ディフィシル６３０に由来する）免疫原性
組成物は、哺乳類において６３０以外の株（例えばＣ．ディフィシルＲ２０２９１）によ
り引き起こされるＣ．ディフィシル感染症を弱めるように、および／またはＣ．ディフィ
シル疾患を弱めるように、哺乳類において有効な免疫応答を誘導することができる。
【０１４８】
その免疫原性組成物または免疫原が免疫応答を誘発する典型的な哺乳類には、あらゆる
哺乳類、例えばマウス、ハムスター、霊長類、およびヒトのような哺乳類が含まれる。好
ましい態様において、その免疫原性組成物または免疫原は、その組成物が投与されたヒト
において免疫応答を誘発する。
【０１４９】
上記で記述したように、毒素Ａ（ＴｃｄＡ）および毒素Ｂ（ＴｃｄＢ）はＲｈｏ／Ｒａ
ｃ／Ｒａｓファミリーの低分子量ＧＴＰアーゼを不活性化する相同性のグルコシルトラン
スフェラーゼである。ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢの哺乳類標的細胞への作用は、ＧＴＰアー
ゼの受容体に媒介されるエンドサイトーシス、膜移行、自己タンパク質分解性プロセシン
グ、およびモノグルコシル化の多段階機構に依存する。これらの機能活性の多くはその毒
素の一次配列内の別個の領域に帰せられており、その毒素は画像化されて（ｉｍａｇｅｄ
）これらの分子が構造において類似していることが示されている。
【０１５０】
ＴｃｄＡに関する野生型遺伝子は、約３０８ｋＤａの推定分子量を有し、約２７１０ア
ミノ酸を有するタンパク質をコードする約８１３０ヌクレオチドを有する。本明細書で用
いられる際、野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡにはあらゆる野生型Ｃ．ディフィシル株か
らのＣ．ディフィシルＴｃｄＡが含まれる。野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡには、例え
ばＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴプログラムにより初期設定のギャップウェイト（ｇａｐ  
ｗｅｉｇｈｔｓ）を用いて最適に整列させた際にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１（完全長）に対
して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、
好ましくは約９８％、より好ましくは約９９％、または最も好ましくは約１００％の同一
性を有する野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡのアミノ酸配列が含まれてよい。
【０１５１】
好ましい態様において、野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡにはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１
で示されるアミノ酸配列が含まれ、それはＣ．ディフィシル株６３０からのＴｃｄＡに関
する野生型アミノ酸配列を記述している（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＹＰ＿００１０８
７１３７．１および／またはＣＡＪ６７４９４．１においても開示されている）。Ｃ．デ
ィフィシル株６３０は当該技術においてＰＣＲ−リボタイプ０１２株であるものとして知
られている。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９はＣ．ディフィシル株６３０からのＴｃｄＡに関す
る野生型遺伝子を記述しており、それはＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＮＣ＿００９０８９
．１においても開示されている。
【０１５２】
野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡの別の例には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５で示される
アミノ酸配列が含まれ、それはＣ．ディフィシル株Ｒ２０２９１からのＴｃｄＡに関する
野生型アミノ酸配列を記述している（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＹＰ＿００３２１７０
８８．１においても開示されている）。Ｃ．ディフィシル株Ｒ２０２９１は当該技術にお
いて高病毒性株およびＰＣＲ−リボタイプ０２７株であるものとして知られている。Ｃ．
ディフィシル株Ｒ２０２９１からのＴｃｄＡに関するアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎ
Ｏ：１に対して約９８％の同一性を有する。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６はＣ．ディフィシ
ル株Ｒ２０２９１からのＴｃｄＡに関する野生型遺伝子を記述しており、それはＧｅｎＢ
ａｎｋアクセス番号ＮＣ＿０１３３１６．１においても開示されている。
【０１５３】
野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡの追加の例には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７で示され
るアミノ酸配列が含まれ、それはＣ．ディフィシル株ＣＤ１９６からのＴｃｄＡに関する
野生型アミノ酸配列を記述している（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＣＢＡ６１１５６．１
においても開示されている）。ＣＤ１９６は最近のカナダでの大流行からの株であり、そ
れは当該技術においてＰＣＲ−リボタイプ０２７株として知られている。Ｃ．ディフィシ
ル株ＣＤ１９６からのＴｃｄＡに関するアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対し
て約９８％の同一性を有し、Ｃ．ディフィシル株Ｒ２０２９１からのＴｃｄＡに対して約
１００％の同一性を有する。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８はＣ．ディフィシル株ＣＤ１９６
からのＴｃｄＡに関する野生型遺伝子を記述しており、それはＧｅｎＢａｎｋアクセス番
号ＦＮ５３８９７０．１においても開示されている。
【０１５４】
野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡに関するアミノ酸配列のさらなる例にはＳＥＱ  ＩＤ
ＮＯ：１９が含まれ、それはＣ．ディフィシル株ＶＰＩ１０４６３からのＴｃｄＡに関
する野生型アミノ酸配列を記述している（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＣＡＡ６３５６４
．１においても開示されている）。Ｃ．ディフィシル株ＶＰＩ１０４６３からのＴｃｄＡ
に関するアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対して約１００％（９９．８％）の
同一性を有する。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０はＣ．ディフィシル株ＶＰＩ１０４６３から
のＴｃｄＡに関する野生型遺伝子を記述しており、それはＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｘ
９２９８２．１においても開示されている。
【０１５５】
野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡの追加の例には、疾病管理予防センター（ＣＤＣ、ジ
ョージア州アトランタ）から得ることができる野生型Ｃ．ディフィシル株からのＴｃｄＡ
が含まれる。本発明者らは、ＣＤＣから得ることが出来る野生型Ｃ．ディフィシル株から
のＴｃｄＡのアミノ酸配列には、最適に整列させた際に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１（Ｃ．
ディフィシル６３０からのＴｃｄＡ）のアミノ酸残基１〜８２１に対して少なくとも約９
９．３〜１００％の同一性が含まれることを発見した。表１参照。
【０１５６】
本発明者らは、野生型Ｃ．ディフィシル株からのＴｃｄＡのアミノ酸配列には、最適に
整列させた際に（例えば完全長配列を最適に整列させた際に）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１
に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７
％、９８％、９９％、約１００％までの同一性が含まれ得ることも発見した。
【０１５７】
表１：ＣＤＣから得られた野生型Ｃ．ディフィシル株および最適に整列させた際のそれ
ぞれの野生型Ｃ．ディフィシル株からのＴｃｄＡのアミノ酸残基１〜８２１のＳＥＱ  Ｉ
Ｄ  ＮＯ：１のアミノ酸残基１〜８２１に対するパーセント同一性。
【０１５８】
【表１】
2018052938.tif 000003
【０１５９】
従って、１態様において、その野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡのアミノ酸配列には、
例えばＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴプログラムにより初期設定のギャップウェイトを用い
て最適に整列させた際にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の残基１〜９００の間の等しい長さの配
列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９
７％、好ましくは約９８％、より好ましくは約９９％、または最も好ましくは約１００％
の同一性を有する、少なくとも約５００、６００、７００、または８００個の連続した残
基の配列が含まれる。例には、上記で記述された株（例えばＲ２０２９１、ＣＤ１９６等
）および表１において列挙された株が含まれる。
【０１６０】
別の態様において、その野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡのアミノ酸配列には、最適に
整列させた際にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８７〜１０９から選択されるいずれかの配列に対し
て少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、好ましくは
約９７％、好ましくは約９８％、より好ましくは約９９％、または最も好ましくは約１０
０％の同一性を有する配列が含まれる。表１−ａ参照。
【０１６１】
【表２−１】
2018052938.tif 000004
【０１６２】
【表２−２】
2018052938.tif 000005
【０１６３】
ＴｃｄＢに関する野生型遺伝子は、約２７０ｋＤａの推定分子量を有し、約２３６６ア
ミノ酸を有するタンパク質をコードする約７０９８ヌクレオチドを有する。本明細書で用
いられる際、野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢにはあらゆる野生型Ｃ．ディフィシル株か
らのＣ．ディフィシルＴｃｄＢが含まれる。野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢには、例え
ばＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴプログラムにより初期設定のギャップウェイトを用いて最
適に整列させた際にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に対して少なくとも約９０％、９１％、９２
％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、好ましくは約９８％、より好ましくは約
９９％、または最も好ましくは約１００％の同一性を有する野生型のアミノ酸配列が含ま
れてよい。好ましい態様において、野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢにはＳＥＱ  ＩＤ  
ＮＯ：２で示されるアミノ酸配列が含まれ、それはＣ．ディフィシル株６３０からのＴｃ
ｄＢに関する野生型アミノ酸配列を記述している（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＹＰ＿０
０１０８７１３５．１および／またはＣＡＪ６７４９２においても開示されている）。Ｓ
ＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０はＣ．ディフィシル株６３０からのＴｃｄＢに関する野生型遺伝
子を記述しており、それはＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＮＣ＿００９０８９．１において
も開示されている。
【０１６４】
野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢの別の例には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１で示される
アミノ酸配列が含まれ、それはＣ．ディフィシル株Ｒ２０２９１からのＴｃｄＢに関する
野生型アミノ酸配列を記述している（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＹＰ＿００３２１７０
８６．１および／またはＣＢＥ０２４７９．１においても開示されている）。Ｃ．ディフ
ィシル株Ｒ２０２９１からのＴｃｄＢに関するアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２
に対して約９２％の同一性を有する。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２はＣ．ディフィシル株Ｒ
２０２９１からのＴｃｄＢに関する野生型遺伝子を記述しており、それはＧｅｎＢａｎｋ
アクセス番号ＮＣ＿０１３３１６．１においても開示されている。
【０１６５】
野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢの追加の例には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３で示され
るアミノ酸配列が含まれ、それはＣ．ディフィシル株ＣＤ１９６からのＴｃｄＢに関する
野生型アミノ酸配列を記述している（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＹＰ＿００３２１３６
３９．１および／またはＣＢＡ６１１５３．１においても開示されている）。ＳＥＱ  Ｉ
Ｄ  ＮＯ：２４はＣ．ディフィシル株ＣＤ１９６からのＴｃｄＢに関する野生型遺伝子を
記述しており、それはＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＮＣ＿０１３３１５．１においても開
示されている。Ｃ．ディフィシル株ＣＤ１９６からのＴｃｄＢに関するアミノ酸配列は、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に対して約９２％の同一性を有する。
【０１６６】
野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢに関するアミノ酸配列のさらなる例にはＳＥＱ  ＩＤ
ＮＯ：２５が含まれ、それはＣ．ディフィシル株ＶＰＩ１０４６３からのＴｃｄＢに関
する野生型アミノ酸配列を記述している（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｐ１８１７７およ
び／またはＣＡＡ３７２９８においても開示されている）。Ｃ．ディフィシル株ＶＰＩ１
０４６３からのＴｃｄＢに関するアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に対して１０
０％の同一性を有する。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６はＣ．ディフィシル株ＶＰＩ１０４６
３からのＴｃｄＢに関する野生型遺伝子を記述しており、それはＧｅｎＢａｎｋアクセス
番号Ｘ５３１３８．１においても開示されている。
【０１６７】
野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢの追加の例には、疾病管理予防センター（ＣＤＣ、ジ
ョージア州アトランタ）から得ることができる野生型Ｃ．ディフィシル株からのＴｃｄＢ
が含まれる。本発明者らは、ＣＤＣから得ることが出来る野生型Ｃ．ディフィシル株から
のＴｃｄＢのアミノ酸配列には、最適に整列させた際に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２（Ｃ．
ディフィシル６３０からのＴｃｄＢ）のアミノ酸残基１〜８２１に対して少なくとも約９
６〜１００％の同一性が含まれることを発見した。表２参照。
【０１６８】
表２：ＣＤＣから得られた野生型Ｃ．ディフィシル株および最適に整列させた際のそれ
ぞれの野生型Ｃ．ディフィシル株からのＴｃｄＢのアミノ酸残基１〜８２１のＳＥＱ  Ｉ
Ｄ  ＮＯ：２のアミノ酸残基１〜８２１に対するパーセント同一性。
【０１６９】
【表３】
2018052938.tif 000006
【０１７０】
従って、１態様において、野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢのアミノ酸配列には、例え
ばＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴプログラムにより初期設定のギャップウェイトを用いて最
適に整列させた際にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の残基１〜９００の間の等しい長さの配列に
対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、好まし
くは約９７％、好ましくは約９８％、より好ましくは約９９％、または最も好ましくは約
１００％の同一性を有する、少なくとも約５００、６００、７００、または８００個の連
続した残基の配列が含まれる。例には、上記で記述された株（例えばＲ２０２９１、ＣＤ
１９６等）および表２において列挙された株が含まれる。
【０１７１】
別の態様において、その野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢのアミノ酸配列には、最適に
整列させた際にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１０〜１３３から選択されるいずれかの配列に対
して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、好ましく
は約９７％、好ましくは約９８％、より好ましくは約９９％、または最も好ましくは約１
００％の同一性を有する配列が含まれる。表２−ａ参照。
【０１７２】
【表４−１】
2018052938.tif 000007
【０１７３】
【表４−２】
2018052938.tif 000008
【０１７４】
毒素ＡおよびＢに関する遺伝子（ｔｃｄＡおよびｔｃｄＢ）は３個の追加の小さいオー
プンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であるｔｃｄＤ、ｔｃｄＥ、およびｔｃｄＣが含ま
る１９．６ｋｂの遺伝子座（病原性遺伝子座、ＰａＬｏｃ）の一部であり、病毒性の役に
立っていると考えることができる。ＰａＬｏｃは毒素産生株において安定且つ保存されて
いることが知られている。それは現在までに分析されている全ての毒素産生株において同
じ染色体組込み部位に存在する。非毒素産生株ではその病原性遺伝子座（ＰａＬｏｃ）は
存在しない。従って、本明細書で記述される野生型Ｃ．ディフィシル株の１つの特徴は、
病原性遺伝子座の存在である。本明細書で記述される野生型Ｃ．ディフィシル株の別の好
ましい特徴は、ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢ両方の産生である。
【０１７５】
１態様において、その野生型Ｃ．ディフィシル株は、Ｃ．ディフィシル６３０またはＶ
ＰＩ１０４６３の病原性遺伝子座に少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４
％、９５％、９６％、９７％、好ましくは約９８％、より好ましくは約９９％、または最
も好ましくは約１００％同一である病原性遺伝子座を有する株である。Ｃ．ディフィシル
ＶＰＩ１０４６３の全病原性遺伝子座配列は、ＥＭＢＬデータベースにおいて配列アクセ
ス番号Ｘ９２９８２で登録されており、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６においても示されてい
る。ＰａＬｏｃが参照株ＶＰＩ１０４６３のＰａＬｏｃと同一である株は、毒素タイプ（
ｔｏｘｉｎｏｔｙｐｅ）０と呼ばれる。毒素タイプＩ〜ＶＩＩ、ＩＸ、ＸＩＩ〜ＸＶ、お
よびＸＶＩＩＩ〜ＸＸＩＶの株は、それらの毒素遺伝子における変動にも関わらず、Ｔｃ
ｄＡおよびＴｃｄＢ両方を産生する。
【０１７６】
その毒素のＮ末端に、グルコシルトランスフェラーゼドメインが位置する。その毒素の
グルコシルトランスフェラーゼ活性はその毒素の細胞毒性機能と関係している。機序また
は理論により束縛されるわけではないが、両方の毒素におけるグルコシルトランスフェラ
ーゼ活性は、Ｒｈｏ／Ｒａｃ／Ｒａｓスーパーファミリーの低分子量ＧＴＰ結合タンパク
質のモノグルコシル化を触媒すると信じられている。これらのＧＴＰ結合タンパク質のグ
ルコシル化後、細胞生理は劇的に修正され、結果としてその毒素に感染した宿主細胞の構
造的完全性の喪失および必須のシグナル伝達経路の崩壊がもたらされる。マンガン、ウリ
ジン二リン酸（ＵＤＰ）、およびグルコース結合に関わるＡｓｐ−Ｘａａ−Ａｓｐ（ＤＸ
Ｄ）モチーフは、そのグルコシルトランスフェラーゼドメインの典型的な特徴である。機
序または理論により束縛されるわけではないが、触媒活性に重要な残基、例えばＤＸＤモ
チーフは、既知の“歴史上の”株、例えば６３０からのＴｃｄＢおよび高病毒性株、例え
ばＲ２０２９１からのＴｃｄＢの間で異なっていないと信じられる。そのＤＸＤモチーフ
は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の番号付けに従う野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡの残基２
８５〜２８７に、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の番号付けに従う野生型Ｃ．ディフィシ
ルＴｃｄＢの残基２８６〜２８８に位置している。
【０１７７】
グローバルアラインメントアルゴリズム（例えば配列分析プログラム）は当該技術にお
いて既知であり、２個以上のアミノ酸毒素配列を最適に整列させてその毒素に特定のシグ
ナチャーモチーフ（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｍｏｔｉｆ）（例えばグルコシルトランスフェ
ラーゼドメイン中のＤＸＤ、下記で記述されるシステインプロテアーゼドメイン中のＤＨ
Ｃ等）が含まれるかどうかを決定するために用いることができる。最適に整列させた配列
（単数または複数）を、それぞれの参照配列（例えばＴｃｄＡに関するＳＥＱ  ＩＤ  Ｎ
Ｏ：１またはＴｃｄＢに関するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）に対して比較して、そのシグナ
チャーモチーフの存在を決定する。“最適なアラインメント”は、最も高いパーセント同
一性の点数を与えるアラインメントを指す。そのようなアラインメントは、既知の配列分
析プログラムを用いて実施することができる。１態様において、初期設定のパラメーター
の下でのＣＬＵＳＴＡＬアラインメント（例えばＣＬＵＳＴＡＬＷ）がクエリ配列を参照
配列に対して比較することにより適切な野生型毒素を同定するために用いられる。保存さ
れたアミノ酸残基の相対的番号付けは、その整列させた配列内の小さい挿入または欠失（
例えば５個アミノ酸以下）を説明するため、その参照アミノ酸配列の残基の番号付けに基
づく。
【０１７８】
本明細書で用いられる際、用語“の番号付けに従い”は、所与のアミノ酸またはポリヌ
クレオチド配列を参照配列と比較する際の参照配列の残基の番号付けを指す。言い換えれ
ば、所与のポリマーの数または残基の位置は、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配
列内のその残基の実際の数値的位置によるのではなく、その参照配列に関して示される。
【０１７９】
例えば、所与のアミノ酸配列、例えば高病毒性野生型Ｃ．ディフィシル株のアミノ酸配
列を、２つの配列の間の残基の一致を最適化するために必要に応じてギャップを導入する
ことにより参照配列（例えば歴史上の野生型Ｃ．ディフィシル株、例えば６３０の配列）
に対して整列させることができる。これらの場合では、そのギャップが存在するが、所与
のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列中の残基の番号付けはそれを整列させた参照配列
に関してなされる。本明細書で用いられる際、“参照配列”は、配列比較に関する基準と
して用いられる定められた配列を指す。
【０１８０】
別途記載しない限り、本明細書におけるＴｃｄＡのアミノ酸位置に対する全ての言及は
、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の番号付けを指す。別途記載しない限り、本明細書におけるＴ
ｃｄＢのアミノ酸位置に対する全ての言及は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の番号付けを指す
。
【０１８１】
ＴｃｄＡのグルコシルトランスフェラーゼドメインは、本明細書で用いられる際、野生
型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡ、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の典型的な残基１、１０１
、または１０２で開始してよく、典型的な残基５４２、５１６、または２９３で終了して
よい。ＤＸＤモチーフ領域が含まれる限り、ＴｃｄＡの残基１〜５４２のあらゆる最小の
残基の位置を最大の残基の位置と組み合わせてグルコシルトランスフェラーゼドメインに
関する配列を定めることができる。例えば、１態様において、ＴｃｄＡのグルコシルトラ
ンスフェラーゼドメインにはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７が含まれ、それはＳＥＱ  ＩＤ  
ＮＯ：１の残基１０１〜２９３と同一であり、それにはＤＸＤモチーフ領域が含まれる。
別の態様において、ＴｃｄＡのグルコシルトランスフェラーゼドメインにはＳＥＱ  ＩＤ
ＮＯ：２８が含まれ、それはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の残基１〜５４２と同一である。
【０１８２】
ＴｃｄＢのグルコシルトランスフェラーゼドメインは、本明細書で用いられる際、野生
型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢ、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の典型的な残基１、１０１
、または１０２で開始してよく、典型的な残基５４３、５１６、または２９３で終了して
よい。ＤＸＤモチーフ領域が含まれる限り、ＴｃｄＢの残基１〜５４３のあらゆる最小の
残基の位置を最大の残基の位置と組み合わせてグルコシルトランスフェラーゼドメインに
関する配列を定めることができる。例えば、１態様において、ＴｃｄＢのグルコシルトラ
ンスフェラーゼドメインにはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９が含まれ、それはＳＥＱ  ＩＤ  
ＮＯ：２の残基１０１〜２９３と同一であり、それにはＤＸＤモチーフ領域が含まれる。
別の態様において、ＴｃｄＢのグルコシルトランスフェラーゼドメインにはＳＥＱ  ＩＤ
ＮＯ：３０が含まれ、それはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の残基１〜５４３と同一である。
【０１８３】
理論または機序により束縛されるわけではないが、ＴｃｄＡおよび／またはＴｃｄＢの
Ｎ末端がそのグルコシルトランスフェラーゼドメインに関する自己タンパク質分解性プロ
セスにより切断されて移行し、宿主細胞の細胞質ゾル中に放出され、そこでそれはＲａｃ
／Ｒａｓ／Ｒｈｏ  ＧＴＰアーゼと相互作用することができると信じられている。野生型
Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡはＬ５４２およびＳ５４３の間で切断されることが示されてい
る。野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢはＬ５４３およびＧ５４４の間で切断されることが
示されている。
【０１８４】
システインプロテアーゼドメインはその毒素の自己触媒的タンパク質分解活性と関係し
ている。システインプロテアーゼドメインはグルコシルトランスフェラーゼドメインの下
流に位置しており、触媒三つ組（ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｔｒｉａｄ）アスパラギン酸、ヒ
スチジン、およびシステイン（ＤＨＣ）、例えば野生型ＴｃｄＡのＤ５８９、Ｈ６５５、
およびＣ７００、ならびに野生型ＴｃｄＢのＤ５８７、Ｈ６５３、およびＣ６９８を特徴
とし得る。機序または理論により束縛されるわけではないが、その触媒三つ組は“歴史上
の”株、例えば６３０からの毒素および高病毒性株、例えばＲ２０２９１からのＴｃｄＢ
の間で保存されていると信じられている。
【０１８５】
ＴｃｄＡのシステインプロテアーゼドメインは、本明細書で用いられる際、野生型Ｔｃ
ｄＡ、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の典型的な残基５４３で開始してよく、典型的な残
基８０９、７６９、７６８、または７６７で終了してよい。触媒三つ組ＤＨＣモチーフ領
域が含まれる限り、野生型ＴｃｄＡの５４３〜８０９のあらゆる最小の残基の位置を最大
の残基の位置と組み合わせてシステインプロテアーゼドメインに関する配列を定めること
ができる。例えば、１態様において、ＴｃｄＡのシステインプロテアーゼドメインにはＳ
ＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２が含まれ、それはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２の残基４７、１１３
、および１５８に位置するＤＨＣモチーフ領域を有し、それはそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  Ｎ
Ｏ：１の番号付けに従う野生型ＴｃｄＡのＤ５８９、Ｈ６５５、およびＣ７００に対応す
る。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＴｃｄＡの残基５４３〜８０
９と同一である。
【０１８６】
ＴｃｄＢのシステインプロテアーゼドメインは、本明細書で用いられる際、野生型Ｔｃ
ｄＢ、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の典型的な残基５４４で開始してよく、典型的な残
基８０１、７６７、７５５、または７００で終了してよい。触媒三つ組ＤＨＣモチーフ領
域が含まれる限り、野生型ＴｃｄＢの５４４〜８０１のあらゆる最小の残基の位置を最大
の残基の位置と組み合わせてシステインプロテアーゼドメインに関する配列を定めること
ができる。例えば、１態様において、ＴｃｄＢのシステインプロテアーゼドメインにはＳ
ＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３が含まれ、それにはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３の残基４４、１１
０、および１１５に位置するＤＨＣモチーフ領域が含まれ、それはそれぞれＳＥＱ  ＩＤ
ＮＯ：２の番号付けに従う野生型ＴｃｄＢのＤ５８７、Ｈ６５３、およびＣ６９８に対
応する。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＴｃｄＢの残基５４４〜
７６７と同一である。別の態様において、ＴｃｄＢのシステインプロテアーゼドメインに
はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＴｃｄＢの残基５４４〜８０１が含まれる。
【０１８７】
本発明において、その免疫原性組成物には変異体Ｃ．ディフィシル毒素が含まれる。用
語“変異体”は、本明細書で用いられる際、対応する野生型の構造または配列と、その対
応する野生型の構造と比較して架橋を有することにより、および／または例えばＧＡＰま
たはＢＥＳＴＦＩＴプログラムにより初期設定のギャップウェイトを用いて最適に整列さ
せた際に対応する野生型の配列と比較して少なくとも１個の変異を有することにより異な
る構造または配列を示す分子を指す。用語“変異体”には、本明細書で用いられる際、さ
らに対応する野生型分子と異なる機能的特性（例えば抑止されたグルコシルトランスフェ
ラーゼおよび／または抑止されたシステインプロテアーゼ活性）を示す分子が含まれる。
【０１８８】
上記で記述された野生型株のいずれかからのＣ．ディフィシル毒素を、それから変異体
Ｃ．ディフィシル毒素を生成する源として用いることができる。好ましくは、Ｃ．ディフ
ィシル６３０がそれから変異体Ｃ．ディフィシル毒素を生成する源である。
【０１８９】
その変異は、通常はその位置に位置する野生型アミノ酸残基の置換、欠失、切り詰め（
ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）または修飾を含んでよい。好ましくは、その変異は非保存的アミ
ノ酸置換である。本発明は、本明細書で記述される変異体毒素のいずれかをコードする核
酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドも意図している。
【０１９０】
“非保存的”アミノ酸置換は、本明細書で用いられる際、次の表３に従うあるクラスか
らのアミノ酸の別のクラスからのアミノ酸との交換を指す：
【０１９１】
【表５】
2018052938.tif 000009
【０１９２】
非保存的アミノ酸置換の例には、アスパラギン酸残基（Ａｓｐ、Ｄ）がアラニン残基（
Ａｌａ、Ａ）により置き換えられる置換が含まれる。他の例には、アスパラギン酸残基（
Ａｓｐ、Ｄ）のアスパラギン残基（Ａｓｎ、Ｎ）による置き換え；アルギニン（Ａｒｇ、
Ｒ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）、リシン（Ｌｙｓ、Ｋ）、および／またはヒスチジン
（Ｈｉｓ、Ｈ）残基のアラニン残基（Ａｌａ、Ａ）による置き換えが含まれる。
【０１９３】
保存的置換は、例えば表３に従う同じクラスからのアミノ酸の間での交換を指す。
本発明の変異体毒素は、例えば部位特異的変異誘発、変異原（例えば紫外線）を用いる
変異誘発等のような、変異を調製するための当該技術で既知の技法により調製することが
できる。好ましくは、部位特異的変異誘発が用いられる。あるいは、目的配列を有する核
酸分子を直接合成することができる。そのような化学合成法は、当該技術で既知である。
【０１９４】
本発明において、その変異体Ｃ．ディフィシル毒素には、対応する野生型Ｃ．ディフィ
シル毒素と比較してグルコシルトランスフェラーゼドメイン中に少なくとも１個の変異が
含まれる。１態様において、そのグルコシルトランスフェラーゼドメインには少なくとも
２個の変異が含まれる。好ましくは、その変異はその毒素のグルコシルトランスフェラー
ゼ酵素活性を対応する野生型Ｃ．ディフィシル毒素のグルコシルトランスフェラーゼ酵素
活性と比較して低下させる、または抑止する。
【０１９５】
変異を起こすことができるＴｃｄＡのグルコシルトランスフェラーゼドメイン中の典型
的なアミノ酸残基には、野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡと比較して、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎ
Ｏ：１の番号付けに従って、以下の少なくとも１個またはそれらのあらゆる組み合わせが
含まれる：Ｗ１０１、Ｄ２６９、Ｒ２７２、Ｄ２８５、Ｄ２８７、Ｅ４６０、Ｒ４６２、
Ｓ５４１、およびＬ５４２。
【０１９６】
ＴｃｄＡのグルコシルトランスフェラーゼドメインにおける典型的な変異には、野生型
Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡと比較して、以下の少なくとも１種類またはそれらのあらゆる
組み合わせが含まれる：Ｗ１０１Ａ、Ｄ２６９Ａ、Ｒ２７２Ａ、Ｄ２８５Ａ、Ｄ２８７Ａ
、Ｅ４６０Ａ、Ｒ４６２Ａ、Ｓ５４１Ａ、およびＬ５４２Ｇ。好ましい態様において、Ｔ
ｃｄＡのグルコシルトランスフェラーゼドメインには、野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡ
と比較して、Ｌ５４２Ｇ変異が含まれる。別の好ましい態様において、ＴｃｄＡのグルコ
シルトランスフェラーゼドメインには、野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡと比較して、Ｄ
２８５ＡおよびＤ２８７Ａ変異が含まれる。
【０１９７】
変異を起こすことができるＴｃｄＢのグルコシルトランスフェラーゼドメイン中の典型
的なアミノ酸残基には、野生型Ｃ．ディフィシル毒素Ｂと比較して、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ
：２の番号付けに従って、以下の少なくとも１個またはそれらのあらゆる組み合わせが含
まれる：Ｗ１０２、Ｄ２７０、Ｒ２７３、Ｄ２８６、Ｄ２８８、Ｎ３８４、Ｄ４６１、Ｋ
４６３、Ｗ５２０、およびＬ５４３。
【０１９８】
ＴｃｄＢのグルコシルトランスフェラーゼドメインにおける典型的な変異には、野生型
Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢと比較して、以下の少なくとも１種類またはそれらのあらゆる
組み合わせが含まれる：Ｗ１０２Ａ、Ｄ２７０Ａ、Ｄ２７０Ｎ、Ｒ２７３Ａ、Ｄ２８６Ａ
、Ｄ２８８Ａ、Ｎ３８４Ａ、Ｄ４６１Ａ、Ｄ４６１Ｒ、Ｋ４６３Ａ、Ｋ４６３Ｅ、Ｗ５２
０Ａ、およびＬ５４３Ａ。好ましい態様において、ＴｃｄＢのグルコシルトランスフェラ
ーゼドメインには、野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢと比較して、Ｌ５４３Ａが含まれる
。別の好ましい態様において、ＴｃｄＢのグルコシルトランスフェラーゼドメインには、
野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢと比較して、Ｄ２８６ＡおよびＤ２８８Ａ変異が含まれ
る。
【０１９９】
本明細書において上記で記述された変異のいずれも、システインプロテアーゼドメイン
における変異と組み合わせることができる。本発明において、その変異体Ｃ．ディフィシ
ル毒素には、対応する野生型Ｃ．ディフィシル毒素と比較してシステインプロテアーゼド
メイン中に少なくとも１個の変異が含まれる。好ましくは、その変異はその毒素のシステ
インプロテアーゼ活性を対応する野生型Ｃ．ディフィシル毒素のシステインプロテアーゼ
活性と比較して低下させる、または抑止する。
【０２００】
変異を起こすことができるＴｃｄＡのシステインプロテアーゼドメイン中の典型的なア
ミノ酸残基には、野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡと比較して、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１
の番号付けに従って、以下の少なくとも１個またはそれらのあらゆる組み合わせが含まれ
る：Ｓ５４３、Ｄ５８９、Ｈ６５５、およびＣ７００。ＴｃｄＡのグルコシルトランスフ
ェラーゼドメインにおける典型的な変異には、野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡと比較し
て、以下の少なくとも１種類またはそれらのあらゆる組み合わせが含まれる：Ｓ５４３Ａ
、Ｄ５８９Ａ、Ｄ５８９Ｎ、Ｈ６５５Ａ、Ｃ７００Ａ。好ましい態様において、ＴｃｄＡ
のシステインプロテアーゼドメインには、野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡと比較して、
Ｃ７００Ａ変異が含まれる。
【０２０１】
変異を起こすことができるＴｃｄＢのシステインプロテアーゼドメイン中の典型的なア
ミノ酸残基には、野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢと比較して、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２
の番号付けに従って、以下の少なくとも１個またはそれらのあらゆる組み合わせが含まれ
る：Ｇ５４４、Ｄ５８７、Ｈ６５３、およびＣ６９８。ＴｃｄＢのグルコシルトランスフ
ェラーゼドメインにおける典型的な変異には、野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢと比較し
て、以下の少なくとも１種類またはそれらのあらゆる組み合わせが含まれる：Ｇ５４４Ａ
、Ｄ５８７Ａ、Ｄ５８７Ｎ、Ｈ６５３Ａ、Ｃ６９８Ａ。好ましい態様において、ＴｃｄＢ
のシステインプロテアーゼドメインには、野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢと比較して、
Ｃ６９８Ａ変異が含まれる。変異を起こすことができるＴｃｄＢのシステインプロテアー
ゼドメイン中の追加のアミノ酸残基には、野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢと比較して、
Ｋ６００および／またはＲ７５１が含まれる。典型的な変異には、Ｋ６００Ｅおよび／ま
たはＲ７５１Ｅが含まれる。
【０２０２】
従って、本発明の変異体Ｃ．ディフィシル毒素には、対応する野生型Ｃ．ディフィシル
毒素と比較して変異を有するグルコシルトランスフェラーゼドメインおよび変異を有する
システインプロテアーゼドメインが含まれる。
【０２０３】
典型的な変異体Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡには、対応する野生型Ｃ．ディフィシル毒素
Ａと比較して２８５位および２８７位においてアミノ酸置換を有するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ
：２９が含まれるグルコシルトランスフェラーゼドメインならびに１５８位においてアミ
ノ酸置換を有するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２を含むシステインプロテアーゼドメインが含
まれる。例えば、そのような変異体Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡにはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：
４で示されるアミノ酸配列が含まれ、ここで最初のメチオニンは場合により存在しない。
別の態様において、その変異体Ｃ．ディフィシル毒素ＡにはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４で
示されるアミノ酸配列が含まれる。
【０２０４】
変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ａのさらなる例にはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７で示されるア
ミノ酸配列が含まれ、それはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と比較してＤ２６９Ａ、Ｒ２７２Ａ
、Ｄ２８５Ａ、Ｄ２８７Ａ、Ｅ４６０Ａ、Ｒ４６２Ａ、およびＣ７００Ａ変異を有し、こ
こで最初のメチオニンは場合により存在しない。別の態様において、その変異体Ｃ．ディ
フィシル毒素Ａには、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３で示されるアミノ酸配列が含まれる。
【０２０５】
別の典型的な変異体ＴｃｄＡにはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４が含まれ、ここで１０１、
２６９、２７２、２８５、２８７、４６０、４６２、５４１、５４２、５４３、５８９、
６５５、および７００位の残基はあらゆるアミノ酸であってよい。
【０２０６】
一部の態様において、その変異体Ｃ．ディフィシル毒素は対応する野生型Ｃ．ディフィ
シル毒素と比較して低下した、または抑止された自己タンパク質分解性プロセシングを示
す。例えば、変異体Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡには、対応する野生型Ｃ．ディフィシルＴ
ｃｄＡと比較して、以下の残基：Ｓ５４１、Ｌ５４２および／またはＳ５４３の１個にお
ける変異またはそれらのあらゆる組み合わせが含まれていてよい。好ましくは、その変異
体Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡには、対応する野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡと比較して
、以下の変異：Ｓ５４１Ａ、Ｌ５４２Ｇ、およびＳ５４３Ａの少なくとも１種類またはそ
れらのあらゆる組み合わせが含まれる。
【０２０７】
別の典型的な変異体Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡには、対応する野生型Ｃ．ディフィシル
ＴｃｄＡと比較して、Ｓ５４１Ａ、Ｌ５４２、Ｓ５４３およびＣ７００変異が含まれる。
典型的な変異体Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢには、対応する野生型Ｃ．ディフィシル毒素
Ｂと比較して２８６位および２８８位においてアミノ酸置換を有するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ
：３１を含むグルコシルトランスフェラーゼドメインならびに１５５位においてアミノ酸
置換を有するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３を含むシステインプロテアーゼドメインが含まれ
る。例えば、そのような変異体Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢにはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６で
示されるアミノ酸配列が含まれ、ここで最初のメチオニンは場合により存在しない。別の
態様において、その変異体Ｃ．ディフィシル毒素ＡにはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６で示さ
れるアミノ酸配列が含まれる。
【０２０８】
変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ｂのさらなる例にはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８で示されるア
ミノ酸配列が含まれ、それはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８と比較し
てＤ２７０Ａ、Ｒ２７３Ａ、Ｄ２８６Ａ、Ｄ２８８Ａ、Ｄ４６１Ａ、Ｋ４６３Ａ、および
Ｃ６９８Ａ変異を有し、ここで最初のメチオニンは場合により存在しない。別の態様にお
いて、その変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ａには、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８５で示されるア
ミノ酸配列が含まれる。
【０２０９】
別の典型的な変異体ＴｃｄＢにはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５が含まれ、ここで１０１、
２６９、２７２、２８５、２８７、４６０、４６２、５４１、５４２、５４３、５８９、
６５５、および７００位の残基はあらゆるアミノ酸であってよい。
【０２１０】
別の例として、変異体Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢには、対応する野生型Ｃ．ディフィシ
ルＴｃｄＢと比較して５４３および／または５４４位における変異が含まれていてよい。
好ましくは、その変異体Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢには、対応する野生型Ｃ．ディフィシ
ルＴｃｄＢと比較して、Ｌ５４３および／またはＧ５４４変異が含まれる。より好ましく
は、その変異体Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢには、対応する野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄ
Ｂと比較して、Ｌ５４３Ａおよび／またはＧ５４４Ａ変異が含まれる。
【０２１１】
別の典型的な変異体Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢには、対応する野生型Ｃ．ディフィシル
ＴｃｄＢと比較してＬ５４３Ｇ、Ｇ５４４ＡおよびＣ６９８変異が含まれる。
１側面において、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の番号付けに従うアミノ酸残基１
〜１５００からのいずれかの位置において変異を有し、典型的な変異体Ｃ．ディフィシル
毒素Ｂを定める、単離されたポリペプチドに関する。例えば、１態様において、その単離
されたポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸残基８３０〜９９０に変異を
含む。変異に関する典型的な位置には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の番号付けに従う９７０
位および９７６位が含まれる。好ましくは、その残基８３０〜９９０の変異は置換である
。１態様において、その変異は非保存的置換であり、ここでＡｓｐ（Ｄ）および／または
Ｇｌｕ（Ｅ）アミノ酸残基が例えばリシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、およびヒスチジン
（Ｈ）のような酸性化の際に中和されないアミノ酸残基により置き換えられている。典型
的な変異にはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のＥ９７０Ｋ、Ｅ９７０Ｒ、Ｅ９７０Ｈ、Ｅ９７６
Ｋ、Ｅ９７６Ｒ、Ｅ９７６Ｈが含まれ、変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ｂが定められる。
【０２１２】
別の側面において、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の番号付けに従うアミノ酸残基
１〜１５００からのいずれかの位置において変異を有し、典型的な変異体Ｃ．ディフィシ
ル毒素Ａを定める、単離されたポリペプチドに関する。例えば、１態様において、その単
離されたポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸残基８３２〜９９２に変異
を含む。変異に関する典型的な位置には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の番号付けに従う９７
２および９７８位が含まれる。好ましくは、その残基８３２〜９９２の変異は置換である
。１態様において、その変異は非保存的置換であり、ここでＡｓｐ（Ｄ）および／または
Ｇｌｕ（Ｅ）アミノ酸残基が例えばリシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、およびヒスチジン
（Ｈ）のような酸性化の際に中和されないアミノ酸残基により置き換えられている。典型
的な変異にはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＤ９７２Ｋ、Ｄ９７２Ｒ、Ｄ９７２Ｈ、Ｄ９７８
Ｋ、Ｄ９７８Ｒ、Ｄ９７８Ｈが含まれ、変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ａが定められる。
【０２１３】
本発明のポリペプチドには、一部の場合において宿主細胞に媒介されるプロセスの結果
として最初のメチオニン残基が含まれていてよい。例えば組み換え生成手順において用い
られる宿主細胞および／またはその宿主細胞の発酵もしくは増殖条件に依存して、翻訳開
始コドンによりコードされるＮ末端のメチオニンは細胞中で翻訳後にポリペプチドから除
去され得る、またはそのＮ末端のメチオニンはその単離されたポリペプチドにおいて存在
するままであり得ることが当該技術において知られている。
【０２１４】
従って、１側面において、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４で示されるアミノ酸配列が
含まれる単離されたポリペプチドに関し、ここで（１位における）最初のメチオニンは場
合により存在しない。１態様において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の最初のメチオニンは存
在しない。１側面において、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４で示されるアミノ酸配列
が含まれる単離されたポリペプチドに関し、それは最初のメチオニンの非存在を除いてＳ
ＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４と同一である。
【０２１５】
別の側面において、その単離されたポリペプチドにはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６で示され
るアミノ酸配列が含まれ、ここで（１位における）最初のメチオニンは場合により存在し
ない。１態様において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６の最初のメチオニンは存在しない。１側
面において、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６で示されるアミノ酸配列が含まれる単離
されたポリペプチドに関し、それは最初のメチオニンの非存在を除いてＳＥＱ  ＩＤ  Ｎ
Ｏ：６と同一である。
【０２１６】
さらなる側面において、その単離されたポリペプチドにはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７で示
されるアミノ酸配列が含まれ、ここで（１位における）最初のメチオニンは場合により存
在しない。１態様において、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３で示されるアミノ酸配列
が含まれる単離されたポリペプチドに関し、それは最初のメチオニンの非存在を除いてＳ
ＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７と同一である。さらに別の側面において、その単離されたポリペプ
チドにはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８で示されるアミノ酸配列が含まれ、ここで（１位におけ
る）最初のメチオニンは場合により存在しない。１態様において、その単離されたポリペ
プチドにはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８５で示されるアミノ酸配列が含まれ、それは最初のメ
チオニンの非存在を除いてＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８と同一である。
【０２１７】
１側面において、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４が含まれる免疫原性組成物に関し、
ここで（１位における）最初のメチオニンは場合により存在しない。別の側面において、
本発明はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６が含まれる免疫原性組成物に関し、ここで（１位におけ
る）最初のメチオニンは場合により存在しない。さらなる側面において、本発明はＳＥＱ
ＩＤ  ＮＯ：７が含まれる免疫原性組成物に関し、ここで（１位における）最初のメチ
オニンは場合により存在しない。さらに別の側面において、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ
：８が含まれる免疫原性組成物に関し、ここで（１位における）最初のメチオニンは場合
により存在しない。
【０２１８】
別の側面において、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３が含まれる免疫原性組成物に関
する。１側面において、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４が含まれる免疫原性組成物に
関する。１側面において、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８５が含まれる免疫原性組成物
に関する。別の側面において、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６が含まれる免疫原性組
成物に関する。
【０２１９】
哺乳類における免疫応答の生成に加えて、本明細書で記述される免疫原性組成物はまた
、対応する野生型Ｃ．ディフィシル毒素と比較して低減した細胞毒性を有する。好ましく
は、その免疫原性組成物は安全であり、且つ哺乳類における投与に関してそれぞれの野生
型毒素の細胞毒性と比較して最小限（例えば約６〜８ｌｏｇ１０の低減）の細胞毒性を有
する〜細胞毒性を有しない。
【０２２０】
本明細書で用いられる際、細胞毒性という用語は当該技術において理解されている用語
であり、アポトーシス性の細胞死および／または細胞の１種類以上の通常の生化学的また
は生物学的機能がその細胞毒性薬剤の非存在を除いて同一の条件下の同一の細胞と比較し
て異常に弱められている（ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ）状態を指す。毒性は、例えば細胞に
おいて、または哺乳類において、５０％の細胞死を誘導するのに必要な薬剤の量（すなわ
ちそれぞれＥＣ５０またはＥＤ５０）として、または当該技術で既知の他の方法により定
量化することができる。
【０２２１】
細胞毒性を示すためのアッセイは当該技術において既知であり、例えば細胞円形化アッ
セイ（ｃｅｌｌ  ｒｏｕｎｄｉｎｇ  ａｓｓａｙｓ）である（例えばKuehne et al. Natu
re. 2010 Oct 7;467(7316):711-3を参照）。ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢの作用は細胞の円形
化（例えば形態の喪失）および死を引き起こし、そのような現象は光学顕微鏡により見る
ことができる。例えば図９を参照。
【０２２２】
当該技術で既知の追加の典型的な細胞毒性アッセイには、（Busch et al., J Biol Che
m. 1998 Jul 31;273(31):19566-72において記述されているような）[１４Ｃ]グルコース
で標識されたＲａｓの蛍光体画像化に関するグルコシル化アッセイ、および好ましくは下
記の実施例において記述されるインビトロ細胞毒性アッセイが含まれ、ここでＥＣ５０は
細胞、好ましくはヒト二倍体線維芽細胞（例えばＩＭＲ９０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１
８６（商標）））においてその毒素の非存在下で同一の条件下で同一の細胞と比較して少
なくとも約５０％の細胞変性作用（ＣＰＥ）を示す免疫原性組成物の濃度を指してよい。
そのインビトロ細胞毒性アッセイは、細胞、好ましくはヒト二倍体線維芽細胞（例えばＩ
ＭＲ９０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１８６（商標）））においてその毒素の非存在下で同
一の条件下で同一の細胞と比較して野生型Ｃ．ディフィシル毒素に誘導される細胞変性作
用（ＣＰＥ）の少なくとも約５０％を阻害する組成物の濃度を評価するために用いられて
もよい。追加の典型的な細胞毒性アッセイには、Doern et al., J Clin Microbiol. 1992
Aug;30(8):2042-6において記述されている細胞毒性アッセイが含まれる。細胞毒性は、
毒素で処理した細胞においてＡＴＰレベルを測定することにより決定することもできる。
例えば、ルシフェラーゼに基づく基質、例えばＣＥＬＬＴＩＴＥＲＧＬＯ（登録商標）（
Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いることができ、それは相対光単位（ＲＬＵ）として測定される発
光を放射する。そのようなアッセイにおいて、細胞生存度はその細胞中のＡＴＰの量また
はＲＬＵ値に正比例し得る。
【０２２３】
１態様において、その免疫原性組成物の細胞毒性は、対応する野生型Ｃ．ディフィシル
毒素と比較して少なくとも約１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０
００、７０００、８０００、９０００、１００００、１１０００、１２０００、１３００
０倍、１４０００倍、１５０００倍、またはより多く低減されている。例えば表２０を参
照。
【０２２４】
別の態様において、その免疫原性組成物の細胞毒性は、対応する野生型毒素と同一条件
下で比較して少なくとも約２−ｌｏｇ１０、より好ましくは約３−ｌｏｇ１０、そして最
も好ましくは約４−ｌｏｇ１０以上低減されている。例えば、変異体Ｃ．ディフィシルＴ
ｃｄＢは、標準的な細胞変性作用アッセイ（ＣＰＥ）で測定した際に、少なくとも約１０
−１２ｇ／ｍｌのＥＣ５０値を有し得る典型的な野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢと比較
して、約１０−９ｇ／ｍｌのＥＣ５０値を有し得る。例えば下記の実施例の節中の表７Ａ
、７Ｂ、８Ａおよび８Ｂを参照。
【０２２５】
さらに別の態様において、その変異体Ｃ．ディフィシル毒素の細胞毒性は、例えばイン
ビトロ細胞毒性アッセイ、例えば本明細書で記述されるインビトロ細胞毒性アッセイによ
り測定した際に、少なくとも約５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、
３００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、６００μｇ／ｍｌ、７００μ
ｇ／ｍｌ、８００μｇ／ｍｌ、９００μｇ／ｍｌ、１０００μｇ／ｍｌ、またはより大き
いＥＣ５０を有する。従って、好ましい態様において、その免疫原性組成物および変異体
毒素は哺乳類への投与に関して生物学的に安全である。
【０２２６】
機序または理論により束縛されるわけではないが、野生型ＴｃｄＡと比較してＤ２８５
およびＤ２８７変異を有するＴｃｄＡ、ならびに野生型ＴｃｄＢと比較してＤ２８６およ
びＤ２８８変異を有するＴｃｄＢはグルコシルトランスフェラーゼ活性において欠陥があ
り、従って細胞変性作用の誘導において欠陥があると予想された。加えて、ＤＨＣモチー
フ中に変異を有する毒素は自己触媒的プロセシングにおいて欠陥があり、従って細胞毒性
作用を一切有しないと予想された。
【０２２７】
しかし、本発明者らは、驚くべきことに、数ある中でも、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４を有
する典型的な変異体ＴｃｄＡおよびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６を有する典型的な変異体Ｔｃ
ｄＢは、機能不全のグルコシルトランスフェラーゼ活性および機能不全のシステインプロ
テアーゼ活性を示すにも関わらず、（野生型Ｃ．ディフィシル６３０毒素から著しく低減
してはいたが）意外にも細胞毒性を示すことを発見した。機序または理論により束縛され
るわけではないが、その変異体毒素は新規の機序により細胞毒性をもたしていると信じら
れる。それでもなお、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４を有する典型的な変異体ＴｃｄＡおよびＳ
ＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６を有する典型的な変異体ＴｃｄＢは、驚くほど免疫原性であった。
下記の実施例を参照。
【０２２８】
野生型毒素の化学的架橋はその毒素の不活性化に失敗する可能性を有するが、本発明者
らはさらに、変異体毒素の少なくとも１個のアミノ酸において化学的に架橋することはそ
の変異体毒素の細胞毒性を化学的架橋を欠く同一の変異体毒素と比較して、そして対応す
る野生型毒素と比較してさらに低減することを発見した。好ましくは、その変異体毒素は
その化学的架橋剤との接触の前に精製される。
【０２２９】
さらに、化学的架橋剤が有用なエピトープを変化させる可能性にも関わらず、本発明者
らは驚くべきことに、化学的に架橋された少なくとも１個のアミノ酸を有する遺伝学的に
改変された変異体Ｃ．ディフィシル毒素は結果として多数の中和抗体またはその結合断片
を引き出す免疫原性組成物をもたらすことを発見した。従って、中和抗体分子と関係する
エピトープは意外にも以下の化学的架橋を保持していた。
【０２３０】
架橋（本明細書において“化学的不活性化”または“不活性化”とも呼ばれる）は、２
個以上の分子を共有結合により化学的に連結するプロセスである。用語“架橋試薬”、“
架橋剤”、および“クロスリンカー”は、ペプチド、ポリペプチド、および／またはタン
パク質上の特定の官能基（第１級アミン類、スルヒドリル類（ｓｕｌｈｙｄｒｙｌｓ）、
カルボキシル類、カルボニル類等）と反応する、および／またはそれに化学的に付着する
ことができる分子を指す。１態様において、その分子はペプチド、ポリペプチド、および
／またはタンパク質上の特定の官能基（第１級アミン類、スルヒドリル類（ｓｕｌｈｙｄ
ｒｙｌｓ）、カルボキシル類、カルボニル類等）と反応する、および／またはそれに化学
的に付着することができる２個以上の反応性末端を含有していてよい。好ましくは、その
化学的架橋剤は水溶性である。別の好ましい態様において、その化学的架橋剤はヘテロ二
官能性クロスリンカーである。別の態様において、その化学的架橋剤は二官能性クロスリ
ンカーではない。化学的架橋剤は当該技術で既知である。
【０２３１】
好ましい態様において、その架橋剤はゼロ長（ｚｅｒｏ−ｌｅｎｇｔｈ）架橋剤である
。“ゼロ長”クロスリンカーは、２個の分子の官能基の間の直接の架橋を媒介または生成
するであろう架橋剤を指す。例えば、２個のポリペプチドの架橋において、ゼロ長クロス
リンカーは結果として外来の要素を組み込むことなく橋、または１つのポリペプチドのア
ミノ酸側鎖からのカルボキシル基および別のポリペプチドのアミノ基の間の架橋の形成を
もたらすであろう。ゼロ長架橋剤は、例えばヒドロキシルおよびカルボキシル部分の間の
エステル結合の形成、および／またはカルボキシルおよび第１級アミノ部分の間のアミド
結合の形成を触媒することができる。
【０２３２】
典型的な適切な化学的架橋剤には、ホルムアルデヒド；ホルマリン；アセトアルデヒド
；プロピオンアルデヒド；１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジ
イミド（ＥＤＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド
塩酸塩、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−（４−エチル）カルボジイミド
メト−ｐ−トルエンスルホネート（ＣＭＣ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイ
ミド（ＤＣＣ）、およびＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、およびそ
れらの誘導体が含まれる、水溶性カルボジイミド類（ＲＮ＝Ｃ＝ＮＲ’）；ならびにＮ−
ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）；フェニルグリオキサール；および／またはＵＤＰ
−ジアルデヒドが含まれる。
【０２３３】
好ましくは、その架橋剤はＥＤＣである。変異体Ｃ．ディフィシル毒素ポリペプチドが
ＥＤＣにより（例えばそのポリペプチドをＥＤＣと接触させることにより）化学的に修飾
される場合、１態様において、そのポリペプチドには（ａ）そのポリペプチドのアスパラ
ギン酸残基の側鎖およびそのポリペプチドのリシン酸残基の側鎖の間の少なくとも１個の
架橋が含まれる。１態様において、そのポリペプチドには（ｂ）そのポリペプチドのグル
タミン酸残基の側鎖およびそのポリペプチドのリシン酸残基の側鎖の間の少なくとも１個
の架橋が含まれる。１態様において、そのポリペプチドには（ｃ）そのポリペプチドのＣ
末端のカルボキシル基およびそのポリペプチドのＮ末端のアミノ基の間の少なくとも１個
の架橋が含まれる。１態様において、そのポリペプチドには（ｄ）そのポリペプチドのＣ
末端のカルボキシル基およびそのポリペプチドのリシン酸残基の側鎖の間の少なくとも１
個の架橋が含まれる。１態様において、そのポリペプチドには（ｅ）そのポリペプチドの
アスパラギン酸残基の側鎖および第２の単離されたポリペプチドのリシン酸残基の側鎖の
間の少なくとも１個の架橋が含まれる。１態様において、そのポリペプチドには（ｆ）そ
のポリペプチドのグルタミン酸残基の側鎖および第２の単離されたポリペプチドのリシン
酸残基の側鎖の間の少なくとも１個の架橋が含まれる。１態様において、そのポリペプチ
ドには（ｇ）そのポリペプチドのＣ末端のカルボキシル基および第２の単離されたポリペ
プチドのＮ末端のアミノ基の間の少なくとも１個の架橋が含まれる。１態様において、そ
のポリペプチドには（ｈ）そのポリペプチドのＣ末端のカルボキシル基および第２の単離
されたポリペプチドのリシン酸残基の側鎖の間の少なくとも１個の架橋が含まれる。例え
ば、図２４および図２５を参照。
【０２３４】
“第２の単離されたポリペプチド”は、ＥＤＣとの反応の間に存在するあらゆる単離さ
れたポリペプチドを指す。１態様において、第２の単離されたポリペプチドは、第１の単
離されたポリペプチドと同一の配列を有する変異体Ｃ．ディフィシル毒素ポリペプチドで
ある。別の態様において、第２の単離されたポリペプチドは、第１の単離されたポリペプ
チドと異なる配列を有する変異体Ｃ．ディフィシル毒素ポリペプチドである。
【０２３５】
１態様において、そのポリペプチドには（ａ）〜（ｄ）の修飾から選択される少なくと
も２個の修飾が含まれる。典型的な態様において、そのポリペプチドには（ａ）そのポリ
ペプチドのアスパラギン酸残基の側鎖およびそのポリペプチドのリシン酸残基の側鎖の間
の少なくとも１個の架橋ならびに（ｂ）そのポリペプチドのグルタミン酸残基の側鎖およ
びそのポリペプチドのリシン酸残基の側鎖の間の少なくとも１個の架橋が含まれる。さら
なる態様において、そのポリペプチドには（ａ）〜（ｄ）の修飾から選択される少なくと
も３個の修飾が含まれる。さらに別の態様において、そのポリペプチドには（ａ）、（ｂ
）、（ｃ）、および（ｄ）の修飾が含まれる。
【０２３６】
１より多くの変異体ポリペプチドがＥＤＣによる化学修飾の間に存在する場合、１態様
において、その結果として生じる組成物には（ａ）〜（ｈ）の修飾のいずれかの少なくと
も１個が含まれる。１態様において、その組成物には（ａ）〜（ｈ）の修飾から選択され
る少なくとも２個の修飾が含まれる。さらなる態様において、その組成物には（ａ）〜（
ｈ）の修飾から選択される少なくとも３個の修飾が含まれる。さらに別の態様において、
その組成物には（ａ）〜（ｈ）の修飾から選択される少なくとも４個の修飾が含まれる。
別の態様において、その組成物には（ａ）〜（ｈ）の修飾のそれぞれの少なくとも１個が
含まれる。
【０２３７】
典型的な態様において、その結果として生じる組成物には（ａ）そのポリペプチドのア
スパラギン酸残基の側鎖およびそのポリペプチドのリシン酸残基の側鎖の間の少なくとも
１個の架橋；ならびに（ｂ）そのポリペプチドのグルタミン酸残基の側鎖およびそのポリ
ペプチドのリシン酸残基の側鎖の間の少なくとも１個の架橋が含まれる。１態様において
、その組成物にはさらに（ｃ）そのポリペプチドのＣ末端のカルボキシル基およびそのポ
リペプチドのＮ末端のアミノ基の間の少なくとも１個の架橋；ならびに（ｄ）そのポリペ
プチドのＣ末端のカルボキシル基およびそのポリペプチドのリシン酸残基の側鎖の間の少
なくとも１個の架橋が含まれる。
【０２３８】
別の典型的な態様において、その結果として生じる組成物には（ｅ）そのポリペプチド
のアスパラギン酸残基の側鎖および第２の単離されたポリペプチドのリシン酸残基の側鎖
の間の少なくとも１個の架橋；（ｆ）そのポリペプチドのグルタミン酸残基の側鎖および
第２の単離されたポリペプチドのリシン酸残基の側鎖の間の少なくとも１個の架橋；（ｇ
）そのポリペプチドのＣ末端のカルボキシル基および第２の単離されたポリペプチドのＮ
末端のアミノ基の間の少なくとも１個の架橋；ならびに（ｈ）そのポリペプチドのＣ末端
のカルボキシル基および第２の単離されたポリペプチドのリシン酸残基の側鎖の間の少な
くとも１個の架橋が含まれる。
【０２３９】
さらなる典型的な態様において、その結果として生じる組成物には（ａ）そのポリペプ
チドのアスパラギン酸残基の側鎖およびそのポリペプチドのリシン酸残基の側鎖の間の少
なくとも１個の架橋；（ｂ）そのポリペプチドのグルタミン酸残基の側鎖およびそのポリ
ペプチドのリシン酸残基の側鎖の間の少なくとも１個の架橋；（ｅ）そのポリペプチドの
アスパラギン酸残基の側鎖および第２の単離されたポリペプチドのリシン酸残基の側鎖の
間の少なくとも１個の架橋；ならびに（ｆ）そのポリペプチドのグルタミン酸残基の側鎖
および第２の単離されたポリペプチドのリシン酸残基の側鎖の間の少なくとも１個の架橋
が含まれる。
【０２４０】
好ましい態様において、その化学的架橋剤にはホルムアルデヒドが含まれ、より好まし
くはリシンの非存在下でホルムアルデヒドが含まれる薬剤が含まれる。グリシンまたは他
の適切な第１級アミンを有する化合物を、架橋反応における失活剤（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）
として用いることができる。従って、別の好ましい態様において、その化学的薬剤にはホ
ルムアルデヒドおよびグリシンの使用が含まれる。
【０２４１】
さらに別の好ましい態様において、その化学的架橋剤にはＥＤＣおよびＮＨＳが含まれ
る。当該技術で既知であるように、ＮＨＳをＥＤＣのカップリングプロトコル中に含める
ことができる。しかし、本発明者らは、驚くべきことに、ＮＨＳはその変異体Ｃ．ディフ
ィシル毒素の、対応する野生型毒素と比較した場合の、遺伝学的に変異させた毒素と比較
した場合の、そしてＥＤＣにより化学的に架橋されている遺伝学的に変異させた毒素と比
較した場合の細胞毒性のさらなる低下を促進することができることを発見した。例えば実
施例２２を参照。従って、機序または理論により束縛されるわけではないが、（例えば変
異体毒素ポリペプチド、ＥＤＣ、およびＮＨＳの反応の結果として生じる）そのポリペプ
チドの少なくとも１個のリシン残基の側鎖に連結されたベータ−アラニン部分を有する変
異体毒素ポリペプチドは、例えばベータ−アラニン部分が存在しないＣ．ディフィシル毒
素（野生型または変異体）と比較して、その変異体毒素の細胞毒性のさらなる低下を促進
し得る。
【０２４２】
ＥＤＣおよび／またはＮＨＳの使用には、グリシンまたは他の適切な第１級アミンを有
する化合物の失活剤としての使用も含まれてよい。例えばグリシンメチルエステルおよび
アラニンのような、第１級アミンを有するあらゆる化合物を失活剤として用いることがで
きる。好ましい態様において、その失活剤化合物は非重合体性親水性第１級アミンである
。非重合体性親水性第１級アミンの例には、例えばアミノ糖類、アミノアルコール類、お
よびアミノポリオール類が含まれる。非重合体性親水性第１級アミンの具体的な例には、
グリシン、エタノールアミン、グルカミン、アミン官能性を持たせた（ａｍｉｎｅ  ｆｕ
ｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ）ポリエチレングリコール、およびアミン官能性を持たせたエ
チレングリコールオリゴマー類が含まれる。
【０２４３】
１側面において、本発明は、ＥＤＣおよび非重合体性親水性第１級アミン、好ましくは
グリシンにより化学修飾された少なくとも１個のアミノ酸側鎖を有する変異体Ｃ．ディフ
ィシル毒素ポリペプチドに関する。（例えばＥＤＣ、ＮＨＳで処理し、グリシンで失活さ
せた（ｑｕｅｎｃｈｅｄ）三重変異体毒素の反応の）結果として生じるグリシン付加物は
、対応する野生型毒素と比較してその変異体毒素の細胞毒性の低下を促進し得る。
【０２４４】
１態様において、変異体Ｃ．ディフィシル毒素ポリペプチドがＥＤＣおよびグリシンに
より化学修飾される場合、そのポリペプチドには、そのポリペプチドがＥＤＣにより修飾
される際の少なくとも１個の修飾（例えば上記で記述された（ａ）〜（ｈ）の修飾のいず
れかの少なくとも１個）、ならびに以下の典型的な修飾の少なくとも１個が含まれる：（
ｉ）そのポリペプチドのＣ末端のカルボキシル基に連結されたグリシン部分；（ｊ）その
ポリペプチドの少なくとも１個のアスパラギン酸残基の側鎖に連結されたグリシン部分；
および（ｋ）そのポリペプチドの少なくとも１個のグルタミン酸残基の側鎖に連結された
グリシン部分。例えば、図２４および図２５を参照。
【０２４５】
１態様において、変異体Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡの少なくとも１個のアミノ酸は化学
的に架橋されており、および／または変異体Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢの少なくとも１個
のアミノ酸は化学的に架橋されている。別の態様において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、Ｓ
ＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：
８の少なくとも１個のアミノ酸は化学的に架橋されている。例えば、その少なくとも１個
のアミノ酸は、カルボジイミドが含まれる薬剤、例えばＥＤＣにより化学的に架橋するこ
とができる。カルボジイミド類は、（例えばアスパラギン酸および／またはグルタミン酸
の側鎖からの）遊離のカルボキシルおよび（例えばリシン残基の側鎖中の）アミノ基の間
で共有結合を形成して安定なアミド結合を形成することができる。
【０２４６】
別の例として、その少なくとも１個のアミノ酸は、ＮＨＳが含まれる薬剤により化学的
に架橋することができる。ＮＨＳエステルで活性化されたクロスリンカーは、（例えばそ
れぞれのポリペプチド鎖のＮ末端の、および／またはリシン残基の側鎖中の）第１級アミ
ンと反応してアミド結合を生じることができる。
【０２４７】
別の態様において、その少なくとも１個のアミノ酸は、ＥＤＣおよびＮＨＳが含まれる
薬剤により化学的に架橋することができる。例えば、１態様において、本発明はＳＥＱ  
ＩＤ  ＮＯ：４で示されるアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチドに関し、ここで
１位のメチオニン残基は場合により存在せず、ここでそのポリペプチドにはＥＤＣおよび
ＮＨＳにより化学的に修飾された少なくとも１個のアミノ酸側鎖が含まれる。別の態様に
おいて、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６で示されるアミノ酸配列を有する単離されたポ
リペプチドに関し、ここで１位のメチオニン残基は場合により存在せず、ここでそのポリ
ペプチドにはＥＤＣおよびＮＨＳにより化学的に修飾された少なくとも１個のアミノ酸側
鎖が含まれる。さらに別の態様において、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４、ＳＥＱ
ＩＤ  ＮＯ：８６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８５、ＳＥＱ  
ＩＤ  ＮＯ：７、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８で示されるアミノ酸配列を有する単離さ
れたポリペプチドに関する。そのポリペプチドは、そのポリペプチドをＥＤＣおよびＮＨ
Ｓと接触させることにより修飾される。例えば図２４および図２５を参照。
【０２４８】
変異体Ｃ．ディフィシル毒素ポリペプチドがＥＤＣおよびＮＨＳにより（例えば接触に
より）化学的に修飾される場合、１態様において、そのポリペプチドにはそのポリペプチ
ドがＥＤＣにより修飾される際の少なくとも１個の修飾（例えば上記で記述された（ａ）
〜（ｈ）の修飾のいずれかの少なくとも１個）、および（ｌ）そのポリペプチドの少なく
とも１個のリシン残基の側鎖に連結されたベータ−アラニン部分が含まれる。
【０２４９】
別の側面において、本発明は変異体Ｃ．ディフィシル毒素ポリペプチドに関し、ここで
そのポリペプチドにはＥＤＣ、ＮＨＳ、および非重合体性親水性第１級アミン、好ましく
はグリシンにより化学修飾された少なくとも１個のアミノ酸側鎖が含まれる。１態様にお
いて、そのポリペプチドにはそのポリペプチドがＥＤＣにより修飾される際の少なくとも
１個の修飾（例えば上記で記述された（ａ）〜（ｈ）の修飾のいずれかの少なくとも１個
）、そのポリペプチドがグリシンにより修飾される際の少なくとも１個の修飾（例えば上
記で記述された（ｉ）〜（ｋ）の修飾のいずれかの少なくとも１個）、および（ｌ）その
ポリペプチドの少なくとも１個のリシン残基の側鎖に連結されたベータ−アラニン部分が
含まれる。例えば、図２４および図２５を参照。
【０２５０】
１側面において、本発明は変異体Ｃ．ディフィシル毒素ポリペプチドに関し、ここでそ
のポリペプチドの少なくとも１個のリシン残基の側鎖はベータ−アラニン部分に連結され
ている。１態様において、そのポリペプチドの第２のリシン残基の側鎖はアスパラギン酸
残基の側鎖に、および／またはグルタミン酸残基の側鎖に連結されている。そのポリペプ
チドの“第２の”リシン残基には、ベータ−アラニン部分に連結されていないそのポリペ
プチドのリシン残基が含まれる。その第２のリシン残基が連結されているアスパラギン酸
の側鎖および／またはグルタミン酸の側鎖は、そのポリペプチドのアスパラギン酸の側鎖
および／またはグルタミン酸の側鎖であって分子内架橋を形成していてよく、または第２
のポリペプチドのアスパラギン酸の側鎖および／またはグルタミン酸の側鎖であって分子
間架橋を形成していてよい。別の態様において、そのポリペプチドの少なくとも１個のア
スパラギン酸残基の側鎖および／または少なくとも１個のグルタミン酸残基の側鎖はグリ
シン部分に連結されている。そのグリシン部分に連結されているアスパラギン酸残基およ
び／またはグルタミン酸残基は、リシン残基には連結されていない。
【０２５１】
化学的に架橋された変異体Ｃ．ディフィシル毒素ポリペプチドのさらに別の例として、
少なくとも１個のアミノ酸をホルムアルデヒドが含まれる薬剤により化学的に架橋するこ
とができる。ホルムアルデヒドはＮ末端のアミノ酸残基のアミノ基ならびにアルギニン、
システイン、ヒスチジン、およびリシンの側鎖と反応することができる。ホルムアルデヒ
ドおよびグリシンはシッフ塩基付加物を形成することができ、それは第１級Ｎ末端アミノ
基、アルギニン、およびチロシン残基、ならびにより低い程度でアスパラギン、グルタミ
ン、ヒスチジン、およびトリプトファン残基に付着することができる。
【０２５２】
化学的架橋剤は、その処理された毒素が、例えばインビトロ細胞毒性アッセイにより、
または動物毒性により測定した際に同一の条件下で未処理の毒素よりも低い毒性（例えば
約１００％、９９％、９５％、９０％、８０％、７５％、６０％、５０％、２５％、また
は１０％低い毒性）を有する場合、毒素の細胞毒性を低減すると言われる。
【０２５３】
好ましくは、その化学的架橋剤は、その変異体Ｃ．ディフィシル毒素の細胞毒性を、同
一の条件下であるがその化学的架橋剤の非存在下でのその変異体毒素と比較して、少なく
とも約２−ｌｏｇ１０の低減、より好ましくは約３−ｌｏｇ１０の低減、そして最も好ま
しくは約４−ｌｏｇ１０以上低減する。野生型毒素と比較した場合、その化学的架橋剤は
好ましくはその変異体毒素の細胞毒性を少なくとも約５−ｌｏｇ１０の低減、約６−ｌｏ
ｇ１０の低減、約７−ｌｏｇ１０の低減、約８−ｌｏｇ１０の低減、またはより大きく低
減する。
【０２５４】
別の好ましい態様において、その化学的に不活性化された変異体Ｃ．ディフィシル毒素
は、例えばインビトロ細胞毒性アッセイ、例えば本明細書で記述されるインビトロ細胞毒
性アッセイにより測定した際に、少なくとも約５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２０
０μｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、６００μｇ／
ｍｌ、７００μｇ／ｍｌ、８００μｇ／ｍｌ、９００μｇ／ｍｌ、１０００μｇ／ｍｌ以
上のＥＣ５０値、またはより大きいＥＣ５０値を示す。
【０２５５】
その変異体毒素を化学的架橋剤と接触させるための反応条件は当業者の専門知識の範囲
内であり、その条件は用いられる薬剤に応じて異なってよい。しかし、本発明者らは、驚
くべきことに、変異体Ｃ．ディフィシル毒素ポリペプチドを化学的架橋剤と接触させ、一
方でその変異体毒素の機能性エピトープを維持し、且つ細胞毒性を対応する野生型毒素と
比較して低下させるための最適な反応条件を発見した。
【０２５６】
好ましくは、その反応条件は変異体毒素を架橋剤と接触させるために選択され、ここで
その変異体毒素は約０．５、０．７５、１．０、１．２５、１．５、１．７５、２．０ｍ
ｇ／ｍｌの最小濃度〜約３．０、２．５、２．０、１．５、または１．２５ｍｇ／ｍｌの
最大濃度を有する。あらゆる最小値をあらゆる最大値と組み合わせてその反応に関する変
異体毒素の適切な濃度の範囲を定めることができる。最も好ましくは、その変異体毒素は
その反応に関して約１．０〜１．２５ｍｇ／ｍｌの濃度を有する。
【０２５７】
１態様において、その反応において用いられる薬剤は、約１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４
ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、または５０ｍＭの
最小濃度および約１００ｍＭ、９０ｍＭ、８０ｍＭ、７０ｍＭ、６０ｍＭ、または５０ｍ
Ｍの最大濃度を有する。あらゆる最小値をあらゆる最大値と組み合わせてその反応に関す
る化学薬剤の適切な濃度の範囲を定めることができる。
【０２５８】
その薬剤にホルムアルデヒドが含まれる好ましい態様において、用いられる濃度は好ま
しくは約２ｍＭ〜８０ｍＭのあらゆる濃度、最も好ましくは約４０ｍＭである。その薬剤
にＥＤＣが含まれる別の好ましい態様において、用いられる濃度は好ましくは約１．３ｍ
Ｍ〜約１３ｍＭ、より好ましくは約２ｍＭ〜３ｍＭのあらゆる濃度、最も好ましくは約２
．６ｍＭである。
【０２５９】
その変異体毒素をその化学的架橋剤と接触させる典型的な反応時間には、約０．５、１
、２、３、４、５、６、１２、２４、３６、４８、または６０時間の最小値、および約１
４日間、１２日間、１０日間、７日間、５日間、３日間、２日間、１日間、または１２時
間の最大値が含まれる。あらゆる最小値をあらゆる最大値と組み合わせて適切な反応時間
の範囲を定めることができる。
【０２６０】
好ましい態様において、その変異体毒素をその化学的架橋剤と接触させる工程は、その
変異体Ｃ．ディフィシル毒素の細胞毒性を、適切なヒト細胞、例えばＩＭＲ−９０細胞に
おいて、標準的なインビトロ細胞毒性アッセイにおいて、その架橋剤の非存在下での同一
の変異体毒素と比較して、少なくとも約１０００μｇ／ｍｌのＥＣ５０値まで低減するの
に十分な期間の間行われる。より好ましくは、その反応工程は、その変異体毒素の細胞毒
性を適切なヒト細胞において少なくとも約１０００μｇ／ｍｌのＥＣ５０値まで低減する
のに十分な期間の少なくとも２倍の長さ、最も好ましくは少なくとも３倍以上の長さの時
間の間行われる。１態様において、その反応時間は約１６８時間（または７日間）を超え
ない。
【０２６１】
例えば、その薬剤にホルムアルデヒドが含まれる１態様において、その変異体毒素をそ
の薬剤と好ましくは約１２時間接触させ、それはその変異体Ｃ．ディフィシル毒素の細胞
毒性を、適切なヒト細胞、例えばＩＭＲ−９０細胞において、標準的なインビトロ細胞毒
性アッセイにおいて、その架橋剤の非存在下での同一の変異体毒素と比較して、少なくと
も約１０００μｇ／ｍｌのＥＣ５０値まで低減するのに十分である典型的な期間であるこ
とが示された。より好ましい態様において、その反応は約４８時間実施され、それはその
反応に関する十分な期間の少なくとも約３倍の長さである。そのような態様において、そ
の反応時間は好ましくは約７２時間より長くない。
【０２６２】
その薬剤にＥＤＣが含まれる別の態様において、その変異体毒素をその薬剤と好ましく
は約０．５時間、より好ましくは少なくとも約１時間、または最も好ましくは約２時間接
触させる。そのような態様において、その反応時間は好ましくは約６時間より長くない。
【０２６３】
その変異体毒素をその化学的架橋剤と接触させる典型的なｐＨには、約ｐＨ５．５、６
．０、６．５、７．０、または７．５の最小値、および約ｐＨ８．５、８．０、７．５、
７．０、または６．５の最大値が含まれる。あらゆる最小値をあらゆる最大値と組み合わ
せて適切なｐＨの範囲を定めることができる。好ましくは、その反応はｐＨ６．５〜７．
５で、好ましくはｐＨ７．０で行われる。
【０２６４】
その変異体毒素をその化学的架橋剤と接触させる典型的な温度には、約２℃、４℃、１
０℃、２０℃、２５℃、または３７℃の最小温度、および約４０℃、３７℃、３０℃、２
７℃、２５℃、または２０℃の最大温度が含まれる。あらゆる最小値をあらゆる最大値と
組み合わせて適切な反応温度を定めることができる。好ましくは、その反応は約２０℃〜
３０℃で、最も好ましくは約２５℃で行われる。
【０２６５】
上記で記述された免疫原性組成物には、１種類の変異体Ｃ．ディフィシル毒素（Ａまた
はＢ）が含まれていてよい。従って、その免疫原性組成物は、製剤またはキット中で別個
のバイアル（例えば変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ａが含まれる組成物に関する別個のバイ
アルおよび変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ｂが含まれる組成物に関する別個のバイアル）を
占めることができる。その免疫原性組成物は、同時、順次、または別々の使用を意図され
ていてよい。
【０２６６】
別の態様において、上記で記述される免疫原性組成物には変異体Ｃ．ディフィシル毒素
（ＡおよびＢ）の両方が含まれていてよい。記述された変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ａお
よび変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ｂのあらゆる組み合わせを、免疫原性組成物に関して組
み合わせてよい。従って、その免疫原性組成物は、単一のバイアル（例えば変異体Ｃ．デ
ィフィシルＴｃｄＡが含まれる組成物および変異体Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢが含まれる
組成物の両方を含有する単一のバイアル）中で組み合わせることができる。好ましくは、
その免疫原性組成物には変異体Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡおよび変異体Ｃ．ディフィシル
ＴｃｄＢが含まれる。
【０２６７】
例えば、１態様において、その免疫原性組成物にはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４およびＳＥ
Ｑ  ＩＤ  ＮＯ：６が含まれ、ここでＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ
：６のそれぞれの少なくとも１個のアミノ酸は化学的に架橋されている。別の態様におい
て、その免疫原性組成物には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７が
含まれる変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ａ、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６またはＳＥＱ  
ＩＤ  ＮＯ：８を含む変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ｂが含まれ、ここでその変異体Ｃ．デ
ィフィシル毒素のそれぞれの少なくとも１個のアミノ酸は化学的に架橋されている。
【０２６８】
別の態様において、その免疫原性組成物には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ
ＮＯ：８４、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３から選択されるあらゆる配列、ならびに
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８５
から選択されるあらゆる配列が含まれる。別の態様において、その免疫原性組成物には、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６が含まれる免疫原性組成物が
含まれる。別の態様において、その免疫原性組成物には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３およ
びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８５が含まれる免疫原性組成物が含まれる。別の態様において、
その免疫原性組成物には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３、ＳＥ
Ｑ  ＩＤ  ＮＯ：８６、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８５が含まれる。
【０２６９】
本発明の組成物、例えば変異体毒素Ａおよび／または変異体毒素Ｂが含まれる免疫原性
組成物のいずれも、療法的作用に関して異なる比率または量で組み合わせることができる
ことが理解されている。例えば、その変異体Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡおよび変異体Ｃ．
ディフィシルＴｃｄＢは、免疫原性組成物中に０．１：１０〜１０：０．１、Ａ：Ｂの範
囲の比率で存在することができる。別の態様において、例えば、その変異体Ｃ．ディフィ
シルＴｃｄＢおよび変異体Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡは、免疫原性組成物中に０．１：１
０〜１０：０．１、Ｂ：Ａの範囲の比率で存在することができる。１つの好ましい態様に
おいて、その比率は、その組成物に変異体ＴｃｄＡの総量よりも大きな変異体ＴｃｄＢの
総量が含まれるような比率である。
【０２７０】
１側面において、免疫原性組成物は中和抗体またはその結合断片に結合することができ
る。好ましくは、その中和抗体またはその結合断片は本明細書において下記で記述される
中和抗体またはその結合断片である。１つの典型的な態様において、免疫原性組成物は抗
毒素Ａ抗体またはその結合断片に結合することができ、ここでその抗毒素Ａ抗体またはそ
の結合断片にはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６のアミノ酸配列を有する可変軽鎖およびＳＥＱ
ＩＤ  ＮＯ：３７のアミノ酸配列を有する可変重鎖が含まれる。例えば、その免疫原性
組成物には変異体Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、またはＳＥＱ  
ＩＤ  ＮＯ：７が含まれていてよい。別の例として、その免疫原性組成物にはＳＥＱ  Ｉ
Ｄ  ＮＯ：８４またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３が含まれていてよい。
【０２７１】
別の典型的な態様において、免疫原性組成物は抗毒素Ｂ抗体またはその結合断片に結合
することができ、ここでその抗毒素Ｂ抗体またはその結合断片にはＢ８−２６の可変軽鎖
およびＢ８−２６の可変重鎖が含まれる。例えば、その免疫原性組成物には変異体Ｃ．デ
ィフィシルＴｃｄＢ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８が含まれ
ていてよい。別の例として、その免疫原性組成物にはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６またはＳ
ＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８５が含まれていてよい。
【０２７２】
組み換え細胞
別の側面において、本発明は、組み換え細胞またはその子孫に関する。１態様において
、その細胞またはその子孫には変異体Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡおよび／または変異体Ｃ
．ディフィシルＴｃｄＢをコードするポリヌクレオチドが含まれる。
【０２７３】
別の態様において、その組み換え細胞またはその子孫には、例えばＧＡＰまたはＢＥＳ
ＴＦＩＴプログラムにより初期設定のギャップウェイトを用いて最適に整列させた際に、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、またはＳ
ＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のいずれかに対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％
、９４％、９５％、９６％、９７％、好ましくは約９８％、より好ましくは約９９％、ま
たは最も好ましくは約１００％の同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列が含
まれる。
【０２７４】
別の態様において、その組み換え細胞またはその子孫には、例えばＧＡＰまたはＢＥＳ
ＴＦＩＴプログラムにより初期設定のギャップウェイトを用いて最適に整列させた際に、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３、ま
たはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８５のいずれかに対して少なくとも約９０％、９１％、９２％
、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、好ましくは約９８％、より好ましくは約９
９％、または最も好ましくは約１００％の同一性を有するポリペプチドをコードする核酸
配列が含まれる。
【０２７５】
追加の態様において、その組み換え細胞またはその子孫には、例えばＧＡＰまたはＢＥ
ＳＴＦＩＴプログラムにより初期設定のギャップウェイトを用いて最適に整列させた際に
、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５、Ｓ
ＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７のいずれかに対して少なくと
も約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、好ましくは約
９８％、より好ましくは約９９％、または最も好ましくは約１００％の同一性を有する核
酸配列が含まれる。
【０２７６】
その組み換え細胞は、本発明のポリペプチドの組み換え生成において有用なあらゆる細
胞、例えば原核細胞または真核細胞に由来してよい。好ましくは、その組み換え細胞は、
約５０００、６０００、好ましくは約７０００、そしてより好ましくは約８０００ヌクレ
オチド以上より大きい異種核酸配列を発現するのに適したあらゆる細胞に由来する。その
原核宿主細胞は、あらゆるグラム陰性またはグラム陽性細菌であってよい。典型的な態様
において、その原核宿主細胞は毒素および／または芽胞をコードする内在性ポリヌクレオ
チドを欠いている。
【０２７７】
グラム陰性細菌には、カンピロバクター、大腸菌、フラボバクテリウム、フゾバクテリ
ウム、ヘリコバクター、イリオバクター（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ）、ナイセリア（Ｎｅｉ
ｓｓｅｒｉａ）、シュードモナス、サルモネラ、およびウレアプラズマ（Ｕｒｅａｐｌａ
ｓｍａ）が含まれるが、それらに限定されない。例えば、その組み換え細胞は、参照によ
り本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１００１３７６２号、段落［０２０１］
〜［０２３０］において記述されているようなシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）細胞に由来してよい。
【０２７８】
グラム陽性細菌には、バシラス、クロストリジウム、エンテロコッカス、ゲオバシラス
（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクト
コッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、オセアノバシラス（Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕ
ｓ）、スタフィロコッカス、ストレプトコッカス、およびストレプトマイセスが含まれる
が、それらに限定されない。好ましくは、その細胞はＣ．ディフィシル細胞に由来する。
【０２７９】
本発明者らは、Ｃ．ディフィシル毒素をコードする内在性のポリヌクレオチドを欠いて
いる野生型Ｃ．ディフィシルの株を同定した。その内在性の毒素Ａおよび毒素Ｂ遺伝子を
欠いている株には以下の株が含まれ、それはアメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）
（バージニア州マナサス）を通して入手可能である：Ｃ．ディフィシル１３５１（ＡＴＣ
Ｃ  ４３５９３（商標））、Ｃ．ディフィシル３２３２（ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−１８０１（
商標））、Ｃ．ディフィシル７３２２（ＡＴＣＣ  ４３６０１（商標））、Ｃ．ディフィ
シル５０３６（ＡＴＣＣ  ４３６０３（商標））、Ｃ．ディフィシル４８１１（ＡＴＣＣ
４３６０２（商標））、およびＣ．ディフィシルＶＰＩ  １１１８６（ＡＴＣＣ  ７０
００５７（商標））。
【０２８０】
従って、１態様において、その組み換えＣ．ディフィシル細胞は本明細書で記述される
株に由来する。好ましくは、その組み換えＣ．ディフィシル細胞またはその子孫は、Ｃ．
ディフィシル１３５１、Ｃ．ディフィシル５０３６、およびＣ．ディフィシルＶＰＩ  １
１１８６からなる群に由来する。より好ましくは、その組み換えＣ．ディフィシル細胞ま
たはその子孫は、Ｃ．ディフィシルＶＰＩ  １１１８６細胞に由来する。
【０２８１】
好ましい態様において、その組み換えＣ．ディフィシル細胞またはその子孫の芽胞形成
遺伝子は不活性化されている。芽胞は感染性、高度に耐性である可能性があり、Ｃ．ディ
フィシルのその宿主の外部の好気性環境における存続を促進する可能性がある。芽胞は抗
微生物療法の間のＣ．ディフィシルの宿主内部での生存にも寄与する可能性がある。従っ
て、芽胞形成遺伝子を欠くＣ．ディフィシル細胞は、哺乳類への投与のための安全な免疫
原性組成物を生産するために有用である。加えて、そのような細胞の使用は、製造の間の
安全性、例えばその施設、将来の製品、およびスタッフを保護するための安全性を促進す
る。
【０２８２】
標的化された不活性化のための芽胞形成遺伝子の例には、ｉｎｔｅｒ  ａｌｉａ、ｓｐ
ｏ０Ａ、ｓｐｏＩＩＥ、σＥ、σＧ、およびσＫが含まれる。好ましくは、ｓｐｏ０Ａ遺
伝子が不活性化される。
【０２８３】
Ｃ．ディフィシルの芽胞形成遺伝子を不活性化する方法は、当該技術で既知である。例
えば、芽胞形成遺伝子は、選択可能なマーカー、例えば抗生物質耐性マーカーの標的化さ
れた挿入により不活性化することができる。例えば、Heap et al., J Microbiol Methods
. 2010 Jan;80(1):49-55; Heap et al., J. Microbiol. Methods, 2007 Sept; 70(3):452
-464;およびUnderwood et al., J Bacteriol. 2009 Dec;191(23):7296-305を参照。例え
ば、参照により３３〜６６ページから本明細書にそのまま援用される、“DNA Molecules 
and Methods”と題されたMintonらの国際公開第２００７／１４８０９１号、または対応
する米国公開ＵＳ  ２０１１０１２４１０９  Ａ１、段落［００１３７］〜［０２２７］
も参照。
【０２８４】
変異体Ｃ．ディフィシル毒素を生成する方法
１側面において、本発明は、変異体Ｃ．ディフィシル毒素を生成する方法に関する。１
態様において、その方法には上記で記述されたいずれかの組み換え細胞またはその子孫を
ポリペプチドを発現するための適切な条件下で培養することが含まれる。
【０２８５】
別の態様において、その方法には組み換え細胞またはその子孫を変異体Ｃ．ディフィシ
ル毒素をコードするポリヌクレオチドを発現するための適切な条件下で培養することが含
まれ、ここでその細胞には変異体Ｃ．ディフィシル毒素をコードするポリヌクレオチドが
含まれ、ここでその変異体には対応する野生型クロストリジウム・ディフィシル毒素と比
較して少なくとも１個の変異を有するグルコシルトランスフェラーゼドメインおよび少な
くとも１個の変異を有するシステインプロテアーゼドメインが含まれる。１態様において
、その細胞は毒素をコードする内在性ポリヌクレオチドを欠いている。
【０２８６】
さらなる態様において、その方法には組み換えＣ．ディフィシル細胞またはその子孫を
変異体Ｃ．ディフィシル毒素をコードするポリヌクレオチドを発現するための適切な条件
下で培養することが含まれ、ここでその細胞には変異体Ｃ．ディフィシル毒素をコードす
るポリヌクレオチドが含まれ、且つその細胞はＣ．ディフィシル毒素をコードする内在性
ポリヌクレオチドを欠いている。
【０２８７】
別の側面において、本発明は、変異体Ｃ．ディフィシル毒素を生成する方法に関する。
その方法には以下の工程が含まれる：（ａ）Ｃ．ディフィシル細胞を組み換え大腸菌細胞
と接触させ、ここでそのＣ．ディフィシル細胞はＣ．ディフィシル毒素をコードする内在
性ポリヌクレオチドを欠いており、その大腸菌細胞には変異体Ｃ．ディフィシル毒素をコ
ードするポリヌクレオチドが含まれ；（ｂ）そのＣ．ディフィシル細胞および大腸菌細胞
を、そのポリヌクレオチドを大腸菌細胞からＣ．ディフィシル細胞に移すための適切な条
件下で培養し；（ｃ）その変異体Ｃ．ディフィシル毒素をコードするポリヌクレオチドを
含むＣ．ディフィシル細胞を選択し；（ｄ）工程（ｃ）のＣ．ディフィシル細胞をそのポ
リヌクレオチドを発現するための適切な条件下で培養し；そして（ｅ）その変異体Ｃ．デ
ィフィシル毒素を単離する。
【０２８８】
本発明の方法において、その組み換え大腸菌細胞には本明細書で記述される変異体Ｃ．
ディフィシル毒素をコードする異種ポリヌクレオチドが含まれる。そのポリヌクレオチド
はＤＮＡまたはＲＮＡであってよい。１つの典型的な態様において、その変異体Ｃ．ディ
フィシル毒素をコードするポリヌクレオチドは、大腸菌のコドン使用頻度に関してコドン
最適化されている。ポリヌクレオチドをコドン最適化するための方法は当該技術において
既知である。
【０２８９】
１態様において、そのポリヌクレオチドには上記で記述したような変異体Ｃ．ディフィ
シルＴｃｄＡをコードするポリヌクレオチドに少なくとも約６０％、６５％、７０％、７
５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９
３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である核
酸配列が含まれる。変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ａをコードする典型的なポリヌクレオチ
ドには、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：
４４、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５が含まれる。
【０２９０】
別の態様において、そのポリヌクレオチドには上記で記述したような変異体Ｃ．ディフ
ィシルＴｃｄＢをコードするポリヌクレオチドに少なくとも約６０％、６５％、７０％、
７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、
９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である
核酸配列が含まれる。変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ｂをコードする典型的なポリヌクレオ
チドには、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ
：４６、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７が含まれる。別の態様において、そのポリヌク
レオチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ
：８５、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６をコードしている。
【０２９１】
１態様において、その異種ポリヌクレオチドが含まれる大腸菌細胞はその変異体Ｃ．デ
ィフィシル毒素をコードする異種ポリヌクレオチドの安定な宿主となる（ｓｔａｂｌｙ  
ｈｏｓｔｓ）大腸菌細胞である。典型的な大腸菌細胞には、ＭＡＸ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃ
ｙ（登録商標）Ｓｔｂｌ２（商標）大腸菌コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カ
リフォルニア州カールスバッド）、Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）Ｓｔｂｌ３（商標）化
学的コンピテント大腸菌（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）、
ＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸ（商標）Ｓｔｂｌ４（商標）大腸菌コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎ）、および大腸菌ＣＡ４３４からなる群から選択される細胞が含まれる。好ま
しい態様において、その大腸菌クローニング宿主細胞はＤＨ５αではない。より好ましく
は、その大腸菌クローニング宿主細胞はＭＡＸ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ（登録商標）Ｓｔ
ｂｌ２（商標）大腸菌コンピテント細胞である。
【０２９２】
本発明の方法にはさらに、Ｃ．ディフィシル細胞および大腸菌細胞をそのポリヌクレオ
チドを大腸菌細胞からＣ．ディフィシル細胞に移すための適切な条件下で培養し、結果と
して組み換えＣ．ディフィシル細胞をもたらす工程が含まれる。好ましい態様において、
その培養条件は、そのポリヌクレオチドをその大腸菌細胞（供与細胞）からＣ．ディフィ
シル細胞（受容細胞）中に移し、結果として遺伝的に安定な継承（ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃ
ｅ）をもたらすのに適している。
【０２９３】
最も好ましくは、その培養条件は当該技術で既知である細菌の接合に適している。“接
合”は、ポリヌクレオチドの（例えば細菌プラスミドからの）一方向性の移動が１つの細
菌細胞（すなわち“供与者”）から別の細菌細胞（すなわち“受容者”）に対して起こる
、ポリヌクレオチドの移動の特定のプロセスを指す。接合プロセスには供与細胞の受容細
胞に対する接触が含まれる。好ましくは、供与大腸菌細胞は大腸菌ＣＡ４３４細胞である
。
【０２９４】
大腸菌細胞からＣ．ディフィシル細胞へのポリヌクレオチドの移動のための典型的な適
切な（接合）条件には、Ｃ．ディフィシルのブレインハートインフュージョンブロス（Ｂ
ＨＩ；Ｏｘｏｉｄ）またはシェドラー嫌気ブロス（Ｓｃｈａｅｄｌｅｒｓ  ａｎａｅｒｏ
ｂｉｃ  ｂｒｏｔｈ）（ＳＡＢ；Ｏｘｏｉｄ）中での増殖液体培養が含まれる。別の態様
において、固体Ｃ．ディフィシル培養物を新鮮な血液寒天（ＦＢＡ）またはＢＨＩ寒天上
で増殖させることができる。好ましくは、Ｃ．ディフィシルを嫌気性環境（例えば、８０
％  Ｎ２、１０％  ＣＯ２、および１０％  Ｈ２[体積／体積]）中で３７℃で増殖させる
。１態様において、その適切な条件には、大腸菌をルリア−ベルターニ（ＬＢ）ブロス上
で、またはＬＢ寒天上で３７℃で好気的に増殖させることが含まれる。Ｃ．ディフィシル
への接合性移動に関して、典型的な適切な条件には、大腸菌をＦＢＡ上で嫌気的に増殖さ
せることが含まれる。抗生物質が当該技術で既知であるように液体および固体培地中に含
まれていてよい。そのような抗生物質の例には、サイクロセリン（２５０μｇ／ｍｌ）、
セフォキシチン（８μｇ／ｍｌ）、クロラムフェニコール（１２．５μｇ／ｍｌ）、チア
ンフェニコール（１５μｇ／ｍｌ）、およびエリスロマイシン（５μｇ／ｍｌ）が含まれ
る。
【０２９５】
本発明の方法にはさらに、結果として得られた変異体Ｃ．ディフィシル毒素をコードす
るポリヌクレオチドが含まれる組み換えＣ．ディフィシル細胞を選択する工程が含まれる
。典型的な態様において、その組み換えＣ．ディフィシル細胞は、その変異体Ｃ．ディフ
ィシル毒素をコードするポリヌクレオチドの組み換え大腸菌細胞からの接合を介した受容
者である。
【０２９６】
本発明の方法には、その組み換え細胞またはその子孫を、その変異体Ｃ．ディフィシル
毒素をコードするポリヌクレオチドを発現し、結果として変異体Ｃ．ディフィシル毒素の
産生をもたらすための適切な条件下で培養する工程が含まれる。組み換え細胞がそのポリ
ヌクレオチドを発現するための適切な条件には、Ｃ．ディフィシル細胞を増殖させるのに
適した培養条件が含まれ、それは当該技術で既知である。例えば、適切な条件には、その
Ｃ．ディフィシル形質転換体をブレインハートインフュージョンブロス（ＢＨＩ；Ｏｘｏ
ｉｄ）またはシェドラー嫌気ブロス（ＳＡＢ；Ｏｘｏｉｄ）中で培養することが含まれて
よい。別の態様において、固体Ｃ．ディフィシル培養物をＦＢＡまたはＢＨＩ寒天上で増
殖させることができる。好ましくは、そのＣ．ディフィシルを嫌気性環境（例えば、８０
％  Ｎ２、１０％  ＣＯ２、および１０％  Ｈ２[体積／体積]）中で３７℃で増殖させる
。
【０２９７】
１態様において、本発明の方法には、結果として生じる変異体Ｃ．ディフィシル毒素を
単離する工程が含まれる。タンパク質をＣ．ディフィシルから単離する方法は、当該技術
で既知である。
【０２９８】
別の態様において、その方法には、結果として生じる変異体Ｃ．ディフィシル毒素を精
製する工程が含まれる。ポリペプチドを精製する方法、例えばクロマトグラフィーは、当
該技術で既知である。
【０２９９】
典型的な態様において、その方法にはさらにその単離された変異体クロストリジウム・
ディフィシル毒素を上記で記述した化学的架橋剤と接触させる工程が含まれる。好ましく
は、その薬剤にはホルムアルデヒド、エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カル
ボジイミド、またはＥＤＣおよびＮＨＳの組み合わせが含まれる。典型的な反応条件は、
上記で、および下記の実施例の節で記述されている。
【０３００】
別の側面において、本発明は、あらゆる方法により、好ましくは上記で記述される方法
のいずれかにより生成された、本明細書で記述される変異体Ｃ．ディフィシル毒素が含ま
れる免疫原性組成物に関する。
【０３０１】
抗体
驚くべきことに、上記で記述された本発明の免疫原性組成物はインビボで新規の抗体を
引き出し、これはその免疫原性組成物にはそれぞれの野生型Ｃ．ディフィシル毒素の保存
された天然の構造（例えば保存された抗原エピトープ）が含まれることおよびその免疫原
性組成物にはエピトープが含まれることを示唆している。Ｃ．ディフィシルの１つの株か
らの毒素に対して産生された抗体は、Ｃ．ディフィシルの別の株により産生された対応す
る毒素に結合することができる可能性がある。すなわち、その抗体およびその結合断片は
“交差反応性”である可能性があり、それは多数のＣ．ディフィシル株から産生された毒
素上の類似の抗原部位と反応する能力を指す。交差反応性には、抗体の、その産生を刺激
しなかった抗原と反応または結合する能力、すなわち、抗原および異なるが類似の抗原に
対して生成された抗体の間の反応も含まれる。
【０３０２】
１側面において、本発明者らは、驚くべきことに、複数のＣ．ディフィシル毒素に対し
て中和作用を有するモノクローナル抗体およびその同じものを生成する方法を発見した。
本発明の抗体は、インビトロでＣ．ディフィシル毒素の細胞毒性を中和することができ、
哺乳類細胞へのＣ．ディフィシル毒素の結合を阻害することができ、および／またはイン
ビボでＣ．ディフィシル毒素の腸管毒性を中和することができる。本発明は、前記のもの
のいずれかをコードする核酸配列が含まれる単離されたポリペプチドにも関する。加えて
、本発明は、その組成物を投与されなかった哺乳類と比較して、哺乳類においてＣ．ディ
フィシル感染症、Ｃ．ディフィシル関連疾患、症候群、病気、症状、および／またはそれ
らの合併症を処置する、予防する、それらの危険性を低下させる、それらの重症度を低下
させる、それらの発生率を低下させる、および／またはそれらの発症を遅らせるための前
記の組成物のいずれかの使用、ならびに前記の組成物を調製するための方法に関する。
【０３０３】
本発明者らはさらに、その中和モノクローナル抗体の少なくとも２種類の組み合わせは
ＴｃｄＡまたはＴｃｄＢのそれぞれの中和において意外にも相乗作用を示すことができる
ことを発見した。抗毒素抗体またはその結合断片は、Ｃ．ディフィシル感染症の抑制にお
いて有用であり得る。
【０３０４】
“抗体”は、少なくとも１または２個の重（Ｈ）鎖可変領域（本明細書においてＶＨと
略される）、および少なくとも１または２個の軽（Ｌ）鎖可変領域（本明細書においてＶ
Ｌと略される）が含まれるタンパク質である。そのＶＨおよびＶＬ領域は、さらに“相補
性決定領域”（“ＣＤＲ”）と呼ばれる超可変性の領域へと細分することができ、“フレ
ームワーク領域”（ＦＲ）と呼ばれるより保存されている領域がその間に挟まっている。
フレームワーク領域およびＣＤＲの範囲は正確に定義されている（Kabat, E. A., et al.
Sequences of Proteins of Immunological Interest , 第５版, U.S. Department of He
alth and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, 1991、およびChothia, C. et
al., J. Mol. Biol. 196:901-917, 1987を参照）。用語“抗体”にはＩｇＡ、ＩｇＧ、
ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭ型（ならびにその亜型）の完全な免疫グロブリンが含まれ、ここ
でその免疫グロブリンの軽鎖はカッパまたはラムダ型であってよい。
【０３０５】
その抗体分子は完全長（例えばＩｇＧ１またはＩｇＧ４抗体）であることができる。そ
の抗体は、以下のアイソタイプ：ＩｇＧ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ
４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、またはＩｇＥが含まれる様々なアイソタイ
プの抗体であることができる。１つの好ましい態様において、その抗体はＩｇＧアイソタ
イプ、例えばＩｇＧ１である。別の好ましい態様において、その抗体はＩｇＥ抗体である
。
【０３０６】
別の態様において、その抗体分子には“抗原結合断片”または“結合断片”が含まれ、
本明細書で用いられる際、それはＣ．ディフィシルの毒素（例えば毒素Ａ）に特異的に結
合する抗体の部分を指す。その結合断片は、例えば、１個以上の免疫グロブリン鎖が完全
長ではないが毒素に特異的に結合する分子である。
【０３０７】
抗体の“結合断片”という用語の範囲内に含まれる結合部分の例には、（ｉ）ＶＬ、Ｖ
Ｈ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価の断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領
域においてジスルフィド結合により連結された２個のＦａｂ断片を含む二価の断片である
Ｆ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）
抗体の単一の腕のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからな
るｄＡｂ断片（Ward et al., Nature 341:544-546, 1989）；ならびに（ｖｉ）特異的に
結合するために十分な枠組みを有する単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、例えば可変
領域の抗原結合部分が含まれる。
【０３０８】
軽鎖可変領域の結合断片および重鎖可変領域の結合断片、例えばＦｖ断片の２個のドメ
インであるＶＬおよびＶＨは、組み換え的方法を用いて、それらが単一のタンパク質鎖と
して作られることを可能にする合成リンカーにより連結することができ、ここでそのＶＬ
およびＶＨ領域は対になって一価の分子を形成する（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られ
る；例えばBird et al. (1988) Science 242:423-426;およびHuston et al. (1988) Proc
. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883を参照）。そのような単鎖抗体も、抗体の“結合
断片”という用語の範囲内に含まれる。これらの抗体部分は当該技術で既知の技法を用い
て得られ、その部分は完全な抗体と同じ方法で有用性に関してスクリーニングされる。
【０３０９】
本明細書で用いられる際、特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド上のエピトー
プに“特異的に結合する”、またはそれに“特異的である”抗体は、その特定のポリペプ
チドまたは特定のポリペプチド上のエピトープに、いずれの他のポリペプチドまたはポリ
ペプチドエピトープにも実質的に結合することなく結合する抗体である。例えば、標的に
“特異的に結合する”生体分子（例えばタンパク質、核酸、抗体等）に言及する際、その
生体分子は、指定された条件（例えば抗体の場合は免疫アッセイ条件）下で測定した際に
、その標的が含まれる不均質な分子の集団中でその標的分子に結合し、且つ他の分子には
有意な量では結合しない。その抗体およびその標的の間の結合反応は、不均質な分子の集
団中のその標的の存在の決定的なものである。例えば、“特異的結合”または“特異的に
結合する”は、Ｃ．ディフィシルの野生型および／または変異体毒素に対して非特異的抗
原に関するその親和性よりも少なくとも２倍大きい親和性で結合する抗体またはその結合
断片の能力を指す。
【０３１０】
典型的な態様において、その抗体はキメラ抗体である。キメラ抗体は、当該技術で既知
の組み換えＤＮＡ技法により生成することができる。例えば、マウス（または他の種の）
モノクローナル抗体分子のＦｃ定常領域をコードする遺伝子を制限酵素で消化してそのマ
ウスのＦｃをコードする領域を除去し、ヒトのＦｃ定常領域をコードする遺伝子の均等な
部分で置き換えることができる。キメラ抗体は組み換えＤＮＡ技法により作成することも
でき、ここでマウスの可変領域をコードするＤＮＡをヒトの定常領域をコードするＤＮＡ
にライゲーションすることができる。
【０３１１】
別の典型的な態様において、その抗体またはその結合断片は、当該技術で既知の方法に
よりヒト化される。例えば、一度マウスの抗体を得たら、その抗体のＣＤＲをヒトのＣＤ
Ｒの少なくとも一部で置き換えることができる。ヒト化抗体は、抗原結合に直接関わって
いないマウスのＦｖ可変領域の配列をヒトのＦｖ可変領域からの均等な配列で置き換える
ことにより生成することもできる。ヒト化抗体を生成するための一般的な方法は当該技術
で既知である。
【０３１２】
例えば、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡまたはＣ．ディフィシルＴｃｄＢに対して向けられ
たモノクローナル抗体は、標準的な技法、例えばハイブリドーマ技法により生成すること
もできる（例えばKohler and Milstein, 1975, Nature, 256: 495-497を参照）。簡潔に
は、不死の細胞株をＣ．ディフィシルＴｃｄＡ、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢ、または本明
細書で記述される変異体Ｃ．ディフィシル毒素で免疫した哺乳類からのリンパ球と融合さ
せ、結果として得られたハイブリドーマ細胞の培養上清をスクリーニングして、Ｃ．ディ
フィシルＴｃｄＡまたはＣ．ディフィシルＴｃｄＢに結合するモノクローナル抗体を産生
するハイブリドーマを同定する。典型的には、その不死の細胞株は、そのリンパ球と同じ
哺乳類種に由来する。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、そ
のハイブリドーマの培養上清をＥＬＩＳＡのようなアッセイを用いてＣ．ディフィシルＴ
ｃｄＡまたはＣ．ディフィシルＴｃｄＢに結合する抗体に関してスクリーニングするこに
より検出される。ヒトのハイブリドーマを類似の方法で調製することができる。
【０３１３】
免疫処置および選択による抗体の生成に対する代替手段として、本発明の抗体は、Ｃ．
ディフィシルＴｃｄＡ、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢ、または本明細書で記述される変異体
Ｃ．ディフィシル毒素を用いて組み換え組み合わせ（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ）免疫
グロブリンライブラリーをスクリーニングすることにより同定することもできる。その組
み換え抗体ライブラリーは、例えばｓｃＦｖライブラリーまたはＦａｂライブラリーであ
ってよい。さらに、本明細書で記述される本発明の抗体を競合結合試験において用いて追
加の抗ＴｃｄＡまたは抗ＴｃｄＢ抗体およびその結合断片を同定することができる。例え
ば、追加の抗ＴｃｄＡまたは抗ＴｃｄＢ抗体およびその結合断片は、ヒト抗体ライブラリ
ーをスクリーニングして競合結合アッセイにおいて本明細書で記述される本発明の抗体と
競合するそのライブラリー内の分子を同定することにより同定することができる。
【０３１４】
加えて、本発明に含まれる抗体には、当該技術で既知のファージディスプレイ法を用い
ることにより生成することができる組み換え抗体が含まれる。ファージディスプレイ法で
は、ファージを用いてレパートリーまたは抗体ライブラリー（例えばヒトまたはマウス）
から発現される抗原結合ドメインを提示することができる。本明細書で記述される免疫原
（例えば変異体Ｃ．ディフィシル毒素）に結合する抗原結合ドメインを発現するファージ
を、例えば標識された抗原を用いて選択または同定することができる。
【０３１５】
特定のアミノ酸が置換されている、欠失している、または付加されている抗体およびそ
の結合断片も、本発明の範囲内である。特に、好ましい抗体はフレームワーク領域中に、
例えば抗原への結合を向上させるようなアミノ酸置換を有する。例えば、その免疫グロブ
リン鎖の選択された少数の受容者のフレームワーク残基を対応する供与者のアミノ酸で置
き換えることができる。その置換の好ましい位置には、ＣＤＲに隣接する、またはＣＤＲ
と相互作用することができるアミノ酸残基が含まれる。供与者からのアミノ酸の選択に関
する基準が米国特許第５，５８５，０８９号（例えば段１２〜１６）において記述されて
いる。その受容者のフレームワークは、成熟したヒト抗体のフレームワーク配列またはコ
ンセンサス配列であることができる。
【０３１６】
本明細書で用いられる際、“中和抗体またはその結合断片”は、哺乳類において、およ
び／または細胞培養において、病原体（例えばＣ．ディフィシルＴｃｄＡまたはＴｃｄＢ
）に結合してその病原体の感染性および／または活性をその中和抗体またはその結合断片
の非存在下での同一の条件下でのその病原体と比較して低減する（例えば細胞毒性を低減
する）それぞれの抗体またはその結合断片を指す。１態様において、その中和抗体または
その結合断片は、その中和抗体またはその結合断片の非存在下での同一の条件下でのその
病原体の生物学的活性と比較して、その病原体の生物学的活性の少なくとも約７０％、７
５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはより多くを中和することができ
る。
【０３１７】
本明細書で用いられる際、用語“抗毒素抗体またはその結合断片”は、それぞれのＣ．
ディフィシル毒素（例えばＣ．ディフィシル毒素Ａまたは毒素Ｂ）に結合する抗体または
その結合断片を指す。例えば、抗毒素Ａ抗体またはその結合断片は、ＴｃｄＡに結合する
抗体またはその結合断片を指す。
【０３１８】
本明細書で記述される抗体またはその結合断片は、例えばマウス、ヒト、ウサギ、およ
びヤギが含まれる、野生型および／またはトランスジェニックのあらゆる動物において産
生させることができる。
【０３１９】
上記で記述される免疫原性組成物が、以前に例えばワクチン接種のために集団に投与さ
れている免疫原性組成物である場合、その対象において生じた抗体応答を、同じ株からの
、およびその抗体の産生を刺激しなかった株からの毒素を中和するために用いることがで
きる。例えば、免疫原性組成物により生成される６３０株および様々な野生型Ｃ．ディフ
ィシル株からの毒素の間の交差反応性に関する試験を示す実施例３７を参照。
【０３２０】
１側面において、本発明は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡに特異的な抗体またはその結合
断片に関する。ＴｃｄＡに特異的に結合するモノクローナル抗体には、Ａ６５−３３；Ａ
６０−２２；Ａ８０−２９および／または、好ましくはＡ３−２５が含まれる。
【０３２１】
１側面において、本発明は、あらゆる野生型Ｃ．ディフィシル株、例えば上記で記述さ
れた野生型Ｃ．ディフィシル株からのＴｃｄＡに、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に特異
的な抗体またはその結合断片に関する。別の側面において、本発明は、上記で記述された
免疫原性組成物に特異的な抗体またはその結合断片に関する。例えば、１態様において、
その抗体またはその結合断片は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７
が含まれる免疫原性組成物に特異的である。別の態様において、その抗体またはその結合
断片はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７が含まれる免疫原性組成物
に特異的であり、ここでＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７の少なく
とも１個のアミノ酸はホルムアルデヒド、ＥＤＣ、ＮＨＳ、またはＥＤＣおよびＮＨＳの
組み合わせにより架橋されている。別の態様において、その抗体またはその結合断片は、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３が含まれる免疫原性組成物に
特異的である。
【０３２２】
Ａ６５−３３；Ａ６０−２２；Ａ８０−２９および／または、好ましくはＡ３−２５の
可変重鎖および軽鎖領域に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％
、９５％、９６％、９７％、好ましくは約９８％、より好ましくは約９９％、または最も
好ましくは約１００％同一である可変重鎖および可変軽鎖領域を有する抗体またはその結
合断片も、ＴｃｄＡに結合することができる。
【０３２３】
１態様において、その抗体またはその抗原結合断片には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７で
示されるようなＡ３−２５の可変重鎖領域のアミノ酸配列に対して少なくとも約６０％、
６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、
９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１
００％同一であるアミノ酸配列が含まれる可変重鎖領域が含まれる。
【０３２４】
別の態様において、その抗体またはその抗原結合断片には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６
で示されるようなＡ３−２５の可変軽鎖領域のアミノ酸配列に対して少なくとも約６０％
、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％
、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または
１００％同一であるアミノ酸配列が含まれる可変軽鎖領域が含まれる。
【０３２５】
さらに別の側面において、その抗体またはその抗原結合断片には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ
：３７で示される可変重鎖領域のアミノ酸配列に対して少なくとも約６０％、６５％、７
０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９
２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一
であるアミノ酸配列が含まれる可変重鎖領域、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６で示され
る可変軽鎖領域のアミノ酸配列に対して少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、
８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、
９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸
配列が含まれる可変軽鎖領域が含まれる。
【０３２６】
別の態様において、Ａ６５−３３；Ａ６０−２２；Ａ８０−２９および／または、好ま
しくはＡ３−２５の可変重鎖および／または可変軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有す
る抗体またはその結合断片は、ＴｃｄＡにも結合することができる。Ａ３−２５の可変重
鎖領域のＣＤＲを下記の表４において示す。
【０３２７】
【表６】
2018052938.tif 000010
【０３２８】
Ａ３−２５の可変軽鎖領域のＣＤＲを下記の表５において示す。
【０３２９】
【表７】
2018052938.tif 000011
【０３３０】
１態様において、その抗体またはその結合断片には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１（ＣＤ
Ｒ  Ｈ１）、４２（ＣＤＲ  Ｈ２）および４３（ＣＤＲ  Ｈ３）で示されるような重鎖相
補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列、および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８（Ｃ
ＤＲ  Ｌ１）、３９（ＣＤＲ  Ｌ２）および４０（ＣＤＲ  Ｌ３）で示されるような軽鎖
ＣＤＲのアミノ酸配列が含まれる。
【０３３１】
１つの典型的な態様において、Ｃ．ディフィシル毒素Ａに特異的な抗体またはその結合
断片は、ＴｃｄＡのＮ末端領域内のエピトープ、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の番号付
けに従うＴｃｄＡのアミノ酸１〜１２５６のエピトープに特異的に結合する。
【０３３２】
好ましい態様において、Ｃ．ディフィシル毒素Ａに特異的な抗体またはその結合断片は
、毒素ＡのＣ末端領域内のエピトープ、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の番号付けに従う
ＴｃｄＡのアミノ酸１８３２〜２７１０のエピトープに特異的に結合する。例にはＡ３−
２５；Ａ６５−３３；Ａ６０−２２；Ａ８０−２９が含まれる。
【０３３３】
さらに別の態様において、Ｃ．ディフィシル毒素Ａに特異的な抗体またはその結合断片
はＣ．ディフィシル毒素Ａの“移行”領域内のエピトープ、例えば好ましくはＳＥＱ  Ｉ
Ｄ  ＮＯ：１の番号付けに従うＴｃｄＡの残基９５６〜１１２８が含まれるエピトープ、
例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の番号付けに従うＴｃｄＡのアミノ酸６５９〜１８３２の
エピトープに特異的に結合する。
【０３３４】
別の側面において、本発明は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢに特異的な抗体またはその結
合断片に関する。例えば、その抗体またはその結合断片は、あらゆる野生型Ｃ．ディフィ
シル株、例えば上記で記述された野生型Ｃ．ディフィシル株からのＴｃｄＢに、例えばＳ
ＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に特異的であってよい。別の側面において、本発明は、上記で記述
された免疫原性組成物に特異的な抗体またはその結合断片に関する。例えば、１態様にお
いて、その抗体またはその結合断片は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎ
Ｏ：８が含まれる免疫原性組成物に特異的である。
【０３３５】
別の態様において、その抗体またはその結合断片はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６またはＳＥ
Ｑ  ＩＤ  ＮＯ：８が含まれる免疫原性組成物に特異的であり、ここでＳＥＱ  ＩＤ  Ｎ
Ｏ：６またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８の少なくとも１個のアミノ酸はホルムアルデヒド、
ＥＤＣ、ＮＨＳ、またはＥＤＣおよびＮＨＳの組み合わせにより架橋されている。別の態
様において、その抗体またはその結合断片は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６またはＳＥＱ  
ＩＤ  ＮＯ：８５が含まれる免疫原性組成物に特異的である。
【０３３６】
ＴｃｄＢに特異的に結合するモノクローナル抗体には、本明細書で記述されるＢ２−３
１；Ｂ５−４０、Ｂ７０−２；Ｂ６−３０；Ｂ９−３０；Ｂ５９−３；Ｂ６０−２；Ｂ５
６−６；および／または、好ましくはＢ８−２６クローンにより産生される抗体が含まれ
る。
【０３３７】
ＴｃｄＢにも結合することができる抗体またはその結合断片には、Ｂ２−３１；Ｂ５−
４０、Ｂ７０−２；Ｂ６−３０；Ｂ９−３０；Ｂ５９−３；Ｂ６０−２；Ｂ５６−６、好
ましくはＢ８−２６、Ｂ５９−３、および／またはＢ９−３０の可変重および軽鎖領域に
対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％
、好ましくは約９８％、より好ましくは約９９％、または最も好ましくは約１００％同一
である可変重鎖および可変軽鎖領域を有する抗体またはその結合断片が含まれる。
【０３３８】
１態様において、その抗体またはその抗原結合断片には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９で
示されるようなＡ３−２５の可変重鎖領域のアミノ酸配列に対して少なくとも約６０％、
６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、
９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１
００％同一であるアミノ酸配列が含まれる可変重鎖領域が含まれる。
【０３３９】
１態様において、その抗体またはその抗原結合断片には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０で
示されるようなＡ３−２５の可変重鎖領域のアミノ酸配列に対して少なくとも約６０％、
６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、
９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１
００％同一であるアミノ酸配列が含まれる可変重鎖領域が含まれる。
【０３４０】
１態様において、その抗体またはその抗原結合断片には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１で
示されるようなＡ３−２５の可変重鎖領域のアミノ酸配列に対して少なくとも約６０％、
６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、
９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１
００％同一であるアミノ酸配列が含まれる可変重鎖領域が含まれる。
【０３４１】
別の態様において、その抗体またはその抗原結合断片には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５
で示されるようなＡ３−２５の可変軽鎖領域のアミノ酸配列に対して少なくとも約６０％
、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％
、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または
１００％同一であるアミノ酸配列が含まれる可変軽鎖領域が含まれる。
【０３４２】
別の態様において、その抗体またはその抗原結合断片には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６
で示されるようなＡ３−２５の可変軽鎖領域のアミノ酸配列に対して少なくとも約６０％
、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％
、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または
１００％同一であるアミノ酸配列が含まれる可変軽鎖領域が含まれる。
【０３４３】
別の態様において、その抗体またはその抗原結合断片には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７
で示されるようなＡ３−２５の可変軽鎖領域のアミノ酸配列に対して少なくとも約６０％
、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％
、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または
１００％同一であるアミノ酸配列が含まれる可変軽鎖領域が含まれる。
【０３４４】
Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢの中和抗体（Ｂ８−２６  ｍＡｂ）の可変重鎖に関するアミ
ノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９において示されている。表２５−ａ参照。
【０３４５】
【表８】
2018052938.tif 000012
【０３４６】
Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢの中和抗体（Ｂ８−２６  ｍＡｂ）の可変軽鎖に関するアミ
ノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５において示されている。表２５−ｂ参照。
【０３４７】
【表９】
2018052938.tif 000013
【０３４８】
１態様において、その抗体またはその結合断片には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１（ＣＤ
Ｒ  Ｈ１）、５２（ＣＤＲ  Ｈ２）および５３（ＣＤＲ  Ｈ３）において示されるような
重鎖ＣＤＲのアミノ酸配列および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７（ＣＤＲ  Ｌ１）、
５８（ＣＤＲ  Ｌ２）および５９（ＣＤＲ  Ｌ３）において示されるような軽鎖ＣＤＲの
アミノ酸配列が含まれる。
【０３４９】
Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢの中和抗体（Ｂ５９−３  ｍＡｂ）の可変重鎖に関するアミ
ノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０において示されている。表２６−ａ参照。
【０３５０】
【表１０】
2018052938.tif 000014
【０３５１】
Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢの中和抗体（Ｂ５９−３  ｍＡｂ）の可変軽鎖に関するアミ
ノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６において示されている。表２６−ｂ参照。
【０３５２】
【表１１】
2018052938.tif 000015
【０３５３】
１態様において、その抗体またはその結合断片には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２（ＣＤ
Ｒ  Ｈ１）、６３（ＣＤＲ  Ｈ２）および６４（ＣＤＲ  Ｈ３）において示されるような
重鎖ＣＤＲのアミノ酸配列および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８（ＣＤＲ  Ｌ１）、
６９（ＣＤＲ  Ｌ２）および７０（ＣＤＲ  Ｌ３）において示されるような軽鎖ＣＤＲの
アミノ酸配列が含まれる。
【０３５４】
Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢの中和抗体（Ｂ９−３０  ｍＡｂ）の可変重鎖に関するアミ
ノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１において示されている。表２７−ａ参照。
【０３５５】
【表１２】
2018052938.tif 000016
【０３５６】
Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢの中和抗体（Ｂ９−３０  ｍＡｂ）の可変軽鎖に関するアミ
ノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７において示されている。表２７−ｂ参照。
【０３５７】
【表１３】
2018052938.tif 000017
【０３５８】
１態様において、その抗体またはその結合断片には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３（ＣＤ
Ｒ  Ｈ１）、７４（ＣＤＲ  Ｈ２）および７５（ＣＤＲ  Ｈ３）において示されるような
重鎖ＣＤＲのアミノ酸配列および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９（ＣＤＲ  Ｌ１）、
８０（ＣＤＲ  Ｌ２）および８１（ＣＤＲ  Ｌ３）において示されるような軽鎖ＣＤＲの
アミノ酸配列が含まれる。
【０３５９】
１側面において、本発明は、あらゆるＣ．ディフィシル株、例えば上記で記述されたＣ
．ディフィシル株からの野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢに、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ
：２に特異的な抗体またはその結合断片に関する。別の側面において、本発明は、上記で
記述された免疫原性組成物に特異的な抗体またはその結合断片に関する。例えば、１態様
において、その抗体またはその結合断片は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６またはＳＥＱ  ＩＤ
ＮＯ：８が含まれる免疫原性組成物に特異的である。別の態様において、その抗体また
はその結合断片はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８が含まれる免疫
原性組成物に特異的であり、ここでＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：
８の少なくとも１個のアミノ酸はホルムアルデヒド、ＥＤＣ、ＮＨＳ、またはＥＤＣおよ
びＮＨＳの組み合わせにより架橋されている。
【０３６０】
Ｂ２−３１；Ｂ５−４０、Ｂ７０−２；Ｂ６−３０；Ｂ９−３０；Ｂ５９−３；Ｂ６０
−２；Ｂ５６−６；および／または、好ましくはＢ８−２６の可変重および軽鎖領域に対
して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、
好ましくは約９８％、より好ましくは約９９％、または最も好ましくは約１００％同一で
ある可変重鎖および可変軽鎖領域を有する抗体またはその結合断片も、ＴｃｄＢに結合す
ることができる。
【０３６１】
１態様において、その抗体またはその抗原結合断片には、Ｂ８−２６の可変重鎖領域の
アミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９）に対して少なくとも約６０％、６５％、７０
％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２
％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一で
あるアミノ酸配列が含まれる可変重鎖領域が含まれる。
【０３６２】
別の態様において、その抗体またはその抗原結合断片には、Ｂ８−２６の可変軽鎖領域
のアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５）に対して少なくとも約６０％、６５％、７
０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９
２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一
であるアミノ酸配列が含まれる可変軽鎖領域が含まれる。
【０３６３】
さらに別の側面において、その抗体またはその抗原結合断片には、Ｂ８−２６の可変重
鎖領域のアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９）に対して少なくとも約６０％、６５
％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１
％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００
％同一であるアミノ酸配列が含まれる可変重鎖領域およびＢ８−２６の可変軽鎖領域のア
ミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５）に対して少なくとも約６０％、６５％、７０％
、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％
、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であ
るアミノ酸配列が含まれる可変軽鎖領域が含まれる。
【０３６４】
別の態様において、Ｂ２−３１；Ｂ５−４０、Ｂ７０−２；Ｂ６−３０；Ｂ９−３０；
Ｂ５９−３；Ｂ６０−２；Ｂ５６−６；および／または、好ましくはＢ８−２６の可変重
鎖および／または可変軽鎖のＣＤＲを有する抗体またはその結合断片も、ＴｃｄＢに結合
することができる。
【０３６５】
１態様において、その抗体またはその結合断片には、Ｂ８−２６の重鎖相補性決定領域
（ＣＤＲ）のアミノ酸配列および／またはＢ８−２６の軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列が含ま
れる。
【０３６６】
好ましい態様において、Ｃ．ディフィシル毒素Ｂに特異的な抗体またはその結合断片は
、毒素ＢのＮ末端領域内のエピトープ、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の番号付けに従う
ＴｃｄＢのアミノ酸１〜１２５６のエピトープに特異的に結合する。例にはＢ２−３１；
Ｂ５−４０；Ｂ８−２６；Ｂ７０−２；Ｂ６−３０；およびＢ９−３０が含まれる。
【０３６７】
典型的な態様において、Ｃ．ディフィシル毒素Ｂに特異的な抗体またはその結合断片は
、毒素ＢのＣ末端領域内のエピトープ、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の番号付けに従う
ＴｃｄＢのアミノ酸１８３２〜２７１０のエピトープに特異的に結合する。
【０３６８】
さらに別の態様において、Ｃ．ディフィシル毒素Ｂに特異的な抗体またはその結合断片
はＣ．ディフィシル毒素Ｂの“移行”領域内のエピトープ、例えば好ましくはＳＥＱ  Ｉ
Ｄ  ＮＯ：２の番号付けに従うＴｃｄＢの残基９５６〜１１２８が含まれるエピトープ、
例えばＴｃｄＢのアミノ酸６５９〜１８３２のエピトープに特異的に結合する。例にはＢ
５９−３；Ｂ６０−２；およびＢ５６−６が含まれる。
【０３６９】
抗体の組み合わせ
その抗毒素抗体またはその結合断片は、他の抗Ｃ．ディフィシル毒素抗体（例えば他の
モノクローナル抗体、ポリクローナルガンマグロブリン）またはその結合断片との組み合
わせで投与することができる。用いることができる組み合わせには、抗毒素Ａ抗体または
その結合断片および抗毒素Ｂ抗体またはその結合断片が含まれる。
【０３７０】
別の態様において、組み合わせには抗毒素Ａ抗体またはその結合断片および別の抗毒素
Ａ抗体またはその結合断片が含まれる。好ましくは、その組み合わせには中和性抗毒素Ａ
モノクローナル抗体またはその結合断片および別の中和性抗毒素Ａモノクローナル抗体ま
たはその結合断片が含まれる。驚くべきことに、本発明者らは、そのような組み合わせは
結果として毒素Ａの細胞毒性の中和において相乗作用をもたらすことを発見した。例えば
、その組み合わせには、以下の中和性抗毒素Ａモノクローナル抗体：Ａ３−２５；Ａ６５
−３３；Ａ６０−２２；およびＡ８０−２９の少なくとも２種類の組み合わせが含まれる
。より好ましくは、その組み合わせにはＡ３−２５抗体ならびに以下の中和性抗毒素Ａモ
ノクローナル抗体：Ａ６５−３３；Ａ６０−２２；およびＡ８０−２９の少なくとも１種
類が含まれる。最も好ましくは、その組み合わせには４種類の抗体：Ａ３−２５；Ａ６５
−３３；Ａ６０−２２；およびＡ８０−２９の全てが含まれる。
【０３７１】
さらなる態様において、組み合わせには抗毒素Ｂ抗体またはその結合断片および別の抗
毒素Ｂ抗体またはその結合断片が含まれる。好ましくは、その組み合わせには中和性抗毒
素Ｂモノクローナル抗体またはその結合断片および別の中和性抗毒素Ｂモノクローナル抗
体またはその結合断片が含まれる。驚くべきことに、本発明者らは、そのような組み合わ
せは結果として毒素Ｂの細胞毒性の中和において相乗作用をもたらすことを発見した。よ
り好ましくは、その組み合わせには以下の中和性抗毒素Ｂモノクローナル抗体：Ｂ８−２
６；Ｂ９−３０およびＢ５９−３の少なくとも２種類の組み合わせが含まれる。最も好ま
しくは、その組み合わせには３種類の抗体：Ｂ８−２６；Ｂ９−３０およびＢ５９−３の
全てが含まれる。
【０３７２】
さらに別の態様において、組み合わせには抗毒素Ｂ抗体またはその結合断片および別の
抗毒素Ｂ抗体またはその結合断片が含まれる。前に述べたように、本発明者らは、中和性
モノクローナル抗体の少なくとも２種類の組み合わせは意外にも毒素Ａおよび毒素Ｂのそ
れぞれの中和において相乗作用を示し得ることを発見した。
【０３７３】
別の態様において、本発明の薬剤は混合物として配合することができ、またはそれによ
り結果として抗毒素Ａおよび抗毒素Ｂ結合特性の両方を有する共有結合的に連結された抗
体（または共有結合的に連結された抗体断片）がもたらされる当該技術で認識されている
技法を用いて化学的もしくは遺伝学的に連結することができる。その組み合わせ配合は、
その薬剤の単独または別の薬剤との組み合わせでの親和性、結合活性、または生物学的有
効性のような１個以上のパラメーターの決定により導かれてよい。
【０３７４】
そのような併用療法は、好ましくは、例えばＣ．ディフィシル関連疾患または障害の抑
制、（例えば再発の）予防、および／または処置におけるそれらの療法的活性において相
加的および／または相乗的である。そのような併用療法を施すことは、所望の作用を達成
するために必要なその療法剤（例えば抗体もしくは抗体断片の混合物、または架橋された
、もしくは遺伝学的に融合した二重特異性抗体もしくは抗体断片）の投与量を減少させる
ことができる。
【０３７５】
本発明の組成物、例えば抗毒素Ａおよび／または抗毒素Ｂ抗体またはそれらの結合断片
のいずれも、療法的作用に関して異なる比率または量で組み合わせることができることが
理解されている。例えば、その抗毒素Ａおよび抗毒素Ｂ抗体またはそれらのそれぞれの結
合断片は、組成物中に０．１：１０〜１０：０．１、Ａ：Ｂの範囲の比率で存在すること
ができる。別の態様において、その抗毒素Ａおよび抗毒素Ｂ抗体またはそれらのそれぞれ
の結合断片は、組成物中に０．１：１０〜１０：０．１、Ｂ：Ａの範囲の比率で存在する
ことができる。
【０３７６】
別の側面において、本発明は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡに対する中和抗体を生成する
方法に関する。その方法には、上記で記述したような免疫原性組成物を哺乳類に投与し、
その哺乳類から抗体を回収することが含まれる。好ましい態様において、その免疫原性組
成物にはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４を有する変異体Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡが含まれ、こ
こでその変異体Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡの少なくとも１個のアミノ酸は、好ましくはホ
ルムアルデヒドまたは１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
により化学的に架橋されている。生成することができるＴｃｄＡに対する典型的な中和抗
体には、Ａ６５−３３；Ａ６０−２２；Ａ８０−２９および／またはＡ３−２５が含まれ
る。
さらに別の側面において、本発明は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢに対する中和抗体を生成
する方法に関する。その方法には、上記で記述したような免疫原性組成物を哺乳類に投与
し、その哺乳類から抗体を回収することが含まれる。好ましい態様において、その免疫原
性組成物にはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６を有する変異体Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢが含まれ
、ここでその変異体Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢの少なくとも１個のアミノ酸は、好ましく
はホルムアルデヒドまたは１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイ
ミドにより化学的に架橋されている。生成することができるＴｃｄＢに対する典型的な中
和抗体には、Ｂ２−３１；Ｂ５−４０、Ｂ７０−２；Ｂ６−３０；Ｂ９−３０；Ｂ５９−
３；Ｂ６０−２；Ｂ５６−６；および／またはＢ８−２６が含まれる。
【０３７７】
配合物
（例えば本明細書で記述される変異体Ｃ．ディフィシル毒素、免疫原性組成物、抗体お
よび／またはその抗体結合断片が含まれる組成物のような）本発明の組成物は、様々な形
態であってよい。これらには、例えば半固体および固体剤形、坐剤、液体形態、例えば液
体溶液（例えば注射可能な溶液および不融性の（ｉｎｆｕｓｉｂｌｅ）溶液）、分散液ま
たは懸濁液、リポソーム類、および／または例えば凍結乾燥された（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚ
ｅｄ）粉末の形態、凍結乾燥された（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｉｅｄ）形態、噴霧乾燥された
形態、および／または発泡乾燥された（ｆｏａｍ−ｄｒｉｅｄ）形態のような乾燥した形
態が含まれる。座剤に関して、結合剤およびキャリヤーには例えばポリアルキレングリコ
ール類またはトリグリセリド類が含まれ、そのような座剤は本発明の組成物を含有する混
合物から形成することができる。典型的な態様において、その組成物は注射前の液体のビ
ヒクル中での溶解または懸濁に適した形態である。別の典型的な態様において、その組成
物はリポソームまたは微粒子、例えばポリラクチド、ポリグリコライド（ｐｏｌｙｇｌｙ
ｃｏｌｉｄｅ）、またはコポリマー中で乳化または封入されている（ｅｎｃａｐｓｕｌａ
ｔｅｄ）。
【０３７８】
好ましい態様において、その組成物は凍結乾燥されており、使用前にその場で再構成さ
れる。
１側面において、本発明は、薬学的に許容可能なキャリヤーと一緒に配合された、（例
えば本明細書で記述される変異体Ｃ．ディフィシル毒素、免疫原性組成物、抗体および／
またはその抗体結合断片が含まれる組成物のような）本明細書で記述される組成物のいず
れかが含まれる医薬組成物に関する。“薬学的に許容可能なキャリヤー”には、生理的に
適切であるあらゆる溶媒、分散媒、安定剤、希釈剤、および／または緩衝剤が含まれる。
【０３７９】
典型的な安定剤には、炭水化物、例えばソルビトール、マンニトール、デンプン、デキ
ストラン、スクロース、トレハロース、ラクトース、および／またはグルコース；不活性
なタンパク質、例えばアルブミンおよび／またはカゼイン；および／または他の大きなゆ
っくりと代謝される高分子、例えば多糖類、例えばキトサン、ポリ乳酸、ポリグリコール
酸およびコポリマー（例えばラテックスで官能性を持たせたＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）
アガロース、アガロース、セルロース等）、アミノ酸、重合体性アミノ酸、アミノ酸コポ
リマー、ならびに脂質凝集体（例えば油滴またはリポソーム）が含まれる。加えて、これ
らのキャリヤーは免疫刺激剤（すなわちアジュバント）として機能することができる。
【０３８０】
好ましくは、その組成物にはトレハロースが含まれる。トレハロースの好ましい量（重
量％）には、約１％、２％、３％、または４％の最小値から約１０％、９％、８％、７％
、６％、または５％の最大値までが含まれる。あらゆる最小値をあらゆる最大値と組み合
わせて適切な範囲を定めることができる。１態様において、その組成物には、例えば０．
５ｍＬの用量あたり約３％〜６％のトレハロース、最も好ましくは４．５％のトレハロー
スが含まれる。
【０３８１】
適切な希釈剤の例には、蒸留水、生理食塩水、生理的リン酸緩衝生理食塩水、グリセロ
ール、アルコール（例えばエタノール）、リンガー溶液、デキストロース溶液、ハンクス
平衡塩類溶液、および／または凍結乾燥賦形剤が含まれる。
【０３８２】
典型的な緩衝剤には、リン酸塩（例えばリン酸カリウム、リン酸ナトリウム）；酢酸塩
（例えば酢酸ナトリウム）；コハク酸塩（例えばコハク酸ナトリウム）；グリシン；ヒス
チジン；炭酸塩、トリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、および／または
重炭酸塩（例えば重炭酸アンモニウム）緩衝剤が含まれる。好ましくは、その組成物には
トリス緩衝剤が含まれる。トリス緩衝剤の好ましい量には、約１ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、
７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭの最小値から約１００ｍＭ、５０ｍＭ、２０ｍＭ，１
９ｍＭ、１８ｍＭ、１７ｍＭ、１６ｍＭ、１５ｍＭ、１４ｍＭ、１３ｍＭ、１２ｍＭ、ま
たは１１ｍＭの最大値までが含まれる。あらゆる最小値をあらゆる最大値と組み合わせて
適切な範囲を定めることができる。１態様において、その組成物には、例えば０．５ｍＬ
の用量あたり約８ｍＭ〜１２ｍＭのトリス緩衝剤、最も好ましくは１０ｍＭのトリス緩衝
剤が含まれる。
【０３８３】
別の好ましい態様において、その組成物にはヒスチジン緩衝剤が含まれる。ヒスチジン
緩衝剤の好ましい量には、約１ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍ
Ｍの最小値から約１００ｍＭ、５０ｍＭ、２０ｍＭ，１９ｍＭ、１８ｍＭ、１７ｍＭ、１
６ｍＭ、１５ｍＭ、１４ｍＭ、１３ｍＭ、１２ｍＭ、または１１ｍＭの最大値までが含ま
れる。あらゆる最小値をあらゆる最大値と組み合わせて適切な範囲を定めることができる
。１態様において、その組成物には、例えば０．５ｍＬの用量あたり約８ｍＭ〜１２ｍＭ
のヒスチジン緩衝剤、最も好ましくは１０ｍＭのヒスチジン緩衝剤が含まれる。
【０３８４】
別の好ましい態様において、その組成物にはリン酸緩衝剤が含まれる。リン酸緩衝剤の
好ましい量には、約１ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭの最小
値から約１００ｍＭ、５０ｍＭ、２０ｍＭ，１９ｍＭ、１８ｍＭ、１７ｍＭ、１６ｍＭ、
１５ｍＭ、１４ｍＭ、１３ｍＭ、１２ｍＭ、または１１ｍＭの最大値までが含まれる。あ
らゆる最小値をあらゆる最大値と組み合わせて適切な範囲を定めることができる。１態様
において、その組成物には、例えば０．５ｍＬの用量あたり約８ｍＭ〜１２ｍＭのリン酸
緩衝剤、最も好ましくは１０ｍＭのリン酸緩衝剤が含まれる。
【０３８５】
その緩衝剤のｐＨは一般に、選択される有効物質を安定化するように選択されると考え
られ、当業者はそれを既知の方法により確かめることができる。好ましくは、その緩衝剤
のｐＨは生理的ｐＨの範囲内であろう。従って、好ましいｐＨの範囲は約３から約８まで
、より好ましくは約６．０から約８．０まで；さらにもっと好ましくは約６．５から約７
．５まで；そして最も好ましくは約７．０〜約７．２である。
【０３８６】
一部の態様において、その医薬組成物には界面活性剤が含まれていてよい。それが両性
、非イオン性、陽イオン性または陰イオン性であれ、あらゆる界面活性剤が適切である。
典型的な界面活性剤には、ポリオキシエチレンソルビタンエステル類界面活性剤（例えば
ＴＷＥＥＮ（登録商標））、例えばポリソルベート２０および／またはポリソルベート８
０；ラウリル、セチル、ステアリルおよびオレイルアルコール類に由来するポリオキシエ
チレン脂肪エーテル類（Ｂｒｉｊ界面活性剤として知られる）、例えばトリエチレングリ
コールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ３０）；トリトンＸ  １００、またはｔ−オクチ
ルフェノキシポリエトキシエタノール；ならびにソルビタンエステル類（一般にＳＰＡＮ
類として知られる）、例えばソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ８５）およびソルビタ
ンモノラウレート、ならびにそれらの組み合わせが含まれる。好ましい界面活性剤にはポ
リソルベート８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）が含まれる。
【０３８７】
ポリソルベート８０の好ましい量（重量％）には、約０．００１％、０．００５％、ま
たは０．０１％の最小値から約０．０１０％、０．０１５％、０．０２５％、または１．
０％の最大値までが含まれる。あらゆる最小値をあらゆる最大値と組み合わせて適切な範
囲を定めることができる。１態様において、その組成物には約０．００５％〜０．００１
５％のポリソルベート８０、最も好ましくは０．０１％のポリソルベート８０が含まれる
。
【０３８８】
典型的な態様において、その免疫原性組成物にはトレハロースおよびホスフェート８０
が含まれる。別の典型的な態様において、その免疫原性組成物にはトリス緩衝剤およびポ
リソルベート８０が含まれる。別の典型的な態様において、その免疫原性組成物にはヒス
チジン緩衝剤およびポリソルベート８０が含まれる。さらに別の典型的な態様において、
その免疫原性組成物にはリン酸緩衝剤およびポリソルベート８０が含まれる。
【０３８９】
１つの典型的な態様において、その免疫原性組成物にはトレハロース、トリス緩衝剤お
よびポリソルベート８０が含まれる。別の典型的な態様において、その免疫原性組成物に
はトレハロース、ヒスチジン緩衝剤およびポリソルベート８０が含まれる。さらに別の典
型的な態様において、その免疫原性組成物にはトレハロース、リン酸緩衝剤およびポリソ
ルベート８０が含まれる。
【０３９０】
本明細書で記述される組成物には、さらに石油、動物、植物、または合成由来の構成要
素、例えば落花生油、大豆油、および／または鉱油が含まれていてよい。例には、プロピ
レングリコールまたはポリエチレングリコールのようなグリコール類が含まれる。
【０３９１】
一部の態様において、その医薬組成物にはさらにホルムアルデヒドが含まれる。例えば
、好ましい態様において、さらにホルムアルデヒドが含まれる医薬組成物は免疫原性組成
物を有し、ここでその免疫原性組成物の変異体Ｃ．ディフィシル毒素はホルムアルデヒド
が含まれる化学的架橋剤と接触させてある。その医薬組成物中に存在するホルムアルデヒ
ドの量は、約０．００１％、０．００２％、０．００３％、０．００４％、０．００５％
、０．００６％、０．００７％、０．００８％、０．００９％、０．０１０％、０．０１
３％、または０．０１５％の最小値から約０．０２０％、０．０１９％、０．０１８％、
０．０１７％、０．０１６％、０．０１５％、０．０１４％、０．０１３％、０．０１２
％、０．０１１％または０．０１０％の最大値まで様々であってよい。あらゆる最小値を
あらゆる最大値と組み合わせて適切な範囲を定めることができる。１態様において、その
医薬組成物には約０．０１０％ホルムアルデヒドが含まれる。
【０３９２】
一部の代わりの態様において、本明細書で記述される医薬組成物にはホルムアルデヒド
が含まれない。例えば、好ましい態様において、ホルムアルデヒドが含まれない医薬組成
物は免疫原性組成物を有し、ここでその変異体Ｃ．ディフィシル毒素の少なくとも１個の
アミノ酸はＥＤＣが含まれる薬剤により化学的に架橋されている。より好ましくは、その
ような態様において、その変異体Ｃ．ディフィシル毒素はホルムアルデヒドが含まれる化
学的架橋剤と接触させていない。別の典型的な態様において、凍結乾燥された形態である
医薬組成物にはホルムアルデヒドは含まれない。
【０３９３】
別の態様において、本明細書で記述される組成物には下記で記述されるようなアジュバ
ントが含まれていてよい。好ましいアジュバントは、免疫原への内因性免疫応答を、その
免疫応答の質的形態に影響を及ぼし得るその免疫原における立体構造変化を引き起こすこ
となく増強する。
【０３９４】
典型的なアジュバントには、３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ（商
標））（ＧＢ  ２２２０２１１（ＧＳＫ）参照）；水酸化アルミニウムゲル、例えばＡｌ
ｈｙｄｒｏｇｅｌ（商標）（Ｂｒｅｎｎｔａｇ  Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ、デンマーク）；ア
ルミニウム塩類（例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム）
が含まれ、それは免疫刺激剤、例えばＭＰＬまたは３−ＤＭＰ、ＱＳ−２１、重合体性ま
たは単量体性アミノ酸、例えばポリグルタミン酸またはポリリシンと共に、またはそれら
なしで用いることができる。
【０３９５】
さらに別の典型的なアジュバントは、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、例えばＣｐＧオ
リゴヌクレオチド（例えば国際公開第１９９８／０４０１００号、国際公開第２０１０／
０６７２６２号を参照）、またはサポニンおよび免疫刺激性オリゴヌクレオチド、例えば
ＣｐＧオリゴヌクレオチド（例えば国際公開第００／０６２８００号を参照）である。好
ましい態様において、そのアジュバントはＣｐＧオリゴヌクレオチド、最も好ましくはＣ
ｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ  ＯＤＮ）である。好ましいＣｐＧ  ＯＤＮは
、Ｂ細胞を優先的に活性化するＢクラスのＣｐＧ  ＯＤＮである。本発明の側面において
、そのＣｐＧ  ＯＤＮは核酸配列５’  Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊
Ｃ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ  ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４８）を有し
、ここで＊はホスホロチオエート結合を示す。この配列のＣｐＧ  ＯＤＮはＣｐＧ  ２４
５５５として知られており、それは国際公開第２０１０／０６７２６２号において記述さ
れている。好ましい態様において、ＣｐＧ  ２４５５５は水酸化アルミニウム塩、例えば
Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌと一緒に用いられる。
【０３９６】
さらなるクラスの典型的なアジュバントには、サポニンアジュバント類、例えばＳｔｉ
ｍｕｌｏｎ（商標）（ＱＳ−２１、それはトリテルペングリコシドまたはサポニンである
；Ａｑｕｉｌａ、マサチューセッツ州フレーミングハム）またはそれから生成される粒子
、例えばＩＳＣＯＭ類（免疫刺激複合体）およびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）アジ
ュバントが含まれる。従って、本発明の組成物は、ＩＳＣＯＭ類、ＣＴＢを含有するＩＳ
ＣＯＭＳ、リポソームの形態で送達されてよく、またはアクリレート類もしくはポリ（Ｄ
Ｌ−ラクチド−コ−グリコシド）のような化合物中に封入されて吸着に適した大きさのマ
イクロスフィアを形成していてよい。典型的には、用語“ＩＳＣＯＭ”は、グリコシド類
、例えばトリテルペノイドサポニン類（特にＱｕｉｌ  Ａ）、および疎水性領域を含有す
る抗原の間で形成された免疫原性複合体を指す。好ましい態様において、そのアジュバン
トはＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸアジュバントである。
【０３９７】
他の典型的なアジュバントには、ＲＣ−５２９、ＧＭ−ＣＳＦおよび完全フロイントア
ジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）が含まれる。
さらに別のクラスの典型的なアジュバントは、Ｎ−グリコシルアミド類、Ｎ−グリコシ
ル尿素類およびＮ−グリコシルカルバメート類が含まれる糖脂質類似体であり、そのそれ
ぞれが糖残基においてアミノ酸で置換されている。
【０３９８】
場合により、その医薬組成物には２種類以上の異なるアジュバントが含まれる。アジュ
バントの好ましい組み合わせには、例えば以下のアジュバントの少なくとも２種類が含ま
れるアジュバントのあらゆる組み合わせが含まれる：ミョウバン、ＭＰＬ、ＱＳ−２１、
ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ、ＣｐＧ、およびＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ。典型的なアジュバントの
組み合わせには、ＣｐＧおよびＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌの組み合わせが含まれる。
【０３９９】
あるいは、１態様において、その組成物はその哺乳類にアジュバントの非存在下で投与
される。
本明細書で記述される組成物は、予防および／または療法的適用に関して、例えば非経
口、局所、静脈内、粘膜、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、髄腔内、腹腔内、鼻腔内、筋内
、皮内、注入、直腸、および／または経皮経路のようなあらゆる投与経路により投与する
ことができる。好ましい態様において、その組成物の投与経路は非経口投与であり、より
好ましくは筋内投与である。典型的な筋内投与は腕または脚の筋肉において実施される。
【０４００】
本明細書で記述される組成物は、Ｃ．ディフィシル感染症の予防および／または処置に
おいて少なくとも部分的に有効である療法との組み合わせで投与することができる。例え
ば、本発明の組成物は、生物療法；生菌療法；便移植（ｓｔｏｏｌ  ｉｍｐｌａｎｔｓ）
；免疫療法（例えば静脈内免疫グロブリン）；および／またはＣ．ディフィシル関連疾患
（ＣＤＡＤ）の抗生物質処置に関するケアの受け入れられている標準、例えばメトロニダ
ゾールおよびバンコマイシンの前に、それらと同時に、またはそれらの後に投与すること
ができる。
【０４０１】
毒素Ａおよび毒素Ｂに関する本発明の組成物は、その哺乳類にあらゆる組み合わせで投
与することができる。例えば、変異体Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡが含まれる免疫原性組成
物は、その哺乳類に、変異体Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢが含まれる免疫原性組成物の投与
の前に、それと同時に、またはその後に投与することができる。逆に、変異体Ｃ．ディフ
ィシルＴｃｄＢが含まれる免疫原性組成物は、その哺乳類に、変異体Ｃ．ディフィシルＴ
ｃｄＡが含まれる免疫原性組成物の投与の前に、それと同時に、またはその後に投与する
ことができる。
【０４０２】
別の態様において、抗毒素Ａ抗体またはその結合断片が含まれる組成物は、その哺乳類
に、抗毒素Ｂ抗体またはその結合断片が含まれる組成物の投与の前に、それと同時に、ま
たはその後に投与することができる。逆に、抗毒素Ｂ抗体またはその結合断片が含まれる
組成物は、その哺乳類に、抗毒素Ａ抗体またはその結合断片が含まれる組成物の投与の前
に、それと同時に、またはその後に投与することができる。
【０４０３】
さらなる態様において、本発明の組成物は、その哺乳類に、薬学的に許容可能なキャリ
ヤーの投与の前に、それと同時に、またはその後に投与することができる。例えば、アジ
ュバントは変異体Ｃ．ディフィシル毒素が含まれる組成物の投与の前に、それと同時に、
またはその後に投与することができる。従って、本発明の組成物および薬学的に許容可能
なキャリヤーは同じバイアル中に包装することができ、またはそれらを別々のバイアル中
に包装して使用前に混合することができる。その組成物は、１回量投与および／または多
数回用量投与（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｏｓｅ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）のために
配合することができる。
【０４０４】
哺乳類においてＣ．ディフィシル感染を防御および／または処置する方法
１側面において、本発明は、哺乳類においてＣ．ディフィシル毒素に対する免疫応答を
誘導する方法に関する。その方法には、有効量の本明細書で記述される組成物をその哺乳
類に投与することが含まれる。例えば、その方法には、その哺乳類においてそれぞれのＣ
．ディフィシル毒素に対する免疫応答を生じさせるために有効な量を投与することが含ま
れてよい。
【０４０５】
典型的な態様において、本発明は、哺乳類においてＣ．ディフィシルＴｃｄＡに対する
免疫応答を誘導する方法に関する。その方法には、有効量の変異体Ｃ．ディフィシルＴｃ
ｄＡが含まれる免疫原性組成物をその哺乳類に投与することが含まれる。別の典型的な態
様において、本発明は、哺乳類においてＣ．ディフィシルＴｃｄＢに対する免疫応答を誘
導する方法に関する。その方法には、有効量の変異体Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢが含まれ
る免疫原性組成物をその哺乳類に投与することが含まれる。
【０４０６】
さらなる態様において、その方法には、有効量の変異体Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡが含
まれる免疫原性組成物および有効量の変異体Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢが含まれる免疫原
性組成物をその哺乳類に投与することが含まれる。追加の側面において、本明細書で記述
される組成物は、哺乳類において、その組成物を投与されなかった哺乳類と比較して、Ｃ
．ディフィシル感染症、Ｃ．ディフィシル関連疾患、症候群、病気、症状、および／また
はそれらの合併症を処置する、予防する、それらの危険性を低下させる、それらの重症度
を低下させる、それらの発生率を低下させる、および／またはそれらの発症を遅らせるた
めに用いることができる。その方法には、有効量のその組成物をその哺乳類に投与するこ
とが含まれる。
【０４０７】
感染の重症度に基づいて、Ｃ．ディフィシル感染により引き起こされる３種類の臨床症
候群が認められている。最も重度の形態は偽膜性大腸炎（ＰＭＣ）であり、それは大量の
下痢、腹痛、疾患の全身的徴候、および結腸の特徴的な内視鏡的外観を特徴とする。
【０４０８】
抗生物質関連大腸炎（ＡＡＣ）も大量の下痢、腹痛および圧痛、全身的徴候（例えば発
熱）、ならびに白血球増加を特徴とする。ＡＡＣにおける腸管損傷はＰＭＣにおける腸管
損傷よりも重症度が低く、ＰＭＣにおける結腸の特徴的な内視鏡的外観は存在せず、死亡
率は低い。
【０４０９】
最後に、抗生物質関連下痢（ＡＡＤ、それはＣ．ディフィシル関連下痢（ＣＤＡＤ）と
しても知られている）は比較的軽度な症候群であり、軽度〜中程度の下痢を特徴とし、（
例えば腹痛および圧痛を特徴とするような）大きな腸の炎症および感染の全身的徴候（例
えば発熱）の両方を欠いている。
【０４１０】
これらの３種類の別個の症候群は、典型的には順に増大する頻度で起こる。すなわち、
ＰＭＣは典型的にはＡＡＣより低い頻度で起こり、ＡＡＤは典型的にはＣ．ディフィシル
疾患の最も頻繁な臨床像である。
【０４１１】
Ｃ．ディフィシル感染症の頻繁な厄介な問題は疾患の再発または再燃であり、それはＣ
．ディフィシル疾患から回復した全ての患者の２０％に至るまでにおいて起こる。再燃は
臨床的にＡＡＤ、ＡＡＣ、またはＰＭＣとみなすことができる。一度再燃した患者は、再
度再燃する可能性がより高い。
【０４１２】
本明細書で用いられる際、Ｃ．ディフィシル感染症の状態には、例えば軽度、軽度〜中
程度、中程度、および重度のＣ．ディフィシル感染症が含まれる。Ｃ．ディフィシル感染
症の状態は、その感染症の症状の存在および／または重症度に依存して変動してよい。
【０４１３】
Ｃ．ディフィシル感染症の症状には、例えば下痢；大腸炎；痙攣、発熱、便中の白血球
、および大腸生検における炎症を伴う大腸炎；偽膜性大腸炎；低アルブミン血症；全身水
腫；白血球増加；敗血症；腹痛；無症候性保菌；および／または合併症およびその感染症
の発現の間に存在する中間的な病理学的表現型、ならびにそれらの組み合わせ等のような
、生理的、生化学的、組織学的および／または行動学的症状が含まれ得る。従って、例え
ば、有効量の本明細書で記述される組成物の投与は、例えば、その組成物を投与されなか
った哺乳類と比較して、下痢；腹痛、痙攣、発熱、大腸生検における炎症、低アルブミン
血症、全身水腫、白血球増加、敗血症、および／または無症候性保菌等を処置する、予防
する、それらの危険性を低下させる、それらの重症度を低下させる、それらの発生率を低
下させる、および／またはそれらの発症を遅らせることができる。
【０４１４】
Ｃ．ディフィシル感染症の危険因子には、例えば以下の危険因子が含まれ得る：現在ま
たは近い将来の抗微生物薬（例えば正常な結腸微生物叢の崩壊を引き起こす抗生物質、例
えばクリンダマイシン、セファロスポリン類、メトロニダゾール、バンコマイシン、フル
オロキノロン類（レボフロキサシン、モキシフロキサシン、ガチフロキサシン、およびシ
プロフロキサシンが含まれる）、リネゾリド等が含まれる、嫌気性細菌に対する抗細菌ス
ペクトルおよび／または活性を有するあらゆる抗微生物剤が含まれる）の使用；現在また
は近い将来の処方されたメトロニダゾールまたはバンコマイシンの退薬：現在または近い
将来の健康管理施設（例えば病院、長期療養施設等）および健康管理従事者への入院（ａ
ｄｍｉｓｓｉｏｎ）；現在または近い将来のプロトンポンプ阻害剤、Ｈ２拮抗薬、および
／またはメトトレキセート、またはそれらの組み合わせによる処置；現在の胃腸疾患、例
えば炎症性腸疾患、またはその危険性；その哺乳類に対する過去、現在または近い将来の
胃腸手術または胃腸手技；過去または現在のＣ．ディフィシル感染症および／またはＣＤ
ＡＤの再発、例えばＣ．ディフィシル感染症および／またはＣＤＡＤを一度または一度よ
り多く有したことがある患者；ならびに少なくとも約６５歳以上の年齢のヒト。
【０４１５】
本明細書で記述される方法において、その哺乳類は例えばマウス、ハムスター、霊長類
、およびヒトのようなあらゆる哺乳類であってよい。好ましい態様において、その哺乳類
はヒトである。本発明によれば、そのヒトにはＣ．ディフィシル感染症、Ｃ．ディフィシ
ル関連疾患、症候群、病気、症状、および／またはそれらの合併症を示したことがある人
；現在Ｃ．ディフィシル感染症、Ｃ．ディフィシル関連疾患、症候群、病気、症状、およ
び／またはそれらの合併症を示している人；ならびにＣ．ディフィシル感染症、Ｃ．ディ
フィシル関連疾患、症候群、病気、症状、および／またはそれらの合併症の危険にさらさ
れている人が含まれてよい。
【０４１６】
Ｃ．ディフィシル感染の症状を示したことがある人の例には、上記で記述した症状を示
したことがある、または示している人；Ｃ．ディフィシル感染症および／またはＣ．ディ
フィシル関連疾患（ＣＤＡＤ）を有したことがある、または有している人；ならびにＣ．
ディフィシル感染症および／またはＣＤＡＤの再発を有する人が含まれる。
【０４１７】
Ｃ．ディフィシル感染の危険にさらされている患者の例には、以下の人が含まれる：計
画された抗微生物薬の使用の危険にさらされている、または現在それを経験している人；
処方されたメトロニダゾールまたはバンコマイシンの退薬の危険にさらされている、また
は現在それを経験している人；計画された健康管理施設（例えば病院、長期療養施設等）
および健康管理従事者への入院の危険にさらされている、または現在それを経験している
人；および／または計画されたプロトンポンプ阻害剤、Ｈ２拮抗薬、および／またはメト
トレキセート、またはそれらの組み合わせによる処置の危険にさらされている、または現
在それを受けている人；胃腸疾患、例えば炎症性腸疾患を有したことがある、または経験
している人；胃腸手術または胃腸手技を受けたことがある、または受けている人；ならび
にＣ．ディフィシル感染症および／またはＣＤＡＤの再発を有したことがある、または有
している人、例えばＣ．ディフィシル感染症および／またはＣＤＡＤを一度、または一度
より多く有したことがある患者；約６５歳以上である人。そのような危険にさらされてい
る患者は現在Ｃ．ディフィシル感染症の症状を示している可能性があり、または示してい
ない可能性もある。
【０４１８】
無症候性の患者において、予防および／または処置はあらゆる年齢において（例えば約
１０、２０、または３０歳において）開始することができる。しかし、１態様において、
患者が少なくとも約４５、５５、６５、７５、または８５歳に達するまでは処置を開始す
る必要はない。例えば、本明細書で記述される組成物は、５０〜８５歳の無症候性のヒト
に投与されてよい。
【０４１９】
１態様において、哺乳類においてＣ．ディフィシル感染症、Ｃ．ディフィシル関連疾患
、症候群、病気、症状、および／またはそれらの合併症を予防する、それらの危険性を低
下させる、それらの重症度を低下させる、それらの発生率を低下させる、および／または
それらの発症を遅らせる方法には、有効量の本明細書で記述される組成物をそれを必要と
する哺乳類、Ｃ．ディフィシル感染症の危険にさらされている哺乳類、および／またはＣ
．ディフィシル感染症にかかりやすい哺乳類に投与することが含まれる。有効量には、例
えば、哺乳類において、その組成物を投与されなかった哺乳類と比較して、Ｃ．ディフィ
シル感染症、Ｃ．ディフィシル関連疾患、症候群、病気、症状、および／またはそれらの
合併症を予防する、それらの危険性を低下させる、それらの重症度を低下させる、それら
の発生率を低下させる、および／またはそれらの発症を遅らせるのに十分な量が含まれる
。有効量の本明細書で記述される組成物の投与は、例えば下痢；腹痛、痙攣、発熱、大腸
生検における炎症、低アルブミン血症、全身水腫、白血球増加、敗血症、および／または
無症候性保菌等を予防する、それらの危険性を低下させる、それらの重症度を低下させる
、それらの発生率を低下させる、および／またはそれらの発症を遅らせることができる。
好ましい態様において、その方法には有効量の本明細書で記述される免疫原性組成物をそ
れを必要とする哺乳類、Ｃ．ディフィシル感染症の危険にさらされている哺乳類、および
／またはＣ．ディフィシル感染症にかかりやすい哺乳類に投与することが含まれる。
【０４２０】
追加の態様において、哺乳類においてＣ．ディフィシル感染症、Ｃ．ディフィシル関連
疾患、症候群、病気、症状、および／またはそれらの合併症を処置する、それらの重症度
を低下させる、および／またはそれらの発症を遅らせる方法には、有効量の本明細書で記
述される組成物をＣ．ディフィシル感染症の疑いがある、または現在それを患っている哺
乳類に投与することが含まれる。有効量には、例えば、哺乳類において、その組成物を投
与されなかった哺乳類と比較して、Ｃ．ディフィシル感染症、Ｃ．ディフィシル関連疾患
、症候群、病気、症状、および／またはそれらの合併症を処置する、それらの重症度を低
下させる、および／またはそれらの発症を遅らせるのに十分な量が含まれる。
【０４２１】
有効量のその組成物の投与は、その対象においてＣ．ディフィシル感染の少なくとも１
種類の徴候または症状、例えば下記で記述される徴候または症状を改善することができる
。有効量の本明細書で記述される組成物の投与は、例えば、その組成物を投与されなかっ
た哺乳類と比較して、下痢の重症度を低下させる、および／または発生率を低下させる；
腹痛、痙攣、発熱、大腸生検における炎症、低アルブミン血症、全身水腫、白血球増加、
敗血症、および／または無症候性保菌等の重症度を低下させる、および／または発生率を
低下させることができる。場合により、感染症の症状、徴候、および／または危険因子の
存在は、処置を開始する前に決定される。好ましい態様において、その方法には有効量の
本明細書で記述される抗体および／またはその結合断片をＣ．ディフィシル感染症の疑い
がある、または現在それを患っている哺乳類に投与することが含まれる。
【０４２２】
従って、その組成物の有効量は、本発明の方法において所望の作用（例えば予防的およ
び／または療法的作用）を達成するのに十分な量を指す。例えば、投与に関する免疫原の
量は、注射あたり約１μｇ、５μｇ、２５μｇ、５０μｇ、７５μｇ、１００μｇ、２０
０μｇ、５００μｇ、または１ｍｇの最小値から約２ｍｇ、１ｍｇ、５００μｇ、２００
μｇの最大値まで様々であってよい。あらゆる最小値をあらゆる最大値と組み合わせて適
切な範囲を定めることができる。典型的には、免疫原あたり約１０、２０、５０または１
００μｇがそれぞれのヒトへの注射に関して用いられる。
【０４２３】
対象に投与される本発明の組成物の量は、その感染症のタイプおよび重症度に、および
／またはその人の特徴、例えば全身の健康状態、年齢、性別、体重および薬物への耐性に
依存してよい。それは疾患の程度、重症度、およびタイプにも依存してよい。有効量はま
た、投与経路、標的部位、その患者の生理状態、その患者の年齢、その患者がヒトか動物
か、施された他の療法、および処置が予防的か療法的かのような要因に応じて異なってよ
い。当業者は、これらおよび他の要因に応じて適切な量を決定することができるであろう
。
【０４２４】
有効量には、本明細書における方法での使用に関して１回有効用量（ｏｎｅ  ｅｆｆｅ
ｃｔｉｖｅ  ｄｏｓｅ）または（例えば２、３、４回用量、またはより多くの用量のよう
な）多数回有効用量（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｄｏｓｅｓ）が含まれて
よい。有効投与量は、安全性および有効性を最適化するように用量設定される必要がある
可能性がある。
【０４２５】
予防的および／または療法的使用を成し遂げるために適切な投与の量および頻度の組み
合わせは、予防的に、または療法的に有効な計画と定義される。予防および／または療法
計画において、その組成物は典型的には十分な免疫応答が達成されるまで１回より多くの
投与量で投与される。典型的には、その免疫応答を監視し、その免疫応答が衰え始めたら
反復投与量を与える。
【０４２６】
その組成物は、ある期間にわたって多数回の投与量で投与することができる。処置は、
その療法剤（例えば変異体Ｃ．ディフィシル毒素が含まれる免疫原性組成物）に対する抗
体または活性化されたＴ細胞もしくはＢ細胞応答をアッセイすることにより時間にわたっ
て監視することができる。その応答が減少した場合、それは追加免疫投与量が必要である
ことを示している。
【実施例】
【０４２７】
実施例１：毒素陰性Ｃ．ディフィシル株の同定
毒素（ＡおよびＢ）遺伝子および毒素発現を欠くＣ．ディフィシル株を同定するため、
１３のＣ．ディフィシル株を試験した。１３のＣ．ディフィシル株の培養液を、毒素Ａに
関するＥＬＩＳＡにより試験した。７つの株は毒素Ａを発現していた：Ｃ．ディフィシル
１４７９７−２、Ｃ．ディフィシル６３０、Ｃ．ディフィシルＢＤＭＳ、Ｃ．ディフィシ
ルＷ１１９４、Ｃ．ディフィシル８７０、Ｃ．ディフィシル１２５３、およびＣ．ディフ
ィシル２１４９。図３参照。
【０４２８】
６つの株は毒素Ａを発現しておらず、病原性遺伝子座全体を欠いていた：Ｃ．ディフィ
シル１３５１（ＡＴＣＣ  ４３５９３（商標））、Ｃ．ディフィシル３２３２（ＡＴＣＣ
ＢＡＡ−１８０１（商標））、Ｃ．ディフィシル７３２２（ＡＴＣＣ  ４３６０１（商
標））、Ｃ．ディフィシル５０３６（ＡＴＣＣ  ４３６０３（商標））、Ｃ．ディフィシ
ル４８１１（４  ＡＴＣＣ  ３６０２（商標））、およびＣ．ディフィシルＶＰＩ  １１
１８６（ＡＴＣＣ  ７０００５７（商標））。ＶＰＩ  １１１８６を、接合によるプラス
ミドＤＮＡの取り込みに対するその有効性に基づいて選択した。
【０４２９】
その同じ１３の株を、その病原性遺伝子座（ＰａＬｏｃ; Braun et al., Gene. 1996 N
ov 28;181(1-2):29-38.）の外側のプライマーを用いる多重ＰＣＲアッセイで試験した。
そのＰＣＲの結果は、ＥＬＩＳＡによる６つの毒素Ａ陰性株からのＤＮＡはＰａＬｏｃか
らのいずれの遺伝子（ｔｃｄＡ〜ｔｃｄＥ）も増幅しないことを示した。ＰａＬｏｃに隣
接する配列（ｃｄｄ３およびｃｄｕ２）は存在していた（データは示していない）。
【０４３０】
実施例２：Ｃ．ディフィシルＶＰＩ  １１１８６における芽胞形成経路の不活性化
Ｃ．ディフィシル産生株（ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｓｔｒａｉｎ）の芽胞形成機能のノ
ックアウトは、安全な製造環境における大規模発酵を容易にする。非芽胞形成性Ｃ．ディ
フィシル株を作り出すためにＣｌｏｓＴｒｏｎシステムを用いた。Heap et al., J Micro
biol Methods. 2009 Jul;78(1):79-85を参照。ＣｌｏｓＴｒｏｎシステムは、部位特異的
な挿入によるｓｐｏ０Ａ１クロストリジウム遺伝子の不活性化のためにグループＩＩイン
トロンを用いて標的化された遺伝子不活性化を可能にする。その毒素マイナス産生株ＶＰ
Ｉ  １１１８６に対してそのＣｌｏｓＴｒｏｎ技術による芽胞形成不活性化を施した。エ
リスロマイシン耐性変異体を選択し、挿入カセットの存在をＰＣＲにより確かめた（示し
ていない）。２個の独立したクローンが芽胞を形成できないことを確かめた。
【０４３１】
実施例３：細胞毒性機能を不活性化するための毒素ＡおよびＢ遺伝子の遺伝子改変
株６３０Δのゲノム配列に基づく完全長変異体毒素ＡおよびＢのオープンリーディング
フレーム（ＯＲＦ）を、Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈでのカスタム合成のため
に設計した。例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９〜１４を参照。細胞毒性の原因であるグルコ
シルトランスフェラーゼ活性に関する活性部位を、２個の対立遺伝子置換：毒素Ａに関し
てＤ２８５Ａ／Ｄ２８７Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３参照）、および毒素Ｂに関してＤ２
８６Ａ／Ｄ２８８Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５参照）により変化させた。２つのヌクレオ
チドを、それぞれのアスパラギン酸（Ｄ）コドンにおいて変異させてアラニン（Ａ）に関
するコドンを作り出した。例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９〜１４を参照。加えて、システ
イン残基を欠く変異体毒素を発現する一対のベクターを、Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ  Ｂｉｏ
ｔｅｃｈでのカスタム合成後に構築した。変異体毒素Ａからの７個のシステイン残基およ
び変異体毒素Ｂからの９個のシステイン残基をアラニンで置き換えた。その置換には、Ａ
およびＢ毒素の自己触媒的プロテアーゼの触媒的システインが含まれる。また、ベクター
構築に関して用いられる制限酵素部位を削除するために必要である場合、サイレント変異
を導入した。
【０４３２】
実施例４：ｐＭＴＬ８４１２１ｆｄｘ発現ベクター
Ｃ．ディフィシル変異体毒素抗原発現のために用いられたプラスミドシャトルベクター
は、Ｍｉｎｔｏｎ研究室により開発されたｐＭＴＬ８０００シリーズモジュラーシステム
から選択された（Heap et al., J Microbiol Methods. 2009 Jul;78(1):79-85を参照）。
選択されたベクターｐＭＴＬ８４１２１ｆｄｘは、Ｃ．ディフィシルプラスミドｐＣＤ６
Ｇｒａｍ＋レプリコン、ｃａｔＰ（クロラムフェニコール／チアンフェニコール）選択
用マーカー、ｐ１５ａ  Ｇｒａｍ−レプリコンおよびｔｒａ機能、ならびにＣ．スポロゲ
ネス（Ｃ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ）フェレドキシンプロモーター（ｆｄｘ）および遠位の
（ｄｉｓｔａｌ）マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）を含有する。実験によるデータは
、低コピー数のｐ１５ａレプリコンは代替案であるＣｏｌＥ１よりも大腸菌中での大きな
安定性を与えることを示唆した。ｆｄｘプロモーターは、それがＣＡＴレポーターコンス
トラクト（例えばｔｃｄＡ、ｔｃｄＢ；または異種のｔｅｔＲまたはｘｙｌＲ）を用いた
実験において試験された他のプロモーターよりも高い発現をもたらしたために選択された
（データは示していない）。
【０４３３】
実施例５：改変された毒素ＯＲＦのｐＭＴＬ８４１２１ｆｄｘ中へのクローニング
株６３０Δのゲノム配列に基づく完全長変異体毒素ＡおよびＢのオープンリーディング
フレーム（ＯＲＦ）を、ｐＭＴＬ８４１２１ｆｄｘベクターのマルチクローニングＮｄｅ
ＩおよびＢｇｌＩＩ部位を用いて、標準的な分子生物学の技法を用いてサブクローニング
した。クローニングを容易にするため、そのＯＲＦに開始コドンを含有する近位のＮｄｅ
Ｉ部位およびその停止コドンのすぐ下流のＢｇｌＩＩ部位を隣接させた。
【０４３４】
実施例６：三重変異体を作り出すためのＴｃｄＡの部位特異的変異誘発
自己触媒的プロテアーゼドメインの触媒的システイン残基を、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３
および５、すなわち“二重変異体”のそれぞれにおいて置換した（すなわち、ＴｃｄＡに
関してＣ７００ＡおよびＴｃｄＢに関してＣ６９８Ａ）。変異体毒素Ａの変異誘発に関し
て、ＴｃｄＡ  Ｄ２８５Ａ／Ｄ２８７Ａ発現プラスミドからの２．４８ｋｂのＮｄｅＩ−
ＨｉｎｄＩＩＩ断片をｐＵＣ１９（同じもので切断した）中にサブクローニングし、この
鋳型に対して部位特異的変異誘発を実施した。一度その新しい対立遺伝子をＤＮＡ配列分
析により確認し、その改変されたＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を発現ベクターｐＭＴＬ
８４１２１ｆｄｘ中に再導入して“三重変異体”、すなわちＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４およ
びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６を作り出した。
【０４３５】
実施例７：三重変異体を作り出すためのＴｃｄＢの部位特異的変異誘発
変異体毒素Ｂの変異誘発のため、変異体毒素Ｂプラスミドからの３．２９ｋｂのＮｄｅ
Ｉ−ＥｃｏＮＩ断片を改変して再導入した。ＥｃｏＮＩ部位は入手可能なクローニングベ
クター中に存在しないため、わずかに大きい３．５ｋｂのＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＶ断片をｐ
ＵＣ１９（ＮｄｅＩ−ＳｍａＩにより調製された）中にサブクローニングした。変異誘発
後、その改変された内部の３．３ｋｂのＮｄｅＩ−ＥｃｏＮＩ断片を切り出し、それを用
いて対応する変異体毒素Ｂ発現ベクターｐＭＴＬ８４１２１ｆｄｘの断片を置き換えた。
この方向の（ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ）計画のクローニング効率は極めて低いことが分か
ったため、１．５ｋｂのＤｒａＩＩＩの置き換えを含む、Ｃ６９８Ａ対立遺伝子を導入す
るための代替計画を並行して試みた。両方の計画が独立して所望の組み換え体をもたらし
た。
【０４３６】
実施例８：部位特異的変異誘発による追加の変異体毒素変種の作製
少なくとも１２の異なるＣ．ディフィシル変異体毒素変種を構築した。対立遺伝子置換
をＮ末端の変異体毒素遺伝子断片中に部位特異的変異誘発（Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ（登
録商標）キット）により導入した。生物学的活性において野生型Ｃ．ディフィシル株から
精製された天然の毒素に対して定量的に均等なタンパク質を生成するこのプラスミドに基
づく系の能力を評価するための参照対照としての組み換え毒素も設計した。この場合、本
来のグルコシルトランスフェラーゼの置換を元に戻すように対立遺伝子置換を導入した。
加えて、一対のシステインを含まない変異体毒素ベクターを、Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ  Ｂ
ｉｏｔｅｃｈでのカスタム合成後に構築した。
【０４３７】
その１２の毒素の変種には、（１）Ｄ２８５Ａ／Ｄ２８７Ａ変異を有する変異体Ｃ．デ
ィフィシル毒素Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）；（２）Ｄ２８６Ａ／Ｄ２８８Ａ変異を有
する変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）；（３）Ｄ２８５Ａ／Ｄ
２８７Ａ、Ｃ７００Ａ変異を有する変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ
：４）；（４）Ｄ２８６Ａ／Ｄ２８８Ａ、Ｃ６９８Ａ変異を有する変異体Ｃ．ディフィシ
ル毒素Ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）；（５）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を有する組み換え
毒素Ａ；（６）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２を有する組み換え毒素Ｂ；（７）Ｃ７００Ａ変異
を有する変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ａ；（８）Ｃ６９８Ａ変異を有する変異体Ｃ．ディ
フィシル毒素Ｂ；（９）Ｃ７００Ａ、Ｃ５９７Ｓ、Ｃ１１６９Ｓ、Ｃ１４０７Ｓ、Ｃ１６
２３Ｓ、Ｃ２０２３Ｓ、およびＣ２２３６Ｓ変異を有する変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ａ
；（１０）Ｃ６９８Ａ、Ｃ３９５Ｓ、Ｃ５９５Ｓ、Ｃ８２４Ｓ、Ｃ８７０Ｓ、Ｃ１１６７
Ｓ、Ｃ１６２５Ｓ、Ｃ１６８７Ｓ、およびＣ２２３２Ｓ変異を有する変異体Ｃ．ディフィ
シル毒素Ｂ；（１１）Ｄ２８５Ａ、Ｄ２８７Ａ、Ｃ７００Ａ、Ｄ２６９Ａ、Ｒ２７２Ａ、
Ｅ４６０Ａ、およびＲ４６２Ａ変異を有する変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ａ（ＳＥＱ  Ｉ
Ｄ  ＮＯ：７）；ならびに（１２）Ｄ２７０Ａ、Ｒ２７３Ａ、Ｄ２８６Ａ、Ｄ２８８Ａ、
Ｄ４６１Ａ、Ｋ４６３Ａ、およびＣ６９８Ａ変異を有する変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ｂ
（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）が含まれる。
【０４３８】
実施例９：形質転換体の安定性
一般的に用いられるＤＨ５α大腸菌研究室株を用いると、再編成されたプラスミドが得
られた。対照的に、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｓｔｂｌ２（商標）大腸菌宿主を用いた形質
転換は、ＬＢクロラムフェニコール（２５μｇ／ｍｌ）プレート上での３０℃における３
日間の増殖の後、増殖の遅い完全長変異体毒素組み換え体をもたらした。関連するＳｔｂ
ｌ３（商標）およびＳｔｂｌ４（商標）大腸菌株を用いるとより低いクローニング効率が
得られたが、これらの系統はプラスミドの維持に関して安定であることが分かった。続い
て形質転換体を寒天において、または液体培養中で、クロラムフェニコール選択下で３０
℃において増殖させた。（Ｍｉｌｌｅｒの）ＬＢ培地は動物由来物質を含まないトリプト
ン−大豆に基づく培地と比較して形質転換体の回収率および増殖を向上させることも分か
った。
【０４３９】
実施例１０：Ｃ．ディフィシルの野生型または遺伝子変異体毒素遺伝子をコードするｐ
ＭＴＬ８４１２１ｆｄｘによる形質転換
Ｃ．ディフィシルの大腸菌接合伝達による形質転換を、本質的にHeap et al., Journal
of Microbiological Methods, 2009. 78(1): p. 79-85において記述されているように行
った。大腸菌宿主ＣＡ４３４を、野生型または様々な変異体毒素遺伝子をコードするｐＭ
ＴＬ８４１２１ｆｄｘを用いて形質転換した。大腸菌宿主ＣＡ４３４は、発現プラスミド
をＣ．ディフィシル産生株ＶＰＩ  １１１８６  ｓｐｏ０Ａ１中に移動させるための中間
体である。ＣＡ４３４は大腸菌ＨＢ１０１の派生株である。この株はＴｒａ＋  Ｍｏｂ＋
Ｒ７０２接合性プラスミドを有し、それはＫｍ、Ｔｃ、Ｓｕ、Ｓｍ／Ｓｐｅ、およびＨ
ｇ（Ｔｎ１８３１による）に対する耐性を与える。化学的コンピテントまたはエレクトロ
コンピテント細胞ＣＡ４３４細胞を調製し、発現ベクター形質転換体をＭｉｌｌｅｒのＬ
Ｂ  ＣＡＭプレート上で３０℃において選択した。３日後に見えてくる増殖の遅いコロニ
ーを選んで３ｍＬ  ＬＢクロラムフェニコール培養において対数期中期まで増殖させた（
３０℃において約２４時間、２２５ｒｐｍ、オービタルシェーカー）。壊れた線毛を避け
るために大腸菌培養物を低速（５，０００ｇ）遠心分離により回収し、細胞のペレットを
１ｍＬ  ＰＢＳ中で大孔径のホールピペットを用いて穏やかに再懸濁した。細胞を低速遠
心分離により濃縮した。逆さにしてＰＢＳの大部分を除去し、排水した（ｄｒａｉｎｅｄ
）ペレットを嫌気室中に移して０．２ｍＬのＣ．ディフィシル培養物と共に再懸濁し、Ｂ
ＨＩＳ寒天プレート上にスポットし、８時間または一夜増殖させた。変異体毒素Ａ形質転
換体の場合、一夜の接合でよりよい結果が達成された。細胞のパッチを０．５ｍＬのＰＢ
Ｓ中にかき集め、０．１ｍＬを大腸菌供与細胞を殺すために１５μｇ／ｍＬチアンフェニ
コール（クロラムフェニコールのより強力な類似体）およびＤ−サイクロセリン／セホキ
シチンを補ったＢＨＩＳ選択培地上に蒔いた。１６〜２４時間後に見えてきた形質転換体
を、新しい（補助物質を加えた）ＢＨＩＳプレート上に再度画線することにより純化し、
その後の培養物を組み換え毒素または変異体毒素の発現に関して試験した。優れた発現を
示しているクローンからグリセロールパーマネント（Ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｐｅｒｍａｎｅ
ｎｔｓ）およびシードストック（ｓｅｅｄ  ｓｔｏｃｋｓ）を調製した。また、２ｍＬの
培養液からプラスミドのミニプレップを、細胞をリゾチームにより前処理する（必須では
ない）改変されたＱｉａｇｅｎキットの手順を用いて調製した。そのＣ．ディフィシルミ
ニプレップＤＮＡを、クローンの完全性を確かめるためのＰＣＲ配列決定のための鋳型と
して用いた。あるいは、プラスミドミニプレップＤＮＡを大腸菌Ｓｔｂｌ２（商標）形質
転換体から調製し、配列決定した。
【０４４０】
実施例１１：毒素ＡおよびＢの三重変異体（それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４および６
）および七重Ｂ変異体（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）のＣ．ディフィシル発現分析
形質転換体を２ｍＬ培養（型にはまった分析のため）で、または通気穴に蓋をしたフラ
スコ中（時間経過実験のため）でのどちらかで増殖させた。試料（２ｍＬ）を短時間遠心
分離（１０，０００ｒｐｍ、３０秒間）して細胞を濃縮し：上清をデカントして１０倍濃
縮し（Ａｍｉｃｏｎ−ｕｌｔｒａ  ３０ｋ）；ペレットを排水して−８０℃で凍結させた
。細胞のペレットを氷上で解かし、１ｍＬの溶解緩衝液（トリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５；
１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５％グリセロール）中で再懸濁し、超音波処理（微小チップを用い
た１×２０秒のバースト（ｂｕｒｓｔ））した。その溶解物を４℃で遠心分離し、上清を
５倍濃縮した。上清および溶解物の試料を試料緩衝液と合わせて熱処理（１０分間、８０
℃）した後、２通りの（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）３〜８％トリス−酢酸ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲ
ル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上に装填した（ｌｏａｄｉｎｇ）。１枚のゲルをクーマシー
で染色し、２枚目のゲルをウェスタン分析のためにエレクトロブロットした。毒素Ａ特異
的および毒素Ｂ特異的ウサギ抗血清（Ｆｉｔｇｅｒａｌｄ；Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ）を用い
て変異体毒素ＡおよびＢの変種を検出した。七重変異体毒素Ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８
）の発現も、ウェスタンブロットハイブリダイゼーションにより確認した。
【０４４１】
実施例１２：変異体毒素のグルコシルトランスフェラーゼ活性の抑止
遺伝子二重変異体（ＤＭ）毒素ＡおよびＢ（それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３および５
）および三重変異体（ＴＭ）毒素ＡおよびＢ（それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４および６
）は、ＵＤＰ−１４Ｃ−グルコース［３０μＭ］、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２、
１００ｍＭ  ＫＣｌ、４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ＭｎＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、およ
び０．１μｇ／μＬ  ＢＳＡの存在下でのインビトログルコシル化アッセイにおいて、１
４Ｃ−グルコースを１０μｇのＲｈｏＡ、Ｒａｃ１およびＣｄｃ４２  ＧＴＰアーゼに移
さなかった。しかし、野生型ＡおよびＢ毒素対照（それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１およ
び２を有する）は、それぞれ１０および１ｎｇの低い用量（およびより低い用量、データ
は示していない）において（図４Ａおよび４Ｂ）、１００μｇの変異体毒素の存在下にお
いてさえも（図４Ｂ）、１４Ｃ−グルコースをＧＴＰアーゼに効率的に移し、これはそれ
ぞれの野生型毒素と比較して少なくとも１００，０００倍の低減を示している。類似の結
果がＣｄｃ４２  ＧＴＰアーゼに関して検出された（データは示していない）。
【０４４２】
具体的には、図４Ｂにおいて、野生型毒素Ａおよび毒素Ｂ（１ｎｇ）または三重変異体
毒素Ａおよび三重変異体毒素Ｂ（１００μｇ）をＵＤＰ−１４Ｃ−グルコースの存在下で
ＲｈｏＡ  ＧＴＰアーゼと共に３０℃で２時間保温した。説明したように、１ｎｇの野生
型ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢは１４Ｃ−グルコースをＲｈｏＡに移したが、１００μｇの三
重変異体毒素Ａおよび三重変異体毒素Ｂは移さなかった。１ｎｇの野生型ＴｃｄＡまたは
ＴｃｄＢをそれぞれ１００μｇの三重変異体毒素Ａまたは三重変異体毒素Ｂによる反応中
に添加した場合、ＲｈｏＡのグルコシル化が検出され、これはグルコシル化阻害剤がない
ことを示している。グルコシル化活性に関する検出の感度は、１００μｇの変異体毒素の
バックグラウンド中の１ｎｇの野生型毒素（１：１００，０００の比率）であることが確
かめられた。その結果は、三重変異体毒素Ａおよび三重変異体毒素Ｂ中のグルコシルトラ
ンスフェラーゼの活性部位における変異があらゆる測定可能なグルコシルトランスフェラ
ーゼ活性を低減した（それぞれの野生型毒素の活性と比較して１００，０００倍低い活性
よりも低い）ことを示している。グルコシル化されたＧＴＰアーゼのＴＣＡ沈殿によりグ
ルコシルトランスフェラーゼ活性を定量化するための類似のアッセイも開発した。
【０４４３】
実施例１３：自己触媒的システインプロテアーゼ活性の抑止
自己触媒的切断の機能は、三重遺伝子変異体ＡおよびＢ（ＴＭ）（それぞれＳＥＱ  Ｉ
Ｄ  ＮＯ：４および６）において、そのシステインプロテアーゼ切断部位を変異させた場
合、抑止された。図５において図説されているように、野生型（ｗｔ）毒素ＡおよびＢ（
それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３および５）はイノシトール−６−リン酸の存在下で切断
される。二重変異体毒素ＡおよびＢ（それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３および５）も、野
生型に関する切断と同様に、イノシトール−６−リン酸の存在下で切断される（データは
示していない）。毒素Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）は３０８ｋＤａから２４５および６
０ｋＤａの２個の断片へと切断される。毒素Ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）は２７０ｋＤ
ａから２０７および６３ｋＤａの２個の断片へと切断される。三重変異体毒素ＡおよびＢ
（ＴＭ）（それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４および６）は、イノシトール−６−リン酸の
存在下においてさえも、それぞれ３０８および２０７ｋＤａにおいて影響を受けないまま
である。図５参照。従って、そのシステインプロテアーゼ活性は遺伝子改変により不活性
化された。
【０４４４】
より具体的には、図５において、１μｇの三重変異体Ａおよび三重変異体Ｂを、Ｌｉｓ
ｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓからの野生型ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢと並行して室温（２１
±５℃）で９０分間保温した。その切断反応は、２０μＬの量で、トリス−ＨＣｌ、ｐＨ
７．５、２ｍＭ  ＤＴＴ中で、イノシトール−６−リン酸（ＴｃｄＡに関して１０ｍＭお
よびＴｃｄＢに関して０．１ｍＭ）の存在下または非存在下で実施された。次いで全反応
量を３〜８％ＳＤＳ／ＰＡＧＥ上に装填し；タンパク質のバンドを銀染色により可視化し
た。説明したように、ｗｔＴｃｄＡおよびＴｃｄＢはイノシトール−６−リン酸の存在下
で切断されてそれぞれ２４５ｋＤおよび６０ｋＤならびに２０７ｋＤおよび６３ｋＤの２
個のタンパク質のバンドになった。三重変異体毒素Ａおよび三重変異体毒素Ｂは切断され
ず、従って三重変異体毒素ＡにおけるＣ７００Ａ変異および三重変異体毒素ＢにおけるＣ
６９８Ａ変異は切断を妨げることが確認された。
【０４４５】
実施例１４：三重変異体毒素ＡおよびＢ（それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４および６）
の残存する細胞毒性
その遺伝子変異体毒素を、ヒト二倍体肺線維芽細胞株であるＩＭＲ９０細胞におけるイ
ンビトロ細胞毒性アッセイによりそれらの細胞毒性に関して評価した。これらの細胞は毒
素ＡおよびＢの両方に対して感受性である。代わりの好ましい態様として、ミドリザル（
Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ａｅｔｈｉｏｐｓ）からのベロ正常腎臓細胞を、それらは
毒素ＡおよびＢに対する適度な感受性を有することが観察されたため、その細胞毒性アッ
セイにおいて用いることができる。好ましくは、ＨＴ−２９ヒト結腸直腸腺癌細胞は、そ
れらはその毒素に対してベロおよびＩＭＲ９０細胞株と比較して著しく減少した感受性を
示したため、その細胞毒性アッセイにおいて用いられない。例えば下記の表６を参照。
【０４４６】
【表１４】
2018052938.tif 000018
【０４４７】
系列希釈した遺伝子変異体毒素またはｗｔ毒素の試料を、９６ウェル組織培養プレート
中で増殖した細胞単層に添加した。３７℃で７２時間保温した後、そのプレートを、相対
発光単位（ＲＬＵ）として表される発光を生じる、ルシフェラーゼに基づくＣｅｌｌＴｉ
ｔｅｒＧｌｏ（登録商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）の添加
により細胞のＡＴＰレベルを測定することにより、代謝的に活性な細胞に関して評価した
。高いＲＬＵはその細胞が生存可能であることを示し、低いＲＬＵはその細胞が代謝的に
活性ではなく瀕死であることを示す。ＥＣ５０として表される細胞毒性のレベルは、細胞
培養対照におけるレベルと比較してＲＬＵにおける５０％の低減を引き出すｗｔ毒素また
は遺伝子変異体毒素の量として定義される（このアッセイの詳細を下記で提供する）。図
６、表７Ａ、および表８Ａにおいて示されるように、ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢのＥＣ５０
値はそれぞれ約０．９２ｎｇ／ｍＬおよび０．００９ｎｇ／ｍＬであった。三重変異体毒
素Ａおよび三重変異体毒素ＢのＥＣ５０値はそれぞれ約８６００ｎｇ／ｍＬおよび７４ｎ
ｇ／ｍＬであった。ｗｔ毒素と比較した細胞毒性におけるおおよそ１０，０００倍の低減
にも関わらず、両方の遺伝子変異体毒素はなお細胞毒性の低い残存レベルを示した。この
残存する細胞毒性は中和性抗毒素モノクローナル抗体により遮断することができ、これは
、それはその三重変異体毒素に特異的であるがそのｗｔ毒素の既知の酵素活性（グルコシ
ル化または自己タンパク質分解）にはおそらく関連していないことを示している。
【０４４８】
両方のｗｔ毒素は強力なインビトロでの細胞毒性を示し、少量のその毒素は哺乳類細胞
に対して例えば細胞の円形化（細胞変性作用またはＣＰＥ）および（ＡＴＰレベルにより
測定されるような）代謝活性の欠如のような様々な作用を引き起こすのに十分である。従
って、その変異体毒素原薬（ｄｒｕｇ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ）中に残存する細胞毒性が
残っていないことを確かめるために、２種類のインビトロアッセイ（ＣＰＥまたは細胞円
形化アッセイおよびＡＴＰアッセイ）が開発された。その結果はＥＣ５０として表され、
それは１）その細胞の５０％のＣＰＥの発現、または２）相対光単位として測定されるよ
うなＡＴＰレベルにおける５０％の低減を引き起こす毒素または変異体毒素の量である。
【０４４９】
ＣＰＥアッセイにおいて、試料または原薬を系列希釈し、ＩＭＲ９０細胞と共に保温し
、それを可能性のある細胞変性作用に関して観察する。そのＣＰＥアッセイは、０（正常
な細胞）〜４（約１００％の細胞が円形化している）の尺度上で採点され、２の点数（約
５０％の細胞が円形化している）がその試験試料のＥＣ５０値として定義される。この方
法は１０００μｇ／ｍＬの濃度での変異体毒素原薬の試験のために用いられ、それはこの
アッセイにおいてマトリックス干渉（ｍａｔｒｉｘ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）なしで
試験することができる最大許容可能濃度である。従って、検出可能な細胞毒性がない場合
はＥＣ５０＞１０００μｇ／ｍＬとして報告される。
【０４５０】
ＡＴＰアッセイはＡＴＰから生成される発光シグナルの量の測定に基づき、それは代謝
的に活性な細胞の数に比例する。このアッセイにおいてアッセイ干渉なしで試験すること
ができる最大許容可能濃度は、約２００μｇ／ｍＬである。従って、このアッセイにおい
て検出可能な細胞毒性がない場合はＥＣ５０＞２００μｇ／ｍＬとして報告される。
【０４５１】
異なる濃度の変異体毒素ＡおよびＢを、毒素対照と並行して細胞に添加した。そのアッ
セイのエンドポイントは、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）
を用いる細胞ＡＴＰレベルにより決定される細胞生存度であった。発光の程度はＡＴＰレ
ベルまたは生存可能な細胞の数に比例している。
【０４５２】
野生型（ｗｔ）毒素Ａのインビトロ細胞毒性（ＥＣ５０）は９２０ｐｇ／ｍＬであり、
毒素Ｂに関しては９ｐｇ／ｍＬであった。変異体毒素Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）のイ
ンビトロ細胞毒性（ＥＣ５０）は８６００ｎｇ／ｍＬであり、変異体毒素Ｂ（ＳＥＱ  Ｉ
Ｄ  ＮＯ：６）に関しては７４ｎｇ／ｍＬであった。これらの値はそれぞれ９３４８およ
び８２２２倍の低減を表しているが、両方の変異体毒素において残存する細胞毒性が検出
された。
【０４５３】
言い換えると、三重変異体毒素ＡおよびＢ（それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４および６
）の細胞毒性はＩＭＲ−９０細胞におけるインビトロ細胞毒性アッセイにおいてｗｔ毒素
ＡおよびＢ（それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１および２）と比較して著しく低減した。図
６において図説されるように、両方の三重変異体毒素はｗｔ毒素と比較して細胞毒性にお
ける著しい低減（１０４倍）を示したが、両方の三重変異体毒素のより高い濃度において
残存する細胞毒性が観察された。
【０４５４】
さらに、それぞれの三重変異体毒素の残存する細胞毒性は、その毒素に特異的な抗体に
より完全に中和することができた（例えば、野生型毒素の毒性と比較して、毒性における
少なくとも６〜８ｌｏｇ１０の低減）。下記の実施例１６を参照。
【０４５５】
細胞培養アッセイは、細胞毒性の検出に関してインビボの動物モデルよりも高感度であ
る。マウス致死負荷モデルにおいて腹腔内または静脈内経路のどちらかにより送達された
際、ｗｔＴｃｄＡはマウスあたり約５０ｎｇのＬＤ５０を有し、一方でｗｔＴｃｄＢはよ
り強力でマウスあたり約５ｎｇのＬＤ５０を有する。対照的に、上記で記述された細胞培
養に基づくインビトロアッセイは、ｗｔＴｃｄＡに関してウェルあたり１００ｐｇおよび
ｗｔＴｃｄＢに関してウェルあたり２ｐｇのＥＣ５０値を有する。
【０４５６】
実施例１５：遺伝子七重変異体毒素Ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）の残存する細胞毒性
図７で図説されるように、ＥＣ５０値は三重変異体毒素Ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）
（２０．７８ｎｇ／ｍＬ）および七重変異体毒素Ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）（３５．
９ｎｇ／ｍＬ）変異体に関して類似しており、これはそのグルコシルトランスフェラーゼ
活性部位およびＧＴＰアーゼ基質結合部位をさらに改変するための４個の追加の変異はそ
の遺伝子変異体毒素の細胞毒性をそれ以上低減しなかったことを示している。そのＥＣ５
０値は、二重変異体毒素Ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）に関しても三重および七重変異体
毒素に関するＥＣ５０値と類似していた（データは示していない）。この観察は、その変
異体毒素の細胞毒性に関する機序は驚くべきことにグルコシルトランスフェラーゼおよび
基質認識機序と無関係であることを示唆している。
【０４５７】
実施例１６：三重変異体毒素ＡおよびＢ（それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４および６）
の残存する細胞毒性
その残存する細胞毒性の性質をさらに評価するため、その変異体毒素（ＳＥＱ  ＩＤ  
ＮＯ：４および６）をそれらのそれぞれの中和抗体と混合して保温した後、その混合物を
ＩＭＲ９０細胞の単層に添加した。
【０４５８】
その結果（図８）は、変異体毒素ＡおよびＢ（それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４および
６）の残存する細胞毒性は変異体毒素Ａ（上のパネル、図８）および変異体毒素Ｂ（下の
パネル、図８）に特異的な中和抗体を用いて完全に抑止され得ることを示した。増大する
濃度の変異体毒素Ａ（上のパネル）およびＢ（下のパネル）を、ウサギ抗毒素ポリクロー
ナル（ｐＡｂ、１：１０希釈）またはマウスモノクローナル抗体（３．０ｍｇ  ＩｇＧ／
ｍＬを含有するストックから１：５０希釈）と共に保温した後、ＩＭＲ９０細胞に添加し
た。ＩＭＲ９０細胞との３７℃における７２時間の処理（保温）後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ
−Ｇｌｏ（登録商標）基質を添加し、相対光単位（ＲＬＵ）を分光光度計においてＡＴＰ
レベルを測定するための発光プログラムを用いて測定した。ＡＴＰレベルがより低いほど
、毒性がより高い。対照にはそれらの対応するＥＣ５０値の４倍で添加されたＴｃｄＡお
よびＴｃｄＢが含まれていた。
【０４５９】
公開された報告は、その毒素のグルコシルトランスフェラーゼまたは自己触媒的プロテ
アーゼドメインにおける変異は結果としてその毒性の完全な不活性化をもたらすことを示
唆している。しかし、我々のデータはこれらの公開された報告とは一致せず、これは公開
された報告における粗製の培養物の溶解物に対して我々の研究で試験された高度に精製さ
れた変異体毒素の増大した濃度；１２時間未満でなされた観察に対して変異体毒素で処理
した細胞の細胞円形化が観察された時点の増大（例えば２４時間、４８時間、７２時間、
または９６時間）；公開された報告で開示された細胞毒性アッセイにおけるＨＴ−２９ヒ
ト結腸直腸腺癌細胞に対して、本細胞毒性アッセイにおける毒素に対して著しく高い感受
性を示す細胞株の使用；および／またはその変異体毒素の残存する毒性を駆動している可
能性のあるグルコシル化以外の未知の活性もしくはプロセスに起因する可能性がある。
【０４６０】
実施例１７：遺伝子変異体毒素の細胞毒性の新規の機序
遺伝子変異体毒素の残存する細胞毒性の機序を調べるため、ＩＭＲ−９０細胞をｗｔ毒
素Ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）または遺伝子変異体毒素Ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）
で処理し、Ｒａｃ１  ＧＴＰアーゼのグルコシル化を処理の時間で試験した。試料を２４
時間から９６時間までにおいて収集し、細胞抽出物を調製した。グルコシル化されたＲａ
ｃ１をグルコシル化されていないＲａｃ１から、Ｒａｃ１に対する２種類の抗体を用いた
ウェスタンブロットにより識別する。一方の抗体はＲａｃ１の両方の形態を認識し（２３
Ａ８）、他方（１０２）はグルコシル化されていないＲａｃ１のみを認識する。図２２で
図説されるように、毒素Ｂに関して、総Ｒａｃ１レベルは時間が経過しても変化しないま
まであり、Ｒａｃ１の大部分はグルコシル化されていた。一方で遺伝子変異体毒素Ｂ（Ｓ
ＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）を用いた処理は結果として総Ｒａｃ１の有意な低減をもたらした
が、そのＲａｃ１は全ての時点においてグルコシル化されていなかった。これは、Ｒａｃ
１レベルは遺伝子変異体毒素を用いた処理により負の影響を受けるが、ｗｔ毒素によって
は影響を受けないことを示している。図２２で図説されるように、アクチンのレベルは示
した時点において毒素および遺伝子変異体毒素Ｂで処理した細胞において類似しており、
モック処理した細胞と類似していた。これは、その遺伝子変異体毒素は野生型毒素に駆動
されるグルコシル化経路とは異なる機序により細胞毒性を発揮することを示した。
【０４６１】
実施例１８：遺伝子変異体毒素の化学的処理
細胞毒性活性において４ｌｏｇの低減を示した遺伝学的に改変された変異体毒素は好ま
しいが、細胞毒性におけるさらなる低減（２〜４ｌｏｇ）が考えられた。２つの化学的不
活性化計画が評価されてきた。
【０４６２】
第１の方法は、その変異体毒素を不活性化するためにホルムアルデヒドおよびグリシン
を用いる。ホルムアルデヒドでの不活性化は、ホルムアルデヒドおよびそのタンパク質上
の第１級アミンの間でシッフ塩基（イミン）を形成することにより起こる。次いでそのシ
ッフ塩基はいくつかのアミノ酸残基（Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ
）と反応して分子内架橋または分子間架橋のどちらかを形成することができる。この架橋
はそのタンパク質の構造を固定させてそれを不活性にする。加えて、ホルムアルデヒドは
グリシンと反応してシッフ塩基を形成することができる。次いでそのグリシルシッフ塩基
はアミノ酸残基と反応して分子間タンパク質−グリシン架橋を形成することができる。ホ
ルムアルデヒドは、その遺伝子変異体毒素の細胞毒性活性を検出可能な限界より下まで低
減した（細胞毒性における低減は、三重変異体Ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）に関して８
ｌｏｇ１０より大きく、三重変異体Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）に関して６ｌｏｇ１０
より大きい）。しかし、そのホルムアルデヒドで不活性化された（ＦＩ）三重変異体毒素
を２５℃で保温した際に、時間の経過に伴い復帰が観察された。その細胞毒性の復帰は、
低量のホルムアルデヒド（０．０１〜０．０２％）をＦＩ−三重変異体毒素の保管溶液中
に添加することにより防ぐことができる。実施例２３参照。
【０４６３】
別の方法は、不活性化された変異体毒素を生成するために１−エチル−３−（３−ジメ
チルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨ
Ｓ）処理を用いる。この方法において、ＥＤＣ／ＮＨＳはタンパク質上のカルボキシル基
と反応して活性化されたエステルを形成する。次いでその活性化されたエステルはそのタ
ンパク質上の第１級アミンと反応して安定なアミド結合を形成することができる。ホルム
アルデヒド反応と同様に、この反応は結果として分子内および分子間架橋をもたらす。Ｅ
ＤＣ／ＮＨＳを用いた処理により形成されたアミド結合は、ホルマリン不活性化により形
成された不安定なイミン結合よりも安定であり、不可逆的である。活性化されたエステル
のそのポリペプチド上の第１級アミンとの反応により形成される架橋に加えて、グリシン
およびベータ−アラニン付加物の両方が形成され得る。機序または理論により束縛される
わけではないが、グリシンが未反応の活性化されたエステルを失活させるために添加され
る際、グリシン付加物が生成される。グリシンのアミンがそのポリペプチド上の活性化さ
れたエステルと反応して安定なアミド結合を形成する。機序または理論により束縛される
わけではないが、ベータ−アラニン付加物は活性化されたベータ−アラニンのそのポリペ
プチド上の第１級アミンとの反応により形成される。この反応は、結果として安定なアミ
ド結合をもたらす。活性化されたベータ−アラニンは、３モルのＮＨＳの１モルのＥＤＣ
との反応により生成される。
【０４６４】
細胞毒性活性の遺伝学的に改変された変異体毒素と比較して２〜４ｌｏｇ（天然の毒素
と比較して６〜８ｌｏｇ）の低減を達成するため、その化学的に不活性化された変異体毒
素は１０００μｇ／ｍＬ以上のＥＣ５０値を有するべきである。細胞毒性活性における低
減に加えて、ドットブロット分析により決定されるような重要なエピトープを保持するこ
とは好都合であろう。現在までに、細胞毒性の低減およびエピトープ認識基準の両方を満
たすいくつかの反応条件が同定されている。数バッチの不活性化された変異体毒素が動物
試験のために調製されており、少数の代表的なバッチからの分析データを表７Ａおよび７
Ｂ、表８Ａおよび８Ｂにおいて示す。
【０４６５】
【表１５】
2018052938.tif 000019
【０４６６】
【表１６】
2018052938.tif 000020
【０４６７】
【表１７】
2018052938.tif 000021
【０４６８】
【表１８】
2018052938.tif 000022
【０４６９】
実施例１９：精製
発酵の終了時に、発酵槽を冷却する。細胞のスラリーを連続遠心分離により回収し、適
切な緩衝液中で再懸濁する。細胞懸濁液の溶解は高圧ホモジナイゼーションにより達成さ
れる。変異体毒素Ａに関して、そのホモジネートを凝集させ（ｆｌｏｃｃｕｌａｔｅｄ）
、その凝集した溶液に対して連続遠心分離を行う。この溶液を濾過し、次いで下流の処理
のために移す。変異体毒素Ｂに関して、そのホモジネートを連続遠心分離により透明にし
、次いで下流の処理のために移す。
【０４７０】
変異体毒素Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）を２つのクロマトグラフィー工程を用いて精
製し、続いて最終緩衝液交換を行う。その透明になった溶解液を疎水性相互作用クロマト
グラフィー（ＨＩＣ）カラム上に装填し、結合した変異体毒素をクエン酸ナトリウム勾配
を用いて溶離する。次いでそのＨＩＣカラムからの生成物のプールを陽イオン交換（ＣＥ
Ｘ）カラム上にロードし、結合した変異体毒素Ａを塩化ナトリウム勾配を用いて溶離する
。精製された変異体毒素Ａを含有するＣＥＸのプールを、透析濾過により最終緩衝液中に
交換する（ｅｘｃｈａｎｇｅｄ  ｉｎｔｏ）。その精製された変異体毒素Ａを、透析濾過
により最終原薬中間緩衝液中に交換する。透析濾過の後、保持液（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）
を０．２ミクロンフィルターを通して濾過した後、化学的に不活性化して最終的な原薬と
する。そのタンパク質濃度は１〜３ｍｇ／ｍＬを目標とする。
【０４７１】
変異体毒素Ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）を２つのクロマトグラフィー工程を用いて精
製し、続いて最終緩衝液交換を行う。その透明になった溶解液を陰イオン交換（ＡＥＸ）
カラム上に装填し、結合した変異体毒素を塩化ナトリウム勾配を用いて溶離する。ＡＥＸ
カラムからの生成物のプールにクエン酸ナトリウムを添加し、疎水性相互作用クロマトグ
ラフィー（ＨＩＣ）カラム上に装填する。結合した変異体毒素をクエン酸ナトリウム勾配
を用いて溶離する。精製された変異体毒素ポリペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）を含
有するＨＩＣのプールを、透析濾過により最終緩衝液中に交換する。その精製された変異
体毒素Ｂを、透析濾過により最終原薬中間緩衝液中に交換する。透析濾過の後、保持液を
０．２ミクロンフィルターを通して濾過した後、化学的に不活性化して最終的な原薬とす
る。そのタンパク質濃度は１〜３ｍｇ／ｍＬを目標とする。
【０４７２】
実施例２０：ホルムアルデヒド／グリシン不活性化
精製後、その遺伝子変異体毒素ＡおよびＢ（それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４および６
）を４０ｍＭ（１．２ｍｇ／ｍｌ）のホルムアルデヒドを用いて２５℃で４８時間不活性
化する。その不活性化は、４０ｍＭ（３ｍｇ／ｍｌ）グリシンを含有する１０ｍＭホスフ
ェート、１５０ｍＭ塩化ナトリウム緩衝液中でｐＨ７．０±０．５で実施される。その不
活性化の期間は、ＩＭＲ９０細胞でのＥＣ５０における１０００ｕｇ／ｍＬより大きい濃
度までの低減に必要な期間の３倍を超えるように設定される。４８時間後、その生物学的
活性は天然の毒素と比較して７〜８ｌｏｇ１０低減される。４８時間の保温の後、その不
活性化された変異体毒素を透析濾過により最終原薬緩衝液中に交換する。例えば、１００
ｋＤ再生セルロースアセテート限外濾過カセットを用いて、その不活性化された毒素を１
〜２ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、緩衝液交換する。
【０４７３】
実施例２１：Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド（Ｅ
ＤＣ）／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）不活性化
精製後、その遺伝子変異体毒素（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：
６）を、１ｍｇの精製された遺伝子変異体毒素ＡおよびＢ（それぞれおおよそ２．６ｍＭ
および４．４ｍＭ）あたり０．５ｍｇのＥＤＣおよび０．５ｍｇのＮＨＳを用いて２５℃
で２時間不活性化する。その反応を１００ｍＭの終濃度までのグリシンの添加により停止
し、反応物を２５℃でさらに２時間保温する。その不活性化は、１０ｍＭホスフェート、
１５０ｍＭ塩化ナトリウム緩衝液中でｐＨ７．０±０．５で実施される。その不活性化の
期間は、ＩＭＲ９０細胞でのＥＣ５０における１０００ｕｇ／ｍＬより大きい濃度までの
低減に必要な期間の３倍を超えるように設定される。２時間後、その生物学的活性は天然
の毒素と比較して７〜８ｌｏｇ１０低減される。４時間の保温の後、その不活性化された
変異体毒素を透析濾過により最終原薬緩衝液中に交換する。例えば、１００ｋＤ再生セル
ロースアセテート限外濾過カセットを用いて、その不活性化された毒素を１〜２ｍｇ／ｍ
Ｌまで濃縮し、緩衝液交換する。
【０４７４】
別途記載しない限り、以下の用語は、実施例の節において用いられる際、実施例２１に
おける本記述に従って生成された組成物を指す：“ＥＤＣ／ＮＨＳで処理された三重変異
体”；“ＥＤＣで不活性化された変異体毒素”；“変異体毒素［Ａ／Ｂ］原薬”；“ＥＩ
−変異体毒素”；“ＥＤＣ／ＮＨＳ−三重変異体毒素”。例えば、以下の用語は同義であ
る：“ＥＤＣ／ＮＨＳで処理された三重変異体毒素Ａ”；“ＥＤＣで不活性化された変異
体毒素Ａ”；“変異体毒素Ａ原薬”；“ＥＩ−変異体毒素Ａ”；“ＥＤＣ／ＮＨＳ−三重
変異体毒素Ａ”。別の例として、以下の用語は同義である：“ＥＤＣ／ＮＨＳで処理され
た三重変異体毒素Ｂ”；“ＥＤＣで不活性化された変異体毒素Ｂ”；“変異体毒素Ｂ原薬
”；“ＥＩ−変異体毒素Ｂ”；“ＥＤＣ／ＮＨＳ−三重変異体毒素Ｂ”。
【０４７５】
変異体毒素Ａ原薬および変異体毒素Ｂ原薬は、それぞれバッチプロセスを用いて製造さ
れ、それには以下の工程が含まれる：（１）それぞれの遺伝子三重変異体毒素ポリペプチ
ドをコードするプラスミドを含有する毒素陰性Ｃ．ディフィシル株（ＶＰＩ  １１１８６
）の（大豆加水分解物、酵母抽出物ＨＴ  ＹＥＳＴ（商標）４１２（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ
Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、グルコース、およびチアンフェニコール中での）発酵、（２
）その遺伝子変異体毒素（“原薬中間体”）の、無細胞溶解物からの、イオン交換および
疎水性相互作用クロマトグラフィー手順を用いた、少なくとも９５％より大きい純度まで
の精製、（３）ＥＤＣ／ＮＨＳを用いた処理、続いてグリシンを用いた失活／キャッピン
グによる化学的不活性化、ならびに（４）最終緩衝液マトリックス中への交換。
【０４７６】
実施例２２：不活性化および配合の条件を支持する研究
遺伝子変異体毒素の化学的不活性化を最適化するため、統計学的実験計画（ＤＯＥ）を
実施した。ＤＯＥにおいて調べられた要素には、温度、ホルムアルデヒド／グリシンの濃
度、ＥＤＣ／ＮＨＳの濃度および時間が含まれていた（表９および１０）。生物学的活性
の喪失を監視するため、ＩＭＲ９０細胞におけるＥＣ５０値を決定した。加えて、処理後
の様々な時点におけるＩＭＲ−９０細胞の細胞形態も観察した。処理後７２時間における
形態を示す図９を参照。タンパク質構造への作用を決定するため、その毒素の異なるドメ
インに対して産生させたモノクローナル抗体の一団（ｐａｎｅｌ）を用いるドットブロッ
ト分析を用いてエピトープ認識を監視した。
【０４７７】
【表１９】
2018052938.tif 000023
【０４７８】
【表２０】
2018052938.tif 000024
【０４７９】
Ｃ．ディフィシル変異体毒素のホルムアルデヒド／グリシン不活性化において、最終的
な反応条件は、細胞毒性活性における所望のレベルの低減（７〜８ｌｏｇ１０）が達成さ
れる一方でエピトープ認識を最大化するように選択された。上記の実施例２０を参照。
【０４８０】
Ｃ．ディフィシル変異体毒素のＥＤＣ／ＮＨＳ不活性化において、最終的な反応条件は
、細胞毒性活性における所望のレベルの低減（７〜８ｌｏｇ１０）が達成される一方でエ
ピトープ認識を最大化するように選択された。上記の実施例２１を参照。
【０４８１】
代わりの態様において、そのＥＤＣ−ＮＨＳ反応はアラニンの添加により停止され、そ
れはその反応を十分に停止する。アラニンの使用は結果として、その反応をグリシンによ
り停止した場合の修飾に類似した変異体毒素タンパク質上の修飾をもたらし得る。例えば
、アラニンを添加することによる停止は、結果としてその変異体毒素のグルタミン酸およ
び／またはアスパラギン酸残基の側鎖上のアラニン部分をもたらす可能性がある。別の代
わりの態様において、そのＥＤＣ−ＮＨＳ反応はグリシンメチルエステルの添加により停
止され、それはその反応を十分に停止する。
【０４８２】
最適な条件下での化学的に不活性な三重変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ａおよび毒素Ｂの
生成は、結果として残存する細胞毒性の検出不能なレベル（＞１０００μｇ／ｍＬ−ＣＰ
Ｅアッセイにより試験される最も高い濃度）までのさらなる低減をもたらしたが、毒素特
異的中和抗体へのそれらの反応性により測定されるように、抗原性を維持している。表２
８において示される結果は、ｗｔ毒素からＥＤＣ／ＮＨＳで処理された三重変異体毒素ま
で通した細胞毒性における段階的な低減を実証している。免疫蛍光標識は三重変異体毒素
（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４および６）および変異体毒素原薬がＩＭＲ−９０細胞に対する
比較可能な結合を示すことを確証し、これはその細胞毒性の喪失がその細胞への低減した
結合によるものではなかったことを示唆している（データは示していない）。変異体毒素
Ａ原薬と比較して、変異体毒素Ｂ原薬は細胞毒性においてより高い倍率の低減を達成し、
それは観察されたＴｃｄＡと比較したＴｃｄＢの約６００倍高い作用強度と一致している
。
【０４８３】
【表２１】
2018052938.tif 000025
【０４８４】
ＥＤＣのみにより、またはＥＤＣおよびスルホ−ＮＨＳにより修飾された変異体毒素Ｂ
に関する細胞毒性アッセイの結果も評価した。表２９参照。
【０４８５】
【表２２】
2018052938.tif 000026
【０４８６】
条件：三重変異体毒素Ｂ（“ＴＭ  ＴｃｄＢ”）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）を、変異
体毒素Ｂ：ＥＤＣ：スルホ−ＮＨＳ＝１：０．５：０．９４の重量比で修飾した。この比
率は、実施例２１で記述されたような標準的なＥＤＣ／ＮＨＳ反応とモル的に均等である
（スルホ−ＮＨＳのより高いＭＷに関して補正した）。スルホ−ＮＨＳの作用を決定する
ため、そのスルホ−ＮＨＳの比率を標準的な比率の０．５倍から２倍まで変動させた。１
×ＰＢＳ  ｐＨ７．０中で２５℃において２通りの反応を実施し、ＥＤＣ溶液の添加によ
り開始した。２時間後、反応を１ＭグリシンｐＨ７．０（終濃度０．１Ｍ）の添加により
停止し、さらに２時間保温した。停止した反応物を脱塩し、変異体毒素Ｂ原薬（“ＴＭ  
ＴｃｄＢ−ＥＤＣ”）をＶｉｖａｓｐｉｎ  ２０装置を用いて濃縮し、無菌のバイアル中
に濾過滅菌し、それを用いて細胞毒性アッセイにおける評価を行った。
【０４８７】
同じモル比において、スルホ−ＮＨＳはＥＣ５０をＮＨＳに関する＞１０００ｕｇ／ｍ
Ｌと比較して約２５０ｕｇ／ｍＬまで低減した。２倍のモル比においてさえも、スルホ−
ＮＨＳは細胞毒性の低下においてＮＨＳほど有効ではないようであった。表３０参照。
【０４８８】
【表２３】
2018052938.tif 000027
【０４８９】
修飾の数およびタイプを決定するため、ＥＤＣ／ＮＨＳおよびＥＤＣ／スルホ−ＮＨＳ
で不活性化された三重変異体毒素Ｂ試料の両方に対してペプチドマッピングを実施した。
両方の試料において類似の量のグリシン付加物、架橋およびデヒドロアラニン修飾が観察
された。しかし、スルホ−ＮＨＳ試料ではベータ−アラニンは観察されなかった。
【０４９０】
野生型毒素Ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を、標準的なプロトコル（実施例２１参照）
を用いて不活性化し；毒素Ｂ：ＥＤＣ：ＮＨＳ  １：０．５：０．５、１×ＰＢＳ  ｐＨ
７．０中で２５℃において２時間、次いで１Ｍグリシン（終濃度０．１Ｍ）により停止し
、さらに２時間保温した。その試料を脱塩し、濃縮し、それを用いて細胞毒性アッセイを
行った。この試料に関するＥＣ５０は２４４ｎｇ／ｍＬ未満であった。
【０４９１】
実施例２３：復帰試験
ホルムアルデヒド／グリシンまたはＥＤＣ／ＮＨＳで不活性化されたＣ．ディフィシル
変異体毒素のどちらかに関して復帰が起こるかどうかを決定するため、不活性化された変
異体毒素の試料（１ｍｇ／ｍＬ）を２５℃で５〜６週間保温した。分割量（Ａｌｉｑｕｏ
ｔｓ）を毎週取り出し、ＩＭＲ９０細胞におけるＥＣ５０値を決定した。１つのホルムア
ルデヒド／グリシンで不活性化された試料はホルムアルデヒドを含有せず、１つの試料は
０．０１％ホルムアルデヒドを含有していた。ＥＣ５０をＣＰＥアッセイにより測定した
。
【０４９２】
【表２４】
2018052938.tif 000028
【０４９３】
２５℃において、残留するホルムアルデヒドの非存在下では、部分的な復帰が観察され
る（表１１）。５週間後、その細胞毒性活性はおおよそ３倍まで増大した。その細胞毒性
活性は増大したが、５週間後、なお天然の毒素と比較して７ｌｏｇ１０の低減があった。
復帰はホルマリンを０．０１０％の濃度で含ませることにより完全に防がれた。ＥＤＣ／
ＮＨＳで不活性化された試料では復帰は観察されなかった。ＥＤＣ／ＮＨＳで処理された
三重変異体毒素Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）およびＥＤＣ／ＮＨＳで処理された三重変
異体毒素Ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）の両方の４つのロット全てに関して、その６週間
の保温全体を通してＥＣ５０値は＞１０００μｇ／ｍＬの出発レベルに留まっていた。対
照的に、ＦＩで処理された三重変異体毒素Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）およびＦＩで処
理された三重変異体毒素Ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）のＥＣ５０値は安定せず、許容で
きないほど低いＥＣ５０値まで低下し、これは細胞毒性における増大または不活性化の復
帰を示している。表１１参照。
【０４９４】
細胞毒性を検出不能なレベル（ＣＰＥアッセイにより測定した際に＞１０００μｇ／ｍ
Ｌ）まで安定して低減することに加えて、ＥＤＣ／ＮＨＳを用いて不活性化された変異体
毒素は毒素中和性ｍＡｂの標的である重要なエピトープを保持していた。表３１参照。Ｆ
Ｉ変異体毒素は同じ抗原決定基の喪失を示した。
【０４９５】
【表２５】
2018052938.tif 000029
【０４９６】
実施例２４：前臨床免疫原性試験
重要な前臨床目標には、Ｃ．ディフィシル変異体毒素ＡおよびＢが含まれる組成物を小
動物および非ヒト霊長類（ＮＨＰ）において試験することが含まれる。マウスおよびハム
スターを、とりわけそのＣ．ディフィシル組成物がその変異体毒素ＡおよびＢに対する中
和抗体を引き出すことができるかどうかを決定するために免疫した。その抗原を、マウス
、ハムスター、およびカニクイザル・マカクにおける一連の免疫処置の後、血清中和抗体
応答の誘導に関して試験した。遺伝子変異体毒素および／または化学的に不活性化された
変異体毒素を、中性緩衝液、リン酸アルミニウム緩衝液、または一部の態様においてＩＳ
ＣＯＭＡＴＲＩＸをアジュバントとして含有する緩衝液中で配合した。中和抗体応答は一
般に、それぞれの追加免疫または最終投与の約２〜４週間後に試験された。
【０４９７】
その毒素中和アッセイは抗血清のＣ．ディフィシルＴｃｄＡまたはＴｃｄＢにより媒介
される細胞毒性作用を中和する能力を実証し、従って試料中に存在する抗体の機能活性を
測定することができる。毒素中和アッセイを、ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢの両方に感受性で
あるヒト肺線維芽細胞株のＩＭＲ−９０に対して実施した。簡潔には、９６ウェルマイク
ロタイタープレートに、毒素に媒介される細胞毒性の標的の役目を果たすＩＭＲ−９０細
胞を蒔いた。それぞれの試験血清試料を、ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢを中和する能力に関し
て別々に分析した。試験抗血清の適切な系列希釈物を一定濃度のＴｃｄＡまたはＴｃｄＢ
と混合し、加湿した恒温器（３７℃／５％ＣＯ２）中で３７℃において９０分間保温して
その毒素の中和を起こさせた。品質管理のため、全てのプレートには既知の力価の抗毒素
抗体が含まれる参照標準および対照が含まれていた。９０分後、その毒素−抗血清混合物
をＩＭＲ−９０細胞の単層に添加し、そのプレートをさらに７２時間保温した。続いて、
代謝的に活性な細胞中に存在するアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）レベルを決定するために
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）基質をそのアッセイプレートに添加し、それを
相対光単位（ＲＬＵ）として測定した。大きいＡＴＰレベルは高い細胞生存度を示し、レ
ベルはその試料中に存在する抗体によるその毒素の中和の量に正比例する。前臨床データ
に関して、そのＲＬＵデータをその試験抗血清試料の希釈値に対してプロットして４パラ
メーターロジスティック（４−ＰＬ）回帰反応当てはめ曲線を生成した。その中和力価を
、細胞毒性における５０％の低減を示す試料希釈値として表した。
【０４９８】
実施例２５：マウス免疫原性試験：ｍｕＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ２０１０−０６
この試験の目的は、それぞれが異なる方法により化学的に不活性化された変異体Ｃ．デ
ィフィシル毒素Ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）の２種類の形態の免疫原性を評価すること
であった。この試験において、未処理の変異体毒素Ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）（遺伝
学的に不活性化されているが化学的に不活性化されていない）を、アジュバントと共に、
またはアジュバントなしで、対照として用いた。
【０４９９】
１０匹のマウスの群を、１０μｇの表１２に従う免疫原を用いて筋内に免疫した。
【０５００】
【表２６】
2018052938.tif 000030
【０５０１】
結果：そのマウスにおいて、そのワクチン候補のそれぞれの投与後に有害事象はなかっ
た。図１０で図説されるように、それぞれの群中のマウスはそれぞれの変異体毒素の３回
目の投与の後に著しい強い抗毒素Ｂ中和抗体を発現した。
【０５０２】
１２週目の力価に基づいて、マウスにおいてＥＤＣで不活性化された変異体毒素Ｂ（群
２）およびホルマリンで不活性化された変異体毒素（群１）は強力な中和応答を生じさせ
たようである。
【０５０３】
化学的不活性化の非存在下では、その遺伝子変異体毒素Ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）
は２回の投与後に中和応答を生じさせ（群３〜４、８週目）、それは３回目の投与後にブ
ーストされた（群３〜４、１２週目）。
【０５０４】
実施例２６：マウス免疫原性試験：ｍｕＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ２０１０−０７：
この試験の目的は、化学的に不活性化されたＣ．ディフィシル変異体毒素ＡおよびＢ（
それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４および６）の、単独または組み合わせのどちらかでの免
疫原性を評価することであった。全ての群に関して、免疫原はリン酸アルミニウムをアジ
ュバントとして用いて配合された。
【０５０５】
５匹のマウスの群を、１０μｇの表１３に従う免疫原を用いて筋内に免疫した。
【０５０６】
【表２７】
2018052938.tif 000031
【０５０７】
結果：そのマウスにおいて、そのワクチン候補のそれぞれの投与後に有害事象はなかっ
た。図１１で図説されるように、化学的に不活性化された遺伝子変異体毒素の２回の投与
後に、抗毒素Ａ中和抗体（群３〜５）は３〜４ｌｏｇ１０の力価までブーストされ、一方
で抗毒素Ｂ中和抗体（群１〜２、５）は低〜検出不能のままであり、それは上記で記述さ
れたマウス試験からのデータ（図１０）と一致している。抗毒素Ｂ中和抗体は群１、２、
および５において３回目の投与後に２〜３ｌｏｇ１０までブーストされ（１２週目の力価
）、４回目の投与の２週間後にそれらのピークに達した（１４週目の力価）。群３〜５に
おける抗毒素Ａ中和抗体の力価は３回目（１２週目の力価）および４回目の免疫処置（１
４週目の力価）後にわずかに増大した。
【０５０８】
実施例２７：ハムスター免疫原性試験：ｈａｍＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ２０１０−０２
：
この試験の目的は、Ｃ．ディフィシル三重変異体および化学的に不活性化された変異体
毒素ＡおよびＢの免疫原性および保護能力をシリアンゴールデンハムスターモデルにおい
て評価することであった。シリアンゴールデンハムスターモデルは、ヒトのＣＤＡＤを模
擬実験するための最高の利用可能な負荷モデルである。マウス試験ｍｕＣ．ｄｉｆｆｉｃ
ｉｌｅ２０１０−０７において用いられたバッチと同じバッチの変異体毒素ＡおよびＢを
、この試験において用いた。対照として、１つの群にアルミニウム含有アジュバントなし
で変異体毒素を与えた。
【０５０９】
５匹のシリアンゴールデンハムスターの群を、１０μｇの表１４に従う免疫原を用いて
筋内に免疫した。
【０５１０】
【表２８】
2018052938.tif 000032
【０５１１】
結果：その変異体毒素による免疫処置後に有害事象は観察されなかった。図１２で図説
されるように、変異体毒素の１回投与後、抗毒素Ａ中和応答はホルマリンで不活性化され
た変異体毒素（群１〜２）に関して２〜３ｌｏｇ１０であり、ＥＤＣで不活性化された変
異体毒素（群３）に関して３〜４ｌｏｇ１０であった。２回目の投与後、３つの群全てに
おいて抗毒素Ａ抗体がブーストされた。３つの群全てにおいて抗毒素Ａ抗体は３回目の投
与後には増大したように見えなかった。類似の結果が４回目の免疫処置後に観察され、こ
こで力価における増大はアルミニウムアジュバントを含有しないホルマリンで不活性化さ
れた群（群２）において観察された。
【０５１２】
抗毒素Ｂ中和応答は、１回投与後はホルマリンで不活性化された変異体毒素の群（群１
〜２）では検出不能であり、ＥＤＣで不活性化された変異体毒素（群３）に関しては２ｌ
ｏｇ１０をちょうど超えていた。２回目の投与後、２個のホルマリンで不活性化された群
（群１〜２）における抗毒素Ｂ中和抗体力価は３〜４ｌｏｇ１０まで増大し、一方でＥＤ
Ｃで不活性化された群（群３）における抗毒素Ｂ中和抗体力価は４〜５ｌｏｇ１０まで増
大した。３つの群全てに関して、３回目および／または４回目の投与後に抗毒素Ｂ中和抗
体力価における増大が観察され、全ての群が１６週目（最後の投与後）にピーク力価に達
した。図１２参照。
【０５１３】
図１３において、化学的に不活性化された遺伝子変異体毒素に対する中和抗体応答のレ
ベル（図１２）を、Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎ
ｃ．（カリフォルニア州キャンベル）（本明細書において“Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏ”または“
Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ”とも呼ばれる）のトキソイド（すなわち、Ｌｉｓｔ
Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入したトキソイドを野生型毒
素のホルマリン不活性化により調製した；ハムスター負荷モデルを確立するために用いら
れた対照試薬）により引き出された中和抗体応答のレベルと比較した。
【０５１４】
本明細書で用いられる際、図および表中の“ＦＩ”は、別途記載しない限りその毒素の
２５℃において２日間のホルマリン／グリシン処理を指す。本明細書で用いられる際、図
および表中の“ＥＩ”は、別途記載しない限り３０℃において４時間のＥＤＣ／ＮＨＳ処
理を指す。図１３において、５匹のハムスター動物をそれぞれの変異体毒素組成物で処置
し、一方で１１匹のハムスター動物をＬｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入したトキ
ソイドで処置した。
【０５１５】
図１３におけるデータは、表１４に従って投与されたハムスターにおいて、ＥＤＣで不
活性化された変異体毒素が含まれる免疫原性組成物により誘導された、２回投与後の毒素
Ａ（図１３Ａ）および毒素Ｂ（図１３Ｂ）に対するそれぞれの中和抗体力価は、Ｌｉｓｔ
Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌのトキソイドにより引き出されたそれぞれの中和抗体力価よりも
高いことを示している。
【０５１６】
実施例２８：ハムスター免疫原性試験：Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｈａｍ２０１０−０
２（続き）
変異体毒素の保護的有効性を評価するため、免疫したハムスターに、免疫しなかった動
物の１つの対照群と共に、まず正常な腸内細菌叢を崩壊させるためにクリンダマイシン抗
生物質の経口用量（３０ｍｇ／ｋｇ）を与えた。５日後、そのハムスターに野生型Ｃ．デ
ィフィシルの芽胞（６３０株、動物あたり１００ｃｆｕ）の経口用量で負荷を与えた。動
物を負荷後１１日間毎日ＣＤＡＤの徴候に関して監視し、それはハムスターでは濡れた尻
尾（ｗｅｔ  ｔａｉｌ）として知られている。いくつかの異なるパラメーターを臨床的に
採点するシステムを用いて、重症のＣＤＡＤを有すると決定された動物を安楽死させた。
そのパラメーターには、刺激後の活動性、脱水症状、排泄物、温度、および体重等が含ま
れており、それらは当該技術で既知である。
【０５１７】
１１日目において、その試験を終了し、全ての生存している動物を安楽死させた。図１
４は、免疫しなかった対照と比較した、３つの免疫した群（群１〜３、表１４に従う）の
それぞれに関する生存曲線を示す。見て分かるように、免疫しなかった動物は全て重症の
ＣＤＡＤを発現し、負荷後１〜３日目に安楽死を必要とした（０％生存）。ホルマリンで
不活性化された変異体毒素を投与された両方の群は６０％生存曲線を有し、動物は３日目
（群１）または４日目（群２）まで安楽死を必要としなかった。ＥＤＣで不活性化された
変異体毒素を投与された群は８０％生存曲線を有し、（５匹中の）１匹の動物が７日目に
安楽死を必要とした。従って、そのハムスターはＣ．ディフィシルの芽胞による致死的負
荷から保護された。
【０５１８】
実施例２９：ハムスター免疫原性試験：ｈａｍＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ２０１０−０３
：遺伝子的および化学的に不活性化されたＣ．ディフィシル変異体毒素の免疫原性
この試験の目的は、アジュバントを加えないＣ．ディフィシル三重変異体および化学的
に不活性化された変異体毒素ＡおよびＢ（それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４および６）の
免疫原性をシリアンゴールデンハムスターモデルにおいて評価することであった。マウス
試験ｍｕＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ２０１０−０７において用いられたバッチと同じバッチ
の変異体毒素ＡおよびＢ（それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４および６）を、この試験にお
いて用いた。対照として、１つの群（群１）にリン酸緩衝生理食塩水をプラセボとして与
えた。
【０５１９】
５または１０匹のシリアンゴールデンハムスターの群を、表１５に従う免疫原を用いて
免疫した。動物は３回の投与を受けた。加えて、動物は２週ごとに投与された。
【０５２０】
【表２９】
2018052938.tif 000033
【０５２１】
結果：図１５参照。プラセボ対照群では抗毒素ＡまたはＢ抗体は観察されなかった。１
回投与後、抗毒素Ａ中和抗体がホルマリンで不活性化された群（群２）および遺伝子変異
体毒素群（群４）に関して２〜３ｌｏｇ１０で、ＥＤＣで不活性化された群（群３）に関
して３〜４ｌｏｇ１０で観察された。抗毒素Ａ中和抗体は、これらの群（２〜４）のそれ
ぞれにおいて関連する変異体毒素による２回目の免疫処置後に増大した（図１５における
２週目の力価を３週目の力価と比較）。変異体毒素の３回目の投与（４週目に与えられた
）後、群２〜４における抗毒素Ａ中和抗体力価はそれらの４週目の力価と比較して増大し
た。
【０５２２】
抗毒素Ｂ中和抗体は２回目の投与後に検出可能であり、ここでホルマリンで不活性化さ
れた（群２）およびＥＤＣで不活性化された（群３）抗毒素Ｂ中和抗体は３〜４ｌｏｇ１
０まで増大し、遺伝子三重変異体（群４）に関して２〜３ｌｏｇ１０まで増大した。３回
目の免疫処置（４週目）後、その抗毒素Ｂ中和抗体力価はホルマリンで不活性化された変
異体毒素（群２）および遺伝子変異体毒素（群４）に関して３〜４ｌｏｇ１０、ＥＤＣで
不活性化された変異体毒素（群３）に関して４〜５ｌｏｇ１０までブーストされた。
【０５２３】
抗毒素Ａおよび抗毒素Ｂ中和抗体の両方に関して、ピーク力価は全てのワクチン接種さ
れた群（群２〜４）に関して６週目（３回目の投与後）に観察された。
Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ／ＣｐＧまたはＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸで抗原性補強した免疫原性
組成物の評価
Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ、またはＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ／ＣｐＧ
２４５５５（Ａｌｈ／ＣｐＧ）と共に配合された化学的に不活性化された変異体毒素が含
まれる免疫原性組成物で免疫されたハムスターは、強い中和性抗毒素抗血清を発現した。
ピークの抗毒素Ａおよび抗毒素Ｂ応答は、Ａｌｈ／ＣｐＧまたはＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ中
で配合された変異体毒素で免疫された群において、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌのみと共に配合
されたワクチンと比較した場合に２〜３倍高く、統計的に有意であった。５０％中和力価
を示す表３２を参照。ハムスター（ｎ＝１０／群）を、０、２、および４週目に、１００
μｇのＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ、または２００μｇのＣｐＧ２４５５５＋１００μｇのＡｌ
ｈｙｄｒｏｇｅｌ、または１０ＵのＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸと共に配合された各１０μｇの
変異体毒素Ａ原薬および変異体毒素Ｂ原薬を用いてＩＭで免疫した。それぞれの時点にお
いて血清を収集し、機能的抗毒素活性に関して毒素中和アッセイで分析した。幾何平均力
価を表３２において提供する。アスタリスク（＊）は、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ群における
力価と比較した場合の統計的有意性（ｐ＜０．０５）を示す。
【０５２４】
【表３０】
2018052938.tif 000034
【０５２５】
これらのアジュバントと共に配合された変異体毒素原薬が含まれる免疫原性組成物の保
護的有効性を試験した。ハムスターを免疫し、経口クリンダマイシン（３０ｍｇ／ｋｇ）
を５週目に与え、上記で記述された方法に従って負荷を与えた。免疫されないハムスター
の１つの群（ｎ＝５）が対照として含まれた。Ａｌｈ／ＣｐＧまたはＩＳＣＯＭＡＴＲＩ
Ｘのどちらかで抗原性補強された変異体毒素原薬で免疫されたハムスター（１００％生存
）において、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌのみ（７０％生存）と比較して増大した有効性が観察
された。従って、そのハムスターはＣ．ディフィシルの芽胞による致死的負荷から保護さ
れた。
【０５２６】
実施例３０：カニクイザル・マカクにおけるクロストリジウム・ディフィシルワクチン
接種
この試験の目的は、低および高用量のＥＤＣで不活性化された、およびホルマリンで不
活性化されたＣ．ディフィシル変異体毒素のカニクイザル・マカクにおける免疫原性を試
験することであった。抗原性補強されない対照の役目を果たす１つの群（群５）を除いて
、全ての変異体毒素をアジュバントとしてのＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）中で配合
した。
【０５２７】
【表３１】
2018052938.tif 000035
【０５２８】
結果：図１６は、０、２、３、４、６、８、および１２週目におけるこれらの動物にお
ける抗毒素中和抗体応答を示す。抗毒素Ａ力価は５つの群全てに関して１回投与後に２〜
３ｌｏｇ１０であった（２週目の力価）。これらの力価は、それぞれの群に関してそれぞ
れのそれに続く投与の後にブーストされた。これらの動物において、３および４週目の間
に力価の低下はなかった。全ての群に関して、ピーク力価は４〜５ｌｏｇ１０であった。
全ての時点において、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸアジュバントなしの群（群５）は最も低い力
価を有し、これは免疫応答のブーストにおけるＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸの有用性を示してい
る。アジュバントなしの対照群（群５）は１２週目にピーク力価に達し、高用量のＥＤＣ
で不活性化された変異体毒素で免疫された群（群４）も同様であり；全ての他の群は最後
の投与の２週間後である６週目にピーク力価に達した。全ての群における力価は２回目の
投与後にブーストされた（３週目の時点）。抗毒素Ａ応答と同様に、抗毒素Ｂ応答は３週
目から４週目までで低下しなかった。３回目の投与後（６週目の時点）、全ての群におけ
る抗毒素Ｂ中和抗体力価は、低用量のホルマリンで不活性化された群（群１）および高用
量のＥＤＣで不活性化された群（群４）（その両方がちょうど４ｌｏｇ１０より大きい力
価を有していた）を除き、３〜４ｌｏｇ１０であった。ピーク力価は、８週目にピーク力
価を有していた低用量のＥＤＣで不活性化された群（群３）を除き、全ての群に関して１
２週目に観察された。全ての群が４ｌｏｇ１０より大きいピーク力価を有していた。
【０５２９】
実施例３１：モノクローナル抗体の生成
毒素ＡおよびＢは多くの構造的相同性を共有しているが、その抗体の中和活性は毒素特
異的であることが分かった。この発明において、個々の毒素に特異的であり、様々なエピ
トープおよび機能ドメインに向けられ、そして天然の毒素に対して高い親和性および強力
な中和活性を有するいくつかの抗体が同定された。毒素ＡおよびＢ  ｍＡｂを生成するた
め、商業的に入手可能なホルマリンで不活性化された（ＦＩ）変異体毒素またはその触媒
部位中に特異的な変異を導入することにより非毒性にされた組み換えホロ変異体毒素（Ｓ
ＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４および６）のどちらかで免疫されたマウスからそれぞれ抗体を単離
した。その抗体のエピトープマッピングは、毒素Ａに対するｍＡｂの大部分（５２種類の
内の４９種類）はその毒素の非触媒性Ｃ末端ドメインに向けられていることを示した。
【０５３０】
毒素Ｂに対するモノクローナル抗体は、そのタンパク質の３個のドメインを標的として
いた。合計１７種類の毒素Ｂ特異的ｍＡｂの内で、６種類はＮ末端（例えば６３０のよう
な野生型Ｃ．ディフィシルのＴｃｄＢのアミノ酸１〜５４３）に、６種類はＣ末端（例え
ば６３０のような野生型Ｃ．ディフィシルのＴｃｄＢのアミノ酸１８３４〜２３６６）に
、そして５種類は中央の移行ドメイン（例えば６３０のような野生型Ｃ．ディフィシルの
ＴｃｄＢのアミノ酸７９９〜１８３３）に特異的であった。従って、変異体Ｃ．ディフィ
シル毒素（例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４および６）を免疫抗原として用いるアプローチ
は、その変異体毒素の抗原構造に悪影響を及ぼす傾向があるホルマリン不活性化プロセス
と比較して、全てではないとしてもほとんどの抗原エピトープを提示する重要な利点を与
える。
【０５３１】
実施例３２：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６のアミノ酸配列を有する可変軽鎖およびＳＥＱ
ＩＤ  ＮＯ：３７のアミノ酸配列を有する可変重鎖が含まれる毒素Ａ  ｍＡｂ  Ａ３−
２５の特性付け。
【０５３２】
ｍＡｂ  Ａ３−２５は、この抗体は一般的に利用可能なＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡに
関するアイソタイプ判別キットを用いてその免疫グロブリン（Ｉｇ）アイソタイプを明ら
かにする全ての試みを拒絶したため、特に興味深かった。Ｉｇ  Ｈ鎖特異的抗血清を用い
たウェスタンブロットによるさらなる分析は、Ａ３−２５がＩｇＥアイソタイプのもので
あることを示し、これはｍＡｂ生成において稀な出来事であった。これはＡ３−２５のハ
イブリドーマ細胞から単離されたｍＲＮＡのヌクレオチド配列決定によりさらに確証され
た。Ａ３−２５のＨおよびＬ鎖の可変領域のヌクレオチド配列から推定されたアミノ酸配
列が図１７において示されている。
【０５３３】
Ａ３−２５  ｍＡｂをＣ．ディフィシル感染および疾患に関する動物モデルにおいてさ
らに評価するため、公開された方法に従うそのεＨ鎖の可変領域のマウスγ重鎖上への分
子移植（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｒａｆｔｉｎｇ）により、そのＩｇアイソタイプをマウ
スＩｇＧ１に変更した。
【０５３４】
実施例３３：毒素特異的抗体の中和能力およびエピトープマッピング
さらに、機能性／中和抗体を同定する試みにおいて、全てのモノクローナル抗体を、標
準的な細胞変性作用（ＣＰＥ）アッセイにおいて、または細胞生存度の指標としてのＡＴ
Ｐの測定に基づくよりストリンジェント且つ定量的なアッセイにおいて、野生型毒素を中
和する能力に関して評価した。
【０５３５】
合計５２種類の毒素Ａ特異的抗体の内で、４種類のｍＡｂ（Ａ３−２５、Ａ６５−３３
、Ａ６０−２２およびＡ８０−２９）（表１７および図１８）は様々なレベルの中和活性
を示した。その抗体のエピトープをマッピングするため、ＢｉａＣｏｒｅ競合結合アッセ
イおよび血球凝集阻止（ＨＩ）アッセイを実施した。結果は、これらの抗体は毒素Ａタン
パク質の異なるエピトープを標的としている可能性があることを示した（表１７）。その
タンパク質上の結合部位の位置をさらに同定するため、その抗体を既知の配列の毒素断片
を用いるウェスタンブロットまたはドットブロットアッセイにおいて個々に評価した。４
種類の中和性ｍＡｂは全てその毒素のＣ末端領域に向けられていることが分かった。
【０５３６】
合計１７種類の毒素Ｂ特異的抗体から、９種類が中和性であることが分かった。９種類
の中和性ｍＡｂの内で、それらの６種類はＮ末端に、その他の３種類はＢ毒素の移行ドメ
インに向けられていた（表１８）。ＢｉａＣｏｒｅ競合結合アッセイに基づいて、その９
種類の中和性モノクローナル抗体抗体を、図１９で示されるように４つのエピトープ群に
分類した。
【０５３７】
【表３２】
2018052938.tif 000036
【０５３８】
【表３３】
2018052938.tif 000037
【０５３９】
実施例３４：著しく高められた中和活性を有する新規の毒素Ａ抗体の組み合わせの同定
：
４種類の毒素Ａ  ｍＡｂ（Ａ３−２５、Ａ６５−３３、Ａ６０−２２およびＡ８０−２
９）は、個々にＡＴＰに基づく中和アッセイにおいて試験した際、毒素Ａの不完全または
部分的な中和を示した。ｍＡｂ  Ａ３−２５は最も強力な抗体であり、その他の３種類は
中和性がより低く、Ａ８０−２９はバックグラウンドよりかろうじて上であった（図１８
）。しかし、Ａ３−２５をその他の３種類のｍＡｂのいずれか１種類と組み合わせた場合
、図２０Ａ〜Ｃにおいて示されるように、３つの組み合わせ全てにおいて中和における相
乗作用が観察され、それは個々の抗体の中和の総和よりもはるかに大きかった。加えて、
３つの組み合わせは全て、通常抗毒素Ａポリクローナル抗体を用いて観察される完全な中
和能力を示した。
【０５４０】
実施例３５：著しく高められた中和活性を示す新規の毒素Ｂ抗体の組み合わせの同定：
我々は、ＢｉａＣｏｒｅ分析により同定された異なるエピトープ群からの毒素Ｂ  ｍＡ
ｂによる相乗的中和も観察した。群１の最も優勢なｍＡｂである毒素Ｂ  ｍＡｂ  Ｂ８−
２６を、群３からの多数のｍＡｂと組み合わせた。その組み合わせを毒素Ｂ特異的中和ア
ッセイにおいて評価し、その結果を図２１および表１９において示す。
【０５４１】
【表３４】
2018052938.tif 000038
【０５４２】
Ｂ８−２６をエピトープ群３のｍＡｂと組み合わせた場合、相乗的中和作用が観察され
たが、他のｍＡｂでは一切観察されなかった（データは示していない）。
実施例３６：安全且つ有効な変異体毒素組成物に関するｍＡｂによるインビトロスクリ
ーニング：
遺伝子工学により生成されたＣ．ディフィシルの遺伝子変異体毒素ＡおよびＢ（例えば
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４および６）は、インビトロ細胞毒性アッセイを用いて残存する細
胞毒性を示した。我々はそれぞれの変異体毒素Ｃ．ディフィシル毒素に関して細胞毒性に
おける約４ｌｏｇの低減を達成した（表２０）が、例えばホルマリン処理によるその変異
体毒素のさらなる化学的不活性化が好ましかった。しかし、化学的不活性処理は過酷であ
る可能性があり、これらの毒素または変異体毒素の重要な抗原エピトープに悪影響を及ぼ
す可能性がある。
【０５４３】
【表３５】
2018052938.tif 000039
【０５４４】
バイオプロセスの最適化のため、三重変異体ＴｃｄＡおよびＢ（１ｍｇ／ｍＬ）のホル
マリンおよびＥＤＣ／ＮＨＳ処理を用いた化学的不活性化に関して統計学的実験計画（Ｄ
ＯＥ）を実施した。三重変異体ＴｃｄＡのホルマリン不活性化を最適化するため、我々は
ホルマリン／グリシンの濃度（２０〜４０ｍＭ）、ｐＨ（６．５〜７．５）、および温度
（２５〜４０℃）を変動させた。三重変異体ＴｃｄＢに関して、我々はホルマリン／グリ
シン濃度を２から８０ｍＭまで変動させ、温度およびｐＨはそれぞれ２５℃および７．０
であった。全てのホルマリン処理に関する保温時間は２４時間であった。ホルマリン不活
性化に関して、表２１および２３中の“４０／４０”はその反応において用いられたホル
マリンおよびグリシンの濃度を表す。ＥＤＣ／ＮＨＳ処理に関して、我々はＥＤＣ／ＮＨ
Ｓの濃度を０．２５から２．５ｍｇ／三重変異体ＴｃｄＡのｍｇまで、および０．１２５
から２．５ｍｇ／三重変異体ＴｃｄＢのｍｇまで変動させ、２５℃で４時間保温した。反
応の終了時に、全ての試料を１０ｍＭホスフェート、ｐＨ７．０中で脱塩した。精製後、
処理されたＴｃｄを残存する細胞毒性に関して、そしてドットブロット分析によりエピト
ープのｍＡｂ認識に関して分析した。目標は、中和性ｍＡｂの一団により認識されるエピ
トープに負の影響を及ぼすことなく（＋＋＋＋または＋＋＋）細胞毒性を所望のレベル（
ＥＣ５０＞１０００μｇ／ｍＬ）まで低減する処理条件を同定することであった。その処
理条件（表２１〜２４中でチェックマーク“u”を付けてある）は、少なくとも４種類の
中和性ｍＡｂに対する反応性を保持する一方で細胞毒性においてそれぞれの野生型毒素の
細胞毒性と比較して６〜８ｌｏｇ１０の低減を示す、潜在的に安全且つ有効な免疫原性組
成物をもたらした。選ばれた結果を表２１〜２４において説明する。三重変異体毒素に対
する処理条件の変動からの追加のデータおよびインビトロ細胞毒性および毒性中和アッセ
イからのデータを、表３３および表３４において示す。例えば、その変異体毒素の好まし
い架橋処理条件に関するさらなる詳細を提供する上記の実施例２０および２１も参照。
【０５４５】
【表３６】
2018052938.tif 000040
【０５４６】
【表３７】
2018052938.tif 000041
【０５４７】
【表３８】
2018052938.tif 000042
【０５４８】
【表３９】
2018052938.tif 000043
【０５４９】
【表４０−１】
2018052938.tif 000044
【０５５０】
【表４０−２】
2018052938.tif 000045
【０５５１】
表３３において参照された三重変異体毒素Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）の試料に関す
る化学架橋反応条件
試料１〜４をＥＤＣ／ＮＨＳにより修飾した。条件：３０℃、２０ｍＭ  ＭＥＳ／１５
０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ６．５。反応をＥＤＣの添加により開始した。２時間の反応後、
試料Ａ、Ｂ、およびＣに１Ｍグリシンを５０ｍＭのグリシンの終濃度まで添加した。試料
Ｄにはグリシンを添加しなかった。その反応は、下記で示されるように異なる変異体毒素
Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）：ＥＤＣ：ＮＨＳの重量比を有するように設定された。
【０５５２】
１  Ｌ４４１６６−１５７Ａ  １：０．２５：０．２５  ｗ：ｗ：ｗ
２  Ｌ４４１６６−１５７Ｂ  １：１．２５：１．２５
３  Ｌ４４１６６−１５７Ｃ  １：２．５：２．５
４  Ｌ４４１６６−１５７Ｄ  １：２．５：２．５
試料５  Ｌ４４９０５−１６０Ａ  ８０ｍＭ  ＨＣＨＯ、８０ｍＭグリシン、８０ｍＭ
ＮａＰＯ４  ｐＨ７、１ｍｇ／ｍＬ変異体毒素Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）タンパク
質、２５℃において４８時間の反応。
【０５５３】
試料６  Ｌ４４１６６−１６６  変異体毒素Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）の２５℃に
おける２０ｍＭ  ＭＥＳ／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ６．５中でのＥＤＣ／ＮＨＳ修飾
。変異体毒素Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）：ＥＤＣ：ＮＨＳ＝１：０．５：０．５。反
応をＥＤＣの添加により開始した。２時間の反応後、１Ｍグリシンを０．１Ｍのグリシン
の終濃度まで添加し、さらに２時間保温した。この時間の後、反応緩衝液をＳｅｐｈａｄ
ｅｘ  Ｇ２５上で１×ＰＢＳに交換した。
【０５５４】
試料７  Ｌ４４９０５−１７０Ａ  ８０ｍＭ  ＨＣＨＯ、８０ｍＭグリシン、８０ｍＭ
ＮａＰＯ４  ｐＨ７、１ｍｇ／ｍＬ変異体毒素Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）タンパク
質、３５℃において４８時間の反応。このホルマリン反応は、抗原結合が重度に減少する
であろうような過度の架橋を生成することに向けられた。
【０５５５】
試料８  Ｌ４４８９７−６１  ３２ｍＭ  ＨＣＨＯ／８０ｍＭグリシン、２５℃におい
て７２時間の反応。
試料９  Ｌ４４８９７−６３  ８０ｍＭ  ＨＣＨＯ／８０ｍＭグリシン、２５℃におい
て７２時間の反応。
【０５５６】
以下の反応は全て２４時間の反応時間を有していた。
試料１０  Ｌ４４８９７−７２  チューブ番号１  ２５℃、８０ｍＭ  ＮａＰｉ  ｐＨ
６．５、２０ｍＭ  ＨＣＨＯ／２０ｍＭグリシン
試料１１  Ｌ４４８９７−７２  チューブ番号２  ２５℃、８０ｍＭ  ＮａＰｉ  ｐＨ
６．５、４０ｍＭ  ＨＣＨＯ／４０ｍＭグリシン
試料１２  Ｌ４４８９７−７２  チューブ番号３  ３２．５℃、８０ｍＭ  ＮａＰｉ  
ｐＨ７．０、３０ｍＭ  ＨＣＨＯ／３０ｍＭグリシン
試料１３  Ｌ４４８９７−７２  チューブ番号４  ３２．５℃、８０ｍＭ  ＮａＰｉ  
ｐＨ７．０、３０ｍＭ  ＨＣＨＯ／３０ｍＭグリシン
試料１４  Ｌ４４８９７−７２  チューブ番号５  ３２．５℃、８０ｍＭ  ＮａＰｉ  
ｐＨ７．０、３０ｍＭ  ＨＣＨＯ／３０ｍＭグリシン
試料１５  Ｌ４４８９７−７５  チューブ番号６  ２５℃、８０ｍＭ  ＮａＰｉ  ｐＨ
７．５、２０ｍＭ  ＨＣＨＯ／２０ｍＭグリシン
試料１６  Ｌ４４８９７−７５  チューブ番号７  ２５℃、８０ｍＭ  ＮａＰｉ  ｐＨ
７．５、４０ｍＭ  ＨＣＨＯ／４０ｍＭグリシン
試料１７  Ｌ４４８９７−７５  チューブ番号８  ４０℃、８０ｍＭ  ＮａＰｉ  ｐＨ
６．５、２０ｍＭ  ＨＣＨＯ／２０ｍＭグリシン
試料１８  Ｌ４４８９７−７５  チューブ番号９  ４０℃、８０ｍＭ  ＮａＰｉ  ｐＨ
６．５、４０ｍＭ  ＨＣＨＯ／４０ｍＭグリシン
試料１９  Ｌ４４８９７−７５  チューブ番号１０  ４０℃、８０ｍＭ  ＮａＰｉ  ｐ
Ｈ７．５、２０ｍＭ  ＨＣＨＯ／２０ｍＭグリシン
試料２０  Ｌ４４８９７−７５  チューブ番号１１  ４０℃、８０ｍＭ  ＮａＰｉ  ｐ
Ｈ７．５、４０ｍＭ  ＨＣＨＯ／４０ｍＭグリシン
以下の８個の試料は、７８ｍＭ  ＨＣＨＯおよび７６ｍＭグリシンを含有する８０ｍＭ
ＮａＰｉ  ｐＨ７．０中で２５℃において示された時間の間反応させた。
【０５５７】
試料２１  Ｌ４４８９７−１０１（前修飾（ｐｒｅ−ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ））Ｔ
ｘＡ対照、時間ゼロ、対照試料、修飾されていない、またはＨＣＨＯ／グリシンに曝露し
ていない
試料２２  Ｌ４４８９７−１０１、２時間
試料２３  Ｌ４４８９７−１０１、４時間
試料２４  Ｌ４４８９７−１０１、６時間
試料２５  Ｌ４４８９７  １０２、２４時間
試料２６  Ｌ４４８９７−１０３、５１時間
試料２７  Ｌ４４８９７−１０４、７４時間
試料２８  Ｌ４４８９７−１０５、１２０時間
試料２９（Ｌ４４９８０−００４）は、ＥＤＣ／ＮＨＳ修飾された変異体毒素Ａ（ＳＥ
Ｑ  ＩＤ  ＮＯ：４）（三重変異体毒素Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）−ＥＤＣ）であっ
た。反応条件は２５℃であり、緩衝液は２０ｍＭ  ＭＥＳ／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ
６．６であった。三重変異体毒素Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）：ＥＤＣ：ＮＨＳ＝１：
０．５：０．５  ｗ：ｗ：ｗ。反応をＥＤＣの添加により開始した。２時間の反応後、グ
リシンを０．１Ｍの終濃度まで添加し、２５Ｃでさらに２時間反応させた。反応をＳｅｐ
ｈａｄｅｘ  Ｇ２５上での脱塩により終了させた。
【０５５８】
以下の１２個の試料および２個の対照は復帰実験であり、ここで試料を２５℃および３
７℃で保温した。
反応１＝２５℃、８０ｍＭ  ＮａＰｉ  ｐＨ７．０、４０ｍＭ  ＨＣＨＯのみ（グリシ
ンなし）、２４時間の反応。
【０５５９】
反応２＝２５℃、８０ｍＭ  ＮａＰｉ  ｐＨ７．０、４０ｍＭ  ＨＣＨＯ／４０ｍＭ  
グリシン、２４時間の反応
試料  反応
３０  反応番号１  ０週目、２５℃
３１  反応番号１  １週目、２５℃
３２  反応番号１  ２週目、２５℃
３３  反応番号１  ３週目、２５℃
３４  反応番号１  ４週目、２５℃
３５  反応番号１  ３週目、３７℃
３６  反応番号２  ０週目、２５℃
３７  反応番号２  １週目、２５℃
３８  反応番号２  ２週目、２５℃
３９  反応番号２  ３週目、２５℃
４０  反応番号２  ４週目、２５℃
４１  反応番号２  ３週目、３７℃
４２  ＴｘＡ  対照  ３週目、２５℃
４３  ＴｘＡ  対照  ３週目、３７℃
次の４個の試料は、８０ｍＭ  ＮａＰｉ  ｐＨ７．０、４０ｍＭ  ＨＣＨＯ／４０ｍＭ
グリシン中での２５℃における示された時間の間の反応により生成された。
【０５６０】
４４  Ｌ４４８９７−１１６−６  ２９．５時間
４５  Ｌ４４８９７−１１６−７  ５７．５時間
４６  Ｌ４４８９７−１１６  −８  ７９．５時間
４７  Ｌ４４８９７−１１６−９  １２３．５時間
試料４８  Ｌ４４８９７−１３９  ２５℃、８０ｍＭ  ＮａＰｉ  ｐＨ７．０、４０ｍ
Ｍ  ＨＣＨＯ／４０ｍＭグリシンにおける４８時間の反応。
【０５６１】
試料４９  Ｌ４４１６６−２０４  変異体毒素Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）のＥＤＣ
／ＮＨＳ修飾。２５Ｃ、緩衝液１×ＰＢＳ  ｐＨ７．０。変異体毒素Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  
ＮＯ：４）：ＥＤＣ：ＮＨＳ＝１：０．５：０．５  ｗ：ｗ：ｗ。ＥＤＣ／ＮＨＳとの２
時間の反応、次いで１Ｍグリシンを０．１Ｍの終濃度まで添加し、さらに２時間反応。緩
衝液をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５上で２０ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン／１００ｍＭ  ＮａＣｌ
ｐＨ６．５に交換した。
【０５６２】
【表４１−１】
2018052938.tif 000046
【０５６３】
【表４１−２】
2018052938.tif 000047
【０５６４】
【表４１−３】
2018052938.tif 000048
【０５６５】
【表４１−４】
2018052938.tif 000049
【０５６６】
表３４において参照された変異体毒素Ｂの試料に関する化学架橋反応条件
三重変異体毒素Ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）を化学的に架橋し、以下の反応条件に従
って試験した。Ｌ４４９０５−８６試料を、３種類のホルマリン反応のバリエーションお
よび２種類の保温温度を含む実験において試験した。合計１８個の試料に関して、それぞ
れの日に６個の試料を得た。リスト中の最初の試料は未処理の対照である（それにより合
計１９個の試料となる）。その未処理の対照には、未処理の三重変異体毒素Ｂポリペプチ
ド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）が含まれていた。
【０５６７】
反応１（“Ｒｘｎ１”）＝８０ｍＭ  ＨＣＨＯ、８０ｍＭグリシン、８０ｍＭ  ＮａＰ
Ｏ４  ｐＨ７、１ｍｇ／ｍＬ三重変異体毒素Ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）タンパク質
反応２（“Ｒｘｎ２”）＝８０ｍＭ  ＨＣＨＯ、グリシンなし、８０ｍＭ  ＮａＰＯ４
ｐＨ７、１ｍｇ／ｍＬ三重変異体毒素Ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）タンパク質
反応３（“Ｒｘｎ３”）＝８０ｍＭ  ＨＣＨＯ、グリシンなし、８０ｍＭ  ＮａＰＯ４
ｐＨ７、１ｍｇ／ｍＬ三重変異体毒素Ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）タンパク質＋シア
ノボロヒドリドキャッピング。
【０５６８】
シアノボロヒドリドキャッピングは、８０ｍＭ  ＣＮＢｒＨ４の脱塩された最終反応物
への添加および３６℃で２４時間の保温を含んでいた。
試料Ｌ３４３４６−３０Ａに関して、１グラムの三重変異体毒素Ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎ
Ｏ：６）あたり０．５ｇのＥＤＣおよびＮＨＳ、２０ｍＭ  ＭＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣ
ｌ、ｐＨ６．５中で３０℃において４時間。
【０５６９】
試料Ｌ３４３４６−３０Ｂに関して、１グラムの三重変異体毒素Ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎ
Ｏ：６）あたり０．５ｇのＥＤＣおよびＮＨＳ、２０ｍＭ  ＭＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣ
ｌ、ｐＨ６．５中で３０℃において２時間、続いてグリシンの添加（ｇ／Ｌの終濃度）お
よび３０℃においてさらに２時間の保温。Ｌ３４３４６−３０ＡおよびＬ３４３４６−３
０Ｂに関する２つの反応の間の唯一の違いは、反応Ｌ３４３４６−３０Ｂへのグリシンの
添加である。
【０５７０】
実施例３７：免疫原性組成物により誘導される抗体は、様々なＣ．ディフィシル株から
の毒素を中和することができる。
その変異体毒素原薬が含まれる免疫原性組成物により誘導された抗体が広いスペクトル
の多様な毒素配列を中和することができるかどうかを評価するため、多様なリボタイプお
よび毒素タイプを代表する株を配列決定して、変異体毒素原薬と比較した様々な株の間の
遺伝的多様性の程度を確認した。次いで、様々な株からの分泌された毒素を含有する培養
上清を、免疫されたハムスターからの血清を用いたインビトロ中和アッセイにおいて試験
し、その免疫原性組成物の適用範囲（ｃｏｖｅｒａｇｅ）を決定し、その免疫原性組成物
の循環している臨床株からの多様な毒素に対して保護する能力を決定した。
【０５７１】
ＨＴ−２９細胞（結腸癌細胞株）およびＩＭＲ−９０細胞の両方を用いて、ＣＤＣ株か
ら発現された毒素の中和を試験した。ＨＴ−２９細胞はＴｃｄＡに対してより感受性であ
り；これらの細胞における精製されたＴｃｄＡのＥＣ５０は、ＴｃｄＢに関する３．３ｎ
ｇ／ｍＬと比較して１００ｐｇ／ｍＬである。一方で、ＩＭＲ−９０細胞はＴｃｄＢに対
してより感受性であり；これらの細胞における精製されたＴｃｄＢのＥＣ５０は、Ｔｃｄ
Ａに関する０．９２〜１．５ｎｇ／ｍＬと比較して９〜３０ｐｇ／ｍＬの範囲である。こ
れらの細胞株におけるＴｃｄＡおよびＴｃｄＢ両方に関するそのアッセイの特異性を、ポ
リクローナルおよびモノクローナル毒素特異的抗体両方を用いることにより確かめた。ア
ッセイの標準化のため、２４種類のＣＤＣ分離株の培養濾液をそれらのそれぞれのＥＣ５
０値の４倍の濃度で試験した。その株の３種類は、その中和アッセイでの試験に関して低
すぎる毒素レベルを有していた。
【０５７２】
米国およびカナダにおけるＣ．ディフィシルの循環している株の９５％より大きい割合
を含む多様なアイソタイプ／毒素タイプを代表する２４種類の株を、ＣＤＣから得た。こ
れらの分離株の中には、リボタイプ０２７、００１および０７８を代表する株、米国、カ
ナダおよび英国におけるＣＤＡＤの３種類の流行株があった。株２００４０１３および２
００４１１８はリボタイプ０２７を代表し；株２００４１１１はリボタイプ００１を代表
し、株２００５０８８、２００５３２５および２００７８１６はリボタイプ０７８を代表
していた。疾患を引き起こす臨床分離株および６３０株の間の遺伝的多様性の程度を確認
するため、これらの臨床株からの毒素遺伝子（ｔｃｄＡおよびｔｃｄＢ）を完全に配列決
定した。表３５参照。その毒素のアミノ酸配列を、Ｍｅｇａｌｉｇｎ（商標）プログラム
（ＤＮＡＳＴＡＲ（登録商標）Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ（登録商標））中のＣｌｕｓｔａｌＷ
を用いて整列させ、配列の同一性に関して分析した。ｔｃｄＡに関して、ゲノムアライン
メント分析は、その臨床分離株の全ておよび株６３０が全体で約９８〜１００％のアミノ
酸配列の同一性を共有していることを示した。ｔｃｄＡ遺伝子のＣ末端部分はわずかによ
り大きく分岐していた。同じ分析をｔｃｄＢ遺伝子に関して実施し、それはより大きな配
列の分岐を示した。特に、株２００７８３８／ＮＡＰ７／１２６および２００７８５８／
ＮＡＰ１／ｕｎｋ５はＮ末端（９７〜１００％）およびＣ末端ドメイン（８８〜１００％
；データは示していない）において６３０株からの最も大きな分岐パターンを示した。
【０５７３】
ハムスター血清プール（ＨＳ）を、変異体ＴｃｄＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）および
変異体ＴｃｄＢ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）が含まれる免疫原で免疫されたシリアンゴー
ルデンハムスターから収集し、ここでその変異体毒素は例えば上記で記述された実施例２
９、表１５に従ってＥＤＣにより不活性化され、リン酸アルミニウムと共に配合された。
表３５における結果は、少なくともそれぞれの培養上清からの毒素Ｂがインビトロ中和ア
ッセイにおいてその免疫されたハムスターからの血清により中和されたことを示している
。
【０５７４】
【表４２】
2018052938.tif 000050
【０５７５】
図２３は、ＩＭＲ−９０細胞における様々なＣ．ディフィシル株からの毒素調製物を用
いた中和アッセイの結果を示す。そのデータは、ハムスター抗血清中のＴｃｄＢ中和抗体
が、高病毒性株およびＴｃｄＡ陰性、ＴｃｄＢ陽性株を含め、試験した２１種類の分離株
全てからの毒素を中和することができたことを示している。Ｃ．ディフィシルの少なくと
も１６種類の異なる株をＣＤＣ（ジョージア州アトランタ）（前述）から得て、当該技術
において既知であるような、および上記で記述したような適切な条件の下で、Ｃ．ディフ
ィシル培地中で培養した。分泌された毒素を含有する培養上清を分析してそれらのＩＭＲ
−９０単層に対する細胞毒性（ＥＣ５０）を決定し、続いてリン酸アルミニウムと共に配
合された変異体毒素Ａ原薬および変異体毒素Ｂ原薬で免疫されたハムスターからの様々な
希釈度の血清を用いて、そのＥＣ５０の４倍での標準的なインビトロ中和アッセイで試験
した。それぞれの株の培養上清から得られた粗製の毒素および精製された毒素（Ｌｉｓｔ
Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓから得た市販の毒素）（それぞれの上清から精製されたもので
はない）を、上記で記述されたインビトロ細胞毒性アッセイを用いて、ＩＭＲ−９０細胞
に対する細胞毒性に関して試験した。
【０５７６】
図２３Ａ〜Ｋにおいて、そのグラフはインビトロ細胞毒性試験（前述）からの結果を示
し、ここでＡＴＰレベル（ＲＬＵ）を以下：Ｃ．ディフィシル培養液およびハムスター血
清のプール（■）；粗製の毒素およびハムスター血清のプール（●）；精製された毒素お
よびハムスター血清のプール（▲）；粗製の毒素（▼）、対照；ならびに精製された毒素
（◆）、対照の増大する濃度に対してプロットした。それぞれの株からの毒素はその細胞
に４×ＥＣ５０値で添加された。
【０５７７】
図２３Ａ〜Ｋで示されるように、記述された免疫原を与えられたハムスターは、驚くべ
きことに、少なくとも以下の１６種類の異なるＣ．ディフィシルのＣＤＣ株からの毒素に
対してそれぞれの毒素のみの対照と比較して中和活性を示す中和抗体を発現した：２００
７８８６（図２３Ａ）；２００６０１７（図２３Ｂ）；２００７０７０（図２３Ｃ）；２
００７３０２（図２３Ｄ）；２００７８３８（図２３Ｅ）；２００７８８６（図２３Ｆ）
；２００９２９２（図２３Ｇ）；２００４０１３（図２３Ｈ）；２００９１４１（図２３
Ｉ）；２００５０２２（図２３Ｊ）；２００６３７６（図２３Ｋ）。それからの毒素が試
験され、それがリン酸アルミニウム中で配合された変異体毒素Ａ原薬および変異体毒素Ｂ
原薬が含まれる免疫原性組成物により中和された追加のＣ．ディフィシル株に関して、表
３５も参照。
【０５７８】
別の試験において、（ＣＤＣから、および英国のＬｅｅｄｓ病院から得た）様々なＣ．
ディフィシル株からの分泌された毒素を含有する培養上清を、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌと共
に配合された変異体毒素Ａ原薬および変異体毒素Ｂ原薬を投与されたハムスターからの血
清を用いたインビトロ中和アッセイにおいて試験した。実験設計に関して表３６を参照。
その結果を表３７および表３８において示す。
【０５７９】
【表４３】
2018052938.tif 000051
【０５８０】
【表４４−１】
2018052938.tif 000052
【０５８１】
【表４４−２】
2018052938.tif 000053
【０５８２】
【表４５−１】
2018052938.tif 000054
【０５８３】
【表４５−２】
2018052938.tif 000055
【０５８４】
実施例３８：ＥＤＣ／ＮＨＳ三重変異体毒素のペプチドマッピング
ＥＤＣ／ＮＨＳで不活性化された三重変異体毒素を特性付けるため、ＥＤＣ／ＮＨＳで
処理された三重変異体毒素Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）の４ロットおよびＥＤＣ／ＮＨ
Ｓで処理された三重変異体毒素Ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）の４ロットに対してペプチ
ドマッピング実験を実施した。その変異体毒素をトリプシンで消化した後、結果として生
じたペプチド断片を逆相ＨＰＬＣを用いて分離した。質量スペクトル分析を用いて、その
不活性化プロセスの結果として起こった修飾を同定した。変異体毒素Ａ原薬および変異体
毒素Ｂ原薬両方に関して、理論上のトリプシン消化ペプチド（ｔｒｙｐｔｉｃ  ｐｅｐｔ
ｉｄｅｓ）の９５％より多くが同定された。架橋およびグリシン付加物（グリシンはキャ
ッピング剤として用いられた）が同定された。変異体毒素Ａ原薬および変異体毒素Ｂ原薬
両方において、ベータ−アラニン付加物も観察された。機序または理論により束縛される
わけではないが、そのベータ−アラニン付加物は３モルのＮＨＳの１モルのＥＤＣとの反
応の結果であるようであり、それはＮＨＳで活性化されたベータ−アラニンを形成する。
次いでこの分子はリシン基と反応してベータ−アラニン付加物（＋７０Ｄａ）を形成する
ことができる。ＥＤＣ／ＮＨＳで処理された三重変異体毒素Ｂの試料において、低レベル
（０．０７モル／モルタンパク質）のデヒドロアラニン（−３４Ｄａ）も観察された。デ
ヒドロアラニンはシステイン残基の脱スルホン化の結果である。同じタイプおよび程度の
修飾がそれぞれの変異体毒素の４つのバッチ全てにおいて観察され、これはそのプロセス
が一貫した生成物を生成することを示している。（９５％より大きい配列包括度での）ペ
プチドマッピングは、その修飾が存在することを確証している。その修飾の要約を表３９
において示す。図２４〜２５も参照。加えて、その三重変異体毒素Ａ原薬の、および三重
変異体毒素Ｂ原薬の大きさおよび電荷の不均一性は、化学的不活性化の非存在下でのそれ
ぞれの三重変異体毒素Ａおよび三重変異体毒素Ｂの大きさおよび電荷の不均一性と比較し
て増大していた。結果として、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）および陰イオン
交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）のプロフィールは比較的広いピークを有していた（デ
ータは示していない）。
【０５８５】
【表４６】
2018052938.tif 000056
【０５８６】
実施例３９：製剤の製造
Ｃ．ディフィシル免疫原性組成物（製剤）は、２種類の有効な医薬成分（変異体毒素Ａ
原薬および変異体毒素Ｂ原薬）を含有する。典型的な製剤は、変異体毒素Ａ原薬および変
異体毒素Ｂ原薬のそれぞれが含まれる、１０ｍＭトリス緩衝液  ｐＨ７．４、４．５％（
ｗ／ｗ）トレハロース二水和物、および０．０１％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０を含有
する凍結乾燥された配合物である。その免疫原性組成物は、その凍結乾燥されたワクチン
を希釈剤を用いて、またはＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌを含有する希釈剤を用いてのどちらかで
再懸濁することにより、注射用に調製される。プラセボには注射用の滅菌通常生理食塩水
溶液（０．９％塩化ナトリウム）が含まれるであろう。
【０５８７】
【表４７】
2018052938.tif 000057
【０５８８】
緩衝液の調製
注射用水（ＷＦＩ）を調剤容器に入れる。混合しながら賦形剤を添加して溶液になるま
で溶解させる。そのｐＨを測定する。必要であれば、ｐＨをＨＣｌを用いて７．４±０．
１に調節する。その溶液をＷＦＩにより最終重量まで希釈し、次いで０．２２μｍ  Ｍｉ
ｌｌｉｐｏｒｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＳＨＣ  ＸＬ１５０フィルターを用いて濾過する。濾
過前の（ｐｒｅ−ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）生物負荷低減試料を濾過の前に得る。その濾過
された緩衝液を、モル浸透圧濃度およびｐＨに関して試料採取する。
【０５８９】
配合物の調製
解凍した変異体毒素原薬を、以下の操作の順序で予め計算した量に基づいて配合容器中
にプールする：０．６ｍｇ／ｍＬを達成するための目標希釈緩衝液量の５０％をまずその
容器に入れ、続いて変異体毒素Ａ原薬を添加し、１００ｒｐｍで５分間混合する。次いで
変異体毒素Ｂ原薬をその容器に添加し、その溶液を０．６ｍｇ／ｍＬの希釈点までさらに
希釈し、次いで１００ｒｐｍでさらに５分間混合する。試料を取り出し、総変異体毒素濃
度に関して試験する。その溶液をプロセス中の変異体毒素濃度の値に基づいて１００パー
セントの量まで希釈し、次いで１００ｒｐｍで１５分間混合する。配合された製剤を、濾
過前の（ｐｒｅ−ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）ｐＨおよび生物負荷に関して試料採取する。次
いで配合された製剤を一夜貯蔵に関してＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＳＨＣ  
ＸＬ１５０を用いて濾過し、または濾過滅菌のために充填ラインへと運ぶ。
【０５９０】
その配合されたバルクを充填エリアへと運び、生物負荷に関して試料採取し、次いで２
個の直列のＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＳＨＣ  ＸＬ１５０フィルターで濾過
滅菌する。その配合されたバルクを、発熱物質を除去されたガラスバイアル中に、０．７
３ｍＬの目標充填量で充填する。その充填されたバイアルに部分的に栓をして、次いで凍
結乾燥機中に装填する。凍結乾燥サイクルを表４１で示したように実施する。サイクルの
完了時に、凍結乾燥チャンバーに窒素を０．８ａｔｍまで戻し充填し（ｂａｃｋ−ｆｉｌ
ｌｅｄ）、次いで栓を完全に締める（ｓｅａｔｅｄ）。チャンバーから取り出し、そのバ
イアルにフリップオフ式の封を用いて蓋をする。
【０５９１】
【表４８】
2018052938.tif 000058
【０５９２】
製剤の安定性のデータを表４２において要約する。そのデータは、その製剤が２〜８℃
で少なくとも３ヶ月間または２５℃もしくは４０℃で少なくとも１ヶ月間の貯蔵の間、物
理的および化学的に安定であることを示唆している。両方の貯蔵条件下で、試験した最近
の時点まで、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により検出される不純物のレベル
は変化せず、インビトロ抗原性における変化もなかった。
【０５９３】
【表４９】
2018052938.tif 000059
【０５９４】
実施例４０；ワクチン希釈剤
生理食塩水に関して、再構成の際の等張溶液を確実にするため、６０ｍＭ  ＮａＣｌが
アジュバントを一切含まない凍結乾燥された製剤に関する希釈剤として用いられる。
【０５９５】
Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ：Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ“８５”２％（Ｂｒｅｎｎｔａｇ）は、
水酸化アルミニウムの八面体結晶シートからなる商業的に入手可能な適正製造基準（ＧＭ
Ｐ）グレードの製品である。典型的なＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ希釈剤配合物を、表４３にお
いて示す。その典型的な配合は、上記で記述された製剤との組み合わせで用いることがで
きる。
【０５９６】
【表５０】
2018052938.tif 000060
【０５９７】
Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌアジュバントを用いた試験は、ｐＨ６．０から７．５までにおい
て、変異体毒素Ａ原薬および変異体毒素Ｂ原薬の１ｍｇ  Ａｌ／ｍＬ  Ａｌｈｙｄｒｏｇ
ｅｌへの１００％の結合を示す。両方の原薬の最大結合は、試験した最も高いタンパク質
濃度（それぞれ３００μｇ／ｍＬ）において見られた。
【０５９８】
タンパク質のＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌへの結合を、２００μｇ／ｍＬのそれぞれの原薬お
よび０．２５から１．５ｍｇ／ｍＬまでの範囲のＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌを含有する凍結乾
燥された製剤配合物によっても試験した。その製剤を様々な濃度のＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ
を含有する希釈剤を用いて再構成し、結合したそれぞれの変異体毒素のパーセントを測定
した。Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌの全ての試験した濃度は、その抗原の１００％の結合を示し
た。
【０５９９】
変異体毒素Ａ原薬および変異体毒素Ｂ原薬（それぞれ２００μｇ／ｍＬ）の目標用量に
おけるタンパク質のＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌへの結合速度論も評価した。その結果は、その
変異体毒素原薬の１００％が２４時間のＲＴでの時間経過全体を通してＡｌｈｙｄｒｏｇ
ｅｌに結合していたことを示している。
【０６００】
ＣｐＧ  ２４５５５およびＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ：ＣｐＧ  ２４５５５は、配列５−Ｔ
ＣＧ  ＴＣＧ  ＴＴＴＴＴＣ  ＧＧＴ  ＧＣＴ  ＴＴＴ−３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８
）を有する合成２１塩基長オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）である。ＣｐＧ  ２４
５５５およびＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ希釈剤の組み合わせに関する典型的な配合を表４４に
おいて示す。その典型的な配合は、上記で記述された製剤との組み合わせで用いることが
できる。
【０６０１】
【表５１】
2018052938.tif 000061
【０６０２】
ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）：ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）アジュバント
は、当該技術で既知のサポニンに基づくアジュバントである。ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登
録商標）アジュバント配合物に関する典型的な配合を表４５において示す。その典型的な
配合は、上記で記述された製剤との組み合わせで用いることができる。
【０６０３】
【表５２】
2018052938.tif 000062
【０６０４】
実施例４１：ＮＨＰモデルにおけるＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌで抗原性補強した変異体毒素
原薬組成物の免疫原性および前臨床概念実証
ＮＨＰ、特にカニクイザル・マカクにおけるＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌで抗原性補強した変
異体毒素Ａ原薬および変異体毒素Ｂ原薬組成物の免疫原性を評価した。２週間間隔（０、
２、４週目）で投与あたり１０μｇのそれぞれの変異体毒素Ａ原薬および変異体毒素Ｂ原
薬組成物（Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌと共に配合）で免疫されたＮＨＰは、強い中和抗毒素応
答を発現した。表４６参照。抗毒素Ａおよび抗毒素Ｂ中和応答の両方が３回目の免疫処置
後に保護範囲に達し、少なくとも３３週目（試験した最後の時点）を通して保護範囲内ま
たはその上に留まっていた。
【０６０５】
カニクイザル・マカク（ｎ＝８）を、０、２および４週目において、２５０μｇのＡｌ
ｈｙｄｒｏｇｅｌ中で配合されたそれぞれ１０μｇの変異体毒素Ａ原薬および変異体毒素
Ｂ原薬でＩＭで免疫した。それぞれの時点において血清を収集し、機能的抗毒素活性に関
して毒素中和アッセイにおいて分析した。ＧＭＴを表４６において提供する。その表で提
供されている保護力価範囲は中和抗体力価範囲を表しており、それはＭｅｒｃｋモノクロ
ーナル抗体療法試験におけるＣ．ディフィシル感染の再発における有意な低減と相関して
いる。
【０６０６】
【表５３】
2018052938.tif 000063
【０６０７】
Ｍｅｒｃｋ  ｍＡｂ療法試験からのヒト保護抗体力価の、ＮＨＰにおけるＰｆｉｚｅｒ
のワクチン候補により誘導された力価に対する相関
Ｍｅｒｃｋ／Ｍｅｄａｒｅｘ  ｍＡｂによる第２相有効性試験(Lowy et al., N Engl J
Med. 2010 Jan 21;362(3):197-205)は、血清中の中和性抗毒素ｍＡｂのレベルおよびＣ
ＤＡＤの再発の予防の間の相関を実証しているようである。その毒素特異的ｍＡｂのヒト
への投与の後、ヒトの受容者における１０〜１００μｇ／ｍＬの範囲の血清抗体レベルは
再発に対して保護するようである（ＣＤＡＤの再発における７０％の低減）。
【０６０８】
変異体毒素原薬が含まれる免疫原性組成物を、その免疫原性組成物がヒトにおいて潜在
的に有効な中和抗体応答を誘導することができるかどうかを評価するため、Ｍｅｒｃｋ／
Ｍｅｄａｒｅｘ第２相試験からの公開されたデータをＮＨＰモデルにおいてその免疫原性
組成物により誘導された抗体のレベルと比較することにより試験した。これは、Ｍｅｒｃ
ｋ／Ｍｅｄａｒｅｘ  ｍＡｂの以前に公開された特徴を利用して再発の徴候を示さない対
象から得られた血清中のこれらのｍＡｂの範囲（１０〜１００μｇ／ｍＬ）を５０％中和
力価に変換し、これらの力価（“保護力価範囲”）を本明細書で記述される前臨床モデル
において観察された力価と比較することにより成し遂げられた。表４６で示されるように
、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌで抗原性補強された変異体毒素Ａ原薬および変異体毒素Ｂ原薬が
含まれる免疫原性組成物はＮＨＰにおいて免疫応答を生じさせ、それは３回目の投与後に
“保護範囲”に達し、３３週目を通してこの範囲内またはその上に留まっていた。ＮＨＰ
において本発明のＣ．ディフィシル免疫原性組成物により誘導された毒素中和抗体のレベ
ルは、ＣＤＡＤの再発から保護されたようであったＭｅｒｃｋ／Ｍｅｄａｒｅｘ試験の対
象における血清抗体レベルに匹敵する。
【０６０９】
実施例４２：ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸまたはＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ／ＣｐＧ  ２４５５５
（Ａｌｈ／ＣｐＧ）で抗原性補強された変異体毒素原薬組成物のＮＨＰモデルにおける免
疫原性
ＮＨＰにおいて、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸおよびＡｌｈ／ＣｐＧは両方とも、Ａｌｈｙｄ
ｒｏｇｅｌのみと共に投与されたワクチンと比較した場合に、抗毒素ＡおよびＢの中和力
価を統計的に有意に高めた（表４７）。バックグラウンドより上の抗毒素応答は、Ａｌｈ
／ＣｐＧまたはＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸのどちらかと共に投与されたワクチンにより、Ａｌ
ｈｙｄｒｏｇｅｌのみ（４〜６週目）と比較してより早い時点で誘発され（２〜４週目）
、それはヒトにおけるＣＤＡＤの再発からの保護に対して重要な作用を有する可能性があ
る。Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌと比較して、Ａｌｈ／ＣｐＧにより、またはＩＳＣＯＭＡＴＲ
ＩＸにより抗原性補強された免疫原性組成物は保護範囲（実施例４１も参照）に達する抗
毒素中和力価をより迅速に生成し、それはこの範囲内またはこの範囲より上に３３週目を
通して留まっている。
【０６１０】
表４７において示されるように、カニクイザル・マカクを、０、２、および４週目にお
いて、２５０μｇのＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（ｎ＝８）、または５００μＭのＣｐＧ＋２５
０μｇのＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（ｎ＝１０）、または４５ＵのＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（ｎ
＝１０）中で配合されたそれぞれ１０μｇの変異体毒素Ａ原薬および変異体毒素Ｂ原薬で
、ＩＭで免疫した。それぞれの時点において血清を収集し、機能的抗毒素活性に関して上
記で記述された毒素中和アッセイで分析した。ＧＭＴを表中に列挙する。アスタリスク（
＊）は、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ群における力価と比較した場合の統計的有意性（ｐ＜０．
０５）を示す。保護力価範囲は、Ｍｅｒｃｋ／Ｍｅｄａｒｅｘ  ｍＡｂ療法試験に従うＣ
．ディフィシル感染の再発における有意な低減と相関する中和抗体力価範囲を表す。
【０６１１】
【表５４】
2018052938.tif 000064
【０６１２】
ＮＨＰにおいて生成された中和抗毒素抗体力価に対する、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸまたは
Ａｌｈ／ＣｐＧアジュバントの存在下で投与された変異体毒素Ａ原薬および変異体毒素Ｂ
原薬の用量も評価した。１つの試験において、ＮＨＰにＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ中で配合さ
れた低（１０μｇ）または高（１００μｇ）用量のそれぞれの変異体毒素原薬を投与した
。応答を免疫処置後のそれぞれの時点において比較した。表４８で示されるように、抗毒
素中和力価は両方の処置群において強かった。抗毒素Ａ力価はほとんどの時点において低
用量群および高用量群の間でほぼ同等であり、一方で抗毒素Ｂ力価に関しては高用量群に
おいてより高い傾向があった。
【０６１３】
【表５５】
2018052938.tif 000065
【０６１４】
表４８で示されるように、カニクイザル・マカク（ｎ＝５）を、０、２、および４週目
において、４５ＵのＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸと共に配合されたそれぞれ１０μｇまたは１０
０μｇの変異体毒素Ａ原薬および変異体毒素Ｂ原薬で、ＩＭで免疫した。それぞれの時点
において血清を収集し、機能的抗毒素活性に関して毒素中和アッセイで分析した。ＧＭＴ
を表中に列挙する。保護力価範囲は、Ｍｅｒｃｋ／Ｍｅｄａｒｅｘ  ｍＡｂ療法試験での
Ｃ．ディフィシル感染の再発における有意な低減と相関する中和抗体力価範囲を表す。
【０６１５】
抗毒素Ｂ応答の速度論を高めるための試みにおいて、ＮＨＰを、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ
またはＡｌｈ／ＣｐＧアジュバントの存在下で増大する容量の変異体毒素Ｂ原薬（１０、
５０、または１００μｇ）と混合した一定用量の変異体毒素Ａ原薬（１０μｇ）で免疫し
た。アジュバントに関わらず、より高い用量の変異体毒素Ｂ原薬（５０または１００μｇ
のどちらか）を与えられた群に関して、１０μｇ用量の変異体毒素Ｂ薬物と比較してより
高い抗毒素Ｂ中和応答を誘導する傾向があった（表５０、統計的に有意な増大を示すため
、＊の印を付けた）。この傾向は、最後の免疫処置後のほとんどの時点において観察され
た。しかし、いくつかの場合において、抗毒素Ａ中和応答は変異体毒素Ｂの量が増大した
際に統計的に有意な減少を示した（表４９において＾の印を付けた）。
【０６１６】
表４９および表５０で示されるように、ＮＨＰ（群あたり１０匹）を、０、２、および
４週目において、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（投与あたり４５Ｕ）と共に、またはＡｌｈ／Ｃ
ｐＧ（投与あたり２５０μｇ／５００μｇ）と共に配合された異なる比率の変異体毒素Ａ
原薬および変異体毒素Ｂ原薬（１０μｇの変異体毒素Ａ原薬に加えて１０、５０、または
１００μｇいずれかの変異体毒素Ｂ原薬；表４９および表５０においてそれぞれ１０Ａ：
１０Ｂ、１０Ａ：５０Ｂおよび１０Ａ：１００Ｂと表されている）で、ＩＭで免疫した。
表４９は抗毒素Ａ力価を示す。表５０は抗毒素Ｂ力価を示す。ＧＭＴを表中に列挙する。
保護力価範囲は、Ｍｅｒｃｋ  ｍＡｂ療法試験でのＣ．ディフィシル感染の再発における
有意な低減と相関する中和抗体力価範囲を表す。記号＾は、中和力価における１０Ａ：１
０Ｂ群と比較した統計的に有意な減少（ｐ＜０．０５）を表す。アスタリスクの記号＊は
、中和力価における１０Ａ：１０Ｂ群と比較した統計的に有意な増大（ｐ＜０．０５）を
表す。
【０６１７】
【表５６】
2018052938.tif 000066
【０６１８】
【表５７】
2018052938.tif 000067
【０６１９】
実施例４３：カニクイザルにおける免疫原性組成物による４週間の回復期間を有する５
週反復投与ＩＭ毒性試験
カニクイザルにおけるＰＦ−０６４２５０９５（水酸化アルミニウムおよびＣｐＧ  ２
４５５５アジュバントとの組み合わせでの三重変異体毒素Ａ原薬および三重変異体毒素Ｂ
原薬が含まれる免疫原性組成物）を用いた５週ＩＭ反復投与毒性試験を、水酸化アルミニ
ウムおよびＣｐＧ  ２４５５５アジュバントとの組み合わせでのＣ．ディフィシル三重変
異体毒素Ａ原薬および三重変異体毒素Ｂ原薬（ＰＦ−０６４２５０９５）の可能性のある
毒性および免疫原性を評価するために実施した。０．２または０．４ｍｇ／投与でのＰＦ
−０６４２５０９５、三重変異体毒素Ａ原薬および三重変異体毒素Ｂ原薬（それぞれ低お
よび高用量の免疫原性組成物群）、水酸化アルミニウムとして０．５ｍｇのアルミニウム
、および１ｍｇのＣｐＧ  ２４５５５ならびにアジュバントの組み合わせのみ（水酸化ア
ルミニウム＋ＣｐＧ  ２４５５５；ＰＦ−０６３７６９１５）をカニクイザル（６匹／性
別／群）にＩＭで予備刺激投与（ｐｒｉｍｅ  ｄｏｓｅ）として投与し、続いて３回の追
加免疫投与を行った（１、８、２２、および３６日目）。別個の群の動物（６匹／性別）
に、おおよそ７．０のｐＨの０．９％等張生理食塩水を与えた。その免疫原性組成物のビ
ヒクルは、ｐＨ７．４の１０ｍＭトリス緩衝液、４．５％トレハロース二水和物、および
０．１％ポリソルベート８０で構成されていた。アジュバント対照のビヒクルは、６０ｎ
Ｍ  ＮａＣｌを含むｐＨ６．５の１０ｍＭヒスチジン緩衝液で構成されていた。総投与量
は注射あたり０．５ｍＬであった。全ての用量は左および／または右四頭筋（ｑｕａｒｄ
ｒｉｃｅｐｓ  ｍｕｓｃｌｅ）中に投与された。選択された動物は、その試験の投与期の
間に観察されるあらゆる作用の可逆性を評価するため、４週間の投与なしの観察期間を経
た。
【０６２０】
この試験において、不都合な所見はなかった。ＰＦ−０６４２５０９５は十分に耐容さ
れ、全身毒性の証拠なしで局所的な炎症反応のみをもたらした。投与期の間、４および３
８日目においてフィブリノーゲン（２３．１％〜２．３倍）、ならびに４（２．１倍〜２
７．５倍）および３８（２．３倍〜１０１．５倍）日目においてＣ反応性タンパク質、な
らびに３６および／または３８日目においてグロブリン（１１．１％〜２４．１％）にお
ける事前調査からの用量依存性の増大が免疫原性組成物で処置された群において見られ、
それは抗原性補強された免疫原性組成物の投与に対する予想された炎症反応と一致してい
た。
【０６２１】
４日目に気付かれたフィブリノーゲンおよびＣ反応性タンパク質における増大は、高用
量免疫原性組成物群においてのみ、フィブリノーゲン（２５．６％〜６５．５％）および
Ｃ反応性タンパク質（４．５倍および５．６倍）における増大により、８日目までに部分
的に回復した。インターロイキン（ＩＬ）−６における増大は、低および高用量免疫原性
組成物群において、１日目、３時間目（８．３倍〜１２７．２倍の個々の値、１日目、０
時間目、用量応答）および３６日目、３時間目（９．４倍〜３９．５倍の個々の値、３６
日目、０時間目）において観察された。他のサイトカイン類（ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、
インターフェロン誘導性タンパク質（ＩＰ−１０）および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）
では変化は観察されなかった。これらの急性期タンパク質およびサイトカインにおける増
大は、外来抗原の投与に対する予想された正常な生理的応答の一部であった。これらの臨
床病理パラメーターにおけるＰＦ−０６４２５０９５に関連する、またはアジュバントに
関連する変化は、回復期には存在しなかった（サイトカイン類は回復期の間は評価されな
かった）。加えて、注射部位において局在性の変化が存在し、それはアジュバント対照群
ならびに低および高用量免疫原性組成物群において類似の発生率および重症度であり；従
ってそれらはＰＦ−０６４２５０９５に直接関連していなかった。投与期の間、その変化
にはマクロファージの浸潤による筋線維の分離を特徴とする最小限〜中程度の慢性活動性
炎症が含まれ、それはしばしば好塩基性粒状物質（アルミニウム含有アジュバントと解釈
される）、リンパ球、形質細胞、好中球、好酸球、壊死性残屑、および浮腫を含有してい
た。その好塩基性粒状物質は、これらの慢性活動性炎症の病巣内で細胞外にも存在してい
た。回復期の終了時に、最小限〜中程度の慢性炎症および単核細胞の浸潤、ならびに最小
限の線維化が存在していた。これらの注射部位の所見は、そのアジュバントに対する局所
的な炎症反応を表す。他の顕微鏡的変化には、腸骨（流入領域）リンパ節における最小限
〜中程度の増大したリンパ系細胞充実度および脾臓中の胚中心における最小限の増大した
細胞充実度が含まれ、それはアジュバント対照群ならびに低および高用量免疫原性組成物
群において投与期の間に気付かれた。回復期の終了時に、これらの顕微鏡的所見はより低
い重症度であった。これらの作用は抗原刺激に対する免疫応答を表しており、アジュバン
トまたはＰＦ−０６４２５０９５に対する薬理学的応答であった。抗ＤＮＡ抗体における
試験物に関連する増大はなかった。
【０６２２】
不都合な所見の非存在に基づいて、この試験における最大無毒性量（ＮＯＡＥＬ）は、
４回の投与に関して２回の０．５ｍＬの注射として投与された高用量免疫原性組成物群（
０．４ｍｇのＰＦ−０６４２５０９５としての三重変異体毒素Ａ原薬および三重変異体毒
素Ｂ原薬／投与）である。
【０６２３】
実施例４４：ハムスターに受動的に移された血清陽性ＮＨＰの有効性
５匹のシリアンゴールデンハムスターの群に、正常な腸内細菌叢を崩壊させるためにク
リンダマイシン抗生物質の経口用量（３０ｍｇ／ｋｇ）を投与した。５日後、そのハムス
ターに野生型Ｃ．ディフィシルの芽胞（６３０株、動物あたり１００ｃｆｕ）の経口用量
で負荷を与え、表５１に従うＮＨＰ血清を腹腔内（ＩＰ）投与した。機序または理論によ
り束縛されるわけではないが、その芽胞による負荷後の疾患症状は典型的には負荷の約３
０〜４８時間後に開始を示す。
【０６２４】
そのハムスターに投与されたＮＨＰ血清は、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸと共に配合された変
異体毒素Ａ原薬および変異体毒素Ｂ原薬（１０：１０、１０：５０、および１０：１００
Ａ：Ｂの比率）による３回の免疫処置後に最も高い力価を示しているＮＨＰ血清試料（
抗毒素Ａ血清および抗毒素Ｂ血清）からプールされた（実施例４２、表４９、および表５
０を参照）。そのＮＨＰ血清は、実施例４２において記述されたように、５、６、および
８週目の時点（免疫処置は０、２、および４週目に行われた）から収集された。結果を下
記の表５２〜５４において示す。記号“＋”は、不応答動物である３番の動物を含まない
幾何平均（ＧＭ）を（）中に示す。“＊ＴＢ”は最後の採血を表し、その日にその動物を
安楽死させ、それは全ての動物に関して同じではない。
【０６２５】
【表５８】
2018052938.tif 000068
【０６２６】
【表５９】
2018052938.tif 000069
【０６２７】
【表６０】
2018052938.tif 000070
【０６２８】
【表６１】
2018052938.tif 000071
【０６２９】
別の試験において、シリアンゴールデンハムスターに正常な腸内細菌叢を崩壊させるた
めにクリンダマイシン抗生物質の経口用量（３０ｍｇ／ｋｇ）を投与した。５日後、その
ハムスターに野生型Ｃ．ディフィシルの芽胞（６３０株、動物あたり１００ｃｆｕ）の経
口用量で負荷を与え、表５５に従うＮＨＰ血清を腹腔内（ＩＰ）投与した。機序または理
論により束縛されるわけではないが、その芽胞による負荷後の疾患症状は典型的には負荷
の約３０〜４８時間後に開始を示す。
【０６３０】
そのハムスターに投与されたＮＨＰ血清は、ＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌおよびＣｐＧ  ２４
５５５と共に配合された変異体毒素Ａ原薬および変異体毒素Ｂ原薬（１０：１０、１０：
５０、および１０：１００  Ａ：Ｂの比率）による３回の免疫処置後にＮＨＰから収集さ
れた試料からプールされた（実施例４２、表４９、および表５０を参照）。そのＮＨＰ血
清は、実施例４２において記述されたように、５、６、８、および１２週目の時点（ＮＨ
Ｐは０、２、および４週目に免疫された）から収集された。結果を下記の表５６〜５９に
おいて示す。ハムスターからの血清を阻止濃度（ＩＣ５０）の値を決定するためにさらに
調べ、それは上記で記述された毒素中和アッセイを用いて決定された。ハムスターにおい
て本発明のＣ．ディフィシル免疫原性組成物により誘導された毒素中和抗体のレベルは、
ＣＤＡＤの再発から保護されたようであったＭｅｒｃｋ／Ｍｅｄａｒｅｘ試験の対象にお
ける血清抗体レベルに匹敵する。
【０６３１】
【表６２】
2018052938.tif 000072
【０６３２】
【表６３】
2018052938.tif 000073
【０６３３】
【表６４】
2018052938.tif 000074
【０６３４】
【表６５】
2018052938.tif 000075
【０６３５】
【表６６−１】
2018052938.tif 000076
【０６３６】
【表６６−２】
2018052938.tif 000077
【０６３７】
実施例４５：変異体毒素原薬の特性付け
三重変異体毒素Ａの一次構造をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４において示す。ＳＥＱ  ＩＤ  
ＮＯ：４の１位におけるＮＨ２末端Ｍｅｔ残基はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２の開始コドン
に由来し、単離されたタンパク質には存在しない（例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４を参
照）。従って、実施例１２〜実施例４５において、“ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４”は最初の
（１位の）メチオニンが存在しないＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４を指す。精製された三重変異
体毒素Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）（原薬中間体−ロットＬ４４９９３−１３２）およ
びＥＤＣ／ＮＨＳ処理された三重変異体毒素Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）（“変異体毒
素Ａ原薬”−ロットＬ４４８９８−０１２）は両方ともＳＬＩＳＫＥＥＬＩＫＬＡＹＳＩ
（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の２〜１６位）で開始する単一のＮＨ２末端配列を示した。
【０６３８】
三重変異体毒素Ｂの一次構造をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６において示す。ＳＥＱ  ＩＤ  
ＮＯ：６の１位におけるＮＨ２末端Ｍｅｔ残基は開始コドンに由来し、単離されたタンパ
ク質には存在しない（例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６を参照）。従って、実施例１２〜
実施例４５において、“ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６”は最初の（１位の）メチオニンが存在
しないＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６を指す。精製された三重変異体毒素Ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎ
Ｏ：６）（原薬中間体−ロット０１０）およびＥＤＣ／ＮＨＳ処理された三重変異体毒素
Ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）（“変異体毒素Ｂ原薬”−ロットＬ４４９０６−１５３）
は両方ともＳＬＶＮＲＫＱＬＥＫＭＡＮＶＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６の２〜１６位）で
開始する単一のＮＨ２末端配列を示した。
【０６３９】
円二色性（ＣＤ）分光法を用いて、三重変異体Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）および変
異体毒素Ａ原薬の二次および三次構造を評価した。ＣＤ分光法を用いて、三重変異体Ｂ（
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）および変異体毒素Ｂ原薬の二次および三次構造も評価した。Ｃ
Ｄ分光法を用いて、ｐＨの構造に対する可能性のある作用も評価した。ＥＤＣ処理の三重
変異体毒素Ａへの作用を、変異体毒素Ａ原薬に関して得られたＣＤデータを三重変異体毒
素Ａに関して得られたデータと比較することにより分析した。ＥＤＣ処理の三重変異体毒
素Ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）への作用を、変異体毒素Ｂ原薬に関して得られたＣＤデ
ータを三重変異体毒素Ｂに関して得られたデータと比較することにより分析した。
【０６４０】
変異体毒素Ａ原薬の遠紫外ＣＤデータを様々なｐＨにおいて得た。ｐＨ５．０〜７．０
で記録されたスペクトルはその二次構造中のαヘリックスの高い割合を示しており、これ
はそのタンパク質のポリペプチド主鎖がαヘリックスに支配される十分に定められた（ｗ
ｅｌｌ−ｄｅｆｉｎｅｄ）立体構造をとっていることを示唆している。
【０６４１】
変異体毒素Ａ原薬の近紫外ＣＤスペクトルも得た。２６０〜３００ｎｍの強い負の楕円
率は、芳香族側鎖が唯一の固定した環境中にあること、すなわち変異体毒素Ａ原薬が三次
構造を有していることを示すものである。実際、個々の芳香族側鎖のタイプに起因する特
徴的な特徴をそのスペクトル内で識別することができる：約２９０ｎｍにおける肩および
約２８３ｎｍにおける最も大きな負のピークは規則正しいトリプトファン側鎖による偏光
の吸収によるものであり、２７６ｎｍにおける負のピークはチロシン側鎖からのものであ
り、２６２および２６８ｎｍにおける小さい肩は三次接触に参加しているフェニルアラニ
ン残基を示している。遠および近紫外の結果は、変異体毒素Ａ原薬が生理的ｐＨにおいて
コンパクトに折りたたまれた構造を保持している証拠を提供する。ｐＨ５．０〜７．０に
おいて観察されたほぼ同一の遠および近紫外ＣＤスペクトルは、このｐＨ範囲内では検出
可能な構造変化は起こっていないことを示している。ＣＤデータはｐＨ３．０および４．
０では収集することができず、これはそのタンパク質がこれらのｐＨ点では不溶性であっ
たためである。変異体毒素Ａ原薬の遠および近紫外ＣＤスペクトルの三重変異体毒素Ａの
遠および近紫外ＣＤスペクトルとの比較において、両方のタンパク質のスペクトルは試験
した実験条件の全ての下で本質的に同一であり、これはＥＤＣ処理が三重変異体毒素Ａの
二次および三次構造に検出可能な作用を有しなかったことを示している。この発見は、そ
れぞれストークス半径および沈降／摩擦係数において検出可能な変化を示さないゲル濾過
および分析用超遠心法の結果と一致している。
【０６４２】
変異体毒素Ａ原薬（ならびに三重変異体毒素Ａ）は２５個のトリプトファン残基を含有
し、それは一次配列全体にわたって分布しており、便利な内在性蛍光プローブの役目を果
たすことができる。温度の関数としての変異体毒素Ａ原薬の３００〜４００ｎｍの蛍光発
光スペクトルを得た。６．８℃において、変異体毒素Ａ原薬は２８０ｎｍでの励起の際に
特徴的なトリプトファン蛍光発光スペクトルを示す。蛍光発光最大値は約３３５ｎｍにお
いて観察され、これはトリプトファン残基が極性の水性環境ではなくタンパク質内部に典
型的な非極性の環境中にあることを示している。その蛍光発光スペクトルの結果は、この
報告で提供されるＣＤ実験の結果と合わせて、変異体毒素Ａ原薬がコンパクトに折りたた
まれた構造を保持していることを確証している。
【０６４３】
外来のプローブである８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸（８−ａｎｉｌｉｎｏ
−１−ｎａｐｈｔａｌｅｎｅ  ｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）（ＡＮＳ）の蛍光を用いて
、ｐＨにおける変化の際の変異体毒素Ａ原薬および三重変異体毒素Ａにおける可能性のあ
る立体構造変化を特性付けた。その結果から分かるように、変異体毒素Ａ原薬または三重
変異体毒素ＡのどちらをｐＨ７．０においてそのプローブで滴定した（ｔｉｔｒａｔｅｄ
）際にもＡＮＳ蛍光強度における増大は本質的に存在せず、これはこれらの条件下ではそ
のタンパク質上に疎水性表面は露出していないことを示唆している。ｐＨを２．６に変え
ることは、プローブの濃度における増大の際のＡＮＳ蛍光量子収率における、蛍光量子収
率が見かけ上の飽和に達するまでの劇的な増大をもたらす。このＡＮＳ蛍光量子収率にお
ける増大は、低いｐＨ（２．６）において、変異体毒素Ａ原薬および三重変異体毒素Ａの
両方が疎水性表面を露出させるｐＨに誘導される立体構造変化を起こすことを示している
。そのような立体構造変化は、三重変異体毒素ＡのＥＤＣに誘導される修飾および不活性
化は変異体毒素Ａ原薬（ＤＳ）の立体構造の柔軟性を制限しなかったことを示している。
【０６４４】
ＥＤＣ処理の三重変異体毒素Ａの水力学的特性への作用を、Ｇ４０００  ＳＷＸＬカラ
ム上でのサイズ排除クロマトグラフィーを用いて評価した。変異体毒素Ａ原薬および三重
変異体毒素Ａを、ｐＨ７．０、６．０、および５．０で平衡化したＧ４０００  ＳＷＸＬ
カラム上に注入した。そのデータは、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて変異体毒素
Ａ原薬および三重変異体毒素Ａのストークス半径における違いを検出することができなか
ったことを示している。従って、ＥＤＣ処理は三重変異体毒素Ａの水力学的特性およびそ
れに対応して全体的な分子の形状に劇的には影響を及ぼさなかった。
【０６４５】
三重変異体毒素Ａおよび変異体毒素Ａ原薬のさらなる分析を、多角度レーザー光散乱（
ＭＡＬＬＳ）技法を用いて実施した。三重変異体毒素ＡのＥＤＣによる処理は、結果とし
て様々な多量体および単量体の種からなる不均質な混合物の生成をもたらした。そのよう
な不均質性は、そのタンパク質のカルボキシルおよび第１級アミンの間の多数のＥＤＣに
誘導される分子間および分子内共有結合の導入を反映している。
【０６４６】
得られたデータは、三重変異体毒素Ａおよび変異体毒素Ａ原薬（ＥＤＣで処理された三
重変異体毒素Ａ）の物理的および化学的特徴を提供し、それらの一次、二次、および三次
構造の重要な特徴を記述している。生成されたデータは、三重変異体毒素ＡのＥＤＣによ
る処理は結果としてそのポリペプチド鎖の共有結合性修飾をもたらしたが、そのタンパク
質の二次および三次構造には影響を及ぼさなかったことを実証している。ＥＤＣによる処
理は分子内および分子間架橋をもたらす。変異体毒素Ａ原薬（ならびに三重変異体毒素Ａ
）に関して得られた生化学的および生物物理学的パラメーターを表６０において提供する
。
【０６４７】
【表６７】
2018052938.tif 000078
【０６４８】
変異体毒素Ｂ原薬の遠紫外ＣＤデータを様々なｐＨにおいて得た。ｐＨ５．０〜７．０
で記録されたスペクトルはその二次構造中のαヘリックスの高い割合を示しており、これ
はそのタンパク質のポリペプチド主鎖がαヘリックスに支配される十分に定められた（ｗ
ｅｌｌ−ｄｅｆｉｎｅｄ）立体構造をとっていることを示唆している。
【０６４９】
変異体毒素Ｂ原薬の近紫外ＣＤスペクトルも得た。２６０〜３００ｎｍの強い負の楕円
率は、芳香族側鎖が唯一の固定した環境中にあること、すなわち変異体毒素Ｂ原薬が三次
構造を有していることを示すものである。実際、個々の芳香族側鎖のタイプに起因する特
徴的な特徴をそのスペクトル内で識別することができる：約２９０ｎｍにおける肩および
約２８３ｎｍにおける最も大きな負のピークは規則正しいトリプトファン側鎖による偏光
の吸収によるものであり、２７６ｎｍにおける負のピークはチロシン側鎖からのものであ
り、２６２および２６８ｎｍにおける小さい肩は三次接触に参加しているフェニルアラニ
ン残基を示している。遠および近紫外ＣＤスペクトルは、変異体毒素Ｂ原薬が生理的ｐＨ
においてコンパクトに折りたたまれた構造を保持している証拠を提供する。ｐＨ５．０〜
７．０において観察された非常に類似した遠および近紫外ＣＤスペクトルは、このｐＨ範
囲内では検出可能な二次または三次の構造変化は起こっていないことを示している。ＣＤ
データはｐＨ３．０および４．０では収集することができず、これはそのタンパク質がこ
れらのｐＨ点では不溶性であったためである。
【０６５０】
変異体毒素Ｂ原薬の遠および近紫外ＣＤスペクトルの三重変異体毒素Ｂの遠および近紫
外ＣＤスペクトルとの比較において、両方のタンパク質のスペクトルはｐＨ５．０〜７．
０において非常に類似しており、これはＥＤＣ処理がそのタンパク質の二次および三次構
造に検出可能な作用を有しなかったことを示している。
【０６５１】
三重変異体毒素Ｂは１６個のトリプトファン残基を含有し、それは一次配列全体にわた
って分布しており、便利な内在性蛍光プローブの役目を果たすことができる。温度の関数
としての変異体毒素Ｂ原薬の３００〜４００ｎｍの蛍光発光スペクトルを得た。７℃にお
いて、変異体毒素Ｂ原薬は２８０ｎｍでの励起の際に特徴的なトリプトファン蛍光発光ス
ペクトルを示す。蛍光発光最大値は約３３５ｎｍにおいて観察され、これはトリプトファ
ン残基が極性の水性環境ではなくタンパク質内部に典型的な非極性の環境中にあることを
示している。この結果は、ＣＤ実験の結果（上記参照）と合わせて、変異体毒素Ｂ原薬が
コンパクトに折りたたまれた構造を保持していることを確証している。
【０６５２】
外来のプローブである８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸（８−ａｎｉｌｉｎｏ
−１−ｎａｐｈｔａｌｅｎｅ  ｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）（ＡＮＳ）の蛍光を用いて
、ｐＨにおける変化の際の変異体毒素Ｂ原薬および三重変異体毒素Ｂにおける可能性のあ
る立体構造変化を特性付けた。その結果から分かるように、変異体毒素Ｂ原薬または三重
変異体毒素ＢのどちらをｐＨ７．０においてそのプローブで滴定した（ｔｉｔｒａｔｅｄ
）際にもＡＮＳ蛍光強度における増大は本質的に存在せず、これはこれらの条件下ではそ
のタンパク質上に疎水性表面は露出していないことを示唆している。ｐＨを２．６に変え
ることは、変異体毒素Ｂ原薬の存在下でのプローブの濃度における増大の際のＡＮＳ蛍光
量子収率における、蛍光量子収率が見かけ上の飽和に達するまでの劇的な増大をもたらす
。このＡＮＳ蛍光量子収率における増大は、低いｐＨ（２．６）において、変異体毒素Ｂ
原薬が疎水性表面を露出させるｐＨに誘導される立体構造変化を起こすことを示している
。そのような立体構造変化は、三重変異体毒素ＢのＥＤＣに誘導される修飾および不活性
化は変異体毒素Ｂ原薬（ＤＳ）の立体構造の柔軟性を制限しなかったことを示している。
【０６５３】
ＥＤＣ処理の三重変異体毒素Ｂの水力学的特性への作用を、Ｇ４０００  ＳＷＸＬカラ
ム上でのサイズ排除クロマトグラフィーを用いて評価した。変異体毒素Ｂ原薬および三重
変異体毒素Ｂを、ｐＨ７．０、６．０、５．０で平衡化したＧ４０００  ＳＷＸＬカラム
上に注入した。そのデータは、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて変異体毒素Ｂ原薬
および三重変異体毒素Ｂのストークス半径における違いを検出することができなかったこ
とを示しており、従って、ＥＤＣ処理はそのタンパク質の水力学的特性およびそれに対応
して全体的な分子の形状に劇的には影響を及ぼさなかった。
【０６５４】
三重変異体毒素Ｂおよび変異体毒素Ｂ原薬のさらなる分析を、多角度レーザー光散乱（
ＭＡＬＬＳ）技法を用いて実施した。三重変異体毒素ＢのＥＤＣによる処理は、結果とし
て様々な多量体および単量体の種からなるより不均質な混合物の生成をもたらした。その
ような不均質性は、そのタンパク質のカルボキシルおよび第１級アミンの間の多数のＥＤ
Ｃに誘導される分子間および分子内共有結合の導入を反映している。
【０６５５】
得られたデータは、三重変異体毒素Ｂおよび変異体毒素Ｂ原薬（ＥＤＣで処理された三
重変異体毒素Ｂ）の物理的および化学的特徴を提供し、それらの一次、二次、および三次
構造の重要な特徴を記述している。生成されたデータは、三重変異体毒素ＢのＥＤＣによ
る処理は結果としてそのポリペプチド鎖の共有結合性修飾をもたらしたが、そのタンパク
質の二次および三次構造には影響を及ぼさなかったことを実証している。ＥＤＣによる処
理は分子内および分子間架橋をもたらす。変異体毒素Ｂ原薬（ならびに三重変異体毒素Ｂ
）に関して得られた主要な生化学的および生物物理学的パラメーターを表６１において提
供する。
【０６５６】
【表６８】
2018052938.tif 000079
【０６５７】
本発明の側面
以下の条項は、本発明の追加の態様を記述する：
Ｃ１．  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４で示されるアミノ酸配列が含まれる単離されたポリペ
プチドであって、１位のメチオニン残基が場合により存在せず、且つ該ポリペプチドに１
−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）およびＮ−ヒ
ドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）により化学的に修飾された少なくとも１個のアミノ酸
側鎖が含まれる、前記単離されたポリペプチド。
【０６５８】
Ｃ２．  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６で示されるアミノ酸配列が含まれる単離されたポリペ
プチドであって、１位のメチオニン残基が場合により存在せず、且つ該ポリペプチドに１
−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）およびＮ−ヒ
ドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）により化学的に修飾されたアミノ酸側鎖が含まれる、
前記単離されたポリペプチド。
【０６５９】
Ｃ３．  ポリペプチドのアスパラギン酸残基の少なくとも１個の側鎖またはポリペプチ
ドのグルタミン酸残基の少なくとも１個の側鎖がグリシンにより化学的に修飾されている
、条項Ｃ１またはＣ２に記載の単離されたポリペプチド。
【０６６０】
Ｃ４．  ポリペプチドに以下：
ａ）ポリペプチドのアスパラギン酸残基の側鎖およびポリペプチドのリシン酸残基の側
鎖の間の少なくとも１個の架橋；ならびに
ｂ）ポリペプチドのグルタミン酸残基の側鎖およびポリペプチドのリシン酸残基の側鎖
の間の少なくとも１個の架橋
が含まれる、条項Ｃ１〜Ｃ３のいずれかに記載の単離されたポリペプチド。
【０６６１】
Ｃ５．  ポリペプチドに該ポリペプチドの少なくとも１個のリシン残基の側鎖に連結さ
れたベータ−アラニン部分が含まれる、条項Ｃ１〜Ｃ４のいずれかに記載の単離されたポ
リペプチド。
【０６６２】
Ｃ６．  ポリペプチドに該ポリペプチドのアスパラギン酸残基の側鎖に、または該ポリ
ペプチドのグルタミン酸残基の側鎖に連結されたグリシン部分が含まれる、条項Ｃ４に記
載の単離されたポリペプチド。
【０６６３】
Ｃ７．  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４で示されるアミノ酸配列が含まれる単離されたポリペ
プチドであって、１位のメチオニン残基が場合により存在せず、且つ該ポリペプチドの少
なくとも１個のリシン残基の側鎖がベータ−アラニン部分に連結されている、前記単離さ
れたポリペプチド。
【０６６４】
Ｃ８．  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６で示されるアミノ酸配列が含まれる単離されたポリペ
プチドであって、１位のメチオニン残基が場合により存在せず、且つ該ポリペプチドの少
なくとも１個のリシン残基の側鎖がベータ−アラニン部分に連結されている、前記単離さ
れたポリペプチド。
【０６６５】
Ｃ９．  ポリペプチドの第２のリシン残基の側鎖がアスパラギン酸残基の側鎖に、また
はグルタミン酸残基の側鎖に連結されている、条項Ｃ７またはＣ８に記載の単離されたポ
リペプチド。
【０６６６】
Ｃ１０．  ポリペプチドのアスパラギン酸の側鎖またはグルタミン酸の側鎖がグリシン
部分に連結されている、条項Ｃ７〜Ｃ９のいずれかに記載の単離されたポリペプチド。
Ｃ１１．  ポリペプチドが少なくとも約１００μｇ／ｍｌのＥＣ５０を有する、条項Ｃ
１〜Ｃ１０のいずれかに記載の単離されたポリペプチド。
【０６６７】
Ｃ１２．  １位のメチオニン残基が場合により存在しない、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４で
示されるアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチド、および１位のメチオニン残基が
場合により存在しない、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６で示されるアミノ酸配列を有する単離さ
れたポリペプチドが含まれる免疫原性組成物であって、該ポリペプチドが１−エチル−３
−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスク
シンイミド（ＮＨＳ）により化学的に修飾された少なくとも１個のアミノ酸側鎖を有する
、前記免疫原性組成物。
【０６６８】
Ｃ１３．  ポリペプチドに以下：
ａ）該ポリペプチドのリシン残基の側鎖に連結された少なくとも１個のベータ−アラニ
ン部分；
ｂ）該ポリペプチドのリシン残基の側鎖およびアスパラギン酸残基の側鎖の間の少なく
とも１個の架橋；ならびに
ｃ）該ポリペプチドのリシン残基の側鎖およびグルタミン酸残基の側鎖の間の少なくと
も１個の架橋
のいずれかの少なくとも１が含まれる、条項Ｃ１２に記載の免疫原性組成物。
【０６６９】
Ｃ１４．  ポリペプチドが少なくとも約１００μｇ／ｍｌのＥＣ５０を有する、条項Ｃ
１２に記載の免疫原性組成物。
Ｃ１５．  １位のメチオニン残基が場合により存在しない、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４で
示されるアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチド、および１位のメチオニン残基が
場合により存在しない、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６で示されるアミノ酸配列を有する単離さ
れたポリペプチドが含まれる免疫原性組成物であって、且つ
ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の少なくとも１個のリシン残基の側鎖がベータ−アラニン
部分に連結されており、且つ
ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６の少なくとも１個のリシン残基の側鎖がベータ−アラニン
部分に連結されている、
前記免疫原性組成物。
【０６７０】
Ｃ１６．  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の第２のリシン残基の側鎖がアスパラギン酸残基の
側鎖に、またはグルタミン酸残基の側鎖に連結されており、且つＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６
の第２のリシン残基がアスパラギン酸残基の側鎖に、またはグルタミン酸残基の側鎖に連
結されている、条項Ｃ１５に記載の免疫原性組成物。
【０６７１】
Ｃ１７．  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドのア
スパラギン酸残基の側鎖またはグルタミン酸残基の側鎖がグリシン部分に連結されており
、１位のメチオニン残基が場合により存在しない、条項Ｃ１２〜Ｃ１６のいずれかに記載
の免疫原性組成物。
【０６７２】
Ｃ１８．  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドのア
スパラギン酸残基の側鎖またはグルタミン酸残基の側鎖がグリシン部分に連結されており
、１位のメチオニン残基が場合により存在しない、条項Ｃ１２〜Ｃ１６のいずれかに記載
の免疫原性組成物。
【０６７３】
Ｃ１９．  ポリペプチドが少なくとも約１００μｇ／ｍｌのＥＣ５０を有する、条項Ｃ
１２〜Ｃ１８のいずれかに記載の免疫原性組成物。
Ｃ２０．  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４で示されるアミノ酸配列を有する単離されたポリ
ペプチドおよびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６で示されるアミノ酸配列を有する単離されたポ
リペプチドが含まれる免疫原性組成物であって、それぞれのポリペプチドに以下：
ａ）該ポリペプチドのアスパラギン酸残基の側鎖および該ポリペプチドのリシン酸残基
の側鎖の間の少なくとも１個の架橋；
ｂ）該ポリペプチドのグルタミン酸残基の側鎖および該ポリペプチドのリシン酸残基の
側鎖の間の少なくとも１個の架橋；
ｃ）該ポリペプチドの少なくとも１個のリシン残基の側鎖に連結されたベータ−アラニ
ン部分；ならびに
ｄ）該ポリペプチドの少なくとも１個のアスパラギン酸残基の側鎖に、または該ポリペ
プチドの少なくとも１個のグルタミン酸残基の側鎖に連結されたグリシン部分
が含まれる、前記免疫原性組成物。
【０６７４】
Ｃ２１．  対応する野生型クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａと比較して少なくと
も１個の変異を有するグルコシルトランスフェラーゼドメイン、および少なくとも１個の
変異を有するシステインプロテアーゼドメインが含まれる、変異体クロストリジウム・デ
ィフィシル毒素Ａが含まれる免疫原性組成物。
【０６７５】
Ｃ２２．  変異が非保存的アミノ酸置換である、条項Ｃ２１に記載の組成物。
Ｃ２３．  置換にアラニン置換が含まれる、条項Ｃ２２に記載の組成物。
Ｃ２４．  野生型クロストリジウム・ディフィシル毒素ＡにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に
対して少なくとも９５％の同一性を有する配列が含まれる、条項Ｃ２１〜Ｃ２３のいずれ
かに記載の組成物。
【０６７６】
Ｃ２５．  野生型クロストリジウム・ディフィシル毒素ＡにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に
対して少なくとも９８％の同一性を有する配列が含まれる、条項Ｃ２４に記載の組成物。
Ｃ２６．  野生型クロストリジウム・ディフィシル毒素ＡにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１が
含まれる、条項Ｃ２５に記載の組成物。
【０６７７】
Ｃ２７．  グルコシルトランスフェラーゼドメインに少なくとも２個の変異が含まれる
、条項Ｃ２１〜Ｃ２６のいずれかに記載の組成物。
Ｃ２８．  少なくとも２個の変異がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の番号付けに従うアミノ酸
位置１０１、２６９、２７２、２８５、２８７、２６９、２７２、４６０、４６２、５４
１、または５４２に存在する、条項Ｃ２７に記載の組成物。
【０６７８】
Ｃ２９．  グルコシルトランスフェラーゼドメインにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９が含ま
れる、条項Ｃ２１〜Ｃ２６のいずれかに記載の組成物。
Ｃ３０．  グルコシルトランスフェラーゼドメインにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９のアミ
ノ酸位置１０１、２６９、２７２、２８５、２８７、２６９、２７２、４６０、４６２、
５４１、または５４２、またはそれらのあらゆる組み合わせに存在する少なくとも２個の
非保存的変異が含まれる、条項Ｃ２９に記載の組成物。
【０６７９】
Ｃ３１．  システインプロテアーゼドメインにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の番号付けに従
う７００、５８９、６５５、５４３位、またはそれらのあらゆる組み合わせに存在する変
異が含まれる、条項Ｃ２１〜Ｃ２６のいずれかに記載の組成物。
【０６８０】
Ｃ３２．  システインプロテアーゼドメインにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２が含まれる、
条項Ｃ２１〜Ｃ２６のいずれかに記載の組成物。
Ｃ３３．  システインプロテアーゼドメインにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２の１、４７、
１１３、１５８、またはそれらのあらゆる組み合わせに存在する非保存的変異が含まれる
、条項Ｃ３２に記載の組成物。
【０６８１】
Ｃ３４．  変異体クロストリジウム・ディフィシル毒素ＡにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４が
含まれる、条項Ｃ２１に記載の組成物。
Ｃ３５．  変異体クロストリジウム・ディフィシル毒素ＡにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４
が含まれる、条項Ｃ２１に記載の組成物。
【０６８２】
Ｃ３６．  変異体クロストリジウム・ディフィシル毒素ＡにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７が
含まれる、条項Ｃ２１に記載の組成物。
Ｃ３７．  変異体クロストリジウム・ディフィシル毒素ＡにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３
が含まれる、条項Ｃ２１に記載の組成物。
【０６８３】
Ｃ３８．  変異体クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａの少なくとも１個のアミノ酸
が化学的に架橋されている、条項Ｃ２１〜Ｃ３３のいずれかに記載の組成物。
Ｃ３９．  アミノ酸がホルムアルデヒドにより化学的に架橋されている、条項Ｃ３８に
記載の組成物。
【０６８４】
Ｃ４０．  アミノ酸が１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミ
ドにより化学的に架橋されている、条項Ｃ３８に記載の組成物。
Ｃ４１．  アミノ酸がＮ−ヒドロキシスクシンイミドにより化学的に架橋されている、
条項Ｃ３８またはＣ４０に記載の組成物。
【０６８５】
Ｃ４２．  組成物が抗毒素Ａ中和抗体またはその結合断片により認識される、条項Ｃ２
１〜Ｃ４１のいずれかに記載の組成物。
Ｃ４３．  対応する野生型のクロストリジウム・ディフィシル毒素Ａと比較して２８５
位および２８７位においてアミノ酸置換を有するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９が含まれるグ
ルコシルトランスフェラーゼドメインならびに１５８位においてアミノ酸置換を有するＳ
ＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２が含まれるシステインプロテアーゼドメインが含まれる変異体ク
ロストリジウム・ディフィシル毒素Ａが含まれる免疫原性組成物であって、該変異体クロ
ストリジウム・ディフィシル毒素Ａの少なくとも１個のアミノ酸が化学的に架橋されてい
る、前記免疫原性組成物。
【０６８６】
Ｃ４４．  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７が含まれる免疫原性
組成物であって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７の少なくとも１
個のアミノ酸が化学的に架橋されている、前記免疫原性組成物。
【０６８７】
Ｃ４５．  少なくとも１個のアミノ酸がホルムアルデヒドにより架橋されている、条項
Ｃ４３またはＣ４４に記載の組成物。
Ｃ４６．  少なくとも１個のアミノ酸が１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミドにより架橋されている、条項Ｃ４３またはＣ４４に記載の組成物。
【０６８８】
Ｃ４７．  少なくとも１個のアミノ酸がＮ−ヒドロキシスクシンイミドにより架橋され
ている、条項Ｃ４３、Ｃ４４、またはＣ４６に記載の組成物。
Ｃ４８．  組成物が抗毒素Ａ中和抗体またはその結合断片により認識される、条項Ｃ４
３またはＣ４４に記載の組成物。
【０６８９】
Ｃ４９．  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４が含まれる免疫原性組成物。
Ｃ５０．  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４が含まれる免疫原性組成物。
Ｃ５１．  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７が含まれる免疫原性組成物。
【０６９０】
Ｃ５２．  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３が含まれる免疫原性組成物。
Ｃ５３．  少なくとも１個のアミノ酸が化学的に架橋されている、条項Ｃ４９〜Ｃ５２
のいずれかに記載の組成物。
【０６９１】
Ｃ５４．  組成物が対応する野生型クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａと比較して
減少した細胞毒性を示す、条項Ｃ２１〜Ｃ５１のいずれかに記載の組成物。
Ｃ５５．  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４が含まれる単離されたポリペプチド。
【０６９２】
Ｃ５６．  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６が含まれる単離されたポリペプチド。
Ｃ５７．  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３が含まれる単離されたポリペプチド。
Ｃ５８．  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８５が含まれる単離されたポリペプチド。
【０６９３】
Ｃ５９．  対応する野生型クロストリジウム・ディフィシル毒素Ｂと比較して少なくと
も１個の変異を有するグルコシルトランスフェラーゼドメインおよび少なくとも１個の変
異を有するシステインプロテアーゼドメインが含まれる変異体クロストリジウム・ディフ
ィシル毒素Ｂが含まれる免疫原性組成物。
【０６９４】
Ｃ６０．  変異が非保存的アミノ酸置換である、条項Ｃ５９に記載の組成物。
Ｃ６１．  置換にアラニン置換が含まれる、条項Ｃ６０に記載の組成物。
Ｃ６２．  野生型クロストリジウム・ディフィシル毒素ＢにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に
対して少なくとも９５％の同一性を有する配列が含まれる、条項Ｃ５９〜Ｃ６１のいずれ
かに記載の組成物。
【０６９５】
Ｃ６３．  野生型クロストリジウム・ディフィシル毒素ＢにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に
対して少なくとも９８％の同一性を有する配列が含まれる、条項Ｃ６２に記載の組成物。
Ｃ６４．  野生型クロストリジウム・ディフィシル毒素ＢにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２が
含まれる、条項Ｃ６３に記載の組成物。
【０６９６】
Ｃ６５．  グルコシルトランスフェラーゼドメインに少なくとも２個の変異が含まれる
、条項Ｃ５９〜Ｃ６４のいずれかに記載の組成物。
Ｃ６６．  少なくとも２個の変異がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の番号付けに従うアミノ酸
位置１０２、２８６、２８８、２７０、２７３、３８４、４６１、４６３、５２０、また
は５４３に存在する、条項Ｃ６５に記載の組成物。
【０６９７】
Ｃ６７．  グルコシルトランスフェラーゼドメインにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１が含ま
れる、条項Ｃ５９〜Ｃ６４のいずれかに記載の組成物。
Ｃ６８．  グルコシルトランスフェラーゼドメインにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１のアミ
ノ酸位置１０２、２８６、２８８、２７０、２７３、３８４、４６１、４６３、５２０、
または５４３に存在する少なくとも２個の非保存的変異が含まれる、条項Ｃ６７に記載の
組成物。
【０６９８】
Ｃ６９．  システインプロテアーゼドメインにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の番号付けに従
う６９８、６５３、５８７、５４４位、またはそれらのあらゆる組み合わせに存在する変
異が含まれる、条項Ｃ５９〜Ｃ６４のいずれかに記載の組成物。
【０６９９】
Ｃ７０．  システインプロテアーゼドメインにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３が含まれる、
条項Ｃ５９〜Ｃ６４のいずれかに記載の組成物。
Ｃ７１．  システインプロテアーゼドメインにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３の１、４４、
１１０、１５５位、またはそれらのあらゆる組み合わせに存在する非保存的変異が含まれ
る、条項Ｃ７０に記載の組成物。
【０７００】
Ｃ７２．  変異体クロストリジウム・ディフィシル毒素ＢにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６が
含まれる、条項Ｃ５９に記載の組成物。
Ｃ７３．  変異体クロストリジウム・ディフィシル毒素ＢにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６
が含まれる、条項Ｃ５９に記載の組成物。
【０７０１】
Ｃ７４．  変異体クロストリジウム・ディフィシル毒素ＢにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８が
含まれる、条項Ｃ５９に記載の組成物。
Ｃ７５．  変異体クロストリジウム・ディフィシル毒素ＢにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８５
が含まれる、条項Ｃ５９に記載の組成物。
【０７０２】
Ｃ７６．  変異体クロストリジウム・ディフィシル毒素Ｂの少なくとも１個のアミノ酸
が化学的に架橋されている、条項Ｃ５９〜Ｃ７１のいずれかに記載の組成物。
Ｃ７７．  アミノ酸がホルムアルデヒドにより化学的に架橋されている、条項Ｃ７６に
記載の組成物。
【０７０３】
Ｃ７８．  アミノ酸が１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミ
ドにより化学的に架橋されている、条項Ｃ７６に記載の組成物。
Ｃ７９．  少なくとも１個のアミノ酸がＮ−ヒドロキシスクシンイミドにより架橋され
ている、条項Ｃ７６またはＣ７８に記載の組成物。
【０７０４】
Ｃ８０．  組成物が抗毒素Ｂ中和抗体またはその結合断片により認識される、条項Ｃ５
９〜Ｃ７９のいずれかに記載の組成物。
Ｃ８１．  対応する野生型のクロストリジウム・ディフィシル毒素Ｂと比較して２８６
位および２８８位においてアミノ酸置換を有するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１が含まれるグ
ルコシルトランスフェラーゼドメインならびに１５５位においてアミノ酸置換を有するＳ
ＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３が含まれるシステインプロテアーゼドメインが含まれる変異体ク
ロストリジウム・ディフィシル毒素Ｂが含まれる免疫原性組成物であって、該変異体クロ
ストリジウム・ディフィシル毒素Ｂの少なくとも１個のアミノ酸が化学的に架橋されてい
る、前記免疫原性組成物。
【０７０５】
Ｃ８２．  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８が含まれる免疫原性
組成物であって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８の少なくとも１
個のアミノ酸が化学的に架橋されている、前記免疫原性組成物。
【０７０６】
Ｃ８３．  少なくとも１個のアミノ酸がホルムアルデヒドにより架橋されている、条項
Ｃ８１またはＣ８２に記載の組成物。
Ｃ８４．  少なくとも１個のアミノ酸が１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミドにより架橋されている、条項Ｃ８１またはＣ８２に記載の組成物。
【０７０７】
Ｃ８５．  少なくとも１個のアミノ酸がＮ−ヒドロキシスクシンイミドにより架橋され
ている、条項Ｃ８１、Ｃ８２、またはＣ８４に記載の組成物。
Ｃ８６．  組成物が抗毒素Ｂ中和抗体またはその結合断片により認識される、条項Ｃ８
１またはＣ８２に記載の組成物。
【０７０８】
Ｃ８７．  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６が含まれる免疫原性組成物。
Ｃ８８．  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６が含まれる免疫原性組成物。
Ｃ８９．  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８が含まれる免疫原性組成物。
【０７０９】
Ｃ９０．  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８５が含まれる免疫原性組成物。
Ｃ９１．  組成物が対応する野生型クロストリジウム・ディフィシル毒素Ｂと比較して
減少した細胞毒性を示す、条項Ｃ５９〜Ｃ８９のいずれかに記載の組成物。
【０７１０】
Ｃ９２．  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４が含まれる免疫原性組成物およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎ
Ｏ：６が含まれる免疫原性組成物であって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４および６のそれぞれ
の少なくとも１個のアミノ酸が化学的に架橋されている、前記免疫原性組成物。
【０７１１】
Ｃ９３．  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４が含まれる免疫原性組成物およびＳＥＱ  ＩＤ  
ＮＯ：８６が含まれる免疫原性組成物であって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４および８６の
それぞれの少なくとも１個のアミノ酸が化学的に架橋されている、前記免疫原性組成物。
【０７１２】
Ｃ９４．  少なくとも１個のアミノ酸がホルムアルデヒドにより架橋されている、条項
Ｃ９２またはＣ９３に記載の組成物。
Ｃ９５．  少なくとも１個のアミノ酸が１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミドにより架橋されている、条項Ｃ９２またはＣ９３に記載の組成物。
【０７１３】
Ｃ９６．  少なくとも１個のアミノ酸がＮ−ヒドロキシスクシンイミドにより架橋され
ている、条項Ｃ９２、Ｃ９３、またはＣ９５に記載の組成物。
Ｃ９７．  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎ
Ｏ：１３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ
：４５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７が含まれる、組み
換え細胞またはその子孫。
【０７１４】
Ｃ９８．  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：
７、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８をコードする核酸配列が含まれる、組み換え細胞また
はその子孫。
【０７１５】
Ｃ９９．  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４をコードする核酸配列が含まれる、組み換え細胞
またはその子孫。
Ｃ１００．  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６をコードする核酸配列が含まれる、組み換え細
胞またはその子孫。
【０７１６】
Ｃ１０１．  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３をコードする核酸配列が含まれる、組み換え細
胞またはその子孫。
Ｃ１０２．  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８５をコードする核酸配列が含まれる、組み換え細
胞またはその子孫。
【０７１７】
Ｃ１０３．  前記の細胞がグラム陽性細菌細胞に由来する、条項Ｃ９７またはＣ９８に
記載の組み換え細胞。
Ｃ１０４．  細胞がクロストリジウム・ディフィシル細胞に由来する、条項Ｃ９７、Ｃ
９８、またはＣ９９に記載の組み換え細胞。
【０７１８】
Ｃ１０５．  細胞が毒素をコードする内在性ポリヌクレオチドを欠いている、条項Ｃ９
７〜Ｃ１０４のいずれかに記載の組み換え細胞。
Ｃ１０６．  細胞がクロストリジウム・ディフィシル１３５１、クロストリジウム・デ
ィフィシル３２３２、クロストリジウム・ディフィシル７３２２、クロストリジウム・デ
ィフィシル５０３６、クロストリジウム・ディフィシル４８１１、およびクロストリジウ
ム・ディフィシルＶＰＩ  １１１８６からなる群から選択されるクロストリジウム・ディ
フィシル細胞に由来する、条項Ｃ１０４またはＣ１０５のいずれかに記載の細胞。
【０７１９】
Ｃ１０７．  細胞がクロストリジウム・ディフィシルＶＰＩ  １１１８６細胞である、
条項Ｃ１０６に記載の細胞。
Ｃ１０８．  クロストリジウム・ディフィシル細胞の芽胞形成遺伝子が不活性化されて
いる、条項Ｃ１０６またはＣ１０７に記載の細胞。
【０７２０】
Ｃ１０９．  芽胞形成遺伝子にｓｐｏ０Ａ遺伝子またはｓｐｏＩＩＥ遺伝子が含まれる
、条項Ｃ１０８に記載の細胞。
Ｃ１１０．  組み換え細胞またはその子孫を変異体クロストリジウム・ディフィシル毒
素をコードするポリヌクレオチドを発現するための適切な条件下で培養することが含まれ
る、変異体クロストリジウム・ディフィシル毒素を生成する方法であって、該細胞に該変
異体クロストリジウム・ディフィシル毒素をコードするポリヌクレオチドが含まれ、且つ
該変異体に対応する野生型クロストリジウム・ディフィシル毒素と比較して少なくとも１
個の変異を有するグルコシルトランスフェラーゼドメインおよび少なくとも１個の変異を
有するシステインプロテアーゼドメインが含まれる、前記方法。
【０７２１】
Ｃ１１１．  細胞が毒素をコードする内在性ポリヌクレオチドを欠いている、条項Ｃ１
１０に記載の方法。
Ｃ１１２．  組み換え細胞またはその子孫に条項Ｃ９７〜Ｃ１１１のいずれかに記載の
細胞が含まれる、条項Ｃ１１０に記載の方法。
【０７２２】
Ｃ１１３．  さらに変異体クロストリジウム・ディフィシル毒素を単離することが含ま
れる、条項Ｃ１１０に記載の方法。
Ｃ１１４．  さらに単離された変異体クロストリジウム・ディフィシル毒素をホルムア
ルデヒドと接触させることが含まれる、条項Ｃ１１３に記載の方法。
【０７２３】
Ｃ１１５．  接触が最大で１４日間行われる、条項Ｃ１１４に記載の方法。
Ｃ１１６．  接触が最大で４８時間行われる、条項Ｃ１１５に記載の方法。
Ｃ１１７．  接触が約２５℃で行われる、条項Ｃ１１４に記載の方法。
【０７２４】
Ｃ１１８．  さらに単離された変異体クロストリジウム・ディフィシル毒素をエチル−
３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドと接触させることが含まれる、条項
Ｃ１１３に記載の方法。
【０７２５】
Ｃ１１９．  接触が最大で２４時間行われる、条項Ｃ１１８に記載の方法。
Ｃ１２０．  接触が最大で４時間行われる、条項Ｃ１２０に記載の方法。
Ｃ１２１．  接触が約２５℃で行われる、条項Ｃ１１８に記載の方法。
【０７２６】
Ｃ１２２．  さらに単離された変異体クロストリジウム・ディフィシル毒素をＮ−ヒド
ロキシスクシンイミドと接触させることが含まれる、条項Ｃ１１８に記載の方法。
Ｃ１２３．  条項Ｃ１１０〜Ｃ１２２のいずれかに記載の方法により生成された免疫原
性組成物。
【０７２７】
Ｃ１２４．  免疫原性組成物を哺乳類に投与することおよび該哺乳類から抗体を回収す
ることが含まれる、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａに対する中和抗体を生成する
方法であって、前記の免疫原性組成物にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４が含まれ、１位のメチオ
ニン残基が場合により存在せず、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の少なくとも１個のアミノ酸が
ホルムアルデヒド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、または１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル
）カルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドの組み合わせにより架橋されてい
る、前記方法。
【０７２８】
Ｃ１２５．  免疫原性組成物を哺乳類に投与することおよび該哺乳類から抗体を回収す
ることが含まれる、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａに対する中和抗体を生成する
方法であって、前記の免疫原性組成物にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４が含まれ、ＳＥＱ  Ｉ
Ｄ  ＮＯ：８４の少なくとも１個のアミノ酸がホルムアルデヒド、１−エチル−３−（３
−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、または１
−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシス
クシンイミドの組み合わせにより架橋されている、前記方法。
【０７２９】
Ｃ１２６．  免疫原性組成物を哺乳類に投与することおよび該哺乳類から抗体を回収す
ることが含まれる、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ｂに対する中和抗体を生成する
方法であって、前記の免疫原性組成物にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６が含まれ、１位のメチオ
ニン残基が場合により存在せず、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６の少なくとも１個のアミノ酸が
ホルムアルデヒド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、または１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル
）カルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドの組み合わせにより架橋されてい
る、前記方法。
【０７３０】
Ｃ１２７．  免疫原性組成物を哺乳類に投与することおよび該哺乳類から抗体を回収す
ることが含まれる、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａに対する中和抗体を生成する
方法であって、前記の免疫原性組成物にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６が含まれ、ＳＥＱ  Ｉ
Ｄ  ＮＯ：８６の少なくとも１個のアミノ酸がホルムアルデヒド、１−エチル−３−（３
−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、または１
−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシス
クシンイミドの組み合わせにより架橋されている、前記方法。
【０７３１】
Ｃ１２８．  免疫原性組成物に特異的な抗体またはその抗体結合断片であって、前記の
免疫原性組成物に１位のメチオニン残基が場合により存在しないＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４
または１位のメチオニン残基が場合により存在しないＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７が含まれる
、前記抗体またはその抗体結合断片。
【０７３２】
Ｃ１２９．  条項Ｃ１２８に記載の抗体またはその抗体結合断片であって、１位のメチ
オニン残基が場合により存在しないＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４または１位のメチオニン残基
が場合により存在しないＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７の少なくとも１個のアミノ酸がホルムア
ルデヒド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、Ｎ−ヒド
ロキシスクシンイミド、または１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボ
ジイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドの組み合わせにより架橋されている、前記
抗体またはその抗体結合断片。
【０７３３】
Ｃ１３０．  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１（ＣＤＲ  Ｈ１）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２
（ＣＤＲ  Ｈ２）およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３（ＣＤＲ  Ｈ３）で示される重鎖相補
性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８（ＣＤＲ  Ｌ
１）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９（ＣＤＲ  Ｌ２）およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０（Ｃ
ＤＲ  Ｌ３）で示される軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列が含まれる、抗体またはその抗体結合
断片。
【０７３４】
Ｃ１３１．  抗体またはその抗体結合断片にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７で示されるアミ
ノ酸配列が含まれる重鎖およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６で示されるアミノ酸配列が含ま
れる軽鎖が含まれる、条項Ｃ１２８、Ｃ１２９、またはＣ１３０に記載の抗体またはその
抗体結合断片。
【０７３５】
Ｃ１３２．  条項Ｃ１２８〜Ｃ１３１のいずれかに記載のいずれかから選択される２以
上の抗体またはその抗体結合断片の組み合わせが含まれる組成物。
Ｃ１３３．  免疫原性組成物に特異的な抗体またはその抗体結合断片であって、前記の
免疫原性組成物に１位のメチオニン残基が場合により存在しないＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６
または１位のメチオニン残基が場合により存在しないＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８が含まれる
、前記抗体またはその抗体結合断片。
【０７３６】
Ｃ１３４．  条項Ｃ１２３に記載の抗体またはその抗体結合断片であって、１位のメチ
オニン残基が場合により存在しないＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６または１位のメチオニン残基
が場合により存在しないＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８の少なくとも１個のアミノ酸がホルムア
ルデヒド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、Ｎ−ヒド
ロキシスクシンイミド、または１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボ
ジイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドの組み合わせにより架橋されている、前記
抗体またはその抗体結合断片。
【０７３７】
Ｃ１３５．  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１（ＣＤＲ  Ｈ１）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２
（ＣＤＲ  Ｈ２）およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３（ＣＤＲ  Ｈ３）において示される重
鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７（ＣＤ
Ｒ  Ｌ１）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８（ＣＤＲ  Ｌ２）およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５
９（ＣＤＲ  Ｌ３）において示される軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列が含まれる、抗体または
その抗体結合断片。
【０７３８】
Ｃ１３６．  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１（ＣＤＲ  Ｈ１）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２
（ＣＤＲ  Ｈ２）およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３（ＣＤＲ  Ｈ３）において示される重
鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８（ＣＤ
Ｒ  Ｌ１）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９（ＣＤＲ  Ｌ２）およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７
０（ＣＤＲ  Ｌ３）において示される軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列が含まれる、抗体または
その抗体結合断片。
【０７３９】
Ｃ１３７．  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３（ＣＤＲ  Ｈ１）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４
（ＣＤＲ  Ｈ２）およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７５（ＣＤＲ  Ｈ３）において示される重
鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９（ＣＤ
Ｒ  Ｌ１）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８０（ＣＤＲ  Ｌ２）およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８
１（ＣＤＲ  Ｌ３）において示される軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列が含まれる、抗体または
その抗体結合断片。
【０７４０】
Ｃ１３８．  条項Ｃ１３３〜Ｃ１３７のいずれかから選択される２以上の抗体またはそ
の抗体結合断片の組み合わせが含まれる組成物。
Ｃ１３９．  哺乳類においてクロストリジウム・ディフィシル感染症を処置する方法で
あって、該哺乳類に１位のメチオニン残基が場合により存在しないＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：
４が含まれる免疫原性組成物および１位のメチオニン残基が場合により存在しないＳＥＱ
ＩＤ  ＮＯ：６が含まれる免疫原性組成物を投与することが含まれ、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎ
Ｏ：４および６のそれぞれの少なくとも１個のアミノ酸がホルムアルデヒドにより架橋さ
れている、前記方法。
【０７４１】
Ｃ１４０．  哺乳類においてクロストリジウム・ディフィシル感染症を処置する方法で
あって、該哺乳類に１位のメチオニン残基が場合により存在しないＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：
４が含まれる免疫原性組成物および１位のメチオニン残基が場合により存在しないＳＥＱ
ＩＤ  ＮＯ：６が含まれる免疫原性組成物を投与することが含まれ、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎ
Ｏ：４およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のそれぞれの少なくとも１個のアミノ酸が１−エチ
ル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ド、または１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドおよびＮ−
ヒドロキシスクシンイミドの組み合わせにより架橋されている、前記方法。
【０７４２】
Ｃ１４１．  哺乳類においてクロストリジウム・ディフィシル感染症を処置する方法で
あって、該哺乳類にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４が含まれる免疫原性組成物およびＳＥＱ  
ＩＤ  ＮＯ：８６が含まれる免疫原性組成物を投与することが含まれ、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎ
Ｏ：８４およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６のそれぞれの少なくとも１個のアミノ酸が１−
エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスク
シンイミドにより架橋されている、前記方法。
【０７４３】
Ｃ１４２．  哺乳類においてクロストリジウム・ディフィシルに対する免疫応答を誘導
する方法であって、該哺乳類に１位のメチオニン残基が場合により存在しないＳＥＱ  Ｉ
Ｄ  ＮＯ：４が含まれる免疫原性組成物および１位のメチオニン残基が場合により存在し
ないＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６が含まれる免疫原性組成物を投与することが含まれ、ＳＥＱ
ＩＤ  ＮＯ：４およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のそれぞれの少なくとも１個のアミノ酸
がホルムアルデヒドにより架橋されている、前記方法。
【０７４４】
Ｃ１４３．  哺乳類においてクロストリジウム・ディフィシルに対する免疫応答を誘導
する方法であって、該哺乳類に１位のメチオニン残基が場合により存在しないＳＥＱ  Ｉ
Ｄ  ＮＯ：４が含まれる免疫原性組成物および１位のメチオニン残基が場合により存在し
ないＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６が含まれる免疫原性組成物を投与することが含まれ、ＳＥＱ
ＩＤ  ＮＯ：４およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のそれぞれの少なくとも１個のアミノ酸
が１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、Ｎ−ヒドロキシス
クシンイミド、または１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドの組み合わせにより架橋されている、前記方法。
【０７４５】
Ｃ１４４．  哺乳類においてクロストリジウム・ディフィシルに対する免疫応答を誘導
する方法であって、該哺乳類にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４が含まれる免疫原性組成物およ
びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６が含まれる免疫原性組成物を投与することが含まれ、ＳＥＱ
ＩＤ  ＮＯ：８４およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６のそれぞれの少なくとも１個のアミ
ノ酸が１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドおよびＮ−ヒド
ロキシスクシンイミドにより架橋されている、前記方法。
【０７４６】
Ｃ１４５．  哺乳類がそれを必要とする哺乳類である、条項Ｃ１３９〜Ｃ１４４のいず
れかに記載の方法。
Ｃ１４６．  哺乳類が再発性クロストリジウム・ディフィシル感染症を有する、条項Ｃ
１３９〜Ｃ１４４のいずれかに記載の方法。
【０７４７】
Ｃ１４７．  組成物が非経口投与される、条項Ｃ１３９〜Ｃ１４４のいずれかに記載の
方法。
Ｃ１４８．  組成物にさらにアジュバントが含まれる、条項Ｃ１３９〜Ｃ１４４のいず
れかに記載の方法。
【０７４８】
Ｃ１４９．  アジュバントにアルミニウムが含まれる、条項Ｃ１４８に記載の方法。
Ｃ１５０．  アジュバントに水酸化アルミニウムゲルおよびＣｐＧオリゴヌクレオチド
が含まれる、条項Ｃ１４８に記載の方法。
【０７４９】
Ｃ１５１．  アジュバントにＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）が含まれる、条項Ｃ１
４８に記載の方法。
【図１Ａ】
2018052938.tif 000080
【図１Ｂ】
2018052938.tif 000081
【図１Ｃ】
2018052938.tif 000082
【図１Ｄ】
2018052938.tif 000083
【図１Ｅ】
2018052938.tif 000084
【図１Ｆ】
2018052938.tif 000085
【図１Ｇ】
2018052938.tif 000086
【図１Ｈ】
2018052938.tif 000087
【図２Ａ】
2018052938.tif 000088
【図２Ｂ】
2018052938.tif 000089
【図２Ｃ】
2018052938.tif 000090
【図２Ｄ】
2018052938.tif 000091
【図２Ｅ】
2018052938.tif 000092
【図２Ｆ】
2018052938.tif 000093
【図３】
2018052938.tif 000094
【図４】
2018052938.tif 000095
【図５】
2018052938.tif 000096
【図６】
2018052938.tif 000097
【図７】
2018052938.tif 000098
【図８】
2018052938.tif 000099
【図９】
2018052938.tif 000100
【図１０】
2018052938.tif 000101
【図１１】
2018052938.tif 000102
【図１２】
2018052938.tif 000103
【図１３】
2018052938.tif 000104
【図１４】
2018052938.tif 000105
【図１５】
2018052938.tif 000106
【図１６Ａ】
2018052938.tif 000107
【図１６Ｂ】
2018052938.tif 000108
【図１７】
2018052938.tif 000109
【図１８】
2018052938.tif 000110
【図１９】
2018052938.tif 000111
【図２０Ａ】
2018052938.tif 000112
【図２０Ｂ】
2018052938.tif 000113
【図２０Ｃ】
2018052938.tif 000114
【図２１Ａ】
2018052938.tif 000115
【図２１Ｂ】
2018052938.tif 000116
【図２２】
2018052938.tif 000117
【図２３Ａ】
2018052938.tif 000118
【図２３Ｂ】
2018052938.tif 000119
【図２３Ｃ】
2018052938.tif 000120
【図２３Ｄ】
2018052938.tif 000121
【図２３Ｅ】
2018052938.tif 000122
【図２３Ｆ】
2018052938.tif 000123
【図２３Ｇ】
2018052938.tif 000124
【図２３Ｈ】
2018052938.tif 000125
【図２３Ｉ】
2018052938.tif 000126
【図２３Ｊ】
2018052938.tif 000127
【図２３Ｋ】
2018052938.tif 000128
【図２４】
2018052938.tif 000129
【図２５】
2018052938.tif 000130
【配列表】
2018052938000001.app