(57)【要約】      （修正有）【課題】特定のアセチルトランスフェラーゼを発現し、特定の構造を有するカロテノイドを産生することができる微生物の提供。【解決手段】特定のアミノ酸配列を有し、かつ、（ａ）少なくとも１つのβ−イオノンおよび／または少なくとも１つのε−イオノン環ならびに（ｂ）少なくとも１つの環結合ヒドロキシル基を有するカロテノイド分子を、対応する、部分的にまたは完全にアセチル化されたカロテノイド分子に変換する活性を有する、アセチルトランスフェラーゼを発現することができる形質転換微生物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、または配列番号１４のポリペプチド；
ｂ．アミノ酸の置換、挿入、または欠失によって、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、または配列番号１４から誘導され、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、または配列番号１４の配列とアミノ酸レベルで少なくとも５０％の相同性を有するポリペプチド
からなる群から選択されるアセチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
タンパク質が、（ａ）少なくとも１つのβ−イオノンおよび／または少なくとも１つのε−イオノン環ならびに（ｂ）少なくとも１つの環結合ヒドロキシル基を有するカロテノイド分子を、対応する、部分的にまたは完全にアセチル化されたカロテノイド分子に変換するための酵素活性を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記タンパク質が、ゼアキサンチン、アスタキサンチン、ルテイン、およびβ−クリプトキサンチンを、ゼアキサンチンモノまたはジアセタート、アスタキサンチンモノまたはジアセタート、ルテインモノまたはジアセタート、およびβ−クリプトキサンチンアセタートにそれぞれ変換するための酵素活性を有する、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
請求項１に記載のポリペプチドをコードする単離核酸。
【請求項５】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号１３において示される配列からなる、請求項４に記載の単離核酸。
【請求項６】
発現宿主細胞における前記ポリペプチドの産生を指示する１つ以上の（いくつかの）コントロール配列に作動可能に連結された、請求項４または５に記載のポリヌクレオチドを含む核酸構築物または発現ベクター。
【請求項７】
アセチルトランスフェラーゼ活性を有する少なくとも１つの異種ポリペプチドが発現される、カロテノイドを産生することができる形質転換微生物。
【請求項８】
請求項４もしくは５に記載の核酸または請求項６に記載の核酸構築物が発現される、請求項７に記載の形質転換微生物。
【請求項９】
カロテノイド代謝が野生型のものとは異なる、カロテノイドの産生のための請求項７または８に記載の形質転換微生物。
【請求項１０】
前記微生物が、油産生株である、請求項７〜９のいずれか一項に記載の形質転換微生物。
【請求項１１】
前記油産生株が、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の株である、請求項１０に記載の形質転換微生物。
【請求項１２】
前記微生物が、細菌である、請求項７〜９のいずれか一項に記載の形質転換微生物。
【請求項１３】
前記細菌株が、パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ）の株である、請求項１２に記載の形質転換微生物。
【請求項１４】
請求項７〜１３のいずれか一項に記載の形質転換微生物を産生するためのプロセスであって、１つ以上の調節シグナルに機能的に連結された、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号１３において示される配列からなる核酸または核酸構築物を導入するステップを含むプロセス。
【請求項１５】
カロテノイドの産生のための、請求項７〜１３のいずれか一項に記載の形質転換微生物の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の背景］
本発明は、新規なアセチルトランスフェラーゼ、そのためにコードする核酸配列、これらの配列を含む発現構築物およびベクター、それにより形質転換された微生物、ならびにゼアキサンチン、アスタキサンチン、ルテイン、またはβ−クリプトキサンチンに関するカロテノイドの微生物学的産生のためのプロセスに関する。
【０００２】
カロテノイドは、光合成生物（たとえば植物、藻類、シアノバクテリア）およびいくつかの真菌を含む、ある生物によって天然に産生される黄色から赤色までの色の範囲にわたる有機顔料である。
【０００３】
ルテイン、ゼアキサンチン、またはアスタキサンチンなどのカロテノイドは、着色物質およびビタミンＡ誘導体の前駆物質としてヒトおよび家畜の食物において重要な添加物となる。そのうえ、カロテノイドは、免疫応答の増強などの健康促進作用と、それらの酸化防止特性により、栄養補助食品としてのそれらの使用を興味深いものにする癌予防作用とを有する。カロテノイドおよびカロテノイド含有量を増加させた食品を調製する実利的なプロセスは、そのため、非常に重要である。カロテノイドを調製するための、特に実利的なプロセスは、カロテノイド生成生物からの、カロテノイド生合成のためのタンパク質および生合成遺伝子を利用する生物工学的プロセスである。
【０００４】
［発明の概要］
本発明は、それぞれ、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、もしくは配列番号１４のアミノ酸配列またはアミノ酸の置換、挿入、もしくは欠失によってこれらの配列から誘導され、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、もしくは配列番号１４の配列とアミノ酸レベルで少なくとも５０％の相同性を有する配列を含むタンパク質またはポリペプチドに関する。
【０００５】
本発明者らは、驚いたことに、たとえばゼアキサンチンまたはアスタキサンチンとして、少なくとも１つのヒドロキシル基を含有する特定のカロテノイドを産生することができる宿主細胞への本発明によるアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の組み込みが、宿主細胞におけるカロテノイドプロファイルを改変し、本発明によるタンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子により形質転換されていない株と比較して、細胞におけるカロテノイド化合物（アセチル化および非アセチル化形態）の蓄積の増加または増強を可能にする、カロテノイドのアセチル化形態が産生されることを発見した。
【０００６】
本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを含む核酸構築物、組換え発現ベクター、および組換え宿主細胞、ならびにポリペプチドを産生するための方法にも関する。
【０００７】
本発明はまた、改善された系、特に、アセチルトランスフェラーゼ活性を有する少なくとも１つの異種ポリペプチドが発現される、カロテノイドの生物学的産生のための形質転換微生物をも提供する。
【０００８】
好ましい一実施例では、本発明は、１つ以上のカロテノイドを産生する油産生真菌（たとえば酵母を含む）を提供する。本発明はまた、そのような酵母および真菌を構築する方法、カロテノイドを産生するためにそのような酵母および真菌を使用する方法、ならびにそのような油産生酵母または真菌において産生されたカロテノイドを使用して食品添加物もしくは飼料添加物または栄養補給剤などのカロテノイド含有組成物を調製する方法をも提供する。特に、本発明は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する酵母および真菌を生成するための系および方法を提供する。
【０００９】
［配列表の概要］
配列番号１は、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のアセチルトランスフェラーゼＡＴＦ１をコードする非最適化ＤＮＡ配列である。
【００１０】
配列番号２は、Ｓ．バヤヌス（Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ）由来のアセチルトランスフェラーゼＡＴＦ１をコードする非最適化ＤＮＡ配列である。
【００１１】
配列番号３は、Ｓ．ミカタエ（Ｓ．ｍｉｋａｔａｅ）由来のアセチルトランスフェラーゼＡＴＦ１をコードする非最適化ＤＮＡ配列である。
【００１２】
配列番号４は、Ｓ．クドリアブゼビ（Ｓ．ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ）由来のアセチルトランスフェラーゼＡＴＦ１の非最適化ＤＮＡ配列である。
【００１３】
配列番号５は、配列番号１から推定されるアミノ酸配列である。
【００１４】
配列番号６は、配列番号２から推定されるアミノ酸配列である。
【００１５】
配列番号７は、配列番号３から推定されるアミノ酸配列である。
【００１６】
配列番号８は、配列番号４から推定されるアミノ酸配列である。
【００１７】
配列番号９は、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における発現のために最適化されるＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のアセチルトランスフェラーゼＡＴＦ１をコードするＤＮＡ配列である。
【００１８】
配列番号１０は、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における発現のために最適化されるＳ．バヤヌス（Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ）由来のアセチルトランスフェラーゼＡＴＦ１をコードするＤＮＡ配列である。
【００１９】
配列番号１１は、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における発現のために最適化されるＳ．ミカタエ（Ｓ．ｍｉｋａｔａｅ）由来のアセチルトランスフェラーゼＡＴＦ１をコードするＤＮＡ配列である。
【００２０】
配列番号１２は、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における発現のために最適化されるＳ．クドリアブゼビ（Ｓ．ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ）由来のアセチルトランスフェラーゼＡＴＦ１をコードするＤＮＡ配列である。
【００２１】
配列番号１３は、Ｓ．アルボリコラス（Ｓ．ａｒｂｏｒｉｃｏｌｕｓ）由来のアセチルトランスフェラーゼＡＴＦ１をコードする非最適化ＤＮＡ配列である。
【００２２】
配列番号１４は、配列番号１３から推定されるアミノ酸配列である。
【００２３】
配列番号１５は、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における発現のために最適化されるＳ．アルボリコラス（Ｓ．ａｒｂｏｒｉｃｏｌｕｓ）由来のアセチルトランスフェラーゼＡＴＦ１をコードするＤＮＡ配列である。
【００２４】
配列番号１６は、Ｐ．デニトリフィカンス（Ｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）ＰＤ１２２２コドン使用頻度表を使用して、パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ）における発現のために最適化されるＳ．バヤヌス（Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ）由来のアセチルトランスフェラーゼＡＴＦ１をコードするＤＮＡ配列である。
【００２５】
配列番号１７は、Ｐ．デニトリフィカンス（Ｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）ＰＤ１２２２コドン使用頻度表を使用して、パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ）における発現のために最適化されるＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のアセチルトランスフェラーゼＡＴＦ１をコードするＤＮＡ配列である。
【００２６】
配列番号１８は、内部ＮｄｅＩ部位を除去した、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のアセチルトランスフェラーゼＡＴＦ１の非最適化ＤＮＡ配列である。
【００２７】
［定義］
単離ポリペプチド：用語「単離ポリペプチド」は、自然界に見つけられるそのポリペプチドに比べて、人の手によって修飾されるポリペプチドを意味する。一態様では、ポリペプチドが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定されるように、少なくとも１％純粋、たとえば少なくとも５％純粋、少なくとも１０％純粋、少なくとも２０％純粋、少なくとも４０％純粋、少なくとも６０％純粋、少なくとも８０％純粋、および少なくとも９０％純粋である。
【００２８】
実質的に純粋なポリペプチド：用語「実質的に純粋なポリペプチド」は、それが本来または組換えで関連している、多くても１０重量％、多くても８重量％、多くても６重量％、多くても５重量％、多くても４重量％、多くても３重量％、多くても２重量％、多くても１重量％、および多くても０．５重量％の他のポリペプチド材料しか含有しない調製物を意味する。好ましくは、ポリペプチドは、調製物中に存在する総ポリペプチド材料のうちで、少なくとも９２重量％純粋、たとえば少なくとも９４重量％純粋、少なくとも９５重量％純粋、少なくとも９６重量％純粋、少なくとも９７重量％純粋、少なくとも９８重量％純粋、少なくとも９９重量％純粋、少なくとも９９．５重量％純粋、および１００重量％純粋である。本発明のポリペプチドは、好ましくは、実質的に純粋な形態をしている。これは、たとえば、よく知られている組換え方法によってまたは古典的な精製方法によってポリペプチドを調製することによって達成することができる。
【００２９】
配列同一性：２つのアミノ酸配列の間のまたは２つのヌクレオチド配列の間の関連性は、パラメーター「配列同一性」によって説明される。
【００３０】
本発明の目的のために、２つのアミノ酸配列の間の配列同一性の程度は、好ましくはバージョン３．０．０以降のＥＭＢＯＳＳパッケージのＮｅｅｄｌｅプログラム（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６−２７７）に実装されるＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）を使用して決定される。使用される任意選択のパラメーターは、１０のギャップオープンペナルティー、０．５のギャップエクステンションペナルティー、およびＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。Ｎｅｅｄｌｅが表示する「最長の同一性（ｌｏｎｇｅｓｔ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを使用して得られる）の出力は、同一性パーセントとして使用され、以下のように計算される。
（同一残基×１００）／（アライメントの長さ−アライメント中のギャップの総数）
【００３１】
本発明の目的のために、２つのデオキシリボヌクレオチド配列の間の配列同一性の程度は、好ましくはバージョン３．０．０以降のＥＭＢＯＳＳパッケージのＮｅｅｄｌｅプログラム（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００、前掲）に実装されるＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０、前掲）を使用して決定される。使用される任意選択のパラメーターは、１０のギャップオープンペナルティー、０．５のギャップエクステンションペナルティー、およびＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ  ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。Ｎｅｅｄｌｅが表示する「最長の同一性」（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを使用して得られる）の出力は、同一性パーセントとして使用され、以下のように計算される。
（同一デオキシリボヌクレオチド×１００）／（アライメントの長さ−アライメント中のギャップの総数）
【００３２】
断片：用語「断片」は、成熟ポリペプチドのアミノおよび／またはカルボキシル末端から欠失した１つ以上の（いくつかの）アミノ酸を有するポリペプチドを意味する；ここで、断片はアセチルトランスフェラーゼ活性を有する。
【００３３】
対立遺伝子変異体：用語「対立遺伝子変異体」は、同じ染色体遺伝子座を占める遺伝子の２つ以上の代替形態のいずれかを意味する。対立遺伝子の変異は、突然変異を通して天然に発生し、集団内で多型をもたらし得る。遺伝子突然変異は、サイレントとすることができ（コードポリペプチドにおいて変化はない）、または改変アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしてもよい。ポリペプチドの対立遺伝子変異体は、遺伝子の対立遺伝子変異体によってコードされるポリペプチドである。
【００３４】
単離ポリヌクレオチド：用語「単離ポリヌクレオチド」は、自然界に見つけられるそのポリヌクレオチドに比べて、人の手によって修飾されるポリヌクレオチドを意味する。一態様では、単離ポリヌクレオチドが、アガロース電気泳動法によって決定されるように、少なくとも１％純粋、たとえば少なくとも５％純粋、少なくとも１０％純粋、少なくとも２０％純粋、少なくとも４０％純粋、少なくとも６０％純粋、少なくとも８０％純粋、少なくとも９０％純粋、および少なくとも９５％純粋である。ポリヌクレオチドは、ゲノム、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、半合成、合成起源、またはその任意の組み合わせであってもよい。
【００３５】
実質的に純粋なポリヌクレオチド：用語「実質的に純粋なポリヌクレオチド」は、他の外来のまたは望まれないヌクレオチドがない、遺伝子操作されたポリペプチド産生系内での使用に適した形態をしているポリヌクレオチド調製物を意味する。したがって、実質的に純粋なポリヌクレオチドは、それが本来または組換えで関連している、多くても１０重量％、多くても８重量％、多くても６重量％、多くても５重量％、多くても４重量％、多くても３重量％、多くても２重量％、多くても１重量％、および多くても０．５重量％の他のポリヌクレオチド材料しか含有しない。しかしながら、実質的に純粋なポリヌクレオチドは、プロモーターおよびターミネーターなど、天然に存在する５’および３’非翻訳領域を含んでいてもよい。好ましくは、ポリヌクレオチドは、少なくとも９０重量％純粋、たとえば少なくとも９２重量％純粋、少なくとも９４重量％純粋、少なくとも９５重量％純粋、少なくとも９６重量％純粋、少なくとも９７重量％純粋、少なくとも９８重量％純粋、少なくとも９９重量％純粋、および少なくとも９９．５重量％純粋である。本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは、実質的に純粋な形態をしている。
【００３６】
コード配列：用語「コード配列」は、ポリペプチドのアミノ酸配列を直接的に特定するポリヌクレオチドを意味する。コード配列の境界は、一般に、オープンリーディングフレームによって決定され、これは、通常、ＡＴＧ開始コドンまたはＧＴＧおよびＴＴＧなどの代替の開始コドンで始まり、ＴＡＡ、ＴＡＧ、およびＴＧＡなどの終止コドンで終了する。コード配列は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成、または組換えポリヌクレオチドであってもよい。
【００３７】
ｃＤＮＡ：用語「ｃＤＮＡ」は、真核細胞から得られる成熟、スプライス、ｍＲＮＡ分子から逆転写によって調製することができるＤＮＡ分子を意味する。ｃＤＮＡは、対応するゲノムＤＮＡ中に存在し得るイントロン配列を欠く。最初の一次ＲＮＡ転写物は、成熟スプライスｍＲＮＡとして現われる前に、スプライシングを含む一連のステップを通してプロセシングされる、ｍＲＮＡに対する前駆物質である。
【００３８】
核酸構築物：用語「核酸構築物」は、天然に存在する遺伝子から単離されるもしくはそうでなければ自然界に存在しないであろう形で核酸のセグメントを含有するように修飾されるまたは合成である、一本鎖または二本鎖の核酸分子を意味する。核酸構築物という用語は、核酸構築物が本発明のコード配列の発現に必要とされるコントロール配列を含有する場合、用語「発現カセット」と同義となる。
【００３９】
コントロール配列：用語「コントロール配列」は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現に必要な、すべての構成成分を意味する。それぞれのコントロール配列は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して本来のものもしくは外来性のものであってもよく、または互いに本来のものもしくは外来性のものであってもよい。そのようなコントロール配列は、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列、および転写ターミネーターを含むが、これらに限定されない。最低でも、コントロール配列は、プロモーターならびに転写および翻訳終止シグナルを含む。コントロール配列は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコード領域とのコントロール配列のライゲーションを容易にする特異的な制限部位を導入する目的のためにリンカーが提供されてもよい。
【００４０】
作動可能に連結された：用語「作動可能に連結された」は、コントロール配列がコード配列の発現を指示するように、コントロール配列がポリヌクレオチドのコード配列に関して適切な位置に配置される構成を意味する。
【００４１】
発現：用語「発現」は、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、および分泌を含むが、これらに限定されない、ポリペプチドの産生に関与する任意のステップを含む。
【００４２】
発現ベクター：用語「発現ベクター」は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、その発現をもたらすさらなるヌクレオチドに作動可能に連結された直鎖または環状ＤＮＡ分子を意味する。
【００４３】
宿主細胞：用語「宿主細胞」は、本発明のポリヌクレオチドを含む核酸構築物または発現ベクターによる形質転換、トランスフェクション、形質導入、接合、およびその他同種のものに感受性の任意の細胞型を意味する。用語「宿主細胞」は、複製の間に起こる突然変異により親細胞と同一でない、親細胞の任意の子孫を包含する。
【００４４】
変異体：用語「変異体」は、１つ以上の（いくつかの）位置に１つ以上の（いくつかの）アミノ酸残基の改変、すなわち置換、挿入、および／または欠失を含む、アセチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドを意味する。置換は、ある位置を占めるアミノ酸の、異なるアミノ酸との置換を意味し；欠失は、ある位置を占めるアミノ酸の除去を意味し；挿入は、ある位置を占めるアミノ酸に隣接して１〜３つのアミノ酸を追加することを意味する。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】株ＭＬ１１２１８におけるゼアキサンチン産生が発酵の初期に急激に増加し、次いで、ゼアキサンチン産生が終わるにつれて横ばい状態になることを示す。
【図２】Ｓｃ−ＡＴＦ１遺伝子のコピーを全く持たない株ＭＬ１２５６２と比較して、株ＭＬ１２７０７におけるアスタキサンチン産生の速度が、発酵の初期に、より高く、実行の終了時に、より高い力価に到達することを示す。
【図３】両方の株におけるゼアキサンチン産生が、発酵の初期に、類似する産生プロファイルを有するが、ＭＬ１１２１８における産生が横ばい状態になり、ゼアキサンチン産生が終わることを示す。
【図４】Ｓｂ−ＡＴＦ１遺伝子を持たない株ＭＬ１２５６２と比較して、株ＭＬ１２８１９におけるアスタキサンチン産生の速度が、類似するが、実行の終了時に、より高い力価に到達することを示す。
【図５】ＡＴＦ１を内部に持つ株が約１０％のモノアセチル化および約４％のジアセチル化ゼアキサンチンを産生したことを示す（全ゼアキサンチンのパーセンテージとして）。
【図６】この方法を使用するゼアキサンチン関連化合物についての典型的なクロマトグラムを示す。
【図７】上記の方法を使用するアスタキサンチン関連化合物についての典型的なクロマトグラムを示す。
【００４６】
［発明の詳細な説明］
以後のアセチルトランスフェラーゼは、カロテノイドまたは少なくとも１つのヒドロキシル基を含有するカロテノイド誘導体、たとえばゼアキサンチンまたはアスタキサンチンにアセチル基を転移し、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、もしくは配列番号１４のアミノ酸配列またはアミノ酸の置換、挿入、もしくは欠失によってこれらの配列から誘導され、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、もしくは配列番号１４の配列とアミノ酸レベルで少なくとも５０％の相同性を有する配列を含む本発明によるタンパク質または酵素を意味する。
【００４７】
配列番号５において示されるアミノ酸配列は、配列番号１において示されるｃＤＮＡ配列の翻訳から誘導され、配列番号６において示されるアミノ酸配列は、配列番号２において示されるｃＤＮＡ配列の翻訳から誘導され、配列番号７において示されるアミノ酸配列は、配列番号３において示されるｃＤＮＡ配列の翻訳から誘導され、配列番号８において示されるアミノ酸配列は、配列番号４において示されるｃＤＮＡ配列の翻訳から誘導され、配列番号１４において示されるアミノ酸配列は、配列番号１３において示されるｃＤＮＡ配列の翻訳から誘導される。
【００４８】
置換は、１つ以上のアミノ酸による１つ以上のアミノ酸の交換を意味する。交換は、好ましくは、保存的と呼ばれるものであり、交換されるアミノ酸は、もとのアミノ酸に類似する特性を有し、たとえば、ＡｓｐによるＧｌｕ、ＡｓｎによるＧｌｎ、ＩｌｅによるＶａｌ、ＩｌｅによるＬｅｕ、ＴｈｒによるＳｅｒの交換である。
【００４９】
欠失は、直接的な連結によるアミノ酸の交換である。欠失のための好ましい位置は、ポリペプチドの末端および個々のタンパク質ドメインの間の連結である。
【００５０】
挿入は、ポリペプチド鎖の中へのアミノ酸の導入であり、その点で、形式上、１つ以上のアミノ酸による直接的な連結の交換となる。
【００５１】
２つのタンパク質の間の相同性は、それぞれのタンパク質の全長にわたるアミノ酸の同一性を意味し、これは、以下のパラメーターを設定して、コンピュータープログラムＧＡＰの支援による比較によって計算される（ＵＷＧＣＧ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，ｐｒｏｇｒａｍ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｏｆ  Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９７０，４８：４４３−４５３）。
Ｇａｐ  Ｗｅｉｇｈｔ：１２
Ｌｅｎｇｔｈ  Ｗｅｉｇｈｔ：４
Ａｖｅｒａｇｅ  Ｍａｔｃｈ：２．９１２
Ａｖｅｒａｇｅ  Ｍｉｓｍａｔｃｈ：−２．００３
【００５２】
配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、または配列番号１４の配列とアミノ酸レベルで少なくとも５０％の相同性を有するタンパク質は、上記のセットのパラメーターによる上記のプログラムアルゴリズムを使用する配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、または配列番号１４の配列とのその配列の比較において、少なくとも５０％、好ましくは６０％、特に好ましくは７０％の同一性を有するタンパク質を意味する。
【００５３】
アセチルトランスフェラーゼは、天然のまたは遺伝的に操作された生物からのこれらのタンパク質をコードする適切な核酸の遺伝子発現によって、以後説明されるように、調製することができる。
【００５４】
本発明は、カロテノイドまたはたとえばゼアキサンチン、［ベータ］−クリプトキサンチン、３’−ヒドロキシエキネノン、３−ヒドロキシエキネノン、アドニキサンチン（４−ケトゼアキサンチン）、アスタキサンチン、フェニコキサンチン（アドニルビン）、［アルファ］−クリプトキサンチン、もしくはルテインまたは４０個までのＣ原子を有するその誘導体など、少なくとも１つのヒドロキシル基を含有するカロテノイド誘導体にアセチル基を転移するプロセスにさらに関する。好ましくは、そのようなカロテノイドまたはカロテノイド誘導体は、たとえば３−ヒドロキシ−６−ビニル−［ベータ］−イオノン、３−ヒドロキシ−４−ケト−６−ビニル−［ベータ］−イオノン、３−ヒドロキシレチノール、３−ヒドロキシ−４−ケトレチノール、３−ヒドロキシレチナール、３−ヒドロキシ−４−ケトレチナール、３−ヒドロキシレチン酸、３−ヒドロキシ−４−ケトレチン酸、またはルテインなど、分子中に少なくとも１つの３−ヒドロキシ−［ベータ］−イオノンまたは少なくとも１つの３−ヒドロキシ−４−ケト−［ベータ］−イオノンまたは少なくとも１つの３−ヒドロキシ−［イプシロン］−イオノンまたは少なくとも１つの３−ヒドロキシ−４−ケト−［イプシロン］−イオノン構造エレメントを含有する。
【００５５】
本発明はまた、本発明によるアセチルトランスフェラーゼの１つをコードする核酸配列にも関する。好ましい核酸は、配列番号１、ＳＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、配列番号３、配列番号４、または配列番号１３の配列を有する。
【００５６】
本発明は、個々のまたは複数のヌクレオチドの追加、置換、挿入、および／または欠失によって得られ、所望の特異性を有するアセチルトランスフェラーゼをさらにコードする、配列番号１、ＳＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、配列番号３、配列番号４、または配列番号１３の配列による核酸の機能的なアナログにさらに関する。
【００５７】
本発明はまた、いわゆるサイレント突然変異を含むまたは特定の起源または宿主生物のコドン使用頻度に従って、特に言及される配列と比較して修飾される核酸配列およびそのような核酸配列の天然に存在する変異体をも包含する。
【００５８】
本発明はまた、遺伝子コードの縮退によって得られる、核酸配列の修飾体（すなわち対応するアミノ酸配列においていかなる変化をも伴わない）または保存的ヌクレオチド置換（すなわち、対応するアミノ酸が、電荷、サイズ、極性、および／もしくは溶解性が同じである他のアミノ酸と交換される）ならびにヌクレオチド追加、挿入、逆位、または欠失によって修飾される配列をも包含し、これらの配列は、「修飾基質プロファイル」を有する、本発明によるアセチルトランスフェラーゼおよび対応する相補的配列をコードする。
【００５９】
本発明は、調節核酸配列の遺伝的コントロール下に本発明による核酸配列を含む発現構築物、およびこれらの発現構築物の少なくとも１つを含むベクターにさらに関する。
【００６０】
本発明はまた、組換え核酸分子にも関する。「組換え核酸分子」は、主として、核酸分子を指すか、または核酸配列は、２つ以上の異なる遺伝的供給源由来の核酸分子を含む。本発明によれば、組換え核酸分子は、発現構築物、すなわち、発現コントロール配列に適切に作用するように連結された、本発明によるアセチルトランスフェラーゼを有するポリペプチドをコードする核酸配列または宿主染色体の中に統合された同じ核酸配列とすることができる。
【００６１】
好ましくは、本発明による構築物は、対象コード配列の５’上流のプロモーターおよび３’下流のターミネーター配列ならびに任意選択で、さらに通常の調節エレメントを包含し、それぞれのケースで、コード配列と適切に作用するように連結される。適切に作用する連結は、調節エレメントのそれぞれが、コード配列の発現に際してその意図される機能を果たすことができるような形をした、プロモーター、コード配列、ターミネーター、および適切な場合、他の調節エレメントの一連の配置を意味するとして理解されたい。適切に作用するように連結することができる配列の例は、標的配列またはその他には翻訳エンハンサー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、およびその他同種のものである。さらなる調節エレメントは、選択マーカー、増幅シグナル、複製開始点、およびその他同種のものを包含する。
【００６２】
人工調節配列に加えて、天然の調節配列は、実際の構造遺伝子の上流になお存在することができる。必要な場合、この天然の調節は、遺伝子修飾によってスイッチを切られてもよく、遺伝子の発現は、増強させてもよいまたは低下させてもよい。しかしながら、遺伝子構築物はまた、構造がより単純であってもよい、すなわち、さらなる調節シグナルは、構造遺伝子の上流に挿入されず、それを調節する天然のプロモーターは除去されない。その代わりに、調節がもはや起こらず、遺伝子発現を増加させるまたは低下させるように、天然の調節配列を突然変異させる。核酸配列の１つ以上のコピーが遺伝子構築物中に存在してもよい。
【００６３】
適したプロモーターの例は、グラム陰性菌において有利に用いられるｃｏｓ、ｔａｃ、ｔｒｐ、ｔｅｔ、ｔｒｐ−ｔｅｔ、Ｉｐｐ、ｌａｃ、Ｉｐｐ−ｌａｃ、ｌａｃｌｑ、Ｔ７、Ｔ５、Ｔ３、ｇａｌ、ｔｒｃ、ａｒａ、ＳＰ６、ｌ−ＰＲ、またはｌ−ＰＬプロモーター；ならびにグラム陽性プロモーターａｍｙおよびＳＰＯ２、酵母プロモーターＡＤＣ１、ＭＦａ、Ａｃ、Ｐ−６０、ＣＹＣ１、ＧＡＰＤＨ、ＴＥＦ１または植物プロモーターＣａＭＶ／３５Ｓ、ＳＳＵ、ＯＣＳ、Ｉｉｂ４、ｕｓｐ、ＳＴＬＳ１、Ｂ３３、ｎｏｓまたはユビキチンもしくはファゼオリンプロモーターである。特に好ましくは、ＰｒＰ１プロモーターなどの誘発性プロモーター、たとえば光、特に、温度誘発性プロモーターの使用である。
【００６４】
原則として、それらの調節配列を有する天然のプロモーターはすべて使用することができる。そのうえ、合成プロモーターもまた、有利な方法で使用されてもよい。
【００６５】
上記に言及される調節配列は、核酸配列およびタンパク質発現の標的発現を可能にすることが意図される。宿主生物に依存して、これは、たとえば、誘発が起こった後のみ遺伝子が発現されるもしくは過剰発現されるまたはそれが即時におよび／もしくは恒常的に発現されるおよび／もしくは過剰発現されることを意味してもよい。
【００６６】
調節配列または因子は、好ましくは、発現に対して陽性の効果を有することができ、このように、後者を増加させるまたは低下させることができる。したがって、調節エレメントの増強は、プロモーターおよび／または「エンハンサー」などの強力な転写シグナルを使用することによって転写レベルで有利に行われてもよい。そのうえ、翻訳はまた、たとえばｍＲＮＡ安定性を改善することによって増強されてもよい。
【００６７】
発現カセットは、適したアセチルトランスフェラーゼヌクレオチド配列およびターミネーターシグナルまたはポリアデニル化シグナルと適したプロモーターを融合することによって生成される。この目的のために、通常の組換えおよびクローニング技術は、たとえばＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）およびＴ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｍ．Ｌ．Ｂｅｒｍａｎ  ａｎｄ  Ｌ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８４）およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）においてそれらが説明されるように、使用される。
【００６８】
適した宿主生物における発現については、組換え核酸構築物または遺伝子構築物は、宿主における最適な遺伝子発現を可能にする宿主特異的なベクターに有利に挿入される。ベクターは、当業者によく知られており、たとえば「Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ」（Ｐｏｕｗｅｌｓ  Ｐ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ−Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ−Ｏｘｆｏｒｄ，１９８５）において見ることができる。ベクターは、プラスミドだけではなく、たとえばファージ、ＳＶ４０、ＣＭＶ、バキュロウイルス、およびアデノウイルスなどのウイルス、トランスポゾン、ＩＳエレメント、プラスミド、コスミド、ならびに直鎖または環状ＤＮＡなど、当業者に知られている他のすべてのベクターもまた意味するとして理解されたい。これらのベクターは、宿主生物においてまたは染色体で自律的に複製することができる。
【００６９】
本発明によるベクターは、たとえば、本発明による少なくとも１つのベクターにより形質転換され、および突然変異体を産生するために使用することができる組換え微生物の生成を可能にする。本発明による上記の組換え構築物は、適した宿主生物の中に有利に導入され、発現される。対象の発現系における上述の核酸の発現をもたらすために当業者に知られている通常のクローニングおよびトランスフェクション方法を使用することが好ましい。適した系は、たとえばｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９７において記載される。
【００７０】
適した宿主生物は、原則として、本発明による核酸、それらの対立遺伝子変異体、およびそれらの機能的均等物または誘導体の発現を可能にするすべての生物である。好ましい出発生物（ｉｎｉｔｉａｌ  ｏｒｇａｎｉｓｍ）は、カロテノイドを天然に合成することができる生物である。しかしながら、カロテノイド生合成遺伝子の導入のためにカロテノイドを合成することができる出発生物もまた、適している。出発生物は、たとえば微生物または植物などの原核生物または真核生物を意味する。好ましい微生物は、細菌、酵母、藻類、または真菌である。
【００７１】
そのため、本発明は、下記に記載される遺伝子修飾生物を調製するためのプロセスにさらに関し、本発明によるアセチルトランスフェラーゼ遺伝子は、出発生物のゲノムの中に導入される。出発生物とは、本発明による遺伝子修飾の前の生物を意味する。
【００７２】
本発明によるアセチルトランスフェラーゼ遺伝子は、原則として、下記に記載される出発生物の中に、当業者に知られているすべての方法によって導入することができ、これらはそれによって遺伝子修飾される。
【００７３】
それらは、形質転換、トランスフェクション、接合、エレクトロポレーションによって、いわゆる粒子銃を使用して、またはマイクロインジェクションによって、出発生物またはその細胞の中に有利に導入される。
【００７４】
当業者は、テキストブックＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｏｌ．１  ，（１９９５），ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（ＩＳＢＮ  ０１９−９６３４７６−９）、Ｋａｉｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、またはＧｕｔｈｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９９４，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓにおいて微生物についての適切な方法を見つけることができる。
【００７５】
言及されてもよい有利な方法の例は、独国特許出願公開第１９８０１  １２０．２号明細書において記載されるように、たとえばＵＲＡ３遺伝子、特にアシュビア（Ａｓｈｂｙａ）由来のＵＲＡ３遺伝子を使用する相同もしくは非相同組換えによるおよび／または下記に記載されるＲＥＭＩ方法（＝「制限酵素媒介性の統合」）によるＤＮＡの導入などの方法である。
【００７６】
ＲＥＭＩ技術は、ある生物の中への、ＤＮＡ構築物のこの制限（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ）に使用された制限エンドヌクレアーゼとの、同じ制限エンドヌクレアーゼにより両端でカットされた直鎖ＤＮＡ構築物の同時形質転換に基づく。次いで、制限エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ構築物が制限酵素と一緒に導入された生物のゲノムＤＮＡをカットする。これは細胞自体の修復メカニズムの活性化に至る。これらの修復メカニズムは、エンドヌクレアーゼによって引き起こされたゲノムＤＮＡ中の鎖の切れ目を修復し、この間に、ゲノムの中に、ある頻度で、同時形質転換ＤＮＡ構築物をさらに組み込む。通常、制限切断部位は、この間にＤＮＡの両端に保持される。
【００７７】
この技術は、真菌の挿入突然変異誘発についてＢｏｅｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９９５，２４８：５４７−５５２）によって記載された。この方法は、非相同組換えがサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）にあるかどうかを見つけ出すために、Ｖｏｎ  Ｓｃｈｉｅｓｔｌ  ａｎｄ  Ｐｅｔｅｓ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９１，８８：７５８５−７５８９）によって使用された。この方法は、誘発性レポーター遺伝子の安定した形質転換および発現の調節について、Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９９６，２５１：７５−８０）によって記載された。
【００７８】
ＲＥＭＩ方法を使用して、ゲノム中の転写活性部位に本発明による核酸断片または本発明による前述のアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を位置させることが可能である。
【００７９】
ゲノムの中に導入されるＤＮＡ構築物の中に少なくとも１つのレポーター遺伝子と一緒に核酸をクローニングすることが可能であり、また、有利である。このレポーター遺伝子は、成長、蛍光、化学、もしくは生物発光アッセイによってまたは光度測定によって、検出性を容易にするはずである。レポーター遺伝子について言及されてもよい例は、抗生物質抵抗性遺伝子、ヒドロラーゼ遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子、生物発光遺伝子、グルコシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、［ベータ］−ガラクトシダーゼ遺伝子、ｇｆｐ遺伝子、リパーゼ遺伝子、エステラーゼ遺伝子、ペルオキシダーゼ遺伝子、［ベータ］−ラクタマーゼ遺伝子、アセチル−、ホスホ−、またはアデニルトランスフェラーゼ遺伝子である。これらの遺伝子は、転写活性、したがって遺伝子の発現を容易に測定し、定量化するのを可能にする。これは、生産性が２倍まで異なる、ゲノム中の部位を同定することが可能であることを意味する。
【００８０】
生物の中に、たとえば、カロテノイド生合成のさらなる遺伝子などの複数の遺伝子を導入することが意図される場合、それらはすべて、単一のベクター中にレポーター遺伝子と一緒に導入することができ、またはレポーター遺伝子を有するそれぞれの個々の遺伝子は、生物の中に、それぞれのケースで１つのベクター中に導入することができ、様々なベクターを同時にまたは連続的に導入することができる。ＲＥＭＩ技術を使用して、それぞれの活性をコードする遺伝子断片を挿入することもまた可能である。
【００８１】
出発生物のゲノムの中に本発明によるアセチルトランスフェラーゼ遺伝子または核酸構築物を統合するのに原則として適した制限酵素はすべて、当業者に知られている。制限切断部位として４つの塩基対しか認識しない制限酵素は、それらが、ゲノムまたは統合されることになっているベクターをあまりに頻繁に切り込むため、それほど好ましくなく、好ましい酵素は、可能な酵素のうちのほんの一部しか言及しないが、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢｇｌＩＩ、ＳｐｈＩ、ＳｐｅＩ、ＸｂａＩ、ＸｈｏＩ、ＮｃｏＩ、ＳａｌＩ、ＣｌａＩ、ＫｐｎＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳａｃＩ、ＰｓｔＩ、ＢｐｎＩ、ＮｏｔＩ、ＳｒｆＩ、またはＳｆｉＩなど、切断部位として６つ、７つ、８つ、またはそれを超える塩基対を認識する。使用される酵素が、導入されることになっているＤＮＡ中に切断部位をもはや有しない場合、有利であり、これは統合の効率を増加させる。通常、５〜５００Ｕ、好ましくは１０〜２５０、特に好ましくは１０〜１００Ｕの酵素が、ＲＥＭＩ混合物中に使用される。酵素は、スクロース、トレハロース、もしくはグルコースなどの糖、グリセロールもしくはポリエチレングリコールなどのポリオール、ｔｒｉｓ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、もしくはＰＩＰＥＳなど、ｐＨ５〜９、好ましくは６〜８、特に好ましくは７〜８の範囲の有利な緩衝作用を有するバッファーなど、浸透圧の安定化のための物質および／またはＭｇ、Ｃｕ、ＣＯ、Ｆｅ、Ｍｎ、もしくはＭｏの無機もしくは有機塩などの核酸を安定化する物質を含有する水溶液中で有利に用いられる。適切な場合、ＥＤＴＡ、ＥＤＤＡ、ＤＴＴ、［ベータ］−メルカプトエタノール、またはヌクレアーゼ阻害剤などの他の物質が存在することもまた、可能である。しかしながら、これらの追加を伴うことなくＲＥＭＩ技術を実行することもまた可能である。
【００８２】
プロセスは、５〜８０℃、好ましくは１０〜６０℃、特に好ましくは２０〜４０℃の範囲の温度で実行される。細胞膜を不安定化するための他の知られている方法は、たとえばエレクトロポレーション、負荷された小胞との融合、またはリチウム塩が好ましいが、リチウム塩、ルビジウム塩、もしくはカルシウム塩などの様々なアルカリ金属塩もしくはアルカリ土類金属塩による不安定化などのプロセスに適している。
【００８３】
本発明は、同様に遺伝子修飾された生物にさらに関し、本発明によるアセチルトランスフェラーゼ遺伝子の発現は、遺伝子修飾によって、出発生物がアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を含有するケースにおいて野生型生物と比較して増加しているか、または出発生物がアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を含有しないケースで引き起こされる。
【００８４】
遺伝子修飾生物は、本発明によるアセチルトランスフェラーゼ遺伝子または核酸構築物が、好ましくは上記に記載される方法のうちの１つによって挿入された生物を意味する。
【００８５】
遺伝子修飾生物は、本発明による少なくとも１つのアセチルトランスフェラーゼ遺伝子または本発明による少なくとも１つの核酸構築物を含有する。出発生物に依存して、核酸は染色体の内部にまたは外部に存在してもよい。
【００８６】
遺伝子修飾生物におけるカロテノイド代謝は、好ましくは、野生型と比較して改変される。
【００８７】
好ましい生物は、組換え細菌、植物、真菌、または酵母である。特定の実施形態では、組換え真菌は、それがその乾燥細胞重量の少なくとも約２０％まで脂質を蓄積することができるという点で油産生真菌であり；アンテラキサンチン、アドニルビン、アドニキサンチン、アスタキサンチン、カンタキサンチン、カプソルビン、β−クリプトキサンチン、α−カロテン、δ−カロテン、ε−カロテン、エキネノン、３−ヒドロキシエキネノン、３’−ヒドロキシエキネノン、γ−カロテン、ψ−カロテン、４−ケト−γ−カロテン、ζ−カロテン、α−クリプトキサンチン、β−クリプトキサンチン、デオキシフレキシキサンチン、ジアトキサンチン、７、８−ジデヒドロアスタキサンチン、ジデヒドロリコペン、フコキサンチン、フコキサンチノール、イソレニエラテン、β−イソレニエラテン、ラクツカキサンチン、ルテイン、リコピン、ミクソバクトン（ｍｙｘｏｂａｃｔｏｎｅ）、ネオキサンチン（ｎｅｏｘａｎｔｈｉｎ）、ノイロスポレン、ヒドロキシノイロスポレン、ペリジニン、フィトエン、ロドピン、ロドピングルコシド、４−ケトン−ルビキサンチン、シホナキサンチン、スフェロイデン、スフェロイデノン、スピリロキサンチン、トルレン、４−ケトン−トルレン、３−ヒドロキシ−４−ケトン−トルレン、ウリオリド、ウリオリドアセタート、ビオラキサンチン、ゼアキサンチン−β−ジグルコシド、ゼアキサンチン、Ｃ３０カロテノイド、およびその組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのカロテノイドを産生し、その乾燥細胞重量の少なくとも約１％まで、産生カロテノイドを蓄積することができる。さらにより好ましくは、組換え真菌は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ブラケスレア（Ｂｌａｋｅｓｌｅａ）、ボトリチス（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、セルコスポラ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、クスダマカビ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）（ジベレラ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ））、クリベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、リポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）、モルティエラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）、ケカビ（Ｍｕｃｏｒ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ヒゲカビ（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）（ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ））、プクキニア（Ｐｕｃｃｉｎｉａ）、フハイカビ（Ｐｙｔｈｉｕｍ）、ロドスポリディウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、スクレロティウム（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、キサントフィロマイセス（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ）（ファフィア（Ｐｈａｆｆｉａ））、およびヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）からなる群から選択される属のメンバーであり、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・��ガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、ブラケスレア・トリスポラ（Ｂｌａｋｅｓｌｅａ  ｔｒｉｓｐｏｒａ）、灰色かび病菌（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）、カンジダ・ジャポニカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）、カンジダ・プルチェリマ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）、カンジダ・レブカウフィ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｅｖｋａｕｆｉ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、カンジダ・ユチリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）、セルコスポラ・ニコチアナエ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ）、クリプトコッカス・カルバタス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓ）、クンニンハメラ・エキヌラタ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ  ｅｃｈｉｎｕｌａｔａ）、クンニンハメラ・エレガンズ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ  ｅｌｅｇａｎｓ）、フザリウム・フジクロイ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）（ジベレラ・ゼアエ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｚｅａｅ））、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、リポマイセス・スターキー（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｓｔａｒｋｅｙｉ）、リポマイセス・リポフェラス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｐｏｆｅｒｕｓ）、モルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）、モルティエラ・ラマニアナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｒａｍａｎｎｉａｎａ）、モルティエラ・イザベリナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｉｓａｂｅｌｌｉｎａ）、モルティエラ・ビナセア（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｖｉｎａｃｅａ）、ムーコル・シルシネロイデス（Ｍｕｃｏｒ  ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ）、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、フィコマイセス・ブラケスレアヌス（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ  ｂｌａｋｅｓｌｅａｎｕｓ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、プクキニア・ディスティンクタ（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｄｉｓｔｉｎｃｔａ）、フィチウム・イレギュラレ（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｉｒｒｅｇｕｌａｒｅ）、ロドスポリディウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）、ロドトルラ・グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ）、ロドトルラ・グラミニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）、ロドトルラ・ムチラギノーザ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ）、ロドトルラ・ピニコーラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｐｉｎｉｃｏｌａ）、ロドトルラ・グラシリス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、白絹病菌（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ  ｒｏｌｆｓｉｉ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、トリコスポロン・クタネウム（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｃｕｔａｎｅｕｍ）、トリコスポロン・プルランス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）、キサントフィロマイセス・デンドロアス（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ）（ファフィア・ロドザイマ（Ｐｈａｆｆｉａ  ｒｈｏｄｏｚｙｍａ））、およびヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）からなる群から選択される種である。
【００８８】
これらの天然に油産生の株のうちで、いくつかはまたカロテノイドをも天然に産生し、いくつかは産生しない；これらの株は、そのうえ、米国特許第７８５１１９９号明細書において開示されるカロテノイド生合成遺伝子の導入によって宿主細胞として利用されてもよい。
【００８９】
特定の実施形態では、組換え細菌が、グラム陰性または陽性である。グラム陽性細菌宿主は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ゲオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、およびストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）を含むが、これらに限定されない。グラム陰性菌は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、およびパラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）を含むが、これらに限定されない。組換え細菌宿主は、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、ブレビバチルス・ブレビス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・クラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・レンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、およびバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）を含むが、これらに限定されない、任意のバチルス目（Ｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）であってもよい。組換え細菌宿主はまた、ストレプトマイセス・アクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトマイセス・アベルミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）、およびストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）を含むが、これらに限定されない、任意のストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）であってもよい。組換え細菌宿主はまた、パラコッカス・デニトリフィカンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、パラコッカス・ベルスタス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｖｅｒｓｕｔｕ）、パラコッカス・カロチニファシエンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｃａｒｏｔｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ）、パラコッカス・マルクシイ（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｃｕｓｉｉ）、およびパラコッカス・ゼアキサンチニファシエンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ）を含むが、これらに限定されない、任意のパラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）であってもよい。組換え細菌は、アンテラキサンチン、アドニルビン、アドニキサンチン、アスタキサンチン、カンタキサンチン、カプソルビン、β−クリプトキサンチン、α−カロテン、δ−カロテン、ε−カロテン、エキネノン、３−ヒドロキシエキネノン、３’−ヒドロキシエキネノン、γ−カロテン、ψ−カロテン、４−ケト−γ−カロテン、ζ−カロテン、α−クリプトキサンチン、デオキシフレキシキサンチン、ジアトキサンチン、７、８−ジデヒドロアスタキサンチン、ジデヒドロリコペン、フコキサンチン、フコキサンチノール、イソレニエラテン、β−イソレニエラテン、ラクツカキサンチン、ルテイン、リコピン、ミクソバクトン（ｍｙｘｏｂａｃｔｏｎｅ）、ネオキサンチン（ｎｅｏｘａｎｔｈｉｎ）、ノイロスポレン、ヒドロキシノイロスポレン、ペリジニン、フィトエン、ロドピン、ロドピングルコシド、４−ケトン−ルビキサンチン、シホナキサンチン、スフェロイデン、スフェロイデノン、スピリロキサンチン、トルレン、４−ケトン−トルレン、３−ヒドロキシ−４−ケトン−トルレン、ウリオリド、ウリオリドアセタート、ビオラキサンチン、ゼアキサンチン−β−ジグルコシド、ゼアキサンチン、Ｃ３０カロテノイド、およびその組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのカロテノイドを産生する。
【００９０】
他の実施形態では、本発明は、カロテノイドを産生するための方法であって、カロテノイドの産生を可能にする条件下で真菌または細菌を培養するステップ；および産生されたカロテノイドを単離するステップを含む方法を提供する。
【００９１】
本発明による遺伝子修飾生物の培養は、適切な野生型の培養など、たとえば微生物の場合には、たとえば寒天プレート上などの適した培地においてもしくは浮遊培養においてまたは植物の場合には、土壌もしくは適宜適した培養液において、それ自体知られている方法で行われる。採取とは、微生物の場合には、微生物の単離および植物の場合には、植物または適切な場合、カロテノイドを含有する特定の植物の一部の切り取りを意味する。カロテノイドは、たとえば生物細胞の破壊、カロテノイドの抽出および抽出またはクロマトグラフィーなどの化学的または物理的分離方法によるカロテノイドの続く精製によって、それ自体知られている方法で単離される。
【００９２】
以下の実施例は、本発明を例証する。
【００９３】
［実施例］
下記の表１は、以下の例証において使用される、あるヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株を記載する。
【００９４】
【表１】
2018183139.tif 000002
【００９５】
ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株ＭＬ９８６３およびＭＬ９３３５は、米国特許第７，８５１，１９９号明細書において記載されるように、ＭＬ３５０およびＡＴＣＣ２０１２４９から始めて、数世代の異種交配を伴う、恒常的プロモーターのコントロール下での異種遺伝子の導入によって構築した。ＧＧＳ遺伝子および切断型ＨＭＧ遺伝子（「ＨＭＧ−ｔｒ」）は、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）配列に由来し、天然のゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼおよびヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子にそれぞれ対応する。ｃａｒＲＰおよびｃａｒＢ遺伝子は、ムーコル・シルシネロイデス（Ｍｕｃｏｒ  ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ）に由来し、それらは、二機能性のフィトエンシンターゼ／リコピンシクラーゼおよびフィトエンデヒドロゲナーゼをそれぞれコードする。ｃｒｔＷ遺伝子は、パルブラルキュラ・ベルムデンシス（Ｐａｒｖｕｌａｒｃｕｌａ  ｂｅｒｍｕｄｅｎｓｉｓ）のカロテンケトラーゼをコードするように合成した。ｃｒｔＺ遺伝子は、キサントバクター・オートトロフィカス（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ  ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）（Ｘａ）から増幅し、またはクロノバクター・パルベリス（Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｐｕｌｖｅｒｉｓ）（以前はエンテロバクター・パルベリス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｐｕｌｖｅｒｉｓ）として知られていた）（Ｅｐ）またはエンテロバクテリアセアエ・バクテリウム（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＤＣ４０４（Ｄｃ）のカロテンヒドロキシラーゼをコードするように合成した。これらの遺伝子は、常にではないが、時に、栄養要求性マーカー（ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＵＲＡ２、ＬＹＳ１、ＡＤＥ１）またはｌｏｘＰ部位、ＨｙｇＲもしくはＮａｔＲマーカーの残りに関連する。
【００９６】
【表２】
2018183139.tif 000003
【００９７】
本明細書において記載される基本的な分子生物学およびＤＮＡ操作手順はすべて、全般的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．またはＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ（ｅｄｓ）．１９８９．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．Ｅ．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｄ．Ｄ．Ｍｏｏｒｅ，Ｊ．Ｇ．Ｓｅｉｄｍａｎ，Ｊ．Ａ．Ｓｍｉｔｈ，Ｋ．Ｓｔｒｕｈｌ（ｅｄｓ．）．１９９８．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｗｉｌｅｙ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に従って実行する。
【００９８】
［実施例１ａ：Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アセチルトランスフェラーゼＡＴＦ１をコードするｐＭＢ６５３２の産生。］
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＡＴＦ１遺伝子は、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）コドンバイアスに従ってコドン最適化し、配列番号９において指定されるＤＮＡ断片をデノボ合成した。デノボ合成の間に、ＮｈｅＩ制限部位を含有する配列５’−ＴＧＣＴＡＧＣＣＡＣＡＡＡＡおよび効率的な翻訳を可能にするための典型的なコザック配列を、ＡＴＧのすぐ上流に追加した。ＭｌｕＩ制限部位を含む配列ＡＣＧＣＧＴ−３’を、終止コドンのすぐ下流に追加した。この配列は、ＮｈｅＩおよびＭｌｕＩを使用して切断し、ＮｈｅＩおよびＭｌｕＩによりカットしたｐＭＢ６１５７にライゲーションし、ｐＭＢ６５３２を産生した。ｐＭＢ６５３２のＳｃ−ＡＴＦ１遺伝子によってコードされる、結果として生じるタンパク質は、配列番号５において指定される。このプラスミドは、ＥｃｏＲＶにより続いて切断し、Ｓｃ−ＡＴＦ１含有カセットを、同じプラスミド由来の２．３５ｋｂ  ＳｓｐＩ−ＰｖｕＩＩ断片の挿入によって二倍にして、ＨｙｇＲマーカーの側面に位置するＳｃ−ＡＴＦ１の一点に集中する転写物をコードするｐＭＢ６５６３を作った。ノーセオトリシン（ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ）抵抗性を与えるＮａｔＲマーカーは、ＳｓｐＩおよびＢａｍＨＩによりｐＭＢ６５６３を切断し、ｐＭＢ６２００由来の１．３ｋｂ  ＳｓｐＩ−ＢａｍＨＩ断片にそれをライゲーションすることによって、このプラスミドにおけるＨｙｇＲを交換するために使用し、ｐＭＢ６６０８を作った。
【００９９】
［実施例１ｂ：ゼアキサンチンを産生することができるヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株の中へのＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アセチルトランスフェラーゼＡＴＦ１の導入］
株ＭＬ１１２１８は、恒常的プロモーターおよびハイグロマイシン抵抗性についての選択可能マーカー、ＨｙｇＲのコントロール下にＳｃ−ＡＴＦＩの２つのコピーを含むＭＢ６５６３のＰｖｕＩＩ断片により形質転換した。１０個のハイグロマイシン抵抗性形質転換体を、３０℃での成長の３〜４日後に形質転換プレート（ＹＰＤ＋１００ｍｇ／Ｌ  ハイグロマイシン）から選んだ。ほとんどの形質転換体は、３０℃で４日間ＹＰＤ中で成長させた場合に、１４〜１７％のモノアセチル化ゼアキサンチンおよび４２〜５７％のジアセチル化ゼアキサンチンを産生した（全ゼアキサンチンのパーセンテージとして）。遊離ゼアキサンチン産生は、全ゼアキサンチンの２７〜４２％の範囲にあった。ある株、ＭＬ１２６４１をさらなる遺伝子操作のために選んだ。
【０１００】
株ＭＬ１２６４１は、恒常的プロモーターおよびノーセオトリシンについての選択可能マーカー、ＮａｔＲのコントロール下にＳｃ−ＡＴＦＩの２つのコピーを含むＸｂａＩ処理ＭＢ６６０８により形質転換した。１０個のノーセオトリシン抵抗性形質転換体を、３０℃での成長の３〜４日後に形質転換プレート（ＹＰＤ＋１００ｍｇ／Ｌ  ノーセオトリシン）から選んだ。いくつかの形質転換体は、３０℃で４日間ＹＰＤ中で成長させた場合に、９〜１６％のモノアシル化および５６〜８０％のジアセチル化ゼアキサンチンを産生した（全ゼアキサンチンのパーセンテージとして）。遊離ゼアキサンチン産生は、全ゼアキサンチンの１１〜２８％の範囲にあった。ある株、ＭＬ１２７３５は、流加発酵槽におけるさらなる分析および培養のために選んだ。
【０１０１】
株ＭＬ１２７３５は、流加プロセスを使用して発酵槽において成長させた。全（遊離プラスエステル化）ゼアキサンチン産生は、Ｓｃ−ＡＴＦ１遺伝子のコピーを全く持たない株ＭＬ１１２１８と比較した場合に、２倍増加した。そのうえ、図１は、株ＭＬ１１２１８におけるゼアキサンチン産生が発酵の初期に急激に増加し、次いで、ゼアキサンチン産生が終わるにつれて横ばい状態になることを示す。対照的に、株ＭＬ１２７３５は、発酵プロセスの初期に、類似する産生プロファイルを有するが、ゼアキサンチン産生は、ＭＬ１１２１８が到達した限界を通り過ぎて増加し続け、発酵は、株ＭＬ１１２１８と異なり、長期間、その生産性を維持する。
【０１０２】
［実施例１ｃ：アスタキサンチンを産生することができるヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株の中へのＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アセチルトランスフェラーゼＡＴＦ１の導入］
株ＭＬ１２５２６は、ＸｂａＩにより処理したＭＢ６５６３（ＨｙｇＲマーカーの側面に位置するＡＴＦ１の一点に集中する転写物を含有する）により形質転換した。５個のハイグロマイシン抵抗性形質転換体を、３０℃での成長の３〜４日後に形質転換プレート（ＹＰＤ＋１００ｍｇ／Ｌ  ハイグロマイシン）から選んだ。３０℃でのＹＰＤ振盪フラスコにおける３〜４日間の続く成長の後に、形質転換体は、２２〜２９％のモノアセチル化および１６〜５６％のジアセチル化アスタキサンチンを産生した（全アスタキサンチンのパーセンテージとして）。遊離アスタキサンチン産生は、全アスタキサンチンの１９〜５９％の範囲にあった。ある株、ＭＬ１２７０７は、流加発酵槽におけるさらなる分析および培養のために選んだ。
【０１０３】
株ＭＬ１２７０７は、流加プロセスを使用して発酵槽において成長させた。図２は、Ｓｃ−ＡＴＦ１遺伝子のコピーを全く持たない株ＭＬ１２５６２と比較して、株ＭＬ１２７０７におけるアスタキサンチン産生の速度が、発酵の初期に、より高く、実行の終了時に、より高い力価に到達することを示す。
【０１０４】
［実施例２ａ：Ｓ．バヤヌス（Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ）、Ｓ．クドリアブゼビ（Ｓ．ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ）、およびＳ．アルボリコラス（Ｓ．ａｒｂｏｒｉｃｏｌｕｓ）アセチルトランスフェラーゼＡＴＦ１をそれぞれコードするｐＭＢ６７３２、ｐＭＢ６７３３、およびｐＭＢ６８１２の産生。］
プラスミドは、表２において記載されるように、様々なサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種由来のＡＴＦ１遺伝子の発現のために生成した。サッカロミセス・バヤヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｙａｎｕｓ）（Ｓｂ）、サッカロミセス・クドリアブゼビ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ）（Ｓｋ）、およびサッカロミセス・アルボリコラス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ａｒｂｏｒｉｃｏｌｕｓ）（Ｓｋ）のＡＴＦ１遺伝子は、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）コドンバイアスに従ってコドン最適化し、配列番号１０、１２、および１５においてそれぞれ指定されるＤＮＡ断片を、デノボ合成した。様々なＡＴＦ１遺伝子のデノボ合成の間に、ＮｈｅＩ制限部位を含有する配列５’−ＴＧＣＴＡＧＣＣＡＣＡＡＡＡおよび効率的な翻訳を可能にするための典型的なコザック配列を、ＡＴＧのすぐ上流に追加した。ＭｌｕＩ制限部位を含む配列ＡＣＧＣＧＴ−３’を、終止コドンのすぐ下流に追加した。配列は、ＮｈｅＩおよびＭｌｕＩを使用して切断し、ＮｈｅＩおよびＭｌｕＩによりカットしたｐＭＢ６１５７にライゲーションし、ｐＭＢ６７３２、ｐＭＢ６７３３、およびｐＭＢ６８１２をそれぞれ産生した。ｐＭＢ６７３２、ｐＭＢ６７３３、およびｐＭＢ６８１２のＡＴＦ１遺伝子によってコードされる、結果として生じるタンパク質は、配列番号６、８、および１４においてそれぞれ指定される。
【０１０５】
［実施例２ｂ：Ｓ．バヤヌス（Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ）アセチルトランスフェラーゼＡＴＦ１の２つのコピーを内部に持つｐＭＢ６８３２の産生］
Ｓ．バヤヌス（Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ）ＡＴＦ１はまた、恒常的プロモーターを持つ２つの他のベクター（ｐＭＢ６６５５およびｐＭＢ６６７４）の中にも、上記に記載されるように挿入し、ｐＭＢ６７６９およびｐＭＢ６７７１を作り、一方のカセットを持つｐＭＢ６７６９由来のＰｖｕＩＩ−ＳｓｐＩ断片の、他方のカセットおよびハイグロマイシン抵抗性マーカーを持つＥｃｏＲＶ切断ｐＭＢ６７７１の中への移転を介して、２つの別個のカセットを組み合わせ、ｐＭＢ６８３２を得た。
【０１０６】
［実施例２ｃ：ゼアキサンチンを産生することができるヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株の中へのＳ．バヤヌス（Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ）、Ｓ．クドリアブゼビ（Ｓ．ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ）、およびＳ．アルボリコラス（Ｓ．ａｒｂｏｒｉｃｏｌｕｓ）由来のアセチルトランスフェラーゼＡＴＦ１遺伝子の導入］
株ＭＬ１１２１８は、ＸｂａＩにより処理したＭＢ６７３２（Ｓｂ−ＡＴＦ１）、ＭＢ６７３３（Ｓｋ−ＡＴＦ１）、およびＭＢ６８１２（Ｓａ−ＡＴＦ１）により独立して形質転換した。それぞれのプラスミドの１０個のハイグロマイシン抵抗性形質転換体を、３０℃での成長の３〜４日後に形質転換プレート（ＹＰＤ＋１００ｍｇ／Ｌ  ハイグロマイシン）から選んだ。３０℃でのＹＰＤ振盪フラスコにおける３〜４日間の続く成長の後に、形質転換体はゼアキサンチン産生について分析し、コントロール株、ＭＬ１１２１８と比較した。Ｓ．バヤヌス（Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ）ＡＴＦ１（ｐＭＢ６７３２）を内部に持つ形質転換体は、４〜１６％のモノアセチル化ゼアキサンチンおよび４６〜８５％のジアセチル化ゼアキサンチンを産生した（全ゼアキサンチンのパーセンテージとして）。遊離ゼアキサンチン産生は、全ゼアキサンチンの８〜３８％の範囲にあった。Ｓ．クドリアブゼビ（Ｓ．ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ）ＡＴＦ１（ｐＭＢ６７３３）を内部に持つある形質転換体は、約３％のモノアセチル化ゼアキサンチンを産生し、ジアセチル化ゼアキサンチンは産生しなかった（全ゼアキサンチンのパーセンテージとして）。Ｓ．アルボリコラス（Ｓ．ａｒｂｏｒｉｃｏｌｕｓ）ＡＴＦ１（ｐＭＢ６８１２）を内部に持つ形質転換体は、２０〜２２％のモノアセチル化ゼアキサンチンおよび３０〜４５％のジアセチル化ゼアキサンチンを産生した（全ゼアキサンチンのパーセンテージとして）。遊離ゼアキサンチン産生は、全ゼアキサンチンの３４〜４９％の範囲にあった。
【０１０７】
Ｓ．バヤヌス（Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ）ＡＴＦ１は、さらなる研究のためにおよび発酵槽におけるそのアセチル化能力を調査するために選んだ。株ＭＬ１１２１８は、Ｓ．バヤヌス（Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ）ＡＴＦ１の２つのコピーを内部に持つｐＭＢ６８３２のＰｖｕＩＩ断片により形質転換した。６個のハイグロマイシン抵抗性形質転換体を、３０℃での成長の３〜４日後に形質転換プレート（ＹＰＤ＋１００ｍｇ／Ｌ  ハイグロマイシン）から選んだ。３０℃でのＹＰＤ振盪フラスコにおける３〜４日間の続く成長の後に、形質転換体は、５〜６％のモノアセチル化ゼアキサンチンおよび８３〜９０％のジアセチル化ゼアキサンチンを産生した（ゼアキサンチンのパーセンテージとして）。遊離ゼアキサンチン産生は、全ゼアキサンチンの４〜１４％の範囲にあった。ある株、ＭＬ１３１２９は、流加発酵槽におけるさらなる分析および培養のために選んだ。
【０１０８】
株ＭＬ１３１２９は、流加プロセスを使用して発酵槽において成長させた。全（遊離プラスエステル化）ゼアキサンチン産生は、Ｓｂ−ＡＴＦ１遺伝子のコピーを全く持たない株ＭＬ１１２１８と比較した場合に、１．８倍増加した。そのうえ、図３は、両方の株におけるゼアキサンチン産生が、発酵の初期に、類似する産生プロファイルを有するが、ＭＬ１１２１８における産生が横ばい状態になり、ゼアキサンチン産生が終わることを示す。対照的に、ゼアキサンチン産生は、ＭＬ１１２１８が到達した限界を通り過ぎて株ＭＬ１３１２９において増加し続け、そのレベルのほぼ２倍に近づく。
【０１０９】
［実施例２ｄ：アスタキサンチンを産生することができるヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株の中へのＳ．バヤヌス（Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ）およびＳ．クドリアブゼビ（Ｓ．ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ）由来のアセチルトランスフェラーゼＡＴＦ１遺伝子の導入］
株ＭＬ１２５２６は、ＸｂａＩにより処理したＭＢ６７３２（ＳｂＡＴＦ１）およびＭＢ６７３３（Ｓｋ−ＡＴＦ１）により独立して形質転換した。それぞれのプラスミドの１０個のハイグロマイシン抵抗性形質転換体を、３０℃での成長の３〜４日後に形質転換プレート（ＹＰＤ＋１００ｍｇ／Ｌ  ハイグロマイシン）から選んだ。３０℃でのＹＰＤ振盪フラスコにおける３〜４日間の続く成長の後に、形質転換体はアスタキサンチン産生について分析し、コントロール株、ＭＬ１２５２６と比較した。Ｓｂ−ＡＴＦ１プラスミドｐＭＢ６７３２を内部に持つ形質転換体は、１６〜３０％のモノアセチル化アスタキサンチンおよび５７〜７６％のジアセチル化アスタキサンチン（全アスタキサンチンのパーセンテージとして）を産生した。遊離アスタキサンチン産生は、全アスタキサンチンの８〜３７％の範囲にあった。Ｓｋ−ＡＴＦ１プラスミドｐＭＢ６７３３を内部に持つ形質転換体は、９〜２４％のモノアセチル化アスタキサンチンおよび１〜６％のジアセチル化アスタキサンチンを産生した（全アスタキサンチンのパーセンテージとして）。遊離アスタキサンチン産生は、全アスタキサンチンの７０〜９０％の範囲にあった。Ｓｂ−ＡＴＦ１プラスミドｐＭＢ６７３２を内部に持つある株、ＭＬ１２８１９は、流加発酵槽におけるさらなる分析および培養のために選んだ。株ＭＬ１２８１９は、流加プロセスを使用して発酵槽において成長させた。図４は、Ｓｂ−ＡＴＦ１遺伝子を持たない株ＭＬ１２５６２と比較して、株ＭＬ１２８１９におけるアスタキサンチン産生の速度が、類似するが、実行の終了時に、より高い力価に到達することを示す。
【０１１０】
［実施例３ａ：天然のおよびコドン最適化Ｓ．バヤヌス（Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ）およびＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＴＦ１をコードするｐＭＢ６９７６、ｐＭＢ６９７７、ｐＭＢ６９７８、およびｐＭＢ６９７９の産生］
Ｓ．バヤヌス（Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ）およびＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＴＦ１遺伝子は、パラコッカス・デニトリフィカンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｏｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）ＰＤ１２２２コドン使用頻度表を使用してパラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）種株Ｒ１１４／ｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−Ｒ１１４−ＰｃｒｔＥ−ｃｒｔＥＲ１１４における発現のためにコドン最適化し（米国特許出願公開第２００７０２０２５７９  Ａ１号明細書、米国特許第７２３２６７９  Ｂ２号明細書）、配列番号１６および配列番号１７においてそれぞれ指定されるＤＮＡ断片を、デノボ合成した。配列番号２および配列番号１８において指定される非コドン最適化Ｓ．バヤヌス（Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ）およびＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＴＦ１遺伝子もまた、デノボ合成した。野生型Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＴＦ１遺伝子は、デノボ合成の間に除去されたＮｄｅＩ部位を含有する。デノボ合成の間に、配列５’−ＣＡＴは、ＮｄｅＩ制限部位を作るためにＡＴＧのすぐ上流に追加した。ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を含む配列ＡＡＧＣＴＴ−３’は、終止コドンのすぐ下流に追加した。Ｓ．バヤヌス（Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ）およびＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＴＦ１のコドン最適化および非コドン最適化バージョンの両方は、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩにより切断したプラスミドｐＲＫ−ＰｃｒｔＥ−ｃｒｔＥ（ｐＲＫ４１５に由来、Ｋｅｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ．１９８８，７０：１９１−１９７）を使用して、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）のｃｒｔＥプロモーターのコントロール下にクローニングし、ｐＭＢ６９７６（Ｓｂ−ＡＴＦ１野生型）、ｐＭＢ６９７７（Ｓｃ−ＡＴＦ１野生型）、ｐＭＢ６９７８（コドン最適化Ｓｂ−ＡＴＦ１）、およびｐＭＢ６９７９（コドン最適化Ｓｃ−ＡＴＦ１）を産生した。ｐＭＢ６９７６およびｐＭＢ６９７８におけるＳｂ−ＡＴＦ１遺伝子によってコードされる、結果として生じるタンパク質は、配列番号６において指定される。ｐＭＢ６９７７およびｐＭＢ６９７９におけるＳｃ−ＡＴＦ１遺伝子によってコードされる、結果として生じるタンパク質は、配列番号５において指定される。
【０１１１】
下記の表３は、以下の例証において使用される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を記載する。
【０１１２】
【表３】
2018183139.tif 000004
【０１１３】
下記の表４は、以下の例証において使用されるパラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）株を記載する。
【０１１４】
【表４】
2018183139.tif 000005
【０１１５】
［実施例３ｂ：接合を介した、ゼアキサンチンを産生することができるパラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）株の中へのＳ．バヤヌス（Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ）およびＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＴＦ１の導入］
プラスミドｐＭＢ６９７５（ｐＲＫ４１５コントロールプラスミド）ならびに異なるＡＴＦ１遺伝子を内部に持つプラスミドｐＭＢ６９７６、ｐＭＢ６９７７、ｐＭＢ６９７８、およびｐＭＢ６９７９は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株Ｓ１７−１に形質転換し、株ＭＢ７７０６、ＭＢ７００７、ＭＢ７７０８、ＭＢ７７０９、およびＭＢ７７１０を産生した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株Ｓ１７−１はその染色体中に伝達遺伝子を含有する動員宿主（ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｈｏｓｔ）である。ベクターｐＲＫ４１５は、発現プラスミドとして使用され、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）の中にそれを移動させるのに必要な伝達遺伝子を内部に持つ。プラスミドｐＭＢ６９７５〜ｐＭＢ６９７９は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＭＢ７７０６〜ＭＢ７７１０との接合ならびに１００ｍｇ／Ｌ  リファンピシンおよび２．５ｍｇ／Ｌ  テトラサイクリンに対する選択を介してパラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）種株Ｒ１１４／ｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−Ｒ１１４−ＰｃｒｔＥ−ｃｒｔＥＲ１１４（ＲｉｆＲ）の中に個々に導入した。作られたパラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）接合完了体は、Ｒ１１４／ｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−Ｒ１１４−ＰｃｒｆＥ−ｃｒｆＥＲ１１４＋ｐＭＢ７００６、Ｒ１１４／ｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−Ｒ１１４−ＰｃｒｔＥ−ｃｒｔＥＲ１１４＋ｐＭＢ７００７、Ｒ１１４／ｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−Ｒ１１４−ＰｃｒｔＥ−ｃｒｔＥＲ１１４＋ｐＭＢ７００８、Ｒ１１４／ｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−Ｒ１１４−ＰｃｒｔＥ−ｃｒｔＥＲ１１４＋ｐＭＢ７００９、およびＲ１１４／ｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−Ｒ１１４−ＰｃｒｔＥ−ｃｒｔＥＲ１１４＋ｐＭＢ７０１０と命名した。
【０１１６】
異なるＡＴＦ１遺伝子を内部に持つ６つのパラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）接合完了体およびコントロールプラスミドを内部に持つ６つの接合完了体を選択し、Ｆ−培地（１０ｇ／ｌトリプトン、１０ｇ／ｌ酵母抽出物、３０ｇ／ｌ  ＮａＣｌ、１０ｇ／ｌ  Ｄ−グルコース、５ｇ／ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、ｐＨ７．０）上で２４時間、２００ｒｐｍで２８℃で成長させ、カロテノイド産生について分析した。１ミリリットルのブロスを採取し、遠心沈殿し、細胞ペレットは、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）サンプルについて記載されるようにカロテノイドを抽出した。最適化および非最適化Ｓ．バヤヌス（Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ）およびＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＴＦ１遺伝子を内部に持つすべてのパラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）株は、遊離ゼアキサンチン、β−クリプトキサンチン、およびカロテンに加えて、アセチル化ゼアキサンチンおよびβ−クリプトキサンチンを産生した。コントロール株、ＡＴＦ１を有していないＲ１１４／ｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−Ｒ１１４−ＰｃｒｆＥ−ｃｒｆＥＲ１１４＋ｐＭＢ７００６は、アセチル化ゼアキサンチンもアセチル化β−クリプトキサンチンも産生しない。
【０１１７】
Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来の野生型およびコドン最適化ＡＴＦ１遺伝子をそれぞれ内部に持つ２つの典型的なパラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）接合完了体、Ｒ１１４／ｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−Ｒ１１４−ＰｃｒｆＥ−ｃｒｆＥＲ１１４＋ｐＭＢ７００８−１１およびＲ１１４／ｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−Ｒ１１４−ＰｃｒｆＥ−ｃｒｆＥＲ１１４＋ｐＭＢ７０１０−９は、より詳細な分析およびコントロール株、Ｒ１１４／ｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−Ｒ１１４−ＰｃｒｆＥ−ｃｒｆＥＲ１１４＋ｐＭＢ７００６−１０に対する比較のために選んだ。株は、上記に記載されるようにＦ−培地上で成長させた。５００マイクロリットルの全ブロスを採取し、４８時間、凍結乾燥させた。カロテノイドは、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）サンプルについて記載されるように抽出し、分析した。図５は、ＡＴＦ１を内部に持つ株が約１０％のモノアセチル化および約４％のジアセチル化ゼアキサンチンを産生したことを示す（全ゼアキサンチンのパーセンテージとして）。ＡＴＦ１を内部に持つ株はまた、コントロール株よりも７４％および６５％のより多くのヒドロキシル化産物（アセチル化および遊離ゼアキサンチンおよびβ−クリプトキサンチン）を産生した（５５％および４３％のより多くの全ゼアキサンチン）。
【０１１８】
［実施例４：ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）およびパラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）細胞からの抽出およびＨＰＬＣによるカロテノイド産生の定量化］
生成された株の振盪フラスコ試験およびカロテノイド分析は、米国特許第７，８５１，１９９  Ｂ２号明細書において以前に記載される方法に従って実行した。
【０１１９】
ＨＰＬＣおよびＨＰＬＣ  ＤＡＤ  ＭＳによるヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）およびパラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｕｓ）由来のアセチル化カロテノイドの定量化のために、以下の方法を使用した。
【０１２０】
［順相カロテノイド方法］
Ｗａｔｅｒｓ  ７１７オートサンプラーに付けられたＷａｔｅｒｓ  １５２５バイナリポンプは、サンプルを注入するために使用した。セキュリティーシリカガードカラムキットを有するＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  ３μ  Ｓｉｌｉｃａ（２）、１５０×４．６ｍｍカラムは、カロテノイドを分離するために使用した。ＣａｒｏｔｅＮａｔｕｒｅ（ＧｍｂＨ、Ｉｍ  Ｂｕｄｌｅｒ  ８、ＣＨ−４４１９  Ｌｕｐｓｉｎｇｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から購入したまたはＤＳＭ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｌｔｄ．から得た合成カロテノイドサンプルは、標準試料として使用した。アスタキサンチンおよびゼアキサンチンのアセチル化化合物は、Ｋａｅｗｋｏｏｌａ  ａｎｄ  Ｋｒｉｓｎａｎｇｋｕｒａ，Ｃｈｅｍ  Ｐｈｙｓ  Ｌｉｐｉｄｓ．２０１０，１６３：６８５−６８８およびＫａｅｗｋｏｏｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．２００９，１１１：４７４−４８０において概説される実験に基づいて合成した。およそ１００ｍｇ／Ｌのカロテノイドを酢酸エチル中に溶解し、水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムのいずれかの過剰塩基を追加した。サンプルは、室温で暗中に置き、１〜５日間、定期的に分析した。次いで、合成アセチル化構成成分は、保持時間マーカーとして使用したが、定量化は、非アセチル化化合物に基づく。ゼアキサンチンおよびアスタキサンチン以外の他のすべてのアセチル化化合物は、ＵＶスペクトルの特徴のみによって同定した。移動相は、アスタキサンチン関連化合物については、１０００ｍＬヘキサン、３０ｍＬイソプロパノール、および０．１ｍＬ酢酸からなったまたはゼアキサンチン関連化合物については、１０００ｍＬヘキサン、６０ｍＬイソプロパノール、および０．１ｍＬ酢酸からなった。それぞれの実行についての流速は、毎分０．６ｍＬとした。カラム温度は、外界温度とした。注入体積は２０μＬとした。検出器は、２１０〜６００ｎｍを収集するフォトダイオードアレイ検出器とした。
【０１２１】
この方法を使用するゼアキサンチン関連化合物についての典型的なクロマトグラムを図６に示す。
１：カロテン
２：アセチル化β−クリプトキサンチン
３：ジアセチル化ゼアキサンチン
４：β−クリプトキサンチン
５：モノアセチル化ゼアキサンチン
６：ゼアキサンチン
【０１２２】
上記の方法を使用するアスタキサンチン関連化合物についての典型的なクロマトグラムを図７に示す。
１：カロテン
２：ジアセチル化アドニキサンチン
３：モノアセチル化アドニキサンチン
４：ジアセチル化アスタキサンチン
５：アドニルビン
６：モノアセチル化アスタキサンチン
７：アスタキサンチン
【０１２３】
［ＨＰＬＣ  ＤＡＤ  ＭＳ法］
ＨＰＬＣ  ＤＡＤ  ＭＳによるアセチル化ゼアキサンチンの決定のために、サンプルは、氷冷抽出溶媒（０．０１％ブチル−ヒドロキシ−トルエン（ＢＨＴ）を含有する、ヘキサンおよび酢酸エチルの５０／５０  ｖ／ｖミックス中に再懸濁した。Ｗａｔｅｒｓ  Ｘ−Ｂｒｉｄｇｅ  Ｃ１８カラム（３．５μｍ、２．１×５０ｍｍ）を備えたＡｌｌｉａｎｃｅ  ２７９５  ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ）システムおよびＴｈｅｒｍｏ  Ｂａｓｉｃ  ８ガードカラム（２．１×１０ｍｍ）を２５℃でカロテノイドを分離するために使用した。標準カロテノイドサンプルを標準物質として使用した。移動相および流速を下記に示す（溶媒Ａ＝酢酸エチル；溶媒Ｂ＝水；溶媒Ｃ＝メタノール；溶媒Ｄ＝アセトニトリル）。注入体積は１０μＬとした。検出器は、Ｍｉｃｒｏ  Ｍａｓｓ  Ｑｕａｔｔｒｏ  Ｍｉｃｒｏ質量分析計と縦一列に並んだＷａｔｅｒｓ  ９９６フォトダイオードアレイ検出器とした。質量分析計は、正イオンモードでのシングルイオンモニタリングのためにデフォルト設定で実行した。使用するコーン電圧は３５Ｖとした。ゼアキサンチンについての保持時間は、１．０９分であり、４５０ｎｍの最大吸光度、正イオンモードにおいてモノアイソトピック質量５６９．４であった。モノアセチル化ゼアキサンチンの保持時間は、２．６８分であり、４５０ｎｍの最大吸光度、正イオンモードにおいてモノアイソトピック質量６１１．４であった。ジアセチル化ゼアキサンチンの保持時間は、３．０８分であり、４５０ｎｍの最大吸光度、正イオンモードにおいてモノアイソトピック質量６５３．４であった。他のカロテノイドについての保持時間は：β−クリプトキサンチン、３．２分、リコピン、３．６分、γ−カロテン、３．８分、およびβ−カロテン、３．９５分であった。
【０１２４】
【表５】
2018183139.tif 000006
【図１】
2018183139.tif 000007
【図２】
2018183139.tif 000008
【図３】
2018183139.tif 000009
【図４】
2018183139.tif 000010
【図５】
2018183139.tif 000011
【図６】
2018183139.tif 000012
【図７】
2018183139.tif 000013
【配列表】
2018183139000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年6月26日(2018.6.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アセチルトランスフェラーゼ活性を有する少なくとも１つの異種ポリペプチドが発現される、カロテノイドを産生することができる形質転換微生物であって、
前記アセチルトランスフェラーゼ活性が、（ａ）少なくとも１つのβ−イオノンおよび／または少なくとも１つのε−イオノン環ならびに（ｂ）少なくとも１つの環結合ヒドロキシル基を有するカロテノイド分子を、対応する、部分的にまたは完全にアセチル化されたカロテノイド分子に変換することであり、
前記ポリペプチドが、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号１４のポリペプチドからなる群から選択される、形質転換微生物。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、ゼアキサンチン、アスタキサンチン、ルテインおよびβ−クリプトキサンチンを、ゼアキサンチンモノまたはジアセタート、アスタキサンチンモノもしくはジアセタート、ルテインモノもしくはジアセタート、およびβ−クリプトキサンチンアセタートにそれぞれ変換するための酵素活性を有する、請求項１に記載の形質転換微生物。
【請求項３】
前記微生物が、油産生株又は細菌である、請求項１又は２に記載の形質転換微生物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の形質転換微生物を産生するためのプロセスであって、１つ以上の調節シグナルに機能的に連結された、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号１３において示される配列からなる核酸または核酸構築物を導入するステップを含むプロセス。
【請求項５】
アセチル化されたカロテノイドの産生のための、請求項１〜３のいずれか一項に記載の形質転換微生物の使用。
【外国語明細書】
2018183139000001.pdf