(57)【要約】【課題】Ｘ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ（式中Ｘは、Ｇｌｙ、ＨｙｐおよびＧｌｕ以外のアミノ酸残基）で示されるトリペプチドおよび前記トリペプチドを含む骨芽細胞の分化促進剤および骨形成促進剤を提供する。【解決手段】Ｘ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ（式中Ｘは、Ｇｌｙ、ＨｙｐおよびＧｌｕ以外のアミノ酸残基）で示されるトリペプチド、またはその医学的に許容可能な塩である。このトリペプチド（塩）は、骨芽細胞の分化を促進し、骨形成を促進するため、骨芽細胞の分化促進剤および骨形成促進剤として使用することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｘ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ（式中Ｘは、Ｇｌｙ、ＨｙｐおよびＧｌｕ以外のアミノ酸残基）で示されるトリペプチドまたはその医学的に許容可能な塩を含有する、骨芽細胞の分化促進剤。
【請求項２】
前記トリペプチドが、Ａｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｐｈｅ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｌｕｅ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｓｅｒ−Ｈｙｐ−ＧｌｙおよびＴｈｒ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙからなる群から選択される１以上のペプチド、またはその医学的に許容可能な塩を含有する、請求項１に記載の骨芽細胞の分化促進剤。
【請求項３】
前記トリペプチドが、Ａｌａ−Ｈｙｐ−ＧｌｙまたはＬｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙのいずれかであるペプチド、またはその医学的に許容可能な塩を含有する、請求項１に記載の骨芽細胞の分化促進剤。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の骨芽細胞の分化促進剤を含む、骨形成促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｘ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ（式中Ｘは、Ｇｌｙ、ＨｙｐおよびＧｌｕ以外のアミノ酸残基）で示されるトリペプチドまたはその医学的に許容可能な塩を含有する、骨芽細胞の分化促進剤および骨形成促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
コラーゲンは、細胞内で−（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）−（式中、ＸおよびＹはそれぞれ同一でも異なってもよいアミノ酸残基を示す。）の繰り返し構造を有するポリペプチド鎖として合成され、Ｙに位置するＰｒｏはほとんどがヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）へと水酸化される。その後、３本のポリペプチド鎖が三重螺旋構造を形成して細胞外へと分泌され、さらにコラーゲン線維となって皮膚、腱、骨などの様々な結合組織に沈着し、主要な細胞外マトリックスタンパク質として機能する。これらの結合組織から抽出したコラーゲンやゼラチン（熱変性コラーゲン）にクロストリジウム属やグリモンティア属由来のコラゲナーゼを作用させると、Ｎ末端がＧｌｙの、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙで示されるトリペプチドを生成する。これら微生物由来コラゲナーゼは、ＹとＧｌｙとの間を切断するエンドプロテアーゼであり、トリペプチドのＮ末端はＧｌｙとなる。これに対し、Ｃ末端がＧｌｙのコラーゲン／ゼラチン由来のトリペプチドも存在する（特許文献１）。コラーゲンまたはゼラチンに、ＰｒｏまたはＨｙｐのＣ末端側に隣接するアミノ酸残基とその次のアミノ酸残基との間のペプチド結合を切断するショウガ根茎由来酵素を添加すると、Ｘ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙで示されるペプチドを生成することができるという。
【０００３】
Ｘ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙで示されるトリペプチドとして、Ａｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｐｈｅ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙなどがある。これらトリペプチドを含むコラーゲン加水分解物を経口摂取すると、血中のＸ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ濃度が対照のコラーゲン加水分解物を経口摂取した場合と比較して有意に上昇するとの報告がある（非特許文献１）。近年、コラーゲン加水分解物を経口摂取することにより、Ｐｒｏ−ＨｙｐやＸ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ型トリペプチドなどのコラーゲン由来オリゴペプチドが血中で非常に高濃度で検出されることが報告され、それらペプチドの効果効能に注目が集まっている。Ｘ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ型トリペプチドの生理作用としては、Ａｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙのコラーゲン合成促進効果（特許文献２）、Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｓｅｒ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ａｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙのエラスチン産生促進効果（特許文献３）、Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ａｌａ−Ｈｙｐ−ＧｌｙのジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害活性（特許文献４）、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ａｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｓｅｒ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙのアンジオテンシン変換酵素阻害効果（非特許文献２）などが報告されている。
【０００４】
また、コラーゲン加水分解物摂取による骨代謝改善（特許文献５）、コラーゲン加水分解物による骨分化促進効果（非特許文献３、非特許文献４）などの報告もある。また、コラーゲン加水分解組成物に代えて、Ｐｒｏ−Ｈｙｐによる骨分化促進効果も報告されている（非特許文献５）。
【０００５】
更に、Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙを用いた、前駆軟骨細胞または骨芽細胞の増殖促進剤もある（特許文献６）。ペプチド固相合成法で調製したＧｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙをマウス正常骨芽細胞ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１に１０ｎｍｏｌ／ｍｌで添加してアルカリホスファターゼ活性（以下、ＡＬＰ活性と称する。）を測定したところ、対照に対して１．８倍という高い骨芽細胞の分化促進作用が示され、および対照に対して１．７倍という高い骨芽細胞の増殖促進率が示されたという。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２０１４／１７４７４号
【特許文献２】特開２０１０−０２４２００号公報
【特許文献３】特開２０１４−１４１４５０号公報
【特許文献４】国際公開第２０１２／１０２３０８号
【特許文献５】特開２０１３−１２４２２１号公報
【特許文献６】特開２０１５−５９０８７号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Taga Y, et al., ”Efficient absorption of X-hydroxyproline (Hyp)-Gly after oral administration of a novel gelatin hydrolysate prepared using ginger protease”, J. Agric. Food Chem., (2016) 64(14):2962-2970
【非特許文献２】鶏コラーゲン加水分解物摂取後のヒト血中ペプチドの動態とＡＣＥ阻害作用、日本食品科学工学会誌、２００９年、５６巻６号、ｐ３２６−３３３
【非特許文献３】Guillerminet F, et al., "Hydrolyzed collagen improves bone metabolism and biomechanical parameters in ovariectomized mice: an in vitro and in vivo study", Bone, (2010) 46(3):827-834.
【非特許文献４】Liu J, et al., "Bovine collagen peptides compounds promote the proliferation and differentiation of MC3T3-E1 pre-osteoblasts", PLoS One, (2014) 9(6):e99920.
【非特許文献５】Kimira Y, et al., "Collagen-derived dipeptide prolyl-hydroxyproline promotes differentiation of MC3T3-E1 osteoblastic cells", Biochem. Biophys. Res. Commun., (2014) 453(3):498-501.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
非特許文献５では、Ｐｒｏ−ＨｙｐによりＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の分化が促進され、特許文献６ではＧｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙにより、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞のＡＬＰ活性が増加したというが、より分化能や骨形成促進作用に優れ、また工業的に多量に生産可能なペプチドの開発が望まれる。
【０００９】
上記現状に鑑み、本発明は、Ｘ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ（式中Ｘは、Ｇｌｙ、ＨｙｐおよびＧｌｕ以外のアミノ酸残基）で示されるトリペプチドを含む、骨芽細胞の分化促進剤を提供することを目的とする。
【００１０】
また本発明は、Ｘ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ（式中Ｘは、Ｇｌｙ、ＨｙｐおよびＧｌｕ以外のアミノ酸残基）で示されるトリペプチドを含む、骨形成促進剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者等は、Ｘ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ（式中Ｘは、Ｇｌｙ、ＨｙｐおよびＧｌｕ以外のアミノ酸残基）で示されるトリペプチドについて詳細に検討したところ、これらが骨芽細胞の分化促進作用を有することを見出し、本発明を完成させた。
【００１２】
すなわち本発明は、Ｘ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ（式中Ｘは、Ｇｌｙ、ＨｙｐおよびＧｌｕ以外のアミノ酸残基）で示されるトリペプチドまたはその医学的に許容可能な塩を含有する、骨芽細胞の分化促進剤を提供するものである。
【００１３】
また本発明は、前記トリペプチドが、Ａｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｐｈｅ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｌｕｅ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｓｅｒ−Ｈｙｐ−ＧｌｙおよびＴｈｒ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙからなる群から選択される１以上のペプチド、またはその医学的に許容可能な塩を含有する、前記骨芽細胞の分化促進剤を提供するものである。
【００１４】
また本発明は、前記トリペプチドが、Ａｌａ−Ｈｙｐ−ＧｌｙまたはＬｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙのいずれかであるペプチド、またはその医学的に許容可能な塩を含有する、前記骨芽細胞の分化促進剤を提供するものである。
【００１５】
更に、本発明は、前記骨芽細胞の分化促進剤を含む、骨形成促進剤を提供するものである。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、Ｘ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ（式中Ｘは、Ｇｌｙ、ＨｙｐおよびＧｌｕ以外のアミノ酸残基）で表されるトリペプチドを含む骨分化促進剤等が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、Ｘ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ（式中Ｘは、Ｇｌｙ、ＨｙｐおよびＧｌｕ以外のアミノ酸残基）で示されるトリペプチドまたはその医学的に許容可能な塩を含有する、骨芽細胞の分化促進剤である。以下、本発明を詳細に説明する。
【００１８】
（１）Ｘ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ
本発明で使用するトリペプチドは、Ｘ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙで示され、Ｘは、Ｇｌｙ、ＨｙｐおよびＧｌｕ以外のアミノ酸残基である。好ましくは、Ａｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｐｈｅ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｓｅｒ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｔｈｒ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙである。上記式で示されるトリペプチドを生成するには、特許文献４を参照して、コラーゲンやゼラチンの−（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）−で示されるペプチド鎖に、１次酵素としてコラゲナーゼや黄色コウジカビ由来プロテアーゼを作用させ、次いで２次酵素としてＮ末端から２番目にプロリンまたはヒドロキシプロリン以外のアミノ酸が存在する場合にＮ末端からアミノ酸を遊離させるペプチダーゼを作用させてもよい。また、ＰｒｏまたはＨｙｐのＣ末端側に隣接するアミノ酸残基とその次のアミノ酸残基との間のペプチド結合を切断するショウガ根茎由来酵素を添加し、その単独の酵素反応によってより簡便かつ多量にＸ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙで示されるペプチドを生成することができる。Ｘ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙで示されるペプチドは、これらのペプチド組成物から液体クロマトグラフィーその他の方法で精製して調製することができる。
【００１９】
また、「固相合成法」や「液相合成法」などの公知のペプチド合成法によって製造することもできる。固相合成法としては、Ｆｍｏｃ法、Ｂｏｃ法の何れであってもよい。表面をアミノ基で修飾した樹脂ビーズを固相として用い、縮合剤としてジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）を用いる。トリペプチドのＣ−末端にあたるＧｌｙのＮ−末端をＦｍｏｃ基で保護し、上記樹脂ビーズのアミノ基とペプチド結合させる。固相を溶媒で洗浄し、その後、固相に結合しているＧｌｙのＦｍｏｃ基の脱保護を行う。溶媒で樹脂ビーズを洗浄後、Ｆｍｏｃ−Ｈｙｐ−ＯＨ、ＤＩＣおよびＨＯＢｔをそれぞれ反応溶液に加える。反応後、樹脂ビーズを溶媒で洗浄し、Ｎ−末端のＦｍｏｃ基を脱保護し、溶媒で樹脂ビーズを洗浄する。その後、Ｆｍｏｃ−Ｘ−ＯＨ、ＤＩＣおよびＨＯＢｔをそれぞれ加え、固相上でペプチドを合成する。合成後に、Ｎ−末端のＦｍｏｃ基を除去し、減圧乾燥した後に得られた乾燥樹脂ビーズをＴＦＡで処理し、樹脂ビーズからＸ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ粗生成物をＴＦＡに溶出させる。得られた粗生成物を精製水に溶解し、液体クロマトグラフィー等で精製し、Ｘ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙを単離する。
【００２０】
上記Ｘ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙで示されるトリペプチドは、塩を形成するものであってもよい。塩は、医学的に許容可能な塩であることが好ましい。「医学的に許容可能な塩」とは、薬理学的に許容可能であり、投与された対象に対して略無毒である塩形態をいう。例えば、無毒の有機酸塩または無機酸塩がある。無機酸としては、塩化水素酸、硫酸、またはリン酸などがある。有機酸としては、カルボン酸、ホスホン酸、スルホン酸があり、たとえば酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ヒドロキシブチル酸、リンゴ酸、マレイン酸、マロン酸、サリチル酸、フマル酸、琥珀酸、アジピン酸、酒石酸、クエン酸、グルタル酸、２−または３−グリセロリン酸、ならびに当業者には周知の他の鉱物の酸がある。また、無機塩基や有機塩基との塩であってもよい。無機塩基としては、アルカリまたはアルカリ土類金属（たとえば、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、またはマグネシウム）水酸化物、アンモニア、アンモニウム水酸化物などがある。また、有機塩基としては、アルキルアミン、ヒドロキシアルキルアミン、Ｎ−メチルグルカミン、ベンジルアミン、ピペリジン、ピロリジンなどがある。
【００２１】
（２）骨芽細胞の分化促進剤
上記Ｘ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙで示されるトリペプチドやその医学的に許容可能な塩は、骨芽細胞の分化促進剤として使用することができる。
骨組織が形成されることを骨化といい、膜内骨化と軟骨内骨化とに大別される。膜内骨化は頭蓋骨等で観察され、間葉系細胞が直接、骨芽細胞に分化して骨基質を産生する骨形成様式をいう。一方、軟骨内骨化とは、未分化間葉系細胞が軟骨細胞に分化して軟骨原基を形成し、軟骨細胞が肥大軟骨細胞に分化し、周囲の軟骨膜に含まれる細胞が骨芽細胞に分化し、これらによって石灰化した軟骨組織を骨組織に置換する骨形成様式をいう。何れの骨形成過程でも骨芽細胞が関与する点で共通する。骨芽細胞の分化が促進されると骨形成が促進される。
【００２２】
マウス頭蓋冠由来ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞は、胎児マウスの頭蓋骨より樹立された前駆骨芽細胞株である。骨芽細胞へと分化誘導されるとアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）を発現するため、骨芽細胞の分化の指標としてＡＬＰ活性が用いられている。よって、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞培養時にサンプルを添加し、未処置対照に対するサンプル添加時のＡＬＰ活性を求めると、骨芽細胞への分化に対する作用を調べることができる。骨芽細胞の分化誘導は、生体を構成する種々の骨形成にポジティブに寄与して骨形成が促進されると考えられる。ただし、ＡＬＰ活性の上昇と細胞増殖とは同義ではない。一般の細胞分化の過程では増殖が止まってから分化が起こり、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞も同様である。後記する実施例に示すように、前記Ｘ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙは、骨芽細胞の分化を促進し、ゆえに骨芽細胞の分化促進剤として使用することができる。
【００２３】
（３）骨形成促進剤
前記Ｘ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙやその医学的に許容可能な塩は、骨形成促進剤として使用することができる。上記したように、前記Ｘ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙで示されるトリペプチドやその医学的に許容可能な塩は、骨芽細胞の分化促進作用があり、この分化促進作用によって骨形成を促進することができる。
【００２４】
（４）剤型等
骨芽細胞の分化促進剤や骨形成促進剤は、経口的、または非経口的に投与することができる。経口投与の場合は、前記Ｘ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙで示されるトリペプチドやその医学的に許容可能な塩をそのまま散剤、顆粒剤、丸剤としてもよく、表面に糖衣その他で加工したコーティング剤や、カプセルに充填したカプセル剤、適当な溶媒に溶解した経口液剤や懸濁剤、乳化剤によって乳化してなる乳剤などの何れであってもよい。非経口投与の場合は、ローション剤、軟膏剤、貼付剤（パップ剤）、注射剤、坐剤、点鼻剤等がある。
【００２５】
上記骨芽細胞の分化促進剤や骨形成促進剤には、剤型に応じて賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、保存料、抗酸化剤、界面活性剤、ｐＨ調整剤、保湿剤、増粘剤、無機充填剤、結合剤、希釈剤、着色料、香料、紫外線吸収剤などを添加してもよい。なお、Ｘ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙとしては、コラーゲン含有食品を分解して精製したものに限定されず、精製を行わずＸ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙを含有するタンパク質加水分解物を使用してもよい。
【００２６】
骨芽細胞の分化促進剤や骨形成促進剤として使用する際の上記ペプチドの投与量は、対象の状態や体重、剤型、投与経路等によって異なるが、成人１日当たり、経口投与の場合は、１〜５０００ｍｇ、好ましくは２〜２０００ｍｇ、より好ましくは５〜５００ｍｇである。患部に直接投与する場合は、０．１〜５００ｍｇ、好ましくは０．２〜２００ｍｇ、より好ましくは０．５〜５０ｍｇである。製剤は、１日１〜数回に分けて投与してもよく、または１〜数日に１回投与してもよい。
【００２７】
上記骨芽細胞の分化促進剤や骨形成促進剤は、飲食物に添加してもよい。このような飲食物として、野菜やフルーツ、乳酸菌などを含むジュースその他の飲料、ゼリー、ヨーグルト、プリン、アイスクリームなどの半流動性食品などがあり、また他の食材に混練して固形食品に調製してもよい。
【実施例】
【００２８】
次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は何ら本発明を制限するものではない。
【００２９】
(製造例１）
ショウガ根茎の外皮を除去して細切後−３０℃で凍結保存し、この凍結ショウガに対し５倍量（重量／容量）の冷アセトンを添加してホモジナイザーで十分破砕した。この破砕液をろ過して残渣を分取し、再度５倍量の冷アセトンで洗浄・ろ過してから室温で風乾して、ショウガ酵素粉末を得た。
ウシ皮膚由来Ｉ型コラーゲン溶液を６０℃で３０分間加熱して調製したウシゼラチン溶液に、塩酸を加えてｐＨ４．０に調整し、２ｍＭとなるようにジチオトレイトールを添加して５％ゼラチン溶液を調製した。これに、１／１０量の前記ショウガ酵素粉末を添加し、振盪しながら５０℃で１６時間反応させた。反応終了後、ショウガ酵素粉末をろ過により除き、ろ液をさらに限外ろ過（Ｖｉｖａｓｐｉｎ  ２０−１０Ｋ、ＧＥヘルスケア社製）した。回収したろ液を凍結乾燥し、ペプチド組成物を得た。このペプチド組成物の重量平均分子量は５９０であった。ついで、下記ＬＣ／ＭＳ測定条件で分析し、主要なＸ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ型トリペプチドの生成量を定量した。ゼラチン１ｇあたりの主要なトリペプチドの生成量を表１に示す。
【００３０】
（結果）
ショウガ根茎由来酵素を用いることでゼラチンから様々なＸ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ型トリペプチドが多量に生成された。中でもＡｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙの生成量は７．４９ｍｇ／ｇ、Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙの生成量は７．９９ｍｇ／ｇと、他のＸ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ型トリペプチドと比較し、特に高いペプチド生成が示された。
【００３１】
（１）ＬＣ／ＭＳ測定条件
高速液体クロマトグラフ：1200Series(Agilent Technologies)、
質量分析装置：3200QTRAP(AB Sciex)、
分析カラム：Ascentis Express F5 5μm, 4.6mmi.d.×250mm(SUPELCO)、
カラム温度：４０℃、
移動相：Ａ液；１０ｍＭ酢酸アンモニウム、Ｂ液；１００％アセトニトリル、
グラジエント条件：
０〜７．５分：Ａ液１００％、
７．５〜２０分：Ａ液１００〜２５％；Ｂ液０〜７５％、
２０〜２５分：Ａ液２５％；Ｂ液７５％、
２５〜３０分：Ａ液１００％、
流速：０．４ｍＬ／ｍｉｎ、
（２）質量分析条件：
イオン化：ＥＳＩ、ポジティブ、
分析モード：Multiple Reaction Monitoring(MRM)モード、
イオンスプレー電圧：３ｋＶ、
イオンソース温度：７００℃
【００３２】
【表１】
2018052899.tif 000002
【００３３】
（実施例１）
マウス頭蓋冠由来骨芽細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を用いて、表１に記載される各Ｘ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ型トリペプチドの骨芽細胞分化促進効果について評価を行った。なお、表１に記載されるトリペプチドは、Ａｎｙｇｅｎ社のカスタム合成サービスにより化学合成したものを使用した。
ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞は、１０％ウシ胎児血清含有アルファＭＥＭ中に５×１０４細胞／ウェルの条件で２４−ウェル細胞培養プレート中に準備した。翌日、細胞がコンフルエントになっていることを確認後、培地を分化培地（１０％透析済みウシ胎児血清（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、１００μｇ／ｍＬアスコルビン酸、１０ｍＭグリセロール２−リン酸二ナトリウム含有アルファＭＥＭ）で置換し、表１に示すトリペプチドを終濃度２００ｎｍｏｌ／ｍＬになるように添加した。対照には、トリペプチドに代えて蒸留水を同量添加した。２日おきに分化培地を交換し、表１に示すトリペプチドを終濃度２００ｎｍｏｌ／ｍＬになるように添加した。６日間培養後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、３．７％ホルムアルデヒドにて固定した。
【００３４】
ＰＢＳ、Ｔｗｅｅｎ２０を含むトリス緩衝生理食塩水、Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＮＭ溶液（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．５、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５Ｍ  ＭｇＣｌ２）で洗浄後、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（１８．７５ｍｇ／ｍＬ  ｐ−ニトロブルーテトラゾリウムクロリド、９．４ｍｇ／ｍＬ  ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸ｐ−トルイジン塩を６７％メチルスルホキシド（ｖ／ｖ）に溶解した液）をＴＮＭ溶液で５０倍希釈し、各ウェルに３００μＬずつ添加してＡＬＰ染色を行った。Ｉｍａｇｅ  Ｊにてウェル中でＡＬＰ陽性を示す面積を数値化した。
【００３５】
Ｎ＝３で独立して２回くりかえし、計６サンプルの平均値および標準誤差を、対照を１とした相対評価で示した。ｔ検定にて、対照に対してｐ＜０．０５で統計的有意差ありと設定した。結果を表２に示す。
【００３６】
（比較例１）
トリペプチドに代えてＰｒｏ−Ｈｙｐ（Ｂａｃｈｅｍ社製）を使用した以外は実施例２と同様に操作し、ＡＬＰ活性を算出した。結果を表２に示す。
【００３７】
（結果）
ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞に各Ｘ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ型トリペプチドおよびＰｒｏ−Ｈｙｐを添加すると、それぞれＡＬＰ活性が上昇した。さらに、ＡＬＰ活性の上昇はＰｒｏ−Ｈｙｐでは対照に対して１．４倍であったのに対し、各トリペプチド全てでそれ以上のＡＬＰ活性の上昇を示した。ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞は、骨芽細胞へと分化誘導されるとＡＬＰを発現するため、各トリペプチドは、骨芽細胞の分化誘導作用が高いと考えられる。中でもＡｌａ−Ｈｙｐ−ＧｌｙおよびＬｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙは特に高い骨芽細胞の分化誘導作用を持つことが示された。
【００３８】
【表２】
2018052899.tif 000003