(57)【要約】      （修正有）【課題】被験体におけるインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘発する方法の提供。【解決手段】組換えインフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）ポリペプチドであって、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス分離株に広い反応性を示す免疫応答を誘発するために最適化したポリペプチド。【選択図】図９Ａ
2018183149.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えインフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）ポリペプチドであって、
（ｉ）配列番号１と少なくとも９６％同一または配列番号１の残基２〜５６６と少なくとも９６％同一；
（ｉｉ）配列番号２と少なくとも９９％同一または配列番号２の残基２〜５６６と少なくとも９９％同一；
（ｉｉｉ）配列番号３と少なくとも９９％同一または配列番号３の残基２〜５６６と少なくとも９９％同一；
（ｉｖ）配列番号４と少なくとも９９％同一または配列番号４の残基２〜５６６と少なくとも９９％同一；
（ｖ）配列番号５と少なくとも９８．４％同一または配列番号５の残基２〜５６６と少なくとも９８．４％同一；
（ｖｉ）配列番号６と少なくとも９９％同一または配列番号６の残基２〜５６５と少なくとも９９％同一；
（ｖｉｉ）配列番号７と少なくとも９７％同一または配列番号７の残基２〜５６６と少なくとも９７％同一；あるいは
（ｖｉｉｉ）配列番号８を含む、
アミノ酸配列を含む、組換えインフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）ポリペプチド。
【請求項２】
組換えインフルエンザＨＡポリペプチドであって、
（ｉ）配列番号１と比較して１０個以下のアミノ酸置換；
（ｉｉ）配列番号２と比較して８個以下のアミノ酸置換；
（ｉｉｉ）配列番号３と比較して６個以下のアミノ酸置換；
（ｉｖ）配列番号４と比較して７個以下のアミノ酸置換；
（ｖ）配列番号５と比較して９個以下のアミノ酸置換；
（ｖｉ）配列番号６と比較して６個以下のアミノ酸置換；または
（ｖｉｉ）配列番号７と比較して１０個以下のアミノ酸置換
を含む、組換えインフルエンザＨＡポリペプチド。
【請求項３】
配列番号１の残基２〜５６６、配列番号２の残基２〜５６６、配列番号３の残基２〜５６６、配列番号４の残基２〜５６６、配列番号５の残基２〜５６６、配列番号６の残基２〜５６５、または配列番号７の残基２〜５６６のアミノ酸配列を含む、請求項１または請求項２に記載の組換えインフルエンザＨＡポリペプチド。
【請求項４】
配列番号１の残基２〜５６６、配列番号２の残基２〜５６６、配列番号３の残基２〜５６６、配列番号４の残基２〜５６６、配列番号５の残基２〜５６６、配列番号６の残基２〜５６５、または配列番号７の残基２〜５６６のアミノ酸配列からなる、請求項１または請求項２に記載の組換えインフルエンザＨＡポリペプチド。
【請求項５】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、または配列番号７のアミノ酸配列を含む、請求項１または請求項２に記載の組換えインフルエンザＨＡポリペプチド。
【請求項６】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、または配列番号７のアミノ酸配列からなる、請求項１または請求項２に記載の組換えインフルエンザＨＡポリペプチド。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のインフルエンザＨＡポリペプチドをコードする単離核酸。
【請求項８】
前記核酸を哺乳動物細胞での発現のためにコドン最適化する、請求項７に記載の単離核酸。
【請求項９】
請求項７または請求項８に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１０】
前記インフルエンザＨＡポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結したプロモーターをさらに含む、請求項９に記載のベクター。
【請求項１１】
請求項９または請求項１０に記載のベクターを含む単離細胞。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のインフルエンザＨＡポリペプチドを含むインフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項１３】
インフルエンザノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質、インフルエンザマトリックス（Ｍ１）タンパク質、またはその両方をさらに含む、請求項１２に記載のインフルエンザＶＬＰ。
【請求項１４】
前記ＨＡポリペプチドをコードするベクター、インフルエンザＮＡタンパク質をコードするベクター、およびインフルエンザＭ１タンパク質をコードするベクターで宿主細胞を該ＨＡタンパク質、該Ｍ１タンパク質、および該ＮＡタンパク質を発現させるのに十分な条件下でトランスフェクトすることによって生成される、請求項１〜６のいずれか１項に記載のインフルエンザＨＡポリペプチドを含むインフルエンザＶＬＰ。
【請求項１５】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のインフルエンザＨＡポリペプチドを含む融合タンパク質。
【請求項１６】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のインフルエンザＨＡポリペプチド、請求項１５に記載の融合タンパク質、または請求項１３〜１５のいずれか１項に記載のＶＬＰ、および薬学的に許容され得るキャリアを含む組成物。
【請求項１７】
被験体におけるインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘発する方法であって、請求項１〜７のいずれか１項に記載のインフルエンザＨＡポリペプチド、請求項１６に記載の融合タンパク質、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載のＶＬＰ、または請求項１６に記載の組成物を投与するステップを含む、方法。
【請求項１８】
インフルエンザウイルスに対して被験体を免疫する方法であって、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載のＶＬＰおよび薬学的に許容され得るキャリアを含む組成物を前記被験体に投与するステップを含む、方法。
【請求項１９】
前記組成物がアジュバントをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記組成物を筋肉内投与する、請求項１８または請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記組成物が約１〜約２５μｇの前記ＶＬＰを含む、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記組成物が約１５μｇの前記ＶＬＰを含む、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年１１月２７日に出願された米国仮特許出願第６１／７３０，１８６号の優先権の利益を請求し、その全体が参考として本明細書に援用される。
【０００２】
分野
本開示は、Ｈ１Ｎ１ウイルス分離株に対して広い反応性を示す免疫応答を誘発する最適化したインフルエンザ血球凝集素タンパク質およびワクチンとしてのその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
インフルエンザウイルスはオルトミクソウイルス科のメンバーである。インフルエンザウイルスには、Ａ型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザ、およびＣ型インフルエンザと命名された３つのサブタイプが存在する。インフルエンザビリオンは、以下のタンパク質をコードするセグメント化ネガティブセンスＲＮＡゲノムを含む：血球凝集素（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、マトリックス（Ｍ１）、プロトンイオンチャネルタンパク質（Ｍ２）、核タンパク質（ＮＰ）、ポリメラーゼ塩基性タンパク質１（ＰＢ１）、ポリメラーゼ塩基性タンパク質２（ＰＢ２）、ポリメラーゼ酸性タンパク質（ＰＡ）、および非構造タンパク質２（ＮＳ２）。ＨＡ、ＮＡ、Ｍ１、およびＭ２が膜結合タンパク質であるのに対して、ＮＰ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、およびＮＳ２はヌクレオカプシド結合タンパク質である。Ｍ１タンパク質は、インフルエンザ粒子の最も豊富なタンパク質である。ＨＡおよびＮＡタンパク質は、ウイルス付着（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）およびウイルス粒子の細胞への侵入を担うエンベロープ糖タンパク質であり、ウイルス中和および防御免疫のための主な免疫優性エピトープの供給源である。ＨＡおよびＮＡタンパク質の両方は、インフルエンザ予防ワクチンの最も重要な成分と見なされている。
【０００４】
毎年、季節性インフルエンザは、米国のみで３００，０００人超の入院患者および３６，０００人の死亡者を生じている（非特許文献１（Ｓｉｍｏｎｓｅｎら，Ｌａｎｃｅｔ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ７：６５８−６６，２００７））。２００９年における新規のＨ１Ｎ１インフルエンザウイルスの出現により、新規のインフルエンザパンデミックがいかに急速に世界中を駆け巡り得るかということが証明された。
【０００５】
現在、米国では以下の２種のインフルエンザワクチンアプローチが承認されている−不活化スプリットワクチンおよび弱毒化ウイルス生ワクチン。不活化ワクチンは体液性免疫応答を有効に誘導することができるが、一般に、不十分な細胞性免疫応答しか示さない。生ウイルスワクチンは感染リスクが高いので、それを免疫低下状態の（ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ）患者や妊娠中の患者に投与することができない。したがって、予防範囲の広いインフルエンザウイルスワクチンが必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｓｉｍｏｎｓｅｎら，Ｌａｎｃｅｔ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ７：６５８−６６，２００７
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
概要
Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス分離株に対して広い反応性を示す免疫応答を誘発するために最適化したＨ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドの生成を本明細書中に開示する。最適化したＨＡポリペプチドを、１９１８〜２０１２年に分離された選択Ｈ１Ｎ１ウイルスに基づいた一連のＨＡタンパク質アラインメントおよびその後のコンセンサス配列の生成によって作製した。
【０００８】
Ｈ１Ｎ１インフルエンザに対して広い反応性を示す免疫応答を誘発するために最適化したアミノ酸配列を有する組換えインフルエンザＨＡポリペプチドを本明細書中に提供する。いくつかの実施形態では、ＨＡポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、または配列番号７と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、または配列番号７と比較して５個以下、６個以下、７個以下、８個以下、９個以下、または１０個以下のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＨＡポリペプチドは、配列番号８を含む。いくつかの実施形態では、インフルエンザＨＡポリペプチドは、Ｎ末端メチオニン残基を欠く。
【０００９】
組換えＨＡポリペプチドをコードする単離核酸分子およびベクターも本開示によって提供される。かかるベクターを含む単離細胞をさらに提供する。
【００１０】
本明細書中に開示の最適化したＨＡポリペプチドを含むインフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）および融合タンパク質も提供する。
【００１１】
本明細書中に開示の最適化したインフルエンザＨＡポリペプチド、融合タンパク質、またはＶＬＰを薬学的に許容され得るキャリアに含む組成物をさらに提供する。開示の組成物、融合タンパク質、またはＶＬＰの投与による被験体におけるインフルエンザウイルスに対する免疫応答の誘発方法も本開示によって提供する。
【００１２】
最適化したＨＡポリペプチドを含むＶＬＰを含む組成物の被験体への投与によってインフルエンザウイルスに対して被験体を免疫する方法も提供する。
本発明は、例えば、以下の項目も提供する。
（項目１）
組換えインフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）ポリペプチドであって、（ｉ）配列番号１と少なくとも９６％同一または配列番号１の残基２〜５６６と少なくとも９６％同一；
（ｉｉ）配列番号２と少なくとも９９％同一または配列番号２の残基２〜５６６と少なくとも９９％同一；
（ｉｉｉ）配列番号３と少なくとも９９％同一または配列番号３の残基２〜５６６と少なくとも９９％同一；
（ｉｖ）配列番号４と少なくとも９９％同一または配列番号４の残基２〜５６６と少なくとも９９％同一；
（ｖ）配列番号５と少なくとも９８．４％同一または配列番号５の残基２〜５６６と少なくとも９８．４％同一；
（ｖｉ）配列番号６と少なくとも９９％同一または配列番号６の残基２〜５６５と少なくとも９９％同一；
（ｖｉｉ）配列番号７と少なくとも９７％同一または配列番号７の残基２〜５６６と少なくとも９７％同一；あるいは
（ｖｉｉｉ）配列番号８を含む、
アミノ酸配列を含む、組換えインフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）ポリペプチド。（項目２）
組換えインフルエンザＨＡポリペプチドであって、
（ｉ）配列番号１と比較して１０個以下のアミノ酸置換；
（ｉｉ）配列番号２と比較して８個以下のアミノ酸置換；
（ｉｉｉ）配列番号３と比較して６個以下のアミノ酸置換；
（ｉｖ）配列番号４と比較して７個以下のアミノ酸置換；
（ｖ）配列番号５と比較して９個以下のアミノ酸置換；
（ｖｉ）配列番号６と比較して６個以下のアミノ酸置換；または（ｖｉｉ）配列番号７と比較して１０個以下のアミノ酸置換
を含む、組換えインフルエンザＨＡポリペプチド。
（項目３）
配列番号１の残基２〜５６６、配列番号２の残基２〜５６６、配列番号３の残基２〜５６６、配列番号４の残基２〜５６６、配列番号５の残基２〜５６６、配列番号６の残基２〜５６５、または配列番号７の残基２〜５６６のアミノ酸配列を含む、項目１または項目２に記載の組換えインフルエンザＨＡポリペプチド。
（項目４）
配列番号１の残基２〜５６６、配列番号２の残基２〜５６６、配列番号３の残基２〜５６６、配列番号４の残基２〜５６６、配列番号５の残基２〜５６６、配列番号６の残基２〜５６５、または配列番号７の残基２〜５６６のアミノ酸配列からなる、項目１または項目２に記載の組換えインフルエンザＨＡポリペプチド。
（項目５）
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、または配列番号７のアミノ酸配列を含む、項目１または項目２に記載の組換えインフルエンザＨＡポリペプチド。
（項目６）
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、または配列番号７のアミノ酸配列からなる、項目１または項目２に記載の組換えインフルエンザＨＡポリペプチド。
（項目７）
項目１〜６のいずれか１項に記載のインフルエンザＨＡポリペプチドをコードする単離核酸。
（項目８）
前記核酸を哺乳動物細胞での発現のためにコドン最適化する、項目７に記載の単離核酸。
（項目９）
項目７または項目８に記載の核酸を含むベクター。
（項目１０）
前記インフルエンザＨＡポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結したプロモーターをさらに含む、項目９に記載のベクター。
（項目１１）
項目９または項目１０に記載のベクターを含む単離細胞。
（項目１２）
項目１〜６のいずれか１項に記載のインフルエンザＨＡポリペプチドを含むインフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
（項目１３）
インフルエンザノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質、インフルエンザマトリックス（Ｍ１）タンパク質、またはその両方をさらに含む、項目１２に記載のインフルエンザＶＬＰ。
（項目１４）
前記ＨＡポリペプチドをコードするベクター、インフルエンザＮＡタンパク質をコードするベクター、およびインフルエンザＭ１タンパク質をコードするベクターで宿主細胞を該ＨＡタンパク質、該Ｍ１タンパク質、および該ＮＡタンパク質を発現させるのに十分な条件下でトランスフェクトすることによって生成される、項目１〜６のいずれか１項に記載のインフルエンザＨＡポリペプチドを含むインフルエンザＶＬＰ。（項目１５）
項目１〜６のいずれか１項に記載のインフルエンザＨＡポリペプチドを含む融合タンパク質。
（項目１６）
項目１〜６のいずれか１項に記載のインフルエンザＨＡポリペプチド、項目１５に記載の融合タンパク質、または項目１３〜１５のいずれか１項に記載のＶＬＰ、および薬学的に許容され得るキャリアを含む組成物。
（項目１７）
被験体におけるインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘発する方法であって、項目１〜７のいずれか１項に記載のインフルエンザＨＡポリペプチド、項目１６に記載の融合タンパク質、項目１２〜１４のいずれか１項に記載のＶＬＰ、または項目１６に記載の組成物を投与するステップを含む、方法。
（項目１８）
インフルエンザウイルスに対して被験体を免疫する方法であって、項目１２〜１４のいずれか１項に記載のＶＬＰおよび薬学的に許容され得るキャリアを含む組成物を前記被験体に投与するステップを含む、方法。
（項目１９）
前記組成物がアジュバントをさらに含む、項目１８に記載の方法。（項目２０）
前記組成物を筋肉内投与する、項目１８または項目１９に記載の方法。（項目２１）
前記組成物が約１〜約２５μｇの前記ＶＬＰを含む、項目１８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
（項目２２）
前記組成物が約１５μｇの前記ＶＬＰを含む、項目２１に記載の方法。
【００１３】
上記および他の本発明の目的、特徴、および利点は、添付の図面を参照して進められる以下の詳細な記載からより明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、方法Ｘ−１に従ってＨ１Ｎ１  ＨＡコンセンサス配列を生成するために使用したプロセスの模式図である。
【００１５】
【図２】図２は、方法Ｘ−２に従ってＨ１Ｎ１  ＨＡコンセンサス配列を生成するために使用したプロセスの模式図である。
【００１６】
【図３】図３は、方法Ｘ−３に従ってＨ１Ｎ１  ＨＡコンセンサス配列を生成するために使用したプロセスの模式図である。
【００１７】
【図４】図４は、方法Ｘ−４に従ってＨ１Ｎ１  ＨＡコンセンサス配列を生成するために使用したプロセスの模式図である。
【００１８】
【図５】図５は、方法Ｘ−５に従ってＨ１Ｎ１  ＨＡコンセンサス配列を生成するために使用したプロセスの模式図である。
【００１９】
【図６】図６は、方法Ｘ−６に従ってＨ１Ｎ１  ＨＡコンセンサス配列を生成するために使用したプロセスの模式図である。
【００２０】
【図７】図７は、方法Ａ−５に従ってＨ１Ｎ１  ＨＡコンセンサス配列を生成するために使用したプロセスの模式図である。
【００２１】
【図８Ａ】図８Ａ〜８Ｂは、本明細書中に配列番号１〜７として記載したＨ１Ｎ１  ＨＡタンパク質の配列アラインメントを示す。
【図８Ｂ】図８Ａ〜８Ｂは、本明細書中に配列番号１〜７として記載したＨ１Ｎ１  ＨＡタンパク質の配列アラインメントを示す。
【００２２】
【図９Ａ】図９Ａ〜９Ｆは、Ｈ１Ｎ１インフルエンザ分離株のパネルに対するワクチン接種した（０、４、１２週目）マウス由来の赤血球凝集阻害（ＨＡＩ）血清抗体価を示すグラフである。各ワクチン群についてのＨＡＩ力価を、１４週目にＨ１Ｎ１インフルエンザウイルスを使用して決定した。方法Ｘ−１  ＨＡ（図９Ａ）、方法Ｘ−２  ＨＡ（図９Ｂ）、方法Ｘ−３  ＨＡ（図９Ｃ）、方法Ｘ−４  ＨＡ（図９Ｄ）、方法Ｘ−５  ＨＡ（図９Ｅ）、および方法Ｘ−６  ＨＡ（図９Ｆ）を含むＶＬＰでワクチン接種したマウスのＨＡＩ力価を示す。値は、ｌｏｇ２変換幾何平均力価（＋９５％信頼区間）を示す。
【図９Ｂ】図９Ａ〜９Ｆは、Ｈ１Ｎ１インフルエンザ分離株のパネルに対するワクチン接種した（０、４、１２週目）マウス由来の赤血球凝集阻害（ＨＡＩ）血清抗体価を示すグラフである。各ワクチン群についてのＨＡＩ力価を、１４週目にＨ１Ｎ１インフルエンザウイルスを使用して決定した。方法Ｘ−１  ＨＡ（図９Ａ）、方法Ｘ−２  ＨＡ（図９Ｂ）、方法Ｘ−３  ＨＡ（図９Ｃ）、方法Ｘ−４  ＨＡ（図９Ｄ）、方法Ｘ−５  ＨＡ（図９Ｅ）、および方法Ｘ−６  ＨＡ（図９Ｆ）を含むＶＬＰでワクチン接種したマウスのＨＡＩ力価を示す。値は、ｌｏｇ２変換幾何平均力価（＋９５％信頼区間）を示す。
【図９Ｃ】図９Ａ〜９Ｆは、Ｈ１Ｎ１インフルエンザ分離株のパネルに対するワクチン接種した（０、４、１２週目）マウス由来の赤血球凝集阻害（ＨＡＩ）血清抗体価を示すグラフである。各ワクチン群についてのＨＡＩ力価を、１４週目にＨ１Ｎ１インフルエンザウイルスを使用して決定した。方法Ｘ−１  ＨＡ（図９Ａ）、方法Ｘ−２  ＨＡ（図９Ｂ）、方法Ｘ−３  ＨＡ（図９Ｃ）、方法Ｘ−４  ＨＡ（図９Ｄ）、方法Ｘ−５  ＨＡ（図９Ｅ）、および方法Ｘ−６  ＨＡ（図９Ｆ）を含むＶＬＰでワクチン接種したマウスのＨＡＩ力価を示す。値は、ｌｏｇ２変換幾何平均力価（＋９５％信頼区間）を示す。
【図９Ｄ】図９Ａ〜９Ｆは、Ｈ１Ｎ１インフルエンザ分離株のパネルに対するワクチン接種した（０、４、１２週目）マウス由来の赤血球凝集阻害（ＨＡＩ）血清抗体価を示すグラフである。各ワクチン群についてのＨＡＩ力価を、１４週目にＨ１Ｎ１インフルエンザウイルスを使用して決定した。方法Ｘ−１  ＨＡ（図９Ａ）、方法Ｘ−２  ＨＡ（図９Ｂ）、方法Ｘ−３  ＨＡ（図９Ｃ）、方法Ｘ−４  ＨＡ（図９Ｄ）、方法Ｘ−５  ＨＡ（図９Ｅ）、および方法Ｘ−６  ＨＡ（図９Ｆ）を含むＶＬＰでワクチン接種したマウスのＨＡＩ力価を示す。値は、ｌｏｇ２変換幾何平均力価（＋９５％信頼区間）を示す。
【図９Ｅ】図９Ａ〜９Ｆは、Ｈ１Ｎ１インフルエンザ分離株のパネルに対するワクチン接種した（０、４、１２週目）マウス由来の赤血球凝集阻害（ＨＡＩ）血清抗体価を示すグラフである。各ワクチン群についてのＨＡＩ力価を、１４週目にＨ１Ｎ１インフルエンザウイルスを使用して決定した。方法Ｘ−１  ＨＡ（図９Ａ）、方法Ｘ−２  ＨＡ（図９Ｂ）、方法Ｘ−３  ＨＡ（図９Ｃ）、方法Ｘ−４  ＨＡ（図９Ｄ）、方法Ｘ−５  ＨＡ（図９Ｅ）、および方法Ｘ−６  ＨＡ（図９Ｆ）を含むＶＬＰでワクチン接種したマウスのＨＡＩ力価を示す。値は、ｌｏｇ２変換幾何平均力価（＋９５％信頼区間）を示す。
【図９Ｆ】図９Ａ〜９Ｆは、Ｈ１Ｎ１インフルエンザ分離株のパネルに対するワクチン接種した（０、４、１２週目）マウス由来の赤血球凝集阻害（ＨＡＩ）血清抗体価を示すグラフである。各ワクチン群についてのＨＡＩ力価を、１４週目にＨ１Ｎ１インフルエンザウイルスを使用して決定した。方法Ｘ−１  ＨＡ（図９Ａ）、方法Ｘ−２  ＨＡ（図９Ｂ）、方法Ｘ−３  ＨＡ（図９Ｃ）、方法Ｘ−４  ＨＡ（図９Ｄ）、方法Ｘ−５  ＨＡ（図９Ｅ）、および方法Ｘ−６  ＨＡ（図９Ｆ）を含むＶＬＰでワクチン接種したマウスのＨＡＩ力価を示す。値は、ｌｏｇ２変換幾何平均力価（＋９５％信頼区間）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
配列表
添付の配列表に列挙した核酸配列およびアミノ酸配列を、米国特許法施行規則１．８２２で定義のように、ヌクレオチド塩基については標準的な略語を使用し、アミノ酸については３文字表記を使用して示す。各核酸配列についてたった１つの鎖を示すが、表示の鎖を参照することによって相補鎖が含まれると理解される。本配列表を、２０１３年１１月６日に作成したＡＳＣＩＩテキストファイル（４２．９ＫＢ）として提出し、この配列表は、本明細書中で参考として援用される。添付の配列表では、以下を列挙する。
【００２４】
配列番号１〜７は、最適化したＨ１Ｎ１  ＨＡタンパク質のアミノ酸配列である。これらの配列を図８にも示す。
【００２５】
配列番号８は、最適化したＨ１Ｎ１  ＨＡタンパク質のコンセンサスアミノ酸配列である。
【００２６】
詳細な説明
Ｉ．略語
ＣＯＢＲＡ：計算で最適化した広い反応性を示す抗原
ＨＡ：血球凝集素
ＨＡＩ：赤血球凝集阻害
ＨＲＰ：セイヨウワサビペルオキシダーゼ
Ｍ１：マトリックスタンパク質１
ＮＡ：ノイラミニダーゼ
ＰＦＵ：プラーク形成単位
ＶＬＰ：ウイルス様粒子
【００２７】
ＩＩ．用語および方法
別途記載がない限り、技術用語を従来の用法にしたがって使用する。分子生物学における一般用語の定義を、Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ  Ｖ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓによる出版，１９９４（ＩＳＢＮ  ０−１９−８５４２８７−９）；Ｋｅｎｄｒｅｗら．（編集），Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．による出版，１９９４（ＩＳＢＮ  ０−６３２−０２１８２−９）；およびＲｏｂｅｒｔ  Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（編集），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．による出版，１９９５（ＩＳＢＮ  １−５６０８１−５６９−８）に見出すことができる。
【００２８】
本開示の種々の実施形態の概説を容易にするために、特定の用語について以下の説明を提供する。
【００２９】
アジュバント：抗原に対する免疫応答を非特異的に増強する物質またはビヒクル。アジュバントは、抗原を吸着するミネラル（ミョウバン、水酸化アルミニウム、またはホスフェート）の懸濁液または抗原溶液を鉱油に乳化する油中水型乳濁液（例えば、フロイント不完全アジュバント）、抗原性をさらに増強するために時折死滅マイコバクテリアを含む油中水型乳濁液（フロイント完全アジュバント）を含むことができる。免疫賦活性オリゴヌクレオチド（ＣｐＧモチーフを含むものなど）もアジュバントとして使用することができる（例えば、米国特許第６，１９４，３８８号；同第６，２０７，６４６号；同第６，２１４，８０６号；同第６，２１８，３７１号；同第６，２３９，１１６号；同第６，３３９，０６８号；同第６，４０６，７０５号；および同第６，４２９，１９９号を参照のこと）。アジュバントはまた、生体分子（共刺激分子など）を含む。例示的な生物学的アジュバントは、ＩＬ−２、ＲＡＮＴＥＳ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、Ｇ−ＣＳＦ、ＬＦＡ−３、ＣＤ７２、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＯＸ−４０Ｌ、および４１ＢＢＬを含む。
【００３０】
投与：本明細書中で使用する場合、被験体に組成物を投与することとは、組成物を被験体に付与するか、適用するか、接触させることを意味する。多数の経路（例えば、局所、経口、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内、髄腔内、および皮内など）のうちのいずれかによって投与することができる。
【００３１】
抗体：特異的アミノ酸配列を有するＢリンパ球系細胞によって産生される免疫グロブリン分子。抗体は、ヒトまたは他の動物において特異的抗原（免疫原）によって惹起される。抗体は、いくつかの実証可能な方法での抗原との特異的な反応によって特徴付けられ、抗体および抗原は相互に関して定義される。「抗体応答の誘発」は、抗原または他の分子が抗体産生を誘導することができることをいう。
【００３２】
抗原：動物における抗体の産生またはＴ細胞応答を刺激することができる化合物、組成物、または物質（動物に注射するか動物に吸収される組成物が含まれる）。抗原は、特異的な体液性免疫または細胞性免疫の産物（異種免疫原によって誘導される産物が含まれる）と反応する。開示の組成物および方法のいくつかの実施形態では、抗原はインフルエンザＨＡタンパク質である。
【００３３】
コドン最適化した：「コドン最適化した」核酸は、コドンが特定の系（種の群の特定の種など）での発現に最適なように変化している核酸配列をいう。例えば、核酸配列を、哺乳動物細胞での発現のために最適化することができる。コドン最適化は、コードされたタンパク質のアミノ酸配列を変化させない。
【００３４】
融合タンパク質：２つの異なる（異種）タンパク質の少なくとも一部をコードする核酸配列から操作した核酸配列の発現によって生成するタンパク質。融合タンパク質を作製するために、核酸配列は同一の読み枠内に存在していなければならず、且つ内部終止コドンを含まなければならない。例えば、融合タンパク質は、異種タンパク質に融合したインフルエンザＨＡを含む。
【００３５】
血球凝集素（ＨＡ）：インフルエンザウイルス表面糖タンパク質。ＨＡは、ウイルス粒子の宿主細胞への結合およびその後のウイルスの宿主細胞への侵入を媒介する。多数のインフルエンザＨＡタンパク質のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は当該分野で公知であり、公的に利用可能である（ＧｅｎＢａｎｋに寄託された配列など）。ＨＡ（ＮＡと共に）は、２つの主要なインフルエンザウイルス抗原決定基のうちの１つである。
【００３６】
免疫応答：免疫系の細胞（Ｂ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、または多形核球（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｎｕｃｌｅｏｃｙｔｅ）など）の刺激（抗原またはワクチンなど）に対する応答。免疫応答は、宿主の防御反応に関与する身体の任意の細胞（例えば、インターフェロンまたはサイトカインを分泌する上皮細胞が挙げられる）を挙げることができる。免疫応答には、先天性免疫応答または炎症が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中で使用する場合、防御免疫応答は、感染から被験体を防御する（感染を防止するか、感染に関連する疾患の発症を防止する）免疫応答をいう。免疫応答の測定方法は当該分野で周知であり、例えば、リンパ球（Ｂ細胞またはＴ細胞など）の増殖および／または活性、サイトカインまたはケモカインの分泌、炎症、および抗体産生などの測定が挙げられる。
【００３７】
免疫原：適切な条件下で免疫応答（動物における抗体の産生またはＴ細胞応答など）を刺激することができる化合物、組成物、または物質（動物に注射するか吸収される組成物が含まれる）。本明細書中で使用する場合、「免疫原性組成物」は、免疫原（ＨＡポリペプチドなど）を含む組成物である。
【００３８】
免疫する：ワクチン接種などによって感染症から被験体を防御すること。
【００３９】
インフルエンザウイルス：オルトミクソウイルス科に属するセグメント化負鎖ＲＮＡウイルス。インフルエンザウイルスには３つの型が存在する（Ａ型、Ｂ型、およびＣ型）。Ａ型インフルエンザウイルスは、広範な種々の鳥類および哺乳動物（ヒト、ウマ、海洋哺乳動物、ブタ、フェレット、およびニワトリが含まれる）に感染する。動物では、ほとんどのＡ型インフルエンザウイルスは、気道および腸管に軽度の限局性感染を引き起こす。しかし、高病原性Ａ型インフルエンザ株（Ｈ５Ｎ１など）は、家禽類において全身性感染を引き起こし、その死亡率は１００％に達し得る。２００９年に、Ｈ１Ｎ１インフルエンザはヒトインフルエンザの最も一般的な原因であった。ブタ起源の新規のＨ１Ｎ１株が２００９年に出現し、世界保健機関によってパンデミック宣言された。この株は、「ブタインフルエンザ（ｓｗｉｎｅ  ｆｌｕ）」と呼ばれていた。Ｈ１Ｎ１  Ａ型インフルエンザウイルスはまた、１９１８年のスペイン風邪パンデミック、１９７６年のフォートディクスアウトブレイク、および１９７７〜１９７８年のソ連風邪エピデミックに関与していた。
【００４０】
単離された：「単離された」生物学的成分（核酸、タンパク質、またはウイルスなど）は、他の生物学的成分（細胞デブリ、または他のタンパク質もしくは核酸など）から実質的に分離または精製して取り出されている。「単離された」生物学的成分には、標準的な精製方法によって精製された成分が挙げられる。この用語はまた、組換え核酸、タンパク質、またはウイルス（またはＶＬＰ）、および化学合成された核酸またはペプチドを包含する。
【００４１】
リンカー：融合タンパク質の２つのポリペプチド間のスペーサーとしての役割を果たす１つ以上のアミノ酸。
【００４２】
マトリックス（Ｍ１）タンパク質：ウイルスエンベロープ内に見出されるインフルエンザウイルス構造タンパク質。Ｍ１は、アセンブリおよび出芽で機能を果たすと考えられている。
【００４３】
ノイラミニダーゼ（ＮＡ）：インフルエンザウイルス膜糖タンパク質。ＮＡは、感染細胞の表面の炭水化物部分からの末端シアル酸残基を切断することによるウイルスＨＡの細胞受容体の破壊に関与する。ＮＡはまた、ウイルスタンパク質からシアル酸残基を切断してウイルスの凝集を防止する。ＮＡ（ＨＡと共に）は、２つの主要なインフルエンザウイルス抗原決定基のうちの１つである。
【００４４】
作動可能に連結した：第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的関係に置かれている場合、第１の核酸配列は第２の核酸配列と作動可能に連結している。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、プロモーターはコード配列に作動可能に連結している。一般に、作動可能に連結したＤＮＡ配列は連続しており、２つのタンパク質コード領域を結合する必要がある場合、同一の読み枠内に存在する。
【００４５】
最適化したインフルエンザＨＡタンパク質：本明細書中で使用する場合、「最適化したインフルエンザＨＡタンパク質」は、１９１８年と２０１２年との間に分離された選択されたＨ１Ｎ１インフルエンザウイルスの配列アラインメント（以下の実施例１に記載）によって生成したＨＡタンパク質コンセンサス配列をいう。最適化したＨＡタンパク質をコードするヌクレオチド配列を、コドン最適化およびＲＮＡ最適化（ＲＮＡ安定性を増大させるためなど）によって哺乳動物細胞での発現のためにさらに最適化した（または最適化することができる）。本明細書中に開示の（そして、本明細書中で配列番号１〜７として記載の）最適化したインフルエンザＨＡタンパク質を、「ＣＯＢＲＡ」配列という。最適化したＨＡポリペプチドを、被験体において広い反応性を示す免疫応答を惹起するようにデザインする。本開示の文脈では、「広い反応性を示す」は、タンパク質配列が被験体において広範なインフルエンザウイルス（特定のサブタイプ内のほとんどまたは全てのインフルエンザウイルスなど）の感染を阻害するか、中和するか、防止するのに十分な免疫応答を誘発することを意味する。いくつかの例では、最適化したインフルエンザＨＡタンパク質は、ほとんどまたは全てのＨ１Ｎ１インフルエンザウイルス分離株に対して免疫応答（防御免疫応答など）を誘発することができる。
【００４６】
アウトブレイク：本明細書中で使用する場合、インフルエンザウイルス「アウトブレイク」は、所定の年の一国内に由来するウイルス分離株の集団をいう。
【００４７】
薬学的に許容され得るビヒクル：本開示で有用な薬学的に許容され得るキャリア（ビヒクル）は、従来のものである。Ｅ．Ｗ．ＭａｒｔｉｎによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，第１５版（１９７５）には、１つ以上の治療組成物（１つ以上のインフルエンザワクチンなど）およびさらなる医薬品の薬学的送達に適切な組成物および製剤が記載されている。
【００４８】
一般に、キャリアの性質は、使用される特定の投与様式に依存する。例えば、非経口製剤は、通常、薬学的および生理学的に許容され得る流動物（水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水性デキストロース、またはグリセロールなど）をビヒクルとして含む注射液を含む。固体組成物（例えば、粉末、丸薬、錠剤、またはカプセルの形態）のために、従来の非毒性固体キャリアには、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムが含まれ得る。生物学的に中性のキャリアに加えて、投与すべき薬学的組成物は、少量の非毒性補助物質（ａｕｘｉｌｉａｒｙ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）（湿潤剤または乳化剤、防腐剤、およびｐＨ緩衝剤（例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレート）など）を含むことができる。
【００４９】
ポリペプチド：単量体がアミド結合によって相互に結合したアミノ酸残基であるポリマー。アミノ酸がα−アミノ酸である場合、Ｌ−光学異性体またはＤ−光学異性体のいずれかを使用することができる。用語「ポリペプチド」または「タンパク質」は、本明細書中で使用する場合、任意のアミノ酸配列を含むことが意図され、糖タンパク質などの修飾配列が含まれる。用語「ポリペプチド」は、天然に存在するタンパク質および組換えまたは合成によって産生されるタンパク質を包含することを特に意図する。用語「残基」または「アミノ酸残基」は、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドに組み込まれるアミノ酸への言及を含む。
【００５０】
保存的アミノ酸置換は、置換された場合に元のタンパク質の性質への干渉が最小限である（すなわち、かかる置換が行われてもタンパク質の構造、および、特に、機能が保存され、有意に変化しない）置換である。保存的置換の例を以下に示す。
【表１】
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【００５１】
保存的置換は、一般に、（ａ）置換領域のポリペプチド骨格の構造（例えば、シートまたはヘリックス高次構造としての）、（ｂ）標的部位の分子の電荷または疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩高性が維持される。
【００５２】
一般にタンパク質の性質を最も大きく変化させると予想される置換は、非保存的な以下の変化である（例えば、（ａ）親水性残基（例えば、セリルまたはトレオニル）で疎水性残基（例えば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリル、またはアラニル）を置換する（または、親水性残基（例えば、セリルまたはトレオニル）を疎水性残基（例えば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリル、またはアラニル）で置換する）変化；（ｂ）システインまたはプロリンで任意の他の残基を置換する（または、システインまたはプロリンを任意の他の残基で置換する）変化；（ｃ）正電荷の側鎖を有する残基（例えば、リシル、アルギニル、またはヒスタジル）で負電荷の残基（例えば、グルタミルまたはアスパルチル）を置換する（または、正電荷の側鎖を有する残基（例えば、リシル、アルギニル、またはヒスタジル）を負電荷の残基（例えば、グルタミルまたはアスパルチル）で置換する）変化；または（ｄ）嵩高い側鎖を有する残基（例えば、フェニルアラニン）で、側鎖を持たない残基（例えば、グリシン）を置換する（または、嵩高い側鎖を有する残基（例えば、フェニルアラニン）を、側鎖を持たない残基（例えば、グリシン）で置換する）変化）。
【００５３】
疾患の防止、処置、または改善：疾患の「防止」は、疾患の完全な発症の抑制をいう。「処置」は、疾患または病的状態が発症し始めた後のそれの兆候または症状を改善する治療的介入をいう。「改善」は、疾患の兆候または症状の数または重症度の減少をいう。
【００５４】
プロモーター：プロモーターは、核酸の転写を指示する一連の核酸制御配列である。プロモーターは、転写開始部位付近の必要な核酸配列を含む。プロモーターはまた、遠位のエンハンサーエレメントまたはリプレッサーエレメントを必要に応じて含む。「構成性プロモーター」は、持続的に活性であり、外部のシグナルまたは分子による調節を受けないプロモーターである。対照的に、「誘導性プロモーター」の活性は、外部のシグナルまたは分子（例えば、転写因子）によって調節される。本明細書中のいくつかの実施形態では、プロモーターはＣＭＶプロモーターである。
【００５５】
精製された：用語「精製された」は、完全に純粋である必要はなく、むしろ、相対的な用語として意図される。したがって、例えば、精製されたペプチド、タンパク質、ウイルス、ＶＬＰ、または他の活性化合物は、天然に会合しているタンパク質および他の夾雑物から全部または部分的に単離されているものである。一定の実施形態では、用語「実質的に精製された」は、細胞、細胞培養培地、または他の粗調製物から単離されており、分画に供して最初の調製物の種々の成分（タンパク質、細胞デブリ、および他の成分など）を除去したペプチド、タンパク質、ウイルス、ＶＬＰ、または他の活性化合物をいう。
【００５６】
組換え：組換え核酸、タンパク質、ウイルス、またはＶＬＰは、天然に存在しない配列を有するか、２つの他の種類の（ｏｔｈｅｒｗｉｓｅ）個別の配列セグメントの人為的組み合わせによって作製される配列を有するものである。この人為的組み合わせを、しばしば、化学合成、または、より一般的には、単離された核酸セグメントの人為的操作（例えば、遺伝子操作技術）によって行う。
【００５７】
配列同一性：アミノ酸配列間または核酸配列間の類似性は、配列間の類似性に関して示され、そうでなければ、配列同一性という。配列同一性は、頻繁に、同一性（または類似性もしくは相同性）百分率に関して測定され、百分率が高いほど２つの配列はより類似する。所与の遺伝子またはタンパク質のホモログまたはバリアントは、標準的な方法を使用してアラインメントした場合に比較的高い配列同一性を有する。
【００５８】
比較のための配列アラインメント法は当該分野で周知である。種々のプログラムおよびアラインメントアルゴリズムは以下に記載されている：ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２，１９８１；ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０；ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４，１９８８；ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ，Ｇｅｎｅ  ７３：２３７−２４４，１９８８；ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３，１９８９；Ｃｏｒｐｅｔら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １６：１０８８１−１０８９０，１９８８；ならびにＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４，１９８８。  Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．６：１１９−１２９，１９９４。
【００５９】
ＮＣＢＩ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ（商標））（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０）は、いくつかの供給源（国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）が含まれる）およびインターネット上で利用可能であり、配列解析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、およびｔｂｌａｓｔｘと併せて用いる。
【００６０】
被験体：生きている多細胞脊椎動物（ヒトおよび非ヒト哺乳動物（非ヒト霊長類など）の両方が含まれるカテゴリー）。
【００６１】
治療有効量：特定の薬剤で処置されている被験体において所望の効果を達成するのに十分な該薬剤の量。例えば、これは、被験体における免疫応答の誘発および／またはインフルエンザウイルスに原因する感染または疾患の防止に有用なインフルエンザウイルスワクチンの量であり得る。理想的には、本開示の文脈では、インフルエンザワクチンの治療有効量は、被験体において実質的な細胞傷害効果を生じることなく被験体においてインフルエンザウイルスに原因する感染に対する耐性を増加させ、感染症を防止し、改善し、そして／または処置するのに十分な量である。被験体における感染に対する耐性を増加させ、感染症を防止し、改善し、そして／または処置するのに有用なインフルエンザワクチンの有効量は、例えば、処置される被験体、治療組成物の投与様式、および他の要因に依存する。
【００６２】
形質転換された：形質転換された細胞は、分子生物学技術によって核酸分子を導入している細胞である。本明細書中で使用する場合、用語、形質転換は、核酸分子をかかる細胞に導入することができる全ての技術（ウイルスベクターでのトランスフェクション、プラスミドベクターでの形質転換、ならびにエレクトロポレーション、リポフェクション、および粒子銃による粒子の加速による裸のＤＮＡの導入が挙げられる）を含む。
【００６３】
ワクチン：疾患（感染症など）の防止、改善、または処置のために投与される免疫応答を刺激することができる免疫原性材料の調製物。免疫原性材料には、例えば、弱毒化または死滅した微生物（弱毒化ウイルスなど）または抗原性のタンパク質、ペプチド、またはこれらに由来するＤＮＡを挙げることができる。ワクチンは、予防的（または防止的）および治療的応答の両方を誘発することができる。投与方法はワクチンに応じて変化するが、接種、摂取、吸入、または他の投与形態を挙げることができる。接種物を、いくつかの経路（非経口（静脈内、皮下、または筋肉内など）が挙げられる）のうちのいずれかによって送達することができる。ワクチンを、免疫応答を追加刺激する（ｂｏｏｓｔ）ためのアジュバントと共に投与することができる。
【００６４】
ベクター：ベクターは、ベクターが宿主細胞内で複製し、そして／または宿主細胞内に組み込まれる能力を破壊することなく外来核酸の挿入を可能にする核酸分子である。ベクターは、それが宿主細胞内で複製することを可能にする核酸配列（複製起点など）を含むことができる。挿入ベクターは、ベクター自体を宿主核酸に挿入することができる。ベクターはまた、１つ以上の選択マーカー遺伝子および他の遺伝エレメントを含むことができる。発現ベクターは、挿入された遺伝子（単数もしくは複数）の転写および翻訳を可能にするのに必要な調節配列を含むベクターである。本開示のいくつかの実施形態では、ベクターは、インフルエンザＨＡ、ＮＡ、またはＭ１タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ベクターはｐＴＲ６００発現ベクターである（米国特許出願公開第２００２／０１０６７９８号；Ｒｏｓｓら，Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１（２）：１０２−１０３，２０００；Ｇｒｅｅｎら，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０：２４２−２４８，２００１）。
【００６５】
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）：１つ以上のウイルス構造タンパク質で構成されるが、ウイルスゲノムを欠くウイルス粒子。ＶＬＰがウイルスゲノムを欠くので、ＶＬＰは非感染性である。さらに、ＶＬＰを、しばしば、異種発現によって産生することができ、容易に精製することができる。ほとんどのＶＬＰは、宿主細胞からの出芽および粒子の放出を駆動する少なくとも１つのウイルスコアタンパク質を含む。かかるコアタンパク質の一例はインフルエンザＭ１である。本明細書中のいくつかの実施形態では、インフルエンザＶＬＰは、ＨＡ、ＮＡ、および／またはＭ１タンパク質を含む。インフルエンザＶＬＰを、ＨＡおよびＮＡタンパク質、ならびに必要に応じてＭ１タンパク質をコードするプラスミドでの宿主細胞のトランスフェクションによって産生させることができる。トランスフェクトした細胞の、タンパク質を発現させるのに適した期間（およそ７２時間など）のインキュベーション後、ＶＬＰを細胞培養上清から単離することができる。実施例２は、細胞上清からのインフルエンザＶＬＰの例示的な精製プロトコールを提供する。この実施例では、ＶＬＰを、低速遠心分離（細胞デブリ除去のため）、真空濾過、および２０％グリセロールによる超遠心分離によって単離する。インフルエンザＶＬＰの他の産生方法が当該分野で公知である（例えば、米国特許出願公開第２００６／０２６３８０４号；同第２００８／００３１８９５号；同第２０１０／０１６６７６９号；および同第２０１０／０２３９６１０号を参照のこと）。
【００６６】
別の説明がない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。単数を示す用語「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上別の意味が明確に示されない限り、複数形を含む。同様に、用語「または」は、文脈上別の意味が明確に示されない限り、「および」を含むことを意図する。それ故、「ＡまたはＢを含む」は、ＡもしくはＢまたはＡおよびＢを含むことを意味する。核酸またはポリペプチドについて与えられた全ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズおよび全ての分子量または分子質量の値は近似値であり、説明のために提供されていることをさらに理解すべきである。本明細書中に記載の方法および材料に類似するか等価な方法および材料を本開示の実施または試験で使用することができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。本明細書中で言及した全ての刊行物、特許出願、特許、および他のリファレンスは、その全体が参考として援用される。矛盾する場合、本明細書（用語の説明が含まれる）に従う。さらに、材料、方法、および実施例は、例証のみを目的とし、本発明の制限を意図しない。
【００６７】
ＩＩＩ．いくつかの実施形態の概要
Ｈ１Ｎ１インフルエンザに対して広い反応性を示す免疫応答を誘発するために最適化したＨ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドの生成を本明細書中に開示する。最適化したＨＡポリペプチドを、１９１８〜２０１２年に分離された選択Ｈ１Ｎ１ウイルスに基づいた一連のＨＡタンパク質アラインメントおよびその後のコンセンサス配列の生成によって作製した。７種のＨＡ配列を生成するために使用した方法を、実施例１および図１〜７に記載する。７種の最適化したＨＡポリペプチドのアミノ酸配列を、本明細書中に配列番号１〜７として示す。さらに、配列番号１〜７のアミノ酸コンセンサス配列を、配列番号８として本明細書中に提供する。
【００６８】
Ｈ１Ｎ１インフルエンザに対して広い反応性を示す免疫応答を誘発するために最適化したアミノ酸配列を有する組換えインフルエンザＨＡポリペプチドを本明細書中に提供する。いくつかの実施形態では、ＨＡポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号８と少なくとも９６％、少なくとも９６．５％、少なくとも９７％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号８と比較して２個以下、３個以下、４個以下、５個以下、６個以下、７個以下、８個以下、９個以下、または１０個以下のアミノ酸置換を含む。
【００６９】
特定の実施形態では、配列番号１と少なくとも９６％、少なくとも９６．５％、少なくとも９７％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一；配列番号２と少なくとも９９％または少なくとも９９．５％同一；配列番号３と少なくとも９９％または少なくとも９９．５％同一；配列番号４と少なくとも９９％または少なくとも９９．５％同一；配列番号５と少なくとも９８．４％、少なくとも９８．６％、少なくとも９８．８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一；配列番号６と少なくとも９９％または少なくとも９９．５％同一；配列番号７と少なくとも９７％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一；あるいは配列番号８を含むアミノ酸配列を含む組換えインフルエンザＨＡポリペプチドを提供する。
【００７０】
他の特定の実施形態では、組換えインフルエンザＨＡポリペプチドは、配列番号１の残基２〜５６６と少なくとも９６％、少なくとも９６．５％、少なくとも９７％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一；配列番号２の残基２〜５６６と少なくとも９９％または少なくとも９９．５％同一；配列番号３の残基２〜５６６と少なくとも９９％または少なくとも９９．５％同一；配列番号４の残基２〜５６６と少なくとも９９％または少なくとも９９．５％同一；配列番号５の残基２〜５６６と少なくとも９８．４％、少なくとも９８．６％、少なくとも９８．８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一；配列番号６の残基２〜５６５と少なくとも９９％または少なくとも９９．５％同一；配列番号７の残基２〜５６６と少なくとも９７％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一；あるいは配列番号８の残基２〜５６６を含むアミノ酸配列を含む。
【００７１】
他の実施形態では、ＨＡポリペプチドのアミノ酸配列は、（ｉ）配列番号１と比較して１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下、または１個以下のアミノ酸置換；（ｉｉ）配列番号２と比較して８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下、または１個以下のアミノ酸置換；（ｉｉｉ）配列番号３と比較して６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下、または１個以下のアミノ酸置換；（ｉｖ）配列番号４と比較して７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下、または１個以下のアミノ酸置換；（ｖ）配列番号５と比較して９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下、または１個以下のアミノ酸置換；（ｖｉ）配列番号６と比較して６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下、または１個以下のアミノ酸置換；あるいは（ｖｉｉ）配列番号７と比較して１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下、または１個以下のアミノ酸置換を含む。
【００７２】
いくつかの例では、インフルエンザＨＡポリペプチドは、配列番号１の残基２〜５６６、配列番号２の残基２〜５６６、配列番号３の残基２〜５６６、配列番号４の残基２〜５６６、配列番号５の残基２〜５６６、配列番号６の残基２〜５６５、配列番号７の残基２〜５６６、または配列番号８の残基２〜５６６のアミノ酸配列を含むか、またはこれらのアミノ酸配列からなる。
【００７３】
他の例では、組換えＨＡポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号８のアミノ酸配列を含むか、またはこれらのアミノ酸配列からなる。
【００７４】
本明細書中に開示の組換えＨＡポリペプチドをコードする単離核酸分子をさらに提供する。いくつかの実施形態では、核酸分子を、哺乳動物細胞中での発現のためにコドン最適化する。核酸分子を、ＲＮＡ安定性のために必要に応じてさらに最適化する。
【００７５】
組換えＨＡポリペプチドをコードする核酸分子を含むベクターも本開示によって提供される。ベクターは、ＨＡポリペプチドの発現のための任意の適切なベクター（哺乳動物発現ベクターなど）であり得る。特定の実施例では、ベクターはｐＴＲ６００発現ベクターである（米国特許出願公開第２００２／０１０６７９８号（本明細書中で参考として援用される）；Ｒｏｓｓら，Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１（２）：１０２−１０３，２０００；Ｇｒｅｅｎら，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０：２４２−２４８，２００１）。
【００７６】
いくつかの実施例では、ベクターは、ＨＡポリペプチドをコードする核酸配列に作動可能に連結したプロモーターを含む。特定の実施例では、プロモーターはＣＭＶプロモーターである。
【００７７】
開示のベクターを含む単離細胞も提供する。いくつかの場合、細胞は、ＶＬＰの産生および発現に適切な任意の細胞型（哺乳動物細胞など）である。
【００７８】
本明細書中に開示の最適化したＨＡポリペプチドを含むインフルエンザＶＬＰをさらに提供する。インフルエンザＶＬＰは、ウイルス粒子の形成に必要な任意のさらなるインフルエンザタンパク質をさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、インフルエンザＶＬＰは、インフルエンザノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質、インフルエンザマトリックス（Ｍ１）タンパク質、またはその両方をさらに含む。
【００７９】
ＨＡポリペプチドをコードするベクター、インフルエンザＮＡタンパク質をコードするベクター、およびインフルエンザＭ１タンパク質をコードするベクターで宿主細胞をＨＡ、Ｍ１、およびＮＡタンパク質を発現させるのに十分な条件下でトランスフェクトすることによって産生された、本明細書中に開示のインフルエンザＨＡポリペプチドを含むインフルエンザＶＬＰも提供する。
【００８０】
最適化したインフルエンザＨＡポリペプチドを含む融合タンパク質を、本開示によってさらに提供する。
【００８１】
本明細書中に開示の最適化したインフルエンザＨＡタンパク質、または最適化したインフルエンザＨＡタンパク質を含む融合タンパク質もしくはＶＬＰを含む組成物も本明細書中に提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、薬学的に許容され得るキャリアおよび／またはアジュバントをさらに含む。例えば、アジュバントは、ミョウバン、フロイント完全アジュバント、生物学的アジュバント、または免疫賦活性オリゴヌクレオチド（ＣｐＧオリゴヌクレオチドなど）であり得る。
【００８２】
本明細書中に開示の最適化したインフルエンザＨＡタンパク質、最適化したインフルエンザＨＡを含む融合タンパク質、最適化したインフルエンザＨＡを含むＶＬＰ、またはその組成物を投与することによって被験体におけるインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘発する方法をさらに提供する。いくつかの実施形態では、インフルエンザウイルスはＨ１Ｎ１インフルエンザウイルスである。いくつかの実施形態では、ＨＡタンパク質、ＨＡ融合タンパク質、またはＶＬＰを、任意の適切な投与経路（例えば、筋肉内など）を使用して投与することができる。いくつかの実施形態では、ＨＡタンパク質、融合タンパク質、またはＶＬＰを、薬学的に許容され得るキャリアおよび／またはアジュバントをさらに含む組成物として投与する。例えば、アジュバントは、ミョウバン、フロイント完全アジュバント、生物学的アジュバント、または免疫賦活性オリゴヌクレオチド（ＣｐＧオリゴヌクレオチドなど）であり得る。
【００８３】
本明細書中に開示の最適化したインフルエンザＨＡタンパク質を含むＶＬＰを被験体に投与することによってまたはその組成物を投与することによってインフルエンザウイルスに対して被験体を免疫する方法も提供する。本方法のいくつかの実施形態では、組成物は、薬学的に許容され得るキャリアおよび／またはアジュバントをさらに含む。例えば、アジュバントは、ミョウバン、フロイント完全アジュバント、生物学的アジュバント、または免疫賦活性オリゴヌクレオチド（ＣｐＧオリゴヌクレオチドなど）であり得る。いくつかの実施形態では、ＶＬＰ（またはその組成物）を筋肉内投与する。
【００８４】
被験体の免疫応答を誘発するか被験体を免疫する方法のいくつかの実施形態では、被験体に、最適化したＨＡタンパク質を含む約１〜約２５μｇのＶＬＰを投与する。特定の実施例では、被験体に、約５〜約２０μｇのＶＬＰまたは約１０〜約１５μｇのＶＬＰを投与する。１つの特定の非限定的な実施例では、被験体に、約１５μｇのＶＬＰを投与する。しかし、当業者は、被験体に投与するためのＶＬＰの治療有効量（例えば、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス感染を防御する量）を決定することができる。
【００８５】
ＩＶ．最適化したＨ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチド
７種の異なる最適化したＨ１Ｎ１  ＨＡポリペプチド配列を本明細書中に提供する。Ｈ１Ｎ１  ＨＡアミノ酸配列を、ＮＣＢＩインフルエンザウイルスリソースデータベースからダウンロードした。１９１８〜２０１２年に分離したインフルエンザウイルス由来のＨ１Ｎ１  ＨＡタンパク質を、コンセンサス配列の生成のために使用した。実施例１は、各コンセンサス配列の生成のために使用した方法を記載している（図１〜７も参照のこと）。
【００８６】
【化１】
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【化２】
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【化３】
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【化４】
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【００８７】
本明細書中に開示のいくつかの実施形態では、ＨＡポリペプチドはＮ末端メチオニン残基を欠く。したがって、いくつかの実施例では、配列番号１〜５および８のいずれか１つの残基２〜５６６を含むか、配列番号６の残基２〜５６５を含むＨＡポリペプチドを提供する。
【００８８】
コドン使用頻度およびＲＮＡ最適化（ＧｅｎｅＡｒｔ；Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を含めて、ＣＯＢＲＡアミノ酸配列を逆翻訳し、哺乳動物細胞での発現のために最適化することができる。最適化した核酸配列を、適切な発現ベクター（ｐＴＲ６００発現ベクター（米国特許出願公開第２００２／０１０６７９８号；Ｒｏｓｓら，Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１（２）：１０２−１０３，２０００；Ｇｒｅｅｎら，Ｖａｃｃｉｎｅ
２０：２４２−２４８，２００１）など）に挿入することができる。
【００８９】
Ｖ．インフルエンザ
インフルエンザウイルスは、オルトミクソウイルス科に属するセグメント化負鎖ＲＮＡウイルスである。インフルエンザウイルスには３つの型が存在する（Ａ型、Ｂ型、およびＣ型）。Ａ型インフルエンザウイルスは、広範な種々の鳥類および哺乳動物（ヒト、ウマ、海洋哺乳動物、ブタ、フェレット、およびニワトリが含まれる）に感染する。動物では、ほとんどのＡ型インフルエンザウイルスは、気道および腸管に軽度の限局性感染を引き起こす。しかし、高病原性Ａ型インフルエンザ株（Ｈ５Ｎ１など）は、家禽類において全身性感染を引き起こし、その死亡率は１００％に達し得る。Ａ型インフルエンザに感染した動物は、しばしば、インフルエンザウイルスの保有宿主として働き、一定のサブタイプがヒトへの種の壁を超えることが示されている。
【００９０】
Ａ型インフルエンザウイルスを、表面糖タンパク質（すなわち、ウイルスの付着および細胞放出に必要な血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ））をコードする２つの遺伝子の抗原性領域の対立遺伝子変異に基づいてサブタイプに分類することができる。現在、Ａ型インフルエンザウイルスでは１６種のＨＡサブタイプ（Ｈ１〜Ｈ１６）および９種のＮＡ（Ｎ１〜Ｎ９）抗原性バリアントが知られている。以前は、３つのサブタイプ（Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、およびＨ３Ｎ２）のみがヒトで循環していることが知られていた。しかし、近年、１９９７年および２００３年の香港で報告されているようにトリＡ型インフルエンザの病原性Ｈ５Ｎ１サブタイプが種の壁を超えてヒトに感染し、数名の患者を死に至らしめたことが報告されている。
【００９１】
動物では、ほとんどのＡ型インフルエンザウイルスは、気道および腸管に軽度の限局性感染を引き起こす。しかし、高病原性Ａ型インフルエンザ株（Ｈ５Ｎ１など）は、家禽類において全身性感染を引き起こし、その死亡率は１００％に達し得る。２００９年に、Ｈ１Ｎ１インフルエンザは、ヒトインフルエンザの最も一般的な原因であった。２００９年に出現したブタ起源Ｈ１Ｎ１の新規の株が、世界保健機関によってパンデミック宣言された。この株は、「ブタインフルエンザ」と呼ばれた。Ａ型インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１はまた、１９１８年のスペイン風邪パンデミック、１９７６年のフォードディクスアウトブレイク、および１９７７〜１９７８年のソ連風邪エピデミックに関与していた。
【００９２】
Ａ型インフルエンザウイルスゲノムは、調節機能を有する９種の構造タンパク質および１種の非構造（ＮＳ１）タンパク質をコードする。インフルエンザウイルスセグメント化ゲノムは、８種のネガティブセンスＲＮＡ（ｎｓＲＮＡ）遺伝子セグメント（ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、ＮＳ、ＨＡ、および  ＮＡ）を含み、これらは、少なくとも１０種のポリペプチド（ＲＮＡ指向性ＲＮＡポリメラーゼタンパク質（ＰＢ２、ＰＢ１、およびＰＡ）、核タンパク質（ＮＰ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、血球凝集素（サブユニットＨＡ１およびＨＡ２）、マトリックスタンパク質（Ｍ１およびＭ２）、および非構造タンパク質（ＮＳ１およびＮＳ２）が含まれる）をコードする（Ｋｒｕｇら，“Ｔｈｅ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｖｉｒｕｓｅｓ，”  Ｒ．Ｍ．Ｋｒｕｇ編，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，１９８９，ｐｐ．８９  １５２中）。
【００９３】
インフルエンザウイルスの広範な疾患を引き起こす能力は、抗原変化を受けることによって免疫系を逃れるその能力に起因する。この抗原変化は、宿主が動物インフルエンザウイルスおよびヒトインフルエンザウイルスの両方に同時に感染する場合に起こると考えられる。宿主内での変異および再集合の間に、ウイルスは、別のウイルス由来のＨＡおよび／またはＮＡ表面タンパク質遺伝子をそのゲノムに組み込み、それにより、新規のインフルエンザサブタイプを生成して免疫系を逃れることができる。
【００９４】
ＨＡは、一般におよそ５６０アミノ酸を含み、総ウイルスタンパク質の２５％に相当するウイルス表面糖タンパク質である。ＨＡは、感染初期の宿主細胞へのウイルス粒子の付着（ａｄｈｅｓｉｏｎ）およびその侵入を担う。ウイルスＨＡ０前駆体のＨＡ１およびＨＡ２サブフラグメントへの切断は、ウイルスが細胞に感染するために必要なステップである。したがって、切断は、宿主細胞内の新規のウイルス粒子が新規の細胞に感染することができるビリオンに変換するために必要である。切断は、完全体ＨＡ０膜タンパク質の、感染細胞の小胞体から原形質膜への輸送中に起こることが公知である。輸送中に、血球凝集素は、一連の翻訳時修飾および翻訳後修飾（前駆体ＨＡのアミノ末端フラグメントＨＡ１およびカルボキシ末端ＨＡ２へのタンパク質分解による切断が含まれる）を受ける。初代組織培養物または樹立細胞株におけるインフルエンザ株の成長における主な困難の１つは、宿主細胞においてインフルエンザ血球凝集素のタンパク質分解による切断活性化が必要であることに原因する。
【００９５】
細胞表面のノイラミン酸含有受容体へのウイルスの付着を非切断ＨＡが媒介することができることが公知であるにもかかわらず、感染サイクルの次のステップ（融合である）が可能でない。ＨＡ２が標的細胞に挿入され、それにより、ウイルスと標的細胞膜との間に架橋を形成することができるように、切断によるＨＡ２の疎水性アミノ末端の露出が必要であることが報告されている。このプロセスの後に２つの膜が融合され、ウイルスが標的細胞に侵入する。
【００９６】
ＨＡのタンパク質分解による活性化は、しばしばカルシウム依存性であり、中性のｐＨが至適である細胞内酵素であるトリプシン様エンドプロテアーゼによるアルギニン残基での切断を伴う。活性化プロテアーゼが細胞酵素であるので、感染された細胞型によってＨＡが切断されるかどうかが決定される。哺乳動物インフルエンザウイルスおよび非病原性トリインフルエンザウイルスのＨＡは、限られた数の細胞型においてのみタンパク質分解による切断に感受性を示す。他方では、Ｈ５およびＨ７サブタイプ間の病原性トリウイルスのＨＡは、広範な異なる宿主細胞に存在するプロテアーゼによって切断される。したがって、宿主範囲が異なり、これは血球凝集素の切断性の相違に起因し、この切断性はウイルスの病原性に相関する。
【００９７】
ノイラミニダーゼ（ＮＡ）は、インフルエンザウイルスの第２の膜糖タンパク質である。ウイルスＮＡの存在は、感染ウイルスに対して多面的防御免疫応答を生じるのに重要であることが示されている。ほとんどのＡ型インフルエンザウイルスについて、ＮＡは４１３アミノ酸長であり、１４１３個のヌクレオチドの遺伝子によってコードされる。９種の異なるＮＡサブタイプがインフルエンザウイルスで同定されており（Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、およびＮ９）、その全てが野鳥間で見出されている。ＮＡは、感染細胞表面の炭水化物部分からの末端ノイラミン酸（シアル酸とも呼ばれる）残基の切断による、ウイルスＨＡの細胞受容体の破壊に関与する。ＮＡはまた、ウイルスタンパク質からシアル酸残基を切断し、ウイルスの凝集を防止する。この機構を使用して、ＮＡは新規に形成されたウイルス粒子の細胞膜に沿った蓄積の防止および粘膜表面に存在する粘液を介したウイルスの輸送の促進によってウイルス子孫の放出を容易にするとの仮説が立てられる。ＮＡは、抗原変異に供される重要な抗原決定基である。
【００９８】
表面タンパク質ＨＡおよびＮＡに加えて、インフルエンザウイルスは６種のさらなる内部遺伝子を含み、この遺伝子は８種の異なるタンパク質（ポリメラーゼ遺伝子（ＰＢ１、ＰＢ２、およびＰＡ）、マトリックスタンパク質（Ｍ１およびＭ２）、核タンパク質（ＮＰ）、および非構造タンパク質（ＮＳ１およびＮＳ２）が挙げられる）を生じる（Ｈｏｒｉｍｏｔｏら，Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．１４（１）：１２９−１４９，２００１）。
【００９９】
子孫ビリオンにパッケージングされるために、ウイルスＲＮＡは、インフルエンザウイルスマトリックス１（Ｍ１）タンパク質および核外輸送タンパク質と会合した３種のインフルエンザウイルスポリメラーゼタンパク質、核タンパク質（ＮＰ）、およびウイルスＲＮＡから構成されるリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体として核から輸送される（Ｍａｒｓｈら，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，８２：２２９５−２３０４，２００８）。エンベロープ内に存在するＭ１タンパク質は、アセンブリおよび出芽において機能を果たすと考えられる。限られた数のＭ２タンパク質がビリオンに組み込まれる（Ｚｅｂｅｄｅｅ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：２７６２−２７７２，１９８８）。Ｍ２タンパク質はＨ＋イオンチャネル活性を有する四量体を形成し、エンドソーム中で低ｐＨによって活性化された場合、ビリオン内部を酸性化し、その脱殻を促進する（Ｐｉｎｔｏら，Ｃｅｌｌ  ６９：５１７−５２８，１９９２）。アマンタジンは、Ｍ２イオンチャネル活性を妨害し、それにより、ウイルス脱殻を阻害することによってウイルス感染を防止する抗インフルエンザ薬である。
【０１００】
ＮＳ１（非構造タンパク質）は、複数の機能（細胞ｍＲＮＡのスプライシングおよび核輸送の調節ならびに翻訳の刺激が含まれる）を有する。ＮＳ１の主な機能は、宿主のインターフェロン活性を打ち消すことのようである。これは、ＮＳ１ノックアウトウイルスがインターフェロン非欠損細胞において生存可能であるが、親ウイルスより非効率に成長したからである（Ｇａｒｃｉａ−Ｓａｓｔｒｅ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２５２：３２４−３３０，１９９８）。
【０１０１】
ＮＳ２はウイルス粒子に検出されている（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎら，Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１１６：６９−８０，１９９１；Ｙａｓｕｄａら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９６：２４９−２５５，１９９３）。ウイルス粒子のＮＳ２タンパク質の平均数は、１３０〜２００分子と推定された。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイは、Ｍ１とＮＳ２との間に直接的なタンパク質間接触を示す。ＮＳ２−Ｍ１複合体はまた、ウイルス感染細胞のライセートにおける免疫沈降によって検出されている。ＮＳ２タンパク質は、Ｍ１タンパク質との相互作用によるＲＮＰの核外輸送で役割を果たすと考えられる（Ｗａｒｄら，Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１４０：２０６７−２０７３，１９９５）。
【０１０２】
ＶＩ．インフルエンザＶＬＰおよびその投与
最適化したＨＡ（配列番号１〜８のいずれか１つとして記載のアミノ酸配列を有するＨＡなど）を含むインフルエンザＶＬＰを本明細書中に提供する。インフルエンザＶＬＰは、一般に、ＨＡ、ＮＡ、およびＭ１タンパク質から構成される。インフルエンザＶＬＰの生成は当該分野で記載されており、当業者の能力の範囲内である。例えば、インフルエンザＶＬＰを、ＨＡ、ＮＡ、およびＭ１タンパク質をコードするプラスミドでの宿主細胞のトランスフェクションによって生成することができる。タンパク質を発現させるのに適した期間（およそ７２時間など）、トランスフェクトした細胞をインキュベートした後、ＶＬＰを細胞培養上清から単離することができる。以下の実施例２は、細胞上清からのインフルエンザＶＬＰの例示的な精製プロトコールを提供する。この実施例では、ＶＬＰを、低速遠心分離（細胞デブリ除去のため）、真空濾過、および２０％グリセロールによる超遠心分離によって単離する。
【０１０３】
本明細書中に開示のインフルエンザＶＬＰを、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルスに対する防御免疫応答を誘発するためのインフルエンザワクチンとして使用することができる。
【０１０４】
インフルエンザＶＬＰまたはその組成物を、組換えウイルスを被験体に導入するために通常使用される任意の経路によって被験体に投与することができる。投与方法には、皮内、筋肉内、腹腔内、非経口、静脈内、皮下、膣、直腸、鼻腔内、吸入、または経口が挙げられるが、これらに限定されない。非経口投与（皮下、静脈内、または筋肉内投与など）は、一般に、注射によって行われる。注射剤を、液体溶液または懸濁液、注射前に液体によって溶液または懸濁液にするのに適切な固体形態、または乳濁液のいずれかとして従来の形態で調製することができる。注射液剤および注射懸濁剤を、上に記載の無菌の粉末、顆粒、および錠剤などから調製することができる。投与は全身であっても局所であってもよい。
【０１０５】
インフルエンザＶＬＰまたはその組成物を、薬学的に許容され得るキャリアなどを使用した任意の適切な様式で投与する。薬学的に許容され得るキャリアは、投与される特定の組成物によって、および組成物を投与するために使用される特定の方法によってある程度決定される。したがって、本開示の薬学的組成物の適切な製剤は広範に存在する。
【０１０６】
非経口投与用調製物には、滅菌された水性または非水性の液剤、懸濁剤、および乳剤が挙げられる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（オリーブ油など）、および注射可能な有機エステル（オレイン酸エチルなど）である。水性キャリアには、水、アルコール溶液／水溶液、乳濁液または懸濁液（食塩水および緩衝媒体が含まれる）が挙げられる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液、または固定油が挙げられる。静脈内ビヒクルには、流体および栄養補充液、および電解質補充液（リンゲルデキストロースに基づいたものなど）などが挙げられる。防腐剤および他の添加物はまた、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなどであり得る。
【０１０７】
組成物のうちのいくつかを、無機酸（塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、およびリン酸など）および有機酸（ギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、およびフマル酸など）との反応によって、または無機塩基（水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムなど）および有機塩基（モノ−、ジ−、トリアルキルアミンおよびモノ−、ジ−、トリアリールアミンならびに置換エタノールアミンなど）との反応によって形成された薬学的に許容され得る酸付加塩または塩基付加塩として潜在的に投与することができる。
【０１０８】
単回用量または複数回用量によって投与することができる。本開示の文脈での被験体への投与用量は、長期間にわたって被験体において有利な治療応答を誘導するかＨ１Ｎ１インフルエンザウイルス感染を抑制または防止するのに十分であるべきである。必要な用量は、被験体の種、年齢、体重、および全身状態、処置される感染症の重症度、使用される特定の組成物、およびその投与様式に応じて被験体ごとに異なる。当業者は、適切な用量を日常的な実験のみを使用して決定することができる。
【０１０９】
治療有効量のインフルエンザＶＬＰのみまたは薬学的に許容され得るキャリアと組み合わせて含む薬学的組成物を本明細書中に提供する。薬学的に許容され得るキャリアには、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびその組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。キャリアおよび組成物は無菌であり得、製剤は投与様式に適合している。組成物はまた、微量の湿潤剤もしくは乳化剤またはｐＨ緩衝剤を含むことができる。組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸薬、カプセル剤、徐放性製剤、または散剤（ｐｏｗｄｅｒ）であり得る。組成物を、伝統的な結合剤およびキャリア（トリグリセリドなど）を使用して坐剤として製剤化することができる。経口製剤は、標準的なキャリア（医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、および炭酸マグネシウムなど）を含むことができる。一般的な薬学的キャリア（無菌食塩水またはゴマ油など）のうちのいずれかを使用することができる。媒体はまた、従来の薬学的補助物質（ａｄｊｕｎｃｔ  ｍａｔｅｒｉａｌ）（例えば、浸透圧調整のための薬学的に許容され得る塩、緩衝剤、および防腐剤など）を含むことができる。本明細書中に提供した組成物および方法と共に使用することができる他の媒体は、通常の生理食塩水およびゴマ油である。
【０１１０】
本明細書中に記載のインフルエンザＶＬＰを、単独または抗原性を増強するための他の治療薬と組み合わせて投与することができる。例えば、インフルエンザＶＬＰを、アジュバント（フロイント不完全アジュバントまたはフロイント完全アジュバントなど）と共に投与することができる。
【０１１１】
必要に応じて、１つ以上のサイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＲＡＮＴＥＳ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、またはＩＦＮ−γなど）、１つ以上の成長因子（ＧＭ−ＣＳＦまたはＧ−ＣＳＦなど）；１つ以上の分子（ＯＸ−４０Ｌまたは４１  ＢＢＬなど）、またはこれらの分子の組み合わせを、生物学的アジュバントとして使用することができる（例えば、Ｓａｌｇａｌｌｅｒら，１９９８，Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．６８（２）：１２２−３８；Ｌｏｔｚｅら，２０００，Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．Ｓｃｉ．Ａｍ．６（Ｓｕｐｐｌ  １）：Ｓ６１−６；Ｃａｏら，１９９８，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  １６（Ｓｕｐｐｌ  １）：２５１−６０；Ｋｕｉｐｅｒら，２０００，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．４６５：３８１−９０を参照のこと）。これらの分子を、宿主の全身に（または局所に）投与することができる。
【０１１２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方における細胞応答を誘導する多くの手段が公知である。種々の抗原に対するｉｎ  ｖｉｖｏでのＣＴＬのプライミングを補助することができる作用物質（ａｇｅｎｔ）としての脂質が同定されている。例えば、米国特許第５，６６２，９０７号に記載のように、パルミチン酸残基を、リジン残基のαおよびεアミノ基に結合し、次いで、（例えば、１つ以上の連結残基（グリシン、グリシン−グリシン、セリン、またはセリン−セリンなど）を介して）免疫原性ペプチドに連結することができる。次いで、脂質付加したペプチドを、ミセル形態に直接注入し、リポソームに組み込むか、アジュバントで乳化することができる。別の例として、大腸菌リポタンパク質（トリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステインリセリル−セリン（ｔｒｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ−Ｓ−ｇｌｙｃｅｒｙｌｃｙｓｔｅｉｎｌｙｓｅｒｙｌ−ｓｅｒｉｎｅ）など）を使用して、適切なペプチドに共有結合した場合に腫瘍特異的ＣＴＬを刺激する（ｐｒｉｍｅ）ことができる（Ｄｅｒｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：５６１，１９８９を参照のこと）。さらに、中和抗体の誘導を適切なエピトープを提示するペプチドに結合体化した（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）同一分子で刺激することもできるので、２つの組成物を組み合わせて望ましいと考えられる体液性応答および細胞性応答の両方の誘発が可能である。
【０１１３】
最適化したＨＡタンパク質を含むＶＬＰの投与を本明細書中で例示するが、当業者は、最適化したインフルエンザＨＡタンパク質自体（ウイルス粒子の非存在下）を、または被験体に免疫応答を誘発するための融合タンパク質として投与することも可能であると理解することになる。
【０１１４】
ある特定の特徴および／または実施形態を例証するために以下の実施例を提供する。これらの実施例は、本開示を記載の特定の特徴または実施形態に制限すると解釈すべきではない。
【実施例】
【０１１５】
実施例１：Ｈ１Ｎ１インフルエンザのＣＯＢＲＡ配列の生成
Ａ型インフルエンザＨ１Ｎ１  ＨＡアミノ酸配列を、ＮＣＢＩインフルエンザウイルスリソースデータベースからダウンロードした。１９１８〜２０１２年の分離株のＨ１Ｎ１
ＨＡタンパク質を、コンセンサス配列の生成のために使用した。７種の異なるコンセンサス配列（配列番号１〜７）を、以下の方法を使用して生成した。
【０１１６】
１．ＣＯＢＲＡ方法Ｘ−１（１９１８−２０１２）
配列を分離日順にまとめ、９種の一次コンセンサス配列を、１９１８−１９３４（８）、１９３５−１９４７（１３）、１９４８−１９５７（１２）、１９７７−１９８３（６９）、１９８４−１９９１（１９）、１９９２−１９９９（５９）、２０００−２００６（３３９）、２００７−２００８（７２２）、および２００９−２０１２（２０７）の分離株を使用して生成した。１９４８〜１９９１から分離したウイルスの第２層コンセンサス配列を、１９４８〜１９５７群、１９７７〜１９８３群、および１９８４〜１９９１群由来の３種の一次コンセンサス層を使用して生成した。図２に示すように、最終コンセンサス配列（第３層；配列番号１）を、６種の一次層コンセンサス配列（１９１８〜１９３４、１９３５〜１９４７、１９９２〜１９９９、２０００〜２００６、２００７〜２００８、および２００９〜２０１２）および第２層コンセンサス配列（１９４８〜１９９１）のアラインメントによって生成した。
【０１１７】
２．ＣＯＢＲＡ方法Ｘ−２（１９３３〜１９４７）
配列を分離日順にまとめて、以下の３種の一次コンセンサス配列を生成した：１９３３〜１９３６（１１）、１９４０〜１９４６（８）、および１９４７（１）。図２に示すように、最終コンセンサス配列（配列番号２）を、３種の一次コンセンサス配列のアラインメントによって生成した。
【０１１８】
３．ＣＯＢＲＡ方法Ｘ−３（１９７８〜２００８）
配列を分離日順にまとめ、５種の一次コンセンサス配列を、１９７８〜１９８３（６５）、１９８４〜１９９１（１９）、１９９２〜１９９９（５９）、２０００〜２００６（３３９）、および２００７〜２００８（７２２）の分離株を使用して生成した。１９７８〜１９９１から分離したウイルスの第２層コンセンサス配列を、１９７８〜１９８３群および１９８４〜１９９１群由来の２種の一次コンセンサス層を使用して生成した。図３に示すように、最終コンセンサス配列（配列番号３）を、３種の一次層コンセンサス配列（１９９２〜１９９９、２０００〜２００６、および２００７〜２００８）および第２層コンセンサス配列（１９７８〜１９９１）のアラインメントによって生成した。
【０１１９】
４．ＣＯＢＲＡ方法Ｘ−４（１９１８〜２００５）
配列を分離日順にまとめ、８種の一次コンセンサス配列を、１９１８〜１９３４（８）、１９３５〜１９４７（１３）、１９４８〜１９５７（１２）、１９７７〜１９８３（６８）、１９８４〜１９８６（９）、１９８７〜１９９１（１２）、１９９２〜１９９９（５９）、および２０００〜２００５（２６３）の分離株を使用して生成した。２種の第２層コンセンサス配列（１９１８〜１９５７および１９７８〜１９９１）を生成した。１９１８〜１９５７二次コンセンサス配列を、１９１８〜１９３４群、１９３５〜１９４７群、および１９４８〜１９５７群由来の３種の一次コンセンサス層を使用して生成した。１９７８〜１９９１二次コンセンサス配列を、１９７７〜１９８３群、１９８４〜１９８６群、および１９８７〜１９９１群由来の３種の一次コンセンサス層を使用して生成した。図４に示すように、最終コンセンサス配列（配列番号４）を、２種の一次層コンセンサス配列（１９９２〜１９９９および２０００〜２００５）および２種の第２層コンセンサス配列（１９１８〜１９５７および１９７８〜１９９１）のアラインメントによって生成した。この配列は、１４２位および１７７位で脱グリコシル化されている。
【０１２０】
５．ＣＯＢＲＡ方法Ｘ−５（１９８２〜２０１２）
配列を分離日順にまとめ、７種の一次コンセンサス配列を、１９８２〜１９８３（４）、１９８４〜１９８６（９）、１９８７〜１９９１（１２）、１９９２〜１９９９（２７）、２０００〜２００６（３３９）、２００７〜２００８（７２２）、および２００９〜２０１２（２０７）の分離株を使用して生成した。１種の第２層コンセンサス配列（１９８２〜１９８６）を、１９８２〜１９８３群および１９８４〜１９８６群由来の２種の一次コンセンサス層を使用して生成した。図５に示すように、最終コンセンサス配列（配列番号５）を、５種の一次層コンセンサス配列（１９８７〜１９９１、１９９２〜１９９９、２０００〜２００６、２００７〜２００８、および２００９〜２０１２）および第２層コンセンサス配列（１９８２〜１９８６）のアラインメントによって生成した。
【０１２１】
６．ＣＯＢＲＡ方法Ｘ−６（１９９９〜２０１２）
配列を分離日順にまとめて、以下の４種の一次コンセンサス配列を生成した：１９９９（５）、２０００〜２００６（３３９）、２００７〜２００８（７２２）、および２００９〜２０１２（２０７）。図６に示すように、最終コンセンサス配列（配列番号６）を、４種の一次コンセンサス配列のアラインメントによって生成した。
【０１２２】
７．ＣＯＢＲＡ方法Ａ−５（１９１８〜２００８）
配列を分離日順にまとめ、１２種の一次コンセンサス配列を、１９１８（１）、１９７６（４）、２００９〜２０１１（１２３）、１９３３〜１９３４（８）、１９３５〜１９４７（１３）、１９４８〜１９５７（１２）、１９７７〜１９８３（６８）、１９８４〜１９８６（９）、１９８７〜１９９１（１２）、１９９２〜１９９９（２７）、２０００〜２００５（５９）、および２００６〜２００８（７９８）の分離株を使用して生成した。図７に示すように、４種の二次コンセンサス配列を、「ブタ」配列または日付順（１９３３〜１９５７、１９７７〜２００５、および２００６〜２００８）にしたがって一次コンセンサス配列をグループ化することによって生成した。最終コンセンサス配列（第３層コンセンサス；配列番号７）を、４種の二次コンセンサス配列のアラインメントによって生成した。
【０１２３】
コドン使用頻度およびＲＮＡ最適化（ＧｅｎｅＡｒｔ；Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を含めて、両方法のいずれかにしたがって生成したＣＯＢＲＡアミノ酸配列を逆翻訳し、哺乳動物細胞での発現のために最適化することができる。最適化した核酸配列を、ｐＴＲ６００発現ベクター（米国特許出願公開第２００２／０１０６７９８号；Ｒｏｓｓら，Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １（２）：１０２−１０３，２０００；Ｇｒｅｅｎら，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０：２４２−２４８，２００１）または発現に適切な任意の他のベクターに挿入することができる。
【０１２４】
実施例２：インフルエンザＶＬＰの調製およびこれを使用した免疫
以下の方法を使用して、最適化したＨＡを含むインフルエンザＶＬＰを生成し、特徴付けることができる。マウス、フェレット、およびマカクの例示的な免疫方法も以下に記載する（ＧｉｌｅｓおよびＲｏｓｓ，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２９（１６）：３０４３−３０５４，２０１１も参照のこと）。
【０１２５】
ワクチン調製物
２９３Ｔ細胞を、Ｍ１、ＮＡ、および最適化したＨＡを発現するプラスミドで一過性にトランスフェクトし、３７℃で７２時間インキュベートする。Ｍ１、ＮＡ、およびＨＡのコード配列を、哺乳動物細胞での発現のためにコドン最適化することができる。上清を回収し、細胞デブリを低速遠心分離およびその後の０．２２μｍの滅菌フィルターによる真空濾過によって除去する。ＶＬＰを、超遠心分離（２０％グリセロール（重量／容積）にて１００，０００×ｇ）にて４℃で４時間精製した。次いで、ペレットをＰＢＳ（ｐＨ７．２）に再懸濁し、１回使用量のアリコートで使用するまで−８０℃で保存する。総タンパク質濃度を、Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡ（商標）タンパク質アッセイ試薬キット（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）によって決定する。
【０１２６】
用量の決定
ＨＡ比含量（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｏｎｔｅｎｔ）を、ウェスタンブロットおよびデンシトメトリーによって決定することができる。精製組換えＣＯＢＲＡ  ＨＡおよび精製ＶＬＰを標準的な総タンパク質量で調製し、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにて電気泳動し、ＰＶＤＦ膜に転写する。ブロットをインフルエンザ感染マウス由来のマウスポリクローナル抗血清で探索し、ＨＡ−抗体複合体をセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合体化したヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ；Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ，ＵＳＡ）を使用して検出する。ＨＲＰを化学発光基質（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｒｏｃｋｆｏｒｄ  ＩＬ，ＵＳＡ）によって検出し、Ｘ線フィルム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ，ＵＳＡ）に感光する。バンド密度を、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ）を使用して決定する。組換えＨＡバンドの密度を使用して標準曲線を計算し、精製ＶＬＰの密度を、組換えＨＡからの結果を使用して内挿する。
【０１２７】
マウス研究
ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｉｓ、雌、６〜８週齢）を、Ｈａｒｌａｎ
Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ＵＳＡ）から購入することができる。マウスを小型アイソレーターユニットに収容し、飼料および水を自由に利用させ、実験動物のためのＵＳＤＡガイドラインにしたがって飼育する。マウスにデンシトメトリーアッセイ由来のＨＡ含量に基づいた３用量の精製ＣＯＢＲＡ  ＨＡ  ＶＬＰ（１．５μｇ、０．３μｇ、または０．０６μｇ）のうちの１つを筋肉内注射によって０週目にワクチン接種し、次いで、３週目に同一用量で追加免疫する。各用量のワクチンを、ミョウバンアジュバント（Ｉｍｊｅｃｔ  Ａｌｕｍ，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、またはビヒクルのみを使用して調合する。各ワクチン接種の１４〜２１日後、麻酔したマウスの後眼窩叢（ｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌ  ｐｌｅｘｕｓ）から採血し、微量遠心チューブに移す。チューブを遠心分離し、血清を取り出し、−８０±５℃で凍結する。各ワクチン群についての赤血球凝集阻害（ＨＡＩ）血清抗体価を、５週目に代表的な再集合体ウイルスまたはＣＯＢＲＡ  ＨＡ  ＶＬＰを使用して決定する。
【０１２８】
最終ワクチン接種の３週間後、マウスを５０μｌ体積の高病原性Ｈ１Ｎ１ウイルスにて鼻腔内でチェレンジする。感染後、マウスを、感染後１４日間にわたって体重減少、疾患の兆候、および死亡について毎日モニタリングする。各体重、疾患スコア（ＴｏａｐａｎｔａおよびＲｏｓｓ，Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １０（１）：１１２，２００９）、および死亡を、各群について接種後毎日記録する。
【０１２９】
フェレット研究
フィッチフェレット（Ｍｕｓｔｅｌａ  ｐｕｔｏｒｉｕｓ  ｆｕｒｏ、雌、６〜１２月齢）（インフルエンザナイーブおよび臭腺除去済み）を、Ｍａｒｓｈａｌｌ  Ｆａｒｍｓ（Ｓａｙｒｅ，ＰＡ，ＵＳＡ）から購入することができる。フェレットをＳａｎｉ−ｃｈｉｐｓ実験動物用床敷（Ｐ．Ｊ．Ｍｕｒｐｈｙ  Ｆｏｒｅｓｔ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｍｏｎｔｖｉｌｌｅ，ＮＪ，ＵＳＡ）を含むステンレススチール製ケージ（Ｓｈｏｒ−ｌｉｎｅ，Ｋａｎｓａｓ  Ｃｉｔｙ，ＫＳ，ＵＳＡ）に対で収容する。フェレットに、Ｔｅｋｌａｄ  Ｇｌｏｂａｌフェレット飼料（Ｈａｒｌａｎ  Ｔｅｋｌａｄ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）および新鮮な水を自由に与える。ＣＯＢＲＡ  ＨＡ  ＶＬＰをＰＢＳ（ｐＨ７．２）で希釈して最終濃度にする。フェレットに、デンシトメトリーアッセイによって決定したＨＡ含量に基づいた２用量の精製ＣＯＢＲＡ  ＶＬＰ（１５μｇ、３μｇ）のうちの１つを筋肉内注射によって０週目に０．２５ｍｌの体積で大腿四頭筋にワクチン接種し、次いで、３週目に同一用量で追加免疫する。ワクチンを使用前に−８０℃で保存し、使用直前にミョウバンアジュバント（Ｉｍｊｅｃｔ  Ａｌｕｍ；Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）を使用して調合する。動物をワクチン接種レジメンの間、有害事象（体重減少、熱（ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）、活動の低下、鼻汁、くしゃみ、および下痢が含まれる）について毎週モニタリングする。ワクチン接種前に、動物をＨＡＩアッセイによって循環Ａ型インフルエンザウイルスおよびＢ型インフルエンザウイルスについて血清陰性であることを確認する。各ワクチン接種の１４〜２１日後、麻酔したフェレットの前大静脈から採血し、微量遠心チューブに移す。チューブを遠心分離し、血清を取り出し、−８０±５℃で凍結する。各ワクチン群についてのＨＡＩ血清抗体価を、５週目に代表的な再集合体ウイルスまたはＣＯＢＲＡ  ＨＡ  ＶＬＰを使用して決定する。
【０１３０】
最終ワクチン接種の３週間後、フェレットを１ｍｌの体積の高病原性Ｈ１Ｎ１ウイルスにて鼻腔内でチェレンジする。感染後、フェレットを、感染後１４日間にわたって体重減少、疾患の兆候、および死亡について毎日モニタリングする。各体重、疾患スコア、および死亡を、各群について接種後毎日記録する。接種後７日間毎日３ｍｌのＰＢＳを麻酔したフェレットの鼻孔に滴下注入することによって鼻洗浄を行う。洗浄液を回収し、使用まで−８０℃で保存する。
【０１３１】
霊長類の免疫
カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ、雄、３〜５歳）を、Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ、ＵＳＡ）から購入することができる。マカクにデンシトメトリーアッセイ由来のＨＡ含量に基づいた精製ＣＯＢＲＡ  ＨＡ  ＶＬＰ（１５μｇ）を筋肉内注射によって０週目にワクチン接種し、次いで、３週目および６週目に同一用量で追加免疫する。ワクチンを、使用直前にミョウバンアジュバント（Ｉｍｊｅｃｔ  Ａｌｕｍ，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）を使用して調合する。各ワクチン接種の２１日後、麻酔したマカクの大腿静脈から採血し、血清分離チューブに移す。チューブについて凝固を活性化させ、その後に遠心分離し、血清を取り出し、−８０±５℃で凍結する。各ワクチン群についてのエンドポイントＩｇＧ力価およびＨＡＩ血清抗体価を、５週目に代表的な再集合体ウイルスまたはＣＯＢＲＡ  ＨＡ  ＶＬＰを使用して決定する。
【０１３２】
最終ワクチン接種の３週間後、マカクを鼻腔内、気管内、および眼窩接種によって１ｍｌの体積の高病原性Ｈ１Ｎ１ウイルスでチェレンジする。感染後、マカクを、感染後５日間にわたって体重減少、疾患の兆候、および死亡について毎日モニタリングする。各体重、疾患スコア、および死亡を、各群について接種後毎日記録する。
【０１３３】
実施例３：ＣＯＢＲＡ  ＨＡ含有ＶＬＰでのマウスの免疫後のＨＡＩ研究
ＣＯＢＲＡ  ＨＡを含むインフルエンザＶＬＰを、実施例２に記載のように生成した。雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週齢）に、方法Ｘ−１（配列番号１）、方法Ｘ−２（配列番号２）、方法Ｘ−３（配列番号３）、方法Ｘ−４（配列番号４）、方法Ｘ−５（配列番号５）、または方法Ｘ−６（配列番号６）のＣＯＢＲＡ  ＨＡを含む３μｇのＶＬＰを筋肉内にワクチン接種した。マウスに、０週目にワクチン接種し（初回抗原刺激用量（ｐｒｉｍｅ  ｄｏｓｅ））、４週目および１２週目に追加免疫した。ワクチンを、ミョウバンアジュバント（Ｉｍｊｅｃｔ  Ａｌｕｍ、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）を使用して調合した。０、４、８、１２、および１４週目に、麻酔したマウスの後眼窩叢（ｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌ  ｐｌｅｘｕｓ）から血液サンプルを採取した。１４週目に、インフルエンザウイルスパネルに対する赤血球凝集阻害（ＨＡＩ）力価を決定した。また、１４週目に、マウスを病原性Ｈ１Ｎ１ウイルスにて鼻腔内でチェレンジ（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）した。
【０１３４】
Ｈ１Ｎ１インフルエンザ株パネル（プエルトリコ／８／１９３４、フォートモンマス／１／１９４７、ブラジル／１９７８、チリ／１９８３、シンガポール／６／１９８６、テキサス／３６／１９９１、北京／１９９５、ニューカレドニア／２０／１９９９、ソロモン島／２００６、ブリスベン／５９／２００７、およびカリフォルニア／０７／２００９）に対するＨＡＩ血清抗体力価を、１４週目に決定した。結果を図９Ａ〜９Ｆに示す。
【０１３５】
本開示の発明の原理を適用することができる多数の可能な実施形態を考慮して、例示の実施形態は本発明の好ましい例を示すことのみを目的とし、本発明の範囲を制限すると見なすべきではないと認識すべきである。むしろ、本発明の範囲は以下の特許請求の範囲によって定義される。したがって、本発明者らは、本特許請求の範囲の範囲および精神の範囲内に入る全てを本発明者らの発明と主張する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年7月27日(2018.7.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えインフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）ポリペプチドであって、
（ｉ）配列番号１または配列番号１の残基２〜５６６のアミノ酸配列；
（ｉｉ）配列番号３または配列番号３の残基２〜５６６のアミノ酸配列；
（ｉｉｉ）配列番号５または配列番号５の残基２〜５６６のアミノ酸配列；または
（ｉｖ）配列番号６または配列番号６の残基２〜５６５のアミノ酸配列；
を含む、組換えインフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）ポリペプチド。
【請求項２】
配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組換えインフルエンザＨＡポリペプチド。
【請求項３】
配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組換えインフルエンザＨＡポリペプチド。
【請求項４】
配列番号５のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組換えインフルエンザＨＡポリペプチド。
【請求項５】
配列番号６のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組換えインフルエンザＨＡポリペプチド。
【請求項６】
請求項１乃至５のいずれか一項に記載のインフルエンザＨＡポリペプチドをコードする単離核酸。
【請求項７】
前記核酸を哺乳動物細胞での発現のためにコドン最適化する、請求項６に記載の単離核酸。
【請求項８】
請求項６または請求項７に記載の核酸を含むベクター。
【請求項９】
前記インフルエンザＨＡポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結したプロモーターをさらに含む、請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
請求項８または請求項９に記載のベクターを含む単離細胞。
【請求項１１】
請求項１乃至５のいずれか一項に記載のインフルエンザＨＡポリペプチドを含むインフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項１２】
インフルエンザノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質、インフルエンザマトリックス（Ｍ１）タンパク質、またはその両方をさらに含む、請求項１１に記載のインフルエンザＶＬＰ。
【請求項１３】
前記ＨＡポリペプチドをコードするベクター、インフルエンザＮＡタンパク質をコードするベクター、およびインフルエンザＭ１タンパク質をコードするベクターで宿主細胞を該ＨＡタンパク質、該Ｍ１タンパク質、および該ＮＡタンパク質を発現させるのに十分な条件下でトランスフェクトすることによって生成される、請求項１乃至５のいずれか一項に記載のインフルエンザＨＡポリペプチドを含むインフルエンザＶＬＰ。
【請求項１４】
請求項１乃至５のいずれか一項に記載のインフルエンザＨＡポリペプチドを含む融合タンパク質。
【請求項１５】
請求項１乃至５のいずれか一項に記載のインフルエンザＨＡポリペプチド、請求項１４に記載の融合タンパク質、または請求項１１乃至１３のいずれか一項に記載のＶＬＰ、および薬学的に許容され得るキャリアを含む組成物。
【請求項１６】
被験体におけるインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘発するための、請求項１乃至５のいずれか一項に記載のインフルエンザＨＡポリペプチド、請求項１４に記載の融合タンパク質、または請求項１１乃至１３のいずれか一項に記載のＶＬＰを含む、組成物。
【請求項１７】
インフルエンザウイルスに対して被験体を免疫するための、請求項１１乃至１３のいずれか一項に記載のＶＬＰおよび薬学的に許容され得るキャリアを含む組成物。
【請求項１８】
前記組成物がアジュバントをさらに含む、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記組成物が、筋肉内投与されることを特徴とする、請求項１７または請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記組成物が約１〜約２５μｇの前記ＶＬＰを含む、請求項１７乃至１９のいずれか一項に記載の組成物。