(57)【要約】【課題】プロバイオティクス製剤および使用のための方法の提供。【解決手段】本明細書では、生体適合性マイクロスフェア、バイオフィルム生成性プロバイオティクス細菌、プレバイオティクス、および／またはプレバイオフィルミクスを含む組成物が提供される。また、組成物を調製および製剤化するための方法、ならびに組成物を使用して疾患を処置または防止するための方法も提供される。一局面では、生体適合性マイクロスフェア、バイオフィルム生成性プロバイオティクス細菌、およびプレバイオティクスを含む組成物が提供され、上記プレバイオティクスは上記プロバイオティクス細菌のための栄養補充物質を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、米国特許法§１１９（ｅ）の下、２０１４年３月６日に出願された米国仮出願第６１／９４９，０５８号（この内容は、その全体が参考として本明細書に援用される）への優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本開示は、新規のプロバイオティクス製剤と、これを使用して疾患を処置または防止するための方法とに関する。
【背景技術】
【０００３】
下痢性疾病は、罹患率および死亡率の世界的な主要原因であり、小児における死亡のうちの約１５％を占める。腸管出血性Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（ＥＨＥＣ）および腸管病原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＰＥＣ）は、小児性下痢の２つの主要な細菌性原因である。これらの病原体が、下痢性疾患を引き起こす機構は、いまだ完全には理解されていないが、病原体が、腸管上皮に生着する（ｃｏｌｏｎｉｚｅ）ときに開始される（ＮａｔａｒｏおよびＫａｐｅｒ（１９９８年）、Ｄｉａｒｒｈｅａｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  Ｃｏｌｉ、Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．、１１巻、１４２〜２０１頁）。
【０００４】
マウスは、ＥＰＥＣおよびＥＨＥＣの両方に対して比較的抵抗性であるため、近縁の病原体、すなわち、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｒｏｄｅｎｔｉｕｍは、ヒトＥＰＥＣおよびＥＨＥＣ感染をモデル化するのに広く使用されているマウス病原体である。マウスでは、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍは、ヒトにおいてＥＰＥＣおよびＥＨＥＣによりもたらされる結腸病態とほとんど識別できない結腸病態を結果としてもたらす（Ｂｏｒｅｎｓｈｔｅｉｎ，  Ｍ．ら（２００８年）、Ｕｔｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  Ｍｏｄｅｌ  ｉｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍｉｃｅ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ、２４巻、３２〜７頁；ＬｕｐｅｒｃｈｉｏおよびＳｃｈａｕｅｒ（２００１年）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｃｏｌｏｎｉｃ  Ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ、Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  Ｉｎｆｅｃｔ、３巻、３３３〜４０頁；Ｍｕｎｄｙ，  Ｔ．  Ｔ．ら（２００５年）、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｉｃｅ  ａｎｄ  Ｍａｎ、Ｃｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、７巻、１６９７〜７０６頁）。Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍは、ＥＰＥＣおよびＥＨＥＣにより保有される、ＬＥＥ（ｌｏｃｕｓ  ｏｆ  ｅｎｔｅｒｏｃｙｔｅ  ｅｆｆａｃｅｍｅｎｔ）病原性アイランドの相同体であって、接着／破壊（ａｔｔａｃｈｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｆｆａｃｉｎｇ）（Ａ／Ｅ）病変の発症に必要なエフェクタータンパク質をコードする相同体を保有するので、これは、驚くべきことではないかもしれない。これらの病変には、上皮の欠損および白血球の浸潤により特徴付けられる、結腸過形成および病理学的大腸炎の発症が随伴する（ＬｕｐｅｒｃｈｉｏおよびＳｃｈａｕｅｒ（２００１年）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｃｏｌｏｎｉｃ  Ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ、Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  Ｉｎｆｅｃｔ．、３巻、３３３〜４０頁）。
【０００５】
腸管上皮は、腸管病原体に対する強力なバリアを提供する。疾患を引き起こすために、腸管病原体は、宿主上皮細胞に付着するか、または宿主上皮細胞を透過／宿主上皮細胞に侵入しなければならない。したがって、上皮細胞との相互作用は、全ての腸管病原体の病原性における最初のステップであり、このステップは、Ａ／Ｅ病原体の使用を介して、結腸内の生着および結果として生じる病態を評価することにより研究することができる。
【０００６】
結腸内のＡ／Ｅ病原体の生着は、腸管微生物叢の組成に依存する。抗生物質の投与（Ｗｌｏｄａｒｓｋａ，  Ｂ．ら（２０１１年）、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ａｌｔｅｒｓ  ｔｈｅ  Ｃｏｌｏｎｉｃ  Ｍｕｃｕｓ  Ｌａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｐｒｅｄｉｓｐｏｓｅｓ  ｔｈｅ  Ｈｏｓｔ  ｔｏ  Ｅｘａｃｅｒｂａｔｅｄ  Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｃｏｌｉｔｉｓ、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ、７９巻、１５３６〜４５頁）または炎症応答の誘導（Ｌｕｐｐ，  Ｍ．  Ｌ．ら（２００７年）、Ｈｏｓｔ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  Ｄｉｓｒｕｐｔｓ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ  ａｎｄ  Ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｔｈｅ  Ｏｖｅｒｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｃｅｌｌ  Ｈｏｓｔ  Ｍｉｃｒｏｂｅ、２巻、１１９〜２９頁）による結腸微生物叢内の腸内菌共生バランス失調（ｄｙｓｂｉｏｓｉｓ）（天然の有益な細菌集団の破壊）の誘導は、病原体の生着を大幅に増強することが示されている。
【０００７】
結腸の腸内菌共生バランス失調はさらに、結腸病原体に対する炎症応答を悪化させうる（Ｗｌｏｄａｒｓｋａ，  Ｂ．ら（２０１１年）、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ａｌｔｅｒｓ  ｔｈｅ  Ｃｏｌｏｎｉｃ  Ｍｕｃｕｓ  Ｌａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｐｒｅｄｉｓｐｏｓｅｓ  ｔｈｅ  Ｈｏｓｔ  ｔｏ  Ｅｘａｃｅｒｂａｔｅｄ  Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｃｏｌｉｔｉｓ、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．、７９巻、１５３６〜４５頁）が、病原体攻撃の非存在下であってもなお、腸内菌共生バランス失調は、炎症性腸疾患（２０１３年９月１０日にオンラインで最初に公表された、Ｍａｃｈｉｅｌｓら、（２０１３年）Ａ  Ｄｅｃｒｅａｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂｕｔｙｒａｔｅ−Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｓｐｅｃｉｅｓ  Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｈｏｍｉｎｉｓ  ａｎｄ  Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ  Ｄｅｆｉｎｅｓ  Ｄｙｓｂｉｏｓｉｓ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ  Ｃｏｌｉｔｉｓ、Ｇｕｔ；Ｍｏｒｇａｎら、（２０１２年）Ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ  ｉｎ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｂｏｗｅｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．、１３巻：Ｒ７９頁）または過敏性腸症候群（Ｃａｒｒｏｌｌら、（２０１２年）Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｄｉａｒｒｈｅａ−Ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔ  Ｉｒｒｉｔａｂｌｅ  Ｂｏｗｅｌ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ、Ｎｅｕｒｏｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｍｏｔｉｌ．、２４巻、５２１〜３０頁、ｅ２４８頁；Ｃｈａｓｓａｒｄ，  Ｍ．ら、（２０１２年）Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｄｙｓｂｉｏｓｉｓ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  Ｇｕｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ  ｏｆ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｃｏｎｓｔｉｐａｔｅｄ−Ｉｒｒｉｔａｂｌｅ  Ｂｏｗｅｌ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ、Ａｌｉｍｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ．、３５巻、８２８〜３８頁）を伴う患者における腸内菌共生バランス失調についての知見により証拠立てられる通り、遺伝子的に感受性の個体における炎症応答を伝搬しうる。
【０００８】
プロバイオティクスとは、十分な高量で摂取されると、宿主に健康上の利益を付与する生菌（ｌｉｖｅ  ｍｉｃｒｏｂｅ）であり（Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｎａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ、「Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ  ｉｎ  Ｆｏｏｄ  Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  Ｐｏｗｄｅｒｅｄ  Ｍｉｌｋ  ｗｉｔｈ  Ｌｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ」（２００１年））、腸管疾患を処置するための実現可能な選択肢として有望となりつつある（ＨｅｍａｒａｊａｔａおよびＶｅｒｓａｌｏｖｉｃ、（２０１３年）Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ  ｏｎ  Ｇｕｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ：  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒｏｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ、Ｔｈｅｒａｐ  Ａｄｖ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ、６巻、３９〜５１頁）。
【０００９】
多くのプロバイオティクス微生物は、免疫系の活性を増強する能力を有するが、少数のプロバイオティクス微生物は、抗炎症効果を有する。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉは、哺乳動物および鳥類の腸管免疫系を調節することが示されている、一般に使用されているプロバイオティクスである（Ｌｉｎら、（２００８年）Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓ  Ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  Ｖｉａ  Ｃ−Ｊｕｎ、Ｉｎｆｌａｍｍ  Ｂｏｗｅｌ  Ｄｉｓ．、１４巻、１０６８〜８３頁）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける研究は、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉの一部の株（ＰＴＡ６４７５など）が、細胞シグナル伝達経路（例えば、ｃ−Ｊｕｎ依存性活性化因子タンパク質１（ＡＰ−１））の下方調節を介して、炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−αなど）を産生する骨髄細胞の能力を抑制しうることを裏付けている（ＪｏｎｅｓおよびＶｅｒｓａｌｏｖｉｃ、（２００９年）Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ  Ｂｉｏｆｉｌｍｓ  Ｐｒｏｄｕｃｅ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｎｄ  Ａｎｔｉ−Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｆａｃｔｏｒｓ、ＢＭＣ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、９巻：３５頁；Ｌｉｎら、（２００８年）Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｒｅｕｔｅｒｉ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓ  Ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  Ｖｉａ  Ｃ−Ｊｕｎ、Ｉｎｆｌａｍｍ  Ｂｏｗｅｌ  Ｄｉｓ．、１４巻、１０６８〜８３頁）。
【００１０】
ＡＴＣＣ２３２７２など、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉの他の株も、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍにより刺激された結腸上皮細胞による、サイトカインおよびケモカイン両方の産生を下方調節しうる。Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉはまた、若年動物および成体動物の両方における結腸炎症も軽減しうる（Ｅａｔｏｎ，  Ａ．ら、（２０１１年）Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ  Ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｄｕｅ
ｔｏ  Ｅｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｉｎ  Ｇｅｒｍｆｒｅｅ  Ｍｉｃｅ、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．、７９巻、１８５〜９１頁；Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒら（２００９年）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ  Ｐｒｅｖｅｎｔｓ  Ｃｏｌｉｔｉｓ  ｂｙ  Ｒｅｄｕｃｉｎｇ  Ｐ−Ｓｅｌｅｃｔｉｎ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ−  ａｎｄ  Ｐｌａｔｅｌｅｔ−Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ  Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ、２９６巻：Ｇ５３４〜４２頁）。
【００１１】
研究では、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉは、結腸のサイトカインおよびケモカインの低減、炎症性細胞の浸潤の低減、結腸上皮細胞の欠損の低減、および病原体の結腸から脾臓へのトランスロケーションの低減により特徴付けられる通り、ストレスによる、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ誘導性大腸炎に対する悪化効果を緩和することが裏付けられている（Ｍａｃｋｏｓら、（２０１３年）Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ
Ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ  ｔｈｅ  Ｓｔｒｅｓｓｏｒ−Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｓｅｖｅｒｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ、８１巻、３２５３〜６３頁）。
【００１２】
Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉの効果は、ストレスにより、軽度〜中等度のＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ誘導性大腸炎がもたらされる場合に最も明らかである。しかし、重度のＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ誘導性大腸炎をもたらすストレス状態下では、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉは、病原体のトランスロケーションおよび全身性炎症応答の発症を防止することは可能であったが、結腸病態の全ての側面を軽減することは可能でなかった（Ｍａｃｋｏｓら、（２０１３年）Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ  Ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ  ｔｈｅ  Ｓｔｒｅｓｓｏｒ−Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｓｅｖｅｒｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ、８１巻、３２５３〜６３頁）。
さらに、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉの、宿主に対する影響は、短命であり、毎日の投与が終了した後では、もはや明らかではない。これらの研究は、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉによる免疫モジュレーションの潜在的可能性を裏付ける。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｅａｔｏｎ，Ａ．ら、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．（２０１１年）７９巻、１８５〜９１頁
【非特許文献２】Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒら、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ  Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ（２００９年）２９６巻：Ｇ５３４〜４２頁
【非特許文献３】Ｍａｃｋｏｓら、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ（２０１３年）８１巻、３２５３〜６３頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
正常状態下では、多くのプロバイオティクスは、直接的（例えば、抗微生物防御の産生）または間接的（例えば、宿主防御の刺激）機構のために、病原体の生着を効果的に防止しうる。病原体の生着を防止し、かつ、過剰な炎症応答を制限することが可能なプロバイオティクス種は少数である。しかし、結腸感染に応答する過剰な結腸炎症は、感染後過敏性腸症候群など、長期にわたる疾病の発症をもたらしうるため、これらのプロバイオティクス種は重要である。したがって、抗菌免疫をなおも維持しながら、結腸病原体への過剰な免疫応答を防止することが可能なプロバイオティクスを開発すれば、腸管感染の、健康に対する短期的影響および長期的影響の両方を防止することができるであろう。
【００１５】
不安およびうつ病は、消化管疾患を伴う成体および小児の両方において一般的な共存症であり（Ｍａｕｎｄｅｒら、（２００８年）Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｓｔｒｅｓｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃｏｕｒｓｅ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅ：  ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ、Ｃｕｒｒ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ、８巻、２４７〜２５２頁；Ｗａｌｅｒら、（２００８年）Ｔｈｅ  Ｍａｎｉｔｏｂａ  ＩＢＤ  ｃｏｈｏｒｔ  ｓｔｕｄｙ：  ａ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ｏｆ  ｌｉｆｅｔｉｍｅ  ａｎｄ  １２−ｍｏｎｔｈ  ａｎｘｉｅｔｙ  ａｎｄ  ｍｏｏｄ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ、Ａｍ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ、１０３巻、１９８９〜１９９７頁）、研究は、消化管疾患を軽減することにより、不安およびうつ病を改善しうることを示唆する（Ｇｕｌｏｋｓｕｚら、（２０１３年）Ｄｅｐｒｅｓｓｉｖｅ  ｓｙｍｐｔｏｍｓ  ｉｎ  Ｃｒｏｈｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ：  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｗｉｔｈ  ｉｍｍｕｎｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ  ａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、８巻（３号）：ｅ６０４３頁）。
【００１６】
本技術の態様および実施形態は、プロバイオティクス細菌を、プレバイオティクス物質と組み合わせて、プロバイオティクス種の排他的成長を刺激し、生体適合性マイクロスフェア上のバイオフィルムであって、有効性および持続性が大きなバイオフィルムの形態で細菌を供給する一助とする。プロバイオティクスのバイオフィルムは、細菌を創傷の部位に導入する手段としての表面であって、天然のゼラチンである親水コロイドに基づく、硬膏剤または包帯剤を含む製剤により創傷を処置する表面上で成長させうることが示されている（すなわち、ＥＰ２４５００６２）。しかし、プロバイオティクス用量を少なくし、かつ、プロバイオティクス細菌の有効性を大きくする必要は満たされておらず、本明細書で開示される方法におけるその適切な製剤は、本出願人らが知る限りにおいて、現在までのところまだ開示されていない。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本技術は、プロバイオティクス株を部位に導入する効率および耐久性を増強する製剤化法を提供する。製剤化法は具体的に、バイオフィルム形成という律速段階を回避する。本技術は、消化管の健康、およびプロバイオティクス細菌が定着する必要のある任意の側面、例えば、消化管、創傷治癒、皮膚、膣、口腔、水の精製に有用である。
【００１８】
プロバイオティクスは、胃腸の微生物叢を保護し、健康な状態へと回復させる天然の方式である。残念ながら、最適条件下であってもなお、プロバイオティクス細菌（典型的に送達される）は、定着するか、または十分に存続するに至っておらず、それらの健康的な効果の大きさおよび持続性は最小限である。律速段階のうちの１つは、導入された細菌が、持続するバイオフィルムを形成する能力である。細菌が、プランクトン様（遊離生息）形態と対比して、既にバイオフィルム（表面付着型群落）の形態にある場合、細菌は、よりたやすく定着し、存続する。プロバイオティクス細菌の肯定的な効果は、それらをバイオフィルム状態で供給することにより、増強することができ、これは、生体適合性であり、かつ、非毒性であるマイクロスフェアの表面上で細菌を成長させることによりたやすく達成することができる。生体適合性マイクロスフェアは、生体分解性ポリマー、非生体分解性ポリマー、金属、またはこれらの組み合わせでありうる。この表面がマイクロスフェアの形態である場合、プレバイオティクス物質および／またはプレバイオフィルミクス（ｐｒｅｂｉｏｆｉｌｍｉｃ）物質を、プロバイオティクス細菌性バイオフィルムの定着および維持を促進するカーゴとして添加することができる。
【００１９】
マイクロスフェアは、病原性細菌の攻撃を制限しながら、プロバイオティクス細菌の定着および生存を促進する一助となりうる、拡散性プレバイオティクス（プロバイオティクス細菌に特異的／排他的な栄養補充物質）カーゴを理想的な形で供給する点において価値を付加している。少なくとも、プロバイオティクス細菌であるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉでは、バイオフィルム状態は、マウスの胃腸内の定着において、プランクトン様形態にある同じ細菌より有利である。
【００２０】
さらに、マウスにバイオフィルムとして導入されるＬ．ｒｅｕｔｅｒｉは、腸管病原性細菌であるＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｒｏｄｅｎｔｉｕｍの病因に対して、そのプランクトン様形態にあるＬ．ｒｅｕｔｅｒｉより、頑健で持続する予防的効果を及ぼす。これらの結果に基づき、プロバイオティクスの新規の製剤であって、腸内菌共生バランス失調に対して、より大きく、持続的な効果をもたらし、患者のコンプライアンスに対する必要を大幅に低減して、胃腸における病因を防止するか、またはさらに処置する製剤をもたらす、高度な統合例が開発された。
【００２１】
バイオフィルム生成性プロバイオティクス細菌は、生体適合性マイクロスフェアの表面に付着し、バイオフィルムを生成する。生体適合性マイクロスフェアは、中実または中空コアを有する。生体適合性マイクロスフェアが中空コアを有する場合、それは、プレバイオティクス、およびプロバイオティクス細菌のための任意の栄養補充物質を、カーゴとして保有しうる。プレバイオティクスは、中空コア内に封入することができる。マイクロスフェアはまた、一態様では、組成物中の健康誘導性細菌と競合しうる病原体に対して選択性である、薬物または化合物または薬剤も保有しうる。生体適合性マイクロスフェア、バイオフィルム生成性プロバイオティクス、およびプレバイオティクスに加えて、新規のプロバイオティクス製剤はまた、バイオフィルムの形成および／または耐久性を支援する物質であるプレバイオフィルミクスも含有することが可能であり、一態様では、プレバイオフィルミクスは、バイオフィルムの形成および／または耐久性を支援する、ＤＮＡ結合性ポリペプチドもしくはタンパク質、および／またはＤＮＡＢＩＩポリペプチドもしくはタンパク質、またはこれらの断片である。
【００２２】
上記の利点に照らし、本明細書では、生体適合性マイクロスフェア、バイオフィルム生成性プロバイオティクス細菌、およびプレバイオティクスを含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはさらにはこれらからなる組成物であって、プレバイオティクスが、プロバイオティクス細菌のための栄養補充物質を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはさらにはこれからなる組成物が提供される。一態様では、組成物は、薬学的に許容される担体または生体適合性足場などの担体をさらに含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはさらにはこれからなる。
【００２３】
一部の実施形態では、組成物は、剤形に製剤化されている。適切な剤形は、坐剤、散剤、液剤（ｌｉｑｕｉｄ）、カプセル剤、咀嚼錠、嚥下錠、バッカル錠、トローチ剤、ロゼンジ剤、ソフトチュー（ｓｏｆｔ  ｃｈｅｗ）、溶液剤、懸濁剤、スプレー剤、チンキ剤、煎剤、注入剤、およびこれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない。
【００２４】
本開示はまた、上記で言及された組成物を調製するための方法であって、生体適合性マイクロスフェアをバイオフィルム生成性プロバイオティクス細菌、プレバイオティクスと混合するステップと、一態様では、プレバイオフィルミクスをさらに混合するステップとを含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはさらにはこれらからなる方法も提供する。さらなる態様では、方法は、有効量の、プロバイオティクス細菌のための栄養補充物質を混合するステップをさらに含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはさらにはこれからなる。
【００２５】
本開示はまた、ＰＧＬＡ生体適合性マイクロスフェアと、少なくともＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ（「Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ」）を含む１または複数のバイオフィルム生成性プロバイオティクス細菌と、プロバイオティクス細菌の成長を支援する量の、スクロース、グリセロール、フルクトース、および／またはマルトースのうちの１または複数を含む栄養補充物質とを含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはさらにはこれらからなる組成物も提供する。組成物は、有効量のＨＵポリペプチドまたはタンパク質をさらに含みうるか、または代替的にこれらから本質的になりうるか、またはさらにはこれらからなりうる。組成物はさらに、薬学的に許容される担体または生体適合性足場を含むことが可能であり、任意選択で、坐剤として製剤化される。
【００２６】
本開示はまた、被験体における炎症性腸疾患、壊死性腸炎（ＮＥＣ）、または心理学的障害もしくは気分障害など、被験体におけるバイオフィルムで処置するのに適する疾患を処置または防止するための方法であって、それを必要とする被験体に、本明細書で記載される組成物を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはさらにはこれからなる、有効量の組成物を投与するステップを含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはさらにはこれからなる方法も提供する。
【００２７】
一部の実施形態では、本明細書で記載される組成物と、診断的使用または治療的使用のための指示書とを含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはこれらからなるキットが提供される。
本発明は、例えば、以下を提供する。
（項目１）
生体適合性マイクロスフェア、バイオフィルム生成性プロバイオティクス細菌、およびプレバイオティクスを含む組成物であって、前記プレバイオティクスは前記プロバイオティクス細菌のための栄養補充物質を含む、組成物。
（項目２）
プレバイオフィルミクスをさらに含む、項目１に記載の組成物。
（項目３）
前記プレバイオフィルミクスが、バイオフィルムの形成および耐久性を支援する薬剤を含む、項目２に記載の組成物。
（項目４）
前記プレバイオフィルミクスが、ＤＮＡ結合性ポリペプチドもしくはタンパク質、および／またはＤＮＡＢＩＩポリペプチドもしくはタンパク質、またはこれらの各々の同等物、任意選択で、配列番号１〜２４のうちの１もしくは複数、またはこれらの各々の生物学的活性断片もしくは同等物を、単独または組み合わせで含むポリペプチドである、項目３に記載の組成物。
（項目５）
前記プレバイオティクスが、水溶性の炭水化物を含み、前記水溶性の炭水化物が、イヌリン、オリゴフルクトース、フルクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、グルコース、マルトース、マルトデキストリン、ポリデキストロース、スクロース、フルクトース、ラクトース、イソマルツロース、ポリオール、グリセロール、およびこれらの組み合わせのうちの１または複数を含む、項目１から４のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６）
薬学的に許容される担体または生体適合性足場をさらに含む、項目１から５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目７）
前記プロバイオティクス細菌が、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ、群Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｌ．ｃａｓｅｉ、Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉ、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ、Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ、Ｌ．ｂｕｃｈｎｅｒｉ、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｂ．ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ、Ｂ．ａｎｇｕｌａｔｉｏｎ、Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ、Ｂ．ｂｒｅｖｅ、Ｂ．ｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ、Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｂ．ｌａｃｔｉｓ、Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ、Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、およびこれらの組み合わせのうちの１または複数である、項目１から６のいずれか一項に記載の組成物。
（項目８）
前記プロバイオティクス細菌が、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ（「Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ」）である、項目７に記載の組成物。
（項目９）
前記プロバイオティクス細菌が、抗菌免疫を支援すること、消化管バリアを増強もしくは支援すること、または疾患に関連する細菌感染に拮抗することのうちの１または複数をもたらす、項目１または８に記載の組成物。
（項目１０）
前記プロバイオティクス細菌が、サイトカインおよびケモカインの産生を下方調節することにより、病原体の生着を防止し、かつ／または過剰な炎症応答を制限する、項目１または８に記載の組成物。
（項目１１）
前記生体適合性マイクロスフェアが、生体分解性ポリマー、非生体分解性ポリマー、金属、またはこれらの組み合わせのうちの１または複数を含む、項目１から１０のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１２）
前記マイクロスフェアが、中実コアを含む、項目１１に記載の組成物。
（項目１３）
前記マイクロスフェアが、中空コアを含む、項目１１に記載の組成物。
（項目１４）
前記プレバイオティクスが、前記中空コア内に封入されている、項目１３に記載の組成物。
（項目１５）
薬剤をさらに含み、前記薬剤が病原体に対して選択性である、項目１から１４のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１６）
前記マイクロスフェアが、生体分解性ポリマーである、項目１から１５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１７）
前記生体分解性ポリマーが、Ｓｅｐｈａｄｅｘ、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（「ＰＬＧＡ」）；ポリカプロラクトン（「ＰＬＣ」）；キトサン；ゼラチン；ＤＮＡ水素；アセタール化デキストラン；ポリ（ラクチド）；ポリ（グリコリド）；ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）；ポリ（乳酸）；ポリ（グリコール酸）；ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）；ポリ（ラクチド）／ポリ（エチレングリコール）コポリマー；ポリ（グリコリド）／ポリ（エチレングリコール）コポリマー；ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）／ポリ（エチレングリコール）コポリマー；ポリ（乳酸）／ポリ（エチレングリコール）コポリマー；ポリ（グリコール酸）／ポリ（エチレングリコール）コポリマー；ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）／ポリ（エチレングリコール）コポリマー；ポリ（カプロラクトン）；ポリ（カプロラクトン）／ポリ（エチレングリコール）コポリマー；ポリ（オルトエステル）；ポリ（ホスファゼン）；ポリ（ヒドロキシブチレート）；ポリ（ヒドロキシブチレート）；ポリ（ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）；ポリカーボネート；ポリエステルアミド；ポリ無水物；ポリ（ジオキサノン）；ポリ（アルキレンアルキレート）；ポリエチレングリコール／ポリオルトエステルコポリマー；ポリウレタン；ポリ（アミノ酸）；ポリエーテルエステル；ポリアセタール；ポリシアノアクリレート；ポリ（オキシエチレン）／ポリ（オキシプロピレン）コポリマー；およびこれらの組み合わせのうちの１または複数である、項目１６に記載の組成物。
（項目１８）
前記生体分解性ポリマーが、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（「ＰＧＬＡ」）および／またはＳｅｐｈａｄｅｘである、項目１７に記載の組成物。
（項目１９）
前記マイクロスフェアが、非生体分解性ポリマーを含む、項目１から１５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目２０）
前記非生体分解性ポリマーが、ポリ（エチレン酢酸ビニル）、ポリ（酢酸ビニル）、シリコーンポリマー、ポリウレタン、セルロース性ポリマーおよびセルロース誘導体、アシル置換酢酸セルロースおよびそれらの誘導体などの多糖、ポリ（エチレングリコール）とポリ（ブチレンテレフタレート）とのコポリマー、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニル、ポリ（ビニルイミダゾール）、クロロスルホン化ポリオレフィン、ポリエチレンオキシド、ならびにこれらのコポリマーおよびブレンドのうちの１または複数である、項目１９に記載の組成物。
（項目２１）
前記マイクロスフェアが、金属を含む、項目１から１５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目２２）
前記金属が、コバルト、クロム、金、ニッケル、白金、ステンレス鋼、チタン、タンタル、ニッケル−チタン、ならびにこれらの合金および組み合わせのうちの１または複数を含む、項目２１に記載の組成物。
（項目２３）
前記マイクロスフェアが、約０．５ミクロン〜約７５ミクロンの平均直径を含む、項目１から２２のいずれか一項に記載の組成物。
（項目２４）
組成物を調製するための方法であって、生体適合性マイクロスフェアをバイオフィルム生成性プロバイオティクス細菌およびプレバイオティクスと混合するステップを含む、方法。
（項目２５）
プレバイオフィルミクスを混合するステップをさらに含む、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記プレバイオフィルミクスが、ＤＮＡ結合性ポリペプチドもしくはタンパク質、および／またはＤＮＡＢＩＩポリペプチドもしくはタンパク質、またはこれらの各々の同等物を含む、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記プレバイオティクスが、イヌリン、オリゴフルクトース、フルクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、グルコース、マルトース、マルトデキストリン、ポリデキストロース、スクロース、フルクトース、ラクトース、イソマルツロース、ポリオール、グリセロール、およびこれらの組み合わせのうちの１または複数を含む、水溶性の炭水化物を含む、項目２４から２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
前記プロバイオティクス細菌が、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ、群Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｌ．ｃａｓｅｉ、Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉ、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ、Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ、Ｌ．ｂｕｃｈｎｅｒｉ、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｂ．ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ、Ｂ．ａｎｇｕｌａｔｉｏｎ、Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ、Ｂ．ｂｒｅｖｅ、Ｂ．ｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ、Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｂ．ｌａｃｔｉｓ、Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ、Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、およびこれらの組み合わせのうちの１または複数を含む、項目２４から２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
前記プロバイオティクス細菌が、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉを含む、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記生体適合性マイクロスフェアが、生体分解性ポリマー、非生体分解性ポリマー、金属、これらの組み合わせのうちの１または複数を含む、項目２４から２９のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
前記マイクロスフェアが、中実コアを含む、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記マイクロスフェアが、中空コアを含む、項目３０に記載の方法。
（項目３３）
前記プレバイオティクスが、前記中空コア内に封入されている、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記マイクロスフェアが、生体分解性ポリマーである、項目２４から３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
前記生体分解性ポリマーが、Ｓｅｐｈａｄｅｘ、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）；ポリカプロラクトン；キトサン；ゼラチン；ＤＮＡ水素；アセタール化デキストラン；ポリ（ラクチド）；ポリ（グリコリド）；ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）；ポリ（乳酸）；ポリ（グリコール酸）；ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）；ポリ（ラクチド）／ポリ（エチレングリコール）コポリマー；ポリ（グリコリド）／ポリ（エチレングリコール）コポリマー；ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）／ポリ（エチレングリコール）コポリマー；ポリ（乳酸）／ポリ（エチレングリコール）コポリマー；ポリ（グリコール酸）／ポリ（エチレングリコール）コポリマー；ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）／ポリ（エチレングリコール）コポリマー；ポリ（カプロラクトン）；ポリ（カプロラクトン）／ポリ（エチレングリコール）コポリマー；ポリ（オルトエステル）；ポリ（ホスファゼン）；ポリ（ヒドロキシブチレート）；ポリ（ヒドロキシブチレート）；ポリ（ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）；ポリカーボネート；ポリエステルアミド；ポリ無水物；ポリ（ジオキサノン）；ポリ（アルキレンアルキレート）；ポリエチレングリコール／ポリオルトエステルコポリマー；ポリウレタン；ポリ（アミノ酸）；ポリエーテルエステル；ポリアセタール；ポリシアノアクリレート；ポリ（オキシエチレン）／ポリ（オキシプロピレン）コポリマー、およびこれらの組み合わせのうちの１または複数を含む、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記生体分解性ポリマーが、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）および／またはＳｅｐｈａｄｅｘを含む、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記マイクロスフェアが、非生体分解性ポリマーを含む、項目２４から３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３８）
前記非生体分解性ポリマーが、ポリ（エチレン酢酸ビニル）、ポリ（酢酸ビニル）、シリコーンポリマー、ポリウレタン、セルロース性ポリマーおよびセルロース誘導体、アシル置換酢酸セルロースおよびそれらの誘導体などの多糖、ポリ（エチレングリコール）とポリ（ブチレンテレフタレート）とのコポリマー、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニル、ポリ（ビニルイミダゾール）、クロロスルホン化ポリオレフィン、ポリエチレンオキシド、ならびにこれらのコポリマーおよびブレンドのうちの１または複数を含む、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記マイクロスフェアが、金属を含む、項目２４から３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目４０）
前記金属が、コバルト、クロム、金、ニッケル、白金、ステンレス鋼、チタン、タンタル、ニッケル−チタン、これらの合金および組み合わせのうちの１または複数を含む、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
疾患の処置または防止を必要とする被験体においてバイオフィルムにより適切に処置される前記疾患を処置または防止するための方法であって、前記被験体に、有効量の項目１から２３のいずれか一項に記載の組成物を投与するステップを含む、方法。
（項目４２）
前記疾患が、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、大腸炎、腸管感染性疾患、下痢性疾病、膣症、壊死性腸炎（ＮＥＣ）、創傷、火傷、乾癬、皮膚炎、歯齲蝕、歯周炎、副鼻腔炎、感染誘導性大腸炎、旅行者下痢、心理学的ストレス、心理学的障害、または健常な細菌にとって代わる病原性細菌により引き起こされる、慢性もしくは再発性疾患のうちのいずれかのうちの１または複数を含む、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記疾患が、膣症である、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
前記疾患が、大腸炎またはＮＥＣである、項目４２に記載の方法。
（項目４５）
前記組成物を、坐剤として投与する、項目４１から４４のいずれか一項に記載の方法。
（項目４６）
プロバイオティクスを被験体に投与する方法であって、ある用量の項目１から２３のいずれか一項に記載の組成物を被験体に投与し、これにより前記プロバイオティクスを投与するステップを含む、方法。
（項目４７）
前記組成物を、約１×１０７〜約１×１０９ＣＦＵ／ｍｌのバイオフィルム生成性プロバイオティクス細菌を提供するように投与する、項目４１から４６のいずれか一項に記載の方法。
（項目４８）
前記組成物を、約６時間、約１２時間、約１８時間、約２４時間、約３６時間、約４８時間および約７２時間で投与する、項目４１から４６のいずれか一項に記載の方法。
（項目４９）
前記組成物を、単回用量で投与する、項目４１から４６のいずれか一項に記載の方法。
（項目５０）
項目１〜２３のいずれか一項に記載の組成物を含む製剤であって、前記組成物が、坐剤、生体適合性足場内、散剤、液剤、カプセル剤、咀嚼錠、嚥下錠、バッカル錠、トローチ剤、ロゼンジ剤、ソフトチュー、溶液剤、懸濁剤、スプレー剤、チンキ剤、煎剤、注入剤、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される剤形で製剤化されている、製剤。
（項目５１）
項目１〜２３のいずれか一項に記載の組成物、および使用のための指示書を含むキット。
（項目５２）
ＰＧＬＡ生体適合性マイクロスフェアと、少なくともＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ（「Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ」）を含む１または複数のバイオフィルム生成性プロバイオティクス細菌と、前記プロバイオティクス細菌の成長を支援する量の、スクロースまたはグリセロールのうちの１または複数を含む栄養補充物質とを含む、組成物。
（項目５３）
有効量のＨＵポリペプチドまたはタンパク質をさらに含む、項目１に記載の組成物。
（項目５４）
薬学的に許容される担体または生体適合性足場をさらに含む、項目５２または５３に記載の組成物。
（項目５５）
前記マイクロスフェアの直径が、約０．５ミクロン〜７５ミクロンの範囲である、項目５２から５４のいずれか一項に記載の組成物。
（項目５６）
項目５２に記載の組成物を調製するための方法であって、ＰＧＬＡ生体適合性マイクロスフェアを、少なくともＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ（「Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ」）を含む有効量の１または複数のバイオフィルム生成性プロバイオティクス細菌、および前記プロバイオティクス細菌の成長を支援する量の、スクロースまたはグリセロールのうちの１または複数を含む栄養補充物質と混合するステップを含む、方法。
（項目５７）
有効量のＨＵポリペプチドまたはタンパク質を混合するステップをさらに含む、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
消化管障害を処置するための方法であって、消化管障害の処置を必要とする被験体に、有効量の項目５２から５５のいずれか一項に記載の組成物を投与し、これにより前記消化管障害を処置するステップを含む、方法。
（項目５９）
前記消化管障害が、感染誘導性大腸炎、炎症性腸疾患、壊死性腸炎（ＮＥＣ）、または旅行者下痢のうちの１または複数である、項目５８に記載の方法。
（項目６０）
前記組成物が、坐剤製剤として投与される、項目５８または５９に記載の方法。
（項目６１）
項目５２〜５５のいずれか一項に記載の組成物と、使用のための指示書とを含むキット。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１Ａおよび１Ｂは、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉバイオフィルムの構造的完全性が、ＤＮＡＢＩＩファミリータンパク質の存在に依拠することを例示する図である。ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ  ＢａｃＬｉｇｈｔ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で染色された、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＬ．ｒｅｕｔｅｒｉバイオフィルムについての共焦点顕微鏡画像である。Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉバイオフィルムを、３７℃および５％のＣＯ２で２４時間にわたり成長させたが、このとき、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉバイオフィルムを、Ａ）ウサギナイーブ血清、Ｂ）ウサギ抗組込み宿主因子ポリペプチド（「ＩＨＦ」）、または無添加の培地（データは示さない）の１：５０の希釈物で、１６時間にわたり処理した。抗ＩＨＦ処理は、最大高さの２０％の減少、平均厚さの３５％の減少、およびバイオマスの４１％の減少を結果としてもたらした（データは示さない）。
【００２９】
【図２】図２は、プレバイオティクス化合物が、プロバイオティクスのバイオフィルムの平均厚さおよびバイオマスを増大させることを例示する図である。播種時における、１０μｇ／ｍｌのＳ．ｍｕｔａｎｓ  ＨＵの、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉバイオフィルムへの添加は、平均厚さおよびバイオマスを、それぞれ、３３％および５５％増大させた。１０μｇ／ｍｌの仔ウシ胸腺ＤＮＡの添加は、平均厚さを４４％増大させ、バイオマスを６８％増大させた。１０μｇ／ｍｌのＨＵとＤＮＡとを併せて添加したところ、いずれか単独の場合と比較して、効果の増大がもたらされ、平均厚さは、５３％増大し、バイオマスは、７８％増大した。
【００３０】
【図３】図３は、単回経口投与による、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉのｉｎ  ｖｉｖｏにおける生着および保持を例示する図である。マウス（ｎ＝３／条件）に、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉを、経口胃管栄養法を介して、プランクトン様培養物、プランクトン様培養物＋ＰＬＧＡ、バイオフィルム培養物、およびバイオフィルム培養物＋ＰＬＧＡとして投与した。７日後、マウスを屠殺し、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ  １６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を、マウス結腸からＰＣＲ増幅した。プロバイオティクスは、バイオフィルム培養物またはＰＬＧＡを存在させた培養物で処置されたマウスにおいて、プランクトン様培養物で処置された場合より高い百分率で見出された。
【００３１】
【図４】図４は、ＰＬＧＡマイクロスフェアおよびＨＵと共に成長させたＬ．ｒｅｕｔｅｒｉバイオフィルムが、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍの脾臓内生着を、バイオフィルムおよびプランクトン様のＬ．ｒｅｕｔｅｒｉより効果的に低減することを例示する図である。マウス（ｎ＝６／条件）を、以下の形態：プランクトン様形態、プランクトン様形態＋ＰＬＧＡ＋ＨＵ、バイオフィルム形態、およびバイオフィルム形態＋ＰＬＧＡ＋ＨＵ（０．１１５μｇ／ｍｌのＰＬＧＡ、１０μｇ／ｍｌのＨＵ）のうちの１つの形態にあるＬ．ｒｅｕｔｅｒｉの単回経口胃管栄養法で処置した。１２時間後、マウスに、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍを胃管栄養法によって与え、感染の１２日後に、剖検のために屠殺した。Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉバイオフィルム＋ＰＬＧＡ＋ＨＵだけが、１ｇ当たりのＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ  ＣＦＵの、統計学的に有意な減少を示した（Ｐ＝０．０３４３）。
【００３２】
【図５】図５は、本開示の組成物が、ＮＥＣの動物モデルにおいて、炎症を軽減し、細菌性病原体に拮抗することを確立する研究の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
配列表
配列番号１は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ８６−０２８ＮＰ株ＩｈｆＡの全長野生型（ｗｔ）；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＡＡＸ８８４２５．１（最終アクセス：２０１１年３月２１日）：
ＭＡＴＩＴＫＬＤＩＩＥＹＬＳＤＫＹＨＬＳＫ  ＱＤＴＫＮＶＶＥＮＦＬＥＥＩＲＬＳＬＥＳＧＱＤＶＫＬＳＧＦＧＮＦＥＬＲＤＫＳＳＲＰＧＲＮＰＫＴＧＤＶＶＰＶＳＡＲＲＶＶＴＦＫＰＧＱＫＬＲＡＲＶＥＫＴＫ
である。
【００３４】
配列番号２は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ８６−０２８ＮＰ株ＨＵの全長野生型；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＹＰ＿２４８１４２．１（最終アクセス：２０１１年３月２１日）：
ＭＲＦＶＴＩＦＩＮＨＡＦＮＳＳＱＶＲＬＳＦＡＱＦＬＲ  ＱＩＲＫＤＴＦＫＥＳＮＦＬＦＮＲＲＹＫＦＭＮＫＴＤＬＩＤＡＩＡＮＡＡＥＬＮＫＫＱＡＫＡＡＬＥＡＴＬＤＡＩＴＡＳＬＫＥＧＥＰＶＱＬＩＧＦＧＴＦＫＶＮＥＲＡＡＲＴＧＲＮＰＱＴＧＡＥＩＱＩＡＡＳＫＶＰＡＦＶＳＧＫＡＬＫＤＡＩＫ
である。
【００３５】
配列番号３は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  Ｒ２８４６株ＩｈｆＡの全長ｗｔ；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＡＤＯ９６３７５（最終アクセス：２０１１年３月２１日）：
ＭＡＴＩＴＫＬＤＩＩＥＹＬＳＤＫＹＨＬＳＫＱＤＴＫＮＶＶＥＮＦＬ  ＥＥＩＲＬＳＬＥＳＧＱＤＶＫＬＳＧＦＧＮＦＥＬＲＤＫＳＳＲＰＧＲＮＰＫＴＧＤＶＶＰＶＳＡＲＲＶＶＴＦＫＰＧＱＫＬＲＡＲＶＥＫＴＫ
である。
【００３６】
配列番号４は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  Ｒｄ株ＩｈｆＡの全長野生型；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＡＡＣ２２９５９．１（最終アクセス：２０１１年３月２１日）：
ＭＡＴＩＴＫＬＤＩＩＥＹＬＳＤＫＹＨＬＳＫＱＤＴＫ  ＮＶＶＥＮＦＬＥＥＩＲＬＳＬＥＳＧＱＤＶＫＬＳＧＦＧＮＦＥＬＲＤＫＳＳＲＰＧＲＮＰＫＴＧＤＶＶＰＶＳＡＲＲＶＶＴＦＫＰＧＱＫＬＲＡＲＶＥＫＴＫ；
である。
【００３７】
配列番号５は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２株ＩｈｆＡの全長野生型；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＡＡＣ７４７８２．１（最終アクセス：２０１１年３月２１日）：
ＭＡＬＴＫＡＥＭＳＥＹＬＦＤＫＬＧＬＳＫＲＤＡＫＥＬＶＥＬＦＦＥ  ＥＩＲＲＡＬＥＮＧＥＱＶＫＬＳＧＦＧＮＦＤＬＲＤＫＮＱＲＰＧＲＮＰＫＴＧＥＤＩＰＩＴＡＲＲＶＶＴ  ＦＲＰＧＱＫＬＫＳＲＶＥＮＡＳＰＫＤＥ；ＤＮＡ  Ｇｅｎｂａｎｋ番号：ＮＣ＿０００９１３
である。
【００３８】
配列番号６は、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＡ０１株ＩｈｆＡの全長野生型；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＡＡＧ０６１２６．１（最終アクセス：２０１１年３月２１日）：
ＭＧＡＬＴＫＡＥＩＡＥＲＬＹＥＥＬＧＬＮＫＲＥＡ  ＫＥＬＶＥＬＦＦＥＥＩＲＱＡＬＥＨＮＥＱＶＫＬＳＧＦＧＮＦＤＬＲＤＫＲＱＲＰＧＲＮＰＫＴＧＥＥＩＰＩＴＡＲＲＶＶＴＦＲＰＧＱＫＬＫＡＲＶＥＡＹＡＧＴＫＳ
である。
【００３９】
配列番号７は、（ＩＨＦα）のβ−３およびα−３部分：ＴＦＲＰＧＱおよびＫＬＫＳＲＶＥＮＡＳＰＫＤＥである。
【００４０】
配列番号８は、（ＩＨＦβ）のβ−３およびα−３部分：ＨＦＫＰＧＫおよびＥＬＲＤＲＡＮＩＹＧである。
【００４１】
配列番号９は、β−３およびα−３部分：ＴＦＫＰＧＱおよびＫＬＲＡＲＶＥＫＴＫである。
【００４２】
配列番号１０は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ２０１９株ＩｈｆＡのβ−３およびα−３部分：ＴＦＫＰＧＱおよびＫＬＲＡＲＶＥＮＴＫである。
【００４３】
配列番号１１は、β−３およびα−３部分：ＴＦＫＰＧＱおよびＫＬＲＡＲＶＥＫＴＫである。
【００４４】
配列番号１２は、β−３およびα−３部分：ＴＦＲＰＧＱおよびＫＬＫＳＲＶＥＮＡＳＰＫＤＥである。
【００４５】
配列番号１３は、β−３およびα−３：ＴＦＲＰＧＱおよびＫＬＫＡＲＶＥＡＹＡＧＴＫＳである。
【００４６】
配列番号１４は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｈｕｐＡ株；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＡＰ＿００３８１８（最終アクセス：２０１１年３月２１日）：
ＭＮＫＴＱＬＩＤＶＩＡＥＫＡＥＬＳＫＴＱＡＫＡＡＬＥＳＴＬＡＡＩＴＥＳＬＫＥＧＤＡＶＱＬＶＧＦＧＴＦＫ  ＶＮＨＲＡＥＲＴＧＲＮＰＱＴＧＫＥＩＫＩＡＡＡＮＶＰＡＦＶＳＧＫＡＬＫＤＡＶＫ
である。
【００４７】
配列番号１５は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｈｕｐＢ株；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＡＰ＿００１０９０．１（最終アクセス：２０１１年３月２１日）：
ＭＮＫＳＱＬＩＤＫＩＡＡＧＡＤＩＳＫＡＡＡＧＲＡＬＤＡＩＩＡＳＶＴＥＳＬＫＥＧＤＤＶＡＬＶＧＦＧ  ＴＦＡＶＫＥＲＡＡＲＴＧＲＮＰＱＴＧＫＥＩＴＩＡＡＡＫＶＰＳＦＲＡＧＫＡＬＫＤＡＶＮ
である。
【００４８】
配列番号１６は、β−３およびα−３部分：ＡＦＶＳＧＫおよびＡＬＫＤＡＶＫである。
【００４９】
配列番号１７は、β−３およびα−３部分：ＳＦＲＡＧＫおよびＡＬＫＤＡＶＮである。
【００５０】
配列番号１８は、ＩＨＦαのＣ末端の２０アミノ酸：ＴＦＲＰＧＱＫＬＫＳＲＶＥＮＡＳＰＫＤＥである。
【００５１】
配列番号１９は、ＩＨＦβのＣ末端の２０アミノ酸：ＫＹＶＰＨＦＫＰＧＫＥＬＲＤＲＡＮＩＹＧである。
【００５２】
配列番号２０は、ＤＮＡＢＩＩ結合性コンセンサス配列：ＷＡＴＣＡＡＮＮＮＮＴＴＲ［配列中、Ｗは、ＡまたはＴであり、Ｎは、任意の塩基であり、Ｒは、プリンである］である。
【００５３】
配列番号２１は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＩＨＦアルファ：ＧＲＮＰＫＴＧＥＤＩＰＩである。
【００５４】
配列番号２２は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＩＨＦベータ：ＧＲＮＰＫＴＧＤＫＶＥＬである。
【００５５】
配列番号２３は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＵアルファ：ＧＲＮＰＱＴＧＫＥＩＫＩである。
【００５６】
配列番号２４は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＵベータ：ＧＲＮＰＱＴＧＫＥＩＴＩである。
【００５７】
詳細な説明
本発明は、当然ながら変化しうるので、記載される特定の実施形態に限定されないことを理解されたい。また、本発明の範囲は、付属の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態について記載することだけを目的とするものであり、限定的であることを意図するものではないことも理解されたい。
【００５８】
そうでないことが規定されない限りにおいて、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。本発明の実施または試行では、本明細書で記載される方法および材料と類似または同等の任意の方法および材料を使用しうるが、ここでは、好ましい方法、デバイス、および材料について記載する。本明細書で引用される全ての技術的刊行物および特許公開は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。本明細書のいかなる内容も、本発明が、先行発明により、このような開示に先行する権利がないことの容認とはみなされないものとする。
【００５９】
本技術の実施では、そうでないことが示されない限りにおいて、当技術分野の技術の範囲内にある、組織培養、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、および組換えＤＮＡについての従来の技法を利用する。例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ編（２００１年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、３版；Ａｕｓｕｂｅｌら編（２００７年）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙシリーズ；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．、Ｎ．Ｙ．）シリーズ；ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎら（１９９１年）ＰＣＲ  １：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ内、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）；ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎら（１９９５年）ＰＣＲ  ２：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編（１９９９年）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（２００５年）Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ    Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：  Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、５版；Ｇａｉｔ編（１９８４年）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；米国特許第４，６８３，１９５号；ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ編（１９８４年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；Ａｎｄｅｒｓｏｎ（１９９９年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ編（１９８４年）Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９８６年））；Ｐｅｒｂａｌ（１９８４年）Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；ＭｉｌｌｅｒおよびＣａｌｏｓ編（１９８７年）Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍａｋｒｉｄｅｓ編（２００３年）Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ；ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編（１９８７年）Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ）；ならびにＨｅｒｚｅｎｂｅｒｇら編（１９９６年）Ｗｅｉｒ’ｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙを参照されたい。
【００６０】
範囲を含む、全ての数値表示、例えば、ｐＨ、温度、時間、濃度、および分子量は、必要に応じて、（＋）もしくは（−）１．０もしくは０．１の増分、または代替的に±１５％、または代替的に１０％、または代替的に５％、または代替的に２％の変動で変化する概数である。常に明示的に言明されているわけではないが、全ての数値表示は、「約」という用語を前置することを理解されたい。また、常に明示的に言明されているわけではないが、本明細書で記載される試薬は、単に例示的なものであり、当技術分野では、このような試薬の同等物が公知であることも理解されたい。
【００６１】
本明細書および特許請求の範囲で使用される、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈により明らかにそうでないことが指示されない限りにおいて、複数の指示対象を含む。例えば、「細菌（ａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）」という用語は、それらの混合物を含む複数の細菌を含む。
【００６２】
本明細書で使用される場合、「含む」という用語は、組成物および方法は、列挙される要素を含むが、他の要素を除外しないことを意味するように意図される。組成物および方法を規定するのに使用される場合の「から本質的になる」とは、意図される使用のための組み合わせに本質的な重要性を有さない他の要素を除外することを意味するものとする。したがって、本明細書で規定される要素から本質的になる組成物は、単離法および精製法、ならびにリン酸緩衝食塩水、保存剤など、薬学的に許容される担体から、微量の夾雑物を除外しないであろう。「からなる」とは、本発明の組成物を投与するための、微量を超える他の成分の要素および実質的な方法ステップを除外することを意味するものとする。これらの移行句の各々により規定される実施形態は、本発明の範囲内にある。
【００６３】
「バイオフィルム」とは、微生物が分泌および／または放出するＤＮＡなどのポリマーと併せて、有機の場合もあり、無機の場合もある、構造の表面に時折付着しうる、微生物の薄層または組織化された群落を意図する。バイオフィルムは、抗生物質（ｍｉｃｒｏｂｉｏｔｉｃｓ）および抗微生物剤に対して極めて抵抗性である。バイオフィルムは、歯肉組織、歯、および修復物に寄生し、歯周プラーク疾患としてもまた公知の、齲蝕および歯周病を引き起こす。バイオフィルムはまた、慢性中耳感染も引き起こす。バイオフィルムはまた、歯科インプラント、ステント、カテーテルライン、およびコンタクトレンズの表面上にも形成されうる。バイオフィルムは、ペースメーカー、心弁置換、人工関節、および他の外科インプラント上で成長する。米国疾病管理予防センターは、院内（ｎｏｓｏｃｏｍｉａｌ（ｈｏｓｐｉｔａｌ−ａｃｑｕｉｒｅｄ））感染のうちの６５％超は、バイオフィルムにより引き起こされると推定している。また、真菌バイオフィルムも、高頻度で医療デバイスを汚染する。真菌バイオフィルムは、慢性膣感染を引き起こし、免疫系が機能不全を来している患者における、致死性の全身感染をもたらす。バイオフィルムはまた、多数の疾患にも関与している。例えば、嚢胞性線維症患者は、抗生物質抵抗性バイオフィルムを結果としてもたらすことが多い、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ感染を有する。
【００６４】
「プレバイオティクス」とは、プロバイオティクス細菌のための栄養補充物質を意図する。プレバイオティクスとは、被験体により（例えば、ヒトなどの哺乳動物により）消化不能であり、１もしくは複数の有益な細菌の成長もしくは活性を刺激し、かつ／または１もしくは複数の病原性細菌の成長もしくは活性を阻害する食物成分、例えば、オリゴ糖である。プレバイオティクスは、被験体における、１または限定数の細菌の成長および／または活性を選択的に刺激しうる。
【００６５】
「プレバイオフィルミクス」とは、バイオフィルムの形成および耐久性を支援する物質を意図し、例えば、プレバイオフィルミクスとは、ＤＮＡ結合性ポリペプチドまたはタンパク質のような、バイオフィルムの細胞外マトリックスを支援する物質の場合もあり、代替的に、付着を促進する物質、例えば、スクロースに転換されうる基質の場合もある。
【００６６】
「ＤＮＡＢＩＩポリペプチドまたはタンパク質」とは、ＤＮＡ結合性ドメインから構成され、したがって、ＤＮＡに対する特異的または一般的アフィニティーを有する、ＤＮＡ結合性タンパク質またはポリペプチドを意図する。一態様では、それらは、副溝において、ＤＮＡに結合する。ＤＮＡＢＩＩタンパク質の非限定的な例は、組込み宿主因子（ＩＨＦ）タンパク質およびＥ．ｃｏｌｉ  Ｕ９３株由来のヒストン様タンパク質（ＨＵ）であり、これらの例を配列番号１〜２４に提示し、さらなる株およびポリペプチドを表４に提示する。また、ポリペプチド断片、およびタンパク質もしくはポリペプチドの生物学的活性を実質的に変化させないアミノ酸修飾を有する同等のポリペプチド、またはそれらの活性断片も意図される。それらの活性断片は、例えば、タンパク質またはポリペプチドのＣ末端側の半分またはＣ末端側の３分の１を含む。バイオフィルムと会合しうる、他のＤＮＡ結合性タンパク質は、ＤＰＳ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＣＡＡ４９１６９）、Ｈ−ＮＳ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＣＡＡ４７７４０）、Ｈｆｑ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＡＣＥ６３２５６）、ＣｂｐＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＢＡＡ０３９５０）およびＣｂｐＢ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＮＰ＿４１８８１３）のほか、同等のポリペプチドおよびそれらの活性断片を含む。
【００６７】
「マイクロスフェア」とは、列挙される特定のサイズ範囲内の、バイオフィルム保有粒子状材料もしくはバイオフィルム保有顆粒状材料、および／または化合物保有（例えば、薬物保有）粒子状材料もしくは化合物保有（例えば、薬物保有）顆粒状材料を意図する。本明細書で使用される場合、マイクロスフェアは、５０ミリメートルまたはこれ未満の直径であり、かつ、１ミクロンまたはこれを超える（例えば、１〜１００、または代替的に１〜７５ミクロン、または代替的に１〜５０、または代替的に１〜２５、または代替的に１〜１０ミクロンの）直径である粒子からなる。このようなマイクロスフェアの非限定的な例は、一部の態様では、医薬または薬物を含有しうる中空マイクロスフェア、マイクロカプセル（この中で、賦形剤は、薬物などのカーゴを取り囲み、含有する、スキンまたはシェルを形成する）、およびマイクロ粒子を含み、これらは、これらの用語が当技術分野で典型的に使用される通り、球状であれ、球状でないのであれ、列挙されたサイズ範囲内の任意の粒子についての総称的用語として使用される。
【００６８】
「生体分解性ポリマー」とは、生体適合性であり、身体での過程により、体内でたやすく処理可能であり、体内に蓄積されない産物へとｉｎ  ｖｉｖｏにおいて分解されうるポリマーを意図する。
【００６９】
「生体適合性」とは、送達系の成分が、組織損傷もヒト生体系に対する損傷も引き起こさないことを意味する。生体適合性を付与するには、ヒトにおける安全使用歴があるか、またはＧＲＡＳ（Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ  Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  Ａｓ  Ｓａｆｅ）ステータスの、ポリマーおよび賦形剤を優先的に使用する。生体適合性とは、組成物中で使用される成分および賦形剤が、身体への有害作用を伴わずに、体内で最終的に「生体吸収される」か、または除去されることを意味する。組成物が生体適合性であり、非毒性とみなされるためには、組成物は、細胞に対して毒性を引き起こしてはならない。同様に、「生体吸収性」という用語は、患者における材料の長期にわたる蓄積を回避するように、ある期間にわたり、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて生体吸収を受ける材料から作製されたマイクロスフェアを指す。生体適合性ナノ粒子は、２年間未満、好ましくは１年間未満、さらにより好ましくは６カ月間未満にわたり生体吸収される。生体吸収の速度は、粒子のサイズ、使用される材料、および当業者によりよく認識されている他の因子と関連する。生体吸収性材料、生体適合性材料の混合物を使用して、本発明で使用されるマイクロスフェアを形成することができる。
【００７０】
「組込み宿主因子」または「ＩＨＦ」タンパク質とは、バクテリオファージにより、それらのＤＮＡを宿主細菌に組み込むのに使用される細菌タンパク質である。これらは、遺伝子組換えのほか、転写および翻訳の調節においても機能する、ＤＮＡ結合性タンパク質である。これらはまた、細胞外微生物のＤＮＡにも結合する。Ｅ．ｃｏｌｉ内のＩＨＦタンパク質サブユニットをコードする遺伝子は、ｈｉｍＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＰＯＡ６Ｘ７．１）およびｈｉｍＤ（ＰＯＡ６Ｙ１．１）遺伝子である。このようなタンパク質の非限定的な例を、添付の配列表に提示し、表４でこれらについて言及する。
【００７１】
「ＨＵ」または「Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｕ９３株に由来するヒストン様タンパク質」とは、Ｅ．ｃｏｌｉと会合することが典型的なヘテロ二量体タンパク質のクラスを指す。ＨＵタンパク質は、ＤＮＡ接合部に結合することが公知である。他の微生物から、類縁のタンパク質が単離されている。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＵの完全アミノ酸配列は、Ｌａｉｎｅら（１９８０年）Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０３巻（３号）：４４７〜４８１頁により報告された。ＨＵタンパク質に対する抗体は、Ａｂｃａｍから市販されている。このようなタンパク質の非限定的な例を、添付の配列表に提示する。
【００７２】
「タンパク質」、「ペプチド」、および「ポリペプチド」という用語は、２つもしくはこれを超えるサブユニットのアミノ酸、アミノ酸類似体、またはペプチド模倣体の化合物を指すように、互換的に、かつ、それらの最も広い意味で使用する。サブユニットは、ペプチド結合で連結することができる。別の実施形態では、サブユニットは、他の結合、例えば、エステル、エーテルなどで連結することができる。タンパク質またはペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含有しなければならないが、タンパク質の配列またはペプチドの配列を含みうるアミノ酸の最大数は、限定されない。本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、グリシン、ならびにＤ光学異性体およびＬ光学異性体の両方、アミノ酸類似体およびペプチド模倣体を含む、天然および／または非天然もしくは合成のアミノ酸を指す。
【００７３】
「Ｃ末端ポリペプチド」とは、ポリペプチドのうちのＣ末端側の半分またはＣ末端側の３分の１を意図する。例として述べると、９０アミノ酸を含有するポリペプチドでは、Ｃ末端ポリペプチドは、アミノ酸４６〜９０またはアミノ酸６０〜９０を含むであろう。別の態様では、用語は、カルボキシ末端からのＣ末端２０アミノ酸を意図する。
【００７４】
「Ｎ末端ポリペプチド」とは、ポリペプチドのうちのＮ末端側の半分を意図する。例として述べると、９０アミノ酸を含有するポリペプチドでは、Ｎ末端ポリペプチドは、アミノ酸１〜４５を含むであろう。別の態様では、用語は、アミノ末端からのＮ末端２０アミノ酸を意図する。
【００７５】
「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、互換的に使用され、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドまたはその類似体である、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有することが可能であり、公知または未知の任意の機能を果たしうる。以下はポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子断片（例えば、プローブ、プライマー、ＥＳＴまたはＳＡＧＥタグ）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、ＲＮＡｉ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体を含みうる。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリヌクレオチドのアセンブリーの前または後に付与することができる。ヌクレオチドの配列は、ヌクレオチドではない成分で中断させることができる。ポリヌクレオチドは、標識化成分とのコンジュゲーションを介するなど、重合化の後でさらに修飾することができる。用語はまた、二本鎖分子および一本鎖分子の両方を指す。そうでないことが指定または要求されない限りにおいて、ポリヌクレオチドである本発明の任意の実施形態は、二本鎖形態、および二本鎖形態を構成することが公知であるかまたは予測される、２つの相補的な一本鎖形態の各々の両方を包含する。
【００７６】
ポリヌクレオチドは、４つのヌクレオチド塩基：アデニン（Ａ）；シトシン（Ｃ）；グアニン（Ｇ）；チミン（Ｔ）；および、ポリヌクレオチドがＲＮＡである場合の、チミンに代えたウラシル（Ｕ）の特異的配列から構成される。したがって、「ポリヌクレオチド配列」という用語は、ポリヌクレオチド分子のアルファベット表示である。このアルファベット表示は、中央演算処理装置を有するコンピュータ内のデータベースに入力することが可能であり、機能的ゲノミクス研究および相同性研究などのバイオインフォーマティックス適用に使用することができる。
【００７７】
ＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸に関して本明細書で使用される「単離」または「組換え」という用語は、高分子ならびにポリペプチドの天然の供給源中に存在する他のＤＮＡまたはＲＮＡのそれぞれから分離される分子を指す。「単離または組換え核酸」という用語は、断片として天然に存在しておらず、天然の状態では見出されない核酸断片を含むことを意味する。本明細書では、「単離」という用語は、他の細胞タンパク質から単離された、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、およびタンパク質を指すようにも使用され、精製ポリペプチドおよび組換えポリペプチドの両方を包含することを意味する。他の実施形態では、「単離または組換え」という用語は、細胞構成要素および他の形の構成要素であって、細胞、組織、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはこれらの断片が、天然では通常会合している、構成要素から分離されていることを意味する。例えば、単離細胞とは、表現型または遺伝子型が類似しない組織または細胞から分離された細胞である。単離ポリヌクレオチドは、例えば、染色体上の、その天然（ｎａｔｉｖｅまたはｎａｔｕｒａｌ）環境では通常会合している、３’側および５’側の連続ヌクレオチドから分離されている。当業者に明らかな通り、天然に存在していないポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはこれらの断片は、その天然に存在している対応物と識別するのに、「単離」を要求しない。
【００７８】
明示的な列挙を伴わないが、そうでないことが意図されない限りにおいて、本発明が、ポリペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、または抗体に関する場合、これらの同等物または生物学的同等物は、本発明の範囲内にあることが意図されることを推察されたい。本明細書で使用される場合、「その生物学的同等物」という用語は、参照タンパク質、参照抗体、参照ポリペプチド、参照ポリヌクレオチドまたは参照核酸に言及する場合の「その同等物」と同義であることを意図し、所望の構造または機能性をなおも維持しながら、最小限の相同性を有する生物学的同等物を意図する。本明細書で具体的に列挙されない限りにおいて、本明細書で言及される、任意の核酸、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはタンパク質はまた、その同等物も含むことが想定される。例えば、同等物は、タンパク質またはその特定の断片にわたり、少なくとも約７０％、または代替的に８０％の相同性もしくは同一性を意図し、代替的に少なくとも約８５％、または代替的に少なくとも約９０％、または代替的に少なくとも約９５％、または代替的に９８％の相同性パーセントもしくは同一性パーセントを意図し、参照タンパク質、参照ポリペプチド、または参照核酸と実質的に同等な生物学的活性を呈示する。
【００７９】
別の配列と、ある特定の百分率（例えば、８０％、８５％、９０％、または９５％）の「配列同一性」を有するポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域（またはポリペプチドもしくはポリペプチド領域）とは、アラインさせた場合、２つの配列を比較する際の、その塩基（またはアミノ酸）が同じである百分率を意味する。アライメントおよび相同性パーセントまたは配列同一性パーセントは、当技術分野で公知のソフトウェアプログラム、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７年）、補遺３０巻、７．７．１８節、表７．７．１において記載されているソフトウェアプログラムを使用して決定することができる。アライメントのためには、デフォルトのパラメータを使用することが好ましい。好ましいアライメントプログラムは、デフォルトのパラメータを使用するＢＬＡＳＴである。特に、好ましいプログラムは、以下のデフォルトのパラメータ：遺伝子コード＝標準；フィルター＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；期待値＝１０；行列＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記載＝５０配列；ソート＝高スコア；データベース＝非冗長である、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲを使用する、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰである。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレス：ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴにおいて見出すことができる。
【００８０】
「相同性」または「同一性」または「類似性」とは、２つのペプチドの間または２つの核酸分子の間の配列類似性を指す。相同性は、比較を目的としてアラインされうる各配列内の位置を比較することにより決定することができる。比較される配列内の位置が、同じ塩基またはアミノ酸により占有される場合、分子は、その位置において相同である。配列の間の相同性の程度は、配列により共有される、マッチする位置または相同な位置の数の関数である。「非類縁の」または「非相同な」配列は、本発明の配列のうちの１つと、４０％未満の同一性、または代替的に２５％未満の同一性を共有する。
【００８１】
本明細書で使用される場合、「発現」とは、ポリヌクレオチドが、ｍＲＮＡに転写される過程、および／または転写されたｍＲＮＡが、その後、ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質に翻訳される過程を指す。ポリヌクレオチドが、ゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核細胞内のｍＲＮＡのスプライシングを含みうる。
【００８２】
ポリヌクレオチドに適用される場合の「コードする」という用語は、その天然状態において、または当業者に周知の方法により操作されると、ポリペプチドおよび／またはその断片のｍＲＮＡを産生するように転写および／または翻訳されうる場合に、ポリペプチドを「コードする」と言われるポリヌクレオチドを指す。アンチセンス鎖とは、このような核酸の相補体であり、コード配列は、それから推定することができる。
【００８３】
診断または処置の「被験体」または「患者」とは、細胞または哺乳動物もしくはヒトなどの動物である。診断または処置に供される非ヒト動物とは、感染または動物モデルに供されるもの、例えば、サル、ラット、マウス、チンチラなどのネズミ科動物、イヌなどのイヌ科動物、ウサギなどのウサギ科動物、家畜、競技用動物、および愛玩動物である。
【００８４】
本明細書で使用される場合、本明細書では「処置する」、「処置」などの用語を、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを意味するように使用する。効果は、障害またはその徴候もしくは症状を完全または部分的に防止する点で予防的である場合もあり、かつ／あるいは障害かつ／または障害に起因する有害作用の部分的もしくは完全な治癒の点で治療的である場合もある。
【００８５】
「防止する」とは、障害または影響に対して素因のある系または被験体における、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏの障害または影響を防止することを意図する。このような「〜を防止する」ことの例は、バイオフィルムを産生することが公知の微生物に感染した系内のバイオフィルムの形成を防止することである。
【００８６】
「培養する」という用語は、多様な種類の培地上または培地中、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける、細胞または生物の繁殖を指す。培養物中で成長させた（ｇｒｏｗｎ）細胞の子孫は、親細胞と、完全に（すなわち、形態的に、遺伝子的に、または表現型的に）同一ではない場合もあることが理解される。「拡大増殖させた（ｅｘｐａｎｄｅｄ）」とは、細胞の任意の増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）または分裂を意味する。
【００８７】
「薬学的に許容される担体」とは、本発明の組成物中で使用されうる、任意の希釈剤、賦形剤、または担体を指す。薬学的に許容される担体は、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質、リン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウムなどの緩衝物質、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、プロタミン硫酸塩、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウムなどの塩または電解質、ポリビニルピロリドン、セルロースベースの物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、蝋、ポリエチレン−ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコール、および羊毛脂を含む。適切な医薬担体については、本分野における標準的な参照用教科書である、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙにおいて記載されている。それらは、意図される投与形態、すなわち、経口錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、シロップなどに関して選択され、従来の薬学的実施に沿うことが好ましい。
【００８８】
「生体適合性足場」とは、被験体への投与時に、バイオフィルムの増殖を支援する能力を伴う足場またはマトリックスを指す。他の実施形態では、生体適合性足場とは、宿主における、望ましくない、局所性または全身性の影響の誘発を伴わずに、宿主内の所望の程度の組込みを伴う、その意図される機能を果たす能力を有する植込み型デバイスの前駆体である。生体適合性足場については、米国特許第６，６３８，３６９号および同第８，８１５，２７６号において記載されている。
【００８９】
「投与」は、単回用量で実行することもでき、処置の過程にわたり、連続的に実行することもでき、間欠的に実行することもできる。投与の最も効果的な手段および投与量を決定する方法は、当業者に公知であり、治療のために使用される組成物、治療目的、処置される標的細胞、および処置される被験体と共に変化するであろう。単回または複数回投与を実行することができ、用量レベルおよび投与パターンは、処置する医師により選択される。当技術分野では、適切な剤形および薬剤を投与する方法が公知である。また、投与経路も決定することができ、最も効果的な投与経路を決定する方法は、当業者に公知であり、処置のために使用される組成物、処置目的、処置される被験体および標的細胞または組織の健康状態または疾患の病期と共に変化するであろう。投与経路の非限定的な例は、経口投与、膣への投与、鼻への投与、注射、局所適用、および坐剤による適用を含む。
【００９０】
「有効量」という用語は、有益または所望の結果または効果を達成するのに十分な量を指す。治療的または予防的適用の文脈では、有効量は、問題の状態の種類および重症度、ならびに全般的健康、年齢、性別、体重、および医薬組成物に対する耐性など、個々の被験体の特徴に依存するであろう。治療用組成物の文脈において、一部の実施形態では、有効量は、病原体に対する防御的応答を結果としてもたらすのに十分な量である。他の実施形態では、有効量は、抗原に対する抗体の産生を結果としてもたらすのに十分な量である。一部の実施形態では、有効量は、それを必要とする被験体に対して受動免疫を付与するのに要求される量である。一部の実施形態では、量は、１）病原体を除去すること；２）健康な微生物叢を回復させること；３）免疫系をモジュレートすること；ならびに４）代謝および代謝経路を維持することのうちの１または複数を達成するのに十分である。
【００９１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける適用の場合、一部の実施形態では、有効量は、問題となる適用のサイズおよび性質に依存するであろう。それはまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ標的の性質および感受性、ならびに使用される方法にも依存するであろう。当業者は、これらの検討事項および他の検討事項に基づき、有効量を決定することが可能であろう。有効量は、実施形態に応じて、１回または複数回の組成物の投与を含みうる。
【００９２】
薬剤および組成物は、医薬の製造において使用することができ、医薬組成物中の有効成分など、従来の手順に従う投与により、ヒトおよび他の動物の処置のためにも使用することができる。
【００９３】
本発明の薬剤は、治療のために、任意の適切な投与経路により投与することができる。また、好ましい経路は、レシピエントの状態および年齢、ならびに処置される疾患と共に変化することも認識されるであろう。
【００９４】
壊死性腸炎（「ＮＥＣ」）とは、腸の部分が、壊死（組織の死）を経る、早産児において主に見られる医学的状態である。ＮＥＣは、生後に生じ（すなわち、死産児では見られない）、２番目に多い死亡原因である。全新生児集中治療室入院患者のうちの７％は、ＮＥＣ関連である。死亡率は、１２％である。
【００９５】
本開示を実施するための方式
下痢性疾病は、世界中で、毎年約４０億人の個体において生じ、２００万人を超える死亡を引き起こす。乳児および若齢の小児における下痢性疾病の最も重要な細菌性原因の中には、生着すると、炎症性サイトカインの増大および結腸組織の構造的変化と関連する、下痢性疾患を誘導する、接着／破壊（Ａ／Ｅ）病原体がある。この急性感染症は、胃腸の健康に対して持続的な影響を及ぼすことがあり、Ａ／Ｅ病原体の感染および過剰な炎症応答は、感染後過敏性腸症候群の発症の公知の危険因子である。
【００９６】
プロバイオティクスは、胃腸の微生物叢を保護し、健康な状態へと回復させる天然の方式であり、生着部位の遠位において、健康を促進することが示されている。Ｍａｃｋｏｓら（２０１３年）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、８１巻、９号（３２５３〜３２６２頁）を参照されたい。残念ながら、最適条件下であってもなお、プロバイオティクス細菌は、定着するか、または十分に存続するに至っておらず、それらの健康的な効果の大きさおよび持続性は最小限である。律速段階のうちの１つは、導入された細菌が、持続するバイオフィルムを形成する能力である。細菌が、プランクトン様（遊離生息）形態と対比して、既にバイオフィルム（表面付着型群落）の形態にある場合、細菌は、よりたやすく定着し、存続する。プロバイオティクス細菌の肯定的な効果は、それらをバイオフィルム状態で供給することにより、増強することができ、これは、生体適合性であり、かつ、非毒性であるマイクロスフェアの表面上で細菌を成長させることによりたやすく達成することができる。生体適合性マイクロスフェアは、生体分解性ポリマー、非生体分解性ポリマー、金属、またはこれらの組み合わせでありうる。この表面がマイクロスフェアの形態である場合、プレバイオティクス物質および／またはプレバイオフィルミクス物質を、プロバイオティクス細菌性バイオフィルムの定着および維持を促進するカーゴとして添加することができる。
【００９７】
マイクロスフェアは、病原性細菌の攻撃を制限しながら、プロバイオティクス細菌の定着および生存を促進する一助となりうる、拡散性プレバイオティクス（プロバイオティクス細菌に特異的／排他的な栄養補充物質）カーゴを理想的な形で供給する点において価値を付加している。少なくとも、プロバイオティクス細菌であるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉでは、バイオフィルム状態は、マウスの胃腸内の定着において、プランクトン様形態にある同じ細菌より有利である。
【００９８】
さらに、マウスにバイオフィルムとして導入されるＬ．ｒｅｕｔｅｒｉは、腸管病原性細菌であるＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｒｏｄｅｎｔｉｕｍの病因に対して、そのプランクトン様形態にあるＬ．ｒｅｕｔｅｒｉより、頑健で持続する予防的効果を及ぼす。これらの結果に基づき、腸内菌共生バランス失調に対して、より大きく、持続的な効果をもたらし、患者のコンプライアンスに対する必要を大幅に低減して、胃腸における病因を防止するか、またはさらに処置する、プロバイオティクスの新規の製剤をもたらす３つの高度な統合例が開発された。
【００９９】
バイオフィルム生成性プロバイオティクス細菌は、生体適合性マイクロスフェアの表面に付着し、バイオフィルムを生成させる。生体適合性マイクロスフェアは、中実または中空コアを有する。生体適合性マイクロスフェアが中空コアを有する場合、それは、プレバイオティクス、およびプロバイオティクス細菌のための任意の栄養補充物質を、カーゴとして保有しうる。プレバイオティクスは、中空コア内に封入することができる。マイクロスフェアはまた、病原体の成長または増殖に対して選択性である、薬物または化合物または薬剤も保有しうる。生体適合性マイクロスフェア、バイオフィルム生成性プロバイオティクス、およびプレバイオティクスに加えて、新規のプロバイオティクス製剤はまた、バイオフィルムの形成および耐久性を支援する物質である、プレバイオフィルミクスも含有することが可能であり、具体的に、プレバイオフィルミクスは、ＤＮＡ結合性ポリペプチドもしくはタンパク質、および／またはＤＮＡＢＩＩポリペプチドもしくはタンパク質、これらの各々の断片および／または同等物である。このようなタンパク質の非限定的な例を、添付の配列表に提示する。１または複数の薬物、化合物、または薬剤のほか、１または複数のプレバイオフィルミクスも、単一のマイクロスフェア内に存在しうる。
【０１００】
プレバイオティクスは、バイオフィルム生成性細菌を含む、任意のプロバイオティクス細菌の成長を支援しうる。プレバイオティクスは通例、イヌリン、オリゴフルクトース、フルクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、グルコース、マルトース、マルトデキストリン、ポリデキストロース、スクロース、フルクトース、ラクトース、イソマルツロース、ポリオール、およびグリセロールなど、水溶性の炭水化物のうちの１または複数である。多様なプレバイオティクスの組み合わせを使用して、プロバイオティクスの成長を支援することができる。
【０１０１】
プロバイオティクスは、健康上の利益を有する、任意の種類の微生物である。プロバイオティクスはまた、一般に、ヨーグルト中、ダイズヨーグルト中などに、活性の生培養物を特別に添加した、発酵食品の一部として、または栄養補助食品として摂取される。プロバイオティクスはまた、坐剤としても摂取することができる。プロバイオティクスの一部の限定的な例は、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ、群Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｌ．ｃａｓｅｉ、Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉ、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ、Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ、Ｌ．ｂｕｃｈｎｅｒｉ、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｂ．ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ、Ｂ．ａｎｇｕｌａｔｉｏｎ、Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ、Ｂ．ｂｒｅｖｅ、Ｂ．ｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ、Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｂ．ｌａｃｔｉｓ、Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ、Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ、およびＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓである。
【０１０２】
プロバイオティクスは、病原体の生着を防止し、かつ／または過剰な炎症応答を制限することにより、抗菌免疫を支援する。理論に束縛されることなしに述べると、プロバイオティクスは、サイトカインおよびケモカインの産生を下方調節する。
【０１０３】
生体適合性マイクロスフェアは、生体分解性ポリマー、非生体分解性ポリマー、金属、またはそれらの混合物のうちの１または複数でありうる。生体分解性ポリマーは、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）またはＰＬＧＡ；ポリカプロラクトンまたはＰＬＣ；キトサン；ゼラチン；ＤＮＡ水素；アセタール化デキストラン；ポリ（ラクチド）；ポリ（グリコリド）；ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）；ポリ（乳酸）；ポリ（グリコール酸）；ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）；ポリ（ラクチド）／ポリ（エチレングリコール）コポリマー；ポリ（グリコリド）／ポリ（エチレングリコール）コポリマー；ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）／ポリ（エチレングリコール）コポリマー；ポリ（乳酸）／ポリ（エチレングリコール）コポリマー；ポリ（グリコール酸）／ポリ（エチレングリコール）コポリマー；ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）／ポリ（エチレングリコール）コポリマー；ポリ（カプロラクトン）；ポリ（カプロラクトン）／ポリ（エチレングリコール）コポリマー；ポリ（オルトエステル）；ポリ（ホスファゼン）；ポリ（ヒドロキシブチレート）；ポリ（ヒドロキシブチレート）；ポリ（ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）；ポリカーボネート；ポリエステルアミド；ポリ無水物；ポリ（ジオキサノン）；ポリ（アルキレンアルキレート）；ポリエチレングリコール／ポリオルトエステルコポリマー；ポリウレタン；ポリ（アミノ酸）；ポリエーテルエステル；ポリアセタール；ポリシアノアクリレート；ポリ（オキシエチレン）／ポリ（オキシプロピレン）コポリマー；Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）コポリマー（エピクロロヒドリンと架橋されたデキストランから作製され、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから市販され、ＫｏｏおよびＷａｎｋａｔ（１９８８年）Ｋｏｒｅａｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．、２１巻（１号）において言及されている）、および／またはこれらの組み合わせから選択されうるがこれらに限定されない。非生体分解性ポリマーは、ポリ（エチレン酢酸ビニル）、ポリ（酢酸ビニル）、シリコーンポリマー、ポリウレタン、セルロース性ポリマーおよびセルロース誘導体、アシル置換酢酸セルロースおよびそれらの誘導体などの多糖、ポリ（エチレングリコール）とポリ（ブチレンテレフタレート）とのコポリマー、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニル、ポリ（ビニルイミダゾール）、クロロスルホン化ポリオレフィン、ポリエチレンオキシド、ならびにこれらのコポリマーおよびブレンドから選択されうるがこれらに限定されない。金属は、コバルト、クロム、金、ニッケル、白金、ステンレス鋼、チタン、タンタル、ニッケル−チタン、ならびにこれらの合金および組み合わせから選択されうるがこれらに限定されない。
【０１０４】
プロバイオティクスのバイオフィルムの耐久性および頑健性を促進するように選択されたマイクロスフェアを同定し、特徴付ける。生体分解性（かつＦＤＡ承認済み）表面である、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）上で形成されたプロバイオティクスのバイオフィルムは、上皮バリアを介する病原体のトランスロケーションの防止に優れたバイオフィルムをもたらすことが示されている。また、バイオフィルムを成長させる表面を創出するのに使用しうる、他のＦＤＡ承認済みまたはＧＲＡＳ（Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ  Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  Ａｓ  Ｓａｆｅ）の材料も検討される。動物モデルにおける生物学的有効性および耐久性ならびに保管寿命を基本的な基準として使用して、結果に優先順位をつける。最後に、プロバイオティクスのバイオフィルムの導入および維持の有効性をさらに改善するため、マイクロスフェア内の拡散性カーゴを介して、プレバイオティクス物質を、プロバイオティクスのバイオフィルム表面へと施す。
【０１０５】
組成物
本開示は、生体適合性マイクロスフェア、バイオフィルム生成性プロバイオティクス細菌、およびプレバイオティクスを含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはさらにはこれらからなる組成物であって、プレバイオティクスが、プロバイオティクス細菌の培養および／または成長のための栄養食物供給源または補充物質を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはさらにはこれからなる組成物を提供する。組成物はさらに、プレバイオフィルミクスを含みうる。プレバイオフィルミクスは、バイオフィルムの形成および耐久性を特異的に支援する物質を含み、プレバイオフィルミクスは、ＤＮＡ結合性ポリペプチドもしくはタンパク質、および／またはＤＮＡＢＩＩポリペプチドもしくはタンパク質でありうる。一態様では、組成物を凍結させる、例えば、瞬時凍結させる。別の態様では、組成物を、粉末形態で凍結乾燥または乾燥させる。さらなる態様では、組成物を、坐剤としての投与または摂取可能形態（例えば、錠剤）での投与のために製剤化する。組成物はさらに、上記で言及されたマイクロスフェアの混合物、例えば、２つもしくはこれを超えるプロバイオティクス細菌、ならびに／または２つもしくはこれを超えるプレバイオフィルミクス、ならびに／またはプロバイオティクス細菌の培養および／もしくは成長を支援する、２つもしくはこれを超える栄養物質および／もしくは補充物質を含有する混合物を含みうる。
【０１０６】
一部の実施形態では、プレバイオティクスは、イヌリン、オリゴフルクトース、フルクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、グルコース、マルトース、マルトデキストリン、ポリデキストロース、スクロース、フルクトース、ラクトース、イソマルツロース、ポリオール、グリセロール、およびこれらの組み合わせのうちの１または複数から選択されるがこれらに限定されない水溶性の炭水化物を含む。一態様では、組成物は、薬学的に許容される担体などの固体または液体担体をさらに含む。
【０１０７】
当業者に明らかな通り、プレバイオティクスおよびプレバイオフィルミクスは、各組成物中で、プロバイオティクス細菌の成長を特異的に支援するように選択する。例だけを目的として述べると、プロバイオティクス細菌が、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉを含む場合、組成物は、被験体または患者に投与されると、プロバイオティクスの成長および維持を支援するのに有効な量の、スクロースと、グリセロールと、任意選択で、ＨＵポリペプチドまたはタンパク質とを含む。プレバイオフィルミクス組成物の非限定的な例は、限定されないが、配列番号１〜２４に提示されるポリペプチド、それらのＣ末端断片、もしくはそれらのＮ末端断片、または表４に提示されるポリペプチドの全長もしくはＣ末端断片もしくはＮ末端断片など、さらなる株ならびにポリペプチドおよびそれらの断片、ならびにこれらの各々の同等物のうちの１または複数を含む。他のプロバイオティクス細菌を支援するためのさらなる栄養補充物質は、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、９版、Ｈｏｌｔら編、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｗｉｌｋｉｎｓ（１９９４年）において開示されている。
【０１０８】
組成物中の使用のためのプロバイオティクス細菌の非限定的な例は、限定されないが、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ、群Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｌ．ｃａｓｅｉ、Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉ、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ、Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ、Ｌ．ｂｕｃｈｎｅｒｉ、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｂ．ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ、Ｂ．ａｎｇｕｌａｔｉｏｎ、Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ、Ｂ．ｂｒｅｖｅ、Ｂ．ｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ、Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｂ．ｌａｃｔｉｓ、Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ、Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、またはこれらの組み合わせのうちの１または複数を含む。当業者に明らかな通り、１または複数の細菌は、単一の組成物中に組み合わせることができる。一部の実施形態では、プロバイオティクス細菌は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉである。細菌は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）など、市販品供給元から入手可能である。一態様では、組成物中の１または複数のプロバイオティクス細菌は、抗菌免疫を支援する。他の態様では、組成物中の１または複数のプロバイオティクス細菌は、サイトカインおよびケモカインの産生を下方調節することにより、病原体の生着を防止し、かつ／または過剰な炎症応答を制限する。一部の実施形態では、組成物は、薬剤をさらに含み、薬剤は、競合的病原体などの病原体に対して選択性である。
【０１０９】
生体適合性マイクロスフェアは、生体分解性ポリマー、非生体分解性ポリマー、金属、またはこれらの組み合わせのうちの１または複数を含む。一部の実施形態では、マイクロスフェアは、中実コアを含む。一部の実施形態では、マイクロスフェアは、中空コアを含む。一部の実施形態では、プレバイオティクスは、マイクロスフェアの中空コア内に封入されている。
【０１１０】
一態様では、本開示は、ＰＬＧＡ生体適合性マイクロスフェアと、１または複数のバイオフィルム生成性プロバイオティクス細菌と、プロバイオティクス細菌の成長を支援する量の、スクロースまたはグリセロールのうちの１または複数を含む栄養補充物質とを含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはさらにはこれらからなる組成物を提供する。バイオフィルム生成性プロバイオティクス細菌は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ（「Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ」）を含みうる。組成物は、有効量のＨＵポリペプチドまたはタンパク質をさらに含みうるか、または代替的にこれらから本質的になりうるか、またはさらにはこれらからなりうる。組成物はさらに、薬学的に許容される担体または生体適合性足場を含むことが可能であり、任意選択で、坐剤として製剤化される。
【０１１１】
マイクロスフェアのサイズは、約０．５ミクロン〜約１００ミクロンの範囲でありうる。ある特定の実施形態では、マイクロスフェアは、約１００ミクロン未満の直径である。他の実施形態では、マイクロスフェアは、約５０ミクロン未満、または約４０ミクロン未満、または約３０ミクロン未満、約２０ミクロン未満、約１０ミクロン未満、または約５ミクロン未満、または３ミクロン未満〜０．５ミクロンの直径である。さらなる実施形態では、マイクロスフェアは、約０．５ミクロン〜約９０ミクロン、または約０．５ミクロン〜約８０ミクロン、または約０．５ミクロン〜約７０ミクロン、または約０．５ミクロン〜約６０ミクロン、または約０．５ミクロン〜約５０ミクロン、または約０．５ミクロン〜約４０ミクロン、または約０．５ミクロン〜約３０ミクロン、または約０．５ミクロン〜約２０ミクロン、または約０．５ミクロン〜約１０ミクロン、または約０．５ミクロン〜約５ミクロン、または約０．５ミクロン〜約３ミクロン、または約０．５ミクロン〜約２ミクロン、または約０．５ミクロン〜約１ミクロンの直径である。代替的に、直径は、約１〜約１００、または代替的に約１〜約７５、または代替的に約１〜約５０、または代替的に約１〜約２５、または代替的に約１〜約１５、または代替的に約１〜約１０ミクロンの直径である。
【０１１２】
一部の実施形態では、マイクロスフェアは、生体分解性ポリマーであり、このような生体分解性ポリマーの非限定的な例は、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（「ＰＬＧＡ」）；ポリカプロラクトン（「ＰＬＣ」）；キトサン；ゼラチン；ＤＮＡ水素；アセタール化デキストラン；ポリ（ラクチド）；ポリ（グリコリド）；ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）；ポリ（乳酸）；ポリ（グリコール酸）；ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）；ポリ（ラクチド）／ポリ（エチレングリコール）コポリマー；ポリ（グリコリド）／ポリ（エチレングリコール）コポリマー；ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）／ポリ（エチレングリコール）コポリマー；ポリ（乳酸）／ポリ（エチレングリコール）コポリマー；ポリ（グリコール酸）／ポリ（エチレングリコール）コポリマー；ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）／ポリ（エチレングリコール）コポリマー；ポリ（カプロラクトン）；ポリ（カプロラクトン）／ポリ（エチレングリコール）コポリマー；ポリ（オルトエステル）；ポリ（ホスファゼン）；ポリ（ヒドロキシブチレート）；ポリ（ヒドロキシブチレート）；ポリ（ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）；ポリカーボネート；ポリエステルアミド；ポリ無水物；ポリ（ジオキサノン）；ポリ（アルキレンアルキレート）；ポリエチレングリコール／ポリオルトエステルコポリマー；ポリウレタン；ポリ（アミノ酸）；ポリエーテルエステル；ポリアセタール；ポリシアノアクリレート；ポリ（オキシエチレン）／ポリ（オキシプロピレン）コポリマー；およびこれらの組み合わせを含む。一部の実施形態では、生体分解性ポリマーは、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）またはＰＬＧＡである。
【０１１３】
一部の実施形態では、マイクロスフェアは、非生体分解性ポリマーを含む。非生体分解性ポリマーの非限定的な例は、限定されないが、ポリ（エチレン酢酸ビニル）、ポリ（酢酸ビニル）、シリコーンポリマー、ポリウレタン、セルロース性ポリマーおよびセルロース誘導体、アシル置換酢酸セルロースおよびそれらの誘導体などの多糖、ポリ（エチレングリコール）とポリ（ブチレンテレフタレート）とのコポリマー、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニル、ポリ（ビニルイミダゾール）、クロロスルホン化ポリオレフィン、ポリエチレンオキシド、ならびにこれらのコポリマーおよびブレンドのうちの１または複数を含む。
【０１１４】
一部の実施形態では、マイクロスフェアは、金属を含む。金属は、コバルト、クロム、金、ニッケル、白金、ステンレス鋼、チタン、タンタル、ニッケル−チタン、ならびにこれらの合金および組み合わせのうちの１または複数から選択されうるがこれらに限定されない。
【０１１５】
医薬組成物
組成物は、凍結組成物、例えば、保管および／または輸送のために、瞬時凍結させるか、乾燥させるか、または凍結乾燥させた組成物として製剤化することができる。加えて、組成物は、単独で投与することもでき、薬学的に許容される担体または生体適合性足場などの担体と組み合わせて投与することもできる。本発明の組成物は、従来の通り、坐剤として直腸内投与することもでき、注射による非経口投与、例えば、静脈内投与、皮下投与、または筋内投与することもできる。他の投与方式に適するさらなる製剤は、経口製剤を含む。経口製剤は、例えば、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなど、通常利用される賦形剤を含む。これらの組成物は、溶液剤、坐剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、持続放出製剤、または散剤の形態をとり、約１０％〜約９５％、好ましくは約２５％〜約７０％の有効成分を含有する。
【０１１６】
組成物は、剤形に適合する方式で、かつ、処置される疾患または状態のために、治療的に有効な量で投与することが典型的である。投与される量は、処置される被験体に依存する。投与される組成物の正確な量は、医療従事者の判断に依存する。また、初回投与および追加投与（ｂｏｏｓｔｅｒ）に適するレジメンも、可変的であるが、初回投与に続いて、後続の投与を施すことにより典型となる。
【０１１７】
多くの場合、約、最大で約、または少なくとも約３、４、５、６、７、８、９、１０日間またはこれを超えて、複数回にわたり組成物を投与することが望ましいであろう。投与は通常、２日間〜１２週間間隔、より通例では、１〜２週間間隔の範囲であろう。免疫系の状態を維持するには、０．５〜５年間、通例、２年間の間隔での定期的な追加投与が望ましいことがある。
【０１１８】
一部の実施形態では、さらなる医薬組成物を被験体に投与して、本明細書で記載される組成物を支援または増強する。本発明の異なる態様は、有効量の組成物を被験体に投与することを伴う。加えて、このような組成物は、免疫系の修飾因子と組み合わせて投与することができる。このような組成物は一般に、薬学的に許容される担体または水性媒体中に溶解させるかまたは分散させる。
【０１１９】
「薬学的に許容される」または「薬理学的に許容される」という語句は、動物またはヒトに投与したときに、有害反応、アレルギー反応、または他の望ましくない反応をもたらさない、分子的実体および組成物を指す。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。当技術分野では、医薬活性物質のための、このような媒体および薬剤の使用が周知である。任意の従来の媒体または薬剤が、有効成分と不適合性である場合を除き、免疫原性組成物および治療用組成物中のその使用が想定される。
【０１２０】
担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリ（エチレングリコール）など）、それらの適切な混合物、および植物油を含有する溶媒または分散媒でありうる。適正な流動性は、例えば、レシチンなど、コーティングの使用により、分散液の場合は、要求される粒子サイズの維持により、かつ、界面活性剤の使用により維持することができる。望ましくない微生物の作用の防止は、多様な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによりもたらすことができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。注射用組成物の遅延吸収は、組成物中の、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によりもたらすことができる。
【０１２１】
治療用組成物の有効量は、意図される目標に基づき決定する。「単位用量」または「投与量」という用語は、被験体における使用に適する、物理的に個別の単位を指し、各単位は、その投与、すなわち、適切な経路およびレジメンと関連して、上記で論じられた所望の応答をもたらすように計算された、所定量の組成物を含有する。処置回数および単位用量の両方に従い投与される量は、所望の結果および／または保護に依存する。組成物の正確な量はまた、医療従事者の判断にも依存し、各個体に特有である。用量に影響を及ぼす因子は、被験体の身体的状態および臨床状態、投与経路、意図される処置目標（症状の緩和  対  治癒）、ならびに効力、安定性、および特定の組成物の毒性を含む。製剤化されると、溶液は、剤形に適合する方式で、治療的または予防的に有効な量で投与されるであろう。製剤は、上記で記載した注射用溶液の種類など、様々な剤形で容易に投与される。
【０１２２】
組成物を調製するためのプロセス
本開示はまた、本明細書で記載される組成物を調製するための方法であって、生体適合性マイクロスフェアを、バイオフィルム生成性プロバイオティクス細菌およびプレバイオティクスと混合、接触または培養するステップを含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはさらにはこれらからなる方法も提供する。一態様では、方法は、細菌によるバイオフィルムの形成および成長を支援するプレバイオフィルミクスを添加または混合するステップをさらに含む。このようなプレバイオフィルミクスの非限定的な例は、ＤＮＡ結合性ポリペプチドもしくはタンパク質、および／またはＤＮＡＢＩＩポリペプチドもしくはタンパク質のうちの１または複数を含む。方法において活用されるプレバイオティクスは、イヌリン、オリゴフルクトース、フルクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、グルコース、マルトース、マルトデキストリン、ポリデキストロース、スクロース、フルクトース、ラクトース、イソマルツロース、ポリオール、グリセロール、およびこれらの組み合わせのうちの１または複数から選択されうるがこれらに限定されない、水溶性の炭水化物を含む。
【０１２３】
治療方法
一部の実施形態では、被験体における疾患を処置または防止するための方法であって、上記で記載した有効量の組成物を、このような処置を必要とする被験体に投与するステップを含む方法が提供される。本明細書で使用される場合、「被験体」とは、動物（例えば、ネズミ科動物、ウシ科動物、イヌ科動物、ネコ科動物、ウマ科動物、サル科動物）またはヒトを意図する。処置される非限定的疾患は、うつ病または不安などの心理学的障害、腸管感染性疾患、感染誘導性大腸炎、旅行者下痢、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、大腸炎、下痢性疾病、膣症（ｖａｇｉｎｏｓｉｓ）、創傷、火傷、乾癬、皮膚炎、歯齲蝕、歯周炎、副鼻腔炎、または健常な細菌（ｈｅａｌｔｈｙ  ｂａｃｔｅｒｉａ）にとって代わる病原性細菌により引き起こされる慢性および／もしくは再発性疾患のうちのいずれか、または壊死性腸炎（ＮＥＣ）を含むがこれらに限定されない。加えて、組成物は、抗菌免疫を支援するか、消化管バリアを増強もしくは支援するか、または疾患に関連する細菌感染に拮抗するためにも投与することができる。一部の実施形態では、疾患は、膣症である。一部の実施形態では、疾患は、大腸炎または旅行者下痢である。当業者に明らかな通り、組成物は、処置される疾患のために、特異的に選択される。一部の実施形態では、組成物は、プレバイオフィルミクスをさらに含む。一部の実施形態では、プレバイオフィルミクスは、ＤＮＡ結合性ポリペプチドもしくはタンパク質、および／またはＤＮＡＢＩＩポリペプチドもしくはタンパク質、例えば、ＨＵ、その断片、および／またはそれら各々の同等物を含む。一部の実施形態では、組成物を、坐剤として投与する。
【０１２４】
一部の実施形態では、方法の組成物を、約１×１０７〜約１×１０９ＣＦＵ／ｍｌのバイオフィルム生成性プロバイオティクス細菌を提供するように投与する。一部の実施形態では、組成物を、約６、１２、１８、２４、３６、４８、および７２時間で投与する。一部の実施形態では、組成物を、単回用量で投与する。
【０１２５】
一部の実施形態では、プロバイオティクスを投与する方法であって、生体適合性マイクロスフェア、バイオフィルム生成性プロバイオティクス細菌、プレバイオティクス、およびプレバイオフィルミクスを含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、なおまたはこれらからなる、ある用量の上記の組成物を、このような処置を必要とする被験体に投与するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、方法の組成物を、約１×１０７〜約１×１０９ＣＦＵ／ｍｌのバイオフィルム生成性プロバイオティクス細菌を提供するように投与する。一部の実施形態では、組成物を、約６、１２、１８、２４、３６、４８、および７２時間で投与する。一部の実施形態では、組成物を、単回用量で投与する。
【０１２６】
キット
一部の実施形態では、本明細書で記載される、１または複数の組成物を含有するキットが提供される。キットは、上記の組成物と、使用のための指示書とを含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはさらにはこれらからなる。代替的に、キットは、マイクロスフェアと、上記の組成物を作製するための指示書とを含む。一態様ではまた、細菌およびプレバイオティクスも、キットにおいて提供される。
【実施例】
【０１２７】
（実施例１）
バイオフィルム状態のＬ．ｒｅｕｔｅｒｉが、マウスの胃腸内の定着のために、プランクトン様細菌より優れているかどうかを決定するために、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉを、経口胃管栄養法を介して導入したが、プランクトン様細菌の保持および有益な効果のために典型的に必要とされる（１５、４１）、毎日の経口胃管栄養法を繰り返す代わりに、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉの単回投与を提供した。Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉは、バイオフィルム培養物中、またはポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）マイクロスフェア、もしくはＦＤＡで承認済みであり、生体分解性で（乳酸およびグリコール酸へと加水分解され）、直径を２０〜３００μｍの範囲とする、他のマイクロスフェア（Ｂｅｅｒら、（１９９８年）Ｐｏｌｙ  （Ｌａｃｔｉｃ−Ｇｌｙｃｏｌｉｃ）  Ａｃｉｄ  Ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ  Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｒｅｄｕｃｅｓ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｉｎ  Ｖｉｖｏ、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ、５巻、７４０〜６頁；Ｋｕｍａｒｉら、（２０１０年）Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  Ｂａｓｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  Ｓｕｒｆ  Ｂ  Ｂｉｏｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ、７５巻、１〜１８頁）上で成長するバイオフィルム内で成長させた。
【０１２８】
プランクトン様細菌の同様の調製物を調製したが、ＰＬＧＡマイクロスフェアおよびプレバイオフィルミクスを、胃管栄養法の直前に添加した。図３において示される通り、７日後にＬ．ｒｅｕｔｅｒｉがマウス結腸内で検出されたマウスの数は、プランクトン様で成長させた細胞と比べて、バイオフィルムとして導入された場合に増大した。また、ＰＬＧＡの存在も、細菌がプランクトン様状態であるか、バイオフィルム状態であるかに関わらず、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉについて陽性であるマウスの数を、ＰＬＧＡが存在しない条件と比較して増大させたが、これは、この短い相互作用（３０分間未満）の間であってもなお、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉが、バイオフィルム形成の前段階である、ＰＬＧＡへの付着を開始しうることを示しうる。胃では、全てのマウスがＬ．ｒｅｕｔｅｒｉを保持する唯一の条件は、ＰＬＧＡを添加したバイオフィルムで成長させた細胞であった。したがって、ＰＬＧＡの存在下にあるバイオフィルム内でＬ．ｒｅｕｔｅｒｉを成長させることにより、胃内および結腸内の生着および存続が、プランクトン様で成長させた細胞の場合と比較して増強されることが明らかである。
【０１２９】
（実施例２）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ  対  Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ  Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるバイオフィルムとして、またはプランクトン様状態において、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍと良好に競合する能力を有するかどうかを決定するため、競合アッセイを開発した。本実施例では、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍバイオフィルムを、ガラス製スライドチャンバー（ＬＢ培地、２４時間、３７℃、５％のＣＯ２）内であらかじめ形成した。次いで、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ（１０８コロニー形成単位（ＣＦＵ））を、両方の生物に適合する培地中のプランクトン様形態として、または３つのバイオフィルム形態のうちの１つ（バイオフィルム、ＰＬＧＡバイオフィルム、ＰＬＧＡ＋ＨＵバイオフィルム；図３における通りの調製）による処理として添加した。１６時間後、スライドチャンバーのバイオフィルム内容物を取り出し、アリコートを、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ（ＭＲＳ）およびＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ（ＬＢ）に選択的な培地上で平板培養した。Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉバイオフィルムで処理されたＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍは、導入されたＬ．ｒｅｕｔｅｒｉの状態に関わらず、非処理の場合と比較して、１ｍｌ当たりのＣＦＵに２分の１未満の減少を示した（表１）。より興味深いことは、１６時間の攻撃の間、全てのＬ．ｒｅｕｔｅｒｉが増殖したが、バイオフィルムの形態で導入されたＬ．ｒｅｕｔｅｒｉは、プランクトン様形態で添加される場合の１０倍を超えるＣＦＵをもたらしたことである。
【表１】
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【０１３０】
逆の実験では、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉバイオフィルムをまず導入し、次いで、プランクトン様形態およびバイオフィルム形態のＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ（１０８ＣＦＵ）で処理した。前の実験とは対照的に、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉは、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍの存在に関わらず、１０倍を超えてＣＦＵが増大する増殖がなおも可能（条件間の差異は２倍未満）であったが、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍは、１６時間の攻撃の間に増殖せず、プランクトン様で導入した場合は、実際にはＣＦＵが低減された。これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏ結果は、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍバイオフィルムを、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉにより、効果的に攻撃することが可能であり、バイオフィルム状態で導入された場合、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉは、プランクトン様細胞より良好に存続することを示す。さらに、あらかじめ形成されたＬ．ｒｅｕｔｅｒｉバイオフィルムは、プランクトン様Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍによる攻撃が確立されるのには適さない環境を創出する。
【０１３１】
（実施例３）
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ  対  Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ
Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉが、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるバイオフィルムとして、またはプランクトン様状態において、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍとより良好に競合する能力を有するかどうかを決定するため、公表されている競合アッセイのあるバージョンを活用した（Ｍａｃｋｏｓら、（２０１３年）Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ  Ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ  ｔｈｅ  Ｓｔｒｅｓｓｏｒ−Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｓｅｖｅｒｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  Ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ、８１巻、３２５３〜６３頁）。略述すると、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉを、上記で記載した通りに、経口胃管栄養法により、マウスに導入した（ｉｎ  ｖｉｖｏにおける、プランクトン様Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ対Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉバイオフィルム）。１２時間後、同等数のプランクトン様Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍもまた、胃管栄養法により添加した。１２日後、全てのマウスを剖検のために屠殺した。プランクトン様Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉの毎日の用量により、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍによる刷子縁上皮の透過および脾臓への伝播を阻止することが可能であることを示す、公表されている研究（Ｍａｃｋｏｓら、（２０１３年）Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ  Ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ  ｔｈｅ  Ｓｔｒｅｓｓｏｒ−Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｓｅｖｅｒｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ、８１巻、３２５３〜６３頁）と異なり、単回用量による、プレバイオフィルミクスで処理されたＬ．ｒｅｕｔｅｒｉバイオフィルム内では、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍによる脾臓への透過において、統計学的に有意な１０分の１の低下が見られた（図４）。この結果は、プレバイオフィルミクスで処理されたプロバイオティクスバイオフィルムが、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、より耐久性の高い表現型を示す程度および頑健性と符合する。
【０１３２】
（実施例４）
プロバイオティクス治療用バイオフィルムの、耐久性および頑健性についての特徴付け
本実施例は、バイオフィルム状態のプロバイオティクスが、プランクトン様で成長させた細菌より優れた製剤をもたらすという強力な証拠を提示している。本実施例はまた、これらのバイオフィルムをどのようにして調製するのかについての１つの例であって、投与頻度を含む例も提示する。加えて、本実施例では、バイオフィルム状態がプランクトン様細菌よりも優れている理由を決定する端緒となるように、バイオフィルム自体の性質を検討する。最後に、本実施例では、ヒト宿主内で実施する低減の前段階として、調製物の保管寿命を検討する。まとめると、本実施例では、プロバイオティクスのバイオフィルム調製物のための条件および構成要素を同定し、特徴付ける。
【０１３３】
（実施例４．１）
成長相の効果
Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、頑健なバイオフィルムを形成し、２４時齢バイオフィルム内のＬ．ｒｅｕｔｅｒｉが、マウスの胃腸内に良好に定着することが示された。本実施例では、バイオフィルムの時齢（ａｇｅ）を変化させて、バイオフィルムの定着に最適な時齢を決定する。
【０１３４】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＬ．ｒｅｕｔｅｒｉバイオフィルム。Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉは、表面へと曝露されると、ほぼ即時的に付着し始める。６時間後、目視可能であり、かつ、古典的なバイオフィルム構造（例えば、キノコ、ＡｂｅｅおよびＫｕｉｐｅｒｓ（２０１１年）Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｂｅｈａｖｉｏｒ  ｗｉｔｈｉｎ  ａｎｄ  Ｏｕｔｓｉｄｅ  ｔｈｅ  Ｈｏｓｔ  ｔｏ  Ｉｍｐｒｏｖｅ  Ｆｏｏｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓａｆｅｔｙ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２２巻、１３３〜５頁）の形成を始めるのに十分なバイオマスがもたらされた。ＣＦＵ（１０８）に対して正規化し、胃管栄養法により、それらをマウス（三連の実験に由来する、時点１つ当たり９例ずつ）に導入して、ＨＵおよび仔ウシ胸腺ＤＮＡを伴うＰＧＬＡマイクロスフェア上で成長させた（上記で記載した通りに）、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉバイオフィルムを、約６、１２、１８、２４、３６、４８、および７２時間で単離する。各マウスは、糞便試料（ＭＲＳ寒天上で培養される）中の総乳酸菌レベルを１２日間にわたり毎日カウントすることにより評価する。
【０１３５】
加えて、本実施例では、リアルタイムＰＣＲ法を使用して、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属（プライマー特異性に関する困難のために、Ｗｅｉｓｅｌｌａ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ、およびＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃの一部の種を含む）、および、具体的には、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉについて、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列コピー数を評価する。１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子コピー数は、糞便中で１２日間にわたり毎日決定するほか、結腸内、盲腸内、小腸内（回腸内、空腸内、および十二指腸内を含む）、および胃内（噴門洞内を含む）でも、リアルタイムＰＣＲを使用して、経口接種後１、３、６、および１２日目において決定する。プランクトン様細胞を伴う偽処置（ｓｈａｍ）マウスおよびプランクトン様細胞を伴わない偽処置マウスを対照として用いる。バイオフィルムで成長させたＬ．ｒｅｕｔｅｒｉで処置されたマウスにおけるＬ．ｒｅｕｔｅｒｉレベルの、偽処置マウスまたはプランクトン様処置マウスと比較した顕著な上昇は、耐久性および頑健性の指標である。
【０１３６】
（実施例４．２）
成長条件の効果
現在までのところ、成長条件の１つのセットである、ＭＲＳ培地中、３７℃の静置培養（ＪｏｎｅｓおよびＶｅｒｓａｌｏｖｉｃ、（２００９年）Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ  Ｂｉｏｆｉｌｍｓ  Ｐｒｏｄｕｃｅ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｎｄ  Ａｎｔｉ−Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｆａｃｔｏｒｓ、ＢＭＣ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、９巻：３５頁）が使用されている。網羅的なリストではないが、本明細書の本実施例では、培地、プレバイオフィルミクスのほか、ｐＨおよび好気性（ａｅｒｏｂｉｃｉｔｙ）も変化させる。
【０１３７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける種々の成長条件。Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉは、各培地中、多様な程度で成長するので、本実施例では、ＬＢ、ＴＨＹＥ（酵母抽出物を伴うＴＨＢ）、ｍＴＳＢ（修飾トリプシンダイズ培養液）を含むＭＲＳの代わりに、バイオフィルムを成長させる他の培地を使用する。加えて、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉの成長は、より酸性の条件下が好適であるので、本実施例ではまた、出発ｐＨも、約５．５、６、６．５、または７に変化させる。Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉは、５％のＣＯ２下で微好気的に成長しうるが、ストレス性条件がバイオフィルムの成長に好適な場合もあり（ＦｌｅｍｍｉｎｇおよびＷｉｎｇｅｎｄｅｒ、（２０１０年）Ｔｈｅ  Ｂｉｏｆｉｌｍ  Ｍａｔｒｉｘ、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、８巻、６２３〜３３頁）、本明細書ではまた、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉバイオフィルムを、空気中または酸素の非存在下でも成長させる（嫌気性チャンバー）。最後に、本実施例では、ＨＵ（約０．１、１、１０、１００μｇ／ｍｌ）および仔ウシ胸腺ＤＮＡ（約０．１、１、１０、１００μｇ／ｍｌ）のプレバイオフィルミクスを変化させる。前述のバイオフィルムは全て、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）染色によるＣＳＬＭにより、頑健な成長の指標としての、高さ、平均厚さ、およびバイオマスについて、三連で評価する。
【０１３８】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける種々の成長条件。バイオフィルムの成長に最適な条件を、初期標準条件ならびにバイオフィルムの創出が最も不良な条件（対照）の両方に対して比較する。バイオフィルムを、実施例４．１で最適化された条件下で、経口胃管栄養法により、各試験について、９匹のマウス（三連の実験に由来する）に導入する。プランクトン様細胞を伴う偽処置マウスおよびプランクトン様細胞を伴わない偽処置マウスを対照として用いる。Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉレベルは、実施例４．１における通りに、攻撃後の１、３、６、および１２日目において、評価する。
【０１３９】
（実施例４．３）
細菌投与の効果
Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉの投与；頻度およびサイズ。投与の頻度および／またはサイズにより、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉの導入の耐久性および頑健性が改善されるかどうかを決定する。Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉバイオフィルムを、ＨＵおよび仔ウシ胸腺ＤＮＡを添加したＰＬＧＡマイクロスフェア上で、２４時間（または実施例４．１および４．２で決定された時齢条件）にわたり成長させる。Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉバイオフィルムを、経口胃管栄養法により、マウスに導入し、用量（１０７、１０８、および１０９ＣＦＵ）ならびに頻度（単回用量、または毎日用量で最長３日にわたる）を変化させる行列を創出し、９つの異なる条件をもたらす。Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉレベルは、実施例４．１で概括した通り、ｉｎ  ｖｉｖｏで、胃管栄養法後１、３、６、および１２日目において評価する。各時点における各条件について、９匹のマウス（三連の実験に由来する）を使用する。プランクトン様細胞を伴う偽処置マウスおよびプランクトン様細胞を伴わない偽処置マウスを対照として用いる。
【０１４０】
（実施例４．４）
分散したバイオフィルム細菌の試験
分散したバイオフィルム由来Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉの試験。分散した細菌を、マウスの胃腸内のそれらの耐久性および頑健性について検討する。Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉバイオフィルムは、ＤＮＡＢＩＩファミリーメンバー（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＩＨＦ）に対する抗血清により分散させることができる。本明細書の本実施例では、抗ＩＨＦ処理に起因して放出（分散）された細菌について調べる。スライドチャンバー内で成長させた、２４時齢Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉバイオフィルム（分散を促進するように、ＰＬＧＡ、ＨＵ、またはＤＮＡを添加しない）を、抗ＩＨＦで処理する（２０）。分散のピークは、処理の約８〜１２時間後である（Ｇｏｏｄｍａｎら（２０１１年）Ｂｉｏｆｉｌｍｓ  Ｃａｎ  Ｂｅ  Ｄｉｓｐｅｒｓｅｄ  ｂｙ  Ｆｏｃｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｏｎ  ａ  Ｃｏｍｍｏｎ  Ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｎｕｃｌｅｏｉｄ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｍｕｃｏｓａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、４巻、６２５〜３７頁）ので、抗体処理の１２時間後に分散したＬ．ｒｅｕｔｅｒｉを含有する馴化培地を、経口胃管栄養法によるマウスへの導入のために使用する。Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉレベルは、実施例４．１で概括した通り、ｉｎ  ｖｉｖｏで、攻撃後１、３、６、および１２日目において評価する。プランクトン様細菌を使用する対照と、最適化されたバイオフィルム細菌とを同様数とする（実施例４．１〜４．３）、各時点について、９匹のマウス（三連の実験に由来する）を使用する。
【０１４１】
バイオフィルムは、胃腸内のプロバイオティクス細菌の定着、存続、および持続性に優れていることが見出される。プランクトン様細菌より優れた特徴を保有するのは、バイオフィルム自体ではなく、バイオフィルムから分散した細菌である。事実上、バイオフィルムは、分散された細菌の生成器として作用するであろう。実際、分散した細菌の、実験室で成長させたプランクトン様細菌と比較した生理学的差異（例えば、抗生物質感受性の差異）が観察されている。
【０１４２】
（実施例４．５）
保管寿命
実施の低減および使用の容易さのために、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ調製物は、十分に安定的な形態であることが必要である。
【０１４３】
凍結。Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉバイオフィルムを瞬時凍結させ、ＣＦＵおよび最小阻害濃度またはＭＩＣ（２ｍｇ／ｍｌを超えるアンピシリン；プランクトン様Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉのＭＩＣは、４μｇ／ｍｌ未満である）の減少は見出されなかったことから、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉは、そのバイオフィルム状態の少なくとも１つの特性であり、ＭＩＣの増強を保持することが示唆される。グリセロール（凍結保護剤（ｃｒｙｏ−ｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）；実施例２もまた参照されたい）を含むおよび含まない−２０℃および−８０℃への周囲空気中での凍結のために、ならびに−８０℃への瞬時凍結（新鮮に調製した細菌懸濁物を含む保存用チューブを、ドライアイス−エタノール中に入れる）のために最適化されたＬ．ｒｅｕｔｅｒｉバイオフィルム（実施例４．１〜４．３）を検討する。
【０１４４】
培地をまず除去し、結果として得られるバイオフィルムをこすり取り、凍結するように処理する。細菌を、これらの温度で、１日間、１週間、または１カ月間にわたり保存し、次いで、経口胃管栄養法によるマウスへの導入に使用するように、周囲室温で解凍する。プランクトン様細菌を使用する対照と、最適化されたバイオフィルム細菌とを同様数とする（実施例４．１〜４．３）、三連の実験に由来する９匹のマウスを使用する。各マウスは、実施例４．１における通りに評価する。
【０１４５】
乾燥。実施例４．５における、最適化された技法を使用する凍結の後の凍結乾燥により最適化されたＬ．ｒｅｕｔｅｒｉバイオフィルム（実施例４．１〜４．３）を検討する。乾燥細菌は、室温で、約１日間、１週間、または１カ月間にわたり保存し、次いで、胃管栄養法によるマウスへの導入に使用するように、周囲室温で、元のバイオフィルム容量の滅菌蒸留水により再び湿潤化する（ｒｅｈｙｄｒａｔｅ）。プランクトン様細菌を使用する対照と、最適化されたバイオフィルム細菌とを同様数とする（実施例４．１〜４．３）、三連の実験に由来する９匹のマウスを使用する。各マウスは、実施例４．１における通りに評価する。
【０１４６】
最後に、１つのＬ．ｒｅｕｔｅｒｉ（ＡＴＣＣ２３２７２）株を活用する。また、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉのさらなる株（例えば、１００−２３株、ＡＴＣＣＰＴＡ６４７５、ＡＴＣＣ５５７３０）も、株の差異を評価するのに検討する。さらなる対照として、市販のＬ．ｒｅｕｔｅｒｉ株（１錠当たり約１億ＣＦＵの、Ｆｌｅｅｔ（登録商標）Ｐｅｄｉａ−Ｌａｘ（商標）Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ  Ｙｕｍｓ（商標）、１分量（ｓｅｒｖｉｎｇ）（５滴、約２００ｕｌ）当たり約１億ＣＦＵの、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｓ（登録商標）ＤＳＭ  １７９３８およびＧｅｒｂｅｒ（登録商標）Ｓｏｏｔｈｅ  Ｃｏｌｉｃ  Ｄｒｏｐｓ、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｓ（登録商標）ＤＳＭ  １７９３８）を検討する。本実施例は、各製品を水中で溶解させ、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍとのｉｎ  ｖｉｔｒｏ競合実験において、それらを直接使用することにより、各製品が、プランクトン様形態のＬ．ｒｅｕｔｅｒｉ株と同等程度であることが示されることを見出す。
【０１４７】
（実施例５）
プロバイオティクスバイオフィルムの耐久性および頑健性を促進する、生体分解性表面およびプレバイオティクス物質の同定および特徴付け
他の種類のマイクロスフェア、ならびにプロバイオティクスの成長を促進し得るか病原体を阻害し得る固有のカーゴも、探索される。
【０１４８】
（実施例５．１）
空のマイクロスフェアの試験
本実施例では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける空のマイクロスフェアである、ＤＮＡ、ゼラチン、ポリ乳酸、ポリ−α−カプロラクトン、キトサン、およびアセタール化デキストランについて検討する。
【０１４９】
ＰＬＧＡマイクロスフェアを、バイオフィルムを成長させる表面として活用するが、目標に有利であると証明され得る他のＦＤＡ承認済みまたはＧＲＡＳの生体分解性マイクロスフェアが存在する。表２において示される通り、５つのさらなる種類のマイクロスフェアを検討する（Ｆ．  Ｃｈｅｌｌａｔら、（２０００年）Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｈｉｔｏｓａｎ−Ｘａｎｔｈａｎ  Ｐｏｌｙｉｏｎｉｃ  Ｃｏｍｐｌｅｘ、Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ．、５１巻、１０７〜１６頁；Ｄ．  Ｃｏｓｔａら、（２０１２年）Ｓｗｅｌｌｉｎｇ  Ｂｅｈａｖｉｏｒ  ｏｆ  ａ  Ｎｅｗ  Ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  Ｈｙｄｒｏｇｅｌ、Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  Ｓｕｒｆ  Ｂ  Ｂｉｏｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ、９２巻、１０６〜１２頁；Ｋａｕｆｆｍａｎら、（２０１２年）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｃｅｔａｌａｔｅｄ  Ｄｅｘｔｒａｎ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｅｔｈａｎｏｌ  ａｓ  ａ  Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔ、ＡＣＳ  Ａｐｐｌ  Ｍａｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ、４巻、４１４９〜５５頁；Ｋｕｍａｒｉら、（２０１０年）Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ
Ｂａｓｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  Ｓｕｒｆ  Ｂ  Ｂｉｏｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ、７５巻、１〜１８頁；Ｓｉｎｈａら、（２００４年）Ｐｏｌｙ−Ｅｐｓｉｌｏｎ−Ｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ  Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ  ａｎｄ  Ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅｓ：  Ａｎ  Ｏｖｅｒｖｉｅｗ、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ、２７８巻、１〜２３頁；ＴｏｐｕｚおよびＯ．  Ｏｋａｙ、（２００９年）Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  ｂｙ  Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  Ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ  ｏｆ  ＤＮＡ、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、１０巻、２６５２〜６１頁）。したがって、ＤＮＡは、バイオフィルムのためのＥＰＳの基礎であるので、マイクロスフェア材料として使用することができる。
【０１５０】
本実施例は、実施例４による、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおける最適化戦略の例である。表２および実施例４．１〜４．５における材料からマイクロスフェアを構築する。初期の測定規準としての、高さ、厚さ、およびバイオマスを使用する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける頑健なバイオフィルムの成長を支援しなかったマイクロスフェアは、もはや検討しない。同様に、その後、ｉｎ  ｖｉｖｏの測定規準において、プランクトン様細菌を上回らなかったマイクロスフェアの種類もまた、もはや検討しない。また、細菌を伴う保管寿命および細菌を伴わない保管寿命、低ｐＨ（胃内の条件）における安定性も想定する。
【表２】
2018087248.tif 000003
【０１５１】
（実施例５．２）
カーゴとしてプロバイオティクスに好適な、プレバイオティクス栄養物質および添加剤の試験
ＰＬＧＡのカーゴは、マイクロスフェアの加水分解速度と比べて、ゆっくりと拡散するか、またはさらに全く拡散しないことが公知である（Ｆｒｅｄｅｎｂｅｒｇら（２０１１年）Ｔｈｅ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ｉｎ  Ｐｏｌｙ（Ｌａｃｔｉｃ−Ｃｏ−Ｇｌｙｃｏｌｉｃ  Ａｃｉｄ）−Ｂａｓｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ−−ａ  Ｒｅｖｉｅｗ、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ、４１５巻、３４〜５２頁）。本実施例では、プレバイオティクスカーゴを伴うマイクロスフェアを合成し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏのマウスモデルにおいて、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉの成長を支援するそれらの能力について評価した。
【０１５２】
本実施例では、栄養物質について、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて検討する。初期試験として、カーゴを、それらの合成中に、ＰＬＧＡマイクロスフェアにロードする（マイクロスフェアの内部に封入されるように）。これらのカーゴは、乳酸菌の成長を支援するので、イヌリン、フルクトオリゴ糖、およびガラクトオリゴ糖を含むがこれらに限定されない。加えて、ＭＲＳ培地は、それらの一部が病原体であるグラム陰性菌に制約され、グリセロールは、ロイテリン（ｒｅｕｔｅｒｉｎ）（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉに、競合細菌に対する利点をもたらすと考えられる抗微生物分子）の産生を刺激するので、ＭＲＳ培地および／またはグリセロールを伴うマイクロスフェアを作製する。これらのマイクロスフェア上のＬ．ｒｅｕｔｅｒｉバイオフィルムの成長は、実施例４（または改変体マイクロスフェアを伴う実施例５．１）において観察される条件で実施し、高さ、厚さ、およびバイオマスについて、ＣＳＬＭにより判定する。
【０１５３】
本実施例では、プレバイオフィルミクスについて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて調べる。実施例４．２における通り、ＰＬＧＡマイクロスフェア（および実施例５．１によるマイクロスフェアの種類）内のカーゴであって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるバイオフィルムの成長を支援するカーゴとしての、プレバイオフィルミクス（ＨＵおよびＤＮＡ）の能力を検討した。各場合に、バイオフィルムを、実施例４において観察される条件下で、ＨＵおよび／またはＤＮＡの存在下で（マイクロスフェアの内部に封入されるように）合成されたマイクロスフェアと共に成長させ、高さ、厚さ、およびバイオマスについて、ＣＳＬＭにより判定する。
【０１５４】
本実施例では、プレバイオティクスとプレバイオフィルミクスとの組み合わせについて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて調べる。本実施例では、２つのプロバイオティクスと、２つのプレバイオフィルミクスカーゴとの組み合わせ（２つずつによる全部で１６通りの組み合わせ、３つずつによる全部で４通りの組み合わせ、および４つ全てによる単一の組み合わせで、合計２１通りの組み合わせとなる）についての行列を創出して、適切なプレバイオティクスまたはプレバイオフィルミクスを見出す。各場合に、バイオフィルムを、実施例１において観察される条件下で、カーゴの存在下で合成されたＰＬＧＡマイクロスフェア（および実施例５．１によるマイクロスフェアの種類）と共に成長させ、高さ、厚さ、およびバイオマスについて、ＣＳＬＭにより判定する。
【０１５５】
本実施例では、最適化された成分について、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて調べる。バイオフィルムをもたらした実施例５．２による条件を、ｉｎ  ｖｉｖｏ実験に使用する。ＰＬＧＡマイクロスフェアカーゴ（または実施例５．１による、２つの最も有望なＰＬＧＡ、および２つの最も有望な、他の種類のマイクロスフェア）についての、４つの最も有望な条件について、各々が三連の実験に由来する９匹のマウスにおいて調べる。各マウスは、実施例４．１における通りに、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉの導入後１、３、６、および１２日目において評価する。偽処置マウス（細菌なし）およびプランクトン様細菌を対照として用いる。
【０１５６】
（実施例５．３）
病原体を妨害するプレバイオティクス栄養物質
多様なプロバイオティクスカーゴを含有するマイクロスフェアについて検討して、それらが、病原体バイオフィルムの成長を支援するかどうかを決定する。プレバイオフィルミクスを含有するマイクロスフェアを、病原体（すなわち、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ  ＤＢＳ１２０株（ｐＣＲＰ１：：Ｔｎ５））ならびにプロバイオティクスと接触させる。
【０１５７】
本実施例では、病原体妨害性栄養物質について、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて調べる。実施例５．２による、同じプレバイオティクスおよびプレバイオフィルミクス物質を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてバイオフィルムを成長させるカーゴとして使用する。Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍを、ＬＢ培地中で成長させ、ＰＬＧＡおよび前述のカーゴを伴うバイオフィルムを播種するのに使用する。バイオフィルムを、空のＰＬＧＡマイクロスフェアと比較して、高さ、厚さ、およびバイオマスについて、ＣＳＬＭにより判定する。
【０１５８】
本実施例では、病原体妨害性栄養物質について、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて調べる。実施例５．３におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏバイオフィルムデータからの結果を考慮して、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍバイオフィルムの成長のための４つのカーゴ、およびｉｎ  ｖｉｖｏのマウスモデルにおけるそれらの使用について検討する。時点１つ当たり、各条件について、９匹のマウス（三連の実験に由来する）を、対照としてのプランクトン様Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍおよび偽処置（細菌なし）と共に使用する。糞便中のＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍレベルは、培養物を介して、経口Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ投与後の全ての日数において決定する。経口Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ投与後１、６、１２、および２４日目において、結腸を取り出し、長手方向に離断して、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを介して、結腸の半分において、炎症性サイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α）、炎症性メディエーター（例えば、誘導性一酸化窒素シンターゼ（ｉＮＯＳ））、およびケモカイン（例えば、ＣＣＬ２）を評価し得る。組織のうちの第二の半分では、免疫組織化学を使用して、白血球（例えば、Ｆ４／８０＋マクロファージ；ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）＋多形核細胞）の結腸への浸潤について評価する。前述の免疫構成要素は、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍに対する防御的免疫に必要であるが、過剰に産生されると、組織損傷性大腸炎をもたらしうる。したがって、結腸病態は、組織のうちの第二の半分におけるＨ＆Ｅ染色を介して評価する。
【０１５９】
したがって、マイクロスフェアバイオフィルム調製物は、代替的な種類のマイクロスフェアおよび様々なカーゴを含みうる。本出願人らの考えでは、バイオフィルム（表面と関係なく）は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける播種時のプロバイオティクスによる生着において、プランクトン様細菌より優れている。
【０１６０】
カーゴの非限定的な例は、限定されないが、腸内菌共生バランス失調をもたらす過程の一部である炎症を低減する生得免疫の特異的エフェクターを含む。例えば、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉは、そのような物質を産生するので、マイクロスフェアは、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉに由来する馴化培地を含みうる。同様に、腸内菌共生バランス失調に起因する病態については一般に、他の細菌、例えば、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍおよびＬ．ｒｅｕｔｅｒｉは、本開示の範囲内にある。
【０１６１】
（実施例６）
マウス胃腸の腸管病原性細菌であるＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍを制限または置換するＬ．ｒｅｕｔｅｒｉの能力についての特徴付け
前の実施例では、マウスの胃腸内で良好な耐久性および頑健性を伴う、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉバイオフィルムを創出する手段を同定し、特徴付ける一方で、また、これらの条件が、どのようにして、マウス腸管病原性Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍに影響を及ぼしうるのかについても検討した。本実施例では、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉバイオフィルムの製剤について検討して、それらが、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍの影響を低減しうるか、またはさらに、導入されているかもしくは現存する病原体を部分的に除去しうるかを決定する。
【０１６２】
（実施例６．１）
Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍの攻撃における、最適化されたＬ．ｒｅｕｔｅｒｉバイオフィルムの成長条件の試験；Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉの作製  ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉに対する、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍによる攻撃。本実施例では、条件のうちのいずれが、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍによる攻撃に対する、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉによる予防を改善するかを体系的に決定する。表３において示される通り、本実施例では、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉを、バイオフィルム（種々の時齢を反映するために、約１２、２４、および４８時齢のバイオフィルム）内で成長させ、次いで、種々の量のプランクトン様Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ（１０７、１０８、および１０９ＣＦＵ）で処理する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける実験を体系的に実施する。実施例４．２（例えば、プレバイオフィルミクスに関して、攻撃のための培地は、両方の細菌種の成長を少なくとも促進とすることが必要とするため）のほか、２．１、２．２、および２．３による、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉバイオフィルムの成長条件について検討する。混合されたバイオフィルムを、処理の１２または２４時間後に、選択性培地上のＣＳＬＭおよびプレートのカウントにより評価して、各条件下で、どちらの種の構築および数が優勢であるかを決定する。対照は、各条件下で、他方の細菌種を伴わない各細菌種（例えば、各スライドチャンバー内で、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉを伴わずに、ＰＬＧＡマイクロスフェアに添加されるＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ）を含む。全ての実験は、三連で行う。
【表３】
2018087248.tif 000004
【０１６３】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉに対する、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍによる攻撃。動物への導入のためのＬ．ｒｅｕｔｅｒｉバイオフィルム調製物には、観察されるＬ．ｒｅｕｔｅｒｉの最大の保持または優位に基づき優先順位をつける。加えて、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉは、実施例４．１、４．４、および４．５に由来する何らかの成功に基づいて調製する。一般に、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉバイオフィルムを、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍによる経口攻撃の１２時間前に導入する。三連の実験は、攻撃の１、６、１２、および２４日後（ピークのＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染は、約１２日目に生じる）において評価される、各条件および各時点につき９匹のマウスによる最終試料サイズについて実行する。糞便中のＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍレベルを評価し、病原体誘導性大腸炎は、実施例５．３における通りに評価する。Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉレベルはまた、実施例４．１における通りにも評価する。いずれの場合にも、対照は、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉを伴わないＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍと、プランクトン様Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉを加えたＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍによる攻撃とを含む。
【０１６４】
（実施例６．２）
攻撃投与の条件の試験
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍによる攻撃を伴う、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉの投与頻度および時期。本明細書の本実施例では、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉの投与が、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍによる攻撃に対する予防薬として作用するその能力に、どのようにして影響を及ぼすのかについて調べる。本実施例では、実施例４．３に由来する、最も頑健で持続する結果を反映する、上位３つのＬ．ｒｅｕｔｅｒｉ投与条件に優先順位をつける。次いで、本実施例では、これらの条件を使用して、これらの、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉで処置されたマウスを、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍで攻撃する（最終回のＬ．ｒｅｕｔｅｒｉ処置の約１２、２４、または３６時間後）。各条件および各時点について、９匹のマウス（三連の実験に由来する）を使用する。Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍおよび単回のプランクトン様Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉで感染させたビヒクルマウスを対照として用いる。Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍレベルおよび病原体誘導性大腸炎は、実施例５．３における通りに、攻撃後の１、６、１２、および２４日目において評価し、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉレベルを実施例４．１における通りに評価する。
【０１６５】
（実施例６．３）
実施例６．１および６．２における結果に基づく、病原性処理の後の治療用プロバイオティクスによる攻撃の試験
実施例６．１および６．２では、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍにより引き起こされる病態に対する予防薬としてのＬ．ｒｅｕｔｅｒｉを使用するための条件を最適化した。本実施例では、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍを、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉの前に導入して、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉによる攻撃が、現存するＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍによる病因に対してどのような効果を及ぼすかを決定した。
【０１６６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍに対する、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉバイオフィルムによる攻撃。本実施例は、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉバイオフィルムが、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍバイオフィルムを、プランクトン様Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉより効果的に攻撃したことを示す。本実施例では、実施例６．１による３つの条件に従ってパターン化された条件下でバイオフィルム形態にあるＬ．ｒｅｕｔｅｒｉを使用する。略述すると、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍバイオフィルム（１２、２４、または３６時齢）を、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉバイオフィルム（１０７、１０８、および１０９ＣＦＵ）で攻撃する。混合されたバイオフィルムは、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉによる、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍバイオフィルムに対する攻撃の１２または２４時間後に、選択性培地上のＣＳＬＭおよびプレートのカウントにより評価して、各条件下で、どちらの種の構築および数が優勢であるかをそれぞれ決定する。対照は、各条件下で、他方の細菌種を伴わない各細菌種（例えば、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍが現存しないスライドチャンバーへのＬ．ｒｅｕｔｅｒｉの添加）を含む。全ての実験は、三連で行う。
【０１６７】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍに対する、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉバイオフィルムによる攻撃。本明細書の本実施例では、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉバイオフィルムが、マウスモデルにおける先にあるＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染を攻撃しうるかどうかを決定する。Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉによる攻撃の前における、３つの異なるＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ条件（単回胃管栄養法の１２、２４、または３６時間）について検討した。投与を含む、４つのＬ．ｒｅｕｔｅｒｉバイオフィルム条件（実施例６．２）を使用して、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍを攻撃する。これらの条件のうちの少なくとも２つは、実施例６．１に由来する。三連の実験に由来する９匹のマウスを使用して、これらの１２の条件の各々について調べる。病原体誘導性大腸炎は、実施例５．３における通りに評価し、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉレベルを実施例４．１における通りに評価する。
【０１６８】
本明細書の、本実施例では、バイオフィルムの形態で導入されたＬ．ｒｅｕｔｅｒｉは、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍによる攻撃に対する予防薬として、かつ、現存するＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染のための処置として、どれほど効果的であるかを決定する。現在まで、条件下のＬ．ｒｅｕｔｅｒｉは、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍのような病原体を除去できていないため、プロバイオティクスが、腸管病原性感染を、防止しうるか、またはさらに治癒させうる条件を見出しうるかどうかは特に重要である。本明細書の結果は、将来のプロバイオティクス手法の根拠をもたらす。
【０１６９】
最後に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを、将来のｉｎ  ｖｉｖｏ実験の前段階として、他の病原体について実施する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ調査に含まれる病原体は、感染方式が異なる腸管病原体であって、侵襲性病原体（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ  ＴｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍおよびＳｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、さらなるＡ／Ｅ病原体（例えば、腸管出血性Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１５７：Ｈ７；および腸管病原性Ｅ．ｃｏｌｉ）、および毒素産生性病原体（例えば、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａおよび腸管毒素原性Ｅ．ｃｏｌｉ）を含む腸管病原体であり、これらの実験の律速段階は、ｉｎ  ｖｉｖｏ状態を十分に模倣する共培養条件を見出すことである。
【０１７０】
（実施例７）
統計学的解析および試料サイズの決定
大半の実験は、複数のパラメータおよび群を伴う。したがって、２、３、または４因子による分散分析（ＡＮＯＶＡ）を、主に使用する。実施例４．１における統計学的手法についての一例として、対象間ＡＮＯＶＡは、対象間変数としての、プロバイオティクス（すなわち、プロバイオティクス  対  ビヒクル対照）、条件（すなわち、バイオフィルム
対  プランクトン様）、および培養時間（すなわち、６、１２、１８、２４、または３６時間）と共に使用する。マウスの異なる群は、経口接種後１、３、６、および１２日目において採取されるため、採取日も、対象間変数として使用する。
【０１７１】
有意な４元相互作用（４−ｗａｙ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）はまず、複数の比較について適用される、改変ボンフェローニ補正係数を伴う、事後独立試料によるｔ検定を使用して解釈する。その後、事後検定を介して、３元および２元相互作用を解釈した後、主効果について解釈する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験およびｉｎ  ｖｉｖｏ実験の両方において、この一般的手法に従う。
【０１７２】
ｉｎ  ｖｉｖｏ実験の固有の可変性のため、群間の統計学的な有意差を同定するのに必要とされる試料サイズの決定にかなりの時間を費やした。集団平均を３．９５とし、集団分散を０．７５とする６つの異なる群（予備的試料サイズを６とする）によるＬ．ｒｅｕｔｅｒｉ投与後におけるＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍレベルについて探索する予備的データを使用して実行した検定力解析により、α＝０．０５の統計学的有意性を得るには、検定力を０．８に維持しながら、時点１つ当たり条件１つ当たりｎ＝９の試料サイズを必要とすることが示された。したがって、全ての動物実験は、処置および時点１つ当たりの試料サイズ９を伴う。これは、各々が処置および時点１つ当たりｎ＝３のマウスを含有する三連の実験に由来するデータを組み合わせることにより達成される。
【０１７３】
プロバイオティクスは、消化上の健康利益のために広く使用されているが、病原体の生着を実際に防止し、炎症応答を低減するプロバイオティクスは少数である。プロバイオティクス細菌の効果は、それらを宿主へと導入する方式により、具体的には、それらをバイオフィルムの形態で成長させることにより、著明に改善することができる。データは、プロバイオティクスであるＬ．ｒｅｕｔｅｒｉによる、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける生着が、バイオフィルムとして成長させる場合、プランクトン様で成長させた細胞と比較して大幅に増強されることを示唆する。加えて、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉを、生体分解性表面（ＰＬＧＡ）の存在下で成長させた場合、生着も増大したことから、条件の最適化により、宿主内のＬ．ｒｅｕｔｅｒｉの定着に関して、大幅な改善が可能となったことが示される。
【０１７４】
予測外であり、かつ、驚くべきことに、本出願人らは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方において、細菌性病原体であるＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍによる攻撃の前における、ＰＬＧＡの存在下にあるバイオフィルムとしてのＬ．ｒｅｕｔｅｒｉによる処置は、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍの数の、プランクトン様Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉによる処置と比較して、有意な低減を引き起こすことを裏付けた。これらのデータは、プロバイオティクスが、バイオフィルムとして提示された場合に、良好に生着しうることから、細菌を導入する方式が、疾患の転帰を大きく反映しうることが示されることを明らかにする。
【０１７５】
（実施例８）
プロバイオティクス微生物はまた、他の点では健康なヒトおよび実験動物における、不安およびうつ病を低減することも示されている。３０日間にわたり毎日投与される、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｉｔｉｃｕｓと、Ｂ．ｌｏｎｇｕｍとの組み合わせは、健康なヒトボランティアおよび健康なラットにおける不安およびうつ病を低減することが示された（Ｍｅｓｓｏｕｄｉら（２０１１年）Ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ  ｐｓｙｃｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  （Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ  Ｒ００５２  ａｎｄ  Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  Ｒ０１７５）  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈｙ  ｈｕｍａｎ  ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ、Ｂｒ  Ｊ  Ｎｕｔｒｉ、１０５巻、７５５〜７６４頁）。
【０１７６】
本実験では、感染性大腸炎自体に対する効果を評価する上記で言及された研究と同じ実験デザインを、わずかに改変して使用して、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ調製物が、感染性大腸炎誘導性疾病、不安様挙動、およびうつ病様挙動を軽減するのに優れているかどうかについて調べる。主要な差異は、動物の挙動について評価するほか、循環サイトカイン、循環ホルモン、および脳内のニューロン活性化についても評価することである。
【０１７７】
予防的Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉが、不安様挙動およびうつ病様挙動などのＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ誘導性疾病を防止しうるかどうかを決定するため、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉバイオフィルムによる予防的処置を評価して、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉが、細菌誘導性疾病、不安様挙動、およびうつ病様挙動を防止するかどうかを決定する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて優れていることが見出されたＬ．ｒｅｕｔｅｒｉバイオフィルムの調製物を、経口胃管栄養法を介して、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍによる経口攻撃の１２時間前に、マウスに投与する。三連の実験は、攻撃後の１、６、１２、および２４日目において評価される、各条件および各時点につき９匹のマウスによる最終試料サイズについて実行する（ピークのＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染は、約１２日目に生じる）。各時点において、動物の挙動を、運動活性（オープンフィールド試験などにおける）、不安様挙動（明暗選択箱試験（ｌｉｇｈｔ：ｄａｒｋ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｔｅｓｔ）および高架式十字迷路などにおける）、うつ病様挙動（尾懸垂試験（ｔａｉｌ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｔｅｓｔ）およびポーソルト強制水泳試験（Ｐｏｒｓｏｌｔ  ｆｏｒｃｅｄ  ｓｗｉｍ  ｔａｓｋ）などにおける）、および疾病挙動（スクロース選択性試験（ｓｕｃｒｏｓｅ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｔｅｓｔ）などによる）について評価する。情動的および疾病挙動と関連する血清サイトカイン（例えば、ＩＬ−１α／βおよびＩＬ−６）は、各日において評価する。また、循環コルチコステロンレベルも評価する。脳内ニューロン、特に、視床下部室傍核の活性化は、ｃ−Ｆｏｓの免疫反応性を使用して評価する。
【０１７８】
また、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉを、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ誘導性疾病、不安様挙動、およびうつ病様挙動を処置する治療薬として使用しうるかどうかも評価する。例えば、確立されたＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染を処置することにより、疾病、不安様挙動、およびうつ病様挙動が軽減されるかどうかを決定するために、組成物について調べる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて優れていることが見出されたＬ．ｒｅｕｔｅｒｉの調製物を、経口胃管栄養法を介して、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍによる経口攻撃の１２、２４、および／または３６時間後に、マウスに投与する。Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍによる攻撃後の１、６、１２、および２４日目において、動物の挙動を、運動活性（オープンフィールド試験などにおける）、不安様挙動（明暗選択箱試験および高架式十字迷路などにおける）、うつ病様挙動（尾懸垂試験およびポーソルト強制水泳試験などにおける）、および疾病挙動（スクロース選択性試験などによる）について評価する。情動的および疾病挙動と関連する循環サイトカイン（例えば、ＩＬ−１α／βおよびＩＬ−６）は、各日において評価する。また、循環コルチコステロンレベルも評価する。脳内ニューロン、特に、視床下部室傍核の活性化は、ｃ−Ｆｏｓの免疫反応性を使用して評価する。
【０１７９】
これらの実施例は、より頑健で長期にわたり耐久性があるプロバイオティクスを創出するように、条件を変更することを許容し、確立されると、細菌感染およびヒト疾患のための処置を最終的に反映しうるｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおいて、これらの条件について調べることを可能とする。
【０１８０】
（実施例９）
ＮＥＣ
プロバイオティクスの投与は、ＮＥＣの防止において有益でありうる。しかし、有益な効果を達成するには、プロバイオティクスは、毎日投与しなければならない。本出願人らは、本明細書において、プロバイオティクスを、プレバイオティクスをロードした生体適合性マイクロスフェアの表面上のバイオフィルムとして成長させ、単回の処置だけで、増強され、より持続する有効性を可能とする新規のプロバイオティクス送達系について記載する。
【０１８１】
帝王切開による分娩後、新生児ラットを、実験的ＮＥＣ［低酸素状態／低体温状態／高張性飼料（ストレス）］にかけた。１日目に、仔ラットを無作為化して、以下の単回腸内用量を受容させた：（１）ビヒクルだけ（１００μＬの滅菌水）（Ｎ＝３２）；（２）１ｍＬ当たり１×１０９ＣＦＵのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ（Ｎ＝９）；（３）プレバイオティクスをロードした生体適合性マイクロスフェア（Ｎ＝１２）；または（４）プレバイオティクスをロードした生体適合性マイクロスフェアとカップリングさせた、１ｍＬ当たり１×１０９ＣＦＵのＬ．ｒｅｕｔｅｒｉ（Ｎ＝３３）。対照仔ラットは、ストレスにかけられなかった（Ｎ＝１０）。ＮＥＣの臨床的徴候が発生した時点で、または出生の９６時間後までに、仔ラットを屠殺した。検証済みの組織学的ＮＥＣ損傷段階分けシステムを使用して、グレード２またはこれを超える損傷を、ＮＥＣと符合すると考えて、ＮＥＣの発生率および重症度を測定した。
【０１８２】
図５にグラフで描示する通り、ストレスにかけられた非処置仔ラットのうちの６９％が、ＮＥＣを発症した。ストレスにかけられた非処置仔ラットと比較して、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉで処置された仔ラットのうちの６７％（ｐ＝０．３２９）、プレバイオティクスをロードしたマイクロスフェアで処置された仔ラットのうちの５０％（ｐ＝０．３６４）、およびプレバイオティクスをロードしたマイクロスフェアとカップリングさせたＬ．ｒｅｕｔｅｒｉで処置された仔ラットのうちの３３％（ｐ＝０．００３）が、ＮＥＣを発症した。ストレスにかけられなかった仔ラットは、ＮＥＣを発症しなかった。
【０１８３】
プレバイオティクスをロードした生体適合性マイクロスフェアとカップリングさせたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓバイオフィルムの単回用量は、ＮＥＣの発生率を低減し、したがって、効果的な処置である。理論に束縛されることなしに述べると、本明細書で開示される組成物は、このような処置を必要とする被験体におけるそれらの使用において、予防的である。
【０１８４】
（実施例１０）
乾燥耐性アッセイ
本出願人らの発明の別の利点は、プロバイオティクス細菌の、改善された長期にわたる生存である。乾燥耐性アッセイを使用して、マイクロスフェアと組み合わされた細菌の安定性および生存可能性について調べた。アッセイは一般に、以下のステップを実施することにより実行することができる。細菌培養物を成長させるために、１ｍｌ〜１．５ｍｌの培養物を、マイクロ遠心管（試験時間当たり条件１つ当たりの遠心管１本）に移す。約１０μｌの湿潤化させたマイクロスフェア、トレハロースを遠心管に添加するか、または遠心管になにも添加しない。遠心管を３０分間にわたりインキュベートし、次いで、遠心分離により、細胞をペレット化させる。上清を除去し、ペレットを滅菌食塩水で２回洗浄する。その後、全ての液体をペレットから除去する。開放した遠心管を、密閉容器内のＤｒｉｅｒｉｔｅの上部に置き、容器を、４０℃のインキュベーター内に置く。７日後、遠心管を取り出し、再び湿潤化させ、ペレットを、１ｍｌの成長培地中に、５分間にわたり懸濁させる。次いで、生存コロニー形成単位について、系列希釈および平板培養を行う。最後に、３０日後および９０日後において、再度の湿潤化および播種を繰り返す。
【０１８５】
Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓおよび特許権のあるＡｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｓｐ．を、強力な乾燥剤であるＤｒｉｅｒｉｔｅ上におきながら、４０℃で９０日間にわたるインキュベーションにかけ、次いで、再び湿潤化させ、生存可能性について調べた。マイクロスフェアを伴わないＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓは、これらの条件でわずか１週間後にコロニー形成単位（ＣＦＵ）の完全な喪失を示すが、セルロースマイクロスフェアと共にインキュベートすると、これらの条件で９０日後において、１０５個の細胞が生存可能である。Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｓｐ．は、マイクロスフェア製剤を伴わずに成長させると、３０日後にＣＦＵの著明な喪失を示し、９０日後には完全な喪失を示すが、過酷な条件で、マイクロスフェアを伴って保存すると、９０日後であってもなお、１ｍｌ当たり１０６ＣＦＵのＡｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｓｐ．が生存可能である。
【０１８６】
（実施例１１）
酸耐性プロトコール（４８ウェルプレート）
Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉの成長培地をカーゴとして充填したマイクロスフェアを、低ｐＨにおける生存率を増強するバイオフィルムを形成するために、緩衝化された栄養物質を細菌へと滲出させる表面をもたらすのに活用した。マイクロスフェアを伴う細菌細胞は、ｐＨ２の胃酸中、４時間にわたる静置の後で、マイクロスフェアを伴わない細胞と比較して、生存コロニー形成単位の、２ｌｏｇを超える増大を示す。さらに、マイクロスフェアを伴うＬ．ｒｅｕｔｅｒｉは、マウス結腸細胞への付着の増大を示し、経口投与された細菌の生着および存続性の不良の問題に対処する。まとめると、新規のマイクロスフェア製剤は、低ｐＨにおける生存率を増大させるだけでなく、また、胃腸内の有益な細菌の生着にも寄与し、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉを、より効果的なプロバイオティクスとしている。
【０１８７】
上記の情報を生み出すのに使用されるアッセイなどの酸耐性プロトコールアッセイは一般に、以下のステップを実施することにより実行することができる。まず、５ｍｌの培養物を、３７℃で（５％のＣＯ２で、または嫌気的に）一晩にわたり成長させ、次いで、培養物を、新鮮な培地中で１：２５００に希釈する。試験時間当たり条件１つ当たり５００ｍｌを、４８ウェルプレートに移す。約１０ｕｌの湿潤化させたマイクロスフェアをウェルに移すか、またはウェルになにも移さない。その後、３７℃、５％のＣＯ２で（または嫌気的に）２０時間にわたり（一晩にわたり）インキュベートする。２０時間で、使用済みの培地を、バイオフィルムから除去し、ｐＨ２の胃酸で置きかえる。２および４時間後、酸をバイオフィルムから除去し、成長培地中のピペット混合により、細胞を懸濁させる。最後に、細胞を系列希釈し、平板培養する。
【０１８８】
（実施例１２）
細胞付着アッセイ
Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉの成長培地をカーゴとして充填したマイクロスフェアを、低ｐＨにおける生存率を増強するバイオフィルムを形成するために、緩衝化された栄養物質を細菌へと滲出させる表面をもたらすのに活用した。マイクロスフェアを伴う細菌細胞は、ｐＨ２の胃酸中、４時間にわたる静置の後で、マイクロスフェアを伴わない細胞と比較して、生存コロニー形成単位の、２ｌｏｇを超える増大を示す。さらに、マイクロスフェアを伴うＬ．ｒｅｕｔｅｒｉは、マウス結腸細胞への付着の増大を示し、経口投与された細菌の生着および存続性の不良の問題に対処する。これらの結果は、新規のマイクロスフェア製剤が、低ｐＨにおける生存率を増大させるだけでなく、胃腸内の有益な細菌の生着にも寄与し、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉを、より効果的なプロバイオティクスとしていることを示す。
【０１８９】
上記の情報を生み出すのに使用されるアッセイなどの細胞付着アッセイは一般に、以下のステップを実施することにより実行することができる。まず、哺乳動物細胞系培養物を成長させ、１ｍｌ当たりの細胞約１０６個まで希釈する。希釈された哺乳動物細胞系５００ｕｌを、４８ウェルプレートに移す。次いで、コンフルエンシーまで成長させ（時間を変化させるが、少なくとも１６時間）、細菌培養物を一晩にわたり成長させる。その後、５００ｕｌの細菌培養物を、１．５ｍｌのマイクロ遠心管（期間当たり条件１つ当たりの管１本）に移す。遠心分離により細菌細胞をペレット化させ、ペレットを２〜３回洗浄して、全ての成長培地を除去する。ペレット化させた細菌を、細胞系培養培地中で再懸濁させる。細胞系培養培地中で湿潤化させたマイクロスフェア、ＭＲＳ中で湿潤化させたマイクロスフェアを懸濁細菌に添加するか、または懸濁細菌になにも添加しない。
【０１９０】
成長培地を、コンフルエンシー状態の哺乳動物細胞培養物ウェルから除去する。細胞系成長培地を伴う細菌条件を、哺乳動物細胞培養物ウェルへと吸引する。３７℃、５％のＣＯ２でインキュベートする。１時間後、使用済みの培地上清を、各ウェルから除去し、細胞を滅菌ＰＢＳで２回洗浄して、付着しなかった細菌を除去する。５００ｕｌのトリプシンを各ウェルに添加して、付着した哺乳動物細胞を、プラスチックからはがし、３７℃で５〜１０分間にわたりインキュベートする。各ウェル内の液体を完全に混合して、哺乳動物細胞を再懸濁させる。次いで、系列希釈および平板培養を行って、哺乳動物細胞への付着を維持した細菌の数を計算する。４および８時間で、使用済みの培地上清を、各ウェルから除去し、細胞を滅菌ＰＢＳで２回洗浄して、付着しなかった細菌を除去する。５００μｌのトリプシンを、各ウェルに添加して、付着した哺乳動物細胞を、プラスチックからはがし、３７℃で５〜１０分間にわたりインキュベートする。各ウェル内の液体を完全に混合して、哺乳動物細胞を再懸濁させる。次いで、系列希釈および平板培養を行って、哺乳動物細胞への付着を維持した細菌の数を計算する。
【０１９１】
そうでないことが規定されない限りにおいて、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。
【０１９２】
本明細書で例示的に記載される本発明は、本明細書では具体的に開示されない、任意の１または複数の要素、１または複数の限定の非存在下で、適切に実施することができる。したがって、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」などの用語は、外延的に、限定を伴わずに読み取るものとする。加えて、本明細書で援用される用語および表現は、限定的な用語ではなく、記載的な用語として使用されており、このような用語および表現の使用において、示され、記載される特徴の任意の同等物またはそれらの部分を除外する意図は存在せず、特許請求される本発明の範囲内では、多様な変更が可能であることが認識されている。
【０１９３】
したがって、本明細書で提示される材料、方法、および例は、好ましい実施形態を表すものであり、例示的なものであり、本発明の範囲に対する限定として意図されるものではないことを理解すべきである。
【０１９４】
本明細書では、本発明について、広く、かつ、一般的に記載してきた。一般的開示の中に収まるより狭い種および下位属的群分けの各々もまた、本発明の一部を形成する。これは、削除される素材が、本明細書で具体的に列挙されるかどうかに関わらず、本発明についての一般的記載であって、任意の対象物を属から除外する条件または否定的限定を伴う記載を含む。
【０１９５】
加えて、マーカッシュ群に関して本発明の特徴または側面について記載する場合、これにより、本発明はまた、マーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたはメンバーの下位群に関しても記載されることを、当業者は認識するであろう。
【０１９６】
本明細書で言及される、全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、各々が参照により個別に組み込まれた場合と同じ程度に、参照によりそれらの全体が明示的に組み込まれる。利益相反の場合は、定義を含む本明細書により管理する。
【０１９７】
他の実施形態は、以下の特許請求の範囲において示される。
【表４−１】
2018087248.tif 000005
【表４−２】
2018087248.tif 000006
【表４−３】
2018087248.tif 000007
【表４−４】
2018087248.tif 000008
【化１】
2018087248.tif 000009
【化２】
2018087248.tif 000010
【化３】
2018087248.tif 000011
【化４】
2018087248.tif 000012
【図１】
2018087248.tif 000013
【図２】
2018087248.tif 000014
【図３】
2018087248.tif 000015
【図４】
2018087248.tif 000016
【図５】
2018087248.tif 000017
【配列表】
2018087248000001.app
【外国語明細書】
2018087248000001.pdf