(57)【要約】【課題】創傷治癒をしつつ、肥厚性瘢痕の形成を抑制できる肥厚性瘢痕形成抑制剤を提供すること。【解決手段】本発明の肥厚性瘢痕形成抑制剤は、間葉系幹細胞の培養上清を含有する。これにより、本発明は、創傷を治癒しつつ、肥厚性瘢痕の形成を抑制することができる。間葉系幹細胞は、好ましくは、脂肪、胎盤、又は臍帯由来の幹細胞である。間葉系幹細胞の培養上清は、凍結乾燥されていることが好ましい。本発明の肥厚性瘢痕形成抑制剤は、絆創膏として用いることが好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
間葉系幹細胞の培養上清を含有する、肥厚性瘢痕形成抑制剤。
【請求項２】
前記間葉系幹細胞は、脂肪、胎盤、又は臍帯由来の幹細胞である、請求項１に記載の肥厚性瘢痕形成抑制剤。
【請求項３】
前記培養上清は、ＦＧＦ１、ＦＧＦ７、ＦＧＦ１０、ＶＥＧＦ及びＰＤＧＦからなる群から選択される１つ以上の成分を含有する、請求項１又は２に記載の肥厚性瘢痕形成抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肥厚性瘢痕形成抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
間葉系幹細胞の上清には成長因子が含まれていることが知られており、これらの成長因子が、創傷を回復させることが知られている。
【０００３】
例えば、特許文献１には、褥瘡の効果を有する歯髄幹細胞の培養上清が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０１３／１４７０８２号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
創傷を治療する際には、治療の跡がケロイドとなり残る可能性があるため、創傷を治癒しつつ肥厚性瘢痕の形成を抑制することが求められている。
【０００６】
本発明は以上の実情に鑑みてなされたものであり、創傷を治癒しつつ、肥厚性瘢痕の形成を抑制できる肥厚性瘢痕形成抑制剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、間葉系幹細胞が、創傷を治癒しつつ、肥厚性瘢痕の形成を抑制できることを見出し、本発明を完成するに至った。より具体的には、本発明は以下のようなものを提供する。
【０００８】
（１）  間葉系幹細胞の培養上清を含有する、肥厚性瘢痕形成抑制剤。
【０００９】
（２）  前記間葉系幹細胞は、脂肪、胎盤、又は臍帯由来の幹細胞である、（１）に記載の肥厚性瘢痕形成抑制剤。
【００１０】
（３）  前記培養上清は、ＦＧＦ１、ＦＧＦ７、ＦＧＦ１０、ＶＥＧＦ及びＰＤＧＦからなる群から選択される１つ以上の成分を含有する、（１）又は（２）に記載の肥厚性瘢痕形成抑制剤。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、創傷治癒をしつつ、肥厚性瘢痕の形成を抑制できる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の実施形態について説明するが、本発明は特にこれに限定されない。
【００１３】
＜肥厚性瘢痕形成抑制剤＞
本発明の肥厚性瘢痕形成抑制剤は、間葉系幹細胞の培養上清を含有する。これにより、創傷を治癒しつつ、肥厚性瘢痕を抑制できる。
【００１４】
本発明の肥厚性瘢痕形成抑制剤は、間葉系幹細胞の培養上清を有効成分とする。間葉系幹細胞の種類は、例えば、脂肪、臍帯、胎盤、骨髄等由来の細胞を用いることができるが、脂肪、臍帯、胎盤由来の幹細胞を用いることが好ましく、脂肪由来の細胞を用いることが特に好ましい。
【００１５】
本発明において、肥厚性瘢痕形成抑制とは、創傷の治癒時におけるコラーゲン繊維に伴う肥厚性瘢痕（ケロイドを含む）の形成を抑制することを意味する。
【００１６】
間葉系幹細胞の培養上清は、細胞の種類に応じて、適宜設定することができるが、以下、脂肪由来の細胞を例にとって説明する。
【００１７】
まず、脂肪組織を皮下から採取し、コレゲナーゼ処理によって間葉系幹細胞を分離する。間葉系幹細胞を適切な無血清培養液の存在下でＣＯ２インキュベ−タ内の培養シャーレあるいは培養タンク内で培養する。培養開始から数日に１回程度用手的あるいは自動的に培養上清液を回収する。回収した培養上清液について適切な滅菌処理（フィルターろ過、ＵＶ滅菌等の非加熱下での滅菌処理が好ましい）を行い、残存ウイルスのチェックを行う。凍結乾燥を行う場合は、ウイルスチェック後に凍結を行う。得られた培養液は、例えば、０．１〜２ｍｌ（例えば、１〜２ｍｌ）程度を使用してもよく、希釈した上（例えば、１０倍程度に）で、０．１〜２ｍｌ（例えば、１〜２ｍｌ）程度使用してもよい。
【００１８】
間葉系幹細胞の種類は、哺乳動物の間葉系幹細胞を用いることができ、例えば、ヒト、ウシ、ブタ、マウス、ラット、ウマ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ等の間葉系幹細胞を用いることができる。これらのうち、ヒト、ブタ、ウシ、ヒツジの間葉系幹細胞を用いることが好ましい。
【００１９】
本発明の間葉系幹細胞の培養上清には、間葉系幹細胞由来の成長因子等の様々な成分が含まれうるが、例えば、ＦＧＦ（繊維芽細胞成長因子）１、ＦＧＦ７、ＦＧＦ１０、ＶＥＧＦ（血管内皮細胞増殖因子）、ＰＤＧＦ（血小板由来増殖因子）、ＦＧＦ２（ｂＦＧＦ）、ＴＧＦ−β（トランスフォーミング増殖因子−β）、ＥＧＦ（上皮成長因子）、ＮＧＦ（神経成長因子）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、コラーゲン、フィブロネクチン等の成分の１つ以上を含んでもよい。これらの成分のうち、肥厚性瘢痕の形成をより抑制できる点で、ＦＧＦ１、ＦＧＦ７、ＦＧＦ１０、ＶＥＧＦ及びＰＤＧＦからなる群から選択される１つ以上の成分を含んでいることが好ましい。他方、肥厚性瘢痕の形成をより抑制できる点で、ＦＧＦ２（ｂＦＧＦ）、ＴＧＦ−β、ＥＧＦ及びＮＧＦからなる群から選択される１つ以上の成分の含有量が少ないか、これらを含まないことが好ましい。含有量の提示としては、例えば、ＦＧＦ１は、０．１〜１００ｐｇ／ｍｌ含まれていてもよい。ＰＤＧＦは０．１〜１０．０ｐｇ／ｍｌ含まれていてもよい。ＦＧＦ７とＦＧＦ１０とは合計で１〜５０ｐｇ／ｍｌ含まれていてもよい。ＶＥＧＦは、１〜２００ｐｇ／ｍｌ含まれていてもよいが、１００ｐｇ／ｍｌ以上であることが好ましい。ＦＧＦ２（ｂＦＧＦ）は、２００ｐｇ／ｍｌ以下（１５０ｐｇ／ｍｌ以下、１００ｐｇ／ｍｌ以下、５０ｐｇ／ｍｌ以下、２５ｐｇ／ｍｌ以下、１０ｐｇ／ｍｌ以下、５．０ｐｇ／ｍｌ以下、２．０ｐｇ／ｍｌ以下、０．５ｐｇ／ｍｌ以下、０．１ｐｇ／ｍｌ以下等）の含有量であってもよいが、１００ｐｇ／ｍｌ以上であることが好ましい。ＴＧＦ−βは、５００ｐｇ／ｍｌ以下（２５０ｐｇ／ｍｌ以下、１００ｐｇ／ｍｌ以下、５０ｐｇ／ｍｌ以下、２０ｐｇ／ｍｌ以下、１０ｐｇ／ｍｌ以下、１．０ｐｇ／ｍｌ以下、０．１ｐｇ／ｍｌ以下等）の含有量であることが好ましく、含まないことが好ましい。ＥＧＦは、過剰に含まないことが好ましく、５００ｐｇ／ｍｌ以下（２５０ｐｇ／ｍｌ以下、１００ｐｇ／ｍｌ以下、５０ｐｇ／ｍｌ以下、２０ｐｇ／ｍｌ以下、１０ｐｇ／ｍｌ以下、１．０ｐｇ／ｍｌ以下、０．１ｐｇ／ｍｌ以下等）の含有量であることが好ましい。ＮＧＦは、５００ｐｇ／ｍｌ以下（２５０ｐｇ／ｍｌ以下、１００ｐｇ／ｍｌ以下、５０ｐｇ／ｍｌ以下、２０ｐｇ／ｍｌ以下、１０ｐｇ／ｍｌ以下、１．０ｐｇ／ｍｌ以下、０．１ｐｇ／ｍｌ以下等）の含有量であることが好ましい。
【００２０】
本発明の肥厚性瘢痕形成抑制剤は、創傷を有する患部に適用される。創傷としては、褥瘡、切り傷、すり傷、さし傷、かき傷、あかぎれ、さかむけ、靴ずれ等や、熱傷（やけど）、術傷等が挙げられる。
【００２１】
本発明の肥厚性瘢痕形成抑制剤は、患部に接触するように使用され、適宜製剤化されたものであってもよい。例えば、粉末剤、液剤、ゲル剤、スプレー剤、絆創膏等の剤形が挙げられる。粉末剤の場合、凍結乾燥した状態で用いられることが好ましい。これらのうち、絆創膏として用いられることが好ましい。製剤化するにあたり、乳化剤、等張化剤、緩衝剤、安定化剤、防腐剤等の成分を適宜使用してもよい。また、培養上清は、生理食塩水等で希釈されたものであってもよい。
【００２２】
絆創膏として用いられる場合、従来の公知の絆創膏の形態で用いることができる。例えば、患部に適用される側の表面を、絆創膏を固定後に、密着かつ圧迫するための接着部と創傷の患部に適用されるパッド部とから構成してもよい。絆創膏は、湿式（いわゆる、ハイドロコロイド型）、乾式のいずれでもよいが、湿式であることが好ましい。特に、凍結乾燥した場合、湿式の絆創膏であることが好ましい。また、培養上清が液状である場合、乾式であることが好ましい。
【００２３】
湿式の場合、例えば、パッド部を、液体を吸収可能な親水性ポリマーを内部に備える粘着剤層により構成することができる。粘着剤層は、例えば、ロジン樹脂、ロジンエステル樹脂、テルペン樹脂、テルペンフェノール樹脂等により構成してよく、また、疎水性のゴムベース成分（スチレン系ブロック共重合体、液状エラストマー成分等）を含んでもよく、さらに可塑剤（ポリエステル化合物等）を含んでもよい。親水性ポリマーとしては、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸塩、デンプン・アクリル酸グラフト重合体、グアーガム、ローカストビーンガム、キサンタンガム、カラヤガム、ペクチン、アルギン酸、ゼラチン、セルロース誘導体（カルボキシメチルセルロース・ナトリウム等）、キチン、キトサン等が挙げられる。親水性ポリマーは粒子状であることが好ましく、例えば、５〜５００μｍの粒径であってもよい。また、乾式の場合、パッド部を、不織布、ガーゼ等により構成することができる。
【００２４】
培養上清は、例えば、凍結乾燥等の粉末剤の形でパッド部中に収容されてもよく、培養上清を液剤又はゲル剤としてパッド部中に染みこませた形態であってもよい。また、培養上清は予め絆創膏に備えてなくてもよく、例えば、粉末剤、液剤、ゲル剤、スプレー剤等の形態として、使用時に絆創膏の粘着剤層又はパッド部に塗布・付着させてから、適用してもよい。
【実施例】
【００２５】
＜培養上清の調製＞
脂肪組織由来の培養上清の調製を行った。まず、ヒト由来の脂肪組織を皮下から採取し、コレゲナーゼ処理によって間葉系幹細胞を分離した後、間葉系幹細胞を無血清培養液の存在下でＣＯ２インキュベ−タ内の培養シャーレ内で培養した。培養開始から数日後、１培養上清液を回収し、回収した培養上清液についてフィルターろ過により滅菌処理を行い、残存ウイルスのチェックを行った上で実施例１に係る培養上清を凍結乾燥した。
【００２６】
凍結乾燥した培養上清１ｍｌを生理食塩水で１０ｍｌに希釈し、０．１ｍｌずつに分注して、後述の「肥厚性瘢痕形成抑制効果の評価」の試験に用いた。
【００２７】
【表１】
2018052897.tif 000002
【００２８】
＜肥厚性瘢痕形成抑制効果の評価＞
実施例１の培養上清と、比較例１としてフィブロブラスト（ＦＧＦ２）（トラフェルミン（遺伝子組換え）、科研製薬）を準備し、実施例１と比較例１を用いて、創傷の治癒効果・肥厚性瘢痕形成抑制効果の評価を行った。具体的には、以下の手順で評価を行った。
【００２９】
被験者５人の右手、左手の両方の人差し指（Ａ）、中指（Ｂ）、薬指（Ｃ）について（（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）はそれぞれｎ＝１０）、メスにより長さ１ｃｍ、深さ３ｍｍの傷をつけた。薬指（Ｃ）の傷については、乾式の絆創膏のパッド部に上記の分注した実施例１に係る上清０．１ｍｌを染みこませてから、絆創膏を傷口に貼り付けた。中指（Ｂ）の傷については、比較例１のフィブロブラストを、用法に従って１００μｇを１ｍｌに溶解し、絆創膏のパッド部に２回噴霧（フィブロブラスト１２μｇ相当）して染みこませてから、絆創膏を傷口に貼り付けた。人差し指（Ａ）の傷については、乾式の絆創膏（コントロール）をそのまま傷口に貼り付けた。全ての人差し指（Ａ）、中指（Ｂ）、薬指（Ｃ）について、１日１回、絆創膏を貼り替え（薬指（Ｃ）については、実施例１に係る上清０．１ｍｌを絆創膏のパッド部に染みこませた上で貼り替え、中指（Ｂ）については、比較例１のフィブロブラスト１００μｇを１ｍｌに溶解し、絆創膏のパッド部に２回噴霧（フィブロブラスト１２μｇ相当）して染みこませた上で貼り替え）、これを連続して５日行った。
【００３０】
被験者５人の右手、左手の両方の人差し指（Ａ）、中指（Ｂ）、薬指（Ｃ）について傷をつけてから、経時的に「傷の治り」、「傷の発赤」、「肥厚性瘢痕」について評価した。その結果を以下の表２〜４に示す。表２は、１０本の（Ａ）〜（Ｃ）の指のうち、傷の治りが観察されたそれぞれの指の数を示す。表３は、１０本の（Ａ）〜（Ｃ）の指のうち、傷の発赤が観察されたそれぞれの指の数を示す。表４は、１０本の（Ａ）〜（Ｃ）の指のうち、肥厚性瘢痕が観察されたそれぞれの指の数を示す。なお、傷口の発赤がなくなったことは、炎症が抑制されたことを意味する。
【００３１】
【表２】
2018052897.tif 000003
【００３２】
【表３】
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【００３３】
【表４】
2018052897.tif 000005
【００３４】
表２に示すように実施例１に係る上清を使用した薬指（Ｃ）において、最も傷の治りが早かった。さらに、表３に示すように、実施例１に係る上清を使用した薬指（Ｃ）においては傷の治りが早かったにもかかわらず、比較例１のフィブロブラストを使用した中指（Ｂ）より、発赤を早く抑制できた。また、表４に示すように、実施例１に係る上清を使用した薬指（Ｃ）においては、比較例１のフィブロブラストを使用した中指（Ｂ）より、肥厚性瘢痕の数が少なく、また、肥厚性瘢痕がなくなるのも早かった。この結果より、間葉系幹細胞の培養上清を用いることで、創傷治癒をしつつ、肥厚性瘢痕の形成を抑制できることがわかった。