(57)【要約】【課題】従来の糖尿病治療剤とは作用機序が異なる新たな糖尿病治療剤、および、当該糖尿病治療剤のスクリーニング方法を提供する。【解決手段】ＳＮＡＰ２３の機能を阻害する物質を有効成分として含有する糖尿病治療剤を用いる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＮＡＰ２３の機能を阻害する物質を有効成分として含有する、糖尿病治療剤。
【請求項２】
上記物質は、アリルスクシニル基、ベンゾチアゾール環を含むアルキル基、または、その両方を有する下記（１）にて示されるスピロケタール環含有化合物である、請求項１に記載の糖尿病治療剤；
【化１】
2018168132.tif 000012
上記（１）にて示される化合物において、
Ｒ１は、Ｈ、Ｍｅ、または、ｎ−Ｂｕであり、
Ｒ２は、下記（２）にて示される群より選択される何れか１つであり、
【化２】
2018168132.tif 000013
Ｒ３は、下記（３）にて示される群より選択される何れか１つであり、
【化３】
2018168132.tif 000014
Ｒ４は、Ｈ、または、ｎ−Ｂｕであり、
Ｒ５は、下記（４）にて示される群より選択される何れか１つであり、
【化４】
2018168132.tif 000015
ｎは、１または２である。
【請求項３】
上記物質は、下記（５）にて示される群より選択される何れか１つの化合物である、請求項２に記載の糖尿病治療剤。
【化５】
2018168132.tif 000016
【請求項４】
採取された細胞に、被検物質を接触させる工程と、
上記細胞におけるＳＮＡＰ２３の機能阻害を検出する工程と、を有する、糖尿病治療剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖尿病治療剤および糖尿病治療剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病を患う患者は、発症前の患者を含めて膨大な数存在し、糖尿病は、国が医療対策に重点をおいている５大疾患のうちの１つに指定されている。
【０００３】
糖尿病を患う患者では、高血糖自体による症状のみならず、様々な合併症が発症する。合併症としては、糖尿病神経障害、糖尿病網膜症、および、糖尿病腎症を挙げることができ、糖尿病治療の主な目的は、これらの合併症を防ぐことにあるといえる。
【０００４】
合併症の中で早期に発症するのは糖尿病神経障害であり、糖尿病神経障害では、手足の先端に痛みやしびれの症状が現れる。糖尿病神経障害が進行すると、手足の感覚が鈍くなるため、手足に傷や火傷を負っても気づかず、手足を切断しなければならない事態を招きかねない。
【０００５】
糖尿病網膜症は、緑内障と並ぶ、失明の主要な原因の１つである。糖尿病網膜症では、初期症状が現れないことが多いため、自覚症状を感じた時には、糖尿病網膜症が進行している場合が多い。
【０００６】
糖尿病腎症は、高血糖によって腎臓の糸球体が硬化して腎臓の機能（例えば、老廃物の濾過機能）が損なわれることによって起こり、糖尿病腎症を患うと、多くの場合、人工透析を受ける必要が生じる。
【０００７】
以上のように、糖尿病を患う患者では様々な症状が発症し、これによって、患者のクオリティオブライフが著しく損なわれることになる。それ故に、現在、糖尿病を治療するための様々な方法の開発が進められている（例えば、特許文献１を参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０１７−５２７８７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、上述のような従来技術は糖尿病の治療にある程度の効果をあげることができるものの、いまだ十分とは言えず、従来とは作用機序が異なる新たな糖尿病治療剤の開発が望まれていた。
【００１０】
本発明の一態様は、従来の糖尿病治療剤とは作用機序が異なる新たな糖尿病治療剤、および、当該糖尿病治療剤のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、ＳＮＡＰ２３（Synaptosomal-associated protein 23）の機能を解析する過程において、ランゲルハンス島ベータ細胞特異的にＳＮＡＰ２３遺伝子を欠損させたノックアウトマウスを作製したところ、当該ノックアウトマウスのランゲルハンス島ベータ細胞では、インスリンの分泌量が増加していることを見出した。従来、ＳＮＡＰ２３はホルモンなどの分泌を促進する機能を有していると考えられており、ＳＮＡＰ２３遺伝子を欠損させたノックアウトマウスでは、ホルモンなどの分泌量が低下することが期待されていた。しかしながら、本発明者のこの発見は、従来の考え方とは真逆の、驚くべき発見であった。本発明者は、この新たに見出された知見に基づいて、ＳＮＡＰ２３の機能を阻害する物質はインスリンの分泌量を増加させ、これによって糖尿病を治療できるのではないかとの独自の仮説を立て、当該仮説に基づいて鋭意検討し、本発明を完成させるに至った。
【００１２】
上記の課題を解決するために、本発明の一態様に係る糖尿病治療剤は、ＳＮＡＰ２３の機能を阻害する物質を有効成分として含有することを特徴としている。
【００１３】
本発明の一態様に係る糖尿病治療剤では、上記物質は、アリルスクシニル基、ベンゾチアゾール環を含むアルキル基、または、その両方を有する下記（１）にて示されるスピロケタール環含有化合物であることが好ましい；
【００１４】
【化１】
2018168132.tif 000002
【００１５】
上記（１）にて示される化合物において、
Ｒ１は、Ｈ、Ｍｅ（methyl）、または、ｎ−Ｂｕ（n-butyl）であり、
Ｒ２は、下記（２）にて示される群より選択される何れか１つであり、
【００１６】
【化２】
2018168132.tif 000003
【００１７】
Ｒ３は、下記（３）にて示される群より選択される何れか１つであり、
【００１８】
【化３】
2018168132.tif 000004
【００１９】
Ｒ４は、Ｈ、または、ｎ−Ｂｕであり、
Ｒ５は、下記（４）にて示される群より選択される何れか１つであり、
【００２０】
【化４】
2018168132.tif 000005
【００２１】
ｎは、１または２である。
【００２２】
本発明の一態様に係る糖尿病治療剤では、上記物質は、
【００２３】
【化５】
2018168132.tif 000006
【００２４】
上記（５）にて示される群より選択される何れか１つの化合物であることが好ましい。
【００２５】
上記の課題を解決するために、本発明の一態様に係る糖尿病治療剤のスクリーニング方法は、採取された細胞に、被検物質を接触させる工程と、上記細胞におけるＳＮＡＰ２３の機能阻害を検出する工程と、を有することを特徴としている。
【発明の効果】
【００２６】
本発明の一態様によれば、従来にない新たな機構による糖尿病治療薬を提供することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】（Ａ）〜（Ｅ）は、本発明の実施例における、ＢｃＫＯマウスの解析結果を示すグラフである。
【図２】（Ａ）〜（Ｅ）は、本発明の実施例における、ＢｃＫＯマウスの解析結果を示すグラフである。
【図３】（Ａ）〜（Ｃ）は、本発明の実施例における、タンパク質複合体の形成能に関する試験結果を示す図である。
【図４】（Ａ）〜（Ｄ）は、本発明の実施例における、ＳＮＡＰ２３タンパク質への結合能を有する化合物の効果を示すグラフである。
【図５】（Ａ）〜（Ｃ）は、本発明の実施例における、ＭＦ２８６の効果を示すグラフである。
【図６】（Ａ）〜（Ｄ）は、本発明の実施例における、ＭＦ２８６の効果を示すグラフである。
【図７】（Ａ）および（Ｂ）は、本発明の実施例における、ＭＦ２８６およびＭＦ２８６類似化合物の効果を示すグラフである。
【図８】本発明の実施例における、ＭＦ２８６類似化合物の効果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明の一実施形態について以下に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。本発明は、以下に説明する各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献及び特許文献の全てが、本明細書中において参考文献として援用される。また、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ〜Ｂ」は、「Ａ以上、Ｂ以下」を意図する。また、本明細書において、特に明記しない限り、「ＳＮＡＰ２３」は、「ＳＮＡＰ２３タンパク質」および「ＳＮＡＰ２３遺伝子」の両方を意図する。
【００２９】
〔１．糖尿病治療剤〕
本発明の一態様に係る糖尿病治療剤は、ＳＮＡＰ２３（例えば、ランゲルハンス島ベータ細胞で発現しているＳＮＡＰ２３）の機能を阻害する物質を有効成分として含有していることを特徴としている。以下、上記物質につき、「機能阻害物質」と称する場合もある。
【００３０】
ＳＮＡＰ２３の機能としては、ランゲルハンス島ベータ細胞におけるインスリンの分泌抑制が挙げられる。それ故に、本明細書において「ＳＮＡＰ２３の機能阻害物質」とは、ランゲルハンス島ベータ細胞におけるインスリンの分泌を促進する物質を意図する。
【００３１】
上記機能阻害物質は、ＳＮＡＰ２３タンパク質の機能（例えば、分泌顆粒の融合の促進および／または阻害における機能）を阻害するものであってもよいし、ＳＮＡＰ２３遺伝子（例えば、ＳＮＡＰ２３タンパク質をコードするＤＮＡ、または、ＳＮＡＰ２３タンパク質をコードするＲＮＡ）の機能（例えば、ＤＮＡからｍＲＮＡへの転写機能、および、ｍＲＮＡからタンパク質への翻訳機能など）を阻害するものであってもよい。なお、上記機能阻害物質によって阻害される機能の程度は、特に限定されない。例えば、機能阻害物質の非存在下での機能を１００％とした場合、機能阻害物質によって、９５％以下、９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、または、１０％以下にまで機能が阻害され得る。
【００３２】
上記機能阻害物質としては、例えば、（ｉ）ＳＮＡＰ２３タンパク質に結合してＳＮＡＰ２３タンパク質の機能を阻害する化合物、（ｉｉ）ＳＮＡＰ２３遺伝子に結合してＳＮＡＰ２３遺伝子の機能を阻害する化合物、（ｉｉｉ）ＳＮＡＰ２３遺伝子（例えば、ＳＮＡＰ２３をコードするｍＲＮＡ）の分解を促進する化合物（例えば、ＲＮＡ）、（ｉｖ）ＳＮＡＰ２３タンパク質の中和抗体、などを挙げることができる。
【００３３】
例えば、上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の化合物、および、上記（ｉｖ）の中和抗体は、ＳＮＡＰ２３タンパク質の機能、および／または、ＳＮＡＰ２３遺伝子の機能を阻害するものであればよく、公知の方法によって作製された物質を用いることも可能であるし、市販の物質を用いることも可能である。
【００３４】
まず、上記（ｉ）の化合物の一例について説明する。しかしながら、本発明は、これらの化合物に限定されない。
【００３５】
本発明の一態様に係る糖尿病治療剤では、上記機能阻害物質は、下記（１）にて示される化合物であり得る；
【００３６】
【化６】
2018168132.tif 000007
【００３７】
アリルスクシニル基、ベンゾチアゾール環を含むアルキル基、または、その両方を有する上記（１）にて示されるスピロケタール環含有化合物において、
Ｒ１は、Ｈ、Ｍｅ、または、ｎ−Ｂｕであり、
Ｒ２は、下記（２）にて示される群より選択される何れか１つであり、
【００３８】
【化７】
2018168132.tif 000008
【００３９】
Ｒ３は、下記（３）にて示される群より選択される何れか１つであり、
【００４０】
【化８】
2018168132.tif 000009
【００４１】
Ｒ４は、Ｈ、または、ｎ−Ｂｕであり、
Ｒ５は、下記（４）にて示される群より選択される何れか１つであり、
【００４２】
【化９】
2018168132.tif 000010
【００４３】
ｎは、１または２である。
【００４４】
上記（１）にて示される化合物は、ＳＮＡＰ２３の機能阻害効果が高い。それ故に、上記（１）にて示される化合物を用いれば、効果的に糖尿病を治療することができる。
【００４５】
本発明の一態様に係る糖尿病治療剤では、上記機能阻害物質は、
【００４６】
【化１０】
2018168132.tif 000011
【００４７】
上記（５）にて示される群より選択される何れか１つの化合物であってもよい。
【００４８】
なお、上記（５）に示される化合物の名称は、上から順に、ＭＦ２８６、ＭＦ２８６’、ＭＦ３４６−２０、Ｓ１３２９１２ＴＭ４３６２、および、ＴＭ５４１−１である。
【００４９】
上記（５）にて示される群より選択される何れか１つの化合物を用いれば、効果的に糖尿病を治療することができる。
【００５０】
上記（ｉｉ）の化合物としては、より具体的に、ＳＮＡＰ２３遺伝子の塩基配列と相補的な塩基配列を有する核酸を挙げることができる。当該核酸であれば、ＳＮＡＰ２３遺伝子と二重鎖を形成することによって、ＳＮＡＰ２３遺伝子からの転写および／または翻訳を阻害することができる。当該核酸の長さ、および、塩基配列は、限定されず、所望の長さ、および、所望の塩基配列であり得る。このような核酸は、市販の核酸合成機を用いて合成することができる。
【００５１】
上記（ｉｉｉ）の化合物としては、より具体的に、ＲＮＡｉ（RNA interference）を引き起こすＲＮＡを挙げることができる。当該ＲＮＡの長さ、および、塩基配列は、限定されず、所望の長さ、および、所望の塩基配列であり得る。このようなＲＮＡは、市販の核酸合成機を用いて合成することができる。
【００５２】
上記（ｖｉ）の中和抗体（例えば、分泌顆粒の融合の促進および／または阻害における機能を中和する抗体）は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、または、これらの断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、または、Ｆｖ）であってもよい。上記中和抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、または、これらの断片であってもよい。
【００５３】
上記中和抗体は、周知の方法（例えば、（１）ＨａｒＬｏｗら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）」、および、（２）岩崎ら、「単クローン抗体  ハイブリドーマとＥＬＩＳＡ、講談社（１９９１）」）にしたがって作製することができる。勿論、市販の抗体を用いることも可能である。
【００５４】
モノクローナル抗体は、当該分野において周知の方法（例えば、（１）ハイブリドーマ法（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，４９５−４９７（１９７５））、（２）トリオーマ法、（３）ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４，７２（１９８３））、および、（４）ＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ  Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，７７−９６（１９８５）））にしたがって作製することができる。
【００５５】
キメラ抗体とは、定常領域がヒトの抗体の定常領域に置き換えられている抗体を意図する。キメラ抗体は、周知方法にしたがって作製され得る（例えば、欧州特許公開公報ＥＰ０１２５０２３を参照）。
【００５６】
ヒト化抗体とは、Ｈ鎖およびＬ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ：complementarity determining region）以外がヒトの抗体の構造に置き換えられている抗体を意図する。
【００５７】
ヒト抗体とは、ヒトの抗体生産に関与する遺伝子が導入されたトランスジェニック動物を用いて作製された抗体を意図する（例えば、欧州特許公開公報ＥＰ０５４６０７３を参照）。
【００５８】
Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、および、Ｆｖは、抗体の全体をプロテアーゼ（例えば、パパイン、または、ペプシン）によって分解し、必要に応じて、分解物を更に還元することによって得ることができる。また、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、および、Ｆｖは、抗体を生産するハイブリドーマから、これらのｃＤＮＡを単離し、当該ｃＤＮＡを発現ベクターに挿入し、当該発現ベクターを宿主に導入することによって得ることができる。この場合には、抗体フラグメントは、抗体フラグメントと別のタンパク質との融合タンパク質として得ることもできる。
【００５９】
本発明の一態様に係る糖尿病治療剤に含有されている有効成分の量は、特に限定されず、例えば、糖尿病治療剤を１００重量％とした場合に、０．００１重量％〜１００重量％、０．０１重量％〜１００重量％、０．１重量％〜１００重量％、０．１重量％〜９５重量％、０．１重量％〜９０重量％、０．１重量％〜８０重量％、０．１重量％〜７０重量％、０．１重量％〜６０重量％、０．１重量％〜５０重量％、０．１重量％〜４０重量％、０．１重量％〜３０重量％、０．１重量％〜２０重量％、または、０．１重量％〜１０重量％であってもよい。
【００６０】
本発明の一態様に係る糖尿病治療剤に含有されている有効成分の量は、特に限定されず、例えば、０．０１ｍｇ〜１０００ｍｇ、０．１ｍｇ〜１０００ｍｇ、１ｍｇ〜１０００ｍｇ、１ｍｇ〜９００ｍｇ、１ｍｇ〜８００ｍｇ、１ｍｇ〜７００ｍｇ、１ｍｇ〜６００ｍｇ、１ｍｇ〜５００ｍｇ、１ｍｇ〜４００ｍｇ、１ｍｇ〜３００ｍｇ、１ｍｇ〜２００ｍｇ、または、１ｍｇ〜１００ｍｇであってもよい。
【００６１】
本発明の一態様に係る糖尿病治療剤は、有効成分以外の成分（例えば、薬学的に受容可能なキャリア）を含んでいてもよい。有効成分以外の成分としては、本発明の一態様に係る糖尿病治療剤が固形製剤である場合には、賦形剤、滑沢剤、結合剤および崩壊剤を挙げることができ、本発明の一態様に係る糖尿病治療剤が液状製剤である場合には、溶剤、溶解補助剤、懸濁剤、等張化剤、緩衝剤および無痛化剤を挙げることができる。その他、有効成分以外の成分として、防腐剤、抗酸化剤および安定化剤も挙げることができる。
【００６２】
上記「賦形剤」としては、例えば、乳糖、白糖、Ｄ−マンニトール、キシリトール、ソルビトール、エリスリトール、デンプンおよび結晶セルロースを挙げることが、これらに限定されない。
【００６３】
上記「滑沢剤」としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ワックス、タルクおよびコロイドシリカを挙げることが、これらに限定されない。
【００６４】
上記「結合剤」としては、例えば、α化デンプン、メチルセルロース、結晶セルロース、白糖、Ｄ−マンニトール、トレハロース、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびポリビニルピロリドンを挙げることが、これらに限定されない。
【００６５】
上記「崩壊剤」としては、例えば、デンプン、カルボキシメチルセルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウムおよびカルボキシメチルスターチナトリウムを挙げることが、これらに限定されない。
【００６６】
上記「溶剤」としては、例えば、注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油およびトリカプリリンを挙げることが、これらに限定されない。
【００６７】
上記「溶解補助剤」としては、例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、トレハロース、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウムおよびクエン酸ナトリウムを挙げることが、これらに限定されない。
【００６８】
上記「懸濁剤」としては、例えば、界面活性剤（例えば、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリン）および親水性高分子（例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース）を挙げることが、これらに限定されない。
【００６９】
上記「等張化剤」としては、例えば、塩化ナトリウム、グリセリンおよびＤ−マンニトールを挙げることが、これらに限定されない。
【００７０】
上記「緩衝剤」としては、例えば、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩およびクエン酸塩を挙げることが、これらに限定されない。
【００７１】
上記「無痛化剤」としては、例えば、ベンジルアルコールを挙げることが、これに限定されない。
【００７２】
上記「防腐剤」としては、例えば、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸およびソルビン酸を挙げることが、これらに限定されない。
【００７３】
上記「抗酸化剤」としては、例えば、亜硫酸塩およびアスコルビン酸を挙げることが、これらに限定されない。
【００７４】
上記「安定化剤」としては、製薬分野において通常用いられるものであればよく、特に限定されない。
【００７５】
本発明の一態様に係る糖尿病治療剤に含有されている有効成分以外の成分の量は、特に限定されず、例えば、糖尿病治療剤を１００重量％とした場合に、０重量％〜９９．９９９重量％、０重量％〜９９．９９重量％、０重量％〜９９．９重量％、５重量％〜９９．９重量％、１０重量％〜９９．９重量％、２０重量％〜９９．９重量％、３０重量％〜９９．９重量％、４０重量％〜９９．９重量％、５０重量％〜９９．９重量％、６０重量％〜９９．９重量％、７０重量％〜９９．９重量％、８０重量％〜９９．９重量％、または、９０重量％〜９９．９重量％であってもよい。
【００７６】
本発明の一態様に係る糖尿病治療剤に含有されている有効成分以外の成分の量は、特に限定されず、例えば、０．０１ｍｇ〜１０００ｍｇ、０．１ｍｇ〜１０００ｍｇ、１ｍｇ〜１０００ｍｇ、１ｍｇ〜９００ｍｇ、１ｍｇ〜８００ｍｇ、１ｍｇ〜７００ｍｇ、１ｍｇ〜６００ｍｇ、１ｍｇ〜５００ｍｇ、１ｍｇ〜４００ｍｇ、１ｍｇ〜３００ｍｇ、１ｍｇ〜２００ｍｇ、または、１ｍｇ〜１００ｍｇであってもよい。
【００７７】
本発明の一態様に係る糖尿病治療剤の投与方法は、特に限定されず、経口的に投与されてもよいし、非経口的に、静脈内、直腸内、腹腔内、筋肉内、鼻内または皮下に投与されてもよい。
【００７８】
本発明の一態様に係る糖尿病治療剤の剤形は、特に限定されず、例えば、注射剤（例えば、腹腔内注射、静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、または、点滴注射剤）、点鼻剤、または、坐剤であってもよい。
【００７９】
〔２．糖尿病治療剤のスクリーニング方法〕
本発明の一態様に係る糖尿病治療剤のスクリーニング方法は、採取された細胞に、被検物質を接触させる工程と、上記細胞におけるＳＮＡＰ２３の機能阻害を検出する工程と、を有することを特徴としている。
【００８０】
被検物質は、糖尿病治療剤に含まれる有効成分の候補となる物質であって、その具体的な構成は、限定されない。被検物質は、低分子化合物、または、高分子化合物であってもよい。また、被検物質は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、糖、または、これらの複合体であってもよい。
【００８１】
採取された細胞は、インスリンを生産、および／または、インスリンを分泌する細胞であればよく、特に限定されない。採取された細胞は、生体から採取されたままの細胞であってもよいし、生体から採取された後、株化された細胞であってもよい。採取された細胞としては、例えば、ランゲルハンス島ベータ細胞を挙げることができる。
【００８２】
採取された細胞に、被検物質を接触させる工程は、例えば、液体培地中で培養されている細胞に被検物質を添加することによって行うことができる。液体培地は、特に限定されず、用いる細胞に応じて、適宜、選択することができる。液体培地中の被検物質の濃度は、特に限定されず、被検物質に応じて、適宜、選択することができる。
【００８３】
本発明の一態様に係る糖尿病治療剤のスクリーニング方法では、採取された細胞に被検物質を接触させた後、必要に応じて当該細胞を更に培養し、その後、当該細胞におけるＳＮＡＰ２３の発現を検出する工程を行う。
【００８４】
ＳＮＡＰ２３の機能阻害を検出する工程では、上述したとおり、ＳＮＡＰ２３の機能として、ランゲルハンス島ベータ細胞におけるインスリンの分泌抑制を挙げることができ、その機能阻害を検出する方法を挙げることができる。また、機能阻害を検出する方法としては、後述する実施例に示すように、例えば、ランゲルハンス島ベータ細胞におけるインスリンの分泌の増加を指標とすることができる。
【００８５】
また、上述した方法以外に、例えば、ＳＮＡＰ２３タンパク質の発現を検出してもよいし、ＳＮＡＰ２３のｍＲＮＡの発現を検出してもよい。ＳＮＡＰタンパク質の発現を検出する場合には、ウエスタンブロッティング法、ＥＬＩＳＡ法（enzyme-linked immunosorbent assay）、免疫組織化学、または、免疫蛍光抗体法などの周知の方法を用いればよい。ＳＮＡＰ２３のｍＲＮＡの発現を検出する場合には、ＰＣＲ法（polymerase chain reaction）、ノーザンブロッティング法、または、in situ hybridization法などの周知の方法を用いればよい。
【００８６】
ＳＮＡＰ２３の発現が低下すれば、インスリンの分泌量が増加すると考えられる。それ故に、ＳＮＡＰ２３の発現を低下させることができる被検物質は、糖尿病治療剤に含有される有効成分として用いることができる。
【００８７】
それ故に、ＳＮＡＰ２３の機能阻害または発現を検出する工程において、被検物質と接触していない細胞におけるＳＮＡＰ２３の機能あるいは発現量を１００％とした場合、被検物質と接触させた細胞におけるＳＮＡＰ２３の機能あるいは発現量が、９５％以下、好ましくは９０％以下、より好ましくは８０％以下、より好ましくは７０％以下、より好ましくは６０％以下、より好ましくは５０％以下、より好ましくは４０％以下、より好ましくは３０％以下、より好ましくは２０％以下、最も好ましくは１０％以下にまで低下していれば、当該被検物質を糖尿病治療剤に含有される有効成分として選択することができる。
【実施例】
【００８８】
＜１．ＳＮＡＰ２３遺伝子のノックアウトマウスの作製＞
周知の方法にしたがって、ランゲルハンス島のベータ細胞特異的にＳＮＡＰ２３遺伝子を欠損させたノックアウトマウスを作製した。なお、ノックアウトマウスの詳細については、「Masataka Kunii et al., “Opposing roles for SNAP23 in secretion in exocrine and endocrine pancreatic cells” Journal of Cell Biology, Vol.215, No.1, 121-138」を参照のこと。なお、当該文献は、参考として本明細書中に援用される。
【００８９】
具体的に、ランゲルハンス島のベータ細胞特異的にＳＮＡＰ２３遺伝子を欠損させたノックアウトマウス（以下、ＢｃＫＯマウスと呼ぶ）（ＲＩＰ−Ｃｒｅ；Ｓｎａｐ２３ｆｌｏｘｅｄ／−  ｏｒ  ｆｌｏｘｅｄ／ｆｌｏｘｅｄ）は、Ｓｎａｐ２３  ｆｌｏｘｅｄマウス（Ｓｎａｐ２３ｆｌｏｘｅｄ／−  ｏｒ  ｆｌｏｘｅｄ／ｆｌｏｘｅｄ）と、ラットインスリン遺伝子プロモーターによってＣｒｅを発現するＲＩＰ−Ｃｒｅマウス（Herrera, P. L. （2001） Adult insulin- and glucagon-producing cells differentiate from two independent cell lineages. Development 127: 2317-2322、および、Kitamura, T., Y. Ido - Kitamura, M. Kobayashi, O. Kikuchi, T. Sasaki, R. A. DePinho, and D. Accili. （2009） Regulation of pancreatic juxtaductal endocrine cell formation by FoxO1. Mol Cell Biol 29: 4417-4430を参照）と、の交配によって得た。
【００９０】
＜２．ＢｃＫＯマウスの解析＞
対照試験用のマウスおよびＢｃＫＯマウスに関して、絶食時および自由摂食時における、血糖値および血漿中インスリン濃度を測定した。なお、血糖値および血漿中インスリン濃度は、公知の方法に従って測定した（例えば、Gomi, H., S. Mizutani, K. Kasai, S. Itohara, and T. Izumi. (2005) Granuphilin molecularly docks insulin granules to the fusion machinery. J Cell Biol 171: 99-109を参照）。その結果を、図１の（Ａ）および（Ｂ）に示す。なお、図１の（Ａ）および（Ｂ）において、「Ｆｒｅｅ」は、自由摂食時のデータを示し、「Ｒｅｓｔ」は、２時間絶食したときのデータを示し、「Ｆａｓｔ」は、１８時間絶食したときのデータを示し、「Ｒｅｆｅｄ」は、１８時間絶食後に再度、自由摂食させた時のデータを示している。
【００９１】
図１の（Ａ）に示すように、対照試験用のマウス（Ｃｔｒｌ）とＢｃＫＯマウスとでは、最初の自由摂食時、および、絶食時における血糖値は、略同じであった。一方、１８時間絶食後に再度、自由摂食させた時は、ＢｃＫＯマウスの血糖値が、対照試験用のマウスの血糖値よりも低かった。
【００９２】
更に、図１の（Ｂ）に示すように、１８時間絶食後に再度、自由摂食させた時は、ＢｃＫＯマウスの血漿中インスリン濃度は、対照試験用のマウスの血漿中インスリン濃度の２倍以上に増加した。
【００９３】
ＳＮＡＰ２３の機能をさらに解析するため、グルコース負荷試験（ＩＰＧＴＴ）を行った。なお、グルコース負荷試験は、公知の方法に従って行った（例えば、Gomi, H., S. Mizutani, K. Kasai, S. Itohara, and T. Izumi. (2005) Granuphilin molecularly docks insulin granules to the fusion machinery. J Cell Biol 171: 99-109を参照）。
【００９４】
具体的に、血糖値は、グルコースおよびインスリンを腹腔内投与し（１  ｇ／ｋｇ  ｗｅｉｇｈｔ、または、０．７５  Ｕ／ｋｇ  ｗｅｉｇｈｔ）、１５分、３０分、６０分および１２０分後に、ＡＣＣＵ−ＣＨＥＫ（Roche）またはＧｌｕｔｅｓｔ  Ｎｅｏ  Ｓｕｐｅｒ（Sanwa Kagaku Kenkyusyo）を用いて測定した。一方、血漿中インスリン濃度は、グルコースを腹腔内投与し、１５分、３０分、６０分後の血漿をＬＢＩＳ  ｍｏｕｓｅ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Shibayagi）によって解析することにより、測定した。
【００９５】
その結果を、図１の（Ｃ）〜（Ｅ）に示す。図１の（Ａ）および（Ｂ）の結果と同様、グルコース投与による血糖値の上昇は、ＢｃＫＯマウスでは有意に抑制された（図１の（Ｃ）を参照）。また、グルコースを腹腔内投与してから１５分後のインスリン分泌量は、ＢｃＫＯマウスでは劇的に増加していた（図１の（Ｄ）を参照）。一方、末梢組織のインスリン感受性を測るインスリン負荷試験（ＩＴＴ）では、対照試験用のマウスとＢｃＫＯマウスとの間に差異が認められなかったため（図１の（Ｅ）を参照）、ＢｃＫＯマウスにおけるＩＰＧＴＴの結果は、インスリンの分泌量の増加によるものであると示唆された。
【００９６】
インスリン開口放出の動態に関する正確な情報を得るため、マウスからランゲルハンス島を単離し、インスリン分泌を解析した。マウスからのランゲルハンス島の単離は、公知の方法に従ってコラゲナーゼ消化によって行った（例えば、Ohara-Imaizumi, M., C. Nishiwaki, T. Kikuta, S. Nagai, Y. Nakamichi, and S. Nagamatsu. (2004) TIRF imaging of docking and fusion of single insulin granule motion in primary rat pancreatic beta-cells: different behaviour of granule motion between normal and Goto-Kakizaki diabetic rat beta-cells. Biochem J 381: 13-18を参照）。
【００９７】
一定時間内のインスリン分泌量の測定では、同じサイズの１０個のランゲルハンス島を、１１０ｍＭ  ＮａＣｌ、４．４ｍＭ  ＫＣｌ、１．４５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１．２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、２．３ｍＭ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｇｌｕｃｏｎａｔｅ、４．８ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、２．２ｍＭ  ｇｌｕｃｏｓｅ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、および、０．３%  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎを含むＫｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ緩衝液（ＫＲＢ）中で３０分間インキュベーションした後、２．２ｍＭまたは１６．７ｍＭのグルコースを含む１ｍＬのＫＲＢ中で更にインキュベーションした。３０分後、２００μＬの上清をインスリン量の測定に使用した。
【００９８】
灌流実験では同じサイズの４０個のランゲルハンス島を使用した。２．８ｍＭグルコースを含むＫＲＢを用いて流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで３０分間灌流したのち、２２ｍＭグルコースを用いて３０分間刺激した。インスリンの分泌量および細胞内含有量は、ｉｎｓｕｌｉｎ  ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Morinaga）を用いて測定した。
【００９９】
ランゲルハンス島を低濃度（２．２ｍＭ）のグルコースで刺激した際、ＢｃＫＯマウスのランゲルハンス島から分泌されたインスリンの量は、対照試験用のマウスのランゲルハンス島から分泌されたインスリンの量と同等であった。しかし、ランゲルハンス島を高濃度（１６．７ｍＭ）のグルコースで刺激すると、ＢｃＫＯマウスのランゲルハンス島から分泌されたインスリンの量は、対照試験用のマウスのランゲルハンス島から分泌されたインスリンの量と比べて、有意に多かった（図２の（Ａ）を参照）。
【０１００】
インスリン分泌の過程には、少なくとも、１段階目の速い分泌と、２段階目の持続的な分泌との、２つの段階がある。この分泌過程を調べるために、単離したランゲルハンス島を用いて灌流実験を行った。
【０１０１】
その結果、ＢｃＫＯマウスのランゲルハンス島から分泌されるインスリンでは、１段階目の分泌のみが増加していた（図２の（Ｂ）および（Ｃ）を参照）。
【０１０２】
更に、ベータ細胞にＧＦＰを付加したインスリンを発現させ、全反射顕微鏡（ＴＩＲＦＭ）を用いて開口放出過程を観察した。
【０１０３】
その結果、ＢｃＫＯマウスのベータ細胞では、すでに細胞膜とドッキングしている顆粒との融合のみが増加しており、細胞膜から離れた顆粒と細胞膜との融合は同じであった（図２の（Ｅ）および（Ｄ）を参照）。これらの結果は、ＳＮＡＰ２３が、１段階目のドッキング顆粒の融合を阻害していることを示唆している。
【０１０４】
多くのＳＮＡＲＥ蛋白質の中で、ＶＡＭＰ２、ｓｙｎｔａｘｉｎ１Ａ、および、ＳＮＡＰ２５は、インスリン顆粒と細胞膜との融合に関与することが知られている。また、ＳＮＡＰ２５−ＶＡＭＰ２−ｓｙｎｔａｘｉｎ１Ａ複合体は、お互いが強固に結合し、ＳＮＡＰ２３−ＶＡＭＰ２−ｓｙｎｔａｘｉｎ１Ａ複合体よりも、効率よく膜融合を起こすことも知られている。
【０１０５】
そこで、ＳＮＡＰ２３が、ＳＮＡＰ２５と、ｓｙｎｔａｘｉｎ１ＡおよびＶＡＭＰ２との結合を競合阻害している可能性を検証した。
【０１０６】
具体的に、リコンビナントのＳＮＡＲＥ蛋白質を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける結合阻害実験を行った。様々な濃度のＨｉｓ−ＳＮＡＰ２３存在下で、ＧＳＴ−ＳＮＡＰ２５と、等モルのＨｉｓ−ＶＡＭＰ２およびＨｉｓ−ｓｙｎｔａｘｉｎ１Ａとの結合を解析した。
【０１０７】
図３の（Ａ）に示すように、ＳＮＡＰ２３は、ＳＮＡＰ２５−ｓｙｎｔａｘｉｎ１Ａ−ＶＡＭＰ２複合体の形成を阻害した。
【０１０８】
ＢｃＫＯマウスのランゲルハンス島において、ＳＮＡＰ２５と、ｓｙｎｔａｘｉｎ１ＡおよびＶＡＭＰ２の発現レベルに変化はなかった。しかし、免疫沈降法では、ＳＮＡＰ２３の欠損によって、ＳＮＡＰ２５と共に免疫沈降するＶＡＭＰ２の増加が認められた（図３の（Ｂ）および（Ｃ）を参照）。この結果は、ＳＮＡＰ２３の欠損によって、ＳＮＡＰ２５−ＶＡＭＰ２−ｓｙｎｔａｘｉｎ１Ａ複合体の形成が増加し、それによってインスリン分泌が増加したことを示唆している。
【０１０９】
＜３．ＳＮＡＰ２３タンパク質への結合能を有する化合物のスクリーニング＞
ＧＳＴ−ＳＮＡＰ２３およびＧＳＴ−ＳＮＡＰ２５を用いて、理化学研究所天然化合物バンク（ＲＩＫＥＮ ＮＰＤｅｐｏ）の化合物ライブラリー（例えば、Zimmermann, T. J., M. Burger, E. Tashiro, Y. Kondoh, N. E. Martinez, K. Gormer, S. Rosin-Steiner, T. Shimizu, S. Ozaki, K. Mikoshiba, N. Watanabe, D. Hall, I. R. Vetter, H. Osada, C. Hedberg, and H. Waldmann. (2013) Boron-based inhibitors of acyl protein thioesterases 1 and 2. ChemBioChem 14: 115-122を参照）をスクリーニングし、ＳＮＡＰ２５よりもＳＮＡＰ２３に強く結合する５種類の化合物（♯１〜♯５）を同定した。
【０１１０】
なお、化合物のスクリーニングは、公知の方法に従って行った（例えば、Zimmermann, T. J., M. Burger, E. Tashiro, Y. Kondoh, N. E. Martinez, K. Gormer, S. Rosin-Steiner, T. Shimizu, S. Ozaki, K. Mikoshiba, N. Watanabe, D. Hall, I. R. Vetter, H. Osada, C. Hedberg, and H. Waldmann. (2013) Boron-based inhibitors of acyl protein thioesterases 1 and 2. ChemBioChem 14: 115-122、および、Hagiwara, K., Y. Kondoh, A. Ueda, K. Yamada, H. Goto, T. Watanabe, T. Nakata, H. Osada, and Y. Aida. (2010) Discovery of novel antiviral agents directed against the influenza A virus nucleoprotein using photo-cross-linked chemical arrays. Biochem Biophys Res Commun 394: 721-727を参照）。
【０１１１】
具体的に、２３，２７５種類の化合物を含む８枚のアレイに、ＧＳＴ−ＳＮＡＰ２３を含有する溶液、または、ＧＳＴ−ＳＮＡＰ２５を含有する溶液(２μＭ、５００μＬ)を加え、３０℃で１時間インキュベートした。アレイを洗浄した後、当該アレイに抗ＧＳＴ抗体を加え、３０℃で１時間インキュベートした。アレイを洗浄した後、当該アレイにＣｙ５で標識された二次抗体を加え、３０℃で１時間インキュベートした。その後、ＧｅｎｅＰｉｘ  ４３００Ａ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｓｃａｎｎｅｒ（Molecular Devices）を用いて、アレイ上における６３５ｎｍの蛍光を測定し、当該蛍光の強度に基づいて、ＳＮＡＰ２３タンパク質への結合能を有する化合物を同定した。
【０１１２】
ＭＩＮ６細胞にそれらの化合物を作用させ、インスリン分泌量を計測した。
【０１１３】
具体的に、９６−ｗｅｌｌプレートで培養したＭＩＮ６細胞に、各化合物（♯１〜♯５）を様々な濃度（３μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、または、３０μｇ／ｍＬ）にて添加し、一晩インキュベートした。
【０１１４】
ＭＩＮ６細胞の生存度は、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔ  Ｒｅａｇｅｎｔ ＳＦ（Nacalai Tesque）によって測定した。野生型マウスから単離したランゲルハンス島については、化合物♯２（０μＭ、０．００１μＭ、０．０１μＭ、０．１μＭ、１μＭ、または、１０μＭ）を添加してから、１時間インキュベートした。
【０１１５】
分泌されたインスリン量を測るため、ランゲルハンス島またはＭＩＮ６細胞をＫＲＢで３回洗浄し、これらを、２２ｍＭまたは１３．９ｍＭのグルコースを含むＫＲＢで１時間刺激した。インスリン量の測定には、ｒａｔ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  ＲＩＡ  ｋｉｔ（Millipore）、または、ＬＢＩＳ  ｍｏｕｓｅ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Shibayagi）を使用した。
【０１１６】
その結果、化合物♯２（具体的には、ＭＦ２８６）が、グルコース刺激に応じたインスリン分泌を有意に増加させた（図４の（Ａ）を参照）。ＭＩＮ６細胞の生存に対するこれらの化合物の影響は小さく、これらの化合物の毒性がインスリン分泌へ及ぼす影響は除外された（図４の（Ｂ）を参照）。
【０１１７】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の動態曲線は、ＭＦ２８６は、ＳＮＡＰ２３に結合し、かつ、ＳＮＡＰ２５にはほとんど結合しないことを示しており、インスリン分泌の増加は、ＳＮＡＰ２３を特異的に阻害した結果であることを示唆している（図４の（Ｃ）を参照）。
【０１１８】
ＭＦ２８６の添加は、単離したランゲルハンス島からのインスリン分泌も濃度依存的に増加させた（図４の（Ｄ）を参照）。ＭＦ２８６の濃度が非常に高いと、インスリン分泌の効果が少なくなるが、これは、初代培養のベータ細胞に対するＭＦ２８６の毒性のためであると考えられる。
【０１１９】
ＭＦ２８６のｉｎ  ｖｉｖｏでの効果を調べるために、ＭＦ２８６を野生型マウス（８週令のメスのＣ５７ＢＬ／６マウス）の腹腔内へ投与し(０．４ｍｇ／ｋｇ ｗｅｉｇｈｔ、または、４ｍｇ／ｋｇ ｗｅｉｇｈｔ)、ＩＰＧＴＴ、ＩＴＴ、および、血漿中インスリンの測定を行った。
【０１２０】
ＭＦ２８６を投与したマウスの血糖値は、ＰＢＳ（phosphate-buffered saline）を投与したマウスに比べて、グルコースを投与してから３０分後に有意に低値となった（図５の（Ａ）を参照）。さらに、血漿中インスリン濃度は、ＰＢＳを投与したマウスよりも、ＭＦ２８６を投与したマウスの方が増加した（図５の（Ｂ）を参照）。対照的に、ＩＴＴは、ＭＦ２８６の投与によって変化が見られなかった（図５の（Ｃ）を参照）。これらの結果は、ＭＦ２８６が、生体内においても、インスリン分泌の増加に効果があることを示唆している。
【０１２１】
ＭＦ２８６がインスリン分泌を増加させる分子メカニズムを解明するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＧＳＴプルダウンアッセイによって、ＳＮＡＲＥ複合体形成に対するＭＦ２８６の効果を検討した。
【０１２２】
ＭＦ２８６を、ＳＮＡＰ２３、ＶＡＭＰ２およびｓｙｎｔａｘｉｎ１Ａの混合液に加えたときに、ｓｙｎｔａｘｉｎ１Ａ−ＳＮＡＰ２３複合体に結合するＶＡＭＰ２の量が減少した（図６の（Ａ）の左側を参照）。対照的に、ＭＦ２８６を、ＳＮＡＰ２５、ＶＡＭＰ２およびｓｙｎｔａｘｉｎ１Ａの混合液に加えた場合は、ｓｙｎｔａｘｉｎ１Ａ−ＳＮＡＰ２５複合体に結合するＶＡＭＰ２の量は変わらなかった（図６の（Ａ）の右側を参照）。これらの結果は、ＭＦ２８６が、ＳＮＡＰ２３−ＶＡＭＰ２−ｓｙｎｔａｘｉｎ１Ａ複合体の形成を特異的に阻害することを示唆している。そして、その結果、ＳＮＡＰ２５−ＶＡＭＰ２−ｓｙｎｔａｘｉｎ１Ａ複合体の形成が増加し、インスリンの分泌量が増加すると考えられる。
【０１２３】
ＭＦ２８６の効果がＳＮＡＰ２３に特異的であることを確認するため、ＢｃＫＯマウスにＭＦ２８６を投与してＩＰＧＴＴを行った。もしＭＦ２８６がＳＮＡＰ２３以外の分子に作用することによって血糖値を低下させるとすれば、ＢｃＫＯマウスにおいても血糖値が低下すると考えられた。しかし、ＭＦ２８６を投与したＢｃＫＯマウスでは、ＰＢＳを投与したマウスと同様の血糖値を示した（図６の（Ｃ）を参照）。
【０１２４】
また、グルコース投与後の血漿中インスリン濃度についても、ＭＦ２８６を投与したＢｃＫＯマウスでは、ＰＢＳを投与したマウスと同様の血漿中インスリン濃度を示した（図６の（Ｄ）を参照）。これらの結果は、ＭＦ２８６の投与によるインスリン分泌の増加が、ＳＮＡＰ２３に由来することを示している。
【０１２５】
長期投与におけるＭＦ２８６の副作用について解析した。ＭＦ２８６を野生型マウスに１日１度、３０日間腹腔内投与した結果、血清生化学検査では、「Ｔｏｔａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ」、「Ａｌｂｕｍｉｎ」、「Ｂｌｏｏｄ  ｕｒｅａ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ」、「Ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ」、「Ｎａ」、「Ｋ」、「Ｃｌ」、「Ｃａ」、「Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ」、「Ａｓｐａｒｔａｔｅ  ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ」、「Ａｌａｎｉｎｅ  ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ」、「Ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ」、「Ａｍｙｌａｓｅ」、「Ｔｏｔａｌ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ」、「Ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅｓ」、「ＨＤＬ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ」、「Ｔｏｔａｌ  ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ」および「Ｇｌｕｓｏｓｅ」などについて、異常を示すことは無かった。また、種々の組織のＨＥ染色においても異常は認められなかった。これらの結果は、ＭＦ２８６が、副作用を起こし難い安全な化合物であることを示唆している。
【０１２６】
なお、図１〜図６において、「＊」はＰ＜０．０５を示し、「＊＊」はＰ＜０．０１を示し、「＊＊＊」はＰ＜０．００１を示している。
【０１２７】
＜４．ＭＦ２８６およびＭＦ２８６類似化合物に関する検討＞
ＭＦ２８６、ＭＦ２８６’、ＭＦ３４６−２０、Ｓ１３２９１２ＴＭ４３６２、および、ＴＭ５４１−１について、効果を検討した。
【０１２８】
まず、ＭＦ２８６、ＭＦ２８６’、および、ＤＭＳＯ（dimethyl sulfoxide）について、単離したマウス膵臓ランゲルハンス島からのインスリン分泌量の増加を試験した。その結果を、図７の（Ａ）に示す。
【０１２９】
図７の（Ａ）から明らかなように、対照試験のＤＭＳＯに比べて、ＭＦ２８６、および、ＭＦ２８６’は、マウス膵臓ランゲルハンス島からのインスリン分泌量を有意に増加させた。
【０１３０】
更に、ＭＦ２８６、ＭＦ２８６’、および、ＰＢＳについて、野生型マウスの血糖値上昇の抑制効果を試験した。その結果を、図７の（Ｂ）に示す。
【０１３１】
図７の（Ｂ）から明らかなように、対照試験のＰＢＳに比べて、ＭＦ２８６、および、ＭＦ２８６’は、野生型マウスの血糖値上昇を有意に抑制した。
【０１３２】
次いで、ＭＦ３４６−２０、Ｓ１３２９１２ＴＭ４３６２、ＴＭ５４１−１、および、エタノールについて、ＭＩＮ６細胞からのインスリン分泌量の増加を試験した。
【０１３３】
図８に示すように、対照試験のエタノールでは、試験に用いるエタノールの量を変化させても、インスリン分泌量に変化は無かった。一方、ＭＦ３４６−２０、Ｓ１３２９１２ＴＭ４３６２、および、ＴＭ５４１−１では、試験に用いる量に依存して、インスリン分泌量が変化した。
【産業上の利用可能性】
【０１３４】
本発明は、糖尿病の治療に利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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