(57)【要約】【課題】改良された免疫原性を有するアレルゲン調製物、及びそのアレルギー治療のための治療的応用のための使用を提供する。【解決手段】アレルゲン調製物は、水中油型エマルション中にアレルゲンを含む。【選択図】図１１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
水中油型エマルション中にアレルゲンを含むアレルゲン調製物。
【請求項２】
代謝可能な油、水、及び１又は複数の界面活性剤を含む、請求項１に記載のアレルゲン調製物。
【請求項３】
前記代謝可能な油が、スクアレン、スクアラン、大豆油、ゴマ油、及びＭｉｇｌｙｏｌ  ８１０油からなる群から選択される、請求項２に記載のアレルゲン調製物。
【請求項４】
前記１又は複数の界面活性剤が、Ｔｗｅｅｎ  ８０、ＣＡＭＰＵＬ  ＰＯＥ−Ｏ低塑性粘度（ＰＶ）界面活性剤、ＳＯＬＩＴＯＬ  ＨＳ１５界面活性剤、プルロニックＦ６８ブロックコポリマー、コール酸ナトリウム、グリセロデオキシコレート、スフィンゴミエリン、スフィンゴシン、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、Ｌ−ａ−ホスファチジルエタノールアミン、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３ホスホコリン、及び卵ホスファチジルコリン、又はこれらの混合物からなる群から選択される、請求項２又は３に記載のアレルゲン調製物。
【請求項５】
前記アレルゲンが、アレルゲン抽出物、精製アレルゲン抽出物、変性アレルゲン抽出物、又は加水分解アレルゲン抽出物である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のアレルゲン調製物。
【請求項６】
前記アレルゲン調製物が、
（ａ）アレルゲン性タンパク質を含む天然アレルゲン源を抽出して抽出物を生成する工程、
（ｂ）前記抽出物を精製して非タンパク質成分を除去して精製抽出物を生成する工程、
（ｃ）前記精製抽出物を変性させて精製変性抽出物を生成する工程、
（ｄ）前記精製変性抽出物を純化して不純物を除去して純化変性抽出物を生成する工程、
（ｅ）所望により行ってもよい、変性アレルゲンを加水分解してアレルゲン加水分解物を生成する工程、
（ｆ）所望により行ってもよい、ペプチドの７０％、より好ましくは８０％が１０，０００Ｄａ〜１，０００Ｄａである精製加水分解物を得るために、前記アレルゲン加水分解物を精製して分子量が１０，０００Ｄａ超及び１，０００Ｄａ未満のペプチドを除去する工程
を含む方法により得ることができ、
前記精製変性抽出物がタンパク質を含み、合わせて全タンパク質の少なくとも６０％（ｗ／ｗ）を構成する最も豊富な（ｗ／ｗ）タンパク質は少なくとも２種のタンパク質であり、全タンパク質が前記精製変性抽出物の乾燥重量の少なくとも６０％（ｗ／ｗ）を占める、請求項５に記載のアレルゲン調製物。
【請求項７】
前記加水分解アレルゲンが、
（ａ）アレルゲン性タンパク質を含むアレルゲン源を抽出して抽出物を生成する工程、
（ｂ）前記抽出物を精製して非タンパク質成分を除去して精製抽出物を生成する工程、
（ｃ）前記精製抽出物を第１の変性剤で変性させて精製変性抽出物を生成する工程、
（ｄ）前記精製変性抽出物を純化して不純物を除去して純化変性抽出物を生成する工程、
（ｅ）所望により行ってもよい、前記純化変性抽出物を第２の変性剤で変性させて変性アレルゲン混合物を生成する工程、及び
（ｆ）所望により行ってもよい、前記変性アレルゲン混合物を加水分解して加水分解アレルゲンを生成する工程、
を含む方法により得ることができる、請求項５に記載のアレルゲン調製物。
【請求項８】
抽出が、塩を含まない溶液中で行われるか、炭酸塩、重炭酸塩、リン酸塩、酢酸塩、ＴＲＩＳ、及びＨＥＰＥＳから選択される塩を含む溶液中で行われる、請求項６又は７に記載のアレルゲン調製物。
【請求項９】
前記抽出物の精製が、イオン交換クロマトグラフィー工程、ゲルろ過若しくサイズ排除クロマトグラフィー工程、沈殿工程、疎水性相互作用クロマトグラフィー工程、擬アフィニティー若しくはアフィニティークロマトグラフィー工程、又は透析ろ過工程のうち１又は複数の工程を含む、請求項６〜８のいずれか一項に記載のアレルゲン調製物。
【請求項１０】
前記抽出物の少なくとも１つの精製工程が、界面活性剤及び／又は変性剤を含む溶液を用いて行われる、請求項６〜９のいずれか一項に記載のアレルゲン調製物。
【請求項１１】
変性が、カオトロピック剤、還元剤、及びその混合物の群から選択される、好ましくは尿素、塩化グアニジウム、ジチオトレイトール、チオグリセロール、β−メルカプトエタノール、及びこれらの混合物から選択される変性剤を用いて行われる、請求項６〜１０のいずれか一項に記載のアレルゲン調製物。
【請求項１２】
尿素の濃度が４Ｍ超、好ましくは５Ｍ超であり且つ／又は塩化グアニジウムの濃度が３Ｍ超、好ましくは４Ｍ超である、請求項１１に記載のアレルゲン調製物。
【請求項１３】
加水分解が、酵素、好ましくはペプシン、トリプシン、又はキモトリプシンを用いて行われる、請求項６〜１２のいずれか一項に記載のアレルゲン調製物。
【請求項１４】
加水分解が、カオトロピック剤、好ましくは尿素及び塩化グアニジウムから選択されるカオトロピック剤、の存在下で行われる、請求項６〜１３のいずれか一項に記載のアレルゲン調製物。
【請求項１５】
加水分解アレルゲンが、分子量１０，０００Ｄａ超及び１，０００Ｄａ未満のペプチドが除去されるように精製され、好ましくは、前記ペプチドの除去が、サイズ排除クロマトグラフィー及び／又は限外ろ過により行われる、請求項６〜１４のいずれか一項に記載のアレルゲン調製物。
【請求項１６】
前記サイズ排除クロマトグラフィー工程が、カオトロピック剤、好ましくは尿素、塩化グアニジウム、エチレングリコール、イソプロパノール、及びこれらの混合物から選択されるカオトロピック剤、の存在下で行われる、請求項１５に記載のアレルゲン調製物。
【請求項１７】
前記アレルゲンが、花粉アレルゲン、乳アレルゲン、毒アレルゲン、卵アレルゲン、雑草アレルゲン、草アレルゲン、樹木アレルゲン、低木アレルゲン、花アレルゲン、野菜アレルゲン、穀物アレルゲン、真菌アレルゲン、果実アレルゲン、液果アレルゲン、ナッツアレルゲン、種子アレルゲン、豆アレルゲン、魚アレルゲン、甲殻類アレルゲン、海産物アレルゲン、肉アレルゲン、香辛料アレルゲン、昆虫アレルゲン、チリダニを含むダニアレルゲン  カビアレルゲン、動物アレルゲン、ハトダニアレルゲン、蠕虫アレルゲン、軟体サンゴアレルゲン、動物鱗屑アレルゲン、線虫アレルゲン、パラゴムノキのアレルゲンから選択される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のアレルゲン調製物。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載のアレルゲン調製物を含む医薬品。
【請求項１９】
アレルギーの治療又は予防に使用するための、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のアレルゲン調製物。
【請求項２０】
容器水中油型エマルション及びアレルゲンの溶液を含む容器を含むキット。
【請求項２１】
前記アレルゲンが、アレルゲン抽出物、精製アレルゲン抽出物、変性アレルゲン抽出物、又は加水分解アレルゲン抽出物である、請求項１９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はアレルゲン調製物に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的なアレルゲンは、花粉、チリダニ、カビ、薬物、食物、並びに動物の毛及び鱗屑である。
【０００３】
最も一般的なアレルギー疾患は鼻炎、喘息、及びアトピー性皮膚炎である。アレルギー性喘息は、慢性炎症性疾患である。アレルギー性疾患の対症療法は、抗ヒスタミン薬、β遮断薬、及びコルチコステロイドを用いてなされる。
【０００４】
更に、いわゆる「特異的」免疫療法は減感作に基づく。典型的には、特異的な原因アレルゲンを皮下注射で患者に投与する。低アレルゲン用量で処置を開始し、用量を増やす。処置は通常数年間続けられる。この種の処置は、患者のコンプライアンスが悪く、患者に重度のアナフィラキシー反応が起こることがあるので、安全上の理由から疑問視されている。
【０００５】
反復皮下注射を含む方法に加え、経口減感作法もある。
【０００６】
米国特許第４，８２２，６１１号は、アレルゲンを用いた経口処置を含むアレルギーの治療方法を開示している。該特許は、市販の「バルク」アレルゲン抽出物の使用を記載しており、バッチ間のばらつきや、異なる製造業者による抽出物の差異を示している。これらの抽出物の調製物は記載されていない。
【０００７】
英国特許第１２４７６１４号は、アレルゲンの抽出方法を開示している。この方法の目的は、アレルゲンの全ての抽出可能成分を含めることにより、より完全で効果的なアレルゲン抽出物を得ることである。
【０００８】
米国特許第５，７７０，６９８号は、アレルゲン活性のあるタンパク質の抽出物を精製するプロセスを開示している。該特許の図２のスペクトルは２８０ｎｍのピークを示していない。このことは、抽出物がかなりの量の非タンパク質不純物を含んでいることを意味する。
【０００９】
国際公開第９９／２２７６２号は同様な方法を開示しており、したがって、この生成物も大量の非タンパク質不純物を含んでいる。
【００１０】
一方、単一エピトープに基づく高度に特異的な調製物を開発する動きがある。例えば、国際公開第００／５８３４９号は、チロシン／アルギニンペアからペプチド結合２個分離れて位置するロイシンを含む単離及び精製されたペプチドを開示している。これらのペプチドは、この場合には特にイヌのアレルギーに対する、治療又は予防を達成するための医薬組成物の製造に用いることができる。
【００１１】
一方では、特異的に同定された単一アレルゲン性分子を精製する方法が用いられる。一方では、できるだけ完全なアレルゲン性抽出物の製造が試みられている。
【００１２】
第１の選択肢では、アレルゲン調製物が所定の患者で寛容を誘導するための関連エピトープを欠いていることが常にあり得る。第２の選択肢には、バッチ間のばらつきや、ＤＮＡ分子、炭水化物、その複合体の脂質のような免疫応答を引き起こし得る化合物の存在という欠点がある。
【００１３】
国際公開第２００８／０００７９３号は、先行技術の欠点の少なくとも一部を克服するアレルゲンの精製方法を記載している。特に、粗アレルゲン抽出物よりもアレルゲン性反応を引き起こす能力が有意に低減しているがＴ細胞を刺激することができる天然アレルゲンに由来する抗原を提供するための方法を記載している。
【００１４】
国際公開第２０１２／１７２０３７号は、加水分解アレルゲンの製造方法を開示している。
【００１５】
著しい進歩にも関わらず、特にアレルギーの治療において、依然としてアレルゲン調製物の免疫原性を改良するニーズがある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明の目的は、改良された免疫原性を有するアレルゲン調製物、及びそのアレルギー治療のための治療的応用のための使用を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
水中油型エマルション中に少なくとも１つのアレルゲンを含むアレルゲン調製物の提供により課題が解決される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
図１：ＩｇＧウェスタンブロットによる免疫反応性。レーン１：分子量マーカー、レーン２：粗草花粉タンパク質抽出物、レーン３：精製アレルゲン変性抽出物。メンブレンはＢＳＡ５％及びミルク３％でブロッキング。患者血清は１／２５０に希釈。ＩｇＧ結合を、１／２，５００に希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ  ＨＲＰで検出し、ＴＭＢ基質により可視化した。アレルゲン１：±６１〜５４ｋＤａ、アレルゲン２：±３６〜３１ｋＤａ。
【００１９】
図２：ＩｇＥウェスタンブロットによる免疫反応性。レーン１：分子量マーカー、レーン２  精製草花粉タンパク質。メンブレンはＢＳＡ５％及びミルク３％でブロッキング。患者血清は１／５に希釈。ＩｇＥ結合を、１／１０，０００に希釈したヤギ抗ヒトＩｇＥ  ＨＲＰにより検出し、ＴＭＢ基質により可視化した。アレルゲン１：±６１〜５４ｋＤａ、アレルゲン２：±３６〜３１ｋＤａ。
【００２０】
図３：ＳＥＣ  Ｇ２５溶出プロファイルの排除ピーク。カラム容積／サンプル容積の比率は１２であった。流速９ｍｌ／ｍｉｎで、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ２５ｍＭ、尿素１．５Ｍ、ｐＨ８．０を用いて樹脂を平衡化した。溶出を２８０ｎｍの吸光度で追跡した。
【００２１】
図４：ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるタンパク質プロファイル。４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル。レーン１：分子量マーカー、レーン２：精製草花粉アレルゲン変性抽出物。染色はクーマシーブリリアントブルーＲ−２５０を用いて行った。
【００２２】
図５：ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるタンパク質及びペプチドプロファイル。４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル。レーン１：分子量マーカー、レーン２：精製草花粉アレルゲン変性抽出物（１３μｇ）、レーン３：加水分解物（１３μｇ）。染色はクーマシーブリリアントブルーＲ−２５０を用いて行った。
【００２３】
図６：Ｇ５０  ＳＥＣ溶出プロファイル。カラムは、尿素２Ｍ、ＮａＣｌ  １００ｍＭ、ｐＨ３．０で平衡化した。流速１５ｍｌ／ｍｉｎ。カラム容積／サンプル容積の比率は１０であった。溶出を２８０ｎｍの吸光度で追跡した。
【００２４】
図７：ＨＰＬＣ分析用の校正曲線。１０μｌの以下の標準物質（１ｍｇ／ｍｌ）をＢｉｏＳｅｐ−ＳＥＣ  Ｓ２０００カラムに注入した：１．ウシ血清アルブミン（６６ｋＤａ）、２．β−ラクトグロブリン（１８．５ｋＤａ）、３．チトクロムＣ（１２ｋＤａ）、４．グルカゴン（３．５ｋＤａ）、５．１ｋＤａ合成ペプチド。
【００２５】
図８：サイズ排除ＨＰＬＣプロファイル。カラム：ＢｉｏＳｅｐ−ＳＥＣ  Ｓ２０００（フェノメネクス社）。溶出バッファー：Ｎａ２ＨＰＯ４  ５０ｍＭ−ＳＤＳ  ０．５％（ｗ／ｖ）、ｐＨ  ６．８。流速１ｍｌ／ｍｉｎ。２１４ｎｍで検出。１０μｌのサンプルを注入した。１０ｋＤａ〜１ｋＤａの範囲の曲線下面積を用いて目的のペプチドの百分率を算出した。
【００２６】
図９：花粉由来生成物のアレルゲン性特性。花粉アレルギーのボランティアに由来する血液サンプルを、濃度を増加させた（０、１、１０、１００、及び１０００ｎｇ／ｍｌ）花粉粗抽出物、花粉精製タンパク質、及び花粉精製ペプチドのいずれかとインキュベートした。ＩｇＥ陽性白血球のゲートされたフローサイトメトリーによりｇｐ５３タンパク質発現を測定した。結果は活性化細胞中のｇｐ５３陽性細胞の％として表される（２回の決定の平均値±偏差）。
【００２７】
以下の非限定的な例により本発明の方法を更に例示する。
【００２８】
図１０：２５μｇのピーナッツタンパク質単独で、又は２５μｇのピーナッツタンパク質を水中油型エマルション（Ｏ／Ｗエマルション）、リン酸カルシウム、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウムと組み合わせて処置されたマウスの血清中のピーナッツ特異的ＩｇＧ力価の発達。対照群にはプラセボを注射した。結果は各群（ｎ＝１０）のピーナッツ特異的ＩｇＧ力価の中央値を表している。
【００２９】
図１１：１００μｇのピーナッツペプチド単独で、又は１００μｇのピーナッツペプチドを水中油型エマルション（Ｏ／Ｗエマルション）、リン酸カルシウム、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウムと組み合わせて処置されたマウスの血清中のピーナッツ特異的ＩｇＧ力価の発達。対照群にはプラセボを注射した。結果は各群（ｎ＝１０）の特異的ＩｇＧ力価の中央値を表している。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
水中油型エマルションは、ワクチン製剤との関連で当該技術分野で公知である。国際公開第９５／１７２１０号、国際公開第２００８／０４３７７４号、及びそれらで引用されている参照文献を参照されたい。
【００３１】
アジュバントによりアレルゲン調製物の効率を向上させることができ、それにより調製物中のアレルゲンの必要量を低減できることが見出された。これにより安全性が向上する。更に、Ａｌ（ＯＨ）３のようなアジュバントが、全てのアレルゲンタンパク質／ペプチドに同様に結合することはできないことが見出された。このことは、一部のアレルゲンではＴ細胞及びＢ細胞の刺激が改良するが、別のアレルゲンでは刺激が低減するという点で、効率に悪影響を与え得る。この問題は、単一精製アレルゲンだけでなく、混合物アレルゲン性タンパク質又はアレルゲン性タンパク質の加水分解物も用いられる場合、特に重要である。
【００３２】
本発明の一実施形態は、水中油型エマルション中にアレルゲンを含むアレルゲン調製物である。アレルゲンは、例えばアレルゲン抽出物、精製アレルゲン抽出物、変性アレルゲン抽出物、又は加水分解アレルゲン抽出物であり得る。
【００３３】
好ましくは、アレルゲン調製物は、代謝可能な油、水、及び１又は複数の界面活性剤を含む。
【００３４】
好ましくは、代謝可能な油は、スクアレン、スクアラン、大豆油、ゴマ油、及びＭｉｇｌｙｏｌ  ８１０油からなる群から選択される。
【００３５】
好ましくは、１又は複数の界面活性剤界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ  ８０、ＣＡＭＰＵＬ  ＰＯＥ−Ｏ低塑性粘度（ＰＶ）界面活性剤、ＳＯＬＩＴＯＬ  ＨＳ１５界面活性剤、プルロニックＦ６８ブロックコポリマー、コール酸ナトリウム、グリセロデオキシコレート（ｇｌｙｃｅｒｏｄｅｏｘｙ  ｃｈｏｌａｔｅ）、スフィンゴミエリン、スフィンゴシン、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、Ｌ−ａ−ホスファチジルエタノールアミン、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３ホスホコリン及び卵ホスファチジルコリン、トリオレイン酸ソルビタン、又はこれらの混合物からなる群から選択される。
【００３６】
好ましくは、アレルゲンの濃度は調製物中０．１〜２００μｇ／ｍｌである（２５℃）。
【００３７】
好ましくは、調製物の油含有量は調製物の１〜１０％（ｗ／ｗ）である。
【００３８】
少なくとも１つの界面活性剤の量は、好ましくは油の１〜３０（ｗ／ｗ）である。
【００３９】
ｏ／ｗエマルションの好ましい例は、例えば、
ｐＨ６．５の水性クエン酸パッファー中、
５ｗｔ％スクアレン
０．５ｗｔ％ポリソルベート
０．５ｗｔ％トリオレイン酸ソルビタン
を含む。
【００４０】
更なる実施形態では、ｏ／ｗエマルションは、少なくともスクアレン、水性溶媒、及びポリオキシエチレンアルキルエーテルを含む。
【００４１】
一実施形態では、ｏ／ｗエマルションはアレルゲンを含まないように調製される。その後、アレルゲンを含む溶液をｏ／ｗエマルションと１：９〜９：１（ｗ／ｗ）の比率で混合する。
【００４２】
好ましい実施形態では、アレルゲンは、アレルゲン抽出物、精製アレルゲン抽出物、変性アレルゲン抽出物、又は加水分解アレルゲン抽出物である。
【００４３】
本発明のアレルゲン抽出物を製造するための好ましい方法は、
（ａ）アレルゲン性タンパク質を含むアレルゲン源を抽出して抽出物を生成する工程、
（ｂ）抽出物を精製して非タンパク質成分を除去して精製抽出物を生成する工程、
（ｃ）第１の変性剤で精製抽出物を変性させて精製変性抽出物を生成する工程、
（ｄ）精製変性抽出物を純化（ｒｅｆｉｎｅ）して不純物を除去して純化変性抽出物を生成する工程
を含む。
【００４４】
いくつかの実施形態では、この方法に、
・純化変性抽出物を第２の変性剤で変性させて変性アレルゲン混合物を生成すること
が続く。
【００４５】
工程（ｄ）の後、第２変性工程が行われてもよい。この変性工程のために、第２の変性剤が使用され、この第２の変性剤は工程（ｃ）と同じであってもよく、異なる組成であってもよい。好ましい実施形態では、第２変性工程に使用される還元剤はＴＣＥＰである。
【００４６】
第２変性工程のｐＨは１．５〜９．０に設定されることが好ましい。好ましい実施形態では、ｐＨは７．０未満、５．０未満、又は３．０未満であるが、好ましくは１．０より高い。変性は好ましくは、１５〜４０℃、好ましくは２０〜３７℃の温度で、少なくとも１５分、好ましくは少なくとも３０分、より好ましくは少なくとも６０分行われる。
【００４７】
先行技術の方法とは対照的に、本方法は、抽出物を単一のペプチド又はタンパク質にまで精製せずに主にタンパク質を含むアレルゲン抽出物を製造する。
【００４８】
先行技術の生成物とは対照的に、本発明の生成物は以下の利点を有する：
・タンパク質以外の免疫原性物質が実質的に取り除かれている。
・天然アレルゲン抽出物は、Ｔ細胞及び／又はＢ細胞を刺激することができ、即時型アレルギー反応（好塩基球活性化、マスト細胞脱顆粒）を引き起こす能力が低下している。
【００４９】
出発材料として種々の天然アレルゲンを用いることができる。典型的な天然出発材料は、乳、毒（ｖｅｎｏｍ）、卵、雑草（ｗｅｅｄ）、草（ｇｒａｓｓ）、樹木、低木（ｓｈｒｕｂ）、花、野菜、穀物、真菌、果実、液果（ｂｅｒｒｙ）、ナッツ、種子、豆、魚、甲殻類（ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ）、海産物、肉、香辛料、昆虫、チリダニを含むダニ、カビ、動物、ハトダニ（ｐｉｇｅｏｎ  ｔｉｃｋ）、蠕虫（ｗｏｒｍ）、軟体サンゴ（ｓｏｆｔ  ｃｏｒａｌ）、動物の鱗屑、線虫、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、及びこれらの混合物である。
【００５０】
本発明で用いられる好ましいアレルゲンは特に草花粉、チリダニ、ブタクサ花粉、牛乳、卵白、及びピーナッツである。好ましくは、ピーナッツは、Ａｒａｃｈｉｓ属から、好ましくはｈｙｐｏｇａｅａ種から、より好ましくはｈｙｐｏｇａｅａ及びｆａｓｔｉｇｉａｔａから選択される。亜種としては、Ｖｉｒｇｉｎｉａ、Ｓｐａｎｉｓｈ、Ｖａｌｅｎｃｉａ変種及び／又は例えばＲｕｎｎｅｒ等の雑種、又は更には遺伝子操作により得られるトランスジェニックピーナッツが含まれる。好ましくは、少なくとも２、好ましくは３つの種／亜種／変種／雑種、及び／又はトランスジェニックピーナッツの混合物が使用される。好ましい実施形態では、ピーナッツの赤い種皮（外被）は除去されている。
【００５１】
あるいは、出発材料として合成アレルゲン源を用いることができる。合成アレルゲン源とは、遺伝子改変生物及び／又は組換えタンパク質のように生物工学的に生産されたタンパク質を意味する。
【００５２】
好ましくは、源はアレルゲンの混合物を含む。
【００５３】
本発明のアレルゲン調製物は、寛容及び脱感作を誘導するための医薬組成物及び／又は食品組成物の製造に用いることができる。寛容の誘導はアレルギー反応の治癒又は防止に用いることができる。
【００５４】
治療又は防止されるアレルギー反応はアレルゲン源によって決まる。すなわち、ピーナッツに対するアレルギーはピーナッツに由来するアレルゲンを用いることにより防止又は治療され、草花粉に対するアレルギーは草花粉に由来するアレルゲンで治療される。
【００５５】
材料の抽出後、抽出物を精製して糖、脂質、核酸等の非タンパク質成分を除去する。典型的には複数の異なるタンパク質が精製抽出物のタンパク質画分中に存在する。
【００５６】
先行技術では、１つのタンパク質が精製され、その他の残りのタンパク質は「不純物」とされている。
【００５７】
それに対し、本発明の目的は、タンパク質を一緒に精製することである。精製抽出物中のタンパク質の相対量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びその後のデンシトメトリーのような方法を用いて容易に測定することができる。
【００５８】
タンパク質総重量の６０％が少なくとも２種の最も主要なタンパク質によって占められる、すなわち、どの単一タンパク質も全タンパク質の６０％（ｗ／ｗ）以上でない必要がある。より好ましくは、全タンパク質の６０％が、少なくとも３種の主要タンパク質、好ましくは少なくとも４種の主要タンパク質、より好ましくは少なくとも５、６、７、８、９、又は１０種類のタンパク質によって構成される。
【００５９】
例えば、以下のタンパク質がある。
タンパク質１：２７％
タンパク質２：１３％
タンパク質３：３４％
タンパク質４：１９％
タンパク質５：１７％
【００６０】
合わせて少なくとも６０％（≒６０％以上）を構成する最も主要なタンパク質群はタンパク質３＋１（３４＋２７＝６１％）である。
【００６１】
更に、精製抽出物の全タンパク質含有量は少なくとも６０重量％であり、好ましくは含有量は精製抽出物の少なくとも７０重量％又は８０重量％、より好ましくは９０重量％である。
【００６２】
抽出は好ましくは水溶液を用いて行われる。好適な塩は、炭酸塩、重炭酸塩、リン酸塩、酢酸塩、ＴＲＩＳ、及びＨＥＰＥＳ等の塩であるが、これらに限定されない。
【００６３】
更に、多くの他の抽出法とは対照的に、抽出媒体の量が比較的多いこと、すなわち天然アレルゲン源の重量の少なくとも２０倍、好ましくは重量の１００倍以上であることが好ましい。
【００６４】
抽出物の精製は以下の１又は複数により行ってもよい：
・イオン交換クロマトグラフィー工程（陰イオン交換クロマトグラフィー及び陽イオン交換クロマトグラフィーを含む）、
・サイズ排除クロマトグラフィー工程（ゲルろ過とも呼ばれる）、
・沈殿工程、
・疎水性相互作用クロマトグラフィー工程、
・擬アフィニティー及びアフィニティークロマトグラフィー、並びに／又は
・透析ろ過。
【００６５】
好ましい実施形態では、イオン交換クロマトグラフィーが用いられ、陽イオン交換体の場合、ローディング液のｐＨは、陽イオン交換体の酸性官能基のｐＫａと抽出物中のタンパク質の最も低いｐＫａを有するタンパク質のｐＫａとの間である。陰イオン交換体の場合、ｐＨは、陰イオン交換体の塩基性官能基のｐＫａと抽出物を構成するタンパク質の最も高いｐＫａを有するタンパク質のｐＫａとの間である。
【００６６】
この方法により、全タンパク質がイオン交換体に結合し、一方、中性不純物やイオン交換樹脂と同じ電荷を有する不純物は除去される。
【００６７】
好ましい実施形態では、少なくとも１つの精製工程は、界面活性剤及び／又は変性剤の１又は複数を含む溶液を用いて行われる。界面活性剤は、非イオン性、陰イオン性、陽イオン性、又は両性であり得る。好適な変性剤は、カオトロピック剤、還元剤、及びその混合物である。好適な変性剤は、例えば、尿素、塩化グアニジウム、エチレングリコール、イソプロパノールである。尿素の好適な濃度は３Ｍ以上、好ましくは４Ｍ以上である。グアニジウムの好適な濃度は好ましくは２Ｍ、好ましくは３Ｍ以上である。エチレングリコール及び／又はイソプロパノールの好適な濃度は５重量％以上、より好ましくは１０重量％以上、２０重量％以下である。
【００６８】
場合によっては、精製抽出物の製造で充分である。この種の抽出物は、アレルギー疾患のｅｘ  ｖｉｖｏ／ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏでの診断、予防的及び治療的な処置を行うために用いることができる。
【００６９】
いくつかの実施形態では、方法は更に、
・変性アレルゲンを加水分解してアレルゲン加水分解物を生成する工程
を含む。
【００７０】
この工程は、変性（第１又は第２）の後又は純化の後に続いて行ってもよい。
【００７１】
一部のアレルゲンでは、２段階の変性後、加水分解性が改良されることが示され得る。
【００７２】
これにより得られる生成物の利点は、ペプチドが変性タンパク質の消化産物であることである。
【００７３】
いくつかの実施形態では、加水分解の後に、
・ペプチドの７０％、より好ましくは８０％が１０，０００Ｄａ〜１，０００Ｄａである精製加水分解物を得るために、前記アレルゲン加水分解物を精製して分子量が１０，０００Ｄａ超及び１，０００Ｄａ未満のペプチドを除去すること
が続き、
前記精製変性抽出物はタンパク質を含み、合わせて全タンパク質の少なくとも６０％（ｗ／ｗ）を構成する最も豊富な（ｗ／ｗ）タンパク質は少なくとも２種のタンパク質であり、全タンパク質は精製変性抽出物の乾燥重量の少なくとも６０％（ｗ／ｗ）を占める。
【００７４】
特定のサイズ調整のおかげで、これらは即時型アレルギー反応及び炎症促進反応を誘導する能力が低下している。
【００７５】
変性は、必要な場合、好ましくは、カオトロピック剤、還元剤、又はその混合物の存在下で行われる。好適なカオトロピック剤は例えば尿素及び塩化グアニジウムである。典型的な還元剤は例えばジチオトリエトール、β−メルカプトエタノール、チオグリセロール、及びその混合物である。
【００７６】
加水分解工程は通常、酵素を用いて行われる。好適な酵素は例えばペプシン、トリプシン、キモトリプシンである。この加水分解工程も、カオトロピック剤、好ましくは尿素又は塩化グアニジウムの存在下で行うことができる。加水分解中、尿素及び塩化グアニジウムの濃度は４Ｍ未満、好ましくは３Ｍ未満であるべきである。
【００７７】
加水分解工程は、還元剤、好ましくはＴＣＥＰの存在下でも行うことができる。加水分解中、ＴＣＥＰの濃度は好ましくは１０ｍＭ未満である。好ましくは、ペプシンが用いられる。より好ましくは、ｐＨ範囲が１．０〜３．０のペプシンが用いられる。
【００７８】
サイズ調整工程中、分子量が１０，０００Ｄａより大きい又は１，０００Ｄａより小さいペプチドはある程度除去される。
【００７９】
したがって、精製加水分解物のペプチドは、分子量が１，０００〜１０，０００Ｄａのペプチドを含む。大きい又は小さいペプチドを除去する好適な方法は限外ろ過及びサイズ排除クロマトグラフィーである。このサイズ排除クロマトグラフィーも、カオトロピック剤、例えば尿素、塩化グアニジウム、エチレングリコール、イソプロパノール、及びこれらの混合物の存在下で行ってもよい。
【００８０】
好ましくは、ペプチドの１０％未満が分子量１０．０００Ｄａ超であり、ペプチドの２０％未満が分子量１．０００Ｄａ未満であり、そのため、ペプチドの７０％又はより好ましくは８０％が１０．０００Ｄａ〜１．０００Ｄａとなる。
【００８１】
加水分解物の利点の１つは、ペプチドが精製変性タンパク質の消化産物であることである。これらは、即時型アレルギー反応及び共炎症性（ｃｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）反応を誘導する能力が低減している。
【００８２】
本発明の更なる実施形態は、本発明の方法により得ることができるアレルゲン抽出物である。典型的には、この抽出物中でも、合わせて全タンパク質の少なくとも６０重量％を構成する、重量基準で最も主要なタンパク質は、少なくとも２種のタンパク質、好ましくは少なくとも３若しくは４種のタンパク質、又はより好ましい少なくとも５、６、７、８、９、若しくは１０種類のタンパク質である。純度は、光学濃度２６０ｎｍ：光学濃度２８０ｎｍの比率が＜１、好ましくは＜０．９、より好ましくは０．７５〜０．９である。
【００８３】
更なる実施形態は、本方法により得ることができるアレルゲン加水分解物である。これは、
・アレルギー疾患のｉｎ  ｖｉｖｏ診断：プリック試験、皮内注射、結膜試験、鼻吸入（ｓｎｉｆｆ）試験、及び吸入（ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ）試験；
・アレルギー疾患のｅｘ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断：ＥＬＩＳＡキット又は試験で使用される標準物質；
・アレルギー疾患の予防的及び治療的処置：アジュバントと組み合わせた／組み合わせない、脱感作／減感作処置及び免疫応答の調節のためのワクチン
に用いることができる。
【００８４】
本発明のアレルゲン抽出物は、寛容を誘導するための医薬組成物及び／又は食品組成物の製造に用いることができる。寛容の誘導は、アレルギー反応の治癒又は防止に用いることができる。
【００８５】
本発明の一実施形態は、本アレルゲン調製物を含む医薬組成物である。
【００８６】
更に、医薬組成物は以下の物質の１又は複数を含んでもよい：ヌクレオシド三リン酸、ヌクレオシド二リン酸、ヌクレオシド一リン酸、核酸、ペプチド核酸、ヌクレオシド又はそのアナログ、免疫抑制性サイトカイン、免疫プロテアソームの発現を誘導する化合物、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３又はそのアナログ、リポ多糖、エンドトキシン、熱ショックタンパク質、ＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＰ−チオレドキシン還元酵素のいずれかと組み合わせたチオレドキシン、ジチオスレイトール、サルブタノール等のアドレナリン受容体作動薬、ブトキサミン等のアドレナリン受容体拮抗薬、接着分子ＩＣＡＭ−１の発現を調節する化合物、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システイニル−グリシン（還元型Ｌ−グルタチオン）、アルファ−２−マクログロブリン、Ｆｏｘｐ３遺伝子発現の誘導物質、フラボノイド、イソフラボノイド、プテロカルパノイド（ｐｔｅｒｏｃａｒｐａｎｏｉｄ）、リスベラトロール等のスチルベン、タキキニン受容体拮抗薬、キマーゼ阻害剤、ＣｐＧ若しくはＭＰＬのようなワクチンアジュバント、又はザイモサンのような寛容原性アジュバント、ベータ−１，３−グルカン、調節性Ｔ細胞誘導物質、腸粘膜内層に粒子を付着させるための植物レクチン等の粘膜付着剤、亜鉛、亜鉛塩、多糖、ビタミン、及び細菌溶解物。
【００８７】
本開示において、「抽出」とは、可溶性成分を非可溶性残渣から分離するための、水、バッファー、又は有機溶媒等の抽出媒体を用いたアレルゲン源の処置である。（Ｈ２Ｏを少なくとも５０％含む）水系の使用が好ましい。
【００８８】
本開示において、「変性」とは、タンパク質がそれらの４次、３次、及び２次構造を失うプロセスであり、特にこの用語は１又は複数の変性剤を用いた処置を指す。
【００８９】
本発明の更なる実施形態は、本発明のアレルゲン調製物を含む医薬組成物である。更に、医薬組成物は以下の物質の１又は複数を含んでもよい：ヌクレオシド三リン酸、ヌクレオシド二リン酸、ヌクレオシド一リン酸、核酸、ペプチド核酸、ヌクレオシド又はそのアナログ、免疫抑制性サイトカイン、免疫プロテアソームの発現を誘導する化合物、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３又はそのアナログ、リポ多糖、エンドトキシン、熱ショックタンパク質、ＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＰ−チオレドキシン還元酵素のいずれかと組み合わせたチオレドキシン、還元剤、ジチオスレイトール、サルブタノール等のアドレナリン受容体作動薬、ブトキサミン等のアドレナリン受容体拮抗薬、接着分子ＩＣＡＭ−１の発現を調節する化合物、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システイニル−グリシン（還元型Ｌ−グルタチオン）、アルファ−２−マクログロブリン、Ｆｏｘｐ３遺伝子発現の誘導物質、フラボノイド、イソフラボノイド、プテロカルパノイド、リスベラトロール等のスチルベン、タキキニン受容体拮抗薬、キマーゼ阻害剤、ワクチンアジュバント又は免疫調節薬、例えばＣｐＧ、水酸化アルミニウム、リン酸カルシウム、ＴＬＲ−４作動薬（すなわち、ＭＰＬ）、及びＴＬＲ−９作動薬、又はザイモサンのような寛容原性アジュバント、ベータ−１，３−グルカン、調節性Ｔ細胞誘導物質、腸粘膜内層に粒子を付着させるための植物レクチン等の粘膜付着剤、亜鉛、亜鉛塩、多糖、ビタミン、及び細菌溶解物、又は表面に結合した抗体を提示する粒子。
【００９０】
好ましい実施形態では、医薬組成物は、皮下投与、経鼻投与、経皮投与、リンパ管内投与、経口投与用、舌下薬物送達用、又は腸内薬物送達用に調製される。
【００９１】
国際公開第２００８／０００７８３号及び国際公開第２０１２／１７２０３７号を含む本明細書に引用される全ての参照文献を、本明細書中の明示された教示と組込みが矛盾しない充分な程度に参照により援用する。
【実施例】
【００９２】
実施例１：抽出
花粉（アレルゴン社（ＡＬＬＥＲＧＯＮ）のホソムギ（Ｌｏｌｉｕｍ  ｐｅｒｅｎｎｅ））を１％（ｗ／ｖ）で重炭酸ナトリウム（１２．５ｍＭ）に加え、撹拌しながら２時間インキュベートした。その後、溶液を清澄化し、セライト（アクロス社（ＡＣＲＯＳ））を２％（ｗ／ｖ）で加えて０．２μｍのフィルターに通過させることによりろ過した。このサンプルを粗抽出物とする。
【００９３】
抽出物中のアレルゲンの存在を、花粉アレルギー患者の血清を用いたウェスタンブロッティングにより分析した。ＩｇＧ及びＩｇＥエピトープを抗ヒトＩｇＧ又はＩｇＥ抗体を用いて可視化する。
【００９４】
図１及び２に示されているように、２つの主要なアレルゲンが抽出物中にある。
【００９５】
前記粗抽出物をｐＨ３．０に酸性化し、Ｔｗｅｅｎ  ２０（０．１％、ｖ／ｖ）を加えた。このサンプルを酸性化抽出物とする。
【００９６】
実施例２：アレルゲンタンパク質の精製
アレルゲン抽出物を以下のように精製した：
【００９７】
・陽イオン交換クロマトグラフィー
ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｓ−メンブレン（ザルトリウス社）を、２８×カラム体積（Ｂｅｄ  ｖｏｌｕｍｅ（Ｂｖ））の重炭酸ナトリウム１２．５ｍＭ、クエン酸  ３０ｍＭ、ｐＨ３．０、Ｔｗｅｅｎ  ２０  ０．１％（ｖ／ｖ）で平衡化した。平衡化したメンブレンに前記酸性化抽出物をローディングした。カラムを、最初に３５×Ｂｖの重炭酸ナトリウム１２．５ｍＭ、クエン酸  ３０ｍＭ、ｐＨ３．０、Ｔｗｅｅｎ  ２０  ０．１％（ｖ／ｖ）で洗浄し、次いで、４２×Ｂｖの重炭酸ナトリウム１２．５ｍＭ、クエン酸  ３０ｍＭ、ｐＨ３．０で洗浄した。タンパク質を、炭酸塩０．１Ｍ、塩化ナトリウム０．５Ｍ、ｐＨ９．１５で溶出させた。２８０ｎｍのＯＤによりタンパク質の存在を追跡した。目的の画分をプールした。
【００９８】
・硫安沈殿
この工程は、０〜４℃で行った。
９０％飽和となる量の硫酸アンモニウムを撹拌下で生成物に加えた。塩が完全に溶解した後、撹拌を停止した。懸濁液を一晩インキュベートし、１０，０００ｇで１５分間、２回遠心した。各回、上清を慎重に捨てた。
【００９９】
・変性
ペレットを、尿素６Ｍ、ＤＴＴ  １０ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ０．１Ｍ、ｐＨ８．０に９ｍｇ／ｍｌで再懸濁し、３７℃で１時間インキュベートした。
【０１００】
・Ｇ２５樹脂（アマシャム社のｆｉｎｅ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ）を用いたサイズ排除クロマトグラフィー
変性サンプルをカラムにローディングし、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ２５ｍＭ、尿素１．５Ｍ、ｐＨ８．０でタンパク質を溶出させた。
【０１０１】
２８０ｎｍでのＯＤ測定によりタンパク質の存在を追跡した。目的の画分をプールし、精製変性アレルゲンとした。
【０１０２】
精製アレルゲン抽出物を更に分析した。タンパク質純度を評価するためにタンパク質含有量（ＢＣＡアッセイ）及び乾燥重量を決定した。精製効率も、炭水化物の除去（オルシノール試験）により、及びＯＤ２６０／ＯＤ２８０比率の低下により追跡された。
【０１０３】
表１：精製抽出物を生成するための非タンパク質成分の除去
【０１０４】
【表１】
2018168192.tif 000003
【０１０５】
表１に示されるように、精製プロセスによって、
・抽出物中のタンパク質の百分率の約１５％から８０％への増加
・純粋タンパク質の特徴である０．５に近づくＯＤ２６０／ＯＤ２８０比
・炭水化物の顕著な除去（残りの含有量はタンパク質の炭水化物部位を表し得る）
が可能となる。
【０１０６】
図４は、精製変性アレルゲン抽出物で得られる典型的なＳＤＳ−ＰＡＧＥプロファイルを図示している。図示されているように、６種類のタンパク質が、精製抽出物中のタンパク質の総重量の少なくとも６０％を占めている。
【０１０７】
実施例３：変性アレルゲン抽出物の加水分解
以下のプロトコールを用いて抽出物を加水分解した：
【０１０８】
前記精製アレルゲン抽出物をｐＨ２．０に酸性化した。消化は、２．５ｍｇ／ｍｌの花粉タンパク質及び、３３７ｍｇのタンパク質あたり１単位（Ｅｕ．  Ｐｈ．Ｕ）のペプシン（メルク社）で３７℃にて２時間行った。
【０１０９】
図５は、精製抽出物（レーン２）と加水分解された抽出物（レーン３）との比較を示している。見てわかるように、変性未消化タンパク質に相当する高分子量タンパク質がペプシンとのインキュベーション後に消失している。
【０１１０】
実施例４：精製
ＭＷ≧１０，０００Ｄａ及びＭＷ≦１，０００Ｄａのペプチドを排除するために、加水分解物を以下のように精製した。
【０１１１】
・Ｇ５０樹脂（アマシャム社のｆｉｎｅ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ）を用いたサイズ排除クロマトグラフィー
１６．５％（ｖ／ｖ）のイソプロパノール及び０．１ＭのＮａＣｌを加水分解物に加えた。このサンプルをすぐにＧ５０カラムにローディングした。ペプチドを溶出させ、ペプチド（ＭＷ≦１０ｋＤａ）を含む画分を図６に示されるようにプールした。
【０１１２】
・１ｋＤａメンブレン（ポール社（ＰＡＬＬ）の限外ろ過カセットＯｍｅｇａ  ＰＥＳ）を用いた透析ろ過
ペプチドを１０倍濃縮し、１０倍体積のＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ５０ｍＭ  ｐＨ７．４に透析ろ過し、その後、２．５倍に濃縮した。このサンプルを精製アレルゲン加水分解物とする。
【０１１３】
精製効率はサイズ排除ＨＰＬＣにより調節した。流速１ｍｌ／ｍｉｎでＮａ２ＨＰＯ４  ５０ｍＭ−ＳＤＳ  ０．５％（ｗ／ｖ）  ｐＨ６．８を用いてＢｉｏＳｅｐ−ＳＥＣ  Ｓ２０００カラム（フェノメネクス社）を平衡化した。ペプチドは２１４ｎｍで検出した。
【０１１４】
図７に例示されているように校正曲線から１０ｋＤａ及び１ｋＤａの範囲を算出した。
【０１１５】
図８に示されているように、分子量が１，０００Ｄａ〜１０，０００Ｄａのペプチドが精製加水分解物中の全ペプチドの約７５％を占めている。
【０１１６】
実施例５：アレルゲン性の低下
（実施例１に係る）花粉粗抽出物、（実施例２に係る）精製花粉タンパク質、及び（実施例４に係る）精製花粉ペプチドのアレルゲン性特性を、それらが好塩基球脱顆粒を誘導する能力を測定することにより評価した。
【０１１７】
試験は、濃度を増加させた花粉粗抽出物、精製タンパク質、及び精製ペプチドとインキュベートした花粉アレルギーのボランディア由来の新鮮なヒト血液サンプルを用いてインビトロで行った。活性化細胞（すなわち、ＩｇＥ陽性細胞）の細胞膜上のｇｐ５３タンパク質マーカーの発現をフローサイトメトリー法で測定することにより好塩基球脱顆粒を評価した。このタンパク質は、休止細胞中の顆粒の膜内に通常存在し、細胞活性化後に（顆粒膜と細胞膜の融合により）細胞表面に現れ、したがって、標識された特異的抗ｇｐ５３抗体により検出可能になる。図９に示されるように、精製ペプチドは、精製タンパク質の約３０分の１のアレルゲン性であり、花粉粗抽出物の１００分の１のアレルゲン性である。
【０１１８】
実施例６：アジュバントの影響
アジュバントの影響を分析するために、種々のアジュバントと共にピーナッツペプチド又は変性ピーナッツタンパク質の免疫原性を分析した。
【０１１９】
マウスの処置
ピーナッツペプチド（１００μｇ）若しくはピーナッツタンパク質（２５μｇ）単独で、又はピーナッツペプチド（１００μｇ）若しくはピーナッツタンパク質（２５μｇ）と種々のアジュバント（スクアレン系水中油型エマルション、水酸化アルミニウム（注射１回当たり５００μｇ  Ａｌ３＋）、リン酸アルミニウム（注射１回当たり５００μｇ  Ａｌ３＋）、及びリン酸カルシウム（注射１回当たり２００μｇ  Ｃａ２＋））とを組み合わせて、７週齢の雌の未処置Ｂａｌｂ／ｃマウスに１週間に１回、６週間にわたり皮下注射した。プラセボ溶液を受けた１つの群のマウスも実験に含めた。０、１４、２８、４９、及び６３日目に血液サンプルを回収して処置により誘導された免疫グロブリンレベルを測定した。
【０１２０】
動物血清中のピーナッツタンパク質に特異的な免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の投与量
マイクロタイタープレートをピーナッツタンパク質（２μｇ／ｍｌ）を含む炭酸バッファーで４℃にて一晩コーティングし、洗浄し、非関連タンパク質を含むＰＢＳ  ０．０５％Ｔｗｅｅｎの溶液で３７℃にて１時間ブロッキングした。ウェルを血清サンプルの段階希釈物（１／１００〜１／４３７４０００）で３７℃にて１時間インキュベートした。結合ＩｇＧを、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧで検出した（３７℃で１時間のインキュベーション）。洗浄後、プレートをＴＭＢ基質とインキュベートし、１Ｍ  Ｈ３ＰＯ４で反応を停止させた。４５０ｎｍ及び６５０ｎｍで吸光度を測定した。
【０１２１】
結果は、光学濃度０．３を与える血清希釈度の逆数に相当するピーナッツ特異的ＩｇＧの力価として表される。
【０１２２】
ピーナッツペプチドの調製
ピーナッツアレルゲン及び加水分解ペプチドの調製を、参照により援用する国際公開第２０１２／１７２０３７号に記載の方法に従って行った。
【０１２３】
結果
図１０に示されているように、タンパク質単独での処置はピーナッツ特異的ＩｇＧ生産を誘導する（処置開始後４９日目の中央力価１５０．０００）。アルミニウム塩アジュバントの添加はこのＩｇＧ生産を２倍にする。リン酸カルシウムはこれを強く低下させる（中央ＩｇＧ力価１５．０００）。水中油型エマルションは、処置マウス血清中のピーナッツ特異的ＩｇＧの量を７倍超増加させる（中央ＩｇＧ力価１．１００．０００）
【０１２４】
１００μｇのピーナッツペプチド単独、又はリン酸カルシウム及びリン酸アルミニウムに吸着させた１００μｇのピーナッツペプチドの６回注射後に、ピーナッツ特異的ＩｇＧの生産は観察されなかった（図１１）。ベースライン力価は、最低血清希釈物に相当する値１００に設定されている。ペプチド処置に水中油型エマルション又は水酸化アルミニウムを加えると、処置開始後４９日目からピーナッツ特異的ＩｇＧの中央力価が増大する。
【図１】
2018168192.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2018168192.tif 000012
【図１０】
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【図１１】
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