(57)【要約】      （修正有）【課題】ポリペプチド生成のための細胞培養組成物及び方法の提供。【解決手段】約２００ｍｇ／Ｌから約１２００ｍｇ／Ｌのシスチン；約０．０５ｍｇ／Ｌから約１．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ２；約０．０５ｍｇ／Ｌから約１０．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ６；約０．０５ｍｇ／Ｌから約１２．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ９；及び約０．０５ｍｇ／Ｌから約２．５ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２を含む細胞培養培地とポリペプチドをコードする単離された核酸を含む細胞を接触させる工程を含む、細胞を培養する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
約２００ｍｇ／Ｌから約１２００ｍｇ／Ｌのシスチン；
約０．０５ｍｇ／Ｌから約１．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ２；
約０．０５ｍｇ／Ｌから約１０．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ６；
約０．０５ｍｇ／Ｌから約１２．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ９；及び
約０．０５ｍｇ／Ｌから約２．５ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２
を含む細胞培養培地と細胞を接触させる工程を含む、細胞を培養する方法。
【請求項２】
約０．７ｍＭから約２．５ｍＭのシスチン；
約０．１１μＭから約０．７２μＭのビタミンＢ２；
約４．５μＭから約３０．０μＭのビタミンＢ６；
約３．４μＭから約２２．０μＭのビタミンＢ９；及び
約０．２μＭから約１．５μＭのビタミンＢ１２
を含む細胞培養培地と細胞を接触させる工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞培養物は、ビタミンＢ１、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５及びビタミンＢ７の何れか一又は複数を更に含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
細胞培養培地は
約２．０μＭから約１４．０μＭのビタミンＢ１；
約１１．０μＭから約７２．０μＭのビタミンＢ３；
約６．８μＭから約４４．０μＭのビタミンＢ５；及び
約０．０２μＭから約０．１４μＭのビタミンＢ７
の何れか一又は複数を更に含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
細胞培養培地は、鉄源を更に含む、請求項１から４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
鉄源がクエン酸第二鉄又は硫酸第一鉄である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
細胞培養培地は、約２μＭから約８０μＭの濃度でクエン酸第二鉄を含む、請求項１から６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
細胞培養培地は、約１１．０μＭから約３６．０μＭの濃度でクエン酸第二鉄を含む、請求項１から７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
細胞培養培地は、ヒドロコルチゾンを更に含む、請求項１から８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
細胞培養培地中のヒドロコルチゾンの濃度は、約０．０５μＭから約０．２５μＭである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
細胞培養培地は、化学的に定義された細胞培養培地である、請求項１から１０の何れか一項に記載の方法。
【請求項１２】
細胞培養培地は、化学的に未定義な細胞培養培地である、請求項１から１０の何れか一項に記載の方法。
【請求項１３】
細胞は、細胞の増殖期の間に細胞培養培地と接触される、請求項１から１２の何れか一項に記載の方法。
【請求項１４】
細胞は、細胞生成期の間に細胞培養培地と接触される、請求項１から１３の何れか一項に記載の方法。
【請求項１５】
方法は、細胞培養培地にシステインを添加する工程を更に含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
細胞培養培地中に、システインが、約８０ｍｇ／Ｌから約１５００ｍｇ／Ｌのシステインを提供する量で添加される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
細胞培養培地中に、システインが、約１５００ｍｇ／Ｌのシステインを提供する量で添加される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
細胞培養培地中に、システインが、約１４０ｍｇ／Ｌのシステインを提供する量で添加される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
ポリペプチドをコードする単離された核酸を含む細胞を細胞培養培地中で培養する工程を含む、ポリペプチドを生成する方法であって、
（ａ）細胞培養培地は、
約２００ｍｇ／Ｌから約１２００ｍｇ／Ｌのシスチン；
約０．０５ｍｇ／Ｌから約１．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ２；
約０．０５ｍｇ／Ｌから約１０．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ６；
約０．０５ｍｇ／Ｌから約１２．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ９；
約０．０５ｍｇ／Ｌから約２．５ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２；
を含み、及び
（ｂ）細胞はポリペプチドを発現する、
方法。
【請求項２０】
細胞培養培地は、
約０．７ｍＭから約２．５ｍＭのシスチン；
約０．１１μＭから約０．７２μＭのビタミンＢ２；
約４．５μＭから約３０．０μＭのビタミンＢ６；
約３．４μＭから約２２．０μＭのビタミンＢ９；及び
約０．２μＭから約１．５μＭのビタミンＢ１２
を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
細胞培養物は、ビタミンＢ１、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５及びビタミンＢ７の何れか一又は複数を更に含む、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２２】
細胞培養培地は、
約２．０μＭから約１４．０μＭのビタミンＢ１；
約１１．０μＭから約７２．０μＭのビタミンＢ３；
約６．８μＭから約４４．０μＭのビタミンＢ５；及び
約０．０２μＭから約０．１４μＭのビタミンＢ７
の何れか一又は複数を更に含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
細胞培養培地は、鉄源を更に含む、請求項１９から２２の何れか一項に記載の方法。
【請求項２４】
鉄源がクエン酸第二鉄又は硫酸第一鉄である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
細胞培養培地は、約２μＭから約８０μＭの濃度でクエン酸第二鉄を含む、請求項１９から２４の何れか一項に記載の方法。
【請求項２６】
細胞培養培地は、約１１．０μＭから約３６．０μＭの濃度でクエン酸第二鉄を含む、請求項１９から２５の何れか一項に記載の方法。
【請求項２７】
細胞培養培地は、ヒドロコルチゾンを更に含む、請求項１９から２６の何れか一項に記載の方法。
【請求項２８】
細胞培養培地中のヒドロコルチゾンの濃度は、約０．０５μＭから約０．２５μＭである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
細胞培養培地は、化学的に定義された細胞培養培地である、請求項１９から２８の何れか一項に記載の方法。
【請求項３０】
細胞培養培地は、化学的に未定義な細胞培養培地である、請求項１９から２８の何れか一項に記載の方法。
【請求項３１】
培養は細胞の増殖期の間である、請求項１９から３０の何れか一に記載の方法。
【請求項３２】
培養は細胞の生成期の間である、請求項１９から３１の何れか一に記載の方法。
【請求項３３】
方法は、細胞培養培地にシステインを添加する工程を更に含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
細胞培養培地中に、システインが、約８０ｍｇ／Ｌから約１５００ｍｇ／Ｌのシステインを提供する量で添加される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
細胞培養培地中に、システインが、約１５００ｍｇ／Ｌのシステインを提供する量で添加される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
細胞培養培地中に、システインが、約１４０ｍｇ／Ｌのシステインを提供する量で添加される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
ポリペプチドは抗体である、請求項１９から３６の何れか一項に記載の方法。
【請求項３８】
抗体はＩｇＧ１抗体である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
抗体は、抗ＶＥＧＦ、抗メソテリン、抗ＰＣＳＫ９又は抗ベータ７抗体である、請求項３７又は３８に記載の方法。
【請求項４０】
細胞培養培地からポリペプチドを単離する工程を更に含む、請求項１９から３９の何れか一項に記載の方法。
【請求項４１】
単離されたポリペプチドを含む組成物は、無色又は僅かに着色した液体として現れる、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
組成物は少なくとも１００ｍｇ／ｍＬの濃度で単離されたポリペプチドを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
請求項１９から４２の何れか一項に記載の方法により生成されるポリペプチド。
【請求項４４】
請求項４３に記載のポリペプチド及び薬学的に許容される担体を含む薬学的製剤。
【請求項４５】
化学的に定義された成分を有する細胞培養培地を補充するためのキットであって、該キットは
細胞培養培地中に、約１２００ｍｇ／Ｌのシスチンを提供する量のシスチン；
細胞培養培地中に、約０．０５ｍｇ／Ｌから約１．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ２を提供する量のビタミンＢ２；
細胞培養培地中に、約０．０５ｍｇ／Ｌから約１０．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ６を提供する量のビタミンＢ６；
細胞培養培地中に、約０．０５ｍｇ／Ｌから約１２．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ９を提供する量のビタミンＢ９；及び
細胞培養培地中に、約０．０５ｍｇ／Ｌから約２．５ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２を提供する量のビタミンＢ１２
を含むキット。
【請求項４６】
キットは、
細胞培養培地中に、約０．７ｍＭから約２．５ｍＭのシスチンを提供する量のシスチン；
細胞培養培地中に、約０．１１μＭから約０．７２μＭのビタミンＢ２を提供する量のビタミンＢ２；
細胞培養培地中に、約４．５μＭから約３０．０μＭのビタミンＢ６を提供する量のビタミンＢ６；
細胞培養培地中に、約３．４μＭから約２２μＭのビタミンＢ９を提供する量のビタミンＢ９；及び
細胞培養培地中に、約０．２μＭから約１．５μＭのビタミンＢ１２を提供する量のビタミンＢ１２
を含む、請求項４５に記載のキット。
【請求項４７】
キットは、ビタミンＢ１、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５及びビタミンＢ７の何れか一又は複数を更に含む、請求項４５又は４６に記載のキット。
【請求項４８】
キットは、
細胞培養培地中に、約２．０μＭから約１４．０μＭのビタミンＢ１を提供する量のビタミンＢ１；
細胞培養培地中に、約１１．０μＭから約７２．０μＭのビタミンＢ３を提供する量のビタミンＢ３；
細胞培養培地中に、約６．８μＭから約４４．０μＭのビタミンＢ５を提供する量のビタミンＢ５；及び
細胞培養培地中に、約０．０２μＭから約０．１４μＭのビタミンＢ７を提供する量のビタミンＢ７
の何れか一又は複数を更に含む、請求項４７に記載のキット。
【請求項４９】
キットは、鉄源を更に含む、請求項４５から４８の何れか一項に記載のキット。
【請求項５０】
鉄源がクエン酸第二鉄又は硫酸第一鉄である、請求項４９に記載のキット。
【請求項５１】
キットは、ヒドロコルチゾンを更に含む、請求項４５から５０の何れか一に記載のキット。
【請求項５２】
約２００ｍｇ／Ｌから約１２００ｍｇ／Ｌのシスチン；
約０．０５ｍｇ／Ｌから約１．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ２；
約０．０５ｍｇ／Ｌから約１０．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ６；
約０．０５ｍｇ／Ｌから約１２．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ９；及び
約０．０５ｍｇ／Ｌから約２．５ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２
を含む細胞培養培地
【請求項５３】
約０．７ｍＭから約２．５ｍＭのシスチン；
約０．１１μＭから約０．７２μＭのビタミンＢ２；
約４．５μＭから約３０．０μＭのビタミンＢ６；
約３．４μＭから約２２．０μＭのビタミンＢ９；及び
約０．２μＭから約１．５μＭのビタミンＢ１２
を含む、請求項５２に記載の培地。
【請求項５４】
ビタミンＢ１、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５及びビタミンＢ７の何れか一又は複数を更に含む、請求項５２又は５３に記載の培地。
【請求項５５】
約２．０μＭから約１４．０μＭのビタミンＢ１；
約１１．０μＭから約７２．０μＭのビタミンＢ３；
約６．８μＭから約４４．０μＭのビタミンＢ５；及び
約０．０２μＭから約０．１４μＭのビタミンＢ７
の何れか一又は複数を更に含む、請求項５４に記載の培地。
【請求項５６】
細胞培養培地は、鉄源を更に含む、請求項５２から５５の何れか一項に記載の培地。
【請求項５７】
鉄源がクエン酸第二鉄又は硫酸第一鉄である、請求項５６に記載の培地。
【請求項５８】
細胞培養培地は、約２μＭから約８０μＭの濃度でクエン酸第二鉄を含む、請求項５７に記載の培地。
【請求項５９】
細胞培養培地は、約１１．０μＭから約３６．０μＭの濃度でクエン酸第二鉄を含む、請求項５８に記載の培地。
【請求項６０】
細胞培養培地は、ヒドロコルチゾンを更に含む、請求項５２から５９の何れか一項に記載の培地。
【請求項６１】
細胞培養培地は、約０．０５μＭから約０．２５μＭの濃度でヒドロコルチゾンを含む、請求項６０に記載の培地。
【請求項６２】
約２００ｍｇ／Ｌから約１２００ｍｇ／Ｌのシスチン；
約２μＭから約８０μＭのクエン酸第二鉄；及び
約０．０５μＭから約０．５μＭのヒドロコルチゾン
を含む細胞培養培地と細胞を接触させる工程を含む、細胞を培養する方法。
【請求項６３】
細胞培養培地は、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＢ９及び／又はビタミンＢ１２を更に含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
細胞培養培地は、約０．０５ｍｇ／Ｌから約１．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ２を含む、請求項６２又は６３に記載の方法。
【請求項６５】
細胞培養培地は、約０．０５ｍｇ／Ｌから約１０．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ６を含む、請求項６２から６４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６６】
細胞培養培地は、約０．０５ｍｇ／Ｌから約１２．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ９を含む、請求項６２から６５の何れか一項に記載の方法。
【請求項６７】
細胞培養培地は、約０．０５ｍｇ／Ｌから約２．５ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２を含む、請求項６２から６６の何れか一項に記載の方法。
【請求項６８】
細胞培養培地は、化学的に定義された細胞培養培地である、請求項６２から６７の何れか一項に記載の方法。
【請求項６９】
細胞培養培地は、化学的に未定義な細胞培養培地である、請求項６２から６７の何れか一項に記載の方法。
【請求項７０】
細胞は、細胞の増殖期の間に細胞培養培地と接触される、請求項６２から６９の何れか一項に記載の方法。
【請求項７１】
細胞は、細胞生成期の間に細胞培養培地と接触される、請求項６２から７０の何れか一項に記載の方法。
【請求項７２】
方法は、細胞培養培地にシステインを添加する工程を更に含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
細胞培養培地中に、システインが、約８０ｍｇ／Ｌから約１５００ｍｇ／Ｌのシステインを提供する量で添加される、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
細胞培養培地中に、システインが、約１５００ｍｇ／Ｌのシステインを提供する量で添加される、請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
細胞培養培地中に、システインが、約１４０ｍｇ／Ｌのシステインを提供する量で添加される、請求項７２に記載の方法。
【請求項７６】
ポリペプチドをコードする単離された核酸を含む細胞を細胞培養培地中で培養する工程を含む、ポリペプチドを生成する方法であって、
（ａ）細胞培養培地は
約２００ｍｇ／Ｌから約１２００ｍｇ／Ｌのシスチン；
約２μＭから約８０μＭのクエン酸第二鉄；及び
約０．０５μＭから約０．５μＭのヒドロコルチゾン；
を含み、及び
（ｂ）細胞はポリペプチドを発現する
方法。
【請求項７７】
細胞培養培地は、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＢ９及び／又はビタミンＢ１２を更に含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
細胞培養培地は、約０．０５ｍｇ／Ｌから約１．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ２を含む、請求項７６又は７７に記載の方法。
【請求項７９】
細胞培養培地は、約０．０５ｍｇ／Ｌから約１０．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ６を含む、請求項７６から７８の何れか一項に記載の方法。
【請求項８０】
細胞培養培地は、約０．０５ｍｇ／Ｌから約１２．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ９を含む、請求項７６から７９の何れか一項に記載の方法。
【請求項８１】
細胞培養培地は、約０．０５ｍｇ／Ｌから約２．５ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２を含む、請求項７６から８０の何れか一項に記載の方法。
【請求項８２】
細胞培養培地は、化学的に定義された細胞培養培地である、請求項７６から８１の何れか一項に記載の方法。
【請求項８３】
細胞培養培地は、化学的に未定義な細胞培養培地である、請求項７６から８１の何れか一項に記載の方法。
【請求項８４】
培養は細胞の増殖期の間である、請求項７６から８３の何れか一に記載の方法。
【請求項８５】
培養は細胞の生成期の間である、請求項７６から８４の何れか一に記載の方法。
【請求項８６】
方法は、細胞培養培地にシステインを添加する工程を更に含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
細胞培養培地中に、システインが、約８０ｍｇ／Ｌから約１５００ｍｇ／Ｌのシステインを提供する量で添加される、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
細胞培養培地中に、システインが、約１５００ｍｇ／Ｌのシステインを提供する量で添加される、請求項８６に記載の方法。
【請求項８９】
細胞培養培地中に、システインが、約１４０ｍｇ／Ｌのシステインを提供する量で添加される、請求項８６に記載の方法。
【請求項９０】
ポリペプチドは抗体である、請求項７６から８９の何れか一項に記載の方法。
【請求項９１】
抗体はＩｇＧ１抗体である、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
抗体は、抗ＶＥＧＦ、抗メソテリン、抗ＰＣＳＫ９又は抗ベータ７抗体である、請求項９０又は９１に記載の方法。
【請求項９３】
細胞培養培地からポリペプチドを単離する工程を更に含む、請求項７６から９２の何れか一項に記載の方法。
【請求項９４】
単離されたポリペプチドを含む組成物は、無色又は僅かに着色した液体として現れる、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
組成物は少なくとも１００ｍｇ／ｍＬの濃度で単離されたポリペプチドを含む、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
請求項７６から９５の何れか一項に記載の方法により生成されるポリペプチド。
【請求項９７】
請求項９６に記載のポリペプチド及び薬学的に許容される担体を含む薬学的製剤。
【請求項９８】
化学的に定義された成分を有する細胞培養培地を補充するためのキットであって、該キットは、
細胞培養培地中に、約２００ｍｇ／Ｌから約１２００ｍｇ／Ｌのシスチンを提供する量のシスチン；
細胞培養培地中に、約２μＭから約８０μＭのクエン酸第二鉄の濃度を提供する量のクエン酸第二鉄；
細胞培養培地中に、約０．０５μＭから約０．５μＭのヒドロコルチゾンの濃度を提供する量のヒドロコルチゾン
を含むキット。
【請求項９９】
キットは、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＢ９及び／又はビタミンＢ１２を更に含む、請求項９８に記載のキット。
【請求項１００】
キットは、細胞培養培地中に、約０．０５ｍｇ／Ｌから約１．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ２を提供する量のビタミンＢ２を含む、請求項９８又は９９に記載のキット。
【請求項１０１】
キットは、細胞培養培地中に、約０．０５ｍｇ／Ｌから約１０．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ６を提供する量のビタミンＢ６を含む、請求項９８から１００の何れか一項に記載のキット。
【請求項１０２】
キットは、細胞培養培地中に、約０．０５ｍｇ／Ｌから約１２．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ９を提供する量のビタミンＢ９を含む、請求項９８から１０１の何れか一項に記載のキット。
【請求項１０３】
キットは、細胞培養培地中に、約０．０５ｍｇ／Ｌから約２．５ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２を提供する量のビタミンＢ１２を含む、請求項９８から１０２の何れか一項に記載のキット。
【請求項１０４】
約２００ｍｇ／Ｌから約１２００ｍｇ／Ｌのシスチン；
約２μＭから約８０μＭのクエン酸第二鉄；及び
約０．０５μＭから約０．５μＭのヒドロコルチゾン
を含む細胞培養培地。
【請求項１０５】
培地は、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＢ９及び／又はビタミンＢ１２を更に含む、請求項１０４に記載の培地。
【請求項１０６】
培地は、約０．０５ｍｇ／Ｌから約１．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ２を含む、請求項１０４又は１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
培地は、約０．０５ｍｇ／Ｌから約１０．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ６を含む、請求項１０４から１０６の何れか一項に記載の培地。
【請求項１０８】
培地は、約０．０５ｍｇ／Ｌから約１２．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ９を含む、請求項１０４から１０７の何れか一項に記載の培地。
【請求項１０９】
培地は、約０．０５ｍｇ／Ｌから約２．５ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２を含む、請求項１０４から１０８の何れか一項に記載の培地。
【請求項１１０】
（ａ）ポリペプチドをコードする単離された核酸を含む細胞；及び（ｂ）請求項５２から６１及び１０４から１０９の何れか一項に記載の培地を含む組成物。
【請求項１１１】
（ａ）ポリペプチド；及び（ｂ）請求項５２から６１及び１０４から１０９の何れか一項に記載の培地を含む組成物を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連親出願に対する相互参照
この出願は、２０１２年４月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／６３７，７７８号、２０１２年４月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／６３７，７８０号、及び２０１３年３月１５日に出願された米国非仮特許出願第１３／８４１，８６４の優先権の利益を主張し、これらの各々の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
組換え細胞培養物を用いてインビトロでタンパク質を生成する方法は周知であり、タンパク質ベースの製剤を製造するために工業的規模で使用されている。しかし、重要な課題が、組換え細胞培養からのタンパク質の効率的な製造のために残っている。例えば、タンパク質ベースの製剤は、例えば、サイズ分布、配列の完全性と製品の色など、タンパク質の製造方法によって影響を受ける可能性がある、特定の品質特性を有する。
【０００３】
特に懸念される一品質特性は、タンパク質製剤の色である。タンパク質ベースの製剤の許容可能な色レベルに関する規制要件も満たしている必要がある。従って、許容可能な色を有する（例えば、製品のマーケティングのための規制要件を満足する）タンパク質生成物を生成することは、薬物の生産の重要な態様である。以前の臨床材料と製品品質の互換性を確立することもまた重要であり得る。
【０００４】
モノクローナル抗体の皮下送達に向けた最近の傾向は、処方された薬物物質の濃度の増加（例えば、≧１５０ｍｇ／ｍＬまで）が付きものである。これらの濃度で、製剤の色はより強くすることができ、許容可能な色を有するタンパク質ベースの製剤を生成することを困難にしている。細胞培養条件は、タンパク質ベースの製剤の品質特性に影響を与えることができる。細胞が培養される培地は、タンパク質の生成に特に大きな影響を持つことができる。
【０００５】
インビトロでタンパク質を生成するための組換えＤＮＡ技術は、歴史的に、動物血清やペプトンなどの可変性で化学的に未定義の培地成分を添加した培地で培養した細胞株を使用している。化学的に未定義の栄養素はロット間の可変性につながる可能性があり、動物由来の生成物は、培地を望ましくない成分で汚染する可能性がある。ロット間で一貫性の既知の組成物からなる化学的に定義された細胞培養培地（「ＣＤＭ」）がこれらの懸案事項に取り組むために開発されてきた。タンパク質生産のためのＣＤＭの使用に関連する様々な利点のために、ＣＤＭを利用するプロセスに有利な、血清を含みかつペプトンを含むプロセスからは離れる業界全体の傾向がある。様々なＣＤＭが、例えば、米国特許第４７６７７０４号；同５６９１２０２号；同６０４８７２８号；同６９０００５６号；及び同７６０１５３５号、及び米国特許出願公開番号２００３００８７３７２号及び同２０１１００３９３３０号などの特許文献に記載されている。しかし、化学的に未定義の培地は、タンパク質生成における用途を見出し続けている。
【０００６】
インビトロで許容可能な製品の品質特性を有するタンパク質（例えば、抗体）の生成に関して、改善された対費用効果の高い方法を提供することが引き続き必要とされている。製品の一以上の品質特性を調節する細胞培養培地が所望される。化学的に未定義又は化学的に定義されるかによらず、所望のタンパク質濃度（例えば、≧を１５０ｍｇ／ｍＬ）を維持しつつ、より低い色の強度で一貫してタンパク質生成物を提供する成分を有する、細胞培養培地は、例えば皮下注射のための抗体などのタンパク質生成物の開発において用途を見いだすであろう。
【発明の概要】
【０００７】
発明の簡潔な概要
許容可能な色を持つ製剤を提供する細胞培養培地の組成物が説明され、並びに細胞増殖（即ち、細胞培養）及び／又はタンパク質生成のために培地を使用する方法が説明される。所望のタンパク質ベースの製剤濃度（例えば、≧１００ｍｇ／ｍＬ又は≧１５０ｍｇ／ｍＬ）を維持しつつ、許容可能な色を有するタンパク質ベースの製剤を提供する培地もまた提供され、皮下注射のための抗体の生成用などのタンパク質生成方法における用途を見出すことができる。本明細書で詳述されるように、細胞培養培地は、化学的に未定義又はＣＤＭとすることができる。明細書中に提供される培地を含む組成物、及びポリペプチド（例えば、培地中に宿主細胞によって分泌されるポリペプチド）及び／又はポリペプチドをコードする単離された核酸を含む細胞もまた意図される。本明細書で詳述される方法によって調製されたポリペプチドが提供され、同様にポリペプチド及び担体（例えば、薬学的に受容可能な単体）を含む製剤が提供される。一態様では、ポリペプチド製剤は、許容可能な色を有し、少なくとも１００ｍｇ／ｍＬ又は１５０ｍｇ／ｍＬのタンパク質ベースの製剤濃度を維持するものである。
【０００８】
本明細書で詳述した細胞培養培地は、一般的に、色などのタンパク質生成物品質特性をもたらす量で：（ａ）シスチン又はシステイン；（ｂ）ビタミンＢ２；（ｃ）ビタミンＢ６（ＨＣｌ塩として提供されてもよいピリドキシン及び／又はピリドキサール）；（ｄ）ビタミンＢ９；（ｅ）ビタミンＢ１２；（ｆ）硝酸鉄、クエン酸第二鉄又は硫酸第一鉄などの鉄源；及び（ｇ）ヒドロコルチゾンの一以上を含む。一バリエーションでは、細胞培養培地は、成分（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｇ）の２又は３又は４又は５又は６又は各々を含む。本明細書で提供される細胞培養培地は、成分（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｇ）の任意の組み合わせを、個々及び全ての組み合わせが具体的かつ個別に列挙されるのと同様に含むことが理解される。一態様では、細胞培養培地は、ＣＤＭである。別の態様では、細胞培養培地は、化学的に未定義である。特定のバリエーションでは、本明細書に詳述される細胞培養培地は、（ａ）約３００ｍｇ／Ｌ（幾つかの実施態様では２００ｍｇ／Ｌ）から約１２００ｍｇ／Ｌのシスチン；（ｂ）約０．０５ｍｇ／Ｌから約１．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ２；（ｃ）約０．０５ｍｇ／Ｌから約１０．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ６；（ｄ）約０．０５ｍｇ／Ｌから約１２．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ９；及び（ｅ）約０．０５ｍｇ／Ｌから約２．５ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２を含み、ここで細胞培養培地は、（ａ）一バリエーションではＣＤＭであって良く、及び／又は（ｂ）以下の成分：（１）クエン酸第二鉄又は硫酸第一鉄などの鉄源（一態様において約２μＭから約８０μＭの濃度で存在する）、及び（２）ヒドロコルチゾン（一態様において約０．０５μＭから約０．２５μＭの濃度で存在する）の一以上を更に含んでも良い。他のバリエーションでは、本明細書に詳述される細胞培養培地は、（ａ）約３００ｍｇ／Ｌ（幾つかの実施態様では２００ｍｇ／Ｌ）から約１２００ｍｇ／Ｌのシスチン；（ｂ）約２μＭから約８０μＭのクエン酸第二鉄；及び（ｃ）約０．０５μＭから約０．５μＭのヒドロコルチゾンを含み、及びここで細胞培養培地は、（１）ＣＤＭの一バリエーションであって良く、及び／又は（２）以下の成分：（Ａ）ビタミンＢ２（一態様では、約０．０５ｍｇ／Ｌから約１．０ｍｇ／Ｌの濃度で存在する）；（Ｂ）ビタミンＢ６（一態様では、約０．０５ｍｇ／Ｌから約１０．０ｍｇ／Ｌの濃度で存在する）；（Ｃ）ビタミンＢ９（一態様では、約０．０５ｍｇ／Ｌから約１２．０ｍｇ／Ｌの濃度で存在する）；及び（Ｄ）ビタミンＢ１２（一態様では、約０．０５ｍｇ／Ｌから約２．５ｍｇ／Ｌの濃度で存在する）の一以上を含んでも良い。一バリエーションで本明細書に提供される任意の培地については、培地は、ポリペプチドを生成する方法で使用される場合、ポリペプチドが異なる細胞培養培地中（例えば、同じ培地成分を含まないか又は同じ培地成分を異なる量で含む培地）で生成される場合に得られた電荷変異体（一態様では、それは酸性の電荷変異体である）と比較して、電荷変異体（一態様では、それは酸性の電荷変異体である）の存在を減少させる。本明細書において提供される組成物及び方法の一つのバリエー��ョンにおいて、電荷変異体（一態様では、それは酸性の電荷変異体である）は、ポリペプチド生成物のわずか２５％又は２０％又は１８％又は１５％又は１０％を構成する。本明細書において提供される組成物及び方法の別のバリエーションにおいて、ポリペプチド生成物の少なくとも７５％又は８０％又は８５％又は９０％又は９５％又はそれ以上は、主要種タンパク質である。幾つかのバリエーションにおいて、主要種タンパク質は、タンパク質のアミノ酸配列、二次構造、及び／又は三次構造によって識別されるように、定量的に主要なタンパク質である。幾つかのバリエーションにおいて、主要種タンパク質は、一以上の翻訳後修飾によって識別される定量的に主要なタンパク質である。幾つかのバリエーションにおいて、翻訳後修飾は、グリコシル化である。本明細書に記載のポリペプチド生成物の割合は、ポリペプチド生成物の精製の前に、ポリペプチド生成物の精製後で、又はポリペプチドの精製プロセスの任意の段階で決定することができることが理解される。
【０００９】
酸性の変異体は、種々の方法によって評価することができるが、しかし、好ましくは、そのような方法は、一つ、二つ、三つ、四つ、又は五つの：イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）を含み、ここで組成物は、ＩＥＣの前、後、及び／又はその間に、シアリダーゼで処理され（例えばがシアル化変異体を評価するため）、還元型ＣＥ−ＳＤＳで処理され（例えば、ジスルフィド還元型変異体を評価するため）、非還元型ＣＥ−ＳＤＳで処理され（例えば、非還元性の変異体を評価するため）、ボロン酸クロマトグラフィーで処理され（例えば、糖化変異体を評価するため）、及びペプチドマッピングで処理される（例えば脱アミド化バリアントを評価する）。一バリエーションにおいて、酸性変異体全体は、例えば、カルボン酸官能基を含む弱陽イオン交換体及び／又は陽イオン交換体を使用して（例えば、ＤＩＯＮＥＸ ＰＲＯＰＡＣＴＭＷＣＸ−１０クロマトグラフィーカラムを使用して）イオン交換クロマトグラフィーによって評価される。
【００１０】
本発明の別の態様において、本明細書で詳述した細胞培養培地は、一般的に、色などのタンパク質生成物品質特性をもたらす量で：（ａ）シスチン；（ｂ）ビタミンＢ１；（ｃ）ビタミンＢ２；（ｄ）ビタミンＢ３；（ｅ）ビタミンＢ５；（ｆ）ビタミンＢ６（ＨＣｌ塩として提供されてもよいピリドキシン及び／又はピリドキサール）；（ｇ）ビタミンＢ７；（ｈ）ビタミンＢ９；（ｉ）ビタミンＢ１２；及び（ｊ）硝酸鉄、クエン酸第二鉄又は硫酸第一鉄などの鉄源の一以上を含む。一バリエーションでは、細胞培養培地は、成分（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）及び（ｊ）の２又は３又は４又は５又は６又は７又は８又は９又は各々を含む。本明細書で提供される細胞培養培地は、成分（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、及び（ｊ）の任意の組み合わせを、個々及び全ての組み合わせが具体的かつ個別に列挙されるのと同様に含むことが理解される。一態様では、細胞培養培地は、ＣＤＭである。別の態様では、細胞培養培地は、化学的に未定義である。特定のバリエーションにおいて、本明細書に詳述される細胞培養培地は、（ａ）約０．８ｍＭ（幾つかの実施態様において、０．７ｍＭ）から約２．５ｍＭのシスチン；（ｂ）約０．１１μＭから約０．７２μＭのビタミンＢ２；（ｃ）約４．５μＭから約３０．０μＭのビタミンＢ６；（ｃ）約３．４μＭから約２２．０μＭのビタミンＢ９；及び（ｄ）約０．２μＭから約１．５μＭのビタミンＢ１２を含み、及びここで細胞培養培地は、（ａ）一バリエーションにおいてＣＤＭであって良く、及び／又は（ｂ）以下の成分：（１）クエン酸第二鉄又は硫酸第一鉄などの鉄源（一態様において約１１．０μＭから約３６．０μＭの濃度で存在する）、（２）ビタミンＢ１（一態様において約２．０μＭから約１４．０μＭの濃度で存在する）、（３）ビタミンＢ３（一態様において約１１．０μＭから約７２．０μＭの濃度で存在する）、（４）ビタミンＢ５（一態様において約６．８μＭから約４４．０μＭの濃度で存在する）、及び（５）ビタミンＢ７（一態様において約０．０２μＭから約０．２４μＭの濃度で存在する）の一以上を更に含み得る。
【００１１】
本明細書に詳述される細胞培養培地の使用は、異なる組成からなる細胞培養培地中（例えば、本明細書に詳述されるような培地成分及び／又は成分の量を含まない培地）に生成されたタンパク質生成物と比較した場合、例えば主要種タンパク質の酸化を減少させることによって、タンパク質生成物の安定性（例えば、物理的安定性及び／又は化学的安定性）を高めることができる。本明細書に詳述される細胞培養培地の使用は、異なる組成からなる培地中（例えば、本明細書に詳述されるような培地成分及び／又は成分の量を含まない培地）に生成されたポリペプチド生成物と比較した場合、ポリペプチド生成物の着色形態を減少させ得る。本明細書に詳述される細胞培養培地の使用は、異なる組成からなる培地中（例えば、本明細書に詳述されるような培地成分及び／又は成分の量を含まない培地）に生成されたポリペプチド生成物と比較した場合、細胞培養容器内で他の物質へのポリペプチド生成物の結合（例えば、付加物）を減少させ得る。ポリペプチド組成物の安定性を増す方法が意図され、ポリペプチド生成物の着色形態の存在及び／又は量を減少させ、細胞培養容器内のその他の物質（付加物など）へのポリペプチド生成物の結合を減少させる方法も意図される。
【００１２】
本明細書において詳述する任意の方法により提供されるようなポリペプチドを生成する工程を含む、ポリペプチド（例えば、抗体）を含む製剤を調製し、薬学的に許容される担体又は賦形剤などの一又は複数の製剤成分とポリペプチドを結合する方法も提供される。
【００１３】
本明細書において詳述する任意の方法によって生成されるポリペプチド（例えば、抗体）を含む製剤も提供される。製剤は、ポリペプチド及び薬学的に許容される担体又は賦形剤を含んでもよい。個体への投与に適切であり得るポリペプチド製剤は、単離及び／又は精製された抗体を含み、許容可能な色など一以上の所望の製剤品質特性を持ち得る。一態様では、本明細書において提供される方法の何れかによって得られたポリペプチド生成物を含む製剤は、少なくとも１００ｍｇ／ｍＬ、又は少なくとも１５０ｍｇ／ｍＬの濃度でポリペプチドを含む。少なくとも１００ｍｇ／ｍＬ又は少なくとも１５０ｍｇ／ｍＬのポリペプチド生成物を含む製剤（例えば、ＩｇＧ１抗体などの抗体）もまた許容される色であってもよい。このような製剤は、一態様においてはヒトである個体への皮下注射などの注射用に適切であり得る。幾つかの態様では、注射に適したポリペプチド製剤は、少なくとも１００ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１２５ｍｇ／ｍＬ、又は少なくとも１５０ｍｇ／ｍＬより大きい濃度であり、ＣＯＣアッセイによって測定されるように、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７、Ｂ８、又はＢ９より大きい色強度値を有する。ＣＯＣアッセイにより決定される色強度値は、限定されないが、茶色（Ｂ）、茶色がかった黄色（ＢＹ）、黄色（Ｙ）、緑がかった黄色（ＧＹ）、又は赤色（Ｒ）の任意の一とすることができ、より高い値はより明るい色の強さを示していることが理解される。幾つかの態様では、注射に適したポリペプチド製剤は、少なくとも１００ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１２５ｍｇ／ｍＬ、又は少なくとも１５０ｍｇ／ｍＬより大きい濃度であり、そして色のアッセイ（例えば、全色アッセイ又はニフティアッセイ）によって測定されるように、参照溶液の色強度値未満の色強度値を有している。本明細書において提供されるような製剤は、ポリペプチド生成物を含むことができ、ポリペプチド生成物のわずか２５％又は２０％又は１８％又は１５％又は１０％は、ポリペプチドの電荷変異体である（一態様では酸性の電荷変異体である）。本明細書において詳述される組成物はまたポリペプチド生成物を含んでも良く、ポリペプチド生成物の少なくとも７５％又は８０％又は８５％又は９０％又は９５％又はそれ以上は、主要種タンパク質である。特定のバリエーションにおいて、ポリペプチド（例えば、抗体）生成物を含む製剤が提供され、製剤は、１００ｍｇ／ｍＬ、１２５ｍｇ／ｍＬ、又は１５０ｍｇ／ｍＬより大きい濃度でポリペプチド生成物を含み、製剤は許容可能な色であり、そしてポリペプチド生成物のわずか２５％又は２０％又は１８％又は１５％又は１０％は、ポリペプチド電荷変異体である（一態様では酸性の電荷変異体である）。
【００１４】
細胞培養培地及び一以上の他の成分、例えば細胞及び／又は所望のポリペプチド（例えば、抗体）を含む組成物もまた提供される。組成物は、例えば、播種、細胞増殖、及び細胞生産／維持など細胞培養物の何れか及び全ての段階を包含する。一バリエーションにおいて、（ａ）ポリペプチドをコードする単離された核酸を含む細胞；及び（ｂ）本明細書で提供される細胞培養培地を含む組成物が提供される。別のバリエーションにおいて、（ａ）ポリペプチド；及び（ｂ）本明細書で提供される細胞培養培地を含む組成物が提供され、一態様において、ポリペプチドは、ポリペプチドをコードする単離された核酸を含む細胞によって培地中に分泌され、又はポリペプチドをコードする単離された核酸を含む細胞の溶解によって培地中に放出される。組成物の細胞は、本明細書に詳述される任意の細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）であって良く、そして組成物の細胞培養培地は本明細書に詳述される任意の培地であって良く、あたかも細胞及び培地の個々及び全ての組み合わせが具体的かつ個別に列挙されたかのと同じである。同様に、組成物のポリペプチドは、本明細書に詳述される任意のポリペプチドであって良く、そして組成物の培地は本明細書に詳述される任意の培地であって良く、あたかもポリペプチド及び培地の個々及び全ての組み合わせが具体的かつ個別に列挙されたかのと同じである。
【００１５】
本明細書で詳述されるように細胞培養培地と細胞を接触させることにより、細胞を増殖させる（即ち、細胞を培養する）方法が提供される。細胞を増殖させる（即ち、細胞を培養する）方法の特定のバリエーションにおいて、細胞培養培地はＣＤＭである。一バリエーションでは、細胞を増殖させる（即ち、細胞を培養する）方法は、（ａ）約３００ｍｇ／Ｌ（幾つかの実施態様では２００ｍｇ／Ｌ）から約１２００ｍｇ／Ｌのシスチン；（ｂ）約０．０５ｍｇ／Ｌから約１．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ２；（ｃ）約０．０５ｍｇ／Ｌから約１０．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ６；（ｄ）約０．０５ｍｇ／Ｌから約１２．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ９；及び（ｅ）約０．０５ｍｇ／Ｌから約２．５ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２を含む細胞培養培地と細胞とを接触させる工程を含み、ここで細胞培養培地は、以下の成分：（１）クエン酸第二鉄又は硫酸第一鉄などの鉄源（一態様において約２μＭから約８０μＭの濃度で存在する）、及び（２）ヒドロコルチゾン（一態様において約０．０５μＭから約０．２５μＭの濃度で存在する）の一以上を更に含んでも良い。別のバリエーションでは、細胞を増殖させる（即ち、細胞を培養する）方法であって、該方法は（ａ）約３００ｍｇ／Ｌ（幾つかの実施態様では２００ｍｇ／Ｌ）から約１２００ｍｇ／Ｌのシスチン；（ｂ）約２μＭから約８０μＭのクエン酸第二鉄；及び（ｃ）約０．０５μＭから約０．５μＭのヒドロコルチゾンを含む細胞培養培地と細胞とを接触させる工程を含む方法が提供され、ここで細胞培養培地は、以下の成分：（１）ビタミンＢ２（一態様では、約０．０５ｍｇ／Ｌから約１．０ｍｇ／Ｌの濃度で存在する）；（２）ビタミンＢ６（一態様では、約０．０５ｍｇ／Ｌから約１０．０ｍｇ／Ｌの濃度で存在する）；（３）ビタミンＢ９（一態様では、約０．０５ｍｇ／Ｌから約１２．０ｍｇ／Ｌの濃度で存在する）；及び（４）ビタミンＢ１２（一態様では、約０．０５ｍｇ／Ｌから約２．５ｍｇ／Ｌの濃度で存在する）の一以上を含んでも良い。本明細書において提供される細胞を増殖させる（即ち、細胞を培養する）任意の方法において、細胞は、細胞の増殖段階及び／又は生成期の間に細胞培養培地と接触させてもよい。細胞培養の任意の段階で、本明細書に詳述培地と細胞を接触させることは、例えば細胞の増殖、生成及び維持の間に意図される。当業者によって理解されるように、細胞は、ポリペプチドの生成を含む、細胞の維持及び／又は増殖を促進する条件（例えば、温度、ｐＨ、オスモル濃度、等）の下で、本明細書に詳述される培地と接触させられる。
【００１６】
本発明の別のバリエーションにおいて、細胞を増殖させる（即ち、細胞を培養する）方法は、（ａ）約０．８ｍＭ（幾つかの実施態様において、０．７ｍＭ）から約２．５ｍＭのシスチン；（ｂ）約０．１１μＭから約０．７２μＭのビタミンＢ２；（ｃ）約４．５μＭから約３０．０μＭのビタミンＢ６；（ｃ）約３．４μＭから約２２．０μＭのビタミンＢ９；及び（ｄ）約０．２μＭから約１．５μＭのビタミンＢ１２を含む細胞培養培地と細胞とを接触させる工程を含み、及びここで細胞培養培地は、以下の成分：（１）クエン酸第二鉄又は硫酸第一鉄などの鉄源（一態様において約１１．０μＭから約３６．０μＭの濃度で存在する）、（２）ビタミンＢ１（一態様において約２．０μＭから約１４．０μＭの濃度で存在する）、（３）ビタミンＢ３（一態様において約１１．０μＭから約７２．０μＭの濃度で存在する）、（４）ビタミンＢ５（一態様において約６．８μＭから約４４．０μＭの濃度で存在する）、及び（５）ビタミンＢ７（一態様において約０．０２μＭから約０．２４μＭの濃度で存在する）の一以上を更に含み得る。
【００１７】
本発明の更に別のバリエーションにおいて、細胞を増殖させる（即ち、細胞を培養する）方法は、約０．７ｍＭから約２．５ｍＭのシスチン；約２μＭから約８０μＭのクエン酸第二鉄；約０．０５μＭから約０．５μＭのヒドロコルチゾン；約０．１１μＭから約０．７２μＭのビタミンＢ２；約４．５μＭから約３０．０μＭのビタミンＢ６；（ｃ）約３．４μＭから約２２．０μＭのビタミンＢ９；及び約０．２μＭから約１．５μＭのビタミンＢ１２を含む細胞培養培地と細胞とを接触させる工程を含み、及びここで細胞培養培地は、以下の成分：（１）ビタミンＢ１（一態様において約２．０μＭから約１４．０μＭの濃度で存在する）、（２）ビタミンＢ３（一態様において約１１．０μＭから約７２．０μＭの濃度で存在する）、（３）ビタミンＢ５（一態様において約６．８μＭから約４４．０μＭの濃度で存在する）、及び（４）ビタミンＢ７（一態様において約０．０２μＭから約０．２４μＭの濃度で存在する）の一以上を更に含み得る。
【００１８】
細胞培養培地中で、ポリペプチドをコードする単離された核酸を含む細胞を増殖させること（即ち、細胞培養培地中で培養すること）によるポリペプチドを生成する方法もまた提供され：ここで、（ａ）細胞はポリペプチドを発現し、（ｂ）細胞培養培地は、（１）約３００ｍｇ／Ｌ（幾つかの実施態様では２００ｍｇ／Ｌ）から約１２００ｍｇ／Ｌのシスチン；（２）約０．０５ｍｇ／Ｌから約１．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ２；（３）約０．０５ｍｇ／Ｌから約１０．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ６；（４）約０．０５ｍｇ／Ｌから約１２．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ９；及び（５）約０．０５ｍｇ／Ｌから約２．５ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２を含み、ここで細胞培養培地は、以下の成分：（Ａ）クエン酸第二鉄又は硫酸第一鉄などの鉄源（一態様において約２μＭから約８０μＭの濃度で存在する）、及び（Ｂ）ヒドロコルチゾン（一態様において約０．０５μＭから約０．２５μＭの濃度で存在する）の一以上を更に含んでも良い。別のバリエーションでは、細胞培養培地中で、ポリペプチドをコードする単離された核酸を含む細胞を増殖させること（即ち、細胞培養培地中で培養すること）によるポリペプチドを生成する方法が提供され、ここで：（ａ）細胞はポリペプチドを発現し、（ｂ）細胞培養培地は、（１）約３００ｍｇ／Ｌ（幾つかの実施態様では２００ｍｇ／Ｌ）から約１２００ｍｇ／Ｌのシスチン；（２）約２μＭから約８０μＭのクエン酸第二鉄；及び（３）約０．０５μＭから約０．５μＭのヒドロコルチゾンを含み、ここで細胞培養培地は、以下の成分：（Ａ）ビタミンＢ２（一態様では、約０．０５ｍｇ／Ｌから約１．０ｍｇ／Ｌの濃度で存在する）；（Ｂ）ビタミンＢ６（一態様では、約０．０５ｍｇ／Ｌから約１０．０ｍｇ／Ｌの濃度で存在する）；（Ｃ）ビタミンＢ９（一態様では、約０．０５ｍｇ／Ｌから約１２．０ｍｇ／Ｌの濃度で存在する）；及び（Ｄ）ビタミンＢ１２（一態様では、約０．０５ｍｇ／Ｌから約２．５ｍｇ／Ｌの濃度で存在する）の一以上を更に含んでも良い。
【００１９】
本発明の別のバリエーションにおいて、細胞培養培地中で、ポリペプチドをコードする単離された核酸を含む細胞を増殖させること（即ち、細胞培養培地中で培養すること）によるポリペプチドを生成する方法もまた提供され：ここで、（ａ）細胞はポリペプチドを発現し、（ｂ）細胞培養培地は、（ａ）約０．８ｍＭ（幾つかの実施態様において、０．７ｍＭ）から約２．５ｍＭのシスチン；（ｂ）約０．１１μＭから約０．７２μＭのビタミンＢ２；（ｃ）約４．５μＭから約３０．０μＭのビタミンＢ６；（ｃ）約３．４μＭから約２２．０μＭのビタミンＢ９；及び（ｄ）約０．２μＭから約１．５μＭのビタミンＢ１２を含み、及びここで細胞培養培地は、以下の成分：（１）クエン酸第二鉄又は硫酸第一鉄などの鉄源（一態様において約１１．０μＭから約３６．０μＭの濃度で存在する）、（２）ビタミンＢ１（一態様において約２．０μＭから約１４．０μＭの濃度で存在する）、（３）ビタミンＢ３（一態様において約１１．０μＭから約７２．０μＭの濃度で存在する）、（４）ビタミンＢ５（一態様において約６．８μＭから約４４．０μＭの濃度で存在する）、及び（５）ビタミンＢ７（一態様において約０．０２μＭから約０．２４μＭの濃度で存在する）の一以上を更に含み得る。
【００２０】
本発明の更に別のバリエーションにおいて、細胞培養培地中で、ポリペプチドをコードする単離された核酸を含む細胞を増殖させること（即ち、細胞培養培地中で培養すること）によるポリペプチドを生成する方法もまた提供され：ここで、（ａ）細胞はポリペプチドを発現し、（ｂ）細胞培養培地は、約０．７ｍＭから約２．５ｍＭのシスチン；約２μＭから約８０μＭのクエン酸第二鉄；約０．０５μＭから約０．５μＭのヒドロコルチゾン；約０．１１μＭから約０．７２μＭのビタミンＢ２；約４．５μＭから約３０．０μＭのビタミンＢ６；（ｃ）約３．４μＭから約２２．０μＭのビタミンＢ９；及び約０．２μＭから約１．５μＭのビタミンＢ１２を含む細胞培養培地と細胞とを接触させる工程を含み、及びここで細胞培養培地は、以下の成分：（１）ビタミンＢ１（一態様において約２．０μＭから約１４．０μＭの濃度で存在する）、（２）ビタミンＢ３（一態様において約１１．０μＭから約７２．０μＭの濃度で存在する）、（３）ビタミンＢ５（一態様において約６．８μＭから約４４．０μＭの濃度で存在する）、及び（４）ビタミンＢ７（一態様において約０．０２μＭから約０．２４μＭの濃度で存在する）の一以上を更に含み得る。
【００２１】
本明細書に記載の方法により生成され、又は本明細書に記載の組成物中に存在するポリペプチドは、一バリエーションにおいて、ＩｇＧ１抗体等の抗体であって良い。一態様において、本明細書に記載の方法により生成され、又は本明細書に記載の組成物中に存在するポリペプチドは、抗ＶＥＧＦ、抗メソテリン、抗ＰＣＳＫ９又は抗ベータ７抗体である。本明細書に記載の方法に従って生成され、又は記載される組成物中に存在するポリペプチドは、細胞培養培地から単離しても良く、更に精製することができる。（抗体などの）ポリペプチドはまた、望ましい濃度を達成するために濃縮することができる。ポリペプチドを濃縮する方法は当該分野で知られており、例えば、ポリペプチド又はあタンパク質の濃度は、限外濾過を使用することによって高めることができる。特定のバリエーションにおいて、ポリペプチドは、少なくとも１００ｍｇ／ｍＬ又は１５０ｍｇ／ｍＬの濃度で単離され、及び／又は無色又は僅かに着色した液体として現れる。特定のバリエーションにおいて、組成物は、少なくとも１００ｍｇ／ｍＬの濃度で単離され、及び／又は無色又は僅かに着色した液体として現れる。特定のバリエーションにおいて、組成物は、少なくとも１ｍｇ／ｍＬ又は１０ｍｇ／ｍＬ又は５０ｍｇ／ｍＬ又は７５ｍｇ／ｍＬの濃度で単離されたポリペプチドを含み、及び／又は無色又は僅かに着色した液体として現れる。特定のバリエーションにおいて、組成物は、少なくとも約１ｍｇ／ｍＬ又は約１０ｍｇ／ｍＬ又は約５０ｍｇ／ｍＬ又は約７５ｍｇ／ｍＬの何れか一の濃度で単離されたポリペプチドを含み、及び／又は無色又は僅かに着色した液体として現れる。別のバリエーションにおいて、組成物は、少なくとも約１ｍｇ／ｍＬ又は約１０ｍｇ／ｍＬ又は約５０ｍｇ／ｍＬ又は約７５ｍｇ／ｍＬの何れか一から約１２５ｍｇ／ｍＬまで又は約１５０ｍｇ／ｍＬまでの濃度で単離されたポリペプチドを含み、及び／又は無色又は僅かに着色した液体として現れる。また、記載されるのは、本明細書に詳述される方法により得られたポリペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む組成物である。
【００２２】
細胞培養培地を化学的に定義された成分で補充するためのキットもまた記述され、キットは、（ａ）細胞培養培地中で、約３００ｍｇ／Ｌ（幾つかの実施態様において、２００ｍｇ／Ｌ）から約１２００ｍｇ／Ｌのシスチンを提供する量のシスチン；（ｂ）細胞培養培地中で、約０．０５ｍｇ／Ｌから約１．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ２を提供する量のビタミンＢ２；（ｃ）細胞培養培地中で、約０．０５ｍｇ／Ｌから約１０．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ６を提供する量のビタミンＢ６；（ｄ）細胞培養培地中で、約０．０５ｍｇ／Ｌから約１２．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ９を提供する量のビタミンＢ９；及び（ｅ）細胞培養培地中で、約０．０５ｍｇ／Ｌから約２．５ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２を提供する量のビタミンＢ１２を含み；ここでキットは、以下の成分（１）クエン酸第二鉄又は硫酸第一鉄などの鉄源（一態様において約２μＭから約８０μＭの濃度で鉄源を供給する量である）及び（２）ヒドロコルチゾン（一態様において約０．０５μＭから約０．２５μＭの濃度でヒドロコルチゾンを供給する量である）の一以上を更に含み得る。別のバリエーションにおいて、細胞培養培地を化学的に定義された成分で補充するためのキットもまた記述され、キットは（ａ）細胞培養培地中で、約３００ｍｇ／Ｌ（幾つかの実施態様において、２００ｍｇ／Ｌ）から約１２００ｍｇ／Ｌのシスチンを提供する量のシスチン；（ｂ）細胞培養培地中で、約２μＭから約８０μＭのクエン酸第二鉄の濃度を提供する量のクエン酸第二鉄；及び（ｃ）細胞増殖（即ち、細胞培養）培地中で、約０．０５μＭから約０．５μＭのヒドロコルチゾンの濃度を提供する量のヒドロコルチゾンを含み、ここでキットは、以下の成分：（１）ビタミンＢ２（一態様において、細胞培養培地中で、約０．０５ｍｇ／ｍＬから約１．０ｍｇ／ｍＬのビタミンＢ２を提供する量である）；（２）ビタミンＢ６（一態様において、細胞培養培地中で、約０．０５ｍｇ／ｍＬから約１０．０ｍｇ／ｍＬのビタミンＢ６を提供する量である）；（３）ビタミンＢ９（一態様において、細胞培養培地中で、約０．０５ｍｇ／ｍＬから約１２．０ｍｇ／ｍＬのビタミンＢ９を提供する量である）；及び（４）ビタミンＢ１２（一態様において、細胞培養培地中で、約０．０５ｍｇ／ｍＬから約２．５ｍｇ／ｍＬのビタミンＢ１２を提供する量である）の一以上を更に含み得る。また本明細書において提供されるのは、細胞培養培地に化学的に定義された成分で補充するためのキットであり、キットは：（ａ）細胞培養培地中で、約０．８ｍＭ（幾つかの実施態様において、０．７ｍＭ）から約２．５ｍＭのシスチンを提供する量のシスチン；（ｂ）細胞培養培地中で、約０．１１μＭから約０．７２μＭのビタミンＢ２の濃度を提供する量のビタミンＢ２；（ｃ）細胞培養培地中で、約４．５μＭから約３０．０μＭのビタミンＢ６の濃度を提供する量のビタミンＢ６；（ｄ）細胞培養培地中で、約３．４μＭから約２２．０μＭのビタミンＢ９の濃度を提供する量のビタミンＢ９及び（ｅ）細胞培養培地中で、約０．２μＭから約１．５μＭのビタミンＢ１２の濃度を提供する量のビタミンＢ１２を含み、ここでキットは、以下の成分：（１）クエン酸第二鉄又は硫酸第一鉄など���鉄源（一態様において約１１．０μＭから約３６．０μＭの濃度で存在する）、（２）ビタミンＢ１（一態様において約２．０μＭから約１４．０μＭの濃度で存在する）（３）ビタミンＢ３（一態様において約１１．０μＭから約７２．０μＭの濃度で存在する）、（４）ビタミンＢ５（一態様において約６．８μＭから約４４．０μＭの濃度で存在する）、及び（５）ビタミンＢ７（一態様において約０．０２μＭから約０．２４μＭの濃度で存在する）の一以上を更に含み得る。キットはまた、使用のための説明書、例えば培地（例えば、ＣＤＭ）を調製するための及び／又は細胞培養系からポリペプチド（抗体を含む）を産生するための説明書を含んでいてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、様々な細胞培養条件下で培養された細胞株から単離された抗体サンプルについてＣＯＣアッセイを示す写真である。左から右へ、バイアルは、Ｉ）化学的に未定義培地；ＩＩ）基礎培地１及び流加培地２；ＩＩＩ）基礎培地１及び流加培地２；ＩＶ）基礎培地５及び流加培地４；Ｖ）基礎培地５及び流加培地２；シスチンの代わりにシステインを含む修飾基礎培地３及び流加培地４；ＶＩＩ）基礎培地３及び流加培地４；及びＶＩＩＩ）シスチンの代わりにシステインを含む修飾基礎培地３及び流加培地４の中で培養した細胞から単離された抗体を含む製剤が含まれる。ＣＯＣ値がバイアルの上に示されている。全てのバイアルは、約１５０ｇ／Ｌのタンパク質が含まれる。ニフティアッセイによって測定されるように、製剤ＩＩＩ、ＩＶ、及びＶＩは、それぞれ１．５９、１．４７、０．７１、の色強度値を有していた。全色アッセイによって測定されるように、製剤ＩＩＩ、ＩＶ、及びＶＩは、それぞれ２．６２、２．０４、１．００、の色強度値を有していた。
【図２Ａ−Ｂ】図２は、基礎培地１及び流加培地２と比較して、細胞数と抗体生成の僅かな減少を示す一連のグラフである。Ａ及びＣ）全培養容積のパーセントとして表される血中血球容積（ＰＣＶ）によって測定される、インキュベーション期間中の培養物中の細胞数。Ｂ及びＤ）高速液体クロマトグラフィーにより測定し、抗体力価として表される、インキュベーションの期間中の細胞培養物中の抗体産生。
【図２Ｃ−Ｄ】図２は、基礎培地１及び流加培地２と比較して、細胞数と抗体生成の僅かな減少を示す一連のグラフである。Ａ及びＣ）全培養容積のパーセントとして表される血中血球容積（ＰＣＶ）によって測定される、インキュベーション期間中の培養物中の細胞数。Ｂ及びＤ）高速液体クロマトグラフィーにより測定し、抗体力価として表される、インキュベーションの期間中の細胞培養物中の抗体産生。
【図３】図３は、ビタミンＢ１２と一緒に、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＢ９の可変レベルを含む化学的に定義された培地中（ＣＤＭ）で増殖させた細胞培養物による、生産的細胞バイオマス及び抗体産生に及ぼす影響を実証する一連のグラフである。Ａ）全培養容積のパーセントとして表される血中血球容積（ＰＣＶ）によって測定される、培養中の生産的バイオマス。Ｂ）高速液体クロマトグラフィーにより測定し、抗体力価として表される細胞からの抗体産生。ビタミンＢ２については、−１は０ｍｇ／Ｌの栄養を含む０．２５ｍｇ／Ｌの基礎を示し、１は１０ｍｇ／Ｌの栄養を含む１．４１ｍｇ／Ｌの基礎を示す；ビタミンＢ６については、−１は０ｍｇ／Ｌの栄養を含む５．３５ｍｇ／Ｌの基礎（ピリドキシン）を示し、１は６０ｍｇ／Ｌの栄養を含む０ｍｇ／Ｌの基礎でのピリドキサールを組み合わせた７ｍｇ／Ｌの栄養を含む１５．４２ｍｇ／Ｌの基礎でのピリドキシンを示す；ビタミンＢ９については、−１は０ｍｇ／Ｌの栄養を含む８．６１ｍｇ／Ｌの基礎を示し、１は１９７ｍｇ／Ｌの栄養を含む９．９３ｍｇ／Ｌの基礎を示す；ビタミンＢ１２については、−１は０ｍｇ／Ｌの栄養を含む１．７６ｍｇ／Ｌの基礎を示し、１は４８ｍｇ／Ｌの栄養を含む３．０５ｍｇ／Ｌの基礎を示す。中央の線は、データから導出される線形モデルから算出した予測値を示している。上側及び下側の線は予測の９５％信頼区間を示している。
【図４】図４は、ビタミンＢ１２と一緒に、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＢ９の可変レベルを含むＣＤＭで増殖させた細胞培養物から単離された抗体の色強度を示す一連のグラフである。色の強度は、より高い数値は、より高い色強度を示し、より低い数値はより低い色強度を示す、色のアッセイを用いて決定した。ビタミンＢ２については、−１は０ｍｇ／Ｌの栄養を含む０．２５ｍｇ／Ｌの基礎を示し、１は１０ｍｇ／Ｌの栄養を含む１．４１ｍｇ／Ｌの基礎を示す；ビタミンＢ６については、−１は０ｍｇ／Ｌの栄養を含む５．３５ｍｇ／Ｌの基礎（ピリドキシン）を示し、１は６０ｍｇ／Ｌの栄養を含む０ｍｇ／Ｌの基礎でのピリドキサールを組み合わせた７ｍｇ／Ｌの栄養を含む１５．４２ｍｇ／Ｌの基礎でのピリドキシンを示す；ビタミンＢ９については、−１は０ｍｇ／Ｌの栄養を含む８．６１ｍｇ／Ｌの基礎を示し、１は１９７ｍｇ／Ｌの栄養を含む９．９３ｍｇ／Ｌの基礎を示す；ビタミンＢ１２については、−１は０ｍｇ／Ｌの栄養を含む１．７６ｍｇ／Ｌの基礎を示し、１は４８ｍｇ／Ｌの栄養を含む３．０５ｍｇ／Ｌの基礎を示す。
【図５】図５（Ａ−Ｃ）は、硫酸第一鉄の漸増濃度を含有するＣＤＭ中で増殖させた、生産的細胞バイオマス、抗体産生、及び細胞培養物から単離された抗体の色強度を示す一連のグラフである。Ａ）経時的血中血球容積（ＩＶＰＣＶ）によって測定される培養物中の生産的バイオマス。Ｂ）高速液体クロマトグラフィーにより測定される細胞からの抗体産生。Ｃ）より高い数値は、より高い色強度を示し、より低い数値はより低い色強度を示す、色のアッセイを用いて測定される、細胞から単離された抗体の色の強度。バーは、データの上下の範囲と平均値を示す。Ｄ）は、インビトロで実験で硫酸第一鉄の漸増濃度を含む培地中でインキュベートした抗体の色強度を示すグラフである。
【図６Ａ−Ｃ】図６は、鉄及び様々な鉄源を含む漸増濃度を含有するＣＤＭ中で増殖させた、生産的細胞バイオマス、抗体産生、及び細胞培養物から単離された抗体の色強度を示す一連のグラフである。Ａ）経時的血中血球容積（ＩＶＰＣＶ）によって測定される培養物中の生産的バイオマス。Ｂ）高速液体クロマトグラフィーにより測定される細胞からの抗体産生。Ｃ）より高い数値は、より高い色強度を示し、より低い数値はより低い色強度を示す、色のアッセイを用いて測定される、細胞から単離された抗体の色の強度。バーは、データの上下の範囲と平均値を示す。
【図６Ｄ−Ｅ】図６は、鉄及び様々な鉄源を含む漸増濃度を含有するＣＤＭ中で増殖させた、生産的細胞バイオマス、抗体産生、及び細胞培養物から単離された抗体の色強度を示す一連のグラフである。Ｄ−Ｅ）は、異なる鉄源の可変濃度及び減少させたビタミンＢレベルを含むＣＤＭ中で増殖させた細胞培養物から単離された抗体の抗体産生および色の強さを示す。プラスのサインは、低ビタミン条件を示し、空の球は高いビタミン条件を示す。Ｄ）高速液体クロマトグラフィーにより測定される細胞からの抗体産生。Ｅ）より高い数値は、より高い色強度を示し、より低い数値はより低い色強度を示す、ニフティアッセイを用いて測定される、細胞から単離された抗体の色の強度。
【図７】図７は、インビトロでの実験でカタラーゼの非存在下又は存在下での硫酸第一鉄及びビタミンＢ２の可変濃度を含むＣＤＭ中でインキュベートされた抗体の色の強さを示す一連のグラフである。Ａ）カタラーゼの非存在下での抗体の色強度。Ａ）カタラーゼの存在下での抗体の色強度。より高い数値は、より高い色強度を示し、より低い数値はより低い色強度を示す、色のアッセイによって測定される色の強度。硫酸第一鉄について、−１は０ｍｇ／Ｌの栄養を含む１８μＭの基礎を示し及び１は０μＭの栄養を含む７５μＭの基礎を示す；ビタミンＢ２について、−１は０ｍｇ／Ｌの栄養を含む０．２５ｍｇ／Ｌの基礎を示し及び１は１０ｍｇ／Ｌの栄養を含む１．４１ｍｇ／Ｌの基礎を示す。中央の線は、データから導出される線形モデルから算出した予測値を示している。上側及び下側の線は予測の９５％信頼区間を示している。
【図８】図８は、Ａ）修飾基礎培地１と流加培地２（空球）と比較して、修飾基礎培地３と流加培地４（＋記号）で増殖させた細胞培養物から得られた抗体溶液中の、色強度の減少と酸性電荷変異体の存在の減少との間の相関を示すグラフである。修飾培地１は１０μＭ、１８μＭ又は７５μＭの硫酸第一鉄を含んでいた。修飾培地３は１０μＭ又は１８μＭのクエン酸第二鉄を含んでいた。Ｂ）７５μＭの硫酸第一鉄（＋記号）と比較して、１８μＭの硫酸第一鉄を（空球）を含む培地中で増殖させた細胞培養物から得られた抗体溶液中の、色強度の減少と酸性電荷変異体の存在の減少との間の相関を示すグラフ。Ｃ）ビタミンＢ２、Ｂ６、Ｂ９及びＢ１２の可変レベルを含む培地中で増殖させた細胞培養物から得られた抗体溶液中の、色強度の減少と酸性電荷変異体の存在の減少との間の相関を示すグラフ。ビタミンＢレベルは、低濃度（空球）、中濃度（＋記号）、又は高濃度（空ダイヤモンド）へ同時に変化させた。より高い数値は、より高い色強度を示し、より低い数値はより低い色強度を示す、色のアッセイによって測定される色の強度。抗体溶液中の酸性電荷変異体のパーセントは、イオン交換クロマトグラフィーによって決定した。
【図９】図９は、ビタミンＢ２及びＢ６の減少した濃度を含む培地中で増殖させた細胞培養物から得られた抗体溶液中の、色強度の減少と酸性電荷変異体の存在の減少との間の相関を示す一連のグラフである。Ａ）より高い数値は、より高い色強度を示し、より低い数値はより低い色強度を示す、色のアッセイを用いて測定される場合の、細胞から単離された抗体の色の強度。Ｂ）イオン交換クロマトグラフィーによって決定される、抗体溶液中の酸性電荷変異体のパーセント。ビタミンＢ２については、−１は０ｍｇ／Ｌの栄養を含む０．２５ｍｇ／Ｌの基礎を示し及び１は１０ｍｇ／Ｌの栄養を含む１．４１ｍｇ／Ｌの基礎を示す；ビタミンＢ６については、−１は０ｍｇ／Ｌの栄養を含む５．３５ｍｇ／Ｌの基礎（ピリドキシン）を示し、１は６０ｍｇ／Ｌの栄養を含む０ｍｇ／Ｌの基礎でピリドキサールを組み合わせた７ｍｇ／Ｌの栄養を含む１５．４２ｍｇ／Ｌの基礎でのピリドキシンを示す。
【図１０】図１０は、可変濃度のピリドキサールを含むクエン酸第二鉄対硫酸第一鉄を含む培地中で増殖させた細胞培養物から得られた抗体溶液中の、色強度の減少と酸性電荷変異体の存在の減少を示す一連のグラフである。Ａ）より高い数値は、より高い色強度を示し、より低い数値はより低い色強度を示す、色のアッセイを用いて測定される場合の、細胞から単離された抗体の色の強度。Ｂ）イオン交換クロマトグラフィーによって測定される、抗体溶液中の酸性電荷変異体のパーセント。ピリドキサールについては、−１は０ｍｇ／Ｌの栄養を含む０．ｍｇ／Ｌの基礎を示し及び１は６０ｍｇ／Ｌの栄養を含む０ｍｇ／Ｌの基礎を示す。クエン酸第二鉄又は硫酸第一鉄は、基礎培地で１８μＭとして存在していた。
【図１１】図１１は、流加培地中の可変濃度のビタミンＢ２、Ｂ６、Ｂ９及びＢ１２を含むクエン酸第二鉄対硫酸第一鉄を含む培地中で増殖させた細胞培養物から得られた抗体溶液中の、色強度の減少と酸性電荷変異体のレベルの減少を示す一連のグラフである。Ａ）より高い数値は、より高い色強度を示し、より低い数値はより低い色強度を示す、色のアッセイを用いて測定される場合の、細胞から単離された抗体の色の強度。Ｂ）イオン交換クロマトグラフィーによって測定される、抗体溶液中の酸性電荷変異体のパーセント。レベル１はビタミンＢ２、Ｂ６、Ｂ９、及びＢ１２を含まない流加培地を示す。レベル２は、１０ｍｇ／ＬのビタミンＢ２、７ｍｇ／Ｌのピリドキシン、６０ｍｇ／Ｌのピリドキサール、１９７ｍｇ／ＬのビタミンＢ９、及び４８ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２を含有する流加培地を示す。レベル３は、５ｍｇ／ＬのビタミンＢ２、３．５ｍｇ／Ｌのピリドキシン、３０ｍｇ／Ｌのピリドキサール、９８．５ｍｇ／ＬのビタミンＢ９、及び２４ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２を含有する流加培地を示す。クエン酸第二鉄又は硫酸第一鉄は、基礎培地で１８μＭとして存在していた。
【図１２】図１２は、濃度が減少した鉄、好ましくは鉄源として硫酸第一鉄の代わりにクエン酸第二鉄による鉄を含む基礎培地中で増殖させた細胞培養物から得られた抗体溶液中の、色強度の減少と酸性電荷変異体のレベルの減少を示す一連のグラフである。Ａ）より高い数値は、より高い色強度を示し、より低い数値はより低い色強度を示す、色のアッセイを用いて測定される場合の、細胞から単離された抗体の色の強度。Ｂ）イオン交換クロマトグラフィーによって測定される、抗体溶液中の酸性電荷変異体のパーセント。
【図１３】図１３は、クエン酸第二鉄の減少した濃度を含む基礎培地中で増殖させた細胞培養物から得られた抗体溶液中の、色強度の減少と酸性電荷変異体のレベルの減少を示す一連のグラフである。Ａ）より高い数値は、より高い色強度を示し、より低い数値はより低い色強度を示す、色のアッセイを用いて測定される場合の、細胞から単離された抗体の色の強度。Ｂ）イオン交換クロマトグラフィーによって測定される、抗体溶液中の酸性電荷変異体のパーセント。＊は、示された濃度でクエン酸第二鉄を含有するように修飾された基礎培地１を示す。‡は、示された濃度でクエン酸第二鉄を含有するように修飾された基礎培地３を示す。○は３３℃で培養された細胞から単離された抗体溶液を示す。＋は３７℃で培養された細胞から単離された抗体溶液を示す。
【図１４】図１４は、システインの代わりにシスチンを添加され、ヒドロコルチゾンの存在下で、ビタミンＢ２、Ｂ６、Ｂ９及びＢ１２の減少した濃度を含む基礎培地中で増殖させた細胞培養物から得られた抗体溶液中の、色強度の減少と酸性電荷変異体のレベルの減少を示す一連のグラフである。Ａ）より高い数値は、より高い色強度を示し、より低い数値はより低い色強度を示す、色のアッセイを用いて測定される場合の、細胞から単離された抗体の色の強度。Ｂ）イオン交換クロマトグラフィーによって測定される、抗体溶液中の酸性電荷変異体のパーセント。＊は、１．４１ｍｇ／ＬのビタミンＢ２、１５．４２ｍｇ／Ｌのピリドキシン、０ｍｇ／Ｌのピリドキサール、９．９３ｍｇ／ＬのビタミンＢ９、及び３．０５ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２を含有する基礎培地を示す。‡は、０．７ｍｇ／ＬのビタミンＢ２、７．７ｍｇ／Ｌのピリドキシン、０ｍｇ／Ｌのピリドキサール、４．９ｍｇ／ＬのビタミンＢ９、及び１．５ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２を含有する基礎培地を示す。○は４８０ｍｇ／Ｌのシスチンを示す。△は５２５ｍｇ／Ｌのシステインを示す。ヒドロコルチゾンは、示された溶液中で１５０ｎＭの濃度で存在する。
【図１５】図１５は、色強度についてのＣＯＣアッセイ測定値と比較して、全色アッセイとニフティアッセイ測定値間の相関関係を示す一連のグラフである。Ａ）全色値及びニフティ値はＣＯＣの値を表す記号でプロットした。Ｂ）プロテインＡプール内および対応する薬物物質製剤におけるニフティアッセイによる色の測定は、ＣＯＣの値を表す記号でプロットした。Ｃ）プロテインＡプール内および対応する薬物物質製剤における全色アッセイによる色の測定は、ＣＯＣの値を表す記号でプロットした。空球はＣＯＣ値が≦Ｂ３を表し；空のダイアモンドはＣＯＣ値が≦Ｂ４又はＢＹ４を表し；プラス記号はＣＯＣ値が≦Ｂ５又は≦ＢＹ５を表し；ＤＳ ニフティ及びＤＳ全色は最終薬物物質製剤における対応するアッセイ値を示し；ＰｒｏＡ ニフティ及びＰｒｏＡ全色はプロテインＡプールにおける対応するアッセイ値を示す。
【００２４】
本発明の詳細な記述
細胞増殖（即ち、細胞培養）及びポリペプチド生成のための細胞培養培地及びその培地を使用する方法が記載される。記載された方法によって産生された抗体を含むポリペプチドもまた提供される。培地及び培地を含む組成物並びに記載される方法によって生成された細胞及び／又はポリペプチドを含む組成物を調製するためのキットも提供される。少なくとも１００ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１２５ｍｇ／ｍＬ、又は少なくとも１５０ｍｇ／ｍＬより大きい濃度でポリペプチドを含み、色、乳白光及び着色（ＣＯＣ）アッセイによって測定されるように、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７、Ｂ８、又はＢ９より大きい色強度値を有する薬学的組成物が記述される。また、少なくとも１ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも２５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも５０ｍｇ／ｍＬ、又は少なくとも７５ｍｇ／ｍＬより大きい濃度でポリペプチドを含み、ＣＯＣアッセイによって測定されるように、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７、Ｂ８、又はＢ９より大きい色強度値を有する薬学的組成物も記述される。ＣＯＣアッセイの基準標準は、限定されないが、Ｂ、ＢＹ、Ｙ、ＧＹ、又はＲの任意の一とすることができ、より高い値はより明るい色の強さを示していることが理解される。また、少なくとも１００ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１２５ｍｇ／ｍＬ、又は少なくとも１５０ｍｇ／ｍＬより大きい濃度でポリペプチドを含み、そして色のアッセイ（例えば、全色アッセイ又はニフティアッセイ）によって測定されるように、参照溶液の色強度値未満の色強度値を有する薬学的組成物も提供される。また、少なくとも１ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも２５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも５０ｍｇ／ｍＬ、又は少なくとも７５ｍｇ／ｍＬより大きい濃度でポリペプチドを含み、そして色のアッセイ（例えば、全色アッセイ又はニフティアッセイ）によって測定されるように、参照溶液の色強度値未満の色強度値を有する薬学的組成物も提供される。また、ポリペプチド含有溶液（例えば、抗体含有溶液）において色を評価する方法が提供される。特定のバリエーションでは、培地、方法、キット及び組成物は、ＣＤＭを含む。
【００２５】
ポリペプチド生成に使用される特定の細胞培養培地（例えば、ＣＤＭ）は、許容可能な品質特性を有するポリペプチドの製剤を提供することが見出されている。例えば、特定のＣＤＭは、ＣＤＭの使用に伴う利点を維持しつつ、（例えば、注射用製剤として使用するための）許容可能な色を提供するＣＤＭで産生されたポリペプチドとともに、ポリペプチド製剤の色の強度を調節することが見出されている。これらのＣＤＭは、ポリペプチド生成の方法において使用される場合、異なる培地（例えば、本明細書に詳述されるような培地成分及び／又は組成物の量を含まない培地）中で生成されたポリペプチドと比較して、ポリペプチド製剤の色の強度を減少させることが見出されている。細胞培養培地は、化学的に定義されるか、又は化学的に未定義であってもよい。
【００２６】
理論に縛られることを望まないが、一定の濃度で特定の培地成分（例えばシスチン及び／又はシステイン、特定のＢビタミン、ヒドロコルチゾン及び／又は鉄源など）の使用は、許容可能な品質属性を持し、特に許容可能な色を有するポリペプチド製剤を生成すると考えられている。細胞増殖のために使用される基礎培地中でこれらの培地成分の使用は、ポリペプチド製剤の品質特性に特に影響力があると考えられるが、本明細書中で提供される培地は、基礎及び流加培地を含め、細胞の増殖、維持及びポリペプチド生成プロセスの任意の段階で使用されてもよいことが意図される。本明細書で提供される培地は、細胞を増殖させる（即ち、細胞を培養する）方法において、及びポリペプチドの生成において使用することができ、所望のポリペプチドをコードする単離された核酸を含む細胞の増殖、維持及び／又は生成期における用途を見出し得る。本明細書に記載された培地は、ポリペプチド製剤の一以上の特性（例えば、色、組成、純度、等）又はポリペプチドを生成する方法の一以上の態様（例えば、バッチ間の再現性、製造の容易さ、製造コスト、等）の改善をもたらすために使用することができる。本明細書で提供される培地を用いた細胞培養プロセスによって生成されたポリペプチド（例えば、抗体）が記載される。一態様において、ポリペプチドは、少なくとも１００ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１２５ｍｇ／ｍＬ、又は少なくとも１５０ｍｇ／ｍＬより大きい濃度であり、ＣＯＣアッセイによって測定されるように、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７、Ｂ８、又はＢ９より大きい色強度値を有する。別に態様において、ポリペプチドは、少なくとも１ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも２５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも５０ｍｇ／ｍＬ、又は少なくとも７５ｍｇ／ｍＬより大きい濃度であり、ＣＯＣアッセイによって測定されるように、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７、Ｂ８、又はＢ９より大きい色強度値を有する。幾つかの態様において、ＣＯＣアッセイにより決定される色強度値は、限定されないが、Ｂ、ＢＹ、Ｙ、ＧＹ、又はＲの任意の一とすることができ、より高い値はより明るい色の強さを示している。本明細書において生成されるようなポリペプチド生成物を含む製造品と同様に、本明細書に詳述されるポリペプチド生成物を投与する方法もまた記載される。
【００２７】
定義
本明細書における使用のために、明確に他に示さない限り、用語の「ａ」、「ａｎ」などの使用は、一以上を意味する。
【００２８】
本明細書中の「およそ（約）」の値又はパラメーターへの言及は、その値又はパラメーター自体に対する実施態様を含む（記載する）。例えば、「およそＸ」を言及する記述は、「Ｘ」の記述を含む。数値範囲は、範囲を定義する数値を含む。
【００２９】
「電荷変異体」とは、主要種タンパク質のそれとは異なる電荷を有する主主要種タンパク質（例えば、抗体）の変異体である。
【００３０】
「酸性電荷変異体」は、主要種タンパク質（例えば、抗体）よりも酸性である主要種タンパク質（例えば、抗体）の変異体である。酸性の変異体は、主要種タンパク質（例えば、抗体）に対して負電荷を獲得するか又は正電荷を失っている。このような酸性の電荷変異体は、電荷に従ってタンパク質を分離するイオン交換クロマトグラフィーなどの分離方法を用いて分離することができる。
【００３１】
本明細書において用語「主要種タンパク質」は、組成物中に定量的に優勢なタンパク質（例えば、抗体）分子である、組成物中のタンパク質（例えば、抗体）のアミノ酸配列構造を指す。
【００３２】
細胞を「培養する」とは、細胞の生存及び／又は増殖に適した条件下で細胞培養培地に細胞を接触させることを意味する。
【００３３】
「バッチ培養」は、（細胞及び全ての培養栄養分を含む）細胞培養のための全ての成分が培養プロセスの開始時に培養容器に供給される培養を意味する。
【００３４】
本明細書で使用される用語「流加細胞培養」は、細胞及び培養培地は最初に培養容器に供給され、培養終了前の定期的な細胞及び／又は生成物の回収の有無にかかわらず、追加の培養栄養素が、培養工程の間に培養物に、連続的又は離散的な増分で与えられるバッチ培養を指す。
【００３５】
「灌流培養」は、細胞が、例えば、濾過、カプセル化、マイクロキャリアに固定する等によって、培養中に拘束され、培養培地は連続的又は断続的に導入され、培養容器から除去される培養である。
【００３６】
「培養容器」は、細胞を培養するために使用される容器を指す。培養容器は、それが細胞の培養のために有用である限り任意のサイズであってよい。
【００３７】
「力価」：本明細書で使用する用語「力価」とは、培地容積の所定量で割けられた細胞培養物によって生成された組換え発現されるポリペプチドの総量を指す。力価は、典型的には、培地のミリリットルあたりのポリペプチドのミリグラムの単位で表される。
【００３８】
用語「培地」及び「細胞培養培地」とは、細胞を増殖又は維持するために使用される栄養源を指す。当業者によって理解されるように、栄養源は、細胞にとって増殖及び／又は生存に必要な成分を含有することができるか、又は細胞の増殖及び／又は生存に有用な成分を含んでいてもよい。必須ビタミン、必須又は非必須アミノ酸、及び微量元素は培地成分の例である。
【００３９】
「化学的に定義された細胞培養培地」又は「ＣＤＭ」は、動物血清とペプトンなどの動物由来産物を含まない特定の組成を持つ培地である。この用語はまた、未定義または部分的に定義された成分、例えば、動物血清、動物ペプトン及び植物ペプトンなどの成分を含まない特定の組成を持つ培地をも包含する。当業者によって理解されるように、ＣＤＭは、細胞がＣＤＭに接触してポリペプチドを分泌するように、ポリペプチド生成の過程で使用され得る。従って、組成物は、ＣＤＭ及びポリペプチド生成物を含んでもよいこと、及びポリペプチド生成物の存在は、ＣＤＭを化学的に未定義の状態にはしないことが理解される。
【００４０】
「化学的に未定義な細胞培養培地」は、その化学組成を特定することができず、動物血清とペプトンなどの一以上の動物由来の生成物を含むことができる培地を指す。当業者によって理解されるように、化学的に未定義な細胞培養培地は、栄養源として、動物由来の生成物を含有することができる。この用語はまた、未定義または部分的に定義された成分、例えば、動物血清、動物ペプトン及び植物ペプトンなどの成分を含む細胞培養培地をも包含する。
【００４１】
用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために本明細書において互換的に使用される。ポリマーは、直鎖状又は分岐状でも良く、  修飾アミノ酸を含んでも良く、非アミノ酸によって中断されてもよい。この用語はまた、天然に又は介入：例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、あるいは標識成分との結合など任意の他の操作もしくは修飾によって改変されるアミノ酸ポリマーを包含する。また、定義には、例えば、アミノ酸の一以上の類似体（例えば、非天然アミノ酸などを含む）、並びに当技術分野で公知の他の修飾を含むポリペプチドが含まれる。本明細書中の定義に包含されるポリペプチドの例としては、哺乳動物タンパク質を含み、例えば、レニン；ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモンを含む成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク；α−１−アンチトリプシン；インシュリンＡ−鎖；インシュリンＢ−鎖；プロインシュリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；因子ＶＩＩＩＣ、因子ＩＸ、組織因子（ＴＦ）、及びヴォン・ヴィレブランド(von Willebrands)因子等の凝固因子；プロテインＣ等の抗凝固因子；心房性ナトリウム利尿因子；肺界面活性剤；ウロキナーゼ又はヒト尿又は組織型プラスミノーゲン活性化剤（ｔ−ＰＡ）等のプラスミノーゲン活性化剤；ボンベシン；トロンビン；造血性成長因子；腫瘍壊死因子−α及び−β；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ（regulated on activation normally T-cell expressed and secreted）；ヒトマクロファージ炎症タンパク質（ＭＩＰ−１−α）；ヒト血清アルブミン等の血清アルブミン；ミューラー阻害物質；リラキシンＡ−鎖；リラキシンＢ−鎖；プロレラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；ベータ−ラクタマーゼ等の微生物タンパク質；ＤＮアーゼ；ＩｇＥ；ＣＴＬＡ−４のような細胞毒性Ｔリンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ）；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；ホルモン又は成長因子のレセプター；プロテインＡ又はＤ；リウマチ因子；脳誘導神経向性因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、−４、−５又は−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、又はＮＴ−６）、又はＮＧＦ−β等の神経成長因子等の神経成長因子；血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ）；ａＦＧＦ及びｂＦＧＦ等の繊維芽成長因子；表皮成長因子（ＥＧＦ）；ＴＧＦ−α及びＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４、又はＴＧＦ−β５を含む、ＴＧＦ−βのようなトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）；インシュリン様成長因子−Ｉ及び−ＩＩ（ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ）；ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インシュリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰｓ）；ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０等のＣＤタンパク質；エリスロポエチン；骨誘導因子；免疫毒素；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン−α、−β、及び−γ等のインターフェロン；コロニー刺激因子（ＣＳＦｓ）、例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＳＣＦ、及びＧ−ＣＳＦ；インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ−１からＩＬ−１０；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞レセプター；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；ウイルス性抗原、例えばＡＩＤＳエンベロープの一部等；輸送タンパク質；ホーミングレセプター；アドレシン（ａｄｄｒｅｓｓｉｎ）；調節タンパク質；インテグリン、例えばＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ−４及びＶＣＡＭ；腫瘍関連抗原、例えば、ＣＡ１２５（卵巣癌抗原）又はＨＥＲ２、ＨＥＲ３又はＨＥＲ４レセプター、イムノアドヘシン；上に列挙したタンパク質の何れかの断片及び／又は変異体、並びに例えば上に列挙したタンパク質の何れかを含むタンパク質に結合する、抗体断片を含む抗体が含まれる。
【００４２】
「単離されたポリペプチド」は、それが発現された細胞又は細胞培養物から回収されたポリペプチドを意味する。
【００４３】
「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、互換的に本明細書で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、ＤＮＡ及びＲＮＡが含まれる。ヌクレオチドは、ＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼにより、または合成反応によってポリマー中に組み込むことができる、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド又は塩基、及び／又はそれらの類似体、または任意の基質とすることができる。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びそれらの類似体などの修飾ヌクレオチドを含むことができる。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーの会合の前又は後に付与することができる。
【００４４】
「単離された核酸」は、通常の状況から外れた又は分離される、天然に存在しない、組換え又は天然に存在する配列を意味し及び包含する。
【００４５】
「精製された」ポリペプチドは、その天然の環境に存在するよりも純粋な形態で存在するように、及び／又は実験室条件下で最初に生成され及び／又は合成され及び／又は増幅されるときに、ポリペプチドは純度が増加していることを意味する。純度は相対的な用語であり、必ずしも絶対的な純度を意味するものではない。
【００４６】
用語「抗体」は最も広い意味で用いられ、具体的には、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体断片を包含する。
【００４７】
「抗体断片」は、完全長抗体の一部、一般にはその抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ断片；単鎖抗体分子；ダイアボディ；直鎖抗体；及び抗体断片から形成される多重特異性抗体を含む。
【００４８】
本明細書中で用いる用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を指し、即ちこの集団を含む個々の抗体は、微量で存在し得る天然に生じる可能性のある突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であって、単一の抗原部位に対するものである。更に、典型的には、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含む、従来の（ポリクローナル）抗体製剤とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対するものである。修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集団から得られる抗体の特徴を示し、いずれかの特定の方法による抗体の生産を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本開示に従って用いるべきモノクローナル抗体は、Kohler et al.,Nature,256:495(1975)によって最初に記載されたハイブリドーマ方法によって作成されてもよく、あるいは組換えＤＮＡ方法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号参照）によって作成されてもよい。「モノクローナル抗体」は、例えば、Clackson et al.,Nature,352:624-628(1991)及びMarks et al.,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離してもよい。
【００４９】
「ヒト化」抗体とは、非ヒト（例えば齧歯類）抗体の形態である。非ヒト抗体から得られた最小配列を含むキメラ抗体である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域からの残基が、所望の抗体特異性、親和性、及び性能を有するマウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類などのヒト以外の種（ドナー抗体）の超可変領域からの残基によって置き換えられたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの例においては、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）の残基は、対応する非−ヒト残基によって置き換えられている。更に、ヒト化抗体はレシピエント抗体又はドナー抗体において見いだされない残基を含むことが可能である。これらの修飾は、抗体の性能をさらに改良するために作成される。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも一つ、典型的には２つの可変ドメインの全てを実質的に含み、超可変ループの全て又は実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲの全てまたは実質的に全てが、ヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は、任意で、免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部（Ｆｃ）、典型的には、ヒト免疫グロブリンのそれを含むであろう。更なる詳細については、Jones et al.,Nature,321:522-525(1986);Riechmann et al.,Nature,332:323-329(1988)；及びPresta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596(1992)を参照。
【００５０】
「種依存性抗体」は、二番目の哺乳動物種からの抗原の相同体に対して有している結合親和性よりも、一番目の哺乳動物種からの抗原に対してより強力な結合親和性を有する抗体である。通常、種依存性抗体は、ヒト抗原（即ち、約１×１０-７Ｍ以下、あるいは約１×１０-8以下、あるいは約１×１０-９Ｍ以下の結合親和性（Ｋｄ）値を有する）と「特異的に結合」するが、そのヒト抗原に対する結合親和性よりも、少なくとも約５０倍、少なくとも約５００倍、又は少なくとも約１０００倍弱い、二番目の非ヒト哺乳動物種からの抗原の相同体に対する結合親和性を有する。種依存性抗体は、上で定義した様々な型の抗体の何れでもありうるが、好ましくはヒト化又はヒト抗体である。
【００５１】
「汚染物質」は、所望のポリペプチド生成物とは異なる物質を指す。汚染物質は、限定されないが、ＣＨＯＰなどの宿主細胞物質；浸出プロテインＡ；核酸；所望のポリペプチドの変異体、断片、凝集体または誘導体；別のポリペプチド；内毒素；ウイルス性汚染物質；細胞培養培地成分等が含まれる。
【００５２】
用語「薬学的製剤」は、活性成分の生物学的活性を許容するような形態であって、製剤を投与する被検体にとって許容できない毒性である他の成分を含まない調製物を指す。このような製剤は無菌である。
【００５３】
「無菌」製剤は、無菌であるか、又は全ての生きている微生物及びそれらの胞子を含まない又は本質的に含まない。
【００５４】
「無色又は僅かに着色した」液体は、定量および／または定性分析することによって測定されるポリペプチドを含む液体組成物を意味する。定性分析は、基準標準に対するポリペプチドを含む組成物との比較などの目視検査を含む。
【００５５】
実施態様が語句「含む(comprising)」により本明細書に記載される場合、語句「からなる(consisting of)」及び／又は語句「から本質的になる(consisting essentially of)」により記載される他の類似の実施態様もまた提供されることが理解される。
【００５６】
発明の態様又は実施態様が、マーカッシュ群又は代替の他の分類によって記載されている場合、本発明は、全体として挙げられている全群だけでなく、群の各メンバーを個々に、主要群の全ての可能なサブグループ、一又は複数の群メンバーを欠く主要群を包含する。本発明はまた、請求する発明における一又は複数の任意の群メンバーの明確な除外も考えられる。
【００５７】
細胞培養培地
本明細書で提供される細胞培養培地は、（例えば、細胞を増殖する（即ち、細胞を培養する）及びポリペプチドを産生する）方法、及び本明細書に詳述される組成物における使用を見出すことができる。培地成分は、許容可能な品質特性、例えば許容可能な色など（例えば、注射用製剤として使用するため）を持つポリペプチド製剤を提供することができるとして同定されている。別の培地中で生成されたポリペプチドと比較して、特定の培地成分は、ポリペプチド製剤の色の強度を減少させ、このことは１００ｍｇ／ｍＬ又は１２５ｍｇ／ｍＬ又は１５０ｍｇ／ｍＬのいずれかよりも高い濃度で処方されるポリペプチド生成物において特に重要であり得る。幾つかの態様では、ポリペプチド製剤は、少なくとも１００ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１２５ｍｇ／ｍＬ、又は少なくとも１５０ｍｇ／ｍＬより大きい濃度であり、ＣＯＣアッセイによって測定されるように、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７、Ｂ８、又はＢ９より大きい色強度値を有する。幾つかの態様において、ポリペプチド製剤は、少なくとも１ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも２５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも５０ｍｇ／ｍＬ、又は少なくとも７５ｍｇ／ｍＬより大きい濃度であり、ＣＯＣアッセイによって測定されるように、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７、Ｂ８、又はＢ９より大きい色強度値を有する。幾つかの態様において、ＣＯＣアッセイにより決定される色強度値は、限定されないが、Ｂ、ＢＹ、Ｙ、ＧＹ、又はＲの任意の一とすることができ、より高い値はより明るい色の強さを示している。幾つかの態様では、ポリペプチド製剤は、少なくとも１００ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１２５ｍｇ／ｍＬ、又は少なくとも１５０ｍｇ／ｍＬより大きい濃度であり、そして色のアッセイ（例えば、全色アッセイ又はニフティアッセイ）によって測定されるように、参照溶液の色強度値未満の色強度値を有している。幾つかの態様では、ポリペプチド製剤は、少なくとも１ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも２５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも５０ｍｇ／ｍＬ、又は少なくとも７５ｍｇ／ｍＬより大きい濃度であり、そして色のアッセイ（例えば、全色アッセイ又はニフティアッセイ）によって測定されるように、参照溶液の色強度値未満の色強度値を有している。適切な細胞培養培地は、本発明の簡潔な概要及び他を含め、全体にわたり詳述されている。本明細書に詳述される任意の培地は、細胞増殖、維持及びポリペプチド生成の任意の段階で使用することができ、基礎培地及び／又は流加培地で使用することができる。一つのバリエーションにおいて、本明細書に記載の培地は、許容可能な細胞の生存率および抗体力価のレベル、及び培地で増殖させた細胞培養物から単離したポリペプチド（例えば、抗体）の許容可能な色の強度をもたらす。
【００５８】
以下の成分の一以上を含む細胞培養培地が提供される：（ａ）システイン及び／又はシステイン；（ｂ）ビタミンＢ２、（ｃ）ビタミンＢ６（ピリドキシン及び／又はピリドキサール）、（ｄ）ビタミンＢ９、（ｅ）ビタミンＢ１２、（ｆ）クエン酸第二鉄などの鉄源、（ｇ）ヒドロコルチゾン。一バリエーションでは、細胞培養培地は、成分（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｇ）の２又は３又は４又は５又は６又は各々を含む。本明細書で提供される細胞培養培地は、成分（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｇ）の任意の組み合わせを、個々及び全ての組み合わせが具体的かつ個別に列挙されるのと同様に含むことが理解される。例えば、成分（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｇ）のうちの４つを含む細胞培養培地は、その成分の少なくとも４つが存在する限り、その成分の任意の組み合わせを含んでよいことが理解される。一態様では、細胞培養培地は、ＣＤＭである。別の態様では、細胞培養培地は、化学的に未定義な細胞培養培地である。
【００５９】
培地成分は、当技術分野で知られている形態で組成物に添加することができる。例えば、ビタミンＢ２は、リボフラビン粉末として提供することができ；ビタミンＢ６は、ピリドキシン塩酸又はピリドキサール塩酸として提供することができ；ビタミンＢ９は、葉酸粉末として提供することができ；ビタミンＢ１２は、シアノコバラミン粉末として提供することができ；システインは、Ｌ−システイン一塩酸塩一水和物の粉末として提供することができ；シスチンは、二ナトリウム塩一水和物の粉末として提供することができる。幾つかの実施態様において、ビタミンＢ６は、ピリドキサール塩酸としては提供されない。更なる非限定的な例において、ビタミンＢ１は、チアミン一塩酸塩として提供することができ；ビタミンＢ３は、ナイアシンアミドとして提供することができ；ビタミンＢ５は、Ｄ−パントテン酸カルシウムとして提供することができ；ビタミンＢ７はビオチンとして提供することができる。別の非限定的な例として、鉄は異なる鉄形態又は鉄源で添加してもよい。幾つかの実施態様において、鉄源は、クエン酸第二鉄または硫酸第一鉄である。本明細書中に記載の培地成分は、塩、水和物、含水塩の形態で、又は溶液、抽出物、または固体形態として提供することができる。
【００６０】
一バリエーションにおいて、培地は、シスチン及びビタミンＢ２、Ｂ６、Ｂ９およびＢ１２のそれぞれを含む。一バリエーションにおいて、培地は、シスチン、ビタミンＢ２、Ｂ６、Ｂ９、Ｂ１２、及びクエン酸第二鉄等の鉄源を含む。別のバリエーションにおいて、培地は、シスチン、ビタミンＢ２、Ｂ６、Ｂ９、Ｂ１２、クエン酸第二鉄等の鉄源、及びヒドロコルチゾンの各々を含む。更なるバリエーションにおいて、培地は、シスチン、ヒドロコルチゾン、及びクエン酸第二鉄等の鉄源を含む。更に別のバリエーションにおいて、培地は、シスチン、ヒドロコルチゾン、クエン酸第二鉄などの鉄源、及びビタミンＢ２、Ｂ６、Ｂ９およびＢ１２の少なくとも一を含む。更に別のバリエーションにおいて、培地は、シスチン、ヒドロコルチゾン、クエン酸第二鉄などの鉄源、及びビタミンＢ２、Ｂ６、Ｂ９およびＢ１２の少なくとも二つを含む。更に別のバリエーションにおいて、培地は、シスチン、ヒドロコルチゾン、クエン酸第二鉄などの鉄源、及びビタミンＢ２、Ｂ６、Ｂ９およびＢ１２の少なくとも三つを含む。本明細書に記載される任意の培地において、一態様で、培地はＣＤＭである。一態様では、細胞培養培地は、シスチンを含む。別のバリエーションにおいて、細胞培養培地はシスチンを含み、システインは含まない。別のバリエーションにおいて、細胞培養培地はシスチン及びシステインの療法を含む。
【００６１】
一バリエーションにおいて、培地は、約３００ｍｇ／Ｌ（幾つかの実施態様では２００ｍｇ／Ｌ）から約１２００ｍｇ／Ｌのシスチン；約０．０５ｍｇ／Ｌから約１．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ２；約０．０５ｍｇ／Ｌから約１０．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ６；約０．０５ｍｇ／Ｌから約１２．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ９；及び約０．０５ｍｇ／Ｌから約２．５ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２を含む細胞培養培地である。一バリエーションにおいて、ビタミンＢ２は、約０．０５ｍｇ／Ｌから約０．５０ｍｇ／Ｌの濃度である。別のバリエーションにおいて、ビタミンＢ２は、約０．０５ｍｇ／Ｌから約０．４０ｍｇ／Ｌの濃度である。別のバリエーションにおいて、ビタミンＢ２は、約０．０５ｍｇ／Ｌから約０．３０ｍｇ／Ｌの濃度である。一バリエーションにおいて、ビタミンＢ６は、約０．０５ｍｇ／Ｌから約８．０ｍｇ／Ｌの濃度である。一バリエーションにおいて、ビタミンＢ６は、約０．０５ｍｇ／Ｌから約７．０ｍｇ／Ｌの濃度である。一バリエーションにおいて、ビタミンＢ６は、約０．０５ｍｇ／Ｌから約６．０ｍｇ／Ｌの濃度である。一バリエーションにおいて、細胞培養培地は鉄源を更に含む。一バリエーションにおいて、鉄源は、クエン酸第二鉄または硫酸第一鉄である。一バリエーションにおいて、細胞培養培地は、約２μＭから約８０μＭの濃度でクエン酸第二鉄を含む。本明細書中のバリエーションの何れかにおいて、細胞培養培地はヒドロコルチゾンを更に含む。一バリエーションにおいて、ヒドロコルチゾンは、約０．０５μＭから約０．２５μＭの濃度である。
【００６２】
別のバリエーションにおいて、細胞培養培地は、以下：（ａ）約３００ｍｇ／Ｌ（幾つかの実施態様において、２００ｍｇ／Ｌ）から約１２００ｍｇ／Ｌのシスチン及び／又はシステイン（一態様においてはこれはシスチンである）；（ｂ）約０．０５ｍｇ／Ｌから約１．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ２；（ｃ）約０．０５ｍｇ／Ｌから約１０．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ６（一態様においてはこれはピリドキシンである）；（ｄ）約０．０５ｍｇ／Ｌから約１２．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ９；（ｅ）約０．０５ｍｇ／Ｌから約２．５ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２；（ｆ）約２μＭから約８０μＭの鉄源、例えばクエン酸塩や硫酸塩（一態様においてはこれはクエン酸第二鉄及び／又は硫酸第一鉄である）；及び（ｇ）約０．０５μＭから約０．２５μＭのヒドロコルチゾンの一以上を含む。別のバリエーションにおいて、細胞培養培地は、以下：（ａ）約３００ｍｇ／Ｌ（幾つかの実施態様において、２００ｍｇ／Ｌ）から約６００ｍｇ／Ｌのシスチン及び／又はシステイン（一態様においてはこれはシスチンである）；（ｂ）約０．０５ｍｇ／Ｌから約０．５ｍｇ／ＬのビタミンＢ２；（ｃ）約２．０ｍｇ／Ｌから約８．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ６（一態様においてはこれはピリドキシンである）；（ｄ）約４．０ｍｇ／Ｌから約１２．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ９；（ｅ）約１．０ｍｇ／Ｌから約２．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２；（ｆ）約５μＭから約２５μＭの鉄源、例えばクエン酸塩や硫酸塩（一態様においてはこれはクエン酸第二鉄及び／又は硫酸第一鉄である）；及び（ｇ）約０．１μＭから約０．２μＭのヒドロコルチゾンの一以上を含む。更に別のバリエーションにおいて、細胞培養培地は、以下：（ａ）約４００ｍｇ／Ｌから約５００ｍｇ／Ｌのシスチン及び／又はシステイン（一態様においてはこれはシスチンである）；（ｂ）約０．１ｍｇ／Ｌから約０．３ｍｇ／ＬのビタミンＢ２；（ｃ）約４．０ｍｇ／Ｌから約６．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ６（一態様においてはこれはピリドキシンである）；（ｄ）約７．０ｍｇ／Ｌから約１０．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ９；（ｅ）約１．５ｍｇ／Ｌから約２．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２；（ｆ）約１２μＭから約２０μＭの鉄源、例えばクエン酸塩や硫酸塩（一態様においてはこれはクエン酸第二鉄及び／又は硫酸第一鉄である）；及び（ｇ）約０．１２５μＭから約０．１７５μＭのヒドロコルチゾンの一以上を含む。一バリエーションでは、細胞培養培地は、成分（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｇ）の２又は３又は４又は５又は６又は各々を本明細書に列挙した濃度で含む。細胞培養培地は、成分（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｇ）の任意の組み合わせを、本明細書において提供される濃度の範囲において、個々及び全ての組み合わせが具体的かつ個別に列挙されるのと同様に含むことが理解される。例えば、一バリエーションにおける培地は、成分（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、及び（ｅ）を含み、場合によっては成分（ｆ）及び／又は（ｇ）を含み得る。また別のバリエーションにおいて、培地は、成分（ａ）、（ｆ）、及び（ｇ）を含み、場合によっては成分（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）の何れか一又はそれ以上を含み得る。培地がシスチン又はシステインを含む、任意のバリエーションにおいて、一態様では、培地はシスチンを含み、（そして、更なるバリエーションではシステインを含まない）。培地がビタミンＢ６を含む、任意のバリエーションにおいて、一態様では、培地はピリドキシンを含む。培地が鉄源を含む、任意のバリエーションにおいて、一態様では、鉄源はクエン酸第二鉄である。従って、特定のバリエーションにおいて、培地は、シスチン、ピリドキシン、及びクエン酸第二鉄を含むことが理解される。一態様では、細胞培養培地は、ＣＤＭである。
【００６３】
一バリエーションにおいて、培地は、（ａ）約３００ｍｇ／Ｌ（幾つかの実施態様では２００ｍｇ／Ｌ）から約１２００ｍｇ／Ｌのシスチン；（ｂ）約０．０５ｍｇ／Ｌから約１．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ２；（ｃ）約０．０５ｍｇ／Ｌから約１０．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ６；（ｄ）約０．０５ｍｇ／Ｌから約１２．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ９；及び（ｅ）約０．０５ｍｇ／Ｌから約２．５ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２を含む。一バリエーションにおいて、培地は、（ａ）約３００ｍｇ／Ｌ（幾つかの実施態様では２００ｍｇ／Ｌ）から約１２００ｍｇ／Ｌのシスチン；（ｂ）約０．０５ｍｇ／Ｌから約１．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ２；（ｃ）約０．０５ｍｇ／Ｌから約１０．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ６；（ｄ）約０．０５ｍｇ／Ｌから約１２．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ９；（ｅ）約０．０５ｍｇ／Ｌから約２．５ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２；及び（ｆ）約２μＭから約８０μＭの鉄源、例えばクエン酸第二鉄又は硫酸第一鉄などを含む。別のバリエーションにおいて、培地は、（ａ）約３００ｍｇ／Ｌ（幾つかの実施態様では２００ｍｇ／Ｌ）から約１２００ｍｇ／Ｌのシスチン；（ｂ）約０．０５ｍｇ／Ｌから約１．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ２；（ｃ）約０．０５ｍｇ／Ｌから約１０．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ６；（ｄ）約０．０５ｍｇ／Ｌから約１２．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ９；（ｅ）約０．０５ｍｇ／Ｌから約２．５ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２；（ｆ）約２μＭから約８０μＭの鉄源、例えばクエン酸第二鉄又は硫酸第一鉄など；及び（ｇ）約０．０５μＭから約０．２５μＭのヒドロコルチゾンの各々を含む。更なるバリエーションにおいて、培地は、約３００ｍｇ／Ｌ（幾つかの実施態様では２００ｍｇ／Ｌ）から約１２００ｍｇ／Ｌのシスチン；約２μＭから約８０μＭの鉄源、例えばクエン酸第二鉄又は硫酸第一鉄など；及び約０．０５μＭから約０．２５μＭのヒドロコルチゾンを含む。更に別のバリエーションにおいて、培地は、約３００ｍｇ／Ｌ（幾つかの実施態様では２００ｍｇ／Ｌ）から約１２００ｍｇ／Ｌのシスチン；約２μＭから約８０μＭの鉄源、例えばクエン酸第二鉄又は硫酸第一鉄など；約０．０５μＭから約０．２５μＭのヒドロコルチゾン；及び約０．０５ｍｇ／Ｌから約１．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ２；約０．０５ｍｇ／Ｌから約１０．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ６；約０．０５ｍｇ／Ｌから約１２．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ９；約０．０５ｍｇ／Ｌから約２．５ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２の少なくとも一つ又は二つ又は三つを含む。本明細書に記載される任意の培地において、一態様で、培地はＣＤＭである。本明細書に記載される任意の培地において、一態様で、培地は化学的に未定義な細胞培養培地である。
【００６４】
幾つかの更なるバリエーションにおいて、細胞培養培地は表１に記載される量でシステインを更に含む。例えば、（ａ）約３００ｍｇ／Ｌ（幾つかの実施態様では２００ｍｇ／Ｌ）から約１２００ｍｇ／Ｌのシスチン；（ｂ）約０．０５ｍｇ／Ｌから約１．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ２；（ｃ）約０．０５ｍｇ／Ｌから約１０．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ６；（ｄ）約０．０５ｍｇ／Ｌから約１２．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ９；及び（ｅ）約０．０５ｍｇ／Ｌから約２．５ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２を含む細胞培養培地は、約８０ｍｇ／Ｌから約１５００ｍｇ／Ｌのシステインを更に含むことができる。一バリエーションにおいて、（ａ）約３００ｍｇ／Ｌ（幾つかの実施態様では２００ｍｇ／Ｌ）から約１２００ｍｇ／Ｌのシスチン；（ｂ）約０．０５ｍｇ／Ｌから約１．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ２；（ｃ）約０．０５ｍｇ／Ｌから約１０．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ６；（ｄ）約０．０５ｍｇ／Ｌから約１２．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ９；（ｅ）約０．０５ｍｇ／Ｌから約２．５ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２；及び（ｆ）約２μＭから約８０μＭの鉄源、例えばクエン酸第二鉄又は硫酸第一鉄などを含む細胞培養培地は、約８０ｍｇ／Ｌから約１５００ｍｇ／Ｌのシステインを更に含むことができる。幾つかのバリエーションにおいて、（ａ）約３００ｍｇ／Ｌ（幾つかの実施態様では２００ｍｇ／Ｌ）から約１２００ｍｇ／Ｌのシスチン；（ｂ）約０．０５ｍｇ／Ｌから約１．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ２；（ｃ）約０．０５ｍｇ／Ｌから約１０．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ６；（ｄ）約０．０５ｍｇ／Ｌから約１２．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ９；（ｅ）約０．０５ｍｇ／Ｌから約２．５ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２；（ｆ）約２μＭから約８０μＭの鉄源、例えばクエン酸第二鉄又は硫酸第一鉄など；及び（ｇ）約０．０５μＭから約０．２５μＭのヒドロコルチゾンを含む細胞培養培地は、約８０ｍｇ／Ｌから約１５００ｍｇ／Ｌのシステインを更に含むことができる。更に別のバリエーションにおいて、約３００ｍｇ／Ｌ（幾つかの実施態様では２００ｍｇ／Ｌ）から約１２００ｍｇ／Ｌのシスチン；約２μＭから約８０μＭの鉄源、例えばクエン酸第二鉄又は硫酸第一鉄など；約０．０５μＭから約０．２５μＭのヒドロコルチゾン；及び約０．０５ｍｇ／Ｌから約１．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ２；約０．０５ｍｇ／Ｌから約１０．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ６；約０．０５ｍｇ／Ｌから約１２．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ９；約０．０５ｍｇ／Ｌから約２．５ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２の少なくとも一つ又は二つ又は三つを含む細胞培養培地は、約８０ｍｇ／Ｌから約１５００ｍｇ／Ｌのシステインを更に含むことができる。
【００６５】
個々の培地成分は、一以上の有利な特性（一以上の許容可能な製剤品質特性）をもたらす量で存在し得る。一バリエーションにおいて、本明細書において提供される細胞培養培地は、表１に記載される量で培地成分を含む。培地は、表１の培地成分の何れか一又は複数（例えば、成分（ａ）−（ｇ）の何れか一又は複数、例えば成分（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）を含む培地、又は成分（ａ）、（ｆ）、及び（ｇ）を含む培地、又は成分（ａ）−（ｇ）の各々を含む培地など）を、個々及び全ての組み合わせが具体的かつ個別に列挙されるのと同様に、表１に列挙される量の何れかで含むことができることが理解される。特定のバリエーションにおいて、培地はＣＤＭである。別の特定のバリエーションでは、培地は、化学的に未定義な細胞培養培地である。一バリエーションにおいて、本明細書において提供される培地（例えば、ＣＤＭ）はピリドキシンを含みピリドキサールを含まない。ピリドキサールを含まない培地は基礎培地及び／又は流加培地で用いることができる。一バリエーションにおいて、基礎培地は、ピリドキサールを含まずピリドキシンを含む。
【００６６】
2018183154.tif 000002
2018183154.tif 000003
2018183154.tif 000004
2018183154.tif 000005
【００６７】
幾つかの態様において、本発明は、本明細書において、（ａ）ビタミンＢ１；（ｂ）ビタミンＢ２；（ｃ）ビタミンＢ３；（ｄ）ビタミンＢ５；（ｅ）ビタミンＢ６；（ｆ）ビタミンＢ７；（ｇ）ビタミンＢ９；（ｈ）ビタミンＢ１２；（ｉ）クエン酸第二鉄等の鉄源；及び（ｊ）シスチン、からなる群から選択される成分の一以上を含む細胞培養培地を提供する。幾つかの実施態様において、細胞培養培地は、成分（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）及び（ｊ）の２又は３又は４又は５又は６又は７又は８又は９又は各々を含む。本明細書で提供される細胞培養培地は、成分（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、及び（ｊ）の任意の組み合わせを、個々及び全ての組み合わせが具体的かつ個別に列挙されるのと同様に含むことが理解される。例えば、成分（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｈ）のうちの８つを含む細胞培養培地は、その成分の少なくとも８つが存在する限り、その成分の任意の組み合わせを含んでよいことが理解される。幾つかの実施態様において、本明細書において提供される細胞培養物は、成分（ｂ）、（ｅ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｊ）を含む。本明細書における幾つかの実施態様において、成分（ｂ）、（ｅ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｊ）を含む本明細書において提供される細胞培養物は、（ａ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｆ）を更に含む。本明細書における幾つかの実施態様において、成分（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｊ）を含む、本明細書において提供される細胞培養物は（ｉ）を更に含む。
【００６８】
幾つかの態様において、本明細書において提供される細胞培養培地は、（ａ）ビタミンＢ１；（ｂ）ビタミンＢ２；（ｃ）ビタミンＢ３；（ｄ）ビタミンＢ５；（ｅ）ビタミンＢ６；（ｆ）ビタミンＢ７；（ｇ）ビタミンＢ９；（ｈ）ビタミンＢ１２；（ｉ）クエン酸第二鉄等の鉄源；及び（ｊ）シスチンからなる群から選択される一又は複数の培地成分を、表１Ａに記載される量で含有する。培地は、表１Ａの培地成分の何れか一又は複数（例えば、成分（ａ）−（ｊ）の何れか一又は複数、例えば成分（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｉ）を含む培地、又は成分（ｂ）、（ｅ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｊ）を含む培地、又は成分（ａ）−（ｊ）の一のみを含む培地など）を、個々及び全ての組み合わせが具体的かつ個別に列挙されるのと同様に、表１Ａに列挙される量の何れかで含むことができることが理解される。幾つかの態様において、細胞培養培地は、成分（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｉ）を含み、ここで（ａ）は約２μＭから約１４μＭのビタミンＢ１であり；（ｂ）は約０．１１μＭから約０．７２μＭのビタミンＢ２であり；（ｃ）は約１１μＭから約７２μＭのビタミンＢ３であり；（ｄ）は約６．８μＭから約４４μＭのビタミンＢ５であり；（ｅ）は約４．５μＭから約３０μＭのビタミンＢ６であり；（ｆ）は約０．０２μＭから約０．１４μＭのビタミンＢ７であり；（ｇ）は約３．４μＭから約２２μＭのビタミンＢ９であり；（ｈ）は約０．２μＭから約１．５μＭのビタミンＢ１２であり；（ｉ）は約１１μＭから約３６μＭのクエン酸第二鉄であり；及び（ｊ）は約０．９ｍＭから約１．５ｍＭのシスチンである。
【００６９】
幾つかの更なる態様において、細胞培養培地は表１Ａに記載される量でシステインを更に含む。例えば、（ａ）約２μＭから約１４μＭのビタミンＢ１；（ｂ）約０．１１μＭから約０．７２μＭのビタミンＢ２；（ｃ）約１１μＭから約７２μＭのビタミンＢ３；（ｄ）約６．８μＭから約４４μＭのビタミンＢ５；（ｅ）約４．５μＭから約３０μＭのビタミンＢ６；（ｆ）約０．０２μＭから約０．１４μＭのビタミンＢ７；（ｇ）約３．４μＭから約２２μＭのビタミンＢ９；（ｈ）約０．２μＭから約１．５μＭのビタミンＢ１２；（ｉ）約１１μＭから約３６μＭのクエン酸第二鉄；及び（ｊ）約０．７ｍＭから約２．０ｍＭのシスチンを含む細胞培養培地は、更に、（ｋ）約０．５ｍＭから約２．０ｍＭのシステインを含むことができることが理解される。
【００７０】
2018183154.tif 000006
2018183154.tif 000007
2018183154.tif 000008
2018183154.tif 000009
【００７１】
本明細書において提供される培地（例えば、ＣＤＭ又は化学的に未定義な培地）は、一バリエーションにおいて、シスチンを含みシステインを含まない。システインを含まない培地は基礎培地及び／又は流加培地で用いることができる。一バリエーションにおいて、基礎培地は、システインを含まずシスチンを含む。一バリエーションにおいて、約３００ｍｇ／Ｌ（幾つかの実施態様では２００ｍｇ／Ｌ）から約１２００ｍｇ／Ｌのシスチン；約０．０５ｍｇ／Ｌから約１．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ２；約０．０５ｍｇ／Ｌから約１０．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ６（一実施態様においてこれはピリドキシンである）；約０．０５ｍｇ／Ｌから約１２．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ９；及び約０．０５ｍｇ／Ｌから約２．５ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２を含む基礎培地は、一態様において、（１）ビタミンＢ１（一態様において、約２．０μＭから約１４．０μＭの濃度で存在する）、（２）ビタミンＢ３（一態様において、約１１．０μＭから約７２．０μＭの濃度で存在する）、（３）ビタミンＢ５（一態様において、約６．８μＭから約４４．０μＭの濃度で存在する）、及び（４）ビタミンＢ７（一態様において、約０．０２μＭから約０．２４μＭの濃度で存在する）の何れか一又は複数を更に含むことができ、システインを含まない。別のバリエーションにおいて、約０．８ｍＭ（幾つかの実施態様では０．７ｍＭ）から約２．５ｍＭのシスチン；約０．１１μＭから約０．７２μＭのビタミンＢ２；約４．５μＭから約３０μＭのビタミンＢ６（一実施態様においてこれはピリドキシンである）；約３．４μＭから約２２μＭのビタミンＢ９；及び約０．２μＭから約１．５μＭのビタミンＢ１２を含む基礎培地は、一態様において、（１）ビタミンＢ１（一態様において、約２．０μＭから約１４．０μＭの濃度で存在する）、（２）ビタミンＢ３（一態様において、約１１．０μＭから約７２．０μＭの濃度で存在する）、（３）ビタミンＢ５（一態様において、約６．８μＭから約４４．０μＭの濃度で存在する）、及び（４）ビタミンＢ７（一態様において、約０．０２μＭから約０．２４μＭの濃度で存在する）の何れか一又は複数を更に含むことができ、システインを含まない。本明細書に任意のバリエーションにおいて、基礎培地は、クエン酸第二鉄又は硫酸第一鉄などの鉄源（一態様においては約１１．０μＭから約３６．０μＭの濃度で存在する）を更に含むことができる。本明細書に任意のバリエーションにおいて、基礎培地は、ヒドロコルチゾン（一態様においては約０．０５μＭから約０．５μＭの濃度で存在する）を更に含むことができる。
【００７２】
本明細書において提供される培地（例えば、ＣＤＭ又は化学的に未定義な培地）は、一バリエーションにおいて、システインを含みシスチンを含まない。シスチンを含まない培地は基礎培地又は流加培地で用いることができる。一バリエーションにおいて、流加培地は、シスチンを含まずシステインを含む。一バリエーションにおいて、流加培地は、約８０ｍｇ／Ｌから約１５００ｍｇ／Ｌのシステインを含む。別のバリエーションにおいて、流加培地は、約０．５ｍＭから約２．０ｍＭのシステインを含む。例えば、約３００ｍｇ／Ｌ（幾つかの態様では２００ｍｇ／Ｌ）から約１２００ｍｇ／Ｌのシスチン；約０．０５ｍｇ／Ｌから約１．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ２；約０．０５ｍｇ／Ｌから約１０．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ６（一実施態様においてこれはピリドキシンである）；約０．０５ｍｇ／Ｌから約１２．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ９；及び約０．０５ｍｇ／Ｌから約２．５ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２を含む基礎培地は、一態様において、（１）ビタミンＢ１（一態様において、約２．０μＭから約１４．０μＭの濃度で存在する）、（２）ビタミンＢ３（一態様において、約１１．０μＭから約７２．０μＭの濃度で存在する）、（３）ビタミンＢ５（一態様において、約６．８μＭから約４４．０μＭの濃度で存在する）、及び（４）ビタミンＢ７（一態様において、約０．０２μＭから約０．２４μＭの濃度で存在する）の何れか一又は複数を更に含むことができ、約８０ｍｇ／Ｌから約１５００ｍｇ／Ｌのシステイン（幾つかの態様において、０．５ｍＭから約２．０ｍＭのシステイン）を含む流加培地を補充することができる。別のバリエーションにおいて、約０．８ｍＭ（幾つかの態様では０．７ｍＭ）から約２．５ｍＭのシスチン；約０．１１μＭから約０．７２μＭのビタミンＢ２；約４．５μＭから約３０μＭのビタミンＢ６（一実施態様においてこれはピリドキシンである）；約３．４μＭから約２２μＭのビタミンＢ９；及び約０．２μＭから約１．５μＭのビタミンＢ１２を含む基礎培地は、一態様において、（１）ビタミンＢ１（一態様において、約２．０μＭから約１４．０μＭの濃度で存在する）、（２）ビタミンＢ３（一態様において、約１１．０μＭから約７２．０μＭの濃度で存在する）、（３）ビタミンＢ５（一態様において、約６．８μＭから約４４．０μＭの濃度で存在する）、及び（４）ビタミンＢ７（一態様において、約０．０２μＭから約０．２４μＭの濃度で存在する）の何れか一又は複数を更に含むことができ、約８０ｍｇ／Ｌから約１５００ｍｇ／Ｌのシステイン（幾つかの態様において、０．５ｍＭから約２．０ｍＭのシステイン）を含む流加培地を補充することができる。本明細書に任意のバリエーションにおいて、基礎培地は、クエン酸第二鉄又は硫酸第一鉄などの鉄源（一態様においては約１１．０μＭから約３６．０μＭの濃度で存在する）を更に含むことができる。本明細書に任意のバリエーションにおいて、基礎培地は、ヒドロコルチゾン（一態様においては約０．０５μＭから約０．５μＭの濃度で存在する）を更に含むことができる。
【００７３】
本明細書において提供される培地（例えば、ＣＤＭ又は化学的に未定義な培地）は、一バリエーションにおいて、クエン酸第二鉄を含み硫酸第一鉄を含まない。硫酸第一鉄を含まない培地は基礎培地又は流加培地で用いることができる。一バリエーションにおいて、基礎培地は、硫酸第一鉄を含まずクエン酸第二鉄を含む。
【００７４】
特定のバリエーションにおいて、本明細書において提供される培地は、システイン及び硫酸第一鉄を含まない。このようなバリエーションにおいて、培地は、システイン及び硫酸第一鉄を含まず、システイン及び／又はクエン酸第二鉄を含む。
【００７５】
本明細書において提供される培地は、一バリエーションにおいて、ヒドロコルチゾンを含まない。別のバリエーションにおいて、培地はヒドロコルチゾンを含む。一態様において、培地はヒドロコルチゾンを含み、システイン及び／又は硫酸第一鉄を含まない。別の態様において、培地は、ヒドロコルチゾン及びシスチン及びクエン酸第二鉄を含む。特定のバリエーションにおいて、ヒドロコルチゾンを含む培地は基礎培地である。一バリエーションにおいて、基礎培地は、約０．８ｍＭ（幾つかの実施態様では０．７ｍＭ）から約２．５ｍＭのシスチン；約２μＭから約８０μＭのクエン酸第二鉄；約０．０５μＭから約０．５μＭのヒドロコルチゾンを含み、及びここで基礎培地は、以下の成分：（１）ビタミンＢ２（一態様では、約０．０５ｍｇ／Ｌから約１．０ｍｇ／Ｌの濃度で存在する）；（２）ビタミンＢ６（一態様では、約０．０５ｍｇ／Ｌから約１０．０ｍｇ／Ｌの濃度で存在する）；（３）ビタミンＢ９（一態様では、約０．０５ｍｇ／Ｌから約１２．０ｍｇ／Ｌの濃度で存在する）；及び（４）ビタミンＢ１２（一態様では、約０．０５ｍｇ／Ｌから約２．５ｍｇ／Ｌの濃度で存在する）の一以上を更に含み得る。別のバリエーションにおいて、基礎培地は、約３００ｍｇ／Ｌ（幾つかの態様では２００ｍｇ／Ｌ）から約１２００ｍｇ／Ｌのシスチン；約２μＭから約８０μＭのクエン酸第二鉄；及び約０．０５μＭから約０．５μＭのヒドロコルチゾンを含み、及びここで基礎培地は、以下の成分：（１）ビタミンＢ２（一態様では、約０．０５ｍｇ／Ｌから約１．０ｍｇ／Ｌの濃度で存在する）；（２）ビタミンＢ６（一態様では、約０．０５ｍｇ／Ｌから約１０．０ｍｇ／Ｌの濃度で存在する）；（３）ビタミンＢ９（一態様では、約０．０５ｍｇ／Ｌから約１２．０ｍｇ／Ｌの濃度で存在する）；及び（４）ビタミンＢ１２（一態様では、約０．０５ｍｇ／Ｌから約２．５ｍｇ／Ｌの濃度で存在する）の一以上を更に含み得る。本明細書中のバリエーションの何れかにおいて、基礎培地は、（１）ビタミンＢ１（一態様において、約２．０μＭから約１４．０μＭの濃度で存在する）、（２）ビタミンＢ３（一態様において、約１１．０μＭから約７２．０μＭの濃度で存在する）、（３）ビタミンＢ５（一態様において、約６．８μＭから約４４．０μＭの濃度で存在する）、及び（４）ビタミンＢ７（一態様において、約０．０２μＭから約０．２４μＭの濃度で存在する）の何れか一又は複数を更に含むことができる。
【００７６】
細胞を培養することに使用するための細胞培養培地を調製する方法も提供され、ここで該方法は、ａ）システイン及び／又はシステイン、（ｂ）ビタミンＢ２、（ｃ）ビタミンＢ６（ピリドキシン及び／又はピリドキサール）、（ｄ）ビタミンＢ９、（ｅ）ビタミンＢ１２、（ｆ）クエン酸第二鉄などの鉄源及び（ｇ）ヒドロコルチゾンからなる群から選択される何れか一又は複数の培地成分を組み合わせることを含み、ここで、（ａ）−（ｇ）の各々は表１に記載される量で提供される。また本明細書において提供されるのは、細胞を培養することに使用するための細胞培養培地を調製する方法であって、該方法は、（ａ）ビタミンＢ１；（ｂ）ビタミンＢ２；（ｃ）ビタミンＢ３；（ｄ）ビタミンＢ５；（ｅ）ビタミンＢ６；（ｆ）ビタミンＢ７；（ｇ）ビタミンＢ９；（ｈ）ビタミンＢ１２；（ｉ）クエン酸第二鉄等の鉄源；（ｊ）シスチン；及び（ｋ）システインからなる群から選択される何れか一又は複数の培地成分を、表１Ａに記載される量において、組み合わせることを含む。一バリエーションにおいて、方法は、本明細書に記載される一又は複数の培地成分（例えば、表１又は表１Ａ）を細胞培養に適した成分に添加することを含み、ここで一又は複数の培地成分は逐次的又は同時にその組成物に対して添加され得る。更なるバリエーションにおいて、方法は、本明細書に記載される一又は複数の培地成分（例えば、表１又は表１Ａ）を、第一の期間で、細胞培養に適した組成で組み合わせることを含み、ここで該方法は、第二の期間で、一又は複数の培地成分の量を、細胞培養サイクルの間に、例えば、少なくとも一回、少なくとも二回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、添加することを更に含む。幾つかの実施態様において、細胞培養周期は少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８、日、１９日、２０日、又は任意の日数であり、ここで細胞は、依然として生存しつつ、細胞培養物に残存し得る。細胞の培養に使用するための細胞培養培地を調製する方法の一バリエーションにおいて、細胞培養培地中で、シスチンは、約３００ｍｇ／Ｌ（幾つかの態様では、２００ｍｇ／Ｌ）から約１２００ｍｇ／Ｌのシスチンを提供する量で添加され、ビタミンＢ２は、約０．０５ｍｇ／Ｌから約１．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ２を提供する量で添加される、ビタミンＢ６は、約０．０５ｍｇ／Ｌから約１０．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ６を提供する量で添加され、ビタミンＢ９は、約０．０５ｍｇ／Ｌから約１２．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ９を提供する量で添加され、ビタミンＢ１２は、約０．０５ｍｇ／Ｌから約２．５ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２を提供する量で添加される。細胞の培養に使用するための細胞培養培地を調製する方法の別バリエーションにおいて、細胞培養培地中で、シスチンは、約０．８ｍＭ（幾つかの態様では０．７ｍＭ）から約２．５ｍＭのシスチンを提供する量で添加され、ビタミンＢ２は、約０．１１μＭから約０．７２μＭのビタミンＢ２を提供する量で添加される、ビタミンＢ６は、約４．５μＭから約３０．０μＭのビタミンＢ６を���供する量で添加され、ビタミンＢ９は、約３．４μＭから約２２．０μＭのビタミンＢ９を提供する量で添加され、ビタミンＢ１２は、約０．２μＭから約１．５μＭのビタミンＢ１２を提供する量で添加される。
【００７７】
本明細書中の幾つかのバリエーションにおいて、細胞培養培地は、基礎細胞培養培地である。本明細書中の幾つかのバリエーションにおいて、細胞培養培地は、流加細胞培養培地である。本明細書中の幾つかのバリエーションにおいて、細胞培養培地は、表１に記載される量の、（ａ）シスチン；（ｂ）ビタミンＢ２、（ｃ）ビタミンＢ６（ピリドキシン及び／又はピリドキサール）、（ｄ）ビタミンＢ９、（ｅ）ビタミンＢ１２、（ｆ）クエン酸第二鉄などの鉄源、及び（ｇ）ヒドロコルチゾンからなる群から選択される何れか一又は複数の培地成分を含む基礎細胞培養培地であり、ここで基礎細胞培養培地は、表１に記載される量の（ａ）システインを含む流加細胞培地を（例えば、細胞培養サイクルの開始後の期間において、例えば、一回の細胞培養サイクルのうち少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６倍、少なくとも７倍、等）補充される。本明細書中の幾つかのバリエーションにおいて、細胞培養培地は、表１Ａに記載される量の、（ａ）ビタミンＢ１；（ｂ）ビタミンＢ２；（ｃ）ビタミンＢ３；（ｄ）ビタミンＢ５；（ｅ）ビタミンＢ６；（ｆ）ビタミンＢ７；（ｇ）ビタミンＢ９；（ｈ）ビタミンＢ１２；（ｉ）クエン酸第二鉄などの鉄源；及び（ｊ）シスチンからなる群から選択される何れか一又は複数の培地成分を含む基礎細胞培養培地であり、ここで基礎細胞培養培地は、表１Ａに記載される量の（ｋ）システインを含む流加細胞培地を（例えば、細胞培養サイクルの開始後の期間において、例えば、一回の細胞培養サイクルのうち少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６倍、少なくとも７倍、等）補充される。
【００７８】
当業者によって理解されるように、本明細書に詳述される細胞培養培地は、（例えば、シスチン、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、ビタミンＢ７、ビタミンＢ９、ビタミンＢ１２、鉄、及び任意でヒドロコルチゾンのうち一又は複数の他に）細胞培養のために有用である他の成分を含んでいてもよい。例えば、細胞培養培地は、アミノ酸（例えば、グルタミン、アルギニン、又はアスパラギン）、ビタミン（限定されないが、アスコルビン酸を含む）、微量元素、遷移金属（限定されないが、ニッケル、銅、又は亜鉛を含む）、及び限定されないが、動物及び／又は植物由来の加水分解物などの他の培地成分などの追加の成分を含んでもよいことが理解される。また、本明細書において提供される任意の培地は、ホルモン及び／又は他の増殖因子（例えばインシュリン、トランスフェリン、又は上皮増殖因子）、イオン（例えば、ナトリウム、塩化物、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩）、緩衝液（例えばＨＥＰＥＳ）、ヌクレオシド（例えばアデノシン及びチミジン）、及びグルコース又は同等のエネルギー源を添加してもよい。本明細書に列挙したものなど、追加の細胞培養培地成分は、当業者に知られている細胞培養サイクル中の異なる時点で、適切な濃度で細胞培養培地に含まれていてもよい。
【００７９】
本明細書に提供される培地は、一態様において、ポリペプチドを生成する方法で使用される場合、異なる培地で生成された場合のポリペプチドの品質特性と比較して、一以上の好適な製剤品質特性をもたらす。改変された電荷変異体分布を有するタンパク質生成物の生成（例えば、抗体生成物）は、タンパク質生成物の色などのタンパク質生成物の品質特性に影響を与える可能性がある。加えて、特定の培地成分を使用することにより形成された活性酸素種（ＲＯＳ）は、特定のアミノ酸を酸化して酸化生成物を生成することができる。こうした製剤変異型の存在はまた、色などタンパク質生成物の製剤品質特性を変える場合もある。本明細書に詳述される培地で生成されるポリペプチドを含む組成物（少なくとも１００ｍｇ／Ｌ又は１２５ｍｇ／Ｌ又は１５０ｍｇ／ｍＬのポリペプチド（抗体など）を含む組成物を含む）の色は、一態様において、表２に記載したように色の参照基準値を有する。特定のバリエーションにおいては、本明細書に詳述される培地で生成されるポリペプチドを含む組成物（少なくとも１００ｍｇ／Ｌ又は１２５ｍｇ／Ｌ又は１５０ｍｇ／ｍＬのポリペプチド（抗体など）を含む組成物を含む）の色は、一態様において、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７、Ｂ８、Ｂ９、ＢＹ３、ＢＹ４、ＢＹ５、ＢＹ６、ＢＹ７、Ｙ３、Ｙ４、Ｙ５、Ｙ６、Ｙ７、ＧＹ３、ＧＹ４、ＧＹ５、ＧＹ６、ＧＹ７、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７からなる群から選択される色の参照基準値を有する。別の態様において、本明細書に詳述される培地で生成されるポリペプチドを含む組成物（少なくとも１ｍｇ／Ｌ又は２５ｍｇ／Ｌ又は５０ｍｇ／ｍＬ又は７５ｍｇ／ｍＬのポリペプチド（抗体など）を含む組成物を含む）の色は、一態様において、表２に記載したように色の参照基準値を有する。幾つかのバリエーションにおいては、本明細書に詳述される培地で生成されるポリペプチドを含む組成物（少なくとも１ｍｇ／Ｌ又は２５ｍｇ／Ｌ又は５０ｍｇ／ｍＬ又は７５ｍｇ／ｍＬのポリペプチド（抗体など）を含む組成物を含む）の色は、一態様において、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７、Ｂ８、Ｂ９、ＢＹ３、ＢＹ４、ＢＹ５、ＢＹ６、ＢＹ７、Ｙ３、Ｙ４、Ｙ５、Ｙ６、Ｙ７、ＧＹ３、ＧＹ４、ＧＹ５、ＧＹ６、ＧＹ７、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７からなる群から選択される色の参照基準値を有する。茶色（Ｂ）、茶色がかった黄色（ＢＹ）、黄色（Ｙ）、緑がかった黄色（ＧＹ）、又は赤色（Ｒ）の色の基準値の説明について、ＵＳＰ−２４モノグラフ６３１色と無彩色性。米国薬局方、２０００、頁１９２６−１９２７及び欧州評議会。ヨーロッパ薬局方，２００８、第７版 Ｐ．２２を参照。一バリエーションにおいて、本明細書中に提供される培地は、ポリペプチドを生成する方法で使用される場合、ポリペプチドが別の培地中に生成される場合に得られる電荷変異体（例えば、酸性の電荷変異体）と比較して、電荷変異体（例えば、酸性の電荷変異体）の存在を減少させる。別のバリエーションにおいて、培地は、ポリペプチドを生成する方法で使用される場合、ポリペプチドが別の培地中に生成される場合に得られる活性酸素種と比較して、活性酸素種の存在を減少させる。別のバリエーションにおい��、培地は、ポリペプチドを生成する方法で使用される場合、ポリペプチドが別の培地中に生成される場合に得られる汚染物質と比較して、汚染物質の存在を減少させる。
【００８０】
本明細書に記載されるように、本節及びその他に記載される細胞培養培地を使用する種々な方法（細胞を培養する方法及びポリペプチドを生成する方法など）が提供される。
【００８１】
方法
本明細書に詳述される細胞培養培地（本明細書に詳述される任意のＣＤＭ又は化学的に未定義の培地を含む）は、特定の抗体を含むポリペプチドを生成する細胞を培養する方法で使用することができる。培地は、流加培養、回分培養又は灌流培養によるかどうかに関わらず、細胞を培養する方法において使用することができ、及び本明細書に記載される抗体のいずれかの態様又はバリエーション又は実施態様を含む、抗体を産生する方法で使用することができる。
【００８２】
本明細書で詳述されるように細胞培養培地と細胞を接触させることにより、細胞を増殖させる（即ち、細胞を培養する）方法が提供される。一バリエーションにおいて、方法は、表１に記載される一以上の培地成分を含んでなる細胞培養培地（例えば、表１に列挙した何れかの量において、成分（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）を含む培地、又は成分（ａ）、（ｆ）及び（ｇ）を含む培地、又は成分（ａ）−（ｇ）の各々を含む培地）と細胞を接触させることを含む。一バリエーションにおいて、方法は、表１Ａに記載される一以上の培地成分を含んでなる細胞培養培地（例えば、表１Ａに列挙した何れかの量において、成分（ａ）−（ｊ）を含む培地又は成分（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、及び（ｉ）を含む培地、又は成分（ｂ）、（ｅ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｊ）を含む培地、又は成分（ａ）−（ｊ）の一のみを含む培地）と細胞を接触させることを含む。細胞を増殖させる（即ち、細胞を培養する）方法の特定のバリエーションにおいて、細胞培養培地はＣＤＭである。方法の一態様において、細胞はＣＤＭ基礎培地で増殖される（即ち、培養される）。細胞を増殖させる（即ち、細胞を培養する）方法の別の特定のバリエーションにおいて、細胞培養培地は化学的に未定義な細胞培養培地である。方法の一態様において、細胞は化学的に未定義の細胞培養基礎培地で増殖される（即ち、培養される）。幾つかの態様において、細胞は、細胞の増殖期の間で細胞培養培地と接触させる。幾つかの態様において、細胞は、細胞の生成期の間で細胞培養培地と接触させる。幾つかの態様において、この方法は、細胞培養培地にシステインを添加する工程を更に含む。更なる態様において、細胞培養培地中に、システインが、約８０ｍｇ／Ｌから約１５００ｍｇ／Ｌのシステインを提供する量で添加される。別の更なる態様において、細胞培養培地中に、システインが、約１５００ｍｇ／Ｌのシステインを提供する量で添加される。更に別の更なる態様において、細胞培養培地中に、システインが、約１４０ｍｇ／Ｌのシステインを提供する量で添加される。別の更なる態様において、細胞培養培地中に、システインが、約０．５ｍＭから約２．０ｍＭのシステインを提供する量で添加される。更に別の更なる態様において、細胞培養培地中に、システインが、約０．８ｍＭのシステインを提供する量で添加される。
【００８３】
細胞培養培地中で、ポリペプチドをコードする単離された核酸を含む細胞を増殖させること（即ち、細胞培養培地中で培養すること）によるポリペプチドを生成する方法もまた提供され、ここで（ａ）細胞はポリペプチドを発現し及び（ｂ）化学的に定義された細胞培養培地は、表１に記載の一又は複数の培地成分を含む（例えば、表１に列挙した何れかの量において、成分（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）を含む培地、又は成分（ａ）、（ｆ）及び（ｇ）を含む培地、又は成分（ａ）−（ｇ）の何れかを含む培地）。別のバリエーションにおいて、本明細書に提供されるのは、細胞培養培地中で、ポリペプチドをコードする単離された核酸を含む細胞を増殖させること（即ち、細胞培養培地中で培養すること）によるポリペプチドを生成する方法であって、ここで（ａ）細胞はポリペプチドを発現し及び（ｂ）細胞培養培地は、表１Ａに記載の一又は複数の培地成分を含む（例えば、表１Ａに列挙した何れかの量において、成分（ａ）−（ｊ）を含む培地、又は成分（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、及び（ｉ）を含む培地、又は成分（ｂ）、（ｅ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｊ）を含む培地、又は成分（ａ）−（ｊ）の一のみを含む培地）。細胞培養培地中で（即ち、細胞培養培地中で培養すること）により、ポリペプチドをコードする単離された核酸を含む細胞を増殖させることによってポリペプチドを生成する方法の特定のバリエーションにおいて、細胞培養培地はＣＤＭである。方法の一態様において、細胞はＣＤＭ基礎培地で増殖される（即ち、培養される）。細胞培養培地中で（即ち、細胞培養培地中で培養すること）により、ポリペプチドをコードする単離された核酸を含む細胞を増殖させることによってポリペプチドを生成する方法の別の特定のバリエーションにおいて、細胞培養培地は化学的に未定義な細胞培養培地である。方法の一態様において、細胞は化学的に未定義の細胞培養基礎培地で増殖される（即ち、培養される）。幾つかの態様において、培養は細胞の増殖期の間である。幾つかの態様において、培養は細胞の生成期の間である。幾つかのバリエーションにおいて、この方法は、細胞培養培地にシステインを添加する工程を更に含む。更なるバリエーションにおいて、細胞培養培地中に、システインが、約８０ｍｇ／Ｌから約１５００ｍｇ／Ｌのシステインを提供する量で添加される。別の更なるバリエーションにおいて、細胞培養培地中に、システインが、約１５００ｍｇ／Ｌのシステインを提供する量で添加される。更に別の更なるバリエーションにおいて、細胞培養培地中に、システインが、約１４０ｍｇ／Ｌのシステインを提供する量で添加される。別の更なるバリエーションにおいて、細胞培養培地中に、システインが、約０．５ｍＭから約２．０ｍＭのシステインを提供する量で添加される。更に別の更なるバリエーションにおいて、細胞培養培地中に、システインが、約０．８ｍＭのシステインを提供する量で添加される。
【００８４】
本明細書に詳述されるようなポリペプチドを投与する方法も提供される。例えば、ポリペプチドを含む製剤を個体に投与するための方法が提供され、ここで製剤は、少なくとも１００ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１２５ｍｇ／ｍＬ、又は少なくとも１５０ｍｇ／ｍＬより大きい濃度でポリペプチドを有し、ＣＯＣアッセイによって測定されるように、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７、Ｂ８、又はＢ９より大きい色強度値を有する。幾つかの態様において、ＣＯＣアッセイにより決定される色強度値は、限定されないが、Ｂ、ＢＹ、Ｙ、ＧＹ、又はＲの任意の一とすることができ、ここでより高い値はより明るい色の強さを示している。別の例において、ポリペプチドを含む製剤を個体に投与するための方法が提供され、ここで製剤は、少なくとも１００ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１２５ｍｇ／ｍＬ、又は少なくとも１５０ｍｇ／ｍＬより大きい濃度でポリペプチドを有し、そして色のアッセイ（例えば、全色アッセイ又はニフティアッセイ）によって測定されるように、参照溶液の色強度値未満の色強度値を有している。ポリペプチドの製剤は、任意の適切な手段によって投与することができ、経口、肺内、および鼻腔内、及び局所治療が所望される場合、病巣内投与が含まれる。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与が含まれる。くも膜下腔内投与もまた考えられる。投薬は、その投与が短期間か又は長期であるかどうかに部分的に依存し、任意の適切な経路、例えば、静脈内または皮下注射などの注射により行うことができる。従って、本明細書に提供されるようなポリペプチドを含有する製剤は、注射、例えば個体への皮下注射など（例えば、ヒトへの皮下注射）のために適切であり得る。幾つかの態様では、注射（例えば、皮下注射）に適したポリペプチド含有製剤は、少なくとも１００ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１２５ｍｇ／ｍＬ、又は少なくとも１５０ｍｇ／ｍＬより大きい濃度であり、ＣＯＣアッセイによって測定されるように、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７、Ｂ８、又はＢ９より大きい色強度値を有する。幾つかの態様において、ＣＯＣアッセイにより決定される色強度値は、限定されないが、Ｂ、ＢＹ、Ｙ、ＧＹ、又はＲの任意の一とすることができ、ここでより高い値はより明るい色の強さを示している。幾つかの態様では、注射に適したポリペプチド含有製剤は、少なくとも１００ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１２５ｍｇ／ｍＬ、又は少なくとも１５０ｍｇ／ｍＬより大きい濃度であり、そして色のアッセイ（例えば、全色アッセイ又はニフティアッセイ）によって測定されるように、参照溶液の色強度値未満の色強度値を有している。限定されないが、様々な時間点にわたる、単一または複数回投与、ボーラス投与、パルス注入を含む様々な投与スケジュールが本明細書で考えられている。
【００８５】
他の方法は、本発明の簡潔な概要及びその他など、全体にわたり提供される。
【００８６】
細胞
提供される方法および組成物は、動物、酵母または昆虫細胞を含む、増殖及び／又は本明細書に記載される培地中におけるポリペプチド（例えば、抗体）の生成に適した任意の細胞を使用することができる。一態様において、方法及び組成物の細胞は、細胞培養及びポリペプチドの発現に適した任意の哺乳動物細胞又は細胞型である。本明細書中に提供される方法は（例えば、細胞を増殖させる（即ち、細胞を培養する）方法及び／又はポリペプチドを生成する方法）おい及び組成物は、したがって、動物細胞を含む細胞の任意の適切なタイプを使用することができる。一態様において、方法および組成物は、哺乳動物細胞を使用する。方法及び組成物はまた、ハイブリドーマ細胞を使用することができる。一バリエーションにおいて、哺乳動物細胞は、抗体、抗体断片（リガンド結合断片を含む）、及びキメラ抗体など所望のポリペプチドをコードする、外因性の単離された核酸で形質転換された非ハイブリドーマ哺乳動物細胞である。一バリエーションにおいて、方法及び組成物は、網膜芽細胞腫（ＰＥＲ．Ｃ６（CruCell, Leiden, The Netherlands)）；ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）；ヒト胚腎臓株（懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された２９３又は２９３細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977)）；ハムスター乳児腎細胞（ＢＨＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，Urlaub及びChasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)）；マウスのセルトリ細胞（ＴＭ４， Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)）；サルの腎細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザルの腎細胞（ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１ ５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ，ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２，ＨＢ８０６５）；マウス乳房腫瘍細胞（ＭＭＴ０６０５６２，ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Mather等， Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)）；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝癌株（Ｈｅｐ Ｇ２）からなる群から選択される哺乳動物細胞を用いる。一態様において、方法および組成物は、ＣＨＯ細胞を使用する。特定のバリエーションにおいて、ＣＨＯ細胞株の培養及びＣＨＯ細胞株からのポリペプチド（例えば、抗体）の発現が用いられる。ポリペプチド（例えば、抗体）は、培地（例えば、ＣＤＭ）中に分泌され、そこからポリペプチドが単離及び／又は精製することができ、又はポリペプチドは、ポリペプチドをコードする単離された核酸を含む細胞の溶解によって培地中に放出され得る。
【００８７】
組換え脊椎動物細胞培養での目的のポリペプチドの合成に適応化に適した方法、ベクター及び宿主細胞は、当技術分野において公知であり、例えば、Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981);Mantei et al., Nature, 281:40-46 (1979);Levinson et al.；欧州特許第１１７，０６０号；及び欧州特許第１１７，０５８号に記載されている。ポリペプチドの哺乳動物細胞培養に特に有用なプラスミドは、ｐＲＫ５（ＥＰ公開番号第３０７，２４７号）又はｐＳＶＩ６Ｂ（１９９１年６月１３日公開されたＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／０８２９１）である。
【００８８】
宿主細胞は、発現又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適切に修飾された栄養培地で培養される。哺乳動物細胞については、Graham and van der Erb, Virology, 52:456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈殿法又はHawley-Nelson, Focus 15:73 (1193)のリポフェクタミンＴＭ(Gibco BRL)法が望ましい。哺乳類細胞宿主系形質転換の一般的態様は、当該技術分野において公知であり、例えば、１９８３年８月１６日に発行された米国特許第４，３９９，２１６号に記載されている。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、例えば、Keown et al., Methods in Enzymology (1989), Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)、及びMansour et al., Nature, 336:348-352 (1988)を参照。
【００８９】
本方法及び組成物はまた、細胞培養物中にモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマの使用を包含する。モノクローナル抗体は、免疫した動物からの免疫細胞（典型的には、脾臓細胞又はリンパ節組織からのリンパ球）を回収し、従来の方法で、例えば、骨髄腫細胞又はエプスタイン−バー（ＥＢ）−ウイルス形質変換による融合によって細胞を不死化し、所望の抗体を発現するクローンをスクリーニングすることによって調製される。Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol., 6:511 (1976)によって最初に記載されたハイブリドーマ法はまた、Hammerling et al., In: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y., pp. 563-681 (1981)によって記述され、多くの特異的抗原に対する高レベルのモノクローナル抗体を分泌するハイブリッド細胞株を生成するために広く適用されている。
【００９０】
ポリペプチド
本明細書に詳述される組成物（細胞）及び方法によって生成され、本明細書で提供される組成物中に存在するポリペプチドは、宿主細胞に相同であってもよく、又は好ましくは、それらが異種であり、即ちチャイニーズハムスター卵巣細胞により生成されたヒトタンパク質、又は哺乳動物細胞によって生成された酵母ポリペプチドなど、利用される宿主細胞に対して外因性であることを意味する外因性であってもよい。一バリエーションにおいて、ポリペプチドは、宿主細胞によって直接培地中に分泌された哺乳動物のポリペプチド（抗体など）である。別のバリエーションにおいて、ポリペプチドは、ポリペプチドをコードする単離核酸を含む細胞の溶解により培地中に放出される。
【００９１】
一バリエーションにおいて、ポリペプチドは、鎖の長さが、三次及び／又は四次構造のより高いレベルを生成するのに十分となっているアミノ酸の配列を意味する。一態様において、ポリペプチドは、少なくとも約５から２０ｋＤ、あるいは少なくとも約１５から２０ｋＤ、好ましくは少なくとも約２０ｋＤの分子量を持つことになる。
【００９２】
宿主細胞中で発現可能である任意のポリペプチドは、本開示に従って生成されてもよく、提供される組成物中に存在してもよい。ポリペプチドは、宿主細胞に対して内因性である遺伝子から又は遺伝子工学を介して宿主細胞に導入される遺伝子から発現され得る。ポリペプチドは、天然に存在するものであってもよく、又は代替として、操作されもしくは人間の手で選択された配列を有していてもよい。操作されたポリペプチドは、自然界に個別に生じる他のポリペプチドセグメントから組み立てることができ、又は天然に生じない一以上のセグメントを含んでもよい。
【００９３】
望ましくは、本発明に従って発現され得るポリペプチドは、しばしば、興味深い生物学的又は化学的活性に基づいて選択されるであろう。例えば、本発明は、薬学的又は商業的に任意の関連する酵素、受容体、抗体、ホルモン、調節因子、抗原、結合剤などを発現するために使用することができる。
【００９４】
種々のポリペプチドは、本明細書で提供される方法に従って生成することができ、本明細書に提供される組成物中に存在することができる。細菌ポリペプチドの例としてはアルカリホスファターゼ及びβ−ラクタマーゼが挙げられる。哺乳動物ポリペプチドの例としては、レニン；成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン；ウシ成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；α−１−アンチトリプシン；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；凝固因子、例えばＶＩＩＩＣ因子、ＩＸ因子、組織因子及びフォン・ウィルブランド因子；抗凝固因子、例えばプロテインＣ；心房性ナトリウム利尿因子；肺表面活性剤；プラスミノーゲン活性化因子、例えばウロキナーゼ又はヒト尿又はヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）；ボンベシン；トロンビン；造血成長因子；腫瘍壊死因子−α及び−β；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ（ランテス）(regulated on activation normally T-cell expressed and secreted)；ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−１−α）；血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミン；ミュラー阻害物質；リラキシンＡ鎖；リラキシンＢ鎖；プロリラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；微生物タンパク質、例えばβ−ラクタマーゼ；ＤＮａｓｅ；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）；ホルモン又は増殖因子のレセプター；インテグリン；プロテインＡ又はＤ；リウマチ因子；神経栄養因子、例えば骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経栄養因子−３、−４、−５又は−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５又はＮＴ−６）、又はＮＧＦ−β等の神経成長因子；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）；線維芽細胞成長因子、例えばａＦＧＦ又はｂＦＧＦ；上皮成長因子（ＥＧＦ）；形質転換成長因子（ＴＧＦ）、例えばＴＧＦ−α及びＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４又はＴＧＦ−β５等のＴＧＦ−β；インスリン様成長因子−Ｉ及び−ＩＩ（ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ）；ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）；インスリン様成長因子結合タンパク質；ＣＤタンパク質、例えばＣＤ−３、ＣＤ−４、ＣＤ−８及びＣＤ−１９；エリスロポエチン；骨誘導因子；免疫毒素；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン、例えばインターフェロン−α、−β及び−γ；コロニー刺激因子（ＣＳＦｓ）、例えばＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ及びＧ−ＣＳＦ；インターロイキン（ＩＬｓ）、例えばＩＬ−１からＩＬ−１０；スーパーオキシド・ジスムターゼ；Ｔ−細胞レセプター；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；ウィルス抗原、例えばＡＩＤＳエンベロープの一部；輸送タンパク質；ホーミングレセプター；アドレシン；調節タンパク質；抗体；及び上に列挙したいずれかのポリペプチドの断片等の分子が挙げられる。
【００９５】
抗体は、本発明により産生される哺乳動物ポリペプチドの例であり、提供される組成物中に存在し得る。抗体は、特定の抗原に結合特異性を表す好ましいクラスのポリペプチドである。天然の抗体は通常、２つの同一の軽（Ｌ）鎖と２つの同一の重（Ｈ）鎖からなる約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は１の共有ジスルフィド結合により重鎖と連鎖するが、ジスルフィド連鎖数は種々の免疫グロブリンアイソタイプ間で異なる。各重鎖及び軽鎖はまた等間隔の内鎖ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は一端に、複数の定常ドメインを伴った可変ドメイン（ＶＨ）を有する。各軽鎖は一端に可変ドメイン（ＶＬ）と他端に定常ドメインを有し；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一の定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列する。特定のアミノ酸残基が、軽鎖と重鎖の可変ドメインの界面を形成すると考えられている。
【００９６】
抗体は、すべて免疫グロブリンフォールドに基づく様々な構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子である。例えば、ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合し機能的抗体を形成する二つの「重」鎖及び二つの「軽」鎖を有する。各重鎖及び軽鎖自体は、「定常」（Ｃ）及び「可変」（Ｖ）領域を含む。Ｖ領域は、抗体の抗原結合特異性を決定するＣ領域は、免疫エフェクターとの非抗原特異的相互作用において構造的な支持体及び機能を提供している。抗体又は抗体の抗原結合断片の抗原結合特異性は、特定の抗原に特異的に結合する抗体の能力である。
【００９７】
抗体の抗原結合特異性は、Ｖ領域の構造的特徴によって決定される。可変性は可変ドメインの１１０アミノ酸のスパンにわたって均一に分布しているのではない。その代わりに、Ｖ領域は、それぞれ９−１２アミノ酸長である「高頻度可変領域」と呼ばれる極度の可変性のより短い領域により分離した１５−３０のアミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる相対的に不変の伸長部からなる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、βシート構造を結合し、ある場合にはその一部を形成するループを形成する、３つの高頻度可変領域により連結されたβシート配置を主にとる４つのＦＲをそれぞれ含んでいる。各鎖の高頻度可変領域はＦＲによって極く近傍に一緒に保持され、他の鎖からの高頻度可変領域とともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Kabat等、Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)を参照）。定常ドメインは抗体の抗原への結合に直接は関係しないが、例えば抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）における抗体の関与のような様々なエフェクター機能を示す。
【００９８】
各Ｖ領域は、典型的には、３つの相補性決定領域（「ＣＤＲ」、その各々は「超可変ループ」を含む）、及び４つのフレームワーク領域を含む。抗体結合部位は、特定の所望の抗原に対する実質的な親和性で結合するために必要な最小限の構造単位であり、従って一般に３つのＣＤＲ、及びＣＤＲを保持し適切なコンフォメーションで提示するために、その間に散在する少なくとも３つ、好ましくは４つのフレームワーク領域を含む。古典的な四鎖抗体は、協働してＶＨドメイン及びＶＬドメインによって定義される抗原結合部位を有する。ラクダ及びサメ抗体などの特定の抗体は、軽鎖を欠き、重鎖のみによって形成された結合部位に依存している。単一ドメイン操作免疫グロブリンは、ＶＨとＶＬとの間の協働の欠如下、結合部位が重鎖又は軽鎖の単独によって形成されるように調製することができる。
【００９９】
「可変」という用語は、可変ドメインのある部位が、抗体の中で配列が広範囲に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性及び特異性に使用されているという事実を意味する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様には分布していない。軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方の高頻度可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中される。可変ドメインのより高度に保持された部分はフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、βシート構造を結合し、ある場合にはその一部を形成するループを形成する、３つの高頻度可変領域により連結されたβシート配置を主にとる４つのＦＲをそれぞれ含んでいる。各鎖の高頻度可変領域はＦＲによって極く近傍に一緒に保持され、他の鎖からの高頻度可変領域とともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Kabat等、Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)を参照）。定常ドメインは抗体の抗原への結合に直接は関係しないが、例えば抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）における抗体の関与のような様々なエフェクター機能を示す。
【０１００】
本明細書で使用する用語「超可変領域」は、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を言う。超可変領域は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基（例えば、ＶＬの残基２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）及び８９−９７（Ｌ３）、及びＶＨの残基３１−３５Ｂ（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）及び９５−１０２（Ｈ３）；Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)）及び／又は「超可変ループ」からのアミノ酸残基（例えば、ＶＬの残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）及び９１−９６（Ｌ３）及びＶＨの残基２６−３２（Ｈ１）、５２Ａ−５５（Ｈ２）及び９６−１０１（Ｈ３）；Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）を含み得る。
【０１０１】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基は、本明細書で定義される超可変領域の残基以外の可変ドメイン残基である。
【０１０２】
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれ、各々が単一の抗原結合部位を持つ２つの同一な抗原結合断片、及び残りの「Ｆｃ」断片（名称は容易に結晶化する能力を反映している）を生成した。ペプシン処置は、２つの抗原結合部位を有し、なお抗原を架橋することが可能なＦ（ａｂ’）２断片を産生する。
【０１０３】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む最小抗体断片である。この領域は一の重鎖と一の軽鎖の可変領域ドメインが、堅固な非共有結合をなした二量体からなる。各可変ドメインの３つの超可変領域が、ＶＨ−ＶＬダイマーの表面上で抗原結合部位を定めるために相互作用するのはこの立体配置においてである。まとめて、６つの超可変領域は抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン（又は抗原に対して特異的な３つの超可変領域のみを含むＦｖの半分）でさえ、全結合部位よりも親和性が低くなるが、抗原を認識して結合する能力を有している。
【０１０４】
「Ｆａｂ」断片は、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第一定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの一以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端で２〜３の付加残基を有する点がＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書において、Ｆａｂ’の一般名称であり、定常ドメインのシステイン残基が少なくとも一の遊離チオール基を持つ。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は元々はＦａｂ’断片の対として生成され、その間にヒンジシステインを有する。抗体断片の他の化学結合も知られている。
【０１０５】
任意の脊椎動物種からの抗体（イムノグロブリン）の「軽鎖」には、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つの明確に区別される型の一つが割り当てられる。
【０１０６】
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、抗体は、種々のクラスに割り当てることができる。インタクトな抗体の５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、これらの幾つかは、更にサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、及びＩｇＡ２に分けることができる。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元構成はよく知られている。
【０１０７】
「単鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖に存在する。幾つかの実施態様において、ｓｃＦｖポリペプチドはＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーを更に含み、それはｓＦＶが抗原結合に望まれる構造を形成することを可能にする。ｓｃＦｖの総説については、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies、第１１３巻、Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, 269-315頁 (1994)を参照。
【０１０８】
用語「ダイアボディ」は、２つの抗原結合部位を持つ小さな抗体断片を指し、その断片は、同一ポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同一鎖の２つのドメイン間に対合を可能にするには短すぎるリンカーを用いることにより、そのドメインは別の鎖の相補的ドメインと強制的に対合し、２つの抗原結合部位を作り出す。ダイアボディは、例えば、欧州特許第４０４０９７号；国際公開第９３／１１１６１号；及びHollinger等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)により十分に記載されている。
【０１０９】
本明細書の目的のために、「インタクトな抗体」は、重鎖及び軽鎖可変ドメイン並びにＦｃ領域を含むものである。定常ドメインは、天然配列定常ドメイン（例えば、ヒト天然配列定常ドメイン）又はそのアミノ酸配列変異体であり得る。好ましくは、インタクトな抗体は、一又は複数のエフェクター機能を有する。
【０１１０】
「天然の抗体」は通常、２つの同一の軽（Ｌ）鎖と２つの同一の重（Ｈ）鎖からなる約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は一つのジスルフィド共有結合により重鎖に結合しており、ジスルフィド結合の数は、異なった免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で変化する。各重鎖及び軽鎖はまた等間隔の内鎖ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は一端に、複数の定常ドメインを伴った可変ドメイン（ＶＨ）を有する。各軽鎖は一端に可変ドメイン（ＶＬ）と他端に定常ドメインを有し；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一の定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列する。特定のアミノ酸残基は軽鎖と重鎖の可変ドメインの界面を形成すると考えられている。
【０１１１】
「ネイキッド抗体」は、細胞傷害性部分、ポリマー、又は放射性標識などの異種分子にコンジュゲートされていない抗体（本明細書で定義される）である。
【０１１２】
抗体は注目する「抗原」に対して指向される。好ましくは、この抗原は生物学的に重要なポリペプチドであって、疾患または障害に罹っている個体への抗体の投与の結果、その哺乳動物において治療的便益がもたらされ得る。しかしながら、（腫瘍関連糖脂質抗原のような（米国特許第５，０９１，１７８号参照））非ポリペプチド抗原に対する抗体もまた使用することができる。
【０１１３】
抗原がポリペプチドである場合、それは膜貫通分子（例えば、受容体）または増殖因子のようなリガンドであってよい。例示的な抗原は、レニン；成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン；ウシ成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；α−１−アンチトリプシン；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；凝固因子、例えばＶＩＩＩＣ因子、ＩＸ因子、組織因子（ＴＦ）及びフォン・ウィルブランド因子；抗凝固因子、例えばプロテインＣ；心房性ナトリウム利尿因子；肺表面活性剤；プラスミノーゲン活性化因子、例えばウロキナーゼ又はヒト尿又はヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）；ボンベシン；トロンビン；造血成長因子；腫瘍壊死因子−α及び−β；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ（ランテス）(regulated on activation normally T-cell expressed and secreted)；ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−１−α）；血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミン；ミュラー阻害物質；リラキシンＡ鎖；リラキシンＢ鎖；プロリラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；微生物タンパク質、例えばβ−ラクタマーゼ；ＤＮａｓｅ；ＩｇＥ；ＣＴＬＡ−４などの細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ）；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）；ホルモン又は増殖因子のレセプター；プロテインＡ又はＤ；リウマチ因子；神経栄養因子、例えば骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経栄養因子−３、−４、−５又は−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５又はＮＴ−６）、又はＮＧＦ−β等の神経成長因子；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）；線維芽細胞成長因子、例えばａＦＧＦ又はｂＦＧＦ；上皮成長因子（ＥＧＦ）；形質転換成長因子（ＴＧＦ）、例えばＴＧＦ−α及びＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４又はＴＧＦ−β５等のＴＧＦ−β；インスリン様成長因子−Ｉ及び−ＩＩ（ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ）；ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）；インスリン様成長因子結合タンパク質；ＣＤタンパク質、例えばＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０及びＣＤ４０；エリスロポエチン；骨誘導因子；免疫毒素；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン、例えばインターフェロン−α、−β及び−γ；コロニー刺激因子（ＣＳＦｓ）、例えばＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ及びＧ−ＣＳＦ；インターロイキン（ＩＬｓ）、例えばＩＬ−１からＩＬ−１０；スーパーオキシド・ジスムターゼ；Ｔ−細胞レセプター；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；ウィルス抗原、例えばＡＩＤＳエンベロープの一部；輸送タンパク質；ホーミングレセプター；アドレシン；調節タンパク質；ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ−４およびＶＣＡＭなどのインテグリン；ＨＥＲ２、ＨＥＲ３又はＨＥＲ４受容体のような腫瘍関連抗原；及び上に列挙したいずれかのポリペプチドの断片等の分子が挙げられる。
【０１１４】
本明細書に詳述される抗体に対する好適な分子標的としては、ＣＤタンパク質、例えばＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３４及びＣＤ４０；ＥｒｂＢレセプターファミリーのメンバー、例えばＥＧＦレセプター、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３又はＨＥＲ４レセプター；細胞接着分子、例えばＬＦＡ−１、Ｍａｃ１、ｐ１５０．９５、ＶＬＡ−４、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ、α４／β７インテグリン、及びそのα又はβサブユニットのいずれかを含むαｖ／β３インテグリン（例えば抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１８又は抗ＣＤ１１ｂ抗体）；成長因子、例えばＶＥＧＦ；組織因子（ＴＦ）；αインターフェロン（α−ＩＦＮ）；インターロイキン、例えばＩＬ−８；ＩｇＥ；血液型抗原；ｆｌｋ２／ｆｌｔ３レセプター；肥満（ＯＢ）レセプター；ｍｐｌレセプター；ＣＴＬＡ−４；プロテインＣ等々が挙げられる。
【０１１５】
本明細書の方法により生成することができる抗体（その断片を含む、その抗原結合断片を同様に含む）は、限定されないが、抗ＨＥＲ２、抗体２Ｃ４、抗ＶＥＧＦ、抗体Ｃ２Ｂ８、抗ＣＤ１１ａ、抗組織因子、ＩｇＧ４ｂ、抗ＣＤ４０、抗ＣＤ２０、抗ＩｇＥ、Ｅ２５、Ｅ２６、抗ＰＣＳＫ９及び抗ベータ７を含む。
【０１１６】
細胞増殖及びポリペプチド生成
一般に、細胞は、細胞増殖、維持及び／又はポリペプチド生成のいずれかを促進する一以上の条件の下で、本明細書に記載の細胞培養培地の何れかと結合される（接触される）。細胞を増殖し（即ち、細胞を培養し）、及びポリペプチドを産生する方法は、細胞および細胞培養培地を収容する培養容器（バイオリアクター）を使用する。培養容器は、ガラス、プラスチックまたは金属などの細胞を培養するのに適している任意の材料から構成することができる。典型的には、培養容器は、少なくとも１リットルであり、１０、１００、２５０、５００、１０００、２５００、５０００、８０００、１００００リットル又はそれ以上であって良い。培養プロセスの間に調整することができる培養条件は、限定されないが、ｐＨ及び温度を含む。
【０１１７】
細胞培養は、一般的に、初期増殖期に、細胞培養物の生存、成長及び生存（維持）を助長する条件の下で維持される。正確な条件は、細胞型、細胞が由来する生物、発現されたポリペプチドの性質と特性に依存して変わり得る。
【０１１８】
初期増殖期における細胞培養の温度は、主に細胞培養物が生存し続けるする温度の範囲に基づいて選択される。例えば、初期増殖期の間、ＣＨＯ細胞は３７℃で良好に増殖する。一般に、大半の哺乳動物細胞は約２５℃から４２℃の範囲で良好に増殖する。好ましくは、哺乳動物細胞は約３５℃から４０℃の範囲で良好に増殖する。当業者は、細胞の要求及び要求生産量に応じて、適切な温度又は細胞を増殖させる温度を選択することができるであろう。
【０１１９】
本発明の一実施態様において、初期増殖期の温度は、単一の一定温度で維持される。別の実施態様において、初期増殖期の温度は、ある温度範囲内で維持される。例えば、温度は、初期増殖期の間に絶え間なく上昇又は低下させることができる。あるいは、温度は、初期増殖期の間、様々な時点で離散量だけ上昇又は低下させることができる。当業者は、単一または複数の温度が使用されるべきかどうか、及び温度は絶え間なく又は離散量によって調整されるべきであるかを決定することができるであろう。
【０１２０】
細胞は、より長い又はより短い初期増殖期間で増殖させることができる。一バリエーションにおいて、細胞は、妨げられずに増殖させた場合、細胞が最終的に到達するであろう最大生存細胞密度の定められた割合である生存細胞密度を達成するのに十分な一定期間増殖させる。例えば、細胞は、最大生存細胞密度の１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５又は９９パーセントの所望の生存細胞密度を達成するために十分な時間増殖させても良い。
【０１２１】
別の実施態様において、細胞は、所定の期間増殖させる。例えば、細胞培養の開始濃度、細胞を増殖する温度、及び細胞の固有の増殖速度に依存して、細胞は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０日又はそれ以上以上増殖させてもよい。幾つかの場合において、細胞は、１ヶ月以上増殖させることができる。
【０１２２】
細胞培養物は、細胞への酸素供給及び栄養素の分散を向上させるために初期培養段階の間に攪拌または振とうすることができる。本発明によれば、当業者は、初期増殖期の間、限定されないが、ｐＨ、温度、酸素、等を含むバイオリアクターの特定の内部条件を制御または調節することは有益であり得ることを理解するであろう。例えば、ｐＨは、酸又は塩基の適切な量を供給することによって制御することができ、酸素添加は、当該分野で周知である散布装置により制御することができる。
【０１２３】
最初の培養工程は、増殖期であり、バッチ細胞培養条件は、シードトレイン(seed train)を生成するために、組換え細胞の増殖を増強するように改変される。増殖期は、一般的に、細胞が一般的に急速に分裂、例えば増殖している指数関数的増殖の期間を指す。この期の間、細胞は、一定期間、通常１〜４日間、例えば１、２、３、又は４日間、細胞増殖が最適である条件下で、培養される。宿主細胞の増殖サイクルの決定は、当業者に公知の方法によって、特定の宿主細胞について決定することができる。
【０１２４】
増殖期において、基礎培養培地及び細胞は、バッチ内の培養容器に供給することができる。一態様では、培地は、約５％未満又は１％未満又は０．１％未満の血清及び他の動物由来タンパク質を含む。しかし、所望される場合、血清及び動物由来のタンパク質を使用することができる。特定のバリエーションにおいて、基礎培地はＣＤＭである。１回又は２回のアミノ酸、ビタミン、微量元素及び他の培地成分は、その文書がその全体において本明細書中で参考として援用される欧州特許ＥＰ３０７２４７又は米国特許第６１８０４０１号で指定された範囲を使用することができる。
【０１２５】
別の方法として、ハムＦ１０（シグマ）、最小必須培地（［ＭＥＭ］、シグマ）、ＲＰＭＩ−１６４０（シグマ）及びダルベッコ改変イーグル培地（［ＤＭＥＭ］、Ｓｉｇｍａ）などの市販されている培地は動物細胞の培養に適しており、本明細書に詳述されるように化学的に定義された培地成分を（例えば、提供されるキットを使用することによって）、補充してもよい。更に、その全ての開示が参照により本明細書にその全体が組み込まれるHam and Wallace, Meth. Enz., 58:44 (1979), Barnes and Sato, Anal. Biochem., 102:255 (1980)、米国特許第４，７６７，７０４号；同第４，６５７，８６６号；同第４，９２７，７６２号；又は同第４，５６０，６５５号；国際公開第９０／０３４３０号；国際公開第８７／００１９５号；米国再発行特許第３０，９８５号（U.S. Pat. No. Re. 30,985；又は米国特許第５，１２２，４６９号に記載される培地の何れもが、宿主細胞のための培養培地として使用することができ、その各々は本明細書で詳述されるように化学的に定義された培地成分を（例えば、提供されるキットの使用により）補充してもよい。一態様において、培地が動物ベースの生成物を含む場合、培地にＣＤＭを補充してもよい。
【０１２６】
本明細書に提供される任意の培地は、ホルモン及び／又は他の増殖因子（例えばインスリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子など）、イオン（例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びリン酸塩）、緩衝液（例えばＨＥＰＥＳ）、ヌクレオシド（例えばアデノシン及びチミジン）、微量元素（通常マイクロモル範囲の最終濃度で存在すると定義される無機化合物）、及びグルコース又は同等のエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な栄養補助剤もまた、当業者に知られている適当な濃度で含まれていてもよい。
【０１２７】
それらの増殖の特定の時点で、細胞は、生成期における培養の開始時点に培養培地に接種する種菌を形成してもよい。あるいは、生成期は、増殖期と連続していてもよい。細胞増殖期の後は、一般に、ポリペプチド生成期が続く。
【０１２８】
ポリペプチド生成期の間、細胞培養物は、（増殖期と比較して）細胞培養物の生存および生存率を助長し所望のポリペプチドの発現に適切な培養条件の第二の組の下で維持されてもよい。例えば、続く生成期の間、ＣＨＯ細胞は、２５℃から３５℃の範囲内で組換えポリペプチド及びタンパク質を良好に発現する。細胞密度又は生存率を増加させるためもしくは組換えポリペプチド又はタンパク質の発現を増加させるために複数の別々の温度シフトを使用することができる。一態様において、本明細書において提供される培地は、ポリペプチド生成を増加させる方法で使用される場合、ポリペプチドが別の培地中に生成される場合に得られる汚染物質と比較して、汚染物質の存在を減少させる。一バリエーションにおいて、汚染物質は、電荷変異体又は活性酸素種である。一態様において、本明細書において提供される培地は、ポリペプチド生成を増加させる方法で使用される場合、ポリペプチド生成物が別の培地中に生成される場合に得られる色強度と比較して、ポリペプチド生成物の色強度を減少させる。一バリエーションにおいて、ポリペプチド生成を増加させる方法は、ポリペプチド生成期の間の温度シフト工程を含む。更なるバリエーションにおいては、温度シフト工程は、３１℃から３７℃、３２℃から３７℃、３３℃から３７℃、３４℃から３７℃、３５℃から３７℃、３６℃から３７℃、３１℃から３２℃、３１℃から３３℃、３１℃から３４℃、３１℃から３５℃又は３１℃から３６℃の温度のシフトを含む。
【０１２９】
細胞は、所望の細胞密度又は生成力価に達するまで、次の生成期で維持することができる。一実施態様において、細胞は、組換えポリペプチドの力価が最大に達するまで、次の生成期で維持される。別の実施態様において、培養物は、この時点の前に回収することができる。例えば、細胞は、最大生存細胞密度の１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５又は９９パーセントの生存細胞密度を達成するために十分な時間維持させても良い。幾つかの場合、生存細胞密度が最大に達するようにし、次いで培養物を回収する前に、生存細胞密度をあるレベルに低下させることは望ましいかもしれない。
【０１３０】
特定の場合には、その後の生成期の間、細胞によって枯渇又は代謝された栄養素又は他の培地成分を細胞培養に補充することは有益又は必要であり得る。例えば、細胞培養の監視中に枯渇したと観察される栄養物又は他の培地成分を細胞培養物を補足することは有利であるかもしれない。別法として又は追加的に、続く生成期に先立ち、細胞培養物を補充することは有益又は必要であり得る。非限定的な例として、ホルモン及び／又は他の増殖因子、特定のイオン（例えば、ナトリウム、塩化物、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩）、緩衝液、ビタミン、ヌクレオシド又はヌクレオチド、微量元素（非常に低い最終濃度で通常存在する無機化合物）、アミノ酸、脂質、又はグルコース又は他のエネルギー源を細胞培養物に補充することは有益であるか又は必要な場合がある。
【０１３１】
ポリペプチド精製
対象とするポリペプチドは好ましくは分泌ポリペプチドとして培地から回収されるが、分泌シグナルなしで直接発現された場合、宿主細胞溶解液から回収されてもよい。一態様において、生成されるポリペプチドは、モノクローナル抗体などの抗体である。
【０１３２】
培養培地又は溶解液は粒子状細胞片を除去するために遠心分離される。ポリペプチドはその後、適切な精製手順の典型である以下の手順：イムノアフィニティー又はイオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ、又はカチオン交換樹脂例えばＤＥＡＥでのクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスＧ−７５を用いたゲル濾過；及びＩｇＧ等の汚染物質を除去するためのプロテインＡセファロースカラムを用いて汚染可溶性タンパク質及びポリペプチドから精製される。また、フェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）のようなプロテアーゼインヒビターも、精製中のタンパク分解を阻害するのに有用である。当業者であれば、対象とするポリペプチドに適した精製方法が、組換え細胞培養において発現される際のポリペプチドの特性変化を考慮した修正を必要とする場合があることがわかるであろう。抗体は通常、クロマトグラフィー技術（例えば、プロテインＡ、低ｐＨ溶出段階を伴うアフィニティークロマトグラフィー、及びプロセス不純物を除去するためのイオン交換クロマトグラフィー）を用いて生成可能である。精製されたタンパク質は、濃縮されたタンパク質製剤、例えば、少なくとも１００ｍｇ／ｍＬ又は１２５ｍｇ／ｍＬ又は１５０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度あるいは約１００ｍｇ／ｍＬ又は１２５ｍｇ／ｍＬ又は１５０ｍｇ／ｍＬの濃度を持つものを与えるために濃縮され得る。精製されたタンパク質は、濃縮されたタンパク質製剤、例えば、少なくとも１ｍｇ／ｍＬ又は１０ｍｇ／ｍＬ又は２５ｍｇ／ｍＬ又は５０ｍｇ／ｍＬ又は７５ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度、又は少なくとも約１ｍｇ／ｍＬ又は約１０ｍｇ／ｍＬ又は約５０ｍｇ／ｍＬ又は約７５ｍｇ／ｍＬの何れか一から約１２５ｍｇ／ｍＬ又は約１５０ｍｇ／ｍＬの濃度を持つものを与えるために濃縮され得る。濃縮されたポリペプチド生成物は、濃度条件の下で許容されているレベルまで、例えば、ポリペプチドは溶液中でもはや可溶性でない濃度まで濃縮することができることが理解される。例えば、ポリペプチドの精製方法は、ポリペプチド生成細胞から細胞培養液を回収し、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを介してポリペプチドを精製し、陰イオン及び陽イオン交換クロマトグラフィーを介して更に精製する工程、ウイルスを除去するための濾過、及び、ポリペプチドの最終製剤及び濃度のための最終的な限外濾過及び透析濾過工程を含むことができる。製剤のためのポリペプチドを生成し、精製するための方法の非限定的な例は、Kelley, B. MAbs., 2009, 1(5):443-452に記載され、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１３３】
ポリペプチドの色の評価
本明細書に詳述した方法により生成され、提供される組成物中に存在するポリペプチドは、タンパク質精製プロセスの任意の工程で色を評価することができる。色を評価するための方法は、本明細書に詳述される培地中で増殖させた細胞から細胞培養液を回収し、ポリペプチドを含む組成物（例えば、溶液）を得るために細胞培養液からポリペプチドを精製し、ポリペプチドを含む溶液を色について評価することを含み得る。一バリエーションにおいて、ポリペプチドを含む組成物は、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによる精製後に色について評価される。更なるバリエーションにおいて、ポリペプチドを含む組成物は、イオン交換クロマトグラフィーによる精製後に色について評価される。別のバリエーションにおいて、ポリペプチドを含む組成物は、高速液体クロマトグラフィーによる精製後に色について評価される。更に別のバリエーションにおいて、ポリペプチドを含む組成物は、疎水性相互作用クロマトグラフィーによる精製後に色について評価される。更に別のバリエーションにおいて、ポリペプチドを含む組成物は、サイズ排除クロマトグラフィーによる精製後に色について評価される。一バリエーションにおいて、ポリペプチドを含む組成物は、精密濾過及び限外濾過を含む濾過による精製後に色について評価される。一バリエーションにおいて、ポリペプチドを含む組成物は、色の評価に先立ち濃縮される。（例えば、組成物は、少なくとも１００ｍｇ／ｍＬ、１２５ｍｇ／ｍＬ又は１５０ｍｇ／ｍＬの抗体などのポリペプチドを含んでいてもよい）。幾つかのバリエーションにおいて、色の評価に先立ち、濃縮された組成物は、少なくとも１ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、又は７５ｍｇ／ｍＬの（抗体などの）ポリペプチドを含む。ポリペプチドを含む組成物は、遠心分離、濾過装置、半透過性膜、透析、沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、又は疎水性相互作用クロマトグラフィーによって濃縮することができる。一バリエーションにおいて、ポリペプチドは、色についての評価に先立って、凍結乾燥により濃縮し、再懸濁することができる。ポリペプチドを含む組成物は、本明細書に詳述される技術の一又は複数を用いて、精製後に色について評価することができる。組成物が一回以上の凍結融解サイクルを受けた後の、ポリペプチドを含む組成物の色の評価が本明細書において意図される。ポリペプチドの精製又は濃縮の前における、ポリペプチドを含む細胞培養液の色の評価のための方法が更に本明細書において意図される。
【０１３４】
明細書に記載の培地を用いて本明細書で詳述される方法によって生成された（又は提供された組成物中に存在する）ポリペプチドは、一以上の視覚的色標準を使用することによって色を評価することができる。ポリペプチドを含む組成物の色を評価するための方法は、限定されないが、米国薬局方の色標準及び欧州薬局方の色標準などの国際又は国内の色標準の使用を含む。ＵＳＰ−２４モノグラフ６３１の色と収色性を参照。米国薬局方、２０００、頁１９２６−１９２７及び欧州評議会。ヨーロッパ薬局方、２００８、第７版 Ｐ．２２。これらは参照によりその全体が本明細書に援用される。例えば、色、乳白光及び着色（ＣＯＣ）アッセイがポリペプチドを含有する溶液の色を評価するために使用することができる。一バリエーションにおいて、１２ｍｍの外径の、無色、透明な中性ガラスの同一チューブが、ポリペプチドを含む組成物の２．０ｍＬをモノグラフにおいて処方される参照溶液又は溶媒又は水の２．０ｍＬと比較するために使用される。色は、拡散昼光下で比較され、色の判定、測定、又は評価のために白の背景に対して水平に観察される。別のバリエーションにおいて、平底の無色、透明な中性ガラスで、内径が１５ｍｍから２５ｍｍの同一チューブが、４０ｍｍの層の深さに、モノグラフにおいて処方される参照溶液又は溶媒又は水とともにポリペプチドを含む組成物を比較するために用いられる。色は、拡散昼光下で比較され、色の判定、測定、又は評価のために白の背景に対して垂直に観察される。一バリエーションにおいて、色の判定、測定又は評価は、人間の目視検査によって行うことができる。別のバリエーションにおいて、色の判定、測定又は評価は、自動化されたプロセスよって行うことができる。例えば、チューブは、色の判定、測定、又は評価するためのアルゴリズムで画像を処理するために、チューブを画像化する機械にロードすることができる。ＣＯＣアッセイのための参照標準は、限定されないが、茶色（Ｂ）、茶色がかった黄色（ＢＹ）、黄色（Ｙ）、緑がかった黄色（ＧＹ）、又は赤色（Ｒ）の任意の一とすることができる。茶色の参照標準と比較されるポリペプチドを含む組成物は、Ｂ１（最も暗い）、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７、Ｂ８、又はＢ９（最も明るい）の茶色の参照基準値を付与することができる。茶色がかった黄色の参照標準と比較されるポリペプチドを含む組成物は、ＢＹ１（最も暗い）、ＢＹ２、ＢＹ３、ＢＹ４、ＢＹ５、ＢＹ６、又はＢＹ７（最も明るい）の茶色がかった黄色の参照基準値を付与することができる。黄色の参照標準と比較されるポリペプチドを含む組成物は、Ｙ１（最も暗い）、Ｙ２、Ｙ３、Ｙ４、Ｙ５、Ｙ６、又はＹ７（最も明るい）の黄色の参照基準値を付与することができる。緑がかった黄色の参照標準と比較されるポリペプチドを含む組成物は、ＧＹ１（最も暗い）、ＧＹ２、ＧＹ３、ＧＹ４、ＧＹ５、ＧＹ６、又はＧＹ７（最も明るい）の緑がかった黄色の参照基準値を付与することができる。赤の参照標準と比較されるポリペプチドを含む組成物は、Ｒ１（最も暗い）、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、又はＲ７（最も明るい）の赤の参照基準値を付与することができる。一態様において、許容可能な色は、本��細書で提供されるスケールで最も暗いものを測定することを除いて（例えば、赤色参照基準値のＲ１を除いて）任意の色である。一バリエーションにおいて、本明細書において詳述される培地中で培養された細胞によって生成されるポリペプチドを含む組成物の色は、表２に記載したような参照基準値を有する。本明細書中に記載されるように、一態様において、本明細書の方法及び組成物において使用することができる培地は、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７、Ｂ８、Ｂ９、ＢＹ３、ＢＹ４、ＢＹ５、ＢＹ６、ＢＹ７、Ｙ３、Ｙ４、Ｙ５、Ｙ６、Ｙ７、ＧＹ３、ＧＹ４、ＧＹ５、ＧＹ６、ＧＹ７、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７からなる群から選択される参照標準色値を有するポリペプチド組成物（一バリエーションにおいて、少なくとも１００ｍｇ／ｍＬ又は１２５ｍｇ／ｍＬ又は１５０ｍｇ／ｍＬのポリペプチドを含む組成物である）をもたらすと理解される。一態様において、本明細書の方法及び組成物において使用することができる培地は、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７、Ｂ８、ＢＹ４、ＢＹ５、ＢＹ６、Ｙ４、Ｙ５、Ｙ６、ＧＹ４、ＧＹ５、ＧＹ６、ＧＹ７、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６の何れか一より大きい参照標準色値を有するポリペプチド組成物（一バリエーションにおいて、少なくとも１００ｍｇ／ｍＬ又は１２５ｍｇ／ｍＬ又は１５０ｍｇ／ｍＬのポリペプチドを含む組成物である）をもたらす。当業者に理解されるように、参照標準色の値の説明は、本明細書に詳述される培地、方法又は組成物の何れにも適用され、その記述を更に修正することができる。
【０１３５】
2018183154.tif 000010
2018183154.tif 000011
【０１３６】
別の実施例において、明細書に記載の培地を用いて本明細書で詳述される方法によって生成される（又は提供された組成物中に存在する）ポリペプチドは、定量的アッセイにより色について評価することができる。一バリエーションにおいて、定量的アッセイは、自動化されたプロセスを使用して行うことができる。一バリエーションにおいて、定量的アッセイは、本明細書中に記載される正規化された蛍光強度（ニフティ）アッセイ又は全色アッセイである。例えば、本明細書に記載される方法の何れかにより生成されるポリペプチドを含む溶液は、ポリペプチドを含む溶液を以下の工程を受けることによるニフティアッセイによって色強度について評価することができる：１）ポリペプチドの試験試料をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）に適用し、ここでＳＥＣのための移動相は、特定の温度に維持されたカラムにより特定のｐＨの緩衝液を含み；２）特定の波長（例えば、２８０ｎｍ）でのＵＶ吸収について、及び特定の励起波長（例えば、３５０ｎｍ）及び発光波長（例えば、４２５ｎｍ）による蛍光についてＳＥＣ溶出液をモニタリングし；３）ＵＶ吸光度クロマトグラム及び蛍光発光クロマトグラムにおいて、当技術分野で公知のソフトウェア（例えば、Agilent Chemstationソフトウェア）を用いてポリペプチド種のＳＥＣピークを積分し、及び主ピークの蛍光ピーク面積を主ピークのＵＶ吸光度のピーク面積によって割ることにより蛍光を正規化し；及び４）茶色（Ｂ）、茶色がかった黄色（ＢＹ）、黄色（Ｙ）、緑がかった黄色（ＧＹ）、又は赤色（Ｒ）などの本明細書に開示される参照標準の何れかに基づいて既知のＣＯＣ値を含むポリペプチド参照試料の蛍光に対するポリペプチド試験試料の正規化された蛍光の比率を計算し、ここで、より高い数値（例えば、より高いニフティ値）は、より高い色強度を示し、より低い数値（例えば、より低いニフティ値）はより低い色強度を示す。別の例において、本明細書に記載する方法の何れかによって生成されるポリペプチドを含有する溶液は、本明細書に記載される全色アッセイによって色強度について評価される。例えば、本明細書に記載される方法の何れかにより生成されるポリペプチドを含む溶液は、ポリペプチドを含む溶液を以下の工程を受けることによる全色アッセイによって色強度について評価することができる：１）分光光度計を用いて可視領域（３８０−７８０ｎｍ）で試料を測定することにより、ポリペプチド試験試料の吸収スペクトルを得る；２）「装置によって測定された色座標から色の許容差および色差を計算する標準的な技法」(Standard Practice for Calculation of Color Tolerances and Color Differences from Instrumentally Measured Color Coordinates), Annual Book of ASTM Standards, Vol. 06.01, (2011)に記載されているように、吸収スペクトルをＣＩＥのＬ＊ａ＊ｂ＊色スケールに変換する；３）測定は三次元のＣＩＥＬ＊ａ＊ｂ＊色空間内で試験試料と水の間のユークリッド距離に対応するデルタＥを示している、全色測定を得る；及び４）ポリペプチド試験試料の「全色」測定の、茶色（Ｂ）、茶色がかった黄色（ＢＹ）、黄色（Ｙ）、緑がかった黄色（ＧＹ）、又は赤色（Ｒ）などの本明細書に開示される参照標準の何れかに基づいて既知のＣＯＣ値を含むポリペプチド���照試料のそれに対する比率を計算することにより色強度値を決定し、ここで、より高い全色値は、より高い色強度を示し、より低い全色値はより低い色強度を示す。
【０１３７】
本明細書に詳述される色アッセイは、限定されないが、本明細書に提供されるポリペプチド組成物を含む任意の溶液（例えば、ポリペプチド含有溶液）の色を評価する際に用途を見出すことができる。
【０１３８】
ポリペプチド電荷変異体の評価
電荷変異体（例えば、酸性電荷変異体）の存在を減少させる方法が提供され、ここで、本明細書に詳述される濃度で成分を含有する培地は、ポリペプチドを生成する方法で使用される場合、ポリペプチドが異なる培地（例えば、本明細書に詳述される同一成分及び／又は成分濃度を含まないもの）で生成される場合に得られる電荷変異体（例えば、酸性電荷変異体）と比較して、電荷変異体（例えば、酸性電荷変異体）の存在を減少させる。当業者に理解されるように、参照電荷変異体の説明は、本明細書に詳述される培地、方法又は組成物の何れにも適用され、その記述を更に修正することができる。また、この節で提供される培地の任意のバリエーション又は実施態様は、全体を通して詳述される培地の記述にも同様に適用されることが理解される。本明細書中で使用されるように、用語「電荷変異体の存在を減少させる」とは、電荷変異体の全てタイプ（例えば、酸性電荷変異体、塩基性電荷変異体、及び中性電荷変異体）の量又は存在の減少、又は酸性電荷変異体などの特定の電荷変異体の量又は存在の減少を指すことができる。
【０１３９】
電荷変異体（例えば、酸性電荷変異体）の存在を減少させる方法が提供され、同様に電荷変異体（例えば、酸性電荷変異体）の減少したレベルを含む組成物が提供され、ここで本明細書に詳述される培地は、ポリペプチドを生成する方法で使用される場合、ポリペプチドが異なる培地で生成される場合に得られる電荷変異体と比較して、電荷変異体の存在を減少させる。一バリエーションにおいて、培地は、約３００ｍｇ／Ｌ（幾つかの実施態様では２００ｍｇ／Ｌ）から約１２００ｍｇ／Ｌのシスチン；約０．０５ｍｇ／Ｌから約１．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ２；約０．０５ｍｇ／Ｌから約１０．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ６；約０．０５ｍｇ／Ｌから約１２．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ９；及び約０．０５ｍｇ／Ｌから約２．５ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２を含む化学的に未定義な細胞培養培地である。一バリエーションにおいて、ビタミンＢ２は、約０．０５ｍｇ／Ｌから約０．５０ｍｇ／Ｌの濃度である。別のバリエーションにおいて、ビタミンＢ２は、約０．０５ｍｇ／Ｌから約０．４０ｍｇ／Ｌの濃度である。別のバリエーションにおいて、ビタミンＢ２は、約０．０５ｍｇ／Ｌから約０．３０ｍｇ／Ｌの濃度である。一バリエーションにおいて、ビタミンＢ６は、約０．０５ｍｇ／Ｌから約８．０ｍｇ／Ｌの濃度である。一バリエーションにおいて、ビタミンＢ６は、約０．０５ｍｇ／Ｌから約７．０ｍｇ／Ｌの濃度である。一バリエーションにおいて、ビタミンＢ６は、約０．０５ｍｇ／Ｌから約６．０ｍｇ／Ｌの濃度である。一のバリエーションにおいて、化学的に未定義な細胞培養培地は鉄源を更に含む。一バリエーションにおいて、鉄源は、クエン酸第二鉄または硫酸第一鉄である。一バリエーションにおいて、化学的に未定義な細胞培養培地は、約２μＭから約８０μＭの濃度でクエン酸第二鉄を含む。本明細書中のバリエーションの何れかにおいて、化学的に未定義な細胞培養培地はヒドロコルチゾンを更に含む。一バリエーションにおいて、ヒドロコルチゾンは、約０．０５μＭから約０．２５μＭの濃度である。
【０１４０】
電荷変異体（例えば、酸性電荷変異体）の存在を減少させる方法が提供され、同様に電荷変異体（例えば、酸性電荷変異体）の減少したレベルを含む組成物が提供され、ここで本明細書に詳述される培地は、ポリペプチドを生成する方法で使用される場合、ポリペプチドが異なる培地で生成される場合に得られる電荷変異体と比較して、電荷変異体の存在を減少させる。一バリエーションにおいて、培地は、約３００ｍｇ／Ｌ（幾つかの実施態様では２００ｍｇ／Ｌ）から約１２００ｍｇ／Ｌのシスチン；約２μＭから約８０μＭのクエン酸第二鉄、及び約０．０５μＭから約０．５μＭのヒドロコルチゾンを含む化学的に定義された細胞培養培地である。一バリエーションにおいて、化学的に定義された培地は、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＢ９及びビタミンＢ１２を更に含む。一バリエーションにおいて、ビタミンＢ２は、約０．０５ｍｇ／Ｌから約１．０ｍｇ／Ｌの濃度である。別のバリエーションにおいて、ビタミンＢ２は、約０．０５ｍｇ／Ｌから約０．５０ｍｇ／Ｌの濃度である。別のバリエーションにおいて、ビタミンＢ２は、約０．０５ｍｇ／Ｌから約０．４０ｍｇ／Ｌの濃度である。別のバリエーションにおいて、ビタミンＢ２は、約０．０５ｍｇ／Ｌから約０．３０ｍｇ／Ｌの濃度である。一バリエーションにおいて、ビタミンＢ６は、約０．０５ｍｇ／Ｌから約１０．０ｍｇ／Ｌの濃度である。一バリエーションにおいて、ビタミンＢ６は、約０．０５ｍｇ／Ｌから約８．０ｍｇ／Ｌの濃度である。一バリエーションにおいて、ビタミンＢ６は、約０．０５ｍｇ／Ｌから約７．０ｍｇ／Ｌの濃度である。一バリエーションにおいて、ビタミンＢ６は、約０．０５ｍｇ／Ｌから約６．０ｍｇ／Ｌの濃度である。本明細書における任意のバリエーションにおいて、ビタミンＢ６は、約０．０５ｍｇ／Ｌから約１０．０ｍｇ／Ｌ、約０．０５ｍｇ／Ｌから約８．０ｍｇ／Ｌ、約０．０５ｍｇ／Ｌから約７．０ｍｇ／Ｌ又は約０．０５ｍｇ／Ｌから約６．０ｍｇ／Ｌの濃度である。一バリエーションにおいて、ビタミンＢ９は、約０．０５ｍｇ／Ｌから約１２．０ｍｇ／Ｌの濃度である。本明細書における任意のバリエーションにおいて、ビタミンＢ９は、約０．０５ｍｇ／Ｌから約１２．０ｍｇ／Ｌの濃度である。更なるバリエーションにおいて、ビタミンＢ１２は、約０．０５ｍｇ／Ｌから約２．５ｍｇ／Ｌの濃度である。本明細書における任意のバリエーションにおいて、ビタミンＢ１２は、約０．０５ｍｇ／Ｌから約２．５ｍｇ／Ｌの濃度である。
【０１４１】
電荷変異体（例えば、酸性電荷変異体）の存在を減少させる方法が提供され、同様に電荷変異体（例えば、酸性電荷変異体）の減少したレベルを含む組成物が提供され、ここで本明細書に詳述される培地は、ポリペプチドを生成する方法で使用される場合、ポリペプチドが異なる培地で生成される場合に得られる電荷変異体と比較して、電荷変異体の存在を減少させる。一バリエーションにおいて、培地は、約３００ｍｇ／Ｌ（幾つかの実施態様では２００ｍｇ／Ｌ）から約１２００ｍｇ／Ｌのシスチン；約２μＭから約８０μＭのクエン酸第二鉄、及び約０．０５μＭから約０．５μＭのヒドロコルチゾンを含む化学的に未定義な培地である。一バリエーションにおいて、化学的に未定義な培地は、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＢ９及びビタミンＢ１２を更に含む。一バリエーションにおいて、ビタミンＢ２は、約０．０５ｍｇ／Ｌから約１．０ｍｇ／Ｌの濃度である。別のバリエーションにおいて、ビタミンＢ２は、約０．０５ｍｇ／Ｌから約０．５０ｍｇ／Ｌの濃度である。別のバリエーションにおいて、ビタミンＢ２は、約０．０５ｍｇ／Ｌから約０．４０ｍｇ／Ｌの濃度である。別のバリエーションにおいて、ビタミンＢ２は、約０．０５ｍｇ／Ｌから約０．３０ｍｇ／Ｌの濃度である。一バリエーションにおいて、ビタミンＢ６は、約０．０５ｍｇ／Ｌから約１０．０ｍｇ／Ｌの濃度である。一バリエーションにおいて、ビタミンＢ６は、約０．０５ｍｇ／Ｌから約８．０ｍｇ／Ｌの濃度である。一バリエーションにおいて、ビタミンＢ６は、約０．０５ｍｇ／Ｌから約７．０ｍｇ／Ｌの濃度である。一バリエーションにおいて、ビタミンＢ６は、約０．０５ｍｇ／Ｌから約６．０ｍｇ／Ｌの濃度である。本明細書における任意のバリエーションにおいて、ビタミンＢ６は、約０．０５ｍｇ／Ｌから約１０．０ｍｇ／Ｌ、約０．０５ｍｇ／Ｌから約８．０ｍｇ／Ｌ、約０．０５ｍｇ／Ｌから約７．０ｍｇ／Ｌ又は約０．０５ｍｇ／Ｌから約６．０ｍｇ／Ｌの濃度である。本明細書における任意のバリエーションにおいて、ビタミンＢ６は、約０．０５ｍｇ／Ｌから約１０．０ｍｇ／Ｌの濃度である。一バリエーションにおいて、ビタミンＢ９は、約０．０５ｍｇ／Ｌから約１２．０ｍｇ／Ｌの濃度である。本明細書における任意のバリエーションにおいて、ビタミンＢ９は、約０．０５ｍｇ／Ｌから約１２．０ｍｇ／Ｌの濃度である。更なるバリエーションにおいて、ビタミンＢ１２は、約０．０５ｍｇ／Ｌから約２．５ｍｇ／Ｌの濃度である。本明細書における任意のバリエーションにおいて、ビタミンＢ１２は、約０．０５ｍｇ／Ｌから約２．５ｍｇ／Ｌの濃度である。
【０１４２】
本明細書で詳述される方法によって生成されるポリペプチドを含む組成物を含む、ポリペプチドは、タンパク質精製プロセスの任意の工程で電荷変異体の存在について評価することができる。電荷変異体の存在を評価するための方法は、本明細書に詳述される培地中で増殖させた細胞から細胞培養液を回収し、ポリペプチドを含む組成物を得るために細胞培養液からポリペプチドを精製し、そして、異なる培地中で生成されるときのポリペプチドを含む組成物中の電荷変異体の存在と比較して、電荷変異体の減少の存在についてポリペプチドを含む組成物を評価することを含むことができる。一バリエーションにおいて、ポリペプチドを含む組成物は、酸性電荷変異体又は塩基性電荷変異体を含むことができる。別のバリエーションにおいて、ポリペプチドを含む組成物は、酸性電荷変異体を含む。電荷変異体は、限定されないが、脱アミド化、シアリル化、Ｃ末端リジンの切断、糖化、Ｃ末端リジンアミド化、Ｃ末端グリシンアミド化、スクシンアミド形成、アミノ酸酸化、シアル酸の除去又はそれらの組み合わせに起因して形成され得る。ポリペプチドの精製又は濃縮の前における、ポリペプチドを含む細胞培養液中の電荷変異体の存在の評価方法が更に本明細書において意図される。ポリペプチドを含有する溶液中の電荷変異体の検出のための方法は、限定されないが、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー技術の使用を含む。Khawli, L.A., mAbs., 2010, 2(6):613-624 を参照いただき、これはその全体が参照によって本明細書に援用される。
【０１４３】
本明細書において提供される組成物の一バリエーションにおいて、電荷変異体（一態様では、それは酸性の電荷変異体である）は、ポリペプチド生成物のわずか２５％又は２０％又は１８％又は１５％又は１０％を構成する。本明細書において提供される組成物及び方法の別のバリエーションにおいて、ポリペプチド生成物の少なくとも７５％又は８０％又は８５％又は９０％又は９５％又はそれ以上は、主要種タンパク質である。本明細書で使用される用語「主要種タンパク質」は、タンパク質のアミノ酸配列、二次構造、及び／又は三次構造、並びにグリコシル化などの任意の翻訳後修飾などにより同定される定量的に優勢なタンパク質を更に含むことができる。
【０１４４】
キット
化学的に定義された成分を有する細胞培養培地を補充するためのキットが記載される。キットは、再構成されるべき乾燥した成分を含有することができ、また使用のための（例えば、キットの構成成分を含む培地の補充に使用するための）説明書を含んでいてもよい。キットは、細胞培養培地を補充するのに適切な量で本明細書に提供される培地成分を含有してもよい。一バリエーションにおいて、キットは、表１の培地成分を含む。別のバリエーションにおいて、キットは、表１Ａの培地成分を含む。様々な例示的なキットの実施態様が、「典型的な実施態様」の節に記載されている。加えて、本発明はまた、細胞培養培地を補充するためのキットは、表１又は表１Ａに示す濃度で細胞培養培地中の一又は複数の培地成分を提供する量で、表１又は表１Ａの何れか一又は複数の培地成分を含むバリエーションを含む。一バリエーションにおいて、細胞培養培地を補充するためのキットは、細胞培養培地中で、約０．８ｍＭ（一態様では、０．７ｍＭ）から約２．５ｍＭのシスチンを提供する量のシスチン；細胞培養培地中で、約０．１１μＭから約０．７２μＭのビタミンＢ２を提供する量のビタミンＢ２；細胞培養培地中で、約４．５μＭから約３０．０μＭのビタミンＢ６を提供する量のビタミンＢ６；細胞培養培地中で、約３．４μＭから約２２．０μＭのビタミンＢ９を提供する量のビタミンＢ９；及び細胞培養培地中で、約０．２μＭから約１．５μＭのビタミンＢ１２を提供する量のビタミンＢ１２を含む。本明細書の任意のバリエーションにおいて、キットは、細胞培養培地中で、約２μＭから約８０μＭ（幾つかの態様で、約１１．０μＭから約３６．０μＭ）を提供する量で、クエン酸第二鉄及び硫酸第一鉄などの鉄源を更に含むことができる。
【０１４５】
別のバリエーションにおいて、細胞培養培地を補充するためのキットは、細胞培養培地中で、約０．８ｍＭ（幾つかの態様では、０．７ｍＭ）から約２．５ｍＭのシスチンを提供する量のシスチン；細胞培養培地中で、約２μＭから約８０μＭのクエン酸第二鉄を提供する量のクエン酸第二鉄；細胞培養培地中で、約０．０５μＭから約０．５μＭのヒドロコルチゾンを提供する量のヒドロコルチゾン；細胞培養培地中で、約０．１１μＭから約０．７２μＭのビタミンＢ２を提供する量のビタミンＢ２；細胞培養培地中で、約４．５μＭから約３０．０μＭのビタミンＢ６を提供する量のビタミンＢ６；細胞培養培地中で、約３．４μＭから約２２．０μＭのビタミンＢ９を提供する量のビタミンＢ９；及び細胞培養培地中で、約０．２μＭから約１．５μＭのビタミンＢ１２を提供する量のビタミンＢ１２を含む。
【０１４６】
本明細書の任意のバリエーションにおいて、キットは、細胞培養培地中で、約２．０μＭから約１４．０μＭのビタミンＢ１を提供する量のビタミンＢ１；細胞培養培地中で、約１１．０μＭから約７２．０μＭのビタミンＢ３を提供する量のビタミンＢ３；細胞培養培地中で、約６．８μＭから約４４．０μＭのビタミンＢ５を提供する量のビタミンＢ５；及び細胞培養培地中で、約０．０２μＭから約０．２４μＭのビタミンＢ７を提供する量のビタミンＢ７の何れか一又は複数を更に含み得る。
【０１４７】
本明細書の任意のバリエーションにおいて、キットは、細胞培養培地中で、約８０ｍｇ／Ｌから約１５００ｍｇ／Ｌ（一態様において、０．５ｍＭから約２．０ｍＭ）のシステインを提供する量のシステイン
【０１４８】
本明細書の任意のバリエーションにおいて、細胞培養培地はＣＤＭ又は化学的に未定義な細胞培養培地とすることができる。
【０１４９】
組成物
細胞培養培地及び一以上の他の成分、例えば細胞又は所望のポリペプチド（例えば、抗体）を含む組成物もまた提供される。一バリエーションにおいて、（ａ）ポリペプチドをコードする単離された核酸を含む細胞；及び（ｂ）本明細書で提供される細胞培養培地を含む組成物が提供される。別のバリエーションにおいて、（ａ）ポリペプチド；及び（ｂ）本明細書で提供される細胞培養培地を含む組成物が提供され、一態様において、ポリペプチドは、ポリペプチドをコードする単離された核酸を含む細胞によって培地中に分泌される。更に別のバリエーションにおいて、（ａ）ポリペプチド；及び（ｂ）本明細書で提供される細胞培養培地を含む組成物が提供され、一態様において、ポリペプチドは、ポリペプチドをコードする単離された核酸を含む細胞の溶解によって培地中に放出される。組成物の細胞は、本明細書に詳述される任意の細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）であって良く、組成物の培地は、表１又は表１Ａに詳述される培地成分を含む培地など（ＣＤＭとして良い）本明細書に詳述される任意の培地であって良い。同様に、組成物のポリペプチドは、本明細書に詳述される任意のポリペプチド、例えば抗体とすることができる。
【０１５０】
一バリエーションにおいて、組成物は、色を有していてもよい。一バリエーションにおいて、一以上の視覚的色標準の使用により色が決定され、測定され、又は評価される。視覚的色標準は、限定されないが、米国薬局方の色標準及び欧州薬局方の色標準などの国際又は国内の色標準とすることができる。ＵＳＰ−２４モノグラフ６３１の色と収色性を参照。米国薬局方、２０００、頁１９２６−１９２７及び欧州評議会。ヨーロッパ薬局方、２００８、第７版 Ｐ．２２。これらは参照によりその全体が本明細書に援用される。例えば、組成物の色は、色、乳白光及び着色（ＣＯＣ）アッセイの使用により、決定、測定又は評価することができるＣＯＣアッセイのための参照標準は、限定されないが、茶色（Ｂ）、茶色がかった黄色（ＢＹ）、黄色（Ｙ）、緑がかった黄色（ＧＹ）、又は赤色（Ｒ）の任意の一とすることができる。茶色の参照標準と比較されるポリペプチドを含む組成物は、Ｂ１（最も暗い）、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７、Ｂ８、又はＢ９（最も明るい）の茶色の参照基準値を付与することができる。茶色がかった黄色の参照標準と比較されるポリペプチドを含む組成物は、ＢＹ１（最も暗い）、ＢＹ２、ＢＹ３、ＢＹ４、ＢＹ５、ＢＹ６、又はＢＹ７（最も明るい）の茶色がかった黄色の参照基準値を付与することができる。黄色の参照標準と比較されるポリペプチドを含む組成物は、Ｙ１（最も暗い）、Ｙ２、Ｙ３、Ｙ４、Ｙ５、Ｙ６、又はＹ７（最も明るい）の黄色の参照基準値を付与することができる。緑がかった黄色の参照標準と比較されるポリペプチドを含む組成物は、ＧＹ１（最も暗い）、ＧＹ２、ＧＹ３、ＧＹ４、ＧＹ５、ＧＹ６、又はＧＹ７（最も明るい）の緑がかった黄色の参照基準値を付与することができる。赤の参照標準と比較されるポリペプチドを含む組成物は、Ｒ１（最も暗い）、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、又はＲ７（最も明るい）の赤の参照基準値を付与することができる。本明細書に詳述される組成物は、表２に記載するような又は全体に詳述するような参照基準値を持つことができる。特定のバリエーションにおいて、本明細書において提供される組成物は、少なくとも１００ｍｇ／Ｌ又は１２５ｍｇ／Ｌ又は１５０ｍｇ／Ｌの濃度あるいは約１００ｍｇ／Ｌ又は１２５ｍｇ／Ｌ又は１５０ｍｇ／Ｌ又は１７５ｍｇ／Ｌ又は２００ｍｇ／Ｌの濃度でポリペプチドを含む。別のバリエーションにおいて、本明細書において提供される組成物は、少なくとも１ｍｇ／Ｌ又は１０ｍｇ／Ｌ又は２５ｍｇ／Ｌ又は５０ｍｇ／Ｌ又は７５ｍｇ／Ｌの濃度あるいは約１ｍｇ／Ｌ又は１０ｍｇ／Ｌ又は２５ｍｇ／Ｌ又は５０ｍｇ／Ｌ又は７５ｍｇ／Ｌの濃度でポリペプチドを含む。別のバリエーションにおいて、本明細書において提供される組成物は、少なくとも約１ｍｇ／ｍＬ又は約１０ｍｇ／ｍＬ又は約５０ｍｇ／ｍＬ又は約７５ｍｇ／ｍＬの何れか一から約１２５ｍｇ／ｍＬまで又は約１５０ｍｇ／ｍＬまでの濃度で単離されたポリペプチドを含む。本明細書に提供される任意の組成物は、ポリペプチドの溶解限界までの濃度で、又は被験体に投与された場合、ポリペプチドの治療的有効量を提供する濃度でポリペプチドを含むことができる。本明細書で使用されるよ��に、ポリペプチド（例えば、抗体）の「治療的有効量」は、ポリペプチドが有効である治療について、障害の予防又は治療に有効な量を指す。更なるバリエーションにおいて、本明細書において提供される組成物は、Ｂ４−Ｂ９、ＢＹ４−ＢＹ７、Ｙ４−Ｙ７、ＧＹ４−ＧＹ７及びＲ４−Ｒ７の何れか一から選択される色標準値を有する。また提供されるのは、少なくとも１００ｍｇ／Ｌ又は１２５ｍｇ／Ｌ又は１５０ｍｇ／Ｌの濃度あるいは約１００ｍｇ／Ｌ又は１２５ｍｇ／Ｌ又は１５０ｍｇ／Ｌ又は１７５ｍｇ／Ｌ又は２００ｍｇ／Ｌの濃度でポリペプチドを含む組成物で、ここで組成物は、Ｂ４−Ｂ９、ＢＹ４−ＢＹ７、Ｙ４−Ｙ７、ＧＹ４−ＧＹ７及びＲ４−Ｒ７の何れか一から選択される色標準値を有する。また本明細書において提供されるのは、少なくとも１ｍｇ／Ｌ又は１０ｍｇ／Ｌ又は２５ｍｇ／Ｌ又は５０ｍｇ／Ｌ又は７５ｍｇ／Ｌの濃度あるいは少なくとも約１ｍｇ／ｍＬ又は約１０ｍｇ／ｍＬ又は約５０ｍｇ／ｍＬ又は約７５ｍｇ／ｍＬの何れか一から約１２５ｍｇ／ｍＬまで又は約１５０ｍｇ／ｍＬまでの濃度でポリペプチドを含む組成物であり、ここで組成物は、Ｂ４−Ｂ９、ＢＹ４−ＢＹ７、Ｙ４−Ｙ７、ＧＹ４−ＧＹ７及びＲ４−Ｒ７の何れか一から選択される色標準値を有する。
【０１５１】
別の例において、組成物の色は、ニフティアッセイ又は全色アッセイなど定量的アッセイの使用により、決定され、測定され、又は評価され得る。あるバリエーションにおいて、定量的アッセイにより得られたより高い数値は、より高い色強度を示し、より低い数値はより低い色強度を示す。
【０１５２】
本明細書に記載の方法の何れかにより生成されるポリペプチド（例えば、抗体）の組成物（例えば、薬学的組成物）は、所望の程度の純度を有するその抗体と任意の薬学的に許容される担体(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed.: Williams and Wilkins PA, USA (1980))とを、凍結乾燥製剤または水性溶液の形態で混合することによって調製される。薬学的に許容される担体は、使用される投薬量および濃度でレシピエントに毒性でなく、そしてこれには、限定しないが、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸のような緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチオルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルまたはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジン；マンノサッカライド、ジサッカライド、およびグルコース、マンノースまたはデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム、金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。本明細書における典型的な薬学的に許容される担体は、水溶性の中性アクティブヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）などの介在性薬物分散剤、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Baxter International, Inc.）などのヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質を更に含む。所定の典型的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用法は、ｒＨｕＰＨ２０を含み、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び第２００６／０１０４９６８に開示されている。一態様において、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼなどの１つまたは複数の追加のグルコサミノグリカンと組み合わされる。典型的な凍結乾燥ポリペプチド製剤は、米国特許第６２６７９５８号に記載されている。水性のポリペプチド製剤は、米国特許第６１７１５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されているものが含まれ、後者の製剤はヒスチジン−酢酸緩衝液を含む。インビボ投与に使用される製剤は、一般的に無菌である。無菌性は、例えば、滅菌濾過膜を通して濾過することにより、達成することができる。特定のバリエーションにおいて、本明細書において提供される薬学的製剤は、少なくとも１００ｍｇ／Ｌ又は１２５ｍｇ／Ｌ又は１５０ｍｇ／Ｌの濃度あるいは約１００ｍｇ／Ｌ又は１２５ｍｇ／Ｌ又は１５０ｍｇ／Ｌ又は１７５ｍｇ／Ｌ又は２００ｍｇ／Ｌの濃度でポリペプチドを含む。別のバリエーションにおいて、本明細書において提供される薬学的製剤は、少なくとも１ｍｇ／Ｌ又は��０ｍｇ／Ｌ又は２５ｍｇ／Ｌ又は５０ｍｇ／Ｌ又は７５ｍｇ／Ｌの濃度あるいは約１ｍｇ／Ｌ又は１０ｍｇ／Ｌ又は２５ｍｇ／Ｌ又は５０ｍｇ／Ｌ又は７５ｍｇ／Ｌの濃度でポリペプチドを含む。別のバリエーションにおいて、本明細書において提供される薬学的製剤は、少なくとも約１ｍｇ／ｍＬ又は約１０ｍｇ／ｍＬ又は約５０ｍｇ／ｍＬ又は約７５ｍｇ／ｍＬの何れか一から約１２５ｍｇ／ｍＬまで又は約１５０ｍｇ／ｍＬまでの濃度で単離されたポリペプチドを含む。あるバリエーションにおいて、本明細書において開示される方法により生成されるポリペプチドを含む薬学的製剤は、限定されないが、ＣＯＣアッセイ、全色アッセイ、又はニフティアッセイを用いた色アッセイを用いて色強度について評価される。幾つかの態様では、本明細書において提供される薬学的製剤は、少なくとも１００ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１２５ｍｇ／ｍＬ、又は少なくとも１５０ｍｇ／ｍＬより大きい濃度であり、ＣＯＣアッセイによって測定されるように、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７、Ｂ８、又はＢ９より大きい色強度値を有する。幾つかの態様において、本明細書において提供される薬学的製剤は、少なくとも１ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも２５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも５０ｍｇ／ｍＬ、又は少なくとも７５ｍｇ／ｍＬより大きい濃度であり、ＣＯＣアッセイによって測定されるように、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７、Ｂ８、又はＢ９より大きい色強度値を有する。幾つかの態様において、ＣＯＣアッセイにより決定される色強度値は、限定されないが、Ｂ、ＢＹ、Ｙ、ＧＹ、又はＲの任意の一とすることができ、ここでより高い値はより明るい色の強さを示している。幾つかの態様では、本明細書において提供される薬学的製剤は、少なくとも１００ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１２５ｍｇ／ｍＬ、又は少なくとも１５０ｍｇ／ｍＬより大きい濃度であり、そして色のアッセイ（例えば、全色アッセイ又はニフティアッセイ）によって測定されるように、参照溶液の色強度値未満の色強度値を有している。幾つかの態様では、本明細書において提供される薬学的製剤は、少なくとも１ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも２５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも５０ｍｇ／ｍＬ、又は少なくとも７５ｍｇ／ｍＬより大きい濃度であり、そして色のアッセイ（例えば、全色アッセイ又はニフティアッセイ）によって測定されるように、参照溶液の色強度値未満の色強度値を有している。
【０１５３】
本明細書に開示される全ての参考文献は、その全体が参照により本明細書に援用される。
【０１５４】
典型的な実施態様
１．
細胞培養培地は、
約２００ｍｇ／Ｌから約１２００ｍｇ／Ｌのシスチン；
約０．０５ｍｇ／Ｌから約１．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ２；
約０．０５ｍｇ／Ｌから約１０．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ６；
約０．０５ｍｇ／Ｌから約１２．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ９；及び
約０．０５ｍｇ／Ｌから約２．５ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２
を含む細胞培養培地と細胞を接触させる工程を含む、細胞を培養する方法。
２．
約０．７ｍＭから約２．５ｍＭのシスチン；
約０．１１μＭから約０．７２μＭのビタミンＢ２；
約４．５μＭから約３０．０μＭのビタミンＢ６；
約３．４μＭから約２２．０μＭのビタミンＢ９；及び
約０．２μＭから約１．５μＭのビタミンＢ１２
を含む細胞培養培地と細胞を接触させる工程を含む、実施態様１に記載の方法。
３．
細胞培養物は、ビタミンＢ１、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５及びビタミンＢ７の何れか一又は複数を更に含む、実施態様１又は２に記載の方法。
４．
細胞培養培地は、
約２．０μＭから約１４．０μＭのビタミンＢ１；
約１１．０μＭから約７２．０μＭのビタミンＢ３；
約６．８μＭから約４４．０μＭのビタミンＢ５；及び
約０．０２μＭから約０．１４μＭのビタミンＢ７
の何れか一又は複数を更に含む、実施態様３に記載の方法。
５．
細胞培養培地は、鉄源を更に含む、実施態様１から４の何れか一に記載の方法。
６．
鉄源がクエン酸第二鉄又は硫酸第一鉄である、実施態様５に記載の方法。
７．
細胞培養培地は、約２μＭから約８０μＭの濃度でクエン酸第二鉄を含む、実施態様１から６の何れか一に記載の方法。
８．
細胞培養培地は、約１１．０μＭから約３６．０μＭの濃度でクエン酸第二鉄を含む、実施態様１から７の何れか一に記載の方法。
９．
細胞培養培地は、ヒドロコルチゾンを更に含む、実施態様１から８の何れか一に記載の方法。
１０．
細胞培養培地中のヒドロコルチゾンの濃度は、約０．０５μＭから約０．２５μＭである、実施態様９に記載の方法。
１１．
細胞培養培地は、化学的に定義された細胞培養培地である、実施態様１から１０の何れか一に記載の方法。
１２．
細胞培養培地は、化学的に未定義な細胞培養培地である、実施態様１から１０の何れか一に記載の方法。
１３．
細胞は、細胞の増殖期の間に細胞培養培地と接触される、実施態様１から１２の何れか一に記載の方法。
１４．
細胞は、細胞生成期の間に細胞培養培地と接触される、実施態様１から１３の何れか一に記載の方法。
１５.
方法は、細胞培養培地にシステインを添加する工程を更に含む、実施態様１４に記載の方法。
１６．
細胞培養培地中に、システインが、約８０ｍｇ／Ｌから約１５００ｍｇ／Ｌのシステインを提供する量で添加される、実施態様１５に記載の方法。
１７．
細胞培養培地中に、システインが、約１５００ｍｇ／Ｌのシステインを提供する量で添加される、実施態様１５に記載の方法。
１８．
細胞培養培地中に、システインが、約１４０ｍｇ／Ｌのシステインを提供する量で添加される、実施態様１５に記載の方法。
１９．
ポリペプチドをコードする単離された核酸を含む細胞を細胞培養培地中で培養する工程を含む、ポリペプチドを生成する方法であって、
（ａ）細胞培養培地は、
約２００ｍｇ／Ｌから約１２００ｍｇ／Ｌのシスチン；
約０．０５ｍｇ／Ｌから約１．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ２；
約０．０５ｍｇ／Ｌから約１０．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ６；
約０．０５ｍｇ／Ｌから約１２．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ９；
約０．０５ｍｇ／Ｌから約２．５ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２；
を含み、及び
（ｂ）細胞はポリペプチドを発現する
方法。
２０.
細胞培養培地は、
約０．７ｍＭから約２．５ｍＭのシスチン；
約０．１１μＭから約０．７２μＭのビタミンＢ２；
約４．５μＭから約３０．０μＭのビタミンＢ６；
約３．４μＭから約２２．０μＭのビタミンＢ９；及び
約０．２μＭから約１．５μＭのビタミンＢ１２
を含む、実施態様１９に記載の方法。
２１．
細胞培養物は、ビタミンＢ１、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５及びビタミンＢ７の何れか一又は複数を更に含む、実施態様１９又は２０に記載の方法。
２２．
細胞培養培地は、
約２．０μＭから約１４．０μＭのビタミンＢ１；
約１１．０μＭから約７２．０μＭのビタミンＢ３；
約６．８μＭから約４４．０μＭのビタミンＢ５；及び
約０．０２μＭから約０．１４μＭのビタミンＢ７
の何れか一又は複数を更に含む、実施態様２１に記載の方法。
２３．
細胞培養培地は、鉄源を更に含む、実施態様１９から２２の何れか一に記載の方法。
２４．
鉄源がクエン酸第二鉄又は硫酸第一鉄である、実施態様２３に記載の方法。
２５．
細胞培養培地は、約２μＭから約８０μＭの濃度でクエン酸第二鉄を含む、実施態様１９から２４の何れか一に記載の方法。
２６．
細胞培養培地は、約１１．０μＭから約３６．０μＭの濃度でクエン酸第二鉄を含む、実施態様１９から２５の何れか一に記載の方法。
２７．
細胞培養培地は、ヒドロコルチゾンを更に含む、実施態様１９から２６の何れか一に記載の方法。
２８.
細胞培養培地中のヒドロコルチゾンの濃度は、約０．０５μＭから約０．２５μＭである、実施態様２７に記載の方法。
２９．
細胞培養培地は、化学的に定義された細胞培養培地である、実施態様１９から２８の何れか一に記載の方法。
３０．
細胞培養培地は、化学的に未定義な細胞培養培地である、実施態様１９から２８の何れか一に記載の方法。
３１．
培養は細胞の増殖期の間である、実施態様１９から３０の何れか一に記載の方法。
３２．
培養は細胞の生成期の間である、実施態様１９から３１の何れか一に記載の方法。
３３．
方法は、細胞培養培地にシステインを添加する工程を更に含む、実施態様３２に記載の方法。
３４．
細胞培養培地中に、システインが、約８０ｍｇ／Ｌから約１５００ｍｇ／Ｌのシステインを提供する量で添加される、実施態様３３に記載の方法。
３５．
細胞培養培地中に、システインが、約１５００ｍｇ／Ｌのシステインを提供する量で添加される、実施態様３３に記載の方法。
３６．
細胞培養培地中に、システインが、約１４０ｍｇ／Ｌのシステインを提供する量で添加される、実施態様３３に記載の方法。
３７．
ポリペプチドは抗体である、実施態様１９から３６の何れか一に記載の方法。
３８．
抗体はＩｇＧ１抗体である、実施態様３７に記載の方法。
３９．
抗体は、抗ＶＥＧＦ、抗メソテリン、抗ＰＣＳＫ９又は抗ベータ７抗体である、実施態様３７又は３８に記載の方法。
４０．
細胞培養培地からポリペプチドを単離する工程を更に含む、実施態様１９から３９の何れか一に記載の方法。
４１．
単離されたポリペプチドを含む組成物は、無色又は僅かに着色した液体として現れる、実施態様４０に記載の方法。
４２．
組成物は少なくとも１００ｍｇ／ｍＬの濃度で単離されたポリペプチドを含む、実施態様４１に記載の方法。
４３．
実施態様１９から４２の何れか一に記載の方法により生成されるポリペプチド。
４４．
実施態様４３に記載のポリペプチド及び薬学的に許容される担体を含む薬学的製剤。
４５．
化学的に定義された成分を有する細胞培養培地を補充するためのキットであって、該キットは、
細胞培養培地中に、約２００ｍｇ／Ｌから約１２００ｍｇ／Ｌのシスチンを提供する量のシスチン；
細胞培養培地中に、約０．０５ｍｇ／Ｌから約１．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ２を提供する量のビタミンＢ２；
細胞培養培地中に、約０．０５ｍｇ／Ｌから約１０．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ６を提供する量のビタミンＢ６；
細胞培養培地中に、約０．０５ｍｇ／Ｌから約１２．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ９を提供する量のビタミンＢ９；及び
細胞培養培地中に、約０．０５ｍｇ／Ｌから約２．５ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２を提供する量のビタミンＢ１２
を含むキット。
４６．
キットは、
細胞培養培地中に、約０．７ｍＭから約２．５ｍＭのシスチンを提供する量のシスチン；
細胞培養培地中に、約０．１１μＭから約０．７２μＭのビタミンＢ２を提供する量のビタミンＢ２；
細胞培養培地中に、約４．５μＭから約３０．０μＭのビタミンＢ６を提供する量のビタミンＢ６；
細胞培養培地中に、約３．４μＭから約２２μＭのビタミンＢ９を提供する量のビタミンＢ９；及び
細胞培養培地中に、約０．２μＭから約１．５μＭのビタミンＢ１２を提供する量のビタミンＢ１２
を含む、実施態様４５に記載のキット。
４７．
キットは、ビタミンＢ１、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５及びビタミンＢ７の何れか一又は複数を更に含む、実施態様４５又は４６に記載のキット。
４８．
キットは、
細胞培養培地中に、約２．０μＭから約１４．０μＭのビタミンＢ１を提供する量のビタミンＢ１；
細胞培養培地中に、約１１．０μＭから約７２．０μＭのビタミンＢ３を提供する量のビタミンＢ３；
細胞培養培地中に、約６．８μＭから約４４．０μＭのビタミンＢ５を提供する量のビタミンＢ５；及び
細胞培養培地中に、約０．０２μＭから約０．１４μＭのビタミンＢ７を提供する量のビタミンＢ７
の何れか一又は複数を更に含む、実施態様４７に記載のキット。
４９．
キットは、鉄源を更に含む、実施態様４５から４８の何れか一に記載のキット。
５０．
鉄源がクエン酸第二鉄又は硫酸第一鉄である、実施態様４９に記載のキット。
５１．
キットは、ヒドロコルチゾンを更に含む、実施態様４５から５０の何れか一に記載のキット。
５２．
約２００ｍｇ／Ｌから約１２００ｍｇ／Ｌのシスチン；
約０．０５ｍｇ／Ｌから約１．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ２；
約０．０５ｍｇ／Ｌから約１０．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ６；
約０．０５ｍｇ／Ｌから約１２．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ９；及び
約０．０５ｍｇ／Ｌから約２．５ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２
を含む細胞培養培地。
５３．
約０．７ｍＭから約２．５ｍＭのシスチン；
約０．１１μＭから約０．７２μＭのビタミンＢ２；
約４．５μＭから約３０．０μＭのビタミンＢ６；
約３．４μＭから約２２．０μＭのビタミンＢ９；及び
約０．２μＭから約１．５μＭのビタミンＢ１２
を含む、実施態様５２に記載の培地。
５４．
ビタミンＢ１、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５及びビタミンＢ７の何れか一又は複数を更に含む、実施態様５２又は５３に記載の培地。
５５．
約２．０μＭから約１４．０μＭのビタミンＢ１；
約１１．０μＭから約７２．０μＭのビタミンＢ３；
約６．８μＭから約４４．０μＭのビタミンＢ５；及び
約０．０２μＭから約０．１４μＭのビタミンＢ７
の何れか一又は複数を更に含む、実施態様５４に記載の培地。
５６．
細胞培養培地は、鉄源を更に含む、実施態様５２から５５の何れか一に記載の培地。
５７．
鉄源がクエン酸第二鉄又は硫酸第一鉄である、実施態様５６に記載の培地。
５８．
細胞培養培地は、約２μＭから約８０μＭの濃度でクエン酸第二鉄を含む、実施態様５７に記載の培地。
５９．
細胞培養培地は、約１１．０μＭから約３６．０μＭの濃度でクエン酸第二鉄を含む、実施態様５８に記載の培地。
６０．
細胞培養培地は、ヒドロコルチゾンを更に含む、実施態様５２から５９の何れか一に記載の培地。
６１．
細胞培養培地は、約０．０５μＭから約０．２５μＭの濃度でヒドロコルチゾンを含む、実施態様６０に記載の培地。
６２．
約２００ｍｇ／Ｌから約１２００ｍｇ／Ｌのシスチン；
約２μＭから約８０μＭのクエン酸第二鉄；及び
約０．０５μＭから約０．５μＭのヒドロコルチゾン
を含む細胞培養培地と細胞を接触させる工程を含む、細胞を培養する方法。
６３．
細胞培養培地は、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＢ９及び／又はビタミンＢ１２を更に含む、実施態様６２に記載の方法。
６４．
細胞培養培地は、約０．０５ｍｇ／Ｌから約１．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ２を含む、実施態様６２又は６３に記載の方法。
６５．
細胞培養培地は、約０．０５ｍｇ／Ｌから約１０．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ６を含む、実施態様６２から６４の何れか一に記載の方法。
６６．
細胞培養培地は、約０．０５ｍｇ／Ｌから約１２．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ９を含む、実施態様６２から６５の何れか一に記載の方法。
６７．
細胞培養培地は、約０．０５ｍｇ／Ｌから約２．５ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２を含む、実施態様６２から６６の何れか一に記載の方法。
６８．
細胞培養培地は、化学的に定義された細胞培養培地である、実施態様６２から６７の何れか一に記載の方法。
６９．
細胞培養培地は、化学的に未定義な細胞培養培地である、実施態様６２から６７の何れか一に記載の方法。
７０．
細胞は、細胞の増殖期の間に細胞培養培地と接触される、実施態様６２から６９の何れか一に記載の方法。
７１．
細胞は、細胞生成期の間に細胞培養培地と接触される、実施態様６２から７０の何れか一に記載の方法。
７２．
方法は、細胞培養培地にシステインを添加する工程を更に含む、実施態様７１に記載の方法。
７３．
細胞培養培地中に、システインが、約８０ｍｇ／Ｌから約１５００ｍｇ／Ｌのシステインを提供する量で添加される、実施態様７２に記載の方法。
７４．
細胞培養培地中に、システインが、約１５００ｍｇ／Ｌのシステインを提供する量で添加される、実施態様７２に記載の方法。
７５．
細胞培養培地中に、システインが、約１４０ｍｇ／Ｌのシステインを提供する量で添加される、実施態様７２に記載の方法。
７６．
ポリペプチドをコードする単離された核酸を含む細胞を細胞培養培地中で培養する工程を含む、ポリペプチドを生成する方法であって、
（ａ）細胞培養培地は
約２００ｍｇ／Ｌから約１２００ｍｇ／Ｌのシスチン；
約２μＭから約８０μＭのクエン酸第二鉄；及び
約０．０５μＭから約０．５μＭのヒドロコルチゾン；
を含み；及び
（ｂ）細胞はポリペプチドを発現する、
方法。
７７．
細胞培養培地は、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＢ９及び／又はビタミンＢ１２を更に含む、実施態様７６に記載の方法。
７８．
細胞培養培地は、約０．０５ｍｇ／Ｌから約１．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ２を含む、実施態様７６又は７７に記載の方法。
７９．
細胞培養培地は、約０．０５ｍｇ／Ｌから約１０．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ６を含む、実施態様７６から７８の何れか一に記載の方法。
８０．
細胞培養培地は、約０．０５ｍｇ／Ｌから約１２．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ９を含む、実施態様７６から７９の何れか一に記載の方法。
８１．
細胞培養培地は、約０．０５ｍｇ／Ｌから約２．５ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２を含む、実施態様７６から８０の何れか一に記載の方法。
８２．
細胞培養培地は、化学的に定義された細胞培養培地である、実施態様７６から８１の何れか一に記載の方法。
８３．
細胞培養培地は、化学的に未定義な細胞培養培地である、実施態様７６から８１の何れか一に記載の方法。
８４．
培養は細胞の増殖期の間である、実施態様７６から８３の何れか一に記載の方法。
８５．
培養は細胞の生成期の間である、実施態様７６から８４の何れか一に記載の方法。
８６．
方法は、細胞培養培地にシステインを添加する工程を更に含む、実施態様８５に記載の方法。
８７．
細胞培養培地中に、システインが、約８０ｍｇ／Ｌから約１５００ｍｇ／Ｌのシステインを提供する量で添加される、実施態様８６に記載の方法。
８８．
細胞培養培地中に、システインが、約１５００ｍｇ／Ｌのシステインを提供する量で添加される、実施態様８６に記載の方法。
８９．
細胞培養培地中に、システインが、約１４０ｍｇ／Ｌのシステインを提供する量で添加される、実施態様８６に記載の方法。
９０．
ポリペプチドは抗体である、実施態様７６から８９の何れか一に記載の方法。
９１．
抗体はＩｇＧ１抗体である、実施態様９０に記載の方法。
９２．
抗体は、抗ＶＥＧＦ、抗メソテリン、抗ＰＣＳＫ９又は抗ベータ７抗体である、実施態様９０又は９１に記載の方法。
９３．
細胞培養培地からポリペプチドを単離する工程を更に含む、実施態様７６から９２の何れか一に記載の方法。
９４．
単離されたポリペプチドを含む組成物は、無色又は僅かに着色した液体として現れる、実施態様９３に記載の方法。
９５．
組成物は少なくとも１００ｍｇ／ｍＬの濃度で単離されたポリペプチドを含む、実施態様９４に記載の方法。
９６．
実施態様７６から９５の何れか一に記載の方法により生成されるポリペプチド。
９７．
実施態様９６に記載のポリペプチド及び薬学的に許容される担体を含む薬学的製剤。
９８．
化学的に定義された成分を有する細胞培養培地を補充するためのキットであって、該キットは、
細胞培養培地中に、約２００ｍｇ／Ｌから約１２００ｍｇ／Ｌのシスチンを提供する量のシスチン；
細胞培養培地中に、約２μＭから約８０μＭのクエン酸第二鉄の濃度を提供する量のクエン酸第二鉄；
細胞培養培地中に、約０．０５μＭから約０．５μＭのヒドロコルチゾンの濃度を提供する量のヒドロコルチゾン
を含むキット。
９９．
キットは、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＢ９及び／又はビタミンＢ１２を更に含む、実施態様９８に記載のキット。
１００．
キットは、細胞培養培地中に、約０．０５ｍｇ／Ｌから約１．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ２を提供する量のビタミンＢ２を含む、実施態様９８又は９９に記載のキット。
１０１．
キットは、細胞培養培地中に、約０．０５ｍｇ／Ｌから約１０．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ６を提供する量のビタミンＢ６を含む、実施態様９８から１００の何れか一に記載のキット。
１０２．
キットは、細胞培養培地中に、約０．０５ｍｇ／Ｌから約１２．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ９を提供する量のビタミンＢ９を含む、実施態様９８から１０１の何れか一に記載のキット。
１０３．
キットは、細胞培養培地中に、約０．０５ｍｇ／Ｌから約２．５ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２を提供する量のビタミンＢ１２を含む、実施態様９８から１０２の何れか一に記載のキット。
１０４．
約２００ｍｇ／Ｌから約１２００ｍｇ／Ｌのシスチン；
約２μＭから約８０μＭのクエン酸第二鉄；及び
約０．０５μＭから約０．５μＭのヒドロコルチゾン
を含む細胞培養培地。
１０５．
培地は、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＢ９及び／又はビタミンＢ１２を更に含む、実施態様１０４に記載の培地。
１０６．
培地は、約０．０５ｍｇ／Ｌから約１．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ２を含む、実施態様１０４又は１０５に記載の方法。
１０７．
培地は、約０．０５ｍｇ／Ｌから約１０．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ６を含む、実施態様１０４から１０６の何れか一に記載の培地。
１０８．
培地は、約０．０５ｍｇ／Ｌから約１２．０ｍｇ／ＬのビタミンＢ９を含む、実施態様１０４から１０７の何れか一に記載の培地。
１０９．
培地は、約０．０５ｍｇ／Ｌから約２．５ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２を含む、実施態様１０４から１０８の何れか一に記載の培地。
１１０．
（ａ）ポリペプチドをコードする単離された核酸を含む細胞；及び（ｂ）実施態様５２から６１及び１０４から１０９の何れか一による培地を含む組成物。
１１１．
（ａ）ポリペプチド；及び（ｂ）実施態様５２から６１及び１０４から１０９の何れか一に記載の培地を含む組成物。
【０１５５】
以下の実施例は、説明するために提供されるが、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【０１５６】
許容可能な品質特性、例えば色などを有するタンパク質製剤を生成する培地は、特に、タンパク質生成物が（例えば、少なくとも１００ｍｇ／ｍＬの濃度まで）濃縮される溶液として存在するときに同定される。幾つかの態様において、タンパク質生成物は、少なくとも１ｍｇ／ｍＬを含む組成物として存在する。本明細書で提供される培地中で細胞を培養する方法並びにその培地を使用してポリペプチドを生成する方法が記載される。一態様において、培地は、鉄源及びヒドロコルチゾンを任意に添加された、シスチン及び／又はシステイン及びビタミンＢ２、Ｂ６、Ｂ９及びＢ１２を含む。別の態様において、培地は、ビタミンＢ２、Ｂ６、Ｂ９及びＢ１２を任意に添加された、シスチン及び／又はシステイン、ヒドロコルチゾン及び鉄源を含む。組成物を含有するシスチンが特に考慮される。培地成分の各々は、全体にわたって提供される任意の値で存在してもよい。培地は、化学的に定義されるか、又は化学的に未定義であってもよい。培地は、ポリペプチドの生成方法で使用される場合、異なる培地中で生成されたポリペプチドと比較して、ポリペプチド電荷変異体の存在を減少させることができ、及び／又は活性酸素種の存在を減少させることができる。培地は、細胞培養およびポリペプチド生成のすべての段階を通して用途が見いだされ、基礎培地及び／又は流加培地で使用することができる。本方法の何れかにより生成されるポリペプチド、並びに本明細書に詳述されるポリペプチドを含む薬学的組成物が提供される。一態様において、薬学的組成物は、少なくとも又は約１００ｍｇ／ｍＬ、約１２５ｍｇ／ｍＬ及び１５０ｍｇ／ｍＬの何れかの濃度でポリペプチドを含む。別の態様において、薬学的組成物は、少なくとも又は約１ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ、約２５ｍｇ／ｍＬ、約５０ｍｇ／ｍＬ、及び７５ｍｇ／ｍＬの何れかの濃度でポリペプチドを含む。抗体を含む組成物を作成する方法が考慮される。化学的に定義された成分を有する細胞培養培地を補充するためのキットもまた記載される。
【０１５７】
薬剤物質の開発プロセスを通じて、製品の品質がクリニックで使用するための特定の業界標準を満たしていることが重要である。モノクローナル抗体の皮下送達に向けた最近の傾向は、処方された薬物物質の濃度の≧１００ｍｇ／ｍＬまでの増加を要求している。しかし、これらの高濃度では薬物物質の色がより強くなり、生成物の色に関して確立された品質の期待を満たすことをより困難にしている。本明細書に記載するように、（化学的に未定義なもの又はＣＤＭに関わらず）生成物の品質標準を満たすために、薬物物質の色強度を低減することができる培地への幾つかの改変が同定されている。
【０１５８】
実施例に記載のＣＨＯ細胞株は、以前にKaufman et al., Mol. Cell. Biol., 2(11):1304-1319 (1982)に記載される方法と同様に、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）／メトトレキサート選択方法を使用して、組換えヒト化抗体（本明細書ではＩｇＧ１モノクローナル抗体として言及される）を分泌するように遺伝子的に操作設計された。元のトランスフェクションは、選択剤としてメチオニンスルホキシミン、及びグルタミンを含まない培地を用いたＧＳ選択システムを使用した。続くスーパートランスフェクションは、ｄｈｆｒ選択システム及び選択剤としてメトトレキサートを使用した。２リットルの撹拌懸濁バイオリアクターの中で増殖期を開始する前に、このＣＨＯ細胞株の極低温凍結アンプルを解凍し、５％ＣＯ２を含む加湿インキュベーター中で３７℃で少なくとも２週間振とうフラスコ中で化学的に定義された培地で培養し、良好な増殖及び生存特性を持つ細胞培養懸濁液を得た。
【０１５９】
実施例１：抗体生成細胞株から単離された抗体を含有する製剤中に示される色強度。
ＩｇＧ１モノクローナル抗体（抗ベータ７）を生成することができるＣＨＯ細胞株はペプトンを含有する化学的に未定義な培地中で培養した。単離された抗体を精製し、標準クラリティー、乳白光及び着色（ＣＯＣ）アッセイ（欧州評議会。ヨーロッパ薬局方、２００８、第７版 Ｐ．２２）を用いて色についてアッセイした簡潔には、ＣＯＣアッセイは、平底の無色、透明な中性ガラスで、内径が１５ｍｍから２５ｍｍの同一チューブを使用して行われた。チューブは、分泌されたＩｇＧ１モノクローナル抗体を含む精製され濃縮された細胞培養液から調製した１５０ｇ／Ｌのタンパク質溶液で４０ｍｍの深さまで充填した。抗体溶液を含むチューブは９つの参照チューブ（各々はＢ１（最も暗い）からＢ９（最も明るい）までの範囲の標準溶液を充填）に対して、拡散昼光下で白い背景に対して縦に観察することによって比較した。ＩｇＧ１のモノクローナル抗体溶液をＣＯＣ値≦Ｂ５で測定した（図１；製剤Ｉ）。
【０１６０】
ＩｇＧ１モノクローナル抗体（抗ベータ７）を生成するＣＨＯ細胞株はＣＤＭ中で培養した。細胞培地の調製のために、基礎ＣＤＭ（培地１）及び流加ＣＤＭ（培地２）溶液は、水に溶解し、最適な細胞増殖を確保する最終的なｐＨ及びオスモル濃度に調整された単一のカスタム調製混合粉末に成分を組み合わせることにより、調製した。基礎培地１と流加培地２の各々は、表Ａに記載される目的の成分を含む過剰の２０成分を有していた。グルコースなどの幾つかの培地成分は、混合粉末には混合されず、培地調製中に別々に追加された。細胞培養の増殖期を開始するため、基礎培地１の１Ｌを含む２リットルの撹拌バイオリアクター（Applikon, Foster City, CA）中に約１．０×１０６細胞／ｍＬで播種した。細胞を、生成期の開始のため第３日、６日、及び９日に、細胞培養液のリットル当たり流加培地２の１００ｍＬを添加して流加培養モードで培養した。グルコースの濃度は毎日分析し、グルコース濃度が３ｇ／Ｌを下回った場合、グルコースの枯渇を防止するためにグルコースの５００ｇ／Ｌの原液から補充した。反応器は、較正された溶存酸素、ｐＨ及び温度プローブを備えていた。溶存酸素は、空気及び／又は酸素の散布を介してオンラインで制御した。ｐＨは、ＣＯ２又はＮａ２ＣＯ３を添加することによって制御し、必要に応じて消泡剤を培養物に添加した。細胞培養物は、ｐＨ７．０で、第０日から第３日までは温度を３７℃に、次いで第３日の後に３３℃に維持した。細胞培養物を２７５ｒｐｍで撹拌し、溶存酸素レベルは空気飽和の３０％であった。浸透圧は高度なアドバンスト・インスツルメンツ（Norwood, MA）からの浸透圧計を用いてモニターした。更に、オフラインｐＨ及び代謝物濃度もＮｏｖａ Ｂｉｏｐｒｏｆｉｌｅ ４００(Nova Biomedical, Waltham, MA)を用いて毎日測定した。生細胞密度（ＶＣＣ）及び細胞生存率は、ＶｉＣｅｌｌ（登録商標）自動細胞カウンター（Beckman Coulter, Fullerton, CA）を用いて毎日測定した。目盛付遠心管（Kimble Science Products, Fullerton, CA）が、細胞懸濁液の１０分間の７００×ｇ又は８３６×ｇでの遠心分離後の血中血球容積（ＰＣＶ）を測定するために使用された。ＰＣＶは、総培養体積の百分率として表した。第１４日目の細胞培養期間の終了時に、培養物中のタンパク質の量は、約２〜１０ｇ／Ｌであって、その細胞培養液を遠心分離により回収した。回収した細胞培養液中のモノクローナル抗体は、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。精製後、溶出されたプロテインＡプール中のタンパク質の濃度は、約５〜１０ｇ／Ｌであった。プロテインＡプールは、アミコンセントリコン遠心フィルター装置を使用して１５０ｇ／Ｌまで更に濃縮した (Millipore Corporation, Billerica, MA)。色は濃縮されたプロテインＡプール中で標準ＣＯＣアッセイを使用して測定した。別法として、回収された細胞培養液は、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを介したアフィニティー精製、陰イオン及び陽イオン交換クロマトグラフィー、ウイルスを除去するための濾過、及び標準ＣＯＣアッセイによる色の測定の前に、抗体の最終製剤と濃度のための最終的な限外濾過及び透析濾過工程が含まれる標準的な抗体精製法を用いて精製された。Kelley, B. mAbs., 2009, 1(5):443-452を参照。僅かに濃いけれども、濃縮されたプロテインＡプール中の色の測定は、記載された標準的な抗体精製法によって生成される最終抗体製剤に期待される色を概ね示していた。細胞培養液は、高速液体クロマトグラフィーによる精製の前に細胞培養液を１ｍＬを遠心分離することによって抗体力価の測定のために毎日採取した。ＣＯＣアッセイは、平底の無色、透明な中性ガラスで、内径が１５ｍｍから２５ｍｍの同一チューブを使用して行われた。２本のチューブは各々、分泌されたＩｇＧ１モノクローナル抗体を含む精製され濃縮された細胞培養液から調製した１５０ｇ／Ｌのタンパク質溶液で４０ｍｍの深さまで充填した。抗体溶液を含んだ各チューブは９つの参照チューブ（各々はＢ１（最も暗い）からＢ９（最も明るい）までの範囲の標準溶液を充填）に対して、拡散昼光下で白い背景に対して縦に観察することによって比較した。抗体含有溶液の色の解析は、ＣＯＣ値が≦Ｂ４又は≦Ｂ３を実証した（図１；それぞれ製剤ＩＩ及びＩＩＩ）。
【０１６１】
2018183154.tif 000012
【０１６２】
実施例２：抗体生成細胞株から単離された抗体の色強度は、細胞培養培地中の特定成分の変化によって減少する。
再調合培地がＣＨＯ細胞株によって産生され単離されたモノクローナルＩｇＧ１抗体（抗ベータ７）の色強度を低減させることができるかどうかを決定する細胞培養実験で使用のため、幾つかの栄養素を減少した濃度で含有する基礎培地１及び流加培地２が再調合された。簡潔には、基礎ＣＤＭ（培地３）及び流加ＣＤＭ（培地４）溶液は、水に溶解し、最適な細胞増殖を確保する最終的なｐＨ及びオスモル濃度に調整された単一のカスタム調製混合粉末に成分を組み合わせることにより、調製した。基礎培地３と流加培地４の各々は、表Ｂに記載される目的の成分を含む過剰の２０成分を有していた。グルコースなどの幾つかの培地成分は、混合粉末には混合されず、培地調製中に別々に追加された。同様に、この研究のために変更される培地成分は混合した粉末に含まれていなかったが、培地調製の間に適切なレベルで別々に添加された（表Ｂ）。クエン酸第二鉄は、５ｇ／Ｌのクエン酸第二鉄ストック溶液から添加され、ビタミンＢ２は、リボフラビン粉末として提供され、ビタミンＢ６は、ピリドキシン塩酸またはピリドキサール塩酸として提供され、ビタミンＢ９は、葉酸粉末として提供され、ビタミンＢ１２は、シアノコバラミン粉末として提供され、システインは、Ｌ−システイン一塩酸塩一水和物の粉末として提供され、シスチンは、二ナトリウム塩一水和物の粉末として提供され、及びヒドロコルチゾンは１５０μＭの原液から添加された。
【０１６３】
2018183154.tif 000013
【０１６４】
細胞培養の増殖期を開始するため、基礎培地３の１Ｌを含む２リットルの撹拌バイオリアクター（Applikon, Foster City, CA）中に約１．０×１０６細胞／ｍＬで播種した。細胞を、生成期の開始のため第３日、６日、及び９日に、細胞培養液のリットル当たり流加培地４の１００ｍＬを添加して流加培養モードで培養した。グルコースの濃度は毎日分析し、グルコース濃度が３ｇ／Ｌを下回った場合、グルコースの枯渇を防止するためにグルコースの５００ｇ／Ｌの原液から補充した。反応器は、較正された溶存酸素、ｐＨ及び温度プローブを備えていた。溶存酸素は、空気及び／又は酸素の散布を介してオンラインで制御した。ｐＨは、ＣＯ２又はＮａ２ＣＯ３を添加することによって制御し、必要に応じて消泡剤を培養物に添加した。細胞培養物は、ｐＨ７．０で、第０日から第３日までは温度を３７℃に、次いで第３日の後に３５℃に維持した。細胞培養物を２７５ｒｐｍで撹拌し、溶存酸素レベルは空気飽和の３０％であった。浸透圧は高度なアドバンスト・インスツルメンツ（Norwood, MA）からの浸透圧計を用いてモニターした。更に、オフラインｐＨ及び代謝物濃度も Ｎｏｖａ Ｂｉｏｐｒｏｆｉｌｅ ４００（Nova Biomedical, Waltham, MA）を用いて、毎日測定した。生細胞密度（ＶＣＣ）及び細胞生存率は、ＶｉＣｅｌｌ（登録商標）自動細胞カウンター（Beckman Coulter, Fullerton, CA）を用いて毎日測定した。目盛付遠心管（Kimble Science Products, Fullerton, CA）が、細胞懸濁液の１０分間の７００×ｇ又は８３６×ｇでの遠心分離後の血中血球容積（ＰＣＶ）を測定するために使用された。ＰＣＶは、総培養体積の百分率として表した。第１４日目の細胞培養期間の終了時に、培養物中のタンパク質の量は、約２〜１０ｇ／Ｌであって、その細胞培養液を遠心分離により回収した。回収した細胞培養液中のモノクローナル抗体は、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。精製後、溶出されたプロテインＡプール中のタンパク質の濃度は、約５〜１０ｇ／Ｌであった。プロテインＡプールは、アミコンセントリコン遠心フィルター装置を使用して１５０ｇ／Ｌまで濃縮した（Millipore Corporation, Billerica, MA）。色は濃縮されたプロテインＡプール中で標準ＣＯＣアッセイを使用して測定した。また回収された細胞培養液は、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを介したアフィニティー精製、陰イオン及び陽イオン交換クロマトグラフィー、ウイルスを除去するための濾過、及び標準ＣＯＣアッセイによる色の測定の前の抗体の最終製剤と濃度のための最終的な限外濾過及び透析濾過工程が含まれた標準的な抗体精製法を用いて平行して精製された。Kelley, B. mAbs., 2009, 1(5):443-452を参照。僅かに濃いけれども、濃縮されたプロテインＡプール中の色の測定は、記載された標準的な抗体精製法によって生成される最終抗体製剤に期待される色を概ね示していた。細胞培養液は、高速液体クロマトグラフィーを用いた抗体力価の測定のため、細胞培養液１ｍＬを遠心分離することによって、毎日回収した。ＣＯＣアッセイは、平底の無色、透明な中性ガラスで、内径が１５ｍｍから２５ｍｍの同一チューブを使用して行われた。チューブは、分泌されたＩｇＧ１モノクローナル抗体を含む精製され濃縮された細胞培養液から調製した１５０ｇ／Ｌのタンパク質溶液で４０ｍｍの深さまで充填した。抗体溶液を含むチューブは７つの参照バイアル（各々はＢＹ１（最も暗い）からＢＹ７（最も明るい）までの範囲の標準溶液を充填）に対して、拡散昼光下で白い背景に対して縦に観察することによって比較した。ＩｇＧ１のモノクローナル抗体溶液をＣＯＣ値≦ＢＹ５で測定した（図１；製剤ＶＩＩ）。血中血球容積（ＰＣＶ）は、基礎培地１及び流加培地２で増殖した細胞培養物と比較して、基礎培地３及び流加培地４で増殖した細胞培養物で僅かに減少した。この減少は、僅かに減少した抗体産生と相関していた（図２Ｂ）。ＰＣＶ及び抗体力価へのこの培地の効果を評価する追加の実験は、細胞が基礎培地３及流加培地４で培養される場合、基礎培地１及び流加培地２で培養した細胞と比較して、ＰＣＶは減少することを確認した（図２Ｃ）。前述のように、ＰＣＶの減少は、抗体産生の減少と相関した（図２Ｄ）。
【０１６５】
これらの結果は、基礎培地３及び流加培地４でＣＨＯ細胞を培養することにより生成されるモノクローナルＩｇＧ１抗体の色強度は、基礎培地１及び流加培地２で細胞を培養することにより生成されるモノクローナルＩｇＧ１抗体の色強度と比較して減少することを実証している。
【０１６６】
実施例３：抗体生成細胞株から単離された抗体の色強度は、細胞培養培地中のビタミンＢのレベルの変化によって減少する。
単離された抗体の色強度における基礎培地３及び流加培地４で変更された成分の影響を決定するために、他の培地成分のレベルを一定に保ちつつ、ビタミンＢ２、Ｂ６、Ｂ９及びＢ１２のレベルが変更された。実施例２に記載のように培地を調製した。この研究のために変更される培地成分は混合した粉末に含まれていなかったが、培地調製の間に適切なレベルで別々に添加された。基礎培地５は基礎培地３と同様にビタミンレベルが減少するように調製され、他の全ての成分は基礎培地１と同様に調製された（表Ｃ）。ＣＨＯ細胞からモノクローナルＩｇＧ１抗体（抗ベータ７）を生成するため、細胞培養物は初期増殖期用に基礎培地５を供給され、そして第３日、６日、及び９日に流加培地２又は流加培地４で培養された。実施例２に記載のように、細胞生存率の測定及びモノクローナルＩｇＧ１抗体の単離を行った。抗体精製後に、実施例２に記載のように色強度と抗体力価も測定した。基礎培地５及び基礎培地２で培養された細胞から得られたＩｇＧ１モノクローナル抗体溶液は、ＣＯＣ値が≦Ｂ４で測定された（図１；製剤Ｖ）。基礎培地５及び基礎培地４で培養された細胞から得られたＩｇＧ１モノクローナル抗体溶液は、ＣＯＣ値が≦Ｂ４で測定された（図１；製剤ＩＶ）。
【０１６７】
2018183154.tif 000014
【０１６８】
要因試験は、単離された抗体の色強度における、個々のビタミンＢ成分（ビタミンＢ２、Ｂ６、Ｂ９、及びＢ１２）の寄与を評価するために実施された。ビタミンＢ２のレベルは別々の要因として扱われたが、ピロキシジン及びピリドキサールのレベルは、これら二つの栄養素の濃度を同時に変化させるようにビタミンＢ６として単一の要因で一緒に混合した。同様に、ビタミンＢ９及びＢ１２のレベルは、これらの２つの栄養素の濃度を同時に変化させるように単一の要因として一緒に変化させた。幾つかの培地製剤は、表Ｄ、Ｅ、及びＦに列挙されている培地を含んで調製した。ＣＨＯ細胞からモノクローナルＩｇＧ１抗体（抗ベータ７）を生成するため、細胞培養物は、基礎培地５と流加培地４、基礎培地６と流加培地７、基礎培地８と流加培地９、又は基礎培地１０と流加培地１１が流加培養モードで与えられた。追加の細胞培養物は、１．４１ｍｇ／ＬのビタミンＢ２及び／又は１５．４２ｍｇ／ＬのビタミンＢ６（ピリドキシンとして供給される）を含む基礎培地及び１０ｍｇ／ＬのビタミンＢ２及び／又は７６ｍｇ／ＬのビタミンＢ６（７ｍｇ／Ｌのピリドキシン及び６０ｍｇ／Ｌのピリドキサール）を含む流加培地が与えられた。実施例２に記載のように、細胞生存率の測定及びモノクローナルＩｇＧ１抗体の単離を行った。抗体精製後に、実施例２に記載のように抗体力価を測定した。色の強度は、より高い数値は、より高い色強度を示し、より低い数値はより低い色強度を示す、色のアッセイを用いて決定した。この色アッセイについては、本明細書では正規化された蛍光強度（ニフティ）アッセイとして言及され、約５０から１２５μｇのモノクローナル抗体試料は、０．５ｍＬの／分の均一濃度流速で、Ｇ３０００ＳＷＸＬカラム（ＴＯＳＯＨ）を用いたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって分析した。ＳＥＣのための移動相は、０．２Ｍのリン酸カリウム、０．２５Ｍの塩化カリウム、ｐＨは６．２であった。カラム温度は１５℃にて制御した。ＳＥＣ溶出液は、２８０ｎｍでのＵＶ吸収について、及び３５０ｎｍでの励起波長及び４２５ｎｍでの発光波長による蛍光についてモニタリングした。モノクローナル抗体種のＳＥＣピークは、ＵＶ吸光度及び蛍光発光クロマトグラムにおいてＡｇｉｌｅｎｔ ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェアを用いて積分した。各モノクローナル抗体試料について、抗体質量の寄与による蛍光応答を補正する正規化された蛍光は、主ピークの蛍光ピーク面積を主ピークのＵＶ吸光度のピーク面積によって割ることにより決定した。続いて、試験モノクローナル抗体試料の正規化された蛍光の、ＣＯＣ読み取りが≦Ｂ５であるものを含む参照モノクローナル抗体試料のそれに対する比率を計算することにより、蛍光強度値が決定された。ＪＭＰ８．０．２統計ソフトウェアによる経時的血中血球容積（ＩＶＰＣＶ）と抗体力価レベルの分析は、細胞生存率及び抗体力価レベルは、基礎培地及び流加培地の両方で、ビタミンＢ２とビタミンＢ６レベルの変化によりごく僅かに影響を受けるものの（図３ＡおよびＢ；中央のトレンドライン）、細胞培養培地中のこれら二つのビタミンのレベルの増加は、単離された抗体で色強度を著しく増加させる（図４；中央のトレンドライン）ことを実証した。対照的に、ビタミンＢ９及びビタミンＢ１２のレベルの増加は、細胞生存、抗体力価レベル、又は色の強度に大きな影響を及ぼさなかった（図３及び４；中央のトレンドライン）。更に、色強度の低いレベルは、０．２５ｍｇ／ＬのビタミンＢ２及び５．３５ｍｇ／ＬのビタミンＢ６（ピリドキシンとして供給）及びビタミンＢ２とビタミンＢ６を含まない流加培地を含有する基礎培地を用いて培養した細胞株から単離された抗体で観察された。
【０１６９】
ビタミンＢ１、Ｂ３、Ｂ５およびＢ７の影響も調べた；しかしながら、抗体含有溶液の色強度におけるこれらの栄養素の効果は有意ではなかった。
【０１７０】
2018183154.tif 000015
2018183154.tif 000016
2018183154.tif 000017
【０１７１】
実施例４：抗体生成細胞株から単離された抗体の色強度は、細胞培養培地中のビ鉄源レベルの変化によって減少する。
単離された抗体の色強度における鉄レベルの寄与を評価するために、他の培地成分のレベルを一定に維持しながら、鉄のレベルを変化させた。実施例２に記載のように培地を調製した。この研究のために変更される培地成分は混合した粉末に含まれていなかったが、培地調製の間に適切なレベルで別々に添加された。基礎培地１は、１８μＭの硫酸第一鉄を含有する基礎培地１２及び１０μＭの硫酸第一鉄を含有する基礎培地１３を生成するために、硫酸第一鉄のレベルを低下させるように再調合された。ＣＨＯ細胞からモノクローナルＩｇＧ１抗体（抗ベータ７）を生成するため、細胞培養物は、基礎培地１と流加培地２、基礎培地１２と流加培地２、又は基礎培地１３と流加培地２が流加培養モードで与えられた。実施例２に記載のように、細胞生存率の測定及びモノクローナルＩｇＧ１抗体の単離を行った。抗体精製後に、実施例２に記載のように抗体力価を測定した。色の強度は、より高い数値は、より高い色強度を示し、より低い数値はより低い色強度を示す、色のアッセイを用いて決定した。実施例３に記載されるように、ニフティアッセイとも呼ばれるこの色アッセイが実施された。ＪＭＰ８．０．２統計ソフトウェアによる経時的血中血球容積（ＩＶＰＣＶ）と抗体力価レベルの分析は、細胞生存率及び抗体力価レベルは、７５μＭの濃度の鉄と比較してより低い鉄濃度のレベルで減少するものの（図５Ａ及びＢ）、細胞培養培地中のより低い鉄濃度は、単離された抗体の色強度を著しく減少させることを実証した（図５Ｃ）。
【０１７２】
色に関する細胞培養条件の観察された効果は、細胞内又は細胞外の現象に起因するものであったかどうかを調べるために、インビトロで一連の培養実験を行った。１ｇ／Ｌの量のモノクローナル抗体は、新たに調製した細胞培養培地中でスパイクし、最長６日間３３℃でインキュベートした。インビトロでのインキュベーションのために使用される細胞培養培地は、１０、１８及び７５μＭの硫酸第一鉄の濃度を有していた。ビタミンＢの濃度は、０．２５ｍｇ／ＬのビタミンＢ２、５．３５ｍｇ／ＬのビタミンＢ６（５．３５ｍｇ／Ｌのピリドキシン＋０ｍｇ／Ｌのピリドキサール）、８．６１ｍｇ／ＬのビタミンＢ９及び１．７６ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２の減少したレベルで一定に保たれた。インキュベートした混合物は、０日目、３日目と６日目でサンプリングし、抗体は、プロテインＡクロマトグラフィーにより精製した。単離された抗体を含む溶液は、ニフティアッセイを用いて色強度を測定した。色強度の増加は、７５、１８又は１０μＭの硫酸第一鉄を含む培地中で増殖させた細胞から単離された抗体を含む溶液中で、０日目に１．０単位から６日目にそれぞれ１．８、１．４４又は１．２７単位まで観察された（図５Ｄ）。高い鉄濃度における色の形成の増加は、細胞外のメカニズムが抗体の着色において役割を果たしていることを示す細胞培養実験の結果を反映していた。
【０１７３】
単離された抗体の色強度における鉄の寄与を更に評価するために、他の培地成分のレベルを一定に維持しながら、鉄の源及びレベルを変化させた。実施例２に記載のように培地を調製した。この研究のために変更される培地成分は混合した粉末に含まれていなかったが、培地調製の間に適切なレベルで別々に添加された。基礎培地１は、１８μＭの硫酸第一鉄を含有する基礎培地１２及び１０μＭの硫酸第一鉄を含有する基礎培地１３を生成するために、硫酸第一鉄のレベルを低下させるように再調合された。更に、基礎培地１は、１８μＭの硝酸第二鉄を含む基礎培地１４、１８μＭのクエン酸第二鉄を含む基礎培地１５及び１０μＭのクエン酸第二鉄を含む基礎培地１６を生成するために、鉄のレベルを減少させ並びに異なる鉄源を有するように再調合した。ＣＨＯ細胞からモノクローナルＩｇＧ１抗体（抗ベータ７）を生成するため、細胞培養物は、基礎培地１と流加培地２、基礎培地１２と流加培地２、基礎培地１３と流加培地２、基礎培地１４と流加培地２、基礎培地１５と流加培地２、又は基礎培地１６と流加培地２が流加培養モードで与えられた。実施例２に記載のように、細胞生存率の測定及びモノクローナルＩｇＧ１抗体の単離を行った。抗体精製後に、実施例２に記載のように抗体力価も測定した。色の強度は、より高い数値は、より高い色強度を示し、より低い数値はより低い色強度を示す、色のアッセイを用いて決定した。実施例３に記載されるように、ニフティアッセイとも呼ばれるこの色アッセイが実施された。ＪＭＰ８．０．２統計ソフトウェアによる経時的血中血球容積（ＩＶＰＣＶ）と抗体力価レベルの分析は、細胞生存率及び抗体力価レベルは、７５μＭの濃度の硫酸第一鉄と比較してより低い硫酸第一鉄濃度のレベルで減少することを実証した（図６Ａ及びＢ）。１８μＭのクエン酸第二鉄を含む培地を使用した細胞培養物からの細胞の生存率及び抗体力価のレベルは、７５μＭの硫酸第一鉄を含有する培地に匹敵した（図６Ａ及びＢ）。しかしながら、細胞培養培地中での１８μＭのクエン酸第二鉄の使用は、試験した全ての濃度で、硫酸第一鉄と比較して、単離された抗体で色強度を著しく減少させた（図６Ｃ）。１８μＭ硝酸第二鉄を含有する培地中で増殖させた細胞培養物から単離された抗体の細胞生存率、抗体力価、及び色は、１０μＭ、又は１８μＭの硫酸第一鉄を含有する培地の使用で観察されたものに匹敵した（図６Ａ−Ｃ）。
【０１７４】
ビタミンや鉄に起因する色に対する有益な効果は相加的であるかどうかを試験するために、還元型ビタミンＢのレベル及び還元型鉄濃度は混合された。基礎の培地１３、培地１４、培地１５、及び培地１６は、基礎の培地２１、培地２２、培地２３、及び培地２５をそれぞれ生成するために、ビタミンＢのレベルを減少させて再調合された。更に、基礎培地１は、基礎培地２４を生成するために、ビタミンＢのレベルを減少させ、鉄源として１０μＭの硝酸第二鉄を有するように再調合された。培地２１から２５の減少したビタミンレベルは次の通りである：０．２５ｍｇ／ＬのビタミンＢ２、５．３５ｍｇ／ＬのビタミンＢ６（５．３５ｍｇ／Ｌのピリドキシン＋０ｍｇ／Ｌのピリドキサール）、８．６１ｍｇ／ＬのビタミンＢ９及び１．７６ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２。ＣＨＯ細胞からのモノクローナルＩｇＧ１抗体を生成するため、細胞培養物は、基礎培地２１、２２、２３、２４、又は２５、及び流加培地２が流加培養モードで与えられた。実施例２に記載されるように、モノクローナルＩｇＧ１抗体の単離及び抗体力価の測定を行った。色の強度は、ニフティアッセイで測定した。抗体力価レベル及び色強度の分析は、硫酸第一鉄の濃度が７５μＭから１８μＭに減少し、より低いビタミン濃度と混合される場合、得られる色と力価は、一の要因だけを減少させる場合よりも低いことを実証した（図６Ｄ及びＥ、プラス記号）。しかしながら、硝酸第二鉄または硫酸第一鉄のどちらかについて鉄濃度を１８μＭから１０μＭに低下させることには更なる利点はないように見えた（図６Ｄ及びＥ、プラス記号）。
【０１７５】
抗体色強度に対する活性酸素種（ＲＯＳ）の寄与を調べるために、７５μＭ又は１８μＭの硫酸第一鉄を補充した細胞培養培地を含有するバイアルにモノクローナルＩｇＧ１抗体の２ｇ／Ｌのサンプルをスパイクすることによってインビトロ実験を行った。更なるインビトロ実験を、１．４１ｍｇ／ＬのビタミンＢ２又は０．２５ｍｇ／ＬのビタミンＢ２を補充した細胞培養培地を含有するバイアルにモノクローナルＩｇＧ１抗体（抗ベータ７）の２ｇ／Ｌのサンプルをスパイクすることによってインビトロ実験を行った。試料は、２０３Ｕ／ｍｌのカタラーゼの欠損下又は存在下で、あらゆる細胞を含まずに、５日間３７℃でインキュベートした。色の強度は、より高い数値は、より高い色強度を示し、より低い数値はより低い色強度を示す、色のアッセイを用いて決定した。実施例３に記載されるように、ニフティアッセイとも呼ばれるこの色アッセイが実施された。ＪＭＰ８．０．２統計ソフトウェアの色レベルの分析は、鉄のレベルの増加は、抗体溶液の色強度を増加させるが（図７Ａ）この色の増加は、カタラーゼの添加によって減少する（図７Ｂ；中央のトレンドライン）ことを実証した。対照的に、ビタミンＢ２のレベルの増加は、抗体溶液の色強度を増加させるものの、色強度は、カタラーゼの添加によっ減少しなかった（図７Ａ及びＢ；中央のトレンドライン）。
【０１７６】
実施例５：抗体生成細胞株から単離された抗体の酸性電荷変異体の形成は、細胞培養培地中の特定成分の変化によって減少する。
ＣＨＯ細胞からモノクローナルＩｇＧ１抗体（抗ベータ７）を生成するため、細胞を、１０μＭ、１８μＭまたは７５μＭの何れかの硫酸第一鉄を含む、３種の再調合基礎培地１により培養した。追加の細胞培養物は、１０μＭ又は１８μＭのクエン酸第二鉄のどちらかを各々が含有する、２種の再調合基礎培地３の一つを与えられた（即ち、培養された）全ての細胞培養物は、鉄を含まない流加培地を流加培養モードで与えられた。実施例２に記載されるように、モノクローナルＩｇＧ１抗体の単離及び抗体力価の決定を行った。色の強度は、より高い数値は、より高い色強度を示し、より低い数値はより低い色強度を示す、色のアッセイを用いて決定した。実施例３に記載されるように、ニフティアッセイとも呼ばれるこの色アッセイが実施された。精製された溶液中の抗体の酸性電荷変異体の検出のために、モノクローナル抗体の電荷不均一性は、Ｄｉｏｎｅｘ ＰｒｏＰａｃ ＷＣＸ−１０（４ｘ２５０ｍｍ）カラムを使用するイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）により分析した。分析は、２８０ｎｍでモニターされる溶出物によりＡｇｉｌｅｎｔ１１００ ＨＰＬＣシステムで行った。移動相Ａは２５ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．６）であり、移動相Ｂは、移動相Ａ中の１５０ｍＭの硫酸ナトリウムであった。０．５ｍＬ／分の流速により４５分で０〜３７％Ｂの直線勾配を用いた。カラム温度は４０℃で制御した。モノクローナル抗体の重鎖のＣ末端リシン残基は、塩基性領域の電荷不均一性の複雑さを減少させるため、ＩＥＣ分析の前に、カルボキシペプチダーゼＢによって除去した。ＪＭＰ８．０．２統計ソフトウェアを用いた酸性電荷変異体の存在との関係として色強度の解析は、抗体溶液中における、高い色強度と酸性電荷変異体のレベルの増加との間の強い相関を実証した（図８Ａ）。更に、酸性電荷変異体の存在は、修飾培地１及び培地２で培養された培養細胞株と比較して、修飾培地３及び培地４で培養された細胞株から単離された抗体において著しく減少し、その最大の減少は鉄の最低濃度で観察された（図８Ａ）。
【０１７７】
色強度と酸性電荷変異体の形成との間の相関は、鉄及びビタミンＢの様々なレベルを含む培地で培養した細胞株から得られた抗体含有溶液で試験した。モノクローナルＩｇＧ１抗体は、１８μＭ又は７５μＭ硫酸第一鉄を含有する基礎培地中で、又は１８μＭでの鉄濃度を維持しつつ、低、中又は高レベルのビタミンＢレベルを含む基礎培地で培養したＣＨＯ細胞から生成された。低レベルのビタミンは次の通りである：０．２５ｍｇ／ＬのビタミンＢ２、５．３５ｍｇ／ＬのビタミンＢ６（５．３５ｍｇ／Ｌのピリドキシン＋０ｍｇ／Ｌのピリドキサール）、８．６１ｍｇ／ＬのビタミンＢ９及び１．７６ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２。中レベルのビタミンは次の通りである：０．７０ｍｇ／ＬのビタミンＢ２、７．７ｍｇ／ＬのビタミンＢ６（７．７ｍｇ／Ｌのピリドキシン＋０ｍｇ／Ｌのピリドキサール）、４．９ｍｇ／ＬのビタミンＢ９及び１．５ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２。高レベルのビタミンは次の通りである：１．４１ｍｇ／ＬのビタミンＢ２、１５．４２ｍｇ／ＬのビタミンＢ６（１５．４２ｍｇ／Ｌのピリドキシン＋０ｍｇ／Ｌのピリドキサール）、９．９３ｍｇ／ＬのビタミンＢ９及び３．０５ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２。実施例２に記載されるように、モノクローナルＩｇＧ１抗体の単離及び抗体力価の決定を行った。色強度は、全色アッセイを用いて決定した。全色アッセイのために、試料の相対的な色の定量値は、Berns et al., Billmeyer and Saltzman's Principles of Color Technology、第３版、New York, NY, John Wiley & Sons, Inc., (2000)に記載されているように、色測定のＣＩＥシステムを用いて導出した。簡潔には、水でブランキングの後、きれいな試験試料の吸収スペクトルは、ＨＰ８４５３Ａ分光光度計（１ｃｍ光路長キュベット）を使用して、可視領域（３８０−７８０ｎｍ）において測定した。以前に，装置によって測定された色座標から色の許容差および色差を計算する標準的な技法(Standard Practice for Calculation of Color Tolerances and Color Differences from Instrumentally Measured Color Coordinates), Annual Book of ASTM Standards, Vol. 06.01, (2011)に記載されているように、吸収スペクトルはＣＩＥのＬ＊ａ＊ｂ＊色スケールに変換した。これらの計算のために可視領域での人工的な平坦なスペクトルを光源として用いた。「全色」は、三次元のＣＩＥＬ＊ａ＊ｂ＊色空間内で試験試料と水の間のユークリッド距離に対応するデルタＥを示した。更に、「全色」は、異なる色合いを区別することなく、試験モノクローナル抗体試料の全体的な色を示した。続いて、試験モノクローナル抗体試料の「全色」測定の、ＣＯＣ読み取りが≦Ｂ５であるものを含む参照モノクローナル抗体試料のそれに対する比率を計算することにより、蛍光強度値が決定された。正の相関関係が、増加した鉄濃度の増加した色強度との間に見られた（図８Ｂ）。更に、増加した鉄濃度は、酸性電荷変異体のレベルの増加をもたらした。比較すると、鉄の一定濃度を含む培地中のビタミンＢ２、Ｂ６、Ｂ９およびＢ１２のレベルを同時に変化させると、酸性電荷変異体と色強度との間に相関は認められなかった（図８Ｃ）。
【０１７８】
Ｂ２及びＢ６の様々なレベルを含有する細胞培地で培養された細胞株から単離された抗体において、色強度と酸性電荷変異体の形成との相関関係を調べた。ＣＨＯ細胞からモノクローナルＩｇＧ１抗体（抗ベータ７）を生成するため、細胞培養物は、ビタミンＢ２及びＢ６の様々なレベルを含む基礎及び流加培地に流加培養モードで与えられた。抗体はその後単離され、酸性電荷変異体の存在に加えて、実施例３に記載のニフティアッセイを使用して色強度を測定した。ＪＭＰ８．０．２統計ソフトウェアを使用した酸性電荷変異体の存在との関係としての色強度の分析は、１．４１ｍｇ／ＬのビタミンＢ２及び／又は１５．４２ｍｇ／ＬのビタミンＢ６（ピリドキシンとして供給）を含有する基礎培地及び１０ｍｇ／ＬのビタミンＢ２及び／又は７６ｍｇ／ＬのビタミンＢ６（７ｍｇ／Ｌのピリドキシン及び６０ｍｇ／Ｌのピリドキサール）を含有する流加培地を用いて培養した細胞株から単離された抗体において、酸性電荷変異体の増加したレベルと高い色強度との間に強い相関を実証した（図９Ａ及びＢ）。色強度及び酸性電荷変異体の最低レベルは、０．２５ｍｇ／ＬのビタミンＢ２及び５．３５ｍｇ／ＬのビタミンＢ６（ピリドキシンとして供給）及びビタミンＢ２とビタミンＢ６を含まない流加培地を含有する基礎培地を用いて培養した細胞株から単離された抗体で観察された（図９Ａ及びＢ）。
【０１７９】
異なる鉄源の存在下で様々なレベルのピリドキサールを含有する細胞培地で培養した細胞株から単離された抗体における酸性電荷変異体の形成と色強度の相関を決定するために完全要因試験が実施された。ＣＨＯ細胞からモノクローナルＩｇＧ１抗体（抗ベータ７）を生成するため、細胞は、様々なレベルのピリドキサール含む基礎及び流加培地で培養された。クエン酸第二鉄又は硫酸第一鉄が基礎培地に与えられ、細胞培養プロセスは流加バッチモードで行った。抗体はその後単離され、酸性電荷変異体の存在に加えて、全色アッセイを使用して色強度を測定した。ＪＭＰ８．０．２統計ソフトウェアを使用した酸性電荷変異体の存在との関係としての色強度の分析は、０ｍｇ／Ｌのピリドキサールを１８μＭの硫酸第一鉄と共に含有する基礎培地及び０ｍｇ／Ｌ又は６０ｍｇ／Ｌのピリドキサールを含有する流加培地を用いて培養した細胞株から単離された抗体において、０ｍｇ／Ｌのピリドキサールを１８μＭのクエン酸第二鉄と共に含有する基礎培地及び０ｍｇ／Ｌ又は６０ｍｇ／Ｌのピリドキサールを含有する流加培地を用いて培養した細胞株から単離された抗体に比べて、酸性電荷変異体の増加したレベルと、より高い色強度との間に強い相関を実証した（図１０Ａ及びＢ）。
【０１８０】
異なる鉄源の存在下でビタミンＢ２、Ｂ６、Ｂ９及びＢ１２の様々なレベルを含有する細胞培地で培養された細胞株から単離された抗体において、色強度と酸性電荷変異体の形成との相関関係を調べた。ＣＨＯ細胞からモノクローナルＩｇＧ１抗体（抗ベータ７）を生成するため、１．４１ｍｇ／ＬのビタミンＢ２、１５．４２ｍｇ／Ｌのピリドキシン、０ｍｇ／Ｌのピリドキサール、９．９３ｍｇ／ＬのビタミンＢ９、及び３．０５ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２を含有する基礎培地、及びビタミンＢ２、Ｂ６、Ｂ９及びＢ１２の様々なレベルを各々含有する３つの異なる流加培地により培養した。クエン酸第二鉄又は硫酸第一鉄が基礎培地に与えられ、細胞培養プロセスは流加バッチモードで行った。抗体はその後単離され、酸性電荷変異体の存在に加えて、全色アッセイを使用して色強度を測定した。ＪＭＰ８．０．２統計ソフトウェアを用いた酸性電荷変異体の存在との関係として色強度の解析は、１０ｍｇ／ＬのビタミンＢ２、７ｍｇ／Ｌのピリドキシン、６０ｍｇ／Ｌのピリドキサール、１９７ｍｇ／ＬのビタミンＢ９、及び４８ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２を含有する流加培地と比較して、１８μＭの硫酸第一鉄又は１８μＭのクエン酸第二鉄の何れかの存在下で５ｍｇ／ＬのビタミンＢ２、３．５ｍｇ／Ｌのピリドキシン、３０ｍｇ／Ｌのピリドキサール、９８．５ｍｇ／ＬのビタミンＢ９、及び２４ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２を含有する流加培地で培養した細胞株から単離された抗体において、色強度の減少を示した（図１１Ａ：各々ビタミンレベル２及びビタミンレベル３）。色強度の最大の減少は、ビタミンＢ２、Ｂ６、Ｂ９、及びＢ１２が欠如した流加培地で培養した細胞から単離された抗体において見られた（図１１Ａ：ビタミンレベル１）。ビタミンＢ２、Ｂ６、Ｂ９、及びＢ１２の濃度の減少に伴い、抗体の色強度に著しい減少が生じたものの、予備的結果では酸性電荷変異体の存在下で有意な変化は無かった（図１１Ｂ）。
【０１８１】
異なる起源からの鉄の漸増濃度を含む細胞培地で培養された細胞株から単離された抗体において、色強度と酸性電荷変異体の形成との相関関係を調べた。ＣＨＯ細胞からモノクローナルＩｇＧ１抗体（抗ベータ７）を生成するため、細胞は、１８μＭの硫酸第一鉄を含有する基礎培地１又は１０μＭの硫酸第一鉄を含有する基礎培地１３で、流加培養モードで培養した。更なる細胞培養物に、１８μＭのクエン酸第二鉄を含有する基礎培地１５又は１０μＭのクエン酸第二鉄を含有する基礎培地１６が与えられた。全ての細胞培養物は、鉄を含まない流加培地を流加培養モードで与えられた。実施例３に記載のように、色強度はニフティアッセイを用いて測定した。色強度の最大の減少は、減少したレベルの鉄を含有する基礎培地で培養した細胞から単離された抗体で見られた（図１２Ａ）。単離された抗体溶液において、色強度の減少は酸性電荷変異体の存在の減少と相関していた（図１２Ｂ）。
【０１８２】
クエン酸第二鉄の漸増濃度を含む細胞培地で培養された細胞株から単離された抗体において、色強度と酸性電荷変異体の形成との相関関係を調べた。ＣＨＯ細胞からモノクローナルＩｇＧ１抗体（抗ベータ７）を生成するため、細胞は、１８μＭのクエン酸第二鉄又は３６μＭのクエン酸第二鉄を各々含有する修飾基礎培地１又は修飾基礎培地３で培養した。全ての細胞培養物は、鉄を含まない流加培地を流加培養モードで与えられた。モノクローナルＩｇＧ１抗体は、３３℃又は３７℃でインキュベートした細胞培養物から単離した。色の強度は、より高い数値は、より高い色強度を示し、より低い数値はより低い色強度を示す、色のアッセイ、具体的には全色アッセイを用いて決定した。色強度の最大の減少は、減少したレベルのクエン酸第二鉄を含有する基礎培地で培養した細胞から単離された抗体で見られた（図１３Ａ）。単離された抗体溶液において、色強度の減少は酸性電荷変異体の存在の減少と相関していた。３３℃で培養した細胞から単離された抗体は、酸性電荷変異体の最大の減少を示した（図１３Ｂ）。３３℃から３７℃まで温度を増加させると、修飾基礎培地１又は修飾基礎培地３の何れかで培養した抗体産生細胞によって、約２５００ｍｇ／Ｌから４２５０ｍｇ／Ｌまで、抗体産生の有意な増加をもたらした。
【０１８３】
ＣＨＯ細胞株によって産生された単離されたモノクローナルＩｇＧ１抗体（抗ベータ７）の色強度に対するシステインの寄与を決定する細胞培養実験で使用のため、基礎培地３は、４８０ｍｇ／Ｌのシステインの代わりに５２５ｍｇ／Ｌのシステインを含有するように再調合された。ＣＨＯ細胞からのモノクローナルＩｇＧ１抗体を生成するため、細胞は、５２５ｍｇ／Ｌのシステインを含有する修飾基礎培地３及び流加培地４の中で流加培養モードで培養された。抗体は単離され、色は標準ＣＯＣアッセイを用いて測定した。ＣＯＣアッセイは、平底の無色、透明な中性ガラスで、内径が１５ｍｍから２５ｍｍの同一チューブを使用して行われた。２本のチューブは各々、分泌されたＩｇＧ１モノクローナル抗体を含む精製され濃縮された細胞培養液から調製した１５０ｇ／Ｌのタンパク質溶液で４０ｍｍの深さまで充填した。抗体溶液を含んだ各チューブは、７つの参照バイアル（各々はＢＹ１（最も暗い）からＢＹ７（最も明るい）までの範囲の標準溶液を充填）、又は９つの参照バイアル（各々はＢ１（最も暗い）からＢ９（最も明るい）までの範囲の標準溶液を充填）のどちらかに対して、拡散昼光下で白い背景に対して縦に観察することによって比較した。抗体含有溶液の色の解析は、ＣＯＣ値が≦Ｂ５又は≦ＢＹ５を実証した（図１；それぞれ製剤ＶＩ及びＶＩＩＩ）。抗体製剤ＶＩは、上述したように全色アッセイ及び実施例３に記載したようにニフティアッセイを使用して色強度について更にアッセイした。抗体製剤の色分析は、ニフティアッセイと全色アッセイで測定した場合、それぞれ０．７１及び１．００の色強度値を示した。この抗体製剤は、抗体製剤ＩＩＩ（実施例１に記載）及び抗体製剤ＩＶ（実施例３に記載）の色強度と比較して色が薄かった。抗体製剤ＩＩＩは、ニフティアッセイと全色アッセイで測定した場合、それぞれ１．５９及び２．６１の色強度値を示した。抗体製剤ＩＶは、ニフティアッセイと全色アッセイで測定した場合、それぞれ１．４７及び２．０４の色強度値を示した。
【０１８４】
シスチン又はシステインの存在下又は非存在下、及びヒドロコルチゾンの存在下又は非存在下で、様々な濃度のビタミンＢ２、Ｂ６、Ｂ９及びＢ１２を含有する細胞培地で培養した細胞株から単離した抗体において、酸性電荷変異体の形成と色強度の相関を決定するために、多変量解析が行われた。ＣＨＯ細胞からモノクローナルＩｇＧ１抗体（抗ベータ７）を生成するため、細胞は、１．４１ｍｇ／ＬのビタミンＢ２、１５．４２ｍｇ／Ｌのピリドキシン、０ｍｇ／ｍＬのピリドキサール、９．９３ｍｇ／ＬのビタミンＢ９を含有する修飾基礎培地、及び３．０５ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２、０．７ｍｇ／ＬのビタミンＢ２、７．７ｍｇ／Ｌのピリドキシン、０ｍｇ／Ｌのピリドキサール、４．９ｍｇ／ＬのビタミンＢ９、及び１．５ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２を含有する修飾基礎培地で培養した。更に、基礎培地は、５２５ｍｇ／Ｌのシステイン又は４８０ｍｇ／Ｌのシスチンのどちらかを含めた。更なる基礎培地は、表Ｇにあるように調製され、１５０ｎＭのヒドロコルチゾンが補充された。全ての細胞培養物は、鉄を含まない流加培地を流加培養モードで与えられた。
【０１８５】
2018183154.tif 000018
【０１８６】
モノクローナルＩｇＧ１抗体は、細胞培養物から単離され、色の強度、並びに酸性電荷変異体の存在を測定した。色強度は、上述されるように全色アッセイを用いて決定した。ＪＭＰ８．０．２統計ソフトウェアを用いた酸性電荷変異体の存在との関係として色強度の解析は、システインと比較してシスチンを含有する基礎培地で培養した細胞株から単離された抗体溶液中における、色強度の減少と酸性電荷変異体のレベルの減少との間の相関を実証した（図１４Ａ及びＢ）。更に、ビタミンＢレベルの減少は、その減少を増強するヒドロコルチゾンの添加により、色強度の減少と酸性電荷変異体の形成をももたらした（図１４Ａ及びＢ）。
【０１８７】
実施例６：細胞株から単離されたモノクローナルＩｇＧ１抗体の色強度は、細胞培養培地中の特定成分の変化によって減少した。
基礎細胞培養培地に使用される場合のシスチンの色強度減少作用は、異なるモノクローナルＩｇＧ１抗体を生成するＣＨＯ細胞を用いて更に探求された。細胞株は、２．６ｍＭの濃度でモノマー形態のアミノ酸システイン（システイン）又は１．３ｍＭの濃度でダイマー形態のアミノ酸（シスチン）の何れかを含む未定義な基礎培地で培養された。ｍＡｂ１０の生成は、未定義な基礎培地に細胞を播種することによって細胞培養物中で開始され、流加培養培地が、第３日から１４日にわたる細胞培養サイクルでバイオリアクターに添加された。細胞を、第１日目に３７℃で培養し、温度シフトは、細胞培養サイクルにわたって開始した。培地を回収し、ｍＡｂ１０は、ＣＯＣアッセイによる色強度の評価の前に組成物として回収した。ｍＡｂ１０を含む組成物は、システインを含有する基礎培地で培養した細胞から回収され、無色又は僅かに着色した液体として現れ、ＣＯＣアッセイによって決定される場合Ｂ７の色強度値であった。システインがシスチンに置き換えられた基礎培地で培養した細胞から回収されたｍＡｂ１０を含む組成物は、無色又はＢ８の改善された色強度ＣＯＣ値を有する僅かに着色した液体として現れた。
【０１８８】
多変量解析において、細胞培養物から回収された抗体を含む組成物の色強度における特定の培地成分の影響を評価するため、ＣＨＯ細胞からｍＡｂ１０を生成するための４つの異なるプロトコルを使用した（表Ｈ）。未定義の細胞培養基礎培地中の鉄のレベル並びに鉄源は、プロトコル間で異なっていた。未定義の基礎培地中のビタミンＢレベル及びモノマー形態（システイン）又はダイマー形態（シスチン）のアミノ酸システインはまた、プロトコル間で異なっていた。ｍＡｂ１０の生成は、未定義な基礎培地に細胞を播種することによって細胞培養物中で開始され、流加培養培地が、第３日から１４日にわたる細胞培養サイクルでバイオリアクターに添加された。培地を回収し、ｍＡｂ１０は、ＣＯＣアッセイによる色強度の評価の前に組成物として回収した。回収されたモノクローナル抗体を含有する組成物の色強度の分析は、プロトコル１、２、及び３は、プロトコル４で得られた抗体組成物の色強度（Ｂ６のＣＯＣ値）と比較して、色強度が減少した（Ｂ７のＣＯＣ値）抗体組成物をもたらすことを実証した。これらの結果は、基礎培地においてシステインの代わりにシスチンの使用は、ビタミンＢレベルを減少させ、及び／又は鉄の減少並びに鉄源の変化は、ｍＡｂ１０組成物において色強度の減少をもたらすことを示していた（表Ｈ）。例えば、プロトコル４と比較してプロトコル３において、ビタミンＢレベルの減少及びより低濃度での硫酸第一鉄のクエン酸第二鉄での置換は、シスチンの代わりにシステインの使用を変更する必要なく、抗体組成物の色の強度を減少させた。クエン酸第二鉄は、低濃度で硫酸第一鉄で置換され、シスチンは、ビタミンＢレベルの変更なしにシステインで置換される場合に、色強度の減少における同様の効果が、プロトコル４に対してプロトコル２で観察された。また、プロトコル１に見られるように、ビタミンＢレベルの減少、鉄レベルの減少及び鉄源の変化、並びにシステインの代わりにシスチンの使用は、プロトコル４から得られたｍＡｂ１０組成物に比較して、ｍＡｂ１０組成物の色強度を減少させた（表Ｈ）。
【０１８９】
2018183154.tif 000019
【０１９０】
実施例７：ニフティアッセイ及び全色アッセイは、抗体を含有する溶液中において色強度を測定するための標準的なＣＯＣアッセイに匹敵する。
高濃度製剤に関する最近の重視は、一般的に、モノクローナル抗体液体製剤の色強度を増加している。色は、製剤品質特性と考えられており、それに応じて、プロセスの変更を開発し実施しながら、薬物物質の色は一貫性において厳密に監視されることが重要である。色を測定するために直面している課題の一つは、適切なアッセイの使用である。業界標準であるにもかかわらず、ＣＯＣアッセイは、完全に定量的ではなく、アッセイを行う人の主観的な判断に対して脆弱である。この問題を克服するために、色測定のための２つの異なる方法として、全色アッセイ及びニフティアッセイが、色強度を測定するために実施例に記載するように開発され、使用された。
【０１９１】
これら三つの色測定アッセイとの相関関係を、横軸に全色の値を、縦軸にニフティ値を、全色アッセイとニフティアッセイにより測定される抗体含有溶液に関して実施される実際のＣＯＣの測定値に基づいたデータ点とともにプロットすることにより決定した（図１５Ａ）。全色アッセイ及びニフティアッセイからの定量的測定の間に良好な相関があった（Ｒ２＝０．７５）。加えて、これらのアッセイは実際のＣＯＣ測定と合理的に良く相関していることを見てとることができ、全色アッセイ及びニフティアッセイからの結果は、試料の色強度の有益な予測因子であったことを示している。
【０１９２】
色の強さの測定の前に、抗体を回収し、２つの異なる方法により細胞培養物から精製した。一の方法において、回収した細胞培養液中のモノクローナル抗体は、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。精製後、溶出されたプロテインＡプール中のタンパク質の濃度は、約５〜１０ｇ／Ｌであった。プロテインＡプールは、アミコンセントリコン遠心フィルター装置を使用して１５０ｇ／Ｌまで更に濃縮した。色は、標準ＣＯＣアッセイ、全色アッセイ又はニフティアッセイを使用して濃縮されたプロテインＡプールで測定した。他の方法として、回収された細胞培養液は、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを介したアフィニティー精製、陰イオン及び陽イオン交換クロマトグラフィー、ウイルスを除去するための濾過、及び標準ＣＯＣアッセイ、全色アッセイ又はニフティアッセイによる色の測定の前に、抗体の最終製剤と濃度のための最終的な限外濾過及び透析濾過工程が含まれる標準的な抗体精製法を用いて精製された。
【０１９３】
実施上の配慮のため、実施例に記載した実験のいくつかでは、最終薬物物質の色のためのプロキシとしてプロテインＡプールの色を使用することを決定した。最終的に完全に精製された抗体製剤から得られるであろう色強度のために、プロテインＡプールから調製された抗体製剤で測定された色強度の予測値が評価された。最終的に完全に精製された抗体製剤に対する、プロテインＡプールから得られた抗体含有溶液中でのニフティアッセイ（図１５Ｂ）又は全色アッセイ（図１５Ｃ）によって測定された色強度の比較は、全色測定（Ｒ２＝０．７３）及びニフティ測定（Ｒ２＝０．９８）に対して合理的に良好な相関を示した。全色は、プールの吸光度スペクトルから生じ、従って、より高い色強度は、非抗体不純物の存在のため又は光散乱の増加のため、先行する工程内のプールで期待できる。対照的に、ニフティ値はサイズ排除クロマトグラムの主ピークから測定されるので、着色又は非着色タンパク質分子が優先的に精製されなかった場合、精製プロセスを通して一定のままであることが期待されうる。全体的に、合理的な相関が、プロテインＡプールと処方された薬物物質との間の色測定値の間で見られた。
【図１】
2018183154.tif 000020
【図２Ａ−Ｂ】
2018183154.tif 000021
【図２Ｃ−Ｄ】
2018183154.tif 000022
【図３】
2018183154.tif 000023
【図４】
2018183154.tif 000024
【図５】
2018183154.tif 000025
【図６Ａ−Ｃ】
2018183154.tif 000026
【図６Ｄ−Ｅ】
2018183154.tif 000027
【図７】
2018183154.tif 000028
【図８】
2018183154.tif 000029
【図９】
2018183154.tif 000030
【図１０】
2018183154.tif 000031
【図１１】
2018183154.tif 000032
【図１２】
2018183154.tif 000033
【図１３】
2018183154.tif 000034
【図１４】
2018183154.tif 000035
【図１５】
2018183154.tif 000036
【手続補正書】
【提出日】平成30年8月3日(2018.8.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【外国語明細書】
2018183154000001.pdf