(57)【要約】      （修正有）【課題】目的とするポリペプチドをコードし、定義可能な疾患特徴または測定基準に沿ったより優れた選択性、プロファイリングまたは層別化を可能にする構造および／または化学的特徴を有する、核酸系化合物またはポリヌクレオチドをコードする核酸系化合物を提供する。【解決手段】単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチドは、目的とする腫瘍学関連ポリペプチド、ならびに、特定の塩基配列およびそれらの機能的変異形のいずれかからなる群から選択される１つ以上のセンサー配列をコードするｍＲＮＡを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチドであって、目的とする腫瘍学関連ポリペプチド、ならびに、配列番号３５２９〜４５４９、配列番号５５７１〜６５９１およびそれらの機能的変異形のいずれかからなる群から選択される１つ以上のセンサー配列をコードするｍＲＮＡを含む、前記単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記目的とする腫瘍学関連ポリペプチドが配列番号１３２１〜２４８７、６６１１〜６６１６、７３５５〜７３６１、７４９０、７４９２、７４９３、７５１２、７５１４、７５１６および７５１７からなる群から選択される、請求項１に記載の単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記ｍＲＮＡが、少なくとも、配列番号２４８８〜２４９６、６６１７〜６６２１、７３４８〜７３５４、７３６２〜７４８９、７４９１、７４９４、７５０６、７５１１および７５１３からなる群から選択される核酸配列のオープンリーディングフレームを含む、請求項１に記載の単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記オープンリーディングフレームがコドン最適化された、請求項３に記載の単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記ｍＲＮＡが２つの終止コドンを含む、請求項１に記載の単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記ｍＲＮＡが第１の終止コドン「ＴＧＡ」、ならびに、「ＴＡＡ」、「ＴＧＡ」および「ＴＡＧ」からなる群から選択される第２の終止コドンを含む、請求項１に記載の単離合成シグナルセンサー単離ポリヌクレオチド。
【請求項７】
前記ｍＲＮＡが、少なくとも１４０個のヌクレオチドのポリＡ尾部、三重鎖およびＡーＧカルテットからなる群から選択される、結合ヌクレオシドの３’尾部配列を有する、請求項１に記載の単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチド。
【請求項８】
前記ｍＲＮＡが、キャップ０、キャップ１、ＡＲＣＡ、イノシン、Ｎ１−メチル−グアノシン、２’フルオロ−グアノシン、７−デアザ−グアノシン、８−オキソ−グアノシン、２−アミノ−グアノシン、ＬＮＡ−グアノシン、および２−アジド−グアノシンからなる群から選択される５’末端キャップを少なくとも１つ含む、請求項１に記載の単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチド。
【請求項９】
前記単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチドが実質的に精製されている、請求項１に記載の単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチド。
【請求項１０】
前記単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチドが少なくとも１つの化学修飾を含む、請求項１に記載の単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチド。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの化学修飾が１−メチルシュードウリジンである、請求項１０に記載の単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチド。
【請求項１２】
化学修飾５−メチルシチジンをさらに含む、請求項１１に記載の単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチド。
【請求項１３】
前記単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチドが少なくとも２つの化学修飾を含む、請求項１に記載の単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチド。
【請求項１４】
前記修飾がヌクレオシドおよび／または前記ヌクレオチドの骨格のうちの１つ以上の上に位置する、請求項１３に記載の単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチド。
【請求項１５】
前記修飾がヌクレオシドおよび骨格結合の双方上に位置する、請求項１３に記載の単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチド。
【請求項１６】
前記修飾が前記骨格結合上に位置する、請求項１３に記載の単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチド。
【請求項１７】
単離シグナルセンサーポリヌクレオチドがコドン最適化された、請求項１に記載の単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチド。
【請求項１８】
単離シグナルセンサーポリヌクレオチドが製剤化される、請求項１に記載の単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチド。
【請求項１９】
目的とする前記ポリペプチドが、ＨＩＦサブユニット間の親和性および／またはＨＩＦ−依存性遺伝子発現を調節する因子である、請求項１に記載の単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチド。
【請求項２０】
前記ＨＩＦサブユニットが配列番号６６１１〜６６１６からなる群から選択される、請求項１９に記載の単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチド。
【請求項２１】
前記単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチドが少なくとも１つの翻訳エンハンサー要素を含む、請求項１に記載の単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチド。
【請求項２２】
単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチドであって、
（ａ）結合ヌクレオシドの第１の領域であって、前記第１の領域が、配列番号１３２１〜２４８７、６６１１〜６６１６および７３５５〜７３６１、７４９０、７４９２、７４９３、７５１２、７５１４、７５１６および７５１７からなる群から選択される、目的とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードする、前記結合ヌクレオシドの第１の領域と、
（ｂ）前記第１の領域に対して５’に位置する第１の隣接領域であって、
（ｉ）配列番号１３２１〜２４８７、６６１１〜６６１６、７３５５〜７３６１、７４９０、７４９２、７４９３、７５１２、７５１４、７５１６、７５１７、配列番号１〜４、およびそれらの機能的変異形のうちのいずれかをコードする核酸のうちのいずれかの天然５’非翻訳領域（ＵＴＲ）からなる群から選択される結合ヌクレオシドの配列を含む前記第１の隣接領域と、
（ｃ）前記第１の領域に対して３’に位置する第２の隣接領域であって、
（ｉ’）配列番号１３２１〜２４８７、６６１１〜６６１６、７３５５〜７３６１、７４９０、７４９２、７４９３、７５１２、７５１４、７５１６、７５１７、配列番号５〜２１、およびそれらの機能的変異形のうちのいずれかをコードする核酸のうちのいずれかの天然３’ＵＴＲからなる群から選択される結合ヌクレオシドの配列と、
（ｉｉ’）配列番号３５２９〜４５４９、配列番号５５７１〜６５９１およびそれらの機能的変異形のいずれかからなる群から選択されて位置する１つ以上のセンサー配列と、
（ｉｉｉ’）結合ヌクレオシドの３’尾部配列とを含む前記第２の隣接領域と、を含む、前記単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチド。
【請求項２３】
前記結合ヌクレオシドの第１の領域が核酸配列のオープンリーディングフレームを少なくとも含み、前記核酸配列が配列番号２４８８〜２４９６、６６１７〜６６２１、７３４８〜７３５４、７３６２〜７４８９、７４９１、７４９４、７５０６、７５１１および７５１３からなる群から選択される、請求項２２に記載の単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチド。
【請求項２４】
前記オープンリーディングフレームがコドン最適化された、請求項２３に記載の単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチド。
【請求項２５】
前記第１の領域が２つの終止コドンを含む、請求項２２に記載の単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチド。
【請求項２６】
前記第１の領域が第１の終止コドン「ＴＧＡ」、ならびに、「ＴＡＡ」、「ＴＧＡ」および「ＴＡＧ」から成る群から選択される第２の終止コドンを含む、請求項２２に記載の単離合成シグナルセンサー単離ポリヌクレオチド。
【請求項２７】
前記結合ヌクレオシドの３’尾部配列が、少なくとも１４０個のヌクレオチドのポリＡ尾部、三重鎖、およびポリＡーＧカルテットからなる群から選択される、請求項２２に記載の単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチド。
【請求項２８】
前記第１の隣接領域が少なくとも１つの５’末端キャップをさらに含む、請求項２２に記載の単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチド。
【請求項２９】
前記少なくとも１つの５’末端キャップが、キャップ０、キャップ１、ＡＲＣＡ、イノシン、Ｎ１−メチル−グアノシン、２’フルオロ−グアノシン、７−デアザ−グアノシン、８−オキソ−グアノシン、２−アミノ−グアノシン、ＬＮＡ−グアノシン、および、２−アジド−グアノシンからなる群から選択される、請求項２８に記載の単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチド。
【請求項３０】
単離シグナルセンサーポリヌクレオチドが実質的に精製されている、請求項２８に記載の単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチド。
【請求項３１】
単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチドが少なくとも１つの化学修飾を含む、請求項２２に記載の単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチド。
【請求項３２】
前記少なくとも１つの化学修飾が１−メチルシュードウリジンである、請求項３１に記載の単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチド。
【請求項３３】
化学修飾５−メチルシチジンをさらに含む、請求項３２に記載の単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチド。
【請求項３４】
前記第１の領域に少なくとも２つの化学修飾を含む、請求項２２に記載の単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチド。
【請求項３５】
前記修飾が、ヌクレオシドおよび／または前記ヌクレオチドの骨格のうちの１つ以上の上に位置する、請求項３４に記載の単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチド。
【請求項３６】
前記修飾が、ヌクレオシドおよび骨格結合の双方上に位置する、請求項３４に記載の単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチド。
【請求項３７】
前記修飾が骨格結合上に位置する、請求項３４に記載の単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチド。
【請求項３８】
前記単離シグナルセンサーポリヌクレオチドがコドン最適化された、請求項２２に記載の単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチド。
【請求項３９】
結合ヌクレオシドの前記第１の領域がコドン最適化された、請求項３８に記載の単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチド。
【請求項４０】
前記単離シグナルセンサーポリヌクレオチドが製剤化される、請求項２２に記載の単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチド。
【請求項４１】
目的とする腫瘍学関連ポリペプチドの量を増大することで、必要な対象の疾患、障害および／または状態を治療する方法であって、前記対象に、前記腫瘍学関連ポリペプチドをコードする単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチドを投与することを含む、前記方法。
【請求項４２】
目的とする腫瘍学関連ポリペプチドの量を増大することで、必要な対象の腫瘍成長を軽減、除去または阻止する方法であって、前記対象に、前記腫瘍学関連ポリペプチドをコードする単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチドを投与することを含む、前記方法。
【請求項４３】
目的とする腫瘍学関連ポリペプチドの量を増大することで、必要な対象のがんの症状の少なくとも１つを軽減および／または改善する方法であって、前記対象に、前記腫瘍学関連ポリペプチドをコードする単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチドを投与することを含む、前記方法。
【請求項４４】
前記疾患、障害および／または状態が、副腎皮質癌、進行癌、肛門癌、再生不良性貧血、胆管癌、膀胱癌、骨がん、骨転移、脳腫瘍、脳がん、乳癌、小児癌、原発不明のがん、キャッスルマン病、子宮頸癌、大腸／直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、ユーイング腫瘍、眼癌、胆嚢癌、胃腸カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、ホジキン病、カポジ肉腫、腎細胞癌、喉頭および下咽頭癌、急性リンパ性白血病、急性骨髄白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄単球性白血病、肝臓癌、肝細胞癌（ＨＣＣ）、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、肺カルチノイド腫瘍、皮膚のリンパ腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔および副鼻腔癌、鼻咽腔癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、口腔および中咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、陰茎癌、下垂体部腫瘍、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、成人軟組織の肉腫、基底および扁平細胞皮膚癌、黒色腫、小腸癌、胃癌、睾丸癌、喉頭癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宮肉腫、膣癌、外陰癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍ならびにがん治療によって引き起こされる二次発癌からなる群から選択される、請求項４１〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記腫瘍成長が、副腎皮質癌、進行癌、肛門癌、再生不良性貧血、胆管癌、膀胱癌、骨がん、骨転移、脳腫瘍、脳がん、乳癌、小児癌、原発不明のがん、キャッスルマン病、子宮頸癌、大腸／直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、ユーイング腫瘍、眼癌、胆嚢癌、胃腸カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、ホジキン病、カポジ肉腫、腎細胞癌、喉頭および下咽頭癌、急性リンパ性白血病、急性骨髄白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄単球性白血病、肝臓癌、肝細胞癌（ＨＣＣ）、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、肺カルチノイド腫瘍、皮膚のリンパ腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔および副鼻腔癌、鼻咽腔癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、口腔および中咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、陰茎癌、下垂体部腫瘍、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、成人軟組織の肉腫、基底および扁平細胞皮膚癌、黒色腫、小腸癌、胃癌、睾丸癌、喉頭癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宮肉腫、膣癌、外陰癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍ならびにがん治療によって引き起こされる二次発癌からなる群から選択される疾患、障害および／または状態の結果である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチドの投与が、がん細胞の数を低下させる、がん細胞を除去する、がん細胞の増加を阻止する、および／または、対象のがんの症状を緩和する、請求項４１〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記がんの症状の少なくとも１つが、脱力感、疼痛および痛み、熱、疲労、体重減少、血液凝固、血液のカルシウム量の上昇、白血球数の低下、息切れ、めまい、頭痛、色素沈着過剰、黄疸、紅斑症、そう痒症、多毛症、排便習慣の変化、膀胱機能の変化、永続的な潰瘍、口内の白い斑点、舌上の白点、異常な出血または排泄、身体部分の肥大またはこぶ、消化不良、呑み込みにくさ、いぼまたはほくろの変化、新しい皮膚の変化ならびにしつこい咳およびしわがれ声から成る群から選択される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４８】
単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチドが製剤化される、請求項４１〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチドが０．００１μｇ〜１５０μｇの総１日用量で投与される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
投与が注射、局所投与、眼内投与または鼻腔内投与である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
投与が注射によってであり、前記注射が、皮内、皮下および筋肉内からなる群から選択される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
投与が局所投与であり、前記局所投与が、クリーム、ローション、軟膏、ジェル、スプレー、溶液などからなる群から選択される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
組織または器官のがん細胞に細胞死を優先的に誘導する方法であって、
（ａ）前記組織または器官を単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチドに接触させることを含み、前記単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチドは、
（ｉ）発現がアポトーシスまたは細胞死を引き起こす腫瘍学関連ポリペプチドおよび
（ｉｉ）マイクロＲＮＡの少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位であって、がん細胞での前記マイクロＲＮＡの発現が、正常な非がん細胞での前記マイクロＲＮＡの発現よりも低い、前記少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位をコードする、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年１月１７日出願の米国仮特許出願第６１，７５３，６６１号、表題「Ｓｉｇｎａｌ−Ｓｅｎｓｏｒ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ」、２０１３年１月１８日出願の米国仮特許出願第６１／７５４，１５９号、表題「Ｓｉｇｎａｌ−Ｓｅｎｓｏｒ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ」、  ２０１３年３月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７８１，０９７号、表題「Ｓｉｇｎａｌ−Ｓｅｎｓｏｒ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ」、  ２０１３年５月３１日出願の米国仮特許出願第６１／８２９，３３４号、表題「Ｓｉｇｎａｌ−Ｓｅｎｓｏｒ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ」、２０１３年６月２７日出願の米国仮特許出願第６１／８３９，８９３号、  表題「Ｓｉｇｎａｌ−Ｓｅｎｓｏｒ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ」、２０１３年７月３日出願の米国仮特許出願第６１／８４２，７３３号、表題「Ｓｉｇｎａｌ−Ｓｅｎｓｏｒ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ
Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ」、および２０１３年７月２３日出願の米国仮特許出願第６１／８５７，３０４号、表題「Ｓｉｇｎａｌ−Ｓｅｎｓｏｒ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ」に対する優先権を主張し、各々の内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表の参照
本出願は、配列表とともに電子書式で出願されている。Ｍ３７ＰＣＴ．ｔｘｔと題される配列表ファイルは、２０１３年９月３０日に作成され、９，７４８，４７３バイトの大きさである。この配列表の電子書式での情報は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００３】
発明の分野
本発明は、細胞表現型および微小環境の改変のための、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物およびｍＲＮＡ分子の設計、調製、製造、および／または製剤化のための組成物、方法、プロセス、キット、ならびにデバイスに関する。
【背景技術】
【０００４】
がんは、体内における制御不能の細胞分裂および成長を特徴とする疾患である。米国では、全女性のうちおよそ３分の１、および、全男性のうちおよそ半分の人が生涯のうちにがんを経験する。ポリペプチドは、がん細胞生物学（発癌、細胞周期抑制、ＤＮＡ修復および血管新生）、治療（免疫療法、ホルモン操作、酵素阻害）、がんの種類の診断および決定（例えば、乳癌、前立腺癌、大腸癌および子宮頸癌用の分子マーカー）を含む、疾患のあらゆる方面に関わる。今日使用される化学療法および放射療法といった標準的な治療によってもたらされる望ましくない結果を考慮すると、疾患関連ペプチドおよびその機能の操作のための遺伝子療法は、疾患診断、治療および管理をさらに標的にしたアプローチを提供する。
【０００５】
この目的のために、ある特定の修飾ｍＲＮＡ配列が、免疫応答を単に逃れる、避けるまたは低減するだけではない、それ以上の利点を伴う治療薬としての可能性を有することが以前に示されている。そのような研究は、公開された同時係属出願である、２０１年８月５日に出願された国際公開第ＷＯ２０１２０１９１６８号、２０１１年１０月３日に出願された国際公開第ＷＯ２０１２０４５０８２号、２０１１年１０月３日に出願された国際公開第ＷＯ２０１２０４５０７５号、２０１２年１０月３日に出願された国際公開第ＷＯ２０１３０５２５２３号、２０１２年１２月１４日に出願された国際公開第ＷＯ２０１３０９０６４８号で詳細に記載されており、これらの内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００６】
抗体、ウイルス、獣医学における適用の分野および様々なインビボ環境における修飾ポリヌクレオチドの使用が調査されており、例えば、同時係属出願および共有出願である、２０１２年４月２日出願の米国仮特許出願第６１／６１８，８６２号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ」、２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，６４５号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ」、２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，１３０号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ」、２０１２年４月２日出願の米国仮特許出願第６１／６１８，８６６号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，６４７号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ
ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，１３４号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、２０１２年４月２日出願の米国仮特許出願第６１／６１８，８６８号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ」、２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，６４８号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ」、２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，１３５号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ」、２０１２年４月２日出願の米国仮特許出願第６１／６１８，８７０号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」、２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，６４９号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」、２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，１３９号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」、２０１２年４月２日出願の米国仮特許出願第６１／６１８，８７３号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，６５０号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，１４７号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１２年４月２日出願の米国仮特許出願第６１／６１８，８７８号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌａｓｍａ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，６５４号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌａｓｍａ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，１５２号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌａｓｍａ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１２年４月２日出願の米国仮特許出願第６１／６１８，８８５号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，６５８号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，１５５号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１２年４月２日出願の米国仮特許出願第６１／６１８，８９６号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ
Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｏｕｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１２年７月５日出願の米国仮特許出願第６１／６６８，１５７号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｏｕｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，６６１号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ｏｆ  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｏｕｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，１６０号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｏｕｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１２年４月２日出願の米国仮特許出願第６１／６１８，９１１号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，６６７号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，１６８号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１２年４月２日出願の米国仮特許出願第６１／６１８，９２２号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，６７５号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，１７４号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１２年４月２日出願の米国仮特許出願第６１／６１８，９３５号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ」、２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，６８７号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ」、２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，１８４号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ」、２０１２年４月２日出願の米国仮特許出願第６１／６１８，９４５号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ
Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ」、２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，６９６号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ」、２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，１９１号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ」、２０１２年４月２日出願の米国仮特許出願第６１／６１８，９５３号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ」、２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，７０４号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ」、２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，２０３号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ
Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ」、２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，７２０号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」、２０１２年１２月１４日出願の米国特許仮出願第６１／７３７，２１３号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」、２０１２年８月１０日出願の米国特許仮出願第６１／６８１，７４２号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ−Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」、２０１３年３月９日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００６２号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ
Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ」、２０１３年３月９日出願の米国特許出願第１３／７９１，９２２号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ」、２０１３年３月９日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００６３号、表
題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」、  国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００６４号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ
ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１３年３月９日出願の米国特許出願第１３／７９１，９２１号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１３年３月９日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００５９号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１３年３月９日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００６６号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１３年３月９日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００６７号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１３年３月９日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００６０号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１３年３月９日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００６１号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ」、２０１３年３月９日出願の米国特許出願第１３／７９１，９１０号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ
ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ」、２０１３年３月９日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ第２０１３／０３００６８号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」、および、２０１３年３月９日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００７０号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ−Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」、２０１３年３月１５日出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３１８２１号、表題「Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」に開示されており、各々の内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００７】
修飾ポリヌクレオチドの製剤化および送達が、例えば、同時係属出願および共有出願中である、２０１２年１２月１４日出願の国際公開第ＷＯ２０１３０９０６４８号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ」および２０１２年１２月１４日出願の米国公開第２０１３０１５６８４９号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ」で説明されており、各々の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００８】
次世代の治療剤はまた、がんの複雑な細胞微小環境にも対処しなくてはならず、構造上または機能上のいずれかにせよ、細胞、組織、器官または患者を層別化する能力を有していなくてはならない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、目的とするポリペプチドをコードし、定義可能な疾患特徴または測定基準に沿ったより優れた選択性、プロファイリングまたは層別化を可能にする構造および／または化学的特徴を有する、核酸系化合物またはポリヌクレオチドをコードする核酸系化合物（例えば、シグナルセンサーポリヌクレオチド）を提供することによって、この必要性に対処する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
目的とする腫瘍学関連ポリペプチドを少なくとも１つコードするシグナルセンサーポリヌクレオチド分子の組成物、設計、調製、製造、および／または製剤化方法、プロセス、キット、ならびにデバイスが本明細書に記載される。そのようなシグナルセンサーポリヌクレオチドは、化学的に修飾されたｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）分子であり得る。
【００１１】
本発明は、翻訳された時に死または生存シグナルを送るよう機能する、目的とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードする領域を含む、単離シグナルセンサーポリヌクレオチドを提供する。そのような死または生存シグナルには、（ｉ）１つ以上のタンパク質、核酸または非コード核酸の発現を改変（増大または低下）するもの、（ｉｉ）細胞内の生体分子の結合特性を改変するもの、および／または、（ｉｉｉ）治療上効果のある方法で細胞の微小環境を乱すものが包含される。
【００１２】
任意で、シグナルセンサーポリヌクレオチドはまた、隣接領域に、１つ以上のセンサー配列もコードしてもよい。そのようなセンサー配列は、細胞、組織または器官の微小環境を「感知」し、センサー配列と細胞、組織または器官の微小環境の相互作用次第で、シグナルセンサーポリヌクレオチドに改変した発現または半減期プロファイル（増大または低下）を与えるよう機能する。
【００１３】
１つの態様では、結合ヌクレオシドの第１の領域、前記第１の領域に対して５’に位置する第１の隣接領域および前記第１の領域に対して３’に位置する第２の隣接領域を含む、シグナルセンサーポリヌクレオチドが本明細書で提供される。第１の領域は、限定はしないが配列番号１３２１〜２４８７、６６１１〜６６１６ならびに７３５５〜７３６１、７４９０、７４９２、７４９３、７５１２、７５１４、７５１６および７５１７といった目的とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードし得、第１の隣接領域は、限定はしないが、配列番号１３２１〜２４８７、６６１１〜６６１６、７３５５〜７３６１、７４９０、７４９２、７４９３、７５１２、７５１４、７５１６、７５１７、配列番号１〜４およびそれらの機能的変異形のいずれかをコードする核酸のいずれかの天然５’非翻訳領域（ＵＴＲ）といった、結合ヌクレオシドの配列を含み得る。第１の領域は、配列番号２４８８〜２４９６、６６１７〜６６２１、７３４８〜７３５４、７３６２〜７４８９、７４９１、７４９４、７５０６、７５１１および７５１３からなる群から選択される核酸配列のオープンリーディングフレームを少なくとも含み得る。
【００１４】
第２の隣接領域は、限定はしないが、配列番号１３２１〜２４８７、６６１１〜６６１６、７３５５〜７３６１、７４９０、７４９２、７４９３、７５１２、７５１４、７５１６、７５１７、配列番号５〜２１およびそれらの機能的変異形のいずれかをコードする核酸のいずれかの天然３’ＵＴＲといった結合ヌクレオシドの配列、ならびに、限定はしないが配列番号３５２９〜４５４９、配列番号５５７１〜６５９１およびそれらの機能的変異形といった１つ以上のセンサー配列が位置する。シグナルセンサーポリヌクレオチドはまた、結合ヌクレオシドの３’尾部配列を含み得る。
【００１５】
別の態様では、目的とする腫瘍学関連ポリペプチドならびに限定はしないが配列番号３５２９〜４５４９、配列番号５５７１〜６５９１およびそれらの機能的変異形といったセンサー配列を１つ以上コードするｍＲＮＡを含むシグナルセンサーポリヌクレオチドが本明細書で提供される。目的とする腫瘍学関連ポリペプチドは、配列番号１３２１〜２４８７、６６１１〜６６１６、７３５５〜７３６１、７４９０、７４９２、７４９３、７５１２、７５１４、７５１６および７５１７であり得るが、これらに限定はされない。ｍＲＮＡは配列番号２４８８〜２４９６、６６１７〜６６２１、７３４８〜７３５４、７３６２〜７４８９、７４９１、７４９４、７５０６、７５１１および７５１３からなる群から選択される核酸配列のオープンリーディングフレームを少なくとも１つ含み得る。
【００１６】
シグナルセンサーポリヌクレオチドは、１、２または３つ以上の終止コドンを含み得る。１つの態様では、シグナルセンサーポリヌクレオチドは、２つの終止コドンを含む。非制限的な例として、第１の終止コドンは「ＴＧＡ」であり、第２の終止コドンは「ＴＡＡ」「ＴＧＡ」および「ＴＡＧ」からなる群から選択される。別の態様では、シグナルセンサーポリヌクレオチドは、３つの終止コドンを含む。
【００１７】
シグナルセンサーポリヌクレオチドは、制限はしないが、少なくとも１４０個のヌクレオチドのポリＡ尾部、三重鎖、ポリＡーＧカルテットといった、結合ヌクレオシドの３’尾部配列を有し得る。
【００１８】
シグナルセンサーポリヌクレオチドは、限定はしないが、キャップ０、キャップ１、ＡＲＣＡ、イノシン、Ｎ１−メチル−グアノシン、２’フルオロ−グアノシン、７−デアザ−グアノシン、８−オキソ−グアノシン、２−アミノ−グアノシン、ＬＮＡ−グアノシンおよび２−アジドーグアノシンといった５’キャップを有し得る。
【００１９】
１つの態様では、シグナルセンサーポリヌクレオチドは、限定はしないが、１つ以上のヌクレオシドおよび／またはヌクレオチドの骨格の上に配置される修飾といった、少なくとも１つの化学修飾を含み得る。一実施形態において、シグナルセンサーポリヌクレオチドは、シュードウリジン類似体を含み、例えば、１−カルボキシメチル−シュードウリジン、１−プロピニル−シュードウリジン、１−タウリノメチル−シュードウリジン、１−タウリノメチル−４−チオ−シュードウリジン、１−メチル−シュードウリジン（ｍ１ψ）、１−メチル−４−チオ−シュードウリジン（ｍ１ｓ４ψ）、４−チオ−１−メチル−シュードウリジン、３−メチル−シュードウリジン（ｍ３ψ）、２−チオ−１−メチル−シュードウリジン、１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、ジヒドロシュードウリジン、２−チオ−ジヒドロシュードウリジン、２−メトキシウリジン、２−メトキシー４−チオ−ウリジン、４−メトキシーシュードウリジン、４−メトキシー２−チオ−シュードウリジン、Ｎ１−メチル−シュードウリジン、１−メチル−３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）シュードウリジン（ａｃｐ３ψ）および２′−Ｏ−メチル−シュードウリジン（ψｍ）が挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態では、シグナルセンサーポリヌクレオチドは、シュードウリジン類似体１−メチルシュードウリジンを含む。さらに別の実施形態では、シグナルセンサーポリヌクレオチドは、シュードウリジン類似体１−メチルシュードウリジンおよび修飾ヌクレオシド５−メチルシチジンを含む。
【００２０】
別の態様では、シグナルセンサーポリヌクレオチドは、限定はしないが、１つ以上のヌクレオシドおよび／またはヌクレオチドの骨格の上に配置される修飾といった、化学修飾を少なくとも２つ含み得る。非制限的な例として、シグナルセンサーポリヌクレオチドは、化学修飾１−メチルシュードウリジンおよび５−メチルシチジンを含む。
【００２１】
シグナルセンサーポリヌクレオチドは、限定はしないがＴＥＥ−００１〜ＴＥＥ−７０５といった、少なくとも１つの翻訳エンハンサー要素（ＴＥＥ）を含み得る。
【００２２】
１つの態様では、シグナルセンサーポリヌクレオチドは、限定はしないが、配列番号６６１１〜６６１６といった、ＨＩＦサブユニット間の親和性および／またはＨＩＦ依存性遺伝子の発現を調節する因子をコードする。
【００２３】
シグナルセンサーポリヌクレオチドは、精製および／または製剤化され得る。
【００２４】
シグナルセンサーポリヌクレオチドを使用し、本発明は、目的とする腫瘍学関連ポリペプチドの量を増大することで、治療を必要とする対象の疾患、障害および／または状態を治療する方法を提供し、当該方法には、当該対象に、前記腫瘍学関連ポリペプチドをコードする単離シグナルセンサーポリヌクレオチドを投与することを含む。疾患、障害および／または状態には、副腎皮質癌、進行癌、肛門癌、再生不良性貧血、胆管癌、膀胱癌、骨がん、骨転移、脳腫瘍、脳がん、乳癌、小児癌、原発不明のがん、キャッスルマン病、子宮頸癌、大腸／直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、ユーイング腫瘍、眼癌、胆嚢癌、胃腸カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、ホジキン病、カポジ肉腫、腎細胞癌、喉頭および下咽頭癌、急性リンパ性白血病、急性骨髄白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄単球性白血病、肝臓癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、肺カルチノイド腫瘍、皮膚のリンパ腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔および副鼻腔癌、鼻咽腔癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、口腔および中咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、陰茎癌、下垂体部腫瘍、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、成人軟組織の肉腫、基底および扁平細胞皮膚癌、黒色腫、小腸癌、胃癌、睾丸癌、喉頭癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宮肉腫、膣癌、外陰癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍ならびにがん治療によって引き起こされる二次発癌が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２５】
本発明は、目的とする腫瘍学関連ポリペプチドの量を増大することで、必要とする対象の腫瘍の成長を軽減、除去または防止する方法を提供し、当該方法は、前記腫瘍学関連ポリペプチドをコードする単離シグナルセンサーポリヌクレオチドを、前記対象に投与することを含む。腫瘍の成長は、限定はしないが、副腎皮質癌、進行癌、肛門癌、再生不良性貧血、胆管癌、膀胱癌、骨がん、骨転移、脳腫瘍、脳がん、乳癌、小児癌、原発不明のがん、キャッスルマン病、子宮頸癌、大腸／直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、ユーイング腫瘍、眼癌、胆嚢癌、胃腸カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、ホジキン病、カポジ肉腫、腎細胞癌、喉頭および下咽頭癌、急性リンパ性白血病、急性骨髄白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄単球性白血病、肝臓癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、肺カルチノイド腫瘍、皮膚のリンパ腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔および副鼻腔癌、鼻咽腔癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、口腔および中咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、陰茎癌、下垂体部腫瘍、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、成人軟組織の肉腫、基底および扁平細胞皮膚癌、黒色腫、小腸癌、胃癌、睾丸癌、喉頭癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宮肉腫、膣癌、外陰癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍ならびにがん治療によって引き起こされる二次発癌といった、疾患、障害および／または状態に伴い得、または、当該疾患、障害および／または状態の結果であり得る。
【００２６】
本発明は、目的とするポリペプチドの量を増大することで、必要とする対象のがんの少なくとも１つの症状を軽減および／または改善する方法を提供し、当該方法は、前記腫瘍学関連ポリペプチドをコードする単離シグナルセンサーポリヌクレオチドを前記対象に投与することを含む。症状の非制限的な例としては、脱力感、疼痛および痛み、熱、疲労、体重減少、血液凝固、血液のカルシウム量の上昇、白血球数の低下、息切れ、めまい、頭痛、色素沈着過剰、黄疸、紅斑症、そう痒症、多毛症、排便習慣の変化、膀胱機能の変化、永続的な潰瘍、口内の白い斑点、舌上の白点、異常な出血または排出、身体部分の肥大またはこぶ、消化不良、呑み込みにくさ、いぼまたはほくろの変化、新しい皮膚の変化ならびにしつこい咳およびしわがれ声が挙げられる。
【００２７】
本発明は、組織または器官のがん細胞で細胞死を優先的に誘導する方法を提供し、当該方法は、組織または器官を、その発現によってアポトーシスまたは細胞死が誘導される腫瘍学関連ポリペプチド、および、がん細胞でのマイクロＲＮＡの発現が正常な非がん細胞でのマイクロＲＮＡの発現よりも低いマイクロＲＮＡのマイクロＲＮＡ結合部位を少なくとも１つコードするシグナルセンサーポリヌクレオチドに接触させることを含む。
【００２８】
シグナルセンサーポリヌクレオチドは、０．００１μｇと１５０μｇとの間の総１日用量で投与され得る。シグナルセンサーポリヌクレオチドの投与は注射、局所投与、眼内投与または鼻腔内投与であり得る。１つの態様では、投与は、限定はしないが、皮内、皮下および筋肉内であり得る。別の態様では、投与は、限定はしないが、クリーム、ローション、軟膏、ジェル、スプレー、溶液などを用いて局所的であり得る。
【００２９】
本発明の様々な実施形態の詳細が、以下の発明を実施するための形態において説明される。本発明の他の特長、目的、および利点は、発明を実施するための形態および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかになる。
【００３０】
前述および他の目的、特長、および利点は、添付の図面に図示されるように、本発明の特定の実施形態の以下の記述から明らかになり、その図面において、同様の参照文字は、異なる図面を通して同一の部分を指す。図面は、必ずしも原寸に比例しておらず、むしろ、本発明の様々な実施形態の原理を例示説明することに重点が置かれている。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】本発明の一次構築物の概略図である。
【図２】ポリヌクレオチドのシグナルセンサー要素を示す、本発明の一次構築物の第２の隣接領域の拡大概略図である。
【図３】哺乳動物のアポトーシス誘導因子ショート（ＡＩＦｓｈ）修飾ｍＲＮＡのＡＩＦｓｈタンパク質のゲルプロファイルである。図３ＡはＡＩＦｓｈの予測されるサイズを示す。図３ＢはＡＩＦｓｈの予測されるサイズを示す。
【図４】哺乳動物のＳｉａｈ  Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼ１（ＳＩＡＨ１）修飾ｍＲＮＡのＳＩＡＨ１タンパク質のゲルプロファイルである。図４ＡはＳＩＡＨ１の予測されるサイズを示す。図４ＢはＳＩＡＨ１の予測されるサイズを示す。
【図５】哺乳動物の構成的活性型（Ｃ．Ａ．）カスパーゼ３修飾ｍＲＮＡのＣ．Ａ．カスパーゼ３（逆カスパーゼ３（Ｒｅｖ−カスパーゼ３）としても知られる）タンパク質のゲルプロファイルである。図５ＡはＣ．Ａ．カスパーゼ３の予測されるサイズを示す。図５ＢはＣ．Ａ．カスパーゼ３の予測されるサイズを示す。
【図６】哺乳動物のグラニュリシン修飾ｍＲＮＡのグラニュリシンタンパク質のゲルプロファイルである。図６Ａはグラニュリシンの予測されるサイズを示す。図６Ｂはグラニュリシンの予測されるサイズを示す。
【図７】Ｃ．Ａ．カスパーゼ３およびＣ．Ａ．カスパーゼ６のウェスタンブロットである。図７Ａは、５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全に修飾、または、１−メチルシュードウリジンで完全に修飾されたＣ．Ａ．カスパーゼ３修飾ｍＲＮＡのタンパク質を示す。図７Ｂは、５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全に修飾、または、１−メチルシュードウリジンで完全に修飾される、Ｃ．Ａ．カスパーゼ６修飾ｍＲＮＡのタンパク質を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
治療薬、診断、試薬の分野、および生物学的アッセイにおいて、例えば、核酸の細胞内翻訳およびコードされた目的とするポリペプチドの産生を引き起こすために、インビトロ、インビボ、インサイツ、またはエクスビボにかかわらず、細胞内に核酸、例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）を送達することができることは大変興味深いことである。非組み込みシグナルセンサーポリヌクレオチドの送達および機能が特に重要である。
【００３３】
１個以上の目的とするポリペプチドをコードするシグナルセンサーポリヌクレオチドの組成物（薬学的組成物を含む）、ならびにその設計、調製、製造、および／または製剤化方法が本明細書に記載される。本明細書に記載の目的とするポリペプチドをコードするシグナルセンサーポリヌクレオチドを選択、設計、および／または利用するためのシステム、プロセス、デバイス、およびキットも提供される。
【００３４】
この目的のために、本発明のポリペプチドは、「シグナルセンサーポリヌクレオチド」と呼ばれ、ポリヌクレオチド治療薬（例えば、ｍＲＮＡ）の層別化、プロファイリングおよび／または個別化に特に役立し、特定の細胞型、疾患または細胞の微小環境または生物学的プロファイルに合わせて調節される、新しいクラスのポリヌクレオチド治療薬によってコードされる。
【００３５】
がんは多様な遺伝子発現パターン、物理化学的環境および転移性または運動性挙動を示すことが知られており、ＨａｎａｈａｎおよびＷｅｉｎｂｅｒｇ（Ｃｅｌｌ、２０１１、１４４：６４６−６７４）によると、がんには６つの特徴がある。これらには、増殖性シグナル伝達を維持すること、成長抑制因子を回避すること、細胞死に対して抵抗すること、複製性不死を可能とすること、血管新生を誘導することならびに浸潤および転移を活性化することが含まれる。これらのがんの特徴または機能によって、がんは生存、増殖および播種し、それぞれは、がんの種類によって、異なる時に異なるパターンで生じる。
【００３６】
正常な細胞に害を及ぼさず、がん細胞を選択的に標的にするがん治療薬の開発は、腫瘍学の各領域で最も重要な進行中の取り組みである。本発明のポリヌクレオチドは、そのような治療薬を代表し、例えばがん細胞または正常な細胞といった細胞型によって、細胞系、シグナル増殖（生存）または死を選択的に安定化または不安定化させ、細胞周期または老化を引き起こし、および／または、免疫応答を活性化または回避する能力を有する。
【００３７】
本発明に従い、シグナルセンサーポリヌクレオチド治療薬を用いて、がん細胞の生存優位性または特徴を不安定にし得る（したがって当該治療薬は細胞傷害性となる）。一実施形態において、診断的な試みには、代謝状態（低酸素性、アシドーシス性）、アポトーシス性対生存性の遺伝子プロファイル、細胞周期対老化の段階、免疫状態および存在するストロマ因子を含む、がんのプロファイリング（事前に必要とはされないが）が挙げられるだろう。
【００３８】
一実施形態において、シグナルセンサーポリヌクレオチドは、がん細胞のトランスクリプトームを攪乱する。この攪乱は１つ以上のシグナル伝達または発現事象に影響を及ぼし得る。例えば、コードされた腫瘍学関連ポリペプチドは、がんに関連する遺伝子の発現を誘導または強化すると分かっている転写因子の上流で作用し得る。そのような転写因子を阻害する（結合または隔離減少または分解のいずれかで）腫瘍学関連ポリペプチドをコードするシグナルセンサーポリヌクレオチドの送達はしたがって、がん細胞のトランスクリプトームを改変し得、治療上の効果を有すだろう。そのような転写因子の１つにＨＩＦ−１アルファがある。ＨＩＦ−１アルファと結合できる、または、その発現がより少ないＨＩＦ−１アルファにつながるタンパク質をコードするシグナルセンサーポリヌクレオチドは、ＨＩＦ−１アルファ制御性遺伝子、例えばＶＥＧＦＡまたはＳＬＣ２Ａ１を効果的に抑制し、がんを不安定化させるだろう。
【００３９】
一実施形態において、がんのプロファイルが、シグナルセンサーポリヌクレオチドが選択される前に評価され得る。そのようなプロファイリングデータは、どの関連ポリペプチドを送達するかの選択に関する情報を与えるであろう。アポトーシス、複製能または代謝シグネチャーといった特徴クラスで分類される遺伝子発現のプロファイリングによって、ポリペプチドに関する動的不安定性スコアリングおよびシグナルセンサーポリヌクレオチドの治療域の最適化を可能にするであろう。本明細書で使用されるとき、「動的不安定性指数」は、正常な対応する細胞と比較して、インビトロのがん細胞で、腫瘍学関連標的タンパク質を５０％増大するのに十分なシグナルセンサーポリヌクレオチドの用量を指す。
【００４０】
プロファイリングはまた、アポトーシスクラスに関してカスパーゼ依存性遺伝子発現とカスパーゼ非依存性遺伝子発現との間の区別といった特徴クラス内でなされ得る。または、プロファイリングはアポトーシス、老化（複製能）および代謝クラスの遺伝子プロファイリングといった、複数のクラスにわたって実施され得る。
【００４１】
一実施形態において、本明細書で説明されるシグナルセンサーポリヌクレオチドを用いて、細胞内のポリペプチドの発現および／または量を低減し得る。非制限的な例として、様々な濃度でのＭＹＣ阻害剤Ａ、ＭＹＣ阻害剤Ｂ、ＭＹＣ阻害剤ＣまたはＭＹＣ阻害剤Ｄの効力を決定するために、ＭＹＣ阻害剤Ａ、ＭＹＣ阻害剤Ｂ、ＭＹＣ阻害剤ＣまたはＭＹＣ阻害剤Ｄを、Ｈｅｐ３Ｂ細胞上で使用し得る（例えば実施例５５を参照）。
【００４２】
一実施形態において、本明細書に記載されるシグナルセンサーポリヌクレオチドは、細胞傷害性または細胞保護的ないずれかの治療効果を、例えば正常な細胞対がん性の細胞といった特定の細胞に向けることができる。
【００４３】
一実施形態において、シグナルセンサーポリヌクレオチドは腫瘍学関連ポリペプチドだけでなくセンサー配列もコードするであろう。センサー配列としては、例えば、マイクロＲＮＡ結合部位、転写因子結合部位、内因性核酸結合分子のための偽受容体として作用するよう操作した人工的な結合部位が挙げられる。「センサー領域」は、少なくとも１つのセンサー配列を含むシグナルセンサーポリヌクレオチドの結合ヌクレオシドの領域である。本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチドは、１つ以上のセンサー領域を有し得る。
【００４４】
一実施形態において、１つ以上のセンサー領域が、第１の隣接領域に位置し得る。非制限的な例として、第１の隣接領域のセンサー領域は、少なくとも１つのセンサー配列を含み得る。センサー配列は、ｍｉｒ−１２２、ｍｉｒ−１４２−３ｐ、ｍｉｒ−１４２−５ｐ、ｍｉｒ−１４６、その断片または変異形であり得るが、これらに限定されない。別の非制限的な例としては、第１の隣接領域のセンサー領域は、ｍｉｒ−１２２配列といった少なくとも１つのセンサー配列を含み得る。ｍｉｒ−１２２配列は、ａｍｉｒ−１２２結合部位、ｍｉｒ−１２２種配列、種配列を有さないｍｉｒ−１２２結合部位またはそれらの組み合わせであり得るが、これらに限定されない。
【００４５】
別の実施形態では、１つ以上のセンサー領域が第２の隣接領域に位置し得る。非制限的な例として、第２の隣接領域のセンサー領域はｍｉｒ−１２２、ｍｉｒ−１４２−３ｐ、ｍｉｒ−１４２−５ｐ、ｍｉｒ−１４６、その断片または変異形といったセンサー配列を含み得る。別の非制限的な例として、第２の隣接領域のセンサー領域は、３つのセンサー配列を含み得る。センサー配列は、ｍｉｒ−１２２結合部位、ｍｉｒ−１２２種配列、種配列を有さないｍｉｒ−１２２結合部位またはそれらの組み合わせといったｍｉｒ−１２２配列であり得るが、これらに限定されない。さらに別の非制限的な例として、第２の隣接領域のセンサー領域は、３’ＵＴＲに位置し、センサー領域は、ｍｉｒ−１２２配列であるセンサー配列を含み得る。ｍｉｒ−１２２配列は、ｍｉｒ−１２２結合部位、ｍｉｒ−１２２種配列、種配列を有さないｍｉｒ−１２２結合部位またはそれらの組み合わせであり得るが、これらに限定されない。
【００４６】
一実施形態において、２つ以上のセンサー領域が、限定はしないが、結合ヌクレオチドの第１の領域、第１の隣接領域および／または第２の隣接領域といったシグナルセンサーポリヌクレオチドの同一領域に位置し得る。非制限的な例として、２つ以上のセンサー領域は、第２の隣接領域に位置する。さらに別の非制限的な例として、３つのセンサー領域が第２の隣接領域で３’ＵＴＲに位置する。３つのセンサー領域には、ｍｉｒ−１２２結合部位、ｍｉｒ−１２２種配列、種配列を有さないｍｉｒ−１２２結合部位またはそれらの組み合わせが含まれ得る。
【００４７】
別の実施形態では、２つ以上のセンサー領域が、限定はしないが、結合ヌクレオチドの第１の領域、第１の隣接領域および／または第２の隣接領域といったシグナルセンサーポリヌクレオチドの異なる領域に位置し得る。非制限的な例として第１のセンサー領域は第１の隣接領域に位置し、第２のセンサー領域は第２の隣接領域に位置する。センサー領域は、同一のセンサー配列または異なるセンサー配列を含み得る。
【００４８】
一実施形態において、開始コドンがセンサー領域内に位置する。
【００４９】
一実施形態において、センサー領域は２つ以上のセンサー配列を含み得る。センサー配列は同一または異なり得る。
【００５０】
一実施形態において、センサー領域は、互いに異なるが、同一のｍｉｒ結合部位上に基づき得るセンサー配列を２つ以上含み得る。非制限的な例として、センサー領域は、ｍｉＲ結合部位配列を少なくとも１つ、および、種を除いたｍｉｒ結合部位配列を少なくとも１つ含み得る。別の非制限的な例として、センサー領域は少なくとも１つのｍｉＲ結合部位配列および少なくとも１つのｍｉＲ種配列を含み得る。さらに別の非制限的な例として、センサー領域は種を除いたｍｉｒ結合部位配列を少なくとも１つ、および、ｍｉＲ種配列を少なくとも１つ含み得る。
【００５１】
別の実施形態では、センサー領域は、ＡＢＡＢＡＢまたはＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢまたはＡＢＣＡＢＣＡＢＣまたは１回、２回または４回以上繰り返されるその変異形といったパターンのセンサー配列を２つ以上含み得る。これらのパターンで、各文字Ａ、ＢまたはＣは異なるｍｉＲ配列を表す。
【００５２】
さらに別の実施形態では、シグナルセンサーポリヌクレオチドは、２つ以上のセンサー領域を含み得、各センサー領域は１つ以上のセンサー配列を有する。非制限的な例として、センサー配列は、ＡＢＡＢＡＢまたはＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢまたはＡＢＣＡＢＣＡＢＣまたは各センサー領域で１回、２回または４回以上繰り返されるその変異形といったパターンであり得る。別の非制限的な例として、センサー配列は、ＡＢＡＢＡＢまたはＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢまたはＡＢＣＡＢＣＡＢＣまたはシグナルセンサーポリヌクレオチド全体にわたって１回、２回または４回以上繰り返されるその変異形といったパターンであり得る。これらのパターンで、各文字Ａ、ＢまたはＣは異なるｍｉＲ配列を表す。非制限的な例として、第１のセンサー領域はパターンＡＢＡのセンサー配列を有し得、第２のセンサー領域はパターンＢＡＢのセンサー配列を有し得、その結果シグナルセンサーポリヌクレオチドのセンサー配列の全体のパターンはＡＢＡＢＡＢである。別の非制限的な例として、第１のセンサー領域はセンサー配列ＡＡを有し得、第２のセンサー領域はセンサー配列ＢＢを有し得、第３のセンサー領域はセンサー配列ＡＡを有し得、第４のセンサー領域はセンサー配列ＢＢを有し得、その結果シグナルセンサーポリヌクレオチドのセンサー配列の全体のパターンはＡＡＢＢＡＡＢＢである。
【００５３】
本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチドのセンサー配列は、天然ｍＲＮＡの３−ＵＴＲおよび／または５’ＵＴＲに１つ以上の制御配列を含み得、当該制御配列は、異なる組織および細胞でのｍＲＮＡ安定性および翻訳を制御する。そのようなｃｉｓ調節要素としては、Ｃｉｓ−ＲＮＰ（リボ核タンパク質）／ＲＢＰ（ＲＮＡ結合タンパク質）調節要素、ＡＵ豊富な領域ＡＵＥ、構造化したステムループ、構成的分解要素（ＣＤＥ）、ＧＣ−豊富および他の構造化したｍＲＮＡモチーフが挙げられ得るが、これらに限定されない（Ｐａｒｋｅｒ  ＢＪ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１１、２１、１９２９−１９４３、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。例えば、ＣＤＥは、ロキン（Ｒｏｑｕｉｎ）タンパク質との相互作用によってｍＲＮＡ分解を媒介する制御モチーフのクラスである。特に、進行および炎症の調節因子をコードしてマクロファージ内のサイトカイン生産を制限するＣＤＥが多くのｍＲＮＡに見られる（Ｌｅｐｐｅｋ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ、２０１３、１５３、８６９−８８１、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【００５４】
一実施形態において、特定のＣＤＥが、細胞または組織内でポリペプチドの分解が所望される際に、シグナルセンサーポリヌクレオチドに導入され得る。特定のＣＤＥがまた、タンパク質発現を持続のため細胞または組織内でより安定したｍＲＮＡを維持するために、シグナルセンサーポリヌクレオチドから取り除かれてもよい。
【００５５】
一実施形態において、細胞または組織内のｍｉＲＮＡの有無を決定するためにがん細胞または組織のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）プロファイリングを実施して、シグナルセンサーポリヌクレオチドでセンサー配列として使用する適切なマイクロＲＮＡを決定し得る。
【００５６】
マイクロＲＮＡ遺伝子制御は、限定はしないが、周辺配列の種、配列の種類（例えば、異種性、同種性および人工的）、周辺配列の調節要素および／または周辺配列での構造要素といった、マイクロＲＮＡの周辺の配列から影響を受け得る。マイクロＲＮＡは５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲの影響を受け得る。非制限的な例として、非ヒト３’ＵＴＲは、同一配列の種類のヒト３’ＵＴＲと比較すると、目的とするポリペプチドの発現に対するマイクロＲＮＡ配列の制御効果を増大し得る。
【００５７】
５’−ＵＴＲの他の調節要素および／または構造要素が、マイクロＲＮＡ媒介性遺伝子制御に影響を及ぼし得る。そのような例の１つに５’ＵＴＲの構造化したＩＲＥＳ（配列内リボソーム進入部位）があり、これは、翻訳伸長因子の結合がタンパク質翻訳を開始するために必要である。ＥＩＦ４Ａ２が５’ＵＴＲのこの二次的に構造化された要素に結合することがマイクロＲＮＡ媒介性遺伝子発現には必要である（Ｍｅｉｊｅｒ  ＨＡ  ｅｔ
ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１３、３４０、８２−８５、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。センサーシグナルポリヌクレオチドはさらに、マイクロＲＮＡ媒介性遺伝子制御を強化するためにこの構造化した５’ＵＴＲを含むように修飾され得る。
【００５８】
少なくとも１つのマイクロＲＮＡ部位を本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチドの３’ＵＴＲ内に操作し得る。この文脈では、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０またはそれ以上のマイクロＲＮＡ部位を本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチの３’ＵＴＲ内に操作してもよい。一実施形態において、シグナルセンサーポリヌクレオチドに組み込まれたマイクロＲＮＡ部位は、同一または異なるマイクロＲＮＡ部位であり得る。別の実施形態では、シグナルセンサーポリヌクレオチドに組み込まれたマイクロＲＮＡ部位は、体内の同一または異なる組織を標的し得る。非制限的な例として、シグナルセンサーポリヌクレオチドの３’ＵＴＲにおける組織、細胞型または疾患特異的マイクロＲＮＡ結合部位の導入を通して、特定の細胞型（肝細胞、骨髄系細胞、内皮細胞、がん細胞など）の発現の度合いを低下し得る。
【００５９】
一実施形態において、マイクロＲＮＡ部位は、３’ＵＴＲの５’末端付近、３’ＵＴＲの５’末端と３’末端の間のおよそ真ん中、および／または、３’ＵＴＲの３’末端付近に操作され得る。非制限的な例として、マイクロＲＮＡ部位は３’ＵＴＲの５’末端付近、および、３’ＵＴＲの５’末端と３’末端の間のおよそ真ん中に操作され得る。別の非制限的な例として、マイクロＲＮＡ部位は、３’ＵＴＲの３’末端付近および３’ＵＴＲの５’末端と３’末端の間のおよそ真ん中に操作され得る。さらに別の非制限的な例として、マイクロＲＮＡ部位は、３’ＵＴＲの５’末端付近および３’ＵＴＲの３’末端付近に操作され得る。
【００６０】
別の実施形態では、３’ＵＴＲは４つのマイクロＲＮＡ部位を含み得る。マイクロＲＮＡ部位は、完全なマイクロＲＮＡ部位、マイクロＲＮＡ種配列および／または種配列を有さないマイクロＲＮＡ結合部位であり得る。
【００６１】
一実施形態において、シグナルセンサーポリヌクレオチドを、対象の異なる組織で発現するマイクロＲＮＡ部位を含むよう操作し得る。非制限的な例として、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチドをｍｉＲ−１９２およびｍｉＲ−１２２を含むように操作し、対象の肝臓および腎臓のシグナルセンサーポリヌクレオチドの発現を制御し得る。別の実施形態では、シグナルセンサーポリヌクレオチドを、同一組織に対して２つ以上のマイクロＲＮＡ部位を含むよう操作し得る。例えば、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチドを、ｍｉＲ−１７−９２およびｍｉＲ−１２６を含むように操作し、対象の内皮細胞のシグナルセンサーポリヌクレオチドの発現を制御し得る。
【００６２】
一実施形態において、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチドがコードする腫瘍学関連ポリペプチドに関連する治療域およびまたは発現差異を、変化させ得る。例えば、がん細胞（または正常な細胞）のｍｉＲＮＡシグネチャーを利用してがん細胞で死シグナルがより多く発現される（または、正常な細胞では生存シグナル）ようにシグナルセンサーポリヌクレオチドを設計し得る。がん細胞が特定のｍｉＲＮＡをより低い量で発現する箇所では、そのｍｉＲＮＡ（または複数のｍｉＲＮＡ）のための結合部位をコードするシグナルセンサーポリヌクレオチドがより多く発現れるだろう。したがって、シグナルセンサーポリヌクレオチドがコードする腫瘍学関連ポリペプチドは、細胞死を引き起こすまたは誘導するタンパク質として選択される。同一ｍｉＲＮＡをより多く発現する近隣の非がん細胞では、３’ＵＴＲにコードされる結合部位すなわち「センサー」に結合するｍｉＲＮＡの影響のためにシグナルセンサーポリヌクレオチドがより少ない量で発現され得るので、コードされる死シグナルによる影響はより小さいであろう。逆に、ｍｉＲＮＡの発現量ががん細胞でより多いがん細胞および非がん細胞を含む組織に細胞生存または細胞保護シグナルが送達され得、結果として、がん細胞により少ない生存シグナルが送達され、正常な細胞により多くの生存シグネチャーが送達される。前のパラダイムに従って、異なるシグナルを有する複数のシグナルセンサーポリヌクレオチドを設計および投与し得る。
【００６３】
一実施形態において、シグナルセンサーポリヌクレオチドの発現を、少なくとも１つのセンサー配列をシグナルセンサーポリヌクレオチドに組み込み、シグナルセンサーポリヌクレオチドを製剤化することで、制御し得る。非制限的な例として、ｍｉＲ−１２２結合部位を組み込み、カチオン性脂質ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡを含む脂質ナノ粒子に製剤化されたポリヌクレオチドを有することで、ポリヌクレオチドを同所腫瘍に標的し得る（例えば、実施例５６Ａおよび５６Ｂに記載の実験を参照）。
【００６４】
異なる細胞型のマイクロＲＮＡの発現パターンを理解することで、シグナルセンサーポリヌクレオチドを、特定の細胞型において、または、特定の生物学的状況下のみで、より標的化した発現のために操作することができる。組織特異的マイクロＲＮＡ結合部位の導入によって、組織、または、がんといった生物学的状況の文脈でのタンパク質発現に最適であり得るシグナルセンサーポリヌクレオチドを設計し得る。
【００６５】
操作したシグナルセンサーポリヌクレオチドを用いて、関連した細胞株で形質移入実験を実施し得、タンパク質の生産を、形質移入後の様々な時点でアッセイし得る。例えば、細胞を異なるマイクロＲＮＡ結合部位操作核酸またはシグナルセンサーポリヌクレオチドで形質移入し得、ＥＬＩＳＡキットを関連したタンパク質に用いて、形質移入から６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間および７日後に生産されたタンパク質をアッセイする。インビボ実験もマイクロＲＮＡ結合部位操作分子を用いて実施され、製剤化したシグナルセンサーポリヌクレオチドの組織特異的発現の変化を検査し得る。
【００６６】
一実施形態において、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチドは、抗原を提示する細胞による抗原提示を弱めるために、少なくとも１つのマイクロＲＮＡを含み得る。マイクロＲＮＡは、完全なマイクロＲＮＡ配列、マイクロＲＮＡ種配列、種配列を有さないマイクロＲＮＡ配列またはそれらの組み合わせであり得る。非制限的な例として、シグナルセンサーポリヌクレオチドに組み込まれたマイクロＲＮＡは、造血系に特異的であり得る。別の非制限的な例として、抗原提示を弱めるために本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチドに組み込まれたマイクロＲＮＡは、ｍｉＲ−１４２−３ｐである。
【００６７】
一実施形態において、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチドは、目的とする細胞で、コードされたポリペプチドの発現を低下させるために、少なくとも１つのマイクロＲＮＡを含み得る。非制限的な例として、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチドは、肝臓で目的とするコードされたポリペプチドの発現を低下させるために、少なくとも１つのｍｉＲ−１２２結合部位を含み得る。別の非制限的な例として、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチドは、少なくとも１つのｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位、ｍｉＲ−１４２−３ｐ種配列、種を有さないｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位、ｍｉＲ−１４２−５ｐ結合部位、ｍｉＲ−１４２−５ｐ種配列、種を有さないｍｉＲ−１４２−５ｐ結合部位、ｍｉＲ−１４６結合部位、ｍｉＲ−１４６種配列および／または種配列を有さないｍｉＲ−１４６結合部位を含み得る（例えば、実施例４７および実施例６０に記載される実験を参照）。
【００６８】
本発明に従うと、本明細書で説明されるシグナルセンサーポリヌクレオチドは、当該技術分野の他のポリペプチドコード分子の欠陥を避けるように修飾され得る。したがって、本実施形態では、シグナルセンサーポリヌクレオチドは修飾シグナルセンサーポリヌクレオチドまたは一次構築物、修飾ｍＲＮＡまたはｍｍＲＮＡと呼ぶ。
【００６９】
組織における安定性および／もしくは排除、受容体の取り込みおよび／もしくは動態、組成物による細胞到達、翻訳機構との関わり、ｍＲＮＡ半減期、翻訳の効率、免疫回避、タンパク質産生能力、分泌の効率（適用される場合）、血液循環への到達可能性、タンパク質半減期、ならびに／または細胞の状態、機能、および／もしくは活性の調節のうちの１つ以上を改善するように設計された、目的とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードするシグナルセンサーポリヌクレオチドポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡが本明細書の一部分に提供される。
【００７０】
Ｉ．本発明の組成物
本発明は、１個以上の目的とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードする核酸分子、具体的には、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡを提供する。具体的には、本発明はがんまたはがんに関連した疾患、障害に有用なシグナルセンサーポリヌクレオチドを企図する。本明細書で使用されるとき、「シグナルセンサーポリヌクレオチド」は、翻訳された時に細胞（がん細胞または非がん細胞）に「シグナル」を送り、がん細胞に有害または正常な細胞に有益であるか、がん細胞に有害かつ正常な細胞に有利であるかのいずれかである治療効果を生物体にもたらす、１つ以上の目的とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードする核酸転写物のことである。シグナルセンサーポリヌクレオチドはさらに、ポリヌクレオチドの微小環境を「感知」し、（ａ）翻訳されるペプチドまたはタンパクに関連する機能または表現型の結果、（ｂ）シグナルセンサーポリヌクレオチドの発現量、および／または、双方を改変する配列（翻訳可能または不可能）を含んでいてもよい。
【００７１】
「核酸」という用語は、その最も広い意味において、ヌクレオチドのポリマーを含む任意の化合物および／または物質を含む。これらのポリマーは、多くの場合、シグナルセンサーポリヌクレオチドと称される。本発明の例示の核酸またはシグナルセンサーポリヌクレオチドには、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ、β−Ｄ−リボ配置を有するＬＮＡ、α−Ｌ−リボ配置を有するα−ＬＮＡ（ＬＮＡのジアステレオマー）、２’−アミノ官能化を有する２’−アミノ−ＬＮＡ、および２’−アミノ官能化を有する２’−アミノ−α−ＬＮＡを含む）、またはこれらのハイブリッドが含まれるが、これらに限定されない。
【００７２】
好ましい実施形態において、シグナルセンサーポリヌクレオチドまたは核酸分子は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。本明細書で使用するとき、「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」という用語は、目的とするポリペプチドをコードし、かつ翻訳されてインビトロ、インビボ、インサイツ、またはエクスビボで、コードされた目的とするポリペプチドを産生することができる任意のシグナルセンサーポリヌクレオチドを指す。本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡまたはいずれかの核酸分子であり得、化学的に修飾されていてもよく、または、されていなくてもよい。
【００７３】
従来、ｍＲＮＡ分子の主要成分には、少なくともコーディング領域、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、５’キャップ、およびポリＡ尾部が含まれる。この野生型モジュール構造を基に、本発明は、モジュール組織を維持するが、いくつかの実施形態において、シグナルセンサーポリヌクレオチドが導入される部分への細胞の自然免疫応答の実質的な誘導の欠如を含む、有用な特性をポリヌクレオチドに付与する１つ以上の構造および／もしくは化学修飾または改変を含むシグナルセンサーポリヌクレオチドまたは一次ＲＮＡ構築物を提供することによって従来のｍＲＮＡ分子の機能の範囲を拡大する。したがって、合成的であり得る本発明の修飾ｍＲＮＡ分子は、「ｍｍＲＮＡ」と称される。本明細書で使用するとき、「構造的」特徴または修飾は、２個以上の結合ヌクレオチドが、ヌクレオチド自体への著しい化学修飾なく、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡにおいて挿入、欠失、複製、反転、またはランダム化される特徴または修飾である。化学結合が必然的に破壊および再形成されて構造修飾をもたらすため、構造修飾は、化学的性質のものであり、したがって、化学修飾である。しかしながら、構造修飾は、異なるヌクレオチド配列をもたらす。例えば、ポリヌクレオチド「ＡＴＣＧ」は、「ＡＴ−５ｍｅＣ−Ｇ」に化学修飾され得る。同一のポリヌクレオチドは、「ＡＴＣＧ」から「ＡＴＣＣＣＧ」に構造修飾され得る。ここで、ジヌクレオチド「ＣＣ」が挿入されており、ポリヌクレオチドへの構造修飾をもたらす。
【００７４】
シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡ構造
本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチドは、本明細書で証明されるように核酸系治療薬を用いた効果的なポリペプチド産生の既存の問題の打開に役立つそれらの機能的および／または構造的設計特徴において野生型ｍＲＮＡと区別される。
【００７５】
図１は、本発明の代表的なシグナルセンサー一次構築物１００を示す。本明細書で使用するとき、「一次構築物」または「一次ｍＲＮＡ構築物」という用語は、１個以上の目的とするポリペプチドをコードし、その中でコードされる目的とするポリペプチドが翻訳されることを可能とするのに十分な構造的および／または化学的特徴を保持する、シグナルセンサーポリヌクレオチド転写物を指す。シグナルセンサー一次構築物は、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチドであり得る。構造または化学修飾された場合、一次構築物は、ｍｍＲＮＡと称され得る。
【００７６】
図１を再び参照して、ここで、一次構築物１００は、第１の隣接領域１０４および第２の隣接領域１０６に隣接する結合ヌクレオチド１０２の第１の領域を含有する。本明細書で使用するとき、「第１の領域」は、「コーディング領域」もしくは「コード領域」、または単に「第１の領域」と称され得る。この第１の領域は、コードされた目的とする腫瘍学関連ポリペプチドを含み得るが、これに限定されない。目的とする腫瘍学関連ポリペプチドは、その５’末端に、シグナルペプチド配列領域１０３によってコードされた１つ以上のペプチドシグナル配列を含み得る。隣接領域１０４は、１つ以上の完全または不完全な５’ＵＴＲ配列を含む結合ヌクレオチドの領域を含み得る。隣接領域１０４は、５’末端キャップ１０８も含み得る。第２の隣接領域１０６は、１つ以上の完全または不完全な３’ＵＴＲを含む結合ヌクレオチドの領域を含み得る。隣接領域１０６は、３’尾部配列１１０および３’ＵＴＲ１２０も含み得る。
【００７７】
第１の領域１０２と第１の隣接領域１０４の５’末端の架橋は、第１の操作領域１０５である。従来、この操作領域は、開始コドンを含む。あるいは、この操作領域は、開始コドンを含む任意の翻訳開始配列またはシグナルを含み得る。
【００７８】
第１の領域１０２と第２の隣接領域１０６の３’末端の架橋は、第２の操作領域１０７である。従来、この操作領域は、終止コドンを含む。あるいは、この操作領域は、終止コドンを含む任意の翻訳開始配列またはシグナルを含み得る。本発明に従って、複数の連続終止コドンも使用され得る。一実施形態において、本発明の操作領域は２つの終止コドンを含み得る。第１の終止コドンは「ＴＧＡ」であり得、第２の終止コドンは「ＴＡＡ」、「ＴＧＡ」および「ＴＡＧ」からなる群から選択され得る。操作領域さらに、３つの終止コドンを含み得る。第３の終止コドンは「ＴＡＡ」、「ＴＧＡ」および「ＴＡＧ」からなる群から選択され得る。
【００７９】
図２を見てみると、第２の隣接領域１０６の３’ＵＴＲ  １２０は１つ以上のセンサー配列１３０を含み得る。少なくとも１つのセンサー配列を含む領域を、「センサー領域」と呼ぶ。本明細書で考察するこれらのセンサー配列は、一次構築物またはシグナルセンサーポリヌクレオチドの局所微小環境のリガンド用の偽受容体（または結合部位）として作用する。例えば、マイクロＲＮＡ結合部位またはｍｉＲＮＡ種を、ポリヌクレオチド環境に存在するいずれかのマイクロＲＮＡのための偽受容体として機能するように、センサーとして使用し得る。
【００８０】
概して、本発明のシグナルセンサー一次構築物の第１の領域の最短の長さは、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、ヘキサペプチド、ヘプタペプチド、オクタペプチド、ノナペプチド、またはデカペプチドをコードするのに十分な核酸配列の長さであり得る。別の実施形態において、この長さは、２〜３０個のアミノ酸、例えば、５〜３０、１０〜３０、２〜２５、５〜２５、１０〜２５、または１０〜２０個のアミノ酸のペプチドをコードするのに十分であり得る。この長さは、少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１７、２０、２５、もしくは３０個のアミノ酸のペプチド、または４０個のアミノ酸より長くないペプチド、例えば、３５、３０、２５、２０、１７、１５、１４、１３、１２、１１、もしくは１０個のアミノ酸より長くないペプチドをコードするのに十分であり得る。ポリヌクレオチド配列がコードし得るジペプチドの例には、カルノシンおよびアンセリンが挙げられるが、それらに限定されない。
【００８１】
概して、本発明の目的とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードする第１の領域の長さは、約３０ヌクレオチド長を超える（例えば、少なくとも、約３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，５００、および３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、もしくは１００，０００ヌクレオチド長（１００，０００を含む）まで、またはそれらを超える）。本明細書で使用するとき、「第１の領域」は、「コーディング領域」もしくは「コード領域」、または単に「第１の領域」と称され得る。
【００８２】
いくつかの実施形態において、シグナルセンサーポリヌクレオチドポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、約３０〜約１００，０００個のヌクレオチド（例えば、３０〜５０、３０〜１００、３０〜２５０、３０〜５００、３０〜１，０００、３０〜１，５００、３０〜３，０００、３０〜５，０００、３０〜７，０００、３０〜１０，０００、３０〜２５，０００、３０〜５０，０００、３０〜７０，０００、１００〜２５０、１００〜５００、１００〜１，０００、１００〜１，５００、１００〜３，０００、１００〜５，０００、１００〜７，０００、１００〜１０，０００、１００〜２５，０００、１００〜５０，０００、１００〜７０，０００、１００〜１００，０００、５００〜１，０００、５００〜１，５００、５００〜２，０００、５００〜３，０００、５００〜５，０００、５００〜７，０００、５００〜１０，０００、５００〜２５，０００、５００〜５０，０００、５００〜７０，０００、５００〜１００，０００、１，０００〜１，５００、１，０００〜２，０００、１，０００〜３，０００、１，０００〜５，０００、１，０００〜７，０００、１，０００〜１０，０００、１，０００〜２５，０００、１，０００〜５０，０００、１，０００〜７０，０００、１，０００〜１００，０００、１，５００〜３，０００、１，５００〜５，０００、１，５００〜７，０００、１，５００〜１０，０００、１，５００〜２５，０００、１，５００〜５０，０００、１，５００〜７０，０００、１，５００〜１００，０００、２，０００〜３，０００、２，０００〜５，０００、２，０００〜７，０００、２，０００〜１０，０００、２，０００〜２５，０００、２，０００〜５０，０００、２，０００〜７０，０００、および２，０００〜１００，０００個）を含む。
【００８３】
本発明に従って、第１および第２の隣接領域は、独立して、１５〜１，０００ヌクレオチド長の範囲（例えば、３０、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、および９００を超えるヌクレオチド長、または少なくとも３０、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、および１，０００ヌクレオチド長）であり得る。
【００８４】
本発明に従って、尾部配列は、０〜５００ヌクレオチド長の範囲（例えば、少なくとも６０、７０、８０、９０、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００ヌクレオチド長）であり得る。尾部領域がポリＡ尾部である場合、長さは、ポリＡ結合タンパク質結合の単位で、またはその関数として決定され得る。この実施形態において、ポリＡ尾部は、ポリＡ結合タンパク質の少なくとも４個の単量体に結合するのに十分な長さである。ポリＡ結合タンパク質の単量体は、一続きの約３８個のヌクレオチドに結合する。したがって、約８０個のヌクレオチドおよび１６０個のヌクレオチドのポリＡ尾部が機能的であることが観察されている。
【００８５】
本発明に従って、キャッピング領域は、単一のキャップまたはキャップを形成する一連のヌクレオチドを含み得る。この実施形態において、キャッピング領域は、１〜１０、例えば、２〜９、３〜８、４〜７、１〜５、５〜１０、または少なくとも２、もしくは１０以下のヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態において、キャップは不在である。
【００８６】
本発明に従って、第１および第２の操作領域は、３〜４０、例えば、５〜３０、１０〜２０の範囲、１５、または少なくとも４、もしくは３０以下のヌクレオチド長であり得、開始コドンおよび／または終止コドンに加えて、１つ以上のシグナルおよび／または制限配列を含み得る。
【００８７】
環状シグナルセンサーポリヌクレオチド
本発明に従って、シグナルセンサー一次構築物またはｍｍＲＮＡは、環化またはコンカテマー化されて翻訳コンピテント分子を生成し、ポリＡ結合タンパク質と５’末端結合タンパク質との間の相互作用を補助し得る。環化またはコンカテマー化の機構は、少なくとも３つの異なる経路、すなわち１）化学的経路、２）酵素的経路、および３）リボザイム触媒経路を通って生じ得る。新たに形成された５’／３’連結は、分子内または分子間であり得る。
【００８８】
第１の経路において、核酸の５’末端および３’末端は、接近しているときに分子の５’末端と３’末端との間に新たな共有結合を形成する化学反応基を含有し得る。有機溶媒中で、合成ｍＲＮＡ分子の３’末端上の３’−アミノ末端ヌクレオチドが５’−ＮＨＳ−エステル部分上で求核攻撃を経て新たな５’／３’アミド結合を形成するように、５’末端は、ＮＨＳ−エステル反応基を含有し得、３’末端は、３’−アミノ末端ヌクレオチドを含有し得る。
【００８９】
第２の経路において、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼを用いて、５’−リン酸化核酸分子を核酸の３’−ヒドロキシル基に酵素結合させて、新たなホスホロジエステル結合を形成することができる。反応の例において、１μｇの核酸分子が、製造業者のプロトコルに従って、１〜１０単位のＴ４  ＲＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）と３７℃で１時間インキュベートされる。連結反応が、５’領域および３’領域の両方と並んで塩基対合して、酵素的連結反応を補助することができる分裂したオリゴヌクレオチドの存在下で生じ得る。
【００９０】
第３の経路において、ｃＤＮＡ鋳型の５’末端または３’末端のいずれかは、インビトロ転写中に、結果として生じる核酸分子が核酸分子の５’末端を核酸分子の３’末端に連結することができる活性リボザイム配列を含有し得るように、リガーゼリボザイム配列をコードする。リガーゼリボザイムは、Ｉ群イントロン、Ｉ群イントロン、デルタ肝炎ウイルス、ヘアピンリボザイムに由来し得るか、またはＳＥＬＥＸ（試験管内進化法、ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）によって選択され得る。リボザイムリガーゼ反応は、０〜３７℃の温度で１〜２４時間かかり得る。
【００９１】
シグナルセンサーポリヌクレオチド多量体
本発明に従って、複数のはっきりと異なるシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、３’末端で修飾されたヌクレオチドを用いて３’末端を介して結合され得る。化学的複合体形成を用いて、細胞への送達の化学量論を制御することができる。例えば、グリオキシル酸回路酵素、イソクエン酸リアーゼ、およびリンゴ酸シンターゼは、ＨｅｐＧ２細胞に１：１の比率で供給されて細胞脂肪酸の代謝を変化させ得る。この比率は、一方のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡ種に３’−アジド末端ヌクレオチドを用い、かつ反対側のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡ種にＣ５−エチニルまたはアルキニル含有ヌクレオチドを用いて化学結合シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを化学結合させることによって制御され得る。この修飾されたヌクレオチドは、製造業者のプロトコルに従って末端トランスフェラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を用いて転写後に添加される。３’末端修飾ヌクレオチドの添加後、これら２個のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡ種は、銅の存在下または不在下において水溶液中で合わせられて、文献内に記載のクリック化学機構を介して新たな共有結合を形成し得る。
【００９２】
別の例において、３個以上のシグナルセンサーポリヌクレオチドが官能化リンカー分子を用いて結合され得る。例えば、官能化サッカリド分子は、複数の化学反応基（ＳＨ−、ＮＨ２−、Ｎ３等）を含有して３’−官能化シグナルセンサーポリヌクレオチド分子上の同族部分（すなわち、３’−マレイミドエステル、３’−ＮＨＳ−エステル、アルキニル）と反応するように化学修飾され得る。この修飾されたサッカリド上の反応基の数は、化学量論的様式で制御されて、複合体化されたシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの化学量論比を直接制御し得る。
【００９３】
シグナルセンサーポリヌクレオチド複合体および組み合わせ
腫瘍学関連タンパク質産生をさらに亢進するために、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド一次構築物またはｍｍＲＮＡは、他のポリヌクレオチド、腫瘍学関連ポリペプチド、染料、挿入剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、プソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、アルキル化剤、リン酸塩、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射標識マーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進剤（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ、タンパク質、例えば、糖タンパク質、またはペプチド、例えば、コリガンドに特異的親和性を有する分子、または抗体、例えば、癌細胞、内皮細胞、または骨細胞等の特定の細胞型に結合する抗体、ホルモンおよびホルモン受容体、非ペプチド種、例えば、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、共同因子、または薬物と複合体化されるように設計され得る。
【００９４】
複合体化は、安定性および／または半減期の増加をもたらし得、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを、細胞、組織、または生物体の特定の部位に標的化するときに特に有用であり得る。
【００９５】
本発明に従って、シグナルセンサーポリヌクレオチドｍｍＲＮＡまたは一次構築物は、ＲＮＡｉ剤、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ結合部位、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、触媒ＤＮＡ、ｔＲＮＡ、三重らせん形成を誘導するＲＮＡ、アプタマー、もしくはベクター等のうちの１つ以上とともに投与され得るか、またはこれらをさらにコードし得る。
【００９６】
一実施形態において、本明細書で説明されるシグナルセンサーポリヌクレオチドは、制限はしないが、米国特許出願第２０１３０２１６５６１号に記載される部分といった、様々ながん細胞を標的する部分と複合体化し得、当該出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。シグナルセンサーポリヌクレオチドとがん標的化部分との間の結合は、複合体の効力を高め得る酸切断可能結合であり得、例えば、限定はしないが、米国特許出願第２０１３０２１６５６１号に記載される結合が挙げられ、当該出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００９７】
二機能性シグナルセンサーポリヌクレオチド
本発明の一実施形態は、二機能性シグナルセンサーポリヌクレオチド（例えば、二機能性一次構築物または二機能性ｍｍＲＮＡ）である。その名称が示すように、二機能性シグナルセンサーポリヌクレオチドは、少なくとも２つの機能を有するか、または少なくとも２つの機能の能力があるシグナルセンサーポリヌクレオチドである。これらの分子は、慣例により、多機能性とも称され得る。
【００９８】
二機能性シグナルセンサーポリヌクレオチドの複数の機能は、ＲＮＡによってコードされ得る（この機能は、コードされた産物が翻訳されるまで現れ得ない）か、またはポリヌクレオチド自体の特性であり得る。これは、構造的または化学的であり得る。二機能性修飾シグナルセンサーポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドと共有結合的または静電的に関連した機能を含み得る。さらに、これら２つの機能は、シグナルセンサーポリヌクレオチドおよび別の分子の複合体との関連において提供され得る。
【００９９】
二機能性シグナルセンサーポリヌクレオチドは、抗増殖性腫瘍学関連ペプチドをコードし得る。これらのペプチドは、線状、環状、拘束、またはランダムコイルであり得る。これらは、アプタマー、シグナル伝達分子、リガンド、またはこれらの模倣物もしくはミメティックとして機能し得る。抗増殖性ペプチドは、翻訳されると、３〜５０アミノ酸長であり得る。それらは、５〜４０、１０〜３０、または約１５アミノ酸長であり得る。それらは、一本鎖、多本鎖、または分岐鎖であり得、翻訳されると、複合体、凝集体、または任意の多ユニット構造を形成し得る。
【０１００】
非コードシグナルセンサーポリヌクレオチド
本明細書に記載されるように、部分的または実質的に翻訳可能ではない配列、例えば、非コード領域を有するシグナルセンサーポリヌクレオチドおよび一次構築物が提供される。そのような非コード領域は、シグナルセンサー一次構築物の「第１の領域」であり得る。あるいは、非コード領域は、第１の領域以外の領域であり得る。そのような分子は、通常翻訳されないが、リボソームタンパク質または転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）等の１つ以上の翻訳機構成分への結合および隔離のうちの１つ以上によってタンパク質産生に影響を及ぼし、それによって、細胞におけるタンパク質発現を効果的に低下させるか、細胞における１つ以上の経路またはカスケードを調節し得、それが次いでタンパク質レベルを変化させる。シグナルセンサーポリヌクレオチドおよび／または一次構築物は、１個以上の長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡもしくはｌｉｎｃＲＮＡ）もしくはその部分、低分子核ＲＮＡ（ｓｎｏ−ＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、またはＰｉｗｉ干渉ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）を含有し得るか、あるいはこれらをコードし得る。
【０１０１】
栄養要求性シグナルセンサーポリヌクレオチド
一実施形態において、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチドは、栄養要求性であり得る。本明細書で使用されるとき、「栄養要求性」という表現は、腫瘍学関連タンパク質発現が実質的に阻止されるまたは低下するように、空間的または時間的な合図に応答して自身の分解または不活性化を引き起こす、助長するまたは誘導する少なくとも１つの特長を含むシグナルセンサーポリヌクレオチドを指す。そのような空間的または時間的な合図としては、特定の組織もしくは器官または細胞環境といった、翻訳されるシグナルセンサーポリヌクレオチドの位置が挙げられる。温度、ｐＨ、イオン強度、含水量などに関わる合図もさらに企図される。
【０１０２】
一実施形態において、その特長は、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチドの末端領域に位置する。非制限的な例として、選択された組織での栄養要求性ｍＲＮＡの発現が実質的に阻止されるまたは低下するように、栄養要求性ｍＲＮＡは、末端領域に、選択された組織で発現するｍｉＲに結合するｍｉＲ結合部位を含み得る。この目的のために例えば、ｍｉＲ−１２２結合部位を含む栄養要求性ｍＲＮＡは、肝臓に局在される場合はタンパク質を生産せず、なぜなら、ｍｉＲ−１２２が肝臓で発現され、ｍｉＲの結合は栄養要求性ｍＲＮＡの破壊を実行するからである。非制限的な例として、ＨＥＫ２９３細胞はｍｉＲ−１２２を発現せず、その結果、ＨＥＫ２９３でｍｉＲ−１２２配列を有するシグナルセンサーポリヌクレオチドの下方制御はほとんど一切ないが、ｍｉＲ−１２２を発現する肝細胞に関しては、肝細胞でｍｉＲ−１２２配列を有するシグナルセンサーポリヌクレオチドの下方制御があるだろう（例えば実施例１９に記載される実験を参照）。別の非制限的な例として、少なくとも１つのｍｉＲ−１２２結合部位、種配列を有さないｍｉＲ−１２２結合部位またはｍｉＲ−１２２結合部位をコードし、有するシグナルセンサーポリヌクレオチドを投与する前に、ｍｉＲ−１２２の量を、ＨｅＬａ細胞、初代培養ヒト肝細胞および初代培養ラット肝細胞で測定し得る。投与後、シグナルセンサーポリヌクレオチドの発現を測定して、シグナルセンサーポリヌクレオチドのｍｉＲ−１２２の弱化効果を決定し得る（例えば、実施例４１、４２、４３、５７、５８および５９で説明される実験を参照）。さらに別の非制限的な例として、異なる３’ＵＴＲのｍｉＲ−１２２結合部位、ｍｉＲ−１２２種または種を有さないｍｉＲ−１２２結合部位の効果を、限定はしないが、一番高い弱化効果といった所望する結果のための適切なＵＴＲを決定するために評価し得る（例えば、実施例４６に記載される研究を参照）。
【０１０３】
一実施形態において、栄養要求性ｍＲＮＡの分解または不活性化は、ｐＨの変化に反応する特長を含み得る。非制限的な例として、栄養要求性ｍＲＮＡは、５．０〜６．０のｐＨまたは６．０〜６．５のｐＨといった、ｐＨ４．５〜８．０の間のｐＨを有する環境で引き起こされ得る。ｐＨの変化は、０．１単位、０．２単位、０．３単位、０．４単位、０．５単位、０．６単位、０．７単位、０．８単位、０．９単位、１．０単位、１．１単位、１．２単位、１．３単位、１．４単位、１．５単位、１．６単位、１．７単位、１．８単位、１．９単位、２．０単位、２．１単位、２．２単位、２．３単位、２．４単位、２．５単位、２．６単位、２．７単位、２．８単位、２．９単位、３．０単位、３．１単位、３．２単位、３．３単位、３．４単位、３．５単位、３．６単位、３．７単位、３．８単位、３．９単位、４．０単位またはそれ以上の変化であり得る。
【０１０４】
別の実施形態では、栄養要求性ｍＲＮＡの分解または不活性化は、温度の変化によって引き起こされ得る、または、誘導され得る。非制限的な例として、室温から体温の温度の変化である。温度の変化は、１℃未満、５℃未満、１０℃未満、１５℃未満、２０℃未満、２５℃未満または２５℃超であり得る。
【０１０５】
さらに別の実施形態では、栄養要求性ｍＲＮＡの分解または不活性化は、対象のイオンの量の変化によって引き起こされ得る、または、誘導され得る。イオンは、制限しないが、ナトリウムイオン、カリウムイオン、塩素イオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオンおよび／またはリン酸イオンといった、カチオンまたはアニオンであり得る。
【０１０６】
目的とする腫瘍学関連ポリペプチド
本発明に従って、シグナルセンサー一次構築物は、１個以上の目的とする腫瘍学関連ポリペプチドまたはその断片をコードするように設計される。目的とする腫瘍学関連ポリペプチドは、全ポリペプチド、複数のポリペプチド、またはポリペプチドの断片を含み得るが、これらに限定されず、これらは、独立して、１個以上の核酸、複数の核酸、核酸の断片、または前述のうちのいずれかの変異形によってコードされ得る。本明細書で使用するとき、「目的とする腫瘍学関連ポリペプチド」という用語は、選択されて本発明のシグナルセンサー一次構築物においてコードされる任意のポリペプチドを指す。本明細書で使用するとき、「ポリペプチド」とは、ほとんどの場合ペプチド結合によって結合されるアミノ酸残基（天然または非天然）のポリマーを意味する。この用語は、本明細書で使用するとき、任意の大きさ、構造、または機能を有するタンパク質、ポリペプチド、およびペプチドを指す。いくつかの例において、コードされたポリペプチドが約５０個のアミノ酸よりも小さい場合、このポリペプチドは、ペプチドと称される。ポリペプチドがペプチドである場合、これは、少なくとも約２、３、４、または少なくとも５アミノ酸残基長である。したがって、ポリペプチドは、遺伝子産物、天然に存在するポリペプチド、合成ポリペプチド、相同体、オルソログ、パラログ、前述の断片および他の等価物、変異形、ならびに類似体を含む。ポリペプチドは、単一の分子であり得るか、または二量体、三量体、もしくは四量体等の多分子複合体であり得る。それらは、抗体またはインスリン等の一本鎖または多本鎖ポリペプチドも含み得、会合または結合され得る。ほとんどの場合、ジスルフィド結合が多本鎖ポリペプチドに見られる。「ポリペプチド」という用語は、１個以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工化学的類似体であるアミノ酸ポリマーにも適用され得る。
【０１０７】
「ポリペプチド変異形」という用語は、それらのアミノ酸配列が天然配列または参照配列とは異なる分子を指す。アミノ酸配列変異形は、天然配列または参照配列と比較して、アミノ酸配列内のある特定の位置に置換、欠失、および／または挿入を有し得る。通常、変異形は、天然配列または参照配列と少なくとも約５０％の同一性（相同性）を有し、好ましくは、それらは、天然配列または参照配列と少なくとも約８０％、より好ましくは、少なくとも約９０％同一（相同）である。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、「変異形模倣物」が提供される。本明細書で使用するとき、「変異形模倣物」という用語は、活性化配列を模倣する１個以上のアミノ酸を含有するものである。例えば、グルタミン酸塩は、ホスホロ−トレオニンおよび／またはホスホロ−セリンの模倣物の役割を果たし得る。あるいは、変異形模倣物は、その模倣物を含有する産物の失活または不活性化をもたらし得、例えば、フェニルアラニンは、チロシンの不活性化置換としての機能を果たし得るか、またはアラニンは、セリンの不活性化置換としての機能を果たし得る。
【０１０９】
「相同性」は、アミノ酸配列に適用されるとき、最大の相同パーセントを得るために、配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入した後の第２の配列のアミノ酸配列内の残基と同一の候補アミノ酸配列内の残基の割合（％）と定義される。整列させるための方法およびコンピュータプログラムは、当技術分野で周知である。相同性が同一性パーセントの計算に依存するが、計算に導入されるギャップおよびペナルティのため値が異なり得ることが理解される。
【０１１０】
「相同体」とは、ポリペプチド配列に適用されるとき、第２の種の第２の配列に対してかなりの割合の同一性を有する他の種の対応する配列を意味する。
【０１１１】
「類似体」は、親または出発ポリペプチドの特性のうちの１つ以上を依然として維持する、１つ以上のアミノ酸改変、例えば、アミノ酸残基の置換、付加、または欠失によって異なるポリペプチド変異形を含むよう意図される。
【０１１２】
本発明は、変異形および誘導体を含むポリペプチド系のいくつかの種類の組成物を企図する。これらは、置換、挿入、欠失、および共有結合変異形および誘導体を含む。「誘導体」という用語は、「変異形」という用語と同義に使用されるが、概して、任意の方法で参照分子または出発分子に対して修飾され、かつ／または変化した分子を指す。
【０１１３】
したがって、参照配列、具体的には、本明細書に開示の腫瘍学関連ポリペプチド配列に対して置換、挿入および／または付加、欠失、ならびに共有結合修飾を含有する腫瘍学関連ポリペプチドをコードするシグナルセンサーポリヌクレオチドが、本発明の範囲内に包含される。例えば、配列タグまたはアミノ酸、例えば、１個以上のリジンが、本発明のペプチド配列に付加され得る（例えば、Ｎ末端またはＣ末端で）。配列タグは、ペプチド精製または局在化に使用され得る。リジンを用いて、ペプチド溶解度を増加させるか、またはビオチン化を可能にする。あるいは、ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列のカルボキシおよびアミノ末端領域に位置するアミノ酸残基が任意に欠失されて、切断配列を提供し得る。あるいは、ある特定のアミノ酸（例えば、Ｃ末端またはＮ末端残基）は、配列の使用に応じて、例えば、可溶性のより大きい配列の一部として配列の発現時に欠失され得るか、または固体支持体に結合され得る。
【０１１４】
「置換変異形」とは、ポリペプチドについて言及するとき、天然配列または出発配列内の少なくとも１個のアミノ酸残基が除去され、その場所の同一の位置に異なるアミノ酸が挿入されたものである。これらの置換は、単一置換であり、分子中の１個のアミノ酸のみが置換されたものであり得、またはこれらの置換は、多置換であり、同一の分子中の２個以上のアミノ酸が置換されたものであり得る。
【０１１５】
本明細書で使用するとき、「保存アミノ酸置換」という用語は、配列に通常存在するアミノ酸を、同様の大きさ、電荷、または極性を有する異なるアミノ酸で置換することを指す。保存置換の例には、イソロイシン、バリン、およびロイシン等の非極性（疎水性）残基の別の非極性残基との置換が挙げられる。同様に、保存置換の例には、アルギニンとリジン、グルタミンとアスパラギン、およびグリシンのセリン等の極性（親水性）残基の別の残基との置換が挙げられる。さらに、リジン、アルギニン、もしくはヒスチジン等の塩基性残基の別の塩基性残基との置換、またはアスパラギン酸もしくはグルタミン酸等のある酸性残基の別の酸性残基との置換が、保存置換のさらなる例である。非保存置換の例には、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、メチオニン等の非極性（疎水性）アミノ酸残基の、システイン、グルタミン、グルタミン酸、もしくはリジン等の極性（親水性）残基との置換、および／または極性残基の非極性残基との置換が挙げられる。
【０１１６】
「挿入変異形」とは、ポリペプチドについて言及するとき、１個以上のアミノ酸が天然配列または出発配列内の特定の位置のアミノ酸にすぐ隣接して挿入されたものである。アミノ酸に「すぐ隣接した」とは、アミノ酸のα−カルボキシ官能基またはα−アミノ官能基のいずれかに連結されていることを意味する。
【０１１７】
「欠失変異形」とは、ポリペプチドについて言及するとき、天然アミノ酸配列または出発アミノ酸配列内の１個以上のアミノ酸が除去されたものである。通常、欠失変異形は、１個以上のアミノ酸を分子の特定の領域で欠失させる。
【０１１８】
「共有結合誘導体」は、ポリペプチドについて言及するとき、有機タンパク質性もしくは非タンパク質性誘導体化剤での天然タンパク質もしくは出発タンパク質の修飾、および／または翻訳後修飾を含む。共有結合修飾は、従来、タンパク質の標的アミノ酸残基を、選択された側鎖または末端残基と反応することができる有機誘導体化剤と反応させることによって、または選択された組換え宿主細胞において機能する翻訳後修飾の機構を利用することによって導入される。結果として生じる共有結合誘導体は、組換え糖タンパク質の免疫親和性精製のための抗タンパク質抗体の生物学的活性、免疫学的アッセイ、または調製に重要な残基の特定を目的としたプログラムにおいて有用である。そのような修飾は、当技術分野の技術の範囲内であり、過度の実験なく行われる。
【０１１９】
ある特定の翻訳後修飾は、発現腫瘍学関連ポリペプチドにおける組換え宿主細胞の作用の結果である。グルタミニルおよびアスパラギニル残基は、高い頻度で、翻訳後に対応するグルタミルおよびアスパルチル残基に脱アミド化される。あるいは、これらの残基は、弱酸性条件下で脱アミド化される。これらの残基のいずれかの形態も、本発明に従って産生された腫瘍学関連ポリペプチドに存在し得る。
【０１２０】
他の翻訳後修飾は、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリルまたはトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化を含む（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ｐｐ．７９−８６（１９８３））。
【０１２１】
「特徴」は、ポリペプチドについて言及するとき、分子のはっきりと異なるアミノ酸配列に基づく成分と定義される。本発明のｍｍＲＮＡによってコードされるポリペプチドの特徴には、表面出現、局所立体配座形状、折り畳み、ループ、半ループ、ドメイン、半ドメイン、部位、末端、またはこれらの任意の組み合わせが含まれる。
【０１２２】
本明細書で使用され、ポリペプチドについて言及するとき、「表面出現」という用語は、タンパク質のポリペプチド系成分が最も外側の表面に現れることを指す。
【０１２３】
本明細書で使用され、ポリペプチドについて言及するとき、「局所立体配座形状」という用語は、タンパク質の定義可能な空間内に位置するタンパク質のポリペプチド系構造の出現を意味する。
【０１２４】
本明細書で使用され、ポリペプチドについて言及するとき、「折り畳み」という用語は、エネルギー最小化時のアミノ酸配列の結果として生じる立体構造を指す。折り畳みは、折り畳みプロセスの二次または三次レベルで生じ得る。二次レベルの折り畳みの例には、βシートおよびαヘリックスが挙げられる。三次レベルの折り畳みの例には、エネルギー力の凝集または分離が原因で形成されるドメインおよび領域を含む。このようにして形成された領域は、疎水性および親水性ポケット等を含む。
【０１２５】
本明細書で使用する「回転」という用語は、タンパク質構造に関するとき、ペプチドまたはポリペプチドの骨格の方向を変化させる屈曲を意味し、１、２、または３個以上のアミノ酸残基が関与し得る。
【０１２６】
本明細書で使用され、ポリペプチドについて言及するとき、「ループ」という用語は、ペプチドまたはポリペプチドの骨格の方向を逆転させる役目を果たし得るポリペプチドの構造的特徴を指す。ループがポリペプチドで見つけられ、かつ骨格の方向のみを変化させる場合、これは、４個以上のアミノ酸残基を含み得る。Ｏｌｉｖａらは、少なくとも５つのクラスのタンパク質ループを特定している（Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２６６（４）：８１４−８３０；１９９７）。ループは、開ループまたは閉ループであり得る。閉ループまたは「環状」ループは、架橋部分の間に２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個以上のアミノ酸を含み得る。そのような架橋部分は、ジスルフィド架橋を有するポリペプチドにおいて典型的なシステイン−システイン架橋（Ｃｙｓ−Ｃｙｓ）を含み得るか、またはあるいは架橋部分は、本明細書で用いられるジブロモジルイル剤（ｄｉｂｒｏｍｏｚｙｌｙｌ  ａｇｅｎｔ）等の非タンパク質系のものであり得る。
【０１２７】
本明細書で使用され、ポリペプチドについて言及するとき、「半ループ」という用語は、それが由来するループとして特定されたアミノ酸残基の少なくとも半数を有するループの部分を指す。ループが必ずしも偶数のアミノ酸残基を含有するわけではないことが理解される。したがって、ループが奇数のアミノ酸を含有するか、または奇数のアミノ酸を含むと特定された場合において、奇数のループの半ループは、ループの整数部分または次の整数部分（ループのアミノ酸の数／２＋／−０．５個のアミノ酸）を含む。例えば、７アミノ酸ループと特定されたループは、３個のアミノ酸または４個のアミノ酸（７／２＝３．５＋／−０．５で３または４になる）の半ループをもたらし得る。
【０１２８】
本明細書で使用され、ポリペプチドについて言及するとき、「ドメイン」という用語は、１つ以上の特定可能な構造または機能特徴または特性（例えば、結合能力、タンパク質間の相互作用の部位としての役割を果たす）を有するポリペプチドのモチーフを指す。
【０１２９】
本明細書で使用され、ポリペプチドについて言及するとき、「半ドメイン」という用語は、それが由来するドメインとして特定されたアミノ酸残基の少なくとも半数を有するドメインの部分を意味する。ドメインが必ずしも偶数のアミノ酸残基を含有するわけではないことが理解される。したがって、ドメインが奇数のアミノ酸を含有するか、または奇数のアミノ酸を含むと特定された場合において、奇数のドメインの半ドメインは、ドメインの整数部分または次の整数部分（ドメインのアミノ酸の数／２＋／−０．５個のアミノ酸）を含む。例えば、７アミノ酸ドメインと特定されたドメインは、３個のアミノ酸または４個のアミノ酸（７／２＝３．５＋／−０．５で３または４になる）の半ドメインをもたらし得る。サブドメインがドメインまたは半ドメイン内で特定され得、これらのサブドメインが、それらが由来するドメインまたは半ドメインで特定された構造特性または機能特性のすべてに満たない構造特性または機能特性を有することも理解される。本明細書のドメイン型のうちのいずれを含むアミノ酸もポリペプチドの骨格に沿って隣接している必要はない（すなわち、非隣接アミノ酸が構造的に折り畳まれて、ドメイン、半ドメイン、またはサブドメインをもたらし得る）ことも理解される。
【０１３０】
本明細書で使用され、ポリペプチドについて言及するとき、「部位」という用語は、アミノ酸系の実施形態に関するとき、「アミノ酸残基」および「アミノ酸側鎖」と同義に使用される。部位は、本発明のポリペプチド系分子内で修飾、操作、改変、誘導体化、または変更され得るペプチドまたはポリペプチド内の位置を表す。
【０１３１】
本明細書で使用され、ポリペプチドについて言及するとき、「末端（ｔｅｒｍｉｎｉ）」または「末端（ｔｅｒｍｉｎｕｓ）」という用語は、ペプチドまたはポリペプチドの端を指す。そのような端は、ペプチドまたはポリペプチドの第１または最終部位に限定されるだけでなく、末端領域にさらなるアミノ酸も含み得る。本発明のポリペプチド系分子は、Ｎ末端（アミノ酸によって遊離アミノ基（ＮＨ２）で終端する）もＣ末端（アミノ酸によって遊離カルボキシル基（ＣＯＯＨ）で終端する）もいずれも有することを特徴とし得る。本発明のタンパク質は、ある場合には、ジスルフィド結合または非共有結合力（多量体、オリゴマー）によって結び付けられた複数のポリペプチド鎖から成り得る。これらの種類のタンパク質は、複数のＮ末端およびＣ末端を有する。あるいは、ポリペプチドの末端は、それらが場合によって有機複合体等の非ポリペプチド系部分で始まるか、または終了するように修飾され得る。
【０１３２】
これらの特徴のうちのいずれかが本発明のシグナルセンサー一次構築物またはｍｍＲＮＡによってコードされるポリペプチドの所望の成分であると特定または定義されると、これらの特徴のいくつかの操作および／または修飾のうちのいずれも、移動、交換、反転、欠失、ランダム化、または複製によって行われ得る。さらに、特徴の操作が本発明の分子に対する修飾と同一の結果をもたらすことが理解される。例えば、ドメインの欠失を伴う操作は、全長分子未満をコードする核酸の修飾のような分子の長さの改変をもたらす。
【０１３３】
修飾および操作は、部位特異的変異誘発等であるが、これに限定されない当技術分野で既知の方法によって達成され得る。その後、結果として生じる修飾された分子は、本明細書に記載のアッセイ等のインビトロまたはインビボアッセイ、または当技術分野で既知の任意の他の好適なスクリーニングアッセイを用いて活性について試験され得る。
【０１３４】
本発明に従って、腫瘍学関連ポリペプチドは、一連の実験によって発見されるコンセンサス配列を含み得る。本明細書で使用するとき、「コンセンサス」配列とは、１つ以上の部位で可変性を可能にする配列の集合集団を表す単一配列である。
【０１３５】
当業者によって認識されるように、タンパク質断片、機能的タンパク質ドメイン、および相同タンパク質も、本発明の目的とする腫瘍学関連ポリペプチドの範囲内であると見なされる。例えば、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、または１００を超えるアミノ酸長の参照腫瘍学関連タンパク質の任意のタンパク質断片（少なくとも１個のアミノ酸残基が参照腫瘍学関連ポリペプチド配列よりも短いが、他の点では同一である腫瘍学関連ポリペプチド配列を意味する）が本明細書に提供される。別の例において、本明細書に記載の配列のうちのいずれかと約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、または約１００％同一の一続きの約２０、約３０、約４０、約５０、または約１００個のアミノ酸を含む任意の腫瘍学関連タンパク質が本発明に従って利用され得る。ある特定の実施形態において、本発明に従って利用されるポリペプチドは、本明細書に提供または参照される配列のうちのいずれかに示される２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の変異を含む。
【０１３６】
コードされた腫瘍学関連ポリペプチド
本発明のシグナルセンサー一次構築物またはｍｍＲＮＡは、腫瘍学関連ペプチドおよびタンパク質といった、目的とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードするように設計され得る。
【０１３７】
一実施形態において、本発明のシグナルセンサー一次構築物またはｍｍＲＮＡは、参照腫瘍学関連ポリペプチド配列とある特定の同一性を有する変異形ポリペプチドをコードし得る。本明細書で使用される「参照腫瘍学関連ポリペプチド配列」は、出発腫瘍学関連ポリペプチド配列を指す。参照配列は、野生型配列であり得るか、または、別の配列の設計で参照されるいずれかの配列であり得る。「参照ポリペプチド配列」は例えば、表６に挙げられるタンパク質配列のいずれか１つであり得る。
【０１３８】
当技術分野で既知の「同一性」という用語は、配列を比較することによって決定される２個以上のペプチドの配列間の関係を指す。当技術分野において、同一性は、２個以上のアミノ酸残基のストリング間のマッチ数によって決定されるペプチド間の配列関連性の程度も意味する。同一性は、特定の数学モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち、「アルゴリズム」）によって処理されるギャップアライメント（存在する場合）を有する２つ以上の配列のうちのより小さい配列間の同一のマッチの割合（％）を測定する。関連ペプチドの同一性は、既知の方法によって容易に計算され得る。そのような方法には、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８、Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  １，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ
Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１、およびＣａｒｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．４８，１０７３（１９８８）に記載の方法が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３９】
いくつかの実施形態において、ポリペプチド変異形は、参照腫瘍学関連ポリペプチドと同一または同様の活性を有し得る。あるいは、変異形は、参照腫瘍学関連ポリペプチドと比較して変化（例えば、増加または減少）した活性を有し得る。概して、本発明の特定のシグナルセンサーポリヌクレオチドまたは腫瘍学関連ポリペプチドの変異形は、本明細書に記載され、かつ当業者に既知の配列アライメントプログラムおよびパラメータによって決定されるように、特定の参照シグナルセンサーポリヌクレオチドまたは腫瘍学関連ポリペプチドの変異形と少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％であるが、１００％未満の配列同一性を有する。そのようなアライメントのツールは、ＢＬＡＳＴプログラム一式を含む（Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｆ．Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｔｈｏｍａｓ  Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，Ａｌｅｊａｎｄｒｏ  Ａ．Ｓｃｈaｆｆｅｒ，Ｊｉｎｇｈｕｉ  Ｚｈａｎｇ，Ｚｈｅｎｇ  Ｚｈａｎｇ，Ｗｅｂｂ  Ｍｉｌｌｅｒ，ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９９７），“Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂｅｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）。他のツールは、本明細書、具体的には、「同一性」の定義に記載される。
【０１４０】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムの初期設定パラメータは、例えば、予測閾値１０、ワードサイズ２８、マッチ／ミスマッチスコア１、−２、線形ギャップコストを含む。任意のフィルター、ならびに種特異的繰り返し配列、例えば、ヒト特異的繰り返し配列の選択が適用され得る。
【０１４１】
一実施形態において、シグナルセンサーシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡを用いて対象の疾患、障害および／または状態を治療し得る。
【０１４２】
一実施形態において、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡを用いて対象の腫瘍成長を軽減、除去または防止し得る。
【０１４３】
一実施形態において、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物および／またはｍｍＲＮＡを用いて、対象のがんの少なくとも１つの症状を軽減および／または改善し得る。がんの症状としては、脱力感、疼痛および痛み、熱、疲労、体重減少、血液凝固、血液のカルシウム量の上昇、白血球数の低下、息切れ、めまい、頭痛、色素沈着過剰、黄疸、紅斑症、そう痒症、多毛症、排便習慣の変化、膀胱機能の変化、永続的な潰瘍、口内の白い斑点、舌上の白点、異常な出血または排泄、身体部分の肥大またはこぶ、消化不良、呑み込みにくさ、いぼまたはほくろの変化、新しい皮膚の変化およびしつこい咳またはしわがれ声が挙げられ得るが、これらに限定されない。さらに、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物および／またはｍｍＲＮＡは、限定されないが、ケモブレイン（ｃｈｅｍｏ  ｂｒａｉｎ）、末梢性ニューロパシー、疲労、鬱、吐き気、嘔吐、痛み、貧血、リンパ浮腫、感染症、性的副作用、妊孕能の低下または不妊症、オストミー、不眠症および脱毛といった、がん関連の副作用を軽減し得る。
【０１４４】
腫瘍学関連タンパク質または腫瘍学関連ペプチド
本明細書で開示されるシグナルセンサー一次構築物またはｍｍＲＮＡは、１個以上の有効な、または「試験用の」腫瘍学関連タンパク質または腫瘍学関連ペプチドをコードし得る。
【０１４５】
本発明に従うと、現在販売されている、または開発中の１つ以上の腫瘍学関連タンパク質または腫瘍学関連ペプチドが、本発明の腫瘍学関連シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡによってコードされ得る。理論に束縛されることは望まないが、本発明のシグナルセンサー一次構築物またはｍｍＲＮＡに組み込むことで、少なくとも部分的に、構築物設計の特異性、純度および選択性のために、治療上の効果の改善をもたらす。
【０１４６】
シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物および／またはｍｍＲＮＡは、生物学的および／または生理的なプロセスおよび／または化合物を改変し得、例えば、がん細胞、前がん細胞および／もしくは他の細胞における、細胞周期、ＤＮＡ損傷応答（例えば、ＤＮＡ損傷修復）、アポトーシス、血管新生、細胞運動性、上皮細胞の上皮間葉転換、ホスファチジルイノシトール３（ＰＩ３）キナーゼ／Ａｋｔ細胞性シグナル伝達経路、テロメラーゼ活性および／もしくは発現、腫瘍転移、腫瘍形成、カテプシン、細胞老化、受容体チロシンキナーゼシグナル伝達、代謝および薬物代謝、Ｇタンパク質シグナル伝達、成長因子および受容体、熱ショックタンパク質、ヒストンデアセチラーゼ、ホルモン受容体、低酸素、ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ、プロテインキナーゼ、ＲＡＳシグナル伝達、トピソメラーゼ、転写因子ならびに腫瘍抑制活性が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４７】
一実施形態において、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物および／またはｍｍＲＮＡを用いて、欠失または突然変異させた遺伝子から生産されるタンパク質を置換する目的で、細胞または組織でポリペプチドを発現させ得る。
【０１４８】
さらに、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを用いて、天然および／または合成由来の発癌物質によって生じた癌を治療し得る。別の実施形態では、ポリヌクレオチド、一次構築物および／またはｍｍＲＮＡの使用を用いて、他の生物体によって引き起こされるがんおよび／またはウイルス感染によって引き起こされるがんを治療し得る。
【０１４９】
隣接領域のセンサー：非翻訳領域（ＵＴＲ）
遺伝子の非翻訳領域（ＵＴＲ）は、転写されるが、翻訳されない。５’ＵＴＲが転写開始部位で始まり開始コドンに続くが、開始コドンを含まない一方で、３’ＵＴＲは、終止コドンの直後に始まり、転写終結シグナルまで続く。核酸分子および翻訳の安定性においてＵＴＲが果たす制御的役割についての報告が相次いでいる。ＵＴＲの制御特徴は、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡに組み込まれて、分子の安定性を高め得る。特定の特徴も組み込まれて、万が一それらが望ましくない器官部位に誤指向される場合には転写物の制御された下方制御を確保することができる。非翻訳領域は、ｍＲＮＡを生産し得、および／または、細胞、組織および／または生物体に送達されて、目的とするポリペプチドを生産し得るベクター系に組み込まれ得る。
【０１５０】
一実施形態において、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物および／またはｍｍＲＮＡは、少なくとも１つの末端修飾を含み得る。末端修飾の非制限的な例が、２０１２年１１月２６日出願の米国仮特許出願第６１／７２９，９３３号、表題「Ｔｅｒｍｉｎａｌｌｙ  Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＲＮＡｓ」、２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，２２４号、表題「Ｔｅｒｍｉｎａｌｌｙ  Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ＲＮＡｓ」、２０１３年１月３１日出願の米国仮特許出願第６１／７５８，９２１号、表題「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｕｓｉｎｇ  ＲＮＡ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ」、２０１３年３月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７８１，１３９号、表題「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｕｓｉｎｇ  ＲＮＡ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ」、２０１３年５月３１日出願の米国仮特許出願第６１／８２９，３５９号、表題「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｕｓｉｎｇ  ＲＮＡ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ」、２０１３年６月２７日出願の米国仮特許出願第６１／８３９，９０３号、表題「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ
Ｕｓｉｎｇ  ＲＮＡ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ」、２０１３年７月３日出願の米国仮特許出願第６１／８４２，７０９号、表題「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ
Ｕｓｉｎｇ  ＲＮＡ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ」、２０１３年７月２３日出願の米国仮特許出願第６１／８５７，４３６号、表題「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｕｓｉｎｇ  ＲＮＡ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ」に記載されており、当該仮特許出願の各々の内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。これらの末端修飾には、５’キャップ、末端領域におけるマイクロＲＮＡ結合部位、鎖終止ヌクレオシド、末端領域における翻訳エンハンサー要素ならびにポリＡーＧカルテットおよびステムループ配列を含む尾部配列が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５１】
５’ＵＴＲおよび翻訳開始
天然５’ＵＴＲは、翻訳開始に関与する特徴を有する。それらは、リボソームが多くの遺伝子の翻訳を開始するプロセスに関与することで一般に知られているコザック配列のような特徴を有する。コザック配列は、コンセンサスＣＣＲ（Ａ／Ｇ）ＣＣＡＵＧＧを有し、式中、Ｒは、開始コドン（ＡＵＧ）の３塩基上流のプリン（アデニンまたはグアニン）であり、この後に別の「Ｇ」が続く。５’ＵＴＲは、伸長因子結合に関与する二次構造を形成することも知られている。例えば、二次５’−ＵＴＲ構造の１つにｅＩＦ４Ａ２伸長因子結合のための構造化したＩＲＥＳがあり、これは、３’ＵＴＲにおけるマイクロＲＮＡ媒介性遺伝子抑制に必要である。
【０１５２】
伸長因子結合に関わる５’ＵＴＲの二次構造は、５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲで他のＲＮＡ結合分子と相互作用し、遺伝子発現を調節し得る。例えば、５’ＵＴＲで二次構造化した要素に結合する伸長因子ＥＩＦ４Ａ２は、マイクロＲＮＡ媒介性抑制に必要である（Ｍｅｉｊｅｒ  ＨＡ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１３、３４０、８２−８５、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。５’ＵＴＲにおける異なる二次構築物が隣接領域に組み込まれ、特定の組織または細胞のｍＲＮＡを安定化するかまたは選択的に不安定化するかのいずれかを行い得る。
【０１５３】
特定の標的器官の多量に発現した遺伝子において典型的に見られる特徴を操作することによって、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの安定性および腫瘍学関連タンパク質産生を高めることができる。例えば、アルブミン、血清アミロイドＡ、アポリポタンパク質Ａ／Ｂ／Ｅ、トランスフェリン、αフェトタンパク質、エリスロポエチン、または第ＶＩＩＩ因子等の肝臓で発現したｍＲＮＡの５’ＵＴＲ導入を用いて、肝細胞株または肝臓でのｍｍＲＮＡ等の核酸分子の発現を高めることができる。同様に、他の組織特異的ｍＲＮＡからの５’ＵＴＲを用いてその組織での発現を高めることは、筋肉（ＭｙｏＤ、ミオシン、ミオグロビン、ミオゲニン、ヘルクリン（Ｈｅｒｃｕｌｉｎ））、内皮細胞（Ｔｉｅ−１、ＣＤ３６）、骨髄細胞（Ｃ／ＥＢＰ、ＡＭＬ１、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＤ１１ｂ、ＭＳＲ、Ｆｒ−１、ｉ−ＮＯＳ）、白血球（ＣＤ４５、ＣＤ１８）、脂肪組織（ＣＤ３６、ＧＬＵＴ４、ＡＣＲＰ３０、アディポネクチン）、および肺上皮細胞（ＳＰ−Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ）において可能である。
【０１５４】
他の非ＵＴＲ配列が、５’ＵＴＲ（または３’ＵＴＲ）に組み込まれ得る。例えば、イントロンまたはイントロン配列の一部は、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの隣接領域に組み込まれ得る。イントロン配列の組み込みは、タンパク質産生、ならびにｍＲＮＡ量を増加させ得る。
【０１５５】
翻訳エンハンサー要素（ＴＥＥ）
一実施形態において、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、修飾核酸および／またはｍｍＲＮＡの５’ＵＴＲには、少なくとも１つの翻訳上エンハンサーポリヌクレオチド、翻訳エンハンサー要素、翻訳上エンハンサー要素（複数）（集合的に「ＴＥＥ」（複数可）と呼ぶ）が含まれ得る。非制限的な例として、ＴＥＥは、転写プロモーターと開始コドンとの間に位置し得る。５’ＵＴＲに少なくとも１つのＴＥＥを有するシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、修飾核酸および／またはｍｍＲＮＡは、５’ＵＴＲにキャップを含み得る。さらに、キャップ依存性またはキャップ非依存性翻訳を行うシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、修飾核酸および／またはｍｍＲＮＡの５’ＵＴＲに、少なくとも１つのＴＥＥが位置し得る。
【０１５６】
「翻訳上エンハンサー要素」または「翻訳エンハンサー要素」（本明細書では集合的に「ＴＥＥ」と呼ぶ）という語句は、ｍＲＮＡから生産されるポリペプチドまたはタンパク質の量を増大する配列を指す。
【０１５７】
一実施形態において、ＴＥＥはＵＴＲで保存される要素であり、限定はしないが、キャップ依存性またはキャップ非依存性翻訳といった、核酸の翻訳活性を助長することができる。これらの配列の保存は、ヒトを含む１４種にわたってＰａｎｅｋら（Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１３、１−１０；参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）によって以前に示されている。
【０１５８】
一実施形態において、ＴＥＥは実施例４５の表３５で挙げるＴＥＥのいずれかであり得、その部分および／または断片を含む。ＴＥＥ配列は、表３５に開示されるＴＥＥ配列の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％もしくは９９％超を含み得、および／または、ＴＥＥ配列は、表３５に開示されるＴＥＥ配列の５〜３０個のヌクレオチド断片、５〜２５個のヌクレオチド断片、５〜２０個のヌクレオチド断片、５〜１５個のヌクレオチド断片、５〜１０個のヌクレオチド断片を含み得る。
【０１５９】
１つの非制限的な例として、公知のＴＥＥは、Ｇｔｘホメオドメインタンパク質の５′−リーダーにあり得る（Ｃｈａｐｐｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１：９５９０−９５９４、２００４、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０１６０】
別の非制限的な例として、ＴＥＥは、米国特許出願第２００９０２２６４７０号では配列番号１〜３５、米国特許出願第ＷＯ２０１３０１７７５８１号では配列番号１〜３５、国際特許出願第ＷＯ２００９０７５８８６号では配列番号１〜３５、国際特許出願第ＷＯ２０１２００９６４４号では配列番号１〜５および７〜６４５、国際特許出願第ＷＯ１９９９０２４５９５号では配列番号１、米国特許出願第ＵＳ６３１０１９７号では配列番号１、および、米国特許出願第ＵＳ６８４９４０５号では配列番号１として開示され、当該出願は各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１６１】
さらに別の非制限的な例として、限定はしないが、各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第ＵＳ７４６８２７５号、米国特許公開第ＵＳ２００７００４８７７６号および同第２０１１０１２４１００号ならびに国際特許公開第ＷＯ２００７０２５００８号および同第２００１０５５３６９号に記載されるような配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、ＨＣＶ−ＩＲＥＳまたはＩＲＥＳ要素であり得る。ＩＲＥＳ要素としては、限定はしないが、各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｈａｐｐｅｌｌら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０１：９５９０−９５９４、２００４）およびＺｈｏｕら（ＰＮＡＳ１０２：６２７３−６２７８、２００５）によって、ならびに、米国特許公開第ＵＳ２００７００４８７７６号および同第ＵＳ２０１１０１２４１００号および国際特許公開第ＷＯ２００７０２５００８号に記載されるＧｔｘ配列（例えば、Ｇｔｘ９−ｎｔ、Ｇｔｘ８−ｎｔ、Ｇｔｘ７−ｎｔ）が挙げられ得る。
【０１６２】
「翻訳上エンハンサーポリヌクレオチド」または「翻訳エンハンサーポリヌクレオチド配列」は、本明細書で例として挙げられる、および／または、当該技術分野（例えば、米国特許第ＵＳ６３１０１９７号、米国特許第ＵＳ６８４９４０５号、米国特許第ＵＳ７４５６２７３号、米国特許第ＵＳ７１８３３９５号、米国特許第ＵＳ２００９０２２６４７０号、米国特許第ＵＳ２００７００４８７７６号、米国特許第ＵＳ２０１１０１２４１００号、米国特許第ＵＳ２００９００９３０４９号、米国特許第ＵＳ２０１３０１７７５８１号、国際公開第ＷＯ２００９０７５８８６号、国際公開第ＷＯ２００７０２５００８号、国際公開第ＷＯ２０１２００９６４４号、国際公開第ＷＯ２００１０５５３７１号、国際公開第ＷＯ１９９９０２４５９５号、ならびに欧州特許第ＥＰ２６１０３４１Ａ１号および欧州特許第２６１０３４０Ａ１号を参照；各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる）で開示される特定のＴＥＥまたはそれらの変異形、相似体まもしくは機能的誘導体を１つ以上含むポリヌクレオチドである。特定のＴＥＥの１または複数の複写物がシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、修飾核酸および／またはｍｍＲＮＡに存在し得る。翻訳上エンハンサーポリヌクレオチドのＴＥＥは、１つ以上の配列セグメントで組織化され得る。配列セグメントは、本明細書で例として挙げられる特定のＴＥＥを１つ以上保有し得、各ＴＥＥは１つ以上の複写物で存在する。複数の配列セグメントが翻訳上エンハンサーポリヌクレオチドに存在する場合、同種または異種であり得る。したがって、翻訳上エンハンサーポリヌクレオチドの複数の配列セグメントは、同一もしくは異なる種類の本明細書で例示される特定のＴＥＥ、特定のＴＥＥそれぞれの同一もしくは異なる数の複写物、および／または、各配列セグメント内にＴＥＥの同一もしくは異なる組織を保有し得る。
【０１６３】
一実施形態において、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、修飾核酸および／またはｍｍＲＮＡは、各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ１９９９０２４５９５号、国際公開第ＷＯ２０１２００９６４４号、国際公開第ＷＯ２００９０７５８８６号、国際公開第ＷＯ２００７０２５００８号、国際公開第ＷＯ１９９９０２４５９５号、欧州特許公開第ＥＰ２６１０３４１Ａ１号およびＥＰ２６１０３４０Ａ１号、米国特許第ＵＳ６３１０１９７号、米国特許第ＵＳ６８４９４０５号、米国特許第ＵＳ７４５６２７３号、米国特許第ＵＳ７１８３３９５号、米国特許第ＵＳ２００９０２２６４７０号、米国特許第ＵＳ２０１１０１２４１００号、米国特許第ＵＳ２００７００４８７７６号、米国特許第ＵＳ２００９００９３０４９号および米国特許第ＵＳ２０１３０１７７５８１号で説明されるＴＥＥを少なくとも１つ含み得る。ＴＥＥは、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、修飾核酸および／またはｍｍＲＮＡの５’ＵＴＲに位置し得る。
【０１６４】
別の実施形態では、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、修飾核酸および／またはｍｍＲＮＡは、各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第ＵＳ２００９０２２６４７０号、米国特許第ＵＳ２００７００４８７７６号、米国特許第ＵＳ２０１３０１７７５８１号および米国特許第ＵＳ２０１１０１２４１００号、国際公開第ＷＯ１９９９０２４５９５号、国際公開第ＷＯ２０１２００９６４４号、国際公開第ＷＯ２００９０７５８８６号および国際公開第ＷＯ２００７０２５００８号、欧州特許第ＥＰ２６１０３４１Ａ１号および欧州特許第ＥＰ２６１０３４０Ａ１号、米国特許第ＵＳ６３１０１９７号、米国特許第ＵＳ６８４９４０５号、米国特許第ＵＳ７４５６２７３号、米国特許第ＵＳ７１８３３９５号に記載されるＴＥＥと、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％の同一性を有するＴＥＥを少なくとも１つ含み得る。
【０１６５】
一実施形態において、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、修飾核酸および／またはｍｍＲＮＡの５’ＵＴＲは、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、少なくとも５５個または６０個超のＴＥＥ配列を含み得る。本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、修飾核酸および／またはｍｍＲＮＡの５’ＵＴＲにおけるＴＥＥ配列は、同一または異なるＴＥＥ配列であり得る。ＴＥＥ配列は、ＡＢＡＢＡＢもしくはＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢもしくはＡＢＣＡＢＣＡＢＣまたは１回、２回または４回以上繰り返したその変異形といったパターンであり得る。これらのパターンでは、各文字Ａ、ＢまたはＣは、ヌクレオチドレベルで異なるＴＥＥ配列を表す。
【０１６６】
一実施形態において、５’ＵＴＲは、２つのＴＥＥ配列を分離するスペーサーを含み得る。非制限的な例として、スペーサーは１５個のヌクレオチドのスペーサーおよび／または当該技術分野で知られる他のスペーサーであり得る。非制限的な例として、５’ＵＴＲは、５’ＵＴＲで少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回および少なくとも９回または９回超で繰り返されるＴＥＥ配列−スペーサーモジュールを含み得る。
【０１６７】
別の実施形態では、２つのＴＥＥ配列を分離するスペーサーは、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、修飾核酸および／またはｍｍＲＮＡの翻訳を制御し得る当該技術分野では公知の他の配列を含み得、例えば、本明細書に記載されるｍｉＲ配列（例えばｍｉＲ結合部位およびｍｉＲ種）が挙げられるがこれらに限定されない。非制限的な例として、２つのＴＥＥを分離するために使用される各スペーサーは、異なるｍｉＲ配列またはｍｉＲ配列の異なる成分（例えば、ｍｉＲ種配列）を含み得る。
【０１６８】
一実施形態において、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、修飾核酸および／またはｍｍＲＮＡの５’ＵＴＲにおけるＴＥＥは、米国特許第ＵＳ２００９０２２６４７０号、米国特許第ＵＳ２００７００４８７７６号、米国特許第ＵＳ２０１３０１７７５８１号および米国特許第ＵＳ２０１１０１２４１００号、国際公開第ＷＯ１９９９０２４５９５号、国際公開第ＷＯ２０１２００９６４４号、国際公開第ＷＯ２００９０７５８８６号および国際公開第ＷＯ２００７０２５００８号、欧州特許第ＥＰ２６１０３４１Ａ１号および欧州特許第ＥＰ２６１０３４０Ａ１号、米国特許第ＵＳ６３１０１９７号、米国特許第ＵＳ６８４９４０５号、米国特許第ＵＳ７４５６２７３号、米国特許第ＵＳ７１８３３９５で開示されるＴＥＥ配列の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または９９％超を含み得る。別の実施形態では、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、修飾核酸および／またはｍｍＲＮＡの５’ＵＴＲにおけるＴＥＥは、各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第２００９０２２６４７０号、米国特許第２００７００４８７７６号、米国特許第２０１３０１７７５８１号および米国特許第２０１１０１２４１００号、国際公開第ＷＯ１９９９０２４５９５号、国際公開第ＷＯ２０１２００９６４４号、国際公開第ＷＯ２００９０７５８８６号および国際公開第ＷＯ２００７０２５００８号、欧州特許第２６１０３４１Ａ１号およびＥＰ２６１０３４０Ａ１号、米国特許第６３１０１９７号、米国特許第６８４９４０５号、米国特許第７４５６２７３号、米国特許第７１８３３９５号で開示されるＴＥＥ配列の５〜３０個のヌクレオチド断片、５〜２５個のヌクレオチド断片、５〜２０個のヌクレオチド断片、５〜１５個のヌクレオチド断片、５〜１０個のヌクレオチド断片を含み得る。
【０１６９】
一実施形態において、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、修飾核酸および／またはｍｍＲＮＡの５’ＵＴＲにおけるＴＥＥは、各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｈａｐｐｅｌｌら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０１：９５９０−９５９４、２００４）およびＺｈｏｕら（ＰＮＡＳ１０２：６２７３−６２７８、２００５）に開示され、Ｗｅｌｌｅｎｓｉｅｋら（Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃａｐ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ−ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０１３；ＤＯＩ：１０．１０３８／ＮＭＥＴＨ．２５２２）によって開示された補足表１および補足表２で開示されるＴＥＥ配列の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または９９％超を含み得る。別の実施形態では、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、修飾核酸および／またはｍｍＲＮＡの５’ＵＴＲにおけるＴＥＥは、各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｈａｐｐｅｌｌら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０１：９５９０−９５９４、２００４）およびＺｈｏｕら（ＰＮＡＳ１０２：６２７３−６２７８、２００５）に開示され、Ｗｅｌｌｅｎｓｉｅｋら（Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃａｐ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ−ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０１３；ＤＯＩ：１０．１０３８／ＮＭＥＴＨ．２５２２）によって開示された補足表１および補足表２で開示されるＴＥＥ配列の５〜３０個のヌクレオチド断片、５〜２５個のヌクレオチド断片、５〜２０個のヌクレオチド断片、５〜１５個のヌクレオチド断片、５〜１０個のヌクレオチド断片を含み得る。
【０１７０】
一実施形態において、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、修飾核酸および／またはｍｍＲＮＡの５’ＵＴＲで用いられるＴＥＥは、ＩＲＥＳ配列であり、例えば、各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７４６８２７５号および国際公開第ＷＯ２００１０５５３６９号に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７１】
一実施形態において、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、修飾核酸および／またはｍｍＲＮＡの５’ＵＴＲで用いされるＴＥＥは、各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第２００７００４８７７６号および米国特許第２０１１０１２４１００号ならびに国際公開第ＷＯ２００７０２５００８号および国際公開第ＷＯ２０１２００９６４４号に記載される方法で識別され得る。
【０１７２】
別の実施形態では、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、修飾核酸および／またはｍｍＲＮＡの５’ＵＴＲで用いられるＴＥＥは、各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７４５６２７３号および米国特許第７１８３３９５号、米国特許第２００９００９３０４９号ならびに国際公開第ＷＯ２００１０５５３７１号に記載される転写調節要素であり得る。転写調節要素は、各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７４５６２７３号および米国特許第７１８３３９５号、米国特許第２００９００９３０４９号ならびに国際公開第ＷＯ２００１０５５３７１号に記載される方法といった、当該技術分野で公知の方法で識別され得るが、これらに限定されない。
【０１７３】
さらに別の実施形態では、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、修飾核酸および／またはｍｍＲＮＡの５’ＵＴＲで用いられるＴＥＥは、各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７４５６２７３号および米国特許第７１８３３９５号、米国特許第２００９００９３０４９号ならびに国際公開第ＷＯ２００１０５５３７１号に記載されるオリゴヌクレオチドまたはその部分である。
【０１７４】
本明細書に記載されるＴＥＥを少なくとも１つ含む５’ＵＴＲは、限定はしないが、ベクター系または核酸ベクターといったモノシストロニック配列に組み込まれ得る。非制限的な例として、ベクター系または核酸ベクターは、各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７４５６２７３号および米国特許第７１８３３９５号、米国特許第２００７００４８７７６号、米国特許第２００９００９３０４９号および米国特許第２０１１０１２４１００号ならびに国際公開第ＷＯ２００７０２５００８号および国際公開第ＷＯ２００１０５５３７１号に記載されるものを含み得る。
【０１７５】
一実施形態において、本明細書に記載されるＴＥＥは、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、修飾核酸および／またはｍｍＲＮＡの５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲに位置し得る。３’ＵＴＲに位置するＴＥＥは、５’ＵＴＲに位置する、および／または、５’ＵＴＲへの組み込みに関して説明されたＴＥＥと同一および／または異なり得る。
【０１７６】
一実施形態において、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、修飾核酸および／またはｍｍＲＮＡの３’ＵＴＲは、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、少なくとも５５個または６０個超のＴＥＥ配列を含み得る。本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、修飾核酸および／またはｍｍＲＮＡの３’ＵＴＲにおけるＴＥＥ配列は、同一または異なるＴＥＥ配列であり得る。ＴＥＥ配列は、ＡＢＡＢＡＢまたはＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢまたはＡＢＣＡＢＣＡＢＣまたは１回、２回または４回以上繰り返されるその変異形といったパターンであり得る。これらのパターンでは、各文字Ａ、ＢまたはＣはヌクレオチドレベルで異なるＴＥＥ配列を表す。
【０１７７】
一実施形態において、３’ＵＴＲは、２つのＴＥＥ配列を分離するスペーサーを含み得る。非制限的な例として、スペーサーは１５個のヌクレオチドのスペーサーおよび／または当該技術分野で知られる他のスペーサーであり得る。非制限的な例として、３’ＵＴＲは、３’ＵＴＲで少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回および少なくとも９回または９回超で繰り返されるＴＥＥ配列−スペーサーモジュールを含み得る。
【０１７８】
別の実施形態では、２つのＴＥＥ配列を分離するスペーサーは、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、修飾核酸および／またはｍｍＲＮＡの翻訳を制御し得る当該技術分野では公知の他の配列を含み得、例えば、本明細書に記載されるｍｉＲ配列（例えばｍｉＲ結合部位およびｍｉＲ種）が挙げられるがこれらに限定されない。非制限的な例として、２つのＴＥＥ配列を分離するために使用される各スペーサーは、異なるｍｉＲ配列またはｍｉＲ配列の異なる成分（例えば、ｍｉＲ種配列）を含み得る。
【０１７９】
一実施形態において、ｍｉＲ配列および／またはＴＥＥ配列の組み込みは、ステムループ領域の形状を変え、これは、翻訳を増大および／または低下し得る（例えば、Ｋｅｄｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａ  Ｐｕｍｉｌｉｏ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ＲＮＡ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ
ｓｗｉｔｃｈ  ｉｎ  ｐ２７−３’ＵＴＲ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｍｉＲ−２２１  ａｎｄ  ｍｉＲ−２２  ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．２０１０を参照、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０１８０】
一実施形態において、５’ＵＴＲは、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ配列を含み得る。マイクロＲＮＡ配列は、限定はしないが、１９または２２個のヌクレオチド配列および／または種を有さないマイクロＲＮＡ配列であり得る。
【０１８１】
一実施形態において、５’ＵＴＲにおけるマイクロＲＮＡ配列を用いて、本明細書に記載される核酸および／またはｍＲＮＡを安定化させ得る。
【０１８２】
別の実施形態では、５’ＵＴＲにおけるマイクロＲＮＡ配列を用いて、限定はしないが、開始コドンといった、翻訳開始の部位の到達性を低下し得る。Ｍａｔｓｕｄａら（ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１０  １１（５）：ｅ１５０５７；参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）は、第１の開始コドン（ＡＵＧ）への到達性を低下させるために、開始コドンの周囲（ＡＵＧコドンのＡが＋１である場合−４〜＋３７）でアンチセンスロック核酸（ＬＮＡ）オリゴヌクレオチドおよびエキソン−ジャンクション複合体（ＥＪＣ）を用いた。Ｍａｔｓｕｄａは、開始コドン周辺の配列をＬＮＡまたはＥＪＣで改変すると、核酸またはｍＲＮＡの効率、長さおよび構造上の安定性が影響を受けることを示した。本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチドは、翻訳開始の部位の到達性を低下させるために、翻訳開始の部位付近に、Ｍａｔｓｕｄａらが説明したＬＮＡまたはＥＪＣの代わりにマイクロＲＮＡ配列を含み得る。翻訳開始の部位は、マイクロＲＮＡ配列の前、後ろまたはその中であり得る。非制限的な例として、翻訳開始の部位は、種配列または結合部位といったマイクロＲＮＡ配列内に位置し得る。別の非制限的な例として、翻訳開始の部位は、種配列またはｍｉｒ−１２２結合部位といったｍｉｒ−１２２配列内に位置し得る。
【０１８３】
一実施形態において、本発明の核酸またはｍＲＮＡは、核酸またはｍＲＮＡの領域に、ＲＮＡ結合タンパク質と相互作用し得るマイクロＲＮＡ配列を少なくとも１つ含む。
【０１８４】
ＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）のためのＲＮＡモチーフ
ＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）は、同時転写および転写後遺伝子発現の数多くの側面を制御し得、例えば、ＲＮＡスプライシング、局在化、翻訳、ターンオーバー、ポリアデニル化、キャッピング、修飾、搬出および局在化が挙げられるが、これらに限定されない。限定はしないが、ＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲ）およびｈｎＲＮＰ  Ｋ−相同（ＫＨ）ドメインといったＲＮＡ結合ドメイン（ＲＢＤ）は通常、ＲＢＰとそのＲＮＡ標的との間の配列の関連性を制御する（Ｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２０１３．４９９：１７２−１７７；参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。一実施形態において、標準のＲＢＤは短いＲＮＡ配列と結合し得る。別の実施形態では、標準ＲＢＤは構造ＲＮＡを認識できる。
【０１８５】
一実施形態において、核酸および／またはｍＲＮＡは、限定はしないがＲＮＡ結合ドメイン（ＲＢＤ）といったＲＮＡ結合モチーフを少なくとも１つ含み得る。
【０１８６】
一実施形態において、ＲＢＤは、Ｒａｙら（Ｎａｔｕｒｅ  ２０１３．４９９：１７２−１７７；参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）が記載するＲＢＤ、その断片または変異形のいずれかであり得る。
【０１８７】
一実施形態において、本発明の核酸またはｍＲＮＡは、少なくとも１つのＲＮＡ結合ドメイン（ＲＢＤ）のための配列を含み得る。本発明の核酸またはｍＲＮＡが２つ以上のＲＢＤを含む場合、ＲＢＤは同一の種由来である必要はなく、または、同一の構造上のクラス由来である必要すらない。
【０１８８】
一実施形態において、少なくとも１つの隣接領域（例えば、５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲ）は少なくとも１つのＲＢＤを含み得る。別の実施形態では、第１の隣接領域および第２の隣接領域は双方とも少なくとも１つのＲＢＤを含み得る。ＲＢＤは同一であり得、または、各ＲＢＤは、もう一方のＲＢＤと少なくとも６０％の配列同一性を有し得る。非制限的な例として、少なくとも１つのＲＢＤが、本発明の核酸またはｍＲＮＡの３’ＵＴＲの前、後ろおよび／またはその中に位置し得る。別の非制限的な例として、少なくとも１つのＲＢＤが、３’ＵＴＲの最初の３００個のヌクレオシドの前またはその中に位置し得る。
【０１８９】
別の実施形態では、本発明の核酸および／またはｍＲＮＡは、結合ヌクレオシドの第１の領域に少なくとも１つのＲＢＤを含み得る。ＲＢＤは、コード領域（例えばＯＲＦ）の前、後ろまたはその中に位置し得る。
【０１９０】
さらに別の実施形態では、結合ヌクレオシドの第１の領域および／または少なくとも１つの隣接領域は、少なくとも１つのＲＢＤを含み得る。非制限的な例として、結合ヌクレオシドの第１の領域は、スプライシング因子に関わるＲＢＤを含み得、少なくとも１つの隣接領域は、安定性および／または翻訳因子のためのＲＢＤを含み得る。
【０１９１】
一実施形態において、本発明の核酸および／またはｍＲＮＡは、核酸および／またはｍＲＮＡのコードおよび／または非コード領域に位置するＲＢＤを少なくとも１つ含み得る。
【０１９２】
一実施形態において、少なくとも１つのＲＢＤが少なくとも１つの隣接領域に組み込まれ、本発明の核酸および／またはｍＲＮＡの安定性を増大し得る。
【０１９３】
一実施形態において、ＲＮＡ結合タンパク質モチーフのマイクロＲＮＡ配列を用いて、限定はしないが、開始コドンといった翻訳開始の部位の到達性を低下させ得る。本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチドは、翻訳開始の部位の到達性を低下させるために、翻訳開始の部位付近に、Ｍａｔｓｕｄａらが説明したＬＮＡまたはＥＪＣの代わりにマイクロＲＮＡ配列を含み得る。翻訳開始の部位は、マイクロＲＮＡ配列の前、後ろまたはその中であり得る。非制限的な例として、翻訳開始の部位は、種配列または結合部位といったマイクロＲＮＡ配列内に位置し得る。別の非制限的な例として、翻訳開始の部位は、種配列またはｍｉｒ−１２２結合部位といったｍｉｒ−１２２配列内に位置し得る。
【０１９４】
別の実施形態では、アンチセンスでロックした核酸（ＬＮＡ）オリゴヌクレオチドおよびエキソン−ジャンクション複合体（ＥＪＣ）をＲＮＡ結合タンパク質モチーフで使用し得る。第１の開始コドン（ＡＵＧ）への到達性を低下するために、ＬＮＡおよびＥＪＣを開始コドンの周辺で（ＡＵＧコドンのＡを＋１とする場合、−４〜＋３７）使用し得る。
【０１９５】
３’ＵＴＲおよびＡＵ豊富な要素
３’ＵＴＲは、それらに包理される一続きのアデノシン（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ）およびウリジン（Ｕｒｉｄｉｎｅ）を有することで知られている。これらのＡＵ豊富な特徴は、特に高代謝回転率を有する遺伝子においてよく見られる。それらの配列特徴および機能特性に基づいて、ＡＵ豊富な要素（ＡＲＥ）は、３つのクラスに分類され得る（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）：クラスＩのＡＲＥは、Ｕ豊富な領域内にＡＵＵＵＡモチーフのいくつかの分散したコピーを含有する。Ｃ−ＭｙｃおよびＭｙｏＤは、クラスＩのＡＲＥを含有する。クラスＩＩのＡＲＥは、２個以上の重複したＵＵＡＵＵＵＡ（Ｕ／Ａ）（Ｕ／Ａ）九量体を有する。この種のＡＲＥを含有する分子は、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦ−ａを含む。クラスＩＩＩのＡＲＥは、あまり明確にされていない。これらのＵ豊富な領域は、ＡＵＵＵＡモチーフを含有しない。Ｃ−Ｊｕｎおよびミオゲニンが、十分に研究されたこのクラスの例の２つである。ＡＲＥに結合する大半のタンパク質がメッセンジャーを不安定にすることで知られているが、ＥＬＡＶファミリーのメンバー、中でも注目すべきＨｕＲがｍＲＮＡの安定性を向上させることが実証されている。ＨｕＲは、これら３つのクラスのＡＲＥに結合する。ＨｕＲ特異的結合部位を操作して核酸分子の３’ＵＴＲに入れることで、ＨｕＲ結合、ひいてはインビボでのメッセージの安定化につながる。
【０１９６】
３’ＵＴＲのＡＵ豊富な要素（ＡＲＥ）の導入、除去、または修飾を用いて、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの安定性を調節することができる。特定のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを操作するとき、ＡＲＥの１つ以上のコピーが導入されて、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの安定性を低下させ、それによって、結果として生じるタンパク質の翻訳を抑制し、その産生を低減させ得る。同様に、ＡＲＥは、特定および除去されるか、または変異されて、細胞内安定性を向上させ、ひいては結果として生じるタンパク質の翻訳および産生を増加させることができる。本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを用いた形質移入実験を関連細胞株において行うことができ、タンパク質産生を形質移入後の様々な時点でアッセイすることができる。例えば、細胞を、異なるＡＲＥ操作分子で形質移入することができ、関連タンパク質に対してＥＬＩＳＡキットを用いて形質移入後６時間、１２時間、２４時間、４８時間、および７日時点で産生されたタンパク質をアッセイすることができる。
【０１９７】
３’ＵＴＲおよび三重鎖
一実施形態において、本発明のシグナル配列ポリヌクレオチドは、シグナル配列ポリヌクレオチドの３’末端上に三重鎖を含み得る。本発明の核酸の３’末端には、三重鎖が、単独またはポリＡ尾部と組み合わせて含まれ得る。
【０１９８】
一実施形態において、本発明のシグナル配列ポリヌクレオチドは、少なくとも、第１および第２のＵ豊富な領域、第１と第２の領域との間の保存されたステムループ領域ならびにＡ豊富な領域を含み得る。第１および第２のＵ豊富な領域およびＡ豊富な領域は、対合して核酸の３’末端上に三重鎖を形成し得る。この三重鎖は、核酸を安定化し、核酸の翻訳効率を向上させ、および／または、３’末端を分解から保護し得る。例示的な三重鎖としては、転移関連肺腺癌転写物１（ＭＡＬＡＴ１）、ＭＥＮ−βおよびポリアデニル化核（ＰＡＮ）ＲＮＡの三重鎖配列（Ｗｉｌｕｓｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２０１２  ２６：２３９２−２４０７を参照；参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）が挙げられるが、これに限定されない。一実施形態において本発明の修飾核酸、強化した修飾ＲＮＡまたはリボ核酸の３’末端は、ＴＴＴＴＴＣＴＴＴＴ（配列番号１）を含む第１のＵ豊富な領域、ＴＴＴＴＧＣＴＴＴＴＴ（配列番号２）またはＴＴＴＴＧＣＴＴＴＴ（配列番号３）を含む第２のＵ豊富な領域、ＡＡＡＡＡＧＣＡＡＡＡ（配列番号４）を含むＡ豊富な領域を含む。別の実施形態では、本発明の核酸の３’末端は、第１のＵ豊富な領域、保存された領域、第２のＵ豊富な領域およびＡ豊富な領域を含む三重鎖形成構造を含む。
【０１９９】
一実施形態において、三重鎖は、クローバー型の構造の前のＭＡＬＡＴ１配列の切断から形成され得る。理論に限定される意図はないが、ＭＡＬＡＴ１は非コードの長いＲＮＡであり、これは、切断された時に三重鎖およびｔＲＮＡ様クローバー型構造を形成する。ＭＡＬＡＴ１転写物は次いで核スペックルに局在化し、ｔＲＮＡ様クローバー型は、細胞質に局在化するＷｉｌｕｓｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２００８  １３５（５）：９１９−９３２；参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０２００】
非制限的な例として、ＭＡＬＡＴ１配列を含む本発明の核酸の末端は次いで、クローバー型構造からのＲＮａｓｅＰ切断の後、三重鎖を形成し得、これは、核酸を安定化させる（Ｐｅａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｏｎ−ｍＲＮＡ  ３’  ｅｎｄ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ：ｈｏｗ  ｔｈｅ  ｏｔｈｅｒ  ｈａｌｆ  ｌｉｖｅｓ；ＷＩＲＥｓ  ＲＮＡ  ２０１３；参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０２０１】
一実施形態において、本明細書に記載されるシグナル配列ポリヌクレオチドは、ＭＡＬＡＴ１配列を含む。別の実施形態では、シグナル配列ポリヌクレオチドはポリアデニル化され得る。さらに別の実施形態では、シグナル配列ポリヌクレオチドは、ポリアデニル化されていないが、非修飾核酸またはｍＲＮＡに比べると、分解に対する耐性が増大している。
【０２０２】
一実施形態において、本発明のシグナル配列ポリヌクレオチドは、第２の隣接領域（例えば、３’ＵＴＲ）にＭＡＬＡＴ１配列を含み得る。非制限的な例として、ＭＡＬＡＴ１配列はヒトまたはマウスであり得る。
【０２０３】
別の実施形態では、ＭＡＬＡＴ１配列のクローバー型構造はまた、ＲＮａｓｅＺおよびＣＣＡ添加酵素によるプロセシングを経て、ｍａｓｃＲＮＡ（ＭＡＬＡＴ１−関連小細胞質ＲＮＡ）と呼ばれるｔＲＮＡ様構造を形成し得る。非制限的な例として、ｍａｓｃＲＮＡは、タンパク質またはその断片をコードし得、および／または、マイクロＲＮＡ配列を含み得る。ｍａｓｃＲＮＡは本明細書に記載される化学修飾を少なくとも１つ含み得る。
【０２０４】
ステムループ
一実施形態において、本発明の核酸は、限定はしないが、ヒストンステムループといった、ステムループを含み得る。ステムループは、長さが約２５個または約２６個のヌクレオチドであるヌクレオチド配列であり得、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１３１０３６５９号に記載される配列番号７〜１７が挙げられるが、これらに限定されない。ヒストンステムループは、コード領域に関して３’（例えば、コード領域の３’末端）に位置し得る。非制限的な例として、ステムループは本明細書に記載される核酸の３’末端に位置し得る。
【０２０５】
一実施形態において、ステムループは第２の末端領域に位置し得る。非制限的な例として、ステムループは第２の末端領域の非翻訳領域（例えば、３’ＵＴＲ）内に位置し得る。
【０２０６】
一実施形態において、ヒストンステムループを含む、限定はしないがｍＲＮＡといった核酸は、少なくとも１つの鎖終止ヌクレオシドの添加によって安定化され得る。理論に制限されることは望まないが、少なくとも１つの鎖終止ヌクレオシドの添加によって、核酸の分解が遅くなり得、したがって核酸の半減期が増加し得る。
【０２０７】
一実施形態において、鎖終止ヌクレオシドは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１３１０３６５９号で説明されるものであり得るが、これらに限定されない。別の実施形態では、本発明と一緒に使用され得る鎖終止ヌクレオシドとしては、３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−デオキシウリジン、３’−デオキシシトシン、３’−デオキシグアノシン、３’−デオキシチミン、２’，３’−ジデオキシアデノシン、２’，３’−ジデオキシウリジン、２’，３’−ジデオキシシトシン、２’，３’−ジデオキシグアノシン、２’，３’−ジデオキシチミンといった２’，３’−ジデオキシヌクレオシド、２’−デオキシヌクレオシドまたは−Ｏ−メチルヌクレオシドが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０８】
別の実施形態では、ヒストンステムループを含む、限定はしないがｍＲＮＡといった核酸は、オリジオ（ｏｌｉｇｉｏ）（Ｕ）の添加を阻止および／または阻害し得る修飾を核酸の３’領域に行うことで安定化され得る（例えば、国際公開第ＷＯ２０１３１０３６５９号を参照、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０２０９】
さらに別の実施形態では、ストンステムループを含む、限定はしないがｍＲＮＡといった核酸は、３’−デオキシヌクレオシド、２’，３’−ジデオキシヌクレオシド、３’−０−メチルヌクレオシド、３’−０−エチルヌクレオシド、３’−アラビノシドならびに当該技術分野で公知の、および／または、本明細書に記載される他の修飾ヌクレオシドで終わるオリゴヌクレオチドの添加によって安定化され得る。
【０２１０】
一実施形態において、本発明の核酸には、ヒストンステムループ、ポリＡ尾部配列および／または５’キャップ構造が含まれ得る。ヒストンステムループは、ポリＡ尾部配列の前および／または後ろにあり得る。ヒストンステムループおよびポリＡ尾部配列を含む核酸は、本明細書に記載される鎖終止ヌクレオシドを含み得る。
【０２１１】
別の実施形態では、本発明の核酸は、ヒストンステムループおよび５’キャップ構造を含み得る。５’キャップ構造は、限定はしないが、本明細書に記載されるおよび／または当該技術分野で知られるものを含み得る。
【０２１２】
一実施形態において、保存されたステムループ領域は、本明細書に記載されるｍｉＲ配列を含み得る。非制限的な例として、ステムループ領域は、本明細書に記載されるｍｉＲ配列の種配列を含み得る。別の非制限的な例では、ステムループ領域はｍｉＲ−１２２種配列を含み得る。
【０２１３】
別の実施形態では、保存されるステムループ領域は、本明細書に記載されるｍｉＲ配列を含み得、ＴＥＥ配列も含み得る。
【０２１４】
一実施形態において、ｍｉＲ配列および／またはＴＥＥ配列の組み込みは、ステムループ領域の形状を変化させ、これによって翻訳が増大／低下し得る（例えば、Ｋｅｄｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａ  Ｐｕｍｉｌｉｏ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ＲＮＡ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｓｗｉｔｃｈ  ｉｎ  ｐ２７−３’ＵＴＲ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｍｉＲ−２２１  ａｎｄ  ｍｉＲ−２２  ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．２０１０を参照、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０２１５】
５’キャッピング
ｍＲＮＡの５’キャップ構造は、核外輸送に関与し、ｍＲＮＡの安定性を向上させ、ｍＲＮＡキャップ結合タンパク質（ＣＢＰ）に結合し、これは、ＣＢＰのポリ（Ａ）結合タンパク質との会合を介して細胞におけるｍＲＮＡ安定性および翻訳適格性に関与し、成熟環状ｍＲＮＡ種を形成する。このキャップはさらに、ｍＲＮＡスプライシング中に５’近位のイントロンの除去を支援する。
【０２１６】
内因性ｍＲＮＡ分子は、５’末端キャップされて、末端グアノシンキャップ残基とｍＲＮＡ分子の５’末端転写センスヌクレオチドとの間に５’−ｐｐｐ−５’−トリホスフェート結合をもたらし得る。その後、この５’−グアニル酸キャップがメチル化されて、Ｎ７−メチル−グアニル酸残基を生成し得る。ｍＲＮＡの５’末端の末端および／または前末端転写ヌクレオチドのリボース糖も、任意に２’−Ｏ−メチル化され得る。グアニル酸キャップ構造の加水分解および切断を介する５’デキャッピングは、分解するためにｍＲＮＡ分子等の核酸分子を標的とし得る。
【０２１７】
本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡの修飾は、デキャッピングを阻止する非加水分解性のキャップ構造を生成し、その結果ｍＲＮＡの半減期を増加させ得る。キャップ構造の加水分解が５’−ｐｐｐ−５’ホスホロジエステル結合の切断を必要とするため、修飾ヌクレオチドが、キャッピング反応中に用いられ得る。例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）のワクシニアキャッピング酵素を製造業者の指示に従ってα−チオ−グアノシンヌクレオチドとともに用いて、５’−ｐｐｐ−５’キャップにおけるホスホロチオエート結合を引き起こすことができる。α−メチル−ホスホネートおよびセレノ−ホスフェートヌクレオチド等のさらなる修飾グアノシンヌクレオチドを用いることができる。
【０２１８】
さらなる修飾には、糖環の２’−ヒドロキシル基におけるｍＲＮＡの５’末端および／または５’前末端ヌクレオチドのリボース糖の２’−Ｏ−メチル化（上述のもの）が含まれるが、これに限定されない。複数のはっきりと異なる５’−キャップ構造を用いて、ｍＲＮＡ分子等の核酸分子の５’キャップを生成することができる。
【０２１９】
本明細書において合成キャップ類似体、化学キャップ、化学キャップ類似体、または構造もしくは機能キャップ類似体とも称されるキャップ類似体は、それらの化学構造の点で天然の（すなわち、内因性、野生型、または生理学的）５’キャップとは異なるが、キャップ機能は保持する。キャップ類似体は、化学的（すなわち、非酵素的）もしくは酵素的に合成され、かつ核酸分子に結合され得る。
【０２２０】
例えば、反逆方向キャップ類似体（ＡＲＣＡ）キャップは、５’−５’−トリホスフェート基によって結合される２個のグアニンを含有し、一方のグアニンは、Ｎ７メチル基、ならびに３’−Ｏ−メチル基（すなわち、Ｎ７，３’−Ｏ−ジメチル−グアノシン−５’−トリホスフェート−５’−グアノシン（ｍ７Ｇ−３’ｍｐｐｐ−Ｇ、これは同等に３’Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇと指定され得る）を含有する。他方の未修飾グアニンの３’−Ｏ原子は、キャップされた核酸分子（例えば、ｍＲＮＡまたはｍｍＲＮＡ）の５’末端ヌクレオチドに結合される。Ｎ７−および３’−Ｏ−メチル化グアニンは、キャップされた核酸分子（例えば、ｍＲＮＡまたはｍｍＲＮＡ）の末端部分を提供する。
【０２２１】
別の例示のキャップには、ｍＣＡＰがあり、これは、ＡＲＣＡと同様であるが、グアノシン上に２’−Ｏ−メチル基（すなわち、Ｎ７，２’−Ｏ−ジメチル−グアノシン−５’−トリホスフェート−５’−グアノシン、ｍ７Ｇｍ−ｐｐｐ−Ｇ）を有する。
【０２２２】
キャップ類似体がインビトロ転写反応において同時に起こる核酸分子のキャッピングを可能にする一方で、転写物の最大２０％がキャップされないままである。これ、ならびに内因性細胞転写機構によって産生される核酸の内因性５’−キャップ構造とのキャップ類似体の構造差は、翻訳適格性の低下および細胞安定性の低下をもたらし得る。
【０２２３】
本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡは、より真正の５’−キャップ構造を生成するために、酵素を用いて転写後にもキャップされ得る。本明細書で使用するとき、「より真正の」という表現は、構造的または機能的のいずれかで内因性または野生型特徴を酷似させるか、または模倣する特徴を指す。すなわち、「より真正の」特徴は、先行技術の合成特徴もしくは類似体等と比較して、より良好に内因性、野生型、天然、もしくは生理学的細胞機能および／もしくは構造を表しているか、またはこれは、対応する内因性、野生型、天然または生理学的特徴を１つ以上の点においてしのぐ。本発明のより真正の５’キャップ構造の非限定的な例には、当技術分野で既知の合成５’キャップ構造（または野生型、天然、または生理学的５’キャップ構造）と比較して、とりわけ、強化されたキャップ結合タンパク質の結合、増加した半減期、低下した５’エンドヌクレアーゼに対する感受性、および／または低下した５’デキャッピングを有するものがある。例えば、組換えワクシニアウイルスキャッピング酵素および組換え２’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ酵素は、ｍＲＮＡの５’末端ヌクレオチドとグアニンキャップヌクレオチドとの間に基準の５’−５’−トリホスフェート結合を生成し得、キャップグアニンは、Ｎ７メチル化を含有、ｍＲＮＡの５’末端ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルを含有する。そのような構造は、キャップ１構造と称される。このキャップは、例えば、当技術分野で既知の他の５’キャップ類似体構造と比較して、より高い翻訳適格性および細胞安定性、ならびに細胞炎症誘発性サイトカインの活性化の低下をもたらす。キャップ構造には、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ，ｐＮ２ｐ（キャップ０）、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐ（キャップ１）、および７ｍＧ（５’）−ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮ２ｍｐ（キャップ２）が含まれる。
【０２２４】
シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡが転写後にキャップされ得、かつこのプロセスがより効率的であるため、ほぼ１００％のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡがキャップされ得る。これは、キャップ類似体がインビトロ転写反応の過程でｍＲＮＡに結合されるときの約８０％とは大いに異なる。
【０２２５】
本発明に従って、５’末端キャップは、内因性キャップまたはキャップ類似体を含み得る。本発明に従って、５’末端キャップは、グアニン類似体を含み得る。有用なグアニン類似体には、イノシン、Ｎ１−メチル−グアノシン、２’フルオロ−グアノシン、７−デアザ−グアノシン、８−オキソ−グアノシン、２−アミノ−グアノシン、ＬＮＡ−グアノシン、および２−アジド−グアノシンが含まれる。
【０２２６】
ウイルス配列
限定はしないが大麦縞萎縮ウイルス（ＢＹＤＶ−ＰＡＶ）の翻訳エンハンサー配列といったウイルス配列は、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの３’ＵＴＲに操作および挿入され得、インビトロおよびインビボで構築物の翻訳を刺激し得る。形質移入実験を関連細胞株において行うことができ、ＥＬＩＳＡによってタンパク質産生を形質移入後１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、および７日時点でアッセイすることができる。
【０２２７】
ＩＲＥＳ配列
さらに、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含有し得るシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡが提供される。最初に特徴的なピコルナウイルスＲＮＡと特定されたＩＲＥＳは、５’キャップ構造の不在下でタンパク質合成を開始するときに重要な役割を果たす。ＩＲＥＳは、ｍＲＮＡの唯一のリボソーム結合部位として働き得るか、または複数のリボソーム結合部位のうちの１つの役割を果たし得る。２個以上の機能的リボソーム結合部位を含有するシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、リボソーム（「多シストロン性核酸分子」）によって独立して翻訳されるいくつかの腫瘍学関連ペプチドまたは腫瘍学関連ポリペプチドをコードし得る。シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡにＩＲＥＳが提供されるとき、第２の翻訳可能な領域がさらに任意に提供される。本発明に従って用いられ得るＩＲＥＳ配列の例には、制限なく、ピコルナウイルス（例えば、ＦＭＤＶ）、ペストウイルス（ＣＦＦＶ）、ポリオウイルス（ＰＶ）、脳心筋炎ウイルス（ＥＣＭＶ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、豚コレラウイルス（ＣＳＦＶ）、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、またはコオロギ麻痺ウイルス（ＣｒＰＶ）由来のものが挙げられる。
【０２２８】
ポリＡ尾部
ＲＮＡ処理中、長いアデニンヌクレオチド鎖（ポリＡ尾部）が、安定性を向上させるためにｍＲＮＡ分子といったのポリヌクレオチドに付加され得る。転写直後、転写物の３’末端が切断されて３’ヒドロキシルを遊離させ得る。その後、ポリＡポリメラーゼは、アデニンヌクレオチド鎖をＲＮＡに付加する。ポリアデニル化と呼ばれるこのプロセスは１００〜２５０残基長であり得るポリＡ尾部を付加する。
【０２２９】
特有のポリＡ尾部の長さが、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡにある特定の利点を提供することが見出されている。
【０２３０】
概して、本発明のポリＡ尾部の長さは、３０ヌクレオチド長を超える。別の実施形態において、ポリＡ尾部は、３５ヌクレオチド長を超える（例えば、少なくとも約３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，５００、および３，０００ヌクレオチド長であるか、またはこれらを超える）。いくつかの実施形態において、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、約３０〜約３，０００個のヌクレオチド（例えば、３０〜５０、３０〜１００、３０〜２５０、３０〜５００、３０〜７５０、３０〜１，０００、３０〜１，５００、３０〜２，０００、３０〜２，５００、５０〜１００、５０〜２５０、５０〜５００、５０〜７５０、５０〜１，０００、５０〜１，５００、５０〜２，０００、５０〜２，５００、５０〜３，０００、１００〜５００、１００〜７５０、１００〜１，０００、１００〜１，５００、１００〜２，０００、１００〜２，５００、１００〜３，０００、５００〜７５０、５００〜１，０００、５００〜１，５００、５００〜２，０００、５００〜２，５００、５００〜３，０００、１，０００〜１，５００、１，０００〜２，０００、１，０００〜２，５００、１，０００〜３，０００、１，５００〜２，０００、１，５００〜２，５００、１，５００〜３，０００、２，０００〜３，０００、２，０００〜２，５００、および２，５００〜３，０００個）を含む。
【０２３１】
一実施形態において、ポリＡ尾部は、全体のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの長さに対して設計される。この設計は、コーディング領域の長さ、特定の特徴もしくは領域の長さ（第１もしくは隣接領域等）に基づき得るか、またはポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはｍｍＲＮＡから発現した最終産物の長さに基づき得る。
【０２３２】
この文脈において、ポリＡ尾部は、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはｍｍＲＮＡ、またはその特徴よりも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは１００％長い長さであり得る。ポリＡ尾部は、それが属するポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの画分としても設計され得る。この文脈において、ポリＡ尾部は、構築物の全長または構築物の全長からポリＡ尾部を差し引いた長さの１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％以上であり得る。
【０２３３】
一実施形態において、操作した結合部位、および／またはシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡのポリＡ結合タンパク質のための複合体化を用いて発現を強化し得る。操作した結合部位は、核酸および／またはｍＲＮＡの局所微小環境のリガンドのための結合部位として作用し得るセンサー配列であり得る。非制限的な例として、核酸および／またはｍＲＮＡは、少なくとも１つの操作した結合部位を含み、ポリＡ結合タンパク質（ＰＡＢＰ）およびその類似体の結合親和性を変化し得る。少なくとも１つの操作した結合部位の組み込みは、ＰＡＢＰおよびその類似体の結合親和性を増大し得る。
【０２３４】
さらに、複数のはっきりと異なるシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、ポリＡ尾部の３’末端で修飾されたヌクレオチドを用いて３’末端を介してＰＡＢＰ（ポリＡ結合タンパク質）に結合され得る。形質移入実験を関連細胞株において行うことができ、ＥＬＩＳＡによってタンパク質産生を形質移入後１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、および７日時点でアッセイすることができる。非制限的な例として、形質移入実験を利用して、少なくとも１つの操作した結合部位の添加の結果としての、ＰＡＢＰまたはその類似体の結合親和性に対する効果を評価し得る。
【０２３５】
一実施形態において、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチドおよび一次構築物は、ポリＡーＧカルテットを含むように設計される。Ｇ四重項は、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方においてＧ豊富な配列によって形成され得る４個のグアニンヌクレオチドの環状水素結合アレイである。この実施形態において、Ｇ四重項は、ポリＡ尾部の終端に組み込まれる。結果として生じるｍｍＲＮＡ構築物は、安定性、タンパク質産生、および様々な時点での半減期他のパラメータについてアッセイされる。ポリＡーＧカルテットが、１２０個のヌクレオチドのポリＡ尾部を単独で用いてもたらされるタンパク質産生の少なくとも７５％に相当するタンパク質産生をもたらすことが見出されている。
【０２３６】
一実施形態において、本発明の核酸またはｍＲＮＡはポリＡ尾部を含み得、鎖終止ヌクレオシドの添加によって安定化され得る。ポリＡ尾部を有する核酸および／またはｍＲＮＡはさらに５’キャップ構造を含み得る。
【０２３７】
別の実施形態では、本発明の核酸またはｍＲＮＡは、ポリＡーＧカルテットを含み得る。ポリＡーＧカルテットを有する核酸および／またはｍＲＮＡはさらに５’キャップ構造を含み得る。
【０２３８】
一実施形態において、ポリＡ尾部またはポリＡーＧカルテットを含む核酸またはｍＲＮＡを安定化させるために用いられ得る鎖終止ヌクレオシドは、限定はしないが、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１３１０３６５９号に記載されるものであり得る。別の実施形態では、本発明と一緒に用いられ得る鎖終止ヌクレオシドとしては、限定はしないが、３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−デオキシウリジン、３’−デオキシシトシン、３’−デオキシグアノシン、３’−デオキシチミン、２’，３’−ジデオキシアデノシン、２’，３’−ジデオキシウリジン、２’，３’−ジデオキシシトシン、２’，３’−ジデオキシグアノシン、２’，３’−ジデオキシチミンといった２’，３’−ジデオキシヌクレオシド、２’−デオキシヌクレオシド、または−Ｏ−メチルヌクレオシドが挙げられる。
【０２３９】
別の実施形態では、ポリＡ尾部またはポリＡーＧカルテットを含む、限定はしないが、ｍＲＮＡといった核酸を、オリジオ（Ｕ）の添加を阻止および／または阻害し得る、核酸の３’領域への修飾によって安定化し得る（例えば、国際公開第ＷＯ２０１３１０３６５９号参照、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０２４０】
さらに別の実施形態では、ポリＡ尾部またはポリＡーＧカルテットを含む、限定はしないが、ｍＲＮＡといった核酸を、３’−デオキシヌクレオシド、２’，３’−ジデオキシヌクレオシド、３’−０−メチルヌクレオシド、３’−０−エチルヌクレオシド、３’−アラビノシドならびに当該技術分野で知られる、および／または、本明細書に記載される他の修飾ヌクレオシドの添加によって安定化し得る。
【０２４１】
定量化
一実施形態において、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、１つ以上の体液由来のエクソソームにおいて定量化され得る。本明細書で使用するとき、「体液」には、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、痰、唾液、骨髄、滑液、房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、クーパー腺液または射精前液、汗、糞便、毛髪、涙液、嚢胞液、胸膜および腹水、心嚢液、リンパ液、粥状液、乳糜、胆汁、間質液、帯下、膿汁、皮脂、嘔吐物、膣分泌物、粘膜分泌物、水便、膵液、鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引物、胚盤胞腔液、および臍帯血が含まれる。あるいは、エクソソームは、肺、心臓、膵臓、胃、腸、膀胱、腎臓、卵巣、睾丸、皮膚、結腸、乳房、前立腺、脳、食道、肝臓、および胎盤からなる群から選択される器官から回収され得る。
【０２４２】
定量化方法において、２ｍＬを超えない試料が対象から得られ、エクソソームが、サイズ排除クロマトグラフィー、密度勾配遠心分離、分画遠心分離、ナノ膜限外濾過、免疫吸収捕獲、親和性精製、微小流体分離、またはこれらの組み合わせによって単離される。分析において、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡのレベルまたは濃度は、投与された構築物の発現レベル、存在、不在、切断、または改変であり得る。このレベルを１つ以上の臨床表現型またはヒト疾患バイオマーカーについてのアッセイと相関させることは、有利である。このアッセイが、構築物特異的プローブ、サイトメトリー、ｑＲＴ−ＰＣＲ、実時間ＰＣＲ、ＰＣＲ、フローサイトメトリー、電気泳動、質量分析、またはこれらの組み合わせを用いて行われ得る一方で、エクソソームは、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）等の免疫組織化学法を用いて単離され得る。エクソソームは、サイズ排除クロマトグラフィー、密度勾配遠心分離、分画遠心分離、ナノ膜限外濾過、免疫吸収捕獲、親和性精製、微小流体分離、またはこれらの組み合わせによっても単離され得る。
【０２４３】
これらの方法は、残存しているか、または送達されたシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡのレベルをリアルタイムで監視する能力を研究者に提供する。これは、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡが構造および／または化学修飾に起因して内因性形態とは異なるといった理由から、可能である。
【０２４４】
ＩＩ．シグナルセンサーポリヌクレオチドの設計および合成
本発明に従って用いるシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、化学合成、一般にインビトロ転写（ＩＶＴ）と称される酵素合成、またはより長い前駆体の酵素的もしくは化学的切断等を含むが、これらに限定されない任意の利用可能な技法に従って調製され得る。ＲＮＡを合成する方法は、当技術分野において既知である（例えば、いずれも参照により本明細書に組み込まれる、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（ｅｄ．）Ｏｌｉｇｏヌクレオチドｙｎｔｈｅｓｉｓ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ［Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ］，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ：ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８４、およびＨｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｐ．（ｅｄ．）Ｏｌｉｇｏヌクレオチドｙｎｔｈｅｓｉｓ：ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖ．２８８（Ｃｌｉｆｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．：Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，２００５を参照のこと）。
【０２４５】
本発明のシグナルセンサー一次構築物の設計および合成のプロセスは、概して、遺伝子構築ステップ、ｍＲＮＡ産生ステップ（修飾を伴うか、または伴わない）、および精製ステップを含む。酵素合成方法において、目的とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードする標的シグナルセンサーポリヌクレオチド配列が、増幅されてｃＤＮＡ鋳型を産生するベクターへの組み込みのために最初に選択される。任意に、標的シグナルセンサーポリヌクレオチド配列および／または任意の隣接配列は、コドン最適化され得る。その後、ｃＤＮＡ鋳型を用いて、インビトロ転写（ＩＶＴ）によってｍＲＮＡを産生する。産生後、ｍＲＮＡは、精製および浄化プロセスを経り得る。これらのステップは、以下でより詳細に提供される。
【０２４６】
遺伝子構築
遺伝子構築ステップは、遺伝子合成、ベクター増幅、プラスミド精製、プラスミド線形化および浄化、ならびにｃＤＮＡ鋳型合成および浄化を含み得るが、これらに限定されない。
【０２４７】
遺伝子合成
目的とする腫瘍学関連ポリペプチドまたは標的が産生のために選択された時点で、シグナルセンサー一次構築物が設計される。一次構築物内で、目的とするポリペプチドをコードする結合ヌクレオシドの第１の領域は、選択された核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）転写物のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を用いて構築され得る。ＯＲＦは、野生型ＯＲＦ、アイソフォーム、変異形、またはその断片を含み得る。本明細書で使用するとき、「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」は、目的とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードすることができる核酸配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を指すよう意図される。ＯＲＦは、多くの場合、開始コドンＡＴＧで始まり、ナンセンスまたは終止コドンもしくはシグナルで終わる。
【０２４８】
さらに、第１の領域のヌクレオチド配列は、コドン最適化され得る。コドン最適化方法は、当技術分野において既知であり、いくつかの目標のうちの１つ以上を達成する取り組みにおいて有用であり得る。これらの目標には、標的および宿主生物体におけるコドン頻度を一致させて適切な折り畳みを確実にすること、ＧＣ含量を付勢させてｍＲＮＡの安定性を高めるか、または二次構造を減少させること、遺伝子構築または発現を障害し得る縦列反復コドンまたは塩基泳動を最小限に抑えること、転写および翻訳制御領域をカスタマイズすること、タンパク質輸送配列を挿入または除去すること、コードされたタンパク質における翻訳後修飾部位（例えば、グリコシル化部位）を除去／付加すること、タンパク質ドメインを付加、除去、または組み替えること、制限部位を挿入するか、または欠失させること、リボソーム結合部位およびｍＲＮＡ分解部位を修飾すること、翻訳速度を調節してタンパク質の様々なドメインの適切な折り畳みを可能にすること、あるいはｍＲＮＡ内の問題の二次構造を減少させるか、または排除することが含まれる。コドン最適化ツール、アルゴリズム、およびサービスは、当技術分野において既知であり、非限定的な例には、ＧｅｎｅＡｒｔのサービス（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および／またはＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ  ＣＡ）が挙げられる。一実施形態において、ＯＲＦ配列は、最適化アルゴリズムを用いて最適化される。各アミノ酸のコドン選択肢が表１に提供される。
表１．コドン選択肢
【表０００１】
2018183181.tif 000002
【０２４９】
一実施形態において、ヌクレオチド配列をコドン最適化した後、制限部位を含む領域に関してさらに評価し得る。配列から制限部位を取り除くために、制限部位内の少なくとも１つのヌクレオチドを別のヌクレオチドで置換し得るが、ヌクレオチドの置換はコドン最適化ヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を改変する。
【０２５０】
本発明のいくつかの実施形態において有益であると見なされ得る特徴は、シグナルセンサー一次構築物によってコードされ得、第１または第２の隣接領域としてＯＲＦに隣接し得る。この隣接領域は、ＯＲＦの最適化前および／または後にシグナルセンサー一次構築物に組み込まれ得る。シグナルセンサー一次構築物が５’隣接領域と３’隣接領域の両方を含有する必要はない。そのような特徴の例には、非翻訳領域（ＵＴＲ）、コザック配列、オリゴ（ｄＴ）配列、および検出可能なタグが挙げられるが、これらに限定されず、ＸｂａＩ認識を有し得る複数のクローニング部位も挙げられ得る。
【０２５１】
いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲが、隣接領域として提供され得る。複数の５’または３’ＵＴＲが、隣接領域に含まれ得、同一または異なる配列であり得る。隣接領域の任意の部分（そのような部分がない場合を含み）が、コドン最適化され得、それらのいずれも、独立して、コドン最適化の前および／または後に１つ以上の異なる構造または化学修飾を含有し得る。特徴の組み合わせは、第１および第２の隣接領域に含まれ得、他の特徴内に含有され得る。例えば、ＯＲＦは、ポリＡ尾部の鋳型付加のために、強力なコザック翻訳開始シグナルを含有し得る５’ＵＴＲおよび／またはオリゴ（ｄＴ）配列を含み得る３’ＵＴＲに隣接し得る。
【０２５２】
表２および３は、隣接領域として本発明のシグナルセンサー一次構築物において利用され得る例示のＵＴＲの一覧を提供する。本発明の５’非翻訳領域の代表的な一覧が表２に示される。Ａ、Ｔ、Ｃ、もしくはＧを含む１個以上のヌクレオチドが末端に付加されるか、または末端から除去される５’ＵＴＲの変異形が利用され得る。
表２．５’非翻訳領域
【表０００２】
2018183181.tif 000003
【０２５３】
本発明の３’非翻訳領域の代表的な一覧が表３に示される。Ａ、Ｔ、Ｃ、もしくはＧを含む１個以上のヌクレオチドが末端に付加されるか、または末端から除去される３’ＵＴＲの変異形が利用され得る。
表３．３’非翻訳領域
【表０００３−１】
2018183181.tif 000004
【表０００３−２】
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【表０００３−３】
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【表０００３−４】
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【表０００３−５】
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【表０００３−６】
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【表０００３−７】
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【表０００３−８】
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【表０００３−９】
2018183181.tif 000012
【０２５４】
先の表に列記されるものは例であり、任意の遺伝子由来の任意のＵＴＲが一次構築物のそれぞれの第１または第２の隣接領域に組み込まれ得ることを理解されたい。さらに、任意の既知の遺伝子の複数の野生型ＵＴＲが利用され得る。野生型遺伝子の変異形ではない人工ＵＴＲを提供することも本発明の範囲内である。これらのＵＴＲもしくはその部分は、それらが選択され得る転写物のＵＴＲもしくはその部分と同一の配向で配置され得るか、または配向もしくは位置を変更し得る。したがって、５’または３’ＵＴＲは、反転し、短縮され、延長され、１つ以上の他の５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲでキメラにされ得る。本明細書で使用する「変更される」という用語は、ＵＴＲ配列に関するとき、ＵＴＲが参照配列との関連である点において変化したことを意味する。例えば、３’または５’ＵＴＲは、上で教示される配向もしくは位置の変化によって野生型または天然ＵＴＲに対して変更され得るか、またはさらなるヌクレオチドの包含、ヌクレオチドの欠失、ヌクレオチドの交換もしくは転置によって変更され得る。「変更された」ＵＴＲ（３’または５’にかかわらず）をもたらすこれらの変化のうちのいずれかは、変異形ＵＴＲを含む。
【０２５５】
一実施形態において、５’または３’ＵＴＲ等の二重、三重、または四重ＵＴＲが用いられ得る。本明細書で使用するとき、「二重」ＵＴＲは、同一のＵＴＲの２つのコピーが連続して、または実質的に連続してのいずれかでコードされるものである。例えば、内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許公開第２０１００１２９８７７号に記載の二重β−グロビン３’ＵＴＲが用いられ得る。
【０２５６】
パターン化されたＵＴＲを有することも本発明の範囲内である。本明細書で使用するとき、「パターン化されたＵＴＲ」は、１回、２回、または３回以上繰り返された繰り返しまたは交互のパターン、例えば、ＡＢＡＢＡＢもしくはＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢもしくはＡＢＣＡＢＣＡＢＣまたはその変異形を示すＵＴＲである。これらのパターンにおいて、各文字、Ａ、Ｂ、またはＣは、ヌクレオチドレベルでの異なるＵＴＲを表す。
【０２５７】
一実施形態において、隣接領域は、そのタンパク質が共通の機能、構造、特性特徴を共有する転写物のファミリーから選択される。例えば、目的とする腫瘍学関連ポリペプチドは、特定の細胞、組織で発現するか、または発生中のある時点で発現するタンパク質のファミリーに属し得る。これらの遺伝子のうちのいずれのＵＴＲも、同一または異なるタンパク質ファミリーの任意の他のＵＴＲと交換されて、新たなキメラ一次転写物を作成し得る。本明細書で使用するとき、「タンパク質のファミリー」は、最も広い意味において、少なくとも１つの機能、構造、特徴、局在化、起源、または発現パターンを共有する２個以上の目的とする腫瘍学関連ポリペプチドの群を指すために用いられる。
【０２５８】
最適化後（所望の場合）、シグナルセンサー一次構築物成分は、プラスミド、ウイルス、コスミド、および人工染色体等であるが、これらに限定されないベクターに再構築および変換され得る。例えば、最適化された構築物は、化学的にコンピテントな大腸菌、酵母、アカパンカビ、トウモロコシ、ショウジョウバエ等に再構築および変換され得、高コピー数のプラスミド様または染色体構造は、本明細書に記載の方法によって生じる。
【０２５９】
終止コドン
一実施形態において、本発明のシグナルセンサー一次構築物は、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の前に少なくとも２つの終止コドンを含み得る。終止コドンは、ＴＧＡ、ＴＡＡ、およびＴＡＧから選択され得る。一実施形態において、本発明のシグナルセンサー一次構築物は、終止コドンＴＧＡおよびもう１つの終止コドンを含む。さらなる実施形態において、もう１つの終止コドンは、ＴＡＡであり得る。
【０２６０】
ベクター増幅
シグナルセンサー一次構築物を含有するベクターは、その後、増幅され、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＰＵＲＥＬＩＮＫ（商標）ＨｉＰｕｒｅ  Ｍａｘｉｐｒｅｐキット（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いたマキシプレップ等であるが、これらに限定されない当技術分野で既知の方法を用いてプラスミドが単離および精製される。
【０２６１】
プラスミド線形化
プラスミドは、その後、制限酵素および緩衝液の使用等であるが、これらに限定されない当技術分野で既知の方法を用いて線形化され得る。線形化反応物は、例えば、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＰＵＲＥＬＩＮＫ（商標）ＰＣＲ  Ｍｉｃｒｏキット（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ならびに強アニオン交換ＨＰＬＣ、弱アニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、および疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）等であるが、これらに限定されないＨＰＬＣに基づく精製方法、ならびにＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎの標準ＰＵＲＥＬＩＮＫ（商標）ＰＣＲキット（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を含む方法を用いて精製され得る。精製方法は、もたらされた線形化反応物の大きさに応じて修正され得る。その後、線形化されたプラスミドを用いて、インビトロ転写（ＩＶＴ）反応のためのｃＤＮＡを生成する。
【０２６２】
ｃＤＮＡ鋳型合成
ｃＤＮＡ鋳型は、線形化されたプラスミドにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を経させることによって合成され得る。表４は、本発明のＰＣＲ反応において有用であり得るプライマーおよびプローブの一覧である。この一覧が網羅的ではなく、任意の増幅のためのプライマー−プローブ設計が当技術分野の技術の範囲内であることを理解されたい。プローブは、標的分子に対する塩基対合忠実性および塩基対合強度を高めるように化学的に修飾された塩基も含有し得る。そのような修飾には、５−メチル−シチジン、２、６−ジ−アミノ−プリン、２’−フルオロ、ホスホロ−チオエート、またはロックド核酸が含まれ得る。
表４．プライマーおよびプローブ
【表０００４】
2018183181.tif 000013
【０２６３】
＊ＵＦＰはユニバーサル順方向プライマーであり、ＵＲＰはユニバーサル逆方向プライマーである。
【０２６４】
一実施形態において、ｃＤＮＡは、転写を経る前に配列決定分析のために提出され得る。
【０２６５】
シグナルセンサーポリヌクレオチド生産（シグナルセンサーｍＲＮＡ）
シグナルセンサーポリヌクレオチド産生のプロセスは、インビトロ転写、ｃＤＮＡ鋳型除去およびＲＮＡ浄化、ならびにキャッピングおよび／またはテーリング反応を含み得るが、これらに限定されない。
【０２６６】
インビトロ転写
先のステップで産生されたｃＤＮＡは、インビトロ転写（ＩＶＴ）系を用いて転写され得る。この系は、典型的には、転写緩衝液、ヌクレオチドトリホスフェート（ＮＴＰ）、ＲＮａｓｅ阻害剤、およびポリメラーゼを含む。ＮＴＰは、自家で製造され得るか、供給業者から選択され得るか、または本明細書に記載されるように合成され得る。ＮＴＰは、天然および非天然（修飾された）ＮＴＰを含む本明細書に記載のＮＴＰから選択され得るが、これらに限定されない。ポリメラーゼは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ、および修飾された核酸に組み込まれることができるポリメラーゼ等であるが、これらに限定されない変異体ポリメラーゼから選択され得るが、これらに限定されない。
【０２６７】
ＲＮＡポリメラーゼ
任意の数のＲＮＡポリメラーゼまたは変異形が本発明のシグナルセンサー一次構築物の設計において用いられ得る。
【０２６８】
ＲＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡポリメラーゼ配列のアミノ酸を挿入するか、または欠失させることによって修飾され得る。非限定的な例として、ＲＮＡポリメラーゼは、未修飾ＲＮＡポリメラーゼと比較して、２’−修飾ヌクレオチドトリホスフェートを組み込む能力の向上を示すように修飾され得る（参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２００８０７８１８０号および米国特許第８，１０１，３８５号を参照のこと）。
【０２６９】
変異形は、ＲＮＡポリメラーゼを進化させ、ＲＮＡポリメラーゼアミノ酸および／または核酸配列を最適化し、かつ／または当技術分野で既知の他の方法を用いることによって得られ得る。非限定的な例として、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ変異形は、Ｅｓｖｅｌｔら（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｎａｔｕｒｅ（２０１１）４７２（７３４４）：４９９−５０３）によって立案された連続指向進化システムを用いて進化させられ得、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼのクローンは、９３位のリジンがトレオニンで置換された変異（Ｋ９３Ｔ）、Ｉ４Ｍ、Ａ７Ｔ、Ｅ６３Ｖ、Ｖ６４Ｄ、Ａ６５Ｅ、Ｄ６６Ｙ、Ｔ７６Ｎ、Ｃ１２５Ｒ、Ｓ１２８Ｒ、Ａ１３６Ｔ、Ｎ１６５Ｓ、Ｇ１７５Ｒ、Ｈ１７６Ｌ、Ｙ１７８Ｈ、Ｆ１８２Ｌ、Ｌ１９６Ｆ、Ｇ１９８Ｖ、Ｄ２０８Ｙ、Ｅ２２２Ｋ、Ｓ２２８Ａ、Ｑ２３９Ｒ、Ｔ２４３Ｎ、Ｇ２５９Ｄ、Ｍ２６７Ｉ、Ｇ２８０Ｃ、Ｈ３００Ｒ、Ｄ３５１Ａ、Ａ３５４Ｓ、Ｅ３５６Ｄ、Ｌ３６０Ｐ、Ａ３８３Ｖ、Ｙ３８５Ｃ、Ｄ３８８Ｙ、Ｓ３９７Ｒ、Ｍ４０１Ｔ、Ｎ４１０Ｓ、Ｋ４５０Ｒ、Ｐ４５１Ｔ、Ｇ４５２Ｖ、Ｅ４８４Ａ、Ｈ５２３Ｌ、Ｈ５２４Ｎ、Ｇ５４２Ｖ、Ｅ５６５Ｋ、Ｋ５７７Ｅ、Ｋ５７７Ｍ、Ｎ６０１Ｓ、Ｓ６８４Ｙ、Ｌ６９９Ｉ、Ｋ７１３Ｅ、Ｎ７４８Ｄ、Ｑ７５４Ｒ、Ｅ７７５Ｋ、Ａ８２７Ｖ、Ｄ８５１Ｎ、またはＬ８６４Ｆ等であるが、これらに限定されない少なくとも１つの変異をコードし得る。別の非限定的な例として、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ変異形は、参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許公開第２０１００１２００２４号および同第２００７０１１７１１２号に記載の少なくとも１つの変異をコードし得る。ＲＮＡポリメラーゼの変異形には、置換変異形、保存アミノ酸置換、挿入変異形、欠失変異形、および／または共有結合誘導体も含まれ得るが、これらに限定されない。
【０２７０】
一実施形態において、シグナルセンサー一次構築物は、野生型または変異形ＲＮＡポリメラーゼによって認識されるように設計され得る。そうすることで、シグナルセンサー一次構築物は、野生型または親一次構築物由来の配列変化部位または領域を含有するように修飾され得る。  
【０２７１】
一実施形態において、シグナルセンサー一次構築物は、５’ＵＴＲ内、５’ＵＴＲの前、および／または５’ＵＴＲの後に、少なくとも１つの置換および／または挿入を、シグナルセンサー一次構築物のＲＮＡポリメラーゼ結合または認識部位の上流、ＲＮＡポリメラーゼ結合または認識部位の下流、ＴＡＴＡボックス配列の上流、ＴＡＴＡボックス配列の下流であるが、一次構築物のコーディング領域の上流に含むように設計され得る。
【０２７２】
一実施形態において、シグナルセンサー一次構築物の５’ＵＴＲは、同一の塩基のヌクレオチドの少なくとも１つの領域および／またはストリングの挿入によって置換され得る。ヌクレオチドの領域および／またはストリングは、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、または少なくとも８個のヌクレオチドを含み得るが、これらに限定されず、このヌクレオチドは、天然および／または非天然であり得る。非限定的な例として、このヌクレオチド基は、５〜８個のアデニン、シトシン、チミン、本明細書に開示の他のヌクレオチドのうちのいずれかのストリング、および／またはこれらの組み合わせを含み得る。
【０２７３】
一実施形態において、シグナルセンサー一次構築物の５’ＵＴＲは、アデニン、シトシン、チミン、本明細書に開示の他のヌクレオチドのうちのいずれか、および／またはこれらの組み合わせ等であるが、これらに限定されない２つの異なる塩基のヌクレオチドの少なくとも２つの領域および／またはストリングの挿入によって置換され得る。例えば、５’ＵＴＲは、５〜８個のアデニン塩基を挿入し、その後、５〜８個のシトシン塩基を挿入することによって置換され得る。別の例において、５’ＵＴＲは、５〜８個のシトシン塩基を挿入し、その後、５〜８個のアデニン塩基を挿入することによって置換され得る。
【０２７４】
一実施形態において、シグナルセンサー一次構築物は、ＲＮＡポリメラーゼによって認識され得る転写開始部位の下流に少なくとも１つの置換および／または挿入を含み得る。非限定的な例として、少なくとも１つの置換および／または挿入は、転写開始部位のすぐ下流（＋１〜＋６等であるが、これらに限定されない）の領域内の少なくとも１個の核酸を置換することによって転写開始部位の下流で生じ得る。転写開始部位のすぐ下流のヌクレオチド領域を変化させることにより、開始速度に影響を及ぼし、見かけ上のヌクレオチドトリホスフェート（ＮＴＰ）反応一定値を増加させ、かつ初期転写物を硬化させることによる転写複合体からの短い転写物の解離を高め得る（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｂｒｉｅｂａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００２）４１：５１４４−５１４９）。少なくとも１個の核酸の修飾、置換、および／または挿入は、核酸配列のサイレント変異を引き起こし得るか、またはアミノ酸配列における変異を引き起こし得る。
【０２７５】
一実施形態において、シグナルセンサー一次構築物は、転写開始部位の下流で、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、または少なくとも１３個のグアニン塩基の置換を含み得る。
【０２７６】
一実施形態において、シグナルセンサー一次構築物は、転写開始部位のすぐ下流の領域において、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、または少なくとも６個のグアニン塩基の置換を含み得る。非限定的な例として、その領域内のヌクレオチドがＧＧＧＡＧＡであるとき、グアニン塩基は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、または少なくとも４個のアデニンヌクレオチドによって置換され得る。別の非限定的な例において、その領域内のヌクレオチドがＧＧＧＡＧＡであるとき、グアニン塩基は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、または少なくとも４個のシトシン塩基によって置換され得る。別の非限定的な例において、その領域内のヌクレオチドがＧＧＧＡＧＡであるとき、グアニン塩基は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、もしくは少なくとも４個のチミン、および／または本明細書に記載のヌクレオチドのうちのいずれかによって置換され得る。
【０２７７】
一実施形態において、シグナルセンサー一次構築物は、開始コドンの上流に少なくとも１つの置換および／または挿入を含み得る。明確化のために、当業者は、開始コドンがタンパク質コーディング領域の第１のコドンである一方で、転写開始部位が転写が始まる部位であることを理解する。シグナルセンサー一次構築物は、ヌクレオチド塩基の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、もしくは少なくとも８つの置換および／または挿入を含み得るが、これらに限定されない。ヌクレオチド塩基は、開始コドンの上流の１つ、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４、もしくは少なくとも５つの位置に挿入または置換され得る。挿入および／または置換されたヌクレオチドは、同一の塩基（例えば、すべてＡもしくはすべてＣもしくはすべてＴもしくはすべてＧ）、２個の異なる塩基（例えば、ＡおよびＣ、ＡおよびＴ、もしくはＣおよびＴ）、３個の異なる塩基（例えば、Ａ、Ｃ、およびＴ、もしくはＡ、Ｃ、およびＴ）、または少なくとも４個の異なる塩基であり得る。非限定的な例として、シグナルセンサー一次構築物内のコーディング領域の上流のグアニン塩基は、アデニン、シトシン、チミン、または本明細書に記載のヌクレオチドのうちのいずれかで置換され得る。別の非限定的な例において、シグナルセンサー一次構築物におけるグアニン塩基の置換は、転写開始部位の下流であり、かつ開始コドンの前の領域に１個のグアニン塩基を残すように設計され得る（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｅｓｖｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２０１１）４７２（７３４４）：４９９−５０３を参照のこと）。非限定的な例として、少なくとも５個のヌクレオチドは、転写開始部位の下流および開始コドンの上流の１つの位置に挿入され得、少なくとも５個のヌクレオチドは、同一の塩基型であり得る。
【０２７８】
ｃＤＮＡ鋳型除去および浄化
ｃＤＮＡ鋳型は、デオキシリボヌクレアーゼＩ（ＤＮａｓｅ  Ｉ）での処理等であるが、これに限定されない当技術分野で既知の方法を用いて除去され得る。ＲＮＡ浄化は、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ（Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）のＡＧＥＮＣＯＵＲＴ（登録商標）ＣＬＥＡＮＳＥＱ（登録商標）システム；強アニオン交換ＨＰＬＣ、弱アニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、および疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）等であるが、これらに限定されないＨＰＬＣに基づく精製方法等であるが、これらに限定されない精製方法も含み得る。
【０２７９】
キャッピングおよび／またはテーリング反応
シグナルセンサー一次構築物またはｍｍＲＮＡは、キャッピングおよび／またはテーリング反応も経り得る。キャッピング反応は、５’キャップをシグナルセンサー一次構築物の５’末端に付加する当技術分野で既知の方法を用いて行われ得る。キャッピングのための方法には、ワクシニアキャッピング酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）の使用が含まれるが、これに限定されない。
【０２８０】
ポリＡテーリング反応は、２’Ｏ−メチルトランスフェラーゼおよび本明細書に記載の方法等であるが、これらに限定されない当技術分野で既知の方法を用いて行われ得る。ｃＤＮＡから生成されたシグナルセンサー一次構築物がポリＴを含まない場合、シグナルセンサー一次構築物が浄化される前にポリＡテーリング反応を行うことは有益であり得る。
【０２８１】
精製
シグナルセンサー一次構築物またはｍｍＲＮＡ精製は、ｍＲＮＡまたはｍｍＲＮＡ浄化、品質保証、および品質管理を含み得るが、これらに限定されない。ｍＲＮＡまたはｍｍＲＮＡ浄化は、ＡＧＥＮＣＯＵＲＴ（登録商標）ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）；ポリＴビーズ；ＬＮＡ（商標）オリゴＴ捕捉プローブ（ＥＸＩＱＯＮ（登録商標）Ｉｎｃ、Ｖｅｄｂａｅｋ，Ｄｅｎｍａｒｋ）；または強アニオン交換ＨＰＬＣ、弱アニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、および疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）等であるが、これらに限定されないＨＰＬＣに基づく精製方法等であるが、これらに限定されない当技術分野で既知の方法を用いて行われ得る。「精製されたｍＲＮＡまたはシグナルセンサーｍｍＲＮＡ」等の「精製された」という用語は、ポリヌクレオチドとの関連で用いられるとき、少なくとも１つの混入物質から分離されるものを指す。本明細書で使用するとき、「混入物質」とは、別の物質を不適切、不純、または劣性にする任意の物質である。したがって、精製されたシグナルセンサーポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ）は、天然に見られる形態もしくは環境とは異なる形態もしくは環境、またはそれを処理もしくは精製方法に供する前に存在した形態もしくは環境とは異なる形態もしくは環境において存在する。
【０２８２】
品質保証および／または品質管理検査は、ゲル電気泳動、紫外線吸収、または分析的ＨＰＬＣ等であるが、これらに限定されない方法を用いて行われ得る。
【０２８３】
別の実施形態において、シグナルセンサーｍＲＮＡまたはｍｍＲＮＡは、逆転写ＰＣＲを含むが、これに限定されない方法を用いて配列決定され得る。
【０２８４】
一実施形態において、シグナルセンサーｍＲＮＡまたはｍｍＲＮＡは、紫外可視分光法（ＵＶ／Ｖｉｓ）等であるが、これに限定されない方法を用いて定量化され得る。ＵＶ／Ｖｉｓ分光計の非限定的な例には、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（登録商標）分光計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）がある。定量化されたシグナルセンサーｍＲＮＡまたはｍｍＲＮＡは、シグナルセンサーｍＲＮＡまたはｍｍＲＮＡが適切な大きさであり得るかを決定し、シグナルセンサーｍＲＮＡまたはｍｍＲＮＡの分解が生じていないことを確認するために分析され得る。シグナルセンサーｍＲＮＡおよび／またはｍｍＲＮＡの分解は、アガロースゲル電気泳動；強アニオン交換ＨＰＬＣ、弱アニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、および疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）等であるが、これらに限定されないＨＰＬＣに基づく精製方法；液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣＭＳ）；キャピラリー電気泳動（ＣＥ）；ならびにキャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）等であるが、これらに限定されない方法を用いて確認され得る。
【０２８５】
シグナルペプチドまたはタンパク質
シグナルセンサー一次構築物またはｍｍＲＮＡは、ポリペプチドの治療関連部位への輸送を促進するさらなる特徴もコードし得る。タンパク質輸送を支援するそのような特徴の１つに、シグナルペプチド配列がある。本明細書で使用するとき、「シグナル配列」または「シグナルペプチド」とは、それぞれ、コーディング領域またはコードされたポリペプチドの５’（またはＮ末端）に組み込まれる、それぞれ、約９〜２００ヌクレオチド長（３〜６０アミノ酸長）のポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。これらの配列の付加は、１つ以上の分泌経路を通るコードされた腫瘍学関連ポリペプチドの小胞体への輸送をもたらす。いくつかのシグナルペプチドは、タンパク質が輸送された後にシグナルペプチダーゼによってタンパク質から切断される。
【０２８６】
表５は、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡをコードするために組み込まれ得るシグナルタンパク質またはペプチドの代表的な一覧である。
表５．シグナルペプチド
【表０００５−１】
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【表０００５−２】
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【表０００５−３】
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【表０００５−４】
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【表０００５−５】
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【表０００５−６】
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【表０００５−７】
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【０２８７】
この表において、ＳＳは分泌シグナルであり、ＭＬＳはミトコンドリアリーダーシグナルである。本発明のシグナルセンサー一次構築物またはｍｍＲＮＡは、配列番号９４〜１５５のシグナルぺプチド配列のうちのいずれか、またはその断片もしくは変異形をコードするように設計され得る。これらの配列は、腫瘍学関連ポリペプチドコーディング領域の最初、中間、もしくは最後に含まれ得るか、またはあるいは隣接領域に含まれ得る。さらに、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド一次構築物のうちのいずれかは、配列番号３２〜９３によって定義される配列のうちの１つ以上も含み得る。これらは、第１の領域またはいずれかの隣接領域に存在し得る。
【０２８８】
本発明において利用され得るさらなるシグナルぺプチド配列は、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｎａｌｐｅｐｔｉｄｅ．ｄｅ／またはｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｌｉｎｅ．ｂｉｃ．ｎｕｓ．ｅｄｕ．ｓｇ／ｓｐｄｂ／で見出されるデータベース等のデータベースに教示されるシグナル配列を含む。米国特許第８，１２４，３７９号、同第７，４１３，８７５号、および同第７，３８５，０３４号に記載のものも本発明の範囲内であり、これら各々の内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０２８９】
一実施形態において、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）および／または核外移行シグナル（ＮＥＳ）をコードする核酸配列を含み得る。一態様では、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）をコードする核酸配列を含み得る。ＮＬＳをコードするシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、腫瘍学関連ポリペプチドを核内に輸送し、核微小環境に生存または死シグナルを輸送することができるであろう。別の態様では、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、ＮＥＳ１および／またはＮＥＳ２といった、核外輸送シグナルをコードする核酸配列を含み得る。非制限的な例として、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、ＮＥＳ１、ＮＥＳ２およびＮＬＳシグナルをコードし得、ならびに、ＨＩＦ１−アルファと相互作用してがん細胞のトランスクリプトームを改変するために、翻訳可能ではない腫瘍学関連ポリペプチドまたはスクランブル配列をコードし得る。
【０２９０】
標的選択
本発明に従って、シグナルセンサー一次構築物は、少なくとも１つの目的とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードする結合ヌクレオシドの少なくとも１つの第１の領域を含む。本発明の、目的とする腫瘍学関連ポリペプチド、つまり「標的」または腫瘍学関連タンパク質および腫瘍学関連ペプチドが表６、表７および表４１に列記される。腫瘍学関連ポリペプチドは、その機能およびがん介入の領域に基づいてクラスに分けられ得る。例えば、（１）アポトーシスまたは生存シグナルの不釣り合いに関連した標的（ＡＳ標的）が挙げられ得る。これらは、カスパーゼ依存またはカスパーゼ非依存性標的；（２）複製能力または抗老化（ＣＣ／Ｓ標的）；（３）アシドーシスまたは低酸素症（Ｏ２が１％超）の併発を含む代謝性ストレス（Ｍ標的）；（４）免疫応答（Ｉ標的）；および（５）ＤＮＡ損傷／保護（ＤＤＲ標的）であり得る。
【０２９１】
表６に示されるのは、目的とする腫瘍学関連ポリペプチドの名前および説明に加えて、ＥＮＳＥＭＢＬ転写物ＩＤ（ＥＮＳＴ）、ＥＮＳＥＭＢＬタンパク質ＩＤ（ＥＮＳＰ）であり、それぞれ適用可能な場所に存在し、ならびに、利用可能な場合には最適化配列番号（ＯＰＴ．配列番号）も示される。標的はまた、グループで分類され、「ＡＳ」はアポトーシスシグナル伝達に関わる標的を指し；「Ｍ」は代謝プロセスに関わる標的を指し、および、「ＣＣ／Ｓ」は、細胞周期および老化に関わる標的を指す。
表６．腫瘍学関連標的
【表０００６−１】
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【表０００６−２】
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【表０００６−３】
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【表０００６−４】
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【表０００６−５】
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【表０００６−６】
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【表０００６−７】
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【表０００６−８】
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【表０００６−９】
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【表０００６−１０】
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【表０００６−１１】
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【表０００６−１２】
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【表０００６−１３】
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【表０００６−１４】
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【表０００６−１５】
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【表０００６−１６】
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【表０００６−１７】
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【表０００６−１８】
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【表０００６−１９】
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【表０００６−２０】
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【表０００６−２１】
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【表０００６−２２】
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【表０００６−２３】
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【表０００６−２４】
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【表０００６−２５】
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【表０００６−２６】
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【表０００６−２７】
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【表０００６−２８】
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【表０００６−２９】
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【表０００６−３０】
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【表０００６−３１】
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【表０００６−３２】
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【表０００６−３３】
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【表０００６−３４】
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【表０００６−３５】
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【表０００６−３６】
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【表０００６−３７】
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【表０００６−３８】
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【表０００６−３９】
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【表０００６−４０】
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【表０００６−４１】
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【表０００６−４２】
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【表０００６−４３】
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【表０００６−４４】
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【表０００６−４５】
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【表０００６−４６】
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【表０００６−４７】
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【表０００６−４８】
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【表０００６−４９】
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【表０００６−５０】
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【表０００６−５１】
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【表０００６−５２】
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【表０００６−５３】
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【表０００６−５４】
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【表０００６−５５】
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【表０００６−５６】
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【表０００６−５７】
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【表０００６−５８】
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【表０００６−５９】
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【表０００６−６０】
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【表０００６−６１】
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【表０００６−６２】
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【表０００６−６３】
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【表０００６−６４】
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【０２９２】
表７に示されるのは、よく知られたがん症候群、腫瘍抑制遺伝子、腫瘍抑制遺伝子の機能、染色体の位置および観察される腫瘍の種類である。本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチドは、表に挙げられるもののいずれかのための治療薬として設計され得る。
表７．家族性がん症候群標的
【表０００７−１】
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【表０００７−２】
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【０２９３】
上記標的に加え、腫瘍学関連ポリペプチドは、免疫系の活性Ｔ細胞に識別され得るいずれかの「死シグナル」タンパク質を含み得る。センサーシグナルポリヌクレオチドによってコードされるそのような自殺シグナルタンパク質を、操作したマイクロＲＮＡ結合部位および／または本明細書に記載される他の調節要素を通して特定の組織または細胞（例えばがん細胞）で選択的に発現させ得る。このタンパク質のグループは、がん細胞の表面上に発現した場合、Ｔ細胞を刺激して、Ｔ細胞媒介性免疫応答を誘導し得、こうしてがん細胞を殺す。非制限的な例として、「死シグナル」を表すとして知られるタンパク質のグループには、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７およびＭＨＣ  ＩＩなどが含まれる。
【０２９４】
タンパク質切断シグナルおよび部位
一実施形態において、本発明の腫瘍学関連ポリペプチドは、少なくとも１個のタンパク質切断部位を含有する少なくとも１個のタンパク質切断シグナルを含み得る。タンパク質切断部位は、Ｎ末端とＣ末端の真ん中、Ｎ末端と中間点との間、中間点とＣ末端との間、およびこれらの組み合わせ等であるが、これらに限定されないＮ末端とＣ末端との間の任意の空間で、Ｎ末端、Ｃ末端に位置し得る。
【０２９５】
本発明の腫瘍学関連ポリペプチドは、プロタンパク質コンバターゼ（またはプロホルモンコンバターゼ）、トロンビン、または第Ｘａ因子タンパク質切断シグナルを含み得るが、これらに限定されない。プロタンパク質コンバターゼは、プロホルモンコンバターゼ１／３（ＰＣ１／３）、ＰＣ２、フーリン、ＰＣ４、ＰＣ５／６、対合塩基性アミノ酸切断酵素４（ＰＡＣＥ４）、およびＰＣ７として既知の酵母ケキシンに関連した７個の塩基性アミノ酸特異的サブチリシン様セリンプロテイナーゼと、サブチリシンケキシンアイソザイム１（ＳＫＩ−１）およびプロタンパク質コンバターゼサブチリシンケキシン９（ＰＣＳＫ９）と呼ばれる非塩基性残基で切断する他の２個のサブチラーゼを含む９個のプロテイナーゼのファミリーである。タンパク質切断シグナルアミノ酸配列の非限定的な例が表８に列記される。表８において、「Ｘ」は、任意のアミノ酸を指し、「ｎ」は、０、２、４、または６個のアミノ酸であり得、「＊」は、タンパク質切断部位を指す。表８において、配列番号２４９９は、ｎが４であるときを指し、配列番号２５００は、ｎが６であるときを指す。
表８．タンパク質切断部位配列
【表０００８】
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【０２９６】
一実施形態において、本発明のシグナルセンサー一次構築物およびｍｍＲＮＡは、一次構築物またはｍｍＲＮＡが少なくとも１個のコードされたタンパク質切断シグナルを含有するように操作され得る。コードされたタンパク質切断シグナルは、開始コドンの前、開始コドンの後、コーディング領域の前、コーディング領域内に位置し得、例えば、コーディング領域の中間、開始コドンと中間点との間、中間点と終止コドンとの間、コーディング領域の後、終止コドンの後、２つの終止コドンの間、終止コドンの後、およびこれらの組み合わせ等であるが、これらに限定されない。
【０２９７】
一実施形態において、本発明のシグナルセンサー一次構築物またはｍｍＲＮＡは、少なくとも１個のタンパク質切断部位を含有する少なくとも１個のコードされたタンパク質切断シグナルを含み得る。コードされたタンパク質切断シグナルは、プロタンパク質コンバターゼ（もしくはプロホルモンコンバターゼ）、トロンビン、および／または第Ｘａ因子タンパク質切断シグナルを含み得るが、これらに限定されない。当業者であれば、上の表１または他の既知の方法を用いて、本発明のシグナルセンサー一次構築物またはｍｍＲＮＡに含める適切なコードされたタンパク質切断シグナルを決定することができる。例えば、表８のシグナルから始め、表１のコドンを考慮して、結果として生じる腫瘍学関連ポリペプチドにおいてタンパク質シグナルを生成し得るシグナルセンサー一次構築物のシグナルを設計することができる。
【０２９８】
一実施形態において、本発明の腫瘍学関連ポリペプチドは、少なくとも１個のタンパク質切断シグナルおよび／または部位を含む。
【０２９９】
非限定的な例として、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，３７４，９３０号および米国特許公開第２００９０２２７６６０号は、フーリン切断部位を用いて、発現産物におけるＧＬＰ−１のＮ末端メチオニンをその細胞のゴルジ装置から切断する。一実施形態において、本発明のポリペプチドは、少なくとも１個のタンパク質切断シグナルおよび／または部位を含むが、但し、ポリペプチドがＧＬＰ−１ではないことを条件とする。
【０３００】
一実施形態において、本発明のシグナルセンサー一次構築物またはｍｍＲＮＡは、少なくとも１個のコードされたタンパク質切断シグナルおよび／または部位を含む。
【０３０１】
一実施形態において、本発明のシグナルセンサー一次構築物またはｍｍＲＮＡは、少なくとも１個のコードされたタンパク質切断シグナルおよび／または部位を含むが、但し、シグナルセンサー一次構築物またはｍｍＲＮＡがＧＬＰ−１をコードしないことを条件とする。
【０３０２】
一実施形態において、本発明のシグナルセンサー一次構築物またはｍｍＲＮＡは、２つ以上のコーディング領域を含み得る。複数のコーディング領域が本発明のシグナルセンサー一次構築物またはｍｍＲＮＡに存在する場合、複数のコーディング領域は、コードされたタンパク質切断部位によって分離され得る。非限定的な例として、シグナルセンサー一次構築物またはｍｍＲＮＡは、順序付けられたパターンで書き込まれ得る。そのようなパターンは、ＡＸＢＹ形態に従い、式中、ＡおよびＢは、同一もしくは異なるコーディング領域であり得、かつ／または同一もしくは異なる腫瘍学関連ポリペプチドをコードし得るコーディング領域であり、ＸおよびＹは、同一もしくは異なるタンパク質切断シグナルをコードし得るコードされたタンパク質切断シグナルである。第２のそのようなパターンは、ＡＸＹＢＺ形態に従い、式中、ＡおよびＢは、同一もしくは異なるコーディング領域であり得、かつ／または同一もしくは異なる腫瘍学関連ポリペプチドをコードし得るコーディング領域であり、Ｘ、Ｙ、およびＺは、同一もしくは異なるタンパク質切断シグナルをコードし得るコードされたタンパク質切断シグナルである。第３のパターンは、ＡＢＸＣＹ形態に従い、Ａ、Ｂ、およびＣは、同一もしくは異なるコーディング領域であり得、かつ／または同一もしくは異なる腫瘍学関連ポリペプチドをコードし得るコーディング領域であり、ＸおよびＹは、同一もしくは異なるタンパク質切断シグナルをコードし得るコードされたタンパク質切断シグナルである。
【０３０３】
一実施形態において、腫瘍学関連ポリペプチド、シグナルセンサー一次構築物およびｍｍＲＮＡはまた、ポリペプチド、シグナルセンサー一次構築物およびｍｍＲＮＡがタンパク質切断部位に特異的であるプロテアーゼでの処理によって担体領域または融合パートナーから放出され得るように、前記タンパク質切断部位をコードする配列も含有し得る。
【０３０４】
マイクロＲＮＡ
マイクロＲＮＡ（またはｍｉＲＮＡ）は、核酸分子の３’ＵＴＲに結合し、かつ核酸分子安定性を低下させるか、または翻訳を阻害するかのいずれかによって遺伝子発現を下方制御する１９〜２５ヌクレオチド長の非コードＲＮＡである。本発明の修飾核酸（ｍＲＮＡ）、強化した修飾ＲＮＡまたはリボ核酸は、１つ以上のマイクロＲＮＡ標的配列、マイクロＲＮＡ配列またはマイクロＲＮＡ種を含み得る。そのような配列は、米国特許公開第ＵＳ２００５／０２６１２１８号および米国特許公開第ＵＳ２００５／００５９００５号に教示されるもの等の任意の既知のマイクロＲＮＡに対応し得、これらの内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。非制限的な実施形態として、ヒトゲノムの、公知のマイクロＲＮＡ、その配列および結合部位配列が下記表９に列記される。
【０３０５】
マイクロＲＮＡ配列は、「種」領域、すなわち、成熟マイクロＲＮＡの２〜８位の領域における配列を含み、この配列は、ｍｉＲＮＡ標的配列に対して完全なワトソン・クリック相補性を有する。マイクロＲＮＡ種は、成熟マイクロＲＮＡの２〜８位または２〜７位を含み得る。いくつかの実施形態において、マイクロＲＮＡ種は、７個のヌクレオチド（例えば、成熟マイクロＲＮＡのヌクレオチド２〜８位）を含み得、対応するｍｉＲＮＡ標的におけるこの種相補的部位には、マイクロＲＮＡ１位と反対のアデニン（Ａ）が隣接する。いくつかの実施形態において、マイクロＲＮＡ種は、６個のヌクレオチド（例えば、成熟マイクロＲＮＡのヌクレオチド２〜７位）を含み得、対応するｍｉＲＮＡ標的における種相補的部位は、マイクロＲＮＡ１位と反対のアデニン（Ａ）に隣接する。例えば、Ｇｒｉｍｓｏｎ  Ａ，Ｆａｒｈ  ＫＫ，Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ＷＫ，Ｇａｒｒｅｔｔ−Ｅｎｇｅｌｅ  Ｐ，Ｌｉｍ  ＬＰ，Ｂａｒｔｅｌ  ＤＰ；Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．２００７  Ｊｕｌ
６；２７（１）：９１−１０５を参照されたく、各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる。マイクロＲＮＡ種の塩基は、標的配列と完全な相補性を有する。マイクロＲＮＡ標的配列を操作して、本発明の核酸またはｍＲＮＡの３’ＵＴＲに入れることによって、分解または翻訳減少のためにこの分子を標的化することができるが、但し、問題のマイクロＲＮＡが利用可能であることを条件とする。このプロセスは、核酸分子送達時のオフターゲット効果の危険を低下させる。マイクロＲＮＡ、マイクロＲＮＡ標的領域、およびそれらの発現パターンの特定、ならびに生物学におけるそれらの役割が報告されている（各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｏｎａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ２０１０  １１：９４３−９４９、Ａｎａｎｄ  ａｎｄ  Ｃｈｅｒｅｓｈ  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ２０１１  １８：１７１−１７６、Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ  ａｎｄ  Ｒａｏ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ２０１２  ２６：４０４−４１３（２０１１  Ｄｅｃ  ２０．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｌｅｕ．２０１１．３５６）、Ｂａｒｔｅｌ  Ｃｅｌｌ  ２００９  １３６：２１５−２３３、Ｌａｎｄｇｒａｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２００７  １２９：１４０１−１４１４、Ｇｅｎｔｎｅｒ  ａｎｄ  Ｎａｌｄｉｎｉ，Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ．２０１２  ８０：３９３−４０３およびこれらの文献内の全引用文献）。
【０３０６】
例えば、シグナルセンサーポリヌクレオチドが肝臓に送達されることが意図されないが、そこで落ち着く場合、ｍｉＲ−１２２の１つまたは複数の標的部位が操作されて、シグナルセンサーポリヌクレオチドの３’ＵＴＲに入れられると、肝臓中に豊富なマイクロＲＮＡであるｍｉＲ−１２２が目的とする遺伝子の発現を阻害することができる。異なるマイクロＲＮＡの１つまたは複数の結合部位の導入を操作して、シグナルセンサーポリヌクレオチドの長寿命、安定性、およびタンパク質翻訳をさらに減少させることができる。本明細書で使用するとき、「マイクロＲＮＡ部位」という用語は、マイクロＲＮＡ標的部位もしくはマイクロＲＮＡ認識部位、またはマイクロＲＮＡが結合もしくは会合する任意のヌクレオチド配列を指す。「結合」は、従来のワトソン・クリックハイブリダイゼーション規則に従い得るか、あるいはマイクロＲＮＡ部位に、またはマイクロＲＮＡ部位に隣接して標的配列を有するマイクロＲＮＡの任意の安定した会合を示し得ることを理解されたい。
【０３０７】
逆に、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチドの目的のために、特定の組織でのタンパク質発現を増加させるために自然に生じるマイクロＲＮＡ結合部位を操作して配列から出す（すなわち、配列から除去する）ことができる。例えば、ｍｉＲ−１２２結合部位が除去されて、肝臓でのタンパク質発現を改善することができる。
【０３０８】
一実施形態において、細胞傷害性または細胞保護性ｍＲＮＡ治療薬を、限定はしないが正常および／またはがん細胞（例えばＨＥＰ３ＢまたはＳＮＵ４４９）といった特定の細胞に指向するために、シグナルセンサーポリヌクレオチドは少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位を３’ＵＴＲに含み得る。非制限的な例として、強いアポトーシスシグナルおよび少なくとも１つのｍｉＲ−１２２ａ結合部位がシグナルセンサーポリヌクレオチドによってコードされ、ここで、当該少なくとも１つのｍｉＲ−１２２ａ結合部位は３’ＵＴＲに位置する。別の非制限的な例として、アポトーシス誘導因子短アイソフォーム（ＡＩＦｓｈ）および少なくとも１つのｍｉＲ−１２２ａ結合部位がシグナルセンサーポリヌクレオチドによってコードされ、ここで、当該少なくとも１つのｍｉＲ−１２２ａ結合部位は３’ＵＴＲに位置する。さらに別の非制限的な例として、構成的活性型（Ｃ．Ａ．）カスパーゼ６および少なくとも１つのｍｉＲ−１２２ａ結合部位がシグナルセンサーポリヌクレオチドによってコードされ、ここで、当該少なくとも１つのｍｉＲ−１２２ａ結合部位は３’ＵＴＲに位置する。別の非制限的な例として、ＨＳＶ１−ｔｋおよび少なくとも１つのｍｉＲ−１２２ａ結合部位がシグナルセンサーポリヌクレオチドによってコードされ、ここで、当該少なくとも１つのｍｉＲ−１２２ａ結合部位が３’ＵＴＲに位置する。
【０３０９】
別の実施形態では、細胞傷害性または細胞保護性ｍＲＮＡ治療薬を、限定はしないが正常および／またはがん細胞（例えばＨＥＰ３ＢまたはＳＮＵ４４９）といった特定の細胞に指向するために、シグナルセンサーポリヌクレオチドは３つのｍｉＲＮＡ結合部位を３’ＵＴＲに含み得る。非制限的な例として、強いアポトーシスシグナルおよび３つのｍｉＲ−１２２ａ結合部位がシグナルセンサーポリヌクレオチドによってコードされ、ここで、当該３つのｍｉＲ−１２２ａ結合部位は３’ＵＴＲに位置する。別の非制限的な例として、アポトーシス誘導因子短アイソフォーム（ＡＩＦｓｈ）および３つのｍｉＲ−１２２ａ結合部位がシグナルセンサーポリヌクレオチドによってコードされ、ここで、当該３つのｍｉＲ−１２２ａ結合部位は３’ＵＴＲに位置する。さらに別の非制限的な例として、構成的活性型（Ｃ．Ａ．）カスパーゼ６および３つのｍｉＲ−１２２ａ結合部位がシグナルセンサーポリヌクレオチドによってコードされ、ここで、当該３つのｍｉＲ−１２２ａ結合部位は３’ＵＴＲに位置する。別の非制限的な例として、ＨＳＶ１−ｔｋおよび３つのｍｉＲ−１２２ａ結合部位がシグナルセンサーポリヌクレオチドによってコードされ、ここで、当該３つのｍｉＲ−１２２ａ結合部位が３’ＵＴＲに位置する。
【０３１０】
複数の組織での発現の制御は、導入もしく除去または１もしくは複数のマイクロＲＮＡ結合部位を通して達成され得る。下記表１０で示されるのは、異なる組織および細胞で差次的に発現され、しばしば異なる種類の疾患に関連する（例えば、がん細胞）マイクロＲＮＡである。マイクロＲＮＡ結合部位の除去もしくは挿入またはいずれかの組み合わせの決定は、がん細胞におけるマイクロＲＮＡ発現パターンおよびそのプロファイリング次第である。
【０３１１】
マイクロＲＮＡがｍＲＮＡを制御し、それによってタンパク質発現を制御することが分かっている組織の例としては、肝臓（ｍｉＲ−１２２）、筋肉（ｍｉＲ−１３３、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２０８）、内皮細胞（ｍｉＲ−１７−９２、ｍｉＲ−１２６）、骨髄系細胞（ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２７）、神経系（ｍｉｒ−１２４ａ、ｍｉＲ−９）、多能性細胞（ｍｉＲ−３０２、ｍｉＲ−３６７、ｍｉＲ−２９０、ｍｉＲ−３７１、ｍｉＲ−３７３）、膵島細胞（ｍｉＲ−３７５）、脂肪組織（ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−３０ｃ）、心臓（ｍｉＲ−１ｄ、ｍｉＲ−１４９）、腎臓（ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−２０４）、および肺上皮細胞（ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−１３３、ｍｉＲ−１２６）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３１２】
具体的には、マイクロＲＮＡは免疫細胞（造血細胞）で差次的に発現することで知られており、例えば、抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、樹状細胞およびマクロファージ）、マクロファージ、単球、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、顆粒球、ナチュラルキラー細胞などである。免疫細胞特異的マイクロＲＮＡは、免疫原性、自己免疫、感染症に対する免疫応答、炎症、ならびに、遺伝子療法および組織／器官移植後の所望されない免疫応答にも関わる。免疫細胞特異的マイクロＲＮＡはまた、造血細胞（免疫細胞）の発達、増殖、分化およびアポトーシスの多くの側面を制御する。例えば、ｍｉＲ−１４２およびｍｉＲ−１４６は免疫細胞で排他的に発現され、特に骨髄系樹状細胞で豊富である。ｍｉＲ−１４２結合部位を本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチドの３’−ＵＴＲに導入することは、ｍｉＲ−１４２媒介性ｍＲＮＡ分解を通して、抗原提示細胞での遺伝子発現を選択的に抑制し得、プロフェッショナルなＡＰＣ（例えば、樹状細胞）での抗原提示を制限し、それによって、遺伝子送達後の抗原媒介性免疫応答を阻止する（Ａｎｎｏｎｉ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，ｂｌｏｏｄ，２００９，１１４，５１５２−５１６１を参照、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０３１３】
一実施形態において、免疫細胞、特に抗原提示細胞で発現されることが知られているマイクロＲＮＡ結合部位は、操作されてシグナルセンサーポリヌクレオチドに入れられて、マイクロＲＮＡ媒介性ＲＮＡ分解を通してＡＰＣのセンサーポリヌクレオチドの発現を抑制し、センサーポリヌクレオチドの発現が免疫細胞特異的マイクロＲＮＡが発現されない非免疫細胞では維持される一方で、抗原媒介性免疫応答を抑え得る。例えば、肝臓特異的タンパク質によって引き起こされる免疫原性反応を阻止するために、ｍｉＲ−１２２結合部位を取り除き得、ｍｉＲ−１４２（および／またはｍｉｒＲ−１４６）結合部位が操作されてシグナルセンサーポリヌクレオチドの３’ＵＴＲに入れられ得る（例えば、実施例３８に記載される構築物ならびに実施例３９および４０で説明される実験を参照）。
【０３１４】
ＡＰＣおよびマクロファージのｍＲＮＡの選択的分解および抑制をさらに駆り立てるために、シグナルセンサーポリヌクレオチドは、３’ＵＴＲに別の陰性調節要素を、単独か、またはｍｉｒ−１４２および／またはｍｉｒ−１４６結合部位との組み合わせのいずれかで含み得る。非制限的な例として、１つの調節要素は、構成的分解要素（ＣＤＥ）である。
【０３１５】
免疫細胞特異的マイクロＲＮＡとしては、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−２−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−３ｐ、ｈｓａ−７ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｃ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉ−５ｐ、ｍｉＲ−１０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１１８４、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−１−−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−２−−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−１−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１２７９、ｍｉＲ−１３０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１３２−３ｐ、ｍｉＲ−１３２−５ｐ、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１４３−３ｐ、ｍｉＲ−１４３−５ｐ、ｍｉＲ−１４６ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１４６ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１４７ａ、ｍｉＲ−１４７ｂ、ｍｉＲ−１４８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１５０−３ｐ、ｍｉＲ−１５０−５ｐ、ｍｉＲ−１５１ｂ、ｍｉＲ−１５５−３ｐ、ｍｉＲ−１５５−５ｐ、ｍｉＲ−１５ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１５ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１６−１−３ｐ、ｍｉＲ−１６−２−３ｐ、ｍｉＲ−１６−５ｐ、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ａ−２−３ｐ、ｍｉＲ−１８２−３ｐ、ｍｉＲ−１８２−５ｐ、ｍｉＲ−１９７−３ｐ、ｍｉＲ−１９７−５ｐ、ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｍｉＲ−２１−３ｐ、ｍｉＲ−２１４−３ｐ、ｍｉＲ−２１４−５ｐ、ｍｉＲ−２２３−３ｐ、ｍｉＲ−２２３−５ｐ、ｍｉＲ−２２１−３ｐ、ｍｉＲ−２２１−５ｐ、ｍｉＲ−２３ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２３ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２４−１−５ｐ、ｍｉＲ−２４−２−５ｐ、ｍｉＲ−２４−３ｐ、ｍｉＲ−２６ａ−１−３ｐ、ｍｉＲ−２６ａ−２−３ｐ、ｍｉＲ−２６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２６ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２７ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２８−３ｐ、ｍｉＲ−２８−５ｐ、ｍｉＲ−２９０９、ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２９ｂ−１−５ｐ、ｍｉＲ−２９ｂ−２−５ｐ、ｍｉＲ−２９ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−２９ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−３３１−５ｐ、ｍｉＲ−３３９−３ｐ、ｍｉＲ−３３９−５ｐ、ｍｉＲ−３４５−３ｐ、ｍｉＲ−３４５−５ｐ、ｍｉＲ−３４６、ｍｉＲ−３４ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３６３−３ｐ、ｍｉＲ−３６３−５ｐ、ｍｉＲ−３７２、ｍｉＲ−３７７−３ｐ、ｍｉＲ−３７７−５ｐ、ｍｉＲ−４９３−３ｐ、ｍｉＲ−４９３−５ｐ、ｍｉＲ−５４２、ｍｉＲ−５４８ｂ−５ｐ、ｍｉＲ５４８ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−５４８ｉ、ｍｉＲ−５４８ｊ、ｍｉＲ−５４８ｎ、ｍｉＲ−５７４−３ｐ、ｍｉＲ−５９８、ｍｉＲ−７１８、ｍｉＲ−９３５、ｍｉＲ−９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−９９ｂ−３ｐおよびｍｉＲ−９９ｂ−５ｐが挙げられるが、これらに限定されない。下記表１１に示されるのは、特定の種類の免疫細胞に濃縮されたマイクロＲＮＡである。さらに、新規のマイクロＲＮＡが、ミクロアレーハイブリダイゼーションおよびミクロトーム分析を通して当該技術分野の免疫細胞で発見された（Ｊｉｍａ  ＤＤ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２０１０，１１６：ｅ１１８−ｅ１２７；Ｖａｚ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２０１０，１１，２８８，各内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）．
【０３１６】
肝臓で発現すると分かっているマイクロＲＮＡとしては、ｍｉＲ−１０７，  ｍｉＲ−１２２−３ｐ，  ｍｉＲ−１２２−５ｐ，  ｍｉＲ−１２２８−３ｐ，  ｍｉＲ−１２２８−５ｐ，  ｍｉＲ−１２４９，  ｍｉＲ−１２９−５ｐ，  ｍｉＲ−１３０３，  ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ，  ｍｉＲ−１５１ａ−５ｐ，  ｍｉＲ−１５２，  ｍｉＲ−１９４−３ｐ，  ｍｉＲ−１９４−５ｐ，  ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ，  ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ，  ｍｉＲ−１９９ｂ−３ｐ，  ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐ，  ｍｉＲ−２９６−５ｐ，
ｍｉＲ−５５７，  ｍｉＲ−５８１，  ｍｉＲ−９３９−３ｐ，  ｍｉＲ−９３９−５ｐが挙げられるが、これらに限定されない。いずれの肝臓特異的マイクロＲＮＡ由来のマイクロＲＮＡ結合部位も、シグナルセンサーポリヌクレオチドに導入、またはシグナルセンサーポリヌクレオチドから除去して、肝臓におけるシグナルセンサーポリヌクレオチドの発現を制御し得る。肝臓特異的マイクロＲＮＡ結合部位は、単独で操作され得、または、肝臓のタンパク質発現に対する免疫応答を阻止するために、免疫細胞（例えばＡＰＣ）マイクロＲＮＡ結合部位とさらに組み合わせて操作され得る。
【０３１７】
肺で発現すると分かっているマイクロＲＮＡとしては、ｌｅｔ−７ａ−２−３ｐ、ｌｅｔ−７ａ−３ｐ、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１２６−３ｐ、ｍｉＲ−１２６−５ｐ、ｍｉＲ−１２７−３ｐ、ｍｉＲ−１２７−５ｐ、ｍｉＲ−１３０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１３０ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１３０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１３３ｂ、ｍｉＲ−１３４、ｍｉＲ−１８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１８ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１８ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２４−１−５ｐ、ｍｉＲ−２４−２−５ｐ、ｍｉＲ−２４−３ｐ、ｍｉＲ−２９６−３ｐ、ｍｉＲ−２９６−５ｐ、ｍｉＲ−３２−３ｐ、ｍｉＲ−３３７−３ｐ、ｍｉＲ−３３７−５ｐ、ｍｉＲ−３８１−３ｐ、ｍｉＲ−３８１−５ｐが挙げられるが、これらに限定されない。いずれの肺特異的マイクロＲＮＡ由来のマイクロＲＮＡ結合部位も、シグナルセンサーポリヌクレオチドに導入、またはシグナルセンサーポリヌクレオチドから除去して、肺におけるシグナルセンサーポリヌクレオチドの発現を制御し得る。肺特異的マイクロＲＮＡ結合部位は、単独で操作され得、または、肺のタンパク質発現に対する免疫応答を阻止するために、免疫細胞（例えばＡＰＣ）マイクロＲＮＡ結合部位とさらに組み合わせて操作され得る。
【０３１８】
心臓で発現すると分かっているマイクロＲＮＡとしては、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１３３ｂ、ｍｉＲ−１４９−３ｐ、ｍｉＲ−１４９−５ｐ、ｍｉＲ−１８６−３ｐ、ｍｉＲ−１８６−５ｐ、ｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂ、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２９６−３ｐ、ｍｉＲ−３２０、ｍｉＲ−４５１ａ、ｍｉＲ−４５１ｂ、ｍｉＲ−４９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−４９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４９９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−４９９ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−７４４−３ｐ、ｍｉＲ−７４４−５ｐ、ｍｉＲ−９２ｂ−３ｐおよびｍｉＲ−９２ｂ−５ｐが挙げられるが、これらに限定されない。いずれの心臓特異的マイクロＲＮＡ由来のマイクロＲＮＡ結合部位も、シグナルセンサーポリヌクレオチドに導入、またはシグナルセンサーポリヌクレオチドから除去して、心臓におけるシグナルセンサーポリヌクレオチドの発現を制御し得る。心臓特異的マイクロＲＮＡ結合部位は、単独で操作され得、または、心臓のタンパク質発現に対する免疫応答を阻止するために、免疫細胞（例えばＡＰＣ）マイクロＲＮＡ結合部位とさらに組み合わせて操作され得る。
【０３１９】
神経系で発現すると分かっているマイクロＲＮＡとしては、ｍｉＲ−１２４−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−１−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１２７１−３ｐ、ｍｉＲ−１２７１−５ｐ、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１３２−５ｐ、ｍｉＲ−１３５ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１３５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１３５ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１３５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−１３９−５ｐ、ｍｉＲ−１３９−３ｐ、ｍｉＲ−１４９−３ｐ、ｍｉＲ−１４９−５ｐ、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−１８１ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−１８１ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−１８３−３ｐ、ｍｉＲ−１８３−５ｐ、ｍｉＲ−１９０ａ、ｍｉＲ−１９０ｂ、ｍｉＲ−２１２−３ｐ、ｍｉＲ−２１２−５ｐ、ｍｉＲ−２１９−１−３ｐ、ｍｉＲ−２１９−２−３ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−１−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−２−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｄ−５ｐ、ｍｉＲ−３２９、ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｍｉＲ−３６６５、ｍｉＲ−３６６６、ｍｉＲ−３８０−３ｐ、ｍｉＲ−３８０−５ｐ、ｍｉＲ−３８３、ｍｉＲ−４１０、ｍｉＲ−４２５−３ｐ、ｍｉＲ−４２５−５ｐ、ｍｉＲ−４５４−３ｐ、ｍｉＲ−４５４−５ｐ、ｍｉＲ−４８３、ｍｉＲ−５１０、ｍｉＲ−５１６ａ−３ｐ、ｍｉＲ−５４８ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−５４８ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−５７１、ｍｉＲ−７−１−３ｐ、ｍｉＲ−７−２−３ｐ、ｍｉＲ−７−５ｐ、ｍｉＲ−８０２、ｍｉＲ−９２２、ｍｉＲ−９−３ｐおよびｍｉＲ−９−５ｐが挙げられるが、これらに限定されない。神経系で濃縮されるマイクロＲＮＡにはさらにニューロンで特異的に発現するものが含まれ、例えば、ｍｉＲ−１３２−３ｐ、ｍｉＲ−１３２−３ｐ、ｍｉＲ−１４８ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１４８ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１５１ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２１２−３ｐ、ｍｉＲ−２１２−５ｐ、ｍｉＲ−３２０ｂ、ｍｉＲ−３２０ｅ、ｍｉＲ−３２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３２３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３２４−５ｐ、ｍｉＲ−３２５、ｍｉＲ−３２６、ｍｉＲ−３２８、ｍｉＲ−９２２が挙げられるがこれらに限定はされず、ならびに、グリア細胞で特異的に発現されるものが含まれ、例えば、ｍｉＲ−１２５０、ｍｉＲ−２１９−１−３ｐ、ｍｉＲ−２１９−２−３ｐ、ｍｉＲ−２１９−５ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０６５−３ｐ、ｍｉＲ−３０６５−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−３２−５ｐ、ｍｉＲ−３３８−５ｐ、ｍｉＲ−６５７が挙げられるが、これらに限定されない。いずれのＣＮＳ特異的マイクロＲＮＡ由来のマイクロＲＮＡ結合部位も、シグナルセンサーポリヌクレオチドに導入、またはシグナルセンサーポリヌクレオチドから除去して、神経系におけるシグナルセンサーポリヌクレオチドの発現を制御し得る。神経系特異的マイクロＲＮＡ結合部位は、単独で操作され得、または、神経系のタンパク質発現に対する免疫応答を阻止するために、免疫細胞（例えばＡＰＣ）マイクロＲＮＡ結合部位とさらに組み合わせて操作され得る。
【０３２０】
膵臓で発現すると分かっているマイクロＲＮＡとしては、ｍｉＲ−１０５−３ｐ、ｍｉＲ−１０５−５ｐ、ｍｉＲ−１８４、ｍｉＲ−１９５−３ｐ、ｍｉＲ−１９５−５ｐ、ｍｉＲ−１９６ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２１４−３ｐ、ｍｉＲ−２１４−５ｐ、ｍｉＲ−２１６ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２１６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３７５、ｍｉＲ−７−１−３ｐ、ｍｉＲ−７−２−３ｐ、ｍｉＲ−４９３−３ｐ、ｍｉＲ−４９３−５ｐおよびｍｉＲ−９４４が挙げられるが、これらに限定されない。いずれの膵臓特異的マイクロＲＮＡ由来のマイクロＲＮＡ結合部位も、シグナルセンサーポリヌクレオチドに導入、またはシグナルセンサーポリヌクレオチドから除去して、膵臓におけるシグナルセンサーポリヌクレオチドの制御を調節し得る。膵臓特異的マイクロＲＮＡ結合部位は、単独で操作され得、または、膵臓のタンパク質発現に対する免疫応答を阻止するために、免疫細胞（例えばＡＰＣ）マイクロＲＮＡ結合部位とさらに組み合わせて操作され得る。
【０３２１】
腎臓で発現すると分かっているマイクロＲＮＡとしてはさらに、ｍｉＲ−１２２−３ｐ、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−１９２−３ｐ、ｍｉＲ−１９２−５ｐ、ｍｉＲ−１９４−３ｐ、ｍｉＲ−１９４−５ｐ、ｍｉＲ−２０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２０４−３ｐ、ｍｉＲ−２０４−５ｐ、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２１６ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２１６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２９６−３ｐ、ｍｉＲ−３０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−１−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−２−３ｐ、ｍｉＲ３０ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３２４−３ｐ、ｍｉＲ−３３５−３ｐ、ｍｉＲ−３３５−５ｐ、ｍｉＲ−３６３−３ｐ、ｍｉＲ−３６３−５ｐおよびｍｉＲ−５６２が挙げられるが、これらに限定されない。いずれの腎臓特異的マイクロＲＮＡ由来のマイクロＲＮＡ結合部位も、シグナルセンサーポリヌクレオチドに導入、またはシグナルセンサーポリヌクレオチドから除去して、腎臓におけるシグナルセンサーポリヌクレオチドの発現を制御し得る。腎臓特異的マイクロＲＮＡ結合部位は、単独で操作され得、または、腎臓のタンパク質発現に対する免疫応答を阻止するために、免疫細胞（例えばＡＰＣ）マイクロＲＮＡ結合部位とさらに組み合わせて操作され得る。
【０３２２】
筋肉で発現すると分かっているマイクロＲＮＡとしてはさらに、ｌｅｔ−７ｇ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｇ−５ｐ、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１２８６、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１３３ｂ、ｍｉＲ−１４０−３ｐ、ｍｉＲ−１４３−３ｐ、ｍｉＲ−１４３−５ｐ、ｍｉＲ−１４５−３ｐ、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−１８８−３ｐ、ｍｉＲ−１８８−５ｐ、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂ、ｍｉＲ−２５−３ｐおよびｍｉＲ−２５−５ｐが挙げられるが、これらに限定されない。いずれの筋肉特異的マイクロＲＮＡ由来のマイクロＲＮＡ結合部位も、シグナルセンサーポリヌクレオチドに導入、またはシグナルセンサーポリヌクレオチドから除去して、筋肉におけるシグナルセンサーポリヌクレオチドの発現を制御し得る。筋肉特異的マイクロＲＮＡ結合部位は、単独で操作され得、または、筋肉のタンパク質発現に対する免疫応答を阻止するために、免疫細胞（例えばＡＰＣ）マイクロＲＮＡ結合部位とさらに組み合わせて操作され得る。
【０３２３】
マイクロＲＮＡは内皮細胞、上皮細胞および脂肪細胞といった異なる種類の細胞では差次的に発現される。例えば、内皮細胞で発現されるマイクロＲＮＡとしては、ｌｅｔ−７ｂ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１００−３ｐ、ｍｉＲ−１００−５ｐ、ｍｉＲ−１０１−３ｐ、ｍｉＲ−１０１−５ｐ、ｍｉＲ−１２６−３ｐ、ｍｉＲ−１２６−５ｐ、ｍｉＲ−１２３６−３ｐ、ｍｉＲ−１２３６−５ｐ、ｍｉＲ−１３０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−１７−３ｐ、ｍｉＲ−１８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９ｂ−１−５ｐ、ｍｉＲ−１９ｂ−２−５ｐ、ｍｉＲ−１９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２１７、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２１−３ｐ、ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｍｉＲ−２２１−３ｐ、ｍｉＲ−２２１−５ｐ、ｍｉＲ−２２２−３ｐ、ｍｉＲ−２２２−５ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２９６−５ｐ、ｍｉＲ−３６１−３ｐ、ｍｉＲ−３６１−５ｐ、ｍｉＲ−４２１、ｍｉＲ−４２４−３ｐ、ｍｉＲ−４２４−５ｐ、ｍｉＲ−５１３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−９２ａ−１−５ｐ、ｍｉＲ−９２ａ−２−５ｐ、ｍｉＲ−９２ａ−３ｐ、ｍｉＲ−９２ｂ−３ｐおよびｍｉＲ−９２ｂ−５ｐが挙げられるが、これらに限定されない。多くの新規マイクロＲＮＡが、ディープ配列決定分析から内皮細胞で発見された（Ｖｏｅｌｌｅｎｋｌｅ  Ｃ  ｅｔ
ａｌ．，ＲＮＡ，２０１２，１８，４７２−４８４，参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。）いずれかの内皮細胞特異的マイクロＲＮＡ由来のマイクロＲＮＡ結合部位は、シグナルセンサーポリヌクレオチドに導入、またはシグナルセンサーポリヌクレオチドから除去して、様々な状態で内皮細胞におけるシグナルセンサーポリヌクレオチドの発現を制御し得る。
【０３２４】
さらなる例として、上皮細胞で発現されるマイクロＲＮＡとしては、ｌｅｔ−７ｂ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１２４６、ｍｉＲ−２００ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２００ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２００ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２００ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２００ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−２００ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３３８−３ｐ、ｍｉＲ−４２９、ｍｉＲ−４５１ａ、ｍｉＲ−４５１ｂ、ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−８０２および呼吸性繊毛上皮細胞で特異的であるｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３４ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３４ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−４４９ａ、ｍｉＲ−４４９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−４４９ｂ−５ｐ；肺上皮細胞で特異的であるｌｅｔ−７ファミリー、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１３３ｂ、ｍｉＲ−１２６；腎臓上皮細胞で特異的であるｍｉＲ−３８２−３ｐ、ｍｉＲ−３８２−５ｐならび角膜上皮細胞で特異的であるｍｉＲ−７６２が挙げられるが、これらに限定されない。いずれの上皮細胞特異的マイクロＲＮＡ由来のマイクロＲＮＡ結合部位も、シグナルセンサーポリヌクレオチドに導入、またはシグナルセンサーポリヌクレオチドから除去して、様々な状態で上皮細胞におけるシグナルセンサーポリヌクレオチドの発現を制御し得る。
【０３２５】
さらに、大きなグループのマイクロＲＮＡは胚幹細胞で濃縮され、幹細胞の自己複製、ならびに、神経細胞、心臓、造血細胞、皮膚細胞、骨形成原細胞および筋細胞といった様々な細胞系列の発達および／または分化を制御する（Ｋｕｐｐｕｓａｍｙ  ＫＴ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｍｏｌ  Ｍｅｄ，２０１３，１３（５），７５７−７６４；Ｖｉｄｉｇａｌ  ＪＡ  ａｎｄ  Ｖｅｎｔｕｒａ  Ａ，Ｓｅｍｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．２０１２，２２（５−６），４２８−４３６；Ｇｏｆｆ  ＬＡ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，２００９，４：ｅ７１９２；Ｍｏｒｉｎ  ＲＤ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ，２００８，１８，６１０−６２１；Ｙｏｏ  ＪＫ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ．２０１２，２１（１１），２０４９−２０５７，各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる）。胚性幹細胞に豊富であるマイクロＲＮＡとしては、ｌｅｔ−７ａ−２−３ｐ、ｌｅｔ−ａ−３ｐ、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｌｅｔ７ｄ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｄ−５ｐ、ｍｉＲ−１０３ａ−２−３ｐ、ｍｉＲ−１０３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１０６ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１０６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１２４６、ｍｉＲ−１２７５、ｍｉＲ−１３８−１−３ｐ、ｍｉＲ−１３８−２−３ｐ、ｍｉＲ−１３８−５ｐ、ｍｉＲ−１５４−３ｐ、ｍｉＲ−１５４−５ｐ、ｍｉＲ−２００ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−２００ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−２９０、ｍｉＲ−３０１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３０１ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０２ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３０２ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０２ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−３０２ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３０２ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−３０２ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３０２ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−３０２ｄ−５ｐ、ｍｉＲ−３０２ｅ、ｍｉＲ−３６７−３ｐ、ｍｉＲ−３６７−５ｐ、ｍｉＲ−３６９−３ｐ、ｍｉＲ−３６９−５ｐ、ｍｉＲ−３７０、ｍｉＲ−３７１、ｍｉＲ−３７３、ｍｉＲ−３８０−５ｐ、ｍｉＲ−４２３−３ｐ、ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｍｉＲ−４８６−５ｐ、ｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−５４８ｅ、ｍｉＲ−５４８ｆ、ｍｉＲ−５４８ｇ−３ｐ、ｍｉＲ−５４８ｇ−５ｐ、ｍｉＲ−５４８ｉ、ｍｉＲ−５４８ｋ、ｍｉＲ−５４８ｌ、ｍｉＲ−５４８ｍ、ｍｉＲ−５４８ｎ、ｍｉＲ−５４８ｏ−３ｐ、ｍｉＲ−５４８ｏ−５ｐ、ｍｉＲ−５４８ｐ、ｍｉＲ−６６４ａ−３ｐ、ｍｉＲ−６６４ａ−５ｐ、ｍｉＲ−６６４ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−６６４ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−７６６−３ｐ、ｍｉＲ−７６６−５ｐ、ｍｉＲ−８８５−３ｐ、ｍｉＲ−８８５−５ｐ、ｍｉＲ−９３−３ｐ、ｍｉＲ−９３−５ｐ、ｍｉＲ−９４１、ｍｉＲ−９６−３ｐ、ｍｉＲ−９６−５ｐ、ｍｉＲ−９９ｂ−３ｐおよびｍｉＲ−９９ｂ−５ｐが挙げられるが、これらに限定されない。多くの予測された新規マイクロＲＮＡがヒト胚性幹細胞でのディープ配列決定によって発見されている（Ｍｏｒｉｎ  ＲＤ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ，２００８，１８，６１０−６２１；Ｇｏｆｆ  ＬＡ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，２００９，４：ｅ７１９２；Ｂａｒ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ，２００８，２６，２４９６−２５０５，各内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０３２６】
一実施形態において、胚性幹細胞特異的マイクロＲＮＡの結合部位は、シグナルセンサーポリヌクレオチドの３−ＵＴＲに封入され、またはシグナルセンサーポリヌクレオチドの３−ＵＴＲから除去して、胚性幹細胞の発達および／もしくは分化を調節、変性状態の幹細胞の老化を阻害（例えば、変性疾患）、または、疾患状態にある肝細胞（例えばがん幹細胞）の老化およびアポトーシスを刺激し得る。
【０３２７】
様々ながん細胞／組織および他の疾患でのマイクロＲＮＡの発現差異をプロファイリングするために、多くのマイクロＲＮＡ発現の研究がなされ、当該技術分野で説明されている。特定のがん細胞で異常に過剰発現されるマイクロＲＮＡもあれば、過小発現されるマイクロＲＮＡある。例えば、マイクロＲＮＡはがん細胞（国際公開第ＷＯ２００８／１５４０９８号、米国特許第ＵＳ２０１３／００５９０１５号、米国特許第ＵＳ２０１３／００４２３３３号、国際公開第ＷＯ２０１１／１５７２９４号）、がん幹細胞（米国特許第ＵＳ２０１２／００５３２２４号）、膵臓癌および疾患（米国特許第ＵＳ２００９／０１３１３４８号、米国特許第ＵＳ２０１１／０１７１６４６号、米国特許第ＵＳ２０１０／０２８６２３２号、米国特許第ＵＳ８３８９２１０号）、喘息および炎症（米国特許第ＵＳ８４１５０９６号）、前立腺癌（米国特許第ＵＳ２０１３／００５３２６４号）、肝細胞癌（国際公開第ＷＯ２０１２／１５１２１２号、米国特許第ＵＳ２０１２／０３２９６７２号、国際公開第ＷＯ２００８／０５４８２８号、米国特許第ＵＳ８２５２５３８号）、肺癌細胞（国際公開第ＷＯ２０１１／０７６１４３号、国際公開第ＷＯ２０１３／０３３６４０号、国際公開第ＷＯ２００９／０７０６５３号、米国特許第ＵＳ２０１０／０３２３３５７号）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（国際公開第ＷＯ２０１３／０１１３７８号）、結腸直腸癌細胞（国際公開第ＷＯ２０１１／０２８１７５６号、国際公開第ＷＯ２０１１／０７６１４２号）、癌陽性リンパ節（国際公開第ＷＯ２００９／１００４３０号、米国特許第ＵＳ２００９／０２６３８０３号）、上咽頭癌（欧州特許第ＥＰ２１１２２３５号）、慢性閉塞性肺疾患（米国特許第ＵＳ２０１２／０２６４６２６号、米国特許第ＵＳ２０１３／００５３２６３号）、甲状腺癌（国際公開第ＷＯ２０１３／０６６６７８号）、卵巣癌細胞（米国特許第ＵＳ２０１２／０３０９６４５号、国際公開第ＷＯ２０１１／０９５６２３号）、乳癌細胞（国際公開第ＷＯ２００８／１５４０９８号、国際公開第ＷＯ２００７／０８１７４０号、米国特許第ＵＳ２０１２／０２１４６９９号）、白血病およびリンパ腫（国際公開第ＷＯ２００８／０７３９１５号、米国特許第ＵＳ２００９／００９２９７４号、米国特許第ＵＳ２０１２／０３１６０８１号、米国特許第ＵＳ２０１２／０２８３３１０号、国際公開第ＷＯ２０１０／０１８５６３号、各内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）で差次的に発現される。
【０３２８】
具体的には、特定のがんおよび／または腫瘍細胞で過剰発現されるマイクロＲＮＡ部位は、腫瘍学関連ポリペプチドをコードするシグナルセンサーポリヌクレオチドの３’ＵＴＲから除去され得、がん細胞で過剰発現されるマイクロＲＮＡによって抑制される発現を回復し、こうして、例えば、転写刺激および／または抑圧、細胞周期停止、アポトーシスならびに細胞死といった、対応する生物学的機能を改善する。マイクロＲＮＡ発現が上方制御されない正常な細胞および組織は、影響を受けないままである。
【０３２９】
マイクロＲＮＡはまた、血管新生といった複雑な生物学的プロセスを制御し得る（ｍｉＲ−１３２）  （Ａｎａｎｄ  ａｎｄ  Ｃｈｅｒｅｓｈ  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ２０１１  １８：１７１−１７６）。本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチドでは、シグナルセンサーポリヌクレオチド発現の発現を生物学的に関連のある細胞型または関連のある生物学的プロセスの文脈に合わせるために、そのようなプロセスに関連するマイクロＲＮＡの結合部位を除去または導入し得る。この文脈において、シグナルセンサーポリヌクレオチドは栄養要求性シグナルセンサーポリヌクレオチドとして定義される。
【０３３０】
表９は、本発明と使用され得る、ｍｉＲおよびｍｉＲ結合部位（ｍｉＲ  ＢＳ）ならびにこれらの配列を包括的ではないが列挙したものである。
表９．Ｍｉｒおよびｍｉｒ結合部位
【表０００９−１】
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【表０００９−２】
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【表０００９−３】
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【表０００９−４】
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【表０００９−５】
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【表０００９−６】
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【表０００９−７】
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【表０００９−８】
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【表０００９−９】
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【表０００９−１０】
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【表０００９−１１】
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【表０００９−１２】
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【表０００９−１３】
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【表０００９−１４】
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【表０００９−１５】
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【表０００９−１６】
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【表０００９−１７】
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【表０００９−１８】
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【表０００９−１９】
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【表０００９−２０】
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【表０００９−２１】
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【表０００９−２２】
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【０３３１】
表１０に示される通り、マイクロＲＮＡは異なる組織および細胞で差次的に発現され、しばしば異なる種類の疾患に関連する（例えばがん細胞）。マイクロＲＮＡ結合部位の除去もしくは挿入またはいずれかの組み合わせの決定は、がん細胞におけるマイクロＲＮＡ発現パターンおよびそのプロファイリング次第である。表１０では、「ＨＣＣ」は肝細胞癌を意味し、「ＡＬＬ」は急性リンパ性白血病を意味し、「ＲＣＣ」は腎臓細胞癌を意味し、「ＣＬＬ」は慢性リンパ球白血病を意味し、「ＭＡＬＴ」は粘膜内リンパ組織を意味する。
表１０．ｍｉｒｓ、組織／細胞発現および疾患
【表００１０−１】
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【表００１０−２】
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【表００１０−３】
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【表００１０−４】
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【表００１０−５】
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【表００１０−６】
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【表００１０−７】
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【表００１０−８】
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【表００１０−９】
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【表００１０−１０】
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【表００１０−１１】
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【表００１０−１２】
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【表００１０−１３】
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【表００１０−１４】
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【表００１０−１５】
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【表００１０−１６】
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【表００１０−１７】
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【表００１０−１８】
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【表００１０−１９】
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【表００１０−２０】
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【表００１０−２１】
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【表００１０−２２】
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【表００１０−２３】
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【表００１０−２４】
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【表００１０−２５】
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【表００１０−２６】
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【表００１０−２７】
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【表００１０−２８】
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【表００１０−２９】
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【表００１０−３０】
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【表００１０−３１】
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【表００１０−３２】
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【表００１０−３３】
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【表００１０−３４】
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【表００１０−３５】
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【表００１０−３６】
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【表００１０−３７】
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【表００１０−３８】
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【表００１０−３９】
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【表００１０−４０】
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【表００１０−４１】
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【表００１０−４２】
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【表００１０−４３】
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【表００１０−４４】
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【表００１０−４５】
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【表００１０−４６】
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【表００１０−４７】
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【表００１０−４８】
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【表００１０−４９】
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【表００１０−５０】
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【表００１０−５１】
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【表００１０−５２】
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【表００１０−５３】
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【表００１０−５４】
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【表００１０−５５】
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【表００１０−５６】
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【表００１０−５７】
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【表００１０−５８】
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【表００１０−５９】
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【表００１０−６０】
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【表００１０−６１】
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【表００１０−６２】
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【表００１０−６３】
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【表００１０−６４】
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【表００１０−６５】
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【表００１０−６７】
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【表００１０−６８】
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【表００１０−６９】
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【表００１０−７０】
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【表００１０−７１】
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【表００１０−７２】
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【０３３２】
特定の種類の免疫細胞に濃縮されるマイクロＲＮＡが表１１に列挙される。さらに、ミクロアレーハイブリダイゼーションおよびミクロトーム分析によって、当該技術分野で、新規のマイクロＲＮＡが免疫細胞で発見されている（Ｊｉｍａ  ＤＤ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２０１０，１１６：ｅ１１８−ｅ１２７；Ｖａｚ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ
Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２０１０，１１，２８８，各内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。表１１では、「ＨＣＣ」は肝細胞癌を意味し、「ＡＬＬ」は急性リンパ性白血病を意味し、「ＣＬＬ」は慢性（ｃｈｒｏｍｉｎｃ）リンパ性白血病を意味する。
表１１．免疫細胞のマイクロＲＮＡ
【表００１１−１】
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【表００１１−２】
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【表００１１−３】
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【表００１１−４】
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【表００１１−５】
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【表００１１−６】
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【表００１１−７】
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【０３３３】
ＩＩＩ．修飾
本明細書におけるシグナルセンサーポリヌクレオチド（一次構築物またはｍＲＮＡ分子等）において、「修飾」または必要に応じて「修飾された」という用語は、Ａ、Ｇ、Ｕ、またはＣリボヌクレオチドに対する修飾を指す。概して、本明細書において、これらの用語は、天然に存在する５’末端ｍＲＮＡキャップ部分におけるリボヌクレオチド修飾を指すようには意図されていない。ポリペプチドにおいて、「修飾」という用語は、基準の組の２０個のアミノ酸と比較した修飾を指す。
【０３３４】
この修飾は、様々なはっきりと異なる修飾であり得る。いくつかの実施形態において、コーディング領域、隣接領域、および／または末端領域は、１つ、２つ、または２つ以上の（任意に異なる）ヌクレオシドまたはヌクレオチド修飾を含有し得る。いくつかの実施形態において、細胞に導入された修飾シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、未修飾シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡと比較して、細胞における分解の減少を呈し得る。
【０３３５】
シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡは、糖、核酸塩基、またはヌクレオシド間結合（例えば、結合リン酸／ホスホジエステル結合／ホスホジエステル骨格への）等に対する任意の有用な修飾を含み得る。ピリミジン核酸塩基の１個以上の原子は、任意に置換されたアミノ、任意に置換されたチオール、任意に置換されたアルキル（例えば、メチルもしくはエチル）、またはハロ（例えば、クロロもしくはフルオロ）と置き換えれ得るか、またはこれらで置換され得る。ある特定の実施形態において、修飾（例えば、１つ以上の修飾）は、糖およびヌクレオシド間結合の各々において存在する。本発明に従う修飾は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、またはこれらのハイブリッド）に対するリボ核酸（ＲＮＡ）の修飾であり得る。さらなる修飾が本明細書に記載される。
【０３３６】
本明細書に記載されるように、いくつかの実施形態では、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡは、ｍＲＮＡが導入される細胞の自然免疫応答を実質的に誘導しない。誘導された自然免疫応答の特徴には、１）炎症誘発性サイトカインの発現の増加、２）細胞内ＰＲＲ（ＲＩＧ−Ｉ、ＭＤＡ５等の活性化、および／または３）タンパク質翻訳の終結もしくは減少が含まれる。他の実施形態では、免疫応答が誘導される。
【０３３７】
ある特定の実施形態において、細胞に導入された修飾核酸分子を細胞内で分解することが望ましくあり得る。例えば、修飾核酸分子の分解は、タンパク質産生の正確なタイミングが所望される場合に好ましくあり得る。したがって、いくつかの実施形態において、本発明は、指向された様式で細胞内で作用され得る、分解ドメインを含有する修飾核酸分子を提供する。
【０３３８】
別の態様において、本開示は、シグナルセンサーポリヌクレオチドとの主溝相互作用（例えば、結合）パートナーの結合を攪乱し得るヌクレオシドまたはヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを提供する（例えば、修飾ヌクレオチドは、未修飾ヌクレオチドと比較して、主溝相互作用パートナーに対して低下した結合親和性を有する場合）。
【０３３９】
シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡは、他の作用物質（例えば、ＲＮＡｉ誘導剤、ＲＮＡｉ剤、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、触媒ＤＮＡ、ｔＲＮＡ、三重らせん形成を誘導するＲＮＡ、アプタマー、ベクター等）を任意に含み得る。いくつかの実施形態において、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、１個以上のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）および１個以上の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチド（例えば、ｍｍＲＮＡ分子）を含み得る。これらのシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡについての詳細は、以下に続く。
【０３４０】
シグナルセンサーポリヌクレオチドおよび一次構築物
本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡは、目的とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードする結合ヌクレオシドの第１の領域、第１の領域の５’末端に位置する第１の隣接領域、および第１の領域の３’末端に位置する第２の隣接領域を含む。
【０３４１】
いくつかの実施形態において、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１２年１０月３日（Ｍ９）に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１２／０５８５１９号の方法および修飾に従って構築される。
【０３４２】
シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡは、本明細書に記載の５’および／または３’隣接領域を任意に含み得る。
【０３４３】
シグナルセンサー修飾ＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）分子
本発明は、修飾シグナルセンサーｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）分子のビルディングブロック、例えば、修飾リボヌクレオシド、修飾リボヌクレオチドも含む。例えば、これらのビルディングブロックは、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの調製に有用であり得る。そのようなビルディングブロックは、同時係属出願である、２０１２年１０月３日（Ｍ９）に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１２／０５８５１９号で教示され、この内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０３４４】
核酸塩基における修飾
本開示は、修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドを提供する。本明細書に記載の「ヌクレオシド」は、有機塩基（例えば、プリンもしくはピリミジン）またはその誘導体（本明細書において「核酸塩基」とも称される）と組み合わせて糖分子（例えば、ペントースもしくはリボース）またはその誘導体を含有する化合物と定義される。本明細書に記載される「ヌクレオチド」は、リン酸基を含むヌクレオシドと定義される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるヌクレオシドおよびヌクレオチドは通常、主溝面上で化学的に修飾される。非制限的な例となる修飾には、アミノ基、チオール基、アルキル基、ハロ基または本明細書に記載されるいずれかのものが含まれる。修飾ヌクレオチドは、（１個以上の修飾または非天然ヌクレオシドを含めるために、例えば、化学的、酵素的、または組換え的に）本明細書に記載の任意の有用な方法によって合成され得る。
【０３４５】
修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、修飾核酸塩基を含み得る。ＲＮＡに見られる核酸塩基の例には、アデニン、グアニン、シトシン、およびウラシルが挙げられるが、これらに限定されない。ＤＮＡに見られる核酸塩基の例には、アデニン、グアニン、シトシン、およびチミンが挙げられるが、これらに限定されない。これらの核酸塩基は、修飾または完全に置換されて、強化された特性を有するシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡ分子を提供し得る。例えば、本明細書に記載されるヌクレオシドおよびヌクレオチドは、化学的に修飾され得る。いくつかの実施例では、化学修飾にはアミノ基、チオール基、アルキル基またはハロ基が含まれ得る。
【０３４６】
ヌクレオシド間結合における修飾
シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡ分子に組み込まれ得る修飾ヌクレオチドは、ヌクレオシド間結合（例えば、リン酸骨格）において修飾され得る。本明細書において、ポリヌクレオチド骨格との関連で、「リン酸塩」および「ホスホジエステル」という表現は、同義に使用される。骨格リン酸基は、酸素原子のうちの１個以上を異なる置換基で置換することによって修飾され得る。さらに、修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、未修飾リン酸塩部分の別の本明細書に記載のヌクレオシド間結合との大規模な置換を含み得る。修飾リン酸基の例には、ホスホロチオエート、ホスホロセレナート、ボラノホスフェート、ボラノホスフェートエステル、水素ホスホネート、ホスホロラミデート、ホスホロジアミデート、アルキルまたはアリールホスホネート、およびホスホトリエステルが挙げられるが、これらに限定されない。ホスホロジチオエートは、硫黄で置換された両方の非結合酸素を有する。リン酸リンカーは、結合酸素の窒素（架橋ホスホロアミデート）、硫黄（架橋ホスホロチオエート）、および炭素（架橋メチレンホスホネート）での置換によっても修飾され得る。
【０３４７】
α−チオ置換リン酸部分は、非天然ホスホロチオエート骨格結合を介してＲＮＡおよびＤＮＡポリマーに安定性を付与するように提供される。ホスホロチオエートＤＮＡおよびＲＮＡは、ヌクレアーゼ耐性の増加、続いて細胞環境においてより長い半減期を有する。ホスホロチオエート結合シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡ分子は、細胞の自然免疫分子のより弱い結合／活性化によって自然免疫応答も低下させることが見込まれている。
【０３４８】
特定の実施形態において、修飾ヌクレオシドは、α−チオ−ヌクレオシド（例えば、５’−Ｏ−（１−チオホスフェート）−アデノシン、５’−Ｏ−（１−チオホスフェート）−シチジン（α−チオ−シチジン）、５’−Ｏ−（１−チオホスフェート）−グアノシン、５’−Ｏ−（１−チオホスフェート）−ウリジン、または５’−Ｏ−（１−チオホスフェート）−シュードウリジン）を含む。
【０３４９】
リン原子を含有しないヌクレオシド間結合を含む本発明に従って用いられ得る他のヌクレオシド間結合は、以下の本明細書に記載される。
【０３５０】
修飾糖、核酸塩基、およびヌクレオシド間結合の組み合わせ
本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡは、糖、核酸塩基、および／またはヌクレオシド間結合への修飾の組み合わせを含み得る。これらの組み合わせは、本明細書、または、参照によりその内容全体が本明細書に組み込まれる２０１２年１０月３日（Ｍ９）に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１２／０５８５１９号に記載のいずれか１つ以上の修飾を含み得る。
【０３５１】
シグナルセンサー一次構築物およびｍｍＲＮＡ分子の合成
本発明に従って用いるシグナルセンサーポリペプチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡ分子は、本明細書に記載の任意の有用な技法に従って調製され得る。本明細書に開示のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡ分子の合成において用いられる修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、以下の一般的な方法および手順を用いて容易に入手可能な出発物質から調製され得る。典型的なプロセス条件または好ましいプロセス条件（例えば、反応温度、時間、反応物質のモル比、溶媒、圧力等）が提供される場合、当業者であれば、さらなるプロセス条件を最適化および開発することができるであろう。最適な反応条件は、用いる特定の反応物または溶媒によって異なり得るが、そのような条件は、日常的な最適化手順を用いて当業者によって決定され得る。
【０３５２】
本明細書に記載のプロセスは、当技術分野で既知の任意の好適な方法に従って監視され得る。例えば、産物形成は、核磁気共鳴分光学（例えば、１Ｈもしくは１３Ｃ）、赤外線分光学、分光測光（例えば、紫外線可視）、もしく質量分析等の分光学的手段、または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）もしくは薄層クロマトグラフィー等のクロマトグラフィーによって監視され得る。
【０３５３】
本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡ分子の調製は、様々な化学基の保護および脱保護を伴い得る。保護および脱保護の必要性、ならびに適切な保護基の選択は、当業者によって容易に決定され得る。保護基の化学は、例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｇｒｅｅｎｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｄ．Ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９１において見出され得る。
【０３５４】
本明細書に記載のプロセスの反応は、有機合成分野の技術者によって容易に選択され得る好適な溶媒において行われ得る。好適な溶媒は、反応が行われる温度、すなわち、溶媒の凍結温度から溶媒の沸点の範囲であり得る温度で、出発物質（反応物）、中間体、または産物とは実質的に非反応性であり得る。所与の反応は、１つの溶媒または２つ以上の溶媒の混合物において行われ得る。特定の反応ステップに応じて、特定の反応ステップに好適な溶媒が選択され得る。
【０３５５】
修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチド（例えば、ｍｍＲＮＡ分子）のラセミ混合物の分解は、当技術分野で既知の多数の方法のうちのいずれかによって行われ得る。方法の例には、光学活性の塩形成有機酸である「キラル分解酸」を用いた分別再結晶が挙げられる。分別再結晶法に好適な分解酸には、例えば、酒石酸、ジアセチル酒石酸、ジベンゾイル酒石酸、マンデル酸、リンゴ酸、乳酸、または様々な光学活性カンファースルホン酸のＤおよびＬ形態等の光学活性酸がある。ラセミ混合物の分解は、光学活性分解剤（例えば、ジニトロベンゾイルフェニルグリシン）を充填したカラム上での溶出によっても行われ得る。好適な溶出溶媒組成物は、当業者によって決定され得る。
【０３５６】
修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチド（例えば、ビルディングブロック分子）は、各々が参照によりそれらの全体が組み込まれる、Ｏｇａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．７４：２５８５−２５８８（２００９）、Ｐｕｒｍａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２（１）：７２−７８，（１９９４）、Ｆｕｋｕｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１（４）：５６３−５６８（１９６２）、およびＸｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４８（９）：１７２９−１７４０（１９９２）に記載の合成方法に従って調製され得る。
【０３５７】
本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡは、分子の全長に沿って均一に修飾されてもされなくてもよい。例えば、１種類以上またはすべての種類のヌクレオチド（例えば、プリンもしくはピリミジン、またはＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのうちのいずか１つ以上もしくはすべて）は、本発明のポリヌクレオチドまたはその所与の既定の配列領域（例えば、図１に表される配列領域のうちの１つ以上）において均一に修飾されてもされなくてもよい。いくつかの実施形態において、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド（またはその所与の配列領域）におけるすべてのヌクレオチドＸが修飾され、ここでＸは、ヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのうちのいずれか１つ、または組み合わせＡ＋Ｇ、Ａ＋Ｕ、Ａ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ、Ｇ＋Ｃ、Ｕ＋Ｃ、Ａ＋Ｇ＋Ｕ、Ａ＋Ｇ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ、もしくはＡ＋Ｇ＋Ｃのうちのいずれか１つであり得る。
【０３５８】
異なる糖修飾、ヌクレオチド修飾、および／またはヌクレオシド間結合（例えば、骨格構造）は、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの様々な位置で存在し得る。当業者であれば、ヌクレオチド類似体または他の修飾（複数可）が、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの機能が実質的に低下するように、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの任意の位置（複数可）に位置し得ることを認識する。修飾は、５’または３’末端修飾でもあり得る。シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、約１％〜約１００％の修飾ヌクレオチド（全ヌクレオチド含量または１種類以上のヌクレオチド、すなわち、Ａ、Ｇ、Ｕ、もしくはＣのうちのいずれか１つ以上のいずれかと関連したもの）または任意の中間の割合（例えば、１％〜２０％、１％〜２５％、１％〜５０％、１％〜６０％、１％〜７０％、１％〜８０％、１％〜９０％、１％〜９５％、１０％〜２０％、１０％〜２５％、１０％〜５０％、１０％〜６０％、１０％〜７０％、１０％〜８０％、１０％〜９０％、１０％〜９５％、１０％〜１００％、２０％〜２５％、２０％〜５０％、２０％〜６０％、２０％〜７０％、２０％〜８０％、２０％〜９０％、２０％〜９５％、２０％〜１００％、５０％〜６０％、５０％〜７０％、５０％〜８０％、５０％〜９０％、５０％〜９５％、５０％〜１００％、７０％〜８０％、７０％〜９０％、７０％〜９５％、７０％〜１００％、８０％〜９０％、８０％〜９５％、８０％〜１００％、９０％〜９５％、９０％〜１００％、および９５％〜１００％）を含有し得る。
【０３５９】
いくつかの実施形態において、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、修飾ピリミジン（例えば、修飾ウラシル／ウリジン／Ｕまたは修飾シトシン／シチジン／Ｃ）を含む。いくつかの実施形態において、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡ分子中のウラシルまたはウリジン（概して、Ｕ）は、約１％〜約１００％の修飾ウラシルまたは修飾ウリジン（例えば、１％〜２０％、１％〜２５％、１％〜５０％、１％〜６０％、１％〜７０％、１％〜８０％、１％〜９０％、１％〜９５％、１０％〜２０％、１０％〜２５％、１０％〜５０％、１０％〜６０％、１０％〜７０％、１０％〜８０％、１０％〜９０％、１０％〜９５％、１０％〜１００％、２０％〜２５％、２０％〜５０％、２０％〜６０％、２０％〜７０％、２０％〜８０％、２０％〜９０％、２０％〜９５％、２０％〜１００％、５０％〜６０％、５０％〜７０％、５０％〜８０％、５０％〜９０％、５０％〜９５％、５０％〜１００％、７０％〜８０％、７０％〜９０％、７０％〜９５％、７０％〜１００％、８０％〜９０％、８０％〜９５％、８０％〜１００％、９０％〜９５％、９０％〜１００％、および９５％〜１００％の修飾ウラシルまたは修飾ウリジン）と置換され得る。修飾ウラシルまたはウリジンは、単一の固有の構造を有する化合物または異なる構造（例えば、本明細書に記載の２、３、４つ以上の固有の構造）を有する複数の化合物に置換され得る。いくつかの実施形態において、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡ分子中のシトシンまたはシチジン（概して、Ｃ）は、約１％〜約１００％の修飾シトシンまたは修飾シチジン（例えば、１％〜２０％、１％〜２５％、１％〜５０％、１％〜６０％、１％〜７０％、１％〜８０％、１％〜９０％、１％〜９５％、１０％〜２０％、１０％〜２５％、１０％〜５０％、１０％〜６０％、１０％〜７０％、１０％〜８０％、１０％〜９０％、１０％〜９５％、１０％〜１００％、２０％〜２５％、２０％〜５０％、２０％〜６０％、２０％〜７０％、２０％〜８０％、２０％〜９０％、２０％〜９５％、２０％〜１００％、５０％〜６０％、５０％〜７０％、５０％〜８０％、５０％〜９０％、５０％〜９５％、５０％〜１００％、７０％〜８０％、７０％〜９０％、７０％〜９５％、７０％〜１００％、８０％〜９０％、８０％〜９５％、８０％〜１００％、９０％〜９５％、９０％〜１００％、および９５％〜１００％の修飾シトシンまたは修飾シチジン）と置換され得る。修飾シトシンまたはシチジンは、単一の固有の構造を有する化合物または異なる構造（例えば、本明細書に記載の２、３、４つ以上の固有の構造）を有する複数の化合物に置換され得る。
【０３６０】
ヌクレオチドの組み合わせ
修飾ヌクレオチドと修飾ヌクレオチドの組み合わせのさらなる例が２０１２年１０月３日（Ｍ９）に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１２／０５８５１９号で提供され、参照によりその内容全体が本明細書に組み込まれる。
【０３６１】
いくつかの実施形態において、シチジンの少なくとも２５％は置換される（例えば、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％）。
【０３６２】
いくつかの実施形態において、ウラシルの少なくとも２５％は置換される（例えば、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％）。
【０３６３】
いくつかの実施形態において、シチジンの少なくとも２５％は置換され、ウラシルの少なくとも２５％は置換される（例えば、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％）。
【０３６４】
ＩＶ．薬学的組成物
製剤化、投与、送達、および投薬
本発明は、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせたシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡの組成物および複合体を提供する。薬学的組成物は、任意に、１つ以上のさらなる活性物質、例えば、治療上および／または予防上活性物質を含んでもよい。医薬品の製剤および／または製造における一般の考慮事項は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ２１ｓｔ  ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５において見出され得る。
【０３６５】
いくつかの実施形態において、組成物は、ヒト、すなわちヒト患者または対象に投与される。本開示の目的のために、「活性成分」という表現は、一般に、本明細書に記載の送達対象のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡを指す。
【０３６６】
本明細書に提供される薬学的組成物の説明は、原則的に、ヒトへの投与に好適である薬学的組成物を対象とするが、そのような組成物は一般に、任意の他の動物への、例えば、非ヒト動物、例えば、非ヒト哺乳動物への投与に好適であることが当業者によって理解されるであろう。組成物を種々の動物への投与に好適であるようにするための、ヒトへの投与に好適な薬学的組成物の修飾は、よく理解されており、獣医薬理学の専門家は、たとえ用いるとしても単なる通常の実験法を用いて、そのような修飾を設計および／または実施することができる。薬学的組成物の投与が企図される対象には、ヒトおよび／もしくは他の霊長類；ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウス、および／もしくはラット等の商業的に関連性のある哺乳動物を含む哺乳動物；ならびに／または家禽類、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、および／もしくはシチメンチョウ等の商業的に適切な鳥類を含む鳥類が含まれるが、これらに限定されない。
【０３６７】
本明細書に記載の薬学的組成物の製剤は、薬理学の技術分野で既知であるか今後開発される、任意の方法によって調製されて得る。一般に、そのような調製方法は、活性成分を賦形剤および／または１つ以上の他の副成分と混合し、次いで、必要かつ／または望ましい場合、生成物を所望の単回または複数回用量単位へと分割、成形、および／またはパッケージ化するステップを含む。
【０３６８】
本発明に従う薬学的組成物は、バルクで、１つの単回単位用量として、および／または複数の単回単位用量として、調製され、パッケージ化され、かつ／または販売され得る。本明細書で使用されるとき、「単位用量」は、既定量の活性成分を含む、薬学的組成物の個別的な量である。活性成分の量は一般に、対象に投与されるであろう活性成分の投薬量、および／または例えば、そのような投薬量の２分の１もしくは３分の１等の、そのような投薬量の好都合な分率に等しい。
【０３６９】
本発明に従う薬学的組成物中の活性成分、薬学的に許容される賦形剤、および／または任意のさらなる成分の相対的な量は、治療される対象の素性、大きさ、および／または状態に応じて変化し、組成物が投与されるべき経路に応じてさらに変化するあろう。例として、組成物は、０．１％〜１００ｗ／ｗ％、例えば、０．５〜５０ｗ／ｗ％、１〜３０ｗ／ｗ％、５〜８０ｗ／ｗ％、少なくとも８０ｗ／ｗ％の活性成分を含み得る。
【０３７０】
製剤化
本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡは、：（１）安定性を増加させ、（２）細胞形質移入を増加させ、（３）（例えば、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡのデポー製剤からの）持続放出もしくは遅延放出を可能にし、（４）生体分布を変化させ（例えば、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの標的を特定の組織または細胞型に定める）、（５）コードされたタンパク質の翻訳をインビボで増加させ、かつ／または（６）コードされたタンパク質の放出プロファイルをインビボで変化させるために、１つ以上の賦形剤を用いて製剤化することができる。ありとあらゆる溶媒、分散媒体、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散もしくは懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤もしくは乳化剤、防腐剤等の伝統的な賦形剤に加えて、本発明の賦形剤は、制限なく、リピドイド、リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリマー、リポプレックス、コア−シェルナノ粒子、ペプチド、タンパク質、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはｍｍＲＮＡ（例えば、対象への移植のために）で形質移入された細胞、ヒアルロニダーゼ、ナノ粒子模倣体、およびこれらの組み合わせを含むことができる。さらに、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを、自己組織化核酸ナノ粒子を用いて製剤化し得る。
【０３７１】
したがって、本発明の製剤は、１つ以上の賦形剤を含むことができ、各々は一緒にシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはｍｍＲＮＡの安定性を増加させる、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはｍｍＲＮＡによる細胞形質移入を増加させる、ポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはｍｍＲＮＡによりコードされるタンパク質の発現を増加させる、および／またはシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはｍｍＲＮＡによりコードされるタンパク質の放出プロファイルを変化させる量である。さらに、本発明の一次構築物およびｍｍＲＮＡは、自己集合性核酸ナノ粒子を用いて製剤化されてもよい。
【０３７２】
本明細書に記載の薬学的組成物の製剤は、薬理学の技術分野で既知であるか今後開発される、任意の方法によって調製され得る。一般に、そのような調製方法は、活性成分を賦形剤および／または１つ以上の他の副成分と混合するステップを含む。
【０３７３】
本開示による薬学的組成物は、バルクで、１つの単回単位用量として、および／または複数の単回単位用量として、調製され、パッケージ化され、かつ／または販売されてもよい。本明細書で使用されるとき、「単位用量」は、既定量の活性成分を含む、薬学的組成物の個別的な量を指す。活性成分の量は一般に、対象に投与されるであろう活性成分の投薬量、および／または例えば、そのような投薬量の２分の１もしくは３分の１を含むが、これらに限定されない、そのような投薬量の好都合な分率に等しい。
【０３７４】
本開示による薬学的組成物中の活性成分、薬学的に許容される賦形剤、および／または任意のさらなる成分の相対的な量は、治療されている対象の素性、サイズ、および／または状態に応じて変化し、組成物が投与されるべき経路に応じてさらに変化するであろう。例えば、組成物は、０．１ｗ／ｗ％〜９９％の活性成分を含み得る。
【０３７５】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の製剤は、少なくとも１つのシグナルセンサーｍｍＲＮＡを含有し得る。非限定的な例として、製剤は、１、２、３、４、または５つのシグナルセンサーｍｍＲＮＡを含有してもよい。一実施形態において、製剤は、タンパク質といったカテゴリーから選択されるタンパク質をコードする修飾ｍＲＮＡを含有し得る。一実施形態において、製剤は、少なくとも３つのシグナルセンサー修飾ｍＲＮＡがコードする腫瘍学関連タンパク質を含有する。一実施形態において、製剤は、少なくとも５つのシグナルセンサー修飾ｍＲＮＡがコードする腫瘍学関連タンパク質を含有する。
【０３７６】
薬学的製剤は、所望される特定の剤形に適している、本明細書で使用されるときにありとあらゆる溶媒、分散媒体、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散もしくは懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤もしくは乳化剤、防腐剤等を含むが、これらに限定されない、薬学的に許容される賦形剤をさらに含んでもよい。薬学的組成物を製剤化するための種々の賦形剤および組成物を調製するための技法は、当技術分野で知られている（参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，２００６を参照のこと）。任意の従来の賦形剤媒体が任意の望ましくない生体影響を引き起こすか、またはさもなければ薬学的組成物の任意の他の構成成分（複数可）と有害な様態で相互作用するといった、物質またはその誘導体と不適合性である場合を除いて、その使用が本開示の範囲内で企図され得る。
【０３７７】
いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子の粒径は、増加および／または減少し得る。粒径の変化は、炎症等であるが、これらに限定されない生体反応に対抗する一助となることが可能であり得るか、または哺乳動物に送達されるシグナルセンサー修飾ｍＲＮＡの生体効果を増加させ得る。
【０３７８】
薬学的組成物の製造に使用される薬学的に許容される賦形剤には、不活性希釈剤、界面活性剤および／もしくは乳化剤、防腐剤、緩衝剤、滑沢剤、ならびに／または油が含まれるが、これらに限定されない。そのような賦形剤が任意に本発明の薬学的製剤に含まれてもよい。
【０３７９】
本発明の薬学的組成物は、化学補助剤であり得る共補助剤を少なくとも１つ含み得る。化学補助剤および化学補助剤を含む送達システムの非制限的な例が、参照によりその内容全体が本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１３１３４３４９号で説明されている。化学補助剤は、本明細書に記載される送達ビヒクルと結合もしくは非共有結合し得、または、本明細書に記載される送達ビヒクル内に被包され得る。
【０３８０】
リピドイド
リピドイドの合成が詳細に記載されており、これらの化合物を含有する製剤は、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの送達に特に適している（これらすべてが参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、Ｍａｈｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．２０１０  ２１：１４４８−１４５４、Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ．２０１０  ２６７：９−２１、Ａｋｉｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００８  ２６：５６１−５６９、Ｌｏｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０１０  １０７：１８６４−１８６９、Ｓｉｅｇｗａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０１１１０８：１２９９６−３００１を参照のこと）。
【０３８１】
これらのリピドイドを用いて、齧歯類および非ヒト霊長類において２本鎖低分子干渉ＲＮＡが有効に送達されているが（これらすべて、それらの全体が本明細書に組み込まれる、Ａｋｉｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００８  ２６：５６１−５６９、Ｆｒａｎｋ−Ｋａｍｅｎｅｔｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００８  １０５：１１９１５−１１９２０、Ａｋｉｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００９  １７：８７２−８７９、Ｌｏｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０１０  １０７：１８６４−１８６９、Ｌｅｕｓｃｈｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１  ２９：１００５−１０１０を参照のこと）、本開示は、１本鎖シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを送達することにおけるそれらの製剤化および使用を記載する。これらのリピドイドを含有する複合体、ミセル、リポソーム、または粒子が調製され得、したがって、局所および／または全身投与経路を介したリピドイド製剤の注入後に、コードされたタンパク質の産生によって判定するとき、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの有効な送達をもたらすことができる。シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡのリピドイド複合体は、静脈内、筋肉内、または皮下経路を含むが、これらに限定されない、種々の手段によって投与することができる。
【０３８２】
核酸のインビボ送達は、製剤組成、粒子ＰＥＧ化の性質、負荷の程度、オリゴヌクレオチド対脂質比を含むが、これらに限定されない多くのパラメータ、および粒径といった生物物理学的パラメータによって影響を受け得る（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ａｋｉｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００９  １７：８７２−８７９）。例として、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）脂質のアンカー鎖長のわずかな変化が、インビボ有効性に対する大きな効果をもたらし得る。ペンタ［３−（１−ラウリルアミノプロピオニル）］−トリエチレンテトラミン塩酸塩（ＴＥＴＡ−５ＬＡＰ（９８Ｎ１２−５としても知られる）、Ｍｕｒｕｇａｉａｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４０１：６１（２０１０）を参照のこと）、Ｃ１２−２００（誘導体および変異形を含む）、およびＭＤ１を含むが、これらに限定されない、異なるリピドイドを有する製剤がインビボ活性について試験され得る。
【０３８３】
本明細書において「９８Ｎ１２−５」と称されるリピドイドは、参照によりその全体が組み込まれる、Ａｋｉｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００９  １７：８７２−８７９によって開示されている。
【０３８４】
本明細書において「Ｃ１２−２００」と称されるリピドイドは、両方ともに参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、Ｌｏｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ
Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０１０  １０７：１８６４−１８６９およびＬｉｕ  ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ．２０１０  ６６９−６７０によって開示されている。リピドイド製剤は、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡに加えて、３つもしくは４つのいずれかまたはそれよりも多い構成成分を含む粒子を含むことができる。例として、ある特定のリピドイドを有する製剤は、９８Ｎ１２−５を含むが、これらに限定されず、４２％リピドイド、４８％コレステロール、および１０％ＰＥＧ（Ｃ１４アルキル鎖長）を含有してもよい。別の例として、ある特定のリピドイドを有する製剤は、Ｃ１２−２００を含むが、これらに限定されず、５０％リピドイド、１０％ジステアロイルホスファチジル（ｄｉｓｔｅｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ）コリン、３８．５％コレステロール、および１．５％ＰＥＧ−ＤＭＧを含有してもよい。
【０３８５】
リピドイドは、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡによる細胞形質移入を増加させ、かつ／またはコードされた腫瘍学関連タンパク質の翻訳を増加させることが可能であり得るため、異なるリピドイドの組み合わせを用いて、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの指示によるタンパク質産生の有効性を改善し得る（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１１，１９：１６８８−１６９４を参照のこと）。
【０３８６】
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子の粒径は増大および／または低下し得る。粒径の変化は、限定はしないが炎症といった生物学的反応に抵抗する手助けができ得、または、対象に送達されるシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡの生物学的効果を増大し得る。
【０３８７】
リポソーム、リポプレックス、および脂質ナノ粒子
本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡは、１つ以上のリポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子を用いて製剤化することができる。一実施形態において、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの薬学的組成物は、リポソームを含む。リポソームは、主に脂質二重層から構成され得、栄養素および薬学的製剤の投与のための送達ビヒクルとして使用され得る、人工的に調製された小胞である。リポソームは、直径数百ナノメートルであり得、かつ狭い水性の区画によって分離される一連の同心状二重層を含有し得る多層小胞（ＭＬＶ）、直径５０ｎｍよりも小さい場合がある小さい単細胞小胞（ＳＵＶ）、および直径５０〜５００ｎｍであり得る大きい単層小胞（ＬＵＶ）等であるが、これらに限定されない、異なるサイズのものであり得る。リポソーム設計は、不健康な組織へのリポソームの結合を改善するため、またはエンドサイトーシス等であるが、これらに限定されない事象を活性化するための、オプソニンまたはリガンドを含むが、これらに限定されない。リポソームは、薬学的製剤の送達を改善するために低ｐＨまたは高ｐＨを含有してもよい。
【０３８８】
リポソームの形成は、封入される薬学的製剤およびリポソーム成分、脂質小胞が分散される媒体の性質、封入される物質の有効濃度およびその潜在的な毒性、小胞の適用および／または送達中に伴われる任意のさらなるプロセス、意図される適用のための小胞の最適化サイズ、多分散性、および貯蔵寿命、ならびに安全かつ効率的なリポソーム生成物のバッチ間の再現性および大規模産生の可能性等であるが、これらに限定されない、物理化学特性に依存し得る。
【０３８９】
一実施形態において、本明細書に記載の薬学的組成物は、制限なく、１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）リポソーム、Ｍａｒｉｎａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）によるＤｉＬａ２リポソーム、１，２−ジリノレイルオキシ（ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｌｏｘｙ）−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、およびＭＣ３（参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許公開第２０１００３２４１２０号）から形成されるもの等のリポソーム、ならびにＪａｎｓｓｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｈｏｒｓｈａｍ、ＰＡ）によるＤＯＸＩＬ（登録商標）等であるが、これらに限定されない小分子薬物を送達し得るリポソームを含んでもよい。
【０３９０】
一実施形態において、本明細書に記載の薬学的組成物は、制限なく、以前に記載されており、インビトロおよびインビボでのオリゴヌクレオチド送達に好適であることが示された、安定化プラスミド−脂質粒子（ＳＰＬＰ）または安定化核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）の合成から形成されるもの等のリポソームを含んでもよい（これらすべてが参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、Ｗｈｅｅｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ．１９９９  ６：２７１−２８１、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ．１９９９  ６：１４３８−１４４７、Ｊｅｆｆｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．２００５  ２２：３６２−３７２、Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５  ２：１００２−１００７、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２００６  ４４１：１１１−１１４、Ｈｅｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｏｎｔｒ  Ｒｅｌ．２００５  １０７：２７６−２８７、Ｓｅｍｐｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０１０  ２８：１７２−１７６、Ｊｕｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２００９  １１９：６６１−６７３、ｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓＨｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００８  １９：１２５−１３２を参照のこと）。Ｗｈｅｅｌｅｒらによる元の製造方法は、洗浄剤透析法（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ  ｄｉａｌｙｓｉｓ  ｍｅｔｈｏｄ）であり、それは後にＪｅｆｆｓらによって改善され、自発的小胞形成法（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｖｅｓｉｃｌｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）と称される。リポソーム製剤は、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡに加えて、３〜４つの脂質構成成分から構成される。例としてリポソームは、Ｊｅｆｆｓらによって記載されるように、５５％のコレステロール、２０％のジステアロイルホスファチジル（ｄｉｓｔｅｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ）コリン（ＤＳＰＣ）、１０％のＰＥＧ−Ｓ−ＤＳＧ、および１５％の１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）を含有することができるが、これらに限定されない。別の例として、ある特定のリポソーム製剤は、Ｈｅｙｅｓらによって記載されるように、４８％のコレステロール、２０％のＤＳＰＣ、２％のＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡ、および３０％のカチオン性脂質を含有してもよいが、これらに限定されず、このカチオン性脂質は、１，２−ジステアリルオキシ（ｄｉｓｔｅａｒｌｏｘｙ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＳＤＭＡ）、ＤＯＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、または１，２−ジリノレニルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）であり得る。
【０３９１】
一実施形態において、薬学的組成物は、少なくとも１つの免疫原をコードし得るシグナルセンサーｍｍＲＮＡを送達するために形成され得る、リポソームを含んでもよい。ｍｍＲＮＡは、リポソームによってカプセル封入されてもよく、かつ／またはそれは、水性コアに含有されてもよく、それが次いでリポソームによってカプセル封入されてもよい（参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１２０３１０４６号、同第ＷＯ２０１２０３１０４３号、同第ＷＯ２０１２０３０９１号、および同第ＷＯ２０１２００６３７８号を参照のこと）。別の実施形態において、免疫原をコードし得るシグナルセンサーｍｍＲＮＡは、カチオン性水中油型エマルション中で製剤化されてもよく、そのエマルション粒子は、シグナルセンサーｍｍＲＮＡと相互作用して分子をエマルション粒子に固着させることができる油中子およびカチオン性脂質を含む（国際公開第ＷＯ２０１２００６３８０号を参照のこと）。さらに別の実施形態において、脂質製剤は、形質移入を向上させ得る脂質である少なくともカチオン性脂質、および脂質部分に連結された親水性頭頂基を含有する少なくとも１つの脂質を含んでもよい（参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１１０７６８０７号および米国公開第２０１１０２００５８２号を参照のこと）。別の実施形態において、免疫原をコードするシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡは、官能化脂質二重層の間に架橋を有し得る脂質小胞中に製剤化されてもよい（参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第２０１２０１７７７２４号を参照のこと）。
【０３９２】
一実施形態において、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡは、官能化脂質二重層の間に架橋を有し得る脂質小胞中に製剤化されてもよい。
【０３９３】
一実施形態において、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡは、脂質−ポリカチオン複合体中に製剤化されてもよい。脂質−ポリカチオン複合体の形成は、当技術分野で既知の方法によって、および／または参照により全体が本明細書に組み込まれる米国公開第２０１２０１７８７０２号に記載されるように遂行されてもよい。非限定的な例として、ポリカチオンには、ポリリジン、ポリオルニチン、および／またはポリアルギニンといったカチオン性ペプチドまたはポリペプチドが含まれてもよい。別の実施形態において、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡは、コレステロールまたはジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）等であるが、これらに限定されない中性脂質をさらに含み得る、脂質−ポリカチオン複合体中に製剤化されてもよい。
【０３９４】
リポソーム製剤は、カチオン性脂質構成成分の選択、カチオン性脂質飽和の程度、ＰＥＧ化の性質、すべての構成成分の比率、およびサイズ等の生物物理学的パラメータによって影響を受け得るが、これらに限定されない。Ｓｅｍｐｌｅら（Ｓｅｍｐｌｅら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０１０  ２８：１７２−１７６）による一例において、リポソーム製剤は、５７．１％のカチオン性脂質、７．１％のジパルミトイルホスファチジルコリン、３４．３％のコレステロール、および１．４％のＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡから構成された。別の例として、カチオン性脂質の組成を変化させることにより、ｓｉＲＮＡを種々の抗原提示細胞により有効に送達することができた（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｂａｓｈａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１１  １９：２１８６−２２００）。
【０３９５】
いくつかの実施形態において、ＬＮＰ製剤中のＰＥＧの比率は、増加もしくは減少し得、かつ／またはＰＥＧ脂質の炭素鎖長がＣ１４からＣ１８に修飾されて、ＬＮＰ製剤の薬物動態および／もしくは生体分布を変化させ得る。非限定的な例として、ＬＮＰ製剤は、カチオン性脂質、ＤＳＰＣ、およびコレステロールと比較して、１〜５％の脂質モル比のＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧを含有してもよい。別の実施形態において、ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧは、ＰＥＧ−ＤＳＧ（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロール、メトキシポリエチレングリコール）またはＰＥＧ−ＤＰＧ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロール、メトキシポリエチレングリコール）等であるが、これらに限定されないＰＥＧ脂質と置き換えられてもよい。カチオン性脂質は、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、Ｃ１２−２００、およびＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ等であるが、これらに限定されない、当技術分野で既知の任意の脂質から選択されてもよい。
【０３９６】
一実施形態において、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡのＬＮＰ製剤は３％の脂質モル比でＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧを含有してもよい。別の実施形態では、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物および／またはｍｍＲＮＡのＬＮＰ製剤は、１．５％の脂質モル比でＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧを含有してもよい。
【０３９７】
一実施形態において、薬学的の組成物シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡは、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１２０９９７５５号に記載のＰＥＧ化脂質のうちの少なくとも１つを含んでもよい。
【０３９８】
一実施形態において、薬学的組成物は、ＤｉＬａ２リポソーム（Ｍａｒｉｎａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）、ＳＭＡＲＴＩＣＬＥＳ（登録商標）（Ｍａｒｉｎａ
Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）、中性ＤＯＰＣ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）系リポソーム（例えば、卵巣癌に対するｓｉＲＮＡ送達（Ｌａｎｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ＆Ｔｈｅｒａｐｙ  ２００６  ５（１２）１７０８−１７１３））、およびヒアルロナンコーティングリポソーム（Ｑｕｉｅｔ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｓｒａｅｌ）等であるが、これらに限定されないリポソーム中に製剤化されてもよい。
【０３９９】
いくつかの実施形態では、リポソームは、がんおよび他の疾患の治療または細胞のコレステロール代謝を制御するために製剤化されたリポソームナノ構造であり得る。リポソームナノ構造はまた、がん細胞を殺すためにスカベンジャー受容体Ｂ−１型（ＳＲ−Ｂ１）を含み得る。本明細書に記載されるシグナルセンサーポリヌクレオチドと一緒に用いられ得るリポソームナノ構造の非制限的な例が、国際公開第ＷＯ２０１３１２６７７６号に記載されており、参照によりその内容全体が本明細書に組み込まれる。
【０４００】
一実施形態において、本明細書に記載されるリポソームは、限定はしないがサイトカインといった免疫調節因子を少なくとも１つ含み得る。少なくとも１つの免疫調節因子を含むリポソームを用いる製剤および方法が、国際公開第ＷＯ２０１３１２９９３５号および同第ＷＯ２０１３１２９９３６号で記載されており、各内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。非制限的な例として、少なくとも１つの免疫調節因子を含むリポソームは、がんの治療で用いられ得る。免疫調節因子を含むリポソームは、本明細書に記載されるシグナルセンサーポリヌクレオチドを含み得る。非制限的な例として、免疫調節因子を含むリポソームは、参照によりその内容全体が本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１３１２９９３６号に記載される、粒子性または小胞性免疫調節因子といった少なくとも１つの抗体を組み合わせて使用され得る。
【０４０１】
脂質ナノ粒子製剤は、カチオン性脂質を、急速排出（ｒａｐｉｄｌｙ  ｅｌｉｍｉｎａｔｅｄ）脂質ナノ粒子（ｒｅＬＮＰ）として知られている生分解性カチオン性脂質と置き換えることによって改善されてもよい。ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、およびＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ等であるが、これらに限定されない、イオン化できるカチオン性脂質は、時間とともに血漿および組織中に蓄積することが示されてきており、潜在的な毒性の源であり得る。急速排出脂質の急速な代謝は、ラットにおいて１ｍｇ／ｋｇ用量〜１０ｍｇ／ｋｇ用量の１桁分、脂質ナノ粒子の耐性および治療指数を改善することができる。酵素的に分解されるエステル結合の組み込みは、ｒｅＬＮＰ製剤の活性を依然として維持しながら、カチオン性構成成分の分解および代謝プロファイルを改善することができる。エステル結合は、脂質鎖の内部に位置することができるか、またはそれは、脂質鎖の末端において末端に位置してもよい。内部エステル結合は、脂質鎖内の任意の炭素を置き換えてもよい。
【０４０２】
一実施形態において、内部エステル結合は、飽和炭素のいずれの側に位置してもよい。
【０４０３】
一実施形態において、免疫応答が、ナノ化学種、ポリマー、および免疫原を含み得る脂質ナノ粒子を送達することによって、誘発され得る。（参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第２０１２０１８９７００号および国際公開第ＷＯ２０１２０９９８０５号）。ポリマーは、ナノ化学種をカプセル封入しても、ナノ化学種を部分的にカプセル封入してもよい。免疫原は、本明細書に記載の組換え腫瘍学関連タンパク質、シグナルセンサー修飾ＲＮＡ、および／または一次構築物であってもよい。一実施形態において、脂質ナノ粒子は、病原体に対するもの等であるが、これらに限定されないワクチンにおいて使用するために製剤化されてもよい。
【０４０４】
脂質ナノ粒子は、脂質ナノ粒子が粘膜関門を透過するように、粒子の表面特性を変化させるように操作されてもよい。粘液は、口腔（例えば、周口膜および食道膜ならびに扁桃組織）、眼、胃腸（例えば、胃、小腸、大腸、結腸、直腸）、鼻、呼吸器（例えば、経鼻、咽頭、気管、および気管支膜）、生殖器（例えば、膣内、子宮頚部、および尿道膜）上に位置する粘膜組織等であるが、これらに限定されない。より高い薬物カプセル封入効率および幅広い薬物の持続送達を提供する能力のために好ましい１０〜２００ｎｍよりも大きいナノ粒子、は、粘膜関門を通って急速に拡散するには大きすぎると考えられている。粘液は、継続的に分泌され、脱落し、破棄されるかまたは消化され、再生されるため、捕捉された粒子のほとんどは、数秒または数時間以内に粘膜（ｍｕｃｏｓｌａ）組織から除去され得る。低分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で密にコーティングされた大きいポリマーナノ粒子（直径２００ｎｍ〜５００ｎｍ）は、水中で拡散している同じ粒子よりもわずか４〜６倍低く、粘液を通って拡散した（参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、Ｌａｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ２００７  １０４（５）：１４８２−４８７、Ｌａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．２００９  ６１（２）：１５８−１７１）。ナノ粒子の輸送は、蛍光退色後回復測定（ＦＲＡＰ）および高解像度多数粒子追跡（ＭＰＴ）を含むが、これらに限定されない、透過速度および／または蛍光顕微鏡技法を用いて決定され得る。
【０４０５】
粘液を透過するように操作された脂質ナノ粒子は、ポリマー材料（すなわちポリマーコア）および／またはポリマー−ビタミン複合体および／またはトリブロックコポリマーを含んでもよい。ポリマー材料には、ポリアミン、ポリエーテル、ポリアミド、ポリエステル、ポリカルバメート、ポリ尿素、ポリカーボネート、ポリ（スチレン）、ポリイミド、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリアセチレン、ポリエチレン、ポリエチレンイミン、ポリイソシアネート、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリロニトリル、およびポリアリレートが含まれてもよいが、これらに限定されない。ポリマー材料は、生分解性および／または生体適合性であってもよい。具体的なポリマーの非限定的な例としては、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）、エチレン酢酸ビニルポリマー（ＥＶＡ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（Ｌ−乳酸）（ＰＬＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（Ｌ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＬＧＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）（ＰＤＬＡ）、ポリ（Ｌ−ラクチド）（ＰＬＬＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン−ｃｏ−グリコリド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−ＰＥＯ−ｃｏ−Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−ＰＰＯ−ｃｏ−Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリアルキルシアノアクリレート（ｃｙａｎｏａｃｒａｌａｔｅ）、ポリウレタン、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）、ヒドロキシプロピルメタクリレート（ＨＰＭＡ）、ポリエチレングリコール、ポリ−Ｌ−グルタミン酸、ポリ（ヒドロキシ酸）、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリ（エステルアミド）、ポリアミド、ポリ（エステルエーテル）、ポリカーボネート、ポリエチレンおよびポリプロピレン等のポリアルキレン、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリアルキレンオキシド（ＰＥＯ）等のポリアルキレングリコール、ポリ（エチレンテレフタレート）等のポリアルキレンテレフタレート、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルエーテル、ポリ（酢酸ビニル）等のポリビニルエステル、ポリ（塩化ビニル）（ＰＶＣ）等のハロゲン化ポリビニル、ポリビニルピロリドン、ポリシロキサン、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリウレタン、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース等の誘導体化セルロース、ポリ（メチル（メタ）アクリレート）（ＰＭＭＡ）、ポリ（エチル（メタ）アクリレート）、ポリ（ブチル（メタ）アクリレート）、ポリ（イソブチル（メタ）アクリレート）、ポリ（ヘキシル（メタ）アクリレート）、ポリ（イソデシル（メタ）アクリレート）、ポリ（ラウリル（メタ）アクリレート）、ポリ（フェニル（メタ）アクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、ポリ（オクタデシルアクリレート）等のアクリル酸のポリマー、ならびにそのコポリマーおよび混合物、ポリジオキサノンおよびそのコポリマー、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリプロピレンフマル酸塩、ポリオキシメチレン、ポロキサマー、ポリ（オルト）エステル、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）、およびトリメチレンカーボネート、ポリビニルピロリドンが挙げられる。脂質ナノ粒子は、ブロックコポリマー、および（ポリ（エチレングリコール）−（ポリ（プロピレンオキシド）−（ポリ（エチレングリコール）トリブロックコポリマー（参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第２０１２０１２１７１８号および米国公開２０１００００３３３７号を参照のこと）等であるが、これらに限定されない、コポリマーでコーティングされるか、またはそれと会合されてもよい。コポリマーは、一般に安全と認められる（ＧＲＡＳ）ポリマーであってもよく、脂質ナノ粒子の形成は、新たな化学実体が何ら作り出されないような方式であってもよい。例えば、脂質ナノ粒子は、新たな化学実体を形成することなく、依然としてヒト粘液に急速に透過可能である、ポロキサマーコーティングＰＬＧＡナノ粒子を含んでもよい（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１１  ５０：２５９７−２６００）。
【０４０６】
ポリマー−ビタミン複合体のビタミンは、ビタミンＥであってもよい。この複合体のビタミン部分は、ビタミンＡ、ビタミンＥ、他のビタミン、コレステロール、他の界面活性剤の疎水性部分または疎水性構成成分（例えば、ステロール鎖、脂肪酸、炭化水素鎖、およびアルキレンオキシド鎖）等であるが、これらに限定されない他の好適な構成成分で置換されてもよい。
【０４０７】
粘液を透過するように操作された脂質ナノ粒子には、表面変質剤が含まれ、例えば、シグナルセンサーｍｍＲＮＡ、アニオン性タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン）、界面活性剤（例えば、ジメチルジオクタデシル−アンモニウムブドミド等の、例えば、カチオン性界面活性剤）、糖または糖誘導体（例えば、シクロデキストリン）、核酸、ポリマー（例えば、ヘパリン、ポリエチレングリコール、およびポロキサマー）、粘液溶解剤（例えば、Ｎ−アセチルシステイン、餅草、ブロメライ、パパイン、クレロデンドロン、アセチルシステイン、ブロムヘキシン、カルボシステイン、エプラジノン、メスナ、アンブロキソール、ソブレロール、ドミオドール、レトステイン、ステプロニン、チオプロニン、ゲルゾリン、サイモシンβ４ドルナーゼα、ネルテネキシン、エルドステイン）、およびｒｈＤＮａｓｅを含む種々のＤＮａｓｅであるが、これらに限定されない表面変質剤が含まれてもよい。表面変質薬剤は、粒子の表面に包埋されるもしくは絡ませられるか、または脂質ナノ粒子の表面上に（例えば、コーティング、吸着、共有結合、または他のプロセスによって）配置されてもよい。（参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国公開２０１００２１５５８０号および米国公開２００８０１６６４１４号を参照のこと）。
【０４０８】
粘液透過性脂質ナノ粒子は、本明細書に記載されるシグナルセンサーｍｍＲＮＡを少なくとも１つ含み得る。シグナルセンサーｍｍＲＮＡは脂質ナノ粒子に被包され得、および／または、粒子の表面上に配置され得る。シグナルセンサーｍｍＲＮＡは、脂質ナノ粒子に共有結合し得る。粘液透過性脂質ナノ粒子の製剤は、複数のナノ粒子を含み得る。さらに、製剤は、粘液と相互作用し得る粒子を含み得、周囲の粘液の構造上および／または粘着性特性を改変し、粘液透過性脂質ナノ粒子の粘膜組織への送達を増大し得る粘膜付着を低下し得る。
【０４０９】
脂質ナノ粒子は、脂質ナノ粒子が粘膜関門を透過するように、粒子の表面特性を変化させるように操作されてもよい。粘液は、限定はしないが、口腔（例えば、周口膜および食道膜ならびに扁桃組織）、眼、胃腸（例えば、胃、小腸、大腸、結腸、直腸）、鼻、呼吸器（例えば、経鼻、咽頭、気管、および気管支膜）、生殖器（例えば、膣内、子宮頚部、および尿道膜）といった粘膜組織上に位置する。より高い薬物カプセル封入効率および幅広い薬物の持続送達を提供する能力のために好ましい１０〜２００ｎｍよりも大きいナノ粒子、は、粘膜関門を通って急速に拡散するには大きすぎると考えられている。粘液は、継続的に分泌され、脱落し、破棄されるかまたは消化され、再生されるため、捕捉された粒子のほとんどは、数秒または数時間以内に粘膜（ｍｕｃｏｓｌａ）組織から除去され得る。低分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で密にコーティングされた大きいポリマーナノ粒子（直径２００ｎｍ〜５００ｎｍ）は、水中で拡散している同じ粒子よりもわずか４〜６倍低く、粘液を通って拡散した（参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、Ｌａｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ２００７  １０４（５）：１４８２−４８７、Ｌａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．２００９  ６１（２）：１５８−１７１）。ナノ粒子の輸送は、蛍光退色後回復測定（ＦＲＡＰ）および高解像度多数粒子追跡（ＭＰＴ）を含むが、これらに限定されない、透過速度および／または蛍光顕微鏡技法を用いて決定され得る。
【０４１０】
粘液を透過するように操作された脂質ナノ粒子は、ポリマー材料（すなわちポリマーコア）および／またはポリマー−ビタミン複合体および／またはトリブロックコポリマーを含んでもよい。ポリマー材料には、ポリアミン、ポリエーテル、ポリアミド、ポリエステル、ポリカルバメート、ポリ尿素、ポリカーボネート、ポリ（スチレン）、ポリイミド、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリアセチレン、ポリエチレン、ポリエチレンイミン、ポリイソシアネート、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリロニトリル、およびポリアリレートが含まれてもよいが、これらに限定されない。ポリマー材料は、生分解性および／または生体適合性であってもよい。具体的なポリマーの非限定的な例としては、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）、エチレン酢酸ビニルポリマー（ＥＶＡ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（Ｌ−乳酸）（ＰＬＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（Ｌ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＬＧＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）（ＰＤＬＡ）、ポリ（Ｌ−ラクチド）（ＰＬＬＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン−ｃｏ−グリコリド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−ＰＥＯ−ｃｏ−Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−ＰＰＯ−ｃｏ−Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリアルキルシアノアクリレート（ｃｙａｎｏａｃｒａｌａｔｅ）、ポリウレタン、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）、ヒドロキシプロピルメタクリレート（ＨＰＭＡ）、ポリエチレングリコール、ポリ−Ｌ−グルタミン酸、ポリ（ヒドロキシ酸）、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリ（エステルアミド）、ポリアミド、ポリ（エステルエーテル）、ポリカーボネート、ポリエチレンおよびポリプロピレン等のポリアルキレン、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリアルキレンオキシド（ＰＥＯ）等のポリアルキレングリコール、ポリ（エチレンテレフタレート）等のポリアルキレンテレフタレート、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルエーテル、ポリ（酢酸ビニル）等のポリビニルエステル、ポリ（塩化ビニル）（ＰＶＣ）等のハロゲン化ポリビニル、ポリビニルピロリドン、ポリシロキサン、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリウレタン、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース等の誘導体化セルロース、ポリ（メチル（メタ）アクリレート）（ＰＭＭＡ）、ポリ（エチル（メタ）アクリレート）、ポリ（ブチル（メタ）アクリレート）、ポリ（イソブチル（メタ）アクリレート）、ポリ（ヘキシル（メタ）アクリレート）、ポリ（イソデシル（メタ）アクリレート）、ポリ（ラウリル（メタ）アクリレート）、ポリ（フェニル（メタ）アクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、ポリ（オクタデシルアクリレート）等のアクリル酸のポリマー、ならびにそのコポリマーおよび混合物、ポリジオキサノンおよびそのコポリマー、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリプロピレンフマル酸塩、ポリオキシメチレン、ポロキサマー、ポリ（オルト）エステル、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）、およびトリメチレンカーボネート、ポリビニルピロリドンが挙げられる。脂質ナノ粒子は、ブロックコポリマー、および（ポリ（エチレングリコール）−（ポリ（プロピレンオキシド）−（ポリ（エチレングリコール）トリブロックコポリマー（参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第２０１２０１２１７１８号および米国公開２０１００００３３３７号を参照のこと）等であるが、これらに限定されない、コポリマーでコーティングされるか、またはそれと会合されてもよい。
【０４１１】
ポリマー−ビタミン複合体のビタミンは、ビタミンＥであってもよい。この複合体のビタミン部分は、ビタミンＡ、ビタミンＥ、他のビタミン、コレステロール、他の界面活性剤の疎水性部分または疎水性構成成分（例えば、ステロール鎖、脂肪酸、炭化水素鎖、およびアルキレンオキシド鎖）等であるが、これらに限定されない他の好適な構成成分で置換されてもよい。
【０４１２】
粘液に透過するように操作された脂質ナノ粒子には、ｍｍＲＮＡ、アニオン性タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン）、界面活性剤（例えば、ジメチルジオクタデシル−アンモニウムブドミド等の、例えば、カチオン性界面活性剤）、糖または糖誘導体（例えば、シクロデキストリン）、核酸、ポリマー（例えば、ヘパリン、ポリエチレングリコール、およびポロキサマー）、粘液溶解剤（例えば、Ｎ−アセチルシステイン、餅草、ブロメライ、パパイン、クレロデンドロン、アセチルシステイン、ブロムヘキシン、カルボシステイン、エプラジノン、メスナ、アンブロキソール、ソブレロール、ドミオドール、レトステイン、ステプロニン、チオプロニン、ゲルゾリン、サイモシンβ４ドルナーゼα、ネルテネキシン、エルドステイン）、およびｒｈＤＮａｓｅを含む種々のＤＮａｓｅ等であるが、これらに限定されない表面変質剤が含まれてもよい。表面変質薬剤は、粒子の表面に包埋されるもしくは絡ませられるか、または脂質ナノ粒子の表面上に（例えば、コーティング、吸着、共有結合、または他のプロセスによって）配置されてもよい。（参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国公開２０１００２１５５８０号および米国公開２００８０１６６４１４号を参照のこと）。
【０４１３】
粘液透過性脂質ナノ粒子は、本明細書に記載の少なくとも１つのシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを含んでもよい。シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、脂質ナノ粒子中にカプセル封入され、かつ／または粒子の表面上に配置されてもよい。シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、脂質ナノ粒子に共有結合されてもよい。粘液透過性脂質ナノ粒子の製剤は、複数のナノ粒子を含んでもよい。さらに、製剤は、粘液と相互作用し、周囲の粘液の構造特性および／または付着特性を、粘膜付着を減少させるように変質させ得、それにより粘液透過性脂質ナノ粒子の粘膜組織への送達を増加させ得る、粒子を含有してもよい。
【０４１４】
一実施形態において、ナノ粒子は、少なくとも１つの治療剤（例えば、本明細書に記載されるシグナルセンサーポリヌクレオチド）を含む、Ｍｉｅｓｚａｗｓｋａら（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１３，２４（９），ｐｐ  １４２９-１４３４；その内容が、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）が説明するような二重様式治療のためであり得る。脂質ナノ粒子に製剤化される治療剤または治療剤（複数）は、抗血管新生および細胞傷害剤であり得る（例えば、Ｍｉｅｓｚａｗｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１３，２４（９），ｐｐ  １４２９-１４３４が教示するポリマー−脂質ナノ粒子を参照；その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０４１５】
別の実施形態では、ナノ粒子は、参照によりその内容全体が本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１３１００８６９号に記載されるナノ担体といったＬｙＰ−１ペプチドを含み得る。ＬｙＰ−１ペプチドが本明細書で開示されるナノ粒子に含有され得、または、ペプチドの複合体、誘導体、類似体もしくはペグ化形態であり得る。一実施形態において、ＬｙＰ−１ペプチドを含むナノ粒子は、シグナルセンサーポリヌクレオチドを含み得、がん治療および／または画像処理のために使用され得る。
【０４１６】
一実施形態において、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、制限なく、Ｓｉｌｅｎｃｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｌｏｎｄｏｎ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）によるＡＴＵＰＬＥＸ（商標）系、ＤＡＣＣ系、ＤＢＴＣ系、および他のｓｉＲＮＡ−リポプレックス技術、ＳＴＥＭＧＥＮＴ（登録商標）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）によるＳＴＥＭＦＥＣＴ（商標）、ならびにポリエチレンイミン（ＰＥＩ）またはプロタミンベースの標的を定めたおよび標的を定めない核酸送達等の、リポプレックスとして製剤化される（すべてが参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ａｌｅｋｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００８  ６８：９７８８−９７９８、Ｓｔｒｕｍｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２０１２  ５０：７６−７８、Ｓａｎｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２００６  １３：１２２２−１２３４、Ｓａｎｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２００６  １３：１３６０−１３７０、Ｇｕｔｂｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｕｌｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１０  ２３：３３４−３４４、Ｋａｕｆｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ  ２０１０  ８０：２８６−２９３Ｗｅｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００９  ３２：４９８−５０７、Ｗｅｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００８  ３１：１８０−１８８、Ｐａｓｃｏｌｏ  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．４：１２８５−１２９４、Ｆｏｔｉｎ−Ｍｌｅｃｚｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３４：１−１５、Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５，２３：７０９−７１７、Ｐｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００７  ６；１０４：４０９５−４１００、ｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓＨｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００８  １９：１２５−１３２）。
【０４１７】
一実施形態において、そのような製剤は、それらが受動的または能動的に、肝細胞、免疫細胞、腫瘍細胞、内皮細胞、抗原提示細胞、および白血球を含むが、これらに限定されない異なる細胞型をインビボで指向するようにも構築され得るか、または組成を変化し得る（すべてが参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ａｋｉｎｃ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１０  １８：１３５７−１３６４、Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５  ２３：７０９−７１７、Ｊｕｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２００９  １１９：６６１−６７３、Ｋａｕｆｍａｎｎ
ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ  ２０１０  ８０：２８６−２９３、Ｓａｎｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２００６  １３：１２２２−１２３４、Ｓａｎｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２００６  １３：１３６０−１３７０、Ｇｕｔｂｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｕｌｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１０  ２３：３３４−３４４、Ｂａｓｈａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１１  １９：２１８６−２２００、Ｆｅｎｓｋｅ  ａｎｄ  Ｃｕｌｌｉｓ，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．２００８  ５：２５−４４、Ｐｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００８  ３１９：６２７−６３０、Ｐｅｅｒ  ａｎｄ  Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２０１１  １８：１１２７−１１３３）。肝臓細胞に対する製剤の受動的な標的化の一例としては、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、およびＭＣ３ベースの脂質ナノ粒子製剤が挙げられ、それらはアポリポタンパク質Ｅに結合し、インビボでこれらの製剤の結合および肝細胞中への取り込みを促進することが示されている（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ａｋｉｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１０  １８：１３５７−１３６４）。製剤は、葉酸塩、トランスフェリン、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、および抗体で標的を定めるアプローチにより例として示されるが、これらによって限定されない、それらの表面上の異なるリガンドの発現を介して選択的に標的を定めることもできる（すべてが参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｋｏｌｈａｔｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１  ８：１９７−２０６、Ｍｕｓａｃｃｈｉｏ  ａｎｄ  Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ，Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ．２０１１  １６：１３８８−１４１２、Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｍｅｍｂｒ  Ｂｉｏｌ．２０１０  ２７：２８６−２９８、Ｐａｔｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｔｈｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．２００８  ２５：１−６１、Ｂｅｎｏｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．２０１１  １２：２７０８−２７１４、Ｚｈａｏ  ｅｔ
ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．２００８  ５：３０９−３１９、Ａｋｉｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１０  １８：１３５７−１３６４、Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２０１２  ８２０：１０５−１１６、Ｂｅｎ−Ａｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２０１２  ７５７：４９７−５０７、Ｐｅｅｒ  ２０１０  Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ．２０：６３−６８、Ｐｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００７  １０４：４０９５−４１００、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２０１１  ７２１：３３９−３５３、Ｓｕｂｒａｍａｎｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１０  １８：２０２８−２０３７、Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５  ２３：７０９−７１７、Ｐｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００８  ３１９：６２７−６３０、Ｐｅｅｒ  ａｎｄ  Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２０１１  １８：１１２７−１１３３）。
【０４１８】
一実施形態において、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、固体脂質ナノ粒子として製剤化される。固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）は、平均直径が１０〜１０００ｎｍの球状であり得る。ＳＬＮは、親油性分子を可溶化することができ、界面活性剤および／または乳化剤により安定化され得る、固体脂質コアマトリックスを有する。さらなる実施形態において、脂質ナノ粒子は、自己集合性脂質−ポリマーナノ粒子であってもよい（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＳ  Ｎａｎｏ，２００８，２（８），ｐｐ  １６９６−１７０２を参照のこと）。
【０４１９】
リポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子は、これらの製剤が、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはｍｍＲＮＡによる細胞形質移入を増加させ、かつ／またはコードされたタンパク質の翻訳を増加させることが可能であり得るため、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの指示によるタンパク質産生の有効性を改善するために使用されてもよい。１つのそのような例は、ポリプレックスプラスミドＤＮＡの有効な全身送達を可能にするための脂質カプセル封入の使用を伴う（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｈｅｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００７  １５：７１３−７２０）。リポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子は、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの安定性を増加させるためにも使用され得る。
【０４２０】
ポリマー、生分解性ナノ粒子、およびコア−シェルナノ粒子
本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡは、天然および／または合成ポリマーを用いて製剤化することができる。送達に使用され得るポリマーの非限定的な例としては、ＭＩＲＵＳ（登録商標）Ｂｉｏ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）およびＲｏｃｈｅ  Ｍａｄｉｓｏｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によるＤｙｎａｍｉｃ  ＰＯＬＹＣＯＮＪＵＧＡＴＥ（商標）製剤、制限なく、ＳＭＡＲＴＴ  ＰＯＬＹＭＥＲ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（商標）（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）等のＰＨＡＳＥＲＸ（商標）ポリマー製剤、ＤＭＲＩ／ＤＯＰＥ、ポロキサマー、Ｖｉｃａｌ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）によるＶＡＸＦＥＣＴＩＮ（登録商標）アジュバント、キトサン、Ｃａｌａｎｄｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｐａｓａｄｅｎａ，ＣＡ）によるシクロデキストリン、デンドリマーおよびポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）ポリマー、ＲＯＮＤＥＬ（商標）（ＲＮＡｉ／オリゴヌクレオチドナノ粒子送達）ポリマー（Ａｒｒｏｗｈｅａｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｐａｓａｄｅｎａ，ＣＡ）、ならびにＰＨＡＳＥＲＸ（商標）（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）等であるが、これらに限定されないｐＨ応答性ブロックコポリマー（ｃｏ−ｂｌｏｃｋ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ）が挙げられる。
【０４２１】
ＰＬＧＡ製剤の非限定的な例としては、ＰＬＧＡ注入用デポーが挙げられるが、これらに限定されない（例えば、ＰＬＧＡを、６６％のＮ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）中に溶解させることによって形成され、残りの部分が水性溶媒およびロイプロリドである、ＥＬＩＧＡＲＤ（登録商標）。一旦注入されると、ＰＬＧＡおよびロイプロリドペプチドは、皮下腔に沈殿する）。
【０４２２】
これらのポリマーアプローチのうちの多くは、インビボでオリゴヌクレオチドを細胞の細胞質中に送達することにおいて有効性を実証している（参照により全体が本明細書に組み込まれる、ｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００８  １９：１２５−１３２において概説される）。核酸（この実例では小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を用いて）の強固なインビボ送達をもたらした２つのポリマーアプローチは、動的ポリ複合体（ｐｏｌｙｃｏｎｊｕｇａｔｅ）およびシクロデキストリンベースのナノ粒子である。これらの送達アプローチのうちの第１のアプローチは、動的ポリ複合体を使用し、マウスにおいてインビボでｓｉＲＮＡを有効に送達し、肝細胞内で内因性標的ｍＲＮＡをサイレンシングすることが示されている（Ｒｏｚｅｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００７  １０４：１２９８２−１２８８７）。この特定のアプローチは、多成分ポリマー系であり、その主要な特長として、核酸（この実例ではｓｉＲＮＡ）がジスルフィド結合を介して共有結合され、ＰＥＧ（電荷遮蔽のため）基およびＮ−アセチルガラクトサミン（肝細胞標的化のため）基の両方がｐＨ感受性結合を介して連結される、膜活性ポリマーが含まれる（Ｒｏｚｅｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００７  １０４：１２９８２−１２８８７）。肝細胞に結合し、エンドソームに進入すると、ポリマー複合体は、低ｐＨ環境において解体し、このポリマーがその陽電荷を露出して、エンドソームからの脱出、およびポリマーから細胞質へのｓｉＲＮＡの放出をもたらす。Ｎ−アセチルガラクトサミン基の、マンノース基との置き換えを介して、アシアロ糖タンパク質受容体を発現する肝細胞から、類洞内皮細胞およびクッパー細胞へと標的合わせを変化させ得ることが示された。別のポリマーアプローチは、トランスフェリンを標的とするシクロデキストリン含有ポリカチオンナノ粒子を使用することを伴う。これらのナノ粒子は、トランスフェリン受容体を発現するユーイング肉腫腫瘍細胞において、ＥＷＳ−ＦＬＩ１遺伝子産物の標的を定めたサイレンシングを実証してきており（Ｈｕ−Ｌｉｅｓｋｏｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００５  ６５：８９８４−８９８２）、これらのナノ粒子中に製剤化されたｓｉＲＮＡは、非ヒト霊長類において耐性が良好であった（Ｈｅｉｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００７  １０４：５７１５−２１）。これらの送達戦略の両方は、標的を定めた送達機構およびエンドソームからの脱出機構の両方を用いた合理的なアプローチを組み込む。
【０４２３】
ポリマー製剤は、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの持続放出または遅延放出を可能にし得る（例えば、筋肉内または皮下注入後に）。シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡについての変化した放出プロファイルは、例えば、長期間にわたってコードされたタンパク質の翻訳をもたらすことができる。ポリマー製剤をまた使用して、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの安定性を増加させ得る。生分解性ポリマーが、ｍｍＲＮＡ以外の核酸を分解から保護するために以前に使用されており、インビボでペイロードの持続放出をもたらすことが示されている（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｒｏｚｅｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００７  １０４：１２９８２−１２８８７、Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．２０１０  ７：１４３３−１４４６、Ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．２０１０  Ｏｃｔ  １、Ｃｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｃ  Ｃｈｅｍ  Ｒｅｓ．２０１２  Ｊａｎ  １３、Ｍａｎｇａｎｉｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２０１２  ３３：２３０１−２３０９、Ｂｅｎｏｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．２０１１  １２：２７０８−２７１４、Ｓｉｎｇｈａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｔｈｅｒ．２０１１  ２：１３３−１４７、ｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００８  １９：１２５−１３２、Ｓｃｈａｆｆｅｒｔ  ａｎｄ  Ｗａｇｎｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００８  １６：１１３１−１１３８、Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．２０１１
８：１４５５−１４６８、Ｄａｖｉｓ、Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ．２００９  ６：６５９−６６８、Ｄａｖｉｓ，Ｎａｔｕｒｅ  ２０１０  ４６４：１０６７−１０７０）。
【０４２４】
一実施形態において、薬学的組成物は、持続放出製剤であってもよい。さらなる実施形態において、持続放出製剤は、皮下送達のためであってもよい。持続放出製剤には、ＰＬＧＡミクロスフェア、エチレン酢酸ビニル（ＥＶＡｃ）、ポロキサマー、ＧＥＬＳＩＴＥ（登録商標）（Ｎａｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．Ａｌａｃｈｕａ，ＦＬ）、ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）（Ｈａｌｏｚｙｍｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）、フィブリノーゲンポリマー（Ｅｔｈｉｃｏｎ  Ｉｎｃ．Ｃｏｒｎｅｌｉａ，ＧＡ）、ＴＩＳＳＥＬＬ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ  Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）、ＰＥＧベースのシーリング材、およびＣＯＳＥＡＬ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ  Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）等の手術用シーリング材が含まれ得る。
【０４２５】
非限定的な例として、修飾ｍＲＮＡは、調整可能な放出速度を有する（例えば、数日間および数週間）ＰＬＧＡミクロスフェアを調製し、シグナルセンサー修飾ｍＲＮＡを、カプセル封入プロセス中にシグナルセンサー修飾ｍＲＮＡの完全性を維持しながら、ＰＬＧＡミクロスフェア中にカプセル封入することによって、ＰＬＧＡミクロスフェア中に製剤化されてもよい。ＥＶＡｃは、前臨床の持続放出埋込物適用において広範に使用される、非生分解性（ｎｏｎ−ｂｉｏｄｅｇｒａｄｅａｂｌｅ）の、生体適合性ポリマーである（例えば、緑内障に対するピロカルピン眼内挿入物である持続放出製品Ｏｃｕｓｅｒｔまたは持続放出プロゲステロン子宮内器具であるＰｒｏｇｅｓｔａｓｅｒｔ；経皮送達系Ｔｅｓｔｏｄｅｒｍ、Ｄｕｒａｇｅｓｉｃ、およびＳｅｌｅｇｉｌｉｎｅ；カテーテル）。ポロキサマー  Ｆ−４０７  ＮＦは、５℃未満の温度で低粘度を有する、親水性の非イオン性界面活性剤であるポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンのトリブロックコポリマーであり、１５℃を超える温度で固体ゲルを形成する。ＰＥＧベースの手術用シーリング材は、１分間で調製することができ、３分間でシーリングし、３０日以内に再吸収される、送達デバイスにおいて混合された２つの合成ＰＥＧ構成成分を含む。ＧＥＬＳＩＴＥ（登録商標）および天然ポリマーは、投与部位におけるインサイツのゲル化が可能である。それらは、イオン性相互作用（ｉｎｅｒａｃｔｉｏｎ）を介してタンパク質およびペプチド治療候補と相互作用して、安定化効果を提供することが示されている。
【０４２６】
ポリマー製剤は、葉酸塩、トランスフェリン、およびＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）により例として示されるが、これらによって限定されない異なるリガンドの発現を介して選択的に標的を定めることもできる（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｂｅｎｏｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．２０１１  １２：２７０８−２７１４、Ｒｏｚｅｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００７  １０４：１２９８２−１２８８７、Ｄａｖｉｓ，Ｍｏｌ
Ｐｈａｒｍ．２００９  ６：６５９−６６８、Ｄａｖｉｓ，Ｎａｔｕｒｅ  ２０１０  ４６４：１０６７−１０７０）。
【０４２７】
本発明のシグナルセンサーｍｍＲＮＡは、ポリマー化合物とともにまたはポリマー化合物中に製剤化されてもよい。ポリマーには、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（ｌ−リジン）（ＰＬＬ）、ＰＬＬにグラフトされたＰＥＧ、カチオン性リポポリマー、生分解性カチオン性リポポリマー、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、架橋分岐状ポリ（アルキレンイミン）、ポリアミン誘導体、修飾ポロキサマー、生分解性ポリマー、生分解性ブロックコポリマー、生分解性ランダムコポリマー、生分解性ポリエステルコポリマー、生分解性ポリエステルブロックコポリマー、生分解性ポリエステルブロックランダムコポリマー、線状生分解性コポリマー、ポリ［α−（４−アミノブチル）−Ｌ−グリコール酸）（ＰＡＧＡ）、生分解性架橋カチオン性マルチブロックコポリマーまたはこれらの組み合わせであるが、これらに限定されない少なくとも１つのポリマーが含まれてもよい。
【０４２８】
非限定的な例として、シグナルセンサーｍｍＲＮＡは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，１７７，２７４号に記載のＰＬＬでグラフトされたＰＥＧのポリマー化合物とともに製剤化されてもよい。製剤は、インビトロで細胞を形質移入するため、またはシグナルセンサーｍｍＲＮＡのインビボ送達のために使用されてもよい。別の例において、シグナルセンサーｍｍＲＮＡは、カチオン性ポリマーを含む溶液もしくは媒体中に、乾燥した薬学的組成物中に、または各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる米国公開第２００９００４２８２９号および同第２００９００４２８２５号に記載の乾燥させることができる溶液中に懸濁させてもよい。
【０４２９】
ポリアミン誘導体を用いて、核酸を送達するか、または疾患を治療および／もしくは予防するか、または埋込型もしくは注入型デバイスに含めてもよい（参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第２０１００２６０８１７号）。非限定的な例として、薬学的組成物は、シグナルセンサーｍｍＲＮＡ、ならびに内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国公開第２０１００２６０８１７号に記載のポリアミン誘導体を含んでもよい。
【０４３０】
例えば、本発明のシグナルセンサーｍｍＲＮＡは、ポリ（アルキレンイミン）、生分解性カチオン性リポポリマー、生分解性ブロックコポリマー、生分解性ポリマー、もしくは生分解性ランダムコポリマー、生分解性ポリエステルブロックコポリマー、生分解性ポリエステルポリマー、生分解性ポリエステルランダムコポリマー、線状生分解性コポリマー、ＰＡＧＡ、生分解性架橋カチオン性マルチブロックコポリマー、またはこれらの組み合わせを含む薬学的化合物中に製剤化されてもよい。生分解性カチオン性リポポリマーは、当技術分野で既知の私の方法、ならびに／または参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第６，６９６，０３８号、米国出願第２００３００７３６１９号、および同第２００４０１４２４７４号に記載の方法によって作製されてもよい。ポリ（アルキレンイミン）は、当技術分野で既知の方法、および／または参照により全体が本明細書に組み込まれる米国公開第２０１００００４３１５号に記載の方法を用いて作製されてもよい。生分解性（ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂａｌｅ）ポリマー、生分解性ブロックコポリマー、生分解性ランダムコポリマー、生分解性ポリエステルブロックコポリマー、生分解性ポリエステルポリマー、または生分解性ポリエステルランダムコポリマーは、当技術分野で既知の方法、ならびに／または各々の内容が参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第６，５１７，８６９号および同第６，２６７，９８７号に記載の方法を用いて作製されてもよい。線状生分解性コポリマーは、当技術分野で既知であり、かつ／または米国特許第６，６５２，８８６号に記載の方法を用いて作製されてもよい。ＰＡＧＡポリマーは、当技術分野で既知の方法、ならびに／または参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，２１７，９１２号に記載の方法を用いて作製されてもよい。ＰＡＧＡポリマーは、共重合して、ポリ−Ｌ−リジン、ポリアルギン（ｐｏｌｙａｒｇｉｎｅ）、ポリオルニチン、ヒストン、アビジン、プロタミン、ポリラクチド、およびポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）等であるが、これらに限定されないポリマーとともにコポリマーまたはブロックコポリマーを形成してもよい。生分解性架橋カチオン性マルチブロックコポリマーは、当技術分野で既知の方法、ならびに／または参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第８，０５７，８２１もしくは米国公開第２０１２００９１４５号に記載の方法によって作製されてもよい。例えば、マルチブロックコポリマーは、分岐状ポリエチレンイミンと比較して明確に異なるパターンを有する線状ポリエチレンイミン（ＬＰＥＩ）ブロックを用いて合成されてもよい。さらに、組成物または薬学的組成物は、当技術分野で既知の方法、本明細書に記載の方法、または参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第２０１００００４３１５号もしくは米国特許第６，２６７，９８７号および同第６，２１７，９１２号に記載の方法によって作製されてもよい。
【０４３１】
参照により全体が本明細書に組み込まれる米国公開第２０１００００４３１３号に記載されるように、遺伝子送達組成物は、ヌクレオチド配列およびポロキサマーを含んでもよい。例えば、本発明（ｐｒｅｓｅｎｔ  ｉｎｖｅｉｔｉｏｎ）のシグナルセンサーｍｍＲＮＡは、米国公開第２０１００００４３１３号に記載のポロキサマーを含む遺伝子送達組成物において使用されてもよい。
【０４３２】
一実施形態において、本発明のポリマー製剤は、カチオン性担体を含み得るポリマー製剤を、コレステロール基およびポリエチレングリコール基に共有結合され得るカチオン性リポポリマーと接触させることによって、安定化されてもよい。ポリマー製剤は、参照により全体が本明細書に組み込まれる米国公開第２００９００４２８２９号に記載の方法を用いてカチオン性リポポリマーと接触させてもよい。カチオン性担体には、ポリエチレンイミン、ポリ（トリメチレンイミン）、ポリ（テトラメチレンイミン）、ポリプロピレンイミン、アミノグリコシド−ポリアミン、ジデオキシ−ジアミノ−ｂ−シクロデキストリン、スペルミン、スペルミジン、ポリ（２−ジメチルアミノ）エチルメタクリレート、ポリ（リジン）、ポリ（ヒスチジン）、ポリ（アルギニン）、カチオン化ゼラチン、デンドリマー、キトサン、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、１−［２−（オレオイルオキシ）エチル］−２−オレイル−３−（２−ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロリド（ＤＯＴＩＭ）、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロ酢酸塩（ＤＯＳＰＡ）、３Ｂ−［Ｎ-（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール塩酸塩（ＤＣ−コレステロールＨＣｌ）ジヘプタデシルアミドグリシルスペルミジン（ＤＯＧＳ）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ−（１，２−ジミリスチルオキシプロパ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチル塩化アンモニウムＤＯＤＡＣ）、およびこれらの組み合わせが含まれてもよいが、これらに限定されない。
【０４３３】
本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡは、ポリマー、脂質、および／またはリン酸カルシウム等であるが、これらに限定されない他の生分解性薬剤の組み合わせを用いてナノ粒子として製剤化することもできる。構成成分は、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡの送達が向上し得るようにナノ粒子の微調整を可能にするために、コア−シェル、ハイブリッド、および／または交互積層アーキテクチャとして組み合わされてもよい（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍａｔｅｒ．２００６  ５：７９１−７９６、Ｆｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２００８  ２９：１５２６−１５３２、ＤｅＫｏｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．２０１１  ６３：７４８−７６１、Ｅｎｄｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２０１１  ３２：７７２１−７７３１、Ｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ．２０１１  Ｊｕｎ  ６；８（３）：７７４−８７）。
【０４３４】
脂質および／またはポリマーと組み合わせた生分解性リン酸カルシウムナノ粒子は、インビボでシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡを送達することが示されている。一実施形態において、アニスアミド等の標的化リガンドもまた含有し得る、脂質でコーティングされたリン酸カルシウムナノ粒子を用いて、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡを送達してもよい。例えば、マウス転移性肺モデルにおいてｓｉＲＮＡを有効に送達するために、脂質でコーティングされたリン酸カルシウムナノ粒子が使用された（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｏｎｔｒ
Ｒｅｌ．２０１０  １４２：４１６−４２１、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｏｎｔｒ  Ｒｅｌ．２０１２  １５８：１０８−１１４、Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１２  ２０：６０９−６１５）。この送達系は、ｓｉＲＮＡの送達を改善するために、標的を定めたナノ粒子と、エンドソームからの脱出を向上させるための構成成分リン酸カルシウムとの両方を組み合わせる。
【０４３５】
一実施形態において、ＰＥＧ−ポリアニオンブロックコポリマーとともにリン酸カルシウムを用いて、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡを送達してもよい（Ｋａｚｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｏｎｔｒ  Ｒｅｌ．２００４  ９７：３４５−３５６、Ｋａｚｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｏｎｔｒ  Ｒｅｌ．２００６  １１１：３６８−３７０）。
【０４３６】
一実施形態において、ＰＥＧ電荷変換型ポリマー（Ｐｉｔｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２０１１  ３２：３１０６−３１１４）を用いて、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡを送達するためのナノ粒子を形成してもよい。ＰＥＧ電荷変換型ポリマーは、酸性ｐＨでポリカチオンへと切断され、それ故に、エンドソームからの脱出を向上させることによって、ＰＥＧ−ポリアニオンブロックコポリマーを改善し得る。
【０４３７】
コア−シェルナノ粒子の使用は、カチオン性架橋ナノゲルコアおよび種々のシェルを合成するための高処理アプローチにさらに焦点を当てている（Ｓｉｅｇｗａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０１１  １０８：１２９９６−１３００１）。ポリマーナノ粒子の複合体形成、送達、および内在化は、ナノ粒子のコア構成成分およびシェル構成成分の両方の化学組成を変化させることによって精密に制御することができる。例えば、コア−シェルナノ粒子は、コレステロールをナノ粒子に共有結合させた後に、ｓｉＲＮＡをマウス肝細胞に効率的に送達し得る。
【０４３８】
一実施形態において、中間のＰＬＧＡ層およびＰＥＧを含有する外側の中性脂質層を含む、中空の脂質コアを用いて、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡを送達してもよい。非限定的な例として、ルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒｅａｓｅ）発現腫瘍を担持するマウスにおいて、脂質−ポリマー−脂質ハイブリッドナノ粒子が、従来のリポプレックスと比較して、ルシフェラーゼ発現を有意に抑制することが確認された（Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ．２０１１  ５０：７０２７−７０３１）。
【０４３９】
ペプチドおよびタンパク質
本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡは、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡによる細胞の形質移入を増加させるために、ペプチドおよび／またはタンパク質とともに製剤化することができる。一実施形態において、細胞透過性ペプチドならびに細胞内送達を可能にするタンパク質およびペプチド等であるが、これらに限定されないペプチドを用いて、薬学的製剤を送達してもよい。本発明の薬学的製剤とともに使用され得る細胞透過性ペプチドの非限定的な例としては、細胞内空間への送達を容易にする、ポリカチオンに結合した細胞透過性ペプチド配列、例えば、ＨＩＶ由来ＴＡＴペプチド、ペネトラチン、トランスポータン、またはｈＣＴ由来細胞透過性ペプチドである（例えば、すべてが参照により本明細書に組み込まれる、Ｃａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．３（３）：３１０−８（２００１）、Ｌａｎｇｅｌ，Ｃｅｌｌ−Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ  ＦＬ，２００２）、Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．１１（２８）：３５９７−６１１（２００３）、およびＤｅｓｈａｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．６２（１６）：１８３９−４９（２００５）を参照のこと）。組成物は、組成物の細胞内空間への送達を向上させる細胞透過性薬剤、例えば、リポソームを含むように製剤化することもできる。本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡは、細胞内送達を可能にするために、Ａｉｌｅｒｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）およびＰｅｒｍｅｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）によるペプチドおよび／またはタンパク質等であるが、これらに限定されない、ペプチドおよび／またはタンパク質に複合体形成されてもよい（すべてが参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｃｒｏｎｉｃａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１０  ５：７４７−７５２、ＭｃＮａｕｇｈｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２００９  １０６：６１１１−６１１６、Ｓａｗｙｅｒ，Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．２００９  ７３：３−６、Ｖｅｒｄｉｎｅ  ａｎｄ  Ｈｉｌｉｎｓｋｉ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０１２；５０３：３−３３）。
【０４４０】
一実施形態において、細胞透過性ポリペプチドは、第１のドメインおよび第２のドメインを含み得る。第１のドメインは、超荷電ポリペプチドを含み得る。第２のドメインは、タンパク質結合パートナーを含み得る。本明細書で使用されるとき、「タンパク質結合パートナー」には、抗体およびその機能的断片、足場タンパク質、またはペプチドが含まれるが、これらに限定されない。細胞透過性ポリペプチドは、タンパク質結合パートナーのための細胞内結合パートナーをさらに含み得る。細胞透過性ポリペプチドは、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡが導入され得る細胞から分泌されることが可能であり得る。
【０４４１】
ペプチドまたはタンパク質を含む製剤を用いて、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはｍｍＲＮＡによる細胞形質移入を増加させ、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはｍｍＲＮＡの生体分布を変化させ（例えば、具体的な組織または細胞型を標的とすることによって）、かつ／またはコードされたタンパク質の翻訳を増加させることができる。
【０４４２】
細胞
本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡは、エクスビボで細胞中に形質移入することができ、それがその後、対象に移植される。非限定的な例として、薬学的組成物は、修飾ＲＮＡを肝臓および骨髄細胞に送達するための赤血球、修飾ＲＮＡをウイルス様粒子（ＶＬＰ）中で送達するためのビロソーム、ならびにＭＡＸＣＹＴＥ（登録商標）（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）による細胞、およびＥＲＹＴＥＣＨ（登録商標）（Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）による細胞等であるが、これらに限定されない、修飾ＲＮＡを送達するためのエレクトロポレーション処理された細胞を含んでもよい。ｍｍＲＮＡ以外のペイロードを送達するための赤血球、ウイルス粒子、およびエレクトロポレーション処理された細胞の使用例が、文書化されている（すべてが参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｇｏｄｆｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１２  １２：１２７−１３３、Ｆａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１２  １２：３８５−３８９、Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０１１  １０８：１０９８０−１０９８５、Ｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．２０１０  ２７：４００−４２０、Ｈｕｃｋｒｉｅｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓ．２００７；１７：３９−４７、Ｃｕｓｉ，Ｈｕｍ  Ｖａｃｃｉｎ．２００６  ２：１−７、ｄｅ  Ｊｏｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００６  １３：４００−４１１）。
【０４４３】
本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡの細胞ベースの製剤を用いて、細胞形質移入を確実にし（例えば、細胞担体中の）、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはｍｍＲＮＡの生体分布を変化させ（例えば、細胞担体の標的を具体的な組織または細胞型に定めることによって）、かつ／またはコードされた腫瘍学関連タンパク質の翻訳を増加させてもよい。
【０４４４】
ウイルスおよび非ウイルス媒介性技法を含む、核酸の細胞内への導入に好適である多様な方法が当技術分野で知られている。典型的な非ウイルス媒介性技法の例としては、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム媒介性移入、ヌクレオフェクション、ソノポレーション、熱ショック、マグネトフェクション、リポソーム媒介性移入、マイクロインジェクション、マイクロプロジェクタイル媒介性移入（ナノ粒子）、カチオン性ポリマー媒介性移入（ＤＥＡＥ−デキストラン、ポリエチレンイミン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等）、または細胞融合が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４４５】
ソノポレーション、または細胞超音波処理の技法は、細胞原形質膜の透過性修飾するために音（例えば、超音波周波数）を使用するものである。ソノポレーション法は、当業者に知られており、インビボで核酸を送達するために使用される（すべて参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｙｏｏｎ  ａｎｄ  Ｐａｒｋ，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．２０１０  ７：３２１−３３０、Ｐｏｓｔｅｍａ  ａｎｄ  Ｇｉｌｊａ，Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００７  ８：３５５−３６１、Ｎｅｗｍａｎ  ａｎｄ  Ｂｅｔｔｉｎｇｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００７  １４：４６５−４７５）。ソノポレーション法は、当技術分野で知られており、また、例えば、それが細菌に関する場合には、米国特許公開第２０１００１９６９８３号において、それが他の細胞型に関する場合には、例えば、米国特許公開２０１００００９４２４号において教示され、これらの各々は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０４４６】
エレクトロポレーション技法もまた、当技術分野で周知であり、インビボでおよび臨床的に核酸を送達するために使用される（すべて参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ａｎｄｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２０１０  １０：２６７−２８０、Ｃｈｉａｒｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２０１０  １０：２８１−２８６、Ｈｏｊｍａｎ，Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２０１０  １０：１２８−１３８）。一実施形態において、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、実施例１２に記載されるようにエレクトロポレーションによって送達され得る。
【０４４７】
ヒアルロニダーゼ
本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの筋肉内または皮下局所注入は、ヒアルロナンの加水分解を触媒する、ヒアルロニダーゼを含むことができる。介在性の関門の構成物質であるヒアルロナンの加水分解を触媒することによって、ヒアルロニダーゼは、ヒアルロナンの粘度を低下させて、それによって組織透過性を増加させる（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｆｒｏｓｔ，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．（２００７）４：４２７−４４０）。それらの分散および形質移入された細胞によって産生されるコードされたタンパク質の全身への分布を加速することが有用である。あるいは、ヒアルロニダーゼを用いて、筋肉内にまたは皮下に投与された本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡに曝露される細胞の数を増加させることができる。
【０４４８】
ナノ粒子模倣体
本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、ナノ粒子模倣体内にカプセル封入されかつ／またはそれに吸収され得る。ナノ粒子模倣体は、病原体、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、プリオン、および細胞等であるが、これらに限定されない、生物または粒子の送達機能を模倣することができる。非限定的な例として、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、ウイルスの送達機能を模倣することができる非バイロン（ｖｉｒｏｎ）粒子中にカプセル封入されてもよい（参照により全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１２００６３７６号を参照のこと）。
【０４４９】
ナノチューブ
本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、ロゼットナノチューブ、リンカーを用いたツイン塩基（ｔｗｉｎ  ｂａｓｅｓ）を有するロゼットナノチューブ、カーボンナノチューブおよび／または単層カーボンナノチューブ等であるが、これらに限定されない、少なくとも１つのナノチューブに付着または結合され得る。シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、立体（ｓｔｅｒｉｃ）力、イオン力、共有結合力、および／または他の力等であるが、これらに限定されない力を介してナノチューブに結合され得る。
【０４５０】
一実施形態において、ナノチューブは、１つ以上のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを細胞内に放出することができる。少なくとも１つのナノチューブのサイズおよび／または表面構造を、体内でナノチューブの相互作用を制御し、かつ／または本明細書に開示のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはｍｍＲＮＡに付着または結合するように変化させることができる。一実施形態において、少なくとも１つのナノチューブのビルディングブロックおよび／またはそのビルディングブロックに結合される官能基を、ナノチューブの寸法および／または特性を調整するように変化させることができる。非限定的な例として、ナノチューブの長さは、ナノチューブが正常な血管の壁の穴を通過するのを妨害するが、依然として腫瘍組織の血管におけるより大きい穴を通過するのに十分に小さくあるように変化させてもよい。
【０４５１】
一実施形態において、少なくとも１つのナノチューブは、ポリエチレングリコール等であるが、これらに限定されないポリマーを含む送達向上化合物でコーティングされてもよい。別の実施形態において、少なくとも１つのナノチューブおよび／またはシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、薬学的に許容される賦形剤および／または送達ビヒクルと混合されてもよい。
【０４５２】
一実施形態において、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、少なくとも１つのロゼットナノチューブに付着および／または結合される。ロゼットナノチューブは、当技術分野で既知のプロセスによって、かつ／または参照により全体が本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１２０９４３０４号に記載のプロセスによって形成され得る。少なくとも１つのシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡは、参照により全体が本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１２０９４３０４号に記載のプロセスによって、少なくとも１つのロゼットナノチューブに付着および／または結合されてもよく、ここでロゼットナノチューブまたはロゼットナノチューブを形成するモジュールは、水性媒体中で、少なくとも１つのシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡがロゼットナノチューブに付着または結合するようになり得る条件下で、少なくとも１つのシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡと混合される。
【０４５３】
複合体
本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡは、担体もしくは標的化基に共有結合された、または一緒に融合タンパク質を産生する２つのコード領域を含む（例えば、標的化基および治療的タンパク質またはペプチドを担持する）、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡ等の複合体を含む。
【０４５４】
本発明の複合体は、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）、高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）、またはグロブリン）、炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリンまたはヒアルロン酸）、または脂質等の、天然に生じる物質を含む。リガンドは、合成ポリマー、例えば、合成ポリアミノ酸、オリゴヌクレオチド（例えば、アプタマー）等の組換えまたは合成分子であってもよい。ポリアミノ酸の例としては、ポリアミノ酸は、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリＬ−アスパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン−マレイン酸無水物コポリマー、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド（ｇｌｙｃｏｌｉｅｄ））コポリマー、ジビニルエーテル−マレイン無水物コポリマー、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２−エチルアクリル（ａｃｒｙｌｌｉｃ）酸）、Ｎ−イソプロピルａｃｒｙｌアミドポリマー、またはポリホスファゼン（ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｚｉｎｅ）が挙げられる。ポリアミンの例としては、ポリエチレンイミン、ポリリジン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、シュードペプチド−ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの第四級塩、αヘリックスペプチドが挙げられる。
【０４５５】
ポリヌクレオチド複合体の調製、特にＲＮＡへの調製を教示する、代表的な米国特許には、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第４，８２８，９７９号、同第４，９４８，８８２号、同第５，２１８，１０５号、同第５，５２５，４６５号、同第５，５４１，３１３号、同第５，５４５，７３０号、同第５，５５２，５３８号、同第５，５７８，７１７号、５，５８０，７３１号、同第５，５９１，５８４号、同第５，１０９，１２４号、同第５，１１８，８０２号、同第５，１３８，０４５号、同第５，４１４，０７７号、同第５，４８６，６０３号、同第５，５１２，４３９号、同第５，５７８，７１８号、同第５，６０８，０４６号、同第４，５８７，０４４号、同第４，６０５，７３５号、同第４，６６７，０２５号、同第４，７６２，７７９号、同第４，７８９，７３７号、同第４，８２４，９４１号、同第４，８３５，２６３号、同第４，８７６，３３５号、同第４，９０４，５８２号、同第４，９５８，０１３号、同第５，０８２，８３０号、同第５，１１２，９６３号、同第５，２１４，１３６号、同第５，０８２，８３０号、同第５，１１２，９６３号、同第５，２１４，１３６号、同第５，２４５，０２２号、同第５，２５４，４６９号、同第５，２５８，５０６号、同第５，２６２，５３６号、同第５，２７２，２５０号、同第５，２９２，８７３号、同第５，３１７，０９８号、同第５，３７１，２４１号、同第５，３９１，７２３号、同第５，４１６，２０３号、同第５，４５１，４６３号、同第５，５１０，４７５号、同第５，５１２，６６７号、同第５，５１４，７８５号、同第５，５６５，５５２号、同第５，５６７，８１０号、同第５，５７４，１４２号、同第５，５８５，４８１号、同第５，５８７，３７１号、同第５，５９５，７２６号、同第５，５９７，６９６号、同第５，５９９，９２３号、同第５，５９９，９２８号および同第５，６８８，９４１号、同第６，２９４，６６４号、同第６，３２０，０１７号、同第６，５７６，７５２号、同第６，７８３，９３１号、同第６，９００，２９７号、同第７，０３７，６４６号が含まれるが、これらに限定されない。
【０４５６】
一実施形態において、本発明の複合体は、本発明のシグナルセンサーｍｍＲＮＡのための担体として機能し得る。複合体は、ポリ（エチレングリコール）でグラフトされ得る、ポリアミン、ポリリジン、ポリアルキレンイミン、およびポリエチレンイミン等であるが、これらに限定されないカチオン性ポリマーを含んでもよい。非限定的な例として、複合体は、ポリマー複合体と同様であってもよく、ポリマー複合体を合成する方法は、参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，５８６，５２４号に記載されている。
【０４５７】
複合体は、標的化基、例えば、細胞または組織標的化薬剤、例えば、レクチン、糖タンパク質、脂質、またはタンパク質、例えば、腎臓細胞等の指定される細胞型に結合する抗体も含み得る。標的化基は、チロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、サーファクタントタンパク質Ａ、ムチン炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸塩、ポリアスパラギン酸塩、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸塩、ビタミンＢ１２、ビオチン、ＲＧＤペプチド、ＲＧＤペプチド模倣体、またはアプタマーであり得る。
【０４５８】
標的化基は、タンパク質、例えば、糖タンパク質、またはペプチド、例えば、コリガンド（ｃｏ−ｌｉｇａｎｄ）に対する特異的親和性を有する分子、または抗体、例えば、癌細胞、内皮細胞、もしくは骨細胞等の指定される細胞型に結合する抗体であり得る。標的化基には、ホルモンおよびホルモン受容体も含まれ得る。それらには、等の脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン多価マンノース、多価フコース、またはアプタマー等の非ペプチド種も含まれ得る。リガンドは、例えば、リポ多糖、またはｐ３８
ＭＡＰキナーゼの活性化因子であり得る。
【０４５９】
標的化基は、具体的な受容体を標的とすることが可能な任意のリガンドであり得る。例としては、制限なく、葉酸塩、ＧａｌＮＡｃ、ガラクトース、マンノース、マンノース−６Ｐ、アプタマー（ａｐａｔａｍｅｒｓ）、インテグリン受容体リガンド、ケモカイン受容体リガンド、トランスフェリン、ビオチン、セロトニン受容体リガンド、ＰＳＭＡ、エンドセリン、ＧＣＰＩＩ、ソマトスタチン、ＬＤＬ、およびＨＤＬリガンドが挙げられる。特定の実施形態において、標的化基は、アプタマーである。アプタマーは、修飾されていないことも、本明細書に開示の修飾の任意の組み合わせを有することもあり得る。
【０４６０】
一実施形態において、本発明の薬学的組成物は、ロックト核酸と同様の修飾等であるが、これらに限定されない化学修飾を含んでもよい。
【０４６１】
Ｓａｎｔａｒｉｓによるもの等のロックト核酸（ＬＮＡ）の調製を教示する、代表的な米国特許には、各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第６，２６８，４９０号、同第６，６７０，４６１号、同第６，７９４，４９９号、同第６，９９８，４８４号、同第７，０５３，２０７号、同第７，０８４，１２５号、および同第７，３９９，８４５号が含まれるが、これらに限定されない。
【０４６２】
ＰＮＡ化合物の調製を教示する、代表的な米国特許には、各々が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，５３９，０８２号、同第５，７１４，３３１号、および同第５，７１９，２６２号が含まれるが、これらに限定されない。ＰＮＡ化合物のさらなる教示は、例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７−１５００において見出すことができる。
【０４６３】
本発明の特色をなすいくつかの実施形態は、ホスホロチオエート骨格を有するシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡ、ならびに他の修飾骨格、特に、上に参照される米国特許第５，４８９，６７７号の−−ＣＨ２−−ＮＨ−−ＣＨ２−−、−−ＣＨ２−−Ｎ（ＣＨ３）−−Ｏ−−ＣＨ２−−［メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格として知られている］、−−ＣＨ２−−Ｏ−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−、−−ＣＨ２−−Ｎ（ＣＨ３）−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−、および−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−ＣＨ２−−［式中、天然ホスホジエステル骨格は、−−Ｏ-Ｐ（Ｏ）２−−Ｏ−−ＣＨ２−−として表される］、および上に参照される米国特許第５，６０２，２４０号のアミド骨格を有する、オリゴヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態において、本明細書の特色をなすポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｔｏｔｉｄｅｓ）は、上に参照される米国特許第５，０３４，５０６号のモルホリノ骨格構造を有する。
【０４６４】
２’位における修飾もまた、送達を補助し得る。好ましくは、２’位における修飾は、ポリペプチドコード配列には位置しない、すなわち、翻訳可能領域にない。２’位における修飾は、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、および／または尾部領域に位置してもよい。２’位における修飾は、２’位において次のうちの１つを含むことができる：Ｈ（すなわち、２’−デオキシ）；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキル（式中、アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換または非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキルまたはＣ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであってもよい。例示の好適な修飾には、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２が含まれ、式中、ｎおよびｍは、１〜約１０である。他の実施形態において、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、２’位において次のうちの１つを含む：Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリール、アラルキル、Ｏ−アルカリールもしくはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、薬物動態特性を改善するための基、または薬力学特性を改善するための基、および同様の特性を有する他の置換基。いくつかの実施形態において、修飾は、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３（２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥ）としても知られている）（Ｍａｒｔｉｎｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８：４８６−５０４）すなわち、アルコキシ−アルコキシ基を含む。別の例示の修飾は、本明細書の以下の実施例に記載の２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基（２’−ＤＭＡＯＥとしても知られている）、および同様に本明細書の以下の実施例に記載の２’−ジメチルアミノエトキシ（当技術分野で２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥとしても知られる）、すなわち、２’−Ｏ−−ＣＨ２−−Ｏ−−ＣＨ２−−Ｎ（ＣＨ２）２である。他の修飾は、２’−メトキシ（２’−ＯＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、および２’−フルオロ（２’−Ｆ）を含む。同様の修飾は、他の位置、特に３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位で、または２’−５’結合ｄｓＲＮＡにおいて、および５’末端ヌクレオチドの５’位で行われてもよい。本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の代わりに、シクロブチル部分等の糖模倣体を有してもよい。そのような修飾糖構造の調製を教示する代表的な米国特許には、各々が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，９８１，９５７号、同第���，１１８，８００号、同第５，３１９，０８０号、同第５，３５９，０４４号、同第５，３９３，８７８号、同第５，４４６，１３７号、同第５，４６６，７８６号、同第５，５１４，７８５号、同第５，５１９，１３４号、同第５，５６７，８１１号、同第５，５７６，４２７号、同第５，５９１，７２２号、同第５，５９７，９０９号、同第５，６１０，３００号、同第５，６２７，０５３号、同第５，６３９，８７３号、同第５，６４６，２６５号、同第５，６５８，８７３号、同第５，６７０，６３３号、および同第５，７００，９２０号が含まれるが、これらに限定されない。
【０４６５】
依然として他の実施形態において、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、細胞透過性ポリペプチドに共有結合的に複合体化される。細胞透過性ペプチドは、シグナルペプチド配列も含み得る。本発明の複合体は、増加した安定性、増加した細胞形質移入、および／または変化した生体分布（例えば、具体的な組織または細胞型に標的を定められる）を有するように設計することができる。
【０４６６】
自己集合性核酸ナノ粒子
自己集合性ナノ粒子は、核酸鎖が容易にリプログラミング可能であり得るように精密に制御され得る、明確に定義されたサイズを有する。例えば、２０ｎｍ超の直径が、向上した透過性および保持効果により腎クリアランスを回避し、ある特定の腫瘍への送達を向上させるため、癌標的化ナノ送達担体のために最適な粒径は、２０〜１００ｎｍである。自己集合性核酸ナノ粒子を用いて、向上した送達のために癌標的化リガンドの精密に制御された空間定位および密度を有する、サイズおよび形が均一な単一の集団。非限定的な例として、オリゴヌクレオチドナノ粒子が、短いＤＮＡ断片および治療的ｓｉＲＮＡのプログラミング可能な自己集合を用いて調製された。これらのナノ粒子は、制御可能な粒径ならびに標的リガンド箇所および密度を有して、分子的に同一である。ＤＮＡ断片およびｓｉＲＮＡは、１ステップ反応へと自己集合して、標的を定めたインビボ送達のためにＤＮＡ／ｓｉＲＮＡ四面体ナノ粒子を生成した。（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０１２  ７：３８９−３９３）。
【０４６７】
賦形剤
薬学的製剤は、本明細書で使用されるとき、所望される特定の剤形に適している、ありとあらゆる溶媒、分散媒体、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散もしくは懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤もしくは乳化剤、防腐剤、固体結合剤、滑沢剤等を含む、薬学的に許容される賦形剤をさらに含んでもよい。参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，２００６は、薬学的組成物を製剤化するのに使用される種々の賦形剤およびこれらの調製のための既知の技法を開示する。任意の従来の賦形剤媒体が任意の望ましくない生体影響を引き起こすか、またはさもなければ薬学的組成物の任意の他の構成成分（複数可）と有害な様態で相互作用するといった、物質またはその誘導体と不適合性である場合を除いて、その使用が本開示の範囲内で企図される。
【０４６８】
いくつかの実施形態において、薬学的に許容される賦形剤は、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％純粋である。いくつかの実施形態において、賦形剤は、ヒトにおける使用および獣医学的使用に対して認可されている。いくつかの実施形態において、賦形剤は、米国食品医薬品局（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）によって認可されている。いくつかの実施形態において、賦形剤は、医薬品等級である。いくつかの実施形態において、賦形剤は、米国薬局方（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ（ＵＳＰ））、欧州薬局方（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ（ＥＰ））、英国薬局方（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ）、および／または国際薬局方（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ）の基準を満たしている。
【０４６９】
薬学的組成物の製造に使用される薬学的に許容される賦形剤には、不活性希釈剤、分散化剤および／もしくは造粒剤、界面活性剤および／もしくは乳化剤、崩壊剤、結合剤、防腐剤、緩衝剤、滑沢剤、ならびに／または油が含まれるが、これらに限定されない。そのような賦形剤が任意に薬学的組成物中に含まれてもよい。
【０４７０】
例示の希釈剤には、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸ナトリウム、ラクトース、ショ糖、セルロース、微小結晶セルロース、カオリン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、塩化ナトリウム、乾燥デンプン、トウモロコシデンプン、粉糖等、および／またはこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【０４７１】
例示の造粒剤および／または分散化剤には、ジャガイモデンプン、トウモロコシデンプン、タピオカデンプン、デンプングリコール酸ナトリウム、粘土、アルギン酸、グアーガム、柑橘パルプ、寒天、ベントナイト、セルロースおよび木質製品、天然スポンジ、カチオン交換樹脂、炭酸カルシウム、ケイ酸塩、炭酸ナトリウム、架橋ポリ（ビニル−ピロリドン）（クロスポビドン）、ナトリウムカルボキシメチルデンプン（デンプングリコール酸ナトリウム）、カルボキシメチルセルロース、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム（クロスカルメロース）、メチルセルロース、α化デンプン（デンプン１５００）、微小結晶デンプン、水不溶性デンプン、カルシウムカルボキシメチルセルロース、ケイ酸アルミニウムマグネシウム（ＶＥＥＧＵＭ（登録商標））、ラウリル硫酸ナトリウム、第四級アンモニウム化合物等、ならびに／またはこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【０４７２】
例示の界面活性剤および／または乳化剤には、天然乳化剤（例えば、アカシア、寒天、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、トラガント、コンドラックス（ｃｈｏｎｄｒｕｘ）、コレステロール、キサンタン、ペクチン、ゼラチン、卵黄、カゼイン、羊毛脂、コレステロール、ワックス、およびレシチン）、コロイド状粘土（例えば、ベントナイト［ケイ酸アルミニウム］およびＶＥＥＧＵＭ（登録商標）［ケイ酸アルミニウムマグネシウム］）、長鎖アミノ酸誘導体、高分子量アルコール（例えば、ステアリルアルコール、セチルアルコール、オレイルアルコール、モノステアリン酸トリアセチン（ｔｒｉａｃｅｔｉｎ
ｍｏｎｏｓｔｅａｒａｔｅ）、ジステアリン酸エチレングリコール、モノステアリン酸グリセリル、およびモノステアリン酸プロピレングリコール、ポリビニルアルコール）、カルボマー（例えば、カルボキシポリメチレン、ポリアクリル酸、アクリル酸ポリマー、およびカルボキシビニルポリマー）、カラギーナン、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、粉末化セルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース）、ソルビタン脂肪酸エステル（例えば、モノラウリル酸ポリオキシエチレンソルビタン［ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０］、ポリオキシエチレンソルビタン［ＴＷＥＥＮｎ（登録商標）６０］、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン［ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０］、モノパルミチン酸ソルビタン［ＳＰＡＮ（登録商標）４０］、モノステアリン酸ソルビタン［Ｓｐａｎ（登録商標）６０］、トリステアリン酸ソルビタン［Ｓｐａｎ（登録商標）６５］、モノオレイン酸グリセリル、モノオレイン酸ソルビタン［ＳＰＡＮ（登録商標）８０］）、ポリオキシエチレンエステル（例えば、モノステアリン酸ポリオキシエチレン［ＭＹＲＪ（登録商標）４５］、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリエトキシル化（ｐｏｌｙｅｔｈｏｘｙｌａｔｅｄ）ヒマシ油、ステアリン酸ポリオキシメチレン、およびＳＯＬＵＴＯＬ（登録商標））、ショ糖脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル（例えば、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ（登録商標））、ポリオキシエチレンエーテル、（例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル［ＢＲＩＪ（登録商標）３０］）、ポリ（ビニル−ピロリドン）、モノラウリル酸ジエチレングリコール、オレイン酸トリエタノールアミン、オレイン酸ナトリウム、オレイン酸カリウム、オレイン酸エチル、オレイン酸、ラウリル酸エチル、ラウリル硫酸ナトリウム、ＰＬＵＯＲＩＮＣ（登録商標）Ｆ  ６８、ＰＯＬＯＸＡＭＥＲ（登録商標）１８８、臭化セトリモニウム、塩化セチルピリジニウム、塩化ベンザルコニウム、ドキュセートナトリウム等、ならびに／またはこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【０４７３】
例示の結合剤には、デンプン（例えば、トウモロコシデンプンおよびデンプンペースト）；ゼラチン；糖類（例えば、ショ糖、グルコース、デキストロース、デキストリン、糖蜜、ラクトース、ラクチトール、マンニトール、）；天然および合成ガム（例えば、アカシア、アルギン酸ナトリウム、アイリッシュ・モスの抽出物、パンワールガム（ｐａｎｗａｒ  ｇｕｍ）、ガッチガム（ｇｈａｔｔｉ  ｇｕｍ）、イサポール皮（ｉｓａｐｏｌ  ｈｕｓｋ）の粘液、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、微小結晶セルロース、酢酸セルロース、ポリ（ビニル−ピロリドン）、ケイ酸アルミニウムマグネシウム（（ＶＥＥＧＵＭ（登録商標））、およびカラマツアラビノガラクタン（ｌａｒｃｈ  ａｒａｂｏｇａｌａｃｔａｎ））；アルギン酸塩；ポリエチレンオキシド；ポリエチレングリコール；無機カルシウム塩；ケイ酸；ポリメタクリレート；ワックス；水；アルコール等；ならびにこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【０４７４】
例示の防腐剤には、酸化防止剤、キレート剤、抗菌性防腐剤、抗真菌性防腐剤、アルコール防腐剤、酸性防腐剤、および／または他の防腐剤が含まれ得るが、これらに限定されない。例示の酸化防止剤には、αトコフェロール、アスコルビン酸、パルミチン酸アスコルビル（ａｓｃｏｒｂｉｃ）、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、モノチオグリセロール、メタ重亜硫酸カリウム、プロピオン酸、没食子酸プロピル、アスコルビン酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、および／または硫酸ナトリウムが含まれるが、これらに限定されない。例示のキレート剤には、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸一水和物、エデト酸二ナトリウム、エデト酸二カリウム、エデト酸、フマル酸、リンゴ酸、リン酸、エデト酸ナトリウム、酒石酸、および／またはエデト酸三ナトリウムが含まれる。例示の抗菌性防腐剤には、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、ブロノポール、セトリミド、塩化セチルピリジニウム、クロルヘキシジン、クロロブタノール、クロロクレゾール、クロロキシレノール（ｃｈｌｏｒｏｘｙｌｅｎｏｌ）、クレゾール、エチルアルコール、グリセリン、ヘキセチジ、イミド尿素、フェノール、フェノキシエタノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、プロピレングリコール、および／またはチメロサールが含まれるが、これらに限定されない。例示の抗真菌性防腐剤には、ブチルパラベン、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、安息香酸カリウム、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、および／またはソルビン酸が含まれるが、これらに限定されない。例示のアルコール防腐剤には、エタノール、ポリエチレングリコール、フェノール、フェノール系化合物、ビスフェノール、クロロブタノール、ヒドロキシ安息香酸塩、および／またはフェニルエチルアルコールが含まれるが、これらに限定されない。例示の酸性防腐剤には、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、β−カロテン、クエン酸、酢酸、ジヒドロ酢酸、アスコルビン酸、ソルビン酸、および／またはフィチン酸が含まれるが、これらに限定されない。他の防腐剤には、トコフェロール、酢酸トコフェロール、メシル酸デテロキシム（ｄｅｔｅｒｏｘｉｍｅ  ｍｅｓｙｌａｔｅ）、セトリミド、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ｈｙｄｒｏｘｙｔｏｌｕｅｎｅｄ）（ＢＨＴ）、エチレンジアミン、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム（ＳＬＥＳ）、重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、メタ重亜硫酸カリウム、ＧＬＹＤＡＮＴ  ＰＬＵＳ（登録商標）、ＰＨＥＮＯＮＩＰ（登録商標）、メチルパラベン、ＧＥＲＭＡＬＬ（登録商標）１１５、ＧＥＲＭＡＢＥＮ（登録商標）ＩＩ、ＮＥＯＬＯＮＥ（商標）、ＫＡＴＨＯＮ（商標）、および／またはＥＵＸＹＬ（登録商標）が含まれるが、これらに限定されない。
【０４７５】
例示の緩衝剤には、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、塩化アンモニウム、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、クエン酸カルシウム、グルビオン酸カルシウム、グルセプチン酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、ｄ−グルコン酸、グリセロリン酸カルシウム、乳酸カルシウム、プロパン酸、レブリン酸カルシウム、ペンタン酸、第二リン酸カルシウム、リン酸、第三リン酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、酢酸カリウム、塩化カリウム、グルコン酸カリウム、カリウム混合物、第二リン酸カリウム、第一リン酸カリウム、リン酸カリウム混合物、酢酸ナトリウム、二炭酸ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、第二リン酸ナトリウム、第一リン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム混合物、トロメタミン、水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウム、アルギン酸、発熱性物質除去水、等張食塩水、リンゲル液、エチルアルコール等、および／またはこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【０４７６】
例示の滑沢剤には、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸、シリカ、タルク、麦芽、ベヘン酸（ｂｅｈａｎａｔｅ）グリセリル、水素化植物油、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ロイシン、ラウリル硫酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム等、およびこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【０４７７】
例示の油には、アーモンド油、杏仁油、アボカド油、ババス油、ベルガモット油、ブラックカラント種子油、カデ油、カモミール油、キャノーラ油、キャラウェイ油、カルナウバ油、ヒマシ油、桂皮油、ココアバター油、ココナッツ油、タラの肝油、コーヒー油、トウモロコシ油、綿実油、エミュー油、ユーカリ油、月見草油、魚油、亜麻仁油、ゲラニオール油、ヒョウタン油、ブドウ種子油、ヘーゼルナッツ油、ヒソップ油、ミリスチン酸イソプロピル油、マンゴー種子油、メドウフォーム種子油、ミンク油、ナツメグ油、オリーブ油、オレンジ油、オレンジラフィー油、パーム油、パーム核油、桃仁油、ピーナッツ油、ケシ油、カボチャ種子油、菜種油、コメヌカ油、ローズマリー油、ベニバナ油、ビャクダン油、サスクアナ（ｓａｓｑｕａｎａ）油、セボリー、シーバックソーン油、ゴマ油、シアバター油、シリコーン油、大豆油、ヒマワリ油、ティーツリー油、アザミ油、ツバキ油、ベチバー油、胡桃油、および小麦胚芽油が含まれるが、これらに限定されない。例示の油には、ブチルステアリン酸、カプリル酸トリグリセリド、カプリン酸トリグリセリド、シクロメチコン、セバシン酸ジエチル、ジメチコン３６０、ミリスチン酸イソプロピル、鉱油、オクチルドデカノール、オレイルアルコール、シリコーン油、および／またはこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【０４７８】
調合者の判断に従って、ココアバターおよび坐剤ワックス、着色剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤、ならびに／または芳香剤等の賦形剤が、組成物中に存在し得る。
【０４７９】
送達
本開示は、薬物送達の科学進展の見込みを考慮した任意の適切な経路による、治療目的、薬学目的、診断目的、または撮像目的のうちのいずれのためのシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの送達をも包含する。送達は、ネイキッドであっても製剤化されてもよい。
【０４８０】
ネイキッド送達
本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、ネイキッドで細胞に送達されてもよい。本明細書で使用されるとき、「ネイキッド」とは、形質移入を促進する薬剤を用いずにシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを送達することを指す。例えば、細胞に送達されるポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、修飾を全く含有しない場合がある。ネイキッドシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、細胞に、当技術分野で既知であり、かつ本明細書に記載の投与経路を用いて送達されてもよい。
【０４８１】
製剤化された送達
本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、本明細書に記載の方法を用いて製剤化されてもよい。製剤は、修飾されているかつ／または修飾されていない場合があるシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを含有してもよい。製剤は、細胞透過剤、薬学的に許容される担体、送達剤、生崩壊性または生体適合性ポリマー、溶媒、および持続放出送達デポーをさらに含むことができるが、これらに限定されない。製剤化されたシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、細胞に、当技術分野で既知であり、かつ本明細書に記載の投与経路を用いて送達されてもよい。
【０４８２】
組成物は、直接浸水または浸漬、カテーテルを介して、ゲル、粉末、軟膏、クリーム、ゲル、ローション、および／または液滴によって、組成物でコーティングまたは含浸された織物または生分解性材料等の基質を使用することによって等を含むが、これらに限定されない当技術分野におけるいくつかの方法のうちのいずれかにおける器官または組織への直接送達のためにも製剤化され得る。
【０４８３】
投与
本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、治療上有効成果をもたらす任意の経路によって投与されてもよい。これらには、経腸、経胃腸、硬膜外、経口、経皮、硬膜外（硬膜上）、脳内（大脳の中へ）、脳室内（脳室の中へ）、皮膚上（皮膚上への適用）、皮内、（皮膚自体の中へ）、皮下（皮膚の下）、経鼻投与（鼻を介して）、静脈内（静脈の中へ）、動脈内（動脈の中へ）、筋肉内（筋肉の中へ）、心臓内（心臓の中へ）、骨内輸注（骨髄の中へ）、髄腔内（脊柱管の中へ）、腹腔内（腹腔の中への輸注または注入）、膀胱内輸注、硝子体内（眼を介して）、空洞内注入（陰茎基部の中へ）、膣内投与、子宮内、羊膜外投与、経皮（全身への分布のための無傷の皮膚（ｉｎｔａｃｔ  ｓｋｉｎ）を介した拡散）、経粘膜（粘膜を介した拡散）、ガス注入（鼻からの吸引）、舌下、口唇下、浣腸、点眼（結膜上に）、または点耳におけるもの含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、組成物は、それらが血液−脳関門、血管関門、または他の上皮関門を横断することを可能にするような方式で投与されてもよい。本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡのための非限定的な投与経路が以下に記載される。
【０４８４】
非経口および注入による投与
経口および非経口投与のための液体剤形には、薬学的に許容されるエマルション、マイクロエマルション、溶液、懸濁液、シロップ、および／またはエリキシルが含まれるが、これらに限定されない。活性成分に加えて、液体剤形は、例えば、水または他の溶媒、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、ベンジル安息香酸塩、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（具体的には、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ソルビタンのポリエチレングリコールおよび脂肪酸エステル等の可溶化剤および乳化剤、ならびにこれらの混合物等の、当技術分野で一般的に使用される不活性希釈剤を含んでもよい。不活性希釈剤の他に、経口組成物は、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、甘味剤、香味剤、および／または芳香剤等のアジュバントを含むことができる。非経口投与のためのある特定の実施形態において、組成物は、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ（登録商標）、アルコール、油、変性油、グリコール、ポリソルベート、シクロデキストリン、ポリマー、および／またはこれらの組み合わせ等の可溶化剤と混合される。
【０４８５】
注入用調製物、例えば、滅菌注入用水性または油性懸濁液は、既知の技術に従って、好適な分散化剤、湿潤剤、および／または懸濁化剤を用いて製剤化されてもよい。滅菌注入用調製物は、非毒性の非経口的に許容される希釈剤および／または溶媒中の、滅菌注入用溶液、懸濁液、および／またはエマルション、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液としてのものであってもよい。用いられ得る許容されるビヒクルおよび溶媒の中には、水、リンゲル液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．、および等張塩化ナトリウム溶液がある。無刺激の固定油が溶媒または懸濁化媒体として慣習的に用いられる。この目的のために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む、任意の無菌性の固定油が用いられ得る。オレイン酸等の脂肪酸が注入物の調製において使用され得る。
【０４８６】
注入用製剤は、例えば、細菌保持フィルターを通した濾過によって、かつ／または使用前に滅菌水または他の滅菌注射用媒体中に溶解もしくは分散させることができる滅菌固体組成物の形態で滅菌剤を組み込むことによって、滅菌することができる。
【０４８７】
活性成分の効果を延長するために、皮下または筋肉内注入からの活性成分の吸収を緩徐化することがしばしば望ましい。これは、水への溶解度が低い結晶質または非晶質材料の液体懸濁液の使用によって遂行されてもよい。薬物の吸収速度は次いで、その溶解速度に依存し、溶解速度が今度は、結晶サイズおよび結晶形に依存し得る。あるいは、非経口的に投与される薬物形態の遅延吸収は、薬物を油性ビヒクル中に溶解させるまたは懸濁させることによって遂行される。注入用デポー形態は、薬物のマイクロカプセルマトリックス（ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌｅ  ｍａｔｒｉｃｅｓ）を、ポリラクチド−ポリグリコライド等の生分解性ポリマー中に形成することによって作製される。薬物対ポリマーの比および用いられる特定のポリマーの性質に応じて、薬物放出の速度を制御することができる。他の生分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が挙げられる。デポー注入用製剤は、薬物を、身体組織と適合性のリポソームまたはマイクロエマルション中に封入することによって調製される。
【０４８８】
直腸および膣内投与
直腸または膣内投与のための組成物は、典型的に坐剤であり、それは組成物を、周囲温度では固体であるが、体温では液体であり、したがって直腸または膣腔で溶解して活性成分を放出する、ココアバター、ポリエチレングリコール、または坐剤ワックス等の好適な非刺激性賦形剤と混合することによって調製することができるる。
【０４８９】
経口投与
経口投与のための固体剤形には、カプセル、錠剤、丸薬、粉剤、および顆粒が含まれる。そのような固体剤形において、活性成分は、クエン酸ナトリウムもしくはリン酸二カルシウム等の少なくとも１つの不活性な薬学的に許容される賦形剤、および／または充填剤もしくは増量剤（例えば、デンプン、ラクトース、ショ糖、グルコース、マンニトール、およびケイ酸）、結合剤（例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリジノン、ショ糖、およびアカシア）、保水剤（例えば、グリセロール）、崩壊剤（例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、ある特定のケイ酸塩、および炭酸ナトリウム）、溶解遅延剤（ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｒｅｔａｒｄｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ）（例えば、パラフィン）、吸収促進剤（例えば、第四級アンモニウム化合物）、湿潤剤（例えば、セチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロール）、吸収剤（例えば、カオリンおよびベントナイト粘土）、ならびに滑沢剤（例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム）、ならびにこれらの混合物と混合される。カプセル、錠剤、および丸薬の場合、剤形は、緩衝剤も含んでもよい。
【０４９０】
局所または経皮投与
本明細書に記載されるように、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを含有する組成物は、局所的な投与のために製剤化されてもよい。皮膚は、それが容易に接触可能であるため、送達に理想的な標的であり得る。遺伝子発現は、皮膚に対してのみ制限され、非特異的な毒性を回避する可能性があるだけでなく、皮内の特定の層および細胞型にも制限され得る。
【０４９１】
送達された組成物の皮膚発現の部位は、核酸送達の経路に依存する。次の３つの経路がシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを皮膚へと送達するために考慮される：（ｉ）局所適用（例えば、局所／局部治療および／または腫瘍学関連用途のため）、（ｉｉ）経皮注入（例えば、局所／局部治療および／または腫瘍学関連用途のため）、ならびに（ｉｉｉ）全身送達（例えば、皮膚領域および皮膚外領域の両方を侵す皮膚疾患の治療のため）。シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、当技術分野で既知のいくつかの異なるアプローチによって皮膚に送達することができる。非カチオン性リポソーム−ＤＮＡ複合体、カチオン性リポソーム−ＤＮＡ複合体の局所適用、粒子媒介性（遺伝子銃）、穿刺媒介性遺伝子形質移入、およびウイルス送達アプローチ等であるが、これらに限定されない、ほとんどの局所送達アプローチが、ＤＮＡの送達に有効であることが示されている。核酸の送達後に、遺伝子産物が、基底角化細胞、皮脂腺細胞、真皮線維芽細胞、および真皮マクロファージを含むが、これらに限定されない、いくつかの異なる皮膚細胞型において検出されている。
【０４９２】
一実施形態において、本発明は、本発明の方法を好都合にかつ／または有効に行うための多様なドレッシング（例えば、創傷ドレッシング）または包帯（例えば、粘着包帯）を提供する。典型的に、ドレッシングまたは包帯は、使用者が対象（複数可）の複数の治療を行うことを可能にするために、本明細書に記載の十分な量の薬学的組成物および／またはシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはｍｍＲＮＡを含むことができる。
【０４９３】
一実施形態において、本発明は、１回を超える注入で送達されるシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡ組成物を提供する。
【０４９４】
一実施形態において、局所および／または経皮投与の前に、皮膚等の少なくとも１つの組織の領域が、透過性を増加させ得るデバイスおよび／または溶液に供されてもよい。一実施形態において、組織は、皮膚の透過性を増加させるために、研磨デバイスに供されてもよい（参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許公開第２００８０２７５４６８号を参照のこと）。別の実施形態において、組織は、超音波強化デバイスに供されてもよい。超音波強化デバイスには、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第２００４０２３６２６８号ならびに米国特許第６，４９１，６５７号および同第６，２３４，９９０号に記載のデバイスが含まれてもよいが、これらに限定されない。組織の透過性を向上させる方法は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第２００４０１７１９８０号および同第２００４０２３６２６８号ならびに米国特許第６，１９０，３１５号に記載されている。
【０４９５】
一実施形態において、デバイスを用いて、本明細書に記載の修飾ｍＲＮＡ製剤を送達する前に組織の透過性を増加させてもよい。皮膚の透過性は、当技術分野で既知の方法、および／または参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，１９０，３１５号に記載の方法によって測定することができる。非限定的な例として、修飾ｍＲＮＡ製剤は、参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，１９０，３１５号に記載の薬物送達方法によって送達されてもよい。
【０４９６】
別の非限定的な例において、組織は、透過性を増加させ得るデバイスに組織が供され得る前、その間および／またはその後に、局所麻酔薬の共融混合物（ＥＭＬＡ）クリームで処理されてもよい。Ｋａｔｚら（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ａｎｅｓｔｈ  Ａｎａｌｇ（２００４）；９８：３７１−７６）は、ＥＭＬＡクリームを低エネルギーと組み合わせて使用して、表在性皮膚鎮痛の発生が低エネルギー超音波での前処理の早くも５分後に見られたことを示した。
【０４９７】
一実施形態において、透過性を増加させるために組織が処理される前、その間、および／またはその後に、促進剤が組織に適用されてもよい。促進剤には、輸送促進剤、物理的促進剤、および空洞形成（ｃａｖｉｔａｔｉｏｎ）促進剤が含まれるが、これらに限定されない。促進剤の非限定的な例は、参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，１９０，３１５号に記載されている。
【０４９８】
一実施形態において、デバイスを用いて、免疫応答を呼び起こす物質をさらに含有し得る、本明細書に記載の修飾ｍＲＮＡの製剤を送達する前に、組織の透過性を増加させてもよい。別の非限定的な例において、免疫応答を呼び起こす物質を含有する製剤は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第２００４０１７１９８０号および同第２００４０２３６２６８号に記載の方法によって送達されてもよい。
【０４９９】
組成物の局所および／または経皮投与のための剤形には、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、泡状物質、粉末、溶液、スプレー、吸入剤、および／またはパッチが含まれてもよい。一般に、活性成分は、滅菌条件下で、必要とされ得る通りに薬学的に許容される賦形剤ならびに／または任意の必要とされる防腐剤および／もしくは緩衝液と混和される。さらに、本発明は、経皮パッチの使用を企図し、それはしばしば、身体への化合物の制御送達を提供するという追加の利点を有し得る。そのような剤形は、例えば、化合物を適正な媒体中に溶解させるおよび／または分与することによって、調製することができる。あるいは、またはさらに、速度は、速度制御膜を提供することかつ／または化合物をポリマーマトリックスおよび／もしくはゲル中に分散させることによってのいずれかで制御することができる。
【０５００】
局所投与に好適な製剤には、リニメント剤、ローション等の液体および／もしくは半液体調製物、クリーム、軟膏、および／もしくはペースト等の水中油型および／もしくは油中水型エマルション、ならびに／または溶液および／もしくは懸濁液が含まれるが、これらに限定されない。
【０５０１】
局所的に投与可能な製剤は、例えば、約０．１ｗ／ｗ％〜約１０ｗ／ｗ％の活性成分を含み得るが、活性成分の濃度は、最大で溶媒中の活性成分の可溶性の限度まで高くてもよい。局所投与のための製剤は、本明細書に記載のさらなる成分のうちの１つ以上をさらに含んでもよい。
【０５０２】
透過エンハンサー
一実施形態において、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物およびｍｍＲＮＡは、様々な透過エンハンサーを用いて、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物およびｍｍＲＮＡを、１つ以上の過剰増殖性疾患、障害または状態に関連する少なくとも１つの領域に送達し得る。ほとんどの薬剤は、イオン化および非イオン化形態の双方で溶液に存在する。しかし、通常は、脂質溶解性または脂溶性薬剤のみが容易に細胞膜を超える。超える膜を透過エンハンサーで処理した場合、非脂溶性薬剤でさえも、細胞膜を超え得ることが分かっている。細胞膜を超えて非脂溶性薬剤を拡散する手助けをするのに加え、透過エンハンサーは脂溶性薬剤の透過性も強化する。
【０５０３】
透過エンハンサーは、５つの幅の大きいカテゴリー、すなわち、界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート化剤および非キレート非界面活性剤の１つに属するものとして分類され得る（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２）。透過エンハンサーの上記クラスはそれぞれ、下記でさらに詳細に説明する。例えば胆汁酸／塩と組み合わせた脂肪酸／塩というように、透過エンハンサーの組み合わせも、本発明の範囲に包含され得る。透過エンハンサーの組み合わせの他の非制限的な例として、ラウリン酸、カプリン酸およびＵＤＣＡのナトリウム塩の組み合わせが含まれる。
【０５０４】
界面活性剤
本発明と関わりの中で、界面活性剤（または、「表面活性剤」）は、水性溶液に溶解した際に、溶液の表面張力、または、水性溶液と他の液体との間の界面張力を低下し、粘膜経由のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物およびｍｍＲＮＡの吸収を高める結果を伴う、化学物質である。胆汁酸塩および脂肪酸の加え、これらの透過エンハンサーには、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−９−−ラウリルエーテルおよびポリオキシエチレン−２０−セチルエーテル）（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ
Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２）；およびＦＣ−４３といった全フッ素置換エマルション（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８８，４０，２５２）が含まれる。
【０５０５】
脂肪酸
透過エンハンサーとして作用する様々な脂肪酸およびその誘導体には、オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸（ｎ−カプリン酸）、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリかプレート、モノオレイン（１−モノオレオイル−ラック−グリセロール、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセロール１−モノかプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、そのＣ１−Ｃ１０アルキルエステル（例えば−メチル、イソプロピルおよびｔ−ブチル）、およびそのモノ−、ジ−グリセリド（すなわち、オレアート、ラウレート、かプレート、ミリステート、パルミテート、ステアレート、リノレエートなど）が挙げられるが、これらに限定されない（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｙｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３；Ｅｌ  Ｈａｒｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９２，４４，６５１−６５４）。
【０５０６】
胆汁酸塩
胆汁の生物学的役割としては、脂質および脂溶性ビタミンの分散および吸収の助長が挙げられる（Ｂｒｕｎｔｏｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ３８  ｉｎ：Ｇｏｏｄｍａｎ＆Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，９ｔｈ  Ｅｄ．，Ｈａｒｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９６，ｐｐ．９３４−９３５）。様々な天然の胆汁酸塩およびその合成誘導体が、透過エンハンサーとして作用する。このように、「胆汁酸塩」という語句には、胆汁に天然に存在するいずれかの成分およびその合成誘導体のいずれもが包含される。本発明の胆汁酸塩としては、コール酸（またはその薬剤的に許容できるナトリウム塩コール酸ナトリウム）、デヒドロコール酸（デヒドロコール酸ナトリウム）、デオキシコール酸（デオキシコール酸ナトリウム）、グルコール（ｇｌｕｃｈｏｌｉｃ）酸グルコール酸（ｇｌｕｃｈｏｌａｔｅ）ナトリウム）、グリコール（ｇｌｙｃｈｏｌｉｃ）酸（グリココール酸ナトリウム）、グリコデオキシコール酸（グリコデオキシコール酸ナトリウム）、タウロコール酸（タウロコール酸ナトリウム）、タウロデオキシコール酸（タウロデオキシコール酸ナトリウム）、ケノデオキシコール酸（ケノデオキシコール酸ナトリウム）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、タウロ−２４，２５−ジヒドロ−フシジン酸ナトリウム（ＳＴＤＨＦ）、グリコジシドロフシジン酸ナトリウムおよびポリオキシエチレン  −  ９  −  ラウリルエーテル（ＰＯＥ）が挙げられるが、これらに限定されない（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ  ９２；Ｓｗｉｎｙａｒｄ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ３９  Ｉｎ：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄ．，Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９０，ｐａｇｅｓ７８２−７８３；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３；Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９２，２６３，２５；Ｙａｍａｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９０，７９，５７９−５８３）。
【０５０７】
キレート化剤
本発明との関わりで使用されるキレート化剤は、金属イオンと複合体を形成して金属イオンを溶媒から取り除き、粘膜経由のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物およびｍｍＲＮＡの吸収が強化される結果を伴う化合物として定義され得る。本発明における透過エンハンサーとしての使用に関して、キレート化剤はＤＮａｓｅ阻害剤としても役立ち得る追加的な効果を有し、なぜなら、多くの特徴づけられたＤＮＡヌクレアーゼは、触媒作用のために二価金属イオンを必要とし、こうしてキレート化剤によって阻害されるからである（Ｊａｒｒｅｔｔ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，１９９３，６１８，３１５−３３９）。本発明のキレート化剤としては、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、クエン酸、サリチレート（例えばサリチル酸ナトリウム、５−メトキシサリチレートおよびホモバニレート）、コラーゲンのＮ−アシル誘導体、ラウレス−９およびベータ−ジケトン（エナミン）のＮ−アミノアシル誘導体が挙げられるが、これらに限定されない（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ  ９２；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３；Ｂｕｕｒ
ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌ．，１９９０，１４，４３−５１）。
【０５０８】
非キレート化非界面活性剤
本明細書で使用される非キレート化非界面活性剤透過強化性化合物は、キレート化剤または界面活性剤としては取るに足らない活性を示すが、それにも関わらず、消化の粘膜経由のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物およびｍｍＲＮＡの吸収を強化する化合物として定義され得る（Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３）。このクラスの透過エンハンサーとしては、不飽和環状尿素、１−アルキル−および１−アルケニルアザシクロ−アルカノン誘導体（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ  ９２）；ならびに、ジクロフェナクナトリウム、インドメタシンおよびフェニルブタゾンといった非ステロイド性抗炎症剤が挙げられるが、これらに限定されない（Ｙａｍａｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８７，３９，６２１−６２６）。
【０５０９】
細胞レベルでシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物およびｍｍＲＮＡの取り込みを強化する剤も、本発明の薬剤および他の組成物に添加してもよい。例えば、リポフェクチンといったカチオン性脂質（Ｊｕｎｉｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，７０５，１８８）、カチオン性グリセロール誘導体およびポリリジンといったポリカチオン性分子（Ｌｏｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＴ国際公開第ＷＯ  ９７／３０７３１号）も、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物およびｍｍＲＮＡの細胞の取り込みを強化することで知られている。
【０５１０】
他の剤を用いて投与するシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物およびｍｍＲＮＡの透過を強化し得、例えば、エチレングリコールおよびプロピレングリコールといったグリコール、２−ピロールといったピロール、アゾン、リモネンおよびメントンといったテルペンが挙げられる。
【０５１１】
デポー投与
本明細書に記載されるように、いくつかの実施形態において、組成物は、持続放出のためのデポー中に製剤化される。一般に、具体的な器官または組織（「標的組織」）が、投与のための標的とされる。
【０５１２】
本発明のいくつかの態様において、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、標的組織内またはその近位で空間的に保持される。標的組織（１つ以上の標的細胞を含有する）を組成物と、組成物、特に組成物の核酸構成成分（複数可）が標的組織内に実質的に保持される、つまり、組成物の少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．９、９９．９９、または９９．９９％超が標的組織内に保持されるような条件下で接触させることによって、組成物を哺乳類対象の標的組織に提供する方法が提供される。有利なことに、保持は、１つ以上の標的細胞に進入する、組成物中に存在する核酸の量を測定することによって決定される。例えば、投与の一定期間後に、対象に投与される核酸の少なくとも１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．９、９９．９９、または９９．９９％超が、細胞内に存在する。例えば、哺乳類対象への筋肉内注入が、リボ核酸および形質移入試薬を含有する水性組成物を用いて行われ、組成物の保持は、筋肉細胞内に存在するリボ核酸の量を測定することによって決定される。
【０５１３】
本発明の態様は、標的組織（１つ以上の標的細胞を含有する）を組成物と、組成物が標的組織内に実質的に保持されるような条件下で接触させることによって、組成物を哺乳類対象の標的組織に提供する方法を対象とする。組成物は、目的とするポリペプチドが少なくとも１つの標的細胞内で産生されるように、有効量のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを含有する。組成物は一般に、細胞透過剤、および薬学的に許容される担体を含有するが、「ネイキッド」核酸（細胞透過剤または他の薬剤を含まない核酸等）もまた企図される。
【０５１４】
いくつかの状況において、組織内の細胞によって産生される腫瘍学関連タンパク質の量は、望ましくは増加される。好ましくは、腫瘍学関連タンパク質産生のこの増加は、標的組織内の細胞に空間的に制限される。したがって、哺乳類対象の組織内における目的とする腫瘍学関連タンパク質の産生を増加させる方法が提供される。標的組織の既定体積内に含有される細胞の実質的な割合（％）において目的とするポリペプチドを産生するように組成物の単位量が決定されていることで特徴付けられる、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを含有する組成物が提供される。
【０５１５】
いくつかの実施形態において、組成物は、複数の異なるシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを含み、このシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡのうちの１つ以上が目的とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードする。任意に、組成物は、組成物の細胞内送達を補助するための細胞透過剤も含有する。標的組織の既定体積内に含有される細胞のかなりの割合（％）において目的とする腫瘍学関連ポリペプチドを産生する（一般に、既定体積に隣接した、または標的組織に遠位の組織において、目的とする腫瘍学関連ポリペプチドの大幅な産生を誘導することなく）のに必要とされる組成物の用量の決定が行われる。この決定に次いで、決定された用量が哺乳類対象の組織に直接導入される。
【０５１６】
一実施形態において、本発明は、１回を超える注入でまたは分割用量注入によって送達される対象となるシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを提供する。
【０５１７】
一実施形態において、本発明は、小型の使い捨て薬物リザーバまたはパッチポンプを用いて、標的組織の付近で保持されてもよい。パッチポンプの非限定的な例としては、ＢＤ（登録商標）（Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）、Ｉｎｓｕｌｅｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）、ＳｔｅａｄｙＭｅｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）、Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）、ＵｎｉＬｉｆｅ（Ｙｏｒｋ，ＰＡ）、Ｖａｌｅｒｉｔａｓ（Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，ＮＪ）、およびＳｐｒｉｎｇＬｅａｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）によって製造および／または販売されるものが挙げられる。
【０５１８】
肺投与
薬学的組成物は、口腔を介した肺投与に好適な製剤中に調製され、パッケージ化され、かつ／または販売されてもよい。そのような製剤は、活性成分を含み、かつ約０．５ｎｍ〜約７ｎｍまたは約１ｎｍ〜約６ｎｍの範囲の直径を有する、乾燥粒子を含んでもよい。そのような組成物は、好適には、噴射剤の流れが粉末を分散するようにそこに向けられ得る乾燥粉末リザーバを含むデバイスを用い、かつ／または密封容器中の低沸点噴射剤中に溶解および／もしくは懸濁させた活性成分を含むデバイス等の自己噴射溶媒／粉末分与容器を用いた投与のために、乾燥粉末の形態にある。そのような粉末は、粒子の少なくとも９８重量％が０．５ｎｍ超の直径を有し、粒子の少なくとも９５％（数量）が７ｎｍ未満の直径を有する、粒子を含む。あるいは、粒子の少なくとも９５重量％は、１ｎｍ超の直径を有し、粒子の少なくとも９０％（数量）は、６ｎｍ未満の直径を有する。乾燥粉末組成物は、糖等の固体微粉末希釈剤を含んでもよく、それは単位用量形態で好都合に提供される。
【０５１９】
低沸点噴射剤には一般に、大気圧で６５°Ｆ（約１８．３℃）を下回る融点を有する液体噴射剤が含まれる。一般に、噴射剤は、組成物の５０ｗ／ｗｖ％〜９９．９ｗ／ｗｖ％を構成し得、活性成分は、組成物の０．１ｗ／ｗ％〜２０ｗ／ｗ％を構成し得る。噴射剤は、液体非イオン性および／もしくは固体アニオン性界面活性剤ならびに／または固体希釈剤（活性成分を含む粒子と同じ規模の粒径を有し得る）等のさらなる成分をさらに含んでもよい。
【０５２０】
肺送達のために製剤化される薬学的組成物は、溶液および／または懸濁液の液滴の形態で活性成分を提供してもよい。そのような製剤は、任意に滅菌された、活性成分を含む、水性および／または希釈アルコール溶液および／または懸濁液として調製され、パッケージ化され、かつ／または販売されてもよく、好都合に、任意の噴霧および／または微粒化デバイスを用いて投与され得る。そのような製剤は、サッカリンナトリウム等の香味剤、揮発性油、緩衝剤、界面活性剤、および／または安息香酸メチルヒドロキシ等の防腐剤を含むが、これらに限定されない１つ以上のさらなる成分をさらに含んでもよい。この投与経路によって提供される液滴は、約０．１ｎｍ〜約２００ｎｍの範囲の平均直径を有し得る。
【０５２１】
鼻腔内、経鼻、および頬側投与
肺送達に有用であるとして本明細書に記載される製剤は、薬学的組成物の鼻腔内送達に有用である。鼻腔内投与に好適な別の製剤は、活性成分を含み、約０．２μｍ〜５００μｍの平均粒子を有する、粗粉である。そのような製剤は、鼻からの吸入が行われる様態で、すなわち、鼻に近接して保持された粉末の容器からの鼻孔を通じた急速な吸入によって、投与される。
【０５２２】
経鼻投与に好適な製剤は、例えば、最少約０．１ｗ／ｗ％〜最大１００ｗ／ｗｖ％の活性成分を含んでもよく、本明細書に記載のさらなる成分のうちの１つ以上を含んでもよい。薬学的組成物は、頬側投与に好適な製剤中に調製され、パッケージ化され、かつ／または販売されてもよい。そのような製剤は、例えば、従来の方法を用いて作製される錠剤および／またはロゼンジの形態にあってもよく、また、例えば、０．１ｗ／ｗ％〜２０ｗ／ｗ％の活性成分であってもよく、残りが経口的に溶解性および／または分解性の組成物、ならびに任意に、本明細書に記載のさらなる成分のうちの１つ以上を含む。代わりに、頬側投与に好適な製剤は、活性成分を含む、粉末ならびに／またはエアロゾル化および／もしくは微粒化溶液および／もしくは懸濁液を含んでもよい。そのような粉末化、エアロゾル化、および／またはエアロゾル化製剤は、分散されるとき、約０．１ｎｍ〜約２００ｎｍの範囲の平均粒径および／または液滴径を有し得、本明細書に記載の任意のさらなる成分のうちの１つ以上をさらに含んでもよい。
【０５２３】
眼内投与
薬学的組成物は、眼内投与に好適な製剤中に調製され、パッケージ化され、かつ／または販売されてもよい。そのような製剤は、例えば、水性または油性液体賦形剤中に、例えば、０．１／１．０ｗ／ｗ％の活性成分の溶液および／または懸濁液を含む、点眼の形態にあってもよい。そのような液滴は、緩衝剤、塩、および／または本明細書に記載の任意のさらなる成分のうちのもう１つ以上をさらに含んでもよい。有用である他の眼内投与可能な製剤には、微小結晶形態でおよび／またはリポソーム調製物中に活性成分を含むものが含まれる。点耳および／または点眼は、本発明の範囲内にあるものとして企図される。
【０５２４】
ペイロード投与：検出可能な薬剤および治療剤
本明細書に記載のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、物質（「ペイロード」）の生体標的への送達、例えば、標的の検出のための検出可能な物質の送達、または治療剤の送達が所望される、いくつかの異なるシナリオにおいて使用することができる。検出方法には、インビトロ画像法およびインビボ画像法の両方、例えば、免疫組織化学、生物発光画像法（ＢＬＩ）、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、ポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）、電子顕微鏡法、Ｘ線コンピュータ断層撮影法、ラマン画像法、光干渉断層撮影法、吸収画像法、熱画像法、蛍光反射画像法、蛍光顕微鏡法、蛍光分子トモグラフィー画像法、核磁気共鳴画像法、Ｘ線画像法、超音波画像法、光音響画像法、研究室アッセイ、またはタギング／染色／画像法が必要とされる任意の状況における方法が含まれ得るが、これらに限定されない。
【０５２５】
シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、任意の有用な定位でリンカーおよびペイロードの両方を含むように設計することができる。例えば、２つの末端を有するリンカーを用いて、デアザ−アデノシンもしくはデアザ−グアノシンのＣ−７もしくはＣ−８位において、またはシトシンもしくはウラシルのＮ−３もしくはＣ−５位に等、一方の末端がペイロードに、および他方の末端が核酸塩基に結合される。本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチドは、１つを超えるペイロード（例えば、標識および転写阻害剤）、ならびに切断可能リンカーを含むことができる。一実施形態において、修飾ヌクレオチドは、切断可能リンカーの一方の末端が７−デアザ−アデニンのＣ７位に結合され、リンカーの他方の末端が阻害剤（例えば、シチジン上の核酸塩基のＣ５位）に結合され、標識（例えば、Ｃｙ５）がリンカーの中心に結合される、修飾７−デアザ−アデノシン三リン酸塩である（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，９９４，３０４号の図５におけるＡ＊ｐＣｐ  Ｃ５  Ｐａｒｇ  Ｃａｐｌｅｓｓの化合物１ならびに第９および１０欄を参照のこと）。修飾７−デアザ−アデノシン三リン酸塩がコード領域へと組み込まれると、結果として生じる切断可能リンカーを有するシグナルセンサーポリヌクレオチドは、標識および阻害剤（例えば、ポリメラーゼ阻害剤）に結合される。リンカーが切断されると（例えば、切断可能ジスルフィド部分を有するリンカーを還元するための還元条件により）、標識および阻害剤が放出される。さらなるリンカーおよびペイロード（例えば、治療剤、検出可能な標識、および細胞透過性ペイロード）が本明細書に記載される。
【０５２６】
例えば、本明細書に記載のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を再プログラミングするのに使用することができ、それによりクラスター中の総細胞と比較して、形質移入される細胞を直接追跡することができる。別の例において、リンカーを介してシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡに結合され得、また蛍光標識され得る薬物を用いて、薬物をインビボで、例えば、細胞内で追跡することができる。他の例としては、細胞内への可逆的な薬物送達におけるシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの使用が挙げられるが、これらに限定されない。
【０５２７】
本明細書に記載のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、ペイロード、例えば、検出可能な薬剤または治療剤の、特定の細胞小器官への細胞内標的化において使用することができる。例示の細胞内標的には、高度なｍＲＮＡプロセシングのための核局在化、または阻害剤を含有するｍＲＮＡに連結された核局在化配列（ＮＬＳ）が含まれ得るが、これらに限定されない。
【０５２８】
さらに、本明細書に記載のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを用いて、例えば、生存動物において、治療剤を細胞または組織に送達することができる。例えば、本明細書に記載のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを用いて、癌細胞を死滅させるために高極性化学療法剤を送達することができる。リンカーを介して治療剤に結合されるシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、部材の透過を容易にすることにより、治療剤が細胞内に移動して細胞内標的に到達することを可能にし得る。
【０５２９】
別の例において、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、切断可能リンカーを介してポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡウイルス阻害性ペプチド（ＶＩＰ）に結合され得る。切断可能リンカーは、ＶＩＰおよび色素を細胞内に放出することができる。別の例において、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、リンカーを介して、コレラ毒素、ジフテリア毒素、および百日咳毒素等のいくつかの細菌毒素の作用に関与する、ＡＤＰ−リボシレートに結合され得る。これらの毒素タンパク質は、ヒト細胞において標的タンパク質を修飾するＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼである。例えば、コレラ毒素ＡＤＰ−リボシレートＧタンパク質は、致命的な下痢をもたらす、小腸の内壁からの大量の体液分泌を引き起こすことによって、ヒト細胞を変性させる。
【０５３０】
いくつかの実施形態において、ペイロードは、細胞毒、放射性イオン、化学療法剤、または他の治療剤等の治療剤であってもよい。細胞毒または細胞傷害性薬剤には、細胞に有害であり得るいずれの薬剤も含まれる。例としては、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラセンジオン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙａｎｔｈｒａｃｉｎｅｄｉｏｎｅ）、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン（ｄｅｈｙｄｒｏｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ）、糖質コルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、マイタンシノイド、例えば、マイタンシノール（参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第５，２０８，０２０号）、ラケルマイシン（ＣＣ−１０６５、すべてが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，４７５，０９２号、同第５，５８５，４９９号、および同第５，８４６，５４５号を参照のこと）、ならびにこれらの類似体または相同体が挙げられるが、これらに限定されない。放射性イオンには、ヨウ素（例えば、ヨウ素１２５またはヨウ素１３１）、ストロンチウム８９、リン、パラジウム、セシウム、イリジウム、リン酸塩、コバルト、イットリウム９０、サマリウム１５３、およびプラセオジミウムが含まれるが、これらに限定されない。他の治療剤には、代謝拮抗薬（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルダカルバジン（ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ））、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオテパクロラムブシル、ラケルマイシン（ＣＣ−１０６５）、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびｃｉｓ−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（かつてはダウノマイシン）およびｄオキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（かつてはアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ））、および抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、タキソール、およびマイタンシノイド）が含まれるが、これらに限定されない。
【０５３１】
いくつかの実施形態において、ペイロードは、種々の有機小分子、無機化合物、ナノ粒子、酵素もしくは酵素基質、蛍光物質、発光物質（例えば、ルミノール）、生物発光物質（例えば、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびイクオリン）、化学発光物質、放射性物質（例えば、１８Ｆ、６７Ｇａ、８１ｍＫｒ、８２Ｒｂ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１３３Ｘｅ、２０１Ｔｌ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、３Ｈ、またはｒ９９ｍＴｃ（例えば、過テクネチウム酸塩（テクネチウム酸塩（ＶＩＩ）、ＴｃＯ４−として）、および造影剤（例えば、金（例えば、金ナノ粒子）、ガドリニウム（例えば、キレート化Ｇｄ）、酸化鉄（例えば、超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯ）、単結晶酸化鉄ナノ粒子（ＭＩＯＮ）、および極小超常磁性酸化鉄（ＵＳＰＩＯ）、マンガンキレート（例えば、Ｍｎ−ＤＰＤＰ）、硫酸バリウム、ヨード系造影剤媒体（イオヘキソール（Ｉｏｈｅｘｏｌ））、微小気泡、またはペルフルオロ炭素）等の検出可能な薬剤であり得る。そのような光検出可能な標識には、例えば、制限なく、４−アセトアミド−４’−イソチオシアン酸スチルベン−２，２’ジスルホン酸；アクリジンおよび誘導体（例えば、アクリジンおよびアクリジンイソチオシアネート）；５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）；４−アミノ−Ｎ−［３−ビニルスルホニル）フェニル］ナフタルイミド−３，５ジスルホン酸塩；Ｎ−（４−アニリノ−１−ナフチル）マレイミド；アントラニルアミド；ＢＯＤＩＰＹ；ブリリアントイエロー；クマリンおよび誘導体（例えば、クマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ、クマリン１２０）、および７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（クマリン１５１）；シアニン色素；シアノシン；４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）；５’５”−ジブロモピロガロール−スルホナフタレン（ｎａｐｈｔｈａｌｅｉｎ）（ブロモピロガロールレッド）；７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアン酸フェニル）−４−メチルクマリン；ジエチレントリアミン五酢酸塩；４，４’−ジイソチオシアン酸ジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸；４，４’−ジイソチオシアン酸スチルベン−２，２’−ジスルホン酸；５−［ジメチルアミノ］−ナフタレン−１−スルホニルクロリド（ＤＮＳ、ダンシルクロリド）；４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）；エオシンおよび誘導体（例えば、エオシンおよびエオシンイソチオシアネート）；エリスロシンおよび誘導体（例えば、エリスロシンＢおよびエリスロシンイソチオシアネート）；エチジウム；フルオロセインおよび誘導体（例えば、５−カルボキシフルオロセイン（ＦＡＭ）、５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオロセイン（ＤＴＡＦ）、２’，７’−ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオロセイン、フルオロセイン、フルオロセインイソチオシアネート、Ｘ−ローダミン−５−（および−６）−イソチオシアネート（ＱＦＩＴＣまたはＸＲＩＴＣ）、およびフルオレスカミン）；２−［２−［３−［［１，３−ジヒドロ−１，１−ジメチル−３−（３−スルホプロピル）−２Ｈ−ベンズ［ｅ］インドール−２−イリデン］エチリデン］−２−［４−（エトキシカルボニル）−１−ピペラジニル］−１−シクロペンテン−１−イル］エテニル］−１，１−ジメチル−３−（３−スルホプロピル（ｓｕｌｆｏｒｐｒｏｐｙｌ））−１Ｈ−ベンズ［ｅ］インドリウム水酸化物、分子内塩、ｎ，ｎ−ジエチルエタンアミン（１：１）（ＩＲ１４４）との化合物；５−クロロ−２−［２−［３−［（５−クロロ−３−エチル−２（３Ｈ）−ベンゾチアゾール−イリデン）エチリデン］−２−（ジフェニルアミノ）−１−シクロペンテン−１−イル］エテニル］−３−エチルベンゾチアゾリウム過塩素酸塩（ＩＲ１４０）；マラカイトグリーンイソチオシアネート；４−メチルウンベリフェロンオルトクレゾールフタレイン；ニトロチロシン；パラローザニリン；フェノールレッド；Ｂ−フィコエリトリン；ｏ−フタルジアルデヒド；ピレンおよび誘導体（例えば、ピレン、酪酸ピレン、およびスクシンイミジル１−ピレン）；酪酸塩量子ドット；リアクティブレッド４（ＣＩＢＡＣＲＯＮ（商標）ブリリアントレッド３Ｂ−Ａ）；ローダミンおよび誘導体（例えば、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、リサミンローダミンＢスルホニルクロリドローダミン（ｒｈｏｄａｒｎｉｎｅ）（Ｒｈｏｄ）、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸイソチオシアネート、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１、スルホローダミン１０１のスルホニルクロリド誘導体（テキサスレッド）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）テトラメチルローダミン、およびテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）；リボフラビン；ロゾール酸；テルビウムキレート誘導体；シアニン−３（Ｃｙ３）；シアニン−５（Ｃｙ５）；シアニン−５．５（Ｃｙ５．５）、シアニン−７（Ｃｙ７）；ＩＲＤ  ７００；ＩＲＤ  ８００；Ａｌｅｘａ  ６４７；Ｌａ  Ｊｏｌｔａ  Ｂｌｕｅ；フタロシアニン；ならびにナフタロシアニンが含まれる。
【０５３２】
いくつかの実施形態において、検出可能な薬剤は、活性化されると検出可能となる、検出不可能な前駆体（例えば、蛍光発生テトラジン−フルオロフォア構築物（例えば、テトラジン−ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、テトラジン−オレゴングリーン４８８、またはテトラジン−ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ−Ｘ）、または酵素により活性化可能な蛍光発生剤（例えば、ＰＲＯＳＥＮＳＥ（登録商標）（ＶｉｓＥｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ））であってもよい。酵素標識組成物が使用され得るインビトロアッセイには、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降アッセイ、免疫蛍光法、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、およびウェスタンブロット分析が含まれるが、これらに限定されない。
【０５３３】
組み合わせ
シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、１つ以上の他の治療剤、予防剤、診断剤、または撮像剤と組み合わせて使用されてもよい。「と組み合わせて」とは、薬剤が同時に投与されるかつ／または一緒に送達するために製剤化される必要があることを暗示するようには意図さないが、これらの送達方法は、本開示の範囲内にある。組成物は、１つ以上の他の所望の治療薬または医療処置と並行して、その前に、またはその後に投与することができる。一般に、各薬剤は、その薬剤のために決定された用量でおよび／または時間スケジュールに基づいて投与されるであろう。いくつかの実施形態において、本開示は、薬学的、予防的、診断的、または撮像組成物を、それらの生体利用能を改善し、それらの代謝を低減および／もしくは修飾し、それらの排泄を阻害し、かつ／またはそれらの体内分布を修飾し得る薬剤と組み合わせて、送達することを包含する。非限定的な例として、シグナルセンサー核酸またはｍｍＲＮＡは、癌の治療のためまたは過剰増殖性細胞を制御するための医薬品と組み合わせて使用されてもよい。参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許第７，９６４，５７１号において、リポポリマーとともにインターロイキン−１２をコードするＤＮＡプラスミドを含む薬学的組成物を使用し、また少なくとも１つの抗癌剤または化学療法剤を投与する、原発性または転移性固形腫瘍の治療のための併用療法が記載される。さらに、抗増殖性分子をコードする本発明のシグナルセンサー核酸およびｍｍＲＮＡは、リポポリマーとともに薬学的組成物中にあってもよい（例えば、抗増殖性分子をコードするＤＮＡプラスミドおよびリポポリマーを含む薬学的組成物を特許請求する、参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第２０１１０２１８２３１号を参照のこと）、それは少なくとも１つの化学療法剤または抗癌剤とともに投与され得る。
【０５３４】
投薬
本発明は、本発明に従う修飾ｍＲＮＡおよびそれらのコードされたタンパク質または複合体をそれを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。核酸、タンパク質、もしくは複合体、またはその薬学的、画像化、診断的、もしくは予防的組成物は、疾患、障害、および／または状態（例えば、記憶障害の取り組みに関連した疾患、障害、および／または状態）の予防、治療、診断、または画像化に有効な任意の量および任意の投与経路を用いて対象に投与することができる。必要とされる正確な量は、対象の種、年齢、および全身状態、疾患の重症度、特定の組成物、その投与方法、その活性方法等に応じて、対象によって異なる。本発明に従う組成物は、投与を容易にし、かつ投薬量を均一にするために、典型的には、単位剤形で製剤化される。しかしながら、本発明の組成物の総１日使用量は、適切な医学的判断の範囲内で担当医によって決定されてもよいことが理解される。任意の特定の患者の特定の治療上有効、予防上有効、または適切な画像化用量レベルは、治療される障害および障害の重症度；用いられる特定の化合物の活性；用いられる特定の組成物；患者の年齢、体重、全体的な健康状態、性別、および食生活；投与時間、投与経路、および用いられる特定の化合物の排泄速度；治療の持続期間；用いられる特定の化合物と組み合わせて、またはそれと同時に使用される薬物；医学分野で周知の要素等を含む様々な要素に依存する。
【０５３５】
ある特定の実施形態において、本発明に従う組成物は、所望の治療的、診断的、予防的、または画像効果を得るために、１日当たり約０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約０．００５ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、または約１ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇ（対象の体重）を１日１回以上送達するのに十分な投薬量レベルで投与され得る。所望の投薬量は、１日３回、１日２回、１日１回、１日おきに、２日おきに、週１回、２週間に１回、３週間に１回、または４週間に１回送達されてもよい。ある特定の実施形態において、所望の投薬量は、複数回の投与（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回以上の投与）によって送達されてもよい
【０５３６】
本発明に従って、分割用量レジメンでのｍｍＲＮＡの投与が哺乳類対象においてより高いレベルのタンパク質を産生することが見出されている。本明細書で使用されるとき、「分割用量」とは、単回単位用量または総１日用量の２つ以上の用量、例えば、単回単位用量の２回以上の投与への分割である。本明細書で使用されるとき、「単回単位用量」とは、１回用量で／一度に／単一経路で／単一接触点で、すなわち、単回投与事象で投与される任意の治療薬の用量である。本明細書で使用されるとき、「総１日用量」は、２４時間内に所与または処方される量である。これは、単回単位用量として投与されてもよい。一実施形態において、本発明のｍｍＲＮＡは、分割用量で対象に投与される。ｍｍＲＮＡは、緩衝液のみまたは本明細書に記載の製剤中で製剤化されてもよい。
【０５３７】
剤形
本明細書に記載の薬学的組成物は、局所、鼻腔内、気管内、または注入用（例えば、静脈内、眼内、硝子体内、筋肉内、心臓内、腹腔内、皮下）等の本明細書に記載の剤形に製剤化され得る。
【０５３８】
液体剤形
非経口投与用の液体剤形には、薬学的に許容されるエマルション、マイクロエマルション、溶液、懸濁液、シロップ、および／またはエリキシルが含まれるが、これらに限定されない。活性成分に加えて、液体剤形は、水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（具体的には、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ソルビタンポリエチレングリコールおよび脂肪酸エステル、ならびにこれらの混合物を含むが、これらに限定されない当技術分野で一般に使用される不活性希釈剤を含んでもよい。非経口投与についてのある特定の実施形態において、組成物は、可溶化剤、例えば、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ（登録商標）、アルコール、油、修飾油、グリコール、ポリソルベート、シクロデキストリン、ポリマー、および／またはこれらの組み合わせと混合されてもよい。
【０５３９】
注入物
注入用調製物、例えば、滅菌注入用水性または油性懸濁液は、既知の技術に従って製剤化されてもよく、好適な分散化剤、湿潤剤、および／または懸濁化剤を含んでもよい。滅菌注入用調製物は、非毒性の非経口的に許容される希釈剤および／または溶媒、例えば、１，３−ブタンジオール溶液中の滅菌注入用溶液、懸濁液、および／またはエマルションであり得る。用いられ得る許容されるビヒクルおよび溶媒の中には、水、リンガー溶液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．、および等張性塩化ナトリウム溶液が含まれるが、これらに限定されない。無刺激固定油が溶媒または懸濁化媒体として慣習的に用いられる。この目的のために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む任意の無刺激固定油が用いられ得る。オレイン酸等の脂肪酸が注入物の調製において使用され得る。
【０５４０】
注入用製剤は、例えば、細菌保持フィルターを通した濾過によって、かつ／または使用前に滅菌剤を滅菌水または他の滅菌注入用媒体中に溶解もしくは分散され得る滅菌固体組成物の形態で組み込むことによって滅菌され得る。
【０５４１】
活性成分の効果を長引かせるために、皮下または筋肉内注入からの活性成分の吸収を遅延させることが所望され得る。これは、水への溶解度が低い結晶質または非晶質材料の液体懸濁液の使用によって遂行されてもよい。その後、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの吸収速度は、その溶解速度に依存し、次いで、結晶の大きさおよび結晶形態に依存し得る。あるいは、非経口的に投与されたシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの遅延吸収は、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを油ビヒクル中に溶解または懸濁させることによって遂行され得る。注入用デポー形態は、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡのマイクロカプセルマトリックスを、ポリラクチド−ポリグリコリド等の生分解性ポリマー中に形成することによって作製される。シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡとポリマーとの比率、および用いられる特定のポリマーの性質に応じて、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの放出速度を調節することができる。他の生分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が挙げられるが、これらに限定されない。デポー注入用製剤は、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを、身体組織と適合性のリポソームまたはマイクロエマルション中に封入することによって調製されてもよい。
【０５４２】
肺
肺送達に有用であるとして本明細書に記載される製剤は、薬学的組成物の鼻腔内送達にも使用され得る。鼻腔内投与に好適な別の製剤は、活性成分を含み、約０．２μｍ〜５００μｍの平均粒子を有する粗粉であってもよい。そのような製剤は、鼻からの吸入が行われる様態で、すなわち鼻に近接して保持された粉末の容器からの鼻孔を通じた急速な吸入によって投与されてもよい。
【０５４３】
経鼻投与に好適な製剤は、例えば、最少約０．１ｗ／ｗ％〜最大１００ｗ／ｗ％の活性成分を含んでもよく、本明細書に記載のさらなる成分のうちの１つ以上を含んでもよい。薬学的組成物は、頬側投与に好適な製剤中に調製され、パッケージ化され、かつ／または販売されてもよい。そのような製剤は、例えば、従来の方法を用いて作製される錠剤および／またはロゼンジの形態であってもよく、例えば、約０．１ｗ／ｗ％〜２０ｗ／ｗ％の活性成分を含有してもよく、この平衡物は、経口溶解性および／または分解性組成物と、任意に、本明細書に記載のさらなる成分のうちの１つ以上とを含んでもよい。代わりに、頬側投与に好適な製剤は、活性成分を含む、粉末ならびに／またはエアロゾル化および／もしくは微粒化溶液および／もしくは懸濁液を含んでもよい。そのような粉末化、エアロゾル化、および／またはエアロゾル化製剤は、分散されるとき、約０．１ｎｍ〜約２００ｎｍの範囲の平均粒径および／または液滴径を有し得、本明細書に記載の任意のさらなる成分のうちの１つ以上をさらに含んでもよい。
【０５４４】
医薬品の製剤および／または製造における一般の考慮事項は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ２１ｓｔｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５において見出され得る（参照により本明細書に組み込まれる）。
【０５４５】
コーティング剤またはシェル
錠剤、糖衣錠、カプセル、丸剤、および顆粒の固体剤形を、コーティング剤およびシェル、例えば、腸溶性コーティング剤および医薬品製剤化分野で周知の他のコーティング剤で調製することができる。それらは、任意に、乳白剤を含んでもよく、それらが、腸管のある特定の部分において、任意に、遅延様式で、活性成分（複数可）のみを放出するか、またはそれを優先的に放出する組成物であり得る。使用することができる包埋組成物の例としては、ポリマー物質およびワックスが挙げられる。同様の種類の固体組成物は、そのような賦形剤をラクトースまたは乳糖、ならびに高分子量ポリエチレングリコール等として使用した軟質および硬質充填ゼラチンカプセル中の充填剤として用いてもよい。
【０５４６】
薬学的組成物の特性
本明細書に記載の薬学的組成物は、生物学的利用能、治療域、および／または分布量のうちの１つ以上によって特徴付けられ得る。
【０５４７】
生物学的利用能
シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、本明細書に記載の送達剤で組成物に製剤化されるとき、本明細書に記載の送達剤を欠いた組成物と比較して、生物学的利用能の増加を呈し得る。本明細書で使用されるとき、「生物学的利用能」という用語は、哺乳動物に投与されるシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの所与の量の全身利用能を指す。生物学的利用能は、化合物を哺乳動物に投与した後に、変化していない形態の化合物の曲線下面積（ＡＵＣ）または最大血清または血漿濃度（Ｃｍａｘ）を測定することによって評価され得る。ＡＵＣは、縦座標（Ｙ軸）に沿った化合物の血清または血漿濃度を横座標（Ｘ軸）に沿った時間に対してプロットした曲線下面積の決定である。一般に、特定の化合物のＡＵＣは、当業者に既知の方法、および参照により本明細書に組み込まれるＧ．Ｓ．Ｂａｎｋｅｒ，Ｍｏｄｅｒｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，Ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｖ．７２，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｉｎｃ．，１９９６に記載の方法を用いて算出され得る。
【０５４８】
Ｃｍａｘ値は、化合物を哺乳動物に投与した後に哺乳動物の血清または血漿において達成される化合物の最大濃度である。特定の化合物のＣｍａｘ値は、当業者に既知の方法を用いて測定され得る。「生物学的利用能の増加」または「薬物動態の改善」という表現は、哺乳動物においてＡＵＣ、Ｃｍａｘ、またはＣｍｉｎとして測定された第１のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの全身利用能が、本明細書に記載の送達剤と共投与された場合、本明細書に記載の送達剤との共投与が行われない場合よりも高いことを意味する。いくつかの実施形態において、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの生物学的利用能は、少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％増加し得る。
【０５４９】
治療域
シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、本明細書に記載の送達剤で組成物に製剤化されるとき、本明細書に記載の送達剤を欠いた投与されたシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡ組成物の治療域と比較して、投与されたシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡ組成物の治療域の増加を呈し得る。本明細書で使用されるとき、「治療域」は、治療的効果を誘発する可能性の高い、血漿濃度の範囲、または作用部位における治療上活性物質のレベルの範囲を指す。いくつかの実施形態において、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの治療域は、本明細書に記載の送達剤と共投与されるとき、少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％増加し得る。
【０５５０】
分布量
シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、本明細書に記載の送達剤で組成物に製剤化されるとき、本明細書に記載の送達剤を欠いた組成物と比較して、分布量（Ｖｄｉｓｔ）の改善、例えば、低減または標的化を呈し得る。分布量（Ｖｄｉｓｔ）は、体内の薬物の量を血液または血漿中の薬物の濃度と関連付ける。本明細書で使用されるとき、「分布量」という用語は、血液または血漿中の濃度と同一の濃度で体内の薬物の総量を含有するよう要求される液量を指し、Ｖｄｉｓｔは、体内の薬物の量／血液または血漿中の薬物の濃度に等しい。例えば、用量１０ｍｇおよび血漿濃度１０ｍｇ／Ｌの場合、分布量は、１リットルである。分布量は、薬物が血管外組織に存在する程度を反映する。大量の分布量は、血漿タンパク質結合と比較して組織構成成分に結合する化合物の傾向を反映する。臨床現場において、Ｖｄｉｓｔを用いて負荷用量を決定し、定常状態濃度を達成することができる。いくつかの実施形態において、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの分布量は、本明細書に記載の送達剤と共投与されるとき、少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％減少し得る。
【０５５１】
生物学的効果
一実施形態において、動物に送達されるシグナルセンサー修飾ｍＲＮＡの生物学的効果は、動物におけるタンパク質発現を分析することによって分類され得る。タンパク質発現は、本発明のシグナルセンサー修飾ｍＲＮＡを投与した哺乳動物から収集された生体試料を分析することによって決定され得る。一実施形態において、哺乳動物に投与されるシグナルセンサー修飾ｍＲＮＡによってコードされた少なくとも５０ｐｇ／ｍＬの発現タンパク質が好ましくあり得る。例えば、哺乳動物に送達されるシグナルセンサー修飾ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の５０〜２００ｐｇ／ｍＬの発現タンパク質が、哺乳動物における治療上有効量のタンパク質と見なされ得る。
【０５５２】
質量分析による修飾核酸の検出
質量分析（ＭＳ）は、分子のイオン変換後の分子の構造質量および分子量／濃度情報を提供することができる分析的技法である。分子は、最初に、イオン化されて正電荷または負電荷を得て、次いで、それらは、質量分析器を通って移動して、それらの質量／電荷（ｍ／ｚ）比に従って検出器の異なる領域に到達する。
【０５５３】
質量分析は、分画された試料をイオン化し、かつさらなる分析のために荷電分子を作成するためのイオン源を含む質量分析計を用いて行われる。例えば、試料のイオン化は、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）、光イオン化、電子イオン化高速原子衝撃（ＦＡＢ）／液体二次イオン化（ＬＳＩＭＳ）、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）、電界イオン化、電界脱離、サーモスプレー／血漿スプレーイオン化、および粒子ビームイオン化によって実施され得る。当業者であれば、イオン化方法の選択が、測定される分析物、試料の種類、検出器の種類、正モードと負モードの選択等に基づいて決定され得ることを理解する。
【０５５４】
試料がイオン化された後、その結果作成される正電荷イオンまたは負電荷イオンが分析されて、質量対電荷比（すなわち、ｍ／ｚ）を決定することができる。質量対電荷比の決定に好適な分析器には、四重極分析器、イオントラップ分析器、および飛行時間分析器が含まれる。イオンは、いくつかの検出モードを用いて検出され得る。例えば、選択されたイオンは、検出され得る（すなわち、選択的イオン監視モード（ＳＩＭ）を用いて）か、またはあるいは、イオンは、走査モード、例えば、多重反応監視（ＭＲＭ）もしくは選択反応監視（ＳＲＭ）を用いて検出され得る。
【０５５５】
ペプチド標準物の安定した同位体標識化希釈と連動した液体クロマトグラフィー−多重反応監視（ＬＣ−ＭＳ／ＭＲＭ）が、タンパク質の検証に有効な方法であることが示されている（例えば、Ｋｅｓｈｉｓｈｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ２００９  ８：２３３９−２３４９、Ｋｕｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ２００９  ５５：１１０８−１１１７、Ｌｏｐｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ
Ｃｈｅｍ  ２０１０  ５６：２８１−２９０）。バイオマーカー発見の研究で頻繁に用いられる標的化されていない質量分析とは異なり、標的化されたＭＳ方法は、計器の完全な分析能力を複合体混合物中の何十〜何百もの選択されたペプチドに集中させるＭＳのペプチド配列に基づくモードである。検出および断片化を目的とするタンパク質に由来するペプチドのみに制限することによって、感受性および再現性は、発見モードのＭＳ方法と比較して劇的に改善される。このタンパク質の質量分析に基づく多重反応監視（ＭＲＭ）定量化方法は、臨床試料の迅速な標的化された多重化タンパク質発現プロファイリングを介してバイオマーカーの発見および定量化に劇的に影響を与えることができる。
【０５５６】
一実施形態において、本発明の少なくとも１つの修飾ｍＲＮＡによってコードされる少なくとも１つのタンパク質を含有し得る生体試料は、ＭＲＭ−ＭＳ法によって分析され得る。生体試料の定量化は、内部標準物として同位体標識ペプチドまたはタンパク質をさらに含むことができるが、これらに限定されない。
【０５５７】
本発明に従って、生体試料は、対象から得られた時点で、酵素消化に供されてもよい。本明細書で使用されるとき、「消化」という用語は、より短いペプチドに分裂することを意味する。本明細書で使用されるとき、「タンパク質を消化するために試料を処理する」という表現は、試料中のタンパク質を解体するような方法で試料を操作することを意味する。これらの酵素には、トリプシン、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ、およびキモトリプシンが含まれるが、これらに限定されない。一実施形態において、本発明の少なくとも１つの修飾ｍＲＮＡによってコードされる少なくとも１つのタンパク質を含有し得る生体試料は、酵素を用いて消化され得る。
【０５５８】
一実施形態において、本発明の修飾ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質を含有し得る生体試料は、エレクトロスプレーイオン化を用いてタンパク質について分析され得る。エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）質量分析（ＥＳＩＭＳ）は、それらが質量分析によって分析される前に溶液から気相へのイオンの移動を支援するために電気的エネルギーを用いる。試料は、当技術分野で既知の方法を用いて分析され得る（例えば、Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｒｅｖ．２００３  ２４（１）：３−１２）。溶液に含有されるイオン種は、液滴の微粒スプレーを分散させ、溶媒を蒸発させ、高度に帯電した液滴の噴霧を生成するためにイオンを液滴から排出させることによって気相に移動し得る。高度に帯電した液滴の噴霧は、四重極質量分析器等であるが、これに限定されない、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つの質量分析器を用いて分析され得る。さらに、質量分析法には、精製ステップが含まれ得る。非限定的な例として、第１の四重極は、単一ｍ／ｚ比を選択するように設定されてもよく、従って、異なるｍ／ｚ比を有する他の分子イオンを濾去することができ、これは、ＭＳ分析前に複雑で時間のかかる試料精製手順を排除し得る。
【０５５９】
一実施形態において、本発明の修飾ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質を含有し得る生体試料は、タンデムＥＳＩＭＳ系（例えば、ＭＳ／ＭＳ）において、タンパク質について分析され得る。非限定的な例として、液滴は、産物スキャン（もしくは娘スキャン）、前駆体スキャン（親スキャン）、中性損失、または多重反応監視を用いて分析され得る。
【０５６０】
一実施形態において、本発明の修飾ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質を含有し得る生体試料は、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析（ＭＡＬＤＩＭＳ）を用いて分析され得る。ＭＡＬＤＩは、タンパク質等の巨大分子および小分子の両方の非破壊蒸発およびイオン化を提供する。ＭＡＬＤＩ分析において、分析物は、最初に、紫外線吸収弱有機酸も含み得るが、これに限定されない高モル過剰のマトリックス化合物と共結晶化される。ＭＡＬＤＩに用いられるマトリックスの非限定的な例としては、a−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸、３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシ桂皮酸、および２，５−ジヒドロキシ安息香酸がある。分析物−マトリックス混合物のレーザー放射は、マトリックスおよび分析物の蒸発をもたらし得る。レーザー誘起脱離は、無傷の分析物の高イオン収率を提供し、高精度の化合物の測定を可能にする。試料は、当技術分野で既知の方法を用いて分析され得る（例えばＬｅｗｉｓ，Ｗｅｉ  ａｎｄ  Ｓｉｕｚｄａｋ，Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０００：５８８０−５８９４）。非限定的な例として、ＭＡＬＤＩ分析に用いられる質量分析器には、線形飛行時間（ＴＯＦ）、ＴＯＦリフレクトロン、またはフーリエ変換質量分析器が含まれ得る。
【０５６１】
一実施形態において、分析物−マトリックス混合物は、乾燥液滴法を用いて形成され得る。生体試料は、マトリックスと混合されて飽和マトリックス溶液を作成し、マトリックスと試料の比率は、およそ５０００：１である。その後、一定分量（およそ０．５〜２．０μＬ）の飽和マトリックス溶液が、乾燥させられて分析物−マトリックス混合物を形成する。
【０５６２】
一実施形態において、分析物−マトリックス混合物は、薄層法を用いて形成され得る。マトリックス均質薄膜が最初に形成され、その後、その試料が適用され、マトリックスによって吸収されて分析物−マトリックス混合物を形成し得る。
【０５６３】
一実施形態において、分析物−マトリックス混合物は、厚層法を用いて形成され得る。マトリックス均質薄膜は、ニトロ−セルロースマトリックス添加剤で形成される。均一なニトロ−セルロースマトリックス層が得られた時点で、試料が適用され、マトリックスに吸収されて、分析物−マトリックス混合物を形成する。
【０５６４】
一実施形態において、分析物−マトリックス混合物は、サンドイッチ法を用いて形成され得る。マトリックス結晶の薄層が、薄層法にあるように調製され、その後、水性トリフルオロ酢酸、試料、およびマトリックスの液滴が添加される。その後、試料はマトリックスに吸収されて、分析物−マトリックス混合物を形成する。
【０５６５】
Ｖ．本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡの使用
本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡは、好ましい実施形態において、免疫応答および／もしくは分解経路等の有害な生体応答の回避（ａｖｏｉｄａｎｃｅ）もしくは回避（ｅｖａｓｉｏｎ）、発現の閾値の克服および／もしくはタンパク質産生能力の改善、改善された発現率もしくは翻訳効率、改善された薬物もしくはタンパク質半減期および／もしくはタンパク質濃度、最適化されたタンパク質局在化を提供して、組織内の安定性および／もしくはクリアランス、受容体による取り込みおよび／もしくは動態、組成物による細胞到達、翻訳機構との関わり、分泌効率（該当する場合）、血液循環への到達可能性、ならびに／または細胞の状態、機能、および／もしくは活性の調節のうちの１つ以上を改善するように設計される。
【０５６６】
治療薬
治療剤
本明細書に記載される、修飾核酸および修飾ＲＮＡ等の本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡ、ならびにそれらから翻訳されるタンパク質は、治療剤または予防剤として使用することができる。それらは、医薬において使用するために提供される。例えば、本明細書に記載のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、対象に投与することができ、このシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、インビボで翻訳されて、対象において治療的または予防的腫瘍学関連ポリペプチドを産生する。ヒトおよび他の哺乳動物における疾患または状態の診断、治療、または予防のための組成物、方法、キット、および試薬が提供される。本発明の活性治療剤は、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはｍｍＲＮＡ、ポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはｍｍＲＮＡを含有する細胞、またはシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡから翻訳されるポリペプチドを含む。
【０５６７】
ある特定の実施形態において、抗体依存性細胞傷害性を誘導するタンパク質とともに、哺乳類対象の免疫性を後押しするタンパク質（単数または複数）をコードする翻訳可能領域を含有する、１つ以上のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを含有する、組み合わせ治療薬が本明細書に提供される。
【０５６８】
本明細書に記載のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを用いて、細胞集団内で組換えポリペプチドの翻訳を誘導する方法が、本明細書に提供される。そのような翻訳は、インビボ、エクスビボ、培養下、またはインビトロであり得る。細胞集団は、少なくとも１つのヌクレオシド修飾および組換え腫瘍学関連ポリペプチドをコードする翻訳可能領域を有するシグナルセンサー核酸を含有する有効量の組成物と接触させられる。集団は、シグナルセンサー核酸が細胞集団の１つ以上の細胞内に局在化され、組換え腫瘍学関連ポリペプチドが細胞内でシグナルセンサー核酸から翻訳されるような条件下で接触させられる。
【０５６９】
組成物の「有効量」は、少なくとも部分的に、標的組織、標的細胞型、投与手段、核酸の物理的特徴（例えば、サイズ、および修飾ヌクレオシドの程度）、および他の決定因子に基づいて提供される。一般に、有効量の組成物は、細胞内での効率的な、好ましくは対応する未修飾核酸を含有する組成物よりも効率的な、タンパク質産生を提供する。増加した効率は、増加した細胞形質移入（すなわち、核酸で形質移入された細胞の割合（％））、核酸からの増加したタンパク質翻訳、減少した核酸分解（例えば、修飾核酸からのタンパク質翻訳の増加した持続期間によって実証される）、または宿主細胞の低減された自然免疫応答によって実証され得る。
【０５７０】
本発明の態様は、必要性のある哺乳類対象において組換えポリペプチドのインビボ翻訳を誘導する方法を対象とする。その中で、少なくとも１つの構造修飾または化学修飾および組換えポリペプチドをコードする翻訳可能領域を有する核酸を含有する、有効量の組成物が、本明細書に記載の送達方法を用いて対象に投与される。核酸は、核酸が対象の細胞内に局在化され、組換えポリペプチドが細胞内で核酸から翻訳されるような量および他の条件下で提供される。核酸が局在化される細胞、または細胞が存在する組織は、１周期以上の核酸投与により標的とされ得る。
【０５７１】
ある特定の実施形態において、投与されるシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、組換え腫瘍学関連ポリペプチドが翻訳される細胞、組織、または生物内で実質的に不在である機能的活性を提供する、１つ以上の組換えポリペプチドの産生を指示する。例えば、欠損した機能的活性は、酵素的活性、構造的活性、または遺伝子調節活性の性質を有し得る。関連する実施形態において、投与されるシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、組換え腫瘍学関連ポリペプチドが翻訳される細胞内に存在しているが、実質的に不全である機能的活性を増加させる（例えば、相乗的に）、１つ以上の組換え腫瘍学関連ポリペプチドの産生を指示する。
【０５７２】
他の実施形態において、投与されるシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、組換え腫瘍学関連ポリペプチドが翻訳される細胞内で実質的に不在である１つの腫瘍学関連ポリペプチド（または複数の腫瘍学関連ポリペプチド）を置き換える、１つ以上の組換えポリペプチドの産生を指示する。そのような不在性は、コード遺伝子の遺伝子突然変異またはその調節経路に起因し得る。いくつかの実施形態において、組換え腫瘍学関連ポリペプチドは、細胞内の内因性腫瘍学関連タンパク質のレベルを所望のレベルまで増加させ、そのような増加は、内因性腫瘍学関連タンパク質のレベルを正常未満のレベルから正常なレベルへと、または正常なレベルから過正常なレベルへと至らせ得る。
【０５７３】
あるいは、組換え腫瘍学関連ポリペプチドは、細胞内に存在する、最上の表面上にある、または細胞から分泌される内因性タンパク質の活性に拮抗するように機能する。通常、内因性腫瘍学関連タンパク質の活性は、例えば、内因性腫瘍学関連タンパク質の突然変異が変化した活性または局在化をもたらすことに起因して、対象に有害である。さらに、組換え腫瘍学関連ポリペプチドは、細胞内に存在する、最上の表面上にある、または細胞から分泌される生体部分の活性に、直接的または間接的に拮抗する。拮抗対象の生体部分の例としては、脂質（例えば、コレステロール）、リポタンパク質（例えば、低比重リポタンパク質）、核酸、炭水化物、志賀毒素および破傷風毒素等のタンパク質毒素、またはボツリヌス毒素、コレラ毒素、およびジフテリア毒素等の小分子毒素が挙げられる。さらに、拮抗対象の生物学的分子は、細胞傷害性活性または細胞増殖抑制性活性等の望ましくない活性を示す内因性タンパク質である場合がある。
【０５７４】
本明細書に記載の組換え腫瘍学関連タンパク質は、細胞内、可能性としては核等の特定の区画内での局在化のために操作されてもよく、または細胞からの分泌もしくは細胞の原形質膜への移行のために操作される。
【０５７５】
いくつかの実施形態において、本発明に従った修飾シグナルセンサーｍＲＮＡおよびそのコードされた腫瘍学関連ポリペプチドを本明細書に記載される様々な疾患、障害、および／または状態のいずれかの治療のために使用され得る。
【０５７６】
腫瘍学関連の適用
一実施形態において、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物および／またはｍｍＲＮＡを、がん、がん関連および／またはがん治療関連障害、副作用および／または状態の治療、管理、特徴づけおよび／または診断に使用し得る。そのような疾患、障害および状態には、副腎皮質癌、進行癌、肛門癌、再生不良性貧血、胆管癌、膀胱癌、骨がん、骨転移、脳腫瘍、脳がん、乳癌、小児癌、原発不明のがん、キャッスルマン病、子宮頸癌、大腸／直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、ユーイング腫瘍、眼癌、卵管癌、胆嚢癌、胃腸カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、ホジキン病、カポジ肉腫、腎細胞癌、喉頭および下咽頭癌、急性リンパ性白血病、急性骨髄白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄単球性白血病、肝臓癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、肺カルチノイド腫瘍、皮膚のリンパ腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔および副鼻腔癌、鼻咽腔癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、口腔および中咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、陰茎癌、下垂体部腫瘍、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、成人軟組織の肉腫、基底および扁平細胞皮膚癌、黒色腫、小腸癌、胃癌、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宮肉腫、膣癌、外陰癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。
【０５７７】
別の実施形態では、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物および／またはｍｍＲＮＡを、ケモブレイン（ｃｈｅｍｏ  ｂｒａｉｎ）、末梢性ニューロパシー、疲労、鬱、吐き気および嘔吐、痛み、貧血、リンパ浮腫、感染症、がん治療によって引き起こされる二次発癌、性的副作用、妊孕能の低下または不妊症、オストミー、不眠症および脱毛といった、少なくとも１つのがん関連またはがん治療関連障害、副作用または状態の治療、管理および操作に使用され得る。
【０５７８】
一実施形態において、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物および／またはｍｍＲＮＡを用いて、対象のがんの少なくとも１つの症状の効果を低減し得る。症状としては、脱力感、疼痛および痛み、熱、疲労、体重減少、血液凝固、血液のカルシウム量の上昇、白血球数の低下、息切れ、めまい、頭痛、色素沈着過剰、黄疸、紅斑症、そう痒症、多毛症、排便習慣の変化、膀胱機能の変化、永続的な潰瘍、口内の白い斑点、舌上の白点、異常な出血または排泄、身体部分の肥大またはこぶ、消化不良、呑み込みにくさ、いぼまたはほくろの変化、新しい皮膚の変化ならびにしつこい咳またはしわがれ声が挙げられ得るが、これらに限定しない。
【０５７９】
一実施形態において、シグナルセンサーポリヌクレオチドを、任意の数のがん細胞または正常な細胞株で調査し得る。これらの調査で有用であり得る細胞株の非制限的な例としては、ＭＲＣ−５、Ａ５４９、Ｔ８４、ＮＣＩ−Ｈ２１２６［Ｈ２１２６］、ＮＣＩ−Ｈ１６８８［Ｈ１６８８］、ＷＩ−３８、ＷＩ−３８ＶＡ−１３亜系統２ＲＡ、ＷＩ−２６ＶＡ４、Ｃ３Ａ［ＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ、ＨｅｐＧ２の誘導体（ＡＴＣＣＨＢ−８０６５）］、ＴＨＬＥ−３、Ｈ６９ＡＲ、ＮＣＩ−Ｈ２９２［Ｈ２９２］、ＣＦＰＡＣ−１、ＮＴＥＲＡ−２ｃｌ．Ｄ１［ＮＴ２／Ｄ１］、ＤＭＳ７９、ＤＭＳ５３、ＤＭＳ１５３、ＤＭＳ１１４、ＭＳＴＯ−２１１Ｈ、ＳＷ１５７３［ＳＷ−１５７３、ＳＷ１５７３］、ＳＷ１２７１［ＳＷ−１２７１、ＳＷ１２７１］、ＳＨＰ−７７、ＳＮＵ−３９８、ＳＮＵ−４４９、ＳＮＵ−１８２、ＳＮＵ−４７５、ＳＮＵ−３８７、ＳＮＵ−４２３、ＮＬ２０、ＮＬ２０−ＴＡ［ＮＬ２０Ｔ−Ａ］、ＴＨＬＥ−２、ＨＢＥ１３５−Ｅ６Ｅ７、ＨＣＣ８２７、ＨＣＣ４００６、ＮＣＩ−Ｈ２３［Ｈ２３］、ＮＣＩ−Ｈ１２９９、ＮＣＩ−Ｈ１８７［Ｈ１８７］、ＮＣＩ−Ｈ３５８［Ｈ−３５８、Ｈ３５８］、ＮＣＩ−Ｈ３７８［Ｈ３７８］、ＮＣＩ−Ｈ５２２［Ｈ５２２］、ＮＣＩ−Ｈ５２６［Ｈ５２６］、ＮＣＩ−Ｈ７２７［Ｈ７２７］、ＮＣＩ−Ｈ８１０［Ｈ８１０］、ＮＣＩ−Ｈ８８９［Ｈ８８９］、ＮＣＩ−Ｈ１１５５［Ｈ１１５５］、ＮＣＩ−Ｈ１４０４［Ｈ１４０４］、ＮＣＩ−Ｎ８７［Ｎ８７］、ＮＣＩ−Ｈ１９６［Ｈ１９６］、ＮＣＩ−Ｈ２１１［Ｈ２１１］、ＮＣＩ−Ｈ２２０［Ｈ２２０］、ＮＣＩ−Ｈ２５０［Ｈ２５０］、ＮＣＩ−Ｈ５２４［Ｈ５２４］、ＮＣＩ−Ｈ６４７［Ｈ６４７］、ＮＣＩ−Ｈ６５０［Ｈ６５０］、ＮＣＩ−Ｈ７１１［Ｈ７１１］、ＮＣＩ−Ｈ７１９［Ｈ７１９］、ＮＣＩ−Ｈ７４０［Ｈ７４０］、ＮＣＩ−Ｈ７４８［Ｈ７４８］、ＮＣＩ−Ｈ７７４［Ｈ７７４］、ＮＣＩ−Ｈ８３８［Ｈ８３８］、ＮＣＩ−Ｈ８４１［Ｈ８４１］、ＮＣＩ−Ｈ８４７［Ｈ８４７］、ＮＣＩ−Ｈ８６５［Ｈ８６５］、ＮＣＩ−Ｈ９２０［Ｈ９２０］、ＮＣＩ−Ｈ１０４８［Ｈ１０４８］、ＮＣＩ−Ｈ１０９２［Ｈ１０９２］、ＮＣＩ−Ｈ１１０５［Ｈ１１０５］、ＮＣＩ−Ｈ１１８４［Ｈ１１８４］、ＮＣＩ−Ｈ１２３８［Ｈ１２３８］、ＮＣＩ−Ｈ１３４１［Ｈ１３４１］、ＮＣＩ−Ｈ１３８５［Ｈ１３８５］、ＮＣＩ−Ｈ１４１７［Ｈ１４１７］、ＮＣＩ−Ｈ１４３５［Ｈ１４３５］、ＮＣＩ−Ｈ１４３６［Ｈ１４３６］、ＮＣＩ−Ｈ１４３７［Ｈ１４３７］、ＮＣＩ−Ｈ１５２２［Ｈ１５２２］、ＮＣＩ−Ｈ１５６３［Ｈ１５６３］、ＮＣＩ−Ｈ１５６８［Ｈ１５６８］、ＮＣＩ−Ｈ１５７３［Ｈ１５７３］、ＮＣＩ−Ｈ１５８１［Ｈ１５８１］、ＮＣＩ−Ｈ１６１８［Ｈ１６１８］、ＮＣＩ−Ｈ１６２３［Ｈ１６２３］、ＮＣＩ−Ｈ１６５０［Ｈ−１６５０、Ｈ１６５０］、ＮＣＩ−Ｈ１６５１［Ｈ１６５１］、ＮＣＩ−Ｈ１６６６［Ｈ−１６６６、Ｈ１６６６］、ＮＣＩ−Ｈ１６７２［Ｈ１６７２］、ＮＣＩ−Ｈ１６９３［Ｈ１６９３］、ＮＣＩ−Ｈ１６９４［Ｈ１６９４］、ＮＣＩ−Ｈ１７０３［Ｈ１７０３］、ＮＣＩ−Ｈ１７３４［Ｈ−１７３４、Ｈ１７３４］、ＮＣＩ−Ｈ１７５５［Ｈ１７５５］、ＮＣＩ−Ｈ１７５５［Ｈ１７５５］、ＮＣＩ−Ｈ１７７０［Ｈ１７７０］、ＮＣＩ−Ｈ１７９３［Ｈ１７９３］、ＮＣＩ−Ｈ１８３６［Ｈ１８３６］、ＮＣＩ−Ｈ１８３８［Ｈ１８３８］、ＮＣＩ−Ｈ１８６９［Ｈ１８６９］、ＮＣＩ−Ｈ１８７６［Ｈ１８７６］、ＮＣＩ−Ｈ１８８２［Ｈ１８８２］、ＮＣＩ−Ｈ１９１５［Ｈ１９１５］、ＮＣＩ−Ｈ１９３０［Ｈ１９３０］、ＮＣＩ−Ｈ１９４４［Ｈ１９４４］、ＮＣＩ−Ｈ１９７５［Ｈ−１９７５、Ｈ１９７５］、ＮＣＩ−Ｈ１９９３［Ｈ１９９３］、ＮＣＩ−Ｈ２０２３［Ｈ２０２３］、ＮＣＩ−Ｈ２０２９［Ｈ２０２９］、ＮＣＩ−Ｈ２０３０［Ｈ２０３０］、ＮＣＩ−Ｈ２０６６［Ｈ２０６６］、ＮＣＩ−Ｈ２０７３［Ｈ２０７３］、ＮＣＩ−Ｈ２０８１［Ｈ２０８１］、ＮＣＩ−Ｈ２０８５［Ｈ２０８５］、ＮＣＩ−Ｈ２０８７［Ｈ２０８７］、ＮＣＩ−Ｈ２１０６［Ｈ２１０６］、ＮＣＩ−Ｈ２１１０［Ｈ２１１０］、ＮＣＩ−Ｈ２１３５［Ｈ２１３５］、ＮＣＩ−Ｈ２１４１［Ｈ２１４１］、ＮＣＩ−Ｈ２１７１［Ｈ２１７１］、ＮＣＩ−Ｈ２１７２［Ｈ２１７２］、ＮＣＩ−Ｈ２１９５［Ｈ２１９５］、ＮＣＩ−Ｈ２１９６［Ｈ２１９６］、ＮＣＩ−Ｈ２１９８［Ｈ２１９８］、ＮＣＩ−Ｈ２２２７［Ｈ２２２７］、ＮＣＩ−Ｈ２２２８［Ｈ２２２８］、ＮＣＩ−Ｈ２２８６［Ｈ２２８６］、ＮＣＩ−Ｈ２２９１［Ｈ２２９１］、ＮＣＩ−Ｈ２３３０［Ｈ２３３０］、ＮＣＩ−Ｈ２３４２［Ｈ２３４２］、ＮＣＩ−Ｈ２３４７［Ｈ２３４７］、ＮＣＩ−Ｈ２４０５［Ｈ２４０５］、ＮＣＩ−Ｈ２４４４［Ｈ２４４４］、ＵＭＣ−１１、ＮＣＩ−Ｈ６４［Ｈ６４］、ＮＣＩ−Ｈ７３５［Ｈ７３５］、ＮＣＩ−Ｈ７３５［Ｈ７３５］、ＮＣＩ−Ｈ１９６３［Ｈ１９６３］、ＮＣＩ−Ｈ２１０７［Ｈ２１０７］、ＮＣＩ−Ｈ２１０８［Ｈ２１０８］、ＮＣＩ−Ｈ２１２２［Ｈ２１２２］、Ｈｓ５７３．Ｔ、Ｈｓ５７３．Ｌｕ、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５、ＢＥＡＳ−２Ｂ、ＨｅｐＧ２、Ｔｅｒａ−１、Ｔｅｒａ−２、ＮＣＩ−Ｈ６９［Ｈ６９］、ＮＣＩ−Ｈ１２８［Ｈ１２８］、ＣｈａＧｏ−Ｋ−１、ＮＣＩ−Ｈ４４６［Ｈ４４６］、ＮＣＩ−Ｈ２０９［Ｈ２０９］、ＮＣＩ−Ｈ１４６［Ｈ１４６］、ＮＣＩ−Ｈ４４１［Ｈ４４１］、ＮＣＩ−Ｈ８２［Ｈ８２］、ＮＣＩ−Ｈ４６０［Ｈ４６０］、ＮＣＩ−Ｈ５９６［Ｈ５９６］、ＮＣＩ−Ｈ６７６Ｂ［Ｈ６７６Ｂ］、ＮＣＩ−Ｈ３４５［Ｈ３４５］、ＮＣＩ−Ｈ８２０［Ｈ８２０］、ＮＣＩ−Ｈ５２０［Ｈ５２０］、ＮＣＩ−Ｈ６６１［Ｈ６６１］、ＮＣＩ−Ｈ５１０Ａ［Ｈ５１０Ａ、ＮＣＩ−Ｈ５１０］、ＳＫ−ＨＥＰ−１、Ａ−４２７、Ｃａｌｕ−１、Ｃａｌｕ−３、Ｃａｌｕ−６、ＳＫ−ＬＵ−１、ＳＫ−ＭＥＳ−１、ＳＷ９００［ＳＷ−９００、ＳＷ９００］、Ｍａｌｍｅ−３ＭおよびＣａｐａｎ−１を包含するＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）由来のものが挙げられる。
【０５８０】
一実施形態において、本明細書に記載されるシグナルセンサーポリヌクレオチドを、ヒト肺腺癌で調査し得る。非制限的な例として、５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全に修飾または１−メチルシュードウリジンで完全に修飾した構成的活性型カスパーゼ３をコードするシグナルセンサーポリヌクレオチドを、培養したヒト肺腺癌Ａ５４９細胞に送達し得る（例えば、実施例５３に説明される実験を参照）。別の非制限的な例として、５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾または１−メチルシュードウリジンで完全に修飾した構成的活性型カスパーゼ６をコードするシグナルセンサーポリヌクレオチド培養したヒト肺腺癌Ａ５４９細胞に送達し得る（例えば、実施例５３に説明される実験を参照）。
【０５８１】
別の実施形態では、本明細書に記載されるシグナルセンサーポリヌクレオチドを、ヒト肝細胞癌で調査し得る。非制限的な例として、５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全に修飾したまたは１−メチルシュードウリジンで完全に修飾した構成的活性型カスパーゼ３をコードするシグナルセンサーポリヌクレオチドをヒト肝細胞癌Ｈｅｐ３Ｂ細胞に送達し得る（例えば、実施例５４に記載される実験を参照）。
【０５８２】
一実施形態において、シグナルセンサーポリヌクレオチドを動物モデルで調査し得る。非制限的な例として、動物モデルは、Ｆｕｋａｚａｗａら（Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１０；３０：４１９３−４２００）の肺癌モデルといった肺癌のためであり得、ここでは、一様にドミナントネガティブを発現するＭｙｃ（Ｏｍｏｍｙｃ）マウスを、ＫＲＡＳ突然変異ポジティブ肺癌モデルマウスと交雑させることで、類遺伝子マウスを作製する。Ｏｍｏｍｙｃの存在下で、突然変異したＫＲＡＳの発現によって生じるがん腫瘍が類遺伝子マウスで退縮し、ＯｍｏｍｙｃがＫＲＡＳ突然変異ポジティブ肺癌の腫瘍細胞死を引き起こしたことを示す。
【０５８３】
非制限的な例として、ヒト肺癌異種移植もＦｕｋａｚａｗａの方法によって準備され、ここでは、背側の横腹に４×１０６個のＡ５４９細胞を皮下接種することで、４週齢の雌のＢＡＬＢ／Ｃヌードマウスに、ヒト肺癌異種移植を確立する（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｊａｐａｎ，Ｋａｎａｇａｗａ，Ｊａｐａｎ）。マウスを無作為に６つのグループに割り当てる（ｎ＝６／グループ）、腫瘍が約０．５ｃｍの直径に到達後（腫瘍接種からおよそ６日後）。各グループのマウスの背側の横腹に、選択した投薬レジメンに関して、ＰＢＳ、５×１０１０ｖｐの対照物、またはシグナルセンサーポリヌクレオチドを含む１００μｌの溶液を注射する。次いで動物をじっくり観察し、生存実験または他の分析が実施される。
【０５８４】
一実施形態において、シグナルセンサーポリヌクレオチドをトランスジェニック動物モデルで調査し得る。非制限的な例として、トランスジェニック動物モデルは、ＬＳＬ−ＫＲＡＳＧ１２Ｄ：ＴＲＥ  Ｏｍｏｍｙｃ：ＣＭＶ  ｒｔＴＡトリプルトランスジェニック動物であり、これは、吸入を通して投与されｌｏｘＰを導入した終止コドンの切除を通して癌遺伝子の発現を誘導するＣｒｅリコンビナーゼを発現するアデノウイルスの使用に関わり、ドキシサイクリンを介して広範囲であるＯｍｏｍｙｃ発現を制御する。モデルはＳｏｕｃｅｋら（Ｎａｔｕｒｅ，１−５（２００８））で報告されている。別の非制限的な例として、ＳｏｕｃｅｋのマウスをＬＳＬＫＲＡＳＧ１２Ｄシングルトランスジェニックマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と交雑し得、ＭＹＣ阻害剤Ｄまたは本明細書に記載される他の腫瘍学関連ポリペプチドを発現するシグナルセンサーポリヌクレオチドの吸入送達、または、そうでなければ肺送達の実験のために使用され得る。
【０５８５】
別の実施形態では、シグナルセンサーポリヌクレオチドをマウス内マウスモデルで調査し得、例えば、Ｚｅｎｄｅｒのｐ５３−／−：ｃ−Ｍｙｃ過剰発現ＨＣＣモデルであるが、これに限定されない（Ｃｅｌｌ．２００６  Ｊｕｎｅ  ３０；１２５（７）：１２５３-１２６７）。
【０５８６】
一実施形態において、シグナルセンサーポリヌクレオチドを非生殖系列遺伝子操作マウス（ＮＧＥＭＭ）で調査し得る。非制限的な例として、マウス内マウスモデルの設計は、ＷＴまたは腫瘍抑制因子欠失（ｐ５３−／−といった）１２９  Ｓｖ／Ｅｖ  Ｍｍ  ＥＳ細胞クローンから始まり；肝臓特異的画像処理のための肝臓活性化タンパク質（ＬＡＰ）プロモーター指向性テトラサイクリントランス活性化因子（ｔＴＡ）およびｔｅｔＯ−ルシフェラーゼを導入し；結果として得られる、ｃ−Ｍｙｃおよび他の肝臓関連プログラム癌遺伝子のために使用されるＬＡＰ−ｔＴＡ：ｔｅｔＯ−ルシフェラーゼクローンを凍結し；ｔｅｔＯ駆動型癌遺伝子、例えばｔｅｔＯｃＭｙｃを添加し；結果として得られるＬＡＰ−ｔＴＡ：ｔｅｔＯ−ルシフェラーゼ：ｔｅｔＯ−ＭＹＣクローンを凍結し；結果として得られるＥＳクローンをＣ５７Ｂｌ／６胚細胞に注入して偽妊娠マザーに移植し、それによって、得られたキメラ動物は、ドキシサイクリンの除去の後、腫瘍モデルである（すなわちＴｅｔ−Ｏｆｆ）。モデルの種類は理想としては、正常な肝細胞に囲まれた、ｃ−Ｍｙｃ駆動型、ルシフェラーゼ発現ＨＣＣの誘導性小結節をはっきり表す。
【０５８７】
別の実施形態では、シグナルセンサーポリヌクレオチドをマウスのＨＥＰ３Ｂ細胞を用いた同所ＨＣＣモデルで調査し得る（Ｃｒｏｗｎ  Ｂｉｏ）。
【０５８８】
非制限的な例として、上記の動物はいずれもＭＹＣ阻害剤Ｄをコードするシグナルセンサーポリヌクレオチドを調査するために使用され得る。実験には、限定はしないが、ＭＹＣ阻害剤Ｄのための非翻訳可能ｍＲＮＡおよびビヒクル単独送達といった陰性対照をコードするシグナルセンサーポリヌクレオチドも含み得る。動物は遺伝子発現、腫瘍状態および／またはがん表現型または遺伝子型に通常関わる特徴のいずれかに関して評価され得る。
【０５８９】
別の非制限的な例として、上記の動物モデルのいずれかを用いてドミナントネガティブｈＴＥＲＴをコードするシグナルセンサーポリヌクレオチドを調査し得る。実験にはまた、限定はしないがドミナントネガティブｈＴＥＲＴのための非翻訳可能ｍＲＮＡおよびビヒクル単独送達といった陰性対照をコードするシグナルセンサーポリヌクレオチドが含まれ得る。動物は遺伝子発現、腫瘍状態および／またはがん表現型または遺伝子型に通常関わる特徴のいずれかに関して評価され得る。
【０５９０】
別の非制限的な例として、上記の動物モデルのいずれかが、ドミナントネガティブサバイビンをコードするシグナルセンサーポリヌクレオチドを調査するために使用され得る。実験にはまた、限定はしないがドミナントネガティブサバイビンのための非翻訳可能ｍＲＮＡおよびビヒクル単独送達といった陰性対照をコードするシグナルセンサーポリヌクレオチドが含まれ得る。動物は遺伝子発現、腫瘍状態および／またはがん表現型または遺伝子型に通常関わる特徴のいずれかに関して評価され得る。
【０５９１】
一実施形態において、細胞傷害性または細胞保護性ｍＲＮＡ治療薬を、限定はしないが、本明細書に記載される動物モデルの正常および／またはがん細胞といった特定の細胞に指向するために、シグナルセンサーポリヌクレオチドは少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位を３’ＵＴＲに含み得る。非制限的な例として、強いアポトーシスシグナルおよび少なくとも１つのｍｉＲ−１２２ａ結合部位がシグナルセンサーポリヌクレオチドによってコードされ、ここで、当該少なくとも１つのｍｉＲ−１２２ａ結合部位は３’ＵＴＲに位置する。別の非制限的な例として、アポトーシス誘導因子短アイソフォーム（ＡＩＦｓｈ）および少なくとも１つのｍｉＲ−１２２ａ結合部位がシグナルセンサーポリヌクレオチドによってコードされ、ここで、当該少なくとも１つのｍｉＲ−１２２ａ結合部位は３’ＵＴＲに位置する。さらに別の非制限的な例として、構成的活性型（Ｃ．Ａ．）カスパーゼ６および少なくとも１つのｍｉＲ−１２２ａ結合部位がシグナルセンサーポリヌクレオチドによってコードされ、ここで、当該少なくとも１つのｍｉＲ−１２２ａ結合部位は３’ＵＴＲに位置する。別の非制限的な例として、ＨＳＶ１−ｔｋおよび少なくとも１つのｍｉＲ−１２２ａ結合部位がシグナルセンサーポリヌクレオチドによってコードされ、ここで、当該少なくとも１つのｍｉＲ−１２２ａ結合部位が３’ＵＴＲに位置する。
【０５９２】
別の実施形態では、細胞傷害性または細胞保護性ｍＲＮＡ治療薬を、限定はしないが、本明細書に記載される動物モデルの正常および／またはがん細胞といった特定の細胞に指向するために、シグナルセンサーポリヌクレオチドは３つのｍｉＲＮＡ結合部位を３’ＵＴＲに含み得る。非制限的な例として、強いアポトーシスシグナルおよび３つのｍｉＲ−１２２ａ結合部位がシグナルセンサーポリヌクレオチドによってコードされ、ここで、当該３つのｍｉＲ−１２２ａ結合部位は３’ＵＴＲに位置する。別の非制限的な例として、アポトーシス誘導因子短アイソフォーム（ＡＩＦｓｈ）および３つのｍｉＲ−１２２ａ結合部位がシグナルセンサーポリヌクレオチドによってコードされ、ここで、当該３つのｍｉＲ−１２２ａ結合部位は３’ＵＴＲに位置する。さらに別の非制限的な例として、構成的活性型（Ｃ．Ａ．）カスパーゼ６および３つのｍｉＲ−１２２ａ結合部位がシグナルセンサーポリヌクレオチドによってコードされ、ここで、当該３つのｍｉＲ−１２２ａ結合部位は３’ＵＴＲに位置する。別の非制限的な例として、ＨＳＶ１−ｔｋおよび３つのｍｉＲ−１２２ａ結合部位がシグナルセンサーポリヌクレオチドによってコードされ、ここで、当該３つのｍｉＲ−１２２ａ結合部位が３’ＵＴＲに位置する。
【０５９３】
がんの一般的なカテゴリー
脳がん
脳がんは、通常悪性脳腫瘍の成長に関連する、脳の組織における異常な細胞の成長である。脳腫瘍は成長して脳の付近の領域を圧迫し、これによって、脳のその部分は本来働くべくように働くことを阻害され得る。脳がんが脳外部の他の組織に転移することはめったにない。顕微鏡下でがん細胞がどれだけ異常に見えるかに基づいた腫瘍の悪性度を用いて、成長の遅い腫瘍と成長の速い腫瘍との間の違いを区別し得る。悪性度Ｉの腫瘍は成長が遅く、付近の組織にはめったに転移せず、正常な細胞に似た細胞を有し、腫瘍全体を外科手術で取り除くことが可能である。悪性度ＩＩの腫瘍も成長は遅いが、付近の組織に転移し得、再発し得る。悪性度ＩＩＩの腫瘍は成長が速く、付近の組織に転移する可能性が高く、腫瘍細胞は正常な細胞とはかなり異なって見える。高悪性度である悪性度ＩＶは成長も転移も早く、腫瘍に死細胞の領域があり得る。脳がんの症状には、起床時の頭痛または嘔吐後になくなる頭痛、頻繁に起こる吐き気および嘔吐、視覚、聴覚および発話問題、平衡感覚障害および歩行困難、片方側の身体の脱力感、異常な眠気または活動レベルの変化、人格または行動の異常な変化、発作が包含されるが、これらに限定されない。
【０５９４】
本発明の一実施形態において、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを用いて、脳がんと診断されたまたは診断され得る対象の疾患、障害および／または状態を治療し得、前記対象に目的とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを投与することで治療し得る。一実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを用いて、脳がんと診断されたまたは診断され得る対象の腫瘍の成長を軽減、除去または阻害し得、前記対象に目的とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを投与することで軽減、除去または阻害し得る。一実施形態において、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを用いて、脳がんと診断されたまたは診断され得る対象の少なくとも１つのがんの症状を軽減および／または改善し得、前記対象に目的とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを投与することで軽減および／または改善し得る。
【０５９５】
乳癌
乳癌は、限定はしないが、管および小葉といった、男女双方の胸の組織で形成される。最も一般的な乳癌の種類は、乳管癌であり、これは、管の細胞で始まる。ローブまたは小葉で始まる小葉癌は、双方の胸でしばしば発見される。珍しい種類の乳癌である炎症性乳癌では、胸が温かくなり、赤くなって腫れる。遺伝性乳癌は、全乳癌のおよそ５〜１０％を占め、改変された遺伝子がいくつかの民族でよく見られ、それによってその民族は乳癌に対してより高い感受性を有する。乳癌の症状として、胸部もしくは胸部付近またはわきの下領域での塊または肥厚部、胸のサイズまたは形状の変化、胸の皮膚のくぼみまたは歪み、内向きになった胸の乳首、乳首から出る母乳ではない流体、うろこ状、赤色または腫れている、胸、乳首または乳輪の皮膚、オレンジの皮膚（橙皮上皮膚（ｐｅａｕ  ｄ’ｏｒａｎｇｅ））のような胸のくぼみが挙げられるが、これらに限定されない。
【０５９６】
一実施形態において、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを用いて、乳癌と診断されたまたは診断され得る対象の疾患、障害および／または状態を治療し得、前記対象に目的とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを投与することで治療し得る。一実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを用いて、乳癌と診断されたまたは診断され得る対象の腫瘍の成長を軽減、除去または阻害し得、前記対象に目的とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを投与することで軽減、除去または阻害し得る。一実施形態において、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを用いて、乳癌と診断されたまたは診断され得る対象の少なくとも１つの癌の症状を軽減および／または改善し得、前記対象に目的とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを投与することで軽減および／または改善し得る。
【０５９７】
子宮頚癌
子宮頚癌は、子宮頚部の組織で形成され、通常成長速度は遅い。子宮頚癌の原因は通常ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染と関係がある。子宮頚癌はいずれの徴候も示さないが、可能性のある症状としては、膣の出血、異常な膣分泌物、骨盤痛および性行の際の痛みが挙げられ得るが、これらに限定されない。
【０５９８】
一実施形態において、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを用いて、子宮頚癌と診断されたまたは診断され得る対象の疾患、障害および／または状態を治療し得、前記対象に目的とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを投与することで治療し得る。一実施形態において、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを用いて、子宮頚癌と診断されたまたは診断され得る対象の腫瘍の成長を軽減、除去または阻害し得、前記対象に目的とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを投与することで軽減、除去または阻害し得る。一実施形態において、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを用いて、子宮頚癌と診断されたまたは診断され得る対象の少なくとも１つの癌の症状を軽減および／または改善し得、前記対象に目的とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを投与することで軽減および／または改善し得る。
【０５９９】
食道癌
食道癌は、食道の内側を覆う組織に形成される癌である。２種類の一般的な食道癌が存在し、これらは悪性になる細胞の種類から名前が付けられる。扁平上皮癌は、食道の内側を覆う薄く平らな細胞に形成される癌である（類表皮癌とも呼ばれる）。粘液といった流体を生産および放出する腺（分泌）細胞で始まるがんは、腺癌と呼ばれる。食道癌に関連する一般的な症状としては、痛みを伴う嚥下または嚥下困難、体重の軽減、胸骨の奥の痛み、しわがれ声および咳、ならびに消化不良および胸やけが挙げられるが、これらに限定されない。
【０６００】
一実施形態において、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを用いて、食道癌と診断されたまたは診断され得る対象の疾患、障害および／または状態を治療し得、前記対象に目的とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを投与することで治療し得る。一実施形態において、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを用いて、食道癌と診断されたまたは診断され得る対象の腫瘍の成長を軽減、除去または阻害し得、前記対象に目的とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを投与することで軽減、除去または阻害し得る。一実施形態において、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを用いて、食道癌と診断されたまたは診断され得る対象の少なくとも１つの癌の症状を軽減および／または改善し得、前記対象に目的とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを投与することで軽減および／または改善し得る。
【０６０１】
家族性がん症候群
家族性がん症候群は、対象ががんを進行する遺伝的素因を表す。全てのがんの５〜１０％は遺伝性であり、ある血縁者から別の血縁者に受け継がれる特定の遺伝子を通して継承される。これらの遺伝子変化の１つを遺伝した対象は、その生涯でがんを進行させる可能性がより高くあり得る。家族性がん症候群としては、毛細血管拡張性運動失調、基底細胞母斑症候群、母斑性基底細胞癌症候群、ゴーリン症候群、ベックウィズ・ヴィーデマン症候群、バート・ホッジ・デューブ症候群、ブルーム症候群、遺伝性乳癌および／または卵巣癌、カーニー複合疾患、位Ｉ型およびＩＩ型タイプ、家族性脊索腫、大腸癌、遺伝性非ポリポーシスリンチ症候群、コステロ症候群、顔皮膚骨格症候群（Ｆａｃｉｏ−Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ−Ｓｋｅｌｅｔａｌ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、カウデン病、先天性角化異常症、食道癌との肥厚化、食道癌との手掌足底角化症、ハウエル・エバンス症候群、遺伝性多発性外骨症、ファンコーニ貧血、遺伝性びまん性胃癌、消化管間質腫瘍、多発性消化管間質腫瘍、家族性上皮小体機能亢進症、急性骨髄白血病、家族性白血病、慢性リンパ球性白血病、リー・フラウメニ症候群、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、遺伝性多発性黒色腫、多彩異数性モザイク、多発性内分泌新生物Ｉ型、２Ａ型および２Ｂ型、家族性甲状腺髄様癌、家族性多発性骨髄腫、遺伝性神経芽細胞腫、神経繊維腫症１型および２型、ナイミーヘン症候群、遺伝性膵癌、遺伝性傍神経節腫、ポイツ・ジェガース症候群、家族性大腸腺腫症、家族性若年性ポリポーシス、ＭＹＨ関連ポリポーシス、遺伝性前立腺癌、多発性皮膚子宮筋腫を伴う遺伝性腎細胞癌、遺伝性腎細胞癌、遺伝性乳頭状腎細胞癌、ラブドイド素因症候群（Ｒｈａｂｄｏｉｄ  Ｐｒｅｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ロスムンド・トムソン症候群、シンプソン・ゴラビ・ベーメル症候群、家族性精巣胚細胞性腫瘍、家族性非甲状腺髄様癌、結節性硬化症、フォンヒッペル・リンダウ病、家族性ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ウェルナー症候群、家族性ウィルムス腫瘍および色素性乾皮症といった障害が挙げられるが、これらに限定されない。
【０６０２】
一実施形態において、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを用いて、家族性がん症候群と診断されたまたは診断され得る対象の疾患、障害および／または状態を治療し得、前記対象に目的とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを投与することで治療し得る。一実施形態において、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを用いて、家族性がん症候群と診断されたまたは診断され得る対象の腫瘍の成長を軽減、除去または阻害し得、前記対象に目的とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを投与することで軽減、除去または阻害し得る。一実施形態において、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを用いて、家族性がん症候群と診断されたまたは診断され得る対象の少なくとも１つのがんの症状を軽減および／または改善し得、前記対象に目的とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを投与することで軽減および／または改善し得る。
【０６０３】
白血病
白血病は、多くの血液細胞が生産され、血流に入るようすることができる骨髄などの血液形成組織で始まるがんの一形態である。白血病は中枢神経系にも転移し得、脳および脊髄がんを引き起こし得る。白血病の種類には、成人急性リンパ球性、小児急性リンパ急性、成人急性骨髄性、慢性リンパ性、慢性骨髄性および毛様細胞が挙げられるが、これらに限定されない。白血病の非制限的な症状の例としては、脱力感または疲労感、熱、あざができやすい、出血しやすい、点状出血、息切れ、体重の軽減または食欲低下、骨または胃の痛み、肋骨下部の満腹感、および、首、わき、胃または鼠径部の痛みの伴わない塊が挙げられる。
【０６０４】
一実施形態において、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを用いて、白血病と診断されたまたは診断され得る対象の疾患、障害および／または状態を治療し得、前記対象に目的とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを投与することで治療し得る。一実施形態において、本発明のシングルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを用いて、白血病と診断されたまたは診断され得る対象の腫瘍の成長を軽減、除去または阻害し得、前記対象に目的とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを投与することで軽減、除去または阻害し得る。一実施形態において、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを用いて、白血病と診断されたまたは診断され得る対象の少なくとも１つのがんの症状を軽減および／または改善し得、前記対象に目的とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを投与することで軽減および／または改善し得る。
【０６０５】
肝臓癌
肝臓癌には、肝臓の組織で形成される原発性肝臓癌と、身体の別の部分から肝臓に転移した続発性肝臓癌、または転移性肝臓癌の２種類がある。肝臓癌の可能性のある症状としては、胸郭の真下の右部分上の硬い塊、右上腹部における不快感、右肩甲骨周囲の痛み、原因不明の体重軽減、黄疸、異常な疲労感、吐き気および食欲低下が挙げられるが、これらに限定されない。
【０６０６】
一実施形態において、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを用いて、肝臓癌と診断されたまたは診断され得る対象の疾患、障害および／または状態を治療し得、前記対象に目的とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを投与することで治療し得る。一実施形態において、本発明のシングルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを用いて、肝臓癌と診断されたまたは診断され得る対象の腫瘍の成長を軽減、除去または阻害し得、前記対象に目的とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを投与することで軽減、除去または阻害し得る。一実施形態において、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを用いて、肝臓癌と診断されたまたは診断され得る対象の少なくとも１つの癌の症状を軽減および／または改善し得、前記対象に目的とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを投与することで軽減および／または改善し得る。
【０６０７】
肝細胞癌
ｃ−ｍｙｃタンパク質は、通常の細胞プロセスでの重要な役割を有する多機能性ｂＨＬＨＺｉｐ転写因子であり、ヒトのがんの大部分で異常に制御される。ｃ−、Ｎ−およびＬ−Ｍｙｃは、Ｍａｘ、ＭａｄおよびＭｉｚ−１といったパートナーと二量体化し得るファミリーメンバーである。このタンパク質は多数の示唆される転写標的のトランス活性化および抑制に関わり、近年の研究によって、Ｍｙｃのために、進行するがんでトランス活性化される遺伝子の「転写増幅因子」としての役割が示された。これは、がん細胞増殖、成長、生合成代謝、リボ合成および翻訳ならびにおそらく発癌性シグナルが通らなくてはいけない非重複節において、良く確立された機能を有する。
【０６０８】
ＭＹＣ阻害剤Ｄ（Ｏｍｏｍｙｃとしても知られる）は、４つの突然変異Ｅ５７Ｔ、Ｅ６４Ｉ、Ｒ７０Ｑ、Ｒ７１Ｎが導入されたヒトｃ−Ｍｙｃオリゴマー化ドメインからなる、特殊なドミナントネガティブ９０ａ．ａ．タンパク質である（Ｓｏｕｃｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９９８；１７，  ２４６３−２４７２）。重要なことに、結合および阻害能力で選択性を示す：ｃ−Ｍｙｃ、Ｎ−Ｍｙｃ、ＭａｘおよびＭｉｚ−１に結合する。Ｍｉｚ−１指向性トランス抑制を維持する一方で、Ｅ−ｂｏｘ媒介性トランス活性化を阻害し得る。ＭＹＣ阻害剤Ｄの治療上の可能性は、ＯＭＯＭＹＣのトランスジェニック発現がＭｙｃＥＲＴＡＭ誘導性角化細胞増殖を遮断したインビボで具体的に示されており（Ｓｏｕｃｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＣＤＤ  ２００４；１１，１０３８−１０４５）；トランスジェニックＯｍｏｍｙｃは、可逆的毒性を有するＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄマウスモデルで、それぞれ、成熟肺腫瘍の形成の確立を阻害し、成熟肺腫瘍の形成の退縮を誘導し（Ｓｏｕｃｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２００８，４５５，６７９−６８３）；トランスジェニックＯｍｏｍｙｃは、腫瘍形成を阻害し、制御可能な副作用を有する膵臓神経内分泌癌のＲＩＰ１−ＴＡＧ２モデルにおいて、確立された腫瘍を退縮させ、さらに、がん細胞Ｍｙｃに関して許容的な腫瘍微小環境の維持における役割を示し（Ｓｏｄｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２０１１，２５，９０７−９１６）；ならびに、「ＯｍｏｍｙｃはインビトロおよびインビボでＫＲＡＳ突然変異性ヒト肺腺癌Ａ５４９細胞の細胞死を誘導する」と報告された（Ｆｕｋａｚａｗａ
ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２０１０，３０，４１９３−４２００）。
【０６０９】
ＭＹＣ阻害剤Ｄの指向性発現を通した発癌性ｃ−Ｍｙｃの阻害が少なくともＨＣＣのサブセットで効果的な療法になり得ることは理にかなっているが、ＨＣＣにおける概念の証拠はまだ実証されていない。
【０６１０】
いくつかの実施形態では、本発明には、肝細胞癌（ＨＣＣ）の治療のためのセンサー配列の有無に関わらず、関連ポリペプチドとしてＭＹＣ阻害剤Ｄをコードするシグナルセンサーポリヌクレオチドが含まれる。ＨＣＣの研究は、Ｈｏｓｈｉｄａらが説明するＨＣＣ細胞株のサブクラスのいずれかで実施され得る（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００９；６９：７３８５−７３９２）。これらは、より多いＴＧＦ−ベータおよびＷＮＴシグナル伝達を有し、早期再発のより高いリスクを示し、および早期再発のより高いリスクに関連するＳ２細胞、ｍｙｃおよびＡＫＴ発現の増加および最も高い量のアルファ胎児タンパク質を示すＳ２、または、幹細胞様表現型を維持するＳ３を包含する。Ｓ１およびＳ２型はまた、増加したＥ２Ｆ１発現および低下したｐ５３発現を表すことが示されており；一方で、Ｓ２単独はインターフェロンの低下した量を示した。Ｓ１細胞株としては、ＳＮＵ‐３８７、ＳＮＵ‐４２３、ＳＮＵ‐４４９、ＳＮＵ‐４７５、ＳＮＵ‐１８２、ＳＫ‐Ｈｅｐ１、ＨＬＥ、ＨＬＦおよびＦｏｃｕｓが挙げられ、一方で、Ｓ２細胞株としては、Ｈｕｈ‐１、Ｈｕｈ‐６、Ｈｕｈ‐７、ＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３Ｂ、Ｈｅｐ３Ｂ‐ＴＲ、Ｈｅｐ４０およびＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞が挙げられる。
【０６１１】
肺癌
肺癌は、肺の組織、通常は、気道に並ぶ細胞に形成され、小細胞肺癌または非小細胞肺癌のいずれかとして分類される。小細胞肺癌には２種類あり、小細胞癌と、複合型小細胞癌である。非小細胞肺がんの種類としては、扁平上皮癌（癌は扁平細胞で始まる）、大細胞癌（癌は複数の種類の細胞で始まり得る）および腺癌（癌は肺胞に並ぶ細胞および粘液を作る細胞で始まる）がある。肺癌の症状としては、胸の不快感または痛み、時間が経ってもなくならないまたは悪化する咳、呼吸困難、喘鳴、唾液の血液、しわがれ声、食欲低下、理由不明の体重軽減、疲労感、嚥下困難ならびに顔および／または首の静脈の腫れが挙げられるが、これらに限定されない。
【０６１２】
一実施形態において、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを用いて、肺癌と診断されたまたは診断され得る対象の疾患、障害および／または状態を治療し得、前記対象に目的とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを投与することで治療し得る。一実施形態において、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを用いて、肺癌と診断されたまたは診断され得る対象の腫瘍の成長を軽減、除去または阻害し得、前記対象に目的とするポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを投与することで軽減、除去または阻害し得る。一実施形態において、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを用いて、肺癌と診断されたまたは診断され得る対象の少なくとも１つの癌の症状を軽減および／または改善し得、前記対象に目的とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを投与することで軽減および／または改善し得る。
【０６１３】
リンパ腫
リンパ腫は、免疫系の細胞で始まるがんである。ホジキンリンパ腫を有する対象は、リード・シュテルンベルク細胞呼ばれる細胞を有し、非ホジキンリンパ腫には、大きな群の免疫系細胞のがんが包含される。リンパ腫の例としては、頚部、わきの下または鼠径部の痛みのない腫れたリンパ節、理由不明の熱、あふれ出る寝汗、理由不明の体重軽減、皮膚のかゆみおよび疲弊が挙げられるが、これらに限定されない。
【０６１４】
一実施形態において、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを用いて、リンパ腫と診断されたまたは診断され得る対象の疾患、障害および／または状態を治療し得、前記対象に目的とするポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを投与することで治療し得る。一実施形態において、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを用いて、リンパ腫と診断されたまたは診断され得る対象の腫瘍の成長を軽減、除去または阻害し得、前記対象に目的とするポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを投与することで軽減、除去または阻害し得る。一実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを用いて、リンパ腫と診断されたまたは診断され得る対象の少なくとも１つのがんの症状を軽減および／または改善し得、前記対象に目的とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを投与することで軽減および／または改善し得る。
【０６１５】
卵巣癌
卵巣癌は、卵巣上皮癌（卵巣の表面で始まる）または悪性生殖細胞腫瘍（がんは卵細胞で始まる）のいずれかである、卵巣組織に形成される癌である。卵巣癌の症状としては、腹部の痛みまたは腫れ、骨盤での痛み、おなら、腹部膨満または便秘といった胃腸管の問題および月経停止後の膣出血が挙げられるが、これらに限定されない。
【０６１６】
一実施形態において、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを用いて、卵巣癌と診断されたまたは診断され得る対象の疾患、障害および／または状態を治療し得、前記対象に目的とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを投与することで治療し得る。一実施形態において、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物またはシグナルセンサーｍｍＲＮＡを用いて、卵巣癌と診断されたまたは診断され得る対象の腫瘍の成長を軽減、除去または阻害し得、前記対象に目的とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを投与することで軽減、除去または阻害し得る。一実施形態において、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物またはシグナルセンサーｍｍＲＮＡを用いて、卵巣癌と診断されたまたは診断され得る対象の少なくとも１つの癌の症状を軽減および／または改善し得、前記対象に目的とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを投与することで軽減および／または改善し得る。
【０６１７】
前立腺癌
前立腺の組織に形成される前立腺は、主に年配の男性が患う。前立腺癌の非制限的な例としては、弱いまたは断続的な尿の流れ、頻尿、排尿困難、排尿の際の痛みまたはひりひりした痛み、尿または精液の血液、なくならない背中、おしりまたは骨盤の痛みおよび痛みを伴う射精が挙げられるが、これらに限定されない。
【０６１８】
一実施形態において、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを用いて、前立腺癌と診断されたまたは診断され得る対象の疾患、障害および／または状態を治療し得、前記対象に目的とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを投与することで治療し得る。一実施形態において、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを用いて、前立腺癌と診断されたまたは診断され得る対象の腫瘍の成長を軽減、除去または阻害し得、前記対象に目的とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを投与することで軽減、除去または阻害し得る。一実施形態において、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを用いて、前立腺癌と診断されたまたは診断され得る対象の少なくとも１つの癌の症状を軽減および／または改善し得、前記対象に目的とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを投与することで軽減および／または改善し得る。
【０６１９】
睾丸癌
睾丸癌は１つまたは双方の睾丸の組織に形成され、若いまたは中年男性に最も見られる。多くの睾丸癌は、生殖細胞にあり、睾丸生殖細胞腫瘍と呼ばれる。睾丸細胞腫瘍には、精上皮種および非精上皮種と呼ばれる２種類がある。睾丸癌の一般的な症状としては、いずれかの睾丸における痛みのない塊または腫れ、睾丸の感じ方における変化、下腹部または鼠径部の鈍痛、陰嚢における流体の突然の形成、および、睾丸または陰嚢における痛みまたは不快感が挙げられるが、これらに限定されない。
【０６２０】
一実施形態において、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを用いて、睾丸癌と診断されたまたは診断され得る対象の疾患、障害および／または状態を治療し得、前記対象に目的とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを投与することで治療し得る。一実施形態において、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを用いて、睾丸癌と診断されたまたは診断され得る対象の腫瘍の成長を軽減、除去または阻害し得、前記対象に目的とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードする単離シグナルセンサーポリヌクレオチドを投与することで軽減、除去または阻害し得る。一実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを用いて、睾丸癌と診断されたまたは診断され得る対象の少なくとも１つの癌の症状を軽減および／または改善し得、前記対象に目的とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを投与することで軽減および／または改善し得る。
【０６２１】
咽頭癌
咽頭癌は、咽頭の組織で形成され、鼻咽腔（鼻咽腔癌）、中咽頭（中咽頭癌）、下咽頭（咽頭下部癌）および喉頭（喉頭癌）の癌を包含する。咽頭癌の一般的な症状には、なくならないのどの痛み、耳の痛み、頚部の塊、痛みの伴う嚥下または嚥下困難、声の変化またはしわがれ声、呼吸困難または発話困難、鼻血、難聴、耳の痛みまたは耳鳴り、頭痛、胸骨奥の鈍痛、咳および理由不明の体重軽減が挙げられるが、これらに限定されない。
【０６２２】
一実施形態において、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを用いて、咽頭癌と診断されたまたは診断され得る対象の疾患、障害および／または状態を治療し得、前記対象に目的とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを投与することで治療し得る。一実施形態において、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを用いて、咽頭癌と診断されたまたは診断され得る対象の腫瘍の成長を軽減、除去または阻害し得、前記対象に目的とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを投与することで軽減、除去または阻害し得る。一実施形態において、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを用いて、咽頭癌と診断されたまたは診断され得る対象の少なくとも１つの癌の症状を軽減および／または改善し得、前記対象に目的とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを投与することで軽減および／または改善し得る。
【０６２３】
低酸素誘導因子（ＨＩＦ）の阻害
低酸素誘導因子（ＨＩＦ）は、酸素欠乏への細胞順応を制御する。がん細胞は、ＨＩＦに結合して有害状況での成長を持続し、こうして代謝、増殖、存続および移動性を包含する細胞再プログラムを促進する。ヒトのがん生検でのＨＩＦ過剰発現は、高転移性および脂肪率と相互関連する。
【０６２４】
ＨＩＦはＧＬＵＴ１、ＧＬＵＴ３、ＡＬＤＯＡ、ＥＮＯ１、ＧＡＰＤＨ、ＨＫ１、ＨＫ２、ＰＦＫＬ、ＰＧＫ１、ＰＫＭ２、ＬＤＨＡといった代謝に関する遺伝子、ＩＧＦ−２、ＴＧＦＡ、ＶＥＧＦＡといった増殖に関する遺伝子、ＴＥＲＴ、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４といった存続に関する遺伝子、ＺＥＢ１、ＺＥＢ２、ＳＮＡＩ２、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ９、ＡＭＦ、ＭＥＴ、ＰＴＨｒＰといった細胞移動−湿潤に関する遺伝子を制御する（Ｋｅｉｔｈ、ｅｔａｌＮａｔＲｅｖＣａｎｃｅｒ２０１２；１２：９−２２）。
【０６２５】
一実施形態において、１つ以上のシグナルセンサーポリヌクレオチドをがん細胞に投与し、がんの不安定化を調査し得る。配列、用量、投与経路の選択は、細胞、腫瘍、組織または生物体の診断的評価によって知らされてもよく、その診断的評価としては、がんの発現プロファイリング、代謝的評価（低酸素性、アシドーシス性）、アポトーシス対存続プロファイリング、細胞周期対老化プロファイリング、免疫感受性、および／またはストロマ因子の評価が挙げられるが、これらに限定されない。
【０６２６】
一実施形態において、シグナルセンサーポリヌクレオチドは、腫瘍学関連ポリペプチド、ＣＩＴＥＤ４およびＳＨＡＲＰ１のいずれかまたは双方をコードし得る。シグナルセンサーポリヌクレオチドは次いで、いずれかまたは双方の投与ががん細胞においてＨＩＦ−１アルファのトランスクリプトームの阻害につながる箇所へ投与する。ＨＩＦ１−アルファ遺伝子制御発現の抑制は、双方のポリヌクレオチドが一緒に投与される際により高い抑制を伴って投与の際に生じる。ＨＩＦ１−アルファ下でのルシフェラーゼといったレポーター構築物を、ｖａｎ  ｄｅ  Ｓｌｕｉｓらが開示した方法と同様の方法で使用する（Ｊ
Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２０１０；１２０（６）：２１１９-２１３０）。ＣＩＴＥＤ４およびＳＨＡＲＰ１双方の発現は低下したＨＩＦ１−アルファ発現および同時に付随するＨＩＦ１−アルファ制御遺伝子発現の低下につながることが知られている。シグナルセンサーポリヌクレオチドの有効性を決定するために、細胞死および／または増殖も評価し得る。
【０６２７】
別の実施形態では、ＣＩＴＥＤ４およびＳＨＡＲＰ１は低酸素状況でそれ自体が下方制御されるがん細胞株を用いてさらに実験を実施し得る。陽性結果は、天然タンパク質をシグナルセンサーポリヌクレオチドで置き換えた代謝プロファイル（この場合、ＣＩＴＥＤ４およびＳＨＡＰＲ１の低酸素性順応）を特異的に標的にすると、このプロファイルを有するがん細胞のトランスクリプトームおよび生存優位性に直接影響を及ぼし得ることを実証するであろう。データはさらに、低酸素状況下のシグナルセンサーポリヌクレオチド対ビヒクルの相対的影響は、正常な細胞よりもがん細胞に関してより有意であったことを示し得（すなわち、がん細胞はＣＩＴＥＤ４＋ＳＨＡＲＰ１下方制御に基づいて不釣り合いな生存優位性を有する）、これによって、正常な細胞がこのタンパク質の過剰生産に対するよりも、このタンパク質の置き換えに対してがん細胞は感受性がさらに高くなることを示し得る。がん細胞は低酸素状況を経験する可能性が高く、正常酸素圧状況下の正常な細胞は、生存優位性に関してＨＩＦ１アルファに依存していないため、ＣＩＴＥＤ４およびＳＨＡＲＰ１過剰発現に耐容性を示し得ることが理解される。
【０６２８】
一実施形態において、インビボ実験が、インビトロ実験の設計に従って実施され、ここで、ＨＩＦ−１アルファは転移性においてその最大部分の利点を与えるようなので、動物モデルは、がん設定で転移性を確実に示すものである。動物には、未治療または対照ポリヌクレオチドと比較して、シグナルセンサーポリヌクレオチドを投与する。動物細胞、組織および／または器官を次いで、遺伝子発現プロファイルまたはトランスクリプトームレベルでの変化に関して評価する。
【０６２９】
補因子間の滴定
２つの補因子間の結合親和性を滴定するために、実験を実行し得る。本明細書で使用される「滴定」という語句は、１つ以上の因子を、目的とする特性を評価するために、その溶液、シナリオまたはシリーズに体系的に（例えば、増加量で、または、１つ以上の因子が体系的に修飾される）導入する方法を指す。本実施形態では、目的とする特性は２つの補因子間の親和性である。１つの実施形態では、２つの補因子をコードする構築物を得て、および／または合成して、変異体構築物のシリーズを準備および／または合成する。変異構築物には、切断変異体（ＮまたはＣ末端ドメインのいずれかで１つ以上のアミノ酸が欠如する変異体タンパク質）、領域的欠失［タンパク質の（１つ以上のアミノ酸を含む）内部領域が不在であるタンパク質］を有する変異体、単一のアミノ酸置換（正常に発現されるアミノ酸が代替アミノ酸で置換される）を有する変異体、１つ以上の追加アミノ酸が、内部に、または、いずれかの末端に追加された変異体、領域的置換［タンパク質の（１つ以上のアミノ酸を含む）内部領域が、（１つ以上のアミノ酸を含む）代替領域および／またはこれらのいずれかの組み合わせで置換されるタンパク質］を有する変異対が包含され得る。変異体構築物はランダムに突然変異され、または、調査されている２つの補因子間の結合に必要な分子相互作用の既存の知識に基づいて、標的とする突然変異に供する。
【０６３０】
いくつかの実施形態では、変異体タンパク質のシリーズを、突然変異がポリペプチド鎖に沿って進行パターンを追うように設計する。そのようなシリーズによって、補因子間の相互作用の特定の側面または特長をより把握することができ得る。変異体シリーズには、例えば、それぞれ単一のアミノ酸が置換された変異体の生産が包含され、ここで、各変異体は、その突然変異したポリペプチド配列に沿って異なるアミノ酸を有する（例えば、アラニンが置換されており、それによって、各位置のアミノ酸側鎖の影響が除去される）。他の実施例では、変異体シリーズは、シリーズの変異体が増加するサイズの切断を含むように設計される。別の例では、類似した方法で翻訳後修飾（例えば、リン酸化、アセチル化、ユビキチン化、グリコシル化など）が可能なアミノ酸を変異体シリーズのポリペプチド配列に沿って突然変異させ得る。
【０６３１】
変異体補因子での滴定実験では、結合に有利な状況下で双方の補因子をまとめることで、２つ補因子間のベースライン親和性を確立し、補因子間の結合親和性がアッセイされる。結合親和性は、当該技術分野で知られる様々な方法のいずれかを用いて評価され得る。そのような方法としては、ウェスタンブロット分析、免疫沈澱、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）、蛍光退色後回復測定（ＦＲＡＰ）、蛍光極性化技術および／または表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）系技術が挙げられるが、これらに限定されない。滴定では、一方法に従うと、１つまたは双方の補因子の変異体シリーズを２つの未突然変異補因子と組み合わせ（て、野生型と突然変異タンパク質との間の結合競合を可能にす）る。異なる変異体の増加する濃度の存在下で、２つの補因子間の親和性における変化が評価され、比較および／または結合に関して競合している変異体シリーズに存在する特定の突然変異に対してプロット化する。または、シリーズの変異体補因子を、対応する未突然変異結合パートナーと別々に組み合わせ、結合親和性を評価する。野生型補因子（変異体補因子に対応）の増加する濃度が導入され、変異体補因子と対応する未突然変異結合パートナーとの間の結合における変化が評価される。結果として得られる結合曲線と他の試験変異体の結合曲線との間で比較を行う。
【０６３２】
いくつかの実施形態では、２つの補因子間の結合親和性の滴定を、第３の因子の増加する濃度の存在または不在下で評価する。そのような第３の因子は、２つの補因子間の結合の阻害剤または活性剤であり得る。上記の通り、変異体のシリーズが第３の因子のために作製され得、そのようなシリーズを滴定実験で用い、２つの補因子間の結合に対する突然変異の効果を評価し得る。
【０６３３】
滴定実験で得た情報を用いて、補因子間の相互作用を調節する因子をコードする修飾ｍＲＮＡを設計し得る。
【０６３４】
いくつかの実験では、ＨＩＦ１サブユニット（ＨＩＦ１−アルファ、ＨＩＦ２−アルファおよびＡＲＮＴ）および／または突然変異ＨＩＦ１サブユニットおよび／またはＨＩＦ１と相互作用する他のタンパク質の間の結合親和性を評価する滴定実験を実行する。滴定実験では、ＨＩＦ１−アルファ、ＨＩＦ２−アルファ、ＡＲＮＴおよび／または第３の相互作用因子のうち１つ以上に関して、構築物を用いて作製される変異体シリーズを用い得る。いくつかの実施形態では、変異体シリーズはＨＩＦ１−アルファに関して作製される。ＨＩＦ１−アルファおよびＨＩＦ２−アルファは、細胞内の正常なレベルの酸素の下で、ＨＩＦヒドロキシラーゼによってヒドロキシル化され、分解の助長および／または転写活性を遮断する。ヒドロキシル化は、酸素のレベルが低下するに伴って低下し、ＨＩＦ１−アルファおよび／またはＨＩＦ２−アルファがその補因子、ＡＲＮＴと結合することを可能にし、ＨＩＦ−応答要素（ＨＲＥ）を含む遺伝子の発現上昇につながる（Ｋｅｉｔｈ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，ＨＩＦ１α  ａｎｄ  ＨＩＦ２α：ｓｉｂｌｉｎｇ  ｒｉｖａｌｒｙ  ｉｎ  ｈｙｐｏｘｉｃ  ｔｕｍｏｕｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ．  ２０１１  Ｄｅｃ  １５；１２（１）：９−２２）。一実施形態では、ＨＩＦ１−アルファ変異体シリーズが作製され、ここでは、シリーズの突然変異がポリペプチド鎖（プロリン４０２、プロリン５６４および／またはアスパラギン８０３を包含するが、これらに限定されない）に沿ってヒドロキシル化部位を１つ以上漸進的に除去し、それによってＨＩＦ１−アルファの変異体バージョンの安定性および／または転写活性を調節する。別の実施形態では、代替補因子、ＨＩＦ２−アルファを用いて変異体シリーズを作製する。そのような変異体シリーズは、ポリペプチド鎖（プロリン４０５、プロリン５３１および／またはアスパラギン８４７を包含するが、これらに限定されない）に沿ってヒドロキシル化部位を１つ以上漸進的に除去し、それによってＨＩＦ２−アルファの変異体バージョンの安定性および／または転写活性を調節する。別の実施形態では、ＡＲＮＴとの相互作用に必要な領域を漸進的に突然変異し、それによってＡＲＮＴと結合し、ＨＩＦ依存性遺伝子発現を調節する改変した能力を有する変異体を作るＨＩＦ１−アルファおよび／またはＨＩＦ２−アルファ変異体シリーズを作製する。別の実施形態では、他のＨＩＦサブユニットとの相互作用に必要な領域を漸進的に突然変異し、それによって、ＨＩＦサブユニットと結合し、ＨＩＦ依存性遺伝子発現を調節する改変した能力を有する変異体を作るＡＲＮＴ変異体シリーズを作製する。
【０６３５】
いくつかの実施形態では、変異体シリーズをＶｏｎ  Ｈｉｐｐｅｌ−Ｌａｎｄａｕ腫瘍抑制タンパク質（ｐＶＨＬ）のために作製する。このタンパク質は、ヒドロキシル化ＨＩＦ１−アルファおよびＨＩＦ２−アルファに結合し、そのユビキチン化および分解を助長する。一実施形態では、ＨＩＦ１サブユニットとの相互作用に必要な領域を漸進的に突然変異し、それによって、ＨＩＦ１サブユニットと結合し、ＨＩＦ依存性遺伝子発現を調節する改変した能力を有する変異体を作る変異体シリーズを作製する。
【０６３６】
滴定実験で使用され得る転写物およびポリペプチド配列の非制限的な例は、表２７（転写物）および表２８（ポリペプチド）に示される。
【０６３７】
ＶＩ．キットおよびデバイス
キット
本発明は、好都合におよび／または効果的に本発明の方法を行うための多様なキットを提供する。典型的には、キットは、使用者が対象の（複数可）複数の治療を実施する、および／または複数の実験を実施することを可能にするのに十分な量および／または数の構成成分を含む。
【０６３８】
一態様において、本発明は、本発明の分子（シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡ）を含むキットを提供する。一実施形態において、キットは、１つ以上の機能的抗体またはその機能断片を含む。
【０６３９】
そのキットは、翻訳可能領域を含む第１のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを含む、腫瘍学関連タンパク質産生のためのものであり得る。キットは、製剤組成物を形成するための包装および説明書ならびに／または送達剤をさらに含んでもよい。送達剤は、本明細書で開示される食塩水、緩衝液、リピドイド（ｌｉｐｉｄｏｉｄ）、または任意の送達剤を含んでもよい。
【０６４０】
一実施形態において、緩衝液には、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、リン酸塩、および／またはＥＤＴＡが含まれてもよい。別の実施形態において、緩衝液は、食塩水、２ｍＭカルシウムを含有する食塩水、５％ショ糖、２ｍＭカルシウムを含有する５％ショ糖、５％マンニトール、２ｍＭカルシウムを含有する５％マンニトール、Ｒｉｎｇｅｒの乳酸塩、塩化ナトリウム、２ｍＭカルシウムを含有する塩化ナトリウムを含み得るが、これらに限定されない）。さらなる実施形態において、緩衝液は沈殿されてもよく、または凍結乾燥されてもよい。各構成成分の量は、一貫した、再現性のある高濃度食塩水または単純緩衝製剤を可能にするように変更され得る。構成成分は、一定期間にわたって、および／または多様な条件下での緩衝液中における修飾ＲＮＡの安定性を増加させるようにも変更され得る。一態様において、本発明は、標的細胞内に導入されるとき、所望の量の翻訳可能領域によってコードされる腫瘍学関連タンパク質を産生するのに有効な量で提供される、翻訳可能領域を含むシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡと、細胞の自然免疫応答を実質的に阻害するのに有効な量で提供される、阻害性核酸を含む第２のシグナルセンサーポリヌクレオチドと、包装および説明書と、を含む、腫瘍学関連タンパク質産生のためのキットを提供する。
【０６４１】
一態様において、本発明は、シグナルセンサーポリヌクレオチドが細胞ヌクレアーゼによる低減された分解を示す、翻訳可能領域を含むシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡと、包装および説明書と、を含む、腫瘍学関連タンパク質産生のためのキットを提供する。
【０６４２】
一態様において、本発明は、そのポリヌクレオチドが細胞ヌクレアーゼによる低減された分解を示す、翻訳可能領域を含むシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡと、第１の核酸の翻訳可能領域の翻訳に適した哺乳類細胞と、を含む、腫瘍学関連タンパク質産生のためのキットを提供する。
【０６４３】
デバイス
本発明は、目的とするポリペプチドをコードするシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを組み込み得るデバイスを提供する。これらのデバイスは、安定した製剤中に、ヒト患者等のそれを必要とする対象に即時に送達されることができる製剤中にシグナルセンサーポリヌクレオチドを合成するための試薬を含有する。
【０６４４】
いくつかの実施形態において、デバイスは、自己完結型であり、任意に、生成されたシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの合成および／または分析のための指示を得るための無線遠隔通信が可能である。デバイスは、少なくとも１つのシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡ、および好ましくは無制限の異なるシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡのモバイル合成が可能である。ある特定の実施形態において、デバイスは、１または少数の個体によって輸送されることができる。他の実施形態において、デバイスは、卓上または机に合うように調整される。他の実施形態において、デバイスは、スーツケース、バックパック、または同様の大きさの対象に収まるように調整される。別の実施形態において、デバイスは、ポイントオブケアまたは手持ち式デバイスであってもよい。さらなる実施形態において、デバイスは、乗用車、運搬車、もしくは救急車等の自動車、または戦車もしくは兵員輸送車等の軍用車両に収まるように調整される。目的とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードする修飾シグナルセンサーｍＲＮＡ生成するために必要な情報は、デバイスに存在するコンピュータ可読媒体内に存在する。
【０６４５】
一実施形態において、デバイスは、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの形態で投与された腫瘍学関連タンパク質のレベルを評価するために使用され得る。デバイスは、血液、尿、または他の生物流体（ｂｉｏｆｌｕｉｄｉｃ）検査を含んでもよい。
【０６４６】
いくつかの実施形態において、デバイスは、シグナルセンサー核酸および腫瘍学関連ポリペプチド配列であり得る核酸およびポリペプチド配列のデータベースを用いて通信（例えば、無線通信）が可能である。デバイスは、１つ以上の試料容器を挿入するための少なくとも１つの試料ブロックを含む。そのような試料容器は、テンプレートＤＮＡ、ヌクレオチド、酵素、緩衝剤、および他の試薬等の任意の数の材料の液体または他の形態を受け入れることが可能である。試料容器は、試料ブロックとの接触によって加熱または冷却されることも可能である。試料ブロックは、一般的に、少なくとも１つの試料ブロックのための１つ以上の電子制御装置を有するデバイス基部と通信している。試料ブロックは、好ましくは、試料容器およびその構成要素を約−２０℃〜＋１００℃を超える温度に加熱および／または冷却することができるような加熱モジュールである、加熱モジュールを含む。デバイス基部は、電池または外部電圧源等の電圧源と通信している。デバイスは、ＲＮＡ合成のための材料を貯蔵および分配するための手段も含む。
【０６４７】
任意に、試料ブロックは、合成された核酸を分離するためのモジュールを含む。あるいは、デバイスは、試料ブロックに作動可能に連結される分離モジュールを含む。好ましくは、デバイスは、合成された核酸を分析するための手段を含む。そのような分析には、配列同一性（ハイブリダイゼーション等によって実証される）、望ましくない配列の不在、合成されたｍＲＮＡの完全性の測定（分光光度法と組み合わせた微小流体粘度測定によるもの等）、ならびに修飾ＲＮＡの濃度および／または効力（分光光度法によるもの等）が挙げられる。
【０６４８】
ある特定の実施形態において、デバイスは、対象から得られた生物材料中に存在する病原体の検出のための手段、例えば、微生物同定用のＩＢＩＳ  ＰＬＥＸ−ＩＤシステム（Ａｂｂｏｔｔ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ）と組み合わせられる。
【０６４９】
本明細書に記載の薬学的組成物を皮内送達する際に用いるのに適したデバイスには、米国特許第４，８８６，４９９号、同第５，１９０，５２１号、同第５，３２８，４８３号、同第５，５２７，２８８号、同第４，２７０，５３７号、同第５，０１５，２３５号、同第５，１４１，４９６号、および同第５，４１７，６６２号に記載のデバイス等の短針デバイスが挙げられる。皮内組成物は、ＰＣＴ出願第ＷＯ９９／３４８５０号に記載のデバイスおよびその機能的等価物等の皮膚の中への針の有効な貫通長さを制限するデバイスによって投与され得る。液体ジェット式注入器を介して、および／または角質層に穴を開ける針を介して、液体組成物を真皮に送達し、真皮に到達するジェットを生じるジェット式注入デバイスが好適である。ジェット式注入デバイスは、例えば、米国特許第５，４８０，３８１号、同第５，５９９，３０２号、同第５，３３４，１４４号、同第５，９９３，４１２号、同第５，６４９，９１２号、同第５，５６９，１８９号、同第５，７０４，９１１号、同第５，３８３，８５１号、同第５，８９３，３９７号、同第５，４６６，２２０号、同第５，３３９，１６３号、同第５，３１２，３３５号、同第５，５０３，６２７号、同第５，０６４，４１３号、同第５，５２０，６３９号、同第４，５９６，５５６号、同第４，７９０，８２４号、同第４，９４１，８８０号、同第４，９４０，４６０号、ならびにＰＣＴ出願第ＷＯ９７／３７７０５号および同第ＷＯ９７／１３５３７号に記載されている。圧縮ガスを用いて、粉末形態にあるワクチンを加速させ、皮膚の外層を通して真皮に到達させる弾道粉末／粒子送達デバイスが、好適である。あるいは、またはさらに、従来のシリンジを皮内投与の古典的なマントゥー法で用いることができる。
【０６５０】
いくつかの実施形態において、デバイスは、ポンプであってもよく、または血液脳関門を横断する本発明の化合物または組成物の投与用のカテーテルを含む。そのようなデバイスには、加圧嗅覚送達デバイス、イオン泳動デバイス、多層微小流体デバイス等が挙げられるが、これらに限定されない。そのようなデバイスは、携帯型または固定型であってもよい。それらは、身体に埋め込み可能であるか、または身体に外的に係留されるか、またはそれらの組み合わせであってもよい。
【０６５１】
投与用デバイスを用いて、本発明で教示される単回、複数回、または分割投薬レジメンに従って、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを送達してもよい。そのようなデバイスは、以下に記載される。
【０６５２】
細胞、器官、および組織への複数回投与のための当技術分野で既知の方法およびデバイスは、本発明の実施形態として本明細書で開示される方法および組成物とともに使用されることが企図される。これらには、例えば、複数の針、例えば、ルーメンまたはカテーテルを用いるハイブリッドデバイスならびに熱、電流、または放射線駆動機構を利用するデバイスを有する方法およびデバイスが挙げられる。
【０６５３】
本発明に従って、これらの複数回投与デバイスを利用して、本明細書で企図される単回用量、複数回用量、または分割された用量が送達されてもよい。
【０６５４】
治療剤を固体組織に送達するための方法は、Ｂａｈｒａｍｉらによって説明されており、例えば、米国特許公開第２０１１０２３０８３９号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｂａｈｒａｍｉによると、一連の針はデバイス内に組み込まれ、各針の長さに沿ってその固体組織内の任意の箇所で実質的に同量の流体を送達する。
【０６５５】
生物組織を横断して生物材料を送達するためのデバイスは、Ｋｏｄｇｕｌｅらによって説明されており、例えば、米国特許公開第２０１１０１７２６１０号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｋｏｄｇｕｌｅによると、１つ以上の金属から作製され、かつ約２００ミクロン〜約３５０ミクロンの外径および少なくとも１００ミクロンの長さを有する複数の中空型マイクロニードルがデバイス内に組み込まれ、ペプチド、タンパク質、炭水化物、核酸分子、脂質、および他の薬学的に有効な成分またはそれらの組み合わせを送達する。
【０６５６】
治療剤の組織への送達のための送達プローブは、Ｇｕｎｄａｙらによって説明されており、例えば、米国特許公開第２０１１０２７０１８４号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｇｕｎｄａｙによると、複数の針がデバイス内に組み込まれ、デバイスは、付加されたカプセルを作動位置と非作動位置との間で移動させ、その針を通してカプセルの外に薬剤を出させる。
【０６５７】
複数回注入医療器具が、Ａｓｓａｆによって説明されており、例えば、米国特許公開第２０１１０２１８４９７号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ａｓｓａｆによると、複数の針がデバイス内に組み込まれ、デバイスは、その針のうちの１つ以上に接続するチャンバと、各注入の後、連続的にそのチャンバに医療用流体を補充する手段と、を有する。
【０６５８】
一実施形態において、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、少なくとも３つの針を介して皮下にまたは筋肉内に、同時または６０分以内に３つの異なる、任意に隣接した部位へ投与される（例えば、同時または６０以内に４、５、６、７、８、９、または１０個の部位への投与）。分割された用量は、各々が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許公開第２０１１０２３０８３９号および同第２０１１０２１８４９７号に記載のデバイスを用いて、同時に隣接した組織に投与され得る。
【０６５９】
物質を患者の身体に注入するための少なくとも部分的に埋め込み可能なシステム、具体的には陰茎勃起刺激システムが、Ｆｏｒｓｅｌｌによって説明されており、例えば、米国特許公開第２０１１０１９６１９８号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｆｏｒｓｅｌｌによると、複数の針がデバイス内に組み込まれ、デバイスは、患者の左および右の陰核海綿体に隣接する１つ以上の筐体とともに埋め込まれる。また、針を通して薬物を供給するためにリザーバおよびポンプも埋め込まれる。
【０６６０】
治療的有効量の鉄分の経皮送達のための方法が、Ｂｅｒｅｎｓｏｎによって説明されており、例えば、米国特許公開第２０１００１３０９１０号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｂｅｒｅｎｓｏｎによると、複数の針を用いて、イオン泳動パッチ上のイオン性鉄分の経皮送達を強化するために角質層内に複数のマイクロチャネルを作製することができる。
【０６６１】
生物組織を横断する生物材料の送達のための方法が、Ｋｏｄｇｕｌｅらによって説明されており、例えば、米国特許公開第２０１１０１９６３０８号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｋｏｄｇｕｌｅによると、治療的活性成分を含む複数の生分解性マイクロニードルがデバイスに組み込まれ、タンパク質、炭水化物、核酸分子、脂質、および他の薬学的活性成分、またはそれらの組み合わせを送達する。
【０６６２】
ボツリヌス毒素組成物を含む経皮パッチが、Ｄｏｎｏｖａｎによって説明されており、例えば、米国特許公開第２００８０２２００２０号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｄｏｎｏｖａｎによると、複数の針がパッチ内に組み込まれ、血液を破裂させることなく、皮膚の角質層を通して突出するその針を通してボツリヌス毒素を角質層下に送達する。
【０６６３】
およそ０．２〜１５ｍＬの液体製剤を保持することができる小さい使い捨ての薬物リザーバ、またはパッチポンプを皮膚上に配置し、製剤を細い針（例えば、２６〜３４ゲージ）を用いて連続的に皮下に送達することができる。非限定的な例として、パッチポンプは、３０〜３４ゲージ針を有するばね式の５０ｍｍ×７６ｍｍ×２０ｍｍ（ＢＤ（商標），Ｍｉｃｒｏｉｎｆｕｓｅｒ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ  ＮＪ）、インスリン等の薬物送達に使用される２ｍＬリザーバを有する４１ｍｍ×６２ｍｍ×１７ｍｍ（ＯＭＮＩＰＯＤ（登録商標），Ｉｎｓｕｌｅｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）、または０．５〜１０ｍＬリザーバを有する４３〜６０ｍｍ直径、１０ｍｍ厚（ＰＡＴＣＨＰＵＭＰ（登録商標），ＳｔｅａｄｙＭｅｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）であってもよい。さらに、パッチポンプは、電池式および／または充電式であり得る。
【０６６４】
低温治療の箇所への活性剤の投与用の凍結探針が、Ｔｏｕｂｉａによって説明されており、例えば、米国特許公開第２００８０１４００６１号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｔｏｕｂｉａによると、複数の針がプローブ内に組み込まれ、プローブは、チャンバ内への活性剤を受容し、薬剤を組織に投与する。
【０６６５】
炎症を治療するか、もしくは予防し、または健常な関節を促進するための方法が、Ｓｔｏｃｋらによって説明されており、例えば、米国特許公開第２００９０１５５１８６号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｓｔｏｃｋによると、複数の針がデバイスに組み込まれ、シグナル伝達調節因子化合物を含有する組成物を投与する。
【０６６６】
多部位注入システムが、Ｋｉｍｍｅｌｌらによって説明されており、例えば、米国特許公開第２０１００２５６５９４号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｋｉｍｍｅｌｌによると、複数の針がデバイス内に組み込まれ、その針を通して薬物を角質層内に送達する。
【０６６７】
インターフェロンを皮内区画に送達するための方法が、Ｄｅｋｋｅｒらによって説明されており、例えば、米国特許公開第２００５０１８１０３３号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｄｅｋｋｅｒによると、０〜１ｍｍの露出された高さを持つ放出口を有する複数の針がデバイス内に組み込まれ、それが０．３ｍｍ〜２ｍｍの深さで物質を送達することによって、薬物動態およびバイオアベイラビリティを改善する。
【０６６８】
遺伝子、酵素、および生物薬剤を組織細胞に送達するための方法が、Ｄｅｓａｉによって説明されており、例えば、米国特許公開第２００３００７３９０８号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｄｅｓａｉによると、複数の針が体内に挿入されるデバイス内に組み込まれ、その針を通して薬物流体を送達する。
【０６６９】
線維芽細胞を用いて不整脈を治療するための方法が、Ｌｅｅらによって説明されており、例えば、米国特許公開第２００４０００５２９５号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｌｅｅによると、複数の針がデバイス内に組み込まれ、線維芽細胞を組織の局所的領域に送達する。
【０６７０】
磁力制御されたポンプ使用して脳腫瘍を治療するための方法が、Ｓｈａｃｈａｒらによって説明されており、例えば、米国特許第７７９９０１２号（方法）および同第７７９９０１６号（デバイス）に教示され、それらの内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｓｈａｃｈａｒによると、複数の針がポンプに組み込まれ、ポンプは、制御された速度でその針を通して薬物治療剤を押す。
【０６７１】
雌哺乳類における膀胱の機能的障害を治療する方法が、Ｖｅｒｓｉらによって説明されており、例えば、米国特許第８，０２９，４９６号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｖｅｒｓｉによると、一連のマイクロニードルがデバイス内に組み込まれ、その針を通して直接膀胱の膀胱三角部内に治療剤を送達する。
【０６７２】
マイクロニードル経皮輸送デバイスが、Ａｎｇｅｌらによって説明されており、例えば、米国特許第７，３６４，５６８号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ａｎｇｅｌによると、複数の針がデバイス内に組み込まれ、デバイスは、異なる方向から表面内に挿入されるその針を通して物質を体表内に輸送する。マイクロそのニードル経皮輸送デバイスは、中実型マイクロニードルシステムまたは中空型マイクロニードルシステムであってもよい。非限定的な例として、中実型マイクロニードルシステムは、薬物で被覆された約１５０〜７００μｍの高さの、ｃｍ２当たり３００〜１５００の中実マイクロニードルを伴う最大０．５ｍｇの容量を有し得る。マイクロニードルは、角質層に透過し、短い持続期間（例えば、２０秒間〜１５分間）、皮膚に残存する。別の例において、中空型マイクロニードルシステムは、最大３ｍＬの容量を有し、およそ９５０μｍの高さであるｃｍ２当たり１５〜２０マイクロニードルを用いて液体製剤を送達する。マイクロニードルは皮膚に透過し、液体製剤がデバイスから皮膚内に流れることを可能にする。中空型マイクロニードルシステムは、製剤体積および粘度に応じて、１〜３０分間で消耗し得る。
【０６７３】
皮下輸注用デバイスが、Ｄａｌｔｏｎらによって説明されており、例えば、米国特許第７，１５０，７２６号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｄａｌｔｏｎによると、複数の針がデバイス内に組み込まれ、その針を通して流体を皮下組織に送達する。
【０６７４】
マイクロカニューレを通したワクチンおよび遺伝子治療剤の皮内送達用デバイスおよび方法が、Ｍｉｋｓｚｔａらによって説明されており、例えば、米国特許第７，４７３，２４７号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｍｉｔｓｚｔａによると、少なくとも１つの中空型マイクロニードルがデバイス内に組み込まれ、０．０２５ｍｍ〜２ｍｍの深さでワクチンを対象の皮膚に送達する。
【０６７５】
インスリンを送達する方法が、Ｐｅｔｔｉｓらによって説明されており、例えば、米国特許第７，７２２，５９５号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｐｅｔｔｉｓによると、２つの針はデバイス内に組み込まれ、第１の針はインスリンを皮内区画に送達するように２．５ｍｍ未満の深さで、第２の針はインスリンを皮内区画に送達するように２．５ｍｍ超えかつ５．０ｍｍ未満の深さで、両方の針は基本的に同時に皮膚内に挿入される。
【０６７６】
吸引下での皮膚注入送達が、Ｋｏｃｈａｍｂａらによって説明されており、例えば、米国特許第６，８９６，６６６号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｋｏｃｈａｍｂａによると、互いに比較的に隣接した複数の針がデバイス内に組み込まれ、皮膚層の下に流体を注入する。
【０６７７】
皮膚を通して物質を取り除くか、または送達するためのデバイスが、Ｄｏｗｎらによって説明されており、例えば、米国特許第６，６０７，５１３号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｄｏｗｎによると、複数の皮膚透過メンバーがデバイス内に組み込まれ、約１００ミクロンから約２０００ミクロンの長さを有し、約３０〜５０ゲージである。
【０６７８】
物質を皮膚に送達するためのデバイスが、Ｐａｌｍｅｒらによって説明されており、例えば、米国特許第６，５３７，２４２号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｐａｌｍｅｒによると、一連のマイクロニードルがデバイス内に組み込まれ、その針と皮膚との接触を強化するために引っ張りアセンブリを使用し、物質のより均一な送達をもたらす。
【０６７９】
局所薬物送達のための灌流デバイスが、Ｚａｍｏｙｓｋｉによって説明されており、例えば、米国特許第６，４６８，２４７号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｚａｍｏｙｓｋｉによると、複数の皮下針が、皮下注射器が後退するときに皮下注射器の内容物を組織内に注入するデバイス内に組み込まれる。
【０６８０】
マイクロニードルおよびヒト皮膚との間の相互作用を改善することによる組織を横断する薬物および生体分子の増強された輸送のための方法が、Ｐｒａｕｓｎｉｔｚらによって説明されており、例えば、米国特許第６，７４３，２１１号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｐｒａｕｓｎｉｔｚによると、複数のマイクロニードルがデバイス内に組み込まれ、デバイスは、そこにマイクロニードルが適用される、より強固で、より変形しにくい表面を示すことができる。
【０６８１】
医薬剤の器官内投与のためのデバイスが、Ｔｉｎｇらによって説明されており、例えば、米国特許第６，０７７，２５１号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｔｉｎｇによると、増強投与のための側面開口部を有する複数の針がデバイス内に組み込まれ、デバイスは、その針を針チャンバからおよび針チャンバ中へ伸長および後退することによって医薬剤をリザーバからその針の中へ押し進め、その医薬剤を標的器官に注入する。
【０６８２】
複数の持針器および皮下多重チャネル輸注ポートが、Ｂｒｏｗｎによって説明されており、例えば、米国特許第４，６９５，２７３号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｂｒｏｗｎによると、持針器上の複数の針が輸注ポートの中隔を通して挿入され、その輸注ポート内の単離されたチャンバと連通する。
【０６８３】
二重皮下シリンジが、Ｈｏｒｎによって説明されており、例えば、米国特許第３，５５２，３９４号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｈｏｒｎによると、デバイス内に組み込まれる２つの針が、６８ｍｍ未満の間隔で離間され、異なるスタイルおよび長さであってもよく、このため注入が異なる深さで行われることを可能にする。
【０６８４】
複数の針および複数の流体区画を有するシリンジが、Ｈｅｒｓｈｂｅｒｇによって説明されており、例えば、米国特許第３，５７２，３３６号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｈｅｒｓｈｂｅｒｇによると、複数の針が複数の流体区画を有するシリンジ内に組み込まれ、１つの注入に混合することができない相性の悪い薬物を同時に投与することができる。
【０６８５】
流体の皮内の注入のための外科用器具が、Ｅｌｉｓｃｕらによって説明されており、例えば、米国特許第２，５８８，６２３号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｅｌｉｓｃｕによると、複数の針がその器具内に組み込まれ、流体を皮内により幅広い分散で注入する。
【０６８６】
複数の乳房内の乳管への物質の同時送達のための装置が、Ｈｕｎｇによって説明されており、例えば、欧州特許第１８１８０１７号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｈｕｎｇによると、複数のルーメンがデバイス内に組み込まれ、乳管網のオリフィスを通して挿入し、流体を乳管網に送達する。
【０６８７】
心臓または他の器官の組織への薬物の導入のためのカテーテルが、Ｔｋｅｂｕｃｈａｖａによって説明されており、例えば、国際公開第ＷＯ２００６１３８１０９号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｔｋｅｂｕｃｈａｖａによると、平坦な軌道で器官壁に進入する２つの湾曲針が組み込まれる。
【０６８８】
医薬剤を送達するためのデバイスが、Ｍｃｋａｙらによって説明されており、例えば、国際公開第ＷＯ２００６１１８８０４号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｍｃｋａｙによると、各針上に複数のオリフィスを有する複数の針がデバイス内に組み込まれ、脊髄円板の内部円板空間等の組織への局部送達を容易にする。
【０６８９】
哺乳類皮膚内の皮内空間内に免疫調節物質を直接送達するための方法が、Ｐｅｔｔｉｓによって説明されており、例えば、国際公開第ＷＯ２００４０２００１４号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｐｅｔｔｉｓによると、複数の針がデバイス内に組み込まれ、針を通して物質を０．３ｍｍ〜２ｍｍの深さに送達する。
【０６９０】
全身性吸収および改善された薬物動態のための皮膚の少なくとも２つの区画内へ物質を投与するための方法およびデバイスが、Ｐｅｔｔｉｓらによって説明されており、例えば、国際公開第ＷＯ２００３０９４９９５号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｐｅｔｔｉｓによると、約３００μｍ〜約５ｍｍの長さを有する複数の針がデバイス内に組み込まれ、皮内および皮下組織区画へ同時に送達する。
【０６９１】
針およびローラーを有する薬物送達デバイスが、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎらによって説明されており、例えば、国際公開第ＷＯ２０１２００６２５９号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｚｉｍｍｅｒｍａｎによると、ローラー内に位置する複数の中空針がデバイス内に組み込まれ、ローラーが回転すると、針を通してリザーバ内の内容物を送達する。
【０６９２】
カテーテルおよび／またはルーメンを利用する方法およびデバイス
カテーテルおよびルーメンを使用する方法およびデバイスを用いて、単回、複数回、または分割された投薬スケジュールにおいて本発明のｍｍＲＮＡを投与することができる。そのような方法およびデバイスを、以下に記載する。
【０６９３】
骨格筋芽細胞から損傷された心臓の心筋へのカテーテルベースの送達が、Ｊａｃｏｂｙらによって説明されており、例えば、米国特許公開第２００６０２６３３３８号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｊａｃｏｂｙによると、複数の針がデバイス内に組み込まれ、その少なくとも一部が血管内に挿入され、針を通して細胞組成物を対象の心臓の局所領域に送達する。
【０６９４】
神経毒素を用いて喘息を治療するための装置が、Ｄｅｅｍらによって説明されており、例えば、米国特許公開第２００６０２２５７４２号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｄｅｅｍによると、複数の針がデバイス内に組み込まれ、その針を通して神経毒素を気管支組織内に送達する。
【０６９５】
複数成分療法を施すための方法が、Ｎａｙａｋによって説明されており、例えば、米国特許第７，６９９，８０３号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｎａｙａｋによると、複数の注入カニューレがデバイス内に組み込まれてもよく、深さを制御するための深度スロットが含まれてもよく、治療用物質はそこで組織内に送達される。
【０６９６】
チャネルを切断し、少なくとも１つの治療剤を組織の所望の領域内に送達するための外科用デバイスが、ＭｃＩｎｔｙｒｅらによって説明されており、例えば、米国特許第８，０１２，０９６号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。ＭｃＩｎｔｙｒｅによると、複数の針がデバイス内に組み込まれ、これはチャネルを取り囲む組織の領域内に治療剤を分注し、特に経心筋血行再建手術によく適している。
【０６９７】
雌哺乳類における膀胱の機能的障害を治療する方法が、Ｖｅｒｓｉらによって説明されており、例えば、米国特許第８，０２９，４９６号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｖｅｒｓｉによると、一連のマイクロニードルがデバイス内に組み込まれ、その針を通して直接膀胱の膀胱三角部内に治療剤を送達する。
【０６９８】
流体を柔軟な生体バリアーに送達するためのデバイスおよび方法が、Ｙｅｓｈｕｒｕｎらによって説明されており、例えば、米国特許第７，９９８，１１９号（デバイス）および同第８，００７，４６６（方法）号に教示され、それらの内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｙｅｓｈｕｒｕｎによると、デバイス上のマイクロニードルが柔軟な生体バリアーに透過および伸長し、流体は中空型マイクロニードルの孔を通して注入される。
【０６９９】
心外膜表面を有し、心外膜を有する心臓の組織の領域に物質を介して注入するための、胴体内に配置される方法が、Ｂｏｎｎｅｒらによって説明されており、例えば、米国特許第７，６２８，７８０号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｂｏｎｎｅｒによると、デバイスは、針を組織内に操縦し、その針を通して医薬剤を組織内に注入するための細長いシャフトおよび遠位注入ヘッドを有する。
【０７００】
穿刺創を密封するためのデバイスが、Ｎｉｅｌｓｅｎらによって説明されており、例えば、米国特許第７，９７２，３５８号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｎｉｅｌｓｅｎによると、複数の針がデバイス内に組み込まれ、穿刺路を取り囲む組織内に閉鎖剤を送達する。
【０７０１】
筋形成および血管形成のための方法が、Ｃｈｉｕらによって説明されており、例えば、米国特許第６，５５１，３３８号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｃｈｉｕによると、少なくとも１．２５ｍｍの最大直径と、６〜２０ｍｍの穿刺深度を提供するのに有効な長さと、を有する５〜１５の針がデバイス内に組み込まれ、心筋近くに挿入し、外因性血管新生または筋原性因子をその針の少なくとも一部の中にある導管を通してその心筋に供給する。
【０７０２】
前立腺組織の治療ための方法が、Ｂｏｌｍｓｊらによって説明されており、例えば、米国特許第６，５２４，２７０号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｂｏｌｍｓｊによると、尿道を通して挿入されるカテーテルを含むデバイスが、周囲の前立腺組織内に伸長可能な少なくとも１つの中空端を有する。収斂薬および鎮痛薬は、その端部を通してその前立腺組織内に投与される。
【０７０３】
流体を骨内部位に輸注する方法が、Ｆｉｎｄｌａｙらによって説明されており、例えば、米国特許第６，７６１，７２６号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｆｉｎｄｌａｙによると、軟質材料の層で覆われた材料の硬質殻を貫通することが可能な複数の針がデバイス内に組み込まれ、その材料の硬質殻から下へ規定の距離で流体を送達する。
【０７０４】
薬物を血管壁内に注入するためのデバイスが、Ｖｉｇｉｌらによって説明されており、例えば、米国特許第５，７１３，８６３号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｖｉｇｉｌによると、複数の注入器がデバイス内の可撓管のそれぞれの上に設置され、血管壁内への輸注のためにマルチルーメンカテーテルを通してその可撓管の中へ、およびその注入器の外へ薬物流体を導入する。
【０７０５】
治療用および／または診断用薬剤を身体通路を取り囲む組織に送達するためのカテーテルが、Ｆａｘｏｎらによって説明されており、例えば、米国特許第５，４６４，３９５号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｆａｘｏｎによると、少なくとも１つの針カニューレがカテーテル内に組み込まれ、カテーテルの外部へ突出するその針を通して所望の薬剤を組織に送達する。
【０７０６】
治療剤を送達するためのバルーンカテーテルが、Ｏｒｒによって説明されており、例えば、国際公開第ＷＯ２０１００２４８７１号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｏｒｒによると、複数の針がデバイス内に組み込まれ、治療剤を組織内の異なる深さに送達する。
【０７０７】
電流を利用する方法およびデバイス
本明細書に教示される単回、複数回、または分割された投薬レジメンに従って、電流を利用する方法およびデバイスを用いて、本発明のｍｍＲＮＡを送達することができる。そのような方法およびデバイスが、以下に記載される。
【０７０８】
電気コラーゲン誘導治療デバイスが、Ｍａｒｑｕｅｚによって説明されており、例えば、米国特許公開第２００９０１３７９４５号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｍａｒｑｕｅｚによると、複数の針がデバイス内に組み込まれ、皮膚を繰り返し穿刺し、最初に皮膚に適用される物質の一部を皮膚部分に引き込む。
【０７０９】
動電システムが、Ｅｔｈｅｒｅｄｇｅらによって説明されており、例えば、米国特許公開第２００７０１８５４３２号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｅｔｈｅｒｅｄｇｅによると、マイクロニードルがデバイス内に組み込まれ、電流によって、針を通して薬物を標的とされる治療部位に推進する。
【０７１０】
イオン泳動デバイスが、Ｍａｔｓｕｍｕｒａらによって説明されており、例えば、米国特許第７，４３７，１８９号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｍａｔｓｕｍｕｒａによると、複数の針がデバイス内に組み込まれ、イオン化可能薬物をより速い速度で、またはより高効率で生体内に送達することができる。
【０７１１】
無針注入およびエレクトロポレーションによる生物活性剤の皮内送達が、Ｈｏｆｆｍａｎｎらによって説明されており、例えば、米国特許第７，１７１，２６４号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｈｏｆｆｍａｎｎによると、１つ以上の無針注入器がエレクトロポレーションデバイスに組み込まれ、無針注入とエレクトロポレーションとの組み合わせは、薬剤を皮膚、筋肉、または粘膜の細胞内に導入するのに十分である。
【０７１２】
電気透過化処理（ｅｌｅｃｔｒｏｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）を介した細胞内送達のための方法が、Ｌｕｎｄｋｖｉｓｔらによって説明されており、例えば、米国特許第６，６２５，４８６号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｌｕｎｄｋｖｉｓｔによると、一対の針電極がカテーテル内に組み込まれる。そのカテーテルは体内ルーメン内に位置し、そのルーメンを取り囲む組織内に透過させるためのその針電極が続く。次いでデバイスは、その針電極のうちの少なくとも１つを通して薬剤を導入し、その針電極で電界をかけ、その薬剤が細胞膜を通して治療部位の細胞内へ通過することを可能にする。
【０７１３】
経皮免疫化のための送達システムが、Ｌｅｖｉｎらによって説明されており、例えば、国際公開第ＷＯ２００６００３６５９号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｌｅｖｉｎによると、複数の電極がデバイス内に組み込まれ、電気エネルギーを電極間に印加し、経皮送達を容易にするためのマイクロチャネルを皮膚内に生成する。
【０７１４】
ＲＦエネルギーを皮膚の中へ送達するための方法が、Ｓｃｈｏｍａｃｋｅｒによって説明されており、例えば、国際公開第ＷＯ２０１１１６３２６４号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｓｃｈｏｍａｃｋｅｒによると、複数の針がデバイス内に組み込まれ、針がＲＦエネルギーをプレート上の孔を通して皮膚に挿入し、送達するように、皮膚をプレートとの接触に誘引するために減圧する。
【０７１５】
ＶＩＩ．定義
本明細書中の種々の箇所で、本開示の化合物の置換基が、群においてまたは範囲において開示される。本開示は、そのような群および範囲のメンバーのありとあらゆる個々の部分的組み合わせを含むことが具体的に意図される。例えば、「Ｃ１−６アルキル」という用語は、メチル、エチル、Ｃ３アルキル、Ｃ４アルキル、Ｃ５アルキル、およびＣ６アルキルを個々に開示することが具体的に意図される。
【０７１６】
約：本明細書で使用されるとき、「約」という用語は、列挙される値の＋／−１０％を意味する。
【０７１７】
組み合わせて投与される：本明細書で使用されるとき、「組み合わせて投与される」または「組み合わせた投与」という用語は、２つ以上の薬剤が、同時にまたは患者に対する各薬剤の効果の重複があるような間隔内で、対象に投与されることを意味する。いくつかの実施形態において、それらは、互いの約６０、３０、１５、１０、５、または１分以内に投与される。いくつかの実施形態において、薬剤の投与は、組み合わせ（例えば、相乗的）効果が達成されるように、互いに十分に近接して間隔を置かれる。
【０７１８】
動物：本明細書で使用されるとき、「動物」という用語は、動物界の任意のメンバーを指す。いくつかの実施形態において、「動物」は、任意の発達段階にあるヒトを指す。いくつかの実施形態において、「動物」は、任意の発達段階にある非ヒト動物を指す。ある特定の実施形態において、非ヒト動物は、哺乳動物（例えば、齧歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、またはブタ）である。いくつかの実施形態において、動物には、哺乳動物、鳥類、爬虫類、両生類、サカナ、および蠕虫が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、動物は、トランスジェニック動物、遺伝子操作動物、またはクローンである。
【０７１９】
目的とする抗原または所望の抗原：本明細書で使用されるとき、「目的とする抗原」または「所望の抗原」という用語は、本明細書に記載の抗体、ならびにそれらの断片、変異体、変異形、および改変体によって免疫特異的に結合される、本明細書に提供されるタンパク質および他の生体分子を含む。目的とする抗原の例としては、インスリン、インスリン様成長因子、ｈＧＨ、ｔＰＡ、インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、インターフェロン（ＩＦＮ）α、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＦＮω、またはＩＦＮτ、ＴＮＦαおよびＴＮＦβ、ＴＮＦγ、ＴＲＡＩＬ等の腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）；Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＣＰ−１、およびＶＥＧＦ等のサイトカインが挙げられるが、これらに限定されない。
【０７２０】
およそ：本明細書で使用されるとき、目的とする１つ以上の値に適用される「およそ」または「約」という用語は、定められる参照値と同様である値を指す。ある特定の実施形態において、「およそ」または「約」という用語は、別途定められるか、または文脈から別途明白でない限り、定められる参照値のいずれかの方向（それよりも大きいまたはそれよりも小さい）における、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ未満の内に該当する値の範囲を指す（そのような数字が可能な値の１００％を超えるような場合を除く）。
【０７２１】
と会合される：本明細書で使用されるとき、２つ以上の部分に関して使用される際、「と会合される」、「複合体化される」、「連結される」、「結合される」、および「係留される」という用語は、直接、または連結剤としての役目を果たす１つ以上のさらなる部分を介してのいずれかで、その部分が互いに物理的に会合されるか、または結合されて、その部分が、構造が使用される条件下、例えば、生理的条件下で、物理的に会合されたままであるように十分に安定した構造を形成することを意味する。「会合」は、厳密に直接的な共有化学結合を経る必要はない。それは、「会合した」実体が物理的に会合したままであるように十分に安定したイオン結合もしくは水素結合またはハイブリダイゼーションベースの結合性も示唆し得る。
【０７２２】
二機能性：本明細書で使用されるとき、「二機能性」という用語は、少なくとも２つの機能を維持することが可能である任意の物質、分子、または部分を指す。この機能は、同じ結果または異なる結果を達成してもよい。この機能をもたらす構造は、同じであることも、異なることもある。例えば、本発明の二機能性修飾ＲＮＡが、細胞傷害性ペプチド（第１の機能）をコードし得る一方で、コードＲＮＡを含むヌクレオシドは、それ自体として、細胞傷害性（第２の機能）である。この例において、癌細胞への二機能性修飾ＲＮＡの送達は、癌を寛解させ得るまたは治療し得るペプチドまたはタンパク質分子をもたらすだけでなく、万一、修飾ＲＮＡの翻訳の代わりに分解が生じることがあった場合、ヌクレオシドの細胞傷害性ペイロードを細胞に送達するであろう。
【０７２３】
生体適合性：本明細書で使用されるとき、「生体適合性」という用語は、損傷、毒性、または免疫系による拒絶の危険性をほとんどもしくは全くもたらさず、生細胞、組織、器官、または系と適合性であることを意味する。
【０７２４】
生分解性：本明細書で使用されるとき、「生分解性」という用語は、生き物の作用によって無害の生成物へと分解されることが可能であることを意味する。
【０７２５】
生物学的に活性：本明細書で使用されるとき、「生物学的に活性」という表現は、生体系および／または生物において活性を有する任意の物質の特徴を指す。例えば、生物に投与されるときに、その生物に対して生物学的効果を有する物質は、生物学的に活性であると見なされる。特定の実施形態において、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、そのシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡのほんの一部分でも、生物学的に活性であるか、生物学的に関連性があると見なされる活性を模倣する場合、生物学的に活性であると見なされ得る。
【０７２６】
がん：本明細書で使用されるとき、対象の「がん」という用語は、制御不能の増殖、不死、転移能、速い成長および増殖速度といった特徴、ならびに、一定の特徴的な形態学的特長を保有する細胞の存在を指す。しばしばがん細胞は腫瘍の形態であるが、そのような細胞は対象内に単独で存在し得、または、白血球細胞のように独立した細胞として血流内を循環し得る。
【０７２７】
細胞の成長：本明細書で使用されるとき、「細胞の成長」という用語は、主に細胞の数における成長と関連し、これは、細胞の再生の速度が細胞死（例えば、アポトーシスまたは壊死）の速度よりも大きいときに、細胞の再生によって発生する（すなわち、増殖）。
【０７２８】
化学用語：以下は、「アシル」から「チオール」までの種々の化学用語の定義を提供する。
【０７２９】
本明細書で使用されるとき、「アシル」という用語は、本明細書に定義されるカルボニル基を介して親分子基に結合される、本明細書に定義される水素またはアルキル基（例えば、ハロアルキル基）を表し、ホルミル（すなわち、カルボキシアルデヒド基）、アセチル、プロピオニル、ブタノイル等により例として示される。例示の非置換アシル基は、１〜７、１〜１１、または１〜２１個の炭素を含む。いくつかの実施形態において、アルキル基は、本明細書に記載の１、２、３、または４個の置換基でさらに置換される。
【０７３０】
本明細書で使用されるとき、「アシルアミノ」という用語は、本明細書に定義されるアミノ基を介して親分子基に結合される、本明細書に定義されるアシル基を表す（すなわち、−Ｎ（ＲＮ１）−Ｃ（Ｏ）−Ｒであり、式中、Ｒは、Ｈであるか、または任意に置換されるＣ１−６、Ｃ１−１０、もしくはＣ１−２０アルキル基であり、ＲＮ１は、本明細書に定義される通りである）。例示の非置換アシルアミノ基は、１〜４１個の炭素（例えば、１〜７、１〜１３、１〜２１、２〜７、２〜１３、２〜２１、または２〜４１個の炭素）を含む。いくつかの実施形態において、アルキル基は、本明細書に記載の１、２、３、もしくは４個の置換基でさらに置換され、かつ／またはアミノ基は、−ＮＨ２もしくは−ＮＨＲＮ１であり、式中、ＲＮ１は、独立して、ＯＨ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＮＲＮ２２、ＳＯ２ＯＲＮ２、ＳＯ２ＲＮ２、ＳＯＲＮ２、アルキル、またはアリールであり、各ＲＮ２は、Ｈ、アルキル、またはアリールであり得る。
【０７３１】
本明細書で使用されるとき、「アシルオキシ」という用語は、酸素原子を介して親分子基に結合される、本明細書に定義されるアシル基を表す（すなわち、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒであり、式中、Ｒは、Ｈであるか、または任意に置換されるＣ１−６、Ｃ１−１０、もしくはＣ１−２０アルキル基である）。例示の非置換アシルオキシ基は、１〜２１個の炭素（例えば、１〜７または１〜１１個の炭素）を含む。いくつかの実施形態において、アルキル基は、本明細書に記載の１、２、３、もしくは４個の置換基でさらに置換され、かつ／またはアミノ基は、−ＮＨ２もしくは−ＮＨＲＮ１であり、式中、ＲＮ１は、独立して、ＯＨ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＮＲＮ２２、ＳＯ２ＯＲＮ２、ＳＯ２ＲＮ２、ＳＯＲＮ２、アルキル、またはアリールであり、各ＲＮ２は、Ｈ、アルキル、またはアリールであり得る。
【０７３２】
本明細書で使用されるとき、「アルカリール（ａｌｋａｒｙｌ）」という用語は、本明細書に定義されるアルキレン基を介して親分子基に結合される、本明細書に定義されるアリール基を表す。例示の非置換アルカリール基は、７〜３０個の炭素（例えば、Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリール、Ｃ１−１０アルク−Ｃ６−１０アリール、またはＣ１−２０アルク−Ｃ６−１０アリール等の、７〜１６または７〜２０個の炭素）である。いくつかの実施形態において、アルキレンおよびアリールは各々、それぞれの基について本明細書に定義される１、２、３、または４個の置換基でさらに置換され得る。接頭辞「アルク−」に続く他の基は、同じように定義され、ここで「アルク」は、別途注記のない限り、Ｃ１−６アルキレンを指し、結合される化学構造は、本明細書に定義される通りである。
【０７３３】
「アルクシクロアルキル（ａｌｋｃｙｃｌｏａｌｋｙｌ）」という用語は、本明細書に定義されるアルキレン基（例えば、１〜４、１〜６、１〜１０、または１〜２０個の炭素のアルキレン基）を介して親分子基に結合される、本明細書に定義されるシクロアルキル基を表す。いくつかの実施形態において、アルキレンおよびシクロアルキルは各々、それぞれの基について本明細書に定義される１、２、３、または４個の置換基でさらに置換され得る。
【０７３４】
本明細書で使用されるとき、「アルケニル」という用語は、別途明記されない限り、１つ以上の炭素−炭素二重結合を含有する、２〜２０個の炭素（例えば、２〜６または２〜１０個の炭素）の、一価の直鎖または分岐鎖基を表し、エテニル、１−プロペニル、２−プロペニル、２−メチル−１−プロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル等により例として示される。アルケニルは、シスおよびトランス異性体の両方を含む。アルケニル基は、本明細書に定義されるアミノ、アリール、シクロアルキル、もしくはヘテロシクリル（例えば、ヘテロアリール）から独立して選択される１、２、３、もしくは４個の置換基、または本明細書に記載の例示のアルキル置換基のうちのいずれかで、任意に置換されてもよい。
【０７３５】
「アルケニルオキシ」という用語は、式−ＯＲの化学置換基を表し、式中、Ｒは、別途明記されない限り、Ｃ２−２０アルケニル基（例えば、Ｃ２−６またはＣ２−１０アルケニル）である。例示のアルケニルオキシ基には、エテニルオキシ、プロペニルオキシ等が含まれる。いくつかの実施形態において、アルケニル基は、本明細書に定義される１、２、３、または４個の置換基（例えば、ヒドロキシ基）でさらに置換され得る。
【０７３６】
「アルクヘテロアリール」という用語は、本明細書に定義されるアルキレン基を介して親分子基に結合される、本明細書に定義されるヘテロアリール基を指す。例示の非置換アルクヘテロアリール基は、２〜３２個の炭素（例えば、Ｃ１−６アルク−Ｃ１−１２ヘテロアリール、Ｃ１−１０アルク−Ｃ１−１２ヘテロアリール、またはＣ１−２０アルク−Ｃ１−１２ヘテロアリール等の、２〜２２、２〜１８、２〜１７、２〜１６、３〜１５、２〜１４、２〜１３、または２〜１２個の炭素）である。いくつかの実施形態において、アルキレンおよびヘテロアリールは各々、それぞれの基について本明細書に定義される１、２、３、または４個の置換基でさらに置換され得る。アルクヘテロアリール基は、アルクヘテロシクリル基の部分集合である。
【０７３７】
「アルクヘテロシクリル」という用語は、本明細書に定義されるアルキレン基を介して親分子基に結合される、本明細書に定義されるヘテロシクリル基を表す。例示の非置換アルクヘテロシクリル基は、２〜３２個の炭素（例えば、Ｃ１−６アルク−Ｃ１−１２ヘテロシクリル、Ｃ１−１０アルク−Ｃ１−１２ヘテロシクリル、またはＣ１−２０アルク−Ｃ１−１２ヘテロシクリル等の、２〜２２、２〜１８、２〜１７、２〜１６、３〜１５、２〜１４、２〜１３、または２〜１２個の炭素）である。いくつかの実施形態において、アルキレンおよびヘテロシクリルは各々、それぞれの基について本明細書に定義される１、２、３、または４個の置換基でさらに置換され得る。
【０７３８】
「アルコキシ」という用語は、式−ＯＲの化学置換基を表し、式中、Ｒは、別途明記されない限り、Ｃ１−２０アルキル基（例えば、Ｃ１−６またはＣ１−１０アルキル）である。例示のアルコキシ基には、メトキシ、エトキシ、プロポキシ（例えば、ｎ−プロポキシおよびイソプロポキシ）、ｔ−ブトキシ等が含まれる。いくつかの実施形態において、アルキル基は、本明細書に定義される１、２、３、または４個の置換基（例えば、ヒドロキシまたはアルコキシ）でさらに置換され得る。
【０７３９】
「アルコキシアルコキシ」という用語は、アルコキシ基で置換されるアルコキシ基を表す。例示の非置換アルコキシアルコキシ基は、２〜４０個の炭素（例えば、Ｃ１−６アルコキシ−Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−１０アルコキシ−Ｃ１−１０アルコキシ、またはＣ１−２０アルコキシ−Ｃ１−２０アルコキシ等の、２〜１２または２〜２０個の炭素）を含む。いくつかの実施形態において、各アルコキシ基は、本明細書に定義される１、２、３、または４個の置換基でさらに置換され得る。
【０７４０】
「アルコキシアルキル」という用語は、アルコキシ基で置換されるアルキル基を表す。例示の非置換アルコキシアルキル基は、２〜４０個の炭素（例えば、Ｃ１−６アルコキシ−Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−１０アルコキシ−Ｃ１−１０アルキル、またはＣ１−２０アルコキシ−Ｃ１−２０アルキル等の、２〜１２または２〜２０個の炭素）を含む。いくつかの実施形態において、アルキルおよびアルコキシは各々、それぞれの基について本明細書に定義される１、２、３、または４個の置換基でさらに置換され得る。
【０７４１】
本明細書で使用されるとき、「アルコキシカルボニル」という用語は、カルボニル原子を介して親分子基に結合される、本明細書に定義されるアルコキシを表す（例えば、−Ｃ（Ｏ）−ＯＲであり、式中、Ｒは、Ｈであるか、または任意に置換されるＣ１−６、Ｃ１−１０、もしくはＣ１−２０アルキル基である）。例示の非置換アルコキシカルボニルは、１〜２１個の炭素（例えば、１〜１１または１〜７個の炭素）を含む。いくつかの実施形態において、アルコキシ基は、本明細書に記載の１、２、３、または４個の置換基でさらに置換される。
【０７４２】
本明細書で使用されるとき、「アルコキシカルボニルアルコキシ」という用語は、本明細書に定義されるアルコキシカルボニル基で置換される、本明細書に定義されるアルコキシ基を表す（例えば、−Ｏ−アルキル−Ｃ（Ｏ）−ＯＲであって、式中、Ｒは、任意に置換されるＣ１−６、Ｃ１−１０、またはＣ１−２０アルキル基である）。例示の非置換アルコキシカルボニルアルコキシは、３〜４１個の炭素（例えば、Ｃ１−６アルコキシカルボニル−Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−１０アルコキシカルボニル−Ｃ１−１０アルコキシ、またはＣ１−２０アルコキシカルボニル−Ｃ１−２０アルコキシ等の、３〜１０、３〜１３、３〜１７、３〜２１、または３〜３１個の炭素）を含む。いくつかの実施形態において、各アルコキシ基は、独立して、本明細書に記載の１、２、３、または４個の置換基（例えば、ヒドロキシ基）でさらに置換される。
【０７４３】
本明細書で使用されるとき、「アルコキシカルボニルアルキル」という用語は、本明細書に定義されるアルコキシカルボニル基で置換される、本明細書に定義されるアルキル基を表す（例えば、−アルキル−Ｃ（Ｏ）−ＯＲであって、式中、Ｒは、任意に置換されるＣ１−２０、Ｃ１−１０、またはＣ１−６アルキル基である）。例示の非置換アルコキシカルボニルアルキルは、３〜４１個の炭素（例えば、Ｃ１−６アルコキシカルボニル−Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−１０アルコキシカルボニル−Ｃ１−１０アルキル、またはＣ１−２０アルコキシカルボニル−Ｃ１−２０アルキル等の、３〜１０、３〜１３、３〜１７、３〜２１、または３〜３１個の炭素）を含む。いくつかの実施形態において、各アルキルおよびアルコキシ基は、独立して、本明細書に記載の１、２、３、または４個の置換基（例えば、ヒドロキシ基）でさらに置換される。
【０７４４】
本明細書で使用されるとき、「アルキル」という用語は、別途明記されない限り、１〜２０個（例えば、１〜１０または１〜６個）の炭素の直鎖および分岐鎖両方の飽和基を含む。アルキル基は、メチル、エチル、ｎ−およびイソ−プロピル、ｎ−、ｓｅｃ−、イソ−、およびｔｅｒｔ−ブチル、ネオペンチル等により例として示され、次のものからなる群から独立して選択される１、２、３個の置換基で、または２個以上の炭素のアルキル基の場合には４個の置換基で、任意に置換されてもよい：（１）Ｃ１−６アルコキシ；（２）Ｃ１−６アルキルスルフィニル；（３）本明細書に定義されるアミノ（例えば、非置換アミノ（すなわち、−ＮＨ２）または置換アミノ（すなわち、−Ｎ（ＲＮ１）２、式中、ＲＮ１は、アミノについて定義される通りである）；（４）Ｃ６−１０アリール−Ｃ１−６アルコキシ；（５）アジド；（６）ハロ；（７）（Ｃ２−９ヘテロシクリル）オキシ；（８）ヒドロキシ；（９）ニトロ；（１０）オキソ（例えば、カルボキシアルデヒドまたはアシル）；（１１）Ｃ１−７スピロシクリル；（１２）チオアルコキシ；（１３）チオール；（１４）−ＣＯ２ＲＡ’（式中、ＲＡ’は、（ａ）Ｃ１−２０アルキル（例えば、Ｃ１−６アルキル）、（ｂ）Ｃ２−２０アルケニル（例えば、Ｃ２−６アルケニル）、（ｃ）Ｃ６−１０アリール、（ｄ）水素、（ｅ）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリール、（ｆ）アミノ−Ｃ１−２０アルキル、（ｇ）−（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’のポリエチレングリコール（式中、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３の各々は、独立して、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、Ｒ’は、ＨまたはＣ１−２０アルキルである）、および（ｈ）−ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１のアミノ−ポリエチレングリコール（式中、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３の各々は、独立して、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、各ＲＮ１は、独立して、水素であるか、または任意に置換されるＣ１−６アルキルである）からなる群から選択される）；（１５）−Ｃ（Ｏ）ＮＲＢ’ＲＣ’（式中、ＲＢ’およびＲＣ’の各々は、独立して、（ａ）水素、（ｂ）Ｃ１−６アルキル、（ｃ）Ｃ６−１０アリール、および（ｄ）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリールからなる群から選択される）；（１６）−ＳＯ２ＲＤ’（式中、ＲＤ’は、（ａ）Ｃ１−６アルキル、（ｂ）Ｃ６−１０アリール、（ｃ）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリール、および（ｄ）ヒドロキシからなる群から選択される）；（１７）−ＳＯ２ＮＲＥ’ＲＦ’（式中、ＲＥ’およびＲＦ’の各々は、独立して、（ａ）水素、（ｂ）Ｃ１−６アルキル、（ｃ）Ｃ６−１０アリール、および（ｄ）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリールからなる群から選択される）；（１８）−Ｃ（Ｏ）ＲＧ’（式中、ＲＧ’は、（ａ）Ｃ１−２０アルキル（例えば、Ｃ１−６アルキル）、（ｂ）Ｃ２−２０アルケニル（例えば、Ｃ２−６アルケニル）、（ｃ）Ｃ６−１０アリール、（ｄ）水素、（ｅ）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリール、（ｆ）アミノ−Ｃ１−２０アルキル、（ｇ）−（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’のポリエチレングリコール（式中、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３の各々は、独立して、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、Ｒ’は、ＨまたはＣ１−２０アルキルである）、および（ｈ）−ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１のアミノ−ポリエチレングリコール（式中、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３の各々は、独立して、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、各ＲＮ１は、独立して、水素であるか、または任意に置換されるＣ１−６アルキルである）からなる群から選択される）；（１９）−ＮＲＨ’Ｃ（Ｏ）ＲＩ’（式中、ＲＨ’は、（ａ１）水素および（ｂ１）Ｃ１−６アルキルからなる群から選択され、ＲＩ’は、（ａ２）Ｃ１−２０アルキル（例えば、Ｃ１−６アルキル）、（ｂ２）Ｃ２−２０アルケニル（例えば、Ｃ２−６アルケニル）、（ｃ２）Ｃ６−１０アリール、（ｄ２）水素、（ｅ２）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリール、（ｆ２）アミノ−Ｃ１−２０アルキル、（ｇ２）−（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’のポリエチレングリコール（式中、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３の各々は、独立して、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、Ｒ’は、ＨまたはＣ１−２０アルキルである）、および（ｈ２）−ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１のアミノ−ポリエチレングリコール（式中、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３の各々は、独立して、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、各ＲＮ１は、独立して、水素であるか、または任意に置換されるＣ１−６アルキルである）からなる群から選択される）；（２０）−ＮＲＪ’Ｃ（Ｏ）ＯＲＫ’（式中、ＲＪ’は、（ａ１）水素および（ｂ１）Ｃ１−６アルキルからなる群から選択され、ＲＫ’は、（ａ２）Ｃ１−２０アルキル（例えば、Ｃ１−６アルキル）、（ｂ２）Ｃ２−２０アルケニル（例えば、Ｃ２−６アルケニル）、（ｃ２）Ｃ６−１０アリール、（ｄ２）水素、（ｅ２）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリール、（ｆ２）アミノ−Ｃ１−２０アルキル、（ｇ２）−（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’のポリエチレングリコール（式中、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３の各々は、独立して、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、Ｒ’は、ＨまたはＣ１−２０アルキルである）、および（ｈ２）−ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１のアミノ−ポリエチレングリコール（式中、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３の各々は、独立して、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、各ＲＮ１は、独立して、水素であるか、または任意に置換されるＣ１−６アルキルである）からなる群から選択される）；ならびに（２１）アミジン。いくつかの実施形態において、これらの基の各々は、本明細書に記載されるようにさらに置換され得る。例えば、Ｃ１−アルカリールのアルキレン基は、オキソ基でさらに置換されて、それぞれのアリーロイル（ａｒｙｌｏｙｌ）置換基をもたらすことができる。
【０７４５】
本明細書で使用されるとき、「アルキレン」および接頭辞「アルク−」という用語は、２つの水素原子の除去によって直鎖または分岐鎖の飽和炭化水素に由来する、飽和二価炭化水素基を表し、メチレン、エチレン、イソプロピレン等により例として示される。「Ｃｘ−ｙアルキレン」および接頭辞「Ｃｘ−ｙアルク−」という用語は、ｘ〜ｙ個の炭素を有するアルキレン基を表す。ｘに関する例示の値は、１、２、３、４、５、および６であり、ｙに関する例示の値は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、または２０である（例えば、Ｃ１−６、Ｃ１−１０、Ｃ２−２０、Ｃ２−６、Ｃ２−１０、またはＣ２−２０アルキレン）。いくつかの実施形態において、アルキレンは、アルキル基について本明細書に定義される１、２、３、または４個の置換基でさらに置換され得る。
【０７４６】
本明細書で使用されるとき、「アルキルスルフィニル」という用語は、−Ｓ（Ｏ）−基を介して親分子基に結合されるアルキル基を表す。例示の非置換アルキルスルフィニル基は、１〜６、１〜１０、または１〜２０個の炭素である。いくつかの実施形態において、アルキル基は、本明細書に定義される１、２、３、または４個の置換基でさらに置換され得る。
【０７４７】
本明細書で使用されるとき、「アルキルスルフィニルアルキル」という用語は、アルキルスルフィニル基によって置換された、本明細書に定義されるアルキル基を表す。例示の非置換アルキルスルフィニルアルキル基は、２〜１２、２〜２０、または２〜４０個の炭素である。いくつかの実施形態において、各アルキル基は、本明細書に定義される１、２、３、または４個の置換基でさらに置換され得る。
【０７４８】
本明細書で使用されるとき、「アルキニル」という用語は、炭素−炭素三重結合を含有する、２〜２０個の炭素原子（例えば、２〜４、２〜６、または２〜１０個の炭素）の、一価の直鎖または分岐鎖基を表し、エチニル、１−プロピニル等により例として示される。アルキニル基は、本明細書に定義されるアリール、シクロアルキル、またはヘテロシクリル（例えば、ヘテロアリール）から独立して選択される１、２、３、もしくは４個の置換基、または本明細書に記載の例示のアルキル置換基のうちのいずれかで、任意に置換されてもよい。
【０７４９】
「アルキニルオキシ」という用語は、式−ＯＲの化学置換基を表し、式中、Ｒは、別途明記されない限り、Ｃ２−２０アルキニル基（例えば、Ｃ２−６またはＣ２−１０アルキニル）である。例示のアルキニルオキシ基には、エチニルオキシ、プロピニルオキシ等が含まれる。いくつかの実施形態において、アルキニル基は、本明細書に定義される１、２、３、または４個の置換基（例えば、ヒドロキシ基）でさらに置換され得る。
【０７５０】
本明細書で使用されるとき、「アミジン」という用語は、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２基を表す。
【０７５１】
本明細書で使用されるとき、「アミノ」という用語は、−Ｎ（ＲＮ１）２を表し、式中、各ＲＮ１は、独立して、Ｈ、ＯＨ、ＮＯ２、Ｎ（ＲＮ２）２、ＳＯ２ＯＲＮ２、ＳＯ２ＲＮ２、ＳＯＲＮ２、Ｎ−保護基、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アリール、アルカリール、シクロアルキル、アルクシクロアルキル、カルボキシアルキル、スルホアルキル、ヘテロシクリル（例えば、ヘテロアリール）、またはアルクヘテロシクリル（例えば、アルクヘテロアリール）であり、これらの列挙されるＲＮ１基の各々は、各基について本明細書に定義されるように任意に置換され得るか、または２つのＲＮ１が組み合わさって、ヘテロシクリルもしくはＮ保護基を形成し、各ＲＮ２は、独立して、Ｈ、アルキル、またはアリールである。本発明のアミノ基は、非置換アミノ（すなわち、−ＮＨ２）または置換アミノ（すなわち、−Ｎ（ＲＮ１）２）であり得る。好ましい実施形態において、アミノは、−ＮＨ２または−ＮＨＲＮ１であり、式中、ＲＮ１は、独立して、ＯＨ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＮＲＮ２２、ＳＯ２ＯＲＮ２、ＳＯ２ＲＮ２、ＳＯＲＮ２、アルキル、カルボキシアルキル、スルホアルキル、またはアリールであり、各ＲＮ２は、Ｈ、Ｃ１−２０アルキル（例えば、Ｃ１−６アルキル）、またはＣ６−１０アリールであり得る。
【０７５２】
本明細書に記載の「アミノ酸」という用語は、側鎖、アミノ基、および酸性基（例えば、−ＣＯ２Ｈのカルボキシ基または−ＳＯ３Ｈのスルホ基）を有する分子を指し、このアミノ酸は、側鎖、アミノ基、または酸性基（例えば、側鎖）によって親分子基に結合される。いくつかの実施形態において、アミノ酸は、カルボニル基によって親分子基に結合され、この側鎖またはアミノ基は、カルボニル基に結合される。例示の側鎖には、任意に置換されるアルキル、アリール、ヘテロシクリル、アルカリール、アルクヘテロシクリル、アミノアルキル、カルバモイルアルキル、およびカルボキシアルキルが含まれる。例示のアミノ酸には、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、ヒドロキシノルバリン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、ノルバリン、オルニチン、フェニルアラニン、プロリン、ピロリジン、セレノシステイン、セリン、タウリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンが含まれる。アミノ酸基は、次のものからなる群から独立して選択される１、２、３個の置換基で、または２個以上の炭素のアミノ酸基の場合には４個の置換基で、任意に置換されてもよい：（１）Ｃ１−６アルコキシ；（２）Ｃ１−６アルキルスルフィニル；（３）本明細書に定義されるアミノ（例えば、非置換アミノ（すなわち、−ＮＨ２）または置換アミノ（すなわち、−Ｎ（ＲＮ１）２（式中、ＲＮ１は、アミノについて定義される通りである））；（４）Ｃ６−１０アリール−Ｃ１−６アルコキシ；（５）アジド；（６）ハロ；（７）（Ｃ２−９ヘテロシクリル）オキシ；（８）ヒドロキシ；（９）ニトロ；（１０）オキソ（例えば、カルボキシアルデヒドまたはアシル）；（１１）Ｃ１−７スピロシクリル；（１２）チオアルコキシ；（１３）チオール；（１４）−ＣＯ２ＲＡ’（式中、ＲＡ’は、（ａ）Ｃ１−２０アルキル（例えば、Ｃ１−６アルキル）、（ｂ）Ｃ２−２０アルケニル（例えば、Ｃ２−６アルケニル）、（ｃ）Ｃ６−１０アリール、（ｄ）水素、（ｅ）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリール、（ｆ）アミノ−Ｃ１−２０アルキル、（ｇ）−（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’のポリエチレングリコール（式中、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３の各々は、独立して、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、Ｒ’は、ＨまたはＣ１−２０アルキルである）、および（ｈ）−ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１のアミノ−ポリエチレングリコール（式中、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３の各々は、独立して、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、各ＲＮ１は、独立して、水素であるか、または任意に置換されるＣ１−６アルキルである）からなる群から選択される）；（１５）−Ｃ（Ｏ）ＮＲＢ’ＲＣ’（式中、ＲＢ’およびＲＣ’の各々は、独立して、（ａ）水素、（ｂ）Ｃ１−６アルキル、（ｃ）Ｃ６−１０アリール、および（ｄ）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリールからなる群から選択される）；（１６）−ＳＯ２ＲＤ’（式中、ＲＤ’は、（ａ）Ｃ１−６アルキル、（ｂ）Ｃ６−１０アリール、（ｃ）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリール、および（ｄ）ヒドロキシからなる群から選択される）；（１７）−ＳＯ２ＮＲＥ’ＲＦ’（式中、ＲＥ’およびＲＦ’の各々は、独立して、（ａ）水素、（ｂ）Ｃ１−６アルキル、（ｃ）Ｃ６−１０アリール、および（ｄ）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリールからなる群から選択される）；（１８）−Ｃ（Ｏ）ＲＧ’（式中、ＲＧ’は、（ａ）Ｃ１−２０アルキル（例えば、Ｃ１−６アルキル）、（ｂ）Ｃ２−２０アルケニル（例えば、Ｃ２−６アルケニル）、（ｃ）Ｃ６−１０アリール、（ｄ）水素、（ｅ）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリール、（ｆ）アミノ−Ｃ１−２０アルキル、（ｇ）−（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’のポリエチレングリコール（式中、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３の各々は、独立して、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、Ｒ’は、ＨまたはＣ１−２０アルキルである）、および（ｈ）−ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１のアミノ−ポリエチレングリコール（式中、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３の各々は、独立して、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、各ＲＮ１は、独立して、水素であるか、または任意に置換されるＣ１−６アルキルである）からなる群から選択される）；（１９）−ＮＲＨ’Ｃ（Ｏ）ＲＩ’（式中、ＲＨ’は、（ａ１）水素および（ｂ１）Ｃ１−６アルキルからなる群から選択され、ＲＩ’は、（ａ２）Ｃ１−２０アルキル（例えば、Ｃ１−６アルキル）、（ｂ２）Ｃ２−２０アルケニル（例えば、Ｃ２−６アルケニル）、（ｃ２）Ｃ６−１０アリール、（ｄ２）水素、（ｅ２）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリール、（ｆ２）アミノ−Ｃ１−２０アルキル、（ｇ２）−（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’のポリエチレングリコール（式中、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３の各々は、独立して、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、Ｒ’は、ＨまたはＣ１−２０アルキルである）、および（ｈ２）−ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１のアミノ−ポリエチレングリコール（式中、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３の各々は、独立して、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、各ＲＮ１は、独立して、水素であるか、または任意に置換されるＣ１−６アルキルである）からなる群から選択される）；（２０）−ＮＲＪ’Ｃ（Ｏ）ＯＲＫ’（式中、ＲＪ’は、（ａ１）水素および（ｂ１）Ｃ１−６アルキルからなる群から選択され、ＲＫ’は、（ａ２）Ｃ１−２０アルキル（例えば、Ｃ１−６アルキル）、（ｂ２）Ｃ２−２０アルケニル（例えば、Ｃ２−６アルケニル）、（ｃ２）Ｃ６−１０アリール、（ｄ２）水素、（ｅ２）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリール、（ｆ２）アミノ−Ｃ１−２０アルキル、（ｇ２）−（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’のポリエチレングリコール（式中、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３の各々は、独立して、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、Ｒ’は、ＨまたはＣ１−２０アルキルである）、および（ｈ２）−ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１のアミノ−ポリエチレングリコール（式中、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３の各々は、独立して、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、各ＲＮ１は、独立して、水素であるか、または任意に置換されるＣ１−６アルキルである）からなる群から選択される）；ならびに（２１）アミジン。いくつかの実施形態において、これらの基の各々は、本明細書に記載されるようにさらに置換され得る。
【０７５３】
本明細書で使用されるとき、「アミノアルコキシ」という用語は、本明細書に定義されるアミノ基によって置換された、本明細書に定義されるアルコキシ基を表す。アルキルおよびアミノは各々、それぞれの基について本明細書に記載の１、２、３、または４個の置換基（例えば、ＣＯ２ＲＡ’（式中、ＲＡ’は、（ａ）Ｃ１−６アルキル、（ｂ）Ｃ６−１０アリール、（ｃ）水素、および（ｄ）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリール、例えば、カルボキシからなる群から選択される））でさらに置換され得る。
【０７５４】
本明細書で使用されるとき、「アミノアルキル」という用語は、本明細書に定義されるアミノ基によって置換された、本明細書に定義されるアルキル基を表す。アルキルおよびアミノは各々、それぞれの基について本明細書に記載の１、２、３、または４個の置換基（例えば、ＣＯ２ＲＡ’（式中、ＲＡ’は、（ａ）Ｃ１−６アルキル、（ｂ）Ｃ６−１０アリール、（ｃ）水素、および（ｄ）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリール、例えば、カルボキシからなる群から選択される））でさらに置換され得る。
【０７５５】
本明細書で使用されるとき、「アリール」という用語は、１つまたは２つの芳香族環を有する単環式、二環式、または多環式の炭素環式環系を表し、フェニル、ナフチル、１，２−ジヒドロナフチル、１，２，３，４−テトラヒドロナフチル、アントラセニル、フェナントレニル、フルオレニル、インダニル、インデニル等により例として示され、次のものからなる群から独立して選択される１、２、３、４、または５個の置換基で任意に置換されてもよい：（１）Ｃ１−７アシル（例えば、カルボキシアルデヒド）；（２）Ｃ１−２０アルキル（例えば、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ−Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキルスルフィニル−Ｃ１−６アルキル、アミノ−Ｃ１−６アルキル、アジド−Ｃ１−６アルキル、（カルボキシアルデヒド）−Ｃ１−６アルキル、ハロ−Ｃ１−６アルキル（例えば、ペルフルオロアルキル）、ヒドロキシ−Ｃ１−６アルキル、ニトロ−Ｃ１−６アルキル、またはＣ１−６チオアルコキシ−Ｃ１−６アルキル）；（３）Ｃ１−２０アルコキシ（例えば、ペルフルオロアルコキシ等のＣ１−６アルコキシ）；（４）Ｃ１−６アルキルスルフィニル；（５）Ｃ６−１０アリール；（６）アミノ；（７）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリール；（８）アジド；（９）Ｃ３−８シクロアルキル；（１０）Ｃ１−６アルク−Ｃ３−８シクロアルキル；（１１）ハロ；（１２）Ｃ１−１２ヘテロシクリル（例えば、Ｃ１−１２ヘテロアリール）；（１３） （Ｃ１−１２ヘテロシクリル）オキシ；（１４）ヒドロキシ；（１５）ニトロ；（１６）Ｃ１−２０チオアルコキシ（例えば、Ｃ１−６チオアルコキシ）；（１７）−（ＣＨ２）ｑＣＯ２ＲＡ’（式中、ｑは、０〜４の整数であり、ＲＡ’は、（ａ）Ｃ１−６アルキル、（ｂ）Ｃ６−１０アリール、（ｃ）水素、および（ｄ）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリールからなる群から選択される）；（１８）−（ＣＨ２）ｑＣＯＮＲＢ’ＲＣ’（式中、ｑは、０〜４の整数であり、ＲＢ’およびＲＣ’は、（ａ）水素、（ｂ）Ｃ１−６アルキル、（ｃ）Ｃ６−１０アリール、および（ｄ）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリールからなる群から独立して選択される）；（１９）−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＲＤ’（式中、ｑは、０〜４の整数であり、ＲＤ’は、（ａ）アルキル、（ｂ）Ｃ６−１０アリール、および（ｃ）アルク−Ｃ６−１０アリールからなる群から選択される）；（２０）−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＮＲＥ’ＲＦ’（式中、ｑは、０〜４の整数であり、ＲＥ’およびＲＦ’の各々は、独立して、（ａ）水素、（ｂ）Ｃ１−６アルキル、（ｃ）Ｃ６−１０アリール、および（ｄ）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリールからなる群から選択される）；（２１）チオール；（２２）Ｃ６−１０アリールオキシ；（２３）Ｃ３−８シクロアルコキシ；（２４）Ｃ６−１０アリール−Ｃ１−６アルコキシ；（２５）Ｃ１−６アルク−Ｃ１−１２ヘテロシクリル（例えば、Ｃ１−６アルク−Ｃ１−１２ヘテロアリール）；（２６）Ｃ２−２０アルケニル；ならびに（２７）Ｃ２−２０アルキニル。いくつかの実施形態において、これらの基の各々は、本明細書に記載されるようにさらに置換され得る。例えば、Ｃ１−アルカリールまたはＣ１−アルクヘテロシ��リルのアルキレン基は、オキソ基でさらに置換されて、それぞれのアリーロイルおよび（ヘテロシクリル）オイル置換基をもたらすことができる。
【０７５６】
本明細書で使用されるとき、「アリールアルコキシ」という用語は、酸素原子を介して親分子基に結合される、本明細書に定義されるアルカリール基を表す。例示の非置換アルコキシアルキル基は、７〜３０個の炭素（例えば、Ｃ６−１０アリール−Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ６−１０アリール−Ｃ１−１０アルコキシ、またはＣ６−１０アリール−Ｃ１−２０アルコキシ等の、７〜１６または７〜２０個の炭素）を含む。いくつかの実施形態において、アリールアルコキシ基は、本明細書に定義される１、２、３、または４個の置換基で置換され得る。
【０７５７】
「アリールオキシ」という用語は、式−ＯＲ’の化学置換基を表し、式中、Ｒ’は、別途明記されない限り、６〜１８個の炭素のアリール基である。いくつかの実施形態において、アリール基は、本明細書に定義される１、２、３、または４個の置換基で置換され得る。
【０７５８】
本明細書で使用されるとき、「アリーロイル」という用語は、カルボニル基を介して親分子基に結合される、本明細書に定義されるアリール基を表す。例示の非置換アリーロイル基は、７〜１１個の炭素のものである。いくつかの実施形態において、アリール基は、本明細書に定義される１、２、３、または４個の置換基で置換され得る。
【０７５９】
「アジド」という用語は、−Ｎ３基を表し、それは、−Ｎ＝Ｎ＝Ｎとしても表され得る。
【０７６０】
本明細書で使用されるとき、「二環式」という用語は、芳香族でも非芳香族でもあり得る２つの環を有する構造を指す。二環式構造には、本明細書に定義されるスピロシクリル基、および１つ以上の架橋を共有する２つの環が含まれ、そのような架橋は、１個の原子、または２個、３個、もしくはそれよりも多い原子を含む鎖を含むことができる。例示の二環式基には、二環式カルボシクリル基（その第１および第２の環は、本明細書に定義されるカルボシクリル基である）；二環式アリール基（その第１および第２の環は、本明細書に定義されるアリール基である）；二環式ヘテロシクリル基（その第１の環は、ヘテロシクリル基であり、第２の環は、カルボシクリル（例えば、アリール）またはヘテロシクリル（例えば、ヘテロアリール）基である）；および二環式ヘテロアリール基（その第１の環は、ヘテロアリール基であり、第２の環は、カルボシクリル（例えば、アリール）またはヘテロシクリル（例えば、ヘテロアリール）基である）が含まれる。いくつかの実施形態において、二環式基は、シクロアルキル、ヘテロシクリル、およびアリール基について本明細書に定義される１、２、３、または４個の置換基で置換され得る。
【０７６１】
本明細書で使用されるとき、「炭素環式」および「カルボシクリル」という用語は、芳香族でも非芳香族でもあり得る環が炭素原子によって形成される、任意に置換されるＣ３−１２単環式、二環式、または三環式構造を指す。炭素環式構造には、シクロアルキル、シクロアルケニル、およびアリール基が含まれる。
【０７６２】
本明細書で使用されるとき、「カルバモイル」という用語は、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（ＲＮ１）２を表し、式中、各ＲＮ１の意味は、本明細書に提供される「アミノ」の定義において見出される。
【０７６３】
本明細書で使用されるとき、「カルバモイルアルキル」という用語は、本明細書に定義されるカルバモイル基によって置換された、本明細書に定義されるアルキル基を表す。アルキル基は、本明細書に記載の１、２、３、または４個の置換基でさらに置換され得る。
【０７６４】
本明細書で使用されるとき、「カルバミル」という用語は、構造−ＮＲＮ１Ｃ（＝Ｏ）ＯＲまたは−ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（ＲＮ１）２を有するカルバメート基を指し、式中、各ＲＮ１の意味は、本明細書に提供される「アミノ」の定義において見出され、Ｒは、本明細書に定義されるアルキル、シクロアルキル、アルクシクロアルキル、アリール、アルカリール、ヘテロシクリル（例えば、ヘテロアリール）、またはアルクヘテロシクリル（例えば、アルクヘテロアリール）である。
【０７６５】
本明細書で使用されるとき、「カルボニル」という用語は、Ｃ（Ｏ）基を表し、それは、Ｃ＝Ｏとしても表され得る。
【０７６６】
「カルボキシアルデヒド」という用語は、構造−ＣＨＯを有するアシル基を表す。
【０７６７】
本明細書で使用されるとき、「カルボキシ」という用語は、−ＣＯ２Ｈを意味する。
【０７６８】
本明細書で使用されるとき、「カルボキシアルコキシ」という用語は、本明細書に定義されるカルボキシ基によって置換された、本明細書に定義されるアルコキシ基を表す。アルコキシ基は、アルキル基について本明細書に記載の１、２、３、または４個の置換基でさらに置換され得る。
【０７６９】
本明細書で使用されるとき、「カルボキシアルキル」という用語は、本明細書に定義されるカルボキシ基によって置換された、本明細書に定義されるアルキル基を表す。アルキル基は、本明細書に記載の１、２、３、または４個の置換基でさらに置換され得る。
【０７７０】
本明細書で使用されるとき、「シアノ」という用語は、−ＣＮ基を表す。
【０７７１】
「シクロアルコキシ」という用語は、式−ＯＲの化学置換基を表し、式中、Ｒは、別途明記されない限り、本明細書に定義されるＣ３−８シクロアルキル基である。シクロアルキル基は、本明細書に記載の１、２、３、または４個の置換基でさらに置換され得る。例示の非置換シクロアルコキシ基は、３〜８個の炭素である。いくつかの実施形態において、シクロアルキル基は、本明細書に記載の１、２、３、または４個の置換基でさらに置換され得る。
【０７７２】
本明細書で使用されるとき、「シクロアルキル」という用語は、別途明記されない限り、３〜８個の炭素の一価の飽和または不飽和非芳香族環状炭化水素基を表し、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、ビシクロ［２．２．１．］ヘプチル等により例として示される。シクロアルキル基が１つの炭素−炭素二重結合を含むとき、シクロアルキル基は、「シクロアルケニル」基と称され得る。例示のシクロアルケニル基には、シクロペンテニル、シクロヘキセニル等が含まれる。本発明のシクロアルキル基は、次のもので任意に置換され得る：（１）Ｃ１−７アシル（例えば、カルボキシアルデヒド）；（２）Ｃ１−２０アルキル（例えば、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ−Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキルスルフィニル−Ｃ１−６アルキル、アミノ−Ｃ１−６アルキル、アジド−Ｃ１−６アルキル、（カルボキシアルデヒド）−Ｃ１−６アルキル、ハロ−Ｃ１−６アルキル（例えば、ペルフルオロアルキル）、ヒドロキシ−Ｃ１−６アルキル、ニトロ−Ｃ１−６アルキル、またはＣ１−６チオアルコキシ−Ｃ１−６アルキル）；（３）Ｃ１−２０アルコキシ（例えば、ペルフルオロアルコキシ等のＣ１−６アルコキシ）；（４）Ｃ１−６アルキルスルフィニル；（５）Ｃ６−１０アリール；（６）アミノ；（７）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリール；（８）アジド；（９）Ｃ３−８シクロアルキル；（１０）Ｃ１−６アルク−Ｃ３−８シクロアルキル；（１１）ハロ；（１２）Ｃ１−１２ヘテロシクリル（例えば、Ｃ１−１２ヘテロアリール）；（１３） （Ｃ１−１２ヘテロシクリル）オキシ；（１４）ヒドロキシ；（１５）ニトロ；（１６）Ｃ１−２０チオアルコキシ（例えば、Ｃ１−６チオアルコキシ）；（１７）−（ＣＨ２）ｑＣＯ２ＲＡ’（式中、ｑは、０〜４の整数であり、ＲＡ’は、（ａ）Ｃ１−６アルキル、（ｂ）Ｃ６−１０アリール、（ｃ）水素、および（ｄ）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリールからなる群から選択される）；（１８）−（ＣＨ２）ｑＣＯＮＲＢ’ＲＣ’（式中、ｑは、０〜４の整数であり、ＲＢ’およびＲＣ’は、（ａ）水素、（ｂ）Ｃ６−１０アルキル、（ｃ）Ｃ６−１０アリール、および（ｄ）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリールからなる群から独立して選択される）；（１９）−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＲＤ’（式中、ｑは、０〜４の整数であり、ＲＤ’は、（ａ）Ｃ６−１０アルキル、（ｂ）Ｃ６−１０アリール、および（ｃ）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリールからなる群から選択される）；（２０）−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＮＲＥ’ＲＦ’（式中、ｑは、０〜４の整数であり、ＲＥ’およびＲＦ’の各々は、独立して、（ａ）水素、（ｂ）Ｃ６−１０アルキル、（ｃ）Ｃ６−１０アリール、および（ｄ）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリールからなる群から選択される）；（２１）チオール；（２２）Ｃ６−１０アリールオキシ；（２３）Ｃ３−８シクロアルコキシ；（２４）Ｃ６−１０アリール−Ｃ１−６アルコキシ；（２５）Ｃ１−６アルク−Ｃ１−１２ヘテロシクリル（例えば、Ｃ１−６アルク−Ｃ１−１２ヘテロアリール）；（２６）オキソ；（２７）Ｃ２−２０アルケニル；ならびに（２８）Ｃ２−２０ア��キニル。いくつかの実施形態において、これらの基の各々は、本明細書に記載されるようにさらに置換され得る。例えば、Ｃ１−アルカリールまたはＣ１−アルクヘテロシクリルのアルキレン基は、オキソ基でさらに置換されて、それぞれのアリーロイルおよび（ヘテロシクリル）オイル置換基をもたらすことができる。
【０７７３】
本明細書で使用されるとき、「ジアステレオマー」という用語は、互いの鏡像でなく、互いの上に重ね合わせ不可能である、立体異性体を意味する。
【０７７４】
本明細書で使用されるとき、本明細書で使用される薬剤の「有効量」は、有益なまたは所望の結果、例えば、臨床結果をもたらすのに十分な量であり、したがって、「有効量」は、それが適用されている前後関係に依存する。例えば、癌を治療する薬剤を投与することの前後関係において、有効量の薬剤は、例えば、薬剤の投与を伴わずに得られる反応と比較して、本明細書に定義される癌の治療を達成するのに十分な量である。
【０７７５】
本明細書で使用されるとき、「鏡像異性体」という用語は、少なくとも８０％（すなわち、一方の鏡像異性体が少なくとも９０％および他方の鏡像異性体が多くても１０％）、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９８％の光学純度または鏡像異性体過剰率（当技術分野で標準の方法によって決定するとき）を有する、本発明の化合物の各個々の光学活性型を意味する。
【０７７６】
本明細書で使用されるとき、「ハロ」という用語は、臭素、塩素、ヨウ素、またはフッ素から選択されるハロゲンを表す。
【０７７７】
本明細書で使用されるとき、「ハロアルコキシ」という用語は、ハロゲン基（すなわち、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩ）によって置換された、本明細書に定義されるアルコキシ基を表す。ハロアルコキシは、１、２、３個のハロゲンで、または２個以上の炭素のアルキル基の場合には４個のハロゲンで置換されてもよい。ハロアルコキシ基には、ペルフルオロアルコキシ（例えば、−ＯＣＦ３）、−ＯＣＨＦ２、−ＯＣＨ２Ｆ、−ＯＣＣｌ３、−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｂｒ、−ＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２Ｂｒ）ＣＨ３、および−ＯＣＨＩＣＨ３が含まれる。いくつかの実施形態において、ハロアルコキシ基は、アルキル基について本明細書に記載の１、２、３、または４個の置換基でさらに置換され得る。
【０７７８】
本明細書で使用されるとき、「ハロアルキル」という用語は、ハロゲン基（すなわち、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩ）によって置換された、本明細書に定義されるアルキル基を表す。ハロアルキルは、１、２、３個のハロゲンで、または２個以上の炭素のアルキル基の場合には４個のハロゲンで置換されてもよい。ハロアルキル基には、ペルフルオロアルキル（例えば、−ＣＦ３）、−ＣＨＦ２、−ＣＨ２Ｆ、−ＣＣｌ３、−ＣＨ２ＣＨ２Ｂｒ、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２Ｂｒ）ＣＨ３、および−ＣＨＩＣＨ３が含まれる。いくつかの実施形態において、ハロアルキル基は、アルキル基について本明細書に記載の１、２、３、または４個の置換基でさらに置換され得る。
【０７７９】
本明細書で使用されるとき、「ヘテロアルキレン」という用語は、構成炭素原子のうちの１個または２個が各々、窒素、酸素、または硫黄によって置き換えらた、本明細書に定義されるアルキレン基を指す。いくつかの実施形態において、ヘテロアルキレン基は、アルキレン基について本明細書に記載の１、２、３、または４個の置換基でさらに置換され得る。
【０７８０】
本明細書で使用されるとき、「ヘテロアリール」という用語は、芳香族である、本明細書に定義されるヘテロシクリルの部分集合を表し、すなわち、それらは単環式または多環式環系内に４ｎ＋２個のπ電子を含有する。例示の非置換ヘテロアリール基は、１〜１２個（例えば、１〜１１、１〜１０、１〜９、２〜１２、２〜１１、２〜１０、または２〜９個）の炭素ものもである。いくつかの実施形態において、ヘテロアリールは、ヘテロシクリル基について定義される１、２、３、または４個の置換基で置換される。
【０７８１】
本明細書で使用されるとき、「ヘテロシクリル」という用語は、別途明記されない限り、窒素、酸素、および硫黄からなる群から独立して選択される１、２、３、または４個のヘテロ原子を含有する、５、６、または７員環を表す。５員環は、０〜２つの二重結合を有し、６および７員環は、０〜３つの二重結合を有する。例示の非置換ヘテロシクリル基は、１〜１２個（例えば、１〜１１、１〜１０、１〜９、２〜１２、２〜１１、２〜１０、または２〜９個）の炭素のものである。「ヘテロシクリル」という用語は、１個以上の炭素および／またはヘテロ原子が単環式環の２つの隣接していない員を架橋する、架橋多環式構造を有する複素環式化合物、例えば、キヌクリジニル基も表す。「ヘテロシクリル」という用語は、上記の複素環式環のうちのいずれかが１、２、もしくは３つの炭素環式環、例えば、アリール環、シクロヘキサン環、シクロヘキセン環、シクロペンタン環、シクロペンテン環、またはインドリル、キノリル、イソキノリル、テトラヒドロキノリル、ベンゾフリル、ベンゾチエニル等の別の単環式の複素環式環に縮合される、二環式、三環式、および四環式基を含む。縮合ヘテロシクリルの例としては、トロパンおよび１，２，３，５，８，８ａ−ヘキサヒドロインドリジンが挙げられる。複素環には、ピロリル、ピロリニル、ピロリジニル、ピラゾリル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピリジル、ピペリジニル、ホモピペリジニル、ピラジニル、ピペラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、オキサゾリル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリル、イソオキサゾリジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、チアゾリル、チアゾリジニル、イソチアゾリル、イソチアゾリジニル、インドリル、インダゾリル、キノリル、イソキノリル、キノキサリニル、ジヒドロキノキサリニル、キナゾリニル、シノリニル、フタラジニル、ベンズイミダゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアジアゾリル、フリル、チエニル、チアゾリジニル、イソチアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、オキサジアゾリル（例えば、１，２，３−オキサジアゾリル）、プリニル、チアジアゾリル（例えば、１，２，３−チアジアゾリル）、テトラヒドロフラニル、ジヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、ジヒドロチエニル、ジヒドロインドリル、ジヒドロキノリル、テトラヒドロキノリル、テトラヒドロイソキノリル、ジヒドロイソキノリル、ピラニル、ジヒドロピラニル、ジチアゾリル、ベンゾフラニル、イソベンゾフラニル、ベンゾチエニル等が含まれ、１つ以上の二重結合が還元され、水素と置き換えられる、それらのジヒドロおよびテトラヒドロ形態を含む。さらに他の例示のヘテロシクリルには、２，３，４，５−テトラヒドロ−２−オキソ−オキサゾリル；２，３−ジヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−イミダゾリル；２，３，４，５−テトラヒドロ−５−オキソ−１Ｈ−ピラゾリル（例えば、２，３，４，５−テトラヒドロ−２−フェニル−５−オキソ−１Ｈ−ピラゾリル）；２，３，４，５−テトラヒドロ−２，４−ジオキソ−１Ｈ−イミダゾリル（例えば、２，３，４，５−テトラヒドロ−２，４−ジオキソ−５−メチル−５−フェニル−１Ｈ−イミダゾリル）；２，３−ジヒドロ−２−チオキソ−１，３，４−オキサジアゾリル（例えば、２，３−ジヒドロ−２−チオキソ−５−フェニル−１，３，４−オキサジアゾリル）；４，５−ジヒドロ−５−オキソ−１Ｈ−トリアゾリル（例えば、４，５−ジヒドロ−３−メチル−４−アミノ５−オキソ−１Ｈ−トリアゾリル）；１，２，３，４−テトラヒドロ−２，４−ジオキソピリジニル（例えば、１，２，３，４−テトラヒドロ−２，４−ジオキソ−３，３−ジエチルピリジニル）；２，６−ジオキソ−ピペリジニル（例えば、２，６−ジオキソ−３−エチル−３−フェニルピペリジニル）；１，６−ジヒドロ−６−オキソピリジミニル；１，６−ジヒドロ−４−オキソピリミジニル（例えば、２−（メチルチオ）−１，６−ジヒドロ−４−オキソ−５−メチルピリミジン−１−イル）；１，２，３，４−テトラヒドロ−２，４−ジオキソピリミジニル（例えば、１，２，３，４−テトラヒドロ−２，４−ジオキソ−３−エチルピリミジニル）；１，６−ジヒドロ−６−オキソ−ピリダジニル（例えば、１，６−ジヒドロ−６−オキソ−３−エチルピリダジニル）；１，６−ジヒドロ−６−オキソ−１，２，４−トリアジニル（例えば、１，６−ジヒドロ−５−イソプロピル−６−オキソ−１，２，４−トリアジニル）；２，３−ジヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−インドリル（例えば、３，３−ジメチル−２，３−ジヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−インドリルおよび２，３−ジヒドロ−２−オキソ−３，３’−スピロプロパン−１Ｈ−インドール−１−イル）；１，３−ジヒドロ−１−オキソ−２Ｈ−イソ−インドリル；１，３−ジヒドロ−１，３−ジオキソ−２Ｈ−イソ−インドリル；１Ｈ−ベンゾピラゾリル（例えば、１−（エトキシカルボニル）−１Ｈ−ベンゾピラゾリル）；２，３−ジヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−ベンズイミダゾリル（例えば、３−エチル−２，３−ジヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−ベンズイミダゾリル）；２，３−ジヒドロ−２−オキソ−ベンゾオキサゾリル（例えば、５−クロロ−２，３−ジヒドロ−２−オキソ−ベンゾオキサゾリル）；２，３−ジヒドロ−２−オキソ−ベンゾオキサゾリル；２−オキソ−２Ｈ−ベンゾピラニル；１，４−ベンゾジオキサニル；１，３−ベンゾジオキサニル；２，３−ジヒドロ−３−オキソ，４Ｈ−１，３−ベンゾチアジニル；３，４−ジヒドロ−４−オキソ−３Ｈ−キナゾリニル（例えば、２−メチル−３，４−ジヒドロ−４−オキソ−３Ｈ−キナゾリニル）；１，２，３，４−テトラヒドロ−２，４−ジオキソ−３Ｈ−キナゾリル（例えば、１−エチル−１，２，３，４−テトラヒドロ−２，４−ジオキソ−３Ｈ−キナゾリル）；１，２，３，６−テトラヒドロ−２，６−ジオキソ−７Ｈ−プリニル（例えば、１，２，３，６−テトラヒドロ−１，３−ジメチル−２，６−ジオキソ−７Ｈ−プリニル）；１，２，３，６−テトラヒドロ−２，６−ジオキソ−１Ｈ−プリニル（例えば、１，２，３，６−テトラヒドロ−３，７−ジメチル−２，６−ジオキソ−１Ｈ−プリニル）；２−オキソベンズ［ｃ，ｄ］インドリル；１，１−ジオキソ−２Ｈ−ナフト［１，８−ｃ，ｄ］イソチアゾリル；および１，８−ナフチレンジカルボキサミドが含まれる。さらなる複素環には、３，３ａ，４，５，６，６ａ−ヘキサヒドロ−ピロｌｏ［３，４−ｂ］ピロｌ−（２Ｈ）−イル、および２，５−ジアザビシクロ［２．２．１］ヘプタン−２−イル、ホモピペラジニル（またはジアゼパニル）、テトラヒドロピラニル、ジチアゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾチエニル、オキセパニル、チエパニル、アゾカニル、オキセカニル、およびチオカニルが含まれる。複素環基は、式：
【０７８２】
【化１】
2018183181.tif 000189
の基も含み、式中、
【０７８３】
Ｅ’は、−Ｎ−および−ＣＨ−からなる群から選択され、Ｆ’は、−Ｎ＝ＣＨ−、−ＮＨ−ＣＨ２−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＨ−、−ＣＨ＝Ｎ−、−ＣＨ２−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２Ｏ−、−ＯＣＨ２−、−Ｏ−、および−Ｓ−からなる群から選択され、Ｇ’は、−ＣＨ−および−Ｎ−からなる群から選択される。本明細書で言及されるヘテロシクリル基のうちのいずれかは、次のものからなる群から独立して選択される１、２、３、４、または５個の置換基で任意に置換されてもよい：（１）Ｃ１−７アシル（例えば、カルボキシアルデヒド）；（２）Ｃ１−２０アルキル（例えば、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ−Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキルスルフィニル−Ｃ１−６アルキル、アミノ−Ｃ１−６アルキル、アジド−Ｃ１−６アルキル、（カルボキシアルデヒド）−Ｃ１−６アルキル、ハロ−Ｃ１−６アルキル（例えば、ペルフルオロアルキル）、ヒドロキシ−Ｃ１−６アルキル、ニトロ−Ｃ１−６アルキル、またはＣ１−６チオアルコキシ−Ｃ１−６アルキル）；（３）Ｃ１−２０アルコキシ（例えば、ペルフルオロアルコキシ等のＣ１−６アルコキシ）；（４）Ｃ１−６アルキルスルフィニル；（５）Ｃ６−１０アリール；（６）アミノ；（７）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリール；（８）アジド；（９）Ｃ３−８シクロアルキル；（１０）Ｃ１−６アルク−Ｃ３−８シクロアルキル；（１１）ハロ；（１２）Ｃ１−１２ヘテロシクリル（例えば、Ｃ２−１２ヘテロアリール）；（１３） （Ｃ１−１２ヘテロシクリル）オキシ；（１４）ヒドロキシ；（１５）ニトロ；（１６）Ｃ１−２０チオアルコキシ（例えば、Ｃ１−６チオアルコキシ）；（１７）−（ＣＨ２）ｑＣＯ２ＲＡ’（式中、ｑは、０〜４の整数であり、ＲＡ’は、（ａ）Ｃ１−６アルキル、（ｂ）Ｃ６−１０アリール、（ｃ）水素、および（ｄ）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリールからなる群から選択される）；（１８）−（ＣＨ２）ｑＣＯＮＲＢ’ＲＣ’（式中、ｑは、０〜４の整数であり、ＲＢ’およびＲＣ’は、（ａ）水素、（ｂ）Ｃ１−６アルキル、（ｃ）Ｃ６−１０アリール、および（ｄ）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリールからなる群から独立して選択される）；（１９）−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＲＤ’（式中、ｑは、０〜４の整数であり、ＲＤ’は、（ａ）Ｃ１−６アルキル、（ｂ）Ｃ６−１０アリール、および（ｃ）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリールからなる群から選択される）；（２０）−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＮＲＥ’ＲＦ’（式中、ｑは、０〜４の整数であり、ＲＥ’およびＲＦ’の各々は、独立して、（ａ）水素、（ｂ）Ｃ１−６アルキル、（ｃ）Ｃ６−１０アリール、および（ｄ）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリールからなる群から選択される）；（２１）チオール；（２２）Ｃ６−１０アリールオキシ；（２３）Ｃ３−８シクロアルコキシ；（２４）アリールアルコキシ；（２５）Ｃ１−６アルク−Ｃ１−１２ヘテロシクリル（例えば、Ｃ１−６アルク−Ｃ１−１２ヘテロアリール）；（２６）オキソ；（２７）（Ｃ１−１２ヘテロシクリル）イミノ；（２８）Ｃ２−２０アルケニル；ならびに（２９）Ｃ２−２０アルキニル。��くつかの実施形態において、これらの基の各々は、本明細書に記載されるようにさらに置換され得る。例えば、Ｃ１−アルカリールまたはＣ１−アルクヘテロシクリルのアルキレン基は、オキソ基でさらに置換されて、それぞれのアリーロイルおよび（ヘテロシクリル）オイル置換基をもたらすことができる。
【０７８４】
本明細書で使用されるとき、「（ヘテロシクリル）イミノ」という用語は、イミノ基を介して親分子基に結合される、本明細書に定義されるヘテロシクリル基を表す。いくつかの実施形態において、ヘテロシクリル基は、本明細書に定義される１、２、３、または４個の置換基で置換され得る。
【０７８５】
本明細書で使用されるとき、「（ヘテロシクリル）オキシ」という用語は、酸素原子を介して親分子基に結合される、本明細書に定義されるヘテロシクリル基を表す。いくつかの実施形態において、ヘテロシクリル基は、本明細書に定義される１、２、３、または４個の置換基で置換され得る。
【０７８６】
本明細書で使用されるとき、「（ヘテロシクリル）オイル」という用語は、カルボニル基を介して親分子基に結合される、本明細書に定義されるヘテロシクリル基を表す。いくつかの実施形態において、ヘテロシクリル基は、本明細書に定義される１、２、３、または４個の置換基で置換され得る。
【０７８７】
本明細書で使用されるとき、「炭化水素」という用語は、炭素および水素原子のみからなる基を表す。
【０７８８】
本明細書で使用されるとき、「ヒドロキシ」という用語は、−ＯＨ基を表す。
【０７８９】
本明細書で使用されるとき、「ヒドロキシアルケニル」という用語は、１〜３個のヒドロキシ基によって置換された、本明細書に定義されるアルケニル基を表すが、但し、１個を超えるヒドロキシ基がアルキル基の単一の炭素原子に結合することはないことを条件とし、それはジヒドロキシプロペニル、ヒドロキシイソペンテニル等により例として示される。
【０７９０】
本明細書で使用されるとき、「ヒドロキシアルキル」という用語は、１〜３個のヒドロキシ基によって置換された、本明細書に定義されるアルキル基を表すが、但し、１個を超えるヒドロキシ基が、アルキル基の単一の炭素原子に結合することはないことを条件とし、それはヒドロキシメチル、ジヒドロキシプロピル等により例として示される。
【０７９１】
本明細書で使用されるとき、「異性体」という用語は、本発明の化合物のいずれかの任意の互変異性体、立体異性体、鏡像異性体、またはジアステレオマーを意味する。本発明の化合物は、１つ以上のキラル中心および／または二重結合を有することができ、したがって、二重結合異性体（すなわち、幾何Ｅ／Ｚ異性体）またはジアステレオマー（例えば、鏡像異性体（すなわち、（＋）または（−））またはシス／トランス異性体）等の立体異性体として存在し得ることが認識される。本発明に従って、本明細書に描写される化学構造、したがって本発明の化合物は、対応する立体異性体のすべて、つまり、立体異性的に純粋な形態（例えば、幾何的に純粋、鏡像異性的に純粋、またはジアステレオマー的に純粋）と、鏡像異性体混合物および立体異性体混合物、例えば、ラセミ体との両方を包含する。本発明の化合物の鏡像異性体混合物および立体異性体混合物は、キラル相ガスクロマトグラフィー、キラル相高性能液体クロマトグラフィー、キラル塩錯体としての化合物の結晶化、またはキラル溶媒中の化合物の結晶化等の周知の方法によって、典型的にそれらの構成要素の鏡像異性体または立体異性体へと分解することができる。鏡像異性体および立体異性体は、周知の不斉合成法によって、立体異性的または鏡像異性的に純粋な中間体、試薬、および触媒からも得ることができる。
【０７９２】
本明細書で使用されるとき、「Ｎ保護アミノ」という用語は、本明細書に定義される１つまたは２つのＮ保護基に結合している、本明細書に定義されるアミノ基を指す。
【０７９３】
本明細書で使用されるとき、「Ｎ保護基」という用語は、合成手順中に、望ましくない反応に対してアミノ基を保護するよう意図される基を表す。一般的に使用されるＮ保護基は、参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｒｅｅｎｅ，“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，”  ３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９９）に開示されている。Ｎ保護基には、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ピバロイル、ｔ−ブチルアセチル、２−クロロアセチル、２−ブロモアセチル、トリフルオロアセチル、トリクロロアセチル、フタリル、ｏ−ニトロフェノキシアセチル、α−クロロブチリル、ベンゾイル、４−クロロベンゾイル、４−ブロモベンゾイル、４−ニトロベンゾイル等の、アシル、アリーロイル、またはカルバミル基、および保護されたまたは保護されいないＤ、Ｌ、またはＤ等のキラル助剤、アラニン、ロイシン、フェニルアラニン等のＬ−アミノ酸；ベンゼンスルホニル、ｐ−トルエンスルホニル等のスルホニル含有基；ベンジルオキシカルボニル、ｐ−クロロベンジルオキシカルボニル、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル、２−ニトロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ブロモベンジルオキシカルボニル、３，４−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、３，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、２，４−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、２−ニトロ−４，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、３，４，５−トリメトキシベンジルオキシカルボニル、１−（ｐ−ビフェニルｙｌ）−１−メチルエトキシカルボニル、α，α−ジメチル−３，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、ベンズヒドリルオキシカルボニル、ｔ−ブチルオキシカルボニル、ジイソプロピルメトキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル、エトキシカルボニル、メトキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、２，２，２，−トリクロロエトキシカルボニル、フェノキシカルボニル、４−ニトロフェノキシカルボニル、フルオレニル−９−メトキシカルボニル、シクロペンチルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、シクロヘキシルオキシカルボニル、フェニルチオカルボニル等のカルバメート形成基、ベンジル、トリフェニルメチル、ベンジルオキシメチル等のアルカリール基、ならびにトリメチルシリル等のシリル基が含まれる。好ましいＮ保護基は、ホルミル、アセチル、ベンゾイル、ピバロイル、ｔ−ブチルアセチル、アラニル、フェニルスルホニル、ベンジル、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、およびベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）である。
【０７９４】
本明細書で使用されるとき、「ニトロ」という用語は、−ＮＯ２基を表す。
【０７９５】
本明細書で使用されるとき、「オキソ」という用語、＝Ｏを表す。
【０７９６】
本明細書で使用されるとき、「ペルフルオロアルキル」という用語は、アルキル基に結合した各水素ラジカルがフッ化物ラジカルによって置き換えられた、本明細書に定義されるアルキル基を表す。ペルフルオロアルキル基は、トリフルオロメチル、ペンタフルオロエチル等により例として示される。
【０７９７】
本明細書で使用されるとき、「ペルフルオロアルコキシ」という用語は、アルコキシ基に結合した各水素ラジカルがフッ化物ラジカルによって置き換えられた、本明細書に定義されるアルコキシ基を表す。ペルフルオロアルコキシ基は、トリフルオロメトキシ、ペンタフルオロエトキシ等により例として示される。
【０７９８】
本明細書で使用されるとき、「スピロシクリル」という用語は、その両端が親基の同じ炭素原子に結合してスピロ環式基を形成するＣ２−７アルキレンジラジカル、およびまた、その両端が同じ炭素原子に結合するＣ１−６ヘテロアルキレンジラジカルを表す。スピロシクリル基を形成するヘテロアルキレンラジカルは、窒素、酸素、および硫黄からなる群から独立して選択される１、２、３、または４個のヘテロ原子を含有することができる。いくつかの実施形態において、スピロシクリル基は、そのジラジカルが結合する炭素原子を除いて、１〜７個の炭素を含む。本発明のスピロシクリル基は、シクロアルキル基および／またはヘテロシクリル基に対する任意の置換基として本明細書に提供される１、２、３、または４個の置換基で任意に置換されてもよい。
【０７９９】
本明細書で使用されるとき、「立体異性体」という用語は、化合物（例えば、本明細書に記載の任意の式の化合物）が有し得るすべての可能性のある様々な異性型ならびに立体配座型、特にすべての可能性のある立体化学的および立体配座的異性型、基本的な分子構造のすべてのジアステレオマー、鏡像異性体、および／または配座異性体を指す。本発明のいくつかの化合物は、異なる互変異性型として存在してもよく、後者のすべてが本発明の範囲内に含まれる。
【０８００】
本明細書で使用されるとき、「スルホアルキル」という用語は、−ＳＯ３Ｈのスルホ基によって置換された、本明細書に定義されるアルキル基を表す。いくつかの実施形態において、アルキル基は、本明細書に記載の１、２、３、または４個の置換基でさらに置換され得る。
【０８０１】
本明細書で使用されるとき、「スルホニル」という用語は、−Ｓ（Ｏ）２−基を表す。
【０８０２】
本明細書で使用されるとき、「チオアルカリール」という用語は、式−ＳＲの化学置換基を表し、式中、Ｒは、アルカリール基である。いくつかの実施形態において、アルカリール基は、本明細書に記載の１、２、３、または４個の置換基でさらに置換され得る。
【０８０３】
本明細書で使用されるとき、「チオアルクヘテロシクリル」という用語は、式−ＳＲの化学置換基を表し、式中、Ｒは、アルクヘテロシクリル基である。いくつかの実施形態において、アルクヘテロシクリル基は、本明細書に記載の１、２、３、または４個の置換基でさらに置換され得る。
【０８０４】
本明細書で使用されるとき、「チオアルコキシ」という用語は、式−ＳＲの化学置換基を表し、式中、Ｒは、本明細書に定義されるアルキル基である。いくつかの実施形態において、アルキル基は、本明細書に記載の１、２、３、または４個の置換基でさらに置換され得る。
【０８０５】
「チオール」という用語は、−ＳＨ基を表す。
【０８０６】
化合物：本明細書で使用されるとき、「化合物」という用語は、描写される構造のすべての立体異性体、幾何異性体、互変異性体、および同位体を含むことが意図される。
【０８０７】
本明細書に記載の化合物は、不斉であり得る（例えば、１つ以上の立体中心を有する）。別途指定されない限り、鏡像異性体およびジアステレオマー等の、すべての立体異性体が意図される。不斉置換炭素原子を含有する本開示の化合物は、光学活性型またはラセミ型で単離することができる。光学活性型を光学活性の出発物質からどのように調製するかに関する方法は、ラセミ混合物の分解によって、または立体選択的合成によって等、当技術分野で知られている。オレフィンの多くの幾何異性体、Ｃ＝Ｎ二重結合等もまた、本発明に記載の化合物中に存在することができ、すべてのそのような安定な異性体が本開示において企図される。本開示の化合物のシスおよびトランス幾何異性体が記載され、それは異性体の混合物としてまたは分離した異性型として単離され得る。
【０８０８】
本開示の化合物は、互変異性型も含む。互変異性型は、単結合の隣位二重結合との交換、およびプロトンの付随する移動からもたらされる。互変異性型は、同じ実験式および総電荷を有する異性体プロトン化状態である、プロトン互変異性体（ｐｒｏｔｏｔｒｏｐｉｃ  ｔａｕｔｏｍｅｒｓ）を含む。例示のプロトン互変異性体には、ケトン−エノール対、アミド−イミド酸対、ラクタム−ラクチム対、アミド−イミド酸対、エナミン−イミン対、およびプロトンが複素環式系の２つ以上の位置を占有し得る環状型、例えば、１Ｈ−および３Ｈ−イミダゾール、１Ｈ−、２Ｈ−、および４Ｈ−１，２，４−トリアゾール、１Ｈ−および２Ｈ−イソインドール、ならびに１Ｈ−および２Ｈ−ピラゾールが含まれる。互変異性型は、平衡し得るか、または適切な置換によって１つの形態へと立体的に固定され得る。
【０８０９】
本開示の化合物は、中間体または最終化合物中で生じる原子の同位体もすべて含む。「同位体」は、同じ原子番号を有するが、核内の中性子の数が異なることに起因して異なる質量数を有する、原子を指す。例えば、水素の同位体には、トリチウムおよびジュウテリウムが含まれる。
【０８１０】
本開示の化合物および塩は、通例の方法によって、溶媒または水分子と組み合わせて溶媒和物および水和物を形成することにより調製することができる。
【０８１１】
状態：本明細書で使用されるとき、「状態」という用語は、観察可能な症状と一緒に現れる障害を指す。
【０８１２】
保存される：本明細書で使用されるとき、「保存される」という用語は、比較されている２つ以上の配列の同じ位置において変化することなく生じる残基である、それぞれ、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列のヌクレオチド残基またはアミノ酸残基を指す。比較的保存されているヌクレオチドまたはアミノ酸は、配列内の他の箇所に現れるヌクレオチドまたはアミノ酸よりも関連した配列の間で保存されているものである。
【０８１３】
いくつかの実施形態において、２つ以上の配列は、それらが互いに１００％同一である場合、「完全に保存される」と言われる。いくつかの実施形態において、２つ以上の配列は、それらが互いに少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一である場合、「高度に保存される」と言われる。いくつかの実施形態において、２つ以上の配列は、それらが互いに約７０％同一、約８０％同一、約９０％同一、約９５％、約９８％、または約９９％同一である場合、「高度に保存される」と言われる。いくつかの実施形態において、２つ以上の配列は、それらが互いに少なくとも３０％同一、少なくとも４０％同一、少なくとも５０％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一である場合、「保存される」と言われる。いくつかの実施形態において、２つ以上の配列は、それらが互いに約３０％同一、約４０％同一、約５０％同一、約６０％同一、約７０％同一、約８０％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９８％同一、または約９９％同一である場合、「保存される」と言われる。配列の保存は、オリゴヌクレオチドまたはポリペプチドの全長に適用してもよく、またはその一部分、領域、または特長に適用してもよい。
【０８１４】
環状または環化：本明細書で使用されるとき、「環状」という用語は、連続ループの存在を指す。環状分子は、円形である必要はなく、単に連結してサブユニットの途切れのない鎖を形成すればよい。本発明の操作されたＲＮＡまたはｍＲＮＡ等の環状分子は、単一ユニットであっても多量体であってもよく、または複合体もしくは高次構造の１つ以上の構成要素を含んでもよい。
【０８１５】
細胞増殖抑制性：本明細書で使用されるとき、「細胞増殖抑制性」は、細胞（例えば、哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞）、細菌、ウイルス、真菌、原虫、寄生虫、プリオン、またはこれらの組み合わせの成長、分裂、または増殖を阻害する、低減する、抑制することを指す。
【０８１６】
細胞傷害性：本明細書で使用されるとき、「細胞傷害性」は、細胞（例えば、哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞）、細菌、ウイルス、真菌、原虫、寄生虫、プリオン、またはこれらの組み合わせを死滅させるか、あるいはそれらに有害、有毒、または致命的な影響を引き起こすことを指す。
【０８１７】
送達：本明細書で使用されるとき、「送達」は、化合物、物質、実体、部分、積荷、またはペイロードを送達する作用または様態を指す。
【０８１８】
送達剤：本明細書で使用されるとき、「送達剤」は、標的とされる細胞へのシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡのインビボ送達を少なくとも部分的に容易にする、任意の物質を指す。
【０８１９】
不安定化される：本明細書で使用されるとき、「不安定な」、「不安定化する」、または「不安定化領域」という用語は、同じ領域または分子の出発形態、野生型、または天然型よりも安定性が低い領域または分子を意味する。
【０８２０】
検出可能な標識：本明細書で使用されるとき、「検出可能な標識」は、放射線写真撮影、蛍光、化学発光、酵素的活性、吸光等を含む当技術分野で既知の方法によって容易に検出される別の実体と結合されるか、それとともに組み込まれるか、またはそれと会合される１つ以上のマーカー、シグナル、または部分を指す。検出可能な標識には、放射性同位体、フルオロフォア、発色団、酵素、色素、金属イオン、リガンド、例えば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンおよびハプテン、量子ドット等が含まれる。検出可能な標識は、本明細書に開示のペプチドまたはタンパク質における任意の位置に位置してもよい。それらは、アミノ酸、ペプチド、もしくはタンパク質の内にあっても、またはＮ末端もしくはＣ末端に位置してもよい。
【０８２１】
疾患：本明細書で使用されるとき、「疾患」という用語は、しばしば特定の身体上の症状を示す、生物体の身体に影響を及ぼす異常な状態を指す。
【０８２２】
障害：本明細書で使用されるとき、「障害」という用語は、身体の正常な機能または確立した系の破壊または正常な機能への干渉を指す。
【０８２３】
消化：本明細書で使用されるとき、「消化」という用語は、より小さい片または構成成分へと分解することを意味する。ポリペプチドまたはタンパク質に言及するとき、消化は、ペプチドの産生をもたらす。
【０８２４】
遠位：本明細書で使用されるとき、「遠位」という用語は、中心ら離れて、または目的とする点もしくは領域から離れて位置することを意味する。
【０８２５】
用量分割係数（ＤＳＦ）−用量分割治療のＰＵＤを、総１日用量または単回単位用量のＰＵＤで割った比率。値は、投薬レジメンの群の比較から導出される。
【０８２６】
コードされたタンパク質の切断シグナル：本明細書で使用されるとき、「コードされたタンパク質の切断シグナル」は、タンパク質切断シグナルをコードするヌクレオチド配列を指す。
【０８２７】
操作：本明細書で使用されるとき、本発明の実施形態は、それらが、構造的であろうと化学的であろうと、出発点分子、野生型分子、または天然分子から異なる特長または特性を有するように設計されるとき、「操作」される。
【０８２８】
エクソソーム：本明細書で使用されるとき、「エクソソーム」は、哺乳類細胞によって分泌される小胞、またはＲＮＡ分解に関与する複合体である。
【０８２９】
発現：本明細書で使用されるとき、核酸配列の「発現」は、次の事象のうちの１つ以上を指す：（１）ＤＮＡ配列からのＲＮＡテンプレートの生成（例えば、転写による）、（２）ＲＮＡ転写のプロセシング（例えば、スプライシング、編集、５’キャップ形成、および／または３’末端プロセシングによる）、（３）ＲＮＡのポリペプチドまたはタンパク質への翻訳、および（４）ポリペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾。
【０８３０】
特長：本明細書で使用されるとき、「特長」は、特徴、特性、または特有の要素を指す。
【０８３１】
製剤：本明細書で使用されるとき、「製剤」は、少なくともシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡと、送達剤とを含む。
【０８３２】
断片：本明細書で使用されるとき、「断片」は、一部分を指す。例えば、タンパク質の断片は、培養細胞から単離された完全長タンパク質を消化することによって得られる、ポリペプチドを含み得る。
【０８３３】
機能的：本明細書で使用されるとき、「機能的」生体分子は、それが特徴付けられる特性および／または活性を示す形態にある、生体分子である。
【０８３４】
遺伝子型：本明細書で使用されるとき、「遺伝子型」は、対象、細胞、組織、器官および／または生物体の遺伝子型、すなわちは遺伝的体質の変化を指す。
【０８３５】
相同性：本明細書で使用されるとき、「相同性」という用語は、ポリマー分子間、例えば、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子）間、および／またはポリペプチド分子間の全体的な関連性を指す。いくつかの実施形態において、ポリマー分子は、それらの配列が少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一または同様である場合、互いと「相同」であると見なされる。「相同」という用語は必然的に、少なくとも２つの配列（ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列）間の比較を指す。本発明に従って、２つのポリヌクレオチド配列は、それらがコードするポリペプチドが、少なくとも約２０アミノ酸の少なくとも一続きにわたって少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはさらに９９％である場合、相同であると見なされる。いくつかの実施形態において、相同ポリヌクレオチド配列は、少なくとも４〜５つの固有に指定されるアミノ酸の一続きをコードする能力によって特徴付けられる。６０ヌクレオチド長未満のポリヌクレオチド配列について、相同性は、少なくとも４〜５つの固有に指定されるアミノ酸の一続きをコードする能力によって特徴付けられる。本発明に従って、２つのタンパク質配列は、タンパク質が、少なくとも約２０アミノ酸の少なくとも一続きにわたって少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％同一である場合、相同であると見なされる。
【０８３６】
同一性：本明細書で使用されるとき、「同一性」という用語は、ポリマー分子間、例えば、オリゴヌクレオチド分子（例えば、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子）間、および／またはポリペプチド分子間の全体的な関連性を指す。２つのポリヌクレオチド配列の同一性パーセントの算出は、例えば、最適な比較目的のために２つの配列を整列させることによって行うことができる（例えば、最適なアライメントのために第１および第２の核酸配列の一方または両方にギャップを導入することができ、比較目的のために非同一配列を無視することができる）。ある特定の実施形態において、比較目的のために整列される配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％である。対応するヌクレオチド位置におけるヌクレオチドが次いで比較される。第１の配列内の位置が、第２の配列内の対応する位置と同じヌクレオチドによって占有されるとき、その分子は、その位置で同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列の最適なアライメントのために導入する必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮に入れながら、配列によって共有される同一位置の数の関数である。２つの配列間の配列の比較および同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを用いて遂行することができる。例えば、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、各々が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４、およびＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ
Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１に記載の方法の等を用いて決定することができる。例えば、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＭｅｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ，１９８９，４：１１−１７）のアルゴリズムを用いて決定することができ、それはＰＡＭ１２０重量残基表、１２のギャップ長ペナルティ、および４のギャップペナルティを用いてＡＬＩＧＮプログラム（第２．０版）に組み込まれている。２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、あるいは、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスを使用するＧＣＧソフトウェアパッケージにおけるＧＡＰプログラムを用いて決定することができる。配列間の同一性パーセントを決定するために一般的に用いられる方法には、参照により本明細書に組み込まれるＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ  Ｊ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）に開示の方法が含まれるが、これらに限定されない。同一性を決定するための技法は、公的に利用可能なコンピュータプログラムにおいて成文化されている。２つの配列間の相同性を決定するための例示のコンピュータソフトウェアには、ＧＣＧプログラムパッケージ、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２（１），３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．、２１５、４０３（１９９０））が含まれるが、これらに限定されない。
【０８３７】
遺伝子の発現を阻害する：本明細書で使用されるとき、「遺伝子の発現を阻害する」という表現は、遺伝子の発現産物の量の低減を引き起こすことを意味する。発現産物は、遺伝子から転写されたＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）、または遺伝子から転写されたｍＲＮＡから翻訳されたポリペプチドであり得る。典型的に、ｍＲＮＡのレベルの低減は、そこから翻訳されたポリペプチドのレベルの低減をもたらす。発現のレベルは、ｍＲＮＡまたはタンパク質を測定するための標準的な技法を用いて決定されてもよい。
【０８３８】
インビトロ：本明細書で使用されるとき、「インビトロ」という用語は、生物（例えば、動物、植物、または微生物）内ではなく、例えば、試験管または反応槽中、細胞培養物中、ペトリ皿中等の、人工的な環境で生じる事象を指す。
【０８３９】
インビボ：本明細書で使用されるとき、「インビボ」という用語は、生物（例えば、動物、植物、もしくは微生物、またはその細胞もしくは組織）内で生じる事象を指す。
【０８４０】
単離された：本明細書で使用されるとき、「単離された」という用語は、それが会合された（自然にであるか、実験的設定であるかにかかわらず）構成成分のうちの少なくとも一部から分離された物質または実体を指す。単離された物質は、それが会合した物質に関して様々なレベルの純度を有し得る。単離された物質および／または実体は、それらが最初に会合されたその他の構成成分の少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、またはそれよりも多くから分離され得る。いくつかの実施形態において、単離された薬剤は、約８０％超、約８５％超、約９０％超、約９１％超、約９２％超、約９３％超、約９４％超、約９５％超、約９６％超、約９７％超、約９８％超、約９９％超、または約９９％超純粋である。本明細書で使用されるとき、物質は、他の構成成分が実質的にない場合、「純粋」である。実質的に単離される：「実質的に単離される」とは、化合物が、それが形成されたまたは検出された環境から実質的に分離されることを意味する。部分的分離には、例えば、本開示の化合物を豊富に含んだ組成物が含まれ得る。実質的な分離には、少なくとも約５０重量％、少なくとも約６０重量％、少なくとも約７０重量％、少なくとも約８０重量％、少なくとも約９０重量％、少なくとも約９５重量％、少なくとも約９７重量％、または少なくとも約９９重量％の本開示の化合物、またはその塩を含有する組成物が含まれ得る。化合物およびそれらの塩を単離するための方法は、当技術分野で通例である。
【０８４１】
リンカー：本明細書で使用されるとき、リンカーは、例えば、１０〜１，０００原子の原子団を指し、炭素、アミノ、アルキルアミノ、酸素、硫黄、スルホキシド、スルホニル、カルボニル、およびイミン等であるが、これらに限定されない、原子または群からなり得る。リンカーは、第１の末端で核酸塩基または糖部分上の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドに、および第２の末端でペイロード、例えば、検出可能な薬剤または治療剤に、結合され得る。リンカーは、核酸配列への組み込みを干渉しないような十分な長さものもであり得る。リンカーは、任意の有用な目的のため、例えば、ｍｍＲＮＡ多量体（例えば、２つ以上のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはｍｍＲＮＡ分子の連鎖を介して）またはｍｍＲＮＡ複合体を形成するため、かつ本明細書に記載のペイロードを投与するために使用することができる。リンカーに組み込むことができる化学基の例としては、アルキル、アルケニル、アルキニル、アミド、アミノ、エーテル、チオエーテル、エステル、アルキレン、ヘテロアルキレン、アリール、またはヘテロシクリルが挙げられるが、これらに限定されず、これらの各々は、本明細書に記載されるように任意に置換され得る。リンカーの例としては、不飽和アルカン、ポリエチレングリコール（例えば、エチレンまたはプロピレングリコールモノマー単位、例えば、ジエチレングリコール、ジプロピレングリコール、トリエチレングリコール、トリプロピレングリコール、テトラエチレングリコール、またはテトラエチレングリコール）、ならびにデキストランポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。他の例としては、還元剤または光分解を用いて切断され得る、例えば、ジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）またはアゾ結合（−Ｎ＝Ｎ−）等の、リンカー内の切断可能部分が挙げられるが、これらに限定されない。選択的に切断可能な結合の非限定的な例としては、例えば、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、または他の還元剤および／もしくは光分解の使用によって切断され得る、アミド結合、ならびに例えば、酸性または塩基性加水分解によって切断され得る、エステル結合が挙げられる。
【０８４２】
転移：本明細書で使用されるとき、「転移」という用語は、がんが初めに原発腫瘍として生じた場所から身体の遠位の箇所に転移するプロセスを意味する。
【０８４３】
治療の方法：「治療の方法」という表現またはそれに同等する表現は、例えばがんに適用される場合、がん細胞の数を低下または除去する、がん細胞の数の増加を阻止する、または、対象のがんの症状を緩和するように設計される行動の手順または過程を指す。がんまたは他の腫瘍学関連障害を治療する方法は、必ずしも、がん細胞または他の障害が実際に完全に除去されること、細胞の数または障害が実際に軽減すること、または、がんまたは他の障害の症状が実際に緩和されることを意味するわけではない。しばしば、がんを治療する方法は、成功率は低くても、対象の病歴および推定される生存予期を踏まえて、それでも全体的に有益な行動過程と考えられる状況で、実施されるだろう。
【０８４４】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位：本明細書で使用されるとき、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位は、ｍｉＲＮＡの少なくとも「シード」領域が結合する、核酸転写物のヌクレオチド箇所または領域を表す。
【０８４５】
修飾された：本明細書で使用されるとき、「修飾された」とは、本発明の分子の変化した状態または構造を指す。分子は、化学的、構造的、および機能的修飾を含む、多くの方式で修飾されてもよい。一実施形態において、本発明のｍＲＮＡ分子は、例えば、それが天然リボヌクレオチドＡ、Ｕ、Ｇ、およびＣに関わるとき、非天然ヌクレオシドおよび／またはヌクレオチドの導入によって修飾される。キャップ構造等の非標準のヌクレオチドは、それらがＡ、Ｃ、Ｇ、Ｕリボヌクレオチドの化学構造とは異なっていても「修飾される」と見なされない。
【０８４６】
粘液：本明細書で使用されるとき、「粘液」は、粘性であり、ムチン糖タンパク質を含む、天然物質を指す。
【０８４７】
天然に生じる：本明細書で使用されるとき、「天然に生じる」は、人工的補助を伴わずに自然界に存在することを意味する。
【０８４８】
非ヒト脊椎動物：本明細書で使用されるとき、「非ヒト脊椎動物」には、野生種および家畜化された種を含む、ホモサピエンスを除くすべての脊椎動物が含まれる。非ヒト脊椎動物の例としては、アルパカ、バンテン、バイソン、ラクダ、ネコ、ウシ、シカ、イヌ、ロバ、ガヤル、ヤギ、モルモット、ウマ、ラマ、ラバ、ブタ、ウサギ、トナカイ、ヒツジ、水牛、およびヤク等の哺乳動物が挙げられるが、これらに限定されない。
【０８４９】
オフターゲット：本明細書で使用されるとき、「オフターゲット」は、任意の１つ以上の標的、遺伝子、または細胞転写物への任意の意図されない効果を指す。
【０８５０】
腫瘍学関連：本明細書で使用されるとき、「腫瘍学関連」という用語は、限定はしないががんを包含する、過剰増殖疾患、障害および／または状態のうち１つ以上のいずれかの側面に関連する、あらゆる疾患、障害、状態、治療、プロセス、物質または化合物を指す。
【０８５１】
オープンリーディングフレーム：本明細書で使用されるとき、「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」は、所与のリーディングフレーム内に終止コドンを含有しない配列を指す。
【０８５２】
作動可能に連結される：本明細書で使用されるとき、「作動可能に連結される」という表現は、２つ以上の分子、構築物、転写物、実体、部分等の間の機能的結合を指す。
【０８５３】
パラトープ：本明細書で使用されるとき、「パラトープ」は、抗体の抗原結合部位を指す。
【０８５４】
患者：本明細書で使用されるとき、「患者」は、治療を求め得るもしくは治療を必要とし得る、治療を要する、治療を受けている、治療を受けることになる、または特定の疾患もしくは状態のために訓練を受けた専門家の看護下にある、対象を指す。
【０８５５】
任意に置換される：本明細書において、「任意に置換されるＸ」（例えば、任意に置換されるアルキル）という形態の語句は、「Ｘであって、式中、Ｘは、任意に置換される」（例えば、「アルキル、式中、該アルキルは、任意に置換される」）と同等であることが意図される。特長「Ｘ」（例えば、アルキル）自体が任意であることを意味することは意図されない。
【０８５６】
ペプチド：本明細書で使用されるとき、「ペプチド」は、５０アミノ酸長以下、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸長である。
【０８５７】
薬学的組成物：「薬学的組成物」という表現は、疾患、障害および／または状態の原因を変える組成物を指す。
【０８５８】
薬学的に許容される：「薬学的に許容される」という表現は、本明細書で、健全な医療判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴わずにヒトおよび動物の組織と接触して使用するのに好適であり、妥当な便益／危険性比率に見合った、化合物、材料、組成物、および／または剤形を指すように用いられる。
【０８５９】
薬学的に許容される賦形剤：本明細書で使用されるとき、「薬学的に許容される賦形剤」という表現は、本明細書に記載の化合物以外のものであり（例えば、活性化合物を懸濁させるまたは溶解させることが可能なビヒクル）、かつ患者において実質的に非毒性および非炎症性である特性を有する、任意の成分を指す。賦形剤には、例えば、粘着防止剤（ａｎｔｉａｄｈｅｒｅｎｔｓ）、酸化防止剤、結合剤、コーティング剤、圧縮助剤（ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｉｄｓ）、崩壊剤、色素（色）、軟化剤、乳化剤、充填剤（希釈剤）、薄膜形成剤またはコーティング剤、香味剤、着香剤、流動促進剤（流動性促進剤）、滑沢剤、防腐剤、印刷インキ、吸着剤、懸濁化剤または分散化剤、甘味剤、および水和水が含まれてもよい。例示の賦形剤には、次のものが含まれるが、これらに限定されない：ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム（第二）、ステアリン酸カルシウム、クロスカルメロース、架橋結合ポリビニルピロリドン、クエン酸、クロスポビドン、システイン、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、マルチトール、マンニトール、メチオニン、メチルセルロース、メチルパラベン、微小結晶セルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポビドン、α化デンプン、プロピルパラベン、パルミチン酸レチニル、シェラック、二酸化ケイ素、カルボキシメチルセルロースナトリウム、クエン酸ナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、ソルビトール、デンプン（トウモロコシ）、ステアリン酸、ショ糖、タルク、二酸化チタン、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＣ、およびキシリトール。
【０８６０】
薬学的に許容される塩：本開示は、本明細書に記載の化合物の薬学的に許容される塩も含む。本明細書で使用されるとき、「薬学的に許容される塩」は、既存の酸または塩基部分をその塩形態に変換する（例えば、遊離塩基を好適な有機酸と反応させることによって）ことによって親化合物が修飾される、開示される化合物の誘導体を指す。薬学的に許容される塩の例としては、アミン等の塩基性残基の鉱酸塩または有機酸塩、カルボン酸等の酸性残基のアルカリ塩または有機塩等が挙げられるが、これらに限定されない。代表的な酸付加塩には、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプトン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素、２−ヒドロキシ−エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリル酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチニン酸塩（ペクチンａｔｅ）、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアネート、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩等が含まれる。代表的なアルカリ金属またはアルカリ土類金属塩には、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム等、ならびにアンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミン等を含むが、これらに限定されない、非毒性アンモニウム、第四級アンモニウム、およびアミンカチオンが含まれる。本開示の薬学的に許容される塩には、例えば、非毒性無機酸または有機酸から形成される、親化合物の従来の非毒性塩が含まれる。本開示の薬学的に許容される塩は、従来の化学方法によって、塩基性または酸性部分を含有する親化合物から合成することができる。一般に、そのような塩は、これらの化合物の遊離酸型または遊離塩基型を、化学量論的量の適切な塩基または酸と、水中もしくは有機溶媒中で、またはその２つの混合物中で反応させることによって調製することができ、一般に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはブタノール）、またはアセトニトリル等の非水性媒体が好ましい。好適な塩の一覧は、各々が参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．１４１８、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｕｓｅ，Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ  ａｎｄ  Ｃ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ（ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，２００８、およびＢｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，６６，１−１９（１９７７）において見出される。
【０８６１】
薬学的に許容される溶媒和物：本明細書で使用されるとき、「薬学的に許容される溶媒和物」という用語は、好適な溶媒の分子が結晶格子に組み込まれる、本発明の化合物を意味する。好適な溶媒は、投与される投薬量で生理学的に耐性がある。例えば、溶媒和物は、結晶化、再結晶化、または沈殿によって、有機溶媒、水、またはそれらの混合物を含む溶液から調製されてもよい。好適な溶媒の例としては、エタノール、水（例えば、一、二、および三水和物）、Ｎ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ’−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン（ＤＭＥＵ）、１，３−ジメチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２−（１Ｈ）−ピリミジノン（ＤＭＰＵ）、アセトニトリル（ＡＣＮ）、プロピレングリコール、酢酸エチル、ベンジルアルコール、２−ピロリドン、ベンジル安息香酸塩等が挙げられる。水が溶媒であるとき、その溶媒和物は、「水和物」と称される。
【０８６２】
薬物動態：本明細書で使用されるとき、「薬物動態」は、生存生物に投与される物質の運命の決定に関わるような、分子または化合物の任意の１つ以上の特性を指す。薬物動態は、吸収、分布、代謝、および排泄の程度および速度を含む、いくつかの領域に分割される。これは、一般的に、ＡＤＭＥと称され、ここで（Ａ）吸収は、物質が血液循環に進入するプロセスであり、（Ｄ）分布は、身体の流体および組織全体にわたる物質の分散または散布であり、（Ｍ）代謝（または生体内変換）は、親化合物の娘代謝産物への不可逆的な変換であり、（Ｅ）排泄（または排除）は、身体からの物質の排除を指す。まれな場合において、いくつかの薬物は、身体組織内に不可逆的に蓄積する。
【０８６３】
表現型：本明細書で使用されるとき、「表現型」は対象、細胞、組織、器官および／または生物体の観察可能な特徴のセットを指す。
【０８６４】
物理化学：本明細書で使用されるとき、「物理化学」は、物理特性および／または化学特性のものまたはそれに関わることを意味する。
【０８６５】
予防する：本明細書で使用されるとき、「予防する」という用語は、感染、疾患、障害、および／もしくは状態の発症を部分的もしくは完全に遅延させること；特定の感染、疾患、障害、および／もしくは状態の１つ以上の症状、特長、もしくは臨床徴候の発症を部分的もしくは完全に遅延させること；特定の感染、疾患、障害、および／もしくは状態の１つ以上の症状、特長、もしくは徴候の発症を部分的もしくは完全に遅延させること；感染からの、特定の疾患、障害、および／もしくは状態の進行を部分的もしくは完全に遅延させること；ならびに／または感染、疾患、障害、および／もしくは状態に関連した病理を発症する危険性を減少さることを指す。
【０８６６】
プロドラッグ：本開示は、本明細書に記載の化合物のプロドラッグも含む。本明細書で使用されるとき、「プロドラッグ」は、化学的または物理的変化を経ると治療薬として作用する物質、分子、または実体に属する形態にある、任意の物質、分子、または実体を指す。プロドラッグは、何らかの方式で共有結合されるかまたは隔離され得、哺乳類対象に投与される前、投与されると、または投与された後に、活性薬物を放出するか、または活性薬物部分に変換される。プロドラッグは、化合物中に存在する官能基を、修飾部分が通例の操作でまたはインビボでのいずれかで親化合物へと切断されるような方式で修飾することによって、調製することができる。プロドラッグは、ヒドロキシル、アミノ、スルフヒドリル、またはカルボキシル基が任意の基に結合される化合物であり、それは哺乳類対象に投与されると、切断されてそれぞれ遊離ヒドロキシル、アミノ、スルフヒドリル、またはカルボキシル基を形成する。プロドラッグの調製および使用は、両方とも参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、Ｔ．Ｈｉｇｕｃｈｉ  ａｎｄ  Ｖ．Ｓｔｅｌｌａ，“Ｐｒｏ−ｄｒｕｇｓ  ａｓ  Ｎｏｖｅｌ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，”Ｖｏｌ．１４  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａ．Ｃ．Ｓ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓに、およびＢｉｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，ｅｄ．Ｅｄｗａｒｄ  Ｂ．Ｒｏｃｈｅ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７で論じられている。
【０８６７】
増殖する：本明細書で使用されるとき、「増殖する」という用語は、成長する、拡大する、もしくは増加する、または急速な成長、拡大、もしくは増加を引き起こすことを意味する。「増殖性」は、増殖する能力を有することを意味する。「抗増殖性」は、増殖特性に反するか、または増殖特性に不適切である特性を有することを意味する。
【０８６８】
タンパク質切断部位：本明細書で使用されるとき、「タンパク質切断部位」は、化学的、酵素的、または光化学的手段によってアミノ酸鎖の制御された切断が遂行される部位を指す。
【０８６９】
タンパク質切断シグナル：本明細書で使用されるとき、「タンパク質切断シグナル」は、切断のためにポリペプチドにフラグまたはマークを付ける少なくとも１つのアミノ酸を指す。
【０８７０】
進行：本明細書で使用されるとき、「進行」という用語（例えば、がんの進行）は、疾患もしくは状態の発達もしくは悪化、または、疾患もしくは状態への発達もしくは悪化を指す。
【０８７１】
目的とするタンパク質：本明細書で使用されるとき、「目的とするタンパク質」または「所望のタンパク質」という用語は、本明細書に提供されるもの、ならびにそれらの断片、変異体、変異形、および改変体を含む。
【０８７２】
近位：本明細書で使用されるとき、「近位」という用語は、中心の、または目的とする点もしくは領域のより近くに位置することを意味する。
【０８７３】
シュードウリジン：本明細書で使用されるとき、シュードウリジンは、ヌクレオシドウリジンのＣ−グリコシド異性体を指す。「シュードウリジン類似体」は、シュードウリジンの任意の修飾、変異形、アイソフォーム、または誘導体である。例えば、シュードウリジン類似体には、１−カルボキシメチル−シュードウリジン、１−プロピニル−シュードウリジン、１−タウリノメチル−シュードウリジン、１−タウリノメチル−４−チオ−シュードウリジン、１−メチル−シュードウリジン（ｍ１ψ）、１−メチル−４−チオ−シュードウリジン（ｍ１ｓ４ψ）、４−チオ−１−メチル−シュードウリジン、３−メチル−シュードウリジン（ｍ３ψ）、２−チオ−１−メチル−シュードウリジン、１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、ジヒドロシュードウリジン、２−チオ−ジヒドロシュードウリジン、２−メトキシウリジン、２−メトキシ−４−チオ−ウリジン、４−メトキシ−シュードウリジン、４−メトキシ−２−チオ−シュードウリジン、Ｎ１−メチル−シュードウリジン、１−メチル−３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）シュードウリジン（ａｃｐ３ψ）、および２’−Ｏ−メチル−シュードウリジン（ψｍ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０８７４】
精製される：本明細書で使用されるとき、「精製する」、「精製される」、「精製」は、実質的に純粋にするか、または望ましくない構成成分、汚染材料、混和物、もしくは不完全性を取り除くことを意味する。
【０８７５】
退縮：本明細書で使用されるとき、「退縮」または「退縮の度合い」という用語は、表現型的または遺伝子型的のいずれかで、がん進行が逆行することを指す。がん進行を遅めるまたは止めることは退縮と見なされてよい。
【０８７６】
効果を軽減する：本明細書で使用されるとき、「効果を低下させる」という表現は、症状を指している場合、対象の症状を軽減、除去または緩和することを意味する。必ずしも、症状が実際に完全に除去、軽減または緩和されるという意味ではない。
【０８７７】
試料：本明細書で使用されるとき、「試料」または「生体試料」という用語は、その組織、細胞、または構成部分の部分集合（例えば、血液、粘液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、唾液、羊水、臍帯血、尿、膣液、および精液を含むが、これらに限定されない体液）を指す。試料には、例えば、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、皮膚の外部切片、呼吸器管、腸管、および尿生殖器管、涙液、唾液、乳、血液細胞、腫瘍、器官を含むが、これらに限定されない、全生物、またはその組織、細胞、もしくは構成部分の部分集合、またはその画分もしくは一部分から調製される、ホモジネート、可溶化液、または抽出物がさらに含まれ得る。試料はさらに、タンパク質または核酸分子等の細胞構成成分を含有し得る、栄養ブロスまたはゲル等の培地を指す。
【０８７８】
副作用：本明細書で使用されるとき、「副作用」という表現は治療の二次的な効果を指す。
【０８７９】
シグナルぺプチド配列：本明細書で使用されるとき、「シグナルぺプチド配列」という表現は、タンパク質の輸送または局在化を指示することができる配列を指す。
【０８８０】
シグナルセンサーポリヌクレオチド：本明細書で使用されるとき、「シグナルセンサーポリヌクレオチド」は、翻訳された時に「シグナル」を細胞（がん細胞または非がん細胞）に送達し、がん細胞に有害または正常な細胞に有益であるか、がん細胞に有害かつ正常な細胞に有利であるかのいずれかである治療効果を生物体にもたらす、目的とする腫瘍学関連ポリペプチドを１つ以上コードする核酸転写物である。シグナルセンサーポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの微小環境を「感知」し、（ａ）翻訳されるペプチドまたはタンパク質に関連する機能または表現型的結果、（ｂ）シグナルセンサーポリヌクレオチドの発現量、および／または双方を変化する配列（翻訳可能または不可能）をさらに含んでいてもよい。
【０８８１】
単回単位用量：本明細書で使用されるとき、「単回単位用量」は、１回用量／一度に／単一経路／単一接触点、すなわち、単一の投与事象において投与される、任意の治療薬の用量である。
【０８８２】
類似性：本明細書で使用されるとき、「類似性」という用語は、ポリマー分子間、例えば、ポリヌクレオチド分子（例えば、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子）間、および／またはポリペプチド分子間の全体的な関連性を指す。ポリマー分子の互いとの類似性パーセントの算出は、同一性パーセントの算出と同様に行うことができるが、当技術分野で理解されるように、類似性パーセントの算出が保存的置換を考慮に入れることを除く。
【０８８３】
皮膚：「皮膚」という用語は対象の身体の天然の外部被覆を形成する組織の薄い層であり、表皮および真皮を包含する。真皮は皮膚の表面上皮である表皮の下部にある生組織の厚い層である。
【０８８４】
分割用量：本明細書で使用されるとき、「分割用量」は、単回単位用量または総１日用量の、２つ以上の用量への分割である。
【０８８５】
安定した：本明細書で使用されるとき、「安定した」は、反応混合物から有用な純度で単離後に残存するのに十分に強固であり、好ましくは効果的な治療剤へと製剤可能である、化合物を指す。
【０８８６】
安定化される：本明細書で使用されるとき、「安定化」、「安定化される」、「安定化領域」という用語は、安定させるまたは安定となることを意味する。
【０８８７】
対象：本明細書で使用されるとき、「対象」または「患者」という用語は、本発明に従う組成物が、例えば、実験、診断、予防、および／または治療目的のために投与され得る、任意の生物を指す。典型的な対象には、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、およびヒト等の哺乳動物）および／または植物が含まれる。
【０８８８】
実質的に：本明細書で使用されるとき、「実質的に」という用語は、目的とする特徴または特性の全範囲もしくは程度またはほぼ全範囲もしくは程度を示す、定性的状態を指す。生物学技術分野の専門家であれば、生物学的および化学的現象が、完了するかつ／もしくは完了まで進行する、または絶対的な結果を達成するもしくはそれを回避することは、あってもまれであることを理解するであろう。「実質的に」という用語は、したがって、多くの生物学的および化学的現象に本来的に存在するの完全性の潜在的な欠如を捕捉するように本明細書で使用される。
【０８８９】
実質的に等しい：それが用量間の時差に関するように本明細書で使用されるとき、この用語は、プラス／マイナス２％を意味する。
【０８９０】
実質的に同時に：本明細書で使用され、かつそれが複数の用量に関するとき、この用語は、２秒以内を意味する。
【０８９１】
を患う：疾患、障害、および／または状態「を患う」個体は、疾患、障害、および／もしくは状態であると診断されているか、または疾患、障害、および／もしくは状態の１つ以上の症状を呈する。
【０８９２】
に罹患しやすい：疾患、障害、および／または状態「に罹患しやすい」個体は、疾患、障害、および／もしくは状態であると診断されておらず、かつ／または疾患、障害、および／もしくは状態の症状を呈しないことがあるが、疾患もしくはその症状を発症する傾向を内部に持つ。いくつかの実施形態において、疾患、障害、および／または状態（例えば、癌）に罹患しやすい個体は、次のうちのうちの１つ以上によって特徴付けられ得る：（１）疾患、障害、および／または状態の発症に関連した遺伝子突然変異、（２）疾患、障害、および／または状態の発症に関連した遺伝子多型、（３）疾患、障害、および／または状態に関連したタンパク質および／または核酸の増加したおよび／または減少した発現および／または活性、（４）疾患、障害、および／または状態の発症に関連した習慣および／または生活様式、（５）疾患、障害、および／または状態の家族歴、ならびに（６）疾患、障害、および／または状態の発症に関連した微生物への曝露および／またはその微生物への感染。いくつかの実施形態において、疾患、障害、および／または状態に罹患しやすい個体は、その疾患、障害、および／または状態を発症することになる。いくつかの実施形態において、疾患、障害、および／または状態に罹患しやすい個体は、その疾患、障害、および／または状態を発症することにはならない。
【０８９３】
症状：本明細書で使用されるとき、「症状」という用語は、疾患、障害および／または状態の兆候である。例えば、症状は、それを有する対象は感じ得る、または、気づき得るが、対象の外面的な見た目または挙動を見ることでは容易に評価され得ない。症状の例としては、脱力感、疼痛および痛み、熱、疲労、体重減少、血液凝固、血液のカルシウム量の上昇、白血球数の低下、息切れ、めまい、頭痛、色素沈着過剰、黄疸、紅斑症、そう痒症、多毛症、排便習慣の変化、膀胱機能の変化、永続的な潰瘍、口内の白い斑点、舌上の白点、異常な出血または排泄、身体部分の肥大またはこぶ、消化不良、呑み込みにくさ、いぼまたはほくろの変化、新しい皮膚の変化およびしつこい咳またはしわがれ声が挙げられるが、これらに限定されない。
【０８９４】
合成：「合成」という用語は、人間の手によって生成される、調製される、および／または製造されることを意味する。本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチドもしくはポリペプチドまたは他の分子の合成は、化学的であっても酵素的であってもよい。
【０８９５】
標的とされる細胞：本明細書で使用されるとき、「標的とされる細胞」は、目的とする任意の１つ以上の細胞を指す。この細胞は、インビトロで、インビボで、インサイツで、または生物の組織もしくは器官内で見つけられ得る。生物は、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒト、最も好ましくは患者であり得る。
【０８９６】
治療剤：「治療剤」という用語は、対象に投与されたときに、治療、診断、および／もしくは予防効果を有し、かつ／または所望の生物学的および／もしくは薬理学的効果を誘発する、任意の薬剤を指す。
【０８９７】
治療上有効量：本明細書で使用されるとき、「治療上有効量」という用語は、感染、疾患、障害、および／または状態を患うか、またはそれらに罹患しやすい対象に投与されたときに、感染、疾患、障害、および／または状態を治療する、その症状を改善する、診断する、予防する、かつ／またはその発症を遅延させるのに十分である、送達対象の薬剤（例えば、核酸、薬物、治療剤、診断剤、予防剤等）の量を意味する。
【０８９８】
治療上有効成果：本明細書で使用されるとき、「治療上有効成果」という用語は、感染、疾患、障害、および／または状態を患うか、またはそれらに罹患しやすい対象において、感染、疾患、障害、および／または状態を治療し、その症状を改善し、診断し、予防し、かつ／またはその発症を遅延させるのに十分である成果を意味する。
【０８９９】
総１日用量：本明細書で使用されるとき、「総１日用量」は、２４時間の期間に与えられるまたは処方される量である。それは、単回単位用量として投与されてもよい。
【０９００】
転写因子：本明細書で使用されるとき、「転写因子」という用語は、例えば、転写の活性化または抑制によって、ＤＮＡのＲＮＡへの転写を調節する、ＤＮＡ結合タンパク質を指す。いくつかの転写因子は、転写の調節を単独でもたらす一方で、他の転写因子は、他のタンパク質と協働して作用する。いくつかの転写因子は、ある特定の条件下で、転写の活性化および抑制の両方を行うことができる。一般に、転写因子は、標的遺伝子の調節領域内の特定のコンセンサス配列に非常に類似した、特定の標的配列（単数または複数）に結合する。転写因子は、標的遺伝子の転写を単独でまたは他の分子と複合して調節し得る。
【０９０１】
治療する：本明細書で使用されるとき、「治療する」という用語は、特定の感染、疾患、障害、および／もしくは状態の１つ以上の症状または特徴を、部分的にまたは完全に緩和すること、寛解させること、改善すること、軽減すること、その発症を遅延させること、その進行を阻害すること、その重症度を低減すること、および／またはその発生率を低減することを指す。例えば、癌を「治療する」とは、腫瘍の生存、成長、および／または転移を阻害することを指し得る。治療は、疾患、障害、および／または状態に関連した病理を発症する危険性を減少させる目的のために、疾患、障害、および／もしくは状態の徴候を呈しない対象に、ならびに／または疾患、障害、および／もしくは状態の早期徴候のみを呈する対象に投与されてもよい。
【０９０２】
腫瘍：本明細書で使用されるとき、「腫瘍」は良性であろうと悪性であろうと、組織の異常な成長を指す。
【０９０３】
腫瘍の成長；本明細書で使用されるとき、「腫瘍の成長」または「腫瘍の転移」という用語は、腫瘍の質量もしくは体積の増加または腫瘍分布の拡大を指す。
【０９０４】
未修飾：本明細書で使用されるとき、「未修飾」は、任意の方式で変化させられる前の任意の物質、化合物、または分子を指す。未修飾は、生体分子の野生型または天然型を指し得るが、必ずしもそうとは限らない。分子は、一連の修飾を経てもよく、それによって各修飾分子は、その後の修飾のための「未修飾」出発分子としての役目を果たし得る。
【０９０５】
均等物および範囲
当業者であれば、ほんの日常的な実験を用いて、本明細書に記載の本発明に従う具体的な実施形態に対する多くの均等物を認識するか、解明することができる。本発明の範囲は、上記の説明に限定されるようには意図されず、むしろ添付の特許請求の範囲に記載されるように限定されることが意図される。
【０９０６】
特許請求の範囲において、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」等の冠詞は、それとは反対の指定があるか、または文脈から別途明白でない限り、１つまたは２つ以上を意味し得る。群の１つ以上の構成員の間に「または」を含む特許請求項または記述は、それとは反対の指定があるか、または文脈から別途明白でない限り、その群の構成員のうちの１つ、２つ以上、またはすべてが、所与の生成物またはプロセスにおいて存在するか、それにおいて用いられるか、あるいはそれと関連性がある場合、満たされると見なされる。本発明は、群の厳密に１つの構成員が所与の生成物またはプロセスにおいて存在するか、それにおいて用いられるか、あるいはそれと関連性のある実施形態を含む。本発明は、群の構成員のうちの１つを超えるものまたはすべてが所与の生成物またはプロセスにおいて存在するか、それにおいて用いられるか、あるいはそれと関連性のある実施形態を含む。
【０９０７】
また、「含む」という用語は、制限がないことが意図され、さらなる要素またはステップの組み込みを許容するが、それを必要とするわけではないことに留意する。「含む」という用語が本明細書で使用されるとき、「からなる」という用語もそれ故に包含され、開示される。
【０９０８】
範囲が与えられる場合、端点が含まれる。さらに、別途指定されるか、または文脈および当業者の理解から別途明白でない限り、範囲として表される値は、文脈上、そうでないとする明確な指示がない限り、本発明の異なる実施形態において定められる範囲内で、その範囲の下限の単位の１０分の１までの任意の具体的な値または部分範囲をとることができることを理解されたい。
【０９０９】
さらに、先行技術の範囲内に該当する本発明の任意の特定の実施形態が、請求項のうちの任意の１つ以上から明示的に除外されてもよいことを理解されたい。そのような実施形態は当業者に既知であるとされるため、その除外が本明細書に明示的に記載されないとしても、それらは除外されてもよい。本発明の組成物の任意の特定の実施形態（例えば、任意の核酸またはそれによってコードされるタンパク質、任意の産生方法、任意の使用方法等）が、先行技術の存在に関連するか否かに関わらず、任意の理由で、任意の１つ以上の請求項から除外され得る。
【０９１０】
すべての引用される情報源、例えば、参考文献、刊行物、データベース、データベースエントリ、および本明細書に引用される技術は、引用文に明示的に述べられないとしても、参照により本出願に組み込まれる。引用される情報源および本出願の相反する記述がある場合には、本出願における記述が優先されるものとする。
【０９１１】
節および表の見出しは、限定するようには意図されない。
【実施例】
【０９１２】
実施例１．シグナルセンサーポリヌクレオチドの産生
【０９１３】
本発明に記載の修飾シグナルセンサーｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）は、標準的な実験室方法および材料を用いて作製することができる。目的とする遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ポリＡ尾部の鋳型付加のために、強力なコザック翻訳開始シグナルを含有し得る５’非翻訳領域（ＵＴＲ）および／またはオリゴ（ｄＴ）配列を含み得るα−グロビン３’ＵＴＲに隣接し得る。修飾ｍＲＮＡは、細胞の自然免疫応答を低減させるように修飾され得る。細胞の応答を低減させる修飾には、シュードウリジン（ψ）および５−メチル−シチジン（５ｍｅＣ、５ｍｃ、またはｍ５Ｃ）が含まれ得る（参照により本明細書に組み込まれる、Ｋａｒｉｋｏ  ＫらＩｍｍｕｎｉｔｙ  ２３：１６５−７５（２００５）、Ｋａｒｉｋｏ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １６：１８３３−４０（２００８）、Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ＢＲらＮＡＲ（２０１０）を参照のこと）。
【０９１４】
ＯＲＦは、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、カリフォルニア州）等であるが、これに限定されない最適化サービスから購入することができる、様々な上流または下流付加（β−グロビン、タグ等であるがこれらに限定されない）も含み得、ＸｂａＩ認識を有し得る複数のクローニング部位も含有し得る。構築物を受容すると、それが再構築され、化学的にコンピテントな大腸菌に変換され得る。
【０９１５】
本発明には、ＮＥＢ  ＤＨ５−αコンピテント大腸菌を使用してもよい。変換は、ＮＥＢの指示に従って、１００ｎｇのプラスミドを用いて行う。プロトコルは次の通りである。
【０９１６】
氷上のＮＥＢ  ５−αコンピテント大腸菌細胞の管を１０分間解凍する。
【０９１７】
１ｐｇ〜１００ｎｇのプラスミドＤＮＡを含有する１〜５μｌを細胞混合物に添加する。管を慎重に４〜５回振り、細胞とＤＮＡを混合する。ボルテックスしないこと。
【０９１８】
混合物を３０分間氷上に置く。混ぜないこと。
【０９１９】
４２℃で正確に３０秒間熱ショックを与える。混ぜないこと。
【０９２０】
５分間氷上に置く。混ぜないこと。
【０９２１】
室温のＳＯＣを９５０μｌピペットで混合物に入れる。
【０９２２】
３７℃で６０分間置く。激しく振盪させる（２５０ｒｐｍ）か、または回転させる。
【０９２３】
選択プレートを３７℃に温める。
【０９２４】
管を振り、逆さにすることによって完全に細胞を混合する。
【０９２５】
５０〜１００μｌの各希釈物を選択プレートに広げ、３７℃で一晩インキュベートする。あるいは、３０℃で２４〜３６時間または２５℃で４８時間インキュベートする。
【０９２６】
次いで、単一コロニーを使用し、適切な抗生物質を用いて５ｍｌのＬＢ成長培地を接種し、５時間成長させる（２５０ＲＰＭ、３７℃）。次いで、これを使用して、２００ｍｌの培養培地を接種し、同じ条件下で一晩成長させる。
【０９２７】
プラスミドを単離するために（最大８５０μｇ）、製造業者の指示に従ってＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＰＵＲＥＬＩＮＫ（商標）ＨｉＰｕｒｅ  Ｍａｘｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（カールスバッド、カリフォルニア州）を用いてマキシプレップを行う。
【０９２８】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）のためのｃＤＮＡを生成するために、プラスミドを、ＸｂａＩ等の制限酵素を用いてまず線形化する。ＸｂａＩでの典型的な制限消化には、以下が含まれる：プラスミド１．０μｇ、１０倍緩衝液１．０μｌ、ＸｂａＩ１．５μｌ、ｄＨ２０最大１０μｌ、３７℃で１時間のインキュベーション。実験室規模（５μｇ未満）で行う場合、製造業者の指示に従ってＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＰＵＲＥＬＩＮＫ（商標）ＰＣＲ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ（カールスバッド、カリフォルニア州）を用いて、反応物を浄化する。より大規模な精製は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの標準的ＰＵＲＥＬＩＮＫ（商標）ＰＣＲ  Ｋｉｔ（カールスバッド、カリフォルニア州）等、より大きな充填容量を有する製品を用いて行う必要があり得る。浄化した後、線形化されたベクターを、ＮａｎｏＤｒｏｐを用いて定量化し、アガロースゲル電気泳動を用いて分析して線形化を確認する。
【０９２９】
非限定的な例として、Ｇ−ＣＳＦは、目的とするポリペプチドを表し得る。実施例１〜５に概説されるステップに使用される配列を、表１２に示す。開始コドン（ＡＴＧ）は、表１２の各配列中に下線で示されていることに留意されたい。
表１２．Ｇ−ＣＳＦの配列
【表００１２−１】
2018183181.tif 000190
【表００１２−２】
2018183181.tif 000191
【０９３０】
実施例２：ｃＤＮＡ産生のためのＰＣＲ
ｃＤＮＡの調製のためのＰＣＲ手順を、Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ウーバン、マサチューセッツ州）による２×ＫＡＰＡ  ＨＩＦＩ（商標）ＨｏｔＳｔａｒｔ  ＲｅａｄｙＭｉｘを用いて行う。このシステムには、２×ＫＡＰＡ  ＲｅａｄｙＭｉｘ１２．５μｌ、順方向プライマー（１０ｕＭ）０．７５μｌ、逆方向プライマー（１０ｕＭ）０．７５μｌ、鋳型ｃＤＮＡ１００ｎｇ、および２５．０μｌに希釈したｄＨ２０が含まれる。反応条件は、９５℃で５分間、９８℃で２０秒間を２５サイクル、その後５８℃で１５秒間、続いて７２℃で４５秒間、次いで７２℃で５分間、次いで４℃で終了までである。
【０９３１】
本発明の逆方向プライマーは、ｍＲＮＡにおけるポリＡ１２０のためのポリＴ１２０を組み込む。より長いかまたは短いポリ（Ｔ）路を有する他の逆方向プライマーを使用して、ｍＲＮＡにおけるポリ（Ａ）尾部の長さを調節することができる。
【０９３２】
反応物を、製造業者の指示に従ってＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＰＵＲＥＬＩＮＫ（商標）ＰＣＲ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ（カールスバッド、カリフォルニア州）を用いて浄化する（５μｇまで）。より大規模な反応は、より大容量の製品を用いて浄化する必要がある。浄化した後、ｃＤＮＡを、ＮａｎｏＤｒｏｐを用いて定量化し、アガロースゲル電気泳動によって分析して、ｃＤＮＡが予測した大きさであることを確認する。次いで、ｃＤＮＡを、シークエンシング分析に出した後に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応を進める。
【０９３３】
実施例３．ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応により、修飾ヌクレオチドまたは修飾ＲＮＡを含有するｍＲＮＡを生成する。投入するヌクレオチドトリホスフェート（ＮＴＰ）混合物は、天然および非天然のＮＴＰを用いて自家作製したものである。
【０９３４】
典型的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応物には、次のものが含まれる。
【０９３５】
鋳型ｃＤＮＡ  １．０μｇ
【０９３６】
１０倍転写緩衝液（４００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１９０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭスペルミジン）２．０μｌ
【０９３７】
カスタムＮＴＰ（２５ｍＭずつ）７．２μｌ
【０９３８】
ＲＮａｓｅ阻害剤  ２０Ｕ
【０９３９】
Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ  ３０００Ｕ
【０９４０】
ｄＨ２０  最大２０．０μｌ
【０９４１】
３７℃で３時間〜５時間のインキュベーション。
【０９４２】
粗製ＩＶＴ混合物を、翌日の浄化のために４℃で一晩保管され得る。次いで、１ＵのＲＮａｓｅ不含ＤＮａｓｅを使用して、元の鋳型を消化させる。３７℃で１５分間のインキュベーションの後、ｍＲＮＡを、製造業者の指示に従ってＡｍｂｉｏｎのＭＥＧＡＣＬＥＡＲ（商標）キット（オースチン、テキサス州）を用いて精製する。このキットは、最大５００μｇのＲＮＡを精製することができる。浄化させた後、ＲＮＡを、ＮａｎｏＤｒｏｐを用いて定量化し、アガロースゲル電気泳動によって分析して、ＲＮＡが適正な大きさであること、およびＲＮＡの分解が生じていないことを確認する。
【０９４３】
実施例４．ｍＲＮＡの酵素キャッピング
ｍＲＮＡのキャッピングを、次のように行い、混合物には、ＩＶＴ  ＲＮＡが６０μｇ〜１８０μｇおよびｄＨ２０が最大７２μｌ含まれる。混合物を、６５℃で５分間インキュベートしてＲＮＡを変性させ、その後すぐに氷上に移す。
【０９４４】
このプロトコルは、次いで、１０倍キャッピング緩衝液（０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、６０ｍＭ  ＫＣｌ、１２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）（１０．０μｌ）、２０ｍＭ  ＧＴＰ（５．０μｌ）、２０ｍＭ  Ｓ−アデノシルメチオニン（２．５μｌ）、ＲＮａｓｅ阻害剤（１００Ｕ）、２’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（４００Ｕ）、ワクシニアキャッピング酵素（グアニリルトランスフェラーゼ）（４０Ｕ）、ｄＨ２０（２８μｌまで）、および６０μｇのＲＮＡについては３７℃で３０分間のインキュベーションまたは１８０μｇのＲＮＡでは最大２時間のインキュベーションを伴う。
【０９４５】
次いで、ｍＲＮＡを、製造業者の指示に従ってＡｍｂｉｏｎのＭＥＧＡＣＬＥＡＲ（商標）キット（オースチン、テキサス州）を用いて精製する。浄化させた後、ＲＮＡを、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ウォルサム、マサチューセッツ州）を用いて定量化し、アガロースゲル電気泳動によって分析して、ＲＮＡが適正な大きさであること、およびＲＮＡの分解が生じていないことを確認する。また、配列決定のためのｃＤＮＡを生成するために、ＲＮＡ産物に、逆転写ＰＣＲを実行して配列決定を行ってもよい。
【０９４６】
実施例５．ポリＡテーリング反応
ｃＤＮＡにポリＴがない場合、最終産物を浄化する前に、ポリＡテーリング反応を行う必要がある。これは、キャップされたＩＶＴ  ＲＮＡ（１００μｌ）、ＲＮａｓｅ阻害剤（２０Ｕ）、１０倍テーリング緩衝液（０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２．５Ｍ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２）（１２．０μｌ）、２０ｍＭ  ＡＴＰ（６．０μｌ）、ポリＡポリメラーゼ（２０Ｕ）、ｄＨ２０最大１２３．５μｌを混合し、３７℃で３０分間インキュベートすることによって行う。ポリＡ尾部が既に転写物中に存在する場合、テーリング反応を省略し、直接ＡｍｂｉｏｎのＭＥＧＡＣＬＥＡＲ（商標）ｋｉｔ（オースチン、テキサス州）（最大５００μｇ）での浄化に進んでもよい。ポリＡポリメラーゼは、好ましくは、酵母に発現される組み換え酵素である。
【０９４７】
本明細書において実行および記載される試験においては、ポリＡ尾部は、１６０ヌクレオチド長を含むように、ＩＶＴ鋳型にコードされる。しかしながら、ポリＡテーリング反応の進行性または完全性は、常に正確に１６０個のヌクレオチドをもたらすわけではないことを理解されたい。したがって、約１６０ヌクレオチド、例えば、約１５０〜１６５、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、または１６５のポリＡ尾部は、本発明の範囲内である。
【０９４８】
実施例６．天然の５’キャップおよび５’キャップ類似体
修飾ＲＮＡの５’キャッピングは、製造業者のプロトコルに従って、次の化学的ＲＮＡキャップ類似体を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応の際に付随して完了し得、５’グアノシンキャップ構造が生成される：３’−Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ［ＡＲＣＡキャップ］、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ
ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ  、マサチューセッツ州）。修飾ＲＮＡの５’キャッピングは、ワクシニアウイルスキャッピング酵素を用いて転写後に完了し、「キャップ０」構造：ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ、マサチューセッツ州）を生成し得る。キャップ１構造は、ワクシニアウイルスキャッピング酵素および２’−Ｏメチルト−ランスフェラーゼの両方を用いて生成され得、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ−２’−Ｏ−メチルが得られる。キャップ２構造は、２’−Ｏメチル−トランスフェラーゼを用いて、５’末端から３番目のヌクレオチドの２’−Ｏ−メチル化の後に、キャップ１構造から生成され得る。キャップ３構造は、２’−Ｏメチル−トランスフェラーゼを用いて、５’末端から４番目のヌクレオチドの２’−Ｏ−メチル化の後に、キャップ２構造から生成され得る。酵素は、好ましくは組み換え源に由来する。
【０９４９】
哺乳動物細胞に形質移入する場合、修飾ｍＲＮＡは、１２〜１８時間、または１８時間を超える、例えば、２４、３６、４８、６０、７２、もしくは７２時間を超える安定性を有する。
【０９５０】
実施例７．キャッピング
Ａ．タンパク質発現アッセイ
【０９５１】
ＡＲＣＡ（３’Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ）キャップ類似体またはキャップ１構造を含有する、ヒトＧ−ＣＳＦをコードする合成ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡは配列番号６５６７に示され、各シトシンにおける５−メチルシチジンおよび各シチジン部位におけるシュードウリジン置換で完全に修飾されたｍＲＮＡ配列は配列番号６５７０に示され、約１６０ヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｔｏｉｄｉｅ）長のポリＡ尾部は配列内には示されない）を、等濃度でヒト初代ケラチノサイトに形質移入することができる。形質移入の６、１２、２４、および３６時間後に、培養培地に分泌されたＧ−ＣＳＦの量を、ＥＬＩＳＡによってアッセイすることができる。培地中により高レベルのＧ−ＣＳＦを分泌する合成ｍＲＮＡは、より高度は翻訳的にコンピテントなキャップ構造を有する合成ｍＲＮＡに対応する。
【０９５２】
Ｂ．純度分析合成
ＡＲＣＡキャップ類似体またはキャップ１構造の粗製合成産物を含有する、ヒトＧ−ＣＳＦをコードする合成ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡは配列番号６５６７に示され、各シトシンにおける５−メチルシチジンおよび各シチジン部位におけるシュードウリジン置換で完全に修飾されたｍＲＮＡ配列は配列番号６５７０に示され、約１６０ヌクレオチドのポリＡ尾部は配列内に示されない）を、変性アガロース−尿素ゲル電気泳動またはＨＰＬＣ分析を用いて、純度について比較することができる。電気泳動により単一の集約された帯域を有する合成ｍＲＮＡは、複数の帯域または筋状の帯域を有する合成ｍＲＮＡと比較して、より高い純度の産物に対応する。単一のＨＰＬＣピークを有する合成ｍＲＮＡもより高い純度の産物に対応する。より高効率のキャッピング反応により、より純粋なｍＲＮＡ集団が得られる。
【０９５３】
Ｃ．サイトカイン分析
ＡＲＣＡキャップ類似体またはキャップ１構造を含有する、ヒトＧ−ＣＳＦをコードする合成ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡは配列番号６５６７に示され、各シチジンにおける５−メチルシチジンおよび各ウリジン部位におけるシュードウリジン置換により完全に修飾されたｍＲＮＡ配列は配列番号６５７０に示され、約１６０ヌクレオチド長のポリＡ尾部は配列内に示されない）を、複数の濃度でヒト初代ケラチノサイトに形質移入することができる。形質移入の６、１２、２４、および３６時間後に、培養培地に分泌されたＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−β等の炎症促進性サイトカインの量を、ＥＬＩＳＡによってアッセイすることができる。培地中により高レベルの炎症促進性サイトカインを分泌する合成ｍＲＮＡは、免疫活性化キャップ構造を有する合成ｍＲＮＡに対応する。
【０９５４】
Ｄ．キャッピング反応効率
ＡＲＣＡキャップ類似体またはキャップ１構造を含有する、ヒトＧ−ＣＳＦをコードする合成ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡは配列番号６５６７に示される、各シチジンにおける５−メチルシチジンおよび各ウリジン部位におけるシュードウリジン置換により完全に修飾されたｍＲＮＡ配列は各シトシンにおける配列番号６５７０に示され、約１６０ヌクレオチド長のポリＡ尾部は、配列内に示されない）を、キャップされたｍＲＮＡのヌクレアーゼ処理の後に、ＬＣ−ＭＳによってキャッピング反応効率について分析することができる。キャップされたｍＲＮＡのヌクレアーゼ処理により、ＬＣ−ＭＳによって検出可能な遊離ヌクレオチドとキャップされた５’−５−トリホスフェートキャップ構造の混合物が得られる。ＬＣ−ＭＳスペクトル上のキャップされた生成物の量は、反応からの全ｍＲＮＡの割合として表すことができ、キャッピング反応効率に対応するであろう。より高いキャッピング反応効率を有するキャップ構造は、ＬＣ−ＭＳにより、より高い量のキャップされた生成物を有するであろう。
【０９５５】
実施例８．修飾ＲＮＡまたはＲＴ  ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動
個々の修飾ＲＮＡ（２０μｌ体積中２００〜４００ｎｇ）または逆転写されたＰＣＲ産物（２００〜４００ｎｇ）を、非変性１．２％アガロースＥ−ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバッド、カルフォルニア州）のウェルに充填し、製造業者のプロトコルに従って１２〜１５分間泳動させる。
【０９５６】
実施例９．Ｎａｎｏｄｒｏｐ修飾ＲＮＡの定量化およびＵＶスペクトルデータ
ＴＥ緩衝液（１μｌ）中の修飾ＲＮＡを、Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ＵＶ吸光読み取りに使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応からの各ＲＮＡの収率を定量化する。
【０９５７】
実施例１０．シグナルセンサーポリヌクレオチドの製剤化
シグナルセンサーポリヌクレオチドを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ実験のために製剤化してもよく、２０１２年１２月１４日に提出された国際出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ１２／０６９６１０号に教示の方法に従い、内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０９５８】
実施例１１．シグナルセンサーポリヌクレオチドの検出または分析のアッセイおよび方法
シグナルセンサーポリヌクレオチドを、同時係属出願の２０１３年３月９日に提出された国際出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００７０号および２０１２年８月１０日に提出された米国特許第６１／６８１，７４２号（ＭＮＣ２）に記載の方法を使用して観察してもよく、内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０９５９】
実施例１２．シグナルセンサーポリヌクレオチドの試験のための細胞株
シグナルセンサーポリヌクレオチドを任意の数の癌または正常な細胞株で研究してもよい。本発明に有用な細胞株として、ＡＴＣＣ（マナサス、バージニア州）のものが挙げられ、表１３に列挙する。
表１３．細胞株
【表００１３−１】
2018183181.tif 000192
【表００１３−２】
2018183181.tif 000193
【表００１３−３】
2018183181.tif 000194
【表００１３−４】
2018183181.tif 000195
【表００１３−５】
2018183181.tif 000196
【表００１３−６】
2018183181.tif 000197
【表００１３−７】
2018183181.tif 000198
【表００１３−８】
2018183181.tif 000199
【表００１３−９】
2018183181.tif 000200
【表００１３−１０】
2018183181.tif 000201
【表００１３−１１】
2018183181.tif 000202
【表００１３−１２】
2018183181.tif 000203
【表００１３−１３】
2018183181.tif 000204
【表００１３−１４】
2018183181.tif 000205
【０９６０】
実施例１３．シグナルセンサーポリヌクレオチド試験のための動物モデル
本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチドの試験のために様々な動物モデルを使用することができる。とりわけ肺癌および肝癌についてのモデルが挙げられる。
【０９６１】
Ｆｕｋａｚａｗａらの肺癌モデル（Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１０；３０：４１９３−４２００）をシグナルセンサーポリヌクレオチドの試験に適用する。簡潔に言えば、コンジェニックマウスが、ＫＲＡＳ変異−陽性肺癌モデルマウスで遍在的に発現しているドミナントネガティブのＭｙｃ（Ｏｍｏｍｙｃ）マウスを交配することによって作成される。Ｏｍｏｍｙｃの存在下では、突然変異したＫＲＡＳの発現によって引き起こされる肺腫瘍がコンジェニックマウスでは退行し、ＯｍｏｍｙｃがＫＲＡＳ変異陽性肺癌の腫瘍細胞死を引き起こしたことを示している。
【０９６２】
ヒト肺癌異種移植片はまた、Ｆｕｋａｚａｗａの方法によって調製される。簡潔には、ヒト肺癌異種移植片を、背側脇腹に４倍の１０６のＡ５４９細胞の皮下接種によって４週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｊａｐａｎ、神奈川県、日本）に確立する。マウスを無作為に６群（ｎ＝６／群）に割り当てる。腫瘍の直径が約０．５ｃｍ（腫瘍接種後約６日）に到達した後、各群のマウスに、選択された投与方法について、ｄｏｒｓａｌｆｌａｎｋ腫瘍にＰＢＳ、５×１０１０ｖｐの対照または信号センサポリヌクレオチドを含む１００μｌの溶液を注射する。動物を近くで観察し、ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｓｔｕｄｉｅｓｏｒ他の分析を行う。
【０９６３】
ＬＳＬ−ＫＲＡＳＧ１２Ｄ：ＴＲＥ  Ｏｍｏｍｙｃ：ＣＭＶ  ｒｔＴＡのトリプルトランスジェニックモデルは、ｆｌｏｘ化終止コドンの切除によって、癌遺伝子の発現を誘導するために、吸入を介して投与されるＣｒｅリコンビナーゼを発現するアデノウイルスの使用することを含み、広範なＯｍｏｍｙｃ発現をドキシサイクリンによって制御する。モデルはＳｏｕｃｅｋら（Ｎａｔｕｒｅ、１−５（２００８））に報告されている。ＳｏｕｃｅｋのマウスはＬＳＬＫＲＡＳＧ１２Ｄ単一のトランスジェニックマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と交配することができ、ＭＹＣ阻害剤Ｄまたはポリペプチドが関連する他の腫瘍を発現するシグナルセンサーポリヌクレオチドの吸入送達または他の肺送達の試験に使用することができる。
【０９６４】
マウスインマウスモデルを使用してもよい。当該モデルは、ツェンダーのＨＣＣモデルを過剰発現するｐ５３−／−：ｃ−Ｍｙｃに似ている（Ｃｅｌｌ．２００６  Ｊｕｎｅ  ３０；１２５（７）：１２５３-１２６７）。
【０９６５】
当該モデルの設計は、ＷＴまたは腫瘍抑制因子が削除された（ｐ５３−／−等）１２９
Ｓｖ／ＥｖのＭｍ  ＥＳ細胞クローンから始まり、肝臓活性化タンパク質（ＬＡＰ）プロモーター向けテトラサイクリントランス活性化因子（ｔＴＡ）および肝臓特異的イメージングのためのｔｅｔＯ−ルシフェラーゼの導入、得られたＬＡＰ−ｔＴＡの凍結、ｔｅｔＯ−ルシフェラーゼをクローン化し、ｃ−Ｍｙｃおよび他の肝臓関連のプログラム癌遺伝子に使用すること、ｔｅｔＯ駆動癌遺伝子、例えばｔｅｔＯｃＭｙｃの追加、得られるＬＡＰ−ｔＴＡ：ｔｅｔＯ−ルシフェラーゼ：ｔｅｔＯ−ＭＹＣクローンの凍結、得られたＥＳクローンをＣ５７Ｂｌ／６胚細胞に注射し、擬似妊娠中の母親に移植し、それによって得られたキメラ動物はドキシサイクリンの除去（すなわちＴｅｔ−Ｏｆｆ）の際に腫瘍モデルとなる。このモデルは、理想的には、正常な肝細胞に囲まれるｃ−Ｍｙｃ駆動、ルシフェラーゼを発現するＨＣＣの誘導性小結節を明示する。
【０９６６】
また、マウスのＨＥＰ３Ｂ細胞株を用いた同所性ＨＣＣのモデルを、使用してもよい（Ｃｒｏｗｎ  Ｂｉｏ）。
【０９６７】
非生殖細胞系遺伝子操作されたマウスモデル（ＮＧＥＭＭ）プラットフォームは、シグナルセンサーポリヌクレオチドを探索するために利用することもできるプラットフォームである。
【０９６８】
実施例１４．  ＨＩＦ１−αの阻害：ＳＨＡＲＰ１およびＣＩＴＥＤ４
低酸素誘導因子（ＨＩＦ）は、酸素欠乏に対する細胞の適応を制御する。癌細胞は、不利な条件での成長を維持するためにＨＩＦと関わり、代謝、増殖、生存および移動を含む細胞再プログラムを促進する。ヒト癌生検のＨＩＦの過剰発現は、高転移および死亡率と相関する。
【０９６９】
ＨＩＦは、ＧＬＵＴ１、ＧＬＵＴ３、ＡＬＤＯＡ、ＥＮＯ１、ＧＡＰＤＨ、ＨＫ１、ＨＫ２、ＰＦＫＬ、ＰＧＫ１、ＰＫＭ２、ＬＤＨＡ等代謝、ＩＧＦ−２、ＴＧＦＡ、ＶＥＧＦＡ等の増殖、ＴＥＲＴ、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４等の生存、ＺＥＢ１、ＺＥＢ２、ＳＮＡＩ２、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ９、ＡＭＦ、ＭＥＴ、ＰＴＨｒＰ等の細胞移動−侵入に関連する遺伝子を制御する（Ｋｅｉｔｈら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ２０１２；１２：９−２２）。
【０９７０】
癌の不安定化を調べるために、１つ以上のシグナルセンサーポリヌクレオチドを、癌細胞に投与することができる。配列、用量または投与経路の選択は、細胞、腫瘍、組織または生物の診断評価によって知らされてもよく、限定されないが、癌の発現プロファイリング、代謝の評価（低酸素、アシドーシス）、アポトーシス対生存プロファイリング、細胞周期対老化プロファイリング、免疫感受性、および／または間質因子の評価が挙げられる。
【０９７１】
腫瘍関連ポリペプチドのいずれかまたは両方をコードする試験シグナルセンサーポリヌクレオチドのアームでは、ＣＩＴＥＤ４とＳＨＡＲＰ１のいずれかまたは両方が、癌細胞におけるＨＩＦ−１αのトランスクリプトームの阻害をもたらす場所に投与される。ＨＩＦ１−α遺伝子の制御された発現の抑制は、両方のポリヌクレオチドを一緒に投与する場合、より高い抑制で投与されるときに発生する。ＨＩＦ１−αの下でルシフェラーゼ等のレポーター構築物は、ｖａｎ  ｄｅ  Ｓｌｕｉｓらによって開示された方法に類似する様式で使用される（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．  ２０１０；１２０（６）：２１１９-２１３０）。ＣＩＴＥＤ４とＳＨＡＲＰ１の両方の発現によって、ＨＩＦ１−αが減少し、ＨＩＦ１−α制御遺伝子発現が同時に減少することが知られている。細胞死および／または増殖の評価も行う。
【０９７２】
追加の実験は、低酸素条件下で、ＣＩＴＥＤ４とＳＨＡＲＰ１がそれ自体下方制御される癌細胞株を使用することを含む。したがって、陽性の結果は、シグナルセンサーセンサポリヌクレオチドを経由して、天然タンパク質を置換して、代謝プロファイル（この場合、ＣＩＴＥＤ４とＳＨＡＰＲ１の低酸素適応）を特に標的とすることが、直接的にこのプロファイルで、癌細胞のトランスクリプトームおよび生存優位性に影響を与えることができることを実証する。さらに、データは、低酸素条件下でシグナルセンサーポリヌクレオチド対ビヒクルの相対的影響が、正常細胞よりも癌細胞により顕著であったことを示す。（すなわち、癌細胞は、それらのＣＩＴＥＤ４＋ＳＨＡＲＰ１下方制御に基づいて、不均衡な生存優位性を持っている）当該タンパク質の置換により感受性を持たせ、その後、正常な細胞がそれを過剰産生する。癌細胞はおそらく低酸素状態を経験し、正常な細胞は生存率有意性について、ＨＩＦ１−αトランスクリプトームに依存しないため、正常酸素圧条件下で、ＣＩＴＥＤ４とＳＨＡＲＰ１の過剰発現を許容することができることが理解される。
【０９７３】
ＨＩＦ−１αは転移の場合に最大部分の有利性を与えるように思われるため、動物モデルが癌の設定の転移を表すものであるｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験の設計に従って、ｉｎ  ｖｉｖｏ実験を行う。無処置または対照ポリヌクレオチドと比較して、動物にシグナルセンサーポリヌクレオチドを投与する。その後、動物細胞、組織および／または器官を、遺伝子発現プロファイルまたはトランスクリプトームレベルの変化について評価する。
【０９７４】
実施例１５．  シグナルセンサーポリヌクレオチド輸送の変更：ＮＬＳおよびＮＥＳ
本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチドに組み込むことができる２つの核輸出シグナル（ＮＥＳ）は、ミュラーらによって報告されたものを含み（Ｔｒａｆｆｉｃ、２００９、１０：５１４−５２７）、遺伝子ＣＯＭＭＤ１を介したシグナル伝達に関連している。これらはＮＥＳ１、ＰＶＡＩＩＥＬＥＬ（配列番号６５９６）およびＮＥＳ２、ＶＮＱＩＬＫＴＬＳＥ（配列番号６５９７）である。
【０９７５】
核局在化シグナルも使用することもできる。当該配列は、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号：６５９８）である。
【０９７６】
細胞株またはマウスに、その中にコードされたＮＬＳまたはＮＥＳを有する１つ以上のシグナルセンサーポリヌクレオチドを投与する。投与時、ポリヌクレオチドを代わりの場所、例えば、ＮＬＳを使用して核内に輸送する。ＮＬＳを有する癌関連ポリペプチドは、それが核微小環境に生存しているまたは死んだシグナルのいずれかを伝達する核に輸送されることになる。核に局在化することができるポリペプチドとして、細胞、組織または生物に治療上有益な様式で、細胞の発現プロファイルを変更するために機能するＤＮＡについて改変された結合特性を有するものが挙げられる。
【０９７７】
１つの実験では、シグナルセンサーポリヌクレオチドを、Ｍｕｌｌｅｒら（Ｔｒａｆｆｉｃ  ２００９；１０：５１４−５２７）およびｖａｎ  ｄｅ  Ｓｌｕｉｓら、（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２０１０；１２０（６）：２１１９-２１３０）の方法に従って、ＣＯＭＭＤ１  ｍｕｔ１／ｍｕｔ２＋ＮＬＳ（例えば、攪乱されたＮＥＳシグナルと加えられたＮＬＳの両方）をコードする。シグナル配列は、腫瘍関連ポリペプチドまたは翻訳可能ではないスクランブル配列をコードすることができる。コードされるシグナル配列はＨＩＦ１−αと相互作用し、癌細胞のトランスクリプトームを変更する。
【０９７８】
実験は、正常および低酸素条件下で繰り返される。
【０９７９】
一度特定されると、ＨＩＦ１−α依存シグナルセンサーポリヌクレオチドを、癌細胞系クローン生存で試験し、またはアポトーシスのマーカーを測定し、対照またはモック処理細胞と比較する。
【０９８０】
実施例１６．  原発性肝細胞癌（ＨＣＣ）治療の場合のシグナルセンサーポリヌクレオチド：癌細胞のトランスクリプトームの攪乱
実施例１３で概説した動物モデルを用いて、動物を、ＭＹＣ阻害剤についてのシグナルセンサーポリヌクレオチド対負対照（ＭＹＣ阻害剤Ｄについて翻訳不可能なｍＲＮＡ）対ビヒクルで処理する。また、ＫＲａｓモデルについて、既存の形質導入されたＯｍｏＭｙｃモデル追加を利用することができる。次に、動物の遺伝子発現、腫瘍状態、または癌表現型または遺伝子型に関連する特徴のいずれかを評価する。
【０９８１】
実施例１７．細胞保護シグナルセンサーポリヌクレオチド
癌治療薬（ｍＲＮＡおよび非ｍＲＮＡの両方）の設定の場合に、正常細胞に細胞保護の利点を付与するタンパク質（天然または非天然、細胞内または細胞外）を生じる複数のｍＲＮＡの治療薬を送達する。
【０９８２】
実施例１８．  シグナルセンサーポリヌクレオチドにおけるセンサー配列として有用なｍｉＲＮＡ結合部位（ＢＳ）
特定の細胞（正常および／または癌）に、直接細胞毒性または細胞保護ｍＲＮＡ治療薬を指示するためのｍＲＮＡ治療薬の３’ＵＴＲに、ｍｉＲＮＡの結合部位を使用する。
【０９８３】
強いアポトーシスシグナル（すなわち、ＡＩＦｓｈ−Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｉｎｄｕｃｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ  ｓｈｏｒｔ  ｉｓｏｆｏｒｍ、構成的活性型（Ｃ．Ａ．）カスパーゼ６（Ｒｅｖ−カスパーゼ−６としても知られる）は、ＨＳＶ１−ｔｋ−単純ヘルペスウイルス１−チミジンキナーゼの要素である）を、癌関連ポリペプチドまたは「シグナル」としてコードされ、ｍｉｒ−１２２ａ等の一連の３’ＵＴＲ  ｍｉＲ結合部位と一緒にコードされ、比較的、シグナルセンサーポリヌクレオチドを、正常細胞より癌細胞内で、はるかに安定にする。
【０９８４】
癌細胞株が特異的なｍｉＲシグネチャを有する癌細胞株対正常ｈｅａｐｔｉｃ細胞株を比較する実験をｉｎ  ｖｉｔｒｏで行う。ＳＮＵ４４９またはＨＥＰ３Ｂ細胞（ヒト由来のＨＣＣ細胞株）は、両方とも「検出不能のｍｉＲ−１２２ａ」を有することが示されているため、使用され、正常な肝細胞は非常に高いｍｉＲ−１２２ａのレベルを有する。
【０９８５】
Ａ．  ＡＩＦｓｈをコードしたポリペプチドの試験
まず、ＡＩＦｓｈグナルセンサーポリヌクレオチドに感受性のある（すなわちアポトーシスをもたらす）癌細胞を選択する。
【０９８６】
３つのｍｉＲ−１２２ａ結合部位をＡＩＦｓｈについてｍＲＮＡ配列の３’ＵＴＲにコードし、試験のアームは、２つの細胞株（正常肝細胞、ＳＮＵ４４９またはＨＥＰ３Ｂ）×５治療群（ビヒクルのみ、翻訳不可能なシグナルセンサーポリヌクレオチド、シグナルセンサーポリヌクレオチドＡＩＦｓｈ（３’ＵＴＲにｍｉＲ  ＢＳがない）、３’ＵＴＲ［ｍｉＲ１２２ａ  ＢＳ  ｘ３］−翻訳不可能なシグナルセンサーポリヌクレオチド、３’ＵＴＲ［ｍｉＲ１２２ａ  ＢＳ  ｘ３］−シグナルセンサーポリヌクレオチドＡＩＦｓｈ）を含む。
【０９８７】
期待される結果は、任意の３’ＵＴＲ−ｍｉＲ１２２ａ  ＢＳの非存在下で、正常および癌（ＨＥＰ３ＢまたはＳＮＵ４４９）細胞株の両方のシグナルセンサーポリヌクレオチドＡＩＦｓｈに対して、重要なアポトーシスであることである。しかし、３’ＵＴＲ［ｍｉＲ１２２ａ  ＢＳ×３］の−シグナルセンサーポリヌクレオチドＡＩＦｓｈに対して、正常な細胞株対癌細胞株の相対的なアポトーシスの有意差。
【０９８８】
効果の可逆性は、癌細胞株へのｍｉＲ１２２ａの同時投与（例えば、ｍｉＲ１２２ａ活性を癌細胞株に後退させていくらか形質導入することによって）で示される。
【０９８９】
Ｂ．  Ｃ．Ａ．カスパーゼ６をコードしたポリペプチドの試験
まず、Ｃ．Ａ．カスパーゼ６シグナルセンサーポリヌクレオチド（すなわち、それがアポトーシスをもたらす）に感受性がある癌細胞を選択する。
【０９９０】
３つのｍｉＲ−１２２ａ結合部位をＣ．Ａ．カスパーゼ６についてｍＲＮＡ配列の３’ＵＴＲにコードし、試験のアームは、２つの細胞株（正常肝細胞、ＳＮＵ４４９またはＨＥＰ３Ｂ）×５治療群（ビヒクルのみ、翻訳不可能なシグナルセンサーポリヌクレオチド、シグナルセンサーポリヌクレオチドＡＩＦｓｈ（３’ＵＴＲのｍｉＲ  ＢＳでない）、３’ＵＴＲ［ｍｉＲ１２２ａ  ＢＳ  ｘ３］−翻訳不可能なシグナルセンサーポリヌクレオチド、３’ＵＴＲ［ｍｉＲ１２２ａ  ＢＳ  ｘ３］−シグナルセンサーポリヌクレオチドＣ．Ａ．カスパーゼ６）を含む。
【０９９１】
期待される結果は、任意の３’ＵＴＲ−ｍｉＲ１２２ａ  ＢＳの非存在下で、正常および癌（ＨＥＰ３ＢまたはＳＮＵ４４９）細胞株の両方のシグナルセンサーポリヌクレオチドＣ．Ａ．カスパーゼ６に対して、重要なアポトーシスであることである。しかし、３’ＵＴＲ［ｍｉＲ１２２ａ  ＢＳ×３］の−シグナルセンサーポリヌクレオチドＣ．Ａ．カスパーゼ６に対して、正常な細胞株対癌細胞株の相対的なアポトーシスの有意差。
【０９９２】
Ｃ．  ＨＳＶ１−ｔｋをコードしたポリペプチドの試験
まず、ＨＳＶ１−ｔｋシグナルセンサーポリヌクレオチドに感受性がある（すなわち、アポトーシスをもたらす）癌細胞を選択する。
【０９９３】
３つのｍｉＲ−１２２ａ結合部位をＨＳＶ１−ｔｋについてｍＲＮＡ配列の３’ＵＴＲにコードし、試験のアームは、２つの細胞株（正常肝細胞、ＳＮＵ４４９またはＨＥＰ３Ｂ）×５治療群（ビヒクルのみ、翻訳不可能なシグナルセンサーポリヌクレオチド、シグナルセンサーポリヌクレオチドＨＳＶ１−ｔｋ（３’ＵＴＲのｍｉＲ  ＢＳでない）、３’ＵＴＲ［ｍｉＲ１２２ａ  ＢＳ  ｘ３］−翻訳不可能なシグナルセンサーポリヌクレオチド、３’ＵＴＲ［ｍｉＲ１２２ａ  ＢＳ  ｘ３］−シグナルセンサーポリヌクレオチドＨＳＶ１−ｔｋ）を含む。
【０９９４】
期待される結果は、任意の３’ＵＴＲ−ｍｉＲ１２２ａ  ＢＳの非存在下で、正常および癌（ＨＥＰ３ＢまたはＳＮＵ４４９）細胞株の両方のシグナルセンサーポリヌクレオチドＨＳＶ１−ｔｋに対して、重要なアポトーシスであることである。しかし、３’ＵＴＲ［ｍｉＲ１２２ａ  ＢＳ×３］の−シグナルセンサーポリヌクレオチドＨＳＶ１−ｔｋに対して、正常な細胞株対癌細胞株の相対的なアポトーシスの有意差。
【０９９５】
効果の可逆性は、癌細胞株へのｍｉＲ１２２ａの同時投与（例えば、ｍｉＲ１２２ａ活性を癌細胞株に後退させていくらか形質導入することによって）で示される。
【０９９６】
Ｄ．  シグナルセンサーポリヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ試験
ｉｎ  ｖｉｖｏ動物実験を、本明細書に開示されたモデルまたは市販の同所性ＨＣＣモデルのいずれかを使用して、ＡＩＦｓｈ、Ｃ．Ａ．カズパーゼ６、ＨＳＶ１−ｔｋについて行う。
【０９９７】
実施例１９．  マイクロＲＮＡ結合部位を有する修飾された核酸の発現
ヒト胎児腎臓上皮細胞（ＨＥＫ２９３Ａ）および一次ヒト肝細胞（肝細胞）を、５００μｌの細胞培養培地（ＩｎＶｉｔｒｏ  ＧＲＯ  ｍｅｄｉｕｍ  、セルシス、シカゴ、イリノイ州）にウェル当たり２００，０００の密度で播種した。α−グロビン３’ＵＴＲ（Ｇ−ＣＳＦα）（ｍＲＮＡ配列は配列番号６５９９に示される、配列には示されていない約１６０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１、５−メチルシチジンおよびプソイドウリジンで完全修飾された）α−グロビン３’ＵＴＲおよびｍｉＲ−１２２結合部位を有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦのｍｉＲ−１２２）（ｍＲＮＡ配列は配列番号６６００に示される、配列には示されていない約１６０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１、５メチルシチジンとシュードウリジンで完全修飾された）、または種が削除された（Ｇ−ＣＳＦ種のない）４つのｍｉＲ−１２２結合部位でαグロビン３’ＵＴＲを有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ配列は配列番号６６０１に示される、配列には示されていない約１６０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１、５−メチルシチジンおよびプソイドウリジンで完全修飾された）を有するＧ−ＣＳＦｍＲＮＡを、２４ウェルプレートにウェルあたり２５０ｎｇの濃度で試験した。Ｇ−ＣＳＦの発現をＥＬＩＳＡによって測定し、結果を表１４に示す。
表１４．ｍｉＲ−１２２結合部位  
【表００１４】
2018183181.tif 000206
【０９９８】
ＨＥＫ２９３細胞はｍｉＲ−１２２を発現しないため、ｍｉＲ−１２２を含む配列からＧ−ＣＳＦタンパク質の下方制御がなかった。一方、ヒト肝細胞は、高レベルのｍｉＲ−１２２を発現し、Ｇ−ＣＳＦ配列がｍｉＲ−１２２標的配列を含む場合に観察されるＧ−ＣＳＦタンパク質の劇的な下方制御があった。その結果、ｍＲＮＡは栄養要求性ｍＲＮＡとして機能した。
【０９９９】
実施例２０．  細胞株におけるＭＹＣ阻害剤Ｄの試験
本明細書に記載のように肝臓癌および肺癌の細胞株を、生理食塩水中でＭＹＣ阻害剤Ｄ修飾ｍＲＮＡを形質移入する、または本明細書または国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／６９６１０号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載のように製剤化する。ＭＹＣ阻害剤Ｄ修飾ｍＲＮＡで選択性および／または治療効果を評価するために、正常な肝細胞もＭＹＣ阻害剤Ｄ修飾ｍＲＮＡを形質移入する。
【１０００】
実施例２１．  シグナルセンサーポリヌクレオチドの製剤化
シグナルセンサーポリヌクレオチドを、本明細書に記載され、当技術分野で周知であり、および／または国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／６９６１０号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載のように、脂質ナノ粒子中に製剤化する。腫瘍送達のために、脂質ナノ粒子製剤を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ投与の前に、効率的に送達するために適合する。標的化送達、および／または毒性を低減するために、シグナルセンサーポリヌクレオチドは、少なくとも一つのｍｉＲ結合部位を含む。
【１００１】
脂質ナノ粒子の製剤を、当技術分野で周知であり、または本明細書に記載の方法によって、肝臓癌および肺癌モデル（例えば、本明細書に記載のもの、およびマウスの皮下ヒト異種移植片、マウスの同所性ヒト異種移植片およびトランスジェニック／遺伝子操作されたマウスモデル）に（例えば、静脈内、筋肉内およびまたは鼻腔内）投与する。
【１００２】
実施例２２．  哺乳動物へのシグナルセンサーポリヌクレオチドの送達
シグナルセンサーポリヌクレオチドを肺および／または肝臓癌モデル（例えば、本明細書に記載のもの）をｉｎ  ｖｉｖｏ送達するために製剤化する。シグナルセンサーポリヌクレオチドを、本明細書に記載され、当技術分野で周知であり、および／または国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／６９６１０号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載のように、脂質ナノ粒子中に製剤化する。
【１００３】
肺および／または肝臓癌モデルを、タンパク質発現、アポトーシス、毒性、腫瘍容積による有効性、肝臓酵素レベルおよび腫瘍組織への効果について分析し、製剤化されたシグナルセンサーポリヌクレオチドの肺および／または肝癌モデルへの投与の効果を評価する。シグナルセンサーポリヌクレオチドのタンパク質発現を評価するためにアッセイを使用する。アポトーシス、毒性、腫瘍体積による有効性、肝酵素レベルおよび腫瘍組織を、当技術分野で周知の一般的な方法を用いて評価する。
【１００４】
実施例２３．  用量反応
９８Ｎ１２−５（ＮＰＡ−００５）およびＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ（ＮＰＡ−００３）のナノ粒子製剤を、様々な濃度で試験し、ＦＬ４またはｍＣｈｅｒｒｙのＭＦＩを決定する（配列番号６６０２に示されるｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１６０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１、５メチルシチジンおよびプソイドウリジンで完全修飾）を、あらゆる用量範囲で決定する。試験した製剤を表１５に概説する。９８Ｎ１２−５のナノ粒子製剤の最適濃度を決定するために、製剤化された修飾ＲＮＡ（ウェル当たり１００ｎｇ、１０ｎｇ、１．０ｎｇ、０．１ｎｇおよび０．０１ｎｇ）の様々な濃度を、ＨＥＫ２９３の２４ウェルプレートで試験した。
【１００５】
ヒト胎児腎臓上皮（ＨＥＫ２９３）（ＬＧＣ  ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ＧｍｂＨ、ウェーゼル、ドイツ）を、９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−ｏｎｅ  ＧｍｂＨ、フリッケンハウゼン、ドイツ）に播種し、プレートをコラーゲンタイプ１でプレコーティングした。ＨＥＫ２９３を、１００μｌの細胞培養培地中にウェル当たり３０，０００細胞の密度で播種した。細胞培養培地は、ＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳ、２ｍＭのＬ−グルタミンの添加、１ｍＭのＳｏｄｉｕｍｐｙｒｕｖａｔｅおよび１倍の非必須アミノ酸（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ、ベルリン、ドイツ）および１．２ｍｇ／ｍｌの重炭酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミュンヘン、ドイツ）であった。ｍＣｈｅｒｒｙ  ｍＲＮＡを含有する製剤を、細胞を播種した後、直接、４つに添加してインキュベートした。
【１００６】
９６ウェルのプロバインドＵ底プレート（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＧｍｂＨ、ハイデルベルク、ドイツ）に培養培地上清を移すことによって、細胞を収集した。細胞を１／２量のトリプシン／ＥＤＴＡ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ、ベルリン、ドイツ）でトリプシン処理し、それぞれの上清と共にプールし、１容量のＰＢＳ／２％ＦＣＳ（両方ともＢｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ、ベルリン、ドイツ）／０．５％ホルムアルデヒド（Ｍｅｒｃｋ、ダルムシュタット、ドイツを追加することによって固定した。次に、ＬＳＲＩＩサイトメーター（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＧｍｂＨ、ハイデルベルク、ドイツ）で、５３２ｎｍの励起レーザーおよびＰＥ−テキサスレッド用の６１０／２０フィルターで、試料をフローサイトメーター測定に供した。すべてのイベントの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を分析し、各用量のＦＬ４  ＭＦＩの結果を表１６に示す。同様に、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡのナノ粒子製剤の最適な濃度を決定するために、製剤化された修飾ＲＮＡの濃度を変化させる試験を（ウェルあたり、２５０ｎｇ、１００ｎｇ、１０ｎｇ、１．０ｎｇ、０．１ｎｇおよび０．０１ｎｇ）をＨＥＫ２９３の２４ウェルプレートで行い、各用量のＦＬ４  ＭＦＩの結果を表１７に示す。ＤＬｉＮ−ＫＣ２−ＤＭＡのナノ粒子製剤を、ＨＥＫ２９３の２４ウェルプレート中で、製剤化修飾されたＲＮＡの濃度を変化させて（ウェルあたり２５０ｎｇ、１００ｎｇ、および３０ｎｇ）、各用量のＦＬ４  ＭＦＩの結果を表１８に示す。９８Ｎ１２−５のための１ｎｇ／ｗｅｌｌの用量およびＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡのための１０ｎｇ／ｗｅｌｌの用量はバックグラウンドのＦＬ４  ＭＦＩに近いことを見出した。
【１００７】
濃度がバックグラウンドにどの程度近いかを決定するために、ｍＣｈｅｒｒｙ発現の検出のために最適化されたフィルターセットと共にフローサイトメーターを使用して、バックグラウンドレベルと比較して感受性が増加した結果を得ることができた。２５ｎｇ／ウェル、０．２５ｎｇ／ウェル、０．０２５ｎｇ／ウェルおよび０．００２５ｎｇ／ウェルの用量を、９８Ｎ１２−５（ＮＰＡ−００５）およびＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ（ＮＰＡ−００３）について分析し、ｍＣｈｅｒｒｙのＭＦＩを決定した。表１９に示されるように、０．０２５ｎｇ／ウェルの濃度とそれより低い濃度は、約３８６．１２５であるｍＣｈｅｒｒｙのバックグラウンドＭＦＩレベルに類似している。
表１５．製剤
【表００１５】
2018183181.tif 000207
表１６．ＨＥＫ２９３、ＮＰＡ−００５、２４ウェル、ｎ＝４
【表００１６】
2018183181.tif 000208
表１７．ＨＥＫ２９３、ＮＰＡ−００３、２４−ウェル、ｎ＝４
【表００１７】
2018183181.tif 000209
表１８．ＨＥＫ２９３、ＮＰＡ−００３、２４ウェル、ｎ＝４
【表００１８】
2018183181.tif 000210
表１９．濃度およびＭＦＩ
【表００１９】
2018183181.tif 000211
【１００８】
実施例２４．  ＬＮＰ製剤
ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、９８Ｎ１２−５、Ｃ１２−２００およびＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡの製剤を、ＨＥＫ２９３のプレートでは６０ｎｇ／ウェルまたは６２．５ｎｇ／ウェルのプレートの濃度で、ＨｅｐＧ２細胞のプレートでは６２．５ｎｇ／ウェルの濃度で２４時間インキュベートし、ｍＣｈｅｒｒｙのＭＦＩ（配列番号６６０２に示されるｍＲＮＡ配列）、配列には示されていない約１６０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１、５メチルシチジンおよびプソイドウリジンで完全に修飾された）を各製剤について決定した。
【１００９】
ヒト胎児腎臓上皮（ＨＥＫ２９３）および肝細胞癌上皮（ＨｅｐＧ２細胞）細胞（ＬＧＣ  ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ＧｍｂＨ、ウェーゼル、ドイツ）を、９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−ｏｎｅ  ＧｍｂＨ、フリッケンハウゼン、ドイツ）に播種し、ＨＥＫ２９３細胞のプレートをコラーゲンタイプ１でプレコーティングした。ＨＥＫ２９３を３０，０００の密度で播種し、ＨｅｐＧ２細胞を１００μｌの細胞培養培地中に、ウェルあたり３５，０００細胞の密度で播種した。ＨＥＫ２９３については、細胞培養培地はＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳであり、２ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのＳｏｄｉｕｍｐｙｒｕｖａｔｅおよび１倍の非必須アミノ酸（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ、ベルリン、ドイツ）および１．２ｍｇ／ｍｌの重炭酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミュンヘン、ドイツ）を加え、ＨｅｐＧ２については、細胞培地はＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ダルムシュタット、ドイツ）、１０％ＦＣＳであり、２ｍＭのＬ−グルタミンを追加し、１ｍＭのＳｏｄｉｕｍｐｙｒｕｖａｔｅおよび１倍の非必須アミノ酸（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ、ベルリン、ドイツ）を加えた。ｍＣｈｅｒｒｙ  ｍＲＮＡを含有する製剤（配列番号６６０２に示されるｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１６０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１）、細胞を播種した後、直接４つに添加し、インキュベートした。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）に使用されるＴ７プロモーター、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）および３’ＵＴＲを伴うｍＣｈｅｒｒｙ  ｃＤＮＡは、配列番号６６０３に記載されている。ｍＣｈｅｒｒｙ  ｍＲＮＡを、各ウリジンサイトで、５ｍｅＣで修飾し、各シチジンおよびプソイドウリジン置換で修飾した。
【１０１０】
９６ウェルのプロバインドＵ底プレート（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＧｍｂＨ、ハイデルベルク、ドイツ）に培養培地上清を移すことによって、細胞を収集した。細胞を１／２量のトリプシン／ＥＤＴＡ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ、ベルリン、ドイツ）でトリプシン処理し、それぞれの上清と共にプールし、１用量のＰＢＳ／２％ＦＣＳ（両方ともＢｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ、ベルリン、ドイツ）／０．５％ホルムアルデヒド（Ｍｅｒｃｋ、ダルムシュタット、ドイツを追加することによって固定した。次に、ＬＳＲＩＩサイトメーター（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＧｍｂＨ、ハイデルベルク、ドイツ）で、５３２ｎｍの励起レーザーおよびＰＥ−テキサスレッド用の６１０／２０フィルターで、試料をフローサイトメーター測定に供した。すべてのイベントの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を測定した。
【１０１１】
試験を行った製剤を以下の表２０に概説する。６０ｎｇ／ウェルについては表２１に示し、６２．５ｎｇ／ウェルについては表２２、２３、２４および２５に示すように、ＮＰＡ−００３およびＮＰＡ−０１８の製剤は最も高いｍＣｈｅｒｒｙ  ＭＦＩを有し、ＮＰＡ−００８、ＮＰＡ−０１０およびＮＰＡ−０１３の製剤は、バックグラウンド試料ｍＣｈｅｒｒｙ  ＭＦＩ値に最も類似している。
表２０．製剤
【表００２０】
2018183181.tif 000212
表２１．ＨＥＫ２９３、９６ウェル、６０ｎｇの修飾ＲＮＡ／ウェル
【表００２１】
2018183181.tif 000213
表２２．ＨＥＫ２９３、６２．５ｎｇ／ウェル
【表００２２】
2018183181.tif 000214
表２３．ＨＥＫ２９３、６２．５ｎｇ／ウェル
【表００２３】
2018183181.tif 000215
表２４．ＨｅｐＧ２細胞、６２．５ｎｇ／ウェル
【表００２４】
2018183181.tif 000216
表２５．ＨｅｐＧ２細胞、６２．５ｎｇ／ウェル
【表００２５】
2018183181.tif 000217
【１０１２】
実施例２５．  ＬＮＰのｉｎ  ｖｉｖｏ試験
ｍＣｈｅｒｒｙ  ｍＲＮＡ（配列番号６６０４、配列には示されていない約１６０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１、５−メチルシチジンとプソイドウリジンで完全修飾された）を、シリンジポンプ法を用いて脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）として製剤化した。ＬＮＰを、最終の脂質モル比が５０：１０：３８．５：１．５（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ）の２０：１重量比の修飾ｍＲＮＡに対する総脂質で製剤化した。ｍＣｈｅｒｒｙ製剤を、表２６に列挙し、粒子サイズ、ゼータ電位、およびカプセル化によって特徴づけた。
表２６．ｍＣｈｅｒｒｙ製剤
【表００２６】
2018183181.tif 000218
【１０１３】
１００μｇの修正されたｍＲＮＡ用量のＬＮＰ製剤を、マウス（ｎ＝５）に静脈内投与した。マウスは、投与から２４時間後に屠殺した。ｍＣｈｅｒｒｙ修飾ｍＲＮＡの製剤を投与したマウスの肝臓および脾臓は、免疫組織化学ソーティング（ＩＨＣ）、ウェスタンブロット、または蛍光活性化セル（ＦＡＣＳ）により分析した。
【１０１４】
肝臓の組織学は、セクション全体に均一なｍＣｈｅｒｒｙ発現を示し、未処理の動物は、ｍＣｈｅｒｒｙを発現しなかった。また、ウェスタンブロットも使用して、処理動物のｍＣｈｅｒｒｙ発現を確認し、未処理動物ではｍＣｈｅｒｒｙは検出されなかった。チューブリンを対照マーカーとして使用し、処理された、未処理マウスの両方で検出し、肝細胞の正常なタンパク質の発現は影響を受けなかったことを示した。
【１０１５】
ｍＣｈｅｒｒｙおよび未処理マウスの脾臓でＦＡＣＳおよびＩＨＣも行った。ＦＡＣＳ分析によって、すべての白血球細胞集団はｍＣｈｅｒｒｙの発現について陰性であった。ＩＨＣによって、また、ｍＣｈｅｒｒｙ処理マウスと未処理マウスとの間で、脾臓に観察可能な差はなかった。
【１０１６】
実施例２６．  ２補因子間の結合親和性の滴定
２つの補因子間の結合親和性を滴定するために、実験を実施した。本明細書に使用するとき、用語「滴定」は、目的の特性を評価するために、１つ以上の因子を系統的に導入する方法（例えば、増加しているレベル、または１つ以上の因子を系統的に改変する）、溶液、シナリオまたはその系列を意味する。本実施形態では、目的の特性は、２つの補因子間の結合親和性である。一実施形態では、２つの補因子をコードする構築物を得て、および／または合成し、一連の変異体構築物を調製および／または合成する。変異体構築物は、補因子変異体をコードし、補因子変異体として、切り詰め変異体（Ｎ末端またはＣ末端ドメインのいずれかから１つまたは複数のアミノ酸を欠いている変異タンパク質）、局地的に削除された変異体（タンパク質の内部領域（１つ以上のアミノ酸を含む）が不在である）、単一のアミノ酸置換を有する変異体（正常に発現したアミノ酸が代替アミノ酸で置換される）、内部またはいずれかの末端に加えられる１つ以上の追加のアミノ酸を有する変異体が挙げられ、タンパク質の局所的置換を有する変異体（一つ以上のアミノ酸を含む）は、代替領域（一つ以上のアミノ酸を含む）および／またはこれらの任意の組み合わせで置換される。変異体構築物は無作為に変異し、または観察されている２つの補助因子間の結合に必要な分子間相互作用の既存の知識に基づいて、標的変異に供される。
【１０１７】
いくつかの実施形態では、一連の変異タンパク質は、ポリペプチド鎖に沿って漸進的なパターンに従うように設計されている。このような系列によって、補因子間の相互作用の特定の側面または特徴のより良い理解が可能になる。変異体系列として、例えば、それぞれ単一のアミノ酸置換を有する変異体の一連の産生が挙げられ、各変異体は変異したポリペプチド配列に沿って、異なるアミノ酸を有する（例えば、アラニンは置換され、それによって各位置のアミノ酸側鎖の影響を排除する）。別の例では、一連の変異体は、その系列の変異体がサイズの大きい切断を含むように設計される。別の例では、同様の方法で翻訳後修飾され得るアミノ酸（例えば、リン酸化、アセチル化、ユビキチン化、グリコシル化等）は、一連の変異体のポリペプチド配列に沿って変異させることができる。
【１０１８】
変異体補因子を用いた滴定実験について、２つの補因子間のベースライン親和性は、結合に好ましい条件下で両方の補因子を結合することによって確立され、補因子間の結合親和性がアッセイされる。結合親和性を、当該分野で周知の種々の方法のいずれかを用いて評価することができる。当該方法として、限定されないが、ウェスタンブロット分析、免疫沈降法、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、光退色後（ＦＲＡＰ）の蛍光回復、蛍光偏光技術および／または表面プラズモン共鳴に（ＳＰＲ）に基づく技術が挙げられる。滴定のために、一つの方法によれば、一方または両方の補因子の変異体系列を、２つの突然変異していない補因子と組み合わせる（野生型と変異タンパク質間の競合結合を可能にするために）。異なる変異体の濃度が増加している存在下で、２つの補因子間の親和性の変化を評価し、結合について競合している変異体の系列に存在する特定の突然変異に対して、比較および／またはプロットする。あるいは、系列内の変異体補因子は、個々に、対応する非変異結合パートナーと結合し、結合親和性について評価する。野生型の補因子（変異体補因子に相当）の濃度の増加が導入され、変異体補因子と対応する非変異結合パートナーとの間の結合の変化を評価する。得られた結合曲線と試験された他の変異体の結合曲線との間で比較を行う。
【１０１９】
いくつかの実施形態では、２つの補因子間の結合親和性の滴定は、増加する濃度の第三因子の存在下または非存在下で評価する。そのような第三因子は、２つの補助因子間の結合の阻害剤または活性剤とすることができる。一連の変異体は、上記のように、第三因子のために生成されてもよく、当該系列を滴定実験に使用して、２つの補因子間の結合への突然変異の影響を評価することができる。
【１０２０】
滴定実験から得られた情報は、補因子間の相互作用を調節する因子をコードするように、修飾ｍＲＮＡ分子を設計するために使用することができる。
【１０２１】
いくつかの実施形態では、滴定実験を行い、ＨＩＦ１サブユニット（ＨＩＦ１−α、ＨＩＦ２−αおよびＡＲＮＴ）、および／または変異ＨＩＦ１サブユニットおよび／またはＨＩＦ１と相互作用する他のタンパク質間の結合親和性を評価する。滴定実験は、ＨＩＦ１−α、ＨＩＦ２−α、ＡＲＮＴおよび／または第三相互作用因子のうちの１つ以上についての構築物を使用して生成された変異体系列を使用してもよい。いくつかの実施形態では、変異体系列はＨＩＦ１−αについて生成される。ＨＩＦ１−αおよびＨＩＦ２−αを、細胞内の酸素の正常なレベルの下でＨＩＦヒドロキシラーゼ酵素によってヒドロキシル化し、分解を促進しおよび／または転写活性を遮断する。ヒドロキシル化は酸素レベルの低下に伴って減少し、ＨＩＦ１−αおよび／またはＨＩＦ２−αがそれらの補因子と結合することを可能にし、ＡＲＮＴがＨＩＦ応答要素（ＨＲＥ）を含む遺伝子の発現を増加させる（Ｋｅｉｔｈ，Ｂ．ら、ＨＩＦ１α  ａｎｄ  ＨＩＦ２α：  ｓｉｂｌｉｎｇ  ｒｉｖａｌｒｙ  ｉｎ  ｈｙｐｏｘｉｃ  ｔｕｍｏｕｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ．２０１１  Ｄｅｃ  １５；１２（１）：９−２２）。一実施形態では、ＨＩＦ１−αの変異体系列が生成され、この系列内の変異が、ポリペプチド鎖に沿って、１つ以上のヒドロキシル化部位を進行性に排除し（限定されないが、プロリン４０２、プロリン５６４および／またはアスパラギン８０３を含む）、それによってＨＩＦ１−αの変異体版の安定性および／または転写活性を調節する。別の実施形態では、変異体系列を生成するために、代替の補因子であるＨＩＦ２−αを使用する。当該変異体系列は、ポリペプチド鎖（限定されないが、プロリン４０５、プロリン５３１および／またはアスパラギン８４７を含む）に沿って１つ以上のヒドロキシル化部位を進行性に排除し、それによってＨＩＦ２−αの変異体版の安定性および／または転写活性を調節する。別の実施形態では、ＡＲＮＴとの相互作用に必要な領域を進行性に変異させるＨＩＦ１−αおよび／またはＨＩＦ２−α変異体系列を生成し、それによってＡＲＮＴと結合し、ＨＩＦ依存性遺伝子発現を調節するために改変された能力を有する変異体を作成する。別の実施形態では、他のＨＩＦサブユニットとの相互作用に必要な領域を進行性に変異させるＡＲＮＴ変異体系列を生成し、それによってＨＩＦ  サブユニットと結合し、ＨＩＦ依存性遺伝子発現を調節するために改変された能力を有する変異体を作成する。
【１０２２】
いくつかの実施形態では、フォン・ヒッペル・ランダウ腫瘍抑制タンパク質（ｐＶＨＬ）のために変異体系列を生成する。このタンパク質は、ヒドロキシル化ＨＩＦ１−αおよびＨＩＦ２−αに結合し、そのユビキチン化および分解を促進する。一実施形態では、ＨＩＦ１サブユニットとの相互作用に必要な領域を進行性に変異させる変異体系列を生成し、それによってＨＩＦ１サブユニットと結合し、ＨＩＦ依存性遺伝子発現を調節するために改変された能力を有する変異体を作成する。
【１０２３】
滴定実験で使用するためのタンパク質標的のための転写配列およびポリペプチド配列を（それぞれ）表２７と表２８に示す。目的のポリペプチドをコードする遺伝子の名前と記述は、ＥＮＳＥＭＢＬトランスクリプトＩＤ（ＥＮＳＴ）および転写配列（表２７）またはＥＮＳＥＭＢＬタンパク質ＩＤ（ＥＮＳＰ）およびペプチド配列（表２８）を伴う。本発明のいくつかの実施形態では、ＨＩＦサブユニットおよび／またはＨＩＦ依存性遺伝子発現との間の親和性を調節する因子をコードするように、修飾ｍＲＮＡを設計することができる。このような修飾されたｍＲＮＡは、滴定実験から得られた知識を用いて設計することができる。
表２７．滴定実験のための追加の標的の転写産物配列
【表００２７−１】
2018183181.tif 000219
【表００２７−２】
2018183181.tif 000220
【表００２７−３】
2018183181.tif 000221
【表００２７−４】
2018183181.tif 000222
【表００２７−５】
2018183181.tif 000223
【表００２７−６】
2018183181.tif 000224
【表００２７−７】
2018183181.tif 000225
【表００２７−８】
2018183181.tif 000226
【表００２７−９】
2018183181.tif 000227
【表００２７−１０】
2018183181.tif 000228
【表００２７−１１】
2018183181.tif 000229
【表００２７−１２】
2018183181.tif 000230
【表００２７−１３】
2018183181.tif 000231
【表００２７−１４】
2018183181.tif 000232
【表００２７−１５】
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表２８．滴定実験のための追加のターゲットのためのペプチド配列
【表００２８−１】
2018183181.tif 000234
【表００２８−２】
2018183181.tif 000235
【表００２８−３】
2018183181.tif 000236
【１０２４】
実施例２７〜３３の材料
表２９は、実施例２７〜３３に記載の修飾ｍＲＮＡ配列を説明している。
表２９
【表００２９−１】
2018183181.tif 000237
【表００２９−２】
2018183181.tif 000238
【表００２９−３】
2018183181.tif 000239
【１０２５】
実施例２７．  アポトーシス誘導因子の短いタンパク質の検出：ウエスタンブロット法
ＣＤ１マウス（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、サウスイーストン、マサチューセッツ州）に、ｌｉｐｏｌｅｘ化アポトーシス誘導因子ショート（ＡＩＦｓｈ）修飾ｍＲＮＡ（表２９に示されるｍＲＮＡ配列、配列に示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１）を静脈投与し、当該修飾ｍＲＮＡは、５メチルシチジンおよびプソイドウリジン（５ｍＣ／ｐＵ）で完全修飾され、および５メチルシチジンおよび１−メチルプソイドウリジン（５ｍＣ／１ｍｐＵ）で完全修飾され、２−チオウリジンで修飾された２５％のウリジン、および５メチルシチジン（ｓ２Ｕと５ｍＣ）で修飾された２５％のシチジン、プソイドウリジン（ｐＵ）で完全修飾され、または１−メチルプソイドウリジン（１ｍｐＵ）で完全修飾された。マウスに、１００μｌの滅菌基礎ＤＭＥＭ培地（添加剤なし、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、グランドアイランド、ニューヨーク州）中、２μｌのリポフェクタミン２０００（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、グランドアイランド、ニューヨーク州）と複合された２μｇのｍＲＮＡの用量を投与した。
【１０２６】
６時間後、動物を屠殺し、血清と脾臓を収集する。脾臓を６ウェルプレートに移し、１ｍｌのＰＢＳの存在下で、氷に維持した。１つの脾臓をメスで数回切り分け、ＰＢＳが細胞の放出によって濁るまで、脾細胞をゴム細胞スクレーパーで絞り出した。
【１０２７】
線維状成分を残して、細胞を１２ウェル細胞培養プレートに位置する１００μｍ細胞ストレーナー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、サンノゼ、ＣＡ）に移した。重力により細胞を細胞ストレーナーに通し、１２ウェル培養皿の下に収集した。１ｍｌのＰＢＳをエッペンドルフチューブに自由に浮遊している脾細胞と共に移動させ、２０００ｒｐｍで５分間遠心した。ＰＢＳを捨て、細胞ペレットを５００μｌの新鮮なＰＢＳと合わせた。脾細胞を、２０００ｒｐｍで５分間の短時間ボルテックスすることにより再懸濁した。ＰＢＳを捨て、１ｍｌのＢＤ  Ｐｈａｒｍｌｙｓｅを細胞ペレットに添加した。脾細胞を短時間のボルテックスによって再懸濁した。細胞を、室温で３分間インキュベートし、次に５分間、２００ｒｐｍで遠心した。細胞を５００μｌのＰＢＳで２回洗浄し、上記のように遠心した。細胞を５００μｌのＰＢＳで再懸濁し、上記のように遠心した。
【１０２８】
２５０μｌの脾臓細胞を１倍のＰｈａｒｍｌｙｓｅ緩衝液と合わせ、短時間ボルテックスあるいはピペットで再懸濁し、２０００ｒｐｍで２分間遠心した。
【１０２９】
一本のチューブ中、哺乳動物細胞（ＢｏｓｔｏｎＢｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、アッシュランド、マサチューセッツ州）のためのプロテアーゼ阻害剤カクテルで、５００μｌのＲＩＰＡ緩衝液中に細胞ペレットを再懸濁し、溶解物を凍結するか、すぐにＢＣＡアッセイを続行する。第二のチューブ中、２５０μｌのＦＡＣＳ染色キット固定液（４％のホルムアルデヒド、Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、ミネソタ州）を加え、次に室温で１０分間インキュベートする。細胞を５００μｌのＰＢＳで２回洗浄し、上記のように遠心した。細胞ペレットを５００ＰＢＳに再懸濁し、４℃で保存した。
【１０３０】
タンパク質溶解物を、１．５ｍｍのすぐに使用できるビス−トリス  ゲルを有するＮｕＰＡＧＥ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥシステム（チャンバーと電源）に、助剤としてのＭＯＰＳ緩衝液と共に４〜１２％のアクリルアミド勾配に充填した（全てＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、グランドアイランド、ニューヨーク州）。各溶解物の試料を４０μｌの最終容量に調製した。当該試料は、可変体積の２５μｇのタンパク質溶解物、体積２６μｌを作製するためのＲＩＰＡ緩衝液、４μｌの１０倍還元剤および１０μｌの４倍のＳＤＳローディング緩衝液（両方とも  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、グランドアイランド、ニューヨーク州）を含有した。試料を５分間９５℃で加熱し、ゲルに充填した。メーカーによって、２００Ｖ、１２０ｍＡおよび最大２５Ｗの標準設定を選択した。実行時間は６０分であったが、色素が移動しゲルの下端に到達する時間を超えることはなかった。
【１０３１】
実行を終了した後、プラスチックケースを割り、容器に入っていたゲルは、すぐに使用できるニトロセルロース膜キットおよび電源（ｉＢＬＯＴ、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、グランドアイランド、ニューヨーク州）に移動した。デフォルト設定を使用して、タンパク質溶解物を、高アンペアの電力によって、ゲルから膜に移した。
【１０３２】
移動後、膜を１５分間、１倍のＴＢＳ中、５％のＢＳＡ中でインキュベートし、次にさらに１５分間、１倍のＴＢＳ＋０．１％のＴｗｅｅｎ中、５％のＢＳＡ中でインキュベートした。ＡＩＦｓｈタンパク質に対する一次抗体（ＡＩＦｓｈウサギポリクローナル抗体、Ａｂｃａｍ、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）を、室温で３時間、１：５００〜１：２０００の希釈の１倍のＴＢＳ溶液中、３ｍｌの５％ＢＳＡに適用し、オービタルシェーカーで穏やかに撹拌した。膜を、１倍のＴＢＳ／０．１％のＴｗｅｅｎで、穏やかに撹拌しながら、５分ずつ３回洗浄する。二次抗体（ヤギ抗ウサギＨＲＰコンジュゲート、Ａｂｃａｍ、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）を、西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートし、一次抗体に複合体化した。二次抗体を１倍のＴＢＳ中、５％ＢＳＡで、１：１０００〜１：５０００で希釈し、室温で３時間インキュベートした。
【１０３３】
インキュベーション時間の終わりに、１倍のＴＢＳ／０．１％のＴｗｅｅｎで穏やかに撹拌しながら、膜を５分ずつ３回洗浄した。指示通りに、膜を５ｍｌのＰｉｅｒｃｅ  ＷｅｓｔＰｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ
Ｆｉｓｈｅｒ、ロックフォード、イリノイ州）で展開した。
【１０３４】
図３Ａおよび図３Ｂに示すように、ウェスタンブロットは、各化学的性質について評価された２つの試料それぞれについて、６０ｋｄの予想されるサイズの周りにタンパク質を検出した。
【１０３５】
実施例２８．  Ｓｉａｈ  Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼ１タンパク質の検出：ウエスタンブロット法
ＣＤ１マウス（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、サウスイーストン、マサチューセッツ州）に、ｉｐｏｌｅｘｅｄ  ｓｉａｈＥ３ユビキチンタンパク質リガーゼ１（ＳＩＡＨ１）修飾ｍＲＮＡを静脈内投与した（配列番号６６１８に示されるｍＲＮＡ配列（表２９）、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１）、当該修飾ｍＲＮＡは、５−メチルシチジンとプソイドウリジンで完全修飾され（５ｍＣ／ｐＵ）、５メチルシチジンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾され（５ｍＣ／ｐＵ）、２−チオウリジンで修飾された２５％のウリジンおよび５−メチルシチジンで修飾された２５％のシチジン（ｓ２Ｕおよび５ｍＣ）、プソイドウリジンで完全修飾され（ｐＵ）、または１−メチルプソイドウリジンで完全修飾された（１ｍｐＵ）。マウスに、１００μｌの滅菌基礎ＤＭＥＭ培地（添加剤なし、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、グランドアイランド、ニューヨーク州）中、２μｌのリポフェクタミン２０００（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、グランドアイランド、ニューヨーク州）と複合された２μｇのｍＲＮＡの用量を投与した。
【１０３６】
６時間後、動物を屠殺し、血清および脾臓を収集する。脾臓を６ウェルプレートに移し、１ｍｌのＰＢＳの存在下で、氷に維持した。１つの脾臓をメスで数回切り分け、ＰＢＳが細胞の放出によって濁るまで、脾細胞をゴム細胞スクレーパーで絞り出した。
【１０３７】
線維状成分を残して、細胞を１２ウェル細胞培養プレートに位置する１００μｍ細胞ストレーナー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、サンノゼ、ＣＡ）に移した。重力により細胞を細胞ストレーナーに通し、１２ウェル培養皿の下に収集した。１ｍｌのＰＢＳをエッペンドルフチューブに自由に浮遊している脾細胞と共に移動させ、２０００ｒｐｍで５分間遠心した。ＰＢＳを捨て、細胞ペレットを５００μｌの新鮮なＰＢＳと合わせた。脾細胞を、２０００ｒｐｍで５分間の短時間ボルテックスすることにより再懸濁した。ＰＢＳを捨て、１ｍｌのＢＤ  Ｐｈａｒｍｌｙｓｅを細胞ペレットに添加した。脾細胞を短時間のボルテックスによって再懸濁した。細胞を、室温で３分間インキュベートし、次に５分間、２００ｒｐｍで遠心した。細胞を５００μｌのＰＢＳで２回洗浄し、上記のように遠心した。細胞を５００μｌのＰＢＳで２回洗浄し、上記のように再懸濁した。
【１０３８】
２５０μｌの脾臓細胞を１倍のＰｈａｒｍｌｙｓｅ緩衝液と合わせ、短時間ボルテックスあるいはピペットで再懸濁し、２０００ｒｐｍで２分間遠心した。
【１０３９】
１本のチューブ中、哺乳動物細胞（ＢｏｓｔｏｎＢｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、アッシュランド、マサチューセッツ州）のためのプロテアーゼ阻害剤カクテルで、５００μｌのＲＩＰＡ緩衝液中に細胞ペレットを再懸濁し、溶解物を凍結するか、すぐにＢＣＡアッセイを続行する。２番目のチューブ中、２５０μｌのＦＡＣＳ染色キット固定液（４％のホルムアルデヒド、Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、ミネソタ州）を加え、次に室温で１０分間インキュベートする。細胞を５００μｌのＰＢＳで２回洗浄し、上記のように遠心した。細胞ペレットを５００  ＰＢＳに再懸濁し、４℃で保存した
【１０４０】
タンパク質溶解物を、１．５ｍｍのすぐに使用できるビス−トリス  ゲルを有するＮｕＰＡＧＥ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥシステム（チャンバーと電源）に、助剤としてのＭＯＰＳ緩衝液と共に４〜１２％のアクリルアミド勾配に充填した（全てＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、グランドアイランド、ニューヨーク州）。各溶解物の試料を、最終容量を４０μｌに調製した。当該試料は、可変体積の２５μｇのタンパク質溶解物、体積２６μｌを作製するためのＲＩＰＡ緩衝液、４μｌの１０倍還元剤および１０μｌの４倍のＳＤＳローディング緩衝液（両方ともＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、グランドアイランド、ニューヨーク州）を含有した。試料を５分間９５℃で加熱し、ゲルに充填した。メーカーによって、２００Ｖ、１２０ｍＡおよび最大２５Ｗの標準設定を選択した。実行時間は６０分であったが、色素が移動しゲルの下端に到達する時間を超えることはなかった。
【１０４１】
実行を終了した後、プラスチックケースを割り、容器に入っていたゲルは、すぐに使用できるニトロセルロース膜キットおよび電源（ｉＢＬＯＴ、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、グランドアイランド、ニューヨーク州）に移動した。デフォルト設定を使用して、タンパク質溶解物を、高アンペアの電力によって、ゲルから膜に移した。
【１０４２】
移動後、膜を１５分間、１倍のＴＢＳ中、５％のＢＳＡ中でインキュベートし、次にさらに１５分間、１倍のＴＢＳ＋０．１％のＴｗｅｅｎ中、５％のＢＳＡ中でインキュベートした。ＳＩＡＨ１タンパク質に対する一次抗体（ＳＩＡＨ１ウサギポリクローナル抗体、Ａｂｃａｍ、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）を、室温で３時間、１：５００〜１：２０００の希釈の１倍のＴＢＳ溶液中、３ｍｌの５％ＢＳＡに適用し、オービタルシェーカーで穏やかに撹拌した。膜を、１倍のＴＢＳ／０．１％のＴｗｅｅｎで、穏やかに撹拌しながら、５分ずつ３回洗浄する。二次抗体（ヤギ抗ウサギＨＲＰコンジュゲート、Ａｂｃａｍ、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）を、西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートし、一次抗体に複合体化した。二次抗体を１倍のＴＢＳ中、５％ＢＳＡで、１：１０００〜１：５０００で希釈し、室温で３時間インキュベートした。
【１０４３】
インキュベーション時間の終わりに、膜を、１倍のＴＢＳ／０．１％のＴｗｅｅｎで穏やかに撹拌しながら、５分ずつ３回洗浄した。指示通りに、膜を５ｍｌのＰｉｅｒｃｅ  ＷｅｓｔＰｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、ロックフォード、イリノイ州）で展開した。
【１０４４】
図４Ａおよび図４Ｂに示すように、ウェスタンブロットは、各化学的性質について評価された２つの試料それぞれについて、３１ｋｄの予想されるサイズの周りにタンパク質を検出した。
【１０４５】
実施例２９．  リバースカスパーゼ３タンパク質の検出：ウエスタンブロット法
ＣＤ１マウス（ハーランラボラトリーズ、サウスイーストン、マサチューセッツ州）に、ｌｉｐｏｌｅｘ化構成的活性型（Ｃ．Ａ．）カスパーゼ３（リバースカスパーゼ３またはＲｅｖ−カスパーゼ３としても知られる）修飾ｍＲＮＡ（配列番号６６１９に示されるｍＲＮＡ）を静脈投与し、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１）は５−メチルシチジンとプソイドウリジンで完全修飾され（５ｍＣ／ｐＵ）、５メチルシチジンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾され（５ｍＣ／ｐＵ）、２−チオウリジンで修飾された２５％のウリジンおよび５−メチルシチジンで修飾された２５％のシチジン（ｓ２Ｕおよび５ｍＣ）、プソイドウリジンで完全修飾され（ｐＵ）、または１−メチルプソイドウリジンで完全修飾された（１ｍｐＵ）。マウスに、１００μｌの滅菌基礎ＤＭＥＭ培地（添加剤なし、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、グランドアイランド、ニューヨーク州）中、２μｌのリポフェクタミン２０００（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、グランドアイランド、ニューヨーク州）と複合された２μｇのｍＲＮＡの用量を投与した。
【１０４６】
６時間後、動物を屠殺し、血清および脾臓を収集する。脾臓を６ウェルプレートに移し、１ｍｌのＰＢＳの存在下で、氷に維持した。１つの脾臓をメスで数回切り分け、ＰＢＳが細胞の放出によって濁るまで、脾細胞をゴム細胞スクレーパーで絞り出した。
【１０４７】
線維状成分を残して、細胞を１２ウェル細胞培養プレートに位置する１００μｍ細胞ストレーナー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、サンノゼ、カリフォルニア州）に移した。重力により細胞を細胞ストレーナーに通し、１２ウェル培養皿の下に収集した。１ｍｌのＰＢＳをエッペンドルフチューブに自由に浮遊している脾細胞と共に移動させ、２０００ｒｐｍで５分間遠心した。ＰＢＳを捨て、細胞ペレットを５００μｌの新鮮なＰＢＳと合わせた。脾細胞を、２０００ｒｐｍで５分間の短時間ボルテックスすることにより再懸濁した。ＰＢＳを捨て、１ｍｌのＢＤ  Ｐｈａｒｍｌｙｓｅを細胞ペレットに添加した。脾細胞を短時間のボルテックスによって再懸濁した。細胞を、室温で３分間インキュベートし、次に５分間、２００ｒｐｍで遠心した。細胞を５００μｌのＰＢＳで２回洗浄し、上記のように遠心した。細胞を５００μｌのＰＢＳで再懸濁し、上記のように遠心した。
【１０４８】
２５０μｌの脾臓細胞を１倍のＰｈａｒｍｌｙｓｅ緩衝液と合わせ、短時間ボルテックスあるいはピペットで再懸濁し、２０００ｒｐｍで２分間遠心した。
【１０４９】
１本のチューブ中、哺乳動物細胞（ＢｏｓｔｏｎＢｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、アッシュランド、マサチューセッツ州）のためのプロテアーゼ阻害剤カクテルで、５００μｌのＲＩＰＡ緩衝液中に細胞ペレットを再懸濁し、溶解物を凍結するか、すぐにＢＣＡアッセイを続行する。２番目のチューブ中、２５０μｌのＦＡＣＳ染色キット固定液（４％のホルムアルデヒド、Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、ミネソタ州）を加え、次に室温で１０分間インキュベートする。細胞を５００μｌのＰＢＳで２回洗浄し、上記のように遠心した。細胞ペレットを５００  ＰＢＳに再懸濁し、４℃で保存した。
【１０５０】
タンパク質溶解物を、１．５ｍｍのすぐに使用できるビス−トリス  ゲルを有するＮｕＰＡＧＥ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥシステム（チャンバーと電源）に、助剤としてのＭＯＰＳ緩衝液と共に４〜１２％のアクリルアミド勾配に充填した（全てＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、グランドアイランド、ニューヨーク州）。各溶解物の試料を、最終体積を４０μｌに調製した。当該試料は、可変体積の２５μｇのタンパク質溶解物、体積２６μｌを作製するためのＲＩＰＡ緩衝液、４μｌの１０倍還元剤および１０μｌの４倍のＳＤＳローディング緩衝液（両方ともＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、グランドアイランド、ニューヨーク州）を含有した。試料を５分間９５℃で加熱し、ゲルに充填した。メーカーによって、２００Ｖ、１２０ｍＡおよび最大２５Ｗの標準設定を選択した。実行時間は６０分であったが、色素が移動しゲルの下端に到達する時間を超えることはなかった。
【１０５１】
実行を終了した後、プラスチックケースを割り、容器に入っていたゲルは、すぐに使用できるニトロセルロース膜キットおよび電源（ｉＢＬＯＴ、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、グランドアイランド、ニューヨーク州）に移動した。デフォルト設定を使用して、タンパク質溶解物を、高アンペアの電力によって、ゲルから膜に移した。
【１０５２】
移動後、膜を１５分間、１倍のＴＢＳ中、５％のＢＳＡ中でインキュベートし、次にさらに１５分間、１倍のＴＢＳ＋０．１％のＴｗｅｅｎ中、５％のＢＳＡ中でインキュベートした。標的タンパク質に対する一次抗体（カスパーゼ３ウサギポリクローナル抗体、Ａｂｃａｍ、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）を、室温で３時間、１：５００〜１：２０００の希釈の１倍のＴＢＳ溶液中、３ｍｌの５％ＢＳＡに適用し、オービタルシェーカーで穏やかに撹拌した。膜を、１倍のＴＢＳ／０．１％のＴｗｅｅｎで、穏やかに撹拌しながら、５分ずつ３回洗浄する。二次抗体（ヤギ抗ウサギＨＲＰコンジュゲート、Ａｂｃａｍ、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）を、西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートし、一次抗体に複合体化させた。二次抗体を１倍のＴＢＳ中、５％ＢＳＡで、１：１０００〜１：５０００で希釈し、室温で３時間インキュベートした。
【１０５３】
インキュベーション時間の終わりに、膜を、１倍のＴＢＳ／０．１％のＴｗｅｅｎで穏やかに撹拌しながら、５分ずつ３回洗浄した。指示通りに５ｍｌのピアースＷｅｓｔＰｉｃｏ化学発光Ｓｕｂｔｒａｔｅ（サーモフィッシャー、ロックフォード、ＩＬ）で膜を展開した。
【１０５４】
図５Ａおよび図５Ｂに示すように、ウェスタンブロットは、各化学的性質について評価された２つの試料それぞれについて、３２ｋｄの予想されるサイズの周りにタンパク質を検出した。
【１０５５】
実施例３０．  グラニュライシンタンパク質の検出：ウエスタンブロット法
ＣＤ１マウス（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、サウスイーストン、マサチューセッツ州）に、ｌｉｐｏｌｅｘ化グラニュライシンｍＲＮＡ（配列番号６６２０（表２９）に示されるｍＲＮＡ、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１）を静脈内投与し、当該ｍＲＮＡ配列は、５−メチルシチジンとプソイドウリジンで完全修飾され（５ｍＣ／ｐＵ）、５メチルシチジンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾され（５ｍＣ／１ｍｐＵ）、２−チオウリジンで修飾された２５％のウリジンおよび５−メチルシチジンで修飾された２５％のシチジン（ｓ２Ｕおよび５ｍＣ）、プソイドウリジンで完全修飾され（ｐＵ）、または１−メチルプソイドウリジンで完全修飾された（１ｍｐＵ）。マウスに、１００μｌの滅菌基礎ＤＭＥＭ培地（添加剤なし、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、グランドアイランド、ニューヨーク州）中、２μｌのリポフェクタミン２０００（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、グランドアイランド、ニューヨーク州）と複合された２μｇのｍＲＮＡの用量を投与した。
【１０５６】
６時間後、動物を屠殺し、血清および脾臓を収集する。脾臓を６ウェルプレートに移し、１ｍｌのＰＢＳの存在下で、氷に維持した。１つの脾臓をメスで数回切り分け、ＰＢＳが細胞の放出によって濁るまで、脾細胞をゴム細胞スクレーパーで絞り出した。
【１０５７】
線維状成分を残して、細胞を１２ウェル細胞培養プレートに位置する１００μｍ細胞ストレーナー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、サンノゼ、カリフォルニア州）に移した。重力により細胞を細胞ストレーナーに通し、１２ウェル培養皿に下に収集した。１ｍｌのＰＢＳをエッペンドルフチューブに自由に浮遊している脾細胞と共に移動させ、２０００ｒｐｍで５分間遠心した。ＰＢＳを捨て、細胞ペレットを５００μｌの新鮮なＰＢＳと合わせた。脾細胞を、２０００ｒｐｍで５分間の短時間ボルテックスすることにより再懸濁した。ＰＢＳを捨て、１ｍｌのＢＤ  Ｐｈａｒｍｌｙｓｅを細胞ペレットに添加した。脾細胞を短時間のボルテックスによって再懸濁した。細胞を、室温で３分間インキュベートし、次に５分間、２００ｒｐｍで遠心した。細胞を５００μｌのＰＢＳで２回洗浄し、上記のように遠心した。細胞を５００μｌのＰＢＳで再懸濁し、上記のように遠心した。
【１０５８】
２５０μｌの脾臓細胞を１倍のＰｈａｒｍｌｙｓｅ緩衝液と合わせ、短時間ボルテックスあるいはピペットで再懸濁し、２０００ｒｐｍで２分間遠心した。
【１０５９】
１本のチューブ中、哺乳動物細胞（ＢｏｓｔｏｎＢｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、アッシュランド、マサチューセッツ州）のためのプロテアーゼ阻害剤カクテルで、５００μｌのＲＩＰＡ緩衝液中に細胞ペレットを再懸濁し、溶解物を凍結するか、すぐにＢＣＡアッセイを続行する。２番目のチューブ中、２５０μｌのＦＡＣＳ染色キット固定液（４％のホルムアルデヒド、Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、ミネソタ州）を加え、次に室温で１０分間インキュベートする。細胞を５００μｌのＰＢＳで２回洗浄し、上記のように遠心した。細胞ペレットを５００  ＰＢＳに再懸濁し、４℃で保存した。
【１０６０】
タンパク質溶解物を、１．５ｍｍのすぐに使用できるビス−トリス  ゲルを有するＮｕＰａｇｅ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥシステム（チャンバーと電源）に、助剤としてのＭＯＰＳ緩衝液と共に４〜１２％のアクリルアミド勾配に充填した全てＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、グランドアイランド、ニューヨーク州）。各溶解物の試料を、最終体積を４０μｌに調製した。当該試料は、可変体積の２５μｇのタンパク質溶解物、体積２６μｌを作製するためのＲＩＰＡ緩衝液、４μｌの１０倍還元剤および１０μｌの４倍のＳＤＳローディング緩衝液（両方ともＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、グランドアイランド、ニューヨーク州）を含有した。試料を５分間９５℃で加熱し、ゲルに充填した。メーカーによって、２００Ｖ、１２０ｍＡおよび最大２５Ｗの標準設定を選択した。実行時間は６０分であったが、色素が移動しゲルの下端に到達する時間を超えることはなかった。
【１０６１】
実行を終了した後、プラスチックケースを割り、容器に入っていたゲルは、すぐに使用できるニトロセルロース膜キットおよび電源（ｉＢＬＯＴ、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、グランドアイランド、ニューヨーク州）に移動した。デフォルト設定を使用して、タンパク質溶解物を、高アンペアの電力によって、ゲルから膜に移した。
【１０６２】
移動後、膜を１５分間、１倍のＴＢＳ中、５％のＢＳＡ中でインキュベートし、次にさらに１５分間、１倍のＴＢＳ＋０．１％のＴｗｅｅｎ中、５％のＢＳＡ中でインキュベートした。グラニュライシンタンパク質に対する一次抗体（グラニュライシンマウスモノクロナール抗体、Ａｂｃａｍ、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）を、室温で３時間、１：５００〜１：２０００の希釈の１倍のＴＢＳ溶液中、３ｍｌの５％ＢＳＡに適用し、オービタルシェーカーで穏やかに撹拌した。膜を、１倍のＴＢＳ／０．１％のＴｗｅｅｎで、穏やかに撹拌しながら、５分ずつ３回洗浄する。二次抗体（ロバ抗マウスＨＲＰコンジュゲート，Ａｂｃａｍ社、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）を、西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートし、一次抗体の抗体に結合した。二次抗体を１×ＴＢＳ中、５％ＢＳＡで、１：１０００〜１：５０００で希釈し、室温で３時間インキュベートした。
【１０６３】
インキュベーション時間の終わりに、膜を、１倍のＴＢＳ／０．１％のＴｗｅｅｎで穏やかに撹拌しながら、５分ずつ３回洗浄した。指示通りに膜を５ｍｌのピアースＷｅｓｔＰｉｃｏ化学発光Ｓｕｂｔｒａｔｅ（サーモフィッシャー、ロックフォード、ＩＬ）で展開した。
【１０６４】
図６Ａおよび図６Ｂに示すように、ウェスタンブロットは、各化学的性質について評価された２つの試料それぞれについて、１６ｋｄの予想されるサイズの周りにタンパク質を検出した。
【１０６５】
実施例３１．  ペプチドの識別の確認
ペプチドの識別を確認するために，定量的ＬＣ−多重反応モニタリング（ＭＲＭ）を用いて質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）と並行して、液体クロマトグラフィー−質量分析法を用いてタンパク質を評価することができる。本明細書に記載の任意のタンパク質標的の特定は、定量的ＬＣ−多重反応モニタリング（ＭＲＭ）アッセイ（Ｂｉｏｇｎｏｓｙｓ  ＡＧ、スイス）を用いて質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）と並行して、液体クロマトグラフィー−質量分析法を用いて評価することができる。修飾されたｍＲＮＡから発現されたタンパク質を含有するＨｅＬａ細胞溶解物は、細胞溶解物中のペプチドの識別を確認するために定量的ＬＣ−ＭＲＭアッセイ（Ｂｉｏｇｎｏｓｙｓ、スイス）を有するＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用して評価される。特定されたペプチド断片は、当該技術分野で周知および／または記載された方法を用いてアイソフォームを含む、既知のタンパク質と比較される。
【１０６６】
Ａ．  試料の準備
溶解緩衝液中の各試料のタンパク質は、５ｍＭのトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を用いて３７℃で１時間インキュベートすることによって還元する。アルキル化は、室温で、暗所で３０分間、１０ｍＭのヨードアセトアミドを用いて行われる。タンパク質は、プロテアーゼでトリプシン（シーケンスグレード、ＰｒｏｍｅｇａＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、マディソン、ウィスコンシン州）を用いてペプチドに消化され、タンパク質比は１：５０である。消化は、３７℃（合計消化時間は１２時間である）で一晩行われる。ペプチドは、製造業者の指示に従ってＣ１８スピンカラム（Ｔｈｅ  Ｎｅｓｔ  Ｇｒｏｕｐ、サウスボロ、マサチューセッツ州）を使用して質量分析のためにクリーンアップされる。ペプチドを、完全に乾燥させ、ＬＣ溶媒Ａ（１％アセトニトリル、０．１％ギ酸（ＦＡ））に再懸濁する。全ての溶媒は、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ（登録商標）（セントルイス、ミズーリ州）からのＨＰＬＣグレードであり、全ての化学物質は、特に明記しない限り、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ（登録商標）（セントルイス、ミズーリ州）から得られる。
【１０６７】
Ｂ．  ＬＣ−ＭＳ／ＭＳおよびＬＣ−ＭＲＭ
ペプチドが、すべての質量分析について、Ｐｒｏｘｅｏｎ  Ｅａｓｙ  ｎＬＣナノ液体クロマトグラフィーシステム上で、充填されたＣ１８カラムに注射される（Ｍａｇｉｃ  ＡＱ、３μｍの粒子サイズ、２００オングストロームの細孔サイズ、Ｍｉｃｈｒｏｍ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｉｎｃ（オーバーン、カリフォルニア州）、１１ｃｍのカラムの長さ、７５μｍの内径、Ｎｅｗ  Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ（マサチューセッツ州））。ＬＣ溶媒は、Ａ：０．１％のＦＡを含む水中の１％アセトニトリル、Ｂ：０．１％ＦＡを有するアセトニトリル中の３％の水。ショットガン分析のためのＬＣ勾配は、１２０分で５〜３５％の溶媒Ｂ、次に２分で３５〜１００％の溶媒Ｂ、８分間で１００％溶媒Ｂである（総勾配の長さは１３０分）。ペプチドの検出のために実行されるＬＣ−ＭＳ／ＭＳショットガンは、標準的なナノエレクトロスプレー源を装備したＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（ビレリカ、マサチューセッツ州）Ｑ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ質量分析計で実施される。ＬＣ−ＭＲＭのためのＬＣ勾配は、３０分で５〜３５％の溶媒Ｂ、次に２分で３５〜１００％の溶媒Ｂ、８分間で１００％溶媒Ｂ（総勾配の長さは４０分）である。Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（ビレリカ、マサチューセッツ州）ＴＳＱ  Ｖａｎｔａｇｅのトリプル四重極質量分析計は、標準的なナノエレクトロスプレー源を装備している。再校正のため予定外のＭＲＭモードでは、遷移ごとに２０ミリ秒の滞留時間で運転される。試料間のペプチドの相対的定量のためにＴＳＱ  Ｖａｎｔａｇｅを４分の取得ウィンドウ長で、スケジュールＭＲＭモードで動作させる。ＬＣ溶離液は、１．９ｋＶでエレクトロスプレーされ、ＭＲＭ分析は、０．７ＤａのＱ１ピーク幅を使用して実行される。衝突エネルギーは、ベンダーの仕様に従って線形回帰によってＴＳＱ  Ｖａｎｔａｇｅについて計算する。
【１０６８】
Ｃ．  アッセイのデザイン、データ処理と解析
ＬＣ−ＭＲＭアッセイの生成のために、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析からの１２の最も強いフラグメントイオンを、スケジュールＬＣ−ＭＲＭモードで測定し、データはＭＱＵＥＳＴ（登録商標）（Ｃｌｕｅｔｅｃ、カールスルーエ、ドイツ）、ｍＰｒｏｐｈｅｔのスコアリング部分を使用して処理した（Ｒｅｉｔｅｒら、ｍＰｒｏｐｈｅｔ：Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｄａｔａ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  ＳＲＭ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１１（８），４３０−４３５；内容は参照により本明細書に取り込まれる）。アッセイは手動で検証され、正確なフラグメント強度が決定され、ｉＲＴ（ｉｎｄｅｘｅｄ  ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｔｉｍｅｓ）がＢｉｏｇｎｏｓｙｓのｉＲＴペプチドに対して割り当てられる（Ｅｓｃｈｅｒら．Ｕｓｉｎｇ  ｉＲＴ，ａ  ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ  ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ  ｆｏｒ  ｍｏｒｅ  ｔａｒｇｅｔｅｄ
ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２０１２（１２），１１１１−１１２１、内容は参照により本明細書に取り込まれる）。試料の系列に渡るペプチドの相対的定量化のために、各アッセイの８つの最も強い遷移を試料の系列に渡って測定する。データ分析はＳｐｅｃｔｒｏＤｉｖｅ（商標）を用いて行う（Ｂｉｏｇｎｏｓｙｓ、Ｓｃｈｌｉｅｒｅｎ、スイス）。総ピーク面積を、選択されたペプチドについて比較し、０．０５の偽発見率を適用する。０．０５以下のＱ値を有するペプチドを排除し、それぞれの試料中に検出されないと考えられている。
【１０６９】
実施例３２．  確認および化学修飾ｍＲＮＡからのペプチド識別の確認
ｓｉａｈ  Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼ１（ＳＩＡＨ１）修飾ｍＲＮＡから製造されるタンパク質含む細胞溶解物（配列番号６６１８（表２９）によって示されるｍＲＮＡ、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１）、ＭＹＣ阻害剤Ｄ（ヒトｃ−ｍｙｃを構成する固有のドミナントネガティブな９０アミノ酸タンパク質）修飾ｍＲＮＡ（配列番号６６２１（表２９）に示されるｍＲＮＡ、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１）、当該修飾ｍＲＮＡは、５−メチルシチジンおよびプソイドウリジン（５ｍＣおよびｐＵ）で完全修飾され、５−メチルシチジンと１−メチルプソイドウリジン（５ｍＣおよび１ｍｐＵ）で完全修飾され、２５％のウリジンの場合は２−チオウリジンで修飾され、２５％のシチジンの場合は５−メチルシチジンで修飾され（ｓ２Ｕおよび５ｍＣ）、プソイドウリジン（ｐＵ）で完全修飾され、または１−メチルプソイドウリジン（１ｍｐＵ）で完全修飾され、実施例３１に記載されるように、手定量的ＬＣ−ＭＲＭのＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用して評価する。評価されたタンパク質について特定されたペプチド断片を、表３０に示す。
表３０．タンパク質およびペプチド断片配列
【表００３０】
2018183181.tif 000240
【１０７０】
実施例３３．  確認および１−メチルプソイドウリジン修飾ｍＲＮＡからのペプチド識別の確認
グラニュライシンｍＲＮＡから産生されたタンパク質を含有する細胞溶解物（表２９に示すｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１）は１−メチルプソイドウリジン（１ｍｐＵ）で完全修飾され、実施例３１に記載したように定量的ＬＣ−ＭＲＭのＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて評価した。評価されたタンパク質について同定されたペプチド断片を、表３１に示す。表３１では、「Ｕｎｉｐｒｏｔ  ＩＤ」は、ペプチド断片配列が、データベース内のすべてのレビュータンパク質に対してブラストしたときに、ＵｎｉＰｒｏｔのデータベースからのタンパク質識別子を意味する。
表３１．タンパク質およびペプチド断片配列
【表００３１】
2018183181.tif 000241
【１０７１】
実施例３４．  癌の治療における信号センサポリヌクレオチド（ＨＣＣ）：ドミナントネガティブＳＴＡＴ３およびＡｋｔ  ｍＲＮＡを用いた癌細胞のトランスクリプトームの攪乱
実施例１３で概説した動物モデルを用いて、動物を、ドミナントネガティブＳＴＡＴ３分子またはドミナントネガティブＡｋｔ分子をコードするシグナルセンサーポリヌクレオチドで処置し、その発現によってＰＩ−３キナーゼ誘導発癌性形質転換が妨げられることが示され、神経膠芽腫細胞（Ｖｏｇｔ  ａｎｄ  Ｈａｒｔ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖ，２０１１  １：４８１−４８６；参照によりその全体が本明細書に含まれる）に含まれる。動物に、ドミナントネガティブＳＴＡＴ３  ｍＲＮＡをコードするｍＲＮＡ対ドミナントネガティブ  Ａｋｔ  ｍＲＮＡ対負の対照ｍＲＮＡ（複数の終止コドンを含む同ｍＲＮＡの非翻訳版）対送達および製剤の適切な経路を使用したビヒクルを注射する。次に、動物の遺伝子発現、腫瘍状態、または癌表現型または遺伝子型に関連する特徴のいずれかを評価する。癌のためのドミナントネガティブアプローチの他の例は概説されており、同様に修飾ｍＲＮＡと使用することができる（Ｍｏｓｓ  ａｎｄ  Ｌｅｍｏｉｎｅ  Ｃｈａｐｔｅｒ  １５  ＲＮＡ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｄｏｍｉｎａｎｔ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｉｎ  Ｖｉｒａｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【１０７２】
実施例３５．  癌の治療におけるシグナルセンサーポリヌクレオチド（ＨＣＣ）：ドミナントネガティブｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡを用いた癌細胞のトランスクリプトームの攪乱
実施例１３で概説した動物モデルを用いて、ドミナントネガティブｈＴＥＲＴをコードするシグナルセンサーポリヌクレオチドで動物を処理し、その発現が、テロメラーゼ活性を妨害し、癌細胞のアポトーシスを引き起こすことが示されている（Ａｇｒａｗａｌら２０１２  Ｒｅｃｅｎｔ  Ｐａｔ  Ａｎｒｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  ７：１０２−１１７，Ｓａｍｙら２０１２  Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  １１：２３８４−２３９３，Ｎｇｕｙｅｎら２００９  Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ．８：３２２７−３２３３、参照によりその全体が本明細書に含まれる）。特殊なＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼであるテロメラーゼは、真核生物の染色体の末端にテロメアを拡張し、安定化させる。テロメアの進行性の喪失は、限られた数の細胞分裂をもたらし、ヒト細胞の老化のメカニズムに関連づけられている。不定増殖によって特徴付けられる腫瘍細胞は、テロメラーゼによって維持される安定したテロメアの長さを有している。正常細胞と癌細胞のテロメラーゼ酵素の発現の差は、癌細胞を老化に導くテロメアを不安定にし、短くするために、テロメラーゼ酵素活性を阻害する腫瘍特異的抗テロメラーゼのアプローチの発展につながっている。そのような１つのアプローチは、ドミナントネガティブのｈＴＥＲＴを発現するように修飾ｍＲＮＡを使用することである。したがって、動物にドミナントネガティブｈＴＥＲＴのｍＲＮＡをコードしているｍＲＮＡ対負の対照ｍＲＮＡ（複数の終止コドンを含む同ｍＲＮＡの非翻訳版）対送達および製剤の適切な経路を用いたビヒクルを注射する。次に、動物の遺伝子発現、腫瘍状態、または癌表現型または遺伝子型に関連する特徴のいずれかを評価する。癌のためのドミナントネガティブアプローチの他の例は概説されており、同様に修飾ｍＲＮＡと使用することができる（Ｍｏｓｓ  ａｎｄ  Ｌｅｍｏｉｎｅ
Ｃｈａｐｔｅｒ  １５  ＲＮＡ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｄｏｍｉｎａｎｔ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｉｎ  Ｖｉｒａｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎら、ｅｄｓ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【１０７３】
実施例３６．  癌の治療におけるシグナルセンサーポリヌクレオチド（ＨＣＣ）：ドミナントネガティブサバイビンｍＲＮＡを用いた癌細胞のトランスクリプトームの攪乱
【１０７４】
実施例１３で概説した動物モデルを用いて、ドミナントネガティブサバイビン（Ｃ８４Ａ他）をコードするシグナルセンサーポリヌクレオチドで、動物を処置し、その発現が癌細胞のアポトーシスを引き起こすことが示されている（Ｃｈｅｕｎｇら２０１０ＣａｎｃｅｒＣｅｌｌ  Ｉｎｔ．  １０：３６、参照によりその全体が本明細書に含まれる）。サバイビンは、多くの異なる癌で広く発現されるアポトーシスの阻害剤（ＩＡＰ）ファミリーのメンバーである。サバイビンの過剰発現は、癌細胞の薬物耐性と関連し、化学療法および放射線療法後の患者の生存率を低下させる。サバイビンの機能に拮抗する薬剤は、多くの形態の癌の治療に期待される。そのようなアプローチの１つは、ドミナントネガティブサバイビンを（Ｃ８４Ａ変異は記載される例である）を発現するように修飾ｍＲＮＡを使用することである。したがって、動物に、ドミナントネガティブサバイビンｍＲＮＡをコードするｍＲＮＡ対負の対照ｍＲＮＡ（複数の終止コドンを含む同ｍＲＮＡの非翻訳版）対送達および製剤の適切な経路を用いたビヒクルを注射する。次に、動物の遺伝子発現、腫瘍状態、または癌表現型または遺伝子型に関連する特徴のいずれかを評価する。癌のためのドミナントネガティブアプローチの他の例は、概説されており、同様に修飾ｍＲＮＡと使用することができる（Ｍｏｓｓ  ａｎｄ  Ｌｅｍｏｉｎｅ  Ｃｈａｐｔｅｒ  １５
ＲＮＡ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｄｏｍｉｎａｎｔ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｉｎ  Ｖｉｒａｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎら，  ｅｄｓ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【１０７５】
実施例３７．  マイクロＲＮＡ結合部位を有する修飾された核酸の発現
ヒト胎児腎臓上皮細胞（ＨＥＫ２９３Ａ）、または単球由来樹状細胞（ＭＤＤＣ）またはＰＢＭＣ等の高発現のｍｉｒ−１４２／１４６を有する細胞または細胞株を示す抗体を、５００μｌの細胞培養培地（ＣｅｌｓｉｓのＩｎＶｉｔｒｏ  ＧＲＯ培地、シカゴ、イリノイ州）を、ウェル当たり２００，０００密度で播種する。Ｇ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（配列番号６５９５に示されるｍＲＮＡ、配列には示されていない少なくとも１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１）ｍｉＲ−１４２−５ｐの結合部位を有するＧ−ＣＳＦのｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦのｍｉＲ−１４２−５ｐ）（ｃＤＮＡ配列は配列番号６６２７に示され、ｍＲＮＡ配列は配列番号６６２８に示されている、配列中に示されていない少なくとも１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１）、ｍｉＲ−１４２−５ｐ結合部位から種配列を有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ  ｍｉＲ−１４２−５ｐ−ｓｅｅｄ）（ｃＤＮＡ配列は、配列番号６６２９に示されている、ｍＲＮＡ配列は、配列番号６６３０に示されている、配列には示されていない少なくとも１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１）種配列なしのｍｉＲ−１４２−５ｐ結合部位を有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ  ｍｉＲ−１４２−５ｐ−ｓｅｅｄｌｅｓｓ）（ｃＤＮＡ配列は配列番号６６３１で示される、ｍＲＮＡ配列は配列番号６６３２で示される、配列中に示されていない少なくとも１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１）ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位を有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ  ｍｉＲ−１４２−３ｐ）（ｃＤＮＡ配列は、配列番号６６３３に示されている、ｍＲＮＡ配列は、配列番号６６３４に示されている、配列には示されていない少なくとも１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１）、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位から種配列を有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ  ｍｉＲ−１４２−３ｐ−ｓｅｅｄ）（ｃＤＮＡ配列は配列番号６６３５で示される、ｍＲＮＡ配列は配列番号６６３６で示される、配列中に示されていない少なくとも１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１）、種配列なしのｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位を有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ  ｍｉＲ−１４２−３ｐ−ｓｅｅｄｌｅｓｓ）（ｃＤＮＡ配列は配列番号６６３７で示される、ｍＲＮＡ配列は配列番号６６３８で示される、配列中に示されていない少なくとも１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１）ｍｉＲ−１４６ａ結合部位を有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ  ｍｉＲ−１４６ａ）（ｃＤＮＡ配列は、配列番号６６３９に示されている、ｍＲＮＡ配列は配列番号６６４０に示されている、配列中に示されていない少なくとも１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１）ｍｉＲ−１４６ａ結合部位から種配列を有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ  ｍｉＲ−１４６ａ−ｓｅｅｄ）（ｃＤＮＡ配列は、配列番号６６４１に示されている、ｍＲＮＡ配列は配列番号６６４２に示されている、配列には示されていない少なくとも１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ��）種配列なしのｍｉＲ−１４６ａ結合部位を有するＧ−ＣＳＦ
ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ  ｍｉＲ−１４６ａ−ｓｅｅｄｌｅｓｓ）（ｃＤＮＡ配列は配列番号６６４３で示される、ｍＲＮＡ配列は配列番号６６４４に示されている、配列には示されていない少なくとも１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１）を、２４ウェルプレート中、ウェルあたり２５０ｎｇの濃度で試験する。ｍＲＮＡ配列を、本明細書に記載および／または当該技術分野で周知の様々な化学修飾で評価し、５−メチルシチジンおよびプソイドウリジンで完全修飾され、５−メチルシチジンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾され、プソイドウリジンで完全修飾され、１−メチルプソイドウリジンで完全修飾され、ウリジン残基の２５％は２−チオウリジンで修飾され、シチジン残基の２５％は５−メチルシチジンで修飾される。各試料中のＧ−ＣＳＦの発現をＥＬＩＳＡによって測定する。
【１０７６】
前述のｍｉＲ結合部位を有するＤＮＡおよびｍＲＮＡ  Ｇ−ＣＳＦ配列を表３２に示す。表では、各配列の開始コドンに下線が引いてある。
表３２．ｍｉＲ結合部位を有するＧ−ＣＳＦ構築物
【表００３２−１】
2018183181.tif 000242
【表００３２−２】
2018183181.tif 000243
【表００３２−３】
2018183181.tif 000244
【表００３２−４】
2018183181.tif 000245
【表００３２−５】
2018183181.tif 000246
【表００３２−６】
2018183181.tif 000247
【表００３２−７】
2018183181.tif 000248
【表００３２−８】
2018183181.tif 000249
【表００３２−９】
2018183181.tif 000250
【１０７７】
結合部位「種」配列はｍｉｒｃｏＲＮＡ結合を誘導するのに十分であるようであり、Ｇ−ＣＳＦの発現は、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−３ｐ−ｓｅｅｄ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ−ｓｅｅｄ、ｍｉＲ−１４６ａまたはｍｉＲ−１４６ａ−ｓｅｅｄを形質移入された細胞で下方制御されるはずである。一方、ｍｉＲ−１４２−３ｐ−ｓｅｅｄｌｅｓｓ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ−ｓｅｅｄｌｅｓｓ、ｍｉＲ−１４６ａ−ｓｅｅｄｌｅｓｓは、マイクロＲＮＡ結合部位のないＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡを形質移入された細胞と比較して、Ｇ−ＣＳＦの発現を変化させないはずである。
【１０７８】
実施例３８．  修飾された核酸媒介免疫刺激を抑制するためのＡＰＣ特異的マイクロＲＮＡ結合部位
マイクロＲＮＡの結合部位をｍＲＮＡ治療薬の３’ＵＴＲ  に使用し、選択的に免疫細胞のｍＲＮＡ治療薬を分解し、ｍＲＮＡ治療薬の送達によって引き起こされる望ましくない免疫原性反応を抑える。
【１０７９】
抗原提示細胞（ＡＰＣ）でシグナルセンサーポリヌクレオチドをより不安定にする一連の３’ＵＴＲ  ｍｉＲ部位を含むシグナルセンサーポリヌクレオチド、例えば、限定されないが、ｍｉｒ−１４２−５ｐ、ｍｉｒ−１４２−３ｐ、ｍｉｒ−１４６ａ−５ｐおよびｍｉｒ−１４６ａ−３ｐは、本発明の腫瘍関連ポリペプチドをコードする。シグナルセンサーポリヌクレオチドを不安定にする３’ＵＴＲのｍｉＲ結合部位の追加は、修飾ｍＲＮＡ媒介免疫刺激を抑えるであろう。
【１０８０】
ＡＰＣ特異的マイクロＲＮＡシグネチャー対当該シグネチャーを持たないものとのシグナルセンサーポリペプチドによって誘導されるサイトカイン発現（例えば、ＴＮＦ−α）の比較実験を、本明細書に記載および／または当技術分野で周知の方法によりｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施する。
【１０８１】
実施例３９．  ｍｉＲ結合部位を有するｍＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現
ヒト胎児腎臓上皮細胞（ＨＥＫ２９３Ａ）、高発現のｍｉｒ−１４６／１４２を有する提示細胞または細胞株、例えば、単球由来樹状細胞（ＭＤＤＣ）またはＰＢＭＣを、５００μｌの細胞培養培地中、ウェルあたり２００，０００密度で播種する（ＣｅｌｓｉｓのＩｎＶｉｔｒｏ  ＧＲＯ培地、シカゴ、イリノイ州）。実施例３７に記載したように、培養細胞を、マイクロＲＮＡシグネチャーのある場合とない場合とで、Ｇ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡを形質移入する。細胞は、５日間連続して形質移入される。形質移入複合体を、形質移入の各ラウンドから４時間後に除去する。
【１０８２】
培養上清を、分泌Ｇ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＤＣＳ５０）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）およびインターフェロンα（形質移入し、製造業者のプロトコルの後に毎日ＥＬＩＳＡによるＩＦＮ−α）についてアッセイする。形質移入の最初のラウンドから６時間および１８時間後、その後の隔日にＣＥＬＬ  ＴＩＴＥＲ  ＧＬＯ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ７５７０）を使用して生存率について、細胞を分析する。回収した細胞から同時に、全てのＲＮＡを単離し、製造業者のプロトコルに従ってＲＮＡＥＡＳＹマイクロキット（カタログ番号７４００４）を使用してＤＮＡＳＥ（登録商標）で処理する。１００ｎｇの総ＲＮＡを、製造業者のプロトコルに従って、大容量のｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４３６８８１４）を用いてｃＤＮＡ合成のために使用する。その後、製造業者のプロトコルに従ってＢｉｏｒａｄ  ＣＦＸ  ３８４機器でＳｙｂｒＧｒｅｅｎを用いた定量的リアルタイムＰＣＲによって先天的免疫応答遺伝子の発現について、ｃＤＮＡを分析する。
【１０８３】
実施例４０．  先天性免疫応答の試験のｉｎ  ｖｉｖｏ検出
シグナルセンサータンパク質発現およびｉｎ  ｖｉｖｏ免疫反応を試験するために、雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５）を実施例３７に記載したようにマイクロＲＮＡシグネチャーのある場合とない場合で、Ｇ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡを筋肉内に注射する。血液を投与から８時間後に回収する。Ｇ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−αのタンパク質レベルは、ＥＬＩＳＡによって決定される。
【１０８４】
サイトカイン産生の差は、血清中のマウスＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−αレベルによって測定するときに見られる。ｍｉＲ−１４２およびｍｉＲ−１４６ａは結合部位または結合部位種を有するＧ−ＣＳＦ修飾ｍＲＮＡの注射は、より低いレベルのｉｎ  ｖｉｖｏのサイトカイン応答を示す。
【１０８５】
実施例４１．  初代肝細胞におけるｍｉＲ−１２２の発現
ラットおよびヒト初代肝細胞の肝細胞特異的ｍｉＲ−１２２のレベルを測定した。Ｈｅｌａ細胞および初代ラットおよびヒト肝細胞を培養し、ＲＮＡを細胞溶解物から抽出した。ラットおよびヒト初代肝細胞のｍｉＲ−１２２レベルを、Ｈｅｌａ細胞のそれと比較した。ｍｉＲ−１２２レベルは、Ｈｅｌａ細胞に比べて、それぞれ初代ヒト肝細胞では約６倍増加し、初代ラット肝細胞では約１２倍増加した。
【１０８６】
実施例４２．  肝細胞におけるｍｉｒ−１２２結合部位を有する修飾された核酸の発現
初代ラットおよびヒト肝細胞およびＨｅｌａ細胞を、５００μｌの細胞培養培地中でウェル当たり２００，０００密度（ＣｅｌｓｉｓのＩｎＶｉｔｒｏ  ＧＲＯ培地、シカゴ、イリノイ州）に播種した。３’ＵＴＲにｍｉＲ−１２２結合部位を有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ  ｍｉＲ−１２２−１Ｘ）（配列番号６６００に示されるｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１）は５メチルシチジンおよびプソイドウリジン（５ｍＣ／ｐＵ）で完全修飾され、またはプソイドウリジン（ｐＵ）または削除された種子（Ｇ−ＣＳＦ種なし）を有する４つのｍｉＲ−１２２結合部位を有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡで完全修飾され（配列番号６６０１に示されるｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１）は、５−メチルシチジンとプソイドウリジン（５ＭＣ／ｐＵ）で完全修飾され、またはプソイドウリジン（ｐＵ）で完全修飾され、２４ウェルプレート中、ウェルあたり２５０ｎｇの濃度で試験した。形質移入から２４時間後に、Ｇ−ＣＳＦの発現をＥＬＩＳＡによって測定し、結果を表３３に示す。
表３３．Ｇ−ＣＳＦ  ｍｉｒ１２２発現
【表００３３】
2018183181.tif 000251
【１０８７】
実施例４３．  肝細胞のｍｉｒ−１２２結合部位を有する修飾された核酸の発現
翻訳の抑制および／または標的メッセンジャーＲＮＡの分解によるマイクロＲＮＡ制御遺伝子の発現。Ｇ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡを含むＭｉｒ−１２２結合部位を、肝細胞に翻訳による調節を行った。
【１０８８】
初代ラットおよびヒト肝細胞およびＨｅｌａ細胞を、５００μｌの細胞培養培地中でウェル当たり２００，０００密度（ＩｎＶｉｔｒｏ  ＧＲＯ  ｍｅｄｉｕｍ  ｆｒｏｍ  Ｃｅｌｓｉｓ、シカゴ、イリノイ州）に播種した。Ｇ−ＣＳＦのｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦα）（配列番号６６５９に示されるｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１）は５−メチルシチジンとプソイドウリジン（５ｍＣ／ｐＵ）３’ＵＴＲ（Ｇ−ＣＳＦ  ｍｉＲ−１２２−１Ｘ）のｍｉＲ−１２２結合部位を有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（配列番号６６００に示されるｍＲＮＡ、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１）は５メチルシチジンおよびプソイドウリジン（５ｍＣ／ｐＵ）で完全修飾され、または削除された種（Ｇ−ＣＳＦ種なし）を有する４つのｍｉＲ−１２２結合部位を有するＧ−ＣＳＦ
ｍＲＮＡで完全修飾され（配列番号６６０１に示されるｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１）は、５−メチルシチジンとプソイドウリジン（５ｍＣ／ｐＵ）で完全修飾され、またはプソイドウリジン（ｐＵ）で完全修飾され、２４ウェルプレート中、ウェルあたり２５０ｎｇの濃度で試験した。形質移入から２４時間後に、Ｇ−ＣＳＦの発現をＥＬＩＳＡによって測定した。Ｇ−ＣＳＦ薬剤（ｍＲＮＡ）レベルおよびタンパク質レベルを、表３４に示す。
表３４．Ｇ−ＣＳＦ薬剤およびタンパク質レベル
【表００３４】
2018183181.tif 000252
【１０８９】
実施例４４．微小生理系  
ポリヌクレオチド、一次構築物および／または本発明のｍｍＲＮＡを、緩衝液、脂質ナノ粒子およびＰＬＧＡ等の本明細書に記載される方法１つを使用して製剤化する。これらの製剤を、その後に投与するか、または国際公開番号ＷＯ２０１３０８６５０２号、ＷＯ２０１３０８６４８６号およびＷＯ２０１３０８６５０５号（その各々の内容は参照により全体が本明細書に組み込まれる）に記載のように臓器チップから作成された微小生理系と接触させる。
【１０９０】
実施例４５．  非翻訳領域の翻訳エンハンサー要素（ＴＥＥ）
シグナルセンサーポリヌクレオチドの５’および／または３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、一次構築物および／または本明細書に記載のｍｍＲＮＡは、少なくとも１つの翻訳エンハンサー要素（ＴＥＥ）を含むことができる。５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲに含むことができるそのようなＴＥＥとして、限定されないが、表３５に列挙したものが挙げられ、部分および／またはその断片を含む。ＴＥＥ配列は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または９９％以上の表３５に開示されたＴＥＥ配列を含むことができ、および／またはＴＥＥ配列は、５〜３０ヌクレオチド断片、５〜２５ヌクレオチド断片、５〜２０ヌクレオチド断片、５〜１５ヌクレオチド断片、５〜１０ヌクレオチド断片の表３５に開示されたＴＥＥ配列を含みことができる。
表３５．ＴＥＥ配列
【表００３５−１】
2018183181.tif 000253
【表００３５−２】
2018183181.tif 000254
【表００３５−３】
2018183181.tif 000255
【表００３５−４】
2018183181.tif 000256
【表００３５−５】
2018183181.tif 000257
【表００３５−６】
2018183181.tif 000258
【表００３５−７】
2018183181.tif 000259
【表００３５−８】
2018183181.tif 000260
【表００３５−９】
2018183181.tif 000261
【表００３５−１０】
2018183181.tif 000262
【表００３５−１１】
2018183181.tif 000263
【表００３５−１２】
2018183181.tif 000264
【表００３５−１３】
2018183181.tif 000265
【表００３５−１４】
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【表００３５−１５】
2018183181.tif 000267
【表００３５−１６】
2018183181.tif 000268
【表００３５−１７】
2018183181.tif 000269
【表００３５−１８】
2018183181.tif 000270
【表００３５−１９】
2018183181.tif 000271
【表００３５−２０】
2018183181.tif 000272
【表００３５−２１】
2018183181.tif 000273
【表００３５−２２】
2018183181.tif 000274
【表００３５−２３】
2018183181.tif 000275
【表００３５−２４】
2018183181.tif 000276
【表００３５−２５】
2018183181.tif 000277
【表００３５−２６】
2018183181.tif 000278
【表００３５−２７】
2018183181.tif 000279
【表００３５−２８】
2018183181.tif 000280
【表００３５−２９】
2018183181.tif 000281
【表００３５−３０】
2018183181.tif 000282
【表００３５−３１】
2018183181.tif 000283
【表００３５−３２】
2018183181.tif 000284
【表００３５−３３】
2018183181.tif 000285
【表００３５−３４】
2018183181.tif 000286
【表００３５−３５】
2018183181.tif 000287
【表００３５−３６】
2018183181.tif 000288
【表００３５−３７】
2018183181.tif 000289
【表００３５−３８】
2018183181.tif 000290
【表００３５−３９】
2018183181.tif 000291
【表００３５−４０】
2018183181.tif 000292
【表００３５−４１】
2018183181.tif 000293
【表００３５−４２】
2018183181.tif 000294
【表００３５−４３】
2018183181.tif 000295
【表００３５−４４】
2018183181.tif 000296
【表００３５−４５】
2018183181.tif 000297
【表００３５−４６】
2018183181.tif 000298
【表００３５−４７】
2018183181.tif 000299
【表００３５−４８】
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【表００３５−４９】
2018183181.tif 000301
【表００３５−５０】
2018183181.tif 000302
【表００３５−５１】
2018183181.tif 000303
【１０９１】
実施例４６．  ｍｉＲ−１２２で修飾された核酸のｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現
翻訳抑制および／または標的メッセンジャーＲＮＡの分解によるマイクロＲＮＡ遺伝子発現。ヒトまたはマウスのα−グロビン３’翻訳不可能領域（ＵＴＲ）でのＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡおよび第ＩＸ因子ｍＲＮＡの発現を、３’ＵＴＲのｍｉＲ−１２２配列を使用してヒト初代肝細胞において下方制御した。
【１０９２】
初代ヒト肝細胞を、５００μｌの細胞培養培地（ＣｅｌｓｉｓのＩｎＶｉｔｒｏ  ＧＲＯ培地、シカゴ、イリノイ州）に、ウェル当り３５００００の密度で播種した。
【１０９３】
ヒトα−グロビン３’ＵＴＲ（Ｇ−ＣＳＦ  Ｈｓ３’ＵＴＲ、配列番号７３２０に示されるｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１）またはマウスα−グロビン３’ＵＴＲ（Ｇ−ＣＳＦ  Ｍｍ３’ＵＴＲ、配列番号７３２１に示されるｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１）は、５−メチルシチジンおよび１−プソイドウリジンで完全修飾された。３’ＵＴＲにｍｉＲ−１２２配列を有するヒト３’ＵＴＲを含むＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ  Ｈｓ３’ＵＴＲ  ｍｉＲ−１２２、配列番号７３２２に示されるｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１）、または３’ＵＴＲ中のｍｉＲ−１２２種配列（Ｇ−ＣＳＦ  Ｈｓ３’ＵＴＲ  ｍｉＲ−１２２種、配列番号７３２３に示されるｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１）または３’ＵＴＲに種配列のないｍｉＲ−１２２配列（Ｇ−ＣＳＦ  Ｈｓ３’ＵＴＲ  ｍｉＲ−１２２種なし、配列番号７３２４に示されるｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１）は、５−メチルシチジンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾された。３’ＵＴＲにｍｉＲ−１２２配列を有するマウス３’ＵＴＲを含むＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ  Ｍｍ３’ＵＴＲ  ｍｉＲ−１２２、配列番号７３２５に示されるｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１）、または３’ＵＴＲ中のｍｉＲ−１２２種配列（Ｇ−ＣＳＦ  Ｍｍ３’ＵＴＲ  ｍｉＲ−１２２種、配列番号７３２６に示されるｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１）または３’ＵＴＲに種配列がないｍｉＲ−１２２配列（Ｇ−ＣＳＦ  Ｍｍ３’ＵＴＲ  ｍｉＲ−１２２種なし、配列番号７３２７に示されるｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１）は５−メチルシチジンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾された。
【１０９４】
ヒトα−グロビン３’ＵＴＲを有する第ＩＸ因子ｍＲＮＡ（Ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ  Ｈｓ３’ＵＴＲ、配列番号７３２８に示されるｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１）またはマウスα−グロビン３’ＵＴＲ（Ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ  Ｍｍ３’ＵＴＲ、配列番号７３２９に示されるｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１）は、５−メチルシチジンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾された。３’ＵＴＲにｍｉＲ−１２２配列を有するヒト３’ＵＴＲを含む第ＩＸ因子ｍＲＮＡ（Ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ  Ｈｓ３’ＵＴＲ  ｍｉＲ−１２２、配列番号７３３０に示されるｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１）、または３’ＵＴＲ中のｍｉＲ−１２２種配列（Ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ  Ｈｓ３’ＵＴＲ  ｍｉＲ−１２２種、配列番号７３３１に示されるｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１）または３’ＵＴＲに種配列がないｍｉＲ−１２２配列（Ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ  Ｈｓ３’ＵＴＲ  ｍｉＲ−１２２種なし、配列番号７３３２に示されるｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１）は、５−メチルシチジンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾された。３’ＵＴＲにｍｉＲ−１２２配列を有するマウス３’ＵＴＲを含む第ＩＸ因子ｍＲＮＡ（Ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ  Ｍｍ３’ＵＴＲ  ｍｉＲ−１２２、配列番号７３３３に示されるｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１）、または３’ＵＴＲ中のｍｉＲ−１２２種配列（Ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ  Ｍｍ３’ＵＴＲ  ｍｉＲ−１２２種、配列番号７３３４に示されるｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１）または３’ＵＴＲに種配列がないｍｉＲ−１２２配列（Ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ  Ｍｍ３’ＵＴＲ  ｍｉＲ−１２２種なし、配列番号７３３５に示されるｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１）は５−メチルシチジンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾された。
【１０９５】
Ｇ−ＣＳＦまたは第ＩＸ因子ｍＲＮＡ配列を、２４ウェルプレートにウェルあたり５００ｎｇの濃度で試験した。形質移入から２４、４８および７２時間後に、タンパク質の発現をＥＬＩＳＡで測定した。Ｇ−ＣＳＦのタンパク質レベルを表３６に示し、第ＩＸ因子のタンパク質レベルを表３７に示す。
表３６．Ｇ−ＣＳＦタンパク質発現
【表００３６】
2018183181.tif 000304
表３７．第ＩＸ因子タンパク質発現
【表００３７】
2018183181.tif 000305
【１０９６】
実施例４７．  ｍｉｒ−１４２またはｍｉＲ−１４６結合部位で修飾された核酸のｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現
ＨｅＬａおよびＲＡＷ２６４細胞をそれぞれ、１００μｌの細胞培養培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）ウェル当り１７０００および８００００の密度で播種した。
【１０９７】
Ｇ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ、配列番号６５９５に示されるｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１）は５−メチルシチジンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾された。
【１０９８】
３’ＵＴＲにｍｉＲ−１４２−３ｐ配列を有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ  ｍｉＲ−１４２−３ｐ、配列番号６６３４に示されるｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１）、または３’ＵＴＲ中のｍｉＲ−１４２−３ｐ種配列（Ｇ−ＣＳＦ  ｍｉＲ−１４２−３ｐ種、配列番号６６３６に示されるｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１）または３’ＵＴＲに種配列がないｍｉＲ−１４２−３ｐ配列（Ｇ−ＣＳＦ  ｍｉＲ−１４２−３ｐ種なし、配列番号６６３８に示されるｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１）は５−メチルシチジンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾された。
【１０９９】
３’ＵＴＲにｍｉＲ−１４２−５ｐ配列を有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ  ｍｉＲ−１４２−５ｐ、配列番号６６２８に示されるｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１）、または３’ＵＴＲ中のｍｉＲ−１４２−５ｐ種配列（Ｇ−ＣＳＦ  ｍｉＲ−１４２−５ｐ種、配列番号６６３０に示されるｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１）または３’ＵＴＲに種配列がないｍｉＲ−１４２−５ｐ配列（Ｇ−ＣＳＦ  ｍｉＲ−１４２−５ｐ種なし、配列番号６６３２に示されるｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１）は５−メチルシチジンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾された。
【１１００】
３’ＵＴＲにｍｉＲ−１４６ａ配列を有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ  ｍｉＲ−１４６ａ、配列番号６６４０に示されるｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１）、または３’ＵＴＲ中のｍｉＲ−１４６ａ種配列（Ｇ−ＣＳＦ  ｍｉＲ−１４６ａ種、配列番号６６４２に示されるｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１）もしくは３’ＵＴＲに種配列がないｍｉＲ−１４６ａ配列（Ｇ−ＣＳＦ
ｍｉＲ−１４６ａ種なし、配列番号６６４４に示されるｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１）は５−メチルシチジンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾された。
【１１０１】
Ｇ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ配列のそれぞれを、各細胞型について２４ウェルプレートにウェルあたり５００ｎｇの濃度で試験した。形質移入から２４時間後、タンパク質の発現をＥＬＩＳＡで測定し、タンパク質レベルを表３８に示す。３’ＵＴＲのｍｉＲ−１４２−３ｐ配列とのＧ−ＣＳＦ配列は、ＲＡＷ２６４のＧ−ＣＳＦ発現を下方制御したが、３’ＵＴＲのｍｉＲ−１４２−５ｐまたはｍｉＲ−１４６ａ配列とのＧ−ＣＳＦ配列はＧ−ＣＳＦ発現を下方制御しなかった。
表３８．Ｇ−ＣＳＦ発現
【表００３８】
2018183181.tif 000306
【１１０２】
実施例４８．  修正された核酸の発現へのコザック配列の影響
ＨｅＬａ細胞を１００μｌの細胞培養培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）にウェルあたり１７０００の密度で播種した。ＩＲＥＳ配列およびコザック配列を有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ  ＩＲＥＳ  Ｋｏｚａｋ、配列番号７３３６に示されるｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１）、ＩＲＥＳ配列を有するがコザック配列を有さないＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ  ＩＲＥＳ、配列番号７３３７に示されるｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１）、ＩＲＥＳもコザック配列も有さないＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（ＧＣＳＦ  ｎｏ  Ｋｏｚａｋ、配列番号７３３８に示されるｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１）、またはコザック配列を有するＧ−ＣＳＦ配列（Ｇ−ＣＳＦ  Ｋｏｚａｋ、配列番号７３３９に示されるｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１）は５−メチルシチジンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾され、２４ウェルプレートにウェルあたり７５ｎｇの濃度で試験を行った。形質移入から２４時間後に、Ｇ−ＣＳＦの発現をＥＬＩＳＡで測定し、結果を表３９に示す。
表３９．Ｇ−ＣＳＦ発現
【表００３９】
2018183181.tif 000307
【１１０３】
実施例４９．  ＭＡＬＡＴ１構築物
ヒトまたはマウスＭＡＬＡＴ１配列で、Ｇ−ＣＳＦまたはｍＣｈｅｒｒｙをコードしている修飾ｍＲＮＡおよび対応するｃＤＮＡ配列を以下の表４０に示す。表４０では、各配列の開始コドンに下線を引き、ＭＡＬＡＴ１配列を太字にしている。
表４０．ＭＡＬＡＴ１構築物
【表００４０−１】
2018183181.tif 000308
【表００４０−２】
2018183181.tif 000309
【表００４０−３】
2018183181.tif 000310
【表００４０−４】
2018183181.tif 000311
【表００４０−５】
2018183181.tif 000312
【１１０４】
これらの修飾されたｍＲＮＡ配列は、本明細書に記載の少なくとも一つの化学的修飾を含むことができる。Ｇ−ＣＳＦまたはｍＣｈｅｒｒｙ修飾ｍＲＮＡ配列を、本明細書に記載および／または当技術分野に周知の方法を用いて、形質移入および／または投与の前に製剤化することができる。
【１１０５】
Ｇ−ＣＳＦまたはｍＣｈｅｒｒｙをコードする修飾ｍＲＮＡ配列を、本明細書に開示の方法および／または当技術分野に周知の方法を使用して、様々な細胞型にｉｎ  ｖｉｔｒｏの形質移入することができ、例えば、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、ＰＢＭＣおよびＢＪ線維芽細胞および２０１３年６月２７日に提出された同時係属中の米国仮出願第６１／８３９９０３号（内容は参照により本明細書に取り込まれる）の表２５に記載されているものが挙げられる。次に、細胞を本明細書に開示、および／または当技術分野周知の方法を用いて分析し、Ｇ−ＣＳＦまたはｍＣｈｅｒｒｙの濃度、および／または細胞生存率を決定する。
【１１０６】
実施例５０．  癌関連の標的
セプチン４は、対象の腫瘍関連ポリペプチドであり得る。目的の癌関連ポリペプチドをコードする遺伝子の名前と説明の他に、ＥＮＳＥＭＢＬトランスクリプトＩＤ（ＥＮＳＴ）、ＥＮＳＥＭＢＬタンパク質ＩＤ（ＥＮＳＰ）を表４１に示し、それぞれ適用可能な場合に存在し、最適化された配列番号（ＯＰＴ．ＳＥＱ  ＩＤ）が使用可能であるときに存在する。
表４１．癌関連の標的
【表００４１】
2018183181.tif 000313
【１１０７】
実施例５１．  確認と化学修飾ｍＲＮＡからのペプチド識別の確認
以下から産生されたタンパク質を含む細胞溶解物、以下、（ａ）アポトーシス誘導因子１、ミトコンドリアの短いアイソフォーム（ＡＩＦｓｈ、遺伝子名ＡＩＦＭ１）修飾ｍＲＮＡ（配列番号６６１７（表４２）に示されるｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１）、（ｂ）１（ＣＯＭＭＤ１）修飾ｍＲＮＡを含む銅代謝（Ｍｕｒｒ１）領域（配列番号７４９１（表４２）に示されるｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１）、および（ｄ）ｄｉａｂｌｏ、ＩＡＰ結合性ミトコンドリアタンパク質（ＤＩＡＢＬＯ）修飾ｍＲＮＡ（配列番号７４９４（表４２）に示されるｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１）、５−メチルシチジンおよびプソイドウリジン（５ｍＣおよびｐＵ）で完全修飾され、５−メチルシチジンと１−メチルプソイドウリジン（５ｍＣおよび１ｍｐＵ）で完全修飾され、２−チオウリジンで修飾された２５％のウリジンおよび５−メチルシチジンで修飾された２５％の２−シチジン（ｓ２Ｕおよび５ｍＣ）、プソイドウリジン（ｐＵ）で完全修飾され、または１−メチルプソイドウリジン（１ｍｐＵ）で完全修飾され、実施例３１に記載されるように、定量的ＬＣ−ＭＲＭのＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用して評価した。表４２．標的配列
【表００４２−１】
2018183181.tif 000314
【表００４２−２】
2018183181.tif 000315
【表００４２−３】
2018183181.tif 000316
【表００４２−４】
2018183181.tif 000317
【１１０８】
評価されたタンパク質について同定したペプチド断片を表４３に示す。
表４３．タンパク質およびペプチド断片配列
【表００４３】
2018183181.tif 000318
【１１０９】
実施例５２．  Ｃ．Ａ．カスパーゼ３およびＣ．Ａ．カスパーゼ６の検出
ヒト肺癌Ａ５４９細胞を６ウェルに播種し、リポフェクタミン２０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および５μｇの構成的活性型（Ｃ．Ａ．）カスパーゼ３ｍＲＮＡを形質移入した（配列番号６６１９（表４４）に示されるｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１）または構成的活性型（Ｃ．Ａ．）カスパーゼ６ｍＲＮＡ（配列番号７５０６（表４４）に示されるｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１）を形質移入し、当該修飾ｍＲＮＡは、５メチルシチジンおよび１−メチルプソイドウリジン（５ＭＣおよび１ｍｐＵ）で完全修飾され、１−メチルプソイドウリジン（１ｍｐＵ）で完全修飾された。細胞を、形質移入から７〜１０時間後に収集し、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ、インディアナポリス、インディアナ）を含むＲＩＰＡ緩衝液に溶解した。レーンあたり２０μｇの細胞溶解物に、ウェスタンブロットを実行し、内因性および導入されたカスパーゼ３、内因性および導入されたカスパーゼ６、カスパーゼ３下流基質ＰＡＲＰおよびカスパーゼ６下流基板ラミンＡ／Ｃを検出した。対照の溶解物と比較して、Ｃ．Ａ．カスパーゼ３およびＣ．Ａ．カスパーゼ６修飾ｍＲＮＡが形質移入された細胞に、それぞれ、高いレベルの切断されたカスパーゼ３および切断されたカスパーゼ６を検出した。図７に示すように、下流の基質のＰＡＲＰおよびラミンＡ／Ｃの切断が、Ｃ．Ａ．カスパーゼ３修飾ｍＲＮＡ（図７Ａ）およびＣ．Ａ．カスパーゼ６修飾ｍＲＮＡ（図７Ｂ）で処理した細胞で検出された。図７Ａおよび７Ｂに示したウエスタンブロットの５つレーンは、１）形質移入されていないＨｅＬａ細胞、２）形質移入されていないＡ５４９５ＭＣ、３）Ａ５４９のリポフェクタミンのみの対照、４）５ｍＣ、１ｍｐＵ修飾ｍＲＮＡを形質移入されたＡ５４９からの溶解物を含む。
表４４．Ｃ．Ａ．カスパーゼ配列
【表００４４−１】
2018183181.tif 000319
【表００４４−２】
2018183181.tif 000320
【１１１０】
実施例５３．  修飾Ｃ．Ａ．カスパーゼ３およびＣ．Ａ．カスパーゼ６ｍＲＮＡの発現
培養ヒト肺腺癌Ａ５４９細胞の活性を、ＷＳＴ−１基質（Ｒｏｃｈｅ、インディアナポリス、インディアナ州）のミトコンドリアデヒドロゲナーゼによって変換されたホルマザンを測定することによって評価した。９６ウェルあたり７５００の細胞を、様々な用量のリポフェクタミン２０００リポプレックス化構成的活性型（Ｃ．Ａ．）カスパーゼ３ｍＲＮＡ（配列番号６６１９（表４４）に示されるｍＲＮＡ、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１）または構成的活性型（Ｃ．Ａ．）カスパーゼ６ｍＲＮＡ（配列番号７５０６（表４４）に示されるｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１）は完全に１−メチルプソイドウリジン（５ｍＣおよび１ｍｐＵ）で完全修飾され、１−メチルプソイドウリジン（１ｍｐＵ）もしくは対照タンパク質（ｅＧＦＰ（配列番号７５０７に示されるｍＲＮＡ）で完全修飾され、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１、５−メチルシチジンおよび１−メチルプソイドウリジン（５ＭＣおよび１ｍｐＵ）で完全修飾され、または１−メチルプソイドウリジン（１ｍｐＵ）およびルシフェラーゼで完全修飾され、（配列番号７５０８に示されるｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１、５−メチルシチジンおよび１−メチルプソイドウリジン（５ＭＣおよび１ｍｐＵ）で完全修飾され、または１−メチルプソイドウリジン（１ｍｐＵ）で完全修飾された））の単回投与で処理した。細胞活性は、ＷＳＴ−１製造業者のプロトコルに従ってｍＲＮＡの処置から１日後に培養した細胞で測定し、バックグラウンドシグナルについて補正された変換されたホルマザンの４５０ｎｍの吸光度の読み取りとしてプロットされる。表４５に示すように、形質移入されたＣ．Ａ．カスパーゼｍＲＮＡ（０ｎｇ、２ｎｇ、１０ｎｇ、５０ｎｇおよび２５０ｎｇ）の量が増加し、対照と比較して（細胞活性の読み出しのときに）光学密度（ＯＤ）シグナルを著しく阻害した。同様の結果が、ヒト肺腺癌Ｈ４４１細胞およびヒト子宮頸癌ＨｅＬａ細胞で得られた。
表４５．細胞活性
【表００４５】
2018183181.tif 000321
【１１１１】
実施例５４．  ＭＹＣ阻害剤で修飾されたｍＲＮＡ
ヒト肝細胞癌ＨＥＰ３Ｂ細胞を３×１０６細胞／ウェルの播種密度で６ウェルプレートに播種し、ｍＲＮＡを形質移入したリポフェクタミン−２０００は、５メチルシチジンおよび１−メチルプソイドウリジン（５ＭＣおよび１ｍｐＵ）で完全修飾され、または１−メチルプソイドウリジン（１ｍｐＵ）で完全修飾され、以下をコードするように設計され、以下、蛍光タンパク質ｍＣｈｅｒｒｙ（配列番号に示されるｍＲＮＡ配列６６０２、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１）、非翻訳可能な第ＩＸ因子（配列番号７５０９に示されるｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１）、完全長の野生型Ｃ−ＭＹＣ配列番号に示される（配列番号７５１０に示されるｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１）、ＭＹＣ阻害剤Ａ（配列番号７５１１（表４６）に示されるｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１）、ＭＹＣ阻害剤Ｂ（配列番号７５１３（表４６）に示されるｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１）、ＭＹＣ阻害剤Ｃ（配列番号７４１８（表４６）に示されるｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１）、ＭＹＣ阻害剤Ｄ（配列番号７５１５（表４６）に示されるｍＲＮＡ配列、列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１）。細胞を、形質移入から８時間後に収集し、溶解物を、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ、インディアナポリス、インディアナ州）を含むＲＩＰＡ溶解緩衝液を用いて作製した。ＢＣＡアッセイにより決定された等量の溶解物を、４〜１２％のビス−トリス  ゲルを介してＳＤＳ−ＰＡＧＥにより溶解し、ニトロセルロースブロットに移動させ、適切な一次抗体および二次抗体でプローブした。ウエスタンブロットは、ＨＥＰ３Ｂ細胞で、４つ修飾ｍＲＮＡ  ＭＹＣ阻害剤の陽性発現および全長Ｃ−ＭＹＣを明らかにした。
表４６．ＭＹＣ阻害剤配列
【表００４６−１】
2018183181.tif 000322
【表００４６−２】
2018183181.tif 000323
【１１１２】
実施例５５．  ＭＹＣ阻害剤で修飾されたｍＲＮＡの発現
Ｈｅｐ３Ｂ細胞を、２５００細胞／ウェルの播種密度で９６ウェルプレートに播種し、０、０．２ｎＭ、０．７ｎＭ、２ｎＭまたは６ｎＭの修飾ｍＲＮＡを形質移入したリポフェクタミン２０００は、１−メチルプソイドウリジン（１ｍｐＵ）で完全修飾され、以下をコードするように設計され、以下、ｍＣｈｅｒｒｙ（配列番号６６０２に示されるｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１）、非翻訳可能な第ＩＸ因子（配列番号７５０９に示されるｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１）、完全長の野生型Ｃ−ＭＹＣ（配列番号７５１０に示されるｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１）、ＭＹＣ阻害剤Ａ（配列番号７５１１に示されるｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１）、ＭＹＣ阻害剤Ｂ（配列番号７５１３に示されるｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１）、ＭＹＣ阻害剤Ｃ（配列番号７５１５に示されるｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１）およびＭＹＣ阻害剤Ｄ（配列番号６６２１に示されるｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１）。細胞活性を、製造業者の指示（Ｒｏｃｈｅ、インディアナポリス、インディアナ州）に従ってＷＳＴ−１を用いた形質移入から４８時間後に測定した。吸光度の読み取りを、ＷＳＴ−１を添加してから４時間後に、４５０ｎｍ収集し、バックグラウンド補正された結果を表４７に示す。阻害剤（ＭＹＣ阻害剤Ａ、ＭＹＣ阻害剤Ｂ、ＭＹＣ阻害剤Ｃ、およびＭＹＣ阻害剤Ｄ）のそれぞれの３つ最高濃度は、対照に比べ吸光度信号を減少させた。
表４７．細胞の活動
【表００４７】
2018183181.tif 000324
【１１１３】
実施例５６．  修飾ｍＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏ発現
Ａ．  ＢＡＬＢ／Ｃ  ヌードマウス
ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに、ｍｉＲ−１２２結合部位のない０．１ミリグラム／ｋｇのルシフェラーゼ修飾ｍＲＮＡを静脈投与し（「非標的ｍＲＮＡ」、配列番号７５１８に示されるｍＲＮＡ、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１、５−メチルシチジンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾された）、当該ルシフェラーゼ修飾ｍＲＮＡは、表４８に記載の脂質ナノ粒子、またはルシフェラーゼ修飾ｍＲＮＡは、表４９に記載の脂質ナノ粒子中に製剤化された３’ＵＴＲにｍｉＲ−１２２結合部位を有するルシフェラーゼ修飾ｍＲＮＡで製剤化された（「ｍｉＲ−１２２標的ｍＲＮＡ」、配列番号７５１９に示されるｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１、５メチルシチジンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾された）である。
表４８．非標的ｍＲＮＡの脂質ナノ粒子
【表００４８】
2018183181.tif 000325
表４９．標的ｍＲＮＡの脂質ナノ粒子
【表００４９】
2018183181.tif 000326
【１１１４】
処置から２４時間後、動物に麻酔をかけ、ルシフェラーゼ基質Ｄ−ルシフェリンを注射し、１５分後に、生きている動物からの生物発光イメージング（ＢＬＩ）をＩＶＩＳイメージャーで評価した。シグナルが非標的ｍＲＮＡを注射した動物から、およびｍｉＲ−１２２標的ｍＲＮＡから得られ、表５０に示す。ｍｉＲ  １２２標的ｍＲＮＡで処理した動物の肝臓から産生される全体の光シグナルは、非標的ｍＲＮＡより２９倍低く、３’ＵＴＲの操作された要素が正常組織のタンパク質発現を阻害し得ることを示している。
表５０．操作されたｍｉＲ１２２結合部位によって調整された修飾ｍＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏ発現
【表００５０】
2018183181.tif 000327
【１１１５】
Ｂ．  肝細胞癌Ｈｅｐ３Ｂ細胞を有するＢＡＬＢ／ｃヌードマウス
ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの肝臓内に、２×１０６の肝細胞癌ＨＥＰ３Ｂ細胞を移植し、同所性腫瘍が２４日間で増殖した。腫瘍を有するマウスに、ｍｉＲ−１２２結合部位のない０．１ｍｇ／ｋｇのルシフェラーゼ修飾ｍＲＮＡを静脈投与し、当該修飾ｍＲＮＡは、（「非標的ｍＲＮＡ」、配列番号７５１８に示されるｍＲＮＡ７５１８、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１、５−メチルシチジンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾された）または３’ＵＴＲにｍｉＲ−１２２結合部位を有するルシフェラーゼ修飾ｍＲＮＡ（「ｍｉＲ−１２２標的ｍＲＮＡ」配列番号７５１９に示されるｍＲＮＡ、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１、５メチルシチジンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾された）であり、当該ルシフェラーゼ修飾ｍＲＮＡは、表４５に記載の脂質ナノ粒子中に製剤化された。処理から２４時間後の動物に麻酔をかけ、ルシフェラーゼ基質Ｄ−ルシフェリンを注射し、２０分後に、生きている動物からの生物発光イメージング（ＢＬＩ）をＩＶＩＳイメージャーで評価した。隣接する正常肝臓と比較して、同所性腫瘍からの信号を定量化、およびｍｉＲ−１２２標的ｍＲＮＡは、正常肝臓と比較して腫瘍において２倍の濃縮にわたって達成された脂質ナノ粒子を介して、全身に送達された。
【１１１６】
実施例５７．  ｍｉｒ−１２２配列で修飾された核酸
Ａ．  ＨｅＬａ細胞
ＨｅＬａ細胞を１００μｌの細胞培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）中、ウェル当たり１５，０００の密度で播種した。３’ＵＴＲにｍｉＲ−１２２の配列を有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ  ｍｉＲ１２２、配列番号７３２５に示されるｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１、５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾された）または３’ＵＴＲに種配列のないｍｉＲ−１２２の配列を有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ配列（Ｇ−ＣＳＦ種なし、配列番号７３２７に示されるｍＲＮＡ、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１、５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾）を、９６ウェルプレート中、７５ｎｇのｍＲＮＡの濃度でウェル当たり０．３μｌのリポフェクタミン２０００を形質移入した。上清は形質移入後、１６〜１８時間の間に収集し、Ｇ−ＣＳＦの発現をＥＬＩＳＡにより測定し、結果を表５１に示す。
表５１．ＨｅＬａのＧ−ＣＳＦ細胞発現
【表００５１】
2018183181.tif 000328
【１１１７】
Ｂ．  初代ヒトおよびラット肝細胞細胞
初代ヒトまたはラット肝細胞細胞を５００μｌの細胞培養培地中でウェルあたり３５０，０００細胞の密度で播種した（ｉｎ  ｖｉｔｒｏＧＲＯ  ＣＰおよびＩｎＶｉｔｒｏＧＲＯ  ＨＩ培地＋２．２％のＴｏｒｐｅｄｏ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  Ｍｉｘ）。３’ＵＴＲにｍｉＲ−１２２の配列を有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ  ｍｉＲ１２２、配列番号７５２０に示されるｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１、５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾）または３’ＵＴＲにＧ−ＣＳＦの種配列のないｍｉＲ−１２２配列を有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ種なし、配列番号７５２１に示されるｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１、５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾された）を、一次ヒト肝細胞および初代ラット肝細胞について２４ウェルプレート中、ウェルあたり５００ｎｇのｍＲＮＡの濃度で、ウェル当たり１μｌのリポフェクタミン２０００を形質移入した。上清は形質移入後、１６〜１８時間の間に収集し、Ｇ−ＣＳＦの発現をＥＬＩＳＡにより測定し、結果を表５２に示す。ｍＲＮＡのｍｉｒ−１２２結合部位配列は、初代肝細胞のＧ−ＣＳＦタンパク質の発現の勢いを弱める。
表５２．肝細胞のＧ−ＣＳＦ発現
【表００５２】
2018183181.tif 000329
【１１１８】
実施例５８．  ｍｉｒ−１２２配列を有する修飾された核酸の時間経過
Ａ．ＨｅＬａ細胞
ＨｅＬａ細胞を１００μｌの細胞培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）中、ウェル当たり１７，０００の密度で播種した。３’ＵＴＲにｍｉＲ−１２２配列を有さないＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ、配列番号７３２１に示されるマウス３’ＵＴＲ  ｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１。５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾され、配列番号７３２０に示されるヒト３’ＵＴＲ  ｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１、５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾された）、３’ＵＴＲにｍｉＲ−１２２配列を有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ  ｍｉＲ１２２、配列番号７３２５に示される３’ＵＴＲ  ｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１、５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾され、配列番号７３２２に示されるヒト３’ＵＴＲ  ｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１、５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾された）、３’ＵＴＲにｍｉＲ−１２２種配列を有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ種、配列番号７３２６に示されるマウス３’ＵＴＲ  ｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１。５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾され、配列番号７３２３に示されるヒト３’ＵＴＲ  ｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、  ５’キャップ、キャップ１、５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾された）、３’ＵＴＲに種配列のないｍｉＲ−１２２配列を有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ種なし、配列番号７３２７に示されるマウス３’ＵＴＲ  ｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１、５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾され、配列番号７３２４に示されるヒト３’ＵＴＲ  ｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ、５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾）、３’ＵＴＲにｍｉＲ−１２２配列のない第ＩＸ因子ｍＲＮＡ（ＦＩＸ、配列番号７３２９に示されるマウス３’ＵＴＲ  ｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１、５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾され、配列番号７３２８に示されるヒト３’ＵＴＲ  ｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１、５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾された）、３’ＵＴＲにｍｉＲ−１２２配列を有する第ＩＸ因子ｍＲＮＡ（ＦＩＸ  ｍｉＲ１２２、配列番号７３３３に示されるマウス３’ＵＴＲ  ｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ���部、５’キャップ、キャップ１、５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾され、配列番号７３３０に示されるヒト３’ＵＴＲ  ｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１、５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾された）、３’ＵＴＲにｍｉＲ−１２２の種配列を有する第ＩＸ因子ｍＲＮＡ（ＦＩＸ種、配列番号７３３４に示されるマウス３‘ＵＴＲ  ｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１、５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾され、配列番号７３３１に示されるヒト３’ＵＴＲ  ｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１、５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾された）または３’ＵＴＲに種配列のないｍｉＲ−１２２配列を有する第ＩＸ因子ｍＲＮＡ（ＦＩＸ種なし、配列番号７３３５に示されるマウス３’  ＵＴＲ  ｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１、５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾され、配列番号７３３２に示されるヒト３’ＵＴＲ  ｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１、５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾された）を６ウェルプレートにウェル当たり７５ｎｇのｍＲＮＡの濃度でリポフェクタミン２０００のウェルあたり０．３μｌを形質移入した。上清を形質移入後１６〜１８時間の間に収集し、Ｇ−ＣＳＦまたは第ＩＸ因子の発現をＥＬＩＳＡにより測定し、結果を表５３に示す。
表５３．ＨｅＬａの発現
【表００５３】
2018183181.tif 000330
【１１１９】
Ｂ．  初代ヒトおよびラット肝細胞
初代ヒトまたはラット肝細胞細胞を、５００μｌの細胞培養培地中でウェルあたり３５０，０００の細胞密度で播種した（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＧＲＯ  ＣＰおよびＩｎＶｉｔｒｏＧＲＯ  ＨＩ培地＋２．２％のＴｏｒｐｅｄｏ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ）。３’ＵＴＲにｍｉＲ−１２２配列を有さないＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ、配列番号７３２１に示されるマウス３’ＵＴＲ  ｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１、５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾され、配列番号７３２０に示されるヒト３’ＵＴＲ  ｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１、５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾された）、３’ＵＴＲにｍｉＲ−１２２配列を有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ  ｍｉＲ１２２、配列番号７３２５に示される３’ＵＴＲ  ｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１、５−メチルシトシンおよび１−  メチルプソイドウリジンで完全修飾され、  配列番号７３２２に示されるヒト３’ＵＴＲ  ｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、
５’キャップ、キャップ１、５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾された）、３’ＵＴＲにｍｉＲ−１２２種配列を有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ種、配列番号７３２６に示されるマウス３’ＵＴＲ  ｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１。５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾され、配列番号７３２３に示されるヒト３’ＵＴＲ  ｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１、５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾された）、３’ＵＴＲに種配列のないｍｉＲ−１２２配列を有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ種なし、配列番号７３２７に示されるマウス３’ＵＴＲ
ｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１、５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾され、配列番号７３２４に示されるヒト３’ＵＴＲ  ｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ、５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾された）、３’ＵＴＲにｍｉＲ−１２２配列のない第ＩＸ因子ｍＲＮＡ（ＦＩＸ、配列番号７３２９に示されるマウス３’ＵＴＲ  ｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１、５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾され、配列番号７３２８に示されるヒト３’ＵＴＲ  ｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１、５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾された）、３’ＵＴＲにｍｉＲ−１２２配列を有する第ＩＸ因子ｍＲＮＡ（ＦＩＸ  ｍｉＲ１２２、配列番号７３３３に示されるマウス３’  ＵＴＲ  ｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１、５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾され、配列番号７３３０に示されるヒト３’ＵＴＲ  ｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１、５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾）、第３’ＵＴＲにｍｉＲ−１２２の種配列を有するＩＸ因子ｍＲＮＡ（ＦＩＸ種、配列番号７３３４に示されるマウス３’ＵＴＲ  ｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１、５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾され、配列番号７３３１に示されるヒト３’ＵＴＲ  ｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１、５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾された）または３’ＵＴＲに種配列のないｍｉＲ−１２２配列を有する第ＩＸ因子ｍＲＮＡ（ＦＩＸ種なし、配列番号７３３５に示されるマウス３’ＵＴＲ  ｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１、５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾され、配列番号７３３２に示されるヒト３’ＵＴＲ  ｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１、５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾された）を一次ヒト肝細胞および初代ラット肝細胞について２４ウェルプレート中、ウェルあたり５００ｎｇの濃度でウェル当たり１μｌのリポフェクタミン２０００を形質移入した。上清を形質移入後、２４時間、４８時間、７２時間で採取し、Ｇ−ＣＳＦおよび第ＩＸ因子の発現をＥＬＩＳＡにより測定し、結果を表５４に示す。ｍＲＮＡ中のｍｉｒ−１２２結合部位の配列は、初代肝細胞の第ＩＸ因子タンパク質の発現を減衰させた。
表５４．肝細胞のＧ−ＣＳＦ発現
【表００５４】
2018183181.tif 000331
【１１２０】
実施例５９．  癌細胞にｍｉｒ−１２２配列を有する修飾された核酸の時間経過
Ａ．  ｍｉＲ−１２２のベースレベル
ヒト肝細胞、ラット肝細胞、ヒト肝細胞癌細胞（ＨＥＰ３Ｂ）およびＨｅＬａ細胞のｍｉｒ−１２２の基準レベルは、製造業者のプロトコルを使用して、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）分析により決定した。レベルをＵ６に正規化し、その結果を表５５に示す。
表５５．様々な細胞型のｍｉＲ−１２２レベル
【表００５５】
2018183181.tif 000332
【１１２１】
Ｂ．  初代ヒト肝細胞およびＨＥＰ３Ｂ細胞
初代ヒト肝細胞を、１００μｌの細胞培養培地中にウェルあたり５０，０００細胞の密度で播種した（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＧＲＯ  ＣＰおよびＩｎＶｉｔｒｏＧＲＯ  ＨＩ培地＋２．２％Ｔｏｒｐｅｄｏ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  Ｍｉｘ）およびＨＥＰ３Ｂ細胞を、１００μｌの細胞培養培地ＭＥＭ＋１０％ＦＢＳでウェルあたり２０，０００細胞の密度で播種した。３’ＵＴＲにｍｉＲ−１２２配列を有さないＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ、配列番号７３２０に示されるマウス３’ＵＴＲ  ｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１、５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾された）、３’ＵＴＲにｍｉＲ−１２２配列を有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ  ｍｉＲ１２２、配列番号７３２２に示されるｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１、５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾された）、３’ＵＴＲにｍｉＲ−１２２の種配列を有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ種、配列番号７３２３に示されるｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１、５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾された）または３’ＵＴＲに種配列のないｍｉＲ−１２２配列を有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ種なし、配列番号７３２４に示されるｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１、５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾された）を６ウェルプレートにウェル当たり７５ｎｇのｍＲＮＡの濃度で、ウェルあたり０．３μｌのリポフェクタミン２０００を形質移入した。上清を形質移入後、２４時間、４８時間、７２時間で採取し、Ｇ−ＣＳＦの発現をＥＬＩＳＡにより測定し、結果を表５６に示す。ｍＲＮＡ中のｍｉｒ−１２２結合部位の配列は、初代ヒト肝細胞ではＧ−ＣＳＦタンパク質の発現が減衰したが、ＨＥＰ３Ｂ細胞では減衰しなかった。
表５６．Ｇ−ＣＳＦ発現
【表００５６】
2018183181.tif 000333
【１１２２】
実施例６０．  ｍｉｒ−１４２  ３ｐ配列を有する修飾された核酸の時間経過
【１１２３】
Ａ．  ｍｉＲ−１４３  ３ｐのベースレベル
【１１２４】
ＲＡＷ２６４．７細胞およびＨｅＬａ細胞のｍｉＲ−１４２  ３ｐのベースレベルは、製造業者のプロトコルを使用して、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）分析により決定した。レベルをＵ６に正規化し、その結果を表５７に示す。
表５７．種々の細胞型におけるｍｉＲ−１４２  ３ｐのレベル
【表００５７】
2018183181.tif 000334
【１１２５】
Ｂ．  ＨｅＬａおよびＲＡＷ２６４．７細胞
ＨｅＬａ細胞を、１００μｌの細胞培養培地ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳに、ウェル当たり１７，０００の密度で播種し、ＲＡＷ２６４．７細胞を１００μｌの細胞培養培地ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳに、ウェル当たり２００，０００密度で播種した。３’ＵＴＲにｍｉＲ−１４２  ３ｐ配列を有さないＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ、配列番号７５２２に示されるｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１、５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾された）、３’ＵＴＲにｍｉＲ−１４２  ３ｐ配列を有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ  ｍｉＲ−１４２  ３ｐ、配列番号７５２３に示すｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１、５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾された）、３’ＵＴＲにｍｉＲ−１４２  ３ｐの種配列を有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ種、配列番号７５２４に示すｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１、５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾された）または３’ＵＴＲに種配列のないｍｉＲ−１４２  ３ｐ配列を有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ種なし、配列番号７５２５に示されるｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ、５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾）を、ＨｅＬａについては、９６ウェルプレート中、ウェルあたり７５ｎｇのｍＲＮＡ濃度で、ウェル当たり０．３μｌのリポフェクタミン２０００を播種し、または、ＲＡＷ２６４．７については、２４ウェルプレート中、ウェルあたり２５０ｎｇのｍＲＮＡ濃度で、ウェル当たり１μｌのリポフェクタミン２０００を播種した。上清は形質移入後、１６〜１８時間の間に収集し、Ｇ−ＣＳＦの発現をＥＬＩＳＡにより測定し、結果を表５８に示す。Ｇ−ＣＳＦのｍｉＲ−１４２  ３ｐ部位が、ＲＡＷ２６４．７細胞ではＧ−ＣＳＦの発現を下方制御することが示された。
表５８．発現
【表００５８】
2018183181.tif 000335
【１１２６】
Ｃ．  ＲＡＷ２６４．７細胞の時間経過
ＲＡＷ２６４．７細胞を、１００μｌの細胞培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）中、ウェルあたり６０，０００細胞の密度で播種した。３’ＵＴＲにｍｉＲ−１４２  ３ｐ配列を有さないＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ、配列番号７５２２に示されるｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１、５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾）、３’ＵＴＲにｍｉＲ−１４２  ３ｐ配列を有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ  ｍｉＲ１４２  ３ｐ、配列番号７５２３に示されるｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１、５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾）、３’ＵＴＲにｍｉＲ−１４２  ３ｐの種配列を有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ種、配列番号７５２４に示すｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１、５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾された）または３’ＵＴＲも種配列のないｍｉＲ−１４２  ３ｐ配列を有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ種なし、配列番号７５２５に示されるｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１、５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾）を９６ウェルプレートに、ウェル当たり７５ｎｇのｍＲＮＡの濃度で、ウェルあたり０．３μｌのリポフェクタミン２０００を形質移入した。上清を形質移入後、２４時間、４８時間、７２時間で採取し、Ｇ−ＣＳＦの発現をＥＬＩＳＡにより測定し、結果を表５９に示す。ｍＲＮＡ中のｍｉＲ−１４２  ３ｐ結合部位配列は、経時的に、ＲＡＷ２６４．７細胞のＧ−ＣＳＦの強力な発現を抑制することを示した。表５９．Ｇ−ＣＳＦ発現
【表００５９】
2018183181.tif 000336
【１１２７】
Ｄ．  ＰＢＭＣのｍｉＲ−１４２  ３ｐ
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を１００μｌの細胞培養培地中のウェルあたり１５０，０００細胞の密度で播種した（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭおよび形質移入後１０％ＦＢＳを追加）。３’ＵＴＲにｍｉＲ−１４２  ３ｐの配列を有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ  ｍｉＲ１４２  ３ｐ、配列番号７５２３に示されるｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１、５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾）、３’ＵＴＲにｍｉＲ−１４２  ３ｐの種配列を有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ種、配列番号７５２４に示すｍＲＮＡ配列、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１、５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾）または３’ＵＴＲに種配列がないｍｉＲ−１４２  ３ｐを有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ種なし、配列番号７５２５に示されるｍＲＮＡ、配列には示されていない約１４０ヌクレオチドのポリＡ尾部、５’キャップ、キャップ１、５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾）を、２つまたは３つのドナーのために、９６ウェルプレート中のウェルあたり５００ｎｇのｍＲＮＡの濃度で、ウェルあたり０．４μｌのリポフェクタミン２０００を３つ組で形質移入した。上清を形質移入後２４時間で回収し、Ｇ−ＣＳＦの発現は、ＥＬＩＳＡによって測定した。２つのドナーについての結果を、表６０に示し、３つのドナーについての結果を表６１に示す。ｍＲＮＡ中のｍｉＲ−１４２  ３ｐ結合部位配列は、ヒトＰＢＭＣでＧ−ＣＳＦの発現を下方制御することを示した。
表６０．ＰＢＭＣ発現（２つのドナー）
【表００６０】
2018183181.tif 000337
表６１．ＰＢＭＣ発現（３つのドナー）
【表００６１】
2018183181.tif 000338
【１１２８】
その他の実施形態
使用されている言葉は、説明するためにあり、限定するものではなく、そのより広い態様で、本発明の真の範囲および精神から逸脱することなく、変更が添付の特許請求の範囲内でなされ得ることを理解されたい。
【１１２９】
本発明は、いくつかの記載の実施形態に関して、いくらかの長さで、いくらかの具体性をもって説明してきたが、任意の詳細または実施形態または特定の実施形態に限定されることを意図せず、先行技術の観点で当該請求項を可能な限り広く解釈するため、したがって、本発明の意図する範囲を効果的に包含するために、添付の特許請求の範囲を参照して解釈されるべきものである。
【１１３０】
本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が制御する。さらに、セクションの見出し、材料、方法、および実施例は単なる例示であり、限定することを意図するものではない。
【図１】
2018183181.tif 000339
【図２】
2018183181.tif 000340
【図３】
2018183181.tif 000341
【図４】
2018183181.tif 000342
【図５】
2018183181.tif 000343
【図６】
2018183181.tif 000344
【図７】
2018183181.tif 000345
【配列表】
2018183181000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年8月31日(2018.8.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチドであって、目的とする腫瘍学関連ポリペプチド、ならびに、配列番号３５２９〜４５４９、配列番号５５７１〜６５９１およびそれらの機能的変異形のいずれかからなる群から選択される１つ以上のセンサー配列をコードするｍＲＮＡを含む、前記単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチド。