(57)【要約】【課題】これまでアルドステロン合成酵素発現阻害作用について知られていなかった化合物を有効成分とする新規のアルドステロン合成酵素発現阻害を提供すること。【解決手段】ボルテゾミブ又はその塩を含有する、アルドステロン合成酵素発現阻害剤【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ボルテゾミブ又はその塩を含有する、アルドステロン合成酵素発現阻害剤。
【請求項２】
ＣＹＰ１１Ｂ２の発現を抑制するための、請求項１に記載のアルドステロン合成酵素発現阻害剤。
【請求項３】
Ｃａ２＋下流の因子に作用する、請求項１又は２に記載のアルドステロン合成酵素発現阻害剤。
【請求項４】
ボルテゾミブ又はその塩を含有する、アルドステロン合成酵素の発現阻害により処置し得る疾患の予防又は治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルドステロン合成酵素発現阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
本邦における高血圧患者数は約4，000万人と推定されているが、そのうち降圧薬を内服していても降圧不十分な患者数は約1，000万人存在すると想定されている。また、3種類以上の降圧薬を内服しても降圧目標に達しない治療抵抗性高血圧患者数は、高血圧全患者の約2割に上ると考えられている。従って、既存の降圧剤、より具体的には、アンジオテンシンII受容体拮抗薬（ARB）、ACE阻害剤、Ca拮抗剤等の公知の降圧剤とは違う作用を示す新規降圧薬の開発は、いまだ必要であると思われる。
【０００３】
降圧薬の探索研究に関するスクリーニング方法が数々報告されているなか、アルドステロン合成酵素遺伝子の発現量を指標に用いる方法が報告されている（非特許文献１）。この報告の中では、アルドステロン合成酵素遺伝子のプロモーター領域下流にルシフェラーゼ（Luc）遺伝子が連結された遺伝子を導入した細胞株を用意し、当該細胞株をいくつかのARBの存在下で培養に供し、培養後に当該細胞におけるLuc遺伝子の発現の計測することで、スクリーニング方法として確立していることが示されている。しかし、このスクリーニング方法だけでは、ヒット化合物のもたらすアルドステロン合成酵素遺伝子の発現抑制がARBに代表されるようなレニン−アンジオテンシン系に作用して観察されるものなのか、レニン−アンジオテンシン系とは独立した系に作用した結果なのかを判定することはできず、公知の降圧剤とは違う作用を有する新規降圧剤の探索研究に供する手技としては課題が残されている。
【０００４】
また、レニン−アンジオテンシン系が関与すると考えられる高血圧が大動脈の肥厚やリモデリングを引き起こしているとされ、これら症状を緩和する観点からの創薬研究もおこなわれている（例えば、非特許文献２）。しかし、こうした研究報告もレニン−アンジオテンシン系が関与する現象に焦点を絞ったアプローチであるため、有望な効果を示す物質が特定された場合でも、当該物質の作用はARBのようにレニン−アンジオテンシン系の中に存在する分子に対するものである可能性が高い。
【０００５】
以上から、ARB、ACE阻害剤、Ca拮抗剤等の公知の降圧剤とは違う作用を示す新規降圧薬の開発が待望されながらも、その探索に関する創薬研究開発は未だに多難を極めているといえる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第3717934号
【特許文献２】特許第5261488号
【特許文献３】特許第5736314号
【特許文献４】特表2010-539183
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Matsuda et al.(2014) Mol Cell Endocrinol 383, 60-68
【非特許文献２】Shuai Li, et al.(2013) PLOS ONE e78564
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、これまでアルドステロン合成酵素発現阻害作用について知られていなかった化合物を有効成分とする新規のアルドステロン合成酵素発現阻害を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
かかる状況の下、本発明者らは数千種類の化合物について検討した結果、ボルテゾミブ又はその塩が、アルドステロン合成酵素の発現を抑制することを見出した。本発明は、かかる新規の知見に基づくものである。
【００１０】
従って、本発明は、以下の項を提供する：
項１．ボルテゾミブ又はその塩を含有する、アルドステロン合成酵素発現阻害剤。
【００１１】
項２．ＣＹＰ１１Ｂ２の発現を抑制するための、項１に記載のアルドステロン合成酵素発現阻害剤。
【００１２】
項３．Ｃａ２＋下流の因子に作用する、項１又は２に記載のアルドステロン合成酵素発現阻害剤。
【００１３】
項４．ボルテゾミブ又はその塩を含有する、アルドステロン合成酵素の発現阻害により処置し得る疾患の予防又は治療剤。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、これまでアルドステロン合成酵素の発現阻害効果について知られていなかった化合物であるボルテゾミブ又はその塩を有効成分として用いることによって、新規のアルドステロン合成酵素発現阻害剤を提供することができる。
【００１５】
ここで、本発明の有効成分であるボルテゾミブは、プロテアソーム阻害剤としての機能またはそれに基づく各種抗がん剤としての用途が知られている化合物である（特許文献１〜４）。
【００１６】
一方、従来、アンジオテンシンII受容体拮抗薬（ARB）、ACE阻害剤、Ca拮抗剤等の種々の作用を示す種々の降圧剤について報告があるが、これらの降圧剤のうち、アルドステロン合成酵素の直接的な発現阻害効果について報告されているものはない。従って、上記本発明の驚くべき効果は、従来技術から予想し得ないものである。（ARBやACE阻害剤も間接的には発現を阻害する。）
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】実施例１の各試験の結果を示す。
【図２】実施例２の各試験の結果を示す。
【図３】実施例３の各試験の結果を示す。
【図４】実施例４の各試験の結果を示す。
【図５】実施例５の各試験の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
アルドステロン合成酵素発現阻害剤
本発明は、ボルテゾミブ又はその塩を含有する、アルドステロン合成酵素発現阻害剤を提供する。本発明の有効成分であるボルテゾミブ［ＣＡＳ  Ｎｏ．１７９３２４−６９−７、｛（１Ｒ）−３−メチル−１−［（２Ｓ）−３−フェニル−２−（ピラジン−２−カルボキサミド）プロパンアミド］ブチル｝ボロン酸）（｛（１Ｒ）−３−Ｍｅｔｈｙｌ−１−［（２Ｓ）−３−ｐｈｅｎｙｌ−２−（ｐｙｒａｚｉｎｅ−２−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ）ｐｒｏｐａｎａｍｉｄｏ］ｂｕｔｙｌ｝ｂｏｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）］は、下記構造を有する公知の物質である：
【００１９】
【化１】
2018168079.tif 000002
【００２０】
本発明の有効成分であるボルテゾミブの塩は、酸付加塩と塩基との塩を包含する。酸付加塩の具体例として、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、過塩素酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、安息香酸塩、トリフルオロ酢酸塩、酢酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩等の有機酸塩、及びグルタミン酸塩、アスパラギン酸塩等の酸性アミノ酸塩が挙げられる。塩基との塩の具体例としては、ナトリウム塩、カリウム塩又はカルシウム塩のようなアルカリ金属又はアルカリ土類金属塩、ピリジン塩、トリエチルアミン塩のような有機塩基との塩、リジン、アルギニン等の塩基性アミノ酸との塩が挙げられる。
【００２１】
本発明の有効成分であるボルテゾミブ及びその塩は、水和物又は溶媒和物の形で存在することもあるので、これらの水和物及び溶媒和物もまた本発明の有効成分である化合物に包含される。これらの溶媒は、１種単独で、又は２種以上の混合溶媒として用いることができる。
【００２２】
溶媒和物を形成する溶媒としては、エタノール、プロパノール等のアルコール、酢酸等の有機酸、酢酸エチル等のエステル類、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等のエーテル類、アセトン等のケトン類、ＤＭＳＯ等が例示される。
【００２３】
本発明においては、本発明の有効成分であるボルテゾミブ又はその塩そのものをアルドステロン合成酵素発現阻害剤として用いても、薬学的に許容される各種担体（例えば、等張化剤、キレート剤、安定化剤、ｐＨ調節剤、防腐剤、抗酸化剤、溶解補助剤、粘稠化剤等）と組み合わせた医薬組成物として用いてもよい。
【００２４】
等張化剤としては、例えば、グルコース、トレハロース、ラクトース、フルクトース、マンニトール、キシリトール、ソルビトール等の糖類、グリセリン、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等の多価アルコール類、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム等の無機塩類等が挙げられる。これらの等張化剤は、１種単独で、又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００２５】
キレート剤としては、例えば、エデト酸二ナトリウム、エデト酸カルシウム二ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、エデト酸四ナトリウム、エデト酸カルシウム等のエデト酸塩類、エチレンジアミン四酢酸塩、ニトリロ三酢酸又はその塩、ヘキサメタリン酸ソーダ、クエン酸等が挙げられる。これらのキレート剤は、１種単独で、又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００２６】
安定化剤としては、例えば、亜硫酸水素ナトリウム等が挙げられる。
【００２７】
ｐＨ調節剤としては、例えば、塩酸、炭酸、酢酸、クエン酸等の酸が挙げられ、さらに水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ金属水酸化物、炭酸ナトリウム等のアルカリ金属炭酸塩又は炭酸水素塩、酢酸ナトリウム等のアルカリ金属酢酸塩、クエン酸ナトリウム等のアルカリ金属クエン酸塩、トロメタモール等の塩基等が挙げられる。これらのｐＨ調節剤は、１種単独で、又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００２８】
防腐剤としては、例えば、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチル等のパラオキシ安息香酸エステル、グルコン酸クロルヘキシジン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウム等の第４級アンモニウム塩、アルキルポリアミノエチルグリシン、クロロブタノール、ポリクォード、ポリヘキサメチレンビグアニド、クロルヘキシジン等が挙げられる。これらの防腐剤は、１種単独で、又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００２９】
抗酸化剤としては、例えば、亜硫酸水素ナトリウム、乾燥亜硫酸ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、濃縮混合トコフェロール等が挙げられる。これらの抗酸化剤は、１種単独で、又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００３０】
溶解補助剤としては、例えば、安息香酸ナトリウム、グリセリン、Ｄ−ソルビトール、ブドウ糖、プロピレングリコール、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴール、Ｄ−マンニトール等が挙げられる。これらの溶解補助剤は、１種単独で、又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００３１】
粘稠化剤としては、例えば、ポリエチレングリコール、メチルセルロース、エチルセルロース、カルメロースナトリウム、キサンタンガム、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール等が挙げられる。これらの粘稠化剤は、１種単独で、又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００３２】
医薬組成物の実施形態において、組成物中のボルテゾミブ又はその塩の含有量は特に限定されず、ボルテゾミブの含有量換算で、例えば、９０質量％以上、７０質量％以上、５０質量％以上、３０質量％以上、１０質量％以上、５質量％以上、１質量％以上等の条件から適宜設定できる。
【００３３】
製剤形態は、特に限定されず、例えば錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤等の経口投与剤；注射剤（静脈注射、筋肉注射、局所注射等）、含嗽剤、点滴剤、外用剤（軟膏、クリーム、貼付薬、吸入薬）、座剤等の非経口投与剤等の各種製剤形態を挙げることができる。上記製剤形態のうち、好ましいものとしては、例えば、注射剤（静脈注射、筋肉注射、局所注射等）、経口剤（錠剤、カプセル剤等）等が挙げられ、より好ましくは、経口剤等が挙げられる。
【００３４】
本発明において、ボルテゾミブ又はその塩の投与量は、投与経路、患者の年齢、体重、症状等によって異なり一概に規定できないが、ボルテゾミブの投与量として、成人に対する１日投与量が通常、約５０００ｍｇ以下、好ましくは約１０００ｍｇ以下になる量とすればよい。ボルテゾミブ又はその塩の投与量の下限も特に限定されず、例えば、ボルテゾミブの投与量として、成人に対する１日投与量が通常、０．１ｍｇ以上、好ましくは０．５ｍｇ以上の範囲で適宜設定できる。１日１回投与する場合は、１製剤中にこの量が含まれていればよく、１日３回投与する場合は、１製剤中にこの３分の１量が含まれていればよい。
【００３５】
本発明のアルドステロン合成酵素発現阻害剤は、哺乳動物等の患者に投与される。哺乳動物としては、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ等が挙げられる。
【００３６】
本発明によれば、ボルテゾミブ又はその塩の作用により、アルドステロン合成酵素発現を抑制することができる。アルドステロン合成酵素としては、例えば、ＣＹＰ１１Ｂ２によりコードされる酵素等が挙げられる。ＣＹＰ１１Ｂ２は、アンジオテンシンＩＩ及びカリウムにより制御されるだけでなく、コルチコトロピン（ＡＣＴＨ）及びｃＡＭＰによっても制御されると言われている（非特許文献１、６０頁、右欄、１１〜１４行目）。また、後述の実施例に示すように、本発明によれば、ボルテゾミブ又はその塩は、細胞内カルシウム濃度の上昇後に変動するＣＹＰ１１Ｂ２の発現制御因子に作用するものと考えられる。本発明において、細胞内カルシウム濃度の上昇後に変動するＣＹＰ１１Ｂ２の発現制御因子を、Ｃａ２＋下流の因子と示すことがある。
【００３７】
アルドステロン合成酵素の発現阻害により処置し得る疾患の予防又は治療剤
本発明は、また、ボルテゾミブ又はその塩を含有する、アルドステロン合成酵素の発現阻害により処置し得る疾患の予防又は治療剤を提供する。
【００３８】
アルドステロン合成酵素の発現阻害により処置し得る疾患としては、アルドステロン合成酵素の発現阻害により処置し得る高血圧症、原発性アルドステロン症、腎血管性高血圧症、腎性高血圧等が挙げられる。
【００３９】
ここで、腎血管性高血圧症及び腎性高血圧症において、アルドステロンは、レニン−アンジオテンシン系で産生されるアンジオテンシンＩＩの作用により、副腎皮質から分泌されるが、原発性アルドステロン症においては細胞内カルシウム代謝異常によりアルドステロン合成・分泌が亢進される。さらに、アルドステロン合成酵素ＣＹＰ１１Ｂ２は、アンジオテンシンＩＩ及びカリウムにより制御されるだけでなく、コルチコトロピン（ＡＣＴＨ）及びｃＡＭＰによっても制御されると言われている（非特許文献１）。従って、アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗剤（ＡＲＢ）を投与しても改善されない高血圧等の疾患については、レニン−アンジオテンシン系とは別の経路によりアルドステロン合成が促進されていることも予想される。かかる状況の下、本発明の有効成分であるボルテゾミブ又はその塩はアルドステロン合成酵素の発現を阻害するため、本発明は、レニン−アンジオテンシン系とは別の経路によりアルドステロン合成が促進されている疾患の治療に対しても有効であり、非常に有用である。
【００４０】
本発明のアルドステロン合成酵素の発現阻害により処置し得る疾患の予防又は治療剤の有効成分、製剤形態、投与量等は、アルドステロン合成酵素発現阻害剤と同様である。
【００４１】
本発明のアルドステロン合成酵素の発現阻害により処置し得る疾患の予防又は治療剤も、本発明のアルドステロン合成酵素発現阻害剤と同様に、有効成分であるボルテゾミブ又はその塩そのものを予防又は治療剤として用いても、薬学的に許容される各種担体（例えば、等張化剤、キレート剤、安定化剤、ｐＨ調節剤、防腐剤、抗酸化剤、溶解補助剤、粘稠化剤等）と組み合わせた医薬組成物として用いてもよい。
【００４２】
また、上記医薬組成物は、ボルテゾミブ又はその塩以外に、降圧剤、原発性アルドステロン症の治療剤をさらに含んでいてもよい。かかる降圧剤としては、例えば、ARB、Ca拮抗剤等が挙げられる。かかる原発性アルドステロン症の治療剤としては、例えば、アルドステロン拮抗薬（スピロノラクトン、エプレノロン等）が挙げられる。
【００４３】
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【実施例】
【００４４】
１．試験方法
１−１．化合物
化合物スクリーニングに用いたＶａｌｉｄａｔｅｄ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  Ｌｉｂｒａｒｙは東京大学創薬機構より分与された。アンジオテンシンＩＩ（Ｓｉｇｍａ）は０．１％  Ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ，Ｓｉｇｍａ）を含むＰｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）に、塩化カリウム（Ｗａｋｏ）は水に、ボルテゾミブ（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ベラプロスト（Ｃａｙｍａｎ）はＤｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（ＤＭＳＯ）に溶解した。
【００４５】
１−２．細胞培養
Ｈ２９５Ｒ細胞の培養は維持培地としてＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２（Ｗａｋｏ）に１０％  Ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１．２５  ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）、１  ｘ  Ｉｎｓｕｌｉｎ−Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ−Ｓｅｌｅｎｉｕｍ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１  ｘ  ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｗａｋｏ）、５．３５μｇ／ｍＬ  リノール酸（Ｓｉｇｍａ）を加えたものを使用した。なお、ＦＢＳは非働化処理（５５℃、３０分）を行ったものを使用した。また、アンジオテンシンＩＩ及びカリウム刺激時は刺激培地としてＤＭＥＭ（Ｗａｋｏ）にチャコール処理を行ったＦＢＳを終濃度１％になるように加え、培養を行った。２９３Ｔ細胞、及びＨｅＬａ細胞の培養はＤＭＥＭに１０％  ＦＢＳを加えたものを使用した。すべての細胞培養は３７℃、５％のＣＯ２雰囲気下において行った。細胞の継代培養にはＴｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた。
【００４６】
１−３．マウス飼育、ｉｎ  ｖｉｖｏ  解析
Ｃ５７ＢＬ／６マウス及びツクバ高血圧マウスは室温、湿度をコントロールした室内で飼育し、１２時間ずつの明暗照明下で飼育した。つくば高血圧マウスはヒトレニンを発現するトランスジェニックマウスｈＲＮ８−１２系統とヒトアンジオテンシノーゲンを発現するトランスジェニックマウスｈＡＧ２−５系統を交配することで作出した。これらのトランスジェニックマウスは理化学研究所バイオリソースセンターより分与された。
【００４７】
６週齢の野生型もしくはつくば高血圧マウスに４００μｇ／ｋｇのボルテゾミブをＰＢＳに溶解し４日に１回腹腔内投与を行った。１０週齢の時点で血圧を測定し、副腎を摘出した。なお、化合物投与の前後で体重を測定した。マウスの血圧は非観血血圧測定装置ＢＰ−９８Ａ−Ｌ（ソフトロン）によるテールカフ法を用いて測定した。屠殺後、摘出した副腎はＲＴ−ＰＣＲによるｍＲＮＡ発現解析及び免疫組織染色に供した。
【００４８】
１−４．ルシフェラーゼアッセイ
ＣＹＰ１１Ｂ２遺伝子プロモーター（−１５２１〜＋２）とホタルルシフェラーゼのキメラ遺伝子を組み込んだＨ２９５Ｒ細胞株（Ｍａｔｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  ２０１４  Ｍａｒ  ５；３８３（１−２）：６０−８．）は３．３３ｘ１０５個ずつ３８４穴プレートに播種し、二日間培養後に所定の化合物を１０μＭ含む培地に交換し２４時間培養した。その後、１μＭ  アンジオテンシンＩＩを含む培地に交換し、６時間培養後に等量のＯＮＥ−Ｇｌｏ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｇｍｅｇａ）を加えＰｈｅｒａｓｔａｒ（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ）を用いて発光強度を測定した。
【００４９】
１−５．細胞増殖アッセイ
Ｈ２９５Ｒ細胞を２．５ｘ１０４個ずつ９６穴プレートに播種し、２４時間後に１０μＭの化合物を含む維持培地に置換した。さらに２４時間培養後、ＷＳＴ−１  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔａｋａｒａ）を用い、説明書に従って細胞増殖解析を行った。
【００５０】
１−６．ＲＮＡ抽出（細胞、副腎）、逆転写、定量ＰＣＲ
スクリーニング実験においては（図１Ｄ）、Ｈ２９５Ｒ細胞に所定の化合物を１０μＭ含む維持培地で２４時間処理し、その後、１μＭアンジオテンシンＩＩを含む刺激培地で６時間処理した後にＳｅｐａｓｏｌ−ＲＮＡ  Ｉ  Ｓｕｐｅｒ  Ｇ（ナカライテスク）を用いて定法通りＲＮＡ抽出を行った。ボルテゾミブ効果の検証実験では（図２Ｃ，  Ｄ，Ｅ）、Ｈ２９５Ｒ細胞を０．１μＭボルテゾミブを含む維持培地で１２時間培養した後、０．１μＭアンジオテンシンＩＩを含む刺激培地で６時間処理した後に上記と同様にＲＮＡ抽出を行った。ベラプロスト効果の検証実験では（図５Ｂ）、２もしくは２０μＭベラプロストを含む維持培地で１２時間Ｈ２９５Ｒ細胞を培養した後、０．１μＭアンジオテンシンＩＩを含む刺激培地で６時間処理したＲＮＡ抽出を行った。また、マウスより摘出した副腎からのＲＮＡ抽出にはＩＳＯＧＥＮ（日本ジーン）を用いた。得たＲＮＡはＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｔａｋａｒａ）を用いて逆転写し、その産物を用いて定量ＰＣＲ法による発現量解析を行った。ヒトＧＡＰＤＨ、ヒトＮｕｒｒ１、ヒトＮＧＦＩＢ及びマウスＧａｐｄｈの解析にはＫＡＰＡ  ＳＹＢＲ  Ｆａｓｔ  ｑＰＣＲ  ｋｉｔ（ＫＡＰＡ）を用い、ヒトＣＹＰ１１Ｂ２、マウスＣｙｐ１１ｂ２の解析にはＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ  ｐｒｏｂｅ  ｑＰＣＲ  ｍｉｘ（東洋紡）を用いた。これらの測定にはＴｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔａｋａｒａ）を使用した。用いたプライマー及びプローブは表１に示した。
【００５１】
１−７．アルドステロン抽出、ＥＬＩＳＡ
０．１μＭボルテゾミブを含む維持培地で１２時間培養したＨ２９５Ｒ細胞を０．１μＭアンジオテンシンＩＩを含む刺激培地で２４時間処理し培養上清を回収した。Ａｌｄｏｓｔｅｒｏｎｅ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（ＣＡＹＭＡＮ）の説明書に従い、ジクロロメタン（和光純薬）を用いて培養上清からアルドステロンの抽出を行った。得た試料をＡｌｄｏｓｔｅｒｏｎｅ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔに供し、培養上清中に含まれるアルドステロン濃度を測定した。
【００５２】
１−８．免疫組織染色
ホルマリン固定を行ったマウス副腎はパラフィン包埋した後、薄切した。脱パラフィン後、抗原賦活化を行い、ＣＹＰ１１Ｂ２抗体と反応させた。さらに、ヒストファインシンプルステインＭＡＸ  ＰＯ（ニチレイ）を用いてペルオキシダーゼ標識二次抗体を結合させ、ジアミノベンジジンを用いて発色させた。また、薄切した連続切片はヘマトキシリン染色にも供した。免疫組織染色に用いたＣＹＰ１１Ｂ２抗体はミシシッピ大学Ｇｏｍｅｚ−Ｓａｎｃｈｅｚ博士より分与された。
【００５３】
【表１】
2018168079.tif 000003
【００５４】
実施例１  ＣＹＰ１１Ｂ２の発現変動を指標にしたスクリーニング
Ｖａｌｉｄａｔｅｄ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  Ｌｉｂｒａｒｙに由来する１９７９種類の化合物を用い、前記「１−４．」に記載の方法に従い、ルシフェラーゼアッセイを行った。結果（各化合物のＩｎＨ（ＩｎＨ＝
（１−（（化合物処理時の実測値−無刺激時の平均値）／（刺激時の平均値−無刺激時の平均値）））ｘ１００）の分布）を図１Ａに示す。ＩｎＨ５０％を閾値としてスクリーニングした結果、１７４種類の化合物が選抜された。次に、１７４種類の化合物を用いて、再度同様のルシフェラーゼアッセイを行い、６６種類の化合物が選抜された（図１Ｂ）。次に、既存のアンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬を除く５９種類の化合物を用い、前記「１−５．」に記載の方法に従い、細胞増殖アッセイを行った。結果を図１Ｃに示す。ＤＭＳＯコントロールに対する相対ｖｉａｂｉｔｌｉｔｙ９０％を閾値としてスクリーニングした結果、２３種類の化合物が選択された。次に、当該２３種類の化合物を１０μＭの濃度で２４時間化合物処理を行ったＨ２９５Ｒ細胞について、「１−６．」に記載の方法に従って、Ｈ２９５細胞からのＲＮＡ抽出、逆転写を行い、ＣＹＰ１１Ｂ２並びにＧＡＰＤＨの発現量解析を定量ＰＣＲにて行った。結果（各化合物のＩｎＨの分布）を図１Ｄに示す。ＩｎＨ  ４０％を閾値としてスクリーニングした結果、１５種類の化合物が選抜された。１５種類の化合物を下記表２に示す。以下の実施例については、これら１５種類の化合物のうち、明確な標的分子、作用機序が明らかにされている点から、ボルテゾミブを選択して用いた。
【００５５】
【表２】
2018168079.tif 000004
【００５６】
実施例２．ＣＹＰ１１Ｂ２の発現に対するボルテゾミブの影響の評価
種々の濃度でボルテゾミブを用い、前記「１−４．」に記載の方法に従って、ルシフェラーゼアッセイを行った。また、同様に種々の濃度でボルテゾミブを用い、前記「１−５．」に記載の方法に従って、細胞増殖アッセイを行った。結果を図２Ｂに示す。図２Ｂに示すように、ボルテゾミブは、濃度依存的にＣＹＰ１１Ｂ２遺伝子プロモーター活性を阻害した。次に、１０μＭのボルテゾミブ又はＤＭＳＯを用いて化合物処理を行ったＨ２９５Ｒ細胞について、「１−６．」に記載の方法に従って、Ｈ２９５細胞からのＲＮＡ抽出、逆転写、定量ＰＣＲ（ＣＹＰ１１Ｂ２／ＧＡＰＤＨ）を行った。当該試験は、アンジオテンシンＩＩ処理していないＨ２９５細胞（ＮＴ）及び０．１μＭアンジオテンシンＩＩで６時間処理したＨ２９５細胞（ＡｎｇＩＩ）の両方に対して行った。結果を図２Ｃに示す。図２Ｃから、アンジオテンシンＩＩ処理により亢進したＣＹＰ１１Ｂ２のｍＲＮＡ発現がボルテゾミブ添加により、阻害されたことが分かる。同様にして、ヒトＮｕｒｒ１、ヒトＮＧＦＩＢについても試験を行った（図２Ｄ、図２Ｅ）。図２Ｄからボルテゾミブ処理によってもＮｕｒｒ１発現のアンジオテンシンＩＩ応答性に変化がないことが示された。すなわち、ボルテゾミブによる発現抑制作用はＣＹＰ１１Ｂ２発現に対して選択性を有することが示された。また、図２ＥからＮＧＦＩＢ発現はボルテゾミブ処理により増加することが示された。Ｎｕｒｒ１やＮＧＦＩＢはＣＹＰ１１Ｂ２の転写活性化因子であることが報告されているが、ボルテゾミブによるＣＹＰ１１Ｂ２発現阻害はＮｕｒｒ１やＮＧＦＩＢの発現阻害によるものではないと考えられる。さらに、１０μＭのボルテゾミブ又はＤＭＳＯを用いて化合物処理を行ったＨ２９５Ｒ細胞について、前記「１−７」の記載に従い、アルドステロン抽出及びＥＬＩＳＡでの検出を行った。当該試験も、アンジオテンシンＩＩ処理していないＨ２９５細胞（ＮＴ）及び０．１μＭアンジオテンシンＩＩで２４時間処理したＨ２９５細胞（ＡｎｇＩＩ）の両方に対して行った。結果を図２Ｆに示す。図２Ｆから、アンジオテンシンＩＩ処理により亢進したアルドステロンの分泌がボルテゾミブにより抑制されたことが分かる。
【００５７】
実施例３
野生型マウス及びツクバ高血圧マウスを用い、前記「１−３．」に記載の方法に従って、血圧測定を行った。結果を図３Ａに示す。図３Ａからツクバ高血圧マウスでは血圧が上昇していることが確認できた。次に、これらのマウスを用い、前記「１−６．」に記載の方法に従って、副腎におけるＣｙｐ１１ｂ２  ｍＲＮＡ発現解析を行った。結果を図３Ｂに示す。図３Ｂからツクバ高血圧マウスでは副腎Ｃｙｐ１１ｂ２発現が亢進していることが分かる。次に、これらのマウスを用い、前記「１−８．」に記載の方法に従って、ＣＹＰ１１Ｂ２抗体を用いた副腎の免疫染色を行った。結果を図３Ｃに示す。図３Ｃからツクバ高血圧マウスにおいて副腎球状層でＣＹＰ１１Ｂ２タンパク質の発現が増加していることが分かる。
【００５８】
実施例４．
野生型マウス及びツクバ高血圧マウスを用い、前記「１−３．」に記載の方法に従って、ボルテゾミブ投与前後の体重変化解析を行った。結果を図４Ａに示す。図４Ａからいずれのマウスにおいてもボルテゾミブ投与による有意な体重変化は認められなかった。次に、これらのマウスを用い、前記「１−３．」に記載の方法に従って、ボルテゾミブ投与の血圧への影響解析を行った。結果を図４Ｂに示す。図４Ｂからボルテゾミブはツクバ高血圧マウスの血圧を有意に硬化させることが分かる。次に、これらのマウスを用い、前記「１−６．」に記載の方法に従って、ボルテゾミブの副腎Ｃｙｐ１１ｂ２  ｍＲＮＡ発現への影響解析を行った。結果を図４Ｃに示す。図４Ｃからボルテゾミブ投与はツクバ高血圧マウスの副腎Ｃｙｐ１１ｂ２  ｍＲＮＡ発現亢進を阻害するであることが分かる。次に、これらのマウスを用い、前記「１−８．」に記載の方法に従って、副腎免疫染色を行った。結果を図４Ｄに示す。図４Ｄからボルテゾミブ投与により副腎球状層におけるＣＹＰ１１Ｂ２タンパク質発現量が低下していることが分かる。
【００５９】
実施例５．
０．１μＭボルテゾミブを含む維持培地で１２時間処理した後、２０ｍＭ塩化カリウムを含む刺激培地で６時間培養したＨ２９５Ｒ細胞を用い、前記「１−６．」に記載の方法に従って、定量ＰＣＲによるＣＹＰ１１Ｂ２  ｍＲＮＡ発現解析を行った。結果を図５Ａに示す。図５Ａからボルテゾミブ処理は、アンジオテンシンＩＩ応答と同様にＣＹＰ１１Ｂ２発現の塩化カリウム応答を抑制することが分かる。また、アンジオテンシンＩＩ及び塩化カリウムの両方の刺激によるＣＹＰ１１Ｂ２の発現上昇を抑制することから、ボルテゾミブは、前記刺激による細胞内カルシウム濃度の上昇後に変動するＣＹＰ１１Ｂ２の発現制御因子（以下、Ｃａ２＋下流の因子）を標的とすることが示唆され、ＡＲＢ、ＡＣＥ阻害剤またはＣａ２＋拮抗剤とは異なる標的と機序によりＣＹＰ１１Ｂ２の発現を抑制することが分かる。
【００６０】
次に、２もしくは２０μＭベラプロストを含む維持培地で１２時間培養した後、０．１μＭアンジオテンシンＩＩで６時間培養したＨ２９５Ｒ細胞を用い、前記「１−６．」に記載の方法に従って、ベラプロストのＣＹＰ１１Ｂ２発現応答に対する影響を検証した。結果を図５Ｂに示す。図５Ｂからいずれの濃度においてもベラプロストはＣＹＰ１１Ｂ２の塩化カリウム応答に影響を与えないことが分かる。ベラプロストはプロスタサイクリン受容体に作用し、慢性動脈閉塞症や肺高血圧症に用いられ、血管を広げることで血圧を下げる効果が知られている。本実施例により、ベラプロストによる血圧降下作用はＣＹＰ１１Ｂ２の発現抑制による作用ではないことがわかる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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