(57)【要約】      （修正有）【課題】抗ＲＡＮＫＬ抗体及び使用方法の提供。【解決手段】（ｉ）特定の配列で表される、ＶＨＣＤＲ１領域とＶＨＣＤＲ２領域とＶＨＣＤＲ３領域とを含む重鎖可変領域と、（ｉｉ）特定の配列で表される、ＶＬＣＤＲ１領域とＶＬＣＤＲ２領域とＶＬＣＤＲ３領域とを含む軽鎖可変領域とを含む、ＲＡＮＫＬに結合する単離抗体又はその抗原結合フラグメント、あるいはＣＤＲ領域における８個までのアミノ酸置換を除いて、（ｉ）及び（ｉｉ）の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域と同一の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗体の改変体、又はその抗原結合フラグメント。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書中に記載される発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２０１３年３月１４日に出願された米国仮出願第６１／７８６，０５０号（この出願は、その全体が参考として本明細書に援用される）に対する優先権を主張する。
【０００２】
配列表に関する記載
本出願に関連する配列表は、ハードコピーの代わりにテキストフォーマットで提供し、参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名前は、ＡＰＥＸ＿０１４＿０１ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。テキストファイルは１１７ＫＢであり、２０１４年３月１１日に作成され、ＥＦＳ−Ｗｅｂにより電子出願した。
【０００３】
背景
技術分野
本発明は、概して抗ＲＡＮＫＬ抗体、ならびにこれを使用する組成物および方法に関する。より詳しくは、本発明は、抗ＲＡＮＫＬ抗体およびそれらの製造および用途に関する。そのような抗体は、たとえば、骨転移等の種々の骨再吸収性疾患および腫瘍性疾患のいずれかを処置する方法において有用である。
【背景技術】
【０００４】
関連技術の説明
骨の形態形成および再構築は、発達期および成人期を通して骨構造を代謝し、再構築する骨再吸収性破骨細胞および骨形成性骨芽細胞の協調作用により達成される。骨は、基本的多細胞単位と呼ばれる骨格内の特定の部位で、絶えず再吸収され、形成される。ヒトの体内の骨の総質量の１０％が、毎年再構築されると推定される。活性化時、造血性単球／マクロファージ前駆体から区別する破骨細胞は、基本的多細胞単位に移動し、骨の一部を再吸収し、最後にはアポトーシスを起こす。続いて、前造骨性／間質細胞から発生する、新しく生成した骨芽細胞が、再吸収部位で骨を形成する。破骨細胞の発達は前造骨性細胞により制御され、その結果、骨の再吸収および形成のプロセスは強く協調され、したがって、骨形成の波を骨再吸収の各サイクルの後に続くようにする。骨芽細胞活性と破骨細胞活性との間のアンバランスにより、骨の質量の減少（骨粗鬆症）または増加（大理石骨病）を特徴とする、骨格異常になる可能性がある（Ｋｈｏｓｌａ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、２００１、１４２、５０５０−５０５５、Ｎａｋａｓｈｉｍａら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．、２００３、１５、２８０−２８７）。
【０００５】
骨芽細胞と破骨細胞との間の情報交換は、サイトカインおよび細胞間接触を介して起こる。骨再構築において重要な調節的役割を担うサイトカインは、ＮＦ−カッパＢリガンドの受容体活性化因子（ＲＡＮＫＬ）である。ＲＡＮＫＬは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーメンバーとして最初に同定され［腫瘍壊死因子関連活性化誘発サイトカイン（ＴＲＡＮＣＥ）、破骨細胞分化抑制因子リガンド（ＯＰＧＬ）、ならびに破骨細胞分化因子（ＯＤＦ）および腫瘍壊死因子（リガンド）スーパーファミリーメンバー１１（ＴＮＦＳＦ１１）としても知られる］、続いて、インビトロで破骨細胞分化を誘発することができる因子として同定された（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９７、３９０、１７５−１７９、Ｌａｃｅｙら、Ｃｅｌｌ、１９９８、９３、１６５−１７６、Ｗｏｎｇら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９９７、１８６、２０７５−２０８０、Ｙａｓｕｄａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９８、９５、３５９７−３６０２）。ヒトＲＡＮＫＬ遺伝子は、染色体１３ｑ１４に位置する。ＲＡＮＫＬの最高発現レベルは、骨、骨髄およびリンパ系組織内で見いだされ（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９７、３９０、１７５−１７９、Ｌａｃｅｙら、Ｃｅｌｌ、１９９８、９３、１６５−１７６、Ｗｏｎｇら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９９７、１８６、２０７５−２０８０、Ｙａｓｕｄａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９８、９５、３５９７−３６０２）、脳、心臓、腎臓、骨格筋および皮膚でも検出可能である（Ｋａｒｔｓｏｇｉａｎｎｉｓら、Ｂｏｎｅ、１９９９、２５、５２５−５３４）。
【０００６】
ＲＡＮＫＬは、３種のＲＡＮＫＬサブユニットから組み立てられ、機能的三量体分子を形成する。ＲＡＮＫＬは、最初は、細胞膜に固着し、メタロプロテアーゼ−ディスインテグリンＴＮＦ−アルファ転換酵素（ＴＡＣＥ）のタンパク質分解作用により細胞表面から放出されるタンパク質の小さな分画である（Ｌｕｍら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９９、２７４、１３６１３−１３６１８）。ＲＡＮＫＬは、破骨細胞分化および活性を刺激するのに、および破骨細胞アポトーシスを抑制するのに必要充分である（Ｆｕｌｌｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９９８、１８８、９９７−１００１、Ｌａｃｅｙら、Ｃｅｌｌ、１９９８、９３、１６５−１７６、Ｌｕｍら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９９、２７４、１３６１３−１３６１８、Ｙａｓｕｄａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９８、９５、３５９７−３６０２）。ＲＡＮＫは、前造骨性細胞および骨髄間質細胞の表面で発現する。その発現は、ビタミン−Ｄ３、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、インターロイキン１−ベータおよびＴＮＦ−アルファをはじめとする種々のホルモン、サイトカイン、成長因子およびグルココルチコイドによって、正または負に調節可能で、これらは全て、ＲＡＮＫＬ発現を増加する（Ｋｏｎｇら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ、２０００、２１、４９５−５０２）。
【０００７】
骨再吸収および形成のサイクルの開始で、ＲＡＮＫＬは前破骨（ｐｒｅｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｉｃ）細胞上のその機能的受容体ＲＡＮＫに結合する（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９７、３９０、１７５−１７９、Ｌａｃｅｙら、Ｃｅｌｌ、１９９８、９３、１６５−１７６）。ＲＡＮＫＬとＲＡＮＫとの間のこの相互作用により、多核形成、骨再吸収機能、および系統特異的マーカー酒石酸塩抵抗性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）の発現を表現型的に特徴とする、成熟した破骨細胞の形成が刺激される（Ｂｕｒｇｅｓｓら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９９、１４５、５２７−５３８、Ｈｓｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、１９９９、９６、３５４０−３５４５、Ｌｕｍら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９９、２７４、１３６１３−１３６１８、Ｙａｓｕｄａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９８、９５、３５９７−３６０２）。あるいは、ＲＡＮＫＬは、主に骨髄間質細胞によって発現し、ＲＡＮＫＬによる破骨細胞の成熟および活性化を抑制するように働く可溶性受容体破骨細胞分化抑制因子（ＯＰＧ）に結合できる（Ｌａｃｅｙら、Ｃｅｌｌ、１９９８、９３、１６５−１７６、Ｙａｓｕｄａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９８、９５、３５９７−３６０２）。骨再構築の主要な制御因子であるＰＴＨは、ＯＰＧ発現を減少させ、同時にＲＡＮＫＬ発現を増加させることによって、破骨細胞機能を刺激する（ＬｅｅおよびＬｏｒｅｎｚｏ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１９９９、１４０、３５５２−３５６１）。前造骨性細胞が分化すると、ＲＡＮＫＬ  ｍＲＮＡレベルは有意に減少し、一方ＯＰＧ  ｍＲＮＡレベルは増加する（Ｇｏｒｉら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、２０００、１４１、４７６８−４７７６）。このようなＲＡＮＫＬレベルとＯＰＧレベルとの間の動的関係により破骨細胞活性の波、次いで骨芽細胞活性の波が起こるようにし、これにより骨の再吸収および形成のサイクルが完了する。
【０００８】
ＲＡＮＫＬは、細胞内ストアからのカルシウムの放出により、破骨細胞中のカルシウムの一過性上昇を誘発する（Ｋｏｍａｒｏｖａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２００３、２７８、８２８６−８２９３）。Ｔ細胞では、Ｔ細胞受容体活性化誘発カルシウム流動は、ＲＡＮＫＬ発現の誘発を引き起こすだけである（Ｗａｎｇら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００２、３２、１０９０−１０９８）。
【０００９】
ＲＡＮＫＬ遺伝子の破壊に関しホモ接合体であるマウスは、予期される頻度で生まれるが、３週齢で離乳した後、重度の成長遅滞を示す。ＲＡＮＫＬ欠損マウスは、破骨細胞形成をサポートする骨芽細胞が無能であるため、重度の大理石骨病（骨の肥厚）、歯の萌出における欠陥、および破骨細胞の完全な欠乏を示す（Ｋｏｎｇら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ、２０００、２１、４９５−５０２）。
【００１０】
ＲＡＮＫＬ機能は、骨形態形成および再構築に限られない。ＲＡＮＫＬ−欠損マウスも、Ｔリンパ球およびＢリンパ球の初期分化において欠損を示し、全てのリンパ節を欠き、ＲＡＮＫＬは、必須の破骨細胞分化因子であるほかに、リンパ節器官形成およびリンパ球発生の制御因子であることを実証する（Ｋｏｎｇら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ、２０００、２１、４９５−５０２）。Ｔ細胞受容体刺激はＲＡＮＫＬ遺伝子発現を誘発し、次いで、Ｔ細胞内のｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼの活性化を促す（Ｗｏｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９７、２７２、２５１９０−２５１９４）。また、ＲＡＮＫＬは、骨髄由来樹状細胞でアポトーシスを阻害することによって、骨髄誘導樹状細胞の重要な生存因子として免疫系機能に関与する（Ｌｕｍら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９９、２７４、１３６１３−１３６１８、Ｗｏｎｇら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９９７、１８６、２０７５−２０８０）。さらに、ＲＡＮＫＬは、マウスにおいて、妊娠期間中、小葉腺胞乳房構造の発達にも必要である（Ｆａｔａら、Ｃｅｌｌ、２０００、１０３、４１−５０）。
【００１１】
ＲＡＮＫＬによる破骨細胞の不適切な活性化により、骨の再吸収の過程間でアンバランスが生じ、その結果、骨の再吸収速度が骨形成の速度を超えることになる。局所または全身的な骨喪失は、閉経後骨粗鬆症および加齢性骨粗鬆症、歯周炎、家族性膨張性骨溶解症（ｆａｍｉｌｉａｌ  ｅｘｐａｎｓｉｌｅ  ｏｓｔｅｏｌｙｓｉｓ）ならびにパジェット病をはじめとする、多くの骨減少性障害に観察される（Ｋｈｏｓｌａ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、２００１、１４２、５０５０−５０５５）。ＲＡＮＫＬ  ｍＲＮＡの上方制御には、これらの疾患のいくつかが報告されている。
【００１２】
パジェット病は、骨再吸収の増加を誘発する多数の異常破骨細胞を特徴とする。ＲＡＮＫＬ  ｍＲＮＡ発現は、パジェット病患者に由来する細胞株および骨髄の両方において上昇する。さらに、パジェット病患者からの破骨細胞前駆体は、正常細胞に比べ非常に低いＲＡＮＫＬ濃度で破骨細胞形成を起こす（Ｍｅｎａａら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、２０００、１０５、１８３３−１８３８）。
【００１３】
骨減少性病態を伴う他の疾患、たとえば、関節リウマチ、慢性ウィルス感染症ならびに成人性および小児性白血病は、活性化Ｔ細胞および骨破壊を特徴とする（Ｋｏｎｇら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ、２０００、２１、４９５−５０２）。関節リウマチは、進行性破骨細胞介在骨再吸収を特徴とする慢性炎症性疾患である。関節リウマチの関節液は、破骨細胞前駆体、ＲＡＮＫＬ発現Ｔ細胞、およびＯＰＧ生成Ｂ細胞を含む。関節リウマチの関節液からの培養マクロファージは、ＲＡＮＫＬ依存性過程において、破骨細胞に分化し得る（Ｉｔｏｎａｇａら、Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、２０００、１９２、９７−１０４）。ヒト関節リウマチの臨床的特徴の多くを模倣する実験的に誘発された関節炎のＴ細胞依存性ラットモデルにおいて、ＯＰＧ処置によるＲＡＮＫＬ機能の阻害は、骨破壊を防ぐ（Ｋｏｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９９、４０２、３０４−３０９）。
【００１４】
多発性骨髄腫は、骨粗鬆症および骨破壊が顕著な特徴の癌である。ミエローマ細胞株は、ＲＡＮＫＬ発現を刺激し、一方、骨髄間質細胞によりＯＰＧ発現が阻害され、その結果、ＲＡＮＫＬレベルとＯＰＧレベルとの間のバランスが壊れ、破骨細胞の異常な生成および活性化が起こる（Ｐｅａｒｓｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２００１、９８、１１５８１−１１５８６）。ＲＡＮＫＬの分泌形も悪性の体液高カルシウム血症を引き起こす癌細胞によって発現される（Ｎａｇａｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２０００、２６９、５３２−５３６）。ＯＰＧ発現の同時減少に伴うＲＡＮＫＬの増加も、骨芽細胞系統細胞のグルココルチコイド処置後に観察され、これは、前記細胞の破骨細胞形成も刺激し、グルココルチコイドを全身的に使用することにより重度の骨粗鬆症になるメカニズムを示唆する（Ｈｏｆｂａｕｅｒら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１９９９、１４０、４３８２−４３８９）。
【００１５】
これらの発見は、免疫機能と骨生理機能との間の連結を示し、また、免疫障害に関連する骨密度損失の分子的な説明を提供し、ＲＡＮＫＬ機能の阻害およびその結果としての破骨細胞の活性は、骨減少性症状を寛解させ得ることを示唆する（Ｋｏｎｇら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ、２０００、２１、４９５−５０２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｋｈｏｓｌａ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ（２００１）１４２、５０５０〜５０５５
【非特許文献２】Ｎａｋａｓｈｉｍａら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．（２００３）１５、２８０〜２８７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
多くの疾患におけるＲＡＮＫＬ関与の結果として、ＲＡＮＫＬの発現の上方制御が、非常に多くの異なる種類の骨減少性疾患に関連することを考えれば、骨破壊を特徴とする障害の処置にとりわけ重要である、ＲＡＮＫＬ機能を効果的に阻害し得る追加の薬剤の必要性が残っている。
【００１８】
本発明は、ＲＡＮＫＬ機能を阻害する組成物および方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明の一態様は、（ｉ）配列番号：３で表されるＶＨＣＤＲ１領域と、配列番号：４で表されるＶＨＣＤＲ２領域と、配列番号：５で表されるＶＨＣＤＲ３領域とを含む重鎖可変領域と、（ｉｉ）配列番号：６または１５で表されるＶＬＣＤＲ１領域と、配列番号：７で表されるＶＬＣＤＲ２領域と、配列番号：８で表されるＶＬＣＤＲ３領域とを含む軽鎖可変領域とを含む、ＲＡＮＫＬに結合する単離抗体またはその抗原結合フラグメント、または前記ＣＤＲ領域における８個までのアミノ酸置換を除いて、（ｉ）および（ｉｉ）の重鎖可変領域および軽鎖可変領域と同一の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む前記抗体の改変体、またはその抗原結合フラグメントを提供する。本明細書に記載の単離抗体、またはその抗原結合フラグメントの一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含む。本明細書に記載の単離抗体、またはその抗原結合フラグメントの他の実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号：２で表されるアミノ酸配列を含む。
【００２０】
本発明の他の態様は、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、ＲＡＮＫＬに結合する単離抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。一実施形態では、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む単離抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号：２で表されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域も含む。さらなる実施形態では、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む単離抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号：２で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域も含む。
【００２１】
本発明の他の態様は、配列番号：２で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、ヒトＲＡＮＫＬに結合する単離抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。一実施形態では、配列番号：２で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む単離抗体、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号：１で表されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域も含む。
【００２２】
ある実施形態では、本明細書の抗体はヒト化されている。例示的ヒト化抗体は、配列番号：９で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ領域と、配列番号：１０または１１で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ領域とを含んでもよい。ある他の実施形態では、ヒト化抗体は、配列番号：２２６で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ領域と、配列番号：２２７で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ領域とを含んでもよい。他の実施形態では、ヒト化抗体は、配列番号：２２９で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ領域と、配列番号：２３０で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ領域とを含んでもよい。さらに他の実施形態では、ヒト化抗体は、配列番号：２３１で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ領域と、配列番号：２３２で表されるアミノ酸配列を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）ＶＬ領域とを含んでもよい。
【００２３】
ある実施形態では、本明細書の抗体は、単鎖抗体、ＳｃＦｖ、ヒンジ領域を欠く一価抗体、およびミニボディからなる群より選択されてもよい。一実施形態では、抗体は、ＦａｂまたはＦａｂ’フラグメントである。他の実施形態では、抗体は、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントまたは全抗体である。ある他の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、ヒトＩｇＧ定常ドメインを含む。一実施形態では、ＩｇＧ定常ドメインは、ＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインを含む。他の実施形態では、ＩｇＧ定常ドメインは、ＩｇＧ２  Ｆｃ領域を含む。
【００２４】
本発明の他の態様は、特定のヒトＲＡＮＫＬにおいて、ＲＡＮＫＬに結合するために、本明細書に記載の抗体いずれかと競合する抗体を提供する。
【００２５】
本発明の他の態様は、約０．１６ｎＭまたはそれ未満のＫＤでＲＡＮＫＬを結合する単離抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。ある実施形態では、本発明で記載の抗体は、約０．０１６ｎＭと０．３６ｎＭとの間のＫＤでＲＡＮＫＬに結合する。ある実施形態では、本明細書に記載の抗体は、約０．０２６ｎＭと０．２６ｎＭとの間のＫＤでＲＡＮＫＬに結合する。ある実施形態では、本明細書に記載の抗体は、約０．０３６ｎＭと０．３６ｎＭとの間のＫＤでＲＡＮＫＬに結合する。ある実施形態では、本発明に記載の抗体は、約０．０５ｎＭ、０．０６ｎＭ、０．０７ｎＭ、０．０８ｎＭ、０．０９ｎＭ、０．１ｎＭ、０．１５ｎＭ、０．１６ｎＭ、０．１７ｎＭ、０．１８ｎＭ、０．１９ｎＭ、０．２ｎＭ、０．２５ｎＭ、０．３ｎＭ、０．３５ｎＭ、または０．４ｎＭのＫＤでＲＡＮＫＬに結合する。
【００２６】
本発明の他の態様は、（ａ）ＲＡＮＫＬのＲＡＮＫへの結合を妨害する、（ｂ）ＲＡＮＫＬ誘発破骨細胞分化を阻害する、（ｃ）破骨細胞活性を阻害する、（ｄ）骨喪失を阻害し、骨密度を増やす、（ｅ）ヒトおよびげっ歯類ＲＡＮＫＬの両方を結合し、阻害する、または（ｆ）ａ．〜ｅ．の任意の１つまたはそれより多くの組合わせを行う、単離抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【００２７】
本発明の他の態様は、本明細書に記載するように、単離抗体をコード化する単離ポリヌクレオチド、またはその抗原結合フラグメントも提供する。本発明は、単離抗体をコード化するポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および該ベクターを含む単離宿主細胞も提供する。
【００２８】
本発明の他の態様は、生理的に許容され得る担体と、治療的有効量の本明細書に記載の単離抗体またはその抗原結合フラグメントとを含む組成物を提供する。
【００２９】
本発明のさらに他の態様は、骨減少性障害を持つ患者を処置する方法であって、該患者に、生理的に許容され得る担体と、治療的有効量の本明細書に記載の単離抗体またはその抗原結合フラグメントとを含む組成物を投与することにより骨減少性障害を処置することを含む方法を提供する。この点に関し、骨減少性障害は、骨粗鬆症、歯周炎、癌関連骨転移、多発性骨髄腫、関節リウマチ、乾癬性関節炎、家族性膨張性骨溶解症、パジェット病、若年性パジェット病、破骨細胞腫、慢性ウィルス感染症ならびに成人性および小児性白血病に関連する骨喪失、ならびにプロテーゼ周囲の骨喪失からなる群より選択される。
【００３０】
本発明の他の態様は、（ｉ）図１に示すＶＨ領域のいずれか１つのＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、（ｉｉ）図１に示す抗体のいずれか１つの対応ＶＬ領域のＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域とを含む、ＲＡＮＫＬに結合する単離抗体またはその抗原結合フラグメント、または前記ＣＤＲ領域における８個までのアミノ酸置換を除いて、（ｉ）および（ｉｉ）の重鎖可変領域および軽鎖可変領域と同一の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む前記抗体の改変体、またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【００３１】
本発明のさらに他の態様は、図１に示すＶＨ領域のいずれか１つを含む重鎖可変領域を含む、ＲＡＮＫＬに結合する単離抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。この点に関し、そのような抗体は、図１に示すような対応ＶＬ領域に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をさらに含んでもよい。他の実施形態では、そのような抗体は、図１に示すような対応軽鎖可変領域をさらに含んでもよい。
【００３２】
本発明のさらなる態様は、図１に示すＶＬ領域のいずれか１つを含む軽鎖可変領域を含む、ＲＡＮＫＬに結合する単離抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。この点に関し、そのような抗体は、図１に示すような対応ＶＨ領域に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域をさらに含んでもよく、または図１に示すような対応重鎖可変領域をさらに含んでもよい。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
（ｉ）配列番号：３で表されるＶＨＣＤＲ１領域と、配列番号：４で表されるＶＨＣＤＲ２領域と、配列番号：５で表されるＶＨＣＤＲ３領域とを含む重鎖可変領域と、（ｉｉ）配列番号：６または１５で表されるＶＬＣＤＲ１領域と、配列番号：７で表されるＶＬＣＤＲ２領域と、配列番号：８で表されるＶＬＣＤＲ３領域とを含む軽鎖可変領域とを含む、ＲＡＮＫＬに結合する単離抗体またはその抗原結合フラグメント、あるいは前記ＣＤＲ領域における８個までのアミノ酸置換を除いて、（ｉ）および（ｉｉ）の重鎖可変領域および軽鎖可変領域と同一の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む前記抗体の改変体、またはその抗原結合フラグメント。
（項目２）
前記重鎖可変領域が、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含む、項目１に記載の単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目３）
前記軽鎖可変領域が、配列番号：２で表されるアミノ酸配列を含む、項目１に記載の単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目４）
配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、ＲＡＮＫＬに結合する単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目５）
配列番号：２で表されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、項目４に記載の単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目６）
配列番号：２で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、項目４に記載の単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目７）
配列番号：２で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、ヒトＲＡＮＫＬに結合する単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目８）
配列番号：１で表されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、項目７に記載の単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目９）
前記抗体がヒト化されている、項目１に記載の単離抗体。
（項目１０）
（ａ）前記ＶＨ領域が配列番号：９で表されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ領域が配列番号：１０または１１で表されるアミノ酸配列を含む、または（ｂ）前記ＶＨ領域が配列番号：２２６で表されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ領域が配列番号：２２７で表されるアミノ酸配列を含む、項目９に記載の単離抗体。
（項目１１）
前記抗体が、単鎖抗体、ＳｃＦｖ、ヒンジ領域を欠く一価抗体、およびミニボディからなる群より選択される、項目１に記載の単離抗体。
（項目１２）
前記抗体が、ＦａｂまたはＦａｂ’フラグメントである、項目１に記載の単離抗体。
（項目１３）
前記抗体が、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントである、項目１に記載の単離抗体。
（項目１４）
前記抗体が、全抗体である、項目１に記載の単離抗体。
（項目１５）
ヒトＩｇＧ定常ドメインを含む、項目１に記載の単離抗体。
（項目１６）
前記ＩｇＧ定常ドメインが、ＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインを含む、項目１５に記載の単離抗体。
（項目１７）
前記ＩｇＧ定常ドメインが、ＩｇＧ２  Ｆｃ領域を含む、項目１５に記載の単離抗体。
（項目１８）
ヒトＲＡＮＫＬへの結合に関して、項目１に記載の抗体と競合する、単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目１９）
約０．１６ｎＭまたはそれ未満のＫＤでＲＡＮＫＬを結合する、単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目２０）
ａ．ＲＡＮＫＬのＲＡＮＫへの結合を妨害する、
ｂ．ＲＡＮＫＬ誘発破骨細胞分化を阻害する、
ｃ．破骨細胞活性を阻害する、
ｄ．骨喪失を阻害し、かつ骨密度を増やす、
ｅ．ヒト、げっ歯類およびサルのＲＡＮＫＬを結合し、かつそれを阻害する、または
ｆ．ａ．〜ｅ．のうちの任意の１つまたはそれより多くの組合わせを行う、
単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目２１）
項目１または項目１０に記載の単離抗体またはその抗原結合フラグメントをコード化する、単離ポリヌクレオチド。
（項目２２）
項目２１に記載の単離ポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
（項目２３）
項目２２に記載のベクターを含む、単離宿主細胞。
（項目２４）
生理的に許容され得る担体と、治療的有効量の項目１または項目１０に記載の単離抗体またはその抗原結合フラグメントとを含む、組成物。
（項目２５）
骨減少性障害にかかっている患者を処置するための方法であって、前記患者に、項目２４に記載の組成物を投与することにより、前記骨減少性障害を処置することを含む、方法。
（項目２６）
前記骨減少性障害が、骨粗鬆症、歯周炎、癌関連骨転移、多発性骨髄腫、関節リウマチ、乾癬性関節炎、家族性膨張性骨溶解症、パジェット病、若年性パジェット病、破骨細胞腫、慢性ウィルス感染症ならびに成人性および小児性白血病に関連する骨喪失、ならびにプロテーゼ周囲の骨喪失からなる群より選択される、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
（ｉ）図１に示すＶＨ領域のいずれか１つのＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、（ｉｉ）図１に示す抗体のいずれか１つの対応ＶＬ領域のＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域とを含む、ＲＡＮＫＬに結合する単離抗体またはその抗原結合フラグメント、または前記ＣＤＲ領域における８個までのアミノ酸置換を除いて、（ｉ）および（ｉｉ）の重鎖可変領域および軽鎖可変領域と同一の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む前記抗体の改変体、またはその抗原結合フラグメント。
（項目２８）
図１に示すＶＨ領域のいずれか１つを含む重鎖可変領域を含む、ＲＡＮＫＬに結合する単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目２９）
図１に示す対応ＶＬ領域に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をさらに含む、項目２８に記載の単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目３０）
図１に示す対応軽鎖可変領域をさらに含む、項目２９に記載の単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目３１）
図１に示すＶＬ領域のいずれか１つを含む軽鎖可変領域を含む、ＲＡＮＫＬに結合する単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目３２）
図１に示す対応ＶＨ領域に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域をさらに含む、項目３１に記載の単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目３３）
図１に示す対応重鎖可変領域をさらに含む、項目３１に記載の単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１−１】図１Ａおよび図１Ｂは、それぞれ、４０の抗−ＲＡＮＫＬウサギ抗体重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列アラインメントを示す。図１Ｃは、クローン２３ウサギ親クローンおよびヒト化クローン２３  ＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列アラインメントを示す。図１に示されたＶＨおよびＶＬ配列に関する配列番号は、配列番号：１、２、９〜１１および１６〜９３で表される。下線が引かれたＣＤＲ配列は、配列番号：３〜８、１３〜１５および９４〜２２５で表される。図１Ｄは、クローン４０８ウサギ親クローンおよびヒト化クローン４０８  ＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列アラインメントを示す。図１Ｅは、クローンＥＢＩ５１−２２ウサギ親クローンおよびヒト化クローンＥＢＩ−５１−２２  ＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列アラインメントを示す。
【図１−２】図１Ａおよび図１Ｂは、それぞれ、４０の抗−ＲＡＮＫＬウサギ抗体重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列アラインメントを示す。図１Ｃは、クローン２３ウサギ親クローンおよびヒト化クローン２３  ＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列アラインメントを示す。図１に示されたＶＨおよびＶＬ配列に関する配列番号は、配列番号：１、２、９〜１１および１６〜９３で表される。下線が引かれたＣＤＲ配列は、配列番号：３〜８、１３〜１５および９４〜２２５で表される。図１Ｄは、クローン４０８ウサギ親クローンおよびヒト化クローン４０８  ＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列アラインメントを示す。図１Ｅは、クローンＥＢＩ５１−２２ウサギ親クローンおよびヒト化クローンＥＢＩ−５１−２２  ＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列アラインメントを示す。
【図１−３】図１Ａおよび図１Ｂは、それぞれ、４０の抗−ＲＡＮＫＬウサギ抗体重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列アラインメントを示す。図１Ｃは、クローン２３ウサギ親クローンおよびヒト化クローン２３  ＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列アラインメントを示す。図１に示されたＶＨおよびＶＬ配列に関する配列番号は、配列番号：１、２、９〜１１および１６〜９３で表される。下線が引かれたＣＤＲ配列は、配列番号：３〜８、１３〜１５および９４〜２２５で表される。図１Ｄは、クローン４０８ウサギ親クローンおよびヒト化クローン４０８  ＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列アラインメントを示す。図１Ｅは、クローンＥＢＩ５１−２２ウサギ親クローンおよびヒト化クローンＥＢＩ−５１−２２  ＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列アラインメントを示す。
【図１−４】図１Ａおよび図１Ｂは、それぞれ、４０の抗−ＲＡＮＫＬウサギ抗体重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列アラインメントを示す。図１Ｃは、クローン２３ウサギ親クローンおよびヒト化クローン２３  ＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列アラインメントを示す。図１に示されたＶＨおよびＶＬ配列に関する配列番号は、配列番号：１、２、９〜１１および１６〜９３で表される。下線が引かれたＣＤＲ配列は、配列番号：３〜８、１３〜１５および９４〜２２５で表される。図１Ｄは、クローン４０８ウサギ親クローンおよびヒト化クローン４０８  ＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列アラインメントを示す。図１Ｅは、クローンＥＢＩ５１−２２ウサギ親クローンおよびヒト化クローンＥＢＩ−５１−２２  ＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列アラインメントを示す。
【図２】図２Ａ〜図２Ｄは、４０抗ＲＡＮＫＬ抗体のＲＡＮＫＬ−遺伝子導入された２９３細胞への結合を示すグラフである。
【図３−１】図３Ａ〜図３Ｇは、ＲＡＮＫＬのその同族受容体（ＲＡＮＫ）への結合を妨害する、抗ＲＡＮＫＬ抗体の能力を示す。
【図３−２】図３Ａ〜図３Ｇは、ＲＡＮＫＬのその同族受容体（ＲＡＮＫ）への結合を妨害する、抗ＲＡＮＫＬ抗体の能力を示す。
【図４】図４Ａ〜図４Ｄは、ヒトＲＡＮＫＬおよびマウスＲＡＮＫＬを有する抗ＲＡＮＫＬ抗体の交差反応性を示す棒グラフである。
【図５】図５は、ＲＡＮＫＬで誘発された破骨細胞の細胞分化の抗ＲＡＮＫＬ抗体による阻害を示すグラフである。
【図６】図６Ａおよび図６Ｂは、それらの親ウサギ抗体と比較した、２９３細胞の表面で発現するＲＡＮＫＬへのヒト化抗ＲＡＮＫＬ抗体２３および４０８の結合を示すグラフである。使用したクローン２３ヒト化重鎖および軽鎖は、図で示すように、配列番号：１０（２３Ｖｋ）または１１（２３Ｖｋｂ）で表されるヒト化ＶＬのいずれかを有する、ＶＨ  ２３ＨＺＤ−１  ＨＣ（ＶＨ配列は、配列番号：９で表される）であった。
【図７】図７Ａ〜図７Ｃは、ヒト化抗体２３、４０８およびＥＢＩ−５１−２２は、それらの親ウサギクローンと比較して、ＲＡＮＫへのＲＡＮＫＬ結合の同等の妨害活性を実証したことを示す。使用したクローン２３ヒト化重鎖および軽鎖は、図示するように、配列番号：１０（２３Ｖｋ）または１１（２３Ｖｋｂ）で表されるヒト化ＶＬのいずれかを有する、ＶＨ  ２３ＨＺＤ−１  ＨＣ（ＶＨ配列は、配列番号：９で表される）であった。
【図８】図８Ａおよび図８Ｂは、ヒト化抗ＲＡＮＫＬ抗体２３、４０８およびＥＢＩ−５１−２２のヒトＲＡＮＫＬによって誘発された破骨細胞分化を阻害する能力を示す。使用したクローン２３ヒト化重鎖および軽鎖は、図示するように、配列番号：１０（２３Ｖｋ）または１１（２３Ｖｋｂ）で表されるヒト化ＶＬのいずれかを有する、ＶＨ  ２３ＨＺＤ−１  ＨＣ（ＶＨ配列は、配列番号：９で表される）であった。
【図９】図９Ａおよび図９Ｂは、ヒト化抗ＲＡＮＫＬ抗体２３、４０８およびＥＢＩ−５１−２２のマウスＲＡＮＫＬによって誘発された破骨細胞分化を阻害する能力を示す。使用したクローン２３ヒト化重鎖および軽鎖は、図示するように、配列番号：１０（２３Ｖｋ）または１１（２３Ｖｋｂ）で表されるヒト化ＶＬのいずれかを有する、ＶＨ  ２３ＨＺＤ−１  ＨＣ（ＶＨ配列は、配列番号：９で表される）であった。
【図１０】図１０は、ウサギ抗ＲＡＮＫＬ抗体２３がインビボで有意に破骨細胞活性を阻害したことを示す。
【図１１】図１１は、ＯＶＸマウスにおいて、抗ＲＡＮＫＬ抗体２３が骨密度を有意に増加したことを実証する棒グラフである。使用したクローン２３ヒト化重鎖および軽鎖は、配列番号：１１（２３Ｖｋｂ）で表されるヒト化ＶＬを有するＶＨ  ２３ＨＺＤ−１  ＨＣ（ＶＨ配列は、配列番号：９で表される）であった。
【図１２】図１２は、ｈ２３ｎ  ＩｇＧ２ヒト化クローン２３抗体を、図示するように、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２を持つクローン２３ヒト化ＶＨ  ２３ＨＺＤ−１  ＨＣ／ヒト化Ｖｋｂ軽鎖と比較したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
配列の簡単な説明
配列番号：１は、クローン２３ウサギ抗ＲＡＮＫＬ抗体のＶＨ領域のアミノ酸配列である。
【００３５】
配列番号：２は、クローン２３ウサギ抗ＲＡＮＫＬ抗体のＶＬ領域のアミノ酸配列である。
【００３６】
配列番号：３は、クローン２３ウサギ抗ＲＡＮＫＬ抗体のＶＨＣＤＲ１領域のアミノ酸配列である。
【００３７】
配列番号：４は、クローン２３ウサギ抗ＲＡＮＫＬ抗体のＶＨＣＤＲ２領域のアミノ酸配列である。
【００３８】
配列番号：５は、クローン２３ウサギ抗ＲＡＮＫＬ抗体のＶＨＣＤＲ３領域のアミノ酸配列である。
【００３９】
配列番号：６は、クローン２３ウサギ抗ＲＡＮＫＬ抗体のＶＬＣＤＲ１領域のアミノ酸配列である。
【００４０】
配列番号：７は、クローン２３ウサギ抗ＲＡＮＫＬ抗体のＶＬＣＤＲ２領域のアミノ酸配列である。
【００４１】
配列番号：８は、クローン２３ウサギ抗ＲＡＮＫＬ抗体のＶＬＣＤＲ３領域のアミノ酸配列である。
【００４２】
配列番号：９は、クローン２３ウサギ抗ＲＡＮＫＬ抗体（２３ＨＺＤ−１  ＨＣ）のＶＨ領域のヒト化配列のアミノ酸配列である。
【００４３】
配列番号：１０は、クローン２３ウサギ抗ＲＡＮＫＬ抗体のＶＬ領域のヒト化配列のアミノ酸配列である。本明細書では、２３ＬＨＺＤまたはＶｋとも言う。
【００４４】
配列番号：１１は、クローン２３ウサギ抗ＲＡＮＫＬ抗体のＶＬ領域の第２ヒト化配列のアミノ酸配列である。本明細書では、２３ＬＨＺＤ＿ｂまたはＶｋｂ）とも言う。
【００４５】
配列番号：１２は、クローン２３ウサギ抗ＲＡＮＫＬ抗体（２３ＨＺＤ−２  ＨＣ）のＶＨ領域の第２ヒト化配列のアミノ酸配列である。
【００４６】
配列番号：１３は、２３ＨＺＤ−２ヒト化クローン２３ウサギ抗ＲＡＮＫＬ抗体のＶＨＣＤＲ１のアミノ酸配列である。
【００４７】
配列番号：１４は、２３ＨＺＤ−２ヒト化クローン２３ウサギ抗ＲＡＮＫＬ抗体のＶＨＣＤＲ２のアミノ酸配列である。
【００４８】
配列番号：１５は、クローン２３ウサギ抗ＲＡＮＫＬ抗体（ＶＬｂＣＤＲ１）の第２ヒト化ＶＬ配列のＶＬＣＤＲ１のアミノ酸配列である。
【００４９】
【表１−１】
2018183176.tif 000002
【００５０】
【表１−２】
2018183176.tif 000003
【００５１】
【表１−３】
2018183176.tif 000004
【００５２】
【表１−４】
2018183176.tif 000005
【００５３】
【表１−５】
2018183176.tif 000006
【００５４】
【表１−６】
2018183176.tif 000007
【００５５】
【表１−７】
2018183176.tif 000008
【００５６】
【表１−８】
2018183176.tif 000009
配列番号：２２６は、クローン２３ウサギ抗ＲＡＮＫＬ抗体（ｈ２３ｎ  ＶＨ）のＶＨ領域の第３ヒト化配列のアミノ酸配列である。
【００５７】
配列番号：２２７は、クローン２３ウサギ抗ＲＡＮＫＬ抗体（ｈ２３ｎ  ＶＬ）のＶＬ領域の第３ヒト化配列のアミノ酸配列である。
【００５８】
配列番号：２２８は、ｈ２３ｎ  ＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列である。
【００５９】
配列番号：２２９は、クローン４０８ウサギ抗ＲＡＮＫＬ抗体のヒト化ＶＨ領域のアミノ酸配列である。
【００６０】
配列番号：２３０は、クローン４０８ウサギ抗ＲＡＮＫＬ抗体のヒト化ＶＬ領域のアミノ酸配列である。
【００６１】
配列番号：２３１は、クローンＥＢＩ５１−２２ウサギ抗ＲＡＮＫＬ抗体のヒト化ＶＨ領域のアミノ酸配列である。
【００６２】
配列番号：２３２は、クローンＥＢＩ５１−２２ウサギ抗ＲＡＮＫＬ抗体用ヒト化ＶＬのアミノ酸配列である。
【００６３】
詳細な説明
本開示は、特定のエピトープ特異性および機能的特性を有する特定の抗体において、ＲＡＮＫＬに特異的に結合する抗体およびその抗原結合フラグメントに関する。本発明の一実施形態は、ＲＡＮＫＬに結合し、ＲＡＮＫとのＲＡＮＫＬ結合を妨害し、ＲＡＮＫ誘発下流域細胞のシグナル伝達および生物学的効果を阻害することができる特異的ヒト化抗体およびそのフラグメントを包含する。本発明のより詳しい実施形態では、本明細書で記載される抗体は、約０．１６ｎＭの親和性でＲＡＮＫＬに特異的に結合し、ＲＡＮＫへのＲＡＮＫＬの結合を妨害する。さらなる実施形態では、本明細書で記載される抗体は、約０．０５ｎＭ〜約０．２５ｎＭの親和性でＲＡＮＫＬに特異的に結合し、ＲＡＮＫへのＲＡＮＫＬの結合を妨害する。他の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、約０．０８、０．０９、０．０９５、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．１７、０．１８、０．１９、または約０．２ｎＭ〜約０．２５ｎＭの親和性で、ＲＡＮＫＬに特異的に結合する。さらなる実施形態では、本明細書に記載される抗体は、約０．１６ｎＭまたはそれ未満の親和性でＲＡＮＫＬに特異的に結合し、ＲＡＮＫへのＲＡＮＫＬの結合を妨害する。
【００６４】
本発明の実施形態は、ＲＡＮＫに関連する疾患および障害、またはその異常な発現の診断、判定および処置のための抗ＲＡＮＫＬ抗体またはその抗原結合フラグメントの使用に関する。対象抗体は、疾患の中でもとりわけ、骨粗鬆症、歯周炎、癌関連骨転移、多発性骨髄腫、関節リウマチ、乾癬性関節炎、家族性膨張性骨溶解症、パジェット病（若年性パジェット病を含む）破骨細胞腫、慢性ウィルス感染症ならびに成人性および小児性白血病に関連する骨喪失、ならびにプロテーゼ周囲の骨喪失を始めとする骨減少性障害の処置または予防において使用される。
【００６５】
本発明の実践は、特に反対のことが示されない限り、当該技術範囲内のウィルス学、免疫学、微生物学、分子生物学および組換えＤＮＡ技術の従来の方法を採用するであろう。その多くを、説明の目的のために以下に記載する。それらの技術は、下記文献に充分に説明されている。たとえば、以下を参照のこと。Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｒ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（２００９）、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第３編、Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９９５、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３編、２００１）、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８２）、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｉ  ＆  ＩＩ巻（Ｄ．  Ｇｌｏｖｅｒ編）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ編、１９８４）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．  Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８５）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）、Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８６）、Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）、および他の類似する文献。
【００６６】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、内容が明確に他のことを示していない限り、複数形のものを含む。
【００６７】
文脈で他のことを要求しない限り、本明細書全体を通して、用語「含む“ｃｏｍｐｒｉｓｅ”」またはその変形「含む“ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ”」または「含んでいる“ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ”」は、記載された１つの要件、または複数の要件あるいは完全体の完全体または群を含むことが含意され、任意の他の要件、または複数の要件あるいは完全体の完全体または群を排除するものではないことが理解されるだろう。
【００６８】
本明細書の各実施形態は、他に明らかに記載がない限り、必要な変更を加えて、全ての他の実施形態に適用されるものである。
【００６９】
組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、ならびに組織培養および形質転換には、標準的な技術を使用してもよい（たとえば、エレクトロポレーション、リポフェクション）。酵素反応および精製技術は、製造者の仕様書に従って、当該技術分野で既知の方法で、または本明細書に記載されるように行ってもよい。これらおよび関連する技術および手順は、当該分野で周知の従来の方法に従って、本明細書全体に引用され、検討されている種々の普遍的でより詳しい参考文献に記載のように、通例通りに行ってもよい。特に定義されていない限り、本明細書に記載される分子生物学、分析化学、合成有機化学、ならびに医学および薬学化学に関連して利用されている命名法およびそれらの実験法および技術は、当該分野で周知であり、よく使用されているものである。組換え技術、分子生物学的、微生物学的、化学的合成、化学分析、製剤、処方、および伝達、および患者の処置に関しては、標準的な技術を使用してもよい。
【００７０】
本発明の実施形態は、ＲＡＮＫＬに結合する抗体に関する。特に、本明細書に記載される抗体は、予測できないほど高い親和性でＲＡＮＫＬに特異的に結合し、ＲＡＮＫＬへのＲＡＮＫの結合を妨害し、ＲＡＮＫ活性を妨害し、異常なＲＡＮＫ発現に関連する疾患の処置に治療的な有用性を有する。また、本明細書に記載される抗体は、種々のＲＡＮＫＬ介在生物学的効果を阻害する能力等の有利な特性も持つ（たとえば、破骨細胞の細胞分化および／または活性、骨密度の喪失／減少）。また、本明細書に記載される抗体は、ＲＡＮＫＬ受容体内部移行に対する効果も持ち得る。
【００７１】
ヒト化バージョンを含む、例示的抗体、抗原結合フラグメント、ＶＨ、ＶＬ、またはその相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列は、配列番号：１〜２３２で表される。
【００７２】
当該分野で周知のように、抗体は、イムノグロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１つのエピトープ認知部位を介して、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチド等の標的に特異的に結合し得るイムノグロブリン分子である。本明細書で使用する用語は、無処理のポリクローナルまたはモノクローナル抗体だけでなく、そのフラグメント（たとえば、ｄＡｂ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ）、単鎖（ＳｃＦｖ）、その合成改変体、天然型改変体、求められる特性の抗原結合フラグメントを持つ抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、および任意の他の求められる特異性の抗原結合部位またはフラグメント（エピトープ認知部位）を含むイムノグロブリン分子の修飾構造体も包含する。「二重特異性抗体」、遺伝子融合により構築される多価または多選択性フラグメント（ＷＯ９４／１３８０４、Ｐ．Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０、６４４４−６４４８、１９９３）も本明細書で検討する抗体の特定の形である。ＣＨ３ドメインに結合するｓｃＦｖを含むミニボディも本発明に含まれる（Ｓ．Ｈｕら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５６、３０５５−３０６１、１９９６）。たとえば、以下を参照のこと。Ｗａｒｄ、Ｅ．Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４１、５４４−５４６（１９８９）、Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２、４２３−４２６、１９８８、Ｈｕｓｔｏｎら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、８５、５８７９−５８８３、１９８８）、ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５、ＷＯ９４／１３８０４、Ｐ．Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０、６４４４−６４４８、１９９３、Ｙ．Ｒｅｉｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、１４、１２３９−１２４５、１９９６、Ｓ．Ｈｕら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５６、３０５５−３０６１、１９９６。
【００７３】
本明細書で使用される用語「抗原結合フラグメント」は、関心のある抗原、特にＲＡＮＫＬに結合するイムノグロブリン重および／または軽鎖のＣＤＲを少なくとも１つ含むポリペプチドフラグメントを言う。この点に関し、本明細書に記載される抗体の抗原結合フラグメントは、ＲＡＮＫＬを結合する抗体から、本明細書で表されるＶＨおよびＶＬ配列の１、２、３、４、５または６個全てＣＤＲを含んでもよい。本明細書に記載されるＲＡＮＫＬ特異的抗体の抗原結合フラグメントは、ＲＡＮＫＬに結合することができる。ある実施形態では、抗原結合フラグメントを含む抗原結合フラグメントまたは抗体は、ＲＡＮＫＬへのＲＡＮＫ結合、続いて起こるシグナル伝達現象を防止または阻害する。ある実施形態では、抗原結合フラグメントは、ヒトＲＡＮＫＬの生物学的活性に、特異的に結合するおよび／または阻害または調節する。
【００７４】
用語「抗原」は、抗体等の選択的結合剤によって結合され得る、およびさらに、その抗原のエピトープに結合し得る抗体を生成するために、動物において、使用され得る分子または分子の一部を言う。抗原は、１つまたはそれを超えるエピトープを有してもよい。
【００７５】
用語「エピトープ」は、イムノグロブリンまたはＴ細胞受容体に特異的に結合し得る任意の決定要因、好ましくはポリペプチド決定要因を含む。エピトープは、抗体によって結合された抗原の領域である。ある実施形態では、エピトープ決定要因は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリルまたはスルホニル等の分子の化学的に活性なサーフェースグルーピングが挙げられ、ある実施形態では、特異的な三次元構造特徴および／または特異的荷電特性を有してもよい。ある実施形態では、抗体は、タンパク質および／またはマクロ分子の混成物中でその標的抗原を優先的に認識すると、抗原を特異的に結合すると言われる。抗体は、平行解離定数が≦１０−７または１０−８Ｍで、抗原を特的に結合すると言われている。いくつかの実施形態では、平行解離定数は、≦１０−９Ｍまたは≦１０−１０Ｍであってもよい。
【００７６】
ある実施形態では、本明細書に記載されるような抗体およびその抗原結合フラグメントは、それぞれ、ＣＤＲにサポートを提供し、互いに関連するＣＤＲの空間的な関係を規定する、重鎖と軽鎖との間のフレームワーク領域（ＦＲ）セットに挟まれる重鎖および軽鎖ＣＤＲセットを含む。本明細書で使用される用語「ＣＤＲセット」は、重鎖Ｖ領域または軽鎖Ｖ領域の３つの高頻度可変領域を言う。これらの領域を、重鎖または軽鎖のＮ末端から進んで、それぞれ、「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」および「ＣＤＲ３」と表す。したがって、抗原結合部位は、重鎖Ｖ領域および軽鎖Ｖ領域のいずれかからのＣＤＲセットを含む、６つのＣＤＲを含む。単一ＣＤＲ（たとえば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３）を含むポリペプチドを、本明細書では、「分子認知ユニット」と言う。多数の抗原−抗体複合体の結晶学的分析は、ＣＤＲのアミノ酸残基が、結合抗原との広範囲な接触を形成することを実証し、ここで、最も広い抗原接触は、重鎖ＣＤＲ３とのものである。したがって、分子認知ユニットは、主として、抗原結合部位の特異性の原因である。
【００７７】
本明細書で使用される用語「ＦＲセット」は、重鎖Ｖ領域または軽鎖Ｖ領域のＣＤＲセットのＣＤＲを形作る４つのフランキングアミノ酸配列を言う。いくつかのＦＲ残基は、結合抗原と接触してもよいが、ＦＲは主として、Ｖ領域を、抗原結合部位、特にＣＤＲに直接隣接するＦＲ残基に折り畳む原因となる。ＦＲ内では、あるアミノ残基およびある構造的特徴が非常に高く保存される。この点に関し、全てのＶ領域配列は、約９０個のアミノ酸残基の内部ジスルフィドループを含む。Ｖ領域が結合部位に折り畳まれると、ＣＤＲは、抗原結合表面を形成する、突き出たループモチーフとして表示される。ＣＤＲループの折り畳まれた形を、正確なＣＤＲアミノ酸配列に関係なく、ある「規範的」構造にする、ＦＲの保存された構造領域が存在することが一般的に認識されている。さらに、あるＦＲ残基は、抗体重鎖および軽鎖の相互反応を安定化する非共役ドメイン間接触に関与することが知られている。
【００７８】
イムノグロブリン可変ドメインの構造および位置は、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．第４編、ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ．１９８７、およびそのアップデート、現在インターネットで入手可能（ｉｍｍｕｎｏ．ｂｍｅ．ｎｗｕ．ｅｄｕ）を参照して決定してもよい。
【００７９】
「モノクローナル抗体」は、均一な抗体集団を言い、ここで、モノクローナル抗体は、エピトープの選択的結合に関与するアミノ酸（天然型および非天然型）で構成される。モノクローナル抗体は、高特異的で、単一エピトープに対して向けられている。用語「モノクローナル抗体」は、無処理のモノクローナル抗体および全長モノクローナル抗体ばかりでなく、そのフラグメント（たとえば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ）、単一鎖（ＳｃＦｖ）、その改変体、抗原結合部分を含む融合タンパク質、ヒト化モノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、および必要な特異性およびエピトープに結合する能力の抗原結合フラグメント（エピトープ認知部位）を含む他のイムノグロブリン分子の修飾構成体のいかなるものも包含する。抗体の供給源または（たとえば、ハイブリドーマ、ファージ選択、組換え発現、遺伝子導入動物、その他によって）それを作製する方法に関して、限定するものではない。該用語は、全イムノグロブリン、および「抗体」の定義の下に、先に記載したフラグメント等も含む。
【００８０】
タンパク質分解酵素パパインは、ＩｇＧ分子を優先的に切断して数種のフラグメントを生成し、その２つ（Ｆ（ａｂ）フラグメント）は、それぞれ、無処理の抗原結合部位を含む共有結合性ヘテロ二量体を含む。酵素ペプシンは、ＩｇＧ分子を切断して、両抗原結合部位を含むＦ（ａｂ’）２フラグメントを始めとする、数種のフラグメントを提供することができる。本発明のある実施形態による使用のためのＦｖフラグメントは、ＩｇＭ、まれにＩｇＧまたはＩｇＡイムノグロブリン分子の優先的タンパク質切断によって生成することができる。しかし、Ｆｖフラグメントは、当該分野で公知の組換え技術を使用して誘導することがより一般的である。Ｆｖフラグメントとして、多くの抗原認知および生来の抗体分子の結合性能を保持する抗原結合部位を含む、非共有結合ＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体を含む。Ｉｎｂａｒら（１９７２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、６９：２６５９−２６６２、Ｈｏｃｈｍａｎら（１９７６）Ｂｉｏｃｈｅｍ  １５：２７０６−２７１０、およびＥｈｒｌｉｃｈら（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９：４０９１−４０９６。
【００８１】
ある実施形態では、単一鎖ＦｖまたはｓｃＦＶ抗体を検討する。たとえば、カッパ体（Ｉｌｌら、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１０：９４９−５７（１９９７）、ミニボディ（Ｍａｒｔｉｎら、ＥＭＢＯ  Ｊ  １３：５３０５−９（１９９４）、二重特異性抗体（Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、ＰＮＡＳ  ９０：６４４４−８（１９９３）、またはジャヌシン（Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、ＥＭＢＯ  Ｊ  １０：３６５５−５９（１９９１）およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｕｐｐｌ．７：５１−５２（１９９２）を、所望の特異性を持つ抗体の選択に関して本願の教示に従って、標準の分子生物学的技術を使用して調製してもよい。さらに他の実施形態では、本開示のリガンドを包含する二重特異性またはキメラ抗体を生成してもよい。たとえば、キメラ抗体は、ＣＤＲと、異なる抗体からのフレームワーク領域とを含んでもよく、一方、１つの結合ドメインを介してＲＡＮＫＬに、および第２の結合ドメインを介して第２の分子に特異的に結合する二重特異性抗体を生成してもよい。これらの抗体は、組換え分子生物学的技術によって生成してもよいし、または物理的に一緒に組み合わせてもよい。
【００８２】
単一鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ポリペプチドは、ペプチドコード化リンカーによって連結されたＶＨ−およびＶＬ−コード化遺伝子を含む遺伝子融合から発現される、共有結合的に連結されたＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体である。Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５（１６）：５８７９−５８８３。抗体Ｖ領域から自然に凝集した（しかし化学的に分離された）軽および重ポリペプチド鎖を、抗原結合部位の構造に実質的に類似する、３次元構造に折り畳まれるであろうｓＦｖ分子に変換するために、化学構造を見分ける多数の方法が記載されている。たとえば、以下を参照のこと。米国特許第５，０９１，５１３号および第５，１３２，４０５号、Ｈｕｓｔｏｎら、および米国特許第４，９４６，７７８号、Ｌａｄｎｅｒら。
【００８３】
ある実施形態では、本明細書に記載されるようなＲＡＮＫＬ結合抗体は、二重特異性抗体の形態をしている。二重特異性抗体は、ポリペプチドの多量体であり、各ポリペプチドは、イムノグロブリン軽鎖の結合領域を含む第１ドメインと、イムノグロブリン重鎖の結合領域を含む第２ドメインとを含み、該２つのドメインは連結されている（たとえば、ペプチドリンカーによって）が、互いに一体となり抗原結合部位を形成することができない。抗原結合部位は、多量体内の１つのポリペプチドの第１ドメインと、該多量体内の他のポリペプチドの第２ドメインとの一体化によって形成される（ＷＯ９４／１３８０４）。
【００８４】
抗体のｄＡｂフラグメントは、ＶＨドメインで構成される（Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４１、５４４−５４６（１９８９））。
【００８５】
二重特異性抗体が使用される場合、これらは、従来の二重特異性抗体であってもよく、種々の方法（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．およびＷｉｎｔｅｒ  Ｇ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４、４４６−４４９（１９９３））で製造することができる。たとえば、化学的に、または複合型ハイブリドーマから、あるいは先に記載した二重特異性抗体フラグメントの任意のものから調製してもよい。二重特異性抗体およびｓｃＦｖは、可変ドメインだけを使用してＦｃ領域なしで構築することができ、抗イディオタイプの反応の影響を減らすことができる。
【００８６】
二重特異性全抗体に反するような二重特異性抗体は、簡単に構築され、大腸菌で発現するので、これらも、特に有用であり得る。適切な結合特異性の二重特異性抗体（および抗体フラグメント等の多くの他のポリペプチド）は、ファージディスプレイ（ＷＯ９４／１３８０４）を使用して、ライブラリから簡単に選択することができる。たとえば、二重特異性抗体の１つのアームが、抗原Ｘに対して向けられた特異性で一定に保たれる場合、ライブラリは、他のアームが変更され、適切な特異性の抗体が選択されると、作ることができる。二重特異性全抗体は、ノブ−ホール技術により生成してもよい（Ｊ．Ｂ．Ｂ．Ｒｉｄｇｅｗａｙら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，９，６１６−６２１，１９９６）。
【００８７】
ある実施形態では、本明細書に記載される抗体は、ＵｎｉＢｏｄｙ（登録商標）の形態で提供されてもよい。ＵｎｉＢｏｄｙ（登録商標）は、除去されたヒンジ領域を持つＩｇＧ４抗体である（ＧｅｎＭａｂ  Ｕｔｒｅｃｈｔ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ参照、また、たとえば、ＵＳ２００９０２２６４２１も参照）。この独自の抗体技術は、現在の小抗体フォーマットより長い、予測された治療可能窓を持つ、安定で、より小さな抗体フォーマットを造りだす。ＩｇＧ４抗体は、不活性で、したがって免疫系と相互作用しないと考えられる。全ヒトＩｇＧ４抗体は、抗体のヒンジ領域を排除することにより変性し、対応する無処理のＩｇＧ４に対して、特徴的な安定性特性を持つ半分子フラグメントを得てもよい（ＧｅｎＭａｂ、Ｕｔｒｅｃｈｔ）。ＩｇＧ４分子の半減化により、同族抗原（たとえば、疾患標的）に結合することができるＵｎｉＢｏｄｙ（登録商標）の１領域しか残らないので、ＵｎｉＢｏｄｙ（登録商標）は、標的細胞上の１部位のみに一価で結合する。ある癌細胞表面抗原に関して、この一価結合は、同じ抗原特異性を持つ二価抗体を使用する場合に見られ得るような癌細胞増殖を刺激しないので、ＵｎｉＢｏｄｙ（登録商標）技術は、従来の抗体による処置では治りにくいある種類の癌の処置選択肢に寄与し得る。小サイズのＵｎｉＢｏｄｙ（登録商標）は、ある型の癌を処置する場合、非常に役立つことができ、より大きな固体腫瘍に対して分子をより良好に分布させ、効能を増加させる可能性がある。
【００８８】
ある実施形態では、本開示の抗体は、ナノボディの形態を取ってもよい。Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）は、単一遺伝子によってコード化され、ほとんど全ての原核および真核宿主、たとえば、大腸菌（たとえば、米国特許第６，７６５，０８７号参照）、カビ（たとえば、ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓまたはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）および酵母（たとえば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｍｙｃｅｓ、ＨａｎｓｅｎｕｌａまたはＰｉｃｈｉａ（たとえば、米国特許第６，８３８，２５４号参照）で効果的に生成される。生成過程は大規模化することができ、数キログラムの量のナノボディを生産している。Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）は、長い貯蔵有効期間を有する、すぐに使える溶液として処方してもよい。Ｎａｎｏｃｌｏｎｅ（登録商標）方法（たとえば、ＷＯ０６／０７９３７２参照）は、Ｂ細胞の自動高処理選択に基づく、所望の標的に対してＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）を生成する独自方法である。
【００８９】
ある実施形態では、本明細書に開示されるような抗ＲＡＮＫＬ抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒト化されている。これを、キメラ分子と言い、一般的に組換え技術を使用して調製され、非ヒト種のイムノグロブリンに由来する抗原結合部位、およびヒトイムノグロブリンの構造および／または配列に基づく分子の残存イムノグロブリン構造を有する。抗原結合部位は、可変ドメインにおいて、定常ドメインに融合する完全可変ドメイン、または適切なフレームワーク領域にグラフトするＣＤＲのみを含んでもよい。エピトープ結合部位は、野生型でも、１またはそれを超えるアミノ酸置換で修飾されてもよい。これにより、ヒト個体において、免疫原として定常領域が排除されるが、外来性可変領域への免疫応答の可能性は残る（ＬｏＢｕｇｌｉｏ，Ａ．Ｆ．ら、（１９８９）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６：４２２０−４２２４、Ｑｕｅｅｎら、ＰＮＡＳ（１９８８）８６：１００２９−１００３３、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８８）３３２：３２３−３２７）。本明細書で開示する抗ＲＡＮＫＬ抗体のヒト化の例示的方法として、米国特許第７，４６２，６９７号に記載された方法が挙げられる。本発明のある実施形態による例示的ヒト化抗体は、配列番号：９、１０、１９、２０および２２６〜２３２で表されるヒト化配列を含む。
【００９０】
他のアプローチでは、ヒト由来定常領域上だけでなく、可変領域を、修飾することおよびヒト型にできるだけ近くに作り直すように修飾することにも焦点を当てる。重鎖および軽鎖の両方の可変領域には、問題のエピトープへの応答が異なり、結合性能を決定する、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）（これらは、ある種においては比較的保存され、ＣＤＲの足場材料を提供すると推定される４つのフレームワーク領域（ＦＲ）によって隣接されている）が含まれていることが知られている。非ヒト抗体を特定のエピトープに応答して調製する場合、可変領域は、修飾すべきヒト抗体に存在するＦＲ上の非ヒト抗体に由来するＣＤＲをグラフト化することによって、「作り直す」または「ヒト化」することができる。これらのアプローチの種々の抗体への適用は、以下に報告されている。Ｓａｔｏ  Ｋ．ら、（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５３：８５１−８５６．Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  Ｌ．ら、（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  Ｍ．ら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６、Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ  Ｃ．Ａ．ら（１９９１）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ４：７７３−３７８３、Ｍａｅｄａ  Ｈ．ら、（１９９１）Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ２：１２４−１３４、Ｇｏｒｍａｎ  Ｓ．Ｄ．ら（１９９１）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８：４１８１−４１８５、Ｔｅｍｐｅｓｔ  Ｐ．Ｒ．ら（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：２６６−２７１、Ｃｏ  Ｍ．Ｓ．ら、（１９９１）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８：２８６９−２８７３、Ｃａｒｔｅｒ  Ｐ．ら、（１９９２）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：４２８５−４２８９、およびＣｏ  Ｍ．Ｓ．ら（１９９２）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４８：１１４９−１１５４。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、全てのＣＤＲ配列（たとえば、マウス抗体からの６個全てのＣＤＲを含むヒト化マウス抗体）を保存する。他の実施形態では、ヒト化抗体は、本来の抗体に関して変更された１個またはそれを超えるＣＤＲ（１、２、３、４、５、または６個）を有し、本来の抗体からの１個またはそれを超えるＣＤＲ「に由来する」１個またはそれを超えるＣＤＲとも言う。
【００９１】
ある実施形態では、本開示の抗体は、キメラ抗体であってもよい。この点に関し、キメラ抗体は、異なる抗体の異種Ｆｃ部分に動作可能に連結されたまたは融合された抗ＲＡＮＫＬ抗体の抗原結合フラグメントで構成されている。ある実施形態では、異種Ｆｃドメインはヒト起源のものである。他の実施形態では、異種Ｆｃドメインは、ＩｇＡ（サブクラスＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む）、およびＩｇＭを含む親抗体からの異なるＩｇクラスを形成してもよい。さらなる実施形態では、異種Ｆｃドメインは、１またはそれを超える異なるＩｇクラスからのＣＨ２およびＣＨ３ドメインで構成されてもよい。ヒト化抗体に関して先に記載したように、キメラ抗体の抗ＲＡＮＫＬ抗原結合フラグメントは、本明細書に記載される抗体の１またはそれを超えるＣＤＲのみを含んでもよく（たとえば、本明細書に記載される抗体のＣＤＲの１、２、３、４、５または６個）、または可変ドメイン全体（ＶＬ、ＶＨまたは両方）を含んでもよい。
【００９２】
ある実施形態では、ＲＡＮＫＬ結合抗体は、本明細書に記載される抗体の１個またはそれを超えるＣＤＲを含む。この点に関し、所望の特異的結合を保持しながら、抗体のＶＨＣＤＲ３だけの転移を行うことができることがあることが示されている（Ｂａｒｂａｓら、ＰＮＡＳ（１９９５）９２：２５２９−２５３３）。また、ＭｃＬａｎｅら、ＰＮＡＳ（１９９５）９２：５２１４−５２１８、Ｂａｒｂａｓら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９４）１１６：２１６１−２１６２も参照。
【００９３】
Ｍａｒｋｓら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９２、１０：７７９−７８３）には、可変ドメイン領域の５’末端に向かうまたはこれに隣接するコンセンサスプライマーを、ヒトＶＨ遺伝子の第３フレームワーク領域へのコンセンサスプライマーと共に使用して、ＣＤＲ３が欠乏したＶＨ可変ドメインのレパートリーを得る、抗体可変ドメインのレパートリーを生成する方法が記載されている。Ｍａｒｋｓらは、さらに、このレパートリーをどのようにして特定の抗体のＣＤＲ３と組み合わせるかについても記載する。類似した技術を使用して、本明細書で記載する抗体のＣＤＲ３由来配列を、ＣＤＲ３が欠乏したＶＨまたはＶＬドメインのレパートリー、および同族ＶＬまたはＶＨドメインと組み合わされた、シャッフルされた完全ＶＨまたはＶＬドメインとシャッフルして、ＲＡＮＫＬを結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを得てもよい。次いで、レパートリーを、ＷＯ９２／０１０４７のファージディスプレイシステム等の適した宿主システムにおいて、適した抗体またはその抗原結合フラグメントが選択されるように、表示してもよい。レパートリーは、少なくとも約１０４個の個々のメンバー、上は数桁の大きさ、たとえば、約１０６〜１０８個、または１０１０個もしくはそれを超えるメンバーで構成されてもよい。類似のシャッフルまたは組合わせ技術は、β−ラクタム分解酵素遺伝子に関する技術を記載するが、該アプローチは抗体の生成のために使用されたことを認める、Ｓｔｅｍｍｅｒ（Ｎａｔｕｒｅ、１９９４、３７０：３８９−３９１）にも開示されている。
【００９４】
さらなる代替案は、１またはそれを超える選択されたＶＨおよび／またはＶＬ遺伝子のランダム変異誘発を使用して、本明細書で記載する本発明の実施形態の１またはそれを超えるＣＤＲ−由来配列を持つ、新規なＶＨまたはＶＬ領域を生成し、可変ドメイン全体の中に変異を造りだすことである。そのような技術は、間違いやすいＰＣＲを使用した、Ｇｒａｍらが記載する（１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：３５７６−３５８０）。使用してもよい他の方法は、ＶＨまたはＶＬ遺伝子のＣＤＲ領域への変異誘発を示すものである。そのような技術は、Ｂａｒｂａｓら（１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１：３８０９−３８１３）およびＳｃｈｉｅｒら（１９９６、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：５５１−５６７）によって開示される。
【００９５】
ある実施形態では、本明細書に記載される抗体の特異的ＶＨおよび／またはＶＬは、ＲＡＮＫＬへの大きな親和性のような、所望の特性を持つ抗体を同定するために、相補的な可変ドメインのライブラリをスクリーニングするために、使用してもよい。そのような方法は、たとえば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３）１５０：８８０−８８７、Ｃｌａｒｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９１）３５２：６２４−６２８に記載されている。
【００９６】
ＲＡＮＫＬへの結合等の所望の結合活性を有する抗体を同定するために、ＣＤＲを混合し対応させる他の方法を使用してもよい。たとえば、Ｋｌｉｍｋａら、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ（２０００）８３：２５２−２６０は、マウスＶＬおよびマウスＶＨからの保持されたＣＤＲ３およびＦＲ４を持つヒトＶＨライブラリを使用してスクリーニングする手順を記載する。抗体を得た後、ＶＨをヒトＶＬライブラリに対してスクリーニングし、抗原を結合した抗体を得る。Ｂｅｉｂｏｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０００）２９６：８３３−８４９は、マウス重鎖全体とヒト軽鎖ライブラリとを使用するスクリーニング手順を記載する。抗体を得た後、１つのＶＬを、マウスのＣＤＲ３を保持したヒトＶＨライブラリと組み合わせた。抗原を結合することができる抗体が得られた。Ｒａｄｅｒら、ＰＮＡＳ（１９９８）９５：８９１０−８９１５は、先に記載したＢｅｉｂｏｅｒらと類似する手順を記載する。
【００９７】
これらの正式に記載した技術は、それ自体、当該分野で公知である。しかし、当業者は、当該分野で日常的方法を使用し、本明細書に記載される本発明のいくつかの実施形態による、抗体またはその抗原結合フラグメントを得るために、前記技術を使用することができるだろう。
【００９８】
本明細書では、ＲＡＮＫＬ抗原に特異的な抗体抗原結合ドメインを得る方法も開示する。該方法は、本明細書で提示されるＶＨドメインのアミノ酸配列において、１個またはそれを超えるアミノ酸の付加、削除、置換または挿入により、ＶＨドメインのアミノ酸配列改変体であるＶＨドメインを提供することと、場合によっては、このように生成したＶＨドメインを１またはそれを超えるＶＬドメインと組み合わせることと、ＶＨドメインまたはＶＨ／ＶＬ混合物あるいは複数の混合物を試験して、特異的結合メンバー、またはＲＡＮＫＬに特異的な抗体抗原結合ドメインを、場合によっては１またはそれを超える所望の特性とともに同定することとを含む。ＶＬドメインは、本明細書で実質的に表したアミノ酸配列を有してもよい。本明細書で開示するＶＬドメインの１またはそれを超える配列改変体を、１またはそれを超えるＶＨドメインと組み合わせた類似の方法を使用してもよい。
【００９９】
抗体またはポリペプチドに「特異的に結合する」または「優先的に結合する」（本明細書で交換可能に使用される）エピトープは、当該分野でより理解されている用語であり、そのような特異的または優先的結合を決定する方法も当該分野で周知である。分子は、特定の細胞または物質と、それが代わりの細胞または物質と反応または会合する場合と比べて、より頻度が高く、より迅速に、より長い時間および／またはより大きな親和性で反応または会合する場合、「特異的結合」または「優先的結合」を示すと言われる。抗体は、他の物質との結合とに比べて、標的により大きな親和性で、結合活性で、より簡単に、および／またはより長い時間結合する場合、「特異的に結合する」または「優先的に結合する」。たとえば、ＲＡＮＫＬエピトープに特異的にまたは優先的に結合する抗体は、それが他のＲＡＮＫＬエピトープまたは非ＲＡＮＫＬエピトープに結合する場合に比べて、１つのＲＡＮＫＬエピトープに、より大きな親和性で、結合活性で、より容易に、および／またはより長い時間結合する抗体である。この定義を読むことによって、たとえば、第１標的に特異的にまたは優先的に結合する抗体（または部分やエピトープ）は、第２標的には特異的にまたは優先的に結合してもしなくてもよいことも理解される。このように、「特異的結合」または「優先的結合」は、必ずしも独占的結合である必要はない（含み得るが）。そうとは限らないが、一般的に、結合の記載は、優先的結合を意味する。
【０１００】
免疫学的結合は、一般的に、イムノグロブリン分子と抗原との間に起こり、たとえば、静電的、イオン的、親水性および／または疎水性引力または反発、立体力、水素結合、ファンデルワールス力、および他の相互作用（これらは説明的なもので、これらに限定されない）の結果によりイムノグロブリンが特異的である種類の非共有結合相互作用を言う。免疫学的結合相互作用の強さまたは親和性は、相互作用の解離定数（Ｋｄ）によって表すことができ、Ｋｄが小さいほど親和性は大きい。選択されたポリペプチドの免疫学的結合特性は、当該分野で周知の方法を使用して定量化することができる。そのような方法の１つは、抗原結合部位／抗原複合体の形成および解離の速度の測定を必要とし、ここで、該速度は、複合体パートナーの濃度、相互作用の親和性、および両方向において速度に同じように影響する幾何学的パラメータに依存する。したがって、「結合速度定数」（Ｋｏｎ）および「解離速度定数」（Ｋｏｆｆ）の両方は、濃度の計算、ならびに結合および解離の実際の速度によって決定することができる。Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎ比は、親和性に関連しない全てのパラメータの取消しを可能にし、したがって、解離定数Ｋｄと同じである。一般的には、Ｄａｖｉｅｓら（１９９０）Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９：４３９−４７３を参照。
【０１０１】
ある実施形態では、本明細書に記載される抗ＲＡＮＫＬ抗体の親和性は、約１００、１５０、１５５、１６０、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８または１９９ピコモルであり、いくつかの実施形態では、抗体は、ＲＡＮＫＬに関してさらに高い親和性を有してもよい。
【０１０２】
エピトープに関して、用語「免疫学的に活性」または「残存免疫学的に活性」は、抗体（たとえば、抗ＲＡＮＫＬ抗体）の、異なる条件下での、たとえばエピトープが還元または変性条件を受けた後、該エピトープに結合する能力を言う。
【０１０３】
本願のある好ましい実施形態による抗体またはその抗原結合フラグメントは、（ｉ）抗原に特異的に結合し、かつ（ｉｉ）本明細書で開示するＶＨおよび／またはＶＬドメイン、または本明細書で開示するＶＨＣＤＲ３、またはこれらの任意の改変体を含む、本明細書に記載される任意の抗体と、ＲＡＮＫＬへの結合に関し、競合するものであってもよい。抗体間での競合は、たとえば、ＥＬＩＳＡを使用しておよび／または特異的リポーター分子の、他の標識化されていない抗体の存在下で検出することができる１抗体へのタグ付けによって、同じエピトープまたは重なりあうエピトープを結合する特異的抗体の同定を可能にすることによって、簡単にインビトロでアッセイしてもよい。したがって、本明細書では、本明細書に記載される、ＲＡＮＫＬに結合する抗体と競合するヒト抗体抗原結合部位を含む、特異的抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
【０１０４】
この点に関し、本明細書で使用される用語「と競合する」「結合を阻害する」、および「結合を妨害」（たとえば、ＲＡＮＫへのＲＡＮＫＬの結合の阻害／妨害、またはＲＡＮＫＬへの抗ＲＡＮＫＬ抗体の結合の阻害／妨害を参照）は、変更可能に使用され、部分的なおよび完全な阻害／妨害を包含する。ＲＡＮＫへのＲＡＮＫＬ結合の阻害／妨害は、阻害または妨害なしでＲＡＮＫＬがＲＡＮＫに結合した時に起こる細胞シグナル伝達の正常なレベルまたはタイプを減らすまたは変えることが好ましい。阻害および妨害は、ここで開示するような抗ＲＡＮＫＬ抗体と接触した時、抗ＲＡＮＫＬ抗体と接触していないＲＡＮＫＬと比べて、ＲＡＮＫへのＲＡＮＫＬの結合において、いかなる測定可能な減少も含むものであり、たとえば、ＲＡＮＫへのＲＡＮＫＬ結合は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％妨害される。
【０１０５】
イムノグロブリンの定常領域は、可変領域より少ない配列多様性を示し、重要な生化学的事象を誘発するために、多数の天然タンパク質結合に関与する。ヒトにおいては、ＩｇＡ（サブクラスＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む）、およびＩｇＭを含む、５つの異なる抗体のクラスが存在する。これらの抗体クラスの間の際立った特徴は、より微妙な違いがＶ領域に存在するが、それらの定常領域である。
【０１０６】
抗体のＦｃ領域は、多数のＦｃ受容体およびリガンドと相互作用し、エフェクター機能と言われる重要な機能的性能のアレイを与える。ＩｇＧに関し、Ｆｃ領域は、Ｉｇドメイン、ＣＨ２およびＣＨ３、ならびにＣＨ２に続くＮ−末端ヒンジを含む。ＩｇＧクラスのＦｃ受容体の重要なファミリーは、Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）である。これらの受容体は、抗体と免疫系の細胞アームとの間の情報交換を媒介する（Ｒａｇｈａｖａｎら、１９９６、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  １２：１８１−２２０、Ｒａｖｅｔｃｈら、２００１、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９：２７５−２９０）。ヒトにおいて、このタンパク質ファミリーは、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、たとえば、イソ型ＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩｂおよびＦｃγＲＩｃ、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、たとえば、イソ型ＦｃγＲＩＩａ（たとえば、アロタイプＨ１３１およびＲ１３１）、ＦｃγＲＩＩｂ（たとえば、ＦｃγＲＩＩｂ−１およびＦｃγＲＩＩｂ−２）およびＦｃγＲＩＩｃ、ならびに、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、たとえば、イソ型ＦｃγＲＩＩＩａ（たとえば、アロタイプＶ１５８およびＦ１５８）およびＦｃγＲＩＩＩｂ（たとえば、アロタイプＦｃγＲＩＩＩｂ−ＮＡ１およびＦｃγＲＩＩＩｂ−ＮＡ２）が挙げられる（Ｊｅｆｆｅｒｉｓら、２００２、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ８２：５７−６５）。これらの受容体は、典型的には、Ｆｃへの結合を媒介する細胞外ドメイン、膜架橋領域、および細胞内のあるシグナル伝達事象を媒介する細胞内ドメインを有する。これらの受容体は、単球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、好酸球、肥満細胞、血小板、Ｂ細胞、大型顆粒リンパ球、ランゲルハンス細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、およびＴ細胞を始めとする、様々な免疫細胞中で発現する。Ｆｃ／ＦｃγＲ複合体の形成により、これらのエフェクター細胞は、結合した抗原の部位に補充され、典型的には、細胞内のシグナル伝達事象、および続いて起こる重要な免疫応答、たとえば、炎症メディエーターの放出、Ｂ細胞の活性化、エンドサイトーシス、ファゴサイトーシス、および細胞毒性攻撃を起こす。
【０１０７】
細胞障害性および食作用性エフェクター機能を媒介する能力は、抗体が標的細胞を破壊する可能性のあるメカニズムである。ＦｃγＲを発現する非特異的細胞障害性細胞が、標的細胞上の結合した抗体を認識し、次いで標的細胞の溶解を起こす細胞媒介反応を、抗体依存性細胞媒介細胞障害性（ＡＤＣＣ）と言う（Ｒａｇｈａｖａｎら、１９９６、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  １２：１８１−２２０、Ｇｈｅｔｉｅら、２０００、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８：７３９−７６６、Ｒａｖｅｔｃｈら、２００１、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９：２７５−２９０）。ＦｃγＲを発現する非特異的細胞障害性細胞が標的細胞上の結合した抗体を認識し、次いで標的細胞の食作用を起こす細胞媒介反応を、抗体依存性細胞媒介食作用（ＡＤＣＰ）と言う。全てのＦｃγＲは、Ｆｃ上の同じ領域を、Ｃｇ２（ＣＨ２）ドメインのＮ末端および先行するヒンジで結合する。この相互作用は、構造的によく特徴付けられ（Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎら、２００１、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３０９：７３７−７４９）、ヒトＦｃγＲＩＩＩｂの細胞外ドメインへ結合するヒトＦｃのいくつかの構造は、解明されている（ｐｄｂ登録コード１Ｅ４Ｋ）（Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎら、２０００、Ｎａｔｕｒｅ  ４０６：２６７−２７３）（ｐｄｂ登録コード１ＩＩＳおよび１ＩＩＸ）（Ｒａｄａｅｖら、２００１、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６：１６４６９−１６４７７）。
【０１０８】
異なるＩｇＧサブクラスは、ＦｃγＲに関し、異なる親和性を有し、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３は、典型的には、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４より実質的に良好に受容体に結合する（Ｊｅｆｆｅｒｉｓら、２００２、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ８２：５７−６５）。全てのＦｃγＲは、異なる親和性で、ＩｇＧ  Ｆｃ上の同じ領域を結合する。すなわち、高親和性結合剤ＦｃγＲＩは、ＩｇＧ１に関しＫｄが１０−８Ｍ−１であり、一方、低親和性受容体ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩは、一般に、それぞれ、１０−６および１０−５で結合する。ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃγＲＩＩＩｂの細胞外ドメインは、９６％同一であるが、ＦｃγＲＩＩＩｂは、細胞内シグナル伝達ドメインを有さない。さらに、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ／ｃ、およびＦｃγＲＩＩＩａは、免疫受容体チロシン系活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を有する細胞内ドメインを有することを特徴とする、免疫複合体が引き起こす活性化の陽性制御因子であるのに対し、ＦｃγＲＩＩｂは、免疫受容体チロシン系阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を有し、したがって、阻害性である。したがって、前者を活性化受容体と言い、ＦｃγＲＩＩｂを阻害性受容体と言う。また、受容体は、発現パターンおよび異なる免疫系細胞におけるレベルが異なる。複雑さのさらに他のレベルは、ヒトプロテオームにおける多数のＦｃγＲ遺伝子多型の存在である。臨床的意義と特に関連のある遺伝子多型は、Ｖ１５８／Ｆ１５８  ＦｃγＲＩＩＩａである。ヒトＩｇＧ１は、Ｆ１５８アロタイプより大きな親和性で、Ｖ１５８アロタイプに結合する。この親和性における違い、およびおそらくＡＤＣＣおよび／またはＡＤＣＰへのその効果は、抗ＣＤ２０抗体リツキシマブ（ＩＤＥＣ製薬会社の登録商標であるＲｉｔｕｘａｎ（登録商標）の効能で、有意な決定要因であることが示されている。Ｖ１５８アロタイプの患者は、リツキシマブ処置に対し有利に応答するが、より低い親和性のＦ１５８アロタイプの患者はあまり応答しない（Ｃａｒｔｒｏｎら、２００２、Ｂｌｏｏｄ  ９９：７５４−７５８）。約１０〜２０％のヒトがＶ１５８／Ｖ１５８ホモ接合型で、４５％がＶ１５８／Ｆ１５８ヘテロ接合型で、３５〜４５％のヒトがＦ１５８／Ｆ１５８ホモ接合型である（Ｌｅｈｒｎｂｅｃｈｅｒら、１９９９、Ｂｌｏｏｄ  ９４：４２２０−４２３２、Ｃａｒｔｒｏｎら、２００２、Ｂｌｏｏｄ  ９９：７５４−７５８）。したがって、８０〜９０％のヒトが低い応答者であり、すなわち、Ｆ１５８  ＦｃγＲＩＩＩａの少なくとも１つの対立遺伝子である。
【０１０９】
また、Ｆｃ領域は、補体カスケードの活性化に関与する。古典的補体経路では、Ｃ１は、Ｃ１ｑサブユニットとともに、抗原（複数を含む）との複合体を形成しているＩｇＧまたはＩｇＭのＦｃフラグメントに結合する。本発明のある実施形態では、Ｆｃ領域への修飾は、本明細書に記載されるようなＲＡＮＫＬ特異的抗体の、補体システムを活性化する能力を変更する（増強するまたは減らす）修飾が含まれる（たとえば、米国特許第７，７４０，８４７号参照）。補体活性化を評価するために、補体依存性細胞障害性（ＣＤＣ）アッセイを行ってもよい（たとえば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０２：１６３（１９９６）参照）。
【０１１０】
したがって、ある実施形態では、本発明は、変えられた機能的特性、たとえば、減少または増強されたＣＤＣ、ＡＤＣＣまたはＡＤＣＰ活性、または特異的ＦｃγＲに関する増強された結合親和性、または増加した血清半減期を持つ修飾Ｆｃ領域を有する抗ＲＡＮＫＬ抗体を提供する。本明細書で検討する他の修飾Ｆｃ領域は、たとえば、発行された米国特許第７，３１７，０９１号、第７，６５７，３８０号、第７，６６２，９２５号、第６，５３８，１２４号、第６，５２８，６２４号、第７，２９７，７７５号、第７，３６４，７３１号、米国公開公報ＵＳ２００９０９２５９９号、ＵＳ２００８０１３１４３５号、ＵＳ２００８０１３８３４４号、および国際公開公報ＷＯ２００６／１０５３３８号、ＷＯ２００４／０６３３５１号、ＷＯ２００６／０８８４９４号、ＷＯ２００７／０２４２４９に記載されている。
【０１１１】
したがって、ある実施形態では、所望の結合特異性を持つ抗体可変ドメインは、イムノグロブリン定常ドメイン配列に融合する。ある実施形態では、融合は、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含むＩｇ重鎖定常ドメインによる。融合物の少なくとも１つに存在する軽鎖結合に必要な部位を含む第１重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好ましい。イムノグロブリン重鎖融合物および、望ましい場合は、イムノグロブリン軽鎖をコード化するＤＮＡは、別の発現ベクターに挿入され、適した宿主細胞に共遺伝子導入される。これにより、構築において使用される３種のポリペプチド鎖の不均等な比率が、所望の二重特異性抗体の最適収率を提供した場合、実施形態において３種のポリペプチドフラグメントの相互比率の調整において、より大きな柔軟性が提供される。しかし、少なくとも２種のポリペプチド鎖の同じ比率での発現が高い収率となる、または比率が所望の鎖の組合わせの収率に有意な影響を与えない場合、２種または３種全部のポリペプチド鎖のコード化配列を単一発現ベクターに挿入することができる。
【０１１２】
本発明の抗体（ならびにその抗原結合フラグメントおよび改変体）は、たとえば、精製または診断用途に使用するために、エピトープタグまたは標識を含むように修飾されてもよい。抗体複合体を作るために、当該分野で知られている多くの連結基があり、たとえば、米国特許第５，２０８，０２０号、欧州特許第０４２５２３５Ｂ１号、およびＣｈａｒｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：１２７−１３１（１９９２）に開示されるものが挙げられる。連結基として、先に記載した特許に開示されるような、ジスルフィド基、チオエーテル基、酸性感応基、感光性基、ペプチダーゼ感応基、またはエステラーゼ感応基が挙げられ、ジスルフィド基およびチオエーテル基が好ましい。
【０１１３】
他の検討した実施形態では、本明細書に記載されるようなＲＡＮＫＬ特異的抗体は、他の治療化合物と複合または動作可能に連結されてもよく、これらを本明細書では複合物と言う。複合物は、細胞殺傷薬、化学療法薬、サイトカイン、血管新生阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、または毒素、放射性同位体、または他の治療的活性剤であってもよい。化学療法薬、サイトカイン、血管新生阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、および他の治療薬は、先に記載され、これらの先に記載した薬剤の全てに、抗体複合物の用途がある。
【０１１４】
代替実施形態では、抗体は、毒素に複合または動作可能に連結され、毒素として、細菌、真菌、植物または動物起源の小分子毒素および酵素的に活性な毒素、およびそのフラグメントおよび／または改変体が挙げられるが、これらに限定されない。小分子毒素として、サポリン（Ｋｕｒｏｄａ  Ｋら、Ｔｈｅ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ７０：１２８６−１２９４（２０１０）、Ｌｉｐ  ＷＬ．ら、２００７  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ４：２４１−２５１、Ｑｕａｄｒｏｓ  ＥＶ．ら、２０１０  Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ、９（１１）、３０３３−４０、Ｐｏｌｉｔｏ  Ｌ．ら、２００９  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ、１４７、７１０−７１８）、カリケアマイシン、メイタンシン（米国特許第５，２０８，０２０号）、トリコセン、およびＣＣ１０６５が挙げられるが、これらに限定されない。毒素として、ＲＮａｓｅ、ゲロニン、エンジイン、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、コレラ毒素、ゲロニン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  細菌外毒素（ＰＥ４０）、赤痢菌毒素、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ毒素、およびヤマゴボウ抗ウィルスタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１５】
一実施形態では、本開示の抗体またはその抗原結合フラグメントは、１個またはそれを超えるマイタンシノイド分子に複合されている。マイタンシノイドは、チュブリン重合を阻害することによって作用するマイトトキシン阻害剤である。マイタンシンは、東部アフリカの灌木Ｍａｙｔｅｎｕｓ  ｓｅｒｒａｔａから初めて単離された（米国特許第３，８９６，１１１号）。続いて、ある微生物もマイタンシノイドを生成することが発見され、たとえば、マイタンシノールおよびＣ−３マイタンシノールエステル類がある（米国特許第４，１５１，０４２号）。合成マイタンシノール、ならびにその誘導体および類縁体は、たとえば、米国特許第４，１３７，２３０号、第４，２４８，８７０号、第４，２５６，７４６号、第４，２６０，６０８号、第４，２６５，８１４号、第４，２９４，７５７号、第４，３０７，０１６号、第４，３０８，２６８号、第４，３０８，２６９号、第４，３０９，４２８号、第４，３１３，９４６号、第４，３１５，９２９号、第４，３１７，８２１号、第４，３２２，３４８号、第４，３３１，５９８号、第４，３６１，６５０号、第４，３６４，８６６号、第４，４２４，２１９号、第４，４５０，２５４号、第４，３６２，６６３、および第４，３７１，５３３号に開示されている。マイタンシノイドを含む免疫複合物、およびそれらの治療的用途は、たとえば、米国特許第５，２０８，０２０号および第５，４１６，０６４号、欧州特許第０４２５２３５Ｂ１号、ヒト大腸癌に対して向けられたモノクローナル抗体Ｃ２４２に連結されたマイタンシノイド指定ＤＭ１を含む免疫複合物を記載する、Ｌｉｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：８６１８−８６２３（１９９６）に開示されている。複合物は、培養された大腸癌細胞に対して高い細胞障害性が見いだされ、インビボ腫瘍増殖アッセイで、抗腫瘍活性を示した。
【０１１６】
抗体−マイタンシノイド複合物は、抗体またはマイタンシノイド分子のいずれかの生物学的な活性を有意に減少することなく、抗体をマイタンシノイド分子に化学的に連結することにより調製される。毒素／抗体の１個の分子であっても、裸の抗体を使う場合を上回って、細胞障害性を増強することは期待されるが、抗体分子１個当たり平均で３〜４個のマイタンシノイド分子が複合しているものは、抗体の機能または溶解性に悪影響を与えることなく、標的細胞の細胞障害性の増強において効力を示している。マイタンシノイドは、当該分野で周知であり、公知の技術により合成、または天然源から単離することができる。適したマイタンシノイドが、たとえば、米国特許第５，２０８，０２０号、ならびに、本明細書で先に記載した他の特許公報および非特許刊行物に開示されている。好ましいマイタンシノイドは、マイタンシノール、および芳香環において、または種々のマイタンシノールエステル類等のマイタンシノール分子の他の位置で修飾されているマイタンシノール類縁体である。
【０１１７】
関心のある他の複合物は、１個またはそれを超えるカリケアマイシン分子に複合した抗体を含む。抗生物質のカリケアマイシンファミリーは、サブピコモル濃度で、二重鎖ＤＮＡ切断を作ることができる。カリケアマイシンの構造類縁体も使用してよい（Ｈｉｎｍａｎら、１９９３、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：３３３６−３３４２、Ｌｏｄｅら、１９９８、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５８：２９２５−２９２８）（米国特許第５，７１４，５８６号、米国特許第５，７１２，３７４号、米国特許第５，２６４，５８６号、米国特許第５，７７３，００１号）。オーリスタチンＥ（ＡＥ）およびモノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）等のドラスタチン１０類縁体は、現在開示されている抗体またはその改変体の複合物としての用途があり得る（Ｄｏｒｏｎｉｎａら、２００３、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２１（７）：７７８−８４、Ｆｒａｎｃｉｓｃｏら、２００３  Ｂｌｏｏｄ  １０２（４）：１４５８−６５）。有用な酵素的に活性な毒素として、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、菌体外毒素Ａ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａから）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデッシンＡ鎖、アルファ−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアチンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害剤、クルシン、クロチン、ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エコマイシンおよびトリコテセンが挙げられるが、これらに限定されない。たとえば、国際公開ＷＯ９３／２１２３２を参照のこと。本開示は、さらに、複合物または融合物が、本明細書に記載されるようなＲＡＮＫＬ特異的抗体と、核酸分解活性を持つ化合物、たとえば、リボヌクレアーゼまたはデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）等のＤＮＡエンドヌクレアーゼとの間に形成する実施形態も検討する。
【０１１８】
代替実施形態では、本明細書で開示する抗体は、放射性同位体に複合または動作可能に連結し、放射性複合物を形成してもよい。種々の放射性同位体は、放射性複合抗体の製造で使用可能である。例として、９０Ｙ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１１Ａｔおよび２１２Ｂｉが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１９】
本明細書に記載される抗体は、ある他の実施形態では、細胞毒素（たとえば、細胞分裂阻害剤または細胞殺傷剤）、治療薬または放射性元素（たとえば、アルファ−放射体、ガンマ−放射体、等）等の治療部分に複合してもよい。細胞毒素または細胞殺傷剤は、細胞に有害な任意の薬剤を含む。例として、パクリタキセル／パクリタキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、およびこれらの類縁体または同族体が挙げられる。細胞毒素の好ましい例の１つは、サポリン（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから入手可能）である。治療薬として、代謝拮抗薬（たとえば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルダカルバジン）、アルキル化剤（たとえば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロフォスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびシスジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（たとえば、ダウノルビシン（以前は、ダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（たとえば、ダクチノマイシン（以前は、アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ）、ならびに有糸分裂阻害薬（たとえば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２０】
さらに、ＲＡＮＫＬ特異的抗体（抗原結合フラグメント等の本明細書で提供するその機能的フラグメントを含む）は、ある実施形態では、放射性物質または大環状キレート化剤等の、放射性金属イオンを複合するのに有用な治療部分に複合されてもよい。ある実施形態では、大環状キレート化剤は、リンカー分子を介して抗体に結合することができる１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸（ＤＯＴＡ）であり得る。そのようなリンカー分子は、当該分野で一般的に知られ、Ｄｅｎａｒｄｏら、１９９８、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４：２４８３−９０、Ｐｅｔｅｒｓｏｎら、１９９９、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１０：５５３、およびＺｉｍｍｅｒｍａｎら、１９９９、Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２６：９４３−５０に記載されている。
【０１２１】
さらに別の実施形態では、抗体−受容体複合物を患者に投与し、続いて、清澄剤を使用して結合していない複合物を循環から除去し、次いで、細胞殺傷剤（たとえば、放射性ヌクリオチド）に複合化された「リガンド」（たとえば、アビジン）を投与する、腫瘍前ターゲティングにおいて利用するために、抗体を、「受容体」（たとえば、ストレプトアビジン）に複合してもよい。代替実施形態では、抗体依存性酵素媒介プロドラグ治療（ＡＤＥＰＴ）を使用するために、抗体を酵素に複合または動作可能に連結する。ＡＤＥＰＴは、プロドラグ（たとえば、ペプチジル化学治療薬、国際公開ＷＯ８１／０１１４５号を参照）を活性抗癌剤に変換するプロドラグ活性酵素に、抗体を複合または動作可能に連結することによって使用してもよい。たとえば、国際公開ＷＯ８８／０７３７８号および米国特許第４，９７５，２７８号を参照のこと。ＡＤＥＰＴに有用な免疫複合物の酵素成分として、酵素をより活性で細胞障害性のある形に変換するような方法で、プロドラグ上で作用することができる任意の酵素が挙げられる。これらのおよび関連する実施形態の方法において有用な酵素として、リン酸塩含有プロドラグを遊離の薬物に変換するのに有用なアルカリホスファターゼ、硫酸塩含有プロドラグを遊離の薬物に変換するのに有用なアリールスルファターゼ、非毒性５−フルオロシトシンを抗癌剤に変換するのに有用なシトシンデアミナーゼ、５−フルオロウラシル、ペプチド含有プロドラグを遊離の薬物に変換するのに有用なプロテアーゼ、たとえば、セラチアプロテアーゼ、テルモリシン、ズブチリシン、カルボキシペプチダーゼおよびカテプシン（たとえば、カテプシンＢおよびＬ）、Ｄ−アミノ酸置換基を含むプロドラグを変換するのに有用なＤ−アラニルカルボキシペプチダーゼ、炭水化物切断酵素、たとえば、β−ガラクトシダーゼおよびグリコシル化プロドラグを遊離の薬物に変換するのに有用なノイラミミダーゼ（ｎｅｕｒａｍｉｍｉｄａｓｅ）、α−ラクタムで誘導された薬物を遊離の薬物に変換するのに有用なベータ−ラクタマーゼ、およびそのアミン窒素で、それぞれ、フェノキシアセチルまたはフェニルアセチル基により誘導された薬物を、遊離の薬物に変換するのに有用なペニシリンアミダーゼ、たとえば、ペニシリンＶアミダーゼまたはペニシリンＧアミダーゼが挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、当該分野では「アブザイム」としても知られる酵素活性を持つ抗体も、プロドラグを活性薬に変換するために使用してよい（たとえば、Ｍａｓｓｅｙ、１９８７、Ｎａｔｕｒｅ  ３２８：４５７−４５８参照）。抗体−アブザイム複合物は、アブザイムの腫瘍細胞集団への送達のために調製することができる。
【０１２２】
免疫複合物は、種々の２官能性タンパク質カップリング剤、たとえば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの２官能性誘導体（たとえば、アジプイミド酸ジメチルＨＣＬ）、活性エステル（たとえば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（たとえば、グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒｅｌｄｅｈｙｄｅ））、ビス−アジド化合物（たとえば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（たとえば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（たとえば、トルエン２，６−ジイソシアネート）、およびビス−活性フッ素化合物（たとえば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を使用して作成しもよい。ジスルフィド連結を提供するための特別のカップリング剤として、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）（Ｃａｒｌｓｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１７３：７２３−７３７［１９７８］）およびＮ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルチオ）ペンタノアート（ＳＰＰ）が挙げられる。リンカーは、１またはそれを超える切断可能な成分の脱離を促進する「切断可能なリンカー」であってもよい。たとえば、酸に不安的なリンカーを使用してもよい（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：１２７−１３１（１９９２）、米国特許第５，２０８，０２０号）。
【０１２３】
本明細書では、本発明の抗体（およびポリペプチド）の他の修飾も検討する。たとえば、抗体は、種々の非タンパク質性ポリマー、たとえば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールの共重合体の１つに連結されてもよい。また、抗体を、たとえば、コロイド薬物送達システム（たとえば、リポソーム、アルブミン小球体、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）、またはマイクロエマルジョン中で、コアセルベーション技術によってまたは界面重合（たとえば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセル、およびポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル）によって調製されたマイクロカプセル中に封入してもよい。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６編、Ｏｓｌｏ、Ａ．編、（１９８０）に開示されている。
【０１２４】
本明細書で使用する「担体」は、使用される薬用量および濃度で、担体に暴露される細胞または哺乳類に対し無毒性である、医薬的に許容され得る担体、賦形剤、または安定剤が挙げられる。生理的に許容され得る担体は、ｐＨ緩衝水溶液であることが多い。生理的に許容され得る担体の例として、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸等の緩衝液、アスコルビン酸を含む抗酸化剤、低分子（約１０残基未満の）ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、またはイムノグロブリン等のタンパク質、ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリシン等のアミノ酸、グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む、単糖類、二糖類、および他の炭水化物、ＥＤＴＡ等のキレート剤、マンニトールまたはソルビトール等の糖アルコール、ナトリウム等の塩形成対イオン、および／または非イオン性界面活性剤、たとえばポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ（商標））、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびポロキサマー（ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標））等が挙げられる。
【０１２５】
抗ＲＡＮＫＬ抗体の所望の機能的特性は、インビトロまたはインビボモデルを使用し、当業者に公知の種々の方法、親和性／結合アッセイ（たとえば、表面プラズモン共鳴、競合阻害アッセイ）、細胞障害性アッセイ、細胞生存率アッセイ、ＲＡＮＫＬに応答する細胞増殖または分化アッセイ（たとえば、Ｒａｗ細胞アッセイまたは他の破骨細胞分化アッセイ）、骨密度アッセイ、骨喪失の阻害の測定、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）活性アッセイ等を使用して評価してもよい。他のアッセイでは、本明細書に記載される抗体の、破骨細胞の細胞分化および／または活性等の正常ＲＡＮＫ／ＲＡＮＫＬ媒介応答を妨害する能力を試験してもよいし、または骨密度の喪失のインビボ阻害を試験してもよい。また、本明細書に記載される抗体のＲＡＮＫＬ受容体内部移行、インビトロおよびインビボ効力等への効果を試験してもよい。そのようなアッセイは、当業者に知られた、確立したプロトコル（たとえば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌ．Ａｓｓｏｃ．Ｉｎｃ．＆  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，ＮＹ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（編集：Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａｄａ  Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄａｖｉｄ  Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ、Ｅｔｈａｎ  Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ、Ｗａｒｒｅｎ  Ｓｔｒｏｂｅｒ  ２００１  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ，ＮＹ）、または市販のキットを使用して行ってもよい。
【０１２６】
本発明は、ある実施形態では、さらに、本明細書に記載されるような抗体またはその抗原結合フラグメントをコード化する単離された核酸、たとえば、本明細書に記載されるようなＣＤＲ、ＶＨまたはＶＬドメインをコード化する核酸を提供する。核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。これらおよび関連実施形態は、本明細書に記載されるＲＡＮＫＬを結合する抗体をコード化するポリヌクレオチドを含んでもよい。本明細書で使用される用語「単離ポリヌクレオチド」は、ゲノム、ｃＤＮＡまたは合成起源またはこれらのある組合わせのポリヌクレオチドを意味すべきで、その起源のせいで、単離ポリヌクレオチドは、（１）単離ポリヌクレオチドが自然界で発見されるポリヌクレオチドの全部または一部と随伴しない、（２）自然界ではそれが連結していないポリヌクレオチドに連結する、（３）より大きな配列の一部として自然界では起こらない。
【０１２７】
用語「動作可能に連結された」は、この用語が適用されている成分が、適した条件下で該成分の生来の機能を実施できるようにする関係にあることを意味する。たとえば、タンパク質コード化配列に「動作可能に連結」された転写制御配列は、制御配列の転写活性と互換性のある条件下で、タンパク質コード化配列の発現を達成できるように、タンパク質コード化配列に結合されている。
【０１２８】
本明細書で使用される用語「制御配列」は、それらが結合または動作可能に連結しているコード化配列の発現、プロセシングまたは細胞内局在化に影響することができるポリヌクレオチド配列を言う。そのような制御配列の性質は、宿主生物に依存するかもしれない。特定の実施形態では、原核生物の転写制御配列は、プロモーター、リボソーム性結合部位、および転写終結配列を含んでもよい。他の特定の実施形態では、真核生物の転写制御配列は、転写因子用の１個または複数の認知部位を含むプロモーター、転写促進配列、転写終結配列、およびポリアデニル化配列を含んでもよい。ある実施形態では、「制御配列」は、リーダー配列および／融合パートナー配列を含むことができる。
【０１２９】
本明細書で言う用語「ポリヌクレオチド」は、一重鎖または二重鎖核酸ポリマーを意味する。ある実施形態では、ポリヌクレオチドを含むヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはいずれかの種類のヌクレオチド修飾形態であり得る。当該修飾としては、ブロモウリジン等の塩基性修飾、アラビノシドおよび２’，３’−ジデオキシリボース等のリボース修飾、およびホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニラデート（ｐｈｏｓｈｏｒａｎｉｌａｄａｔｅ）、およびホスホロアミデート等のヌクレオチド間連結修飾が挙げられる。用語「ポリヌクレオチド」は、特に、ＤＮＡの一重および二重鎖形態を含む。
【０１３０】
用語「天然型ヌクレオチド」として、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドが挙げられる。用語「修飾ヌクレオチド」は、修飾または置換糖基等を持つヌクレオチドを含む。用語「オリゴヌクレオチド連結」として、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニラデート、ホスホロアミデート等のオリゴヌクレオチド連結が挙げられる。たとえば、以下を参照のこと。ＬａＰｌａｎｃｈｅら、１９８６、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１４：９０８１；Ｓｔｅｃら、１９８４、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１０６：６０７７、Ｓｔｅｉｎら、１９８８、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１６：３２０９、Ｚｏｎら、１９９１、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ、６：５３９、Ｚｏｎら、１９９１、ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ  ＡＮＤ  ＡＮＡＬＯＧＵＥＳ：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ、ｐｐ．８７−１０８（Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ、編集）、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｅｎｇｌａｎｄ、Ｓｔｅｃら、米国特許第５，１５１，５１０、Ｕｈｌｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｐｅｙｍａｎ、１９９０、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、９０：５４３、これらの開示は、任意の目的のため、参照により本明細書に組み込まれる。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドまたはそのハイブリッド形成の検出を可能にする、検出可能な標識を含むことができる。
【０１３１】
用語「ベクター」は、コード化情報を宿主細胞に転移するために使用される任意の分子（たとえば、核酸、プラスミド、またはウィルス）を言うのに使用される。用語「発現ベクター」は、宿主細胞の形質転換に適し、関心のある異種核酸配列の発現に向かうおよび／または制御する核酸配列を含むベクターを言う。発現として、イントロンが存在する場合、転写、翻訳、およびＲＮＡスライシング等のプロセシングが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３２】
当業者に理解されるように、ポリヌクレオチドは、ゲノム配列、ゲノム外およびプラスミドコード化配列、およびより小さく設計された、発現する、遺伝子断片を含んでもよく、またはタンパク質、ポリペプチド、ペプチド等を発現するように適応させてもよい。そのようなセグメントは、自然に単離、または当業者によって合成的に修飾してもよい。
【０１３３】
また、当業者に認識されるように、ポリヌクレオチドは、一重鎖（コード化またはアンチセンス）でも、二重鎖でもよく、また、ＤＮＡ分子（ゲノム、ｃＤＮＡ、または合成の）でも、ＲＮＡ分子でもよい。ＲＮＡ分子として、イントロンを含み、１対１でＤＮＡ分子と対応するｈｎＲＮＡ分子、およびイントロンを含まないｍＲＮＡ分子が挙げられる。追加のコード化または非コード化配列は、必要ではないが、本開示によるポリヌクレオチド内に存在してもよく、ポリヌクレオチドは、必要ではないが、他の分子および／または支持材料に連結してもよい。ポリヌクレオチドは、生来の配列を含んでもよいし、そのような配列の改変体または誘導体をコード化する配列を含んでもよい。
【０１３４】
したがって、これらおよび関連実施形態によれば、本開示は、本明細書に記載される抗ＲＡＮＫＬ抗体をコード化するポリヌクレオチドも提供する。ある実施形態では、本明細書に記載されるような抗体をコード化するポリヌクレオチド配列のいくつかのまたは全てと、そのようなポリヌクレオチドの補体とを含むポリヌクレオチドが提供される。
【０１３５】
他の関連実施形態では、ポリヌクレオチド改変体は、本明細書に記載される抗ＲＡＮＫＬ抗体をコード化するポリヌクレオチド配列に実質的な同一性を有してもよい。たとえば、ポリヌクレオチドは、少なくとも７０％の、好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％またはそれを超える配列同一性を含むポリヌクレオチドであってもよく、ここで、配列同一性は、参照ポリヌクレオチド配列、たとえば、本明細書に記載される抗体をコード化する配列と、本明細書に記載される方法（たとえば、以下に記載するような、標準パラメータを使用するＢＬＡＳＴ分析）を使用して比較される。当業者は、コドン縮退度、アミノ酸類似性、読取り枠位置決め等を考慮に入れ、２つのヌクレオチド配列によって、コード化されたタンパク質の対応する同一性を決定するために、これらの値を適切に調整することができることを理解するだろう。
【０１３６】
典型的には、ポリヌクレオチド改変体は、１またはそれを超える置換、付加、削除および／または挿入を、好ましくは、改変体ポリヌクレオチドによりコード化された抗体の結合親和性を本明細書で特異的に表されたポリヌクレオチド配列によってコード化された抗体に対して、実質的に減少しないように含むだろう。
【０１３７】
ある他の関連実施形態では、ポリヌクレオチドフラグメントは、本明細書に記載されるような抗体をコード化する配列に同一のまたは相補的な配列の種々の長さの連続した伸長を含み、または本質的にこれらからなっていてもよい。たとえば、少なくとも約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、２００、３００、４００、５００または１０００個またはそれを超える、およびこれら数字の間にある全ての中間長さの連続する、本明細書で開示する抗体またはその抗原結合フラグメントをコード化する配列のヌクレオチドを含むまたはこれらから本質的になるポリヌクレオチドが提供される。この文脈における「中間長さ」は、例示された数字の間にある任意の長さ、たとえば、５０、５１、５２、５３、その他、１００、１０１、１０２、１０３、その他、１５０、１５１、１５２、１５３、等、２００〜５００、５００〜１，０００等の全ての整数を含むことは容易に理解されるだろう。本明細書で記載するようなポリヌクレオチド配列は、生来の配列にはない、付加的なヌクレオチドによって、一端または両端で伸長してもよい。この付加的配列は、本明細書に記載される抗体をコード化するポリヌクレオチドの一端、または本明細書に記載される抗体をコード化するポリヌクレオチドの両端に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個のヌクレオチドで構成されてもよい。
【０１３８】
他の実施形態では、中程度から高いストリンジェンシー条件下で、本明細書で提供される抗体、その抗原結合フラグメント、そのフラグメント、またはその相補的な配列をコード化するポリヌクレオチド配列にハイブリッドし得るポリヌクレオチドを提供する。ハイブリッド形成技術は、分子生物学の分野で周知である。説明の目的のために、本明細書で提供するポリヌクレオチドの他のポリヌクレオチドでのハイブリッド形成を試験するために適した中程度のストリンジェントな条件として、５Ｘ  ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液中で予備洗浄をすることと、５０℃〜６０℃で５Ｘ  ＳＳＣ、一晩ハイブリダイズすることと、次いで、それぞれ、０．１％ＳＤＳを含む２Ｘ、０．５Ｘおよび０．２Ｘ  ＳＳＣで、６５℃２０分の洗浄を２回行うこととを含む。ハイブリッド形成のストリンジェンシーは、たとえば、ハイブリッド形成溶液の塩含有量および／またはハイブリッド形成を行う温度を変更することにより、簡単に操作できることを当業者は理解するだろう。たとえば、他の実施形態では、適した高ストリンジェントなハイブリッド形成条件として、ハイブリッド形成の温度を、たとえば、６０℃〜６５℃、または６５℃〜７０℃に上昇させた以外、先に記載した条件を含む。
【０１３９】
ある実施形態では、先に記載したポリヌクレオチド、たとえば、ポリヌクレオチド改変体、フラグメントおよびハイブリダイズ配列は、ＲＡＮＫＬを結合する抗体、またはその抗原結合フラグメントをコード化する。他の実施形態では、そのようなポリヌクレオチドは、ＲＡＮＫＬおよびここで特異的に表した抗体配列に、少なくとも約５０％、少なくとも約７０％、ある実施形態では少なくとも約９０％結合する、抗体あるいは抗原結合フラグメント、またはそのＣＤＲ、およびをコード化する。さらなる実施形態では、そのようなポリヌクレオチドは、本明細書で記載した抗体より大きな親和性で、たとえば、量的に少なくとも約１０５％、１０６％、１０７％、１０８％、１０９％または１１０％で、ＲＡＮＫＬおよびここで特異的に表した抗体配列に結合する抗体あるいは抗原結合フラグメント、またはそのＣＤＲをコード化する。
【０１４０】
本明細書の他で記載するように、代表的なポリペプチドの３次元構造（たとえば、本明細書で提示するような、ＲＡＮＫＬ特異的抗体の改変体、たとえば、ここで提示するような、抗原結合フラグメントを有する抗体タンパク質）の決定は、１個またはそれを超えるアミノ酸の置換、付加、削除または挿入等の日常的方法によって行ってもよく、ここで、選択された天然または非天然アミノ酸は、そのように誘導された構造的改変体が、現在開示されている種の空間充填特性を保持しているかどうかを決定する目的で、仮想的にモデル化することができる。たとえば、親和性が保たれるように、またはより良好な親和性を達成するように、抗体内で、適切なアミノ酸置換（または適切なアミノ酸配列をコード化するポリヌクレオチド）を決定するための種々のコンピュータプログラムが、当業者に知られている。
【０１４１】
本明細書に記載されるポリヌクレオチド、またはそのフラグメントは、そのコード化配列の長さに関わらず、他のＤＮＡ配列、たとえば、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、付加制限酵素部位、多回クローニング部位、他のコード化部分等と、その全長がかなり変わるように組み合わせてもよい。したがって、ほとんどどんな長さの核酸フラグメントを使用してもよいことが考えられ、全長は、好ましくは、調製の容易さおよび意図する組換えＤＮＡプロトコルの用途によって限定される。たとえば、全長が塩基ペアの長さで約１０，０００、約５０００、約３０００、約２，０００、約１，０００、約５００、約２００、約１００、約５０の等（全ての中間長さを含む）の例示的ポリヌクレオチド部分が有用であると考えられる。
【０１４２】
ポリヌクレオチド配列を比較する場合、以下に記載するように、最大一致を配列比較した場合、２つの配列でヌクレオチドの配列が同じなら、２つの配列は「同一」であると言う。２つの配列の間の比較は、典型的には、配列を比較窓上で比較することによって行われ、配列類似性の局所領域を同定、比較する。本明細書で使用される「比較窓」は、少なくとも約２０の連続する位置、通常は３０〜約７５、４０〜約５０の部分を言い、２つの配列を最適に配列比較した後、配列を同じ数の連続する位置の参照配列と比較してもよい。
【０１４３】
比較のための配列の最適アラインメントは、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ（登録商標）バイオ情報ソフトウェア一揃い（ＤＮＡＳＴＡＲ社、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）中でＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラムを使用し、デフォルトパラメータを使用して行ってもよい。このプログラムには、以下の参照に記載する、数種のアラインメントスキームが盛り込まれている。Ｄａｙｈｏｆｆ、Ｍ．Ｏ．（１９７８）Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ。Ｄａｙｈｏｆｆでは、Ｍ．Ｏ．（ｅｄ．）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ第５巻、Ｓｕｐｐｌ．３、ｐｐ．３４５−３５８、Ｈｅｉｎ  Ｊ．、Ｕｎｉｆｉｅｄ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｓ、ｐｐ．６２６−６４５（１９９０）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ第１８３巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、Ｈｉｇｇｉｎｓ、Ｄ．Ｇ．およびＳｈａｒｐ、Ｐ．Ｍ．、ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３（１９８９）、Ｍｙｅｒｓ、Ｅ．Ｗ．およびＭｕｌｌｅｒ  Ｗ．、ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１−１７（１９８８）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、Ｅ．Ｄ．、Ｃｏｍｂ．Ｔｈｅｏｒ  １１：１０５（１９７１）、Ｓａｎｔｏｕ、Ｎ．Ｎｅｓ、Ｍ．、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅ  ｖｏｌ．４：４０６−４２５（１９８７）、Ｓｎｅａｔｈ、Ｐ．Ｈ．Ａ．およびＳｏｋａｌ、Ｒ．Ｒ．、Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ−ｔｈｅ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ、Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ（１９７３）、Ｗｉｌｂｕｒ、Ｗ．Ｊ．およびＬｉｐｍａｎ、Ｄ．Ｊ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．、Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：７２６−７３０（１９８３）。
【０１４４】
あるいは、比較のための配列の最適アラインメントは、スミスアンドウォーターマンの局所的同一性アルゴリズム、Ａｄｄ．ＡＰＬ．Ｍａｔｈ  ２：４８２（１９８１）、ニードルマンアンドブンシュの同一性アラインメントアルゴリズム、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）、ピアソンアンドリップマンの類似性探索法Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）、これらのアルゴリズムのコンピュータ化実行、（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）でのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、または検査によって行ってもよい。
【０１４５】
配列一致度および配列類似度を決定するために適したアルゴリズムの好ましい１例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９７７）、およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載されている。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０は、たとえば、本明細書に記載されるパラメータを用いて使用して、２またはそれを超えるポリヌクレオチドの中で、配列一致度を決定することができる。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、米国立バイオテクノロジー情報センターによって一般公開されている。例示的な１例では、ヌクレオチド配列に関し、パラメータＭ（一組のマッチング残余に関するリワードスコア、常に＞０）およびＮ（非マッチング残余に関するペナルティスコア、常に＜０）を使用して累積スコアを計算することができる。各方向におけるワードヒットの伸展は、累積アラインメントスコアが、その最大達成値からの量Ｘによって乖離した時、１またはそれを超えるネガティブスコアリング残余アラインメントの累積により、累積スコアが０またはそれ未満になった時、またはいずれかの配列の末端に到達した時、止められる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、ＴおよびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、初期値として、１１のワード長（Ｗ）、および１０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５（１９８９）参照）アラインメント、５０の（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両鎖の比較を使用する。
【０１４６】
ある実施形態では、「配列一致度」は、２つの最適配列比較配列を、少なくとも２０の位置の比較の窓の上で比較することにより決定され、ここで、比較窓内のポリヌクレオチド配列部分は、２つの配列の最適アラインメントの参照配列（添加または削除を含まない）と比較して、２０パーセントまたはそれ未満、通常、５〜１５パーセント、または１０〜１２パーセントの付加または削除（すなわち隙間）を含んでもよい。同一の核酸塩基が両配列で起こる位置の数を決定してマッチ位置の数を得、マッチ位置の数を参照配列中の位置の総数（すなわち窓サイズ）で割り、得られた数字に１００を掛けて配列一致度を得ることにより、パーセンテージを計算することができる。
【０１４７】
遺伝コードの縮退の結果、本明細書に記載されるような抗体をコード化する多くのヌクレオチド配列が存在することは当業者には理解されるであろう。これらのポリヌクレオチドの中には、ＲＡＮＫＬに結合する抗体をコード化する生来のまたは本来のポリヌクレオチド配列のヌクレオチド配列に対して最小の配列一致を有する者もある。それでにもかかわらず、コドン使用における違いにより変化するポリヌクレオチドを、本開示により、明確に検討する。ある実施形態では、哺乳類の発現のためにコドンを最適化した配列を特に検討する。
【０１４８】
したがって、本発明の他の実施形態では、本明細書に記載される抗体の改変体および／または誘導体の調製のために、部位特異的変異誘発等の変異誘発アプローチを使用してもよい。このアプローチにより、それらをコード化する基礎ポリヌクレオチドの変異誘発によって、ポリペプチド配列内での特異的修飾を行うことができる。これらの技術は、１またはそれを超えるヌクレオチド配列のポリヌクレオチドへの変化を導入することにより、たとえば１またはそれを超える前述の考えを組み込む、配列改変体を調製および試験する簡単なアプローチを提供する。
【０１４９】
部位特異的変異誘発は、所望の変異のＤＮＡ配列をコード化する特異的オリゴヌクレオチド配列および充分に大量の隣接するヌクレオチドを使用して変異体を生成することを可能にし、充分なサイズのプライマー配列および配列複雑度を提供し、スキャンされる削除接合部の両端に安定な二本鎖を形成する。変異は、選択されたポリヌクレオチド配列において、ポリヌクレオチドそれ自身の特性を改良、変更、減少、修飾または他に変化させるおよび／またはコード化されたポリペプチドの特性、活性、組成、安定性または一次配列を変更するために使用してもよい。
【０１５０】
ある実施形態では、発明者らは、コード化されたポリペプチドの１またはそれを超える特性、たとえば、抗体またはその抗原結合フラグメントの結合親和性、特定のＦｃ領域の機能、または特定のＦｃγＲのためのＦｃ領域の親和性を変更するために、本明細書で開示する抗体またはその抗原結合フラグメントをコード化するポリヌクレオチド配列の変異誘発を検討する。部位特異的変異誘発の技術は、当該分野で周知であり、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの両方の改変体を造るために広く使用される。たとえば、部位特異的変異誘発は、ＤＮＡ分子の特異的部分を変更するためによく使用される。そのような実施形態では、長さが、典型的には、約１４〜約２５ヌクレオチド等を含むプライマーを、変更される配列の接合部の両端上の約５〜約１０の残基とともに使用される。
【０１５１】
当業者に理解されるように、部位特異的変異誘発技術では、一重鎖および二重鎖形態の両方に存在するファージベクターがしばしば使用される。部位特異的変異誘発で有用な典型的なベクターとして、Ｍ１３ファージ等のベクターが挙げられる。これらのファージは、簡単に商業的に入手でき、それらの使用は、一般的に、当業者に周知である。また、二重鎖プラスミドは、プラスミドからファージへの関心がある遺伝子を転移するステップを排除する部位特異的変異誘発において、日常的に使用される。
【０１５２】
一般的に、本発明による部位特異的変異誘発は、先ず、一重鎖ベクターを得る、またはその配列内の所望のペプチドをコード化するＤＮＡ配列を含む二重鎖ベクターの２つの鎖を別の一部を融解することにより行う。所望の変異配列を持つオリゴヌクレオチドプライマーは、一般的に、合成的に調製される。次いで、このプライマーを一重鎖ベクターでアニールし、変異含有鎖の合成を完全にするために、大腸菌ポリメラーゼＩ  Ｋｌｅｎｏｗフラグメント等のＤＮＡ重合酵素で処理する。したがって、１本鎖が変異のない本来の配列をコード化し、第２鎖が所望の変異を有するヘテロ２本鎖が形成される。このヘテロ２本鎖ベクターは、次いで、大腸菌細胞等の適切な細胞を形質転換するために使用され、変異配列を持つ組換えベクターを含むクローンが選択される。
【０１５３】
部位特異的変異誘発を使用する、選択されたペプチドをコード化するＤＮＡ部分の配列改変体の調製は、有用な種を生成する可能性のある手段を提供するが、それらをコード化するペプチドおよびＤＮＡ配列の配列改変体が得られ得る他の方法があるので、限定を意味するものではない。たとえば、所望のペプチド配列をコード化する組換えベクターは、ヒドロキシアミン等の変異誘発剤で処置して、配列改変体を得てもよい。これらの方法およびプロトコルに関する詳細は、Ｍａｌｏｙら、１９９４、Ｓｅｇａｌ、１９７６、ＰｒｏｋｏｐおよびＢａｊｐａｉ、１９９１、Ｋｕｂｙ、１９９４、およびＭａｎｉａｔｉｓら、１９８２の教示にあり、これらは、その目的に関して、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５４】
本明細書で使用される用語「オリゴヌクレオチド特異的変異誘発手順」は、その初期濃度に関連する特異的核酸分子の濃度を増加させることになる、または増幅等の検出可能なシグナルの濃度を増加させることになる、テンプレート依存型方法およびベクター媒介増殖を言う。本明細書で使用される用語「オリゴヌクレオチド特異的変異誘発手順」は、プライマー分子のテンプレート依存型伸長に関与する仮定を言うものである。用語テンプレート依存型方法は、核酸の新しく合成された鎖の配列が相補的塩基対形成の周知のルールによって記録されるＲＮＡまたはＤＮＡ分子の核酸合成を言う（たとえば、Ｗａｔｓｏｎ、１９８７参照）。典型的には、ベクター媒介方法は、核酸フラグメントのＤＮＡまたはＲＮＡベクターへの導入、ベクターのクローン増幅、および増幅された核酸フラグメントの回収に関与する。そのような方法の例示は、米国特許第４，２３７，２２４号に提供され、これは、特に、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５５】
ポリペプチド改変体の生成に関する他のアプローチでは、米国特許第５，８３７，４５８号に記載されるような、繰返し配列組換えを使用してもよい。このアプローチでは、組換えおよびスクリーニングまたは選択の反復サイクルを行い、たとえば、増加した結合親和性を有する個々のポリヌクレオチド改変体を「進化」させる。また、ある実施形態は、本明細書に記載されるような少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、プラスミド、ベクター、転写または発現カセットの形態で構築物を提供する。
【０１５６】
多くの実施形態では、対象モノクローナル抗体コード化する核酸を宿主細胞に直接導入し、該細胞を、コード化された抗体の発現を誘発するのに充分な条件下でインキュベートする。当業者に周知の標準的な技術を、本明細書で提供するポリペプチドおよび核酸配列と組み合わせて使用して、この開示の抗体を調製する。開示される特定の抗体をコード化する適切な核酸配列を決定するために、ポリペプチド配列を使用してもよい。種々の発現システムのために、当業者に周知の標準方法に従って核酸配列を最適化し、特定のコドン「プリファランス」を反映させてもよい。
【０１５７】
ある関連する実施形態によれば、１またはそれを超える本明細書に記載されるような構築物と、任意の抗体、ＣＤＲ、ＶＨあるいはＶＬドメイン、またはその抗原結合フラグメントをコード化する核酸とを含む組換え宿主細胞、およびコード化核酸からの発現を含む、コード化された生成物を生成する方法が提供される。発現は、適切な条件下で、核酸を含む組換え宿主細胞を培養することにより、都合よく達成されるかもしれない。発現による生成の後、抗体またはその抗原結合フラグメントを、任意の適した技術を使用して、単離および／または精製してもよく、次いで、目的通りに使用される。
【０１５８】
本明細書で提供される抗体またはその抗原結合フラグメント、ならびにコード化核酸分子およびベクターは、たとえば、それらの自然環境から、実質的に純粋あるいは均一な形態に、または核酸の場合、所望の機能を持つポリペプチドをコード化する配列以外は、起源の拡散または遺伝子のないあるいは実質的にない形態に単離されおよび／または精製されてもよい。核酸はＤＮＡまたはＲＮＡを含んでもよく、全体的または部分的に合成であってもよい。文脈で他のことを必要としない限り、本明細書で表したようなヌクレオチド配列対する参照は、特定配列を持つＤＮＡ分子を包含し、Ｔの代わりにＵが置き換わる特定配列を持つＲＮＡ分子を包含する。
【０１５９】
種々の異なる宿主細胞におけるポリペプチドのクローニングおよび発現のシステムは、周知である。適した宿主細胞として、細菌、哺乳動物細胞、酵母およびバキュロウィルスシステムが挙げられる。異種ポリペプチドの発現のための当該分野で入手可能な哺乳動物細胞株として、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ヒーラ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ＮＳＯマウスメラノーマ細胞、およびその他多くのものが挙げられる。一般的で、好ましい細菌宿主は大腸菌である。
【０１６０】
大腸菌等の原核における抗体および抗原結合フラグメントの発現は、当該分野で確立されている。参考のために、たとえば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ａ．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：５４５−５５１（１９９１）を参照。培養における真核細胞の発現も、抗体またはその抗原結合フラグメントの生成に関する選択肢として、当業者に利用可能である。最近のレビュー、たとえば、Ｒｅｆ、Ｍ．Ｅ．（１９９３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．４：５７３−５７６、Ｔｒｉｌｌ  Ｊ．Ｊ．ら（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ６：５５３−５６０を参照のこと。
【０１６１】
適切な制御因子配列を含み、必要に応じて、プロモーター配列、終結配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子および他の配列を含む、適正なベクターは、選択または構築することができる。ベクターは、必要に応じて、プラスミド、ウィルス性たとえばファージ、または、ファージミドで合ってもよい。さらなる詳細は、たとえば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：第２編、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ．を参照のこと。核酸の操作、たとえば、核酸構築物の調製、変異誘発、配列決定、細胞および遺伝子発現へのＤＮＡの導入、およびタンパク質の分析に関する、多くの公知の技術およびプロトコルは、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２編、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９９２、またはこの最新版に詳細に記載されている。
【０１６２】
用語「宿主細胞」は、１またはそれを超える本明細書で記載する抗体をコード化する核酸配列を導入している、または導入し得る、および本明細書で記載する任意の抗体をコード化する遺伝子等の、関心のある選択された遺伝子をさらに発現する、または発現し得る細胞を言うために使用される。該用語は、親細胞の子孫を含み、選択された遺伝子が存在する限り、該子孫が、元の親と形態学または遺伝子体質的に同一であってもなくてもよい。したがって、そのような核酸を宿主細胞に導入することを含む方法も検討する。該導入は、任意の入手可能な技術を使用してよい。真核細胞に関し、適した技術として、リン酸カルシウム遺伝子導入、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、レトロウィルスまたは他のウィルス、たとえば、ワクシニア、または昆虫細胞に関し、バキュロウィルスを使用するリポソーム媒介遺伝子導入および形質導入が挙げられる。細菌細胞に関し、適した技術として、塩化カルシウム形質転換、エレクトロポレーション、およびバクテリオファージを使用する遺伝子導入が挙げられる。導入は、たとえば、遺伝子が発現する条件下で宿主細胞を培養することによって、核酸からの発現を起こすまたは核酸を発現させた後に続いて行ってもよい。一実施形態では、核酸は、宿主細胞のゲノム（たとえば、染色体）に組み込まれる。組込みは、標準の技術に従って、組換えを促進する配列をゲノムに封入することによって、促進してもよい。
【０１６３】
また、本発明は、ある実施形態で、特定のポリペプチド、たとえば、本明細書に記載されるようなＲＡＮＫＬ特異的抗体を発現するために、発現システムにおいて、先に記載した構築物を使用することを含む方法を提供する。用語「形質導入」は、通常、ファージによって、１つの細菌から他のものにする遺伝子の転移を言うために使用する。また、「形質導入」は、レトロウィルスによる、真核細胞配列の獲得および転移を言う。用語「遺伝子導入」は、細胞による外来性または外因性ＤＮＡの取り込み言うために使用され、外因性ＤＮＡが細胞膜の内部に導入された場合、細胞は「遺伝子導入されている」。多数の遺伝子導入技術が当該分野でで周知であり、本明細書に開示されている。たとえば、Ｇｒａｈａｍら、１９７３、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：４５６、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ、Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄａｖｉｓら、１９８６、ＢＡＳＩＣ  ＭＥＴＨＯＤＳ  １Ｎ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、およびＣｈｕら、１９８１、Ｇｅｎｅ  １３：１９７を参照。このような技術を使用して、１またはそれを超える外因性ＤＮＡ部分を適した宿主細胞に導入することができる。
【０１６４】
本明細書で使用される用語「形質転換」は、細胞の遺伝子特徴の変化であり、細胞が修飾されて新しいＤＮＡを含む場合、細胞は形質転換されていると言う。たとえば、細胞が生来の状態から遺伝的に修飾されると、細胞は形質転換される。遺伝子導入または形質導入の後、形質転換ＤＮＡは、細胞の染色体に物理的な組込みによって細胞のそれを組み換え、複製することなく、エピソーク要素として、過渡的に維持され、またはプラスミドとして、独立して複製するかもしれない。ＤＮＡが細胞の分裂で複製される時、細胞は安定に形質転換されていると考えられる。核酸分子、ポリペプチド、宿主細胞等の生物学的な物質と組み合わせて使用される場合、用語「天然型」または「生来の」は、天然にあり、ヒトによって操作されていない物質を言う。同様に、本明細書で使用される「非天然型」または「非生来の」は、天然にはない、またはヒトによって構造的に修飾され、もしくは合成された物質を言う。
【０１６５】
用語「ポリペプチド」「タンパク質」および「ペプチド」および「糖タンパク質」は、変更可能に使用され、いかなる特定の長さも限定されないアミノ酸のポリマーを意味する。該用語は、ミリスチル化、硫酸化、グルコシル化、リン酸エステル化、およびシグナル配列の付加または削除等の修飾を排除しない。用語「ポリペプチド」または「タンパク質」は、１またはそれを超えるアミノ酸の鎖を意味し、ここで、各鎖は、ペプチド結合によって共有結合で連結したアミノ酸を含み、前記ポリペプチドまたはタンパク質は、ペプチド結合によって非共有結合的および／または共有結合的に互いに連結し、生来のタンパク質の配列、すなわち、天然型および特異的非組換え細胞、または遺伝視改変または組換え細胞によって生成されたタンパク質を有する複数の鎖、および生来のタンパク質のアミノ酸配列を有する分子、または１またはそれを超える生来の配列のアミノ酸からの削除、該アミノ酸への付加および／または該アミノ酸の置換を有する分子を含み得る。用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、具体的には、本開示のＲＡＮＫＬに結合する抗体、または抗ＲＡＮＫＬ抗体の１またはそれを超えるアミノ酸から削除、該アミノ酸に付加および／または該アミノ酸の置換を持つ配列を包含する。したがって、「ポリペプチド」または「タンパク質」は、１個（「モノマー」と呼ぶ）のまたは複数（「多量体」と呼ぶ）のアミノ酸鎖を含み得る。
【０１６６】
本明細書で言う用語「単離タンパク質」は、対象タンパク質が、（１）少なくともいくつかの、通常は自然界で見られる他のタンパク質を含まない、（２）同じ供給源から、たとえば、同じ種からの他のタンパク質を本質的に含まない、（３）異なる種からの細胞によって発現する、（４）少なくとも約５０％ポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、または自然界でともに存在する他の物質から分離されている、（５）「単離タンパク質」と自然界でともに存在しているあるタンパク質の部分と結合（共有結合または非共有結合相互作用によって）していない、（６）自然界でともに存在していないポリペプチドに動作可能に結合（共有結合または非共有結合相互作用によって）している、または（７）自然界では起こらないことを意味する。そのような単離タンパク質は、場合によっては合成供給源のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡまたは他のＲＮＡ、またはこれらの任意の組合わせによってコード化され得る。ある実施形態では、単離タンパク質は、タンパク質またはポリペプチドまたはその使用（治療、診断、予防、研究、その他）を妨害する自然環境で見いだされる他の夾雑物を実質的に含まない。
【０１６７】
用語「ポリペプチドフラグメント」は、単量体または多量体が可能で、アミノ末端削除、カルボキシル末端削除および／または内部削除、または天然型または組換えで生成されたポリペプチドの置換を有するポリペプチドを言う。ある実施形態では、ポリペプチドフラグメントは、少なくとも５〜約５００のアミノ酸長のアミノ酸鎖を含むことができる。ある実施形態では、フラグメントは、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００または４５０アミノ酸長さであることが理解されるだろう。特に有用なポリペプチドフラグメントは、抗原結合ドメインまたは抗体のフラグメントを含む機能的ドメインを含む。抗ＲＡＮＫＬ抗体の場合、有用なフラグメントとして、ＣＤＲ領域、とりわけ重鎖または軽鎖のＣＤＲ３領域、重鎖または軽鎖の可変領域、２個のＣＤＲを含む抗体鎖の部分またはその可変領域等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６８】
ポリペプチドは、タンパク質のＮ末端にシグナル（またはリーダー）配列を含んでもよく、これは、タンパク質の転移に共翻訳的にまたは後翻訳的に関与する。シグナルペプチドを含む、本明細書で提供されるいかなるポリペプチドアミノ酸配列も、本明細書に記載される、そのようなシグナルまたはリーダーペプチドのない用途に関して検討される。当業者が認識しているであろうように、シグナルペプチドは、通常、プロセシングの間に切断され、活性な抗体タンパク質中には含まれない。また、ポリペプチドは、ポリペプチド（たとえば、ポリ−Ｈｉｓ）の合成、精製、または同定の容易性のため、またはポリペプチドの固体支持体への結合を増強するために、リンカーまたは他の配列に、インフレーム融合または複合してもよい。
【０１６９】
また、ペプチドリンカー／スペーサー配列は、所望の場合は、各ポリペプチドのその第２および／または第３構造への折り畳みを確保するのに充分な距離で、複数のポリペプチド成分を分離するために使用してもよい。そのようなペプチドリンカー配列は、当該分野で周知の標準技術を使用して、融合ポリペプチドに組み込むことができる。
【０１７０】
あるペプチドスペーサー配列は、たとえば、（１）それらの柔軟な伸長された立体構造を取る能力、（２）それらは、第１および第２ポリペプチド上の機能エピトープと相互作用できる第２構造を取ることができないこと、および／または（３）ポリペプチド機能エピトープと反応するかもしれない疎水性または荷電残基の喪失に基づいて選択してもよい。
【０１７１】
例示的な一実施形態では、ペプチドスペーサー配列が、たとえば、Ｇｌｙ、ＡｓｎおよびＳｅｒ残基を含む。ＴｈｒおよびＡｌａ等の他の中性付近のアミノ酸も、スペーサー配列に含まれてもよい。
【０１７２】
スペーサーとして有用に使用できるかもしれない他のアミノ酸配列として、Ｍａｒａｔｅａら、Ｇｅｎｅ  ４０：３９  ４６（１９８５）、Ｍｕｒｐｈｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：８２５８  ８２６２（１９８６）、米国特許第４，９３５，２３３号および米国特許第４，７５１，１８０号に開示されたものが挙げられる。
【０１７３】
他の例示的スペーサーとして、たとえば、Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｓｐ  （Ｃｈａｕｄｈａｒｙら、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：１０６６−１０７０）（配列番号：２３３）およびＬｙｓ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ（Ｂｉｒｄら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６）（配列番号：２３４）が挙げられる。
【０１７４】
いくつかの実施形態で、第１および第２ポリペプチドが、機能ドメインを分離し、立体障害を防止するために使用することができる、非必須Ｎ末端アミノ酸領域を有する場合は、スペーサー配列は必要ではない。２つのコード化配列を、スペーサーなしで直接、または、たとえば、１〜３回繰り返される５量体Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号：２３５）で構成される、柔軟なポリリンカーを使用することによって融合することができる。そのようなスペーサーは、ＶＨおよびＶＬの間に挿入されることによって、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）の構築において使用されている（Ｂｉｒｄら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６、Ｈｕｓｔｏｎら、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：５９７９−５８８３）。
【０１７５】
ある実施形態では、ペプチドスペーサーは、２枚の単鎖抗体の可変領域を形成するベータシートの間に、正しい相互作用を可能にするように設計される。
【０１７６】
ある例示的実施形態では、ペプチドスペーサーは、１〜５の間のアミノ酸、５〜１０の間のアミノ酸、５〜２５の間のアミノ酸、５〜５０の間のアミノ酸、１０〜２５の間のアミノ酸、１０〜５０の間のアミノ酸、１０〜１００の間のアミノ酸、または任意の上記数字の間の範囲のアミノ酸である。
【０１７７】
他の例示的実施形態では、ペプチドスペーサーは、約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０またはそれを超えるアミノ酸長さである。
【０１７８】
本明細書に記載される抗体のアミノ酸配列修飾（複数を含む）を検討した。たとえば、抗体の結合親和性および／または他の生物学的特性を改良することが望ましいだろう。たとえば、適切なヌクレオチド鎖を抗体またはその鎖をコード化するポリヌクレオチドに導入することによって、またはペプチド合成によって、抗体のアミノ酸配列改変体を調製してもよい。そのような修飾として、たとえば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの削除および／または該残基への挿入および／または該残基の置換が挙げられる。最終構築物が所望の特性（たとえば、ＲＡＮＫＬへの高い親和性結合）を持つ限り、最終抗体にたどり着くために、任意の削除、挿入および置換の組合わせを行ってもよい。また、アミノ酸の変化は、グルコシル化部位の数または位置の変更等の抗体の翻訳後的プロセスを変えてもよい。先に記載した本発明のポリペプチドのための任意の異形および修飾は、本発明の抗体にも含まれる。
【０１７９】
本開示は、本明細書で開示する抗体の改変体を提供する。ある実施形態では、そのような改変体抗体、またはその抗原結合フラグメントあるいはそのＣＤＲは、ＲＡＮＫＬおよび本明細書で特異的に表された抗体配列に、少なくとも約５０％、少なくとも約７０％、および、ある実施形態では、少なくとも約９０％で結合する。さらなる実施形態では、改変体抗体あるいは抗原結合フラグメント、またはそのＣＤＲは、ＲＡＮＫＬおよび本明細書で特異的に表された抗体配列に、本明細書で記載する抗体より高い親和性で結合し、たとえば、量的に、少なくとも約１０５％、１０６％、１０７％、１０８％、１０９％または１１０％結合する。
【０１８０】
特定の実施形態では、対象抗体は、ａ）本明細書に記載される抗ＲＡＮＫＬ抗体の重鎖可変領域に、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、ｂ）本明細書に記載される抗ＲＡＮＫＬ抗体の軽鎖可変領域に、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、またはａ）およびｂ）の両方を有してもよい。例示的な重鎖および軽鎖領域のアミノ酸配列は、配列番号：１、２、９−１２および１６−９３で表される。
【０１８１】
特定の実施形態では、抗体は、ａ）ｉ．アミノ酸配列が本明細書に記載される選択された抗体の重鎖ＣＤＲ１領域と同一のＣＤＲ１領域、ｉｉ．アミノ酸配列が選択された抗体の重鎖ＣＤＲ２領域と同一のＣＤＲ２領域、およびｉｉｉ．アミノ酸配列が選択された抗体の重鎖ＣＤＲ３領域と同一のＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域と、ｂ）ｉ．アミノ酸配列が選択された抗体の軽鎖ＣＤＲ１領域と同一のＣＤＲ１領域、ｉｉ．アミノ酸配列が選択された抗体の軽鎖ＣＤＲ２領域と同一のＣＤＲ２領域、およびｉｉｉ．アミノ酸配列が選択された抗体の軽鎖ＣＤＲ３領域と同一のＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変ドメインとを含んでもよく、ここで、抗体は、選択された標的（たとえば、ＲＡＮＫＬ）を特異的に結合する。さらなる実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、改変体は、ＶＨおよびＶＬ領域のＣＤＲ領域において、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５またはそれ以上までのアミノ酸置換を除いて、選択された抗体と同一の重鎖および軽鎖を含む改変体抗体である。この点に関し、選択された抗体のＣＤＲ領域において、１、２、３、４、５、６、７、８または、ある実施形態では、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５またはそれを超えるアミノ酸置換があってもよい。ＶＨ領域および／またはＶＬ領域においていずれかのＣＤＲにおける置換でもよい（たとえば、Ｍｕｌｌｅｒ、１９９８、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ６：１１５３−１１６７参照）。本明細書に記載される（および図１Ａ〜図１Ｄで示される）抗ＲＡＮＫＬ抗体のＶＨおよびＶＬ  ＣＤＲのアミノ酸配列は、配列番号：３−８、１３−１５、９４−２２５および２２８で表される。
【０１８２】
代表的なポリペプチド（たとえば、本明細書で提供される改変体ＲＡＮＫＬ特異的抗体、たとえば、本明細書で提供される抗原結合フラグメントを有する抗体タンパク質）の三次元構造の決定は、１またはそれを超えるアミノ酸の置換、付加、削除または挿入等の日常的方法によって行ってもよく、ここで、選択された天然または非天然アミノ酸は、そのように誘導された構造的改変体が、現在開示されている種の空間充填特性を保持しているかどうかを決定する目的で、仮想的にモデル化することができる。たとえば、Ｄｏｎａｔｅら、１９９４  Ｐｒｏｔ．Ｓｃｉ．３：２３７８、Ｂｒａｄｌｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０９：１８６８−１８７１（２００５）、Ｓｃｈｕｅｌｅｒ−Ｆｕｒｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１０：６３８（２００５）、Ｄｉｅｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０３：１２４４（２００６）、Ｄｏｄｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ４５０：１７６（２００７）、Ｑｉａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ４５０：２５９（２００７）、Ｒａｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２７：１０１４−１０１８（２０１０）参照。本明細書で提供されるＲＡＮＫＬ−特異的抗体、その抗原結合ドメインの合理的設計のためのような、これらのおよび関連する実施形態で使用してもよいコンピュータアルゴリズムのいくつかの付加的な非限定例示として、３−Ｄグラフィックおよびビルトインスクリプトを使用して、大きな生体分子系を表示する、アニメ化する、および分析するための分子視覚化プログラムであるＶＭＤが挙げられる（Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｌｌｉｎｏｉｓ、Ｕｒｂａｎａ−Ｃｈａｍｐａｇｎｅのウェブサイト、ｋｓ．ｕｉｕｃ．ｅｄｕ／Ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｖｍｄ／．）。多くの他のコンピュータプログラムが、当該分野で公知であり、当業者に利用可能であり、エネルギー最小化形態の空間充填モデル（ファンデルワールス半径）、異なる化学基に関して高い親和性の領域を決定するために検索するＧＲＩＤから、原子寸法の決定を可能にし、これにより結合、Ｍｏｎｔｅ  Ｃａｒｌｏサーチを強化し、数学的アラインメント、およびＣＨＡＲＭＭ（Ｂｒｏｏｋｓら（１９８３）Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．４：１８７−２１７）およびＡＭＢＥＲ（Ｗｅｉｎｅｒら（１９８１）Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．１０６：７６５）を計算し、力場計算および分析を評価する（Ｅｉｓｅｎｆｉｅｌｄら（１９９１）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６１：Ｃ３７６−３８６、Ｌｙｂｒａｎｄ（１９９１）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｅｌｇ．４６：４９−５４、Ｆｒｏｉｍｏｗｉｔｚ（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ８：６４０−６４４、Ｂｕｒｂａｍら（１９９０）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ７：９９−１１１、Ｐｅｄｅｒｓｅｎ（１９８５）Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．６１：１８５−１９０、およびＫｉｎｉら（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｄｙｎ．９：４７５−４８８も参照）。多くの適切な計算的なコンピュータプログラムも、たとえばＳｃｈｒｏｅｄｉｎｇｅｒ（Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から市販されている。
【０１８３】
本発明の他の実施形態では、抗ＲＡＮＫＬ抗体およびそのヒト化バージョンは、ウサギモノクローナル抗体に由来し、特にＲａｂＭＡｂ（登録商標）技術を使用して生成される。これらの抗体は、最小配列修飾を必要とするので有利であり、それにより、変異系統（ＭＬＧ）ヒト化技術を使用して、ヒト化の後、機能的特性の保持を促進する（たとえば、米国特許第７，４６２，６９７号参照）。したがって、本開示の抗ＲＡＮＫＬ抗体を造る例示的な方法として、たとえば、米国特許第５，６７５，０６３号および第７，４２９，４８７号に記載されたＲａｂＭａｂ（登録商標）ウサギモノクローナル抗体技術が挙げられる。この点に関し、ある実施形態では、開示の抗ＲＡＮＫＬ抗体は、ウサギにおいて生成される。特定の実施形態では、ウサギ脾臓細胞と融合可能なウサギ由来の不死性Ｂリンパ球を、抗体を生成するハイブリッド細胞を生成するために使用する。この不死性Ｂリンパ球は、内因性イムノグロブリン重鎖を検出可能に発現せず、ある実施形態では、変化したイムノグロブリン重鎖コード化遺伝子を含むかもしれない。
【０１８４】
組成物および使用方法
本開示は、ＲＡＮＫＬ特異的抗体、その抗原結合フラグメントを含む組成物、および種々の治療的設定でのそのような組成物の投与を提供する。
【０１８５】
純粋な形または適切な医薬組成物での本明細書に記載されるＲＡＮＫＬ特異的抗体の投与は、類似する有用性を与える薬剤の投与の許容されたモードのいかなるものによっても行うことができる。医薬組成物は、抗体または抗体含有組成物を、適切な生理的に許容され得る担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせることによって調製され、固体、半個体、液体またはガス状形態の製剤、たとえば、錠剤、カプセル、粉末剤、顆粒剤、軟膏、溶液、座薬、注射剤、吸入剤、ゲル、小球体および噴霧剤に処方してもよい。さらに、他の医薬活性成分（本明細書の他で記載する他の抗癌剤）および／または塩類、緩衝液および安定剤等の適した賦形剤を組成物内に存在させてもよいが、これらは必要ではない。投与は、種々の異なる経路、たとえば、経口的、非経口的、経鼻的、静脈内、皮内、皮下または局所的に達成してもよい。投与の好ましいモードは、処置または防止すべき症状の性質に依存する。投与後に癌の進行および／または転移を減らす、阻害する、防止するまたは遅らせる量は効果的と考えられる。
【０１８６】
ある実施形態では、たとえば、腫瘍質量の少なくとも５０％の減少等の、生存腫瘍の量の統計的に有意な減少、またはスキャン寸法の変化（たとえば、統計的有意性で減少）によって示された場合、投与量は腫瘍退縮を起こす結果となるのに充分な量である。他の実施形態では、投与量は、たとえば、骨粗鬆症、歯周炎、癌関連骨転移、多発性骨髄腫、関節リウマチ、乾癬性関節炎、家族性膨張性骨溶解症、パジェット病（若年性パジェット病を含む）、破骨細胞腫、慢性ウィルス感染症に関連する骨喪失および成人性および小児性白血病、ならびにプロテーゼ周囲の骨喪失を始めとする骨減少性障害に関連する症候において、臨床的に有用な減少を起こす結果となるのに充分な量である。そのような臨床的に関連する症候は、当業者に知られ、骨喪失、背部痛、歯肉の腫れ、赤いまたは紫色の歯肉、歯肉の圧痛、歯の間の膿、口臭、圧痛、ほてり、腫れ、関節腫脹、数時間続く朝のこわばり、腕の皮膚の下の組織の硬いコブ（リウマトイド結節）、疲労、熱および体重減少が挙げられるが、これらに限定されない。当業者には理解されるように、兆候および症候は、重症度および患者間で変化するかもしれない。
【０１８７】
正確な薬用量および処置期間は、処置される疾患の関数であり、公知の試験プロトコルを使用して、または当該分野で公知のモデル系における組成物を試験し、推定することにより、経験的に決定されてもよい。また、対象臨床試験を行ってもよい。薬用量は、緩和すべき症状の重症度によっても変化するかもしれない。医薬組成物は、一般的に、望ましくない副作用を最小限に抑えながら、治療的に有用な効果を発揮するように、処方され、投与される。組成物は、一度に投与してもよいし、多数の小さな用量に分け、時間を空けて投与してもよい。特定の対象全てに関して、特異的薬用量レジメンを、個々の必要に従って、時間をかけて調整してもよい。
【０１８８】
ＲＡＮＫＬ特異的抗体含有組成物は、単独で、または他の公知の癌の処置、たとえば、放射線治療、化学療法、移植術、免疫治療、ホルモン治療、光線力学的治療等と組み合わせて投与してよい。また、組成物は、抗生物質と組み合わせて投与してもよい。
【０１８９】
したがって、これらおよび関連する医薬組成物を投与する典型的な経路は、経口的、局所的、経皮的、吸入、非経口的、舌下的、頬側的、直腸、経腟的および鼻腔内経路が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用される、用語非経口的は、皮下注射、静脈内、筋肉内、内部胸骨内注射または点滴技術を含む。本発明のある実施形態による医薬組成物は、組成物を患者に投与した時に、該組成物内に含まれる活性成分が、生物学的に利用可能になるように処方される。対象または患者に投与されるであろう組成物は、たとえば、錠剤が単一の用量単位の場合、１またはそれを超える用量単位の形態を取ってもよく、本明細書で記載するＲＡＮＫＬ特異的抗体の噴霧剤形の容器は、複数の用量単位を保ってもよい。そのような剤形を調製する実際の方法は、当業者に公知または明らかになるだろう。たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０編（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０００）参照。いずれにしても、投与すべき組成物は、本明細書の技術に従って、関心のある疾患または症状の処置のために、治療的有効量の本開示の抗体を含む。
【０１９０】
医薬組成物は、固体または液体の形態であってもよい。一実施形態では、担体（複数を含む）は粒子状であり、組成物は、たとえば、錠剤または粉末形態になる。担体（複数を含む）は、液体でもよく、組成物は、たとえば、経口油、注射可能な液体または噴霧剤であり、これは、たとえば、吸入投与に有用である。経口的投与を意図する場合、医薬組成物は、固体または液体のどちらかの形態が好ましく、ここで、半固体、半液体、懸濁液およびゲル形態は、固体または液体として本明細書で考える形態内に含まれる。
【０１９１】
経口的投与用の固体組成物として、医薬組成物は、粉末、顆粒、圧縮錠剤、ピル、カプセル、チューインガム、ウェーハ等に処方してもよい。そのような固体組成物は、典型的には、１種またはそれを超える不活性希釈剤または食用担体を含むだろう。さらに、１種またはそれを超える以下のものが存在してもよい。カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、微結晶性セルロース、トラガントガムまたはゼラチン等の結合剤、デンプン、ラクトースまたはデキストリン等の賦形剤、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、プリモゲル、トウモロコシデンプン等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムまたはステロテックス等の潤滑剤、コロイド状二酸化ケイ素等の滑剤、サッカロースまたはサッカリン等の甘味剤、ペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジフレーバー等の香味料、および着色剤。医薬組成物をカプセル、たとえばゼラチンカプセルの形態とする場合、該組成物は、先に記載した種類の物質に加えて、ポリエチレングリコールまたは油等の液体担体を含んでもよい。
【０１９２】
医薬組成物は、液体の形態、たとえば、エリキシル、シロップ、溶液、乳液、または懸濁液であってもよい。液体は、２例として、経口的投与または注射による送達のためであってもよい。経口的投与を意図する場合、好ましい組成物は、本発明の化合物に加えて、１種またはそれを超える甘味剤、保存料、顔料／着色剤、および風味増強剤を含む。注射による投与を意図する組成物では、１種またはそれを超える界面活性剤、保存料、湿潤剤、分散剤、懸濁剤、緩衝液、安定剤、および等張化剤が含まれてもよい。
【０１９３】
溶液、懸濁液または他の類似する形態であろうと、液体医薬組成物は、１種またはそれを超える以下のアジュバントを含んでもよい。無菌希釈剤、たとえば、注射用水、食塩水、好ましくは、生理食塩水、リンゲル液、等張塩化ナトリウム、溶剤または懸濁溶媒として作用し得る合成モノまたはジグリセリド等の不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の溶剤、抗菌剤、たとえば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン、抗酸化剤、たとえば、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム、キレート化剤、たとえば、エチルレンジアミン四酢酸、緩衝液、たとえば、酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩、および等張性調整剤、たとえば、塩化ナトリウムまたはデキストロース。非経口製剤はガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨て型注射器、または多人数用バイアルに封入することができる。生理食塩水は、好ましいアジュバントである。注射可能な医薬組成物は無菌であるのが好ましい。
【０１９４】
非経口的、経口的投与のいずれかを意図する液体医薬組成物は、適した薬用量が得られるような量の、本明細書で開示するＲＡＮＫＬ特異的抗体を含むべきである。典型的には、この量は組成物中、少なくとも０．０１％の抗体である。経口投与を意図する場合、この量は、組成物の重量の０．１と約７０％との間で変化してよい。ある経口医薬組成物は、約４％と約７５％との間の抗体を含む。ある実施形態では、本発明による医薬組成物および製剤は、希釈前、非経口用量単位が、０．０１と１０重量％の抗体を含むように調製される。
【０１９５】
医薬組成物は、局所的投与を意図してもよく、この場合、担体は、溶液、乳液、軟膏またはゲル基剤を含むのが適切である。基剤は、たとえば、１またはそれを超える以下のものを含んでもよい。ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、ミツロウ、鉱物油、水およびアルコール等の希釈剤、ならびに乳化剤および安定剤。増粘剤を局所的投与用の医薬組成物に存在させてもよい。経皮的投与を意図する場合、組成物は、経皮パッチまたはイオン泳動デバイスを含んでもよい。医薬組成物は、たとえば、直腸内で溶けて薬物を放出する座薬の形態で、直腸投与を意図してもよい。直腸投与用組成物は、適した非刺激性賦形剤として、油性基剤を含んでもよい。そのような基材として、ラノリン、ココアバターおよびポリエチレングリコールが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９６】
医薬組成物は、固体または液体用量単位の物理的形態を変形する種々の材料を含んでもよい。たとえば、組成物は、活性成分の周りに被覆シェルを形成する材料を含んでもよい。被覆シェルを形成する材料は、典型的には、不活性で、たとえば、糖、シェラック、および他の腸溶コーティング剤から選択してもよい。あるいは、活性成分を、ゼラチンカプセルに入れてもよい。固体または液体形態の医薬組成物は、本発明の抗体に結合し、化合物の送達の手助けをする薬剤を含んでもよい。この能力で作用する、適した薬剤として、他のモノクローナルまたはポリクローナル抗体、１種またはそれを超えるタンパク質またはリポソームが挙げられる。医薬組成物は、噴霧剤として投与することができる用量単位から本質的になるものであってもよい。用語噴霧剤は、コロイド状性質のシステムから加圧パッケージからなるシステムの及ぶ種々のシステムを示すために使用する。送達は、液化または圧縮されたガスによるもの、または活性成分を分配するのに適したポンプシステムによるものでもよい。噴霧剤は、活性成分（複数を含む）を送達するために、単相、２相、または３相システムで送達してもよい。噴霧剤の送達には、必要な容器、アクティベーター、バルブ、サブ容器等が含まれ、これらが一緒になって、キットを形成してもよい。当業者であれば、過度の実験を行うことなく、好ましい噴霧剤を決定するだろう。
【０１９７】
医薬組成物は、医薬分野で周知の方法によって調製してもよい。たとえば、注射による投与を意図する医薬組成物は、本明細書に記載されるＲＡＮＫＬ特異的抗体と、場合によっては、１種またはそれを超える塩、緩衝液および／または安定剤とを含む組成物と、無菌の希釈水とを、溶液を形成するように組み合わせることによって調製することができる。界面活性剤を加えて、均一な溶液または懸濁液の形成を促進してもよい。界面活性剤は、水性送達システムにおいて、抗体の溶解または均一な懸濁を促進するように、非共有結合的に抗体組成物と相互作用する化合物である。
【０１９８】
組成物は、種々の要因、たとえば、使用される特異的化合物（たとえば、ＲＡＮＫＬ特異的抗体）の活性、化合物の代謝安定性および作用の長さ、患者の年齢、体重、健康状態、性別および食習慣、投与のモードおよび期間、排泄速度、薬物の組合わせ、特定の障害または症状の重症度、および患者が受ける治療により変化する治療的有効量で投与してもよい。一般的に、治療的に有効な一日量（７０ｋｇの哺乳類に関し）は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ（すなわち０．０７ｍｇ）〜約１００ｍｇ／ｋｇ（すなわち７．０ｇ）、好ましい治療的有効量（７０ｋｇの哺乳類に関し）は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ（すなわち０．７ｍｇ）〜約５０ｍｇ／ｋｇ（すなわち３．５ｇ）、さらに好ましい治療的有効量（７０ｋｇの哺乳類に関し）は、約１ｍｇ／ｋｇ（すなわち７０ｍｇ）〜約２５ｍｇ／ｋｇ（すなわち１．７５ｇ）である。
【０１９９】
また、本開示のＲＡＮＫＬ特異的抗体を含む組成物は、１種またはそれを超える他の治療薬の投与と同時に、その前にまたはその後に投与してもよい。そのような併用療法として、本発明の化合物と１種またはそれを超える追加の活性剤とを含む単一医薬的投与製剤の投与、および本発明の抗体と各活性剤とを、それぞれ、それ自身の医薬的投与製剤で含む組成物の投与が挙げられる。たとえば、本明細書に記載されるような抗体および他の活性剤を、一緒に、錠剤またはカプセル等の単一経口投与組成物として、または投与される各薬剤を別々の経口投与製剤として患者に投与することができる。同様に、本明細書に記載されるような抗体および他の活性剤は、一緒に、たとえば、食塩水または他の生理的に許容され得る溶液の単一経口投与組成物として、または投与される各薬剤を別々の経口投与製剤として患者に投与することができる。別々の投与製剤を使用する場合、抗体と１種またはそれを超える付加的活性剤を含む組成物は、本質的に同じ時間に、すなわち同時に、または別々の食い違った時間に、すなわち経時的に任意の順番で投与することができ、併用療法は、全てのこれらのレジメンを含むと理解される。
【０２００】
したがって、ある実施形態では、１種またはそれを超える他の治療薬と組み合わせたこの開示の抗ＲＡＮＫＬ抗体組成物の投与も検討する。そのような治療薬は、関節リウマチ、炎症または癌等の、本明細書に記載されるような特定の疾患状態の標準的処置として、当該分野で許容されている。検討した代表的な治療薬として、サイトカイン、成長因子、ステロイド、ＮＳＡＩＤ、ＤＭＡＲＤ、抗炎症剤、化学療法剤、放射線治療剤、または他の活性剤および補助剤が挙げられる。
【０２０１】
ある実施形態では、本明細書で開示する抗ＲＡＮＫＬ抗体は、任意の数の化学治療薬と共に投与してもよい。化学治療薬の例として、アルキル化剤、たとえば、チオテパおよびシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（商標））、スルホン酸アルキル、たとえば、ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファン、アジリジン誘導体、たとえば、ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、およびウレドーパ、エチレンイミンおよびメチルアメラミン、たとえば、アルトレートアミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスファオルアミド（ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈａｏｒａｍｉｄｅ）およびトリメチルオロメラミン、ナイトロジェンマスタード、たとえば、クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノブエンビキン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード、ニトロソ尿素（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａｓ）、たとえば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン、抗生物質、たとえば、アクラシノマイシン（ａｃｌａｃｉｎｏｍｙｓｉｎｓ）、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン、代謝拮抗薬、たとえば、メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、葉酸類縁体、たとえば、デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート、プリン類縁体、たとえば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン、ピリミジン類縁体、たとえば、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、５−ＦＵ、アンドロゲン、たとえば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン、抗副腎剤、たとえば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン、葉酸補充剤、たとえば、フロリン酸、アセグラトン、アルドホスファミドグリコシド、アミノレブリン酸、アムサクリン、ベストラブシル、ビサントレン、エダトラキセート、デフォファミン、デメコルシン、ジアジコン、エルフォルミチン、酢酸エリプチニウム、エトグルシド、硝酸ガリウム、ヒドロキシ尿素、レンチナン、ロニダミン、ミトグアゾン、ミトキサントロン、モピダモール、ニトラクリン、ペントスタチン、フェナメット、ピラルビシン、ポドフィリン酸、２−エチルヒドラジド、プロカルバジン、ＰＳＫ．ＲＴＭ．、ラゾキサン、シゾフィラン、スピロゲルマニウム、テヌアゾン酸、トリアジコン、２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン、ウレタン、ビンデシン、ダカルバジン、マンノムスチン、ミトブロニトール、ミトラクトール、ピポブロマン、ガシトシン、アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）、シクロホスファミド、チオテパ、タキソイド、たとえば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）およびドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｒｈｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ、Ａｎｔｏｎｙ、Ｆｒａｎｃｅ）、クロラムブシル、ゲムシタビン、６−チオグアニン、メルカプトプリン、メトトレキサート、白金類縁体、たとえば、シスプラチンおよびカルボプラチン、ビンブラスチン、白金、エトポシド（ＶＰ−１６）、イホスファミド、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、ナベルビン、ノバントロン、テニポシド、ダウノマイシン、アミノプテリン、ゼローダ、イバンドロネート、ＣＰＴ−１１、トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ  ２０００、ジフルオロメチルオミチン（ＤＭＦＯ）、レチノイン酸誘導体、たとえば、Ｔａｒｇｒｅｔｉｎ（商標）（ベキサロテン）、Ｐａｎｒｅｔｉｎ（商標）（アリトレチノイン）、ＯＮＴＡＫ（商標）（デニロイキンジフチトクス）、エスペラミシン、カペシタビン、ならびに上に記載した任意のものの医薬的に許容され得る塩、酸または誘導体が挙げられる。またこの定義には、腫瘍上のホルモン作用を調整または阻害するように作用する抗ホルモン剤も含まれ、たとえば、抗エストロゲン、たとえば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アリマターゼ阻害４（５）−イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリソトン、およびトレミフェン（フェアストン）、および抗アンドロゲン、たとえば、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセリレン、ならびにおよび上に記載した任意のものの医薬的に許容され得る塩、酸または誘導体が挙げられる。
【０２０２】
種々の他の治療薬は、本明細書に記載される抗ＲＡＮＫＬ抗体と共に使用してもよい。一実施形態では、抗体は、抗炎症剤とともに投与される。抗炎症剤または抗炎症薬として、ステロイドおよびグルココルチコイド（たとえば、ベタメタゾン、ブデソニド、デキサメタゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、トリアムシノロン）、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤＳ）、たとえば、アスピリン、イブプロフェン、ナプロキセン、メトトレキサート、スルファサラジン、レフルノミド、抗ＴＮＦ薬、シクロホスファミドおよびミコフェノール酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０３】
代表的なＮＳＡＩＤは、イブプロフェン、ナプロキセン、ナプロキセンナトリウム、Ｃｏｘ−２阻害剤、たとえば、ＶＩＯＸＸ（登録商標）（ロフェコキシブ）およびＣＥＬＥＢＲＥＸ（登録商標）（セレコキシブ）、およびシアル酸付加物からなる群より選択される。代表的な鎮痛剤は、アセトアミノフェン、オキシコドン、塩酸プロポルキシフェン（ｐｒｏｐｏｒｘｙｐｈｅｎｅ）のトラマドールからなる群より選択される。代表的なグルココルチコイドは、コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロンまたはプレドニゾンからなる群より選択される。代表的な生物学的応答調整物質として、細胞表面マーカーに対する分子（たとえば、ＣＤ４、ＣＤ５、その他）、サイトカイン阻害剤、たとえば、ＴＮＦ拮抗剤（たとえば、エタネルセプト（ＥＮＢＲＥＬ（登録商標））、アダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ（登録商標））およびインフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標）））、ケモカイン阻害剤および接着分子阻害剤が挙げられる。生物学的応答調整物質として、モノクローナル抗体および分子の組換え形が挙げられる。代表的なＤＭＡＲＤとして、アザチオプリン、シクロホスファミド、シクロスポリン、メトトレキサート、ペニシラミン、レフルノミド、スルファサラジン、ヒドロキシクロロキン、Ｇｏｌｄ（経口的（オーラノフィン）および筋肉内）、およびミノサイクリンが挙げられる。
【０２０４】
ある実施形態では、本明細書に記載される抗体は、サイトカインと共に投与される。本明細書で使用される「サイトカイン」は、細胞間メディエーターとして他の細胞で作用する１つの細胞集団によって放出されるタンパク質の総称を意味する。そのようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、および昔からのポリペプチドホルモンである。サイトカインの中には、成長ホルモン、たとえば、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモン、副甲状腺ホルモン、チロキシン、インスリン、プロインスリン、リラキシン、プロリラキシン、糖タンパク質ホルモン、たとえば、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、および黄体形成ホルモン（ＬＨ）、肝臓成長因子、繊維芽細胞成長因子、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、腫瘍壊死因子−アルファおよび−ベータ、ミューラー管阻害物質、マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド、インヒビン、アクチビン、血管内皮成長因子、インテグリン、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）、神経成長因子、たとえば、ＮＧＦ−ベータ、血小板成長因子、形質転換成長因子（ＴＧＦ）、たとえば、ＴＧＦ−アルファおよびＴＧＦ−ベータ、インスリン様成長因子−Ｉおよび−ＩＩ、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、骨誘発因子、インターフェロン、たとえばインターフェロン−アルファ、ベータおよび−ガンマ、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、たとえば、マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）、および顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）、インターロイキン（ＩＬ）、たとえば、ＩＬ−１、ＩＬ−１ａｌｐｈａ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、腫瘍壊死因子、たとえば、ＴＮＦ−アルファまたはＴＮＦ−ベータ、ならびにＬＩＦおよびｋｉｔリガンド（ＫＬ）等の他のポリペプチド因子が含まれる。本明細書で使用される用語サイトカインには、天然源からのまたは組換え細胞培養からのタンパク質、および生来の配列サイトカインの生物学的に活性な等価物が含まれる。
【０２０５】
本明細書で記載するＲＡＮＫＬ−特異的抗体を含む組成物は、本明細書に記載される疾患に罹患する個体に投与してもよい。該疾患として、たとえば、骨粗鬆症、歯周炎、癌関連骨転移、多発性骨髄腫、関節リウマチ、乾癬性関節炎、家族性膨張性骨溶解症、パジェット病（若年性パジェット病を含む）、破骨細胞腫、慢性ウィルス感染症ならびに成人性および小児性白血病に関連する骨喪失、ならびにプロテーゼ周囲の骨喪失を始めとする骨減少性障害が挙げられるが、これに限定されない。ヒト疾患の処置のためのインビボ用途では、一般的に、投与の前に、本明細書に記載される抗体を医薬組成物に取り入れる。医薬組成物は、１種またはそれを超える本明細書に記載される抗体を、本明細書の他で記載したような、生理的に許容され得る担体または賦形剤と組み合わせて含む。医薬組成物を調製するために、有効量の１種またはそれを超える化合物を、投与の特定のモードに適することが当業者に公知の任意の医薬的担体（複数を含む）または賦形剤と混合する。医薬的担体は、液体、半液体または固体でもよい。非経口的、皮内的、皮下または局所的用途のために使用される溶液または懸濁液は、たとえば、無菌希釈剤（たとえば、水）、食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶剤、抗菌剤（たとえば、ベンジルアルコールおよびメチルパラベン）、抗酸化剤（たとえば、アスコルビン酸および亜硫酸水素ナトリウム）、キレート化剤（たとえば、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ））、緩衝液（たとえば、酢酸塩、クエン酸塩、およびリン酸塩）が挙げられる。静脈内投与の場合は、適した担体として、生理食塩水またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、およびグルコース、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、およびこれらの混合物等の増粘剤および安定化剤含む溶液が挙げられる。
【０２０６】
本明細書に記載されるＲＡＮＫＬ特異的抗体を含む組成物は、時間放出製剤または被覆等の、抗体が体から素早く除去をされることを防ぐ担体で調製されてもよい。そのような担体として、徐放性製剤が挙げられ、たとえば、移植およびマイクロカプセル化送達システム、ならびにエチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、ポリオルトエステル、ポリ乳酸、および当業者に公知の他のポリマー等の生分解性、生体適合性ポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０７】
本明細書では、ＲＡＮＫＬを結合する抗体を使用する処置方法が提供される。一実施形態では、本発明の抗体を、ＲＡＮＫＬの不適切な発現に関与する疾患を持つ患者に投与し、これは、本開示の文脈において、たとえば、存在するタンパク質の量、変異体タンパク質の存在、またはその両方における変化（たとえば、統計的に有意な増加または減少）のため、異常なＲＡＮＫＬ発現または活性を特徴とする疾患および障害を含むことを意味する。過剰は、分子レベルでの過剰発現、作用部位での長いまたは蓄積された出現、または正常に検出可能なＲＡＮＫＬの活性と比較して活性が増加すること（たとえば、統計的に有意な方法において）を含む（これらに限定されない）いかなる原因でも起こる。そのようなＲＡＮＫＬの過剰は、正常な発現、出現、またはＲＡＮＫＬシグナル伝達事象の活性と比較して測定することができ、該測定は、本明細書に記載される抗体の開発および／または臨床試験において、重要な役割を担うだろう。
【０２０８】
特に、本発明の抗体は、ＲＡＮＫＬの発現に関連する種々の骨減少性障害の処置に有用である。たとえば、本発明の一実施形態は、障害、たとえば（これに限定されない）、骨粗鬆症、歯周炎、癌関連骨転移、多発性骨髄腫、関節リウマチ、乾癬性関節炎、家族性膨張性骨溶解症、パジェット病（若年性パジェット病を含む）破骨細胞腫、慢性ウィルス感染症ならびに成人性および小児性白血病に関連する骨喪失、ならびにプロテーゼ周囲の骨喪失を始めとする骨減少性障害を、治療的有効量の本明細書で開示するＲＡＮＫＬ特異的抗体を癌患者に投与することによる処置の方法を提供する。投与後、統計的に有意な方法（たとえば、当業者に知られるであろう適切な制御）で、癌の進行および／または転移を阻害、防止、または遅らせる量は、有効であると考えられる。
【０２０９】
他の実施形態は、骨減少性障害、たとえば（これらに限定されない）骨粗鬆症、歯周炎、癌関連骨転移、多発性骨髄腫、関節リウマチ、乾癬性関節炎、家族性膨張性骨溶解症、パジェット病（若年性パジェット病を含む）破骨細胞腫、慢性ウィルス感染症ならびに成人性および小児性白血病に関連する骨喪失、ならびにプロテーゼ周囲の骨喪失の進行を、進行の防止を必要とする患者に、治療的有効量の本明細書で開示するＲＡＮＫＬ特異的抗体（たとえば、投与後、統計的に有意な方法、すなわち、当業者に知られるであろう適切な制御と比較して、癌の転移を阻害、防止、または遅らせる量）を投与することにより、防止する方法を提供する。
【０２１０】
他の実施形態は、骨減少性障害、たとえば（これらに限定されない）骨粗鬆症、歯周炎、癌関連骨転移、多発性骨髄腫、関節リウマチ、乾癬性関節炎、家族性膨張性骨溶解症、パジェット病（若年性パジェット病を含む）破骨細胞腫、慢性ウィルス感染症ならびに成人性および小児性白血病に関連する骨喪失、ならびにプロテーゼ周囲の骨喪失を、１またはそれを超えるこれらの障害を持つ患者に、治療的有効量の本明細書で開示するＲＡＮＫＬ特異的抗体を投与することにより、防止する方法を提供する。
【０２１１】
他の実施形態は、骨減少性障害、たとえば、骨粗鬆症、歯周炎、癌関連骨転移、多発性骨髄腫、関節リウマチ、乾癬性関節炎、家族性膨張性骨溶解症、パジェット病（若年性パジェット病を含む）破骨細胞腫、慢性ウィルス感染症ならびに成人性および小児性白血病に関連する骨喪失、ならびにプロテーゼ周囲の骨喪失の進行または予防を、１またはそれを超えるこれらの疾患に罹患している患者に、治療的有効量の本明細書で開示するＲＡＮＫＬ特異的抗体を投与することにより、処置、阻害する方法を提供する。
【０２１２】
他の実施形態では、本発明の抗ＲＡＮＫＬ抗体は、結合抗原、たとえば、構造エピトープの構造を決定するために使用され、該構造は、次いで、この構造を持つまたは模倣する化合物を、たとえば、化学的モデリングおよびＳＡＲ方法によって、開発するために使用してもよい。
【０２１３】
本発明の種々の他の実施形態は、一部、ＲＡＮＫＬを発現する細胞または組織の存在を検出するための診断用途に関する。したがって、本開示は、試料においてＲＡＮＫＬを検出する方法、たとえば、ＲＡＮＫＬを発現する細胞または組織の検出を提供する。そのような方法は、種々の公知の検出フォーマット、たとえば、免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）、免疫細胞化学的検査（ＩＣＣ）、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成（ＩＳＨ）、ホールマウントｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成（ＷＩＳＨ）、蛍光性ＤＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成（ＦＩＳＨ）、流動細胞計測法、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、および酵素連結免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）（これらに限定されない）に適用することができる。
【０２１４】
ＩＳＨは、標識化された相補的なＤＮＡまたはＲＮＡ鎖（すなわち、一次結合剤）を使用して、細胞または組織（ｉｎ  ｓｉｔｕ）の一部に、または組織が充分充分小さければ、組織全体（ホールマウントＩＳＨ）に、特異的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を局在化させる種類のハイブリッド形成である。これは、抗体を一次結合剤として使用して、組織中にタンパク質を局在化する免疫組織化学的検査とは種類が異なることは、当業者であれば理解するだろう。ＤＮＡ  ＩＳＨは、染色体の構造を決定するために、ゲノムＤＮＡで使用することができる。蛍光性ＤＮＡ  ＩＳＨ（ＦＩＳＨ）は、たとえば、染色体完全性を評価するために、医療診断において使用することができる。ＲＮＡ  ＩＳＨ（ハイブリッド形成組織化学的検査）は、ｍＲＮＡおよび他の転写物を測定または組織の部分またはホールマウント内に局在化するために使用される。
【０２１５】
種々の実施形態において、本明細書に記載される抗体は、直接または間接的に検出され得る検出可能な標識に複合されている。この点に関し、抗体「複合物」は、検出可能な標識に共有結合で連結している抗ＲＡＮＫＬ抗体と言う。本発明では、ＤＮＡプローブ、ＲＮＡプローブ、モノクローナル抗体、その抗原結合フラグメント、およびその抗体誘導体、たとえば、単一鎖−可変−フラグメント抗体またはエピトープタグを付けた抗体は、全て、検出可能な標識に共有結合で連結可能である。「直接検出」では、１個のみの検出可能な抗体、すなわち一次検出可能抗体が使用される。したがって、直接検出は、検出可能な標識に複合した抗体は、第２の抗体（二次抗体）を添加する必要なく、それ自体で検出され得ることを意味する。
【０２１６】
「検出可能な標識」は、試料における標識の存在および／または濃度を示す、検出可能な（たとえば、視覚的、電子光学的、その他）シグナルを造りだせる分子または物質である。抗体に複合する場合、該検出可能な標識は、特異的抗体が向かう標的を配置するおよび／または定量するために使用することができる。こうして、試料中の標的の存在および／または濃度は、検出可能な標識により造りだされるシグナルの検出により検出することができる。検出可能な標識は、直接または間接的に検出することができ、数種の異なる検出可能な標識が複合した、異なる特異的抗体の組合わせを、１種またはそれを超える標的を検出するために使用することができる。
【０２１７】
直接検出することができる検出可能な標識の例として、蛍光色素、放射性物質および金属粒子が挙げられる。一方、間接的検出では、一次抗体を適用した後、１種またはそれを超える追加の抗体、すなわち二次抗体の適用を必要とする。したがって、検出は、二次抗体または結合剤の検出可能な一次抗体への検出によって行われる。二次結合剤または抗体の添加を必要とする検出可能な一次結合剤または抗体の例として、検出可能な酵素結合剤および検出可能なハプテン結合剤または抗体が挙げられる。
【０２１８】
いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、第１結合剤を含む、核酸ポリマーに複合する（たとえば、ＩＳＨ、ＷＩＳＨまたはＦＩＳＨプロセスにおいて）。他の実施形態では、検出可能な標識は、第１結合剤を含む抗体に複合する（たとえば、ＩＨＣプロセスにおいて）。
【０２１９】
本開示の方法で使用される抗体に複合してもよい検出可能な標識の例として、蛍光標識、酵素標識、放射性同位体、化学発光性標識、電気化学発光性標識、生物発光性標識、ポリマー、ポリマー粒子、金属粒子、ハプテン、および色素が挙げられる。
【０２２０】
蛍光標識の例として、５−（および６）−カルボキシフルオレセイン、５−または６−カルボキシフルオレセイン、６−（フルオレセイン）−５−（および６）−カルボキシアミドヘキサン酸、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、テトラメチルローダミン、およびＣｙ２、Ｃｙ３、およびＣｙ５等の色素、ＡＭＣＡを含む、場合によっては置換されたクマリン、ＰｅｒＣＰ、Ｒ−フィコエリトリン（ＲＰＥ）およびアロフィコエリトリン（ＡＰＣ）を含むフィコビリタンパク質、テキサスレッド、プリンストンレッド、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）およびその類縁体、ならびにＲ−フィコエリトリンまたはアロフィコエリトリンの複合物、無機蛍光標識、たとえば、被覆ＣｄＳｅナノ微結晶等の半導体材料に基づく粒子が挙げられる。
【０２２１】
ポリマー粒子標識の例として、ポリスチレン、ＰＭＭＡまたはシリカのマイクロ粒子またはラテックス粒子（これらは、蛍光色素で埋め込むことができ）、または色素、酵素または基材を含むポリマーミセルまたはカプセルがある。
【０２２２】
金属粒子標識の例として、金粒子および被覆金粒子が挙げられ、これらは、銀染色により変換することができる。ハプテンの例として、ＤＮＰ、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ビオチン、およびジゴキシゲニンが挙げられる。酵素標識の例として、ホスホラデュッシュパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰまたはＡＰ）、β−ガラクトシダーゼ（ＧＡＬ）、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、β−Ｎ−アセチルグルコサミミダーゼ（ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｍｉｄａｓｅ）、β−グルクロニダーゼ、インベルターゼ、キサンチンオキシダーゼ、ホタルルシフェラーゼおよびグルコースオキシダーゼ（ＧＯ）が挙げられる。ホスホラデュッシュパーオキシダーゼ用の通常使用される基材の例として、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、ニッケル強化ジアミノベンジジン、３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）、ベンジジンジヒドロクロライド（ＢＤＨＣ）、Ｈａｎｋｅｒ−Ｙａｔｅｓ試薬（ＨＹＲ）、インドファンブルー（ＩＢ）、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、４−クロロ−１−ナフトール（ＣＮ）、アルファ−ナフトールプロニン（アルファ−ＮＰ）、ｏ−ジアニシジン（ＯＤ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、２−（ｐ−ヨードフェニル）−３−ｐ−ニトロフェニル−５−フェニルテトラゾリウムクロライド（ＩＮＴ）、テトラニトルブルーテトラゾリウム（ＴＮＢＴ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−ベータ−Ｄ−ガラクトシド／フェロ−フェリシアニド（ＢＣＩＧ／ＦＦ）が挙げられる。
【０２２３】
アルカリフォスフォターゼのためによく使われる基質の例として、ナフトール−ＡＳ−Ｂ１−ホスフェート／ファーストレッドＴＲ（ＮＡＢＰ／ＦＲ）、ナフトール−ＡＳ−ＭＸ−ホスフェート／ファーストレッドＴＲ（ＮＡＭＰ／ＦＲ）、ナフトール−ＡＳ−Ｂ１−ホスフェート／−ファーストレッドＴＲ（ＮＡＢＰ／ＦＲ）、ナフトール−ＡＳ−ＭＸ−ホスフェート／ファーストレッドＴＲ（ＮＡＭＰ／ＦＲ）、ナフトール−ＡＳ−Ｂ１−ホスフェート／ニューフクシン（ＮＡＢＰ／ＮＦ）、ブロモクロロインドリルホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）、５−Ｂｒｏｍｏ−４−クロロ−３−インドリル−ｂ−−ｄ−ガラクトピラノシド（ＢＣＩＧ）が挙げられる。
【０２２４】
発光標識の例として、ルミノール、イソルミノール、アクリジニウムエステル、１，２−ジオキセタン、およびピリドピリダジンが挙げられる。電気化学発光性標識の例として、ルテニウム誘導体が挙げられる。放射性標識の例として、ヨウ化物、コバルト、セレン、トリチウム、炭素、イオウおよびリンの放射性同位体が挙げられる。
【０２２５】
検出可能な標識は、本明細書に記載される抗体、または関心のある生物学的マーカー、たとえば、抗体、核酸プローブ、またはポリマーに特異的に結合する他の任意の分子に連結してもよい。さらに、検出可能な標識は、第２および／または第３および／または第４および／または第５結合剤または抗体、その他にも複合することができることは、当業者であれば、理解するだろう。さらに、当業者は、関心のある生物学的マーカーを特徴付けるために使用される追加の結合剤または抗体は、それぞれ、シグナル増幅ステップとして役立つかもしれないことを理解するだろう。検出可能な物質がたとえば、色素、コロイド状金粒子、発光試薬である場合、生物学的マーカーを、たとえば、光学顕微鏡、蛍光顕微鏡、電子顕微鏡を使用して視覚的に検出してもよい。生物学的マーカーに結合する視覚的に検出可能な物質を、分光光度計を使用して検出してもよい。検出可能な物質が放射性同位体の場合、検出は、オートラジオグラフィーによって視覚的に、またはシンチレーションカウンターを用いて非視覚的に行うことができる。たとえば、Ｌａｒｓｓｏｎ、１９８８、Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌａ．）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第８０巻１９９８、Ｊｏｈｎ  Ｄ．Ｐｏｕｎｄ（編集）（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎ．Ｊ．）参照。
【０２２６】
本発明は、さらに、試料中のＲＡＮＫＬまたはＲＡＮＫＬを発現する細胞または組織を検出するキットも提供し、ここで、キットは、本明細書に記載されるような、少なくとも１個の抗体、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクターまたは宿主細胞を含む。ある実施形態では、キットは、緩衝液、酵素、標識、基質、ビーズ、または本発明の抗体が付着している他の表面等と、使用のための指示書とを含んでもよい。
【実施例】
【０２２７】
実施例１
抗ＲＡＮＫＬ抗体の生成とヒト化
４匹のニュージーランドホワイトウサギを、完全フロイントアジュバント中の組換えヒトＲａｂＦｃ−ＲＡＮＫＬで皮下免疫化した。最も高い血清力価およびＲＡＮＫＬ中性化活性を持つウサギを、細胞融合のための脾摘出術の４日前に、ＰＢＳ中のＲａｂＦＣ−ＲＡＮＫＬで静脈内追加免疫した。
【０２２８】
抗体生成
脾細胞を免疫化ウサギから採取し、ＰＥＧ４０００（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を使用して、ウサギプラズマ細胞腫細胞２４０Ｅ−Ｗ２で融合した。ＨＡＴ（ハイポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン）による選択の後、元の９６−ウェルプレート内で成長するハイブリドーマクローンを、溶媒変更で、新しい９６−ウェルプレートに移した。ハイブリドーマ上澄み液を収集し、直接ＥＬＩＳＡにおけるＲＡＮＫＬへの特異的結合に関してスクリーニングした。ＥＬＩＳＡ結合アッセイで陽性の１２０個のハイブリドーマを、機能的スクリーニングのために選択した。
【０２２９】
ハイブリドーマの機能的スクリーニング
初期機能的スクリーニングに関し、確認した１２０個の陽性クローンからの上澄み液を、ＦＡＣＳによりＲＡＮＫＬ結合を、およびＥＬＩＳＡにより中和ＲＡＮＫＬ／ＲＡＮＫ結合を試験した。これらの実験により、５６個のユニーク陽性クローンが同定され、さらに、これらの機能的活性をＲＡＷ細胞アッセイで試験した。ＲＡＷ細胞アッセイにより、ＲＡＮＫＬにより誘発されたＲＡＷ細胞破骨細胞分化の阻害を測定する。５６個のクローンがＲＡＮＫＬ活性を中和することが分かった。ＲＡＮＫＬ活性を中和したトップの４０個のクローンを、さらなる機能的特徴付けのための分子クローニングおよび組換え発現のために、さらに選択した。図１Ａおよび図１Ｂは、それぞれ、トップ４０個のクローンのＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列のアラインメントを示す。
【０２３０】
組換え抗ＲＡＮＫＬ抗体
トップ４０個のクローンからのウサギＩｇＧのＬ鎖のＤＮＡフラグメントおよびＨ鎖の可変領域（ＶＨ）を、ＰＣＲによって増幅した。Ｌ鎖フラグメントを、Ｉ部位ではなく、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩで、ｐＴＴ５ベクターにクローン化し、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩおよびＫｐｎ  Ｉ部位で、ＶＨフラグメントを、Ｈ鎖ビルトインｐＴＴ５ベクターの定常領域にクローン化した。各ハイブリドーマについて、ＬまたはＨ鎖の３個のＤＮＡクローンを配列決定し、コンセンサス配列を持つプラスミドを、同定し、組換え発現のために使用した。組換え抗体を発現するために、ＬおよびＨ鎖プラスミドを、２９３−６Ｅ細胞（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  Ｃａｎａｄａ）に共遺伝子導入した。５日後、上澄み液を採取し、機能的アッセイの前に、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して定量化し、ＩｇＧ濃度を測定した。
【０２３１】
組換え抗ＲＡＮＫＬ抗体の機能的スクリーニング
上述のように同定された、選択された抗ＲＡＮＫＬ抗体の潜在的効力を特徴付けるために、多くのアッセイを使用した。図２に示すように、流動細胞計測法を使用して、選択された抗ＲＡＮＫＬ抗体の細胞表面上のＲＡＮＫＬの結合を試験した。４０個の抗ＲＡＮＫＬ抗体は全て、２９３個の細胞の表面で発現したＲＡＮＫＬに特異的に結合し、クローン２３、４０８およびＥＢＩ−５１−２２は、４０個のクローンの中で最も良好な結合を示した。さらに、図３で示すように、選択された抗ＲＡＮＫＬ抗体のＲＡＮＫＬの受容体へのＲＡＮＫＬ結合の妨害を試験した。特に、Ｒ＆Ｄ（８ｕｇ／ｍｌ）から購入したヒトＲＡＮＫを、実験の１６時間前に、９６−ウェルプレートに塗布した。続いて、プレートを、種々の濃度の組換え抗ＲＡＮＫＬ抗体でプレインキュベートした、０．５ｕｇ／ｍｌのＲＡＮＫＬを用い、３７℃で３０分処理した。マウス抗ヒトＲＡＮＫＬ抗体を使用して塗布ＲＡＮＫに結合したＲＡＮＫＬを検出し、二次ヤギ抗マウスＨＲＰを使用してシグナルを検出した。４０個の抗ＲＡＮＫＬ抗体は、全て、ＲＡＮＫへのＲＡＮＫＬの結合を特異的に妨害し、クローン２３、４０８およびＥＢＩ−５１−２２は、最も良好な妨害剤であった。
【０２３２】
さらなる実験では、選択された抗ＲＡＮＫＬ抗体のマウスＲＡＮＫＬへの交差反応性を試験した（図４参照）。以下の表１に結果をまとめ、これは、とりわけ、クローン７、３７、１９３、２０、２１０、２３、２２０、２２７、２４６、２５６、２７０、２９９、３１８、３２７、３７９、３８３、４１６、４２０、４４７、４７６、４８０、５４７、５６５、ＥＢＩ−５１−４およびＥＢＩ−５１−２３が、マウスＲＡＮＫＬへの強い交差反応性を有することを示す。
【０２３３】
【表１−９】
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さらに、ＲＡＮＫＬによって刺激された破骨細胞分化の阻害を試験するＲＡＷ細胞（ＲＡＷ２４６．７細胞）アッセイを使用して、抗ＲＡＮＫＬ抗体を評価した。Ｒａｗ２６４．７細胞株は、ネズミ科白血病ウィルス誘発腫瘍に由来した、ネズミ科マクロファージ細胞株である。要するに、ＲＡＷ２６４．７細胞は、ＲＡＮＫＬの存在下で破骨細胞様細胞に分化し、該破骨細胞分化は、破骨細胞の特性であるＴＲＡＰ活性により測定することができる。ＲＡＷ２６４．７細胞を、細胞培養培地中、一定量のＲＡＮＫＬ（４０ｎｇ／ｍｌ）および種々の量の抗ＲＡＮＫＬ抗体の存在下、４日間インキュベートした。４日間の最後に、酒石酸塩抵抗性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）活性について、細胞を、透過処理および酸性化により染色し、次いで、パラ−ニトロフェニルホスフェートで５分間処理した。０．５ＭのＮａＯＨ溶液５０ｕｌを加えることにより、反応を止めた。このアッセイでは、ＴＲＡＰ活性により、パラ−ニトロフェニルホスフェートはパラ−ニトロフェノールに変換され、これは、４０５ｎｍでの光学密度測定により定量化することができる。ＡＭＧ１６２ベンチマーク抗体と比較した、トップクローンの光学密度のプロット対抗ＲＡＮＫＬ濃度のプロットを図５に示し、ＩＣ５０を以下の表２にまとめる。クローン２３、ＥＢＩ−５１−２２、３２７、４０８、９１および３８３では、ＡＭＧ１６２と比べて、ＲＡＮＫＬ誘発破骨細胞分化を強く妨害したことを示した。
【０２３４】
本発明の研究では、ＡＭＧ１６２をベンチマークとして使用した。これは、ＲＡＮＫＬ（ＴＮＦａ／ｂ、ＴＲＡＩＬ、ＣＤ４０Ｌに結合していない）に関して特異的な完全ヒトＩｇＧ２抗体である。この抗体を、ＨｕＩｇ−ＴＧマウス（リンパ節融合）で、ＣＨＯ−ＲＡＮＫＬ（全長）細胞免疫化によって生成した。これは、ヒトＲＡＮＫＬに関して高い親和性を有する（Ｋｄ＝３×１０−１２Ｍ）。これは、ＩＣ５０  ＲＬ結合の阻害：９．４ｎｇ／ｍｌ、およびＩＣ５０破骨細胞様細胞形成の阻害、５０ｎｇ／ｍｌを示す。ＡＭＧ１６２は、ヒト（サル）特異的であるが、ネズミ科ＲＡＮＫＬへの結合は示さない。長いＰＫおよびＰＤプロファイルを有し、骨粗鬆症、骨転移および関節リウマチ（ＲＡ）の処置に使用されてきた。その副作用として、おそらくＴ、ＢおよびＤＣ細胞機能の干渉による潜在的な感染が挙げられる。
【０２３５】
【表２】
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選択されたトップ抗ＲＡＮＫＬ抗体の親和性を、表面プラズモン共鳴を使用して試験した。それを以下の表３にまとめる。結果は、クローン＃２３は、ベンチマーク抗体ＡＭＧ１６２に類似する結合親和性を有することを示した。クローン＃２３は、破骨細胞分化の強い阻害、高い結合親和性、およびマウスＲＡＮＫＬとの交差反応性を示し、したがって、これをインビボ研究およびヒト化のトップリード候補として選択した。
【０２３６】
【表３】
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また、クローン＃４０８および＃５１−２２も破骨細胞分化の強い阻害、高い結合親和性を示し、マウスＲＡＮＫＬとの交差反応性は示さなかった。これらのクローンを、ヒト化のバックアップ候補として選択した。
【０２３７】
ヒト化設計
ＣＤＲをヒト生殖系列にグラフトすることにより、クローン２３、４０８およびＥＢＩ−５１−２２をヒト化した。先ず、クローンの重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＫ）可変領域配列を、ヒト生殖系列ＶＨおよびＶＫデータベースに対してブラストした。最も近いヒト生殖系列配列を同定し、ヒト化テンプレートとして使用した。次に、ＣＤＲ接触または鎖間接触に潜在的に関与するフレームワーク領域内のウサギ残基を、ヒトおよびマウス抗体からの知識に基づいて同定した。抗体の構造的活性に重要でないと考えられる残基を、先のヒト化ウサギ抗体からの知識に基づいて同定した。
【０２３８】
クローン２３のヒト化ＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号：９、１２、２２６、１０−１１および２２７で表される。なお、３つの異なるヒト化ＶＨおよび３つの異なるヒト化ＶＬ領域が構築された。ヒト化ＶＨ  ２３ＨＺＤ−１  ＨＣは配列番号：９で表され、配列番号：１０（＃２３ＶＬ）および１１（＃２３ＶＬｂ）で表されるヒト化ＶＬ両方で試験した（以下でさらに検討する図６〜９、１１および１２参照）。最も高い親和性を持つヒト化２３クローンは、それぞれ、配列番号：２２６および２２７で表されるｈ２３ｎ  ＶＨおよびＶＬであった（図１２参照）。ｈ２３ｎクローンのＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号：３、４および２２８で表される。ｈ２３ｎクローンのＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号：１５、７および８で表される。図１Ｃは、クローン２３親ウサギ、ならびにヒト化ＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列のアラインメントを示す。
【０２３９】
クローン４０８のヒト化ＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号：２２９および２３０で表される。クローン４０８親ウサギ、ならびにヒト化ＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列のアラインメントを、図１Ｄに示す。
【０２４０】
クローンＥＢＩ５１−２２のヒト化ＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号：２３１および２３２で表される。クローンＥＢＩ５１−２２親ウサギならびにヒト化ＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列のアラインメントを、図１Ｅに示す。
【０２４１】
ヒト化クローン（複数を含む）の発現
Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｎｅａｇｅ  Ｇｕｉｄｅｄ（ＭＬＧ）法を使用して、クローン２３を、カッパ軽鎖を持つヒトＩｇＧ２サブクラスにヒト化し、４０８およびＥＢＩ−５１−２２を、ヒトＩｇＧ１サブクラスおよびカッパ軽鎖にヒト化した。ＭＬＧ法は、ネズミ科由来抗体のヒト化で使用するＣＤＲグラフト法とは、概念的および技術的両方で異なる。機能的抗体のパネルの生物学的および配列情報によりガイドされるヒト化は、ヒト化抗体において、完全な抗体活性の保持を可能にする。ＭＬＧでは、フレームワークにおける残基ばかりでなく、抗体のＣＤＲ領域における残基もヒト化される。ＤＮＡコード化ヒト化ＶＫ（クローン２３のＶＫ−ＨＺＤまたはＶＫ−ＨＺＤ−ｂ）およびＶＨ−ＨＺＤは、ＭＣＬａｂ（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）により合成した。ヒト化抗体を発現するために、ヒト化ＶＫフラグメントをＨｉｎｄ  ＩＩＩおよびＮｈｅ  ＩでヒトＣＫビルトインｐＴＴ５ベクターに、およびヒト化ＶＨをＨｉｎｄ  ＩＩＩおよびＢｓｉＷ  Ｉ部位でヒトＩｇＧ２  ＣＨビルトインｐＴＴ５ベクターにクローン化した。ヒトＣＫおよびＩｇＧ２  ＣＨのＤＮＡおよびアミノ酸配列を、定常領域に関して選択した。抗体のヒト化バージョンを、２９３−６Ｅ細胞中で発現させ、タンパク質Ａカラムにより精製し、ＰＢＳ緩衝液に対して透析した後、ＵＶ２８０により定量化した。
【０２４２】
ヒト化候補抗ＲＡＮＫＬ抗体クローン２３の機能的スクリーニング
上述のように同定されたクローン２３、４０８およびＥＢＩ−５１−２２ヒト化候補抗ＲＡＮＫＬ抗体の潜在的効力を特徴付けるために、多くのアッセイを使用した。特に、遺伝子導入された２９３細胞を使用して、ウサギ抗ＲＡＮＫＬ抗体およびそれらのヒト化対応物のＲＡＮＫＬを発現する細胞への結合を試験した（図６参照）。ヒト化２３および４０８の結合親和性は、それらの親ウサギ抗体に近い。
【０２４３】
さらに、ヒト化候補のＥＬＩＳＡにおいて受容体−リガンド結合を妨害する能力を試験した（図７参照）。要するに、実験の１６時間前に、ＲＡＮＫ（８ｕｇ／ｍｌ）を９６−ウェルプレートに塗布した。続いて、プレートを、種々の濃度のヒト化抗ＲＡＮＫＬ抗体でインキュベートした、０．５ｕｇ／ｍｌのＲＡＮＫＬで、３７℃３０分間処理した。マウス抗ヒトＲＡＮＫＬ抗体を使用してＲＡＮＫＬを検出し、二次ヤギ抗マウスＨＲＰを使用してシグナルを検出した。ＡＭＧ１６２を陽性コントロールとして使用した。結果は、ヒト化抗体は、全て、それらの親ウサギクローンと比べてそれと匹敵する妨害活性を有し、全て、ベンチマークＡＭＧ１６２より強力であることを実証した。
【０２４４】
さらなる実験では、ヒト化抗体のＲＡＮＫＬによって誘発されるＲＡＷ細胞破骨細胞分化を阻害する能力を試験した（図８および９（マウス）を参照）。要するに、ＲＡＷ２６４．７細胞を、細胞培養培地中、一定量のヒトＲＡＮＫＬ（４０ｎｇ／ｍｌ）および種々の量のウサギおよびヒト化抗ＲＡＮＫＬ抗体の存在下、４日間インキュベートした。４日間の最後に、酒石酸塩抵抗性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）活性について、細胞を、透過処理および酸性化により染色し、次いで、パラニトロフェニルホスフェートで５分間処理した。０．５ＭのＮａＯＨ溶液５０ｕｌを加えることにより、反応を止めた。ＴＲＡＰ活性により、パラニトロフェニルホスフェートはパラニトロフェノールに変換され、これを、４０５ｎｍでの光学密度測定により定量化した。ヒト化２３の２つのバージョンの破骨細胞阻害を図８Ａに示し、ヒト化抗ＲＡＮＫＬ４０８およびヒト化ＥＢＩ−５１−２２を図８Ｂに示す。結果は、ヒト化抗体は全て、ヒトＲＡＮＫＬに応答して、匹敵する破骨細胞分化への阻害効果を有し、全て、ＡＭＧ１６２と比較して、より強力なまたは劣らない活性を示した。図９Ａおよび図９Ｂに示すように、ヒト化２３  ｖｋｂは、マウスＲＡＮＫＬ−誘発破骨細胞の細胞分化の強い阻害効果を示し、一方、ヒト化４０８およびＥＢＩ−５１−２２はより少ない効果を示した。ＡＭＧ１６２はマウスＲＡＮＫＬに結合しないので、マウスＲＡＮＫＬ誘発破骨細胞分化を阻害しなかった。
【０２４５】
ヒト化候補抗ＲＡＮＫＬ抗体クローン２３のインビボ効力
インビボ効力をネズミ科骨粗鬆症モデルで評価した。４月齢の雌Ｃ５７／ＢＬ６マウスを、卵巣切除（ＯＶＸ）し、８匹の追加のマウスには偽手術した。次いで、ヒト化クローン２３の試験のために、マウスを、以下の表４にまとめるように、８匹の６グループに分けた。
【０２４６】
【表４】
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グループ２〜６の動物に、ビヒクルコントロール、ビスホスホネート陽性コントロール（アレンドロネート）、または試験品を、１週間に２回を４週間、合計で８用量を皮下注射した。骨デンシトメトリ分析のために、量的コンピュータ断層撮影（ｐＱＣＴ）骨デンシトメトリ機を使用した。右近位脛骨のＢＭＤを４週モニターした。検死で集めた右大腿骨の骨密度を、対応する組織診断を用い、１２週でスキャンした。ＰＤマーカーを、１、２、３および４週で試験した。処置の間、血液を、処置の２４時間前、毎週、眼窩後出血により集めた。インビボ破骨細胞活性のバイオマーカーであるＴＲＡＰ−５ｂ血清濃度を、ＥＬＩＳＡにより測定した。
【０２４７】
図１０に示すように、特に、親２３ウサギ抗体の単一投与後（１週）、２３処置グループでは、ＴＲＡＰ５ｂ（破骨細胞活性のバイオマーカーである酒石酸塩抵抗性酸性ホスファターゼ５ｂ）に関し、コントロールグループに比べて有意に大きな減少が観察され、これは、試験グループでのより強い破骨細胞活性の阻害（９０％阻害）を示す。
【０２４８】
ｐＱＣＴ結果は、ウサギおよびヒト化抗ＲＡＮＫＬ２３両方による処置は、小柱状ＢＭＤに関し、ＯＶＸビヒクル処置マウスの骨質量に比べて、４週で、有意に高い骨質量を得る結果となることを示した。一方、陽性コントロールであるアレンドロネートは、骨質量の保存への限界効果を示しただけであった（図１１参照）。
【０２４９】
追加の実験では、クローン２３のｈ２３ｎ  ＩｇＧ２ヒト化バージョンのＲＡＮＫＬへの結合を、ｈ２３  ＩｇＧ１およびｈ２３  ＩｇＧ２と比較した。この実験のために、ＨＣおよびＬＣの両方を２９３細胞に共遺伝子導入（ｃｏｎｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）し、排泄された抗体を精製した。ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、ｈ２３ｎ  ＩｇＧ２のＲＡＮＫＬタンパク質への結合親和性をｈ２３  ＩｇＧ１およびｈ２３  ＩｇＧ２と比較した。図１２に示す結果は、ｈ２３ｎヒト化抗体は、クローン２３の他のヒト化バージョンと比較して、改良された結合親和性を有することを示した。
【０２５０】
要約すると、これらの実験は、ＲＡＮＫＬへの高い結合親和性（Ｋｄ＝０．１６ｎＭ）を持つＲＡＮＫＬに対するヒト化ＩｇＧ２モノクローナル抗体の開発を記載する。ヒト化クローン２３は、ヒト、サルおよびマウスＲＡＮＫＬと交差反応性である。これによりインビボで抗体の直接評価を可能にし、バイオマーカー開発を容易にする。この抗体は、強力なＲＡＮＫＬ中和活性を発揮し、ＲＡＮＫ受容体へのＲＡＮＫＬ結合を妨害し、ＲＡＮＫＬ誘発破骨細胞分化を阻害し、マウスにおけるインビボでのＯＶＸ誘発骨喪失を阻害する。また、ヒト化２３抗ＲＡＮＫＬ抗体は、デノスマブ（ＡＭＧ１６２）とは異なるエピトープに結合し、安全性および効力プロフィールにおける改良をもたらし得る。
【０２５１】
上述の種々の実施形態を組み合わせて、さらなる実施形態を提供することができる。本明細書および／または出願データーシートに記載された全ての米国特許、米国特許出願公報、米国特許出願、外国の特許、外国の特許出願、および非特許文献は、その全体が、参照により本明細書に組み込まれる。種々の特許、出願および公報の概念を使用し、さらなる実施形態を提供するために、必要であれば、実施形態の態様を変更することができる。
【０２５２】
これらおよび他の変更は、先に詳述した開示に沿って、実施形態に行うことができる。一般的に、以下の特許請求の範囲において使用された用語は、特許請求の範囲を、明細書および特許請求の範囲に開示された特定の実施形態に限定するように解釈されるべきではなく、特許請求の範囲に記載するものと等価の全範囲とともに、全ての可能性のある実施形態を含むと解釈すべきである。したがって、特許請求の範囲は、開示により限定されない。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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