(57)【要約】【課題】本発明が解決しようとする課題は、高い薬物：脂質比であり、血清中での分解およびクリアランスから核酸を保護し、全身送達に好適であり、そして、核酸の細胞内送達をもたらすことができると同時に、患者に対して著しい毒性および／または危険性を伴わない核酸−脂質粒子を提供することである。【解決手段】前記課題は、カチオン性脂質の脂質部分（例えば、疎水性鎖）に位置する１個以上の生分解性基を有する式（Ｉ）のカチオン性脂質によって解決される。2018087250.tif 000071【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
2018087250.tif 000067
の化合物またはその塩であって、式中、
Ｒ’は存在しないか、水素またはアルキル（例えば、Ｃ１〜Ｃ４アルキル）であり；
Ｒ１およびＲ２に関しては、
（ｉ）Ｒ１およびＲ２は、各々独立して、任意選択で置換されているアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、複素環、もしくはＲ１０であるか；
（ｉｉ）Ｒ１およびＲ２は、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意選択で置換されている複素環式環を形成しているか；または
（ｉｉｉ）Ｒ１およびＲ２のうちの一方は、任意選択で置換されているアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、もしくは複素環であり、他方は、（ａ）隣接する前記窒素原子および（ｂ）前記窒素原子に隣接する（Ｒ）ａ基と共に、４員〜１０員の複素環式環もしくはヘテロアリール（例えば、６員環）を形成しており；
Ｒの各存在は、独立して−（ＣＲ３Ｒ４）−であり；
Ｒ３およびＲ４の各存在は、独立して、水素、ＯＨ、アルキル、アルコキシ、−ＮＨ２、Ｒ１０、アルキルアミノ、またはジアルキルアミノであり；
Ｒ１０の各存在は、独立して、ＰＥＧ、ならびにポリ（オキサゾリン）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（グリセロール）、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ［Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド］およびポリ（アミノ酸）をベースとするポリマーから選択され、ここで、
（ｉ）前記ＰＥＧまたはポリマーは、直鎖または分岐であり、（ｉｉ）前記ＰＥＧまたはポリマーは、ｎ個のサブユニットが重合したものであり、（ｉｉｉ）ｎは、１０〜２００単位の間の数平均重合度であり、そして（ｉｖ）前記式の化合物は、２個以下のＲ１０基を有しており；
Ｑに向かう破線は存在しないか、または結合であり；
前記Ｑに向かう破線が存在しない場合は、その時は、Ｑは存在しないか、もしくは−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ４）−、−Ｎ（Ｒ５）Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−Ｓ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｏ−Ｎ＝Ｃ（Ｒ５）−、−Ｃ（Ｒ５）＝Ｎ−Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５）−、−Ｎ（Ｒ５）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５）−、−Ｎ（Ｒ５）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−Ｃ（Ｓ）Ｏ−もしくは−Ｃ（Ｒ５）＝Ｎ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−であり；または
前記Ｑに向かう破線が結合である場合は、その時は、（ｉ）ｂは０であり、かつ（ｉｉ）Ｑとそれに隣接する第３級炭素（Ｃ＊）とは５個〜１０個の環原子を有する置換もしくは非置換の単環式もしくは二環式の複素環式基を形成しており；
Ｒ５の各存在は、独立して、水素またはアルキルであり；
ＸおよびＹは、各々独立して、−（ＣＲ６Ｒ７）ｃ−であり；
Ｒ６およびＲ７の各存在は、独立して、水素、ＯＨ、アルキル、アルコキシ、−ＮＨ２、アルキルアミノ、またはジアルキルアミノであり；
Ｍ１およびＭ２は、各々独立して、生分解性基であり；
ａは、１、２、３、４、５または６であり；
ｂは、０、１、２、または３であり；
ｃの各存在は、独立して、２〜１０であり；そして
Ｚ１およびＺ２は、各々独立して、（ｉ）Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルキル、（ｉｉ）Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルキル（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、または（ｉｉｉ）
【化２】
2018087250.tif 000068
（式中、Ｒ８およびＲ９の各々は、Ｃ２〜Ｃ８アルキルである）である、
化合物またはその塩。
【請求項２】
式：
【化３Ａ】
2018087250.tif 000069
【化３Ｂ】
2018087250.tif 000070
を有する化合物またはその塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１１年１２月７日に出願された米国仮特許出願第６１／５６８，１２１号の利益を請求するものであり、この仮特許出願は、参照により本明細書に援用される。
【０００２】
本発明は、生分解性脂質に関し、そして活性薬剤（例えば、核酸）の送達のためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
治療核酸としては、例えば、スモール干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、プラスミド、免疫刺激性核酸、アンチセンス、アンタゴｍｉｒ（ａｎｔａｇｏｍｉｒ）、アンチｍｉｒ（ａｎｔｉｍｉｒ）、マイクロＲＮＡ模倣物、スーパーｍｉｒ（ｓｕｐｅｒｍｉｒ）、Ｕ１アダプター、およびアプタマーが挙げられる。ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡに関しては、これらの核酸は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれるプロセスを介して特定のタンパク質の細胞内レベルをダウンレギュレートし得る。ＲＮＡｉの治療用途は極めて広範である。というのは、ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ構築物は、標的タンパク質に対して指向された任意のヌクレオチド配列を用いて合成され得るからである。現在までに、ｓｉＲＮＡ構築物は、インビトロおよびインビボの両方のモデルにおいて標的タンパク質を特異的にダウンレギュレートする能力を示している。さらに、ｓｉＲＮＡ構築物は、現在臨床試験において評価されているところである。
【０００４】
しかしながら、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ構築物が現在直面している２つの問題は、第１に、それらが血漿におけるヌクレアーゼ消化に対して感受性であること、そして第２に、それらが遊離ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡとして全身投与される場合、タンパク質ＲＩＳＣと結合し得るところである細胞内コンパートメントに入るそれらの能力が限られていることである。他の脂質成分（例えば、コレステロールおよびＰＥＧ脂質）と共にカチオン性脂質と、オリゴヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ）とから形成される脂質ナノ粒子が、オリゴヌクレオチドの細胞取り込みを促進するために使用されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
オリゴヌクレオチドの送達のための改善されたカチオン性脂質および脂質ナノ粒子の必要性が存続している。好ましくは、これらの脂質ナノ粒子は、高い薬物：脂質比を提供し、血清中での分解およびクリアランスから核酸を保護し、全身送達に好適であり、かつ核酸の細胞内送達をもたらすものであることが願われる。また、これらの脂質−核酸粒子は、核酸の有効用量での患者処置が患者に対する著しい毒性および／または危険性を伴うことにならないように、十分に許容されるものでありかつ適切な治療指数を提供するものであるべきである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、核酸−脂質粒子を形成するのに好適なカチオン性脂質に関する。本発明のカチオン性脂質の各々は、１個以上の生分解性基を含む。生分解性基は、カチオン性脂質の脂質部分（例えば、疎水性鎖）に位置する。これらのカチオン性脂質は、活性薬剤（例えば、核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ））を送達するための脂質粒子中に組み込まれ得る。カチオン性脂質中への生分解性基（１個または複数）の組み込みは、標的領域への活性薬剤の送達に続くカチオン性脂質のより迅速な代謝および身体からの除去を結果としてもたらす。その結果、これらのカチオン性脂質は、生分解性基を有さない類似のカチオン性脂質よりも低い毒性を有する。
【０００７】
１つの実施形態において、カチオン性脂質は、式：
【化１】
2018087250.tif 000002
の化合物またはその塩（例えば、その薬学的に受容可能な塩）であり、式中、
Ｒ’は存在しないか、水素またはアルキル（例えば、Ｃ１〜Ｃ４アルキル）であり；
Ｒ１およびＲ２に関しては、
（ｉ）Ｒ１およびＲ２は、各々独立して、任意選択で置換されているアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、複素環、もしくはＲ１０であるか；
（ｉｉ）Ｒ１およびＲ２は、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意選択で置換されている複素環式環を形成しているか；または
（ｉｉｉ）Ｒ１およびＲ２のうちの一方は、任意選択で置換されているアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、もしくは複素環であり、他方は、（ａ）隣接する窒素原子および（ｂ）窒素原子に隣接する（Ｒ）ａ基と共に、４員〜１０員の複素環式環もしくはヘテロアリール（例えば、６員環）を形成しており；
Ｒの各存在は、独立して、−（ＣＲ３Ｒ４）−であり；
Ｒ３およびＲ４の各存在は、独立して、水素、ＯＨ、アルキル、アルコキシ、−ＮＨ２、Ｒ１０、アルキルアミノ、またはジアルキルアミノであり（１つの好ましい実施形態において、Ｒ３およびＲ４の各存在は、独立して、水素またはＣ１〜Ｃ４アルキルである）；
Ｒ１０の各存在は、独立して、ＰＥＧ、ならびにポリ（オキサゾリン）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（グリセロール）、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ［Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド］およびポリ（アミノ酸）をベースとするポリマーから選択され、ここで、
（ｉ）ＰＥＧまたはポリマーは、直鎖または分岐であり、（ｉｉ）ＰＥＧまたはポリマーは、ｎ個のサブユニットが重合したものであり、（ｉｉｉ）ｎは、１０〜２００単位の間の数平均重合度であり、そして（ｉｖ）ここで、当該式の化合物は、２個以下のＲ１０基（好ましくは１個以下のＲ１０基）を有しており；
Ｑに向かう破線は存在しないか、または結合であり；
当該Ｑに向かう破線が存在しない場合は、その時は、Ｑは存在しないか、もしくは−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ４）−、−Ｎ（Ｒ５）Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−Ｓ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｏ−Ｎ＝Ｃ（Ｒ５）−、−Ｃ（Ｒ５）＝Ｎ−Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５）−、−Ｎ（Ｒ５）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５）−、−Ｎ（Ｒ５）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−Ｃ（Ｓ）Ｏ−もしくは−Ｃ（Ｒ５）＝Ｎ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−であり；または
当該Ｑに向かう破線が結合である場合は、その時は、（ｉ）ｂは０であり、かつ（ｉｉ）Ｑとそれに隣接する第３級炭素（Ｃ＊）とは５個〜１０個の環原子を有する置換もしくは非置換の単環式もしくは二環式の複素環式基を形成しており（例えば、複素環式基中のヘテロ原子は、ＯおよびＳ、好ましくはＯから選択される）；
Ｒ５の各存在は、独立して、水素またはアルキルであり；
ＸおよびＹは、各々独立して、−（ＣＲ６Ｒ７）ｃ−であり；
Ｒ６およびＲ７の各存在は、独立して、水素、ＯＨ、アルキル、アルコキシ、−ＮＨ２、アルキルアミノ、またはジアルキルアミノであり（１つの好ましい実施形態において、Ｒ６およびＲ７の各存在は、独立して、ＨまたはＣ１〜Ｃ４アルキルである）；
Ｍ１およびＭ２は、各々独立して、生分解性基（例えば、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＳＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−ＯＣ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｏ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（Ｒ５）＝Ｎ−、−Ｎ＝Ｃ（Ｒ５）−、−Ｃ（Ｒ５）＝Ｎ−Ｏ−、−Ｏ−Ｎ＝Ｃ（Ｒ５）−、−Ｃ（Ｏ）（ＮＲ５）−、−Ｎ（Ｒ５）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）（ＮＲ５）−、−Ｎ（Ｒ５）Ｃ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ５）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＳｉ（Ｒ５）２Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）（ＣＲ３Ｒ４）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、または−ＯＣ（Ｏ）（ＣＲ３Ｒ４）Ｃ（Ｏ）−）であり；
ａは、１、２、３、４、５または６であり；
ｂは、０、１、２、または３であり；
ｃの各存在は、独立して、２〜１０（すなわち、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）であり；そして
Ｚ１およびＺ２は、各々独立して、（ｉ）Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルキル、（ｉｉ）Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルキル（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、または（ｉｉｉ）
【化２】
2018087250.tif 000003
（式中、Ｒ８およびＲ９の各々は、独立して、Ｃ２〜Ｃ８アルキル（例えば、Ｃ２−アルキル、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、ｎ−Ｃ４アルキル）である）である。
【０００８】
１つの実施形態において、（ｉ）Ｒ１およびＲ２は、各々独立して、任意選択で置換されているアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、もしくは複素環であるか；または（ｉｉ）Ｒ１およびＲ２は、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意選択で置換されている複素環式環を形成している。
【０００９】
１つの実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、両方ともアルキル（例えば、メチル）である。
【００１０】
さらなる実施形態において、ａは３である。別の実施形態において、ｂは０である。
【００１１】
さらなる実施形態において、ａは３であり、ｂは０であり、かつＲは−ＣＨ２−である。さらにさらなる実施形態において、ａは３であり、ｂは０であり、Ｒは−ＣＨ２−であり、かつＱは−Ｃ（Ｏ）Ｏ−である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２はメチルであり、ａは３であり、ｂは０であり、Ｒは−ＣＨ２−であり、かつＱは−Ｃ（Ｏ）Ｏ−である。
【００１２】
別の実施形態において、ＸおよびＹは、各々独立して、−（ＣＨ２）ｃ−である。変数ｃは、例えば４〜１０または６〜１０であり得る。例えば、ＸおよびＹは、独立して、−（ＣＨ２）８−または−（ＣＨ２）９−である。１つの実施形態において、ＸおよびＹは、−（ＣＨ２）８−である。別の実施形態（ｒｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）において、ＸおよびＹは、−（ＣＨ２）９−である。
【００１３】
さらなる実施形態において、Ｍ１およびＭ２は、各々独立して、−ＯＣ（Ｏ）−または−Ｃ（Ｏ）Ｏ−である。例えば、１つの実施形態において、Ｍ１およびＭ２は、各々−Ｃ（Ｏ）Ｏ−である。
【００１４】
なおさらなる実施形態において、Ｚ１およびＺ２は、各々独立して、Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルキルである。例えば、１つの実施形態において、Ｚ１およびＺ２は、各々シクロへキシルである。別の実施形態において、Ｚ１およびＺ２は、各々デカヒドロナフタレニル（例えば、２−デカヒドロナフタレニル）である。
【００１５】
さらなる実施形態において、Ｚ１およびＺ２は、各々独立して、分岐アルキルであり、ここで、この分岐アルキルの各分岐は、２個以上の炭素原子（例えば、４個以上の炭素原子）を含有し、アルキル基は、生分解性基に対してα位の炭素原子において分岐している。
【００１６】
例えば、特定の実施形態において、Ｚ１およびＺ２は、各々独立して、式（ＩＩ）：
【化３】
2018087250.tif 000004
で表され、式中、Ｒ８およびＲ９は、各々独立して、Ｃ３〜Ｃ８アルキル（例えば、Ｃ４アルキル（例えば、ｎ−ブチル））である。
【００１７】
１つの実施形態において、式Ｉの化合物は、下位式（ｓｕｂｆｏｒｍｕｌａ）（ＩＩＩ）：
【化４】
2018087250.tif 000005
のものであり、式中、Ｘ、Ｙ、Ｚ１およびＺ２は、式Ｉについて上で定義したとおりである。
【００１８】
別の実施形態において、式（Ｉ）中の生分解性基（例えば、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−）に対してα位またはβ位である基ＸまたはＹ内の炭素原子は、１個もしくは２個のアルキル基（例えば、１個のＣ１〜Ｃ４アルキル基（例えば、−ＣＨ３置換基）、または２個のＣ１〜Ｃ４アルキル基（例えば、２個の−ＣＨ３置換基））で置換され得る、またはスピロ環式基（例えば、Ｃ３〜Ｃ５シクロアルキル（例えば、Ｃ３シクロアルキル））を有し得る。例えば、生分解性基に対してα位またはβ位である基ＸまたはＹ内の炭素原子は、独立して、
【化５】
2018087250.tif 000006
（式中、ｎは４〜６である）から選択され得る。
【００１９】
１つの実施形態において、Ｍ１基またはＭ２基と基ＸまたはＹ由来の隣接した可変部分（１つまたは複数）とは、基：
【化６】
2018087250.tif 000007
（式中、ｎは４〜６である）を形成している。
【００２０】
さらに別の実施形態は、本発明のカチオン性脂質を含む脂質粒子である。１つの実施形態において、脂質粒子は、本明細書に記載されるような式Ｉのｃ化合物を含む。別の実施形態において、脂質粒子は、本明細書に記載されるような式ＩＩＩの化合物を含む。
【００２１】
好ましい実施形態において、脂質粒子は、中性脂質と、凝集を低減できる脂質と、カチオン性脂質と、任意選択でステロール（例えば、コレステロール）とを含む。好適な中性脂質としては、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、およびＳＭが挙げられるが、これらに限定されない。凝集を低減できる好適な脂質としては、ＰＥＧ脂質（例えば、ＰＥＧ−ＤＭＡ、ＰＥＧ−ＤＭＧ、またはそれらの組み合わせ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２２】
脂質粒子は、活性薬剤（例えば、治療薬剤）をさらに含み得る。活性薬剤は、核酸（例えば、プラスミド、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、マイクロＲＮＡ、アンタゴｍｉｒ、アプタマー、またはリボザイム）であり得る。好ましい実施形態において、核酸はｓｉＲＮＡである。別の好ましい実施形態において、核酸はｍｉＲＮＡである。
【００２３】
別の実施形態において、脂質粒子は、本発明のカチオン性脂質と、中性脂質と、ステロールとを含む。脂質粒子は、活性薬剤（例えば、核酸（例えば、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ））をさらに含み得る。
【００２４】
本明細書に記載される脂質粒子は、脂質ナノ粒子であり得る。
【００２５】
本発明のさらに別の実施形態は、本発明の脂質粒子と薬学的に受容可能なキャリアとを含む薬学的組成物である。
【００２６】
１つの実施形態において、カチオン性脂質は、核酸分子の送達まで無傷のままであり、送達後、疎水性尾部の切断がインビボで起こる。
【００２７】
別の実施形態において、本発明は、核酸分子と本発明のカチオン性脂質とを含む核脂質粒子（ｎｕｃｌｅｉｃ  ｌｉｐｉｄ  ｐａｒｔｉｃｌｅ）を投与することを含む、核酸分子を送達する方法に関する。１つの実施形態において、カチオン性脂質は、核酸分子の送達まで無傷のままであり、送達後、疎水性尾部の切断がインビボで起こる。
【００２８】
さらに別の態様は、細胞における標的遺伝子の発現を、本発明の脂質粒子を細胞に供給することにより調節する方法である。活性薬剤は、プラスミド、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、マイクロＲＮＡ、アンタゴｍｉｒ、アプタマー、およびリボザイムから選択される核酸であり得る。好ましい実施形態において、核酸は、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡである。
【００２９】
さらに別の態様は、被験体におけるポリペプチドの過剰発現により特徴付けられる疾患または障害を、本発明の薬学的組成物を被験体に提供することにより処置する方法であって、活性薬剤が、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドから選択される核酸であり、かつ当該ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドが、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその相補体に特異的に結合するポリヌクレオチドを含む、方法である。好ましい実施形態において、核酸は、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡである。
【００３０】
さらに別の態様は、被験体におけるポリペプチドの過少発現により特徴付けられる疾患または障害を、本発明の薬学的組成物を被験体に提供することにより処置する方法であって、活性薬剤が、当該ポリペプチドまたはその機能的変異体もしくは断片をコードするプラスミドである、方法である。
【００３１】
さらに別の態様は、被験体における免疫応答を、薬学的組成物を被験体に提供することにより誘導する方法であって、活性薬剤が、免疫刺激性オリゴヌクレオチドである、方法である。
【００３２】
さらに別の態様は、上に記載した組成物または脂質粒子を含むトランスフェクション剤であって、当該組成物または脂質粒子が核酸を含む、トランスフェクション剤である。当該剤は、細胞と接触させると、効率的に核酸をその細胞に送達し得る。さらに別の態様は、上に記載した組成物または脂質粒子を入手または形成し、その組成物または脂質粒子を細胞と接触させることにより、細胞の内部に核酸を送達する方法である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
１つの態様において、本発明は、中性脂質と、凝集を低減できる脂質と、カチオン性脂質と、任意選択でステロールとを含む脂質粒子に関する。特定の実施形態において、脂質粒子は、活性薬剤（例えば、治療薬剤）をさらに含む。これらの脂質、それを含む脂質粒子および組成物、ならびに治療薬剤を送達して遺伝子およびタンパク質発現を調節するためのそれらの使用の様々な例示的な実施形態が、以下にさらに詳細に説明される。
【００３４】
カチオン性脂質
１つの実施形態において、カチオン性脂質は、式Ｉの化合物である。別の実施形態において、カチオン性脂質は、式ＩＩＩの化合物である。以下の開示内容は、式Ｉの化合物の種々の実施形態である。
【００３５】
１つの実施形態において、Ｍ１およびＭ２は、各々独立して、
−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＳＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−ＯＣ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｏ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（Ｒ５）＝Ｎ−、−Ｎ＝Ｃ（Ｒ５）−、−Ｃ（Ｒ５）＝Ｎ−Ｏ−、−Ｏ−Ｎ＝Ｃ（Ｒ５）−、−Ｃ（Ｏ）（ＮＲ５）−、−Ｎ（Ｒ５）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）（ＮＲ５）−、−Ｎ（Ｒ５）Ｃ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ５）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＳｉ（Ｒ５）２Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）（ＣＲ３Ｒ４）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、または−ＯＣ（Ｏ）（ＣＲ３Ｒ４）Ｃ（Ｏ）−
である。
【００３６】
別の実施形態において、Ｍ１およびＭ２は、各々独立して、
−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、−Ｃ（Ｒ５）＝Ｎ−、−Ｎ＝Ｃ（Ｒ５）−、−Ｃ（Ｒ５）＝Ｎ−Ｏ−、−Ｏ−Ｎ＝Ｃ（Ｒ５）−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５）−、−Ｎ（Ｒ５）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｓ）−、−ＯＳｉ（Ｒ５）２Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）（ＣＲ３Ｒ４）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、または−ＯＣ（Ｏ）（ＣＲ３Ｒ４）Ｃ（Ｏ）−
である。
【００３７】
さらに別の実施形態において、Ｍ１およびＭ２は、各々独立して、
−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｒ５）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ５）＝Ｎ−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５）−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−Ｃ（Ｓ）Ｏ−、−ＯＳｉ（Ｒ５）２Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）（ＣＲ３Ｒ４）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、または−ＯＣ（Ｏ）（ＣＲ３Ｒ４）Ｃ（Ｏ）−
である。
【００３８】
別の実施形態において、Ｍ１およびＭ２は、各々−Ｃ（Ｏ）Ｏ−である。
【００３９】
１つの実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、各々独立して、任意選択で置換されているアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、または複素環である。１つの実施形態において、Ｒ１は、アルキルであり、そしてＲ２は、アルキル、シクロアルキルまたはシクロアルキルアルキルである。１つの実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、各々独立して、アルキル（例えば、Ｃ１〜Ｃ４アルキル（例えば、メチル、エチル、またはイソプロピル））である。１つの実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、両方ともメチルである。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意選択で置換されている複素環式環（例えば、Ｎ−メチルピペラジニル）を形成している。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２のうちの一方は、
【化７】
2018087250.tif 000008
である（例えば、Ｒ１は上記の２つの基のうちの１つであり、Ｒ２は水素である）。
【００４０】
１つの実施形態において、Ｒ’は、水素またはアルキルである。別の実施形態において、Ｒ’は、水素またはメチルである。１つの実施形態において、Ｒ’は存在しない。１つの実施形態において、Ｒ’は、存在しないかまたはメチルである。
【００４１】
正電荷を有する原子（例えば、窒素原子）を含有するカチオン性脂質化合物に関して、この化合物はまた、負に荷電した対イオンも含む。対イオンは、任意のアニオン（例えば、有機アニオンまたは無機アニオン）であり得る。アニオンの好適な例としては、トシレート、メタンスルホネート、アセテート、シトレート、マロネート、タータレート、スクシネート、ベンゾエート、アスコルベート、α−ケトグルタレート、α−グリセロホスフェート、ハライド（例えば、クロリド）、スルフェート、ニトレート、バイカーボネート、およびカーボネートが挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施形態において、対イオンは、ハライド（例えば、Ｃｌ）である。
【００４２】
１つの実施形態において、各Ｒは、独立して、−（ＣＲ３Ｒ４）−であり、式中、Ｒ３およびＲ４は、各々独立して、Ｈまたはアルキル（例えば、Ｃ１〜Ｃ４アルキル）である。例えば、１つの実施形態において、各Ｒは、独立して、−（ＣＨＲ４）−であり、式中、各Ｒ４は、独立して、Ｈまたはアルキル（例えば、Ｃ１〜Ｃ４アルキル）である。別の実施形態において、各Ｒは、独立して、−ＣＨ２−、−Ｃ（ＣＨ３）２−または−ＣＨ（ｉＰｒ）−（式中、ｉＰｒはイソプロピルである）である。別の実施形態において、各Ｒは、−ＣＨ２−である。
【００４３】
別の実施形態において、Ｒ５は、各場合において、水素またはメチルである。例えば、Ｒ５は、各場合において、水素であり得る。
【００４４】
１つの実施形態において、Ｑは存在しないか、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５）−、−Ｎ（Ｒ５）Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−Ｓ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｒ５）＝Ｎ−Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５）−、−Ｎ（Ｒ５）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５）−、−Ｎ（Ｒ５）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−Ｃ（Ｓ）Ｏ−または−Ｃ（Ｒ５）＝Ｎ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−である。１つの実施形態において、Ｑは、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−である。
【００４５】
１つの実施形態において、Ｑに向かう破線は存在せず、ｂは０であり、かつＲ’Ｒ１Ｒ２Ｎ−（Ｒ）ａ−Ｑ−とそれに隣接する第３級炭素（Ｃ＊）とは以下の基：
【化８】
2018087250.tif 000009
を形成しており、式中、ｎは１〜４である（例えば、ｎは２である）。
【００４６】
１つの実施形態において、Ｑに向かう破線は存在せず、ｂは０であり、かつＲ’Ｒ１Ｒ２Ｎ−（Ｒ）ａ−Ｑ−とそれに隣接する第３級炭素とは以下の基：
【化９】
2018087250.tif 000010
を形成しており、式中、ｎは１〜４であり（例えば、ｎは２である）、かつＲ１、Ｒ２、Ｒ、ａ、およびｂは式（Ｉ）について定義したとおりである。１つの実施形態において、ａは３である。
【００４７】
１つの実施形態において、Ｑに向かう破線は存在せず、ｂは０であり、かつＲ’Ｒ１Ｒ２Ｎ−（Ｒ）ａ−Ｑ−とそれに隣接する第３級炭素とは以下の基：
【化１０】
2018087250.tif 000011
を形成しており、式中、ｎは１〜４であり（例えば、ｎは２である）、かつＲ１、Ｒ２、Ｒ、ａ、およびｂは式（Ｉ）について定義したとおりである。１つの実施形態において、ａは０である。例えば、当該基は：
【化１１】
2018087250.tif 000012
であり得る。
【００４８】
１つの実施形態において、ｂは０である。別の実施形態において、ａは２、３または４であり、かつｂは０である。例えば、１つの実施形態において、ａは３であり、かつｂは０である。別の実施形態において、ａは３であり、ｂは０であり、かつＱは−Ｃ（Ｏ）Ｏ−である。
【００４９】
特定の実施形態において、カチオン性脂質中に存在する生分解性基は、エステル（例えば、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−または−ＯＣ（Ｏ）−）、ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）、オキシム（例えば、−Ｃ（Ｈ）＝Ｎ−Ｏ−または−Ｏ−Ｎ＝Ｃ（Ｈ）−）、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｒ５）＝Ｎ−、−Ｎ＝Ｃ（Ｒ５）−、−Ｃ（Ｒ５）＝Ｎ−Ｏ−、−Ｏ−Ｎ＝Ｃ（Ｒ５）−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５）、−Ｎ（Ｒ５）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）（ＮＲ５）−、（ＮＲ５）Ｃ（Ｓ）−、−Ｎ（Ｒ５）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５）−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｓ）−、−ＯＳｉ（Ｒ５）２Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）（ＣＲ３Ｒ４）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、または−ＯＣ（Ｏ）（ＣＲ３Ｒ４）Ｃ（Ｏ）−から選択される。
【００５０】
本発明のカチオン性脂質（式Ｉおよび式ＩＩＩの化合物を含む）に好適なコレステロール部分は、式：
【化１２】
2018087250.tif 000013
を有する。
【００５１】
さらなる実施形態には、頭部基と、１つ以上の疎水性尾部と、その頭部基と１つ以上の尾部との間のリンカーとを有するカチオン性脂質が含まれる。頭部基としては、アミン；例えば、所望のｐＫａを有するアミンが挙げられ得る。ｐＫａは、脂質の構造、特に頭部基の性質；例えば、官能基（例えば、アニオン性官能基、水素結合ドナー官能基、水素結合アクセプター基、疎水性基（例えば、脂肪族基）、親水性基（例えば、ヒドロキシルまたはメトキシ）、またはアリール基）の有無および位置の影響を受け得る。頭部基アミンは、カチオン性アミン；第１級、第２級または第３級アミンであり得；頭部基は、１個のアミン基（モノアミン）、２個のアミン基（ジアミン）、３個のアミン基（トリアミン）、またはオリゴアミンもしくはポリアミンのようにより多くのアミン基を含み得る。頭部基は、アミンほど塩基性の強くない官能基（例えば、イミダゾール基、ピリジン基、またはグアニジニウム基など）を含み得る。頭部基は、双性イオン性であり得る。他の頭部基もまた好適である。
【００５２】
１つ以上の疎水性尾部には、２つの疎水性鎖が含まれ得、これらは、同じかまたは異なり得る。尾部は脂肪族であり得、例えば、尾部は、炭素および水素からなり得、飽和または不飽和のいずれかであるが、芳香環は有さない。尾部は、脂肪酸尾部であり得る。いくつかのそのような基としては、オクタニル、ノナニル、デシル、ラウリル、ミリスチル、パルミチル、ステアリル、α−リノレイル、ステアリドニル、リノレイル、γ−リノレニル、アラカドニル、およびオレイルが挙げられる。他の疎水性尾部もまた好適である。
【００５３】
リンカーとしては、例えば、グリセリドリンカー、非環式グリセリドアナログリンカー、または環式リンカー（スピロリンカー、二環式リンカー、および多環式リンカーを含む）が挙げられ得る。リンカーは、エーテル、エステル、ホスフェート、ホスホネート、ホスホロチオエート、スルホネート、ジスルフィド、アセタール、ケタール、イミン、ヒドラゾン、またはオキシムなどの官能基を含み得る。他のリンカーおよび官能基もまた好適である。
【００５４】
１つの実施形態において、カチオン性脂質は、ラセミ混合物である。別の実施形態において、カチオン性脂質は、１つのジアステレオマーに富んでいる（例えば、そうしたカチオン性脂質は、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８０％または少なくとも７０％のジアステレオマー過剰率を有する）。さらに別の実施形態において、カチオン性脂質は、１つのエナンチオマーに富んでいる（例えば、そうした脂質は、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８０％または少なくとも７０％のエナンチオマー過剰率を有する）。さらに別の実施形態において、カチオン性脂質は、キラル的に純粋（ｃｈｉｒａｌｌｙ  ｐｕｒｅ）であり、例えば、単一の光学異性体である。さらに別の実施形態において、カチオン性脂質は、１つの光学異性体について富化されている。
【００５５】
カチオン性脂質は、１個以上の生分解性基を含む。生分解性基（１個または複数）は、生物環境において（例えば、生物体、器官、組織、細胞、または細胞小器官において）結合破壊反応を受け得る１つ以上の結合を含む。生分解性結合を含む官能基としては、例えば、エステル、ジチオール、およびオキシムが挙げられる。生分解は、被験体に投与されたときの身体からの化合物のクリアランスに影響を及ぼす要因であり得る。生分解は、細胞ベースのアッセイで測定され得、このアッセイでは、カチオン性脂質を含む製剤が細胞に曝露され、様々な時点で試料が採取される。脂質画分が細胞から抽出され、ＬＣ−ＭＳにより分離および分析され得る。ＬＣ−ＭＳデータから、生分解の速度（例えば、ｔ１／２値など）が測定され得る。
【００５６】
例えば、化合物
【化１３】
2018087250.tif 000014
は、各脂肪族鎖中にエステル結合を含み、このエステル結合は、例えば生物環境において、例えばリパーゼまたはエステラーゼに曝露されると、加水分解を受け得る。化合物の構造は、当然のことながら、化合物が生分解を受ける速度に影響を及ぼす。したがって、
【化１４】
2018087250.tif 000015
のような関連化合物は、異なる生分解速度を示すことが予想されるであろう。生分解速度に対するより大きな影響が、加水分解部位における化合物の構造の変化から予想されるであろう。加水分解速度に影響を及ぼし、それによって生分解および被験体の身体からのクリアランスの速度に影響を及ぼし得る１つの改変は、加水分解反応の脱離基が第２級アルコールではなく第１級アルコールを有するようにすることである。
【００５７】
例えば、理論に拘束されることを望むものではないが、上に示した化合物１および化合物２は、下記のスキームに示されるように代謝され得る。
【化１５】
2018087250.tif 000016
【００５８】
１つの実施形態において、本明細書に記載される実施形態のうちの任意のもののカチオン性脂質は、約３時間未満（例えば、約２．５時間未満、約２時間未満、約１．５時間未満、約１時間未満、約０．５時間未満または約０．２５時間未満）のインビボ半減期（ｔ１／２）を（例えば、肝臓、脾臓または血漿において）有する。
【００５９】
別の実施形態において、１個または複数の生分解性基を含む本明細書に記載される実施形態のうちの任意のもののカチオン性脂質は、その１個または複数の生分解性（ｂｉｏｄｅｇｒａｂｌｅ）基を有さない同様のカチオン性脂質についてのインビボ半減期（ｔ１／２）の約１０％未満（例えば、約７．５％未満、約５％未満、約２．５％未満）のインビボ半減期（ｔ１／２）を（例えば、肝臓、脾臓または血漿において）有する。
【００６０】
いくつかのカチオン性脂質は、頭部基と組み合わされた疎水性基として好都合に表され得る。例として、化合物：
【化１６】
2018087250.tif 000017
は、次のように頭部基と疎水性基との組み合わせであると見なされ得る。
【化１７】
2018087250.tif 000018
【００６１】
したがって、いくつかの好適な頭部基としては、表１に示されているものが挙げられる。
【００６２】
【表１Ａ】
2018087250.tif 000019
【表１Ｂ】
2018087250.tif 000020
【表１Ｃ】
2018087250.tif 000021
【００６３】
いくつかの好適な疎水性尾部基としては、表２に示されているものが挙げられる。
【００６４】
【表２Ａ】
2018087250.tif 000022
【表２Ｂ】
2018087250.tif 000023
【００６５】
別の態様において、本発明は、式Ｉの化合物を調製する方法に関する。好適な例示的な合成方法は、下記のスキーム１およびスキーム２に示されている。下記のスキームにおける可変部分は、上記の式Ｉ中の同じ位置にある可変部分と同じである。
【００６６】
本発明の（例えば、Ｍ１および／またはＭ２が−ＯＣ（Ｏ）−である）化合物は、下記に示されるスキーム１によって調製され得る。
【化１８】
2018087250.tif 000024
【００６７】
本発明の（例えば、Ｍ１および／またはＭ２が−Ｃ（Ｏ）Ｏ−である）化合物を調製する別の方法は、下記のスキーム２に示されている。
【化１９】
2018087250.tif 000025
【００６８】
１つの実施形態において、本発明のカチオン性脂質は、以下の化合物、およびその塩（その薬学的に受容可能な塩を含む）から選択される。
【化２０Ａ】
2018087250.tif 000026
【化２０Ｂ】
2018087250.tif 000027
【化２０Ｃ】
2018087250.tif 000028
【化２０Ｄ】
2018087250.tif 000029
【００６９】
別の実施形態において、本発明のカチオン性脂質は、以下の化合物、およびその塩（その薬学的に受容可能な塩を含む）から選択される。
【化２１Ａ】
2018087250.tif 000030
【化２１Ｂ】
2018087250.tif 000031
【００７０】
カチオン性脂質には、代替的な脂肪酸基および示されているものとは別のジアルキルアミノ基（アルキル置換基が異なるもの（例えば、Ｎ−エチル−Ｎ−メチルアミノ−、およびＮ−プロピル−Ｎ−エチルアミノ−）を含む）を有するものが含まれる。
【００７１】
特定の実施形態において、カチオン性脂質は、当該脂質が生理的ｐＨ以下のｐＨ（例えば、ｐＨ７．４）においては正に荷電し、別のｐＨ、好ましくは生理的ｐＨ以上のｐＨにおいては中性となるように、少なくとも１個のプロトン化可能なまたは脱プロトン化可能な基を有している。このような脂質もまた、カチオン性脂質と称される。当然のことながら、ｐＨの関数としてのプロトンの付加または除去は平衡過程であること、および、荷電脂質または中性脂質への言及は支配的な化学種の性質に言及するものであり、脂質の全てが荷電形態または中性形態で存在することを必要とするものではないことが理解されるであろう。脂質は、１個より多くのプロトン化可能なもしくは脱プロトン化可能な基を有し得るか、または双性イオン性であり得る。
【００７２】
特定の実施形態において、プロトン化可能な脂質（すなわち、カチオン性脂質）は、約４〜約１１の範囲内のプロトン化可能基のｐＫａを有する。例えば、脂質は、脂質粒子中に組み込まれる場合、約４〜約７、例えば、約５〜約７（例えば、約５．５〜約６．８）のｐＫａを有し得る。このような脂質は、より低いｐＨの製剤化段階においてはカチオン性であり得るが、粒子は、およそｐＨ７．４の生理的ｐＨにおいては（完全にではないが）大部分が表面中和されるであろう。
【００７３】
特定の実施形態において、脂質は、荷電脂質である。本明細書で使用される場合、用語「荷電脂質」は、１つまたは２つの脂質アシル鎖または脂質アルキル鎖と、第４級アミノ頭部基とを有する脂質を包含するが、これらに限定されない。第４級アミンは、永久正電荷を有している。頭部基は、任意選択で、イオン化可能基（例えば、生理的ｐＨにおいてプロトン化され得る第１級、第２級、または第３級アミン）を含み得る。第４級アミンの存在は、イオン化可能基のｐＫａを、第４級アミンがない（例えば、第４級アミンが第３級アミンに置き換えられている）構造的に類似した化合物におけるそうした基のｐＫａと比べて変えることができる。
【００７４】
本発明に含まれるのは、本明細書に記載されるカチオン性脂質の遊離形態、ならびにその薬学的に受容可能な塩および立体異性体である。カチオン性脂質は、アミンカチオン性脂質のプロトン化塩であり得る。用語「遊離形態」とは、非塩形態のアミンカチオン性脂質をいう。遊離形態は、好適な希塩基水溶液（例えば、希ＮａＯＨ水、希炭酸カリウム水、希アンモニア水および希重炭酸ナトリウム水）で塩を処理することにより再生され得る。
【００７５】
本発明のカチオン性脂質の薬学的に受容可能な塩は、塩基性部分または酸性部分を含有する本発明のカチオン性脂質から、従来の化学的方法によって合成され得る。一般に、塩基性カチオン性脂質の塩は、イオン交換クロマトグラフィーによるか、または遊離塩基を好適な溶媒もしくは溶媒の種々の組み合わせにおいて化学量論量もしくは過剰量の所望の塩形成無機酸もしくは有機酸と反応させることによるかのいずれかによって調製される。同様に、酸性化合物の塩は、適切な無機塩基または有機塩基との反応によって形成される。
【００７６】
したがって、本発明のカチオン性脂質の薬学的に受容可能な塩には、塩基性の本発明のカチオン性脂質を無機酸または有機酸と反応させることによって形成される本発明のカチオン性脂質の無毒性塩が含まれる。例えば、無毒性塩には、無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸など）から誘導される塩、および有機酸（例えば、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パモ酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、２−アセトキシ−安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、イセチオン酸、およびトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ））から調製される塩が含まれる。
【００７７】
本発明のカチオン性脂質が酸性である場合、好適な「薬学的に受容可能な塩」とは、薬学的に受容可能な無毒性塩基（無機塩基および有機塩基を含む）から調製される塩をいう。無機塩基から誘導される塩には、アルミニウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩、銅塩、第二鉄塩、第一鉄塩、リチウム塩、マグネシウム塩、第二マンガン塩、第一マンガン塩、カリウム塩、ナトリウム塩、および亜鉛塩が含まれる。１つの実施形態において、塩基は、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、カリウムおよびナトリウムから選択される。薬学的に受容可能な有機無毒性塩基から誘導される塩には、第１級、第２級および第３級アミン、置換アミン（天然に存在する置換アミンを含む）、環状アミン、ならびに塩基性イオン交換樹脂（例えば、アルギニン、ベタインカフェイン、コリン、Ｎ，Ｎ１−ジベンジルエチレンジアミン、ジエチルアミン、２−ジエチルアミノエタノール、２−ジメチルアミノエタノール、エタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−エチルモルホリン、Ｎ−エチルピペリジン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドラバミン（ｈｙｄｒａｂａｍｉｎｅ）、イソプロピルアミン、リジン、メチルグルカミン、モルホリン、ピペラジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン、テオブロミン、トリエチルアミン、トリメチルアミントリプロピルアミン、およびトロメタミン）の塩が含まれる。
【００７８】
本発明のカチオン性脂質は、潜在的に内部塩または双性イオンであり得るということにも気づかれるであろう。というのは、生理的条件下において、化合物中の脱プロトン化された酸性部分（例えば、カルボキシル基）はアニオン性であり得るからであり、その場合、この電子電荷は、プロトン化またはアルキル化された塩基性部分（例えば、第４級窒素原子）のカチオン電荷と内部で均衡した状態であり得るであろう。
【００７９】
上に具体的に記載したカチオン性脂質に加えて、生理的ｐＨ付近において正味の正電荷を有する１種以上のさらなるカチオン性脂質もまた、本明細書に記載される脂質粒子および組成物中に含まれ得る。そのようなカチオン性脂質としては、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＤＡＣ」）；Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ−Ｎ−トリエチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＴＭＡ」）；Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（「ＤＤＡＢ」）；Ｎ−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＴＡＰ」）；１，２−ジオレイルオキシ−３−トリメチルアミノプロパンクロリド塩（「ＤＯＴＡＰ．Ｃｌ」）；３β−（Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル）コレステロール（「ＤＣ−Ｃｈｏｌ」）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ−２−（スペルミンカルボキサミド）エチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムトリフルオロアセテート（「ＤＯＳＰＡ」）、ジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン（「ＤＯＧＳ」）、１，２−ジレオイル（ｄｉｌｅｏｙｌ）−ｓｎ−３−ホスホエタノールアミン（「ＤＯＰＥ」）、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（「ＤＯＤＡＰ」）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ジオレイルオキシ）プロピルアミン（「ＤＯＤＭＡ」）、およびＮ−（１，２−ジミリスチルオキシプロパ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（「ＤＭＲＩＥ」）が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、カチオン性脂質の多くの市販の調製物（例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（ＤＯＴＭＡおよびＤＯＰＥを含む、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬから入手可能）、およびＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（ＤＯＳＰＡおよびＤＯＰＥを含む、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬから入手可能）など）が使用され得る。
【００８０】
他の脂質成分
本明細書に記載される脂質粒子および組成物はまた、１種以上の中性脂質を含み得る。中性脂質は、存在する場合、生理的ｐＨにおいて非荷電形態または中性の双性イオン性形態のいずれかで存在する多くの脂質化学種のうちの任意のものであり得る。そのような脂質としては、例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、セファリン、およびセレブロシドが挙げられる。１つの実施形態において、中性脂質成分は、２個のアシル基を有する脂質（例えば、ジアシルホスファチジルコリンおよびジアシルホスファチジルエタノールアミン）である。１つの実施形態において、中性脂質は、Ｃ１０〜Ｃ２０の範囲内の炭素鎖長を有する飽和脂肪酸を含む。別の実施形態において、中性脂質は、Ｃ１０〜Ｃ２０の範囲内の炭素鎖長を有するモノ不飽和脂肪酸またはジ不飽和脂肪酸を含む。好適な中性脂質としては、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、ＤＳＰＣ、およびＳＭが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８１】
本明細書に記載される脂質粒子および組成物（ｃｏｍｐｏｓｉｔｏｓｎ）はまた、凝集を低減できる１種以上の脂質も含み得る。形成の間の粒子の凝集を低減する脂質の例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾脂質（ＰＥＧ−ＤＭＧおよびＰＥＧ−ＤＭＡなどのＰＥＧ脂質）、モノシアロガングリオシドＧｍ１、およびポリアミドオリゴマー（「ＰＡＯ」）（例えば、（参照によりその全体が援用される米国特許第６，３２０，０１７号明細書に記載されている））が挙げられる。好適なＰＥＧ脂質としては、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミンおよびＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ−セラミドコンジュゲート（例えば、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ１４またはＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０）（例えば、参照により本明細書に援用される米国特許第５，８２０，８７３号明細書に記載されているもの）、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミンおよびＰＥＧ修飾１，２−ジアシルオキシプロパン−３−アミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロールおよびＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、ｍＰＥＧ（ｍｗ２０００）−ジアステアロイル（ｄｉａｓｔｅａｒｏｙｌ）ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８２】
当該脂質粒子および組成物は、ステロール（例えば、コレステロール）を含み得る。
【００８３】
脂質粒子
さらなる態様において、本発明は、本明細書に記載されるカチオン性脂質のうちの１種以上を含む脂質粒子に関する。１つの実施形態において、脂質粒子は、式Ｉ〜ＶＩＩの１種以上の化合物を含む。
【００８４】
脂質粒子としては、リポソームが挙げられるが、これに限定されない。本明細書で使用される場合、リポソームは、水性内部を取り囲む脂質含有膜を有する構造物である。
【００８５】
別の実施形態は、本発明のカチオン性脂質と、非カチオン性脂質（例えば、中性脂質）と、任意選択でＰＥＧ−脂質コンジュゲート（例えば、本明細書において述べられる脂質粒子の凝集を低減するための脂質）と、核酸とを含む、核酸−脂質粒子（例えば、ＳＮＡＬＰ）である。本明細書で使用される場合、用語「ＳＮＡＬＰ」とは、安定な核酸−脂質粒子をいう。ＳＮＡＬＰは、脂質でできた粒子であって、核酸（例えば、干渉ＲＮＡ）が脂質内に封入されている粒子である。特定の例において、ＳＮＡＬＰは、全身適用に有用である。というのは、ＳＮＡＬＰは、静脈内（ｉ．ｖ．）注射に続いて延長された循環寿命を示し得、ＳＮＡＬＰは、遠位部位（例えば、投与部位から物理的に分離された部位）にて蓄積し得、そしてＳＮＡＬＰは、この遠位部位において標的遺伝子発現のサイレンシングをもたらし得るからである。核酸は、国際公開第００／０３６８３号パンフレット（この特許文献の開示内容は参照によりその全体が本明細書において援用される）に示されているように、凝集剤（ｃｏｎｄｅｎｓｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）と複合体化され、ＳＮＡＬＰ内に封入され得る。
【００８６】
例えば、脂質粒子は、カチオン性脂質と、融合促進脂質（例えば、ＤＰＰＣ）と、中性脂質と、コレステロールと、ＰＥＧ修飾脂質とを含み得る。１つの実施形態において、脂質粒子は、カチオン性脂質約２０〜７０％：融合促進脂質０．１〜５０％：中性脂質５〜４５％：コレステロール２０〜５５％：ＰＥＧ修飾脂質０．５〜１５％のモル比にある上記の脂質混合物を含む。
【００８７】
脂質粒子の別の実施形態において、カチオン性脂質は、約２０％および約６０％のモル百分率で存在し、中性脂質は、約５％〜約２５％のモル百分率で存在し、ステロールは、約２５％〜約５５％のモル百分率で存在し、そしてＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ−ＤＭＡ、ＰＥＧ−ＤＭＧ、またはそれらの組み合わせでありかつ約０．５％〜約１５％のモル百分率で存在する。
【００８８】
特定の実施形態において、モル脂質比は、ｍｏｌ％カチオン性脂質／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＤＭＧまたはＰＥＧ−ＤＭＡに関して）およそ４０／１０／４０／１０、３５／１５／４０／１０または５２／１３／３０／５である。この混合物は、０．１〜５０％、０．１〜５０％、０．５〜５０％、１〜５０％、５％〜４５％、１０％〜４０％、または１５％〜３５％のモル比の融合促進脂質とさらに組み合わされ得る。換言すれば、脂質／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＤＭＧまたはＰＥＧ−ＤＭＡの４０／１０／４０／１０混合物が５０％のモル比の融合促進ペプチドと組み合わされる場合、結果として生じる脂質粒子は、２０／５／２０／５／５０（ｍｏｌ％カチオン性脂質／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＤＭＧまたはＰＥＧ−ＤＭＡ／融合促進ペプチド）の総モル比を有し得る。別の実施形態において、これらの組成物中の中性脂質ＤＳＰＣは、ＰＯＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＥまたはＳＭと置き換えられる。
【００８９】
１つの実施形態において、脂質粒子は、本発明のカチオン性脂質と、中性脂質と、ステロールと、ＰＥＧ修飾脂質とを含む。１つの実施形態において、脂質粒子は、モルベースで約２５％〜約７５％（例えば、モルベースで約３５〜約６５％、約４５〜約６５％、約６０％、約５７．５％、約５７．１％、約５０％または約４０％）のカチオン性脂質を含む。１つの実施形態において、脂質粒子は、モルベースで約０％〜約１５％（例えば、モルベースで約３〜約１２％、約５〜約１０％、約１５％、約１０％、約７．５％、約７．１％または約０％）の中性脂質を含む。１つの実施形態において、中性脂質はＤＰＰＣである。１つの実施形態において、中性脂質はＤＳＰＣである。１つの実施形態において、製剤は、モルベースで約５％〜約５０％（例えば、モルベースで約１５〜約４５％、約２０〜約４０％、約４８％、約４０％、約３８．５％、約３５％、約３４．４％、約３１．５％または約３１％）のステロールを含む。１つの実施形態において、ステロールはコレステロールである。
【００９０】
本明細書に記載される脂質粒子は、１種以上の治療薬剤をさらに含み得る。好ましい実施形態において、脂質粒子は、核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）（例えば、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ）を含む。
【００９１】
１つの実施形態において、脂質粒子は、モルベースで約０．１％〜約２０％（例えば、モルベースで約０．５％〜約１０％、約０．５〜約５％、約１０％、約５％、約３．５％、約１．５％、約０．５％、または約０．３％）のＰＥＧ修飾脂質を含む。１つの実施形態において、ＰＥＧ修飾脂質は、ＰＥＧ−ＤＭＧである。１つの実施形態において、ＰＥＧ修飾脂質は、ＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡである。１つの実施形態において、脂質粒子は、モルベースで２５〜７５％のカチオン性脂質、０．５〜１５％の中性脂質、５〜５０％のステロール、および０．５〜２０％のＰＥＧ修飾脂質を含む。
【００９２】
１つの実施形態において、脂質粒子は、モルベースで３５〜６５％のカチオン性脂質、３〜１２％の中性脂質、１５〜４５％のステロール、および０．５〜１０％のＰＥＧ修飾脂質を含む。１つの実施形態において、脂質粒子は、モルベースで４５〜６５％のカチオン性脂質、５〜１０％の中性脂質、２５〜４０％のステロール、および０．５〜５％のＰＥＧ修飾脂質を含む。１つの実施形態において、ＰＥＧ修飾脂質は、２，０００Ｄａの平均分子量のＰＥＧ分子を含む。１つの実施形態において、ＰＥＧ修飾脂質は、ＰＥＧ−ジスチリルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＳＧ）である。
【００９３】
１つの実施形態において、脂質：ｓｉＲＮＡの比は、少なくとも約０．５：１、少なくとも約１：１、少なくとも約２：１、少なくとも約３：１、少なくとも約４：１、少なくとも約５：１、少なくとも約６：１、少なくとも約７：１、少なくとも約１１：１または少なくとも約３３：１である。１つの実施形態において、脂質：ｓｉＲＮＡ比の比は、約１：１〜約３５：１の間、約３：１〜約１５：１の間、約４：１〜約１５：１の間、または約５：１〜約１３：１の間である。１つの実施形態において、脂質：ｓｉＲＮＡ比の比は、約０．５：１〜約１２：１の間である。
【００９４】
１つの実施形態において、脂質粒子は、ナノ粒子である。さらなる実施形態において、脂質粒子は、約５０ｎｍ〜約３００ｎｍ（例えば、約５０ｎｍ〜約２５０ｎｍ、例えば、約５０ｎｍ〜約２００ｎｍ）の平均直径サイズを有する。
【００９５】
１つの実施形態において、本明細書に記載される実施形態のうちの任意のもののカチオン性脂質を含有する脂質粒子は、約３時間未満（例えば、約２．５時間未満、約２時間未満、約１．５時間未満、約１時間未満、約０．５時間未満または約０．２５時間未満）のインビボ半減期（ｔ１／２）を（例えば、肝臓、脾臓または血漿において）有する。
【００９６】
別の実施形態において、本明細書に記載される実施形態のうちの任意のもののカチオン性脂質を含有する脂質粒子は、その１個または複数の生分解性（ｂｉｏｄｅｇｒａｂｌｅ）基を有さない同様のカチオン性脂質についてのインビボ半減期（ｔ１／２）の約１０％未満（例えば、約７．５％未満、約５％未満、約２．５％未満）のインビボ半減期（ｔ１／２）を（例えば、肝臓、脾臓または血漿において）有する。
【００９７】
さらなる成分
本明細書に記載される脂質粒子および組成物は、１種以上の抗酸化剤をさらに含み得る。抗酸化剤は、脂質粒子を安定させ、脂質粒子中に存在するカチオン性脂質および／または活性薬剤の劣化を防止、低減および／または阻止する。抗酸化剤は、親水性抗酸化剤、親油性抗酸化剤、金属キレート化剤、一次抗酸化剤、二次抗酸化剤、それらの塩、およびそれらの混合物であり得る。特定の実施形態において、抗酸化剤は、金属キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡまたはその塩）を、単独で、または１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、もしくはそれ以上のさらなる抗酸化剤（例えば、一次抗酸化剤、二次抗酸化剤、または他の金属キレート化剤）と組み合わせて含む。１つの好ましい実施形態において、抗酸化剤は、金属キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡまたはその塩）を１種以上の一次抗酸化剤および／または二次抗酸化剤との混合物として含む。例えば、抗酸化剤は、ＥＤＴＡまたはその塩と、一次抗酸化剤（例えば、α−トコフェロールまたはその塩）と、二次抗酸化剤（例えば、パルミチン酸アスコルビルまたはその塩）との混合物を含み得る。１つの実施形態において、抗酸化剤は、少なくとも約１００ｍＭのシトレートまたはその塩を含む。抗酸化剤の例としては、親水性抗酸化剤、親油性抗酸化剤、およびそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。親水性抗酸化剤の非限定的な例としては、キレート化剤（例えば、金属キレート化剤）（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、シトレート、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＢＡＰＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、２，３−ジメルカプト−１−プロパンスルホン酸（ＤＭＰＳ）、ジメルカプトコハク酸（ＤＭＳＡ）、ｃｃ−リポ酸、サリチルアルデヒドイソニコチノイルヒドラゾン（ＳＩＨ）、ヘキシルチオエチルアミン塩酸塩（ＨＴＡ）、デスフェリオキサミン、それらの塩、およびそれらの混合物）が挙げられる。さらなる親水性抗酸化剤には、アスコルビン酸、システイン、グルタチオン、ジヒドロリポ酸、２−メルカプトエタンスルホン酸、２−メルカプトベンズイミダゾールスルホン酸、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム、それらの塩、およびそれらの混合物が含まれる。親油性抗酸化剤の非限定的な例としては、ビタミンＥ異性体（例えば、α−、β−、γ−、およびδ−トコフェロールならびにα−、β−、γ−、およびδ−トコトリエノール）；ポリフェノール（例えば、２−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチルフェノール、２−ｆｅｒｔ−ブチル−５−メチルフェノール、および２−ｔｅｒｔ−ブチル−６−メチルフェノール）；ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）（例えば、２−ｔｅｒｉ−ブチル−４−ヒドロキシアニソールおよび３−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシアニソール）；ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）；ｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノン（ＴＢＨＱ）；パルミチン酸アスコルビル；ｒｃ−プロピルガレート；それらの塩；およびそれらの混合物が挙げられる。好適な抗酸化剤およびそのような抗酸化剤を含有する製剤は、参照により本明細書に援用される国際公開第２０１１／０６６６５１号パンフレットに記載されている。
【００９８】
別の実施形態において、脂質粒子または組成物は、抗酸化剤ＥＤＴＡ（またはその塩）、抗酸化剤シトレート（またはその塩）、またはＥＤＴＡ（またはその塩）を、１種以上の一次および／または二次抗酸化剤（例えば、α−トコフェロール（またはその塩）および／またはパルミチン酸アスコルビル（またはその塩））（例えば、それらの混合物）と組み合わせて含有する。
【００９９】
１つの実施形態において、抗酸化剤は、脂質粒子中に存在するカチオン性脂質の劣化を防止、阻止または低減するのに十分な量で存在する。例えば、抗酸化剤は、少なくとも約もしくは約０．１ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ、１０ｍＭ、１００ｍＭ、５００ｍＭ、１Ｍ、２Ｍ、もしくは５Ｍ、または約０．１ｍＭ〜約１Ｍ、約０．１ｍＭ〜約５００ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約２５０ｍＭ、もしくは約０．１ｍＭ〜約１００ｍＭの濃度で存在し得る。
【０１００】
本明細書に記載される脂質粒子および組成物は、アポリポタンパク質をさらに含み得る。本明細書で使用される場合、用語「アポリポタンパク質」または「リポタンパク質」とは、当業者に知られているアポリポタンパク質ならびにその変異体および断片、ならびに後述されるアポリポタンパク質アゴニスト、アナログまたはその断片をいう。
【０１０１】
好ましい実施形態において、活性薬剤は、核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）である。例えば、活性薬剤は、関心のある産物に関してコードされた核酸（ＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンタゴｍｉｒ、ＤＮＡ、プラスミド、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）（例えば、一本鎖の１７〜２５ヌクレオチド長のｍｉＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、スモール干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）が挙げられるが、これらに限定されない）、抗原、その断片、タンパク質、ペプチド、ワクチン、および小分子、またはそれらの混合物であり得る。１つのより好ましい実施形態において、核酸は、オリゴヌクレオチド（例えば、１５〜５０ヌクレオチド長（または１５〜３０もしくは２０〜３０ヌクレオチド長））である。ｓｉＲＮＡは、例えば、１６〜３０ヌクレオチド長の二重鎖領域を有し得る。別の実施形態において、核酸は、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、デコイオリゴヌクレオチド、スーパーｍｉｒ、ｍｉＲＮＡ模倣物、またはｍｉＲＮＡインヒビターである。スーパーｍｉｒとは、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはその両方またはその改変物の、一本鎖、二本鎖または部分的に二本鎖のオリゴマーまたはポリマーであって、ｍｉＲＮＡと実質的に同一でありかつその標的に対してアンチセンスであるヌクレオチド配列を有するものをいう。ｍｉＲＮＡ模倣物は、１つ以上のｍｉＲＮＡの遺伝子サイレンシング能力を模倣するために使用され得る分子のクラスを表す。したがって、用語「マイクロＲＮＡ模倣物」とは、ＲＮＡｉ経路に入りかつ遺伝子発現を調節することが可能な合成ノンコーディングＲＮＡをいう（すなわち、このｍｉＲＮＡは、内因性ｍｉＲＮＡの供給源からの精製によっては得られない）。
【０１０２】
脂質−核酸粒子中に存在する核酸は、任意の形態であり得る。核酸は、例えば、一本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、または二本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドであり得る。二本鎖ＲＮＡの非限定的な例としては、ｓｉＲＮＡが挙げられる。一本鎖核酸には、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、マイクロＲＮＡ、および三重鎖形成オリゴヌクレオチドが含まれる。本発明の脂質粒子はまた、１つ以上のリガンドにコンジュゲートされている核酸を送達し得る。
【０１０３】
薬学的組成物
脂質粒子は、特に治療薬剤と関連させる場合、例えば薬学的に受容可能な希釈剤、賦形剤またはキャリア（例えば、生理食塩水またはリン酸緩衝液）をさらに含む、薬学的組成物として製剤化され得る。
【０１０４】
結果として生じる薬学的調製物は、従来のよく知られている滅菌技術によって滅菌され得る。次いで、水溶液は、使用に向けて包装され得るか、または無菌条件下で濾過されて凍結乾燥され得る。その凍結乾燥された調製物は、投与前に、滅菌水溶液と合わされる。こうした組成物は、生理的条件に近づくように、必要に応じて、薬学的に受容可能な補助物質（例えば、ｐＨ調整および緩衝剤ならびに張性調整剤（例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、および塩化カルシウム））を含有し得る。さらに、脂質懸濁液は、貯蔵中のフリーラジカルおよび脂質過酸化による損傷から脂質を保護する脂質保護剤を含み得る。親油性のフリーラジカル抑制剤（例えば、α−トコフェロール）および水溶性の鉄特異的キレート化剤（例えば、フェリオキサミン）が好適である。
【０１０５】
薬学的製剤中の脂質粒子または脂質−核酸粒子の濃度は、例えば約０．０１重量％未満から約０．０５〜５重量％または少なくとも約０．０５〜５重量％から１０〜３０重量％ほど多くまで変化し得る。
【０１０６】
製造方法
カチオン性脂質、それを含有する脂質粒子、ならびにそのカチオン性脂質および／または脂質粒子を含有する薬学的組成物を製造する方法は、例えば、国際公開第２０１０／０５４４０６号パンフレット、同第２０１０／０５４４０１号パンフレット、同第２０１０／０５４４０５号パンフレット、同第２０１０／０５４３８４号パンフレット、同第２０１０／０４２８７７号パンフレット、同第２０１０／１２９７０９号パンフレット、同第２００９／０８６５５８号パンフレットおよび同第２００８／０４２９７３号パンフレット、ならびに米国特許出願公開第２００４／０１４２０２５号明細書、同第２００６／００５１４０５号明細書および同第２００７／００４２０３１号明細書に記載されており、これらの特許文献の各々は、参照によりその全体が援用される。
【０１０７】
例えば、１つの実施形態において、有機溶液（例えば、エタノール）中の１種以上の脂質（本明細書に記載される実施形態のうちの任意のもののカチオン性脂質を含む）の溶液が調製される。同様に、緩衝化（例えば、クエン酸塩緩衝液）水溶液中の１種以上の活性（治療）薬剤（例えば、ｓｉＲＮＡ分子または２種のｓｉＲＮＡ分子の１：１モル混合物など）の溶液が調製される。この２つの溶液が混合され、希釈されて、ｓｉＲＮＡ脂質粒子のコロイド懸濁液を形成する。１つの実施形態において、ｓｉＲＮＡ脂質粒子は、約８０〜９０ｎｍの平均粒径を有する。さらなる実施形態において、分散体は、０．４５／２ミクロンフィルターを通して濾過され、濃縮され、接線流濾過（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  ｆｌｏｗ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）によって透析濾過され得る。
【０１０８】
定義
本明細書で使用される場合、用語「カチオン性脂質」は、１つまたは２つの脂肪酸鎖または脂肪性脂肪族（ｆａｔｔｙ  ａｌｉｐｈａｔｉｃ）鎖と、生理的ｐＨにおいてプロトン化されてカチオン性脂質を形成し得るアミノ酸含有頭部基とを有する脂質を包含する。一部の実施形態において、カチオン性脂質は、「アミノ酸コンジュゲートカチオン性脂質」と称される。
【０１０９】
当該複合体の投与が疾患または障害に有効な治療レジメンである被験体または患者は、好ましくはヒトであるが、任意の動物（臨床試験またはスクリーニングもしくは活性実験の文脈における実験動物を含む）であり得る。したがって、当業者により容易に理解され得るように、本発明の方法、化合物および組成物は、任意の動物（特に哺乳動物）（ヒト、家庭内動物（例えば、ネコまたはイヌの被験体）、農場動物（例えば、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、およびブタの被験体であるが、これらに限定されない）、野生動物（野生状態のものか動物園にいるものかを問わない）、研究動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イヌ、およびネコ、鳥類種（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、および鳴禽類））を包含するが、決してこれらに限定されない）への投与に、すなわち獣医学的医療用途に、特に適している。
【０１１０】
上記の一般式に記載されている化学基の多くは、特定の順番（例えば、−ＯＣ（Ｏ）−）で記されている。化学基は、別段の指示がない限り、示されている順番で一般式中に組み込まれることになることが意図されている。例えば、−（Ｒ）ｉ−（Ｍ１）ｋ−（Ｒ）ｍ−（式中、Ｍ１は−Ｃ（Ｏ）Ｏ−であり、そしてｋは１である）という形の一般式は、別段の規定がない限り、−（Ｒ）ｉ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｒ）ｍ−をいう。化学基が特定の順番で記されている場合、別段の規定がない限り、逆の順番もまた企図されているものと理解されるべきである。例えば、Ｍ１が−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−と定義される一般式−（Ｒ）ｉ−（Ｍ１）ｋ−（Ｒ）ｍ−（すなわち、−（Ｒ）ｉ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（Ｒ）ｍ−）において、別段の規定がない限り、Ｍ１が−ＮＨＣ（Ｏ）−である化合物（すなわち、−（Ｒ）ｉ−ＮＨＣ（Ｏ）−（Ｒ）ｍ−）もまた企図されている。
【０１１１】
本明細書で使用される場合、用語「生分解性基」とは、生物環境において（例えば、生物体、器官、組織、細胞、または細胞小器官において）結合破壊反応を受け得る１つ以上の結合を含む基をいう。例えば、生分解性基は、哺乳動物（例えば、ヒト）の身体によって（例えば、加水分解によって）代謝され得る。生分解性結合を含むいくつかの基としては、例えば、エステル、ジチオール、およびオキシムが挙げられるが、これらに限定されない。生分解性基の非限定的な例は、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＳＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−ＯＣ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｏ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（Ｒ５）＝Ｎ−、−Ｎ＝Ｃ（Ｒ５）−、−Ｃ（Ｒ５）＝Ｎ−Ｏ−、−Ｏ−Ｎ＝Ｃ（Ｒ５）−、−Ｃ（Ｏ）（ＮＲ５）−、−Ｎ（Ｒ５）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）（ＮＲ５）−、−Ｎ（Ｒ５）Ｃ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ５）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＳｉ（Ｒ５）２Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）（ＣＲ３Ｒ４）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、または−ＯＣ（Ｏ）（ＣＲ３Ｒ４）Ｃ（Ｏ）−である。
【０１１２】
本明細書で使用される場合、「脂肪族」基は、炭素原子が鎖状に結合しており、かつ飽和または不飽和のいずれかである、非芳香族基である。
【０１１３】
用語「アルキル」および「アルキレン」とは、直鎖または分岐鎖の飽和炭化水素部分をいう。１つの実施形態において、アルキル基は、直鎖の飽和炭化水素である。別段の規定がない限り、「アルキル」または「アルキレン」基は、１個〜２４個の炭素原子を含有する。代表的な飽和直鎖アルキル基としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、およびｎ−へキシルが挙げられる。代表的な飽和分岐アルキル基としては、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、およびイソペンチルが挙げられる。
【０１１４】
用語「アルケニル」とは、１つ以上の炭素−炭素二重結合を有する直鎖または分岐鎖の炭化水素部分をいう。１つの実施形態において、アルケニル基は、１つ、２つ、または３つの二重結合を含み、それ以外は飽和している。別段の規定がない限り、「アルケニル」基は、２個〜２４個の炭素原子を含有する。アルケニル基は、シスおよびトランスの両方の異性体を包含する。代表的な直鎖および分岐のアルケニル基としては、エチレニル、プロピレニル、１−ブテニル、２−ブテニル、イソブチレニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、３−メチル−１−ブテニル、２−メチル−２−ブテニル、および２，３−ジメチル−２−ブテニルが挙げられる。
【０１１５】
用語「アルキニル」とは、１つ以上の炭素−炭素三重結合を有する直鎖または分岐鎖の炭化水素部分をいう。別段の規定がない限り、「アルキニル」基は、２個〜２４個の炭素原子を含有する。代表的な直鎖および分岐のアルキニル基としては、アセチレニル、プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、および３−メチル−１−ブチニルが挙げられる。
【０１１６】
別段の規定がない限り、用語「アシル」とは、水素、アルキル、部分飽和もしくは完全飽和のシクロアルキル、部分飽和もしくは完全飽和の複素環、アリール、またはヘテロアリールで置換されているカルボニル基をいう。例えば、アシル基には、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル（例えば、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、バレリル、カプロイル、およびｔ−ブチルアセチル）、（Ｃ３〜Ｃ２０）シクロアルキルカルボニル（例えば、シクロプロピルカルボニル、シクロブチルカルボニル、シクロペンチルカルボニル、およびシクロへキシルカルボニル）、複素環式カルボニル（例えば、ピロリジニルカルボニル、ピロリド−２−オン−５−カルボニル、ピペリジニルカルボニル、ピペラジニルカルボニル、およびテトラヒドロフラニルカルボニル）、アロイル（例えば、ベンゾイル）およびヘテロアロイル（例えば、チオフェニル−２−カルボニル、チオフェニル−３−カルボニル、フラニル−２−カルボニル、フラニル−３−カルボニル、１Ｈ−ピロイル−２−カルボニル、１Ｈ−ピロイル−３−カルボニル、およびベンゾ［ｂ］チオフェニル−２−カルボニル）などの基が含まれる。
【０１１７】
用語「アリール」とは、芳香族単環式、二環式、または三環式の炭化水素環系をいう。別段の規定がない限り、「アリール」基は、６個〜１４個の炭素原子を含有する。アリール部分の例としては、フェニル、ナフチル、アントラセニル、およびピレニルが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１８】
用語「シクロアルキル」および「シクロアルキレン」とは、飽和の単環式または二環式の炭化水素部分（例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、およびシクロへキシル）をいう。別段の規定がない限り、「シクロアルキル」または「シクロアルキレン」基は、３個〜１０個の炭素原子を含有する。
【０１１９】
用語「シクロアルキルアルキル」とは、アルキル基に結合したシクロアルキル基であって、そのアルキル基が分子の残部に結合しているものをいう。
【０１２０】
用語「複素環」（または「複素環式化合物」）とは、非芳香族の５員〜８員の単環式、または７員〜１２員の二環式、または１１員〜１４員の三環式の環系であって、飽和または不飽和のいずれかであり、かつ、窒素、酸素および硫黄から独立して選択される１個〜３個のヘテロ原子（単環式の場合）、１個〜６個のヘテロ原子（二環式の場合）、または１個〜９個のヘテロ原子（三環式の場合）を含有するものをいい、ここで、窒素および硫黄のヘテロ原子は任意選択で酸化されていてもよく、また、窒素ヘテロ原子は任意選択で第４級化されていてもよい。例えば、複素環は、シクロアルコキシ基であり得る。複素環は、複素環中の任意のヘテロ原子または炭素原子を介して分子の残部に結合し得る。複素環としては、モルホリニル、ピロリジノニル、ピロリジニル、ピペリジニル（ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｙｌ）、ピペリジニル（ｐｉｐｅｒｉｚｙｎｙｌ）、ヒダントイニル、バレロラクタミル、オキシラニル、オキセタニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロピリジニル、テトラヒドロプリミジニル（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐｒｉｍｉｄｉｎｙｌ）、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロピリミジニル、テトラヒドロチオフェニル、およびテトラヒドロチオピラニルが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２１】
用語「ヘテロアリール」とは、芳香族の５員〜８員の単環式、７員〜１２員の二環式、または１１員〜１４員の三環式の環系であって、１個〜３個のヘテロ原子（単環式の場合）、１個〜６個のヘテロ原子（二環式の場合）、または１個〜９個のヘテロ原子（三環式の場合）（ここで、ヘテロ原子は、Ｏ、ＮまたはＳから選択される）（例えば、炭素原子および１個〜３個、１個〜６個または１個〜９個（それぞれ、単環式、二環式または三環式の場合）のＮ、ＯまたはＳのヘテロ原子）を有するものをいう。本明細書に記載されるヘテロアリール基はまた、共通の炭素−炭素結合を有する縮合環を含み得る。
【０１２２】
用語「置換」とは、別段の指示がない限り、所与の構造中の１つ以上の水素ラジカルの、特定の置換基のラジカルへの置き換えをいい、その置換基としては、ハロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロシクリル、チオール、アルキルチオ、オキソ、チオキシ、アリールチオ、アルキルチオアルキル、アリールチオアルキル、アルキルスルホニル、アルキルスルホニルアルキル、アリールスルホニルアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、アリールアミノカルボニル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、ハロアルキル、アミノ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アルキルアミノアルキル、アリールアミノアルキル、アミノアルキルアミノ、ヒドロキシ、アルコキシアルキル、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、アミノカルボニルアルキル、アシル、アラルコキシカルボニル、カルボン酸、スルホン酸、スルホニル、ホスホン酸、アリール、ヘテロアリール、複素環式化合物、および脂肪族基が挙げられるが、これらに限定されない。置換基は、さらに置換され得るものと理解される。例示的な置換基としては、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、および環状アミノ化合物が挙げられる。
【０１２３】
用語「ハロゲン」または「ハロ」とは、フルオロ、クロロ、ブロモおよびヨードをいう。
【０１２４】
以下の略語が、本出願において使用され得る。
ＤＳＰＣ：ジステアロイルホスファチジルコリン；ＤＰＰＣ：１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；ＰＯＰＣ：１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−ホスファチジルコリン；ＤＯＰＥ：１，２−ジレオイル（ｄｉｌｅｏｙｌ）−ｓｎ−３−ホスホエタノールアミン；ＰＥＧ−ＤＭＧとは、一般に、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロール−メトキシポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ２０００）をいう；ＴＢＤＰＳＣｌ：ｔｅｒｔ−ブチルクロロジフェニルシラン；ＤＭＡＰ：ジメチルアミノピリジン；ＮＭＯ：Ｎ−メチルモルホリン−Ｎ−オキシド；ＬｉＨＤＭＳ：リチウムビス（トリメチルシリル）アミド；ＨＭＰＡ：ヘキサメチルホスホルアミド；ＥＤＣ：１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド；ＤＩＰＥＡ：ジイソプロピルエチルアミン；ＤＣＭ：ジクロロメタン；ＴＥＡ：トリエチルアミン；ＴＢＡＦ：テトラブチルアンモニウムフルオリド。
【０１２５】
種々の有機基および保護基を調製する方法は、当該技術分野において知られており、それらの使用および修飾は、一般に当業者の能力の範囲内である（例えば、Ｇｒｅｅｎ，Ｔ．Ｗ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（１９９９）；Ｓｔａｎｌｅｙ  Ｒ．Ｓａｎｄｌｅｒ  ａｎｄ  Ｗｏｌｆ  Ｋａｒｏ，Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｒｏｕｐ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ（１９８９）；Ｇｒｅｇ  Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９６）；およびＬｅｒｏｙ  Ｇ．Ｗａｄｅ，Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  Ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８０）を参照されたい）。簡潔に述べると、保護基は、官能基の望まれない反応性を低減するかまたは排除する任意の基である。保護基は、官能基に付加されて、特定の反応の間それの反応性をマスクし、その後除去されて、元の官能基を現し得る。一部の実施形態において、「アルコール保護基」が使用される。「アルコール保護基」は、アルコール官能基の望まれない反応性を低下させるかまたは排除する任意の基である。保護基は、当該技術分野において周知の技術を用いて付加および除去され得る。
【０１２６】
当該化合物は、本明細書に記載される技術または知られている有機合成技術のうちの少なくとも１つによって調製され得る。
【実施例】
【０１２７】
実施例１
中間体１の合成：
【化２２】
2018087250.tif 000032
ＤＣＭ（１２５ｍＬ）中の９−ブロモノナン−１−オール（５ｇ、２２．４ｍｍｏｌ）および２，３−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン（１．９３ｇ、２３ｍｍｏｌ）の溶液に、ＰＰＴＳ（６２８ｍｇ、２．５ｍｍｏｌ、ｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム）を添加した。この混合物を、室温で３時間撹拌し、次いで濃縮した。残渣をヘキサン中に取り、濾過した。濾液を濃縮し、乾式カラムクロマトグラフィー（ヘキサン中０〜５％の酢酸エチル）によって精製した。これにより、無色の油状物（６．７５ｇ、２２．０ｍｍｏｌ、９８％）を得た。
【０１２８】
中間体２の合成：
【化２３】
2018087250.tif 000033
１０ｍＬの無水エーテル中のマグネシウム（５８８ｍｇ、２４．２ｍｍｏｌ））およびヨウ素の小結晶に、４０ｍＬの無水（ａｎｈｙ）ジエチルエーテル中の中間体１（６．７５ｇ、２２ｍｍｏｌ）の溶液の５ｍＬを添加した。この混合物を、２０分間還流させ、次いで中間体１溶液の残りを添加した。混合物を一晩還流させ続けた。混合物を室温まで冷却させ、続いてギ酸エチル（２６ｍｍｏｌ、２．１ｍＬ、１．９３ｇ）を１０分で滴下した。さらなるエーテル（３０ｍＬ）を添加した。結果として生じた混合物を、周囲温度で一晩撹拌した。混合物をエーテルで希釈し、飽和ＮＨ４Ｃｌ溶液を添加した。水相を、エーテルで抽出した。合わせた有機抽出物をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。濃縮により淡黄色の油状物が得られ、これを、シリカゲル（２３０〜４００メッシュ）上でヘキサン中３０％の酢酸エチルを用いて溶出させるカラムクロマトグラフィーによって直ちに清浄化した。これにより、所望の生成物（０１３−１１Ｂ）を僅かに黄色の油状物（６．９５ｇ）として得た。
【０１２９】
ホルメート（０１３−１１Ｂ、６．９６ｇ）およびＫＯＨ（１３ｍｍｏｌ、１３ｍＬの水中８０８ｍｇ）を、ＥｔＯＨ（７５ｍＬ）中で、窒素下において室温で２時間撹拌した。反応が完結すると、１５滴の濃ＨＣｌを反応混合物に添加し、溶媒を蒸発させた。残渣をヘキサン（３×３０ｍＬ）で洗浄し、濾過した。濾液を濃縮して、僅かに黄色の油状物（５．４５ｇ）を得た。油状物を、カラムクロマトグラフィー（ヘキサン中０〜１５％の酢酸エチル）によって精製した。これにより、所望の生成物を白色固体（０１３−１１Ｃ−中間体２、２．８６ｇ）として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：４．５８（ｍ，２Ｈ），３．９１−３．８５（ｍ，２Ｈ），３．７５（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，１Ｈ），３．７２（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，１Ｈ），３．５９（ｍ，１Ｈ），３．５３−３．４８（ｍ，２Ｈ），３．４０（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，１Ｈ），３．３７（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，１Ｈ），１．８８−１．７９（ｍ，２Ｈ），１．７６−１．６９（ｍ，２Ｈ），１．６３−１．５０（ｍ，８Ｈ（水ピークとの重複のため推定値）），１．５０−１．２６（ｍ，３２Ｈ）。
【０１３０】
中間体３の合成：
【化２４】
2018087250.tif 000034
アルゴン雰囲気下において、ジクロロメタン（８０ｍＬ）中の０１３−１１Ｃ−中間体２（２．４０ｇ、４．９６ｍｍｏｌ）、４−ジメチルアミノ酪酸塩酸塩（１．６７ｇ、１０ｍｍｏｌ）、４−（ジメチルアミノ）ピリジン（３００ｍｇ）およびトリエチルアミン（１．６７ｍＬ、１２ｍｍｏｌ）を投入した丸底フラスコに、ジシクロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣ、２．２７ｇ、１１ｍｍｏｌ）を添加した。周囲温度で１６時間撹拌してすぐに、白色沈殿物を濾過によって除く。濾液を濃縮乾固した。結果として生じた残渣を、水および酢酸エチル／ヘキサン（約１：３）中に取った。２つの層を分離した。水相を、ＨＣｌおよび重炭酸ナトリウムでｐＨ８に調整した。次いでこの水相を、ヘキサン（３×５０ｍＬ）で抽出した。合わせた抽出物を、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮した。残渣を、シリカゲル上でのカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン中０〜６％のメタノール）によって精製した。これにより、所望の生成物を無色の油状物（２．７０ｇ、４．５１ｍｍｏｌ、９２％）として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：４．８７（五重線様，Ｊ＝６．２Ｈｚ，１Ｈ），４．５８（ｍ，２Ｈ），３．９１−３．８５（ｍ，２Ｈ），３．７５（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，１Ｈ），３．７２（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，１Ｈ），３．５４−３．４８（ｍ，２Ｈ），３．４０（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，１Ｈ），３．３７（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，１Ｈ），２．３３（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），２．２９（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），２．２３（ｓ，６Ｈ），１．８９−１．６９（ｍ，６Ｈ），１．６３−１．４９（ｍ，１６Ｈ），１．４０−１．２６（ｍ，２４Ｈ）。
【０１３１】
中間体４の合成：
【化２５】
2018087250.tif 000035
ＥｔＯＨ（８０ｍＬ）中のＸＤ−０１３−１５−中間体３（２．７０ｇ、４．５１ｍｍｏｌを含有するフラスコに、室温で、ｐ−トルエンスルホン酸一水和物（４．５ｍｍｏｌ、８５５ｍｇ）を添加し、２４時間撹拌した。反応を希重炭酸ナトリウム溶液（２００ｍＬ）でクエンチした後、水層を、ジエチルエーテル（３×１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を半飽和ブライン（１００ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣を、シリカゲル上でのカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン中０〜１４％のメタノール）によって精製した。これにより、所望の生成物を僅かに黄色の固体（１．６０４ｇ、３．７３ｍｍｏ、８３％）として得た。
【０１３２】
化合物１の合成：
【化２６】
2018087250.tif 000036
ジシクロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣ、８５１ｍｇ、４．１２ｍｍｏｌ、５．５当量）を、ジクロロメタン（２０ｍＬ）中のシクロヘキサンカルボン酸（４７９ｍｇ、３．７４ｍｍｏｌ、５当量）、ＸＤ−０１３−１７−中間体４（３２１ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌ）および４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、６０ｍｇ）およびトリエチルアミン（４．１２ｍｍｏｌ、０．５７ｍＬ）の溶液に添加した。１６時間撹拌した後に、この混合物を濃縮し、残渣をヘキサンおよび水中に取った。白色沈殿物を濾別する。無色の濾液を、希炭酸ナトリウムで２回洗浄した。水相を、ヘキサンで１回（７０ｍＬ）抽出した。合わせた有機相をブライン（１００ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、濃縮乾固した。残渣を、シリカゲル上でのカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０〜５％のメタノール）によって精製した。これにより、所望の生成物を僅かに黄色の油状物（２６４ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ、５４％）として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：４．８７（五重線様、Ｊ＝６．２Ｈｚ，１Ｈ），４．０５（ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，４Ｈ），２．３５−２．２５（ｍ，６Ｈ），２．２３（ｓ，６Ｈ），１．９３−１．８７（ｍ，４Ｈ），１．８４−１．７３（ｍ，６Ｈ），１．６８−１．５７（ｍ，６Ｈ），１．５６−１．３９（ｍ，８Ｈ），１．３６−１．２１（ｍ，３０Ｈ）。
【０１３３】
化合物２の合成：
【化２７】
2018087250.tif 000037
化合物２（ＸＤ−０１３−２０）を、ＸＤ−０１３−１８−化合物１について説明したやり方と同様のやり方で調製した（僅かに黄色の油状物、３２７ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ、６６．７％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：４．８７（五重線様，Ｊ＝６．２Ｈｚ，１Ｈ），４．０６（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，４Ｈ），２．４２（六重線様，Ｊ＝７Ｈｚ，２Ｈ），２．３３（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），２．２９（ｔ様，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），２．２３（ｓ，６Ｈ），１．８０（五重線，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），１．７０−１．４８（ｍ，８Ｈ（推定値；水ピークと重複）），１．４８−１．２０（ｍ，３６Ｈ），１．１４（ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ，６Ｈ），０．９０（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，６Ｈ）。
【０１３４】
化合物３の合成：
【化２８】
2018087250.tif 000038
化合物３（ＸＤ−０１３−１６）を、化合物１（ＸＤ−０１３−１８）について説明したやり方と同様のやり方で調製した（僅かに黄色の油状物、１８９ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ、７８％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：４．８７（五重線様，Ｊ＝６．２Ｈｚ，１Ｈ），４．０６（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，４Ｈ），２．７２（五重線，Ｊ＝８Ｈｚ，２Ｈ），２．３３（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），２．２９（ｔ様，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），２．２３（ｓ，６Ｈ），１．９３−１．４８（ｍ，２６Ｈ），１．３６−１．２５（ｍ，２４Ｈ）。
【０１３５】
化合物４の合成：
【化２９】
2018087250.tif 000039
化合物４（ＸＤ−０１３−４１）を、化合物１（ＸＤ−０１３−１８）について説明したやり方と同様のやり方で調製した（僅かに黄色の油状物、２０１ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ、７５％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：４．８７（五重線様，Ｊ＝６．２Ｈｚ，１Ｈ），４．０８（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，４Ｈ），２．３５−２．２４（ｍ，６Ｈ），２．２２（ｓ，６Ｈ），１．７９（五重線様，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），１．６６−１．４１（ｍ，１６Ｈ），１．３７−１．２１（ｍ，３２Ｈ），０．８９（２つの三重線，１２Ｈ）。
【０１３６】
化合物５の合成
【化３０】
2018087250.tif 000040
化合物５（ＸＤ−０１３−４２）を、化合物１（ＸＤ−０１３−１８）について説明したやり方と同様のやり方で調製した（僅かに黄色の油状物、２３３ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ、８８％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：４．８７（五重線様，Ｊ＝６．２Ｈｚ，１Ｈ），４．０６（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，４Ｈ），２．３５−２．２６（ｍ，８Ｈ），２．２７（ｓ，６Ｈ），１．８３−１．７２（ｍ，８Ｈ），１．６７−１．４８（ｍ，２０Ｈ），１．３７−１．２４（ｍ，２４Ｈ），１．１５−１．０６（ｍ，４Ｈ）。
【０１３７】
化合物６の合成：
【化３１】
2018087250.tif 000041
化合物６は、ここで説明される方法によって調製される。
【０１３８】
中間体５の合成：
【化３２】
2018087250.tif 000042
１８０ｍＬのエタノール中の１０ｇ（４５ｍｍｏｌ）の８−ブロモオクタン酸の氷塩で冷却した溶液に、９ｍＬの塩化アセチル（１２７ｍｍｏｌ）を、Ａｒ下でゆっくりと添加する。結果として生じた混合物を２０分間撹拌した後に、冷却浴を取り除いた。この溶液を、室温で一晩（２０時間）放置する。溶媒を、減圧下で除去した。残存している油状物をヘキサン（２００ｍＬ）に溶解させ、希重炭酸ナトリウムで２回（２×７０ｍＬ）洗浄した。水相を、ヘキサン（１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機溶液をブライン（２×７０ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、濃縮して、無色の油状物（１０．４９ｇ、４１．８ｍｍｏｌ、９３％）を得た。
【０１３９】
中間体６の合成：
【化３３】
2018087250.tif 000043
ＥｔＯＨ（１０ｍＬ）中のナトリウムエトキシド（１．４２２ｇ、２０．９ｍｍｏｌ）の溶液に、ジエチルアセトンジカルボキシレート（４．２３ｇ、３．８００ｍＬ、２０．９ｍｍｏｌ）を添加した。撹拌溶液を還流温度に加熱し、次いで８−ブロモオクタン酸エチル（ＸＤ−０１３−１９、５．２４ｇ、２０．９ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加した。撹拌および加熱を２時間継続した。さらなるナトリウムエトキシド溶液（１０ｍＬのＥｔＯＨ中２０．９ｍｍｏｌ）を還流温度で添加した後に、さらなる２０．９ｍｍｏｌの８−ブロモオクタン酸エチルを滴下した。添加が完了した後、この混合物を１６時間加熱し撹拌した。減圧下において、エタノールの大部分を除去した。残渣に水（７０ｍＬ）およびエーテル（２５０ｍＬ）を添加した。飽和ＮＨ４Ｃｌ溶液を添加して、ｐＨ７に調整した。２つの層を分離した。エーテル溶液を、再度、希ＮＨ４Ｃｌ、ブラインで洗浄した。濃縮により、褐色がかった油状物（１１．４４ｇ）がもたらされた。この油状物を、濃塩酸（２１ｍＬ）と氷酢酸（１０．５ｍＬ）との混合物と共に１８時間沸騰させることにより加水分解した。加水分解混合物を減圧下で蒸発乾固させ、固体残渣を水で洗浄し、アセトンから結晶化させた。生成物を十分に乾燥させ、淡色固体（１．７４ｇ）として得た。
【０１４０】
中間体７の合成：
【化３４】
2018087250.tif 000044
ＤＣＣ（９５７ｍｇ、４．６４ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（２０ｍＬ）中のシクロヘキサノール（６９６ｍｇ、６．９６ｍｍｏｌ）、中間体６（ＸＤ−０１３−２１）（４００ｍｇ、１．１６ｍｍｏｌ）および４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、３６６ｍｇ、３ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。１６時間撹拌した後に、この反応混合物を濾過した。濾液を濃縮した。残渣を、シリカゲル上でのカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中０〜５％の酢酸エチル）によって精製した。これにより、所望の生成物を白色固体（０．４４ｇ、０．８７ｍｍｏｌ、７５％）として得た。
【０１４１】
中間体８の合成：
【化３５】
2018087250.tif 000045
ジクロロメタン（２５ｍＬ）中の１０％メタノール中の中間体８（ＸＤ−０１３−２３）の溶液を５℃に冷却し、続いてＮａＢＨ４（１．７４ｍｍｏｌ、６６ｍｇ）を添加した。１０分間撹拌した後に、冷却浴を取り除き、反応を室温で３０分間撹拌した。重炭酸ナトリウム溶液（約３０ｍＬ）およびジクロロメタン（６０ｍＬ）で希釈した。有機層を分離し、水層をジクロロメタン（３×３０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮した。残渣をカラム（４０ｍＬのシリカゲル）上に負荷した。このカラムをヘキサン中の酢酸エチル（４〜１５％）で溶出させた。所望の生成物を、白色固体（０．４０ｇ、０．７８ｍｍｏｌ、９０％）として得た。
【０１４２】
化合物６の合成：
【化３６】
2018087250.tif 000046
アルゴン雰囲気下において、ジクロロメタン（２０ｍＬ）中のＸＤ−０１３−２４−中間体８（４００ｍｇ、０．７８ｍｍｏｌ）、４−ジメチルアミノ酪酸塩酸塩（２６１ｍｇ、１．５６ｍｍｏｌ）、４−（ジメチルアミノ）ピリジン（６０ｍｇ）およびトリエチルアミン（２６１μＬ）を投入した丸底フラスコに、ジシクロへキシルカルボジイミド（３５４ｍｇ、１．７２ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を周囲温度で１６時間撹拌した後に、白色沈殿物を濾過によって除く。濾液を濃縮乾固した。結果として生じた残渣を、シリカゲル（２３０〜４００メッシュ、４０ｍＬ）上でジクロロメタン中のメタノール（０〜５％）を用いて溶出させるカラムクロマトグラフィーによって精製した。これにより、所望の生成物を無色の油状物（３３０ｍｇ、０．５３ｍｍｏｌ、６８％）として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ：４．８７（五重線様，Ｊ＝６．２Ｈｚ，１Ｈ），４．７６（ｍ，２Ｈ），２．３５−２．２５（ｍ，８Ｈ），２．２２（ｓ，６Ｈ），１．８７−１．５６（ｍ，１４Ｈ），１．５５−１．２２（ｍ，３６Ｈ）。
【０１４３】
化合物７の合成：
【化３７】
2018087250.tif 000047
化合物７（ＸＤ−０１３−２９）を、化合物６（ＸＤ−０１３−２５）について説明したやり方と同様のやり方で調製した（無色の油状物、４２１ｍｇ、０．７１ｍｍｏｌ、ＸＤ−０１３−２１−中間体６からの３工程での全収率６１％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：５．１９−５．１４（ｍ，２Ｈ），４．８６（五重線様，Ｊ＝６．２Ｈｚ，１Ｈ），２．３８−２．２３（ｍ，１４Ｈ），１．９１−１．７９（ｍ，６Ｈ），１７７−１．５５（ｍ，１６Ｈ），１．５５−１．４６（ｍ，４Ｈ），１．３５−１．２２（ｍ，２０Ｈ）。
【０１４４】
化合物８の合成：
【化３８】
2018087250.tif 000048
化合物８（ＸＤ−０１３−３３）を、化合物６（ＸＤ−０１３−２５）について説明したやり方と同様のやり方で調製した（無色の油状物、２９５ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ、ＸＤ−０１３−２１−中間体６からの３工程での全収率３５％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：４．９１−４．８３（ｍ，３Ｈ），２．３５−２．２６（ｍ，８Ｈ），２．２２（ｓ，６Ｈ），１．７９（五重線様，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），１．６６−１．５９（ｍ，４Ｈ（水ピークと重複）），１．５６−１．４８（ｍ，１２Ｈ），１．３５−１．２２（ｍ，３６Ｈ），０．８９（ｔ様，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１２Ｈ）。
【０１４５】
化合物９の合成：
【化３９】
2018087250.tif 000049
化合物９（ＸＤ−０１３−４５）を、化合物６（ＸＤ−０１３−２５）について説明したやり方と同様のやり方で調製した（僅かに黄色の油状物、３０９ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ、ＸＤ−０１３−２１−中間体６からの３工程での全収率４５％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：４．８７（五重線様，Ｊ＝６．２Ｈｚ，１Ｈ），４．０６（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，４Ｈ），２．３５−２．２６（ｍ，８Ｈ），２．２３（ｓ，６Ｈ），１．８３−１．７１（ｍ，８Ｈ），１．６８−１．５７（ｍ，１４Ｈ（水ピークと重複）），１．５５−１．４６（ｍ，８Ｈ），１．３９−（ｍ，２２Ｈ），１．１３−１．０３（４Ｈ）。
【０１４６】
化合物１０の合成：
【化４０】
2018087250.tif 000050
化合物１０（ＸＤ−０１３−５８）を、化合物６（ＸＤ−０１３−２５）について説明したやり方と同様のやり方で調製した（僅かに黄色の油状物、２０５ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ、ＸＤ−０１３−２１−中間体６からの３工程での全収率３１％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：４．８６（ｍ，１Ｈ），４．０９（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，４Ｈ），２．３５−２．２７（ｍ，８Ｈ），２．２２（ｓ，６Ｈ），１．７９（五重線様，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），１．６８−１．５６（ｍ，８Ｈ），１．５０−１．４１（ｍ，４Ｈ），１．３８−１．２２（ｍ，２４Ｈ），１．１１−１．０６（ｍ，２Ｈ），０．９５（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，６Ｈ），０．９０（ｓ，１８Ｈ）。
【０１４７】
化合物１１の合成：
【化４１】
2018087250.tif 000051
化合物１１（ＸＤ−０１３−６０）を、化合物６（ＸＤ−０１３−２５）について説明したやり方と同様のやり方で調製した（僅かに黄色、１７５ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ、ＸＤ−０１３−２１−中間体６からの３工程での全収率２７％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：５．１１−５．０３（ｍ，２Ｈ），４．８７（ｍ，１Ｈ），２．３５−２．２５（ｍ，８Ｈ），２．２３（ｓ，６Ｈ），１．７９（五重線様，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），１．６８−１．５６（ｍ，８Ｈ），１．５５−１．４５（ｍ，８Ｈ），１．３４−１．２２（ｍ，２４Ｈ），０．９１（ｄ，２４Ｈ）。
【０１４８】
化合物１２の合成：
【化４２】
2018087250.tif 000052
化合物１２（ＸＤ−０１３−６３）を、化合物６（ＸＤ−０１３−２５）について説明したやり方と同様のやり方で調製した。化合物１２は、僅かに黄色の油状物として生成された（１９７ｍｇ、ｍｍｏｌ、ＸＤ−０１３−２１−中間体６からの３工程での全収率２９％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：５．００−４．９２（ｍ，１Ｈ），４．８７（ｍ，１Ｈ），４．７９−４．６８（ｍ，１Ｈ），２．３５−２．２３（ｍ，８Ｈ），２．２３（ｓ，６Ｈ），１．７９（五重線様，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ）。
【０１４９】
中間体１１（５−ヨード吉草酸エチル）の合成：
アセトン（３００ｍＬ）中の５−ブロモ吉草酸エチル（２５ｇ）およびヨウ化ナトリウム（９０ｇ）の溶液を、室温で一晩撹拌した。この反応混合物を、水（２００ｍＬ）で希釈し、ジエチルエーテル（２００ｍＬ）で抽出した。有機画分を水で洗浄し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、溶媒を除去して、５−ヨード吉草酸エチル（３２ｇ）を得た。
【０１５０】
中間体１２（７−オキソ−トリデカン−１，１３−二酸）の合成：
ナトリウムエトキシド（３．６ｇ）を、無水エタノール（３０ｍＬ）に溶解させた。ジエチルアセトンジカルボキシレート（１２ｇ）を添加し、溶液を加熱して還流させた。５−ヨード吉草酸エチル（１６ｇ）をゆっくりと添加し、溶液を１時間還流させた。エタノール（３０ｍＬ）中のナトリウムエトキシド（３．６ｇ）の溶液を添加し、続いて５−ヨード吉草酸エチル（１６ｇ）を添加した。溶液を一晩還流させた。この反応混合物を冷却し、水（２００ｍＬ）で希釈し、ジエチルエーテル（２００ｍＬ）で抽出した。有機画分を水で洗浄し、溶媒を除去した。残渣を酢酸（３０ｍＬ）および濃塩酸（６０ｍＬ）で処理し、次いで一晩還流させた。溶液を冷却し、水で希釈し、ジクロロメタンで抽出した。溶媒を除去し、残渣をアセトンから再結晶化させて、７−オキソ−トリデカン−１，１３−二酸を白色粉末（５．９ｇ）として得た。
【０１５１】
化合物１３の合成：
【化４３】
2018087250.tif 000053
７−オキソトリデカン二酸１，１３−ビス（ノナン−５−イル）の合成：ジクロロメタン（２０ｍＬ）中の７−オキソ−トリデカン−１，１３−二酸（１．０１ｇ）、４−ジメチルアミノピリジン（１．４３ｇ）、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ−エチルカルボジイミド塩酸塩（２．１ｇ）およびノナン−５−オール（１．９６ｇ）の溶液を、室温で一晩撹拌した。溶液を希塩酸で洗浄し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、溶媒を除去した。残渣を、ジクロロメタンを溶離剤として用いてシリカゲル（２０ｇ）カラムを下方に通過させて、２．８５ｇの生成物を得た。
【０１５２】
７−ヒドロキシトリデカン二酸１，１３−ビス（ノナン−５−イル）の合成：ジクロロメタン（２０ｍＬ）およびメタノール（１ｍＬ）中の７−オキソトリデカン二酸１，１３−ビス（ノナン−５−イル）（２．８５ｇ）の溶液を、水素化ホウ素ナトリウム（０．６０ｇ）で処理した。反応が（ＴＬＣによって判断して）完結したときに、溶液を水で希釈し、酸性化し、ジクロロメタンで抽出した。有機画分を無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、溶媒を除去した。残渣を、０〜３％メタノール／ジクロロメタンを溶離剤として用いてシリカゲル（２０ｇ）カラムを下方に通過させて、１．２６ｇの生成物を得た。
【０１５３】
７−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝トリデカン二酸１，１３−ビス（ノナン−５−イル）の合成：ジクロロメタン（２０ｍＬ）中の７−ヒドロキシトリデカン二酸１，１３−ビス（ノナン−５−イル）（１．２６ｇ）、４−ジメチルアミノピリジン（０．９８ｇ）、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ−エチルカルボジイミド塩酸塩（０．７８ｇ）およびＮ，Ｎ−ジメチルアミノ酪酸塩酸塩（１．２２ｇ）の溶液を、室温で一晩撹拌した。この溶液を希塩酸で洗浄し、続いて重炭酸ナトリウム水で洗浄した。有機相を無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、溶媒を除去した。残渣を、０〜３％メタノール／ジクロロメタンを溶離剤として用いてシリカゲル（２０ｇ）カラムを下方に通過させて、１．０４ｇの生成物を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ４．８７（ｐ；Ｊ＝６．２Ｈｚ；３Ｈ）；２．３（ｍ；８Ｈ）；２．２２（ｂｓ；６Ｈ）；１．７８（ｐ；Ｊ＝７．２Ｈｚ；２Ｈ）；０．８９（ｔ；Ｊ＝６．８Ｈｚ；１２Ｈ）。
【０１５４】
化合物１４の合成：
【化４４】
2018087250.tif 000054
７−オキソトリデカン二酸１，１３−ジシクロへキシルの合成：ジクロロメタン（２０ｍＬ）中の７−オキソ−トリデカン−１，１３−二酸（１．０２ｇ）、４−ジメチルアミノピリジン（１．４６ｇ）、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ−エチルカルボジイミド塩酸塩（２．２ｇ）およびシクロヘキサノール（２．４０ｇ）の溶液を、室温で一晩撹拌した。この溶液を希塩酸で洗浄し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、溶媒を除去した。残渣を、ジクロロメタンを溶離剤として用いてシリカゲル（２０ｇ）カラムを下方に通過させて、１．５２ｇの生成物を得た。
【０１５５】
７−ヒドロキシトリデカン二酸１，１３−ジシクロへキシルの合成：ジクロロメタン（２０ｍＬ）およびメタノール（１ｍＬ）中の７−オキソトリデカン二酸１，１３−ジシクロへキシル（１．５２ｇ）の溶液を、水素化ホウ素ナトリウム（０．７０ｇ）で処理した。反応が（ＴＬＣによって判断して）完結したときに、溶液を水で希釈し、酸性化し、ジクロロメタンで抽出した。有機画分を無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、溶媒を除去した。残渣を、０〜３％メタノール／ジクロロメタンを溶離剤として用いてシリカゲル（２０ｇ）カラムを下方に通過させて、１．４１ｇの生成物を得た。
【０１５６】
７−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝トリデカン二酸１，１３−ジシクロへキシルの合成：ジクロロメタン（２０ｍＬ）中の７−ヒドロキシトリデカン二酸１，１３−ジシクロへキシル（１．４１ｇ）、４−ジメチルアミノピリジン（１．４５ｇ）、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ−エチルカルボジイミド塩酸塩（０．９１ｇ）およびＮ，Ｎ−ジメチルアミノ酪酸塩酸塩（１．６７ｇ）の溶液を、室温で一晩撹拌した。この溶液を希塩酸で洗浄し、続いて重炭酸ナトリウム水で洗浄した。有機相を無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、溶媒を除去した。残渣を、０〜８％メタノール／ジクロロメタンを溶離剤として用いてシリカゲル（２０ｇ）カラムを下方に通過させて、１．６４ｇの生成物を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ４．８６（ｐ；Ｊ＝６．１Ｈｚ；１Ｈ）；４．７５（ｍ；２Ｈ）；２．３（ｍ；８Ｈ）；２．２２（ｓ；６Ｈ）。
【０１５７】
化合物１５の合成：
【化４５】
2018087250.tif 000055
７−オキソトリデカン二酸１，１３−ジシクロペンチルの合成：ジクロロメタン（２０ｍＬ）中の７−オキソ−トリデカン−１，１３−二酸（０．９９ｇ）、４−ジメチルアミノピリジン（１．４７ｇ）、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ−エチルカルボジイミド塩酸塩（２．３２ｇ）およびシクロペンタノール（２．００ｇ）の溶液を、室温で一晩撹拌した。この溶液を希塩酸で洗浄し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、溶媒を除去した。残渣を、ジクロロメタンを溶離剤として用いてシリカゲル（２０ｇ）カラムを下方に通過させて、１．２３ｇの生成物を得た。
【０１５８】
７−ヒドロキシトリデカン二酸１，１３−ジシクロペンチルの合成：ジクロロメタン（２０ｍＬ）およびメタノール（１ｍＬ）中の７−オキソトリデカン二酸１，１３−ジシクロペンチル（１．２３ｇ）の溶液を、水素化ホウ素ナトリウム（０．６ｇ）で処理した。反応が（ＴＬＣによって判断して）完結したときに、溶液を水で希釈し、酸性化し、ジクロロメタンで抽出した。有機画分を無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、溶媒を除去した。残渣を、０〜２％メタノール／ジクロロメタンを溶離剤として用いてシリカゲル（２０ｇ）カラムを下方に通過させて、１．３６ｇの生成物を得た。
【０１５９】
７−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝トリデカン二酸１，１３−ジシクロペンチルの合成：ジクロロメタン（２０ｍＬ）中の７−ヒドロキシトリデカン二酸１，１３−ジシクロペンチル（１．３６ｇ）、４−ジメチルアミノピリジン（１．２７ｇ）、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ−エチルカルボジイミド塩酸塩（１．０５ｇ）およびＮ，Ｎ−ジメチルアミノ酪酸塩酸塩（１．６２ｇ）の溶液を、室温で一晩撹拌した。この溶液を希塩酸で洗浄し、続いて重炭酸ナトリウム水で洗浄した。有機相を無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、溶媒を除去した。残渣を、０〜８％メタノール／ジクロロメタンを溶離剤として用いてシリカゲル（２０ｇ）カラムを下方に通過させて、１．５７ｇの生成物を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ５．１５（ｍ；２Ｈ）；４．８６（ｐ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，１Ｈ）；２．３（ｍ，８Ｈ）；２．２２（ｓ；６Ｈ）。
【０１６０】
化合物１６の合成：
【化４６】
2018087250.tif 000056
７−オキソトリデカン二酸１，１３−ジウンデシルの合成：ジクロロメタン（２０ｍＬ）中の７−オキソ−トリデカン−１，１３−二酸（０．５９ｇ）、４−ジメチルアミノピリジン（０．７５ｇ）、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ−エチルカルボジイミド塩酸塩（１．２０ｇ）およびウンデカノール（１．１７ｇ）の溶液を、室温で一晩撹拌した。この溶液を希塩酸で洗浄し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、溶媒を除去した。残渣を、ジクロロメタンを溶離剤として用いてシリカゲル（２０ｇ）カラムを下方に通過させて、１．０３ｇの生成物を得た。
【０１６１】
７−ヒドロキシトリデカン二酸１，１３−ジウンデシルの合成：ジクロロメタン（２０ｍＬ）およびＴＨＦ（２０ｍＬ）中の７−オキソトリデカン二酸１，１３−ジウンデシル（１．０３ｇ）の溶液を、水素化ホウ素ナトリウム（１ｇ）で処理した。反応が（ＴＬＣによって判断して）完結したときに、溶液を水で希釈し、酸性化し、ジクロロメタンで抽出した。有機画分を無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、溶媒を除去した。残渣を、０〜２％メタノール／ジクロロメタンを溶離剤として用いてシリカゲル（２０ｇ）カラムを下方に通過させて、０．８８ｇの生成物を得た。
【０１６２】
７−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝トリデカン二酸１，１３−ジウンデシルの合成：ジクロロメタン（２０ｍＬ）中の７−ヒドロキシトリデカン二酸１，１３−ジウンデシル（０．８８ｇ）、４−ジメチルアミノピリジン（０．６８ｇ）、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ−エチルカルボジイミド塩酸塩（０．５４ｇ）およびＮ，Ｎ−ジメチルアミノ酪酸塩酸塩（０．８２ｇ）の溶液を、室温で一晩撹拌した。この溶液を希塩酸で洗浄し、続いて重炭酸ナトリウム水で洗浄した。有機相を無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、溶媒を除去した。残渣を、０〜５％メタノール／ジクロロメタンを溶離剤として用いてシリカゲル（２０ｇ）カラムを下方に通過させて、０．７７ｇの生成物を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ４．８７（ｐ；Ｊ＝６．２Ｈｚ；１Ｈ）；４．０５（ｔ；Ｊ＝６．７Ｈｚ；４Ｈ）；２．３（ｍ；８Ｈ）；２．２２（ｓ；６Ｈ）；１．７９（ｐ；Ｊ＝７．３Ｈｚ；１Ｈ）；０．８７（ｔ；Ｊ＝６．８Ｈｚ；６Ｈ）
【０１６３】
化合物１７の合成：
【化４７】
2018087250.tif 000057
７−オキソトリデカン二酸１，１３−ビス（２Ｅ）−３，７，１１，１５−テトラメチルヘキサデカ−２−エン−１−イルの合成：ジクロロメタン（２０ｍＬ）中の７−オキソ−トリデカン−１，１３−二酸（０．５１ｇ）、４−ジメチルアミノピリジン（０．７６ｇ）、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ−エチルカルボジイミド塩酸塩（０．６０ｇ）およびフィトール（１．７７ｇ）の溶液を、室温で一晩撹拌した。この溶液を希塩酸で洗浄し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、溶媒を除去した。残渣を、ジクロロメタンを溶離剤として用いてシリカゲル（２０ｇ）カラムを下方に通過させて、１．７ｇの生成物を得た。
【０１６４】
７−ヒドロキシトリデカン二酸１，１３−ビス（２Ｅ）−３，７，１１，１５−テトラメチルヘキサデカ−２−エン−１−イルの合成：メタノール（５ｍＬ）およびＴＨＦ（１０ｍＬ）中の７−オキソトリデカン二酸１，１３−ビス（２Ｅ）−３，７，１１，１５−テトラメチルヘキサデカ−２−エン−１−イル（１．７ｇ）の溶液を、水素化ホウ素ナトリウム（１ｇ）で処理した。反応が（ＴＬＣによって判断して）完結したときに、溶液を水で希釈し、酸性化し、ジクロロメタンで抽出した。有機画分を無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、溶媒を除去した。残渣を、０〜２％メタノール／ジクロロメタンを溶離剤として用いてシリカゲル（２０ｇ）カラムを下方に通過させて、０．８９ｇの生成物を得た。
【０１６５】
７−｛［４−ジメチルアミノ）−ブタノイル］オキシ｝トリデカン二酸１，１３−ビス（２Ｅ）−３，７，１１，１５−テトラメチルヘキサデカ−２−エン−１−イルの合成：ジクロロメタン（２０ｍＬ）中の７−ヒドロキシトリデカン二酸１，１３−ビス（２Ｅ）−３，７，１１，１５−テトラメチルヘキサデカ−２−エン−１−イル（０．８９ｇ）、４−ジメチルアミノピリジン（０．４６ｇ）、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ−エチルカルボジイミド塩酸塩（０．３７ｇ）およびＮ，Ｎ−ジメチルアミノ酪酸塩酸塩（０．６３ｇ）の溶液を、室温で一晩撹拌した。この溶液を希塩酸で洗浄し、続いて重炭酸ナトリウム水で洗浄した。有機相を無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、溶媒を除去した。残渣を、０〜４％メタノール／ジクロロメタンを溶離剤として用いてシリカゲル（２０ｇ）カラムを下方に通過させて、０．６２ｇの生成物を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ４．８７（ｐ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，３Ｈ）
【０１６６】
化合物１８の合成：
【化４８】
2018087250.tif 000058
化合物１８（ＸＤ−０１３−６６）を、適切な出発物質を用いて、化合物１（ＸＤ−０１３−１８）について説明したやり方と同様のやり方で調製した。化合物１９は、僅かに黄色の油状物として生成された（２３８ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ、８９％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：４．８７（五重線様，Ｊ＝６．２Ｈｚ，１Ｈ），４．０６（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，４Ｈ），２．３９−２．２７（ｍ，１４Ｈ），１．８３（五重線，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），１．６６−１．５８（ｍ，８Ｈ（推定値；水ピークと重複））、１．５４−１．４８（ｍ，４Ｈ），１．３７−１．２２（４０Ｈ），０．８９（ｔ様，Ｊ＝６．８Ｈｚ，６Ｈ）。
【０１６７】
化合物１９の合成：
【化４９】
2018087250.tif 000059
化合物１９（ＸＤ−０１３−９２）を、化合物１（ＸＤ−０１３−１８）について説明したやり方と同様のやり方で調製した。化合物１９は、無色の油状物として生成された（２０８ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ、６３％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：４．８７（五重線様，Ｊ＝６．２Ｈｚ，１Ｈ），４．０８（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，４Ｈ），２．３８−２．３２（ｍ，４Ｈ），２．２７（ｓ，６Ｈ），２．３０−２．２２（ｍ，２Ｈ），１．８２（五重線様，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），１．６６−１．４１（ｍ，１６Ｈ），１．３７−１．２１（ｍ，３６Ｈ），０．９２−０．８６（ｍ，１２Ｈ）。
【０１６８】
化合物２０の合成：
【化５０】
2018087250.tif 000060
化合物２０（ＸＤ−０１３−８１）を、化合物６（ＸＤ−０１３−２５）について記載したやり方と同様のやり方で調製した。化合物２０は、僅かに黄色の油状物として生成された（３８１ｍｇ、０．５２ｍｍｏｌ、ＸＤ−０１３−２１−中間体６からの３工程での全収率５５％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：４．９１−４．８３（ｍ，３Ｈ），２．３５−２．２６（ｍ，８Ｈ），２．２２（ｓ，６Ｈ），１．７９（五重線様，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），１．６６−１．５９（ｍ，４Ｈ），１．５６−１．４７（ｍ，１２Ｈ），１．３５−１．２２（ｍ，４０Ｈ），０．９１−０．８６（ｍ，１２Ｈ）。
【０１６９】
化合物２１の合成：
【化５１】
2018087250.tif 000061
化合物２１（ＸＤ−０１６−１６）を次のように調製した。
【０１７０】
中間体１３（０１６−１１）の合成：ベンゼン（４０ｍＬ）中のアルコール０１６−９３Ｃ（上に示す）および１−クロロ−４−ブロモブタン（８ｍｍｏｌ、０．９２ｍＬ）の溶液に、ＮａＨ（１３０ｍｇ）を添加した。１６時間還流させた。さらなるＮａＨ（４０ｍｇ）を添加し、１６時間還流させた。さらなるＮａＨ（９０ｍｇ）を添加し、３日間還流させた。ベンゼンを除去し、残渣をヘキサン−ＥｔＯＡｃ中に取り、水、ブラインで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。濃縮により、無色の油状物（２ｇ）を得た。残渣を、シリカゲル上でのカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中のＥｔＯＡｃ、０〜２５％）によって精製した。これにより、所望の生成物を無色の油状物（０．２８ｇ、０．４８ｍｍｏｌ、塩化物に基づき２４％）として得た。未反応の出発物質を、より後の画分に回収した（０．６３ｇ、１．３０ｍｍｏｌ、６３％）。
【０１７１】
中間体１４（０１６−１４）の合成：上記の生成物、すなわち中間体１３−０１６−１１（０．２８ｇ、０．４８ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（２Ｍ、１５ｍＬ）中のジメチルアミンの溶液に溶解させた。この溶液に微量のＮａＩを添加し、混合物を２日間６８〜７２Ｃで加熱した。混合物を冷却し、減圧下で濃縮した。残渣をヘキサン−ＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）中に取り、水、ブラインで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮した。残渣を、同じ反応の先のバッチからの生成物と合わせた。これにより、全部で０．４１ｇの所望の生成物を得た。
【０１７２】
中間体１５（０１６−１５）の合成：ＥｔＯＨ（２０ｍＬ）中のＴＨＰ保護したジ−ＯＨ（０．４１ｇ、０．７ｍｍｏｌ、中間体１４−０１６−１４）の溶液に、室温においてｐ−トルエンスルホン酸水和物（０．７ｍｍｏｌ、１３３ｍｇ）を添加し、７０〜５５Ｃで１．５時間加熱した。濃縮し、残渣を飽和重炭酸ナトリウム（５０ｍＬ）および水（５０ｍＬ）中に取り、この混合物をジエチルエーテル（２×７５ｍＬ）で抽出し、合わせた有機層をブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。濃縮し、残渣をヘキサン（２×１ｍＬ）で洗浄した。これにより、所望の生成物を褐色がかった固体（０．２４ｇ）として得た。
【０１７３】
化合物２１（０１６−１６）の合成：アルゴン雰囲気下において、ジクロロメタン（１５ｍＬ）中のアルコール０１６−１５（０．２４ｇ、０．５８ｍｍｏｌ）、２−エチルヘキサン酸（５００ｍｇ、３．４６ｍｍｏｌ、６当量）、４−（ジメチルアミノ）ピリジン（２００ｍｇ）およびトリエチルアミン（０．４８７ｍＬ、３．５ｍｍｏｌ）を投入した丸底フラスコに、ジシクロへキシルカルボジイミド（７７４ｍｇ、３．７５ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を周囲温度で２０時間撹拌後、混合物を濃縮した。残渣を、ヘキサン／ＥｔＯＡｔ（１００ｍＬ）中に取った。沈殿物を濾過によって除く。濾液を希塩化アンモニウム溶液で洗浄し、濃縮した。残渣を、シリカゲル上でのカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中のメタノール、０〜１０％）によって精製した。これにより、所望の生成物を僅かに黄色の油状物（１５０ｍｇ）として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：４．０８（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，４Ｈ），３．４２（ｔ様，６．２Ｈｚ，２Ｈ），３．１８（五重線様，５．５Ｈｚ，１Ｈ），２．５１−２．４４（ｍ，２Ｈ），２．３６（ｓ，６Ｈ），２．２９−２．２２（ｍ，２Ｈ），１．８５（ｂｒ．水（低磁場（ｌｏｗ  ｆｉｅｌｄ）へのシフトは、アミノ基と水との間の相互作用によるものであり得る）），１．６７−１．５５（ｍ，１２Ｈ），１．５５−１．４１（ｍ，８Ｈ），１．３９−１．２１（ｍ，３２Ｈ），０．８９（２組の三重線，１２Ｈ）。
【０１７４】
化合物２２の合成：
【化５２】
2018087250.tif 000062
化合物２２を次のように調製した。
【０１７５】
中間体１６の合成（１３−オキソ−ペンタコサン−１，２５−二酸（ＳＭＡ−１１−１００））：ナトリウムエトキシド（１．５６ｇ）を、無水エタノール（３０ｍＬ）に溶解させた。ジエチルアセトンジカルボキシレート（４．５ｇ）を添加し、溶液を加熱して還流させた。１１−ブロモドデカン酸エチル（６．８ｇ）をゆっくりと添加し、溶液を１時間還流させた。ナトリウムエトキシド（１．５３ｇ）を添加し、続いて１１−ブロモドデカン酸エチル（１８ｇ）を添加した。溶液を一晩還流させた。この反応混合物を冷却し、水で希釈し、希塩酸で酸性化し、塩化メチレンで抽出した。有機画分を水で洗浄し、溶媒を除去した。粗生成物を、メタノール／塩化メチレンを溶離剤として用いてシリカゲルカラム（８０ｇ）を下方に通過させて、未反応の出発物質を回収した。生成物を含有する残渣を、酢酸（１０ｍＬ）および濃塩酸（２０ｍＬ）で処理し、次いで一晩還流させた。この溶液を冷却し、水で希釈し、濾過した。収集した沈殿物をアセトンから再結晶化させて、１３−オキソ−ペンタコサン−１，２５−二酸を白色粉末（２．９ｇ）として得た。
【０１７６】
１３−オキソ−ペンタコサン二酸１，２５−ビス（ヘキシル）の合成：ジクロロメタン（２０ｍＬ）中の中間体１６（１３−オキソ−ペンタコサン−１，２５−二酸）（１．００ｇ）、４−ジメチルアミノピリジン（１．１２ｇ）、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ−エチルカルボジイミド塩酸塩（０．９９ｇ）およびノナン−５−オール（１．４０ｇ）の溶液を、室温で一晩撹拌した。この溶液を、希塩酸で洗浄し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、溶媒を除去した。残渣を、ジクロロメタンを溶離剤として用いてシリカゲル（２０ｇ）カラムを下方に通過させて、０．８２ｇの生成物を得た。
【０１７７】
１３−ヒドロキシ−ペンタコサン二酸１，２５−ビス（ヘキシル）の合成：テトラヒドロフラン（２３ｍＬ）およびメタノール（１０ｍＬ）中の１３−オキソ−ペンタコサン二酸１，２５−ビス（ヘキシル）（０．８２ｇ）の溶液を、水素化ホウ素ナトリウム（０．６３ｇ）で処理した。反応を１５分間撹拌し、次いで水で希釈し、酸性化し、ジクロロメタンで抽出した。有機画分を、無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、溶媒を除去した。残渣を、ジクロロメタンを溶離剤として用いてシリカゲル（２０ｇ）カラムを下方に通過させて、０．５９ｇの生成物を得た。
【０１７８】
１３−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝ペンタコサン二酸１，２５−ジヘキシルの合成：ジクロロメタン（２０ｍＬ）中の１３−ヒドロキシ−ペンタコサン二酸１，２５−ビス（ヘキシル）（０．５９ｇ）、４−ジメチルアミノピリジン（０．４６ｇ）、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ−エチルカルボジイミド塩酸塩（０．３６ｇ）およびＮ，Ｎ−ジメチルアミノ酪酸塩酸塩（０．６４ｇ）の溶液を、室温で１時間撹拌した。この溶液を希塩酸で洗浄し、続いて重炭酸ナトリウム水で洗浄した。有機相を無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、溶媒を除去した。残渣を、０〜４％メタノール／ジクロロメタンを溶離剤として用いてシリカゲル（２０ｇ）カラムを下方に通過させて、０．５７ｇの生成物を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ４．８７（ｐ；Ｊ＝６．２Ｈｚ；３Ｈ）；４．０６（ｔ；Ｊ＝６．７Ｈｚ；４Ｈ）；２．２５−２．３６）（ｍ；８Ｈ）；２．３（ｍ；８Ｈ）；２．２２（ｓ；６Ｈ）；１．７９（ｐ；Ｊ＝７．４Ｈｚ；２Ｈ）；０．９０（ｔ；Ｊ＝６．８Ｈｚ；６Ｈ）。
【０１７９】
化合物２３の合成：
【化５３】
2018087250.tif 000063
１３−オキソペンタコサン二酸１，２５−ビス（２，６−ジメチルヘプタン−４−イル）の合成：ジクロロメタン（２０ｍＬ）中の中間体１６（１３−オキソ−ペンタコサン−１，２５−二酸）（１．０１ｇ）、４−ジメチルアミノピリジン（０．８６ｇ）、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ−エチルカルボジイミド塩酸塩（０．９５ｇ）および２，６−ジメチルヘプタン−４−オール（１．９２ｇ）の溶液を、室温で一晩撹拌した。この溶液を希塩酸で洗浄し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、溶媒を除去した。残渣を、ジクロロメタンを溶離剤として用いてシリカゲル（２０ｇ）カラムを下方に通過させて、０．４０ｇの生成物を得た。
【０１８０】
１３−ヒドロキシペンタコサン二酸１，２５−ビス（２，６−ジメチルヘプタン−４−イル）の合成：テトラヒドロフラン（１０ｍＬ）およびメタノール（１０ｍＬ）中の１３−オキソペンタコサン二酸１，２５−ビス（２，６−ジメチルヘプタン−４−イル）（０．４０ｇ）の溶液を、水素化ホウ素ナトリウムで処理した。反応を３０分間撹拌し、次いで水で希釈し、酸性化し、ジクロロメタンで抽出した。有機画分を無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、溶媒を除去した。残渣を、ジクロロメタンを溶離剤として用いてシリカゲル（２０ｇ）カラムを下方に通過させて、０．４０ｇの生成物を得た。
【０１８１】
１３−｛［４−（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ｝−ペンタコサン二酸１，２５−ビス（２，６−ジメチルヘプタン−４−イル）の合成：ジクロロメタン（２０ｍＬ）中の１３−ヒドロキシペンタコサン二酸１，２５−ビス（２，６−ジメチルヘプタン−４−イル）（０．４９ｇ）、４−ジメチルアミノピリジン（０．４５ｇ）、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ−エチルカルボジイミド塩酸塩（０．２８ｇ）およびＮ，Ｎ−ジメチルアミノ酪酸塩酸塩（０．３２ｇ）の溶液を、室温で２時間撹拌した。この溶液を希塩酸で洗浄し、続いて重炭酸ナトリウム水で洗浄した。有機相を無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、溶媒を除去した。残渣を、０〜８％メタノール／ジクロロメタンを溶離剤として用いてシリカゲル（２０ｇ）カラムを下方に通過させて、０．４８ｇの生成物を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ５．０７（ｍ，Ｊ＝４．３Ｈｚ；２Ｈ）；４．８７（ｐ；Ｊ＝６．４Ｈｚ；１Ｈ）；４．１５（ｔ；Ｊ＝６．４Ｈｚ；８Ｈ）；２．３２（ｔ；Ｊ＝７．５Ｈｚ；２Ｈ）；２．２７（ｑ；Ｊ＝７．６Ｈｚ；６Ｈ）；２．２２（ｓ；６Ｈ）；１．７９（ｐ；Ｊ＝７．５Ｈｚ；２Ｈ）；０．９０（ｄ；Ｊ＝６．６Ｈｚ；２４Ｈ）。
【０１８２】
実施例２：カチオン性脂質由来のリポソームを用いたＦＶＩＩインビボ評価
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ，ＭＡ）は、尾静脈注射によって、０．０１ｍＬ／ｇの体積で、生理食塩水か、または所望の製剤中のｓｉＲＮＡかのいずれかを受ける。投与後の様々な時点において、動物をイソフルオラン（ｉｓｏｆｌｕｏｒａｎｅ）吸入によって麻酔し、血液を眼窩後出血によって血清分離器管中に採取する。第ＶＩＩ因子タンパク質の血清レベルを、発色アッセイ（Ｃｏａｓｅｔ  Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩ、ＤｉａＰｈａｒｍａ  Ｇｒｏｕｐ，ＯＨ、またはＢｉｏｐｈｅｎ  ＦＶＩＩ、Ａｎｉａｒａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＯＨ）を用いて、製造業者のプロトコルに従って、各試料について測定する。標準曲線を、生理食塩水で処理した動物から採取した血清を用いて生成する。肝臓ｍＲＮＡレベルが評価される実験においては、投与後の様々な時点において、動物を犠牲にし、肝臓を取り出し、液体窒素中で急冷凍する。冷凍した肝組織を、粉砕して粉末にする。組織溶解物を調製し、第ＶＩＩ因子およびアポＢの肝臓ｍＲＮＡレベルを分岐ＤＮＡアッセイ（ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ  Ａｓｓａｙ、Ｐａｎｏｍｉｃｓ，ＣＡ）を用いて測定する。
【０１８３】
実施例３：インビボ齧歯類第ＶＩＩ因子サイレンシングモデルを用いた種々のカチオン性脂質を含有する脂質粒子製剤の有効性の測定
凝固カスケードにおける重要なタンパク質である第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）は、肝臓（肝細胞）において合成され、血漿中に分泌される。血漿中ＦＶＩＩレベルは、単純なプレートベースの比色アッセイによって測定され得る。そういうものであるから、ＦＶＩＩは、肝細胞由来タンパク質のｓｉＲＮＡ媒介性ダウンレギュレーションを測定するため、ならびに核酸脂質粒子およびｓｉＲＮＡ（例えば、表１９に示すｓｉＲＮＡ）の血漿濃度および組織分布をモニタリングするための、好都合なモデルである。
【０１８４】
【表３】
2018087250.tif 000064
【０１８５】
本明細書に記載されるカチオン性脂質を用いて、国際公開第２０１０／０８８５３７号パンフレット（参照によりその全体が援用される）に記載されているように、インライン混合法を用いてＡＤ−１６６１二重鎖を含有するリポソームを製剤化する。脂質粒子を、以下のモル比：５０％のカチオン性脂質／１０％のジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）／３８．５％のコレステロール／１．５％のＰＥＧ−ＤＭＧ（平均ＰＥＧ分子量が２０００の１−（モノメトキシ−ポリエチレングリコール）−２，３−ジミリストイルグリセロール）を用いて製剤化する。
【０１８６】
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ，ＭＡ）は、尾静脈注射によって、生理食塩水かまたは製剤化されたｓｉＲＮＡかのいずれかを受ける。投与後の様々な時点において、血清試料を、眼窩後出血によって採取する。第ＶＩＩ因子タンパク質の血清レベルを、発色アッセイ（Ｂｉｏｐｈｅｎ  ＦＶＩＩ、Ａｎｉａｒａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＯＨ）を用いて、各試料について測定する。第ＶＩＩ因子の肝臓ｍＲＮＡレベルを測定するために、動物を犠牲にし、肝臓を取り出し、液体窒素中で急冷凍する。冷凍組織から組織溶解物を調製し、第ＶＩＩ因子の肝臓ｍＲＮＡレベルを分岐ＤＮＡアッセイ（ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ  Ａｓｓａｙ、Ｐａｎｏｍｉｃｓ，ＣＡ）を用いて定量化する。
【０１８７】
ＦＶＩＩ活性を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける静脈内（ボーラス）注射から４８時間後に、ＦＶＩＩ  ｓｉＲＮＡで処理した動物において評価する。ＦＶＩＩを、血清または組織中のタンパク質レベルを測定するための市販のキットを用いて、製造業者の指示に従って、マイクロプレートスケールで測定する。ＦＶＩＩ減少を、非処理のコントロールマウスと比較して求め、その結果を％残留ＦＶＩＩとして表す。２つの用量レベル（０．０５ｍｇ／ｋｇおよび０．００５ｍｇ／ｋｇのＦＶＩＩ  ｓｉＲＮＡ）を、各新規リポソーム組成物のスクリーニング（ｓｃｒｅｅｎ）において使用する。
【０１８８】
実施例４：事前に形成された小胞を用いたｓｉＲＮＡ製剤
粒子を含有するカチオン性脂質を、事前形成小胞法を用いて作製する。カチオン性脂質、ＤＳＰＣ、コレステロールおよびＰＥＧ−脂質を、それぞれ４０／１０／４０／１０のモル比でエタノールに可溶化する。脂質混合物を、水性緩衝液（５０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ４）に、それぞれ３０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）および６．１ｍｇ／ｍＬの最終エタノールおよび脂質濃度になるように、混合しながら添加し、押出前に２分間、室温で平衡させる。水和した脂質を、Ｎｉｃｏｍｐ分析により測定して７０〜９０ｎｍの小胞直径が得られるまで、Ｌｉｐｅｘ  Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｌｉｐｉｄｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ）を用いて２２℃にて、２枚積重ねた８０ｎｍ細孔径のフィルター（Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅ）に通して押出す。これには、一般に、１〜３回の通過を要する。小さな小胞を形成しない一部のカチオン性脂質混合物については、より低いｐＨの緩衝液（５０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ３）を用いてその脂質混合物を水和させてＤＳＰＣ頭部基上のホスフェート基をプロトン化することが、安定な７０〜９０ｎｍ小胞を形成するのを助ける。
【０１８９】
ＦＶＩＩ  ｓｉＲＮＡ（３０％のエタノールを含有する５０ｍＭクエン酸塩のｐＨ４水溶液に可溶化した）を、事前に３５℃に平衡させた小胞に、混合しながら約５ｍＬ／分の速度で添加する。０．０６（ｗｔ／ｗｔ）の最終の標的ｓｉＲＮＡ／脂質比が達成された後、この混合物を、３５℃にてさらに３０分間インキュベートして、ＦＶＩＩ  ｓｉＲＮＡの小胞の再組織化および封入を可能にする。次いで、エタノールを除去し、外部緩衝液を、透析または接線流透析濾過のいずれかによって、ＰＢＳ（１５５ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．５）と置き換える。最終の封入ｓｉＲＮＡ対脂質比を、サイズ排除スピンカラムまたはイオン交換スピンカラムを用いて非封入ｓｉＲＮＡを除去した後に測定する。
【０１９０】
実施例５：脂質製剤の有効性のインビボ測定
試験製剤を、以下のインライン混合法を用いて調製した。
【０１９１】
インライン混合法の一般プロトコル
一方は脂質を含有しそして他方はｓｉＲＮＡを含有する、それぞれ異なった別個の原液を調製する。脂質Ａ、ＤＳＰＣ、コレステロールおよびＰＥＧ脂質を含有する脂質原液（ｓｔｏｃｋ）を、９０％エタノールに可溶化させることにより調製する。残りの１０％は、低ｐＨクエン酸塩緩衝液である。脂質原液の濃度は、４ｍｇ／ｍＬである。このクエン酸塩緩衝液のｐＨは、使用される融合性脂質（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ  ｌｉｐｉｄ）の種類によってｐＨ３〜５の間で変化し得る。ｓｉＲＮＡもまた、４ｍｇ／ｍＬの濃度でクエン酸塩緩衝液に可溶化させる。小規模用に、５ｍＬの各原液を調製する。
【０１９２】
ｓｉＲＮＡと合わせる前に、原液が完全に透明になり、脂質が完全に可溶化されていなければならない。したがって、原液は、脂質を完全に可溶化するために加熱され得る。このプロセスにおいて使用されるｓｉＲＮＡは、非修飾オリゴヌクレオチドであっても修飾されていてもよく、また、コレステロールなどの親油性部分とコンジュゲートされていてもよい。
【０１９３】
個々の原液を、各溶液をＴ字形接合部にポンプで送ることにより合わせる。デュアルヘッドＷａｔｓｏｎ−Ｍａｒｌｏｗポンプを用いて、２つの流れの開始および停止を同時に制御する。線流速を高めるために、１．６ｍｍポリプロピレン管をさらに小さくして、０．８ｍｍ管にする。このポリプロピレンライン（ＩＤ＝０．８ｍｍ）を、Ｔ字形接合部の両側に取り付ける。ポリプロピレンＴは、１．６ｍｍの直線状縁部を、結果として生じる４．１ｍｍの容積に対して有している。ポリプロピレンラインの大きな末端（１．６ｍｍ）の各々を、可溶化された脂質原液または可溶化されたｓｉＲＮＡのいずれかを含有する試験管に入れる。Ｔ字形接合部の後に、合わされた流れが排出するところである単一の管を設置する。この管は、次いで、２倍体積のＰＢＳを含む容器内に延びている。ＰＢＳは、高速で撹拌されている。ポンプについての流速は、３００ｒｐｍまたは１１０ｎｉＬ／分という設定である。エタノールを除去し、透析によってＰＢＳと交換する。次いで、この脂質製剤を、適切な作用濃度まで、遠心分離または透析濾過を用いて濃縮する。
【０１９４】
試験製剤を、最初に、雌の７〜９週齢の１５〜２５ｇの雌Ｃ５７Ｂ１／６マウスにおいて、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇおよび５．０ｍｇ／ｋｇで、１処置群当たり３匹のマウスとして、それらの製剤のＦＶＩＩノックダウンについて評価する。全ての研究が、リン酸緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ、コントロール群）または基準製剤のいずれかを受けた動物を含む。製剤を、試験の直前にＰＢＳで適切な濃度まで希釈する。マウスを秤量し、適切な投薬量を計算する（１０μｌ／ｇ体重）。試験および基準製剤ならびにＰＢＳ（コントロール動物用）を、外側尾静脈によって静脈内投与する。２４時間後にケタミン／キシラジンの腹腔内注射で動物に麻酔をかけ、５００〜７００μｌの血液を、心臓穿孔によって血清分離器管（ＢＤ  Ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ）内に採取する。血液を１５℃にて１０分間２，０００×ｇで遠心分離し、血清を採取し、分析まで−７０℃で保存する。血清試料を３７℃で３０分間解凍し、ＰＢＳで希釈し、９６ウェルアッセイプレート中にアリコートする。第ＶＩＩ因子レベルを、発色アッセイ（Ｂｉｏｐｈｅｎ  ＦＶＩＩキット、Ｈｙｐｈｅｎ  ＢｉｏＭｅｄ）を用いて製造業者の指示に従って評価し、吸収を、４０５ｎｍ波長のフィルターを備えたマイクロプレートリーダーで測定する。血漿ＦＶＩＩレベルを定量化し、ＥＤ５０（コントロール動物と比較して血漿ＦＶＩＩレベルにおいて５０％の減少を結果としてもたらす用量）を、コントロール動物からのプール血清試料から生成した標準曲線を用いて計算する。高レベルのＦＶＩＩノックダウン（ＥＤ５０＜＜０．１ｍｇ／ｋｇ）を示す関心のある製剤を、独立した研究において、より低い用量範囲で再試験して効力を確認し、ＥＤ５０レベルを確立する。
【０１９５】
以下の表は、本明細書に記載されるカチオン性脂質の一部についてのＥＤ５０値を示す。
【０１９６】
【表４Ａ】
2018087250.tif 000065
【表４Ｂ】
2018087250.tif 000066
【０１９７】
これらの変更および他の変更が、上記の詳細な説明に鑑みて、実施形態に加えられ得る。一般に、以下の特許請求の範囲において、使用される用語は、本明細書および特許請求の範囲に開示された特定の実施形態に特許請求の範囲を限定するものと解釈されるべきではなく、そのような特許請求の範囲が権利を有する等価物の全範囲と共に全ての可能な実施形態を包含するものと解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は、本開示によって限定されるものではない。
【外国語明細書】
2018087250000001.pdf