(57)【要約】      （修正有）【課題】核酸試料の平易な処理及び増幅に使用することができ、ユーザータイム及び起こりうる汚染を低減させる利点をもつ、核酸を増幅するために使用することのできる組成物、方法及びキットの提供。【解決手段】ｉ）α−シクロデキストリン等の封鎖剤、ポリメラーゼ及びデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を含む試薬組成物を、真空状態で凍結乾燥する工程と、ｉｉ）核酸を含有する溶液を、凍結乾燥された試薬組成物とともにインキュベートする工程と、ｉｉｉ）核酸を増幅する工程とを含んでおり、核酸が固相支持体に固定化され、溶解試薬が固体支持体に組み込まれている、核酸増幅方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
封鎖剤、ポリメラーゼ及びデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を含む、核酸増幅のための乾燥試薬組成物。
【請求項２】
前記封鎖剤がシクロデキストリンである、請求項１記載の乾燥試薬組成物。
【請求項３】
前記シクロデキストリンが、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、６−Ｏ−α−Ｄ−マルトシル−βシクロデキストリン、ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン及び２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン並びにそれらの誘導体からなる群から選択される、請求項２記載の乾燥試薬組成物。
【請求項４】
前記シクロデキストリンがα−シクロデキストリンである、請求項２又は請求項３記載の乾燥試薬組成物。
【請求項５】
１以上のプライマーをさらに含む、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の乾燥試薬組成物。
【請求項６】
賦形剤混合物をさらに含む、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の乾燥試薬組成物。
【請求項７】
前記賦形剤混合物が、１０×ＰＣＲ緩衝液、フィコール７０、フィコール４００、メレジトース及びヌクレアーゼフリー水を含む、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の乾燥試薬組成物。
【請求項８】
交換緩衝液をさらに含む、請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の乾燥試薬組成物。
【請求項９】
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をさらに含む、請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載の乾燥試薬組成物。
【請求項１０】
前記ポリメラーゼが、ＯｍｎｉＫｌｅｎ  Ｔａｑ（ＯＫＴ）である、請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載の乾燥試薬組成物。
【請求項１１】
α−シクロデキストリン、１以上のプライマー、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、ＢＳＡ、賦形剤混合物及び交換緩衝液を含む、請求項１乃至請求項１０のいずれか１項記載の乾燥試薬組成物。
【請求項１２】
核酸増幅用の乾燥試薬組成物を製造する方法であって、
ｉ）ポリメラーゼと封鎖剤及びｄＮＴＰとを混合して、それらの混合物を得る工程と、
ｉｉ）混合物を乾燥させて乾燥試薬組成物を形成する工程と
を含む、核酸増幅のための乾燥試薬組成物を生成するための方法。
【請求項１３】
工程ｉ）の混合物が、１以上のプライマーをさらに含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
工程ｉ）の混合物が、賦形剤混合物をさらに含む、請求項１２及び１３記載の方法。
【請求項１５】
工程ｉ）の混合物が、交換緩衝液をさらに含む、請求項１２乃至請求項１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
乾燥工程が、凍結乾燥によって達成される、請求項１２乃至請求項１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
乾燥工程の前に組成物を凍らせる工程をさらに含む、請求項１２乃至請求項１６のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
核酸増幅方法であって、
ｉ）核酸を含有する溶液を、請求項１乃至請求項１１のいずれか１項記載の乾燥試薬組成物とともにインキュベートする工程と、
ｉｉ）核酸を増幅する工程と
を含む方法。
【請求項１９】
増幅方法がポリメラーゼ連鎖反応である、請求項１８記載の核酸増幅法。
【請求項２０】
増幅方法が、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応又は等温増幅を含む、請求項１８記載の核酸増幅法。
【請求項２１】
工程ｉ）の前に、水を核酸に添加することによって溶液を形成する工程をさらに含む、請求項１８乃至請求項２０のいずれか１項記載の方法。
【請求項２２】
核酸が固相支持体に固定化されている、請求項１８乃至請求項２１のいずれか１項記載の方法。
【請求項２３】
固相支持体がセルロース系マトリックスである、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
固相支持体が予め打ち抜いたディスクの形態である、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
固相支持体が、ＦＴＡの予め打ち抜いたディスクの形態である、請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
溶解試薬が固体マトリックスに組み込まれている、請求項２２乃至請求項２５のいずれか１項記載の方法。
【請求項２７】
増幅が単一の反応器で実行される、請求項１８乃至請求項２６のいずれか１項記載の方法。
【請求項２８】
検出系を用いて増幅核酸を検出及び／又は定量化する方法であって、
ｉ）請求項１８乃至請求項２７のいずれか１項記載の方法を用いて核酸を増幅して増幅核酸を生成する工程と、
ｉｉ）増幅核酸を検出する工程と、
ｉｉｉ）所望により増幅核酸を定量化する工程と
を含む方法。
【請求項２９】
検出系が、ＰＣＲ画像形成系である、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
請求項１乃至請求項１１のいずれか１項記載の乾燥試薬、及びその取扱説明書を含む、核酸増幅用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸増幅の分野、特に核酸を増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応の使用に関する。本発明は、核酸試料の平易な増幅のために核酸増幅試薬を凍結乾燥するか又はフリーズドライすることによる、核酸を増幅するために使用することのできる方法及びキットを提供する。本発明は、核酸の平易な処理に用途を有し、遺伝子型判定、診断及び法医学において特に有用である。
【背景技術】
【０００２】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、核酸を増幅するために分子生物学で使用される一般的なツールである。米国特許第４６８３２０２号（Ｍｕｌｌｉｓ，Ｃｅｔｕｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）は、核酸又はその混合物に含まれる任意の所望の特定の核酸配列を増幅するための方法を記載する。
【０００３】
米国特許第５７０５３４５号（Ｌｕｎｄｉｎ他）は、核酸調製の方法を記載する。この方法では細胞を含有する試料が溶解されて核酸を放出し、試料がシクロデキストリンで処理されて抽出溶媒を中和する。この系の利点は、従来の洗剤除去が分離工程を必要とするということである；しかし洗剤を中和するためにシクロデキストリンを添加することにより、分離工程の必要がなくなり、従って汚染のリスクが低下する。
【０００４】
国際公開第９９３８９６２号（Ｈｅａｌｔｈ，Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）は、結合した溶解試薬を含む固相支持体を記載する。溶解試薬は、洗剤、キレート化剤、水及び所望によりＲＮＡ消化酵素を含むことができる。ＰＣＲ増幅のための方法は、増幅分析のために、核酸の精製のためのさらなる工程を必要とする。
【０００５】
国際公開第９１０２０４０号（Ｋｏｓａｋ）は、定性的及び定量的核酸配列分析のための、増幅反応混合物中の、シクロデキストリンで標識したプライマーを用いる発明を記載する。この発明の利益は、より高いシグナル効率及び標識色の多様性である。
【０００６】
国際公開第９５３２７３９号（Ａｇｒａｗａｌ）は、非共有結合によってシクロデキストリンと錯体を形成しているオリゴヌクレオチドを記載する。しかし、オリゴヌクレオチドによるシクロデキストリンの組み込みは、オリゴヌクレオチドの細胞取り込みのためであって、ＰＣＲ反応でのヌクレオチドの増幅のためのものではなかった。
【０００７】
国際公開第２０１００６６９０８号（Ｂｅｃｋｅｒｓ他）は、ＰＣＲの特異性、感受性及び／又は収量を改善するためのシクロデキストリンの使用を記載する。この方法は、少なくとも１つのシクロデキストリンを含み、反応混合物で増幅反応を実施する反応混合物中で実施される増幅反応を開示する。このＰＣＴ出願は、同じ容器内に少なくともシクロデキストリンと、ＰＣＲ試薬のリストからの少なくとも１つの成分を含む試料中の標的核酸の増幅のためのキットを開示する。この出願はまた、キットがいくつかの成分を含むプレミックスとして提供されてもよいことも開示し、それは脱水した凍結乾燥形態で提供されてもよい。しかし、該出願中に、そのような凍結乾燥された、プレミックスされたキットの例、又は実際にそのようなキットを調製することのできた方法の例はない。
【０００８】
ＤＮＡ増幅のための現在の方法は、いくつかの工程を含むことの多いＤＮＡ精製手順を伴い、それは汚染の機会を増加させる。これは単調で退屈なプロセスであり、先行技術の方法は、コスト、複雑さ、及び特に、ユーザータイムに関していくつかの明らかな欠点を有する。例えば、カラムに基づく核酸精製は、核酸を精製するための典型的な固相抽出方法である。この方法は、緩衝液のｐＨ及び塩含有量に応じた、シリカ又はその他の支持体への吸着による核酸結合に依存する。適した緩衝液の例としては、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ（ＴＥ）緩衝液又はリン酸緩衝液（反応性アミンによるＤＮＡマイクロアレイ実験で使用される）が挙げられる。そのようなスピンカラムでの核酸の精製には、多数の複雑で単調な工程が含まれる。スピンカラムでの核酸精製は、一般に３つの時間のかかる複雑な工程／段階を伴う：
核酸を含有する試料をカラムに添加すると、緩衝液、変性剤（塩酸グアニジンなど）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、イソプロパノール及びｐＨ指示薬を含有してよい結合溶液の（カラムのシラノール基に対して）低いｐＨ及び塩濃度によって、核酸が結合する；
カラムを５ｍＭ  ＫＰＯ4、ｐＨ８．０又は類似物、８０％ＥｔＯＨ）で洗浄する；及び
カラムを緩衝液又は水で溶離する。
【０００９】
代替方法は、ＤＮＡがシリカ又はガラス粒子又はガラスビーズと結合するように、カオトロピック剤の存在下での核酸の結合を含む。この性質を用いて、アルカリ条件下でガラス粉末又はシリカビーズを用いて核酸を精製した。典型的なカオトロピック剤には、グアニジンチオシアン酸塩又はグアニジン塩酸塩が挙げられ、最近はガラスビーズはミニカラムを含有するガラスで置き換えられている。
【００１０】
阻害剤の作用を含む、定量的リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応の落とし穴の一部がＢｕｓｔｉｎ＆Ｎｏｌａｎによって記載されている（Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２００４，１５，１５５−１６６）。
【００１１】
法医学用途におけるＰＣＲ増幅の失敗に対する最善の防御は、健全な試料の取扱い及びプロセシング技術と、ＤＮＡを効率的に精製することが示された抽出系とを組み合わせることである。
【００１２】
一般に、ＰＣＲ試薬はグリセロール溶液中に保存され、これは室温よりも低い温度で維持されなければならない。凍結乾燥又はフリーズドライは、別な方法では不安定な生体分子の長期安定性を可能にし、簡便な保存、輸送及び再構成の方法を提供するので、核酸分析の試薬の調製及びその他の生物学的過程で広く用いられるプロセスである。しかし、ＰＣＲ分析のための凍結乾燥もしくはフリーズドライ試薬を作製することに関する多数の技術的課題がある。乾燥生物学的試薬組成物を作製するための現在の技術は、ドライブレンド、噴霧乾燥、フリーズドライ、流動床乾燥、及び／又は極低温冷凍などの手順を伴う。これらの手順の全てに、一貫性及び信頼性を含む限界及び欠点がある。
【００１３】
ドライブレンド技術（Ｍｕｚｚｉｏ  ｅｔ  ａｌ  ２００２，Ｐｏｗｄｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２４，１−７）では、化学物質の均質なブレンドを得ることは、それらの異なる密度のために困難である場合が多い。さらに、非常に少量の構成成分を大量のその他の構成成分と混合する場合に、均質性を達成することは特に困難である。たとえ均質性が達成されたとしても、少量のブレンドされた生物学的化学物質を再現可能に分配することは困難である。
【００１４】
噴霧乾燥技術（米国特許第４７１２３１０号）は、試薬が最初に溶液に溶解されるので、より均質な化学物質のブレンドを提供する。しかし、噴霧乾燥によって、正確な量のブレンドされた化学物質を分配することは困難である。この欠点を克服するために、結果として得られる粒子は通常、錠剤などの均一な粒度を得るために、凝集によって再加工する。しかし、凝集して塊になった粒子は、一般に元の噴霧乾燥粒子もしくは粉末よりも可溶性が低い。また、これらの手順は時々フルオロカーボン低温溶液を使用するが、これは環境に対して有害であり得る。
【００１５】
流動床技術（Ｒｕｂｉｎａ，１９９９，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２３，１０４−１１３）は、液体試薬ブレンドを粒子に噴霧し、この液体を乾燥させて、ブレンドされた試薬でコーティングされた粒子を得ることに頼る。この手順を用いて、均一な大きさの粒子を得ること及び均一なコーティングを作製することは困難である。
【００１６】
生物学的製剤を安定化させるための別の方法がフリーズドライである。フリーズドライの１つの欠点は、処分することが困難であるフロン系冷媒の使用であり、フリーズドライプロセスは不正確である上に調節が困難である可能性がある。実際に、試薬の定期的なフリーズドライは、分子生物学プロセスで使用される特に不安定な試薬を溶液全体に提供できないことがある。さらに、フリーズドライプロセス中の生成物の分解は一般によくあることであり、フリーズドライ生成物は、保存中に完全に安定しているとは限らない。プロセス制御が重要であり、調節することが困難であり得る（Ｔａｎｇ＆Ｐａｋｉｌ，２００４，Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｆｒｅｅｚｅ−Ｄｒｙｉｎｇ  Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ：Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｄｖｉｃｅ；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２１，１９１−２００）。
【００１７】
生物学的製剤を安定化させる別の方法は、生物学的試薬組成物を空気乾燥することによる（Ｒａｔｔｉ，２００１，Ｈｏｔ  Ａｉｒ  ａｎｄ  Ｆｒｅｅｚｅ−Ｄｒｙｉｎｇ  ｏｆ  Ｈｉｇｈ  Ｖａｌｕｅ  Ｆｏｏｄｓ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ．Ｊ．Ｆｏｏｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ４９，３１１−３１９）。空気乾燥プロセスのいくつかの問題は、乾燥した生成物が直ちに分配可能な形態でないことである。また、生物学的試薬は、乾燥プロセスの温度以上で安定していなければならず、それは正確に制御することが困難なプロセスである。
【００１８】
フリーズドライ技術を用いる１つの専門化されたプロセスは、低温の液体と接触した後、フリーズドライされる液滴又は球体の形成である。この技術の１つの欠点は、試薬球体が脆弱で崩壊しやすいことである。
【００１９】
生物学的試薬を安定化させるためにこれまでに使用されてきた担体又は充填剤の１つの種類は、ガラス形成充填剤（米国特許第５５６５３１８号）である。生物学的試薬溶液は、ガラス形成充填剤（水溶性又は水膨潤性物質である）の中に組み込まれる。次に、それらを乾燥させて、生物学的試薬を固定し安定化させるガラス質の組成物を生成する（米国特許第５５９３８２４号）。
【００２０】
グルコース、スクロース、マルトース又はマルトトリオースなどの炭水化物は、ガラス形成物質の重要な群である。その他のポリヒドロキシ化合物、例えばソルビトールのような炭水化物誘導体及び化学修飾炭水化物などを使用することができる。ガラス形成物質の別の重要な群は、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、又はポリエチレンイミンなどの合成ポリマーである。
【００２１】
ガラス形成物質のさらなる例には、フィコール（商標）などの糖共重合体が含まれる（米国特許第３３００４７４号）。フィコールは、水溶液に直ちに溶解する、中性の高度に分枝した高質量の親水性多糖である。フィコールの半径は２〜７ｎｍに及ぶ。それは多糖とエピクロロヒドリンとの反応によって調製される。フィコールは５，０００〜１，０００，０００の間の分子量を有し、エーテル橋によって二官能基と結合されているスクロース残基を含有する。そのような基は、２個、３個又はそれ以上の炭素原子、しかし通常は１０個以下の炭素原子からなるアルキレンであってよい。二官能基は、糖残基を一緒に連結するのに役立つ。これらのポリマーは、例えば、糖とハロヒドリン又はビス−エポキシ化合物との反応によって作成されてよい。ガラスは、一般に非常に高い粘度をもつ過冷却液体として定義される。
【００２２】
上述の参考文献の１つの欠点は、通常安定化しガラス状に固化した生物材料が粉砕されて粉末となるか、配合されて錠剤となるか、又はマイクロタイタープレートのような容器中の薄いガラス質の膜の中で維持されることである。ガラス質の固定化された生物材料の組成物を作成及び使用するための多数の方法が試みられてきた。１つの系は、乾燥した、最終ユーザーに適した容器、例えば微量遠心管などの中に分配される、薄いガラス質の膜を利用する。しかし、このプロセスは限定的にしか成功しなかった。
【００２３】
そのため、ＰＣＲによる核酸増幅の前に試料からポリメラーゼ連鎖反応を実施するための改良され簡略化されたプロセスが必要とされている。さらに、グリセロール中及び低温で保存する必要なく、室温で保存、輸送及び再構成することのできるＰＣＲ試薬混合物が必要とされている。本発明は、これらの問題に取り組み、単一工程の核酸増幅に使用することのできる方法及びキットを提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２４】
【特許文献１】国際公開第２０１０／０６６９０８号
【発明の概要】
【００２５】
本発明は、全ての必要とされるＰＣＲ試薬を、核酸試料の簡単な増幅のための凍結乾燥形式に組み込むことによって、核酸を増幅するために使用することのできる方法及びキットを提供する。
【００２６】
本発明の第一の態様では、封鎖剤、ポリメラーゼ及びデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を含む、核酸増幅のための乾燥試薬組成物が提供される。金属イオン封鎖剤とポリメラーゼ及びｄＮＴＰを乾燥試薬組成物に組み込むことの利点は、核酸増幅に必要な工程の数を減少させ、従ってオペレータの時間を節約し、オペレータの使用を容易にすることである。
【００２７】
一態様では、核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びオリゴヌクレオチドからなる群から選択される。
【００２８】
用語「核酸」は、本明細書では用語「ヌクレオチド」と同じ意味で使用され、それには、ＤＮＡ、例えばプラスミドＤＮＡ及びゲノムＤＮＡなど；ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓＲＮＡ及びＲＮＡｉなど；並びにタンパク質核酸、ＰＮＡが含まれる。
【００２９】
別の態様では、封鎖剤はシクロデキストリンである。シクロデキストリンは、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン及びそれらの誘導体からなる群から選択することができる。シクロデキストリンは、６−Ｏ−α−Ｄ−マルトシル−βシクロデキストリン、ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン及び２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンからなる群からなり得る。金属イオン封鎖剤は、好ましくはα−シクロデキストリンである。封鎖剤はキレート化剤ではない。キレート化剤は、金属と化合してキレートを形成する化学物質であり、多くの場合重金属イオンを捕捉するために使用される（Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｅｎｇｌｉｓｈ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ，（Ｃ）ＨａｒｐｅｒＣｏｌｌｉｎｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  ２００３）。溶解試薬の一例は、ドデシル硫酸ナトリウムである；ナトリウムは金属イオンである、しかし、Ｒａｍａｍｕｒｔｈｙ  Ｐａｌｅｐｕ  ａｎｄ  Ｖｉｎｃｅｎｔ  Ｃ．Ｒｅｉｎｓｂｏｒｏｕｇｈによれば（Ｃａｎ  Ｊ．Ｃｈｅｍ  Ｖｏｌ  ６６，３２５−３２８，１９８８）、親水性頭部でないシクロデキストリンと相互作用するのは疎水性尾部である。
【００３０】
別の態様様では、乾燥試薬組成物は１以上のプライマーを含む。
【００３１】
別の態様様では、乾燥試薬組成物は賦形剤混合物をさらに含む。
【００３２】
用語「賦形剤混合物」は、本明細書では、調製品又は混合物を構成するために用いられる添加剤又は構成成分を示すために使用され、例えばＰＣＲ緩衝液、フィコール７０、フィコール４００、メレジトース、トレハロース、安定化タンパク質及びヌクレアーゼフリー水からなってよい。
【００３３】
用語「ＰＣＲ緩衝液」は、本明細書では、ＤＮＡポリメラーゼの活性に最適な条件を作り出すために必要な緩衝液を示すために使用され、例えばＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ2、ゼラチン及びヌクレアーゼフリー水からなってよい。
【００３４】
別の態様様では、乾燥試薬組成物は、交換緩衝液をさらに含む。
【００３５】
用語「交換緩衝液」は、本明細書では、それによって１つの緩衝液が除去され、別の代わりとなる緩衝液に置き換えられる、少量のイオン性溶質の除去に用いられる緩衝液を示すために使用され、例えばＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ＣａＣｌ2、洗剤、ＲＥ９６０、ＭｇＣｌ2、ＫＣｌ及びヌクレアーゼフリー水からなってよい。
【００３６】
別の態様様では、乾燥試薬組成物は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をさらに含む。
【００３７】
一態様では、ポリメラーゼは、ＯｍｎｉＫｌｅｎ  Ｔａｑ（ＯＫＴ）ポリメラーゼである。或いは、ポリメラーゼは、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｏｌ  Ｉ及びクレノウ断片、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、改質バクテリオファージ  Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ、Ｂｓｔポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｐｏｗポリメラーゼ、Ｖｅｎｔポリメラーゼ、Ｐａｂ  Ｐｏｌ  Ｉ  ＤＮＡポリメラーゼ、サーマス・サーモフィラス、カルボキシドサーマス・ハイドロゲノフォーマス（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ）、ＳＰ６及びＳＰ７  ＲＮＡポリメラーゼからなる群から選択することができる。
【００３８】
別の態様様では、好ましい実施形態は、α−シクロデキストリン、１以上のプライマー、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、ＢＳＡ、賦形剤混合物及び交換緩衝液を含む乾燥試薬組成物である。
【００３９】
本発明の第２の態様では、
ｉ）ポリメラーゼと封鎖剤及びｄＮＴＰとを混合して、それらの混合物を得る工程、及び
ｉｉ）混合物を乾燥させて乾燥試薬組成物を形成する工程
を含む核酸増幅用の乾燥試薬組成物を製造する方法が提供される。
【００４０】
一態様では、混合物は、１以上のプライマーをさらに含む。
【００４１】
別の態様では、混合物は、賦形剤混合物をさらに含む。
【００４２】
別の態様様では、混合物は、交換緩衝液をさらに含む。
【００４３】
一態様では、乾燥工程は、混合物を凍結乾燥することによって達成される。
【００４４】
別の態様では、乾燥工程の前に組成物を凍結させる工程をさらに含む。
【００４５】
本発明の第３の態様では、
ｉ）核酸を含有する溶液を上記の乾燥試薬組成物とともにインキュベートする工程及び、
ｉｉ）核酸を増幅させる工程
を含む、核酸増幅方法が提供される。
【００４６】
一態様では、増幅方法は、ポリメラーゼ連鎖反応である。
【００４７】
別の態様では、増幅方法は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応又は等温増幅を含む。
【００４８】
別の態様様では、工程ｉ）の前に、水を核酸に添加することによって溶液が形成される。
【００４９】
一態様では、核酸は固相支持体に固定されている。
【００５０】
別の態様では、固相支持体は、セルロース系マトリックスである。
【００５１】
別の態様様では、固体マトリックスは、ガラス、ガラス繊維、マイクロガラス繊維、シリカ、シリカゲル、酸化シリカ、セルロース、ニトロセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリエステル、ポリアミド、炭水化物ポリマー、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリフッ化ビニリデン、羊毛及び多孔質セラミックからなる群から選択される。固体マトリックスは、ガラスもしくはシリカに基づく固相媒体、プラスチックに基づく固相媒体又はセルロースに基づく固相媒体を含んでよい。固相支持体は、好ましくは、セルロース系マトリックスである。セルロース系マトリックスの例としては、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社から入手可能なＦＴＡ（商標）（データファイル５１６６８）、９０３新生児カード及び３１−ＥＴＦカードが挙げられる。
【００５２】
一態様では、固相支持体は、予め打ち抜いたディスクの形態である。
【００５３】
別の態様では、固相支持体は、ＦＴＡの予め打ち抜いたディスクの形態である。
【００５４】
別の態様様では、溶解試薬は、固体マトリックスに組み込まれている。
【００５５】
一態様では、溶解試薬は、陰イオン性界面活性剤又は洗剤を含む。ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）は、生物細胞を溶解させるために頻繁に使用される陰イオン性界面活性剤の一例である。
【００５６】
別の態様では、増幅は、単一の反応器、例えば試験管又はマルチウェルプレートのウェルで実行される。
【００５７】
本発明の方法は、単一の反応ウェルか又は高スループット９６ウェル形式のいずれかにおいて、Ｂａｒｏｎらによって記載される自動試料処理と組み合わせて使用することができる（２０１１，Ｆｏｒｅｎｓｉｃｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ：Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  Ｓｅｒｉｅｓ，９３，ｅ５６０−ｅ５６１）。このアプローチは、最小数の工程を含み、試料処理量を増加させるであろう。この手順に必要な操作は、現在使用されているプロトコールと比べて少なく、労働集約型のキット（例えば、ＱＩＡｍｐ  ＤＮＡブラッドミニキット、Ｑｉａｇｅｎ）よりも多いので、オペレータによって誘発される誤り、例えば相互汚染なども減少する。この手順は操作をほとんど必要としないので試料の取り違えの危険性も減少する。重要なことには、この方法は、高スループットスクリーニング用のマルチウェル形式に直ちに移すことができる。従って、本発明は、遺伝子照合を助けるためにＰＣＲ反応を実行するための試料処理を改良することができる。本発明は、試料の取扱いを容易にするために９６ウェル／ハイスループット形式で実行することができ、従って試料のバッチ処理を排除することができる。
【００５８】
ポリメラーゼ連鎖反応試薬の乾燥もしくは凍結乾燥製剤の利点は、それらが水の添加によって平易に可溶化されることができ、従ってオペレータの時間を節約し、オペレータの使用を容易にするという点である。オペレータの間違いを最小限にするために、乾燥試薬混合物は、反応器、例えばマルチウェルプレートのウェルなどの中に予め分配することができる。予め配合され、予め分配された、周囲温度で安定なビーズ又はケークは、増幅反応を単一のウェル又は反応器内で実行することを可能にし、反応間でのより大きな再現性を確実にし、ピペット操作の工程を最小限にし、ピペット操作による誤り及び汚染の可能性を低減する。
【００５９】
本発明の第４の態様では、
ｉ）本明細書上文に記載される方法を用いて核酸を増幅して、増幅核酸を作製する工程、
ｉｉ）増幅核酸を検出する工程、及び
ｉｉｉ）所望により増幅核酸を定量化する工程
を含む検出系を用いる、増幅核酸の検出及び／又は定量化方法が提供される。
【００６０】
一態様では、検出系は、ＰＣＲ画像形成系である。
【００６１】
別の態様では、検出系は、蛍光又は発光に基づく系である。
【００６２】
核酸は、ウイルス、原核生物又は真核生物が起源であってよいことは当然理解される。
【００６３】
一態様では、核酸試料は細胞試料中に存在する。細胞試料は、哺乳動物、鳥、魚もしくは植物又はそれらの細胞培養に由来してよい。好ましくは、細胞試料は哺乳類起源、最も好ましくはヒト起源である。核酸を含有する試料は、どんな供給源に由来してもよい。これには、例えば、ヒト及び動物の生理学的／病理学的体液（例えば、分泌物、排泄物、浸出液）又は細胞懸濁液；植物の生理学的／病理学的液体又は細胞懸濁液；細菌、真菌、プラスミド、ウイルス、プリオンなどの液体生成物、抽出物又は懸濁液；ヒト又は動物の体組織（例えば、骨、肝臓、腎臓など）の液体抽出物又はホモジネート；ＤＮＡ又はＲＮＡ合成の媒体、化学的に又は生化学的に合成したＤＮＡ又はＲＮＡの混合物；並びに、ＤＮＡ又はＲＮＡが液体媒体中に存在するか又は存在することのできる任意のその他の供給源が含まれる。
【００６４】
別の態様様では、本方法は、分子診断ツール、人物同定ツール、法医学ツール、ＳＴＲプロファイリングツール及びＤＮＡプロファイリングからなる群から選択されるツールとして使用するためのものである。
【００６５】
本発明の第５の態様では、本明細書上文に記載される乾燥試薬組成物及びその取扱説明書を含む、核酸を増幅するためのキットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】α−シクロデキストリンを含む又は含まない、核酸増幅試薬ケークとともに未洗浄血液をスポットしたＦＴＡ紙のＰＣＲ増幅の結果を示す図である。
【図２】α−シクロデキストリンを含む、核酸増幅試薬ケークとともに未洗浄血液をスポットしたＦＴＡ紙のＰＣＲ増幅の結果を示す図である。
【図３】核酸増幅製剤をフリーズドライするための最良の濃度を示す、核酸増幅試薬ケーク中の、滴定したＯｍｎｉＫｌｅｎ  Ｔａｑ（ＯＫＴ）ポリメラーゼのＰＣＲ増幅の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００６７】
使用した化学物質及び材料
化学物質及びそれらの供給源の一覧を下に記載する：
核酸を保存するためのＦＴＡ紙は、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＵＫ  Ｌｉｍｉｔｅｄより得た；
正常なヒト血液（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ｌｔｄ）；
ゲノムＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｃｏｄｅ  Ｇ１５２Ａ）；
１ｋｂ  ＤＮＡラダー（Ｐｒｏｍｅｇａ  製品コードＧ５７１Ａ）；
Ｈａｒｒｉｓ  Ｕｎｉ−ｃｏｒｅパンチ、１．２ｍｍ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｚ７０８８６０−２５ｅａ、ロット３１１０）；
ＯｍｎｉＫｌｅｎｔａｑ  ポリメラーゼ（Ｍｏ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ、カタログコード１２２５−２５０）；
デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ）；
ＰＣＲ等級ウシ血清アルブミン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ）；
順方向及び逆方向β−グロビンプライマー（Ｓｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓ）（β−グロビン１．３  順方向  ５’−ＴＴＡＧＧＣＣＴＴＡＧＣＧＧＧＣＴＴＡＧＡＣ−３’（配列番号１）及びβ−グロビン  １．３  逆方向  ５’−ＣＣＡＧＧＡＴＴＴＴＴＧＡＴＧＧＧＡＣＡＣＧ−３’（配列番号２））；
α−シクロデキストリン（Ｆｌｕｋａ  コード２８７０５）及び
滅菌水（Ｓｉｇｍａ  製品コードＷ４５０２）。
【００６８】
賦形剤混合物：
フィコール７０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）；
フィコール４００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及び
メレジトース（Ｓｉｇｍａ）
サイクル配列ミックス  １０Ｘ：
Ｔｒｉｚｍａ（Ｓｉｇｍａ）；
ＫＣｌ（Ｓｉｇｍａ）；
ＭｇＣｌ（Ｓｉｇｍａ）及び
ヌクレアーゼフリー水（Ｓｉｇｍａ）
交換緩衝液：
Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ８．５（Ｓｉｇｍａ）；
１Ｍ  ＣａＣｌ2（Ｓｉｇｍａ）；
１．０Ｍ  ＭｇＣｌ2（Ｓｉｇｍａ）；
２．０Ｍ  ＫＣｌ（Ｓｉｇｍａ）及び
ＲＨＯＤＡＦＡＣ  ＲＥ−９６０（７％  ＲＥ９６０）（Ｋａｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）
実験結果
ｑＰＣＲを用いる、セルロースマトリックスからの乾燥した血液スポットからのＤＮＡ測定
ＰＣＲ試薬をシクロデキストリンと合し、表１中の以下の条件下で凍結乾燥した。
【００６９】
【表１】
2018183156.tif 000003
試料を９６ウェルプレート中の凍結乾燥核酸増幅組成物と合した。
【００７０】
ＰＣＲ反応は以下の通り設定した：
血液をスポットしたＦＴＡを、シクロデキストリンを含有するか又は含有しない核酸増幅試薬ケークとともにウェルに添加した。標準物質及び試料を適切なウェルに添加した。プレートを１０００ｒｐｍで１分間遠心し、密封した。ＰＣＲは、ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＰＴＣ−２００サーモサイクラーで製造業者の取扱説明書に従って実行した。
【００７１】
熱サイクル条件は：９５℃５分間、９５℃３０秒間、５５／６５℃１分間、７２℃２分間とそれに続く３５サイクルの：９５℃３０秒間、５５／６５℃１分間、７２℃２分とそれに続く７２℃１０分間であった。
【００７２】
増幅に続いて、アガロースゲル電気泳動（１ｘＴＥＡ緩衝液、１％アガロースゲル）を用いてＰＣＲ産物の可視化を達成した。
【００７３】
９６ウェルＰＣＲプレートの標準ウェルに、５μｌの１Ｋｂ  ＤＮＡラダーを１μｌの６ｘ添加液とともに添加した。
【００７４】
結果を図１、２及び３に示す。
【００７５】
図１は、α−シクロデキストリンを含む又は含まない、凍結乾燥した核酸増幅組成物と未洗浄血液をスポットしたＦＴＡ：レーンＭ：１ｋｂラダー；レーン１〜４：シクロデキストリンを含まない凍結乾燥した核酸増幅組成物と全血をスポットしたＦＴＡパンチ（１．２ｍｍ）；レーン５〜８：シクロデキストリンを含有する凍結乾燥した核酸増幅組成物と全血をスポットしたＦＴＡパンチ（１．２ｍｍ）のＰＣＲ増幅を示す。
【００７６】
図２は、α−シクロデキストリンを含む又は含まない、凍結乾燥した核酸増幅組成物と未洗浄血液をスポットしたＦＴＡ：レーンＭ：１ｋｂラダー；レーン１〜２：シクロデキストリンを含有する凍結乾燥した核酸増幅組成物と全血をスポットしたＦＴＡパンチ（１．２ｍｍ）；レーン３〜４：シクロデキストリンを含有する凍結乾燥した核酸増幅組成物とＦＴＡパンチ（１．２ｍｍ）；レーン５〜６：シクロデキストリンを含まない凍結乾燥した核酸増幅組成物と全血をスポットしたＦＴＡパンチ（１．２ｍｍ）のＰＣＲ増幅を示す。
【００７７】
図３は、α−シクロデキストリンを含まない、様々な濃度のＯＫＴ  Ｔａｑポリメラーゼを含む凍結乾燥した核酸増幅組成物と未洗浄血液をスポットしたＦＴＡのＰＣＲ増幅を示す：レーン１〜８は、６Ｕ  ＯＫＴを含み、レーン１〜３は全血をスポットしたＦＴＡパンチを含み、レーン４〜６はゲノムＤＮＡを含み、レーン７〜８はＤＮＡ鋳型を含まない；レーン９〜１６は８Ｕ  ＯＫＴを含み、レーン９〜１１は全血をスポットしたＦＴＡパンチを含み、レーン１２〜１４はゲノムＤＮＡを含み、レーン１５〜１６はＤＮＡ鋳型を含まない；レーン１７〜２４は１０Ｕ  ＯＫＴを含み、レーン１７〜１９は全血をスポットしたＦＴＡパンチを含み、レーン２０〜２２はゲノムＤＮＡを含み、レーン２３〜２４はＤＮＡ鋳型を含まない；レーン２５〜３２は１２Ｕ  ＯＫＴを含み、レーン２５〜２７は全血をスポットしたＦＴＡパンチを含み、レーン２８〜３０はゲノムＤＮＡを含み、レーン３１〜３２はＤＮＡ鋳型を含まない。
【００７８】
【表２】
2018183156.tif 000004
【００７９】
【表３】
2018183156.tif 000005
【００８０】
【表４】
2018183156.tif 000006
【００８１】
【表５】
2018183156.tif 000007
【００８２】
【表６】
2018183156.tif 000008
【００８３】
【表７】
2018183156.tif 000009
【００８４】
【表８】
2018183156.tif 000010
【００８５】
【表９】
2018183156.tif 000011
本発明の好ましい例となる実施形態が記載されるが、本発明が、説明のためだけに示されるものであって限定として示されるものでない、記載される実施形態以外によって実践することができることを当業者は理解するであろう。本発明は以下の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図１】
2018183156.tif 000012
【図２】
2018183156.tif 000013
【図３】
2018183156.tif 000014
【手続補正書】
【提出日】平成30年7月12日(2018.7.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸増幅方法であって、
ｉ）封鎖剤、ポリメラーゼ及びデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を含む試薬組成物を、真空状態で凍結乾燥する工程と、
ｉｉ）核酸を含有する溶液を、前記凍結乾燥された試薬組成物とともにインキュベートする工程と、
ｉｉｉ）核酸を増幅する工程と
を含んでおり、核酸が固相支持体に固定化され、溶解試薬が固体支持体に組み込まれている、方法。
【請求項２】
前記封鎖剤が、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、６−Ｏ−α−Ｄ−マルトシル−βシクロデキストリン、ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン及び２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン並びにそれらの誘導体からなる群から選択されるシクロデキストリンである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
増幅方法がポリメラーゼ連鎖反応であるか、或いは逆転写ポリメラーゼ連鎖反応又は等温増幅を含む、請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項４】
固相支持体がセルロース系マトリックスである、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
固相支持体が予め打ち抜いたディスクの形態又はＦＴＡの予め打ち抜いたディスクの形態である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
増幅が単一の反応器で実行される、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
工程ｉｉ）の前に、水を核酸に添加することによって溶液を形成する工程をさらに含む、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
検出系を用いて増幅核酸を検出及び／又は定量化する方法であって、
ｉ）請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の方法を用いて核酸を増幅して増幅核酸を生成する工程と、
ｉｉ）増幅核酸を検出する工程と
を含む方法。
【請求項９】
ｉｉｉ）増幅核酸を定量化する工程をさらに含む、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
検出系がＰＣＲ画像形成系である、請求項８又は請求項９記載の方法。
【外国語明細書】
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