(57)【要約】      （修正有）【課題】生物学的に活性なリコンビナント卵胞刺激ホルモンを使用して、非ヒト哺乳動物において繁殖成績を向上させるための方法及び組成物の提供。【解決手段】非ヒト哺乳動物において繁殖成績を向上させるための、リコンビナントＦＳＨ（ｒＦＳＨ）類似体又はｒＦＳＨ類似体を含む組成物の使用であって、前記ｒＦＳＨ類似体を卵胞同期化後に単回投与で前記非ヒト哺乳動物に投与する、使用。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ヒト哺乳動物において繁殖成績を向上させるための、リコンビナントＦＳＨ（ｒＦＳＨ）類似体又はｒＦＳＨ類似体を含む組成物の使用であって、前記ｒＦＳＨ類似体を卵胞同期化後に単回投与で前記非ヒト哺乳動物に投与する、使用。
【請求項２】
約０．０１μg〜約５mgに含まれる用量範囲で、ｒＦＳＨを単回投与で投与する、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
約１μg〜２mg、好ましくは約１０μg〜１mgに含まれる用量範囲で、ｒＦＳＨを単回投与で投与する、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
５０μg又は１００μgの用量で、ｒＦＳＨを単回投与で投与する、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
全身投与によって、好ましくは筋肉内投与によって、より好ましくは注射によって、前記ｒＦＳＨを投与する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
前記ｒＦＳＨ類似体が、非ヒト哺乳動物ＦＳＨアルファ鎖の配列を有するアルファサブユニットと、該アルファ鎖と同じ種の非ヒト哺乳動物ＦＳＨベータ鎖の配列を有するベータサブユニットとを含み、前記アルファサブユニット及びベータサブユニットがペプチドリンカーによって共有結合されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
ｒＦＳＨ類似体が、有蹄動物リコンビナントＦＳＨ類似体、好ましくは、ペプチドリンカーによって共有結合されたウシアルファサブユニット及びウシベータサブユニットを含むウシリコンビナントＦＳＨ類似体である、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
アルファサブユニットが、配列番号１と少なくとも９５％相同の配列を含むポリペプチドであり、ベータサブユニットが、配列番号２と少なくとも９５％相同の配列を含むポリペプチドである、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
ペプチドリンカーが、ヒト絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）である、請求項６〜８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
ペプチドリンカーが、配列Ｇ４Ｓを含む、請求項６〜８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
ｒＦＳＨが、配列番号３と少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２】
排卵時近くに、好ましくはｒＦＳＨ投与の２〜７日後、より好ましくは４〜６日後に、前記非ヒト哺乳動物を授精させることをさらに含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１３】
好ましくは排卵時近くに、より好ましくはｒＦＳＨ類似体投与の２〜７日後、さらにより好ましくは４〜６日後に、前記非ヒト哺乳動物から卵母細胞を採取することをさらに含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１４】
前記ｒＦＳＨを少なくとも１つのプロスタグランジンと組み合わせて注射する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１５】
前記ｒＦＳＨをプロゲスターゲンに基づく処理と組み合わせて注射する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１６】
（ａ）卵胞同期化処理された非ヒト哺乳動物、例えば有蹄動物、又は非ヒト哺乳動物群、例えば有蹄動物群を提供すること；
（ｂ）約０．０１μg〜約５mgに含まれる用量範囲で、好ましくは注射によって、より好ましくは筋肉内注射によって、単回用量のｒＦＳＨ類似体を前記非ヒト哺乳動物又は非ヒト哺乳動物群に投与すること；及び
（ｃ）場合により、好ましくは排卵時近くに、より好ましくは投与工程（ｂ）の２〜７日後、さらにより好ましくは４〜６日後に、好ましくは人工授精によって該非ヒト哺乳動物若しくは非ヒト哺乳動物群を授精させること、又は該非ヒト哺乳動物若しくは非ヒト哺乳動物群から卵母細胞を採取すること
を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１７】
（ａ）非ヒト哺乳動物、例えば有蹄動物、又は非ヒト哺乳動物群、例えば有蹄動物群を処理し、卵胞同期化すること；
（ｂ）約０．０１μg〜約５mgに含まれる用量範囲で、好ましくは注射によって、より好ましくは筋肉内注射によって、単回用量のｒＦＳＨ類似体を前記非ヒト哺乳動物又は非ヒト哺乳動物群に投与すること；及び
（ｃ）場合により、好ましくは排卵時近くに、より好ましくは投与工程（ｂ）の２〜７日後、さらにより好ましくは４〜６日後に、好ましくは人工授精によって該非ヒト哺乳動物若しくは非ヒト哺乳動物群を授精させること、又は該非ヒト哺乳動物若しくは非ヒト哺乳動物群から卵母細胞を採取すること
を含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１８】
卵胞同期化が、好ましくは、プロスタグランジン、プロゲスターゲン及び／又はＧｎＲＨによる非ヒト哺乳動物のホルモン処理によって得られる、請求項１６〜１７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１９】
卵胞同期化が、プロゲスターゲン及びプロスタグランジンＰＧＦ２アルファの組み合わせの投与によって得られる、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
卵胞同期化が、卵胞アブレーションによって得られる、請求項１６〜１７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２１】
前記類似体が、１つ又は複数の賦形剤又は担体と共に組成物中に製剤化されている、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２２】
非ヒト哺乳動物が、好ましくは、ウシ、ヒツジ又はウマから選択される、有蹄動物であり、より好ましくはウシである、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２３】
ウシ又はウシの群において繁殖成績を向上させるための方法であって、
（ａ）卵胞同期化を誘導するのに有効な量で、プロスタグランジン、プロゲスターゲン及び／又はＧｎＲＨを該ウシ又は該ウシ群の少なくとも２つのメンバーに投与すること、及び
（ｂ）リコンビナントＦＳＨ類似体１０μg〜１mgを単回投与で該卵胞同期化ウシに投与すること
を含む、方法。
【請求項２４】
非ヒト哺乳動物において過剰排卵を誘導することによって繁殖成績を向上させる、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２５】
非ヒト哺乳動物において妊娠を向上させることによって繁殖成績を向上させる、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２６】
前記非ヒト哺乳動物において排卵率を向上させることによって繁殖成績を向上させる、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２７】
非ヒト哺乳動物において繁殖成績を向上させるための方法であって、リコンビナントＦＳＨ（ｒＦＳＨ）類似体又はｒＦＳＨ類似体を含む組成物を前記非ヒト哺乳動物に投与することを含み、前記ｒＦＳＨ類似体を卵胞同期化後に単回投与で前記非ヒト哺乳動物に投与する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的に活性なリコンビナント卵胞刺激ホルモン（ｒＦＳＨ）を使用して、非ヒト哺乳動物において繁殖成績を向上させるための方法及び組成物に関する。本発明はまた、ｒＦＳＨを使用して、非ヒト哺乳動物において排卵、胚生産又は妊娠を向上させるための方法に関する。本発明は、特にウシ又はウマなどの有蹄動物で、人工授精又は体外受精プログラムに使用され得る。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ウシ、ウマ又は他の有蹄動物などの非ヒト哺乳動物において繁殖成績を向上させる能力は、所有者にとって大きな利益になり得る。これは、このような非ヒト哺乳動物において受精能及び／又は受胎能を向上させることによって達成され得る。現在、エストラジオール及び他のホルモン、例えばＧｎＲＨ（ゴナドトロピン放出ホルモン）、ＬＨ（黄体形成ホルモン）、ＦＳＨ（卵胞刺激ホルモン）又はプロゲスターゲン（例えば、プロゲステロン）を使用して、ターゲット種に存在するホルモンの自然レベル又はほぼ自然レベルを模倣することに基づいて、繁殖成績を向上させるいくつかの方法又はプロトコールが提案されている。これらのプロトコールのいくつかは、発情期検出の必要がなく定時の人工授精を可能にする同期化方法で、雌における排卵を同期化して、卵胞の刺激、成長及び排卵を促進する工程を含む。これらのいわゆる同期化プロトコールは、世界中の商業乳牛群で広く使用されている。
【０００３】
卵胞波の出現を同期化するのに使用される最も一般的な処理の１つは、異なる種類のエストロゲンの使用を含む。しかしながら、世界の多くの地域では、このステロイドホルモンは使用不可能であり、エストラジオールが利用不可能な国々では、例えば、胚ドナーウシの過剰排卵過程の改善を目的として、卵胞期及び黄体期をコントロールする代替方法が開発されている。有望な選択肢と思われるアプローチは、ＧｎＲＨ誘発排卵後の新たな卵胞波の出現時に、ＦＳＨ処理を開始することである。加えて、現在入手可能なＦＳＨ製品の半減期は、一般的に短いので（約６時間）、過剰排卵プロトコールは、４〜５日間にわたって１日２回のＦＳＨ処理を含むが、これはかなり時間がかかり、ストレスが多く、誤りが生じやすい。さらに、現在開発されている過剰排卵スキームにおけるこれらの頻繁な管理は、例えば、牧草地で飼われている肉牛にそれを適用することをほとんど不可能にする。したがって、標準的な過剰排卵アプローチは、卵胞波の出現時（これは、通常、自然に生じる発情期の８〜１２日後に起こる）に、ＦＳＨを複数回注射することに基づいている。この方法は「発情期ベース」として公知であり、胚生産の点で効率的であるが、発情周期の段階によって調整され、発情期検出を必要とする。その後の研究により、「発情期ベース」のプログラムでは、授精から排卵までのより理想的な間隔を可能にする最新の同期化プロトコールと比較して、受精率が有意に低いことが見出された。
【０００４】
ＦＳＨ刺激プロトコールの長期化が排卵応答を増大させ得るかを決定するために、研究が行われている。著者らは、ＦＳＨ注射期間を４日間連続から７日間連続に延長することにより、卵胞の成長が持続され、より多くの卵胞が排卵能力を獲得し得ると結論しているようである。この仮説を異なる牛種で確認するために、より多くの研究が進行中である。
【０００５】
報告されている別のプロトコールでは、４日間ではなく３日間にわたってウシをＦＳＨで処理し、４日目の最後２回の注射を２回のｅＣＧ（ウマ絨毛性ゴナドトロピン）注射に替えた（Barros et al., 2008）。この処理は胚の数を増加させるようだが、処理時間は依然として長い。加えて、ｅＣＧはかなり長い分子であり、繰り返し使用すると抗体形成を誘導して、おそらくはこの種のプロトコールの広範／頻繁な使用を制限すると記載されている。
【０００６】
ＦＳＨ注射の回数を減少させるために、ＦＳＨを徐放性ポリマー（ヒアルロナン）に埋め込む代替プロトコールが開発されている。この徐放製剤を使用して、「発情期ベース」の過剰排卵スケジュール後に単回注射が行われた。しかしながら、著者らは、ヒアルロナンは過度に粘性であり、単回筋肉内注射はより低い過剰排卵応答をもたらしたと結論している（Bo et al., 2010）。
【０００７】
欧州特許出願公開第２１３４１６５号では、単鎖ＦＳＨを使用して生殖を向上させるための代替方法（ペプチドリンカーによって両サブユニットを共有結合し、発情期の７〜１３日後にこれを単回投与で投与する）が提案されている。この方法によれば、基準発情（estrus）（又は発情（heat））日（最後の発情日）を特定することによってＦＳＨ注射用に動物を準備し、次いで、その動物の周期の７〜８日目にＦＳＨを単回注射で投与する。結果は十分なように見えるが、最も有効な処理計画を決定するためには、動物の個々の観察及びモニタリングが必要とされる。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、生物学的に活性なリコンビナント卵胞刺激ホルモン（ｒＦＳＨ）を使用して、非ヒト哺乳動物において繁殖成績を向上させるための方法及び組成物に関する。本発明はまた、非ヒト哺乳動物において生殖、特に受精能及び受胎能を向上させるための改善された方法を提供する。
【０００９】
より具体的には、本発明は、投与回数及び投与量を最小限にすることによって、非ヒト哺乳動物において改善された繁殖成績を提供する改善されたｒＦＳＨ系組成物及び処理方法を提供する。
【００１０】
本発明の特定の目的は、卵胞同期化プロトコール及び／又は処理を受けている非ヒト哺乳動物において繁殖成績を向上させるのに使用するための、リコンビナントｒＦＳＨ類似体又はｒＦＳＨ類似体を含む組成物に関する。より好ましくは、ｒＦＳＨ類似体を、好ましくは、約０．０１μg〜約５mgに含まれる用量範囲で単回投与で投与する。
【００１１】
本発明の特定の目的は、卵胞同期化プロトコール及び／又は処理を受けている非ヒト哺乳動物において繁殖成績を向上させるための、リコンビナントｒＦＳＨ類似体又はｒＦＳＨ類似体を含む組成物の使用に関する。より好ましくは、ｒＦＳＨ類似体を、好ましくは、約０．０１μg〜約５mgに含まれる用量範囲で単回投与で投与する。
【００１２】
本発明の別の目的は、１又は複数の非ヒト哺乳動物において繁殖成績を向上させるのに使用するための、ｒＦＳＨ類似体（又はｒＦＳＨ類似体を含む組成物）であって、好ましくは、１０μg〜１mgに含まれる用量範囲で、卵胞同期化後に単回投与で前記１又は複数の非ヒト哺乳動物のそれぞれに投与されるｒＦＳＨ類似体にある。
【００１３】
本発明の別の目的は、１又は複数の非ヒト哺乳動物において繁殖成績を向上させるための方法であって、好ましくは、１０μg〜１mgに含まれる用量範囲で、ｒＦＳＨ類似体を卵胞同期化後に単回投与で前記１又は複数の非ヒト哺乳動物のそれぞれに投与することを含む方法にある。
【００１４】
本発明のさらなる目的は、１又は複数の非ヒト哺乳動物において過剰排卵を誘導するための方法であって、ｒＦＳＨ類似体を前記１又は複数の非ヒト哺乳動物のそれぞれに投与することを含み、好ましくは、１０μg〜１mgに含まれる用量範囲で、前記ｒＦＳＨ類似体を卵胞同期化プロトコール及び／又は処理後に単回投与で前記非ヒト哺乳動物に投与する方法である。
【００１５】
本発明の別の目的は、１又は複数の非ヒト哺乳動物において排卵率を向上させるための方法であって、ｒＦＳＨ類似体を前記１又は複数の非ヒト哺乳動物のそれぞれに投与することを含み、好ましくは、１０μg〜１mgに含まれる用量範囲で、前記ｒＦＳＨ類似体を単回投与で前記非ヒト哺乳動物に投与する方法である。好ましくは、卵胞同期化後に投与を実施する。
【００１６】
本発明の別の目的は、１又は複数の非ヒト哺乳動物において卵母細胞を生産又は回収するための改善された方法であって、ｒＦＳＨ類似体を前記１又は複数の非ヒト哺乳動物のそれぞれに投与することを含み、好ましくは、１０μg〜１mgに含まれる用量範囲で、前記ｒＦＳＨ類似体を単回投与で前記非ヒト哺乳動物に投与する方法である。
【００１７】
好ましくは、卵胞同期化後に投与を実施する。このような方法は、体外受精（ＩＶＦ）プロトコール又は手順の性能を改善するのに特に有利である。
【００１８】
この点では、本発明のさらなる目的は、体外受精（ＩＶＦ）方法であって、非ヒト哺乳動物ドナーから卵母細胞を得る工程、及び前記卵母細胞を体外受精させる工程を含み、好ましくは、１０μg〜１mgに含まれる用量範囲で、ｒＦＳＨ類似体を単回投与することによって該非ヒト哺乳動物ドナーを処理して、卵母細胞生産を向上させる体外受精（ＩＶＦ）方法に関する。好ましくは、非ヒト哺乳動物ドナーの卵胞同期化後に、投与を実施する。
【００１９】
本発明の別の目的は、非ヒト哺乳動物において黄体の質及び量を改善するための方法であって、ｒＦＳＨ類似体を前記非ヒト哺乳動物に投与することを含み、好ましくは、１０μg〜１mgに含まれる用量範囲で、前記ｒＦＳＨ類似体を単回投与で前記非ヒト哺乳動物に投与する方法である。
【００２０】
特定の実施態様では、本発明は、
（ａ）卵胞同期化処理された非ヒト哺乳動物（例えば、有蹄動物）若しくは非ヒト哺乳動物（例えば、有蹄動物）群を提供すること；又は、非ヒト哺乳動物（例えば、有蹄動物）若しくは非ヒト哺乳動物（例えば、有蹄動物）群を卵胞同期化処理すること；
（ｂ）約０．０１μg〜約５mgに含まれる用量範囲で、好ましくは注射によって、より好ましくは筋肉内注射によって、単回用量のｒＦＳＨ類似体を前記非ヒト哺乳動物又は哺乳動物群に投与すること；及び
（ｃ）好ましくは排卵時近くに、より好ましくは投与工程（ｂ）の２〜７日後、さらにより好ましくは４〜６日後に、好ましくは人工授精によって該非ヒト哺乳動物若しくは非ヒト哺乳動物群を授精させること
を含む方法に関する。
【００２１】
この方法は、発情期を検出又はモニタリングする必要がなく、特に非ヒト哺乳動物群により有効である。
【００２２】
別の特定の実施態様では、本発明は、
（ａ）卵胞同期化処理された有蹄動物若しくは有蹄動物群を提供すること；又は、有蹄動物若しくは有蹄動物群を卵胞同期化処理すること；
（ｂ）約１０μg〜約１mgに含まれる用量範囲で、好ましくは注射によって、より好ましくは筋肉内注射によって、単回用量のｒＦＳＨ類似体を前記有蹄動物又は有蹄動物群に投与すること；
（ｃ）好ましくは、卵胞吸引によって、該有蹄動物から卵母細胞を回収すること；
（ｄ）場合により、該回収した卵母細胞を体外受精させること；及び
（ｅ）場合により、レシピエント動物、好ましくは、約１０μg〜約１mgに含まれる用量範囲で単回用量のｒＦＳＨ類似体を投与することによって予め処理されたレシピエント動物に、該受精させた卵母細胞を移植すること
を含む方法に関する。
【００２３】
本発明に使用のためのｒＦＳＨ類似体は、好ましくは、単鎖ｒＦＳＨである。さらに、ｒＦＳＨ類似体は、好ましくは、本質的に純粋な形態で使用され、場合により、１つ又は複数の薬学的に許容し得る賦形剤又は担体と併せて使用される。
【００２４】
本発明は、哺乳動物、好ましくは任意の有蹄動物、例えばウシ、ヒツジ、ウマ、ヒツジ又はヤギで使用され得る。本発明の組成物及び方法は、ウシにおいて受精能及び／又は受胎能、特に過剰排卵、排卵率、卵母細胞生産又は黄体（ＣＬ）の質及び量を向上させるのに特に有効である。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ｒＦＳＨ類似体を用いて繁殖成績を向上させるのに使用したプロトコール。
【図２】本発明に使用するためのウシｒＦＳＨ類似体のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列。ベータサブユニット及びアルファサブユニットを連結するＣＴＰリンカー配列には下線が付されている。下線が付されている太字のヌクレオチドは、シグナルペプチドをコードする。
【００２６】
発明の詳細な説明
本発明は、非ヒト哺乳動物、好ましくは有蹄動物、さらにより好ましくはウシにおいて繁殖成績を向上させるための方法を提供する。特に、リコンビナント単鎖ＦＳＨは、過剰排卵、胚生産の向上及び／又は妊娠の向上によって例証した場合の、非ヒト哺乳動物の雌における受精能及び／又は受胎能を刺激するのに使用される。リコンビナント単鎖ＦＳＨはまた、卵胞の成長及び成熟を刺激して、卵母細胞の回収、過剰排卵及び排卵率の改善、並びに黄体（ＣＬ）の質及び量の改善をもたらすのに有効である。
【００２７】
リコンビナント単鎖ＦＳＨは、胚移植及び体外受精を含む授精プロトコール及び／又は処理に使用され得る。本発明は、任意の有蹄動物、好ましくはウシで使用され得る。
【００２８】
定義
本発明との関連では、用語「繁殖成績を向上させる」又は「繁殖成績の向上」は、非ヒト哺乳動物又は複数の非ヒト哺乳動物が受精及び受胎する可能性を高めることを指す。
【００２９】
繁殖成績の向上は、卵胞の成長及び／若しくは成熟の刺激、又は黄体の質及び量の改善を含む。
【００３０】
繁殖成績の向上はまた、授精した非ヒト哺乳動物又は複数の非ヒト哺乳動物が妊娠し、生きている子孫を出産し、又は生存可能な胚を発達させる可能性の上昇を含む。
【００３１】
繁殖成績の向上はまた、非ヒト哺乳動物又は複数の非ヒト哺乳動物が子宮内及び／又は体外で生産する生存可能な胚の数の増加を含む。繁殖成績の向上は、受精能、受胎能、過剰排卵、卵母細胞の比率、排卵率、胚生産及び／又は妊娠の向上を含む。向上は、好ましくは、未処理非ヒト哺乳動物と比較しておよそ少なくとも１％、より好ましくは少なくとも２％、３％、４％、５％、１０％又はそれ以上である。
【００３２】
本発明との関連では、用語「受精能」又は「受精」は、受精可能な卵母細胞を生産する能力を指す。
【００３３】
本発明との関連では、用語「受胎」又は「受胎能」は、妊娠を達成する能力を指す。
【００３４】
本発明との関連では、用語「過剰排卵」は、排卵される卵胞の数及び／又は受精卵の創出の増大を指す。
【００３５】
用語「妊娠」は、その一部が現在妊娠しているか、又は授精済みで妊娠の可能性がある非ヒト哺乳動物又は非ヒト哺乳動物群を指す。
【００３６】
本明細書で使用される用語「発情期」は、非ヒト哺乳動物が妊娠する可能性が最も高い期間を指す。発情期は、非ヒト哺乳動物が発情状態にあることの行動的実証（発情していることを示すことを含む）によって検出又はモニタリングされ得る。
【００３７】
「授精」は、限定されないが、自然授精及び人工授精（ＡＩ）並びに体外受精（ＩＶＦ）を含む当技術分野で公知の任意の方法によって、精液を導入することを指す。
【００３８】
動物「群」は、例えば、少なくとも２つの非ヒト哺乳動物の任意の群、例えば集団又は一団を表す。
【００３９】
「有蹄動物」は、蹄を有する任意の動物、特に２つの分類学的な目Perissodactyla及びCetartiodactylaを指す。
【００４０】
用語「投与」は、経口、経腸粘膜、非経口又は経皮などの全ての投与経路を指す。好ましくは、投与経路は注射である。
【００４１】
本発明との関連では、用語「卵胞同期化」は、卵胞波の出現の同期化を指す。
【００４２】
リコンビナントＦＳＨ類似体
卵胞刺激ホルモンは、生殖ホルモンのクラスに属する。ＦＳＨは、アルファ及びベータと称される２つの鎖（又はサブユニット）から構成される。生理学的条件下では、両サブユニットは、非共有結合相互作用によって連結されている。異なる種由来のＦＳＨのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は開示されており、ウシＦＳＨ（Kim KE et al., 1988, "nucleotide sequence of the bovine gene for follicle-stimulating hormone beta-subunit", DNA1988, 7(4): 227-233）又はヒトＦＳＨ：gene bankナンバーＣＡＡ４３９９６．１など、公共データベースで入手可能である。
【００４３】
本発明は、ＦＳＨ類似体を利用する。用語「類似体」は、一般的に、天然化合物の生理学的効果を模倣する化合物を表す。類似体は天然化合物と構造的に類似しており、例えば、生産方法に起因して、又は差異が有益な活性を類似体に付与するので、構造的差異を示してもよい。
【００４４】
好ましい実施態様では、本発明のＦＳＨ類似体は、共有結合されたアルファサブユニット及びベータサブユニットの両方を有するＦＳＨである。このような好ましいＦＳＨ類似体はまた、「単鎖」ＦＳＨと表記され得る。
【００４５】
好ましい実施態様では、本発明は、アルファサブユニットが、ペプチドリンカーによってベータサブユニットに共有結合されたリコンビナントＦＳＨを使用する。本発明は、ＦＳＨのこのようなリコンビナント単鎖類似体が、有蹄動物において繁殖成績を向上させるための改善された特性を提供することを示す。ペプチドリンカーは、ＦＳＨのコンフォメーション及び活性に影響を及ぼさない任意のペプチドリンカーであり得る。好ましい実施態様では、リンカーは、ＣＴＰリンカー、例えば、米国特許第６，２４２，５８０号及び米国特許出願公開第２００８／０３１２１５１号に記載されているヒト絨毛性ゴナドトロピンのカルボキシ末端ペプチドの配列を含むリンカーである。別の実施態様では、リンカーは、複数回繰り返され得る（Ｇ４Ｓ）配列を含むペプチドである。
【００４６】
本発明に使用するためのリコンビナントウシＦＳＨ類似体のｃＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を図２に示す（配列番号３及び配列番号４）。第１の部分（アミノ酸１〜１２９）は、ウシＦＳＨベータサブユニットの配列（配列番号２）に対応し、中央部分は、カルボキシ末端ペプチドリンカー（アミノ酸１３０〜１５７）に対応し、第３の部分（アミノ酸１５８〜２５３）は、ウシＦＳＨアルファサブユニットの配列（配列番号１、欧州特許出願公開第２１３４１６５号も参照のこと）に対応する。
【００４７】
本発明の一実施態様は、配列番号３のアミノ酸配列、又は配列番号３のアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する単鎖リコンビナントウシＦＳＨを使用する。
【００４８】
前記方法がウシを処理するためのものである場合、上に開示されているウシＦＳＨ類似体（すなわち、ウシＦＳＨ由来のアルファドメイン及びベータドメインがペプチドリンカーによって連結されたリコンビナントＦＳＨ）を使用することが好ましい。
【００４９】
前記方法が別の有蹄動物を処理するためのものである場合、前記有蹄動物由来のＦＳＨ類似体を使用することが好ましい。
【００５０】
タンパク質は、好ましくは、本質的に純粋である（すなわち、少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７、９８又は９９％の純粋レベルを有する）。
【００５１】
好ましい実施態様では、ＦＳＨは、適切な医薬製剤を含む組成物で投与される。医薬製剤は、１つ又は複数の賦形剤又は担体を含み得る。
【００５２】
好ましい一実施態様では、ウシＦＳＨは、１００００IU/mg超；より好ましくは１３０００IU/mg超、例えば約１６０００IU/mgの活性を有する。ASRM practice committee (Fertility and Sterility, vol90, supl3, November 2008- American Society for Reproductive Medecine)が公開している変換係数によれば、ウシＦＳＨ １００００IUは、６００μgに対応する。
【００５３】
処理
前記のように、本発明は、リコンビナントＦＳＨ類似体を使用して、非ヒト哺乳動物において繁殖成績を向上させるための新規な方法に関する。本発明は、例えば、処理動物において排卵率及び／若しくは過剰排卵、並びに／又は黄体の質及び量を改善するために、授精プログラム、特に有蹄動物の人工授精に使用され得、並びに例えば、ドナー動物からの卵母細胞の回収及び／又はレシピエント動物において妊娠率を改善するために、体外受精プログラムに使用され得る。
【００５４】
より具体的には、本発明の目的は、非ヒト哺乳動物において繁殖成績を向上させるのに使用するためのリコンビナントＦＳＨ類似体であって、ペプチドリンカーによって共有結合されたアルファサブユニット及びベータサブユニットを含み、好ましくは、１０μg〜１mgに含まれる用量で、卵胞同期化後に単回投与で前記非ヒト哺乳動物に投与されるリコンビナントＦＳＨ類似体に関する。
【００５５】
本発明の別の目的は、非ヒト哺乳動物において繁殖成績又は胚生産を向上させるための方法であって、１０μg〜１mgに含まれる用量で、リコンビナントＦＳＨ類似体を卵胞同期化後に単回投与で前記非ヒト哺乳動物に投与することを含み、前記リコンビナントＦＳＨ類似体が、ペプチドリンカーによって共有結合されたアルファサブユニット及びベータサブユニットを含む方法にある。
【００５６】
本発明の別の目的は、非ヒト哺乳動物において卵母細胞の回収を改善するための方法であって、１０μg〜１mgに含まれる用量で、リコンビナントＦＳＨ類似体を卵胞同期化後に単回投与で前記非ヒト哺乳動物に投与することを含み、前記リコンビナントＦＳＨ類似体が、ペプチドリンカーによって共有結合されたアルファサブユニット及びベータサブユニットを含む方法にある。
【００５７】
本発明の別の目的は、非ヒト哺乳動物において妊娠率を向上させるための方法であって、１０μg〜１mgに含まれる用量で、リコンビナントＦＳＨ類似体を卵胞同期化後に単回投与で前記非ヒト哺乳動物に投与することを含み、前記リコンビナントＦＳＨ類似体が、ペプチドリンカーによって共有結合されたアルファサブユニット及びベータサブユニットを含む方法にある。
【００５８】
本発明の別の目的は、非ヒト哺乳動物において排卵率を向上させるための方法であって、１０μg〜１mgに含まれる用量で、リコンビナントＦＳＨ類似体を卵胞同期化後に単回投与で非ヒト哺乳動物に投与することを含み、前記リコンビナントＦＳＨ類似体が、ペプチドリンカーによって共有結合されたアルファサブユニット及びベータサブユニットを含む方法にある。
【００５９】
本発明のさらなる目的は、非ヒト哺乳動物において過剰排卵を誘導するための方法であって、リコンビナントＦＳＨ類似体を非ヒト哺乳動物に投与することを含み、前記リコンビナントＦＳＨ類似体が、ペプチドリンカーによって共有結合されたアルファサブユニット及びベータサブユニットを含み、好ましくは、１０μg〜１mgに含まれる用量で、前記リコンビナントＦＳＨ類似体を卵胞同期化後に単回投与で前記哺乳動物に投与する方法である。
【００６０】
好ましい実施態様では、前記方法は、
（ａ）非ヒト哺乳動物（例えば、有蹄動物）若しくは非ヒト哺乳動物群（例えば、有蹄動物群）を卵胞同期化処理すること、又は卵胞同期化処理された非ヒト哺乳動物（例えば、有蹄動物）若しくは非ヒト哺乳動物群（例えば、有蹄動物群）を提供すること；
（ｂ）リコンビナントＦＳＨ類似体１０μg〜１mgを単回投与で該処理非ヒト哺乳動物に投与すること；及び
（ｃ）場合により、好ましくは排卵時近くに、より好ましくは投与工程（ｂ）の２〜７日後、さらにより好ましくは４〜６日後に、該非ヒト哺乳動物を授精させ、及び／又は卵母細胞を採取すること
を含む。
【００６１】
第１の処理工程では、新たな卵胞波の出現を同期化する。本発明は、本発明のリコンビナントＦＳＨと組み合わせると、ホルモンがより低用量で注射がより少ない場合でさえ、このような処理が胚生産の改善を可能にすることを示す。
【００６２】
ウシなどの非ヒト哺乳動物では、卵胞の成長は連続的ではなく、波のように起こる（１周期当たり２〜４つの波）。各波は、前の波の主卵胞が最大サイズに達する際に大体始まり、その際に、多数の小さな卵胞が急成長期を開始する。この卵胞群から、１つの卵胞が、他のものよりもかなり大きなサイズに成長することができる。この大きな卵胞は、副卵胞と称されるより小さな卵胞の成長を調節及び制限する能力を有するので、主卵胞と称される。最大サイズに達した数日後、主卵胞は退行し始めて死ぬ。主卵胞が退行するにつれて、他の卵胞を制限するその能力は低下する；したがって、新たな卵胞波が始まる。このダイナミックプロセスの結果、発情周期の各日において、少なくとも１つの大きな卵胞を含む全てのサイズの卵胞が存在する。
【００６３】
卵胞波の同期化は、限られた期間内に全ての非ヒト哺乳動物を処理し、したがって、授精の経済的利益を受ける機会を与える。発情周期の同期化により、処理された雌の大部分が受精、厳密に同期化された発情期及び排卵を示す。
【００６４】
排卵の同期化又は定時ＡＩプロトコール（timed-AI protocol）は、排卵が所定時間に開始するように卵胞の成長及び定時の排卵を人為的に刺激し、発情行動をモニタリングする必要がない方法及び／又はプロトコールを指す。ウシで適用される一般的な方法及びプロトコールの概説は、Bo et al in the  28thAnnual meeting AETE- Saint Malo, France, 7-8th September 2012 (Recent advances in the control of follicular development and superovulation protocols in cattle)の論文に記載されている。
【００６５】
新たな卵胞波の出現は、ホルモン処理又は物理的処理によって実施され得る。ホルモン処理は、プロスタグランジン、プロゲスターゲン又はＧｎＲＨなどの適切なホルモンの投与を含む。物理的処理は、卵胞アブレーションを含む。
【００６６】
好ましい実施態様では、好ましくは、プロゲスターゲン、プロゲスターゲン−プロスタグランジンの組み合わせ、プロスタグランジンのみ、プロゲスターゲン−エストロゲンの組み合わせ、ゴナドトロピン−プロスタグランジンの組み合わせ（プロゲスターゲンの有無にかかわらず）による非ヒト哺乳動物のホルモン処理によって卵胞同期化を行う。
【００６７】
好ましい実施態様では、以下の処理の１つによって卵胞同期化を行う：
−  ＰＧＦ２アルファ又はその類似体；
−  ＧｎＲＨ＋ＰＧＦ２アルファ
−  場合により、エストロゲン又はＰＧＦ２アルファ又はＧｎＲＨと組み合わせたプロゲスターゲン（プロゲステロン．．．のような）。
【００６８】
具体的な投与量及び／又はプロトコールは、当技術分野で、例えばThatcher et al., 2001 (American Association of Bovine Practitioner, AABP, Vancouver, 95-105); Diskin et al., 2001 (occasional publication n° 26, p175, British society of Animal Science);又はPursley et al., 1995 (Theriogenology 44 p915)などに開示されている。また、プロゲスターゲンは、インプラントなどの特定のデバイスを使用して投与され得る（例えば、Ceva Sante AnimaleのPRID）。
【００６９】
別の実施態様では、卵胞アブレーションによって、卵胞同期化を行う。卵胞アブレーションは、少なくとも１つの卵胞の排除、除去又は破壊を表す。卵胞アブレーションは、物理的な卵胞アブレーション法、例えば発情周期のランダムな段階における焼灼又は超音波誘導経膣卵胞吸引を指す（Bergfelt, 1997）。アブレーションは、全ての卵胞を対象とし得るか、又は少なくとも主卵胞を確実に抑制するために１つ若しくは２つの最も大きな卵胞のみ（Baracaldo et al., 2000）を対象とし得る。
【００７０】
好ましい実施態様では、本発明は、
（ａ）プロゲスターゲン、プロゲスターゲン−プロスタグランジンの組み合わせ、プロスタグランジン、プロゲスターゲン−エストロゲンの組み合わせ若しくはゴナドトロピン−プロスタグランジンの組み合わせ（プロゲスターゲンの有無にかかわらず）で非ヒト哺乳動物（例えば、有蹄動物）若しくは非ヒト哺乳動物（例えば、有蹄動物）群を卵胞同期化処理すること；又はプロゲスターゲン、プロゲスターゲン−プロスタグランジンの組み合わせ、プロスタグランジン、プロゲスターゲン−エストロゲンの組み合わせ若しくはゴナドトロピン−プロスタグランジンの組み合わせ（プロゲスターゲンの有無にかかわらず）で卵胞同期化処理された非ヒト哺乳動物（例えば、有蹄動物）若しくは非ヒト哺乳動物（例えば、有蹄動物）群を提供すること；
（ｂ）リコンビナントＦＳＨ類似体１０μg〜１mgを単回投与で該処理非ヒト哺乳動物（例えば、有蹄動物）に投与すること；及び
（ｃ）場合により、好ましくは排卵時近くに、より好ましくは投与工程（ｂ）の２〜７日後、さらにより好ましくは４〜６日後に、（ｂ）の処理非ヒト哺乳動物（例えば、有蹄動物）を授精させ、及び／又は（ｂ）の処理非ヒト哺乳動物（例えば、有蹄動物）から卵母細胞を採取することを含む方法に関する。
【００７１】
工程（ｂ）では、限定されないが、全身投与、例えば筋肉内、静脈内、皮下などを含む当技術分野でそれ自体が公知の任意の手段又は技術を使用して、リコンビナントＦＳＨ類似体を投与し得る。好ましい投与経路は、筋肉内注射である。
【００７２】
好ましい実施態様では、本発明の組成物又は方法は、単回用量のｒＦＳＨ類似体５０μgを使用する。
【００７３】
別の好ましい実施態様では、本発明の組成物又は方法は、単回用量のｒＦＳＨ類似体１００μgを使用する。
【００７４】
実験セクションで示されている結果は、有蹄動物のような同期化非ヒト哺乳動物において、このような単回投与は受精胚の生産を引き起こし、生殖活動を実質的に向上させることを示している。
【００７５】
好ましい実施態様では、前記方法は、好ましくは排卵時近くに、より好ましくはｒＦＳＨ類似体投与の２〜７日後、さらにより好ましくは４〜６日後に、前記有蹄動物を授精させる工程（ｃ）をさらに含む。
【００７６】
ｒＦＳＨだけではなく、黄体形成ホルモン、絨毛性ゴナドトロピン及びプロスタグランジンなどのさらなるホルモンを場合により投与する。一実施態様では、ｒＦＳＨ類似体の投与に加えて、プロスタグランジンを非ヒト哺乳動物に投与する。典型的には注射によって単回投与として、又は数時間おいて投与される複数回投与として、プロスタグランジンを場合により投与する。一実施態様では、第１の用量のプロスタグランジンをｒＦＳＨ類似体投与後に非ヒト哺乳動物に投与し、続いて、第１のプロスタグランジン投与の約６時間〜１日後に、第２の用量のプロスタグランジンを非ヒト哺乳動物に投与する。
【００７７】
あるいは、前記方法は、好ましくは排卵時近くに、より好ましくはｒＦＳＨ類似体投与の２〜７日後、さらにより好ましくは４〜６日後に、（ｂ）の処理非ヒト哺乳動物から卵母細胞を回収又は採取する工程（ｃ）を含む。卵母細胞は、当技術分野でそれ自体が公知の技術、例えば限定されないが、卵胞吸引によって回収され得る。採取された卵母細胞は、改善された受精特性を示す。採取された卵母細胞を体外受精し、続いて、レシピエント非ヒト哺乳動物、例えば有蹄動物に移植し得る。
【００７８】
本発明は、任意の有蹄動物、例えばウシ、ヒツジ、ヤギ、シカ、ヤク、水牛、バイソン、アンテロープ、ガゼル、ヘラジカ、トナカイ、ムース、オオツノヒツジ、キリン、ラクダ、ブタ、ウマ、アルパカ及びビクーニャで使用され得る。それは、若雌ウシを含む雌の乳牛を処理するのに特に適切である。
【００７９】
特許請求の範囲に記載されている本発明を例証する以下の実験セクションにおいて、本発明のさらなる態様及び利点を開示する。
【００８０】
実施例
実施例１  −  同期化非ヒト哺乳動物において、ｒＦＳＨ類似体５０μgの単回投与が繁殖成績に及ぼす効果
本発明者らは、ウシｒＦＳＨ類似体（５０μg／若雌ウシ）の単回筋肉内注射で１４日齢の若雌ウシを処理した。卵胞アブレーションの３０時間（２４〜４８時間のウィンドウ）後に、注射を実施した。使用したウシｒＦＳＨ類似体を図２に示す。処理プロトコールを図１に示す。
【００８１】
最初のＦＳＨ注射（Ｆ０）の２日後及び３日後に、プロスタグランジンＰＧＦ２αを全ての群に２回注射した。Ｆ０の５日後にｈＣＧ（ヒト絨毛性ゴナドトロピン）注射を実施し、ｈＣＧ処理の１２時間後及び２４時間後に人工授精（ＡＩ）を実施した。ＡＩの７日後に、非外科的手順による胚の採取を行った。
【００８２】
Folltropin（登録商標）-V (Bioniche Animal Health Product, Canada)を参照処理として使用した。Folltropin（登録商標）-Vは、ブタ下垂体から得られた精製凍結乾燥フォリトロピン抽出物である。Folltropin（登録商標）-V（５０mg）を４日間にわたって漸減用量で１日２回筋肉内投与した（処理終了時の累積ＦＳＨは、４００mg／若雌ウシである）。１４日齢の若雌ウシをFolltropin（登録商標）-Vで処理した。
【００８３】
様々なパラメータを測定した：
−  過剰排卵：洗浄日においてＣＬ（黄体）が＞２の場合に、過剰排卵が成功したとみなした；
−  排卵率：ウシ１頭当たりの排卵応答の全群ＬＳＭ（最小二乗平均）に基づく；
−  胚の質：ウシ１頭当たりの生存可能な胚の数の全群ＬＳＭ（最小二乗平均）に基づく；
【００８４】
結果を以下の表に示す。
【００８５】
【表１】
2018168189.tif 000002
【００８６】
結果は、本発明の処理が、ウシで過剰排卵応答を明確に誘導し得ることを示している。比較として、参照プロトコール（Folltropin（登録商標）-Vなどの天然ＦＳＨ ４００mgを８回注射）で処理した若雌ウシでは、本発明の処理（ｒＦＳＨ類似体５０μgを単回注射）は、より高い排卵率（８１％対７６％）及びより多数の生存可能な胚（７．９個対５．９個）をもたらした。したがって、（参照処理によって全頭が過剰排卵した一方で）本発明の処理によって１頭の若雌ウシが過剰排卵しなかった場合であっても、胚の質は、本発明の方が優れていると思われる。したがって、卵胞同期化処理をｒＦＳＨ類似体の単回注射と組み合わせることにより、過剰排卵胚の安定生産が可能になる。
【００８７】
実施例２  −  同期化非ヒト哺乳動物において、ｒＦＳＨ類似体１００μgの単回投与が繁殖成績に及ぼす効果
本発明者らは、ウシｒＦＳＨ類似体（１００μg／若雌ウシ）の単回筋肉内注射で１４日齢の若雌ウシを処理した。卵胞アブレーションの３０時間（２４〜４８時間のウィンドウ）後に、注射を実施した。使用したウシｒＦＳＨ類似体を図２に示す。処理プロトコールを図１に示す。
【００８８】
最初のＦＳＨ注射（Ｆ０）の２日後及び３日後に、プロスタグランジンＰＧＦ２αを全ての群に２回注射した。Ｆ０の５日後にｈＣＧ（ヒト絨毛性ゴナドトロピン）注射を実施し、ｈＣＧ処理の１２時間後及び２４時間後に人工授精（ＡＩ）を実施した。ＡＩの７日後に、非外科的手順による胚の採取を行った。
【００８９】
Folltropin（登録商標）-V (Bioniche Animal Health Product, Canada)を参照処理として使用した。Folltropin（登録商標）-Vは、ブタ下垂体から得られた精製凍結乾燥フォリトロピン抽出物である。Folltropin（登録商標）-V（５０mg）を４日間にわたって漸減用量で１日２回筋肉内投与した（処理終了時の累積ＦＳＨは、４００mg／若雌ウシである）。１４日齢の若雌ウシをFolltropin（登録商標）-Vで処理した。
【００９０】
様々なパラメータを測定した：
−  過剰排卵：洗浄日において２ＣＬ（黄体）が＞２の場合に、過剰排卵が成功したとみなした；
−  排卵率：ウシ１頭当たりの排卵応答の全群ＬＳＭ（最小二乗平均）に基づく；
−  胚の質：ウシ１頭当たりの生存可能な胚の数の全群ＬＳＭ（最小二乗平均）に基づく；
【００９１】
結果を以下の表に示す。
【００９２】
【表２】
2018168189.tif 000003
【００９３】
結果は、本発明の処理が、ウシで過剰排卵応答を明確に誘導し得ることを示している。比較として、参照プロトコール（Folltropin（登録商標）-Vなどの天然ＦＳＨ ４００mgを８回注射）で処理した若雌ウシでは、本発明の処理（ｒＦＳＨ類似体１００μgを単回注射）は、より高い排卵率（８８％対７６％）をもたらした。したがって、（参照処理によって全頭が過剰排卵した一方で）本発明の処理によって２頭の若雌ウシが過剰排卵しなかった場合であっても、胚の質は、２つの製品間で同等であると思われる。前記処理は、７０％超の過剰排卵応答を達成し、さらには胚の質の点で基準を満たしていた。したがって、卵胞同期化処理をｒＦＳＨ類似体の単回注射と組み合わせることにより、過剰排卵胚の安定生産が可能になる。
【図１】
2018168189.tif 000004
【図２】
2018168189.tif 000005
【配列表】
2018168189000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年7月27日(2018.7.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【外国語明細書】
2018168189000001.pdf