(57)【要約】  【課題】  後のゲノム解析に影響を与えることなく、ゲノム解析に供する液滴を単離する方法、およびゲノム解析方法を提供する。  【解決手段】  本発明は、ゲノム解析用液滴の単離方法であり、エマルション形成工程と、核酸増幅工程と、検出工程と、分取工程とを含み、前記エマルション形成工程は、  細胞を含む試料と、エマルション形成溶媒とを接触させて、前記エマルション形成溶媒中に、前記試料中の細胞を含む複数の液滴を形成する工程であり、前記核酸増幅工程は、  前記液滴について、ターゲット細胞に含まれるターゲットゲノムの増幅を行う工程であり、前記検出工程は、  前記液滴における前記ターゲットゲノムの増幅の有無を検出する工程であり、前記分取工程は、  前記ターゲットゲノムの増幅が検出された液滴を、前記ターゲット細胞のターゲットゲノム由来の増幅産物を含むゲノム解析用液滴として分取する工程であることを特徴とする。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
エマルション形成工程と、核酸増幅工程と、検出工程と、分取工程とを含み、
前記エマルション形成工程は、
細胞を含む試料と、エマルション形成溶媒とを接触させて、前記エマルション形成溶媒中に、前記試料中の細胞を含む複数の液滴を形成する工程であり、
前記核酸増幅工程は、
前記液滴について、ターゲット細胞に含まれるターゲットゲノムの増幅を行う工程であり、
前記検出工程は、
前記液滴における前記ターゲットゲノムの増幅の有無を検出する工程であり、
前記分取工程は、
前記ターゲットゲノムの増幅が検出された液滴を、前記ターゲットゲノム由来の増幅産物を含むゲノム解析用液滴として分取する工程であることを特徴とするゲノム解析用液滴の単離方法。
【請求項２】
前記エマルション形成工程において、前記ターゲットゲノムの増幅用試薬の存在下、液滴を形成し、
前記核酸増幅工程において、前記液滴に含まれる前記増幅用試薬を用いて、前記ターゲットゲノムの増幅を行う、請求項１記載のゲノム解析用液滴の単離方法。
【請求項３】
前記エマルション形成工程において、前記ターゲットゲノムの増幅用試薬の非存在下、液滴を形成し、
前記核酸増幅工程において、前記増幅用試薬を添加し、前記ターゲットゲノムの増幅を行う、請求項１記載のゲノム解析用液滴の単離方法。
【請求項４】
前記増幅用試薬に、前記増幅の検出のための検出試薬を共存させ、
前記増幅用試薬が、前記ターゲットゲノムを増幅するためのプライマーを含み、
前記検出試薬が、インターカレータまたはプローブを含む、請求項２または３記載のゲノム解析用液滴の単離方法。
【請求項５】
さらに、解析工程を含み、
前記解析工程は、前記解析用液滴に含まれるターゲットゲノム由来の増幅産物について、解析を行う、請求項１から４のいずれか一項に記載のゲノム解析用液滴の単離方法。
【請求項６】
前記エマルション形成工程において、
前記エマルション形成溶媒は、非水溶性溶媒を含み、
前記非水溶性溶媒中に、前記複数の液滴が形成され、
前記複数の液滴は、前記試料を含む水溶性の液滴である、請求項１から５のいずれか一項に記載のゲノム解析用液滴の単離方法。
【請求項７】
流路を有するデバイスを使用し、
前記流路内で、前記エマルション形成工程、前記増幅工程および前記検出工程を行う、請求項１から６のいずれか一項に記載のゲノム解析用液滴の単離方法。
【請求項８】
前記流路内で、さらに、前記分取工程を行う、請求項７記載のゲノム解析用液滴の単離方法。
【請求項９】
ターゲットゲノム由来の増幅産物を含むゲノム解析用液滴の単離工程と、解析工程とを含み、
前記単離工程は、
細胞を含む試料から、請求項１から８のいずれか一項に記載の単離方法により、ターゲット細胞のターゲットゲノム由来の増幅産物を含むゲノム解析用液滴を単離する工程であり、
前記解析工程は、
前記単離されたゲノム解析用液滴に含まれる前記増幅産物について、ゲノム解析を行う工程であることを特徴とするターゲット細胞由来のゲノム解析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ゲノム解析用液滴の単離方法、およびゲノム析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
様々な細胞を含む試料から、ターゲット細胞を単離して、ターゲットゲノムについての解析を行う場合、ターゲット細胞の単離方法として、近年、セルソーティングが一般的になっている。中でも、エマルション化により細胞を含む液滴（ドロップレット）を形成する方法では、核酸増幅を利用して、ターゲット細胞を含む液滴の分取（ソーティング）が行われている。
【０００３】
セルソーティングの具体的な方法としては、例えば、まず、細胞を含む試料についてエマルション化を行い、前記エマルション中に液滴を形成する。そして、前記エマルション中の液滴について、ＰＣＲ等の核酸増幅法により、ターゲット細胞に由来する短鎖の配列を増幅させ、プローブ等を用いて、前記増幅の有無を検出する。そして、増幅が確認された液滴を、ターゲット細胞を含む液滴として分取し、これを、ゲノム解析等の試料とする（非特許文献１）。ゲノム解析においては、例えば、前記液滴について、さらに、前記ターゲット細胞のターゲットゲノムの核酸増幅を行い、得られたターゲットゲノムの増幅産物を次世代シーケンシング（ＮＧＳ）に供し、アッセンブリングすることで、前記ターゲット細胞のターゲットゲノムを解析できる（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Dennis J. Eastburn, et al., 「Identification and genetic analysis of cancer cells with PCR-activated cell sorting」Nucleic  Acids  Research,  2014,  Vol. 42,  No. 16  e128
【非特許文献２】Yong Hou,  et al., 「Comparison of variations detectionbetween whole-genome amplification methods used in single-cell resequencing」 GIGA Science, 2015, 4:37
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
前記セルソーティングにおける核酸増幅は、前記液滴中の細胞の有無の確認を目的とするため、前述のように、例えば、ゲノムにおける短い領域（例えば、８０〜３００ｂｐ程度）を設定して、増幅が行われる。しかしながら、増幅の検出により分取された液滴には、セルソーティングでの短鎖の増幅産物が大量に混入されており、その量は、液滴中に含まれる細胞由来のゲノムと比較して非常に多い。このため、ゲノム解析のために、前記分取した液滴について、さらに、ターゲットゲノムの核酸増幅を行っても、ゲノム解析に供する試料には、ターゲットゲノム由来の増幅産物の他に、解析対象ではない大量の短鎖の増幅産物が混入されたままで、これらの短鎖の増幅産物がシーケンシングされ、ターゲット細胞のターゲットゲノムの解析結果に影響を与えるという問題がある。
【０００６】
そこで、本発明は、後のゲノム解析に影響を与えることなく、ゲノム解析に供することができる液滴を単離する方法、およびゲノム解析方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記目的を達成するために、本発明は、ゲノム解析用液滴の単離方法であり、
エマルション形成工程と、核酸増幅工程と、検出工程と、分取工程とを含み、
前記エマルション形成工程は、
細胞を含む試料と、エマルション形成溶媒とを接触させて、前記エマルション形成溶媒中に、前記試料中の細胞を含む複数の液滴を形成する工程であり、
前記核酸増幅工程は、
前記液滴について、ターゲット細胞に含まれるターゲットゲノムの増幅を行う工程であり、
前記検出工程は、
前記液滴における前記ターゲットゲノムの増幅の有無を検出する工程であり、
前記分取工程は、
前記ターゲットゲノムの増幅が検出された液滴を、前記ターゲットゲノム由来の増幅産物を含むゲノム解析用液滴として分取する工程であることを特徴とする。
【０００８】
本発明は、ターゲット細胞由来のゲノム解析方法であり、
ターゲットゲノム由来の増幅産物を含むゲノム解析用液滴の単離工程と、解析工程とを含み、
前記単離工程は、
細胞を含む試料から、前記本発明の単離方法により、ターゲット細胞のターゲットゲノム由来の増幅産物を含むゲノム解析用液滴を単離する工程であり、
前記解析工程は、
前記単離されたゲノム解析用液滴に含まれる前記増幅産物について、ゲノム解析を行う工程であることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、ゲノム解析用液滴の単離において、液滴中の細胞の有無を確認するにあたって、後の解析対象となるターゲットゲノムを増幅するため、例えば、前述のように、ターゲットゲノムの解析対象ではない短鎖の増幅産物は含まれない。このため、本発明の単離方法により得られたゲノム解析用液滴を用いれば、例えば、前記短鎖の増幅産物の影響を回避して、そのまま、シーケンシングとアッセンブリングとにより、ゲノム解析を行うことができる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明のゲノム解析用液滴の単離方法は、例えば、前記エマルション形成工程において、前記ターゲットゲノムの増幅用試薬の存在下、液滴を形成し、前記核酸増幅工程において、前記液滴に含まれる前記増幅用試薬を用いて、前記ターゲットゲノムの増幅を行う。
【００１１】
本発明のゲノム解析用液滴の単離方法は、例えば、前記エマルション形成工程において、前記ターゲットゲノムの増幅用試薬の非存在下、液滴を形成し、前記核酸増幅工程において、前記増幅用試薬を添加し、前記ターゲットゲノムの増幅を行う。
【００１２】
本発明のゲノム解析用液滴の単離方法は、例えば、前記増幅用試薬に、前記増幅の検出のための検出試薬を共存させ、前記増幅用試薬が、前記ターゲットゲノムを増幅するためのプライマーを含み、前記検出試薬が、インターカレータまたはプローブを含む。
【００１３】
本発明のゲノム解析用液滴の単離方法は、例えば、さらに、解析工程を含み、前記解析工程は、前記解析用液滴に含まれるターゲットゲノム由来の増幅産物について、解析を行う。
【００１４】
本発明のゲノム解析用液滴の単離方法は、例えば、前記エマルション形成工程において、前記エマルション形成溶媒は、非水溶性溶媒を含み、前記非水溶性溶媒中に、前記複数の液滴が形成され、前記複数の液滴は、前記試料を含む水溶性の液滴である。
【００１５】
本発明のゲノム解析用液滴の単離方法は、例えば、流路を有するデバイスを使用し、前記流路内で、前記エマルション形成工程、前記増幅工程および前記検出工程を行う。
【００１６】
本発明のゲノム解析用液滴の単離方法は、例えば、前記流路内で、さらに、前記分取工程を行う。
【００１７】
本発明の単離方法および解析方法は、ゲノム解析用液滴の分取のための核酸増幅として、ゲノム解析の対象となるターゲットゲノムの増幅を行うことがポイントであり、その他の工程や条件は、特に制限されない。
【００１８】
以下、本発明の単離方法および解析方法の実施形態について、例をあげて説明する。本発明の単離方法および解析方法は、下記の実施形態によって何ら限定および制限されない。また、各実施形態の記載は、それぞれ互いに援用できる。
【００１９】
（ゲノム解析用液滴の単離方法）
本発明の単離方法は、前述のように、ゲノム解析用液滴の単離方法であり、
エマルション形成工程と、核酸増幅工程と、検出工程と、分取工程とを含み、
前記エマルション形成工程は、
細胞を含む試料と、エマルション形成溶媒とを接触させて、前記エマルション形成溶媒中に、前記試料中の細胞を含む複数の液滴を形成する工程であり、
前記核酸増幅工程は、
前記液滴について、ターゲット細胞に含まれるターゲットゲノムの増幅を行う工程であり、
前記検出工程は、
前記液滴における前記ターゲットゲノムの増幅の有無を検出する工程であり、
前記分取工程は、
前記ターゲットゲノムの増幅が検出された液滴を、前記ターゲットゲノム由来の増幅産物を含むゲノム解析用液滴として分取する工程であることを特徴とする。
【００２０】
前記エマルション形成工程は、前述のように、細胞を含む試料と、エマルション形成溶媒とを接触させて、前記エマルション形成溶媒中に、前記試料中の細胞を含む複数の液滴を形成する工程である。前記エマルション形成溶媒中における前記液滴の形成によって、前記試料を、複数の液滴に分割して区画することができる。そして、前記液滴のそれぞれに、前記試料中の様々な細胞が、分配されることになる。
【００２１】
前記試料の種類は、何ら制限されず、細胞が存在すると考えられる試料があげられる。前記試料は、例えば、生体試料があげられ、具体例としては、血液、リンパ液、脳脊髄液、精液、尿、鼻水、鼻腔ぬぐい液（スワブ）等である。前記生体は、特に制限されず、例えば、ヒト；ウシ、ブタ、ヒツジ、マウス、ラット、ウサギおよびウマ等の非ヒト哺乳類；鳥類；魚類等の動物の生体があげられる。
【００２２】
前記エマルション形成溶媒は、特に制限されず、その中に、前記試料を含む液滴を形成できるものであればよい。前記エマルション形成溶媒は、例えば、非水溶性溶媒であり、前記非水溶性溶媒中に、前記試料を含む水溶性の液滴が形成できる。
【００２３】
前記非水溶性溶媒は、例えば、油、ミネラルオイル、クロロホルム、芳香族化合物等があげられる。前記非水溶性溶媒は、例えば、一種類を単独で使用してもよいし、二種類以上を併用してもよい。
【００２４】
前記液滴の形成においては、例えば、さらに、水溶性溶媒を共存させてもよい。前記水溶性溶媒は、例えば、水、緩衝液、水溶性高分子溶液等があげられる。前記水溶性溶媒は、例えば、一種類を単独で使用してもよいし、二種類以上を併用してもよい。
【００２５】
前記液滴の形成においては、例えば、後述する増幅工程において使用する試薬を共存させてもよい。これにより、前記試薬を含有する液滴が形成されるため、例えば、後述する増幅工程において、新たに試薬を添加することなく、増幅工程における増幅反応を行うことができる。前記試薬に関しては、後述する。
【００２６】
前記形成する液滴の大きさは、特に制限されず、その平均体積は、下限が、例えば、４ｐＬ以上であり、上限が、例えば、１０ｎＬ以下である。
【００２７】
前記液滴に含まれる細胞の個数は、特に制限されない。前記液滴１個に含まれる細胞数は、例えば、５個以下、２個以下、好ましくは１個である。
【００２８】
前記エマルション形成溶媒中における液滴の形成方法は、特に制限されず、前記エマルション形成溶媒と、前記試料とを接触させることで、前記エマルション形成溶媒中に、複数の液滴を形成できる。前記接触は、例えば、前記エマルション形成溶媒に、前記試料を接触させてもよいし、前記試料に、前記エマルション形成溶媒を接触させてもよい。前記液滴の形成方法は、例えば、公知のドロップレット作製方法が適用できる。
【００２９】
前記液滴の形成には、例えば、マイクロ流路を有するエマルション化デバイスを使用できる。前記デバイスは、前記マイクロ流路として、例えば、サンプル用流路と、エマルション形成溶媒用流路と、これらの連結部と、前記連結部から導出される導出流路とを含む。このデバイスを用いた場合、例えば、以下のように液滴が形成される。まず、前記連結部には、前記エマルション形成溶媒用流路から、前記エマルション形成溶媒が導入され、つぎに、前記エマルション形成溶媒が導入された前記連結部に向かって、前記サンプル用流路から、前記試料（例えば、任意で前記水溶性溶媒を含む）が導入される。そして、前記連結部において、前記エマルション形成溶媒と前記試料とが接触し、エマルション化され、前記連結部から前記導出流路に、エマルション（前記エマルション形成溶媒中に液滴が分散された状態）として導出される。なお、前記試料と前記水溶性溶媒とは、例えば、前述のように、予め混合した混合液として、前記デバイスの流路に導入してもよいし、別々に流路に導入してもよい。後者の場合、前記連結部の上流において、前記サンプル用流路と試薬用流路とを有し、前記連結部に向かって、前記サンプル用流路から前記試料が導入され、前記試薬用流路から前記水溶性溶媒や任意で前記試薬等が導入されてもよい。
【００３０】
前記増幅工程は、前述のように、前記エマルション形成工程で形成された液滴について、ターゲット細胞に含まれるターゲットゲノムの増幅を行う工程である。
【００３１】
前記増幅工程において、増幅する対象のターゲットゲノムは、特に制限されず、ゲノム解析の目的に応じて適宜決定できる。本発明は、従来のように、ゲノム解析の目的とは別に、前記液滴中の細胞の有無を検出することのみを目的として、短鎖の配列を増幅するのではなく、後にゲノム解析する対象のゲノムを増幅することがポイントである。このため、前記増幅工程において、増幅させるゲノムは、後の解析対象のターゲットゲノムであり、また、前記ターゲットゲノムにおける増幅させる領域は、いわゆるゲノム解析に必要な領域である。ゲノム解析は、一般的に、ターゲットゲノムの一部が重複する複数の領域を増幅させ、配列を解読し、解読した配列結果をアッセンブリして、ターゲットゲノム全体を解析する。したがって、本発明の単離方法も、前記増幅工程におけるターゲットゲノムの増幅は、ゲノム解析に必要となる複数の領域の増幅であることが好ましい。この場合、ターゲットゲノムにおいて、増幅させる各領域の長さは、例えば、４００ｂｐ〜６０ｋｂｐであり、解析する全体の長さは、例えば、２４６ｂｐ〜１．５×１０７ｂｐである。本発明におけるゲノム解析は、例えば、ホールゲノム解析があげられる。この場合、例えば、複数の遺伝子座を含む複数の領域を増幅させてもよいし、全遺伝子について、各遺伝子の全長または部分領域を増幅させてもよい。
【００３２】
前記増幅工程において、前記核酸増幅の方法は、特に制限されず、ＰＣＲ法等の公知の手法が採用できる。前記増幅用試薬は、特に制限されず、例えば、ポリメラーゼ、プライマー、ｄＮＴＰ等があげられる。
【００３３】
前記増幅工程で使用する前記増幅用試薬は、例えば、予め前記液滴に含有させてもよいし、前記増幅工程時に前記液滴に添加してもよく、操作が容易であることから、前者が好ましい。前者の場合、例えば、前記エマルション形成工程において、前記増幅用試薬の存在下、液滴を形成し、前記核酸増幅工程において、前記液滴に含まれる前記増幅用試薬を用いて、前記ターゲットゲノムの増幅を行えばよい。また、後者の場合、例えば、前記エマルション形成工程において、前記増幅用試薬の非存在下、液滴を形成し、前記核酸増幅工程において、前記増幅用試薬を添加し、前記ターゲットゲノムの増幅を行えばよい。
【００３４】
前述のように、前記エマルション形成工程は、マイクロ流路を有するデバイスを用いて行えることから、前記増幅工程も、同様に、前記デバイスのマイクロ流路内で行うことが好ましい。この場合、前記デバイスは、例えば、前記導出流路の下流に連結された増幅流路を有し、前記増幅流路内で前記増幅を行うことができる。
【００３５】
前記検出工程は、前述のように、前記液滴における前記ターゲットゲノムの増幅の有無を検出する工程である。前記増幅の有無を検出する方法は、特に制限されず、例えば、前記増幅方法、使用した前記増幅用試薬の種類等に応じて、適宜設定できる。
【００３６】
前記増幅の有無を検出する方法は、特に制限されず、例えば、一般的な、インターカレータ法、プローブ法等があげられる。前記検出には、例えば、前記検出方法に応じて、インターカレータ、プローブ等の検出用試薬が使用できる。前記プローブの種類は、特に制限されず、例えば、ＴａｑＭａｎプローブ等が使用できる。前記検出用試薬は、例えば、前記増幅用試薬と共存させてもよい。
【００３７】
前記検出工程で使用する前記検出用試薬は、例えば、予め前記液滴に含有させてもよいし、前記検出工程時に前記液滴に添加してもよく、操作が容易であることから、前者が好ましい。前者の場合、例えば、前記エマルション形成工程において、前記増幅用試薬および前記検出用試薬の存在下、液滴を形成し、前記核酸増幅工程において、前記液滴に含まれる前記増幅用試薬を用いて、前記ターゲットゲノムの増幅を行い、前記検出工程において、前記液滴に含まれる前記検出用試薬を用いて、前記増幅の有無を検出すればよい。また、後者の場合、例えば、前記エマルション形成工程において、前記増幅用試薬および前記検出用試薬の非存在下、液滴を形成し、前記核酸増幅工程において、前記増幅用試薬を添加し、前記ターゲットゲノムの増幅を行い、前記検出工程において、前記検出用試薬を滴下し、前記増幅の有無を検出すればよい。
【００３８】
前述のように、前記エマルション形成工程および前記増幅工程は、マイクロ流路を有するデバイスを用いて行えることから、前記検出工程も、同様に、前記デバイスのマイクロ流路内で行うことが好ましい。この場合、前記デバイスは、例えば、前記増幅流路の下流に検出流路を有し、前記検出流路内で前記増幅を行うことができる。
【００３９】
本発明において、前記増幅工程と前記検出工程は、例えば、順番に行ってもよいが、同時に行うこともできる。後者の場合、例えば、前記増幅用試薬と前記検出用試薬の共存下で、前記増幅工程と前記検出工程とを行えばよい。また、前記マイクロ流路を有するデバイスを用いる場合、前記デバイスは、例えば、前記導出流路の下流に連結された増幅流路を有し、前記増幅流路内で前記増幅と前記検出とを行うことができる。
【００４０】
前記分取工程は、前述のように、前記ターゲットゲノムの増幅が検出された液滴を、前記ターゲット細胞のターゲットゲノム由来の増幅産物を含むゲノム解析用液滴として分取する工程である。前記核酸増幅後の液滴から、増幅が検出された液滴を選択して分取することにより、例えば、後述するように、これを用いて、ゲノム解析を行うことができる。
【００４１】
前述のように、前記デバイスを用いて前記検出工程までを行った場合には、例えば、前記デバイスから、前記液滴を導出させ、別の容器（マイクロチューブ等）に回収することで単離できる。
【００４２】
本発明は、例えば、前記エマルション形成工程の後、前記核酸増幅工程の前、または前記核酸増幅工程と同時に、前記エマルション内の前記液滴に含まれる細胞について、核酸等の細胞内成分を放出する処理を行う。前記細胞内成分の放出は、特に制限されず、例えば、一般的な細胞溶解試薬を用いることができる。前記細胞溶解試薬は、例えば、前記エマルション工程の後、前記エマルション内の前記液滴に添加してもよいし、前記エマルション形成工程において、前記試料と前記エマルション形成溶媒とに接触させることで、前記エマルション形成溶媒中の液滴に含有させてもよい。前記試薬としては、例えば、界面活性剤と、塩と、溶媒とを含む溶液があげられる。前記界面活性剤としては、例えば、デオキシコール酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム等の陰イオン界面活性剤等があげられ、前記塩としては、例えば、塩化ナトリウム等があげられ、前記溶媒としては、各種緩衝液があげられる。前記試薬の組成の具体例としては、例えば、５０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ、０．５ｗ／ｖ％デオキシコール酸ナトリウム、０．１ｗ／ｖ％ラウリル硫酸ナトリウム、および１．０ｗ／ｖ％  ＮＩＰ−４０が例示できる。前記細胞溶解試薬を前記液滴に含有させることによって、例えば、前記液滴中で、前記細胞から、核酸等の細胞内成分を放出させることができる。前記液滴中で前記細胞から前記細胞内成分を放出させる際、その処理条件は、特に制限されない。
【００４３】
本発明は、さらに、解析工程を含んでもよい。前記解析工程は、例えば、前記解析用液滴に含まれるターゲットゲノム由来の増幅産物について、解析を行う工程である。前記解析については、後述する。
【００４４】
（ターゲット細胞由来のゲノム解析方法）
本発明の解析方法は、前述のように、ターゲット細胞由来のゲノム解析方法であり、
ターゲットゲノム由来の増幅産物を含むゲノム解析用液滴の単離工程と、解析工程とを含み、
前記単離工程は、
細胞を含む試料から、前記本発明の単離方法により、ターゲット細胞のターゲットゲノム由来の増幅産物を含むゲノム解析用液滴を単離する工程であり、
前記解析工程は、
前記単離されたゲノム解析用液滴に含まれる前記増幅産物について、ゲノム解析を行う工程であることを特徴とする。
【００４５】
本発明の解析方法は、本発明の単離方法によってゲノム解析用液滴を単離することがポイントであり、その他の工程や条件は、特に制限されない。本発明の解析方法において、前記単離工程の単離方法は、前記本発明のゲノム解析用液滴の単離方法の記載を援用できる。
【００４６】
本発明の解析方法は、前記単離工程において、解析目的のターゲットゲノムの増幅を行っており、単離した前記ゲノム解析用液滴については、さらに増幅処理を行うことなく、例えば、シーケンシング等の解析を行うことができる。そして、前記単離工程において、解析の対象ではない配列の増幅を行っていないことから、従来のように、短鎖の増幅産物の影響を回避して、目的のゲノム解析を行うことができる。
【００４７】
前記解析工程は、前述のように、前記単離されたゲノム解析用液滴に含まれる前記増幅産物について、ゲノム解析を行う工程である。前記ゲノム解析は、例えば、公知の方法があげられ、具体例としては、ＦＩＳＨ、Ｇ−Ｂａｎｄ、ＮＧＳ等である。
【００４８】
以上、実施形態および実施例を参照して、本発明を説明したが、本発明は、上記発明のスコープ内で当業者が理解し得る様々な変更をすることができる。また、本明細書で引用する特許文献および学術文献等の文献に記載の内容は、全て引用により本明細書に取り込むものとする。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明によれば、ゲノム解析用液滴の単離において、液滴中の細胞の有無を確認するにあたって、後の解析対象となるターゲットゲノムの増幅を行うため、例えば、前述のように、ターゲットゲノムの解析対象ではない短鎖の増幅産物が含まれない。このため、本発明の単離方法により得られたゲノム解析用液滴を用いれば、例えば、前記短鎖の増幅産物の影響を回避して、そのまま、シーケンシングとアッセンブリングとにより、ゲノム解析を行うことができる。