(57)【要約】      （修正有）【課題】良性、前癌性又は非転移性の腫瘍の治療方法の提供。【解決手段】有効量のＶＥＧＦ特異的アンタゴニストを被検体に投与し、前記ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストが、ＶＥＧＦに特異的に結合するポリペプチド、リボザイム、ペプチボディ、アンチセンス核酸塩基オリゴマー、小ＲＮＡ分子およびアプタマーからなる群から選択される、良性、前癌性又は非転移性の腫瘍を発症するリスクにある被検体の治療方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体の良性、前癌性又は非転移性の癌の治療方法であって、有効量のＶＥＧＦ特異的アンタゴニストを被検体に投与することを含む方法。
【請求項２】
前記のＶＥＧＦ特異的アンタゴニストの投与によって、前記の良性、前癌性又は非転移性の癌が浸潤性ないしは転移性の癌になるのが妨げられる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記良性、前癌性又は非転移性の癌がステージ０、ステージＩ又はステージＩＩの癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記のＶＥＧＦ特異的アンタゴニストの投与によって、前記の良性、前癌性又は非転移性の癌がステージＩＩＩ又はステージＩＶの癌に進行するのが妨げられる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記のＶＥＧＦ特異的アンタゴニストの投与により腫瘍サイズが低減する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
癌、ポリープ又は遺伝性癌症候群の家族歴を有する被検体の治療方法であって、該被検体の良性、前癌性又は非転移性の癌の発症ないしは再発を予防するために有効な量のＶＥＧＦ特異的アンタゴニストを該被検体に投与することを含む方法。
【請求項７】
前記方法により、臨床的に検出可能な癌を有したことがない被検体又は良性癌しか有したことのない被検体における前記良性、前癌性又は非転移性の癌の発症又は再発が妨げられる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
切除不能な腫瘍を有する被検体の腫瘍サイズを低減する方法であって、有効量のＶＥＧＦ特異的アンタゴニストを被検体に投与することを含み、該ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストの投与により腫瘍サイズが低減し、それによって腫瘍の完全な切除が可能となる、方法。
【請求項９】
腫瘍の完全な切除の後に、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストの有効量を前記被検体に投与する工程をさらに含む、請求項８に記載の方法。  
【請求項１０】
手術可能な癌を有する被検体の治療方法であって、手術の前にＶＥＧＦ特異的アンタゴニストの有効量を被検体に投与し、手術を行うことによって癌が切除されることを含む、方法。
【請求項１１】
癌の再発を予防するために、手術後にＶＥＧＦ特異的アンタゴニストの有効量を前記被検体に投与する工程をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記のＶＥＧＦ特異的アンタゴニストの投与により微小転移性癌の増殖が妨げられる、請求項９又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストを被検体に投与することを含む、手術可能な癌を有する被検体のネオアジュバント療法の方法。
【請求項１４】
被検体における癌の再発の予防方法であって、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストを被検体に投与することを含み、該投与によって該被検体の癌の再発が妨げられる、方法。
【請求項１５】
被検体における癌再発の可能性を低減する方法であって、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストを被検体に投与することを含み、該投与によって該被検体における癌の再発の可能性が低減される、方法。
【請求項１６】
前記のＶＥＧＦ特異的アンタゴニストの投与により、臨床的に検出可能な腫瘍又はその転移の発生の可能性が妨げられるか又は低減される、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
被検体がＶＥＧＦ特異的アンタゴニストの投与の工程の前に根治手術を受けている、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１８】
ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストが単独療法である、請求項１、６、８、１０、１３、１４、１５および１７の何れか一に記載の方法。
【請求項１９】
被検体が既に抗癌治療により治療されている、請求項１、６、８、１０、１３、１４、１５、１７および１８の何れか一に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗癌療法が抗血管形成療法を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
腫瘍を取り除き、その後にＶＥＧＦ特異的アンタゴニストを被検体に投与する工程を含む、被検体における腫瘍の再増殖の予防方法。
【請求項２２】
腫瘍を取り除き、その後にＶＥＧＦ特異的アンタゴニストを被検体に投与する工程を含む、腫瘍を有する被検体における癌の再発の予防方法。
【請求項２３】
腫瘍の除去とＶＥＧＦ特異的アンタゴニストの投与との間に、２週間より長い期間をさらに含む、請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項２４】
期間が２週間を超え、１年未満である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
腫瘍の除去とＶＥＧＦ特異的アンタゴニストの投与との間に、２８日の期間をさらに含む、請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項２６】
腫瘍の除去とＶＥＧＦ特異的アンタゴニストの投与との間に、手術切開が完全に治癒するか又は傷の裂開の危険性が低くなるために十分な時間である期間をさらに含む、請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項２７】
ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストが単独療法である、請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項２８】
前記癌の再発について被検体をモニタリングすることを更に含む、請求項１、６、８、１０、１３、１４、１５、１８および２２の何れか一に記載の方法。
【請求項２９】
癌又は腫瘍が、胃腸、結腸直腸、胸部、卵巣、肺又は腎臓である、請求項１、６、８、１０、１３、１４、１５、１８、２１および２２の何れか一に記載の方法。
【請求項３０】
更なる抗癌療法を投与することを更に含む、請求項１、６、８、１０、１３、１４、１５、１８、２１および２２の何れか一に記載の方法。
【請求項３１】
前記更なる抗癌療法が化学療法である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記のＶＥＧＦ特異的アンタゴニストが、ＶＥＧＦに特異的に結合するポリペプチド、リボザイム、ペプチボディ、アンチセンス核酸塩基オリゴマー、小ＲＮＡ分子およびアプタマーからなる群から選択される、請求項１、６、８、１０、１３、１４、１５、１８、２１および２２の何れか一に記載の方法。
【請求項３３】
前記のＶＥＧＦに特異的に結合するポリペプチドが、可溶性ＶＥＧＦレセプタータンパク質、ないしはそのＶＥＧＦ結合断片、又はキメラＶＥＧＦレセプタータンパク質である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記キメラＶＥＧＦレセプタータンパク質がＦｌｔ−１／Ｆｃ、ＫＤＲ／Ｆｃ又はＦｌｔ／ＫＤＲ／Ｆｃである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記のＶＥＧＦに特異的に結合するポリペプチドが抗ＶＥＧＦ抗体ないしはその抗原結合断片である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記抗ＶＥＧＦ抗体がモノクローナル抗体である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記モノクローナル抗体がキメラ、ヒト化、又は完全ヒト抗体である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記モノクローナル抗体がベバシズマブである、請求項３７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
癌はヒトの健康を脅かす最も致死率の高いものの一つである。米国だけでも、毎年１，３００，０００人近くの患者が新たに癌に罹患しており、循環器系疾患に次いで２番目の死因となっており、およそ４人に１人を占める。固形腫瘍はこれらの死の大部分の原因である。特定の癌の医学治療においてめざましい進歩があるにもかかわらず、すべての癌の全体の５年生存率は過去２０年においておよそ２０％しか改善されていない。癌又は悪性腫瘍は転移して、制御されずに急速に成長し、タイムリな検出と治療を極めて難しくする。
癌治療の現在の方法は比較的非選択性であり、一般に癌がより悪性な段階に進行した後に腫瘍を標的とするものである。手術は患部組織を取り除き、放射線療法は固形腫瘍を縮小し、そして、化学療法は急速に分裂する細胞を殺す。特に、化学療法は多くの副作用を生じ、場合によっては与えられうる用量を制限するほど重症となるため、有効と思われる薬剤でも使用が妨げられる。さらに、癌は化学療法剤に耐性となることが多い。初期の段階又は良性腫瘍の治療は、悪性又は転移の状態への進行を予防し、それによって癌に伴う羅病率および死亡率を低減することが望ましい。
【０００２】
手術可能な癌を新規に診断されたほとんどの患者にとって、標準的な処置は根治手術の後に化学療法である。このような治療は、再発を予防し、生存率を改善するためにできるだけ多くの初期および転移性疾患を除去することを目的とする。実際、これらのほとんどの患者は手術後に残存する腫瘍の肉眼的所見はない。しかしながら、この患者の多くは後に再発が起こり、最終的にこの疾患で死に至りうる。これは、生存能力のある腫瘍細胞のわずかが手術前に転移性となり、手術を逃れ、現在の検出技術に限界があるために手術後には検出されないために生じる。
したがって、術後アジュバント(補助)治療は、残存する微小転移性癌細胞が再定着し抵抗性になる前にこれらの細胞を取り除くために手術の補助的な武器として重要となっている。過去の数十年間にわたって、アジュバント療法の進歩は概して高まっており、様々な化学療法剤が盛んに用いられている。多くの化学療法投薬計画は、肺、胸部および結腸直腸の癌などの初期段階の主な癌の徴候を有する患者を補助的に治療する際に臨床的有用性を示している。Strauss et al. J Clin Oncol 22:7019 (2004)；International Adjuvant Lung Cancer Trial Collaboration Group N Engl J Med 350:351-60 (2004)。Moertel et al. Ann Intern Med 122:321-6 (1995)；IMPACT Lancet 345:939-44 (1995)；Citron et al. J Clin Oncol 21:1431-9 (2003)。
【０００３】
化学ベースのアジュバント療法の有用性が確立されているにもかかわらず、いかなる種類の化学療法にも伴う１つの主な制限は顕著な毒性である。一般に、化学療法剤は腫瘍部位を標的とするものではなく、正常細胞と腫瘍細胞とを区別することができない。毒性の問題は、特に、長い治療および患者の生活の質への長続きする影響のためにアジュバント環境においては負荷となる。さらに、再発のリスクが低い患者のアジュバント化学療法の利点は不明なままであり、彼らが化学療法の副作用を被ることに価値があるかどうか、疑問にさせるものである。
主な根治手術の前に施される補助治療であるネオアジュバント(術前補助)療法は、癌療法の他の重要な一部として浮かび上がっている。根治手術の前にネオアジュバント処置を行う利点がいくつかある。第一に、腫瘍体積、腹水および胸水の浸出が減少するために、手術前の患者の一般状態を向上することが促されうる。第二に、腫瘍体積が減少することによって、手術範囲が減少し患者の臓器およびその機能が保護されうる。これは、例えば乳癌患者にとって特に貴重である。また、腫瘍体積が減少することによって手術が不可能な腫瘍の手術が可能となりうる。最後に、ネオアジュバント療法は、手術によって完全に腫瘍を除去する可能性を向上させ、これによって生存を向上させうる。過去１０年にわたって、乳癌、頭頸部癌、直腸癌、膀胱癌、非小細胞肺癌、子宮頸癌、食道および胃癌および前立腺癌などの癌を有する患者を治療するために、様々な化学療法剤や放射線を用いたネオアジュバント療法について多くの臨床試験が行われている。概要については、Tanvetyanon et al., Southern Med. J. 98:338-344 (2005)を参照。
【０００４】
前述したように、いかなる種類の化学療法にも伴うある主な制限は、顕著な毒性である。多くのネオアジュバント化学療法投薬計画はわずらわしく、長い期間にわたる常習的な治療を必要とする。さらに、再発のリスクが低い患者のアジュバント化学療法の利点、特に生存率的な利点は不明なままであり、彼らがすぐに手術をしないで待つことに価値があるかどうか、疑問にさせるものである。
血管新生は、血管内皮細胞が増殖して、切り取って、既存の血管性網状組織から新規な血管を形成するように再編成する重要な細胞性の現象である。血管供給の発達は正常な増殖過程にも病理学的な増殖過程にも必須のものであるというやむを得ない証拠がある。酸素と養分の送達だけでなく、代謝産物の除去は、多細胞生物に生じるほとんどの増殖過程において律速段階を表す。
【０００５】
新規な血管の誘導が腫瘍血管新生の主な様式であると考えられているが、最近のデータはいくつかの腫瘍は既存の宿主血管を取り込むことによって成長しうることを示した。取り込まれた血管系は次いで退行し、腫瘍縁辺で酸素圧低下により誘導される血管新生によって最終的に逆になる腫瘍退行を引き起こす。
正常および異常な血管新生の両方の重要なポジティブ調節因子の一つは、血管内皮性増殖因子(ＶＥＧＦ)−Ａである。ＶＥＧＦ−Ａは、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−Ｅ、ＶＥＧＦ−ＦおよびＰｌＧＦを含む遺伝子ファミリーの一つである。ＶＥＧＦ−Ａは、２つの高親和性レセプターチロシンキナーゼであるＶＥＧＦＲ-１(Ｆｌｔ-１)およびＶＥＧＦＲ-２(Ｆｌｋ-１／ＫＤＲ)にまず結合し、その後、ＶＥＧＦ−Ａの血管内皮細胞分裂シグナル伝達の主な伝達物質となる。さらに、ニューロピリン−１は、ヘパリン-結合ＶＥＧＦ−Ａアイソフォームのレセプターとして同定されており、血管の発達において役割を果たしうる。
【０００６】
血管新生因子であることに加えて、多面発現性増殖因子としてのＶＥＧＦは、内皮細胞の生存および増殖、血管透過性および拡張、単球走化性およびカルシウム流入などの他の生理学的過程において複数の生物学的効果を現す。さらに、他の研究では、網膜色素上皮細胞、膵管細胞およびシュワン細胞などの内皮細胞でないわずかな種類の細胞に対してＶＥＧＦが分裂促進作用を有することが報告されている。
病的状態において血管新生の主な調節因子としてＶＥＧＦが認識されたことにより、病理学的血管新生を伴う状態においてＶＥＧＦ活性を遮断するという試みが生じている。
ＶＥＧＦ発現は大多数の悪性腫瘍において上方制御されており、ＶＥＧＦの過剰発現は、多くの固形腫瘍の進行した段階又は予後不良と相関している。したがって、ＶＥＧＦシグナル伝達経路を阻害する分子が、病理学的血管新生が強調される比較的進行した固形腫瘍の治療のために用いられている。
【０００７】
後期段階および転移腫瘍ないしは浸潤性腫瘍を含み、病理学的血管新生を伴う状態又は疾患の発達におけるＶＥＧＦの役割が関係している所見があるにもかかわらず、初期段階ないしは良性癌、休止状態の後の腫瘍の再発における、又は休止中の腫瘍、悪性腫瘍ないしは微小転移性癌のからの二次部位腫瘍の発達におけるＶＥＧＦの役割についてはほとんど知られていない。本発明はこれらおよび他の必要性を解決するためのものであり、それは以下の開示を参照することにより明らかであろう。
【発明の概要】
【０００８】
化学療法と組み合わせるＶＥＧＦ特異的アンタゴニストの使用は、中でも転移性結腸直腸癌および非小細胞肺癌の患者において有益であることが示されているが、良性又は初期の腫瘍、休止状態、手術又は他の介入の後の腫瘍の再発、休止腫瘍、悪性腫瘍又は微小転移性癌からの二次部位腫瘍の発達に対する、又は、アジュバントないしはネオアジュバント環境においての、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストの影響についてはほとんど知られていない。本発明者等は、本明細書において、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストは良性、前癌性、非転移性および手術可能な腫瘍を含む初期段階の腫瘍の治療に用いられうることを示す結果を提供する。結果は、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストが、癌(例えば良性又は悪性の癌)のネオアジュバント療法のために、又はアジュバント療法の方法を含む癌再発(例えば良性又は悪性の癌)の可能性を予防しておよび／又は低減するために用いられうることをさらに示す。本発明は、良性、初期段階、および手術可能な(手術の前および後の)癌を含む、癌患者のより有効で毒性の低い治療についてのめざましい医学的発見を構成する。
【０００９】
したがって、本発明は、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストの有効量を被検体に投与することを含む、被検体の良性、前癌性又は転移性の癌の治療方法を特徴とする。ある実施態様では、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストの投与によって、前記の良性、前癌性又は非転移性の癌が浸潤性ないしは転移性の癌になるのが妨げられる。例えば、前記の良性、前癌性又は非転移性の癌はステージ０、ステージＩ又はステージＩＩの癌であり、ある実施態様では、前記のＶＥＧＦ特異的アンタゴニストの投与によって、前記の良性、前癌性又は非転移性の癌が次のステージ、例えばステージＩ、ステージＩＩ、ステージＩＩＩ又はステージＩＶの癌に進行するのが妨げられる。ある実施態様では、前記ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストは、被検体の良性、前癌性又は非転移性の腫瘍を治療するため、又は良性、前癌性又は非転移性の腫瘍が浸潤性ないしは転移性の癌になるのを妨げるために十分な量で、一時の間投与される。ある実施態様では、前記ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストは、良性、前癌性又は非転移性の腫瘍の腫瘍サイズ、腫瘍量、又は腫瘍数を低減する。また、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストは、良性、前癌性又は非転移性の腫瘍の血管密度を減少させるために一時の間、ある量で投与されてもよい。
【００１０】
本明細書において記述されるように、本発明の方法は、例えば、ステージ０(例えばインサイツのカルチノーマ)、ステージＩ又はステージＩＩの癌を治療するために用いられうる。ネオアジュバントおよびアジュバント療法の方法は、良性又は悪性などのあらゆる種類の癌を治療するために用いられうる。本発明のある実施態様では、癌は、上皮細胞固形腫瘍、例えば、限定するものではないが、胃腸癌、大腸癌、乳癌、前立腺癌、腎臓癌、肺癌(例えば非小細胞肺癌)、メラノーマ、卵巣癌、膵癌、頭頸部癌、肝癌および軟組織癌(例えばＮＨＬおよび多発性骨髄腫のようなＢ細胞リンパ腫および慢性リンパ球性白血病のような白血病)である。他の実施態様では、良性、前癌性又は非転移性の癌は、ポリープ、腺腫、線維腫、脂肪腫、ガストリノーマ、インスリノーマ、軟骨腫、骨腫、血管腫、リンパ管腫、髄膜腫、平滑筋腫、横紋筋腫、扁平細胞乳頭腫、聴覚の神経腫、神経線維腫、胆管嚢胞腺腫(cystanoma)、平滑筋腫、中皮腫、テラトーマ、粘液腫、トラコーマ、肉芽腫、過誤腫、移行細胞乳頭腫、唾液腺の多形性腺腫、類腱腫、類皮嚢胞乳頭種、嚢腺腫、局所性の結節性の過形成、又は結節性の再生性過形成である。他の実施態様では、方法は、腺腫を治療するために用いられるのが望ましい。腺腫の非限定的な例には、肝細胞腺腫、腎臓腺腫、後腎腺腫、気管支の腺腫、胞状の腺腫、副腎腺腫、下垂体腺腫、副甲状腺腺腫、膵臓腺腫、唾液腺腺腫、肝細胞性腺腫、胃腸腺腫、管状腺腫、および胆管腺腫が含まれる。
【００１１】
また、本発明は、被検体の良性、前癌性又は非転移性の癌の発症ないしは再発を予防するために有効な量のＶＥＧＦ特異的アンタゴニストを被検体に投与することを含む方法を特徴とする。本発明のある実施態様では、被検体は、癌、ポリープ又は癌症候群の危険がある。ある例では、被検体は、癌、ポリープ又は遺伝性の癌症候群(例えば複合内分泌腺新生物１型(ＭＥＮ１))の家族歴を有する。本発明のある態様では、被検体は、良性、前癌性又は非転移性の胃腸腫瘍、類腱腫又は腺腫(例えば胃腸腺腫、下垂体腺腫又は膵臓腺腫)を発症するリスクにある。ある実施態様では、前記方法によって、腫瘍を有したことがない被検体、臨床的に検出可能な癌を有したことがない被検体、又は良性腫瘍しか有したことのない被検体における前記良性、前癌性又は非転移性の癌の発症又は再発が妨げられる。
他の態様では、本発明は、被検体のステージ０、ステージＩ、又はステージＩＩの胃腸腫瘍を治療するために十分な量と時間でＶＥＧＦ特異的アンタゴニストを被検体に投与することを含む、被検体のステージ０、ステージＩ、又はステージＩＩの胃腸腫瘍の治療方法を特徴とする。胃腸腫瘍は、肛門癌、結腸直腸癌、直腸癌、食道癌、胆嚢癌、胃癌、肝癌、膵癌および小腸の癌を含む胃腸系のステージ０、ステージＩ、又はステージＩＩの癌のいずれかでありうる。一実施態様では、胃腸腫瘍は、ステージ０(例えば高いグレードの腺腫)又はステージＩの腫瘍である。一実施態様では、被検体は、胃腸腫瘍を治療するための切除をまだ経ていない。
【００１２】
他の態様では、本発明は、被検体の胃腸腫瘍の発症又は再発を予防するために十分な量と時間でＶＥＧＦ特異的アンタゴニストを被検体に投与することを含む、胃腸腫瘍を発症するリスクにある被検体の治療方法を特徴とする。胃腸腫瘍は、限定するものではないが、腺腫、一又は複数のポリープ、又はステージ０、Ｉ又はＩＩの癌を含むいずれの胃腸腫瘍であってもよい。
上記方法のある実施態様では、被検体は、５０歳以上のヒトであるか、遺伝性の癌症候群を有するか、又は、大腸癌又はポリープの家族歴を有する。遺伝性の胃腸癌の非限定的な例には、家族性大腸ポリープ症(ＦＡＰ)、ガードナー症候群、膵癌および遺伝性非ポリープ症結腸直腸癌(ＨＮＰＣＣ)が含まれる。ある実施態様では、被検体は、結腸内視術を既に行っていてもよいし、行っていなくてもよい。一実施態様では、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストは、ＦＡＰを有する被検体の腺腫性結腸直腸ポリープ症の数を低減するための時間と量で投与される。
【００１３】
他の態様では、本発明は、被検体の癌の再発の可能性を妨げるか又は低減するために十分な量と時間でＶＥＧＦ特異的アンタゴニストを被検体に投与することを含む、被検体の癌の再発の可能性を予防又は低減する方法を特徴とする。本発明は、腫瘍を取り除き(例えば根治手術を使用して)、その後被検体にＶＥＧＦ特異的アンタゴニストを投与する工程を含む、腫瘍を有する被検体の癌の再発を予防する方法を含む。本発明は、腫瘍を取り除き(例えば根治手術を使用して)、その後被検体にＶＥＧＦ特異的アンタゴニストを投与する工程を含む、腫瘍を有する被検体の癌の再増殖を予防する方法を含む。関連の態様では、本発明には、被検体の癌の再発を予防する方法又は被検体の癌の再発の可能性を低減する方法であって、場合によって、手術の前にＶＥＧＦ特異的アンタゴニストの有効量を被検体に投与し、根治手術を行い、そして手術後にＶＥＧＦ特異的アンタゴニストの有効量を投与することを含み、この手術後のＶＥＧＦ特異的アンタゴニストの投与により、癌の再発が妨げられるか又は癌の再発の可能性が低減される方法が含まれる。他の関連した態様では、本発明には、被検体の癌の再発を予防する方法又は被検体の癌の再発の可能性を低減する方法であって、任意の更なる抗癌治療剤が存在しない場合に、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストの有効量を被検体に投与することを含み、この投与により、被検体の癌の再発が妨げられるか又は被検体の癌の再発の可能性が低減される方法が含まれる。
【００１４】
上記それぞれの態様では、腫瘍は、本明細書中に記載の固形腫瘍および特に腫瘍および腺腫を含むがこれに限らずいずれの種類の腫瘍であってもよい。被検体は、臨床的に検出可能か又は検出可能でない休止中の腫瘍又は微小転移性癌を有しうる。この態様の一実施態様では、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストは、休止中の腫瘍又は微小転移性癌の血管新生を低減するために十分な量と時間で投与される。他の実施態様では、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストは、臨床上検出可能な腫瘍の発症又はその転移を予防するため、ないしは被検体の生存期間を増加させるために十分な量と時間で投与される。
一実施態様では、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストは単独療法である。他の実施態様では、被検体は、例えば抗癌療法を用いて腫瘍について既に治療されている。ある例では、抗癌療法は手術である。他の実施態様では、被検体は、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストの投与の前、最中(例えば、同時)、又は後に更なる抗癌療法にて更に治療されうる。抗癌療法の例には、手術、放射線療法(放射線治療)、生物療法、免疫療法、化学療法又はこれら療法の組合せが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００１５】
被検体が根治手術を経た実施態様では、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストは、通常、被検体が手術から回復する期間の後に投与される。この期間には、外科的な切開の創傷治癒又は治癒に必要な期間、創傷裂開のリスクが低くなるために必要な期間、又は手術前の健康レベルと本質的に同等か又はそれより良好な健康レベルに回復するために被検体に必要とされる期間が含まれうる。また、根治手術の完了とＶＥＧＦ特異的アンタゴニストの第一投与との間の期間には、被検体が治療的投薬の間に一定の時間を必要とするか又は患者が求める休薬期間に必要な期間が含まれうる。一般に、根治手術の完了とＶＥＧＦ特異的アンタゴニスト療法の開始との間の期間には、１週間未満、１週間、２週間、３週間、４週間(２８日)、５週間、６週間、７週間、８週間、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１年、２年、３年、それ以上が含まれうる。一実施態様では、根治手術とＶＥＧＦ特異的アンタゴニストの投与との間の期間は、２週を超え、１年未満である。
上記それぞれの態様は、癌の再発について被検体をモニタリングすることを更に含みうる。
【００１６】
また、本発明は、被検体、例えばヒト患者の手術可能な癌の手術除去前のネオアジュバント療法の方法であって、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニスト、例えばベバシズマブの有効量を患者に投与することを含み、該患者が腫瘍又は癌と診断されている方法を提供する。ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストは、単独で、又は、少なくとも一つの化学療法剤と組み合わせて投与されてもよい。
また、本発明には、手術の前にＶＥＧＦ特異的アンタゴニストの有効量を被検体に投与し、その後手術を行うことによって癌が切除されることを含む、手術可能な癌を有する被検体の治療方法が含まれる。一実施態様では、前記方法は、癌の再発を予防するために、手術後にＶＥＧＦ特異的アンタゴニストの有効量を前記被検体に投与する工程をさらに含む。
【００１７】
他の態様では、本発明は、根治手術の前に、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニスト、例えばベバシズマブの有効量と、少なくとも一の化学療法剤とを、手術可能な癌を有する被検体に投与することを含む、ネオアジュバント療法の方法に関する。前記方法は、被検体の無病生存率(ＤＦＳ)又は全生存率(ＯＳ)を延長させるために用いられうる。一実施態様では、ＤＦＳ又はＯＳは処置開始のおよそ２〜５年後に評価される。
他の態様では、本発明は、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストの有効量を被検体に投与することを含み、この投与によって腫瘍サイズが低減し腫瘍の完全な切除が可能となる、切除不可能な腫瘍を有する被検体における腫瘍サイズを低減する方法を含む。一実施態様では、前記方法は、腫瘍の完全な切除の後に、被検体にＶＥＧＦ特異的アンタゴニストの有効量を投与することを更に含む。
【００１８】
他の態様では、本発明は、以下の工程を含む、被検体の癌の治療方法に関する。ａ) 各周期が、所定の間隔で、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニスト、例えばベバシズマブの有効量と、少なくとも一つの化学療法剤を被検体に投与することを含む、複数の治療周期を含む第一段階、ｂ) 癌が取り除かれる根治手術、そして、ｃ) 各周期が、所定の間隔で、いずれの化学療法剤も伴わずに、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニスト、例えばベバシズマブの有効量を被検体に投与することを含む、複数の維持周期を含む第二段階。一実施態様では、第一段階は、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニスト、例えばベバシズマブと第一化学療法投薬が投与される第一の複数の治療周期の後に、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニスト、例えばベバシズマブと第二化学療法投薬が投与される第二の複数の治療周期を含む。一実施態様では、治療される癌が乳癌である場合、第一化学療法投薬はドキソルビシンとシクロホスファミドを含み、第二化学療法投薬はパクリタキセルを含む。
【００１９】
本発明は、根治手術の後に、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニスト、例えばベバシズマブの有効量を、転移性又は非転移性の癌を有する被検体に投与することを含む方法を提供する。一実施態様では、前記方法は少なくとも一つの化学療法剤の使用を更に含む。前記方法は被検体のＤＦＳ又はＯＳを延ばすために用いられうる。一実施態様では、ＤＦＳ又はＯＳは治療開始のおよそ２〜５年後に評価される。一実施態様では、被検体は治療後少なくとも１〜５年の間無病である。
一態様では、方法は、ａ) 各周期が、所定の間隔で、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニスト、例えばベバシズマブの有効量と、少なくとも一つの化学療法剤を被検体に投与することを含む、複数の治療周期を含む第一段階とｂ) 各周期が、所定の間隔で、いずれの化学療法剤も伴わずに、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニスト、例えばベバシズマブの有効量を被検体に投与することを含む、複数の維持周期を含む第二段階とを含み、このとき、組み合わせた第一および第二の段階は、最初の術後治療の後、少なくとも１年の間継続される。一実施態様では、第一段階は、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニスト、例えばベバシズマブと第一化学療法投薬が投与される第一の複数の治療周期の後に、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニスト、例えばベバシズマブと第二化学療法投薬が投与される第二の複数の治療周期を含む。治療される癌が乳癌である場合、例えば、第一化学療法投薬はドキソルビシンとシクロホスファミドを含み、第二化学療法投薬はパクリタキセルを含む。
【００２０】
上記各々の態様のある実施態様では、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストは、ＶＥＧＦに結合するか又はＶＥＧＦ発現ないし生物活性を減弱する化合物である。ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストは、以下の例示的な化合物のいずれか一つであってもよい。ＶＥＧＦに特異的に結合するポリペプチド、ＶＥＧＦ特異的リボザイム、ＶＥＧＦ特異的ペプチボディ、ＶＥＧＦポリペプチドをコードする核酸分子の少なくとも一部に相補的なアンチセンス核酸塩基オリゴマー、ＶＥＧＦポリペプチドをコードする核酸分子の少なくとも一部に相補的な小ＲＮＡ分子、又はアプタマー。ＶＥＧＦに特異的に結合するポリペプチドは、可溶性ＶＥＧＦレセプタータンパク質、又はそのＶＥＧＦ結合断片、又はキメラＶＥＧＦレセプタータンパク質、例えばＦｌｔ−１／Ｆｃ、ＫＤＲ／Ｆｃ又はＦｌｔ／ＫＤＲ／Ｆｃであってもよい。また、ＶＥＧＦに特異的に結合するポリペプチドは、抗ＶＥＧＦ抗体又はその抗原結合断片であってもよい。抗ＶＥＧＦ抗体又はその抗原結合断片は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、完全なヒト抗体又はヒト化抗体であってもよい。本発明の方法で有用な例示的な抗体には、ベバシズマブ(ＡＶＡＳＴＩＮ(登録商標))、Ｇ６-３１、Ｂ２０-４．１およびこれらの断片が含まれる。また、抗体又はその抗原結合断片は、Ｆｃ部、Ｆ(ａｂ')２、Ｆａｂ又はＦｖ構造を欠く抗体であってもよい。
【００２１】
疾患の種類および重症度に応じて、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニスト、例えばベバシズマブの所定の用量は本明細書中に記載されており、およそ１μｇ／ｋｇからおよそ５０ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくはおよそ５ｍｇ／ｋｇからおよそ１５ｍｇ／ｋｇ、例として限定するものではないが７．５ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇでありうる。投与の頻度は、疾患の種類や重症度によって変化するであろう。数日以上にわたって投与を繰り返す場合には、状態に応じて、本明細書中に記載の方法ないしは当分野で公知の方法によって測定されるところの、癌が治療されるまで、又は所望の治療効果が達成されるまで治療が続けられる。ある例では、本発明のＶＥＧＦ特異的アンタゴニスト(例えば抗体)は、週に１回、２週間に１回、又は３週間に１回、およそ５ｍｇ／ｋｇからおよそ１５ｍｇ／ｋｇ、例えば限定するものではないが７．５ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。しかしながら、他の投与計画が有用であるかもしれない。本発明の療法の経過は、従来の技術およびアッセイによって容易にモニターされる。
上記各々の態様の更なる実施態様では、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストは、局所的に、又は、全身的に(例えば、経口又は静脈内に)投与される。一実施態様では、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストによる治療は、患者が、１年、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年、１０年、１１年および１２年からなる群から選択される期間の間、癌がなくなるまでの間の長期にわたる。
【００２２】
被検体は、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストの投与の前、最中又は後に多くの異なる方法で治療されうるが、各々の本発明の態様の一実施態様では、被検体は手術又は化学療法なしで治療される他の実施態様では、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストによる治療は、臨床医によって評価されるか又は本明細書において記述されるように、単独療法であるか、又はＶＥＧＦ特異的アンタゴニスト治療期間の間単独療法である。
他の実施態様では、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストによる治療は、更なる抗癌療法、例えば限定するものではないが、手術、放射線療法、化学療法、鑑別療法、生物療法、免疫療法、血管新生インヒビターおよび抗増殖性化合物と組み合わされる。また、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストによる治療は、上記の種類の治療的投薬のいずれか組合せも含んでもよい。さらに、細胞障害性剤、抗血管形成剤および抗増殖性剤が、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストと組み合わせて用いられてもよい。一実施態様では、抗癌療法は化学療法である。例えば、化学療法剤は、例えば、アルキル化剤、アンチメタボライ、葉酸類似体、ピリミジン類似体、プリン類似体および関連するインヒビター、ビンカアルカロイド、エピポドフィロトキシン、抗生物質、Ｌ-アスパラギナーゼ、トポイソメラーゼインヒビター、インターフェロン、プラチナ配位複合体、アントラセンジオン置換尿素、メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤、副腎皮質ステロイド、プロゲスチン、エストロゲン、抗エストロゲン、アンドロゲン、抗アンドロゲン物質、性腺刺激ホルモン放出ホルモンなどから選択される。いくつかの態様では、化学療法剤およびＶＥＧＦ特異的アンタゴニストが同時に投与される。
【００２３】
更なる抗癌療法を含む実施態様では、被検体は、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストの投与の前、最中(例えば同時)、又は後に更なる抗癌療法によって更に治療されうる。一実施態様では、抗癌療法は、それについてイリノテカン、フルオロウラシル、ロイコボリン、ゲムシタビン又はこれらの組合せの投与を含む化学療法である。一実施態様では、単独ないしは抗癌療法と共に投与されるＶＥＧＦ特異的アンタゴニストは、維持療法として投与されうる。一態様では、前立腺癌、卵巣癌および乳癌のための抗癌療法はホルモン療法であってもよい。ある例示的実施態様では、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストは、抗Ｈｅｒ２抗体、又はその断片ないしはその誘導体(例えばハーセプチン(登録商標)抗体)を含まない抗癌療法と組み合わせて投与される。
本発明の方法は、初期腫瘍を治療および予防することによって、進行した癌に伴う罹病率および死亡率の減少を生じさせるより進行した段階への進行を妨げる際に特に有益である。また、本発明の方法は、腫瘍の再発、又は腫瘍、例えば初期腫瘍の除去の後に存続する休止中の腫瘍の再増殖を予防する際に、又は微小転移性癌の発症ないしは増殖を低減又は予防する際にも有益である。
本発明の方法には、癌は、固形腫瘍、例えば例として、乳癌、結腸直腸癌、直腸癌、肺癌、腎臓細胞癌、神経膠腫(例えば未分化星状細胞腫、未分化オリゴ星状細胞腫、未分化乏突起細胞腫、多形性神経膠芽腫)、腎臓癌、前立腺癌、肝癌、膵癌、軟組織肉腫、カルチノイドカルチノーマ、頭頸部癌、メラノーマおよび卵巣癌であってもよい。一実施態様では、癌は胃腸癌である。
【００２４】
本発明の上記各々の態様の更なる実施態様では、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストは、良性、前癌性又は非転移性の癌を含むがこれらに限定されるものではない腫瘍又は癌の癌細胞数を(例えば２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％以上)減少させるために、腫瘍、ポリープ又は腺腫のサイズを低減するために、腫瘍量を低減するために、周辺臓器への癌細胞の浸潤を阻害するために(すなわち、ある程度減弱するかおよび／又は停止させるために)、ホルモンの分泌を低減するために、ポリープの数を減少させるために、良性、前癌性又は非転移性の癌を含むがこれらに限定されるものではない腫瘍又は癌の血管密度を低減するために、腫瘍転移を阻害するために、腫瘍成長又は腫瘍細胞増殖を低減するか又は阻害するために、休止中の腫瘍の成長を低減するか又は予防するために、微小転移性癌の成長又は増殖を低減するか又は予防するために、治療又は除去の後に腫瘍の再成長を低減するか又は予防するために、良性、前癌性又は非転移性の腫瘍を有することが疑われる被検体又は診断された被検体のＤＦＳ又はＯＳを増加させる又は延長させるために、および／又は癌と関係している症状の一又は複数をある程度軽減させるために、ある量又はある時間で投与される。ある例では、生存率は被検体のＤＦＳ又はＯＳとして測定され、ＤＦＳ又はＯＳは治療開始のおよそ２〜５年後に評価される。いくつかの更なる実施態様では、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストは、被検体の癌の発症又は再発を予防するために用いられる。ある例では、癌再発の防止は、疾患再発が集団の少なくともおよそ８０％で生じなかったことを確認するために、およそ４年後に被検体の集団において評価される。他の例では、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストは、被検体における腫瘍又は癌の再発の可能性を低減するために用いられる。ある例では、癌再発はおよそ３年に評価され、このとき癌の再発は化学療法単独によって治療される被検体と比較して少なくともおよそ５０％減少する。
また、本発明の方法は、癌又は腫瘍の再発について被検体をモニターすることを含みうる。
本発明の他の特徴や利点は、以下の詳細な説明、図面、および特許請求の範囲から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】Ａｐｃｍｉｎ／＋腺腫および正常な絨毛におけるＶＥＧＦ−Ａ発現を示す一連の顕微写真である。１４週齢のＡｐｃｍｉｎ／＋マウスの小腸(図１Ａ、１Ｄ)および大腸(図１Ｂ、１Ｅ)の腸管腺腫、並びに正常絨毛(図１Ｃ、１Ｆ)に対するＶＥＧＦ−Ａをプローブとしたインサイツハイブリダイゼーションは、上皮細胞(矢印)および間質細胞(矢頭)におけるＶＥＧＦ−Ａ発現を示す。明視野；図１Ａ−１Ｃ、暗視野；図１Ｄ−１Ｆ。
【図２Ａ】図２Ａ−Ｆは、ＶＥＧＦ−Ａの阻害は腫瘍量を低減し生存率を延長することを示す一連のグラフである。図２Ａは一群の個体マウスの腫瘍量を示すグラフである。腫瘍量は、最大から最小の腫瘍量の値をバーで示す。白いクロスは群平均を示す。＊Ｐ＜０．００８、＊＊ｐ＜５．３×１０−５。Ｎは動物数を示す。
【図２Ｂ】腫瘍全数の割合と直径によって腫瘍の分布を示す一連のグラフである。Ｎは一群の腫瘍の数を示す。
【図２Ｃ】処置の３週間後(上段)および処置の６週間後(中段)の、腫瘍サイズ頻度のオーバレイを示す一連のグラフである。下段グラフは、０日目(下段)と比較したときの腫瘍サイズ頻度のオーバレイを示す。垂直バーは、ｍＡｂ Ｇ６-３１処置動物において大きくなる腫瘍頻度のサイズ以下を示す。３週間の処置で１ｍｍおよび６週間の処置で１．２ｍｍ。
【図２Ｄ】腸管の位置に対してプロットされる平均腫瘍直径を示すグラフである。Ｎは、第一、第二、第三、および第４小腸区画それぞれの１群当たりの腫瘍数を示す。０日目は、１２匹の動物を含み、他のグループは１０匹を含む。Ｓ；胃、Ｃ；盲腸、Ｒ；直腸。バーはＳＥＭを表す。＊Ｐ＜１．０×１０−１０、ｍＡｂ Ｇ６−３１  ３又は６週と比較した時の＊＊ｐ＜０．００２。
【図２Ｅ】降順に示す１４のＡｐｃｍｉｎ／＋ビリン−Ｃｒｅ(黒色カラム)およびＡｐｃｍｉｎ／＋；ＶＥＧＦｌｏｘ；ビリン−Ｃｒｅ(灰色カラム)マウスの平均腫瘍直径を示すグラフである。バーは標準偏差(ＳＤ)を表す。
【図２Ｆ】ｍＡｂ Ｇ６−３１処置マウス(灰色の線)又はコントロールＩｇＧ(黒色の線)のカプラン・マイヤーを示すグラフである。白色矢印は処置の継続を表す。生存期間の中央値は灰色の矢印によって示される。＊Ｐ＜２．４×１０−３。Ｎは一群中のマウスの数を表す。
【図３】図３Ａ−３Ｌは、増殖的な指標でなく腫瘍形態を変える際の抗ＶＥＧＦ−Ａ治療の効果を示す。図３Ａ−３Ｂは、メチレンブルーで染色した小腸の空腸部分の顕微写真である。図３Ｃ−３Ｄは、Ｈ＆Ｅ染色した空腸の切片の低倍率画像を示す顕微写真である。図３Ｅ−３Ｆは、Ｈ＆Ｅ染色した空腸の腫瘍切片の高倍率画像を示す顕微写真である。図３Ｇ−３Ｊは、腫瘍組織および正常な粘膜のＫｉ−６７抗体による免疫組織化学的染色を示す顕微写真である。Ｈ＆Ｅによる対比染色。図３Ｋは、核の総数と比較したときのＫｉ−６７についての核ポジティブの割合として表す増殖指標を示すグラフである。バーはＳＥＭを表す。図３Ｌは、コントロールＩｇＧ(Ｎ１−Ｎ４)又はｍＡｂ Ｇ６−３１(Ｎ５−Ｎ８)にて処置した動物からの正常な粘膜溶解物のウエスタンブロット分析である。コントロールＩｇＧ(Ｔ１−Ｔ４)又はｍＡｂ Ｇ６−３１(Ｔ５−Ｔ８)にて処置した動物からの腫瘍溶解物。
【図４】ｍＡｂ Ｇ６−３１処置により低減された腫瘍血管領域密度を示す。図４Ａ−Ｂは、空腸からの腫瘍の免疫組織化学的染色からの８０μｍ切片の共焦点画像である。グリーン−ＣＤ３１、血管内皮細胞；青−Ｅカドヘリン、上皮細胞；赤−平滑筋アクチン。図４Ｃは、分析した総腫瘍領域と比較したときのＣＤ３１についてポジティブなパーセント領域として表される血管性密度を示すグラフである。バーはＳＥＭを表す。ｎは分析した腫瘍の数を示す。
【図５】抗ＶＥＧＦ−Ａ処置が下垂体腫瘍成長を阻害することを示す一連のグラフである。図５Ａは、処置の９、２５、３９、５３および６７日目のコントロールＩｇＧ(黒色線)およびｍＡｂ Ｇ６−３１(灰色線)処置群の平均腫瘍体積を示すグラフである。バーはＳＥＭを表す。Ｎは一群中のマウスの数を示す。図５Ｂは、コントロールＩｇＧ(実線)又はｍＡｂ  Ｇ６−３１(破線)にて処置した個々のマウスの腫瘍体積を示すグラフである。７匹のマウスは、病気のため研究のエンドポイントの前に安楽死した(６７日時に終了)。図５Ｃは、処置開始後の９、２５、３９、５３および６７日目に評価したコントロールＩｇＧ(黒色線)およびｍＡｂ Ｇ６−３１(灰色線)処置群の腫瘍倍増のない生存率を示すグラフである。図５Ｃは、処置の１、７、１４、２１、２８および３５日目のコントロールＩｇＧ(黒色線)およびｍＡｂ Ｇ６−３１(灰色線)処置皮下下垂体腫瘍移植の腫瘍体積測定値を示すグラフである。バーはＳＥＭを表す。Ｎは一群中のマウスの数を示す。
【図６】脳下垂体およびＭｅｎ１＋／−下垂体腺腫がＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦＲ−１およびＶＥＧＦＲ−２を発現することを示すグラフである。ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦＲ−１およびＶＥＧＦＲ−２の相対的な発現は、野生型脳下垂体(黒色カラム)、Ｍｅｎ１＋／−マウスの非腫瘍性脳下垂体組織(灰色)、小さい未処置下垂体腺腫、コントロールＩｇＧ処置下垂体腫瘍(赤色)、およびＭｅｎ１＋／−マウスのｍＡｂ Ｇ６−３１処置下垂体腫瘍(青色)について示す。バーはＳＥＭを表す。Ｎｓ；有意でない。
【図７】Ｍｅｎ１＋／−マウスからの代表的な下垂体腫瘍の一連のＭＲＩ画像である。処置の９、３９および６７日目のコントロールＩｇＧおよびｍＡｂ Ｇ６−３１処置マウスの下垂体腺腫を有する冠状切片を示す。９日の間、下垂体腺腫の端は黄色のアスタリスクにより強調されている。処置開始後９、３９および６７日目それぞれの、コントロールＩｇＧ処置腫瘍の体積は２３．２、５５．９および１４２．０ｍｍ３であり、ｍＡｂ Ｇ６−３１処置腫瘍の体積は１８．９、２７．２および３５．３ｍｍ３であった。
【図８】Ｍｅｎ１＋／−マウスの下垂体および膵臓の腫瘍の組織学的試験を示す一連の画像である。図８Ａ−ＢはＨ＆Ｅ染色した下垂体腫瘍を示し、図８Ｅ−ＦはＨ＆Ｅ染色した膵臓腫瘍を示す。図８Ｃ−Ｄは、汎内皮細胞マーカーＭＥＣＡ−３２によるインサイツの下垂体腫瘍の免疫組織化学染色を示し、図８Ｇ−Ｈは、汎内皮細胞マーカーＭＥＣＡ−３２によるインサイツの膵臓腫瘍の免疫組織化学染色を示す。図８Ｉは、下垂体腫瘍における血管密度をアッセイした結果を示すグラフであり、図８ＪはコントロールＩｇＧおよび抗ＶＥＧＦ処置動物における膵臓腫瘍の血管密度をアッセイした結果を示すグラフである。バーはＳＤを表す。Ｎｃ＝有意なし。
【図９】Ｍｅｎ１＋／−マウスの下垂体腫瘍および下垂体腫瘍移植片がプロラクチンについてポジティブに染色することを示す一連の画像である。免疫組織化学染色は、抗プロラクチン抗体によるインサイツの下垂体腫瘍(図９Ａ−Ｂ)および皮下下垂体腫瘍移植片(図９Ｃ−Ｄ)について示す。図９Ｅ−Ｆは、乳腺に隣接した移植された下垂体腫瘍がプロラクチン誘導性の分泌変化を示すことを示している画像である(画像の左側)。
【図１０】血清プロラクチンおよび成長ホルモンレベルは下垂体腫瘍および下垂体腫瘍移植片をもつマウスにおいて上昇されていることを示す。図１０Ａは、１９の未処置、腫瘍保持Ｍｅｎ１＋／−マウスの下垂体腫瘍体積(ｍｍ３)に対してプロットした血清ＰＲＬ(ｎｇ／ｍｌ)レベルを示すグラフである。これはポジティブな相関を示す。図１０Ｂは、コントロールＩｇＧ(黒色の三角形)およびｍＡｂ Ｇ６−３１(灰色の丸)にて処置したＭｅｎ１＋／−マウスの試験エンドポイントの下垂体腫瘍体積に対してプロットした血清ＰＲＬレベルを示すグラフである。図１０Ｃ−Ｄは、処置の１日目および３５日目の下垂体腺腫移植片を有するマウスの血清プロラクチン(Ｃ)および成長ホルモン(Ｄ)を示すグラフである。
【図１１】膵島腫瘍発達のマウスＲｉｐ−ＴβＡｇモデルにおける初期腫瘍進行の間の抗ＶＥＧＦ処置(「介入(インターベンション)」)の効果を示すグラフである。グラフは、アイソタイプ一致コントロールモノクローナル抗体による処置と比較したときの、９〜１１週の抗ＶＥＧＦ抗体による処置後の血管形成島の平均数によって測定される、腫瘍血管新生の減少を示す。
【図１２Ａ】膵島腫瘍発達のマウスＲｉｐ−ＴβＡｇモデルにおける抗ＶＥＧＦ抗体による処置とアイソタイプ一致コントロールモノクローナル抗体との間で、腫瘍量又は生存率に有意な差がなかったことを示す、退縮試験の結果を示す。アイソタイプ一致コントロールモノクローナル抗体によって処置されたマウスと比較したときの、抗ＶＥＧＦ抗体によって処置されたマウスにおける腫瘍量を示すグラフである。
【図１２Ｂ】膵島腫瘍発達のマウスＲｉｐ−ＴβＡｇモデルにおける抗ＶＥＧＦ抗体による処置とアイソタイプ一致コントロールモノクローナル抗体との間で、腫瘍量又は生存率に有意な差がなかったことを示す、退縮試験の結果を示す。アイソタイプ一致コントロールモノクローナル抗体によって処置されたマウスと比較したときの、抗ＶＥＧＦ抗体によって処置されたマウスにおける経時的な生存率を示すグラフである。
【図１３】タキサン又はゲムシタビンによる細胞切除後の腫瘍の再成長を抑止するための長期にわたる抗ＶＥＧＦ療法の有効性を示すグラフである。
【図１４】初期未処置下垂体腺腫(図１４Ａ、ドット線の上)が、隣接する正常な下垂体前葉(ドット線の下)と比較して、成長ホルモンについて弱いポジティブを示し、可変的であることを示す一連の画像である。４つの移植された下垂体腫瘍(コントロールＩｇＧ処置)のうちの１つは、成長ホルモンについて弱いポジティブであった(図１４Ｂ)。ｍａｂ Ｇ６−３１(図１４Ｃ)又はコントロールＩｇＧ(図１４Ｄ)で処置したマウスからの原発性下垂体腫瘍は、成長ホルモンについて局所的にポジティブである。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
（詳細な説明）
Ｉ．定義
本明細書中で用いる「ＶＥＧＦ」又は「ＶＥＧＦ-Ａ」なる用語は、Leung等 Science, 246:1306 (1989)、およびHouck等 Mol. Endocrin., 5:1806 (1991)によって記載されているように、１６５アミノ酸のヒト血管内皮細胞増殖因子と、関連した１２１-、１４５-、１８９-、および２０６-アミノ酸のヒト血管内皮細胞増殖因子、並びにそれらの天然に生じる対立遺伝子型およびプロセシング型を意味する。ＶＥＧＦ−Ａは、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−Ｅ、ＶＥＧＦ−ＦおよびＰｌＧＦを含む遺伝子ファミリの一部である。ＶＥＧＦ−Ａは主に、ＶＥＧＦＲ−１(Ｆｌｔ−１)およびＶＥＧＦＲ−２(Ｆｌｋ−１／ＫＤＲ)の２つの高親和性レセプターチロシンキナーゼに結合し、後者はＶＥＧＦ−Ａの血管内皮細胞分裂促進シグナルの主な伝達物質である。さらに、ニューロピリン−１は、ヘパリン-結合ＶＥＧＦ−Ａアイソフォームのレセプターとして同定されており、血管の発達に役割がありうる。また、「ＶＥＧＦ」又は「ＶＥＧＦ−Ａ」なる用語は、マウス、ラット又は霊長類などの非ヒト動物種由来のＶＥＧＦも意味する。特定の種由来のＶＥＧＦは、ヒトＶＥＧＦはｈＶＥＧＦ、マウスＶＥＧＦはｍＶＥＧＦなどの用語で表されることが多い。また、「ＶＥＧＦ」なる用語は、１６５アミノ酸のヒト血管内皮細胞増殖因子のアミノ酸８〜１０９、又は１〜１０９を含むポリペプチドの切断型又は断片を指すために用いられる。そのようなＶＥＧＦ型を指すときは、本明細書では、例えば、「ＶＥＧＦ(８−１０９)」、「ＶＥＧＦ(１−１０９)」又は「ＶＥＧＦ１６５」と表す。「切断した(切断型の)」天然のＶＥＧＦのアミノ酸位置は、天然のＶＥＧＦ配列に示される数で示す。例えば、切断型の天然ＶＥＧＦのアミノ酸位置１７(メチオニン)は、天然のＶＥＧＦ中の位置１７(メチオニン)でもある。切断型の天然ＶＥＧＦは、ＫＤＲに対して結合親和を有しＦｌｔ−１レセプターは天然のＶＥＧＦと同程度である。
【００２７】
本明細書中で用いる「ＶＥＧＦ変異体」なる用語は、天然のＶＥＧＦ配列に一又は複数のアミノ酸変異を含むＶＥＧＦポリペプチドを指す。場合によって、一又は複数のアミノ酸変異にはアミノ酸置換(一又は複数)が含まれる。本明細書に記載のＶＥＧＦ変異体を省略記号で表すために、数は、推定天然ＶＥＧＦのアミノ酸配列に沿ったアミノ酸残基の位置を指す(上掲のLeung et al.および上掲のHouck et al.に示される)。
「天然配列」ポリペプチドは、天然由来の対応するポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでなる。よって、天然配列ポリペプチドは任意の哺乳動物からの天然に生じるポリペプチドのアミノ酸配列を有し得る。このような天然配列ポリペプチドは、自然から単離することもできるし、あるいは組換え又は合成手段により生産することもできる。「天然配列」ポリペプチドという用語は特にポリペプチドの天然に生じる切断型又は分泌型(例えば細胞外ドメイン配列)、ポリペプチドの天然に生じる変異体型(例えば、選択的スプライシング型)および天然に生じる対立遺伝子変異体を包含する。
ポリペプチド「変異体」は天然配列ポリペプチドと少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する生物学的に活性なポリペプチドを意味する。そのような変異体には、例えば一又は複数のアミノ酸残基が、ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端に付加され、又は欠失されているポリペプチドが含まれる。通常は、変異体は天然配列ポリペプチドと少なくともおよそ８０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくともおよそ９０％のアミノ酸配列同一性、又はさらにより好ましくは少なくともおよそ９５％のアミノ酸配列同一性を有する。
【００２８】
「ＶＥＧＦ生物学的活性」には、任意のＶＥＧＦレセプターへの結合又は任意のＶＥＧＦシグナル伝達活性、例えば正常および異常な血管形成および脈管形成の調節(Ferrara and Davis-Smyth (1997) Endocrine Rev. 18: 4-25；Ferrara (1999) J. Mol. Med. 77: 527-543)、胚性の脈管形成および血管形成の促進(Carmeliet et al. (1996) Nature 380:435-439；Ferrara et al. (1996) Nature 380:439-442)、および雌生殖管における、および骨の成長および軟骨形成のための周期的血管増殖の調節(Ferrara et al. (1998) Nature Med. 4: 336-340；Gerber et al. (1999) Nature Med. 5: 623-628)が含まれる。血管形成および脈管形成における血管新生因子であることに加えて、多面発現増殖因子としてのＶＥＧＦは、他の生理的過程、例えば内皮細胞生存、脈管透過性および血管拡張、単球走化性、およびカルシウム流入において複数の生物学的効果を示す(上掲のFerrara and Davis-Smyth (1997)、およびCebe-Suarez et al. Cell. Mol. Life Sci. 63: 601-615 (2006))。さらに、近年の研究では、わずかな内皮性以外の細胞種、例えば網膜色素上皮細胞、膵管細胞およびシュワン細胞に対するＶＥＧＦの分裂促進効果が報告されている。Guerrin et al. (1995) J. Cell Physiol. 164:385-394；Oberg-Welsh et al. (1997) Mol. Cell. Endocrinol. 126:125-132；Sondell et al. (1999) J. Neurosci. 19:5731-5740。
「ＶＥＧＦ特異的アンタゴニスト」は、本明細書中のセクションＩＩＩ以降に記載されている。
【００２９】
「抗ＶＥＧＦ抗体」は、十分な親和性と特異性を有してＶＥＧＦに結合する抗体である。選択された抗体は、通常、ＶＥＧＦに対して十分に強い結合親和性を有しており、例えば該抗体は１００ｎＭ〜１ｐＭのＫｄ値を有してｈＶＥＧＦを結合しうる。抗体親和性は、例えば、表面プラスモン共鳴ベースのアッセイ(例えばＰＣＴ出願公開番号ＷＯ２００５／０１２３５９に記載される、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ)、酵素結合免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)、および競合アッセイ(例えばＲＩＡのもの)で測定されてもよい。ある実施態様では、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体は、ＶＥＧＦ活性が伴う疾患又は症状を標的および干渉する際の治療用薬剤として用いられうる。また、抗体は、例えばその治療上の有効性を評価するために、他の生物学的活性アッセイの対象とされうる。このようなアッセイは従来技術において周知であり、標的抗原と抗体の使用目的に依存する。例として、ＨＵＶＥＣ阻害アッセイ(下記の実施例にて説明される)、腫瘍細胞増殖阻害アッセイ(例えば国際公開８９／０６６９２にて説明される)、抗体依存性細胞傷害活性(ＡＤＣＣ)および補体媒介性細胞障害活性(ＣＤＣ)アッセイ(米国特許第５５００３６２号)、およびアゴニスト活性又は造血アッセイ(国際公開９５／２７０６２を参照)などがある。抗ＶＥＧＦ抗体は通常、ＶＥＧＦ−Ｂ又はＶＥＧＦ−Ｃなどの他のＶＥＧＦホモログにも、ＰＩＧＦ、ＰＤＧＦ又はｂＦＧＦなどの他の増殖因子にも結合しないであろう。抗ＶＥＧＦ抗体に関する更なる情報は、セクションＩＩＩ、Ａ以降にある。
【００３０】
本明細書および特許請求の範囲を通して、免疫グロブリン重鎖中での残基の番号付けは、出典明示によりここに取り込まれるKabat等, Sequence of Proteins of Immunological Interest 5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991)におけるＥＵインデクスのものである。「カバットにおけるＥＵインデクス」はヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の残基番号付けを意味する。
「抗体」という用語は最も広義に使用され、モノクローナル抗体(完全長モノクローナル抗体を含む)、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体(例えば二重特異性抗体)、およびそれらが所望の生物活性を示す限り抗体断片が特に包含される。
【００３１】
本発明の「Ｋｄ」又は「Ｋｄ値」は、段階的な力価の非標識ＶＥＧＦの存在下で、最小濃度の(１２５Ｉ)-標識Ｆａｂ(１０９)にてＦａｂを均衡化して、抗Ｆａｂ抗体コートプレートにて結合したＶＥＧＦを捕獲することによってＶＥＧＦに対するＦａｂの溶液結合親和性を測定するアッセイで示されるような(Chen, et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881)、抗体およびＶＥＧＦ分子のＦａｂ型(バージョン)を用いて実行される放射性標識したＶＥＧＦ結合アッセイ(ＲＩＡ)で測定される一実施態様のものである。アッセイの条件を決めるために、ミクロタイタープレート(Dynex)を５μｇ／ｍｌの捕獲抗Ｆａｂ抗体(Cappel Labs)を含む５０ｍＭ炭酸ナトリウム(ｐＨ９．６)にて一晩コートして、その後２％の(ｗ／ｖ)ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳにて室温で２〜５時間(およそ２３℃)、ブロックする。非吸着プレート(Ｎｕｎｃ＃２６９６２０)に、１００ｐＭ又は２６ｐＭの［１２５Ｉ］ＶＥＧＦ(１０９)を段階希釈した所望のＦａｂ、例えばＦａｂ−１２と混合する(Prestaら., (1997) Cancer Res. 57: 4593-4599))。ついで対象のＦａｂを一晩インキュベートする；しかし、インキュベーションは確実に平衡状態に達するまでに６５時間かかるかもしれない。その後、混合物を捕獲プレートに移し、室温で１時間インキュベートする。そして、溶液を取り除き、プレートを０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳにて８回洗浄する。プレートが乾燥したら、１５０μｌ／ウェルの閃光物質(MicroScint-20; Packard)を加え、プレートをＴｏｐｃｏｕｎｔγ計測器(Packard)にて１０分間計測する。最大結合の２０％か又はそれ以下濃度のＦａｂをそれぞれ競合結合測定に選択する。他の実施態様によると、〜１００反応単位(ＲＵ)の固定したｈＶＥＧＦ(８−１０９) ＣＭ５チップを用いて２５℃のＢＩＡｃｏｒｅＴＭ-２０００又はＢＩＡｃｏｒｅＴＭ-３０００(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)にて表面プラズモン共鳴アッセイを行ってＫｄ又はＫｄ値を測定する。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ(CM5, BIAcore Inc.)を、提供者の指示書に従ってＮ-エチル-Ｎ'-(３-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩(ＥＤＣ)およびＮ-ヒドロキシスクシニミド(ＮＨＳ)で活性化した。ヒトＶＥＧＦを１０ｍＭ 酢酸ナトリウム(ｐＨ４．８)で５μｇ／ｍｌ(〜０．２μＭ)に希釈し、結合したタンパク質の反応単位(ＲＵ)がおよそ１０になるように５μｌ／分の流速で注入した。ヒトＶＥＧＦの注入後、反応しない群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入した。動力学的な測定のために、２倍の段階希釈したＦａｂ(０．７８ｎＭから５００ｎＭ)を２５℃、およそ２５μｌ／分の流速で０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０(ＰＢＳＴ)を含むＰＢＳに注入した。会合および解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル(simple one-to-one Langmuir binding model) (BIAcore Evaluationソフトウェアバージョン3.2)を用いて、会合速度(Ｋｏｎ)と解離速度(Ｋｏｆｆ)を算出した。平衡解離定数(Ｋｄ)をＫｏｆｆ／Ｋｏｎ比として算出した。例として、Chen, Y.,ら, (1999) J. Mol Biol 293:865-881を参照。上記の表面プラスモン共鳴アッセイによる結合速度が１０６Ｍ−１Ｓ−１を上回る場合、分光計、例えば、流動停止を備えた分光光度計(stop-flow equipped spectrophometer)(Aviv Instruments)又は撹拌キュベットを備えた８０００シリーズＳＬＭ-Ａｍｉｎｃｏ分光光度計(ThermoSpectronic)で測定される、漸増濃度のヒトＶＥＧＦ短型(８−１０９)又はマウスＶＥＧＦの存在下にて、ＰＢＳ(ｐＨ７．２)、２５℃の、２０ｎＭの抗ＶＥＧＦ抗体(Ｆａｂ型)の蛍光放出強度(励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｍ、帯域通過＝１６ｎｍ)における増加又は減少を測定する蛍光消光技術を用いて結合速度を測定することができる。
【００３２】
「遮断(ブロック)」抗体又は抗体「アンタゴニスト」は、結合する抗原の生物学的活性を阻害するか又は低減させるものである。例えば、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニスト抗体はＶＥＧＦを結合し、ＶＥＧＦの能力を阻害して血管内皮細胞の増殖を誘導する。好適な遮断抗体ないしアンタゴニスト抗体は、抗原の生物学的活性を完全に阻害する。
特に断らない限りは、本明細書全体を通して「多価抗体」という表現は３又はそれ以上の抗原結合部位を含む抗体を指すために使用される。例えば、多価抗体は３又はそれ以上の抗原結合部位を持つように遺伝子操作されたもので、一般には天然配列ＩｇＭ又はＩｇＡ抗体ではない。
【００３３】
「Ｆｖ」断片は、完全な抗原認識および結合部位を含む抗体断片である。この領域は、堅く結合した重鎖可変ドメイン１つと軽鎖可変ドメイン１つの二量体から成り、その結合は自然界では例えばｓｃＦｖにおけるように共有結合である。各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用してＶＨ−ＶＬ二量体の表面の抗原結合部位を確定するのはこの構成である。この６つのＣＤＲ又はそのサブセットは、共同して抗体に抗原結合特異性を賦与する。しかし、単一の可変ドメイン(又は抗原に特異的なＣＤＲを３つしか含んでいないＦｖの半分)でさえ、通常は結合部位全体より親和性は低いものの、抗原を認識して結合する能力を有する。
【００３４】
本明細書で使われるように、「抗体可変ドメイン」は相補性決定領域(ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３)ならびにフレームワーク領域(ＦＲ)のアミノ酸配列を含む、抗体分子の軽鎖および重鎖の部分を指す。ＶＨは重鎖の可変ドメインを指す。ＶＬは軽鎖の可変ドメインを指す。本発明で使用される方法によると、ＣＤＲとＦＲに割り当てられるアミノ酸位置はカバットに従って規定される(Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institute of Health, Bethesda, Md., 1987および1991))。抗体又は抗原結合断片のアミノ酸のナンバリングも、カバットのそれに準じる。
【００３５】
本明細書で使われるように、「相補性決定領域」(ＣＤＲ、すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３)なる用語は、抗原結合のために存在している必要がある抗体可変ドメインのアミノ酸残基を指す。各可変ドメインは、一般的にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と同定される３つのＣＤＲ領域を持つ。各相補性決定領域はカバットが記載しているような「相補性決定領域」からのアミノ酸残基(すなわち、軽鎖可変ドメインの残基約２４〜３４(Ｌ１)、５０〜５６(Ｌ２)、および８９〜９７(Ｌ３)ならびに重鎖可変ドメインの３１〜３５(Ｈ１)、５０〜６５(Ｈ２)および９５〜１０２(Ｈ３)；Kabatら, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD.(1991))、および／又は「超可変ループ」からの残基(すなわち、軽鎖可変ドメインの残基約２６〜３２(Ｌ１)、５０〜５２(Ｌ２)および９１〜９６(Ｌ３)ならびに重鎖可変ドメインの２６〜３２(Ｈ１)，５３〜５５(Ｈ２)および９６〜１０１(Ｈ３)；ChothiaおよびLesk, J.Mol.Biol.196:901-917頁(1987))を含んでもよい。いくつかの場合には、相補性決定領域はカバットの記載により定義されているＣＤＲ領域および超可変ループの両方からのアミノ酸を含むことができる。例えば、抗体４Ｄ５の重鎖のＣＤＲＨ１は、アミノ酸２６〜３５を含む。
【００３６】
「フレームワーク領域」(以下ＦＲと称す)は、ＣＤＲ残基以外の可変ドメイン残基である。各可変ドメインは、一般的にＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４と同定される４つのＦＲを持つ。ＣＤＲがカバットの定義に従うならば、軽鎖ＦＲ残基は残基約１〜２３(ＬＣＦＲ１)、３５〜４９(ＬＣＦＲ２)、５７〜８８(ＬＣＦＲ３)および９８〜１０７(ＬＣＦＲ４)に位置し、重鎖ＦＲ残基は重鎖残基の残基約１〜３０(ＨＣＦＲ１)、３６〜４９(ＨＣＦＲ２)、６６〜９４(ＨＣＦＲ３)および１０３〜１１３(ＨＣＦＲ４)に位置する。ＣＤＲが超可変ループからのアミノ酸残基を含むならば、軽鎖ＦＲ残基は軽鎖の残基約１〜２５(ＬＣＦＲ１)、３３〜４９(ＬＣＦＲ２)、５３〜９０(ＬＣＦＲ３)および９７〜１０７(ＬＣＦＲ４)に位置し、重鎖ＦＲ残基は重鎖残基の残基約１〜２５(ＨＣＦＲ１)、３３〜５２(ＨＣＦＲ２)、５６〜９５(ＨＣＦＲ３)および１０２〜１１３(ＨＣＦＲ４)に位置する。いくつかの場合には、ＣＤＲがカバットの定義によるＣＤＲと超可変ループのそれの両方からのアミノ酸を含む場合、ＦＲ残基はそれに応じて調節されるであろう。例えば、ＣＤＲＨ１がアミノ酸Ｈ２６−Ｈ３５を含むとき、重鎖ＦＲ１残基は位置１〜２５にあり、ＦＲ２残基は位置３６〜４９にある。
【００３７】
「Ｆａｂ」断片は、軽鎖の可変および定常ドメインと重鎖の可変ドメインおよび第１の定常ドメイン(ＣＨ１)を含む。Ｆ(ａｂ')２抗体断片は一対のＦａｂ断片を含み、通常これらはその間にあるヒンジシステインによってそのカルボキシ末端の近くで共有結合により連結される。抗体断片の他の化学的結合も当技術分野で公知である。
「単鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。通常、ＦｖポリペプチドはＶＨおよびＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、このリンカーはｓｃＦｖが抗原結合にとって望ましい構造を形成するのを可能にする。ｓｃＦｖのレビューに関しては、Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol.113, RosenburgおよびMoore編, Springer-Verlag, New York, 269-315頁(1994)を参照。
【００３８】
「ダイアボディ(diabody)」なる用語は、抗原結合部位を２つ備える小さな抗体断片を指し、この抗体断片は同じポリペプチド鎖(ＶＨおよびＶＬ)内で軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に連結した重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を含む。同じ鎖の上の２つのドメインの間で対合させるにはあまりに短いリンカーを用いて、このドメインを他の鎖の相補性ドメインと強制的に対合させ、２つの抗原結合部位をつくる。ダイアボディについては、例えば欧州特許第４０４０９７号；国際公開第９３／１１１６１号；およびHollinger他, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:6444-6448(1993)でさらに詳しく記載されている。
「線状抗体」なる表現はZapata等, Protein Eng., 8(10):1057-1062頁(1995)に記載されている抗体を指す。つまり、これらの抗体は相補性の軽鎖ポリペプチドと共に一対の抗原結合領域を形成する、一対のタンデムＦｄセグメント(ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１)を含む。線状抗体は二重特異性又は単一特異性であり得る。
【００３９】
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する、すなわち、集団に含まれる個々の抗体が、少量で存在しうる自然に生じる可能性のある突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、一つの抗原性部位に対している。さらに、典型的に異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を含む従来の(ポリクローナル)抗体調製物と比べて、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。「モノクローナル」なる修飾は、抗体の実質的に均一な集団から得られている抗体の特徴を指すもので、ある特定の方法によって抗体が作製されることを必要とすると解釈されるものではない。例えば、本発明において用いられるモノクローナル抗体は、Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)によって初めて記載されるハイブリドーマ法によって作製されてもよいし、組み換えＤＮＡ法を用いて作製されてもよい(例として米国特許第４８１６５６７号を参照)。また、「モノクローナル抗体」は、例としてClackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)およびMarks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)に記載の技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離されうる。
ここで、モノクローナル抗体は、重鎖および／又は軽鎖の一部が、特定の種由来の抗体、あるいは特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか又は相同性があり、鎖の残りの部分が他の種由来の抗体、あるいは他の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか又は相同である「キメラ」抗体(免疫グロブリン)、並びにそれが所望の生物的活性を有する限りこのような抗体の断片を特に含む(米国特許第４８１６５６７号;およびMorrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855(1984))。
【００４０】
非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」形とは、非ヒト免疫グロブリンから得られた最小配列を含むキメラ抗体である。多くの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギ又はヒト以外の霊長類のような所望の特異性、親和性および能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)の高頻度可変領域の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。場合によって、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性をさらに洗練するために行われる。一般的に、ヒト化抗体は、全て又はほとんど全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに一致し、全て又はほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリン配列である、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は場合によって、免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む。さらなる詳細は、Jones等, Nature 321, 522-525(1986)；Riechmann等, Nature 332, 323-329(1988)；およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593-596(1992)を参照のこと。
【００４１】
「ヒト抗体」は、ヒトにより生成される抗体のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基を有するもの、および／又は本明細書中に開示したヒト抗体をつくるためのいずれかの技術を使用して、つくられたものである。この定義におけるヒト抗体は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特別に除く。ヒト抗体は、当分野で公知の様々な技術を用いて製造することができる。一実施態様では、ヒト抗体は、ヒト抗体を発現するファージライブラリから選択される(Vaughan et al. Nature Biotechnology 14:309-314 (1996)：Sheets et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 6157-6162 (1998))；Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)；Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991))。また、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座をトランスジェニック動物、例えば内在性免疫グロブリン遺伝子が部分的に又は完全に不活性化されているマウスに導入することによって作製されてもよい。抗原負荷すると、ヒト抗体の産生が観察される。これは遺伝子再構成、アセンブリおよび抗体レパートリを含むあらゆる点でヒトに見られるものを酷似している。この方策は、例えば米国特許第５５４５８０７号、同第５５４５８０６号、同第５５６９８２５号、同第５６２５１２６号、同第５６３３４２５号、同第５６６１０１６号、および以下の科学的な刊行物、Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992)；Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994)；Morrison, Nature 368:812-13 (1994)；Fishwild et al., Nature Biotechnology 14: 845-51 (1996)；Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996)；Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995)に記載されている。あるいは、ヒト抗体は、標的抗原に対する抗体を産生するヒトＢリンパ球の不死化により調製されうる(このようなＢリンパ球は、個体から回収されてもよいし又はインビトロで免疫化されていてもよい)。例として、Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)；Boerner et al., J. Immunol., 147 (1): 86-95 (1991)；および米国特許第５７５０３７３号を参照のこと。
【００４２】
「親和性成熟」抗体は、その１つ以上のＣＤＲに１つ以上の変更を有する抗体であって、そのような変更を有しない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性を向上させる。好ましい親和性成熟抗体は、標的抗原に対して、ナノモル単位の、さらにはピコモル単位の親和性を有する。親和成熟抗体は、当技術分野において既知の方法により生産できる。Marks他は、Bio/Technology, 10:779-783(1992年)において、ＶＨドメインとＶＬドメインのシャフリングによる親和成熟を開示している。ＣＤＲおよび／又はフレームワーク残基のランダムな突然変異誘発が、Barbas他、Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813(1994)；Schier他、Gene, 169:147-155 (1995)；Yelton他、J. Immunol., 155:1994-2004 (1995)；Jackson他, J. Immunol., 154(7):3310-9 (1995)；およびHawkins他, J. Mol. Biol., 226:889-896 (1992)に開示されている。
【００４３】
抗体の「機能的抗原結合部位」は標的抗原に結合可能なものである。抗原結合部位の抗原結合親和性は、抗原結合部位が由来する親抗体と必ずしも同じほどは強くはないが、抗原に結合する能力は、抗原に結合する抗体を評価するために知られている既知の様々な方法の何れか一つを使用して測定できるものでなければならない。更に、ここの多価抗体の抗原結合部位の各々の抗原結合親和性は定量的に同じである必要はない。本明細書中の多量体抗体に対して、米国特許公開２００５０１８６２０８の実施例２に記載されるように、機能的抗原結合部位の数は超遠心分離分析法を使用して評価することができる。この分析法によれば、多量体抗体に対する標的抗原の異なった比を組み合わせ、複合体の平均分子量を、機能的結合部位の異なった数を仮定して算定する。これらの理論値を、機能的結合部位の数を評価するために得られた実際の実権値と比較する。
指定された抗体の「生物学的特性」を有する抗体は同じ抗原に結合する他の抗体とは区別されるその抗体の生物学的特性の一又は複数を保有するものである。
対象の抗体が結合する抗原上のエピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)に記載のものなどの常套的な交差遮断(cross-blocking)アッセイを行ってもよい。
【００４４】
「種依存性抗体」、例えば哺乳動物抗-ヒトＩｇＥ抗体は、二番目の哺乳動物種からの抗原の相同体に対して有している結合親和性よりも、一番目の哺乳動物種からの抗原に対してより強力な結合親和性を有するものである。通常、種依存性抗体は、ヒト抗原(すなわち、約１×１０−７Ｍ以下、好ましくは約１×１０−８Ｍ以下、最も好ましくは約１×１０−９Ｍ以下の結合親和性(Ｋｄ)値を有する)と「特異的に結合」するが、そのヒト抗原に対する結合親和性よりも、少なくとも約５０倍、又は少なくとも約５００倍、又は少なくとも約１０００倍弱い、二番目の非ヒト哺乳動物種からの抗原の相同体に対する結合親和性を有する。種依存性抗体は、上にて定義した種々の型の抗体のいずれでもあることが可能だが、典型的にはヒト化又はヒト抗体である。
【００４５】
ここで用いる「抗体変異」又は「抗体変異体」は、種依存性の抗体のアミノ酸残基の一つ以上が変更された種依存性の抗体のアミノ酸配列変異体を指す。このような変異体は、必然的に種依存性の抗体と１００％未満の配列同一性又は類似性がある。一実施態様では、抗体変異体は、種依存性の抗体の重鎖又は軽鎖の可変ドメインの何れかのアミノ酸配列と、少なくとも７５％、より好ましくは、少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも８５％、より好ましくは、少なくとも９０％、および最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性又は類似性があるアミノ酸配列を有する。ここでは、最大のパーセント配列同一性を得るために、本配列に関する同一性又は類似性は、種依存性の抗体残基と同一(すなわち同じ残基)又は類似(すなわち共通の側鎖の性質に基づく同じ群由来のアミノ酸残基、以下を参照)である候補配列配列を整列し、必要であれば間隙(ギャップ)を入れて、候補配列中のアミノ酸残基の割合として測定したものである。配列同一性又は類似性に影響を及ぼすように、可変ドメインを除く抗体配列、Ｎ末端、Ｃ末端又は内部伸展のいずれにも、欠失又は挿入はない。
【００４６】
本発明のアミノ酸配列を含む抗体又はポリペプチドの半減期を増大させるために、例えば米国特許第５７３９２７７号に記載のように、抗体(特に抗体断片)へサルベージレセプター結合エピトープ接着させることができる。例えば、サルベージレセプター結合エピトープをコードする核酸分子は、操作した核酸分子によって発現される融合タンパク質が本発明のポリペプチド配列とサルベージレセプター結合エピトープを含むように、本発明のポリペプチド配列をコードする核酸のフレーム内に連結させることができる。ここで使用される場合の「サルベージレセプター結合エピトープ」なる用語は、ＩｇＧ分子のインビボ血清半減期を増加させる原因であるＩｇＧ分子(例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４)のＦｃ領域のエピトープを意味する(例えば、Ghetie, V等, (2000) Ann. Rev. Immunol. 18:739-766, 表１)。Ｆｃ領域内に置換を有する抗体および血清半減期が増大した抗体については、国際公開００／４２０７２、国際公開０２／０６０９１９； Shields, R.L., ら.,  (2001) JBC 276(9):6591-6604；Hinton, P.R., (2004) JBC 279(8):6213-6216)にも記載されている。他の実施態様では、例えば他のポリペプチド配列に接着させることによっても血清半減期が増大しうる。例えば、血清アルブミンが抗体又はポリペプチドに結合するように、抗体又は本発明の方法に有用な他のポリペプチドをＦｃＲｎレセプター又は血清アルブミン結合ペプチドに結合する血清アルブミン又は血清アルブミンの一部に接着させることができ、例としてこのようなポリペプチド配列は国際公開０１／４５７４６に開示されている。一実施態様では、接着した血清アルブミンペプチドはアミノ酸配列DICLPRWGCLWを含む。他の実施態様では、Ｆａｂの半減期はこれらの方法によって増大する。血清アルブミン結合ペプチド配列については、Dennis, M.S., ら., (2002) JBC 277(38):35035-35043も参照のこと。
【００４７】
「キメラＶＥＧＦレセプタータンパク質」は、少なくとも２つの異なるタンパク質から得られるアミノ酸配列を有するＶＥＧＦレセプター分子であって、そのうちの少なくとも１はＶＥＧＦレセプタータンパク質である。ある実施態様では、キメラＶＥＧＦレセプタータンパク質は、結合してＶＥＧＦの生物学的活性を阻害することが可能である。
【００４８】
「単離された」ポリペプチドは、その自然環境の成分から同定され分離されおよび／又は回収されたものを意味する。その自然環境の汚染成分は、ポリペプチドないしは抗体の診断又は治療への使用を妨害しうる物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。ある実施態様では、ポリペプチドないし抗体は、(1)ローリー(Lowry)法により定量して、９５重量％のポリペプチドより多くなるほど、最も好ましくは９９重量％より多くなるまで、 (2)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得るのに充分な程度にまで、あるいは(3)クーマシーブルー又は銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性が得られるように十分な程度にまで精製される。ポリペプチドの自然環境の少なくとも一つの成分が存在しないため、単離されたポリペプチドないし抗体には、組換え細胞内にインサイツのポリペプチドないし抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドないし抗体は少なくとも一の精製工程により調製される。
「断片」とは、好ましくは、参照核酸分子又はポリペプチドの全体の長さの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又はそれ以上を含むポリペプチド又は核酸分子の一部を意味する。断片は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００、２００、３００、４００、５００、６００又はそれ以上のヌクレオチド、ないしは１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、１９０、２００アミノ酸又はそれ以上を含みうる。
【００４９】
「抗血管新生剤」又は「血管新生(血管形成)インヒビター」は、直接的又は間接的に、血管新生、脈管形成又は望ましくない血管透過を阻害する、小分子量の物質、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、単離したタンパク質、組換えタンパク質、抗体、又はそれらのコンジュゲート又は融合タンパク質を意味する。抗血管形成剤には、結合して、血管形成因子又はそのレセプターの血管形成活性をブロックする作用剤が含まれることが理解されるであろう。例えば、抗血管形成剤は、上記に定義したように血管形成剤に対する抗体又はアンタゴニスト、例えば、ＶＥＧＦ−Ａに対する、又は、ＶＥＧＦ−Ａレセプター(例えばＫＤＲレセプター又はＦｌｔ−１レセプター)に対する抗体、ＧｌｅｅｖｅｃＴＭ(イマチニブメシレート(Imatinib Mesylate))などの抗ＰＤＧＦＲインヒビターである。また、抗血管新生剤には、天然の血管新生インヒビター、例えばアンジオスタチン、エンドスタチンなどが含まれる。KlagsbrunおよびD'Amore, Annu. Rev. Physiol., 53:217-39 (1991)；StreitおよびDetmar, Oncogene, 22:3172-3179 (2003)(例えば、悪性黒色腫の抗血管形成治療を記載している表３)；Ferrara & Alitalo, Nature Medicine 5(12): 1359-1364 (1999)；Tonini等, Oncogene, 22:6549-6556 (2003)(例えば、公知の抗血管新生因子を記載している表２)；および、Sato Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003)(例えば、臨床試験で用いられる抗血管形成剤を記載している表１)を参照。
【００５０】
「治療」は治療的処置および予防又は阻害的処置の両方を意味する。治療が必要なものには、既に良性、前癌性又は非転移性の腫瘍を有しているもの、並びに癌の発症又は再発が予防されるべきであるものが含まれる。
「治療的有効量」なる用語は、哺乳類の疾病や疾患を治療又は予防するためのＶＥＧＦ特異的アンタゴニストの量に相当する。前癌性、良性又は初期の腫瘍の場合、治療的有効量のＶＥＧＦ特異的アンタゴニストにより、癌細胞の数が減少、原発性腫瘍の大きさを小さく、癌細胞の周辺器官への浸潤を阻害(すなわち、ある程度に遅く、好ましくは止める)、腫瘍の転移を阻害(すなわち、ある程度に遅く、好ましくは止める)、腫瘍の成長をある程度阻害、および／又は疾患に関連する一又は複数の症状をある程度緩和しうる。休止状態又は微小転移性癌の腫瘍を治療するために、治療的有効量のＶＥＧＦ特異的アンタゴニストにより、微小転移性癌の数又は増殖を低減、休止中の腫瘍の成長を低減又は予防、又は、(例えば、手術、放射線療法又は化学療法などの抗癌療法を用いた)治療又は除去の後の腫瘍の再発を低減又は予防しうる。ある程度、薬剤は、成長を妨げおよび／又は現存の癌細胞を殺すことが可能で、細胞分裂停止性および／又は細胞障害性である。癌治療では、インビボにおける有効性は、生存期間、病状の進行時間(ＴＴＰ)、応答速度(ＲＲ)、応答の持続期間、寛解の期間、および／又は生活の質を評価することにより測定されうる。有効量は、無病生存率(ＤＦＳ)を向上させ得、全生存率(ＯＳ)を向上させ得、再発の可能性を減少させ得、再発までの時間を延長させ得、遠隔再発(すなわち原発性部位の外側の再発)までの時間を延長させ得、癌を治癒させ得、癌(例えば、癌特異的な調査を使用して測定される)の症状を向上させ得、二次原発性癌などの出現を低減させうる。
「手術可能な」癌は原発性臓器に限局しており手術に適する癌である。
【００５１】
「生存」は、生存している患者を指し、無病生存率(ＤＦＳ)、無進行生存率(ＰＦＳ)および全生存率(ＯＳ)を含む。生存率はカプラン・マイヤー法によって推定され得、生存率の違いは層別ログランク試験を用いて計算される。
「無病生存率(ＤＦＳ)」は、治療の開始から又は初期診断から一定期間、例えばおよそ１年、およそ２年、およそ３年、およそ４年、およそ５年、およそ１０年などの間癌を再発せずに生存している患者を指す。本発明の一態様では、ＤＦＳは包括解析(intent-to-treat)の原則に従って分析される。つまり、患者は割り当てられた治療を基礎として評価される。ＤＦＳの分析に用いる事象には、癌の限局性、領域および遠位的な再発、二次的な癌の発症、および既往(例えば乳癌の再発又は二番目の原発性癌)のない患者における全死因死亡が含まれうる。
「全生存率」は、治療の開始から又は初期診断から一定期間、例えばおよそ１年、およそ２年、およそ３年、およそ４年、およそ５年、およそ１０年などの間生存している患者を指す。本発明の根底となる研究では、生存率分析のために使用した事象は、全死因死亡であった。
「延長生存率」は、未処置の患者と比較して(すなわち、ＶＥＧＦ抗体などのＶＥＧＦ特異的アンタゴニストにて処置されていない患者と比較して)、又はコントロール処置プロトコール、例えばパクリタキセルなどの化学療法剤のみによる処置と比較して、処置した患者においてＤＦＳおよび／又はＯＳが増加していることを意味する。生存率は、処置開始後又は最初に診断された後、少なくともおよそ６か月、又は少なくともおよそ１年、又は少なくともおよそ２年、又は少なくともおよそ３年、又は少なくともおよそ４年、又は少なくともおよそ５年、又は少なくともおよそ１０年などの間モニターされる。
【００５２】
生存率分析の「危険率」は、２つの生存率曲線間の相違の概要であって、経過観察期間の間の、コントロールと比較したときの治療に対する死のリスクの減少を表す。危険率は、現象の割合についての統計的定義である。本発明では、危険率は、実験的アームの現象の確率をある特定の時点でのコントロールアームの現象の確率で割って表すものと定義される。
「同時に」なる用語は、投与の時間の少なくとも一部がオーバーラップしている、２以上の治療薬の投与を指すために本明細書中で用いられる。したがって、同時投与には、一又は複数の薬剤の投与が一又は複数の他の薬剤の投与をやめた後に続く場合の投薬計画が包含される。
「単独療法」は、治療期間の経過中に癌又は腫瘍の治療のために単剤しか含まない治療的投薬計画を意味する。ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストを用いた単独療法は、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストがその治療期間の間に更なる抗癌療法がない状態で投与されることを意味する。
「維持療法」とは、疾患再発又は進行の可能性を低減するために施される治療的投薬計画を意味する。維持療法は、被検体の寿命まで延長された時間を含む任意の長さの時間に提供されてもよい。維持療法は、最初の療法の後又は、最初ないしは更なる療法と共に提供されてもよい。維持療法のために使用する用量は変化してもよく、他の種の療法に使用する用量と比較して、減少した用量を包含しうる。
【００５３】
本明細書中の「ネオアジュバント(術前補助)療法」又は「術前療法」は、手術の前に施す療法を指す。ネオアジュバント療法の目標は、即時性の全身性処置を提供することであり、標準的な一連の手術の後に全身性治療を行う場合にさもなければ増殖しうる微小転移性癌を潜在的に除去する。また、ネオアジュバント療法は、腫瘍のサイズを低減することによって、当初切除不可能であった腫瘍を完全に切除する又は一部の臓器およびその機能を保存することが可能となるための助けとなりうる。さらに、ネオアジュバント療法は薬剤有効性のインビボ評価を可能とし、その評価によりその後の治療の選択が導かれる。  
本明細書中の「アジュバント(補助)療法」は、手術後に施される治療を指し、疾患の再発のリスクを低減するために、残存する疾患の所見が検出されないものとする。アジュバント療法の目的は、癌の再発を予防することによって、癌関連の死亡の機会を低減することである。
本明細書中の「標準的な治療の」化学療法は、特定の癌を治療するために通常使用する化学療法剤を指す。
「根治手術」は、医学界で用いられる用語として用いる。根治手術には、例えば、肉眼で認められる腫瘍のすべてが除去又は切除されるものを含む、腫瘍が除去又は切除される手順、手術その他のものが包含される。根治手術には、例えば、腫瘍の完全ないしは治療上の切除又は完全な全体の切除が含まれる。根治手術には、一又は複数の段階で生じる手順が含まれ、例えば一又は複数の手術又は他の手順が腫瘍の切除前に行われる複数の段階の手術手順が含まれる。根治手術には、関連する臓器、一部の臓器および組織、並びに周辺臓器、例としてリンパ節、臓器の一部又は組織を含む腫瘍を除去ないしは切除するための手順が含まれる。
【００５４】
「癌」および「癌性」なる用語は、典型的に制御不能な細胞成長に特徴が特徴がある、哺乳動物の生理学的状態を関すか又は記述する。良性および悪性、並びに休止中の腫瘍又は微傷転移組織がこの定義に包含される。「初期段階の癌」又は「初期段階の腫瘍」は、浸潤性でも転移性でもなく、又はステージ０、Ｉ又はＩＩの癌として分類される癌を意味する。
「前癌性」なる用語は、典型的に癌に進行する又は癌に発達する症状ないし成長を指す。「前癌性の」成長は、細胞周期調節、細胞性増殖又は分化のマーカーによって測定されうる、異常な細胞周期調節、増殖又は分化によって特徴が示される細胞を有する。
「形成異常」は、組織、臓器又は細胞の任意の異常な成長ないしは発達を意味する。好ましくは、形成異常は高いグレードであるか、前癌性である。
「転移」とは、その原発性部位から体の他の場所への癌の蔓延を意味する。癌細胞は、原発性腫瘍から切り離れ、リンパ管および血管へ浸透し、血流を循環し、身体の至る所の正常組織の離れた病巣で成長しうる(転移)。転移は局所又は遠位でありうる。転移は経時的な過程であり、原発性腫瘍から切り離れ、血流を駆けめぐり、遠位部位に止まる腫瘍細胞に付随するものである。新たな部位で、細胞は、血液供給を確立し、成長して生命を脅かす体積を形成しうる。腫瘍細胞内の刺激性分子および阻害性分子の経路はこの作用を制御するものであり、腫瘍細胞と遠位部位の宿主細胞との間の相互作用も有意である。
【００５５】
「微小転移性癌(micrometastasis)」は、原発性腫瘍から身体の他の部位へ拡がっている少数の細胞を意味する。微小転移性癌はスクリーニング又は診断用試験において検出されるかもしれないし、されないかもしれない。
「非転移性」とは、良性である癌、又は原発部位に止まり、リンパ管や血管系ないしは原発部位以外の組織に浸透しない癌を意味する。一般的に、非転移性癌は、ステージ０、Ｉ又はＩＩの癌、場合によってステージＩＩＩの癌のいずれかの癌である。
「ステージ０」、「ステージＩ」、「ステージＩＩ」、「ステージＩＩＩ」又は「ステージＩＶ」との腫瘍又は癌の呼称は、当分野で公知の総合段階分類法(Overall Stage Grouping)又はローマ数字段階付け法(Roman Numeral Staging methods)を用いた腫瘍又は癌の分類を表す。癌の実際のステージは癌の種類に依存するが、一般には、ステージ０の癌はインサイツの病巣にあり、ステージＩの癌は小さく限局した腫瘍であり、ステージＩＩおよびＩＩＩの癌は局所のリンパ節の併発を示す局所的に進行した腫瘍であり、ステージＩＶの癌は転移性癌を表す。各種類の腫瘍に特異的なステージは臨床医に公知である。
【００５６】
本明細書中で用いる「腫瘍」は、悪性又は良性にかかわらず、すべての腫瘍性細胞成長および増殖、並びにすべての前癌性および癌性の細胞および組織を指す。
「原発性腫瘍」又は「原発性癌」は元の癌を意味し、被検体の身体の他の組織、臓器又は部位に位置する転移性病巣を意味しない。
「良性腫瘍」又は「良性癌」は、元の部位に限局したままである腫瘍を意味し、遠位の部位への浸潤、侵入又は転移の能力を有さない。
本明細書中の「癌再発」は、治療の後に癌が回復することを指し、原発性臓器での癌の回復だけでなく、癌が原発性臓器以外で回復する遠位性再発も包含する。
「腫瘍休止」は、腫瘍細胞が存在するが、腫瘍進行は臨床上見られない、持続性の不活発状態を意味する。休止腫瘍はスクリーニング又は診断用試験において検出されるかもしれないし、されないかもしれない。
「腫瘍量」は、体内の癌細胞の数、腫瘍のサイズ、又は癌の量を意味する。また、腫瘍量(tumor burden)は腫瘍負荷(tumor load)とも称される。
「腫瘍数」は腫瘍の数を意味する。
【００５７】
「被検体」は、哺乳類、例えば限定するものではないが、ヒト又はヒト以外の哺乳動物、例としてウシ、ウマ科、イヌ、ヒツジ又はネコを意味する。被検体はヒトであることが望ましい。
被検体の「集団」は、例えば臨床試験において、又は癌ネオアジュバント療法などの特定の症状についてＦＤＡ承認に従って腫瘍学者によって観察される癌を有する被検体の集団を指す。一実施態様では、集団は、少なくとも３０００の被検体を含む。
「抗癌療法」なる用語は、癌を治療する際に有用な療法を指す。抗癌治療剤の例には、限定するものではないが、例えば、手術、化学療法剤、増殖阻害剤、細胞障害剤、放射線療法に用いる薬剤、抗血管新生剤、アポトーシス剤、抗チューブリン薬剤、および癌を治療するための他の薬剤、例として、抗ＨＥＲ-２抗体、抗ＣＤ２０抗体、上皮性増殖因子レセプター(ＥＧＦＲ)アンタゴニスト(例えばチロシンキナーゼインヒビター)、ＨＥＲ１／ＥＧＦＲインヒビター(例えばエルロチニブ(ＴａｒｃｅｖａＴＭ)、血小板由来増殖因子インヒビター(例えばＧｌｅｅｖｅｃＴＭ(メシル酸イマチニブ))、ＣＯＸ-２インヒビター(例えばセレコキシブ)、インターフェロン、サイトカイン、以下の標的ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＰＤＧＦＲ−β、ＢｌｙＳ、ＡＰＲＩＬ、ＢＣＭＡ又はＶＥＧＦレセプター(一又は複数)、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２および他の生理活性かつ有機化学的薬剤などの一又は複数に結合するアンタゴニスト(例えば中和抗体)が含まれる。また、その組合せが本発明に包含される。
【００５８】
ここで用いられる「細胞障害性剤」は、細胞の機能を阻害又は抑制し、および／又は細胞破壊を起こす物質を意味する。この用語は、放射性同位元素(例えば、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０およびＲｅ１８６)、化学治療薬、および細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素又はその断片を意味する。
【００５９】
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化学的化合物である。化学療法剤の例には、癌の治療に有用な化学的化合物が含まれる。化学療法剤の例には、チオテパおよびシクロスホスファミド(CYTOXAN(登録商標))のようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、およびウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類；アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethylenethiophosphaoramide)およびトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類およびメチラメラミン類；アセトゲニン(acetogenins)(特にブラタシン(bullatacin)およびブラタシノン(bullatacinone))；カンプトセシン(合成類似体トポテカン(topotecan)を含む)；ブリオスタチン；カリスタチン(callystatin)；ＣＣ-１０６５(そのアドゼレシン(adozelesin)、カルゼレシン(carzelesin)およびバイゼレシン(bizelesin)合成類似体を含む)；クリプトフィシン(cryptophycin)(特にクリプトフィシン１およびクリプトフィシン８)；ドラスタチン(dolastatin)；デュオカルマイシン(duocarmycin )(合成類似体、ＫＷ−２１８９およびＣＢＩ−ＴＭ１を含む)； エレトロビン(eleutherobin)；パンクラチスタチン(pancratistatin)；サルコディクチン(sarcodictyin)；スポンジスタチン(spongistatin)；クロランブシル、クロルナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタード等のナイトロジェンマスタード；ニトロスレアス(nitrosureas)、例えばカルムスチン(carmustine)、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン(lomustine)、ニムスチン、ラニムスチン；エネジイン(enediyne) 抗生物質等の抗生物質(例えば、カリケアマイシン(calicheamicin)、特にカリケアマイシンガンマ１ＩおよびカリケアマイシンオメガＩ１、例えば、Agnew  Chem Intl. Ed. Engl., 33：183-186(1994)を参照のこと；ダイネミシンＡ(dynemicinＡ)を含むダイネミシン(dynemicin)；クロドロネート(clodronate)などのビスホスホネート(bisphosphonates)；エスペラマイシン(esperamicin)； 同様にネオカルチノスタチン発光団および関連色素蛋白エネジイン(enediyne) 抗生物質発光団)、アクラシノマイシン(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン(bleomycins)、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン(carminomycin)、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorubicin)、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ(登録商標)ドキソルビシン (モルフォリノ−ドキソルビシン、シアノモルフォリノ-ドキソルビシン、２-ピロリノ-ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシンを含む)、エピルビシン、エソルビシン(esorubicin)、イダルビシン、マセロマイシン(marcellomycin)、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン(mitomycins)、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイ���ン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、クエラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)；メトトレキセートおよび５-フルオロウラシル(５-ＦＵ)のような抗-代謝産物；デノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)のような葉酸類似体；フルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンのようなプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)のようなピリミジン類似体；カルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)のようなアンドロゲン類；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのような抗副腎剤；フロリン酸(frolinic acid)のような葉酸リプレニッシャー(replenisher)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル(eniluracil)；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium acetate)；エポチロン(epothilone)；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン(lonidamine)；メイタンシン(maytansine)およびアンサマイトシン(ansamitocin)のようなメイタンシノイド(maytansinoid)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダモール(mopidamol)；ニトラクリン(nitracrine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ポドフィリン酸(podophyllinic acid)；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ(登録商標)多糖類複合体(JHS Natural Products, Eugene, OR)；ラゾキサン(razoxane)；リゾキシン(rhizoxin)；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２''-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン(trichothecenes)(特に、Ｔ-２トキシン、ベラキュリンＡ(verracurin A)、ロリデンＡ(roridin A)およびアングイデン(anguidine))；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド(「Ara-C」)；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えばタキソール(登録商標)パクリタキセル、(Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ)、ＡＢＲＡＸＡＮＥＴＭ クレモフォール(Cremophor)を含まない、アルブミン設計のナノ粒子形状のパクリタキセル(American  Pharmaceutical  Partners, Schaumberg, Illinois)およびタキソテア(登録商標)ドキセタキセル、(Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France)；クロランブシル；ＧＥＭＺＡＲ(登録商標)ゲンシタビン(gemcitabine)；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；シスプラチンおよびカルボプラチンのようなプラチナ類似体；ビンブラスチン；プラチナ；エトポシド(ＶＰ-１６)；ミトキサントン；ビンクリ���チン；ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ(登録商標)ビノレルビン；ナベルビン(Navelbine)；ノバントロン(novantrone)；テニポシド；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセローダ(xeloda)；イバンドロナート(ibandronate)；イリノテカン(カンプトサル(Camptosar)、ＣＰＴ-１１)(５−ＦＵおよびリューコボリンとのイリノテカンの治療処方を含む)；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸などのレチノイド類；カペシタビン(capecitabine)；コンブレタスタチン(combretastatin)；リューコボリン(leucovorin)(ＬＶ)；オキサリプラチン(oxaliplatin)、オキサリプラチン治療処方(FOLFOX)を含む；ＰＫＣ−αのインヒビター、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ、ＥＧＦＲ(例として、エルロチニブ(erlotinib)(ＴａｒｃｅｖａＴＭ))および細胞増殖を減少させるＶＥＧＦ−Ａ、並びに上述したものの製薬的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体が含まれる。
【００６０】
また、この定義には、腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように働く抗ホルモン剤、抗エストロゲンおよび選択的エストロゲンレセプターモジュレーター(ＳＥＲＭ)など、例えばタモキシフェン(ＮＯＬＶＡＤＥＸ(登録商標)タモキシフェンを含む)、ラロキシフェン(raloxifene)、ドロロキシフェン、４-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、ＬＹ１１７０１８、オナプリストーン(onapristone)、およびＦＡＲＥＳＴＯＮ・トレミフェン(Fareston)；アロマターゼ酵素を阻害するアロマターゼ阻害物質、それらは副腎でのエストロゲン産生を調節するものであり、例えば４(５)-イミダゾール類、アミノグルテチミド、ＭＥＧＡＳＥ(登録商標)メゲストロールアセテート、ＡＲＯＭＡＳＩＮ(登録商標)エキセメスタン、ホルメスタイン(formestanie)、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳＯＲ(登録商標)ゾロゾール(vorozole)、ＦＥＭＡＲＡ(登録商標)レトロゾールおよびＡＲＩＭＩＤＥＸ(登録商標)アナストロゾール；；および抗アンドロゲン、例えばフルタミド(flutamide)、ニルタミド(nilutamide)、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリン；並びにトロキサシタビン(troxacitabine)(1,3-ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体)；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に不粘着性細胞増殖に関係するシグナル伝達経路の遺伝子の発現を抑制するもの、例えばＰＫＣ−ａｌｐｈａ、ラルフおよびＨ−Ｒａｓ；リボザイム、例えばＶＥＧＦ発現インヒビター(例えばＡＮＧＩＯＺＹＭＥ(登録商標)リボザイム)およびＨＥＲ２発現インヒビター；遺伝子治療ワクチン、例えばＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ(登録商標)ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ(登録商標)ワクチンおよびＶＡＸＩＤ(登録商標)ワクチン)などのワクチン；ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ(登録商標)ｒＩＬ−２；ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ(登録商標)トポイソメラーゼ１インヒビター；ＡＢＡＲＥＬＩＸ(登録商標)rmRH；ビノレルビン(Vinorelbine)およびエスペラミシン(Esperamicins)(米国特許第４６７５１８７号を参照)並びに上記のものの製薬的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体が含まれる。
【００６１】
ここで用いられる際の「増殖阻害剤」は、細胞の増殖をインビトロおよび／又はインビボで阻害する化合物又は組成物を意味する。よって、増殖阻害剤は、Ｓ期で細胞の割合を有意に減少させるものである。増殖阻害剤の例は、細胞周期の進行を(Ｓ期以外の位置で)阻害する薬剤、例えばＧ１停止又はＭ期停止を誘発する薬剤を含む。古典的なＭ期ブロッカーは、ビンカス(ビンクリスチンおよびビンブラスチン)、タキソール(登録商標)、およびトポＩＩ阻害剤、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、およびブレオマイシンを含む。またＧ１停止させるこれらの薬剤は、Ｓ期停止にも波及し、例えば、ＤＮＡアルキル化剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５-フルオロウラシル、およびアラ-Ｃである。更なる情報は、The Molecular Basis of Cancer, MendelsohnおよびIsrael, 編, Chapter 1, 表題「Cell cycle regulation, oncogene, and antineoplastic drugs」, Murakami等, (WB Saunders: Philadelphia, 1995)、特に１３頁に見出すことができる。
【００６２】
「サイトカイン」という用語は、一つの細胞集団から放出されるタンパク質であって、他の細胞に対して細胞間メディエータとして作用するものの包括的な用語である。そのようなサイトカインの例は、リンフォカイン、モノカイン、および伝統的なポリペプチドホルモンである。サイトカインには、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、Ｎ-メチオニルヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラクシン；プロリラクシン；卵胞刺激ホルモン(ＦＳＨ)、甲状腺刺激ホルモン(ＴＳＨ)、および黄体形成ホルモン(ＬＨ)のような糖タンパク質ホルモン；上皮性増殖因子；肝増殖因子；線維芽細胞増殖因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子-αおよび-β；ミューラー阻害物質；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子；インテグリン；トロンボポエチン(ＴＰＯ)；神経成長因子、例えばＮＧＦ-α；血小板増殖因子；ＴＧＦ-αおよびＴＧＦ-βのようなトランスフォーミング成長因子(ＴＧＦ)；インスリン様成長因子IおよびII；エリスロポイエチン(ＥＰＯ)；オステオインダクティブ因子；インターフェロン、例えばインターフェロン−α、−β、−γ；コロニー刺激因子(ＣＳＦ)、例えばマクロファージ−ＣＳＦ(Ｍ−ＣＳＦ)；顆粒球-マクロファージ-ＣＳＦ(ＧＭ-ＣＳＦ)；および顆粒球−ＣＳＦ(Ｇ−ＣＳＦ)；ＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、  ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、  ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２のインターロイキン(ＩＬ)；ＴＮＦ−α又はＴＮＦ−βなどの腫瘍壊死因子；およびＬＩＦおよびキットリガンド(ＫＬ)を含む他のポリペプチド因子が含まれる。ここで使用される場合は、サイトカインなる用語は天然源由来あるいは組換え細胞培養由来のタンパク質および天然配列サイトカインの生物的に活性な等価物を含む。
【００６３】
この出願で用いられる用語「プロドラッグ」は、親薬剤に比較して腫瘍細胞に対する細胞障害性が低く、酵素的に活性化又はより活性な親形態に変換される製薬的活性物質の前駆体又は誘導体形態を意味する。例えば、Wilman, 「Prodrugs in Cancer Chemotherapy」, Biochemical Society Transactions, 14, :375-382, 615th Meeting, Belfast (1986)、およびStella 等, 「Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery」、Directed Drug Delivery, Borchardt等(編), 247-267項, Humana Press (1985)参照。本発明のプロドラッグは、限定するものではないが、ホスファート含有プロドラッグ、チオホスファート含有プロドラッグ、スルファート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ-アミノ酸修飾プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、β-ラクタム含有プロドラッグ、任意に置換されたフェノキシアセトアミド含有プロドラッグ又は任意に置換されたフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、より活性のある細胞毒のない薬剤に転換可能な５-フルオロシトシンおよび他の５-フルオロウリジンプロドラッグを含む。限定はしないが、本発明で使用されるプロドラッグ形態に誘導体化可能な細胞障害性剤の例には、前記の化学療法剤が含まれる。
【００６４】
「放射線療法」とは、正常に機能する能力を制限するため又は全く細胞を破壊するために、細胞に十分な損傷を誘導する有向性のγ線又はβ線の使用を意味する。治療の用量および治継続期間を決定するためには公知の多くの方法があることは明らかであろう。典型的な治療は、１回の投与として、１日当たり１０〜２００単位(グレイ)の典型的な用量として施される。
「低減又は阻害」は、全体の好ましくは２０％以上、より好ましくは、５０％以上、そして最も好ましくは７５％、８５％、９０％、９５％、又はそれ以上の減少を引き起こす能力。低減又は阻害は、治療する疾患の症状、転移性癌又は微小転移性癌の存在ないしはサイズ、原発性腫瘍のサイズ、休止腫瘍の存在ないしはサイズ、又は血管新生疾患の血管のサイズないしは数を指しうる。
【００６５】
「アンチセンス核酸塩基オリゴマー」は、長さにかかわらず、遺伝子のコード鎖又はｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的である核酸塩基オリゴマーを意味する。
「核酸オリゴマー」とは、連鎖群によって共に連結される、少なくとも８核酸塩基、好ましくは少なくとも１２、最も好ましくは少なくとも１６塩基の鎖を含む化合物を意味する。この定義には、修飾および非修飾の非天然および天然のオリゴヌクレオチド、並びにプロテイン核酸(Protein Nucleic Acid)、ロックド核酸およびアラビノ核酸(arabinonucleic acid)などのオリゴヌクレオチド模倣体が含まれる。多くの核酸塩基および連鎖群が本発明の核酸塩基オリゴマーに用いられ得、米国特許公開２００３０１１４４１２(例として公報の２７−４５段落を参照)および同２００３０１１４４０７(例として公報の３５−５２段落を参照)に記載のものが含まれる。これら公報は出典明記によって本明細書に援用される。また、核酸塩基オリゴマーは翻訳開始部位および終止部位を標的としてもよい。ある実施態様では、アンチセンス核酸塩基オリゴマーはおよそ８〜３０ヌクレオチドを含む。また、アンチセンス核酸塩基オリゴマーは、ＶＥＧＦ ｍＲＮＡ又はＤＮＡに相補的である少なくとも４０、６０、８５、１２０又はそれ以上の連続したヌクレオチドを含んでもよいし、完全長ｍＲＮＡ又は遺伝子と同じ長さでもよい。
【００６６】
「小ＲＮＡ」とは、少なくとも１５ヌクレオチド、好ましくは１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４又は３５ヌクレオチド長、最長および５０又は１００ヌクレオチド長(間のすべての整数を含む)である、一本鎖又は二本鎖いずれかのＲＮＡ分子を意味する。ある実施態様では、小ＲＮＡはＲＮＡｉを媒介することができる。本明細書中で用いる「ＲＮＡｉを媒介する」なる表現は、ＲＮＡｉ機構又はプロセスによって分解されるＲＮＡを識別する能力を指す。この用語には、ＲＮＡは「小干渉ＲＮＡ」および「マイクロＲＮＡ」であることも包含される。一般に、マイクロＲＮＡ(ｍｉＲＮＡ)は、ダイサーによっておよそ７０ヌクレオチドヘアピン前駆ＲＮＡからプロセシングされる、小さく(例えば１７−２６ヌクレオチド)、一本鎖の非コードＲＮＡである。小干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)はより小さいサイズでかつ非コードのものであるが、ｓｉＲＮＡは、長いｄｓＲＮＡからプロセシングされ、通常二本鎖である。また、ｓｉＲＮＡには、ｓｉＲＮＡ二本鎖の両方の鎖が単一ＲＮＡ分子内に含まれている短いヘアピンＲＮＡが包含されうる。小ＲＮＡは、両タイプのＲＮＡを表すために用いてもよい。これらの用語には、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、単離されたＲＮＡ(部分的に精製されたＲＮＡ、基本的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組み換えて生成されたＲＮＡ)、並びに一又は複数のヌクレオチドの付加、欠失、置換および／又は変更によって天然に生じるＲＮＡとは異なる改変したＲＮＡが包含される。このような変更には、小ＲＮＡの末端又は内部(ＲＮＡの一又は複数のヌクレオチドでの)などへの非ヌクレオチド物質の付加が含まれうる。本発明のＲＮＡ分子のヌクレオチドは、天然に生じないヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドを含む規格外のヌクレオチドを含んでもよい。核酸分子への更なる修飾については上記の「核酸塩基オリゴマー」を参照のこと。一実施態様では、ＲＮＡ分子は３'ヒドロキシル基を含む。
【００６７】
「静脈内注入」なる用語は、およそ５分以上、好ましくはおよそ３０〜９０分の時間をかけて動物又はヒト患者の静脈への薬剤の導入を意味するものであり、本発明では静脈内注入があるいは１０時間未満かけて投与されることもある。
「静脈内ボーラス」又は「静脈内圧力(intravenous push)」なる用語は、動物又はヒトに静脈に薬剤を投与して、およそ１５分未満、好ましくは５分未満で身体が薬剤を受け取ることを意味する。
「皮下投与」なる用語は、動物又はヒト患者の皮下、好ましくは皮膚と皮下組織の間の嚢内に、薬剤貯蔵物から相対的にゆっくりと、持続的に運搬されることによる薬剤の導入を意味する。
【００６８】
「皮下注入」なる用語は、動物又はヒト患者の皮下、好ましくは皮膚と皮下組織の間の嚢内に、限定するものではないが３０分以下ないし９０分以下の時間をかけて、薬剤貯蔵物から相対的にゆっくりと、持続的に運搬されることによる薬剤の導入を意味する。場合によって、動物又はヒト患者の皮下にインプラントされる薬剤運搬ポンプを刺し入れることによって注入されてもよい。この場合のポンプは決まった量の薬剤を３０分、９０分又は治療期間などの決まった期間の間運搬するものである。
「皮下ボーラス」なる用語は、動物又はヒト患者の皮下への薬剤の投与であって、ボーラス薬剤運搬(ドラッグデリバリー)は好ましくはおよそ１５分未満、より好ましくは５分未満、最も好ましくは６０秒未満である。好ましくは、投与は皮膚と皮下組織の間の嚢内であり、その嚢は例えば皮膚をつまんだり引き上げたりして皮下組織を除去することによって作ったものである。
【００６９】
本明細書中で用いられる「標識」なる用語は、ポリペプチドに直接的又は間接的にコンジュゲートされている検出可能な化合物又は組成物を指す。標識自体が検出可能なもの(例えば放射性標識又は蛍光性標識)であってもよく、酵素標識の場合、検出可能な基質化合物ないしは組成物の化学的変化を触媒するものであってもよい。
【００７０】
ＩＩ．初期ステージ腫瘍治療およびネオアジュバント療法およびアジュバント療法のためのＶＥＧＦ特異的アンタゴニストの使用
本発明は、良性、前癌性又は非転移性の腫瘍を有する被検体を治療するための、休止中の腫瘍又は微小転移性癌を有する被検体を治療するための、又は癌を有しているないしは癌を発症するリスクにある被検体を治療するための、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストの使用を特徴とする。例えば、ＶＥＧＦを阻害するための２つの独立した手法、すなわち、ＶＥＧＦ−ＡおよびＶＥＧＦ−Ａの遺伝的欠失をターゲティングするモノクローナル抗体(ｍＡｂ)による単独療法を用いて、本発明者等は、初期腸管腺腫形成のＡｐｃｍｉｎ／＋マウスモデルを用いて、ＶＥＧＦシグナル伝達を阻害すると腫瘍成長が十分停止され、腸管腺腫モデルに長期生存の利点が生じることを示した。また、本発明者等は、ＶＥＧＦ−Ａを標的とするモノクローナル抗体(ｍＡｂ)を用いて、ＶＥＧＦ−Ａの阻害は、多発性内分泌腫瘍症１型(ＭＥＮ１)のマウスモデルにおいて過剰なホルモン分泌を低くするため、および下垂体腺腫成長を阻害するために十分であることを示した。さらに、本発明者等は、マウス膵島腫瘍モデル(ＲＩＰ−ＴβＡｇ)およびＶＥＧＦ−Ａを標的とするモノクローナル抗体(ｍＡｂ)を用いて、ＶＥＧＦの阻害によって腫瘍血管新生が劇的に減少し、手術又は化学療法剤を用いた細胞切除後の治療として用いると腫瘍の再成長が抑制されることを示した。本発明は、ネオアジュバントおよびアジュバント環境におけるＶＥＧＦアンタゴニストの使用も特徴とする。
【００７１】
ＩＩＩ．ＶＥＧＦ特異的アンタゴニスト  
ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストは、ＶＥＧＦへの結合、ＶＥＧＦ発現レベルの低減、又はＶＥＧＦ生物学的活性、例えば一又は複数のＶＥＧＦレセプターへのＶＥＧＦの結合およびＶＥＧＦが媒介する血管新生および内皮細胞生存又は増殖の中和、遮断、阻害、無効、低減ないしは干渉が可能である分子(ペプチジル又は非ペプチジル)を指す。好ましくは、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストは、ＶＥＧＦの発現レベル又は生物学的活性を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれ以上低減するか又は阻害する。ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストによって阻害されるＶＥＧＦは、ＶＥＧＦアイソフォーム又は複数のＶＥＧＦアイソフォーム、例えばＶＥＧＦ(８−１０９)、ＶＥＧＦ(１−１０９)、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１４５、ＶＥＧＦ１８９又はＶＥＧＦ２０６であることが望ましい。
本発明の方法で有用なＶＥＧＦ特異的アンタゴニストには、ＶＥＧＦを特異的に結合するペプチジルないしは非ペプチジル化合物、例として、抗ＶＥＧＦ抗体およびその抗原結合性断片、ＶＥＧＦポリペプチドのアンタゴニスト変異体、又はＶＥＧＦに特異的に結合するその断片、およびＶＥＧＦに特異的に結合して一又は複数のレセプター(例えば、可溶性ＶＥＧＦレセプタータンパク質、又はそのＶＥＧＦ結合断片、又はキメラＶＥＧＦレセプター)、融合タンパク質(例えば、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ(Regeneron))、およびＶＥＧＦ１２１-ゲロニン(Peregrine)が含まれる。また、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストには、ＶＥＧＦポリペプチドをコードする核酸分子の少なくとも断片に相補的なアンチセンス核酸塩基オリゴマー、ＶＥＧＦポリペプチドをコードする核酸分子の少なくとも断片に相補的な小ＲＮＡ、ＶＥＧＦを標的とするリボザイム、ＶＥＧＦに対するペプチボディ、およびＶＥＧＦアプタマーが包含される。
【００７２】
Ａ．抗ＶＥＧＦ抗体
本発明の方法に有用である抗ＶＥＧＦ抗体には、ＶＥＧＦに対して十分な親和性と特異性を有して結合し、ＶＥＧＦの生物学的活性を低減ないし阻害することができる任意の抗体又はその抗原結合断片が含まれる。抗ＶＥＧＦ抗体は、通常、他のＶＥＧＦホモログ、例えばＶＥＧＦ−Ｂ又はＶＥＧＦ−Ｃにも他の増殖因子、例えばＰｌＧＦ、ＰＤＧＦ又はｂＦＧＦにも結合しない。
本発明のある実施態様では、抗ＶＥＧＦ抗体には、限定するものではないが、ハイブリドーマＡＴＣＣ ＨＢ １０７０９から生成されるモノクローナル抗ＶＥＧＦ抗体Ａ４.６.１と同じエピトープに結合するモノクローナル抗体、Presta et al. (1997) Cancer Res. 57: 4593-4599に従って生成される組み換えヒト化抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体、例としてベバシズマブ(ＢＶ；アバスチン(登録商標))として知られる抗体が含まれる。ベバシズマブには、ヒトＶＥＧＦのそのレセプターへの結合をブロックするマウス抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体Ａ.４.６.１からの、変異したヒトＩｇＧ１フレームワーク領域および抗原結合性相補性決定領域が含まれる。大部分のフレームワーク領域を含む、ベバシズマブのアミノ酸配列のおよそ９３％は、ヒトＩｇＧ1由来であり、配列のおよそ７％はマウス抗体Ａ4.6.1由来である。ベバシズマブは、およそ１４９０００ダルトンの分子質量を有し、グリコシル化される。ベバシズマブおよび他のヒト化抗ＶＥＧＦ抗体は、２００５年２月２６日発行の米国特許第６８８４８７９号にさらに記述される。抗体の更なる例には、限定するものではないが、ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ２００５／０１２３５９に記載されるように、Ｇ６又はＢ２０系列抗体(例えば、Ｇ６−３１、Ｂ２０−４.１)が含まれる。更なる抗体については、米国特許第７０６０２６９号、同第６５８２９５９号、同第６７０３０２０号；同第６３４２２１９号；同第６０５４２９７号；国際公開９８／４５３３２；国際公開９６／３００４６；国際公開９４／１０２０２；欧州特許第０６６６８６８号Ｂ１；米国特許出願公開番号２００６００９３６０、同２００５０１８６２０８、同２００３０２０６８９９、同２００３０１９０３１７、同２００３０２０３４０９および同２００５０１１２１２６；およびPopkov et al., Journal of Immunological Methods 288:149-164 (2004)を参照のこと。本発明に用いられうる抗体の他の例には、残基Ｆ１７、Ｍ１８、Ｄ１９、Ｙ２１、Ｙ２５、Ｑ８９、Ｉ９１、Ｋ１０１、Ｅ１０３およびＣ１０４を含むかあるいは、残基Ｆ１７、Ｙ２１、Ｑ２２、Ｙ２５、Ｄ６３、Ｉ８３およびＱ８９を含むヒトＶＥＧＦ上の機能的エピトープに結合するものが含まれる。
【００７３】
本発明によるＧ６系列抗体は、ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ２００５／０１２３５９の図７、２４−２６および３４−３５のいずれかに記載の一連のＧ６抗体又はＧ６由来抗体から得られる抗ＶＥＧＦ抗体である。一実施態様では、Ｇ６系列抗体は、残基Ｆ１７、Ｙ２１、Ｑ２２、Ｙ２５、Ｄ６３、Ｉ８３およびＱ８９を含むヒトＶＥＧＦ上の機能的エピトープに結合する。
本発明に係るＢ２０系列抗体は、ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ２００５／０１２３５９の図２７−２９のいずれか一に記載の一連のＢ２０抗体又はＢ２０由来抗体から得られる抗ＶＥＧＦ抗体である。一実施態様では、Ｂ２０系列抗体は、残基Ｆ１７、Ｍ１８、Ｄ１９、Ｙ２１、Ｙ２５、Ｑ８９、Ｉ９１、Ｋ１０１、Ｅ１０３およびＣ１０４を含むヒトＶＥＧＦ上の機能的エピトープに結合する。
【００７４】
本発明の「機能的エピトープ」は、抗体の結合にエネルギー的に関与する抗原のアミノ酸残基を意味する。エネルギー的に関与している抗原の残基の何れか一の突然変異(例えば、アラニン又はホモログ突然変異による野生型ＶＥＧＦの突然変異)により、抗体の結合が破壊され、抗体の相対親和度比率(ＩＣ５０突然変異ＶＥＧＦ／ＩＣ５０野生型ＶＥＧＦ)は５より大きくなるであろう(国際公開２００５／０１２３５９の実施例２を参照のこと)。一実施態様では、相対親和度比率は、溶液結合ファージディスプレイＥＬＩＳＡによって測定される。簡単に言えば、９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐイムノプレート(ＮＵＮＣ)は、２ｕｇ／ｍｌの濃度の試験抗体のＦａｂ型を含むＰＢＳにて４℃で終夜をかけてコートし、ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０(ＰＢＴ)にて室温で２時間かけてブロックする。ｈＶＥＧＦアラニン点突然変異(残基８−１０９型)又は野生型ｈＶＥＧＦ(８−１０９)をディスプレイするファージのＰＢＳ階段希釈物を、まずＦａｂコートプレート上で室温で１５分間インキュベートし、ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０(ＰＢＳＴ)にてプレートを洗浄する。結合したファージを、ＰＢＴにて１：５０００に希釈した抗Ｍ１３モノクローナル抗体西洋わさびペルオキシダーゼ(Amersham Pharmacia)コンジュゲートにて検出し、３,３',５,５'-テトラメチルベンジジン(ＴＭＢ、Kirkegaard &amp; Perry Labs, Gaithersburg, MD)基質とおよそ５分間反応させ、１．０ＭのＨ３ＰＯ４にて消光して、４５０ｎｍの分光光度を読んだ。ＩＣ５０値(ＩＣ５０,ａｌａ／ＩＣ５０,ｗｔ)の比率は、結合親和性の(相対的な結合能)低減を倍数で表す。
【００７５】
Ｂ．ＶＥＧＦレセプター分子
２つの最も良好に特徴付けられたＶＥＧＦレセプターは、ＶＥＧＦＲ１(別名Ｆｌｔ−１)およびＶＥＧＦＲ２(別名マウスホモログのＫＤＲおよびＦＬＫ−１)である。各々のＶＥＧＦファミリメンバーの各々のレセプターの特異性は変化するが、ＶＥＧＦ−ＡはＦｌｔ−１およびＫＤＲに結合する。完全長Ｆｌｔ−１レセプターは、７つのＩｇドメイン、膜貫通ドメイン、およびチロシンキナーゼ活性を有する細胞内ドメインを有する細胞外ドメインを含む。細胞外ドメインはＶＥＧＦの結合に関与しており、細胞内ドメインはシグナル伝達に関与している。
ＶＥＧＦに特異的に結合するＶＥＧＦレセプター分子又はその断片は、ＶＥＧＦタンパク質に結合して補足し、それによってシグナル伝達を妨げるための本発明の方法に用いられうる。ある実施態様では、ＶＥＧＦレセプター分子又はそのＶＥＧＦ結合断片は、可溶型、例えばｓＦｌｔ−１である。レセプターの可溶型は、ＶＥＧＦに結合して標的細胞の表面上に存在する天然のレセプターへのその結合を妨げることによって、ＶＥＧＦタンパク質の生物活性に対して阻害作用を及ぼす。また、ＶＥＧＦレセプター融合タンパク質も包含され、その例を後述する。
【００７６】
キメラＶＥＧＦレセプタータンパク質は、少なくとも２つの異なるタンパク質由来のアミノ酸配列を有するレセプター分子であり、そのうちの少なくとも１はＶＥＧＦレセプタータンパク質(例えばｆｌｔ−１又はＫＤＲレセプター)であり、ＶＥＧＦに結合してＶＥＧＦの生物活性を阻害することができる。ある実施態様では、本発明のキメラＶＥＧＦレセプタータンパク質は、２つの異なるＶＥＧＦレセプター分子だけから得られるアミノ酸配列からなるが、ｆｌｔ−１および／又はＫＤＲレセプターの細胞外リガンド結合領域の１、２、３、４、５、６又は７つすべてのＩｇ様ドメインを含むアミノ酸配列は、他の無関係なタンパク質、例えば免疫グロブリン配列のアミノ酸配列に連結されうる。Ｉｇ様ドメインが結合される他のアミノ酸配列は、当業者に容易に明らかであろう。キメラＶＥＧＦレセプタータンパク質の例には、例えば、可溶性Ｆｌｔ−１／Ｆｃ、ＫＤＲ／Ｆｃ又はＦＬｔ−１／ＫＤＲ／Ｆｃ(別名ＶＥＧＦ  Ｔｒａｐ)が含まれる。(例としてＰＣＴ出願公開番号ＷＯ９７／４４４５３を参照のこと)。
本発明の可溶性ＶＥＧＦレセプタータンパク質又はキメラＶＥＧＦレセプタータンパク質には、膜貫通ドメインを介して細胞の表面に固定されていないＶＥＧＦレセプタータンパク質が含まれる。また、キメラレセプタータンパク質を含むＶＥＧＦレセプター可溶型は、ＶＥＧＦに結合してＶＥＧＦを不活性化することができるが、膜貫通領域を含んでおらず、したがって一般に、この分子が発現される細胞の細胞膜に結合したものとならない。
【００７７】
Ｃ．リボザイム
リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒できる酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイムは、相補的標的ＲＮＡへの配列特異的ハイブリダイゼーション、次いでヌクレオチド鎖切断的開裂により作用する。潜在的ＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位は、既知の技術で同定できる。更なる詳細は、例えば、Rossi, Current Biology 4: 469-471 (1994)およびＰＣＴ公報、国際公開９７／３３５５１を参照のこと。
ＶＥＧＦ発現を標的とするある例示的なリボザイムはAngiozymeTMである。(例として米国特許出願公開番号２００６００３５２７８を参照のこと)。
【００７８】
Ｄ．アプタマー
アプタマーは、ＶＥＧＦポリペプチドなどの標的分子に特異的に結合する立体構造を形成する核酸分子である。アプタマーの生成および治療的使用は、従来技術において十分に確立されている。例として米国特許第５４７５０９６号参照。ＶＥＧＦアプタマーはペグ化された修飾オリゴヌクレオチドであり、細胞外ＶＥＧＦに結合できるように三次元高次構造をとっている。年齢関連性黄斑変性を治療するためにＶＥＧＦを標的とする治療的に有用なアプタマーの一例はペガプタニブ(MacugenTM, Eyetech, New York)である。アプタマーについての更なる情報は、米国特許出願公開番号２００６０１４８７４８に見られる。
【００７９】
Ｅ．ペプチボディ
ペプチボディは、免疫グロブリン分子の断片又は一部をコードするアミノ酸配列に連結されたペプチド配列である。ポリペプチドは、特異的な結合のためのいずれかの方法、限定するものではないがファージディスプレイ技術などによって選択されるランダム化配列から得られうる。一実施態様では、選択されたポリペプチドは、免疫グロブリンのＦｃ部分をコードするアミノ酸配列に連結されてもよい。ＶＥＧＦに特異的に結合して、ＶＥＧＦをアンタゴナイズするペプチボディもまた、本発明の方法に有用である。
【００８０】
Ｆ．ＶＥＧＦ特異的アンタゴニスト性核酸分子
また、本発明の方法は、アンチセンス核酸塩基オリゴマーおよび小ＲＮＡを含むＶＥＧＦ特異的アンタゴニスト性核酸分子の使用を特徴とする。
一実施態様では、本発明は、ＶＥＧＦ ＲＮＡに向けられたアンチセンス核酸塩基オリゴマーの使用を特徴とする。相補的核酸配列(センス鎖又はコード鎖)に結合することによって、アンチセンス核酸塩基オリゴマーは、おそらくＲＮアーゼＨによるＲＮＡ鎖の酵素的切断によりタンパク質発現を阻害することができる。
本発明の方法および組成物に特に有用なアンチセンス核酸塩基オリゴマーの一例は、モルフォリノオリゴマーである。モルフォリノは、核酸分子内の特定の配列への他の分子の接触をブロックするために用いられる。それらは、リボ核酸(ＲＮＡ)の小さい(〜２５塩基)領域に対する他の分子の接触をブロックすることができる。モルフォリノは、ホスホロジアミデートモルフォリノオリゴの頭文字であるＰＭＯと時に称される。
【００８１】
モルフォリノは、細胞が標的とするタンパク質を作製するのを妨げることによって、又はプレｍＲＮＡのスプライシングを変更することによって遺伝子機能をノックダウンするために用いられる。モルフォリノは、標準的な核酸塩基対合によってＲＮＡの相補的な配列に結合する合成分子である。モルフォリノは標準的な核酸塩基を有するが、それらの塩基はデオキシリボースリングの代わりにモルフォリンリングに結合し、リン酸塩の代わりにホスホロジアミデート基により連結される。無電荷ホスホロジアミデート基を有する陰イオン性リン酸塩の置換により、通常の生理学的ｐＨ範囲においてイオン化を取り除かれるので、生物又は細胞のモルフォリノは非荷電分子である。
モルフォリノは、ＲＮＡ内の標的配列を「立体的にブロックする」又はＲＮＡ内の標的配列に結合して、さもなくばＲＮＡと相互作用するかもしれない分子をブロックすることによって作用する。完全に非天然の主鎖を有するために、モルフォリノは、細胞性タンパク質によって認識されない。ヌクレアーゼはモルフォリノを分解せず、モルフォリノはｔｏｌｌ様レセプターを活性化しないので、これらは先天性の免疫応答、例として、インターフェロンシステム又はＮＦ−κＢ媒介性炎症応答を活性化しない。また、モルフォリノは、ＤＮＡのメチル化を修飾することが知られていない。したがって、ＶＥＧＦの発現レベル又は生物活性を低減又は阻害しうるＶＥＧＦのいずれかの部位に向けられたモルフォリノは、本発明の方法および組成物に特に有用である。
【００８２】
また、本発明は、ＶＥＧＦの発現を阻害するためのＲＮＡ干渉(ＲＮＡｉ)の使用を特徴とする。ＲＮＡｉは、二本鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)の導入によって開始される転写後遺伝子サイレンシングの形態である。一般的に「ｓｉＲＮＡ」、「小ＲＮＡ」又は「マイクロＲＮＡ」として知られる短い１５〜３２のヌクレオチド二本鎖ＲＮＡは、線虫(Zamore et al., Cell 101: 25-33)および、哺乳類の組織培養細胞株(Elbashir et al., Nature 411:494-498, 2001、出典明記によって本明細書に援用される)において遺伝子発現を下方制御する際に有効である。哺乳動物のこの手法の更なる治療的有効性は、McCaffrey et al. (Nature 418:38-39. 2002)によってインビボにおいて示された。小ＲＮＡは、少なくとも１５のヌクレオチド、好ましくは１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５のヌクレオチド長、および最高５０又は１００ヌクレオチド長(間のすべての整数を含む)である。ＶＥＧＦのいずれかの領域と実質的に同一であるか又は相補的であるこのような小ＲＮＡは、本発明のＶＥＧＦ特異的アンタゴニストとして包含される。
【００８３】
小ＲＮＡの特定の要件および修飾は当分野で周知であり、例えば、ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ０１／７５１６４および米国公開番号２００６０１３４７８７、同２００５０１５３９１８、同２００５００５８９８２、同２００５００３７９８８および同２００４０２０３１４５において記述される。これらの関連部分は出典明記によって本明細書中に援用される。具体的な実施態様では、ｓｉＲＮＡは、例えば、ｄｓＲＮＡがおよそ１７〜およそ２６のヌクレオチドのＲＮＡ分子にプロセシングされる条件下において酵素ダイサーの存在下で、長い二本鎖ＲＮＡがプロセシングされることによって合成又は生成されうる。ｓｉＲＮＡは、また、対応するＤＮＡ断片(例えばヘアピンＤＮＡコンストラクト)の発現によって生成されてもよい。通常、ｓｉＲＮＡは、特徴的な２-から３-ヌクレオチドの３'オーバーハング(突出)末端を有し、これらは(２'-デオキシ)チミジン又はウラシルであることが好ましい。ｓｉＲＮＡは一般的に３'ヒドロキシル基を含む。いくつかの実施態様では、一本鎖ｓｉＲＮＡ又はブラント末端の二本鎖ＲＮＡが用いられる。ＲＮＡの安定性を更に上げるために、３'突出は分解に対して安定である。一実施態様では、ＲＮＡは、プリンヌクレオチド、例えばアデノシン又はグアノシンを含むことによって安定する。あるいは、修飾した類似体によるピリミジンヌクレオチドの置換、例えば(２'-デオキシ)チミドによるウリジン２-ヌクレオチド突出の置換は、許容され、ＲＮＡｉの効率に影響しない。２'ヒドロキシル基の欠失により、組織培養液での突出のヌクレアーゼ耐性が有意に上がる。
【００８４】
ｓｉＲＮＡ分子は、化学合成又はショウジョウバエインビトロシステムを用いた組換え産生を含む様々なプロトコールにより得られうる。それらはDharmacon Research Inc.又はXeragon Inc.などの会社から商業的に得られうるし、又は、市販のキット、例えばAmbionのＳｉｌｅｎｃｅｒＴＭ ｓｉＲＮＡ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎキット(カタログ番号１６２０)又はNew England BioLabsのＨｉＳｃｒｉｂｅＴＭ ＲＮＡｉ転写キット(カタログ番号Ｅ２０００Ｓ)を用いて合成することもできる。
あるいは、ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡのインビトロ転写のための標準的な手順およびｄｓＲＮＡアニーリング手順、例えばElbashir et al. (Genes & Dev. 15: 188-200, 2001)、Girard et al. (Nature 442:199-202 (2006))、Aravin et al. (Nature 442:203-207 (2006))、Grivna et al. (Genes Dev. 20: 1709-1714 (2006)))およびLau et al. (Science 313:363-367 (2006))に記載の手順を用いて調製されうる。
Yu et al. (Proc. Natl. Acad. Sci USA, 99:6047-6052, 2002)又はPaddison et al. (Genes & Dev, 16:948-958, 2002)に記載される、短いヘアピンＲＮＡ(ｓｈＲＮＡ)もまた、本発明の方法で使われてもよい。ｓｈＮＡは、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方が単一のＲＮＡ分子内に包含され、ヌクレオチド(３以上)のループによって連結されるように、設計される。ｓｈＲＮＡは、上記および上掲のYu et al.に記載される標準的なインビトロＴ７転写合成を用いて合成され、精製されうる。ｓｈＲＮＡは、また、細胞内に形質移入され、ｓｈＲＮＡのインビボ発現に用いられうるマウスＵ６プロモーター配列を有する発現ベクター内にサブクローニングされうる。
【００８５】
哺乳動物細胞へのｄｓＲＮＡの形質移入又は導入のためには、様々な方法が利用可能である。例えば、限定するものではないが、TransIT-TKOTM (Mirus、カタログ番号MIR 2150)、TransmessengerTM (Qiagen、カタログ番号301525)、OligofectamineTMおよびLipofectamineTM (Invitrogen、カタログ番号MIR 12252-011およびカタログ番号13778-075)、siPORTTM (Ambion、カタログ番号1631)、DharmaFECTTM (Fisher Scientific、カタログ番号T-2001-01)を含む、ｓｉＲＮＡの脂質ベースの形質移入に有用な形質移入試薬が様々市販されている。また、ｓｉＲＮＡの形質移入のための電気穿孔ベースの方法のためには、siPORTerTM(Ambion Inc. カタログ番号１６２９)などの試薬も市販されている。マイクロインジェクション技術もまた用いられてもよい。また、小ＲＮＡは、細胞内に導入された発現コンストラクトから転写され得、この発現コンストラクトには一又は複数の転写調節配列に作用可能に連結した小ＲＮＡを転写するためのコード配列が含まれる。場合によって、プラスミド、ベクター又はウイルスベクターはまた、ｄｓＲＮＡ又はｓｉＲＮＡの運搬のために使われてもよく、このようなベクターは当分野で公知である。各々の形質移入試薬のためのプロトコールは、製造業者から入手可能である。
【００８６】
ＩＶ．治療的使用
血管新生のＶＥＧＦの役割に関しては多くの情報があるにもかかわらず、良性、前癌又は非転移性の癌における、又はアジュバントないしはネオアジュバント環境におけるＶＥＧＦの役割についてはほとんど知られていない。本発明者等は、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストが良性、前癌性又は非転移性の癌の治療のため、休止中の腫瘍又は微小転移性癌の治療のため、腫瘍再発又は再成長の防止のため、又は、癌を発達させるリスクがある被検体における癌の治療又は予防のために用いられうることを発見した。また、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストは、非転移性の癌を有する被検体の治療のたの、根治手術の後の、又は被検体の手術可能な癌の外科的手術の前に治療が施される手術可能な癌を有する被検体の治療のための、アジュバント療法に用いられうる。医療的な適用については以下のように療法、防止、ネオアジュバント療法およびアジュバント療法に分けられるが、これらの分類は必ずしも相互に排他的ではないことは当業者に明らかであろう。
【００８７】
Ａ．腫瘍の分類
癌なる用語は、前癌性の増殖、良性腫瘍、悪性腫瘍および休止中の腫瘍を含むがこれに限らず、用語癌は、一まとまりの増殖性疾患を包含する。良性腫瘍は、起源の部位に限局化されたままであり、遠位部位に浸潤、侵入又は転移する能力を有していない。悪性腫瘍は、周辺の他の組織に侵入して、障害を与える。また、それらは、起源の部位から切り離れる能力を獲得し、通常はリンパ節が配置されるリンパ系や血流を介して身体の他の部位に拡がりうる(転移する)。休止中の腫瘍は、腫瘍細胞が存在する静止腫瘍であるが、腫瘍の発達は臨床的に見られない。
原発性腫瘍は、それらが起こる組織の種類によって分類され、転移性腫瘍は、癌細胞が由来する組織の種類によって分類される。時間とともに、悪性腫瘍の細胞は、より異常になり、正常細胞のようではなくなる。癌細胞にみられるこの変化は、腫瘍グレードと呼ばれており、癌細胞は、十分に分化されている(低グレード)、中程度に分化されている、ほとんど分化されていない、又は、未分化である(高グレード)と表される。十分に分化した細胞はで全く正常な見かけであり、起源の正常細胞のようである。未分化な細胞は、細胞の起源を決定することがもはや不可能であるほど異常となっている細胞である。
【００８８】
癌段階付けシステムは、癌が解剖学的にどれくらい拡がるかを表しており、同じステージの集団において類似の予後および治療をもつ患者を表すものである。生検および特定の画像法、例えば胸部Ｘ線、乳房Ｘ線写真、骨スキャン、ＣＴスキャンおよびＭＲＩスキャンを含む様々な試験を癌の段階付けの支援として実施してもよい。また、血液検査および臨床評価を用いて、患者の全体の健康を評価し、癌が特定の器官まで拡がったかどうか検出する。
癌を段階付けするために、対癌米国合同委員会はまず、ＴＮＭ分類システムを使用して、癌、特に固形腫瘍に文字分類を付す。癌は、文字Ｔ(腫瘍サイズ)、Ｎ(触診可能な節)および／又はＭ(転移)で示される。Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３およびＴ４は、原発性病巣のサイズの増加を表し、Ｎ０、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３は、次第に進行する節の併発を示し、そして、Ｍ０およびＭ１は、遠位転移の有無を反映する。
【００８９】
総合段階分類法(Overall Stage Grouping)又はローマ数字段階付け法(Roman Numeral Staging methods)としても知られる第二の段階付け法では、原発性病巣のサイズと節拡散および遠位転移の存在を取り入れて、癌はステージ０〜ＩＶに分けられる。このシステムでは、症例はローマ数字によって表されるＩからＩＶの４つのステージに分類されるか、又は「再発」と分類される。いくつかの癌では、ステージ０は非浸潤性乳管癌又は上皮内小葉癌などを「インサイツ」又は「Ｔｉｓ」と称されている。高グレードの腺腫もまたステージ０と分類されうる。一般的に、ステージｉの癌は、通常治療可能である小さな限局した癌であるのに対して、ステージＩＶは通常手術の不可能な癌又は転移性の癌を表す。ステージＩＩおよびＩＩＩの癌は、通常局所的に進行しており、および／又は局所のリンパ節の併発を表す。一般的に、より高いステージの番号は、腫瘍サイズの拡大、および／又は近辺リンパ節および／又は原発性腫瘍に近接する臓器への癌の拡散を含む、より広域の疾患を表す。これらの段階付けは正確に定められるが、定義は各々の種類の癌について異なっており、当業者に公知である。
ＮＣＩのサーベイランス、疫学および最終結果プログラム(End Results Program)(ＳＥＥＧ)などの多くの癌レジストリは略式の段階付けを用いる。このシステムは全種類の癌に用いられる。癌の症例を５の主なカテゴリーに分類する。
インサイツ(In situ)は、発生した細胞の層にだけ存在する初期癌である。
限局(Localized)は、発生した臓器に限局しており、拡散の所見が見られない癌である。
局所(Regional)は、近くのリンパ節又は器官および組織に起源の(原発性)部位を越えて蔓延した癌である。
遠位(Distant)は、原発性部位から遠位器官又は遠位リンパ節まで蔓延した癌である。
未知(Unknown)は、段階を表すために十分な情報がない症例を表すために用いる。
【００９０】
さらに、原発性腫瘍が取り除かれたあと、癌が数か月又は数年戻ることは、一般的である。すべての目に見える腫瘍が根絶された後に繰り返される癌は、再発性疾患と呼ばれている。原発性腫瘍の領域で繰り返される疾患は局所的に再発性であり、転移として繰り返される疾患は遠位性再発と称する。休止中の腫瘍は、腫瘍細胞が存在している静止状態で存在する腫瘍であるが、腫瘍発達は臨床的に見られない。微小転移性癌(micrometastases)は、原発性腫瘍から身体の他の部分に広がったわずかな転移又は多くの細胞である。微小転移性癌は、スクリーニング又は診断検査において検出されるかもしれないし、検出されないかもしれない。本発明の方法は、例えば、休止中の腫瘍又は微小転移性癌が存在するが臨床的には検出される、もしくは検出されない環境で、休止腫瘍ないしは微小転移性癌の発症又は腫瘍の再発を予防するために有用である。
【００９１】
本発明の方法は、良性、前癌性又は非転移性の腫瘍を含むがこれらに限定されない初期癌の治療にも有用である。これには、任意のステージ０、Ｉ又はＩＩの腫瘍、任意の非転移性ステージＩＩ腫瘍、形成異常を含むがこれに限定されない、典型的に癌に先立つ又は癌に発達する任意の状態、および、起源の部位に局所化されたままで、遠位の部位に浸潤、侵入ないしは転移しない任意の腫瘍が含まれる。良性、前癌性又は非転移性の腫瘍の例には、ポリープ、腺腫、線維腫、脂肪腫、ガストリノーマ、インスリノーマ、軟骨腫、骨腫、血管腫、リンパ管腫、髄膜腫、平滑筋腫、横紋筋腫、扁平細胞パピローマ、聴覚の神経腫、神経線維腫、胆管シスタノーマ(bile duct cystanoma)、平滑筋腫、中皮腫、テラトーマ、粘液腫、トラコーマ、肉芽腫、過誤腫、移行細胞パピローマ、唾液腺の多形性腺腫、類腱腫、類皮嚢胞性パピローマ(dermoid cystpapilloma)、嚢腺腫、局所性結節過形成、結節性の再生性過形成が含まれる。
【００９２】
血管新生が原発性腫瘍増殖および転移に関与するので、本発明によって提供される血管新生を阻害する治療は、原発性部位の腫瘍の腫瘍性成長を阻害するだけでなく、二次部位での腫瘍の転移を予防して、他の療法による腫瘍の攻撃を可能にすることができる。本明細書において治療される癌の例には、固形および被固形又は軟組織腫瘍が含まれる。例として、カルチノーマ、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫および白血病などがあるが、これらに限定されるものではない。このような癌のより具体的な例には、扁平細胞癌；肺癌(小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌および肺の扁平上皮癌を含む)；腹膜の癌、肝細胞性癌、胃癌(胃腸癌を含む)；膵癌；神経膠芽腫；子宮頸癌；卵巣癌；肝癌；膀胱癌；肝腫瘍；乳癌；大腸癌；結腸直腸癌；子宮内膜ないしは子宮カルチノーマ；唾液腺カルチノーマ；腎臓ないしは腎臓癌；肝癌；前立腺癌；外陰部癌；甲状腺癌；肝癌；そして、様々な種類の頭頸部癌、並びにＢ細胞リンパ腫(低グレードの／濾胞性非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)；小リンパ球性(ＳＬ)ＮＨＬ；中程度のグレードの／濾胞性ＮＨＬ；中程度のグレードの広汎性ＮＨＬ；高いグレードの免疫芽細胞ＮＨＬ；高いグレードのリンパ芽球ＮＨＬ；高いグレードの小非開裂細胞型ＮＨＬ；巨大病変(bulky disease)ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；エイズ関連のリンパ腫；およびワルデンシュトレームマクログロブリン血症)；慢性リンパ球性白血病(ＣＬＬ)；急性リンパ芽球性白血病(ＡＬＬ)；線毛細胞白血病；慢性骨髄芽球性白血病；および移植後のリンパ増殖性疾患(ＰＴＬＤ)、並びに母斑症、浮腫(脳腫瘍と関係しているものなど)およびメイグス症候群と関係している異常な血管性増殖が含まれる。より具体的には、本発明のＶＥＧＦ特異的アンタゴニストによる治療に反応する癌には、乳癌、結腸直腸癌、直腸癌、非小細胞肺癌、非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)、腎細胞癌、前立腺癌、肝癌、膵癌、軟組織肉腫、カポジ肉腫、カルチノイド細胞腫、頭頸部癌、脳腫瘍、膠腫(例えば未分化星状細胞腫、未分化乏突起星状細胞腫、未分化乏突起膠腫、多形性神経膠芽腫)、メラノーマ、卵巣癌、中皮腫および多発性骨髄腫が含まれる。より好ましくは、本発明の方法は、ヒト患者の結腸直腸癌を治療するために用いられる。
【００９３】
Ｂ．腺腫
一実施態様では、本発明の方法は、腺腫として知られる良性上皮細胞腫瘍の治療のために用いられる。腺腫は腺性起源を有する良性腫瘍である。腺腫は一般的に分泌のために使用する上皮細胞に由来する。上皮細胞は身体の至る所に配置するが、このような細胞のサブセットだけが分泌に使われる。分泌に使われる上皮細胞は腺と呼ばれる特異的な身体の部分を作る。腺は、汗、唾液、母乳、粘液およびホルモン類を含むがこれらに限らず体の多くの物質を形成する仕事を有する。腺腫は、体内のほとんどの腺細胞から形成されうる。
腺腫は、悪性又は癌性の腫瘍と同じように形成されうる。腺腫は、良性であり、他の器官又は組織へと転移しないか又は拡がらない。ほとんどの腺腫が良性のままであるにもかかわらず、腺腫の中には悪性腫瘍に発達するものもあり、発達が起こると、新しい悪性の腺腫は腺癌と呼ばれる。例えば、大腸および直腸の癌は、腺腫又はポリープとして生じ、後に腺癌に発達し得、気管支の腺腫は、肺癌に発達しうる。
しばしば、腺腫は、発達する器官又は腺組織に顕著な影響を及ぼす。しばしば、腺腫は過剰なレベルのホルモン類を分泌する。これが生じると、この作用は罹患者に非常に不快なものとなりうる。場合によって、この作用は生命を脅かすものとなりうる。しかしながら、腺腫の中には明らかな作用のないまま発達するものもある。
【００９４】
例えば肝臓の腺腫など、女性により一般的であるある種の腺腫がある。他、大腸腺腫などは、年をとった成人、例えば５０歳以上の成人において最も一般的である。さらに、患者の腺腫を発達させる素因となる因子がある。例えば、経口避妊薬を使用する女性は、肝臓腺腫を発達させるリスクが高くなりうる。ある種の腺腫、例えば大腸腺腫は遺伝しうる。
腺腫に関連した症状は変化に富む。例えば、線維腺腫と呼ばれる胸部腺腫は、一般的に症状を引き起こさず、罹患者はそれを検出することができないほど小さいかもしれない。しかしながら、他の胸部腺腫は触知できるほど十分に大きいかもしれない。それに反して、肺腺腫は、熱、悪寒、息切れおよび血の混じった咳を引き起こしうる。
腺腫は、血液および尿の試料の採取、超音波画像、コンピューター断層装置(ＣＴ)スキャニングおよび磁気共鳴画像(ＭＲＩ)を含む様々な技術を使用して診断される。一般的に、生検は、腫瘍が良性であるか悪性であるかを決定するために使用される。本発明の方法は、例えば休止中の腫瘍又は微小転移性癌を有する被検体における、腺腫の治療、腺腫再発の治療ないしは予防のために、又は腺腫に関連する危険因子のいずれかを有する被検体における腺腫の予防のために特に有用である。
【００９５】
Ｃ．胃腸腫瘍
他の実施態様では、本発明の方法は、良性、前癌性、非転移性、又は休止中の胃腸腫瘍、又は胃腸腫瘍からの微小転移性癌の治療のために用いられる。これには、任意のステージ０、Ｉ又はＩＩの腫瘍；一般的に胃腸癌に先行するか又は胃腸癌に発達する任意の腫瘍又は状態；そして、起源の部位に限局したままで、遠位部位に浸潤、侵入ないしは転移していない任意の胃腸腫瘍が含まれる。任意のポリープ、腺腫、腫瘍、又は消化系、特に食道、胃、肝臓、胆道(胆嚢、胆管、ファーター膨大部)、腸、膵臓、大腸、直腸および肛門の癌が胃腸腫瘍に包含される。以下、これらの詳細について説明する。
【００９６】
(i) 肛門癌
肛門癌は、肛門管又は肛門部端の悪性腫瘍である。肛門癌は、肛門部の形成異常としてしばしば始まる。肛門部の形成異常は、異常な変化があるが、周囲組織への浸潤の徴候を示さない肛門の細胞からなる。肛門部の形成異常の最も重症型は、細胞が癌細胞のように見えるが正常細胞が存在する領域を越えて侵入していないインサイツのカルチノーマ(細胞腫)と称される。時間につれて、形成異常は最終的に、細胞が侵襲性になり、転移する能力を獲得するか、又は身体の他の部位へ切り離れるように変化する。肛門部の形成異常は、肛門部の上皮内腫瘍形成(ＡＩＮ)と称されることが多い。肛門癌が蔓延する場合、通常、周囲組織への直接の侵入又はリンパ系を介するものである。起こりうるが、血液による肛門癌の蔓延はあまり一般的ではない。
いくつかの因子が肛門癌と関係している。最も重要なことに、ヒト乳頭腫ウイルス(ＨＰＶ)による感染は、肛門癌に関連があることが示されており、子宮頸癌および頭頸部の癌を含むいくつかの他の癌と関係している。他の性感染ウイルスであるヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ)は肛門癌との関連があり、ＨＩＶに感染している個体はＨＰＶによる感染の危険が高い。肛門癌は肛門癌へ進歩する前に肛門部の形成異常としてまず始まるようであるので、ＡＩＮの既往歴を有する患者は肛門癌を発達させる危険が高い。さらに、良性肛門部の状態、例えば肛門部の瘻孔、裂肛、肛門周囲膿瘍又は痔核を有する患者では肛門癌の割合が高いようである。
本発明の方法は、初期肛門癌の治療のために、例えば休止中の腫瘍又は微小転移性癌を有する被検体における、肛門癌再発の治療ないしは予防のために、又は肛門癌に関連する危険因子のいずれかを有する被検体における肛門癌の予防のために特に有用である。
【００９７】
(ii) 結腸直腸および直腸癌
大腸(colon)は、腸(large intestine)で最も長い部分であり、結腸(large bowel)としても知られる。大腸癌は、西洋諸国において、男性および女性の両方で、癌で共通して３番目に多いタイプである。発病はアフリカ系アメリカ人において最も高く、大腸癌で死ぬ確率も高い。大腸癌のリスクは５０歳以降に実質的に上昇するが、毎年、それより若い人たちの多くにも報告されている。一般に、大腸および直腸癌は合わせて分類され、関係している同じ危険因子を有する。大腸癌、ポリープ又は遺伝性の大腸癌症候群(例えばＦＡＰおよびＨＮＰＣＣ)の既往歴又は家族歴を有する個体だけでなく潰瘍性大腸炎又はクローン病患者もすべてリスクが高く、一般の集団よりも若い時期にスクリーニングされる必要がある。大腸癌を有する一等親血縁者(親、兄弟又は子)を有する者は、罹患親類を有しない者の２〜３倍の癌発症リスクを有する。
大腸癌は、臨床医に知られている様々な技術を使用して診断されうる。初期にはいずれの症状も伴わないことが多いので、スクリーニング試験は、初期の大腸癌(例えばポリープ又は腺腫)を診断するために最も有効な方法である。一般に、ポリープは腫瘍に成長し、出血したり大腸を閉塞したりして症状を引き起こす。これらの症状には、直腸からの出血、排便後の便ないしはトイレへの出血、便の形状の変化(すなわち細線化)、腹部の痙攣痛、および排便が起こらない時の排便感などがある。間欠的に出血しうる腫瘍およびポリープでは、血液は、糞便潜血検査(ＦＯＢＴ)と呼ばれる試験によって、便試料において検出されうる。ＦＯＢＴのみでは、およそ２４％の癌を発見するのみである。軟性Ｓ字結腸鏡検査又は結腸内視術もまた、結腸直腸癌を診断するために用いられうる。
【００９８】
通常、結腸直腸癌は、以下の通りに段階付けされる。
ステージ０(インサイツのカルチノーマとも称される)−癌は大腸壁の最も外側部分に限局される。
ステージＩ−癌は大腸壁の第二および第三の層へと拡がっているが、外側の大腸壁以外には拡がっていない。これは、デュークスＡ大腸癌とも称される。
ステージＩＩ−癌は大腸壁を越えて拡がっているが、いずれのリンパ節にも浸潤していない(リンパ節は感染および疾患に対向する際に働く小器官である)。これは、デュークスＢ大腸癌とも称される。
ステージＩＩＩ−癌は大腸壁を越えてリンパ節にも拡がっているが、身体の他の領域までは拡がっていない。これは、デュークスＣ大腸癌とも称される。
ステージＩＶ−癌は身体の他の領域(すなわち肝臓および肺)に拡がっている。これは、デュークスＤ大腸癌とも称される。
本発明の方法は、初期大腸直腸癌の治療のために、例えば休止中の腫瘍又は微小転移性癌を有する被検体における、結腸直腸癌再発の治療ないしは予防のために、又は上記のような結腸直腸癌の危険因子のいずれかを有する被検体における結腸直腸癌の予防のために特に有用である。
【００９９】
(iii) 食道癌
食道は、喉と胃を連結する筋肉の管である。大多数の食道癌は、食道の内壁(粘膜)から発達し、食道の残りを構成する筋肉又は軟骨細胞からは発達しない。食道の内壁は、喉から胃につれて変化している点でいくらか特有なものである。上方の(近位の)食道では、食道の内壁は喉の内壁と似ており、扁平細胞からなる。したがって、癌がこの領域で発達すると、この癌は通常扁平上皮癌である。下方の(遠位の)食道では、より共通した種類の癌は、腺癌と呼ばれている。
浸潤癌に加えて、患者は、インサイツのカルチノーマと称される前癌性の病変と診断されることが多い。これらの前癌性病変は、扁平上皮癌又は腺癌の発達の前に観察されうる。インサイツのカルチノーマは、食道の内壁がより深い組織へ浸潤しないで、癌性の変化と類似の変化を起こす場合に、インサイツのカルチノーマが生じる。したがって、細胞自体は癌に似た資質を有するが、浸潤は生じず、蔓延する危険もない。癌そのものの前駆体であると思われる他の種の病変は、バレット食道と呼ばれており、以降に詳細に説明する。
【０１００】
食道癌は１年あたりおよそ１３５００人のアメリカ人に起こり、およそ１２５００の死を引き起こす。ほとんどの患者は５０代又は６０代に診断され、女性のおよそ４倍の男性が診断される。過去において、診断された食道癌の大多数(〜85％)は、上部食道に起こった扁平細胞癌であった。この種の癌の危険因子には喫煙とアルコール常用が含まれる。両方とも独立した危険因子(喫煙がより強い)であると考えられているが、食道癌の発達については２つの間の相乗効果であるようである。食道の扁平上皮癌の発達のための他の潜在的な発癌物質は、ニトロソアミン、アスベスト繊維および石油製品である。
これは、通常、下部食道の腺癌のリスクにある患者群と対比される。扁平上皮癌と比較した場合、腺癌は以前はあまり一般的でない疾患であった。しかしながら、最近では扁平上皮癌よりより一般的になっている。腺癌は一般に、バレット食道の環境において起こると考えられており、このバレット食道とは食道の通常の内壁が胃に似ている内壁に置き換わっている状態である。バレット食道は内視鏡検査によって診断され、この光ファイバーカメラは食道の中を見るため、および疑わしい領域を生検するために用いられる。バレット食道は、下部食道が胃酸に慢性的に曝されていることによって生じると考えられている。この曝露は、胃食道逆流疾患(ＧＥＲＤ)患者において起こり、これによって、食物による又は睡眠中の夜間の、胸やけ、膨満感、食欲不振又は胃痛の症状を患者に引き起こす。慢性ＧＥＲＤ患者は、バレット食道を発達させるリスクがあり、それによって、食道の腺癌を発症するリスクが高い。
【０１０１】
食道の内壁が異常なときに、定義上、バレット食道が起こるが、異常の程度のレベルは変化しうる。これは形成異常について段階付けされており、バレット食道がどの程度癌に進行しそうかを決定するために用いられる。癌へ進行する高い可能性がある顕著な前癌性の変化があるので、高いグレードの形成異常を有するバレット食道を有する患者は３か月ごとに内視鏡検査によって経過観察するか、ないしは実際に処置を行うべきである。局所の食道癌又は形成異常を記録するために最も感度のよい試験は、内視鏡検査である。内視鏡検査については、食道に関する領域は光ファイバーカメラで直接観察することができるし、異常の位置、出血の有無および閉塞の量は視覚化されうる。喉頭鏡検査(喉を観察する)又は気管支鏡検査法(気管および気道を観察する)の実施もまた、食道癌の場所および範囲によって必要となりうる。今日のケアの基本は、超音波内視鏡試験(ＥＵＳ)と称される内視鏡検査の間の超音波の実施などである。ＣＴスキャン、バリウム嚥下試験、Ｘ線および他の常法の試験、例えば血液スクリーニング試験は、典型的に、適切に癌を診断して段階付けするために実施される。
本発明の方法は、初期食道癌の治療のために、例えば休止中の腫瘍又は微小転移性癌を有する被検体における、食道癌再発の治療ないしは予防のために、又は上記のような食道癌の危険因子のいずれかを有する被検体における食道癌の予防のために特に有用である。
【０１０２】
(iv) 胆嚢癌
胆嚢は、胆汁を格納して、濃縮する小さい西洋梨状の器官である。胆嚢および肝臓は肝管によってつながっている。胆嚢の原発性癌は、毎年米国ではおよそ６０００人の成人に罹患している。これの癌の多くは腺癌であり、顕微鏡下の腫瘍細胞の出現に応じて、小突起、結節および管などのサブタイプがある。あまり一般的でないサブタイプには扁平細胞、印環細胞、および腺扁平(腺棘細胞腫)が含まれる。
胆嚢癌は高齢の患者に見られることが多く、診断時の年齢の正中値は６２〜６６年となる。女性に生じることが多く、女性：男性の比率はおよそ３：１である。
胆石、高いエストロゲンレベル、タバコ喫煙、アルコール、肥満および女性と関係しているが、胆嚢癌の原因は不明である。また、炎症性腸疾患(潰瘍性大腸炎およびクローン病)患者は、おそらく肝外胆道癌を発症する確率が１０倍である。
一般に、胆嚢癌は、一般的な肝・胆道系疾患を示唆する血液の様々な物質の異常なレベルを調査するために代謝化学および肝機能パネルを含む実験室的試験、および詳細な既往歴および身体検査により診断される。尿検査は、通常、これら物質のいくつかの尿中レベルを評価するために行われる。超音波、ＭＲＩ、胆管造影およびＣＴスキャンのような更なる技術もまた、用いられてもよい。
本発明の方法は、初期胆嚢癌の治療のために、例えば休止中の腫瘍又は微小転移性癌を有する被検体における、胆嚢癌再発の治療ないしは予防のために、又は上記のような胆嚢癌の危険因子のいずれかを有する被検体における胆嚢癌の予防のために特に有用である。
【０１０３】
(v) 胃癌
胃癌は胃の癌である。米国では、胃癌は現在１４番目に一般的な癌として分類される。４０歳以前に胃癌を見ることはまれであり、その発病はその後年齢と共に増加する。
９０％以上の胃癌は胃の内壁から生ずる。この内壁は腺を有するため、それから生じる癌は腺腫と称され、もっと進行した場合には腺癌と称される。胃に生じうる他の癌(リンパ組織から生じるリンパ腫、筋組織から生じる平滑筋肉腫、腺のない内壁から生じる扁平細胞カルチノーマ)があるが、その大多数は腺癌である。
また、研究により、ヘリコバクターピロリ感染が胃癌と関連づけられた。Ｈ.ピロリは幽門胃潰瘍および慢性萎縮性胃炎と関係しており、これにより、Ｈ.ピロリに感染した患者において胃癌の発症が高いことが説明されうる。しかしながら、胃癌の発達におけるＨ.ピロリの正確な役割は不明なままである。
様々な試験を用いて、二倍のコントラストバリウムラジオグラフ(「上部ＧＩ」又は「バリウム嚥下」と称する)および上部内視鏡検査を含む胃癌を正確に識別する。ＣＴスキャン、ＰＥＴスキャンおよび腹腔鏡検査を含む他の手順が、胃癌の診断のために用いられる。
本発明の方法は、初期胃癌の治療のために、例えば休止中の腫瘍又は微小転移性癌を有する被検体における、胃癌再発の治療ないしは予防のために、又は上記のような胃癌の危険因子のいずれかを有する被検体における胃癌の予防のために特に有用である。
【０１０４】
(vi) 肝癌
多くの良性肝腫瘍がある。血管腫は、肝臓の最も一般的な良性腫瘍であり、肝臓内で良性の血液の充満した腫瘍が形成する場合に生じる。他の良性腫瘍には、腺腫および局所性の結節性過形成が含まれる。これらの腫瘍は周囲組織を侵襲しないし転移もしないが、Ｘ線撮影画像上で良性と悪性の腫瘍の相違を識別することは難しいことが多い。
肝細胞から生じる癌である肝細胞癌(ＨＣＣ)は、最も一般的な種類の原発性肝癌であって、すべての肝癌の約７０％を占める。肝臓内で胆管から生じる癌は、胆管細胞癌として知られており、すべての肝癌の１０〜２０％を示す。これらの癌は、肝臓内の胆管から生じるか(肝内胆管癌として知られる)、又は肝臓以外から引き起こすならば胆管内から生じうる(肝外胆管癌として知られる)。まれに他のタイプの癌が肝臓内で起こりうる。これらには、血管肉腫(悪性の血液充満腫瘍)および、肝芽腫(非常に若い子供において発症するまれな癌)などがある。
肝癌と関係している多くの危険因子がある。米国では、肝癌の最も一般的な危険因子は肝硬変である。Ｃ型肝炎ウイルス(ＨＣＶ)の慢性感染もまた、米国の肝癌の一般的な原因である。世界的には、他の危険因子、例えばＢ型肝炎ウイルス(ＨＢＶ)の慢性感染およびアフラトキシンＢ１食品汚染が、より一般的である。
【０１０５】
肝癌を発見するために用いるいくつかのスクリーニングテストがある。スクリーニングテストとなりうるものは、αフェトプロテイン(ＡＦＰ)の血液濃度の検出を伴う。ＡＦＰは、胎児の血液中に高レベルで観察されるが、通常出生後に消失するタンパク質である。ＡＦＰレベルは、ＨＣＣがある場合に増加し、肝癌の発症のマーカーであってもよい。肝癌を発症するリスクが高い患者の中にはＡＦＰレベルについて常に試験される者がいるが、すべての肝癌が血中のＡＦＰを高いレベルで産生するとは限らず、ほとんどの患者は高いＡＦＰレベルを有することが明らかになる頃には、腫瘍はすでに進行した段階にある。他の血液タンパク質が、肝癌のためのスクリーニングツールとして用いられる可能性がある。いくつかの研究から、デス−γ−カルボキシプロトロンビン(ＤＣＰ)およびレンズマメアグルチニン反応性分画(ＡＦＰ-Ｌ３)などのタンパク質の使用もまた、肝癌形成のマーカーとして用いられうることが示されているが、実際には、これらはまれに使われる。
さらに、肝癌が疑われるときに、超音波、ＣＴスキャン、ＭＲＩ、アンジオグラフィ、フルオロデオキシグルコース-ポジトロン放出断層撮影(ＦＤＧ-ＰＥＴ)、生検および探索ラポラトミー(exploratory laporatomy)を行って肝癌を更に診断および段階付けする。
本発明の方法は、初期肝癌の治療のために、例えば休止中の腫瘍又は微小転移性癌を有する被検体における、肝癌再発の治療ないしは予防のために、又は上記のような肝癌の危険因子のいずれかを有する被検体における肝癌の予防のために特に有用である。
【０１０６】
(vii) 膵癌
膵臓は、胃および脊椎との間の、腹部内の深くに位置する、西洋梨状の腺で長さおよそ６インチである。３つの部位があり、最も広い部分は頭部と呼ばれ、中間の部位は体部であり、薄い端は尾部と呼ばれている。膵臓はインスリンを含むホルモン類を作る役割を担い、血糖値および酵素の制御を支えており、この酵素類は食物の消化のために腸によって使われる。これらの酵素は膵臓内の管を介して輸送され、酵素を胃に運ぶ総胆管に流れ込む。膵癌の発病は、６０から８０歳の間で最も高く、４０歳未満の人々には滅多に見られない。男性と女性に等しく観察されるが、近年では女性の割合が上昇しており、これは女性の喫煙率が上がっているからかもしれない。タバコ喫煙者は、２〜３倍膵癌を発症しやすい。母、父又は兄弟が疾患に罹った場合、そのリスクは３倍になる。胸部又は大腸の癌の家族歴もリスクが上がる。このリスクの増加は、癌を引き起こしている遺伝子の遺伝された突然変異による。この疾患の実際の原因、知られていないが、遺伝性遺伝子の変化および環境曝露によって生じる変化の組み合わせの結果であると考えられる。
医師が患者が膵癌にかかっているかもしれないと思うときに、超音波、ＣＴスキャンおよび内視鏡検査を用いて癌を診断して段階付けする。膵癌患者の中には、高いレベルの炭水化物抗原１９−９(ＣＡ１９−９)を有する者もいる。高いレベルを有する患者では、他の試験と組み合わせて診断を確認する際、そして、治療の間に疾患をモニターする際に有用である。治療中、定期的にレベルを調べ、癌が安定しているか悪くなっているかを調べることができる。
本発明の方法は、初期肝癌の治療のために、例えば休止中の腫瘍又は微小転移性癌を有する被検体における、肝癌再発の治療ないしは予防のために、又は上記のような肝癌の危険因子のいずれかを有する被検体における肝癌の予防のために特に有用である。
【０１０７】
(viii) 小腸癌
小腸(small intestine)としても知られる小腸(small bowel)は、胃と結腸(colon)と称される大腸(large bowel)とを連結する消化管の一部である。小腸には３つの異なる部位がある。１)十二指腸、２)空腸、および３)回腸。驚くべきことに、残りの消化管と比較して小腸は驚くほど長い長さにもかかわらず、小腸癌は非常にまれである。これには、腸で始まった癌、又は他の身体の部位から広まってきた癌が含まれる。具体的には、小腸癌は、米国で診断されたすべての腸癌の５％未満、そして、すべての癌のおよそ０．５％を占めている。
ほとんどの小腸癌の原因は不明である。しかしながら、小腸癌を発症する可能性を増やしうるいくつかの危険因子となりうるものがある。いくつかの例として、クローン病、脂肪便症疾患、ポイツ・ジェガーズ症候群、および腸管ポリープ症などがある。
顕微鏡下の所見および起源の細胞によって、小腸癌には４つの主要なタイプがある。腺癌は最も一般的なタイプである。典型的に、腸の内壁又は内部の層において始まって、通常十二指腸に起こる。二つ目のタイプは肉腫であり、代表的なサブタイプは平滑筋肉腫であり、この平滑筋肉腫は小腸の筋肉壁において始まって、通常回腸に起こる。三つ目のタイプはカルチノイドであり、小腸の特定のホルモン産生細胞において始まって、通常回腸、時に虫垂(そ大腸の第一部位である)で起こる。四つ目のタイプはリンパ腫であり、小腸のリンパ組織において始まって、通常空腸に起こる。リンパ腫の最も代表的なサブタイプは非ホジキンリンパ腫である。小腸癌のまれなサブタイプは消化管間質腫瘍であり、小腸のいずれかの部位で生じうる。
小腸の癌は、通常、完全な臨床既往歴、身体検査および便試料、内視鏡検査又は結腸内視術、バリウムＣ線、ＣＴスキャン、超音波又は他のＸ線を使用して診断される。
本発明の方法は、初期の小腸癌の治療のために、例えば休止中の腫瘍又は微小転移性癌を有する被検体における、小腸癌再発の治療ないしは予防のために、又は上記のような小腸の癌の危険因子のいずれかを有する被検体における小腸の癌の予防のために特に有用である。
【０１０８】
Ｖ．防止
本発明の更なる態様では、本発明者等は、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストが良性、前癌性又は早い段階の癌の治療のために、又は、腫瘍再発の治療又は防止のために使われうるということを発見した。この方法を用いて癌その物を治療するか、又は転移性ないしは侵襲性の段階又はより高いグレードないしはステージへの癌の進行を予防することができる。例えば、本発明の方法は、ステージＩ又はより高い段階の腫瘍への進行を予防するために、ステージ０の癌又はポリープを有する被検体を治療するために用いられうる。同様に、ステージＩＩの癌を有する患者では、この方法は、ステージＩＩＩ又はステージＩＶの癌への癌の進行を予防するために用いてもよい。
また、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストは、腫瘍の再発を予防するために用いてもよい。例えば、腫瘍が同定され、治療された場合(例えば、化学療法により又は外科的に取り除かれる)、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストは、局所的な結腸直腸腫瘍の再発又は結腸直腸腫瘍の転移を予防するために用いてもよい。腫瘍の再発の予防のために、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストは、例えば、休止中の腫瘍又は微小転移性癌を治療するため、又は休止中の腫瘍又は微小転移性癌の成長又は再成長を予防するために用いてもよい。この場合、これらの腫瘍は臨床上検出されるかもしれないし、検出されないかもしれない。
また、本発明者等は、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストが、癌に罹ったことがない被検体、又は癌を発症するリスクにある被検体において癌を予防するために用いられうることを発見した。癌と関係していることが知られている様々な危険因子があり、それらの多くを上記している。例示的な危険因子には、加齢(すなわち、５０歳以上)、癌の家族歴、ＨＰＶ、ＨＩＶ、ＨＢＶおよびＨＣＶによるウイルス感染、経口避妊薬使用、肝硬変、潰瘍性大腸炎、バレット食道、Ｈ.ピロリ感染およびポリープ又は形成異常の存在が含まれる。さらに、遺伝性癌症候群を有することが知られている被検体は、癌を発症する危険があると考えられる。このような症候群の非限定的な例には、ＡＰＣ、ＨＮＰＣＣ、ガードナー症候群、およびＭＥＮ１が含まれる。癌を発症する更なる危険因子は、臨床評価に応じて決定され得、ホルモン類又は血液タンパク質、例えばＰＳＡ(前立腺癌) ＣＡ−１２５(卵巣癌)、ＡＦＰ(肝癌)、ＤＣＰ(肝癌)およびＣＡ１９−９(膵癌)のレベルの上昇などがある。
【０１０９】
ＶＩ．ネオアジュバント(術前補助)療法
本発明は、被検体、例えばヒト患者の手術可能な癌の外科的除去の前のネオアジュバント療法であって、、患者(例えば、ここで患者は、腫瘍および／又は癌と診断されている)にＶＥＧＦ特異的アンタゴニスト、例えばＶＥＧＦ抗体の有効量を投与することを含む方法を提供する。場合によって、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストは、少なくとも一の化学療法剤と組み合わせて投与される。また、癌の再発を予防するために手術後に被検体にＶＥＧＦ特異的アンタゴニストの有効量を投与する更なる工程は、本明細書に記載のネオアジュバント療法によって使用されてもよい。手術後に被検体にＶＥＧＦ特異的アンタゴニストの有効量を投与する更なる工程を含む方法では、本明細書に記載のいずれかのアジュバント法が用いられてもよい。
例えば、一方法は、以下の工程を含む被検体の癌を治療することを含む。ａ) 各治療周期が、所定の間隔で、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニスト、例えばベバシズマブの有効量と、場合によって少なくとも一つの化学療法剤を被検体に投与することを含む、複数の治療周期を含む第一段階、ｂ) 癌が取り除かれる根治手術、そして、場合によって、ｃ) 各維持周期が、所定の間隔で、いずれの化学療法剤も伴わずに、又はいずれかの化学療法剤と共に、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニスト、例えばベバシズマブの有効量を被検体に投与することを含む、複数の維持周期を含む第二段階。
【０１１０】
ネオアジュバント療法では、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストは、腫瘍の癌細胞数を(例えば、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又はそれ以上)低減するために、腫瘍のサイズを低減するために(例えば切除術が可能になるくらい)、腫瘍量を低減するために、末梢器官への癌細胞浸潤を阻害する(すなわち、ある程度低減するかおよび／又は停止する)ために、腫瘍の脈管密度を低減するために、腫瘍転移を阻害するために、腫瘍成長又は腫瘍細胞増殖を低減するか又は阻害するために、休止中の腫瘍の成長を低減するか又は予防するために、微小転移性癌の成長又は増殖を低減するか又は予防するために、良性、前癌性又は非転移性の腫瘍に罹りやすい、又は診断された被検体のＤＦＳ又はＯＳを増やす又は延ばすために、および／又は癌関連の症状の一又は複数をある程度軽減するために、ある量又はある時間で(例えば経時的に特定の治療投薬計画で)投与されてよい。
ある例では、ネオアジュバント療法はＤＦＳ又はＯＳを延ばすために投与され、このときＤＦＳ又はＯＳは抗体の最初の投与のおよそ２〜５年後に評価される。ある実施態様では、被検体のＤＦＳ又はＯＳは、治療の開始、又は最初の診断のおよそ３〜５年、およそ４〜５年、又は少なくともおよそ４、又は少なくともおよそ５年後に評価される。典型的に、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストは、ＶＥＧＦ抗体、例えばベバシズマブである。
【０１１１】
他の例では、抗体および／又は化学療法の投与により、被検体集団において３年でおよそ５０％再発(原発性器官における癌の再発および／又は遠位再発)が減少する(このとき本明細書中の「およそ５０％」はおよそ４５％からおよそ７０％の範囲を含む)、例えば、化学療法(例えばタキソイド、例としてパクリタキセル)のみで治療される被検体と比較して、原発性器官における再発が３年でおよそ５２％、および／又は遠位再発が３年でおよそ５３％減少する。
ＶＥＧＦ特異的アンタゴニスト、例えばＶＥＧＦ抗体は、被検体、例えばヒト患者に、公知の方法、例えばボーラスとしてないしはある期間にわたって連続的な注入による静脈内投与に従って、又は、筋肉内、腹膜内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液包内、髄膜下、経口、局所的、又は吸入の経路によって投与される。抗体の静脈内投与が好ましい。
【０１１２】
ＶＥＧＦ特異的アンタゴニスト、例えばＶＥＧＦ抗体は単剤として投与されてもよいが、場合によってＶＥＧＦ抗体および一又は複数の化学療法剤と組み合わせて投与される。一実施態様では、少なくとも一の化学療法剤はタキソイドである。併用投与には、異なる製剤又は単一の薬物製剤を用いて同時投与ないしは同時的な投与、および何れかの順序での連続投与が含まれ、このとき、両方(又はすべて)の活性薬剤が同時にそれらの生物活性を示す期間があることが好ましい。ゆえに、化学療法剤は、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニスト、例えばＶＥＧＦ抗体の投与の前か後に投与されてもよい。この実施態様では、化学療法剤の少なくとも一の投与とＶＥＧＦ特異的アンタゴニスト、例えばＶＥＧＦ抗体の少なくとも一の投与との間の経過時間は、好ましくはおよそ１か月以下および最も好ましくはおよそ２週間以下である。あるいは、化学療法剤とＶＥＧＦ特異的アンタゴニスト、例えばＶＥＧＦ抗体は、単一の製剤又は異なる製剤で同時に患者に投与される。化学療法剤(例えばタキソイド)とＶＥＧＦ抗体(例えばベバシズマブ)の組合せによる治療により、相乗的、又はより大きな付加的な治療的利点を患者にもたらしうる。
通常、化学療法剤は、投与される場合、公知の用量で投与されるか、又は抗代謝性化学療法剤の投与に帰因するネガティブな副作用ないし薬剤の組合せ作用に従って、場合によって、低い用量で投与される。このような化学療法剤の調製および投薬計画は、製造業者の指示に従って用いられるか、技術者によって、経験的に決定されうる。化学療法剤がパクリタキセルである場合、好ましくは、毎週(例えば８０ｍｇ／ｍ２で)又は３週間ごと(例えば１７５ｍｇ／ｍ２又は１３５ｍｇ／ｍ２で)に投与される。好適なドセタキセル用量には、６０ｍｇ／ｍ２、７０ｍｇ／ｍ２、７５ｍｇ／ｍ２、１００ｍｇ／ｍ２(３週間ごと)；又は、３５ｍｇ／ｍ２又は４０ｍｇ／ｍ２(毎週)が含まれる。
【０１１３】
組み合わされうる様々な化学療法剤は上に開示される。本発明のある実施態様では、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニスト、例えばＶＥＧＦ抗体と組み合わされる化学療法剤には、例えば、タキソイド(ドセタキセルおよびパクリタキセルを含む)、ビンカ(例えばビノレルビン又はビンブラスチン)、白金化合物(例えばカルボプラチン又はシスプラチン)、アロマターゼインヒビター(例えばレトロゾール、アナストロゾール又はエキセメスタン)、抗エストロゲン(例えばフルベストラント又はタモキシフェン)、エトポシド、チオテパ、シクロホスファミド、メトトレキセート、リポソームドキソルビシン、ペグ化リポソームドキソルビシン、カペシタビン、ゲムシタビン、ＣＯＸ-２インヒビター(たとえばセレコキシブ)、又はプロテオゾームインヒビター(例えばＰＳ３４２)が含まれるが、これらに限定されるものではない。
アンスラサイクリン(例えばドキソルビシン又はエピルビシン)が被検体に投与される場合、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニスト、例えばベバシズマブの投与の前および／又は後に投与されるのが好ましい。しかしながら、循環器系毒性を低減した、変性アンスラサイクリン、例としてリポソームドキソルビシン(ＴＬＣ Ｄ-９９(ＭＹＯＣＥＴ(登録商標))、ペグ化リポソームドキソルビシン(ＣＡＥＬＹＸ(登録商標))、又はエピルビシンをＶＥＧＦ特異的アンタゴニスト、例えばベバシズマブと組み合わせてもよい。
【０１１４】
投与計画の一実施態様では、本発明のネオアジュバント療法は、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニスト、例えばベバシズマブと一又は複数の化学療法剤とが、複数のネオアジュバント周期で患者に投与され、その後腫瘍を根治的に取り除くための外科手術が行われる第一段階を含む。特定の治療計画に従い、各ネオアジュバント周期は１〜３週からなる。例えば、治療周期は３週であってもよく、これは患者が３週間ごとに１用量の化学療法剤と１用量のベバシズマブを服用することを意味する。また、治療周期は２週であってもよく、これは患者が２週間ごとに１用量の化学療法剤と１用量のベバシズマブを服用することを意味する。ネオアジュバント治療の第一段階全体はおよそ４〜８周期の間持続してもよい。本発明のある実施態様では、ネオアジュバント療法は手術間の１年未満の間継続し、一実施態様では、６か月未満継続する。疾患の種類および重症度に応じて、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニスト、例えばベバシズマブの好適な用量は、およそ１μｇ／ｋｇからおよそ５０ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくはおよそ５ｍｇ／ｋｇからおよそ１５ｍｇ／ｋｇの範囲で、限定するものではないが７．５ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇなどである。いくつかの態様では、化学療法投薬計画は、従来の高用量間欠投与を伴う。いくつかの他の態様では、化学療法剤は、定期的に中断することなく、よりわずかでより頻繁な用量を用いて投与される(「メトロノーム的化学療法」)。本発明の治療法の経過は、従来の技術およびアッセイによって容易にモニターされる。
【０１１５】
ＶＥＧＦ抗体および化学療法剤以外の、他の治療的投薬計画は、それと組み合わされてもよい。例えば、第二(第三、第四など)の化学療法剤が投与されてもよく、第二化学療法剤は、他の異なるタキソイド化学療法剤であるか、又はタキソイドでない化学療法剤である。例えば、第二の化学療法剤は、タキソイド(例えばパクリタキセル又はドセタキセル)、ビンカ(例えばビノレルビン)、白金化合物(例えばシスプラチン又はカルボプラチン)、抗ホルモン剤(例えばアロマターゼインヒビター又は抗エストロゲン)、ゲムシタビン、カペシタビンなどであってもよい。例示的な組合せには、タキソイド／白金化合物、ゲムシタビン／タキソイド、ゲムシタビン／ビノレルビン、ビノレルビン／タキソイド、カペシタビン／タキソイドなどが含まれる。異なる化学療法剤の「反応混液(カクテル)」が投与されてもよい。
【０１１６】
ＶＥＧＦ抗体と組み合わされてもよい他の治療薬には、他のＶＥＧＦアンタゴニスト又はＶＥＧＦレセプターアンタゴニスト、例えば第二の抗ＶＥＧＦ抗体、ＶＥＧＦ変異体、可溶性ＶＥＧＦレセプター断片、ＶＥＧＦ又はＶＥＧＦＲをブロックすることができるアプタマー、中和抗ＶＥＧＦＲ抗体、ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼのインヒビターおよびこれらいずれかの組み合わせのいずれか一又は複数が含まれる。本発明の抗体による組み合わせ腫瘍療法のために有用な他の治療的薬剤には、腫瘍増殖に伴う他の因子、例として、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２(Ｈｅｒ２としても知られる)、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４又はＴＮＦのアンタゴニストが含まれる。ある例示的な実施態様では、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストの組成物は、抗ＥｒｂＢ２抗体、又はその断片ないしはその誘導体(例えばハーセプチン(登録商標)抗体)を含まない。本発明のある実施態様では、抗ＶＥＧＦ抗体は、ＶＥＧＦレセプター、ＦＧＦレセプター、ＥＧＦレセプターおよびＰＤＧＦレセプターなどの一又は複数のチロシンキナーゼレセプターを標的とする小分子レセプターチロシンキナーゼインヒビター(ＲＴＫＩ)と組み合わせて用いられうる。多くの治療的小分子ＲＴＫＩは、当分野で公知であり、バタラニブ(ＰＴＫ７８７)、エルロチニブ(ＴＡＲＣＥＶＡ(登録商標))、ＯＳＩ−７９０４、ＺＤ６４７４(ＺＡＣＴＩＭＡ(登録商標))、ＺＤ６１２６(ＡＮＧ４５３)、ＺＤ１８３９、スニチニブ(ＳＵＴＥＮＴ(登録商標))、セマキシニブ(ＳＵ５４１６)、ＡＭＧ７０６、ＡＧ０１３７３６、イマチニブ(ＧＬＥＥＶＥＣ(登録商標))、ＭＬＮ−５１８、ＣＥＰ-７０１、ＰＫＣ−４１２、ラパチニブ(ＧＳＫ５７２０１６)、ＶＥＬＣＡＤＥ(登録商標)、ＡＺＤ２１７１、ソラフェニブ(ＮＥＸＡＶＡＲ(登録商標))、ＸＬ８８０およびＣＨＩＲ−２６５が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１１７】
前記いずれかの同時投与される薬剤の好適な用量は、現在使用されている用量であり、薬剤とＶＥＧＦ抗体の組み合わせ作用(相乗効果)に応じて少なくしてもよい。
上記の治療内容に加えて、患者は、放射線療法を受けてもよい。
本発明のある実施態様では、投与されたＶＥＧＦ抗体は、インタクトな、ネイキッド抗体である。しかしながら、ＶＥＧＦ抗体は細胞障害性剤とコンジュゲートされてもよい。ある実施態様では、コンジュゲートされた抗体および／又は結合する抗原が細胞によって内部移行され、その結果結合する癌細胞を殺す該コンジュゲートの治療効果が増す。一実施態様では、細胞障害性剤は癌細胞内の核酸を標的とするか、又は核酸を干渉する。このような細胞障害性剤の例には、メイタンシノイド、カリケアマイシン、ＲＮＡ分解酵素およびＤＮＡエンドヌクレアーゼなどがある。
【０１１８】
ＶＩＩ．アジュバント療法
本発明は、根治手術の後に、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニスト、例えばＶＥＧＦ抗体を非転移性の癌を有する被検体に投与することを含むアジュバント療法の方法を提供する。
例えば、一方法は、以下の工程を含みうる。ａ) 各治療周期が、所定の間隔で、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニスト、例えばベバシズマブの有効量と、場合によって少なくとも一つの化学療法剤を被検体に投与することを含む、複数の治療周期を含む第一段階、そして、ｂ) 各維持周期が、所定の間隔で、いずれの化学療法剤も伴わずに、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニスト、例えばベバシズマブの有効量を被検体に投与することを含む、複数の維持周期を含む第二段階、このとき組み合わせた第一および第二の段階は最初の術後治療後少なくとも１年間継続する。一実施態様では、第一段階は、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニスト、例えばベバシズマブと第一化学療法投薬計画が投与される第一の複数の治療周期の後に、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニスト、例えばベバシズマブと第二化学療法投薬計画が投与される第二の複数の治療周期を含む。
【０１１９】
アジュバント療法では、腫瘍の癌細胞数を(例えば、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又はそれ以上)低減するために、腫瘍のサイズを低減するために、腫瘍量を低減するために、末梢器官への癌細胞浸潤を阻害する(すなわち、ある程度低減するかおよび／又は停止する)ために、腫瘍の脈管密度を低減するために、腫瘍転移を阻害するために、腫瘍成長又は腫瘍細胞増殖を低減するか又は阻害するために、休止中の腫瘍の成長を低減するか又は予防するために、微小転移性癌の成長又は増殖を低減するか又は予防するために、治療又は除去後の腫瘍の再増殖を低減する又は阻害するために、および／又は癌関連の症状の一又は複数をある程度軽減するために、ある量又はある時間で(例えば経時的に特定の治療投薬計画で)投与されてよい。いくつかの更なる実施態様では、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストを用いて、被検体の癌の発症又は再発を予防することができる。ある例では、癌再発の防止は、疾患再発が集団の少なくともおよそ８０％で生じなかったことを確認するために、およそ４年後に被検体集団において評価される。他の例では、疾患再発の予防はおよそ３年に評価され、このとき疾患再発が、化学療法剤単独により治療された被検体と比較して少なくともおよそ５０％低減している。
【０１２０】
ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストは、通常、被検体が手術から回復した期間の後に投与される。この期間には、外科的な切開の創傷治癒又は治癒に必要な期間、創傷裂開のリスクが低くなるために必要な期間、又は手術前の健康レベルと本質的に同等か又はそれより良好な健康レベルに回復するために被検体に必要とされる期間が含まれうる。また、根治手術の完了とＶＥＧＦ特異的アンタゴニストの第一投与との間の期間には、被検体が治療的投薬の間に一定の時間を必要とするか又は患者が求める休薬期間に必要な期間が含まれうる。一般に、根治手術の完了とＶＥＧＦ特異的アンタゴニスト療法の開始との間の期間には、１週間未満、１週間、２週間、３週間、４週間(２８日)、５週間、６週間、７週間、８週間、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１年、２年、３年、又はそれ以上が含まれうる。一実施態様では、根治手術とＶＥＧＦ特異的アンタゴニストの投与との間の期間は、２週を超え、１年未満である。
ある例では、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニスト、例えばＶＥＧＦ抗体は、無病生存率(ＤＦＳ)又は全生存率(ＯＳ)を延長させるためのある量で投与され、このときＤＦＳ又はＯＳは抗体の最初の投与のおよそ２〜５年後に評価される。ある実施態様では、被検体のＤＦＳ又はＯＳは、治療の開始又は最初の診断の、およそ３〜５年、およそ４〜５年、又は少なくともおよそ４又は少なくともおよそ５年後に評価される。
【０１２１】
ＶＥＧＦ特異的アンタゴニスト、例えばＶＥＧＦ抗体は、被検体、例えばヒト患者に、公知の方法、例えばボーラスとしてないしはある期間にわたって連続的な注入による静脈内投与に従って、又は、筋肉内、腹膜内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液包内、髄膜下、経口、局所的、又は吸入の経路によって投与される。抗体の静脈内投与が好ましい。
ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストは単剤として投与されてもよい。他の実施態様では、患者は、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストと一又は複数の化学療法剤との組合せにより治療される。いくつかの実施態様では、少なくとも一の化学療法剤はタキソイドである。併用投与には、異なる製剤又は単一の薬物製剤を用いて同時投与ないしは同時的な投与、および何れかの順序での連続投与が含まれ、このとき場合によって、両方(又はすべて)の活性薬剤が同時にそれらの生物活性を示す期間があることが好ましい。ゆえに、化学療法剤は、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニスト、例えばＶＥＧＦ抗体の投与の前か後に投与されてもよい。この実施態様では、化学療法剤の少なくとも一の投与とＶＥＧＦ特異的アンタゴニスト、例えばＶＥＧＦ抗体の少なくとも一の投与との間の経過時間は、好ましくはおよそ１か月以下および最も好ましくはおよそ２週間以下である。あるいは、化学療法剤とＶＥＧＦ抗体は、単一の製剤又は異なる製剤で同時に患者に投与される。化学療法剤(例えばタキソイド)とＶＥＧＦ抗体(例えばベバシズマブ)の組合せによる治療により、相乗的、又はより大きな付加的な治療的利点を患者にもたらしうる。
【０１２２】
通常、化学療法剤は、投与される場合、公知の用量で投与されるか、又は場合によって抗代謝性化学療法剤の投与に帰因するネガティブな副作用ないし薬剤の組合せ作用に従って、低い用量で投与される。このような化学療法剤の調製および投薬計画は、製造業者の指示に従って用いられるか、技術者によって、経験的に決定されうる。化学療法剤がパクリタキセルである場合、好ましくは、毎週(例えば８０ｍｇ／ｍ２で)又は３週間ごと(例えば１７５ｍｇ／ｍ２又は１３５ｍｇ／ｍ２で)に投与される。好適なドセタキセル用量には、６０ｍｇ／ｍ２、７０ｍｇ／ｍ２、７５ｍｇ／ｍ２、１００ｍｇ／ｍ２(３週間ごと)；又は、３５ｍｇ／ｍ２又は４０ｍｇ／ｍ２(毎週)が含まれる。
【０１２３】
組み合わされうる様々な化学療法剤は上に開示される。ＶＥＧＦ抗体と組み合わされる化学療法剤には、例えば、タキソイド(ドセタキセルおよびパクリタキセルを含む)、ビンカ(例えばビノレルビン又はビンブラスチン)、白金化合物(例えばカルボプラチン又はシスプラチン)、アロマターゼインヒビター(例えばレトロゾール、アナストロゾール又はエキセメスタン)、抗エストロゲン(例えばフルベストラント又はタモキシフェン)、エトポシド、チオテパ、シクロホスファミド、メトトレキセート、リポソームドキソルビシン、ペグ化リポソームドキソルビシン、カペシタビン、ゲムシタビン、ＣＯＸ-２インヒビター(たとえばセレコキシブ)、又はプロテオゾームインヒビター(例えばＰＳ３４２)が含まれるが、これらに限定されるものではない。
アンスラサイクリン(例えばドキソルビシン又はエピルビシン)が被検体に投与される場合、アンスラサイクリン／シクロホスファミドの併用が手術後であってＶＥＧＦ抗体とタキソイドの投与の前に被検体に投与された以下の実施例に開示されるプロトコールなどにおいて、ＶＥＧＦ抗体の投与の前および／又は後に投与されるのが好ましい。しかしながら、循環器系毒性を低減した、変性アンスラサイクリン、例としてリポソームドキソルビシン(ＴＬＣ Ｄ-９９(ＭＹＯＣＥＴ(登録商標))、ペグ化リポソームドキソルビシン(ＣＡＥＬＹＸ(登録商標))、又はエピルビシンをＶＥＧＦ抗体と組み合わせてもよい。
【０１２４】
ある投与計画では、本発明のアジュバント療法は、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニスト、例えばＶＥＧＦ抗体と一又は複数の化学療法剤が複数の治療周期において患者に投与される第一段階と、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニスト、例えばＶＥＧＦ抗体が複数の維持周期において単剤として使われる第二段階とを含む。特定の治療計画に従って、各治療周期は１〜３週からなる。例えば、治療周期はＶＥＧＦ特異的アンタゴニストとしてベバシズマブを含み、３週であってもよく、これは患者が３週間ごとに１用量の化学療法剤と１用量のベバシズマブを服用することを意味する。また、治療周期は２週であってもよく、これは患者が２週間ごとに１用量の化学療法剤と１用量のベバシズマブを服用することを意味する。治療の第一段階全体はおよそ４〜８周期の間持続してもよい。第二の維持段階の間、ベバシズマブは、特定の周期の長さに応じて、２週間に１回(biweekly)又は３週間に１回(triweekly)、全体でおよそ３０〜５０周期の間投与される。ある実施態様では、アジュバント療法は、治療の開始から少なくとも１年の間継続し、被検体の経過はその時以後経過観察されるであろう。疾患の種類および重症度に応じて、ＶＥＧＦ抗体の好適な用量は、およそ１μｇ／ｋｇからおよそ５０ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくはおよそ５ｍｇ／ｋｇからおよそ１５ｍｇ／ｋｇの範囲で、限定するものではないが７．５ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇなどである。いくつかの態様では、化学療法投薬計画は、従来の高用量間欠投与を伴う。いくつかの他の態様では、化学療法剤は、定期的に中断することなく、よりわずかでより頻繁な用量を用いて投与される(「メトロノーム的化学療法」)。本発明の療法の経過は、従来の技術およびアッセイによって容易にモニターされる。
【０１２５】
抗体および／又は化学療法の投与により、被検体集団において３年でおよそ５０％再発(原発性器官における癌の再発および／又は遠位再発)が減少する(このとき本明細書中の「およそ５０％」はおよそ４５％からおよそ７０％の範囲を含む)、例えば、化学療法(例えばタキソイド、例としてパクリタキセル)のみで治療される被検体と比較して、原発性器官における再発が３年でおよそ５２％、および／又は遠位再発が３年でおよそ５３％減少する。
本明細書中の本発明は、根治手術の後に、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニスト、例えばＶＥＧＦ抗体の有効量と少なくとも一の化学療法剤とを被検体に投与することと、被検体の少なくともおよそ８０％(好ましくは少なくともおよそ８５％)においておよそ４年後に疾患の再発が起こっていないことを確認するために、４年又はそれ以上の後に被検体を評価することを含む、非転移性の癌を有するヒト被検体集団における非転移性の癌の治癒方法を提供する。集団は、３０００以上のヒト被験体を含んでいてもよい。
本発明はさらに、根治手術の後に、有効量のベバシズマブと少なくとも一の化学療法剤とを被検体に投与することを含む、非転移性の癌を有するヒト被検体集団において疾患再発の可能性を低減する方法であって、このとき疾患再発の可能性が、タキソイドのみによって治療された被検体と比較して３年で少なくともおよそ５０％低減している方法に関する。
【０１２６】
ＶＥＧＦ抗体および化学療法剤以外の、他の治療的投薬計画は、それと組み合わされてもよい。例えば、第二(第三、第四など)の化学療法剤が投与されてもよく、第二化学療法剤は、他の異なるタキソイド化学療法剤であるか、又はタキソイドでない化学療法剤である。例えば、第二の化学療法剤は、タキソイド(例えばパクリタキセル又はドセタキセル)、ビンカ(例えばビノレルビン)、白金化合物(例えばシスプラチン又はカルボプラチン)、抗ホルモン剤(例えばアロマターゼインヒビター又は抗エストロゲン)、ゲムシタビン、カペシタビンなどであってもよい。例示的な組合せには、タキソイド／白金化合物、ゲムシタビン／タキソイド、ゲムシタビン／ビノレルビン、ビノレルビン／タキソイド、カペシタビン／タキソイドなどが含まれる。異なる化学療法剤の「反応混液(カクテル)」が投与されてもよい。
ＶＥＧＦ抗体と組み合わされてもよい他の治療薬には、他のＶＥＧＦアンタゴニスト又はＶＥＧＦレセプターアンタゴニスト、例えば第二の抗ＶＥＧＦ抗体、ＶＥＧＦ変異体、可溶性ＶＥＧＦレセプター断片、ＶＥＧＦ又はＶＥＧＦＲをブロックすることができるアプタマー、中和抗ＶＥＧＦＲ抗体、ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼのインヒビターおよびこれらいずれかの組み合わせのいずれか一又は複数が含まれる。本発明の抗体による組み合わせ腫瘍療法のために有用な他の治療的薬剤には、腫瘍増殖に伴う他の因子、例として、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２(Ｈｅｒ２としても知られる)、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４又はＴＮＦのアンタゴニストが含まれる。ある例示的な実施態様では、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストの組成物は、抗ＥｒｂＢ２抗体、又はその断片ないしはその誘導体(例えばハーセプチン(登録商標)抗体)を含まない。ある実施態様では、抗ＶＥＧＦ抗体は、ＶＥＧＦレセプター、ＦＧＦレセプター、ＥＧＦレセプターおよびＰＤＧＦレセプターなどの一又は複数のチロシンキナーゼレセプターを標的とする小分子レセプターチロシンキナーゼインヒビター(ＲＴＫＩ)と組み合わせて用いられうる。多くの治療的小分子ＲＴＫＩは、当分野で公知であり、バタラニブ(ＰＴＫ７８７)、エルロチニブ(ＴＡＲＣＥＶＡ(登録商標))、ＯＳＩ−７９０４、ＺＤ６４７４(ＺＡＣＴＩＭＡ(登録商標))、ＺＤ６１２６(ＡＮＧ４５３)、ＺＤ１８３９、スニチニブ(ＳＵＴＥＮＴ(登録商標))、セマキシニブ(ＳＵ５４１６)、ＡＭＧ７０６、ＡＧ０１３７３６、イマチニブ(ＧＬＥＥＶＥＣ(登録商標))、ＭＬＮ−５１８、ＣＥＰ-７０１、ＰＫＣ−４１２、ラパチニブ(ＧＳＫ５７２０１６)、ＶＥＬＣＡＤＥ(登録商標)、ＡＺＤ２１７１、ソラフェニブ(ＮＥＸＡＶＡＲ(登録商標))、ＸＬ８８０およびＣＨＩＲ−２６５が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１２７】
前記いずれかの同時投与される薬剤の好適な用量は、現在使用されている用量であり、薬剤とＶＥＧＦ抗体の組み合わせ作用(相乗効果)に応じて少なくしてもよい。
上記の治療内容に加えて、患者は、放射線療法を受けてもよい。
ある実施態様では、投与されたＶＥＧＦ抗体は、インタクトな、ネイキッド抗体である。しかしながら、ＶＥＧＦ抗体は細胞障害性剤とコンジュゲートされてもよい。ある実施態様では、コンジュゲートされた抗体および／又は結合する抗原が細胞によって内部移行され、その結果結合する癌細胞を殺す該コンジュゲートの治療効果が増す。一実施態様では、細胞障害性剤は癌細胞内の核酸を標的とするか、又は核酸を干渉する。このような細胞障害性剤の例には、メイタンシノイド、カリケアマイシン、ＲＮＡ分解酵素およびＤＮＡエンドヌクレアーゼなどがある。
【０１２８】
ＶＩＩＩ．用量、製剤および継続期間
ＶＥＧＦ特異的アンタゴニスト組成物は、医学的実用性に合わせた様式で調製し、１回分に分けて、投与される。ここで考慮する要因は、治療する特定の疾患、治療する特定の被検体、個々の患者の臨床状態、疾患の原因、薬剤の運搬部位、投与の方法、投与の日程計画、および医師が知る他の因子を含む。投与されるＶＥＧＦ特異的アンタゴニストの「治療上有効量」は、このようなことを考慮して調整され、良性、前癌性又は初期の癌を予防、改善、又は治療、又は安定化させるために、又は例えば、ネオアジュバント又はアジュバント環境において、腫瘍、休止中の腫瘍、又は微小転移性癌の発生又は再発を治療又は予防するために必要な最少量である。ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストは必ずではないが場合によって、癌ないしは癌を発症するリスクを予防又は治療するために現在用いられる一又は複数の薬剤とともに製剤化される。他の薬剤の有効量は、製剤中に存在するＶＥＧＦ特異的アンタゴニストの量、疾患又は治療の種類、および上記の他の因子によって決まる。これらは、一般的に、ここに記載されるものと同じ用量および投与経路で、又はここに記載される用量のおよそ１〜９９％で、用いられる。
【０１２９】
疾患の種類および重症度に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ(例えば０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ)のＶＥＧＦ特異的アンタゴニストを、例えば一又は複数の分割投与又は連続注入によって患者投与の初期候補用量とすることができる。ある典型的な１日量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であろう。特に望ましい用量は、例えば７．５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇおよび１５ｍｇ／ｋｇなどである。症状に応じて、数日間以上にわたる繰り返し投与では、治療は、上記又は当分野で公知の方法によって測定して、癌が治療されるまで持続する。しかしながら、他の投与計画が有用であるかもしれない。ある例では、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストは抗体である場合、本発明の抗体は、週に１回、２週間に１回、又は３週間に１回、およそ５ｍｇ／ｋｇからおよそ１５ｍｇ／ｋｇの範囲で、限定するものではないが７．５ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇなどで投与される。本発明の療法の経過は、従来の技術およびアッセイによって容易にモニターされる。
ある例では、ベバシズマブはＶＥＧＦ特異的アンタゴニストである。ベバシズマブは、４ｍｌ又は１６ｍｌのベバシズマブ(２５ｍｇ／ｍｌ)を送達するために、１００ｍｇおよび４００ｍｇの防腐剤を含まない、使い捨てのバイアルで治療的使用のために供給される。１００ｍｇの生成物は、２４０ｍｇのα,α-トレハロース無水和物、２３．２ｍｇのリン酸ナトリウム(一塩基性、一水和物)、４．８ｍｇのリン酸ナトリウム(二塩基性、無水)、１．６ｍｇのポリソルベート２０および注入用の水、ＵＳＰに製剤化される。４００ｍｇの生成物は、９６０ｍｇのα,α-トレハロース無水和物、９２．８ｍｇのリン酸ナトリウム(一塩基性、一水和物)、１９．２ｍｇのリン酸ナトリウム(二塩基性、無水)、６．４ｍｇのポリソルベート２０および注入用の水、ＵＳＰに製剤化される。
【０１３０】
治療の継続期間は、医学上の所定の長さ、又は、所望の治療効果(例えば本明細書において記述される効果)が達成されるまで、長い間継続するであろう。ある実施態様では、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニスト療法は、２か月、４か月、６か月、８か月、１０か月、１年、２年、３年、４年、５年間、又は被検体の生存期間以下のある年数の間続けられる。
通常、良性、前癌性又は初期の癌の緩和ないしは治療又は癌(良性又は悪性)のアジュバントないしはネオアジュバント療法は、癌と関係する一又は複数の症状又は医学的な問題を少なくすることを伴う。薬剤の治療上有効量により、腫瘍の癌細胞数を(例えば、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又はそれ以上)低減すること、腫瘍のサイズを低減すること、腫瘍量を低減すること、末梢器官への癌細胞浸潤を阻害する(すなわち、ある程度低減するかおよび／又は停止する)こと、腫瘍の脈管密度を低減すること、腫瘍転移を阻害すること、腫瘍成長又は腫瘍細胞増殖を低減するか又は阻害すること、休止中の腫瘍の成長を低減するか又は予防すること、微小転移性癌の成長又は増殖を低減するか又は予防すること、(例えばアジュバント療法において)治療ないしは除去後の腫瘍の再増殖を低減するか又は予防すること、良性、前癌性又は非転移性の腫瘍ないしは悪性腫瘍に罹りやすい、又は診断された被検体のＤＦＳ又はＯＳを増やす又は延ばすこと、(例えばネオアジュバント療法において)手術が可能になるまで腫瘍のサイズを低減すること、および／又は癌関連の症状の一又は複数をある程度軽減すること、の一又はいずれかの組み合わせを達成することができる。いくつかの更なる実施態様では、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストは、被検体の癌の発生又は再発を予防するために用いられうる。ある例では、癌再発の防止は、疾患再発が集団の少なくともおよそ８０％で生じなかったことを確認するために、およそ４年後に被検体集団において評価される。他の例では、疾患再発の予防はおよそ３年に評価され、このとき疾患再発が、化学療法剤単独により治療された被検体と比較して少なくともおよそ５０％低減している。
【０１３１】
ある例では、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニスト、例えばＶＥＧＦ抗体は、ＤＦＳ又はＯＳを延長させるためのある量で投与され、このときＤＦＳ又はＯＳは抗体の最初の投与のおよそ２〜５年後に評価される。ある実施態様では、被検体のＤＦＳ又はＯＳは、治療の開始又は最初の診断の、およそ３〜５年、およそ４〜５年、又は少なくともおよそ４又は少なくともおよそ５年後に評価される。
一実施態様では、本発明は、良性、前癌性又は非転移性の腫瘍に罹りやすい又は診断された被検体の生存期間を延ばすために用いられうる。生存期間は、薬剤の第一投与から死までの時間と定められる。また、生存期間は、治療群対対照群の層別化した危険率(ＨＲ)で測定することができ、それは治療の間の患者の死のリスクを表す。
さらに他の実施態様では、本発明の治療は、癌に罹りやすい又は癌と診断された被検体、例えばヒト患者であって、様々な抗癌療法によって治療されている集団において有意に応答速度を増加する。応答速度は、治療に反応した治療された患者のパーセンテージとして定められる。一態様では、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストおよび手術、放射線療法、又は一又は複数の化学療法剤を用いた本発明の組合せ治療は、手術、放射線療法又は化学療法のみで治療された群と比較して、治療された患者群において応答速度を有意に上げ、その増加は０．００５未満のカイ二乗ｐ値を有する。
【０１３２】
腫瘍、休止中の腫瘍又は微小転移性癌の発症又は再発の治療又は予防は、一般に腫瘍の最初の治療ないしは除去(例えば、手術、化学療法又は放射線療法などの抗癌療法)後の腫瘍ないしは転移の形成の予防を伴う。手術は、腫瘍細胞又は休止中の微小転移性小結節を残し得、それらは「血管形成プログラム」を再活性化して、より指数関数的腫瘍増殖を促しうる。休止中の腫瘍又は微小転移性癌の存在が臨床測定値又は選別を使用して必ずしも検出可能であるというわけではないが、治療上有効量は、臨床医に知られている技術を使用して、休止中の腫瘍、微小転移性癌、転移又は腫瘍再発の検出を予防するか又は低減するために十分であるものである。ある例では、外科的に腫瘍を除去することによって腫瘍について治療される被検体は、その後ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストで治療され、休止中の腫瘍、微小転移性癌又は腫瘍再発の検出のために経時的にモニターされる。ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストは、(例えば、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストの前、それとともに、又はその後の)他の抗癌療法と組み合わせて投与されてもよく、一方又は両方の療法は維持療法として続けられてもよい。
癌の治療の治療的有効性の更なる測定値は、米国特許出願公開番号２００５０１８６２０８において記述される。
【０１３３】
治療用製剤は、所望の純度を有する活性成分を、任意の生理的に許容される担体、賦形剤又は安定剤と混合することによって、当分野で公知の標準的な方法を用いて調製される(Remington's Pharmaceutical Sciences (20th edition), ed. A. Gennaro, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA)。許容可能な担体には、生理食塩水、又はリン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸などのバッファ；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量(およそ１０未満の残基)のポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン、アミノ酸、例として、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジン；単糖、二糖および他の炭水化物、例としてグルコース、マンノース又はデキストリン；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖アルコール、例えばマンニトール又はソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；および／又は非イオン性界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭ又はＰＥＧが含まれる。
場合によって、しかし、好ましくは、製剤は、薬学的に許容可能な塩、一般的に、例えば塩化ナトリウムを、好ましくは生理的濃度で含有する。場合によって、本発明の製剤は、薬学的に許容可能な防腐剤を含有してもよい。いくつかの実施態様では、保存の濃度は、０．１から２．０％、一般的にｖ／ｖの範囲である。好適な防腐剤には製薬の分野で知られているものが含まれる。ベンジルアルコール、フェノール、ｍ−クレゾール、メチルパラベンおよびプロピルパラベンは、防腐剤の例である。場合によって、本発明の製剤は、０．００５〜０．０２％の濃度で、薬学的に許容可能な界面活性剤を含んでもよい。
【０１３４】
また、本明細書中の製剤は、治療される特定の徴候の必要に応じて、一よりも多い活性な化合物、好ましくは互いに悪影響を与えない相補的活性を有するものを含有してもよい。このような分子は、意図する目的のために有効である量で組み合わされて適切に存在する。
活性成分はまた、コロイド性薬物デリバリーシステム(例えば、リポソーム、アルブミンマイクロカプセル、ミクロエマルション、ナノ−粒子、およびナノカプセルなど)又はマクロエマルション中、例えば、それぞれ、コアセルベーション法又は界面重合法によって製造された、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−(メチルメタシラート)(poly-(methylmethacylate) マイクロカプセルに取込むことができる。このような技術は、上掲のRemington's Pharmaceutical Sciencesにおいて開示される。
【０１３５】
徐放性製剤も調製できる。徐放性製剤の適切な例には、抗体を含有する固形疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが含まれ、このマトリックスはフィルムやマイクロカプセル等の成形品の形である。徐放性マトリックスの例として、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(２−ヒドロキシエチルメタクリレート)又はポリ(ビニルアルコール))、ポリアクチド(米国特許第３７７３９１９号)、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタマートの共重合体、非−分解性エチレン−ビニルアセテート、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴＴＭ(乳酸−グリコール酸共重合体および酢酸ロイプロリド(leuprolide acetate)から構成される注射用ミクロスフェア)のような分解性乳酸−グリコール酸共重合体、およびポリ−Ｄ−(−)−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン−ビニルアセテートおよび乳酸−グルコール酸のようなポリマーは分子を１００日間にわたって放出することができるが、ある種のヒドロゲルはタンパクをより短時間の間放出する。被包された抗体が体内に長時間維持された場合、３７℃で水分に暴露されて変性するか凝集し、結果として生物学的活性を失い免疫原性が変化するかもしれない。関与する機構に応じて安定化のための合理的な戦略を考案することができる。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換を介する分子間Ｓ−Ｓ結合の形成であることが分かれば、安定化は、スルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含量のコントロール、適当な添加物の使用、および特異的なポリマーマトリックス組成物の使用によって達成することができる。
【０１３６】
本発明のＶＥＧＦ特異的アンタゴニストは、ボーラスとして又はある期間の連続注入による静脈内投与、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液内、包膜内、経口、局所などの投与経路又は吸入経路などの既知の方法で哺乳類、好ましくはヒトに投与される。広範囲な副作用又は毒性がＶＥＧＦ拮抗作用と関係している場合、局所投与が特に望ましい。また、エクスビボ方策が医療適用のために用いられてもよい。エクスビボ方策は、ＶＥＧＦアンタゴニストをコードするポリヌクレオチドを被検体から得られる細胞に形質移入させるか又は形質導入させることを伴う。形質移入させるか又は形質導入させた細胞は、次いで被検体に戻される。細胞は、造血性細胞(例えば骨髄細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、Ｔ細胞又はＢ細胞)、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、ケラチン合成細胞又は筋細胞を含むが、これらに限定されるものではない様々な範囲のいずれかでありうる。
例えば、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストが抗体である場合、抗体は、非経口的、皮下、腹膜内、肺内、鼻腔内、局所の免疫抑制性治療のために所望するならば、病巣内の投与を含む、任意の適切な手段によって投与される。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹膜内、又は皮下の投与が含まれる。さらに、抗体は、特に抗体の用量を低減したパルス注入によって最適に投与される。好ましくは、投薬は、投与が短期であるか長期であるかにある程度依存して、注射、最も好ましくは静脈内又は皮下注射によってなされる。
【０１３７】
他の例では、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニスト化合物は、直接注射などによって局所的に投与され、疾患又は腫瘍の位置が可能である場合には、注射は周期的に繰り返されてもよい。また、例えば休止中の腫瘍又は微小転移性癌の局所の再発又は転移を予防するか又は低減するために、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストは、被検体の全身に、又は腫瘍細胞、例えば腫瘍の外科的切除後の腫瘍床ないしは腫瘍に直接送達されてもよい。
あるいは、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストをコードする核酸配列を含有する阻害性核酸分子又はポリヌクレオチドは、被検体の適切な細胞に送達されてもよい。ある実施態様では、核酸は、腫瘍そのものに対するものであってもよい。
核酸は、使用されるベクターに適切な任意の手段によって細胞に導入されてもよい。多くのこのような方法は当分野で周知である(上掲のSambrook et al.、およびWatson et al., Recombinant DNA, Chapter 12, 2d edition, Scientific American Books, 1992)。遺伝子運搬の方法の例には、リポソームが媒介する形質移入、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム／ＤＥＡＥデキストラン方法、遺伝子銃、およびマイクロインジェクションが含まれる。
【０１３８】
ＩＸ．併用療法
また、本発明は、本発明の２以上のＶＥＧＦ特異的アンタゴニストの組み合わせ、又は少なくとも一のＶＥＧＦ特異的アンタゴニストと一又は複数の付加的抗癌療法との組み合わせの使用を特徴とする。抗癌療法の例としては、手術、放射線療法(照射療法)、生物療法、免疫療法、化学療法又はこれらの療法の組合せが挙げられるが、これらに限定されるものではない。さらに、細胞障害性剤、抗血管形成および抗増殖性の薬剤が、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストと組み合わせて用いられてもよい。
ある例では、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストは、根治手術後の非転移性癌の治療のためのアジュバント療法として使われる。この例では、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストは、少なくとも一の付加的化学療法剤の有無にかかわらず提供されてもよい。
他の例では、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストは、手術の前に手術可能な癌の治療のためのネオアジュバント療法として使われる。この例では、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストは、少なくとも一の付加的化学療法剤の有無にかかわらず手術の前に提供されてもよい。
【０１３９】
ある例では、本発明は、一又は複数の化学療法剤(例えば反応混液(カクテル))とのＶＥＧＦ特異的アンタゴニストの使用を特徴とする。化学療法剤の非限定的な例には、イリノテカン、フルオロウラシル、ロイコボリン又はいずれかの組合せが含まれる。併用投与には、異なる製剤又は単一の薬物製剤を用いた同時投与、および何れかの順序での連続投与が含まれ、このとき、両方(又はすべて)の活性薬剤が同時にそれらの生物活性を示す期間があることが好ましい。このような化学療法剤の調製および投薬スケジュールは、製造業者の指示に従うか、熟練した医師によって経験的に決定される。化学療法の調製および投薬スケジュールはChemotherapy Service Ed., M. C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, Md. (1992)にも記載されている。化学療法剤は、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストの投与に先立って、或いは後に、又は同時に投与することができる。
また、本明細書中の製剤は、治療される特定の徴候の必要に応じて、一よりも多い活性な化合物、好ましくは互いに悪影響を与えない相補的活性を有するものを含有してもよい。例えば、一製剤中に、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ(例えばＶＥＧＦ上の異なるエピトープに結合する抗体)、ＶＥＧＦＲ又はＥｒｂＢ２(例えばハーセプチン(登録商標))に結合する抗体をさらに提供することが望ましい。ある例示的な実施態様では、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストのための組成物は、抗ＥｒｂＢ２抗体又はその断片ないしはその誘導体(例えばハーセプチン(登録商標)抗体)を含まない。あるいは、又は、さらに、組成物は、細胞障害性剤、サイトカイン、増殖阻害性剤および／又は小分子ＶＥＧＦＲアンタゴニストを含んでもよい。このような分子は、意図する目的のために有効である量で、組み合わされて適切に存在する。
【０１４０】
疾患の予防又は治療のために、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストの好適な用量は、治療する疾患の種類、上記に定まるように、疾患の重症度と経過、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストを予防目的で投与するか治療目的で投与するか、以前の治療、患者の既往歴やＶＥＧＦ特異的アンタゴニストへの応答性、および主治医の指示に依存するであろう。ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストは、１回、又は、一連の治療を通じて患者に適切に投与される。併用療法投薬計画では、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストおよび本発明の一又は複数の抗癌治療薬は、治療的に有効な量又は相乗的な量で投与される。本明細書中で用いる、治療上有効量は、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストと一又は複数の他の治療薬との同時投与、又は本発明の組成物の投与により、上記のように癌が低減又は阻害される程度である。治療的に相乗的な量は、特定の疾患に関連する状態や症状を相乗的ないしは有意に低減する又は除去するために必要な、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストと一又は複数の他の治療剤との量である。
【０１４１】
ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストと一又は複数の他の治療的薬剤は、腫瘍、休止中の腫瘍の発症ないしは再発、又は微小転移性癌を低減するか除去するためのある量およびある時間で同時又は連続的に投与されうる。ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストと一又は複数の他の治療薬は、腫瘍の再発の可能性を予防するか又は低減するために、維持療法として投与されてもよい。
ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストは、単独で、又は、他の抗癌治療的化合物と組み合わせて、キットとして包装されてもよいキットは、患者への単位用量の投与を支援する任意選択成分、例えば粉末形態を再構成するためのバイアル、注射用シリンジ、カスタマイズされたＩＶ運搬システム、吸入器などを含んでもよい。さらに、単位用量キットは、組成物の調製および投与のための指示を含んでもよい。キットは、一患者のための１回使用の単位用量、特定の患者のための複数回使用として製造されてもよいし(一定用量で、又は、このとき個々の化合物が治療進行につれて効力が変化しうる)、又は、キットは、複数の患者への投与に適する複数用量を含んでもよい(「ばら包装」)。キット構成成分は、カートン、ブリスター包装、瓶、チューブなどに積められてもよい。
【０１４２】
Ｘ．製造品
本発明の他の一実施態様では、上記の疾患の治療のために有用な材料を含有している製造品が提供される。製造品は、容器と、ラベルと、パッケージ挿入物とを具備する。適切な容器には、例えば瓶、バイアル、注射器などが含まれる。容器はガラス又はプラスチック等の様々な材料から形成される。容器は、状態の治療に有効な組成物を保持し、無菌のアクセスポートを有してもよい(例えば、容器は、皮下注射針で穿孔可能なストッパを有する静脈注射用溶液のバッグ又はバイアルでもよい)。組成物中の少なくとも一の活性薬剤は、抗ＶＥＧＦ抗体である。容器上又は容器に添付されたラベルは、組成物が選択の症状を治療するために用いられることを示す。製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えばリン酸緩衝生理食塩水、リンガー液およびデキストロース溶液を含む第二の容器を更に具備してもよい。さらに、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、およびシリンジを含む、商業上および使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。さらに、製造品は、例えば、組成物が他の組成物と組み合わされて用いるべきではないという警告、又は抗ＶＥＧＦ抗体組成物のみを又は抗癌組成物と組み合わせて患者に投与するように組成物の使用者に指示することを含む、使用のための指示を有するパッケージ挿入物を具備する。「使用のための指示」なる用語は、適用治療、医薬、治療、治療計画などについての示唆を、例えばパッケージ挿入物の形態ないしは他の書面の販促用材料の形態で書面などの任意の手段で提供することを意味する。
【０１４３】
Ｘ．材料の寄託
以下のハイブリドーマ細胞株は、ブダペスト条約の規定の下に、American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USAに寄託されている。
抗体名称      ＡＴＣＣ番号                 寄託日
Ａ４.６.１    ＡＴＣＣ ＨＢ−１０７０９    １９９１年３月２９日
【実施例】
【０１４４】
実施例１  ＶＥＧＦ−Ａの阻害による腸管腺腫増殖の抑止とＡｐｃｍｉｎ／＋マウスの長期生存
家族性腺腫性ポリポーシス(ＦＡＰ)および大多数の散発性結腸直腸癌の症候群はＡＰＣ遺伝子の突然変異によって生じる。ＦＡＰ患者は、上部胃腸(ＧＩ)管の腫瘍および類線維腫を含む、結腸外の腫瘍に加えて、下部胃腸(ＧＩ)管に数百から数千もの腺腫ポリープを発達させる。コドン８５０のヘテロ接合性切断対立遺伝子を有するＡｐｃｍｉｎ／＋マウスは、生殖細胞系ＡＰＣ突然変異をもつＦＡＰ患者のポリープ症のいくつかの特徴を呈する(Moser et al., Science 247:322-324 (1990)、Su et al., Science 256:668-670 (1992))。Ａｐｃｍｉｎ／＋マウスでの腫瘍形成の発生は早期成体期であり、一般的にこの動物は、Ｃ５７ＢＬ／６遺伝的背景において６０〜１５０の腸管ポリープを発達させる。腫瘍発達によりマウスの寿命が重度に損なわれ、通常５か月齢のごろに貧血症および／又は低タンパク血症で死に至る(Moser et al., Science 247:322-324 (1990))。ＦＡＰを有するヒトが一般的に結腸腺腫を発達させるのに対して、Ａｐｃｍｉｎ／＋マウスは、理由は完全に理解されてはいないが、小腸に大多数のポリープを発達させる。これらのポリープは、直径１〜２ｍｍのサイズに達し、より大きなポリープ(直径最高４ｍｍ)が低い頻度で生じる。まれ、一般に１動物あたり０〜３の結腸腺腫のみが観察される。
【０１４５】
Ａｐｃは、細胞性の過程、例えば増殖、アポトーシス、細胞移動、細胞接着、微小管集合、シグナル伝達、および染色体分離に関与することが報告されている(Nathke, Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 20:337-366 (2004)に概説される)。Ａｐｃの最も調べられた機能は、Ｗｎｔシグナル伝達経路上のβ-カテニンの調節因子としてのその役割である(Nathke, Mol. Pathol. 52:169-173 (1999)に概説される)。簡単にいうと、Ｗｎｔシグナル伝達の非存在下で、ＡｐｃはａｘｉｎとＧＳＫ−３βに結合し、細胞質のβ-カテニンの破壊破壊複合体を形成し、それによって核転座とその後の転写因子のＴ細胞因子／リンパ系エンハンサー因子(ＴＣＦ／ＬＥＦ)ファミリの活性を阻害する。ＴＣＦ／ＬＥＦの転写標的は、前述の細胞経路に伴われる分子を含む。
異種移植片のモデルは天然の環境での腫瘍の発達を繰り返さないので、異種移植片の腫瘍成長のメカニズムを調査することにいくつかの制限がある。天然に生じる、遺伝的に罹患しやすい非悪性腫瘍モデルに対する抗血管形成療法の効果を調べるために、本発明者等は腸管腺腫のＡｐｃｍｉｎ／＋モデルを調べた。以下の実施例では、例示的なＶＥＧＦ特異的アンタゴニストである抗ＶＥＧＦ−Ａ ｍＡｂによる短期および長期の治療の後、並びに腸管上皮細胞のＣｒｅ−ＬｏｘＰ技術によるＶＥＧＦ−Ａの遺伝子欠失の後に、Ａｐｃｍｉｎ／＋マウスの腫瘍表現型を分析した。
後述する実験のために、Ａｐｃｍｉｎ／＋マウス(保存番号００２０２０、５)、および１２.４ＫｂＶｉｌＣｒｅマウス(保存番号００４５８６、これ以降ＶｉｌｌｉｎＣｒｅ、Madison et al., J. Biol. Chem. 277:33275-33283 (2002))をThe Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)から得た。ＶＥＧＦｌｏｘ／ｌｏｘマウス(これ以降ＶＥＧＦｌｏｘ)は既に公開されている(Gerber et al., Development 126:1149-1159 (1999))。マウスは、バリア設備のマイクロアイソレーターケージに収容し、適宜餌を与えた。動物および実験プロトコールの維持は、連邦規制に従って行い、Institutional Animal Care and Use Committeeの承認を得た。
【０１４６】
Ａｐｃｍｉｎ／＋腸管腺腫におけるＶＥＧＦ−Ａの発現
Ａｐｃｍｉｎ／＋マウスにおける腸管腫瘍のＶＥＧＦ−Ａの発現パターンを調査するために、本発明者等は、１４週齢のマウスの腺腫に対してインサイツハイブリダイゼーションを行った。これらの実験のために、インサイツハイブリダイゼーションは先に述べられているように(Ferrara et al., Am. J. Pathol. 162:1881-1893 (2003))行った。簡単にいうと、中性に緩衝したホルマリンにて固定して、脱水して、パラフィン包埋した腸管組織切片を脱パラフィン化して、水和させて、２０μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫにて３７℃で１５分間かけて脱タンパク質(deproteination)した。[３３Ｐ]ＵＴＰ標識したセンスおよびアンチセンスのリボプローブを５５℃で終夜をかけてハイブリダイズさせ、その後０．１×標準的クエン酸塩類にて５５℃で２時間かけて高ストリンジェンシー洗浄を行った。乾燥したスライドガラスをコダックＢｉｏＭａｘ ＭＲオートラジオグラフフィルム(Eastman Kodak Co., Rochester, NY)に室温で３日間露光させ、その後ＮＴＢ２核飛跡乳剤(nuclear track emulsion)(Eastman Kodak Co.)に浸漬させ、乾燥剤を含む密封したプラスチック性のスライドボックス中で４℃で２８日間かけて露光し、反応させて、(ヘマトキシリンエオシン)Ｈ＆Ｅにて対比染色した。先に述べられているように(Ferrara et al., Am. J. Pathol. 162:1881-1893 (2003))、ＶＥＧＦ−Ａプローブを調製した。ＶＥＧＦ−Ａプローブ長はＮＭ＿０３１８３６のヌクレオチド２９７−６４５に対応する３４９ヌクレオチドとした。上方プライマー配列は、5'- CAA CGT CAC TAT GCA GAT CAT GCG(配列番号：１)であり、下方プライマー配列は、5'- GGT CTA GTT CCC GAA ACC CTG AG(配列番号：２)とした。
これらのインサイツハイブリダイゼーション実験では、ＶＥＧＦ−Ａ発現は、正常な腸管絨突起上皮と比較して様々な強度で上皮細胞に観察されたのに対して、腺腫の間質細胞、並びに正常な絨毛の間質において局所性の顕著なシグナルが観察された(図１Ａ−Ｆ)。
【０１４７】
ＶＥＧＦ−Ａの阻害によるＡｐｃｍｉｎ／＋マウスの腫瘍量の低下
抗ＶＥＧＦ−Ａ療法がマウスの良性腸管腫瘍の腫瘍量を低減するのに有効であるか否かを決定するために、本発明者等は、免疫応答を誘発する可能性を低くするために、マウス−ヒトキメラ形式の抗ＶＥＧＦ−Ａ ｍＡｂ Ｇ６−３１にてＡｐｃｍｉｎ／＋マウスを治療した。抗ＶＥＧＦ−Ａ ｍＡｂ Ｇ６−３１は、記載されているように(Liang et al., J. Biol. Chem. 281:951-961 (2006))、ヒトＦａｂファージライブラリから得た。マウスの長期投与に適切な抗体を生成するために、可変ドメインを、マウスＩｇＧ２ａ定常ドメインに融合した。ｍＡｂ Ｇ６−３１(Liang et al., J. Biol. Chem. 281:951-961 (2006))又はアイソタイプ一致コントロールマウスＩｇＧ２ａ(抗ＧＰ１２０)、いずれも５ｍｇ／ｋｇの用量を、ＰＢＳにて９０〜１４０μｌ体積にして、週に１回腹膜内投与した。処置は、３週、６週、最高１年間、又はマウスが瀕死とわかるまで続けた。各群につき５〜１４匹のマウスの処置は９１±３日齢に開始した。
本発明者等は、マウスおよびヒトのＶＥＧＦ−Ａの両方を潜在的にブロックする能力を有するので、ｍＡｂ Ｇ６−３１を選択した(Liang et al., J. Biol. Chem. 281:951-961 (2006))。これは、マウスでなくヒトのＶＥＧＦ−Ａを阻害する、よく特徴付けられた抗ＶＥＧＦ ｍＡｂ Ａ.４.６.１と異なっている(Gerber et al., Cancer Res. 60: 6253-6258 (2000)、Liang et al., J. Biol. Chem. 281:951-961 (2006))。腫瘍量に対するｍＡｂ Ｇ６−３１の短期効果を評価するために、１コホートにつき１０匹のマウスの処置を１３週齢に開始し、３〜６週間続けた。処置開始時の腫瘍表現型を決定するために、１３週齢時(０日目)に１２匹のマウスの無処置コントロール群を分析した。
【０１４８】
３又は６週間の抗ＶＥＧＦ−Ａ ｍＡｂによる処置により、Ａｐｃｍｉｎ／＋マウスでの全体の腫瘍量が有意に低減した。０日目に、Ａｐｃｍｉｎ／＋マウスの平均腫瘍量は３９．３ｍｍ３(１２．３ｍｍ３から９７．０ｍｍ３)であった(図２Ａ)。コントロールＩｇＧにて３週間処置したマウスの平均腫瘍量が９６．８ｍｍ３(４７．１−２９９．９ｍｍ３)であったのに対して、ｍＡｂ Ｇ６−３１にて３週間処置したマウスの平均腫瘍量は２３．５ｍｍ３(４．５−５８．２ｍｍ３)であった。ｍＡｂ Ｇ６−３１処置により平均腫瘍量が７６％に減少、又は４分の１減少し、これは統計学的に有意であった(ｐ＜０．００８)。コントロールＩｇＧの６週間の投与の後、腫瘍量は平均１９８．６ｍｍ３(４０．５−３１５．７ｍｍ３)に達したのに対して、ｍＡｂ Ｇ６−３１にて治療したマウスの腫瘍量は２８．４ｍｍ３(３．２−７５．９ｍｍ３)と低いままであり、平均腫瘍量が８６％に減少又は７分の１減少し、これは有意であった(ｐ＜５．３×１０−５)(図２Ａ)。
ｍＡｂ Ｇ６−３１による３および６週間の処置の後の腫瘍量の顕著な減少は、腺腫数の減少とは対照的に、腺腫サイズの減少によるものであった。コントロールＩｇＧによる３週間の処置の後の平均腫瘍数は１１６±９(±ＳＥＭ)であったのに対して、ｍＡｂ Ｇ６−３１投与後の平均腫瘍数は１０７±１１であった(ｐ＜０．２８)。コントロールＩｇＧによる６週間の処置の後の平均腫瘍数は１２０±１１であったのに対して、ｍＡｂ Ｇ６−３１投与後の平均腫瘍数は１００±１０であった(ｐ＜０．０９)。０日目に、マウスは平均１００±９腫瘍であった。
【０１４９】
腫瘍サイズおよび数の分析のために、腺胃から直腸までの腸管を縦に切開し、水で洗い流し、平面を濾紙に広げた。Ｎｏｔｏｘ  Ｈｉｓｔｏ  Ｆｉｘａｔｉｖｅ(Scientific Design Laboratory Inc., Des Plaines, IL)による終夜固定とメチレンブルー０．１％水溶液にて染色した後、小腸および大腸各々の腸管腺腫の数、場所および直径を、ライカ解剖顕微鏡上の２０×拡大率の下での接眼スケールにて、処置を明らかにせずに、一人の観察者によってスコア付けした。この方法により、直径０．３ｍｍ以上のポリープを確実に記録した。腫瘍体積は半球として算出した。各々のマウスの腫瘍量は、その腫瘍体積の合計として算出した。Ｐ値は、両側スチューデントｔ検定によって算出した。未処置群のマウス(０日目)を、抗体処置したマウスのコントロールとして処置開始時(１３週)に分析した。
３又は６週間の処置の間、腺腫の増殖が抗ＶＥＧＦ−Ａ処置を逃れたという所見はなく、コントロールＩｇＧにて処置したマウスの腫瘍の広域なサイズ分布(図２Ｂ、上から２番目と４番目のグラフ)と比較して、ｍＡｂ Ｇ６−３１にて治療したマウスの腫瘍は、より狭いサイズ分布であった(図２Ｂ、中段および下段のグラフ)。コントロールＩｇＧを３週間投与したマウスの平均ポリープ直径は１．２８ｍｍであり、ｍＡｂ Ｇ６−３１は０．８５ｍｍであったのに対して(ｐ＜９．２×１０−１１７)、コントロールＩｇＧを６週間投与したマウスの平均ポリープ直径は１．６４ｍｍであり、ｍＡｂ Ｇ６−３１は０．８６ｍｍであった(ｐ＜２．７×１０−２１４)。０日目の平均腫瘍直径は０．９７ｍｍであった。
【０１５０】
興味深いことに、抗ＶＥＧＦ−Ａ処置は、すべてのサイズの腫瘍の成長を阻害するように見えた。ｍＡｂ Ｇ６−３１による３週間の処置の後には、小さい腫瘍(直径０．３−１．０ｍｍ、６週間の処置では０．３−１．２ｍｍ)の頻度は、コントロール処置群よりも大きかったのに対して、直径１．０ｍｍより大きな腫瘍の頻度(６週間では＞１．２ｍｍ)は減少した(図２Ｃ、上段および中段のグラフ)。０日目の腫瘍サイズ分布の比較から(図２Ｃ、下段グラフ)、腺腫の成長がｍＡｂ Ｇ６−３１投与の開始により実質的に抑制されたことが示唆された。
さらに、抗ＶＥＧＦ−Ａ ｍＡｂ Ｇ６−３１は、すべての小腸領域の腺腫増殖を抑制することに有効であった。３週間および６週間の処置の後には、コントロールＩｇＧ処置と比較して、ｍＡｂ Ｇ６−３１処置により有意に低い平均腫瘍直径が観察された(図２Ｄ)。さらに、ｍＡｂ Ｇ６−３１にて処置されたマウスの第一腸管区画における平均腺腫直径は、０日目にマウスに観察されたものよりも有意に減少していた(図２Ｄの二重アスタリスク)。結腸腺腫の平均腫瘍直径の減少は統計的な有意差には達しなかった(図２Ｄ)。ｍＡｂ Ｇ６−３１にて３週間処置されたマウスの大腸ポリープの平均直径は１.３±０.３ｍｍ(±ＳＥＭ)であったのに対して、コントロールＩｇＧにて処置したマウスの平均直径は２.５±０.４ｍｍであった(ｐ＜０．０６４)。ｍＡｂ Ｇ６−３１による６週間の治療の後の大腸腫瘍の平均直径は２.２±０.３ｍｍであり、コントロールＩｇＧ投与の後には２．６±０．３ｍｍであった(ｐ＜０．３７)。
【０１５１】
腸管上皮細胞におけるＶＥＧＦ−Ａの欠失による平均腫瘍直径の減少
次に、本発明者等は、Ａｐｃｍｉｎ／＋モデルにおいて小腸上皮供給源のＶＥＧＦ−Ａの腺腫への発達に対する寄与を分析することを目的とした。この目的のために、ＶＥＧＦ−ＡがＣｒｅ／ｌｏｘＰ技術によって腸管上皮細胞において条件付きで欠失されているマウス(ＶＥＧＦｌｏｘ；ビリン−Ｃｒｅマウス)と交配させた１３週齢のＡｐｃｍｉｎ／＋マウスにおいて、上記の通りに、腫瘍直径および数を評価した。Ａｐｃｍｉｎ／＋；ビリン−ＣｒｅおよびＡｐｃｍｉｎ／＋；ＶＥＧＦｌｏｘ；ビリン−Ｃｒｅマウスは、１３週齢時に分析した。
アクチン結合タンパク質および分化した吸収性の細胞の刷子縁の主要な構造成分であるビリン(Villin)の発現は、腸管の後腸内胚葉の胚発生の間に生じ、それ以後は小腸および大腸の内胚葉全体にわたって拡がる(Braunstein et al., Dev. Dyn. 224: 90-102 (2002)、Ezzell et al., Development 106:407-419 (1989)、Maunoury et al., EMBO J. 7:3321-3329 (1988)、およびMaunoury et al., Development 115:717-728 (1992))。成体では、ビリン分布は、腺窩(crypts)の未成熟増殖性細胞では中程度の尖端極性(apical polarization)で、および小腸の絨毛の内側を覆っている十分に分化した細胞の刷子縁では強い極性で散在している(Robine et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 8488-8492 (1985))。ビリンプロモーターによって作動されるＣｒｅリコンビナーゼ(ビリン−Ｃｒｅ)の発現は、腺窩から絨毛尖端および大腸を経て十二指腸までの腸管上皮のすべての細胞におけるビリン遺伝子の発現パターンを繰り返し、既に特徴付けられている(Madison et al., J. Biol. Chem. 277:33275-33283 (2002))。
【０１５２】
表現型分析により、コントロールＡｐｃｍｉｎ／＋；ビリン−Ｃｒｅマウスの平均腫瘍直径は１．０２±０．３ｍｍ(±ＳＥＭ)であったのに対して、Ａｐｃｍｉｎ／＋；ＶＥＧＦｌｏｘ；ビリン−Ｃｒｅマウスの平均腫瘍直径は０．８２±０．３ｍｍであり(図２Ｅ)、１９．８％の減少を示した(ｐ＜７．２×１０−５)。腫瘍数は２つの群の間であまり異ならなかった。Ａｐｃｍｉｎ／＋；ビリン−Ｃｒｅマウスは、１３７±１１腸管腺腫であったのに対して、Ａｐｃｍｉｎ／＋；ＶＥＧＦｌｏｘ；ビリン−Ｃｒｅマウスは１５０±１７腺腫を有した(ｐ＜０．２７)。
これらのデータは、大腸を経て十二指腸、および腺窩から絨毛尖端のすべての腸管上皮細胞においてＶＥＧＦ−Ａが欠失すると腫瘍成長が有意に阻害されるが、抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体の全身投与により生じる程度と比較してその程度は低いことを示す。ゆえに、これらのデータは、ＶＥＧＦ−Ａの上皮以外の供与源がＡｐｃｍｉｎ／＋マウスの腸管の腺腫の成長に関与することを示唆する。
【０１５３】
ＶＥＧＦ−Ａの阻害によるＡｐｃｍｉｎ／＋マウスの生存中央値の延長
腫瘍成長阻害において抗ＶＥＧＦ−Ａ処置が有効であるとして、本発明者等は、ｍＡｂ Ｇ６−３１による処置がＡｐｃｍｉｎ／＋マウスに長期の利益を与えるか否かを調べることを試みた。この目的のために、ｍＡｂ Ｇ６−３１又はコントロールＩｇＧの投与は、最高５２週又はマウスが瀕死と認められるまで続けた。興味深いことに、ｍＡｂ Ｇ６−３１処置により、コントロールＩｇＧによる２４週からｍＡｂ Ｇ６−３１による３３．６週までの生存中央値が増加した(ログランクｐ＜２．４×１０−３)(図２Ｆ)。
ｍＡｂ Ｇ６−３１にて処置された４匹のマウスの腫瘍表現型は、３２、５１、６４又は６６週齢で安楽死させて分析した(それぞれｍＡｂ Ｇ６−３１による処置の１９、３８、５１又は５３週後)。表１に示すように、平均腫瘍直径は、１９週齢マウスで観察される直径に近似したレベルのままであった(コントロールＩｇＧにより６週間処理したマウスでは１．６４ｍｍ)。同様に、腫瘍数は、１３週齢マウスの数と同程度のままであった(０日目のマウス群は５９−１６１腸管腺腫、平均１００であった)。組織学的解析において平面切片を採取した１５(マウス１−４に識別された数の合計)のうちの３の結腸腺腫(表１の各マウス２、３および４の１匹)は、悪性転換を示さなかった。
【０１５４】
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要約すると、長期の抗ＶＥＧＦ−Ａ処置は、一般に、十分に通用するものであり、Ａｐｃｍｉｎ／＋マウスの生存を増加させた。さらに、ｍＡｂ Ｇ６−３１によって長期処置したマウスにおける腫瘍数と平均腫瘍直径はマウスの齢数から見て著しく低いままであり、これは新規の腺腫形成および腺腫増殖の抑制と一致していた。
【０１５５】
抗ＶＥＧＦ−Ａによって処置したＡｐｃｍｉｎ／＋マウスにおける通常血清総タンパク、アルブミンおよびトリグリセライドレベルと、減少した脾臓骨髄外造血
一般的な所見として、ｍＡｂ Ｇ６−３１にて処置されたＡｐｃｍｉｎ／＋マウスは、コントロールＩｇＧにて処置したマウスよりかなり敏感であり、応答性があるようであった。さらに、Moser et al (Moser et al., Science 247:322-324 (1990))によって最初に報告された進行性貧血症を示唆する青白い足は、ｍＡｂ Ｇ６−３１にて処置された動物ではなくコントロールＩｇＧにて処置された動物において、定期的に観察された。この所見と一致して、コントロールＩｇＧを投与したＡｐｃｍｉｎ／＋マウスの平均総血清タンパクおよび血清アルブミン濃度が減少していたのに対して、総タンパクおよびアルブミンレベルはｍＡｂ Ｇ６−３１にて処置したマウスでは正常範囲内であった(表２)。
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【０１５６】
Ａｐｃｍｉｎ／＋マウスについて報告されたように(Moser et al., Science 247:322-324 (1990))、低タンパク血症と一致して、平均トリグリセリドレベルはコントロールＩｇＧにて処置された動物において上昇したが、ｍＡｂ Ｇ６−３１による処置により基準値と同レベルにまで低くなった(表２)。
３週間又は６週間の処置の後に処置に関連する体重の違いはないが、コントロールＩｇＧによって処置したマウスでは平均脾臓質量が有意に増加していた(ｐ＜２．３×１０−３)。コントロールＩｇＧの３週間の投与の後、このマウスは０．２６ｇ、又は体重の１．１７％の平均脾臓質量を有していたが、ｍＡｂ Ｇ６−３１にて３週間処置したマウスでは平均脾臓質量が０．１１ｇ(体重の０．４９％)であった。コントロールＩｇＧにて処置したマウスの平均脾臓質量の増加は骨髄外造血(腸管出血に続発するこの場合では代償的な赤血球形成であるＥＭＨ)と一致しており、これは脾臓の組織学的試験によって確認された。コントロールＩｇＧにて６週間処置した１０匹中１０匹のマウスが顕著なＥＭＨを示したのに対して、ｍＡｂ Ｇ６−３１にて処置した２匹のマウスは中程度のＥＭＨであり、５匹は軽度のＥＭＨであり、３匹は脾臓に特徴的な変化がなかった。ｍＡｂ Ｇ６−３１にて１８〜５３週間処置された５匹のうち４匹のマウスは脾臓の軽度〜広範囲なＥＭＨと診断された。
ｍＡｂ Ｇ６−３１にて短期に処置されたマウスの脾臓においてＥＭＨがより低い程度であることは、抗ＶＥＧＦ−Ａ療法が腸管出血を低減することに対して有益な効果を有することを示唆する。
【０１５７】
ｍＡｂ Ｇ６−３１による長期処置の後の腎臓の変化
高親和性抗ＶＥＧＦ−Ａ ｍＡｂ Ｇ６−３１を投与することに関連した潜在的な毒性を調べるために、短期(３〜６週間)および長期(１８〜５３)の処置後に膵臓、肝臓および腎臓を組織学的に分析した。組織学的分析のために、Ｎｏｔｏｘ固定の腸管組織を脱水し、パラフィンに包埋し、切断して、標準的なプロトコールに従って組織学的分析のためにＨ＆Ｅにて染色した。
３〜６週間処置した動物では有意な毒性は見られなかった。ｍＡｂ Ｇ６−３１による長期処置の後、５匹のうち５匹のマウスが、様々な(軽度〜重度の)広汎性包括的糸球体硬化症と、膵臓の中程度の間質浮腫(低タンパク血症を反映する)を示した。これらの所見は、ｍＡｂ Ｇ６−３１の長期投与から生じる既に観察された毒性と一致している。重要なことに、増加した生存中央値によって反映される健康の全体の改善が副作用を上回るものであった。
【０１５８】
増殖性指標の変化を伴わないｍＡｂ Ｇ６−３１処置による腫瘍形態の変化
抗ＶＥＧＦ−Ａ ｍＡｂ Ｇ６−３１による処置の後のＡｐｃｍｉｎ／＋マウスにおける腸管ポリープの特徴をさらに表すために、肉眼での分析および上記の通りに組織学的分析を行った。ｍＡｂ Ｇ６−３１にて処置されたポリープの全体の形態は、コントロールＩｇＧにて処置されたポリープのものとは顕著に異なった(図３Ａ−Ｂ)。一般的にコントロールＩｇＧを投与したマウスの腫瘍が相対的に破壊されておらず、滑らかな表面を有しているのに対して、ｍＡｂ Ｇ６−３１にて処置された動物の腫瘍は、それらの表面上に深い陥入を有して現れた。組織学的分析により、ｍＡｂ Ｇ６−３１およびコントロールＩｇＧにて処置したマウスの腫瘍が管状腺腫であることが明らかとなった(図３Ｃ−Ｆ)。コントロールＩｇＧにて処置されたマウスの腺腫は、顕著な絨毛内上皮性増殖を有しており、垂直および横方向に拡がり、典型的に、基部から内腔表面へ２倍より大きく拡がった。ごく小さい線維性の間質があった。ｍＡｂ Ｇ６−３１にて処置されたマウスの腺腫は、絨毛内上皮細胞が少なく、内腔表面上の面積が小さく、浅く、かつ隣接する絨毛が少ないという特徴を有していた。両処置群の結腸ポリープの組織学的分析は、大量の血管結合組織間質と様々な量(１００％以下)の形成異常上皮を有するpendunculatedされた管状腺腫を示した。
【０１５９】
腫瘍組織および正常な粘膜での増殖の範囲を評価するために、Ｋｉ−６７抗体による間接的な免疫組織化学的染色を行った(図３Ｇ−Ｊ)。これら実験のために、Ｎｏｔｏｘ固定し、脱水し、そしてパラフィン包埋した腸管の組織切片を脱パラフィン化し、水和して、Ｔａｒｇｅｔ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ(DAKO, Glostrup, Denmark)に９９℃でインキュベートして、その後内因性ペルオキシダーゼ活性の反応を止め、アビジンおよびビオチン(Vector, Burlingame, CA)のブロックを行った。切片をさらに、３％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳの１０％ブロッキング血清にて３０分かけてブロックした。組織切片を、ブロッキング血清にて希釈した一次抗体とともに６０分間インキュベートし、ＴＢＳＴバッファ(DAKO)にて洗浄して、そして、二次抗体とともに３０分間インキュベートし、ＴＢＳＴにて洗浄し、ＡＢＣ Ｅｌｉｔｅ試薬(Vector)に３０分間インキュベートした後、Ｍｅｔａｌ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ＤＡＢ(Pierce, Rockford, IL)中でインキュベートしてマイヤーのヘマトキシリンにて対比染色した。用いた一次抗体はＫｉ−６７(ＳＰ６、１：２００、Lab Vision, Fremont, CA)に対するウサギポリクローナルとした。用いた二次抗体はビオチン化されたヤギ抗ウサギ(７．５μｇ／ｍｌ、Vector)であった。すべての工程は室温で行った。
【０１６０】
定量分析により、コントロールＩｇＧ又はｍＡｂ Ｇ６−３１により処置されたマウスの腫瘍におけるＫｉ−６７ポジティブ細胞が類似の量であることが明らかとなった。同様に、正常な隣接した粘膜の増殖の指標は、両処置間で同程度であった(図３Ｋ)。増殖の指標は、Ｋｉｓｉｇｈｔアッセイ(Ariol Review (v2.6))を利用したＡｒｉｏｌ ＳＬ５０スライドスキャニング顕微鏡システム(Applied Imaging, Inc., San Jose, CA)によって得られる腫瘍組織と正常な粘膜の５μｍパラフィン切片の画像から定量化した。腫瘍組織および正常な粘膜の領域を手動で識別し、盲検試験者によって境界を付けた。核の合計と比較したときのＫｉ−６７ポジティブ核の割合として測定される増殖の指標は、ポジティブ閾値の定義に従って核の色に基づいて、半自動の様式で定量化した。増殖の指標測定値は、ｍＡｂ Ｇ６−３１治療群(ｎ＝３)では２９腫瘍と、コントロールＩｇＧ群(ｎ＝３)では４４腫瘍(すべて６週間処置する)の分析を含んだ。
ｍＡｂ Ｇ６−３１による増殖阻害が主要なシグナル伝達経路の分子パートの発現レベルの変化に付随して起こるか否かを試験するために、ウエスタンブロット分析を行った。ｍＡｂ Ｇ６−３１およびコントロール抗体にて治療したマウスの空腸腺腫および正常な隣接粘膜をメスで採取して、ＲＩＰＡ溶解バッファのＯＭＮＩ ＴＨ１１５ホモジナイザーにて、機械的に均質にした。使用する一次抗体は、ｐ３８ ＭＡＰＫ、リン光体−ｐ３８ ＭＡＰＫ、ｐ４２／ｐ４４ ＭＡＰＫ、リン光体−ｐ４２／ｐ４４ ＭＡＰＫ、ＰＴＥＮ、Ａｋｔ、リン光体−Ａｋｔ、およびリン光体−ＧＳＫ３α／βに対するウサギポリクローナル(すべて１：１０００、Cell Signaling, Danvers, MA)とした。使用する二次抗体は西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗ウサギであった(１：５０００、Chemicon)。
試験される多くの分子の発現レベルがｍＡｂ Ｇ６−３１による処置によっても不変であったのに対して、４つのうち３つの腫瘍試料におけるホスホ−ｐ３８ ＭＡＰＫレベルが正常な粘膜に見られるレベルへ適切に回復したことが観察された(図３Ｌ；ｐ−ｐ３８、Ｔ５−Ｔ８をＮ５−Ｎ８と比較する)。
【０１６１】
ｍＡｂ Ｇ６−３１処置腫瘍における血管密度の減少
ＶＥＧＦ−ＡがＶＥＧＦＲ-２シグナル伝達による血管内皮細胞の分裂促進因子であることが知られているので、本発明者等は、抗ＣＤ３１抗体による厚い組織切片の免疫組織化学染色によって、Ｍａｂ Ｇ６−３１およびコントロールＩｇＧによって処置したマウスにおける腫瘍血管網状組織を調べた(図４Ａ−Ｂ)。共焦点顕微鏡撮像のために、マウスは、イソフルラン麻酔下で１％パラホルムアルデヒド(ＰＦＡ)を含むＰＢＳにて灌流固定し、腸管をフィルター紙の上に平らに拡げ、その後４％ＰＦＡにて固定して、３０％スクロースを含むＰＢＳに４℃で終夜浸し、その後Ｏ.Ｃ.Ｔ.に包埋して、ドライアイスにて凍結した。凍結切片は、８０μｍに切断し、４％ＰＦＡに１０分間かけて固定し、０．２％トリトン-Ｘ-１００を含むＰＢＳにて透過処理し、０．２％トリトン-Ｘ-１００を含むＰＢＳの５％の正常ヤギ血清にて３０分間ブロックした。一次抗体を含むブロックバッファにて終夜、二次抗体とともに５〜６時間インキュベートし、ＰＢＳにて洗浄し、ヘキスト３３３４２(０．５ｍｇ／ｍｌ；Sigma, St. Louis, MO)にて対比染色した。使用する一次抗体は、ＣＤ31に対するハムスターモノクローナル(１：５００、Chemicon, Temecula, CA)、Ｅカドヘリンに対するラットモノクローナル(１：２５００、Zymed, South San Francisco, CA)、および平滑筋アクチンに対するＣｙ３コンジュゲートマウスモノクローナル(１：１０００、Sigma)とした。使用する二次抗体は、Ｃｙ５コンジュゲート抗アルメニアンハムスター(１：５００、Jackson Immunoresearch, Cambridgeshire, UK)、およびＡＬＥＸＡ  ４８８コンジュゲート抗ラット(１：５００、Molecular Probes, Eugene, OR)とした。
【０１６２】
Ａｐｃｍｉｎ／＋マウスの腫瘍の血管密度は、ツァイスＡｘｉｏｐｌａｎ２蛍光顕微鏡(Thornwood, NY)上のＣＣＤカメラで獲得されるデジタル画像から定量化した。４つの群の各々(コントロールＩｇＧ又はｍＡｂ Ｇ６−３１にて３週間又は６週間処置されたマウス)は、２匹のマウスからなり、各群から１１〜２２の腫瘍を分析した。８０μｍ腫瘍切片の血管領域は、ＩｍａｇｅＪ ｖ.１.３６ (http://rsb.info.nih.gov/ij/)を使用したＣＤ３１ポジティブ蛍光の閾値に基づいた区分けによって算出した。次いで、血管密度は、総腫瘍領域に対するＣＤ３１ポジティブピクセルの比率として算出した。各群からのすべての腫瘍の値は平均を取って、その群の平均値を得た。
血管密度の定量化は、ｍＡｂ Ｇ６−３１にて治療したマウスの腫瘍の血管性構成成分が、コントロールＩｇＧにて処置したマウスに見られるものと比較して減少したことを示した(図４Ｃ)。コントロールＩｇＧの３週間の投与の後に、平均腫瘍血管領域密度が２３．２％であったのに対して、ｍＡｂ Ｇ６−３１の投与の後では、１８．６％まで減少した。コントロールＩｇＧにて６週間処置した腫瘍の平均血管領域は２５．５％であったのに対して、ｍＡｂ Ｇ６−３１にて処置したマウスの腫瘍の平均血管領域密度は１９．７％であった。
【０１６３】
考察
本発明者等は、良性の腸管腫瘍形成のＶＥＧＦ−Ａの役割を調査するために、Ａｐｃｍｉｎ／＋マウスを用いた。第一に、実験は、強力な増殖を経ている定着した腸管腺腫に対する短期および長期の抗ＶＥＧＦ−Ａ処置の効果を測定するように設定した。本発明者等は、抗ＶＥＧＦ−Ａ ｍＡｂ Ｇ６−３１による処置により腫瘍量が有意に低下し、Ａｐｃｍｉｎ／＋マウスの生存率が延長したことを示した。
Ａｐｃｍｉｎ／＋マウスの腫瘍量に対する、食餌と非ステロイド性抗炎症剤(ＮＳＡＩＤ)を含む化学抗癌剤の効果について、様々な研究が行われている(Corpet et al., Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 12:391-400 (2003)に概説される)。この最新版はhttp://corpet.net/minにある。これらの研究の多くは腫瘍数の有意な減少を報告している。ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２を標的とするピロキシカムおよびスリンダクなどのＮＳＡＩＤは、Ａｐｃｍｉｎ／＋マウスの腫瘍形成を抑制する際(Boolbol et al., Cancer Res. 56: 2556-2560 (1996)、Chiu et al., Cancer Res. 57: 4267-4273 (1997)、Hansen-Petrik et al., Cancer Lett. 175:157-163 (2002)、Ritland et al., Carcinogenesis 20:51-58 (1999))、加えてセレコキシブ(Jacoby et al., Cancer Res. 60: 5040-5044 (2000))およびＡ−285969 (Wagenaar-Miller et al., Br. J. Cancer 88:1445-1452 (2003))などのＣＯＸ−２インヒビターを選択するために、最も強力な薬剤の一つであった。また、併用療法は腫瘍数を少なくするために成功裏に用いられている。Torrance等は、スリンダクと組み合わせて特定の上皮性増殖因子レセプターインヒビターであるＥＫＩ−７８５を利用して、腫瘍数のほぼすべての除去を示した(Torrance et al., Nat. Med. 6: 1024-1028 (2000))。同様に、化学療法剤であるラルチトレキセド(ＲＴＸ)と５−フルオロウラシル(ＦＵ)の併用効果により、Ａｐｃｍｉｎ／＋腫瘍数が有意に(３７％)減少した(Murphy et al., Cancer Biol. Ther. 3:1169-1176 (2004))。近年では、レセプターチロシンキナーゼ(ＲＴＫ)インヒビターＡＺＤ２１７１の短期投与は、Ａｐｃｍｉｎ／＋モデルの腫瘍量の減少を示した(Goodlad et al., Carcinogenesis 27:2133-2139 (2006))。彼らは、ＡＺＤ２１７１による処置の早期開始(６週間目)により腫瘍数を減少させることができるのに対して、その後の介入(１０週間目)では腫瘍サイズを低減するのみであることに注目した(上掲のGoodlad et al.)。しかしながら、この処置は血管密度に対して作用を示さなかった(上掲のGoodlad et al)。ＡＺＤ２１７１は、ＶＥＧＦＲ１、２および３を含むがこれらに限らずいくつかのＲＴＫを阻害する(Wedge et al., Cancer Res. 65: 4389-4400 (2005))。
【０１６４】
本発明者等は、１３週目に投与される抗ＶＥＧＦ−Ａ Ｍａｂ Ｇ６−３１が既存の腫瘍の数を減少させないが、腫瘍サイズを低減し、新規な腺腫形成を阻害するようであったことを観察した。これらの結果は生存の観察された増加と相関した。しかしながら、本発明者等は、抗ＶＥＧＦ特異的腫瘍防止手法(処置開始が早いもの)が、本研究に用いた腫瘍介入手法(処置開始が遅いもの)よりも、腫瘍数を減少させることにおいて潜在的により有効である可能性があると考える。いずれにしても、抗ＶＥＧＦ特異的阻害は、腫瘍成長のすべての段階で有効であった。
本発明者等の研究は最終的に、ＶＥＧＦ−ＡのターゲッティングがＡｐｃｍｉｎ／＋モデルにおいて重大な治療効果を達成するために十分であることを示す。Ｍａｂ Ｇ６−３１による全身性ＶＥＧＦ−Ａ阻害を、Ａｐｃｍｉｎ／＋；ＶＥＧＦｌｏｘ；ビリン−Ｃｒｅマウスにおける腸管上皮区画のＶＥＧＦ−Ａの遺伝子欠失と比較すると、上皮細胞だけでなく、ＶＥＧＦ−Ａの他の細胞供与源もＡｐｃｍｉｎ／＋腺腫増殖において重要な役割を果たしていることが示唆される。ＶＥＧＦ−Ａのこれらの更なる供与源には潜在的に、単核細胞(Sunayama et al., Carcinogenesis 23:1351-1359 (2002))および間質線維芽細胞(Seno et al., Cancer Res. 62: 506-511 (2002)、(Williams et al., J. Clin. Invest. 105:1589-1594 (2000))が含まれる。本発明者等のインサイツの分析は、腺腫および正常な絨毛内の上皮以外でのＶＥＧＦ−Ａ発現が示され、この所見を裏付けるものである。
【０１６５】
多くのデータから、ｍＡｂ Ｇ６−３１の観察された抗腫瘍作用の多くは血管新生の抑制によって媒介されていると考えられる(Wise et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 96:3071-3076 (1999)、Zachary et al., Cardiovasc Res. 49: 568-581 (2001))。実際、抗ＶＥＧＦ−Ａモノクローナル抗体に応答した血管供給の減少は、腫瘍異種移植片研究において観察されている(Borgstrom et al., Prostate 35:1-10 (1998))。これと一致して、コントロールＩｇＧにて処置したマウスの腫瘍と比較して、Ａｐｃｍｉｎ／＋腸管腺腫の血管領域密度の減少は、ｍＡｂ Ｇ６−３１の３週間および６週間の投与の後に観察された。
ＶＥＧＦ−Ａの阻害によって１ｍｍより小さい腺腫の有意な蓄積が観察されたことは、Ａｐｃｄｅｌｔａ７１６モデルにおいて見られたように(Seno et al., Cancer Res. 62: 506-511 2002))、Ａｐｃｍｉｎ／＋マウスの腸管腺腫において、一般に腫瘍発達のためと考えられるよりも早くに、血管形成スイッチが起こりうることを示唆する。
本発明者等の研究の重要で予想外の結論は、単一の血管形成因子をターゲットとする抗血管形成単独療法は、腫瘍増殖を抑制するのに非常に有効であり、生存利益を得うることである。これは、このような治療の主な利益は、化学療法剤の伝達を容易にするために腫瘍血管を「正常化する」ことであるという、悪性腫瘍の研究から主に集積された見解とは対照的であるようである(Jain et al., Nat. Med. 7: 987-989 (2001))。突然変異を獲得し、潜在的に治療耐性を生じる良性腫瘍の可能性を低減することが、少なくともある程度、この相違の説明となりうると、考えられる。したがって、本発明者等のデータは、化学療法剤を必要としない、良性腫瘍の手術以外の治療手段を提唱する。
【０１６６】
実施例２  多発性内分泌腫瘍症のマウスモデルにおいて下垂体腺腫の増殖を阻害し、血清プロラクチンと成長ホルモンレベルを低減する抗ＶＥＧＦ−Ａモノクローナル抗体
多発性内分泌腫瘍症(ＭＥＮ)は、２以上の内分泌腺を伴う腫瘍の発症を特徴とする疾患である。患者は、副甲状腺、膵島細胞および下垂体前葉において腫瘍が併発した場合に、ＭＥＮ１型(ＭＥＮ１)と分類される。通常タンパク質ｍｅｎｉｎの切断ないしは欠如が生じる、ＭＥＮ１遺伝子の突然変異が疾患の基礎をなすことを発見した(Pannett et al., Endocr. Relat. Cancer 6:449-473 (1999)に概説される)。残りの対立遺伝子の欠失も頻繁に腫瘍に起こるという所見と併せて、(Bystrom et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 87:1968-1972 (1990)、Debelenko et al., Cancer Res. 57: 2238-2243 (1997)、Larsson et al., Nature 332:85-87 (1988))、ＭＥＮ１は腫瘍サプレッサー遺伝子として分類されている。ＭＥＮ１は主に常染色体優性疾患として遺伝するのに対して、ＭＥＮ１遺伝子のデノボ突然変異はＭＥＮ１の散発性症例の原因と考えられている。
ｍｅｎｉｎの機能のほとんどは未知のままである。偏在して発現する、主に核６１０-アミノ酸タンパク質は、上述した経路のタンパク質部位とインビトロで相互作用することによって、転写調節、ＤＮＡプロセシングと修復、および細胞骨格組織に関与することが示唆されている(Agarwal et al., Horm. Metab. Res. 37: 369-374 (2005)に概説される)。しかしながら、今まで同定されたいずれのタンパク質相互作用をもってしてもＭＥＮ１の腫瘍原性が説明されない。
【０１６７】
膵臓腫瘍(５０％以上はガストリノーマ(ガストリン産生腫瘍)であり１０〜３０％はインスリノーマ(膵島細胞腺腫)である)の近年の標準的な治療は、ガストリノーマの場合には基礎酸分泌量の低減であるのに対して、インスリノーマの最適治療は手術であるようである。下垂体腫瘍の治療はホルモンの性質に応じて内科治療を変化させることによる選択的な手術からなるのに対して、副甲状腺腫瘍の根治治療は過剰に活性な腺の外科的除去である。しかしながら、多様性が程度および副甲状腺除去の程度および時期には変動がある(Brandi et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 86:5658-5671 (2001)に概説される)。ＭＥＮ１の診断および治療に対する新規な手法の生成上の最近の開発は、最近再検討されている(Viola et al., Curr. Opin. Oncol. 17:24-27 (2005))。
相同組み換えにより、マウス遺伝子Ｍｅｎ１のエキソン３−８が欠失のための標的とされた(Crabtree et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:1118-1123 (2001))。９か月齢までに、ヘテロ接合体Ｍｅｎ１マウスは、副甲状腺腫の更なる一般的な所見を有する膵島病変を発達させることが報告された。膵島、副甲状腺、甲状腺、副腎皮質および下垂体のより大きな、より多くの腫瘍は、１６か月齢までに観察され(Crabtree et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 98:1118-1123 (2001))、ヒトの疾患に著しく類似した特徴を示す。
【０１６８】
抗ＶＥＧＦ−Ａ手法がヒト悪性癌細胞株由来の様々な前臨床モデルの治療に用いられているので(Geber et al., Cancer Res. 60: 2178-2189 (2000)に概説される)、ＶＥＧＦ−Ａが媒介する血管新生をブロックすると腫瘍が抑制されることを示す証拠が十分にある(Gerber et al., Cancer Res. 60: 6253-6258 (2000)、Holash et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:11393-11398 (2002)、Millauer et al., Nature 367:576-579 (1994)、Prewett et al., Cancer Res. 59: 5209-5218 (1999)、Wood et al., Cancer Res. 60: 2178-2189 (2000))。しかしながら、腫瘍異種移植片は天然の環境において腫瘍の発達を十分に反復しない。さらにこれまでのところ、抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体療法は、良性腫瘍又は内分泌起源の腫瘍の増殖の阻害に試みられていない。内分泌組織特異的腺腫の発達におけるＶＥＧＦ−Ａの役割を調べるために、本発明者等は、天然に生じる非悪性腫瘍モデルであるＭＥＮ１のＭｅｎ１＋／−マウスモデルに対する抗血管形成療法の作用を試験した。Ｍｅｎ１＋／−マウスにおける下垂体腺腫、並びにＢａｌｂ／ｃヌードマウスにおける皮下下垂体腫瘍移植片の腫瘍体積を、例示的なＶＥＧＦ特異的アンタゴニストである抗ＶＥＧＦ−Ａモノクローナル抗体(ｍＡｂ)による短期処置の後に分析した。さらに、抗ＶＥＧＦ−Ａ ｍＡｂによって、ＭＥＮ１に関連した上昇ホルモン濃度を低下させる能力を調べた。
後述する実験のために、Ｍｅｎ１＋／−マウス(保存番号００４０６６)をThe Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)から、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスをCharles River Laboratories Inc. (Wilmington, MA)から得た。実験的な混合１２９−ＦＶＢバックグラウンドのＭｅｎ１＋／−雌マウスは、Ｍｅｎ１＋／−雄と雌を交雑させることによって得た。マウスは、バリア設備のマイクロアイソレーターケージに収容し、適宜餌を与えた。動物および実験プロトコールの維持は、連邦規制に従って行い、Institutional Animal Care and Use Committeeの承認を得た。
【０１６９】
Ｍｅｎ１＋／−下垂体腺腫の増殖を阻害するｍＡｂ Ｇ６−３１による処置
抗ＶＥＧＦ−Ａ療法が下垂体腺腫の増殖の阻害において有効か否かを調べるために、１２５の１１−１３か月齢のＭｅｎ１＋／−雌マウスに対してＭＲＩを行い、下垂体腺腫を有するマウスを同定した。腫瘍をもつマウスに対して１４および２８日後に再度画像処理を行い、腺腫の増殖速度を定着させた。試験開始時に１日に１２．４％の平均腫瘍増殖と１５．５８±４．０ｍｍ３(±ＳＥＭ)の平均腫瘍体積を有する９匹のマウスのコホートにはコントロールＩｇＧを、試験開始時に１日に１０．２％の平均腫瘍増殖と１６．７０±５．７ｍｍ３(±ＳＥＭ)の平均腫瘍体積を有する８匹のマウスのコホートには抗ＶＥＧＦ−Ａ ｍＡｂ Ｇ６−３１を、６７日間、又はマウスの瀕死を認識するまで投与した。ｍＡｂ Ｇ６−３１およびコントロールＩｇＧ抗体による処置のために、５ｍｇ／ｋｇの抗ＶＥＧＦ ｍＡｂ Ｇ６−３１(Liang et al., J. Biol. Chem. 281:951-961 (2005))又はアイソタイプ一致コントロールＩｇＧ(抗ＧＰ１２０)を１００〜２００μｌＰＢＳ体積で、週に１回投与した。下垂体腺腫インサイツに有する８匹(ｍＡｂ Ｇ６−３１)又は９匹(コントロールＩｇＧ)のＭｅｎ１＋／−マウスの投与は、１３．５−１４．５か月齢時に開始し、６７日間又はマウスの瀕死を認識するまで続けた。皮下下垂体腺腫移植を有する２３匹(コントロールＩｇＧ)又は３５匹(ｍＡｂ Ｇ６−３１)のＢａｌｂ／ｃヌードマウスの処置は、移植の４か月後に開始し、３５日間、又は、マウスの瀕死を認識するまで、あるいは腫瘍体積が３０００ｍｍ３の体積に達するまで続けた。
【０１７０】
動物は、２週間ごとにＭＲＩにて撮像し、インビボでの下垂体腺腫の増殖を追跡した。ＭＲＩ画像は、９．４Ｔ水平ボア磁石(Oxford Instruments Ltd., Oxford, UK)にて撮像し、送受信(Varian, Inc.)のための３ｃｍ体積のコイルを用いたＶａｒｉａｎＩｎｏｖａコンソール(Varian, Inc., Palo Alto, CA)によって調整した。高速スピンエコー連続撮像は、４秒の反復時間、８のエコー列長(echo train length)、１２ｍｓのエコー間隔、４８ｍｓの有効エコー時間および平均６によって行った。画像マトリクスは１２８２であり、視野(２０ｍｍ)２および０．５ｍｍのスライス厚であった。マウスは医用空気中２％イソフルランにて腹臥位に拘束し、体温を直腸プローブにてモニターし、１５分の撮像の間、温風にて３７℃に維持した。撮像後、動物を加熱表面上で回復させ、収容施設に戻した。原発性下垂体腫瘍体積は、Ａｎａｌｙｚｅソフトウェア(AnalyzeDirect, Inc., Lenexa, KS)にて描かれる、三次元の対象領域を用いてＭＲＩデータから算出した。
３９日の処置時に、コントロールＩｇＧ処置群と比較して、ｍＡｂ Ｇ６−３１処置群において平均下垂体腫瘍体積の統計学的に有意な減少が観察された(図５Ａ)。試験のエンドポイント(６７日)時に、ｍＡｂ Ｇ６−３１処置により平均腫瘍体積が７２％に減少、又は３．７分の１減少し、これは統計学的に有意であった(ｐ値は０．０１６未満)。ほとんど(９のうち６匹)のコントロールＩｇＧ処置Ｍｅｎ１＋／−腫瘍は処置期間にわたってずっと強く増殖したのに対して、８のうちの７匹のｍＡｂ Ｇ６−３１処置下垂体腺腫の増殖が有意に減速した(図５Ｂ)。４匹のコントロールＩｇＧ処置マウスと、３匹のｍＡｂ Ｇ６−３１処置マウスは病気のために試験のエンドポイント前に安楽死させた。ここに処置２５日目の撮像前の１匹のコントロールＩｇＧ処置マウスも含む。腫瘍倍加のない生存がｍＡｂ Ｇ６−３１処置群において有意に増加した(ログランクｐ＜０．０１９)ことから(図５Ｃ)、コントロールＩｇＧにて処置したマウスと比較して、下垂体腫瘍増殖の阻害によりこれらマウスの健康が改善されたことが示唆される。ｍＡｂ Ｇ６−３１処置群の２匹のマウスの腫瘍体積は、治療の６７日目までに２倍にならなかった。
【０１７１】
皮下下垂体腺腫移植の成長を阻害する抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体
Ｍｅｎ１＋／−下垂体腺腫移植モデルに対する抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体治療の有効性を試験するために、以下の手順に従って、６〜８週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスの側腹部に皮下腫瘍を定着させた。これらの実験のために、Ｍｅｎ１＋／−マウスから単一のインサイツ下垂体腺腫を摘出し、およそ１ｍｍ３切片に切り、、ＢＤマトリゲル基質ベースメントメンブラン(BD, Bedford, MA)と混合し、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスの背面の側腹部に、２００μｌの体積で皮下接種した。４か月後に、単一の皮下腫瘍(およそ９００ｍｍ３の体積)を摘出し、切り、マトリゲルと混合して、上記のように接種し、下垂体腺腫移植をもつマウスのコホートを確立した。
皮下下垂体腺腫移植の腫瘍サイズは、最大の腫瘍直径とそれに垂直な直径を採取することによって、カリパスツール(Fred V. Fowler Co. Inc., Newton, MA)にて測定した。腫瘍体積は以下の式を使用して算出した。Ｖ＝πａｂ２／６(ａ＝最大腫瘍直径、ｂ＝垂直な直径)。
【０１７２】
処置開始時に５１５±４２ｍｍ３の平均腫瘍体積を有する３５匹のマウスのコホートにはｍＡｂ Ｇ６−３１を、処置開始時に５２７±６４ｍｍ３の平均腫瘍体積を有する２３匹のマウスのコホートにはコントロールＩｇＧを、前記の方法を用いて３５日間投与した。試験のエンドポイント時に、コントロールＩｇＧ処置腫瘍はその体積がほぼ４倍、２０７１±１５２ｍｍ３の平均になっていたのに対して、ｍＡｂ Ｇ６−３１にて処置したマウスの腫瘍増殖は実質的に停止した。平均腫瘍体積は、３５日目に５５６±８９ｍｍ３であった(図5Ｄ)。ｍＡｂ Ｇ６−３１処置により平均腫瘍体積が７３％に減少、又は３．７分の１減少し、これは統計学的に有意であった(ｐ＜１．９×１０−１２)。
これらのデータにより、Ｍｅｎ１のヘテロ接合性によって生じやすくなった、皮下下垂体腺腫移植同様に下垂体腺腫の増殖の阻害における抗ＶＥＧＦ−Ａ ｍＡｂ Ｇ６−３１の有効性が確認された。
【０１７３】
正常な脳下垂体および下垂体腫瘍組織におけるＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦＲ−１およびＶＥＧＦＲ−２の発現
下垂体組織におけるＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦＲ−１およびＶＥＧＦＲ−２の発現レベルを調べるため、そしてその発現レベルがｍＡｂ Ｇ６−３１処置によって変化するか否かを試験するために、本発明者等は、５つのコントロールＩｇＧ処置(平均体積９６．２±８．７ｍｍ３)と５つのｍＡｂ Ｇ６−３１処置(３５．２±４．０ｍｍ３)のインサイツ下垂体腺腫とともに、５つの月齢が一致する小さい未処置(９．７±２．９ｍｍ３)の下垂体腺腫、４つのＭｅｎ１＋／−マウスの月齢が一致する正常な下垂体、および８つの月齢が一致する野生型下垂体腺腫試料において、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦＲ−１およびＶＥＧＦＲ−２の相対的な発現の平均を比較した。また、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦＲ−１およびＶＥＧＦＲ−２の発現を、５つのコントロールＩｇＧ処置(平均体積２０６３±２０５ｍｍ３)と５つのｍＡｂ Ｇ６−３１処置(５７７±４５ｍｍ３)の下垂体腺腫移植から調べた。
これらの実験のために、総ＤＮＡのないＲＮＡを、製造業者のプロトコールに従って、ＲＮｅａｓｙキット(Qiagen, Hilden, Germany)にてフラッシュ凍結下垂体腺腫又は正常な下垂体から調製した。ワンステップ定量的ＲＴ−ＰＣＲを、SuperScript III Platinum One-Step qRT-PCRキット(Invitrogen, Carlsbad, CA)、１００ｎｇの総ＲＮＡ、４５ｎＭの各ＰＣＲプライマー、および１２．５ｎＭのタックマンプローブを含め、５０μｌの総体積で行った。対象の遺伝子の発現を検出するために、以下のタックマン遺伝子発現アッセイプライマーとプローブとの混合物(Applied Biosystems, Foster City, CA)を用いた。ＶＥＧＦ−Ａ(アッセイＩＤ：Ｍｍ００４３７３０４＿ｍ１)、ＶＥＧＦＲ−１(アッセイＩＤ：Ｍｍ００４３８９８０＿ｍ１)およびＶＥＧＦＲ−２(アッセイＩＤ：Ｍｍ００４４００９９＿ｍ１)。ＧＡＰＤＨ発現は社内施設において合成されたプライマーとタックマンプローブを使用して検出した。(フォワードプライマー配列：ATGTTCCAGT ATGACTCCAC TCACG(配列番号：３)；リバースプライマー配列：GAAGACACCA GTAGACTCCA CGACA(配列番号：４)；タックマンプローブ配列：AAGCCCATCA CCATCTTCCA GGAGCGAGA(配列番号：５))。
【０１７４】
反応は、アプライドバイオシステム７５００リアルタイムＰＣＲシステムを使用して、以下の条件にて実行した。逆転写工程(４８℃で１５分間)、その後変性工程(９５℃で２分間)、そして９５℃で１５秒間および６０℃で１分間を４０サイクル。各々の試料の遺伝子発現のレベルは、内在コントロールとしてＧＡＰＤＨ遺伝子を、比較対象としてマウス胎盤総ＲＮＡ(Clontech, Mountain View, CA)を用いて、相対的な定量化法(ｄｄＣｔ法)によって決定した。
とりわけ、コントロールＩｇＧ処置下垂体腺腫、小さい未処理腫瘍、および野生型ないしはＭｅｎ１＋／−マウスの正常な下垂体と比較して、インサイツのｍＡｂ Ｇ６−３１処置腺腫において、ＶＥＧＦ−Ａの平均相対発現が有意に上昇していた(図６)。ＶＥＧＦ−Ａ発現は、両皮下腫瘍移植片試料において同等に高かった。ｍＡｂ Ｇ６−３１処置腫瘍のＶＥＧＦ−Ａ転写産物の観察されたレベルの高さは、ｍＡｂ Ｇ６−３１によるＶＥＧＦ−Ａの全身的な隔離に対する代償性のメカニズムの結果である可能性がある。しかしながら、高いＶＥＧＦ−Ａは腫瘍増殖を制御するためには十分でないようであった。
ＶＥＧＦＲ−１の平均相対発現が異なる組織試料内で適度に変化しないようであるのに対して、腫瘍移植片、小さい未処理の腫瘍、又は野生型ないしはＭｅｎ１＋／−マウスの正常な下垂体に見られる発現と比較して、コントロールＩｇＧないしはｍＡｂ Ｇ６−３１にて処置したインサイツの腫瘍試料では、ＶＥＧＦＲ−２の平均相対発現が低くなっているようであった(図６)。
【０１７５】
腫瘍成長のインビボ追跡調査を可能にさせるＭＲＩ
ＭＲＩを前記のように用いて、一週おきに動物を撮像することによって処置期間中ずっとインサイツの下垂体腺腫の成長を追跡調査した。処置開始の９、３９および６７日後に得た、１匹のコントロールＩｇＧ処置Ｍｅｎ１＋／−マウスおよび１匹のｍＡｂ Ｇ６−３１処置Ｍｅｎ１＋／−マウスの代表的な腺腫を用いた脳の冠状切片のグラフを図７に示す。
【０１７６】
下垂体および膵臓の腫瘍の組織学
Ｍｅｎ１＋／−下垂体腺腫がｍＡｂ Ｇ６−３１およびコントロールＩｇＧにて処置したマウスにおいて組織学的に類似していた(図８Ａ−Ｂ)。これらの実験のために、ホルマリン固定組織は、脱水し、パラフィンに包埋し、切断し、そして標準的なプロトコールに従って組織学的分析のためにヘマトキシリン−エオシン(Ｈ＆Ｅ)にて染色した。一般的に、腫瘍細胞は、小さく(直径１０ミクロン以下)、高い核／細胞質比率を有し、有糸分裂が活発であることが多く、１０の６２５ミクロン直径野につき最高４０の有糸分裂の形態がある。腫瘍は視覚上固形又は嚢胞状であり、多発性の内皮細胞が並ぶ管、急性の出血性領域(フィブリンないしは細胞の編成がない、内皮以外が並ぶ空隙の完全な赤血球)、および点在したヘモジデリン含有マクロファージを有し、これは出血前歴に一致している。多様な単細胞壊死とごく小さい線維形成があった。腫瘍血管は不規則な間隔を有し、典型的には５〜１０ミクロンの直径であるが、稀に５０ミクロンの大きさのものがあり、腫瘍以外の血管周囲間質細胞はほとんどない。
コントロールＩｇＧ処置腫瘍とｍＡｂ Ｇ６−３１処置腫瘍の間の血管パターンは、汎内皮細胞(panendothelial cell)マーカー抗体ＭＥＣＡ-３２による間接的な免疫組織化学染色によって観察された(図８Ｃ−Ｄ)。これらの実験のために 、 ホルマリン固定し、 パラフィン包埋した組織切片を脱パラフィン化して、内在性ペルオキシダーゼ活性の反応停止とアビジンおよびビオチン(Vector, Burlingame, CA)のブロックを行った。切片は、３％ＢＳＡを含み１０％正常ウサギ血清を含むＰＢＳにて３０分かけてブロックした。次いで、組織切片は、一次抗体とともに６０分間、ビオチン化した二次抗体とともに３０分間インキュベートし、ＡＢＣ試薬(Vector, Burlingame, CA)にて３０分間インキュベートし、その後Ｍｅｔａｌ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ＤＡＢ (Pierce, Rockford, IL)にて５分間インキュベートした。次いで、切片をマイヤーのヘマトキシリンにて対比染色した。使用する一次抗体は、０．１０μｇ／ｍｌのヤギ抗マウスプロラクチン(R&D systems, Minneapolis, MN)と２μｇ／ｍｌのラット抗マウス汎内皮細胞抗原、クローンＭＥＣＡ３２(BD Biosciences, San Jose, CA)とした。使用する二次抗体は、７．５μｇ／ｍｌのビオチン化したウサギ抗ヤギ(Vector, Burlingame, CA)と、２．５μｇ／ｍｌのビオチン化したウサギ抗ラット(Vector, Burlingame, CA)とした。汎内皮細胞抗原染色は、Ｔａｒｇｅｔ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ(Dako, Carpenteria, CA)による９９℃、２０分間の前処置を必要とした。他の全ての工程は室温で行った。
【０１７７】
血管密度は、ｍａｂ Ｇ６−３１処置により、コントロールＩｇＧ処置腫瘍の血管密度の４６％に有意に低減した(ｐ値＝０．００９；図８Ｉ)。両処置群において、腫瘍血管分布は、正常な隣接した下垂体前葉における血管分布より少なかった。血管密度の定量化のために、ＭＥＣＡ−３２で染色した切片を、１０×対物レンズを用いた、Ａｒｉｏｌ ＳＬ-５０のスライドスキャニングプラットフォーム(Applied Imaging; San Jose, CA)にて分析した。下垂体腫瘍領域を識別し、手動で輪郭を描いた。ＭＥＣＡ-３２染色に対応するピクセルカラーを定め、それに沿って血管領域を測定した。腫瘍細胞核は、ピクセルカラーと対象の形状によって識別した。次いで、血管領域を下垂体腫瘍細胞数に正規化した。ＭＥＣＡ−３２染色領域を膵島腫瘍領域に正規化したことを除いて、膵島も同様に分析した。
処置したＭｅｎ１＋／−マウスでは、下垂体腫瘍に加えて、膵島腫瘍が識別されることが多く、試験のエンドポイント時に膵島腫瘍を組織学的に分析した。膵島腫瘍(切断平面の１０５μｍ２より大きいものとして定義される)は、有意な出血も壊死もなく、典型的に固形であった。抗ＶＥＧＦ−Ａ Ｍａｂ Ｇ６−３１にて処置した６匹の動物の腫瘍(ｎ＝３２腫瘍)は、コントロールＩｇＧにて処置した５匹の動物の腫瘍(ｎ＝４５腫瘍；ｐ値＝０．０２６)の平均してたった３９％の領域であった。コントロールＩｇＧにて処置した膵臓腺腫(図８Ｅ−Ｆ)は、一般により大きく(切断平面の最高７．０ｍｍ)、ｍＡｂ Ｇ６−３１処置腺腫よりも多く血管を有するようである(切断平面の最大５．０ｍｍの腫瘍直径)。コントロールＩｇＧにて処置した７匹のマウスのうち４匹では、膵島腫瘍は、拡張し、血液を満たした、薄壁の、直径３００μｍ以下の内皮細胞が並んだ空隙を含んでいたのに対して、ｍＡｂ Ｇ６−３１処置マウスの膵臓腺腫は顕著な血管分布を欠くことが多かった(図8Ｇ−Ｈ)。ｍＡｂ Ｇ６−３１にて処置した８匹のマウスのうち１匹の膵臓腫瘍は、拡張した血管を示した。ヘモジデリンを含むマクロファージはいずれの処置によっても膵臓腫瘍から間欠的に観察された。これは、膵島出血を示唆するものである。
【０１７８】
膵島腫瘍の血管密度は、Ｇ６−３１処置によって、コントロールＩｇＧにて処置した膵島腫瘍の血管密度の５６％にまで有意に減少した(ｐ値＝２*１０−７)。また、Ｍａｂ Ｇ６−３１処置マウスの「正常な」膵島(切断平面の１０５μｍ２未満)は、大きさは小さいが、コントロールＩｇＧにて処置した動物の膵島の７６％にまで血管密度が減少した(ｐ-値＝４＊１０−７；図８Ｊを参照)。コントロールＩｇＧにて処置した単一の雄動物は、孤立した直径１２ｍｍの副腎皮質性腫瘍であり、ＭＥＮ１症候群の腺の認識された腫瘍タイプを有していた。
皮下下垂体腺腫移植の組織構造はインサイツの下垂体腫瘍の組織構造と同程度であったことから、離れた部位で内分泌腫瘍増殖が成功裏に反復発生したことを示す。
【０１７９】
プロラクチン産生細胞腫(プロラクチノーマ)であるＭｅｎ１下垂体腺腫
ＭＥＮ１患者のおよそ６０パーセントの下垂体腺腫は、プロラクチン(ＰＲＬ)を、２５％未満は成長ホルモン(ＧＨ)を、５％は副腎皮質刺激ホルモンを分泌する(ACTH, Trump et al., QJM 89:653-669 (1996))。Ｍｅｎ１＋／−マウスの下垂体腺腫がプロラクチンを分泌するか否かを調べるために、コントロールＩｇＧおよびｍＡｂ Ｇ６−３１にて処置したインサイツの下垂体腺腫、並びに下垂体腫瘍移植片に対して、抗ＰＲＬ抗体にて免疫組織化学的染色を行った。６つうちの６つのコントロールＩｇＧと５つのうちの５つのｍＡｂ Ｇ６−３１の処置下垂体腺腫は、細胞のおよそ５０〜９５％にプロラクチン特異的なポジティブ染色を示すので、これらの腺腫をプロラクチン産生細胞腫と定めた(図９Ａ−９Ｂ)。この結果と一致して、Crabtree等は、Ｍｅｎ１ＴＳＭ／＋下垂体腫瘍が免疫組織化学的染色においてＰＲＬポジティブであったことを報告した(Crabtree et al., Proc. Natl. Sci USA 98:1118-1123 (2001))。プロラクチン染色は、いずれの処置によっても下垂体腺腫移植片でもポジティブであった(図９Ｃ−９Ｄ)。これらの腫瘍からの機能的プロラクチン分泌と一致して、移植された下垂体腺腫を有する雌マウスの乳房組織は常に、コントロールＩｇＧおよび抗ＶＥＧＦ−Ａの処置動物の両方において中程度〜著しい乳汁の変化を示した(図９Ｅ、Ｆ)。
免疫組織化学的染色によって評価されるように、１１のうち６の未処理原発性下垂体腺腫は成長ホルモンについて局所的かつ弱いポジティブを示したのに対して、４つのうちの１の移植下垂体腺腫のみが局所的かつ弱い染色を示しただけであった(図１４Ｂ)。Ｇ６−３１およびコントロールＩｇＧにて処置したインサイツの下垂体腺腫に、成長ホルモンの発現があった(図６Ｃ、Ｄ)。正常な下垂体前葉は、細胞の２０〜３０％以下に強い反応を示した。(図１４Ａ)。
【０１８０】
未処理およびコントロールＩｇＧにて処置したマウスでは下垂体腫瘍体積と相関し、ｍＡｂ Ｇ６−３１処置によって減少する血清プロラクチンレベル
Ｍｅｎ１＋／−マウスから試験したすべてのコントロールＩｇＧとすべてのｍＡｂ Ｇ６−３１の処置下垂体腺腫が、免疫組織化学的分析によりプロラクチンについてポジティブであったので、本発明者等は、血清ＰＲＬレベルがＭｅｎ１＋／−下垂体腺腫保持マウスにおいて上昇しているか否かを調べた。この目的を達成するために、本発明者等は始めに、４６匹の未処置のＭｅｎ１＋／−雌マウスを下垂体腺腫状態と血清ＰＲＬレベルについて、そして５匹の野生型同腹仔コントロールを血清ＰＲＬレベルについて分析した。血清プロラクチン量は、National Hormone & Peptide Program at Harbor UCLA (Torrance, CA)にて分析した。
これらマウスの月齢の範囲は、１５．６〜１０．５か月、平均１３．３月齢であった。野生型マウスの平均血清ＰＲＬレベルは４３．８±２５．３(±ＳＥＭ)ｎｇ／ｍｌであった。４６のうちの２７匹のＭｅｎ１＋／−マウスは、ＭＲＩ分析では検出可能な下垂体腫瘍を有していなかった。これらマウスの平均血清ＰＲＬレベルは６９．０±２４．６ｎｇ／ｍｌであった。１０匹のマウス群は、平均体積１．７±０．６ｍｍ３の小さな下垂体腫瘍を有していた。これらマウスの血清ＰＲＬレベルは平均１８８．７±６１．９ｎｇ／ｍｌに上昇していた。大きな下垂体腺腫(平均体積８３．１±２３．８ｍｍ３)を有した９匹のマウスは、平均１３２３９．８±３４６６．５ｎｇ／ｍｌの血清ＰＲＬであった。これらのデータから、Ｍｅｎ１＋／−マウスの血清ＰＲＬレベルと下垂体腺腫体積との間にポジティブな相関がある(ピアソンの相関係数Ｒ＝０．９４)(図１０Ａ)ことが確認され、このことから、血清ＰＲＬレベルは、下垂体腺腫状態の推測をはっきりさせる際の診断用ツールとして有用であることが示唆される。
【０１８１】
抗ＶＥＧＦ−Ａ処置が血清ＰＲＬレベルに作用したか否かを試験するために、本発明者等は、試験のエンドポイント時に(６７日目)、下垂体腺腫をインサイツで有する７匹のコントロールＩｇＧ処置および７匹のｍＡｂ Ｇ６−３１処置のＭｅｎ１＋／−マウスの血清を分析した。コントロールＩｇＧ処置マウスでは、平均血清ＰＲＬレベルは１２５６６．７±３０４７．４ｎｇ／ｍｌに上昇し、一般に腫瘍体積の増加とともに増加した(１１６．２±１８．５ｍｍ３の平均)(Ｒ＝０．８０(ｐ＜０．０３))。分析したｍＡｂ Ｇ６−３１処置Ｍｅｎ１＋／−マウスでは、血清ＰＲＬレベルは、５１６３．７±１６０８．９ｎｇ／ｍｌと低いままであったが、腫瘍体積との統計学的な相関は見られなかった(平均腫瘍体積３５．３±６．５ｍｍ３)(Ｒ＝−０．１２、ｐ＜０．８０)(図１０Ｂ)。にもかかわらず、これらのデータは、コントロールＩｇＧ処置マウスと比較して、ｍＡｂ Ｇ６−３１が下垂体腺腫増殖を阻害する上に、平均血清ＰＲＬの減少も引き起こす(ｐ＜０．０５３)ことを示す。
【０１８２】
皮下下垂体腫瘍移植片を有するマウスの血清ＰＲＬレベルを低下させる抗ＶＥＧＦ−Ａ処置
上記のデータが、抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体処置により腫瘍を有するＭｅｎ１＋／−マウスのＰＲＬの血清レベルが低下することを示すので、本発明者等はさらに、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおける皮下下垂体腺腫移植片についてこれを調べた。治療開始時(１日目)と試験のエンドポイント時(３５日目)に採取した、２３匹のコントロールＩｇＧと３５匹のｍＡｂ Ｇ６−３１の処置マウス起源の試料から、血清ＰＲＬを測定した。１日目の平均血清ＰＲＬが２つの処置群の間で同程度であったのに対して、３５日目ではｍＡｂ Ｇ６−３１処置群は血清ＰＲＬレベルを有意に低下させた(それぞれ図１０ＣおよびＤ)。
ＭＥＮ１プロラクチン産生細胞腫の現在の治療には内科治療又は選択的な脳下垂体除去の後に放射線療法を含むので、ｍＡｂ Ｇ６−３１の処置により腫瘍増殖の顕著な阻害とともにＰＲＬ血清レベルが低くなったことを示す本発明者等のデータは、ＭＥＮ１患者に新規な治療となりうる手段を提供するものである。
【０１８３】
Ｍｅｎ１＋／−マウスにおいて上昇する血清インスリンレベル
血清インスリンレベルがＭｅｎ１＋／−マウスにおいて上昇したか否かを試験するために、コントロールＩｇＧにて処置した６匹の絶食していないマウスと、ｍＡｂ Ｇ６−３１にて処置した６匹の絶食していないマウスからの血清試料を分析したところ、組織学的分析ではすべてに膵臓病変が同定された。また、製造業者の指示に従って、高感受性マウスインスリンＥＬＩＳＡキット(Mercodia, Uppsala, Sweden)を用いて、５匹の絶食していない月齢が一致した野生型マウスからの血清インスリンレベルを分析した。治療との相関は観察されなかったが、平均血清インスリンは、野生型マウス(１．４±０．７ｎｇ／ｍｌ(±ＳＥＭ))と比較して、Ｍｅｎ１＋／−マウス(コントロールＩｇＧ、３．８±２．６ｎｇ／ｍｌ；ｍＡｂ Ｇ６−３１、３．７±２．４ｎｇ／ｍｌ)において著しく上昇していた。
【０１８４】
考察
本発明者等のデータは、ＶＥＧＦ−Ａに対するモノクローナル抗体による処置が腫瘍増殖阻害に十分であることが示されたので、ＶＥＧＦ−ＡがＭＥＮ１のマウスモデルにおいて良性下垂体腺腫の増殖に必要であることを示す。
入手可能な文献に基づくと、ｍＡｂ Ｇ６−３１の観察された抗腫瘍作用の多くは、ＶＥＧＦＲ−２依存性血管新生の抑制によって媒介される可能性がある(Wise et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 96: 3071-3076 (1999)および、Zachary et al., Cardiovasc. Res. 49: 568-581 (2001))。大きな下垂体腺腫におけるＶＥＧＦＲ−２ｍＲＮＡの相対的な平均発現は抗ＶＥＧＦ−Ａ処置の影響を有意に受けなかったのに対して(図６)、ＭＥＣＡ−３２の免疫組織化学的染色は、Ｍａｂ Ｇ６−３１によって処置した下垂体腫瘍および膵臓腫瘍において血管分布が非常に有意に減少した(およそ５０％の減少)ことを示した。抗ＶＥＧＦ−Ａにて処置した腫瘍増殖における対応する減少は、下垂体腺腫および膵臓腺腫の両方に見られた。また、正常な膵島における血管密度は抗ＶＥＧＦ−Ａ処置によって有意に減少したが、その変化の大きさ(コントロールＩｇＧ処置の２５％の減少)は膵臓腺腫において観察される減少よりも小さかった。
Ｍａｂ Ｇ６−３１にて処置した腫瘍において観察されたＶＥＧＦ−Ａ転写産物のレベルの高さは、Ｍａｂ Ｇ６−３１によるＶＥＧＦ−Ａの全身的な隔離に対する代償性のメカニズムの結果である可能性がある。しかしながら、このようなＶＥＧＦ−Ａの上昇は腫瘍増殖を制御するために十分ではなかったようである。
抗ＶＥＧＦ−Ａ ｍＡｂ Ｇ６−３１処置による単独療法が、腺腫増殖を効果的に阻害することによってＭｅｎ１＋／−マウスの腫瘍量を有意に低下させたことを示したことに加えて、本発明者等は、血清プロラクチンレベルも低下することを示した。したがって、本発明者等のデータは、内分泌の良性腫瘍の手術以外の治療の可能性とともに、化学療法剤を使用することなく疾患の進行を停止させることを提唱する。あるいは、このようなＶＥＧＦ−Ａブロックは薬物と組み合わされてもよい。例えば、プロラクチンを分泌している腺腫では、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストはドーパミンアゴニストと組み合わされてもよい。
【０１８５】
実施例３  様々なステージの発癌のＲＩＰ−ＴβＡｇモデルにおける抗ＶＥＧＦインターベンションの有効性と退縮／生存有効性
様々なステージの腫瘍増殖における抗ＶＥＧＦ療法の役割をさらに理解するために、本発明者等は、ＲＩＰ−ＴβＡｇを含む多くの臨床前腫瘍モデルを調べた。ＲＩＰ-ＴβＡｇ(Exelixis, Inc.)は、ＳＶ４０ラージＴ抗原(ＴＡｇ)の導入遺伝子発現によって制御されるマウス膵島腫瘍モデルの調整バージョン(conditional version)である(膵臓のβ-細胞を標的としており、ＴＡｇはｐ５３とＲｂの両方を結合することによって強力なオンコジーンとして機能する)。ＲＩＰ−ＴβＡｇは、先に述べられているＲＩＰ−ＴＡｇモデルと表現型が類似している(Hanahan, Nature 315:115-122 (1985)；Bergers et al., Science 284 (808-811), 1999)。本発明者等は、このモデルが、およそ５週目に、ＶＥＧＦシグナル伝達や「血管形成スイッチ」(すなわち、新規の血管形成の過程の開始)の活性を含む、一連の増悪ステージを経て進行することを明らかにした。１０週までに小さい腫瘍が形成され、これは悪性変換の始まりと一致する。１２週までに大きな、侵襲性のカルチノーマが形成する。ゆえに、１０週齢前に、マウスの細胞増殖が悪性であるか又は転移性であるかは認識されない。１０〜１２週齢の期間には、一般に浸潤性の癌の形成が含まれる。
【０１８６】
これらの実験のために、ＲＩＰ−ＴβＡｇマウスを収容し、標準的なＩＡＣＵＣ勧告に従って処置し、マウスに高糖固形飼料と５％スクロース水を与えて、膵臓のインスリン分泌β細胞の増加によって生じる高インスリン血症の症状を緩和した。９−９．５又は１１−１２週齢のマウスに、５ｍｇ／ｋｇの抗ＶＥＧＦ抗体又はアイソタイプが一致した抗ブタクサコントロールモノクローナル抗体を含む滅菌リン酸塩緩衝生理食塩水を週に２回腹腔内注入した。「インターベンション(介入)実験」では、９−９．５週齢のマウスを１４日間処置した後に試験した。「退縮(regression)実験」では、１１−１２週齢のマウスを、処置の７、１４および２１日間後に調べた。生存率を調べるために、他のマウスのコホートをマウスが羅病又は死亡を呈するまで処置した。インターベンションおよび退縮実験の予め決めた各時間点に、各マウスの膵臓および脾臓を摘出し、撮影した。膵臓内の腫瘍数は、各々の球状腫瘍を取り出し、計数することによって決定した。腫瘍量を決定し、各々の腫瘍の２つの最大直径を計測し、球状体体積計算(×２、ｙを乗じる)に０．５２を乗じて体積を算出した。マウスの膵臓内のすべての腫瘍の体積を合計して、総腫瘍量を決定した。平均と標準偏差を算出し、データをマイクロソフトエクセルｖ１１.３.３(Microsoft, Inc.)を用いてグラフにした。異なる群の腫瘍数および負荷との間の統計的比較は、スチューデントｔ検定を使用して行った。生存率分析のためのカプランマイアー曲線は、ＪＭＰ６．０(SAS Institute, Inc.)を用いて生成し、ログランク分析を用いて統計的に比較を行った。
抗ＶＥＧＦ抗体によって９週齢の動物を処置すると(「インターベンション」実験)、腫瘍血管新生が劇的に減少した(図１１)。１１週齢の動物を処置すると(「退縮実験」)、腫瘍血管分布と増殖が減少した(図１２Ａ)。しかしながら、インターベンション実験とは対照的に、腫瘍増殖の減少は一時的にしか検出されず、生存率への影響はなかった(図１２Ｂ)。これらの研究は、初期腫瘍が、進行した腫瘍と比較して、抗ＶＥＧＦ標的治療法により影響を受けることを示した。
【０１８７】
実施例４  臨床前モデルにおける抗ＶＥＧＦおよび化学療法剤
手術は、「血管形成プログラム」を再活性化させ、指数関数的腫瘍増殖を促す可能性を有する、腫瘍細胞や休止微小転移性小結節を取り残しうる。
本発明者等は、抗ＶＥＧＦ療法と同時に又は連続して、腫瘍をサイトリデュース(cytoreduce)する強力な化学療法剤を投薬した後、抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体による維持療法を行うことによって、モデル腫瘍休止状態にマウス遺伝的腫瘍およびヒト異種移植片を用いた。ゆえに、本発明者等は、腫瘍が、例として場合によっては標的とした抗ＶＥＧＦ療法を含む処置に難治性、再発性ないしは抵抗性である腫瘍に形成ないしは再形成された後に腫瘍を追跡するというよりも、むしろ腫瘍の再発を予防するためにマウスを処置している。図１３は、ドセタキセルは腫瘍量を軽減する際に非常に有効であるが、休止中の細胞はおよそ２か月後に再び成長するという所見を示す。しかしながら、たとえ大きくてしっかりと定着した腫瘍の増殖にほとんど作用しなくても、抗ＶＥＧＦによる同時処置により腫瘍の再成長が抑制される。更なるデータは、長期にわたる抗ＶＥＧＦ療法も、タキサン又はゲムシタビンによるサイトリダクション(cytoreduction)の後に腫瘍の再増殖を抑制することを示す。これらの結果は、休止中の腫瘍ないしは微小転移性癌の増殖ないしは再増殖を効果的にブロックするために抗ＶＥＧＦが用いられうることを示す。これらの所見は、血管新生が肉眼で見える腫瘍の形成に関連する急速なクローン増殖の必要条件であるという事実と矛盾しないものであり、腫瘍の始めの治療の後および、新規な腫瘍の形成、休止中の腫瘍、悪性腫瘍又は微小転移性癌の再活性化の前の、腫瘍休止の維持および腫瘍再増殖の抑制におけるＶＥＧＦ特異的アンタゴニスト(例えばＧ６又はＢ２０系列の抗体を含むがこれらに限定しない抗ＶＥＧＦ抗体)の使用の裏付けとなるものである。
【０１８８】
実施例５  ベバシズマブを用いたネオアジュバント療法
本実施例は、触診可能かつ手術可能な乳癌を有する患者のネオアジュバント療法におけるベバシズマブの使用を例示する。
ネオアジュバント化学療法は、局所的に進行したかないしは潜在的に手術可能な大きな乳癌の治療において広く使われている。ランダム化試験は、ネオアジュバント化学療法が乳房切除の必要性を低くし(これによって胸部を保存する)、アジュバント化学療法と同程度の全体生存率となることを示した。Powles et al., J. Clin. Oncol. 13:547-52 (1995)；Fisher et al., J. Clin. Oncol. 16:2672-85 (1998)。  
本療法の一次目的は、触診可能かつ手術可能な乳癌を有する患者の化学療法にベバシズマブを加えることによって、臨床上の利点を向上することである。具体的には、ネオアジュバント療法の臨床有効性の一次測定値のうちの１つは、病理学的完全寛解(ｐＣＲ)率でありうる。他の測定値には、奏効率(ＯＲ)、臨床完全寛解率(ｃＣＲ)、疾患のない生存期間(ＤＦＳ)および全生存期間(ＯＳ)が含まれる。さらに、治療の副作用は、例えば、外科的な合併症率、毒性および心機能に対する副作用によってモニターされてもよい。特定の遺伝子発現又は他のバイオマーカーの活性もまた、治療に対する応答のマーカーとして使われてもよい。
病理学的完全寛解(ｐＣＲ)が、治療有効性の予後のマーカーとして使われている。ｐＣＲは、手術時のネオアジュバント療法後に腫瘍の組織学的所見が残存していないことを示す。研究は、ｐＣＲを達成している患者の生存率が著しく改善されたことを示唆した。しかしながら、病理学的寛解を段階分けするための標準的な方法はなく、ｐＣＲが有効性の代理マーカーとして用いられうるか否かについては意見が分かれている。
【０１８９】
ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストによるネオアジュバント療法に適切な患者は、予め決めた判定基準およびガイドラインに基づいて選択され、この判定基準およびガイドラインは治療下にある特定の癌に応じて変わる。例えば、患者は、平均寿命、年齢、癌の既往、血液学的／肝機能および心機能、治療履歴、生殖の状況および計画、および精神学的状態ないしは常習的状態に基づいて選択されてもよい。さらに重要なことに、原発性腫瘍は、測定可能および又は手術可能でなければならない。
治療投薬計画には、化学療法とＶＥＧＦ特異的アンタゴニスト、例えばベバシズマブが含まれる。場合によって、更なる治療的薬剤(一又は複数)が、同様に投薬計画に用いられてもよい。典型的に、特定の癌の種類(例えば標準的な療法投薬計画)のために共通して用いられる化学療法投薬計画は、ベバシズマブと組み合わせて使われる。例えば、乳癌をネオアジュバント的に治療するために、ドセタキセル、パクリタキセル又はドキソルビシン／シクロホスファミド(ＡＣ)投薬計画が、ベバシズマブと組み合わされて使われてもよい。あるいは、ドセタキセルベース又はパクリタキセルベースの投薬計画およびＡＣ投薬計画が、ベバシズマブと組み合わされた化学療法剤として連続して使われてもよい。非小細胞肺癌を治療するために、シスプラチン(単独で又は、他の化学薬剤、例えばゲムシタビン、ドセタキセル又はビノレルビンと組み合わされて)が、ベバシズマブと組み合わされて一次化学薬剤として用いられうる。結腸直腸癌を治療するために、一方では、５−ＦＵベースの投薬計画(例えばＦＯＬＦＯＸ)が、ベバシズマブと組み合わされて使われてもよい。
【０１９０】
化学療法剤とＶＥＧＦ特異的アンタゴニスト、例えばベバシズマブが、所定の用量および間隔で、多くのサイクルにわたって患者に投与される。例えば、ベバシズマブは、１５ｍｇ／ｋｇを３週間ごとに４サイクル、又は１０ｍｇ／ｋｇを２週間ごとに６サイクル、投与されてもよい。他の例では、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニスト、例えばベバシズマブは、７．５ｍｇ／ｋｇを２ないし３週間に１回投与される。患者は、治療の間、応答についてモニターされる。ネオアジュバント療法の完了により、患者は原発性腫瘍を取り除くための手術を受ける。この原発性腫瘍は、ネオアジュバント療法前に手術可能であったか、又はネオアジュバント療法に応答して手術可能になるものである。手術後に、患者は、患者の特定の状態に応じて、化学療法の有無にかかわらずＶＥＧＦ特異的アンタゴニスト療法、例えばベバシズマブを続けられる。場合によって、患者は、同様に放射線療法を受けてもよい。患者の経過は治療および治療後の期間の間ずっとモニターされる。
抗ＶＥＧＦ治療と関係する副作用(ＡＥ)もまた、厳密にモニターされ、管理されなければならない。以前の研究から公知である主なＡＥには、高血圧、タンパク尿症、出血、血栓塞栓性現象、胃腸穿孔／瘻孔および創傷治癒合併症などがある。高血圧のような特定のＡＥは医薬によって管理されうる。ＡＥが重篤で管理不可能である場合、治療はやめなければならない。  
【０１９１】
実施例６  ベバシズマブを用いたアジュバント療法
本実施例は、切除した癌を有する患者のアジュバント療法における化学療法と組み合わせたベバシズマブの使用を例示する。
ベバシズマブによるアジュバント療法に適切な患者は、予め決めた判定基準およびガイドラインに基づいて選択され、この判定基準およびガイドラインは治療下にある特定の癌に応じて変わる。例えば、患者は、平均寿命、年齢、癌の既往、血液学的／肝機能および心機能、生活習慣、治療履歴、生殖の状況および計画、および精神学的状態ないしは常習的状態に基づいて選択されてもよい。さらに重要なことに、患者は、アジュバント治療の前に癌を完全に切除されていなければならない。切除術の認められた種類は特定の腫瘍の種類に依存する。また、患者の癌の代表的な十分な病理学素材は、初期のステージの分析、および有効性測定のために有用でなければならない。治療時に、手術したばかりでなければならないが、患者は手術から完全に回復していなければならない。例えば、患者は、手術後３〜６週間以上かつ８〜１２週間未満にアジュバント治療を始めなければならない。
【０１９２】
治療投薬計画には、化学療法とベバシズマブが含まれる。場合によって、更なる治療的薬剤(一又は複数)が、同様に投薬計画に用いられてもよい。典型的に、ベバシズマブと組み合わされた化学療法剤は、治療の第一ステージの間に使われ、その後残りの期間には単一の薬剤維持治療としてベバシズマブが用いられる。例えば、患者は、およそ４〜１２のサイクルの間、化学療法剤とベバシズマブによって治療され、次いで１〜２年以下の間にベバシズマブ単独にて治療される。化学療法的＋ベバシズマブ治療の各サイクルの継続期間は、使用する特定の薬剤および用量に依存する。例えば、ベバシズマブは３週おきに１５ｍｇ／ｋｇを１サイクルとして、又は、２週おきに５ｍｇ／ｋｇを１サイクルとして投与されうる。他の例では、ベバシズマブは、７．５ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇを２週間おき又は３週間おきに投与されうる。
特定の癌の種類(例えば標準的な療法投薬計画)に共通して使用される化学療法投薬計画が、ベバシズマブと組み合わされて使われる。例えば、乳癌のアジュバント療法のために、ドセタキセル、パクリタキセル又はドキソルビシン／シクロホスファミド(ＡＣ)投薬計画が、ベバシズマブと組み合わされて使われてもよい。あるいは、ドセタキセルベース又はパクリタキセルベースの投薬計画およびＡＣ投薬計画が、ベバシズマブと組み合わされた化学療法剤として連続して使われてもよい。非小細胞肺癌を治療するために、シスプラチン(単独で又は、他の化学薬剤、例えばゲムシタビン、ドセタキセル又はビノレルビンと組み合わされて)が、ベバシズマブと組み合わされて一次化学薬剤として用いられうる。結腸直腸癌を治療するために、一方では、５−ＦＵベースの投薬計画(例えばＦＯＬＦＯＸ)が、ベバシズマブと組み合わされて使われてもよい。
【０１９３】
ベバシズマブによるアジュバント治療の目的は、患者の生存率、好ましくは無疾患生存率を向上させることである。一方、アジュバント治療は長期であるので、ベバシズマブに関連する任意の副作用も厳密にモニターされなければならない。生存率はカプラン−マイヤー法によって推定され得、生存率の任意の相違は層化されたログランク検定を用いて計算される。コックス比例危険モデルを用いた多変量分析を用いて、生存率に対する予後因子の同時効果を推定する。予後因子との相互作用はコックス比例危険モデルにて調べられる。ＳＡＳ統計的ソフトウェアパッケージがすべての計算に用いられる。Ｐ値が０．０５以下であるときに、データは統計学的に有意であると考慮される。すべての統計的検定は二辺性(two-sided)である。
抗ＶＥＧＦ治療と関係する副作用(ＡＥ)は、厳密にモニターされ、管理されなければならない。以前の研究から公知である主なＡＥには、高血圧、タンパク尿症、出血、血栓塞栓性現象、胃腸穿孔／瘻孔および創傷治癒合併症などがある。高血圧のような特定のＡＥは医薬によって管理されうる。ＡＥが重篤で管理不可能である場合、治療はやめなければならない。
【０１９４】
他の実施態様
前述の記載から、多様な使用および条件に合わせるために本明細書に記載の本発明に変更および修飾がなされることは明らかであろう。このような実施態様もまた、以下の特許請求の範囲内である。
本明細書中に引用したすべての出版物、特許出願および特許文献、例えば２００６年１２月１９日に出願の米国仮特許出願第６０／８７０７４１号；２００６年１２月１９日に出願の第６０／８７０７４５号；２００６年１２月２７日に出願の第６０／８７７２６７号；２００７年３月２２日に出願の第６０／９１９６３８号；２００７年７月５日に出願の第６０／９５８３８４号；および２００７年１１月２０日に出願の第６０／９８９３９７号は、あたかも各々独立した出版物、特許又は特許出願が特別にかつ個別に出典明記によって援用されているのと同程度に出典明記によって本明細書中に援用される。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年11月10日(2017.11.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載の発明。 
【外国語明細書】
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