(57)【要約】      （修正有）【課題】有用物質の細胞内取り込み向上効果を有する飲作用促進剤の提供。【解決手段】細胞の飲作用促進剤として用いる場合における大豆加水分解物の配合量は、有効量存在すれば良い。一般的には蒸発乾燥分に換算して０．０００１〜１００質量％が好ましく、特に０．０１〜１０．０質量％の範囲が最適である。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
大豆加水分解物を含有することを特徴とした細胞の飲作用促進剤
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大豆加水分解物を含有することを特徴とした細胞の飲作用促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物の細胞内に所望の物質を取り込ませることは、医学、薬学、農学、生物工学等のバイオ関連分野における研究開発に有用な手段である。
ＤＮＡやＲＮＡ等の遺伝子、酵素や抗体等の蛋白、又は薬剤等の低分子化合物など、細胞内に取り込ませることで産業上有用な結果が得られる物質は多岐に渡る。しかしながら、有用な物質を細胞内に取り込ませる際に細胞へ障害を与える方法では細胞が死滅してしまうため、障害性の低い細胞内への物質取り込み方法が求められている。
【０００３】
細胞内に物質を取り込ませる方法として、電気穿孔法が知られている。電気穿孔法は短パルスの電流を利用して分子量の大きい物質を細胞内に導入する技術である。細胞を電気パルスにさらすと細胞膜に一時的に孔が形成され、物質はこの孔を通過して細胞内に入り込むと考えられている。電気穿孔法は遺伝子を細胞内に導入する方法として利用され、遺伝子導入動物製造方法（特許文献１）などに用いられている。しかしながら、電気穿孔法は特殊な装置を必要とする他、取り込ませる物質を電気的に損傷する場合があり、より簡便で温和な方法が求められていた。
【０００４】
他にも、細胞内への物質取り込みを促進させる物質として、遺伝子導入に汎用されるカチオン性脂質が知られている。カチオン性脂質は、負に帯電している取り込み対象物質と混合すると、静電相互作用によって複合体を形成し、さらに負に帯電した細胞膜表面に強くひきつけられ、エンドサイトーシスにより細胞内へと効率的に核酸分子を導入することができると考えられている（非特許文献１）。カチオン性脂質を用いる方法は、特殊な装置を使用しない点および温和な条件で使用できる点で優れている。しかしながら、取り込みを促進させることができる対象が複合体を形成できる物質に限られることや、細胞に対する化学的な障害性を示すことがある点で課題が残っていた。
【０００５】
エンドサイトーシスは、細胞自身が細胞外の物質を取り込む機構として知られている。エンドサイトーシスは分子量が大きい物質や、疎水性の細胞膜を通り抜けることができない高極性の物質を積極的に細胞内に物質を取り込む機構である。例えば、体内の異物を細胞内に取り込み分解するためや、細胞内に必要な物質を取り込むために機能している。エンドサイトーシスは、取り込む物質の種類やその機構の違いから、食作用と、飲作用とに大別される（非特許文献２）。
【０００６】
食作用は、主にマクロファージ、好中球など食細胞が体内のある程度大きなサイズの異物（細菌、ウイルス、寄生虫）や異常代謝物（ヘモジデリンなど）を取り込み分解する機構である。食作用は異物に対する体内の免疫機構の一部であり、自然免疫に分類される。表面が正に荷電しているか、あるいは疎水性であること、などが食作用を誘導する物質の条件として知らており、カチオン性脂質は主に食作用を介して対象物質を細胞内に取り込ませているものと考えられる。
【０００７】
一方で、飲作用は、食作用とは異なり、食細胞以外の細胞でも発達した機構であり、細胞外液を取り込むことで、細胞外液中に存在する細胞の生育に必要な栄養分などを取り込む、細胞の生存に必須の機構だと考えられている。細胞の飲作用は非特異的な物質取り込み機構であり、低分子の物質および高分子の物質どちらも取り込むことが知られている。
【０００８】
そこで、本発明者らは、この飲作用のメカニズムに着眼し、飲作用を促進することができれば産業上有用な物質の細胞内への取り込みを向上させることができるのではないかと考えた。さらに、先行技術である電気穿孔法やカチオン性脂質を用いた細胞内への物質取り込み促進法のように、特殊な装置や細胞や対象物質に対する厳しい条件、複合体形成を必要とすることなく、より簡便かつ低障害性で様々な対象物質に対して細胞内への物質取り込みを向上させることができるのではないかと考えた。
【０００９】
本発明では、有用物質の細胞内取り込み向上効果を高めることができる素材を探索し、大豆加水分解物に顕著な効果を見出した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００２−０６５１１２
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】河▲崎▼  陸ら、Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ．３１−２、２４２（２０１６）
【非特許文献２】水島  昇、細胞が自分を食べるオートファジー、９−１０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、有用物質の細胞内取り込み向上効果を有する飲作用促進剤の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは上述の課題解決のために鋭意研究した結果、有用物質の細胞内取り込み向上効果について大豆加水分解物に顕著な効果を見出し、上記課題を解決した。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、有用物質の細胞内取り込み向上効果を有する飲作用促進剤を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】細胞への色素取り込みを指標とした物質取り込み向上剤の評価１
【図２】細胞への色素取り込みを指標とした物質取り込み向上剤の評価２
【図３】大豆加水分解物の細胞障害性への影響評価
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明に用いる大豆（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）は、マメ科ダイズ属の植物である。使用する部位は種子である。種子は生の状態のもの、もしくは乾燥物を用いてもよい。また、粉末状、ペースト状、液状等に加工処理した種子を用いることもできる。食品として加工された状態の大豆種子、例えば、きな粉、豆乳、おから、豆腐等を使用することもできる。さらに各種溶剤、例えば、水；メチルアルコール、エチルアルコール等の低級１価アルコール；グリセリン、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール等の液状多価アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン；酢酸エチルなどのアルキルエステル；ベンゼン、ヘキサン等の炭化水素；ジエチルエーテル等のエーテル類；ジクロルメタン、クロロホルム等のハロゲン化アルカン等の１種または２種以上を用いて大豆種子から抽出した抽出物を用いることもできる。
【００１７】
本発明の大豆加水分解物は、最終的に大豆を加水分解したものであれば良く、大豆を加水分解して得ることができる他、各種溶媒を用いて得られた大豆抽出物を加水分解しても良いし、大豆を加水分解した後に各種溶媒を用いて得られた抽出物でも良い。当該大豆加水分解物は、大豆中の多糖類が加水分解されているもの、大豆中のタンパク質が加水分解されているもの、これらが混在するもののいずれであってもよい。好ましくは、大豆中のタンパク質が加水分解されている大豆加水分解物である。
【００１８】
本発明の大豆加水分解物は、酸分解、アルカリ分解、又は酵素分解のいずれによって調製されたものであってもよく、その調製方法についても当該技術分野において通常用いられている方法を採用することができる。
大豆を加水分解する場合は、例えば乾燥した種子であれば質量比で１〜１０００倍量、特に１０〜１００倍量の酸、アルカリ溶液、タンパク質分解酵素液を用い、０℃以上、特に２０℃〜４０℃で１時間以上、特に３〜７日間行うのが好ましい。また、酸、アルカリ溶液を加える場合は６０〜１００℃で１〜３時間、加熱処理しても良い。各種タンパク質分解酵素溶液を用いる場合は各酵素の至適条件で処理するのが好ましい。大豆抽出物を加水分解する場合も、大豆を加水分解した後に抽出物を得る場合も、これに準じて行えばよい。大豆抽出物を加水分解する場合は各種溶剤で調製した抽出物を用い、必要により溶媒を留去後、酸、アルカリ分解、または酵素分解のいずれによって調製されたものを使用することができる。また、大豆を加水分解して得られた後の大豆加水分解物から各種溶剤で抽出を行い、乾固させたもの、および溶液の状態のものを使用することもできる。
【００１９】
大豆を加水分解するための処理液は特に限定されないが、酸もしくはアルカリ溶液による処理、またはタンパク質分解酵素液 (例えば 、ペプシン、パパイン、 トリプシン、キモトリプシン、およびスブチリシン等)等の１種または２種以上を用いることができる。特に酸による加水部分解が好適である。酸、アルカリを用いて加水分解を行う場合は中和処理を行うことが好ましい。
【００２０】
以上のような条件で得られる大豆加水分解物は溶液のまま用いても良いが、さらに必要により、濾過等の処理をして、濃縮、粉末化したものを適宜使い分けて用いることができる。また、分子カットフィルター等を用いて特定の分子量に分画した画分を用いることもできる。
【００２１】
本発明を細胞の飲作用促進剤として用いる場合における大豆加水分解物の配合量は、有効量存在すれば良い。一般的には蒸発乾燥分に換算して０．０００１〜１００質量％が好ましく、特に０．０１〜１０．０質量％の範囲が最適である。
【００２２】
本発明の飲作用促進剤には、本発明の効果を損なわない範囲で、その他の成分、たとえば、油脂、ロウ類、炭化水素油、エステル油、高級アルコール、シリコーン油、紫外線吸収剤、紫外線散乱剤、保湿剤、界面活性剤、水溶性高分子、増粘剤、粉体、各種有効成分、皮膚保護剤、老化防止剤、大豆加水分解物以外の植物抽出物、防腐剤、消炎剤、ｐＨ調整剤、金属イオン封鎖剤、酸化防止剤などと併用することができる。
【００２３】
以下、本発明を実施例について具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【００２４】
〈被験物質１：大豆加水分解物〉
乾燥大豆１０ｇに対して１Ｎ塩酸を４０ｇ添加し、８０℃、２時間加熱処理を行った。  抽出後、ろ過布を用いてろ過を行った。ろ過後、サンプル溶液の容量と同程度の１Ｎ水酸化ナトリウムを添加し、ｐＨ＝７．０になるように中和処理を行った。中和後、前処理用フィルター（クロマトディスク、非水系０．４５μｍ、十慈フィールド）を用いて、ろ過を行った。ろ過後、分子カットフィルター（ＣｅｎｔｒｉｓａｒｔＩ、１０，０００ＭＷＣＯ、日本ジェネティクス）を用いて、２，０００×ｇで２時間限外ろ過を行った。限外ろ過後の溶液を凍結乾燥機を用いて、完全に乾燥させた。  乾燥物を１％の濃度になるよう蒸留水で溶解し、滅菌ろ過フィルター（Ｍｉｎｉｓａｒｔ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ｓｔｅｄｉｍ）を用いて、滅菌ろ過した。
【００２５】
〈被験物質２：大豆水抽出物〉
乾燥大豆１０ｇに対して蒸留水を４０ｇ添加し、８０℃、２時間加熱抽出を行った。  抽出後、ろ過布を用いてろ過を行った。ろ過後、前処理用フィルターを用いて、ろ過を行った。ろ過後、分子カットフィルターを用いて、２，０００×ｇで２時間限外ろ過を行った。限外ろ過後の溶液を凍結乾燥機を用いて、完全に乾燥させた。乾燥物を１％の濃度になるよう蒸留水で溶解し、滅菌ろ過フィルターを用いて、滅菌ろ過した。
【００２６】
〈被験物質３：小豆加水分解物〉
乾燥小豆（Ｖｉｇｎａ  ａｎｇｕｌａｒｉｓ）１０ｇに対して１Ｎ塩酸を４０ｇ添加し、８０℃、２時間加熱処理を行った。抽出後、ろ過布を用いてろ過を行った。ろ過後、サンプル溶液の容量と同程度の１Ｎ水酸化ナトリウムを添加し、ｐＨ＝７．０になるように中和処理を行った。中和後、前処理用フィルターを用いて、ろ過を行った。ろ過後、分子カットフィルターを用いて、２，０００×ｇで２時間限外ろ過を行った。限外ろ過後の溶液を凍結乾燥機を用いて、完全に乾燥させた。乾燥物を１％の濃度になるよう蒸留水で溶解し、滅菌ろ過フィルターを用いて、滅菌ろ過した。
【００２７】
〈被験物質４：エンドウ豆加水分解物〉
乾燥エンドウ豆（Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ  Ｌ．）１０ｇに対して１Ｎ塩酸を４０ｇ添加し、８０℃、２時間加熱処理を行った。抽出後、ろ過布を用いてろ過を行った。ろ過後、サンプル溶液の容量と同程度の１Ｎ水酸化ナトリウムを添加し、ｐＨ＝７．０になるように中和処理を行った。中和後、前処理用フィルターを用いて、ろ過を行った。ろ過後、分子カットフィルターを用いて、２，０００×ｇで２時間限外ろ過を行った。限外ろ過後の溶液を凍結乾燥機を用いて、完全に乾燥させた。乾燥物を１％の濃度になるよう蒸留水で溶解し、滅菌ろ過フィルターを用いて、滅菌ろ過した。
【００２８】
〈細胞の飲作用評価試験１〉
ヒト表皮角化細胞株  ＨａＣａＴ  １．５×１０５  Ｃｅｌｌｓ／ｍＬを５％のＦＢＳを含有するＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）に分散し、２４ウェルプレート（ＴｒｕｅＬｉｎｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｐｌａｔｅｓ、ＴｒｕｅＬｉｎｅ）の各ウェルに５００μＬずつ播種した。３７℃，５％ＣＯ２下で２４ｈｒインキュベートした。２４ｈｒ後、１０ｎＭの蛍光色素（Ｂｌｏｃｋ−ｉＴ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｏｌｉｇｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するＤＭＥＭ４５０μＬに交換した。本蛍光色素は、遺伝子導入効率を測定する際に遺伝子導入のマーカーとして一般に利用されているものである。大豆の加水分解物と大豆の水抽出物（被験物質１および被験物質２）を最終濃度が１０ｐｐｍとなるように５０μＬ添加した。ｃｏｎｔｒｏｌには蒸留水を添加した。２４ｈｒ後、氷冷しながらＰＢＳ（−）で３回洗浄した。５００μＬ  ＰＢＳ（−）を添加し、顕微鏡（励起波長５４５ｎｍ、吸収波長６０５ｎｍ、×４倍、蛍光顕微鏡ＢＺ−Ｘ７００、キーエンス）により写真撮影を行った。ＩｍａｇｅＪで撮影した画像ファイルを開き、画像の色調をＲＧＢに分離した。ｒｅｄの画像のウィンドウを選択し、２値化により細胞形状を抽出した。抽出された形状の面積を測定し、細胞内に取り込まれた蛍光色素量とした。結果を図１に示した。
【００２９】
大豆加水分解物を添加した細胞で蛍光色素の細胞内への取り込みが促進されており、細胞の飲作用を促進する効果が認められた。大豆の水抽出物には細胞の飲作用を促進する効果が認められなかったことから、大豆を加水分解することで得られた分解物に特徴的に認められる効果であることが確認された（図１）。
【００３０】
尚、本試験では遺伝子導入マーカーとして一般的な色素を用いた飲作用促進効果測定結果を示したが、カチオン性ペプチド化合物などを飲作用の対象とした場合にも同様の効果が認められており、カチオン性脂質による物質の細胞内取り込み向上作用とは機序が異なることが示唆されている。
【００３１】
〈細胞の飲作用評価試験２〉
ヒト表皮角化細胞株  ＨａＣａＴ  １．５×１０５  Ｃｅｌｌｓ／ｍＬを５％のＦＢＳを含有するＤＭＥＭに分散し、２４ウェルプレートの各ウェルに５００μＬずつ播種した。３７℃、５％ＣＯ２下で２４ｈｒインキュベートした。２４ｈｒ後、１０ｎＭの蛍光色素を含有するＤＭＥＭ  ４５０μＬに交換した。大豆、小豆、エンドウ豆の加水分解物（被験物質１、被験物質３、被験物質４）を最終濃度が１０ｐｐｍとなるように５０μＬ添加した。ｃｏｎｔｒｏｌには蒸留水を添加した。２４ｈｒ後、氷冷しながらＰＢＳ（−）で３回洗浄した。５００μＬ  ＰＢＳ（−）を添加し、顕微鏡により写真撮影を行った。ＩｍａｇｅＪで撮影した画像ファイルを開き、画像の色調をＲＧＢに分離した。ｒｅｄの画像のウィンドウを選択し、２値化により細胞形状を抽出した。抽出された形状の面積を測定し、細胞内に取り込まれた蛍光色素量とした。結果を図２に示した。
【００３２】
大豆加水分解物を添加した細胞で蛍光色素の細胞内への取り込みが促進されたが、小豆およびエンドウ豆加水分解物には細胞の飲作用を促進する効果が認められなかった。このことから、細胞の飲作用促進効果はマメ科の中でも大豆の加水分解物に特徴的に認められる効果であることが確認された (図２)。
【００３３】
〈細胞障害性試験〉
大豆加水分解物の細胞への障害性を確認した。  ヒト表皮角化細胞株  ＨａＣａＴ  ５．０×１０４  Ｃｅｌｌｓ／ｍＬを５％のＦＢＳを含有するＤＭＥＭに分散し、２４ウェルプレートの各ウェルに５００μＬずつ播種した。３７℃、５％ＣＯ２下で２４ｈｒインキュベートした。２４ｈｒ後、１０ｎＭの蛍光色素を含有するＤＭＥＭ  ４５０μＬに交換した。大豆加水分解物（被験物質１）を最終濃度が１０、５０、１００ｐｐｍとなるように５０μＬ添加した。ｃｏｎｔｒｏｌには蒸留水を添加した。３７℃、５  ％  ＣＯ２下で７２ｈｒ後、１０％の細胞増殖度測定用試薬（Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８、Ｄｏｊｉｎｄｏ）を含むＤＭＥＭ培地に培地交換した。３７℃、５％ＣＯ２下で３０ｍｉｎインキュベートした。３０ｍｉｎ後にマイクロプレートリーダーを用いて、４５０ｎｍの吸光度を測定した。測定試料添加ウェルの吸光度をＳ（Ｓａｍｐｌｅ）、蒸留水添加ウェルの吸光度をＣ（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、測定試料を含まない試薬のみの吸光度をＢ（Ｂｌａｎｋ）として、以下の算出式で細胞増殖度を算出した。
【００３４】
【数１】
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【００３５】
大豆加水分解物は細胞の飲作用促進作用が認められる１０ｐｐｍで細胞障害性を示さず、さらに１０倍濃い濃度である１００ｐｐｍでも細胞障害性を示さなかった（図３）。大豆加水分解物を用いた細胞の飲作用促進は細胞への障害性の低い安全な物質取り込み向上方法であることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明によれば、飲作用を促進することにより、特殊な装置や細胞や対象物質に対する厳しい条件、複合体形成を必要とすることなく、より簡便かつ低障害性で様々な対象物質に対して、有用物質の細胞への取り込みを促進することが可能になり、高い細胞生存率を保ちながら有用物質に期待される効果を確実に早期実現することが可能になる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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