(57)【要約】      （修正有）【課題】高純度な組換えヒト血清アルブミンを単離、精製するクロマトグラフ法の提供。【解決手段】組換えヒト血清アルブミン粗抽出物を陽イオン交換クロマトグラフィーにかけ、バッファーにアルコール加えてエンドトキシンを取り除いて一次産物Ｉを得るステップと、結合条件において、一次産物Ｉを陰イオン・疎水性複合担体の交換クロマトグラフィーにかけ、中間産物ＩＩを得るステップと、中間産物ＩＩを疎水性クロマトグラフィーにかけ、精製後に高純度の組換えヒト血清アルブミン標的産物を得るステップを含んでなるクロマトグラフ法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
高純度の組換えヒト血清アルブミンを単離、精製するクロマトグラフ法であって、順に、
１）組換えヒト血清アルブミンの粗抽出物を陽イオン交換クロマトグラフィーにかけ、バッファーにアルコールを加えることでエンドトキシンを取り除き、一次産物Ｉを取得し、
前記バッファーは、洗浄バッファー、平衡化バッファーＩ、及び平衡化バッファーＩＩを含み、そのうち、洗浄バッファーが体積比で１０〜２０％のエタノールを含み、平衡化バッファーＩが体積比で０〜１０％のエタノールを含み、平衡化バッファーＩＩが体積比で５〜１５％のエタノールを含み、
前記陽イオン交換クロマトグラフィーの陽イオン・疎水性複合担体が、Ｃａｐｔｏ（登録商標）−ＭＭＣ又はＢｅｓｔａｒｏｓｅ（登録商標）  Ｄｉａｍｏｎｄ  ＭＭＣであり、
２）一次産物Ｉを陰イオン交換クロマトグラフィーにかけ、中間産物ＩＩを取得し、
前記陰イオン交換クロマトグラフィーの陰イオン・疎水性複合担体が、Ｃａｐｔｏ（登録商標）−Ａｄｈｅｒｅ又はＢｅｓｔａｒｏｓｅ（登録商標）  Ｄｉａｍｏｎｄ  ＭＭＡであり、
３）中間産物ＩＩを疎水性クロマトグラフィーにかけ、高純度の組換えヒト血清アルブミン標的産物を取得し、
前記疎水性クロマトグラフィーの担体が、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）  ＨＰ、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）  ＦＦ、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｂｅｓｔａｒｏｓｅ（登録商標）  ＨＰ又はＰｈｅｎｙｌ  Ｂｅｓｔａｒｏｓｅ（登録商標）  ＦＦである
ステップを含み、得られた組換えヒト血清アルブミンのＨＰＬＣ純度が少なくとも９９．９９９９％である、クロマトグラフ法。
【請求項２】
前記洗浄バッファーは１５％の無水エタノールを含み、前記平衡化バッファーＩＩは１０％の無水エタノールを含んでなる、請求項１に記載のクロマトグラフ法。
【請求項３】
前記洗浄バッファーは、無水酢酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、１５％の無水エタノールを含み、ＮａＣｌで導電率を８３ｍＳ／ｃｍに調整し、酢酸でｐＨをｐＨ４．６〜５.０に調整してなる、請求項１または２に記載のクロマトグラフ法。
【請求項４】
前記平衡化バッファーＩは、無水酢酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １５ｇ／Ｌを含み、酢酸でｐＨ４．２〜４．８に調整してなる、請求項１から３のいずれか一項に記載のクロマトグラフ法。
【請求項５】
前記平衡化バッファーＩＩは、無水酢酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １５ｇ／Ｌ、１０％の無水エタノールを含み、酢酸でｐＨ４．２〜４．８に調整してなる、請求項１から４のいずれか一項に記載のクロマトグラフ法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物工学分野に属し、具体的には、臨床用途に適用可能な高純度の組換えヒト血清アルブミン（ＯｓｒＨＳＡ）を単離、精製するクロマトグラフ法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト血清アルブミン（ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ，ＨＳＡ）は、５８５個のアミノ酸からなる一本鎖構造の非グリコシル化タンパク質であり、分子量が６６．５ｋＤであり、等電点が４．７〜４．９の範囲にある。ヒト血清アルブミンは、ヒト血漿中に最も多く含まれるタンパク質として血漿総タンパク質の６０％程度を占め、ヒト血液１リットル当たりにＨＳＡを約４０ｇ含む。ＨＳＡは血漿に限らず、組織、生体分泌液、皮膚及びリンパ腔にも存在する。正常な生理条件において、ＨＳＡは、血漿コロイド浸透圧の維持、栄養質及び創傷癒合の促進に寄与するとともに、キャリアー物質として、例えば、ホルモン等の疎水性生体分子、生理活性物質及び薬物の血液における輸送に関与する。したがって、ＨＳＡは重要な薬用タンパク質であり、臨床において主に失血、火傷、熱傷、形成外科手術及び脳損傷による低アルブミン血症、並びに肝硬変、腎性浮腫等の治療に使われる。
【０００３】
現在、臨床に使われるＨＳＡは、主にヒト血漿から抽出、単離することによって製造される。ところで、このような製造法には以下の欠点がある。一方では、血漿供給源に限界があり、すなわち、限られた血液供給源からＨＳＡ及びその関連製剤の製造需要をなかなか満足できなかった。他方では、血液自体が危険要因になる可能性があり、例えば、肝炎ウイルス、ＨＩＶウイルス等の危険な感染性病原体が混入する恐れがあり、血漿から抽出するＨＳＡの使用に大きな不安を抱える場合があった。
【０００４】
現代ＤＮＡ組換えと合成技術の進展に伴い、研究者らが組換えヒト血清アルブミン（以下、ＯｓｒＨＳＡと称する場合がある）の製造と応用に強い関心を示し、今まで既に各種の異なる発現系においてＯｓｒＨＳＡを大量に製造する試みがなされ、例えば、大腸菌（Ｌａｔｔａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，５：１３０９〜１３１４，１９８７）、枯草菌（Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｃ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：２９１７〜２９２５，１９８７）等の原核生物、酵母（ＷＯ００／４４７７２，ＥＰ０６８３２３３Ａ２，ＵＳ５６１２１９６）、動物細胞培養等の真核生物を利用してＯｓｒＨＳＡを製造する技術が確立された。しかしながら、これらの方法は、発現レベルが低く、又は製造コストが高いといった問題点を抱え、産業規模の製造に適したものではない。
【０００５】
本発明者による中国特許出願２０１０１０６０６６３５．８号に開示されている水稲の子実からＯｓｒＨＳＡを抽出する方法に基づき、本発明は、ＯｓｒＨＳＡのエンドトキシン含有量を低下させ、純度を＞９９．９９９９％に高めることに着目し、更に関連の処理プロセスについて鋭意検討を行ったところ、本発明の新しい技術案を得ることに至った。ここで、上記特許出願２０１０１０６０６６３５．８号に開示の技術事項全体が本発明の背景技術として援用される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、トランスジェニック水稲の子実のタンパク質粗抽出液から組換えヒト血清アルブミンを単離、精製するクロマトグラフ法を提供することを目的とし、精製後に得られる組換えヒト血清アルブミンの純度が９９．９９９９％に達し、エンドトキシン含有量がわが国のヒト血清アルブミンの薬局方規格に満たすものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明に係る技術案は、以下のとおりである。
【０００８】
組換えヒト血清アルブミン（ＯｓｒＨＳＡ）を単離、精製するクロマトグラフ法であって、以下のステップを含んでなる。すなわち、１）組換えヒト血清アルブミンの粗抽出物を陽イオン交換クロマトグラフィーにかけ、バッファーにアルコールを加えることでエンドトキシンを取り除き、一次産物Ｉを取得し、２）一次産物Ｉを陰イオン交換クロマトグラフィーにかけ、中間産物ＩＩを取得し、３）中間産物ＩＩを疎水性クロマトグラフィーにかけ、高純度の組換えヒト血清アルブミン標的産物を取得する。
【０００９】
具体的に、上記陽イオン交換クロマトグラフィーの陽イオン・疎水性複合担体は、Ｃａｐｔｏ−ＭＭＣ又はＢｅｓｔａｒｏｓｅ  Ｄｉａｍｏｎｄ  ＭＭＣである。陰イオン交換クロマトグラフィーの陰イオン・疎水性複合担体は、Ｃａｐｔｏ−Ａｄｈｅｒｅ又はＢｅｓｔａｒｏｓｅ  Ｄｉａｍｏｎｄ  ＭＭＡである。疎水性クロマトグラフィーの担体は、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｂｅｓｔａｒｏｓｅ  ＨＰ又はＰｈｅｎｙｌ  Ｂｅｓｔａｒｏｓｅ  ＦＦである。
【００１０】
具体的には、本発明の方法に係るアルコールは、エタノール及びイソプロパノールから選ばれる。
【００１１】
具体的には、本発明の方法に係るバッファーは、洗浄バッファー、平衡化バッファーＩ、及び平衡化バッファーＩＩを含み、そのうち、洗浄バッファーは体積比で１０〜２０％のアルコールを含み、平衡化バッファーＩは体積比で０〜１０％のアルコールを含み、平衡化バッファーＩＩは体積比で５〜１５％のアルコールを含む。前記アルコールは、１価アルコール及び２価アルコールから選ばれる。より具体的には、前記アルコールは、エタノール又はイソプロパノールである。
【００１２】
好ましくは、前記洗浄バッファーは、１５％の無水エタノールを含み、平衡化バッファーＩＩは、１０％の無水エタノールを含む。より好ましくは、前記洗浄バッファーは、無水酢酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、１５％の無水エタノールを含み、ＮａＣｌで導電率を８３ｍＳ／ｃｍに調整し、酢酸でｐＨをｐＨ４．６〜５．０に調整してなる。平衡化バッファーＩは、無水酢酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、ＮａＣl １５ｇ／Ｌを含み、酢酸でｐＨ４．２〜４．８に調整してなる。平衡化バッファーＩＩは、無水酢酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １５ｇ／Ｌ、及び１０％の無水エタノールを含み、酢酸でｐＨ４．２〜４．８に調整してなる。
【００１３】
或いは、好ましくは、前記洗浄バッファーは、体積比で１０〜１６％のイソプロパノールを含み、平衡化バッファーＩＩは、体積比で４〜１１％のイソプロパノールを含む。より好ましくは、前記洗浄バッファーは、無水酢酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、１５〜１６％のイソプロパノールを含み、ＮａＣｌで導電率を８２〜８９ｍＳ／ｃｍに調整し、酢酸でｐＨをｐＨ４．８〜４．９に調整してなる。平衡化バッファーＩは、無水酢酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １１ｇ／Ｌを含み、酢酸でｐＨ４．５に調整してなる。平衡化バッファーＩＩは、無水酢酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １５ｇ／Ｌ、及び１０〜１１％のイソプロパノールを含み、酢酸でｐＨ４．５に調整してなる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】３種類の異なる条件下における、Ｃａｐｔｏ−ＭＭＣクロマトグラフィーの精製効果及び負荷量の測定結果を示す図である。そのうち、Ｍが分子量マーカー、Ｌが抽出液サンプル、Ｍｌが対照組、Ｍ２がテスト組１、Ｍ３がテスト組２、ＦＴが通過画分、Ｍ３ＦＴがＭ３テスト組の通過画分であり、６００、６６０及び７３０は、それぞれ６００ｍＬ、６６０ｍＬ及び７３０ｍＬ注入した時の通過画分であり、Ｗａｓｈは、ＯｓｒＨＳＡ画分を含む洗浄液であり、Ｅｌｕｔｉｏｎは、ＯｓｒＨＳＡ画分を含む溶出液である。
【図２】Ｃａｐｔｏ−ＭＭＣとＢｅｓｔａｒｏｓｅ  Ｄｉａｍｏｎｄ  ＭＭＣを用いて一次精製を行う場合の純度を比較する図である。そのうち、ＧＥ−ＭＭＣがＣａｐｔｏ−ＭＭＣ、Ｂｅｓｔ−ＭＭＣがＢｅｓｔａｒｏｓｅ  Ｄｉａｍｏｎｄ  ＭＭＣであり、Ｅｌｕは、２種類の担体を用いて一次精製を行う場合の溶出液を示し、Ｍが分子量マーカー、ＦＴが通過画分、ｗａｓｈがＯｓｒＨＳＡ洗浄液、ＥｌｕがＯｓｒＨＳＡ画分を含む溶出液、Ｓが抽出液サンプル、ＣＩＰ１が担体再生１の溶出液、ＣＩＰ２が担体再生２の溶出液である。
【図３】ＵＮＯ  Ｓｐｈｅｒｅ  Ｓのアルコール添加時とアルコール非添加時におけるクロマトグラフィーの精製効果を比較する図である。そのうち、ＣＫが対照組、ＵＥがテスト組（サンプルと平衡化液に１０％のエタノールを加える）、Ｍが分子量マーカー、Ｌｏａｄがサンプル、ＦＴが通過画分、Ｅｌｕｔｉｏｎが２種類の異なる条件で溶出する場合の標的ピーク回収液、ＣＩＰが担体再生のサンプルである。
【図４】Ｃａｐｔｏ−ＡｄｈｅｒｅとＢｅｓｔａｒｏｓｅ  Ｄｉａｍｏｎｄ  ＭＭＡを用いて通過条件で中間精製を行う場合のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析結果を比較する図である。そのうち、Ｍが分子量マーカー、ＭＭＣがサンプル、ＦＴがＯｓｒＨＳＡ画分を含む通過液、ＣＩＰが担体再生のサンプルである。
【図５】Ｃａｐｔｏ−ＡｄｈｅｒｅとＢｅｓｔａｒｏｓｅ  Ｄｉａｍｏｎｄ  ＭＭＡを用いて結合条件で中間精製を行う場合の結果を比較する図である。そのうち、Ｍが分子量マーカー、Ｌがサンプル、ＦＴが通過画分、ＥｌｕがＯｓｒＨＳＡ画分を含む溶出液、Ｃが担体再生のサンプルである。
【図６】Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰとＰｈｅｎｙｌ  Ｂｅｓｔａｒｏｓｅ  ＨＰ疎水性クロマトグラフィーによって最終精製を行う場合の結果を比較する図である。そのうち、Ｍが分子量マーカー、Ａｄが注入サンプル、ＦＴがＯｓｒＨＳＡ画分を含む通過液、ＣＩＰが担体再生のサンプルである。
【図７】水稲の子実由来のタンパク質を精製する前後における不純物の検出結果を示す図である。そのうち、左図は、水稲の子実由来のヒト血清アルブミンを精製する前後における不純物を検出する場合のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析比較図であり、右図は、水稲の子実由来のヒト血清アルブミンを精製する前後における、水稲の子実の不純物全体に対する抗体を用いてハイブリッドした場合のウェスタンブロット検出結果を示し、Ｍは、分子量マーカーである。
【図８】本発明の１つの実施例における、ＯｓｒＨＳＡ単離・精製の結果を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析図である。そのうち、ＡがＣａｐｔｏ−ＭＭＣクロマトグラフィー、ＢがＣａｐｔｏ−Ａｄｈｅｒｅクロマトグラフィー、ＣがＰｈｅｎｙｌ  ＨＰクロマトグラフィーであり、Ｌがサンプル注入液、ＦＴが通過液、Ｗが洗浄液、Ｅｌｕが溶出液、Ｃが担体ＣＩＰのサンプルである。
【図９】本発明の別の１つの実施例における、ＯｓｒＨＳＡ単離・精製の結果を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析図（左図）、及び対応のウェスタンブロット解析図（右図）である。そのうち、ＡがＣａｐｔｏ−ＭＭＣクロマトグラフィー、ＢがＣａｐｔｏ−Ａｄｈｅｒｅクロマトグラフィー、ＣがＰｈｅｎｙｌ  ＨＰクロマトグラフィーであり、Ｍが分子量マーカー、Ｌがサンプル注入液、ＦＴが通過液、Ｗが洗浄液、Ｅが溶出液、Ｃが担体ＣＩＰのサンプルである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の特徴と長所をより深く理解できるように、添付の図面を参照しながら本発明を詳細に説明する。以下の実施例は、本発明に係る方法を例示したに過ぎず、本発明の構成がこれらの実施例によって何ら制限されるものではない。
【００１６】
以下の実施例で使われる試薬及び装置は、特に説明がない限り、全て通常の市販のものである。
【００１７】
実施例１：ＯｓｒＨＳＡ抽出液の調製
本出願人による中国特許出願２００５１００１９０８４．４号に記載の方法を参照してＯｓｒＨＳＡを含むトランスジェニック水稲を作製し、並びに、本出願人による中国特許出願２０１０１０６０６６３５．８号に記載の方法を参照して水稲の子実からＯｓｒＨＳＡを抽出し、清澄なＯｓｒＨＳＡ抽出液を得た。
【００１８】
実施例２：陽イオン交換クロマトグラフィーによる一次精製の条件選定
本出願人による中国特許出願２０１０１０６０６６３５．８号に記載の方法を参考して行った。組み分けとして、テスト組と対照組に分けた。
【００１９】
１．Ｃａｐｔｏ−ＭＭＣ陽イオン交換クロマトグラフィーによる一次精製、及びアルコール添加によるエンドトキシンの除去処理
以下、Ｃａｐｔｏ−ＭＭＣ陽イオン交換クロマトグラフィーを利用して一次精製を行い、並びに、テスト組のバッファーにエタノールを添加してＯｓｒＨＳＡ抽出液におけるエンドトキシンを取り除いた。対照組（Ｍ１）は、エタノールを添加せずに処理を施した。
【００２０】
テスト組１（Ｍ２）：平衡化液とサンプルに１０％のエタノールを加え、具体的な処理条件は、次のとおりである。
【００２１】
カラム充填：Ｃａｐｔｏ−ＭＭＣ担体約３０ｍＬをＸＫ１６／４００ｍｍクロマトカラムに充填し、０．５Ｎ  ＮａＯＨで３０分間洗い流して発熱因子を死滅させた。
【００２２】
平衡化：平衡化バッファー（無水酢酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １５ｇ／Ｌ、１０％（ｖ／ｖ）無水エタノール、酢酸でｐＨ４．５に調製したもの）２００ｍＬを用いて流速３００ｃｍ／ｈでクロマトカラムを平衡化し、ｐＨを４．５に安定させた。
【００２３】
サンプル注入：ＯｓｒＨＳＡを含み且つ清澄な抽出液サンプルに１０％（ｖ／ｖ）無水エタノールと１１ｇ／Ｌ  ＮａＣｌを加え、ＮａＯＨでｐＨ４．５に調整した後、６００ｃｍ／ｈの流速でカラムに注入し、サンプルの導電率が２０〜２１ｍＳ／ｃｍ、ｐＨが４．５であった。
【００２４】
再平衡化：サンプルを注入した後、平衡化バッファー（無水酢酸ナトリウム２ ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １５ｇ／Ｌ、１０％（ｖ／ｖ）無水エタノール、酢酸でｐＨ４．５に調整し、注射用水で調製したもの）１００ｍＬを用いて流速３００ｃｍ／ｈでクロマトカラムを再び平衡化させた。
【００２５】
洗浄：洗浄バッファー（無水酢酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  ５８．５ｇ／Ｌ、酢酸でｐＨ４．８に調整し、注射用水で調製したもの）２００ｍＬを用いて流速３００ｃｍ／ｈで不純物を洗い流した。
【００２６】
溶出：溶出バッファー（リン酸二水素ナトリウム２．６７ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム２．８２ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  ２３．４ｇ／Ｌ、ｐＨ６．３〜６．４、注射用水で調製したもの）を用いて標的ピークを溶離させ、ＯｓｒＨＳＡ含有画分を得た。
【００２７】
テスト組２（Ｍ３）：平衡化液とサンプルに１０％のエタノールを加え、洗浄液に２０％のエタノールを加え、具体的な処理条件は、次のとおりである。
【００２８】
カラム充填：Ｃａｐｔｏ−ＭＭＣ担体約３０ｍＬをＸＫ１６／４００ｍｍクロマトカラムに（カラム高さが２１ｃｍ）充填し、０．５Ｎ  ＮａＯＨで３０分間洗い流して発熱因子を死滅させた。
【００２９】
平衡化：平衡化バッファー（無水酢酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １５ｇ／Ｌ、１０％（ｖ／ｖ）無水エタノール、酢酸でｐＨ４．５に調製したもの）２００ｍＬを用いて流速３００ｃｍ／ｈでクロマトカラムを平衡化し、ｐＨを４．５に安定させた。
【００３０】
サンプル注入：ＯｓｒＨＳＡを含み且つ清澄な抽出液サンプルに１０％（ｖ／ｖ）無水エタノールと１１ｇ／Ｌ  ＮａＣｌを加え、ＮａＯＨでｐＨ４．５に調整した後、６００ｃｍ／ｈの流速でカラムに注入し、サンプルの導電率が２０〜２１ｍＳ／ｃｍ、ｐＨが４．５であった。
【００３１】
再平衡化：サンプルを注入した後、平衡化バッファー（無水酢酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １５ｇ／Ｌ、１０％（ｖ／ｖ）無水エタノール、酢酸でｐＨ４．５に調整し、注射用水で調製したもの）１００ｍＬを用いて流速３００ｃｍ／ｈでクロマトカラムを再び平衡化させた。
【００３２】
洗浄：洗浄バッファー（無水酢酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １２０ｇ／Ｌ、２０％（ｖ／ｖ）無水エタノール、酢酸でｐＨ４．８に調整し、注射用水で調製したもの）２００ｍＬを用いて流速３００ｃｍ／ｈで不純物を洗い流した。
【００３３】
溶出：溶出バッファー（リン酸二水素ナトリウム２．６７ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム２．８２ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  ２３．４ｇ／Ｌ、ｐＨ６．３〜６．４、注射用水で調製したもの）を用いて標的ピークを溶離させ、ＯｓｒＨＳＡ含有画分を得た。
【００３４】
結果：純度及び負荷量の測定結果を図１に示す。対照組と２つのテスト組が、純度において明らかな差がなく、洗浄液にアルコールを添加して洗浄することで１７〜２６ＫＤの不純物バンドの除去に有利であることが確認できた。また、アルコール添加して洗浄する場合、Ｃａｐｔｏ−ＭＭＣの負荷量に影響がなく、３組試験のＦＴ結果から負荷量が全て３０ｍＬ抽出液／ｍＬ担体を超えることが確認できた。
【００３５】
エンドトキシン除去効果：表１（Ｃａｐｔｏ−ＭＭＣのアルコール添加洗浄によるエンドトキシン除去効果の比較）に示されるように、Ｃａｐｔｏ−ＭＭＣのアルコール添加洗浄クロマトグラフィーが、エンドトキシン除去に対して良好な効果を示し、対照試験に比べ、平衡化液と抽出液サンプルに１０％（ｖ／ｖ）エタノールを加え、洗浄液に２０％のエタノールを加えてＣａｐｔｏ−ＭＭＣクロマトグラフィーを行う場合、エンドトキシン除去効果が最もよく、対照試験の約３．６倍に達することが確認できた。
【００３６】
【表１】
2018087207.tif 000002
【００３７】
２．Ｃａｐｔｏ−ＭＭＣのアルコール添加洗浄によるエンドトキシン除去処理の条件最適化
（２．１）抽出液サンプルにアルコール添加とアルコール無添加の場合の、エンドトキシン除去効果の比較
具体的な処理条件は、以下のとおりである。
【００３８】
対照組（Ｍ１）：平衡化液とサンプルに１０％のエタノールを加え、洗浄液に２０％のエタノールを加え、具体的な処理条件は、次のとおりである。
【００３９】
カラム充填：Ｃａｐｔｏ−ＭＭＣ担体約２９ｍＬをＢｉｏＲａｄ１５／４００ｍｍクロマトカラムに充填し、０．５Ｎ  ＮａＯＨで３０分間洗い流して発熱因子を死滅させた。
【００４０】
平衡化：平衡化バッファーＩ（無水酢酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １５ｇ／Ｌ、１０％（ｖ／ｖ）無水エタノール、酢酸でｐＨ４．５に調製したもの）２００ｍＬを用いて流速３００ｃｍ／ｈでクロマトカラムを平衡化し、ｐＨを４．５に安定させた。
【００４１】
サンプル注入：ＯｓｒＨＳＡを含み且つ清澄な抽出液サンプルに１０％（ｖ／ｖ）無水エタノールと１１ｇ／Ｌ  ＮａＣｌを加え、ＮａＯＨでｐＨ４．５に調整した後、６００ｃｍ／ｈの流速でカラムに注入した。サンプル注入量が８７０ｍＬであり、サンプルの導電率が２０〜２１ｍＳ／ｃｍ、ｐＨが４．５、サンプルのエンドトキシン量が１０００〜２０００ＥＵ／ｍＬであった。
【００４２】
再平衡化：サンプルを注入した後、平衡化バッファーＩＩ（無水酢酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １５ｇ／Ｌ、１０％（ｖ／ｖ）無水エタノール、酢酸でｐＨ４．５に調整し、注射用水で調製したもの）１００ｍＬを用いて流速３００ｃｍ／ｈでクロマトカラムを再び平衡化させた。
【００４３】
洗浄：洗浄バッファー（無水酢酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、２０％（ｖ／ｖ）無水エタノール、ＮａＣｌで導電率を８３ｍＳ／ｃｍに調整し、酢酸でｐＨ４．８に調整し、注射用水で調製したもの）２００ｍＬを用いて流速３００ｃｍ／ｈで不純物を洗い流した。
【００４４】
溶出：溶出バッファー（リン酸二水素ナトリウム２．６７ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム２．８２ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  ２３．４ｇ／Ｌ、ｐＨ６．３〜６．４、注射用水で調製したもの）を用いて標的ピークを溶離させ、ＯｓｒＨＳＡ含有画分を得た。
【００４５】
テスト組（Ｍ２）：サンプルと平衡化液Ｉにエタノールを添加せず、サンプルを注入した後、１０％のエタノールを含む平衡化液ＩＩ  １５０ｍＬ（約５ＣＶに相当する）で平衡化し、洗浄時に２０％のエタノールを加えた以外、他の条件はＭ１と同様である。
【００４６】
結果は表２（Ｃａｐｔｏ−ＭＭＣのサンプルと平衡化液にエタノール添加とエタノール無添加の場合の、エンドトキシン除去効果の比較）に示され、２組の平行試験において総ＥＵの低下倍率がほぼ一致し、サンプルと平衡化液Ｉにアルコール添加とアルコール無添加の場合、エンドトキシン除去効果への影響がさほど顕著ではないことが確認できた。両者の回収液のタンパク質濃度と体積がさほど変わりなく、且つエンドトキシン量も同様であることから、サンプルと平衡化液Ｉにエタノールを添加しなくても同様のエンドトキシン除去効果が得られることが更に実証された。
【００４７】
【表２】
2018087207.tif 000003
【００４８】
（２．２）洗浄液の異なるアルコール添加量によるエンドトキシン除去効果の比較
対照組１（Ｍ１）：
カラム充填：Ｃａｐｔｏ−ＭＭＣ担体約２９ｍＬをＢｉｏＲａｄｌ５／４００ｍｍクロマトカラムに充填し、０．５Ｎ  ＮａＯＨで３０分間洗い流して発熱因子を死滅させた。
【００４９】
平衡化：平衡化バッファーＩ（無水酢酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １５ｇ／Ｌ、酢酸でｐＨ４．５に調製したもの）２００ｍＬを用いて流速３００ｃｍ／ｈでクロマトカラムを平衡化し、ｐＨを４．５に安定させた。
【００５０】
サンプル注入：ＯｓｒＨＳＡを含み且つ清澄な抽出液サンプルに１１ｇ／Ｌ  ＮａＣｌを加え、ＮａＯＨでｐＨ４．５に調整した後、６００ｃｍ／ｈの流速でカラムに注入した。サンプル注入量が６５０ｍＬであり、サンプルの導電率が２０〜２１ｍＳ／ｃｍ、ｐＨが４．５、サンプルのエンドトキシン量が１０００〜２０００ＥＵ／ｍＬであった。
【００５１】
再平衡化：サンプルを注入した後、平衡化バッファーＩＩ（無水酢酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １５ｇ／Ｌ、１０％（ｖ／ｖ）無水エタノール、酢酸でｐＨ４．５に調整し、注射用水で調製したもの）１５０ｍＬを用いて流速３００ｃｍ／ｈでクロマトカラムを再び平衡化させた。
【００５２】
洗浄：洗浄バッファー（無水酢酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、２０％（ｖ／ｖ）無水エタノール、ＮａＣｌで導電率を８３ｍＳ／ｃｍに調整し、酢酸でｐＨ４．８に調整し、注射用水で調製したもの）２００ｍＬを用いて流速３００ｃｍ／ｈで不純物を洗い流した。
【００５３】
溶出：溶出バッファー（リン酸二水素ナトリウム２．６７ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム２．８２ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  ２３．４ｇ／Ｌ、ｐＨ６．３〜６．４、注射用水で調製したもの）を用いて標的ピークを溶離させ、ＯｓｒＨＳＡ含有画分を得た。
【００５４】
テスト組１（Ｍ２）：洗浄液に１５％（ｖ／ｖ）無水エタノールを添加した以外、他の条件はＭ１と同様である。
【００５５】
テスト組２（Ｍ３）：洗浄液に１０％（ｖ／ｖ）無水エタノールを添加した以外、他の条件はＭ１と同様である。
【００５６】
結果は、表３（Ｃａｐｔｏ−ＭＭＣの洗浄液にエタノール添加量が異なる場合のエンドトキシン除去効果の比較）に示される通りである。
【００５７】
【表３】
2018087207.tif 000004
【００５８】
表３の分析から、Ｍ３組においてエンドトキシンの総ＥＵが３８倍低下し、Ｍ１（対照組）に比べて顕著な差異があると確認できる。また、Ｍ２組において１５％のエタノールを加えた場合、５２倍低下し、回収液のエンドトキシン量がＭ１と同様であり、Ｍ１（対照組）に比較して顕著な差異がなく、ＭＭＣ洗浄液のエタノール濃度を１５％程度に下げてもエンドトキシンの除去効果に明らかな影響がないのが確認できた。
【００５９】
（２．３）洗浄液にイソプロパノール添加して洗浄することによるエンドトキシンの除去効果
対照組（ＣＫ）：
カラム充填：Ｃａｐｔｏ−ＭＭＣ担体約２９ｍＬをＢｉｏＲａｄ１５／４００ｍｍクロマトカラムに充填し、０．５Ｎ  ＮａＯＨで３０分間洗い流して発熱因子を死滅させた。
【００６０】
平衡化：平衡化バッファーＩ（無水酢酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １５ｇ／Ｌ、酢酸でｐＨ４．５に調製したもの）２００ｍＬを用いて流速３００ｃｍ／ｈでクロマトカラムを平衡化し、ｐＨを４．５に安定させた。
【００６１】
サンプル注入：６００ｃｍ／ｈの流速でサンプルを注入し、サンプル注入量が９００ｍＬであり、サンプルの導電率が５〜８ｍＳ／ｃｍ、ｐＨが４．５、サンプルのエンドトキシン量が１０００〜２０００ＥＵ／ｍＬであった。
【００６２】
再平衡化：サンプルを注入した後、平衡化バッファーＩＩ（無水酢酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １５ｇ／Ｌ、１０％（ｖ／ｖ）エタノール、酢酸でｐＨ４．６〜４．７に調整し、注射用水で調製したもの）１５０ｍＬを用いて流速３００ｃｍ／ｈでクロマトカラムを再び平衡化させた。
【００６３】
洗浄：洗浄バッファー（無水酢酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、ＮａＣｌで導電率を８２〜８９ｍＳ／ｃｍに調整し、１５％（ｖ／ｖ）エタノール、酢酸でｐＨ４．７〜４．９に調整し、注射用水で調製したもの）２００ｍＬを用いて流速３００ｃｍ／ｈで不純物を洗い流した。
【００６４】
溶出：溶出バッファー（リン酸二水素ナトリウム２．６７ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム２．８２ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  ２３．４ｇ／Ｌ、ｐＨ６．３〜６．４、注射用水で調製したもの）を用いて標的ピークを溶離させ、ＯｓｒＨＳＡ含有画分を得た。
【００６５】
テスト組１（Ｍｌ）：
カラム充填：Ｃａｐｔｏ−ＭＭＣ担体約２９ｍＬをＢｉｏＲａｄ１５／４００ｍｍクロマトカラムに充填し、０．５Ｎ  ＮａＯＨで３０分間洗い流して発熱因子を死滅させた。
【００６６】
平衡化：平衡化バッファーＩ（無水酢酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １５ｇ／Ｌ、酢酸でｐＨ４．５に調製したもの）２００ｍＬを用いて流速３００ｃｍ／ｈでクロマトカラムを平衡化し、ｐＨを４．５に安定させた。
【００６７】
サンプル注入：６００ｃｍ／ｈの流速でサンプルを注入し、サンプル注入量が９００ｍＬであり、サンプルの導電率が５〜８ｍＳ／ｃｍ、ｐＨが４．５、サンプルのエンドトキシン量が１０００−２０００ＥＵ／ｍＬであった。
【００６８】
再平衡化：サンプルを注入した後、平衡化バッファーＩＩ（無水酢酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １５ｇ／Ｌ、４〜６％（ｖ／ｖ）イソプロパノール、酢酸でｐＨ４．６〜４．７に調整し、注射用水で調製したもの）１５０ｍＬを用いて流速３００ｃｍ／ｈでクロマトカラムを再び平衡化させた。
【００６９】
洗浄：洗浄バッファー（無水酢酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、１０〜１１％（ｖ／ｖ）イソプロパノール、ＮａＣｌで導電率を８２〜８９ｍＳ／ｃｍに調整し、酢酸でｐＨ４．７〜４．９に調整し、注射用水で調製したもの）２００ｍＬを用いて流速３００ｃｍ／ｈで不純物を洗い流した。
【００７０】
溶出：溶出バッファー（リン酸二水素ナトリウム２．６７ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム２．８２ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  ２３．４ｇ／Ｌ、ｐＨ６．３〜６．４、注射用水で調製したもの）を用いて標的ピークを溶離させ、ＯｓｒＨＳＡ含有画分を得た。
【００７１】
テスト組２（Ｍ２）：平衡化バッファーＩＩの４〜６％（ｖ／ｖ）イソプロパノールを１０〜１１％（ｖ／ｖ）イソプロパノールに変え、洗浄液の１０〜１１％（ｖ／ｖ）イソプロパノールを１５〜１６％（ｖ／ｖ）イソプロパノールに変え、且つ導電率を７５〜７６ｍＳ／ｃｍに下げた以外、他の条件はＭ1組と同様である。
【００７２】
結果は、表４（Ｃａｐｔｏ−ＭＭＣのイソプロパノール添加洗浄によるエンドトキシン除去効果の比較）に示される通りである。
【００７３】
【表４】
2018087207.tif 000005
【００７４】
表４の分析から、対照組においてエンドトキシンの総ＥＵが５２倍低下したのに対し、Ｍ１組及びＭ２組においてそれぞれ４５０倍及び７１０倍低下し、エンドトキシン除去効果がエタノールを添加して洗浄する場合に比べて顕著に高まることが確認できた。また、Ｍ２組においてイソプロパノール含有量を１５％（ｖ／ｖ）に増加した場合、エンドトキシンが７１０倍低下し、Ｍ１と同等のエンドトキシン除去効果を示したことから、平衡化液のイソプロパノール添加量を４〜１１％（ｖ／ｖ）にすることのできることが実証され、また、洗浄液のイソプロパノール添加量が１０〜１６％（ｖ／ｖ）の範囲、導電率が７５〜８９ｍＳ／ｃｍの範囲においてエンドトキシンの除去効果がさほど変わらないことが確認できた。
【００７５】
３．陽イオンクロマトグラフィー担体の選定、及びアルコール添加洗浄によるエンドトキシンの除去効果
（３．１）Ｂｅｓｔａｒｏｓｅ  Ｄｉａｍｏｎｄ  ＭＭＣによる陽イオン交換クロマトグラフィー、及びアルコール添加洗浄によるエンドトキシンの除去処理
具体的な処理条件は、次のとおりである。
【００７６】
カラム充填：Ｂｅｓｔａｒｏｓｅ  Ｄｉａｍｏｎｄ  ＭＭＣ担体約３３ｍＬをＢｉｏＲａｄ１５／４００ｍｍクロマトカラムに充填し、０．５Ｎ  ＮａＯＨで３０分間洗い流して発熱因子を死滅させた。
【００７７】
平衡化：平衡化バッファーＩ（無水酢酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １５ｇ／Ｌ、酢酸でｐＨ４．５に調製したもの）２００ｍＬを用いて流速３００ｃｍ／ｈでクロマトカラムを平衡化し、ｐＨを４．５に安定させた。
【００７８】
サンプル注入：ＯｓｒＨＳＡを含み且つ清澄な抽出液サンプルに１１ｇ／Ｌ  ＮａＣｌを加え、ＮａＯＨでｐＨ４．５に調整した後、６００ｃｍ／ｈの流速でカラムに注入した。サンプル注入量が６００ｍＬであり、サンプルの導電率が２０〜２１ｍＳ／ｃｍ、ｐＨが４．５、サンプルのエンドトキシン量が１５００〜２０００ＥＵ／ｍＬであった。
【００７９】
再平衡化：サンプルを注入した後、平衡化バッファーＩＩ（無水酢酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １５ｇ／Ｌ、１０％（ｖ／ｖ）無水エタノール、酢酸でｐＨ４．５に調整し、注射用水で調製したもの）１５０ｍＬを用いて流速３００ｃｍ／ｈでクロマトカラムを再び平衡化させた。
【００８０】
洗浄：洗浄バッファー（無水酢酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、１５％（ｖ／ｖ）無水エタノール、ＮａＣｌで導電率を８３ｍＳ／ｃｍに調整し、酢酸でｐＨ４．８に調整し、注射用水で調製したもの）２００ｍＬを用いて流速３００ｃｍ／ｈで不純物を洗い流した。
【００８１】
溶出：溶出バッファー（リン酸二水素ナトリウム２．６７ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム２．８２ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  ２３．４ｇ／Ｌ、ｐＨ６．３〜６．４、注射用水で調製したもの）を用いて標的ピークを溶離させ、ＯｓｒＨＳＡ含有画分を得た。
【００８２】
図２に示される結果から、純度においてＢｅｓｔａｒｏｓｅ  Ｄｉａｍｏｎｄ  ＭＭＣとＣａｐｔｏ−ＭＭＣとの間に明らかな差がなく、Ｂｅｓｔａｒｏｓｅ  Ｄｉａｍｏｎｄ  ＭＭＣをＯｓｒＨＳＡの一次精製に利用可能であることが確認できた。
【００８３】
エンドトキシン除去効果：Ｂｅｓｔａｒｏｓｅ  Ｄｉａｍｏｎｄ  ＭＭＣを使用し、アルコールを添加してクロマトグラフィーを行うことにより抽出液サンプルについて一次精製を施すと、エンドトキシンの総ＥＵが６２倍低下し、Ｃａｐｔｏ−ＭＭＣと同様のエンドトキシン除去効果があることが確認できた。
【００８４】
（３．２）ＵＮＯ  Ｓｐｈｅｒｅ  Ｓによる陽イオン交換クロマトグラフィー、及びアルコール添加によるエンドトキシンの除去効果
対照組（ＣＫ）：本発明者による中国特許出願２０１０１０６０６６３５．８号に記載の方法を参照し、サンプル注入量が４００ｍＬであった。
【００８５】
テスト組（ＵＥ）について、具体的な処理条件は、次のとおりである。
カラム充填：ＵＮＯ  Ｓｐｈｅｒｅ  Ｓ担体約１８ｍＬをＢｉｏＲａｄ１５／２００ｍｍクロマトカラムに充填し、０．５Ｎ  ＮａＯＨで３０分間洗い流して発熱因子を死滅させた。
【００８６】
平衡化：平衡化バッファー（無水酢酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、１０％（ｖ／ｖ）無水エタノール、酢酸でｐＨ４．５に調整し、注射用水で調製したもの）１００ｍＬを用いて流速３００ｃｍ／ｈでクロマトカラムを平衡化し、ｐＨを４．５に安定させた。
【００８７】
サンプル注入：ＯｓｒＨＳＡを含み且つ清澄な抽出液サンプルに１０％（ｖ／ｖ）無水エタノールを加え、醋酸でｐＨ４．５に調整した後、３００ｃｍ／ｈの流速でカラムに注入した。サンプル注入量が４００ｍＬであり、サンプルのエンドトキシン量が８００〜１０００ＥＵ／ｍＬである。
【００８８】
再平衡化：サンプルを注入した後、平衡化バッファー６０ｍＬを用いて流速３００ｃｍ／ｈでクロマトカラムを平衡化させた。
【００８９】
溶出：溶出バッファー（無水酢酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １４．６ｇ／Ｌ、醋酸でｐＨ５．５に調整し、注射用水で調製したもの）を用いて標的ピークを溶離させ、ＯｓｒＨＳＡ含有画分を得た。
【００９０】
図３に示される結果から、純度においてＵＮＯ  Ｓｐｈｅｒｅ  ｓの対照組とアルコール添加組との間に明らかな差がなく、すなわち、ＵＮＯ  Ｓｐｈｅｒｅ  ｓのアルコール添加のクロマトグラフィーを一次精製に使用可能であることが実証された。
【００９１】
エンドトキシン除去効果：ＵＮＯ  Ｓｐｈｅｒｅ  ｓを使用し、アルコールを添加してクロマトグラフィーを行うことにより抽出液サンプルについて一次精製を施すと、エンドトキシンの総ＥＵの低下状況が対照組に比べてさほど変わりなく、アルコールを添加して洗浄したとしてもＵＮＯ  Ｓｐｈｅｒｅ  Ｓのエンドトキシン除去効果を更に高めることができないのが確認でき、ＵＮＯ  Ｓｐｈｅｒｅ  Ｓ担体自体の基質構成に起因するものと考えられる。一方、Ｃａｐｔｏ−ＭＭＣとＢｅｓｔａｒｏｓｅ  Ｄｉａｍｏｎｄ  ＭＭＣは、何れも複合性のマルチリガンド結合担体であるため、弱い陽イオン交換と疏水性を兼ね備えることがその分離特性に寄与したと考えられる。
【００９２】
実施例３：陰イオン交換クロマトグラフィーによる中間精製の条件選定
１．ＯｓｒＨＳＡ通過条件（すなわち、導電率４０ｍＳ／ｃｍ、ｐＨ７．０の条件において、ＯｓｒＨＳＡ画分が担体に吸着せずにそのまま通過し、不純物が担体に吸着することにより単離、精製を行うこと）において、Ｃａｐｔｏ−ＡｄｈｅｒｅとＢｅｓｔａｒｏｓｅ  Ｄｉａｍｏｎｄ  ＭＭＡを利用する陰イオン交換クロマトグラフィー
カラム高さが２０．５ｃｍのＸＫ１６ｘ４００ｍｍクロマトカラムを使用し、Ｃａｐｔｏ−Ａｄｈｅｒｅ担体約４０ｍＬを充填した。平衡化バッファー（２５ｍＭ  ＰＢ、ＮａＣｌ  ２３．４ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０）約８ＣＶを用いて平衡化し、ＵＶ、ｐＨ及びｃｏｎｄがベースラインに達するようにした。Ｃａｐｔｏ−ＭＭＣ又はＢｅｓｔａｒｏｓｅ  Ｄｉａｍｏｎｄ  ＭＭＣの溶出液サンプルをｐＨ７．０に調整し、３００ｃｍ／ｈの流速で２８８ｍＬ注入した。通過紫外線の吸収値が＞２０ｍＡＵに達してから回収を開始し、ＯｓｒＨＳＡを含む標的画分を得た。負荷量を測定するため、２０ｍＬごとにサンプルを一回取り、通過部分の純度が顕著に変化しない総注入量を記録し、３００ｃｍ／ｈの流速における、Ｃａｐｔｏ−Ａｄｈｅｒｅ担体１ｍLあたりの実際負荷量を算出した。
【００９３】
Ｂｅｓｔａｒｏｓｅ  Ｄｉａｍｏｎｄ  ＭＭＡ担体を使用してＯｓｒＨＳＡ通過条件において行うクロマトグラフィーの条件は、Ｃａｐｔｏ−Ａｄｈｅｒｅと同じく、平行試験を行ってその精製効果と負荷量を比較した。
【００９４】
ＯｓｒＨＳＡ通過条件において２種類の陰イオン担体で中間精製を行った後、ＨＰＬＣ純度が９８％以上に達し、図４に示されるように、２種類の担体が純度において顕著な差がないのが確認できた。
【００９５】
２．ＯｓｒＨＳＡ結合条件においてＣａｐｔｏ−Ａｄｈｅｒｅを利用する陰イオン交換クロマトグラフィー
結合条件として、先ず、標的タンパク質を担体に結合させ、一部の不純物を通過させた後、特定の塩及びｐＨで標的タンパク質を溶離することにより、標的産物を単離、精製して回収した。このような条件としては、例えば、導電率２０ｍＳ／ｃｍ、ｐＨ７．０〜７．５において標的画分を陰イオン担体に吸着させ、その後、導電率４０ｍＳ／ｃｍ、ｐＨ７．０〜７．２の条件において標的画分を溶離し、不純物を取り除いて標的産物を回収した。
【００９６】
Ｃａｐｔｏ−Ａｄｈｅｒｅ担体約２２ｍＬをＢｉｏＲａｄ１５／２００ｍｍクロマトカラムに充填し、平衡化バッファー（リン酸二水素ナトリウム１．０ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム５．０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  ５．０ｇ／Ｌ、ｐＨ７．５〜７．６）２２０ｍＬを用いて流速３００ｃｍ／ｈでカラムを平衡化し、ｐＨを７．５〜７．６に安定させた。そして、Ｃａｐｔｏ−ＭＭＣ又はＢｅｓｔａｒｏｓｅ  Ｄｉａｍｏｎｄ  ＭＭＣの溶出液サンプルを水で希釈して導電率を１９〜２１ｍＳ／ｃｍにし、ＮａＯＨでｐＨ７．０に調整した後、流速３００ｃｍ／ｈで１５０ｍＬ注入した。平衡化バッファー約１００ｍを用いて再び平衡化した後、溶出バッファー（リン酸二水素ナトリウム１．５ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム５．０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  ２３．４ｇ／Ｌ、ｐＨ７．１〜７．２）を用いて流速３００ｃｍ／ｈでカラムを洗い流し、溶出ピークを回収してＯｓｒＨＳＡ含有画分を得た。回収液のエンドトキシン量が１００〜２００ＥＵ／ｍＬであった。
【００９７】
Ｂｅｓｔａｒｏｓｅ  Ｄｉａｍｏｎｄ  ＭＭＡ担体を使用し、ＯｓｒＨＳＡ結合条件において行うクロマトグラフィーの条件は、Ｃａｐｔｏ−Ａｄｈｅｒｅの場合と同じく、平行試験を行ってその精製効果と負荷量を比較した。
【００９８】
ＯｓｒＨＳＡ結合条件において、Ｃａｐｔｏ−Ａｄｈｅｒｅ及びＢｅｓｔａｒｏｓｅＤｉａｍｏｎｄ  ＭＭＡの２種類の担体を用いて中間精製を行った後、純度が何れも９９．９％以上（ＥＬＩＳＡ検出結果）に達することが確認でき、Ｂｅｓｔａｒｏｓｅ  Ｄｉａｍｏｎｄ  ＭＭＡとＣａｐｔｏ−Ａｄｈｅｒｅが同様の精製効果を示すことが実証された。電気泳動の写真を、図５に示す。
【００９９】
３．Ｃａｐｔｏ−ＡｄｈｅｒｅとＢｅｓｔａｒｏｓｅ  Ｄｉａｍｏｎｄ  ＭＭＡによる陰イオン交換クロマトグラフィーの条件選定
Ｃａｐｔｏ−ＡｄｈｅｒｅとＢｅｓｔａｒｏｓｅＤｉａｍｏｎｄＭＭＡの２種類の担体をパラレールに比較することにより、同様の条件において、Ｃａｐｔｏ−ＭＭＣ又はＢｅｓｔａｒｏｓｅ  Ｄｉａｍｏｎｄ  ＭＭＣの溶出液サンプルに対する２種類の担体の中間精製効果及び負荷量がほぼ一致することが確認でき、２種類の陰イオン交換クロマトグラフィー担体が何れもＯｓｒＨＳＡの中間精製に適用可能であることが実証された。
【０１００】
２種類の担体のＯｓｒＨＳＡ通過条件における負荷量が、結合条件の場合に比べて高くなり、前者の負荷量が約２５ｍｇサンプル／ｍＬ担体であり、後者の負荷量が約２０ｍｇサンプル／ｍＬ担体であった。しかし、ＯｓｒＨＳＡ結合条件における精製効果が、通過条件における精製効果を超え、前者の純度が９９．９％以上に達することに対し、後者は９８％〜９９％に止まった。
【０１０１】
ＯｓｒＨＳＡ通過条件において、殆どのエンドトキシンがＯｓｒＨＳＡと共にそのまま通過し、担体のエンドトキシン除去効果があまりよくないが、ＯｓｒＨＳＡ結合条件において、サンプルのエンドトキシンに対する２種類の担体の除去効果が通過条件の場合を超えた。結合条件において、一部の遊離型エンドトキシンがサンプル注入時にそのまま通過し、一部のエンドトキシンが担体に緊密に吸着したため、選択的にＯｓｒＨＳＡを溶離させることができ、良好なエンドトキシン除去効果を得た。
【０１０２】
各要素を全面的に考慮すると、２種類の陰イオン交換担体Ｃａｐｔｏ−ＡｄｈｅｒｅとＢｅｓｔａｒｏｓｅ  Ｄｉａｍｏｎｄ  ＭＭＡのクロマトグラフィー条件として、ＯｓｒＨＳＡ結合条件が最適であった。
【０１０３】
実施例４：疎水性クロマトグラフィーによる最終精製の条件選定
１．Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰによる疎水性クロマトグラフィー
本出願人による中国特許出願２０１０１０６０６６３５．８号に記載の方法を参照し、Ｐｈｅｎｙｌ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ担体約２８ｍＬをＸＫ１６／２００ｍｍクロマトカラムに充填した後、平衡化バッファー（無水酢酸ナトリウム２．３２ｇ／Ｌ、リン酸二水素ナトリウム２．８１ｇ／Ｌ、カプリル酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム６６ｇ／Ｌ、ｐＨ６．５）１５０ｍＬを用いて流速１００ｃｍ／ｈでクロマトカラムを平衡化した。Ｃａｐｔｏ−Ａｄｈｅｒｅ又はＢｅｓｔａｒｏｓｅ Ｄｉａｍｏｎｄ ＭＭＡで精製したＯｓｒＨＳＡを含む溶出画分１００ｍＬに、硫酸アンモニウムを加えて導電率を７５ｍＳ／ｃｍに調整した後、プリル酸ナトリウム０．１５ｇを加え、塩酸でｐＨ６．５に調整して１００ｃｍ／ｈの流速でカラムに注入した。通過画分を集めてＯｓｒＨＳＡ含有画分を回収し、並びに処理段階ごとにサンプルを取って負荷量を測定し、中間精製後のサンプルに対する担体１ｍＬ当たりの実際負荷量を算出した。電気泳動の写真を、図６に示す。
【０１０４】
２．Ｐｈｅｎｙｌ  Ｂｅｓｔａｒｏｓｅ  ＨＰによる疎水性クロマトグラフィー
Ｐｈｅｎｙｌ  Ｂｅｓｔａｒｏｓｅ  ＨＰ担体約２４ｍＬをＸＫ１６／２００ｍｍクロマトカラムに充填し、本実施例の上記１で説明したクロマトグラフ法を参照して平行試験を行った。電気泳動の写真を、図６及び図７に示す。
【０１０５】
結果と分析：
Ｃａｐｔｏ−Ａｄｈｅｒｅ又はＢｅｓｔａｒｏｓｅ  Ｄｉａｍｏｎｄ  ＭＭＡによる中間精製のサンプルを、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ又はＰｈｅｎｙｌ  Ｂｅｓｔａｒｏｓｅ  ＨＰ疎水性クロマトグラフィーにかけた場合、純度が何れも９９．９９９９％（ＥＬＩＳＡ検出）に達し、水稲の子実由来のタンパク質不純物が全く検出されなかった。２種類の疏水性担体は、純度においてさほど変わりなく、２種類の疎水性クロマトグラフィー担体で精製したＯｓｒＨＳＡ含有画分のエンドトキシン量も共に０．０６ＥＵ／ｍｇ未満であった。これらの結果から、ＯｓｒＨＳＡの最終精製にＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ又はＰｈｅｎｙｌ  Ｂｅｓｔａｒｏｓｅ  ＨＰ疎水性クロマトグラフィー担体を用いることができ、精製とエンドトキシン除去効果も良好であることが確認できた。
【０１０６】
実施例５：組換えヒト血清アルブミンの単離と精製
陽イオン交換による一次精製：Ｃａｐｔｏ−ＭＭＣ担体約４００ｍＬをＸＫ５０／４００ｍｍクロマトカラムに充填し、０．５Ｎ  ＮａＯＨで３０分間洗い流して発熱因子を死滅させた後、平衡化バッファーＩ（無水酢酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １１ｇ／Ｌ、酢酸でｐＨ４．５に調製したもの）２Ｌを用いて流速３００ｃｍ／ｈでクロマトカラムを平衡化し、ｐＨを５．０に安定させた。サンプル注入量が１０Ｌであり、サンプルの導電率が２０．３ｍＳ／ｃｍ、ｐＨ４．８であった。サンプルを注入した後、平衡化バッファーＩＩ（無水酢酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １５ｇ／Ｌ、１０〜１１％（ｖ／ｖ）無水エタノール、酢酸でｐＨ４．８に調整し、注射用水で調製したもの）２Ｌを用いて流速３００ｃｍ／ｈで再びクロマトカラムを平衡化し、洗浄バッファー（無水酢酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、１６％（ｖ／ｖ）無水エタノール、ＮａＣｌで導電率を８３．５ｍＳ／ｃｍに調整し、酢酸でｐＨ５．０に調整し、注射用水で調製したもの）３０００ｍＬを用いて流速３００ｃｍ／ｈで不純物を洗い流した。溶出バッファー（リン酸二水素ナトリウム２．６７ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム２．８２ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  ２３．４ｇ／Ｌ、ｐＨ６．３〜６．４、注射用水で調製したもの）を用いて標的ピークを溶離させ、ＯｓｒＨＳＡ含有画分を得た。電気泳動の写真を、図８のＡに示す。
【０１０７】
陰イオン・疎水性複合担体の交換クロマトグラフィーによる中間精製：Ｃａｐｔｏ−Ａｄｈｅｒｅ担体約６８ｍＬをＸＫ２６／２００ｍｍクロマトカラムに充填し、平衡化バッファー（リン酸二水素ナトリウム１．０ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム５．０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  ５．０ｇ／Ｌ、ｐＨ７．５〜７．６）６００ｍＬを用いて流速３００ｃｍ／ｈでカラムを平行化し、ｐＨを７．５〜７．６に安定させた後、流速３００ｃｍ／ｈでサンプル５００ｍＬを注入した。平衡化バッファー約２００ｍＬを用いて再びカラムを平衡化し、溶出バッファー（リン酸二水素ナトリウム１．５ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム５．０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  ２３．４ｇ／Ｌ、ｐＨ７．１〜７．２）を用いて流速３００ｃｍ／ｈでカラムを洗い流し、溶出ピークを回収してＯｓｒＨＳＡ含有画分を得た。回収液のエンドトキシン量が１００〜２００ＥＵ／ｍＬであった。電気泳動の写真を、図８のＢに示す。
【０１０８】
疏水性クロマトグラフィーによる最終精製：Ｐｈｅｎｙｌ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ担体約１５ｍＬをＸＫ１６／２００ｍｍクロマトカラムに充填し、平衡化バッファー（無水酢酸ナトリウム２．３２ｇ／Ｌ、リン酸二水素ナトリウム２．８１ｇ／Ｌ、カプリル酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム６６ｇ／Ｌ、ｐＨ６．５）１００ｍＬを用いて流速１００ｃｍ／ｈでクロマトカラムを平衡化させた。Ｃａｐｔｏ−Ａｄｈｅｒｅで精製したＯｓｒＨＳＡを含む溶出画分１００ｍＬに、硫酸アンモニウムを加えて導電率を７５ｍＳ／ｃｍに調整した後、カプリル酸ナトリウム０．１５ｇを加え、塩酸でｐＨ６．５に調整して１００ｃｍ／ｈの流速でカラムに注入した。通過画分を回収してＯｓｒＨＳＡ含有画分を得、そのエンドトキシン量が０．０８ＥＵ／ｍｇ未満であり、純度が９９．９９９９％を超えた。電気泳動の写真を、図８のＣに示す。
【０１０９】
実施例６：組換えヒト血清アルブミンの単離と精製
Ｃａｐｔｏ−ＭＭＣ担体約４００ｍＬをＸＫ５０／４００ｍｍクロマトカラムに充填し、０．５Ｎ  ＮａＯＨで３０分間洗い流して発熱因子を死滅させた後、平衡化バッファーＩ（無水酢酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １１ｇ／Ｌ、酢酸でｐＨ４．５に調製したもの）２０００ｍＬを用いて流速３００ｃｍ／ｈでクロマトカラムを平衡化し、ｐＨを４．５に安定させた。サンプル注入量が１００００ｍＬであり、サンプルの導電率が５．５〜８．０ｍＳ／ｃｍ、ｐＨが４．５であった。サンプルを注入した後、平衡化バッファーＩＩ（無水酢酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １５ｇ／Ｌ、１０〜１１％（ｖ／ｖ）イソプロパノール、酢酸でｐＨ４．５に調整し、注射用水で調製したもの）２０００ｍＬを用いて流速３００ｃｍ／ｈで再びクロマトカラムを平衡化し、洗浄バッファー（無水酢酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、１５〜１６％（ｖ／ｖ）イソプロパノール、ＮａＣｌで導電率を８２〜８９ｍＳ／ｃｍに調整し、酢酸でｐＨ４．８〜４．９に調整し、注射用水で調製したもの）３０００ｍＬを用いて流速３００ｃｍ／ｈで不純物を洗い流した。溶出バッファー（リン酸二水素ナトリウム２．６７ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム２．８２ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  ２３．４ｇ／Ｌ、ｐＨ６．３〜６．４、注射用水で調製したもの）を用いて標的ピークを溶離させ、ＯｓｒＨＳＡ含有画分を得た。電気泳動の写真を、図９（Ａ）に示す。
【０１１０】
陰イオン・疎水性複合担体の交換クロマトグラフィーによる中間精製：Ｃａｐｔｏ−Ａｄｈｅｒｅ担体約６８ｍＬをＸＫ２６／２００ｍｍクロマトカラムに充填し、平衡化バッファー（リン酸二水素ナトリウム１．０ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム５．０ｇ／Ｌ、ＮａＣ１  ５．０ｇ／Ｌ、ｐＨ７．５〜７．６）６００ｍＬを用いて流速３００ｃｍ／ｈでカラムを平衡化し、ｐＨを７．５〜７．６に安定させた後、流速３００ｃｍ／ｈでサンプル５００ｍＬを注入した。平衡化バッファー約２００ｍＬを用いて再びカラムを平衡化し、溶出バッファー（リン酸二水素ナトリウム１．５ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム５．０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  ２３．４ｇ／Ｌ、ｐＨ７．１〜７．２）を用いて流速３００ｃｍ／ｈでカラムを洗い流し、溶出ピークを回収してＯｓｒＨＳＡ含有画分を得た。回収液のエンドトキシン量が１００〜２００ＥＵ／ｍＬであった。電気泳動の写真を、図９のＢに示す。
【０１１１】
疏水性クロマトグラフィーによる最終精製：Ｐｈｅｎｙｌ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ担体約１５ｍＬをＸＫ１６／２００ｍｍクロマトカラムに充填し、平衡化バッファー（無水酢酸ナトリウム２．３２ｇ／Ｌ、リン酸二水素ナトリウム２．８１ｇ／Ｌ、カプリル酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム６６ｇ／Ｌ、ｐＨ６．５）１００ｍＬを用いて流速１００ｃｍ／ｈでクロマトカラムを平衡化させた。Ｃａｐｔｏ−Ａｄｈｅｒｅで精製したＯｓｒＨＳＡを含む溶出画分１００ｍＬに硫酸アンモニウムを加えて導電率を７５ｍＳ／ｃｍに調整し、カプリル酸ナトリウム０．１５ｇを加え、塩酸でｐＨ６．５に調整した後、１００ｃｍ／ｈの流速でカラムに注入した。通過画分を回収してＯｓｒＨＳＡ含有画分を得、そのエンドトキシンが０．０８ＥＵ／ｍｇ未満であり、純度が９９．９９９９％を超えた。電気泳動の写真を、図９のＣに示す。
本明細書に記載の発明は、以下の項目に記載の形態によっても実施され得る。
［項目１］
高純度の組換えヒト血清アルブミンを単離、精製するクロマトグラフ法であって、順に、
１）組換えヒト血清アルブミンの粗抽出物を陽イオン交換クロマトグラフィーにかけ、バッファーにアルコールを加えることでエンドトキシンを取り除き、一次産物Ｉを取得し、
上記バッファーは、洗浄バッファー、平衡化バッファーＩ、及び平衡化バッファーＩＩを含み、そのうち、洗浄バッファーが体積比で１０〜２０％のアルコールを含み、平衡化バッファーＩが体積比で０〜１０％のアルコールを含み、平衡化バッファーＩＩが体積比で５〜１５％のアルコールを含み、
上記陽イオン交換クロマトグラフィーの陽イオン・疎水性複合担体が、Ｃａｐｔｏ−ＭＭＣ又はＢｅｓｔａｒｏｓｅ  Ｄｉａｍｏｎｄ  ＭＭＣであり、
２）一次産物Ｉを陰イオン交換クロマトグラフィーにかけ、中間産物ＩＩを取得し、
上記陰イオン交換クロマトグラフィーの陰イオン・疎水性複合担体が、Ｃａｐｔｏ−Ａｄｈｅｒｅ又はＢｅｓｔａｒｏｓｅ  Ｄｉａｍｏｎｄ  ＭＭＡであり、
３）中間産物ＩＩを疎水性クロマトグラフィーにかけ、高純度の組換えヒト血清アルブミン標的産物を取得し、
上記疎水性クロマトグラフィーの担体が、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｂｅｓｔａｒｏｓｅ  ＨＰ又はＰｈｅｎｙｌ  Ｂｅｓｔａｒｏｓｅ  ＦＦである
ステップを含み、得られた組換えヒト血清アルブミンのＨＰＬＣ純度が少なくとも９９．９％である、クロマトグラフ法。
［項目２］
上記アルコールは、エタノール及びイソプロパノールから選ばれる、項目１に記載のクロマトグラフ法。
［項目３］
上記洗浄バッファーは１５％の無水エタノールを含み、上記平衡化バッファーＩＩは１０％の無水エタノールを含んでなる、項目１または２に記載のクロマトグラフ法。
［項目４］
上記洗浄バッファーは、無水酢酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、１５％の無水エタノールを含み、ＮａＣｌで導電率を８３ｍＳ／ｃｍに調整し、酢酸でｐＨをｐＨ４．６〜５.０に調整してなる、項目１から３のいずれか一項に記載のクロマトグラフ法。
［項目５］
上記平衡化バッファーＩは、無水酢酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １５ｇ／Ｌを含み、酢酸でｐＨ４．２〜４．８に調整してなる、項目１から４のいずれか一項に記載のクロマトグラフ法。
［項目６］
上記平衡化バッファーＩＩは、無水酢酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １５ｇ／Ｌ、１０％の無水エタノールを含み、酢酸でｐＨ４．２〜４．８に調整してなる、項目１から５のいずれか一項に記載のクロマトグラフ法。
［項目７］
上記バッファーは、洗浄バッファー、平衡化バッファーＩ及び平衡化バッファーＩＩを含み、そのうち、洗浄バッファーが体積比で１０〜１６％のイソプロパノールを含み、平衡化バッファーＩＩが体積比で４〜１１％のイソプロパノールを含んでなる、項目１から６のいずれか一項に記載のクロマトグラフ法。
［項目８］
上記洗浄バッファーが１５〜１６％のイソプロパノールを含み、上記平衡化バッファーＩＩが１０〜１１％のイソプロパノールを含んでなる、項目７に記載のクロマトグラフ法。
［項目９］
上記洗浄バッファーは、無水酢酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、１５〜１６％のイソプロパノールを含み、ＮａＣｌで導電率を８２〜８９ｍＳ／ｃｍに調整し、酢酸でｐＨをｐＨ４．８〜４．９に調整してなる、項目７に記載のクロマトグラフ法。
［項目１０］
上記平衡化バッファーＩは、無水酢酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １１ｇ／Ｌを含み、酢酸でｐＨ４．５に調整してなる、項目７に記載のクロマトグラフ法。
［項目１１］
上記平衡化バッファーＩＩは、無水酢酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １５ｇ／Ｌ、１０〜１１％のイソプロパノールを含み、酢酸でｐＨ４．５に調整してなる、項目７に記載のクロマトグラフ法。
【図１】
2018087207.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年2月23日(2018.2.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
高純度の組換えヒト血清アルブミンを単離、精製するクロマトグラフ法であって、順に、
１）組換えヒト血清アルブミンの粗抽出物を陽イオン交換クロマトグラフィーにかけ、バッファーにアルコールを加えることでエンドトキシンを取り除き、一次産物Ｉを取得し、
前記バッファーは、平衡化バッファーＩ、平衡化バッファーＩＩ、洗浄バッファーを含み、そのうち、
平衡化バッファーＩが体積比で０から１０％のアルコールを含み、
平衡化バッファーＩＩが体積比で５から１５％のアルコールを含み、
洗浄バッファーが体積比で１０から２０％のアルコールを含み、
前記洗浄バッファーにおけるアルコールの濃度は、前記平衡化バッファーＩＩにおけるアルコールの濃度より大きく、
２）一次産物Ｉを陰イオン交換クロマトグラフィーにかけ、中間産物ＩＩを取得し、
３）中間産物ＩＩを疎水性クロマトグラフィーにかけ、高純度の組換えヒト血清アルブミン標的産物を取得する、
ステップを含む、
クロマトグラフ法。
【請求項２】
前記洗浄バッファーは１５％のエタノールを含む、
請求項１に記載のクロマトグラフ法。
【請求項３】
前記洗浄バッファーは、
無水酢酸ナトリウム２ｇ／Ｌを含み、
ＮａＣｌで導電率を８３ｍＳ／ｃｍに調整し、
酢酸でｐＨをｐＨ４．６から５.０に調整してなる、
請求項１または２に記載のクロマトグラフ法。
【請求項４】
前記平衡化バッファーＩは、
無水酢酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １５ｇ／Ｌを含み、
酢酸でｐＨ４．２から４．８に調整してなる、
請求項１から３のいずれか一項に記載のクロマトグラフ法。
【請求項５】
前記平衡化バッファーＩＩは、
無水酢酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １５ｇ／Ｌ、１０％のエタノールを含み、
酢酸でｐＨ４．２から４．８に調整してなる、
請求項１から４のいずれか一項に記載のクロマトグラフ法。
【請求項６】
前記平衡化バッファーＩは、０から１０％のイソプロパノールを含み、
前記平衡化バッファーＩＩは、１０から１１％のイソプロパノールを含む、
前記洗浄バッファーは、１５から１６％のイソプロパノールを含み、
請求項１に記載のクロマトグラフ法。
【請求項７】
前記洗浄バッファーは、
無水酢酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、１５から１６％のイソプロパノールを含み、
ＮａＣｌで導電率を８２から８９ｍＳ／ｃｍに調整し、
酢酸でｐＨをｐＨ４．８から４．９に調整してなる、
請求項１または６に記載のクロマトグラフ法。
【請求項８】
前記平衡化バッファーＩは、
無水酢酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １１ｇ／Ｌを含み、
酢酸でｐＨ４．５に調整してなる、
請求項１、６、７のいずれか１項に記載のクロマトグラフ法。
【請求項９】
前記平衡化バッファーＩＩは、
無水酢酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １５ｇ／Ｌ、１０から１１％のイソプロパノールを含み、
酢酸でｐＨ４．５に調整してなる、
請求項１、６、７、８のいずれか１項に記載のクロマトグラフ法。
【請求項１０】
前記陽イオン交換クロマトグラフィーの陽イオン・疎水性複合担体が、Ｃａｐｔｏ（登録商標）−ＭＭＣである、
請求項１から９のいずれか１項に記載のクロマトグラフ法。
【請求項１１】
前記陰イオン交換クロマトグラフィーの陰イオン・疎水性複合担体が、Ｃａｐｔｏ（登録商標）−Ａｄｈｅｒｅである、
請求項１から１０のいずれか１項に記載のクロマトグラフ法。
【請求項１２】
前記疎水性クロマトグラフィーの担体が、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）  ＨＰ、またはＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）  ＦＦである、
請求項１から１１のいずれか１項に記載のクロマトグラフ法。