(57)【要約】      （修正有）【課題】高力価のパッケージ化レンチウイルスベクターを産生するレンチウイルスパッケージ化コンストラクトの提供。【解決手段】ＨＩＶ−1の非サブタイプＢのｇａｇ−ｐｏｌ配列、特にサブタイプＤのｇａｇ−ｐｏｌ配列を含んでなるレンチウイルスパッケージ化ベクター。これらベクターを含む宿主細胞、ＨＩＶ−１非サブタイプＢのＧａｇおよび／またはＰｏｌタンパク質を含むレンチウイルスベクター粒子。さらに、これらベクターの製造および使用のための方法。【選択図】図１
2018183165.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
組換えワクチンは、組換えＤＮＡ技術の進歩とともに開発されており、ウイルスゲノムの修飾により修飾ウイルスの産生が可能となっている。このようにして、宿主において特異的免疫応答を生じさせるために、感染時に標的細胞内で発現される免疫原性タンパク質をコードするように、非病原性ウイルス内に遺伝子配列を導入することが可能となっている。
【０００２】
このようなワクチンはワクチン技術の大きな進歩を成す(Kutzler et al., Nat Rev Genet, 9(10) : 776-788, 2008)。特に、これらは、生（弱毒化）ウイルスを回避し、不活性化ワクチンの製造に伴うリスクを排除する点で従来のワクチンに勝る利点を有する。
【０００３】
修飾されたレトロウイルス（レトロウイルスベクター）を用いた遺伝子送達はMannら(Cell, 33(1):153-9, 1983)によって１９８０年代初期に紹介された。最も一般的に使用される発癌性レトロウイルスベクターはモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）に基づくものである。それらは、ポリタンパク質であるＧａｇ、ＰｏｌおよびＥｎｖが製造され、ウイルス複製のためにトランスに必要とされる単純なゲノムを持っている(Breckpot et al., 2007, Gene Ther, 14(11):847-62；He et al. 2007, Expert Rev vaccines, 6(6):913-24)。一般的にシスで必要とされる配列は、長い末端反復配列（ＬＴＲ）とその周辺、つまり、統合に必要な逆方向リピート（ＩＲまたはａｔｔ部位）、パッケージング配列Ψ、輸送ＲＮＡ結合部位（プライマー結合部位、  ＰＢＳ）、および逆転写に関与するいくつかのその他の配列（プラス鎖開始のために必要な、ポリプリン帯であるＰＰＴ、およびＬＴＲ内リピートＲ）である。複製欠損レトロウイルスベクターを生成するためには、  一般的にはｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を完全に欠失させ、発現カセットで置換する。
【０００４】
レトロウイルスベクターは他のウイルスシステムに比べていくつかの利点を示すため、レンチウイルスゲノムに由来するレトロウイルスベクター（すなわちレンチウイルスベクター）が、遺伝子治療および免疫療法の両目的のための有望な手段として浮上している。特に、レンチウイルスベクター自体は毒性がなく、他のレトロウイルスとは異なり、レンチウイルスは非分裂細胞、特に樹状細胞に形質導入することが可能で(He et al. 2007, Expert Rev vaccines, 6(6): 913-24)、それにより内因性経路を介した抗原提示が可能となる。
【０００５】
レンチウイルスはレトロウイルス科のスローウイルスの属を表し、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ウマ伝染性脳炎ウイルス（ＥＩＡＶ）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）およびネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）が含まれる。レンチウイルスはその宿主に無期限に存続し、生涯にわたる感染の経過中に変動する割合で連続的に複製することができる。その宿主におけるウイルスの持続的な複製は宿主防御を回避する能力に依存する。
【０００６】
組換えレンチウイルスベクターの設計は、レンチウイルスのシス−およびトランス−作用型配列の分離に基づく。非分裂細胞での効率的な組み込みおよび複製には、レンチウイルスゲノムでの２つのシス作用型配列、つまりセントラルポリプリン帯（ｃＰＰＴ）とセントラル末端配列（ＣＴＳ）の存在を必要とする。これらは、セントラルＤＮＡ「フラップ」と称される三重鎖ＤＮＡ構造の形成をもたらすものであり、これにより樹状細胞（ＤＣ）を含む非分裂細胞の核への遺伝子移送の効率が最大限となる(Zennou et al., 2000, Cell, 101(2) 173-85; Arhel et al., 2007, EMBO J, 26(12):3025-37)。
【０００７】
ＨＩＶ−１レンチウイルスベクターは、パッケージングコンストラクトからトランスにベクターをパッケージするためにサブタイプＢ  Ｇａｇ、Ｐｏｌ、ＴａｔおよびＲｅｖタンパク質を提供することに基づいて生成されている(Naldini et al, PNAS 15: 11382-8 (1996)；Zufferey et al,  Nature Biotechnology 15:871-875 (1997)；Dull et al, Journal of Virology (1997))。これらの研究はサブタイプＢ  ＧａｇおよびＰｏｌタンパク質を用いて行われた。ＨＩＶ−１パッケージングコンストラクトにおける非サブタイプＢ  ｇａｇおよびｐｏｌ配列の効果は評価されなかった。
【０００８】
サブタイプＢ以外に多くの異なるＨＩＶ−１のサブタイプがある。Ｃ、ＥおよびＡなどのＨＩＶ−１のいくつかのサブタイプは、米国および欧州での主要なサブタイプであるＨＩＶ−１サブタイプＢよりも効率良く感染するようである。Essex et al., Adv Virus Res. 1999; 53:71-88。先進西欧諸国で発見されたＨＩＶ−１の主要なサブタイプであるクレードＢは、ＨＩＶ感染者の大部分が存在するアフリカやアジアに存在するサブタイプおよび組換え体とはかなり異なっている。Spira et al., J. Antimicrobial Chemotherapy (2003) 51, 229-240。このように、北米や欧州で遭遇するサブタイプＢレトロウイルスと世界規模で人類を悩ますウイルスサブタイプとの間には重大な相違が存在しうる。同文献。サブタイプの多様性はＨＩＶ感染の様式に影響を与えうる。同性愛および静脈内薬物乱用は、欧州および米国でのクレードＢ株について観察された感染の主な様式である。同文献。これとは対照的に、クレードＡ、Ｃ、ＤおよびＥは異性間感染が主流であるアフリカやアジアで優位を占める。同文献。さらに、いくつかの研究では、ＡＩＤＳの進行は感染サブタイプに応じて異なることを示唆している。同文献。したがって、ＨＩＶ−１サブタイプＢは、他のＨＩＶ−１サブタイプよりもかなり異なっているようである。
【０００９】
ＨＩＶ系統分類は通常、同じ単離体の複数のサブゲノム領域に由来するヌクレオチド配列（ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ）、または完全長ゲノム配列分析に基づく。完全長に近いＨＩＶ−１の配列の系統分析により、ＨＩＶ−１サブタイプＢが遺伝学的にＨＩＶサブタイプＤに最も近かったことが明らかとなった（図１）。ＨＩＶ−１のＧａｇおよびＰｏｌタンパク質配列の系統分析によっても、ＨＩＶ−１サブタイプＢは遺伝学的にＨＩＶサブタイプＤに最も近いことを示した（図２）。
【００１０】
それにもかかわらず、ＨｌＶ−１−ＮＤＫサブタイプＤウイルスは、ＨＩＶ−１  ＢＲＵプロトタイプサブタイプＢウイルスよりも有意にＣＤ４＋リンパ球に対して細胞変性を示す。これは、サブタイプＤウイルスの亢進した融合性および感染力に起因しうる。De Mareuil et al., J. Virol. 66: 6797 (1992)。組換えウイルスの表現型分析は、ＨＩＶ−１−ＮＤＫマトリクス（ＭＡ）タンパク質のＮ末端部分の７５アミノ酸は、ＨＩＶ−１−ＮＤＫエンベロープ糖タンパク質と共に、ＣＤ４＋リンパ球におけるＨＩＶ−１−ＮＤＫの融合性の亢進並びにいくつかのＣＤ４−細胞株におけるＨＩＶ−１−ＮＤＫの感染性の亢進を担っていることを示した。同文献。
【００１１】
注入量を減らし、投薬を増やし、ワクチン接種の費用を低減し、そして一回に治療されうる患者の数を増やすために、高力価のパッケージ化レンチウイルスベクターを産生するレンチウイルスパッケージ化コンストラクトが当分野で必要とされている。本願発明はこの需要を満たすものである。
【発明の概要】
【００１２】
レンチウイルスパッケージ化プラスミドのＨＩＶ−１のサブタイプＢのｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子（コンストラクトｐ８．７４）を、サブタイプＤのＨＩＶ−１のｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子に置き換えて、コンストラクトｐＴｈＶ−ＧＰ−Ｎを製造した。このコンストラクトをレンチウイルスベクター製造のために用いた。コンストラクトｐ８．７４に比べてｐＴｈＶ−ＧＰ−Ｎプラスミドを用いるとおよそ２倍高い力価が得られた。よって、サブタイプＤウイルスのＧａｇ−Ｐｏｌは、サブタイプＢウイルスのＧａｇ−Ｐｏｌと比較して、レンチウイルスベクター粒子の力価を増加させる。
【００１３】
本発明は、特にＨＩＶ−１  ＮＤＫ由来のサブタイプＤのｇａｇ−ｐｏｌ配列を含んでなるレンチウイルスパッケージ化ベクターを包含する。好適な実施形態では、レンチウイルスパッケージ化ベクターは、配列番号：１のヌクレオチド配列を含む。好適な実施形態では、レンチウイルスパッケージ化ベクターは配列番号：２のアミノ酸配列をコードする。
【００１４】
配列番号：１のヌクレオチド配列は以下の通りである。
atgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggaaaattagatacatgggaaagaattcggttacggccaggaggaaagaaaaaatatgcactaaaacatttgatatgggcaagcagggagctagaacgatttacacttaatcctggccttttagagacatcagaaggctgtaaacaaataataggacagctacaaccatctattcaaacaggatcagaagaaattagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtacatgaaaggatagaggtaaaagacaccaaagaagctgtagaaaagatggaggaagaacaaaacaaaagtaagaaaaagacacagcaagcagcagctgatagcagccaggtcagccaaaattaccctatagtgcagaacctacaggggcaaatggtacatcaggccatatcacctagaactttgaacgcatgggtaaaagtaatagaagaaaaggccttcagcccggaagtaatacccatgttttcagcattatcagaaggagccaccccacaagatttaaacaccatgctaaacacagtggggggacatcaagcagctatgcaaatgctaaaagagaccatcaatgacgaagctgcagaatgggacagattacatccagtgcatgcagggcctgttgcaccaggccaaatgagagaaccaaggggaagtgatatagcaggaactactagtacccttcaggaacaaatagcatggatgacaagcaacccacctatcccagtaggagaaatctataaaagatggataatcctgggattaaataaaatagtaagaatgtatagccctgtcagcattttggacataagacagggaccaaaggaaccttttagagactatgtagaccggttctataaaactctaagagccgagcaagcttcacaggatgtaaaaaactggatgacagaaaccttgttggtccaaaatgcaaacccagattgtaaaactatcttaaaagcattgggaccacaggctacactagaagaaatgatgacagcatgccagggagtgggggggcccggccataaagcaagagttttggctgaggcaatgagccaagtaacaggttcagctactgcagtaatgatgcagagaggcaattttaagggcccaagaaaaagtattaagtgtttcaactgtggcaaggaagggcacacagcaaaaaattgcagggcccctagaaaaaagggctgttggaaatgcggaagggaaggacaccaaatgaaagattgcactgaaagacaggctaattttttagggaagatttggccttcccacaagggaaggccggggaattttcttcagagcagaccagagccaacagccccaccagcagagagcttcgggtttggggaggagataaccccctctcagaaacaggagcagaaagacaaggaactgtatcctttagcttccctcaaatcactctttggcaacgacccctcgtcacaataaagatagggggacagctaaaggaagctctattagatacaggagcagatgatacagtattagaagaaataaatttgccaggaaaatggaagccaaaaatgatagggggaattggaggttttatcaaagtaagacagtatgatcaaatactcatagaaatctgtggatataaagctatgggtacagtattagtaggacctacacctgtcaacataattggaagaaatttgttgacccagattggctgcactttaaattttccaattagtcctattgaaactgtaccagtaaaattaaagccaggaatggatggcccaaaagttaaacaatggccattgacgaagaaaaaataaaagcattaacagaaatttgtacagaaatggaaaaggaaggaaaaatttcaagaattgggcctgaaaatccatataatactccaatatttgccataaagaaaaaagacagtaccaagtggagaaaattagtagatttcagagaacttaataagagaactcaagatttctgggaggttcaattaggaataccgcatcctgcagggctgaaaaagaaaaaatcagtaacagtactggatgtgggtgatgcatatttctcagttcccttagatgaagattttaggaaatataccgcatttaccatacctagtataaacaatgagacaccagggattagatatcagtacaatgtgctcccacagggatggaaaggatcaccggcaatattccaaagtagcatgacaaaaatcttagagccctttagaaaacaaaatccagaaatagttatctatcaatacatggatgatttgtatgtaggatctgacttagaaatagggcagcatagaacaaaaatagaggaattaagagaacatctattgaggtggggatttaccacaccagataaaaaacatcagaaagaacctccatttctttggatgggttatgaactccatcctgataaatggacagtacagcctataaacctgccagaaaaagaaagctggactgtcaatgatatacagaagttagtggggaaattaaactgggcaagccagatttatgcaggaattaaagtaaagcaattatgtaaactccttaggggaaccaaagcactaacagaagtagtaccactaacagaagaagcagaattagaactggcagaaaacagggaaattctaaaagaaccagtacatggagtgtattatgacccatcaaaagacttaatagcagaactacagaaacaaggggacggccaatggacataccaaatttatcaagaaccatttaaaaatctaaaaacaggaaagtatgcaagaacgaggggtgcccacactaatgatgtaaaacaattaacagaggcagtgcaaaaaatagccacagaaagcatagtgatatggggaaagactcctaaatttaaactacccatacaaaaggaaacatgggaaacatggtggatagagtattggcaagccacctggattcctgagtgggaatttgtcaatacccctcctttagtaaaattatggtaccagttagagaaggaacccataataggagcagaaactttctatgtagatggggcagctaatagagagactaaattaggaaaagcaggatatgttactgacagaggaagacagaaagttgtccctttcactgacacgacaaatcagaagactgagttacaagcaattaatctagctttacaggattcgggattagaagtaaacatagtaacagattcacaatatgcactaggaatcattcaagcacaaccagataagagtgaatcagagttagtcagtcaaataatagagcagctaataaaaaaggaaaaggtttacctggcatgggtaccagcacacaaaggaattggaggaaatgaacaagtagataaattagtcagtcagggaatcaggaaagtactatttttggatggaatagataaggctcaggaagaacatgagaaatatcacaacaattggagagcaatggctagtgattttaacctaccacctgtggtagcgaaagaaatagtagctagctgtgataaatgtcagctaaaaggagaagccatgcatggacaagtagactgtagtccaggaatatggcaattagattgtacacatctggaaggaaaagttatcctggtagcagttcatgtagccagtggctatatagaagcagaagttattccagcagaaacggggcaagaaacagcatactttctcttaaaattagcaggaagatggccagtaaaagtagtacatacagataatggcagcaatttcaccagtgctacagttaaggccgcctgttggtgggcagggatcaaacaggaatttggaattccctacaatccccaaagtcaaggagtagtagaatctatgaataaagaattaaagaaaattataggacaggtaagagatcaagctgaacatcttaagacagcagtacaaatggcagtatttatccacaattttaaaagaaaaggggggattgggggatacagtgcaggggaaagaataatagacataatagcaacagacatacaaactagagaattacaaaaacaaatcataaaaattcaaaattttcgggtttattacagggacagcagagatccaatttggaaaggaccagcaaagcttctctggaaaggtgaaggggcagtagtaatacaagacaatagtgacataaaggtagtaccaagaagaaaagtaaagatcattagggattatggaaaacagatggcaggtgatgattgtgtggcaagtagacaggatgaggattaac  （配列番号：１）
【００１５】
配列番号：２のアミノ酸配列は以下の通りである。
MGARASVLSGGKLDAWERIRLRPGGKKKYALKHLIWASRELERIALNPGLLETSEGCKQIIGQLQPSIQTGSEELRSLYNTIATLYCVHERIEVKDTKEAVEKMEEEQNKSKKKTQQAAADSSQVSQNYPIVQNLQGQMVHQAISPRTLNAWVKVIEEKAFSPEVIPMFSALSEGATPQDLNTMLNTVGGHQAAMQMLKETINDEAAEWDRLHPVHAGPVAPGQMREPRGSDIAGTTSTLQEQIAWMTSNPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPVSILDIRQGPKEPFRDYVDRFYKTLRAEQASQDVKNWMTETLLVQNANPDCKTILKALGPQATLEEMMTACQGVGGPGHKARVLAEAMSQVTGSVTAVMMQRGNFKGPRKSIKCFNCGKEGHTAKNCRAPRKKGCWKCGREGHQMKDCSERQANFLGKIWPSHKGRPGNFLQSRPEPTAPPAESFGFGEEITPSQKQEQKDKELYPLASLKSLFGNDPSSQFFREDLAFPQGKAGEFSSEQTRANSPTSRELRVWGGDNPLSETGAEGQGTVSFSFPQITLWQRPLVTIKIGGQLKEALLDTGADDTVLEEMNLPGKWKPKMIGGIGGFIKVRQYDQILIEICGYKAMGTVLVGPTPVNIIGRNLLTQIGCTLNFPISPIETVPVKLKPGMDGPKVKQWPLTEEKIKALTEICTEMEKEGKISRIGPENPYNTPIFAIKKKDSTKWRKLVDFRELNKRTQDFWEVQLGIPHPAGLKKKKSVTVLDVGDAYFSVPLDEDFRKYTAFTIPSINNETPGIRYQYNVLPQGWKGSPAIFQSSMTKILEPFRKQNPEIVIYQYMDDLYVGSDLEIGQHRTKIEELREHLLRWGFTTPDKKHQKEPPFLWMGYELHPDKWTVQPIKLPEKESWTVNDIQKLVGKLNWASQIYAGIKVKQLCKLLRGTKALTEVVPLTEEAELELAENREILKEPVHGVYYDPSKDLIAELQKQGDGQWTYQIYQEPFKNLKTGKYARTRGAHTNDVKQLTEAVQKIATESIVIWGKTPKFKLPIQKETWETWWIEYWQATWIPEWEFVNTPPLVKLWYQLEKEPIIGAETFYVDGAANRETKLGKAGYVTDRGRQKVVPFTDTTNQKTELQAINLALQDSGLEVNIVTDSQYALGIIQAQPDKSESELVSQIIEQLIKKEKVYLAWVPAHKGIGGNEQVDKLVSQGIRKVLFLDGIDKAQEEHEKYHNNWRAMASDFNLPPVVAKEIVASCDKCQLKGEAMHGQVDCSPGIWQLDCTHLEGKVILVAVHVASGYIEAEVIPAETGQETAYFLLKLAGRWPVKVVHTDNGSNFTSATVKAACWWAGIKQEFGIPYNPQSQGVVESMNKELKKIIGQVRDQAEHLKTAVQMAVFIHNFKRKGGIGGYSAGERIIDIIATDIQTRELQKQIIKIQNFRVYYRDSRDPIWKGPAKLLWKGEGAVVIQDNSDIKVVPRRKVKIIRDYGKQMAGDDCVASRQDED （配列番号：２）
【００１６】
本発明は、特にＨＩＶ−１  ＮＤＫ由来のサブタイプＤのＭＡ配列を含んでなるレンチウイルスパッケージ化ベクターを包含する。好適な実施形態では、レンチウイルスパッケージ化ベクターは配列番号：３のアミノ酸配列を含むＭＡタンパク質をコードする。
【００１７】
配列番号：３のアミノ酸配列は以下の通りである。
MGARASVLSGGKLDTWERIRLRPGGKKKYALKHLIWASRELERFTLNPGLLETSEGCKQIIGQLQPSIQTGSEEIRSLYNTVATLYCVHERIEVKDTKEAVEKMEEEQNKSKKKTQQAAADSSQVSQNY  （配列番号：３）
【００１８】
好ましくは、ＨＩＶ  Ｇａｇ  ＭＡタンパク質をコードするレンチウイルスパッケージ化ベクターは、パッケージ化レンチウイルスベクターの力価において、ＨＩＶ−１  ＢＲＵのＨＩＶ  Ｇａｇ  ＭＡタンパク質、例えばｐ８．７４をコードするレンチウイルスパッケージ化ベクターと比較して、少なくとも１．５倍の増加、または少なくとも２倍の増加を生じる。好ましくは、レンチウイルスパッケージ化ベクターは複製が欠損しており、Ψ部位を欠いている。
【００１９】
好適な実施形態では、レンチウイルスパッケージ化ベクターは、１２位のアミノ酸がグルタミン酸でなく、１５位のアミノ酸がアルギニンでないＨＩＶ  Ｇａｇ  ＭＡタンパク質をコードする。好ましくは、レンチウイルスパッケージ化ベクターは、４６位のバリンと６１位のロイシンの両方を持っていない。
【００２０】
好適な実施形態では、ＭＡタンパク質の１２位のアミノ酸はリジンである。好適な実施形態では、１５位のアミノ酸はスレオニンである。好適な実施形態では、１５位のアミノ酸はアラニンである。好適な実施形態では、４６位のアミノ酸はロイシンである。好適な実施形態では、６１位のアミノ酸はイソロイシンである。好適な実施形態では、６１位のアミノ酸はメチオニンである。
【００２１】
ある実施形態では、ベクターは機能的なＥｎｖタンパク質をコードしていない。
【００２２】
本発明は、上記レンチウイルスパッケージ化ベクターの製造方法およびレンチウイルスパッケージ化ベクターの使用方法を包含する。
【００２３】
図面を参照することにより本発明がより具体的に理解される。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】ＨＩＶウイルスの系統樹を示す。
【図２Ａ】ＨＩＶ  ＧＡＧ（Ａ）のタンパク質の系統樹を示す。ＧＡＧタンパク質配列はhttp://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/NEWALIGN/align.htmlから入手した。各々既知のＨＩＶクレードから、一患者のウイルス配列（クレードＢについて）または二の患者のウイルス配列を無作為に選択し、ＧＡＧタンパク質配列を比較対象クレードＢタンパク質(B.FR.83.HXB2_LAI_IIIB_BRU.KO3455)と比較した。ベクターＮＴＩアドバンス１１ (Invitrogen)を用いてアラインメントを行った。
【図２Ｂ】ＨＩＶ  ＰＯＬ（Ｂ）のタンパク質の系統樹を示す。ＰＯＬタンパク質配列はhttp://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/NEWALIGN/align.htmlから入手した。各々既知のＨＩＶクレードから、一患者のウイルス配列（クレードＢについて）または二の患者のウイルス配列を無作為に選択し、ＰＯＬタンパク質配列を比較対象クレードＢタンパク質(B.FR.83.HXB2_LAI_IIIB_BRU.KO3455)と比較した。ベクターＮＴＩアドバンス１１  (Invitrogen)を用いてアラインメントを行った。
【図３】ベクター製造に用いたｐ８．７４とｐＴｈＶ−ＧＰ−Ｎのプラスミドにより得た力価を示す。プロウイルスプラスミド（ｐＦＬＡＰ−ＣＭＶ−ＧＦＰ）、シュードタイピングプラスミド（ｐＴＨＶ−ＶＳＶ．Ｇ）および、共通して用いたパッケージ化プラスミド（ＢＲＵ株由来のｐ８．７４）またはＮＤＫ由来のパッケージ化プラスミド（ｐＴＨＶ−ＧＰ−Ｎ）を用いてレンチウイルス粒子を製造した。各々のパッケージ化プラスミドにより１８の異なる形質移入が生じ、これら粒子の力価はＦＡＣＳ分析により測定した。β２ミクログロブリンプロモータ作動性ＨＩＶ抗原発現を含むプロウイルスプラスミドを用いるベクターによっても同様な結果が得られた。
【図４】野生型ＢＲＵおよびＮＤＫウイルスの製造と各々の初期効率の評価を示す。２９３Ｔ細胞は、野生型ＢＲＵ（ｐＢＲＵ）またはＮＤＫ（ｐＮＤＫ−Ｎ）ウイルスをコードするプラスミドを用いて形質移入した。４８時間後にウイルス上清を採集し、希釈してＰ４−ＣＣＲ５細胞（ＨＩＶ  ＬＴＲによってその発現が作動される安定ルシフェラーゼレポーター遺伝子を包含する）に感染させ、（ウイルスが持つ）ＴＡＴタンパク質の存在下でルシフェラーゼを産生させた。ＢＲＵまたはＮＤＫウイルスの段階希釈物をＰ４−ＣＣＲ５細胞感染に用い、ルシフェラーゼの発現（Ａ）またはルシフェラーゼ／Ｐ２４比（Ｂ）を測定した。
【図５】異なる比率のＢＲＵ（ｐ８．７４）およびＮＤＫ（ｐＴｈＶ  ＧＰ−Ｎ）由来のパッケージ化プラスミドを用いたベクター製造を示す。各々の条件（０μｇ  ＮＤＫ＋１０μｇ  ＢＲＵから１０μｇ  ＮＤＫ＋０μｇ  ＢＲＵ）について、力価（灰色のバー）とＰ２４レベル（黒色四角）を測定した。
【図６】ＢＲＵ（８．７４）またはＮＤＫ（ｐＴｈＶ  ＧＰ−Ｎ）由来のパッケージ化プラスミドを用いて製造したベクター上清物のウェスタンブロットを示す。Ｐ２４タンパク質と前駆体の検出は、ＮＩＨ抗−Ｐ２４  ＭＡＢ（１８３−Ｈ１２−５Ｃ）を用いて行った。
【図７】クレードＢウイルスのＮ末端ＭＡ配列（ＢＲＵ；配列番号：３）とクレードＤウイルス（ＮＤＫ；配列番号：４）との配列アラインメントを示す。
【図８】クレードＢウイルスのＮ末端ＭＡ配列の配列アラインメントを示す。
【図９】クレードＤウイルスのＮ末端ＭＡ配列の配列アラインメントを示す。
【図１０】クレードＢウイルス（ＢＲＵ）のＮ末端ＭＡ配列と他のクレードのウイルスとの配列アラインメントを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
発明の詳細な説明
サブタイプＢ  ＨＩＶ−１ウイルスは、サブタイプＢウイルスが感染する効率が低く、異なる様式で感染する点で他のＨＩＶ−１サブタイプとは異なる。それにもかかわらず、サブタイプＢウイルスは、ＨＩＶ−１レンチウイルスベクターおよびレンチウイルスパッケージ化ベクターの製造に広く使用されてきた。非サブタイプＢウイルスのＧａｇおよびＰｏｌタンパク質がレンチウイルスパッケージ化ベクターの作製に使用することができるか否かを決定するために、レンチウイルスパッケージ化プラスミドのＨＩＶ−１サブタイプＢのｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子（コンストラクトｐ８．７４）を、サブタイプＤのＨＩＶ−１のｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子に置き換え、コンストラクトｐＴｈＶ−ＧＰ−Ｎを生成した。レンチウイルスベクター製造にこのコンストラクトを用いた。コンストラクトｐ８．７４と比較して、ｐＴｈＶ−ＧＰ−Ｎプラスミドを用いた場合におよそ２倍高い力価が得られた（図３）。よって、パッケージ化ベクターにおけるサブタイプＤ  ＨＩＶ−１  Ｇａｇ−Ｐｏｌは、サブタイプＢ  ＨＩＶ−１  Ｇａｇ−Ｐｏｌによって観察された力価よりもレンチウイルスベクターの力価を増加させた。
【００２６】
レンチウイルスベクターの力価の増加は、レンチウイルスベクターの投与における不純物の低減に有益である。これにより注入量の低減や投薬の増加が容易となる。さらに、投薬に必要な材料の量や労力が減少し、１回のレンチウイルスベクターによって処置可能な患者数が増加することにより、ワクチン接種の費用が減少する。
【００２７】
ＨＩＶ−１  ＢＲＵおよびＨＩＶ−１  ＮＤＫウイルスの段階希釈物により、ＨＩＶ−１  ＮＤＫウイルスがウイルスのライフサイクルの初期段階でさらに効率が良いことが示された（図４）。異なる量のサブタイプＢおよびサブタイプＤのパッケージ化ベクターを混合することによって、サブタイプＤパッケージ化ベクターは、レンチウイルスベクターの調製物におけるｐ２４のレベルおよび力価の両方を増加したことが示された（図５）。サブタイプＤパッケージ化ベクターを用いたレンチウイルスベクター調製物におけるｐ２４は完全にプロセシングされていないことも観察され、これは高次のｐ２４前駆体を示すものである（図６）。よって、サブタイプＤパッケージ化ベクターにおけるＧａｇタンパク質は、サブタイプＢパッケージ化ベクターとの相違を示す。
【００２８】
ＨＩＶ−１  Ｅｎｖと共に、ＨＩＶ−１−ＮＤＫマトリクス（ＭＡ）タンパク質のＮ末端部分の７５アミノ酸は、ＣＤ４＋リンパ球におけるＨＩＶ−１−ＮＤＫの融合性の亢進並びにいくつかのＣＤ４−細胞株におけるＨＩＶ−１−ＮＤＫの感染性の亢進を担っていることは知られている。De Mareuil et al., J. Virol. 66: 6797 (1992)。サブタイプＢおよびサブタイプＤのパッケージ化ベクターによるレンチウイルスベクターの作製に用いられるＥｎｖタンパク質は同じ（すなわち、ＶＳＶ）であるので、ＨＩＶ−１  ＭＡの唯一の違いは、サブタイプＢとサブタイプＤのパッケージ化ベクターに存在する。
【００２９】
ＨＩＶ−１ウイルスの種々のクレードに由来するＭのＮ−末端７５アミノ酸内のアミノ酸の保存および相違を調べた。ＨＩＶ−１  ＮＤＫは、ＨＩＶ−１  ＢＲＵとは１０のアミノ酸が相違していた（図７）。しかしながら、ＨＩＶ−１  ＮＤＫを２０の異なるＨＩＶ−１サブタイプＢウイルスと比較したときには、これらの相違のうち８個のみが観察された（図８）。他のサブタイプＤウイルスをこの比較に含めた場合、これら相違のうち４つのみが残った（図９）。これらの相違は、サブタイプＤウイルスにおけるアミノ酸１２位でのグルタミン酸の欠損、アミノ酸１５位でのアルギニンの欠損、アミノ酸４６位でのバリンの欠損、およびアミノ酸６１位でのロイシンの欠損である。
【００３０】
他のサブタイプウイルスを比較に含めた場合、他のサブタイプはサブタイプＤと一致し、これら相違のほとんどすべてが保存されているようであった（図１０）。非サブタイプＢウイルスのほとんどすべては１２位にリジンを表した。非サブタイプＢウイルスの多くは１５位にアラニンを表した。ほとんどすべての非サブタイプＢウイルスは４６位にロイシンを表した。ほとんどすべての非サブタイプＢウイルスは６１位にメチオニンまたはイソロイシンを表した。非サブタイプＢウイルスは、１５位のアルギニン、４６位のロイシンおよび６１位のメチオニンまたはイソロイシン以外のアミノ酸、１２位のリジンの一致を表した。
【００３１】
本発明は、非サブタイプＢのＧａｇおよび／またはＰｏｌタンパク質をコードするパッケージ化ベクター、およびこれらベクターを含む宿主細胞を包含する。さらに、本発明は、非サブタイプＢのＧａｇおよび／またはＰｏｌタンパク質をコードするパッケージ化ベクターの製造方法を包含する。また、本発明は、これらパッケージ化ベクターを用いてレンチウイルスベクターを作製する方法、および非サブタイプＢのＧａｇおよび／またはＰｏｌタンパク質を含むレンチウイルスベクターを包含する。
【００３２】
パッケージ化ベクター
本発明は、非サブタイプＢのＧａｇおよび／またはＰｏｌタンパク質をコードするパッケージ化ベクターを包含する。レンチウイルス「パッケージ化ベクター」は、ここでは、機能的なＨＩＶ−１  Ｅｎｖをコードせず、Ψ部位を欠いているが、パッケージ化のために好適なレンチウイルスのシス作用型シグナルを含むベクターと同時形質移入した場合にウイルス粒子内へ取り込まれうるレンチウイルスＧａｇおよび／またはＰｏｌタンパク質を発現することができる核酸配列として定義される。本発明のレンチウイルスパッケージ化ベクターは、自身の配列をパッケージ化し、逆転写することによってそれ自身複製することができない。
【００３３】
パッケージ化ベクターはＲＮＡまたはＤＮＡベクターであってよい。非サブタイプＢのＧａｇおよびＰｏｌタンパク質は、サブタイプＡ、サブタイプＣ、サブタイプＤ、サブタイプＥ、サブタイプＦ１、サブタイプＦ２、サブタイプＧ、サブタイプＨ、およびサブタイプＪのタンパク質、およびこれらの組換え体から選択されうる。好適なパッケージ化ベクターは配列番号：１を含むかまたは配列番号：２をコードする。
【００３４】
本発明は、非サブタイプＢのＧａｇタンパク質をコードするパッケージ化ベクター、およびこれらベクターを含む宿主細胞を包含する。非サブタイプＢのＧａｇタンパク質は、サブタイプＡ、サブタイプＣ、サブタイプＤ、サブタイプＥ、サブタイプＦ１、サブタイプＦ２、サブタイプＧ、サブタイプＨ、およびサブタイプＪのタンパク質、およびこれらの組換え体から選択されうる。好適なパッケージ化ベクターは、配列番号：２のＧａｇタンパク質部分をコードする。
【００３５】
本発明は、非サブタイプＢのＭＡタンパク質をコードするパッケージ化ベクター、およびこれらベクターを含む宿主細胞を包含する。非サブタイプＢのＭＡタンパク質は、サブタイプＡ、サブタイプＣ、サブタイプＤ、サブタイプＥ、サブタイプＦ１、サブタイプＦ２、サブタイプＧ、サブタイプＨ、およびサブタイプＪのタンパク質、およびこれらの組換え体から選択されうる。好適なパッケージ化ベクターは、配列番号：３または配列番号：２のＭＡタンパク質部分をコードする。
【００３６】
様々な実施形態では、パッケージ化ベクターは、配列番号：１または、配列番号：１と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一である核酸配列を含む。様々な実施形態では、パッケージ化ベクターは、配列番号：２、配列番号：３、または、配列番号：２あるいは配列番号：３と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるアミノ酸配列をコードする。
【００３７】
ここで用いる、２つの核酸配列のパーセント同一性は、Devereuxら(Nucl. Acids Res. 12:387, 1984)によって記述され、ウィスコンシン大学遺伝子コンピュータグループ（ＵＷＧＣＧ）から入手可能なＧＡＰコンピュータプログラム、バージョン６．０を使用して配列情報を比較すること、（１）Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358, 1979によって記述されたような、Gribskov and Burgess, Nucl. Acids Res. 14:6745, 1986の、ヌクレオチドのための単一比較マトリックス（同一性に１および非同一性に０の値を含む）；（２）それぞれのギャップに３．０のペナルティーおよびそれぞれのギャップにおけるそれぞれのシンボルにさらなる０．１０のペナルティー；および（３）末端ギャップに対してはペナルティーなし、を含むＧＡＰプログラムのためのデフォルトパラメーターを用いることによって、決定することができる。
【００３８】
様々な実施形態では、ベクターは、以下の特徴の一または複数を有するＨＩＶ−１  ＭＡタンパク質をコードする配列を含む：  
アミノ酸１２位のグルタミン酸の欠失；
アミノ酸１５位のアルギニンの欠失；
アミノ酸４６位のバリンの欠失；および
アミノ酸６１位のロイシンの欠失。  
【００３９】
様々な実施形態では、ベクターは、以下の特徴の一または複数を有するＨＩＶ−１  ＭＡタンパク質をコードする配列を含む：  
１２位のアミノ酸がリシンであり；  
１５位のアミノ酸がスレオニンであり；  
１５位のアミノ酸がアラニンであり；
４６位のアミノ酸がロイシンであり；  
６１位のアミノ酸がイソロイシンであり；および／または
６１位のアミノ酸がメチオニンである。
【００４０】
パッケージ化ベクターはＨＩＶ−１  ＧａｇおよびＰｏｌをコードすることが好ましい。最も好ましくは、パッケージ化ベクターはＨＩＶ−１  Ｇａｇ  ＭＡタンパク質をコードする。
【００４１】
パッケージ化ベクターは、ＧａｇおよびＰｏｌの発現のためのウイルス性または非ウイルス性の配列を含みうる。パッケージ化ベクターは、ＨＩＶ−１  ＬＴＲまたはＨＩＶ−１  ＬＴＲのＵ３領域を含みうる。他の実施形態では、パッケージ化ベクターはＨＩＶ−１  ＬＴＲを含まない。任意のプロモータを用いてＧａｇおよびＰｏｌを発現させることができる。好ましくは、プロモータはヒト細胞において強いプロモータである。最も好ましくは、パッケージ化ベクターには、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＣＭＶ初期エンハンサー／ニワトリβアクチン（ＣＡＧ）プロモータ、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモータ、ヒトホスホグリセリン酸キナーゼ（ｈＰＧＫ）プロモータ、またはコードした遺伝子、例えばＧａｇおよびｐｏｌの発現を作動するＬＴＲプロモータ由来のＵ３（例えば、骨髄増殖性肉腫ウイルス（ＭＰＳＶ）Ｕ３）が含まれる。
【００４２】
好ましくは、パッケージ化ベクターはポリアデニル化シグナルを含む。任意のポリアデニル化シグナルであってよい。好ましくは、ポリアデニル化シグナルはヒト細胞において強いシグナルである。最も好ましくは、ポリアデニル化シグナルは、ヒトα２グロビンまたはウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナルである。
【００４３】
好ましくは、パッケージ化ベクターはＲｅｖ応答配列（ＲＲＥ）を含む。好適な実施形態では、パッケージ化ベクターはＨＩＶ−１のＲｅｖタンパク質を発現する。好適な実施形態では、パッケージ化ベクターは、少なくとも一のスプライスドナー部位と少なくとも一のスプライスアクセプター部位を含む。ある実施形態では、パッケージ化ベクターはＨＩＶ−１  Ｔａｔタンパク質を発現する。
【００４４】
好適な実施形態では、パッケージ化ベクターは、ＨＩＶ−１のＶｉｆ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ、および／またはＮｅｆをコードする配列を欠いている。パッケージ化ベクターは、本明細書に記載の特徴の一または複数を有するＨＩＶ−１  ＭＡタンパク質をコードする配列を含むことができる。
【００４５】
ある実施形態では、パッケージ化ベクターは、ただ１つのＨＩＶ−１タンパク質であるＧａｇをコードする。ある実施形態では、パッケージ化ベクターは、２つのＨＩＶ−１タンパク質であるＧａｇおよびＰｏｌをコードする。ある実施形態では、パッケージ化ベクターは、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、ＲｅｖおよびＴａｔから選択される３つのＨＩＶ−１タンパク質 をコードする。ある実施形態では、パッケージ化ベクターは、４つのＨＩＶ−１タンパク質であるＧａｇ、Ｐｏｌ、ＲｅｖおよびＴａｔをコードする。
【００４６】
ある実施形態では、ベクターは、（５’から３’）ＣＭＶプロモーター、ＨＩＶ−１のＧａｇ−Ｐｏｌをコードする核酸配列、ＴａｔおよびＲｅｖのエクソンコード部分、スプライスドナー部位、ＲＲＥを含むイントロン、スプライスアクセプター部位、ＴａｔおよびＲｅｖのエクソンコード部分、およびポリアデニル化シグナルを含む。好ましくは、ＨＩＶ−１Ｇａｇ−ＰｏｌはサブタイプＤのＨＩＶ−１Ｇａｇ−Ｐｏｌである。
【００４７】
パッケージ化ベクターは、細菌または真核細胞における複製の起点をさらに含んでよい。パッケージ化ベクターは、細菌または真核細胞での選択用の選択マーカー遺伝子を含んでよい。
【００４８】
本発明は、本発明のパッケージ化ベクターを含む宿主細胞を包含する。宿主細胞は、本発明のパッケージ化ベクターを一過性に形質移入することができる。宿主細胞は、宿主細胞のゲノムに組み込まれた本発明のパッケージ化ベクターを有する細胞株であってよい。多くの異なる細胞は好適な宿主細胞である。好ましくは、細胞はヒト細胞であり、最も好ましくは、不死化ヒト細胞株である。ある実施形態では、細胞はＨＥＫ２９３Ｔ細胞である。ある実施形態では、細胞はＨｅＬａ、ＨＴ１０８０またはＰＥＲ  Ｃ６細胞である(Delenda et al, Cells for Gene Therapy and vector Production, from Methods in Biotechnology, Vol 24 : Animal Cell Biotechnology : Methods and Protocols, 2nd Ed. Edited by R. Portner, Humana Press Inc., Totowa, NJ)。
【００４９】
パッケージ化システム
本発明は、非サブタイプＢのＧａｇおよび／またはＰｏｌタンパク質を発現する細胞を含むレンチウイルスパッケージ化システムを包含する。ここでは、レンチウイルスの「パッケージ化システム」は、Ψ部位の非存在下で少なくともレンチウイルスのＧａｇおよびＰｏｌタンパク質を発現し、Ψ部位を含む外因性核酸をパッケージ化し、逆転写することができる細胞を含む、細胞ベースのシステムとして定義される。レンチウイルスパッケージ化システムの細胞はまた、他のウイルスタンパク質を発現することができる。好ましくは、レンチウイルスパッケージ化システムは、エンベロープタンパク質を発現する。エンベロープタンパク質は、レンチウイルス（例えばＨＩＶ−１  Ｅｎｖ）または非レンチウイルス（例えばＶＳＶ、シンドビスウイルス、狂犬病ウイルス）のエンベロープタンパク質であってよい。様々な実施形態では、レンチウイルスパッケージ化システムは、ＨＩＶ−１  Ｔａｔおよび／またはＲｅｖタンパク質を発現する。
【００５０】
様々な実施形態では、レンチウイルスパッケージ化システムの細胞は、そのゲノムに安定して組み込まれるＨＩＶ−１のＧａｇおよび／またはＰｏｌをコードする配列を含む。様々な実施形態では、レンチウイルスパッケージ化システムの細胞は、そのゲノムに安定して組み込まれるエンベロープタンパク質をコードする配列を含む。様々な実施形態では、レンチウイルスパッケージ化システムの細胞は、そのゲノムに安定して組み込まれるＨＩＶ−１のＴａｔおよび／またはＲｅｖをコードする配列を含む。
【００５１】
様々な実施形態では、レンチウイルスパッケージ化システムの細胞はＨＩＶ−１のＧａｇおよび／またはＰｏｌタンパク質を一過性に発現する。様々な実施形態では、レンチウイルスパッケージ化システムの細胞はエンベロープタンパク質を一過性に発現する。様々な実施形態では、レンチウイルスパッケージ化システムの細胞はＨＩＶ−１のＴａｔおよび／またはＲｅｖタンパク質を一過性に発現する。
【００５２】
レンチウイルスパッケージ化システムの細胞は、サブタイプＡ、サブタイプＣ、サブタイプＤ、サブタイプＥ、サブタイプＦ１、サブタイプＦ２、サブタイプＧ、サブタイプＨ、およびサブタイプＪのタンパク質、およびこれらの組換え体から選択される非サブタイプＢのＧａｇおよびＰｏｌタンパク質を発現することができる。ある実施形態では、レンチウイルスパッケージ化システムの細胞は、配列番号：１を含むかまたは配列番号：２を発現する。
【００５３】
様々な実施形態では、レンチウイルスパッケージ化システムの細胞は、非サブタイプＢのＧａｇタンパク質を発現する。非サブタイプＢのＧａｇタンパク質は、サブタイプＡ、サブタイプＣ、サブタイプＤ、サブタイプＥ、サブタイプＦ１、サブタイプＦ２、サブタイプＧ、サブタイプＨ、およびサブタイプＪのタンパク質、およびこれらの組換え体から選択されうる。
【００５４】
様々な実施形態では、レンチウイルスパッケージ化システムの細胞は、非サブタイプＢのＭＡタンパク質を発現する。非サブタイプＢのＭＡタンパク質は、サブタイプＡ、サブタイプＣ、サブタイプＤ、サブタイプＥ、サブタイプＦ１、サブタイプＦ２、サブタイプＧ、サブタイプＨ、およびサブタイプＪのタンパク質、およびこれらの組換え体から選択されうる。好適なパッケージ化ベクターは、配列番号：３または配列番号：２の  ＭＡタンパク質部分をコードする。
【００５５】
様々な実施形態では、レンチウイルスパッケージ化システムの細胞は、本発明のレンチウイルスベクターのいずれかを含んでよい。
【００５６】
様々な実施形態では、レンチウイルスパッケージ化システムの細胞は、配列番号：１または、配列番号：１と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一である核酸配列を含む。様々な実施形態では、レンチウイルスパッケージ化システムの細胞は、配列番号：２、配列番号：３、または、配列番号：２あるいは配列番号：３と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるアミノ酸配列を発現する。
【００５７】
パッケージ化ベクターの製造方法
本発明は、非サブタイプＢのＧａｇおよび／またはＰｏｌタンパク質をコードするパッケージ化ベクターの製造方法を包含する。パッケージ化ベクターは、本明細書で説明する特徴のいずれかを含みうる。
【００５８】
ある実施形態では、本方法は、非サブタイプＢ  ＨＩＶ−１ウイルスからのＧａｇおよび／またはＰｏｌ配列を、非ＨＩＶプロモーター（例えばＣＭＶプロモーター）の制御下でプラスミドに挿入し、パッケージ化ベクターを作製することを含む。ある実施形態では、パッケージ化ベクターは、ただ１つのＨＩＶ−１タンパク質をコードする。ある実施形態では、パッケージ化ベクターは、２つのＨＩＶ−１タンパク質をコードする。ある実施形態では、パッケージ化ベクターは、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、ＲｅｖおよびＴａｔから選択される３つのＨＩＶ−１タンパク質をコードする。ある実施形態では、パッケージ化ベクターは、４つのＨＩＶ−１タンパク質、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、ＲｅｖおよびＴａｔをコードする。
【００５９】
様々な実施形態では、本プラスミドは、CMVプロモーター、TatおよびRevのエクソンコード部分、スプライスドナー部位、RREを含むイントロン、スプライスアクセプター部位、TatおよびRevのエクソンコード部分、およびポリアデニル化シグナルの一または複数を含む。
【００６０】
様々な実施形態では、本パッケージ化ベクターは、CMVプロモーター、TatおよびRevのエクソンコード部分、スプライスドナー部位、RREを含むイントロン、スプライスアクセプター部位、TatおよびRevのエクソンコード部分、およびポリアデニル化シグナルを含む。
【００６１】
非サブタイプB HIV-1ウイルスは、サブタイプA、サブタイプC、サブタイプD、サブタイプE、サブタイプF1、サブタイプF2、サブタイプG、サブタイプH、およびサブタイプJのウイルス、およびこれらの組換え体から選択されうる。
【００６２】
ある実施形態では、本方法は、ＨＩＶ−１サブタイプＢウイルスのＧａｇ配列を含むベクターをパッケージ化することと、ベクター内のＧａｇ配列をＨＩＶ−１非サブタイプＢウイルスの配列で置き換えることとを含む。
【００６３】
非サブタイプＢ  ＨＩＶ−１ウイルスは、サブタイプＡ、サブタイプＣ、サブタイプＤ、サブタイプＥ、サブタイプＦ１、サブタイプＦ２、サブタイプＧ、サブタイプＨ、およびサブタイプＪのウイルス、およびこれらの組換え体から選択されうる。好適な実施形態では、非サブタイプＢ  ＨＩＶ−１ウイルスはＨＩＶ−１  ＮＤＫである。
【００６４】
レンチウイルスベクターの製造方法
本発明はまた、ＨＩＶ−１非サブタイプＢのＧａｇおよび／またはＰｏｌタンパク質をコードするパッケージ化ベクターを使用し、レンチウイルスベクターを作製するための方法を包含する。ある実施形態では、本発明は、レンチウイルスベクターを用いて、ＨＩＶ−１非サブタイプＢのＧａｇまたはＰｏｌタンパク質をコードするパッケージ化ベクターを、細胞に投与することを包含する。パッケージ化ベクターは、本明細書で説明する特徴のいずれかを含みうる。
【００６５】
レンチウイルスベクターは、Ψ部位およびプライマー結合部位を含む、パッケージ化および逆転写のためのシス作用型配列を含む。好ましくは、レンチウイルスベクターは、２つのＨＩＶ−１  ＬＴＲ配列を含む。ある実施形態では、ＬＴＲの一つは、Ｕ３およびＲ配列を欠いている。好ましくは、レンチウイルスベクターは、セントラルポリプリン帯（ｃＰＰＴ）とセントラル末端配列（ＣＴＳ）を含む。レンチウイルスベクターは、レンチウイルスまたは、選択マーカーや腫瘍抗原などの非レンチウイルスタンパク質をコードすることが好ましい。
【００６６】
ある実施形態では、レンチウイルスベクターは、一または複数のＨＩＶ抗原、好ましくはＨＩＶ−１抗原を含む。最も好ましくは、抗原はＧａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖ、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ、Ｎｅｆ、Ｔａｔ、またはＲｅｖ抗原である。抗原は、単一の抗原、抗原の混合、抗原性ポリペプチド、またはこれらのタンパク質由来の抗原性ポリペプチドの混合であってよい。好適な実施形態では、レンチウイルスベクターはＨＩＶ−１のｐ２４  Ｇａｇ抗原を含む。
【００６７】
ある実施形態では、本発明は、ＮＩＳ含有プロモーターを含むレンチウイルスベクターを包含する。「ＮＩＳ含有プロモーター」は、ＮＦ−κＢ結合部位、インターフェロン刺激性応答エレメント（ＩＳＲＥ）、ＳＸＹモジュール（ＳＸＹ）を含む。天然に生じるＮＩＳ含有プロモーターの例は、β２ｍプロモーターおよびＭＨＣクラスＩ遺伝子プロモーターである。これらの天然に生じるＮＩＳ含有プロモーターは、概して、クローニングされ、タンパク質β２ｍまたはＭＨＣクラスＩタンパク質をコードする遺伝子のプロモーター領域から再合成されるか、あるいはゲノムデータベース（例：ＮＣＢＩポリヌクレオチドデータベース  http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/dna-rna）内でそのタンパク質を推定上コードすると称されている。β２ｍとクラスＩ  ＭＨＣタンパク質とはいずれも主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）の一つである。β２ｍとクラスＩ  ＭＨＣプロモーター配列もまた、ゲノムデータベース内でそのようなものとして、すなわちβ２ｍおよびクラスＩ  ＭＨＣプロモーター配列であると注釈されている。
【００６８】
ＭＨＣクラスＩおよびβ２ミクログロブリンのプロモーターは、ＮＩＳ含有プロモーターの共通の構造的相同性を含む。これらプロモーターもまた、樹状細胞内で強く活性化される能力、並びに他のヒト身体組織の大部分で強度を下げる能力を共有する。
【００６９】
ある実施形態では、パッケージ化ベクターおよびレンチウイルスベクターは、共に細胞内へ導入され、パッケージ化ベクターによって製造されるＧａｇタンパク質とレンチウイルスベクターによって製造される核酸とを含むレンチウイルスベクター粒子の形成を可能にする。好ましくは、これは、パッケージ化ベクターおよびレンチウイルスベクターを用いた細胞の同時形質移入によって達成される。細胞はまた、Ｅｎｖタンパク質、好ましくはＶＳＶ糖タンパク質Ｇをコードする核酸により形質移入されてよい。好ましくは、レンチウイルスベクター粒子は、適切な宿主細胞内で移行、逆転写および発現が可能である。
【００７０】
ある実施形態では、パッケージ化ベクターまたはレンチウイルスベクターは細胞へ安定して組み込まれ、組み込まれていないベクターは細胞へ形質移入してレンチウイルスベクター粒子の形成を可能にする。
【００７１】
ある実施形態では、本方法はさらに、細胞によって製造されたレンチウイルスベクターを回収することを含む。
【００７２】
ある実施形態では、本方法はさらに、サブタイプＢのＧａｇまたはＰｏｌタンパク質をコードする同じパッケージ化ベクターよりも高い力価のレンチウイルスベクターをパッケージ化するパッケージ化ベクターの選択を含む。好ましくは、力価は、サブタイプＢのＧａｇまたはＰｏｌタンパク質をコードするパッケージ化ベクターと比較して少なくとも１．５または２倍増加している。
【００７３】
レンチウイルスベクター粒子
本発明はまた、ＨＩＶ−１非サブタイプＢのＧａｇおよび／またはＰｏｌタンパク質を含むレンチウイルスベクター粒子を包含する。非サブタイプＢのＧａｇおよびＰｏｌタンパク質は、本明細書に記載の特徴のいずれかを含むことができる。
【００７４】
レンチウイルスベクター粒子は、Ｇａｇ、ＰｏｌおよびＥｎｖタンパク質と併せてΨ部位およびプライマー結合部位を含む、パッケージ化および逆転写のためのシス作用型配列を含む核酸を含む。好ましくは、核酸は、２つのＨＩＶ−１  ＬＴＲ配列を含む。ある実施形態では、一方のＬＴＲはＵ３およびＲ配列を欠いている。好ましくは、レンチウイルスベクター粒子の核酸は、セントラルポリプリン帯（ｃＰＰＴ）とセントラル末端配列（ＣＴＳ）を含む。核酸は、レンチウイルスまたは、選択マーカーや腫瘍抗原などの非レンチウイルスタンパク質をコードすることが好ましい。好ましくは、レンチウイルスベクター粒子はVSV糖タンパク質を含む。
【００７５】
好ましくは、レンチウイルスベクターはＮＩＳ含有プロモーターを含む。ある実施形態では、プロモーターはβ２ｍプロモーターである。
【００７６】
ある実施形態では、レンチウイルスベクターは一または複数のＨＩＶ抗原、好ましくはＨＩＶ−１抗原を含む。最も好ましくは、抗原は、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖ、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ、Ｎｅｆ、ＴａｔまたはＲｅｖ抗原である。
【００７７】
本発明のレンチウイルスベクターは、ヒト宿主を含む宿主細胞に投与されうる。
【００７８】
レンチウイルスベクター粒子は、特定の細胞種用の標的メカニズムを含みうる。例として、出典明記によってここに援用されるYang et al., Targeting lentiviral vectors to specific cell types in vivo, PNAS 113(31):11479-11484 (2006)を参照のこと。ターゲティングは、細胞上の細胞表面タンパク質に結合する抗体を介して達成することができる。標的細胞種は、樹状細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞であるのが好ましい。樹状細胞種へのターゲティングが好ましく、DC表面タンパク質に特異的に結合するエンベロープタンパク質を介して達成することができる。例として、出典明記によってここに援用されるYang et al., Engineered Lentivector Targeting of Dendritic Cells for In Vivo, Nat Biotechnol. 2008 March ; 26(3): 326-334を参照のこと。
【００７９】
さらに、本発明は、エピトープ、より具体的にはベクターに存在する導入遺伝子によってコードされるものに対して免疫応答を誘導し、またはその発生や改善へ寄与することができる治療的組成物を調製するための、特にレンチウイルスベクター粒子の形態での本発明に係るレンチウイルスベクターの使用に関する。
【実施例】
【００８０】
実施例１  プラスミドの構築
ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子は、鋳型としてＨＩＶ−１  ＮＤＫのクローン、ｐＮＤＫ−Ｎおよび２つのプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。ｐＴｈＶ−ＧＰ−Ｎプラスミドを得るために、ＰＣＲ産物をＥａｇＩ  ／ＳａｌＩにて消化し、ＥａｇＩ  ／ＳａｌＩにて消化したパッケージ化コンストラクトｐ８．７４に挿入した。
【００８１】
実施例２  形質移入によるレンチウイルスベクターの製造
レンチウイルスベクター貯蔵液は、ｐＦＬＡＰ  ＣＭＶ  ＧＦＰ  ｂｉｓおよびｐＴＨＶ−ＶＳＶ．Ｇ  （ＩＮＤＩ−ＣＯ）ｂｉｓをｐ８．７４またはｐＴｈＶ−ＧＰ−Ｎと組み合わせて用いて製造した。ｐ８．７４にて１８回、ｐＴｈＶ−ＧＰ−Ｎにて１８回、合計３６回の形質移入を行った。すべての上清物を−８０℃に保存した。
【００８２】
プラスミドｐＦＬＡＰ−ＣＭＶ  ＧＦＰ  ｂｉｓは、フローサイトメトリーにてその発現が検出することができる緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードしていた。
【００８３】
実施例３  レンチウイルスベクター製造の力価
ベクター力価は２９３Ｔ細胞におけるＧＦＰ発現の頻度によって決定した。細胞は、１ウェルあたり１×１０５細胞の密度に達するまで、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中で、２４ウェルプレートにて培養した。次いで、細胞を３００μＬの終容量中で異なる容量のベクター上清を形質導入した。２時間後、１０％ＦＢＳを含有する７００μlの新鮮培地を各ウェルに添加した。形質導入の７２時間後に、培地を除去し、細胞をダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS、Gibco）中で洗浄した。細胞を０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Gibco）にて除去した。トリプシン処理は３００μｌの完全ＤＭＥＭを添加して止め、細胞をＦＡＣＳのためにチューブに移して、その後、ＧＦＰ発現細胞の数を、５０９ｎｍの励起波長を用いたＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（BD Biosciences）にて計数した。３０％未満のＧＦＰ陽性細胞の割合のみを考慮した。
【００８４】
結果を図３に示す。ｐＴｈＶ−ＧＰ−Ｎとｐ８．７４のベクター産物との間に有意差が見られ、ｐＴｈＶ−ＧＰ−Ｎプラスミドを用いた場合に力価が高かった。実際、パッケージ化プラスミドｐＴｈＶ−ＧＰ−Ｎにより得られたベクター力価は、従来用いられるプラスミドｐ８．７４にて得られたベクター力価の２倍であった(スチューデント検定によるとｐ＜０．００１）。
【００８５】
実施例４  ｐＴｈＶ−ＧＰ−Ｎによるレンチウイルスベクターの力価の増加
ＨＩＶ−１  ＢＲＵおよびＨＩＶ−１  ＮＤＫウイルスは、２９３Ｔ細胞上で作製し、形質導入されたＰ４  ＣＣＲ５細胞に使用した。これらの細胞は、ＨＩＶ  ＬＴＲの制御下に安定したルシフェラーゼ遺伝子を包含する。これらがＴＡＴタンパク質を形質移入している場合（ＷＴ  ＨＩＶに感染している場合）、ＬａｃＺ遺伝子が発現され、ルシフェラーゼ発現を測定することができる。ＨＩＶ−１のＧａｇ  ｐ２４およびルシフェラーゼ発現を測定した。図４に結果を示し、野生型ＮＤＫウイルスが、野生型ＢＲＵウイルスよりも高い形質導入率を有することが確認される。
【００８６】
実施例５  ｐＴｈＶ−ＧＰ−Ｎによるｐ２４および力価の増加
異なる比率のｐ８．７４およびｐＳＤ  ＧＰ  ＮＤＫパッケージ化ベクターを用いて、レンチウイルスベクター粒子を製造した。それぞれの比率について力価およびｐ２４レベルを測定した。結果を図５に示し、ｐ２４レベルおよび製造力価の亢進を担うＮＤＫパッケージ化ベクターの存在が示された。
【００８７】
実施例６  ｐＴｈＶ−ＧＰ−Ｎによるｐ２４プロセシングの低減
パッケージ化ベクターｐ８．７４およびｐＴＨＶ−ＧＰ−Ｎを用いて、レンチウイルスベクター粒子を含む上清を製造した。ＮＩＨ抗Ｐ２４  ＭＡＢ（１８３−Ｈ１２−５Ｃ）を用いて上清についてウエスタンブロットを行った。結果を図６に示し、ＢＲＵがウイルス上清中にｐ２４のみを示す場合にＮＤＫが高いｐ２４合成を生成するようであるので（ウイルス上清にｐ２４前駆体が存在）、ＮＤＫとＢＲＵパッケージ化プラスミドとの差異は、ｐ２４タンパク質と前駆体との製造に因るものであることが確認される。
【００８８】
例示的実施形態
１．Ψ部位を欠き、ＨＩＶ−１  Ｇａｇ  ＭＡタンパク質をコードする、複製欠損レンチウイルスパッケージ化ベクターであって、該ＨＩＶ−１  Ｇａｇ  ＭＡタンパク質が、
ａ）１２位にグルタミン酸でないアミノ酸を持ち、
ｂ）１５位にアルギニンでないアミノ酸を持ち、
ｃ）４６位のバリンと６１位のロイシンを持っておらず、
該ＨＩＶ−１  Ｇａｇ  ＭＡタンパク質をコードするレンチウイルスパッケージ化ベクターが、ＨＩＶ−１  ＢＲＵのＨＩＶ−１  Ｇａｇ  ＭＡタンパク質をコードするレンチウイルスパッケージ化ベクターと比較して、パッケージ化レンチウイルスベクターの力価が少なくとも１．５倍増加している、複製欠損レンチウイルスパッケージ化ベクター。
２．１２位のアミノ酸がリジンである、実施形態１に記載のベクター。
３．１２位のアミノ酸がアルギニンである、実施形態１に記載のベクター。
４．１５位のアミノ酸がスレオニンである、実施形態１に記載のベクター。
５．１５位のアミノ酸がアラニンである、実施形態１に記載のベクター。
６．４６位のアミノ酸がロイシンである、実施形態１に記載のベクター。
７．６１位のアミノ酸がイソロイシンである、実施形態１に記載のベクター。
８．６１位のアミノ酸がメチオニンである、実施形態１に記載のベクター。
９．１５位のアミノ酸がスレオニンである、実施形態２に記載のベクター。
１１．４６位のアミノ酸がロイシンである、実施形態２に記載のベクター。
１２．６１位のアミノ酸がイソロイシンである、実施形態２に記載のベクター。
１３．４６位のアミノ酸がロイシンである、実施形態９に記載のベクター。
１４．６１位のアミノ酸がイソロイシンである、実施形態９に記載のベクター。
１５．６１位のアミノ酸がイソロイシンである、実施形態１３に記載のベクター。
１６．ＨＩＶ−１のＧａｇ  ＭＡタンパク質が、ＨＩＶ−１  ＮＤＫのＨＩＶ−１  Ｇａｇ  ＭＡタンパク質である、実施形態１５に記載のベクター。
１７．ベクターが配列番号：４のアミノ酸配列をコードする、実施形態１６に記載のベクター。
１８．非サブタイプＢ  ＨＩＶ−１ウイルスからのＧａｇおよび／またはＰｏｌ配列を、非ＨＩＶプロモーターの制御下でプラスミドに挿入し、パッケージ化ベクターを作製することを含む、パッケージ化ベクターの製造方法。
１９．レンチウイルスベクターを用いて、非サブタイプＢ  ＨＩＶ−１のＧａｇまたはＰｏｌタンパク質をコードするパッケージ化ベクターを、細胞に投与することを含む、レンチウイルスベクターの作製方法。
２０．さらに、サブタイプＢ  ＨＩＶ−１のＧａｇまたはｐｏｌタンパク質をコードする同じパッケージ化ベクターよりも高い力価のレンチウイルスベクターをパッケージ化するパッケージ化ベクターを選択することを含む、実施形態１９に記載の方法。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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