(57)【要約】      （修正有）【課題】乳癌細胞の成長又は増殖を阻害するための方法の提供。【解決手段】乳癌細胞の成長又は増殖を阻害することの必要な被験者へそれを阻害するのに有効である量でＭＥＬＫ阻害剤を投与すること。ここで該乳癌細胞は、エストロゲン受容体（ＥＲ）陰性である。いくつかの側面において、本方法には、乳癌細胞の成長又は増殖を阻害することの必要な被験者へそれを阻害するのに有効である量でＭＥＬＫ阻害剤、ＦｏｘＭ１阻害剤、又はＭＥＬＫ阻害剤及びＦｏｘＭ１阻害剤を投与することが含まれ、ここで該乳癌細胞は、エストロゲン受容体（ＥＲ）陰性である。乳癌の治療の方法と、ＭＥＬＫ阻害剤、ＦｏｘＭ１阻害剤、又はＭＥＬＫ阻害剤及びＦｏｘＭ１阻害剤での治療から利益を得る可能性がある担癌被験者を同定する方法も提供する。【選択図】図１６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳癌細胞の成長又は増殖を阻害することの必要な被験者へそれを阻害するのに有効である量でＭＥＬＫ阻害剤を投与することを含んでなる、該乳癌細胞の成長又は増殖を阻害するための方法であって；
ここで該乳癌細胞は、エストロゲン受容体（ＥＲ）陰性である、前記方法。
【請求項２】
ＭＥＬＫ阻害剤がｓｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｓｉＲＮＡがｓｈＲＮＡを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＭＥＬＫ阻害剤が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、及びこれらの組合せからなる群より選択されるＭＥＬＫ標的ヌクレオチド配列を有するｓｈＲＮＡを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
乳癌細胞がプロゲステロン受容体（ＰＲ）陰性である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
乳癌細胞がヒト表皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）陰性である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
乳癌細胞の成長又は増殖を阻害することの必要な被験者へそれを阻害するのに有効である量でＭＥＬＫ阻害剤、ＦｏｘＭ１阻害剤、又はＭＥＬＫ阻害剤及びＦｏｘＭ１阻害剤を投与することを含んでなる、該乳癌細胞の成長又は増殖を阻害するための方法であって；
ここで該乳癌細胞は、エストロゲン受容体（ＥＲ）陰性である、前記方法。
【請求項８】
ＭＥＬＫ阻害剤がｓｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ｓｉＲＮＡがｓｈＲＮＡを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ＭＥＬＫ阻害剤が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、及びこれらの組合せからなる群より選択されるＭＥＬＫ標的ヌクレオチド配列を有するｓｈＲＮＡを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ＦｏｘＭ１阻害剤がｓｉＲＮＡを含む、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
ＦｏｘＭ１阻害剤が配列番号２９からなるヌクレオチド配列を有するｓｉＲＮＡを含む、請求項７〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
ＦｏｘＭ１阻害剤がチオストレプトンである、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
乳癌細胞がプロゲステロン受容体（ＰＲ）陰性である、請求項７〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
乳癌細胞がヒト表皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）陰性である、請求項７〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
乳癌を有する被験者を治療するための方法であって：
該被験者の乳癌細胞中のエストロゲン受容体発現状況を判定すること；
エストロゲン受容体陰性である乳癌細胞を有する被験者へＭＥＬＫ阻害剤を投与することを含んでなる、前記方法。
【請求項１７】
被験者の乳癌細胞中のプロゲステロン受容体発現状況を判定すること；及び、エストロゲン受容体陰性であってプロゲステロン受容体陰性である乳癌細胞を有する被験者へＭＥＬＫ阻害剤を投与することを含んでなる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
被験者の乳癌細胞中のヒト表皮成長因子受容体２発現状況を判定すること；及び、ヒト表皮成長因子受容体２陰性である乳癌細胞を有する被験者へＭＥＬＫ阻害剤を投与することを含んでなる、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項１９】
ＭＥＬＫ阻害剤がｓｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
ｓｉＲＮＡがｓｈＲＮＡを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ＭＥＬＫ阻害剤が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、及びこれらの組合せからなる群より選択されるＭＥＬＫ標的ヌクレオチド配列を有するｓｈＲＮＡを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ＭＥＬＫ阻害剤がＭＥＬＫのプロモーター領域へのＦｏｘＭ１の結合に干渉する、請求項１６〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
乳癌を有する被験者を治療するための方法であって：
該被験者の乳癌細胞中のエストロゲン受容体発現状況を判定すること；
エストロゲン受容体陰性である乳癌細胞を有する被験者へＭＥＬＫ阻害剤、ＦｏｘＭ１阻害剤、又はＭＥＬＫ阻害剤及びＦｏｘＭ１阻害剤を投与することを含んでなる、前記方法。
【請求項２４】
被験者の乳癌細胞中のプロゲステロン受容体発現状況を判定すること；及び、エストロゲン受容体陰性であってプロゲステロン受容体陰性である乳癌細胞を有する被験者へＭＥＬＫ阻害剤、ＦｏｘＭ１阻害剤、又はＭＥＬＫ阻害剤及びＦｏｘＭ１阻害剤を投与することを含んでなる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
被験者の乳癌細胞中のヒト表皮成長因子受容体２発現状況を判定すること；及び、ヒト表皮成長因子受容体２陰性である乳癌細胞を有する被験者へＭＥＬＫ阻害剤、ＦｏｘＭ１阻害剤、又はＭＥＬＫ阻害剤及びＦｏｘＭ１阻害剤を投与することを含んでなる、請求項２３又は２４に記載の方法。
【請求項２６】
ＭＥＬＫ阻害剤がｓｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項２３〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
ｓｉＲＮＡがｓｈＲＮＡを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ＭＥＬＫ阻害剤が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、及びこれらの組合せからなる群より選択されるＭＥＬＫ標的ヌクレオチド配列を有するｓｈＲＮＡを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ＦｏｘＭ１阻害剤がｓｉＲＮＡを含む、請求項２３〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
ＦｏｘＭ１阻害剤が配列番号２９からなるヌクレオチド配列を有するｓｉＲＮＡを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ＦｏｘＭ１阻害剤がチオストレプトンである、請求項２３〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
ＭＥＬＫ阻害剤がＭＥＬＫ１のプロモーター領域へのＦｏｘＭ１の結合に干渉する、請求項２３〜２７と請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
ＭＥＬＫ阻害剤又はＦｏｘＭ１阻害剤での治療から利益を得る可能性がある担癌被験者を同定する方法であって：
被験者の乳癌細胞中のエストロゲン受容体発現状況を判定すること；及び／又は
非乳癌細胞と比べて乳癌細胞中のＭＥＬＫ発現レベルを判定すること；及び
エストロゲン受容体陰性である、及び／又は非乳癌細胞と比べて乳癌細胞におけるＭＥＬＫの発現レベルがより高い乳癌細胞を有する被験者を同定することを含んでなり；
ここでエストロゲン受容体陰性の乳癌細胞、及び／又はより高いレベルのＭＥＬＫ発現を有する被験者は、該被験者をＭＥＬＫ阻害剤、ＦｏｘＭ１阻害剤、又はＭＥＬＫ阻害剤及びＦｏｘＭ１阻害剤で治療することの必要性を示す、前記方法。
【請求項３４】
被験者へＭＥＬＫ阻害剤、ＦｏｘＭ１阻害剤、又はＭＥＬＫ阻害剤及びＦｏｘＭ１阻害剤を投与することを含んでなる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ＭＥＬＫ阻害剤がｓｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項３３又は３４に記載の方法。
【請求項３６】
ＭＥＬＫ阻害剤が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、及びこれらの組合せからなる群より選択されるＭＥＬＫ標的ヌクレオチド配列を有するｓｈＲＮＡを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
ＦｏｘＭ１阻害剤がｓｉＲＮＡを含む、請求項３３〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
ＦｏｘＭ１阻害剤が配列番号２９からなるヌクレオチド配列を有するｓｉＲＮＡを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
ＦｏｘＭ１阻害剤がチオストレプトンである、請求項３３〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
ＭＥＬＫ阻害剤がＭＥＬＫのプロモーター領域へのＦｏｘＭ１の結合に干渉する、請求項３３〜３５と請求項３７〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
被験者の乳癌細胞中のプロゲステロン受容体発現状況を判定することを含んでなる、請求項３３〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
ＭＥＬＫの発現を下方調節することが可能な薬剤の有効量と医薬的に許容される担体を含んでなる組成物であって、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、及びこれらの組合せからなる群より選択されるＭＥＬＫ標的ヌクレオチド配列を有するｓｉＲＮ
Ａを含む、前記組成物。
【請求項４３】
ｓｉＲＮＡが配列番号５〜配列番号１２からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項４２の組成物。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
[0001]  本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国仮特許出願番号６１／７５１，７０３（２０１３年１月１１日出願）の利益を特許請求する。
【０００２】
連邦政府により支援された研究又は開発
[0002]  本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された連邦政府認可番号ＣＡ１３４５０２、Ｐ５０ＣＡ０８９３９３−０８Ｓ１、及びＣＡ１４８１６４−０１と米国国防省によって授与された連邦政府認可番号ＢＣ０５１５６５の下での政府支援でなされた。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
[0003]  乳癌は、組織学、治療応答、及び患者の治療転帰において高度の多様性がある異質性疾患である。転写プロファイリング解析により、乳癌の少なくとも５種の主要な「固有」サブタイプ：正常乳腺様、ルミナルＡ、ルミナルＢ、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ高濃度、及び基底細胞様乳癌（ＢＢＣ）が再現性よく同定されてきた（Perou et al., 2000; Sorlie
et al., 2001）。これらの分子サブタイプは、ヒト乳腺腫瘍のゲノミクス、エピジェネ
ティクス、トランスクリプトミクス、及びプロテオミクスのレベルでの包括的な特性決定において最近確定された（Koboldt et al., 2012）。これらのサブタイプの中で、基底細胞様乳癌（ＢＢＣ）は、攻撃的な表現型と不良な予後と強く関連している（Foulkes et al. 2010; Perou 2011）。そのルミナル対照物とは異なって、ＢＢＣ細胞では、エストロ
ゲン受容体（ＥＲ）とプロゲステロン受容体（ＰＲ）の発現が欠落しているので、臨床的に定義される「トリプルネガティブ」乳癌（ＴＮＢＣ）（これも、ＥＲ／ＰＲ発現の欠損によって特性決定される）と重なる部分が多い（Foulkes et al. 2010; Perou 2011）。
ルミナル乳癌の治療にきわめて有効である標的指向療法に対してＢＢＣ又はＴＮＢＣ細胞が相対的に無反応であるのは、これらの分子標的の欠損によるからである。このサブタイプの分子病変形成を確定して潜在的な治療標的を同定することは、依然としてＢＢＣ／ＴＮＢＣにとって重要な課題である。
【０００４】
[0004]  キナーゼは、腫瘍病変形成に頻繁に関与する独自の遺伝子集団の代表である。実際、多種類のヒト癌にわたる多くのキナーゼにおいて、多数の突然変異、コピー数及び／又は発現レベルにおける変化が観測されてきた。加えて、キナーゼはまた、薬理学的に扱いやすく、低分子を介するようなキナーゼ活性の阻害は、癌治療にきわめて有効な戦略となっている（Zhang et al., 2009）。従って、ＥＲ／ＰＲ発現陰性乳癌に有効な長期治療戦略のために「新薬開発を可能にする（druggable）」標的を解明するやり方でＥＲ／
ＰＲ発現陰性細胞に必須のキナーゼ（複数）を同定すること、その治療戦略から利益を得る可能性がある患者を同定する新たな方法、及び有効な長期治療戦略で患者を治療する方法へのニーズが依然としてある。
【発明の概要】
【０００５】
[0005]  本発明は、乳癌細胞の成長又は増殖を阻害するための方法へ向けられる。この方法には、乳癌細胞の成長又は増殖を阻害することの必要な被験者へそれを阻害するのに有効である量でＭＥＬＫ阻害剤を投与することが含まれ、ここで該乳癌細胞は、エストロゲン受容体（ＥＲ）陰性である。いくつかの側面において、本方法には、乳癌細胞の成長又は増殖を阻害することの必要な被験者へそれを阻害するのに有効である量でＦｏｘＭ１阻害剤を投与することが含まれ、ここで該乳癌細胞は、エストロゲン受容体（ＥＲ）陰性である。いくつかの側面において、本方法には、乳癌細胞の成長又は増殖を阻害することの必要な被験者へそれを阻害するのに有効である量でＭＥＬＫ阻害剤、ＦｏｘＭ１阻害剤
、又はＭＥＬＫ阻害剤及びＦｏｘＭ１阻害剤を投与することが含まれ、ここで該乳癌細胞は、エストロゲン受容体（ＥＲ）陰性である。
【０００６】
[0006]  本発明はまた、乳癌を有する被験者を治療するための方法へ向けられる。この方法には、被験者の乳癌細胞中のエストロゲン受容体発現状況を判定することと、エストロゲン受容体（ＥＲ）陰性である乳癌細胞を有する被験者へＭＥＬＫ阻害剤を投与することが含まれる。いくつかの側面において、本方法には、被験者の乳癌細胞中のエストロゲン受容体発現状況を判定することと、エストロゲン受容体（ＥＲ）陰性である乳癌細胞を有する被験者へＦｏｘＭ１阻害剤を投与することが含まれる。いくつかの側面において、本方法には、被験者の乳癌細胞中のエストロゲン受容体発現状況を判定することと、エストロゲン受容体（ＥＲ）陰性である乳癌細胞を有する被験者へＭＥＬＫ阻害剤、ＦｏｘＭ１阻害剤、又はＭＥＬＫ阻害剤及びＦｏｘＭ１阻害剤を投与することが含まれる。
【０００７】
[0007]  本発明の別の側面には、ＭＥＬＫ阻害剤、ＦｏｘＭ１阻害剤、又はＭＥＬＫ阻害剤及びＦｏｘＭ１阻害剤での治療から利益を得る可能性がある癌を有する被験者を同定する方法が含まれる。この方法には、被験者の乳癌細胞中のエストロゲン受容体発現状況を判定すること、及び／又は非乳癌細胞と比べた乳癌細胞中のＭＥＬＫ発現レベルを判定することが含まれる。本方法にはまた、エストロゲン受容体陰性である、及び／又は非乳癌細胞と比べて乳癌細胞におけるＭＥＬＫの発現レベルがより高い乳癌細胞を有する被験者を同定することが含まれる。いくつかの側面において、エストロゲン受容体陰性の乳癌細胞、及び／又はより高いレベルのＭＥＬＫ発現を有する被験者は、該被験者をＭＥＬＫ阻害剤で治療することの必要性を示す。いくつかの側面において、エストロゲン受容体陰性の乳癌細胞、及び／又はより高いレベルのＭＥＬＫ発現を有する被験者は、該被験者をＦｏｘＭ１阻害剤で治療することの必要性を示す。いくつかの側面において、エストロゲン受容体陰性の乳癌細胞、及び／又はより高いレベルのＭＥＬＫ発現を有する被験者は、該被験者をＭＥＬＫ阻害剤、ＦｏｘＭ１阻害剤、又はＭＥＬＫ阻害剤及びＦｏｘＭ１阻害剤で治療することの必要性を示す。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】[0008]  図面１は、ＭＥＬＫを潜在的な癌遺伝子として同定する生体内（in vivo）遺伝子スクリーニングを図解する。  [0009]  （Ａ）生体内腫瘍生成モデルの開発。生成した腫瘍の数と注射の回数を左表に記載した。ヒト乳腺上皮細胞（ＨＭＥＣ）においては、細胞が生体内での腫瘍生成を達成するのに２種の癌遺伝子が必要とされたことに注目されたい。マウスの右画像は、ＰＩＫ３ＣＡ（Ｈ１０４７Ｒ）で形質導入されたＨＭＥＣ−ＤＤ−ＮｅｕＴ細胞において生成された腫瘍を示す。（Ｂ）腫瘍生成を促進する遺伝子の遺伝子スクリーニングの概略図。レトロウイルスのミリストイル化キナーゼのプール（全部で３７個のプール、それぞれ１０〜１２個のユニークなオープンリーディングフレームからなる）をＨＭＥＤ−ＤＤ−ＥｒｂＢ２細胞へ形質導入した。次いで、ヌードマウスの乳腺脂肪体へ細胞を移植した。１２の細胞プールより産生した腫瘍を採取し、ゲノムＤＮＡの抽出を続けた。移植前の細胞由来のゲノムＤＮＡと腫瘍由来のゲノムＤＮＡをｑＰＣＲへ処した。Ｃｔ数の差より相対的な濃縮を導いた。同定した２６種の遺伝子の中では、発生した腫瘍において、ＭＥＬＫが高度に濃縮されている。
【図２】[0010]  図面２は、腫瘍の発生の間に特異的に濃縮された２６種のキナーゼを図解する。（Ａ）スクリーニングヒットのリストと生体内腫瘍におけるそれらの相対的濃縮倍率。濃縮倍率の閾値は、１０に設定する。（Ｂ）スクリーニングヒットのリストとそれらの遺伝子記述。
【図３】[0011]  図面３は、ＭＥＬＫが乳癌において最上位に過剰発現される遺伝子であって、注目すべき予後的価値を有することを図解する。  [0012]  （Ａ）乳癌では、ＭＥＬＫが過剰発現されている。ＴＣＧＡ乳癌コホートにおいて、正常乳腺（ｎ＝６１）と浸潤性乳管癌（ｎ＝３９２）の間でＭＥＬＫ発現について解析した（Koboldt et al., 2012）。各円が個々の標本を表す。各群中の実線は、四分位範囲付きのメジアンを示す。スチューデントの両側ｔ検定よりｐ値を入手した。正常乳腺と比べた悪性乳腺におけるＭＥＬＫ過剰発現についてのｐ値が測定した全２０，４２３種の遺伝子の中で２９位にあることに注目されたい。（Ｂ）ＭＥＬＫ発現は、乳癌の組織学的悪性度（histologic grade）と相関する。ＭＥＬＫの発現を異なる組織学的悪性度の乳腺腫瘍の間で比較した。各群中の実線は、四分位範囲付きのメジアンを示す。ｐ値を一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）で計算した。ＭＥＬＫ発現と疾患悪性度の間の相関性についてのｐ値が、測定した全１２，６２４種の遺伝子の中で３位（Hatzis コホート）と８位（Desmedt コホート）にあって、測定した全１９，５７４種の遺伝子の中で７位（Bittner コホート）にあることに注目されたい。（Ｃ）３つの独立した乳癌患者コホートにおける全生存率のカプラン・マイヤー（Kaplan-Meier）分析。標本を２つの群、ＭＥＬＫの発現が高い群（上位６０％）と低い群（下位４０％）へ分けた。ログランク検定よりｐ値を入手し、GraphPad Prism バージョンを使用してハザード比（ＨＲ）を計算した。（Ｄ）３つの独立した乳癌患者コホートにおける無転移生存率のカプラン・マイヤー分析。標本を（Ｃ）と同様に分けた。ログランクｐ値とハザード比（ＨＲ）を示す。（Ｅ）基底細胞様乳癌における最高のＭＥＬＫ発現。ＰＡＭ５０（Parker et al., 2009）を使用して、各コホート中の標本を５種の別個の分子サブタイプへ分類した。各群中の実線は、四分位範囲付きのメジアンを示す。＊＊＊ｐ＜０．０００１。＊ｐ＜０．０５。（Ｆ）ＭＥＬＫの発現とエストロゲン受容体（ＥＲ、又はＥＳＲ１）のそれの間の逆相関性。各円は、１つの個別のヒト乳腺腫瘍標本を表す（ｎ＝２９５）。GraphPad Prism によって相関分析を実施した。遺伝子発現の全データをOncomine（Rhodes et al., 2004）よりダウンロードして解析した。引用したデータセットの原著は、下記の表Ｓ１に収載する。
【図４】[0013]  図面４は、ＭＥＬＫが乳癌において最上位で過剰発現される遺伝子であって、高い予後的価値を有することを例解する。  [0014]  （Ａ）ＭＥＬＫは、乳腺腫瘍において正常乳腺組織におけるより高いレベルで発現される。（Ｂ）ＭＥＬＫ発現は、疾患の組織学的悪性度と正に相関する。示したｐ値は、７位（測定した全１９，５７４種の遺伝子の中で、Bittner コホート）と３位（測定した全１２，６２４種の遺伝子の中で、Hatzis コホート）にある。（Ｃ）ＭＥＬＫ発現は、転移の予測となる。指定コホートの標本を高ＭＥＬＫ群と低ＭＥＬＫ群へ分けたが、これらは、ＭＥＬＫ発現の降順において上位６０％と下位４０％を表す。カプラン・マイヤー曲線をログランクｐ値とハザード比（ＨＲ）とともに示す。（Ｄ）高ＭＥＬＫ発現では、乳癌患者の低い全生存率が予測される。標本を（Ｃ）と同様にＭＥＬＫの高い群と低い群へ群分けした。ログランク検定よりｐ値を入手して、GraphPad Prism を使用してハザード比（ＨＲ）を計算した。（Ｅ）遺伝子発現プロファイリングによって定義される乳癌のサブタイプにおけるＭＥＬＫ発現。ＰＡＭ５０遺伝子サイン（Parker et al., 2009）に基づいて、標本をサブタイプへ分けた。「ｎｓ」は、「有意でない」を示す。「＊＊＊＊」ｐ＜０．０００１。（Ｆ）ＭＥＬＫの発現とエストロゲン受容体（ＥＲ、又はＥＳＲ１）のそれとの間の逆相関性。（Ｇ）トリプルネガティブ乳癌は、他のサブタイプより高いＭＥＬＫの発現を明示する。エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、又はヒト表皮成長因子２（ＨＥＲ２）の発現に基づいて、患者を疾患のサブタイプで数群へ分類した。全データを Oncomine（Rhodes et al., 2004）よりダウンロードして、再解析した。各パネル（Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ）中の実線は、四分位範囲付きのメジアンを示す。
【図５−１】[0015]  図面５は、ＭＥＬＫ過剰発現が腫瘍生成能を付与することを例解する。  [0016]  （Ａ）野生型ＭＥＬＫは、過剰発現される場合、発癌性である。ＨＭＥＣ−ＤＤ−ＮｅｕＴ細胞を、空（empty）ベクター、ミリストイル化又は野生型ＭＥＬＫで形質導入した。ヌードマウスの乳腺脂肪体へ細胞を移植した。生成した腫瘍の数と注射の回数を表に記載した。（Ｂ）Ｒａｔ１−ＤＤ−ＴＰ５３細胞におけるＭＥＬＫの過剰発現。この細胞にＧＦＰ（陰性対照として）、又は野生型ヒトＭＥＬＫ、又はｐ１１０αの発癌性対立遺伝子（Ｈ１０４７Ｒ）を安定的に導入した。これら遺伝子の異所性発現は、モロニー（Moloney）マウス白血病ウイルスの長い末端反復配列によって推進される。ｐ１１０α（Ｈ１０４７Ｒ）の発現によりＡｋｔリン酸化が高まることに注目されたい。β−チューブリンは、ローディング対照として役立つ。（Ｃ）軟寒天中でのコロニー形成アッセイ。指定の細胞を４０００個／ウェルの細胞密度で１２ウェルプレートに播種した。このプレートを３週後に採取した。上のパネルは、このコロニーの代表的な明視野像を示す。下のパネルは、ウェル当たりのコロニーの全数として示される、コロニー形成の定量分析を示す。ＥＶは、空ベクターを意味する。＊＊＊ｐ＜０．００１。（Ｄ）ＭＥＬＫ過剰発現は、腫瘍生成を推進する。指定の細胞を免疫不全マウスへ移植して、３週後に皮下腫瘍を採取した。上のパネルと下のパネルは、腫瘍の画像と腫瘍重量の定量値をそれぞれ示す。＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図５−２】（Ｅ）Ｒａｔ１−ＤＤ−ＴＰ５３細胞における野生型及びキナーゼ不活性ＭＥＬＫの過剰発現。細胞にｐＷｚｌ空ベクター（ＥＶ）又はＦｌａｇタグ付きＭＥＬＫ収容ｐＷｚｌ（これは、モロニーマウス白血病ウイルスの長い末端反復配列によって推進されるヒトＭＥＬＫを発現する）を安定的に導入した。（Ｆ）キナーゼ不活性ＭＥＬＫの過剰発現は、足場非依存性の細胞増殖を付与しない。コロニー形成アッセイを（Ｃ）のように行った。左パネルと右パネルは、コロニーの代表的な明視野像と定量分析をそれぞれ示す。＊＊＊ｐ＜０．００１。（Ｇ）触媒能のないＭＥＬＫの過剰発現は、腫瘍成長を誘導しない。皮下異種移植を（Ｅ）のように実施した。左パネルと右パネルは、腫瘍画像と腫瘍重量の定量をそれぞれ示す。＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図６−１】[0017]  図面６は、基底細胞様乳癌細胞の増殖にＭＥＬＫが必要であることを実証する。  [0018]  （Ａ）基底乳癌細胞系は、ルミナル癌細胞より高い発現レベルのＭＥＬＫを有する。１６種の確立された基底乳癌細胞系と２０種のルミナル乳癌細胞系の間でのＭＥＬＫ  ｍＲＮＡデータは、Neve データセット（Neve et al., 2006）に由来した。各群の実線は、平均±ＳＥＭを表す。ｐ値をスチューデントのｔ検定によって計算した。（Ｂ）ＭＥＬＫのタンパク質存在量は、ルミナル乳癌細胞より基底乳癌細胞においてより高い。指定の細胞からの溶解液をイムノブロッティングへ処した。ローディング対照としてα−チューブリンを使用した。（Ｃ）２つの基底乳癌細胞系（ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＢＴ−５４９）におけるＭＥＬＫの条件付きノックダウンは、ＭＥＬＫ発現を抑制して、細胞増殖を阻害する。イムノブロッティングの左パネルは、未処理であるか又はドキシサイクリン（Ｄｏｘ，１００ｎｇ／ｍｌ）で３日間処理した細胞におけるＭＥＬＫ発現を示す。中央パネルと右パネルは、プレートのクリスタルバイオレット染色とその染色の定量をそれぞれ示す。エラーバーは、標準偏差を示す。「＊」は、０．００１未満のｐ値を示す。
【図６−２】（Ｄ）２つのルミナル乳癌細胞系（ＭＣＦ−７、Ｔ４７Ｄ）におけるＭＥＬＫの条件付きノックダウンは、ＭＥＬＫ発現を阻害するが、細胞増殖に対してはほとんど効果を発揮しない。このパネルは、（Ｃ）と同様に配置されている。＊ｐ＜０．００１。（Ｅ）ｓｈＭＥＬＫ抵抗性ＭＥＬＫの発現は、ＭＥＬＫサイレンシングによって誘導される表現型をレスキューする。ｔｅｔ−ｏｎ−ｓｈＭＥＬＫが安定したＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞に、ＧＦＰをコードするテトラサイクリン誘導遺伝子発現ベクター、又は野生型ｓｈＭＥＬＫ抵抗性ＭＥＬＫ、又はキナーゼ不活性ｓｈＭＥＬＫ抵抗性ＭＥＬＫを安定的に導入した。外因性のＭＥＬＫにＦｌａｇのタグを付けると、タンパク質ゲル上でのＭＥＬＫのわずかなシフトを引き起こすことに留意されたい。左パネル、中央パネル、及び右パネルは、イムノブロッティング、クリスタルバイオレット染色、及び細胞増殖の定量分析をそれぞれ示す。
【図７−１】[0019]  図面７は、基底細胞様乳癌細胞の増殖にＭＥＬＫが必要であることを実証する。  [0020]  （Ａ）トリプルネガティブ乳癌細胞系は、ＥＲ／ＰＲ＋乳癌細胞より高いレベルのＭＥＬＫを有する。２１種の確立されたトリプルネガティブ乳癌細胞系と１４種のＥＲ／ＰＲ＋乳癌細胞系の間でのＭＥＬＫ  ｍＲＮＡデータは、Neve データセット（Neve et al., 2006）より入手した。各群の実線は、平均±ＳＥＭを表す。ｐ値をスチューデントのｔ検定によって計算した。（Ｂ）２つの追加ＢＢＣ細胞系におけるＭＥＬＫの条件付きノックダウンは、細胞増殖を抑制する。イムノブロッティングの左パネルは、ドキシサイクリン（１００ｎｇ／ｍｌ）へ３日間曝露した細胞におけるＭＥＬＫ発現を示す。右パネルは、細胞増殖の定量を表し、エラーバーは、標準偏差を示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
【図７−２】（Ｃ）ｓｈＭＥＬＫ抵抗性ＭＥＬＫ  ｃＤＮＡ（ＭＥＬＫ−Ｒ）の産生。上パネル、ｓｈＭＥＬＫ２によって標的指向される２１マー配列を太字でマークする。サイレント突然変異は、矢印によって示す。下パネル、指定のｓｈＲＮＡ（スクランブル又はｓｈＭＥＬＫ）を、ＧＦＰをコードするプラスミド、又は親のＭＥＬＫ、又はＭＥＬＫ−Ｒと同時トランスフェクトした。イムノブロッティングのために細胞溶解液を採取した。親の野生型ＭＥＬＫでなくて、ＭＥＬＫ−ＲがｓｈＭＥＬＫへ抵抗することに注目されたい。
【図８−１】[0021]  図面８は、基底細胞様乳癌細胞の悪性腫瘍成長にＭＥＬＫが必要であることを図解する。  [0022]  （Ａ）ＭＥＬＫノックダウンは、足場依存性の細胞成長を抑制する。指定の細胞を０．３％寒天に播種して、１００ｎｇ／ｍｌドキシサイクリンの有り無しで処理した。左パネルと中央パネルは、コロニーのクリスタルバイオレット染色とコロニーの明視野像をそれぞれ示す。右パネルは、１２ウェルプレートのウェルあたりのコロニー数を示す。エラーバーは、標準偏差を表す。＊ｐ＜０．００１。
【図８−２】（Ｂ，Ｃ）ＭＥＬＫの条件付きノックダウンは、腫瘍成長を損なう。安定したｔｅｔ−ｏｎ−ｓｈＭＥＬＫを有するＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞（Ｂ）又はＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（Ｃ）をヌードマウスの乳腺脂肪体へ同所性移植した。このマウスの半数に注射の二日目よりドキシサイクリン補充飲料水を与えた。このヒストグラムは、処理後７週で測定した腫瘍の体積又は重量を示す。エラーバーは、標準誤差を表す。（Ｄ〜Ｇ）定着した腫瘍におけるＭＥＬＫのノックダウンは、基底細胞腫瘍（ＭＤＡ−ＭＢ−４６８，ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）において腫瘍成長を損ねて退縮の引き金になるが、ルミナル腫瘍（Ｔ４７Ｄ，ＭＣＦ−７）においてはそうならない。指定の細胞をマウスの乳腺脂肪体へ移植した。腫瘍が２００ｍｍ３の平均サイズへ成長したとき、マウスを２つの群へ無作為に分けて、１つの群にドキシサイクリンを投与した。処理後の指定日に腫瘍サイズを測定した。＊は、ｐ＜０．００１を意味する。エラーバーは、標準誤差を表す。
【図９】[0023]  図面９は、基底細胞様乳癌細胞の悪性腫瘍成長にＭＥＬＫが必要であることを図解する。  [0024]  安定したｔｅｔ−ｓｈＭＥＬＫを有する指定の細胞に由来する乳腺腫瘍を担うマウスを未処理とするか又はドキシサイクリン補充水で４日間処理した。腫瘍溶解液をイムノブロッティングに使用して、α又はβ−チューブリンをローディング対照として役立てた。
【図１０】[0025]  図面１０は、ＭＥＬＫ阻害が細胞死と有糸分裂妨害を引き起こすことを図解する。  [0026]  （Ａ）イムノブロッティングアッセイにより、ＭＥＬＫ阻害によって誘導されるアポトーシスマーカーが明らかになる。指定の細胞を未処理のままにするか又は１００ｎｇ／ｍｌのドキシサイクリンで４日間処理した。細胞溶解液を調製して、指定の抗体を使用するイムノブロッティングへ処した。（Ｂ）ＭＥＬＫ阻害は、ＤＮＡ断片化を誘導する。指定の安定ｓｈＲＮＡを有するＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞を（Ａ）のように処理して、固定とＤＡＰＩでの染色を続けた。明るくて粒子状の染色がＤＮＡ断片化を示すことに注目されたい。（Ｃ）ＭＥＬＫ阻害は、カスパーゼ依存性の細胞死を引き起こす。ｓｈＭＥＬＫ含有ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞を未処理とするか又は１００ｎｇ／ｍｌのドキシサイクリンで４日間処理し、最後の２日間は、４０μＭ  ｚＶａｄ−ｆｍｋ又は担体で処理した。イムノブロッティングのために溶解液を調製し、β−チューブリンをローディング対照とした。（Ｄ）ＭＥＬＫ阻害は、基底乳癌細胞において選択的に細胞死を誘導する。指定の細胞を未処理にするか又はドキシサイクリンで４日間処理した後で、イムノブロッティングのために細胞溶解液を調製した。ＢＴ５４９では、ＭＥＬＫサイレンシングによりアポトーシスマーカー（切断ＰＡＲＰ）の出現が誘導されるが、ＭＣＦ７細胞においてはそれが誘導されないことに注目されたい。（Ｅ）ＭＥＬＫ阻害は、４ｎ  ＤＮＡを有する細胞の蓄積を誘導する。ｓｈＭＥＬＫ含有ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞を未処理にするか又はドキシサイクリンで５日間処理した。細胞周期分析とイムノブロッティングのために試料を調製した。左パネルは、代表的な細胞周期分布を示し；中央のヒストグラムは、４ｎ  ＤＮＡ含有細胞（％）の定量を示し；そして右パネルは、イムノブロッティングを示す。ＭＥＬＫノックダウンが４ｎ  ＤＮＡ含有細胞の蓄積、並びに有糸分裂マーカーの発現を誘導することに注目されたい。（Ｆ）ＭＥＬＫ阻害によって誘導される欠損性のサイトキネシス。指定の細胞を未処理のままにするか又はドキシサイクリンで４日間処理して、固定とＤＡＰＩ染色を続けた。２０倍の対物レンズで画像を獲得した。各円は、無作為に選択された単一視野を表す（計数した全細胞数は、各群につき＞５００）。このデータは、２個以上の核を有する細胞の百分率を示す。実線は、メジアン±ＳＥＭを示す。（Ｇ）ＭＥＬＫ阻害は、有糸分裂における多面性欠損を誘導する。抗β−チューブリン（緑色）とＤＡＰＩ（ＤＮＡ）で染色した細胞より蛍光画像を入手した。（Ｈ）時間経過微視分析。安定したｓｈＭＥＬＫとヒストン２Ｂ−ＧＦＰを有するＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞を未処理のままにするか又はドキシサイクリンで３日間処理してから、時間経過イメージングへ処した。時間は、時間：分で示す。上パネルは、対照の有糸分裂細胞を示し；中央パネルは、２つの核が細胞死を受けている細胞を示し；下のフレームでは、細胞が後期へ進行し得ず、細胞死で終わっている。
【図１１】[0027]  図面１１は、ＭＥＬＫ阻害が細胞死と有糸分裂妨害を引き起こすことを図解する。  [0028]  （Ａ）未処理であるか又はＭＥＬＫサイレンシングの誘導のためにドキシサイクリンで処理した指定細胞の明視野像。（Ｂ）ｔｅｔ−ｓｈＭＥＬＫ含有ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞のＤＡＰＩ染色と明視野像。細胞を未処理とするか又はドキシサイクリンで４日間処理して、最後の２日間にｚＶａｄ−ｆｍｋ又は担体でさらに処理した。（Ｃ）ＢＴ５４９細胞におけるＭＥＬＫの条件付きノックダウンは、４ｎ  ＤＮＡ含有細胞の蓄積とＧ２／Ｍ停止を誘導する。ｔｅｔ−ｓｈＭＥＬＫ含有ＢＴ５４９細胞をドキシサイクリン無しで、又はドキシサイクリンで５日間処理した。細胞をＦＡＣＳによる細胞周期分析とイムノブロッティングへ処した。左パネル、中央パネル、及び右パネルは、イムノブロッティング、代表的な細胞周期分布ヒストグラム、及び４ｎ  ＤＮＡ含有細胞（％）の定量をそれぞれ示す。実線は、メジアン±ＳＤを示す。（Ｄ）ＤＡＰＩ染色により、多核の細胞が明らかになる。ｔｅｔ−ｓｈＭＥＬＫ含有ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞を未処理とするか又はドキシサイクリン（１００ｎｇ／ｍｌ）で処理した。矢印は、２個以上の核がある細胞を示す。
【図１２−１】[0029]  図面１２は、ＦｏｘＭ１が基底細胞様乳癌において過剰発現されて、ＭＥＬＫの発現を調節することを図解する。  [0030]  （Ａ）ＭＥＬＫの細胞周期依存性の発現。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を未処理のままとする（非同期化、Ａｓ）か又は１００ｎｇ／ｍｌのノコダゾールで１８時間処理した。有糸分裂細胞（Ｍ）を振り落とし操作（shake-off）によって採取すると、付着した細胞では、Ｇ２期（Ｇ２）が豊富であった。有糸分裂細胞のサブセットを洗浄してノコダゾールを除去して、付着した細胞（Ｍ＋４ｈ）を４時間のインキュベーション後に採取した。左パネルと右パネルは、細胞周期のＦＡＣＳ分析とイムノブロッティングを示す。（Ｂ）基底細胞様乳癌におけるＦｏｘＭ１の高発現。指定のデータセット中の標本をＰＡＭ５０遺伝子サイン（Parker et al., 2009）に基づいてサブタイプへ群分けした。＊＊＊ｐ＜０．０００１。＊ｐ＜０．０５。
【図１２−２】（Ｃ）ＦｏｘＭ１の発現とＭＥＬＫの発現は、密接に相関している。ＭＥＬＫの発現をＦｏｘＭ１のそれに対してプロットした。各円は、１つの個別のヒト乳腺腫瘍標本を表し（ＴＣＧＡデータセットでは、ｎ＝３４９；Bittner データセットでは、ｎ＝３３８）、赤色と緑色は、基底細胞様乳癌と他のサブタイプをそれぞれ示す。GraphPad Prism によって相関分析を実施した。（Ｄ）ＦｏｘＭ１のノックダウンは、ＭＥＬＫ発現を抑制する。対照ｓｉＲＮＡ又はＦｏｘＭ１に標的指向するｓｉＲＮＡのいずれかで細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションから３日後に溶解液を採取して、イムノブロッティングへ処した。ＦｏｘＭ１の転写標的として知られるオーロラ（aurora）キナーゼＡ（ＡＵＲＫＡ）（Lefebvre et al., 2010）を陽性対照として使用した。
【図１２−３】（Ｅ）ＦｏｘＭ１阻害は、ＭＥＬＫの発現を下方調節する。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を指定時間の間、担体（０．１％  ＤＭＳＯ）又は１０μＭチオストレプトン（ＦｏｘＭ１の阻害剤）（Hegde et al., 2011）で処理した。イムノブロッティングのためにタンパク質溶解液を調製した。（Ｆ）上パネル：ＭＥＬＫプロモーター中の推定ＦｏｘＭ１結合部位。示したヌクレオチド配列は、ＭＥＬＫプロモーター中の推定ＦｏｘＭ１結合部位（上）とＦｏｘＭ１コンセンサス結合部位（下）である。ヌクレオチドの番号は、ＭＥＬＫの転写開始部位（＋１）に対する。下パネル：ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞におけるＭＥＬＫプロモーターのクロマチン免疫沈降アッセイ。対照のウサギＩｇＧとＦｏｘＭ１に対する抗体を使用した。ＣＤＣ２５Ｂのプロモーター領域用のプライマーを陽性対照として使用した。
【図１３】[0031]  図面１３は、ＦｏｘＭ１が基底細胞様乳癌において過剰発現されて、ＭＥＬＫの発現を調節することを図解する。  [0032]  （Ａ）ＭＥＬＫの細胞周期依存性の発現。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞を未処理のままとする（非同期化、Ａｓ）か又は１００ｎｇ／ｍｌのノコダゾールで１８時間処理した。有糸分裂細胞（Ｍ）を振り落とし操作によって採取し、付着した細胞をＧ２期（Ｇ２）が豊富な細胞として採取した。有糸分裂細胞の一部を洗浄してノコダゾールを除去して、４時間インキュベーションした後で、付着した細胞（Ｍ＋４ｈ）を採取した。この調製した細胞より溶解液を調製して、指定の抗体を使用するイムノブロッティングへ処した。（Ｂ）遺伝子発現プロファイリングによって定義される乳癌のサブタイプにおけるＦｏｘＭ１発現。２つの指定コホート中の標本をＰＡＭ５０遺伝子サイン（Parker et al., 2009）に基づいてサブタイプへ群分けした。「＊＊＊＊」は、ｐ値＜０．０００１を意味する。（Ｃ）ＦｏｘＭ１の発現は、他のサブタイプよりトリプルネガティブ乳癌において有意に高い。エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、又はヒト表皮成長因子２（ＨＥＲ２）のタンパク質発現に基づいて、標本をサブタイプへ分類した。指定のｐ値は、トリプルネガティブ乳癌中のＭＥＬＫ発現をＥＲ／ＰＲ＋乳癌中のそれと比較することから得た。（Ｄ）ＦｏｘＭ１の発現とＭＥＬＫの発現は、密接に相関している。ＭＥＬＫの発現をＦｏｘＭ１のそれに対してプロットした。各円は、個別のヒト乳腺腫瘍標本を表す（van der Vijver データセットでは、ｎ＝２９５；Hatzis データセットでは、ｎ＝５０８）。GraphPad Prism によって相関分析を実施した。（Ｅ）チオストレプトンによるＦｏｘＭ１阻害は、ＭＥＬＫの転写を減少させる。細胞を担体又はチオストレプトンで１６時間処理して、全ＲＮＡを抽出して、ｃＤＮＡ合成を続けた。指定遺伝子用のプライマーを使用して、定量ＰＣＲを実施した。エラーバーは、標準偏差を示す。「＊」は、ｐ値＜０．０１を意味する。
【図１４】[0033]  図面１４は、基底乳癌サブタイプにおいてＭＥＬＫが高度に発現されていることを図解する。
【図１５】[0034]  図面１５は、ＥＲ陰性乳癌細胞におけるＭＥＬＫの高い発現レベルを示す。（Ａ）モデル細胞系におけるＭＥＬＫ遺伝子発現。（Ｂ）ＥＲ−細胞系における増加したＭＥＬＫ発現を示す定量ＰＣＲ。
【図１６】[0035]  図面１６は、ＢＴ５４９（ＥＲ−，高ＭＥＬＫ）乳癌細胞がＭＥＬＫに依存することを示す。
【図１７】[0036]  図面１７は、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＥＲ−，高ＭＥＬＫ）乳癌細胞がＭＥＬＫに依存することを示す。
【図１８】[0037]  図面１８は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＥＲ−，高ＭＥＬＫ）乳癌細胞がＭＥＬＫに依存することを示す。
【図１９】[0038]  図面１９は、ＭＣＦ７（ＥＲ＋，低ＭＥＬＫ）乳癌細胞がＭＥＬＫに依存しないことを示す。
【図２０】[0039]  図面２０は、正常乳腺上皮細胞（ＨＭＥＣ）と不死化ＭＣＦ１０Ａ細胞がＭＥＬＫに依存しないことを示す。
【図２１】[0040]  図面２１は、ＭＥＬＫ依存性ＴＮＢＣ系の増殖にキナーゼ活性が必要とされ得ることが部分レスキューによって示唆されることを図解する。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
[0041]  本発明は、母性胚性ロイシンジッパーキナーゼ（ＭＥＬＫ）が、持続性の腫瘍生成能のために、ＥＲ陰性乳癌細胞、基底細胞様（ＥＲ／ＰＲ陰性）乳癌細胞、及びトリプルネガティブ乳癌細胞において必須であるが、ルミナル乳癌細胞においては必須でない発癌遺伝子キナーゼとして同定されたという発見に関連する。加えて、ＭＥＬＫは、細胞の有糸分裂進行に不可欠なものとして同定されて、ＦｏｘＭ１転写因子によって直接調節されている。本発明はまた、乳癌細胞の成長又は増殖を阻害する方法と、乳癌を有する被験者を治療するための方法に関する。さらに本発明は、ＭＥＬＫ阻害剤又はＦｏｘＭ１阻害剤での治療から利益を得る可能性がある、乳癌を有する被験者を同定する方法に関する。
【００１０】
[0042]  ＭＥＬＫ
[0043]  母性胚性ロイシンジッパーキナーゼ（ＭＥＬＫ）は、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）セリン／スレオニンキナーゼファミリーの非典型的なメンバーである。ＭＥＬＫは、幹細胞再生、細胞周期進行、及びプレｍＲＮＡスプライシングに関連すると示唆されてきた（遺伝子ＩＤ  ９８３３）。
【００１１】
[0044]  ＦｏｘＭ１
[0045]  哺乳動物の転写因子のフォークヘッド（Forkhead）ボックス（Ｆｏｘ）ファミリーには、ウィングド（winged）ヘリックスＤＮＡ結合ドメインにおいて相同性を共有する、５０種より多い哺乳動物タンパク質が含まれる。ＦｏｘＭ１転写因子の発現は、細胞周期のＧ１期に誘導されて、その発現は、Ｓ期と有糸分裂の間も継続する。ＦｏｘＭ１は、すべての増殖中の哺乳動物細胞と腫瘍由来細胞系において発現されて、その発現は、細胞周期を脱した最終分化細胞において消失する。ＦｏｘＭ１タンパク質の転写活性は、Ｒａｓ−ＭＡＰＫシグナル伝達に依存している（Wang et al. 2005）。ＦｏｘＭ１は、多くのＧ２期特異的遺伝子の発現を調節して、染色体安定性に必須である。ＦｏｘＭ１の損失は、Ｇ２期の遅延、染色体の誤分離、及び度重なるサイトキネシスの失敗が含まれる、多面的な細胞周期障害をもたらす。適時の有糸分裂エントリーには、ＦｏｘＭ１によるサイクリンＢの転写活性化が必須である（Laoukili et al. 2005）。
【００１２】
[0046]  乳癌
[0047]  乳癌は、組織学、治療応答、及び患者の治療転帰において高度の多様性がある、異質性疾患である。転写プロファイリング解析により、乳癌の少なくとも５種の「固有」サブタイプ：正常乳腺様、ルミナルＡ、ルミナルＢ、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ高濃度、及び基底細胞様乳癌（ＢＢＣ）が再現性よく同定されてきた（Perou et al., 2000; Sorlie et al., 2001）。そのルミナル対照物とは異なって、ＢＢＣ細胞では、エストロゲン受容体
（ＥＲ）とプロゲステロン受容体（ＰＲ）の発現が欠落しているので、臨床的に定義される「トリプルネガティブ」乳癌（ＴＮＢＣ）（これも、ＥＲ／ＰＲ発現の欠損によって特性決定される）と重なる部分が多い（Foulkes et al. 2010; Perou 2011）。ルミナル乳
癌の治療にきわめて有効である標的指向療法に対してＢＢＣ又はＴＮＢＣ細胞が相対的に無反応であるのは、これらの分子標的が欠損しているためである。本発明の１つの側面は、エストロゲン受容体陰性（ＥＲ−）である癌細胞を有する乳癌被験者を同定する。本発明の別の側面は、プロゲステロン受容体陰性（ＰＲ−）である癌細胞を有する乳癌被験者を同定する。本発明のなお別の側面は、ＨＥＲ２陰性（ＨＥＲ２−）である癌細胞を有する乳癌被験者を同定する。いくつかの態様では、ＥＲ−でＰＲ−である被験者を同定する。いくつかの態様では、ＥＲ−、ＰＲ−、及びＨＥＲ２−である被験者を同定する。
【００１３】
[0048]  被験者のＥＲ、ＰＲ、及びＨＥＲ２状況を判定するために免疫組織化学法又はイムノブロッティング法を使用してよい。他の方法も使用してよい。使用し得る例示のＥＲ抗体は、１Ｄ５抗体であり、使用し得る例示のＰＲ抗体は、Ｃｌｏｎｅ  Ｐｇｒ６３６であり、そして使用し得る例示のＨＥＲ２検定法は、ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔＴＭ（DAKO N
orth America，カリフォルニア州カーピンテリア）である。
【００１４】
[0049]  阻害剤
[0050]  本明細書に使用するように、乳癌細胞を「阻害する」、「阻害すること」、又は「その成長又は増殖を阻害する」という用語は、乳癌細胞の成長を遅らせること、妨げること、阻むこと、又は止めることを意味して、必ずしも乳癌細胞成長の完全な消失を含意しない。「阻害する」、「阻害すること」、等の用語は、２つの状態間の定量的な差異を示して、２つの状態間の少なくとも統計学的に有意な差を意味する。例えば、「乳癌細胞の成長を阻害するのに有効な量」は、その細胞の成長の速度が未処理細胞のそれより少なくとも統計学的に有意に異なるようになることを意味する。そのような用語は、本明細書において、例えば、細胞増殖の速度へ適用される。
【００１５】
[0051]  「ＭＥＬＫ阻害剤」又は「ＦｏｘＭ１阻害剤」という用語は、それぞれＭＥＬＫ又はＦｏｘＭ１の発現又は活性を阻害することが可能なあらゆる化合物、即ち、特に、その遺伝子の転写、ＲＮＡの成熟化、ｍＲＮＡの翻訳、そのタンパク質の翻訳後修飾、そのタンパク質の酵素活性、それの基質との相互作用、等を阻害するあらゆる化合物を意味する。
【００１６】
[0052]  阻害剤の非限定的な例には、ＲＮＡｉ、リボザイム、アンチセンス分子、アプタマー、抗体、又はあらゆる種類のアゴニストが含まれる。いくつかの態様では、ＭＥＬＫ又はＦｏｘＭ１、又はＭＥＬＫとＦｏｘＭ１の両方の発現又は活性を阻害するために、ＲＮＡ干渉を使用してよい。ＲＮＡ干渉に媒介することが可能な分子には、限定されないが、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、及びショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が含まれる。本明細書に使用するように、ＲＮＡｉに媒介することが可能な分子は、ＲＮＡだけを含有する分子に限定される必要はなくて、「ｓｉＮＡ」分子、「低分子干渉核酸」と呼ばれる、化学修飾されたヌクレオチド及び非ヌクレオチドがさらに含まれる。しかしながら、ＲＮＡｉを支援するのにｓｉＮＡ分子内にリボヌクレオチドの存在を必要としない、このようなｓｉＮＡ分子は、単数又は複数の付着リンカー、又は２’−ＯＨ基の有る１以上のヌクレオチドを含有する、他の付着又は結合基、部分、又は鎖を有する可能性がある。ｓｉＮＡ分子には、ヌクレオチド位置の約５、１０、２０、３０、４０、又は５０％にリボヌクレオチドが含まれてもよい。
【００１７】
[0053]  「ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）」という用語は、上記に記載のＲＮＡｉに媒介することが可能な分子によって始動される配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングのプロセスに言及する（Fire et al., 1998, Nature, 391, 806-11）。細胞中の長い二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって、ダイサー（dicer）と呼ばれるリボヌクレアーゼＩＩＩ酵素の
活性が刺激される。ダイサーは、長いｄｓＲＮＡのｓｉＲＮＡの短片へのプロセシングに関与する（Bernstein et al., 2001, Nature, 409, 363-6）。ダイサー活性に由来するｓｉＲＮＡは、典型的には、長さが約２１〜２３個のヌクレオチドであって、約１９個の塩基対の二重鎖が含まれる。
【００１８】
[0054]  ＲＮＡｉ応答はまた、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）とよく言及される、ｓｉＲＮＡを含有するエンドヌクレアーゼ複合体を特徴とするが、これは、ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖に相補的な配列を有する一本鎖ＲＮＡの切断に媒介する。標的ＲＮＡの切断は、ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖に相補的な領域の中央で起こる（Elbashir et al., 2001, Nature, 411, 494-498）。ｓｉＲＮＡ媒介性ＲＮＡｉは、
多様な系で研究されてきた。ショウジョウバエの胚溶解液における最新の研究は、ｓｉＲＮＡの長さ、構造、化学組成、及び配列について、効率的なＲＮＡｉ活性に媒介するのに必須である特定の必要条件を明らかにした（Elbashir et al., 2001, EMBO J., 20, 6877
-88）。ＲＮＡｉの間、標的ｍＲＮＡの分解は、遺伝子発現の必然的な配列特異的阻害と
ともに誘導される。「低分子干渉性」又は「低分子干渉ＲＮＡ」又は「ｓｉＲＮＡ」という用語は、二本鎖ＲＮＡを形成する核酸に言及し、この二本鎖ＲＮＡは、同じ細胞において、そのｓｉＲＮＡが遺伝子又は標的遺伝子として発現されるとき、その遺伝子又は標的遺伝子の発現を抑制するか又は阻害する能力を有する。このように、「ｓｉＲＮＡ」は、相補的な鎖によって形成される二本鎖ＲＮＡに言及する。ハイブリダイズして二本鎖分子を形成するｓｉＲＮＡの相補的な部分は、典型的には、実質的又は完全な同一性を有する。１つの態様において、ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子に対して実質的又は完全な同一性を有して二本鎖ｓｉＲＮＡを形成する核酸に言及する。ｓｉＲＮＡの配列は、標的遺伝子の全長、又はそのサブ配列に一致する可能性がある。ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡの二重鎖部分のヌクレオチド配列が標的指向される遺伝子のヌクレオチド配列に対して実質的に相補的であるという意味で、その遺伝子へ「標的指向」される。ｓｉＲＮＡ配列の二重鎖は、ｓｉＲＮＡと標的ＲＮＡを相補的な塩基対合相互作用により一緒にするのに十分な長さである必要がある。本発明のｓｉＲＮＡは、多様な長さのものであってよい。ｓｉＲＮＡの長さは、好ましくは、１０個以上のヌクレオチドであって、標的ＲＮＡと安定的に相互作用するのに十分な長さであり；具体的には、１０〜３０個のヌクレオチド；より具体的には、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、及び３０個のように、１０と３０の間の任意の整数個のヌクレオチドである。「十分な長さ」は、期待条件下で企図される機能をもたらすのに十分大きな長さである、１０個以上のヌクレオチドのヌクレオチドを意味する。「安定的に相互作用する」という用語は、低分子干渉ＲＮＡの標的核酸との相互作用（例えば、生理学的条件下で標的中の相補的なヌクレオチドと水素結合を形成することによって）に言及する。
【００１９】
[0055]  ｓｉＲＮＡは、核酸配列によってコードされる場合があって、その核酸配列には、プロモーターが含まれる可能性もある。その核酸配列には、ポリアデニル化シグナルも含まれ得る。いくつかの態様において、ポリアデニル化シグナルは、合成の最小ポリアデニル化シグナルである。ｓｉＲＮＡのＲＮＡ二重鎖は、合成オリゴヌクレオチドを使用して、試験管内で構築してよい。
【００２０】
[0056]  いくつかの態様において、阻害剤は、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）配列であってよい。「ショートヘアピンＲＮＡ」又は「ｓｈＲＮＡ」という用語は、ＲＮＡ干渉を介して遺伝子発現を静止させるのに使用し得る強固な（tight）ヘアピンターン
になるＲＮＡ配列を有するＲＮＡ分子に言及する。このｓｈＲＮＡヘアピン構造は、細胞機構によってｓｉＲＮＡへ切断されてから、これがＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）へ結合する。この複合体は、それへ結合しているｓｉＲＮＡに適合するｍＲＮＡへ結合してそれを切断する。ｓｉＲＮＡの配列は、標的遺伝子の全長又はそのサブ配列に一致する可能性がある。ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡの二重鎖部分のヌクレオチド配列が上記に記載されるような標的指向される遺伝子のヌクレオチド配列に対して実質的に相補的であるという意味で、その遺伝子へ「標的指向」される。ｓｈＲＮＡは、組換えＤＮＡ技術を使用して、ベクター中へクローン化することができる。
【００２１】
[0057]  ｓｉＲＮＡは、合成オリゴヌクレオチド又は適正な転写酵素を使用して試験管内で構築しても、適正な転写酵素又は発現ベクターを使用して生体内で構築してもよい。ｓｉＲＮＡには、センスＲＮＡ鎖と相補的なアンチセンスＲＮＡ鎖が含まれ、これらは、標準的なワトソン・クリック型塩基対合相互作用によって一緒にアニールされて塩基対を形成する。本発明のｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖は、相補的な一本鎖ＲＮＡ分子であり得て、この相補的な塩基対を連結してｓｉＲＮＡを形成させるヘアピン構造が含まれ得る、２つの相補的な部分をコードする二本鎖（ｄｓ）ｓｉＲＮＡ又はＤＮＡポリヌクレオチドを形成する。好ましくは、ｄｓＲＮＡ又はＤＮＡポリヌクレオチドによって形
成されるｓｉＲＮＡの二重鎖領域には、約１５〜３０個の塩基対、より好ましくは、約１９〜２５個の塩基対が含まれる。このｓｉＲＮＡ二重鎖領域の長さは、１５と３０の間の任意の正の整数個のヌクレオチドであってよい。
【００２２】
[0058]  ｄｓＲＮＡに由来する本発明のｓｉＲＮＡには、部分精製ＲＮＡ、実質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、又は組換え産生ＲＮＡ、並びに、１以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換、及び／又は改変によって天然に存在するＲＮＡとは異なる、改変されたＲＮＡを含めてよい。このような改変には、ｓｉＲＮＡをヌクレアーゼ消化に対して抵抗性にする修飾を含めて、ｓｉＲＮＡの端（複数）への付加、又はｓｉＲＮＡの１以上の内部ヌクレオチドへの付加といった、非ヌクレオチド物質の付加が含まれる可能性がある。
【００２３】
[0059]  本発明のｓｉＲＮＡの一方又は両方の鎖には、３’オーバーハングが含まれる場合がある。本明細書に使用するように、「３’オーバーハング」は、ＲＮＡ鎖の３’端から延びる少なくとも１つの非対合ヌクレオチドに言及する。従って、ある態様において、ｓｉＲＮＡには、１〜約６個の長さのヌクレオチド（これには、リボヌクレオチド又はデオキシヌクレオチドが含まれる）、好ましくは１〜約５個の長さのヌクレオチド、より好ましくは１〜約４個の長さのヌクレオチド、そして特に好ましくは約２〜約４個の長さのヌクレオチドである、少なくとも１つの３’オーバーハングが含まれる場合がある。
【００２４】
[0060]  ｓｉＲＮＡ分子の両鎖に３’オーバーハングが含まれてよく、オーバーハングの長さは、それぞれの鎖で同じでも異なってもよい。好ましくは、３’オーバーハングは、ｓｉＲＮＡの両鎖に存在し得て、２個の長さのヌクレオチドである。３’オーバーハングはまた、分解に対して安定化される場合がある。例えば、オーバーハングは、アデノシン又はグアノシンヌクレオチドのようなプリンヌクレオチドを含めることによって、ピリミジンヌクレオチドの修飾類似体による置換によって安定化され得る（例えば、３’オーバーハング中のウリジンヌクレオチドの２’−デオキシチミジンでの置換は、寛容されて、ＲＮＡｉ分解の効率に影響を及ぼさない。特に、２’−デオキシチミジン中の２’ヒドロキシルの非存在は、組織培養基において、３’オーバーハングのヌクレアーゼ抵抗性を有意に高める。
【００２５】
[0061]  上記に記載したように、ｓｉＲＮＡのＲＮＡ二重鎖部分は、ヘアピン構造の一部であってよい。このヘアピン構造は、二重鎖を形成する２つの配列の間に位置するループ部分をさらに含有してよい。このループは、長さが変動する可能性がある。いくつかの態様において、ループは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、又は１３個の長さのヌクレオチドであり得る。ヘアピン構造はまた、３’オーバーハング部分又は５’オーバーハング部分を含有してよい。いくつかの態様において、オーバーハングは、０、１、２、３、４、又は５個の長さのヌクレオチドを含有する、３’又は５’オーバーハングである。
【００２６】
[0062]  本発明のｓｉＲＮＡは、当業者に知られたいくつかの技術を使用して入手し得る。例えば、ｓｉＲＮＡは、適正に保護されたリボヌクレオシドホスホロアミダイトと慣用のＤＮＡ／ＲＮＡ合成機を使用して、化学的に合成し得る。ｓｉＲＮＡは、２つの別個の相補的なＲＮＡ分子として合成しても、２つの相補的な領域がある単一のＲＮＡ分子として合成してもよい。合成ＲＮＡ分子又は合成試薬の市販供給業者には、Dharmacon Research（コロラド州ラファイエット、アメリカ）、Pierce Chemical（イリノイ州ロックフ
ォード、アメリカ）、Glen Research（バージニア州スターリング、アメリカ）、ChemGenes（マサチューセッツ州アッシュランド、アメリカ）、及び Cruachem（グラスゴー、イ
ギリス）が含まれる。
【００２７】
[0063]  送達系
[0064]  いくつかの態様において、ＭＥＬＫ阻害剤及び／又はＦｏｘＭ１阻害剤は、ベクターのような核酸送達系を使用して、細胞へ送達され得る。「ベクター」という用語は、ヘルパーウイルスのような適切な制御要素と結合するときに複製が可能であって、遺伝子配列を細胞間で移すことができる、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ウイルス、ビリオン、等のような、どの遺伝要素にも言及する。従って、この用語には、クローニングと発現の担体、並びに複製欠損ウイルスベクターが含まれる。当該技術分野では、多種類のベクターが存在して、公知である。
【００２８】
[0065]  「組換え」という用語は、例えば、細胞、又は核酸、タンパク質、又はベクターへの言及とともに使用される場合、その細胞、核酸、タンパク質、又はベクターが、異種の核酸又はタンパク質の導入、又はネイティブな核酸又はタンパク質の改変によって修飾されたこと、又は該細胞がそのように修飾された細胞に由来することを示す。従って、例えば、組換え細胞は、該細胞のネイティブ（非組換え）型の内部では見出されない遺伝子を発現するか、又は他のやり方では、異常に発現される、十分に発現されない、又は全く発現されないネイティブ遺伝子を発現する。
【００２９】
[0066]  「異種の」という用語は、核酸の諸部分への言及とともに使用される場合、該核酸が、互いに対する同じ関係では天然に見出されない、２以上のサブ配列を含むことを示す。例えば、その核酸は、典型的には、組換え的に産生され、関連の無い遺伝子由来の２以上の配列（例えば、ある供給源由来のプロモーターと別の供給源由来のコーディング領域）が新たな機能性核酸となるように配置される。同様に、異種タンパク質は、互いに対する同じ関係では天然に見出されない２以上のサブ配列を該タンパク質が含むことを示す（例、融合タンパク質）。
【００３０】
[0067]  「機能的に連結している」という用語は、選択された核酸配列（例えば、ｓｉＲＮＡ構築体をコードする）がプロモーターと近接して、該プロモーターがその選択された核酸配列の発現を調節することを可能にすることを意味する。一般に、プロモーターは、転写と翻訳の方向に関して、選択される核酸配列の上流に位置する。
【００３１】
[0068]  分子の「変異体」という用語は、ネイティブ分子の配列に実質的に類似している配列である。ヌクレオチド配列についての変異体には、遺伝暗号の縮重性のために、ネイティブタンパク質と同一のアミノ酸配列をコードする配列が含まれる。上記のような天然に存在する対立遺伝子変異体は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）やハイブリダイゼーション技術を用いるような、分子生物学技術の使用で同定することができる。変異体ヌクレオチド配列には、ネイティブタンパク質、並びにアミノ酸置換を有するポリペプチドをコードする、（例えば、部位特異的変異導入法を使用することによって産生されるような）合成的に誘導されるヌクレオチド配列も含まれる。一般に、本発明のヌクレオチド配列変異体は、ネイティブ（内因性）ヌクレオチド配列に対して少なくとも約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％までの配列同一性を有するものである。
【００３２】
[0069]  特別な核酸配列の「保守的に修飾される変異」という用語は、同一であるか又は本質的に同一であるアミノ酸配列をコードする核酸配列に言及する。遺伝暗号の縮重性の故に、どの所与のポリペプチドも、多数の機能的に同一の核酸によってコードされる。例えば、ＣＧＴ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡ、及びＡＧＧのコドンは、いずれもアミノ酸のアルギニンをコードする。従って、コドンによってアルギニンが特定されるどの位置でも、そのコドンは、コードされるタンパク質を変えることなく、記載の対応コドンのいずれへも変えることができる。このような核酸変異は、「保守的に修飾される変異」の１種である、「サイレント変異」である。ポリペプチドをコードする、本明細書に記載されるどの核酸配列も、他に特記する場合を除けば、あらゆる可能なサイレント変異を記
載する。当業者は、核酸中の各コドン（通常はメチオニンの唯一のコドンである、ＡＴＧを除く）を標準技術によって修飾して、機能的に同一の分子を産生することが可能であることを認められよう。従って、それぞれの記載配列においては、ポリペプチドをコードする核酸のそれぞれの「サイレント変異」が暗黙裡に了解されている。
【００３３】
[0070]  ２以上の核酸又はポリペプチド配列の文脈における「実質的に同一な」又は「実質的な同一性」という用語は、ある比較枠又は指定領域にわたって以下の配列比較アルゴリズムの１つを使用するか又はマニュアル並置と目視検査によって測定されるように、最大の対応について比較して並置する場合に、同一であるか又は同一である特定百分率（即ち、特定の領域にわたって、少なくとも約６０％、好ましくは６５％、７０％、７５％、好ましくは８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性）のアミノ酸残基又はヌクレオチドを有する、２以上の配列又はサブ配列に言及する。この定義は、その文脈が示す場合、ＤＮＡヌクレオチドへ相補的なＲＮＡヌクレオチドといった、配列の相補体（complement）へも類似して言及する。好ましくは、実質的な同一性は、少なくとも約６〜７個のアミノ酸又は２５個のヌクレオチドの長さである領域の範囲で存在する。
【００３４】
[0071]  パーセント配列同一性や配列類似性を判定するのに適しているアルゴリズムの例は、Altschul et al., 1977, Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402 に記載されている、Ｂ
ＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴは、本明細書に記載される諸変数とともに使用されて、本発明の核酸及びタンパク質についてのパーセント配列同一性を判定する。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、米国国立生物工学情報センター（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を通して一般に入手可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さの文字列（word）と並置させるときに、ある正値の閾値スコアＴに合致するか又はこれを満足させる、検索（query）配列中の長さＷの短い文字列を同定す
ることによって高スコア配列対（ＨＳＰ）を最初に同定することを含む。Ｔは、近傍文字列スコア閾値（neighborhood word score threshold）（Altschul et al., 上記）と呼ばれる。これらの初期の近傍文字列ヒットは、これらを含有するより長いＨＳＰを見出す検索を開始するためのシード（seeds）として機能する。この文字列ヒットは、累積アライ
ンメント・スコアが増加し得る限り、各配列に沿って両方向に延長される。ヌクレオチド配列では、変数Ｍ（合致残基対へのリワードスコア；いつでも＞０）と変数Ｎ（非合致残基へのペナルティスコア；いつでも＜０）を使用して計算される。アミノ酸配列では、累積スコアを計算するのに、スコアリングマトリックスを使用する。文字列ヒットの各方向への延長を停止するのは、累積アラインメント・スコアがその最大到達値から数量Ｘだけ低下する場合、この累積スコアが１つ以上の陰性スコアリング（negative-scoring）残基アラインメントの蓄積によりゼロ以下になる場合、又はどちらかの配列の末端に達する場合である。ＢＬＡＳＴアルゴリズムの変数、Ｗ、Ｔ、及びＸによって、上記アラインメントの感度及び速度が決定される。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列についての）は、デフォルトとして１１の文字列長さ（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列についてのＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして３の文字列長さ（Ｗ）、及び１０の期待値（Ｅ）、５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクス（Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89: 10919 (1989) を参照のこと）、５０のアラインメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝
５、Ｎ＝−４、及び両鎖の比較を使用する。
【００３５】
[0072]  ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計解析を実施する（例えば、Karlin and Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787 (1993) を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴニズムによって提供される類似性の１つの尺度は、２つのヌクレオチド又はアミノ酸の配列間の合致が偶然生じる確率の指標を提供する、最小合計確率（smallest sum probability）（Ｐ（Ｎ））である。例えば、ある核酸の参照核
酸への比較において、最小合計確率が約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、そして最も好ましくは約０．００１未満であれば、このテスト核酸は、参照配列に類似しているとみなされる。
【００３６】
[0073]  組換えＤＮＡは、特別な細胞中への導入に有用な任意の手順（例えば、物理学的又は生物学的な方法）によって、ｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡより構成される発現ベクターでのトランスフェクションによって宿主細胞（例、哺乳動物、細菌、酵母、又は昆虫の細胞）の中へ容易に導入して、本発明のＤＮＡ分子又は配列が宿主細胞によって発現されるように、その組換えＤＮＡがそのゲノム中へ安定的に組み込まれているか又はエピソーム性因子として存在している細胞を産生することが可能である。好ましくは、このＤＮＡは、宿主細胞中へベクターを介して導入される。宿主細胞は、好ましくは、真核生物起源（例、植物、哺乳動物、昆虫、酵母、又は真菌起源）であるが、非真核生物起源の宿主細胞も利用してよい。
【００３７】
[0074]  予め選択されたＤＮＡ又はＲＮＡ二重鎖を宿主細胞中へ導入するための物理学的な方法には、限定されないが、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、粒子衝撃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、イムノリポソーム、脂質、カチオン性脂質、リン脂質、又はリポソーム、等が含まれる。当業者には、ＤＮＡ又はＲＮＡ二重鎖を細胞中へ送達するのに、どの方法も使用し得ることがわかっている。
【００３８】
[0075]  ｓｉＲＮＡベクター
[0076]  本発明のｓｉＲＮＡはまた、２つの別々な相補的なＲＮＡ分子として、又は２つの相補的な領域がある単一のＲＮＡ分子として、組換えプラスミドより発現されてよい。
【００３９】
[0077]  本発明のｓｉＲＮＡを発現させるのに適したベクターの選択、このｓｉＲＮＡを発現させるための核酸配列をプラスミドの中へ挿入するための方法、及びこの組換えプラスミドを目的の細胞へ送達するための方法は、当該技術分野の技術範囲内にある。例えば、Sambrook et al. には、組換えＤＮＡベクターを構築する方法とＤＮＡの産生の方法を見出すことができる。
【００４０】
[0078]  本発明のｓｉＲＮＡは、プラスミドベクター中へクローン化されて、どの好適なプロモーターを使用しても発現される、ポリヌクレオチド配列であってよい。本発明のｓｉＲＮＡをプラスミドより発現させるのに適したプロモーターには、限定されないが、Ｈ１及びＵ６  ＲＮＡ  ｐｏｌＩＩＩプロモーター配列とウイルスプロモーター（ウイルスＬＴＲ、アデノウイルス、ＳＶ４０、及びＣＭＶプロモーターが含まれる）が含まれる。特別な組織又は特別な細胞内環境におけるｓｉＲＮＡの発現のための組織特異的な誘導可能又は制御可能なプロモーターを含めて、当業者に知られた追加のプロモーターも使用してよい。ベクターには、限定されないが、イントロン、エンハンサー、及びポリアデニル化配列を含めて、追加の調節又は構造因子も含めてよい。これらの因子は、細胞中のｓｉＲＮＡの最適な性能を得るために所望されるようにＤＮＡに含めてよくて、そのＤＮＡの機能に必要であってもなくてもよい。ｓｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチドと一緒に、又は標的細胞への送達用の別のプラスミドとして、選択可能なマーカー遺伝子又はレポーター遺伝子を含めてもよい。当業者に知られた追加の因子も含めてよい。
【００４１】
[0079]  ｓｉＲＮＡは、上記に記載した諸因子が含まれ得るウイルスベクター中へクローン化されるポリヌクレオチド配列からも発現されてよい。細胞への遺伝子送達に適したウイルスベクターには、限定されないが、すべてのビリオンタンパク質の合成を指令することは可能であるが、感染粒子を作ることは不可能である、複製欠損ウイルスが含まれる
。例示のウイルスには、限定されないが、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レトロウイルス、及びアルファウイルスが含まれる。
【００４２】
[0080]  いくつかの態様において、本発明の実施では、他に示さなければ、当該技術分野の技量内にある、分子生物学、免疫学、微生物学、細胞生物学、及び組換えＤＮＡの慣用技術が利用されよう。例えば、Sambrook, Fritsch and Maniatis,「分子クローニング
：実験マニュアル（MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL）」（現行版)；「分子生
物学の最新プロトコール（CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY）（F. M. Ausubel et al. 監修（現行版)); 「酵素学の方法（METHODS IN ENZYMOLOGY）」シリーズ（アカデミックプレス社）；「ＰＣＲ２：実践アプローチ（PCR 2: A PRACTICAL APPROACH）」現
行版)；「抗体：実験マニュアルと動物細胞培養（ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL and
ANIMAL CELL CULTURE）」（R. I. Freshney, 監修（現行版)；「ＤＮＡクローニング：
実践アプローチ（DNA Cloning: A Practical Approach）」第Ｉ巻と第ＩＩ巻（D. Glover, 監修)；「オリゴヌクレオチド合成（Oligonucleotide Synthesis）」（N. Gait, 監修
、現行版);「核酸ハイブリダイゼーション（Nucleic Acid Hybridization）」（B. Hames
& S. Higgins, 監修、現行版)；「転写と翻訳（Transcription and Translation）（B. Hames & S. Higgins, 監修、現行版)；「基礎ウイルス学（Fundamental Virology）」第
２版、第Ｉ巻と第ＩＩ巻（B. N. Fields and D. M. Knipe, 監修）を参照のこと。
【００４３】
[0081]  診断／予後マーカー
[0082]  いくつかの側面において、本発明は、１以上の診断又は予後マーカーの試料（例、癌患者からの生体試料）中の存在を検出する方法に関する。当業者に知られている多様なスクリーニング方法を使用して、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びタンパク質の検出を含めて、試料中のマーカーの存在を検出することができる。下記に記載する技術を使用して、非癌被験者より入手される試料と比べた、患者より入手される試料中のＭＥＬＫ及び／又はＦｏｘＭ１の存在又は非存在、又は量を決定することができる。いくつかの態様では、患者について、ＥＲ、ＰＲ、及び／又はＨＥＲ２受容体の状況を検査することができる。ＥＲ−、ＥＲ−／ＰＲ−、又はＥＲ−／ＰＲ−／ＨＥＲ２−状況を有する患者における、ＭＥＬＫ及び／又はＦｏｘＭ１の同定、又はＭＥＬＫ及び／又はＦｏｘＭ１の発現レベルは、医師が患者への治療プロトコールを決定するのに役立つ。
【００４４】
[0083]  いくつかの態様において、マーカーは、ＭＥＬＫ及び／又はＦｏｘＭ１についての、対照と比べた遺伝子コピー数の増加、タンパク質発現の増加、ｍＲＮＡ発現の変化、等であり得る。
【００４５】
[0084]  非限定的な例を挙げると、ＥＲ−、ＥＲ−／ＰＲ−、又はＥＲ−／ＰＲ−／ＨＥＲ２−状況を有する患者では、ＭＥＬＫ阻害剤、ＦｏｘＭ１阻害剤、又はＭＥＬＫ阻害剤とＦｏｘＭ１阻害剤の両方で患者を治療することの必要性を示す場合がある。いくつかの態様では、ＭＥＬＫ、ＦｏｘＭ１、又はＭＥＬＫとＦｏｘＭ１の両方の発現が増加した患者では、ＭＥＬＫ阻害剤、ＦｏｘＭ１阻害剤、又はＭＥＬＫ阻害剤とＦｏｘＭ１阻害剤の両方で患者を治療することの必要性を示す場合がある。
【００４６】
[0085]  治療の方法
[0086]  様々な態様において、本発明は、癌を有する患者の治療の方法を提供する。この方法は、概して、阻害剤の投与を含む。１つの阻害剤は、ＭＥＬＫ阻害剤であり得る。１つの阻害剤は、ＦｏｘＭ１阻害剤であり得る。この方法には、ＭＥＬＫ阻害剤とＦｏｘＭ１阻害剤の投与が含まれる場合がある。
【００４７】
[0087]  「〜を治療すること」、「〜を治療する」、又は「治療」は、本発明の文脈では、障害又は疾患に関連した症状の軽減、又はこれらの症状のさらなる進行又は悪化の停
止、又は疾患又は障害の予防又は防止を意味する。例えば、本発明の文脈内では、成功裡の治療に、乳癌に関連した症状の軽減、又は乳癌のような疾患の進行の停止を含めてよい。
【００４８】
[0088]  いくつかの態様において、阻害剤は、ＭＥＬＫ又はＦｏｘＭ１を阻害することが可能な、化学化合物、天然又は合成の化合物、特に、植物、細菌、ウイルス、動物、真核生物、合成、又は半合成の起源の有機又は無機分子である。ＦｏｘＭ１を阻害する化学化合物の非限定的な例には、チオストレプトンが含まれる。
【００４９】
[0089]  本明細書に使用するように、「医薬的に許容される塩」という用語には、例えば、塩基性窒素原子のある化合物より、好ましくは有機酸又は無機酸との酸付加塩として生成される塩、特に、医薬的に許容される塩が含まれる。好適な無機酸は、例えば、塩酸のようなハロゲン酸、硫酸、又はリン酸である。好適な有機酸は、例えば、カルボン酸、ホスホン酸、スルホン酸又はスルファミン酸、例えば、酢酸、プロピオン酸、オクタン酸、デカン酸、ドデカン酸、グリコール酸、乳酸、フマル酸、コハク酸、マロン酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アミノ酸類（グルタミン酸又はアスパラギン酸のような）、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、メチルマレイン酸、シクロヘキサンカルボン酸、アダマンタンカルボン酸、安息香酸、サリチル酸、４−アミノサリチル酸、フタル酸、フェニル酢酸、マンデル酸、桂皮酸、メタン又はエタンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、エタン−１，２−ジスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、４−トルエンスルホン酸、２−ナフタレンスルホン酸、１，５−ナフタレン−ジスルホン酸、２又は３−メチルベンゼンスルホン酸、メチル硫酸、エチル硫酸、ドデシル硫酸、Ｎ−シクロヘキシルスルファミン酸、Ｎ−メチル−、Ｎ−エチル−、又はＮ−プロピル−スルファミン酸、又は他の有機プロトン酸（アスコルビン酸のような）である。
【００５０】
[0090]  本発明の化合物は、単独で使用しても、医薬的に許容される担体又は賦形剤と一緒の組成物において使用してもよい。本発明の医薬組成物は、１以上の医薬的に許容される担体と一緒に製剤化される、治療有効量の化合物を含む。本明細書に使用するように、「医薬的に許容される担体」という用語は、無害で不活性の固体、半固体、又は液体のあらゆる種類の充填剤、希釈剤、被包化材料、又は製剤化助剤を意味する。医薬的に許容される担体として役立つ可能性がある材料のいくつかの例は、乳糖、ブドウ糖、及びショ糖のような糖類；トウモロコシデンプン及びジャガイモデンプンのようなデンプン類；セルロースと、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、及び酢酸セルロースのようなその誘導体；トラガカント粉末；麦芽；ゼラチン；タルク；ココア脂及び坐剤ワックスのような賦形剤；落花生油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、及び大豆油のような油剤；プロピレングリコールのようなグリコール類；オレイン酸エチル及びラウリル酸エチルのようなエステル類；寒天；水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムのような緩衝化剤；アルギン酸；発熱物質除去蒸留水；等張生理食塩水；リンゲル液；エチルアルコール、及びリン酸緩衝溶液剤、並びに、ラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウムのような他の無害で適合可能な滑沢剤、並びに着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤及び芳香剤である。保存剤と抗酸化剤も、製剤開発者の判断に従って組成物中に存在し得る。他の好適な医薬的に許容される賦形剤については、参照により本明細書に組み込まれる、「レミントン製薬科学（Remington's Pharmaceutical Sciences）」マック・パブリッシング社、ニュージャージー州（1991）
に記載されている。
【００５１】
[0091]  本発明の化合物は、慣用の無害な医薬的に許容される担体、アジュバント、及び媒体（vehicles）を所望により含有する投与単位製剤において、ヒトや他の動物へ経口的、非経口的に、舌下より、エアゾール化又は吸入スプレー剤によって、直腸より、嚢内
、膣内、腹腔内、頬内、又は局所的に投与し得る。局所投与は、経皮パッチ剤又はイオントフォレーシスデバイスのような経皮投与の使用を含んでもよい。本明細書に使用する「非経口」という用語には、皮下注射、静脈内、筋肉内、胸骨内の注射、又は注入技術が含まれる。
【００５２】
[0092]  製剤化の方法は、当該技術分野で公知であって、例えば、「レミントン：調剤の科学と実践（Remington: The Science and Practice of Pharmacy）」マックパブリッ
シングカンパニー、ペンシルヴェニア州イーストン、第19版（1995）に開示されている。本発明における使用のための医薬組成物は、無菌で非発熱原性の液体溶液剤又は懸濁液剤、被覆カプセル剤、坐剤、凍結乾燥散剤、経皮パッチ剤の形態、又は当該技術分野で知られた他の形態であり得る。
【００５３】
[0093]  好適な分散剤又は湿潤剤と懸濁剤を使用して、既知の技術に従って、注射可能な調製品、例えば、無菌の注射可能な水性又は油性の懸濁液剤を製剤化し得る。この無菌の注射可能な調製品はまた、無害な非経口的に許容される希釈剤又は溶媒中の無菌の注射可能な溶液剤、懸濁液剤、又は乳液剤（例えば、１，３−プロパンジオール又は１，３−ブタンジオール中の溶液剤として）であってよい。利用し得る、許容される媒体及び溶媒には、水、リンゲル液（Ｕ．Ｓ．Ｐ．）、及び等張塩化ナトリウム溶液がある。加えて、無菌の固定油剤も、溶媒又は懸濁媒体として慣用的に利用される。この目的のためには、合成のモノ若しくはジグリセリドを含めて、どの無刺激性固定油剤も利用してよい。加えて、注射可能製剤の調製には、オレイン酸のような脂肪酸が使用を見出す。注射可能製剤は、例えば、細菌保持フィルターを通す濾過によって、又は使用に先立って無菌水又は他の無菌の注射可能媒体に溶かすか又は分散させることが可能である無菌の固体組成物の形態で滅菌剤を取り込むことによって、滅菌することができる。
【００５４】
[0094]  薬物の効果を延長させるために、皮下又は筋肉内注射からの薬物の吸収を遅らせることがしばしば望まれる。このことは、水にほとんど溶けない結晶性又は非結晶性素材の液体懸濁液剤の使用によって達成され得る。このとき、薬物の吸収速度は、その溶解速度に依存するが、これは、結晶の大きさや結晶型に依存する場合がある。あるいは、非経口投与される医薬剤形の遅延吸収は、該薬物を油性媒体に溶かすか又は懸濁させることによって達成され得る。注射可能なデポー剤形は、ポリラクチド−ポリグリコリドのような生分解性ポリマー中の薬物の微小被包マトリックス剤を生成することによって作製される。薬物の高分子に対する比と利用する特別なポリマーの性質に依存して、薬物放出の速度を制御することができる。他の生分解性ポリマーの例には、ポリ（オルトエステル）及びポリ（無水物）が含まれる。身体組織と適合可能である、リポソーム剤又はミクロ乳液剤に薬物を捕捉させることによっても、注射可能なデポー製剤を調製し得る。
【００５５】
[0095]  直腸又は膣投与用の組成物は、好ましくは、（周囲温度で固体であるが、体温では液体であるので、直腸又は膣腔で融けて、活性化合物を放出する）ココア脂、ポリエチレングリコール、又は坐剤ワックスのような、好適な非刺激性の賦形剤又は担体と本発明の化合物を混合することによって調製することができる、坐剤である。
【００５６】
[0096]  経口投与用の固体剤形には、カプセル剤、錠剤、丸剤、散剤、及び顆粒剤が含まれる。そのような固体剤形において、活性化合物は、クエン酸ナトリウム又はリン酸二カルシウムのような、少なくとも１つの不活性な医薬的に許容される賦形剤又は担体、及び／又はａ）デンプン類、乳糖、ショ糖、ブドウ糖、マンニトール、及び珪酸のような充填剤又は増量剤、ｂ）例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ショ糖、及びアカシアのような結合剤、ｃ）グリセロールのような保潤剤、ｄ）寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモ又はタピオカデンプン、アルギン酸、ある種の珪酸塩、及び炭酸ナトリウムのような崩壊剤、ｅ）パラフィンのような溶解遅延
剤、ｆ）四級アンモニウム化合物のような吸収加速剤、ｇ）例えば、アセチルアルコール及びグリセロールモノステアレートのような湿潤剤、ｈ）カオリン及びベントナイトクレイのような吸収剤、及びｉ）タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール類、ラウリル硫酸ナトリウム、及びこれらの混合物のような滑沢剤と混合される。カプセル剤、錠剤、及び丸剤の場合、剤形は、緩衝化剤も含んでよい。
【００５７】
[0097]  乳糖（lactose）又は乳糖（milk sugar）、並びに高分子量ポリエチレングリ
コール類、等のような賦形剤を使用する軟及び硬充填ゼラチンカプセル剤では、充填剤として、似たタイプの固体組成物も利用してよい。
【００５８】
[0098]  錠剤、糖衣錠剤、カプセル剤、丸剤、及び顆粒剤の固体剤形は、腸溶コーティング剤のようなコーティング剤及びシェル剤や医薬製剤化技術分野で公知の他のコーティング剤とともに調製することができる。それらは、不透明化剤を含有してもよくて、有効成分（複数）だけを、又は選好的に腸管の特定部分において、任意選択的に遅延されるやり方で放出する組成物でもあり得る。使用し得る埋込型組成物の例には、高分子物質とワックス類が含まれる。
【００５９】
[0099]  活性化合物は、上記に述べたような１以上の賦形剤と一緒の微小被包型でもあり得る。錠剤、糖衣錠剤、カプセル剤、丸剤、及び顆粒剤の固体剤形は、腸溶コーティング剤のようなコーティング剤及びシェル剤、放出制御コーティング剤、及び医薬製剤化技術分野で公知の他のコーティング剤とともに調製することができる。そのような固体剤形において、活性化合物は、ショ糖、乳糖、又はデンプンのような少なくとも１つの不活性希釈剤と混合され得る。そのような剤形はまた、通例のように、不活性希釈剤以外の追加物質、例えば、打錠用滑沢剤やステアリン酸マグネシウム及び微結晶性セルロースのような他の打錠補助剤も含んでよい。カプセル剤、錠剤、及び丸剤の場合、その剤形は、緩衝化剤も含んでよい。それらは、不透明化剤を含有してもよくて、有効成分（複数）だけを、又は選好的に腸管の特定部分において、任意選択的に遅延されるやり方で放出する組成物でもあり得る。使用し得る埋込型組成物の例には、高分子物質とワックス類が含まれる。
【００６０】
[00100]  経口投与用の液体剤形には、医薬的に許容される乳液剤、ミクロ乳液剤、溶
液剤、懸濁液剤、シロップ剤、及びエリキシル剤が含まれる。活性化合物に加えて、液体剤形は、例えば、水又は他の溶媒のような、当該技術分野でよく使用される不活性希釈剤、可溶化剤及び乳化剤（エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、ＥｔＯＡｃ、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油剤（特に、綿実油、落花生油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、及びゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール類、ソルビタンの脂肪酸エステル、及びこれらの混合物のような）を含有してよい。不活性希釈剤以外に、この経口組成物には、湿潤剤、乳化剤及び懸濁剤、甘味剤、香味剤、及び芳香剤のようなアジュバントも含めることができる。
【００６１】
[00101]  本発明の化合物の局所又は経皮投与用の剤形には、軟膏剤、ペースト剤、ク
リーム剤、ローション剤、ゲル剤、散剤、溶液剤、スプレー剤、吸入剤、又はパッチ剤が含まれる。有効成分は、無菌条件の下で、医薬的に許容される担体と、必要とされる保存剤又は必要とされ得る緩衝液と一緒に混合される。本発明の範囲内にあるものとして、眼科用製剤、点耳薬剤、等も考慮される。
【００６２】
[00102]  軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤、及びゲル剤は、本発明の活性化合物に加
えて、動物性脂肪及び植物性脂肪、油剤、ワックス剤、パラフィン類、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール類、シリコーン剤、ベントナイト、珪酸、タルク、及び二酸化亜鉛、又はこれらの混合物のような賦形剤を含有してよい。
【００６３】
[00103]  本発明の組成物はまた、液体エアゾール剤又は吸入可能な乾燥粉末剤として
の送達用に製剤化され得る。液体エアゾール製剤は、終末細気管支及び呼吸細気管支へ送達し得る粒径が優勢になるように噴霧化され得る。
【００６４】
[00104]  本発明のエアゾール化製剤は、好ましくは主に１μｍ〜５μｍの間の質量中
間平均直径を有するエアゾール粒子の形成を可能にするように選択される、ジェット、振動多孔板、又は超音波ネブライザーのようなエアゾール形成デバイスを使用して送達され得る。さらに、この製剤は、好ましくは、平衡化したモル浸透圧イオン強度及び塩化物濃度と、本発明の化合物の有効量を感染の部位へ送達することが可能な最小エアゾール化量を有する。追加的に、エアゾール化製剤は、好ましくは、気道の機能性を不都合に損害せず、望まれない副作用を引き起こさない。
【００６５】
[00105]  本発明のエアゾール製剤の投与に適したエアゾール化デバイスには、本発明
の製剤を１〜５μｍの粒径範囲が優勢なエアゾール粒径へ噴霧化することが可能である、例えば、ジェット、振動多孔板、超音波ネブライザーと、活力式（energized）乾燥粉末
吸入器が含まれる。本出願において、「優勢な」は、すべての発生したエアゾール粒子の少なくとも７０％、しかし好ましくは９０％より多くが１〜５μｍ範囲内にあることを意味する。ジェットネブライザーは、空気圧によって作動して、液体溶液剤をエアゾール小滴へ粉砕する。振動多孔板ネブライザーは、迅速に振動する多孔板によって発生する音波真空を使用して溶媒小滴を多孔板より押し出すことによって作動する。超音波ネブライザーは、液体を小さなエアゾール小滴へ剪断する圧電結晶によって作動する。多様の好適なデバイスが利用可能であり、例えば、AERONEB 及び AERODOSE 振動多孔板ネブライザー（AeroGen 社、カリフォルニア州サニーヴェール）、SIDESTREAM ネブライザー（Medic-Aid
社、ウェストサセックス州、イギリス）、PARI LC 及び PARI LC STAR ジェットネブラ
イザー（Pari Respiratory Equipment 社、バージニア州リッチモンド）、及び AEROSONIC（DeVilbiss Medizinische Produkte（ドイツ）GmbH、ハイデン、ドイツ）及び ULTRAAIRE（Omron Healthcare 社、イリノイ州ヴァーノンヒルズ）超音波ネブライザーが含まれ
る。
【００６６】
[00106]  本発明の化合物はまた、本発明の化合物に加えて、乳糖、タルク、珪酸、水
酸化アルミニウム、珪酸カルシウム、及びポリアミド粉末、又はこれらの物質の混合物のような賦形剤を含有し得る、局所粉末剤及びスプレー剤としての使用のために製剤化され得る。スプレー剤は、クロロフルオロヒドロカーボン類のような通例の推進剤を追加的に含有することができる。
【００６７】
[00107]  経皮パッチ剤には、化合物の身体への制御送達をもたらすという追加の利点
がある。そのような剤形は、化合物を適切な媒体に溶解するか又は調合することによって作製することができる。皮膚を通過する化合物の流れを高めるために、吸収エンハンサーも使用することができる。その速度は、速度制御膜を提供すること、又は化合物をポリマーマトリックス又はゲルに分散させることのいずれかによって制御することができる。本発明の化合物はまた、リポソーム剤の形態で投与することができる。当該技術分野で知られているように、リポソームは、一般に、リン脂質又は他の脂質物質から誘導される。リポソーム剤は、水性媒体に分散した単層膜又は多層膜の水和液晶によって生成される。リポソームを生成することが可能な、どの無害な生理学的に許容されて代謝可能な脂質も使用することができる。リポソーム形態の本組成物は、本発明の化合物に加えて、安定化剤、保存剤、賦形剤、等を含有することができる。好ましい脂質は、天然と合成の両方のリ
ン脂質及びホスファチジルコリン類（レシチン類）である。当該技術分野では、リポソームを生成する方法が知られている。例えば、Prescott（監修）、「細胞生物学の方法（Methods in Cell Biology）」XIV 巻、アカデミックプレス、ニューヨーク（1976）、33頁
（及び、以下参照）を参照のこと。
【００６８】
[00108]  化合物は、単独で投与しても、別の阻害剤と組み合わせて投与してもよく、
可能な組合せ療法は、一定の組合せの形態をとるか、又はある化合物と別の阻害剤との投与は、重複するか又は互いに独立してなされる。上記に記載したように、他の治療戦略の文脈でのアジュバント療法が可能であるように、長期療法も、同じく可能である。他の可能な治療法は、腫瘍退縮後に患者の状況を維持するための療法、又は、例えばリスク状態の患者における化学予防療法でさえある。
【００６９】
[00109]  本発明の化合物の有効量には、一般に、乳癌細胞の成長又は増殖を検出可能
なほどに阻害する、又は乳癌の症状の阻害又は軽減を検出するのに十分なあらゆる量が含まれる。担体材料と組み合わせて単一の剤形をもたらし得る有効成分の量は、治療される宿主と特別な投与形式に依って変動するものである。しかしながら、特別な患者への特定の用量レベルは、利用される特定化合物の活性、患者の年齢、体重、健康状態、性別、食事、投与の時間、投与の経路、排出の速度、薬物の組合せ、及び治療を受ける特別な疾患の重症度が含まれる、多様な因子に依存するものであると理解されたい。所与の状況への治療有効量は、定型的な実験によって容易に決定し得て、通常の臨床医の技量と判断の範囲内にある。
【００７０】
[00110]  本発明の治療の方法に従えば、ヒト又は下等哺乳動物のような患者において
、所望の結果を達成するのに必要であるような量と時間において、ある阻害剤の量を該患者へ投与することによって、乳癌細胞の成長が抑制又は予防される。阻害剤の化合物の「乳癌細胞の成長又は増殖を阻害するのに有効である量」とは、どの医学的治療にも適用可能な妥当な利益／リスク比で、乳癌細胞成長を治療するのに十分な阻害剤の量に言及する。
【００７１】
[00111]  しかしながら、本発明の化合物及び組成物の全日使用量は、担当医によって
、健全な医学的判断の範囲内で決定されるものであると理解されたい。どの特別な患者の特定の治療有効量レベルも、治療される障害とその障害の重症度；利用される特定化合物の活性；利用される特定の組成物；患者の年齢、体重、健康状態、性別、及び食事；利用される特定化合物の投与の時間、投与の経路、及び排出の速度；治療の期間；利用される特定化合物と組み合わせて、又は同時に使用される薬物；並びに医療技術分野で公知の類似因子が含まれる、多様な因子に依存するものである。
【００７２】
[00112]  単独で、又は組合せ療法において温血動物（例えば、ヒト）へ投与されるＭ
ＥＬＫ阻害剤又はＦｏｘＭ１阻害剤の用量は、１日につき、好ましくは、ほぼ０．０１ｍｇ／ｋｇ〜ほぼ１０００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくはほぼ１ｍｇ／ｋｇ〜ほぼ１００ｍｇ／ｋｇであり、好ましくは、例えば、同じサイズであり得る、１〜３回の単一用量へ分割される。通常、小児は、成人用量の半分を服用するので、小児における阻害剤の選好的な用量範囲は、１日につき、０．５ｍｇ／ｋｇ〜ほぼ５００ｍｇ／ｋｇであり、好ましくは、同じサイズであり得る、１〜３回の単一用量へ分割される。
【００７３】
[00113]  本明細書の上記及び下記に使用する一般用語は、好ましくは、本開示の文脈
内で、他に指定しなければ、以下の意味を有する。
【実施例】
【００７４】
[00114]  以下の実施例は、本発明をその範囲に限定することなく本発明を例解するの
に役立つ。
【００７５】
[00115]  実施例１：ＨＭＥＣの生体内腫瘍生成に寄与する発癌キナーゼの同定
[00116]  ヒト初代細胞を明確な遺伝要素で形質転換することは、発癌性の形質転換に
関与する特定の遺伝子又は経路を同定するための強力な方法である（Hahn et al.,1999; Zhao et al., 2004）。この目的のために、ヒト乳癌の病理発生に類似する生体内腫瘍生
成モデルを開発した。発癌遺伝子キナーゼの研究に適したヒト乳腺上皮細胞（ＨＭＥＣ）ベースの形質転換系が以前に確立された（Zhao et al., 2003）。この系をさらに最適化
するために、ｐ５３の優性ネガティブ型（ｐ５３ＤＤ）、ＮｅｕＴ、及びＰＩ３ＫＣＡ  Ｈ１０４７Ｒを発現するようにＨＭＥＣを工学処理した。生じる細胞（ＨＭＥＣｓ−ＤＤ−ＮｅｕＴ−ＰＩ３ＫＣＡと命名）は、マウスにおいて正所性の腫瘍を生成するその能力によって判定されるように、完全に形質転換されていた（図面１Ａ）。このモデルは、乳癌において優勢である、ＥｒｂＢ２とＰＩ３ＫＣＡの同時活性化に似ている（Stephens et al., 2012）。
【００７６】
[00117]  次に、レトロウイルスベースのキナーゼライブラリー（Boehm et al., 2007
）を利用して、マウスにおいて発癌遺伝子のＰＩＫ３ＣＡに置き換わってＮｅｕＴと協同して腫瘍生成を促進することができるキナーゼについてのスクリーニングを実施した。３５４ミリストイル化ヒトキナーゼとキナーゼ関連タンパク質をコードする、キノーム（kinome）全体のレトロウイルスライブラリー（Boehm 2007）のサブプールをＨＭＥＣ−ＤＤ−ＮｅｕＴ細胞に感染させた。１０〜１２のユニークキナーゼＯＲＦの３７個のサブプールをＨＭＥＣ−ＤＤ−ＮｅｕＴ細胞へ導入した。次いで、この被感染細胞をヌードマウスの鼠径（inguinal）乳腺脂肪体へ注射して、レシピエントマウスについて腫瘍生成を追跡した。３７個のプールのうち１２個のキナーゼが２〜４ヶ月の潜伏期で腫瘍生成を誘導した。収穫した腫瘍標本と注射前の被感染細胞よりゲノムＤＮＡを抽出した。定量ＰＣＲを使用して、この腫瘍中の候補プールにおける各キナーゼの比存在度を決定した。腫瘍の発生の間に特異的に濃縮される、全部で２６種のキナーゼを見出した（図面２Ａ、２Ｂ）。ヒットとして現れたいくつかのキナーゼは、核内因子κ−Ｂキナーゼサブユニットεの阻害剤（ＩＫＢＫＥ）（Boehm, 2007）、トランスフェクション中の再構成（ＲＥＴ）（Takahashi, 1985）、カゼインキナーゼ１ε（ＣＳＮＫ１Ｅ）（Kim 2010）、ＮＩＭＡ関連セリン／スレオニンキナーゼ６（ＮＥＫ６）（Nassirpour et al., 2010）、及びポロ（polo）様キナーゼ１（Ｐｌｋ１）（Liuetal., 2006）のように、癌原遺伝子又は癌関連遺伝
子としてこれまでに示唆されたことがある。
【００７７】
[00118]  実施例２：ＭＥＬＫは、乳癌において高度に過剰発現されていて、転帰不良
を強く予測する。
【００７８】
[00119]  実施例１において記載した遺伝子スクリーニングからの上位得点ヒットの１
つは、ＡＭＰＫセリン／スレオニンキナーゼファミリーの非典型的なメンバーである（Lizcano et al., 2004）、母性胚性ロイシンジッパーキナーゼ（ＭＥＬＫ）（図面２Ａ）であった。ＭＥＬＫの正確な生物学的機能についてはほとんど知られていないが、このキナーゼは、多様な腫瘍において頻繁に過剰発現されている（Gray et al., 005）。注目すべきことに、浸潤性乳管癌の３９２標本と正常乳腺の６１標本からなる大きなコホートである「癌ゲノムアトラス（Cancer Genome Atlas）（ＴＣＧＡ）（Koboldt et al., 2012）
の乳癌データセットにおいてＭＥＬＫ発現について解析すると、ＭＥＬＫ転写産物のレベルは、その正常対照物と比較して、乳癌においてほぼ８倍高かった（図面２Ａ）。この差示的な発現のｐ値（４．６ｘ１０−５４）により、ＭＥＬＫは、乳癌において上位１％の過剰発現遺伝子として位置付けられる（図面２Ａ）。正常乳腺と比べた、乳癌におけるＭＥＬＫの過剰発現は、他の２つの独立したデータセットについて解析することによってさらに確認された（図面４Ａ；Richardson et al., 2006；Maetal., 2009）。
【００７９】
[00120]  ＭＥＬＫ過剰発現の乳癌に対する潜在的な関連性への洞察を深めるために、
ＭＥＬＫ発現について、疾患の状況との相関性を解析した。全部で１５００名より多い患者からなる、５種の独立した大きなコホート（Desmedt et al., 2007; Hatzis et al., 2011; Schmidt et al., 2008; Wang et al., 2005；表Ｓ１）全体で遺伝子発現データを解析することによって、より高いＭＥＬＫ発現の発現が乳癌のより高い組織学的悪性度と強く関連していることが見出された（図面２Ｂ，４Ｂ）；この相関性のｐ値は、測定した全１２，６２４種以上の遺伝子の中で、いずれも上位１％に位する。図面１４、１５も参照のこと。
【００８０】
[00121]  ＭＥＬＫ発現について、ＭＥＬＫの発現が転移性再発と相関するかどうかを
判定するためにも検証した。早期乳癌患者について転移無しの生存を追跡して、術後にアジュバント全身治療を受けなかった、３種の独立したコホート（van't Veer コホート、Wang コホート、及び Schmidt コホート；表Ｓ１）について解析した。この３種のコホー
トのすべてにおいて、リンパ節陰性腫瘍と当初診断された女性では、より早期の転移と高いＭＥＬＫ発現が強く関連していた（すべてのｐ値＜０．００１，ハザード比＞２；図面３Ｃ，４Ｃ）。大多数の患者が高い悪性度とリンパ節陽性乳癌を有して、ほとんどすべての患者がネオアジュバント化学療法及び／又はホルモン療法を受けた、２種のコホート（Hatzis コホート、Loi コホート；下記の表Ｓ１）についてさらに解析した。ここでも、
ＭＥＬＫの高い発現は、転移再発を確実に予測した（両方のｐ値＜０．００１，ハザード比＞２；図面２Ｃ）。従って、ＭＥＬＫ過剰発現は、化学療法やホルモン療法にかかわりなく、乳癌転移の強力な予測マーカーである。この解析はまた、ＭＥＬＫの発現が高い乳癌が高い悪性度に関連して、慣用の乳癌療法へさほど応答しないことを示す。
【００８１】
[00122]  ＭＥＬＫ発現について、乳癌患者の生存の予測値を解析した。全部で１１０
０名以上の患者について全生存率を追跡した、５種の独立した大きなコホート（Desmedt et al., 2007; Esserman et al., 2012; Kao et al., 2011; Pawitan et al., 2005; van
de Vijver et al., 2002；表Ｓ１）において、ＭＥＬＫの高い発現は、死亡率の増加と
強く相関していた（すべてのｐ値＜０．０５，ハザード比＞２）（図面２Ｄ，４Ｄ）。まとめると、上記のデータは、ＭＥＬＫが、疾患の組織学的悪性度がより高く、転移の可能性が増加して、生存率がより低い乳癌患者を同定する、確実な予後指標となることを示唆する。
【００８２】
[00123]  表Ｓ１
【００８３】
【表１】
2018168193.tif 000003
【００８４】
[00124]  実施例３：異なるサブタイプの乳癌におけるＭＥＬＫの過剰発現
[00125]  乳癌の異質性を考慮して、遺伝子発現プロファイリング（Perou et al., 2000; Sorlie et al., 2001）によって定義されるような異なるサブタイプの乳癌においてＭＥＬＫ発現を解析した。多数の乳癌データセット中の標本をＰＡＭ５０遺伝子サインによって特性決定した（Parker et al., 2009）。全部で１２００名を超える患者からなる４
つの独立したコホートでは、これらの異なるサブタイプの間で、衝撃的に類似したＭＥＬＫ発現のパターンが観測された（図面３Ｅ、４Ｅ）。ルミナルＡと正常細胞様サブタイプは、ＭＥＬＫの最低の発現を示した。ルミナル特異的遺伝子のより低い発現を有するルミナルＢ腫瘍（Solie et al., 2001）とＨＥＲ２濃縮腫瘍は、ルミナルＡ又は正常細胞様腫瘍より高いＭＥＬＫ発現を有した（ｐ＜０．０００１）。最後に、基底細胞様乳癌（ＢＢ
Ｃ）は、すべてのサブタイプの中で最高のＭＥＬＫ発現を示した（ｐ＜０．０００１）。これらの観測事実は、ＭＥＬＫ発現がルミナルマーカーの発現と負に相関するというパターンを示す。実に、ＭＥＬＫの発現とエストロゲン受容体（ＥＲ又はＥＳＲ１）の発現との間には、有意な逆相関性が見出された（図面３Ｆ、４Ｆ、１４Ａ）。
【００８５】
[00126]  乳癌の代わりの類型化では、ＥＲ／ＰＲとＨＥＲ２の発現を使用する。ＥＲ
／ＰＲとＨＥＲ２の発現が欠失したサブタイプである、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）は、基底細胞様乳癌と概ね重なる（Foulkes et al., 2010; Rakha et al, 2008）。
臨床では、診断と治療戦略の選択のために、ＴＮＢＣのようなサブタイプ類型化が定型的に使用されてきたので、この代わりのサブタイプ類型化とＭＥＬＫ発現の相関性について検証した。２つの独立したコホートにおいて（表Ｓ１）、標本をＥＲ／ＰＲとＨＥＲ２の発現に基づいてサブタイプへ群分けした。実に、ＭＥＬＫの発現レベルは、ＴＮＢＣにおいて最高であり、ＨＥＲ２＋において中位であって、ＥＲ／ＰＲ＋乳癌において最低である（図面４Ｇ）。まとめると、上記のデータは、ＴＮＢＣ又はＢＢＣにおいてＭＥＬＫが差示的に過剰発現されていることを示す。
【００８６】
[00127]  実施例４：ＭＥＬＫ過剰発現は、確実な発癌活性を示す
[00128]  ＭＥＬＫの有意な予後的価値は、（特に、基底細胞様）乳癌におけるその顕
著な過剰発現と相俟って、ＭＥＬＫが発癌において決定的な役割を担う可能性があることを示唆した。ヒト癌では、ＭＥＬＫ中の突然変異がほとんど同定されていないので、発癌には、野生型ＭＥＬＫの過剰発現で十分であると仮定した。最初に、初期の腫瘍生成スクリーニングにおいて使用するモデル系であるＨＭＥＣ−ＤＤ−ＮｅｕＴ細胞において、ＭＥＬＫの過剰発現が腫瘍生成を促進することができるという確証について検討した。ＨＭＥＣ−ＤＤ−ＮｅｕＴ細胞を再び工学的に処理して、野生型（ｗｔ−）又はミリストイル化（ｍｙｒ−）ＭＥＬＫを発現するようにした（註：初期スクリーニングにおけるキナーゼをミリストイル化した（Boehm et al., 2007））。空ベクターを発現するＨＭＥＣ−ＤＤ−ＮｅｕＴ細胞がマウスにおいて腫瘍を形成することができなかったのに対し、これらの細胞におけるＷＴ−又はｍｙｒ−ＭＥＬＫの過剰発現は、２ヶ月以内に、１００％のぺネトランス（penetrance）で腫瘍生成をもたらした（図面５Ａ）。
【００８７】
[00129]  ＭＥＬＫがＥｒｂＢ２から独立した「スタンドアロン（stand-alone）」な形質転換能力を有するかどうかを判定するために、ｐ５３ＤＤを発現するＲａｔ１細胞（Ｒａｔ１−ＤＤ）（Zhao et al., 2004）の悪性形質転換を達成するのに単一の癌遺伝子で
十分である、齧歯動物線維芽細胞（Ｒａｔ１）形質転換系を使用した。Ｒａｔ１−ＤＤにおける腫瘍生成を誘導するには、ＮｅｕＴの非存在下での発癌遺伝子ＰＩ３ＫＣＡ  Ｈ１０４７Ｒの発現で十分であることが最近実証された（Ni et al., 2012）。我々は、ＭＥ
ＬＫを発現するＲａｔ１−ＤＤ細胞（Ｒａｔ１−ＤＤ−ＭＥＬＫ）、又は陽性対照としてＰＩ３ＫＣＡ  Ｈ１０４７Ｒを発現するＲａｔ１−ＤＤ細胞（Ｒａｔ１−ＤＤ−ＰＩ３ＫＣＡ  Ｈ１０４７Ｒ）を設計した（図面３Ｂ）。空ベクターを発現するＲａｔ１−ＤＤ細胞は、軟寒天においてコロニーとして成長することも、マウスにおいて腫瘍を形成することもできなかった。衝撃的にも、Ｒａｔ１−ＤＤ−ＭＥＬＫ細胞は、試験管内でのコロニー成長と生体内での腫瘍生成の両方によって裏付けられるように、Ｒａｔ１−ＤＤ−ＰＩ３ＫＣＡ  Ｈ１０４７Ｒ細胞に匹敵し得るほどに確実な形質転換活性を示した（図面２Ｃ，２Ｄ）。
【００８８】
[00130]  最後に、ＭＥＬＫのキナーゼ活性がその形質転換能に必須であるかどうかを
判定するために、ＭＥＬＫ、Ｄ１５０Ａ、又はＴ１６７Ａの触媒不能型（Lizcano et al., 2004; Vulsteke et al., 2004）をＲａｔ−ＤＤ細胞へ導入した。Ｒａｔ１−ＤＤ−Ｍ
ＥＬＫ細胞と異なり、Ｒａｔ１−ＤＤ−ＭＥＬＫ−Ｄ１５０ＡとＲａｔ１−ＤＤ−ＭＥＬＫ−Ｔ１５７Ａの両方の細胞は、軟寒天又はマウスにおいて限られた成長しか示さなかっ
た（図面３Ｅ、３Ｆ、３Ｇ）。まとめると、上記の研究結果は、ＭＥＬＫが異常に過剰発現されるときにきわめて強力な発癌性の推進因子になり得ること、そしてこの発癌能がＭＥＬＫのキナーゼ活性に依拠することを示す。
【００８９】
[00131]  実施例５：ＭＥＬＫは、試験管内と生体内の両方でＢＢＣ細胞の発癌能に不
可欠である。
【００９０】
[00132]  ＭＥＬＫの発癌能は、ＭＥＬＫが最高のレベルで発現されていることが見出
されている乳癌のサブタイプである、ＢＢＣの増殖にＭＥＬＫが必須であり得るとする仮説をもたらした（図面３Ｅ，１４）。上記の検討のために、臨床腫瘍において見出される分子サブタイプとよく似ている乳癌細胞系のセット（Neve et al., 2006）を使用した。
これらの細胞は、広汎に特性決定されて、サブタイプ特異的な療法を開発するために以前より使用されてきた。ＢＢＣに対応する細胞系は、ＭＥＬＫの高い発現レベルを示した（図面１５Ｂ）。この Neve データセットでは、２３のＢＢＣ細胞すべてが、２４のルミナル細胞と比較して、ＭＥＬＫ発現の有意な増加を示した（図面６Ａ）。この細胞系をホルモン受容体（ＥＲ／ＰＲ）及びＨＥＲ２の発現によって群分けするとき、２１のトリプルネガティブ乳癌細胞系のすべてがＥＲ／ＰＲ＋細胞より高いレベルでＭＥＬＫを発現した（図面７Ａ）。これらの結果は、ヒト乳癌におけるＭＥＬＫの発現パターンと一致する（図面３Ｅ、４Ｅ、４Ｆ）。ＭＥＬＫのタンパク質存在量は、イムノブロッティングによって確認されるように、ルミナル細胞（ＭＣＦ７及びＴ４７Ｄ）に比較して、ＢＢＣ細胞においてずっと高い（図面４Ｂ）。このように、これらの細胞系は、ＭＥＬＫの細胞中の機能について評価するための優れたプラットフォームを提供する。
【００９１】
[00133]  上記細胞の増殖におけるＭＥＬＫの役割について検証するために、ドキシサ
イクリンへの曝露時にのみｓｈＲＮＡ転写（そして、結果として標的遺伝子サイレンシング）が誘導される、条件付き遺伝子ノックダウン技術を使用した（Wiederschain et al.,
2009）。ＭＥＬＫに標的指向するために産生された多数の誘導可能なｓｈＲＮＡの中で
、４種のＭＥＬＫ標的配列を同定して、この標的配列へ指向されるｓｈＲＮＡが、ドキシサイクリンで処理した細胞において、ＭＥＬＫ発現を効率的に沈静化して細胞成長を阻害することを見出した（図面６Ｃ、６Ｄ、７Ｂ、１６、１７、１９）。ＭＥＬＫ標的配列とｓｈＲＮＡを作製するためのフォワードプライマーとリバースプライマーを下記の表１に示す。
【００９２】
[00134]  表１
【００９３】
【表２】
2018168193.tif 000004
【００９４】
[00135]  ｓｈＭＥＬＫ１、ｓｈＭＥＬＫ２、ＭＥＬＫ  ｓｈ−４１３、ＭＥＬＫ  ｓ
ｈ−１５９１、及びＭＥＬＫ  ｓｈ−１８０５を基底乳癌細胞並びに２種のルミナル細胞系へ安定的に導入して、ｓｈＲＮＡの導入時の細胞増殖について検証した。示すように、ドキシサイクリンを介したＭＥＬＫノックダウンの誘導は、ＢＴ５４９、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、及びＭＤＡ−ＭＢ−４３６が含まれるＢＢＣ細胞の成長を強く損なった（図面６Ｃ、７Ａ、１６−１８）；対照的に、ＭＥＬＫの発現が有意に低い（図面６Ｂ、１９）２種のルミナル細胞系、ＭＣＦ７とＴ４７Ｄは、ＭＥＬＫサイレンシングの誘導より保護された（図面６Ｄ、１９）。これらの効果がＭＥＬＫの特異的なノックダウンによることを確かめるために、ドキシサイクリン誘導可能でｓｈＭＥＬＫ抵抗性のＭＥＬＫ（ＭＥＬＫ−Ｒ）を安定的に導入することによって、ＭＥＬＫ発現をレスキューした（図面６Ｅ、左パネル；７Ｂ）。ｓｈＭＥＬＫを発現するＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞では、ＭＥＬＫ発現がレスキューされるとき、細胞増殖が正常レベルへ回復した（図面６Ｅ、中央パネルと右パネル）。興味深いことに、ｓｈＲＮＡ抵抗性であるがキナーゼ不活性なＭＥＬＫのバージョン、ＭＥＬＫ−Ｒ（Ｔ１６７Ａ）は、細胞増殖を回復することができず（図面６Ｅ）、ＢＢＣ細胞の増殖にＭＥＬＫのキナーゼ活性が不可欠であることを示唆した。
【００９５】
[00136]  ＢＢＣ細胞中のＭＥＬＫがその発癌性増殖のために必要とされることについ
ても検証した。はじめに、試験管内で、対照ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞とＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞はともに、軟寒天において巨視的コロニーまで速やかに成長した。対照的に、これらの細胞におけるドキシサイクリンによるＭＥＬＫノックダウンの誘導は、コロニー形成のほとんど完全な阻害を引き起こした（図面８Ａ、１７、１８）。次に、ＢＢＣ細胞の生体内腫瘍生成にＭＥＬＫが必須であるかどうかを検証した。安定したｓｈＭＥＬＫを有する乳癌細胞を免疫不全マウスの乳腺脂肪体へ移植して、正所性の腫瘍生成を可能にした。定着した腫瘍を担うマウスにおいて、ドキシサイクリン投与は、効率的なＭＥＬＫ抑制を誘導し（図面９）、生体内で誘導可能なｓｈＲＮＡ系の適格性を立証した。移植後すぐにドキシサイクリンでマウスを処理すると、正所性腫瘍の生成を強く阻害し（図面８Ｂ、８Ｃ）、これらのＢＢＣ細胞が生体内で成長するのにＭＥＬＫが必要とされることを実
証した。定着した異種移植片腫瘍の生体内での維持にＭＥＬＫが必要とされるかどうかをさらに検証するために、基底細胞様乳癌細胞又はルミナル乳癌細胞に由来する異種移植片腫瘍を担うマウスをドキシサイクリンで処理した。注目すべきことに、ＭＥＬＫの下方調節は、ＢＢＣ細胞に由来する腫瘍を実質的に退縮させたが、ルミナル癌細胞由来の腫瘍に対してはほとんど効果がない（図面８Ｄ〜Ｇ、図面９）。まとめると、上記のデータは、ＢＢＣ細胞の試験管内と生体内の両方の増殖にＭＥＬＫが選択的に必要とされることを示唆する。
【００９６】
[00137]  実施例６：ＭＥＬＫの欠失は、ＢＢＣ細胞において不完全な有糸分裂と細胞
死を引き起こす。
【００９７】
[00138]  ＢＢＣ細胞におけるＭＥＬＫの役割の根底にある機序を理解するために、Ｍ
ＥＬＫ枯渇について、様々な細胞プロセスにおける影響を検証した。ドキシサイクリンで処理した細胞では、切断型カスパーゼ３、切断型ＰＡＲＰ、及びＤＮＡ断片化が含まれるアポトーシスマーカーが首尾一貫して観測された（図面１０Ａ、１０Ｂ、図面１１）。汎カスパーゼ阻害剤であるｚＶａｄは、ＭＥＬＫノックダウン誘導性の細胞死を有意に抑制し、ＭＥＬＫ枯渇時に細胞死を実行することにおけるカスパーゼの能動的な役割を示唆した（図面１０Ｃ、図面１１Ｂ）。注目すべきことに、ＭＥＬＫノックダウンによって誘導される細胞死は、ＢＢＣ細胞においてだけで起きたが、ＭＣＦ７のようなルミナル腫瘍細胞においては起こらず（図面１０Ｄ、図面１１Ｃ）、ルミナルではない、基底細胞様乳癌細胞におけるＭＥＬＫの選択要求性についての妥当な説明を提供した。
【００９８】
[00139]  同時並行して、細胞周期に対するＭＥＬＫ枯渇の効果について検討した。ド
キシサイクリン処理時の細胞におけるＭＥＬＫのノックダウンは、ＤＮＡ量が４ｎである細胞の明瞭な蓄積を誘導し（図面１０Ｅ、図面１１Ｄ、左パネルと中央パネル）、Ｇ２／Ｍ停止の誘導を示した。このことに一致して、ドキシサイクリンへ曝露された細胞では、サイクリンＢ１、オーロラキナーゼＡのような有糸分裂のマーカーが上昇していた（図面１０Ｅ、図面１１Ｄ、右パネル）。興味深いことに、ドキシサイクリンは、画像処理細胞において示されるように、核が２個以上の細胞の百分率においてほぼ２倍の増加を誘導し（図面１０Ｆ、図面１１Ｅ）、サイトキネシスの失敗を示唆した。さらに、ＭＥＬＫ枯渇細胞は、単極紡錘体、中心体の誤った局在化、姉妹染色分体の誤った分離、及び非対称な細胞分裂といった、多様な有糸分裂異常を示した（図面１０Ｇ）。
【００９９】
[00140]  ＭＥＬＫノックダウン時に同時に生じる細胞死と不完全な有糸分裂について
、機能上の関連性を検証した。時間経過微視分析を使用して、生細胞における染色体動態のマーカーである、ＧＦＰ−ヒストン２Ｂを発現している細胞が検証された（Kanda et al., 1998）。ＭＥＬＫ発現が下方調節されるときは、単核の近隣細胞よりむしろ二倍核の細胞が細胞死を受けた（図面１０Ｈ、中央パネル）。ドキシサイクリンの存在下での別のシナリオでは、見かけの中期板を有する細胞が後期へ進行することができず、細胞死で終わった（図面１０Ｈ、下パネル）。対照的に、対照細胞は、中期から後期へ容易に進行した（図面１０Ｈ、上パネル）。まとめると、これらのデータは、ＢＢＣ細胞が適切な有糸分裂をＭＥＬＫに依存するので、これらの細胞においてＭＥＬＫを阻害すると、有糸分裂の妨害とその結果としての細胞死が引き起こされるモデルを示唆する。
【０１００】
[00141]  実施例７：ＦｏｘＭ１は、ＢＢＣにおいて過剰発現されて、ＭＥＬＫ発現を
調節する。
【０１０１】
[00142]  ＢＢＣ細胞においてＭＥＬＫが有糸分裂キナーゼであるかどうかを判定する
ために、ＭＥＬＫについて検証した。ノコダゾール誘導性の前中期停止を通して濃縮される有糸分裂細胞では、ＭＥＬＫが高度に蓄積された（図面１２Ａ、図面１３Ａ）。分裂停
止された細胞をノコダゾールから解放してＧ１期へ速やかに進行させると、ＭＥＬＫタンパク質存在量が劇的に減少した（図面１２Ａ、図面１３Ａ）。この発現パターンは、サイクリンＢ１やオーロラキナーゼのような模範的な有糸分裂因子に典型的であって（図面１２Ａ、図面１３Ａ）、ＭＥＬＫが有糸分裂キナーゼであることを示唆する。
【０１０２】
[00143]  有糸分裂に必須である多様な遺伝子の主要制御因子である、ＦｏｘＭ１によ
るＭＥＬＫ調節について検証された（Laoukili et al., 2005; Wang et al., 2005）。興味深いことに、ＭＥＬＫと同じように、ＢＢＣ又はＴＮＢＣサブタイプでは、ＦｏｘＭ１がきわめて高く発現されている（図面１２Ｂ、図面１３Ｂ，１３Ｃ）。さらに、多数の大規模コホートでは、ＦｏｘＭ１発現とＭＥＬＫ発現の間にきわめて密接な相関性が観測された（図面１２Ｃ、図面１３Ｄ）。ｓｉＲＮＡ（配列番号３１）又は化学阻害剤（チオストレプトン）を使用する遺伝子サイレンシングを介してＦｏｘＭ１を阻害すると、ＭＥＬＫの存在量が低下した（図面１２Ｄ、１２Ｅ、図面１３Ｅ）。さらに、我々は、ＭＥＬＫのプロモーターが推定ＦｏｘＭ１結合モチーフ（配列番号４５、図面１２Ｆに示す）を含有して（Wierstra and Alves, 2007）、抗ＦｏｘＭ１抗体を使用するクロマチン免疫沈降アッセイにより、ＭＥＬＫプロモーター領域がその推定結合部位とともに回収される（図面１２Ｅ、１２Ｆ）ことを見出した。まとめると、上記の研究結果は、ＢＢＣにおいて濃縮されてＭＥＬＫを調節する転写因子としてＦｏｘＭ１を同定し、ＢＢＣにおけるＭＥＬＫの過剰発現の根底にある分子機序を提供する。
【０１０３】
[00144]  実験手順
[00145]  プラスミド
[00146]  記載のキナーゼライブラリーに寄託された鋳型ＤＮＡを使用してヒトＭＥＬ
Ｋを増幅して、モロニーマウス白血病ウイルスの長い末端反復配列によって標的遺伝子発現が推進される、ｐＷＺＬレトロウイルスベクター（Zhao et al., 2003）へクローン化
した。ＭＥＬＫ突然変異体（Ｄ１５０Ａ、Ｔ１６７Ａ、又はサイレント突然変異のあるｓｈＭＥＬＫ抵抗性ＭＥＬＫ）は、Quickchange XL 部位特異的突然変異誘発キット（Stratagene）により産生した。プライマーを下記の表Ｓ２に収載する。テトラサイクリン誘導
遺伝子発現系を構築するために、表Ｓ２に収載するプライマーを使用して、ＧＦＰ又は突然変異型ＭＥＬＫを増幅した。ＰＣＲ産物をＡｇｅＩとＰａｃＩで消化して、消化済みのｐＬＫＯ−ＴＲＥＸ（Wee et al., 2008）と連結した。
【０１０４】
[00147]  ｐＷｚｌ−Ｈ２Ｂ−ＧＦＰを構築するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のゲノム
ＤＮＡを鋳型として使用して、ヒトヒストン２Ｂを増幅した。クローニング用のプライマーを表Ｓ２に収載する。ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩとＸｈｏＩで消化した後で、消化済みのｐＷｚｌ−ＧＦＰと連結した。ヒトＭＥＬＫに標的指向するｐＬＫＯ−ｔｅｔ−ｏｎ−ｓｈＲＮＡを産生するために、オリゴヌクレオチドを設計して合成した（ＩＤＴ）。アニーリングに続いて、二本鎖オリゴヌクレオチドをｐＬＫＯベクターと直接連結して、これをＡｇｅＩとＥｃｏＲＩで消化した。スクランブル、ｓｈＭＥＬＫ１、ｓｈＭＥＬＫ２の配列を表Ｓ２に収載する。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をｐＷｚｌプラスミドとパッケージングＤＮＡでトランスフェクトすることによって、レトロウイルスを産生した。典型的には、１．６μｇ  ｐＷｚｌ  ＤＮＡ、１．２μｇ  ｐＣＧ−ＶＳＶＧ、及び１．２μｇ  ｐＣＧ−ｇａｐ／ｐｏｌ、１２μｌの Metafectene Pro 脂質（Biontex）を使用し；ＤＮＡと脂質を３００μｌ  ＰＢＳでそれぞれ希釈して混合し；１５分のインキュベーションに続いて、３００万個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１日前に播種した１つの６ｃｍディッシュへそれらを加えた。トランスフェクションの４８時間後と７２時間後にウイルス上清を採取した。この上清を０．４５μｍ膜に通して濾過した後で、それを８μｇ／ｍｌ  ポリブレン（ミリポア）の存在下に標的細胞へ加えた。２μｇ  ｐＬＫＯ  ＤＮＡ、１．５μｇ  ｐＣＭＶ−ｄＲ８．９１、及び０．５μｇ  ｐＭＤ２−ＶＳＶＧで細胞をトランスフェクトすること以外は類似のアプローチで、レンチウイルスを産生した。最初の感染から７２時間後
より始めて、細胞を抗生物質で選択した。ピューロマイシンとブラスチシジンをそれぞれ１．５μｇ／ｍｌと４μｇ／ｍｌの最終濃度で使用した。
【０１０５】
[00148]  表Ｓ２
【０１０６】
【表３−１】
2018168193.tif 000005
【０１０７】
【表３−２】
2018168193.tif 000006
【０１０８】
[00149]  細胞培養
[00150]  ヒト乳腺上皮細胞（ＨＭＥＣ）をＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、インスリン（
１０μｇ／ｍｌ）、及びヒドロコーチゾン（０．５μｇ／ｍｌ）を補充したＤＭＥＭ／Ｆ−１２において５％  ＣＯ２と３７℃下に維持した。Ｒａｔ１細胞とＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１０％  ＦＢＳ（Invitrogen）を補充したＤＭＥＭにおいて維持した。すべての乳癌細胞系（ＭＣＦ７、Ｔ４７Ｄ、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４３６、ＨＣＣ１１９７、ＢＴ５４９）を１０％  ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ  １６４０培地において培養した。テトラサイクリン誘導遺伝子／ｓｈＲＮＡを安定的に導入した細胞には、Ｔｅｔ承認ＦＢＳ（Clontech）を使用した。
【０１０９】
[00151]  細胞増殖アッセイ
[00152]  典型的には、乳癌細胞を１２ウェルプレートにおいて１ｍｌ培地に１〜２ｘ
１０４個で播種した。翌日、ウェルに１１０μｌの培地を１μｇ／ｍｌのドキシサイクリン無しで、又は有りで（１００ｎｇ／ｍｌの最終濃度に達する）加えて、これを２日ごとに繰り返した。最初の処理から６日後、細胞をホルムアミドで固定して、クロマチン結合性の細胞化学染料であるクリスタルバイオレット（０．０５％、重量／容積）で染色した。このプレートを十分に（extensively）洗浄して、フラットベッドスキャナーで造影し
た。この染色の定量のために、各ウェルへ１ｍｌの１０％酢酸を加えて、色素を抽出した。吸光度は、７５０ｎｍを基準値として、５９０ｎｍで測定した。
【０１１０】
[00153]  コロニー形成アッセイ
[00154]  このアッセイは、他に述べなければ、典型的には１２ウェルプレートにおい
て実施した。０．３％寒天を含有する培地に細胞を懸濁させて、０．６％寒天の層の上へ蒔いた（各ウェルについて、８００μｌの培地、１ｍｌのボトム寒天中４，０００個の細胞）。翌日、このウェルに培地（１００ｎｇ／ｍｌのドキシサイクリン無し、又は有りで）を加えた。細胞播種から３週間後、コロニーをホルムアミドで固定して、造影した。各ウェル中のコロニー数を、ＩｍａｇｅＪ（アメリカ国立衛生研究所）を使用して定量した。
【０１１１】
[00155]  腫瘍異種移植片試験
[00156]  異種移植片試験は、いずれもアメリカ国立衛生研究所からの動物使用ガイド
ラインと、Dana-Farber 癌研究所の動物実験委員会によって承認されたプロトコールに従って実施した。使用したレシピエントマウスは、ＮＣＲ−ヌードマウス（CrTac:NCr-Foxn1nu，Taconic）であった。細胞を４０％のマトリゲル−基底膜マトリックス、ＬＤＥＶフリー（BD Biosciences）に再懸濁させて、注射するまで氷上に置いた。ヒト細胞系を移植するために、注射の同日に、マウスに４００ラドの単一線量をγ線照射した。イソフルランの吸入によってマウスを麻酔して、部位につき１５０μｌの細胞（５ｘ１０６個）を注射した。腫瘍をノギスによって２次元で測定した。式：Ｖ＝０．５ｘ長さｘ幅ｘ幅を使用して、腫瘍体積を計算した。いずれの異種移植片データも、平均±ＳＥＭとして提示する。スチュ−デントの両側ｔ検定を使用して、処置群間の比較を実行した。Openoffice 又
は GraphPad Prism バージョン５．０ｂのいずれかを使用して、計算を実施した。
【０１１２】
この腫瘍生成試験では、５ｘ１０６個のＨＭＥＣ細胞を乳腺脂肪体へ注射して、５ｘ１０６個のＲａｔ１細胞を皮下注射した。腫瘍成長を週２回モニターした。注射後３週間でＲａｔ１異種移植片を採取した。腫瘍成長に対するＭＥＬＫノックダウンの影響について試験するために、２回目の注射日にマウスを無作為に群へ層別して、試験期間の間、未処理のままであるか、又はドキシサイクリン（５％デキストロース飲料水溶液中２ｍｇ／ｍｌ、週２回作り直す）で処理した。腫瘍を週２回測定した。腫瘍維持におけるＭＥＬＫの役割について試験するには、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、又はＭＤＡ−ＭＢ−４６８、又はＭＣＦ−７、又はＴ４７Ｄ細胞の正所性の注射に由来する腫瘍が定着したマウスを無作為に２群へ層別し、１群に飲料水中のドキシサイクリンを与えた。腫瘍を週２回ノギス測定して、腫瘍成長に対するＭＥＬＫノックダウンの効果をモニターした。
【０１１３】
[00157]  時間経過イメージング
[00158]  自動焦点維持装置と湿式インキュベーションチャンバ（３７℃，５％  ＣＯ
２）を装備した Nikon Ti 電動倒立顕微鏡（ニコンイメージングセンター、ハーバード医学校）で時間経過イメージングを実施した。Ｈ２Ｂ  ＧＦＰを安定的に発現する細胞を２４ウェルのガラス底プレートに予め播種して、未処理のままにするか又はドキシサイクリン（最終濃度：１００ｎｇ／ｍｌ）で処理した。２０倍の対物レンズと Hamamatsu ORCA-AG 冷却ＣＣＤカメラで画像を５分ごとに捉えた。ＩｍａｇｅＪ（アメリカ国立衛生研究
所）を使用して、画像を解析した。
【０１１４】
[00159]  免疫蛍光分析
[00160]  予め２４ウェルプレート中へ置いたＮｏ．１．５カバーガラス（１２ｍｍ，
円形）上に細胞を播種した。採取してすぐに、細胞を４％ホルムアミドで１０分間固定した。洗浄後、細胞を０．１％ Trition X-100 で１０分間透過処理した。次いで、細胞を
洗浄して、１％ウシ血清で３０分間ブロックした後で、１％ウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳにおいて調製した一次抗体（抗β−チューブリン、＃２１２８、Cell Signaling
Technology）とともにインキュベートした。４℃で一晩インキュベートした後で、この
試料を洗浄して、Alexa 488 コンジュゲート化二次抗体（Invitrogen）とともに室温で１時間インキュベートした。十分な洗浄の後で、試料を乾燥させて、ProLong Antifade 試
薬（Invitrogen）とともに搭載した。Hamamatsu C8484-03 モノクロームカメラを装備し
た、ニコンイメージングセンター（ハーバード医学校）の Nikon 80i 直立顕微鏡で画像
を獲得した。画像の解析には、異なる色の合流チャンネルとクロッピングが含まれる、Image J を使用した。
【０１１５】
[00161]  イムノブロッティング
[00162]  プロテアーゼ阻害剤カクテル（ロシュ）とホスファターゼ阻害剤カクテル（Thermo Scientific）を補充したＲＩＰＡ緩衝液（２５ｍＭトリス（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ノニデットＰ−４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、及び０．１％ドデシル硫酸ナトリウム）で細胞を溶解した。澄明化した溶解液について、ＢＣＡキット（Thermo Scientific）を使用して、タンパク質濃度を分析した。等量のタンパ
ク質（１０〜２０μｇ）を８％若しくは１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離させて、引き続き、ニトロセルロース膜又は二フッ化ポリビニリデン膜（アマーシャム）の上へ移した。この膜を５％脱脂乳でブロックしてから、一次抗体とともに４℃で一晩インキュベートした。洗浄後、この膜をフルオロフォアコンジュゲート化二次抗体とともに室温で１時間インキュベートした。次いで、この膜を洗浄して、オデッセイ（Odyssey）赤外線スキャ
ナー（Li-Cor Biosciences）で走査した。この試験で使用した一次抗体には、抗ＭＥＬＫ（Epitomics，＃２９１６）、抗α−チューブリン（Abcam）、抗サイクリンＢ１（ミリポア）、抗ビンクリン（シグマ）、抗ＦｏｘＭ１（Santa Cruz）、抗β−チューブリン、抗ホスホ−Ａｋｔ（Ｓ４７３）、抗ホスホＡｋｔ（Ｔ３０８）、抗総Ａｋｔ、抗Ｆｌａｇ、抗切断型ＰＡＲＰ（Ａｓｐ２１４）、抗切断型カスパーゼ３、抗ＡＵＲＫＡ、抗ＡＵＲＫＢ、抗ｐ２７（いずれも、Cell Signaling Technology 由来）が含まれる。使用した二次抗体は、ＩＲＤｙｅ７００コンジュゲート化抗ウサギＩｇＧとＩＲＤｙｅ８００コンジュゲート化抗マウスＩｇＧ（Rockland）であった。
【０１１６】
[00163]  細胞周期分析
[00164]  トリプシン処理によって細胞を採取して、繰り返しピペッティングして、単
細胞懸濁液とした。遠心分離の後で、ボルテックスしながら７０％エタノール（−２０℃）を滴下することによって、細胞を固定した。次いで、５０μｇ／ｍｌのＤＮアーゼフリーＲＮアーゼＡ（シグマ）と０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するヨウ化プロピジウム（５０μｇ／ｍｌ，シグマ）溶液で細胞を染色した。３０分のインキュベーションの後で、試料を洗浄して、０．５％  ＢＳＡに再懸濁させた。この分析は、ＤＦＣＩフローサイトメトリーコアファシリティ（Core Facility）での LSRFortessa（BD Biosciences）で実施した。ＦＬ３−ＡをＦＬ３−Ｈに対してプロットすることにより単細胞に
ゲートをかけて、細胞残滓とダブレットを排除した。各試料につき少なくとも１万個の単細胞を採取した。
【０１１７】
[00165]  クロマチン免疫沈降
[00166]  既報（Lee et al., 2006）のように、クロマチン免疫沈降を実施した。採取
時に、細胞培養皿中の培地に１６％ホルムアミド（Electron Microscopy Sciences）を加えて、１％の最終濃度に達せしめて、室温で１０分間のインキュベーションの後で、グリシン（最終１２５ｍＭ、５分のインキュベーション）でクエンチした。細胞を冷ＰＢＳ中へ削り落とすことによって採取して、遠心分離させた。細胞ペレットをＬＢ１（５０ｍＭ
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、０．５％  ＮＰ−４０、０．２５％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００）で溶解させてから、遠心分離後に、ＬＢ２（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２００ｍＭ
ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ  ＥＧＴＡ）で溶解させて、再び遠心分離の後で、ＬＢ３（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１％デオキシコール酸Ｎａ、０．５％  Ｎ−ラウロイルサルコシン）に再懸濁させた。Ｑ８００Ｒ  ＤＮＡ剪断ソニケーター（Shearing Sonicator）（Qsonica）を振幅５０％、３０秒のオンと３０秒のオフのパルスで１
０分間使用して、試料を音波破砕した。次いで、試料に１０％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を１％の最終濃度で補充して、２０，０００ｘｇで１０分間、４℃で遠心分離させた。この澄明化した溶解液を以下の免疫沈澱に使用し、５０μｌの溶解液をインプットとして取っておいた。
【０１１８】
[00167]  プロテインＧ結合 Dynabeads（Invitrogen）をブロック溶液（ＰＢＳ中０．
５％ウシ血清アルブミン）で洗浄して、ブロック溶液中５μｇの抗ＦｏｘＭ１（ＳＣ−５０２，Santa Cruz Biotechnology）又は５μｇのウサギＩｇＧと一緒に一晩インキュベートして、翌日、ブロック溶液で３回洗浄した。細胞溶解液を抗体／磁気ビーズと一緒に回転させながら、４℃で一晩インキュベートした。翌日、このビーズを磁気スタンドで回収して、ＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．６）、５００ｍＭ  ＬｉＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％  ＮＰ−４０、０．７％デオキシコール酸Ｎａ）で６回洗浄した。５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有するトリス−ＥＤＴＡ緩衝液で１回洗浄後、６５℃で一晩のインキュベーションのために、試料を溶出緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％  ＳＤＳ）に再懸濁させた。また、先の５０μｌインプットを１５０μｌの溶出緩衝液と混合して、逆架橋形成（reverse crosslinking）のために６５℃で一晩インキュベートした。翌日、この試料へＲＮアーゼ（最終０．２μｇ／ｍｌ）を加えて、３７℃で１時間のインキュベーションを続けた。次いで、試料をプロテイナーゼＫ（最終０．２μｇ／ｍｌ）で処理して、５６℃で１時間インキュベートした。QIAquick ＰＣＲ精製キット（Qiagen）でＤＮＡを精製して、３０μｌの水で溶出させた。表
Ｓ２に収載したプライマーを使用する、Quick-Load Taq 2X Master Mix（ＮＥＢ）を使用して、ＰＣＲを実施した。
【０１１９】
[00168]  ｑＲＴ−ＰＣＲ分析
[00169]  培養細胞より、均質化用の QIAshredder スピンカラムとカラム上でのＤＮアーゼ消化を使用して、RNeasy Mini キット（Qiagen）で全ＲＮＡを抽出した。高性能ＲＮＡ→ｃＤＮＡ合成キット（High Capacity RNA to-cDNA Kit）（アプライド・バイオシス
テムズ）を使用して、２マイクログラムのＲＮＡを逆転写した。Power SYBR Green PCR Master Mix（アプライド・バイオシステムズ）を ABI7300 リアルタイムＰＣＲシステムで使用して、ｃＤＮＡを定量的に分析した。使用するプライマーは、表Ｓ２に収載した。サイクリング条件は、９５℃で１５分間、９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、及び７２℃で３０秒の４０サイクルであった。デフォルト分析設定を使用して、Ｃｔ値を発生させた。ΔＣＴをＣｔ（目的の遺伝子）−Ｃｔ（βアクチン）として定義した。ΔΔＣＴをΔＣｔ（処理試料）−Ｃｔ（対照試料）として定義した。相対定量（ＲＱ）を２−ΔΔＣＴとして計算した。統計解析は、スチューデントの検定によって実施した。
【０１２０】
[00170]  遺伝子発現の分析
[00171]  遺伝子発現データを Oncomine（Rhodes et al., 2004）よりダウンロードし
た。臨床データセットの情報を表Ｓ１に収載する。解析結果と図面は、GraphPad Prism 
で作製した。ドットプロットグラフにおいて、各ドットは個々の試料を示し、結果を四分位範囲付きのメジアンとして表す。
【０１２１】
[00172]  生存率分析
[00173]  全生存率又は無転移生存率のデータが利用可能である乳癌患者の独立したコ
ホートについて検証した。このコホートの情報を表Ｓ１に収載する。ＭＥＬＫ発現と関連する生存率のデータを Oncomine（Rhodes et al., 2004）よりダウンロードした。それぞれのコホートで、ＭＥＬＫの発現に基づいて、患者を上位６０％の「高ＭＥＬＫ」群と下位４０％の「低ＭＥＬＫ」群へ分けた。カプラン・マイヤー曲線、並びにログランク（Mantel-Cox）検定、及びハザード比について、GraphPad Prism によって解析した。
【０１２２】
[00174]  統計解析
[00175]  ２群間と３群間の差分比較のためにスチューデントの両側ｔ検定とＡＮＯＶ
Ａ（分散分析）をそれぞれ使用した。生存率との相関性の分析を GraphPad Prism で実施した。
【０１２３】
[00176]  本明細書に提供する定義と開示は、参照により組み込まれる他のすべての定
義と開示を支配して、それに代わるものである。本発明について、本明細書においてその好ましい態様に関連して記載したが、当業者には、付帯の特許請求項において明確化されるような本発明の精神及び範囲より逸脱することなく、具体的に記載しなかった種々の追加、修飾、代用、及び削除をなし得ることが理解されよう。故に、上述の詳しい説明は、限定的ではなくて例示的なものとみなすべきであると企図されて、本発明の精神及び範囲を明確化するように企図されるのは、すべての均等物が含まれる、以下の特許請求項であると理解されたい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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