(57)【要約】      （修正有）【課題】生体物質濃度を高感度で測定できる検出用マイクロ電極を提供する。【解決手段】マイクロ電極の基材部分表面に導電性ダイヤモンドライクカーボン薄膜を形成させることにより、検出プローブとなるべき先端外径が１μｍ以下であり、優れた摺動性を備え、かつ、多様な材質からなる基材をもちいることが出来るという要件を実現し、該マイクロ電極は、一定レベル以上の電気化学的特性を有し、その鋭利な先端形状及び摺動性の良さから、生体内の所望する限局した部位に挿入等することが出来、該部位での所望の物質の定量測定を可能とする。更に該電極は、用途に適合した多様な材質（強度のあるもの・安価なもの・耐久性に優れたもの等）からなる基材により構成することが出来る。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基材表面に、導電性炭素系材料からなる薄膜を形成させた、先端直径1μm以下のマイクロ電極。
【請求項２】
前記導電性炭素系材料が、導電性ダイヤモンドライクカーボン（ＤＬＣ）であることを特徴とする請求項１に記載のマイクロ電極。
【請求項３】
前記基材の先端部およびテーパー部の少なくとも一部に前記薄膜が形成していることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載のマイクロ電極。
【請求項４】
前記基材が、非金属類であることを特徴とする請求項１から請求項３のいずれか１項に記載のマイクロ電極。
【請求項５】
前記ＤＬＣ薄膜のＩＤ／ＩＧ比が０．４〜０．９であることを特徴とする請求項２から請求項４のいずれか１項に記載のマイクロ電極。
【請求項６】
前記薄膜の表面粗さが、算術平均高さＳａを０．０５μｍ以下とすることを特徴とする請求項１から請求項５のいずれか1項に記載のマイクロ電極。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、極細の先端部を有する基材表面に、導電性炭素系材料である導電性ダイヤモンドライクカーボン（ＤＬＣ）薄膜を形成させることによる、先端直径1μm以下のマイクロ電極の作成に関する。
【背景技術】
【０００２】
電気化学測定は、溶液中の水素イオン、微量金属イオン、生体分子等といった対象を高感度に検出する上で大変優れた測定法である。斯様な電気化学法に基づく分析やバイオセンサーにおいては、特に微量な試料の測定や低濃度の目的物質を高感度に測定する技術が重要である。こうした微量試料分析及び高感度測定を行う技術として、測定用電極の微小化は大変重要である。
【０００３】
微小な測定用電極としてマイクロ電極が挙げられる。マイクロ電極とは、微小電極ともいい、電極先端外径がマイクロメートルオーダーに形成されている電極である。微小な先端形状を有することにより、高感度の計測が可能であり、電極近傍の局所的な反応を観察できることから、電気化学の分野において幅広く利用されている。具体的な特徴としては、１）微小領域の測定を可能とする、２）定常状態の電流（マイクロディスク電極等）を得ることができる、３）高速度の応答が可能である、４）高抵抗の媒体の中での電気化学測定を可能になる、等を挙げることが出来るため、単一細胞や生体内測定等に、盛んに応用されている。
【０００４】
マイクロ電極は通常、電流を検出するための良導体材質（金、白金、パラジウムなどの貴金属やカーボンファイバー等）からなる細線及び当該細線を絶縁する素材より構成されている。例えば，金属ワイヤやカーボンファイバーといった良導体細線を絶縁体中に封入し，当該細線の端面を露出させた後，研磨して作製する等の電極が一般的であった。
【０００５】
こうした従来のマイクロ電極の問題点としては、用いられている良導体細線の生体親和性が必ずしも良くはなく、生体内測定を行う際に、表面にタンパク質等の生体物質が付着することで、測定を妨げる等の不具合が生じていた。
【０００６】
近年、ダイヤモンドにホウ素を高濃度にドープしたホウ素ドープダイヤモンド（ＢＤＤ：Boron Doped Diamond）を電極材料とした導電性ダイヤモンド電極が脚光を浴びている。
一般に、絶縁性のダイヤモンドにホウ素を高濃度にドープすると、ホールが生成し（ｐ型半導体）金属的導電性が付与される現象が知られている。当該ＢＤＤは、広い電位窓、小さなバックグラウンド電流、ダイヤモンド由来の高い物理的・化学的安定性などの特徴を有する為、電気化学分析や電気分解において、有効な機能性電極材料として注目されている。
【０００７】
ＢＤＤを用いたマイクロ電極（以下ＢＤＤマイクロ電極とする）は、基材（石英ガラスニードルやタングステンワイヤなど）の表面にＢＤＤを成膜し、必要な部位に絶縁加工を施すことにより作成される。ＢＤＤ膜は生体親和性がよく、タンパク質等が付着しにくい為、従来のマイクロ電極が有していた問題点を解消することが出来る。また、ＢＤＤ成膜処理する管又はワイヤ状の基材の直径を選択することで、所望の先端径サイズのＢＤＤ電極を作製できる為（非特許文献１）、ＢＤＤ膜の厚さ（数μｍ程度）よりも大きな先端径サイズ（即ち、数μｍ以上）であれば、かなり微細な電極を作成することも可能である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】栄長 泰明、２０１３年発行、ＮＥＷ  ＤＩＡＭＯＮＤ、ｖｏｌ．２９、Ｎｏ．４、ｐｐ．２９−３１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
小さなサイズであることを生かし、生体内に直接挿入することで、電気化学センサとしての計測を可能とする電極として注目されているＢＤＤマイクロ電極であるが、生体内の極めて限定した部位での精緻な計測を行うには、必ずしも十分ではないと考えられている。
【００１０】
上記の通り、ＢＤＤマイクロ電極は、ＢＤＤ膜が数μｍ程度の厚みを有する為、如何に基材部位の先端径を鋭利にしても、マイクロ電極としての先端外径を１μｍ以下とすることは困難である。しかしながら、生体内での限局した部位、例えば単独の細胞内に電極を刺入することによる細胞内環境や、細胞外膜の極近傍領域での、電気化学的パラメーター及び／又は生体物質濃度を高感度で測定するには、検出用マイクロ電極のプローブとなるべき先端外径が１μｍ以下であることが強く求められる。
【００１１】
また、ＢＤＤマイクロ電極の別の問題点としては、その摺動性の悪さが挙げられる。ＢＤＤマイクロ電極は、基材（例えば石英ガラスニードル）表面に予めナノダイヤモンドをシーディング処理した後、マイクロ波プラズマＣＶＤ法等により、シードとなる当該ナノダイヤモンドを核としてＢＤＤ層を成長させていく、という製法である為、完成したＢＤＤ膜表面には著しい凹凸が生じ、摺動性は必ずしも良好ではない。生体内の所望の限定部位に電極端子を挿入・設置する上で、この点は大きな課題となっている。
【００１２】
更に、ＢＤＤマイクロ電極は、上記の様な工程で製膜するため、シードに対して炭素を積層していく際に、通常、８００度以上の高温で処理しなければならない。この為、ＢＤＤ膜を製膜可能な基材は、一定以上の融点を有する材質のものに限定されることとなり、ＢＤＤマイクロ電極として利用しうる基材の材質が限定される、という問題点も存在していた。例えば、ＢＤＤマイクロ電極の基材としてガラスニードルを用いた場合、高い融点を持つ石英ガラス製のものを用いる必要があり、より安価で加工性に優れた通常のガラスを用いることは困難である。又、製膜に必要な高温による負担で、ガラスニードル自体が破損し易く、製膜性も損なわれてしまう、という問題が生じている。
【００１３】
上記事情に鑑みて、本発明はマイクロ電極に関するもので、１）検出プローブとなるべき先端外径が１μｍ以下であり、２）優れた摺動性を備え、かつ、３）多様な材質からなる基材をもちいることが出来る、といった特徴を兼ね備えたマイクロ電極を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
発明者らは、上記１）〜３）の全ての要件を満たすことを可能にするべく、マイクロ電極の様々な製造条件につき、鋭意研究を行った。その結果、以下に示すような経緯に基いて、マイクロ電極の基材部分表面に導電性ダイヤモンドライクカーボン薄膜を形成させることにより、要件１）〜３）を実現することが可能であることを見出した。
【００１５】
ダイヤモンドライクカーボン（ＤＬＣ）膜とは、非晶質炭素膜とも呼ばれ、ダイヤモンド構造に対応するｓｐ３結合を有する炭素と、グラファイト構造に対応するｓｐ２結合を有する炭素が不規則に混在したアモルファス構造の膜である。
高硬度・低摩擦、表面が不活性といった特性を有し、比較的低温条件で製膜することが可能な為、金属やガラス等の無機材料のみならず、高分子樹脂等の有機系材料等からなる基材表面のコーティング材として利用することが出来、当該基材表面に耐摩耗性、耐蝕性及び摺動性等の性質をもたらすことが知られている。また、材質が炭素である為、生体に対する適合性も高く、タンパク質等の生体物質が付着しづらいという物性も有している。
【００１６】
更にＤＬＣ膜は、水素（Ｈ）以外の元素を適宜ドーピングし、ＩＣＦ（Intrinsic Carbon Film：真性カーボン膜）となることにより、各種応用用途に合わせた機能を付加することが出来る。具体的には、摺動性、撥水性、親水性、導電性、血小板付着性、タンパク質付着性、抗菌性などの亢進が知られており、該特性から、特に医療用途に適した製品への応用が期待されている。
本件発明に係るマイクロ電極は、生体内での測定に用いられるケースが多い為、ＩＣＦの製膜により該特性を付加することで、さらに広汎な用途に対応し得る機器となることが期待される。
【００１７】
ＤＬＣ膜は、製法や、製造条件、原料を適宜選択することにより、基材にｓｐ３結合を有する炭素とｓｐ２結合を有する炭素との混在比率や製膜された膜厚を制御することが可能である。特に膜厚は、ＢＤＤ膜が製法上、数μｍ以上となってしまうのに対し、ＤＬＣ膜であれば、数十ｎｍ程度のものを製膜することが出来る。
【００１８】
さらにＤＬＣ膜は、選択した原料ガスをプラズマ雰囲気中でイオン化させる等の方法により、導電性を有するものを製膜することが可能である。
【００１９】
ＤＬＣ膜について、上記の様な知見は得られていたものの、ＤＬＣ膜を電極用の基材に製膜して、果たして電極として機能するのか、実用に耐えうる一定レベル以上の電気化学的特性を有し得るのか、については全く不明であった。発明者らは、マイクロ電極を作成する前に、まずは一定の面積を有する平板に、様々な製膜条件での導電性ＤＬＣ膜を製膜することで平板電極を作成し、当該電極を用いたＣＶ測定を行い、併せてＢＤＤ平板電極と比較することで、ある特定の導電性ＤＬＣ膜で作成した電極が、実用化可能なレベルを十分に満たす電気化学的特性を有することを見出した。更に、当該製膜条件による導電性ＤＬＣ膜を微細なガラスニードルに製膜することによって作成したＤＬＣマイクロ電極も又、電気化学センサとして優れた電気化学的特性を有するだけでなく、上記１）〜３）の全ての要件を兼ね備えていることを明らかにすることで、本発明を完成した。
【００２０】
以上の知見に基づいて、本発明は完成されるに至った。
すなわち、本発明は以下の（１）〜（６）に関するものである。
（１）基材表面に、導電性炭素系材料からなる薄膜を形成させた、先端直径1μm以下のマイクロ電極。
（２）前記導電性炭素系材料が、導電性ダイヤモンドライクカーボン（ＤＬＣ）であることを特徴とする（１）に記載のマイクロ電極。
（３）前記基材の先端部およびテーパー部の少なくとも一部に前記薄膜が形成していることを特徴とする（１）又は（２）に記載のマイクロ電極。
（４）前記基材が、非金属類であることを特徴とする（１）から（３）のいずれか１つに記載のマイクロ電極。
（５）前記ＤＬＣ薄膜のＩＤ／ＩＧ比が０．４〜０．９であることを特徴とする（２）から（４）のいずれか１つに記載のマイクロ電極。
（６）前記薄膜の表面粗さが、算術平均高さＳａを０．０５μｍ以下とすることを特徴とする（１）から（５）のいずれか１つに記載のマイクロ電極。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、鋭利な先端を有する基材表面に導電性ＤＬＣ薄膜を形成させた先端直径1μm以下のマイクロ電極することによって、望まれる要件１）〜３）の全ての性質を備えた、これまでにないマイクロ電極を提供することが出来る。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ＢＤＤ膜及びＤＬＣ膜を用いたマイクロ電極の概略図（例示）。
【図２】ＤＬＣ製膜方法（ＨｉＰＩＭＳ法（Ａ）及びイオン化蒸着法（Ｂ））。
【図３】ＤＬＣ平版電極及びマイクロ電極の作成方法。
【図４】ＤＬＣマイクロ電極先端の走査型電子顕微鏡像。
【図５】ＤＬＣ平板電極（Ｈ−１〜３及びＩ−１〜３）と他の平板電極とのＣＶ曲線比較。      走査速度は100mV/Sにて測定した。
【図６】タンパク質存在下での各種平板電極のＣＶ曲線比較。      ＧＣ電極、ＤＬＣ電極（Ｈ−１）及び酸化処理したＤＬＣ電極（Ｈ−１−Ｏ）を比較した。
【図７】タンパク質存在下における各種平板電極のピーク電流密度の経時変化。
【図８】タンパク質存在下における各種平板電極のピーク電位の経時変化。
【図９】ＤＬＣマイクロ電極のＣＶ曲線及び検量線（0.1M Na2SO4中のK4Fe(CN)6）
【図１０】ＤＬＣマイクロ電極のＣＶ曲線及び検量線（1/15M PBS中のテオフィリン）
【図１１】ＤＬＣマイクロ電極のＣＶ曲線及び検量線（1/15M PBS中のゲンタマイシン）
【図１２】レーザー顕微鏡によるＤＬＣ及びＢＤＤ平板電極の表面粗さ測定
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明の形態は、基材表面に導電性炭素系材料からなる薄膜を形成させた先端直径1μm以下のマイクロ電極である。
ここでマイクロ電極とは、上記した通り、電極先端外径がマイクロメートルオーダーに形成されている電極のことであり、その構成等については特に限定はしない。即ち、電流を検出するための良導体材質（金、白金、パラジウムなどの貴金属やカーボンファイバー等）からなる細線及び当該細線を絶縁する素材より構成され、例えば，金属ワイヤやカーボンファイバーといった良導体細線を絶縁体中に封入し，当該細線の端面を露出させた後，研磨して作製する等の電極でもよいが、本発明に係るマイクロ電極としては、図１に示すように、先端を鋭利にした基材の表面の先端部およびテーパー部の少なくとも一部を、良導体材質の膜（ここではＤＬＣやＢＤＤなどの導電性炭素系材料からなる薄膜）により被覆した構造を有する電極が好ましい。
【００２４】
ここで導電性炭素系材料とは、炭素を主原料とする導電性を有する材料のことであり、特に限定はしないが、例えば、ＤＬＣ、ＢＤＤ、グラッシーカーボン（ＧＣ）や導電性カーボンブラック又はこれらに不純物を含有することで、異なる導電性に誘導したものなどが該当する。
【００２５】
本発明に係る導電性炭素系材料からなる薄膜は、単層であっても、複数の層から構成されていてもよい。特に複数の層から構成される場合は、該層を構成する各膜は同一種類の導電性炭素系材料からなる膜であってもよく、異なる材料及び／又は組成からなる膜であってもよい。
【００２６】
本発明においては、マイクロ電極の先端直径を1 μm以下にすることが必要なため、膜厚の微小な製膜が可能であるＤＬＣが特に好ましいため、以下に詳細に述べる。
【００２７】
本発明に係る導電性ＤＬＣ薄膜は既知の方法を用いて形成することができる。特に限定はしないが、例えば、イオン化蒸着法、ＨｉＰＩＭＳ（High Power Impulse Magnetron Sputtering）法、スパッタ法、ＤＣプラズマＣＶＤ法、高周波プラズマＣＤＶ法、化学気相堆積法、プラズマイオン注入法、重畳型高周波プラズマイオン注入法、イオンプレーティング法、アークイオンプレーティング法、イオンビーム蒸着法又はレーザーアブレーション法等により、表面処理対象の基材表面にＤＬＣ膜を形成してもよく、好ましくはイオン化蒸着法、ＨｉＰＩＭＳ法を用いてもよい。図２に、イオン化蒸着法及びＨｉＰＩＭＳ法の原理について示した。また、該薄膜の膜厚は特に限定しないが、０．０１〜１μｍの範囲が好ましく、より好ましくは０．０５〜０．５μｍの範囲である。
【００２８】
特に本発明に係るＤＬＣ膜は、導電性であることが必要である。この為、該ＤＬＣ膜の製膜方法としては、特に限定はしないが、イオン衝撃のコントロールが可能なイオン化蒸着法またはグラファイト成分の多い成膜方法としてＨｉＰＩＭＳ法であることが好ましい。
【００２９】
本発明に係るＤＬＣ膜は、基材に直接接触する形で製膜してもよいが、基材に対する接着性や適当な製膜方法等を考慮して、基材と該膜の間に何らかの中間層を挟んでもよい。該中間層は、特に限定はしないが、好ましくは金属製であり、更に好ましくはケイ素、チタン、クロム、タングステン、アルミニウムなどである。
【００３０】
本発明に係る基材は、マイクロ電極を構成する上で支障が無ければ、特に限定されるものではないが、図１に示したような構成からなるマイクロ電極の場合は、該電極の先端部及びそこに至るまでの構造体を破損することなく安定に維持するのに十分な強度を有し、且つ、上記のＤＬＣ製膜方法により、表面にＤＬＣ膜を剥離することなく安定に形成することが可能な材質からなる基材であればよい。
ＤＬＣ製膜方法における温度条件は、ＢＤＤ製膜における温度条件に比べ、比較的低温である為、該温度条件（例えば、イオン化蒸着法では１５０度程度、ＨｉＰＩＭＳ法では１００度程度）よりも高い融点を有し、該温度にて物理的性状を損なわれない材質であれば、該基材として用いることが可能である。
【００３１】
具体的には、ニッケル、タングステン、クロム、チタン等の純金属、及び、ステンレス鋼（ＳＵＳ）、真鍮、ジュラルミン、チタン合金等に代表される合金（アロイ；複数の金属元素あるいは金属元素と非金属元素から成る金属様のもの）等の金属類、金、銀、白金、パラジウム、ロジウム、イリジウム、ルテニウム、オスミウム等の貴金属類、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテフタレート、塩化ビニール、ポリスチレン（スチロール樹脂）、ＡＢＳ樹脂、アクリル（メタクリア）、ポリアミド（ナイロン樹脂）、ポリカポネード、四フッ化エチレン、エチレン酸ビコポリマー等の熱可逆性樹脂類、フィノール樹脂ベークライト、メラミン（デコラ）、不飽和ポリエステル、エポキシ熱硬化性樹脂等の熱硬化性樹脂類、及びポリマーアロイ（２種類以上の高分子を含んだ多成分系高分子）、ソーダ石灰ガラス、鉛ガラス、ホウケイ酸ガラス、無アルカリガラス、石英ガラス、リン酸塩ガラス等のガラス類、炭化ケイ素及びセラミック（無機物を加熱処理し焼き固めた焼結体）等が挙げられるが、特にこれらに限定されるものではなく、好ましくは、金属類、貴金属類、ガラス類や樹脂類に代表される非金属類（金属類及び貴金属類でないもの）であり、更に好ましくは非金属類であり、非金属類の中で特に好ましくは、ガラス類であり、更に好ましくは、ガラス類の中でもソーダ石灰ガラス等の低融点ガラスである。
【００３２】
電極として一般的に使用されるのは白金であるが、材料コストが高額という課題と、マイクロニードル用材料としては、先端をｎｍオーダーに加工することが容易でないという課題を持つ。
これらの課題に対し、例えば、ガラス類であれは、加熱下において、キャピラリーをひくことにより、長微小先端径を容易に加工でき、また、シングルバレル、マルチバレル型等の所望の特殊構造も容易に作成できる為、非金属類は、用途によっては、金属類に比してより有用な基材となる可能性が示唆されている。
【００３３】
また、他の非金属基材としては、ガラス類の課題とされる脆弱性を解決する目的で、可撓性に優れた樹脂類もあげられる。樹脂類もガラス類同様、熱加工に対する自由度が高く、ｎｍオーダーの先端形状も容易に成形可能である。
ただし、ガラス類及び樹脂類基材共、未処理基材については、タンパク質の非特異吸着抑制が問題となるが、本件発明に係るＤＬＣを必要部分に被覆することにより、特に生体に対して用いるマイクロ電極として使用することが可能となる。
【００３４】
またＨｉＰＭＳ法を用いれば、低温（およそ１００度程度）でＤＬＣの製膜が可能である為、融点の低い樹脂を基材とした所望のマイクロ電極の作成も可能である。
【００３５】
この様な理由により、本件発明においては、特に限定はしないが、基材が、非金属類 であることを特徴とするマイクロ電極が好ましい。
【００３６】
本発明に係るマイクロ電極は、該電極を構成する基材表面に、ＤＬＣ膜等の導電性炭素系材料からなる薄膜が形成され、先端直径1μm以下のマイクロ電極であれば、基材の如何なる部位に該薄膜が形成されていてもよいが、該薄膜を形成することにより、検出プローブとなるべき先端外径が１μｍ以下となり、生体内の所望の部位への電極端子の挿入・設置を容易にする摺動性が実現されることを鑑みると、該薄膜は、該基材の先端部およびテーパー部の少なくとも一部に形成していることが好ましく、図１に例示するような、基材への薄膜の形成が特に好ましい。
【００３７】
本発明に係るマイクロ電極の先端外径は、該電極が図１に示す構造を有した電極である場合、該電極を構成する基材の先端径に該基材表面を覆うＤＬＣ膜厚分を付加した幅長が該マイクロ電極の先端外径となる。
マイクロ電極を構成する基材は、上記の要件を満たすものであれば、いずれの材質から構成される基材でもよく、より鋭利な先端構造を形成しうる材質を選択することも可能である。また、該基材表面に製膜されるＤＬＣ膜の膜厚は、上記の通り０．０１〜１μｍが可能であるため、マイクロ電極の先端外径を１μｍ以下とすることは十分に可能であり、好ましくは０．８μｍ以下、更に好ましくは０．５μｍ以下とすることも可能である。
【００３８】
本件発明に係るマイクロ電極は、特に限定はしないが、電極基材の構造が中実であってもよく、中空であってもよい。特に、電極を測定部位に挿入する際に生じる、該電極を覆う周辺流体の流通あるいは保持が可能な流路が設けられていてもよい。斯様な基材の構造は、特に限定はしないが、ガラス類及び／又は樹脂類からなる基材において容易に作成することが出来る。
【００３９】
ＤＬＣ膜は、上記の通り、ダイヤモンド構造に対応するｓｐ３結合を有する炭素と、グラファイト構造に対応するｓｐ２結合を有する炭素が不規則に混在したアモルファス構造の膜であり、製膜方法や条件を適宜調整することにより、該グラファイト構造及び該アモルファス構造の構成比率を制御することが可能である。該ＤＬＣ膜中の該構成比率（即ち、グラファイト結晶子サイズ）は、ラマン分光測定におけるＤバンド（アモルファス構造を反映）及びＧバンド（グラファイト構造を反映）をピーク分離し、ピーク面積比（ＩＤ／ＩＧ）を算出することで計測することが出来る。
本発明に係るＤＬＣ膜のＩＤ／ＩＧは、特に限定はしないが、発明者らが鋭意研究したところ、０．４〜０．９であることが好ましいことが明らかとなった。
【００４０】
ＤＬＣ膜は、製膜後に様々な後処理を施すことにより、該ＤＬＣ膜に対し更なる機能を付与することも可能である。特に限定はしないが、酸化処理や窒化処理、フッ化処理などがあげられる。例えば、ＤＬＣ膜は元来、生体に対する適合性が高く、タンパク質等の生体物質が付着しづらい物性を有するが、該生体適合性を更に向上させるべく、ＤＬＣ膜の製膜後に酸化処理を施してもよい。酸化処理の方法としては特に限定はしないが、陽極酸化処理、促進酸化処理、各種酸化剤を用いる化学的酸化処理、酸素プラズマ処理、空気などの酸素や水を含む雰囲気中での加熱による酸化処理（気相加熱酸化処理）などがあり、好ましくは促進酸化処理であり、具体的には、オゾン＋紫外線、過酸化水素＋紫外線、オゾン＋過酸化水素があり、特に好ましくはオゾン＋紫外線による酸化処理である。
【００４１】
本件発明に係るマイクロ電極は、特に限定はしないが、該マイクロ電極に係る基材表面に形成された薄膜の表面粗さが、該表面粗さを示す特定のパラメーターにおいて、一定の値を下回ることを特徴としてもよい。
ここで表面粗さとは、被加工物の表面性状を表す指標の一つであり、該指標が低値であればあるほど該表面性状の摺動性は高いことが示唆される。
本件発明に係るマイクロ電極においては、表面粗さが低値である程、例えば、生体等の被測定対象に該マイクロ電極を刺入する場合に、より容易に所望の部位に到達し得ることとなる。
表面粗さを示すパラメーターとしては、最大高さ（Ｓｚ）、最大山高さ（Ｓｐ）、最大谷深さ（Ｓｖ）、算術平均高さ（Ｓａ）等があり、特にいずれかに限定はしないが、算術平均高さ（測定対象表面領域において、該表面領域の平均面に対し、各点の高さの差の絶対値の平均を表したもの）を利用することが一般的である。
本件発明に係るマイクロ電極においては、表面粗さが、算術平均高さＳａを０．３μｍ以下とすることを特徴とするものであってもよく、好ましくは０．１μｍ以下であり、更に好ましくは０．０５μｍ以下であり、最も好ましくは０．０１μｍ以下であってもよい。
【実施例】
【００４２】
以下に実施例を示す。これらは、あくまでも例示にすぎず、本発明の範囲を限定するものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において種々の改良及び設計の変更を行ってもよい。
【００４３】
１．ＨｉＰＩＭＳ法によるＤＬＣ膜を用いた平板電極及びマイクロ電極の作成
１−１．概要
基材表面に導電性ＤＬＣ膜を形成させた平板電極及びマイクロ電極を作成するべく、ＨｉＰＩＭＳ法により、様々な製膜条件での伝導性ＤＬＣ膜の製膜を行った。
【００４４】
１−２．使用装置
真空炉は日本真空技術株式会社のＩＰＢ−４５０ＶＨＳを用いた。ＤＣ電源はＫＹＯＳＡＮのＨＰＫ０６Ｇを使用し、ＨｉＰＩＭＳ電源はナノテック株式会社のＩＣＦ−５００  ｐｌｕｓ  ＳＩを使用した。
【００４５】
１−３．装置概略図
図２に本実験で使用したＨｉＰＩＭＳ法による製膜装置の概略図を示す。本研究で用いた実験装置は、直径650 mm，高さ460 mmの真空チャンバーの両側に130×200 mm2のカーボンターゲットがある。装置横側にマグネトロンスパッタリングのターゲット用大電力パルス電源と基板電がある。長方形電極基板をターゲットから100 mm離れた位置に設置した。
【００４６】
１−４．実験手順と製膜条件
[実験手順]
(Ｈ−１の手順)基板電圧2kVでＤＣ制御を行い、アノード電流0.8A、フィラメント電流30Aの成膜条件でアルゴンガス25sccmを用いイオン化蒸着法により30分ボンバードを行った。
その後、水素フリー炭素膜とガラスの密着と導電性維持を目的としてチタンターゲットとアルゴンガス23sccmを使用しＤＣスパッタリングを出力電圧420Vで30秒間行った後、アルゴンガス14.6sccmを用い基板電圧をかけずにターゲット電圧1000VでＨｉＰＩＭＳ法を7分30秒行った。
(Ｈ−２の手順)前記と同製法でチタン中間層を成膜後、ＤＬＣ膜をアルゴンガス32.5sccmを用い基板電圧をかけてターゲット電圧1000VにてＨｉＰＩＭＳ法により15分製膜を行った。
(Ｈ−３の手順) 前記と同製法でチタン中間層を成膜後、アルゴンガス38.3sccmを用い基板電圧をかけずにターゲット電圧635VにてＨｉＰＩＭＳ法により5分製膜を行った。
[製膜条件]
表１に記載した製膜条件にて製膜検討を行い、ＨｉＰＩＭＳ法において３種類のＤＬＣ膜（Ｈ−１、Ｈ−２、Ｈ−３）により平板電極及びマイクロ電極を作成した。作成の概略図について図３に示す。
【表１】
2018155728.tif 000003
表１．ＨｉＰＩＭＳ法における製膜条件
【００４７】
２．イオン化蒸着法によるＤＬＣ膜を用いた平板電極及びマイクロ電極の作成
２−１．概要
基材表面に導電性ＤＬＣ膜を形成させた平板電極及びマイクロ電極を作成するべく、イオン化蒸着法により、様々な製膜条件での伝導性ＤＬＣ膜の製膜を行った。
【００４８】
２−２．使用装置
装置（ナノテック社製ＮＰＳ３３０）は、真空槽にイオン化蒸着源とＲＦマグネトロンスパッタ源やガスの導入系、ヒーターを備えている。排気は複合分子ポンプとロータリーポンプで行っている。基板電源はＤＣからパルス周波数500Hzから2000Hzまで制御可能で基板出力は5KV50mAである。
【００４９】
２−３．装置概略図
図２に本実験で使用したイオン化蒸着法による製膜装置の概略図を示す。図２に本実験で使用したイオン化蒸着源の概略図を示す。蒸着源は、フィラメント、アノード、基板で構成されている。フィラメント電流は0〜35A、アノード電圧は0〜200Vで作動する。
排気系により真空に保たれた槽内に炭化水素系ガスを導入しフィラメント電流とアノード電圧で発生させた弱電離プラズマ中で炭化水素イオンやラジカルとなる。これらを負バイアスに印加させた基板に衝突させ膜を作製する。
【００５０】
２−４．実験手順と製膜条件
[実験手順]
（Ｉ−１の手順）基板電圧2ｋVで1.5kHz、ｄｕｔｙ30％パルス制御を行い、アノード電流0.8A、フィラメント電流30Aの成膜条件でアルゴンガス8sccmを用いイオン化蒸着法により30分ボンバードを行った。ガラスなどの絶縁物や針のような形状の成膜を行う場合は、成膜時のアーキングを防ぐために必ずパルスで行う。
その後、水素含有炭素膜とガラスの密着と導電性維持を目的としてチタンターゲットとアルゴンガス20sccmを使用しＲＦマグネトロンスパッタリングを出力電力300Wで7分間行った後、アセチレン3.5sccmとホウ酸トリメチル0.3scmを用い基板電圧2kV、アノード電圧60V、フィラメント電流30Aでのイオン化蒸着法を3分行った。
（Ｉ−２の手順）前記と同製法でチタン中間層を製膜後、アセチレン4.06sccmにて基板電圧2kV、アノード電圧、60V、フィラメント電流30Aでのイオン化蒸着法を4分行った。
（Ｉ−３の手順）前記と同製法でチタン中間層を製膜後、アセチレン0.96sccmとヘキサフルオロベンゼン2sccmとホウ酸トリメチル0.6sccmを用い基板電圧2ｋV、アノード電圧60V、フィラメント電流30Aでのイオン化蒸着法を3分行った。
これらの膜厚は75nmとなった。また、同製膜法での膜を付けたガラス板26mm×10mm×1.5mmの抵抗値は、Ｉ−１；23Ω  Ｉ−２；15Ω  Ｉ−３；28Ωとなった。抵抗値測定は、四探針法を用いた。
[製膜条件]
表２に記載した製膜条件にて製膜検討を行い、イオン化蒸着法において３種類のＤＬＣ膜（Ｉ−１、Ｉ−２、Ｉ−３）により平板電極及びマイクロ電極を作成した。作成の概略図について図３に示す。
【表２】
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表２．イオン化蒸着法における製膜条件
【００５１】
３．ＤＬＣ膜を用いたマイクロ電極の走査型電子顕微鏡による観察
３−１．概要
上記１．及び２．で作成したＤＬＣ膜を用いたマイクロ電極が、先端直径1μm以下であることを確認すべく、走査型電子顕微鏡による電極先端部位の検鏡を行った。
【００５２】
３−２．実験方法
日本電子製JSM-7600Fを使用した。観察時の加速電圧は、図４（１）が1 kV、同図（２）が20 kVとした。
【００５３】
３−３．結果
上記イオン化蒸着法にて製膜したＤＬＣ膜を用いたマイクロ電極（サンプル番号Ｉ−１）を検鏡したところ、先端直径が約0.6μmであることが確認された（図４）。
ＢＤＤを用いたマイクロ電極では斯様な先端径が微小なものは作成出来ない。本検討から、ＤＬＣ膜を用いることにより、先端直径1μm以下のマイクロ電極を作成することが可能であることが示された。
【００５４】
４．各条件でのＤＬＣ膜を用いた平板電極でのＣＶ測定
４−１．概要
上記１．及び２．で検討した導電性ＤＬＣ膜を用いた平板電極により、0.1M Na2SO4のＣＶ曲線を測定した。対照電極として、既存のグラッシーカーボン（ＧＣ）電極及びＢＤＤ電極を用い、ＣＶ曲線を比較した。
【００５５】
４−２．実験方法
ガラス製電気化学セル中に0.1M Na2SO4水溶液を入れ、対極を白金線、参照極を銀／塩化銀電極としてポテンショスタット（北斗電工製  ＨＺ−５０００）を用いて、100mV/sの走査速度でＣＶ測定を行った。
【００５６】
４−３．結果
Ｈ−１〜３、Ｉ−１〜３の計６種類のＤＬＣを製膜した平板電極と、ＧＣ平板電極及びＢＤＤ平板電極により、0.1M Na2SO4のＣＶ曲線を測定したところ、図５に示すような結果を得た。
グラッシーカーボン平板電極に比べ、６種類のＤＬＣ平板電極は、いずれも広い電位窓を有しており、ＢＤＤ平板電極の電位窓とほぼ同等の広さであった。
また、バックグラウンド電流は、ＢＤＤ平板電極に比して、ＤＬＣ平板電極はいずれも若干高めではあったが、ＧＣ平板電極よりは低いという結果となった。
ＧＣは、熱硬化性樹脂を炭素化した素材であり、不通気性、導電性、耐酸性、耐摩耗性等の特徴を有し、一般的に電極の素材として広く用いられている。今回、６種類全てのＤＬＣ平板電極において、実用されているＧＣ電極よりも、電位窓及びバックグランド電流とも良好な結果が得られたことから、ＤＬＣは電極用の素材として十分な電気化学的特徴を有していることが示唆された。
【００５７】
５．タンパク質存在下におけるＤＬＣ膜を用いた平板電極でのＣＶ測定
５−１．概要
上記１．及び２．で検討した導電性ＤＬＣ膜を用いた平板電極（Ｈ−１〜３、Ｉ−１〜２の計５種類）において、タンパク質存在下（1g/L BSA）でのＣＶ曲線を、タンパク質添加後継時的に測定した。更にＨ−１の条件にて製膜した平板電極に対して、紫外線＋オゾン酸化処理を施し、ＤＬＣ薄膜を酸化させることによるＣＶ曲線に対する影響も併せて検討した。なお、対照電極として、既存のグラッシーカーボン（ＧＣ）電極を用いた。
【００５８】
５−２．実験方法
ガラス製電気化学セル中に1mMアスコルビン酸を含む1/15 M PBSをを入れ、対極を白金線、参照極を銀／塩化銀電極としてポテンショスタット（北斗電工製  ＨＺ−５０００）を用いて、100mV/sの走査速度でＣＶ測定を行った。この際、溶液中に1g/Lウシ血清アルブミン（BSA）を添加し、添加前（BSAなし）、添加後30、60、120及び180分の各時点にて継時的に測定した。
測定する平板電極は、導電性ＤＬＣ膜を用いた平板電極（Ｈ−１〜３、Ｉ−１〜２の計５種類）、ＧＣ電極に加え、Ｈ−１電極を紫外線及びオゾンにより酸化処理した（紫外線＋オゾン酸化処理）電極（Ｈ−１−Ｏ）も評価した。
紫外線＋オゾン酸化処理の方法は、セン特殊光源製卓上型光表面処理装置UVE-110-1Hを用いた。該処理装置には低圧水銀灯が備わっており、該水銀灯からの紫外光（185 nm, 254 nm）を照射することで、処理を行った。オゾンは空気中の酸素に185 nmの紫外光が照射されることで発生する。ランプとサンプル間の距離は8 cmとし、30分間の照射を実施した。
上記酸化処理の未処置及び処置電極（それぞれＨ−１及びＨ−１−Ｏ）表面のＤＬＣ膜を、Ｘ線光電子分光装置（XPS, Kratos製Axis-Nova）を用いて元素分析した。
【００５９】
５−３．結果
対照電極であるＧＣ電極では、タンパク質添加前（BSAなし）に比してタンパク質添加30分後にＣＶ曲線の形状が大幅に変化し（図６）、タンパク質添加後の如何なる時点においても、ピーク電流密度（図７）及びピーク電位（図８）とも顕著な変動が認められた。
これに対し、導電性ＤＬＣ膜を用いた５種類の平板電極（Ｈ−１〜３、Ｉ−１〜２）はいずれも、ＣＶ曲線形状（図６）、ピーク電流密度（図７）及びピーク電位（図８）共にタンパク質添加による変動は極めて限定的であった。このことより、導電性ＤＬＣ膜を用いた平板電極の一般的な特性として、溶液中のタンパク質の有無に関わりなく、安定したＣＶ測定が可能であることが明らかとなり、導電性ＤＬＣ膜を用いた電極での高い生体適合性が示唆された。
さらに、ＤＬＣ平板電極の１つ（Ｈ−１電極）に紫外線＋オゾン酸化処理を施したところ（Ｈ−１−Ｏ電極）、該平板電極においては、Ｈ−１電極のＣＶ曲線に僅かに存在していた、溶液へのタンパク質添加前及び添加後３０分での変動が殆ど消失していた（図６）。元素分析の結果、ＤＬＣ膜上のＯ／Ｃ原子濃度比は、Ｈ−１電極で0.08であるのに対し、Ｈ−１−Ｏ電極では0.21であり、酸化処理によるＤＬＣ膜上酸素量の大幅な増加が確認された。このことから、ＤＬＣ膜を用いた電極に酸化処理を施すことにより、更に高レベルの生体適合性を実現出来ることが示唆された。
【００６０】
６．ＤＬＣ膜を用いたマイクロ電極でのＣＶ測定及び検量線（0.1M Na2SO4中のK4Fe(CN)6）
６−１．概要
上記４及び５．において、導電性ＤＬＣ膜を用いた平板電極が、実用されている電極（ＧＣ電極）以上の、十分な電気化学的特性を有していることが明らかになった。このため、上記２．で作成したＩ−１のＤＬＣ膜によるマイクロ電極を用いて、0.1M Na2SO4中のK4Fe(CN)6のＣＶ曲線を測定し、併せて、これらの結果に基づき、K4Fe(CN)6の検量線を作成した。
【００６１】
６−２．実験方法
1, 2, 5 mM K4Fe(CN)6を含む0.1 M Na2SO4水溶液をそれぞれ調製し、対極を白金線、参照極を銀／塩化銀電極としてポテンショスタット（北斗電工製 ＨＺ−７０００）を用いて、100 mV/sの走査速度でそれぞれＣＶ測定を行った。
【００６２】
６−３．結果
Ｉ−１のＤＬＣを製膜したマイクロ電極により、0.1M Na2SO4中のK4Fe(CN)6のＣＶ曲線を測定したところ、いずれの濃度においても、マイクロ電極に特有なシグモイド曲線を確認した（図９）。
該シグモイド曲線の、0.74V（vs Ag/AgCl）における電流値と、対応するK4Fe(CN)6濃度をプロットすることで、検量線を作成したところ、両者の間に直線性が認められた（R2＝0.9974）。
以上のことから、該マイクロ電極は、0.1M Na2SO4中のK4Fe(CN)6について定量測定することが可能であることが確認された。
【００６３】
７．ＤＬＣ膜を用いたマイクロ電極でのＣＶ測定及び検量線（1/15M PBS中のテオフィリン）
７−１．概要
上記６．において、上記２．で作成したＩ−１のＤＬＣ膜によるマイクロ電極により、0.1M Na2SO4中のK4Fe(CN)6を定量測定することが可能であることが明らかとなった為、他の化合物に対しても同様の結果が得られるか確認するべく、1/15M PBS中のテオフィリンのＣＶ曲線を測定し、併せて、これらの結果に基づきテオフィリンの検量線を作成した。
【００６４】
７−２．実験方法
100, 200, 250 μMテオフィリンを含む1/15 M PBSをそれぞれ調製し、対極を白金線、参照極を銀／塩化銀電極としてポテンショスタット（北斗電工製  ＨＺ−７０００）を用いて、10 mV/sの走査速度でそれぞれＣＶ測定を行った。
【００６５】
７−３．結果
Ｉ−１のＤＬＣを製膜したマイクロ電極により、1/15M PBS中のテオフィリンのＣＶ曲線を測定したところ、いずれの濃度においても、６．と同様に、マイクロ電極に特有なシグモイド曲線を確認した（図１０）。
該シグモイド曲線の、1.58V（vs Ag/AgCl）における電流値と、対応するテオフィリン濃度をプロットすることで、検量線を作成したところ、両者の間に直線性が認められた（R2＝0.9831）。
以上のことから、該マイクロ電極は、1/15M PBS中のテオフィリンについて定量測定することが可能であることが確認された。
【００６６】
８．ＤＬＣ膜を用いたマイクロ電極でのＣＶ測定及び検量線（1/15M PBS中のゲンタマイシン）
８−１．概要
上記６．及び７．において、上記２．で作成したＩ−１のＤＬＣ膜によるマイクロ電極により、0.1M Na2SO4中のK4Fe(CN)6及び1/15M PBS中のテオフィリンを定量測定することが可能であることが明らかとなった為、更に他の化合物に対しても同様の結果が得られるか確認するべく、1/15M PBS中のゲンタマイシンのＣＶ曲線を測定し、併せて、これらの結果に基づきゲンタマイシンの検量線を作成した。
【００６７】
８−２．実験方法
50, 500, 2000 μMゲンタマイシンを含む1/15 M PBSをそれぞれ調製し、対極を白金線、参照極を銀／塩化銀電極としてポテンショスタット（北斗電工製  ＨＺ−７０００）を用いて、10 mV/sの走査速度でそれぞれＣＶ測定を行った。
【００６８】
８−３．結果
Ｉ−１のＤＬＣを製膜したマイクロ電極により、1/15M PBS中のゲンタマイシンのＣＶ曲線を測定したところ、いずれの濃度においても、６．及び７．と同様に、マイクロ電極に特有なシグモイド曲線を確認した（図１１）。
該シグモイド曲線の、1.21V（vs Ag/AgCl）における電流値と、対応するゲンタマイシン濃度をプロットすることで、検量線を作成したところ、両者の間に直線性が認められた（R2＝0.999）。
以上のことから、該マイクロ電極は、1/15M PBS中のゲンタマイシンについて定量測定することが可能であることが確認された。
【００６９】
テオフィリンはアルカロイドの一種で、強力な気管支拡張作用を有している為、気管支喘息や慢性気管支炎などの呼吸器系疾患の治療薬として用いられ、ゲンタマイシンはアミノグリコシド系抗生物質であり、グラム陰性桿菌による感染症（敗血症や腎盂腎炎など）に用いられる。いずれも臨床的に生体にも投与されている剤である為、該剤の測定が可能であることは、今後、ＤＬＣマイクロ電極が臨床的に利用される可能性を強く示唆している。
【００７０】
９．各種ＤＬＣ膜における、ラマン分光測定によるＤバンド及びＧバンドのピーク面積比（ＩＤ／ＩＧ）の計測
９−１．概要
本発明で使用したＤＬＣ膜（Ｈ−１〜３、Ｉ−１〜３、Ｈ−１−Ｏ）において、ｓｐ３結合を有する炭素と、ｓｐ２結合を有する炭素の構成比率を明らかにする為に、ラマン分光測定を行い、Ｄバンド及びＧバンドをピーク分離し、ピーク面積比（ＩＤ／ＩＧ）を算出した。
【００７１】
９−２．実験方法
レーザーラマン分光光度計（日本分光製  ＮＲＳ−５１００）を用いて、励起波長532 nmにて各ＤＬＣ膜のラマンスペクトルを測定した。得られたスペクトルの1150〜1780 cm-1の範囲について、ピーク解析ソフト（Ｓｙｓｔａｔ社製ＰｅａｋＦｉｔ  ｖ４．１２）を用いてＤバンド（中心波数1350 cm-1付近）とＧバンド（中心波数1550 cm-1付近）にピーク分離した。ＤバンドおよびＧバンドはガウス関数とした。
【００７２】
９−３．結果
今回、電極としての電気化学的特性を有していることが確認された６種類のＤＬＣ膜のＩＤ／ＩＧを測定したところ、ばらつきはあるものの、およそ０．４〜０．９程度であることが明らかとなった（表３）。
Ｈ−１と、Ｈ−１に酸化処理を施したＨ−１−Ｏとを比較したところ、ＩＤ／ＩＧは酸化処理前（Ｈ−１）のおよそ０．６７に対して、酸化処理後（Ｈ−１−Ｏ）は０．６９であり、ほとんど変化なしと考えられた。
このことから、Ｈ−１−Ｏにて認められた生体適合性の亢進は、ｓｐ３結合を有する炭素と、ｓｐ２結合を有する炭素の構成比率の変化によるものではないことが明らかとなった。
【表３】
2018155728.tif 000005
表３  各種ＤＬＣ膜のＩＤ／ＩＧ
【００７３】
１０．各種ＤＬＣ膜及びＢＤＤ膜における、レーザー顕微鏡を用いた表面粗さの計測
１０−１．概要
本発明で使用したＤＬＣ膜（Ｉ−１〜３及びＨ−１）及び対照材であるＢＤＤ膜において、表面の粗さに差異があるのかを検討するべく、レーザー顕微鏡による検鏡を行い、表面の粗さを観察及び計測した。
【００７４】
１０−２．実験方法
使用試験機は、ＬＥＸＴ  ＯＬＳ  ４０００で405nm半導体レーザーにより高精度な測定を実施し647μm角で観察を行い、表面粗さを算出した。光源から照射されたレーザーを、対物レンズを通して試料表面で集光させ、集光点で生じた光はビームスプリッターにより検出器側へ反射しピンホールを通り検出される。このピンホールにより、ピントのあった箇所の情報を得ることができる。
【００７５】
１０−３．結果
今回、電極としての電気化学的特性を有していることが確認された６種類中、４種類のＤＬＣ膜（Ｉ−１〜３及びＨ−１）とＢＤＤ膜の表面状態をレーザー顕微鏡で検鏡したところ、図１２に示すように、ＢＤＤ膜表面の粗さが観察される一方、いずれのＤＬＣ膜の表面も極めて平滑であることが確認された。該画像データより、表面の平均面粗さ（Ｓａ[μm]）を定量したところ、４種類のＤＬＣ膜が、いずれもおよそ０．００９であるのに対し、ＢＤＤ膜では０．３５４であり、およそ４０倍近い差異のあることが明らかとなった。特に製膜方法の異なるＩ−１〜３とＨ−１のいずれのＤＬＣ膜においても、ＢＤＤ膜に対して顕著な表面平滑性を確認できたことより、斯様な膜表面の平滑性は、ＤＬＣ膜を製膜したマイクロ電極全般に広く該当する特徴であると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明に係る、基材表面に導電性炭素系材料、特に導電性ダイヤモンドライクカーボン（ＤＬＣ）薄膜を形成させた、先端直径1μm以下のマイクロ電極は、一定レベル以上の電気化学的特性を有し、その鋭利な先端形状及び摺動性の良さから、生体内の所望する限局した部位に挿入等を行い、該部位での所望の物質の定量測定を可能とする。更に該電極は、用途に適合した多様な材質（強度のあるもの・安価なもの・耐久性に優れたもの等）からなる基材により構成することが出来る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2018155728.tif 000013
【図９】
2018155728.tif 000014
【図１０】
2018155728.tif 000015
【図１１】
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【図１２】
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