(57)【要約】      （修正有）【課題】生体内において、神経伝達物質の前駆体としての生理学的活性または薬理学的活性を示し、高い選択性で検出することができる神経伝達物質の前駆体アミノ酸および生体内において、神経伝達物質の前駆体としての生理学的活性または薬理学的活性を示し、生体内における代謝反応の過程を追跡することができ、さらに高い選択性で検出することができる多重共鳴用のプローブを提供する。【解決手段】式（Ｉ）：2018054622.tif 000023（式中、Ｒ1は、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１〜４のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数６〜１２のアリール基、置換基を有していてもよい炭素数３〜１０の複素環基またはカルボキシル基を示す）で表わされる神経伝達物質の前駆体アミノ酸を有効成分として含有する多重共鳴用のプローブ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
多重共鳴用のプローブであって、式（Ｉ）：    
【化１】
2018054622.tif 000022
（式中、Ｒ1は、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１〜４のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数６〜１２のアリール基、置換基を有していてもよい炭素数３〜１０の複素環基またはカルボキシル基を示す）で表わされる神経伝達物質の前駆体アミノ酸を有効成分として含有することを特徴とするプローブ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多重共鳴用プローブに関する。さらに詳しくは、神経伝達物質に関連する代謝反応の解析、神経伝達物質が関与する疾患の診断を行なうための画像情報の取得などに有用な神経伝達物質の前駆体アミノ酸およびそれを有効成分として含有する多重共鳴用プローブに関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内に存在する化合物は、それぞれ固有の核磁気共鳴（以下、「ＮＭＲ」ともいう）シグナルを有していることから、前記ＮＭＲシグナルを利用するＮＭＲ法によれば、生体内における特定の化合物中の核磁気共鳴活性核のＮＭＲシグナルを検出し、当該ＮＭＲシグナルの強度を測定することにより、高い定量性でかつ低い侵襲性で、生体内における前記化合物の変化、すなわち、生体内における前記化合物の代謝反応の過程を追跡することができる。前記ＮＭＲ法は、分子プローブの1Ｈ核または13Ｃ核を対象とする磁気共鳴スペクトロスコピー（ＭＲＳ）、磁気共鳴スペクトロスコピーイメージング（ＭＲＳＩ）などに応用されている。しかし、生体内には、1Ｈ核または13Ｃ核のノイズシグナルを生じる水、脂質などの内在性の化合物が存在しているため、前記ＭＲＳおよびＭＲＳＩには、分子プローブのＮＭＲシグナルに加えて前記ノイズシグナルまでもが同時に検出されることから、分子プローブのＮＭＲシグナルのみを高い選択性で検出することが困難であるという欠点がある。
【０００３】
そこで、分子プローブのＮＭＲシグナルのみを高い選択性で検出する手法として、19Ｆ−ＮＭＲ法が開発されている。前記19Ｆ−ＮＭＲ法は、例えば、分子プローブとして19Ｆラベル化Ｌ−ドーパを用いて脳内における当該19Ｆラベル化Ｌ−ドーパを検出する方法などに利用されている（例えば、非特許文献１などを参照）。しかし、前記19Ｆラベル化Ｌ−ドーパは、Ｌ−ドーパの分子内に９個の19Ｆ核が導入された化合物であることから、Ｌ−ドーパ本来の生理学的活性または薬理学的活性を失っており、生体内において、代謝されないため、分子プローブとして19Ｆラベル化Ｌ−ドーパを用いる方法には、生体内における当該分子プローブの代謝反応の過程を追跡することができないという欠点がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】シェリー・ディングマン（Ｓｈｅｒｒｙ  Ｄｉｎｇｍａｎ）ら、「マウス脳におけるＬ−ドーパのパーフロオロタグ代謝産物の運命（Ｔｈｅ  Ｆａｔｅ  ｏｆ  Ｐｅｒｆｌｕｏｒｏ‐Ｔａｇｇｅｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ  ｏｆ  Ｌ‐ＤＯＰＡ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ  Ｂｒａｉｎｓ）」、ジャーナル・オブ・イムノアッセイ・アンド・イムノケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、マーセル・デッカー・インコーポレーティッド（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ）、２００４年発行、第２５巻、ｐ．３５９−３７０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、前記従来技術に鑑みてなされたものであり、生体内において、神経伝達物質の前駆体としての生理学的活性または薬理学的活性を示し、高い選択性で検出することができる神経伝達物質の前駆体アミノ酸を提供することを課題とする。また、本発明は、生体内において、神経伝達物質の前駆体としての生理学的活性または薬理学的活性を示し、生体内における代謝反応の過程を追跡することができ、さらに高い選択性で検出することができる多重共鳴用のプローブを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、
〔１〕神経伝達物質の前駆体アミノ酸であって、式（Ｉ）：
【０００７】
【化１】
2018054622.tif 000002
【０００８】
（式中、Ｒ1は、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１〜４のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数６〜１２のアリール基、置換基を有していてもよい炭素数３〜１０の複素環基またはカルボキシル基を示す）
で表わされる神経伝達物質の前駆体アミノ酸、および
〔２〕多重共鳴用のプローブであって、前記〔１〕に記載の神経伝達物質の前駆体アミノ酸を有効成分として含有することを特徴とするプローブ
に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の神経伝達物質の前駆体アミノ酸は、生体内において、神経伝達物質の前駆体としての生理学的活性または薬理学的活性を示し、高い選択性で検出することができるという優れた効果を奏する。また、本発明の多重共鳴用プローブは、生体内において、神経伝達物質の前駆体としての生理学的活性または薬理学的活性を示し、生体内における代謝反応の過程を追跡することができ、さらに高い選択性で検出することができるという優れた効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実施例２〜５において、1Ｈ−｛13Ｃ−15Ｎ｝三重核磁気共鳴法に用いられたパルスシーケンスを示す図である。
【図２】（Ａ）は実施例２で得られた13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパの1Ｈ−｛13Ｃ−15Ｎ｝−ＮＭＲスペクトル、（Ｂ）は実施例２で得られた13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミンの1Ｈ−｛13Ｃ−15Ｎ｝−ＮＭＲスペクトルを示すチャートである。
【図３】実施例３において、13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパおよび13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミンそれぞれの1Ｈ−ＮＭＲスペクトル、1Ｈ−｛13Ｃ｝−ＮＭＲスペクトルおよび1Ｈ−｛13Ｃ−15Ｎ｝−ＮＭＲスペクトルを示すチャートである。
【図４】（Ａ）は実施例４において、肝臓組織抽出液を含む溶液における13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパおよび13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミンそれぞれの1Ｈ−｛13Ｃ−15Ｎ｝−ＮＭＲスペクトルを示すチャート、（Ｂ）は肝臓組織抽出液を含まない溶液における13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパおよび13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミンそれぞれの1Ｈ−｛13Ｃ−15Ｎ｝−ＮＭＲスペクトルを示すチャートである。
【図５】実施例５において、カルビドパを含む反応液およびカルビドパを含まない反応液における13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパおよび13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミンそれぞれの1Ｈ−｛13Ｃ−15Ｎ｝−ＮＭＲスペクトルを示すチャートである。
【図６】実施例５において、ベンゼラジドを含む反応液およびベンゼラジドを含まない反応液における13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパおよび13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミンそれぞれの1Ｈ−｛13Ｃ−15Ｎ｝−ＮＭＲスペクトルを示すチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の神経伝達物質の前駆体アミノ酸は、前述したように、式（Ｉ）：
【００１２】
【化２】
2018054622.tif 000003
【００１３】
（式中、Ｒ1は、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１〜４のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数６〜１２のアリール基、置換基を有していてもよい炭素数３〜１０の複素環基またはカルボキシル基を示す）
で表わされる神経伝達物質の前駆体アミノ酸である。
【００１４】
本発明の神経伝達物質の前駆体アミノ酸は、1Ｈ−13Ｃ−15Ｎ結合を有しているので、生体内において、神経伝達物質の前駆体アミノ酸としての生理学的活性または薬理学的活性を示すものであり、しかも高い選択性で検出することができる。
【００１５】
式（Ｉ）において、Ｒ1は、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１〜４のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数６〜１２のアリール基、置換基を有していてもよい炭素数３〜１０の複素環基またはカルボキシル基である。
【００１６】
前記炭素数１〜４のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記炭素数１〜４のアルキル基が有していてもよい置換基としては、例えば、水酸基、アミノ基、カルボキシル基、シアノ基、ニトロ基、チオール基、メチルチオ基、グアニジル基などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記置換基を有していてもよい炭素数１〜４のアルキル基のなかでは、神経伝達物質の前駆体として高い生理学的活性または薬理学的活性を示すことから、カルボキシメチル基、カルボキシエチル基、ヒドロキシメチル基が好ましく、カルボキシメチル基およびカルボキシエチル基が好ましい。
【００１７】
前記炭素数６〜１２のアリール基としては、例えば、フェニル基、ベンジル基、ナフチル基、トリル基、キシリル基、インデニル基、ビフェニル基などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記炭素数６〜１２のアリール基が有していてもよい置換基は、前記炭素数１〜４のアルキル基が有していてもよい置換基と同様である。前記置換基を有していてもよい炭素数６〜１２のアリール基のなかでは、神経伝達物質の前駆体として高い生理学的活性または薬理学的活性を示すことから、ヒドロキシベンジル基、ジヒドロキシベンジル基、ベンジル基が好ましく、ヒドロキシベンジル基およびジヒドロキシベンジル基がより好ましい。
【００１８】
前記炭素数３〜１０の複素環としては、例えば、インドリル基、イミダゾイル基、チエニル基、ベンゾチエニル基、フリル基、ベンゾフリル基、ピリジル基、キノリル基、２，２’−ビピリジル基などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記複素環基が有していてもよい置換基は、前記炭素数１〜４のアルキル基が有していてもよい置換基と同様である。前記置換基を有していてもよい炭素数３〜１０の複素環基のなかでは、神経伝達物質の前駆体として高い生理学的活性または薬理学的活性を示すことから、インドリル基、ヒドロキシインドリル基、イミダゾイル基が好ましく、ヒドロキシインドリル基およびイミダゾイル基がより好ましい。
【００１９】
Ｒ1のなかでは、神経伝達物質の前駆体として高い生理学的活性または薬理学的活性を示すことから、水素原子、カルボキシル基、カルボキシメチル基、カルボキシエチル基、ヒドロキシメチル基、ベンジル基、ヒドロキシベンジル基、ジヒドロキシベンジル基、インドリル基、ヒドロキシインドリル基およびイミダゾイル基が好ましく、水素原子、カルボキシル基、カルボキシメチル基、カルボキシエチル基、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシベンジル基、ジヒドロキシベンジル基、ヒドロキシインドリル基およびイミダゾイル基がより好ましい。
【００２０】
前記核磁気共鳴活性核は、放射線を発生しない核磁気共鳴活性な原子核である。前記1Ｈ−13Ｃ−15Ｎ結合は、1Ｈの磁化を13Ｃに移動させ、13Ｃの磁化を15Ｎに移動させ、15Ｎの磁化を13Ｃに戻し、13Ｃの磁化を1Ｈに戻すことによって検出することができる。
【００２１】
式（Ｉ）で表わされる前駆体アミノ酸の具体例としては、例えば、式（ＩＩ）：
【００２２】
【化３】
2018054622.tif 000004
【００２３】
で表わされるＬ−ドーパ、式（ＩＩＩ）：
【００２４】
【化４】
2018054622.tif 000005
【００２５】
で表わされるグルタミン酸、式（ＩＶ）：
【００２６】
【化５】
2018054622.tif 000006
【００２７】
で表わされるグリシン、式（Ｖ）：
【００２８】
【化６】
2018054622.tif 000007
【００２９】
で表わされるＬ−セリン、式（ＶＩ）：
【００３０】
【化７】
2018054622.tif 000008
【００３１】
で表わされるチロシン、式（ＶＩＩ）：
【００３２】
【化８】
2018054622.tif 000009
【００３３】
で表わされるヒスチジン、式（ＶＩＩＩ）：
【００３４】
【化９】
2018054622.tif 000010
【００３５】
で表わされる５−ヒドロキシトリプトファンなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００３６】
式（ＩＩ）で表わされるＬ−ドーパは、脱炭酸酵素などの作用によって生体内で代謝され、神経伝達物質（代謝産物）としての式（ＩＩａ）：
【００３７】
【化１０】
2018054622.tif 000011
【００３８】
で表わされるドーパミン、式（ＩＩｂ）：
【００３９】
【化１１】
2018054622.tif 000012
【００４０】
で表わされるノルエピネフィリンまたは式（ＩＩｃ）：
【００４１】
【化１２】
2018054622.tif 000013
【００４２】
で表わされるエピネフィリンに変換されるという生理学的活性または薬理学的活性を有する。式（ＩＩＩ）で表わされるグルタミン酸は、脱炭酸酵素の作用によって生体内で代謝され、神経伝達物質（代謝産物）としての式（ＩＩＩａ）：
【００４３】
【化１３】
2018054622.tif 000014
【００４４】
で表わされるγ−アミノ酪酸に変換されるという生理学的活性または薬理学的活性を有する。
【００４５】
式（ＩＶ）で表わされるグリシンおよび式（Ｖ）で表わされるＬ−セリンは、それぞれ、ヒトの体内で代謝されることにより、神経伝達物質（代謝産物）としての式（Ｖａ）：
【００４６】
【化１４】
2018054622.tif 000015
【００４７】
で表わされるＤ−セリンに変換されるという生理学的活性または薬理学的活性を有する。なお、式（ＩＶ）で表わされるグリシンは、生体内において、神経伝達物質の前駆体として働くとともに、神経伝達物質としても働く化合物である。式（ＶＩ）で表わされるチロシンは、脱炭酸酵素の作用によって生体内で代謝されることにより、神経伝達物質（代謝産物）としての式（ＶＩａ）：
【００４８】
【化１５】
2018054622.tif 000016
【００４９】
で表わされるチラミンに変換されるという生理学的活性または薬理学的活性を有する。式（ＶＩＩ）で表わされるヒスチジンは、脱炭酸酵素の作用によって生体内で代謝されることにより、神経伝達物質（代謝産物）としての式（ＶＩＩａ）：
【００５０】
【化１６】
2018054622.tif 000017
【００５１】
で表わされるヒスタミンに変換されるという生理学的活性または薬理学的活性を有する。式（ＶＩＩＩ）で表わされる５−ヒドロキシトリプトファンは、脱炭酸酵素の作用によって生体内で代謝されることにより、神経伝達物質（代謝産物）としての式（ＶＩＩＩａ）：
【００５２】
【化１７】
2018054622.tif 000018
【００５３】
で表わされるセロトニンに変換されるという生理学的活性または薬理学的活性を有する。
【００５４】
本発明の神経伝達物質の前駆体アミノ酸は、例えば、13Ｃ核および15Ｎ核でラベルしたグリシンを出発物質として用いて当該グリシンのアミノ基に適切な保護基を導入して誘導体を得、得られた誘導体を不斉アルキル化または不斉水素化させ、保護基を除去することなどによって製造することができる。
【００５５】
本発明の神経伝達物質の前駆体アミノ酸は、前述したように、生体内において、神経伝達物質の前駆体アミノ酸としての生理学的活性または薬理学的活性を示すものであり、しかも高い選択性で検出することができることから、多重共鳴用のプローブの有効成分として用いることができる。本発明には、前記神経伝達物質の前駆体アミノ酸を有効成分として含有する多重共鳴用のプローブも包含される。
【００５６】
本発明の多重共鳴用のプローブは、式（Ｉ）で表わされ、1Ｈ、13Ｃおよび15Ｎからなる群より選ばれた少なくとも２種類の核磁気共鳴活性核を有し、かつ異なる共鳴周波数を有する少なくとも３個の核磁気共鳴活性核からなる結合を有している前駆体アミノ酸を有効成分として含有しているため、生体内において、神経伝達物質の前駆体としての生理学的活性または薬理学的活性を示し、しかも高い選択性で検出することができる。また、本発明の多重共鳴用のプローブに含まれる神経伝達物質の前駆体アミノ酸から代謝反応によって生成された神経伝達物質は、前記神経伝達物質の前駆体アミノ酸と区別しながら同時に検出することができる。したがって、本発明の多重共鳴用のプローブによれば、本発明の多重共鳴用のプローブを用いて多重共鳴ＮＭＲ法、多核多重磁気共鳴画像化方法などを行なうことにより、生体内における代謝反応の過程を追跡することができる。
【００５７】
本発明の多重共鳴用のプローブにおける前記神経伝達物質の前駆体アミノ酸の含有量は、前記神経伝達物質の前駆体アミノ酸の種類、多重共鳴用のプローブの用途などによって異なることから、一概には決定することができないので、前記神経伝達物質の前駆体アミノ酸の種類、多重共鳴用のプローブの用途などに応じて適宜決定することが望ましい。本発明の多重共鳴用のプローブにおける前記神経伝達物質の前駆体アミノ酸の含有量は、通常、生体内において、神経伝達物質の前駆体としての生理学的活性または薬理学的活性を示す範囲であればよく、神経伝達物質の前駆体アミノ酸から代謝反応によって生成された神経伝達物質の生理学的活性を十分に発揮させる観点から、好ましくは１μｍｏｌ以上、より好ましくは１０μｍｏｌ以上である。なお、本発明の多重共鳴用のプローブは、前記神経伝達物質の前駆体アミノ酸のみからなるものであってもよい。
【００５８】
本発明の多重共鳴用のプローブは、必要により、当該プローブを用いる部位以外の部位での分解、修飾などによる失活を抑制するための阻害剤、安定化剤、溶解補助剤、薬物運搬体などの助剤を含有していてもよい。
【００５９】
本発明の多重共鳴用のプローブは、生体内において、神経伝達物質の前駆体としての生理学的活性または薬理学的活性を示し、体内における代謝反応の過程を追跡することができ、さらに高い選択性で検出することができることから、多重共鳴ＮＭＲ法、多核多重磁気共鳴画像化方法などに用いることができる。
【００６０】
本発明の多重共鳴用のプローブを多重共鳴ＮＭＲ法に用いる場合、当該多重共鳴ＮＭＲ法は、例えば、本発明の多重共鳴用のプローブを用いて代謝反応を行なうことによって得られた反応生成物または本発明の多重共鳴用のプローブからＮＭＲ測定用試料を調製し、当該ＮＭＲ測定用試料の多重共鳴ＮＭＲスペクトルを測定することによって実施することができる。
【００６１】
本発明の多重共鳴用のプローブを多重磁気共鳴画像化方法に用いる場合、当該多重磁気共鳴画像化方法は、例えば、本発明の多重共鳴用のプローブを検体に付与した後、前記検体に電磁波を照射して前記プローブの前記結合中の各核の間での磁化移動を行ない、当該磁化移動を利用して前記プローブに起因する多重共鳴シグナルを検出し、画像化することによって実施することができる。
【００６２】
検体への前記多重共鳴用のプローブの付与は、例えば、皮下注射、経口投与、経皮投与、静脈投与、腹腔内投与などによって行なうことができるが、本発明は、かかる例示に限定されるものではない。
【００６３】
前記多重共鳴用のプローブを検体に付与する際には、当該多重共鳴用のプローブを分散媒に溶解させて用いることができる。前記分散媒は、プローブを溶解させるための液状の物質であればよく、例えば、生理食塩水、注射用蒸留水、リン酸緩衝水溶液（ＰＢＳ）などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。また、前記多重共鳴用のプローブは、分散媒の他に、必要に応じて薬理上許容できる添加物とともに用いてもよい。
【００６４】
電磁波の照射に際しては、1Ｈ−13Ｃ−15Ｎ結合に基づく1Ｈ−｛13Ｃ−15Ｎ｝三重核磁気共鳴法のパルス系列と磁気共鳴撮像法のパルス系列とを用いることができる。前記磁気共鳴撮像法のパルス系列は、例えば、プローブに含まれる磁気共鳴活性核の縦緩和時間（Ｔ１）、横緩和時間（Ｔ２）などに基づいて適宜設定することができる。前記磁気共鳴撮像法のパルス系列としては、例えば、スピンエコー法、高速スピンエコー法、エコープラナーイメージング法、グラジエントエコー法、スポイルドグラジエントエコー法、コヒーレントグラジエントエコー法などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００６５】
電磁波を照射して前記プローブの前記結合中の各核の間での磁化移動を行なうことによって、前記プローブの前記結合中の各核磁気共鳴活性核に由来する多重共鳴シグナルの出現、消失、強度変化などに基づき、プローブの位置、存在量、構造などの情報を得、かかる情報に基づき画像を構築することができる。
【００６６】
以上説明したように、本発明の神経伝達物質の前駆体アミノ酸および当該神経伝達物質の前駆体アミノ酸を有効成分として含有する本発明の多重共鳴用プローブによれば、生体内において、神経伝達物質の前駆体としての生理学的活性または薬理学的活性を示し、しかも高い選択性で検出することができる。また、本発明の多重共鳴用のプローブに含まれる神経伝達物質の前駆体アミノ酸から代謝反応によって生成された神経伝達物質は、当該前駆体アミノ酸の核磁気共鳴活性核に帰属される多重共鳴ＮＭＲスペクトルとは異なる多重共鳴ＮＭＲスペクトルを示すことから、前記神経伝達物質の前駆体アミノ酸と区別しながら同時に検出することができる。そのため、本発明の多重共鳴用のプローブによれば、生体内における代謝反応の過程を追跡することができる。したがって、本発明の神経伝達物質の前駆体アミノ酸および当該神経伝達物質の前駆体アミノ酸を有効成分として含有する本発明の多重共鳴用プローブは、神経伝達物質に関連する代謝反応の解析、神経伝達物質が関与する疾患の診断を行なうための画像情報の取得などに好適に用いることが期待されるものである。
【実施例】
【００６７】
実施例１
以下に示される化合物１（13Ｃ−15Ｎ−ラベル化グリシン）を出発物質として用い、式：
【００６８】
【化１８】
2018054622.tif 000019
【００６９】
【化１９】
2018054622.tif 000020
【００７０】
（式中、ＣｂｚＣｌは塩化ベンジルオキシカルボニル、Ｃｂｚはベンジルオキシカルボニル基、ＴＥＢＡＣは塩化ベンジルトリエチルアンモニウム、ｔ−ＢｕＢｒは２−ブロモ−２−メチルプロパン、ＤＭＡはＮ,Ｎ−ジメチルアセトアミド、ｔ−ＢｕＯはｔｅｒｔ−ブチルオキシ基、Ｐｄ／Ｃはパラジウム／炭素、ＥｔＯＨはエタノール、Ｐｈ2Ｃ＝ＮＨはベンゾフェノンイミン、Ｐｈはフェニル基、ＢｎＯはベンジルオキシ基、Ｔｏｌｕｅｎｅはトルエン、ｃｉｔｒｉｃ  ａｃｉｄはクエン酸、ＴＨＦはテトラヒドロフラン、Ｅｔ3ＳｉＨはトリエチルシランを示す）
で表わされる反応にしたがって、化合物８（13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパ）を調製した。より具体的には、以下の操作を行なうことにより、化合物１（13Ｃ−15Ｎラベル化グリシン）から化合物８（13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパ）を調製した。
【００７１】
（１）前記式における化合物２の調製
２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液６．８ｍＬに２−13Ｃ−15Ｎグリシン（１．０４ｇ，１３．５ｍｍｏｌ）を加えて溶解させた後、得られた溶液を０℃に冷却した。前記で得られた溶液に塩化ベンジルオキシカルボニル２．３ｍＬ（１６．２ｍｍｏｌ）を加えた後、当該溶液に４Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（３．４ｍＬ）をゆっくりと滴下し、０℃で２０時間撹拌した。前記で得られた溶液をジエチルエーテルで３回洗浄し、水層を分取した。得られた水層に５Ｍ塩酸を加えて当該水層のｐＨを１に調製した後、得られた懸濁液を０℃に冷却し、白色沈殿物を生成させた。前記白色沈殿物を濾別し、減圧下に乾燥させることにより、化合物２〔収量：２．５１ｇ（１１．８９ｍｍｏｌ）、収率：８８％〕を得た。
【００７２】
なお、生成した化合物が前記式における化合物２であることは、以下の1Ｈ−ＮＭＲ、13Ｃ｛1Ｈ｝−ＮＭＲ、15Ｎ｛1Ｈ｝−ＮＭＲおよびＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって確認された。
【００７３】
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz) δ: 7.37-7.32 (5H), 5.28 (d, JCH= 93 Hz, 1H), 5.14 (2H), 4.05 (dd, J = 138 Hz, 5.4 Hz, 2H)
13C{1H}-NMR (CDCl3, 75 MHz) δ: 42.4 (d, 1JCN= 14 Hz)
15N{1H}-NMR (CD3OD, 40 MHz) δ: 71.4 (d, 1JCN= 14 Hz)
ESI-TOF-MS [M + Na]+: 234.0484.
【００７４】
（２）前記式における化合物３の調製
前記で得られた化合物２（２．２６ｇ、１０．７ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（７５ｍＬ）に加えて溶解させた。得られた溶液に、塩化ベンジルトリエチルアンモニウム２．４４ｇ（１０．７ｍｍｏｌ）と２−ブロモ−２−メチルプロパン６７．１ｇ（４９０ｍｍｏｌ）とを加えた後、あらかじめ乾燥させておいた炭酸カリウム３６ｇ（２６０ｍｍｏｌ）を加え、５５℃で２４時間加熱しながら撹拌した。得られた溶液に超純水（１Ｌ）と酢酸エチル（２５０ｍＬ）とを加えて抽出を行ない、有機層を分取した。得られた有機層を超純水（１００ｍＬ）で２回洗浄し、さらに飽和塩化ナトリウム水溶液（１００ｍＬ）で洗浄した。洗浄後に得られた溶液を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過した後、エバポレーターで溶媒を留去し、減圧下に乾燥させることにより、オイル状の化合物３〔収量：２．７３ｇ（９．９９ｍｍｏｌ）、収率９３％〕を得た。
【００７５】
なお、生成した化合物が前記式における化合物３であることは、以下の1Ｈ−ＮＭＲ、13Ｃ｛1Ｈ｝−ＮＭＲ、15Ｎ｛1Ｈ｝−ＮＭＲおよびＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって確認された。
【００７６】
1H-NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 7.38-7.27 (5H), 5.21 (d, JCH = 88 Hz, 1H, 15NH), 5.12 (s, 2H), 3.87 (dd, J = 140, 3.9 Hz, 2H), 1.47 (s, 9H)
13C{1H}-NMR (CDCl3, 75 MHz) δ: 43.4 (d, JCN = 14 Hz)
15N{1H}-NMR (CDCl3, 40 MHz) δ: 68.8 (d, JCN = 14 Hz)
ESI-TOF MS [M + Na]+: 290.1355.
【００７７】
（３）前記式における化合物４の調製
前記で得られた化合物３（２．６７ｇ、９．９９ｍｍｏｌ）を、アルゴンガス雰囲気下でエタノール２０ｍＬに溶解させた後、得られた溶液に５％（パラジウム基準）パラジウム炭素（Ｐｄ／Ｃ）（３００ｍｇ）を加え、アルゴンガスを０℃で水素に置換し、室温で５．５時間激しく撹拌した。その後、得られた反応液を珪藻土濾過助剤〔アルファ・エイサー（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ）社製、商品名：Ｆｉｌｔｅｒ  ａｉｄ、Ｃｅｌｉｔｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｓｕｐｅｒ−ｃｅｌ〕で濾過して当該反応液に含まれるパラジウム炭素を除去し、得られた濾液をエバポレーターで濃縮した。得られた残渣に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と酢酸エチルとを加えて抽出を行ない、有機層を分取した。得られた有機層を無水硫酸マグネシウムで脱水し、エバポレーターで濃縮した後、減圧下に乾燥させることにより、化合物４〔収量：０．９２ｇ（６．９２ｍｍｏｌ）、収率：６９％〕を得た。
【００７８】
なお、生成した化合物が前記式における化合物４であることは、以下の1Ｈ−ＮＭＲ、13Ｃ｛1Ｈ｝−ＮＭＲ、15Ｎ｛1Ｈ｝−ＮＭＲおよびＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって確認された。
【００７９】
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz) δ: 3.31 (d, J = 136 Hz, 2H), 1.47 (s, 9H)
13C{1H}-NMR (CDCl3, 75 MHz) δ: 44.7 (d, JCN = 4.5 Hz)
15N{1H}-NMR (CDCl3, 40 MHz) δ = 7.4 (d, JCN = 4.5 Hz)
ESI-TOF MS [M + H]+ 134.1025.
【００８０】
（４）前記式における化合物５の調製
前記で得られた化合物４（０．９２ｇ、６．９２ｍｍｏｌ）を塩化メチレン溶液（２０．４ｍＬ）に溶解させた後、得られた溶液にベンゾフェノンイミン１．２６ｇ（６．９８ｍｍｏｌ）を加え、室温で２４時間撹拌し、沈殿物を生成させた。生成した沈殿物を濾過して除去した後、得られた濾液をエバポレーターで濃縮した。得られた残渣にジエチルエーテル３０ｍＬを加えた後、生成した不溶物を濾過して除去した。得られた濾液を超純水３０ｍＬで洗浄した後、得られた溶液からエバポレーターで溶媒を減圧下に除去した。得られた固体をエタノールで再結晶させることにより、化合物５〔収量：１．７３ｇ（５．
８２ｍｍｏｌ）、収率：８４％〕を得た。
【００８１】
なお、生成した化合物が前記式における化合物５であることは、以下の1Ｈ−ＮＭＲおよびＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって確認された。
【００８２】
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz) δ: 7.68-7.16 (10H), 4.11 (d, J = 136 Hz, 2H), 1.46 (s, 9H)
ESI-TOF MS [M + H]+ 298.1497.
【００８３】
（５）前記式における化合物６の調製
前記で得られた化合物５（０．４５０ｇ、１．５３ｍｍｏｌ）をトルエン溶液（９ｍＬ）に溶解させた後、得られた溶液に（Ｒ，Ｒ）−３，４，５−トリフルオロフェニル−ＮＡＳ＝ブロミド１４ｍｇ（１．０ｍｏｌ％）と５０質量％水酸化カリウム水溶液３ｍＬとを加え、溶液を０℃に冷却した。得られた溶液に、４−ブロモメチル−１，２−ビスフェニルメトキシベンゼン（０．７１１ｇ、１．８６ｍｍｏｌ）を加え、０℃で３時間撹拌した。得られた反応液に超純水とジエチルエーテルとを加えて抽出を行ない、有機層を分取した。得られた有機層をエバポレーターで濃縮した後、得られた残渣にテトラヒドロフラン（１５ｍＬ）と１Ｍクエン酸水溶液（１５ｍＬ）とを加え、室温で１６時間撹拌した。
得られた反応液からテトラヒドロフランを減圧下に留去し、炭酸水素ナトリウム水溶液で中和（ｐＨ７）した。得られた溶液に塩化メチレンを加えて抽出を行ない、有機層を得た。得られた有機層を無水硫酸マグネシウムで脱水した後、エバポレーターで濃縮した。得られた濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー〔酢酸エチル／ヘキサン（体積比）＝６／４〕で精製することにより、オイル状の化合物６〔収量：０．３３９ｇ（０．７７９ｍｍｏｌ）、収率：５１％、光学純度：９５％ｅｅ〕を得た。
【００８４】
なお、生成した化合物が前記式における化合物６であることは、以下の1Ｈ−ＮＭＲ、13Ｃ｛1Ｈ｝−ＮＭＲ、15Ｎ｛1Ｈ｝−ＮＭＲ、ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳおよび高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって確認された。ＨＰＬＣは、分析カラム〔（株）ダイセル製、商品名：ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ  ＯＤ〕および展開用溶媒〔ヘキサン／２−プロパノール（体積比）＝４／１〕を用い、流速０．５ｍＬ／分の条件で行なった。
【００８５】
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz) δ: 7.46-7.27 (10H), 6.87 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.82 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 6.72 (dd, J = 8.0, 2.0 Hz, 1H), 5.13 (s, 4H) 3.52 (d, J = 140 Hz, 1H), 2.93 (m, 1H), 2.72 (m、1H), 1.47 (br, 2H), 1.42 (s, 9H)
13C{1H}-NMR (CDCl3, 75 MHz) δ: 56.3 (d, JCN = 4.3 Hz)
15N{1H}-NMR (CDCl3, 40 MHz) δ: 21.9 (d, JCN = 4.3 Hz)
ESI-TOF MS [M + H]+ 436.2179. 
HPLC retention time: 15.9 min (S), 18.0 min (R).
【００８６】
（６）前記式における化合物７の調製
前記で得られた化合物６（０．３３９ｇ、０．７７９ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン溶液（８ｍＬ）に加えて溶解させた。得られた溶液に、アルゴンガス雰囲気下に０℃で１０（パラジウム基準）パラジウム炭素（４０ｍｇ）を加えた。さらに、アルゴンガスを０℃で水素に置換し、５０℃で４時間加熱しながら撹拌した。得られた反応液を珪藻土濾過助剤〔アルファ・エイサー（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ）社製、商品名：Ｆｉｌｔｅｒ  ａｉｄ、Ｃｅｌｉｔｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｓｕｐｅｒ−ｃｅｌ〕で濾過して当該反応液に含まれるパラジウム炭素を除去し、得られた濾液をエバポレーターで濃縮した。得られた濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル）で精製することにより、化合物７〔収量：７５．４ｍｇ（０．２９９ｍｍｏｌ）、収率：３８％〕を得た。
【００８７】
なお、生成した化合物が前記式における化合物７であることは、以下の1Ｈ−ＮＭＲ、13Ｃ｛1Ｈ｝−ＮＭＲ、15Ｎ｛1Ｈ｝−ＮＭＲおよびＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって確認された。
【００８８】
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz) δ: 6.68 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 6.60 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 6.48 (dd, J = 8.1, 1.8 Hz, 1H), 5.21 (br, 4H), 3.52 (d, J = 141 Hz, 1H), 2.93 (m, 1H), 2.67 (m, 1H), 1.44 (s, 9H)
13C{1H}-NMR (CDCl3, 75 MHz) δ: 55.4 (d, JCN = 4.5 Hz)
15N{1H}-NMR (CDCl3, 40 MHz) δ: 26.2 (d, JCN = 4.5 Hz)
ESI-TOF-MS [M + H]+ 256.1319.
【００８９】
（７）前記式における化合物８の調製
前記で得られた化合物７（７５．４ｍｇ、０．２９９ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（０．８２ｍＬ）に加えて溶解させた。得られた溶液に、アルゴンガス雰囲気下にトリフルオロ酢酸（０．３９ｍＬ、５．３ｍｍｏｌ）とトリエチルシラン（０．１６ｍＬ、１．０ｍｍｏｌ）とを加え、室温で１９時間撹拌した。得られた反応液をエバポレーターで濃縮した。得られた濃縮物をジエチルエーテルで洗浄した後、当該濃縮物をろ過して溶媒を除去した。得られた固体を混合溶媒（水／２−プロパノール（体積比）＝６／４）で再結晶させることにより、化合物８（収量：２５．３ｍｇ（０．１２７ｍｍｏｌ）、収率：４２％、光学純度：９４％ｅｅ）を得た。
【００９０】
なお、生成した化合物が前記式における化合物８（13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパ）であることは、以下の1Ｈ−ＮＭＲ、13Ｃ｛1Ｈ｝−ＮＭＲ、15Ｎ｛1Ｈ｝−ＮＭＲ、ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳおよびＨＰＬＣによって確認された。ＨＰＬＣは、分析カラム〔（株）ダイセル製、商品名：ＣＲＯＷＮＰＡＫ  ＣＲ（＋）〕および展開用溶媒〔過塩素酸水溶液（ｐＨ２）〕を用い、流速０．５ｍＬ／分の条件で行なった。
【００９１】
1H-NMR (D2O, 300 MHz) δ: 6.75 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 6.67 (d, J = 0.9 Hz, 1H), 6.59 (dd, J = 8.1, 0.9 Hz, 1H), 3.77 (d, 1JCH = 141 Hz 1H), 3.00 (m, 1H), 2.85 (m, 1H)
13C{1H}-NMR (D2O, 75 MHz) δ: 54.9 (d, JCN = 5.9 Hz)
15N{1H}-NMR (D2O, 40 MHz) δ: 33.6 (d, JCN = 5.9 Hz)
ESI-TOF MS [M + H]+ 200.0707. 
HPLC retention time: 5.7 min (R, d-dopa) and 6.6 min (S, l-dopa).
【００９２】
製造例１
以下に示される化合物９（４−ブロモメチル−１，２−ビスフェニルメトキシベンゼン）を出発物質として用い、式：
【００９３】
【化２０】
2018054622.tif 000021
【００９４】
（式中、ＢｎＯはベンジルオキシ基、ＮＭＰはＮ−メチル−２−ピロリドン、Ｐｄ（ＯＨ）2／Ｃは水酸化パラジウム／炭素、ＥｔＯＨはエタノールを示す）
で表わされる反応にしたがって、化合物１１（13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミン塩酸塩）を調製した。より具体的には、以下の操作を行なうことにより、化合物９（４−ブロモメチル−１，２−ビスフェニルメトキシベンゼン）から化合物１１（13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミン塩酸塩）を得た。
【００９５】
４−ブロモメチル−１，２−ビスフェニルメトキシベンゼン（５１０ｍｇ、１．３３ｍｍｏｌ）をＮ−メチルピロリドン（３ｍＬ）に溶解させた。得られた溶液に[13Ｃ，15Ｎ]−シアン化カリウム（１５２ｍｇ、２．２６ｍｍｏｌ）を加え、１００℃で２０時間加熱しながら攪拌した。得られた反応液に飽和重曹水を加えた後、酢酸エチルで抽出した。有機層を水、飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、エバポレーターで濃縮した。得られた濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー〔ヘキサン／酢酸エチル（体積比）＝６／１〕で精製することにより、化合物１０（収量：３２０ｍｇ）を得
た。
【００９６】
得られた化合物１０（３２０ｍｇ）を、アルゴンガス雰囲気下で、エタノール（４ｍＬ）／クロロホルム（２ｍＬ）混合溶液に、０℃で２０％水酸化パラジウム／炭素（８０ｍｇ）を加えた。さらに、アルゴンガスを０℃で水素に置換し、５０℃で終夜加熱撹拌した後、反応溶液を珪藻土濾過助剤〔アルファ・エイサー（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ）社製、商品名：Ｆｉｌｔｅｒ  ａｉｄ、Ｃｅｌｉｔｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｓｕｐｅｒ−ｃｅｌ〕で濾過して、Ｐｄ（ＯＨ）2／Ｃを濾過除去した後、濾液をエバポレーターで濃縮した。残渣を水に溶解し、塩化メチレンで洗浄後、水層を濃縮した。得られた濃縮物を逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）で精製することにより、化合物１１〔収量：７．７ｍｇ（０．０５ｍｍｏｌ）、収率：３．８％〕を得た。
【００９７】
なお、生成した化合物が前記式における化合物１１であることは、以下の1Ｈ−ＮＭＲ、13Ｃ｛1Ｈ｝−ＮＭＲおよびＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって確認された。
【００９８】
1H-NMR (D2O, 400 MHz) δ: 6.77 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 6.70 (s, 1H), 6.62 (d, J = 7.8 Hz), 3.09 (dt, J = 144.3, 6.8 Hz, 2H), 2.73 (m, 2H)
13C{1H}-NMR (D2O, 100 MHz) δ: 41.3 (d, J = 4.1 Hz). 
ESI-TOF-MS [M]+ 156.0887.
【００９９】
実施例２
実施例１で得られた13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパ（２．０ｍＭ）または製造例１で得られた13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミンと、５ｍｍ  ＴＣＩクライオプローブを装備した核磁気共鳴装置〔ブルカー・バイオスピン（Ｂｒｕｋｅｒ  ＢｉｏＳｐｉｎ）社製、商品名：Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ６００（６００ＭＨｚ）〕とを用い、重水中における13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパおよび13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミンそれぞれの1Ｈ−｛13Ｃ−15Ｎ｝−ＮＭＲスペクトルを測定した（積算回数１６回）。実施例２において、1Ｈ−｛13Ｃ−15Ｎ｝三重核磁気共鳴法に用いられたパルスシーケンスを図１に示す。図中、細いバーが９０°パルス、太いバーが１８０°パルスを示す。ＣＨおよびＣＮのカップリング定数1ＪCHおよび1ＪCNに基づき、順に1Ｈから13Ｃへの磁化移動、当該13Ｃから15Ｎへの磁化移動、さらに当該15Ｎから13Ｃへの磁化移動、最終的に13Ｃから1Ｈへの磁化移動により、シグナルを検出するように設定し、13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパと13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミンの同時観測を目的として、1ＪCH＝１４９Ｈｚおよび1ＪCN＝６．２Ｈｚをパラメータとして設定した。実施例２で得られた13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパの1Ｈ−｛13Ｃ−15Ｎ｝−ＮＭＲスペクトルを図２（Ａ）、実施例２で得られた13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミンの1Ｈ−｛13Ｃ−15Ｎ｝−ＮＭＲスペクトルを図２（Ｂ）に示す。
【０１００】
図２（Ａ）に示された結果から、化学シフト値３．８４ｐｐｍの位置に、13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパのメチンの1Ｈ−13Ｃ−15Ｎの1Ｈに帰属される1Ｈ−｛13Ｃ−15Ｎ｝三重共鳴ＮＭＲシグナルが見られることがわかる。また、図２（Ｂ）に示された結果から、化学シフト値３．１３ｐｐｍの位置に、13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミンのメチレンの1Ｈ−13Ｃ−15Ｎの1Ｈに帰属される1Ｈ−｛13Ｃ−15Ｎ｝三重共鳴ＮＭＲシグナルが見られることがわかる。これらの結果から、図１に示されるパルスシーケンスを用いることにより、代謝基質である13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパとその代謝産物である13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミンとを同時に、かつ高い選択性で検出することができることがわかる。
【０１０１】
実施例３
芳香族Ｌ−アミノ酸脱炭酸酵素などの代謝酵素が高発現しているマウス肝臓組織内では、前記芳香族脱炭酸酵素によってＬ−ドーパからドーパミンを生成する代謝反応が行なわれている。そこで、マウス肝臓組織の抽出液と、実施例１で得られた13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパとを用い、13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパの代謝反応を調べた。より具体的には、以下の操作を行なうことにより、13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパの代謝反応を調べた。
【０１０２】
マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス、体重：１５ｇ）の肝臓組織を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）中でホモジナイズすることにより、肝臓組織抽出液を得た。得られた肝臓組織抽出液を、その濃度が１０体積％となるように、反応用混合液〔組成：５００μＭ  13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパ、２ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭエチレンジアミン四酢酸、０．１ｍＭ２−メルカプトエタノールおよび１００μＭピリドキサールリン酸〕に加え、得られた混合液を３７℃で４５分間インキュベーションすることによって反応を行なった。
【０１０３】
得られた反応液と、５ｍｍ  ＴＣＩクライオプローブを装備した核磁気共鳴装置〔ブルカー・バイオスピン（Ｂｒｕｋｅｒ  ＢｉｏＳｐｉｎ）社製、商品名：Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ６００（６００ＭＨｚ）〕とを用い、重水中における13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパおよび13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミンそれぞれの1Ｈ−ＮＭＲスペクトル、1Ｈ−｛13Ｃ｝−ＮＭＲスペクトルおよび1Ｈ−｛13Ｃ−15Ｎ｝−ＮＭＲスペクトルのそれぞれを測定した。パルスシーケンスとして図１に示されたパルスシーケンスを用いた。実施例３において、肝臓組織抽出液を含む溶液における13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパおよび13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミンそれぞれの1Ｈ−ＮＭＲスペクトル、1Ｈ−｛13Ｃ｝−ＮＭＲスペクトルおよび1Ｈ−｛13Ｃ−15Ｎ｝−ＮＭＲスペクトルを図３に示す。図中、（ａ）は3Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパおよび13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミンそれぞれの1Ｈ−ＮＭＲスペクトル、（ｂ）は13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパおよび13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミンそれぞれの1Ｈ−｛13Ｃ｝−ＮＭＲスペクトル、（ｃ）は13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパおよび13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミンそれぞれの1Ｈ−｛13Ｃ−15Ｎ｝−ＮＭＲスペクトルを示す。  
【０１０４】
図３に示された結果から、1Ｈ−｛13Ｃ−15Ｎ｝三重共鳴ＮＭＲによれば、代謝基質である13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパのメチンの1Ｈ−13Ｃ−15Ｎの1Ｈに帰属されるシグナル（３．８４ｐｐｍ）と、13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミンのメチレンの1Ｈ−13Ｃ−15Ｎの1Ｈに帰属されるシグナル（３．１３ｐｐｍ）との双方がみられることがわかる。また、図３に示された結果から、代謝基質である13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパのメチンの1Ｈ−13Ｃ−15Ｎの1Ｈに帰属されるシグナル（３．８４ｐｐｍ）よりも、13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミンのメチレンの1Ｈ−13Ｃ−15Ｎの1Ｈに帰属されるシグナル（３．１３ｐｐｍ）が多くなっていることから、13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパの代謝反応の進行が確認された。これに対し、1Ｈ−ＮＭＲ〔図中、（ａ）参照〕では、多数の1Ｈシグナルがみられることから、13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパの代謝反応を調べることは困難であることがわかる。また、1Ｈ−｛13Ｃ｝−二重共鳴ＮＭＲ〔図中、（ｂ）参照〕では、1Ｈ−ＮＭＲに比べて1Ｈシグナルの数が少なくなっているが、肝臓抽出液中の夾雑物由来の1Ｈシグナルが見られることがわかる。これらの結果から、夾雑物が多数存在する生体系においても、1Ｈ−｛13Ｃ−15Ｎ｝三重共鳴ＮＭＲを用いることにより、13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパと13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミンとを同時に、かつ高い選択性で検出することができることがわかる。
【０１０５】
実施例４
マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス、体重：１５ｇ）の肝臓組織を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）中でホモジナイズすることにより、肝臓組織抽出液を得た。
【０１０６】
得られた肝臓組織抽出液を、その濃度が１０体積％となるように、反応用混合液〔組成：５００μＭ  13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパ、２ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭエチレンジアミン四酢酸、０．１ｍＭ２−メルカプトエタノールおよび１００μＭピリドキサールリン酸〕に加え、得られた溶液を３７℃で４５分間インキュベーションした。一方、前記において、肝臓組織抽出液を前記反応用混合液の代わりにブランクとして超純水を加え、得られた溶液を３７℃で４５分間インキュベーションした。
【０１０７】
インキュベーション後に得られた各溶液と、５ｍｍ  ＴＣＩクライオプローブを装備した核磁気共鳴装置〔ブルカー・バイオスピン（Ｂｒｕｋｅｒ  ＢｉｏＳｐｉｎ）社製、商品名：Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ６００（６００ＭＨｚ）〕とを用い、重水中における13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパおよび13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミンそれぞれの1Ｈ−｛13Ｃ−15Ｎ｝−ＮＭＲスペクトルのそれぞれを測定した。パルスシーケンスとして図１に示されたパルスシーケンスを用いた。実施例４において、肝臓組織抽出液を含む溶液における13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパおよび13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミンそれぞれの1Ｈ−｛13Ｃ−15Ｎ｝−ＮＭＲスペクトルを図４（Ａ）、肝臓組織抽出液を含まない溶液における13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパおよび13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミンそれぞれの1Ｈ−｛13Ｃ−15Ｎ｝−ＮＭＲスペクトルを図４（Ｂ）に示す。図中、ピークＡは13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパのメチンの1Ｈ−13Ｃ−15Ｎの1Ｈに帰属されるシグナル、ピークＢは13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミンのメチレンの1Ｈ−13Ｃ−15Ｎの1Ｈに帰属されるシグナルを示す。
【０１０８】
図４に示された結果から、肝臓組織抽出液を含む溶液においては、13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパのメチンの1Ｈ−13Ｃ−15Ｎの1Ｈに帰属されるシグナル（ピークＡ）および13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミンのメチレンの1Ｈ−13Ｃ−15Ｎの1Ｈに帰属されるシグナル（ピークＢ）の双方がみられるが、肝臓組織抽出液を含まない溶液においては、13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミンのメチレンの1Ｈ−13Ｃ−15Ｎの1Ｈに帰属されるシグナル（ピークＢ）がみられないことがわかる。
【０１０９】
これらの結果から、1Ｈ−13Ｃ−15Ｎ結合を有する13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパを用いることにより、マウスの肝臓組織抽出液中に含まれる芳香族Ｌ−アミノ酸脱炭酸酵素による13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパから13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミンへの代謝を調べることができることがわかる。また、1Ｈ−｛13Ｃ−15Ｎ｝三重共鳴ＮＭＲを用いることにより、13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパと13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミンとを同時に、かつ高い選択性で検出することができることがわかる。なお、式（Ｉ）で表わされ、かつ１Ｈ、１３Ｃおよび15Ｎからなる群より選ばれた少なくとも２種類の核磁気共鳴活性核を有するとともに異なる共鳴周波数を有する少なくとも３個の核磁気共鳴活性核からなる結合を有する他の神経伝達物質の前駆体アミノ酸を多重共鳴用のプローブとして用いたときにも同等の傾向が見られる。
【０１１０】
実施例５
臨床で用いられているＬ−ドーパ製剤は、脳内での薬効を高めるため、肝臓、腎臓などの臓器における代謝分解を抑制するための脱炭酸酵素阻害剤と併用されている。そこで、13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパの脱炭酸代謝反応に対する脱炭酸酵素阻害剤の効果を、13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパおよび13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミンそれぞれの1Ｈ−｛13Ｃ−15Ｎ｝−ＮＭＲスペクトルを測定することによって調べた。より具体的には、以下の操作を行なうことにより、13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパの脱炭酸代謝反応に対する脱炭酸酵素阻害剤の効果を調べた。
【０１１１】
マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス、体重：１５ｇ）の肝臓組織を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）中でホモジナイズすることにより、肝臓組織抽出液を得た。得られた肝臓組織抽出液をその濃度が１０体積％となるように反応用混合液〔組成：５００μＭ  13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパ、２ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭエチレンジアミン四酢酸、０．１ｍＭ２−メルカプトエタノールおよび１００μＭピリドキサールリン酸〕に加えるとともに、カルビドパ（０．１２５当量）またはベンゼラジド（０．１２５当量）を加え、得られた混合液を３７℃で４５分間インキュベーションすることによって反応を行なった。一方、肝臓組織抽出液をその濃度が１０体積％となるように反応用混合液〔組成：５００μＭ  13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパ、２ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭエチレンジアミン四酢酸、０．１ｍＭ２−メルカプトエタノールおよび１００μＭピリドキサールリン酸〕に加え、得られた混合液を３７℃で４５分間インキュベーションすることによって反応を行なった。
【０１１２】
得られた反応液と、５ｍｍ  ＴＣＩクライオプローブを装備した核磁気共鳴装置〔ブルカー・バイオスピン（Ｂｒｕｋｅｒ  ＢｉｏＳｐｉｎ）社製、商品名：Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ６００（６００ＭＨｚ）〕とを用い、13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパおよび13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミンそれぞれの1Ｈ−｛13Ｃ−15Ｎ｝−ＮＭＲスペクトルを測定した。パルスシーケンスとして図１に示されたパルスシーケンスを用いた。実施例５において、カルビドパを含む反応液およびカルビドパを含まない反応液における13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパおよび13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミンそれぞれの1Ｈ−｛13Ｃ−15Ｎ｝−ＮＭＲスペクトルを図５に示す。図５中、（ａ）はカルビドパを含まない反応液における13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパおよび13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミンそれぞれの1Ｈ−｛13Ｃ−15Ｎ｝−ＮＭＲスペクトル、（ｂ）はカルビドパを含む反応液における13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパおよび13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミンそれぞれの1Ｈ−｛13Ｃ−15Ｎ｝−ＮＭＲスペクトルを示す。また、実施例５において、ベンゼラジドを含む反応液およびベンゼラジドを含まない反応液における13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパおよび13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミンそれぞれの1Ｈ−｛13Ｃ−15Ｎ｝−ＮＭＲスペクトルを図６に示す。図６中、（ａ）はベンゼラジドを含まない反応液における13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパおよび13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミンそれぞれの1Ｈ−｛13Ｃ−15Ｎ｝−ＮＭＲスペクトル、（ｂ）はベンゼラジドを含む反応液における13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパおよび13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミンそれぞれの1Ｈ−｛13Ｃ−15Ｎ｝−ＮＭＲスペクトルを示す。また、図５および図６中、ピークＡは13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパのメチンの1Ｈ−13Ｃ−15Ｎの1Ｈに帰属されるシグナル、ピークＢは13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミンのメチレンの1Ｈ−13Ｃ−15Ｎの1Ｈに帰属されるシグナルを示す。
【０１１３】
図５に示された結果から、カルビドパを含まない反応液においては、13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパのメチンの1Ｈ−13Ｃ−15Ｎの1Ｈに帰属されるシグナル（ピークＡ）および13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミンのメチレンの1Ｈ−13Ｃ−15Ｎの1Ｈに帰属されるシグナル（ピークＢ）の双方がみられるが、カルビドパを含む溶液においては、13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミンのメチレンの1Ｈ−13Ｃ−15Ｎの1Ｈに帰属されるシグナル（ピークＢ）がみられないことがわかる。また、図６に示された結果から、ベンゼラジドを含まない反応液においては、13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパのメチンの1Ｈ−13Ｃ−15Ｎの1Ｈに帰属されるシグナル（ピークＡ）および13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミンのメチレンの1Ｈ−13Ｃ−15Ｎの1Ｈに帰属されるシグナル（ピークＢ）の双方がみられるが、ベンゼラジドを含む溶液においては、13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミンのメチレンの1Ｈ−13Ｃ−15Ｎの1Ｈに帰属されるシグナル（ピークＢ）がみられないことがわかる。これらの結果から、13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパを用いることにより、13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパの脱炭酸代謝反応に対する脱炭酸酵素阻害剤の効果を調べることができることがわかる。
【０１１４】
以上の結果から、13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパに代表される式（Ｉ）で表わされる神経伝達物質の前駆体アミノ酸を多重共鳴用のプローブとして用い、1Ｈ−｛13Ｃ−15Ｎ｝三重共鳴ＮＭＲ法を行なうことにより、代謝基質であるＬ−ドーパなどの神経伝達物質の前駆体とその代謝産物であるドーパミンなどの神経伝達物質とを同時に、かつ高い選択性で検出することができ、しかも神経伝達物質の前駆体（代謝基質）から神経伝達物質（代謝産物）への代謝過程を調べることができることが示唆される。
【図１】
2018054622.tif 000024
【図２】
2018054622.tif 000025
【図３】
2018054622.tif 000026
【図４】
2018054622.tif 000027
【図５】
2018054622.tif 000028
【図６】
2018054622.tif 000029
【手続補正書】
【提出日】平成30年2月6日(2018.2.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経伝達物質の前駆体アミノ酸と前記前駆体アミノ酸から代謝反応によって生成された神経伝達物質とを同時に検出する用途に用いられる多重共鳴用のプローブであって、式（ＩＩ）：
【化１】
2018054622.tif 000030
で表わされるＬ−ドーパ、式（ＩＩＩ）：
【化２】
2018054622.tif 000031
で表わされるグルタミン酸、式（ＶＩＩ）：
【化３】
2018054622.tif 000032
で表わされるヒスチジンおよび式（ＶＩＩＩ）：
【化４】
2018054622.tif 000033
で表わされる５−ヒドロキシトリプトファンからなる群より選ばれた神経伝達物質の前駆体アミノ酸を有効成分として含有することを特徴とするプローブ。
【請求項２】
神経伝達物質の前駆体アミノ酸と前記前駆体アミノ酸から代謝反応によって生成された神経伝達物質とを同時に検出する用途に用いられる多重共鳴用のプローブであって、式（Ｉ）：
【化５】
2018054622.tif 000034
（式中、Ｒ1は、カルボキシル基、カルボキシエチル基、ジヒドロキシベンジル基、インドリル基、ヒドロキシインドリル基またはイミダゾイル基を示す）
で表わされる神経伝達物質の前駆体アミノ酸を有効成分として含有することを特徴とするプローブ。