(57)【要約】【課題】本発明は、ウイルス、細菌、寄生虫等の病原体の型または亜型、特にインフルエンザウイルスの亜型を判定するためのＬＡＭＰ法用のプライマーのセット、該プライマーセットを用いた型または亜型の判定方法、該方法を実施するためのキットの提供を目的とする。【解決手段】本発明は、ウイルス、細菌、寄生虫等の病原体の型または亜型の分類の基準となる遺伝子（ＲＮＡまたはＤＮＡ）であって、該型または亜型に属する全ての遺伝子を、塩基配列の類似性に基づいていくつかの小グループに分け、各小グループに属する遺伝子を検出し得るプライマーを可能な限り少ない数になるように設計したプライマーである。さらに、本発明は、前述のように作製したプライマーを用いて、検出対象であるウイルス、細菌、寄生虫等の病原体の型または亜型を判定する方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
病原体の型または亜型判定用オリゴヌクレオチドプライマーであって、以下の（ａ）〜（ｆ）の工程を行い、工程（ｂ）および（ｅ）で決定されるフォワードプライマー設定領域のコンセンサス配列からなるフォワードプライマーのセット。
（ａ）検査対象遺伝子のセンス配列同士またはアンチセンス配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各検査対象遺伝子間で高い相同性を有する領域をフォワードプライマー設定領域として選択する工程、
（ｂ）フォワードプライマー設定領域について、コンセンサス配列を決定する工程、
（ｃ）該コンセンサス配列と各検査対象遺伝子のフォワードプライマー領域の塩基配列の対応する位置の塩基同士を比較し、検査対象遺伝子のフォワードプライマー設定領域の塩基配列の中で、コンセンサス配列の塩基とは異なる塩基の数を、検査対象遺伝子毎にカウントする工程、
（ｄ）工程（ｃ）でカウントされた塩基数が一定数以上である検査対象遺伝子を抽出する工程、
（ｅ）工程（ｄ）で抽出された検査対象遺伝子のフォワードプライマー設定領域の塩基配列同士を再度アライメントし、その設定領域について新たなコンセンサス配列を決定する工程、
（ｆ）抽出される検査対象遺伝子がなくなるまで工程（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）を繰り返す工程、
【請求項２】
前記工程（ａ）および／または工程（ｄ）が下記の工程であることを特徴とする請求項１に記載のフォワードプライマーのセット。
（ａ）検査対象遺伝子のセンス配列同士またはアンチセンス配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上が同一である単一塩基Ｘ、および／または各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上がＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの中から選択されるいずれか２種類または３種類の塩基で構成される混合塩基Ｙを含み、単一塩基Ｘおよび／または混合塩基Ｙが９０％以上を占める連続する塩基配列領域をフォワードプライマー設定領域として選択する工程、
（ｄ）前記工程（ｃ）でカウントされた塩基数が３以上である検査対象遺伝子を抽出する工程、
【請求項３】
病原体の型または亜型判定用のオリゴヌクレオチドプライマーであって、請求項１または２に記載のフォワードプライマーの塩基配列の相補配列からなるリバースプライマーのセット。
【請求項４】
病原体の型または亜型の判定をＬＡＭＰ法で行うためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、以下の（ａ）〜（ｇ）の工程を行い、工程（ｃ）および（ｆ）で決定されるＦ２領域およびＦ１領域のコンセンサス配列のペアを選択し、Ｆ２領域の塩基配列を３’末端側に、Ｆ１領域の塩基配列の相補的配列を５’末端側に有する塩基配列からなるＦＩＰプライマーのセット。
（ａ）検査対象遺伝子のセンス配列同士またはアンチセンス配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各配列間で高い相同性を有する領域をＦ２領域として選択する工程、
（ｂ）工程（ａ）で選択されるＦ２領域の３’末端より３’側下流に存在する領域であって、前記Ｆ２領域と同じ要件を満たす領域をＦ１領域として選択する工程、
（ｃ）各検査対象遺伝子のＦ１領域の塩基配列同士およびＦ２領域の塩基配列同士をアライメントし、アライメントしたＦ１領域の塩基配列およびＦ２領域の塩基配列の中から、各々の領域のコンセンサス配列を決定しペアとして選択する工程、
（ｄ）Ｆ１領域のコンセンサス配列と各検査対象遺伝子のＦ１領域の塩基配列の対応する位置の塩基同士およびＦ２領域のコンセンサス配列と各検査対象遺伝子のＦ２領域の塩基配列の対応する位置の塩基同士を比較し、各検査対象遺伝子のＦ１領域およびＦ２領域の塩基配列に含まれる各領域のコンセンサス配列の塩基と異なる塩基の数を、検査対象遺伝子毎にカウントする工程、
（ｅ）工程（ｄ）でカウントされた塩基数が一定数以上である検査対象遺伝子を抽出する工程、
（ｆ）工程（ｅ）で抽出した検査対象遺伝子のＦ１領域の塩基配列同士およびＦ２領域の塩基配列同士を再度アライメントし、アライメントしたＦ１領域の塩基配列およびＦ２領域の塩基配列の中から、各々の領域の新たなコンセンサス配列を決定しペアとして選択する工程、
（ｇ）抽出される検査対象遺伝子がなくなるまで工程（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）を繰り返す工程、
【請求項５】
病原体の型または亜型判定用のオリゴヌクレオチドプライマーであって、前記工程（ａ）および／または工程（ｅ）が下記の工程であることを特徴とする請求項４に記載のＦＩＰプライマーのセット。
（ａ）検査対象遺伝子のセンス配列同士またはアンチセンス配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上が同一である単一塩基Ｘ、および／または各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上がＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの中から選択されるいずれか２種類または３種類の塩基で構成される混合塩基Ｙから構成される連続する塩基配列領域をＦ２領域として選択する工程、
（ｅ）前記工程（ｄ）でカウントされた塩基数が４以上である検査対象遺伝子、および、カウントされた塩基の数が３であってコンセンサス配列の塩基と異なる塩基がＦ１領域またはＦ２領域のいずれかに偏っている検査対象遺伝子を抽出する工程、
【請求項６】
前記Ｆ１領域の５’末端の塩基とＦ２領域の５’末端の塩基との間に、４０塩基〜６０塩基が存在し、および／または、前記Ｆ１領域およびＦ２領域の塩基数が１０塩基〜２５塩基であることを特徴とする請求項４または５に記載のＦＩＰプライマーのセット。
【請求項７】
前記亜型がＡ型インフルエンザウイルスＨ５亜型であり、以下の（ａ）〜（ｃ）に示されるいずれかのプライマーセットであることを特徴とする請求項４ないし６のいずれかに記載のＦＩＰプライマーのセット。
（ａ）配列番号１〜配列番号２０で表される塩基配列のプライマーからなるセット、
（ｂ）配列番号１１５〜配列番号１１９および配列番号１５６で表される塩基配列のプライマーからなるセット、または
（ｃ）配列番号１３１〜配列番号１３３で表される塩基配列で表される塩基配列のプライマーからなるセット、
【請求項８】
病原体の型または亜型判定用のオリゴヌクレオチドプライマーであって、請求項４ないし６のいずれかに記載のＦＩＰプライマーの塩基配列の相補配列からなるＢＩＰプライマーのセット。
【請求項９】
前記亜型がＡ型インフルエンザウイルスＨ５亜型であり、以下の（ａ）〜（ｃ）に示されるいずれかのプライマーセットであることを特徴とする請求項８に記載のＢＩＰプライマーのセット。
（ａ）配列番号４６〜配列番号８２で表される塩基配列のプライマーからなるセット、
（ｂ）配列番号１２２〜配列番号１２８および配列番号１５７で表される塩基配列のプライマーからなるセット、または
（ｃ）配列番号１３４〜配列番号１３６で表される塩基配列で表される塩基配列のプライマーからなるセット、
【請求項１０】
病原体の型または亜型の判定をＬＡＭＰ法で行うためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、以下の（ａ）〜（ｆ）の工程を行い、工程（ｂ）および（ｅ）で決定されるＦ３領域のコンセンサス配列からなるＦ３プライマーのセット。
（ａ）検査対象遺伝子のセンス配列またはアンチセンス配列であって、請求項４または請求項５に記載のＦ２領域の５’側上流に存在する塩基配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各検査対象遺伝子間で高い相同性を有する領域をＦ３領域として選択する工程、
（ｂ）各検査対象遺伝子のＦ３領域の塩基配列同士をアライメントし、アライメントしたＦ３領域のコンセンサス配列を決定する工程、
（ｃ）該コンセンサス配列と各検査対象遺伝子のＦ３領域の塩基配列の対応する位置の塩基同士を比較し、検査対象遺伝子のＦ３領域の塩基配列に含まれるコンセンサス配列の塩基と異なる塩基の数を、検査対象遺伝子毎にカウントする工程、
（ｄ）工程（ｃ）でカウントされた塩基数が一定数以上である検査対象遺伝子を抽出する工程、
（ｅ）工程（ｄ）で抽出した検査対象遺伝子のＦ３領域の塩基配列同士を再度アライメントし、アライメントしたＦ３領域の新たなコンセンサス配列を決定する工程、
（ｆ）抽出される検査対象遺伝子がなくなるまで工程（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）を繰り返す工程、
【請求項１１】
前記工程（ａ）および／または工程（ｄ）が下記の工程であることを特徴とする請求項１０に記載のＦ３プライマーのセット。
（ａ）検査対象遺伝子のセンス配列またはアンチセンス配列であって、請求項４または請求項５に記載のＦ２領域の５’側上流に存在する塩基配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上が同一である単一塩基Ｘ、および／または各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上がＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの中から選択されるいずれか２種類または３種類の塩基で構成される混合塩基Ｙを含み、単一塩基Ｘおよび／または混合塩基Ｙが９０％以上を占める連続する塩基配列領域をＦ３領域として選択する工程、
（ｄ）前記工程（ｃ）でカウントされた塩基数が３以上である検査対象遺伝子を抽出する工程、
【請求項１２】
病原体の型または亜型の判定をＬＡＭＰ法で行うためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、検査対象遺伝子のセンス配列またはアンチセンス配列の、請求項４または請求項５に記載のＦ２領域の５’側上流に存在する塩基配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上が同一である単一塩基Ｘ、および／または各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上がＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの中から選択されるいずれか２種類または３種類の塩基で構成される混合塩基Ｙを含み、単一塩基Ｘおよび／または混合塩基Ｙが９０％以上を占める連続する塩基配列領域をＦ３領域として選択し、全ての検査対象遺伝子のＦ３領域の塩基配列を網羅するように設計した、単一または複数の混合塩基プライマーからなるＦ３プライマーのセット。
【請求項１３】
前記Ｆ３領域の３’末端の塩基と前記Ｆ２領域の５’末端の塩基との間に０〜６０塩基が存在し、および／または、前記Ｆ３領域の塩基数が１０塩基〜２５塩基であることを特徴とする請求項１０ないし請求項１２のいずれかに記載のＦ３プライマーのセット。
【請求項１４】
前記亜型がＡ型インフルエンザウイルスＨ５型であり、以下の（ａ）〜（ｃ）に示されるいずれかのプライマーセットであることを特徴とする請求項１０ないし１３のいずれかに記載のＦ３プライマーのセット。
（ａ）配列番号２１〜配列番号３４で表される塩基配列のプライマーからなるセット、
（ｂ）配列番号１２０で表される塩基配列のプライマーからなるセット、または
（ｃ）配列番号１３７〜配列番号１３８で表される塩基配列のプライマーからなるセット、
【請求項１５】
病原体の型または亜型の判定をＬＡＭＰ法で行うためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、請求項１０ないし１３のいずれかに記載のＦ３プライマーの塩基配列の相補配列からなるＢ３プライマーのセット。
【請求項１６】
前記亜型がＡ型インフルエンザウイルスＨ５亜型であり、以下の（ａ）〜（ｃ）に示されるいずれかのプライマーセットであることを特徴とする請求項１５に記載のＢ３プライマーのセット。
（ａ）配列番号８３〜配列番号９２で表される塩基配列のプライマーからなるセット、
（ｂ）配列番号１２９で表される塩基配列のプライマーからなるセット、または
（ｃ）配列番号１４２で表される塩基配列で表される塩基配列のプライマーからなるセット、
【請求項１７】
病原体の型または亜型の判定をＬＡＭＰ法で行うためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、以下の（ａ）〜（ｆ）の工程を行い、工程（ｂ）および（ｅ）で決定されるＦＬ領域のコンセンサス配列からなるＦＬプライマーのセット。
（ａ）検査対象遺伝子のセンス配列またはアンチセンス配列であって、請求項４または請求項５に記載のＦ１領域とＦ２領域の間に存在する塩基配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各検査対象遺伝子間で高い相同性を有する領域をＦＬ領域として選択する工程、
（ｂ）各検査対象遺伝子のＦＬ領域の塩基配列同士をアライメントし、アライメントしたＦＬ領域のコンセンサス配列を決定する工程、
（ｃ）該コンセンサス配列と各検査対象遺伝子のＦＬ領域の塩基配列の対応する位置の塩基同士を比較し、検査対象遺伝子のＦＬ領域の塩基配列に含まれるコンセンサス配列の塩基と異なる塩基の数を、検査対象遺伝子毎にカウントする工程、
（ｄ）工程（ｃ）でカウントされた塩基数が一定数以上である検査対象遺伝子を抽出する工程、
（ｅ）工程（ｄ）で抽出した検査対象遺伝子のＦＬ領域の塩基配列同士を再度アライメントし、アライメントしたＦＬ領域の新たなコンセンサス配列を決定する工程、
（ｆ）抽出される検査対象遺伝子がなくなるまで工程（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）を繰り返す工程、
【請求項１８】
前記工程（ａ）および／または工程（ｄ）が下記の工程であることを特徴とする請求項１７に記載のＦＬプライマーのセット。
（ａ）検査対象遺伝子のセンス配列またはアンチセンス配列であって、請求項４または請求項５に記載のＦ１領域とＦ２領域の間に存在する塩基配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上が同一である単一塩基Ｘ、および／または各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上がＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの中から選択されるいずれか２種類または３種類の塩基で構成される混合塩基Ｙを含み、単一塩基Ｘおよび／または混合塩基Ｙが９０％以上を占める連続する塩基配列領域をＦＬ領域として選択する工程、
（ｄ）前記工程（ｃ）でカウントされた塩基数が３以上である検査対象遺伝子を抽出する工程、
【請求項１９】
病原体の型または亜型の判定をＬＡＭＰ法で行うためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、検査対象遺伝子のセンス配列またはアンチセンス配列の、請求項４または請求項５に記載のＦ１領域とＦ２領域の間に存在する塩基配列をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上が同一である単一塩基Ｘ、および／または各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上がＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの中から選択されるいずれか２種類または３種類の塩基で構成される混合塩基Ｙを含み、単一塩基Ｘおよび／または混合塩基Ｙが９０％以上を占める連続する塩基配列領域をＦ３領域として選択し、全ての検査対象遺伝子のＦ３領域の塩基配列を網羅するように設計した、単一または複数の混合塩基プライマーからなるＦＬプライマーのセット。
【請求項２０】
前記ＦＬ領域の塩基数が１０塩基〜２５塩基であることを特徴とする請求項１７ないし１９のいずれかに記載のＦＬプライマーのセット。
【請求項２１】
前記亜型がＡ型インフルエンザウイルスＨ５亜型であり、以下の（ａ）〜（ｃ）に示されるいずれかのプライマーセットであることを特徴とする請求項１７ないし２０のいずれかに記載のＦＬプライマーのセット。
（ａ）配列番号３５〜配列番号４５で表される塩基配列のプライマーからなるセット、
（ｂ）配列番号１２１で表される塩基配列のプライマーからなるセット、または
（ｃ）配列番号１３９〜配列番号１４１で表される塩基配列のプライマーからなるセット、
【請求項２２】
請求項１７ないし２０のいずれかに記載のＦＬプライマーの塩基配列の相補配列からなるＢＬプライマーのセット。
【請求項２３】
前記亜型がＡ型インフルエンザウイルスＨ５型であり、以下の（ａ）〜（ｃ）に示されるいずれかのプライマーセットであることを特徴とする請求項２２に記載のＢＬプライマーのセット。
（ａ）配列番号９３〜配列番号１１４で表される塩基配列のプライマーからなるセット、
（ｂ）配列番号１３０で表される塩基配列のプライマーからなるセット、または
（ｃ）配列番号１４３で表される塩基配列で表される塩基配列のプライマーからなるセット、
【請求項２４】
請求項１に記載のオリゴヌクレオチドプライマーのセットおよび請求項３に記載のオリゴヌクレオチドプライマーのセットを用いて、試料中の病原体の遺伝子由来の核酸を鋳型として、核酸増幅反応を行い、得られた増幅断片を解析して、試料中の病原体の型または亜型を判定する方法。
【請求項２５】
請求項４ないし７のいずれかに記載のＦＩＰプライマーのセットおよび請求項８または９のいずれかに記載のＢＩＰプライマーのセットを用いて、試料中の病原体の遺伝子由来の核酸を鋳型として、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応を行い、得られた増幅断片を解析して、試料中の病原体の型または亜型を判定する方法。
【請求項２６】
請求項１０ないし１４のいずれかに記載のＦ３プライーのセットおよび請求項１５または１６に記載のＢ３プライマーのセットをさらに用いて、試料中の病原体の遺伝子由来の核酸を鋳型として、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応を行い、得られた増幅断片を解析して、試料中の病原体の型または亜型を判定することを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１７ないし２１のいずれかに記載のＦＬプライマーのセットおよび請求項２２または２３に記載のＢＬプライマーのセットをさらに用いて、試料中の病原体の遺伝子由来の核酸を鋳型として、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応を行い、得られた増幅断片を解析して、試料中の病原体の型または亜型を判定することを特徴とする請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１もしくは２に記載のオリゴヌクレオチドプライマーのセット、請求項３に記載のオリゴヌクレオチドプライマーのセット、請求項４ないし７のいずれかに記載のＦＩＰプライマーのセット、請求項８もしくは９に記載のＢＩＰプライマーのセット、請求項１０ないし１４のいずれかに記載のＦ３プライマーのセット、請求項１５もしくは１６に記載のＢ３プライマーのセット、請求項１７ないし２１のいずれかに記載のＦＬプライマーのセット、または、請求項２２もしくは２３に記載のＢＬプライマーのセットの少なくともいずれかのプライマーのセットを含む、病原体の型または亜型を判定するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多様な遺伝子（ＲＮＡ、ＤＮＡ）の型別を高精度に行う判定方法に関するものであって、より具体的には、ＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルス、細菌、寄生虫等の病原体の型または亜型の判定に関する遺伝子増幅法（または核酸増幅法）に使用するプライマーの設計方法、該プライマー、該プライマーを用いた遺伝子型別法および該判定のためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザウイルスはヒトや家畜、家禽に重篤な呼吸器症状を引き起こす、人獣共通感染症の病原体である。
鳥インフルエンザウイルスは、Ａ型のインフルエンザウイルスに属し、自然界においては、野生の水禽類を自然宿主として存在している。水禽類が鳥インフルエンザウイルスに感染しても、一般的には無症状であるが、ニワトリが感染すると高い致死性を示す場合があり、家禽を飼育する農場などにおいては、鳥インフルエンザウイルスの感染に対する対策は必要不可欠である。
一般的には鳥インフルエンザウイルスはヒトには感染しないと考えられてきた。しかし、１９９７年に香港で高病原性のＨ５Ｎ１亜型の鳥インフルエンザウイルスによるヒトの感染が初めて報告され、鳥インフルエンザウイルスの感染によってヒトが高率に死亡することが明らかになった。これ以後、アジアを中心にして高病原性のＨ５Ｎ１亜型ウイルスによる家禽の感染が続いており、畜産業へ多大な経済的被害をもたらすと共に、ヒト感染の継続によって新型インフルエンザの誕生の脅威が続いている。また、２０１３年には中国で、低病原性のＨ７Ｎ９亜型ウイルスによるヒトの致死的感染が起こり、新たな脅威が加わっている。
鳥インフルエンザの対策で重要なことは、早期摘発とそれによるウイルスの撲滅と蔓延防止である。本発明者らは、ウイルスの早期摘発をさらに強化するために、信頼度の高いＬＡＭＰ法の開発を行った。
【０００３】
鳥インフルエンザウイルスを含むインフルエンザウイルスの粒子表面には、ヘマグルチニン（ＨＡ；ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ；ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ）と称されるスパイクタンパク質が存在している。ＨＡはウイルスが細胞にあるレセプターへ結合する際に必要な蛋白質で、ＮＡはレセプターを破壊する酵素で、細胞で作られた子孫ウイルスがレセプターを破壊して細胞表面からリリースされる際に必要な蛋白質である。Ａ型インフルエンザウイルスの場合、ＨＡは１６種類（Ｈ１〜Ｈ１６）、ＮＡは９種類（Ｎ１〜Ｎ９）に血清学的に分類される。また、インフルエンザウイルスはＨＡとＮＡの組み合わせによって、多くの亜型に分類されている。これら亜型の中で、Ｈ５亜型、Ｈ７亜型のＡ型インフルエンザウイルスによる家禽の感染は国際的に殺処分の対象である。また、これらの亜型のウイルスによるヒトへの感染は、時に高い致死率を招くことが知られており、緊急の対策が求められている。
【０００４】
鳥インフルエンザの迅速な制圧に必要なことは、可能な限り速やかにウイルスの亜型を判定し、殺処分の対象となるウイルスか、人に高致死性を誘発する可能性が高いウイルスかを明らかにすることである。これらが確認されれば、迅速な防疫措置によって、感染の拡大、新型ウイルスの誕生を効果的に防止することが可能になる。
現在、最も信頼度の高い鳥インフルエンザウイルスのＨＡ亜型の判定方法は、リアルタイムＰＣＲ法である（特許文献１）。この方法はＨ５亜型またはＨ７亜型のウイルスを幅広く、漏れなく検出できる利点を有しており、公定法として国内外で広く利用されている。しかし、リアルタイムＰＣＲ法は、検出工程が煩雑で、訓練された技術者と専用の高額機器を必要とするため、検査を実施できる機関が限定される。また、リアルタイムＰＣＲ法は検出に３時間を要するため、迅速性に問題がある。このため、リアルタイムＰＣＲ法は多検体の迅速な診断には不向きで、多くのサンプルが次々と持ち込まれると、個々に対応できず、診断の遅れ、感染の拡大を招くリスクが増大すると指摘されている。また、リアルタイムＰＣＲ法に用いられている、現行の混合塩基を使用したプライマー・プローブプライマーでは、現在においても検出漏れが起こる可能性があり、将来において遺伝子の多様性がさらに拡大すれば、検出漏れによって診断が困難になる可能性が高い。
他方、ＬＡＭＰ法（特許文献２および３）は、検出工程が簡便で、迅速（１時間）にウイルスを検出でき、特殊な機器を有しないため、一般検査室で利用できる利点を有している。鳥インフルエンザにおいても、一部の限定されたウイルスを対象にして、高感度かつ迅速に検出する方法が報告されている（特許文献４および特許文献５）が、その信頼度はリアルタイムＰＣＲ法には及ばない。現行のＬＡＭＰ法は一部のウイルス集団を検出できても、多様なウイルス集団を幅広く検出することはできず、検出漏れが頻繁に起こると指摘されている。
【０００５】
上述のように、ウイルス、特に鳥インフルエンザウイルスの検出およびその亜型の特定のためには、信頼性の高いＬＡＭＰ法の確立が待たれているところであるが、現在のところ、まだ、そのような方法は確立されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開2010-252659
【特許文献２】WO2000/28082
【特許文献３】WO2002/024902
【特許文献４】WO2006/049061
【特許文献５】特開2011-167207
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記の事情に鑑み、本発明者らは、簡便かつ迅速に、ウイルス、細菌、寄生虫等の病原体、特にインフルエンザウイルスの亜型を漏れなく検出することを解決課題とし、鋭意研究を進めた。
すなわち、本発明は、インフルエンザウイルスなどのウイルス、細菌、寄生虫等の病原体の型または亜型を、遺伝子増幅法（または、核酸増幅法、例えば、ＬＡＭＰ法、ＰＣＲ法）で判定するためのプライマーの設計方法、該プライマーのセット、該プライマーセットを用いたウイルス、細菌、寄生虫等の病原体の型または亜型の判定方法、該方法を実施するためのキットの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明者らは、インフルエンザウイルス、特に近年家禽への感染による被害の他、ヒトへの感染が懸念されているＡ型ウイルスのＨ５亜型、Ｈ７亜型等に属するインフルエンザウイルスの全てのＨＡ遺伝子またはＮＡ遺伝子を漏れ無く検出し、任意のインフルエンザウイルスの亜型を確実に判定できる遺伝子増幅（または核酸増幅）用のプライマーの作製方法を検討した。
任意の亜型に属するＨＡ遺伝子またはＮＡ遺伝子のすべてを検出するには、該亜型に属する全てのＨＡ遺伝子またはＮＡ遺伝子を、亜型特異的かつ高感度に増幅し得るプライマーを設計する必要があった。これのみならず、実用性を高めるためには、用いるプライマーの本数をできる限り少数にする必要もあった。
そこで、本発明者らは、ＨＡ遺伝子およびＮＡ遺伝子で、ある特定のＨＡ亜型（例えばＨ５亜型）に注目した。その亜型の母集団に属す全てのＨＡ遺伝子を、塩基配列に基づいていくつかのグループ（ポピュレーションあるいは母集団）に分け、各グループに属するＨ５亜型のＨＡ遺伝子を検出し得るプライマーを、可能な限り少ない数になるように設計する方法を見出し、本発明を完成させた。
ポピュレーションプライマー（Ｐプライマー）とは、本発明によって、初めて示されるプライマーの概念であり、遺伝子の集団を近縁な遺伝子からなる母集団に分け、母集団毎に設計するプライマーのことである。母集団ごとに設計したＰプライマーを混合して使用すれば、多様な遺伝子を漏れなく検出できると考えられる。本発明の実施例においては、この着想を実証するべく、Ｐプライマーの新規設計方法を見出し、Ｐプライマーの有用性について検討した。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（２８）である。
（１）病原体の型または亜型判定用オリゴヌクレオチドプライマーであって、以下の（ａ）〜（ｆ）の工程を行い、工程（ｂ）および（ｅ）で決定されるフォワードプライマー設定領域のコンセンサス配列からなるフォワードプライマーのセット。
（ａ）検査対象遺伝子のセンス配列同士またはアンチセンス配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各検査対象遺伝子間で高い相同性を有する領域をフォワードプライマー設定領域として選択する工程、
（ｂ）フォワードプライマー設定領域について、コンセンサス配列を決定する工程、
（ｃ）該コンセンサス配列と各検査対象遺伝子のフォワードプライマー領域の塩基配列の対応する位置の塩基同士を比較し、検査対象遺伝子のフォワードプライマー設定領域の塩基配列の中で、コンセンサス配列の塩基とは異なる塩基の数を、検査対象遺伝子毎にカウントする工程、
（ｄ）工程（ｃ）でカウントされた塩基数が一定数以上である検査対象遺伝子を抽出する工程、
（ｅ）工程（ｄ）で抽出された検査対象遺伝子のフォワードプライマー設定領域の塩基配列同士を再度アライメントし、その設定領域について新たなコンセンサス配列を決定する工程、
（ｆ）抽出される検査対象遺伝子がなくなるまで工程（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）を繰り返す工程、
（２）前記工程（ａ）および／または工程（ｄ）が下記の工程であることを特徴とする上記（１）に記載のフォワードプライマーのセット。
（ａ）検査対象遺伝子のセンス配列同士またはアンチセンス配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上が同一である単一塩基Ｘ、および／または各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上がＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの中から選択されるいずれか２種類または３種類の塩基で構成される混合塩基Ｙを含み、単一塩基Ｘおよび／または混合塩基Ｙが９０％以上を占める連続する塩基配列領域をフォワードプライマー設定領域として選択する工程、
（ｄ）前記工程（ｃ）でカウントされた塩基数が３以上である検査対象遺伝子を抽出する工程、
（３）病原体の型または亜型判定用のオリゴヌクレオチドプライマーであって、上記（１）または（２）に記載のフォワードプライマーの塩基配列の相補配列からなるリバースプライマーのセット。
（４）病原体の型または亜型の判定をＬＡＭＰ法で行うためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、以下の（ａ）〜（ｇ）の工程を行い、工程（ｃ）および（ｆ）で決定されるＦ２領域およびＦ１領域のコンセンサス配列のペアを選択し、Ｆ２領域の塩基配列を３’末端側に、Ｆ１領域の塩基配列の相補的配列を５’末端側に有する塩基配列からなるＦＩＰプライマーのセット。
（ａ）検査対象遺伝子のセンス配列同士またはアンチセンス配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各配列間で高い相同性を有する領域をＦ２領域として選択する工程、
（ｂ）工程（ａ）で選択されるＦ２領域の３’末端より３’側下流に存在する領域であって、前記Ｆ２領域と同じ要件を満たす領域をＦ１領域として選択する工程、
（ｃ）各検査対象遺伝子のＦ１領域の塩基配列同士およびＦ２領域の塩基配列同士をアライメントし、アライメントしたＦ１領域の塩基配列およびＦ２領域の塩基配列の中から、各々の領域のコンセンサス配列を決定しペアとして選択する工程、
（ｄ）Ｆ１領域のコンセンサス配列と各検査対象遺伝子のＦ１領域の塩基配列の対応する位置の塩基同士およびＦ２領域のコンセンサス配列と各検査対象遺伝子のＦ２領域の塩基配列の対応する位置の塩基同士を比較し、各検査対象遺伝子のＦ１領域およびＦ２領域の塩基配列に含まれる各領域のコンセンサス配列の塩基と異なる塩基の数を、検査対象遺伝子毎にカウントする工程、
（ｅ）工程（ｄ）でカウントされた塩基数が一定数以上である検査対象遺伝子を抽出する工程、
（ｆ）工程（ｅ）で抽出した検査対象遺伝子のＦ１領域の塩基配列同士およびＦ２領域の塩基配列同士を再度アライメントし、アライメントしたＦ１領域の塩基配列およびＦ２領域の塩基配列の中から、各々の領域の新たなコンセンサス配列を決定しペアとして選択する工程、
（ｇ）抽出される検査対象遺伝子がなくなるまで工程（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）を繰り返す工程、
（５）病原体の型または亜型判定用のオリゴヌクレオチドプライマーであって、前記工程（ａ）および／または工程（ｅ）が下記の工程であることを特徴とする上記（４）に記載のＦＩＰプライマーのセット。
（ａ）検査対象遺伝子のセンス配列同士またはアンチセンス配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上が同一である単一塩基Ｘ、および／または各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上がＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの中から選択されるいずれか２種類または３種類の塩基で構成される混合塩基Ｙから構成される連続する塩基配列領域をＦ２領域として選択する工程、
（ｅ）前記工程（ｄ）でカウントされた塩基数が４以上である検査対象遺伝子、および、カウントされた塩基の数が３であってコンセンサス配列の塩基と異なる塩基がＦ１領域またはＦ２領域のいずれかに偏っている検査対象遺伝子を抽出する工程、
（６）前記Ｆ１領域の５’末端の塩基とＦ２領域の５’末端の塩基との間に、４０塩基〜６０塩基が存在し、および／または、前記Ｆ１領域およびＦ２領域の塩基数が１０塩基〜２５塩基であることを特徴とする上記（４）または（５）に記載のＦＩＰプライマーのセット。
（７）前記亜型がＡ型インフルエンザウイルスＨ５亜型であり、以下の（ａ）〜（ｃ）に示されるいずれかのプライマーセットであることを特徴とする上記（４）ないし（６）のいずれかに記載のＦＩＰプライマーのセット。
（ａ）配列番号１〜配列番号２０で表される塩基配列のプライマーからなるセット、
（ｂ）配列番号１１５〜配列番号１１９および配列番号１５６で表される塩基配列のプライマーからなるセット、または
（ｃ）配列番号１３１〜配列番号１３３で表される塩基配列で表される塩基配列のプライマーからなるセット、
（８）病原体の型または亜型判定用のオリゴヌクレオチドプライマーであって、上記（４）ないし（６）のいずれかに記載のＦＩＰプライマーの塩基配列の相補配列からなるＢＩＰプライマーのセット。
（９）前記亜型がＡ型インフルエンザウイルスＨ５亜型であり、以下の（ａ）〜（ｃ）に示されるいずれかのプライマーセットであることを特徴とする上記（８）に記載のＢＩＰプライマーのセット。
（ａ）配列番号４６〜配列番号８２で表される塩基配列のプライマーからなるセット、
（ｂ）配列番号１２２〜配列番号１２８および配列番号１５７で表される塩基配列のプライマーからなるセット、または
（ｃ）配列番号１３４〜配列番号１３６で表される塩基配列で表される塩基配列のプライマーからなるセット、
（１０）病原体の型または亜型の判定をＬＡＭＰ法で行うためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、以下の（ａ）〜（ｆ）の工程を行い、工程（ｂ）および（ｅ）で決定されるＦ３領域のコンセンサス配列からなるＦ３プライマーのセット。
（ａ）検査対象遺伝子のセンス配列またはアンチセンス配列であって、上記（４）または（５）に記載のＦ２領域の５’側上流に存在する塩基配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各検査対象遺伝子間で高い相同性を有する領域をＦ３領域として選択する工程、
（ｂ）各検査対象遺伝子のＦ３領域の塩基配列同士をアライメントし、アライメントしたＦ３領域のコンセンサス配列を決定する工程、
（ｃ）該コンセンサス配列と各検査対象遺伝子のＦ３領域の塩基配列の対応する位置の塩基同士を比較し、検査対象遺伝子のＦ３領域の塩基配列に含まれるコンセンサス配列の塩基と異なる塩基の数を、検査対象遺伝子毎にカウントする工程、
（ｄ）工程（ｃ）でカウントされた塩基数が一定数以上である検査対象遺伝子を抽出する工程、
（ｅ）工程（ｄ）で抽出した検査対象遺伝子のＦ３領域の塩基配列同士を再度アライメントし、アライメントしたＦ３領域の新たなコンセンサス配列を決定する工程、
（ｆ）抽出される検査対象遺伝子がなくなるまで工程（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）を繰り返す工程、
（１１）前記工程（ａ）および／または工程（ｄ）が下記の工程であることを特徴とする上記（１０）に記載のＦ３プライマーのセット。
（ａ）検査対象遺伝子のセンス配列またはアンチセンス配列であって、上記（４）または（５）に記載のＦ２領域の５’側上流に存在する塩基配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上が同一である単一塩基Ｘ、および／または各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上がＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの中から選択されるいずれか２種類または３種類の塩基で構成される混合塩基Ｙを含み、単一塩基Ｘおよび／または混合塩基Ｙが９０％以上を占める連続する塩基配列領域をＦ３領域として選択する工程、
（ｄ）前記工程（ｃ）でカウントされた塩基数が３以上である検査対象遺伝子を抽出する工程、
（１２）病原体の型または亜型の判定をＬＡＭＰ法で行うためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、検査対象遺伝子のセンス配列またはアンチセンス配列の、上記（４）または（５）に記載のＦ２領域の５’側上流に存在する塩基配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上が同一である単一塩基Ｘ、および／または各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上がＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの中から選択されるいずれか２種類または３種類の塩基で構成される混合塩基Ｙを含み、単一塩基Ｘおよび／または混合塩基Ｙが９０％以上を占める連続する塩基配列領域をＦ３領域として選択し、全ての検査対象遺伝子のＦ３領域の塩基配列を網羅するように設計した、単一または複数の混合塩基プライマーからなるＦ３プライマーのセット。
（１３）前記Ｆ３領域の３’末端の塩基と前記Ｆ２領域の５’末端の塩基との間に０〜６０塩基が存在し、および／または、前記Ｆ３領域の塩基数が１０塩基〜２５塩基であることを特徴とする上記（１０）ないし（１２）のいずれかに記載のＦ３プライマーのセット。
（１４）前記亜型がＡ型インフルエンザウイルスＨ５型であり、以下の（ａ）〜（ｃ）に示されるいずれかのプライマーセットであることを特徴とする上記（１０）ないし（１３）のいずれかに記載のＦ３プライマーのセット。
（ａ）配列番号２１〜配列番号３４で表される塩基配列のプライマーからなるセット、
（ｂ）配列番号１２０で表される塩基配列のプライマーからなるセット、または
（ｃ）配列番号１３７〜配列番号１３８で表される塩基配列のプライマーからなるセット、
（１５）病原体の型または亜型の判定をＬＡＭＰ法で行うためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、上記（１０）ないし（１３）のいずれかに記載のＦ３プライマーの塩基配列の相補配列からなるＢ３プライマーのセット。
（１６）前記亜型がＡ型インフルエンザウイルスＨ５亜型であり、以下の（ａ）〜（ｃ）に示されるいずれかのプライマーセットであることを特徴とする上記（１５）に記載のＢ３プライマーのセット。
（ａ）配列番号８３〜配列番号９２で表される塩基配列のプライマーからなるセット、
（ｂ）配列番号１２９で表される塩基配列のプライマーからなるセット、または
（ｃ）配列番号１４２で表される塩基配列で表される塩基配列のプライマーからなるセット、
（１７）病原体の型または亜型の判定をＬＡＭＰ法で行うためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、以下の（ａ）〜（ｆ）の工程を行い、工程（ｂ）および（ｅ）で決定されるＦＬ領域のコンセンサス配列からなるＦＬプライマーのセット。
（ａ）検査対象遺伝子のセンス配列またはアンチセンス配列であって、上記（４）または（５）に記載のＦ１領域とＦ２領域の間に存在する塩基配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各検査対象遺伝子間で高い相同性を有する領域をＦＬ領域として選択する工程、
（ｂ）各検査対象遺伝子のＦＬ領域の塩基配列同士をアライメントし、アライメントしたＦＬ領域のコンセンサス配列を決定する工程、
（ｃ）該コンセンサス配列と各検査対象遺伝子のＦＬ領域の塩基配列の対応する位置の塩基同士を比較し、検査対象遺伝子のＦＬ領域の塩基配列に含まれるコンセンサス配列の塩基と異なる塩基の数を、検査対象遺伝子毎にカウントする工程、
（ｄ）工程（ｃ）でカウントされた塩基数が一定数以上である検査対象遺伝子を抽出する工程、
（ｅ）工程（ｄ）で抽出した検査対象遺伝子のＦＬ領域の塩基配列同士を再度アライメントし、アライメントしたＦＬ領域の新たなコンセンサス配列を決定する工程、
（ｆ）抽出される検査対象遺伝子がなくなるまで工程（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）を繰り返す工程、
（１８）前記工程（ａ）および／または工程（ｄ）が下記の工程であることを特徴とする上記（１７）に記載のＦＬプライマーのセット。
（ａ）検査対象遺伝子のセンス配列またはアンチセンス配列であって、上記（４）または（５）に記載のＦ１領域とＦ２領域の間に存在する塩基配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上が同一である単一塩基Ｘ、および／または各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上がＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの中から選択されるいずれか２種類または３種類の塩基で構成される混合塩基Ｙを含み、単一塩基Ｘおよび／または混合塩基Ｙが９０％以上を占める連続する塩基配列領域をＦＬ領域として選択する工程、
（ｄ）前記工程（ｃ）でカウントされた塩基数が３以上である検査対象遺伝子を抽出する工程、
（１９）病原体の型または亜型の判定をＬＡＭＰ法で行うためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、検査対象遺伝子のセンス配列またはアンチセンス配列の、上記（４）または（５）に記載のＦ１領域とＦ２領域の間に存在する塩基配列をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上が同一である単一塩基Ｘ、および／または各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上がＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの中から選択されるいずれか２種類または３種類の塩基で構成される混合塩基Ｙを含み、単一塩基Ｘおよび／または混合塩基Ｙが９０％以上を占める連続する塩基配列領域をＦ３領域として選択し、全ての検査対象遺伝子のＦ３領域の塩基配列を網羅するように設計した、単一または複数の混合塩基プライマーからなるＦＬプライマーのセット。
（２０）前記ＦＬ領域の塩基数が１０塩基〜２５塩基であることを特徴とする上記（１７）ないし（１９）のいずれかに記載のＦＬプライマーのセット。
（２１）前記亜型がＡ型インフルエンザウイルスＨ５亜型であり、以下の（ａ）〜（ｃ）に示されるいずれかのプライマーセットであることを特徴とする上記（１７）ないし（２０）のいずれかに記載のＦＬプライマーのセット。
（ａ）配列番号３５〜配列番号４５で表される塩基配列のプライマーからなるセット、
（ｂ）配列番号１２１で表される塩基配列のプライマーからなるセット、または
（ｃ）配列番号１３９〜配列番号１４１で表される塩基配列のプライマーからなるセット、
（２２）上記（１７）ないし（２０）のいずれかに記載のＦＬプライマーの塩基配列の相補配列からなるＢＬプライマーのセット。
（２３）前記亜型がＡ型インフルエンザウイルスＨ５型であり、以下の（ａ）〜（ｃ）に示されるいずれかのプライマーセットであることを特徴とする上記（２２）に記載のＢＬプライマーのセット。
（ａ）配列番号９３〜配列番号１１４で表される塩基配列のプライマーからなるセット、
（ｂ）配列番号１３０で表される塩基配列のプライマーからなるセット、または
（ｃ）配列番号１４３で表される塩基配列で表される塩基配列のプライマーからなるセット、
（２４）上記（１）に記載のオリゴヌクレオチドプライマーのセットおよび上記（３）に記載のオリゴヌクレオチドプライマーのセットを用いて、試料中の病原体の遺伝子由来の核酸を鋳型として、核酸増幅反応を行い、得られた増幅断片を解析して、試料中の病原体の型または亜型を判定する方法。
（２５）上記（４）ないし（７）のいずれかに記載のＦＩＰプライマーのセットおよび上記（８）または（９）のいずれかに記載のＢＩＰプライマーのセットを用いて、試料中の病原体の遺伝子由来の核酸を鋳型として、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応を行い、得られた増幅断片を解析して、試料中の病原体の型または亜型を判定する方法。
（２６）上記（１０）ないし（１４）のいずれかに記載のＦ３プライーのセットおよび上記（１５）または（１６）に記載のＢ３プライマーのセットをさらに用いて、試料中の病原体の遺伝子由来の核酸を鋳型として、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応を行い、得られた増幅断片を解析して、試料中の病原体の型または亜型を判定することを特徴とする上記（２５）に記載の方法。
（２７）上記（１７）ないし（２１）のいずれかに記載のＦＬプライマーのセットおよび上記（２２）または（２３）に記載のＢＬプライマーのセットをさらに用いて、試料中の病原体の遺伝子由来の核酸を鋳型として、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応を行い、得られた増幅断片を解析して、試料中の病原体の型または亜型を判定することを特徴とする上記（２６）に記載の方法。
（２８）上記（１）もしくは（２）に記載のオリゴヌクレオチドプライマーのセット、上記（３）に記載のオリゴヌクレオチドプライマーのセット、上記（４）ないし（７）のいずれかに記載のＦＩＰプライマーのセット、上記（８）もしくは（９）に記載のＢＩＰプライマーのセット、上記（１０）ないし（１４）のいずれかに記載のＦ３プライマーのセット、上記（１５）もしくは（１６）に記載のＢ３プライマーのセット、上記（１７）ないし（２１）のいずれかに記載のＦＬプライマーのセット、または、上記（２２）もしくは（２３）に記載のＢＬプライマーのセットの少なくともいずれかのプライマーのセットを含む、病原体の型または亜型を判定するためのキット。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、所望のウイルス、細菌、寄生虫等の病原体の型または亜型を判定するためのプライマーのセットを、該型または亜型毎にその分類基準に従って設計することが可能になる。例えば、該プライマーのセットを、インフルエンザウイルスの任意のヘマグルチニン遺伝子（ＨＡ遺伝子）やノイラミニダーゼ遺伝子（ＮＡ遺伝子）の亜型毎に設計し、使用することにより、検査対象となる亜型に属す遺伝子を、迅速かつ簡便に、漏れなく判定することが可能となる。
【００１１】
また、本発明にかかるプライマーのセット、特に、ＬＡＭＰ法用に設計されたプライマーを使用することにより、検査対象のウイルス、細菌、寄生虫等の病原体の型または亜型を、迅速かつ簡便に、漏れなく判定することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、第１の実施形態のフォワードプライマー設定領域（または、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、ＦＬ領域）の選定方法を示した模式図である。
【図２】図２は、第１の実施形態のフォワードプライマー設定領域（または、Ｆ３、ＦＬ領域）に対するプライマーの設計過程を模式的に示した図である。
【図３】図３は、第１の実施形態のフォワードプライマーと第２の実施形態のリバースプライマーのプライマー設定領域（図中の「プライマー領域」）を、ＰＣＲ法およびリアルタイムＰＣＲ法を例として説明した図である。
【図４】図４は、ＦＩＰ領域（Ｆ１領域およびＦ２領域）に、ＦＩＰプライマーを設計する過程を模式的に示した図である。
【図５】１１４本のＰプライマーセット（バージョン１）の設定位置を模式的に示した図（Ａ）と遺伝子（インフルエンザウイルスＶ１２４株）配列上にその位置を示した図である（Ｂ）。図中のＦ１ｃおよびＢ１ｃは、各々、Ｆ１およびＢ１の配列の相補鎖の配列（配列領域）を示す。
【図６】１６本のＰＭ１６プライマーセットの設定位置を模式的に示した図（Ａ）と遺伝子（インフルエンザウイルスＶ１２４株）配列上にその位置を示した図である（Ｂ）。図中のＦ１ｃおよびＢ１ｃは、各々、Ｆ１およびＢ１の配列の相補鎖の配列（配列領域）を示す。
【図７】１１４本のＰプライマーセット（バージョン１）の各プライマー設定領域における各塩基の塩基出現率を示した図である。
【図８】図８は本実施例で用いた、Ｈ５亜型の鳥インフルエンザウイルスのＨＡ遺伝子について、１５株のＰＣＲテンペレートの塩基配列をアライメントした図である。
【図９】図９は塩基ミスマッチ解析に使用したプライマーの番号とその組み合わせを示した図である。
【図１０】図１０は塩基ミスマッチ解析で使用したプライマーの番号とその塩基配列を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の方法は、遺伝学的に分類されている遺伝子（例えば、ウイルス、細菌、寄生虫等の病原体の型または亜型の型別に関係する遺伝子、より具体的にはインフルエンザウイルスのＨＡ遺伝子やＮＡ遺伝子など）の型別に利用することができる。例えば、Ａ型、Ｂ型またはＣ型インフルエンザウイルスのＨＡ亜型およびＮＡ亜型、特に、Ａ型インフルエンザウイルスのＨ５亜型、Ｈ７亜型などについて、好適に実施することができる。
本発明は、核酸増幅法、例えば、ＬＡＭＰ（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法と称される核酸増幅法などを使用して、ウイルス、細菌、寄生虫等の病原体、特にインフルエンザウイルスの亜型を判定するためのプライマーのセットを提供するものである。また、ＬＡＭＰ法に限定されることなく、ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、ハイブリダーゼーション法など、広く遺伝子検査に用いるプライマーやプローブプライマー（本発明の実施形態に開示されるプライマーはプローブプライマーとしても利用することができる）の設計に利用することができる。
また、本発明に係る実施例においては、ＬＡＭＰ法で遺伝子を検出する際に、何個の塩基ミスマッチ（使用するプライマーの塩基配列と増幅対象である遺伝子側のプライマー結合領域の塩基配列との間におけるミスマッチ）までならば、遺伝子検出が可能かについて、プライマーの領域毎に検討し、その成績を実施例に示した（詳細については、実施例を参照のこと）。
その成績を参考にすれば、本発明のプライマーを用いることで、鳥インフルエンザウイルスのＨＡ、ＮＡ遺伝子に限定されることなく、それ以外のウイルス、細菌、寄生虫等の病原体の多様な遺伝子や、宿主の同一遺伝子ファミリーに属す遺伝子など、多様な遺伝子を、ＬＡＭＰ法等の遺伝子検査によって、正確に型別する際に応用できることが理解できる。
ＬＡＭＰ法は、標的遺伝子（検査対象となる遺伝子）の６つの領域に対して４種類のプライマーを、または、８つの領域に対して６種類のプライマーを設計し、鎖置換型のＤＮＡポリメラーゼにより、恒温条件にて、検査対象遺伝子を増幅する方法である（特許文献１および特許文献２などを参照のこと）。例えば、４種類のプライマーを使用してＬＡＭＰ法を行う場合、検査対象遺伝子のセンス配列（アミノ酸をコードするセンス鎖の塩基配列）の５’側から、Ｆ３領域、Ｆ２領域およびＦ１領域を選択し、これらの領域の塩基配列を有する少なくとも２種類のプライマーのセットと、増幅対象の遺伝子のアンチセンス配列の５’側から、Ｂ３領域、Ｂ２領域およびＢ１領域を選択し、これらの領域の塩基配列を有する少なくとも２種類のプライマーのセットを対として、標的領域の増幅を行う。
また、場合によっては、Ｆ１領域とＦ２領域の間に存在する塩基配列の相補鎖の塩基配列を有するプライマー（ＦＬプライマー）と、Ｂ１領域とＢ２領域の間に存在する塩基配列の相補鎖の塩基配列を有するプライマー（ＢＬプライマー）を、上記４種類のプライマーにさらに加えた、６種類のプライマーでＬＡＭＰ法を実施してもよい。
【００１４】
本発明の第１の実施形態は、遺伝子増幅検査（または核酸増幅検査）（例えば、ＬＡＭＰ法、ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法など）および核酸検出法（ＤＮＡチップ法、ＤＮＡハイブリダイゼーション法など）を用いて、試料中のウイルス、細菌、寄生虫等の病原体の遺伝子（ＲＮＡまたはＤＮＡ）の型または亜型判定用オリゴヌクレオチドプライマーであって、以下の（ａ）〜（ｆ）の工程を行い、工程（ｂ）および（ｅ）で決定されるフォワードプライマー設定領域のコンセンサス配列からなるフォワードプライマーのセットである。
（ａ）検査対象遺伝子のセンス配列同士またはアンチセンス配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各検査対象遺伝子間で高い相同性を有する領域をフォワードプライマー設定領域として選択する工程、
（ｂ）フォワードプライマー設定領域について、コンセンサス配列を決定する工程、
（ｃ）該コンセンサス配列と各検査対象遺伝子のフォワードプライマー領域の塩基配列の対応する位置の塩基同士を比較し、検査対象遺伝子のフォワードプライマー設定領域の塩基配列の中で、コンセンサス配列の塩基とは異なる塩基の数を、検査対象遺伝子毎にカウントする工程、
（ｄ）工程（ｃ）でカウントされた塩基数が一定数以上である検査対象遺伝子を抽出する工程、
（ｅ）工程（ｄ）で抽出された検査対象遺伝子のフォワードプライマー設定領域の塩基配列同士を再度アライメントし、その設定領域について新たなコンセンサス配列を決定する工程、
（ｆ）抽出される検査対象遺伝子がなくなるまで工程（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）を繰り返す工程、
【００１５】
まず、本明細書における「試料」とは、インフルエンザウイルスなどのウイルスの他、細菌、寄生虫等の病原体に感染している可能性がある動物（ヒトまたは非ヒト動物）の生体または排泄物から取得されたものを用いることができ、特に限定はしないが、例えば、血液試料、組織試料、より具体的には、喀痰、鼻汁、血液、唾液、血清、血漿、排泄物（尿、便など）などの他、組織等を洗浄した液（例えば、うがい液、鼻腔洗浄液など）などを挙げることができる。
また、「検査対象遺伝子」とは、試料中のウイルスが、例えば、インフルエンザウイルスのＨＡ５亜型に属するものかどうかを判定する場合には、インフルエンザウイルスのＨ５亜型に属する全てのヘマグルチニン遺伝子のことである。つまり、試料中のウイルスが属すると予測されるウイルスの型または亜型の分類基準となる遺伝子であって、該型または亜型に属する全ての遺伝子のことである。ここで、「検査対象遺伝子」とは、特に限定はしないが、例えば、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型のインフルエンザウイルスの任意のＨＡ亜型またはＮＡ亜型に属する全てのヘマグルチニン遺伝子（ＨＡ遺伝子）もしくはノイラミニダーゼ遺伝子（ＮＡ遺伝子）などを例示することができる。
また、センス配列とは、データベースなどで、翻訳フレームとして登録されている鎖の遺伝子配列のことを指し、アンチセンス配列とは、センス配列の相補鎖の塩基配列を指す。
検査対象遺伝子の塩基配列情報は、公知のデータベースや論文等から入手することができる。例えば、検査対象のウイルスが、Ａ型、Ｂ型またはＣ型のインフルエンザウイルスである場合、これらのウイルスの任意のＨＡ亜型に属する全てのウイルスのヘマグルチニン遺伝子の塩基配列情報、または任意のＮＡ亜型に属する全てのウイルスのノイラミニダーゼ遺伝子の塩基配列情報をデータベース（例えば、Influenza Sequence Database(http://www.flu.lanl.gov)など）または論文等から入手することができる。
【００１６】
本発明の第１の実施形態の工程（ａ）は、検査対象遺伝子のセンス配列同士またはアンチセンス配列同士のアライメントを行い、相同性が高い塩基が集積する領域をフォワードプライマー設定領域として選択する工程である。アライメント（複数の塩基配列を整列させること）するには、公開されているアライメントソフトウェア（例えば、CLUSTAW(http://www.ddbj.nig.ac.jp/)など）や市販のソフトウェア（例えば、ジェネティクス社製など）等を利用して行ってもよい。なお、アライメントした際にギャップが含まれていてもよい。
フォワードプライマー設定領域の配列の長さは、ＬＡＭＰ法やＰＣＲ法で核酸を増幅するときに使用するプライマーが通常備えている長さであればよく、選択した領域に含まれるＧＣ含量などを考慮して決定すればよい。フォワードプライマー設定領域の塩基配列の長さは、特に限定はしないが、例えば、１０〜２５塩基程度、好ましくは、１５〜２０塩基程度であればよい。
【００１７】
ここで、「高い相同性を有する領域」とは、特に限定はしないが、例えば、「検査対象遺伝子のセンス配列同士またはアンチセンス配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上が同一である単一塩基Ｘ、および／または各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上がＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの中から選択されるいずれか２種類または３種類の塩基で構成される混合塩基Ｙを含み、単一塩基Ｘおよび／または混合塩基Ｙが９０％以上を占める連続する塩基配列領域」を例示することができる。
図１には、上記例示した「高い相同性を有する領域」をフォワードプライマー設定領域として選択する方法を模式的に示した。図１では、任意の亜型に属するウイルス遺伝子が２２０３遺伝子存在すると仮定した。工程（ａ）の「高い相同性を有する領域」は、例えば、検査対象遺伝子のセンス配列同士またはアンチセンス配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上、好ましくは、９０％以上、より好ましくは９８％以上が同一である単一塩基Ｘ、および／または単一の塩基では出現率が低いが、上位２種類（場合によっては、上位３種類）の塩基の出現率の和が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９８％以上となる混合塩基Ｙから構成され、これらが９０％以上、望ましくは１００％となる、１０〜３０個ほどの塩基が連続する領域のことである。
【００１８】
まず、プライマーを作成する対象となる型または亜型に含まれる遺伝子センス配列（検査対象遺伝子のセンス配列）を全てアライメントし、対応する位置（図１では、位置１、位置２・・・のように示す）の塩基を比較して対応する全ての塩基位置について、Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｃの出現率を求める。
図１の位置１、位置４、位置５および位置１４に出現する塩基は、各々の位置において全て同一であり、「対応する位置の塩基の８０％以上が同一」であり、「単一塩基Ｘ」は、各々、Ａ（位置１）、Ｇ（位置４）、Ｇ（位置５）およびＡ（位置１４）である。また、位置２、位置７〜位置１１、位置１３および位置１５については、いずれの位置においても最も多く出現する塩基が９７％以上の割合を占めているため、「対応する位置の塩基の８０％以上が同一」となり、「単一塩基Ｘ」は、各々、Ｃ（位置２）、Ｃ（位置７）、Ｔ（位置８）、Ｃ（位置９）、Ａ（位置１０）、Ｇ（位置１１）、Ａ（位置１３）、Ａ（位置１５）、Ｔ（位置１１）である。さらに、位置３、位置６、位置１２に出現する塩基ついては、出現頻度の高い上位２種類の塩基（位置３ではＴとＣ、位置６ではＡとＧ、位置１２ではＡとＧ）の出現率の和が、全塩基数（図１の場合は、２２０３個）の９０％以上を占めるので、「対応する位置の塩基の８０％以上がＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの中から選択されるいずれか２種類または３種類の塩基」であり、「混合塩基Ｙ」は、各々、Ｙ（位置３）、Ｒ（位置６）、Ｒ（位置１２）である。
なお、本明細書において混合塩基の表記は、ＩＵＰＡＣの表記法に基づく。
以上のように、上記「高い相同性を有する領域」をフォワードプライマー設定領域として選択することができる。
なお、後述のＦ１、Ｆ２、Ｆ３およびＦＬ領域における「高い相同性を有する領域」も同様に選択することができる。
【００１９】
本発明の第１の実施形態の工程（ｂ）は、各検査対象遺伝子のフォワードプライマー設定領域の塩基配列同士をアライメントし、アライメントしたフォワードプライマー設定領域のコンセンサス配列を決定する工程である。
ここで、コンセンサス配列とは、母集団を構成する検査対象遺伝子をアライメントし、それぞれの塩基位置において出現率が最も高い塩基からなる配列のことである。具体的には、アライメントさせた配列の全ての塩基位置において、４種類の塩基の出現率をそれぞれ求め、塩基出現率が最も高い塩基だけを順番に並べたものがコンセンサス配列である。コンセンサス配列を構成する各塩基の出現率は、「コンセンサス配列の塩基と同一の塩基を持つ検査対象遺伝子数/母集団を構成する全ての検査対象遺伝子数（％）」で示される。塩基出現率が高ければ保存性が高いと判定され、低ければ保存性が低いと判定される。母集団を構成する検査対象遺伝子をより多く検出するには、保存性の高い塩基から構成される領域にプライマーを設計する必要がある。また、母集団を構成する検査対象遺伝子が変われば、コンセンサス配列も異なるため、コンセンサス配列を基に設計するプライマーの塩基配列も異なることになる。
【００２０】
本発明の第１の実施形態の工程（ｃ）は、工程（ｂ）で決定したコンセンサス配列と各検査対象遺伝子のフォワードプライマー設定領域の塩基配列の対応する位置の塩基同士を比較し、検査対象遺伝子のフォワードプライマー設定領域の塩基配列に含まれるコンセンサス配列の塩基とは異なる塩基の数を、検査対象遺伝子毎にカウントする工程である。
図２Ａを参照しながら説明する。例えば、遺伝子８の領域においては、左から（５’側から）３番目の塩基がコンセンサス配列の塩基とは異なるため、コンセンサス配列の塩基とは異なる塩基の数は「１」である。また、遺伝子１１の領域においては、左から３番目、６番目、１５番目の塩基がコンセンサス配列の塩基とは異なるため、コンセンサス配列の塩基とは異なる塩基の数は「３」である。
なお、実施例においては、「コンセンサス配列の塩基とは異なる塩基の数」を「塩基ミスマッチ数」と記載する（以下、同じ）。
【００２１】
本発明の第１の実施形態の工程（ｄ）は、工程（ｃ）でカウントされた塩基数が一定数以上である検査対象遺伝子を抽出する工程である。
ここで、「一定数」とは、コンセンサス配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーによって、遺伝子増幅ができないと判断される塩基ミスマッチ数の限界値のことで、使用するプライマーの長さや、Ｇ、Ｃ含量によっても異なる数値であり、当業者であれば、予備的な実験等により容易に決定することができる数値である。
【００２２】
塩基ミスマッチの限界値は、第１の実施形態のフォワードプライマーと後述の第２の実施形態のリバースプライマーを１組とし、次の様にして求めることができる。
まず、検査対象遺伝子の中から、検査対象遺伝子を一つ選択する。これをテンペレートにして、上述の工程（ａ）で決定されるフォワードプライマー領域と、第２の実施形態の工程（ａ）で決定されるリバースプライマー領域に、一定数の塩基ミスマッチ（例えば、２０塩基のプライマーあたり、０〜３個程度）を導入したプライマーを種々、設計する。それらのプライマーの様々なペアについて、ＰＣＲ等による遺伝子増幅の可否を調べる。これによって、増幅を許容するプライマーまたはプライマーペアあたり、遺伝子増幅を許容できる塩基ミスマッチ数の上限を明らかにできる。本明細書の実施例、材料および実験方法の「７．遺伝子増幅に及ぼす塩基ミスマッチの影響」、「８．塩基ミスマッチ解析」、並びに、結果の「５．遺伝子増幅に及ぼす塩基ミスマッチの影響」、「６．GenBankに登録されている２２１１個のＨ５−ＨＡ遺伝子の増幅推定」の箇所も併せて参照のこと。
「一定数」、すなわち、塩基ミスマッチの限界は、検査対象遺伝子によって異なるが、例えば、検査  対象遺伝子が、例えば、鳥インフルエンザウイルスの任意のＨＡ５亜型に属するＨＡ遺伝子の場合には、１〜５の整数、好ましくは、２〜４の整数、より好ましくは、３である。
図２において一定数が「３」の場合には、抽出される遺伝子は、遺伝子１１、遺伝子１９および遺伝子２０となる（図２Ｂ）。
【００２３】
本発明の第１の実施形態の工程（ｅ）は、工程（ｄ）で抽出した検査対象遺伝子のフォワードプライマー設定領域の塩基配列同士を再度アライメントし、アライメントしたフォワードプライマー設定領域に新たなコンセンサス配列を決定する工程である（図２Ｂ）。
そして、工程（ｆ）において、工程（ｅ）で決定した新たなコンセンサス配列に基づいて、工程（ｃ）、工程（ｄ）および工程（ｅ）を行う。この工程（ｃ）〜（ｅ）を抽出される検査対象遺伝子がなくなるまで繰り返す。図２Ｃでは、２回目に抽出した検査対象遺伝子が遺伝子１９のみとなり（従って、この段階におけるコンセンサス配列は遺伝子１９の塩基配列となる）、さらに抽出する遺伝子は存在しないので、フォワードプライマー設定領域のコンセンサス配列が全て決定されることになる。
決定されたフォワードプライマー設定領域のコンセンサス配列の５’側から３’側に向かう配列をフォワードプライマーの配列として決定する。
なお、各実施形態の「セット」とは、最初に決定されるコンセンサス配列およびその後の繰り返し工程で得られるコンセンサス配列（例えば、第１の実施形態であれば、工程（ｂ）および工程（ｃ）〜（ｅ）を繰り返し行って得られる工程（ｅ）のコンセンサス配列）から構成されるプライマーの集団のことである（他の実施形態においても同じ）。
【００２４】
本発明の第２の実施形態は、第１の実施形態のフォワードプライマーの塩基配列の相補配列からなるリバースプライマーである。第１の実施形態のフォワードプライマーと第２の実施形態のリバースプライマーを１組として、核酸増幅法に使用することができる。ただし、第１の実施形態で選択したフォワードプライマー設定領域と第２の実施形態で選択したリバースプライマー設定領域は、増幅したい領域を挟んで５’側に第１の実施形態のフォワードプライマー設定領域が、３’側に第２の実施形態のリバースプライマー設定領域が選択される必要がある。ＰＣＲ法およびリアルタイムＰＣＲ法を例にして、第１の実施形態のフォワードプライマーおよび第２の実施形態のリバースプライマーのプライマー設定領域（図中の「プライマー領域」）を図３に例示したので参照のこと。
【００２５】
リバースプライマーを作製するために第１の実施形態を行う場合には、第１の実施形態に記載した「フォワードプライマー設定領域」を、「リバースプライマー設定領域」と読み替えるものとする。
すなわち、本発明の第２の実施形態は、遺伝子増幅検査（または核酸増幅検査）（例えば、ＬＡＭＰ法、ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法など）および核酸検出法（DNAチップ法、DNAハイブリダイゼーション法など）を用いて、試料中のウイルス、細菌、寄生虫等の病原体の遺伝子（ＲＮＡまたはＤＮＡ）の型または亜型の判定用オリゴヌクレオチドプライマーであって、以下の（ａ）〜（ｆ）の工程を行い、工程（ｂ）および（ｅ）で決定されるリバースプライマー設定領域のコンセンサス配列の相補配列からなるリバースプライマーのセットである。
（ａ）検査対象遺伝子のセンス配列同士またはアンチセンス配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各検査対象遺伝子間で高い相同性を有する領域をリバースプライマー設定領域として選択する工程、
（ｂ）リバースプライマー設定領域について、コンセンサス配列を決定する工程、
（ｃ）該コンセンサス配列と各検査対象遺伝子のリバースプライマー領域の塩基配列の対応する位置の塩基同士を比較し、検査対象遺伝子のリバースプライマー設定領域の塩基配列の中で、コンセンサス配列の塩基とは異なる塩基の数を、検査対象遺伝子毎にカウントする工程、
（ｄ）工程（ｃ）でカウントされた塩基数が一定数以上である検査対象遺伝子を抽出する工程、
（ｅ）工程（ｄ）で抽出された検査対象遺伝子のリバースプライマー設定領域の塩基配列同士を再度アライメントし、その設定領域について新たなコンセンサス配列を決定する工程、
（ｆ）抽出される検査対象遺伝子がなくなるまで工程（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）を繰り返す工程、
工程（ｄ）の「一定数」については、第１の実施形態の工程（ｄ）の説明箇所を参照のこと。
【００２６】
なお、本発明の第１の実施形態は、リアルタイムＰＣＲ法に使用されるプローブプライマーの作製にも用いることができる。すなわち、第１の実施形態における「オリゴヌクレオチドプライマー」と「フォワードプライマー」または第２の実施形態における「リバースプライマー」を「プローブプライマー」に置き換えて、実施することで、リアルタイムＰＣＲ法に使用されるプローブプライマーの作製が可能である。
【００２７】
本発明の第３の実施形態は、ＬＡＭＰ法を用いて、試料中のウイルス、細菌、寄生虫等の病原体の型または亜型を判定するためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、以下の（ａ）〜（ｇ）の工程を行い、工程（ｃ）および（ｆ）で決定されるＦ２領域およびＦ１領域のコンセンサス配列のペアを選択し、Ｆ２領域の塩基配列を３’末端側に、Ｆ１領域の塩基配列の相補的配列を５’末端側に有する塩基配列からなるＦＩＰプライマーのセットである。
（ａ）検査対象遺伝子のセンス配列同士またはアンチセンス配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各配列間で高い相同性を有する領域をＦ２領域として選択する工程、
（ｂ）工程（ａ）で選択されるＦ２領域の３’末端より３’側下流に存在する領域であって、前記Ｆ２領域と同じ要件を満たす領域をＦ１領域として選択する工程、
（ｃ）各検査対象遺伝子のＦ１領域の塩基配列同士およびＦ２領域の塩基配列同士をアライメントし、アライメントしたＦ１領域の塩基配列およびＦ２領域の塩基配列の中から、各々の領域のコンセンサス配列を決定し、それらをペアとして選択する工程。
（ｄ）Ｆ１領域のコンセンサス配列と各検査対象遺伝子のＦ１領域の塩基配列の対応する位置の塩基同士およびＦ２領域のコンセンサス配列と各検査対象遺伝子のＦ２領域の塩基配列の対応する位置の塩基同士を比較し、各検査対象遺伝子のＦ１領域およびＦ２領域の塩基配列に含まれる、各領域のコンセンサス配列の塩基と異なる塩基の数が、各領域のコンセンサスの塩基配列とは異なる塩基の数を、検査対象遺伝子毎にカウントする工程、
（ｅ）工程（ｄ）でカウントされた塩基数が一定数以上である検査対象遺伝子を抽出する工程、
（ｆ）工程（ｅ）で抽出した検査対象遺伝子のＦ１領域の塩基配列同士およびＦ２領域の塩基配列同士を再度アライメントし、アライメントしたＦ１領域の塩基配列およびＦ２領域の塩基配列の中から、各々の領域の新たなコンセンサス配列を決定し、それらをペアとして選択する工程、
（ｇ）抽出される検査対象遺伝子がなくなるまで、工程（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）を繰り返す工程、
【００２８】
本発明の第３の実施形態は、ウイルス、細菌、寄生虫等の病原体の型または亜型の判定をＬＡＭＰ法で行うためのオリゴヌクレオチドプライマーであるＦＩＰプライマーのセットに関するものである。
第３の実施形態の工程（ａ）は、検査対象遺伝子のセンス配列同士またはアンチセンス配列同士のアライメントを行い、相同性の高い領域をＦ２領域として選択する工程であり、Ｆ２領域の配列の長さは、ＬＡＭＰ法で核酸を増幅するときに使用するプライマーが通常備えている長さであればよく、選択した領域に含まれるＧＣ含量などを考慮して決定すればよい。Ｆ２領域の配列の長さは、特に限定はしないが、例えば、１０〜２５塩基程度、好ましくは、１５〜２０塩基程度であればよい。
検査対象遺伝子の情報の入手およびアライメントについては、第１の実施形態の工程（ａ）に関する説明を参照のこと。
【００２９】
第３の実施形態の工程（ａ）の「高い相同性を有する領域」とは、特に限定はしないが、例えば、「検査対象遺伝子のセンス配列同士またはアンチセンス配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上が同一である単一塩基Ｘ、および／または各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上がＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの中から選択されるいずれか２種類または３種類の塩基で構成される混合塩基Ｙから構成される連続する塩基配列領域」を例示することができる。
図１には、上記例示した「高い相同性を有する領域」をＦ２領域として選択する流れを模式的に示した。なお、詳細は、第１の実施形態の工程（ａ）の部分を参照のこと。
Ｆ２領域（およびＦ１領域（後述））は、全ての対応する塩基位置において、塩基出現率が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９８％以上となる条件を満たす単一塩基Ｘ、および／または単一の塩基では出現率が低いが、上位２種類（場合によっては、上位３種類）の塩基の出現率の和が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９８％以上となる混合塩基Ｙから構成される領域で、１０〜３０個ほどの塩基が連続する領域である。
以上のようにして、Ｆ２領域を選択することができる。
【００３０】
本発明の第３の実施形態の工程（ｂ）では、Ｆ１領域を選択する工程で、工程（ａ）で選択されるＦ２領域の３’末端より３’側下流の領域であって、前記Ｆ２領域と同じ要件を満たす領域をＦ１領域として選択する工程である。
「Ｆ２領域の３’末端より３’側下流の領域」を選択する場合、Ｆ２領域の３’末端からＦ１領域の５’末端までの距離は、特に限定はしないが、この部分は、ＬＡＭＰ法による核酸の増幅が行われるときに、ループを形成する部分になるため、例えば、Ｆ２領域の５’末端の塩基とＦ１領域の５’末端の塩基との間に、３０〜７０塩基程度、好ましくは、４０〜６０塩基程度存在するとよい。Ｆ１領域の配列の長さは、Ｆ２領域と同様、選択した領域に含まれるＧＣ含量などを考慮して決定すればよく、例えば、１０〜２５塩基程度、好ましくは、１５〜２０塩基程度である。
Ｆ１領域は、さらに、Ｆ２領域の選択を行う場合に満たすべき要件を満たす必要がある。すなわち、Ｆ１領域とは、Ｆ２領域の３’末端より３’側下流の領域であるいう要件に加えて、「検査対象遺伝子のセンス配列同士またはアンチセンス配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各配列間で高い相同性を有する領域」という要件を満たす必要がある。ここで、「高い相同性を有する領域」とは、例えば、限定はしないが、「検査対象遺伝子のセンス配列同士またはアンチセンス配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上が同一である単一塩基Ｘ、および／または各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上がＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの中から選択されるいずれか２種類または３種類の塩基で構成される混合塩基Ｙから構成される連続する塩基配列領域」のことである。
【００３１】
本発明の第３の実施形態の工程（ｃ）は、各検査対象遺伝子のＦ１領域の塩基配列同士およびＦ２領域の塩基配列同士をアライメントし、アライメントしたＦ１領域の塩基配列およびＦ２領域の塩基配列の中から、各々の領域のコンセンサス配列（第１の実施形態の工程（ｂ）の説明箇所を参照のこと）を決定しペアとして選択する工程である。ここで、「ペアとして選択する」のは、工程（ｃ）で決定したＦ１領域のコンセンサス配列とＦ２領域のコンセンサス配列を１組のコンセンサス配列として選択し、この１組のＦ１領域とＦ２領域の塩基配列を最終的にはＦＩＰプライマーの塩基配列とするためである。
【００３２】
本発明の第３の実施形態の工程（ｄ）は、Ｆ１領域のコンセンサス配列と各検査対象遺伝子のＦ１領域の塩基配列、および、Ｆ２領域のコンセンサス配列と各検査対象遺伝子のＦ２領域の塩基配列の対応する塩基同士を比較し、Ｆ１領域およびＦ２領域の塩基配列に含まれるコンセンサス配列の塩基とは異なる塩基の数を、検査対象遺伝子のセンス配列毎にカウントする工程である。ここで、「Ｆ１領域およびＦ２領域の塩基配列に含まれるコンセンサス配列の塩基と異なる塩基の数」とは、Ｆ１領域においてコンセンサス配列の塩基と異なる塩基の数と、Ｆ２領域においてコンセンサス配列の塩基と異なる塩基の数を合計した数のことである。
図４を参照しながら説明する。例えば、遺伝子１１のＦ２領域においては、左から（５’側から）３番目、６番目、１５番目の塩基がコンセンサス配列の塩基とは異なるため、コンセンサス配列の塩基とは異なる塩基の数は「３」となり、Ｆ１領域においては、コンセンサス配列の塩基とは異なる塩基の数は「０」である。遺伝子１２のＦ２領域においては、左から６番目の塩基がコンセンサス配列の塩基とは異なるため、コンセンサス配列の塩基とは異なる塩基の数は「１」となり、Ｆ１領域においては、左から６番目、１２番目の塩基がコンセンサス配列の塩基とは異なるため、コンセンサス配列の塩基とは異なる塩基の数は「２」となる。また、遺伝子１４のＦ２領域においては、左から６番目、１２番目の塩基がコンセンサス配列の塩基とは異なるため、コンセンサス配列の塩基とは異なる塩基の数は「２」となり、Ｆ１領域においては、左から６番目、１５番目の塩基がコンセンサス配列の塩基とは異なるため、コンセンサス配列の塩基とは異なる塩基の数は「２」となる。
【００３３】
本発明の第３の実施形態の工程（ｅ）は、工程（ｄ）でカウントされた塩基数が一定数以上である検査対象遺伝子を抽出する工程である。ここで、「一定数」とは、コンセンサス配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーによって、遺伝子増幅ができないと判断される塩基ミスマッチ数の限界値のことで、使用するプライマーの長さや、Ｇ、Ｃ含量によっても異なる数値である。
【００３４】
遺伝子増幅を許容する塩基ミスマッチ数の限界は、塩基ミスマッチを導入したプライマーを組合せた、様々なプライマーセットを用いて、ある１つの検査対象遺伝子の増幅の可否をＬＡＭＰ法で総当り的に調べれば、明らかにすることができる。用いるプライマーとしては、その標的遺伝子と塩基配列が完全に一致する６本のプライマーと、それらのプライマーに、標的遺伝子に対して一定数の塩基ミスマッチが生ずるように設計した変異プライマーである。
６本のプライマーの中で、第３の実施形態のＦＩＰプライマーと後述の第４の実施形態のＢＩＰプライマーは、位置的に左右が逆であっても、増幅に果たす役割は同じと考えられる。同様に、後述の第５の実施形態のＦ３プライマーと後述の第６の実施形態のＢ３プライマー、また後述の第７の実施形態のＦＬプライマーと後述の第８の実施形態のＢＬプライマーも、遺伝子増幅において果たす役割は同じと考えられる。この点を考慮した上で、塩基ミスマッチ数の限界を次の様にして求めることができる。
まず、第３の実施形態で選択されるＦ１およびＦ２領域、第４の実施形態で選択されるＢ１およびＢ２領域、第５の実施形態で選択されるＦ３領域、第６の実施形態で選択されるＢ３領域、第７の実施形態で選択されるＦＬ領域および第８の実施形態で選択されるＢＬ領域の各領域に結合するプライマー配列を、検査対象遺伝子の中から１つ選択した遺伝子について、各々設計する。また、ここで決定されるプライマーの塩基配列に、検査対象遺伝子の塩基配列とは異なる塩基（例えば、２０塩基あたり、０〜３個程度）を一定数、導入したプライマーから構成されるセットを準備する。この際に、ＦＩＰとＢＩＰ、Ｆ３とＢ３、ＦＬとＢＬが左右対称であることを踏まえて、再現性がある結論が得らえるように、プライマー領域当たりの塩基ミスマッチ数を左右対称にする。こうして組み合わせたプライマーセットを用いて、ＬＡＭＰ法による検査対象遺伝子の増幅を調べる。その結果、増幅できたプライマーセットの各領域に含まれる変異ミスマッチ数と、増幅できなかったプライマーセットの各領域に含まれる変異ミスマッチ数を分析して、各プライマー領域当たりの塩基ミスマッチの限界値を決定することができる。（なお、本明細書の実施例、材料および実験方法の「７．遺伝子増幅に及ぼす塩基ミスマッチの影響」、「８．塩基ミスマッチ解析」、並びに、結果の「５．遺伝子増幅に及ぼす塩基ミスマッチの影響」、「６．GenBankに登録されている２２１１個のＨ５−ＨＡ遺伝子の増幅推定」の箇所も併せて参照のこと。）
「一定数」、すなわち、プライマー領域当たりの塩基ミスマッチ数の限界値は、原則としてどの領域でも同じと考えられる。もっとも、ＦＩＰとＢＩＰは、Ｆ３、Ｂ３、ＦＬ、ＢＬと比べて２倍程度の長さがあるので、プライマー当たりの塩基ミスマッチ数は２倍になるが、プライマーとテンペレートの結合は、原則として、プライマー領域当たりの塩基ミスマッチ数に規定される。したがって、これらのことを踏まえて、ＦＩＰプライマー（ＢＩＰも同様）を設計する際には、合計の塩基ミスマッチ数と、塩基ミスマッチがＦ１（Ｂ１）領域またはＦ２（Ｂ２）領域のいずれか一方に偏らないように配慮することも重要である。あるいは、それぞれの領域に全て塩基ミスマッチがある場合と、一部の領域に塩基ミスマッチがある場合では、遺伝子増幅の難易では異なる。そこで、８領域の合計塩基ミスマッチ数を踏まえて、総合的に増幅を推定する必要がある。同様に、Ｆ１領域（Ｂ１領域も同じ）が塩基ミスマッチによって弱く結合しているところに、Ｆ１領域にある塩基ミスマッチによって、Ｆ１領域がさらに弱く結合するとすれば、単独領域からなるＦ３、ＦＬ（Ｂ３、ＢＬも同じ）プライマーに比べて、遺伝子増幅はより困難になると考えらえる。これらのことを踏まえて、プライマー領域当たりの塩基ミスマッチ数の限界値と、全てのプライマー領域の合計ミスマッチ数を実験によって明らかにすることができる。また、実験の再現性が得らえるように、左右対称性を踏まえて、様々なプライマーの組合せについて検討し、塩基ミスマッチ数の限界値を明らかにすることができる。
【００３５】
工程（ｅ）を、「工程（ｄ）でカウントされた塩基数が４以上である検査対象遺伝子、および、カウントされた塩基の数が３であって、それがＦ１領域またはＦ２領域のいずれかに偏っている検査対象遺伝子を抽出する工程」として実施する場合について、図４を参照しながら説明をする。
例えば、遺伝子１４では、コンセンサス配列と異なる塩基の数はＦ２領域で「２」で、Ｆ１領域では「２」であることから、「Ｆ１領域および他のＦ２領域の塩基配列に含まれるコンセンサス配列の塩基と異なる塩基の数」は、「４」となる。従って、遺伝子１４のＦ１領域とＦ２領域は工程（ｅ）において抽出の対象となる。
また、遺伝子１１のＦ２領域では、コンセンサス配列とは異なる塩基の数は「３」であり、Ｆ１領域については「０」であることから、「Ｆ１領域および他のＦ２領域の塩基配列に含まれるコンセンサス配列の塩基とは異なる塩基の数」は、「３」となる。ここで、コンセンサス配列と異なる塩基が、Ｆ１またはＦ２領域に偏っているかどうかを確認すると、コンセンサス配列と異なる塩基は、Ｆ１領域に偏っている。従って、遺伝子１１のＦ１領域とＦ２領域も工程（ｅ）において抽出の対象となる。
次に、遺伝子１２の遺伝子のＦ２領域では、コンセンサス配列と異なる塩基の数は「１個」であり、Ｆ１領域については「２個」であることから、「Ｆ１領域および他のＦ２領域の塩基配列に含まれるコンセンサス配列の塩基とは異なる塩基の数」は、「３個」となる。しかし、コンセンサス配列とは異なる塩基がＦ１領域とＦ２領域のいずれか一方に偏らないことから、遺伝子１２のＦ１領域とＦ２領域は抽出の対象とはならない（図４Ａを参照）。
【００３６】
本発明の第３の実施形態の工程（ｆ）は、工程（ｅ）で抽出した検査対象遺伝子のＦ１領域の塩基配列同士およびＦ２領域の塩基配列同士を再度アライメントし、アライメントしたＦ１領域の塩基配列およびＦ２領域の塩基配列の中から、各々の領域の新たなコンセンサス配列を決定し、それらをペアとして選択する工程である。
そして、工程（ｇ）において、工程（ｆ）で決定した新たなコンセンサス配列に基づいて、工程（ｄ）、工程（ｅ）および工程（ｆ）を行い、抽出される検査対象遺伝子がなくなるまで、工程（ｄ）〜（ｆ）を繰り返す。
以上の工程を行った後、決定されたＦ１領域とＦ２領域のコンセンサス配列のペアを全て選択し、各コンセンサス配列のペアにおいて、Ｆ２領域の塩基配列を３’末端側に、Ｆ１領域の相補鎖の塩基配列（Ｆ１ｃ配列とする）を５’末端側に有する塩基配列をＦＩＰプライマーの塩基配列として決定する。
【００３７】
本発明の第３の実施形態は、上記の工程を経て決定されるＦＩＰプライマーのセットである。本実施形態のＦＩＰプライマーのセットとしては、限定はしないが、例えば、検査対象の試料中に含まれるウイルスが、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５亜型であるかどうかを判定する場合に使用できる配列番号１〜配列番号２０（Ｈ５亜型のユーラシア系統用）で表される配列からなるプライマーの集団、配列番号１１５〜配列番号１１９および配列番号１５６（Ｈ５亜型のユーラシア系統およびアメリカ系統用）で表される配列からなるプライマーの集団、並びに、配列番号１３１〜１３３（Ｈ５亜型のアメリカ系統用）で表される配列からなるプライマーの集団をＦＩＰプライマーのセットとして例示することができる。
【００３８】
本発明の第４の実施形態は、第３の実施形態のＦＩＰプライマーの塩基配列の相補配列からなるＢＩＰプライマーである。第３の実施形態のＦＩＰプライマーと第４の実施形態のＢＩＰプライマーを１組として（つまり、順方向プライマーと逆方向プライマーとして）、ＬＡＭＰ法による核酸増幅法に使用することができる。
ただし、第３の実施形態で選択したＦ２領域と第４の実施形態で選択したＢ２領域は、増幅したい領域を挟んで、５’側に第３の実施形態のＦ２領域が、３’側に第４の実施形態のＢ２領域が設定される必要がある。詳細は、図５または図６のＡを参照のこと。
なお、第４の実施形態のＢＩＰプライマーを作製するために第３の実施形態を実施する場合には、第３の実施形態に記載の「ＦＩＰ」、「Ｆ１」および「Ｆ２」を、各々、「ＢＩＰ」、「Ｂ１」および「Ｂ２」と読み替えるものとする。
【００３９】
すなわち、本発明の第４の実施形態は、ＬＡＭＰ法を用いて、試料中のウイルス、細菌、寄生虫等の病原体の型または亜型を判定するためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、以下の（ａ）〜（ｇ）の工程を行い、工程（ｃ）および（ｆ）で決定されるＢ２領域およびＢ１領域のコンセンサス配列のペアを選択し、Ｂ２領域の塩基配列を３’末端側に、Ｂ１領域の塩基配列の相補的配列を５’末端側に有する塩基配列の相補配列からなるＢＩＰプライマーのセットである。
（ａ）検査対象遺伝子のセンス配列同士またはアンチセンス配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各配列間で高い相同性を有する領域をＦ２領域として選択する工程、
（ｂ）工程（ａ）で選択されるＢ２領域の３’末端より３’側下流に存在する領域であって、前記Ｂ２領域と同じ要件を満たす領域をＢ１領域として選択する工程、
（ｃ）各検査対象遺伝子のＢ１領域の塩基配列同士およびＢ２領域の塩基配列同士をアライメントし、アライメントしたＢ１領域の塩基配列およびＢ２領域の塩基配列の中から、各々の領域のコンセンサス配列を決定し、それらをペアとして選択する工程。
（ｄ）Ｂ１領域のコンセンサス配列と各検査対象遺伝子のＢ１領域の塩基配列の対応する位置の塩基同士およびＢ２領域のコンセンサス配列と各検査対象遺伝子のＢ２領域の塩基配列の対応する位置の塩基同士を比較し、各検査対象遺伝子のＢ１領域およびＢ２領域の塩基配列に含まれる、各領域のコンセンサス配列の塩基と異なる塩基の数が、各領域のコンセンサスの塩基配列とは異なる塩基の数を、検査対象遺伝子毎にカウントする工程、
（ｅ）工程（ｄ）でカウントされた塩基数が一定数以上である検査対象遺伝子を抽出する工程、
（ｆ）工程（ｅ）で抽出した検査対象遺伝子のＢ１領域の塩基配列同士およびＢ２領域の塩基配列同士を再度アライメントし、アライメントしたＢ１領域の塩基配列およびＢ２領域の塩基配列の中から、各々の領域の新たなコンセンサス配列を決定し、それらをペアとして選択する工程、
（ｇ）抽出される検査対象遺伝子がなくなるまで、工程（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）を繰り返す工程、
工程（ｅ）の「一定数」については、第３の実施形態の工程（ｅ）の説明箇所を参照のこと。
【００４０】
本発明の第４の実施形態のＢＩＰプライマーのセットとしては、限定はしないが、例えば、検査対象の試料中に含まれるウイルスが、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５亜型であるかどうかを判定する場合に好適に使用できる配列番号４６〜配列番号８２（Ｈ５亜型のユーラシア系統用）で表される配列からなるプライマーの集団、配列番号１２２〜配列番号１２８および配列番号１５７（Ｈ５亜型のユーラシア系統およびアメリカ系統用）または配列番号１３４〜１３６（Ｈ５亜型のアメリカ系統用）で表される配列からなるプライマーの集団をＢＩＰプライマーのセットとして例示することができる。
【００４１】
本発明の第５の実施形態は、ウイルス、細菌、寄生虫等の病原体の型または亜型の判定をＬＡＭＰ法で行うためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、以下の（ａ）〜（ｆ）の工程を行い、工程（ｂ）および（ｅ）で決定されるＦ３領域のコンセンサス配列からなるＦ３プライマーのセットである。
（ａ）検査対象遺伝子のセンス配列またはアンチセンス配列であって、第３の実施形態におけるＦ２領域の５’側上流に存在する塩基配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各検査対象遺伝子間で高い相同性を有する領域をＦ３領域として選択する工程、
（ｂ）各検査対象遺伝子のＦ３領域の塩基配列同士をアライメントし、アライメントしたＦ３領域のコンセンサス配列を決定する工程、
（ｃ）該コンセンサス配列と各検査対象遺伝子のＦ３領域の塩基配列の対応する位置の塩基同士を比較し、検査対象遺伝子のＦ３領域の塩基配列に含まれるコンセンサス配列の塩基とは異なる塩基の数を、検査対象遺伝子毎にカウントする工程、
（ｄ）工程（ｃ）でカウントされた塩基数が一定数以上である検査対象遺伝子を抽出する工程、
（ｅ）工程（ｄ）で抽出した検査対象遺伝子のＦ３領域の塩基配列同士を再度アライメントし、アライメントしたＦ３領域の新たなコンセンサス配列を決定する工程、
（ｆ）抽出される検査対象遺伝子がなくなるまで工程（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）を繰り返す工程、
【００４２】
Ｆ３領域の配列の長さは、ＬＡＭＰ法やＰＣＲ法で核酸を増幅するときに使用するプライマーが通常備えている長さであればよく、選択した領域に含まれるＧＣ含量などを考慮して決定すればよい。Ｆ３領域の配列の長さは、特に限定はしないが、例えば、１０〜２５塩基程度、好ましくは、１５〜２０塩基程度にしてもよい。
また、Ｆ３領域は、第３の実施形態におけるＦ２領域の５’末端よりも、５’側に存在する領域に選択される。Ｆ２領域の５’末端の塩基とＦ３領域の３’末端の塩基との間に、例えば、０〜６０塩基程度、好ましくは、５〜４０塩基程度、より好ましくは、１０〜２５塩基程度存在するとよい。
【００４３】
本発明の第５の実施形態の工程（ａ）は、検査対象遺伝子のセンス配列またはアンチセンス配列であって、第３の実施形態におけるＦ２領域の５’側上流に存在する塩基配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各検査対象遺伝子間で高い相同性を有する領域をＦ３領域として選択する工程である。
ここで、「高い相同性を有する領域」とは、特に限定はしないが、例えば、「検査対象遺伝子のセンス配列またはアンチセンス配列であって、第３の実施形態におけるＦ２領域の５’側上流に存在する塩基配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上が同一である単一塩基Ｘ、および／または各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上がＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの中から選択されるいずれか２種類または３種類の塩基で構成される混合塩基Ｙを含み、単一塩基Ｘおよび／または混合塩基Ｙが９０％以上を占める連続する塩基配列領域」を例示することができる。
図１には、上記例示した「高い相同性を有する領域」をＦ３領域として選択する方法を模式的に示した。詳細な説明は第１の実施形態の工程（ａ）の説明部分を参照のこと。
【００４４】
本発明の第５の実施形態の工程（ｂ）は、Ｆ３領域同士をアライメントし、アライメントした各Ｆ３領域からコンセンサス配列（第１の実施形態の工程（ｂ）の説明箇所を参照のこと）を決定する工程である。
本発明の第５の実施形態の工程（ｃ）は、Ｆ３領域のコンセンサス配列と各検査対象遺伝子のＦ３領域の塩基配列の対応する位置の塩基同士を比較し、検査対象遺伝子のＦ３領域の塩基配列について、コンセンサス配列の塩基とは異なる塩基の数を、検査対象遺伝子毎にカウントする工程である。「コンセンサス配列と異なる塩基の数」については、第１の実施形態の工程（ｃ）の説明箇所を参照のこと。
本発明の第５の実施形態の工程（ｄ）は、工程（ｃ）でカウントされた塩基数が一定数以上である検査対象遺伝子を抽出する工程である。
ここで、「一定数」とは、コンセンサス配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーによって、遺伝子増幅ができないと判断される塩基ミスマッチ数の限界値のことで、使用するプライマーの長さや、Ｇ、Ｃ含量によっても異なる数値であり、当業者であれば、予備的な実験等により容易に決定することができる数値である。
【００４５】
塩基ミスマッチの限界値は、第３の実施形態のＦＩＰプライマーと第４の実施形態のＢＩＰプライマーのペア、第５の実施形態のＦ３プライマーと後述の第６の実施形態のＢ３プライマーのペア、必要な場合には、後述第７の実施形態のＦＬプライマーと後述の第８の実施形態のＢＬプライマーのペアを１セットとして、次の様にして求めることができる。
まず、第３の実施形態で選択されるＦ１およびＦ２領域、第４の実施形態で選択されるＢ１およびＢ２領域、第５の実施形態で選択されるＦ３領域、第６の実施形態で選択されるＢ３領域、第７の実施形態で選択されるＦＬ領域および第８の実施形態で選択されるＢＬ領域の各領域に結合するプライマー配列を各々決定する。ここで決定されたプライマーの塩基配列に対し、一定数の変異（例えば、２０塩基あたり、０〜５または０〜３個程度の変異）を導入したプライマーペア（すなわち、ＦＩＰプライマーとＢＩＰプライマーのペア、Ｆ３プライマーとＢ３プライマーのペア、ＦＬプライマーとＢＬプライマーのペア）を、各々、複数ペア設計し、ＦＩＰプライマーおよびＢＩＰプライマーのペア、Ｆ３プライマーおよびＢ３プライマーのペア、ＦＬプライマーおよびＢＬプライマーのペアからなるプライマーのセットを複数セット準備する。準備したプライマーセットを用いて、検査対象遺伝子の中から、１つの遺伝子を選択し、この遺伝子をテンペレートとして、ＬＡＭＰ法を実施する。その結果、増幅することができたプライマーセットの各領域に含まれる変異の数と増幅できなかったプライマーセットの各領域に含まれる変異の数を調べ、各プライマー領域当たり何個の塩基ミスマッチまでなら遺伝子増幅が起こるのか、各プライマー領域の合計で何個の塩基ミスマッチ数なら遺伝子増幅はされるのか、塩基ミスマッチの影響を受けやすいプライマー領域はあるのか、などの点に基づいて、塩基ミスマッチ数の限界値を決定することができる。本明細書の実施例、材料および実験方法の「７．遺伝子増幅に及ぼす塩基ミスマッチの影響」、「８．塩基ミスマッチ解析」、並びに、結果の「５．遺伝子増幅に及ぼす塩基ミスマッチの影響」、「６．GenBankに登録されている２２１１個のＨ５−ＨＡ遺伝子の増幅推定」の箇所も併せて参照のこと。
「一定数」、すなわち、塩基ミスマッチの限界は、検査対象遺伝子によって異なるが、例えば、検査  対象遺伝子が、例えば、鳥インフルエンザウイルスの任意のＨＡ５亜型に属するＨＡ遺伝子の場合には、１〜５の整数、好ましくは、２〜４の整数、より好ましくは、３である。
図２において一定数が「３」の場合には、抽出される遺伝子は、遺伝子１１、遺伝子１９および遺伝子２０となる（図２Ｂ）。
【００４６】
本発明の第５の実施形態の工程（ｅ）は、工程（ｄ）で抽出した検査対象遺伝子のＦ３領域の塩基配列同士を再度アライメントし、アライメントしたＦ３領域の新たなコンセンサス配列を決定する工程である（図２Ｂ）。
そして、工程（ｆ）において、工程（ｅ）で決定した新たなコンセンサス配列に基づいて、工程（ｃ）、工程（ｄ）および工程（ｅ）を行い、抽出される検査対象遺伝子がなくなるまで、工程（ｃ）〜（ｅ）を繰り返す。図２Ｃでは、２回目に抽出した検査対象遺伝子が遺伝子１９のみとなり（従って、この段階におけるコンセンサス配列は遺伝子１９のＦ３領域の塩基配列である）、さらに抽出する遺伝子は存在しないので、Ｆ３領域のコンセンサス配列を全て決定されることになる。
決定されたＦ３領域のコンセンサス配列の５’側から３’側に向かう配列をＦ３プライマーの配列として決定する。
【００４７】
本発明の第５の実施形態に係るＦ３プライマーは、上記工程（ａ）により決定されたＦ３領域について、工程（ｂ）〜（ｅ）を行わずに、あるいは、工程（ｂ）〜（ｅ）を行った上で、全ての検査対象遺伝子のセンス配列のＦ３領域の塩基配列を網羅する（全ての検査対象遺伝子のセンス配列のＦ３領域の塩基配列を含む）ように混合塩基を含む混合塩基プライマーを調製し、Ｆ３プライマーとしてもよい。なお、混合塩基プライマーを作製する場合は、２０塩基のプライマー当たり、混合塩基の数は５個以下であることが望ましい。
【００４８】
本発明の第５の実施形態のＦ３プライマーのセットとしては、限定はしないが、例えば、検査対象の試料中に含まれるウイルスが、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５型であるかどうかを判定する場合に使用できる配列番号２１〜配列番号３４（Ｈ５亜型のユーラシア系統用）で表される配列からなるプライマーの集団、配列番号１２０（Ｈ５亜型のユーラシア系統およびアメリカ系統の統合用）で表される配列からなるプライマーの集団、並びに、配列番号１３７、１３８で表される配列（Ｈ５亜型のアメリカ系統用）からなるプライマーの集団をＦ３プライマーのセットとして例示することができる。
【００４９】
本発明の第６の実施形態は、第５の実施形態のＦ３プライマーの塩基配列の相補配列からなるＢ３プライマーである。第５の実施形態のＦ３プライマーと第６の実施形態のＢ３プライマーを１組として（つまり、順方向プライマーと逆方向プライマーとして）、ＬＡＭＰ法による核酸増幅法に使用することができる。
ただし、第５の実施形態で選択したＦ３領域と第６の実施形態で選択したＢ３領域は、増幅したい領域を挟んで５’側に第５の実施形態のＦ３領域が、３’側に第６の実施形態のＢ３領域が設定される必要がある。詳細は、図５または図６のＡを参照のこと。
なお、第６の実施形態のＢ３プライマーを作製するために第５の実施形態を実施する場合には、第３の実施形態に記載の「Ｆ２」および「Ｆ３」を、各々、「Ｂ２」および「Ｂ３」と読み替えるものとする。
【００５０】
すなわち、本発明の第６の実施形態は、ウイルス、細菌、寄生虫等の病原体の型または亜型の判定をＬＡＭＰ法で行うためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、以下の（ａ）〜（ｆ）の工程を行い、工程（ｂ）および（ｅ）で決定されるＢ３領域のコンセンサス配列の相補配列からなるＢ３プライマーのセットである。
（ａ）検査対象遺伝子のセンス配列またはアンチセンス配列であって、第４の実施形態におけるＢ２領域の５’側上流に存在する塩基配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各検査対象遺伝子間で高い相同性を有する領域をＢ３領域として選択する工程、
（ｂ）各検査対象遺伝子のＢ３領域の塩基配列同士をアライメントし、アライメントしたＢ３領域のコンセンサス配列を決定する工程、
（ｃ）該コンセンサス配列と各検査対象遺伝子のＢ３領域の塩基配列の対応する位置の塩基同士を比較し、検査対象遺伝子のＢ３領域の塩基配列に含まれるコンセンサス配列の塩基とは異なる塩基の数を、検査対象遺伝子毎にカウントする工程、
（ｄ）工程（ｃ）でカウントされた塩基数が一定数以上である検査対象遺伝子を抽出する工程、
（ｅ）工程（ｄ）で抽出した検査対象遺伝子のＢ３領域の塩基配列同士を再度アライメントし、アライメントしたＢ３領域の新たなコンセンサス配列を決定する工程、
（ｆ）抽出される検査対象遺伝子がなくなるまで工程（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）を繰り返す工程、
工程（ｄ）の「一定数」については、第５の実施形態の工程（ｄ）の説明箇所を参照のこと。
【００５１】
本発明の第６の実施形態のＢ３プライマーのセットとしては、限定はしないが、例えば、検査対象の試料中に含まれるインフルエンザウイルスが、Ａ型インフルエンザウイルスのＨＡ５亜型であるかどうかを判定する場合に使用できる配列番号８３〜配列番号９２（Ｈ５亜型のユーラシア系統用）で表される配列からなるプライマーの集団、配列番号１２９（Ｈ５亜型のユーラシア系統およびアメリカ系統用）で表される配列からなるプライマーの集団、並びに、配列番号１４２（Ｈ５亜型のアメリカ系統用）で表される配列からなるプライマーの集団をＢ３プライマーのセットとして例示することができる。
【００５２】
本発明の第７の実施形態は、ウイルス、細菌、寄生虫等の病原体の型または亜型の判定をＬＡＭＰ法で行うためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、以下の（ａ）〜（ｆ）の工程を行い、工程（ｂ）および（ｅ）で決定されるＦＬ領域のコンセンサス配列からなるＦＬプライマーのセットである。
（ａ）検査対象遺伝子のセンス配列またはアンチセンス配列であって、第３の実施形態におけるＦ１領域とＦ２領域の間に存在する塩基配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各検査対象遺伝子間で高い相同性を有する領域をＦＬ領域として選択する工程、
（ｂ）各検査対象遺伝子のＦＬ領域の塩基配列同士をアライメントし、アライメントしたＦＬ領域のコンセンサス配列を決定する工程、
（ｃ）該コンセンサス配列と各検査対象遺伝子のＦＬ領域の塩基配列の対応する位置の塩基同士を比較し、検査対象遺伝子のＦＬ領域の塩基配列に含まれるコンセンサス配列の塩基とは異なる塩基の数を、検査対象遺伝子毎にカウントする工程、
（ｄ）工程（ｃ）でカウントされた塩基数が一定数以上である検査対象遺伝子を抽出する工程、
（ｅ）工程（ｄ）で抽出した検査対象遺伝子のＦＬ領域の塩基配列同士を再度アライメントし、アライメントしたＦＬ領域の新たなコンセンサス配列を決定する工程、
（ｆ）抽出される検査対象遺伝子がなくなるまで工程（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）を繰り返す工程、
【００５３】
ＦＬ領域の配列の長さは、ＬＡＭＰ法やＰＣＲ法で核酸を増幅するときに使用するプライマーが通常備えている長さであればよく、選択した領域に含まれるＧＣ含量などを考慮して決定すればよい。Ｆ３領域の配列の長さは、特に限定はしないが、例えば、１０〜２５塩基程度、好ましくは、１５〜２０塩基程度にしてもよい。
また、ＦＬ領域は、上記Ｆ１領域とＦ２領域の間に選択される。ＦＬ領域とＦ１領域またはＦ２領域との距離は特に限定されない。
【００５４】
本発明の第７の実施形態の工程（ａ）は、検査対象遺伝子のセンス配列またはアンチセンス配列であって、第３の実施形態におけるＦ１領域とＦ２領域の間に存在する塩基配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各検査対象遺伝子間で高い相同性を有する領域をＦ３領域として選択する工程である。
ここで、「高い相同性を有する領域」とは、特に限定はしないが、例えば、「検査対象遺伝子のセンス配列またはアンチセンス配列であって、第３の実施形態におけるＦ１領域とＦ２領域の間に存在する塩基配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上が同一である単一塩基Ｘ、および／または各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上がＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの中から選択されるいずれか２種類または３種類の塩基で構成される混合塩基Ｙを含み、単一塩基Ｘおよび／または混合塩基Ｙが９０％以上を占める連続する塩基配列領域」を例示することができる。
図１には、上記例示した「高い相同性を有する領域」をＦＬ領域として選択する方法を模式的に示した。詳細な説明は第１の実施形態の工程（ａ）の説明部分を参照のこと。
【００５５】
本発明の第７の実施形態の工程（ｂ）は、ＦＬ領域同士をアライメントし、アライメントした各ＦＬ領域からコンセンサス配列（第１の実施形態の工程（ｂ）の説明箇所を参照のこと）を決定する工程である。
本発明の第７の実施形態の工程（ｃ）は、ＦＬ領域のコンセンサス配列と各検査対象遺伝子のＦＬ領域の塩基配列の対応する位置の塩基同士を比較し、検査対象遺伝子のＦＬ領域の塩基配列に含まれるコンセンサス配列の塩基とは異なる塩基の数を、検査対象遺伝子毎にカウントする工程である。「コンセンサス配列と異なる塩基の数」については、第１の実施形態の工程（ｃ）の説明箇所を参照のこと。
本発明の第７の実施形態の工程（ｄ）は、工程（ｃ）でカウントされた塩基数が一定数以上である検査対象遺伝子を抽出する工程である。
ここで、「一定数」とは、コンセンサス配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーによって、遺伝子増幅ができないと判断される塩基ミスマッチ数の限界値のことで、使用するプライマーの長さや、Ｇ、Ｃ含量によっても異なる数値であり、当業者であれば、予備的な実験等により容易に決定することができる数値である。
【００５６】
塩基ミスマッチの限界値は、第３の実施形態のＦＩＰプライマーと第４の実施形態のＢＩＰプライマーのペア、第５の実施形態のＦ３プライマーと第６の実施形態のＢ３プライマーのペア、第７の実施形態のＦＬプライマーと後述の第８の実施形態のＢＬプライマーのペアを１セットとして、次の様にして求めることができる。
まず、第３の実施形態で選択されるＦ１およびＦ２領域、第４の実施形態で選択されるＢ１およびＢ２領域、第５の実施形態で選択されるＦ３領域、第６の実施形態で選択されるＢ３領域、第７の実施形態で選択されるＦＬ領域および第８の実施形態で選択されるＢＬ領域の各領域に結合するプライマー配列を各々決定する。ここで決定されたプライマーの塩基配列に対し、一定数の変異（例えば、２０塩基あたり、０〜５または０〜３個程度の変異）を導入したプライマーペア（すなわち、ＦＩＰプライマーとＢＩＰプライマーのペア、Ｆ３プライマーとＢ３プライマーのペア、ＦＬプライマーとＢＬプライマーのペア）を、各々、複数ペア設計し、ＦＩＰプライマーおよびＢＩＰプライマーのペア、Ｆ３プライマーおよびＢ３プライマーのペア、ＦＬプライマーおよびＢＬプライマーのペアからなるプライマーのセットを複数セット準備する。準備したプライマーセットを用いて、検査対象遺伝子の中から、１つの遺伝子を選択し、この遺伝子をテンペレートとして、ＬＡＭＰ法を実施する。その結果、増幅することができたプライマーセットの各領域に含まれる変異の数と増幅できなかったプライマーセットの各領域に含まれる変異の数を調べ、各プライマー領域当たり何個の塩基ミスマッチまでなら遺伝子増幅が起こるのか、各プライマー領域の合計で何個の塩基ミスマッチ数なら遺伝子増幅はされるのか、塩基ミスマッチの影響を受けやすいプライマー領域はあるのか、などの点に基づいて、塩基ミスマッチ数の限界値を決定することができる。本明細書の実施例、材料および実験方法の「７．遺伝子増幅に及ぼす塩基ミスマッチの影響」、「８．塩基ミスマッチ解析」、並びに、結果の「５．遺伝子増幅に及ぼす塩基ミスマッチの影響」、「６．GenBankに登録されている２２１１個のＨ５−ＨＡ遺伝子の増幅推定」の箇所も併せて参照のこと。
「一定数」、すなわち、塩基ミスマッチの限界は、検査対象遺伝子によって異なるが、例えば、検査  対象遺伝子が、例えば、鳥インフルエンザウイルスの任意のＨＡ５亜型に属するＨＡ遺伝子の場合には、１〜５の整数、好ましくは、２〜４の整数、より好ましくは、３である。
図２において一定数が「３」の場合には、抽出される遺伝子は、遺伝子１１、遺伝子１９および遺伝子２０となる（図２Ｂ）。
【００５７】
本発明の第７の実施形態の工程（ｅ）は、工程（ｄ）で抽出した検査対象遺伝子のＦＬ領域の塩基配列同士を再度アライメントし、アライメントしたＦＬ領域の新たなコンセンサス配列を決定する工程である（図２Ｂ）。
そして、工程（ｆ）において、工程（ｅ）で決定した新たなコンセンサス配列に基づいて、工程（ｃ）、工程（ｄ）および工程（ｅ）を行い、抽出される検査対象遺伝子がなくなるまで、工程（ｃ）〜（ｅ）を繰り返す。図２Ｃでは、２回目に抽出した検査対象遺伝子が遺伝子１９のみとなり（従って、この段階におけるコンセンサス配列は遺伝子１９のＦ３領域の塩基配列である）、さらに抽出する遺伝子は存在しないので、ＦＬ領域のコンセンサス配列を全て決定されることになる。
決定されたＦＬ領域のコンセンサス配列の５’側から３’側に向かう配列をＦＬプライマーの配列として決定する。
【００５８】
本発明の第７の実施形態に係るＦＬプライマーは、上記工程（ａ）により決定されたＦＬ領域について、工程（ｂ）〜（ｅ）を行わずに、あるいは、工程（ｂ）〜（ｅ）を行った上で、全ての検査対象遺伝子のセンス配列のＦＬ領域の塩基配列を網羅する（全ての検査対象遺伝子のセンス配列のＦＬ領域の塩基配列を含む）ように混合塩基を含む混合塩基プライマーを調製し、ＦＬプライマーとしてもよい。なお、混合塩基プライマーを作成する場合は、２０塩基のプライマー当たり、混合塩基の数は５個以下であることが望ましい。
【００５９】
本発明の第７の実施形態のＦＬプライマーのセットとしては、限定はしないが、例えば、検査対象の試料中に含まれるウイルスが、Ａ型インフルエンザウイルスのＨＡ５亜型であるかどうかを判定する場合に使用できる配列番号３５〜配列番号４５（Ｈ５亜型のユーラシア系統用）で表される配列からなるプライマーの集団、配列番号１２１（Ｈ５亜型のユーラシア系統およびアメリカ系統の統合用）で表される配列からなるプライマーの集団、並びに、配列番号１３９〜１４１で表される配列（Ｈ５亜型のアメリカ系統用）からなるプライマーの集団をＦＬプライマーのセットとして例示することができる。
【００６０】
本発明の第８の実施形態は、第７の実施形態のＦＬプライマーの塩基配列の相補配列からなるＢＬプライマーである。第７の実施形態のＦＬプライマーと第８の実施形態のＢＬプライマーを加えることで、ＬＡＭＰ法による核酸の検出時間を短縮するのに有効である。
ただし、第７の実施形態で選択したＦＬ領域と第８の実施形態で選択したＢＬ領域は、増幅したい領域を挟んで５’側に第７の実施形態のＦＬ領域が、３’側に第８の実施形態のＢＬ領域が設定される必要がある。詳細は、図５または図６のＡを参照のこと。
なお、第８の実施形態のＢＬプライマーを作製するために第７の実施形態を実施する場合には、第７の実施形態に記載の「Ｆ１」、「Ｆ２」および「ＦＬ」を、各々、「Ｂ１」、「Ｆ２」および「ＦＬ」と読み替えるものとする。
【００６１】
すなわち、本発明の第８の実施形態は、ウイルス、細菌、寄生虫等の病原体の型または亜型の判定をＬＡＭＰ法で行うためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、以下の（ａ）〜（ｆ）の工程を行い、工程（ｂ）および（ｅ）で決定されるＢＬ領域のコンセンサス配列の相補配列からなるＢＬプライマーのセットである。
（ａ）検査対象遺伝子のセンス配列またはアンチセンス配列であって、第４の実施形態におけるＢ１領域とＢ２領域の間に存在する塩基配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各検査対象遺伝子間で高い相同性を有する領域をＢＬ領域として選択する工程、
（ｂ）各検査対象遺伝子のＢＬ領域の塩基配列同士をアライメントし、アライメントしたＢＬ領域のコンセンサス配列を決定する工程、
（ｃ）該コンセンサス配列と各検査対象遺伝子のＢＬ領域の塩基配列の対応する位置の塩基同士を比較し、検査対象遺伝子のＢＬ領域の塩基配列に含まれるコンセンサス配列の塩基とは異なる塩基の数を、検査対象遺伝子毎にカウントする工程、
（ｄ）工程（ｃ）でカウントされた塩基数が一定数以上である検査対象遺伝子を抽出する工程、
（ｅ）工程（ｄ）で抽出した検査対象遺伝子のＢＬ領域の塩基配列同士を再度アライメントし、アライメントしたＢＬ領域の新たなコンセンサス配列を決定する工程、
（ｆ）抽出される検査対象遺伝子がなくなるまで工程（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）を繰り返す工程、
工程（ｄ）の「一定数」については、第７の実施形態の工程（ｄ）の説明箇所を参照のこと。
【００６２】
本発明の第８の実施形態のＢＬプライマーのセットとしては、限定はしないが、例えば、検査対象の試料中に含まれるウイルスが、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５亜型であるかどうかを判定する場合に好適に使用可能な、配列番号９３〜配列番号１１４（Ｈ５亜型のユーラシア系統用）で表される配列からなるプライマーの集団、配列番号１３０（Ｈ５亜型のユーラシア系統およびアメリカ系統用）で表される配列からなるプライマーの集団、並びに、配列番号１４３（Ｈ５亜型のアメリカ系統用）で表される配列からなるプライマーの集団をＢＬプライマーのセットとして例示することができる。
【００６３】
本発明の第１〜第８の実施形態のプライマーは、オリゴヌクレオチドの合成法として当該分野において公知の方法（例えば、ホスホジエステル法など）により、ＤＮＡ自動合成装置などを用いて合成してもよく、あるいは、受託合成を行う機関等に委託して合成してもよい。
【００６４】
本発明の第９の実施形態は、少なくとも本発明の第１の実施形態のフォワードプライマーのセットと第２の実施形態のリバースプライマーのセットのペア、あるいは、第３の実施形態のＦＩＰプライマーのセットと第４の実施形態のＢＩＰプライマーのセットのペアを用いて、試料中のウイルス、細菌、寄生虫等の病原体の遺伝子由来の核酸を鋳型として、核酸増幅反応を行い、得られた増幅断片を解析して、試料中の病原体の型または亜型を判定する方法である。少なくとも本発明の第１の実施形態のフォワードプライマーのセットと第２の実施形態のリバースプライマーのセットのペア、あるいは、第３の実施形態のＦＩＰプライマーのセットと第４の実施形態のＢＩＰプライマーのセットのペアを用いて核酸増幅反応を行い、増幅断片が得られた場合（または、得られた断片の長さ等を確認して想定される長さであった場合）、想定される型または亜型由来の遺伝子由来であると判定することができる。
第１の実施形態のフォワードプライマーと第２の実施形態のリバースプライマーのセットは、従来のＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、ＲＴ−リアルタイムＰＣＲなどの他、ＴＭＡ（Transcription Mediated Amplification）法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification）法、ＬＡＭＰ法、ＲＴ−ＬＡＭＰ法など、核酸増幅のためのプライマーペアを使用して、目的の核酸領域を増幅する方法全てに使用することができる。
また、第３の実施形態のＦＩＰプライマーのセットと第４の実施形態のＢＩＰプライマーのセットは、核酸増幅法全般に使用してもよいが、特に、ＬＡＭＰ法による核酸増幅法に好適に使用することができる。ＦＩＰプライマーのセットとＢＩＰプライマーのセットに加えて、さらに、本発明の第５の実施形態のＦ３プライマーのセットと本発明の第６の実施形態のＢ３プライマーのセット、および／または本発明の第７の実施形態のＦＬプライマーのセットと本発明の第８の実施形態のＢＬプライマーのセットを用いて、ＬＡＭＰ法を行ってもよい。
【００６５】
第１の実施形態のフォワードプライマーのセットと第２の実施形態のリバースプライマーのセットのペア（リアルタイムＰＣＲ法の場合はプローブプライマーを加えた３種類のプライマーセット）、あるいは、第３の実施形態のＦＩＰプライマーのセットと第４の実施形態のＢＩＰプライマーのセットのペアを用いて、核酸増幅法を実施すると、フォワードプライマーとリバースプライマー（リアルタイムＰＣＲ法の場合はプローブプライマーを加えた３種類のプライマーセット）、あるいは、ＦＩＰプライマーとＢＩＰプライマーで挟まれる遺伝子領域を含む領域が増幅される（例えば、図３、図５および図６のＡを参照のこと）。従って、フォワードプライマーとリバースプライマー、あるいは、ＦＩＰプライマーとＢＩＰプライマーによって挟まれる領域が、核酸合成酵素によって増幅可能な距離となるように、Ｆ２領域およびＢ２領域を選択する必要がある。ＦＩＰプライマーとＢＩＰプライマーで挟まれる距離は、特に限定はしないが、例えば、５０ベース〜３００ベース程度、好ましくは、１００ベース〜２００ベース程度である。
なお、本発明の第１〜第８の実施形態のプライマーのセットのいずれかを使用し、ペアとなる他方のプライマーは、本発明にかかるプライマー以外のプライマーを使用して、核酸増幅法を実施することは可能であるから、本発明の第１〜第８の実施形態のプライマーのいずれか１つを使用した場合も、本発明の実施にあたることは言うまでもない。
【００６６】
本発明の第９の実施形態に係る亜型の判定方法において、判定対象が鳥インフルエンザウイルスのＨ５亜型である場合、ＬＡＭＰ法を実施するためのプライマーセット（ＦＩＰ、Ｆ３、ＦＬ、ＢＩＰ、Ｂ３およびＢＬプライマーからなるセット）に含まれるプライマーの塩基配列を、以下に配列番号で例示する。
（１）プライマーセット（Ｈ５亜型のユーラシア系統用「バージョン１」）
ＦＩＰプライマーのセット；配列番号１〜配列番号２０
Ｆ３プライマーのセット；配列番号２１〜配列番号３４
ＦＬプライマーのセット；配列番号３５〜配列番号４５
ＢＩＰプライマーのセット；配列番４６〜配列番号８２
Ｂ３プライマーのセット；配列番号８３〜配列番号９２
ＢＬプライマーのセット；配列番号９３〜配列番号１１４
（２）プライマーセット２（Ｈ５亜型のユーラシア系統用「ＰＭ１６プライマーセット」）
ＦＩＰプライマーのセット；配列番号１１５〜配列番号１１９
Ｆ３プライマーのセット；配列番号１２０
ＦＬプライマーのセット；配列番号１２１
ＢＩＰプライマーのセット；配列番１２２〜配列番号１２８
Ｂ３プライマーのセット；配列番号１２９
ＢＬプライマーのセット；配列番号１３０
（３）プライマーセット３（Ｈ５亜型のアメリカ系統用）
ＦＩＰプライマーのセット；配列番号１３１〜配列番号１３３
Ｆ３プライマーのセット；配列番号１３７〜配列番号１３８
ＦＬプライマーのセット；配列番号１３９〜配列番号１４１
ＢＩＰプライマーのセット；配列番号１３４〜配列番号１３６
Ｂ３プライマーのセット；配列番号１４２
ＢＬプライマーのセット；配列番号１４３
（４）プライマーセット４（Ｈ５亜型のユーラシア系統およびアメリカ系統用「ＰＭ１８プライマーセット」）
ＦＩＰプライマーのセット；配列番号１１５〜配列番号１１９および配列番号１５６
Ｆ３プライマーのセット；配列番号１２０
ＦＬプライマーのセット；配列番号１２１
ＢＩＰプライマーのセット；配列番１２２〜配列番号１２８および配列番号１５７
Ｂ３プライマーのセット；配列番号１２９
ＢＬプライマーのセット；配列番号１３０
【００６７】
ここで、ウイルスの遺伝子の抽出あるいはｃＤＮＡの調製は、常法に従って行うことができる。例えば、判定対象のウイルスがインフルエンザウイルスである場合、インフルエンザウイルスはＲＮＡウイルスであるため、試料からインフルエンザウイルス遺伝子であるＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成し、合成したｃＤＮＡを鋳型にして、ＬＡＭＰ法を行ってもよい。あるいは、ＬＡＭＰ法の核酸増幅反応を行う反応液中に逆転写酵素を添加し、核酸増幅反応を行ってもよい。ＬＡＭＰ法による核酸増幅を行うために使用するＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換活性を有する鎖型依存性核酸合成酵素であれば、特に限定されない。このような酵素としては、Bst DNAポリメラーゼ、Bct(exo-)DNAポリメラーゼ、Csa DNAポリメラーゼなどが挙げられる。
【００６８】
また、本実施形態で使用される逆転写酵素は、ＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成する活性を持つ酵素であればいかなる酵素であってもよく限定はされないが、あえて例示するなら、例えば、M-MVL（Moloney Murine Leukemia Virus）やAMV（Avian Myeloblastosis Virus）などのレトロウイル由来の逆転写酵素、好熱性真正細菌Thermus thermophilusHB8由来の逆転写酵素などを挙げることができる。
【００６９】
ＬＡＭＰ法による増幅産物の検出は公知の方法によって行うことができる。例えば、増幅反応の過程で生じるピロリン酸マグネシウムの量が増大すると反応液が白濁するため、目視により増幅産物の存在を確認することができる。また、反応液中にカルセインを添加しておくと、反応前はマンガンイオンと結合して消光しているカルセインが、増幅反応の過程において生成するピロリン酸イオンによってマンガンイオンが奪われることにより、蛍光を発すようになり、増幅産物の存在を確認することができる。あるいは、増幅産物をアガロース電気泳動によって分離するとラーダー上のバンドが複数生じるため、このバンドを検出することで増幅産物の存在を確認してもよい。
【００７０】
本発明の第１０の実施形態は、本発明の第１〜第８の実施形態のプライマーのセットの少なくともいずれか１セットを含む、ウイルス、細菌、寄生虫等の病原体の型または亜型を判定するためのキットである。また、本発明の実施形態に係るキットには、ＲＮＡを抽出するための試薬、核酸増幅法（ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、ＲＴ−リアルタイムＰＣＲ法、ＴＭＡ法、ＮＡＳＢＡ法、ＬＡＭＰ法、ＲＴ−ＬＡＭＰ法など）による核酸増幅に必要なバッファーや試薬等のほか、使用説明書等を含んでいてもよい。
【００７１】
以下に実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００７２】
材料および実験方法
１．プライマーデータベース
鳥インフルエンザウイルス、ユーラシア系統のＨ５亜型に属する２２１１個のＨＡ遺伝子の塩基配列は、 “Influenza Virus Resource” (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU.html)より取得し、取得した全てのＨＡ遺伝子をアライメントした。アライメントした遺伝子配列をExcelシートに転載し、プライマー用のデータベースを作成した。このプライマー用データベースを用いて、２２１１個のＨＡ遺伝子について、全ての塩基位置における、Ａ、Ｇ、ＴまたはＣの出現率（％）を求めた。
ＨＡ遺伝子上の各プライマー（ＦＩＰ、ＢＩＰ、Ｆ３、Ｂ３、ＦＬおよびＢＬ）の位置は、ＨＡ開裂部位の近傍に設定した（図４Ａおよび図５Ａ）。また、後述する３種類のプライマーセット（Ｓプライマーセット、ＭプライマーセットおよびＰプライマーセット）は、有効性を正しく比較できるように、全てを同じ領域に設定した。
【００７３】
２．プライマーの設計
ウイルス株の遺伝子に特異的なプライマー（Ｓプライマー）
Ｓプライマーは、A/duck/Tsukuba/9/2005 (H5N2)（Ｖ１２４株と略す） のＨＡ遺伝子（アクセッション番号； BAJ23243)を標的に設計されたもので、現在、一般的に使用されているＬＡＭＰ法用のプライマーの例として用いたものである。
混合塩基を含むプライマー（Ｍプライマー）
Ｍプライマーは、多様なＨＡ遺伝子をＰＣＲ法を用いて幅広く検出するために必須のプライマーである（Tsukamotoら, J Clin Microbiol 48:4275-4278, 2010.）。そこで本実施例では、ＭプライマーがＬＡＭＰ法によるＨＡ遺伝子の広範な検出にどの程度有用かを検討した。ＨＡ遺伝子の各塩基位置において、単一の塩基（Ａ、Ｇ、ＴまたはＣ）では、使用した２２１１個の遺伝子の９８％以上をカバーできない塩基がある場合には、遺伝子のカバー率を高めるために混合塩基を用いて、Ｍプライマーを設計した。プライマー当たりの混合塩基の数は原則として５個以下としたが、それでも塩基カバー率が低い塩基位置がある場合には６個以上の混合塩基を用いても良いとした。
【００７４】
ポピュレーションプライマー（Ｐプライマー）
Ｐプライマーは、ＬＡＭＰ法によって多様なＨＡ遺伝子を幅広く検出するために、本発明者らが初めて開発したプライマーである。Ｐプライマーのセットは、プライマー領域において、塩基配列が近縁なＨＡ遺伝子の集団毎にプライマーを設計し、それらを集めたプライマーのセットである。
本研究において（後述）、Ｐプライマーの塩基配列と遺伝子側の塩基配列の間に塩基ミスマッチが２個以内の場合は、該Ｐプライマーで遺伝子増幅が可能であった。これに対して、塩基ミスマッチが３個以上ある遺伝子は、該Ｐプライマーで増幅に６０分以上を必要とするか、増幅されない場合があり、安定した遺伝子検出が困難であった。そこで、各プライマー領域において、塩基ミスマッチ数が２個以下になるようにＰプライマーを設計し、３個以上の遺伝子については、その遺伝子集団を構成する遺伝子をなるべく多くカバーするように、これらのコンセンサス配列からなる新規Ｐプライマーを設計した。新規Ｐプライマーでもカバーできない遺伝子の集団については、新らたな新新規Ｐプライマーを設計した。これを繰り返すことによって、２２１１個の全ての遺伝子に対して、塩基ミスマッチ数が２個以下になるような、Ｐプライマーのセットが設計された。以下にＰプライマーの設計方法を詳述する。
【００７５】
（１）プライマー領域の設定
多くの報告では、プライマーセットの設計には、栄研化学株式会社がウェブ上に公開している、ＬＡＭP法専用のプライマー設計ソフトウェアである「Primer Explorer」が使用されている。しかし、多様性がある鳥インフルエンザウイルスのＨＡ、ＮＡ遺伝子を標的にした場合、Primer Explorerで設計したプライマー領域は、保存性の低い領域に設定される場合が多く、スペクトルの狭いプライマーになり、野外遺伝子を幅広く検出することができない。
この問題を克服するには、多様なＨＡ遺伝子に広く保存されている領域にプライマー領域に選定しなければならない。そこで、遺伝子バンクからダウンロードした２２１１株のＨ５−ＨＡ遺伝子の全ての塩基位置（約１８００塩基）について、センス配列をアライメントしたプライマー専用データベースを構築し、それを用いて保存性の高い領域を探した。具体的には其々の塩基位置毎に、Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｃの出現率をそれぞれ求め、最も出現率が高い塩基だけを順番に配列したコンセンサス配列を構築した（図７）。このコンセンサス配列を構成する各塩基が遺伝子の何％をカバーするかを求めて、これを其々の塩基位置の塩基カバー率とした。
プライマー領域は、塩基カバー率が高い、良く保存された塩基が２０個程度連続する領域でなければならない。具体的には、プライマー領域の塩基出現率が８０％以上（望ましくは９０％以上、より望ましくは９８％以上）となる単一塩基、または、単一塩基の出現率は８０％未満であっても、塩基出現率が高い上位２種類の塩基の出現率の和が８０％以上（望ましくは９０％以上、より望ましくは９８％以上）となる混合塩基が、２０個程度連続する領域をプライマー領域の候補とした。
これらの候補領域について、ウイルス株Ｖ１２４株の人工Ｈ５−ＨＡ遺伝子（Ｈ５亜型のＨＡ遺伝子）と完全に塩基配列が一致するプライマーを設計した。それらのプライマーの組合せの中から、実際に実験によってＶ１２４株の遺伝子を３０分以内に増幅できるプライマーのセットとした。このプライマーセットはある株に特異的なプライマーセット（Strain-specific primer set）との意味を込めて、Ｓプライマーセットと命名した。なお、Ｓプライマーセットは現在、一般に利用されている鳥インフルエンザウイルスのプライマーと同等であることから、本研究ではこれを現行のランプ法のプライマーの例として使用した。
【００７６】
（２）Ｐプライマーの設計
決定されたプライマー領域に個々のＰプライマーを設計する手順について説明する。ＬＡＭＰ法では、ＦＩＰプライマーとＢＩＰプライマーが遺伝子増幅に最も重要な役割を果たしている。ＦＩＰプライマーの長さはＦ３プライマーやＦＬプライマーの２倍ほどあるため、ＦＩＰプライマーにおいて、多様なＨＡ遺伝子を幅広く検出することは特に難しい。ＦＩＰプライマーを設計する際には、プライマー領域の塩基配列が類似した、特定の遺伝子ポピュレーション毎に、プライマーを設計することが重要と考えられる。そこで先ず、ＦＩＰプライマーの設計手順を説明する。
（ｉ）コンセンサス配列の設計：
アライメントしたプライマー用データベースを用いて、其々の塩基位置毎にＡ、Ｇ、Ｔ、Ｃの出現率を求め、最も高い塩基出現率を示す塩基だけを順番に配列させたのがコンセンサス配列となる。
２２１１株のＨ５−ＨＡ遺伝子からなる母集団に対して、Ｆ２領域とＦ１領域をセットにしたコンセンサス配列を構築した（図５を参照）。
（ｉｉ）塩基ミスマッチ数のカウント：
Ｆ２領域とＦ１領域に対するコンセンサス配列と、其々のＨＡ遺伝子の相当する位置の塩基を比較して、両者の種類が一致しない数（「塩基ミスマッチ数」と呼ぶ。）をＨＡ遺伝子毎に、また領域毎にカウントした。
（ｉｉｉ）増幅判定：
Ｆ２領域またはＦ１領域のコンセンサス配列と、其々のＨＡ遺伝子の相当する位置の塩基配列を比較して、何れか一方の領域における塩基ミスマッチ数が３個以上となるＨＡ遺伝子、およびＦ２領域とＦ１領域の塩基ミスマッチ数が共に２個以上（計４以上）となるＨＡ遺伝子は、上記コンセンサス配列を基に設計するPプライマーでは増幅困難と判定した。
（ｉｖ）新規母集団の編成：
増幅困難と判定されたＨＡ遺伝子を抽出し、新規母集団を編成した。
（ｖ）新規コンセンサス配列の設計： 
新規母集団を編成する遺伝子に対して、工程（ｉ）にしたがって、Ｆ２領域とＦ１領域をセットにした新規コンセンサス配列を設計した。
（ｖｉ）検出困難と判定されるＨＡ遺伝子が存在しなくなるまで上記の工程（ｉ）〜（ｖ）を繰り返すことによって、Ｆ２領域とＦ１領域をペアにした、複数のコンセンサス配列のセットを設計した。これによって、全てのＨＡ遺伝子が、Ｆ２領域またはＦ１領域の塩基ミスマッチ数がそれぞれ２個以下で、且つ合計でも３個以下となるコンセンサス配列でカバーされることになる。
（Ｖｉｉ）ＦＩＰプライマーの設計：
得られたコンセンサス配列の各セットにおいて、Ｆ１領域の相補鎖のコンセンサス配列を５末端に、Ｆ２領域のコンセンサス配列を３末端にした融合したＦＩＰプライマーを設計する（配列番号１〜配列番号２０）。これによって、ＦＩＰ領域に対するＰプライマーのセットが設計される。
ＦＩＰプライマー領域の長さはＦ２領域とＦ１領域ともに２０塩基程度が望ましいが、遺伝子が増幅できれば、それより短くても良い。最初に設計したＦＩＰプライマー（Ｌｏｎｇ  ＦＩＰプライマー）の本数は２０本であったが、Ｆ２領域を２０塩基から１６塩基へ、Ｆ１領域を２０塩基から１４塩基へ短縮させたＳｈｏｒｔ  ＦＩＰプライマーにしたところ、本数を計５本にまで減らすことができた（配列番号１１５〜配列番号１１９）。なお、このセットは８種類のプライマー分子の混合物であるが、当該技術分野においては、混合塩基を含めて合成すれば５本のプライマーとして扱われるため、本明細書においては５本と表記する。
ＦＩＰプライマーの位置は、鳥インフルエンザウイルスのＶ１２４株を基準にした場合、Ｌｏｎｇ  ＦＩＰプライマーのＦ２領域は塩基番号９５０〜９６９、Ｆ１（Ｆ１ｃ）領域は塩基番号９９８〜１０１７に（図５）、Ｓｈｏｒｔ  ＦＩＰプライマーのＦ２領域は塩基番号９５４〜９６９に、Ｆ１（Ｆ１ｃ）領域は塩基番号１００４〜１０１７であった（図６）。
【００７７】
（ｖｉｉｉ）ＢＩＰプライマーの設計：
ＢＩＰプライマーはＢ２領域とＢ１領域から構成され、５’末端にはＢ１領域の相補鎖の配列を、３末端にはＢ２領域を融合したプライマーである。ＢＩＰプライマーの設計方法はＦＩＰプライマーの設計と同様である。プライマー領域の塩基配列が類似する、遺伝子ポピュレーション毎にＢＩＰプライマーを設計する。具体的には工程（ｉ）〜工程（ｖｉｉ）を経て、ＢＩＰ領域に対するＰプライマーセットを設計した。
ＢＩＰプライマー領域の長さはＢ１領域とＢ２領域ともに２０塩基程度が望ましいが、遺伝子が増幅できればそれより短くても良い。最初に設計したＢＩＰプライマーの本数は３７本（配列番号４６〜配列番号８２）であったが、Ｂ１領域を１７塩基から１１／１２塩基へ、Ｂ２領域を１９塩基から１７塩基へ短縮させたＳｈｏｒｔ  ＢＩＰプライマーでは、合計７本（配列番号１２２〜配列番号１２８）まで本数を減らすことができた。なお、このセットは１０種類のプライマー分子の混合物であるが、当該技術分野では混合塩基を含めて合成すれば７本のプライマーとして扱われるため、本明細書では７本と表記する。
ＢＩＰプライマーの位置は、Ｖ１２４株を基準にした場合、Ｌｏｎｇ  ＢＩＰプライマーのＢ２領域は塩基番号１０７１〜１０８９、Ｂ１（Ｂ１ｃ）領域は塩基番号１０２４〜１０４０に（図５）、Ｓｈｏｒｔ  ＦＩＰプライマーのＢ２領域は塩基番号１０７３〜１０８９に、Ｂ１（Ｂ１ｃ）領域は塩基番号１０２２〜１０３３であった（図６）。
【００７８】
（ｉｘ）Ｆ３プライマーの設計：
２２１１株のＨ５−ＨＡ遺伝子を用いて構築したプライマー専用データベースから、Ｆ３領域を切り出した。次に、Ｆ３領域のコンセンサス配列（図７を参照）と、個々のＨＡ遺伝子のＦ３領域の塩基配列を比較して、一致しない塩基数（塩基ミスマッチ数）をカウントした。Ｆ３領域において塩基ミスマッチが３以上となるＨＡ遺伝子は、コンセンサス配列を基に設計するプライマーでは増幅困難と判定し、これらを抽出して新規母集団を編成した。新規母集団に対して新規コンセンサス配列を設計し、新規コンセンサス配列と新規母集団に属す各ＨＡ遺伝子の配列を比較して、ＨＡ遺伝子当たりの塩基ミスマッチ数をカウントした。塩基ミスマッチ数が３以上となるＨＡ遺伝子は、新規コンセンサス配列を基に設計するプライマーでは増幅困難と判定し、これらの増幅困難遺伝子を抽出して次の母集団を編成した。この工程を増幅困難な遺伝子がなくなるまで繰り返すことによって、Ｆ３領域に対して、２２１１株のＨ５−ＨＡ遺伝子の其々に対して、塩基ミスマッチ数が２個以下となるＰプライマーのセットが設計される。
Ｆ３プライマーの長さは２０塩基程度が望ましいが、遺伝子が増幅できれば、それより短くても良い。Ｆ３領域のＰプライマーの本数は１４本であった（配列番号２１〜配列番号３４）。
Ｆ３プライマーの位置は、Ｖ１２４株に対しては塩基番号９１７〜９３６に設定された（図５および図６）。
なお、Ｆ３領域はＰプライマーでなくても、混合塩基プライマーを用いることも可能であった（配列番号１２０）。
【００７９】
（ｘ）ＦＬプライマーの設計：
プライマー専用データベースから、ＦＬ領域を切り出し、この情報を基に工程（ｉｘ）に準じてＦＬ領域に対するＰプライマーのセットを設計した。
ＦＬプライマーの長さは２０塩基程度が望ましいが、遺伝子が増幅できれば、それより短くても良い。ＦＬ領域のＰプライマーの本数は１１本であった（配列番号３５〜配列番号４５）。
ＦＬプライマーの位置は、Ｖ１２４株に対しては塩基番号９７４〜９９３に設定された（図５および図６）。
なお、ＦＬ領域はＰプライマーでなくても、混合塩基プライマーを用いることができる（配列番号１２１）。
【００８０】
（ｘｉ）Ｂ３プライマーの設計：
プライマー専用データベースから、Ｂ３領域を切り出し、この情報を基に、工程（ｉｘ）に準じてＢ３領域に対するＰプライマーセットを設計した。
Ｂ３プライマーの長さは２０塩基程度が望ましいが、遺伝子が増幅できれば、それより短くても良い。Ｂ３領域のＰプライマーの本数は１０本であった（配列番号８３〜配列番号９２）。
Ｂ３プライマーの位置は、Ｖ１２４株に対しては塩基番号１０９２〜１１１０に設定された（図５および図６）。
なお、Ｂ３領域はＰプライマーでなくても、混合塩基プライマーを用いることができる（配列番号１２９）。
【００８１】
（ｘｉｉ）ＢＬプライマーの設計：
プライマー専用データベースから、ＢＬ領域を切り出し、この情報を基に、工程（ｉｘ）に準じてＢＬ領域に対するＰプライマーセットを設計した。
ＢＬプライマーの長さは２０塩基程度が望ましいが、遺伝子が増幅できれば、それより短くても良い。ＢＬ領域のＰプライマーの本数は２２本であった（配列番号９３〜配列番号１１４）。
ＢＬプライマーの位置は、Ｖ１２４株に対しては塩基番号１０４９〜１０６８または塩基番号１０５２〜１０７１（混合塩基プライマーの場合）に設定された（図５および図６）。
なお、ＢＬ領域はＰプライマーでなくても、混合塩基プライマーを用いることができる（配列番号１３０）。
【００８２】
８ヶ所のプライマー領域について、それぞれＰプライマーを設計したところ、合計で１１４本からなるＰプライマーセット（バージョン１）が得られた。
【００８３】
３．テンペレートの調整
（１）ＰＣＲテンペレート
インフルエンザウイルス（ｃＤＮＡを含む）を入手することは困難なことから、本研究では、Ｈ５亜型のＨＡ遺伝子の増幅部位を、遺伝子バンク情報を基にして、ＰＣＲによって人工合成したテンペレートを用いた。人工合成したＤＮＡテンペレートの大きさは２７０塩基で、遺伝学的に異なる１５株のＨ５亜型の鳥インフルエンザウイルスを選んだ。それらの塩基配列をアライメントしたものを図８に示す。
これら１５株の遺伝子のうち、７株は１９７６年〜２００９年の間に日本において水鳥の渡り鳥から単離したＬＰＡＩウイルスに由来し、８株は２００３年〜２０１３年の間にAsian H5N1 subtype HPAIのＨ５亜型ＨＡ遺伝子に由来している。これらのＨＡ遺伝子テンペレートは、５本の７０塩基長のオリゴヌクレオチドペアを用いて、２段階のＰＣＲにより合成した。使用したオリゴヌクレオチドは以下の通りである（塩基配列は配列番号で示す）。
【００８４】
Bangladesh 2009株
Forward Primer（プラス鎖、以下同じ）：配列番号１５８、配列番号１５９
Reverse Primer（マイナス鎖）、以下同じ：配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２
Bangladesh 2012株
Forward Primer：配列番号１６３、配列番号１６４
Reverse Primer：配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７
Dk Egypt 2013株
Forward Primer：配列番号１６８、配列番号１７２
Reverse Primer：配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１
Dk VN 2012株
Forward Primer：配列番号１７３、配列番号１７４
Reverse Primer：配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７
Falcon HK 2009株
Forward Primer：配列番号１７８、配列番号１７９
Reverse Primer：配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２
V124株
Forward Primer：配列番号１８３、配列番号１８４
Reverse Primer：配列番号１８５、配列番号１８６、配列番号１８７
V177株
Forward Primer：配列番号１９３、配列番号１９４
Reverse Primer：配列番号１９５、配列番号１９６、配列番号１９７
V265株
Forward Primer：配列番号１９８、配列番号１９９
Reverse Primer：配列番号２００、配列番号２０１、配列番号２０２
V372株
Forward Primer：配列番号２０３、配列番号２０４
Reverse Primer：配列番号２０５、配列番号２０６、配列番号２０７
V382株
Forward Primer：配列番号２０８、配列番号２０９
Reverse Primer：配列番号２１０、配列番号２１１、配列番号２１２
V44株
Forward Primer：配列番号２１３、配列番号２１４
Reverse Primer：配列番号２１５、配列番号２１６、配列番号２１７
V463株
Forward Primer：配列番号２１８、配列番号２１９
Reverse Primer：配列番号２２０、配列番号２２１、配列番号２２２
V77株
Forward Primer：配列番号２２３、配列番号２２４
Reverse Primer：配列番号２２５、配列番号２２６、配列番号２２７
V80株
Forward Primer：配列番号２２８、配列番号２２９
Reverse Primer：配列番号２３０、配列番号２３１、配列番号２３２
【００８５】
７０塩基長のオリゴヌクレオチドペアは、隣接するオリゴヌクレオチドの両末端部分と２０塩基がオーバーラップするようにデザインしてある。最初のＰＣＲでは、Ex Taq（Takara, Shiga, Japan）を含む各チューブに、プライマー１（プラス鎖）および２（マイナス鎖）と、プライマー３（プラス鎖）及び４（マイナス鎖）の２組の組合せで、１５サイクルのＰＣＲ反応を行い、それぞれ１２０塩基のＤＮＡを増幅した。その合成ＤＮＡを１００倍に希釈し、両端の７０塩基長の２つのプライマー（プライマー１（プラス鎖）および５（マイナス鎖））を用いて、３０サイクルのＰＣＲ反応を行って、２７０塩基長のＤＮＡをＰＣＲテンペレートＤＮＡとした。塩基配列解析により、これらの合成ＤＮＡの塩基配列が正しいことを確認してから実験に用いた。
ＰＣＲテンペレートＤＮＡをＬＡＭＰ法に使用する場合、ＰＣＲ増幅産物の１，０００倍希釈液を使用したが、この希釈液には１０６乗分子のテンペレートが含まれている。この濃度は尿膜腔液由来のウイルス液から調製したｃＤＮＡの１０倍希釈液に相当する分子を含んでいる。
【００８６】
（２）ウイルスｃＤＮＡテンペレート
鳥インフルエンザウイルス（Ｈ１〜Ｈ４亜型、Ｈ６亜型、Ｈ８〜Ｈ１２亜型）、鶏伝染性気管支炎ウイルス（Infectious bronchitis virus、IBV）およびニューキャッスル病ウイルス（Newcastle disease virus、NDV）のウイルスゲノムRNAは、感染発育鶏卵の尿膜腔液からViral RNA Purification Kit (Qiagen)を用いて精製した。次に、これを鋳型にしてSuperScript III reverse transcriptase (Takara, Shiga, Japan)を用いて、ウイルスゲノムＲＮＡからウイルスｃＤＮＡを合成した（Tsukamotoら, J Clin Microbiol 48:4275-4278, 2010.）。ＬＡＭＰ法およびリアルタイムＰＣＲには、得られたｃＤＮＡを１０倍に希釈した液を使用した。
【００８７】
４．ＬＡＭＰ法
ＰＣＲテンペレートＤＮＡ（１，０００倍希釈）１μＬ、８０ｐｍｏｌのＦＩＰプライマーおよびＢＩＰプライマー溶液を各々０．５μＬ、４０ｐｍｏｌのＦＬプライマーおよびＢＬプライマー溶液を各々０．５μＬ、５ｐｍｏｌのＦ３プライマーおよびＢ３プライマー溶液を各々０．５μＬ、（ｘ２）酵素反応液を５．０μＬ、Bst DNA polymerase（New England BioLabs, Tokyo）を０．５μＬ、蛍光検出試薬（Eiken Chemical, Tokyo, Japan）を０．５μＬ含む、ＬＡＭＰ法の反応溶液を用いて、総量１０μＬの系で反応させた。（ｘ１）?酵素反応液の組成は、２０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、８ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＳＯ４、０．８ｍｍｏｌ／Ｌ  ベタイン（Sigma, USA）および１．４ｍｍｏｌ／Ｌ  ｄＮＴＰｓ（Promega, USA）とした。
テンペレートを含む反応液を６０℃で６０分間反応させた後、９５℃で２分間の処理によって反応を停止させた。その反応チューブにＵＶを照射し、緑色蛍光の有無から遺伝子増幅の有無を判定した。緑色発光した場合はＨ５亜型のＨＡ遺伝子が陽性と判定した。
【００８８】
５．特異性の検討
Ｈ５亜型の  鳥インフルエンザウイルスを検出するＬＡＭＰ法の反応特異性の検討は、１２種類のＨＡ亜型の鳥インフルエンザウイルスと、鳥インフルエンザウイルス以外の２種類の鶏ウイルスを用いて行った。
反応特異性の検討に使用するテンペレートとしては、鳥インフルエンザウイルスのＨ５亜型およびＨ７亜型については、７０塩基長のプライマーを用いて、人工合成したＰＣＲテンペレートを１，０００倍希釈して用いた。それら以外のＨＡ亜型（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１およびＨ１２亜型）の鳥インフルエンザウイルス、ＮＤＶ（Ｂ１株）およびＩＢＶ（Ｈ１２０株）については、ウイルスｃＤＮＡの１０倍希釈液を反応特異性の検討に使用した。
ＬＡＭＰ法の増幅反応は上記５と同様に、６０℃で６０分間の培養後に反応を停止させてから、紫外線照射によって判定したが、非特異反応の有無は、より厳格に確認するために、増幅反応時間は１２０分まで延長した。
【００８９】
６．感度の検討
ＬＡＭＰ法の標的となるＨ５亜型のＨＡ遺伝子の断片（A/duck/Tsukuba/9/2005(H5N2)株由来）の人工合成ＤＮＡ（４００塩基長、１０１０コピー／μｌ）を挿入したプラスミドテンペレートを１０倍階段希釈して、テンペレートの分子数を１０６コピー／μＬ〜１コピー／μＬの範囲に調製して、プラスミドテンペレートの階段希釈液を準備した。
またＰＣＲで増幅した、Ｈ５亜型のＨＡ遺伝子（A/duck/Tsukuba/9/2005(H5N2)株由来）のＰＣＲテンペレート（２７０塩基長、１０９コピー／μＬ）（上述）を１０倍階段希釈して、テンペレートの分子数を１０６コピー／μＬ〜１コピー／μＬの範囲に調製したＰＣＲテンペレートの希釈液を準備した。
これらの希釈液を用いて、Ｈ５亜型のＬＡＭＰ法の検出限界を調べた。ＬＡＭＰ法の増幅条件は、上記５と同様であるが、増幅時間は１２０分間とした。
【００９０】
７．遺伝子増幅に及ぼす塩基ミスマッチの影響
鳥インフルエンザウイルスのＨＡ遺伝子のような多様な遺伝子を標的とした場合、プライマーと標的遺伝子の塩基配列の間には、多数の塩基ミスマッチが起こると考えられる。塩基ミスマッチ数はウイルス株によって大きく異なると推察され、その数が少なければ遺伝子は容易に増幅されるが、多ければ増幅は困難となる。しかし、実際にどの程度の塩基ミスマッチ数を許容できるのかについては解明されておらず、プライマー設計の指針を構築する際の障害となっていた。
本研究では、ＰＣＲテンペレートとして、A/w. swan/Akita/1/2008 (H5N1)のＨ５−ＨＡ遺伝子を用いて、上記２（２）で設定した６種類、８領域のプライマー領域について、人工的に０〜３個の塩基ミスマッチを導入した各種プライマーを設計した。それらのプライマーを組み合わせてＬＡＭＰ法を行うことによって、プライマー領域当たり何個の塩基ミスマッチまでなら遺伝子増幅が起こるのか、合計で何個の塩基ミスマッチ数なら遺伝子増幅はされるのか、塩基ミスマッチの影響を受けやすいプライマー領域はあるのか、などについて調べた。調べた組合せ（全部で４６セット）を図９に示し、使用したプライマーの塩基配列を図１０に示した。なお、ＬＡＭＰ法の増幅と判定は上記４と同様の方法で行った。
【００９１】
８．塩基ミスマッチ解析
８−１．塩基ミスマッチ数の算出方法
プライマーとして、ＦＩＰプライマーおよびＢＩＰプライマーの領域にはＰプライマー（ＦＩＰ；配列番号１１５〜配列番号１１９、ＢＩＰ；配列番号１２２〜配列番号１２８）を用い、他の４つのプライマー領域（Ｆ３、Ｂ３、ＦＬ、ＢＬ）にはＭプライマー（ＦＬ；配列番号１２１、ＢＬ；配列番号１３０、Ｆ３；配列番号１２０、Ｂ３；配列番号１２９）を用いて、塩基ミスマッチ解析をおこなった。
ＦＩＰプライマーに対して、プライマーデータベースに登録された２２１１個のＨ５−ＨＡ遺伝子の塩基ミスマッチ数を算出する方法について説明する。
データベースにある２２１１個のＨＡ遺伝子の塩基配列のうち、ＦＩＰプライマーのＦ１とＦ２の２領域の塩基配列を取りだし、それらをＥｘｃｅｌ上で連結させ、一体の遺伝子としてデータベースを構築する。次に、上記２（２）の「Ｐプライマーの設計」で説明したように、あるＦＩＰプライマーとＨＡ遺伝子との間にある塩基ミスマッチ数を、全てのＨＡ遺伝子について求める。ただし、ＦＩＰプライマーは最終的に５本の短いＰプライマーが設計されているので、それぞれのプライマーに対して、全てのＨＡ遺伝子の塩基ミスマッチ数を算出することになる。具体的な例で説明する。
例えば、５本のＦＩＰ−Ｐプライマーのそれぞれに対して、あるＨＡ遺伝子の塩基ミスマッチ数が（Ｆ１，Ｆ２，Ｆ１＋Ｆ２）の順番で表記したとして、１本目（０，１，１）、２本目（１，１，２）、３本目（０，０，０）、４本目（２，１，３）、５本目（２，３，５）となったと仮定する。この場合、塩基ミスマッチ数が最少となる３本目のプライマー（０，０，０）であり、これが遺伝子増幅に関係することから、本ＦＩＰ−Ｐプライマーセットに対するこのＨＡ遺伝子の塩基ミスマッチ数は（０，０，０）と算出される。
ＢＩＰ-Ｐプライマーの塩基ミスマッチについても、ＦＩＰ−Ｐプライマーの方法に準じて、全てのＨＡ遺伝子についてＢ１領域、Ｂ２領域、Ｂ１＋Ｂ２領域毎に塩基ミスマッチ数を、７本のＰプライマーのそれぞれについて求めた。その中で、最少となる塩基ミスマッチ数をそのＨＡ遺伝子の塩基ミスマッチ数として、全てのＨＡ遺伝子について算出した。
Ｆ３、Ｂ３、ＦＬ、ＢＬのプライマー領域は、いずれも混合塩基を含むＭプライマーである。基本的にはＦＩＰプライマーと同様の方法で、各プライマーに対する塩基ミスマッチ数を全てのＨＡ遺伝子について算出した。その際に混合塩基の取扱いについては、以下の方法で行った。例えば、混合塩基Ｒは塩基Ａまたは塩基Ｇのいずれでも良いので、プライマーの配列が混合塩基Ｒの場合は、ＨＡ遺伝子の相当する位置の塩基配列は塩基Ａと塩基Ｇは合致するとし、それ以外の塩基（Ｃ，Ｔ）は塩基ミスマッチとして算出した。
【００９２】
８−２．Ｈ５−ＨＡ遺伝子増幅の推定
塩基ミスマッチ数が算出されたプライマー領域が、その遺伝子の増幅を可能にするか否かの判定は、上記２（２）「Ｐプライマーの設計」の（ｉｉｉ）「増幅判定」の基準に従って行った。
ＢＩＰ-Ｐプライマーの増幅の可否は、上記２（２）「Ｐプライマーの設計」の（ｉｉｉ）「増幅判定」の基準にしたがって、ＢＩＰプライマー領域単独として判定した。
また、個々のプライマー領域にある塩基ミスマッチ解析だけでなく、８ヶ所のプライマー領域の合計塩基ミスマッチ数からも、遺伝子増幅の可否を判定した。これによって、今回開発したＰＭ１６プライマーを用いた場合について、２２１１株のＨＡ遺伝子毎に、８ヶ所のプライマー領域の塩基ミスマッチのパターンを明らかにした。
ＬＡＭＰ法による増幅の判定基準は、表３の成績を参考にして行った。即ち、プライマー領域当たりの最大塩基ミスマッチ数が２以下で、かつ合計ミスマッチ数が１０個以下のＨＡ遺伝子は増幅可能と判定した。
【００９３】
結果
１．プライマー領域の設定
ユーラシア系統のＨ５−ＨＡ遺伝子に関し、A/duck/Tsukuba/9/2005(H5N2)のＨ５−ＨＡ遺伝子に対するＳプライマーは、ＨＡ（ヘマグルチニン）の開裂部位を跨ぐように設定した。Ｆ３、Ｆ２およびＦＬは、ＨＡ１領域に、Ｆ１、Ｂ１、ＢＬ、Ｂ２およびＢ３は、ＨＡ２領域に設定した。ＨＡ開裂部位を挟むように設定したのは、ＨＡ１領域がＨ５亜型に特異的であり、ＨＡ２領域が遺伝子間で保存性が高い領域であるからである。こうすることで、少ない本数のプライマーでＨ５亜型に属する全てのＨＡ遺伝子を検出できるようになった。なお、ＨＡ１領域は病原性、抗原性、多様性に関係する領域であり、ＨＡ２領域はウイルス外被に突き刺さったＨＡ２蛋白質で、ＨＡ１のスパイク蛋白質をウイルス粒子表面に提示する働きがある。
上記プライマーセットを用いて、プラスミドテンペレートに含まれるA/duck/Tsukuba/9/2005(H5N2)のＨ５−ＨＡ遺伝子をＬＡＭＰ法で検出できるかを調べたところ、２０分で検出することができた。
【００９４】
２．Ｐプライマーの有用性の検討
Ｓプライマーセットは、現在、報告されているＬＡＭＰ法用のプライマーとして利用されているプライマーと同等のものである。これを用いて、遺伝学的に多様性の高い１０株のＨ５−ＨＡ遺伝子の検出スペクトルを調べた。なお、テンペレートとしては、長いプライマーを用いたＰＣＲ法により合成したＰＣＲテンペレートを使用した（表１）。
【００９５】
【表１】
2018183057.tif 000002
その結果、Ｓプライマーを使用した場合は、１０株のＨＡ遺伝子のうち、４遺伝子しか検出することができなかった。Ｓプライマーセットは以下の通りである。
Ｓプライマーセット
ＦＩＰ；配列番号１４４
ＢＩＰ；配列番号１４５
ＦＬ  ；配列番号１４６
ＢＬ  ；配列番号１４７
Ｆ３  ；配列番号１４８
Ｂ３  ；配列番号１４９
また、Ｍプライマー（混合塩基を含むプライマー）は、多様性の高いＨ５亜型のＨＡ遺伝子を幅広くＰＣＲで検出するためには欠かせないプライマーであるが、ＬＡＭＰ法で使用した場合、どの程度有効であるかは不明であった。そこで、幅広く遺伝子を検出できるように、プライマーデータベースを参考にして、Ｓプライマーの設定領域と同じ領域にＭプライマーを設計し、その遺伝子検出率を調べた。その結果、ＰＣＲ法における有効性とは異なり、ＬＡＭＰ法においてＭプライマーを使用したとしても、１０のＨＡ遺伝子のうち、６遺伝子のみが検出できたに過ぎなかった。
このことから、ＭプライマーはＳプライマーセットより広い検出スペクトルを有するものの、多様な遺伝子を幅広く検出することはできなかった。
以上の結果から、ＬＡＭＰ法で多様なＨＡ遺伝子を幅広く検出するためには、新たなプライマーのセットが必要であることが明らかにされた。Ｍプライマーセットは以下の通りである。
Ｍプライマーセット
ＦＩＰ；配列番号１５０
ＢＩＰ；配列番号１５１
ＦＬ  ；配列番号１５２
ＢＬ  ；配列番号１５３
Ｆ３  ；配列番号１５４
Ｂ３  ；配列番号１５５
【００９６】
そこで、発明者らは、Ｈ５亜型のＨＡ遺伝子を網羅的に検出するために、以下のＰプライマーセットを上述のプライマー設計方法に基づいて作製した。
基本的には、ＦＩＰプライマーとＢＩＰプライマーはＰプライマーであるが、その他のＦ３、Ｂ３、ＦＬ、ＢＬプライマーは、混合塩基を含むプライマーとしても実施可能であった。このようにＰプライマーとＭプライマーを併用するプライマーセットは、ＰＭプライマーと称する。
（３）Ｐプライマーセット（ユーラシア系統用）
ＦＩＰ；配列番号１〜配列番号２０
ＢＩＰ；配列番号４６〜配列番号８２
ＦＬ  ；配列番号３５〜配列番号４５
ＢＬ  ；配列番号９３〜配列番号１１４
Ｆ３  ；配列番号２１〜配列番号３４
Ｂ３  ；配列番号８３〜配列番号９２
（４）ＰＭプライマーセット（ＰプライマーとＭプライマーを併用したプライマーセット）
（４）−１．ユーラシア系統用（「ＰＭ１６プライマーセット」）
ＦＩＰ；配列番号１１５〜配列番号１１９
ＢＩＰ；配列番号１２２〜配列番号１２８
ＦＬ  ；配列番号１２１
ＢＬ  ；配列番号１３０
Ｆ３  ；配列番号１２０
Ｂ３  ；配列番号１２９
（４）−２．アメリカ系統用
ＦＩＰ；配列番号１３１〜配列番号１３３
ＢＩＰ；配列番号１３４〜配列番号１３６
ＦＬ  ；配列番号１３９〜配列番号１４１
ＢＬ  ；配列番号１４３
Ｆ３  ；配列番号１３７〜配列番号１３８
Ｂ３  ；配列番号１４２
ユーラシア系統のＨ５亜型ＨＡ遺伝子に対する１１４本のプライマー（ＦＩＰ；配列番号１〜配列番号２０、ＢＩＰ；配列番号４６〜配列番号８２、ＦＬ；配列番号３５〜配列番号４５、ＢＬ；配列番号９３〜配列番号１１４、Ｆ３；配列番号２１〜配列番号３４、Ｂ３；配列番号８３〜配列番号９２）から構成されるＰプライマーセットを上述の方法により設計した。
【００９７】
１１４本のＰプライマーを用いてＬＡＭＰ法を行ってみたところ、驚くべきことに、１０種類のＨＡ遺伝子の全てが６０分以内に増幅されることが分かった（表１）。このことから、ＬＡＭＰ法で多様な遺伝子を幅広く検出するには、Ｐプライマーが必須であることが明らかになった。
しかし、Ｐプライマーの総数は１１４本と多いため、その数を減らすために、ＰプライマーをＭプライマーと置き換えることが可能かについて検討した。まず、Ｆ３およびＢ３のプライマーサイトをＭプライマーで置き換えたところ、プライマー数を８６本に減らすことができ、１０種類全てのＨＡ遺伝子が増幅できた。また、ＦＬおよびＢＬのプライマーサイトをＭプライマーで置き換えたところ、プライマー数を７６本に減らすことができ、１０種類全てのＨＡ遺伝子が増幅できた（表１）。さらに、４つの領域（Ｆ３、Ｂ３、ＦＬおよびＢＬ）のＰプライマーをＭプライマーに置き換えた場合、プライマーの総数は５６本ともっとも減らすことができ、かつ１０種類全てのＨＡ遺伝子を増幅できた。他方、ＦＩＰおよびＢＩＰのプライマーをＭプライマーに置き換えると、１株ではあったが検出漏れが生じることが分かった（表１）。
以上の結果から、Ｆ３、Ｂ３、ＦＬおよびＢＬの領域にはＭプライマー、ＦＩＰとＢＩＰの領域にはＰプライマーを用いれば、検出スペクトルの広さとプライマー数の減少を兼ねた実用的なＬＡＭＰ法を構築できることが明らかになった。
【００９８】
３．ＦＩＰおよびＢＩＰプライマーの長さの検討
鳥インフルエンザウイルスの診断にＬＡＭＰ法を普及させるためには、ＦＩＰおよびＢＩＰプライマーの数をさらに少なくすることが望ましい。Ｐプライマーの設計を何度もやり直したが、プライマーの数を減らすことはできなかった。プライマーの本数が増える原因は、多様性がある領域を広くカバーしようとすることに起因していたので、プライマーの長さを短くして、多様性を確保することを検討した。その結果、１１４本のＰプライマーセット（「バージョン１」とする）のＦＩＰプライマーとＢＩＰプライマーは、各々、４０ベースと３６ベースであったが、ＦＩＰプライマーを３０ベース（配列番号１１５〜配列番号１１９）に、ＢＩＰプライマーを２８ベース（配列番号１２２〜１２８）に調製した結果、プライマーの総数を１６本にすることができた（バージョン２、ＦＩＰ；配列番号１１５〜配列番号１１９、ＢＩＰ；配列番号１２２〜配列番号１２８、ＦＬ；配列番号１２１、ＢＬ；配列番号１３０、Ｆ３；配列番号１２０、Ｂ３；配列番号１２９；「ＰＭ１６プライマーセット」）。
ＰＭ１６プライマーセットを用いて、前述の１０種類のＨ５−ＨＡ遺伝子に対する検出スペクトルを調べた。その結果、表２に示すように、１０種類のＨ５−ＨＡ遺伝子の全てを、ＰＭ１６プライマーセットで検出することができ、検出時間は平均４４分で、１１４本のＰプライマーを使用した場合の検出時間（平均４５分）と同等であった。
【００９９】
バージョン２のＰＭ１６プライマーセットについて、プライマー濃度を２倍に濃くしたところ、検出時間は平均３５分で、バージョン１のＰプライマーセットを使用した場合の検出時間よりも約１０分に短縮された。この実験には、最近、アジアで流行しているH5N1亜型ウイルスのＨＡ遺伝子５株のＰＣＲテンペレートを追加した。表２に示すように、１５種類のユーラシア系統のＨ５−ＨＡ遺伝子は、ＰＭ１６プライマーセットを用いたＬＡＭＰ法によって全て検出された。
以上の結果から、ＦＩＰおよびＢＩＰプライマーをより短くし、使用濃度を濃くすると、プライマー数を顕著に減らせ、多様なインフルエンザウイルスのＨＡ遺伝子を幅広く、迅速に検出することが可能になった。
【表２】
2018183057.tif 000003
【０１００】
４．参照株の塩基ミスマッチ解析
本実施例で使用した１５種のＰＣＲテンペレートのヌクレオチド配列と、ＰＭ１６プライマーセットのプライマーとの塩基ミスマッチ解析を行い、その結果を表３にまとめた。ＰプライマーのＦＩＰとＢＩＰは、塩基ミスマッチ数が２以下となるように設計したため、実際の塩基ミスマッチ数は、予想通り２以下であった。他方、混合塩基プライマーであるＦ３、Ｂ３、ＦＬおよびＢＬの領域では、塩基ミスマッチ数が０〜３であり、塩基ミスマッチは、Ｆ３およびＢ３プライマーの結合サイトに比較的多く存在していた。以上の結果から、プライマーの塩基配列とテンペレートとの塩基ミスマッチ数が、プライマー領域当たり１〜２個であれば、ＬＡＭＰ法による遺伝子増幅の支障にはならないことが示唆された。
また、１株当たりの塩基ミスマッチ数０〜７個で、この範囲内であれば、ＬＡＭＰ法による遺伝子増幅の障害にはならないことが示唆された。
【表３】
2018183057.tif 000004
【０１０１】
５．遺伝子増幅に及ぼす塩基ミスマッチの影響
プライマーの塩基配列とプライマーの結合領域との間の塩基ミスマッチ数が、ＬＡＭＰ法による遺伝子増幅にどの程度影響を及ぼすかは明らかにされていない。そこで、プライマーとテンペレートの間に塩基ミスマッチ生じるように作製したプライマー使用してＬＡＭＰ法を行い、遺伝子増幅がどう影響を受けるか調べた。実験では、テンペレートとして、A/w. swan/Akita/1/2008(H5N1)  由来のＨＡ遺伝子のＰＣＲテンペレートを用い、それぞれのプライマー領域には０〜３個の塩基ミスマッチを導入し、遺伝子が６０分以内に増幅されるか否かを調べた。調べたプライマーの組合せは図９に示したとおり、合計で４６通りに及んだ。また、用いたプライマー配列を図１０（図１０のプライマーIDが図９の「プライマーの組み合わせ」に表示されている）に示す。
その結果、表４に示すように、４６通り中４１通りにおいて、６０分以内にＨＡ遺伝子を増幅することができた。ミスマッチ数合計が１２個以内であれば、６０分以内にＨＡ遺伝子を検出することが可能であった。ただし、この場合であっても、プライマー領域当たりの塩基ミスマッチ数は２個以内であることが確認された。６０分以内にＨＡ遺伝子を増幅できなかった５個のＨＡ遺伝子について、塩基ミスマッチ数の合計が１４〜１６個の範囲では、ＨＡ遺伝子の増幅に７５分を要し、１６個以上、あるいはプライマー領域当たり３個の塩基ミスマッチがあると、遺伝子増幅は困難であった。
これらの結果から、プライマー当たりの塩基ミスマッチ数が２個以内で、８領域の塩基ミスマッチ数の合計が１０個以内であれば、ＬＡＭＰ法によりＨＡ遺伝子を増幅できることが明らかになった。また、多様なＨ５亜型のＨＡ遺伝子をＬＡＭＰ法で幅広く検出するには、ＰＭ１６プライマーセットは必須であることが明らかになった。
【表４】
2018183057.tif 000005
【０１０２】
６．GenBankに登録されている２２１１個のＨ５−ＨＡ遺伝子の増幅推定
表４の塩基ミスマッチ解析の成績から、本実施例で開発したＰＭ１６プライマーセットは、多様な遺伝子を幅広く検出できる可能性が示唆された。そこで、GenBankに登録されている２２１１個のＨ５−ＨＡ遺伝子（ユーラシア系統）を用いて、ＰＭ１６プライマーセットを用いた場合のＬＡＭＰ法の遺伝子検出率の推定を行った。個々のＨＡ遺伝子の増幅は、ＰＭ１６プライマーセットと個々のＨＡ遺伝子との塩基ミスマッチ数を基に推定した。
塩基ミスマッチ数は、ＦＩＰ領域（Ｆ１＋Ｆ２）、ＢＩＰ領域（Ｂ１＋Ｂ２）、他の４領域（Ｆ３，Ｂ３，ＦＬ，ＢＬ）の３つに分けて、グループ毎に塩基ミスマッチとＨＡ遺伝子数を調べ、表５にまとめた。
【表５】
2018183057.tif 000006
【０１０３】
ＦＩＰプライマー領域に関して、ＨＡ遺伝子の９５％（２０１７遺伝子）が、ＢＩＰプライマー領域に関しては９７％（２１４４遺伝子）が、塩基ミスマッチが０または１個であった。表４の成績から、これらの塩基ミスマッチは遺伝子増幅の障害にはならないと考えられるため、これらの遺伝子は増幅可能と判定された。
表４の結果から、ＦＩＰプラマーおよびＢＩＰプライマーの塩基ミスマッチ数が３個であっても、Ｆ１領域とＦ２領域のいずれか、Ｂ１領域とＢ２領域のいずれかに偏ってなければ、増幅可能と判断することができた。
一方、表５から、ＦＩＰまたはＢＩＰのプライマー領域に２個または３個以上の塩基ミスマッチを持つＨＡ遺伝子は、ＦＩＰ領域でそれぞれ１００個、４個、ＢＩＰ領域では６２個、５個、他の４領域では４個、４個であった。これらのＨＡ遺伝子については、１つのプライマー領域にある塩基ミスマッチ数だけでなく、他のプライマー領域にある塩基ミスマッチの影響を強く受ける可能性が高い。そこでこれらについては、全てのプライマー領域（Ｆ１、Ｂ１、Ｆ２、Ｂ２、Ｆ３、Ｂ３、ＦＬ、ＢＬの８サイト）の塩基ミスマッチパターンから、遺伝子増幅の可否を判定した。
【０１０４】
表６には、８つのプライマー領域の塩基ミスマッチパターンに基づいて、遺伝子増幅を判定することになった２３個のＨＡ遺伝子とその塩基ミスマッチパターンを示した。同一遺伝子が複数のプライマー領域で抽出された場合は一方にまとめた。
これらについて、表４の基準にしたがって遺伝子増幅を推定したところ、増幅困難と判定された遺伝子は、A/duck/Taiwan/DV30-2/2005(H5N2)のＨＡ遺伝子（CY110933）とA/chicken/Egypt/34-2/2008(H5N1) のＨＡ遺伝子（CY062604）だけであった。それら以外の２１個のＨＡ遺伝子は、合計の塩基ミスマッチ数は２〜７個で、プライマー領域にある塩基ミスマッチの偏りもなかった。なお、A/duck/Tsukuba/168/2005(H5N2)のＨＡ遺伝子は、表２で実際に増幅できた遺伝子であり、これと同等の塩基ミスマッチパターンを持つ、A/duck/Korea/GJ54/2004(H5N2)由来のＨＡ遺伝子も増幅可能と判定された。
これらの成績から、GenBankに登録されているＥＵ系統の２２１１個のＨ５−ＨＡ遺伝子のうち、２２０９個のＨＡ遺伝子は、ＰＭ１６プライマーセットを用いたＬＡＭＰ法で増幅可能と判定された。
【表６】
2018183057.tif 000007
【０１０５】
７．本実施例のプライマーを使用したＬＡＭＰ法の反応特異性
本実施例のプライマー（ＰＭ１６プライマーセット）を使用したＨ５亜型のＬＡＭＰ法の反応特異性について、Ｈ１〜Ｈ１２亜型の鳥インフルエンザウイルス遺伝子、ＮＤＶ（Ｂ１株）およびＩＢＶ（Ｈ１２０株）を用いて検討した。
その結果、ＰＭ１６プライマーセットを使用したＨ５亜型のＬＡＭＰ法では、Ｈ５亜型のＨＡ遺伝子のみが検出され、他のＨＡ亜型及び鶏病ウイルスは検出されなかった。なお、コントロール実験として行ったリアルタイムＰＣＲによっても、Ｈ５亜型のテンペレートのみが検出された。
この結果から、本実施例のプライマーを使用したＬＡＭＰ法は、Ｈ５亜型のＨＡ遺伝子を特異的に検出することが確認できた。
【０１０６】
８．ＰＭ１６プライマーセットを用いたＬＡＭＰ法の検出感度
A/duck/Tsukuba/9/2005(H5N2)のＨＡ遺伝子に由来するＰＣＲテンペレートを希釈して、１ウエル当たりの分子数として１０６〜１となるようにして調整した。これをテンペレートにしてＬＡＭＰ法の検出感度を調べた。６０℃、６０分間の培養後、増幅を確認したところ、プラスミドテンペレートとＰＣＲテンペレートのいずれにおいても、検出限界は１ウエル当たり１，０００分子であった。また、A/whooper swan/Akita/1/2008 (H5N1)のＰＣＲテンペレートを用いた場合の検出限界も同様であった。
これらの結果から、本発明に係るＰＭ１６プライマーセットを使用したＬＡＭＰ法の感度は、Ｈ５−ＨＡ遺伝子を臨床サンプルからウイルス遺伝子を直接検出するのに十分に高感度であることが確認できた。
【０１０７】
また、ユーラシア系統用の「ＰＭ１６プライマーセット」は、ユーラシア系統のＨ５亜型ＨＡ遺伝子を広く検出できたことから、アメリカ系統のＨ５亜型-ＨＡ遺伝子をどの程度、検出可能かについて検討した。
アメリカ系統のＨ５−ＨＡ遺伝子３８６個の塩基配列を”Influenza Virus Resource”からダウンロードし、アメリカ系統Ｈ５プライマーデータベースを作製した。このデータベースを使用して、ＰＭ１６プライマーセットによる検出の可否を調べた。以下の判定基準（表７）を満たすＨＡ遺伝子は検出可能と判定した。
【０１０８】
【表７】
2018183057.tif 000008
その結果、３５３個のアメリカ系統のＨ５−ＨＡ遺伝子は検出できると判断された。残りの３３個のＨＡ遺伝子は８領域全ての塩基ミスマッチパターンを調べ、表８にまとめた。Ｆ１、Ｂ１またはＢ２の領域に３個の塩基ミスマッチを４個持つ遺伝子（１，５，６，９）が認められた。このうち２個は同一パターン（５，６）だったので、３個の遺伝子についてＰＣＲテンペレートを合成し、ＰＭ１６プライマーセットを用いて、ＬＡＭＰ法による遺伝子増幅の可否を調べた。その結果、３個の遺伝子（１，５，９）は何れも増幅された。また残りの遺伝子は、ＢＩＰに４個の塩基ミスマッチを持つ３個の遺伝子と、Ｆ３、Ｂ３、ＦＬ、ＢＬのいずれかに２個の塩基ミスマッチを持つ６個の遺伝子（表８）であることが解った。表４の成績を参考にして、これら9遺伝子の検出の可否を推定した。その結果、これらの９遺伝子は全て増幅可能と判定された。以上の結果から、ＰＭ１６プライマーセットを用いたＬＡＭＰ法によって、アメリカ系統のＨ５−ＨＡ遺伝子（３８６個株）は全て増幅可能と判定された。
【表８】
2018183057.tif 000009
【０１０９】
また、上記１３個のＨＡ遺伝子を確実に検出するために、これらに特化したＦＩＰプライマーおよびＢＩＰプライマーを設計した。
ＦＩＰプライマー：GCAAGRACCAGTTTATGTTCATCCTCTTAC（配列番号１５６）
ＢＩＰプライマー：GGACTAAGAAACCCTTCTATRAATCCTGC（配列番号１５７）
これらのプライマーをＰＭ１６プライマーセットに加えた、ＰＭ１８プライマーセットは、上記１３個のＨＡ遺伝子に対して塩基ミスマッチ数が少ないことから、アメリカ系統のＨＡ遺伝子をより確実に増幅可能と期待される。
以上の結果から、ＰＭ１８プライマーセットを用いたＬＡＭＰ法は、ＨＡ亜型のユーラシア系統およびアメリカ系統のＨ５−ＨＡ遺伝子を確実に検出できると判定された。
【産業上の利用可能性】
【０１１０】
本発明は、インフルエンザウイルスの多様なＨＡまたはＮＡ遺伝子を幅広く検出し、ＨＡ及びＮＡ亜型を判定する、精度の高いＬＡＭＰ法用プライマーおよび判定方法に関するものである。本方法は従来法と比較すると、標的遺伝子の検出漏れを顕著に改善し、ＨＡまたはＮＡの遺伝子を亜型特異的且つ網羅的に検出することを可能にしたもので、迅速、簡便なＬＡＭＰ法の実用性を著しく向上させることができる。本法は、変異し易く、多様な病原体によって引き起こされる感染症に対する遺伝子診断法の信頼度を高める技術として、その活用が多いに期待されるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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