(57)【要約】【課題】Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａもしくは毒素Ｂのいずれかまたは毒素Ａおよび毒素Ｂの両方に結合する完全ヒト抗体、前記抗体を含む組成物、ならびに使用方法を提供すること。【解決手段】本発明の抗体は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来の毒素を中和するのに有用であるので、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによって引き起こされる下痢または偽膜性大腸炎の処置を含む、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症に関連する疾患および症候を処置する手段を提供する。前記抗体はまた、前記原発性疾患の重症度および／もしくは持続期間を予防し得るか、またはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの存在に起因する疾患の再発の回数、持続期間および／もしくは重症度、または再燃を予防し得る。本発明の抗体はまた、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによる感染症の診断に有用であり得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａおよび／または毒素Ｂに特異的に結合するヒト抗体およびヒト抗体の抗原結合断片、これらの抗体を含む組成物、ならびにこれらの抗体の治療的使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）はグラム陽性で嫌気性の胞子形成性細菌であり、軽度から重度に及ぶ下痢および大腸炎の症候をもたらすヒトにおける院内感染胃腸疾患の主要な原因である。アンピシリン、アモキシシリン、セファロスポリン、フルオロキノロンおよびクリンダマイシンなどの広域抗生物質による処置により正常な腸内細菌叢が破壊され得ると、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅが腸に定着することが可能になると考えられている（Ｋｅｌｌｙ  ａｎｄ  Ｌａｍｏｎｔ，（１９９８），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．４９：３７５−９０）。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症の処置は、広域抗生物質の使用を停止または変更することを含む場合があり、例えば、バンコマイシン、メトロニダゾールまたはフィダキソマイシンなどの特定の抗クロストリジウム抗生物質による処置を開始することを必要とする。
【０００３】
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症を患っている患者で観察される下痢および炎症は、この細菌による２つの毒素（エンテロトキシン（毒素Ａ）および細胞毒素（毒素Ｂ））の産生に起因すると考えられている。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素ＡおよびＢは、ＧＴＰａｓｅのＲｈｏファミリーのメンバーを阻害する高分子量のグルコシルトランスフェラーゼである。毒素Ａは３０８ｋＤａの分子量を有し、毒素Ｂは２７０ｋＤａの分子量を有する。毒素Ａおよび毒素Ｂは両方とも、トレオニン残基のグルコシル化によって、Ｒｈｏ、ＲａｃおよびＣｄｃ４２などの低分子量ＧＴＰａｓｅを失活させる。これらのＧＴＰａｓｅの阻害は、細胞骨格の脱重合、ある特定のストレス活性化タンパク質キナーゼの遺伝子転写、ホスファチジルイノシトールビスリン酸の合成低下、およびおそらくはさらに細胞極性の喪失につながるシグナル伝達カスケードの停止を引き起こす。細胞骨格構造の喪失は細胞円形化をもたらし、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対する宿主反応の原因であり得る。細胞円形化アッセイでは、毒素Ｂは、毒素Ａよりも少なくとも１，０００倍細胞毒性である。
【０００４】
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素ＡおよびＢはアミノ酸含量が６３％相同であり、類似の三次元構造を有する（Ｄａｖｉｅｓ，ＡＨ，（２０１１），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，４３６：５１７−５２６）。各毒素のＣ末端側の３分の１は、クロストリジウム反復オリゴペプチド（ＣＲＯＰ）と称される高抗原性配列から構成される。毒素ＡおよびＢのＮ末端側の残り３分の２は、配列相同性に関しては互いにそれほど類似しない；しかしながら、各タンパク質のこの部分は、グルコシルトランスフェラーゼ活性を含有する。
【０００５】
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによる感染後の下痢および炎症の発症における毒素Ａおよび／または毒素Ｂの役割は、動物モデルにおける観察結果から裏付けられている。例えば、毒素の経口投与は前記疾患を模倣する（Ｋｅｌｌｙ  ａｎｄ  Ｌａｍｏｎｔ，（１９９８），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．４９：３７５−９０）。毒素ＡおよびＢを欠く突然変異株は、病原性が減少または変化している（Ｌｙｒａｓ  Ｄ，Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ  ＪＲ，Ｈｏｗａｒｔｈ  ＰＫら、Ｎａｔｕｒｅ  ４５８（７２４２），１１７６−１１７９（２００９）；Ｋｕｅｈｎｅ  ＳＡ，Ｃａｒｔｍａｎ  ＳＴ，Ｈｅａｐ  ＪＴ，Ｋｅｌｌｙ  ＭＬ，Ｃｏｃｋａｙｎｅ  Ａ，Ｍｉｎｔｏｎ  ＮＰ，Ｎａｔｕｒｅ  １５，４６７（７３１６），７１１−７１３（２０１０）．）。さらに、毒素に対するポリクローナル抗体の投与は、前記疾患からハムスターを保護することが示されている（Ｇｉａｎａｓｃａら、（１９９９），Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６６（２）：５２７−３８）。臨床では、抗毒素Ａまたは抗毒素Ｂ抗体の存在と、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに関連する下痢および疾患再発に対する保護との間には相関があるという研究が示されている（Ｗａｒｎｙ，Ｍら、（１９９４），Ｉｎｆ．Ｉｍｍｕｎ．６２（２）：３８４−３８９；Ｋｙｎｅ，Ｌら、（２００１），Ｌａｎｃｅｔ  ３５７：１８９−１９３；Ｌｅａｖ，Ｂ．Ａ．，（２０１０），Ｖａｃｃｉｎｅ  ２８（４）：９６５−９６９）。抗毒素抗体の開発は、無症状保菌者を伴う（Ｋｙｎｅ，Ｌら、（２０００），ＮＥＪＭ  ３４２（６），３９０−３９７）。さらに、メトロニダゾールまたはバンコマイシンと併せてＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ抗毒素Ａおよび抗毒素Ｂ抗体の組み合わせを使用した臨床試験では、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによる再発性感染症の割合が減少した（Ｌｏｗｙ，Ｉら、（２０１０），ＮＥＪＭ  ３６２（３）：１９７−２０５）。
【０００６】
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒性Ａに対するモノクローナル抗体が、Ｗｉｌｋｉｎｓらによって米国特許第４，８７９，２１８号明細書に記載されている。加えて、Ｒｏｔｈｍａｎらは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素ＡおよびＢと交差反応するマウスモノクローナル抗体について記載した。さらに、Ｃｏｕｇｈｌｉｎらは、毒素Ａと交差反応しなかったＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ｂに対して特異的なモノクローナル抗体について記載した。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素に対する他の抗体が記載されている（例えば、ＵＳ７，１５１，１５９；ＵＳ７，６２５，５５９；ＵＳ８，２３６，３１１；ＵＳ８，２５７，７０９；ＵＳ公開番号２００９／００８７４７８；ＵＳ２０１０／０２３３１８２；ＵＳ２０１０／０２３３１８１；ＵＳ２０１２／０２８８５０８；ＵＳ２０１２／０１２１６０；ＵＳ２０１１／００２０３５６；ＵＳ２０１２／０１２１６０７；ＥＰ１７６６０９３Ｂ１；ＥＰ１０２４８２６Ｂ１；ＥＰ１５６８３７８Ａ１；ＥＰ２３０５３０３Ａ２；ＥＰ２３０５２９３Ａ２；ＥＰ２４０５９４０Ａ１；ＥＰ２２６１２５３Ａ２；ＷＯ２００６／１２１４２２；ＷＯ２０１１／１３０６５０；ＷＯ２０１０／０９４９７０；ＷＯ２００９／１０８６５２；ＷＯ２０１１／０６３３４６およびＷＯ２００５／０５８３５３を参照のこと）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｋｅｌｌｙ  ａｎｄ  Ｌａｍｏｎｔ，（１９９８），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．４９：３７５−９０
【非特許文献２】Ｄａｖｉｅｓ，ＡＨ，（２０１１），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，４３６：５１７−５２６
【非特許文献３】Ｌｙｒａｓ  Ｄ，Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ  ＪＲ，Ｈｏｗａｒｔｈ  ＰＫら、Ｎａｔｕｒｅ  ４５８（７２４２），１１７６−１１７９（２００９）
【非特許文献４】Ｋｕｅｈｎｅ  ＳＡ，Ｃａｒｔｍａｎ  ＳＴ，Ｈｅａｐ  ＪＴ，Ｋｅｌｌｙ  ＭＬ，Ｃｏｃｋａｙｎｅ  Ａ，Ｍｉｎｔｏｎ  ＮＰ，Ｎａｔｕｒｅ  １５，４６７（７３１６），７１１−７１３（２０１０）
【非特許文献５】Ｇｉａｎａｓｃａら、（１９９９），Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６６（２）：５２７−３８
【非特許文献６】Ｗａｒｎｙ，Ｍら、（１９９４），Ｉｎｆ．Ｉｍｍｕｎ．６２（２）：３８４−３８９
【非特許文献７】Ｋｙｎｅ，Ｌら、（２００１），Ｌａｎｃｅｔ  ３５７：１８９−１９３
【非特許文献８】Ｌｅａｖ，Ｂ．Ａ．，（２０１０），Ｖａｃｃｉｎｅ  ２８（４）：９６５−９６９
【非特許文献９】Ｋｙｎｅ，Ｌら、（２０００），ＮＥＪＭ  ３４２（６），３９０−３９７
【非特許文献１０】Ｌｏｗｙ，Ｉら、（２０１０），ＮＥＪＭ  ３６２（３）：１９７−２０５
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の簡単な概要
本発明は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）によって産生される毒素Ａまたは毒素Ｂのいずれかに特異的に結合するか、またはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａおよび毒素Ｂの両方に結合する（すなわち、毒素Ａおよび毒素Ｂの両方と交差反応するヒトモノクローナル抗体）完全ヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）およびその抗原結合断片を提供する。このような抗体は、毒素Ａもしくは毒素Ｂのいずれかまたは両方に関連する毒性を中和するのに有用であり得、そのようなものとして、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに関連する原発性症状もしくは疾患の重症度を低減するか、または疾患再発の回数、持続期間もしくは重症度を軽減するか、またはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに関連する症状（condition）もしくは疾患に関連する少なくとも１つの症候を改善する
ように作用し得る。このような抗体は単独で、またはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに関連する症状または疾患を処置するのに有用な第２の薬剤と併せて使用され得る。ある特定の実施形態では、毒素Ａ、毒素Ｂまたはその両方に対して特異的な抗体は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに関連する原発性症状もしくは疾患の重症度を低減するため、または疾患再発の回数、持続期間もしくは重症度を軽減するため、またはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに関連する症状もしくは疾患に関連する少なくとも１つの症候を改善するための第２の薬剤と併せて治療的に投与され得る。ある特定の実施形態では、抗体は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに関連する症状または疾患を発症するリスクを有する患者を保護するための単独の治療法として予防的に使用され得る。例えば、高齢患者、または患者をＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症にかかりやすくし得る慢性および／もしくは随伴性基礎病状を有する患者を含むある特定の患者集団は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ症状または疾患を発症するリスクを有し得る。他の有リスク患者集団には、長期間の入院患者、および広域抗生物質（正常な腸内細菌叢を破壊し、患者をＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによる感染症にかかりやすくし得るもの）を服用している患者が含まれる。より最近のデータは、プロトンポンプ阻害剤（ＰＰＩ）を服用している患者が、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに関連する下痢を発症するリスクを有することを示唆している（Ｙｅａｒｓｌｅｙ，Ｋら、（２００６），Ａｌｉｍｅｎｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．２４（４）：６１３−６１９；Ｌｏｗｅ，ＤＯら、Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．（２００６），４３（１０）：１２７２−１２７６）。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症を発症するリスクを有する他の患者集団には、任意の種類の免疫抑制療法、例えば限定されないが、抗癌薬、ある特定の癌を処置するための一般的な放射線療法、または移植後の組織もしくは器官移植片拒絶を予防するための薬物もしくは投薬計画を受けている患者が含まれる。長期の入院、広域抗生物質の服用、および化学療法に関係する腸溶性粘膜関門の破壊により、造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）を受ける患者は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症を発症するリスクが特に高い場合がある（Ｔｈｉｂａｕｌｔ，Ａら、（（１９９１），Ｉｎｆｅｃｔ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｈｏｓｐ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．１２：３４５−８；Ａｎａｎｄ，Ａら、（１９９３），Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７：１０９−１３）。固形器官移植を受ける患者もまた、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症を発症するリスクを有し得る。自己免疫性疾患を患っている患者、または透析中の患者は、有リスク集団に含まれる。より最近の研究では、自己または同種ＨＳＣＴのいずれかを受けた患者は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症を発症するリスクがより大きかっただけではなく、これらの患者は、移植片対宿主病における消化管病変（ＧＩ−ＧＶＨＤ）を発症するリスクもより高かったことが実証された（Ａｌｏｎｓｏ，Ｃ．Ｄら、（２０１２），Ｃｌｉｎ  Ｉｎｆ．Ｄｉｓ，５４：１０５３−１０６３）。本研究では、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症は、ＨＳＣＴ後によく見られる早期合併症であったことが明確に実証されたが、Ｃ��ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症（ＣＤＩ）と、ＧＩ管を障害するＧＶＨＤとの間の正確な関係性または相互作用をより詳細に調査する必要がある。単独で、またはメトロニダゾール、バンコマイシンもしくはフィダキソマイシンなどの第２の薬剤と併せて投与する場合、これらの患者集団のいずれかは、本発明の抗体による処置から恩恵を受けることができる。
【０００９】
本発明の抗体は、全長（例えば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４抗体）でもよいし、または抗原結合部分（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２またはｓｃＦｖ断片）のみを含んでもよし、機能性に影響を与える（例えば、残ったエフェクター機能を排除する）ように改変してもよい（Ｒｅｄｄｙら、（２０００），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：１９２５−１９３３）。
【００１０】
したがって、第１の態様では、本発明は、毒素Ａもしくは毒素Ｂのいずれかに結合するか、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａおよび毒素Ｂの両方に結合するかもしくはこれらの両方と交差反応する単離された完全ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、
ａ）Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａに特異的に結合する前記単離された抗体またはその抗原結合断片が、配列番号２、９８、１１４、１３０、１４６および１６２からなる群より選択される重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）アミノ酸配列内に含まれる３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）と、配列番号１０、１０６、１２２、１３８、１５４および１７０からなる群より選択される軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）アミノ酸配列内に含まれる３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）とを含み；
ｂ）Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ｂに特異的に結合する前記単離された抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１７８、１９４、２１０、２２６、２４２、２５８、２７４、２９０、３０６、３２２、３３８および３５４からなる群より選択されるＨＣＶＲアミノ酸配列内に含まれるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３と、配列番号１８６、２０２、２１８、２３４、２５０、２６６、２８２、２９８、３１４、３３０、３４６および３６２からなる群より選択されるＬＣＶＲアミノ酸配列内に含まれるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３とを含み；および
ｃ）Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａおよび毒素Ｂの両方に結合するか、またはこれらの両方と交差反応する前記単離された抗体または抗原結合断片が、配列番号１８、３４、５０、６６および８２からなる群より選択されるＨＣＶＲアミノ酸配列内に含まれるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３と、配列番号２６、４２、５８、７４および９０からなる群より選択されるＬＣＶＲアミノ酸配列内に含まれるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３とを含む、単離された完全ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００１１】
一実施形態では、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａおよび毒素Ｂの両方に結合する／これらの両方と交差反応するヒトモノクローナル抗体は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａ（ＣＢＤ−Ａ：配列番号３７５）および毒素Ｂ（ＣＢＤ−Ｂ：配列番号３７６）の両方のカルボシキ末端受容体結合ドメイン（ＣＢＤ）に特異的に結合する。
【００１２】
一実施形態では、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａおよび毒素Ｂの両方に結合する／これらの両方と交差反応する単離されたヒト抗体またはその抗原結合断片は、１０−７Ｍ以下のＫＤで毒素Ａおよび毒素Ｂに結合する。
【００１３】
一実施形態では、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａおよび毒素Ｂの両方に結合する／これらの両方と交差反応する単離されたヒト抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１８、３４、５０、６６および８２からなる群より選択される重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）配列のいずれか１つの中に含まれる３つの重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）と、配列番号２６、４２、５８、７４および９０からなる群より選択される軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）配列のいずれか１つの中に含まれる３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）とを含む。ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを同定するための方法および技術は当技術分野で周知であり、本明細書で開示される特定のＨＣＶＲおよび／またはＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを同定するのに使用され得る。ＣＤＲの境界を同定するのに使用され得る例示的な慣例には、例えば、Ｋａｂａｔの定義、Ｃｈｏｔｈｉａの定義およびＡｂＭの定義が含まれる。一般的には、Ｋａｂａｔの定義は配列可変性に基づくものであり、Ｃｈｏｔｈｉａの定義は構造ループ領域の位置に基づくものであり、ＡｂＭの定義はＫａｂａｔのアプローチとＣｈｏｔｈｉａのアプローチとの間の折衷案である。例えば、Ｋａｂａｔ，”Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）；Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉら、（１９９７），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７−９４８；およびＭａｒｔｉｎら、（１９８９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：９２６８−９２７２を参照のこと。抗体内のＣＤＲ配列を同定するために、公的なデータベースも利用可能である。
【００１４】
一実施形態では、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａおよび毒素Ｂの両方に結合する／これらの両方と交差反応する単離されたヒト抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１８、３４、５０、６６および８２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲを含む。
【００１５】
一実施形態では、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａおよび毒素Ｂの両方に結合する／これらの両方と交差反応する単離されたヒト抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２６、４２、５８、７４および９０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む。
【００１６】
一実施形態では、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａおよび毒素Ｂの両方に結合する／これらの両方と交差反応する単離されたヒト抗体またはその抗原結合断片は、（ａ）配列番号１８、３４、５０、６６および８２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲと、（ｂ）配列番号２６、４２、５８、７４および９０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲとを含む。
【００１７】
一実施形態では、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａおよび毒素Ｂの両方に結合する／これらの両方と交差反応する単離されたヒト抗体またはその抗原結合断片は、
（ａ）配列番号２０、３６、５２、６８および８４からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１ドメイン；
（ｂ）配列番号２２、３８、５４、７０および８６からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２ドメイン；
（ｃ）配列番号２４、４０、５６、７２および８８からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３ドメイン；
（ｄ）配列番号２８、４４、６０、７６および９２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１ドメイン；
（ｆ）配列番号３０、４６、６２、７８および９４からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２ドメイン；および
（ｇ）配列番号３２、４８、６４、８０および９６からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３ドメイン
を含む。
【００１８】
一実施形態では、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａおよび毒素Ｂの両方に結合する／これらの両方と交差反応するヒト抗体またはその抗原結合断片は、それぞれ配列番号２０、２２および２４のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３アミノ酸配列と、それぞれ配列番号２８、３０および３２のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３アミノ酸配列とを含む。
【００１９】
一実施形態では、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａおよび毒素Ｂの両方に結合する／これらの両方と交差反応するヒト抗体またはその抗原結合断片は、それぞれ配列番号３６、３８および４０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３アミノ酸配列と、それぞれ配列番号４４、４６および４８のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３アミノ酸配列とを含む。
【００２０】
一実施形態では、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａおよび毒素Ｂの両方に結合する／これらの両方と交差反応する単離されたヒト抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４および８２／９０からなる群より選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアを含む。
【００２１】
一実施形態では、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａおよび毒素Ｂの両方に結合する／これらの両方と交差反応する単離されたヒト抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１８／２６および３４／４２のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアを含む。
【００２２】
一実施形態では、毒素Ａおよび毒素Ｂの両方に結合する／これらの両方と交差反応する単離されたヒト抗体またはその抗原結合断片は、
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａおよび毒素Ｂの両方のカルボシキ末端受容体結合ドメイン内のエピトープに結合し、この場合、前記抗体は、配列番号１８／２６および３４／４２からなる群より選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアを含み；または
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａおよび毒素Ｂの両方のカルボシキ末端受容体結合ドメイン外のエピトープに結合し、この場合、前記抗体は、配列番号５０／５８、６６／７４および８２／９０からなる群より選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアを含む。
【００２３】
一実施形態では、本発明は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａおよび毒素Ｂの両方に結合する／これらの両方と交差反応する完全ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、以下の特徴の１つ以上を示す完全ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を提供する：（ｉ）配列番号１８、３４、５０、６６および８２からなる群より選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＨＣＶＲを含む；（ｉｉ）配列番号２６、４２、５８、７４および９０からなる群より選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＬＣＶＲを含む；（ｉｉｉ）配列番号２４、４０、５６、７２および８８からなる群より選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＨＣＤＲ３ドメインと、配列番号３２、４８、６４、８０および９６からなる群より選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＬＣＤＲ３ドメインとを含む；（ｉｖ）配列番号２０、３６、５２、６８および８４からなる群より選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＨＣＤＲ１ドメインと、配列番号２２、３８、５４、７０および８６からなる群より選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＨＣＤＲ２ドメインと、配列番号２８、４４、６０、７６および９２からなる群より選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＬＣＤＲ１ドメインと、配列番号３０、４６、６２、７８および９４からなる群より選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＬＣＤＲ２ドメインとを含む；（ｖ）１０−９Ｍ以下のＫＤで毒素Ａおよび毒素Ｂに結合する。
【００２４】
一実施形態では、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａおよび毒素Ｂの両方に結合する／これらの両方と交差反応する完全ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、式Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８（配列番号３８１）（式中、Ｘ１はＧｌｙであり、Ｘ２はＰｈｅ、ＶａｌまたはＩｌｅであり、Ｘ３はＴｈｒ、ＡｌａまたはＳｅｒであり、Ｘ４はＰｈｅまたはＬｅｕであり、Ｘ５はＳｅｒ、ＡｒｇまたはＡｓｎであり、Ｘ６はＧｌｙ、Ｔｈｒ、ＡｓｐまたはＳｅｒであり、Ｘ７はＨｉｓまたはＴｙｒであり、Ｘ８はＧｌｙまたはＧｌｕである）を含むＨＣＤＲ１配列と、式Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８（配列番号３８２）（式中、Ｘ１はＩｌｅであり、Ｘ２はＬｅｕ、ＳｅｒまたはＡｓｐであり、Ｘ３はＴｙｒ、ＰｈｅまたはＳｅｒであり、Ｘ４はＡｓｐまたはＳｅｒであり、Ｘ５はＧｌｙであり、Ｘ６はＳｅｒ、Ｇｌｙ、ＡｓｐまたはＴｈｒであり、Ｘ７はＳｅｒ、ＨｉｓまたはＩｌｅであり、Ｘ８はＧｌｕ、ＧｌｎまたはＩｌｅである）を含むＨＣＤＲ２配列と、式Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｘ１７（配列番号３８３）（式中、Ｘ１はＡｌａまたはＶａｌであり、Ｘ２はＬｙｓまたはＡｒｇであり、Ｘ３はＧｌｙまたはＧｌｕであり、Ｘ４はＳｅｒまたはＡｒｇであり、Ｘ５はＩｌｅ、ＡｓｐまたはＴｙｒであり、Ｘ６はＬｅｕ、ＳｅｒまたはＡｓｐであり、Ｘ７はＡｓｎ、Ｓｅｒ、ＧｌｎまたはＨｉｓであり、Ｘ８はＡｒｇ、ＴｙｒまたはＳｅｒであり、Ｘ９はＰｒｏまたはＧｌｙであり、Ｘ１０はＰｈｅまたはＴｙｒであり、Ｘ１１はＡｓｐ、ＧｌｙまたはＴｙｒであり、Ｘ１２はＴｙｒであり、Ｘ１３はＰｈｅ、Ｌｅｕであるかまたは存在せず、Ｘ１４はＧｌｙであるかまたは存在せず、Ｘ１５はＭｅｔであるかまたは存在せず、Ｘ１６はＡｓｐであるかまたは存在せず、Ｘ１７はＶａｌであるかまたは存在しない）を含むＨＣＤＲ３配列と、式Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２（配列番号３８４）（式中、Ｘ１はＧｌｎであり、Ｘ２はＳｅｒまたはＧｌｕであり、Ｘ３はＩｌｅ、ＶａｌまたはＴｈｒであり、Ｘ４はＬｅｕまたはＡｓｐであり、Ｘ５はＰｈｅ、ＬｙｓまたはＡｓｎであり、Ｘ６はＳｅｒまたはＴｒｐであり、Ｘ７はＳｅｒであるかまたは存在せず、Ｘ８はＡｓｎ、Ａｓｐであるかまたは存在せず、Ｘ９はＡｓｎであるかまたは存在せず、Ｘ１０はＬｙｓであるかまたは存在せず、Ｘ１１はＩｌｅ、Ａｓｎであるかまたは存在せず、Ｘ１２はＴｙｒであるかまたは存在しない）を含むＬＣＤＲ１配列と、式Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３（配列番号３８５）（式中、Ｘ１はＴｒｐ、ＬｙｓまたはＡｒｇであり、Ｘ２はＡｌａまたはＴｈｒであり、Ｘ３はＳｅｒである）を含むＬＣＤＲ２配列と、式Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９（配列番号３８６）（式中、Ｘ１はＧｌｎまたはＨｉｓであり、Ｘ２はＧｌｎまたはＧｌｕであり、Ｘ３はＴｙｒであり、Ｘ４はＴｙｒまたはＡｓｎであり、Ｘ５はＴｈｒまたはＳｅｒであり、Ｘ６はＬｅｕ、ＡｌａまたはＴｙｒであり、Ｘ７はＰｒｏ、ＰｈｅまたはＳｅｒであり、Ｘ８はＬｅｕ、ＰｈｅまたはＡｒｇであり、Ｘ９はＴｈｒまたはＡｌａである）を含むＬＣＤＲ３配列とを含む。
【００２５】
一実施形態では、本発明は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａに特異的に結合する単離されたヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、配列番号２、９８、１１４、１３０、１４６および１６２からなる群より選択されるＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれか１つの中に含まれる３つの重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）と、配列番号１０、１０６、１２２、１３８、１５４および１７０からなる群より選択されるＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれか１つの中に含まれる３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）とを含む単離されたヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００２６】
一実施形態では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａに特異的に結合する単離されたヒト抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２、９８、１１４、１３０、１４６および１６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲを含む。
【００２７】
一実施形態では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａに特異的に結合する単離されたヒト抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１０、１０６、１２２、１３８、１５４および１７０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む。
【００２８】
一実施形態では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａに特異的に結合する単離されたヒト抗体またはその抗原結合断片は、（ａ）配列番号２、９８、１１４、１３０、１４６および１６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲと、（ｂ）配列番号１０、１０６、１２２、１３８、１５４および１７０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲとを含む。
【００２９】
一実施形態では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａに特異的に結合する単離されたヒト抗体またはその抗原結合断片は、
（ａ）配列番号４、１００、１１６、１３２、１４８および１６４から選択なる群よりされるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１ドメイン；
（ｂ）配列番号６、１０２、１１８、１３４、１５０および１６６から選択なる群よりされるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２ドメイン；
（ｃ）配列番号８、１０４、１２０、１３６、１５２および１６８から選択なる群よりされるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３ドメイン；
（ｄ）配列番号１２、１０８、１２４、１４０、１５６および１７２から選択なる群よりされるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１ドメイン；
（ｅ）配列番号１４、１１０、１２６、１４２、１５８および１７４から選択なる群よりされるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２ドメイン；および
（ｆ）配列番号１６、１１２、１２８、１４４、１６０および１７６から選択なる群よりされるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３ドメイン
を含む。
【００３０】
一実施形態では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａに特異的に結合する単離されたヒト抗体またはその抗原結合断片は、それぞれ配列番号１４８、１５０および１５２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３アミノ酸配列と、それぞれ配列番号１５６、１５８および１６０のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３アミノ酸配列とを含む。
【００３１】
一実施形態では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａに特異的に結合する単離されたヒト抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２／１０、９８／１０６、１１４／１２２、１３０／１３８、１４６／１５４および１６２／１７０からなる群より選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアを含む。
【００３２】
一実施形態では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａに特異的に結合する単離されたヒト抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１４６／１５４のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアを含む。
【００３３】
一実施形態では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａに特異的に結合する単離されたヒト抗体またはその抗原結合断片は、
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａのカルボシキ末端受容体結合ドメイン内のエピトープに結合し、この場合、前記抗体は、配列番号２／１０、９８／１０６、１３０／１３８、１４６／１５４および１６２／１７０からなる群より選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアを含み；または
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａのカルボシキ末端受容体結合ドメイン外のエピトープに結合し、この場合、前記抗体は、配列番号１１４／１２２のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアを含む。
【００３４】
一実施形態では、本発明は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａに特異的に結合する完全ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、以下の特徴の１つ以上を示す完全ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を提供する：（ｉ）配列番号２、９８、１１４、１３０、１４６および１６２からなる群より選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＨＣＶＲを含む；（ｉｉ）配列番号１０、１０６、１２２、１３８、１５４および１７０からなる群より選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＬＣＶＲを含む；（ｉｉｉ）配列番号８、１０４、１２０、１３６、１５２および１６８からなる群より選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＨＣＤＲ３ドメインと、配列番号１６、１１２、１２８、１４４、１６０および１７６からなる群より選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＬＣＤＲ３ドメインとを含む；（ｉｖ）配列番号４、１００、１１６、１３２、１４８および１６４からなる群より選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＨＣＤＲ１ドメインと、配列番号６、１０２、１１８、１３４、１５０および１６６からなる群より選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＨＣＤＲ２ドメインと、配列番号１２、１０８、１２４、１４０、１５６および１７２からなる群より選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＬＣＤＲ１ドメインと、配列番号１４、１１０、１２６、１４２、１５８および１７４からなる群より選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＬＣＤＲ２ドメインとを含む；（ｖ）１０−９Ｍ以下のＫＤを示す；（ｖｉ）細胞生存率アッセイにおいて、約７ｐＭ〜約６５ｐＭの範囲のＩＣ５０で（３２ｐＭの濃度で）毒素Ａの中和を示す。
【００３５】
一実施形態では、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａに特異的に結合する完全ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、式Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８（配列番号３８７）（式中、Ｘ１はＧｌｙまたはＡｒｇであり、Ｘ２はＰｈｅであり、Ｘ３はＡｓｎまたはＴｈｒであり、Ｘ４はＰｈｅであり、Ｘ５はＧｌｙ、Ｓｅｒ、ＡｓｎまたはＴｈｒであり、Ｘ６はＴｈｒ、Ｓｅｒ、ＡｓｎまたはＡｓｐであり、Ｘ７はＨｉｓ、ＴｙｒまたはＰｈｅであり、Ｘ８はＡｓｐ、Ｖａｌ、ＡｌａまたはＴｙｒである）を含むＨＣＤＲ１配列と、式Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８（配列番号３８８）（式中、Ｘ１はＬｅｕまたはＩｌｅであり、Ｘ２はＴｈｒ、Ｇｌｙ、ＳｅｒまたはＴｒｐであり、Ｘ３はＳｅｒ、Ｔｈｒ、ＧｌｙまたはＰｈｅであり、Ｘ４はＴｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、ＡｓｐまたはＧｌｙであり、Ｘ５はＧｌｙであり、Ｘ６はＧｌｙ、Ａｓｐ、ＳｅｒまたはＡｌａであり、Ｘ７はＳｅｒ、Ｔｈｒ、ＡｓｎまたはＡｌａであり、Ｘ８はＡｌａ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓであるかまたは存在しない）を含むＨＣＤＲ２配列と、式Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｘ１７−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｘ２２−Ｘ２３−Ｘ２４（配列番号３８９）（式中、Ｘ１はＡｌａであり、Ｘ２はＬｙｓまたはＡｒｇであり、Ｘ３はＴｈｒ、ＡｓｐまたはＳｅｒであり、Ｘ４はＰｈｅ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、ＡｌａまたはＬｅｕであり、Ｘ５はＡｓｎ、ＧｌｙまたはＬｙｓであり、Ｘ６はＴｒｐ、Ｇｌｙ、ＡｓｐまたはＩｌｅであり、Ｘ７はＡｓｎ、ＡｌａまたはＰｈｅであり、Ｘ８はＳｅｒ、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、ＧｌｙまたはＡｓｐであり、Ｘ９はＴｙｒ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＧｌｕまたはＬｅｕであり、Ｘ１０はＰｈｅ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙであるかまたは存在せず、Ｘ１１はＡｓｐ．Ｓｅｒ、Ｇｌｙであるかまたは存在せず、Ｘ１２はＴｙｒ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏであるかまたは存在せず、Ｘ１３はＴｙｒ、Ｌｅｕであるかまたは存在せず、Ｘ１４はＴｙｒ、Ｐｈｅであるかまたは存在せず、Ｘ１５はＧｌｙ、Ａｓｎ、Ａｓｐであるかまたは存在せず、Ｘ１６はＭｅｔ、Ａｒｇ、Ｔｙｒであるかまたは存在せず、Ｘ１７はＡｓｐであるかまたは存在せず、Ｘ１８はＴｙｒ、Ｖａｌであるかまたは存在せず、Ｘ１９はＴｙｒであるかまたは存在せず、Ｘ２０はＴｙｒであるかまたは存在せず、Ｘ２１はＧｌｙであるかまたは存在せず、Ｘ２２はＭｅｔであるかまたは存在せず、Ｘ２３はＡｓｐであるかまたは存在せず、Ｘ２４はＶａｌであるかまたは存在しない）を含むＨＣＤＲ３配列と、式Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７（配列番号３９０）（式中、Ｘ１はＧｌｎであり、Ｘ２はＳｅｒ、ＡｓｐまたはＴｈｒであり、Ｘ３はＩｌｅまたはＶａｌであり、Ｘ４はＳｅｒであり、Ｘ５はＴｈｒ、ＡｓｎまたはＳｅｒであり、Ｘ６はＴｙｒ、Ｔｒｐ、ＰｈｅまたはＳｅｒであり、Ｘ７はＴｙｒであるかまたは存在しない）を含むＬＣＤＲ１配列と、式Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３（配列番号３９１）（式中、Ｘ１はＧｌｙ、Ａｌａ、ＬｙｓまたはＴｈｒであり、Ｘ２はＡｌａ、ＴｈｒまたはＶａｌであり、Ｘ３はＳｅｒである）を含むＬＣＤＲ２配列と、式Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０（配列番号３９２）（式中、Ｘ１はＧｌｎであるかまたは存在せず、Ｘ２はＧｌｎ、Ｌｙｓであるかまたは存在せず、Ｘ３はＴｙｒ、Ａｓｎであるかまたは存在せず、Ｘ４はＧｌｙ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓであるかまたは存在せず、Ｘ５はＡｓｎ、Ｓｅｒであるかまたは存在せず、Ｘ６はＳｅｒ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｔｒｐであるかまたは存在せず、Ｘ７はＬｅｕ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒであるかまたは存在せず、Ｘ８はＴｙｒ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、Ｐｒｏであるかまたは存在せず、Ｘ９はＴｈｒ、Ｔｙｒであるかまたは存在せず、Ｘ１０はＴｈｒである）を含むＬＣＤＲ３配列とを含む。
【００３６】
一実施形態では、本発明は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ｂに特異的に結合する単離されたヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、配列番号１７８、１９４、２１０、２２６、２４２、２５８、２７４、２９０、３０６、３２２、３３８および３５４からなる群より選択されるＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれか１つの中に含まれる３つの重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）と、配列番号１８６、２０２、２１８、２３４、２５０、２６６、２８２、２９８、３１４、３３０、３４６および３６２からなる群より選択されるＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれか１つの中に含まれる３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）とを含む単離されたヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００３７】
一実施形態では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ｂに特異的に結合する単離されたヒト抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１７８、１９４、２１０、２２６、２４２、２５８、２７４、２９０、３０６、３２２、３３８および３５４からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲを含む。
【００３８】
一実施形態では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ｂに特異的に結合する単離されたヒト抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１８６、２０２、２１８、２３４、２５０、２６６、２８２、２９８、３１４、３３０、３４６および３６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む。
【００３９】
一実施形態では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ｂに特異的に結合する単離されたヒト抗体またはその抗原結合断片は、（ａ）配列番号１７８、１９４、２１０、２２６、２４２、２５８、２７４、２９０、３０６、３２２、３３８および３５４からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲと、（ｂ）配列番号１８６、２０２、２１８、２３４、２５０、２６６、２８２、２９８、３１４、３３０、３４６および３６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲとを含む。
【００４０】
一実施形態では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ｂに特異的に結合する単離されたヒト抗体またはその抗原結合断片は、
（ａ）配列番号１８０、１９６、２１２、２２８、２４４、２６０、２７６、２９２、３０８、３２４、３４０および３５６から選択なる群よりされるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１ドメイン；
（ｂ）配列番号１８２、１９８、２１４、２３０、２４６、２６２、２７８、２９４、３１０、３２６、３４２および３５８から選択なる群よりされるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２ドメイン；
（ｃ）配列番号１８４、２００、２１６、２３２、２４８、２６４、２８０、２９６、３１２、３２８、３４４および３６０から選択なる群よりされるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３ドメイン；
（ｄ）配列番号１８８、２０４、２２０、２３６、２５２、２６８、２８４、３００、３１６、３３２、３４８および３６４から選択なる群よりされるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１ドメイン；
（ｅ）配列番号１９０、２０６、２２２、２３８、２５４、２７０、２８６、３０２、３１８、３３４、３５０および３６６から選択なる群よりされるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２ドメイン；および
（ｆ）配列番号１９２、２０８、２２４、２４０、２５６、２７２、２８８、３０４、３２０、３３６、３５２および３６８から選択なる群よりされるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３ドメイン
を含む。
【００４１】
一実施形態では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ｂに特異的に結合する単離されたヒト抗体またはその抗原結合断片は、それぞれ配列番号２７６、２７８および２８０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３アミノ酸配列と、それぞれ配列番号２８４、２８６および２８８のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３アミノ酸配列とを含む。
【００４２】
一実施形態では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ｂに特異的に結合する単離されたヒト抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１７８／１８６、１９４／２０２、２１０／２１８、２２６／２３４、２４２／２５０、２５８／２６６、２７４／２８２、２９０／２９８、３０６／３１４、３２２／３３０、３３８／３４６および３５４／３６２からなる群より選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアを含む。
【００４３】
一実施形態では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ｂに特異的に結合する単離されたヒト抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２７４／２８２のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアを含む。
【００４４】
一実施形態では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ｂに特異的に結合する単離されたヒト抗体またはその抗原結合断片は、
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ｂのカルボシキ末端受容体結合ドメイン内のエピトープに結合し、この場合、前記抗体は、配列番号１７８／１８６のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアを含み；または
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ｂのカルボシキ末端受容体結合ドメイン外のエピトープに結合し、この場合、前記抗体は、配列番号１９４／２０２、２１０／２１８、２２６／２３４、２４２／２５０、２５８／２６６、２７４／２８２および２９０／２９８からなる群より選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアを含む。
【００４５】
一実施形態では、本発明は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ｂに特異的に結合する完全ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、以下の特徴の１つ以上を示す完全ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を提供する：（ｉ）配列番号１７８、１９４、２１０、２２６、２４２、２５８、２７４、２９０、３０６、３２２、３３８および３５４からなる群より選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＨＣＶＲを含む；（ｉｉ）配列番号１８６、２０２、２１８、２３４、２５０、２６６、２８２、２９８、３１４、３３０、３４６および３６２からなる群より選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＬＣＶＲを含む；（ｉｉｉ）配列番号１８４、２００、２１６、２３２、２４８、２６４、２８０、２９６、３１２、３２８、３４４および３６０からなる群より選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＨＣＤＲ３ドメインと、配列番号１９２、２０８、２２４、２４０、２５６、２７２、２８８、３０４、３２０、３３６、３５２および３６８からなる群より選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＬＣＤＲ３ドメインとを含む；（ｉｖ）配列番号１８０、１９６、２１２、２２８、２４４、２６０、２７６、２９２、３０８、３２４、３４０および３５６からなる群より選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＨＣＤＲ１ドメインと、配列番号１８２、１９８、２１４、２３０、２４６、２６２、２７８、２９４、３１０、３２６、３４２および３５８からなる群より選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＨＣＤＲ２ドメインと、配列番号１８８、２０４、２２０、２３６、２５２、２６８、２８４、３００、３１６、３３２、３４８および３６４からなる群より選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＬＣＤＲ１ドメインと、配列番号１９０、２０６、２２２、２３８、２５４、２７０、２８６、３０２、３１８、３３４、３５０および３６６からなる群より選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＬＣＤＲ２ドメインとを含む；（ｖ）１０−９Ｍ以下のＫＤを示す；（ｖｉ）細胞生存率アッセイにおいて、約２５ｐＭ〜約３２０ｐＭの範囲のＩＣ５０で（０．０３ｐＭの濃度で）毒素Ｂの中和を示す。
【００４６】
一実施形態では、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ｂに特異的に結合する完全ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、式Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０（配列番号３９３）（式中、Ｘ１はＧｌｙであり、Ｘ２はＰｈｅ、ＡｓｐまたはＴｙｒであり、Ｘ３はＴｈｒ、Ａｓｎ、ＳｅｒまたはＶａｌであり、Ｘ４はＰｈｅまたはＶａｌであり、Ｘ５はＳｅｒ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、ＧｌｕまたはＴｈｒであり、Ｘ６はＳｅｒ、Ｉｌｅ、ＡｓｐまたはＡｒｇであり、Ｘ７はＰｈｅ、ＴｙｒまたはＡｓｎであり、Ｘ８はＧｌｙ、Ａｌａ、ＳｅｒまたはＴｙｒであり；Ｘ９はＡｌａであるかまたは存在せず、Ｘ１０はＡｌａであるかまたは存在しない）を含むＨＣＤＲ１配列と、式Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９（配列番号３９４）（式中、Ｘ１はＩｌｅまたはＴｈｒであり、Ｘ２はＳｅｒ、Ｇｌｙ、ＴｙｒまたはＡｓｎであり、Ｘ３はＴｈｒ、Ｇｌｙ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、ＰｒｏまたはＳｅｒであり、Ｘ４はＡｓｐ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、ＬｙｓまたはＡｓｐであり、Ｘ５はＧｌｙ、ＳｅｒまたはＴｈｒであり、Ｘ６はＳｅｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、ＬｙｓまたはＡｓｎであり、Ｘ７はＬｙｓ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＴｒｐまたはＧｌｙであり、Ｘ８はＬｙｓ、Ｔｈｒ、ＩｌｅまたはＴｙｒであり、Ｘ９はＨｉｓであるかまたは存在しない）を含むＨＣＤＲ２配列と、式Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６（配列番号３９５）（式中、Ｘ１はＡｌａまたはＶａｌであり、Ｘ２はＡｒｇ、Ｌｙｓ、ＴｈｒまたはＳｅｒであり、Ｘ３はＶａｌ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、ＡｒｇまたはＴｙｒであり、Ｘ４はＧｌｙ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、ＬｙｓまたはＡｓｎであり、Ｘ５はＧｌｕ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、ＳｅｒまたはＴｒｐであり、Ｘ６はＬｅｕ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、ＰｒｏまたはＡｓｎであり、Ｘ７はＬｅｕ、Ａｓｐ、Ｔｙｒ、ＳｅｒまたはＡｓｐであり、Ｘ８はＡｓｎ、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、ＡｓｐまたはＧｌｙであり、Ｘ９はＴｙｒ、Ｇｌｙ、Ｐｈｅ、Ａｓｐ、ＴｒｐまたはＶａｌであり、Ｘ１０はＳｅｒ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐであるかまたは存在せず、Ｘ１１はＴｙｒ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｇｌｙであるかまたは存在せず、Ｘ１２はＴｙｒ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｖａｌであるかまたは存在せず、Ｘ１３はＡｓｎ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｐｈｅであるかまたは存在せず、Ｘ１４はＴｙｒ、Ｍｅｔ、Ａｓｐであるかまたは存在せず、Ｘ１５はＡｓｐ、Ｔｙｒであるかまたは存在せず、Ｘ１６はＶａｌであるかまたは存在しない）を含むＨＣＤＲ３配列と、式Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７（配列番号３９６）（式中、Ｘ１はＧｌｎ、ＬｅｕまたはＡｒｇであり、Ｘ２はＧｌｙ、ＡｓｐまたはＳｅｒであり、Ｘ３はＩｌｅまたはＶａｌであり、Ｘ４はＡｒｇ、Ｓｅｒ、ＧｌｙまたはＴｙｒであり、Ｘ５はＳｅｒまたはＡｓｎであり、Ｘ６はＴｒｐ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｐｈｅ、ＳｅｒまたはＡｓｐであり、Ｘ７はＴｙｒであるかまたは存在しない）を含むＬＣＤＲ１配列と、式Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３（配列番号３９７）（式中、Ｘ１はＡｌａ、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｙであり、Ｘ２はＡｌａまたはＴｈｒであり、Ｘ３はＳｅｒである）を含むＬＣＤＲ２配列と、式Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９（配列番号３９８）（式中、Ｘ１はＧｌｎ、ＨｉｓまたはＬｅｕであり、Ｘ２はＧｌｎであり、Ｘ３はＡｌａ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、ＨｉｓまたはＶａｌであり、Ｘ４はＴｙｒ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＩｌｅまたはＬｙｓであり、Ｘ５はＳｅｒ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、ＴｈｒまたはＧｌｙであり、Ｘ６はＰｈｅ、Ｔｙｒ、ＴｒｐまたはＳｅｒであり、Ｘ７はＰｒｏであり、Ｘ８はＬｅｕ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、ＶａｌまたはＴｙｒであり、Ｘ９はＴｈｒである）を含むＬＣＤＲ３配列とを含む。
【００４７】
一実施形態では、本発明は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａおよび／または毒素Ｂに対する特異的結合について、配列番号２、１８、３４、５０、６６、８２、９８、１１４、１３０、１４６、１６２、１７８、１９４、２１０、２２６、２４２、２５８、２７４、２９０、３０６、３２２、３３８および３５４からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号１０、２６、４２、５８、７４、９０、１０６、１２２、１３８、１５４、１７０、１８６、２０２、２１８、２３４、２５０、２６６、２８２、２９８、３１４、３３０、３４６および３６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）のＣＤＲとを含む抗体または抗原結合断片と競合する単離された抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００４８】
関連実施形態では、本発明は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａおよび／または毒素Ｂに対する特異的結合について、配列番号１８／２６、３４／４２、１４６／１５４および２７４／２８２からなる群より選択される重鎖および軽鎖配列ペア内に含まれる重鎖および軽鎖ＣＤＲを含む抗体または抗原結合断片と競合する単離された抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００４９】
一実施形態では、本発明は、配列番号２、１８、３４、５０、６６、８２、９８、１１４、１３０、１４６、１６２、１７８、１９４、２１０、２２６、２４２、２５８、２７４、２９０、３０６、３２２、３３８および３５４からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）のＣＤＲと、配列番号１０、２６、４２、５８、７４、９０、１０６、１２２、１３８、１５４、１７０、１８６、２０２、２１８、２３４、２５０、２６６、２８２、２９８、３１４、３３０、３４６および３６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）のＣＤＲとを含む抗体または抗原結合断片と同じＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａおよび／または毒素Ｂ上のエピトープに結合する単離された抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００５０】
関連実施形態では、本発明は、配列番号１８／２６、３４／４２、１４６／１５４、２７４／２８２からなる群より選択される重鎖および軽鎖配列ペア内に含まれる重鎖および軽鎖ＣＤＲを含む抗体または抗原結合断片と同じＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａおよび／または毒素Ｂ上のエピトープに結合する単離された抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００５１】
本発明のある特定の実施形態では、抗体は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによって産生される毒素Ａのカルボシキ末端受容体結合ドメイン（これの配列は、配列番号３７５に示されている）のアミノ酸残基４６８〜８６３と相互作用し得るか、またはこれに結合し得る。この領域は、配列番号３７８（全長毒素Ａ）の残基２３１５〜２７１０の範囲のアミノ酸残基に対応する。本発明のある特定の実施形態では、抗体は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによって産生される毒素Ａのカルボシキ末端受容体結合ドメイン内のエピトープであって、配列番号３７５の残基４６８〜４８８、配列番号３７５の残基５１０〜５３０、配列番号３７５の残基６０２〜６１０、配列番号３７５の残基６４４〜７０３、配列番号３７５の残基７２４〜７９４、配列番号３７５の残基７９９〜８１４、および配列番号３７５の残基８５８〜８６３からなる群より選択されるエピトープと相互作用し得るか、またはこれらに結合し得る。これらの残基は、配列番号３７８を有する全長毒素Ａ配列内に見られるアミノ酸配列に対応し、これらの特定の領域は、配列番号３７８の残基２３１５〜２３３５、配列番号３７８の残基２３５７〜２３７７、配列番号３７８の残基２４４９〜２４５７、配列番号３７８の残基２４９１〜２５５０、配列番号３７８の残基２５７１〜２６４１、配列番号３７８の残基２６４６〜２６６１、および配列番号３７８の残基２７０５〜２７１０として特定される。一実施形態では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによって産生される毒素Ａのカルボシキ末端受容体結合ドメイン内のエピトープであって、配列番号３７５の残基４６８〜４８８、配列番号３７５の残基５１０〜５３０、配列番号３７５の残基６０２〜６１０、配列番号３７５の残基６４４〜７０３、配列番号３７５の残基７２４〜７９４、配列番号３７５の残基７９９〜８１４、および配列番号３７５の残基８５８〜８６３からなる群より選択されるエピトープに結合するか、またはこれらと相互作用する抗体は、配列番号１４６／１５４のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアを含む。一実施形態では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによって産生される毒素Ａのカルボシキ末端受容体結合ドメイン内のエピトープであって、配列番号３７５の残基４６８〜４８８、配列番号３７５の残基５１０〜５３０、配列番号３７５の残基６０２〜６１０、配列番号３７５の残基６４４〜７０３、配列番号３７５の残基７２４〜７９４、配列番号３７５の残基７９９〜８１４、および配列番号３７５の残基８５８〜８６３からなる群より選択されるエピトープに結合するか、またはこれらと相互作用する抗体は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ｂに特異的に結合する第２の抗体と医薬組成物中で組み合わせられる。一実施形態では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ｂと相互作用するか、またはこれに結合するこの第２の抗体は、配列番号２７４／２８２のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアを含む。
【００５２】
第２の態様では、本発明は、抗毒素Ａおよび／または抗毒素Ｂ抗体またはそれらの断片をコードする核酸分子を提供する。抗体の産生を可能とする条件下で宿主細胞を培養し、産生された抗体を回収することによって抗体を生産する方法と同様、本発明の核酸を保有する組換え発現ベクター、およびこのようなベクターが導入された宿主細胞もまた、本発明に包含される。
【００５３】
一実施形態では、本発明は、配列番号１、１７、３３、４９、６５、８１、９７、１１３、１２９、１４５、１６１、１７７、１９３、２０９、２２５、２４１、２５７、２７３、２８９、３０５、３２１、３３７および３５３からなる群より選択される核酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の相同性を有するその実質的に同一の配列によってコードされるＨＣＶＲを含む抗体またはその断片を提供する。
【００５４】
一実施形態では、ＨＣＶＲは、配列番号１７、３３、１４５および２７３からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
【００５５】
一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号９、２５、４１、５７、７３、８９、１０５、１２１、１３７、１５３、１６９、１８５、２０１、２１７、２３３、２４９、２６５、２８１、２９７、３１３、３２９、３４５および３６１からなる群より選択される核酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の相同性を有するその実質的に同一の配列によってコードされるＬＣＶＲをさらに含む。
【００５６】
一実施形態では、ＬＣＶＲは、配列番号２５、４１、１５３および２８１からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
【００５７】
一実施形態では、本発明はまた、配列番号７、２３、３９、５５、７１、８７、１０３、１１９、１３５、１５１、１６７、１８３、１９９、２１５、２３１、２４７、２６３、２７９、２９５、３１１、３２７、３４３および３５９からなる群より選択されるヌクレオチド配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列によってコードされるＨＣＤＲ３ドメインと、配列番号１５、３１、４７、６３、７９、９５、１１１、１２７、１４３、１５９、１７５、１９１、２０７、２２３、２３９、２５５、２７１、２８７、３０３、３１９、３３５、３５１および３６７からなる群より選択されるヌクレオチド配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列によってコードされるＬＣＤＲ３ドメインとを含む抗体または抗体の抗原結合断片を提供する。
【００５８】
一実施形態では、本発明は、配列番号３、１９、３５、５１、６７、８３、９９、１１５、１３１、１４７、１６３、１７９、１９５、２１１、２２７、２４３、２５９、２７５、２９１、３０７、３２３、３３９および３５５からなる群より選択されるヌクレオチド配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列によってコードされるＨＣＤＲ１ドメインと、配列番号５、２１、３７、５３、６９、８５、１０１、１１７、１３３、１４９、１６５、１８１、１９７、２１３、２２９、２４５、２６１、２７７、２９３、３０９、３２５、３４１および３５７からなる群より選択されるヌクレオチド配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列によってコードされるＨＣＤＲ２ドメインと、配列番号１１、２７、４３、５９、７５、９１、１０７、１２３、１３９、１５５、１７１、１８７、２０３、２１９、２３５、２５１、２６７、２８３、２９９、３１５、３３１、３４７および３６３からなる群より選択されるヌクレオチド配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列によってコードされるＬＣＤＲ１ドメインと、配列番号１３、２９、４５、６１、７７、９３、１０９、１２５、１４１、１５７、１７３、１８９、２０５、２２１、２３７、２５３、２６９、２８５、３０１、３１７、３３３、３４９および３６５からなる群より選択されるヌクレオチド配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列によってコードされるＬＣＤＲ２ドメインとをさらに含む抗体またはその断片を提供する。
【００５９】
第３の態様では、本発明は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａおよび／または毒素Ｂに対して特異的なヒト抗体または抗原結合断片であって、生殖細胞系列のＶＨ配列、ＤＨ配列、およびＪＨ配列由来のヌクレオチド配列セグメントによってコードされるＨＣＶＲと、生殖細胞系列のＶＫ配列およびＪＫ配列由来のヌクレオチド配列セグメントによってコードされるＬＣＶＲとを、表２に示されている組み合わせで含むヒト抗体または抗原結合断片を特徴とする。
【００６０】
本発明は、修飾されたグリコシル化パターンを有する抗体を包含する。一部の適用では、望ましくないグリコシル化部位を除去する修飾、または例えば、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）機能を増大させるフコース部分の除去が有用であり得る（Ｓｈｉｅｌｄら、（２００２）ＪＢＣ  ２７７：２６７３３を参照のこと）。他の適用では、補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）を修飾するために、ガラクトシル化の修飾を施すことができる。
【００６１】
第４の態様では、本発明は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａまたは毒素Ｂのいずれかに結合するか、またはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａおよび毒素Ｂの両方に結合する少なくとも１つの単離された完全ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合断片と、薬学的に許容し得る担体または希釈剤とを含む医薬組成物を提供する。一実施形態では、本発明は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａのみに特異的に結合する単離された完全ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合断片と、薬学的に許容し得る担体または希釈剤とを含む医薬組成物を提供する。一実施形態では、本発明は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ｂのみに特異的に結合する単離された完全ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合断片と、薬学的に許容し得る担体または希釈剤とを含む医薬組成物を提供する。一実施形態では、本発明は、２つの完全ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、１つが毒素Ａに特異的に結合し、１つがＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ｂに特異的に結合する２つの完全ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合断片と、薬学的に許容し得る担体または希釈剤とを含む医薬組成物を提供する。一実施形態では、本発明は、１つの二重結合完全ヒトモノクローナル抗体（毒素Ａおよび毒素Ｂの両方に結合する抗体）と、薬学的に許容し得る担体または希釈剤とを含む医薬組成物を提供する。一実施形態では、本発明は、２つの二重結合完全ヒトモノクローナル抗体（毒素Ａおよび毒素Ｂの両方に結合する抗体）と、薬学的に許容し得る担体または希釈剤とを含む医薬組成物を提供する。医薬組成物に使用される二重抗体は、毒素Ａもしくは毒素Ｂ上の同じエピトープを認識してもよいし、および／もしくはこれに結合してもよいし、または、毒素Ａもしくは毒素Ｂ上の異なるエピトープを認識してもよいし、および／もしくはこれに結合してもよい。このような治療を必要とする患者集団において所望の結果を達成するために、本明細書に記載される抗体の任意の組み合わせを医薬組成物に使用してもよいことを理解するべきである。例えば、毒素Ａのみを認識し、および／またはこれに結合する２つの抗体を組成物に使用してもよい。あるいは、毒素Ｂのみを認識し、および／またはこれに結合する２つの抗体を組成物に使用してもよい。一実施形態では、毒素Ａまたは毒素Ｂのみを認識する／これに結合する１つの抗体を、組成物中で二重結合抗体と組み合わせてもよい。一実施形態では、毒素Ａのみを認識する／これに結合する１つの抗体を、毒素Ｂのみを認識する／これに結合する１つの抗体と組み合わせてもよいし、この組み合わせを組成物に使用してもよい。
【００６２】
一実施形態では、医薬組成物は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａおよび毒素Ｂの両方のカルボシキ末端受容体結合ドメインに結合する完全ヒトモノクローナル抗体であって、本明細書に記載される特徴のいずれか１つ以上を有する完全ヒトモノクローナル抗体を含む。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａおよび毒素Ｂの両方のカルボシキ末端受容体結合ドメインに結合する抗体は、１０−７Ｍ以下のＫＤで、毒素Ａおよび毒素Ｂに結合する。
【００６３】
一実施形態では、組成物は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａおよび毒素Ｂの両方に結合する抗体であって、配列番号１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４および８２／９０からなる群より選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアを有する抗体を含む。
【００６４】
一実施形態では、組成物は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａおよび毒素Ｂの両方に結合する抗体であって、配列番号１８／２６および３４／４２からなる群より選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアを有する抗体を含む。
【００６５】
一実施形態では、医薬組成物は、
ａ）Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａに特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であって、配列番号２、９８、１１４、１３０、１４６および１６２からなる群より選択される重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）アミノ酸配列のいずれか１つの中に含まれる３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）と、配列番号１０、１０６、１２２、１３８、１５４および１７０からなる群より選択される軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）アミノ酸配列のいずれか１つの中に含まれる３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）とを含む単離された抗体またはその抗原結合断片；
ｂ）Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ｂに特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であって、配列番号１７８、１９４、２１０、２２６、２４２、２５８、２７４、２９０、３０６、３２２、３３８および３５４からなる群より選択されるＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれか１つの中に含まれる３つの重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）と、配列番号１８６、２０２、２１８、２３４、２５０、２６６、２８２、２９８、３１４、３３０、３４６および３６２からなる群より選択されるＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれか１つの中に含まれる３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）とを含む単離された抗体またはその抗原結合断片；および
ｃ）Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａおよび毒素Ｂの両方に結合する／これらの両方と交差反応する単離された抗体または抗原結合断片であって、配列番号１８、３４、５０、６６および８２からなる群より選択されるＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれか１つの中に含まれる３つの重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）と、配列番号２６、４２、５８、７４および９０からなる群より選択されるＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれか１つの中に含まれる３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）とを含む単離された抗体または抗原結合断片
から選択される、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素に結合する少なくとも１つの抗体を含む。
【００６６】
一実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載されるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａに特異的に結合する単離された第１の完全ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合断片と、本明細書に記載されるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ｂに特異的に結合する単離された第２の完全ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合断片と、薬学的に許容し得る担体または希釈剤とを含む。
【００６７】
一実施形態では、組成物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａに特異的に結合する少なくとも１つの抗体またはその抗原結合断片と、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ｂに特異的に結合する少なくとも１つの抗体またはその抗原結合断片とを含み、
ａ）毒素Ａに特異的に結合する前記抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２、９８、１１４、１３０、１４６および１６２からなる群より選択される重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）アミノ酸配列のいずれか１つの中に含まれる３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）と、配列番号１０、１０６、１２２、１３８、１５４および１７０からなる群より選択される軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）アミノ酸配列のいずれか１つの中に含まれる３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）とを含み；および
ｂ）毒素Ｂに特異的に結合する前記抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１７８、１９４、２１０、２２６、２４２、２５８、２７４、２９０、３０６、３２２、３３８および３５４からなる群より選択されるＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれか１つの中に含まれる３つの重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）と、配列番号１８６、２０２、２１８、２３４、２５０、２６６、２８２、２９８、３１４、３３０、３４６および３６２からなる群より選択されるＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれか１つの中に含まれる３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）とを含む。
【００６８】
一実施形態では、医薬組成物は、
ａ）Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａに特異的に結合する単離された第１の完全ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、配列番号２、９８、１１４、１３０、１４６および１６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲと、配列番号１０、１０６、１２２、１３８、１５４および１７０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲとを含む単離された第１の完全ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合断片；および
ｂ）Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ｂに特異的に結合する単離された第２の完全ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、配列番号１７８、１９４、２１０、２２６、２４２、２５８、２７４、２９０、３０６、３２２、３３８および３５４からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲと、配列番号１８６、２０２、２１８、２３４、２５０、２６６、２８２、２９８、３１４、３３０、３４６および３６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲとを含む単離された第２の完全ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を含む。
【００６９】
一実施形態では、医薬組成物は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａに特異的に結合する単離された第１の完全ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、配列番号２／１０、９８／１０６、１１４／１２２、１３０／１３８、１４６／１５４および１６２／１７０からなる群より選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアを含む単離された第１の完全ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合断片と、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ｂに特異的に結合する単離された第２の完全ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、配列番号１７８／１８６、１９４／２０２、２１０／２１８、２２６／２３４、２４２／２５０、２５８／２６６、２７４／２８２、２９０／２９８、３０６／３１４、３２２／３３０、３３８／３４６および３５４／３６２からなる群より選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアを含む単離された第２の完全ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合断片とを含む。
【００７０】
別の実施形態では、医薬組成物は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａに特異的に結合する単離された第１の完全ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、配列番号１４６／１５４のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアを含む単離された第１の完全ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合断片と、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ｂに特異的に結合する単離された第２の完全ヒト抗体またはその抗原結合断片であって、配列番号２７４／２８２のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアを含む単離された第２の完全ヒト抗体またはその抗原結合断片とを含む。
【００７１】
別の関連実施形態では、医薬組成物は、
ａ）Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａに特異的に結合する単離された第１のヒト抗体またはその抗原結合断片であって、配列番号１４８のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１と、配列番号１５０のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２と、配列番号１５２のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３と、配列番号１５６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１と、配列番号１５８のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２と、配列番号１６０のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３とを含む単離された第１のヒト抗体またはその抗原結合断片；ｂ）Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ｂに特異的に結合する単離された第２のヒト抗体またはその抗原結合断片であって、配列番号２７６のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１と、配列番号２７８のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２と、配列番号２８０のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３と、配列番号２８４のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１と、配列番号２８６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２と、配列番号２８８のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３とを含む単離された第２のヒト抗体またはその抗原結合断片；および
ｃ）薬学的に許容し得る担体または希釈剤を含む。
【００７２】
一実施形態では、本発明の抗体、または１つ以上の本発明の抗体を含有する組成物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの任意の株由来の毒素Ａもしくは毒素Ｂのいずれかまたは毒素ＡおよびＢの両方を中和するのに使用され得る。
【００７３】
一実施形態では、本発明の抗体、または１つ以上の本発明の抗体を含有する組成物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの超毒性株由来の毒素Ａおよび／またはＢを中和するのに使用され得る。
【００７４】
一実施形態では、本発明の抗体、または１つ以上の本発明の抗体を含有する組成物は、ＢＩ／ＮＡＰ１／０２７株由来の毒素Ａおよび／またはＢを中和するのに使用され得る。
【００７５】
一実施形態では、本発明の抗体、または１つ以上の本発明の抗体を含有する組成物は、ＢＩ／ＮＡＰ１／０２７株由来の毒素Ａおよび／またはＢを中和するのに使用され得、ＢＩ／ＮＡＰ１／０２７株は、ＶＡ５、ＶＡ１７、６３３６および６４４３からなる群より選択される。
【００７６】
一実施形態では、毒素Ａに特異的に結合する第１の抗体を含む抗体組成物を別個の組成物として単独で投与してもよいし、毒素Ｂに特異的に結合する第２の抗体を含む抗体組成物も別個の組成物として投与してもよい。各組成物は、別個のシリンジまたは送達デバイスまたはバイアル中で、患者への送達のために調製され得る。２つの組成物として別個に製剤化する場合、他方の抗体組成物の直前に一方の抗体組成物を投与することによって、両組成物を別個に送達してもよい。あるいは、２つの抗体組成物を投与の直前に混合して同時に投与してもよい。
【００７７】
一実施形態では、本発明は、本発明の抗体または抗体の抗原結合断片と、第２の治療剤との組み合わせである組成物を特徴とする。
【００７８】
第２の治療剤は、低分子薬物、タンパク質／ポリペプチド、抗体、核酸分子、例えば、アンチセンス分子またはｓｉＲＮＡであり得る。第２の治療剤は、合成ものでもよいし、または天然由来のものでもよい。
【００７９】
第２の治療剤は、本発明の抗体またはその断片と組み合わせることが有利な任意の薬剤、例えば、プロバイオティク、抗生物質、トキソイド、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対して特異的なワクチン、またはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａおよび／もしくは毒素Ｂに対する第２の異なる抗体であり得る。
【００８０】
ある特定の実施形態では、第２の治療剤は、本発明の抗体または抗体の抗原結合断片に関連する任意の可能な副作用が生じる場合に、このような副作用に対抗するかまたはこれを軽減する一助となる薬剤であり得る。
【００８１】
また、本発明の抗体および薬学的に許容し得る組成物を、併用療法において用い得ること、すなわち、抗体および薬学的に許容し得る組成物を、１つ以上の他の所望の治療剤または医療手順と同時に、これらの前に、またはこれらの後で投与し得ることも認識されよう。併用レジメンにおいて用いられる療法（治療剤または手順）の特定の組み合わせでは、所望の治療剤および／または手順の適合性、ならびに達成するべき所望の治療効果を考慮に入れる。また、用いられる療法により、同じ障害に対する所望の効果を達成することもでき（例えば、抗体は、同じ障害を処置するのに使用される別の薬剤と同時に投与することができる）、異なる効果（例えば、任意の有害作用のコントロール）を達成し得ることも認識されよう。本明細書で使用される場合、通常は特定の疾患または症状を処置または予防するのに投与されるさらなる治療剤が、処置される疾患または症状に適切である。
【００８２】
当技術分野で認識されているように、複数の治療剤を同時投与する場合は、それに応じて投用量を調整することができる。
【００８３】
第５の態様では、本発明は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに関連する症状もしくは疾患を患っている患者を処置するため、または前記症状もしくは疾患に関連する少なくとも１つの症候もしくは合併症を処置するため、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに関連する症状もしくは疾患の発症のリスクを有する患者におけるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに関連する症状もしくは疾患の発症を予防するための方法であって、前記Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに関連する症状もしくは疾患が予防されるかもしくは重症度および／もしくは持続期間の点で低減されるか、または前記症状もしくは疾患に関連する少なくとも１つの症候もしくは合併症が予防もしくは改善されるか、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによる再発もしくは再燃の頻度および／もしくは持続期間または重症度が軽減されるような、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａおよび／または毒素Ｂに結合する有効量の抗体またはその抗原結合断片；または、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａおよび／または毒素Ｂに結合する有効量の抗体またはその抗原結合断片を含む医薬組成物を前記患者に投与することを含む方法を提供する。
【００８４】
一実施形態では、本発明は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに関連する症状もしくは疾患を患っている患者を処置するのに使用するため、または前記症状もしくは疾患に関連する少なくとも１つの症候もしくは合併症を処置するため、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに関連する症状もしくは疾患の発症のリスクを有する患者におけるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに関連する症状もしくは疾患の発症を予防するための薬品の製造における、１つ以上の本発明の抗体または１つ以上の本発明の抗体を含む医薬組成物の使用であって、前記Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに関連する症状もしくは疾患が予防されるかもしくは重症度および／もしくは持続期間の点で低減されるか、または前記症状もしくは疾患に関連する少なくとも１つの症候もしくは合併症が予防もしくは改善されるか、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによる再発もしくは再燃の頻度および／もしくは持続期間または重症度が軽減される使用を提供する。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに関連する症状または疾患に関連する少なくとも１つの症候または合併症は、食欲不振、腹痛、腹部膨満、出血有りまたは無しの下痢、脱水症、栄養失調、偽膜性大腸炎、完全なまたは部分的な結腸切除、発熱および全身感染症（敗血症）、死亡、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ症状または疾患の再燃、ならびに移植組織または器官の拒絶からなる群より選択され得る。
【００８５】
一実施形態では、本明細書に記載されるように、本発明の抗体または１つ以上の本発明の抗体を含む医薬組成物で処置されるべき患者は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの超毒性分離菌、例えば、ＢＩ／ＮＡＰ１／０２７群に属するものに感染しているか、または超毒性株による感染症を発症するリスクを有し得る。
【００８６】
関連実施形態では、本発明の抗体または１つ以上の本発明の抗体を含有する医薬組成物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの超毒性株、例えば限定されないが、ＢＩ／ＮＡＰ１／０２７株群に属するもののいずれかによって産生される毒素を中和するのに使用され得る。本明細書の実施例１０に記載されているように、本明細書でＶＡ５、ＶＡ１７、６３３６および６４４３と表記される臨床分離菌は、これらの超毒性株に含まれる。
【００８７】
一実施形態では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに関連する症状または疾患を発症するリスクを有する患者であって、本発明の抗体または１つ以上の本発明の抗体を含む組成物による処置から恩恵を受けることができる患者は、高齢（６５歳以上）患者、基礎疾患によりまたは免疫抑制治療薬の投与により免疫無防備状態である患者、患者をＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症に罹患しやすくし得るいくつかの基礎病状を有する患者、長期間（１週間以上）の入院患者、広域抗生物質で長期間（１４日間以上）処置されている患者、癌患者、移植患者、ならびに胃内酸度、胃食道逆流性疾患（ＧＥＲＤ）、胃潰瘍および小腸潰瘍または胸やけを軽減または処置するための胃腸疾患または症状の処置に使用される薬剤、例えば限定されないが、プロトンポンプ阻害剤またはヒスタミンＨ２受容体阻害剤による治療中の患者から選択され得る。
【００８８】
一実施形態では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに関連する症状または疾患を発症するリスクを有する患者は、癌患者である。関連実施形態では、癌患者は、抗癌薬による処置を受けているか、または癌を処置するための放射線療法を受けている。
【００８９】
一実施形態では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに関連する症状または疾患を発症するリスクを有する患者は、移植患者である。関連実施形態では、移植患者は、造血幹細胞移植または固形組織もしくは器官移植を受けている患者である。ある特定の実施形態では、移植患者は、免疫抑制薬もしくは任意の移植拒絶反応抑制薬で処置されているか、または移植後の組織もしくは器官移植片拒絶を予防するための投薬計画による処置を受けている患者である。
【００９０】
一実施形態では、抗体は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに関連する症状もしくは疾患を患っているか、または前記症状もしくは疾患に関連する少なくとも１つの症候もしくは合併症を患っている患者に治療的に投与される（感染症の確立後に投与され、感染症の期間全体を通して与えられる）。一実施形態では、抗体は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに関連する症状もしくは疾患を発症するリスクを有するか、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ症状もしくは疾患に関連する少なくとも１つの症候もしくは合併症を発症するリスクを有する患者に予防的に投与される（感染症の発症前に投与される）。例えば、このような「Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症を発症するリスクを有する患者」には、高齢者（６５歳以上）、または疾患によりもしくは免疫抑制治療薬の投与により免疫無防備状態であり得る患者、または患者をＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症に罹患しやすくし得るいくつかの基礎病状を有する患者、または長期間（一般に、１週間以上）の入院患者、または広域抗生物質で長期間（一般に、１４日間以上）処置されている患者、または胃腸疾患もしくは症状を処置するためのプロトンポンプ阻害剤による治療中の患者が含まれる。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症を発症するリスクを有する他の患者は、組織または器官移植を必要とする患者であって、組織または器官拒絶を予防するための免疫抑制薬による処置を受けている患者である。この患者集団には、自己または同種造血幹細胞移植のいずれかを必要とする個体が含まれる。他の種類の感染症を予防するための高用量の抗生物質治療の服用に加えて、これらの患者に必要な長期の入院は、これらの患者をＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ一次感染に罹患しやすくし得る。あるいは、このような移植を必要とする患者がＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症を既に患っているか、またはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症の症候を示している場合、高用量の抗生物質治療を施し、次いで移植片拒絶を予防するための免疫抑制治療を施すと、その患者は、このような感染症が再発または悪化する傾向を有し得る。さらに、これらの移植患者は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症に罹患するリスクを有し得るだけではなく、移植片対宿主病におけるＧＩ関連病変（ＧＩ−ＧＶＨＤ）による移植拒絶のリスクも有し得る（これは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによる感染症を患っている移植患者で増強されると思われる）（Ａｌｏｎｓｏ，Ｃ．Ｄ．ｅｔ．ａｌ．，（２０１２），Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．５４，１０５３−１０６３を参照のこと）。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症と、ＧＩ管を障害するＧＶＨＤとの間の関係性は現時点では不明であるが、この患者集団は、本発明の抗毒素Ａおよび／または抗毒素Ｂ抗体による治療から恩恵を受けるであろう。この患者集団を治療的に（感染の開始後に）処置し得ることが想定されるが、これらの患者は、本発明の抗体のいずれかの予防的な（感染前の）投与から恩恵を受けるであろうとも考えられる。限定されないが、静脈内注射または皮下注射を含む投与に適切な任意の送達経路によって、本発明の抗体による処置の候補患者に、１つ以上の抗体を含む組成物を投与し得る。
【００９１】
一実施形態では、本発明の抗体を含む医薬組成物は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症を処置するのに有用な１つ以上の治療剤と組み合わせて患者に投与される。
【００９２】
一実施形態では、１つ以上の治療剤は、トキソイド、プロバイオティック、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅワクチン（例えば、不活性化された毒素ＡおよびＢ、例えば限定されないが、ＡＣＡＭ−ＣＤＩＦＦ（商標））、抗生物質（例えば、メトロニダゾール、バンコマイシンまたはフィダキソマイシン）、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａおよび／またはＢに対する別の異なる抗体、ならびにＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ疾患の重症度を軽減するため、またはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ疾患の再発頻度を軽減するため、またはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに関連する症状もしくは疾患に関連する少なくとも１つの症候を改善するために有用な任意の他の緩和療法からなる群より選択され得る。
【００９３】
別の実施形態では、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに関連する症状または疾患に関連する１つの症候または合併症は、下痢、偽膜性大腸炎、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ症状または疾患の再燃／再発、および移植組織または器官の拒絶からなる群より選択される。
【００９４】
他の実施形態は、以下の詳細な説明を精査することによって明らかとなろう。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａもしくは毒素Ｂに特異的に結合するか、または毒素Ａおよび毒素Ｂの両方に結合するかもしくはこれらの両方と交差反応する単離された抗体であって、
ａ）Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａに特異的に結合する前記単離された抗体またはその抗原結合断片が、配列番号２、９８、１１４、１３０、１４６および１６２から選択される重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）アミノ酸配列内に含まれる３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）と、配列番号１０、１０６、１２２、１３８、１５４および１７０から選択される軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）アミノ酸配列内に含まれる３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）とを含み；
ｂ）Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ｂに特異的に結合する前記単離された抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１７８、１９４、２１０、２２６、２４２、２５８、２７４、２９０、３０６、３２２、３３８および３５４から選択されるＨＣＶＲアミノ酸配列内に含まれるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３と、配列番号１８６、２０２、２１８、２３４、２５０、２６６、２８２、２９８、３１４、３３０、３４６および３６２から選択されるＬＣＶＲアミノ酸配列内に含まれるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３とを含み；および
ｃ）Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａおよび毒素Ｂの両方に結合するか、またはこれらの両方と交差反応する前記単離された抗体または抗原結合断片が、配列番号１８、３４、５０、６６および８２から選択されるＨＣＶＲアミノ酸配列内に含まれるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３と、配列番号２６、４２、５８、７４および９０から選択されるＬＣＶＲアミノ酸配列内に含まれるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３とを含む、単離された抗体。
（項目２）
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａに特異的に結合する項目１に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片であって、（ａ）配列番号１４６のアミノ酸配列を有するＨＣＶＲと、（ｂ）配列番号１５４のアミノ酸配列を有するＬＣＶＲとを含む、単離された抗体またはその抗原結合断片。
（項目３）
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａに特異的に結合する項目１に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片であって、配列番号２／１０、９８／１０６、１１４／１２２、１３０／１３８、１４６／１５４および１６２／１７０から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアを含む、単離された抗体またはその抗原結合断片。
（項目４）
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａに特異的に結合する、項目１または３のいずれかに記載の単離された抗体またはその抗原結合断片であって、前記抗体は、
（ａ）配列番号４、１００、１１６、１３２、１４８および１６４から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１ドメイン；
（ｂ）配列番号６、１０２、１１８、１３４、１５０および１６６から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２ドメイン；
（ｃ）配列番号８、１０４、１２０、１３６、１５２および１６８から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３ドメイン；
（ｄ）配列番号１２、１０８、１２４、１４０、１５６および１７２から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１ドメイン；
（ｅ）配列番号１４、１１０、１２６、１４２、１５８および１７４から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２ドメイン；および
（ｆ）配列番号１６、１１２、１２８、１４４、１６０および１７６から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３ドメイン
を含む、単離された抗体またはその抗原結合断片。
（項目５）
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａに特異的に結合する、項目１〜４のいずれかに記載の単離された抗体またはその抗原結合断片であって、前記抗体は、
（ａ）配列番号１４８のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１ドメイン；
（ｂ）配列番号１５０のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２ドメイン；
（ｃ）配列番号１５２のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３ドメイン；
（ｄ）配列番号１５６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１ドメイン；
（ｅ）配列番号１５８のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２ドメイン；および
（ｆ）配列番号１６０のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３ドメイン
を含む、単離された抗体またはその抗原結合断片。
（項目６）
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ｂに特異的に結合する、項目１に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片であって、前記抗体は、（ａ）配列番号２７４のアミノ酸配列を有するＨＣＶＲと、（ｂ）配列番号２８２のアミノ酸配列を有するＬＣＶＲとを含む、単離された抗体またはその抗原結合断片。
（項目７）
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ｂに特異的に結合する、項目１に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片であって、配列番号１７８／１８６、１９４／２０２、２１０／２１８、２２６／２３４、２４２／２５０、２５８／２６６、２７４／２８２、２９０／２９８、３０６／３１４、３２２／３３０、３３８／３４６および３５４／３６２から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアを含む、単離された抗体またはその抗原結合断片。
（項目８）
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ｂに特異的に結合する、項目１または７のいずれかに記載の単離された抗体またはその抗原結合断片であって、前記抗体は、
（ａ）配列番号１８０、１９６、２１２、２２８、２４４、２６０、２７６、２９２、３０８、３２４、３４０および３５６からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１ドメイン；
（ｂ）配列番号１８２、１９８、２１４、２３０、２４６、２６２、２７８、２９４、３１０、３２６、３４２および３５８からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２ドメイン；
（ｃ）配列番号１８４、２００、２１６、２３２、２４８、２６４、２８０、２９６、３１２、３２８、３４４および３６０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３ドメイン；
（ｄ）配列番号１８８、２０４、２２０、２３６、２５２、２６８、２８４、３００、３１６、３３２、３４８および３６４からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１ドメイン；
（ｅ）配列番号１９０、２０６、２２２、２３８、２５４、２７０、２８６、３０２、３１８、３３４、３５０および３６６からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２ドメイン；および
（ｆ）配列番号１９２、２０８、２２４、２４０、２５６、２７２、２８８、３０４、３２０、３３６、３５２および３６８からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３ドメイン
を含む、単離された抗体またはその抗原結合断片。
（項目９）
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ｂに特異的に結合する、項目１または６〜８のいずれかに記載の単離された抗体またはその抗原結合断片であって、前記抗体は、
（ａ）配列番号２７６からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１ドメイン、
（ｂ）配列番号２７８からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２ドメイン；
（ｃ）配列番号２８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３ドメイン；
（ｄ）配列番号２８４からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１ドメイン；
（ｅ）配列番号２８６からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２ドメイン；および
（ｆ）配列番号２８８からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３ドメイン
を含む、単離された抗体またはその抗原結合断片。
（項目１０）
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａおよび毒素Ｂの両方に結合するか、またはこれらの両方と交差反応する、項目１に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片であって、前記抗体は、（ａ）配列番号１８および３４から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲと、（ｂ）配列番号２６および４２から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲとを含む、単離された抗体またはその抗原結合断片。
（項目１１）
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａおよび毒素Ｂの両方に結合するか、またはこれらの両方と交差反応する、項目１に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片であって、配列番号１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４および８２／９０から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアを含む、単離された抗体またはその抗原結合断片。
（項目１２）
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａおよび毒素Ｂの両方に結合するか、またはこれらの両方と交差反応する、項目１または１１のいずれかに記載の単離された抗体またはその抗原結合断片であって、配列番号１８／２６および３４／４２から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアを含む、単離された抗体またはその抗原結合断片。
（項目１３）
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａおよび毒素Ｂの両方に結合するか、またはこれらの両方と交差反応する、項目１または１１のいずれかに記載の単離された抗体またはその抗原結合断片であって、前記抗体は、
（ａ）配列番号２０、３６、５２、６８および８４から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１ドメイン；
（ｂ）配列番号２２、３８、５４、７０および８６から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２ドメイン；
（ｃ）配列番号２４、４０、５６、７２および８８から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３ドメイン；
（ｄ）配列番号２８、４４、６０、７６および９２から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１ドメイン；
（ｅ）配列番号３０、４６、６２、７８および９４から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２ドメイン；および
（ｆ）配列番号３２、４８、６４、８０および９６から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３ドメイン
を含む、単離された抗体またはその抗原結合断片。
（項目１４）
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａおよび毒素Ｂの両方に結合するか、またはこれらの両方と交差反応する項目１、１１または１３のいずれかに記載の単離された抗体またはその抗原結合断片であって、
（ａ）配列番号２０および３６から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１ドメイン；
（ｂ）配列番号２２および３８から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２ドメイン；
（ｃ）配列番号２４および４０から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３ドメイン；
（ｄ）配列番号２８および４４から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１ドメイン；
（ｅ）配列番号３０および４６から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２ドメイン；および
（ｆ）配列番号３２および４８から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３ドメイン
を含む、単離された抗体またはその抗原結合断片。
（項目１５）
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによって産生される毒素Ａのカルボキシ末端受容体結合ドメインのアミノ酸残基４６８〜８６３内のエピトープと相互作用するか、もしくはこれに結合する項目２に記載の単離された抗体、またはその抗原結合断片であって、毒素Ａの前記カルボキシ末端受容体結合ドメインが、配列番号３７５のアミノ酸配列を含む、単離された抗体またはその抗原結合断片。
（項目１６）
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによって産生される毒素Ａのカルボキシ末端受容体結合ドメイン内のエピトープと相互作用するか、もしくはこれに結合する項目２に記載の単離された抗体、またはその抗原結合断片であって、前記エピトープが、配列番号３７５の残基４６８〜４８８、配列番号３７５の残基５１０〜５３０、配列番号３７５の残基６０２〜６１０、配列番号３７５の残基６４４〜７０３、配列番号３７５の残基７２４〜７９４、配列番号３７５の残基７９９〜８１４、および配列番号３７５の残基８５８〜８６３からなる群より選択される、単離された抗体またはその抗原結合断片。
（項目１７）
項目１〜１６のいずれかに記載の１つ以上の抗体と、薬学的に許容し得る担体または希釈剤とを含む、医薬組成物。
（項目１８）
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａに特異的に結合する少なくとも１つの抗体またはその抗原結合断片と、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ｂに特異的に結合する少なくとも１つの抗体またはその抗原結合断片とを含む項目１７に記載の医薬組成物であって、
ａ）毒素Ａに特異的に結合する前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号２、９８、１１４、１３０、１４６および１６２から選択される重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）アミノ酸配列のいずれか１つの中に含まれる３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）と、配列番号１０、１０６、１２２、１３８、１５４および１７０から選択される軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）アミノ酸配列のいずれか１つの中に含まれる３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）とを含み；および
ｂ）毒素Ｂに特異的に結合する前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１７８、１９４、２１０、２２６、２４２、２５８、２７４、２９０、３０６、３２２、３３８および３５４から選択されるＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれか１つの中に含まれる３つの重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）と、配列番号１８６、２０２、２１８、２３４、２５０、２６６、２８２、２９８、３１４、３３０、３４６および３６２から選択されるＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれか１つの中に含まれる３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）とを含む、医薬組成物。
（項目１９）
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａに特異的に結合する前記抗体またはその抗原結合断片が配列番号１４６／１５４のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアを含み、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ｂに特異的に結合する前記抗体またはその抗原結合断片が配列番号２７４／２８２のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアを含む、項目１７または１８のいずれかに記載の医薬組成物。
（項目２０）
ａ）Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａに特異的に結合する単離された第１の抗体またはその抗原結合断片であって、配列番号１４８のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１と、配列番号１５０のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２と、配列番号１５２のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３と、配列番号１５６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１と、配列番号１５８のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２と、配列番号１６０のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３とを含む単離された第１の抗体またはその抗原結合断片；
ｂ）Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ｂに特異的に結合する単離された第２の抗体またはその抗原結合断片であって、配列番号２７６のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１と、配列番号２７８のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２と、配列番号２８０のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３と、配列番号２８４のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１と、配列番号２８６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２と、配列番号２８８のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３とを含む単離された第２の抗体またはその抗原結合断片；および
ｃ）薬学的に許容し得る担体または希釈剤
を含む、項目１７〜１９のいずれかに記載の医薬組成物。
（項目２１）
前記組成物内に含まれる前記抗体が、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの超毒性株由来の毒素ＡおよびＢを中和するのに有効である、項目１７〜２０のいずれかに記載の医薬組成物。
（項目２２）
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの前記超毒性株がＢＩ／ＮＡＰ１／０２７株である、項目２１に記載の医薬組成物。
（項目２３）
前記ＢＩ／ＮＡＰ１／０２７株が、ＶＡ５、ＶＡ１７、６３３６および６４４３から選択される、項目２２に記載の医薬組成物。
（項目２４）
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに関連する症状もしくは疾患を患っている患者を処置するため、または前記症状もしくは疾患に関連する少なくとも１つの症候もしくは合併症を処置するため、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに関連する症状もしくは疾患の発症のリスクを有する患者におけるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに関連する症状もしくは疾患の発症を予防するための方法であって、有効量の項目１７〜２３のいずれかに記載の医薬組成物を前記患者に投与することを含み、前記Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに関連する症状もしくは疾患が予防されるかもしくは重症度および／もしくは持続期間の点で低減されるか、または前記症状もしくは疾患に関連する少なくとも１つの症候もしくは合併症が予防もしくは改善されるか、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの頻度および／もしくは持続期間、またはその再発の重症度、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによる再燃が軽減される、方法。
（項目２５）
前記Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに関連する症状または疾患に関連する少なくとも１つの症候または合併症が、食欲不振、腹痛、腹部膨満、出血有りまたは無しの下痢、脱水症、栄養失調、偽膜性大腸炎、完全なまたは部分的な結腸切除、発熱および全身感染症（敗血症）、死亡、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ症状または疾患の再燃、ならびに移植組織または器官の拒絶からなる群より選択される、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに関連する症状または疾患を発症するリスクを有する前記患者が、高齢患者（６５歳以上）、基礎疾患によりまたは免疫抑制治療薬の投与により免疫無防備状態である患者、患者をＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症に罹患しやすくし得るいくつかの基礎病状を有する患者、長期間（少なくとも１週間）の入院患者、広域抗生物質で長期間（１４日間以上）処置されている患者、癌患者、移植患者、ならびに胃内酸度、胃食道逆流性疾患（ＧＥＲＤ）、胃潰瘍および小腸潰瘍または胸やけを軽減または処置するための胃腸疾患または症状の処置に使用される薬剤、例えば限定されないが、プロトンポンプ阻害剤またはヒスタミンＨ２受容体阻害剤による治療中の患者からなる群より選択される、項目２４または２５に記載の方法。
（項目２７）
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに関連する症状もしくは疾患を患っている患者を処置するのに使用するため、または前記症状もしくは疾患に関連する少なくとも１つの症候もしくは合併症を処置するため、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに関連する症状もしくは疾患の発症のリスクを有する患者におけるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに関連する症状もしくは疾患の発症を予防するための項目１７〜２３のいずれかに記載の医薬組成物であって、前記Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに関連する症状もしくは疾患が予防されるかまたは重症度および／もしくは持続期間の点で低減されるか、または前記症状もしくは疾患に関連する少なくとも１つの症候もしくは合併症が予防もしくは改善されるか、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの頻度および／もしくは持続期間、またはその再発の重症度、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによる再燃が軽減される、医薬組成物。
（項目２８）
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに関連する症状もしくは疾患を患っている患者を処置するのに使用するため、または前記症状もしくは疾患に関連する少なくとも１つの症候もしくは合併症を処置するため、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに関連する症状もしくは疾患の発症のリスクを有する患者におけるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに関連する症状もしくは疾患の発症を予防するための薬品の製造における、項目１７〜２３のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用であって、前記Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに関連する症状もしくは疾患が予防されるかまたは重症度および／もしくは持続期間の点で低減されるか、または前記症状もしくは疾患に関連する少なくとも１つの症候もしくは合併症が予防もしくは改善されるか、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの頻度および／もしくは持続期間、またはその再発の重症度、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによる再燃が軽減される、使用。
（項目２９）
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに関連する症状または疾患を発症するリスクを有する前記患者が、高齢患者、疾患によりまたは免疫抑制治療薬の投与により免疫無防備状態である患者、患者をＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症に罹患しやすくし得るいくつかの基礎病状を有する患者、長期間の入院患者、広域抗生物質で長期間処置されている患者、胃腸疾患または症状を処置するためのプロトンポンプ阻害剤による治療中の患者、癌患者、ならびに移植患者から選択される、項目２７または２８に記載の医薬組成物の使用。
（項目３０）
前記癌患者が、抗癌薬による処置を受けているか、または癌を処置するための放射線療法を受けている、項目２９に記載の医薬組成物の使用。
（項目３１）
前記移植患者が、造血幹細胞移植または固形組織もしくは器官移植を受けている患者である、項目２９に記載の医薬組成物の使用。
（項目３２）
前記移植患者が、免疫抑制薬もしくは任意の移植拒絶反応抑制薬で処置されているか、または移植後の組織もしくは器官移植片拒絶を予防するための投薬計画による処置を受けている者である、項目２９または３１に記載の医薬組成物の使用。
（項目３３）
前記医薬組成物が、第２の治療剤と組み合わせて前記患者に投与される、項目１７〜３２のいずれかに記載の医薬組成物の使用。
（項目３４）
前記第２の治療剤が、トキソイド、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅワクチン、抗生物質、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａおよび／またはＢに対する別の異なる抗体、ならびにＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに関連する症状または疾患に関連する少なくとも１つの症候を改善するのに有用な任意の他の緩和療法から選択される、項目３３に記載の医薬組成物の使用。
（項目３５）
前記Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに関連する症状または疾患に関連する少なくとも１つの症候または合併症が、食欲不振、腹痛、腹部膨満、出血有りまたは無しの下痢、脱水症、栄養失調、偽膜性大腸炎、完全なまたは部分的な結腸切除、発熱および全身感染症（敗血症）、死亡、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ症状または疾患の再燃、ならびに移植組織または器官の拒絶からなる群より選択される、項目３４に記載の使用。
（項目３６）
前記項目のいずれかに含まれる抗体をコードする、単離された核酸。
（項目３７）
項目３６に記載の核酸を含む、発現ベクター。
（項目３８）
項目３７に記載の発現ベクターを含む、単離された宿主細胞。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】図１は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来の毒素Ａおよび毒素Ｂのドメイン構造を示す（Ｄａｖｉｅｓ  ＡＨら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（２０１１），４３６：５１７−５２６を参照のこと）。
【００９６】
【図２】図２は、ハムスター再発アッセイの結果を、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ負荷後のクリンダマイシンおよびバンコマイシン処置を受けて生存しているハムスターの割合、ならびに抗毒素Ａおよび抗毒素Ｂ  ｍＡｂによる処置の効果として示すグラフである。３〜６日目において、すべての抗体を１日１回皮下投与した。陽性対照抗体は、比較用抗体の抗毒素Ａ（対照Ｉ）および抗毒素Ｂ（対照ＩＩ）である。１〜３日目において、バンコマイシンをすべての動物に１０ｍｇ／ｋｇの用量で経口投与した。（点線の●：ＰＢＳ対照；点線の△：１０ｍｇ／ｋｇの陰性アイソタイプ対照；実線の□：各５ｍｇ／ｋｇの対照Ｉ／対照ＩＩ（５／５）；実線の◆：各５ｍｇ／ｋｇのＨ１Ｈ３３３０Ｐ／Ｈ１Ｈ３３４７Ｐ（５／５））。
【００９７】
【図３】図３は、ハムスター再発アッセイの結果を、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ負荷後のクリンダマイシンおよびバンコマイシン処置を受けて生存しているハムスターの割合、ならびに抗毒素Ａおよび抗毒素Ｂ  ｍＡｂの効果として示すグラフである。３日目において、すべての抗体を１回皮下投与した。陽性対照抗体は、比較用抗体の抗毒素Ａ（対照Ｉ）および抗毒素Ｂ（対照ＩＩ）である。１〜３日目において、バンコマイシンをすべての動物に１０ｍｇ／ｋｇの用量で経口投与した。（点線の△：１０ｍｇ／ｋｇの陰性アイソタイプ対照；実線の□：各５ｍｇ／ｋｇの対照Ｉ／対照ＩＩ（５／５）；実線の◆：各５ｍｇ／ｋｇのＨ１Ｈ３３３０Ｐ／Ｈ１Ｈ３３４７Ｐ（５／５）；実線の○：各２ｍｇ／ｋｇの対照Ｉ／対照ＩＩ（２／２）；実線の
【数１】
2018029625.tif 000002
：各２ｍｇ／ｋｇのＨ１Ｈ３３３０Ｐ／Ｈ１Ｈ３３４７Ｐ（２／２））。
【００９８】
【図４】図４は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症の急性ハムスターモデルにおける生存結果を示すグラフである。クリンダマイシン処置（−１日目）後のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ負荷（０日目）を受けて生存しているハムスターの割合として結果を示す。−３日目〜０日目の各４日間において、すべての抗体を皮下投与した。各５０ｍｇ／ｋｇ（５０／５０）、各１６．６ｍｇ／ｋｇ（１６．６／１６．６）、各５．５ｍｇ／ｋｇ（５．５／５．５）および各１．８５ｍｇ／ｋｇ（１．８５／１．８５）で抗体を投与した。（実線の▽：非感染；点線の●：ＰＢＳ対照；点線の△：１００ｍｇ／ｋｇの陰性アイソタイプ対照；実線の◆：各５０ｍｇ／ｋｇのＨ１Ｈ３３３０Ｐ／Ｈ１Ｈ３３４７Ｐ（５０／５０）；実線の○：各１６．６ｍｇ／ｋｇのＨ１Ｈ３３３０Ｐ／Ｈ１Ｈ３３４７Ｐ（１６．６／１６．６）；実線の
【数２】
2018029625.tif 000003
：各５．５ｍｇ／ｋｇのＨ１Ｈ３３３０Ｐ／Ｈ１Ｈ３３４７Ｐ（５．５／５．５）；実線の
【数３】
2018029625.tif 000004
：各１．８５ｍｇ／ｋｇのＨ１Ｈ３３３０Ｐ／Ｈ１Ｈ３３４７Ｐ（１．８５／１．８５）。
【００９９】
【図５】図５は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症の急性ハムスターモデルにおける生存結果を示すグラフである。クリンダマイシン処置（−１日目）後のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ負荷（０日目）を受けて生存しているハムスターの割合として結果を示す。−３日目〜０日目の各４日間において、すべての抗体を皮下投与した。各２０ｍｇ／ｋｇ（２０／２０）または各５ｍｇ／ｋｇ（５／５）で抗体を投与した。（実線の▽：非感染；点線の●：ＰＢＳ対照；点線の△：４０ｍｇ／ｋｇの陰性アイソタイプ対照；実線の□：各２０ｍｇ／ｋｇの対照Ｉ／対照ＩＩ（２０／２０）；実線の
【数４】
2018029625.tif 000005
：各５ｍｇ／ｋｇの対照Ｉ／対照ＩＩ（５／５）；実線の◆：各２０ｍｇ／ｋｇのＨ１Ｈ３３３０Ｐ／Ｈ１Ｈ３３４７Ｐ（２０／２０）；実線の◇：各５ｍｇ／ｋｇのＨ１Ｈ３３３０Ｐ／Ｈ１Ｈ３３４７Ｐ（５／５））。
【発明を実施するための形態】
【０１００】
詳細な説明
本方法について記載する前に、記載される特定の方法および実験条件は変化し得るので、本発明はこのような方法および条件に限定されるわけではないことを理解するべきである。また、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書で使用される専門用語は単に特定の実施形態を説明することを目的とするものであり、限定的であることを意図するものではないことも理解するべきである。
【０１０１】
別段に定義しない限り、本明細書で使用されるすべての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載される方法および材料と類似または同等の任意の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、ここでは、好ましい方法および材料について記載する。
【０１０２】
定義
「毒素Ａ」（「ｔｃｄＡ」とも称される）という用語は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ（本明細書では「Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ」とも称される）によって産生される毒素Ａタンパク質を指す。「毒素Ａ」のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋではアクセッション番号ＣＡＡ６３５６４として提供されており、本明細書では配列番号３７８としても参照される。毒素Ａは、本明細書では配列番号３７７として提供される核酸によってコードされ、ＧｅｎＢａｎｋではアクセッション番号ＡＭ１８０３５５としても見られる。
【０１０３】
「毒素Ｂ」（「ｔｃｄＢ」とも称される）という用語は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによって産生される毒素Ｂタンパク質を指す。「毒素Ｂ」のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋではアクセッション番号ＣＡＪ６７４９２として提供されており、本明細書では配列番号３８０としても参照される。毒素Ｂは、本明細書では配列番号３７９として提供される核酸によってコードされ、ＧｅｎＢａｎｋではアクセッション番号ＡＭ１８０３５５としても見られる。
【０１０４】
「Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａおよび毒素Ｂのカルボキシ末端受容体結合ドメイン」は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来の毒素Ａおよび毒素Ｂの一部分であって、標的細胞に対する結合に関与してそれに続く受容体媒介性エンドサイトーシスを可能にする一部分を指す。本明細書に記載されるように、毒素Ａのカルボキシ末端受容体結合ドメインのアミノ酸配列は、配列番号３７５に示されている。毒素Ｂのカルボキシ末端受容体結合ドメインのアミノ酸配列は、配列番号３７６に示されている。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来の毒素Ａおよび毒素Ｂの様々なドメインが図１に示されており、Ｄａｖｉｅｓら（Ｄａｖｉｅｓ，ＡＨら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（２０１１），４３６：５１７−５２６）にさらに記載されている。
【０１０５】
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに関する「ＢＩ／ＮＡＰ１／０２７」という名称は、欧州および北米にわたる罹患率および死亡率の増加に関連しているＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの高毒性分離菌群を指す（Ｌｏｏ，ＶＧら、（２００５），Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，３５３：２４４２−９；ＭｃＤｏｎａｌｄ，ＬＣら、（２００６），Ｅｍｅｒｇ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ，１２：４０９−１５；ＭｃＤｏｎａｌｄ，ＬＣら、（２００５），Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，３５３：２４３３−４１；Ｒｅｄｅｌｉｎｇｓ，ＭＤら、（２００７），Ｅｍｅｒｇ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １３：１４１７−９）。「ＢＩ／ＮＡＰ１／０２７」という名称はさらに、制限エンドヌクレアーゼ分析による北米パルスフィールドＩ型（ＮＡＰ１）、リボタイプ０２７およびＢＩ群を指す。それは１９８０年代に最初に同定されたが、最初は新たなフルオロキノロン剤に耐性であると同定されておらず、２０００年以前には流行していなかった（Ｗａｒｎｙ，Ｍら、（２００５），Ｌａｎｃｅｔ  ３６６：１０７９−８４；Ｋｅｌｌｙ，ＣＰら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５９：１９３２−４０）。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの「ＢＩ／ＮＡＰ１／０２７」株はまた、毒素Ａおよび毒素Ｂの産生増加、さらなる毒素（バイナリー毒素）の存在、ならびにフルオロキノロン耐性の増加を特徴とする（ＭｃＤｏｎａｌｄ，ＬＣら、（２００５），Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，３５３：２４３３−４１；Ｗａｒｎｙ，Ｍら、（２００５），Ｌａｎｃｅｔ  ３６６：１０７９−８４）。
【０１０６】
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって相互に連結された２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖である、４つのポリペプチド鎖を含む免疫グロブリン分子（すなわち、「完全抗体分子」）のほか、それらの多量体（例えば、ＩｇＭ）またはこれらの抗原結合断片を指すことを意図する。各重鎖は、重鎖可変領域（「ＨＣＶＲ」または「ＶＨ」）と、重鎖定常領域（ドメインＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む）とを含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（「ＬＣＶＲ」または「ＶＬ」）と、軽鎖定常領域（ＣＬ）とを含む。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存的な領域が点在した相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域へとさらに細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へと以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配列される３つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなる。本発明のある特定の実施形態では、抗体（またはその抗原結合断片）のＦＲは、ヒト生殖細胞系列の配列と同一な場合もあり、天然で、または人工的に修飾される場合もある。アミノ酸のコンセンサス配列は、２つ以上のＣＤＲについての対照比較による分析に基づき定義することができる。
【０１０７】
また、１つ以上のＣＤＲ残基を置換するか、または１つ以上のＣＤＲを脱落させることも可能である。１つまたは２つのＣＤＲが結合には必要とされない抗体が科学文献に記載されている。Ｐａｄｌａｎら、（１９９５  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．９：１３３−１３９）は、公表された結晶構造に基づき、抗体とそれらの抗原との接触領域について分析し、ＣＤＲ残基のうちで抗原に実際に接触するのは約５分の１〜３分の１に過ぎないと結論付けた。Ｐａｄｌａｎはまた、１つまたは２つのＣＤＲのアミノ酸が抗原と接触しない抗体も多く見出した（Ｖａｊｄｏｓら、２００２  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３２０：４１５−４２８も参照のこと）。
【０１０８】
抗原に接触しないＣＤＲ残基は、先行研究に基づき、ＣｈｏｔｈｉａによるＣＤＲの外部に存在するＫａｂａｔによるＣＤＲの領域から、分子的モデル化を介して同定することもでき、および／または経験的に同定することもできる（例えば、ＣＤＲＨ２における残基Ｈ６０〜Ｈ６５は必要とされないことが多い）。ＣＤＲまたはその残基を脱落させる場合、通常はそれを別のヒト抗体配列またはこのような配列のコンセンサス配列における対応する位置を占めるアミノ酸で置換する。また、ＣＤＲ内の置換のための位置および置換するアミノ酸は、経験的に選択することもできる。経験的置換は、保存的置換の場合もあり、非保存的置換の場合もある。
【０１０９】
本明細書で開示される完全ヒト抗毒素Ａおよび／または抗毒素Ｂモノクローナル抗体は、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのフレームワーク領域および／またはＣＤＲ領域において、対応する生殖細胞系列の配列と比較して１つ以上のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を含み得る。このような突然変異は、本明細書で開示されるアミノ酸配列を、例えば、公開の抗体配列データベースから入手可能な生殖細胞系列の配列と比較することによって、容易に確認することができる。本発明には、本明細書で開示されるアミノ酸配列のいずれか由来の抗体およびその抗原結合断片であって、１つ以上のフレームワーク領域および／またはＣＤＲ領域内の１つ以上のアミノ酸を、この抗体が由来する生殖細胞系列の配列の対応する残基、または別のヒト生殖細胞系列の配列の対応する残基、または対応する生殖細胞系列の残基の保存的アミノ酸置換へと突然変異させた（本明細書では、このような配列変化を「生殖細胞系列突然変異」と総称する）抗体または断片が含まれる。当業者は、本明細書で開示される重鎖可変領域および軽鎖可変領域の配列から出発して、１つ以上の個別の生殖細胞系列突然変異またはこれらの組み合わせを含む多数の抗体および抗原結合断片を容易に生産することができる。ある特定の実施形態では、ＶＨドメインおよび／またはＶＬドメイン内のフレームワーク残基および／またはＣＤＲ残基のすべてを、抗体が由来する元の生殖細胞系列の配列において見出される残基へと復帰突然変異させる。他の実施形態では、特定の残基だけ、例えば、ＦＲ１の最初の８アミノ酸内もしくはＦＲ４の最後の８アミノ酸内に見出される突然変異残基だけ、またはＣＤＲ１、ＣＤＲ２、もしくはＣＤＲ３内に見出される突然変異残基だけを、元の生殖細胞系列の配列へと復帰突然変異させる。他の実施形態では、フレームワーク残基および／またはＣＤＲ残基の１つ以上を、異なる生殖細胞系列の配列の対応する残基（すなわち、抗体が元来由来した生殖細胞系列の配列とは異なる生殖細胞系列の配列）へと突然変異させる。さらに、本発明の抗体は、フレームワーク領域および／またはＣＤＲ領域内の２つ以上の生殖細胞系列突然変異の任意の組み合わせであって、例えば、個別の特定の残基を、特定の生殖細胞系列の配列の対応する残基へと突然変異させる一方で、元の生殖細胞系列の配列とは異なる特定の他の残基を維持するか、または異なる生殖細胞系列の配列の対応する残基へと突然変異させる組み合わせも含有し得る。得られたならば、１つ以上の生殖細胞系列突然変異を含有する抗体および抗原結合断片は、結合特異性の改善、結合親和性の増大、アンタゴニスト性またはアゴニスト性の生物学的特性の改善または増強（場合によって）、免疫原性の低減などの１つ以上の所望の特性について容易に調べることができる。本発明内には、この一般的な形で得られた抗体および抗原結合断片が包含される。
【０１１０】
本発明はまた、１つ以上の保存的置換を有する、本明細書で開示されるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲのアミノ酸配列のいずれかの変異体を含む完全ヒト抗毒素Ａおよび／または抗毒素Ｂモノクローナル抗体も包含する。例えば、本発明は、本明細書で開示されるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲのアミノ酸配列のいずれかに対して、例えば、１０つ以下、８つ以下、６つ以下、４つ以下などの保存的アミノ酸置換を伴うＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲのアミノ酸配列を有する抗毒素Ａおよび抗毒素Ｂ抗体を包含する。
【０１１１】
本明細書で使用される場合、「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列由来の可変領域および定常領域を有する抗体を包含することを意図する。本発明のヒトｍＡｂは、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるランダム突然変異誘発または部位特異的突然変異誘発を介して導入される突然変異、またはｉｎ  ｖｉｖｏにおける体細胞突然変異を介して導入される突然変異）を、例えば、ＣＤＲにおいて包含することが可能であり、特に、ＣＤＲ３においてこれを包含し得る。しかしながら、本明細書で使用される場合、「ヒト抗体」という用語は、別の哺乳動物種（例えば、マウス）の生殖細胞系列由来のＣＤＲ配列をヒトＦＲ配列へと移植したｍＡｂを包含することは意図しない。
【０１１２】
「特異的に結合する」または「に特異的に結合する」などの用語は、抗体またはその抗原結合断片が、生理学的条件下で、抗原と比較的安定的な複合体を形成することを意味する。特異的結合は、少なくとも約１×１０−６Ｍ以下の平衡解離定数（例えば、ＫＤが小さいほど、より緊密な結合が示される）を特徴とし得る。当技術分野では、２つの分子が特異的に結合するかを決定する方法が周知であり、これらには、例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴などが含まれる。本明細書に記載されるように、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来の毒素Ａに特異的に結合するか、またはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来の毒素Ｂに特異的に結合する抗体を、表面プラズモン共鳴、例えばＢＩＡＣＯＲＥ（商標）によって同定した一方、毒素Ａおよび毒素Ｂの両方のカルボシキ末端受容体結合ドメインに特異的に結合する他のものを同定した。さらに、毒素Ａまたは毒素Ｂおよび１つ以上のさらなる抗原に結合する多重特異性抗体、または毒素Ａまたは毒素Ｂの２つの異なる領域に結合する二重特異性抗体もやはり、本明細書で使用される場合、「特異的に結合する」抗体と考えられる。
【０１１３】
「高親和性」抗体という用語は、表面プラズモン共鳴、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）、または溶液親和性ＥＬＩＳＡによって測定した場合に、ＫＤとして表される毒素Ａまたは毒素Ｂに対する結合親和性が、少なくとも１０−８Ｍ；好ましくは１０−９Ｍ；より好ましくは１０−１０Ｍ、さらにより好ましくは１０−１１Ｍ、さらにより好ましくは１０−１２ＭであるｍＡｂを指す。
【０１１４】
「緩徐なｏｆｆ速度」、「Ｋｏｆｆ」、または「ｋｄ」という用語は、表面プラズモン共鳴、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）によって決定した場合に、１ｘ１０−３ｓ−１以下、好ましくは１ｘ１０−４ｓ−１以下の速度定数で、毒素Ａもしくは毒素Ｂまたはその両方から解離する抗体を意味する。
【０１１５】
本明細書で使用される場合、抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合断片」などの用語には、抗原に特異的に結合して複合体を形成する、任意の天然ポリペプチド、酵素的に得られるポリペプチド、合成ポリペプチド、もしくは遺伝子操作したポリペプチド、または糖タンパク質が含まれる。本明細書で使用される場合、抗体の「抗原結合部分」、「抗体断片」などの用語は、毒素Ａもしくは毒素Ｂまたはその両方に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の断片を指す。
【０１１６】
特定の実施形態では、本発明の抗体または抗体断片を、抗生物質、第２の抗毒素ＡもしくはＢ抗体、またはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅワクチン、またはトキソイド、またはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによって引き起こされる疾患もしくは症状を処置するのに有用な任意の他の治療部分などの治療用部分にコンジュゲートすることができる（「イムノコンジュゲート」）。
【０１１７】
本明細書で使用される場合、「単離された抗体」とは、異なる抗原特異性を有する他の抗体（Ａｂ）を実質的に含まない抗体（例えば、毒素Ａまたは毒素Ｂに特異的に結合する単離された抗体またはその断片は、毒素Ａまたは毒素Ｂ以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）を指すことを意図する。
【０１１８】
本明細書で使用される場合、「遮断抗体」または「中和抗体」（または「毒素Ａおよび／または毒素Ｂ活性を中和する抗体」）とは、その毒素Ａおよび／または毒素Ｂへの結合が、毒素Ａおよび／または毒素Ｂの少なくとも１つの生物学的活性の阻害をもたらす抗体を指すことを意図する。例えば、本発明の抗体は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによって引き起こされる原発性疾患を予防する一助となり得る。あるいは、本発明の抗体は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによって引き起こされる疾患の再発もしくは再燃、またはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染によって引き起こされる少なくとも１つの症候（下痢または偽膜性大腸炎を含む）を予防する能力を示すことも可能である。この毒素Ａおよび／または毒素Ｂの生物学的活性の阻害は、当技術分野で公知の複数の標準的なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ（例えば、本明細書に記載される中和アッセイ）またはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ（例えば、本明細書に記載される抗体の１つ以上の投与後における、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ負荷からの保護を調べるための動物モデル）の１つ以上によって、毒素Ａおよび／または毒素Ｂの生物学的活性についての１つ以上の指標を測定することによって評価することができる。
【０１１９】
本明細書で使用される場合、「表面プラズモン共鳴」という用語は、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）システム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、ＳｗｅｄｅｎおよびＰｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）を使用して、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化を検出することによって、リアルタイムの生物分子間相互作用についての分析を可能とする光学現象を指す。
【０１２０】
本明細書で使用される場合、「ＫＤ」という用語は、特定の抗体−抗原間相互作用についての平衡解離定数を指すことを意図する。
【０１２１】
「エピトープ」という用語は、パラトープとして公知である、抗体分子の可変領域における特異的な抗原結合部位と相互作用する抗原決定基を指す。単一の抗原は、複数のエピトープを有し得る。したがって、異なる抗体は、抗原における異なる領域に結合することが可能であり、異なる生物学的効果を及ぼし得る。「エピトープ」という用語はまた、Ｂ細胞および／またはＴ細胞がそれに対して応答する、抗原における部位も指す。それはまた、抗体が結合する抗原の領域も指す。エピトープは、構造的に定義することもでき、機能的に定義することもできる。機能的エピトープは一般に、構造的エピトープのサブセットであり、相互作用の親和性に直接寄与する残基を有する。エピトープはまた、立体配座的でもあり得る、すなわち、非直鎖状アミノ酸群からなることが可能である。ある特定の実施形態では、エピトープは、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基、またはスルホニル基など、化学的に活性な表面分子の群分けである決定基を包含することが可能であり、ある特定の実施形態では、特定の三次元構造的特徴および／または特定の電荷特徴を有し得る。
【０１２２】
核酸またはその断片に言及する場合の「実質的な同一性」または「実質的に同一な」という用語は、適切なヌクレオチドの挿入または欠失によって別の核酸（またはその相補鎖）に照らして最適に配列決定されれば、以下で論じられるＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、またはＧＡＰなど、配列同一性についての任意の周知のアルゴリズムを介して測定されるヌクレオチド塩基の少なくとも約９０％、および、より好ましくは、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％においてヌクレオチド配列の同一性が認められることを示す。ある特定の場合において、基準核酸分子に対して実質的な同一性を有する核酸分子は、基準核酸分子によってコードされるポリペプチドと同じであるかまたは実質的に類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし得る。
【０１２３】
ポリペプチドに対して適用される場合、「実質的な類似性」または「実質的に類似の」という用語は、デフォルトによるギャップの重みを使用するＧＡＰプログラムまたはＢＥＳＴＦＩＴプログラムなどを介して最適に配列決定されれば、２つのペプチド配列が、少なくとも９０％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％、９８％、または９９％の配列同一性を共有することを意味する。同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換で異なることが好ましい。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基を、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を伴う側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基で置換するアミノ酸置換である。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化させない。２つ以上のアミノ酸配列が保存的置換により互いと異なる場合は、類似性の百分率または程度を上方へと調整して、置換の保存的性質を補正することができる。当業者には、この調整を行うための手段が周知である。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７−３３１を参照のこと。類似の化学的特性を伴う側鎖を有するアミノ酸基の例には、１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン；２）脂肪族ヒドロキシル側鎖：セリンおよびトレオニン；３）アミド含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン；４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン；５）塩基性側鎖：リシン、アルギニン、およびヒスチジン；６）酸性側鎖：アスパラギン酸およびグルタミン酸；ならびに７）硫黄含有側鎖：システインおよびメチオニンが含まれる。好ましい保存的アミノ酸置換基は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、およびアスパラギン−グルタミンである。あるいは、保存的置換とは、Ｇｏｎｎｅｔら、（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１４４３  ４５において開示されているＰＡＭ２５０対数尤度行列で正の値をとる任意の変化でもある。「中程度に保存的」置換とは、ＰＡＭ２５０対数尤度行列において負でない値をとる任意の変化である。
【０１２４】
ポリペプチドの配列類似性は典型的に、配列分析ソフトウェアを使用して測定する。タンパク質分析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含めた様々な置換、欠失、および他の修飾に割り当てられる類似性の測定値を使用して、類似の配列をマッチさせる。例えば、ＧＣＧソフトウェアは、デフォルトパラメータと共に使用して、異なる種の生物由来の相同的なポリペプチドなどの近縁のポリペプチドの間、または野生型タンパク質とその突然変異タンパク質との間の配列相同性または配列同一性を決定し得る、ＧＡＰおよびＢＥＳＴＦＩＴなどのプログラムを含有する。例えば、ＧＣＧ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．１を参照のこと。また、ポリペプチド配列は、ＧＣＧ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．１におけるプログラムであるＦＡＳＴＡをデフォルトパラメータまたは推奨されるパラメータと共に使用しても比較することができる。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３）は、クエリー配列と検索配列との間の最適の重複領域についてのアライメントおよび配列同一性百分率をもたらす（Ｐｅａｒｓｏｎ（２０００）、前出）。本発明の配列を、異なる生物由来の多数の配列を含有するデータベースと比較する場合に好ましい別のアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴコンピュータプログラム、とりわけ、デフォルトによるパラメータを使用するＢＬＡＳＴＰまたはＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３  ４１０および（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９  ４０２を参照のこと。
【０１２５】
特定の実施形態では、本発明の方法に使用される抗体または抗体断片は、単一特異性の場合もあり、二重特異性の場合もあり、多重特異性の場合もある。多重特異性抗体とは、１つの標的ポリペプチドの異なるエピトープに対して特異的な場合もあり、複数の標的ポリペプチドのエピトープに対して特異的な抗原結合ドメインを含有する場合もある。本発明の文脈で使用され得る例示的な二重特異性抗体のフォーマットは、第１の免疫グロブリン（Ｉｇ）ＣＨ３ドメインおよび第２のＩｇ  ＣＨ３ドメインであって、互いに少なくとも１つのアミノ酸だけ異なり、少なくとも１つのアミノ酸差異により、この二重特異性抗体のプロテインＡへの結合が、このアミノ酸差異を欠く二重特異性抗体の場合と比較して低減される、第１および第２のＩｇ  ＣＨ３ドメインの使用を伴う。一実施形態では、第１のＩｇ  ＣＨ３ドメインは、プロテインＡに結合し、第２のＩｇ  ＣＨ３ドメインは、Ｈ９５Ｒ修飾（ＩＭＧＴのエクソン番号付けによる；ＥＵの番号付けではＨ４３５Ｒ）など、プロテインＡへの結合を低減するかまたは消失させる突然変異を含有する。第２のＣＨ３はさらに、Ｙ９６Ｆ修飾（ＩＭＧＴによる；ＥＵではＹ４３６Ｆ）を含み得る。第２のＣＨ３内に見出され得るさらなる修飾にはＩｇＧ１  ｍＡｂの場合のＤ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵではＤ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、およびＶ４２２Ｉ）；ＩｇＧ２  ｍＡｂの場合のＮ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ；ＥＵではＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、およびＶ４２２Ｉ）；ならびにＩｇＧ４  ｍＡｂの場合のＱ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵではＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、およびＶ４２２Ｉ）が含まれる。上記の二重特異性抗体のフォーマットにおける変化は、本発明の範囲内で想定される。
【０１２６】
「治療有効量」という語句は、所望の効果を生じさせるために投与される量を意味する。正確な量は処置目的に依存し、これは公知の技術を使用して当業者に確認可能である（例えば、Ｌｌｏｙｄ（１９９９）Ｔｈｅ  Ａｒｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇを参照のこと）。
【０１２７】
一般的な説明
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅはグラム陽性で胞子形成性の毒素産生細菌であり、ヒトにおける院内抗生物質関連下痢および大腸炎の主要な原因である（Ｂａｒｔｌｅｔｔ，Ｊ．Ｇら、（１９７８），Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２９８：５３１−５３４；Ｋｙｎｅ，Ｌら、（２００１），Ｃｌｉｎ．Ｎ．Ａｍ．３０：７５３−７７７）。広域抗生物質の投与に起因する結腸環境の混乱は、細菌が腸に定着するのにつながる（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｓ．Ｃら、（１９９０），Ｌａｎｃｅｔ  ３３６：９７−１００）。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅが定着したこの患者集団の大部分は下痢（これは、ある特定の場合には偽膜性大腸炎につながる）を発症するが、これは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによる２つの外毒素（毒素Ａおよび毒素Ｂ）の産生に起因すると考えられている。処置は、原因抗生物質を中止するか、または原因抗生物質の投与を変更するか、または原因抗生物質を変更せず、続いてメトロニダゾール、バンコマイシンまたはフィダキソマイシンを投与することからなる。この処置計画は通常は成功するが、治療を中止すると多くの患者は再燃する（Ｆｅｋｅｔｙ，Ｒ．，（１９９７），Ａｍ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，９２：７３９−７５０）。さらに、多くの場合、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌は使用した治療に耐性を持つようになるので処置が失敗し、いくつかの場合には死亡率が増加する（Ｄｗｏｒｃｚｙｎｓｋｉ，Ａら、（１９９１），Ｃｙｔｏｂｉｏｓ．６５：１４９−１５３；Ｆｅｋｅｔｙ，Ｒら、（１９９３），ＪＡＭＡ，２６９：７１−７５）。したがって、この疾患と闘うための、および／またはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅが定着した患者におけるこの疾患の再発を予防するためのより有効な治療法の必要性がある。加えて、有効な薬剤の予防的投与によって、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症を発症するリスクを有する患者を処置する必要性がある。高齢者、特に６５歳以上の患者がこの有リスク患者集団に含まれるが、６５歳未満の患者は、患者をＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによる感染症にかかりやすくし得る任意の基礎疾患の存在に応じて、より大きなリスクを有し得る。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに過去に感染した患者は、より大きな再発リスクを有し得る。リスクを有する他の患者には、基礎病状によりＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症の素因を有する患者、または長期間（少なくとも１週間以上）の入院患者、および／または広域抗生物質による長期処置（１４日間以上）中の患者、ならびに胃食道逆流性疾患（ＧＥＲＤ）、胃潰瘍および小腸潰瘍、および食道炎を処置するためのプロトンポンプ阻害剤を服用している患者が含まれる。これらの薬剤には、デクスランソプラゾール、エソメプラゾール、ランソプラゾール、オメプラゾール、パントプラゾールナトリウム、またはラベプラゾールナトリウムが含まれる。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症を発症するリスクを有する患者への処方について研究中の他の薬剤には、ヒスタミンＨ２受容体遮断薬、例えば、シメチジン、ファモチジン、ニザチジンおよびラニチジンが含まれる。他の研究では、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに関連する下痢の年齢別発生率、より具体的には５０歳以降の患者における増加、および６０歳以降の��者における死亡率の増加が示されている（Ｌｏｏ，ＶＧら、（２００５），Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５３：２４４２−９）。実際、この研究は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素の陽性アッセイの発生率が加齢に伴って増加することを示した先の研究（Ｋａｒｌｓｔｒｏｅｍ，Ｏら、（１９９８），Ｃｌｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ２６：１４１−５）と一致していた。
【０１２８】
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対するより有効な治療法の必要性に対処するために、抗毒素Ａおよび／またはＢ抗体を単独でまたは補助療法として使用した場合に、この疾患を処置する手段として、または少なくともＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症に関連する下痢もしくは大腸炎の再発を予防する手段として使用することができるかを決定するための多くの研究が行われた。（Ｃｏｒｔｈｉｅｒら、（１９９１），Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５９（３）：１１９２−１１９５；Ｋｉｎｋ，Ｊ．Ａ．ａｎｄ  Ｗｉｌｌｉｌａｍｓ，Ｊ．Ａ．，（１９９８），Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６６（５）：２０１８−２０２５；Ｌｏｗｙ，Ｉら、（２０１０），Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６２（３）：１９７−２０５；Ｂａｂｃｏｃｋ，Ｇ．Ｊら；（２００６），Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，７４（１１）：６３３９−６３４７）。より具体的には、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによる感染症の動物モデルを使用して、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来の毒素Ａおよび／または毒素Ｂに対する抗体が一次感染およびｉｎ  ｖｉｖｏ再燃率に及ぼす効果が研究されている（Ｃｏｒｔｈｉｅｒ，Ｇら、（１９９１），Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５９（３）：１１９２−１１９５；Ｋｉｎｋ，Ｊ．Ａら、（１９９８），Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６６（５）：２０１８−２０２５；Ｂａｂｃｏｃｋ，Ｇ．Ｊら、（２００６），７４（１１）：６３３９−６３４７）。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの動物モデルにおける結果により有意な保護が示されたので、前記疾患を有するヒト患者における抗毒素Ａおよび抗毒素Ｂ抗体を使用したさらなる臨床試験が望まれる（Ｌｏｗｙ，Ｉ．，（２０１０），Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６２（３）：１９７−２０５）。
【０１２９】
本明細書に記載される抗体は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａおよび／または毒素Ｂに対する特異的結合を示し、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによる感染症を患っている患者を処置するのに有用であり得る。このような抗体の使用は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによる一次感染を患っている患者を処置する有効な手段であり得るか、またはそれらは、前記疾患の再燃および前記疾患に関連する随伴性症候を予防するのに使用され得るか、または一次感染もしくは前記感染症の再発に関連する下痢もしくは大腸炎の重症度を低減するのに使用され得る。それらは単独で、またはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症を処置するための当技術分野で公知の他の治療部分もしくは治療法、例えば限定されないが、抗生物質療法、例えば、メトロニダゾール、バンコマイシンもしくはフィダキソマイシンとの補助療法として使用され得る。それらは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅワクチン、またはトキソイドの使用、または毒素Ａおよび／もしくはＢに対して特異的な第２もしくは第３の異なる抗体と併せて使用され得る。
【０１３０】
本発明のある特定の実施形態では、本発明の抗体の組み合わせは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの超毒性株によって引き起こされる感染症を処置するのに使用され得る。これまでに最も著名な超毒性流行性分離菌群は、「ＢＩ／ＮＡＰ１／０２７」と称されるものである。これは、欧州および北米にわたるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症の発生に関連している。この名称に該当する分離菌は、毒素Ａおよび毒素Ｂの産生増加、さらなる毒素（バイナリー毒素）の存在、ならびにフルオロキノロン耐性の増加を特徴とする（ＭｃＤｏｎａｌｄ，ＬＣら、（２００５），Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５３：２４３３−４１；Ｗａｒｎｙ，ＭＥら、（２００５），Ｌａｎｃｅｔ  ３６６：１０７９−８４）。この分離菌群はまた、北米パルスフィールド１型（ＮＡＰ１）、リボタイプ０２７およびＢＩ群株とも称され得る。この株群は、１８塩基対のｔｃｄＣ遺伝子欠失を含有しており、それが産生するバイナリー毒素は、ｃｄｔＡおよびｃｄｔＢ遺伝子によってコードされる。この群は、対照株よりもそれぞれ１６倍および２３倍多い量の毒素Ａおよび毒素Ｂを産生すると報告されている（Ｗａｒｎｙ，ＭＥら、（２００５），Ｌａｎｃｅｔ  ３６６：１０７９−８４）。本発明の抗体は、４つの異なる臨床分離Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ＢＩ／ＮＡＰ１／０２７株（ＶＡ５、ＶＡ１７、６３３６および６４４３）によって産生される毒素を中和することが示されたので、本発明の抗体を含む組成物を、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの上記超毒性株による感染症を患っている患者に治療的に投与することもできるし、または本明細書に示される超毒性株および任意の他の臨床関連超毒性株による感染症を発症するリスクを有する患者に予防的に投与することもできると想定される。これらの株を同定する手段は当業者に公知であり、これらの方法には、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ分離菌のパルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）（例えば、Ｆａｗｌｅｙ，ＷＮら、（２００２），Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ４０：３５４６−７を参照のこと）、バイナリー毒素遺伝子および部分的ｔｃｄＣ遺伝子欠失のＰＣＲ分析（例えば、Ｇｏｎｃａｌｖｅｓ，Ｃら、（２００４），Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ４２：１９３３−９；およびＣｏｈｅｎ，ＳＨら、（２０００），Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １８１：６５９−６３を参照のこと）、ならびに制限エンドヌクレアーゼ分析（例えば、Ｃｌａｂｏｔｓ，ＣＲら、（１９９３），Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ３１：１８７０−５を参照のこと）が含まれ得る。
【０１３１】
ある特定の実施形態では、本発明の抗体は、主な免疫原、例えば、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来の天然の不活性化毒素Ａ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＡ６３５６４（配列番号３７８）を参照のこと）もしくは毒素Ｂ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＪ６７４９２（配列番号３８０）を参照のこと）、または前記毒素もしくは毒素断片の組換え不活性型で免疫感作し、続いて、第２の免疫原または前記天然毒素の免疫原活性断片で免疫感作したマウスから得られる。不活性化毒素Ａのみもしくは不活性化毒素Ｂのみのいずれかで動物を免疫感作してもよいし、または不活性化毒素Ａおよび不活性化毒素Ｂの両方で同時に免疫感作してもよい。免疫原として使用する前に、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、過酸化物による処理または酸素処理を含む標準的なトキソイド調製手順を使用して毒素を不活性化することができる（Ｒｅｌｙｖｅｌｄら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，９３：２４，１９８３、Ｗｏｏｄｒｏｗ  ａｎｄ  Ｌｅｖｉｎｅ，ｅｄｓ．Ｎｅｗ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９０）。別の不活性化手段は、ＵＤＰ−ジアルデヒド（これは、他の不活性化法と比較して毒素の天然構造を維持し、それにより、天然毒素とより反応性の抗体を誘導する可能性を高めるように作用し得る）の使用によるものである（Ｇｅｎｔｈら、（２０００），Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６８（３）：１０９４−１１０１）。
【０１３２】
あるいは、標準的な組換え技術を使用して、減少した毒性を示すＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来の突然変異体毒素を生産し、免疫原として使用してもよい（例えば、米国特許第５，０８５，８６２号明細書；米国特許第５，２２１，６１８号明細書；米国特許第５，２４４，６５７号明細書；米国特許第５，３３２，５８３号明細書；米国特許第５，３５８，８６８号明細書；および米国特許第５，４３３，９４５号明細書を参照のこと）。このような突然変異体は、毒素の活性部位に欠失または点突然変異を含有し得る。
【０１３３】
免疫原は、天然毒素Ａもしくは毒素Ｂの生物学的に活性なおよび／もしくは免疫原性の断片、またはそれらの活性断片をコードするＤＮＡであり得る。断片は、毒素Ａまたは毒素ＢのいずれかのＮ末端またはＣ末端ドメインに由来し得る。断片は、グルコシル化酵素ドメイン（Ａ）、自己触媒プロセシングドメイン（Ｃ）、転移ドメイン（Ｄ）または結合ドメイン（Ｂ）を含む毒素Ａまたは毒素Ｂの公知のドメイン（図１を参照のこと）のいずれかに由来し得る。本発明のある特定の実施形態では、免疫原は、配列番号３７８のおよそアミノ酸残基１８３２〜２７１０に及ぶ毒素Ａのカルボキシ末端受容体結合ドメインである。本発明のある特定の実施形態では、免疫原は、配列番号３７５に示されている毒素Ａのカルボキシ末端受容体結合ドメインである。本発明のある特定の実施形態では、免疫原は、配列番号３８０のおよそアミノ酸残基１８３４〜２３６６に及ぶ毒素Ｂのカルボキシ末端受容体結合ドメインである。本発明のある特定の実施形態では、免疫原は、配列番号３７６に示されている毒素Ｂのカルボキシ末端受容体結合ドメインである。
【０１３４】
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来の毒素Ａの全長アミノ酸配列は、配列番号３７８として示されている。
【０１３５】
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来の毒素Ｂの全長アミノ酸配列は、配列番号３８０として示されている。
【０１３６】
ある特定の実施形態では、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａまたは毒素Ｂに特異的に結合する抗体を、上記領域の断片、または本明細書に記載される領域のＮもしくはＣ末端のいずれかまたは両方から前記指定領域を約５〜約２０個のアミノ酸残基分延長したペプチドを使用して調製することができる。ある特定の実施形態では、上記領域またはその断片の任意の組み合わせが、毒素Ａまたは毒素Ｂ特異的抗体の調製に使用され得る。ある特定の実施形態では、毒素Ａもしくは毒素Ｂの上記領域またはそれらの断片のいずれか１つ以上が、単一特異性、二重特異性または多重特異性抗体を調製するのに使用され得る。
【０１３７】
抗体の抗原結合断片
別段に明記さない限り、本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、２つの免疫グロブリン重鎖および２つの免疫グロブリン軽鎖（すなわち、「完全抗体分子」）ならびにその抗原結合断片を含む抗体分子を包含すると理解するものとする。本明細書で使用される場合、抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合断片」などの用語には、抗原に特異的に結合して複合体を形成する、任意の天然ポリペプチド、酵素的に得られるポリペプチド、合成ポリペプチド、もしくは遺伝子操作したポリペプチド、または糖タンパク質が含まれる。本明細書で使用される場合、抗体の「抗原結合部分」、または「抗体断片」という用語は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａおよび／または毒素Ｂのいずれかに特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の断片を指す。抗体断片には、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ｄＡｂ断片、ＣＤＲまたは単離ＣＤＲを含有する断片が含まれ得る。抗体の抗原結合断片は、例えば、タンパク質分解による消化または抗体の可変ドメインおよび（場合によって）定常ドメインをコードするＤＮＡの操作および発現を伴う組換え遺伝子操作法など、任意の適切な標準的技術を使用して完全抗体分子から派生させることができる。このようなＤＮＡは公知であり、および／または、例えば、市販の供給源、ＤＮＡライブラリー（例えば、ファージ抗体ライブラリーを含めた）から容易に入手可能であり、合成可能な場合もある。ＤＮＡは、配列決定し、化学的にまたは分子生物学法を使用して操作し、例えば、１つ以上の可変ドメインおよび／もしくは定常ドメインを適切な構成へと配置するか、またはコドンを導入するか、システイン残基を創出するか、アミノ酸を修飾するか、付加するか、もしくは欠失させることなどもできる。
【０１３８】
抗原結合断片の非限定的な例には、（ｉ）Ｆａｂ断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）Ｆｄ断片；（ｉｖ）Ｆｖ断片；（ｖ）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子；（ｖｉ）ｄＡｂ断片；および（ｖｉｉ）抗体の超可変領域を模倣するアミノ酸残基からなる最小限の認識単位（例えば、ＣＤＲ３ペプチドなどの単離相補性決定領域（ＣＤＲ））、または拘束性ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４ペプチドが含まれる。また、ドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ダイアボディー、トリアボディー、テトラボディー、ミニボディー、ナノボディー（例えば、一価ナノボディー、二価ナノボディーなど）、Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｄｕｌａｒ  ＩｍｍｕｎｏＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（ＳＭＩＰ）、およびサメＩｇＮＡＲ可変ドメインなど、他の操作分子も、本明細書で使用される場合、「抗原結合断片」という表現に包含される。
【０１３９】
抗体の抗原結合断片は、典型的に、少なくとも１つの可変ドメインを含む。可変ドメインは、任意のサイズまたはアミノ酸組成であり得、一般に１つ以上のフレームワーク配列に隣接するか、またはこれらとインフレームである少なくとも１つのＣＤＲを含む。ＶＨドメインをＶＬドメインと会合させた抗原結合断片において、ＶＨドメインとＶＬドメインとは、互いに対して任意の適切な配置下に置くことができる。例えば、可変領域は、二量体であり得、ＶＨ−ＶＨ二量体、ＶＨ−ＶＬ二量体、またはＶＬ−ＶＬ二量体を含有し得る。あるいは、抗体の抗原結合断片は、単量体のＶＨドメインまたはＶＬドメインを含有し得る。
【０１４０】
ある特定の実施形態では、抗体の抗原結合断片は、少なくとも１つの定常ドメインに共有結合的に連結された少なくとも１つの可変ドメインを含有し得る。本発明の抗体の抗原結合断片内に見出され得る可変ドメインおよび定常ドメインの非限定的な例示的構成には、（ｉ）ＶＨ−ＣＨ１；（ｉｉ）ＶＨ−ＣＨ２；（ｉｉｉ）ＶＨ−ＣＨ３；（ｉｖ）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２；（ｖ）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；（ｖｉ）ＶＨ−ＣＨ２−ＣＨ３；（ｖｉｉ）ＶＨ−ＣＬ；（ｖｉｉｉ）ＶＬ−ＣＨ１；（ｉｘ）ＶＬ−ＣＨ２；（ｘ）ＶＬ−ＣＨ３；（ｘｉ）ＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２；（ｘｉｉ）ＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；（ｘｉｉｉ）ＶＬ−ＣＨ２−ＣＨ３；および（ｘｉｖ）ＶＬ−ＣＬが含まれる。上記で列挙した例示的な構成のいずれかを含めた可変ドメインおよび定常ドメインの任意の構成において、可変ドメインおよび定常ドメインは、互いに直接連結される場合もあり、完全または部分的なヒンジ領域またはリンカー領域を介して連結される場合もある。ヒンジ領域は、単一のポリペプチド分子内で隣接する可変ドメインおよび／または定常ドメインの間に、結果として可撓性または半可撓性の連結をもたらす、少なくとも２つの（例えば、５、１０、１５、２０、４０、６０以上の）アミノ酸からなることが可能である。さらに、本発明の抗体の抗原結合断片は、互いと非共有結合的に会合し、および／または１つ以上の単量体のＶＨドメインもしくはＶＬドメインと非共有結合的に会合する（例えば、ジスルフィド結合を介して）、上記で列挙した可変ドメインおよび定常ドメインの構成のいずれかのホモ二量体またはヘテロ二量体（または他の多量体）も含み得る。
【０１４１】
完全抗体分子の場合と同様、抗原結合断片も、単一特異性の場合もあり、多重特異性（例えば、二重特異性）の場合もある。抗体の多重特異性抗原結合断片は典型的に、少なくとも２つの異なる可変ドメインを含み、各可変ドメインは、個別の抗原または同じ抗原における異なるエピトープに特異的に結合することが可能である。当技術分野で利用可能な日常的な技術を使用して、本明細書で開示される例示的な二重特異性抗体のフォーマットを含めた任意の多重特異性抗体フォーマットを、本発明の抗体の抗原結合断片の文脈における使用のために適合させることができる。
【０１４２】
ヒト抗体の調製
当技術分野では、トランスジェニックマウスにおいてヒト抗体を作製する方法が公知である。任意のこのような公知の方法を、本発明の文脈で使用して、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａおよび／または毒素Ｂに特異的に結合するヒト抗体を作ることができる。
【０１４３】
ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）法（例えば、米国特許第６，５９６，５４１号明細書を参照のこと；Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標））またはモノクローナル抗体を作製するための他の任意の公知の方法を使用して、ヒト可変領域およびマウス定常領域を有する、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａおよび／または毒素Ｂに対する高親和性のキメラ抗体をまず単離する。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）法は、マウスが、抗原刺激に反応してヒト可変領域およびマウス定常領域を含む抗体を作製するように、内因性マウス定常領域遺伝子座に作動可能に連結されたヒト重鎖可変領域およびヒト軽鎖可変領域を含むゲノムを有するトランスジェニックマウスの作製を伴う。抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを単離し、ヒト重鎖定常領域およびヒト軽鎖定常領域をコードするＤＮＡに作動可能に連結する。次いで、ＤＮＡを、完全ヒト抗体を発現することが可能な細胞内で発現させる。
【０１４４】
一般に、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスを、対象の抗原で感作し、リンパ球（Ｂ細胞など）を、抗体を発現させるマウスから回収する。リンパ球を骨髄腫細胞系と融合させて不死化ハイブリドーマ細胞系を調製することができ、このようなハイブリドーマ細胞系をスクリーニングおよび選択して、対象の抗原に対して特異的な抗体を産生するハイブリドーマ細胞系を同定する。重鎖および軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを単離し、重鎖および軽鎖の所望のアイソタイプ定常領域に連結することができる。このような抗体タンパク質は、ＣＨＯ細胞などの細胞において生産することができる。あるいは、抗原特異的なキメラ抗体または軽鎖および重鎖の可変ドメインをコードするＤＮＡを、抗原特異的リンパ球から直接単離することもできる。
【０１４５】
まず、ヒト可変領域およびマウス定常領域を有する高親和性のキメラ抗体を単離する。以下の実験についての節で論じる通り、抗体を、親和性、選択性、エピトープなどを含めた所望の特徴について特徴づけて選択する。マウス定常領域を、所望のヒト定常領域で置換して、本発明の完全ヒト抗体、例えば、野生型のＩｇＧ１もしくはＩｇＧ４または改変されたＩｇＧ１もしくはＩｇＧ４を作製する。選択した定常領域は特定の使用に応じて変化し得るが、高親和性抗原結合特性および標的特異性は可変領域内に残る。
【０１４６】
一般に、本発明の抗体は、極めて高い親和性を保有し、典型的に、固相上に固定化されているかまたは溶液相中にある抗原に対する結合によって測定した場合に約１０−１２〜約１０−９ＭのＫＤを保有する。マウス定常領域を、所望のヒト定常領域で置換して、本発明の完全ヒト抗体を作製する。選択した定常領域は特定の使用に応じて変化し得るが、高親和性抗原結合特性および標的特異性は可変領域内に残る。
【０１４７】
生物学的同等物
本発明の抗毒素Ａおよび抗毒素Ｂ抗体ならびに抗体断片は、記載される抗体のアミノ酸配列とは異なるが、毒素Ａまたは毒素Ｂに結合する能力を保持するアミノ酸配列を有するタンパク質を包含する。このような変異体の抗体および抗体断片は、親配列と比較して１つ以上のアミノ酸の付加、欠失、または置換を含むが、記載される抗体と本質的に同等な生物学的活性を示す。同様に、本発明の抗体をコードするＤＮＡ配列も、開示された配列と比較した場合、１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、または置換を含むが、本発明の抗体または抗体断片と生物学的に本質的に同等な抗体または抗体断片をコードする配列を包含する。
【０１４８】
２つの抗原結合タンパク質または抗体は、例えば、単回投与であれ、複数回投与であれ、類似の実験条件下において同じモル用量で投与した場合、それらの吸収速度および吸収度が有意差を示さない薬学的同等物または薬学的代替物であれば、生物学的に同等であると考えられる。一部の抗体は、それらの吸収度は同等であるが、それらの吸収速度が同等でなくとも、このような吸収速度の差異が意図的なものであり、表示において反映され、例えば、長期使用における有効な体内薬物濃度の達成には本質的でなく、特定の被験薬生成物にとって医学的に重要ではないと考えられるために生物学的に同等であると考えられれば、同等物または薬学的代替物と考えられる。
【０１４９】
一実施形態では、２つの抗原結合タンパク質は、それらの安全性、純度、および効力において臨床的に有意味な差異が認められなければ生物学的に同等である。
【０１５０】
一実施形態では、２つの抗原結合タンパク質は、患者を、基準生成物と生物学的生成物との間で１回以上にわたり切り換え、このような切換えを伴わない連続療法と比較して臨床的に重要な免疫原性の変化または有効性の減殺を含めた、有害作用の危険性の予測される増大を伴わずにおくことが可能ならば、生物学的に同等である。
【０１５１】
一実施形態では、２つの抗原結合タンパク質は、それらの両方が、１つ以上の使用条件に対して、１つ以上の共通の作用機構を介して作用するならば、このような機構が知られている限りにおいて、生物学的に同等である。
【０１５２】
生物学的同等性は、ｉｎ  ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法によって実証することができる。生物学的同等性の測定には、例えば、（ａ）抗体またはその代謝物の濃度を、血液、血漿、血清、または他の体液において時間の関数として測定する、ヒトまたは他の哺乳動物におけるｉｎ  ｖｉｖｏ試験；（ｂ）ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるヒトのバイオアベイラビリティーデータと相関し、これを妥当な程度で予測するｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験；（ｃ）抗体の適切な急性の薬理学的効果（またはその標的）を時間の関数として測定する、ヒトまたは他の哺乳動物におけるｉｎ  ｖｉｖｏ試験；および（ｄ）抗体の安全性、有効性、またはバイオアベイラビリティーもしくは生物学的同等性を確立する、十分に制御された臨床試験が含まれる。
【０１５３】
本発明の抗体の生物学的に同等な変異体は、例えば、残基または配列の様々な置換を施すことによって構築することもでき、生物学的活性に必要でない末端または内部の残基または配列を欠失させることによって構築することもできる。例えば、生物学的活性に本質的でないシステイン残基を欠失させるかまたは他のアミノ酸で置換して、復元した際の、不必要であるかまたは不適正な分子内ジスルフィド架橋の形成を防止することができる。他の文脈では、生物学的に同等な抗体は、この抗体のグリコシル化特性を修飾するアミノ酸変化、例えば、グリコシル化を消失させるかまたは除去する突然変異を含む抗体の変異体を包含し得る。
【０１５４】
抗体の生物学的特徴
一般に、本発明の抗体は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａもしくは毒素Ｂのいずれかに、またはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａおよび毒素Ｂの両方に（交差反応性抗体）、またはＡもしくはＢのいずれかの断片に結合することによって機能し得る。
【０１５５】
ある特定の実施形態では、本発明の抗体は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａおよび／または毒素ＢのＣ末端受容体結合ドメインに少なくとも位置するエピトープに結合し得る。一実施形態では、抗体は、毒素Ａのカルボシキ末端受容体結合ドメインのアミノ酸残基１８３２〜２７１０に及ぶ（これは、配列番号３７８のアミノ酸残基１８３２〜２７１０に及ぶ）Ｃ末端領域に結合し得る。本発明のある特定の実施形態では、抗体は、配列番号３７５に示されている毒素Ａのカルボシキ末端受容体結合ドメインに結合し得る。本発明のある特定の実施形態では、抗体は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによって産生される毒素Ａのカルボシキ末端受容体結合ドメイン（これの配列は、配列番号３７５に示されている）のアミノ酸残基４６８〜８６３と相互作用し得るか、またはこれに結合し得る。本発明のある特定の実施形態では、抗体は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによって産生される毒素Ａのカルボシキ末端受容体結合ドメイン内のエピトープであって、配列番号３７５の残基４６８〜４８８、配列番号３７５の残基５１０〜５３０、配列番号３７５の残基６０２〜６１０、配列番号３７５の残基６４４〜７０３、配列番号３７５の残基７２４〜７９４、配列番号３７５の残基７９９〜８１４、および配列番号３７５の残基８５８〜８６３からなる群より選択されるエピトープと相互作用し得るか、またはこれらに結合し得る。一実施形態では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによって産生される毒素Ａのカルボシキ末端受容体結合ドメイン内のエピトープであって、配列番号３７５の残基４６８〜４８８、配列番号３７５の残基５１０〜５３０、配列番号３７５の残基６０２〜６１０、配列番号３７５の残基６４４〜７０３、配列番号３７５の残基７２４〜７９４、配列番号３７５の残基７９９〜８１４、および配列番号３７５の残基８５８〜８６３からなる群より選択されるエピトープに結合するか、またはこれらと相互作用する抗体は、配列番号１４６／１５４のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアを含む。一実施形態では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによって産生される毒素Ａのカルボシキ末端受容体結合ドメイン内のエピトープであって、配列番号３７５の残基４６８〜４８８、配列番号３７５の残基５１０〜５３０、配列番号３７５の残基６０２〜６１０、配列番号３７５の残基６４４〜７０３、配列番号３７５の残基７２４〜７９４、配列番号３７５の残基７９９〜８１４、および配列番号３７５の残基８５８〜８６３からなる群より選択されるエピトープに結合するか、またはこれらと相互作用する抗体は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ｂに特異的に結合する第２の抗体と医薬組成物中で組み合わせられる。一実施形態では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ｂと相互作用するか、またはこれに結合するこの第２の抗体は、配列番号２７４／２８２のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアを含む。
【０１５６】
本発明のある特定の実施形態では、抗体は、配列番号３８０のおよそアミノ酸残基１８３４〜２３６６に及ぶ毒素Ｂのカルボキシ末端受容体結合ドメインに結合し得る。本発明のある特定の実施形態では、抗体は、配列番号３７６に示されている毒素Ｂのカルボキシ末端受容体結合ドメインに結合し得る。
【０１５７】
ある特定の実施形態では、本発明の抗体は、全長天然毒素Ａタンパク質（これのアミノ酸配列は配列番号３７８に示されており、配列番号３７７に示されている核酸配列によってコードされる）の任意の他の領域または断片に結合することによりＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａに関連する毒性を遮断または阻害することによって機能し得る。
【０１５８】
ある特定の実施形態では、本発明の抗体は、全長天然毒素Ｂタンパク質（これのアミノ酸配列は配列番号３８０に示されており、配列番号３７９に示されている核酸配列によってコードされる）の任意の他の領域または断片に結合することによりＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ｂに関連する毒性を遮断または阻害することによって機能し得る。
【０１５９】
ある特定の実施形態では、本発明の抗体は、二重特異性抗体であり得る。本発明の二重特異性抗体は、毒素Ａにおける１つのエピトープに結合し得、毒素Ｂにおける１つのエピトープにも結合し得る。ある特定の実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、毒素Ａにおける２つの異なるエピトープに結合し得る。ある特定の実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、毒素Ｂにおける２つの異なるエピトープに結合し得る。ある特定の実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、毒素Ａまたは毒素Ｂのいずれか１つにおける同じドメイン内の２つの異なる部位に結合してもよいし、または毒素Ａおよび毒素Ｂの両方における同じドメインに結合してもよい。
【０１６０】
一実施形態では、本発明は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａおよび毒素Ｂの両方のカルボキシ末端受容体結合ドメインに結合する完全ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、以下の特徴の１つ以上を示す完全ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を提供する：（ｉ）配列番号１８、３４、５０、６６および８２からなる群より選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＨＣＶＲを含む；（ｉｉ）配列番号２６、４２、５８、７４および９０からなる群より選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＬＣＶＲを含む；（ｉｉｉ）配列番号２４、４０、５６、７２および８８からなる群より選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＨＣＤＲ３ドメインと、配列番号３２、４８、６４、８０および９６からなる群より選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＬＣＤＲ３ドメインとを含む；（ｉｖ）配列番号２０、３６、５２、６８および８４からなる群より選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＨＣＤＲ１ドメインと、配列番号２２、３８、５４、７０および８６からなる群より選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＨＣＤＲ２ドメインと、配列番号２８、４４、６０、７６および９２からなる群より選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＬＣＤＲ１ドメインと、配列番号３０、４６、６２、７８および９４からなる群より選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＬＣＤＲ２ドメインとを含む；（ｖ）１０−９Ｍ以下のＫＤで毒素Ａおよび毒素Ｂに結合する。
【０１６１】
一実施形態では、本発明は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの（毒素Ｂではなく）毒素Ａに特異的に結合する完全ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、以下の特徴の１つ以上を示す完全ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を提供する：（ｉ）配列番号２、９８、１１４、１３０、１４６および１６２からなる群より選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＨＣＶＲを含む；（ｉｉ）配列番号１０、１０６、１２２、１３８、１５４および１７０からなる群より選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＬＣＶＲを含む；（ｉｉｉ）配列番号８、１０４、１２０、１３６、１５２および１６８からなる群より選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＨＣＤＲ３ドメインと、配列番号１６、１１２、１２８、１４４、１６０および１７６からなる群より選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＬＣＤＲ３ドメインとを含む；（ｉｖ）配列番号４、１００、１１６、１３２、１４８および１６４からなる群より選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＨＣＤＲ１ドメインと、配列番号６、１０２、１１８、１３４、１５０および１６６からなる群より選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＨＣＤＲ２ドメインと、配列番号１２、１０８、１２４、１４０、１５６および１７２からなる群より選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＬＣＤＲ１ドメインと、配列番号１４、１１０、１２６、１４２、１５８および１７４からなる群より選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＬＣＤＲ２ドメインとを含む；（ｖ）１０−９Ｍ以下のＫＤを示す；（ｖｉ）細胞生存率アッセイにおいて、約７ｐＭ〜約６５ｐＭの範囲のＩＣ５０で（３２ｐＭの濃度で）毒素Ａの中和を示す。
【０１６２】
一実施形態では、本発明は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの（毒素Ａではなく）毒素Ｂに特異的に結合する完全ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、以下の特徴の１つ以上を示す完全ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を提供する：（ｉ）配列番号１７８、１９４、２１０、２２６、２４２、２５８、２７４、２９０、３０６、３２２、３３８および３５４からなる群より選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＨＣＶＲを含む；（ｉｉ）配列番号１８６、２０２、２１８、２３４、２５０、２６６、２８２、２９８、３１４、３３０、３４６および３６２からなる群より選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＬＣＶＲを含む；（ｉｉｉ）配列番号１８４、２００、２１６、２３２、２４８、２６４、２８０、２９６、３１２、３２８、３４４および３６０からなる群より選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＨＣＤＲ３ドメインと、配列番号１９２、２０８、２２４、２４０、２５６、２７２、２８８、３０４、３２０、３３６、３５２および３６８からなる群より選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＬＣＤＲ３ドメインとを含む；（ｉｖ）配列番号１８０、１９６、２１２、２２８、２４４、２６０、２７６、２９２、３０８、３２４、３４０および３５６からなる群より選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＨＣＤＲ１ドメインと、配列番号１８２、１９８、２１４、２３０、２４６、２６２、２７８、２９４、３１０、３２６、３４２および３５８からなる群より選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＨＣＤＲ２ドメインと、配列番号１８８、２０４、２２０、２３６、２５２、２６８、２８４、３００、３１６、３３２、３４８および３６４からなる群より選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＬＣＤＲ１ドメインと、配列番号１９０、２０６、２２２、２３８、２５４、２７０、２８６、３０２、３１８、３３４、３５０および３６６からなる群より選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＬＣＤＲ２ドメインとを含む；（ｖ）１０−９Ｍ以下のＫＤを示す；（ｖｉ）細胞生存率アッセイにおいて、約２５ｐＭ〜約３２０ｐＭの範囲のＩＣ５０で（０．０３ｐＭの濃度で）毒素Ｂの中和を示す。
【０１６３】
本発明のある特定の抗毒素Ａまたは抗毒素Ｂ抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイによって決定した場合に、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａもしくは毒素Ｂのいずれかまたは両方に結合してその毒性を中和することができる。本発明の抗体が毒素に結合してその活性を中和する能力は、本明細書に記載されるように、結合アッセイまたは毒性中和（細胞死からの保護）アッセイを含む当業者に公知の任意の標準的な方法を使用して測定され得る。
【０１６４】
結合活性を測定するための非限定的な例示的ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは、本明細書の実施例４、５および６に示されている。実施例４および５では、表面プラズモン共鳴によってヒト抗毒素Ａまたは抗毒素Ｂ抗体の結合親和性および速度定数を決定し、測定をＴ２００  Ｂｉａｃｏｒｅ機器で行った。実施例６では、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、結合研究を行った。実施例７では、Ｖｅｒｏ細胞で中和バイオアッセイを開発して、毒素ＡまたはＢと、毒素Ａまたは毒素Ｂのいずれかに対する抗体とで処置した後の細胞生存率を検出した。
【０１６５】
本発明はまた、以下のタンパク質またはペプチド：配列番号３７８（全長毒素Ａ）、配列番号３７８の残基番号１８３２〜２７１０（毒素ＡのＣ末端ドメイン）；配列番号３８０（全長毒素Ｂ）、配列番号３８０の残基１８３４〜２３６６；配列番号３７５（毒素Ａのカルボシキ末端受容体結合ドメイン）；または配列番号３７６のいずれかの少なくとも１つの生物学的に活性な断片に結合する抗毒素ＡまたはＢ抗体およびその抗原結合断片を含む。本発明はまた、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによって産生される毒素Ａのカルボシキ末端受容体結合ドメイン内のエピトープと相互作用するか、またはこれに結合する抗体またはその抗原結合断片であって、前記エピトープが、配列番号３７５のおよそ残基４６８〜およそ８６３に及ぶ残基内に含まれる抗体またはその抗原結合断片を提供する。一実施形態では、毒素Ａに結合する抗体のエピトープは、配列番号３７５の残基４６８〜４８８、配列番号３７５の残基５１０〜５３０、配列番号３７５の残基６０２〜６１０、配列番号３７５の残基６４４〜７０３、配列番号３７５の残基７２４〜７９４、配列番号３７５の残基７９９〜８１４、および配列番号３７５の残基８５８〜８６３からなる群より選択される。本明細書に記載される毒素Ａもしくは毒素Ｂペプチドまたはそれらの断片のいずれかは、抗毒素Ａまたは抗毒素Ｂ抗体を作製するのに使用され得る。
【０１６６】
ペプチドは、タグ付けのための特定の残基、またはＫＬＨなどの担体分子へのコンジュゲーションを目的とする特定の残基の付加または置換を包含するように修飾することができる。例えば、ペプチドのＮ末端またはＣ末端にシステインを付加することもでき、リンカー配列を付加して、例えば、免疫感作のためにＫＬＨへとコンジュゲートされるペプチドを調製することもできる。毒素Ａまたは毒素Ｂに対して特異的な抗体は、さらなる標識または部分を含有しない場合もあり、Ｎ末端またはＣ末端の標識または部分を含有する場合もある。一実施形態では、標識または部分がビオチンである。結合アッセイでは、標識（存在する場合）の配置によって、ペプチドが結合する表面に対するペプチドの方向が決定され得る。例えば、表面をアビジンでコーティングする場合は、Ｎ末端にビオチンを含有するペプチドを、ペプチドのＣ末端部分が表面に対して遠位となるように方向付ける。
【０１６７】
エピトープマッピングおよび関連技術
抗体がポリペプチドまたはタンパク質内の「１つ以上のアミノ酸と相互作用する」かを決定するために、当業者に公知の様々な技術を使用することができる。例示的な技術には、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ．，ＮＹ）によって記載されるアッセイなど、日常的な交差遮断アッセイが挙げられ、これらを実施することができる。他の方法には、アラニン走査突然変異分析、ペプチドブロット分析（Ｒｅｉｎｅｋｅ（２００４）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２４８：４４３−６３）、ペプチド切断分析、結晶学的研究およびＮＭＲ分析が含まれる。加えて、エピトープの切出し、エピトープの抽出、および抗原の化学修飾などの方法も用いることができる（Ｔｏｍｅｒ（２０００）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ９：４８７−４９６）。抗体が相互作用するポリペプチド内のアミノ酸を同定するのに使用され得る別の方法は、質量分析によって検出される水素／重水素交換である。一般的には、水素／重水素交換法は、目的のタンパク質を重水素標識し、続いて抗体を重水素標識タンパク質に結合させることを含む。次に、タンパク質／抗体複合体を水に移すと、抗体複合体によって保護されたアミノ酸内の交換可能なプロトンが、インターフェイスの一部ではないアミノ酸内の交換可能なプロトンよりも遅い速度で重水素−水素逆交換を受ける。その結果、タンパク質／抗体インターフェイスの一部を形成するアミノ酸は重水素を保持し得るので、インターフェイスに含まれないアミノ酸と比較して相対的に高い質量を示す。抗体の解離の後、標的タンパク質をプロテアーゼ切断および質量分析に供することにより、抗体が相互作用する特定のアミノ酸に対応する重水素標識残基が明らかになる。例えば、Ｅｈｒｉｎｇ（１９９９）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６７（２）：２５２−２５９；Ｅｎｇｅｎ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ（２００１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３：２５６Ａ−２６５Ａを参照のこと。
【０１６８】
「エピトープ」という用語は、Ｂ細胞および／またはＴ細胞がそれに対して応答する、抗原における部位を指す。Ｂ細胞エピトープは、隣接アミノ酸から形成される場合もあり、タンパク質の三次フォールディングによって並置される非隣接アミノ酸から形成される場合もある。隣接アミノ酸から形成されるエピトープは、典型的に、変性溶媒へと曝露しても保持されるが、三次フォールディングによって形成されるエピトープは、典型的に、変性溶媒で処理すると失われる。エピトープは、典型的に、固有の空間配座にある少なくとも３つのアミノ酸、より通常には少なくとも５または８〜１０アミノ酸を包含する。
【０１６９】
また、抗原構造ベースの抗体プロファイリング（ＡＳＡＰ）としても公知の修飾支援プロファイリング（ＭＡＰ）は、各抗体の、化学的または酵素的に修飾された抗原表面への結合プロファイルの類似性を介して、同じ抗原を指向する多数のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を類別する方法である（米国特許出願公開第２００４／０１０１９２０号明細書）。各類型は、別の類型によって表されるエピトープと顕著に異なるかまたは部分的に重複する固有のエピトープを反映し得る。この技術は、遺伝子的に異なる抗体に対して特性決定の焦点を当てることができるように、遺伝子的に同一な抗体の迅速なフィルタリングを可能とする。ハイブリドーマスクリーニングに適用した場合、ＭＡＰは、所望の特徴を有するｍＡｂを産生する、まれなハイブリドーマクローンの同定を容易にし得る。ＭＡＰを使用して、本発明の抗体を、異なるエピトープに結合する抗体の群へと選別することができる。
【０１７０】
ある特定の実施形態では、抗毒素Ａもしくは抗毒素Ｂ抗体またはそれらの抗原結合断片は、図１に例示されている領域、または配列番号３７８もしくは３８０、または毒素Ａもしくは毒素Ｂのカルボシキ末端受容体結合ドメインの少なくとも１つのいずれか１つの中のエピトープまたはその断片に結合し、毒素Ａのカルボシキ末端受容体結合ドメインは配列番号３７５に示されており、毒素Ｂのカルボシキ末端受容体結合ドメインは配列番号３７６に示されている。
【０１７１】
本発明は、本明細書の表１に記載される具体的な例示抗体のいずれかと同じエピトープに結合する抗毒素Ａまたは抗毒素Ｂ抗体を包含する。同様に、本発明はまた、毒素Ａもしくは毒素Ｂまたは毒素Ａもしくは毒素Ｂの断片への結合について、本明細書の表１に記載される具体的な例示抗体のいずれかと競合する抗毒素Ａまたは抗毒素Ｂ抗体も包含する。
【０１７２】
抗体が、基準抗毒素Ａまたは抗毒素Ｂ抗体と同じエピトープに結合するか、または基準抗毒素Ａまたは抗毒素Ｂ抗体と結合について競合するかは、当技術分野で公知の日常的な方法を使用することによって容易に決定することができる。例えば、試験抗体が、本発明の基準抗毒素Ａまたは抗毒素Ｂ抗体と同じエピトープに結合するかを決定するには、基準抗体を、飽和条件下で毒素ＡもしくはＢタンパク質または毒素ＡもしくはＢペプチドに結合させる。次に、試験抗体が毒素ＡまたはＢ分子に結合する能力を評価する。試験抗体が、基準抗毒素Ａまたは抗毒素Ｂ抗体との飽和結合の後で、毒素ＡまたはＢに結合することが可能であれば、この試験抗体は、基準抗毒素Ａまたは抗毒素Ｂ抗体とは異なるエピトープに結合すると結論付けることができる。他方、試験抗体が、基準抗毒素Ａまたは抗毒素Ｂ抗体との飽和結合の後で、毒素ＡまたはＢ分子に結合することが可能でなければ、この試験抗体は、本発明の基準抗毒素Ａまたは抗毒素Ｂ抗体が結合したエピトープと同じエピトープに結合し得る。
【０１７３】
抗体が、基準抗毒素Ａまたは抗毒素Ｂ抗体と結合について競合するかを決定するには、上記の結合法を以下の２つの方向で実施する：第１の方向では、基準抗体を飽和条件下で毒素ＡまたはＢ分子に結合させた後で、試験抗体の毒素ＡまたはＢ分子への結合について評価する。第２の方向では、試験抗体を飽和条件下で毒素ＡまたはＢ分子に結合させた後で、基準抗体の毒素ＡまたはＢ分子への結合について評価する。両方の方向において、第１の（飽和）抗体だけが毒素ＡまたはＢ分子に結合することが可能な場合は、試験抗体と基準抗体とが毒素またはＢへの結合について競合すると結論される。当業者によって認識される通り、基準抗体と結合について競合する抗体は、必ずしも基準抗体と同一なエピトープに結合し得るわけではなく、重複または隣接するエピトープに結合することによって、基準抗体の結合を立体的に遮断する場合もある。
【０１７４】
２つの抗体の各々が他方の抗体の抗原への結合を競合的に阻害（遮断）する場合、これらの抗体は同じエピトープまたは重複エピトープに結合する。すなわち、他方の抗体に対して１、５、１０、２０、または１００倍過剰な一方の抗体は、競合的結合アッセイにおいて測定した場合に、少なくとも５０％であるが、好ましくは７５％、９０％、さらにまたは９９％結合を阻害する（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９０  ５０：１４９５−１５０２を参照のこと）。あるいは、一方の抗体の結合を低減するかまたは消失させる、抗原における本質的にすべてのアミノ酸突然変異が、他方の抗体の結合も低減するかまたは消失させる場合、２つの抗体は、同じエピトープを有する。一方の抗体の結合を低減するかまたは消失させる一部のアミノ酸突然変異が、他方の抗体の結合も低減するかまたは消失させる場合、２つの抗体は、重複エピトープを有する。
【０１７５】
次いで、さらなる日常的な実験（例えば、ペプチドの突然変異分析および結合分析）を実施して、観察される試験抗体の結合の欠如が、実のところ、基準抗体と同じエピトープへの結合に起因しているのか、または立体的遮断（または別の現象）が、観察される結合の欠如の一因であるのかを確認することができる。この種の実験は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、表面プラズモン共鳴、フローサイトメトリー、または当技術分野で利用可能な他の任意の定量的もしくは定性的な抗体結合アッセイを使用して実施することができる。
【０１７６】
イムノコンジュゲート
本発明は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによる一次感染の重症度を軽減することができるか、またはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症に関連する少なくとも１つの症候（下痢もしくは大腸炎またはそれらの重症度を含む）を改善することができる薬剤などの治療部分にコンジュゲートされたヒト抗毒素Ａまたは抗毒素Ｂモノクローナル抗体（「イムノコンジュゲート」）を包含する。このような薬剤は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａもしくは毒素Ｂのいずれかまたは両方に対する第２の異なる抗体、またはトキソイド、またはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅワクチンであり得る。抗毒素Ａまたは抗毒素Ｂ抗体にコンジュゲートされ得る治療部分の種類は、処置するべき症状および達成するべき所望の治療効果を考慮する。あるいは、所望の治療効果が、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ感染症または限定されないが偽膜性大腸炎などの任意の感染症から生じる他の任意の症状に関連する続発症または症候を処置することである場合は、その症状の続発症または症候を処置するのに適切な薬剤をコンジュゲートすること、または本発明の抗体の任意の副作用を緩和することも有利であり得る。当技術分野では、イムノコンジュゲートを形成するのに適する薬剤の例が公知であり、例えば、国際公開第０５／１０３０８１号を参照のこと。
【０１７７】
多重特異性抗体
本発明の抗体は、単一特異性の場合もあり、二重特異性の場合もあり、多重特異性の場合もある。多重特異性抗体とは、１つの標的ポリペプチドの異なるエピトープに対して特異的な場合もあり、複数の標的ポリペプチドに対して特異的な抗原結合ドメインを含有する場合もある。例えば、Ｔｕｔｔら、１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０−６９；Ｋｕｆｅｒら、２００４，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：２３８−２４４を参照のこと。本発明の抗体は、別の機能的分子、例えば、別のペプチドまたはタンパク質に連結することもでき、これと共発現させることもできる。例えば、抗体またはその断片は、別の抗体または抗体断片などの１つ以上の他の分子的実体に機能的に連結して（例えば、化学的連結、遺伝子融合、非共有結合的会合を介して、または別の形で）、第２の結合特異性を伴う二重特異性抗体または多重特異性抗体を作製することができる。例えば、本発明は、免疫グロブリンの一方のアームが、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａまたはその断片に対して特異的であり、免疫グロブリンの他方のアームが、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ｂまたは第２の治療標的に対して特異的であるかまたは治療用部分にコンジュゲートされた二重特異性抗体を包含する。本発明のある特定の実施形態では、免疫グロブリンの一方のアームが、毒素ＡのＣ末端ドメインにおけるエピトープまたはその断片に対して特異的であり、免疫グロブリンの他方のアームが、毒素ＢのＣ末端ドメインにおけるエピトープまたはその断片に対して特異的である。
【０１７８】
本発明の文脈で使用され得る例示的な二重特異性抗体のフォーマットは、第１の免疫グロブリン（Ｉｇ）ＣＨ３ドメインおよび第２のＩｇ  ＣＨ３ドメインであって、この第１および第２のＩｇ  ＣＨ３ドメインは互いに少なくとも１つのアミノ酸が異なり、少なくとも１つのアミノ酸差異により、この二重特異性抗体のプロテインＡへの結合が、このアミノ酸差異を欠く二重特異性抗体の場合と比較して低減される、第１および第２のＩｇ  ＣＨ３ドメインの使用を伴う。一実施形態では、第１のＩｇ  ＣＨ３ドメインは、プロテインＡに結合し、第２のＩｇ  ＣＨ３ドメインは、Ｈ９５Ｒ修飾（ＩＭＧＴのエクソン番号付けによる；ＥＵの番号付けではＨ４３５Ｒ）など、プロテインＡへの結合を低減するかまたは消失させる突然変異を含有する。第２のＣＨ３はさらに、Ｙ９６Ｆ修飾（ＩＭＧＴによる；ＥＵではＹ４３６Ｆ）を含み得る。第２のＣＨ３内に見出され得るさらなる修飾にはＩｇＧ１抗体の場合のＤ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵではＤ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、およびＶ４２２Ｉ）；ＩｇＧ２抗体の場合のＮ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ；ＥＵではＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、およびＶ４２２Ｉ）；ならびにＩｇＧ４抗体の場合のＱ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵではＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、およびＶ４２２Ｉ）が含まれる。上記の二重特異性抗体のフォーマットにおける変化は、本発明の範囲内で想定される。
【０１７９】
治療的投与および製剤
本発明は、本発明の抗毒素Ａまたは抗毒素Ｂ抗体またはそれらの抗原結合断片を含む治療用組成物を提供する。本発明に従う治療用組成物の投与は、導入、送達、忍容性などの改善をもたらすために製剤に組み込まれる、適切な担体、賦形剤、および他の薬剤と共に施される。適切な製剤の大半は、すべての製薬化学者に公知の処方集である、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡにおいて見出すことができる。これらの製剤には、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、蝋、油、脂質、脂質（カチオン性脂質またはアニオン性脂質）を含有する小胞（ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）など）、ＤＮＡコンジュゲート、無水吸収ペースト、水中油エマルジョンおよび油中水エマルジョン、カーボワックスエマルジョン（様々な分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、およびカーボワックスを含有する半固体混合物が含まれる。Ｐｏｗｅｌｌら、”Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ”ＰＤＡ（１９９８）Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  ５２：２３８−３１１も参照のこと。
【０１８０】
本発明の各抗体の用量は、投与される対象の年齢および大きさ、標的疾患、標的状態、投与経路などに応じて変化させることができる。患者におけるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症を処置するため、または患者におけるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症に関連する１つ以上の症候、例えば、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症に関連する下痢または大腸炎を処置するため、または前記疾患の再燃を予防するため、または前記疾患の重症度を低減するために本発明の抗体を使用する場合、本発明の各抗体を、通常は、約０．０１〜約３０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約０．１〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重、または約０．１〜約１５ｍｇ／ｋｇ体重、または約０．０２〜約７ｍｇ／ｋｇ体重、または約０．０３〜約５ｍｇ／ｋｇ体重、または約０．０５〜約３ｍｇ／ｋｇ体重、または約１ｍｇ／ｋｇ体重、または約３．０ｍｇ／ｋｇ体重、または約１０ｍｇ／ｋｇ体重、または約２０ｍｇ／ｋｇ体重の単回投与で静脈内投与または皮下投与することが有利である。必要に応じて、複数回投与が行われ得る。症状の重症度に応じて、処置の頻度および持続期間を調整することができる。ある特定の実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、少なくとも約０．１ｍｇ〜約８００ｍｇ、約１〜約６００ｍｇ、約５〜約３００ｍｇ、または約１０〜約１５０ｍｇ、約１０〜約１００ｍｇ、もしくは約１０〜約５０ｍｇの初回投与として投与することができる。ある特定の実施形態では、初回投与の後、初回投与の量とほぼ同じかこれ未満であり得る量で、抗体またはその抗原結合断片の２回目の投与または後続の複数回の投与を行うことができるが、後続の投与は、少なくとも１日間〜３日間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、少なくとも６週間、少なくとも７週間、少なくとも８週間、少なくとも９週間、少なくとも１０週間、少なくとも１２週間、または少なくとも１４週間隔てる。
【０１８１】
例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセルへの封入、突然変異体ウイルスを発現させることが可能な組換え細胞、受容体を介するエンドサイトーシスなどの様々な送達系が公知であり、これらを使用して、本発明の医薬組成物を投与することができる（例えば、Ｗｕら、（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２を参照のこと）。導入法には、皮内経路、経皮経路、筋肉内経路、腹腔内経路、静脈内経路、皮下経路、鼻腔内経路、硬膜外経路、および経口経路が含まれるがこれらに限定されない。組成物は、任意の好都合な経路を介して、例えば、注入またはボーラス注入を介して、上皮または皮膚粘膜の内壁（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜、および腸粘膜など）を介する吸収によって投与することができ、他の生物学的に活性な薬剤と共に投与することができる。投与は、全身投与の場合もあり、局所投与の場合もある。
【０１８２】
医薬組成物はまた、小胞、特に、リポソームによって送達することもできる（例えば、Ｌａｎｇｅｒ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３を参照のこと）。
【０１８３】
ある特定の状況下では、医薬組成物を、制御放出系によって送達することができる。一実施形態では、ポンプを使用することができる。別の実施形態では、ポリマー材料を使用することができる。さらに別の実施形態では、制御放出系を組成物の標的に近接して設置するため、全身投与用量の一部しか必要としない。
【０１８４】
注射用調製物は、静脈内注射用、皮下注射用、皮内注射用、および筋肉内注射用、滴下注入用などの剤形を包含し得る。これらの注射用調製物は、公知の方法を介して調製することができる。例えば、注射用調製物は、例えば、上記で記載した抗体またはその塩を、注射に通常使用される滅菌の水性媒体または油性媒体中に溶解、懸濁、または乳化させることによって調製することができる。注射用の水性媒体としては、例えば、アルコール（例えば、エタノール）、多価アルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤［例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（水素化したヒマシ油のポリオキシエチレン（５０モル）付加物）］などの適切な可溶化剤と組み合わせて使用し得る、生理食塩液、グルコースおよび他の補助剤などを含有する等張性溶液が存在する。油性媒体としては、例えば、安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどの可溶化剤と組み合わせて使用し得るゴマ油、ダイズ油などが用いられる。こうして調製された注射液は、好ましくは適切なアンプル内に充填する。
【０１８５】
本発明の医薬組成物は、標準的な注射針およびシリンジによって、皮下送達することもでき、静脈内送達することもできる。加えて、皮下送達に関しては、本発明の医薬組成物を送達するのに、ペン型送達デバイスの適用が容易である。このようなペン型送達デバイスは、反復使用式の場合もあり、使い捨て式の場合もある。反復使用式のペン型送達デバイスは一般に、医薬組成物を含有する交換式カートリッジを用いる。カートリッジ内のすべての医薬組成物を投与して、カートリッジが空になったら、空のカートリッジは、容易に廃棄し、医薬組成物を含有する新しいカートリッジと交換することができる。こうして、ペン型送達デバイスを反復使用することができる。使い捨て式のペン型送達デバイスには、交換式カートリッジがない。代わりに、使い捨て式のペン型送達デバイスには、デバイス内の容器に保持された医薬組成物があらかじめ充填されている。医薬組成物の容器が空になったら、デバイス全体を廃棄する。
【０１８６】
本発明の医薬組成物の皮下送達では、多数の反復使用式ペン型送達デバイスおよび自己注射式送達デバイスが適用される。ごく少数を挙げれば、例には、ＡＵＴＯＰＥＮ（商標）（Ｏｗｅｎ  Ｍｕｍｆｏｒｄ，Ｉｎｃ．，Ｗｏｏｄｓｔｏｃｋ，ＵＫ）、ＤＩＳＥＴＲＯＮＩＣ（商標）ペン（Ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｕｒｇｈｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＨＵＭＡＬＯＧ  ＭＩＸ  ７５／２５（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＯＧ（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＩＮ  ７０／３０（商標）ペン（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ），ＮＯＶＯＰＥＮ（商標）Ｉ，ＩＩおよびＩＩＩ（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＮＯＶＯＰＥＮ  ＪＵＮＩＯＲ（商標）（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＢＤ（商標）ペン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）、ＯＰＴＩＰＥＮ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ  ＰＲＯ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ  ＳＴＡＲＬＥＴ（商標）、およびＯＰＴＩＣＬＩＫ（商標）（ｓａｎｏｆｉ−ａｖｅｎｔｉｓ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）が含まれるが必ずしもこれらに限定されない。ごく少数を挙げれば、本発明の医薬組成物の皮下送達で適用される使い捨て式ペン型送達デバイスの例には、ＳＯＬＯＳＴＡＲ（商標）ペン（ｓａｎｏｆｉ−ａｖｅｎｔｉｓ）、ＦＬＥＸＰＥＮ（商標）（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）、およびＫＷＩＫＰＥＮ（商標）（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、ＳＵＲＥＣＬＩＣＫ（商標）Ａｕｔｏｉｎｊｅｃｔｏｒ（Ａｍｇｅｎ，Ｔｈｏｕｓａｎｄｓ  Ｏａｋｓ，ＣＡ）、ＰＥＮＬＥＴ（商標）（Ｈａｓｅｌｍｅｉｅｒ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＥＰＩＰＥＮ（Ｄｅｙ，Ｌ．Ｐ．）およびＨＵＭＩＲＡ（商標）ペン（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ）が含まれるが必ずしもこれらに限定されない。
【０１８７】
上記の経口用医薬組成物または非経口用医薬組成物は、有効成分の用量を近似するのに適する単位用量剤形へと調製すると有利である。このような単位用量剤形には、例えば、錠剤、丸薬、カプセル、注射剤（アンプル）、坐剤などが含まれる。含有される前述の抗体の量は一般に、１単位用量剤形当たり約５〜約５００ｍｇであり、とりわけ注射形態では、前述の抗体を約５〜約１００ｍｇ含有し、他の剤形では約１０〜約２５０ｍｇ含有することが好ましい。
【０１８８】
投与計画
本発明のある特定の実施形態によれば、複数用量のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａおよび／またはＢに対する抗体が、規定の時間経過にわたって被験体に投与され得る。本発明のこの態様の方法は、複数用量の毒素Ａおよび／またはＢに対する抗体を被験体に連続投与することを含む。本明細書で使用される場合、「連続投与」は、各用量の毒素Ａおよび／またはＢに対する抗体を、異なる時点（例えば、所定の間隔（例えば、数時間、数日間、数週間または数カ月間）で区切られた異なる日）に被験体に投与することを意味する。本発明は、単一の初回用量の毒素Ａおよび／またはＢに対する抗体、続いて１つ以上の第２回用量の毒素Ａおよび／またはＢに対する抗体、そして場合により続いて１つ以上の第３回用量の毒素Ａおよび／またはＢに対する抗体を患者に連続投与することを含む方法を含む。
【０１８９】
「初回用量」、「第２回用量」および「第３回用量」という用語は、毒性Ａおよび／またはＢに対する抗体の投与の時系列をいう。したがって、「初回用量」は、処置計画の開始時に投与される用量（「ベースライン用量」とも称される）であり；「第２回用量」は、初回用量の後に投与される用量であり；そして「第３回用量」は、第２回用量の後に投与される用量である。初回、第２回、および第３回用量はすべて、同じ量の毒性Ａおよび／またはＢに対する抗体を含有していてもよいが、投与頻度の観点から一般的に互いに異なるものであり得る。しかしながら、ある特定の実施形態では、初回、第２回および／または第３回用量に含まれる毒性Ａおよび／またはＢに対する抗体の量は、処置過程の間互いに変動するものとなる（例えば、必要に応じて増減調整される）。ある特定の実施形態では、２回以上（例えば、２回、３回、４回または５回）の用量を「ローディング用量」として処置計画の開始時に投与し、続いて、その後の用量をより少ない頻度で投与する（「維持用量」）。
【０１９０】
本発明の例示的な実施形態では、各第２回および／または第３回用量は、直前の用量の１〜２６（例えば、１、１１／２、２、２１／２、３、３１／２、４、４１／２、５、５１／２、６、６１／２、７、７１／２、８、８１／２、９、９１／２、１０、１０１／２、１１、１１１／２、１２、１２１／２、１３、１３１／２、１４、１４１／２、１５、１５１／２、１６、１６１／２、１７、１７１／２、１８、１８１／２、１９、１９１／２、２０、２０１／２、２１、２１１／２、２２、２２１／２、２３、２３１／２、２４、２４１／２、２５、２５１／２、２６、２６１／２またはそれ以上）週間後に投与される。本明細書で使用される場合、「直前の用量」という語句は、複数回投与の過程において、その過程における直近の用量の投与前に、用量を間に入れずに患者に投与される毒性Ａおよび／またはＢに対する抗体の用量を意味する。
【０１９１】
本発明のこの態様の方法は、任意の数の第２回および／または第３回用量の毒性Ａおよび／またはＢに対する抗体を患者に投与する工程を含み得る。例えば、ある特定の実施形態では、単一の第２回用量のみが患者に投与される。他の実施形態では、２つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８またはそれ以上）の第２回用量が患者に投与される。同様に、ある特定の実施形態では、単一の第３回用量のみが患者に投与される。他の実施形態では、２つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８またはそれ以上）の第３回用量が患者に投与される。
【０１９２】
複数の第２回用量を含む実施形態では、各第２回用量は、他の第２回用量と同じ頻度で投与され得る。例えば、各第２回用量は、直前の用量の１〜２週間後患者に投与され得る。同様に、複数の第３回用量を含む実施形態では、各第３回用量は、他の第３回用量と同じ頻度で投与され得る。例えば、各第３回用量は、直前の用量の２〜４週間後患者に投与され得る。あるいは、第２回および／または第３回用量が患者に投与される頻度は、処置計画の過程にわたって変動し得る。また、投与頻度は、臨床検査の後、個々の患者の必要性に応じて、処置の過程の間医師によって調整され得る。
【０１９３】
抗体の治療的使用
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａおよび／または毒素Ｂとの相互作用により、本抗体は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ原発性疾患もしくは症状、または前記疾患もしくは症状に関連する少なくとも１つの症候（例えば、下痢または大腸炎）を処置するため、または疾患再燃を予防するため、または疾患再発の重症度、持続期間および／もしくは頻度を低減するために有用である。本発明の抗体はまた、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症を発症または罹患するリスクを有する患者における予防的使用について企図される。これらの患者には、高齢者（例えば、６５歳以上の者）、または疾患によりまたは免疫抑制治療薬の処置により免疫無防備状態である患者、または患者をＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症にかかりやすくする基礎病状（例えば、癌、炎症性腸疾患、腹水貯留を有する肝移植前患者）を有し得る患者、または長期間（例えば、いくつかの場合では、この期間は、２日間または３日間ほど変化し得るが、一般には１週間から２週間またはそれ以上であり得る）の入院（これは、患者を院内感染に罹患しやすくする）患者、または広域抗生物質で長期間（１４日間以上）処置されている患者（いくつかの場合では、患者は、整腸されなければ２４時間以内に感染症に罹患し得るが、他の場合では、これはより長い、例えば１週間以上であり得る）、または胃腸障害を処置するためのプロトンポンプ阻害剤による治療中の患者が含まれる。本発明の抗体は単独で、またはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症を処置するための、もしくはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症に関連する少なくとも１つの症候もしくは合併症（例えば、このような感染症に関連するかまたはこれに起因する下痢または大腸炎）を緩和するための第２の薬剤もしくは第３の薬剤と併せて使用され得ると企図される。第２または第３の薬剤を本発明の抗体と同時に送達してもよいし、またはそれらを本発明の抗体の前後いずれかに別個に投与してもよい。
【０１９４】
本発明のまたさらなる実施形態では、本抗体は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの臨床関連超毒性株によって引き起こされる感染症、またはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症に関連する下痢および大腸炎を含むＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症を患っている患者を処置するための医薬組成物を調製するのに使用される。本発明のさらに別の実施形態では、本抗体は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによる一次感染の重症度を軽減するための、またはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによる再発の重症度、持続期間および／もしくは回数を軽減するための医薬組成物を調製するのに使用される。本発明のさらなる実施形態では、本抗体は、プロバイオティク、抗生物質、トキソイド、ワクチン、または当業者に公知の任意の他の緩和療法を含むＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症を処置するのに有用な任意の他の薬剤との補助療法として使用される。
【０１９５】
併用療法
ある特定の実施形態によれば、本発明の方法は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａおよび／または毒素Ｂに対する抗体と組み合わせて１つ以上のさらなる治療剤を被験体に投与することを含む。本明細書で使用される場合、「組み合わせて」という表現は、さらなる治療剤が、抗毒素Ａおよび／またはＢ抗体を含む医薬組成物の前、その後またはそれと同時に投与されることを意味する。「組み合わせて」という用語はまた、抗毒素Ａおよび／またはＢ抗体ならびに第２の治療剤の連続または同時投与を含む。
【０１９６】
例えば、抗毒素Ａおよび／またはＢ抗体を含む医薬組成物の「前」に投与される場合、さらなる治療剤は、抗毒素Ａおよび／またはＢ抗体を含む医薬組成物の投与の約７２時間、約６０時間、約４８時間、約３６時間、約２４時間、約１２時間、約１０時間、約８時間、約６時間、約４時間、約２時間、約１時間、約３０分、約１５分または約１０分前に投与され得る。抗毒素Ａおよび／またはＢ抗体を含む医薬組成物の「後」に投与される場合、さらなる治療剤は、抗毒素Ａおよび／またはＢ抗体を含む医薬組成物の投与の約１０分、約１５分、約３０分、約１時間、約２時間、約４時間、約６時間、約８時間、約１０時間、約１２時間、約２４時間、約３６時間、約４８時間、約６０時間または約７２時間後に投与され得る。抗毒素Ａおよび／またはＢ抗体を含む医薬組成物との「同時」投与は、さらなる治療剤が、抗毒素Ａおよび／またはＢ抗体を含む医薬組成物の投与（前、後、または同時）の５分未満以内に別個の剤形で被験体に投与されるか、またはさらなる治療剤ならびに抗毒素Ａおよび／またはＢ抗体の両方を含む単一複合投与製剤として被験体に投与されることを意味する。
【０１９７】
併用療法は、本発明の抗毒素Ａまたは抗毒素Ｂ抗体と、本発明の抗体または本発明の抗体の生物学的に活性な断片と有利に組み合わせられ得るさらなる治療剤とを含み得る。
【０１９８】
例えば、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに関して静菌性または殺菌性の抗生物質などの第２または第３の治療剤は、腸内の細菌負荷を減少させるのを助けるために用いられ得る。例示的な抗生物質には、バンコマイシン、メトロニダゾールまたはフィダキソマイシンが含まれる。抗体はまた、他の治療法、例えば、トキソイド、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対して特異的なワクチンまたはプロバイオティック剤、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂｏｕｌａｒｄｉｉと併せて使用され得る。
【０１９９】
抗体の診断的使用
本発明の抗毒素Ａまたは抗毒素Ｂ抗体はまた、例えば、診断目的で、試料中の毒素ＡまたはＢを検出および／または測定するのにも使用することができる。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによって引き起こされると考えられる感染症の確認は、本発明の抗体の１つ以上を使用して、毒素Ａまたは毒素Ｂのいずれかの存在を測定することによって行うことができると予測される。毒素Ａまたは毒素Ｂについての例示的な診断アッセイは、例えば、患者から得た試料を本発明の抗毒素Ａまたは抗毒素Ｂ抗体と接触させる工程を含むことが可能であり、抗毒素Ａまたは抗毒素Ｂ抗体を、検出可能な標識もしくはレポーター分子で標識するか、または毒素Ａまたは毒素Ｂタンパク質を患者試料から選択的に単離するための捕捉リガンドとして使用する。あるいは、診断適用では、標識されていない抗毒素Ａまたは抗毒素Ｂ抗体を、それ自体検出可能に標識された二次抗体と組み合わせて使用することもできる。検出可能な標識またはレポーター分子は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、または１２５Ｉなどの放射性同位体の場合もあり、イソチオシアン酸フルオレセインまたはロダミンなどの蛍光部分または化学発光部分の場合もあり、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、またはルシフェラーゼなどの酵素の場合もある。試料中の毒素Ａまたは毒素Ｂを検出または測定するのに使用され得る特定の例示的アッセイには、酵素免疫測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、および蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）が含まれる。
【０２００】
本発明によるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ診断アッセイにおいて使用され得る試料には、正常状態下または病理学的状態下において、検出可能量のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａもしくは毒素Ｂタンパク質またはその断片を含有する、患者から得られた任意の組織試料または体液試料が含まれる。一般に、健常な患者（例えば、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの存在に関連する疾患または症状に罹患していない患者）から得られた特定の試料における毒素Ａまたは毒素Ｂレベルを測定して、まずＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来の毒素Ａまたは毒素Ｂのベースラインレベルまたは基準レベルを確立する。次いで、毒素Ａまたは毒素Ｂのこのベースラインのレベルを、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに関連する疾患もしくは症状、またはこのような疾患もしくは症状に関連する症候を有することが疑われる個体から得られた試料中で測定された毒素Ａまたは毒素Ｂレベルに対して比較することができる。
【実施例】
【０２０１】
以下の実施例は、本発明の方法および組成物の作製および使用法についての完全な開示および説明を当業者に提供するために示すものであり、本発明者らが自らの発明とみなすものの範囲を限定することを意図するものではない。使用される数字（例えば、量、温度など）に関する精度を確保しようと努めはするが、実験的な誤差および偏差を考慮すべきである。別段に示さない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏温度であり、圧力は大気圧またはその近傍である。
【０２０２】
実施例１．Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａおよび／または毒素Ｂに対するヒト抗体の作製
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａおよび／または毒素Ｂに対する抗体の作製するために、以下のいずれか１つを含む免疫原を使用することができる。ある特定の実施形態では、本発明の抗体は、主な免疫原、例えば、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来の天然の全長不活性化毒素Ａ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＡ６３５６４（配列番号３７８）を参照のこと）および／もしくは毒素Ｂ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＪ６７４９２（配列番号３８０）を参照のこと）、または前記毒素もしくは毒素断片もしくはトキソイドの組換え不活性型で免疫感作し、続いて、第２の免疫原または前記天然毒素の免疫原活性断片で免疫感作したマウスから得られる。不活性化毒素Ａのみもしくは不活性化毒素Ｂのみのいずれかで動物を免疫感作してもよいし、または不活性化毒素Ａおよび不活性化毒素Ｂの両方で同時に免疫感作してもよい。免疫原として使用する前に、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、過酸化物による処理または酸素処理を含む標準的なトキソイド調製手順を使用して毒素を不活性化することができる（Ｒｅｌｙｖｅｌｄら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，９３：２４，１９８３、Ｗｏｏｄｒｏｗ  ａｎｄ  Ｌｅｖｉｎｅ，ｅｄｓ．Ｎｅｗ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９０）。別の不活性化手段は、ＵＤＰ−ジアルデヒド（これは、他の不活性化法と比較して毒素の天然構造を維持し、それにより、天然毒素とより反応性の抗体を誘導する可能性を高めるように作用し得る）の使用によるものである（Ｇｅｎｔｈら、（２０００），Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６８（３）：１０９４−１１０１）。あるいは、標準的な組換え技術を使用して、減少した毒性を示すＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来の突然変異体毒素を生産し、免疫原として使用してもよい（例えば、米国特許第５，０８５，８６２号明細書；米国特許第５，２２１，６１８号明細書；米国特許第５，２４４，６５７号明細書；米国特許第５，３３２，５８３号明細書；米国特許第５，３５８，８６８号明細書；および米国特許第５，４３３，９４５号明細書を参照のこと）。このような突然変異体は、毒素の活性部位に欠失または点突然変異を含有し得る。
【０２０３】
ある特定の実施形態では、本発明の抗体は、天然毒素Ａもしくは毒素Ｂの生物学的に活性なおよび／もしくは免疫原性の断片、またはそれらの活性断片をコードするＤＮＡなどの主な免疫原で免疫感作したマウスから得られる。ある特定の実施形態では、免疫原は、毒素Ａおよび／もしくは毒素ＢのＮ末端もしくはＣ末端由来のペプチド、または毒素Ａおよび／もしくは毒素ＢのＮもしくはＣ末端ペプチド由来の断片であり得る。本発明のある特定の実施形態では、免疫原は、配列番号３７８のおよそアミノ酸残基１８３２〜２７１０に及ぶ毒素Ａのカルボキシ末端受容体結合ドメインである。本発明のある特定の実施形態では、免疫原は、配列番号３７５に示されている毒素Ａのカルボキシ末端受容体結合ドメインである。本発明のある特定の実施形態では、免疫原は、配列番号３８０のおよそアミノ酸残基１８３４〜２３６６に及ぶ毒素Ｂのカルボキシ末端受容体結合ドメインである。本発明のある特定の実施形態では、免疫原は、配列番号３７６に示されている毒素Ｂのカルボキシ末端受容体結合ドメインである。
【０２０４】
したがって、一実施形態では、本発明の抗体は、不活化全長毒素Ａ（トキソイド）もしくは不活化全長毒素Ｂ（トキソイド）のいずれかまたは両方のトキソイドで免疫感作したマウスから得られた。さらに、一実施形態では、抗体は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａのカルボキシ末端受容体結合ドメイン由来のアミノ酸配列を含むポリペプチドで、もしくはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ｂのカルボキシ末端受容体結合ドメイン由来のアミノ酸配列を含むポリペプチドで、またはその両方で同時に免疫感作したマウスから得られた。
【０２０５】
ある特定の実施形態では、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａまたは毒素Ｂに特異的に結合する抗体は、上記領域の断片、または本明細書に記載される領域のＮもしくはＣ末端のいずれかまたは両方から前記指定領域を約５〜約２０個のアミノ酸残基分延長したペプチドを使用して調製され得る。ある特定の実施形態では、上記領域またはその断片の任意の組み合わせが、毒素Ａまたは毒素Ｂ特異的抗体の調製に使用され得る。ある特定の実施形態では、毒素Ａもしくは毒素Ｂの上記領域またはそれらの断片のいずれか１つ以上が、単一特異性、二重特異性または多重特異性抗体を調製するのに使用され得る。
【０２０６】
上記のように、免疫原として使用した全長タンパク質またはそのカルボキシ末端断片を、免疫反応を刺激するアジュバントと共に、ヒト免疫グロブリンの重鎖可変領域およびカッパ軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを含むＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスに直接投与した。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ａおよび／または毒素Ｂ特異的イムノアッセイによって、抗体免疫反応をモニタリングした。所望の免疫反応を達成したら、脾臓細胞を採取し、マウス骨髄腫細胞と融合させてそれらの生存能を維持し、ハイブリドーマ細胞株を形成した。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ａおよび／または毒素Ｂ特異的抗体を産生する細胞株を同定するために、ハイブリドーマ細胞株をスクリーニングおよび選択した。この技術および上記の様々な免疫原を使用して、複数の抗Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ａおよび毒素Ｂ、ならびに交差反応性キメラ抗体（すなわち、ヒト可変ドメインおよびマウス定常ドメインを保有する抗体）を得、このようにして作製したある特定の例示的な抗体を、Ｈ１Ｈ３０６７Ｎ、Ｈ１Ｈ３１３４Ｎ、Ｈ１Ｈ３１１７Ｎ、Ｈ１Ｍ３１２３Ｎ、Ｈ１Ｍ３１２１ＮおよびＨ１Ｍ３１２４Ｎと命名した。
【０２０７】
また、米国特許出願公開第２００７／０２８０９４５号明細書に記載されているように、骨髄腫細胞との融合を用いずに、抗原陽性Ｂ細胞から抗Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ａおよび毒素Ｂ抗体を直接単離した。この方法を使用して、いくつかの完全ヒト抗Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ａおよび毒素Ｂ抗体（すなわち、ヒト可変ドメインおよびヒト定常ドメインを有する抗体）を得た；このようにして作製した例示的な抗体を以下のように命名した：Ｈ１Ｈ３３２８Ｐ、Ｈ１Ｈ３３２４Ｐ、Ｈ１Ｈ３３２５Ｐ、Ｈ１Ｈ３３３０Ｐ、Ｈ１Ｈ３３５０Ｐ、Ｈ１Ｈ３３４７Ｐ、Ｈ１Ｈ３３３５Ｐ、Ｈ１Ｈ３３４４Ｐ．  Ｈ１Ｈ３３３９Ｐ、Ｈ１Ｈ３３３７Ｐ、Ｈ１Ｈ３３４３Ｐ、Ｈ１Ｈ３４１１Ｐ、Ｈ１Ｈ３３５４Ｐ、Ｈ１Ｈ３３１７Ｐ、Ｈ１Ｈ３３５５Ｐ、Ｈ１Ｈ３３９４ＰおよびＨ１Ｈ３４０１Ｐ。
【０２０８】
本実施例の方法にしたがって作製した例示的な抗体の生物学的特性を以下に記載の実施例で詳細に説明する。
【０２０９】
実施例２．重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列
表１には、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来の毒素Ａおよび／または毒素Ｂに対して特異的な選択抗体の重鎖および軽鎖可変領域アミノ酸配列ペア、ならびにそれらの対応する抗体識別子が記載されている。抗体は、典型的には、本明細書では以下の命名法にしたがって称される：Ｆｃの接頭辞（例えば、「Ｈ４Ｈ」、「Ｈ１Ｍ、「Ｈ２Ｍ」）、続いて番号識別子（例えば、表１に示されている「３１１７」）、続いて「Ｐ」または「Ｎ」の接尾辞。したがって、この命名法によれば、抗体は、例えば、「Ｈ１Ｈ３１１７」と称され得る。本明細書で使用される抗体名称のＨ４Ｈ、Ｈ１ＭおよびＨ２Ｍという接頭辞は、抗体の特定のＦｃ領域を示す。例えば、「Ｈ２Ｍ」抗体はマウスＩｇＧ２  Ｆｃを有するのに対して、「Ｈ４Ｈ」抗体はヒトＩｇＧ４  Ｆｃを有する。当業者によって認識されるように、Ｈ１ＭまたはＨ２Ｍ抗体をＨ４Ｈ抗体に変換することもできるし、その逆もまた同様であるが、いずれにしても、表１に示されている番号識別子によって示される可変ドメイン（ＣＤＲを含む）は依然として同じである。抗体名称の番号は同じであるが、接尾辞Ｎ、Ｂ、またはＰが異なる抗体は、ＣＤＲ配列は同一であるが、ＣＤＲ配列以外の領域（すなわち、フレームワーク領域）において配列の変化を伴う重鎖および軽鎖を有する抗体を指す。したがって、特定の抗体のＮ、ＢおよびＰ変異体は、それらの重鎖および軽鎖可変領域内に同一のＣＤＲ配列を有するが、それらのフレームワーク領域内では互いに異なる。
【０２１０】
抗体比較物
比較目的のために、抗毒素Ａおよび抗毒素Ｂ対照を以下の実施例に含めた。実施例では、アイソタイプマッチ陰性対照も使用した。ある抗毒素Ａ対照抗体を本明細書では対照Ｉと命名し、これは、米国特許第７６２５５５９号明細書および米国特許出願公開第２００５／０２８７１５０号明細書に記載されている「３Ｄ８」抗体の重鎖および軽鎖可変ドメイン配列を有する抗毒素Ａ抗体である。ある抗毒素Ｂ抗体を本明細書では対照ＩＩと命名し、これは、米国特許第７６２５５５９号明細書および米国特許出願公開第２００５／０２８７１５０号明細書に記載されている「１２４−１５２」抗体の重鎖および軽鎖可変ドメイン配列を有する抗毒素Ｂ抗体である。別の抗毒素Ａ抗体を本明細書では対照ＩＩＩと命名し、これは、米国特許出願公開第２００９／００８７４７８号明細書に記載されている「３３５８」抗体の重鎖および軽鎖可変ドメイン配列を有する抗毒素Ａ抗体である。
【０２１１】
【表１】
2018029625.tif 000006
【０２１２】
実施例３．可変遺伝子の利用分析
生産した抗体の構造を分析するために、抗体の可変領域をコードする核酸をクローニングし、配列決定した。抗体の核酸配列および抗体の予測アミノ酸配列から、各重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）および軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）について、遺伝子使用を同定した。表２は、本発明による選択抗体の遺伝子使用を示す。
【０２１３】
【表２】
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【０２１４】
実施例４．表面プラズモン共鳴によって決定した場合の、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来の毒素Ａおよび／または毒素Ｂに対する抗体の結合
ヒトモノクローナル抗Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ａおよび／またはＢ抗体の結合親和性および速度定数を、３７℃の表面プラズモン共鳴によって決定した（表３〜５）。Ｔ２００  Ｂｉａｃｏｒｅ機器で測定を行った。
【０２１５】
抗体（ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ（ＡｂＰＩＤ接頭辞Ｈ１Ｈ）またはハイブリドーマ（ＡｂＰＩＤ接頭辞ＨｘＭ）と表す）を、それぞれ抗ヒトまたは抗マウス−Ｆｃのセンサー表面上に捕捉した（Ｍａｂ捕捉フォーマット）。５〜１０ｎＭの範囲の可溶性全長毒素ＡまたはＢ（ＴｅｃｈＬａｂ）を、抗体捕捉表面全体に注入した。抗体−抗原の会合を１５０秒間モニタリングし、緩衝液中での解離を４８０秒間モニタリングした。Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００評価ソフトウェア１．０を使用して、抗原／抗体複合体の解離のＫＤおよび半減期を計算するために、動態分析を実施した。
【０２１６】
表３〜５に見られるように、３種類の抗体を単離した：毒素Ａおよび毒素Ｂの両方に結合した抗体（二重結合物、表３を参照のこと）、毒素Ａのみに結合した抗体（表４）、および毒素Ｂのみに結合した抗体（表５）。毒素Ａおよび毒素Ｂの両方に結合したいくつかの抗体（Ｈ２Ｍ３１２１Ｎ、Ｈ２Ｍ３１２３Ｎ、Ｈ２Ｍ３１２４Ｎ、Ｈ１Ｈ３０６７ＮおよびＨ１Ｈ３１３４Ｎと命名したものを含む）が同定されたので、二重結合物として分類した。単離した抗毒素Ａ抗体は、アイソタイプマッチ比較用Ｍａｂ（対照Ｉ；クローン３Ｄ８（Ａ毒素Ａｂ）およびクローン１２４−１５２（Ｂ毒素Ａｂ）の比較配列については、米国特許第７６２５５５９号明細書を参照のこと）と同様に、ナノモル濃度（ｎＭ）範囲以下で毒素に結合したが、対照ＩＩアイソタイプマッチ比較用Ｍａｂ（クローン１２４−１５２）の範囲内の親和性（約２００〜３００ｐＭ）を示した抗毒素Ｂ結合物はわずか数個であった。ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ；Ｔ１／２（ｍｉｎ）＝（ｌｎ２／ｋｄ）／６０のように、運動速度定数から結合解離平衡定数および解離半減期を計算した。
【０２１７】
【表３】
2018029625.tif 000008
【０２１８】
【表４】
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【０２１９】
【表５】
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【０２２０】
実施例５．表面プラズモン共鳴を使用した、抗Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素ＡおよびＢ抗体の結合ドメインの決定
抗Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ａおよび／またはＢ抗体が、各毒素のＣ末端受容体結合ドメイン（ＣＢＤ）に結合したかを決定するために、研究を行った。これらの研究では、２つの実験Ｂｉａｃｏｒｅフォーマットを用いた。捕捉抗Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ抗体表面を用いた第１のものでは、１００ｎＭのＣＢＤ−毒素Ａ−Ｆｃ（配列番号３７５）またはＣＢＤ−毒素Ｂ−Ｆｃ（配列番号３７６）を流して、反応（ＲＵ）を記録した。ハイブリドーマおよびヒトＦｃフォーマット抗体分析の両方を可能にするために、ヒトおよびマウスＦｃの両方でＣＢＤ−毒素試薬をフォーマットした。抗原（ＣＢＤ−Ｆｃ）捕捉表面を用いた第２フォーマットでは、５００ｎＭの抗Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｍＡｂを流した。このフォーマットでは、ハイブリドーマまたはヒトＦｃフォーマット抗体を、それぞれヒトおよびマウスＦｃ捕捉抗原に流した。両方のフォーマットにおいて、バックグラウンドを有意に超えた反応（＞５０ＲＵ）を、毒素ＡまたはＢのＣＢＤに対する結合と考えた（表６を参照のこと）。抗毒素Ａおよび抗毒素Ｂ抗体の両方について、ＣＢＤ内側および外側のエピトープが得られた。過去の報告にしたがって、対照Ｉ（米国特許第７６２５５５９号明細書および米国特許出願公開第２００５／０２８７１５０号明細書の３Ｄ８抗体）および対照ＩＩ（米国特許第７６２５５５９号明細書および米国特許出願公開第２００５／０２８７１５０号明細書の１２４−１５２抗体）の両方をそれらの各毒素のＣＢＤに対してマッピングした（データは示さず；米国特許出願公開第２００５／０２８７１５０号明細書および米国特許第７６２５５５９号明細書を参照のこと）。
【０２２１】
【表６】
2018029625.tif 000011
【０２２２】
実施例６．サイズ排除クロマトグラフィーを使用した、抗Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素ＡおよびＢ抗体に対する結合ドメインの決定
【０２２３】
抗Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ａおよび／またはＢ抗体が、Ｃ末端受容体結合ドメイン（ＣＢＤ）に結合したかを決定するための優れた方法として、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いた。簡潔に言えば、５％グリセロールを含有するリン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７．４（ＰＢＳ／Ｇ）中で、約５００ｎＭの毒素ＡのＣＢＤ（配列番号３７５）または毒素ＢのＣＢＤ（配列番号３７６）を過剰な抗体と特定モル比（１：５および１：２０；ＣＢＤ：Ｍａｂ）で混合し、室温で１時間インキュベートした。
【０２２４】
１時間後における目に見えるあらゆる沈殿を、＋＋＋（多い）、＋＋（中程度）、＋（わずか）または−（観察されず）として記録した。遠心分離（１６，０００×ｇで５分間）後、抗体およびＣＢＤの混合物を、移動相としてＰＢＳ／Ｇを用いるＳｕｐｅｒｏｓｅ
６カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用したＳＥＣ分析に供した。抗体またはＣＢＤ単独よりも大きい複合体に対応するタンパク質のピークを、Ｃ末端ドメインに対する結合と解釈した。
【０２２５】
これらの結果により、ＣＢＤの結合は、ＳＰＲ（Ｂｉａｃｏｒｅ）およびＣＢＤ研究から推測される結合のドメインから予測されるものによく対応することが実証された（実施例５を参照のこと）。１つの明らかな例外はＨ１Ｈ３１３４Ｎであり、ＣＢＤ−Ａに対する結合がＳＥＣによって観察されなかったが、ＫＤ値は抗体の二重結合特性を示していた。
【０２２６】
【表７】
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【０２２７】
実施例７．抗Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ａおよび／または毒素Ｂ抗体の中和効力の決定
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける抗Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ抗体の中和効力（ＩＣ５０）を決定するために、細胞生存率アッセイを行った。簡潔に言えば、１０％ＦＢＳを補充したＭＥＭα培地で培養したＶｅｒｏ細胞（１．２５ｘ１０３個）を９６ウェルマイクロプレートに播種し、５％ＣＯ２、３７℃で１６〜１８時間インキュベートした。様々な濃度（０〜６６ｎＭ）の抗Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素抗体を細胞に追加し、続いてＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａ（３２または２５ｐＭ）または毒素Ｂ（０．０３ｐＭまたは０．０１ｐＭ）と共に４８時間インキュベートした。毒素を含有しない対照（生存率１００％）と、毒素を含有するが抗体を含有しない対照（相対死亡率１００％）とを用いた。抗体の希釈はすべてトリプリケートで行った。２日間インキュベートした後、テトラゾリウム塩（ＷＳＴ−１；Ｒｏｃｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を追加し、発色させるために４時間待機し、次いで４５０ｎｍの吸光度を記録することによって、細胞生存率を測定した。１１点反応曲線（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ）の４パラメータロジスティック方程式によって、吸光度の値を分析した。
【０２２８】
これら結果により、２５〜３２ｐＭの一定の毒素Ａにおいて、１０個の抗体が７ｐＭ〜６５ｐＭの範囲のＩＣ５０値で毒素Ａに対する中和を示したことが示された（表８Ａ）。注目すべきことに、Ｈ１Ｈ３３３０Ｐは、対照ＩＩＩ（アイソタイプマッチ比較用抗体、米国特許出願公開第２００９／００８７４７８号明細書に記載されているクローン３３５８）と同等の中和効力および対照Ｉ（クローン３Ｄ８については、米国特許出願公開第２００５／０２８７１５０号明細書を参照のこと）よりも約２０倍大きい効力を示した。０．０３ｐＭの一定の毒素Ｂにおいて、いくつかの毒素Ｂ中和抗体は、２５〜１２０ｐＭの範囲のＩＣ５０で、対照ＩＩ（アイソタイプマッチ比較用抗体、米国特許出願公開第２００５／０２８７１５０号明細書のクローン１２４−１５２を参照のこと）よりも有意に大きい効力を示した（表８Ｂ）。抗体Ｈ１Ｍ３０６７ＮおよびＨ１Ｍ３１３４Ｎは、毒素ＡおよびＢの両方に結合することができるが、毒素Ａに対してのみ中和活性を示した。この理由はいまだに不明であるが、この発見について考えられる１つの説明は、抗体は毒素のＣ末端部分の反復領域内の多くの部位に結合することができるが、同じ毒素ドメインの他の部分は哺乳動物の膜と依然として相互作用して、毒素が細胞に進入するのを可能にし得るというものであり得る。
【０２２９】
【表８Ａ】
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【０２３０】
【表８Ｂ】
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【０２３１】
実施例８．二重特異性抗体の作製
本発明の方法を実施するのに使用するために、様々な二重特異性抗体を作製する。例えば、毒素Ａおよび／またはＢの異なるドメインに結合する可変領域を共に連結して、単一の結合分子内に二重ドメインおよび／または二重毒素特異性を付与する、二重特異性フォーマットで、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ａまたは毒素Ｂ特異的抗体を作製する（「二重特異性物」）。適切に設計された二重特異性物は、特異性および結合アビディティーの両方を増加させることによって、全体的な毒素中和効果を増強し得る。図１に示されているように、個々のドメイン（例えば、グルコシル化酵素ドメインであるＮ末端ドメイン（ドメイン「Ａ」と表示）、または自己触媒プロセシングドメイン（ドメイン「Ｃ」と表示）、または転移ドメイン（ドメイン「Ｄ」と表示）、またはカルボキシ末端受容体結合ドメイン（ドメイン「Ｂ」と表示）のセグメント）に対する特異性を有するかまたは１つのドメイン内の異なる領域に結合し得る可変領域を、各領域が別個のエピトープまたは１つのドメイン内の異なる領域に同時に結合することを可能とする構造的な足場において対合させる。二重特異性物の一例では、元のＶＨに対する元の特異性を破壊せずにそのＶＨと対合し得る非同種ＶＬパートナーを同定するために、第１のドメインに対する特異性を有する結合物由来の重鎖可変領域（ＶＨ）を、第２のドメインに対する特異性を有する一連の結合物由来の軽鎖可変領域（ＶＬ）と再結合させる。このようにして、単一のＶＬセグメント（例えば、ＶＬ１）を、２つの異なるＶＨドメイン（例えば、ＶＨ１およびＶＨ２）と組み合わせて、２つの結合「アーム」（ＶＨ１−ＶＬ１およびＶＨ２−ＶＬ１）を含む二重特異性物を作製することができる。単一のＶＬセグメントを使用することによって、系の複雑性が低減され、これによって、二重特異性物（例えば、ＵＳＳＮ１３／０２２７５９および米国特許出願公開第２０１０／０３３１５２７号明細書を参照のこと）を作製するのに使用されるクローニング、発現および精製工程の効率が単純化および増大する。
【０２３２】
あるいは、毒素Ａおよび／または毒素Ｂならびに第２の標的（例えば、限定されないが、第２の異なる抗毒素Ａもしくは抗毒素Ｂ抗体、またはトキソイド、またはワクチンなど）の両方に結合する抗体が、本明細書に記載される技術または当業者に公知の他の技術を使用して、二重特異性フォーマットで調製することができる。単一の結合分子内に二重抗原特異性を付与するために、異なる毒素Ａ領域に結合する抗体可変領域を、例えば、毒素Ｂ上の関連部位に結合する可変領域と連結することができる。この性質を有する適切に設計された二重特異性物は、二重機能性物として役立つ。例えば、毒素Ａおよび毒素Ｂの両方に結合する二重特異性抗体の場合、２つの別個の抗体を含有する組成物の投与を必要とせずに、毒素Ａおよび毒素Ｂの両方を同時により良く中和することができる。毒素Ａに対する特異性を有する可変領域を、毒素Ｂに対する特異性を有する可変領域と組み合わせ、各可変領域が別個の抗原に結合することを可能とする構造的な足場において対合させる。
【０２３３】
抗体についての上記アッセイのいずれかにおいて、二重特異性結合物を、標的抗原、例えば、毒素Ａおよび毒素Ｂに対する結合およびこれらの機能的遮断について試験する。例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ、ＥＬＩＳＡ、サイズ除外クロマトグラフィー、複数角度レーザー光散乱、直接走査熱量測定、および他の方法などの、可溶性タンパク質の結合を測定する標準的な方法を使用して、二重特異性相互作用を評価する。異なる毒素を表す合成ペプチドをマイクロタイタープレートのウェル上にコーティングするＥＬＩＳＡ結合アッセイを使用して毒素Ａおよび毒素Ｂの両方に対する二重特異性抗体の結合を決定し、二次検出抗体を使用して二重特異物の結合を決定する。また、それぞれ二重特異性物またはペプチドが捕捉されているセンサー表面にペプチドまたは二重特異性物を流すことによって、抗体に対するペプチドのリアルタイム結合相互作用を測定する表面プラズモン共鳴実験を使用して結合実験を行うことができる。二重特異性物による毒素Ａおよび毒素Ｂの両方のｉｎ
ｖｉｔｒｏ機能的遮断は、本明細書に記載される中和アッセイなどの任意のバイオアッセイを使用して、または本明細書に記載されるものなどの適切な動物モデルにおけるｉｎ
ｖｉｖｏ保護研究によって決定する。
【０２３４】
実施例９．ハムスター再発モデル（Ａ）および急性ハムスターモデル（Ｂ）における、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症（ＣＤＩ）に対する抗毒素Ａおよび／または抗毒素Ｂ抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性の評価
下記のように、２つの異なるハムスターモデルにおいて、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来の毒素Ａおよび／または毒素Ｂに対して特異的な抗体のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによる感染症に対する有効性を評価した。ハムスターは、クリンダマイシンの存在下ではＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症に感受性であり、通常は感染後２〜４日以内に死亡する。
【０２３５】
（Ａ）再発モデル：−１日目において、雄性シリアゴールデンハムスターに、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ胞子および栄養細胞（合計１０６個）の混合物を含有する経口懸濁液を投与した。感染の２４時間後（０日目）、クリンダマイシン（１０ｍｇ／ｋｇ）の単回皮下注射を動物に行った。１〜３日目において、感染症を改善するために、バンコマイシン（１０ｍｇ／ｋｇ）をハムスターに１日１回経口投与した。抗生物質バンコマイシンは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症を処置するのに臨床的に使用されている。最後のバンコマイシン投与の後、抗体を、その処置および投与群にしたがって４日間（３〜６日目）または１日間（３日目）にわたって１日１回皮下投与した（以下の表９Ａおよび９Ｂを参照のこと）。
【０２３６】
臨床有効性の代わりとして再発モデルを使用した２つの異なる試験（図２および３を参照のこと）を行った。両試験では、２つの抗体の組み合わせを比較した：
１．Ｈ１Ｈ３３３０ＰおよびＨ１Ｈ３３４７Ｐと命名した抗体
２．比較用抗毒素Ａ（対照Ｉ；クローン３Ｄ８の配列については、米国特許第７６２５５５９号明細書を参照のこと）および比較用抗毒素Ｂ抗体（対照ＩＩ；クローン１２４−１５２の配列については、米国特許第７６２５５５９号明細書を参照のこと）
【０２３７】
試験１では、４つの用量の抗体を各抗体５ｍｇ／ｋｇ（合計１０ｍｇ／ｋｇ用量）で投与した。試験２では、１つの用量の抗体を各抗体５ｍｇ／ｋｇまたは２ｍｇ／ｋｇのいずれかで投与した（合計１０ｍｇ／ｋｇまたは４ｍｇ／ｋｇのいずれか）。
【０２３８】
【表９Ａ】
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【０２３９】
【表９Ｂ】
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【０２４０】
実験期間中は、動物を１日２回観察した。一般的な観察には、死亡および疾病の徴候、下痢（「ウェットテイル」）の存在、ならびに全体の外観（活動、取り扱い、接触に対する一般的な反応、被毛の逆立ち）が含まれていた。瀕死状態であると判断した動物を安楽死させた。瀕死状態を決定するのに使用した基準は、長期間（５日間）の体重減少、衰弱状態への進行、長期の倦怠感（３日以上）、麻痺の徴候、皮膚の腐食または外傷、猫背の姿勢、および腹部の膨張であった。観察を継続し、再発モデルについては感染後最大１８日間にわたって死亡または安楽死を記録した。
【０２４１】
（Ｂ）急性モデル：−１日目において、雄性シリアゴールデンハムスターを１０ｍｇ／ｋｇの用量のクリンダマイシンで腹腔内処置した。０日目において、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ胞子を滅菌ＰＢＳで希釈して胞子１００個／３００μｌとし、経口強制飼養によって投与した。皮下経路を使用して、抗体を−３日目から０日目まで４日間毎日投与した。抗体の用量は、図の説明に示されている。研究の概要については、以下の表９Ｃも参照のこと。
【０２４２】
【表９Ｃ】
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【０２４３】
【表９Ｄ】
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【０２４４】
実験期間中は、動物を１日２回観察した。一般的な観察には、死亡および疾病の徴候、下痢（「ウェットテイル」）の存在、ならびに全体の外観（活動、取り扱い、接触に対する一般的な反応、被毛の逆立ち）が含まれていた。瀕死状態であると判断した動物を安楽死させた。瀕死状態を決定するのに使用した基準は、長期間（５日間）の体重減少、衰弱状態への進行、長期の倦怠感（３日以上）、麻痺の徴候、皮膚の腐食または外傷、猫背の姿勢、および腹部の膨張であった。観察を継続し、急性モデルについては最大１０日間にわたって死亡または安楽死を記録した。
【０２４５】
結果
ログランク（マンテルコックス）検定を使用して、ハムスターモデルからのデータの統計分析を行った。一対比較のために、ボンフェローニ補正を臨界Ｐ値に適用した。
【０２４６】
ハムスター再発モデルを使用した複数回投与研究であった第１の試験では（図２を参照のこと）、Ｈ１Ｈ３３３０Ｐ＋Ｈ１Ｈ３３４７Ｐとの併用処置または比較用抗体との併用処置は、アイソタイプ対照またはバンコマイシン単独に対して全生存率の増加を示した（７４〜７８％；抗毒素Ａおよび抗毒素Ｂ抗体の組み合わせ対２７〜４３％；対照治療群）。具体的には、１９日目までに、ＰＢＳのみを投与したハムスターの２７％が生存し、アイソタイプ対照を投与した４３％が生存し、抗毒素Ａ＋抗毒素Ｂ比較用抗体の組み合わせを投与した７４％が生存し、Ｈ１Ｈ３３３０Ｐ（抗Ａ抗体）＋Ｈ１Ｈ３３４７Ｐ（抗Ｂ抗体）の組み合わせを投与した７８％が生存した。
【０２４７】
ハムスター再発モデルを使用した単回投与研究であった第２の試験では（図３を参照のこと）、Ｈ１Ｈ３３３０Ｐ＋Ｈ１Ｈ３３４７Ｐまたは比較用抗体のいずれかとの併用処置は、アイソタイプ対照（陰性対照抗体）と比較して生存率を増加させたが、２ｍｇ／ｋｇ用量と５ｍｇ／ｋｇ用量との間には違いがなかった。
【０２４８】
第１の急性ハムスターモデル研究では（図４を参照のこと）、Ｈ１Ｈ３３３０Ｐ＋Ｈ１Ｈ３３４７Ｐの組み合わせとの処置は、陰性対照と比較して、漸増可能な形で、死亡からのハムスターの有意な保護を示した（すべての群対アイソタイプ対照について、ｐ＜０．０００１）。５０ｍｇ／ｋｇ〜１．８５ｍｇ／ｋｇ（の組み合わせとして投与した各抗体）で用量を漸増したところ、高用量は、最低用量の１日目と比較して、７日目までにすべての動物について保護を提供した。
【０２４９】
急性ハムスターモデルを使用したさらなる研究では（図５を参照のこと）、Ｈ１Ｈ３３３０Ｐ＋Ｈ１Ｈ３３４７Ｐまたは比較用抗体の組み合わせのいずれかとの併用処置は、アイソタイプ対照と比較して生存率を有意に増加させた（図５；４０ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ対照対各２０ｍｇ／ｋｇの対照Ｉ／対照ＩＩ、ｐ＜０．０００１；４０ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ対照対各５ｍｇ／ｋｇの対照Ｉ／対照ＩＩ、ｐ＝０．０００３；４０ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ対照対各２０ｍｇ／ｋｇのＨ１Ｈ３３３０Ｐ／Ｈ１Ｈ３３４７Ｐ、ｐ＜０．０００１；４０ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ対照対各５ｍｇ／ｋｇのＨ１Ｈ３３３０Ｐ／Ｈ１Ｈ３３４７Ｐ、ｐ＜０．０００１）。しかしながら、低用量５ｍｇ／ｋｇの各抗体で試験した場合には、Ｈ１Ｈ３３３０Ｐ＋Ｈ１Ｈ３３４７Ｐの組み合わせとの併用処置は、比較用抗体対照よりも良く、死亡からハムスターを保護したのに対して（ｐ＜０．０００１）、高用量２０ｍｇ／ｋｇの各抗体では、Ｈ１Ｈ３３３０Ｐ＋Ｈ１Ｈ３３４７Ｐの組み合わせ対比較用抗体の組み合わせの間には有意差がなかった（ｐ＝０．７３）。この結果は、急性ハムスターモデルにおける低用量の優位性を明らかに実証しており、より低濃度の臨床では、Ｈ１Ｈ３３３０Ｐ＋Ｈ１Ｈ３３４７Ｐ抗体の投与が比較用抗体と比較して有効であり得ることを示唆している。
【０２５０】
実施例１０．いくつかの群のＢＩ超毒性Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株由来の培養上清によって誘導される細胞毒性の遮断に対する抗毒素Ａおよび抗毒素Ｂ抗体の効果：比較用ｍＡｂとの比較
フィダキソマイシンまたはバンコマイシンで処置する場合、臨床超毒性ＢＩ／ＮＡＰ１／０２７株に感染した患者は、非ＢＩ株に感染した患者よりも治癒率が低い（Ｐｅｔｒｅｌｌａ，ＬＡら、（２０１２），Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，５５（３）：３５１−３５７）。さらに、ＢＩ／ＮＡＰ１／０２７株は、原型株と比較して高いＣＤＩ再発率および高い予想死亡率に関連している（Ｌｏｏ，ＶＧら、（２００５），Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，３５３：２３；Ｐｅｔｒｅｌｌａ，ＬＡら、（２０１２），Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，５５（３）：３５１−３５７。これらの超毒性株は、毒素ＡおよびＢの産生増加、バイナリー毒素の存在、ならびにフルオロキノロン耐性の増加を特徴とする。毒素ＡおよびＢの産生増加は、ｔｃｄＡおよびｔｃｄＢ発現の推定上の負の調節因子であるｔｃｄＣにおける機能喪失型突然変異（これは、生活環を通して持続的な毒素産生をもたらす）によって引き起こされる可能性が最も高い。
【０２５１】
モル比１：１のＨ１Ｈ３３３０ＰおよびＨ１Ｈ３３４７Ｐ混合物が、４種の臨床分離Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ＢＩ／ＮＡＰ１／０２７株由来の毒素を中和する能力を細胞ベースの中和アッセイで試験した。Ｃａｓｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨから、臨床分離超毒性株ＶＡ５およびＶＡ１７を入手した。Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｖｅｔｅｒａｎｓ  Ａｆｆａｉｒｓ，Ｅｄｗａｒｄ  Ｈｉｎｅｓ，Ｊｒ．Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｈｉｎｅｓ，ＩＬから、臨床分離超毒性株６３３６および６４４３を入手した。中和アッセイでは、両方のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素に対する感受性により、サル腎臓上皮細胞株であるＶｅｒｏ細胞を用いた。細胞を、様々な量の抗体カクテルおよびいくつかのＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株から単離した一定量の培養上清と共に４８時間インキュベートした。ＷＳＴ−１試薬（これは、還元されると比色変化をもたらす酸化還元指示薬である）の追加によって、細胞毒性を決定した；細胞成長中の代謝活性はＷＳＴ−１を還元し、４５０ｎｍの吸光度の増加をもたらす。
【０２５２】
いくつかの臨床分離ＢＩ株由来の培養上清は、３７００倍希釈（ＶＡ５株の場合）〜８８２００倍希釈（６４４３株の場合）の範囲の細胞毒性を誘導するＥＣ５０値で、Ｖｅｒｏ細胞に対して広範囲の細胞毒性活性を示した。モル比１：１のＨ１Ｈ３３３０ＰおよびＨ１Ｈ３３４７Ｐ混合物は、すべての群の試験ＢＩ株由来の培養上清によって誘導された細胞毒性を、モル比１：１の比較用抗毒素Ａ（対照Ｉ；クローン３Ｄ８の配列については、米国特許第７６２５５５９号明細書を参照のこと）および比較用抗毒素Ｂ（対照ＩＩ；クローン１２４−１５２の配列については、米国特許第７６２５５５９号明細書を参照のこと）混合物と比較して３４倍超高い中和効力で遮断した。これらのデータは、Ｈ１Ｈ３３３０Ｐ／Ｈ１Ｈ３３４７Ｐ抗体ペアが、比較用ｍＡｂカクテル（ＩＣ５０範囲：１２００〜１７００ｐＭ；表１０を参照のこと）と比較して、試験超毒性ＢＩ株についてピコモル範囲（３１〜４５ｐＭ）のＩＣ５０値で、培養物の細胞毒性を中和することができたことを実証している。
【表１０】
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【０２５３】
実施例１１．抗毒素Ａ抗体Ｈ１Ｈ３３３０Ｐのエピトープマッピング
Ｈ１Ｈ３３３０Ｐが結合した毒素ＡのＣ末端受容体結合ドメイン（ＣＢＤ）（配列番号３７５）のエピトープを、質量分析ベースのプロテオミクスを使用して決定した。簡潔に言えば、毒素ＡのＣＢＤを１２時間トリプシン消化し、１０〜１４％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥで試料を泳動し、続いてニトロセルロース膜に転写し、一次抗体としてＨ１Ｈ３３３０Ｐ抗体または対照Ｉ抗体（３Ｄ８抗体の配列については、米国特許第７６２５５５９号明細書を参照のこと）のいずれかを使用したウエスタンブロット分析を行った。２Ｄ電気泳動、続いてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析を使用して、Ｈ１Ｈ３３３０Ｐ抗体に結合したペプチド配列のさらなる分析を行った。手順を以下により詳細に記載する。
【０２５４】
毒素Ａの限定的トリプシン消化
毒素Ａの組換えＣ末端受容体結合ドメイン（ＣＢＤ）（ＰＢＳ中、０．４μｇ／μｌ）をｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｇｒａｄｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｔｒｙｐｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｃａｔ＃  Ｖ５１１Ｃ）と共に１：８０の質量比で追加し、３７℃で０〜１２時間インキュベートした。２容量の１×Ｌａｅｍｍｌｉ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒを追加することによって酵素を不活化し、９５℃で５分間加熱した。試料を分析まで−２０℃で保存した。
【０２５５】
ウエスタンブロット分析
最初に、１０〜１４％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質分解の程度を調べた。ロードした各試料の量は毒素ＡのＣＢＤの初期量１μｇと同等であり、ゲル中の分離したタンパク質をＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ  ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  ｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ＃  ＬＣ６０６５）で可視化した。
【０２５６】
次いで、０時間および１２時間消化した試料を１０〜１４％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離のために選択し、各試料について毒素ＡのＣＢＤの初期量５０ｎｇと同等量をロードした。分離したタンパク質をニトロセルロース膜（ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｏｓｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）に転写し、ＴＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＴｒｉｓ緩衝生理食塩水溶液）中で、濃度１μｇ／ｍｌの一次抗体Ｈ１Ｈ３３３０Ｐまたは対照抗体Ｉを用いて４℃で一晩プローブし、続いて抗ヒトＩｇＧ  ＨＲＰコンジュゲート二次抗体（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｃａｔ＃  ３１４１２；ＴＢＳＴ中、１：１５，０００希釈）でプローブした。Ｈ１Ｈ３３３０Ｐおよび対照１抗体は両方とも、ヒトＩｇＧ１定常ドメインを有していた。膜を化学発光基質（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｃａｔ＃  ＮＥＬ１０３Ｅ００１ＥＡ）と共にインキュベートし、画像をＸ線フィルムに取り込んだ。
【０２５７】
２Ｄゲル電気泳動
どのアミノ酸が、Ｈ１Ｈ３３３０Ｐ抗体を使用して実施したウエスタンブロットに固有のタンパク質バンドに相当するのかを決定するために、毒素ＡのＣＢＤの１２時間トリプシン消化を使用して、二次元（２Ｄ）ゲルを実施した。
【０２５８】
ゲル内トリプシン消化およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによるペプチドマッピング
２Ｄ−ゲル分析により、４個のタンパク質スポットがそのｐＨ（約９のｐＩ値）域で密接にクラスタ化されており、Ｈ１Ｈ３３３０Ｐを使用したウエスタンブロットによって可視化された５０ｋＤａのバンドを構成していたことが明らかになった。１２時間トリプシン消化を使用した２Ｄゲルから、約５０ｋＤａの対応する分子量を有する４個のタンパク質スポットを切り出し、５０％アセトニトリルによって脱染し、６５ｍＭ  ＤＴＴによって還元し、１３５ｍＭヨードアセトアミドによってアルキル化した。アセトニトリルによって脱水した後、２０ｕｌの２．５ｎｇ／μｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｇｒａｄｅ  ｔｒｙｐｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｃａｔ＃  Ｖ５１１１）を追加してゲルバンドを遮蔽し、３７℃で一晩インキュベートすることによってゲル内消化を行った。
【０２５９】
得られたペプチドをＺｉｐｔｉｐ  Ｃ１８（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｃａｔ＃  ＺＴＣ１８Ｓ０９６）によって脱塩し、Ｂｒｕｋｅｒ  ＵｌｔｒａｆｌｅＸｔｒｅｍｅ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＴＯＦ  ＭＳによって分析した。ＦｌｅｘＡｎａｌｙｓｉｓソフトウェアによってスペクトルを処理し、自己分解トリプシン断片のピークで内部較正した。質量精度１０ｐｐｍで毒素ＡのＣＢＤの配列を含有する社内データベースに対して、較正したピークリストを検索した。
【０２６０】
結果
Ｈ１Ｈ３３３０Ｐによるブロッティングでは、トリプシン消化の１２時間後において約５０ｋＤａの主なタンパク質バンドが示されたが、対照１抗体を用いてブロッティングを行った場合には、トリプシン消化の１２時間後において約５０ｋＤａの分子量を有するタンパク質バンドは観察されなかったことが、これらの結果によって示された。
【０２６１】
どのアミノ酸が、Ｈ１Ｈ３３３０Ｐを使用して実施したウエスタンブロットに固有の５０ｋＤａのタンパク質バンドに相当するのかを決定するために、上記のように、１２時間トリプシン消化を使用して、二次元（２Ｄ）ゲルを実施した。前述のように、２Ｄゲル分析により、４個のタンパク質スポットがそのｐＨ（約９のｐＩ値）域で密接にクラスタ化されており、Ｈ１Ｈ３３３０Ｐを使用したウエスタンブロットによって可視化された５０ｋＤａのバンドを構成していたことが明らかになった。これらの４個のタンパク質スポットの質量分析により、毒素ＡのＣＢＤ（配列番号３７５）のアミノ酸残基４６８〜８６３に及ぶ１７個のマッチングペプチドが同定された。毒素Ａのこの断片（残基４６８〜８６３に及ぶアミノ酸）は、４５ｋＤａの予測分子量および２Ｄゲル分析から得られた値によく対応する９．０１の予測等電点を有する。
【０２６２】
本実施例では、抗毒素Ａ抗体Ｈ１Ｈ３３３０Ｐは、対照１（米国特許第７６２５５５９号明細書では３Ｄ８）のものとは異なるエピトープを有し、アミノ酸４６８〜８６３内において毒素ＡのＣＢＤに結合することが例証されている。Ｈ１Ｈ３３３０Ｐ抗体と相互作用したこの領域内において、特定のアミノ酸配列を同定したところ、これらのアミノ酸配列は、配列番号３７５の残基４６８〜４８８、配列番号３７５の残基５１０〜５３０、配列番号３７５の残基６０２〜６１０、配列番号３７５の配列番号７２４〜７９４の残基６４４〜７０３、配列番号３７５の残基７９９〜８１４、および配列番号３７５の残基８５８〜８６３であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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