(57)【要約】      （修正有）【課題】低分子，ペプチド及び核酸等の生物活性分子を被験体に投与するための薬物送達組成物及びその調製方法の提供。【解決手段】複数の特定の配列番号を有する群より選択される界面活性剤ペプチドを含有する自己組織化ナノ構造中に封入された生物活性分子を含む薬物送達組成物及び前記組成物の調製方法。前記生物活性分子は、被験者の胃腸管に、または血液脳関門を横切って送達される。【選択図】図１
2018052935.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己組織化ナノ構造および生物活性分子を含む放出制御型薬物送達組成物であって、前記ナノ構造は複数の界面活性剤ペプチドを含み、前記界面活性剤ペプチドは、下記からなる群より選択される式を有し：
ａ．（Φ）ｍ（＋）ｎ（式（１））、
ｂ．（＋）ｎ（Φ）ｍ（式（２））、
ｃ．（Φ）ｍ（−）ｎ（式（３））、
ｄ．（−）ｎ（Φ）ｍ（式（４））、
ｅ．（−）ｎ（Φ）ｍ（−）ｎ（式（５））、
ｆ．（＋）ｎ（Φ）ｍ（＋）ｎ（式（６））、
ｇ．（Φ）ｍ（−）ｎ（Φ）ｍ（式（７））、
ｈ．（Φ）ｍ（＋）ｎ（Φ）ｍ（式（８））、
ｉ．（＋）ｎ（Φ）ｍ（−）ｎ（式（９））、
ｊ．（−）ｎ（Φ）ｍ（＋）ｎ（式（１０））、
式中：
（Φ）は、独立して、各事象に対し、疎水性側鎖を含む天然もしくは非天然アミノ酸を表し；
（＋）は、独立して、各事象に対し、生理的ｐＨでカチオン性である側鎖を含む天然もしくは非天然アミノ酸を表し；
（−）は、独立して、各事象に対し、生理的ｐＨでアニオン性である側鎖を含む天然もしくは非天然アミノ酸を表し；
前記末端アミノ酸は任意で置換され；
各事象に対するｍは、５以上の整数を表し；ならびに
各事象に対するｎは、１以上の整数を表し；
さらに、前記生物活性剤はナノ構造内に封入される、
薬物送達組成物。
【請求項２】
前記界面活性剤ペプチドは、式（１）または式（３）を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
（Φ）は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびプロリンからなる群より選択され、好ましくは（Φ）はアラニンである、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
（＋）はヒスチジン、リジンまたはアルギニンからなる群より選択される、または（−）はアスパラギン酸またはグルタミン酸からなる群より選択される、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記界面活性剤ペプチドのＮ末端アミノ酸はアセチル基により置換される、または前記界面活性剤ペプチドのＣ末端アミノ酸はアミノ基で置換される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
ｎは１である、またはｍは５、６または７であり、好ましくはｍは６である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項７】
前記界面活性剤ペプチドはａｃ−ＡＡＡＡＡＡＫ−ＣＯＮＨ２（配列番号：１）、ＫＡＡＡＡＡＡ（配列番号：２）、ａｃ−ＡＡＡＡＡＡＤ−ＣＯＯＨ（配列番号：３）およびＤＡＡＡＡＡＡ−ＣＯＯＨ（配列番号：４）からなる群より選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
前記界面活性剤ペプチドはａｃ−ＡＡＡＡＡＡＫ−ＣＯＮＨ２（配列番号：１）およびａｃ−ＡＡＡＡＡＡＤ−ＣＯＯＨ（配列番号：３）からなる群より選択される、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記ナノ構造はナノベシクルである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記生物活性分子は疎水性である、または親水性である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記生物活性分子は核酸である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記界面活性剤ペプチドはアセチル化Ｎ末端を有する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記界面活性剤ペプチドはＣ末端に正電荷を持つアミノ酸を有する、請求項１または請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記界面活性剤ペプチドはアミド化されたＣ末端を有する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
さらにリポソームを含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
生物活性分子を被験体に投与するために用いられる請求項１〜１５のいずれか１項に記載の組成物であって、当該組成物中の前記生物活性分子は放出制御プロファイルを有する、組成物。
【請求項１７】
前記生物活性分子は、前記被験体の胃腸管に、または血液脳関門を横切って送達され、好ましくは胃腸管に送達される、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記界面活性剤ペプチドは負電荷を持つ、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
生物活性分子を前記界面活性剤ペプチドと、水溶液中、自己組織化に好適な条件下で接触させることを含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の組成物を調製する方法。
【請求項２０】
医学に用いられる、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１２年５月３１に出願された米国仮特許出願第６１／６５３，７８２号の恩典を主張する。上記出願の全教示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
分子自己組織化は、ナノ構造の作製および先端材料の開発につながっている［ｌ］。自己組織化特性を有する脂質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、および多糖類を含む、小さな、生物学的に触発された生体分子の分子設計および合成は、生体材料の分野を著しく進歩させた［２］。自己組織化特性を有する短ペプチドが、１９９３年に発見され、それ以来様々なアミノ酸配列が合成されている。配列によって、自己組織化ペプチドは様々な特性を有し、生物医学において、再生医学および薬物送達系のための許容的生物学的足場としての適用に対し試験されてきた［３，４，５］。両親媒性ペプチドの自己組織化は、脂質および他の化学界面活性剤に類似する安定なナノチューブ、ベシクルまたはミセルの形成につながる［６］。
【０００３】
得られたペプチドアセンブリ超微細構造、例えば、ナノチューブ、ナノドーナツ、ナノバルブ、ナノベシクル、またはミセルの型およびサイズは、ペプチド濃度、ペプチドの臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）、アミノ酸配列、幾何学的制約（アミノ酸の側鎖の長さにより規定される）、自己組織化を誘導するために使用される電解質の型および電荷、媒質のイオン強度およびｐＨに依存する［６，７，８，９］。これらの因子はペプチド整列、充填密度、モノマ間の分子間結合の強度に影響を与え、よって、異なる形態および特性の階層的超分子構造が得られる［６，７］。両親媒性特性を有する自己組織化ペプチドの開発は、バイオテクノロジーにおいて市販の洗浄剤よりも効果的に膜タンパク質を安定化するための［１０，１１］、ならびにナノテクノロジーにおいて、エネルギー変換装置の構築のための［１２］適用に対し新たな道を切り開いた。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、自己組織化ペプチドの追加の適用に関する。発明は、自己組織化ナノ構造および生物活性分子を含む薬物送達組成物に関し、ここで、ナノ構造は界面活性剤ペプチドを含み、生物活性分子はナノ構造に封入される。発明はまた、本明細書で記載される薬物送達組成物を投与することを含む、生物活性分子を被験体に投与する方法ならびに薬物送達組成物を調製するための方法を包含する。
【０００５】
発明は、自己組織化ナノ構造および生物活性分子を含む薬物送達組成物を包含し、ナノ構造は複数の界面活性剤ペプチドを含み、界面活性剤ペプチドは、下記からなる群より選択される式を有し：
ａ．（Φ）ｍ（＋）ｎ（式（１））、
ｂ．（＋）ｎ（Φ）ｍ（式（２））、
ｃ．（Φ）ｍ（−）ｎ（式（３））、
ｄ．（−）ｎ（Φ）ｍ（式（４））、
ｅ．（−）ｎ（Φ）ｍ（−）ｎ（式（５））、
ｆ．（＋）ｎ（Φ）ｍ（＋）ｎ（式（６））、
ｇ．（Φ）ｍ（−）ｎ（Φ）ｍ（式（７））、
ｈ．（Φ）ｍ（＋）ｎ（Φ）ｍ（式（８））、
ｉ．（＋）ｎ（Φ）ｍ（−）ｎ（式（９））および
ｊ．（−）ｎ（Φ）ｍ（＋）ｎ（式（１０））、
式中：
（Φ）は、独立して、各事象に対し、疎水性側鎖を含む天然もしくは非天然アミノ酸を表し；好ましくはアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシンまたはプロリンであり；
（＋）は、独立して、各事象に対し、生理的ｐＨでカチオン性である側鎖を含む天然もしくは非天然アミノ酸を表し；好ましくはヒスチジン、リジンまたはアルギニンであり；
（−）は、独立して、各事象に対し、生理的ｐＨでアニオン性である側鎖を含む天然もしくは非天然アミノ酸を表し；好ましくはアスパラギン酸またはグルタミン酸であり；
末端アミノ酸は任意で置換され；
各事象に対するｍは、５以上の整数を表し；ならびに
各事象に対するｎは、１以上の整数を表し；
さらに、生物活性剤はナノ構造内に封入される。
【０００６】
発明はまた、前記被験体に発明の組成物を投与することを含む、生物活性分子を被験体に投与する方法を包含する。ある一定の実施形態では、生物活性分子は放出制御プロファイルを有する。
【０００７】
発明はまた、薬物送達組成物を調製するための方法を含む。
【０００８】
発明の前記および他の目的、特徴および利点は、添付の図面（同様の参照文字は、異なる図面を通して同じ部分を示す）において示される、発明の好ましい実施形態の下記のより詳細な説明から明らかになるであろう。図面は必ずしもない縮尺通りではなく、代わりに、発明の原理を説明するのに重点が置かれている。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】両親媒性、界面活性剤様、自己組織化ペプチドの分子モデリングを示す。ペプチド長は生物リン脂質に類似する。ペプチドの疎水性ドメインは、６個のアラニンから構成される。図解はＶＭＤにより作成した。
【図２】両親媒性自己組織化ペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムおよびＭＳスペクトルを示す。クロマトグラフィーピークのＭＳ／ＭＳスペクトル分析は、各ペプチド試料の分離された断片は、約９２％のペプチド純度に対応することを示す。
【図３】マイカ上での両親媒性、自己組織化ペプチドナノベシクルのＡＦＭトポグラフィーを示す。（挿入図）ペプチドナノベシクルのサイズ分布ヒストグラムは、ＡＦＭ画像解析から作成した。
【図４】ＣＯＮＴＩＮアルゴリズムにより得られた、ＰＢＳ  ｐＨ７．４中、２５℃での両親媒性ペプチドナノベシクルの実験時間相関関数の逆ラプラス変換分析を示す。白丸：実験データ；実線：逆ラプラス変換により得られた最良適合曲線；黒四角：流体力学半径の体積分布。流体力学直径の平均の大きさを各分布に対して示す。
【図５】電解質濃度に伴う自己組織化ペプチドベシクルのζ−電位の変動を示す。値は、定常レベルで、ｐＨ７．４にて実施された３回の測定の平均である。
【図６】ＰＢＳ  ｐＨ７．４中、２０℃でのインキュベーションで、ペプチドナノベシクルを通る、封入されたカルボキシフルオセイン、ＣＦの放出動力学を示す。
【図７】（上パネル）ＰＢＳ  ｐＨ７．４中、２０℃での両親媒性ペプチドナノベシクルとの相互作用でのナイルレッド発光スペクトルを示す。（下パネル）ＰＢＳ  ｐＨ７．４中、２０℃でのインキュベーションでの、ペプチドナノベシクルを通る、封入されたナイルレッドの放出動力学を示す。
【図８】３、２４、および４８ｈ培養後の、Ｃａｃｏ−２細胞生存率に対する自己組織化両親媒性ペプチドの効果を示す。定量分析は、標準偏差を示すエラーバーと共に平均（ｎ＝５）を表す。第２日に測定した４つの試料間の生存細胞のパーセンテージは著しく異なる（Ｐ＜０．０１）。
【図９】（Ａ）０．２ｍｇ／ｍＬおよび（Ｂ）１．０ｍｇ／ｍＬのペプチドでの、脂質様ペプチドの、ＦＩＴＣ−デキストランのＣａｃｏ−２細胞単層の頂端から側底側への透過に対する効果を示す。（Ｃ）０．２ｍｇlｍＬおよび（Ｄ）１．０ｍｇ／ｍＬの脂質様ペプチドの存在下での、Ｃａｃｏ−２細胞腸上皮の経上皮抵抗を示す。データは平均±Ｓ．Ｄとして示す（ｎ＝４、＊ｐ＜０．０５、ＦＩＴＣ−デキストラン溶液と比較）。矢印はペプチドが成長培地から除去された時間点を示し、単層回収プロセスを示す。
【図１０】自己組織化ペプチド（Ａ）ＣＭＣ（０．０２ｍｇ／ｍＬ）未満および（Ｂ）ＣＭＣ（０．２ｍｇ／ｍＬ）超の存在下での、１８０分（ｎ＝３）後の、トランスウェルの頂端側におけるローダミン−１２３の総輸送（分泌輸送）を示す。
【図１１】２４ｈｒのＣａｃｏ−２細胞培養処理を示す。拡大率４００ｘ。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
発明の好ましい実施形態の説明は以下の通りである。
【００１１】
本明細書では、「１つの（ａまたはａｎ）」は、別に特定されない限り、１つ以上を意味すると解釈される。
【００１２】
本発明は、特定の界面活性剤ペプチドから構成される自己組織化ナノベシクルは、生物活性分子、例えば親水性および疎水性生物活性分子を封入し、放出するために使用することができるという発見に基づく。
【００１３】
両親媒性界面活性剤様自己組織化ペプチドは機能材料であり、これらは、条件によって、様々なナノ構造、例えばナノベシクル、ナノチューブ、およびナノバルブを形成する。アスパラギン酸またはリジンから構成される親水性頭部および６個のアラニン残基の疎水性ドメインを有する両親媒性ペプチドは生物脂質のものに類似する長さを有するように設計された。あるクラスの界面活性剤様、自己組織化ペプチド、すなわち、ａｃ−Ａ６Ｋ−ＣＯＮＨ２（配列番号：１）、ＫＡ６−ＣＯＮＨ２（配列番号：２）、およびａｃ−Ａ６Ｄ−ＣＯＯＨ（配列番号：３）は、生体膜の脂質分子を模倣し、親水性頭部基、疎水性尾部、および２−３ｎｍの長さを有するように設計された。別のペプチド、ＤＡ６−ＣＯＯＨ（配列番号：４）は、６個のアラニンの疎水性ドメインにより分離された荷電頭部および尾部を有するように設計された。これらのペプチドは、電解質溶液に溶解させると、自己組織化し、ペプチドの疎水性ドメインと極性環境の間の相互作用を最小に抑える。生理的条件では、ａｃ−Ａ６Ｋ−ＣＯＮＨ２（配列番号：１）、ＫＡ６−ＣＯＮＨ２（配列番号：２）、ａｃ−Ａ６Ｄ−ＣＯＯＨ（配列番号：３）およびＤＡ６−ＣＯＯＨ（配列番号：４）両親媒性ペプチドは自己組織化し、ナノベシクルを形成する。負電荷を持つＡｃ−Ａ６Ｄ−ＣＯＯＨ（配列番号：１）およびＤＡ６−ＣＯＯＨ（配列番号：４）ペプチドの自己会合の場合、ＡＦＭ顕微鏡検査により、ネックレス様ペプチドベシクル超アセンブリが明らかになった。ベシクルの構造およびサイズは、アミノ酸配列、頭部型、および配列上の電荷分布に依存する。下記でより詳細に記載される放出研究は、ペプチドナノベシクル製剤が、薬物送達適用のための、薬学的に活性な親水性および疎水性化合物の封入および放出のために使用することができることを示す。下記で記載されるように、ペプチドナノベシクル系は生体適合性であり、上皮タイトジャンクションを制御する細胞膜Ｐ−糖タンパク質系との相互作用を含むメカニズムにより、薬物送達を増強する。
【００１４】
短い両親媒性自己組織化ペプチドはペプチド鎖上のアミノ酸の数、型および順序の改変、ならびに細胞透過を促進する活性ペプチド配列および蛍光染料またはビオチンなどの反応性化学基の組み込みを可能にする分子設計を受けやすい。生成および広範囲な改変の容易さにより、調節可能な特性を有するテーラーメイドの配列の合成が可能になる。これらの両親媒性ペプチドモノマが分子自己組織化を受ける場合、形成された超構造成分（例えば、ナノチューブまたはベシクル）は、さらに改変および調整することができ、ペプチドベシクルが治療化合物を封入し、負荷物を徐々に放出する薬物送達適用において機能性が付与される。
【００１５】
本明細書では、「アミノ酸」という用語は、天然または非天然起源のアミノ酸を包含する。アミノ酸はそれらのよく知られた１文字指定により表される：アラニンに対してＡ、システインに対してＣ、アスパラギン酸に対してＤ、グルタミン酸に対してＥ、フェニルアラニンに対してＦ、グリシンに対してＧ、ヒスチジンに対してＨ、イソロイシンに対してＩ、リジンに対してＫ、ロイシンに対してＬ、メチオニンに対してＭ、アスパラギンに対してＮ、プロリンに対してＰ、グルタミンに対してＱ、アルギニンに対してＲ、セリンに対してＳ、スレオニンに対してＴ、バリンに対してＶ、トリプトファンに対してＷおよびチロシンに対してＹ。
【００１６】
「生理的ｐＨ」という用語は約７のｐＨである。いくつかの態様では、生理的ｐＨは約６．６〜約７．８のｐＨである。さらに他の例では、生理的ｐＨは約６．８〜約７．６のｐＨである。さらに他の例では、生理的ｐＨは、約７．０〜約７．４のｐＨである。
【００１７】
「自己組織化」という用語は、環境中の条件に応じて、例えば、水性媒質に添加した場合および／または生理的ｐＨで水性媒質に添加した場合に、原子、分子またはペプチドが規則形状の構造または凝集物を形成するプロセスである。
【００１８】
「臨界凝集濃度」または「臨界ミセル濃度」という用語は、これを超えると界面活性剤ペプチドが規則形状の構造、例えばミセル、ナノチューブまたはナノベシクルに凝集し、または形成する濃度である。
【００１９】
界面活性剤ペプチドは、親水性頭部基および親油性尾部基を有する短ペプチドである。界面活性剤ペプチドは、例えば、米国特許第７，１７９，７８４号、米国特許第７，６７１，２５８号、米国特許出願公開２００３／０１７６３３５Ａ１号および米国特許出願公開第２００６／０２１１６１５Ａ１号（それらの教示は参照により本明細書に組み込まれる）において記載されている。これらの特許公報で記載されるクラスのペプチドは自然に自己組織化し、安定なナノ構造（ｎａｎｏｓｔｕｃｔｕｒｅｓ）を形成する能力を有するように設計され、それが示された。これらの短ペプチド（７〜８個のアミノ酸）は、荷電アミノ酸から構成される規定された親水性頭部基および疎水性アミノ酸、例えばアラニン、バリン、イソロイシンまたはロイシンから作られた親油性尾部から構成される界面活性剤分子において観察されるものに類似する構造を有する。その結果、水溶液中に分散されると、疎水性尾部を水と接触しないように単離するために、両親媒性ペプチドは自己組織化する傾向がある。この自己組織化のための一般的な特徴は、極性界面の形成であり、これは炭化水素および水領域を分離する。いくつかの実施形態では、界面活性剤ペプチドは、１０個以下のアミノ酸の配列を有する。親水性頭部基は極性および／または荷電（生理的ｐＨで正または負電荷のいずれかを持つ）アミノ酸から構成される。疎水性尾部基は、疎水性アミノ酸、例えば非極性および／または無電荷アミノ酸から構成される。１つの実施形態では、親水性アミノ酸は、生理的ｐＨで正電荷を持つ。別の実施形態では、親水性アミノ酸は、生理的ｐＨで負電荷を持つ。水、水溶液、またはイオン性溶液に溶解されると、ペプチド界面活性剤は自己組織化を受け、ナノ構造、例えばミセル、ナノベシクルまたはナノチューブを形成する。いくつかの実施形態では、発明の組成物のペプチドはナノベシクルを形成する。
【００２０】
ある一定の態様では、本発明により使用される界面活性剤ペプチドは下記からなる群より選択される式を有するペプチドである：
ａ．（Φ）ｍ（＋）ｎ（式（１））、
ｂ．（＋）ｎ（Φ）ｍ（式（２））、
ｃ．（Φ）ｍ（−）ｎ（式（３））、
ｄ．（−）ｎ（Φ）ｍ（式（４））、
ｅ．（−）ｎ（Φ）ｍ（−）ｎ（式（５））、
ｆ．（＋）ｎ（Φ）ｍ（＋）ｎ（式（６））、
ｇ．（Φ）ｍ（−）ｎ（Φ）ｍ（式（７））、
ｈ．（Φ）ｍ（＋）ｎ（Φ）ｍ（式（８））、
ｉ．（＋）ｎ（Φ）ｍ（−）ｎ（式（９））、
ｊ．（−）ｎ（Φ）ｍ（＋）ｎ（式（１０））、
式中：
ペプチドのナノ構造への自己組織化に好適で、ナノ構造を形成させる条件下において
（Φ）は、独立して、各事象に対し、疎水性側鎖を含む天然もしくは非天然アミノ酸を表し；好ましくはアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシンまたはプロリンであり；
（＋）は、独立して、各事象に対し、生理的ｐＨでカチオン性である側鎖を含む天然もしくは非天然アミノ酸を表し；好ましくはヒスチジン、リジンまたはアルギニンであり；
（−）は、独立して、各事象に対し、生理的ｐＨでアニオン性である側鎖を含む天然もしくは非天然アミノ酸を表し；好ましくはアスパラギン酸またはグルタミン酸であり；
末端アミノ酸は任意で置換され；
各事象に対するｍは、５以上の整数を表し；ならびに
各事象に対するｎは、１以上の整数を表す。
式（１）〜（１０）の各々を、左から右に読むと、Ｎ末端からＣ末端までのアミノ酸配列に対応する。
【００２１】
さらなる実施形態では、界面活性剤ペプチドのＮ末端は、ブロックされ、例えば、アシル化またはアセチル化される。追加の実施形態では、界面活性剤ペプチドのＣ末端はブロックされ、例えば、エステル化またはアミド化される。１つの態様では、式１、３、４、５、７、８、または１０を有するペプチドは、Ｎ末端アミノ酸で、アシル（例えばアセチルまたはブチルオキシカルボニル基）または他のブロッキング基により置換することができ、末端電荷が除去される。別の態様では、式１、２、４、６、７、８、または１０を有するペプチドは、Ｃ末端アミノ酸で、アミノまたはアルコール基により置換することができ、アミドまたはエステルが形成され、あるいは他のブロッキング基で置換することができ、末端電荷が除去される。１つまたは両方の末端および任意の側鎖残基は、任意でブロックする、またはさらに置換することができ、電荷を改変する（除去または付加する）、および／または界面活性剤の疎水性および／または親水性を増加または減少させることができる。界面活性剤における電荷、疎水性または自己組織化する能力を制御するために使用することができるブロッキング基としては、それぞれ、カルボン酸のエステルおよびアミド、アルコールのシリルエーテル、ならびにアルデヒドおよびケトンのアセタールおよびケタールが挙げられる。保護基化学の分野は概説されており（Ｇｒｅｅｎｅ，  Ｔ．  Ｗ．；  Ｗｕｔｓ，  Ｐ．Ｇ．Ｍ．  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ２ｎｄ  ｅｄ．；  Ｗｉｌｅｙ：  Ｎ．Ｙ．，  １９９１）、これは参照により組み込まれる。
【００２２】
ある一定の実施形態では、界面活性剤ペプチドは、式（１）または式（３）を有する。追加の態様では、界面活性剤ペプチドは式（１）または（３）を有し、ここで、（Φ）は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびプロリンからなる群より選択され；ある一定の実施形態では、（Φ）はアラニンである。さらに追加の実施形態では、ペプチドは式（１）を有し、ここで、（＋）は、ヒスチジン、リジンまたはアルギニンからなる群より選択され；さらに追加の実施形態では、（＋）はリジンである。さらに別の実施形態では、ペプチドは式（３）を有し、ここで、（−）はアスパラギン酸またはグルタミン酸からなる群より選択され；さらに追加の実施形態では、（−）はアスパラギン酸である。いくつかの態様では、界面活性剤ペプチドのＮ末端アミノ酸のカルボン酸は、アセチル基で置換される。ある一定の追加の実施形態では、界面活性剤ペプチドのＣ末端アミノ酸のアミノ基は、アミノ基で置換される。さらに追加の実施形態では、ペプチドは式（１）または（３）を有し、ここで、ｎは１であり、および／またはｍは５、６または７である。さらに追加の態様では、ペプチドは式（１）または（３）を有し、ここで、ｎは１であり、およびｍは６である。さらに追加の態様では、ペプチドは式（１）または（３）を有し、ここで、ｎは１であり、およびｍは６であり、および（Φ）はアラニンである。
【００２３】
いくつかの実施形態では、界面活性剤ペプチドは下記からなる群より選択される：ａｃ−ＡＡＡＡＡＡＫ−ＣＯＮＨ２（配列番号：１）、ＫＡＡＡＡＡＡ−ＣＯＮＨ２（配列番号：２）、ａｃ−ＡＡＡＡＡＡＤ−ＣＯＯＨ（配列番号：３）およびＤＡＡＡＡＡＡ−ＣＯＯＨ（配列番号：４）。さらに追加の実施形態では、界面活性剤ペプチドはａｃ−ＡＡＡＡＡＡＫ−ＣＯＮＨ２（配列番号：１）またはａｃ−ＡＡＡＡＡＡＤ−ＣＯＯＨ（配列番号：３）である。ａｃ−Ａ６Ｋ−ＣＯＮＨ２（配列番号：１）、ＫＡ６−ＣＯＮＨ２（配列番号：２）およびａｃ−Ａ６Ｄ−ＣＯＯＨ（配列番号：３）ペプチドは、６個のアラニン残基の疎水性尾部および荷電側鎖を有するアミノ酸である親水性頭部を有する。頭部および尾部の両方に極性基を有する自己組織化両親媒性ペプチドはＤＡ６−ＣＯＯＨ（配列番号：４）である。他の例示的な界面活性剤ペプチドは、例えば、米国特許第７，１７９，７８４号および米国特許出願公開第２００９０６９５４７号（その各々の内容はこれによって参照により組み込まれる）において記載されている。
【００２４】
本明細書で記載される界面活性ペプチドは、水溶液中で隔離し、自己組織化し、脂質に基づく系に類似するようにナノ構造を形成する。例えば、下記で示されるように、界面活性剤ペプチドを１５０ｍＭの電解質を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液に添加すると、ペプチドモノマの自己組織化のために、濁った懸濁液が形成する。ペプチドモノマは自己組織化し、ナノ構造、例えば、ナノベシクルとなる。ナノベシクルは、自己組織化し、ベシクルを形成するペプチドの疎水性尾部から構成される二重層を含む。生物活性分子は封入され、あるいは言い換えれば、ナノ構造内に捕捉または保持される。生物活性分子は、構造内にいくらかの期間の間保持される限り、ナノ構造内に封入される。下記でより詳細に記載されるように、生物活性分子は被験体に投与した後、ナノ構造から放出させることができる。放出動力学は多くの因子に依存し、それらは以下でより詳細に記載される。
【００２５】
ある一定の実施形態では、自己組織化ナノ構造はナノベシクルである。下記で記載されるように、ナノベシクルの直径は、例えば、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）および／または動的光散乱（ＤＬＳ）を使用して決定することができる。いくつかの例では、ナノベシクルは、約３０〜約８００ｎｍ、約６０ｎｍ〜約５００ｎｍ、または約８０ｎｍ〜約３００ｎｍの平均直径を有する。さらに他の例では、ナノベシクルは、動的光散乱（ＤＬＳ）により測定すると、約８０ｎｍ〜約３００ｎｍの平均直径を有する。ある一定の他の例では、ナノベシクルは、ＤＬＳにより測定すると、約９０ｎｍ〜約２００ｎｍの平均直径を有する。
【００２６】
さらに追加の態様では、組成物はナノ構造を含み、ここで、ナノ構造は複数の界面活性剤ペプチドを含み、ここで、ペプチドモノマは、ａｃ−ＡＡＡＡＡＡＫ−ＣＯＮＨ２（配列番号：１）、ＫＡＡＡＡＡＡ（ＫＡ６−ＣＯＮＨ２）、ａｃ−ＡＡＡＡＡＡＤ−ＣＯＯＨ（配列番号：３）およびＤＡＡＡＡＡＡ−ＣＯＯＨ（配列番号：４）からなる群より選択され、ナノ構造はナノベシクルである。表２は、ＡＦＭまたはＤＬＳを使用して測定した、配列番号：１〜４を有するペプチドから構成されるナノベシクルに対するベシクル直径を示す。ナノベシクルは、例えば、下記表２で記載される範囲内の平均直径を有することができる。ある一定の実施形態では、ペプチドはａｃ−ＡＡＡＡＡＡＫ−ＣＯＮＨ２（配列番号：１）のアミノ酸配列を有し、ナノベシクルは、約１００ｎｍ〜１３５ｎｍの平均直径を有し；いくつかの実施形態では、平均直径はＤＬＳにより測定される。さらに追加の実施形態では、ペプチドはアミノ酸配列ａｃ−ＡＡＡＡＡＡＫ−ＣＯＯＨ（配列番号：３）を有し、ナノベシクルは、約８０ｎｍ〜約１２０ｎｍの平均直径を有し；いくつかの実施形態では、平均直径は、ＤＬＳにより測定される。
【００２７】
さらに追加の実施形態では、生物活性分子は疎水性である。さらなる実施形態では、生物活性分子は親水性である。
【００２８】
本発明の組成物はさらに、追加の分子、例えば、限定はされないが、リポソームを含むことができる。ペプチドはまた、１つ以上の他の分子、例えば、限定はされないが、糖および／または生物活性モチーフ、そのような細胞シグナル伝達および／または細胞透過性アミノ酸を組み込むように改変させることができる。
【００２９】
上記のように、発明はまた、生物活性分子を被験体に投与する方法であって、前記被験体に発明の組成物を投与することを含む方法を包含する。いくつかの実施形態では、生物活性分子は、前記被験体の胃腸管に、または血液脳関門を横切って送達される。ある一定の態様では、生物活性分子は胃腸管に送達され、界面活性剤ペプチドは負電荷を持つ。いくつかの実施形態では、生物活性分子は、上皮単層を横切って送達される。さらに追加の実施形態では、生物活性分子は、薬物送達組成物および／またはナノ構造のＰ−糖タンパク質との相互作用により、上皮単層を横切って送達される。
【００３０】
本明細書で記載されるナノ構造は、生物活性剤を被験体に投与するために使用することができる。「被験体」という用語は動物およびヒトを含む。いくつかの実施形態では、ナノ構造は生物活性剤をヒト被験体に投与するために使用される。
【００３１】
「放出制御プロファイル」という用語は、本明細書では、生物活性分子の本明細書で記載される組成物からの放出の特性を示し、得られた製剤の特定の適用により設計されるであろう。放出制御は遅延、持続または延長放出、などを包含する。本明細書で記載されるナノ構造の使用により、被験体に投与した後、生物活性分子の放出制御が可能になる。所望の放出プロファイルの選択は、当業者に知られている留意事項、例えば、治療される疾患または適応症、治療レジメン、治療される患者、投与経路および／または投与部位、などに依存する。下記でより詳細に記載されるように、生物活性分子の放出動力学は、例えば、ナノ構造（例えば、ナノベシクル）のサイズ、それらの負荷容量を変動させることにより、および／または自己組織化し、ナノ構造を形成する界面活性剤ペプチドモノマの電荷を変化させることにより制御することができる。本明細書で記載される放出制御製剤は、注射可能な調製物、インプラント、経口調製物（例えば、粉末、顆粒、カプセル、錠剤、シロップ、エマルジョン、懸濁液）、および／または局所製剤とすることができる。
【００３２】
例示的な生物活性分子としては、例えば、小分子、ペプチド、および核酸が挙げられる。「ペプチド」という用語は、タンパク質（例えば、サイトカイン、ホルモンおよび凝固因子を含む）および抗体を包含することが理解されるであろう。本発明により投与することができる核酸としては、下記が挙げられるが、それらに限定されない：組換え核酸；ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、およびＲＮＡ。
【００３３】
本発明の製剤としては、経口、経鼻、局所（頬側および舌下を含む）、直腸、腟内および／または非経口投与のために好適なものが挙げられる。製剤は、便宜上、単位剤形で提供することができ、薬学の技術分野でよく知られた任意の方法により調製することができる。活性成分または生物活性分子が単一剤形を生成する量は、治療される宿主、特定の投与方法によって変動するであろう。
【００３４】
これらの製剤または組成物を調製する方法は、生物活性分子を本明細書で記載される界面活性ペプチドと水溶液中、自己組織化に好適な条件下で会合させる工程を含むことができ、任意で、１つ以上の付属の材料成分を含むことができる。自己組織化を可能にする条件は文献に記載されており、下記実施例で詳細に記載されている。そのような条件は、例えば、米国特許第７，１７９，７８４号、米国特許第７，６７１，２５８号、米国特許出願公開２００３／０１７６３３５Ａ１号および米国特許出願公開第２００６／０２１１６１５Ａ１号（それらの教示は参照により本明細書に組み込まれる）において記載されている。そのような条件は、例えば、自己組織化に好適なｐＨ（例えば、生理的ｐＨまたはその付近）および／または自己組織化ペプチドの好適な濃度（例えば、ＣＭＣ以上）を含む。
【００３５】
発明を下記実施例により説明するが、これらは、決して、制限することを意味しない。
【００３６】
例証
材料および方法
界面活性剤様、自己組織化ペプチド．両親媒性ペプチド、アセチル−ＡＡＡＡＡＡＫ−ＣＯＮＨ２（ａｃ−Ａ６Ｋ−ＣＯＮＨ２；配列番号：１）、ＫＡＡＡＡＡＡ−ＣＯＮＨ２（ＫＡ６−ＣＯＮＨ２；配列番号：２）、アセチル−ＡＡＡＡＡＡＤ−ＣＯＯＨ（ａｃ−Ａ６Ｄ−ＣＯＯＨ；配列番号：３）、およびＤＡＡＡＡＡＡ−ＣＯＯＨ（ＤＡ６−ＣＯＯＨ；配列番号：４）を購入した（ＳｙｎＢｉｏＳｃｉ、Ｌｉｖｅｒｍｏｒｅ、ＣＡ）。ペプチドの純度は、エレクトロスプレーイオン化−四重極型−飛行時間型（ＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ）質量分析により決定すると、約９２％であった。ペプチドは粉末で受け取り、リン酸緩衝液生理食塩水、（ＰＢＳ、１００ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７．４）に分散させ、１０ｍｉｎ間、浴中超音波処理器を用いて超音波処理し、可溶化および分散を促進させた。ペプチド溶液をその後、１５ｍｉｎ間平衡化させ、モノマを自己会合させ、アミコンウルトラ３ｋＤａＭＷＣＯに通して濾過して非会合ペプチドモノマおよび他の合成残留分子を除去し、再懸濁させ、０．４μｍフィルタに通して濾過し大きなペプチドベシクル凝集物を除去し、室温でさらに研究の間貯蔵した。
【００３７】
質量分析
溶液中のペプチドを、エレクトロスプレーイオン化−四重極型−飛行時間型（ＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ）質量分析により特徴付けした。ペプチド断片の分離を、Ｚｏｒｂａｘ  ３００  Ｅｘｔｅｎｄ−Ｃ１８カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＣＡ）、およびＡｇｉｌｅｎｔ  ６５１０  Ｑ−ＴＯＦ（噴霧圧力：３．８ｋＶ、ガス温度：２７５℃、ネブライザーガス：１０ｐｓｉ、および乾燥ガス：４Ｌ／ｍｉｎ）に連結させたＡｇｉｌｅｎｔ１２００シリーズクロマトグラフィーシステムを使用して実施した。走査モードにおける陽イオンデータ依存取得範囲は１００−１７９９ｍ／ｚであり、ＭＳ／ＭＳモードでは、１００−２０００ｍ／ｚであった。ＭＳ／ＭＳ取得の電荷優先度は＋２（電荷）、＋３、＞＋３、未知、＋１であった。データを収集し、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ，  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＣＡ）を使用して解析した。ペプチド同定、割当、および可能なアミノ酸化学修飾を、ＭＳ／ＭＳスペクトルの検査により、ＰｒｏｔｅｉｎＰｒｏｓｐｅｃｔｏｒソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ．ｕｃｓｆ．ｅｄｕ／）を使用することにより実施した。
【００３８】
両親媒性ペプチドの臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）．両親媒性ペプチドのＣＭＣを動的光散乱（ＤＬＳ）実験により決定した（ＰＤＤＬＳ／バッチ装置，  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒｓ，  Ｆｒａｎｋｌｉｎ，  ＭＡ）。異なるペプチド濃度の溶液をＰＢＳ中で調製し、０．４μｍ細孔サイズフィルタに通して濾過し、その後、測定した。散乱光を９０°で検出し、アバランシェフォトダイオードに到達した光子の数を記録した。緩衝液の溶媒粘度および屈折率を、それぞれ、２０℃で、０．８９４ｃＰおよび１．３３として得た。データを３つ組で取得し、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｄｅｃｏｎｖｏｌｖｅプログラムで処理した。
【００３９】
粒子サイズ決定．ＤＬＳにより粒子サイズを測定する前に、ＰＢＳ中のペプチドベシクル製剤を０．４μｍフィルタに通して濾過し、ベシクル凝集物を除去した。正規化強度−時間相関関数ｇ（２）（ｑ，ｔ）＝（Ｉ（ｑ，ｔ）Ｉ（ｑ，０））／（Ｉ（ｑ，０））２を、広い時間スケール（１０−７ｓ〜１０４ｓ）にわたり、２８０のチャネルを分離させたフルマルチプルタウデジタル相関器（ｆｕｌｌ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｔａｕ  ｄｉｇｉｔａｌ  ｃｏｒｒｅｌａｔｏｒ）（ＡＬＶ−５０００／ＦＡＳＴ）を使用して、準対数的に測定した。散乱波数ベクトルｑ＝４πｎ-ｓｉｎ（θ／２）／λｏは、散乱角θ（ここでは、我々はθ＝９０°を使用した）、レーザー波長λｏ、および媒質の屈折率ｎに依存する。我々は、５ｍＷ未満の電力で動作するダイオード励起固体レーザーからの６７１ｎｍラインを使用した。散乱光を単一モード光ファイバ（コヒーレンス因子約０．９５）により収集し、アバランシェ光検出器に、その後、分析のためにデジタル相関器に伝達させた。累積時間は、分散物からの強い散乱強度のために、ほぼ数秒であった。結果の再現性を確認するために、いくつかの時間相関関数を各ペプチドベシクル系に対して記録した。希薄懸濁液では、正規化電場時間自己相関関数ｇ（１）（ｑ，ｔ）＝（Ｅ（ｑ，ｔ）Ｅ＊（ｑ，０））／（Ｅ（ｑ，０））２を、実験的に記録した強度自己相関関数ｇ（２）（ｑ，ｔ）２に、Ｓｉｅｇｅｒｔ関係［１３］ｇ（２）（ｑ，ｔ）＝Ｂ［１＋ｆ＊｜ｇ（１）（ｑ，ｔ）｜２により関連させ、ここで、Ｂは、ｇ（２）（ｑ、ｔ）の長い遅延時間挙動を記し、ｆ＊は、希薄ポリスチレン／トルエン溶液の測定から実験的に得られた機器因子を表す。我々の場合、光ファイバ収集により、ｆ＊約０．９５が得られる。電場時間相関関数ｇ（１）（ｔ）（簡単にするために、我々はｑ−依存を断念する）を、独立した指数関数寄与の加重和として分析した、すなわち、ｇ（１）（ｔ）＝∫Ｌ（τ）ｅｘｐ（−ｔ／τ）ｄτ＝∫Ｌ（ｌｎτ）ｅｘｐ（−ｔ／τ）ｄｌｎτ。緩和時間の分布Ｌ（ｌｎｒ）＝τＬ（τ）がｇ＜'＞（ｑ，ｔ）の逆ラプラス変換により、ＣＯＮＴＩＮアルゴリズムを使用して得られた［１４］。
【００４０】
懸濁させた粒子の見かけの流体力学半径を、Ｓｔｏｋｅｓ−Ｅｉｎｓｔｅｉｎの関係Ｒｈ＝ｋＢＴ／６πηＤを用いて決定し、ここで、ｋＢはＢｏｌｔｚｍａｎｎ定数であり、ηは溶媒の粘度であり、およびＤは粒子の拡散係数である。後者はＤ＝１／ｔｑ２により決定され、ここで、τはｇ（１）（ｑ，ｔ）の緩和時間である。
【００４１】
微小電気泳動移動度測定．ペプチドナノベシクル製剤のζ−電位を決定するために、我々は、検出器としてのアバランシェフォトダイオードおよび６３３ｎｍで動作させる４ｍＷＨｅ−Ｎｅレーザーが取り付けられたＮａｎｏ  ＺｅｔａＳｉｚｅｒ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、ＵＫ）を使用した。データをレーザーＤｏｐｐｌｅｒ速度測定および位相解析光散乱（ＰＡＬＳ）により取得した。自己組織化ペプチドをＰＢＳ中に、２０ｍｇ／ｍＬの濃度で分散させ（これはそれらのＣＭＣを超える）、３０ｍｉｎ、２５℃で平衡化させ、その後検出した。微小電気泳動データをＨｅｎｒｙ−Ｓｍｏｌｕｃｈｏｗｓｋｉ式を使用して取得した。
【００４２】
原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）．ＡＦＭ実験では、３μＬをペプチドベシクル分散物（０．２μｍフィルタに通して濾過した、２０ｍｇ／ｍＬのペプチドを含むＰＢＳ）から取り出し、新たに劈開させたマイカ表面（Ｇ２５０−２マイカシート２．５×２．５×０．０１５ｃｍ；Ａｇａｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｌｔｄ，  Ｅｓｓｅｘ，  ＵＫ）上に堆積させた。マイカの露出面は滑らかである（ｒｍｓは約０．４ｎｍである）。イメージング前に、各試料をマイカ上に１ｍｉｎ置き、２００μＬの水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）ですすぎ、窒素ガスストリーム中で乾燥させた。画像は、タッピングモードで動作されるＶｅｅｃｏマルチモードナノスコープ３Ｄコントローラー走査プローブ顕微鏡（Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，  Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ，  ＣＡ）を用いて空気中で直ちに取得された。ＡＦＭイメージング（５１２×５１２画素）を、ソフトケイ素プローブ（ＦＥＳＰ；呼び長さｌｎｏｍ＝２２５μｍ、幅ｗｎｏｍ＝２８μｍ、先端半径Ｒｎｏｍ＝８ｎｍ、共振周波数υｎｏｍ＝７５ｋＨｚ、ばね定数ｋｎｏｍ＝２．８Ｎｍ−１；Ｖｅｅｃｏ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＳＡＳ，  Ｄｏｕｒｄａｎ，  Ｆｒａｎｃｅ）を用いて実施した。典型的な走査パラメータは、タッピング周波数７３ｋＨｚ、それぞれ、積分および比例ゲイン０．２および０．４、設定点０．７−１．０Ｖ、および走査速度１．０−１．５Ｈｚとした。ナノスコープ画像処理ソフトウェアを使用して、ペプチドナノベシクルの高さパターン、断面、およびｒｍｓを得た。２つの異なる試料から、ランダムスポット表面サンプリング（少なくとも５領域）で画像を収集した。
【００４３】
ペプチドベシクルを通じた放出．ペプチドベシクルが薬物送達のために使用することができるかどうかを決定するために、我々は、親水性蛍光プローブ５，６−カルボキシフルオセイン（ＣＦ）のペプチド二重層アセンブリを通る放出動力学を測定した。ペプチド粉末をＰＢＳ中のＣＦ溶液中に添加し、懸濁液を１０ｍｉｎ間プローブ−超音波処理し、続いて１時間平衡化させた。封入されたＣＦは強くクエンチしてあり、よって、放出されたＣＦのみが、蛍光強度シグナルに寄与する。放出されたＣＦを、遠心分離により、１１，０００ｒｐｍで２５ｍｉｎ、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ  ＹＭ−１０メンブランチューブ（１０ｋＤａカットオフ）を用いて除去した。その後、ベシクルをＰＢＳ中に再懸濁させ、１時間、２０℃でインキュベートした。インキュベーション中に新たに放出されたＣＦを、遠心分離により、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ膜を通して収集し、蛍光強度を測定した。このプロセスを１時間毎に繰り返し、グラフを作成し、ＣＦの放出動力学を、時間の関数として示した。測定は全て、Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＬＳ−５０Ｂ分光光度計において、２０℃で、１ｃｍのパスの長さの石英キュベットを使用して実施した。励起波長は４７０ｎｍであり、発光極大が５２０ｎｍで観察された。励起および発光スリット幅を、それぞれ、５．０および２．５ｎｍで設定した。
【００４４】
疎水性薬物取込み．疎水性蛍光プローブナイルレッドを、プローブ分子として使用し、ペプチドナノベシクル二重層を研究した。ナイルレッドは強い溶媒和−クロミズムを示し、発光スペクトルはその局所的微小環境によって変動する。「薄膜」方法を分散物の調製のために使用した。簡単に言うと、０．２ｍｇの両親媒性ペプチドを、エタノールに溶解し、その後、有機溶媒を真空下、ロータリー・エバポレーターにおいて除去した。それから、生成した薄膜を、３．１４μＭナイルレッドを含む１ｍＬのＰＢＳ、ｐＨ７．４で再水和させた。分析前に、分散物を３０分、浴中超音波処理した。全てのスペクトルを室温で、５ｎｍに設定した励起および発光スリット幅を用いて記録した（ＲＦ−５３０１  ＰＣ  Ｓｈｉｍａｔｚｕ分光光度計）。励起波長は５４６ｎｍであり、発光スペクトルを５５０〜７００ｎｍで記録した。
【００４５】
細胞培養．Ｃａｃｏ−２細胞（４０継代）を、３７℃で、組織培養フラスコ内にて、１０％ｖ／ｖＦＢＳ（ウシ胎仔血清）１％非必須アミノ酸および１００μｇ／ｍＬペニシリンおよびストレプトマイシンが補充されたダルベッコ変法基本培地（ＤＭＥＭ）を用いて、５％ｖ／ｖＣＯ２を含む加湿雰囲気中で増殖させた。培地を２−３日毎に、細胞が８０％コンフルエンスに到達するまで交換し、その後、トリプシン処理により継代させた。
【００４６】
細胞生存率ＭＴＴアッセイ．自己組織化ペプチドの細胞生存率および細胞増殖に対する効果をＭＴＴ比色分析アッセイ（Ｓｉｇｍａ）を使用して研究した。Ｃａｃｏ−２細胞を９６−ウェルプレートのウェルで、成長培地を使用して、４×１０３細胞／ｃｍ２の密度が達成されるまで培養した。その後、我々は成長培地を０．２または１０ｍｇ／ｍＬの自己組織化ペプチドを含む新たな成長培地と交換し、細胞を３、２４および４８ｈ、３７℃でインキュベートした。その後、１０μＬのＭＴＴ試薬をウェルの各々に添加し、プレートを３ｈ、３７℃でインキュベートした。その後、１００μＬの洗浄剤溶液を添加し、プレートを暗闇で３ｈ貯蔵し、ホルマザン生成物を溶解させた。光学密度を６００ｎｍで、Ｔｅｋｎｉｋａ（登録商標）ＥＬＩＳＡプレート分光光度計において測定した。
【００４７】
経上皮抵抗および細胞単層透過性．Ｃａｃｏ−２細胞を、２×１０５細胞／ｃｍ２の密度で、２４−ウェル６．５ｍｍトランスウェルポリエステル膜インサート（０．４μｍ細孔サイズ、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＭＡ）上に播種した。培地を２−３日毎に、トランスウェル膜の両側で交換した。２０日後、成長培地を、１０ｍＭ  ＨＢＳＳ／ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．４と交換し、細胞−単層完全性および透過性の研究を実施した。
【００４８】
１０ｍＭのＨＢＳＳ／ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．４中でのＣａｃｏ−２単層の経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を、３０ｍｉｎ毎に５ｈ、Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ−ＥＲＳ（登録商標）装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、細胞成長培地に添加した０．２および１．０ｍｇ／ｍＬの自己組織化ペプチドの存在下でモニタした。１８０ｍｉｎに、１０ｍＭのＨＢＳＳ／ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．４培地を、ＦＢＳを含まないＤＭＥＭと交換し、経上皮抵抗をさらに１２０ｍｉｎ測定し、細胞の処理からの回復能力を評価した。全ての測定を３つ組で実施した。
【００４９】
透過性アッセイでは、我々はトランスウェルの頂端側に、１ｍｇ／ｍＬのＦＩＴＣ−デキストランＭＷ４．４ｋＤａ（Ｓｉｇｍａ）を含む１０ｍＭ  ＨＢＳＳ／ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．４を、０．２または１０ｍｇ／ｍＬの自己組織化ペプチドと共に、またはこれなしで添加した。各時間点で、試料を、側底側から引き出し、ＦＩＴＣ−デキストランの量を、蛍光９６−ウェルプレートリーダーを使用して測定した。励起および発光波長は、それぞれ、４９０ｎｍおよび５３０ｎｍとした。結果を時間の関数としてのＦＩＴＣ−デキストランの累積経上皮輸送として表した。全ての測定を３つ組で実施し、平均±Ｓ．Ｄ．として表した。見かけの透過係数をｃｍ／ｓで表される、Ｐａｐｐ＝（ｄＱ／ｄｔ）／（ＡＣｏ）に従い計算し、ここで、ｄＱは時間ｔでの側底側におけるＦＩＴＣ−デキストランの累積量であり、ｐｍｏｌ／ｓで表される（ｄＱ／ｄｔ）は透過速度であり、Ｃｏは頂端側におけるＦＩＴＣ−デキストランの初期濃度であり、Ａは単層の面積である。増強比ＲはＲ＝（Ｐａｐｐ（ペプチド）／Ｐａｐｐ（対照））に等しい。
【００５０】
分散分析（ＡＮＯＶＡ）を実施し、計算された見かけの透過係数において観察される差が統計的に有意かどうかを決定した。有意なＦ値は、確率が０．０５未満（Ｐ＜０．０５）である場合の、計算された見かけの透過係数における有意の差を示す。
【００５１】
ローダミン１２３の経上皮輸送．Ｃａｃｏ−２単層を通る経上皮輸送を、トランスウェルの側底側に添加した０．５μＭのローダミン−１２３を用いてモニタした。自己組織化ペプチドをトランスウェルの側底側に、ペプチドのＣＭＣ値超および未満の濃度、０．０１６および０．１６ｍｇ／ｍＬで添加した。対照実験を、１％ＳＤＳまたは１００μＭベラパミル（Ｐ−糖タンパク質阻害剤である）の添加を用いて実施した。３０ｍｉｎ毎に試料を、頂端側から引き出し、ＨＰＬＣにより分析した（Ｗａｔｅｒｓ  Ｘｔｅｒｒａ  Ｃ１８  １５０ｍｍ×４６ｍｍ、３．５μｍ分析カラムが取り付けられたＳｈｉｍａｄｚｕ（登録商標）ＨＰＬＣ、流速０．８５ｍｌ／ｍｉｎ、検出器を５００ｎｍで設定）［１５］。アセトニトリル、２０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４．０、および１．５ｍＭのＴＢＡを含む水（５０／２０／３０ｖ／ｖ／ｖ）から構成される移動相を、０．４５μｍフィルタに通して濾過し、超音波処理により脱ガスし、その後使用した。実験の終了前に、経上皮抵抗を測定し、細胞単層完全性が実験条件により影響されていないことを確認した。
【００５２】
免疫細胞化学．Ｃａｃｏ−２細胞（４０継代）を、カバーガラス上で、７０−８０％コンフルエンスに到達するように増殖させ、その後、０．２または１０ｍｇ／ｍＬの自己組織化ペプチドと２４ｈｒ相互作用させた。未処理Ｃａｃｏ−２細胞を対照として使用した。インキュベーション期間の終了時に、カバーガラスをＰＢＳですすぎ、４％ｗ／ｖパラホルムアルデヒドで３０ｍｉｎ、室温で固定した。細胞をその後、０．３％のトリトンＸ−１００と含むＰＢＳで１０ｍｉｎ処理し、続いて、ブロッキング緩衝液（５％ＢＳＡ、１０％ＮＧＳ）を添加し、３０ｍｉｎ、室温でインキュベートした。カバーガラスをその後、ＰＢＳですすぎ、一次マウスモノクローナルＥ−カドヘリン抗体（１：１００）（Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｔｄ、ＵＫ）と共に、１ｈ、室温でインキュベートし、再びＰＢＳで洗浄し、二次Ａｌｅｘａ−Ａｕｏｒ５６８ヤギ抗マウス抗体（１：１０００）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に１ｈインキュベートし、ＰＢＳで洗浄した。ＤＡＰＩを使用して細胞核を染色した。イメージングをＮｉｋｏｎ  Ｄ−Ｅｃｌｉｐｓｅ蛍光顕微鏡により実施した。
【００５３】
結果および考察
この研究で我々が試験したペプチド配列の設計に対する理論的根拠は、生体膜中に存在するリン脂質の長さおよび構造に似ていることであった。ａｃ−Ａ６Ｋ−ＣＯＮＨ２（配列番号：１）、ＫＡ６；−ＣＯＮＨ２（配列番号：２）、およびａｃ−Ａ６Ｄ−ＣＯＯＨ（配列番号：３）ペプチドは、６個のアラニンから構成される疎水性尾部および荷電側鎖を有するアミノ酸である親水性頭部を有する。頭部および尾部の両方に極性基を有する自己組織化両親媒性ペプチド、ＤＡ６−ＣＯＯＨ（配列番号：４）もまた合成し、形態学的、物理化学的、およびペプチド−細胞相互作用分析の結果を、界面活性剤様ペプチドのものと比較した。脂質およびアニオン性界面活性剤のように、脂質様ペプチドは、脂質に基づく系で起こるものに類似するように、水溶液中で隔離し、自己組織化し、ナノ構造を形成する［６，１６］。界面活性剤様ペプチドの、１５０ｍＭの電解質を含むＰＢＳ溶液への添加により、ペプチドモノマの自己組織化による濁った懸濁液の形成が得られる。
【００５４】
ペプチドの質量分析
ペプチドをＨＰＬＣにより分離し、ＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ質量分析により分析した（図２）。全ての荷電状態に対する抽出クロマトグラムの合わせたピーク積分を使用する定量分析は、ペプチドの純度が９０％〜９２％の間であったことを明らかにする。図２におけるＭＳスペクトルにおいて見られるように、試料は微量のより短い、場合によっては、より長いペプチドを含み、これは、合成ペプチド調製物では普通である。ＭＳスペクトル中に存在する割り当てられていないピークは、＋１荷電ペプチドの起源内（ｉｎｔｒａ−ｓｏｕｒｃｅ）断片化による。
【００５５】
ＡＦＭイメージング
我々はＡＦＭを使用して、両親媒性ペプチドアセンブリの形態を研究した。前に、我々はベシクルおよびナノチューブの形成が実験条件に依存することを報告した［６、７、１０］。本明細書では、実験条件は一貫してナノベシクルの形成へと導いた。図３は、両親媒性ペプチドアセンブリのサイズが使用したペプチドの型に依存したことを示す。ペプチドベシクルのサイズ分布分析は、リジンを含む、正電荷を持つａｃ−Ａ６Ｋ−ＣＯＮＨ２（配列番号：１）およびＫＡ６−ＣＯＮＨ２（配列番号：２）ペプチドの自己組織化は、負電荷を持つａｃ−Ａ６Ｄ−ＣＯＯＨ（配列番号：３）およびＤＡ６−ＣＯＯＨ（配列番号：４）ペプチドの会合から得られたものと比べてより大きな粒子となることを示した（図３、挿入図、および表１）。これはおそらく、リジンに比べ、アスパラギン酸の側鎖がより小さいことによるであろう。これにより、ナノベシクル二重層におけるペプチドのより良好な充填が可能になる。
【００５６】
ａｃ−Ａ６Ｄ−ＣＯＯＨ（配列番号：３）およびＤＡ６−ＣＯＯＨ（配列番号：４）ペプチドの場合、イメージトポロジーは、ネックレス様超微細構造を明らかにした。そのような構造は、ナノ粒子コロイド溶液では、１滴の液体が固体表面上で乾燥した場合、普通に観察され、２次元結晶化規則［１７］、あるいは溶媒の蒸発によるナノメートルスケールでのコーヒーリング効果［１８］により説明することができる。ａｃ−Ａ６Ｋ−ＣＯＮＨ２（配列番号：１）およびＫＡ６−ＣＯＮＨ２（配列番号：２）の場合にような個々のペプチドナノベシクルの存在ではなく、そのような超微細構造の形成に向かう、より小さなａｃ−Ａ６Ｄ−ＣＯＯＨ（配列番号：３）およびＤＡ６−ＣＯＯＨ（配列番号：４）ペプチドナノベシクルの会合は、系の表面エネルギー要求により駆動され得る。ａｃ−Ａ６Ｄ−ＣＯＯＨ（配列番号：３）およびＤＡ６−ＣＯＯＨ（配列番号：４）ペプチドナノベシクルからなるネックレス様構造の平均直径は、それぞれ、２００±１１ｎｍおよび１５９±２６ｎｍである。さらに、画像解析により、ａｃ−Ａ６Ｄ−ＣＯＯＨ（配列番号：３）ネックレスは、２３±３のより小さなａｃ−Ａ６Ｄ−ＣＯＯＨ（配列番号：３）ナノベシクルから構成され、一方、より大きなＤＡ６−ＣＯＯＨ（配列番号：４）ナノベシクルから構成されるものは、１ネックレスあたり１１±２ナノベシクルを有することが示された。
【００５７】
これらの観察は、ネックレス形成のメカニズムについての質問を引き起こした。ＡＦＭ試料調製中の乾燥条件の変更により、準安定性ナノベシクルクラスターが明らかになり、ネックレス形成前に、ａｃ−Ａ６Ｄ−ＣＯＯＨ（配列番号：３）およびＤＡ６−ＣＯＯＨ（配列番号：４）ペプチドナノベシクルが、それぞれ、直径１０１±１１および１３５±２４ｎｍを有する緩く結合したクラスターを形成したことが示唆される。試料の乾燥プロセス中に、負電荷を持つペプチドナノベシクル凝集物は、同様の電荷を持つマイカ表面上で解体して広がり、ナノベシクルネックレスが形成された。ａｃ−Ａ６Ｄ−ＣＯＯＨ（配列番号：３）ナノベシクルの場合、より大きな直径のネックレスの形成はおそらく、より大きな直径の１１ペプチドナノベシクルを必要としたＤＡ６−ＣＯＯＨ凝集物と比べて、より小さなサイズおよびより高い数の個々のペプチドナノベシクル、すなわち、１つのａｃ−Ａ６Ｄ−ＣＯＯＨ（配列番号：３）ナノベシクル凝集物あたり２３による。理論的計算により、ａｃ−Ａ６Ｄ−ＣＯＯＨ（配列番号：３）およびＤＡ６−ＣＯＯＨ（配列番号：４）ナノベシクル凝集物のサイズ、すなわち、それぞれ、１０１±１１および１３５±２４ｎｍは、２３および１１の、それぞれ、直径２８±９ｎｍおよび４３±１１ｎｍをそれぞれ、有する密接に充填された個々のナノベシクルとよく相関することが明らかになった。
【００５８】
動的光散乱
ペプチドナノベシクルの流体力学半径、Ｒｈを、ＤＬＳにより決定した。ＰＢＳ  ｐＨ７．４中、２５℃の分散された両親媒性ペプチドベシクルの強度時間相関関数および対応する逆ラプラス変換分析を図４に示す。実線は、ＣＯＮＴＩＮアルゴリズムを使用して得られた最良適合結果を表す。光散乱データの逆ラプラス変換分析により、単峰性ペプチドベシクルサイズ分布が得られたが、ＫＡ６−ＣＯＮＨ２（配列番号：２）ベシクル懸濁液の場合は除かれ、この場合、ピーク分析は、１６４ｎｍおよび９０６ｎｍの平均直径を有するナノベシクルの存在を示し；後者はおそらく、個々のベシクルの凝集物を表す（図４）。ａｃ−Ａ６Ｋ−ＣＯＮＨ２（配列番号：１）ペプチドナノベシクルの平均直径は１２２ｎｍである（図４および表２）。ａｃ−Ａ６Ｋ−ＣＯＮＨ２（配列番号：１）およびＫＡ６−ＣＯＮＨ２（配列番号：２）ペプチドナノベシクルのＤＬＳ測定は、マイカ上に堆積させたナノベシクルのＡＦＭにより決定されたサイズとよく一致する。しかしながら、ａｃ−Ａ６Ｄ−ＣＯＯＨ（配列番号：３）およびＤＡ６−ＣＯＯＨ（配列番号：４）ペプチドベシクルのＤＬＳ分析は、それぞれ、直径９７ｎｍおよび１３７ｎｍを有する粒子を明らかにした。これらの値は、ＡＦＭでは、ネックレス様構造およびナノベシクルクラスターを示した、個々のａｃ−Ａ６Ｄ−ＣＯＯＨ（配列番号：３）およびＤＡ６−ＣＯＯＨ（配列番号：４）ペプチドナノベシクルに対してＡＦＭ分析により決定されたベシクル直径から外れていた。しかしながら、データの検査により、ＤＬＳデータ分析によりナノベシクルクラスターに対して決定されたものに類似する粒子直径が得られたことが示され、これらのクラスターは、ＤＬＳが実施されたＰＢＳ溶液中で安定であることが示唆される（表１、図４）。
【００５９】
ＤＬＳによる粒子サイズ決定は、溶液中のペプチドベシクルの流体力学直径を表し、一方、ＡＦＭイメージングは、乾燥状態のペプチドベシクルについての情報を提供する。われわれは、ＤＬＳおよびＡＦＭから計算されたベシクルサイズの間に良好な一致が存在することを見出し、ベシクル縮小は、ＡＦＭ走査に先行する乾燥プロセス中、無視できることが示唆された。先端広幅化効果のために、ベシクルの実際の直径は、ＡＦＭにより測定されたものよりも小さく［１９］、そのため、ＡＦＭにより観察されたベシクル直径はＤＬＳデータ分析により決定された流体力学直径とよく相関する。
【００６０】
微小電気泳動移動度測定
静電現象は多くの生物学的プロセスにおいて重要である。ナノ粒子系上に電荷を導入すると、それらの生物学的および物理化学的特性を変化させることができる［２０］。極性溶媒中に分散されたベシクルのコロイド安定性は、同様に荷電させた粒子表面間の静電反発と関連する。ＰＢＳ中のペプチドナノベシクル製剤の安定性を決定するために、我々はそれらの表面電位値を測定した。
【００６１】
ｐＨ７．４では、ａｃ−Ａ６Ｋ−ＣＯＮＨ２（配列番号：１）（すなわち，８．５±０．３ｍＶ）およびＫＡ６−ＣＯＮＨ２（配列番号：２）（すなわち、１２．４±０．９ｍＶ）から構成されるベシクルに対して得られた正のζ−電位値は、ペプチドモノマの正味の正電荷による。我々がａｃ−Ａ６Ｋ−ＣＯＮＨ２（配列番号：１）ベシクルに比べて、ＫＡ６−ＣＯＮＨ２（配列番号：２）に対してより高い（ｔ検定、ｐ＜０．０５）ζ−電位値を測定したという事実は、ペプチドの個々の正味荷電、すなわち、ＰＢＳ  ｐＨ７．４中、ＫＡ６−ＣＯＮＨ２（配列番号：２）に対しては（＋２）およびａｃ−Ａ６Ｋ−ＣＯＮＨ２（配列番号：１）に対しては（＋１）と一致する。ａｃ−Ａ６Ｄ−ＣＯＯＨ（配列番号：３）およびＤＡ６−ＣＯＯＨ（配列番号：４）ペプチドから構成されるナノベシクルは、それぞれ、−１５．４±１．１ｍＶおよび−１４．０±１．１ｍＶの負のζ−電位値を示し、ｐＨ７．４での、ａｃ−Ａ６Ｄ−ＣＯＯＨ（配列番号：３）の正味荷電、すなわち、（−２）およびＤＡ６−ＣＯＯＨ（配列番号：４）の正味荷電、すなわち、（−１）に一致する。一定イオン強度でのｐＨの関数としての、ＰＢＳ中でのペプチドナノベシクルの電気泳動挙動を図５に示す。ｐＨが増加するにつれ、正電荷を持つａｃ−Ａ６ＫＣＯＮＨ２（配列番号：１）およびＫＡ６−ＣＯＮＨ２（配列番号：２）ペプチドベシクルの表面電荷は、より低い正の電位値にシフトし、あるいはａｃ−Ａ６Ｄ−ＣＯＯＨ（配列番号：３）およびＤＡ６−ＣＯＯＨ（配列番号：４）ベシクルの場合、アルカリ性溶液中での粒子表面上のヒドロキシル基の吸着の増加のために、より負のζ−電位値にシフトする。
【００６２】
薬物送達適用のためのペプチドベシクルを通じた放出
自己組織化ペプチドナノベシクルを薬物送達適用において使用することができるかどうかを決定するために、我々は、蛍光プローブＣＦのナノベシクル二重層を通じた放出動力学を測定した。図８は、界面活性剤様ａｃ−Ａ６Ｋ−ＣＯＮＨ２（配列番号：１）ペプチドから構成されるペプチドベシクルが、ベシクルの内側に捕捉されたＣＦを、長期間保持したことを示す。放出実験（すなわち、ベシクルの遠心分離および再懸濁）において使用される条件では、ａｃ−Ａ６Ｋ−ＣＯＮＨ２（配列番号：１）ペプチドナノベシクルを通じたＣＦ放出は７ｈ後およそ５０％であった。ａｃ−Ａ６Ｄ−ＣＯＯＨ（配列番号：３）に基づく製剤の場合、ベシクルは、個々の期間において最初に負荷したＣＦの１３％を保持した。ＫＡ６−ＣＯＮＨ２（配列番号：２）およびＤＡ６−ＣＯＯＨ（配列番号：４）ペプチドから構成されるベシクルは、２〜３時間以内にＣＦを完全に放出した。
【００６３】
我々は、封入されたＣＦのａｃ−Ａ６Ｋ−ＣＯＮＨ２（配列番号：１）およびａｃ−Ａ６Ｄ−ＣＯＯＨ（配列番号：２）ナノベシクルを通じた放出動力学の間の差が、単に、負電荷を持つＣＦとベシクルの表面の間の静電相互作用によるものであったかを尋ねた。Ａｃ−Ａ６Ｋ−ＣＯＮＨ２（配列番号：１）はアセチル化およびアミド化され、ＣおよびＮ末端は、それぞれ、ｐＨ７．４にて、リジンのε−アミン基でただ１つの正電荷を有する。ａｃ−Ａ６Ｄ−ＣＯＯＨ（配列番号：３）ペプチドは、アスパラギン酸の負電荷を持つカルボキシル基のために、Ｃ末端で２つの負電荷を有する。別の実験では、我々は、ＣＦを、予め形成させたペプチドナノベシクルを含む分散物に添加した。遠心分離、上清の除去、およびベシクルの再懸濁の後、我々は、系において極小ＣＦ蛍光を観察し、観察された放出プロファイルが、ＣＦのａｃ−Ａ６Ｋ−ＣＯＮＨ２（配列番号：１）、より少ない程度にａｃ−Ａ６Ｄ−ＣＯＯＨ（配列番号：３）ペプチド二重層を通じた封入および緩徐放出によることが示唆される。これらの結果から、ペプチドベシクルは、細胞毒性と関係しているため理想的ではないリポソームに基づく系の代わりとして［２１，２２］、生物系における薬物または遺伝子送達療法のために使用することができることが示唆される。
【００６４】
疎水性薬物取込みおよび放出
我々は次に、ナイルレッドをプローブ分子として使用し、ペプチドベシクル二重層の疎水性特性および構造統合性を研究した。ナイルレッドは疎水性モデル薬物として考えられ、これは、リポソーム二重層安定性を評価するために使用される［２３］。水中でナイルレッドにより放出される蛍光は非常に弱く、約６６０ｎｍで極大を示す。しかしながら、ナイルレッドが極性溶媒との接触から遮断された疎水性環境に埋められると、強度は増加し、極大はブルーシフトする。自己組織化ペプチドベシクルに組み込まれたナイルレッドの発光スペクトルを図７に示す。
【００６５】
６２３ｎｍおよび６２６ｎｍのナイルレッド発光極大が、それぞれ、二価ＫＡ６−ＣＯＮＨ２（配列番号：２）およびａｃ−Ａ６Ｄ−ＣＯＯＨ（配列番号：３）から構成されるペプチドナノベシクル製剤において、６３１ｎｍおよび６４７ｎｍの極大が、それぞれ、一価ａｃ−Ａ６Ｋ−ＣＯＮＨ２（配列番号：１）およびＤＡ６−ＣＯＯＨ（配列番号：４）ペプチドナノベシクルに対して（図７）観察された。これにより、電荷の型に関係なく、１つの電荷を有するペプチドから構成されるナノベシクル中に封入されたナイルレッドの空間配置に比べ、ナイルレッドは２つの電荷を有するペプチドのナノベシクル中のより疎水性の微小環境（すなわち、ペプチド二重層中、より深くに挿入され、極性溶媒との相互作用がより少ない）に配置されることが示唆される。ａｃ−Ａ６ＫＣＯＮＨ２（配列番号：１）ナノベシクル中に封入されたナイルレッドは、他のペプチドナノベシクル系中のナイルレッドに対して記録されたものに比べて著しく高い蛍光収率を有し、他のペプチドナノベシクル中のナイルレッドに比べて、より多くの数のナイルレッド分子がａｃ−Ａ６Ｋ−ＣＯＮＨ２（配列番号：１）ナノベシクル二重層中に収容されることが示唆される。
【００６６】
ナイルレッドのペプチドナノベシクルを通じた放出動力学もまた研究し、我々は、放出は、ａｃ−Ａ６Ｄ−ＣＯＯＨ（配列番号：３）およびａｃ−Ａ６Ｋ−ＣＯＮＨ２（配列番号：１）ナノベシクルの場合、より遅いことを見出し、よって、ペプチドナノベシクルは薬物または遺伝子送達療法のために使用することができることが示唆される。
【００６７】
同時に、我々は、疎水性ナイルレッド分子が、自己組織化し、ベシクルを形成する脂質様ペプチドの疎水性尾部から構成される二重層内に挿入されることを見出した。さらに、ａｃ−Ａ６Ｋ−ＣＯＮＨ２（配列番号：１）ペプチドベシクルの膜二重層安定性とそれらの疎水性および親水性分子を保持する特性の間には相関があると思われる（図６および７）。ＣＦ放出の場合のように、我々は、ａｃ−Ａ６Ｋ−ＣＯＮＨ２（配列番号：１）、および、より少ない程度にａｃ−Ａ６Ｄ−ＣＯＯＨ（配列番号：３）ナノベシクルは、ＫＡ６−ＣＯＮＨ２（配列番号：２）およびＤＡ６−ＣＯＯＨ（配列番号：４）ベシクルに比べて、より高い数のナイルレッド分子を保持することを観察した。
【００６８】
脂質様ペプチドナノベシクルの細胞生存率に対する効果
４つの両親媒性ペプチドの存在下でのＣａｃｏ−２細胞の生存率を分析し、結果から、全てのペプチドは２４ｈおよび４８ｈ後、細胞増殖に影響しなかったことが示唆される。図９は、Ｃａｃｏ−２細胞が２日の培養で約５倍の細胞数増加を示すことを図示し、両親媒性ペプチドの存在下での細胞の活発な増殖が示唆される。自己組織化ペプチドのＣａｃｏ−２細胞生存率に対する効果を定量的に評価するために、我々は、０．２ｍｇ／ｍＬおよび１．０ｍｇ／ｍＬのペプチドを添加して、ＭＴＴアッセイを使用した。これらのペプチド濃度は、ペプチドのＣＭＣ値よりも高く、よって、ペプチドナノベシクルならびにペプチドモノマが系中に存在する。図９に示されるように、細胞をペプチドとインキュベートした場合、細胞生存率の変化は観察されなかった（ｔ検定ｐ＜０．０５）。
【００６９】
とりわけ、アセチル化ａｃ−Ａ６Ｋ−ＣＯＮＨ２（配列番号：１）およびａｃ−Ａ６ＤＣＯＯＨ（配列番号：３）脂質様ペプチドの存在下での処理後４８時間に、我々は細胞異常増殖の増加を観察し、よって、生存率値が１００％を超えた（図９）。我々は自己組織化に界面活性剤特性を付加しても、細胞増殖に有益な効果を有さないことを予測した。この所見は驚くべきであり、細胞と脂質様ペプチドモノマまたはペプチドナノベシクルの間の正のクロストークを意味する。
【００７０】
透過エンハンサーとしての脂質様ペプチド
脂質様ペプチドナノベシクルが、親水性および／または疎水性薬物化合物の封入により、薬物送達適用のために使用することができることを確証したが、我々はペプチドナノベシクルの、治療分子のバイオアベイラビリティを促進および増幅する能力を研究するように設定した。多くの疾患の管理の成功には、効率的な薬物送達が要求される。しかしながら、有効濃度の治療薬の送達は、胃腸管の上皮層または血液脳関門の低い透過性のために困難である。バイオアベイラビリティを増加させるために、様々な透過エンハンサーが開発されている。トランスウェルフィルタ増殖Ｃａｃｏ−２上皮細胞は、上皮透過性を研究するためのインビトロモデル系として考えられる［２４］。自己組織化ペプチドのＣａｃｏ−２細胞単層を通る透過性に対する効果を評価するために、我々は高分子量親水性マーカーＦＩＴＣ−デキストランＭＷ４．４ｋＤａを使用した。傍細胞透過性は、複数の膜貫通タンパク質から構成される細胞のタイトジャンクションにより調節され、上皮層を通る管腔流体および分子の流れを調節するための半透性ゲートとして機能する。
【００７１】
図１０（Ａ＆Ｂ）に示されるように、ペプチドの添加は、対照（すなわち、トランスウェルの頂端側にペプチドなし）と比較して、ＦＩＴＣ−デキストラン輸送の著しい増加（ｐ＜０．０５）を引き起こした。自己組織化ペプチドの共適用なしでの単層を横切るＦＩＴＣ−デキストラン輸送は小さく、ＦＩＴＣ−デキストラン単独では、Ｃａｃｏ−２単層の透過は不十分であることが示される。１．０ｍｇ／ｍＬのａｃ−Ａ６Ｄ−ＣＯＯＨ（配列番号：３）、ＤＡ６−ＣＯＯＨ（配列番号：４）、ａｃ−Ａ６Ｋ−ＣＯＮＨ２（配列番号：１）、およびＫＡ６−ＣＯＮＨ２（配列番号：２）の存在は、対照と比較して、ＦＩＴＣ−デキストランの輸送を、それぞれ、７．９、６．６、５．７、および５．１倍だけ増強させた（図９および表４）。同様に、０．２ｍｇ／ｍＬの界面活性剤様ペプチドを使用した場合、ＦＩＴＣ−デキストラン輸送は、１．０ｍｇ／ｍＬの添加ペプチドで実施した試験に対して前に観察されたのと同じ効率順序に従い増強された。
【００７２】
この範囲における透過増強比により、上皮層完全性を損なうリスクなしで、上皮層を通る増加した薬物輸送が得られ得る。Ｃａｃｏ−２細胞モデルは粘液層を含まないが（これは、いくつかの上皮層中に存在する）、インビトロでの高い吸収増強比は改善された薬物動態と関連する。これらのデータにより、より高いペプチド濃度では、上皮単層を通るＦＩＴＣ−デキストランの透過の一貫した増加が存在し、その効果は、負電荷を持つペプチドナノベシクルの場合に、より顕著であることが示される。
【００７３】
界面活性剤様ペプチドのタイトジャンクションバリアに対する効果を調査するために、我々はＣａｃｏ−２単層を横切る経上皮抵抗を測定した（図９Ｃ＆Ｄ）。上皮単層を横切る経上皮抵抗（傍細胞透過性の指標）の低減は、増加した傍細胞透過性を示す。観察された、時間依存性の、経上皮抵抗の小さな減少は、細胞間のタイトジャンクションの拡大の結果としての、１０ｍＭのＨＢＳＳ／ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．４の存在下での、単層の小イオンに対する透過性の増加による。我々の結果から、対照に相当した界面活性剤様ペプチドの適用は、単層の経上皮抵抗に有意の影響を有さなかったことが示される。この結果は、１８０ｍｉｎ後、細胞集団はペプチドの存在に影響されなかったことを示す、細胞生存率データ（図８）と一致する。同時にこれらのデータにより、脂質様ペプチドは上皮単層のタイトジャンクションと相互作用し、ＦＩＴＣ−デキストランの透過性を、Ｃａｃｏ−２細胞単層完全性を損なわずに増加させることが示唆される。図９で示される結果の比較により、アスパラギン酸含有脂質様ペプチドの自己会合から誘導されるより小さなナノベシクルの存在により、ＦＩＴＣ−デキストラン輸送およびＴＥＥＲ値（ａｃ−Ａ６Ｋ−ＣＯＮＨ２（配列番号：１）およびＫＡ６−ＣＯＮＨ２（配列番号：２）ナノベシクルに対して得られた値に比べて、対照に対して得られたものにより近い）の増加が得られることも示唆される。
【００７４】
ＴＥＥＲ実験の終了時に（すなわち、１８０ｍｉｎ、図９Ｃ＆Ｄの矢印）、細胞にペプチド枯渇成長培地を補充し、経上皮抵抗を３００ｍｉｎまで測定した。全ての場合において、我々は、経上皮抵抗が処理前値の９５−１００％まで戻ったことを見出し、観察されたＴＥＥＲ変化は可逆であり、タイトジャンクション損傷または細胞膜機能の有害損傷によるものではありえないことが示唆される。
【００７５】
ペプチドナノベシクルの存在下でのＣａｃｏ−２単層を通じたローダミン−１２３輸送
自己組織化ペプチドは上皮細胞単層と相互作用し、傍細胞透過性およびＦＩＴＣ−デキストラン輸送を増加させることを観察したので、我々は、Ｐ−糖タンパク質媒介流出を試験することにより、透過性のメカニズムを調査し始めた。Ｐ−糖タンパク質は、主に、血液脳関門に関与するヒト脳毛細血管を含む上皮層の頂端表面に局在し、多くの薬物の活発な流出と関連する［２５］。薬物溶解度を改善する医薬製剤に含められる特定の界面活性剤もまた、Ｐ−糖タンパク質と相互作用し、よって、薬物動態パラメータに影響する［２６，２７］。
【００７６】
理想的な薬物送達ビヒクルはＰ−糖タンパク質機能を調節し、薬物バイオアベイラビリティを増加させることができなければならない。この目的を達成するために、我々は両親媒性ペプチド製剤の、Ｃａｃｏ−２細胞単層におけるＰ−糖タンパク質機能に影響する能力を評価しようとした。上皮単層を通る、Ｐ−糖タンパク質のための基質であるローダミン−１２３の輸送［２８］を、界面活性剤様ペプチドを添加して、および添加なしで測定した。Ｐ−糖タンパク質細胞機能の阻害剤であるベラパミルを、我々のアッセイに対照として含めた［２９］。我々は、（側底から頂端側への）輸送に対する測定を実施した。というのも、基底膜を横切る流入（吸収性輸送）はＰ−糖タンパク質機能により制御されないからである［２８］。
【００７７】
ベラパミルはローダミン−１２３の輸送を阻害した。自己組織化ペプチドモノマの、それらのＣＭＣ未満の濃度での存在は、対照と比較して、ローダミン−１２３輸送の変化を誘導しなかった（図１１）。しかしながら、ａｃ−Ａ６Ｋ−ＣＯＮＨ２（配列番号：１）およびａｃ−Ａ６Ｄ−ＣＯＯＨ（配列番号：３）ペプチドナノベシクルの、すなわち、それらのＣＭＣを超える濃度での添加により、対照と比較して一貫して高い、細胞単層を通るローダミン−１２３輸送値が得られた。ＫＡ６ＣＯＮＨ２（配列番号：２）およびＤＡ６−ＣＯＯＨ（配列番号：４）ナノベシクルの存在はローダミン−１２３輸送に影響しなかった。
【００７８】
これらのデータから、ａｃ−Ａ６Ｋ−ＣＯＮＨ２（配列番号：１）およびａｃ−Ａ６Ｄ−ＣＯＯＨ（配列番号：３）ペプチドナノベシクルは、ペプチドナノベシクルとＰ−糖タンパク質の間の相互作用を含むメカニズムにより可能なローダミン−１２３の分泌輸送を促進することが証明される。この仮説をさらに試験するため、および、ペプチドナノベシクルの、細胞形態および上皮細胞タイトジャンクションへの接着に対する生物学的効果を調査するために、我々は上皮膜抗原Ｅ−カドヘリンに対するモノクローナル抗体を使用して免疫染色を実施した。Ｅ−カドヘリンは上皮細胞の接着結合に局在し、上皮タイトジャンクション形成を調節する膜貫通糖タンパク質である。頂端側（ａｐｉｃｏｌａｔｅｒａｌ）膜から離れたタイトジャンクションおよび接着結合複合物の下方制御または再分布は、細胞単層の崩壊と相関し、小分子、タンパク質および脂質の、頂端と側底ドメインの間の膜を通る自由拡散が可能になる。
【００７９】
我々の結果から、界面活性剤様ペプチドは、それらのＣＭＣ未満および超の濃度では、Ｃａｃｏ−２細胞形態に影響せず、またはタイトジャンクション完全性を不利に改変しないことが示される。Ｅ−カドヘリン染色はペプチド処理Ｃａｃｏ−２細胞膜では強度に陽性であり、蛍光顕微鏡法は陰性対照とペプチド処理単層の間の差を明らかにしなかった。これにより、上皮単層を通るＦＩＴＣ−デキストランＭＷ４．４ｋＤａの透過性およびローダミン−１２３輸送の増加は細胞膜損壊によるものではないことが示唆される。アセチル化した脂質様ペプチドａｃＡ６Ｋ−ＣＯＮＨ２（配列番号：１）およびａｃ−Ａ６Ｄ−ＣＯＯＨ（配列番号：３）は、拡散物質の傍細胞および／または細胞内輸送を含むメカニズムにより透過を増強させる可能性がある。同時に、我々の結果により、脂質様ペプチドモノマおよびペプチドナノベシクルは細胞形態、細胞生存率、および増殖特性に影響しないことが証明され、ペプチドナノベシクルは、薬物送達を含む生物医学適用のための可能性のある良好な候補であることが示唆される。
【００８０】
ペプチドナノベシクルの特徴
自己組織化し、ナノベシクルを形成する全てのペプチドを、疎水性尾部および親水性頭部を考慮して設計した。我々の結果から、ペプチドの界面活性剤特性のみおよびナノベシクルの形成が必要であるが、効率的な薬物送達系の開発のために十分な条件ではないことが示される。全てのペプチドベシクルはそれらの巨視的な組織化を維持するが、それらのいくらかは封入された分子を長期間保持することができない。我々は、疎水性プローブナイルレッドのベシクル二重層内への封入および親水性ＣＦのサイズ約１２６ｎｍを有するａｃ−Ａ６Ｋ−ＣＯＮＨ２（配列番号：１）ペプチドナノベシクルを通じた長期放出を観察した。ａｃ−Ａ６Ｄ−ＣＯＯＨ（配列番号：３）の自己組織化により、約４３ｎｍの小さなナノベシクルが得られ、これらは効率的に疎水性ナイルレッドをペプチド二重層内に封入するが、負電荷を持つＣＦを、ａｃ−Ａ６Ｋ−ＣＯＮＨ２（配列番号：１）ペプチドベシクルに比べてより速く放出してしまう。これらの結果から、ナノベシクルのサイズおよびそれらの負荷容量は、ベシクルを形成するために使用される自己組織化ペプチドモノマの電荷を変化させることにより、薬物の放出動力学を制御する手段を提供することが示唆される。
【００８１】
ペプチド上の電荷の位置を規定するアミノ酸配列もまた、効率的な系を設計するのに重要である。ａｃ−Ａ６Ｋ−ＣＯＮＨ２（配列番号：１）ナノベシクルは負電荷を持つＣＦを著しく保持し、ＫＡ６−ＣＯＮＨ２（配列番号：２）ナノベシクルはそうではなかったが、ＫＡ６−ＣＯＮＨ２（配列番号：２）は１つのモノマあたり２つの正電荷を有する（ｐＨ７．４では、リジンの非アセチル化Ｎ末端アミンおよびε−アミンは荷電される、表１）。迅速なＣＦ放出はまた、ａｃ−Ａ６Ｄ−ＣＯＯＨ（配列番号：３）製剤に比べて、ＤＡ６−ＣＯＯＨ（配列番号：４）ナノベシクルを通じて観察され；ＤＡ６−ＣＯＯＨ（配列番号：４）は、Ｃ末端に１つの負電荷を有し、それはＮ末端では中性であり（１つ正および１つ負）、一方、ａｃ−Ａ６Ｄ−ＣＯＯＨ（配列番号：３）は２つの負電荷を有する。よって、電荷分布はまた、効率的な、ペプチドナノベシクル薬物送達系の設計には重要な因子である。
【００８２】
安定なベシクルの形成では、良好な両親媒性ペプチドは下記を有するべきである：（ｉ）ａｃ−Ａ６Ｋ−ＣＯＮＨ２（配列番号：１）およびａｃ−Ａ６Ｄ−ＣＯＯＨ（配列番号：３）のようなアセチル化Ｎ末端；非アセチル化ペプチドＫＡ６−ＣＯＮＨ２（配列番号：３）およびＤＡ６−ＣＯＯＨ（配列番号：４）はＣＦを保持しなかった、（ｉｉ）Ｃ末端における正電荷を持つアミノ酸；Ｎ末端のリジンはでは良好なＣＦ保持特性を有する安定なペプチドナノベシクルが得られなかった、（ｉｉｉ）アミド化されたＣ末端；Ｃ末端の遊離カルボキシル基を有するａｃ−Ａ６Ｄ−ＣＯＯＨペプチドは、小さなＣＦ保持効率しか示さなかった。
【００８３】
ペプチドの自己組織化の質的プロセスは脂質および脂肪酸のそれに類似するが、ペプチドはこれらの系とは異なる。というのも、ナノベシクル二重層は、アミノ酸の疎水性側鎖間の疎水性相互作用およびペプチドモノマ極性バックボーン間の水素結合の組み合わせにより安定化されるからである。よって、二重層内部化学はリポソームとペプチドナノベシクルの間で異なる。我々は、これらの単純で短く、安価で（＄４５／ｇ未満）および多用途のペプチドは、ベシクルを使用した薬物送達適用の分野で新たな未知を切り開くであろうことを信じる。界面活性剤様、自己組織化ペプチドは、脂質と混合することができ、標的薬物送達のためのハイブリッドペプチド／脂質リポソーム系が形成される。自己組織化ペプチドのリポソーム中への組み込みは機能性を付与し、製剤の二重層湾曲および安定性を調節した［３０］．界面活性剤様ペプチドは容易に改変、および調整することができ、他の分子、例えば糖類および機能的モチーフ、例えば細胞シグナル伝達および細胞透過性アミノ酸配列が組み込まれる。デザイナーペプチドの設計は、おそらく、今後１０年間に生物医学適用のためのそれらの用途に対し、ますます重要な役割を果たすであろう実現技術である。
【００８４】
【表１】
2018052935.tif 000003
【表２】
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【表３】
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【表４】
2018052935.tif 000006
【００８５】
結論
生物脂質に触発され、我々は、疎水性および親水性分子の薬物送達適用のために使用することができるナノベシクルを形成する、自己組織化特性を有する、両親媒性、界面活性剤様ペプチドを考案した。我々は、溶液中のペプチドベシクルの物理化学的および形態学的特性を調査し、我々はペプチド製剤の良好なインビトロ生体適合性を観察した。我々は、ペプチドナノベシクルは、Ｐ−糖タンパク質系との相互作用により、上皮単層を通じた輸送を促進することを証明した。細胞増殖研究は、両親媒性ペプチドは、Ｃａｃｏ−２細胞培養における細胞増殖に影響しなかったことを示した。自己組織化ペプチドベシクルは、生物医学において潜在的有用性を有する新しい型のナノ材料を表す。これらの両親媒性ペプチドは、単一アミノ酸レベルで容易に設計することができるだけでなく、標準ペプチド合成により容易に製造される。我々の結果はさらに、治療特性を有する分子が封入され、体内で徐々に送達される、ペプチドに基づく薬物送達系の開発に対する理解を提供する。
【００８６】
ＭＩＴにおける環境衛生学センター（Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ：ＣＥＨＳ；助成金番号ＮｌＥＨＳ  ＥＳ００２１  ０９）は、質量分析および技術サポートで認められている。
【００８７】
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２７．  Ｔａｙｒｏｕｚ，  Ｙ．，  Ｄｉｎｇ，  Ｒ．，  Ｂｕｒｈｅｎｎｅ，  Ｊ．，  Ｒｉｅｄｅｌ，  Ｋ．  Ｄ．，  Ｗｅｉｓｓ，  Ｊ．，  Ｈｏｐｐｅ−Ｔｉｃｈｙ，  Ｔ．，  Ｈａｅｆｅｌｉ，  Ｗ．  Ｅ．  ＆Ｍｉｋｕｓ，  Ｇ  ．．  （２００３）  Ｃｌｉｎ．  Ｐｈａｒｍａｃａｌ．  Ｔｈｅｒ．  ７３，  ３９７−４０５．
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３０．  Ｙａｇｈｍｕｒ，  Ａ．，  Ｌａｇｇｎｅｒ，  Ｐ．，  Ｚｈａｎｇ，  Ｓ．  ＆  Ｒａｐｐｏｌｔ，  Ｍ．  （２００７）  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ，  ５，  １−１０．
【００８８】
この発明について、その好ましい実施形態を参照して特定的に図示し、記載してきたが、当業者であれば、添付の特許請求の範囲により包含される発明の範囲から逸脱せずに、形態および細部における様々な変更が可能であることが理解されるであろう。
【図１】
2018052935.tif 000007
【図２−１】
2018052935.tif 000008
【図２−２】
2018052935.tif 000009
【図３】
2018052935.tif 000010
【図４】
2018052935.tif 000011
【図５】
2018052935.tif 000012
【図６】
2018052935.tif 000013
【図７】
2018052935.tif 000014
【図８】
2018052935.tif 000015
【図９】
2018052935.tif 000016
【図１０】
2018052935.tif 000017
【図１１】
2018052935.tif 000018
【配列表】
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