(57)【要約】【課題】乳酸菌による抗菌物質の産生能を精度良く評価でき、抗菌物質の産生能が高い乳酸菌を探索できるスクリーニング方法を提供する。【解決手段】容器１内に、乳酸菌と、特定の抗菌物質に対して感受性を有する感受性菌とを混釈した混釈寒天培地２を固化させた後、中和剤を添加した中和剤添加寒天培地３を重層して固化させた状態で所定時間の培養を行う。乳酸菌によって産生される乳酸は中和剤によって中和され、混釈寒天培地２の乳酸濃度の上昇が抑制されるため、ｐＨ低下による乳酸菌の増殖阻害が抑制される。乳酸菌のコロニーの成長が阻害されないことにより、抗菌物質の産生能を精度良く評価することができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳酸菌と、特定の抗菌物質に対する感受性を有する感受性菌とを混釈した混釈寒天培地上に、乳酸を中和する中和剤を添加した中和剤添加寒天培地を重層した状態で培養を行い、前記混釈寒天培地に現れたコロニー周辺に形成された阻止円の大きさに基づいて乳酸菌を選抜することを特徴とする、乳酸菌のスクリーニング方法。
【請求項２】
乳酸を中和する中和剤を添加した第１の中和剤添加寒天培地と、乳酸菌と、特定の抗菌物質に対する感受性を有する感受性菌とを混釈した混釈寒天培地と、乳酸を中和する中和剤を添加した第２の中和剤添加寒天培地とをこの順に重層した状態で培養を行い、前記混釈寒天培地に現れたコロニー周辺に形成された阻止円の大きさに基づいて乳酸菌を選抜することを特徴とする、乳酸菌のスクリーニング方法。
【請求項３】
特定の抗菌物質に対する感受性を有する感受性菌を混釈した混釈寒天培地上に乳酸菌の培養液を塗抹し、当該培養液を塗抹後の混釈寒天培地上にメンブレンフィルターを介して乳酸を中和する中和剤を添加した中和剤添加寒天培地を重層した状態で培養を行い、前記混釈寒天培地に現れたコロニー周辺に形成された阻止円の大きさに基づいて乳酸菌を選抜することを特徴とする、乳酸菌のスクリーニング方法。
【請求項４】
中和剤が不溶性の中和剤である、請求項１から３のいずれか１項に記載の、乳酸菌のスクリーニング方法。
【請求項５】
抗菌物質がナイシンである、請求項１から４のいずれか１項に記載の、乳酸菌のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳酸菌のスクリーニング方法に関し、特に、抗菌物質の産生能が高い乳酸菌を探索するためのスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バクテリオシンは、乳酸菌等の細菌類が産生する抗菌活性を持つペプチドやタンパク質の総称である。バクテリオシンの中でも、Lactococcus lactis subsp. lactisの一部の株が産生するナイシンは、世界約５０か国以上で食品添加物として使用されている。
【０００３】
ナイシンを工業的に安価に生産するには、培養液中のナイシン濃度を極限まで高める必要があるが、ナイシン産生L. lactisには、培養液中のナイシン濃度がある値まで上昇す
ると、それ以上のナイシンの産生が抑制されるシーリング現象が確認されており、ナイシンの高効率生産において問題になる。そこで、高濃度のナイシンへの暴露による自然変異やＵＶ照射等の変異処理により、高濃度のナイシン存在下でもナイシンの産生抑制が起きないナイシン産生株を取得することが求められている。
【０００４】
L. lactisのナイシン産生量を確認する方法として、微生物学的定量法（ナイシン感受
性菌に対する阻止円の大きさで評価）や液体クロマトグラフ質量分析法（ＬＣ／ＭＳ法）が知られており、中でも分析操作が簡便な微生物学的定量法が、基礎研究の分野で広く採用されている。しかしながら、微生物学的定量法は、培養液中のナイシン量を定量する方法であり、株レベルでのナイシン産生能を評価するには、その株毎に培養液を調製する必要があり、その後の定量分析を含めて多大な労力と時間を要する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１１−４１４７４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、株レベルのナイシン産生能を一斉に評価する方法として、ナイシン感受性菌とナイシン産生菌を混釈培養する方法（寒天培地混釈法）、あるいは、感受性菌混釈培地にナイシン産生菌を表面塗抹する方法（寒天培地表面塗抹法）によりコロニーを形成させ、コロニー周辺に現れた阻止円の大きさでナイシン産生能を評価する方法が考えられる。
【０００７】
しかしながら、寒天培地を用いた培養では、乳酸菌自身が産生する乳酸の濃度増加により増殖阻害を受け、コロニーの成長が停止し、妥当性のある評価ができないという問題がある。
【０００８】
それ故に、本発明は、乳酸菌による抗菌物質の産生能を精度良く評価でき、抗菌物質の産生能が高い乳酸菌を探索できるスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明に係る乳酸菌のスクリーニング方法は、乳酸菌と、特定の抗菌物質に対する感受性を有する感受性菌とを混釈した混釈寒天培地上に、乳酸を中和する中和剤を添加した中和剤添加寒天培地を重層した状態で培養を行い、混釈寒天培地に現れたコロニー周辺に形成された阻止円の大きさに基づいて乳酸菌を選抜することを特徴とするものである。
【００１０】
あるいは、乳酸を中和する中和剤を添加した第１の中和剤添加寒天培地と、乳酸菌と、特定の抗菌物質に対する感受性を有する感受性菌とを混釈した混釈寒天培地と、乳酸を中和する中和剤を添加した第２の中和剤添加寒天培地とをこの順に重層した状態で培養を行い、混釈寒天培地に現れたコロニー周辺に形成された阻止円の大きさに基づいて乳酸菌を選抜しても良い。
【００１１】
あるいは、特定の抗菌物質に対する感受性を有する感受性菌を混釈した混釈寒天培地上に乳酸菌の培養液を塗抹し、当該培養液を塗抹後の混釈寒天培地上にメンブレンフィルターを介して乳酸を中和する中和剤を添加した中和剤添加寒天培地を重層した状態で培養を行い、混釈寒天培地に現れたコロニー周辺に形成された阻止円の大きさに基づいて乳酸菌を選抜しても良い。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、乳酸菌による抗菌物質の産生能を精度良く評価でき、抗菌物質の産生能が高い乳酸菌を探索できるスクリーニング方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】第１の実施形態に係る乳酸菌のスクリーニング方法を示す概略断面図
【図２】第２の実施形態に係る乳酸菌のスクリーニング方法を示す概略断面図
【図３】第３の実施形態に係る乳酸菌のスクリーニング方法を示す概略断面図
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明に係る乳酸菌のスクリーニング方法は、特定の抗菌物質に対して感受性を有する感受性菌を摂取した寒天培地を用い、複数の菌株または、同一株から分裂、増殖した菌を含有する乳酸菌の培養液を混釈培養法または平板塗抹培養法により培養し、現れたコロニーの周囲に形成される阻止円の大きさに基づいて、特定の抗菌物質の産生能が高い乳酸菌を選抜する。ただし、乳酸菌が産生する乳酸の濃度が上昇し培地のｐＨが低下すると乳酸菌のコロニーの成長が阻害され、特定の抗菌物質の産生能を正しく評価することができない。また、ｐＨの低下を防ぐために、寒天培地に中和剤として炭酸カルシウムを添加する方法も知られているが、炭酸カルシウムは不溶性で寒天培地が白濁するため、阻止円を観察することができない。そこで、本発明では、乳酸菌を混釈した寒天培地または乳酸菌を塗抹した寒天培地と、乳酸を中和するための中和剤を添加した寒天培地とを重層した状態で培養を行うことにより、乳酸菌の増殖に伴って産生される乳酸を中和剤により中和し、ｐＨ低下による増殖阻害を抑制する。その後、重層した中和剤を含む寒天培地を除去することによって、ｐＨの維持と阻止円の観察を両立する。
【００１５】
本発明の実施形態として、乳酸菌の培養方法及び中和剤を添加した寒天培地の重層方法の違いにより、以下の第１〜第３の実施形態を例示できる。
【００１６】
（第１の実施形態）
図１は、第１の実施形態に係る乳酸菌のスクリーニング方法を示す概略断面図である。
【００１７】
本実施形態では、図１に示すように、容器１内に、乳酸菌と、特定の抗菌物質に対して感受性を有する感受性菌とを混釈した混釈寒天培地２を固化させた後、中和剤を添加した中和剤添加寒天培地３を重層して固化させた状態で所定時間の培養を行う。乳酸菌の増殖に伴って混釈寒天培地２の乳酸濃度が上昇すると、混釈寒天培地２と中和剤添加寒天培地３との乳酸濃度の差により、乳酸が中和剤添加寒天培地３へと移行し、中和剤によって中和される。これにより、中和剤添加寒天培地３との乳酸濃度差が保たれ、結果として、混釈寒天培地２の乳酸濃度の上昇が抑制されるため、ｐＨ低下による乳酸菌の増殖阻害が抑制される。
【００１８】
（第２の実施形態）
図２は、第２の実施形態に係る乳酸菌のスクリーニング方法を示す概略断面図である。
【００１９】
本実施形態では、図２に示すように、容器１内に、中和剤を添加した中和剤添加寒天培地４を固化させた上に、乳酸菌と、特定の抗菌物質に対して感受性を有する感受性菌とを混釈した混釈寒天培地２を固化させ、この上に更に、中和剤を添加した中和剤添加寒天培地４を固化させた状態で所定時間の培養を行う。つまり、本実施形態では、混釈寒天培地２を２層の中和剤添加寒天培地３及び４で挟んだ状態で培養を行う。本実施形態に係るスクリーニング方法においても、乳酸菌の増殖に伴って混釈寒天培地２の乳酸濃度が上昇すると、混釈寒天培地２内の乳酸が中和剤添加寒天培地３及び４へと移行し、中和剤によって中和される。この結果、混釈寒天培地２の乳酸濃度の上昇が抑制されるため、ｐＨ低下による乳酸菌の増殖阻害が抑制される。
【００２０】
本実施形態に係るスクリーニング方法では、混釈寒天培地２が２層の中和剤添加寒天培地３及び４に挟まれていることにより、第１の実施形態と比べて乳酸の中和が速やかに行われ、より効果的に乳酸濃度（ｐＨ低下）を抑制することができる。
【００２１】
（第３の実施形態）
図３は、第３の実施形態に係る乳酸菌のスクリーニング方法を示す概略断面図である。
【００２２】
本実施形態では、図３に示すように、容器１内に、特定の抗菌物質に対して感受性を有する感受性菌を混釈した混釈寒天培地２を固化させた後、固化した混釈寒天培地２の表面に、乳酸菌の培養液をコーンラージ棒等を用いて塗抹する。乳酸菌の培養液を塗抹した混釈寒天培地２の表面をメンブレンフィルター５で覆った後、中和剤を添加した中和剤添加寒天培地３を重層して固化させ、この状態で所定時間の培養を行う。本実施形態に係るスクリーニング方法においても、乳酸菌の増殖に伴って混釈寒天培地２の乳酸濃度が上昇すると、混釈寒天培地２内の乳酸がメンブレンフィルター５を通じて中和剤添加寒天培地３へと移行し、中和剤によって中和される。この結果、混釈寒天培地２の乳酸濃度の上昇が抑制されるため、ｐＨ低下による乳酸菌の増殖阻害が抑制される。
【００２３】
第１及び第２の実施形態では、加温した寒天培地に乳酸菌を接種するため、乳酸菌が熱の影響を受ける可能性があるが、本実施形態のように混釈寒天培地２上に乳酸菌を塗抹する方法では、乳酸菌が熱の影響を受ける虞がない。また、本実施形態のように混釈寒天培地２上に乳酸菌を塗抹した場合、コロニーが培地上に形成されるため、形成されたコロニーを観察しやすいという利点もある。
【００２４】
上記の第１〜第３の実施形態のいずれにおいても、培養完了後に、混釈寒天培地２上の中和剤添加寒天培地３を取り除いてから観察を行うことが好ましい。中和剤が水に不溶性の物質である場合には、中和剤添加寒天培地３が濁っているため、これを除去することにより阻止円の観察がしやすくなる。混釈寒天培地２のうち、感受性菌に対して抗菌作用を有する物質を産生する乳酸菌のコロニーがない部分は、感受性菌の増殖により白濁し、特定の抗菌物質を産生する乳酸菌のコロニーの周囲の部分は、感受性菌が増殖できないことによって白濁せず阻止円が形成される。この阻止円の大きさに基づいて、特定の抗菌物質の産生能が高い乳酸菌のコロニーを選抜する。
【００２５】
産生される乳酸を中和しない場合、乳酸濃度が一定以上となると、ｐＨ低下による増殖阻害のため乳酸菌のコロニーの成長が停止してしまい、一定の大きさまでしか阻止円が大きくならない。したがって、乳酸を中和しない場合には、乳酸菌が有している抗菌物質の産生能を正確に評価することができない。また、寒天培地を用いる場合には、液体培地を
用いた場合と比べると中和剤の添加が容易ではない。
【００２６】
これに対して、本実施形態では、混釈寒天培地２上に中和剤添加寒天培地３を重層するという簡易な方法により、産生する乳酸を中和することができるので、ｐＨ低下による増殖阻害がない状態で乳酸菌を培養できる。この結果、コロニーの周囲に形成される阻止円の大きさは、乳酸菌が本来が有している抗菌物質の産生能を反映したものとなり、抗菌物質の生産能が高い乳酸菌を正確に選抜することが可能となる。
【００２７】
上記の第１〜第３の実施形態において、スクリーニング対象の抗菌物質は、典型的には乳酸菌バクテリオシンであるが、乳酸菌が産生するものであればとくに限定されない。また、感受性菌は、スクリーニング対象の抗菌物質に対して感受性があるものであれば良い。例として、ナイシンの産生能を有する乳酸菌をスクリーニングする場合、ナイシン感受性のブルガリア菌やMicrococcus luteusを感受性菌として使用することができる。また、ガセリシンの産生能を有する乳酸菌をスクリーニングする場合、ガセリキン感受性のブルガリア菌を、ラクチシン3147の産生能を有する乳酸菌をスクリーニングする場合、ラクチシン3147感受性のクレモリス菌（Lactococcus lactis subsp. cremoris）を、それぞれ感受性菌として使用することができる。
【００２８】
また、上記の第１〜第３の実施形態において、混釈寒天培地２の寒天濃度は０．５〜２．０％とすることが好ましく、重層する際に寒天が固化する前に下層上に均一に広げるために、０．７％〜１．０％とすることがより好ましい。一方、中和剤添加寒天培地３の寒天濃度は、１．０〜２．５％とすることが好ましく、１．５〜２．０％とすることがより好ましく、２．０％とすることが更に好ましい。中和剤添加寒天培地３の寒天濃度が１．５％未満の場合、個化後の中和剤添加寒天培地３の硬さが十分でなく、コロニー及び阻止円の観察前の中和剤添加寒天培地３の除去がしにくくなる。また、中和剤添加寒天培地３の寒天濃度が２．５％を越えると、混釈寒天培地２からの乳酸の移行速度が低下するため好ましくない。
【００２９】
また、上記の第１〜第３の実施形態において、混釈寒天培地２上に中和剤添加寒天培地３を重層する際の培地の温度は、４５〜５５℃とすることが好ましく、５０℃とすることがより好ましい。重層時における中和剤添加寒天培地３の温度が４５℃未満となると寒天の凝固点に近づくため、下層上に均一な厚さで重層することが困難となる。一方、重層時における中和剤添加寒天培地３の温度が５５℃を越えると、指示菌や供試菌が死滅するだけでなく、先に固化させた混釈寒天培地２の一部が溶けて中和剤添加寒天培地３と融合してしまい、コロニー及び阻止円の観察前の中和剤添加寒天培地３の除去がしにくくなる。
【００３０】
中和剤添加寒天培地３及び４に添加する中和剤は、乳酸を中和できるものであれば良いが、２価以上の金属の炭酸塩であって、水に対する溶解度が炭酸塩の場合に低く、乳酸塩の場合は高いものが望ましく、例えば、炭酸カルシウムを好適に利用できる。水酸化ナトリウムなどの水溶性の中和剤は、混釈寒天培地２に速やかに拡散し、混釈寒天培地２のｐＨを上昇させ、指示菌と供試菌の生育に影響を及ぼすのに対して、炭酸カルシウムは、培地（水）に溶解しないため、混釈寒天培地２に移行しない。したがって、中和剤として炭酸カルシウムを用いた場合には、乳酸菌及び感受性菌に対して中和剤が影響するおそれがない。
【００３１】
尚、上記の第１の実施形態においては、混釈寒天培地２上に中和剤添加寒天培地３を重層しているが、これとは逆に、中和剤添加寒天培地３上に混釈寒天培地２を重層しても良い。
【実施例】
【００３２】
（実施例１）
ナイシンの生産性を向上させるには、まず、乳酸菌自身が生産するナイシンに対する耐性を向上させる必要がある。そこでL. lactis ME-550株を８ｍｇ／ｍＬのナイシン製剤を含むＭＲＳ寒天培地に塗布し、自然突然変異により生育する株を得た。さらに、１２ｍｇ／ｍＬのナイシン製剤を含むＭＲＳ寒天培地で生育する株を得た。次に、この耐性株に対して生存率が１．０％前後になるように紫外線を照射し、変異株を得た。この変異株と、ＭＲＳ培地で前培養したナイシン感受性菌Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus JCM1002Tを２．５％接種したＭＲＳ寒天培地（寒天濃度２．０％）１５ｍＬに混釈し、φ９０ｍｍ×２０ｍｍの滅菌シャーレに注いで固化させた。次に、固化させたＭＲＳ寒天培地の上に、５０℃に加温した、０．４ｇの炭酸カルシウムを含むＭＲＳ寒天培地（寒天濃度２．０％）１０ｍＬを重層し、３０℃で２４時間培養した。培養後、炭酸カルシウムを含む上層の培地を取り除き、下層に形成された阻止円から無作為に選択した２０個の阻止円の平均径及び標準偏差を求めた。実施例１において、阻止円は９．２８±１．３５ｍｍ（平均値±標準偏差）で、相対標準偏差は０．１５であった。
【００３３】
（比較例１）
０．４ｇの炭酸カルシウムを含むＭＲＳ寒天培地（寒天濃度２．０％）に代えて炭酸カルシウムを含まないＭＲＳ寒天培地（寒天濃度２．０％）１０ｍＬを重層した。培養後、培地上に形成された阻止円から無作為に選択した１０個の阻止円の平均径及び標準偏差を求めた。比較例１において、阻止円は６．７１±１．４０ｍｍ（平均値±標準偏差）で、相対標準偏差は０．２１であった。
【００３４】
（比較例２）
０．４ｇの炭酸カルシウムを含むＭＲＳ寒天培地（寒天濃度２．０％）を重層しない場合について、実施例１と同様の方法で培養を実施した。培養後、培地上に形成された阻止円から無作為に選択した２０個の阻止円の平均径及び標準偏差を求めた。比較例１において、阻止円は５．３９±１．７２ｍｍ（平均値±標準偏差）で、相対標準偏差は０．３２であった。
【００３５】
実施例１と比較例１の結果から、中和剤である炭酸カルシウムを添加した寒天培地を重層することにより、阻止円が大きくなることが判明した。ここで、阻止円の大きさは、ナイシンの産生濃度を示している。また、比較例１と比較例２の比較から、単にＭＲＳ寒天培地を重層した場合、空気中の酸素が遮断される効果で多少阻止円は大きくなるが、炭酸カルシウムを含むＭＲＳ寒天培地を重層した場合ほどの効果はないことが判明した。実施例１においては、炭酸カルシウムにより乳酸菌が産生する乳酸を中和して、ｐＨ低下による増殖阻害がない状態で乳酸菌が生育するため、ナイシンの産生量が増加することが示された。
【００３６】
また、実施例１においては、比較例２に比べて、阻止円の相対標準偏差が小さくなり、ばらつきが少なくなった。これは、阻止円の大きさを指標としたナイシン高生産株のスクリーニングの精度が高まることを意味している。
【００３７】
以上より、本発明によれば、乳酸菌による抗菌物質の産生能が阻止円の大きさに精度良く反映されるため、妥当性のある評価に基づいて、抗菌物質の産生能が高い乳酸菌をスクリーニングできることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明は、抗菌物質の産生能が高い乳酸菌を探索するためのスクリーニング方法として利用でき、乳酸菌を利用した抗菌物質の工業生産に応用できる。
【符号の説明】
【００３９】
１  容器
２  混釈寒天培地
３、４  中和剤添加寒天培地
５  メンブレンフィルター
【図１】
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【図２】
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【図３】
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