(57)【要約】【課題】  効率よくレスベラトロールをピセアタンノールに変換できる、新規なピセアタンノール生産菌を提供することを目的とする。【解決手段】  ピセアタンノール生産菌を受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２４３９または受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２４４０で特定される細菌とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２４３９で特定される細菌。
【請求項２】
受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２４４０で特定される細菌。
【請求項３】
請求項１または２に記載の細菌の抽出物。
【請求項４】
一般式（ＩＩ）で示される化合物の製造方法であって、一般式（Ｉ）で示される化合物に、請求項１または２に記載の細菌またはその抽出物を作用させる、製造方法。
2018157804.tif 000016
（Ｉ）
（式中、Ｒ1〜Ｒ3は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基である。）
2018157804.tif 000017
（ＩＩ）
（式中、Ｒ1〜Ｒ3は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基であり、Ｒ4とＲ5のうち、一方が−Ｈで、もう一方が−ＯＨである。）
【請求項５】
一般式（ＩＩＩ）で示される化合物の製造方法であって、一般式（Ｉ）で示される化合物及び／又は一般式（ＩＩ）で示される化合物に、請求項１または２に記載の細菌またはその抽出物を作用させる、製造方法。
2018157804.tif 000018
（Ｉ）
（式中、Ｒ1〜Ｒ3は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基である。）
2018157804.tif 000019
（ＩＩ）
（式中、Ｒ1〜Ｒ3は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基であり、Ｒ4とＲ5のうち、一方が−Ｈで、もう一方が−ＯＨである。）
2018157804.tif 000020
（ＩＩＩ）
（式中、Ｒ1〜Ｒ3は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基である。）
【請求項６】
Ｒ3は、−Ｈである、請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項７】
一般式（ＩＩ）で示される化合物がピセアタンノールである、請求項３に記載の製造方法。
【請求項８】
前記化合物に、界面活性剤の存在下で請求項１または２に記載の細菌を作用させる、請求項４〜７のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項９】
前記化合物に請求項１または２に記載の細菌を作用させる前に、４−ヒドロキシフェニル酢酸（４−ＨＰＡ）を含有する培地で前記細菌を培養する工程を含む、請求項４〜８のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１０】
一般式（Ｉ）で示される化合物を一般式（ＩＩ）で示される化合物に変換する、細菌の有する酵素活性の測定方法であって、エンシファー（Ensifer）属またはアルスロバクター（Arthrobacter）属に属する細菌またはその抽出物を一般式（Ｉ）で示される化合物に作用させ、一般式（ＩＩ）で示される化合物を検出する工程を含む、測定方法。
2018157804.tif 000021
（Ｉ）
（式中、Ｒ1〜Ｒ3は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基である。）
2018157804.tif 000022
（ＩＩ）
（式中、Ｒ1〜Ｒ3は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基であり、Ｒ4とＲ5のうち、一方が−Ｈで、もう一方が−ＯＨである。）
【請求項１１】
一般式（Ｉ）で示される化合物を一般式（ＩＩ）で示される化合物に変換する細菌のスクリーニング方法であって、
複数のエンシファー（Ensifer）属またはアルスロバクター（Arthrobacter）属に属する細菌またはその抽出物を一般式（Ｉ）で示される化合物に作用させ、一般式（ＩＩ）で示される化合物を検出する工程と、
一般式（ＩＩ）で示される化合物が検出された細菌またはその抽出物を選択する工程を含む、スクリーニング方法。
2018157804.tif 000023
（Ｉ）
（式中、Ｒ1〜Ｒ3は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基である。）
2018157804.tif 000024
（ＩＩ）
（式中、Ｒ1〜Ｒ3は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基であり、Ｒ4とＲ5のうち、一方が−Ｈで、もう一方が−ＯＨである。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ピセアタンノール生産菌に関する。
【背景技術】
【０００２】
レスベラトロールの３’位が水酸化された構造を有するピセアタンノール（3',4',3,5-テトラヒドロキシ-trans-スチルベンまたは3,3',4',5-テトラヒドロキシ-trans-スチルベン）は、抗酸化活性や抗癌活性等の多様な生理活性を示すことが明らかにされつつある注目すべき化合物である（非特許文献１参照）。このようなピセアタンノールの多様な生理活性に着目し、本化合物を含有するパッションフルーツ種子からの抽出物について、健康、医療への応用を目的として種々の研究開発が進められている（特許文献１〜３参照）。
【０００３】
しかし、ピセアタンノールはパッションフルーツやブドウ等の植物に含まれているものの、含量が少ないために、植物からの抽出は効率的な製造法とは言い難い（特許文献４参照）。また、有機合成法によっても得られるが多数の複雑な反応ステップを要する。
【０００４】
最近、大腸菌由来の４−ヒドロキシフェニル酢酸  ３−ヒドロキシラーゼ（ＨＰＡＨ；ＥＣ  １．１４．１３．３）（別名：ｐ−ヒドロキシフェニル酢酸  ３−ヒドロキシラーゼ、４−ヒドロキシフェニル酢酸  ３−モノオキシゲナーゼ、ｐ−ヒドロキシフェニル酢酸ヒドロキシラーゼ、４−ＨＰＡ  ３−ヒドロキシラーゼ）がレスベラトロールからピセアタンノールへ変換できることが開示された（非特許文献２〜３参照；特許文献５参照）。また、この酵素はピセアタンノールをさらに水酸化し、3,4,5,3',5'-ペンタヒドロキシ-trans-スチルベンに変換する活性を有することが明らかになっている（非特許文献４参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１０−０３０９１１号公報
【特許文献２】特開２０１３−１５１４５７号公報
【特許文献３】特開２０１３−１５１４５８号公報
【特許文献４】ＷＯ２０１０−１１３３１５国際公開公報
【特許文献５】ＷＯ２０１５−１０５１０５国際公開公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Mutat Res-Fund Mol M vol.750, p.60-82 (2012)
【非特許文献２】Curr Opin Biotech vol.26 p.71-78 (2014)
【非特許文献３】Tetrahedron Lett vol.55 p.2853-2855 (2014)
【非特許文献４】Biosci Biotechnol Biochem vol.80 p.193-198 (2016)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、効率よくレスベラトロールをピセアタンノールに変換できる、新規なピセアタンノール生産菌を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
４−ヒドロキシフェニル酢酸  ３−ヒドロキシラーゼ（ＨＰＡＨ；ＥＣ  １．１４．１３．３）（別名：ｐ−ヒドロキシフェニル酢酸  ３−ヒドロキシラーゼ、４−ヒドロキシフェニル酢酸  ３−モノオキシゲナーゼ、ｐ−ヒドロキシフェニル酢酸ヒドロキシラーゼ、４−ＨＰＡ  ３−ヒドロキシラーゼ）は、二成分型ＦＡＤ依存性モノオキシゲナーゼの一種であり、レスベラトロールをピセアタンノールに変換することが知られているが、本発明者らは、特に変換活性の高い細菌を発見し、本発明に至った。
【０００９】
本発明の一実施態様は、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２４３９または受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２４４０で特定される細菌またはその抽出物である。
【００１０】
本発明の他の実施態様は、一般式（ＩＩ）で示される化合物の製造方法であって、一般式（Ｉ）で示される化合物に、上記細菌またはその抽出物を作用させる、製造方法である。
2018157804.tif 000002
（Ｉ）
（式中、Ｒ1〜Ｒ3は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基である。）
2018157804.tif 000003
（ＩＩ）
（式中、Ｒ1〜Ｒ3は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基であり、Ｒ4とＲ5のうち、一方が−Ｈで、もう一方が−ＯＨである。）
本発明のさらなる実施態様は、一般式（ＩＩＩ）で示される化合物の製造方法であって、一般式（Ｉ）で示される化合物及び／又は一般式（ＩＩ）で示される化合物に、上記細菌またはその抽出物を作用させる、製造方法である。
2018157804.tif 000004
（Ｉ）
（式中、Ｒ1〜Ｒ3は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基である。）
2018157804.tif 000005
（ＩＩ）
（式中、Ｒ1〜Ｒ3は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基であり、Ｒ4とＲ5のうち、一方が−Ｈで、もう一方が−ＯＨである。）
2018157804.tif 000006
（ＩＩＩ）
（式中、Ｒ1〜Ｒ3は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基である。）
上述のいずれかの製造方法において、一般式（ＩＩ）で示される化合物がピセアタンノールであってもよい。前記化合物に、界面活性剤の存在下で上記細菌を作用させてもよい。前記化合物に上記細菌を作用させる前に、４−ヒドロキシフェニル酢酸（４−ＨＰＡ）を含有する培地で前記細菌を培養する工程を含んでもよい。
【００１１】
本発明のさらなる実施態様は、一般式（Ｉ）で示される化合物を一般式（ＩＩ）で示される化合物に変換する、細菌の有する酵素活性の測定方法であって、エンシファー（Ensifer）属またはアルスロバクター（Arthrobacter）属に属する細菌またはその抽出物を一般式（Ｉ）で示される化合物に作用させ、一般式（ＩＩ）で示される化合物を検出する工程を含む、測定方法である。
2018157804.tif 000007
（Ｉ）
（式中、Ｒ1〜Ｒ3は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基である。）
2018157804.tif 000008
（ＩＩ）
（式中、Ｒ1〜Ｒ3は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基であり、Ｒ4とＲ5のうち、一方が−Ｈで、もう一方が−ＯＨである。）
本発明のさらなる実施態様は、一般式（Ｉ）で示される化合物を一般式（ＩＩ）で示される化合物に変換する細菌のスクリーニング方法であって、複数のエンシファー（Ensifer）属またはアルスロバクター（Arthrobacter）属に属する細菌またはその抽出物を一般式（Ｉ）で示される化合物に作用させ、一般式（ＩＩ）で示される化合物を検出する工程と、一般式（ＩＩ）で示される化合物が検出された細菌またはその抽出物を選択する工程を含む、スクリーニング方法である。
2018157804.tif 000009
（Ｉ）
（式中、Ｒ1〜Ｒ3は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基である。）
2018157804.tif 000010
（ＩＩ）
（式中、Ｒ1〜Ｒ3は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基であり、Ｒ4とＲ5のうち、一方が−Ｈで、もう一方が−ＯＨである。）
【発明の効果】
【００１２】
本発明によって、効率よくレスベラトロールをピセアタンノールに変換できる、新規なピセアタンノール生産菌を提供することができるようになった。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】菌体反応系での化合物の変換を模式的に記載した図である。この系では、Tween80などの界面活性剤を加えることによって、変換効率を上げることができる。
【図２】本発明の一実施例における、ＫＳＨ１株およびＫＳＨ３株によるレスベラトロールからピセアタンノールへの変換後の解析による（Ａ）ＨＰＬＣクロマトグラム（Ｂ）ＭＳスペクトル（Ｃ）ＭＳ／ＭＳスペクトルを示す図である。
【図３】本発明の一実施例において、ＫＳＨ１株およびＫＳＨ３株によるレスベラトロールからピセアタンノールへの変換に対する界面活性剤の影響を調べた結果を示す図である。
【図４】本発明の一実施例において、最適条件下での、ＫＳＨ１株およびＫＳＨ３株によるレスベラトロール（○）からピセアタンノール（●）への変換量を経時的に調べた結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、M.R.Green,&  J. Sambrook (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (4th edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2012); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.等の標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００１５】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例等は、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示または説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
＝＝化合物の変換方法＝＝
本発明の一実施態様によると、一般式（Ｉ）で示される化合物（以下、化合物（Ｉ）と記す）に、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２４３９または受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２４４０で特定される細菌またはその抽出物を作用させて、一般式（ＩＩ）で示される化合物（以下、化合物（ＩＩ）と記す）を合成することができる。また、この反応により、化合物（Ｉ）を化合物（ＩＩ）に変換する、上記細菌の有する酵素活性を測定することができる。
2018157804.tif 000011
（Ｉ）
（式中、Ｒ1〜Ｒ3は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基である。）
2018157804.tif 000012
（ＩＩ）
（式中、Ｒ1〜Ｒ3は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基であり、Ｒ4とＲ5のうち、一方が−Ｈで、もう一方が−ＯＨである。）
ここで、Ｒ3が−Ｈであることが好ましい。さらに、Ｒ1とＲ2が両方とも−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基であることが好ましい。なお、Ｒ1とＲ2が両方とも−ＯＨであることが最も好ましく、この場合、化合物（Ｉ）がレスベラトロールであって、化合物（ＩＩ）がピセアンタノールとなる。この時の化合物変換の模式図を図１に示す。
2018157804.tif 000013
（ＩＶ）レスベラトロール(Resveratrol)
2018157804.tif 000014
（Ｖ）ピセアンタノール(Piceatannol)
（式中、Ｒ4とＲ5のうち、一方が−Ｈで、もう一方が−ＯＨである。）
さらに、長時間作用させることによって、化合物（Ｉ）または化合物（ＩＩ）から、一般式（ＩＩＩ）で示される化合物（以下、化合物（ＩＩＩ）と記す）を合成することができる。
2018157804.tif 000015
（ＩＩＩ）
（式中、Ｒ1〜Ｒ3は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基である。）
ここで作用させる受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２４３９で特定される細菌（本明細書ではＫＳＨ１株と呼ぶ）はエンシファー（Ensifer）属に属する細菌であり、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２４４０で特定される細菌（本明細書ではＫＳＨ３株と呼ぶ）はアルスロバクター（Arthrobacter）属に属する細菌である。
【００１６】
利用する細菌を培養させるための培地は、公知のものを用いることができる。化合物の変換前にＨＰＡＨを誘導しておくのが好ましく、例えば、４−ヒドロキシフェニル酢酸（４−ＨＰＡ）を含有する培地で細菌を所定時間培養すればよい。４−ＨＰＡの濃度は特に限定されないが、０．１ｍＭ以上であることが好ましく、２ｍＭ以上であることがより好ましく、４ｍＭ以上であることがさらに好ましい。また、２０ｍＭ以下であることが好ましく、１０ｍＭ以下であることがより好ましく、６ｍＭ以下であることがさらに好ましい。培養時間は特に限定されないが、６時間以上であることが好ましく、１２時間以上であることがより好ましく、１８時間以上であることがさらに好ましい。
【００１７】
化合物の変換にこれらの細菌の菌体を用いる場合、化合物（Ｉ）は細胞膜を透過するので、例えば、細菌が含まれた反応液に化合物（Ｉ）を添加すると、細胞内で化合物（ＩＩ）及び／又は化合物（ＩＩＩ）が合成される。また、反応液に界面活性剤を添加することで、化合物の変換効率が上昇する。用いる界面活性剤の種類は特に限定されず、ＳＤＳ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ  ８０などを例示できる。界面活性剤の濃度も特に限定されず、当業者が適切な濃度を容易に選択できるが、約０．１％以上約１０％以下が好ましく、約０．５％以上約２％以下がより好ましく、約１％が最も好ましい。
【００１８】
他の実施形態として、化合物の変換に、上述の細菌の抽出物を用いてもよい。細菌の抽出物を調製する方法は酵素活性を失活させない方法であれば特に限定されず、当業者に公知の方法を用いればよい。この抽出物は、抽出後に分画して得られた酵素活性のある画分や、精製して得られた粗精製物あるいは高純度精製物などであってもよい。なお、細菌の抽出物を調製する前に、上記同様、４−ＨＰＡなどを含有する培地で細菌を所定時間培養し、ＨＰＡＨを誘導しておくのが好ましい。
＝＝化合物変換活性の測定方法＝＝
本発明の一実施形態において、化合物（Ｉ）を化合物（ＩＩ）に変換する酵素活性は、エンシファー属またはアルスロバクター属に属する細菌またはその抽出物を化合物（Ｉ）に作用させ、化合物（ＩＩ）を検出することによって、測定できる。これによって、対象の細菌が、化合物（Ｉ）を化合物（ＩＩ）に変換する化合物変換活性を有するかどうか、判別できる。変換反応の詳細は、上述のとおりである。
【００１９】
ここで、エンシファー属またはアルスロバクター属に属する細菌は、天然に存在する細菌でもよく、天然に存在する細菌を人為的に変異させた変異株であってもよい。
＝＝化合物変換活性を有する細菌のスクリーニング方法＝＝
本発明の一実施形態において、複数のエンシファー属またはアルスロバクター属に属する細菌またはその抽出物を化合物（Ｉ）に作用させ化合物（ＩＩ）を検出し、検出可能であった細菌またはその抽出物を選択することによって、化合物（Ｉ）を化合物（ＩＩ）に高効率で変換する細菌のスクリーニングを行うことができる。変換反応の詳細は、上述のとおりである。
【００２０】
ここで、エンシファー属またはアルスロバクター属に属する細菌は、天然に存在する細菌でもよく、天然に存在する細菌を人為的に変異させた変異株であってもよい。
【実施例１】
【００２１】
本実施例では、ＫＳＨ１株およびＫＳＨ３株のレスベラトロール変換産物がピセアタンノールであることを示す。
［変換反応］
５００ｍＭ  ４−ヒドロキシフェニル酢酸（４−ＨＰＡ）／ジメチルスルホキシド溶液を２０μｌ添加したＫＧ培地５ｍＬに（４−ＨＰＡの終濃度５ｍＭ、ジメチルスルホキシドの終濃度１％ｖ／ｖ）、ＫＳＨ１株およびＫＳＨ３株を植菌し、３０℃、２４０ｒｐｍで４８時間培養した。集菌後、グリセロール１０％ｖ／ｖ含有リン酸カリウム緩衝液５０ｍＭ（ｐＨ７．５）で洗菌した菌体２５ｇ／Ｌ（湿重量換算）、レスベラトロール５ｍＭ、ジメチルスルホキシド１％ｖ／ｖ、グリセロール１０％ｖ／ｖ、Ｔｗｅｅｎ８０  １％ｖ／ｖ、リン酸カリウム緩衝液２００ｍＭ（ｐＨ７．５）を組成とする反応液２５０μＬを調製し、３０℃で２４時間振とうした。
【００２２】
なお、ＫＧ培地（ｐＨ７．２）の組成（培地１リットル当たり）は以下の通りである：（ＮＨ4）2ＳＯ4  ３ｇ、ＫＨ2ＰＯ4  １．４ｇ、Ｎａ2ＨＰＯ4  ２．１ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０．２ｇ、ＦｅＣｌ2・５Ｈ2Ｏ  １０．６ｍｇ、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ  ８ｍｇ、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ４ｍｇ、ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ  ２ｍｇ、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ  ０．０２ｍｇ、ＫＩ  ０．２ｍｇ、Ｎａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ  ０．２ｍｇ、ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ  ０．２ｍｇ、Ｈ3ＢＯ3  ０．４ｍｇ、ＮａＣｌ  １０ｍｇ。
［反応生成物のＨＰＬＣによる分析］
反応液に５Ｍ  ＨＣｌ  １０μＬ、メタノール２５０μＬを添加して攪拌後、遠心分離により菌体を除去したサンプルをＨＰＬＣ分析に供した。ＨＰＬＣ分析は島津社製の装置（ＬＣ−１０システム）と和光純薬社製のカラム（Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ  ５Ｃ１８  ＨＧｃｏｌｕｍｎ、カラムサイズ４．６×１５０ｍｍ、粒子径４．２−４．７μｍ）を用いた。サンプルを１０μｌ注入し、０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸：メタノール＝６０：４０の溶離液（０．５ｍｌ／ｍｉｎ）で溶出し、波長２５４ｎｍで検出した。
［反応生成物のＬＣ−ＭＳ及びＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる分析］
反応液から遠心分離およびフィルター処理により菌体を除去したサンプルをＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析に供した。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析はＷａｔｅｒｓ社製の装置（ＡＣＱｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  Ｈ−Ｃｌａｓｓ、ＸＥＶＯ−Ｇ２ＸＳ  ＱＴｏｆ）と和光純薬社製のカラム（Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ  ５Ｃ１８  ＨＧ  ｃｏｌｕｍｎ、カラムサイズ４．６×１５０ｍｍ、粒子径４．２−４．７μｍ）を用い、０．１％ギ酸：メタノール＝６０：４０の溶離液（０．５ｍｌ／ｍｉｎ）で溶出し、イオン化法：ＥＳＩ、Ｎｅｇａｔｉｖｅモード、コリジョンエネルギー：３ｅＶ（ＬＣ−ＭＳ）・２２ｅＶ（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）、キャピラリー電圧：５００Ｖ、コーン電圧：８０．０Ｖ、ソース温度：１５０℃、脱溶媒温度：５００℃の条件でＭＳ分析、ＭＳ／ＭＳ分析を行った。
［分析結果］
ＫＳＨ１株によるレスベラトロール変換産物のＨＰＬＣ分析、ＬＣ−ＭＳ分析およびＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析による同定の詳細を図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃにそれぞれ示す。
【００２３】
ＨＰＬＣ分析において生成物に相当するリテンションタイムは８．６分であり、ピセアタンノール標品のリテンションタイムと一致した（図２Ａ）。またＬＣ−ＭＳ分析における質量値（［Ｍ−Ｈ］：ｍ／ｚ＝２４３．０６５）は、レスベラトロールの一酸素添加産物であることを示している（図２Ｂ）。さらに親イオンのピークに対してＭＳ／ＭＳ分析を行ったところ、ピセアタンノールの標品のＭＳ／ＭＳスペクトルと一致した（図２ｂ）。以上の結果は、生成物がピセアタンノールであることを示す。
【００２４】
なお、ＫＳＨ３株についても、生成物がピセアタンノールであることを示す同様の結果が得られた。 SHAPE  \* MERGEFORMAT
【実施例２】
【００２５】
本実施例では、４−ヒドロキシフェニル酢酸（４−ＨＰＡ）が、ＫＳＨ１株およびＫＳＨ３株において、レスベラトロール水酸化活性を効率的に誘導し、その活性はＢＬ２１（ＤＥ３）株より顕著に高いことを示す。
【００２６】
４−ＨＰＡまたはグルコースを終濃度５ｍＭで添加したＫＧ培地にＫＳＨ１株、ＫＳＨ３株および対照としてＢＬ２１（ＤＥ３）株を植菌し、３０℃、２４０ｒｐｍで４８時間培養した。集菌後、グリセロール１０％ｖ／ｖ含有リン酸カリウム緩衝液５０ｍＭ（ｐＨ７．５）で洗菌した菌体２５ｇ／Ｌ（湿重量換算）、レスベラトロール５ｍＭ、ジメチルスルホキシド１％ｖ／ｖ、グリセロール１０％ｖ／ｖ、Ｔｗｅｅｎ８０  １％ｖ／ｖ、リン酸カリウム緩衝液２００ｍＭ（ｐＨ７．５）を組成とする反応液２５０μＬを調製後、３０℃で２４時間振とうし、生成したピセアタンノールを計量した。
【００２７】
その結果、ＫＳＨ１株では、グルコースではピセアタンノールが生成せず、４−ＨＰＡで培養したときに３．１ｍＭのピセアタンノールが生成した。ＫＳＨ３株では、いずれの炭素源の場合でもピセアタンノールが検出されたが、４−ＨＰＡで培養したときに１．２ｍＭのピセアタンノールが生成したのに対し、グルコースでは、０．１ｍＭが生成しただけであった。対照のＢＬ２１（ＤＥ３）株は、グルコースではピセアタンノールが生成せず、４−ＨＰＡでは０．６ｍＭのピセアタンノールが生成した。
【００２８】
このように、レスベラトロール水酸化活性は、４−ＨＰＡによって強く誘導され、そして、ＫＳＨ１株およびＫＳＨ３株はＢＬ２１（ＤＥ３）株よりも著しく高いレスベラトロール水酸化活性を示す。
【実施例３】
【００２９】
本実施例では、界面活性剤の存在で、ＫＳＨ１株およびＫＳＨ３株によるレスベラトロールのピセアタンノールへの変換が増強されることを示す。
【００３０】
５００ｍＭ４−ＨＰＡ／ジメチルスルホキシド溶液を２０μｌ添加したＫＧ培地５ｍＬに（４−ＨＰＡの終濃度５ｍＭ、ジメチルスルホキシドの終濃度１％ｖ／ｖ）、ＫＳＨ１株およびＫＳＨ３株を植菌し、３０℃、２４０ｒｐｍでＫＳＨ１株については３６時間、ＫＳＨ３株については９時間培養した。集菌後、グリセロール１０％ｖ／ｖ含有リン酸カリウム緩衝液５０ｍＭ（ｐＨ７．５）で洗菌した菌体２５ｇ／Ｌ（湿重量換算）、レスベラトロール５ｍＭ、ジメチルスルホキシド１％ｖ／ｖ、グリセロール１０％ｖ／ｖ、Ｔｗｅｅｎ８０  ０−２．０％  ｖ／ｖ、リン酸カリウム緩衝液２００ｍＭ（ｐＨ７．５）を組成とする反応液２５０μＬを調製後、３０℃で２４時間振とうした。
【００３１】
その結果、図３に示すように、ＫＳＨ１株（図３Ａ）については１．０％ｖ／ｖで最も高い活性を示し、ＫＳＨ３株（図３Ｂ）については３．０％ｖ／ｖで最も高い活性を示した。
【００３２】
この最適条件下でレスベラトロール変換の経時変化を測定した。その結果、図４に示すように、ＫＳＨ１株（図４Ａ）は５ｍＭのレスベラトロールから２４時間で３．６ｍＭのピセアタンノールを合成でき、ＫＳＨ３株（図４Ｂ）は２．６ｍＭのピセアタンノールを合成できた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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