(57)【要約】【課題】１つ以上の酵素的経路から1つの生成物を生成するための方法を提供する。【解決手段】酵素的変換および化学的変換の双方をステップとして含む。グルコースから５−デヒドロ−４−デオキシグルカレート（ＤＤＧ）へ変換するため、およびグルコースから２，５−フランジカルボン酸（ＦＤＣＡ）へ変換するための多様な経路を提供する。また、特異性および効率が高い反応を行う遺伝子操作された酵素の使用も含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
出発基質から酵素的経路または化学的経路の生成物を生成するための方法であって、該経路が、
グルロン酸からＤ−グルカレートへの酵素的変換（ステップ７）、
５−ケトグルコネート（５−ＫＧＡ）からＬ−イズロン酸への酵素的変換（ステップ１５）、
Ｌ−イズロン酸からイダル酸への酵素的変換（ステップ７ｂ）、および
５−ケトクルコネートから４，６−ジヒドロキシ２，５−ジケトヘキサノエート（２，５−ＤＤＨ）への酵素的変換（ステップ１６）、
１，５−グルコノラクトンからグルロノラクトン（ｇｕｌｕｒｏｎｏ−ｌａｃｔｏｎｅ）への酵素的変換（ステップ１９）
からなる群から選択される１つ以上の変換ステップを含む、方法。
【請求項２】
前記１つ以上の変換ステップが、グルロン酸からＤ−グルカレートへの酵素的変換（ステップ７）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記１つ以上の変換ステップが、５−ケトグルコネート（５−ＫＧＡ）からＬ−イズロン酸への酵素的変換（ステップ１５）である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記１つ以上の変換ステップが、Ｌ−イズロン酸からイダル酸への酵素的変換（ステップ７ｂ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記１つ以上の変換ステップが、５−ケトグルコネートから４，６−ジヒドロキシ２，５−ジケトヘキサノエート（２，５−ＤＤＨ）への酵素的変換（ステップ１６）である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記１つ以上の変換ステップが、１，５−グルコノラクトンからグルロノラクトンへの酵素的変換（ステップ１９）である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記酵素的経路の前記生成物が５−デヒドロ−４−デオキシ−グルカレート（ＤＤＧ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記基質がグルコースでありかつ前記生成物が５−デヒドロ−４−デオキシ−グルカレート（ＤＤＧ）であり、前記方法が、
Ｄ−グルコースから１，５−グルコノラクトンへの酵素的変換（ステップ１）、
１，５−グルコノラクトンからグルロノラクトンへの酵素的変換（ステップ１９）、
グルロノラクトンからグルロン酸への酵素的変換（ステップ１Ｂ）、
グルロン酸からＤ−グルカレートへの酵素的変換（ステップ７）、
Ｄ−グルカレートから５−デヒドロ−４−デオキシ−グルカレート（ＤＤＧ）への酵素的変換（ステップ８）
のステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記基質がグルコースでありかつ前記生成物がＤＤＧであり、前記方法が、
Ｄ−グルコースから１，５−グルコノラクトンへの変換（ステップ１）、
１，５−グルコノラクトンからグルコン酸への変換（ステップ１ａ）、
グルコン酸から５−ケトグルコネート（５−ＫＧＡ）への変換（ステップ１４）、
５−ケトグルコネート（５−ＫＧＡ）からＬ−イズロン酸への変換（ステップ１５）、
Ｌ−イズロン酸からイダル酸への変換（ステップ７ｂ）、および
イダル酸からＤＤＧへの変換（ステップ８ａ）
のステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記基質がグルコースでありかつ前記生成物がＤＤＧであり、前記方法が、
Ｄ−グルコースから１，５−グルコノラクトンへの変換（ステップ１）、
１，５−グルコノラクトンからグルコン酸への変換（ステップ１ａ）、
グルコン酸から５−ケトグルコネート（５−ＫＧＡ）への変換（ステップ１４）、
５−ケトグルコネート（５−ＫＧＡ）から４，６−ジヒドロキシ２，５−ジケトヘキサノエート（２，５−ＤＤＨ）への変換（ステップ１６）、
４，６−ジヒドロキシ２，５−ジケトヘキサノエート（２，５−ＤＤＨ）から４−デオキシ−５−トレオ−ヘキソスロースウロン酸（ＤＴＨＵ）への変換（ステップ４）、および
４−デオキシ−５−トレオ−ヘキソスロースウロン酸（ＤＴＨＵ）からＤＤＧへの変換（ステップ５）
のステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記基質がグルコースでありかつ前記生成物がＤＤＧであり、前記方法が、
Ｄ−グルコースから１，５−グルコノラクトンへの変換（ステップ１）、
１，５−グルコノラクトンからグルコン酸への変換（ステップ１ａ）、
グルコン酸から５−ケトグルコネート（５−ＫＧＡ）への変換（ステップ１４）、
５−ケトグルコネート（５−ＫＧＡ）からＬ−イズロン酸への変換（ステップ１５）、
Ｌ−イズロン酸から４−デオキシ−５−トレオ−ヘキソスロースウロン酸（ＤＴＨＵ）への変換（ステップ７ｃ）、および
４−デオキシ−５−トレオ−ヘキソスロースウロン酸（ＤＴＨＵ）からＤＤＧへの変換（ステップ５）
のステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＤＤＧを２，５−フラン−ジカルボン酸（ＦＤＣＡ）へ変換するステップをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＤＤＧを２，５−フラン−ジカルボン酸（ＦＤＣＡ）へ変換するステップをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＤＤＧを２，５−フラン−ジカルボン酸（ＦＤＣＡ）へ変換するステップをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＤＤＧを２，５−フラン−ジカルボン酸（ＦＤＣＡ）へ変換するステップをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＤＤＧをＦＤＣＡへ変換するステップが、ＤＤＧを酸と接触させて該ＤＤＧをＦＤＣＡへ変換することを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＤＤＧをＦＤＣＡへ変換するステップが、ＤＤＧを酸と接触させて該ＤＤＧをＦＤＣＡへ変換することを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＤＤＧをＦＤＣＡへ変換するステップが、ＤＤＧを酸と接触させて該ＤＤＧをＦＤＣＡへ変換することを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＤＤＧをＦＤＣＡへ変換するステップが、ＤＤＧを酸と接触させて該ＤＤＧをＦＤＣＡへ変換することを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
６０℃を超える温度でＤＤＧをアルコール、無機酸と接触させて、ＦＤＣＡを形成するステップ
を含む、ＦＤＣＡの誘導体を合成するための方法。
【請求項２１】
前記アルコールがブタノールまたはエタノールである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
少なくとも２５％モルの収率を有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
ＤＤＧをアルコール、無機酸、および任意選択的に共溶媒と接触させて、ＤＤＧの誘導体を生成するステップ
を含む、ＤＤＧの誘導体を合成する方法。
【請求項２４】
（ａ）前記アルコールがエタノールまたはブタノールであり、
（ｂ）前記無機酸が硫酸であり、かつ
（ｃ）前記共溶媒が、ＴＨＦ、アセトン、アセトニトリル、エーテル、酢酸エチル、酢酸ブチル、ジオキサン、クロロホルム、塩化メチレン、１，２−ジクロロエタン、ヘキサン、ヘプタン、トルエン、四塩化炭素、石油エーテル、およびキシレンからなる群から選択される、
請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ＤＤＧの誘導体を無機酸と接触させて、ＦＤＣＡの誘導体を生成するステップ
を含む、ＦＤＣＡの誘導体を合成するための方法。
【請求項２６】
２５％モルを超える収率を有する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記誘導体が、メチル−ＤＤＧ、エチル−ＤＤＧ、ブチル−ＤＤＧ、ジメチルＤＤＧ、ジエチル−ＤＤＧ、およびジブチルＤＤＧからなる群から選択されるＤＤＧである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＦＤＣＡの誘導体を脱エステル化してＦＤＣＡを得るステップをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＦＤＣＡの誘導体を重合するステップをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
気相中でＤＤＧを無機酸と接触させるステップ
を含む、ＦＤＣＡを合成するための方法。
【請求項３１】
１２０℃を超える温度でＤＤＧを無機酸と接触させるステップ
を含む、ＦＤＣＡを合成するための方法。
【請求項３２】
無水反応条件下でＤＤＧを無機酸と接触させるステップ
を含む、ＦＤＣＡを合成するための方法。
【請求項３３】
出発基質から酵素的経路または化学的経路の生成物を生成するための方法であって、該経路が、
ＤＴＨＵからＤＤＧへの変換（ステップ５）、
グルコン酸からグルロン酸への変換（ステップ６）、
ＤＥＨＵからＤＤＨへの変換（ステップ７Ａ）、
グルロン酸からＤＥＨＵへの変換（ステップ１７Ａ）
からなる群から選択される１つ以上の変換ステップを含む、方法。
【請求項３４】
前記基質がグルコースでありかつ前記生成物がＤＤＧであり、前記方法が、
Ｄ−グルコースから１，５−グルコノラクトンへの変換（ステップ１）、
１，５−グルコノラクトンからグルコン酸への変換（ステップ１ａ）、
グルコン酸から３−デヒドロ−グルコン酸（ＤＨＧ）への変換（ステップ２）、
３−デヒドロ−グルコン酸（ＤＨＧ）から４，６−ジヒドロキシ２，５−ジケトヘキサノエート（２，５−ＤＤＨ）への変換（ステップ３）、
２，５ＤＤＨから４−デオキシ−５−トレオ−ヘキソスロースウロン酸（ＤＴＨＵ）への変換（ステップ４）、
ＤＴＨＵからＤＤＧへの変換（ステップ５）
のステップを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記基質がグルコースでありかつ前記生成物がＤＤＧであり、前記方法が、
Ｄ−グルコースから１，５−グルコノラクトンへの変換（ステップ１）、
１，５−グルコノラクトンからグルコン酸への変換（ステップ１ａ）、
グルコン酸からグルロン酸への変換（ステップ６）、
グルロン酸からグルカレートへの変換（ステップ７）、
グルカレートからＤＤＧへの変換（ステップ８）
のステップを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記基質がグルコースでありかつ前記生成物がＤＤＧであり、前記方法が、
Ｄ−グルコースから１，５−グルコノラクトンへの変換（ステップ１）、
１，５−グルコノラクトンからグルコン酸への変換（ステップ１ａ）、
グルコン酸から５−ケトグルコネート（５−ＫＧＡ）への変換（ステップ１４）、
５−ケトグルコネート（５−ＫＧＡ）から４，６−ジヒドロキシ２，５−ジケトヘキサノエート（２，５−ＤＤＨ）への変換（ステップ１６）、
４，６−ジヒドロキシ２，５−ジケトヘキサノエート（２，５−ＤＤＨ）から４−デオキシ−５−トレオ−ヘキソスロースウロン酸（ＤＴＨＵ）への変換（ステップ４）、および
４−デオキシ−５−トレオ−ヘキソスロースウロン酸（ＤＴＨＵ）からＤＤＧへの変換（ステップ５）
のステップを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記基質がグルコースでありかつ前記生成物がＤＤＧであり、前記方法が、
Ｄ−グルコースから１，５−グルコノラクトンへの変換（ステップ１）、
１，５−グルコノラクトンからグルコン酸への変換（ステップ１ａ）、
グルコン酸から５−ケトグルコネート（５−ＫＧＡ）への変換（ステップ１４）、
５−ケトグルコネート（５−ＫＧＡ）からＬ−イズロン酸への変換（ステップ１５）、
Ｌ−イズロン酸から４−デオキシ−５−トレオ−ヘキソスロースウロン酸（ＤＴＨＵ）への変換（ステップ７Ｂ）、
４−デオキシ−５−トレオ−ヘキソスロースウロン酸（ＤＴＨＵ）からＤＤＧへの変換（ステップ５）
のステップを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
前記基質がグルコースでありかつ前記生成物がＤＤＨであり、前記方法が、
Ｄ−グルコースから１，５−グルコノラクトンへの変換（ステップ１）、
１，５−グルコノラクトンからグルロン酸ラクトンへの変換（ステップ１９）、
グルロン酸ラクトンからグルロン酸への変換（ステップ１Ｂ）、
グルロン酸からＤＥＨＵへの変換（ステップ１７Ａ）、
ＤＥＨＵからＤＤＨへの変換（ステップ７Ａ）
のステップを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】
前記基質がグルコースでありかつ前記生成物がＤＤＨであり、前記方法が、
Ｄ−グルコースから１，５−グルコノラクトンへの変換（ステップ１）、
１，５−グルコノラクトンからグルコン酸への変換（ステップ１ａ）、
グルコン酸からグルロン酸への変換（ステップ６）、
グルロン酸からＤＥＨＵへの変換（ステップ１７Ａ）、
ＤＥＨＵからＤＤＨへの変換（ステップ７Ａ）
のステップを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項４０】
前記１つ以上の変換ステップが、ＤＴＨＵからＤＤＧへの変換（ステップ５）である、請求項３３に記載の方法。
【請求項４１】
前記１つ以上の変換ステップが、グルコン酸からグルロン酸への変換（ステップ６）である、請求項３３に記載の方法。
【請求項４２】
前記１つ以上の変換ステップが、ＤＥＨＵからＤＤＨへの変換（ステップ７Ａ）である、請求項３３に記載の方法。
【請求項４３】
前記１つ以上の変換ステップが、グルロン酸からＤＥＨＵへの変換（ステップ１７Ａ）である、請求項３３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年８月２１日に出願された米国特許仮出願第６１／７０４，４０８号の恩恵を主張し、この米国特許仮出願は、表、図面、および特許請求の範囲を含めて全体を参照により援用する。
【０００２】
配列表の援用
添付の配列表のデータを参照により本出願中に援用する。添付のＳＧＩ１６６０＿１ＷＯ＿ＰＣＴ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５という名称の配列表テキストファイルは、２０１３年８月＿日に作成されたものであり、＿ＫＢである。このファイルは、Ｗｉｎｄｏｗｓ  ＯＳを使用するコンピュータにおいてＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｗｏｒｄを用いて評価することができる。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
近年、有機化学物質の生成のために再生可能な原料を用いる新規かつ有効な方法を特定するためのより多くの努力が注がれている。多量の下流化学物質の処理技術のうち、バイオマス由来の糖から付加価値のある化学物質への変換は、極めて重要であるとみなされている。詳細には、６炭素糖質、すなわち、フルクトースおよびグルコースなどのヘキソースは、自然に存在している単糖のうち最も豊富に存在するものとして広く認識されているため、化学原料として、適宜かつ経済的に利用することが可能である。
【０００４】
糖からのフランおよびフラン誘導体の生成は、化学においておよび触媒反応研究において注目が集まっており、持続可能なエネルギー供給および化学物質生成を達成するための主要なルートの１つを提供する可能性を有するものと考えられている。実際、一体型バイオマス変換プロセスを備えた生物精製所内において利用可能な糖の脱水および／または酸化を行えば、広範囲のフランおよびフラン誘導体を含む多様な製品を大量に得ることが可能になる。
【０００５】
最も商業的価値の高いフランのうち、フラン−２，５−ジカルボン酸（２，５−フランジカルボン酸としても知られる、本明細書中以下ＦＤＣＡと略称する）は、薬剤、殺虫剤、抗菌剤、香料、農業用化学物質を含むいくつかの産業において、およびポリマー材料、例えばバイオプラスチック樹脂の広範囲の製造用途において多様な用途を有する貴重な中間体である。そのため、ＦＤＣＡは、毎年世界中で生成されている最大量の石油化学物質の１つである石油ベースのモノマーであるテレフタル酸（ＴＰＡ）に対する環境に優しい代替物であるとみなされている。実際、米国エネルギー省は、ＦＤＣＡを、将来の「環境に優しい」化学を確立するための付加価値のある化学物質となる糖から生成された、優先度が１２位である化合物の１つとして認定しており、そのため再生可能な中間体化学物質の「眠れる巨人」の１つとして指名されている（Ｗｅｒｐｙ  ａｎｄ  Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ｔｏｐ  Ｖａｌｕｅ  Ａｄｄｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ｆｒｏｍ  Ｂｉｏｍａｓｓ．ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｅｎｅｒｇｙ，Ｂｉｏｍａｓｓ，Ｖｏｌ１，２００４（非特許文献１））。
【０００６】
ＦＤＣＡの商業規模生成については多様な方法が提案されている（総説については、例えばＴｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  Ａ：Ｇｅｎｅｒａｌ，３８５，１−１３，２０１０（非特許文献２）を参照）ものの、現在のところ、ＦＤＣＡの主要な産業合成は、中間体５−ヒドロキシメチルフルフラール（５−ＨＭＦ）へのグルコースまたはフルクトースなどのヘキソースの化学的脱水の後にＦＤＣＡへの化学的酸化を行うことに依存している。しかし、現在の脱水を介したＦＤＣＡ生成プロセスは非選択的であることが多いため、それらの形成直後で無い限り、不安定な中間体生成物がより安定した物質へ転換し得ることが報告されている。そのため、ＦＤＣＡの生成および利用における主な技術的課題は、バイオマス由来の糖からの有効かつ選択的な脱水プロセスの開発である。
【０００７】
したがって、石油ベース原料に代わる再生可能エネルギーとして機能するだけでなく、エネルギーおよび資本集約的技術が少量ですむ代替的手段による、この極めて重要な化合物および他の多数の化学物質および代謝物の生成方法の開発が望まれている。詳細には、糖脱水の選択的制御は極めて強力な技術になり得るため、広範囲のさらなる低コストの構成要素がもたらされ得る。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｗｅｒｐｙ  ａｎｄ  Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ｔｏｐ  Ｖａｌｕｅ  Ａｄｄｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ｆｒｏｍ  Ｂｉｏｍａｓｓ．ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｅｎｅｒｇｙ，Ｂｉｏｍａｓｓ，Ｖｏｌ１，２００４
【非特許文献２】Ｔｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  Ａ：Ｇｅｎｅｒａｌ，３８５，１−１３，２０１０
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、１つ以上の酵素的経路の生成物を生成するための方法を提供する。本発明の方法において用いられる経路は、１つ以上の変換ステップ、例えば、グルロン酸からＤ−グルカレートへの酵素的変換（ステップ７）、５−ケトグルコネート（５−ＫＧＡ）からＬ−イズロン酸への酵素的変換（ステップ１５）、Ｌ−イズロン酸からイダル酸への酵素的変換（ステップ７ｂ）、および５−ケトグルコネートから４，６−ジヒドロキシ２，５−ジケトヘキサノエート（２，５−ＤＤＨ）への酵素的変換（ステップ１６）を含む。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、２，５−フランジカルボン酸（ＦＤＣＡ）を生成物として生成する。これらの方法は、酵素的変換および化学的変換の双方をステップとして含む。グルコースから５−デヒドロ−４−デオキシ−グルカレート（ＤＤＧ）への変換のため、およびグルコースからＦＤＣＡへの変換のための多様な経路も提供される。これらの方法は、特異性および効率が高い反応を行う遺伝子操作された酵素の使用も用い得る。
【００１０】
第１の態様において、本発明は、出発基質から酵素的経路または化学的経路の生成物を生成するための方法を提供する。経路は、以下の変換ステップのうちいずれか１つ以上を含み得る：グルロン酸からＤ−グルカレートへの酵素的変換（ステップ７）、５−ケトグルコネート（５−ＫＧＡ）からＬ−イズロン酸への酵素的変換（ステップ１５）、Ｌ−イズロン酸からイダル酸への酵素的変換（ステップ７ｂ）、および、５−ケトグルコネートから４，６−ジヒドロキシ２，５−ジケトヘキサノエート（２，５−ＤＤＨ）への酵素的変換（ステップ１６）、１，５−グルコノラクトンからグルロノラクトン（ｇｕｌｕｒｏｎｏ−ｌａｃｔｏｎｅ）への酵素的変換（ステップ１９）。
【００１１】
一実施形態において、酵素的経路の生成物は、５−デヒドロ−４−デオキシ−グルカレート（ＤＤＧ）である。様々な実施形態において、方法の基質はグルコースであり得、かつ生成物は５−デヒドロ−４−デオキシ−グルカレート（ＤＤＧ）であり得る。方法は、Ｄ−グルコースから１，５−グルコノラクトンへの酵素的変換（ステップ１）、１，５−グルコノラクトンからグルロノラクトンへの酵素的変換（ステップ１９）、グルロノラクトンからグルロン酸への酵素的変換（ステップ１Ｂ）、グルロン酸からＤ−グルカレートへの酵素的変換（ステップ７）、および、Ｄ−グルカレートから５−デヒドロ−４−デオキシ−グルカレート（ＤＤＧ）への酵素的変換（ステップ８）のステップを含み得る。
【００１２】
本発明の別の方法において、基質はグルコースであり、かつ生成物はＤＤＧであり、かつ方法は、Ｄ−グルコースから１，５−グルコノラクトンへの変換（ステップ１）、１，５−グルコノラクトンからグルコン酸への変換（ステップ１ａ）、グルコン酸から５−ケトグルコネート（５−ＫＧＡ）への変換（ステップ１４）、５−ケトグルコネート（５−ＫＧＡ）からＬ−イズロン酸への変換（ステップ１５）、Ｌ−イズロン酸からイダル酸への変換（ステップ７ｂ）、および、イダル酸からＤＤＧへの変換（ステップ８ａ）のステップを含む。
【００１３】
本発明の別の方法において、基質はグルコースであり、かつ生成物はＤＤＧであり、かつ方法は、Ｄ−グルコースから１，５−グルコノラクトンへの変換（ステップ１）、１，５−グルコノラクトンからグルコン酸への変換（ステップ１ａ）、グルコン酸から５−ケトグルコネート（５−ＫＧＡ）への変換（ステップ１４）、５−ケトグルコネート（５−ＫＧＡ）から４，６−ジヒドロキシ２，５−ジケトヘキサノエート（２，５−ＤＤＨ）への変換（ステップ１６）、４，６−ジヒドロキシ２，５−ジケトヘキサノエート（２，５−ＤＤＨ）から４−デオキシ−５−トレオ−ヘキソスロースウロン酸（ＤＴＨＵ）への変換（ステップ４）、および、４−デオキシ−５−トレオ−ヘキソスロースウロン酸（ＤＴＨＵ）からＤＤＧへの変換（ステップ５）のステップを含む。
【００１４】
本発明の別の方法において、基質はグルコースであり、かつ生成物はＤＤＧであり、かつ方法は、Ｄ−グルコースから１，５−グルコノラクトンへの変換（ステップ１）、１，５−グルコノラクトンからグルコン酸への変換（ステップ１ａ）、グルコン酸から５−ケトグルコネート（５−ＫＧＡ）への変換（ステップ１４）、５−ケトグルコネート（５−ＫＧＡ）からＬ−イズロン酸への変換（ステップ１５）、Ｌ−イズロン酸から４−デオキシ−５−トレオ−ヘキソスロースウロン酸（ＤＴＨＵ）への変換（ステップ７Ｂ）、および、４−デオキシ−５−トレオ−ヘキソスロースウロン酸（ＤＴＨＵ）からＤＤＧへの変換（ステップ５）のステップを含む。
【００１５】
本明細書中に開示される方法のいずれも、ＤＤＧを２，５−フラン−ジカルボン酸（ＦＤＣＡ）へ変換するステップをさらに含み得る。これらの方法のいずれかにおけるＤＤＧからＦＤＣＡへの変換は、ＤＤＧを無機酸と接触させてＤＤＧをＦＤＣＡへ変換することを含み得る。
【００１６】
別の態様において、本発明は、誘導体化（エステル化）ＦＤＣＡを合成するための方法を提供する。方法は、６０℃を超える温度でＤＤＧをアルコール、無機酸と接触させて、誘導体化ＦＤＣＡを形成するステップを含む。異なる実施形態において、アルコールは、メタノール、ブタノール、またはエタノールである。
【００１７】
別の態様において、本発明は、ＦＤＣＡの誘導体を合成するための方法を含む提供する。方法は、ＤＤＧをアルコール、無機酸、および共溶媒と接触させてＤＤＧの誘導体を生成するステップ、任意選択的にＤＤＧの誘導体を精製するステップ、およびＤＤＧの誘導体を無機酸と接触させてＦＤＣＡの誘導体を生成するステップを含む。無機酸は硫酸であり得、アルコールはエタノールまたはブタノールであり得る。様々な実施形態において、共溶媒は、ＴＨＦ、アセトン、アセトニトリル、エーテル、酢酸ブチル、ジオキサン、クロロホルム、塩化メチレン、１，２−ジクロロエタン、ヘキサン、トルエン、およびキシレンのいずれかであり得る。
【００１８】
一実施形態において、ＤＤＧの誘導体はジエチルＤＤＧであり、ＦＤＣＡの誘導体はジエチルＦＤＣＡであり、別の実施形態において、ＤＤＧの誘導体はジブチルＤＤＧであり、ＦＤＣＡの誘導体はジブチルＦＤＣＡである。
【００１９】
別の態様において、本発明は、ＦＤＣＡを合成するための方法を提供する。方法は、気相中でＤＤＧを無機酸と接触させるステップを含む。
【００２０】
別の態様において、本発明は、ＦＤＣＡを合成するための方法を提供する。方法は、１２０℃を超える温度でＤＤＧを無機酸と接触させるステップを含む。
【００２１】
別の態様において、本発明は、ＦＤＣＡを合成するための方法を提供する。方法は、無水反応条件下でＤＤＧを無機酸と接触させるステップを含む。
[本発明1001]
出発基質から酵素的経路または化学的経路の生成物を生成するための方法であって、該経路が、
グルロン酸からＤ−グルカレートへの酵素的変換（ステップ7）、
5−ケトグルコネート（5−ＫＧＡ）からＬ−イズロン酸への酵素的変換（ステップ15）、
Ｌ−イズロン酸からイダル酸への酵素的変換（ステップ7ｂ）、および
5−ケトグルコネートから4，6−ジヒドロキシ2，5−ジケトヘキサノエート（2，5−ＤＤＨ）への酵素的変換（ステップ16）、
1，5−グルコノラクトンからグルロノラクトン（ｇｕｌｕｒｏｎｏ−ｌａｃｔｏｎｅ）への酵素的変換（ステップ19）
からなる群から選択される1つ以上の変換ステップを含む、方法。
[本発明1002]
前記1つ以上の変換ステップが、グルロン酸からＤ−グルカレートへの酵素的変換（ステップ7）である、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記1つ以上の変換ステップが、5−ケトグルコネート（5−ＫＧＡ）からＬ−イズロン酸への酵素的変換（ステップ15）である、本発明1001の方法。
[本発明1004]
前記1つ以上の変換ステップが、Ｌ−イズロン酸からイダル酸への酵素的変換（ステップ7ｂ）である、本発明1001の方法。
[本発明1005]
前記1つ以上の変換ステップが、5−ケトグルコネートから4，6−ジヒドロキシ2，5−ジケトヘキサノエート（2，5−ＤＤＨ）への酵素的変換（ステップ16）である、本発明1001の方法。
[本発明1006]
前記1つ以上の変換ステップが、1，5−グルコノラクトンからグルロノラクトンへの酵素的変換（ステップ19）である、本発明1001の方法。
[本発明1007]
前記酵素的経路の前記生成物が5−デヒドロ−4−デオキシ−グルカレート（ＤＤＧ）である、本発明1001の方法。
[本発明1008]
前記基質がグルコースでありかつ前記生成物が5−デヒドロ−4−デオキシ−グルカレート（ＤＤＧ）であり、前記方法が、
Ｄ−グルコースから1，5−グルコノラクトンへの酵素的変換（ステップ1）、
1，5−グルコノラクトンからグルロノラクトンへの酵素的変換（ステップ19）、
グルロノラクトンからグルロン酸への酵素的変換（ステップ1Ｂ）、
グルロン酸からＤ−グルカレートへの酵素的変換（ステップ7）、
Ｄ−グルカレートから5−デヒドロ−4−デオキシ−グルカレート（ＤＤＧ）への酵素的変換（ステップ8）
のステップを含む、本発明1001の方法。
[本発明1009]
前記基質がグルコースでありかつ前記生成物がＤＤＧであり、前記方法が、
Ｄ−グルコースから1，5−グルコノラクトンへの変換（ステップ1）、
1，5−グルコノラクトンからグルコン酸への変換（ステップ1ａ）、
グルコン酸から5−ケトグルコネート（5−ＫＧＡ）への変換（ステップ14）、
5−ケトグルコネート（5−ＫＧＡ）からＬ−イズロン酸への変換（ステップ15）、
Ｌ−イズロン酸からイダル酸への変換（ステップ7ｂ）、および
イダル酸からＤＤＧへの変換（ステップ8ａ）
のステップを含む、本発明1001の方法。
[本発明1010]
前記基質がグルコースでありかつ前記生成物がＤＤＧであり、前記方法が、
Ｄ−グルコースから1，5−グルコノラクトンへの変換（ステップ1）、
1，5−グルコノラクトンからグルコン酸への変換（ステップ1ａ）、
グルコン酸から5−ケトグルコネート（5−ＫＧＡ）への変換（ステップ14）、
5−ケトグルコネート（5−ＫＧＡ）から4，6−ジヒドロキシ2，5−ジケトヘキサノエート（2，5−ＤＤＨ）への変換（ステップ16）、
4，6−ジヒドロキシ2，5−ジケトヘキサノエート（2，5−ＤＤＨ）から4−デオキシ−5−トレオ−ヘキソスロースウロン酸（ＤＴＨＵ）への変換（ステップ4）、および
4−デオキシ−5−トレオ−ヘキソスロースウロン酸（ＤＴＨＵ）からＤＤＧへの変換（ステップ5）
のステップを含む、本発明1001の方法。
[本発明1011]
前記基質がグルコースでありかつ前記生成物がＤＤＧであり、前記方法が、
Ｄ−グルコースから1，5−グルコノラクトンへの変換（ステップ1）、
1，5−グルコノラクトンからグルコン酸への変換（ステップ1ａ）、
グルコン酸から5−ケトグルコネート（5−ＫＧＡ）への変換（ステップ14）、
5−ケトグルコネート（5−ＫＧＡ）からＬ−イズロン酸への変換（ステップ15）、
Ｌ−イズロン酸から4−デオキシ−5−トレオ−ヘキソスロースウロン酸（ＤＴＨＵ）への変換（ステップ7ｃ）、および
4−デオキシ−5−トレオ−ヘキソスロースウロン酸（ＤＴＨＵ）からＤＤＧへの変換（ステップ5）
のステップを含む、本発明1001の方法。
[本発明1012]
前記ＤＤＧを2，5−フラン−ジカルボン酸（ＦＤＣＡ）へ変換するステップをさらに含む、本発明1008の方法。
[本発明1013]
前記ＤＤＧを2，5−フラン−ジカルボン酸（ＦＤＣＡ）へ変換するステップをさらに含む、本発明1009の方法。
[本発明1014]
前記ＤＤＧを2，5−フラン−ジカルボン酸（ＦＤＣＡ）へ変換するステップをさらに含む、本発明1010の方法。
[本発明1015]
前記ＤＤＧを2，5−フラン−ジカルボン酸（ＦＤＣＡ）へ変換するステップをさらに含む、本発明1011の方法。
[本発明1016]
前記ＤＤＧをＦＤＣＡへ変換するステップが、ＤＤＧを酸と接触させて該ＤＤＧをＦＤＣＡへ変換することを含む、本発明1012の方法。
[本発明1017]
前記ＤＤＧをＦＤＣＡへ変換するステップが、ＤＤＧを酸と接触させて該ＤＤＧをＦＤＣＡへ変換することを含む、本発明1013の方法。
[本発明1018]
前記ＤＤＧをＦＤＣＡへ変換するステップが、ＤＤＧを酸と接触させて該ＤＤＧをＦＤＣＡへ変換することを含む、本発明1014の方法。
[本発明1019]
前記ＤＤＧをＦＤＣＡへ変換するステップが、ＤＤＧを酸と接触させて該ＤＤＧをＦＤＣＡへ変換することを含む、本発明1015の方法。
[本発明1020]
60℃を超える温度でＤＤＧをアルコール、無機酸と接触させて、ＦＤＣＡを形成するステップ
を含む、ＦＤＣＡの誘導体を合成するための方法。
[本発明1021]
前記アルコールがブタノールまたはエタノールである、本発明1020の方法。
[本発明1022]
少なくとも25％モルの収率を有する、本発明1020の方法。
[本発明1023]
ＤＤＧをアルコール、無機酸、および任意選択的に共溶媒と接触させて、ＤＤＧの誘導体を生成するステップ
を含む、ＤＤＧの誘導体を合成する方法。
[本発明1024]
（ａ）前記アルコールがエタノールまたはブタノールであり、
（ｂ）前記無機酸が硫酸であり、かつ
（ｃ）前記共溶媒が、ＴＨＦ、アセトン、アセトニトリル、エーテル、酢酸エチル、酢酸ブチル、ジオキサン、クロロホルム、塩化メチレン、1，2−ジクロロエタン、ヘキサン、ヘプタン、トルエン、四塩化炭素、石油エーテル、およびキシレンからなる群から選択される、
本発明1023の方法。
[本発明1025]
ＤＤＧの誘導体を無機酸と接触させて、ＦＤＣＡの誘導体を生成するステップ
を含む、ＦＤＣＡの誘導体を合成するための方法。
[本発明1026]
25％モルを超える収率を有する、本発明1025の方法。
[本発明1027]
前記誘導体が、メチル−ＤＤＧ、エチル−ＤＤＧ、ブチル−ＤＤＧ、ジメチルＤＤＧ、ジエチル−ＤＤＧ、およびジブチルＤＤＧからなる群から選択されるＤＤＧである、本発明1026の方法。
[本発明1028]
前記ＦＤＣＡの誘導体を脱エステル化してＦＤＣＡを得るステップをさらに含む、本発明1025の方法。
[本発明1029]
前記ＦＤＣＡの誘導体を重合するステップをさらに含む、本発明1025の方法。
[本発明1030]
気相中でＤＤＧを無機酸と接触させるステップ
を含む、ＦＤＣＡを合成するための方法。
[本発明1031]
120℃を超える温度でＤＤＧを無機酸と接触させるステップ
を含む、ＦＤＣＡを合成するための方法。
[本発明1032]
無水反応条件下でＤＤＧを無機酸と接触させるステップ
を含む、ＦＤＣＡを合成するための方法。
[本発明1033]
出発基質から酵素的経路または化学的経路の生成物を生成するための方法であって、該経路が、
ＤＴＨＵからＤＤＧへの変換（ステップ5）、
グルコン酸からグルロン酸への変換（ステップ6）、
ＤＥＨＵからＤＤＨへの変換（ステップ7Ａ）、
グルロン酸からＤＥＨＵへの変換（ステップ17Ａ）
からなる群から選択される1つ以上の変換ステップを含む、方法。
[本発明1034]
前記基質がグルコースでありかつ前記生成物がＤＤＧであり、前記方法が、
Ｄ−グルコースから1，5−グルコノラクトンへの変換（ステップ1）、
1，5−グルコノラクトンからグルコン酸への変換（ステップ1ａ）、
グルコン酸から3−デヒドロ−グルコン酸（ＤＨＧ）への変換（ステップ2）、
3−デヒドロ−グルコン酸（ＤＨＧ）から4，6−ジヒドロキシ2，5−ジケトヘキサノエート（2，5−ＤＤＨ）への変換（ステップ3）、
2，5ＤＤＨから4−デオキシ−5−トレオ−ヘキソスロースウロン酸（ＤＴＨＵ）への変換（ステップ4）、
ＤＴＨＵからＤＤＧへの変換（ステップ5）
のステップを含む、本発明1033の方法。
[本発明1035]
前記基質がグルコースでありかつ前記生成物がＤＤＧであり、前記方法が、
Ｄ−グルコースから1，5−グルコノラクトンへの変換（ステップ1）、
1，5−グルコノラクトンからグルコン酸への変換（ステップ1ａ）、
グルコン酸からグルロン酸への変換（ステップ6）、
グルロン酸からグルカレートへの変換（ステップ7）、
グルカレートからＤＤＧへの変換（ステップ8）
のステップを含む、本発明1033の方法。
[本発明1036]
前記基質がグルコースでありかつ前記生成物がＤＤＧであり、前記方法が、
Ｄ−グルコースから1，5−グルコノラクトンへの変換（ステップ1）、
1，5−グルコノラクトンからグルコン酸への変換（ステップ1ａ）、
グルコン酸から5−ケトグルコネート（5−ＫＧＡ）への変換（ステップ14）、
5−ケトグルコネート（5−ＫＧＡ）から4，6−ジヒドロキシ2，5−ジケトヘキサノエート（2，5−ＤＤＨ）への変換（ステップ16）、
4，6−ジヒドロキシ2，5−ジケトヘキサノエート（2，5−ＤＤＨ）から4−デオキシ−5−トレオ−ヘキソスロースウロン酸（ＤＴＨＵ）への変換（ステップ4）、および
4−デオキシ−5−トレオ−ヘキソスロースウロン酸（ＤＴＨＵ）からＤＤＧへの変換（ステップ5）
のステップを含む、本発明1033の方法。
[本発明1037]
前記基質がグルコースでありかつ前記生成物がＤＤＧであり、前記方法が、
Ｄ−グルコースから1，5−グルコノラクトンへの変換（ステップ1）、
1，5−グルコノラクトンからグルコン酸への変換（ステップ1ａ）、
グルコン酸から5−ケトグルコネート（5−ＫＧＡ）への変換（ステップ14）、
5−ケトグルコネート（5−ＫＧＡ）からＬ−イズロン酸への変換（ステップ15）、
Ｌ−イズロン酸から4−デオキシ−5−トレオ−ヘキソスロースウロン酸（ＤＴＨＵ）への変換（ステップ7Ｂ）、
4−デオキシ−5−トレオ−ヘキソスロースウロン酸（ＤＴＨＵ）からＤＤＧへの変換（ステップ5）
のステップを含む、本発明1033の方法。
[本発明1038]
前記基質がグルコースでありかつ前記生成物がＤＤＨであり、前記方法が、
Ｄ−グルコースから1，5−グルコノラクトンへの変換（ステップ1）、
1，5−グルコノラクトンからグルロン酸ラクトンへの変換（ステップ19）、
グルロン酸ラクトンからグルロン酸への変換（ステップ1Ｂ）、
グルロン酸からＤＥＨＵへの変換（ステップ17Ａ）、
ＤＥＨＵからＤＤＨへの変換（ステップ7Ａ）
のステップを含む、本発明1033の方法。
[本発明1039]
前記基質がグルコースでありかつ前記生成物がＤＤＨであり、前記方法が、
Ｄ−グルコースから1，5−グルコノラクトンへの変換（ステップ1）、
1，5−グルコノラクトンからグルコン酸への変換（ステップ1ａ）、
グルコン酸からグルロン酸への変換（ステップ6）、
グルロン酸からＤＥＨＵへの変換（ステップ17Ａ）、
ＤＥＨＵからＤＤＨへの変換（ステップ7Ａ）
のステップを含む、本発明1033の方法。
[本発明1040]
前記1つ以上の変換ステップが、ＤＴＨＵからＤＤＧへの変換（ステップ5）である、本発明1033の方法。
[本発明1041]
前記1つ以上の変換ステップが、グルコン酸からグルロン酸への変換（ステップ6）である、本発明1033の方法。
[本発明1042]
前記1つ以上の変換ステップが、ＤＥＨＵからＤＤＨへの変換（ステップ7Ａ）である、本発明1033の方法。
[本発明1043]
前記1つ以上の変換ステップが、グルロン酸からＤＥＨＵへの変換（ステップ17Ａ）である、本発明1033の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】タンパク質４７４、４７５、および４７６の粗溶解物および精製酵素の電気泳動ゲルである。
【図２Ａ】図２Ａ〜２Ｈはそれぞれルート１、２、２Ａ、２Ｃ、２Ｄ、２Ｅ、および２Ｆの経路の模式図である。
【図２Ｂ】図２Ａの続きを示す図である。
【図２Ｃ】図２Ｂの続きを示す図である。
【図２Ｄ】図２Ｃの続きを示す図である。
【図２Ｅ】図２Ｄの続きを示す図である。
【図２Ｆ】図２Ｅの続きを示す図である。
【図２Ｇ】図２Ｆの続きを示す図である。
【図２Ｈ】図２Ｇの続きを示す図である。
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｃはそれぞれルート３、４、および５の経路の模式図である。
【図３Ｂ】図３Ａの続きを示す図である。
【図３Ｃ】図３Ｂの続きを示す図である。
【図４】ｐＳＧＩ−３５９によるＤＨＧの生成のためのグルコン酸デヒドラターゼを用いたグルコネートの脱水に関するＨＰＣＬ−ＭＳ分析である。
【図５】グルコン酸デヒドラターゼの活性の測定のためのセミカルバジドアッセイプロットの図表である。
【図６Ａ】本発明の３つの酵素によるグルクロネートの酸化のためのラインウィーバー−バークプロットを提供する。
【図６Ｂ】本発明の３つの酵素によるイズロネートの酸化のためのラインウィーバー−バークプロットを提供する。
【図７Ａ】ＥＣ５．３．１．１７ファミリー中の酵素ＤＴＨＵイソメラーゼを用いた５ＫＧＡおよびイズロネートの異性化のためのＨＰＬＣ分析の時点の結果を示す。対照：対照として、死滅酵素は、加熱不活性化した酵素である。Ｍｅｄ  Ｂｌは、イソメラーゼ添加無しの反応を指す。時点、ｘ軸１＝０．５時間；２＝１；３＝２時間；４＝１６時間である。
【図７Ｂ】ＥＣ５．３．１．１７ファミリー中の酵素を用いた５ＫＧＡおよびイズロネートの異性化の時点のＨＰＬＣ分析を示す。対照：対照として、死滅酵素は、加熱不活性化した酵素である。Ｍｅｄ  Ｂｌは、イソメラーゼ添加無しの反応を指す。時点、Ｘ軸：１＝０時間；２＝１時間；３＝２時間；４＝１７時間である。
【図８】ＥＣ５．３．１．ｎ１ファミリー中の酵素を用いた５ＫＧＡおよびイズロネートの異性化に関する生成物形成を示す。本データは、酵素的アッセイ法から得られた。
【図９】２，５−ＤＤＨの形成のＨＰＬＣ分析と、５ＫＧＡ濃度の経時的低減とを示す。２，５−ＤＤＨの合計イオンカウントが示されている。
【図１０】１，５−グルコノラクトンからのグルロン酸ラクトンの生成を示すＨＰＬＣ−ＭＳクロマトグラムである。真正グルロン酸のトレースのオーバーレイが示されている。
【図１１】スキーム６の反応経路の模式図である。
【図１２Ａ】図１２Ａおよび図１２Ｂは、それぞれ、５−ＫＧＡおよびＤＤＧ反応生成物を示すＬＣ−ＭＳクロマトグラムである。
【図１２Ｂ】図１２Ａの続きを示す図である。
【図１３】ＦＤＣＡおよびＦＤＣＡジブチルエステル誘導体反応生成物を示すＬＣ−ＭＳクロマトグラムである。
【図１４Ａ】ＤＤＧとエタノールとの反応からのジエチル−ＦＤＣＡ合成の粗反応試料のＧＣ−ＭＳ分析である。単一ピークは、ジエチル−ＦＤＣＡに対応していた。
【図１４Ｂ】ＤＤＧとエタノールとの反応からの主要生成物のＭＳ断片化である。
【図１５Ａ】ＤＤＧとエタノールとの反応からのジエチル−ＦＤＣＡ合成の粗反応試料のＧＣ−ＭＳ分析である。単一ピークは、ジエチル−ＦＤＣＡに対応していた。
【図１５Ｂ】ＤＤＧとエタノールとの反応からの主要生成物のＭＳ断片化である。
【図１６】ＤＴＨＵからのＦＤＣＡおよびその誘導体の合成の模式図である。
【図１７Ａ】スキーム１の模式図である。グルコースからのＤＤＧの無細胞酵素合成。酵素を以下に示す：ＳＴ−１：グルコースオキシダーゼ；ＳＴ−１Ａ：加水分解−化学物質；ＳＴ−１４：グルコン酸デヒドロゲナーゼ（ｐＳＧＩ−５０４）；ＳＴ−１５：５−デヒドロ−４−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸イソメラーゼ（ＤＴＨＵＩＳ、ｐＳＧＩ−４３４）；ＳＴ−７Ｂ：ウロン酸デヒドロゲナーゼ（ＵｒｏＤＨ、ｐＳＧＩ−４７６））；ＳＴ−８Ａグルカル酸デヒドラターゼ（ＧｌｕｃＤＨ、ｐＳＧＩ−３５３）；ＳＴ−Ａ：ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ（ＮＡＤＨ＿ＯＸ、ｐＳＧＩ−４３１）；ＳＴ−Ｂ：カタラーゼ。
【図１７Ｂ】最初の３時間における、ＨＰＬＣによって分析された反応中間体の濃度を示す。双方の反応において、ＤＤＧ形成が示される。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、酵素的経路の生成物を生成するための方法を提供する。これらの方法は、基質から生成物への酵素的変換を含み得る。本発明の酵素的および化学的経路を用いることにより、広範な多様な生成物を効率的かつ経済的に合成することが可能になる。本発明の方法および経路によって生成することが可能な１つの生成物として、本発明に従って商業規模で生成することが可能な２，５−フラニルジカルボン酸（ＦＤＣＡ）がある。方法は、本明細書中に開示される、１つ以上の酵素的基質および／または化学的基質から生成物への変換ステップを含み得る。
【００２４】
本発明の経路は、１つ以上のステップを含む。本発明の経路のステップは、正反応または逆反応を含み得て、すなわち、基質Ａは中間体Ｂおよび生成物Ｃへ変換される一方、逆反応においては、基質Ｃは中間体Ｂおよび生成物Ａへ変換されることが理解される。これらの方法において、他に特記無き限り、正反応および逆反応をステップとして説明する。
【００２５】
これらの方法は、酵素的経路であり得る経路の生成物を生成するステップを含む。いくつかの実施形態において、これらの経路は、１つ以上の化学的ステップを含み得る。これらの方法は、基質から生成物への変換の、１つ以上の酵素的および／または化学的変換ステップを含む。方法に含まれ得るステップは、例えば、グルロン酸からＤ−グルカレートへの酵素的変換（ステップ７）、Ｌ−イズロン酸からイダル酸への酵素的変換（７Ｂ）、Ｌ−イズロン酸から４−デオキシ−５−トレオ−ヘキソスロースウロン酸（ＤＴＨＵ）への酵素的変換（７Ｂ）、５−ケトグルコネート（５−ＫＧＡ）からＬ−イズロン酸への酵素的変換（ステップ１５）、Ｌ−イズロン酸からイダル酸への酵素的変換（ステップ７Ｂ）、５−ケトグルコネートから４，６−ジヒドロキシ２，５−ジケトヘキサノエート（２，５−ＤＤＨ）への酵素的変換（ステップ１６）、１，５−グルコノラクトンからグルロノラクトンへの酵素的変換（ステップ１９）の任意の１つ以上を含む。上記のステップの任意の１つ以上が、本発明の方法または経路に含まれ得る。酵素的ステップまたは経路は、ステップの進行のために酵素を反応における触媒として必要とするステップまたは経路である。化学的ステップは、酵素を反応における触媒として用いる必要無く行うことが可能である。方法に記載されるステップの任意の１つ以上は、酵素的ステップであり得る。いくつかの実施形態において、経路の各ステップは全て酵素的ステップであり、他の実施形態において、経路における１つ以上のステップは化学的ステップである。
【００２６】
いくつかの実施形態において、方法のいずれも、変換を行う酵素を含む反応混合物への反応の基質の添加を含むステップを含み得る。よって、グルロン酸をＤ−グルカレートへ変換する方法（ステップ７）は、反応混合物への、出発基質としてのグルロン酸の添加を含み得、Ｌ−イズロン酸からイダル酸への酵素的変換（７Ｂ）は、反応混合物への、出発基質としてのＬ−イズロン酸の添加を含み得、Ｌ−イズロン酸から４−デオキシ−５−トレオ−ヘキソスロースウロン酸（ＤＴＨＵ）への酵素的変換（７Ｂ）は、反応混合物への、出発基質としてのＤＴＨＵの添加を含み得る。方法のいずれにも含まれ得る別のステップは、反応混合物から反応生成物を精製するステップである。よって、Ｄ−グルカレートまたはＬ−イズロン酸、またはイダル酸、または４，６−ジヒドロキシ２，５−ジケトヘキサノエートを精製するステップは、本明細書中に記載される方法のいずれにも含まれ得る。本明細書中に開示される方法のいずれも、反応混合物からＤＤＧまたはＦＤＣＡを分離または精製するステップを含み得る。
【００２７】
方法において用いられる反応混合物は、酵素的変換を行う１つ以上の酵素を含む細胞の細胞溶解物であり得るが、反応混合物の形成のためにユーザが添加した成分を含む反応混合物であってもよいか、あるいは、細胞溶解物から精製された成分を含でもよいか、あるいは細胞生体触媒全体中に含めてもよい。
【００２８】
様々な実施形態において、本発明の方法は、グルコースからＤＤＧへ変換する方法、またはグルコースからＦＤＣＡへ変換する方法、またはグルコースからＤＴＨＵもしくはＤＥＨＵへ変換する方法、あるいはＤＤＧからＦＤＣＡへ変換するための方法である。これらの方法は、方法において出発基質を生成物へ変換するステップを含み得る。出発基質は、方法を開始すると考えられる化学物質であり、生成物は、方法の最終生成物とみなされる化学物質である。中間体とは、（一時的にであれまたは恒久的にであれ）方法において生成される、出発基質と生成物との間に存在する化学物質である。様々な実施形態において、本発明の方法および経路は、約４個または約５個の中間体または４〜５個の中間体、または約３個の中間体または３〜５個の中間体、または６個未満または７個未満または８個未満または９個未満または１０個未満または１５個未満または２０個未満の中間体を有し、すなわち、これらの値は出発基質または最終生成物の数に含まれない。
【００２９】
本発明は、高い収率を有する、グルコースからＦＤＣＡおよび／またはＤＤＧを生成する方法を提供する。理論的収量とは、反応が理想的な条件下で完了した場合に形成されるであろう生成物の量である。異なる実施形態において、本発明の方法は、ＤＤＧをグルコース、フルクトース、またはガラクトースから生成し、理論的収量が少なくとも５０％モル、または少なくとも６０％モルまたは少なくとも７０％モル、または少なくとも８０％モル、少なくとも９０％モルまたは少なくとも９５％モルまたは少なくとも９７％モルまたは少なくとも９８％モルまたは少なくとも９９％モル、あるいは理論的収量が１００％モルである。本発明の方法はまた、少なくとも８０％または少なくとも９０％または少なくとも９９％、または１００％の炭素保持で生成物を提供し、すなわち、初期基質中に存在する特定の炭素原子は、方法の最終生成物中に記載のパーセンテージで存在する。いくつかの実施形態において、方法は、グルコースから脱水反応を介してＤＤＧおよび／またはＦＤＣＡを生成する。
【００３０】
合成ルート
本発明はまた、所望の生成物を合成および生成するための特定の経路を提供する。以下の記載のルートまたは経路のいずれも、グルコースで開始し得、所望の生成物へ流れ得る。いくつかの実施形態において、Ｄ−グルコースは出発基質であり、経路の任意の中間体または最終生成物への経路の方向は下流方向とみなされ、グルコースへの反対方向は上流方向と見なされる。ルートまたは経路は、下流方向または上流方向に流れ得ることが認識される。また、グルコース、フルクトース、ガラクトース、またはいずれかの経路中の任意の中間体も、本発明の方法における出発基質であり得、ＤＤＧ、ＦＤＣＡ、または本発明のルートまたは経路のいずれか中の任意の中間体も、本発明の方法の最終生成物であり得ることが理解される。よって、開示の方法は、任意の出発基質または中間体を開示のルートまたは経路のいずれか中のステップの１つ以上を用いて、開示のルートまたは経路中の任意の最終生成物または中間体へ変換するための本発明のルートまたは経路のいずれか中の開示の任意の１つ以上のステップを含む。よって、例えば、方法は、グルコースからＤＤＧへ、もしくはグルコースからグルロン酸へ、もしくはグルコースからガラクタレートへ、もしくはグルコースからＤＴＨＵへ、もしくはグルコースからＤＥＨＵへ変換するための方法、またはグルコースからグルロン酸への変換するための方法、またはグルコースからイズロン酸への変換するための方法、またはグルコースからイダル酸への変換するための方法、またはグルコースからグルカル酸への変換するための方法、またはガラクタレートからＤＤＧへの変換するための方法、またはグルロン酸からＤ−グルカレートへの変換するための方法、または５−ＫＧＡからＬ−イズロン酸への変換するための方法、またはＬ−イズロン酸からイダル酸への変換するための方法、または５−ＫＧＡから２，５−ＤＤＨ、もしくはＤＴＨＵへの変換するための方法、またはＤＨＧからＤＥＨＵへの変換するための方法であり得る。これらの実施形態において、方法は、方法において開示されるステップと、出発基質としてのグルコースから関連最終生成物への本発明の経路とを用いる。
【００３１】
ルート１を図２Ａに示す。ルート１は、Ｄ−グルコース（または経路中の任意の中間体）を一連の示されるステップを介して酵素的経路を介して５−デヒドロ−４−デオキシ−グルカレート（ＤＤＧ）へ変換する。ルート１は、１，５−グルコノラクトン、グルコン酸、３−デヒドロ−グルコン酸（ＤＨＧ）、４，６−ジヒドロキシ２，５−ジケトヘキサノエート（２，５−ＤＤＨ）、および４−デオキシ−Ｌ−トレオ−ヘキソスロースウロン酸（ＤＴＨＵ）を中間体として有しかつＤＤＧを最終生成物として有する回路を介して、Ｄ−グルコースをＤＤＧへ変換する。経路のいずれについても、図示しないさらなる中間体が存在し得る。これらのステップは、Ｄ−グルコースから１，５−グルコノラクトンへの酵素的変換（ステップ１）と、１，５−グルコノラクトンからグルコン酸への酵素的変換（ステップ１Ａ）と、グルコン酸から３−デヒドロ−グルコン酸（ＤＨＧ）への酵素的変換（ステップ２）と、３−デヒドロ−グルコン酸（ＤＨＧ）から４，６−ジヒドロキシ２，５−ジケトヘキサノエート（２，５−ＤＤＨ）への酵素的変換（ステップ３）と、４，６−ジヒドロキシ２，５−ジケトヘキサノエート（２，５−ＤＤＨ）から４−デオキシ−Ｌ−トレオ−ヘキソスロースウロン酸（ＤＴＨＵ）への酵素的変換（ステップ４）と、４−デオキシ−Ｌ−トレオ−ヘキソスロースウロン酸（ＤＴＨＵ）から５−デヒドロ−４−デオキシグルカレート（ＤＤＧ）への酵素的変換（ステップ５）とである。ルート１はまた、経路中のグルコースまたは任意の中間体が最終生成物としての任意の他の下流中間体へ変換されるサブルートを含み、生成物サブルートへの各基質は、本明細書中にあたかも完全に記載されているかのように開示されているものとしてみなされる。
【００３２】
ルート２を図２Ｂに示し、ルート２は、Ｄ−グルコースをＤＤＧへ変換する。ルート２経路中のステップは、Ｄ−グルコースから１，５−グルコノラクトンへの酵素的変換（ステップ１）と、１，５−グルコノラクトンからグルコン酸への酵素的変換（ステップ１Ａ）と、グルコン酸からグルロン酸への酵素的変換（ステップ６）と、グルロン酸からＤ−グルカレートへの酵素的変換（ステップ７）と、Ｄ−グルカレートからＤＤＧへの酵素的変換（ステップ８）とである。ルート２はまた、経路中のグルコースまたは任意の中間体が最終生成物としての任意の他の下流中間体へ変換されるサブルートを含み、各サブルートは、本明細書中にあたかも完全に記載されているかのように開示されているものとしてみなされる。
【００３３】
ルート２Ａを図２Ｃに示す。ルート２Ａにおけるステップは、Ｄ−グルコースから１，５−グルコノラクトンへの酵素的変換（ステップ１）と、１，５−グルコノラクトンからグルロン酸ラクトンへの酵素的変換（ステップ１９）と、グルロン酸ラクトンからグルロン酸への酵素的変換（ステップ１Ｂ）と、グルロン酸からＤ−グルカレートへの酵素的変換（ステップ７）と、Ｄ−グルカレートから５−デヒドロ−４−デオキシ−グルカレート（ＤＤＧ）への酵素的変換（ステップ８）とである。ルート２Ａはまた、出発基質としての経路中のグルコースまたは任意の中間体が、最終生成物としての任意の他の下流中間体へ変換される、サブルートを含み、各サブルートは、本明細書中にあたかも完全に記載されているかのように開示されているものとしてみなされる。
【００３４】
ルート２Ｂを図２Ｄに示す。ルート２Ｂにおけるステップは、Ｄ−グルコースからグルコン酸への酵素的変換（ステップ１および１Ａ）と、グルコン酸から５−ケトグルコネート（５−ＫＧＡ）への酵素的変換（ステップ１４）と、５−ＫＧＡからＬ−イズロン酸への酵素的変換（ステップ１５）と、Ｌ−イズロン酸からイダル酸への酵素的変換（ステップ７Ｂ）と、イダル酸からＤＤＧへの酵素的変換（ステップ８Ａ）とである。ルート２Ｂはまた、出発基質としての経路中のグルコースまたは任意の中間体が、最終生成物としての任意の他の下流中間体へ変換される、サブルートを含む。各サブルートは、本明細書中にあたかも完全に記載されているかのように開示されているものとしてみなされる。
【００３５】
ルート２Ｃを図２Ｅに示す。ルート２Ｃにおけるステップは、Ｄ−グルコースからグルコン酸への酵素的変換（ステップ１および１Ａ）と、グルコン酸から５−ケトグルコネート（５−ＫＧＡ）への酵素的変換（ステップ１４）と、５−ＫＧＡから４，６−ジヒドロキシ２，５−ジケトヘキサノエート（２，５−ＤＤＨ）への酵素的変換（ステップ１６）と、４，６−ジヒドロキシ２，５−ジケトヘキサノエート（２，５−ＤＤＨ）から４−デオキシ−５−トレオ−ヘキソスロースウロン酸（ＤＴＨＵ）への酵素的変換（ステップ４）と、ＤＴＨＵからＤＤＧへの酵素的変換（ステップ５）とである。ルート２Ｃはまた、出発基質としての経路中のグルコースまたは任意の中間体が、最終生成物としての任意の他の下流中間体へ変換される、サブルートを含み、各サブルートは、本明細書中にあたかも完全に記載されているかのように開示されているものとしてみなされる。
【００３６】
ルート２Ｄを図２Ｆに示す。ルート２Ｄにおけるステップは、Ｄ−グルコースからグルコン酸への酵素的変換（ステップ１および１Ａ）と、グルコン酸から５−ケトグルコネート（５−ＫＧＡ）への酵素的変換（ステップ１４）と、５−ＫＧＡからイズロン酸への酵素的変換（ステップ１５）と、Ｌ−イズロン酸からＤＴＨＵへの酵素的変換（ステップ１７）と、ＤＴＨＵからＤＤＧへの酵素的変換（ステップ５）とである。ルート２Ｄはまた、出発基質としての経路中のグルコースまたは任意の中間体が、最終生成物としての任意の他の下流中間体へ変換される、サブルートを含み、各サブルートは、本明細書中にあたかも完全に記載されているかのように開示されているものとしてみなされる。
【００３７】
ルート２Ｅを図２Ｇに示す。ルート２Ｄにおけるステップは、Ｄ−グルコースから１，５−グルコノラクトンへの酵素的変換（ステップ１）と、１，５−グルコノラクトンからグルロン酸ラクトンへの酵素的変換（ステップ１９）と、グルロン酸ラクトンからグルロン酸への酵素的変換（ステップ１Ｂ）と、グルロン酸から４−デオキシ−エリトロ−ヘキソスロースウロン酸（ＤＥＨＵ）への酵素的変換（ステップ１７Ａ）と、ＤＥＨＵから３−デオキシ−Ｄ−エリトロ−２−ヘキスロサル酸（ＤＤＨ）への酵素的変換（ステップ７Ａ）とである。ルート２Ｅはまた、出発基質としての経路中のグルコースまたは任意の中間体が、最終生成物としての任意の他の下流中間体へ変換される、サブルートを含み、各サブルートは、本明細書中にあたかも完全に記載されているかのように開示されているものとしてみなされる。
【００３８】
ルート２Ｆを図２Ｈに示す。ルート２Ｆにおけるステップは、Ｄ−グルコースからグルコン酸への酵素的変換（ステップ１および１Ａ）と、グルコン酸からグルロン酸への酵素的変換（ステップ６）と、グルロン酸から４−デオキシ−エリトロ−ヘキソスロースウロン酸（ＤＥＨＵ）への酵素的変換（ステップ１７）と、ＤＥＨＵから３−デオキシ−Ｄ−エリトロ−２−ヘキスロサル酸（ＤＤＨ）への酵素的変換（ステップ７Ａ）とである。ルート２Ｆはまた、出発基質としての経路中のグルコースまたは任意の中間体が、最終生成物としての任意の他の下流中間体へ変換される、サブルートを含み、各サブルートは、本明細書中にあたかも完全に記載されているかのように開示されているものとしてみなされる。
【００３９】
ルート３を図３Ａに示す。ルート３におけるステップは、Ｄ−グルコースからグルコン酸への酵素的変換（ステップ１および１Ａ）と、グルコン酸から３−デヒドロ−グルコン酸（ＤＨＧ）への酵素的変換（ステップ２）と、ＤＨＧから４−デオキシ−エリトロ−ヘキソスロースウロン酸（ＤＥＨＵ）への酵素的変換（ステップ６Ａ）と、ＤＥＨＵからＤＤＧへの酵素的変換（ステップ７Ａ）とである。ルート３はまた、出発基質としての経路中のグルコースまたは任意の中間体が、最終生成物としての任意の他の下流中間体へ変換される、サブルートを含み、各サブルートは、本明細書中にあたかも完全に記載されているかのように開示されているものとしてみなされる。
【００４０】
ルート４を図３Ｂに示す。ルート４におけるステップは、Ｄ−グルコースからａ−Ｄ−グルコ−ヘキソジアルド−１，５−ピラノースへの酵素的変換（ステップ９）と、ａ−Ｄ−グルコ−ヘキソジアルド−１，５−ピラノースからａ−Ｄ−グルコピラヌロン酸への酵素的変換（ステップ１０）と、ａ−Ｄ−グルコピラヌロン酸からＤ−グルカル酸１，５−ラクトンへの酵素的変換（ステップ１１）と、Ｄ−グルカル酸１，５−ラクトンからＤ−グルカレートへの酵素的変換（ステップ１Ｃ）と、Ｄ−グルカレートからＤＤＧへの酵素的変換（ステップ８）とである。ルート４はまた、出発基質としての経路中のグルコースまたは任意の中間体が、最終生成物としての任意の他の下流中間体へ変換される、サブルートを含み、各サブルートは、本明細書中にあたかも完全に記載されているかのように開示されているものとしてみなされる。
【００４１】
ルート５を図３Ｃに示す。ルート５におけるステップは、Ｄ−ガラクトースからＤ−ガラクト−ヘキソジアルドースへの酵素的変換（ステップ９Ａ）と、Ｄ−ガラクト−ヘキソジアルドースからガラクツロネートへの酵素的変換（ステップ１０Ａ）と、ガラクツロネートからガラクタレートへの酵素的変換（ステップ１１Ａ）と、ガラクタレートからＤＤＧへの酵素的変換（ステップ１３）とである。ルート５はまた、出発基質としての経路中のガラクトースまたは任意の中間体が、最終生成物としての任意の他の下流中間体へ変換される、サブルートを含み、各サブルートは、本明細書中にあたかも完全に記載されているかのように開示されているものとしてみなされる。
【００４２】
酵素的ステップ
本明細書中に概要を示す方法のステップを行うことが可能な広範な様々な酵素（およびこれらの酵素をコードする核酸）が開示される。本明細書中に開示される本発明のステップを行うための酵素のファミリーおよびクラスに加えて、任意の酵素または本明細書中に開示される酵素のクラスのメンバーに対して配列同一性を有するさらなる酵素（または酵素をコードする核酸）も、任意の酵素または本明細書中に開示される酵素のクラスのメンバーに対して少なくとも４０％または少なくとも５０％または少なくとも６０％または少なくとも７０％または少なくとも８０％または少なくとも９０％または少なくとも９５％または少なくとも９７％または少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するものであれば、本発明において有用である。アミノ酸またはヌクレオチド配列に対するパーセント単位の配列同一性または相同性は、本明細書中、最大パーセントの同一性または相同性を達成するように配列を最大パーセントの同一性のためにアライメントさせ必要ならばギャップを導入した後の、公知のポリペプチドと同一である候補配列中のアミノ酸またはヌクレオチド残基のパーセンテージとして定義される。ヌクレオチドまたはアミノ酸配列レベルにおける相同性または同一性は、配列類似検索に合わせて個別調整された当該分野において公知の方法によって決定することができ、この公知の方法は非限定的に、プログラムであるｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、およびｔｂｌａｓｔｘによって用いられるアルゴリズムを用いたＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）分析（Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９７），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５，３３８９−３４０２、およびＫａｒｌｉｎ（１９９０），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７，２２６４−２２６８）を含む。あるいは、本明細書中に開示される酵素（または当該酵素をコードする核酸）のいずれかの機能性断片を用いてもよい。「機能性断片」という用語は、アミノ末端欠失および／またはカルボキシ末端欠失を有するポリペプチドを指し、残りのアミノ酸配列は、参照配列中の対応する位置に対して少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有し、完全長ポリペプチドの活性の約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％を保持する。機能性断片は、例えば、完全長ポリペプチドの９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、または２０％以下を含み得、例えば、完全長ポリペプチドの約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％までを含み得る。記載のＥＣ番号は、国際生化学・分子生物学連合の命名法委員会の酵素命名法を用いている。
【００４３】
ステップ１：グルコースから１，５−グルコノラクトンへの変換（酸化または脱水素）。このステップは、様々な酵素、例えば、ファミリー酸素依存グルコースオキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．４）またはＮＡＤ（Ｐ）依存グルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１１８、ＥＣ１．１．１．１１９）のものを用いて行うことができる。グルコノバクター・オキシダント（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）は、発酵槽中で増殖させた場合にグルコースを効率的にグルコン酸および５−ケトグルコネート（５−ＫＧＡ）へ酸化させることが分かっている。グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）および他の酸化細菌中に見受けられる可溶性の膜結合性のＰＱＱ依存酵素のファミリーの酵素（ＥＣ１．１．９９．３５およびＥＣ１．１．５．２）を使用することができる。キノタンパク質グルコースは、このステップの実行において有用な別の酵素である。選択される特定の酵素は、表１に示す所望の反応条件と反応中に存在し得る必要な補因子とに依存する。
【００４４】
ステップ１Ａ：１，５−グルコノラクトンからグルコネートへの変換（例えば、加水分解）。このステップは、化学的に水媒体中で行うことができ、加水分解速度は、ｐＨに依存する（Ｓｈｉｍａｈａｒａ，Ｋ，Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｔ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９７０），２０１，４１０）。加水分解は、塩基性ｐＨ（例えば、ｐＨ７．５）においてはより高速であり、酸性ｐＨにおいてはよりゆっくりである。多数の微生物も、特定の１，５−グルコノラクトンヒドロラーゼを含み、そのうちいくつかがクローン化および特性決定されている（ＥＣ３．１．１．１７；Ｓｈｉｎａｇａｗａ，Ｅ  Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００９，７３，２４１−２４４）。
【００４５】
ステップ１Ｂ：グルロン酸ラクトンからグルロン酸への変換。グルロン酸ラクトンの化学加水分解は、水溶液中の自然反応によって行うことができる。この加水分解を触媒することが可能な酵素が、多数のラクトナーゼ（ＥＣ３．１．１．ＸＸおよびより詳細には３．１．１．１７、３．１．１．２５）の中で特定される。
【００４６】
ステップ２：グルコン酸から３−デヒドログルコン酸（ＤＨＧ）への変換。いくつかの酵素、例えば、グルコン酸デヒドラターゼを、グルコン酸のデヒドログルコン酸（ＤＨＧ）への脱水において用いることができる。例を挙げると、グルコン酸デヒドラターゼファミリー（ＥＣ４．２．１３．９）に属するものがある。このようなデヒドラターゼの特定の例が、グルコネートを脱水させることが分かっている（Ｋｉｍ，Ｓ．Ｌｅｅ，Ｓ．Ｂ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｅｎｇ．（２００８），１３，４３６）。このファミリー由来の酵素についての特定の実施例およびそのクローニングを実施例１に示す。
【００４７】
ステップ３：３−デヒドロ−グルコン酸（ＤＨＧ）から４，６−ジヒドロキシ２，５−ジケトヘキサノエート（２，５−ＤＤＨ）への変換。この変換を行うための酵素である２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸５−デヒドロゲナーゼ（またはＤＨＧデヒドロゲナーゼ）（ＥＣ１．１．１．１２７）について記載されている。
【００４８】
ステップ４：４，６−ジヒドロキシ２，５−ジケトヘキサノエート（２，５−ＤＤＨ）から４−デオキシ−Ｌ−トレオ−ヘキソスロースウロン酸（ＤＴＨＵ）への変換。ファミリーＥＣ５．３．１．１２の酵素をこのステップにおいて用いることができ、ステップ１５は、５個のこのような酵素がクローン化され、５−ＫＧＡの脱水についての活性を有することが分かったことを示す。これらの酵素は、２，５−ＤＤＨおよびＤＴＨＵに対する活性も示すであろう。
【００４９】
ステップ５：ＤＴＨＵから５−デヒドロ−４−デオキシ−グルカレート（ＤＤＧ）への変換。ＤＤＧは、例えばアルコールの存在下でアルデヒドを酸化させることが可能な穏やかな化学触媒を用いて、ＤＴＨＵの化学的酸化または酵素的酸化から生成することができる。アルデヒドオキシダーゼを用いて、この酸化を触媒することができる。酸化細菌、例えば、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）およびグルコノバクター（Ｈｏｌｌｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ  Ｇｒｅｅｎ  Ｃｈｅｍ．２０１１，１３，２２６）は、スクリーニングにおいて有用であろう。以下のファミリーの酵素が、この反応を行うことができる：アルデヒドオキシダーゼＥＣ１．２．３．１、アルデヒドフェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＥＣ１．２．７．５）、およびファミリーのＥＣ１．２．１．−ＸＸの全てのファミリー中のもの。ウロン酸デヒドロゲナーゼの酵素（ＥＣ１．１．１．２０３）（例えば、ステップ７を参照）も、この活性を有する。アルコール酸化活性およびアルデヒド酸化活性の双方を有する他の酵素を用いることができる（例えば、アルジトールオキシダーゼファミリー中の酵素（ステップ１９および６を参照）。他の広範な基質オキシダーゼは、可溶性および膜結合性のＰＱＱ依存アルコール／アルデヒドオキシダーゼを含む。より詳細には、可溶性ペリプラスムＰＱＱオキシダーゼ酵素およびＩ型に属するその相同体（ＥＣ１．１．９．１）およびＩＩ（ＥＣ１．１．２．８）ファミリーと、ＥＣ１．１．５．Ｘファミリーに属する膜結合性のＰＱＱオキシダーゼとが有用である。他の実施形態において、ＤＴＨＵ上に作用するアルデヒドデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼが使用可能である。
【００５０】
ステップ６および６Ａ：グルコン酸からグルロン酸（６）への変換および３−デヒドロ−グルコン酸（ＤＨＧ）から４−デオキシ−５−エリトロ−ヘキソスロースウロン酸（ＤＥＨＵ）（６Ａ）への変換。ステップ５中に記載される酵素は、これらの変換において有用である。他の有用な酵素は、ＥＣ１．１．１．ＸＸファミリー中のＮＡＤ（Ｐ）依存デヒドロゲナーゼ、およびより詳細にはグルクロン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１９）、グルクロノラクトンレダクターゼ（ＥＣ１．１．１．２０）を含む。加えて、糖を含む広範な基質範囲を有する多数のＯ２依存アルコールオキシダーゼは、有用であると考えられ（ＥＣ１．１．３．ＸＸ）、ソルビトール／マンニトールオキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．４０）、ヘキソースオキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．５）、アルコールオキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．１３）およびバニリンオキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．３８））を含む。酸化細菌中に存在するＰＱＱ依存酵素および酵素を、これらの変換のために用いることができる。
【００５１】
ステップ７および７Ｂ：グルロン酸からＤ−グルカル酸（７）への変換およびＬ−イズロン酸からイダル酸（７Ｂ）への変換。これらのステップは、本明細書中に記載のようなウロン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．２０３）またはオキシダーゼのファミリーの酵素により達成することができる。
【００５２】
ステップ７Ａ：４−デオキシ−５−エリトロ−ヘキソスロースウロン酸（ＤＥＨＵ）から３−デオキシ−Ｄ−エリトロ−２−ヘキスロサル酸（ＤＤＨ）への変換。ステップ５中に記載される同じ酵素が、この変換の実行において有用となるであろう。
【００５３】
ステップ８および８Ａ：Ｄ−グルカル酸から５−デヒドロ−４−デオキシ−グルカレート（ＤＤＧ）への変換（ステップ８）およびイダル酸からＤＤＧへの変換（ステップ８Ａ）。グルカル酸デヒドラターゼのファミリーの酵素（ＥＣ４．２．１．４０）を用いて、これらのステップを行うことができる。このファミリーの酵素がクローン化されており、グルカレートからＤＤＧへの変換を効率的に行うことが判明している。２つのＤ−グルカル酸デヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．４０）を、以下のクローン化されたグルカル酸デヒドラターゼについての表に示した通りにクローン化した。双方の酵素は、ステップ２に述べるように、セミカルバジドアッセイ法を用いたグルカレートのＤＤＧへの脱水についての極めて高い活性を示した。
【００５４】
クローン化されたグルカル酸デヒドラターゼ
2018139587.tif 000002
【００５５】
ステップ９および９Ａ：Ｄ−グルコースからα−Ｄ−グルコ−ヘキソジアルド−１，５−ピラノース（９）への変換およびＤ−ガラクトースからＤ−ガラクト−ヘキソジアルドース（９Ａ）への変換。オキシダーゼ、例えば、ガラクトースオキシダーゼファミリー（ＥＣ１．１．３．９）のものを、このステップにおいて用いることができる。また、突然変異ガラクトースオキシダーゼをグルコースに関する活性を有するように遺伝子操作することが記載されている（Ａｒｎｏｌｄ，Ｆ．Ｈ．ｅｔ  ａｌＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ，２００２，３（２），７８１）。
【００５６】
ステップ１０：α−Ｄ−グルコ−ヘキソジアルド−１，５−ピラノースからα−Ｄ−グルコピラヌロン酸への変換（ステップ１０）およびＤ−ガラクト−ヘキソジアルドースからガラクツロネートへの変換（１０Ａ）。このステップは、アルデヒドデヒドロゲナーゼのファミリーの酵素を用いて行うことができる。
【００５７】
ステップ１１および１１Ａ：α−Ｄ−グルコピラヌロン酸からグルクロン酸１，５−ラクトンへの変換。ステップ５に記載のようなアルデヒドデヒドロゲナーゼおよびオキシダーゼが、このステップの実行において有用であろう。ステップ７および７Ｂ中に記載のウロン酸デヒドロゲナーゼも、このステップの実行において有用であろう。ステップ１１Ａは、ガラクツロネートからガラクタレートへの変換である。例えばステップ７および７Ｂに記載のようなウロン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．２０３）が、このステップの実行において有用であろう。
【００５８】
ステップ１２：フルクトースからグルコースへの変換。グルコースおよびフルクトースイソメラーゼ（ＥＣ５．３．１．５）が、このステップの実行において有用であろう。
【００５９】
ステップ１３：ガラクタレートから５−デヒドロ−４−デオキシ−Ｄ−グルカレート（ＤＤＧ）への変換。ガラクタル酸デヒドロゲナーゼのファミリーの酵素（ＥＣ４．２．１．４２）を用いてこのステップを行うことができ、さらなる酵素をこのステップのために遺伝子操作することができる。
【００６０】
ステップ１４：グルコネートから５−ケトグルコネート（５−ＫＧＡ）への変換。ＮＡＤ（Ｐ）依存デヒドロゲナーゼのファミリーの複数の酵素（ＥＣ１．１．１．６９）がクローン化され、グルコネートの酸化または５ＫＧＡの還元についての活性を有することが分かった。例えば、グルコノバクター（ＥｘｐａｓｙＰ５０１９９）由来のＮＡＤＰＨ依存グルコン酸５−デヒドロゲナーゼを、本明細書中に示すように大腸菌における最適な発現のために合成して、ｐＥＴ２４（ｐＳＧＩ−３８３）中にクローン化した。酵素を発現させ、必要な活性を有することが分かった。このステップの実行において有用なさらなる酵素は、グルコノバクター中に存在するＰＱＱ依存酵素のファミリーのもの（Ｐｅｔｅｒｓ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，（２０１３），９７，６３９７）と、ステップ６中に記載される酵素とを含む。これらのファミリー由来の酵素は、グルコネートから５ＫＧＡを合成する際にも用いることができる。
【００６１】
ステップ１５：５−ＫＧＡからＬ−イズロン酸への変換。このステップは、実施例４中にさらに述べるように、異なるイソメラーゼファミリー由来の様々な酵素を用いて行うことができる。
【００６２】
ステップ１６：５−ＫＧＡから（４Ｓ）−４，６−ジヒドロキシ２，５−ジケトヘキサノエート（２，５−ＤＤＨ）への変換。この脱水は、グルコン酸デヒドラターゼファミリー（ＥＣ４．２．３．３９）中の酸素、例えば、実施例５またはステップ１７に記載のものを用いて行うことができる。
【００６３】
ステップ１７および１７Ａ：Ｌ−イズロネートから４−デオキシ−５−トレオ−ヘキソスロースウロン酸（ＤＴＨＵ）へおよびグルロネートから４−デオキシ−５−ヘキスロースウロン酸（ＤＨＵ）へ。このステップのパフォーマンスにおいて使用することが可能である、デヒドラターゼのファミリーの酵素が特定された。グルコン酸デヒドラターゼまたはグルカル酸デヒドラターゼのファミリー由来の酵素は、これらのステップを行うための所望の活性を持つであろう。さらに、ファミリーの多数のデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．Ｘ）は、これらのステップのパフォーマンスにおいて有用となるであろう。詳細には、ファミリーの酵素：ＥＣ４．２．１．６（ガラクトン酸デヒドラターゼ）、ＥＣ４．２．１．８（マンノネートデヒドラターゼ）、ＥＣ４．２．１．２５（アラボネートデヒドラターゼ）、ＥＣ４．２．１．３９（グルコン酸デヒドラターゼ）、ＥＣ４．２．１．４０（グルカル酸デヒドラターゼ）、ＥＣ４．２．１．６７（フコネートデヒドラターゼ）、ＥＣ４．２．１．８２（キシロネートデヒドラターゼ）、ＥＣ４．２．１．９０（ラムノン酸デヒドラターゼ）、およびジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（４．２．１．９）などの、２−ケト酸を選択的に生成するように１、２−ジヒドロキシ酸を脱水させる酵素が有用であると考えられる。既知の酵素選択性はアルファ−ケト酸の生成であるため、特定された酵素から、ＤＥＨＵおよびＤＴＨＵが反応生成物としてそれぞれ生成される。
【００６４】
ステップ１９：１，５−グルコノラクトンからグルロン酸ラクトンへの変換。このステップは、アルジトールオキシダーゼのファミリーの酵素（ＥＣ１．１．３．４１）またはステップ６中に記載される酵素により、行うことができる。
【００６５】
ＤＤＧからＦＤＣＡへ変換する方法ならびにエステル化ＤＤＧおよびエステル化ＦＤＣＡを作製する方法
本発明は、ＤＤＧをＦＤＣＡおよびＦＤＣＡエステルへ変換する新規な方法も提供する。ＦＤＣＡのエステルは、ジエチルエステル、ジブチルエステル、および他のエステルを含む。方法は、ＤＤＧをアルコール、無機酸、および任意選択的に共溶媒と接触させてＤＤＧの誘導体を生成することにより、ＤＤＧをＤＤＧエステルへ変換するステップを含む。アルコールは、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、または任意のＣ１−Ｃ２０アルコールであり得る。無機酸は、硫酸であり得る。共溶媒は、ＴＨＦ、アセトン、アセトニトリル、エーテル、酢酸ブチル、ジオキサン、クロロホルム、塩化メチレン、１，２−ジクロロエタン、ヘキサン、トルエン、およびキシレンのいずれかまたは任意の混合物であり得る。その後、エステル化ＤＤＧをエステル化ＦＤＣＡへ変換することができる。この方法を行う前に、ＤＤＧを1つのステップとして任意選択的に精製することができる。ＤＤＧを精製することは、ＤＤＧを含む溶媒から水を除去すること、例えば、８７％を超える水または９０％を超える水または９５％を超える水または９７％を超える水または９８％を超える水または９９％を超える水を、ＤＤＧを含む溶媒から除去することを含み得る。２５％または３０％または３５％または４０％または４５％を超えるモルの収率を得ることができる。
【００６６】
ＤＤＧ精製
ＤＤＧを酸性化させることにより、例えば、ｐＨ約２．５までの濃ＨＣｌの添加による反応物ｐＨの低下により、脱水またはエステル化のためのＤＤＧ精製を行った。このｐＨにおいて、タンパク質および任意の残留グルカレート沈殿物を濾過によって除去し、混合物を凍結乾燥させて、ＤＤＧおよび反応塩からなる白色粉末を得た。このＤＤＧを脱水させて、２，５−ＦＤＣＡを得てもよいか、あるいはエステル化してジブチルＤＤＧ（またはジエチルＤＤＧ）を得た後に脱水してもよい。このＤＤＧを精製またはエステル化する方法は、本明細書中に開示される方法および経路のいずれにおいても1つのステップとして付加され得る。
【００６７】
ＦＤＣＡおよびＦＤＣＡ誘導体を合成するための方法
本発明は、ＦＤＣＡを合成するための多様な方法も提供する。ＦＤＣＡを合成するための１つの方法は、高温でＤＤＧをアルコール、無機酸と接触させて、ＦＤＣＡを形成するステップを含む。アルコールは任意のアルコールであり得、例として（非限定的に）、メタノール、エタノール、プロパノール、およびブタノールが挙げられる。ジオールを用いてもよい。高温は、ＦＤＣＡを形成するための７０℃を超える温度または８０℃を超える温度または９０℃を超える温度または１００℃を超える温度または１１０℃を超える温度または１２０℃を超える温度または１３０℃を超える温度または１４０℃を超える温度または１５０℃を超える温度であり得る。２０％を超えるかまたは３０％を超えるかまたは３５％を超えるかまたは４０％を超える反応収率を達成することができる。
【００６８】
本発明は、ＦＤＣＡの誘導体を合成するための方法も提供する。方法は、ＤＤＧの誘導体を無機酸と接触させてＦＤＣＡの誘導体を生成するステップを含む。無機酸は、例えば硫酸であり得る。任意選択的に、ＤＤＧの誘導体を第２の無機酸と接触させる前に精製してもよい。使用可能なＤＤＧの誘導体の非限定的な例は、メチルＤＤＧ、エチルＤＤＧ、プロピルＤＤＧ、ブチルＤＤＧ、イソブチルＤＤＧ、ジメチルＤＤＧ、ジエチルＤＤＧ、ジプロピルＤＤＧ、ジブチルＤＤＧを含む。生成されたＦＤＣＡの誘導体は、メチルＦＤＣＡ、エチルＦＤＣＡ、プロピルＦＤＣＡ、ブチルＦＤＣＡ、ジメチルＦＤＣＡ、ジエチルＦＤＣＡ、ジプロピルＦＤＣＡ、ジブチルＦＤＣＡ、およびイソブチルＦＤＣＡであり得る。生成されたＦＤＣＡの誘導体は、本方法において用いられるＤＤＧの誘導体に対応する。その後、ＦＤＣＡの誘導体を脱エステル化してＦＤＣＡを生成することができる。方法は、例えば以下に述べるパラメータを用いて気相中で行ってもよい。
【００６９】
ＦＤＣＡまたはＦＤＣＡ誘導体を合成するための別の方法は、気相中でＤＤＧまたはＤＤＧ誘導体（本明細書中に記載される任意のもの）を無機酸と接触させるステップを含み、この接触は、短い滞留時間、例えば、１０秒未満または８秒未満、または６秒未満または５秒未満または４秒未満または３秒未満または２秒未満または１秒未満の滞留時間で行われ得る。滞留時間とは、反応装置を通じた高温流れの反応ゾーン中に試料が存在する時間を指す。方法は、高温で、例えば、１５０℃よりも高温、２００℃よりも高温、２５０℃よりも高温、３００℃よりも高温、または３５０℃よりも高温で行ってもよい。２５％を超えるかまたは３０％を超えるかまたは４０％を超えるかまたは４５％を超えるかまたは５０％モルを超える収率が入手可能である。ＦＤＣＡを合成するための別の方法は、８０℃または９０℃または１００℃または１１０℃または１２０℃を超える温度でＤＤＧを無機酸と接触させるステップを含む。ＦＤＣＡを合成するための別の方法は、無水反応条件下でＤＤＧを無機酸と接触させるステップを含む。様々な実施形態において、無水条件は、ＤＤＧが１０重量％未満または９重量％未満または８重量％未満または７重量％未満または６重量％未満または５重量％未満または４重量％未満または３重量％水未満または２重量％未満の水を含むように、本明細書中に開示されるＦＤＣＡを合成する任意の方法におけるＤＤＧを凍結乾燥することにより、確立することができる。
【００７０】
本明細書中に記載されるＦＤＣＡを合成するための本発明の方法は、今まで利用可能であったものよりもずっと高い収率を提供する。異なる実施形態において、１０％よりも高いかまたは１５％よりも高いかまたは２０％よりも高いかまたは２５％よりも高いかまたは３０％よりも高いかまたは３５％よりも高いかまたは４０％よりも高いかまたは４５％よりも高いかまたは５０％よりも高い、（ＤＤＧに対する）ＦＤＣＡのモル収率を得ることができる。
【実施例】
【００７１】
実施例１−ステップ２：グルコン酸から３−デヒドロ−グルコン酸（ＤＨＧ）へ
グルコネートの脱水に対して自然活性を有する酵素が発見されている（ＥＣ４．２．１．３９）。このファミリー由来の３つの酵素を表１に示すようにクローン化した。酵素ｐＳＧＩ−３６５がクローン化され、グルコネート脱水についての高い活性を有する広範な基質範囲を持つデヒドラターゼであることが判明した（Ｋｉｍ，Ｓ．Ｌｅｅ，Ｓ．Ｂ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｅｎｇ．２００８，１３，４３６）。
【００７２】
（表１）本実験において用いられる酵素、および同一性相同性。全てＰ．ルオレッセンス（Ｐ．ｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）において発現
2018139587.tif 000003
【００７３】
タンパク質３５９、３６０、および３６５は、グルコネート脱水の合成（ゲルは図示せず）において、粗酵素溶解物活性１ｍｇあたり２〜５μモル／分を示した。硫酸アンモニウムによる沈殿によりｐＳＧＩ−３５９を分離させ、緩衝液中に再溶解させ、セミカルバジドアッセイ法によってアッセイした。グルコネート脱水についての、４６．２Ｕ／ｍＬまたは５．３Ｕ／ｍｇ（１単位＝μモル／分）の活性をセミカルバジドアッセイプロットから計算した。Ｋｐｉ１０ｍＭ  ｐＨ８．０を２ｍＭ  ＭｇＣ１２および３．５ｇｒ（０．０１６モル）のグルコン酸ナトリウムと共に含む反応緩衝液（９３ｍＬ）を、７ｍＬの前回のグルコン酸デヒドラターゼ溶液と混合した。反応物を４５℃で１６時間培養した後、１つのアリコートをＨＰＬＣ−ＭＳ（図４）によって分析した。図４に示すように、ＤＨＧの分子量を有する１つの新規主要生成物を生成した。この生成物は、ＤＨＧデヒドラターゼによる活性を有することも判明した。
【００７４】
全タンパク質をｐＲＡＮＧＥＲ（商標）（Ｌｕｃｉｇｅｎ、Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ、ＷＩ）発現ベクターにおいてクローン化し、蛍光菌株において発現させた。ｐＲＡＮＧＥＲ（商標）は、遺伝子の誘導発現のためのｐＢＢＲ１レプリコン、カナマイシン耐性およびｐＢＡＤプロモーターを含む広範な宿主の市販のプラスミドベクターである。酵素アッセイ法のため、アルファケト酸定量化のためのセミカルバジドアッセイ法の改変版を用いて、各酵素の活性を計算した（Ｋｉｍ，Ｓ．；Ｌｅｅ，Ｓ．Ｂ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．２００５，３８７，２７１）。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０〜３２および３３〜３５は、グルコン酸デヒドラターゼ＃０３８５、＃０３３６、およびＥ３ＨＪＵ７のアミノ酸およびヌクレオチド配列をそれぞれ示す。
【００７５】
実施例２−ステップ３：３−デヒドロ−グルコン酸（ＤＨＧ）から（４Ｓ）−４，６−ジヒドロキシ２，５−ジケトヘキサノエート（２，５−ＤＤＨ）へ
ファミリー（ＥＣ１．１．１．１２７）の酵素を用いて、このステップを行うことができる。２つの例は、２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸５−デヒドロゲナーゼおよびＤＨＧデヒドロゲナーゼである。このファミリーから５個の酵素を以下の表２に示すようにクローン化した。ｐＲＡＮＧＥＲ（商標）ベクターを各場合において用いた。
【００７６】
（表２）ＤＨＧオキシドレダクターゼ（または２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸５−デヒドロゲナーゼ）のクローン化
2018139587.tif 000004
【００７７】
ステップ２においてグルコネート脱水から調製された生成物を、表２の溶解物をアッセイするための基質として用いた。以下の表３に示すように、酵素は、ＮＡＤＨ形成を測定するアッセイ法においてＤＨＧの酸化についての活性を示すことが分かった（３４０ｎｍにおける吸光度増加）。
【００７８】
（表３）ＤＨＧオキシドレダクターゼを用いた２，５−ＤＤＨへのＤＨＧの酸化に関する活性計算
単位＝ＮＡＤＨのμモル／分
2018139587.tif 000005
【００７９】
これらの酵素による２，５−ＤＤＨの形成のさらなる検証は、ステップ１６において、ｐＳＧＩ−３９５による（５ＫＧＡの脱水で生成された）２，５−ＤＤＨの還元を示すステップ１６に示した。
【００８０】
実施例３−ステップ７および７Ｂ：グルロン酸からＤ−グルカル酸（７）への変換ならびにＬ−イズロン酸からイダル酸（７Ｂ）への変換
ステップ７および７Ｂを示すため、以下の試験を行った。ウロン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．２０３）は、グルクロン酸およびガラクツロン酸を酸化させる酵素である。公知のウロン酸デヒドロゲナーゼに配列が類似する３つの酵素（Ｅｘｐａｓｙ：Ｑ７ＣＲＱ０；Ｐｒａｔｈｅｒ，Ｋ．Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２００９，１９１，１５６５）を、表４および５に示すような菌種からクローン化した。
【００８１】
（表４）クローン化されたウロン酸デヒドロゲナーゼ
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【００８２】
（表５）配列同一性
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【００８３】
ｐＥＴ２８由来のＨｉｓタグを有する各タンパク質を発現させ、精製した後、スクリーニングを施した。粗溶解物のタンパク質ゲルおよび精製酵素を、図１のゲルにおいて示す。精製後、全酵素について、グルクロネートに対する活性とグルロネートおよびイズロネートに対する活性とを試験した。異なる基質濃度における反応速度測定を行い、各酵素の計算された活性およびＫｍ値を表６に示す。全酵素が、グルクロネートならびにＬ−イズロネートおよびグルロネートに対して良好な活性を示した。
【００８４】
（表６）精製ウロン酸デヒドロゲナーゼの活性およびＫｍ値
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【００８５】
大腸菌細胞において、表４に示す各プラスミドをＢＬ２１ＤＥ３形質転換した。清澄化した溶解物を均等量（２５ｍＬ）の平衡緩衝液と混合し、Ｎｉ  ＮＴＡカラムで精製した。０．０５０ｍＬの多様な希釈度の各精製酵素を０．９５ｍＬの反応緩衝液（１００ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ８．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．７５ｍＭ  ＮＡＤ＋）と混合することにより、各精製酵素の活性を測定した。３４０ｎｍにおけるＮＡＤＨ形成の監視により、反応進行を測定した。図６Ａおよび図６Ｂは、グルクロネートおよびイズロネートの酸化のラインウィーバー−バークプロットを提供する、３つの酵素全てを図６に示す。明確な正の傾きが得られ、全酵素から上記表に示す活性が得られた。ウロン酸デヒドロゲナーゼのタンパク質配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜３として示し、遺伝子をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜６として示す。
【００８６】
実施例４−ステップ１５：５−ケトグルコネート（５−ＫＧＡ）からＬ−イズロン酸（１５）またはグルロン酸（１５Ａ）への変換
この実施例は、５−ＫＧＡからイズロン酸への異性化（ステップ１５）またはグルロン酸への異性化（ステップ１５Ａ）が可能である酵素の特定を示す。３つの異なるイソメラーゼファミリー由来の１３個の酵素を表７に示すようにクローン化し、その配列同一性％を表８に示す。
【００８７】
（表７）クローン化されたイソメラーゼ
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【００８８】
（表８）イソメラーゼの同一性％
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【００８９】
表８に示すように、各ファミリー内における中程度の相同性（下線）を有する酵素をクローニング対象として選択した。Ｌ−イズロネートを主要生成物として生じさせる５−ＫＧＡの異性化についての活性を全ファミリー由来の酵素が示したことがデータから分かった。５．３．１．１７ファミリー（４３３および４３４）由来の２つの酵素も本実施例において用いたところ、５−ケトグルコネート（５ＫＧＡ）からのＤＤＧ形成がみられた。
【００９０】
２つの異なる酵素に対する活性により生成物形成を検出した酵素的方法を用いて、表７からの酵素を用いた５ＫＧＡおよびイズロネートの異性化についての活性を測定した。例えば、生成物イズロネートの活性を、ウロン酸デヒドロゲナーゼ（ｐＳＧＩ−４７６）を用いて測定することにより、５ＫＧＡの異性化を検出した。生成物５ＫＧＡの活性５ＫＧＡレダクターゼ（ｐＳＧＩ−３８３、ＥＣ１．１．１．６９）を測定することにより、イズロネートの異性化を検出した。生成物の存在は、ＧＣ−ＭＳによっても検出された。
【００９１】
全ファミリー由来の酵素は、５ＫＧＡおよびイズロネートの異性化についての活性の変動を示した。ＥＣ５．３．１．１２由来の２つの酵素を無細胞の反応において用いて５ＫＧＡを異性化させ、最終的に実施例に記載のようなＤＤＧを生成した。また、これらの酵素をゲル電気泳動によって精製し、単一バンドを示した。溶解物および５ＫＧＡまたはイズロネートを含む緩衝液を用いた反応において精製イソメラーゼを用いた。ＨＰＬＣ法および上記の酵素的方法の双方を用いて、生成物形成を決定した。ＨＰＬＣアッセイ法および酵素アッセイ法の双方を用いた１７時間の培養の結果を図７Ａに示す。全酵素は、５ＫＧＡおよびイズロネートの双方の異性化において良好な活性を示した。ＳＧＩ４３３、ｐＳＧＩ４３４、ｐＳＧＩ４３５、およびｐＳＧＩ４３６によるイズロネート異性化に関する収率は、酵素的に測定され場合はそれぞれ５６％、４８％  ４２％、（４３６は測定せず）であり、また、ＨＰＬＣアッセイ法によって測定された場合はそれぞれ７８．８％、７８．５％、７３．３％、および７６．６％であった。同一酵素による５ＫＧＡ異性化を１６時間行った後の収率を酵素的アッセイ法によって測定したところ、それぞれ１８％、１７％、および１９％（４３６は測定せず）であり、ＨＰＬＣアッセイ法によって測定したところ、それぞれ１６．６％、１７．８％、１６．３％、および１６．９％であった。
【００９２】
ＥＣ５．３．１．１２酵素
また、ＥＣ５．３．１．１２ファミリー（グルクロネートイソメラーゼ）由来の酵素を、ゲル電気泳動によって精製し、分離し、使用して、５ｍＭの５ＫＧＡまたはイズロン酸を含む緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ  ＺｎＣ１２、ｐＨ８．０）との混合により反応物を調製した。これらの反応物を３０℃において培養し、ＨＰＬＣ法および酵素的方法の双方を用いて生成物形成について分析した。結果を図７Ｂに示す。
【００９３】
５．３．１．１７酵素
酵素ｐＳＧＩ−４７８およびｐＳＧＩ−４７９（５−デヒドロ−４−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸イソメラーゼ）は、５ＫＧＡおよびイズロネートの双方について異性化活性を示した。この活性は、上記のように酵素的アッセイ法によって確認された。ｐＳＧＩ−４７８および−４７９によるイズロネートの異性化に関する収率は、酵素的に測定した場合にそれぞれ５０％および３７％であり、ＨＰＬＣによって測定した場合に２０％および１８％であった。５ＫＧＡ異性化に関する収率は、酵素的に測定した場合にそれぞれ２３％および２６％であり、ＨＰＬＣによって測定した場合にそれぞれ２４％および１６％であった。結果を図７Ａに示す。
【００９４】
５．３．１．ｎ１酵素
このファミリー中の酵素を、ゲル電気泳動によって精製した。生成物形成を上記のような酵素的アッセイ法を用いて測定し、結果を図８に示す。このファミリーにおいてクローン化された全酵素は、５ＫＧＡおよびイズロネートの異性化についての活性を有することが分かった。
【００９５】
各場合において、ＢＬ２１ＤＥ３においてプラスミドを形質転換し、タンパク質をＮｉ  ＮＴＡカラムで精製した。
【００９６】
実施例５−ステップ１６：５−ケト−グルコネート（５ＫＧＡ）から（４Ｓ）−４，６−ジヒドロキシ２，５−ジケトヘキサノエート（２，５−ＤＤＨ）へ
ステップ２（実施例１）に述べた３つのグルコン酸デヒドラターゼを、ステップ８からの精製グルカル酸デヒドラターゼと共に、実施例１に示すように発現させた。活性に対する酵素反応を行い、ＨＰＬＣ−ＭＳ分析から２，５−ＤＤＨの形成が示され（図９）、これは、グルコン酸デヒドラターゼを含む試料中のみの５−ＫＧＡの還元を伴う新規生成物の形成と、ＤＨＧデヒドラターゼ（ｐＳＧＩ−３９５）を用いた酵素的アッセイ法とによっても確認された。３４０ｎｍにおける良好な傾きから、ＮＡＤＨ、ｐＳＧＩ−３９５溶解物、および前回反応のアリコートを混合した場合（データは図示せず）に高い酵素活性が得られたことが分かる。この結果と、ＨＰＬＣ分析とから、グルコン酸デヒドラターゼが５ＫＧＡから２，５−ＤＤＨへの脱水を試験されたことが分かる。
【００９７】
実施例６−ステップ１９：１，５−グルコノラクトンからグルロン酸δ−ラクトンへの変換
１，５−グルコノラクトン酸化は、アルジトールオキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．４１）ファミリー由来の酵素の副活性（ｓｉｄｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）である。これらの酵素は、ソルビトール、キシリトール、グリセロール、および他のものなどの多様なアルジトールを酸化させる。酵素は、以下の表６に示すように、１，５−グルコノラクトンの酸化についての活性を有することが特定された。
【００９８】
（表６）１，５−グルコノラクトンに関する活性を有するアルジトールオキシダーゼ
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＊粗溶解物
【００９９】
表６に示す全精製酵素の溶解物を用いて、反応物を調製した。反応物を５０ｍＭのＫ−リン酸緩衝液ｐＨ７．０および０．５ｍｇ／ｍＬのカタラーゼ中に調製し、３０℃で培養した。新規の生成物がＨＰＬＣ−ＭＳ分析によって観察され、真正基準との比較後にグルロネートと同じ保持時間が示された（図１０）。これはＧＣ−ＭＳによって確認され、この生成物は、グルロネートと同じＭＳフィンガープリントも持っていた。したがって、表中に記載の全アルジトールオキシダーゼは、１，５−グルコノラクトンの６−ＯＨを酸化させてグルロン酸ラクトンを生成することが明らかである。全アルジトールオキシダーゼを、Ｈｉｓタグを有するｐＥＴ２８ａ中にクローン化し、ＢＬ２１ＤＥ３中に発現させ、Ｎｉ  ＮＴＡカラムで精製した。
【０１００】
実施例７−ＦＤＣＡおよび他の中間体の合成
２，５−ＦＤＣＡへの脱水のために、精製ＤＤＧモノカリウム塩を用いた。硫酸をＤＤＧへ添加し、反応物を６０℃において撹拌した。原位置収率を（ＨＰＬＣ−ＭＳによって）計算したところ、約２４％および約２７％であると分かった。
【０１０１】
これらの反応溶液を一緒にして、次いで氷に移すことにより（熱をとるため）希釈した。ほぼ均等量のＴＨＦを添加し、溶液を分液漏斗へ移した。分離が達成されるまで、塩化ナトリウム塩を添加した。最高の可能な溶解のため、添加の間に溶液を撹拌した。水性層を除去し、ＴＨＦ層を飽和ＮａＣＬ溶液により３回超洗浄した。硫酸ナトリウムを添加し、溶液を１晩放置した。２つの層が１晩で再度形成された。水性層を廃棄した後、シリカゲルを溶液へ添加した。その後、それを固体になるまでｒｏｔｏｖａｐを介して濃縮した。固体をシリカフラッシュカラム中へロードした後、クロマトグラフィーにより分離した。画分を濃縮して乾燥させた。分離収率は１７３．９ｍｇであった。補正収率：２４．９％。１Ｈおよび１３ＣＮＭＲおよびＨＰＬＣ−ＭＳ分析により生成物が確認された。
【０１０２】
ＢｕＯＨ／Ｈ２ＳＯ４中でのＤＤＧからジブチル−２，５−ＦＤＣＡヘの脱水
脱水塩を含む非誘導体化凍結乾燥ＤＤＧのＢｕＯＨ中での脱水を、ディーンスターク装置を用いて行った。これらの条件下で、ＤＤＧをＢｕＯＨへ添加した後、Ｈ２ＳＯ４を添加し、反応物を１４０℃で加熱した。４時間攪拌後、ＨＰＬＣ−ＭＳ分析により、ＤＤＧ消失およびジブチル−２，５−ＦＤＣＡの形成が示された。原位置収率を（ＨＰＬＣ−ＭＳによって）計算したところ、３６．５％であった。
【０１０３】
混合物を水、１％ＮａＯＨで抽出し、かつ再度水で抽出した。その後、有機層を最終質量３７．２１ｇまで濃縮した。この質量の一部（３．４４２３ｇ）を除去し、０．３４ｇのジブチル−２，５−ＦＤＣＡを、ＨＰＬＣを用いて精製した。反応物から分離された合計化合物量（３７．２１ｇ）に対する分離生成物の収率を推定し、元々のＤＤＧ中に存在する塩量（約６０％の重量純度）を考慮すると、反応収率は４２％と計算された。１Ｈおよび１３ＣＮＭＲおよびＨＰＬＣ−ＭＳ分析により生成物が確認された。
【０１０４】
ジブチルＤＤＧの合成
別の態様において、本発明は、ＤＤＧの誘導体を合成するための方法を提供する。方法は、ＤＤＧをアルコール、無機酸、および任意選択的に共溶媒と接触させて、ＤＤＧの誘導体を生成するステップを含む。任意選択的に、ＤＤＧの誘導体が精製され得る。この反応は、少なくとも１０％のモル収率または少なくとも１５％のモル収率または少なくとも２０％のモル収率または少なくとも２５％のまたは少なくとも３０％のまたは少なくとも３５％のモル収率または少なくとも４０％のモル収率のＤＤＧの誘導体の収率を持ち得る。無機酸は硫酸であり得、アルコールは、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、イソブタノール、または任意のＣ１−Ｃ２０アルコールであり得る。様々な実施形態において、共溶媒は、ＴＨＦ、アセトン、アセトニトリル、エーテル、酢酸ブチル、ジオキサン、クロロホルム、塩化メチレン、１，２−ジクロロエタン、ヘキサン、トルエン、およびキシレンのいずれかであり得る。アルコールがエタノールである場合、ＤＤＧ誘導体は、ＤＤＧモノエチルエステルおよび／またはＤＤＧジエチルエステルである。アルコールがブタノールである場合、ＤＤＧ誘導体は、ＤＤＧモノ−ブチルエステルおよび／またはＤＤＧジブチルエステルである。
【０１０５】
ＤＤＧモノカリウム塩を以下の手順に従って誘導体化した。機械攪拌器および加熱マントルを備えた１Ｌモートン型の目的とする反応槽に、６０：４０ＤＤＧ：ＫＣ１（３１．２ミリモル）、ＢｕＯＨ、およびヘプタンを注入した。別個の小びんにおいて、硫酸を水へ添加し、溶解後に冷却させた。その後、溶液をフラスコへ添加した。溶液を３０℃で保持した。
【０１０６】
沈殿物を濾過除去し濃縮した。残りのゲルをＥｔＯＡｃ中に溶解させた後、ＴＬＣプレートを溶液でスポットし、プレートをリンモリブデン酸混合物で噴霧した後、少なくとも１５０℃までホットプレート上で加熱して、ＤＤＧ−ＤＢＥ画分を特定した。分離収率：４．６２ｇ（１５．２ミリモル、４７％収率）、９８％超の純度。１Ｈおよび１３ＣＮＭＲおよびＨＰＬＣ−ＭＳ分析により生成物が確認された。
【０１０７】
ＴＨＦ、アセトン、アセトニトリル、エーテル（ジブチル、ジチエルなど）、酢酸ブチルなどのエステル、１、６−ジオキサン、クロロホルム、塩化メチレン、１，２−ジクロロエタン、ヘキサン、トルエン、およびキシレンなどの共溶媒とのＢｕＯＨ（５％〜９５％ｖ／ｖ）の混合物などの様々な溶媒を、ＤＤＧエステルの合成において用いることができ、共溶媒として用いることができる。酸（硫酸、塩酸、ポリリン酸、もしくはＤＯＷＥＸなどの固定酸、または塩基（ピリジン、エチル−アミン、ジエチル−アミン、三フッ化ホウ素）、またはカルボン酸のエステル化に一般的に用いられる他の触媒などの、反応触媒。
【０１０８】
ｎ−ＢｕＯＨ／Ｈ２ＳＯ４中でのジブチル−ＤＤＧからジブチルＦＤＣＡへの脱水
ＤＤＧ−ＤＢＥ（ジブチルエステル）の保存溶液を、ブタノール中に作製し、撹拌子を備えた清潔な乾燥したｌ００ｍＬ丸底フラスコへ移した。フラスコへ、２５ｍＬの濃硫酸を添加した。フラスコを密閉した後、６０℃で２時間攪拌した。原位置収率は、約５６％であると計算された。反応溶液を濃縮し、残留物を、ＭＴＢＥ中に溶解させ、分液漏斗へ移した後、水で洗浄した。回収した有機層を濃縮した後、ＨＰＬＣを介して分離し、分離収率に関しては２５０．７ｍｇ（約９０％純度）、および３５％分離収率（純度に対して補正）であった。１Ｃおよび１３ＣＮＭＲおよびＨＰＬＣ−ＭＳ分析により生成物が確認された。
【０１０９】
実施例８−ＤＤＧおよびＦＤＣＡおよび誘導体の、５−ＫＧＡ（ルート２Ａ）からの無細胞合成
この実施例は、スキーム６（２Ｂのサブスキーム）に従った精製酵素を用いた５ＫＧＡからＤＤＧへの酵素的変換を示し、生成されたＤＤＧを化学的ステップにより脱水してＦＤＣＡにすることも示す。このスキームは、５ＫＧＡの異性化（ステップ１５）およびその後のイダル酸への酸化（ステップ７Ｂ）を含む。また、ＤＤＧを異なる化学条件下で脱水させてＦＤＣＡを得た。最終ステップ（ステップ８Ａ）を、大腸菌由来のグルカ酸デヒドラターゼを用いて行った。
【０１１０】
スキーム６を図１１に示す。このスキームは、５−ＫＧＡからのＤＤＧの無細胞酵素合成を用いて行った。このスキームは、ステップ１５、７Ｂ、および８Ａの実行を含む。２つのさらなるタンパク質を用いて反応経路を完了し、そのうち第１の反応経路は、ＮＡＤＨ−オキシダーゼ（ステップＡ）であり、酸素の存在下でＮＡＤ＋補因子と、ＮＡＤＨオキシダーゼの作用から生成された過酸化物を分解するカタラーゼ（ステップＢ）とを再循環させる。これらの酵素を以下の表７に示す。全酵素はＨｉｓタグを含んでおり、Ｎｉ−ＮＴＡカラムを用いて精製した。このＤＤＧ合成の収率は、少なくとも８８〜９７％であると計算された。
【０１１１】
（表７）
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【０１１２】
５００ｍＬの液体培養を、反応のための各イソメラーゼについて精製した。表７に示す酵素に加えて、各反応物は、５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＺｎＣｌ２および２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＭｎＣｌ２および１ｍＭ  ＮＡＤ＋を含んでいた。１６時間の培養後に反応物をＨＰＬＣによって分析し、図１２はクロマトグラムを示す。
【０１１３】
ＦＤＣＡへの脱水のため、双方の試料の反応混合物を一緒にして、凍結乾燥して白色粉末状にし、この粉末を２つの試料に分割し、それぞれを、０．２５ＭＨ２ＳＯ４を含むＡｃＯＨ中または０．２５ＭＨ２ＳＯ４を含む４．５ｍＬＢｕＯＨ中に溶解させた。双方の反応物を密閉小びん中で２〜４時間、１２０℃において加熱した。反応生成物を図１３に示す。
【０１１４】
試料１および２はそれぞれ、真正基準、および、ＡｃＯＨ／Ｈ２ＳＯ４中の反応から３時間の時点を示す。試料１による試料２のスパイクにより単一ピークがみられ、ＦＤＣＡ生成物がさらに確認された。試料１および３（図１３）はそれぞれ、真正基準、および、ＢｕＯＨ／Ｈ２ＳＯ４中の反応から４時間の時点を示す。酵素反応によるＦＤＣＡ形成により、これらの試料中のＤＤＧの存在がさらに確認される。
【０１１５】
実施例９−グルコースおよびグルコネートからのＤＤＧ合成
この実施例は、グルコースおよびグルコネートからＤＤＧへの酵素的変換を示す。反応は、精製酵素と、触媒としての粗溶解物とによって行った。酵素および基質を、以下の表に示すように生体反応装置において組み合わせた。
2018139587.tif 000013
１．プラスミドを有する組み換え大腸菌の５００ｍＬ液体培養物由来の溶解物
２．ＢＬ２１ＤＥ３／ｐＳＧＩ−４３４の２Ｌ液体培養物由来の溶解物
３．精製酵素、活性  約３０単位（または精製ＧｌｕｃＤ  ３ｍｇ）
４．２５０ｍＬの培養物由来の溶解物
【０１１６】
反応物を３５℃で培養し、溶解した酸素およびｐＨをそれぞれ２０％および８で保持した。複数の時点をＨＰＬＣ−ＭＳによって分析し、結果を図１７Ｂに示す。抽出されたクロマトグラムにおいて、ＤＤＧ質量（図示せず）および対応するＭＳ断片化が確認された。これらの結果は、グルコースまたはグルコネートを伴う酵素の培養中のＤＤＧ生成を明確に示した。
【０１１７】
実施例１０−組み換えグルカル酸デヒドラターゼのための発現カセットの構築
以下の実施例は、大腸菌細胞中の異種発現のためのＤ−グルカル酸デヒドラターゼ活性のコード配列（ＧＤＨ、ＥＣ４．２．１．４０）を含む組み換え核酸構築物の生成を記載する。
【０１１８】
大腸菌（Ｅｘｐａｓｙ：Ｐ０ＡＥＳ２；）由来のＤ−グルカル酸デヒドラターゼ、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）ＡＤＰ１（Ｅｘｐａｓｙ：Ｐ０ＡＥＳ２）をコードする遺伝子、ならびに所有権のあるシュードモナス菌種（ＢＰ１ＭＩＣＴ２１２８１１４）をゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。
【０１１９】
その後、ＰＣＲ増幅遺伝子のそれぞれを細菌形質転換ベクターｐＥＴ２４ａ（＋）へクローン化し、ＧＤＨ遺伝子それぞれの発現をＴ７プロモーターの制御下に置いた。ＰＣＲ増幅インサートそれぞれのヌクレオチド配列も、配列決定確認により確かめた。
【０１２０】
実施例１１−組み換えグルカル酸デヒドラターゼを発現する大腸菌株
実施例９に述べるように構築した発現ベクターのそれぞれを、熱ショック媒介形質転換によりＮｏｖａＢｌｕｅ（ＤＥ３）大腸菌中に導入した。推定形質転換体を、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を追加したＬＢ寒天上で選択した。コロニーＰＣＲアッセイ法において適切なＰＣＲプライマーを用いて、発現ベクターそれぞれを含む陽性クローンを確認した。
【０１２１】
各発現ベクターについて、細菌コロニーを、形質転換プレートから取り出し、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を追加した液体ＬＢ培地において３０℃で２日間増殖させた。その後、培養液を、１５％グリセロールを含む小びん中へ移し、凍結された高純度培養液として−８０℃で保存した。
【０１２２】
実施例１１−ＧＤＨ酵素を発現する組み換え大腸菌細胞の細胞溶解物を用いることによるＤＤＧのインビトロ合成の実証
この実施例は、大腸菌細胞中に生成された組み換えＧＤＨ酵素を用いていかにしてＤＤＧ中間体のインビトロ合成を達成したかについて述べる。
【０１２３】
細胞溶解物の調製：実施例２において上で記載したように構築された組み換え菌種を、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を追加した３ｍＬの液体ＬＢ培地中３０℃で、回転速度を２５０ｒｐｍに事前設定された回転振盪機において１日、個別に増殖させた。この事前培養液を用いて、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含む１００ｍＬのＴＢ培地を植え付けた後、３０℃で２５０ｒｐｍに事前設定された回転振盪機において早期対数期（ＯＤ６００約０．５〜０．６）まで２〜３時間培養した後、イソプロピルＤ−ｌチオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ；０．２５ｍＭ最終濃度）を添加して、タンパク質発現を誘導した。細胞をさらに１８時間３０℃で増殖させた後、遠心分離によって回収し、１５ｍＬの溶解緩衝液（１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．８、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中で再度懸濁させ、超音波処理によって溶解させた。大腸菌細胞中での組み換え酵素の生成を基準プレキャストＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルシステム（ＢｉｏＲａｄ）を用いて定量し、特定の活性をＧｕｌｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３９，４５９０−４６０２，２０００）によって記載される手順に従って測定した。その後、細胞溶解物を、以下に詳述するグラム量のグルカレートをＤＤＧへ変化する能力について試験した。
【０１２４】
グルカレートの酵素的脱水：５グラムのグルカル酸一カリウム（約０．０２モル）を、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む８５ｍＬの５ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液へ添加した。５ＭのＮａＯＨ約２ｍＬの添加後、基質グルカレートが徐々に溶解したことが分かった。反応物のｐＨを約７．８に調節した。その後、１５ｍＬの細胞溶解物は、実施例３に示すような１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．８）中の３つの組み換えデヒドラターゼそれぞれを含む。緩やかに撹拌しながら培養を３０℃で１〜２時間行った後、ＨＰＬＣ−ＭＳ技術を用いて反応物を分析した。ＨＰＬＣ−ＭＳ結果は、予測される生成物ＤＤＧに対応する分子量を有する唯一の主要生成物としての新規ピークと、微量のグルカル酸一カリウム基質とを示した。ＨＰＬＣ−ＭＳ分析において副生成物は何も検出されず、組み換え酵素それぞれによって触媒された変換反応は極めて高効率であり、特異性も高いことが分かった。
【０１２５】
酵素反応由来のＤＤＧ生成物の精製
酵素的脱水を介して精製されたＤＤＧを、以下の２つの技術のうちいずれかを用いることにより精製した。
【０１２６】
酵素的脱水反応物を６ＭのＨＣｌによりｐＨ約２．０まで酸性化させ、濾過して沈殿タンパク質を除去した後、凍結乾燥した。メタノール（ＭｅＯＨ）を凍結乾燥粉末へ添加した後、１０〜１５分間緩やかに攪拌して、ＤＤＧ生成物を溶解させたが、脱水反応混合物中の他の塩（例えば、ＫＣｌおよびホスフェート）は溶解させなかった。懸濁液の濾過およびＭｅＯＨの蒸発の後、実質的に高純度のＤＤＧ酸が得られた。
【０１２７】
いくつかの場合、ＤＤＧ塩の精製のために代替的手順が用いられ、ここで、第１のＭｅＯＨ濾液を約１５〜２５ｍＬの量になるまで濃縮した後、０．５ＭＫＯＨを含む同体積のＭｅＯＨと混合した。ＫＯＨ添加後のＤＤＧのカリウム塩沈殿物を、次いで濾過により単離した。
【０１２８】
ＨＰＬＣ−ＭＳ分析の結果は、これら２つの精製技術から得られた試料中の合計生成物のうち少なくとも９５％をＤＤＧ生成物が構成していたことを示した。
【０１２９】
実施例１２−ワンステップ化学反応におけるＤＤＧからのＦＤＣＡのインビトロ合成の実証
本出願人は、Ｈ２ＳＯ４の存在下におけるＤＤＧからＦＤＣＡへの化学的変換により、ＦＤＣＡ合成（すなわち、遊離酸形態）を達成することができることを発見した。反応は、以下のように行った。約２０ｍｇのＤＤＧ酸（実施例３に述べるように事前精製された塩による粗凍結乾燥粉末）と、０．２５ＭのＨ２ＳＯ４とを、１ｍＬの水および１ｍＬのＤＭＳＯを含む気密シーリングされた管中に添加した。ＤＤＧがこの溶液中に完全溶解したことが分かった。反応物を１０５℃で１８時間攪拌した。粗反応試料に対して行われたＨＰＬＣ−ＭＳ分析の結果は、ＦＤＣＡ遊離酸（ＦＤＣＡ：２，５−フランジカルボン酸）が主要生成物として形成されたことと、微量のいくつかの他の未同定の副生成物が形成されたこととを示した。ＨＰＬＣ−ＭＳ分析における対照として、市販のＦＤＣＡを同じ条件で分析した。
【０１３０】
実施例１３−ＦＤＣＡエステル（ジメチルエステル、ジエチルエステル、ジブチルエステル、およびイソプロピルエステル）のインビトロ合成の実証
精製ＤＤＧからのジエチル−２，５ＦＤＣＡの合成
気密シーリングされた管において、１８ｍＬのＥｔＯＨ、実施例１１に述べるように事前精製された０．２グラム（１ミリモル）のＤＤＧ酸、および０．２５ＭのＨ２ＳＯ４を添加した。ＤＤＧ酸は、この溶液中に完全には溶解しなかった。反応物を１０５℃で１８時間緩やかに攪拌した。粗反応試料のＧＣ−ＭＳ分析の結果は、ジエチル−ＦＤＣＡ主要生成物の形成を示した。対照として、真正ＦＤＣＡを化学的に合成し、エステル化してジエチル−ＦＤＣＡにし、同じ条件で分析した。
【０１３１】
実施例１４−精製ＤＤＧからのジブチル−２，５ＦＤＣＡの合成
気密シーリングされた管において、１８ｍＬのｎ−ＢｕＯＨ、実施例１１に述べるように事前精製された０．２グラム（１ミリモル）のＤＤＧ酸、および０．２５ＭのＨ２ＳＯ４を添加した。ＤＤＧ酸は、この溶液中に完全には溶解しなかった。反応物を１０５℃で１８時間緩やかに攪拌した。図１５に示すように、反応試料のＧＣ−ＭＳ分析の結果は、ジブチル−ＦＤＣＡ（ＦＤＣＡ：２，５−フランジカルボン酸）が主要生成物として形成されたことを示した。対照として、真正ＦＤＣＡを化学的に合成し、エステル化してジブチル−ＦＤＣＡにし、同じ条件で分析した。
【０１３２】
実施例１５−粗ＤＤＧ（未精製）からのジブチル−２，５ＦＤＣＡの合成
実施例１１に述べるようなグルカレートの酵素的脱水から直接得られた未精製の凍結乾燥粉末である０．２グラム（１ミリモル）の粗ＤＤＧ酸を、１８ｍＬのｎ−ＢｕＯＨを含む気密シーリングされた管中に添加した後、０．２５ＭのＨ２ＳＯ４を添加した。粗ＤＤＧ酸は、この溶液中に完全には溶解しなかった。反応物を１０５℃で１８時間緩やかに攪拌した。粗反応試料のＧＣ−ＭＳ分析の結果は、ジブチル−ＦＤＣＡ（ＦＤＣＡ：２，５−フランジカルボン酸）が主要生成物として形成されたことを示した。ＧＣ−ＭＳ結果は、粗凍結乾燥粉末／未精製凍結乾燥粉末中の汚染物質の塩の存在が反応結果に大きな影響を与えなかったことを示した。対照として、真正ＦＤＣＡを化学的に合成し、エステル化してジブチル−ＦＤＣＡにし、同じ条件で分析した。
【０１３３】
実施例１６−固定酸を用いたＦＤＣＡおよび／またはエステルのインビトロ生成
工業的な実施において、固定酸は、いくつかの種類の溶媒（水性、有機、または混合など）において機能することが多いため、脱水の実行に対して多数の利点を提供する。加えて、固定酸は、再循環および再利用が容易である。固定化ＡＭＢＥＲＬＹＳＴ（登録商標）１５（Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）およびＤＯＷＥＸ（登録商標）５０ ＷＸ８（Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ，Ｍｉｄｌａｎｄ，ＭＩ）を用いたＦＤＣＡのエステルの合成のいくつかの例に従う。
【０１３４】
ＤＯＷＥＸ（登録商標）５０ ＷＸ８の使用による粗ＤＤＧからのジブチル−ＦＤＣＡの合成
気密シーリングされた管において、２ｍＬのｎ−ブタノール、２０ｍｇの粗ＤＤＧ酸（塩を含む未精製の凍結乾燥粉末）、および２００ｍｇのＤＯＷＥＸ（登録商標）５０ ＷＸ８を一緒にした。ＤＤＧは、この溶液中に完全には溶解しなかった。反応物を１０５℃で１８時間緩やかに攪拌した。粗反応試料のＧＣ−ＭＳ分析の結果は、ジブチル−ＦＤＣＡ（ＦＤＣＡ：２，５−フランジカルボン酸）が主要生成物として形成されたことを示した。このＧＣ−ＭＳ結果は、粗凍結乾燥粉末／未精製凍結乾燥粉末中の汚染物質の塩（ホスフェートおよびＮａＣｌ）の存在が反応結果に大きく影響しなかったことを示した。対照として、真正ＦＤＣＡを化学合成しエステル化してジブチル−ＦＤＣＡにし、同じ条件で分析した。
【０１３５】
ＡＭＢＥＲＬＹＳＴ（登録商標）１５の使用による粗ＤＤＧからのジブチルＦＤＣＡの合成
気密シーリングされた管において、２ｍＬのｎ−ブタノール、２０ｍｇの粗ＤＤＧ酸（塩を含む粗凍結乾燥粉末）、および２００ｍｇのＡＭＢＥＲＬＹＳＴ（登録商標）１５（Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）を一緒にした。ＤＤＧは、この溶液中に完全には溶解しなかった。反応物を１０５℃で１８時間緩やかに攪拌した。粗反応試料のＧＣ−ＭＳ分析の結果は、ジブチル−ＦＤＣＡ（ＦＤＣＡ：２，５−フランジカルボン酸）が主要生成物として形成されたことを示した。このＧＣ−ＭＳ結果は、粗凍結乾燥粉末／未精製凍結乾燥粉末中の汚染物質の塩（ホスフェートおよびＮａＣｌ）の存在が反応結果に大きく影響しなかったことを示した。対照として、真正ＦＤＣＡを化学合成しエステル化してジブチル−ＦＤＣＡにし、同じ条件で分析した。
【０１３６】
ＡＭＢＥＲＬＹＳＴ（登録商標）１５の使用による粗ＤＤＧからのエチル−ＦＤＣＡの合成
気密シーリングされた管において、２ｍＬのエタノール、２０ｍｇの粗ＤＤＧ酸（塩を含む未精製の凍結乾燥粉末）、および２００ｍｇのＡＭＢＥＲＬＹＳＴ（登録商標）１５（Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）を一緒にした。ＤＤＧは、この溶液中に完全には溶解しなかった。反応物を１０５℃で１８時間緩やかに攪拌した。粗反応試料のＧＣ−ＭＳ分析の結果は、ジエチル−ＦＤＣＡ（ＦＤＣＡ：２，５−フランジカルボン酸）が主要生成物として形成されたことを示した。このＧＣ−ＭＳ結果は、粗凍結乾燥粉末／未精製凍結乾燥粉末中の汚染物質の塩（ホスフェートおよびＮａＣｌ）の存在が反応結果に大きく影響しなかったことを示した。対照として、市販のＦＤＣＡを化学的にエステル化してジエチル−ＦＤＣＡにし、同じ条件で分析した。
【０１３７】
ＤＯＷＥＸ（登録商標）５０ ＷＸ８の使用による粗ＤＤＧからのジエチル−ＦＤＣＡの合成
気密シーリングされた管において、２ｍＬのエタノール、２０ｍｇの粗ＤＤＧ酸（塩を含む未精製の凍結乾燥粉末）、および２００ｍｇのＤＯＷＥＸ（登録商標）５０ ＷＸ８を一緒にした。ＤＤＧは、この溶液中に完全には溶解しなかった。反応物を１０５℃で１８時間緩やかに攪拌した。粗反応試料のＧＣ−ＭＳ分析の結果は、ジエチル−ＦＤＣＡ（ＦＤＣＡ：２，５−フランジカルボン酸）が主要生成物として形成されたことを示した。このＧＣ−ＭＳ結果は、粗凍結乾燥粉末／未精製凍結乾燥粉末中の汚染物質の塩（ホスフェートおよびＮａＣｌ）の存在が反応結果に大きく影響しなかったことを示した。対照として、市販のＦＤＣＡを化学的にエステル化してジエチル−ＦＤＣＡにし、同じ条件で分析した。
【０１３８】
実施例１７−ＦＤＣＡ誘導体の生成
有用性の高い複数のＦＤＣＡ誘導体の合成を図１６に記載し、ここで、ＤＴＨＵの脱水により、フルフラール−５−カルボン酸、すなわちＦＣＡが生成され、その後これを、ＦＤＣＡに化学的または酵素的に酸化させるか、ＦＣＨに還元するか、または、（化学還元的アミノ化もしくはアミノ基転移酵素を用いて）アミノ酸−ＡＦＣへアミノ基転移させる。
【０１３９】
実施例１８−気相反応におけるジブチルＦＤＣＡの生成
この実施例において、ＧＣの入口を、ジブチルＤＤＧからジブチルＦＤＣＡへの脱水を触媒する高温反応装置として用いた。その結果得られた生成物をクロマトグラフィーにより分離し質量分析によって検出した。ブタノール中のジブチルＤＤＧ（１０ｍＭ）および硫酸（１００ｍＭ）の溶液をＧＣ小びん中に入れた。小びんがＧＣに投入され、ＦＤＣＡジブチルエステルが観察された。反応は、３００℃の入口（滞留時間＝４秒）において生じた。６回の注入の平均収率は５４％であった。
ＧＣ設定：直接液体注入／ＭＳ検出器。
入口：３００℃、全流量２９．５１ｍｌ／分、分割比１０：１、分流２４．１ｍｌ／分、隔膜パージ流３ｍＬ／分。
ＧＣライナー：４ｍｍ、ガラスウール（Ｐ／Ｎ５１８３−４６４７）。
カラム流：２．４１ｍｌ／分Ｈｅ一定圧制御。
オーブンプログラム：４０℃で２分保持後、２５℃／分で２７５℃まで上昇、その後４０℃／分で３２５℃まで上昇、２分保持。
カラム：ＨＰ−５ＭＳ、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｇｉｅｓ、３０ｍ×０．２５ｍｍ×０．２５ｕｍ。
合計実行時間：１４．６５分。
ＭＳＤトランスファーライン：２９０℃。
ＭＳ源：２５０℃。
ＭＳ四重極：１５０℃。
保持時間：
２，３−ＦＤＣＡジブチルエステル：９．３分、
２，５−ＦＤＣＡジブチルエステル：９．７分。
【０１４０】
本明細書中に言及される全ての公開文献および特許出願は、個々の公開文献および特許出願が具体的かつ個別に参考のため援用されているかのような程度まで、本明細書中に参考のため援用する。
【０１４１】
いかなる参照も従来技術を構成していることを認めるものではない。参考文献中の考察は、それらの筆者の主張を述べるものであり、本出願人は、引用文献の精度および適切性に反論する権利を保持する。複数の従来技術の公開文献について本明細書中に参照しているが、この参照は、これらの文書のいずれも、当該分野における一般的知識の一部を形成するものとして認めるのものではないことが明確に理解されるであろう。
【０１４２】
また、上記の実施例は、本発明の例示のためのものであり、本発明を限定するものではないことが理解されるべきである。
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
2018139587.tif 000044
【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年4月20日(2018.4.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
出発基質から酵素的経路または化学的経路の生成物を生成するための方法であって、該経路が、５−ケトグルコネート（５−ＫＧＡ）をイソメラーゼと接触させて、５−ケトグルコネート（５−ＫＧＡ）からＬ−イズロン酸への酵素的変換を行う工程（ステップ１５）を含む、方法。
【請求項２】
該経路が、Ｌ−イズロン酸をウロン酸デヒドロゲナーゼと接触させて、Ｌ−イズロン酸からイダル酸への酵素的変換を行う工程（ステップ７ｂ）をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ウロン酸デヒドロゲナーゼが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜３、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜３に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するホモログを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ウロン酸デヒドロゲナーゼが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜６の核酸、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜６の核酸に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するホモログによってコードされる、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記出発基質がグルコースであり、かつ前記生成物が５−デヒドロ−４−デオキシ−グルカレート（ＤＤＧ）である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
Ｄ−グルコースを酸素依存グルコースオキシダーゼと接触させて、１，５−グルコノラクトンを生成する工程（ステップ１）をさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
１，５−グルコノラクトンをグルコン酸へ加水分解する工程（ステップ１ａ）をさらに含む、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
グルコン酸をＮＡＤ（Ｐ）依存デヒドロゲナーゼと接触させて、５−ケトグルコネート（５−ＫＧＡ）を生成する工程（ステップ１４）をさらに含む、請求項５〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
イダル酸をグルカル酸デヒドラターゼと接触させて、ＤＤＧを生成する工程（ステップ８ａ）をさらに含む、請求項５〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記基質がグルコースでありかつ前記生成物がＤＤＧであり、かつ
Ｄ−グルコースを酸素依存グルコースオキシダーゼと接触させて、１，５−グルコノラクトンを生成する工程（ステップ１）、
１，５−グルコノラクトンをグルコン酸へ加水分解する工程（ステップ１ａ）、
グルコン酸をＮＡＤ（Ｐ）依存デヒドロゲナーゼと接触させて、５−ケトグルコネート（５−ＫＧＡ）を生成する工程（ステップ１４）、および
Ｌ−イズロン酸をグルコン酸デヒドラターゼと接触させて、４−デオキシ−５−トレオ−ヘキソスロースウロン酸（ＤＴＨＵ）を生成する工程（ステップ１７）をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
４−デオキシ−５−トレオ−ヘキソスロースウロン酸（ＤＴＨＵ）を酸化して、ＤＤＧを生成する工程（ステップ５）をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項５〜１１のいずれか一項に記載の方法で得られたＤＤＧを無機酸と接触させることにより、前記ＤＤＧを２，５−フラン−ジカルボン酸（ＦＤＣＡ）へ変換するステップをさらに含む、ＦＤＣＡを生成するための方法。
【請求項１３】
前記イソメラーゼが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７〜１９、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７〜１９のイソメラーゼに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するホモログを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記イソメラーゼが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０〜３２の核酸、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０〜３２の核酸に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するホモログによってコードされる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
本発明の別の方法において、基質はグルコースであり、かつ生成物はＤＤＧであり、かつ方法は、Ｄ−グルコースから１，５−グルコノラクトンへの変換（ステップ１）、１，５−グルコノラクトンからグルコン酸への変換（ステップ１ａ）、グルコン酸から５−ケトグルコネート（５−ＫＧＡ）への変換（ステップ１４）、５−ケトグルコネート（５−ＫＧＡ）からＬ−イズロン酸への変換（ステップ１５）、Ｌ−イズロン酸から４−デオキシ−５−トレオ−ヘキソスロースウロン酸（ＤＴＨＵ）への変換（ステップ１７）、および、４−デオキシ−５−トレオ−ヘキソスロースウロン酸（ＤＴＨＵ）からＤＤＧへの変換（ステップ５）のステップを含む。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
別の態様において、本発明は、ＦＤＣＡを合成するための方法を提供する。方法は、無水反応条件下でＤＤＧを無機酸と接触させるステップを含む。
[本発明1001]
出発基質から酵素的経路または化学的経路の生成物を生成するための方法であって、該経路が、
グルロン酸からＤ−グルカレートへの酵素的変換（ステップ7）、
5−ケトグルコネート（5−ＫＧＡ）からＬ−イズロン酸への酵素的変換（ステップ15）、
Ｌ−イズロン酸からイダル酸への酵素的変換（ステップ7ｂ）、および
5−ケトグルコネートから4，6−ジヒドロキシ2，5−ジケトヘキサノエート（2，5−ＤＤＨ）への酵素的変換（ステップ16）、
1，5−グルコノラクトンからグルロノラクトン（ｇｕｌｕｒｏｎｏ−ｌａｃｔｏｎｅ）への酵素的変換（ステップ19）
からなる群から選択される1つ以上の変換ステップを含む、方法。
[本発明1002]
前記1つ以上の変換ステップが、グルロン酸からＤ−グルカレートへの酵素的変換（ステップ7）である、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記1つ以上の変換ステップが、5−ケトグルコネート（5−ＫＧＡ）からＬ−イズロン酸への酵素的変換（ステップ15）である、本発明1001の方法。
[本発明1004]
前記1つ以上の変換ステップが、Ｌ−イズロン酸からイダル酸への酵素的変換（ステップ7ｂ）である、本発明1001の方法。
[本発明1005]
前記1つ以上の変換ステップが、5−ケトグルコネートから4，6−ジヒドロキシ2，5−ジケトヘキサノエート（2，5−ＤＤＨ）への酵素的変換（ステップ16）である、本発明1001の方法。
[本発明1006]
前記1つ以上の変換ステップが、1，5−グルコノラクトンからグルロノラクトンへの酵素的変換（ステップ19）である、本発明1001の方法。
[本発明1007]
前記酵素的経路の前記生成物が5−デヒドロ−4−デオキシ−グルカレート（ＤＤＧ）である、本発明1001の方法。
[本発明1008]
前記基質がグルコースでありかつ前記生成物が5−デヒドロ−4−デオキシ−グルカレート（ＤＤＧ）であり、前記方法が、
Ｄ−グルコースから1，5−グルコノラクトンへの酵素的変換（ステップ1）、
1，5−グルコノラクトンからグルロノラクトンへの酵素的変換（ステップ19）、
グルロノラクトンからグルロン酸への酵素的変換（ステップ1Ｂ）、
グルロン酸からＤ−グルカレートへの酵素的変換（ステップ7）、
Ｄ−グルカレートから5−デヒドロ−4−デオキシ−グルカレート（ＤＤＧ）への酵素的変換（ステップ8）
のステップを含む、本発明1001の方法。
[本発明1009]
前記基質がグルコースでありかつ前記生成物がＤＤＧであり、前記方法が、
Ｄ−グルコースから1，5−グルコノラクトンへの変換（ステップ1）、
1，5−グルコノラクトンからグルコン酸への変換（ステップ1ａ）、
グルコン酸から5−ケトグルコネート（5−ＫＧＡ）への変換（ステップ14）、
5−ケトグルコネート（5−ＫＧＡ）からＬ−イズロン酸への変換（ステップ15）、
Ｌ−イズロン酸からイダル酸への変換（ステップ7ｂ）、および
イダル酸からＤＤＧへの変換（ステップ8ａ）
のステップを含む、本発明1001の方法。
[本発明1010]
前記基質がグルコースでありかつ前記生成物がＤＤＧであり、前記方法が、
Ｄ−グルコースから1，5−グルコノラクトンへの変換（ステップ1）、
1，5−グルコノラクトンからグルコン酸への変換（ステップ1ａ）、
グルコン酸から5−ケトグルコネート（5−ＫＧＡ）への変換（ステップ14）、
5−ケトグルコネート（5−ＫＧＡ）から4，6−ジヒドロキシ2，5−ジケトヘキサノエート（2，5−ＤＤＨ）への変換（ステップ16）、
4，6−ジヒドロキシ2，5−ジケトヘキサノエート（2，5−ＤＤＨ）から4−デオキシ−5−トレオ−ヘキソスロースウロン酸（ＤＴＨＵ）への変換（ステップ4）、および
4−デオキシ−5−トレオ−ヘキソスロースウロン酸（ＤＴＨＵ）からＤＤＧへの変換（ステップ5）
のステップを含む、本発明1001の方法。
[本発明1011]
前記基質がグルコースでありかつ前記生成物がＤＤＧであり、前記方法が、
Ｄ−グルコースから1，5−グルコノラクトンへの変換（ステップ1）、
1，5−グルコノラクトンからグルコン酸への変換（ステップ1ａ）、
グルコン酸から5−ケトグルコネート（5−ＫＧＡ）への変換（ステップ14）、
5−ケトグルコネート（5−ＫＧＡ）からＬ−イズロン酸への変換（ステップ15）、
Ｌ−イズロン酸から4−デオキシ−5−トレオ−ヘキソスロースウロン酸（ＤＴＨＵ）への変換（ステップ17）、および
4−デオキシ−5−トレオ−ヘキソスロースウロン酸（ＤＴＨＵ）からＤＤＧへの変換（ステップ5）
のステップを含む、本発明1001の方法。
[本発明1012]
前記ＤＤＧを2，5−フラン−ジカルボン酸（ＦＤＣＡ）へ変換するステップをさらに含む、本発明1008の方法。
[本発明1013]
前記ＤＤＧを2，5−フラン−ジカルボン酸（ＦＤＣＡ）へ変換するステップをさらに含む、本発明1009の方法。
[本発明1014]
前記ＤＤＧを2，5−フラン−ジカルボン酸（ＦＤＣＡ）へ変換するステップをさらに含む、本発明1010の方法。
[本発明1015]
前記ＤＤＧを2，5−フラン−ジカルボン酸（ＦＤＣＡ）へ変換するステップをさらに含む、本発明1011の方法。
[本発明1016]
前記ＤＤＧをＦＤＣＡへ変換するステップが、ＤＤＧを酸と接触させて該ＤＤＧをＦＤＣＡへ変換することを含む、本発明1012の方法。
[本発明1017]
前記ＤＤＧをＦＤＣＡへ変換するステップが、ＤＤＧを酸と接触させて該ＤＤＧをＦＤＣＡへ変換することを含む、本発明1013の方法。
[本発明1018]
前記ＤＤＧをＦＤＣＡへ変換するステップが、ＤＤＧを酸と接触させて該ＤＤＧをＦＤＣＡへ変換することを含む、本発明1014の方法。
[本発明1019]
前記ＤＤＧをＦＤＣＡへ変換するステップが、ＤＤＧを酸と接触させて該ＤＤＧをＦＤＣＡへ変換することを含む、本発明1015の方法。
[本発明1020]
60℃を超える温度でＤＤＧをアルコール、無機酸と接触させて、ＦＤＣＡを形成するステップ
を含む、ＦＤＣＡの誘導体を合成するための方法。
[本発明1021]
前記アルコールがブタノールまたはエタノールである、本発明1020の方法。
[本発明1022]
少なくとも25％モルの収率を有する、本発明1020の方法。
[本発明1023]
ＤＤＧをアルコール、無機酸、および任意選択的に共溶媒と接触させて、ＤＤＧの誘導体を生成するステップ
を含む、ＤＤＧの誘導体を合成する方法。
[本発明1024]
（ａ）前記アルコールがエタノールまたはブタノールであり、
（ｂ）前記無機酸が硫酸であり、かつ
（ｃ）前記共溶媒が、ＴＨＦ、アセトン、アセトニトリル、エーテル、酢酸エチル、酢酸ブチル、ジオキサン、クロロホルム、塩化メチレン、1，2−ジクロロエタン、ヘキサン、ヘプタン、トルエン、四塩化炭素、石油エーテル、およびキシレンからなる群から選択される、
本発明1023の方法。
[本発明1025]
ＤＤＧの誘導体を無機酸と接触させて、ＦＤＣＡの誘導体を生成するステップ
を含む、ＦＤＣＡの誘導体を合成するための方法。
[本発明1026]
25％モルを超える収率を有する、本発明1025の方法。
[本発明1027]
前記誘導体が、メチル−ＤＤＧ、エチル−ＤＤＧ、ブチル−ＤＤＧ、ジメチルＤＤＧ、ジエチル−ＤＤＧ、およびジブチルＤＤＧからなる群から選択されるＤＤＧである、本発明1026の方法。
[本発明1028]
前記ＦＤＣＡの誘導体を脱エステル化してＦＤＣＡを得るステップをさらに含む、本発明1025の方法。
[本発明1029]
前記ＦＤＣＡの誘導体を重合するステップをさらに含む、本発明1025の方法。
[本発明1030]
気相中でＤＤＧを無機酸と接触させるステップ
を含む、ＦＤＣＡを合成するための方法。
[本発明1031]
120℃を超える温度でＤＤＧを無機酸と接触させるステップ
を含む、ＦＤＣＡを合成するための方法。
[本発明1032]
無水反応条件下でＤＤＧを無機酸と接触させるステップ
を含む、ＦＤＣＡを合成するための方法。
[本発明1033]
出発基質から酵素的経路または化学的経路の生成物を生成するための方法であって、該経路が、
ＤＴＨＵからＤＤＧへの変換（ステップ5）、
グルコン酸からグルロン酸への変換（ステップ6）、
ＤＥＨＵからＤＤＨへの変換（ステップ7Ａ）、
グルロン酸からＤＥＨＵへの変換（ステップ17Ａ）
からなる群から選択される1つ以上の変換ステップを含む、方法。
[本発明1034]
前記基質がグルコースでありかつ前記生成物がＤＤＧであり、前記方法が、
Ｄ−グルコースから1，5−グルコノラクトンへの変換（ステップ1）、
1，5−グルコノラクトンからグルコン酸への変換（ステップ1ａ）、
グルコン酸から3−デヒドロ−グルコン酸（ＤＨＧ）への変換（ステップ2）、
3−デヒドロ−グルコン酸（ＤＨＧ）から4，6−ジヒドロキシ2，5−ジケトヘキサノエート（2，5−ＤＤＨ）への変換（ステップ3）、
2，5ＤＤＨから4−デオキシ−5−トレオ−ヘキソスロースウロン酸（ＤＴＨＵ）への変換（ステップ4）、
ＤＴＨＵからＤＤＧへの変換（ステップ5）
のステップを含む、本発明1033の方法。
[本発明1035]
前記基質がグルコースでありかつ前記生成物がＤＤＧであり、前記方法が、
Ｄ−グルコースから1，5−グルコノラクトンへの変換（ステップ1）、
1，5−グルコノラクトンからグルコン酸への変換（ステップ1ａ）、
グルコン酸からグルロン酸への変換（ステップ6）、
グルロン酸からグルカレートへの変換（ステップ7）、
グルカレートからＤＤＧへの変換（ステップ8）
のステップを含む、本発明1033の方法。
[本発明1036]
前記基質がグルコースでありかつ前記生成物がＤＤＧであり、前記方法が、
Ｄ−グルコースから1，5−グルコノラクトンへの変換（ステップ1）、
1，5−グルコノラクトンからグルコン酸への変換（ステップ1ａ）、
グルコン酸から5−ケトグルコネート（5−ＫＧＡ）への変換（ステップ14）、
5−ケトグルコネート（5−ＫＧＡ）から4，6−ジヒドロキシ2，5−ジケトヘキサノエート（2，5−ＤＤＨ）への変換（ステップ16）、
4，6−ジヒドロキシ2，5−ジケトヘキサノエート（2，5−ＤＤＨ）から4−デオキシ−5−トレオ−ヘキソスロースウロン酸（ＤＴＨＵ）への変換（ステップ4）、および
4−デオキシ−5−トレオ−ヘキソスロースウロン酸（ＤＴＨＵ）からＤＤＧへの変換（ステップ5）
のステップを含む、本発明1033の方法。
[本発明1037]
前記基質がグルコースでありかつ前記生成物がＤＤＧであり、前記方法が、
Ｄ−グルコースから1，5−グルコノラクトンへの変換（ステップ1）、
1，5−グルコノラクトンからグルコン酸への変換（ステップ1ａ）、
グルコン酸から5−ケトグルコネート（5−ＫＧＡ）への変換（ステップ14）、
5−ケトグルコネート（5−ＫＧＡ）からＬ−イズロン酸への変換（ステップ15）、
Ｌ−イズロン酸から4−デオキシ−5−トレオ−ヘキソスロースウロン酸（ＤＴＨＵ）への変換（ステップ17）、
4−デオキシ−5−トレオ−ヘキソスロースウロン酸（ＤＴＨＵ）からＤＤＧへの変換（ステップ5）
のステップを含む、本発明1033の方法。
[本発明1038]
前記基質がグルコースでありかつ前記生成物がＤＤＨであり、前記方法が、
Ｄ−グルコースから1，5−グルコノラクトンへの変換（ステップ1）、
1，5−グルコノラクトンからグルロン酸ラクトンへの変換（ステップ19）、
グルロン酸ラクトンからグルロン酸への変換（ステップ1Ｂ）、
グルロン酸からＤＥＨＵへの変換（ステップ17Ａ）、
ＤＥＨＵからＤＤＨへの変換（ステップ7Ａ）
のステップを含む、本発明1033の方法。
[本発明1039]
前記基質がグルコースでありかつ前記生成物がＤＤＨであり、前記方法が、
Ｄ−グルコースから1，5−グルコノラクトンへの変換（ステップ1）、
1，5−グルコノラクトンからグルコン酸への変換（ステップ1ａ）、
グルコン酸からグルロン酸への変換（ステップ6）、
グルロン酸からＤＥＨＵへの変換（ステップ17Ａ）、
ＤＥＨＵからＤＤＨへの変換（ステップ7Ａ）
のステップを含む、本発明1033の方法。
[本発明1040]
前記1つ以上の変換ステップが、ＤＴＨＵからＤＤＧへの変換（ステップ5）である、本発明1033の方法。
[本発明1041]
前記1つ以上の変換ステップが、グルコン酸からグルロン酸への変換（ステップ6）である、本発明1033の方法。
[本発明1042]
前記1つ以上の変換ステップが、ＤＥＨＵからＤＤＨへの変換（ステップ7Ａ）である、本発明1033の方法。
[本発明1043]
前記1つ以上の変換ステップが、グルロン酸からＤＥＨＵへの変換（ステップ17Ａ）である、本発明1033の方法。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
これらの方法は、酵素的経路であり得る経路の生成物を生成するステップを含む。いくつかの実施形態において、これらの経路は、１つ以上の化学的ステップを含み得る。これらの方法は、基質から生成物への変換の、１つ以上の酵素的および／または化学的変換ステップを含む。方法に含まれ得るステップは、例えば、グルロン酸からＤ−グルカレートへの酵素的変換（ステップ７）、Ｌ−イズロン酸からイダル酸への酵素的変換（７Ｂ）、Ｌ−イズロン酸から４−デオキシ−５−トレオ−ヘキソスロースウロン酸（ＤＴＨＵ）への酵素的変換（１７）、５−ケトグルコネート（５−ＫＧＡ）からＬ−イズロン酸への酵素的変換（ステップ１５）、Ｌ−イズロン酸からイダル酸への酵素的変換（ステップ７Ｂ）、５−ケトグルコネートから４，６−ジヒドロキシ２，５−ジケトヘキサノエート（２，５−ＤＤＨ）への酵素的変換（ステップ１６）、１，５−グルコノラクトンからグルロノラクトンへの酵素的変換（ステップ１９）の任意の１つ以上を含む。上記のステップの任意の１つ以上が、本発明の方法または経路に含まれ得る。酵素的ステップまたは経路は、ステップの進行のために酵素を反応における触媒として必要とするステップまたは経路である。化学的ステップは、酵素を反応における触媒として用いる必要無く行うことが可能である。方法に記載されるステップの任意の１つ以上は、酵素的ステップであり得る。いくつかの実施形態において、経路の各ステップは全て酵素的ステップであり、他の実施形態において、経路における１つ以上のステップは化学的ステップである。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
いくつかの実施形態において、方法のいずれも、変換を行う酵素を含む反応混合物への反応の基質の添加を含むステップを含み得る。よって、グルロン酸をＤ−グルカレートへ変換する方法（ステップ７）は、反応混合物への、出発基質としてのグルロン酸の添加を含み得、Ｌ−イズロン酸からイダル酸への酵素的変換（７Ｂ）は、反応混合物への、出発基質としてのＬ−イズロン酸の添加を含み得、Ｌ−イズロン酸から４−デオキシ−５−トレオ−ヘキソスロースウロン酸（ＤＴＨＵ）への酵素的変換（１７）は、反応混合物への、出発基質としてのＤＴＨＵの添加を含み得る。方法のいずれにも含まれ得る別のステップは、反応混合物から反応生成物を精製するステップである。よって、Ｄ−グルカレートまたはＬ−イズロン酸、またはイダル酸、または４，６−ジヒドロキシ２，５−ジケトヘキサノエートを精製するステップは、本明細書中に記載される方法のいずれにも含まれ得る。本明細書中に開示される方法のいずれも、反応混合物からＤＤＧまたはＦＤＣＡを分離または精製するステップを含み得る。
【手続補正６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２Ｆ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２Ｆ】
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