(57)【要約】【課題】持効性骨破壊阻止剤を提供する。【解決手段】カテキン類とゼラチンの複合体及び水を含む水性組成物を有効成分とする持効性／徐放性骨破壊阻止剤。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
カテキン類とゼラチンの複合体及び水を含む水性組成物を有効成分とする持効性／徐放性骨破壊阻止剤。
【請求項２】
カテキン類がエピガロカテキンガレート（EGCG）である、請求項１に記載の骨破壊阻止剤。
【請求項３】
注射剤の形態である、請求項１又は２に記載の骨破壊阻止剤。
【請求項４】
前記水性組成物が水溶液又は分散液の形態である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の骨破壊阻止剤。
【請求項５】
骨吸収を阻止する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の骨破壊阻止剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、持効性／徐放性骨破壊阻止剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
歯周病や骨粗鬆症・慢性関節リウマチなどの骨破壊疾患は骨を吸収する細胞、すなわち破骨細胞が過剰に活性化されていることが主な原因である。そのため骨破壊疾患に対する薬剤として、破骨細胞の活性を阻害する薬剤、例えばビスフォスフォネート製剤や抗RANKL抗体が現在使用されている。これらは破骨細胞活性を強力に抑制し骨破壊を阻止するが、顎骨壊死や低カルシウム血症などの重篤な副作用を惹起する可能性もよく知られている。
【０００３】
特許文献１は、エピガロカテキンガレート（EGCG）とコラーゲン、ゼラチンなどの天然高分子の複合体を開示する。
【０００４】
非特許文献１は、EGCGが骨吸収抑制能を示すことを動物実験によって報告しているが、EGCG単独・単回の局所注射では有効濃度を長期間維持することが難しい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１５−２０８３６９号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】H. Kanzaki et al., Journal of Dental Research, 2015, 94, 787.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、副作用を示さない新規の骨破壊阻止剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、以下の持効性／徐放性骨破壊阻止剤を提供するものである。
項１．  カテキン類とゼラチンの複合体及び水を含む水性組成物を有効成分とする持効性／徐放性骨破壊阻止剤。
項２．  カテキン類がエピガロカテキンガレート（EGCG）である、項１に記載の骨破壊阻止剤。
項３．  注射剤の形態である、項１又は２に記載の骨破壊阻止剤。
項４．  前記水性組成物が水溶液又は分散液の形態である、項１〜３のいずれか１項に記載の骨破壊阻止剤。
項５．  骨吸収を阻止する、項１〜４のいずれか１項に記載の骨破壊阻止剤。
【発明の効果】
【０００９】
本発明は、カテキン類をゼラチンに共有結合により担持し、水に溶解又は分散させた水溶液もしくは流動性のある分散液の形態で調製される。この分散液は注射剤として歯槽骨、関節などの近傍に注入すると、注入した場所にとどまり持効性を示す。カテキン類をゼラチンに共有結合により担持した複合体は、透析等で未反応のカテキン類原料及びその他の低分子不純物を除去した後、水溶液又は水分散液の状態で保存することができる。
【００１０】
EGCG-ゼラチン複合体は、1回のEGCG-ゼラチンの局所注射で長期間に渡り、有意に歯の移動・吸収を抑制した。
【００１１】
局所のEGCG有効濃度を長期間にわたって維持できる本EGCG-ゼラチン複合体は、骨形成阻害などの副作用のない安全な薬物である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】マウスにおける矯正学的歯の移動実験の結果
【図２】組織切片上における破骨細胞数を示すグラフ
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、骨吸収阻止剤の有効成分として、カテキン類をゼラチンに共有結合により結合した複合体を使用する。カテキン類は複数のフェノール性水酸基を有し、このフェノール性水酸基とゼラチンのアスパラギン酸残基もしくはグルタミン酸残基の側鎖のカルボキシル基（ＣＯＯＨ）がエステル結合で結合し、複合体を形成する。
【００１４】
カテキン類とゼラチンの複合体は、水溶液、水分散液又はヒドロゲルとし、注射剤として投与されるのが好ましい。水溶液又は水分散液の保存は、遮光するのが好ましく、低温（例えば冷蔵庫内）で貯蔵するのが好ましい。また、低温殺菌やγ線照射などにより滅菌処理をすることもできる。
【００１５】
カテキン類とゼラチンの複合体は、凍結乾燥して注射剤として保存することも可能であるが、その場合、水を加えて十分に複合体を水となじませて、水溶液又は水分散液として注射することができる。
【００１６】
カテキン類としては、カテキン（Ｃ）、ガロカテキン（ＧＣ）、エピカテキン（ＥＣ）、エピガロカテキン（ＥＧＣ）、カテキンガレート（ＣＧ）、エピカテキンガレート（ＥＣＧ）、ガロカテキンガレート（ＧＣＧ）、エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）などが挙げられ、好ましくはエピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）、カテキン（Ｃ）、ガロカテキン（ＧＣ）、エピガロカテキン（ＥＧＣ）、カテキンガレート（ＣＧ）、ガロカテキンガレート（ＧＣＧ）が挙げられ、より好ましくはエピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）が挙げられる。
【００１７】
ゼラチンの原料となるコラーゲンとしては、従来公知の原料が広く使用でき、例えば、酸可溶性コラーゲン、中性塩可溶性コラーゲン、酵素可溶化コラーゲン等の可溶性コラーゲンが挙げられる。ゼラチンの原料として、コラーゲンペプチドのような低分子量の原料を使用してもよい。低分子量の原料は、アレルギーのリスクが低い。
【００１８】
好ましいゼラチンは、ゼリー強度(JISK6503)が300g以下、例えば50から300gのものが挙げられる。
【００１９】
代表的なゼラチンの１０００アミノ酸残基あたりのアミノ酸数（アミノ酸組成）を以下の表１に示す。表１は豚皮のゼラチンを示し、牛皮、牛骨のゼラチンもほぼ同様なアミノ酸組成であるが、狂牛病の問題があるので、表１には豚皮由来のゼラチン組成のみを示す。
【００２０】
【表１】
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【００２１】
ゼラチンは、Ｇｌｙが約１／３を占め、Ｇｌｕ＋Ａｓｐ＝１１７個の側鎖ＣＯＯＨ基、Ｌｙｓ＋Ｈｙｌ＋Ａｒｇ＋Ｈｉｓ＝８６個の側鎖アミノ基（ＮＨ２、ＮＨ）、Ｓｅｒ＋Ｔｈｒ＋Ｔｙｒ＝５６個の側鎖ＯＨ基を有している。１１７個の側鎖ＣＯＯＨ基は、ゼラチンのＯＨ基、アミノ基とのエステル結合もしくはアミド結合による分子内架橋もしくは分子間架橋、さらにＯＨ基を含むカテキン類との共有結合（エステル結合）に利用される。このようなエステルによる架橋及び共有結合は、水溶性脱水縮合剤をゼラチン／コラーゲンを含む水中に添加することにより形成することができる。水溶性脱水縮合剤は、ゼラチンとカテキン類を含む水中に加えてもよいが、ゼラチンを含む水中に一部の水溶性脱水縮合剤を加えてゼラチン架橋を形成し、その後にカテキン類と追加の水溶性脱水縮合剤を添加してカテキン類をゼラチンに結合させてもよい。換言すると、ゼラチン架橋反応とカテキン類の結合反応は、同時に行ってもよく、先にゼラチン架橋をある程度形成させておき、その後にカテキン類の結合（このときゼラチン架橋反応も同時に生じ得る）を生じさせてもよい。
【００２２】
カテキン類は、ゼラチン１００重量部に対し、０．０００１〜１５重量部、好ましくは０．００１〜１０重量部、より好ましくは０．０１〜５重量部程度反応させればよい。
【００２３】
本発明で使用する複合体において、カテキン類は０．０００１〜０．１質量%程度、好ましくは０．０００１〜０．０１質量%程度含まれ、ゼラチンは０．０１〜１０質量%程度、好ましくは０．１〜５質量%程度含まれる。
【００２４】
本発明に用いる脱水縮合剤は、水溶性であり、水溶液中でゼラチンのＣＯＯＨ基とカテキン類のＯＨもしくはゼラチンのアミノ基とのエステル結合もしくはアミド結合を形成可能であり、かつ、ゼラチンの架橋が可能であるものであれば特に限定されず、例えば４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ−ＭＭ）などのトリアジン系縮合剤、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミドの水溶性塩、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣ）などが挙げられ、これらを単独でまたは適宜組み合わせて使用可能である。
【００２５】
水溶性脱水縮合剤は、ゼラチン１００重量部に対し、１〜１０００重量部、好ましくは５〜５００重量部、より好ましくは１０〜１００重量部程度反応させればよい。
【００２６】
使用した脱水縮合剤は、水による洗浄もしくは透析などによって除去できる。
【００２７】
本発明の複合体の精製は、常法に従い行うことができ、例えば透析、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどが挙げられる。
【００２８】
本発明の持効性骨破壊阻止剤は、歯周病、インプラント周囲炎、リウマチ、大腿骨頭壊死、骨粗鬆症、歯列矯正などの患者に注射することにより、持続的に骨破壊、骨吸収などを阻止もしくは軽減することができる。
【００２９】
本発明の持効性骨破壊阻止剤において、カテキン類とゼラチンの複合体の濃度は０．０１〜１０質量%程度、好ましくは０．１〜５質量%程度含まれる。また、カテキン類とゼラチンの複合体の投与量は、成人１回の注射剤として０．０００２〜２ｍｇ程度、好ましくは０．００２〜０．２ｍｇ程度である。
【実施例】
【００３０】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明する。
参考例１
豚皮ゼラチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）１００ｍｇを水５ｍｌに５０℃で溶解し、Ｎ−メチルモルホリン（２７．５μｌ）、ＥＧＣＧ（０．７ｍｇ）、ＤＭＴ−ＭＭ（６９．２ｍｇ）を加え、室温で２４時間撹拌した。
【００３１】
得られた溶液を、透析膜としてＲＣ透析チューブ  ポア７  ＭＷＣＯ１０００（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ社製）を使用し、水に対し２４時間透析して未反応のＥＧＣＧ、ＤＭＴ−ＭＭ及びその反応生成物を除去することで、ＥＧＣＧが結合したＥＧＣＧ−ゼラチン複合体（7 mg -EGCG / g-ゼラチン）を得た。
【００３２】
ＥＧＣＧ（０．７ｍｇ）に代えてＥＧＣＧ（０．０７ｍｇ）を使用する以外は上記と同様にしてＥＧＣＧ−ゼラチン複合体（0.7 mg -EGCG / g-ゼラチン）を得た。
【００３３】
実施例１
（１）実験動物 
6週齢雄性BALB/Cマウス13匹を次の3群に分けて実験を行った。 
１. EGCG-ゼラチン(0.7 mg-EGCG / g-ゼラチン)投与群 (n=5) 
２. EGCG-ゼラチン(7 mg-EGCG / g-ゼラチン)投与群 (n=4) 
３. ゼラチン投与群 (n=4)
（２）歯の移動方法
通法に従い、コの字型のニッケルチタンワイヤーを上顎両側第一臼歯間に装着し、上顎両側第一臼歯(M1)を口蓋側へ移動する系を用いた。 
（３）薬剤投与方法
実験開始日に、麻酔下においてEGCG-ゼラチン複合体溶液(5μL)またはゼラチン溶液を上顎第一臼歯口蓋側歯肉へ局所注射した。 
（４）歯の移動量評価方法
実験開始日および7, 14, 21日目に麻酔下において上顎歯列の精密印象を採得、超硬石膏歯列模型を作製、模型をスキャン、拡大印刷、上顎臼歯のトレースを行い、重ね合わせを行うことで経時的な歯の移動量を測定した。結果を図１に示す。測定誤差は0.011 mmであった。EGCG-ゼラチン複合体は、骨の移動（骨破壊・骨吸収）を抑制した。
【００３４】
3週間の歯の移動実験後、通法に従い屠殺・固定後に脱灰し、パラフィン包埋連続切片を作製、パラフィン切片を脱パラ後、TRAP染色を行った。歯槽骨表面に観察されるTRAP陽性細胞（破骨細胞）のカウントを行った。結果を図２に示す。
【００３５】
ゼラチンとEGCGを原料に調製したEGCG-ゼラチン複合体は、骨の移動・吸収を長期間持続的に阻害する優れた骨破壊阻止剤であることが明らかになった。
【００３６】
歯周病などの骨破壊性疾患に対する治療では、その初期には骨吸収の阻害が必要不可欠であり、その後に骨形成促進が要求される。EGCG-ゼラチン複合体は治療の初期段階の骨吸収阻害、治療後半の骨形成促進ステップの両方に有効な材料である。
【図１】
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【図２】
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