(57)【要約】      （修正有）【課題】植物における外来遺伝子の発現のために、ゲノム編集完了後にウイルスベクターを簡便に除去可能であり、且つ前記除去操作による前記植物への悪影響を最小限にできる前記植物ウイルスベクターと、前記植物ウイルスベクターを前記植物に感染させる工程を含みながら、外来ＤＮＡを植物染色体に組み込むことなくゲノム編集を可能とする遺伝子導入方法の提供。【解決手段】特定の核酸配列を含むｍｉＲ３９８により標的とされるｍｉＲ３９８標的核酸配列を有する、ゲノム編集酵素遺伝子導入のための植物ウイルスベクター。ｍｉＲ３９８標的核酸配列が、ｍｉＲ３９８と少なくとも７０％の同一性を有する核酸配列に相補的であるウイルスベクター。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｍｉＲ３９８標的核酸配列を含む、遺伝子導入のためのウイルスベクター。
【請求項２】
配列番号１の配列及び配列番号５〜２６の配列からなる群より選択される配列を有するｍｉＲ３９８により標的とされるｍｉＲ３９８標的核酸配列を有する、請求項１記載のウイルスベクター。
【請求項３】
ｍｉＲ３９８標的核酸配列が、ｍｉＲ３９８と少なくとも７０％の同一性を有する核酸配列に相補的である、請求項１又は２記載のウイルスベクター。
【請求項４】
ｍｉＲ３９８標的核酸配列が、配列番号１の配列及び配列番号５〜２６の配列からなる群より選択される配列の２〜１７位の領域において少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列に相補的である、請求項１〜３のいずれか一項記載のウイルスベクター。
【請求項５】
ｍｉＲ３９８標的核酸配列が、配列番号２、３又は４の配列、又はそれらと少なくとも９０％の同一性を有する配列からなる群より選択される、請求項１〜４のいずれか一項記載のウイルスベクター。
【請求項６】
ｍｉＲ３９８標的核酸配列が、配列番号２、３又は４の配列である、請求項１〜５のいずれか一項記載のウイルスベクター。
【請求項７】
ウイルスベクターが、植物ウイルスベクターである、請求項１〜６のいずれか一項記載のウイルスベクター。
【請求項８】
ベクターが、ナス科植物ウイルスベクターである、請求項７記載のウイルスベクター。
【請求項９】
外被タンパク質を欠損している、請求項１〜８のいずれか一項記載のウイルスベクター。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項記載のウイルスベクターを植物に感染させる工程を含む、遺伝子導入方法。
【請求項１１】
さらに、植物を脱分化及び再分化させる工程を含む、請求項１０記載の遺伝子導入方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｍｉＲ３９８標的核酸配列を含む、遺伝子導入のためのウイルスベクター、
及びそれを植物に感染させる工程を含む、遺伝子導入方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物における外来遺伝子の発現にはいくつかの方法があるが、植物ウイルスベクターは簡便で高発現が見込めるほか、植物ゲノムへの外来ＤＮＡの挿入を経ずに遺伝子発現が可能であるという利点がある。近年注目を集めているゲノム編集技術によって作製した遺伝子操作植物は、組換え体としての規制を受けない可能性があるが、ゲノム編集植物を作製するためには、多くの場合ゲノム編集酵素を発現する組換え体を一旦作製する必要があるため、代替技術の開発競争が行われている（非特許文献１）。ウイルスベクターの利用は有望な代替技術の一つであるが、ゲノム編集完了後にウイルスベクターを除去する必要があり、これが技術的障害となっていた。
【０００３】
他方、ｍｉＲ３９８は、ストレス応答や銅代謝に関与していることが示されている小分子ＲＮＡであるが、シロイヌナズナ等では環境ストレスにより発現が誘導され、標的遺伝子を抑制するｍｉＲＮＡとして報告されている（非特許文献２）。ｍｉＲ３９８の発現を誘導するストレスとしては、多くの植物の脱分化・再分化培地に含まれるショ糖等が挙げられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Woo et al. Nature Biotechnology 33, 1162-1164 (2015)
【非特許文献２】Dugas and Bartel, Plant Mol Biol, 67:403-417 (2008)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
遺伝子導入完了後に簡便に除去可能であり、且つ除去操作による植物への悪影響を最小限にできる植物ウイルスベクターを見出すことを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは鋭意研究の末、従来には知られていなかったｍｉＲ３９８標的核酸配列を含む、遺伝子導入のためのウイルスベクターを使用することにより、ゲノム編集酵素遺伝子を植物に導入し、ゲノム編集完了後に不要となったウイルスベクターを、植物への悪影響を最小限にして除去することにより、外来DNAを植物染色体に組み込むことなくゲノム編集が可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明の要旨は以下である。
【０００８】
［１］ｍｉＲ３９８標的核酸配列を含む、遺伝子導入のためのウイルスベクター。
［２］配列番号１の配列及び配列番号５〜２６の配列からなる群より選択される配列を有するｍｉＲ３９８により標的とされるｍｉＲ３９８標的核酸配列を有する、前記［１］記載のウイルスベクター。
［３］ｍｉＲ３９８標的核酸配列が、ｍｉＲ３９８と少なくとも７０％の同一性を有する核酸配列に相補的である、前記［１］又は［２］記載のウイルスベクター。
［４］ｍｉＲ３９８標的核酸配列が、配列番号１の配列及び配列番号５〜２６の配列からなる群より選択される配列の２〜１７位の領域において少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列に相補的である、前記［１］〜［３］のいずれか記載のウイルスベクター。
［５］ｍｉＲ３９８標的核酸配列が、配列番号２、３又は４の配列、又はそれらと少なくとも９０％の同一性を有する配列からなる群より選択される、前記［１］〜［４］のいずれか記載のウイルスベクター。
［６］ｍｉＲ３９８標的核酸配列が、配列番号２、３又は４の配列である、前記［１］〜［５］のいずれか記載のウイルスベクター。
［７］ウイルスベクターが、植物ウイルスベクターである、前記［１］〜［６］のいずれか記載のウイルスベクター。
［８］ベクターが、ナス科植物ウイルスベクターである、前記［７］記載のウイルスベクター。
［９］外被タンパク質を欠損している、前記［１］〜［８］のいずれか記載のウイルスベクター。
［１０］前記［１］〜［９］のいずれか記載のウイルスベクターを植物に感染させる工程を含む、遺伝子導入方法。
［１１］さらに、植物を脱分化及び再分化させる工程を含む、前記［１０］記載の遺伝子導入方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、遺伝子導入完了後にウイルスベクターを除去するための特別な操作の必要がなく、植物への悪影響を最小限にして、植物に遺伝子を導入することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の一実施態様によるウイルスベクターの設計を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、ｍｉＲ３９８標的核酸配列を含む、遺伝子導入のためのウイルスベクター、及びそれを植物に感染させる工程を含む、遺伝子導入方法を提供する。
【００１２】
ｍｉＲ３９８は単子葉・双子葉問わず広く植物に保存されている。本発明におけるｍｉＲ３９８は、発現形式がタバコと同様であり、かつウイルス感染葉から個体が再生可能な任意の植物のｍｉＲ３９８であればよい。そのようなｍｉＲ３９８としては、例えばタバコ、シロイヌナズナ、イネ、トウモロコシ、大豆、小麦、ジャガイモ、メロン、セイヨウリンゴ、ポプラ、セイヨウアブラナなどのｍｉＲ３９８が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、本発明におけるｍｉＲ３９８は、タバコのｍｉＲ３９８である。
【００１３】
タバコのｍｉＲ３９８の配列は、
５’−ＵＧＵＧＵＵＣＵＣＡＧＧＵＣＧＣＣＣＣＵＧ−３’         （配列番号１）
であるが、本発明において利用可能なさらなるｍｉＲ３９８の配列を表１に例示する。
【００１４】
【表１】
2018029521.tif 000002
【００１５】
本発明のウイルスベクターにおけるｍｉＲ３９８標的核酸配列は、ｍｉＲ３９８の配列と少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％の同一性を有する核酸配列に相補的であればよく、好ましくは配列番号１の配列及び配列番号５〜２６の配列からなる群より選択される配列の２〜１７位の領域において少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、最も好ましくは１００％の同一性を有する核酸配列に相補的であればよい。
【００１６】
本発明のウイルスベクターにおけるｍｉＲ３９８標的核酸配列は、
５’−ＣＡＧＧＧＧＣＧＡＣＣＴＧＡＧＡＡＣＡＣＡ−３’         （配列番号２）
５’−ＴＧＣＧＧＧＴＧＡＣＣＴＧＧＧＡＡＡＣＡＴＡ−３’（配列番号３）
５’−ＡＣＴＣＧＧＴＧＡＣＣＴＧＧＧＡＡＣＡＣＴ−３’         （配列番号４）；
及びそれらと少なくとも９０％の同一性を有する配列からなる群より選択することができ、好ましくは、配列番号２、３又は４の配列である。
【００１７】
既知の植物ウイルスは全て宿主のＲＮＡサイレンシングの影響を受ける。そして、ウイルスを標的とするよう人工的にデザインしたｍｉＲＮＡを発現させることにより、多くのウイルスに対する抵抗性植物の作出が報告されている（例えば、Ｔｕｒｎｉｐ  ｙｅｌｌｏｗ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ：Niu et al., Nat Biotechnol. 2006 Nov; 24 (11): 1420-8；カブモザイクウイルス：Niu et al., Nat Biotechnol. 2006 Nov; 24 (11): 1420-8；キュウリモザイクウイルス：Qu et al., J Virol. 2007 Jun;81(12):6690-9）。よって、本発明のウイルスベクターは、任意の植物ウイルスベクターであればよいが、好ましくはナス科植物ウイルスベクター、例えばトマトモザイクウイルスベクター、トマトブッシースタントウイルスベクター、タバコモザイクウイルスベクター、タバコ茎えそウイルスベクター、ジャガイモＸウイルスベクター、ジャガイモＹウイルスベクターなどが挙げられ、これらに限定されない。
【００１８】
本発明のウイルスベクターは、好ましくは外被タンパク質を欠損しており、それにより除去がより容易となる。
【００１９】
本発明により、遺伝子を導入し得る植物としては、ｍｉＲ３９８の発現様式がタバコと同様であり、かつ感染葉から個体が再生可能な植物であればよく、例えばタバコ、シロイヌナズナ、イネ、トウモロコシ、大豆、小麦、ジャガイモ、メロン、セイヨウリンゴ、ポプラ、セイヨウアブラナなどが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、本発明により遺伝子を導入し得る植物は、タバコである。
【００２０】
本発明は、前記ウイルスベクターを植物に感染させる工程を含む遺伝子導入方法を提供する。本発明による遺伝子導入方法は、好ましくは、さらに植物を脱分化及び再分化させる工程を含む。
【００２１】
ウイルスベクターを植物に感染させる工程及び植物を脱分化及び再分化させる工程は、当該技術分野にて慣用されている任意の工程であればよい。その一例として、タバコにウイルスを接種する工程、その後感染葉からカルスを形成し、再分化させてシュートを得る工程が挙げられるが、これに限定されない。
【実施例】
【００２２】
次に、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り以下の実施例に限定されるものではない。
【００２３】
１．ウイルスベクターの設計
遺伝子導入の効率を簡易的に測定するため、トマトモザイクウイルス（ＴｏＭＶ）ベクターｐＴＬＷ３（Kubota et al. J Virol., 2013, 77 (20): 11016-1026）の外被タンパク質コード領域を黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）遺伝子あるいはメガヌクレアーゼＩ−ＳｃｅＩ遺伝子と置き換えた。ＹＦＰ遺伝子は感染部位の可視化に便利であることから利用したが、ウイルスベクターの性質に影響しないので、任意の配列と置換可能である。Ｉ−ＳｃｅＩは１８塩基の配列を特異的に認識するエンドヌクレアーゼである。タバコは、通常は蛍光を発現しないが、Ｉ−ＳｃｅＩ標的部位が切断され、続いて修復される際にフレームが戻るとホタルルシフェラーゼが発現する遺伝子カセットをゲノムにもつ形質転換タバコを用いることにより、ゲノム編集部位の可視化が可能となる。さらに、配列番号２、３又は４を有するｍｉＲ３９８標的核酸配列又はＳｐａｃｅｒ配列を、ＹＦＰ遺伝子あるいはＩ−ＳｃｅＩ遺伝子の終止コドン直後に配した。ウイルスベクターの設計を図１に示す。
【００２４】
２．ウイルスベクターの感染
各ＴｏＭＶベクタープラスミドをＭｌｕＩで切断した直鎖状ＤＮＡを鋳型にＡｍｐｌｉＣａｐ−Ｍａｘ  Ｔ７  Ｈｉｇｈ  Ｙｉｅｌｄ  Ｍｅｓｓａｇｅ  Ｍａｋｅｒ  Ｋｉｔ（Cellscript、米国）を用いて試験管内転写反応を行い、反応液を水で５〜１０倍希釈したものを、カーボランダムを使いタバコの葉に機械接種した。
【００２５】
ＹＦＰ蛍光の広がりを観察したところ、ｍｉＲ３９８標的配列の有無で大きな差はなかったことから、タバコ葉におけるＴｏＭＶベクターの増殖及びＹＦＰ遺伝子の発現にはｍｉＲ３９８標的核酸配列の挿入による影響はほとんどないと考えられた。
【００２６】
３．植物の脱分化及び再分化
ウイルス接種から１４日後のタバコ葉を５倍希釈したキッチンハイター（登録商標）で滅菌し、YFPあるいはホタルルシフェラーゼの発現が観察された部位を含む約１ｃｍ四方のリーフディスクよりカルスを形成させ、公知のタバコの形質転換法（Oshima et al., Plant Cell. 1990, 2: 95-106）に従ってシュートを形成させた。但し、再分化に用いる培地は選択用の抗生物質を含まないものを用いた。
【００２７】
４．ＲＴ−ＰＣＲによるウイルスの検出
シュートをカルスから切り分けて、新しい培地に移した。３週間後、シュートの１枚目の葉からＩＳＯＳＰＩＮ  Ｐｌａｎｔ  ＲＮＡ（和光純薬工業株式会社）を用いてＲＮＡを抽出した。次に、１００ｎｇのＲＮＡを鋳型とし、ＴｏＭＶの複製タンパク質コード領域を標的とするプライマー（Ｔｏ８６: ５’−ＴＣＡＡＣＡＧＡＧＴＡＡＣＴＧＧＴ−３’（配列番号２７）；及びＴｏ８７：５’−ＧＣＡＧＣＴＡＣＡＧＡＣＴＴＡＧＡ−３’（配列番号２８））とＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（Ｄｙｅ  Ｐｌｕｓ）（タカラバイオ株式会社）を用いてＲＴ−ＰＣＲ（４０サイクル）を行った。ポジティブコントロール、ネガティブコントロールとして、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写で調製したウイルスＲＮＡ、及びウイルスフリーのタバコ葉から抽出したＲＮＡをそれぞれ用いた。ＲＴ−ＰＣＲ後のサンプルを、アガロースゲル電気泳動に供し、ＬＡＳ−３０００（富士フィルム株式会社）を用いてイメージの取り込みを行った。
【００２８】
ネガティブコントロールのＳｐａｃｅｒ配列では１００％（２５／２５）のサンプルでウイルスが検出されたのに対し、配列番号２を有するウイルスベクター感染葉より再分化したシュートでは６０％（１５／２５）のサンプルでウイルスが検出されただけで、残りの４０％のサンプルはウイルスゲノムの蓄積は検出限界以下であった。
【００２９】
５．リアルタイムＰＣＲによるウイルスの検出
再分化シュートの３枚目の葉から前項と同様にＲＮＡを抽出した。次に、４０ｎｇのＲＮＡを鋳型とし、ＴｏＭＶの複製タンパク質コード領域を標的とするプライマー（５１１Ｆ: ５’−ＴＡＴＡＣＣＴＴＴＣＴＡＧＧＣＴＣＧＡＧＡＧＧＧＧ−３’（配列番号２９）；及び６５７Ｒ：５’−ＴＴＣＣＣＧＴＧＴＡＡＣＡＴＴＣＴＴＧＡＧＡＡＴＧ−３’（配列番号３０））とｉＳｃｒｉｐｔ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ  ｗｉｔｈ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（Bio-Rad、米国）を用いてリアルタイムＰＣＲを行い、ｉＱＴＭ５  リアルタイム  ＰＣＲ  解析システムを用いて検出した。
【００３０】
ネガティブコントロールのＳｐａｃｅｒ配列の場合と比較して、配列番号３あるいは４を有するウイルスベクターより再分化したシュートにおけるウイルスゲノムの蓄積量は１万分の１から１０万分の１程度にまで低下している個体が多くみられた。段落［００２７］の結果と合わせると、ウイルスゲノムの蓄積量低下効果は配列番号２、３、４の順に高かった。これらの結果から、用いる標的配列はｍｉＲ３９８との相同性が高いほど効果的であるといえる。
【００３１】
６．結果
ｍｉＲ３９８標的核酸配列を含むウイルスベクターを用いることにより、特別な処理を行わなくても再分化シュートにおいてウイルスベクターの蓄積量が低下し、個体によっては検出限界以下に除去されていることが判明した。
【００３２】
本発明による遺伝子導入法では、外来遺伝子の除去のための交配を必要としないため、栄養繁殖性の作物、Ｆ１品種、果樹などの交配を回避したい植物への非組み換え遺伝子導入に利用可能である。また、形質転換が困難な植物であっても、本発明を適用しうる。また、本発明は、ウイルスベクターを用いて内在性遺伝子の発現抑制を行ったり、すでに感染している他のウイルスに対するＲＮＡサイレンシングを誘導することによる当該ウイルスの根絶治療を行った後のウイルス除去にも適用しうる。
【図１】
2018029521.tif 000003
【配列表】
2018029521000001.app