(57)【要約】      （修正有）【課題】チューブ内の培養液と細胞を一方向に効率的に送流することができ、これによって細胞の凝集塊が互いにぶつかり合うことを抑止して均一な凝集塊を得ることができ、また容量の大きい培養容器を容易に製造することを可能とする細胞容器の提供。【解決手段】可撓性部材を用いて形成された細長のチューブからなり、チューブ１の端部が一又は二以上の接続部材１１で接続されてチューブ内で細胞２を培養する環状の密閉空間が形成された環状培養容器。チューブ１に垂直な開口部ポート１２は、他のチューブを介して外部のバッグなどに接続可能である環状細胞培養容器。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
可撓性部材を用いて形成されたチューブからなり、前記チューブの端部が一又は二以上の接続部材で接続されて前記チューブ内で細胞を培養する環状の密閉空間が形成された環状培養容器。
【請求項２】
前記チューブが、当該環状培養容器の外部と物質の出し入れをするためのポートを備えたことを特徴とする請求項１記載の環状培養容器。
【請求項３】
前記チューブが、ガス透過性を有することを特徴とする請求項１又は２記載の環状培養容器。
【請求項４】
前記チューブの少なくとも一部が弾性変形性を有することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の環状培養容器。
【請求項５】
前記チューブの内面が、低接着表面であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の環状培養容器。
【請求項６】
前記チューブ内に、細胞の凝集塊のサイズを調節するためのサイズ調節フィルターを備えたことを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の環状培養容器。
【請求項７】
二以上の前記チューブが前記接続部材で接続され、複数の環状空間が連結して形成されたことを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の環状培養容器。
【請求項８】
前記接続部材が、二以上のポートを備えたことを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の環状培養容器。
【請求項９】
前記接続部材の少なくとも一部が弾性変形性を有することを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の環状培養容器。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれかに記載の環状培養容器と、ポンプとを備え、
前記チューブに前記ポンプが取り付けられ、前記ポンプを駆動させることにより、前記チューブ内の培養液と細胞が、前記チューブ内において一方向に送流されながら培養される
ことを特徴とする細胞培養システム。
【請求項１１】
請求項８記載の細胞培養システムを用いた細胞培養方法であって、
前記チューブに、凝集塊を形成させて培養できる接着細胞又は浮遊細胞を培養液と共に封入し、
前記ポンプを駆動させることにより、前記チューブ内の培養液と細胞を、前記チューブ内において一方向に送流しながら培養する
ことを特徴とする細胞培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、閉鎖系容器において細胞を大量に培養するための細胞培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医薬品の生産や、遺伝子治療、再生医療、免疫療法等の分野において、細胞や組織、微生物などを人工的な環境下で効率良く大量に培養することが求められている。
このような状況において、培養容器（培養バッグ）に細胞と培養液を充填して、閉鎖系で自動的に細胞を大量培養することが行われている。
【０００３】
閉鎖系容器においてｉＰＳ細胞などの接着細胞を、凝集塊を形成させて培養する場合、凝集塊が沈降して底面に接着しないように、容器内の培養液を撹拌する必要がある。
しかしながら、培養バッグなどの閉鎖系容器を用いて細胞を培養する場合、撹拌された細胞がランダムに動くため、凝集塊同士がぶつかってダメージを受けたり、あるいは凝集塊のサイズが大きくなったり、小さくなったりし、結果として凝集塊サイズが大きくばらつくという問題点があった。
このような問題を解消し得る技術として、培養バッグをドーナツ形状に製袋し、回転振動台上で振動させ、バッグ内において培養液をよく混ざるようにすることによって、細胞を培養する培養容器が提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２００７−５２２８２５号公報
【特許文献２】特開２００５−８７１１４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、このようなドーナツ形状に製袋された培養バッグを用いる場合、培養バッグにシワが発生することによって細胞が滞留することがあり、また、細胞を大量に培養するための容量の大きい培養容器を製造することは、困難であるという問題があった。
【０００６】
そこで、本発明者らは鋭意研究して、可撓性部材を用いて形成された細長のチューブを用いて、当該チューブの端部を接続部材により接続し、形成されたチューブ内の密閉空間に細胞及び培養液を封入した状態で、細胞を一方向に送流しながら細胞を培養することによって、上記問題を解消できることを見いだし、本発明を完成させた。
すなわち、このようなチューブを用いて形成された環状培養容器に、凝集塊を形成させて培養できる接着細胞や浮遊細胞を培養液と共に封入し、ポンプを取り付けてこれを駆動させることによって、チューブ内の培養液と細胞を一方向に送流しながら細胞を培養できる。このような環状培養容器を用いてチューブ内の培養液と細胞を一方向へ流すことで、細胞の凝集塊が互いにぶつかり合うことを抑止でき、より均一な凝集塊を得ることが可能となる。また、このようなチューブからなる環状培養容器によれば、容量の大きい培養容器を容易に製造することも可能となる。
【０００７】
ここで、チューブを用いて形成された培養容器としては、特許文献１に記載の連続培養装置や、特許文献２に記載の培養・回収装置を挙げることができる。
しかしながら、特許文献１に記載の連続培養装置では、チューブ内の培養液と細胞を一方向に送流しながら細胞を培養することが可能なものではなかった。また、特許文献２に記載の培養・回収装置は、チューブの内面に細胞を付着させて培養し、チューブを変形させることによって培養した細胞を剥離させて回収するものであり、細胞を容器に付着させることなく、チューブ内の培養液と細胞を一方向に送流しながら細胞を培養することが可能なものではなかった。
【０００８】
本発明は、上記事情に鑑みなされたものであり、チューブ内の培養液と細胞を一方向に効率的に送流することができ、これによって細胞の凝集塊が互いにぶつかり合うことを抑止して均一な凝集塊を得ることができ、また容量の大きい培養容器を容易に製造することが可能な環状培養容器、細胞培養システム、及び細胞培養方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するため、本発明の環状培養容器は、可撓性部材を用いて形成された細長のチューブからなり、前記チューブの端部が一又は二以上の接続部材で接続されて前記チューブ内で細胞を培養する環状の密閉空間が形成された構成としてある。
【００１０】
また、本発明の細胞培養システムは、上記環状培養容器と、ペリスタルティック方式のポンプとを備え、前記チューブに前記ポンプが取り付けられ、前記ポンプを駆動させることにより、前記チューブ内の培養液と細胞が、前記チューブ内において一方向に送流されながら培養される構成としてある。
【００１１】
また、本発明の細胞培養方法は、上記細胞培養システムを用いた細胞培養方法であって、前記チューブに、凝集塊を形成させて培養できる接着細胞又は浮遊細胞を培養液と共に封入し、前記ポンプを駆動させることにより、前記チューブ内の培養液と細胞を、前記チューブ内において一方向に送流しながら培養する方法としてある。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、チューブ内の培養液と細胞を一方向に効率的に送流することができ、これによって細胞の凝集塊が互いにぶつかり合うことを抑止して均一な凝集塊を得ることができ、また容量の大きい培養容器を容易に製造することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の実施形態に係る環状培養容器の概略構成を示す斜視図である。
【図２】本発明の実施形態に係る環状培養容器の構成を示す模式図である。
【図３】本発明の実施形態に係る複数の環状空間が連結して形成された環状培養容器の構成を示す模式図である。
【図４】本発明の実施形態に係る複数の環状空間が連結して形成された環状培養容器を用いて、培養液を追加する工程を示す図である。
【図５】本発明の実施形態に係る複数の環状空間が連結して形成された環状培養容器の環状空間を積み重ねて配置する様子を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の環状培養容器、細胞培養システム、及び細胞培養方法の実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は、以下の実施形態の具体的な内容に限定されるものではない。
【００１５】
本実施形態の環状培養容器は、可撓性部材を用いて形成された細長のチューブからなり、チューブの端部が一又は二以上の接続部材で接続されてチューブ内で細胞を培養する環状の密閉空間が形成されたことを特徴とする。
また、本実施形態の細胞培養システムは、このような環状培養容器と、ペリスタルティック方式のポンプとを備え、チューブにポンプが取り付けられ、ポンプを駆動させることにより、チューブ内の培養液と細胞が、チューブ内において一方向に送流されながら培養されることを特徴とする。
また、本実施形態の細胞培養方法は、このような細胞培養システムを用いた細胞培養方法であって、チューブに、凝集塊を形成させて培養できる接着細胞又は浮遊細胞を培養液と共に封入し、ポンプを駆動させることにより、チューブ内の培養液と細胞を、前記チューブ内において一方向に送流しながら培養することを特徴とする。
【００１６】
具体的には、本実施形態の環状培養容器は、図１に示すように、可撓性部材からなる細長のチューブ１が接続部材１１により接続されて環状構造を形成し、チューブ１内に密閉空間が形成されている。
環状とは、チューブ１が環を形成するように繋がれていることを意味し、円形に繋がれることに限定するものではなく、図２に示すように矩形やその他の形状となるように繋がれていても良い。また、本実施形態の環状培養容器におけるチューブ1は、接続部材等を用いて材質や剛性などが異なるチューブを複数組み合わせて形成されていても良い。
【００１７】
チューブ１は、ガス透過性を有する部材からなるものであることが好ましい。具体的には、酸素透過係数が４００ｍｌ・ｍｍ／ｍ２・ｄａｙ・ａｔｍ（３７℃−８０％ＲＨ）以上、二酸化炭素透過係数が１２００ｍｌ・ｍｍ／ｍ２・ｄａｙ・ａｔｍ（３７℃−８０％ＲＨ）以上のものであることが好ましく、酸素透過係数が１０００ｍｌ・ｍｍ／ｍ２・ｄａｙ・ａｔｍ（３７℃−８０％ＲＨ）以上、二酸化炭素透過係数が３０００ｍｌ・ｍｍ／ｍ２・ｄａｙ・ａｔｍ（３７℃−８０％ＲＨ）以上のものであることがより好ましい。チューブ１がこのようなガス透過性を有すれば、優れた細胞増殖効率を得ることができる。
【００１８】
また、チューブ１は、一部又は全部が弾性変形性を有する部材からなるものであることが好ましい。チューブ１の少なくとも一部が弾性変形性を有することで、ペリスタルティック方式のポンプ（チューブポンプ、ローラーポンプ、しごきポンプとも称する）を用いて、チューブ１内の培養液と細胞を効率的に送流することができる。また、チューブ１を自由に曲げることができるため、環状培養容器を優れたスペース効率で配置することが可能となる。さらに、環状培養容器内のエアを抜いて真空状態としてから培養液を充填することで、ポンプなどのエア排出手段を用いることが不要であり、各部材点数を少なくすることが可能となる。
【００１９】
さらに、チューブ１は、内容物を確認できるように、一部又は全部が透明性を有することが好ましい。
チューブ１の材料としては、例えばシリコーンゴム、軟質塩化ビニル樹脂、ポリブタジエン樹脂、エチレン−酢酸ビニル共重合体、塩素化ポリエチレン樹脂、ポリウレタン系熱可塑性エラストマー、ポリエステル系熱可塑性エラストマー、シリコーン系熱可塑性エラストマー、スチレン系エラストマー、例えば、ＳＢＳ（スチレン・ブタジエン・スチレン）、ＳＩＳ（スチレン・イソプレン・スチレン）、ＳＥＢＳ（スチレン・エチレン・ブチレン・スチレン）、ＳＥＰＳ（スチレン・エチレン・プロピレン・スチレン）、ポリオレフィン樹脂、フッ素系樹脂等を用いることができる。
すなわち、チューブ１の材料としてこれらを用いると共に、上記のようなガス透過性、弾性変形性、及び透明性を有するものとすることが好ましい。
【００２０】
また、チューブ１の内面を、低接着表面とすることが好ましい。これにより、凝集塊を形成させて培養できる接着細胞などを好適に培養することができる。具体的には、例えばＭＰＣ（2-Methacryloylethyl  Phosphoryl  Choline）ポリマーや、ハイドロゲル等を用いて、チューブ１の内面に細胞低接着処理を施すことが可能である。
【００２１】
さらに、チューブ１内に、細胞の凝集塊のサイズを調節するためのサイズ調節フィルターを備えることも好ましい。これにより、大きくなり過ぎた凝集塊を一定のサイズ以下に分解することができ、凝集塊を一定のサイズに均一に揃えることが可能となる。
【００２２】
接続部材１１は、チューブ１の端部を接続することで、チューブ１内に環状の密閉空間を形成させる。図１では、接続部材１１としてＴ型のチューブコネクタを用い、対向する開口部にチューブ１の端部を挿入して接続している。また、チューブ１に垂直な開口部はポート１２として用いられ、他のチューブを介して外部のバッグなどに接続可能にされている。なお、接続部材１１としては、このようなＴ型のチューブコネクタに限定されず、Ｙ型、Ｉ型、Ｘ型等のチューブコネクタや、その他のチューブ接続器具を用いても良い。
【００２３】
このように、チューブ１には、当該環状培養容器の外部と物質の出し入れをするための一又は二以上のポート１２を備えることが好ましい。この物質には、培養液などの液体の他、空気などの気体や、細胞などの固形物等が含まれる。
具体的には、図２に示すように、ポート１２には、チューブ１内に培養液を供給するための培養液バッグ５や、チューブ１内の空気を取り除いてチューブ１内を培養液で満注させるためのエア排気バッグ６やエアベントフィルター等を接続することができる。また、ポート１２には、サンプリング用のチューブを接続することもできる。
【００２４】
また、図２において、チューブ１と培養液バッグ５、チューブ１とエア排気バッグ６をそれぞれ接続するチューブには、チューブクランプが取り付けられている。チューブ１内に培養液を充填する時に、チューブ１と培養液バッグ５の間のチューブクランプを取り外してポンプ４を駆動させ、培養液バッグ５内の培養液をチューブ１内に充填する。また、チューブ１内にエアが存在している場合、チューブ１とエア排気バッグ６の間のチューブクランプを取り外し、ポンプ４を駆動させて、チューブ１内のエアをエア排気バッグ６へ排出する。そして、エアの排出が完了すると、チューブ１とエア排気バッグ６の間にチューブクランプを取り付ける。また、チューブ１内に細胞２と培養液３が満注となるように充填されると、チューブ１と培養液バッグ５の間にチューブクランプを取り付ける。
【００２５】
このように、チューブ１内の密閉空間には、細胞２と培養液３が充填され、これらをチューブ１内において一方向に送流させながら、細胞２を培養することができる。なお、図１において、細胞２は、凝集塊として模式的に大きく表されている。
【００２６】
チューブ１内における細胞２と培養液３の送流は、ポンプ４を駆動させることで行うことができる。ポンプ４としては、チューブ１をしごくことによってチューブ１内の細胞２と培養液３を送流できるペリスタルティック方式のポンプを好適に用いることができる。
【００２７】
細胞２としては、凝集塊（スフェロイド）を形成させて培養できる接着細胞又は浮遊細胞を好適に用いることができる。具体的には、例えばｉＰＳ細胞、神経幹細胞、胚性幹細胞、肝細胞、膵島細胞、心筋細胞、角膜内皮細胞等の接着細胞や、リンパ球、単球、赤血球、巨核球などの浮遊細胞を挙げることができる。
本実施形態の環状培養容器を用いてこれらの細胞を培養することにより、細胞の凝集塊が互いにぶつかり合うことを抑止することができ、均一なサイズの凝集塊を効率的に得ることが可能となる。
また、本実施形態の環状培養容器は、細長のチューブ１を接続部材１１で接続することによって簡単に製造でき、容量の大きい培養容器を容易に製造することが可能である。
【００２８】
また、本実施形態の環状培養容器を、二以上のチューブ１が接続部材１１で接続され、複数の環状空間が連結して形成されたものとすることも好ましい。
具体的には、例えば、図３に示すように、３個の環状空間が連結して形成されたものとすることができるが、環状空間の個数はこれに限定されず、２個であっても４個以上であっても良い。
同図の例では、図２と同様の環状培養容器に、接続部材１１を介して、２個の環状空間を構成するチューブ１が接続されている。便宜上、左から順に第一の環状空間、第二の環状空間、及び第三の環状空間と称する。第一の環状空間にのみ培養液バッグ５が接続され、またポンプ４が取り付けられているが、これらの両方又は片方を第二の環状空間及び／又は第三の環状空間に接続又は取り付けることもできる。
【００２９】
本実施形態の複数の環状空間が連結して形成された環状培養容器を用いて、例えば、図４に示す方法により、細胞培養を行うことができる。
まず、第一の環状空間と第二の環状空間を接続する接続部材１１に取り付けられたチューブクランプを取り外し、また培養液バッグ５とエア排気バッグ６のチューブクランプを取り外して、ポンプ４を駆動する。そして、第一の環状空間を形成するチューブ１に、図２を用いて前述したように、細胞と培養液を充填し、これらをチューブ１内において一方向に送流することによって、細胞培養を行う。
【００３０】
第一の環状空間において、細胞が一定の密度になるまで増殖すると、次に、第二の環状空間のチューブ１に取り付けられたチューブクランプと、第二の環状空間のエア排気バッグ６に取り付けられたチューブクランプを取り外し、また培養液バッグ５のチューブクランプを取り外す。また、第一の環状空間と第二の環状空間を接続する接続部材１１にチューブクランプを取り付けて、ポンプ４を駆動する。そして、第一の環状空間と第二の環状空間を形成するチューブ１に、細胞と培養液を充填し、これらをチューブ１内において一方向に送流することによって、細胞培養を行う。
【００３１】
第一の環状空間と第二の環状空間において、細胞が一定の密度になるまで増殖すると、次に、第三の環状空間のチューブ１に取り付けられたチューブクランプと、第三の環状空間のエア排気バッグ６に取り付けられたチューブクランプを取り外し、また培養液バッグ５のチューブクランプを取り外す。また、第二の環状空間と第三の環状空間を接続する接続部材１１にチューブクランプを取り付けて、ポンプ４を駆動する。そして、第一の環状空間と第二の環状空間と第三の環状空間を形成するチューブ１に、細胞と培養液を充填し、これらをチューブ１内において一方向に送流することによって、細胞培養を行う。環状空間が４以上ある場合は、同様の工程を繰り返す。
本実施形態の複数の環状空間が連結して形成された環状培養容器を用いて、このように細胞を培養することによって、細胞の増殖に併せて適切に培養空間を増やして培養液を追加し、細胞を効率的に増殖させることが可能となる。
【００３２】
また、このような複数の環状空間が連結して形成された環状培養容器は、図５に示すように、支持柱７に環状空間を積み重ねて配置することができる。同図には、４個の環状空間が連結して形成された環状培養容器が示されている。
このように、本実施形態の複数の環状空間が連結して形成された環状培養容器によれば、環状培養容器を立体的に配置することができ、高いスペース効率を得ることが可能となる。すなわち、数多くの環状空間を有する環状培養容器を製造することで、容量が大きく、またスペース効率に優れた培養容器を容易に製造することが可能となる。
【００３３】
以上説明したように、本実施形態の環状培養容器、細胞培養システム、及び細胞培養方法によれば、チューブ内の培養液と細胞を一方向に効率的に送流することができ、これによって細胞の凝集塊が互いにぶつかり合うことを抑止して均一な凝集塊を得ることができ、また容量の大きい培養容器を容易に製造することが可能となる。
また、数多くの環状空間を有する環状培養容器を製造することで、容量が大きく、スペース効率に優れた培養容器を容易に製造することが可能となる。
【００３４】
本発明は、以上の実施形態に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。
例えば、環状培養容器に複数の培養液バッグを接続したり、細胞回収バッグを接続するなど適宜変更することが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００３５】
本発明は、凝集塊を形成させて培養可能な細胞を、大量に培養する場合に好適に利用することが可能である。
【符号の説明】
【００３６】
１  チューブ
１１  接続部材
１２  ポート
２  細胞
３  培養液
４  ポンプ
５  培養液バッグ
６  エア排気バッグ
７  支持柱
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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