(57)【要約】【課題】アンモニア態窒素及びフェノールを高濃度で含む排水、例えばコークス炉排水中で微細藻類を培養することが可能な、新規かつ改良された微細藻類の培養方法及び微細藻類を提供する。【解決手段】上記課題を解決するために、本発明のある観点によれば、フェノールを１ｍｇ／Ｌ以上、アンモニア態窒素を１００ｍｇ−Ｎ／Ｌ以上含む排水中で増殖可能な微細藻類を排水と接触させた状態で、微細藻類に光を照射することを特徴とする、微細藻類の培養方法が提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
フェノールを１ｍｇ／Ｌ以上、アンモニア態窒素を１００ｍｇ−Ｎ／Ｌ以上含む排水中で増殖可能な微細藻類を前記排水と接触させた状態で、前記微細藻類に光を照射することを特徴とする、微細藻類の培養方法。
【請求項２】
前記微細藻類と、前記排水とを藻類培養槽に投入し、前記微細藻類に光を照射することを特徴とする、請求項１に記載の微細藻類の培養方法。
【請求項３】
前記微細藻類を、吸水性または保水性を有する担体の表面に担持し、前記担体に前記排水を保持させ、かつ気相に露出した前記微細藻類に光を照射することを特徴とする、請求項１に記載の微細藻類の培養方法。
【請求項４】
前記微細藻類は、ＮＳ００１Ｃ株を含むことを特徴とする、請求項１〜３の何れか１項に記載の微細藻類の培養方法。
【請求項５】
前記微細藻類は、ＮＳ００１Ｃ株であることを特徴とする、請求項１〜４の何れか１項に記載の微細藻類の培養方法。
【請求項６】
前記排水は、塩分を３．５質量％以下の割合で含むことを特徴とする、請求項１〜５の何れか１項に記載の微細藻類の培養方法。
【請求項７】
前記排水は、コークス炉から排出されるコークス炉排水を含むことを特徴とする、請求項１〜６の何れか１項に記載の微細藻類の培養方法。
【請求項８】
フェノールを１ｍｇ／Ｌ以上、アンモニア態窒素を１００ｍｇ−Ｎ／Ｌ以上含む排水中で増殖可能であることを特徴とする、微細藻類。
【請求項９】
ＮＳ００１Ｃ株を含むことを特徴とする、請求項８に記載の微細藻類。
【請求項１０】
ＮＳ００１Ｃ株からなる微細藻類。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微細藻類の培養方法及び微細藻類に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、下水等の排水を用いて微細藻類を培養する技術が提案されている。例えば、下水を用いた藻類培養技術として、特許文献１、非特許文献１、非特許文献２の報告がある。藻類の増殖には光合成に必要な二酸化炭素、水、窒素、リン、光が必要であるが、下水中には水、窒素、リン、炭酸イオンが含まれており、そこに光を供給し、さらに空気中の二酸化炭素を利用させることで、藻類培養ができるとされている。また、藻類培養の際に窒素を消費することから、下水中の窒素が藻類増殖に利用され、固液分離により藻類と処理水を分離することで窒素除去が可能と考えられる。
【０００３】
また、特許文献２では少なくとも窒素分またはリン分のいずれか一方を含む排水を膜ろ過した透過水による藻類培養方法が提案されている。これは微細藻類の増殖の際に、排水に含まれる細菌類、原生動物、後生動物等の微生物によって微細藻類の増殖が阻害されるという、いわゆるコンタミネーションを抑制することを課題としており、排水をろ過して微生物を除去することを目的としている。また、藻類培養の際に窒素を消費することから、排水中の窒素が藻類増殖に利用され、固液分離により藻類と処理水を分離することで窒素除去が可能と考えられる。
【０００４】
さらに、特許文献３では従来の活性汚泥微生物と微細藻類とを混在させて下水等の排水を処理する方法が提案されており、微細藻類の従属栄養作用を使って有機物を分解することが可能と考えられる。
【０００５】
ところで、微細藻類の培養では従来、藻類を液体培地中に投入し、懸濁して培養する、いわゆる液体培養が主として用いられてきた。しかし近年、これとは異なり、固体表面上に担持した微細藻類を培養することを特徴とする表面培養が提案されている。例えば、微細藻類の表面培養として、特許文献７、特許文献８、非特許文献１２及び非特許文献１３の報告がある。表面培養では、液体培養よりも少ない面積でより高い生産性が可能である報告されている。また、液体培養では、液体から藻類を回収する固液分離の過程で、遠心濃縮やろ過などのコストとエネルギーを要する方法が用いられる。一方で、表面培養では藻類を固体表面から掻きとる、または洗い流すことで容易に回収可能であるとされている。
【０００６】
また、下水などの排水を用いた微細藻類の培養に、表面培養を適用する技術も報告されている。非特許文献１４では、下水を用いて、表面培養で微細藻類を培養する方法が提案されている。表面培養では、培養した藻類をスクレイパーなどにより担体表面から削り取ることで、藻類が吸収した窒素やリンを排水中から除去することが可能だと考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平８−１０７７８２号公報
【特許文献２】特開２０１４−６０９６７号公報
【特許文献３】特開２０１４−１１３５５９号公報
【特許文献４】特開平５−２８５４９１号公報
【特許文献５】特開２０１６−１９５５８６号公報
【特許文献６】特開２０１２−１７５９６４号公報
【特許文献７】特開２０１６−５４３９号公報
【特許文献８】特開２０１７−９９３０１号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｙ．Ｓ．Ｙｕｎ，Ｓ．Ｂ．Ｌｅｅ，Ｊ．Ｍ．Ｐａｒｋ，Ｃ−Ｉ．Ｌｅｅ，Ｊ．Ｗ．Ｙａｎｇ（１９９７），Ｃａｒｂｏｎ  Ｄｉｏｘｉｄｅ  Ｆｉｘａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ａｌｇａｌ  Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  ＷａｓｔｅｗａｔｅｒＮｕｔｒｉｅｎｔｓ，Ｊ．Ｃｈｅｍ  Ｔｅｃｈ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，Ｖｏｌ．６９，ｐｐ．４５１−４５５
【非特許文献２】本多了，Ｊ．Ｂｏｏｎｎｏｒａｔ，Ｃ．Ｃｈｉｅｍｃｈａｉｓｒｉ，山本和夫（２０１１），膜分離フォトバイオリアクターを用いた藻類濃縮培養による下水処理水からのバイオマス生産・二酸化炭素固定プロセスの開発，第４５回日本水環境学会年会講演集，ｐ．２３３
【非特許文献３】東京都下水道局、芝浦水再生センターにおける全窒素流入負荷に関する一考察（２００８）、［ｏｎｌｉｎｅ］、［２０１４年１０月２３日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｓｕｉ．ｍｅｔｒｏ．ｔｏｋｙｏ．ｊｐ／ｇｉｊｙｕｔｏｕ／ｇｎ２０／ｎｅｎｐｏｕ２００８／５−１−８．ｐｄｆ＞
【非特許文献４】Ｃｏｌｌｏｓ，Ｙ．，＆Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｐ．Ｊ．（２０１４），Ａｃｃｌｉｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｈｉｇｈａｍｍｏｎｉｕｍ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｕｎｉｃｅｌｌｕｌａｒａｌｇａｅ．  Ｍａｒｉｎｅ  ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｌｌｅｔｉｎ，  ８０（１），ｐｐ．８−２３．
【非特許文献５】中山  有ら、都市人工排水系における水・熱輸送に関する観測研究、水工学論文集、第５０巻（２００６）
【非特許文献６】竹山春子、微細藻類によるエネルギー生産と事業展望、ｐ．１（２０１２）
【非特許文献７】三井物産戦略研究所、バイオマス資源としての微細藻類（２０１１）、［ｏｎｌｉｎｅ］、［２０１４年１０月２９日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｍｉｔｓｕｉ．ｍｇｓｓｉ．ｃｏｍ／ｉｓｓｕｅｓ／ｒｅｐｏｒｔ／ｒ１１１２ｊ＿ｕｎｏ．ｐｄｆ＞
【非特許文献８】渡邉信、藻類ハンドブック、ｐｐ．１６０−１６２（２０１２）
【非特許文献９】渡邉信、藻類ハンドブック、ｐｐ．３５１（２０１２）
【非特許文献１０】渡邉信、藻類ハンドブック、ｐｐ．３４５−３４７（２０１２）
【非特許文献１１】Ｓｚａｂｏ  Ｍｉｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４），Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ａｃｃｌｉｍａｔｉｏｎ  ｏｆ    Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｏｃｕｌａｔａ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ  ｂｙ  ｍｕｌｔｉ−ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ  ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６７，ｐｐ．５２１−５２９．
【非特許文献１２】Ｂｊｏｒｎ  Ｐｏｄｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４），Ｐｏｒｕｓ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｂｉｏｆｉｌｍ  Ｒｅａｃｔｏｒ  Ａ  Ｐａｒａｄｉｍｅ  Ｓｈｉｆｔ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏａｌｇａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４０６，ｐｐ．１−１２．
【非特許文献１３】Ｔｉａｎｚｈｏｎｇ  Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３），Ａｔｔａｃｈｅｄ  ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｂｉｏｍａｓｓ  ｆｅｅｄｓｔｏｃｋ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２７，ｐｐ．２１６−２２２．
【非特許文献１４】Ｓｅｕｎｇ−Ｈｏｏｎ  Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４），Ｈｉｇｈｅｒ  Ｂｉｏｍａｓｓ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ  ｉｎ  ａｎ  Ａｔｔａｃｈｅｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｕｓｉｎｇ  Ｗａｓｔｅｗａｔｅｒ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ＭＩｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２４，ｐｐ．１５６６−１５７３．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従来の下水を用いた微細藻類の増殖方法において、下水に含まれる窒素濃度は、非特許文献３によれば全窒素で３０ｍｇ−Ｎ／Ｌ程度、そのうちアンモニア態窒素は２０ｍｇ−Ｎ／Ｌ程度である。一方で、例えば、コークス炉を用いたコークスの製造工程において排出される排水の窒素濃度は、１００ｍｇ−Ｎ／Ｌ以上あり、そのほとんどがアンモニア態窒素（アンモニア分子を構成する窒素原子）である。
【００１０】
ここで、コークスの製造工程では、以下の工程により排水が生成、排出される。すなわち、コークス炉から発生したＣＯＧ（コークス炉ガス）を安水で洗浄、冷却する。ＣＯＧを洗浄、冷却した安水は、アンモニア態窒素、タール、スラッジ、及びＣＯＤ（化学的酸素要求量）成分等を含む。ＣＯＧを洗浄、冷却した後の安水は、タールデカンタ、アンモニアストリッピング装置に順次導入される。タールデカンタでは、安水からタール及びスラッジが除去され、アンモニアストリッピング装置では、安水からアンモニア態窒素の大半が除去される。しかし、アンモニアストリッピング装置から排出された安水には、依然として多くの（すなわち少なくとも１００ｍｇ−Ｎ／Ｌ以上の）アンモニア態窒素およびＣＯＤ成分が残っている。アンモニアストリッピング後の安水に残留するＣＯＤ成分の主なものとして、フェノールなどの芳香族化合物、チオシアン、チオ硫酸などの硫黄化合物がある。
【００１１】
このように、アンモニアストリッピング装置から排出された安水、すなわちコークス炉排水には、極めて高濃度のアンモニア態窒素が含まれている。このため、コークス炉排水中のアンモニア態窒素を用いて微細藻類を培養する技術が強く要望されていた。コークス炉排水中のアンモニア態窒素を用いて微細藻類を培養することができれば、コークス炉排水中のアンモニア態窒素を低減することができるので、環境への負荷が低減される。さらに、微細藻類は、ＣＯ２を吸収して増殖（生長）する。そして、微細藻類はバイオマス資源、すなわち炭材として利用することができる。このように、省資源化、ＣＯ２削減の観点からもコークス炉排水を用いた微細藻類の培養は有用である。
【００１２】
しかしながら、非特許文献４にはアンモニアによる藻類の生長阻害ＥＣ５０値が整理されている。非特許文献４には、全アンモニア濃度が数千μＭ、すなわちアンモニア態窒素濃度が数十ｍｇ−Ｎ／Ｌ程度となる場合、多くの緑藻類、及び、藍藻類、計藻類、渦鞭毛藻、ラフィド藻類で生長阻害が認められることが示されている。さらに、コークス炉排水には、極めて高濃度のフェノールも含まれている。このため、従来の微細藻類は、アンモニア態窒素の濃度が低い下水中では生長可能であったが、アンモニア態窒素濃度が極めて高いコークス炉排水中ではほとんど生長できなかった。さらに、コークス炉排水には、極めて高濃度のフェノールも含まれている。従来の微細藻類は、フェノール耐性がほとんどないので、フェノールが存在する環境下では、死滅するか、あるいは、ほとんど生長できない。したがって、この点からも、従来の微細藻類はコークス炉排水中では培養不可能であった。
【００１３】
なお、特許文献２では、排水を膜ろ過した透過水による微細藻類の増殖が提案されている。しかしながら、特許文献２には、排水の窒素濃度等に関する記載が無く、さらに、藻類種類が複数例示されているものの、それらが高アンモニア態窒素濃度下で生長可能であることは何ら示されていない。また、特許文献３には、微細藻類の従属栄養作用を使って有機物を分解することができる旨が開示されている。しかしながら、特許文献３が対象とする排水は都市下水である。また、特許文献３には、フェノールについての言及はなく、また、アンモニアへの耐性について何ら記述されていない。
【００１４】
また、非特許文献１４では、排水を用いた微細藻類の表面培養法が提案されている。しかしながら、非特許文献１４には、排水の全窒素濃度が記述されているものの、その濃度は８．６３±０．４３ｍｇ／Ｌとコークス炉排水におけるアンモニア態窒素濃度と比べて一桁以上低く、また、フェノール濃度等に関する記載は無い。さらに、藻類種類が複数例示されているものの、それらのアンモニア耐性、フェノール耐性については何ら示されていない。
【００１５】
ところで、コークス炉排水は、海水もしくは淡水で希釈された後、活性汚泥流入水として活性汚泥処理に供される。好気処理のみ行う活性汚泥処理によって、安水からＣＯＤ成分のほとんどを除去することができる。しかし、このような活性汚泥処理によっても、アンモニア態窒素をコークス炉排水から除去することができなかった。さらに、活性汚泥処理後のコークス炉排水のｐＨは淡水よりも高かった。このような高ｐＨ環境も、微細藻類の生育を阻害する一因である。したがって、コークス炉排水を活性汚泥処理した場合であっても、従来の微細藻類をコークス炉排水中で培養することができなかった。したがって、従来の微細藻類では、上述した要望に応えることができなかった。
【００１６】
さらに、特許文献４によれば、コークス炉排水を活性汚泥処理する場合、水温を３０℃程度に維持する必要がある。したがって、活性汚泥処理後のコークス炉排水の水温は概ね３０℃程度となる。一方、下水の水温は外気温の影響を受けやすく、非特許文献５によれば年中を通して１６〜２８℃程度の変動があることが読み取れる。微生物は一般的に至適温度を有しており、培養可能な温度域が異なる。したがって、従来の微細藻類、すなわち下水中で生長可能な微細藻類は、至適温度という観点からも、活性汚泥処理後のコークス炉排水で生長できない可能性があった。このように、従来の微細藻類を活性汚泥処理後のコークス炉排水に適用しても、微細藻類を培養することができなかった。したがって、コークス炉排水を活性汚泥処理しただけでは、上述した要望に応えることができなかった。
【００１７】
一方、特許文献５には、活性汚泥処理後のコークス炉排水、すなわち活性汚泥処理水中で培養可能な微細藻類が開示されている。つまり、特許文献５に開示された微細藻類は、アンモニア態窒素濃度が極めて高い活性汚泥処理水中でも生長可能である。しかし、特許文献５に開示された微細藻類は、フェノール濃度が極めて高い排水中ではほとんど生長できないという問題があった。この点、好気処理が不調の場合には活性汚泥処理水中にフェノール等のＣＯＤ成分も残留することがある。したがって、このような場合、特許文献５に開示された微細藻類はほとんど生長できなかった。さらに、活性汚泥処理水には、活性汚泥由来の雑菌が含まれている。このような雑菌は、微細藻類の生長を阻害する可能性があった。
【００１８】
また、コークス炉排水は石炭に由来する種々の有機化合物を含み、そのうちの一部の種類の有機化合物は、コークス炉排水に着色性を与えている。また、コークス炉排水中ではこれらの有機化合物が凝集体を形成し、懸濁物として排水中に存在している。このため、一般にコークス炉排水は光の透過性が低く、排水内部には光が十分に透過しない。したがって、液体培養では、光合成に必要な光量が不足するために、微細藻類の生育が抑制されるという問題があった。
【００１９】
さらに、液体培養をコークス炉排水に適用する場合、微細藻類の沈降を防ぎ、また光合成に必要なＣＯ２を排水中に溶解させるために、排水の撹拌や、排水への空気の吹き込みが必要になる。しかし、コークス炉排水はフェノールやアンモニア態窒素を高濃度で含むため、撹拌や空気の吹き込みによって、これらの揮発性をもつ有害な化合物が大気中に拡散する恐れがある。また、アンモニア態窒素は藻類にとって栄養となる化合物であるため、揮発により排水中から失われれば、これを十分に利用することが出来ないという問題があった。
【００２０】
さらに、コークス炉排水を活性汚泥処理する場合、コークス炉排水を大量の海水または淡水で薄める必要があるので、処理対象の水量が非常に多くなる。このため、処理設備が大型化するという問題もあった。したがって、特許文献５に開示された技術によっても、上述した要件に十分に応えることができなかった。なお、特許文献１〜３に開示された微細藻類は、下水（すなわち、淡水）中で生長可能な微細藻類なので、コークス炉排水を海水で薄めた場合、上述した理由とも相まって、ほとんど生育しないと推定される。
【００２１】
そこで、本発明は、上記問題に鑑みてなされたものであり、本発明の目的とするところは、アンモニア態窒素及びフェノールを高濃度で含む排水、例えばコークス炉排水中で微細藻類を培養することが可能な、新規かつ改良された微細藻類の培養方法及び微細藻類を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
上記課題を解決するために、本発明のある観点によれば、フェノールを１ｍｇ／Ｌ以上、アンモニア態窒素を１００ｍｇ−Ｎ／Ｌ以上含む排水中で増殖可能な微細藻類を前記排水と接触させた状態で、微細藻類に光を照射することを特徴とする、微細藻類の培養方法が提供される。
【００２３】
ここで、微細藻類の培養方法では、微細藻類と、前記排水とを藻類培養槽に投入し、前記微細藻類に光を照射してもよい。
【００２４】
また、微細藻類の培養方法では、吸水性または保水性を有する担体の表面に担持し、前記担体に前記排水を保持させ、かつ気相に露出した前記微細藻類に光を照射してもよい。
【００２５】
また、微細藻類は、ＮＳ００１Ｃ株を含んでいることが好ましい。更にはＮＳ００１Ｃ株であることがより好ましい。
【００２６】
また、排水は、塩分を３．５質量％以下の割合で含んでいても良い。
【００２７】
また、排水は、コークス炉から排出されるコークス炉排水を含む場合に好適である。
【００２８】
本発明の他の観点によれば、フェノールを１ｍｇ／Ｌ以上、アンモニア態窒素を１００ｍｇ−Ｎ／Ｌ以上含む排水中で増殖可能であることを特徴とする、微細藻類が提供される。
【００２９】
ここで、微細藻類は、ＮＳ００１Ｃ株を含んでいることが好ましい。又はこのような微細藻類としては、ＮＳ００１Ｃ株である。
【発明の効果】
【００３０】
以上説明したように本発明によれば、フェノールを１ｍｇ／Ｌ以上、アンモニア態窒素を１００ｍｇ−Ｎ／Ｌ以上含む排水を用いて微細藻類を増殖可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】本発明の第１の実施形態に係る微細藻類の培養装置の概要を示す説明図である。
【図２】ＮＳ００１Ｃ株の１８Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を示す説明図である。
【図３】本発明の第２の実施形態に係る微細藻類の培養装置の概要を示す説明図であり、藻類支持担体７を水平に設置する場合の一例を示している。
【図４】同実施形態に係る微細藻類の培養装置の概要を示す説明図であり、藻類支持担体７を垂直に設置する場合の一例を示している。
【図５】試験例２の測定結果を示すグラフである。
【図６】試験例３の測定結果を示すグラフである。
【図７】試験例４の測定結果を示すグラフである。
【図８】試験例５の測定結果を示すグラフである。
【図９】試験例６の測定結果を示すグラフである。
【図１０】試験例６の測定結果を示すグラフである。
【図１１】試験例７の測定結果を示すグラフである。
【図１２】試験例８の測定結果を示すグラフである。
【図１３】試験例９の測定結果を示すグラフである。
【図１４】試験例１０の測定結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
以下に添付図面を参照しながら、本発明の好適な実施の形態について詳細に説明する。なお、本明細書及び図面において、実質的に同一の機能構成を有する構成要素については、同一の符号を付することにより重複説明を省略する。
【００３３】
［１．第１の実施形態］
＜１−１．微細藻類の培養装置の構成＞
まず、図１に基づいて、本発明の第１の実施形態に係る微細藻類の培養装置の構成について説明する。微細藻類の培養装置は、藻類培養槽３と、光源４と、固液分離層５とを備える。藻類培養槽３は、微細藻類２を培養するための培養槽である。藻類培養槽３には、少なくとも、排水１、及び微細藻類２が投入される。
【００３４】
排水１は、フェノールを１ｍｇ／Ｌ以上、アンモニア態窒素を１００ｍｇ−Ｎ／Ｌ（窒素原子換算濃度）以上含む排水である。本実施形態に係る微細藻類２は、このような排水１中で増殖可能である。さらに、微細藻類２は、フェノール濃度が６０ｍｇ／Ｌ以上であっても増殖可能である。したがって、フェノール濃度は６０ｍｇ／Ｌ以上であっても良い。フェノール濃度の上限値は、本発明に係る微細藻類が増殖可能な値であれば特に制限されないが、例えば５００ｍｇ／Ｌである。上限値は、好ましくは４００ｍｇ／Ｌであり、さらに好ましくは１５０ｍｇ／Ｌであり、さらに好ましくは１００ｍｇ／Ｌである。アンモニア態窒素濃度の上限値は、本発明に係る微細藻類が増殖可能な値であれば特に制限されないが、例えば１２００ｍｇ／Ｌであり、好ましくは１０００ｍｇ／Ｌであり、さらに好ましくは５００ｍｇ／Ｌであり、さらに好ましくは３００ｍｇ／Ｌであり、さらに好ましくは２００ｍｇ／Ｌである。
【００３５】
このような排水１の例としては、上述したコークス炉排水等が挙げられる。本実施形態による微細藻類２は、排水１中でも培養可能である。このため、コークス炉排水を活性汚泥処理することなくそのまま使用することができる。したがって、海水等による希釈は不要であるので、培養装置の小型化が可能である。さらに、活性汚泥由来の雑菌は排水１に含まれない。もちろん、培養装置の容量に余裕があるのであれば、海水等で希釈されたコークス炉排水を使用しても良い。この場合、塩分の濃度は３．５質量％以下であることが好ましい。また、雑菌等による影響が少ないのであれば、活性汚泥処理済みのコークス炉排水を使用しても良い。
【００３６】
微細藻類２は、排水１中で増殖（培養）可能な微細藻類である。微細藻類２は、具体的には、ＮＳ００１Ｃ株（受領機関：特許生物寄託センター、受領日：２０１７年３月２１日、受領番号：ＦＥＲＭ  ＡＰ−２２３２８）を含む。図２にＮＳ００１Ｃ株の１８Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列を示す。
【００３７】
本発明者は、微細藻類について鋭意研究を重ねたところ、フェノールを１ｍｇ／Ｌ以上、アンモニア態窒素を１００ｍｇ−Ｎ／Ｌ以上含む排水１中でも培養可能な微細藻類が存在することを見出した。以下、本発明者が行った検討について説明する。
【００３８】
微細藻類とは、非特許文献６に記載されている藻類（酸素を発生するタイプの光合成をする生物のうち、いわゆる陸上植物（コケ、シダ、種子植物）を除いたもの）のうち、非特許文献７に記載されている海洋や淡水中に生息する数十ミクロンの微生物を指す。微細藻類は窒素およびリンを摂取することにより増殖する。
【００３９】
本発明者は、排水１中で培養可能な微細藻類を見出すべく、コークス炉排水を活性汚泥処理する安水活性汚泥設備に着目した。すなわち、本発明者は、安水活性汚泥設備の流入路（すなわち、活性汚泥処理に供されるコークス炉排水が流動する流路）に生育している微細藻類を採取した。さらに、本発明者は、フェノールを１ｍｇ／Ｌ以上、アンモニア態窒素を１００ｍｇ−Ｎ／Ｌ以上含む培養液を用意し、この培養液中で微細藻類を培養した。この結果、いくつかの微細藻類が増殖することを確認できた。そこで、本発明者は、これらの微細藻類の増殖速度を比較し、増殖速度のもっとも高いものをＮＳ００１Ｃ株として選定した。そして、本発明者は、ＮＳ００１Ｃ株の液体培養物からＤＮＡを抽出し、１８Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列を決定した。ＮＳ００１Ｃ株の１８Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列は図２に示す通りである。
【００４０】
本発明者は、ＮＳ００１Ｃ株の塩基配列と相同性のある塩基配列を国際塩基配列データベース（ＤＤＢＪ／ＥＮＡ（ＥＭＢＬ）／ＧｅｎＢａｎｋ）から検索した。検索ツールはＢＬＡＳＴを用いた。この結果、ＮＳ００１Ｃ株は、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ属もしくはそれに近縁な微細藻類と推定された。なお、実験の詳細は試験例１にて説明する。
【００４１】
このように、本発明者は、フェノールを１ｍｇ／Ｌ以上、アンモニア態窒素を１００ｍｇ−Ｎ／Ｌ以上含む排水１中で培養可能な微細藻類を特定することに成功した。さらに、このような微細藻類は、ＮＳ００１Ｃ株を含むことも明らかになった。
【００４２】
なお、藻類培養槽３に投入する微細藻類２は、以下の方法で準備すれば良い。すなわち、培養装置によって微細藻類２を培養済みであれば、培養済みの微細藻類２を藻類培養槽３に投入すればよい。一方、このような微細藻類２が存在しない場合には、後述する試験例１と同様の方法で微細藻類２を単離、培養し、この微細藻類２を藻類培養槽３に投入すればよい。
【００４３】
一方、微細藻類２の培養には溶存無機炭素も必要である。溶存無機炭素は、例えば二酸化炭素（ＣＯ２）、炭酸（Ｈ２ＣＯ３）、炭酸水素イオン（ＨＣＯ３−）、炭酸イオン（ＣＯ３２−）等であり、排水１中に通常含まれている。ただし、微細藻類２をより増殖させるには、溶存無機炭素源、すなわち排水１中で溶存無機炭素となりうる材料を排水１に投入してもよい。溶存無機炭素源としては、例えば炭酸ガス、各種炭酸塩等が挙げられる。炭酸塩は、例えばナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩などであってもよい。なお、非特許文献８では、藻類の培養に炭酸塩を使用できることが開示されている。そこで、本発明者は、微細藻類２を炭酸塩で培養可能か検証したところ、特に問題なく培養できた。したがって、溶存無機炭素源として炭酸塩を使用可能である。
【００４４】
溶存無機炭素源の投入量、投入方法は特に制限されず、公知の藻類培養方法で採用されている投入量、投入方法を本実施形態でも適用可能である。例えば、溶存無機炭素源として炭酸ガスを排水１中に投入する場合、藻類培養槽３の底部に散気管を配置し、この散気管から炭酸ガスを排水１中に投入（供給）してもよい。また、炭酸ガスのガス流量は、例えば０．２５ｖｖｍ（ｖｏｌｕｍｅ  ｇａｓ  ｐｅｒ  ｖｏｌｕｍｅ  ｂｒｏｔｈ  ｐｅｒ  ｍｉｎ）程度であってもよい（非特許文献９参照）。
【００４５】
また、藻類培養槽３には、微細藻類の呼吸に必要な酸素が投入される。酸素の投入方法は特に制限されない。例えば、上述した散気管から空気を排水１中に投入することで、空気中の酸素を藻類培養槽３に投入してもよい。ここで、溶存無機炭素源として炭酸ガスを使用する場合、炭酸ガス及び空気の混合ガス中に占める炭酸ガスの体積比は、例えば、０．２〜５体積％であってもよい（非特許文献９参照）。
【００４６】
また、微細藻類２の培養にはリンも必要である。排水１としてコークス炉排水を使用する場合、コークス炉排水には、通常０〜１ｍｇ−Ｐ／Ｌ（リン原子換算濃度）程度のリンしか含まれないため、排水１中のリンが不足している場合、排水１にリン源（例えばリン酸）を投入してもよい。なお、藻類培養槽３中のリン濃度は、ＪＩＳ  Ｋ１０２０  ４６．１．１  モリブデン青吸光光度法等によって測定可能である。
【００４７】
また、藻類培養槽３中のアンモニア態窒素濃度（窒素原子換算濃度）とリン濃度（リン原子換算濃度）の質量比（以下、「Ｎ／Ｐ質量比」とも称する）は１６．７〜３００であることが好ましい。一般にレッドフィールド比においてＮ／Ｐ質量比は１６とされている。これよりリン濃度が高すぎると、すなわちＮ／Ｐ質量比が低すぎると、カルシウム塩を多く含む排水１を使用して微細藻類２を培養する場合に、リン酸カルシウム塩による白濁が発生する場合がある。そして、藻類培養槽３中に白濁が発生した場合、これらの白濁によって光が遮蔽されることから、微細藻類の増殖が抑制される。よって、Ｎ／Ｐ質量比は一定値以上であることが好ましい。さらに、リン濃度は最低限必要な量を添加して調整すれば良く、添加するリンが多すぎると、コストが高くなる。よって、リン濃度は少ない方が、すなわち、Ｎ／Ｐ質量比は高い方がコスト的に好ましい。さらに、リン濃度が１ｍｇ−Ｐ／Ｌ以上であっても、Ｎ／Ｐ比が３００より高くなると藻類濃度または比増殖速度に影響を与える場合があることから、Ｎ／Ｐ質量比には一定の好ましい上限値が存在する。そのため、Ｎ／Ｐ質量比は上述の一定の範囲内に調整されることが好ましい。具体的には、上述したように、Ｎ／Ｐ質量比は１６．７〜３００であることが好ましい。なお、藻類培養槽３には、アンモニア態窒素濃度が非常に高い排水１（例えばコークス炉排水）が投入される。したがって、藻類培養槽３中のアンモニア態窒素濃度は非常に高いので、Ｎ／Ｐ質量比の調整は藻類培養槽３にリン源（例えばリン酸）を投入することで行われればよい。また、例えばリン源を投入しすぎた場合等のように、Ｎ／Ｐ質量比を増大させたい場合もある。この場合、藻類培養槽３にアンモニア源（例えば塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム等の固体または溶液）を投入してもよい。
【００４８】
藻類培養槽３自体の形状は特に制限されない。例えば、藻類培養槽３は、下水処理場、工場排水処理場で設計されている直方体型または円筒形のものが好ましいが、これらに限定されない。また、藻類培養槽３内の微細藻類が増大してくると、微細藻類全体に溶存無機炭素が行き渡りにくくなる。そこで、藻類培養槽３には、撹拌装置が設けられてもよい。また、藻類培養槽３が大容量であっても、水、窒素、光、リン、溶存無機炭素源が適切に微細藻類２に供給されれば微細藻類２の培養は可能である。しかし、特に光については藻類培養槽３の底部まで届きにくくなることが考えられる。その場合は、非特許文献１０に記載のある開放系ポンドシステムのうち、水深が０．３ｍ程度のループ循環式水路を設けたレースウェイ式培養池を藻類培養槽３とすることで、太陽光を十分に底部まで届かせることができる。
【００４９】
光源４は、藻類培養槽３中の微細藻類に光を供給するものである。ここで、光源４から放射される光の波長は、微細藻類が光合成するのに必要な波長を含むことが好ましい。光源４としては、例えば、白熱灯、蛍光灯、ＬＥＤ（発光ダイオード）などが好ましいが、これらに制限されるものではない。なお、光源４から光を照射する代わりに、太陽光を微細藻類２に照射してもよい。この場合、光源４は必ずしも培養装置に設けなくても良い。
【００５０】
なお、光の光量子密度は６０μｍｏｌ／ｍ２／秒以上であることが好ましい。この場合、微細藻類２の増殖速度が大きくなるからである。また、光量子密度の上限値は特に指定しないが、非特許文献１１には太陽光の日中ピークが２，０００μｍｏｌ／ｍ２／秒と記載されており、特許文献６には日光が当たりすぎの部位は強光阻害により増殖が停滞することが記載されていることから、およそ２，０００μｍｏｌ／ｍ２／秒程度が強光阻害を起こさない上限の目安と言える。ただし、この光量子密度は藻類直近におけるものである。なお、光量子密度は、例えば藤原製作所社製光量子計ＭＱ−２００を用いて測定を行うことができる。
【００５１】
藻類培養槽３内で微細藻類２が培養された後、排水１は、微細藻類２とともに固液分離層５に投入される。固液分離層５では、排水１及び微細藻類２の混合物が排水１と微細藻類２とに分離される。分離後の排水１は、処理完了水６として装置外に排出される。なお、固液分離層５は、培養装置が連続処理（微細藻類２を連続的に培養する処理）を行う場合に、培養装置に備えられる。したがって、培養装置がバッヂ処理を行う場合、固液分離層５は培養装置に備えられなくても良い。
【００５２】
＜１−２．微細藻類の培養方法＞
つぎに、図１に示す培養装置を用いた微細藻類の培養方法を説明する。まず、藻類培養槽３に、排水１、及び微細藻類２を投入する。ついで、微細藻類２に光源４から光を照射する。これにより、藻類培養槽３中で微細藻類２が培養される。微細藻類２の生育状況に応じて、光源４からの光量を適宜調整してもよい。ついで、排水１は、微細藻類２とともに固液分離層５に投入される。固液分離層５では、排水１及び微細藻類２の混合物が排水１と微細藻類２とに分離される。分離後の排水１は、処理完了水６として装置外に排出される。
【００５３】
このように、本実施形態によれば、フェノールを１ｍｇ／Ｌ以上、アンモニア態窒素を１００ｍｇ−Ｎ／Ｌ以上含む排水１と微細藻類２を接触させた状態で、微細藻類に光を照射することで、微細藻類２を培養することができる。また、微細藻類の増殖には窒素を必要とするため、栄養源である窒素を多く含んだコークス炉排水等を利用できるので、窒素資源を有効利用することができる。さらに、コークス炉排水は、下水と比べて水温が高いため、微細藻類の増殖速度がより高くなることが期待できる。
【００５４】
［２．第２の実施形態］
＜２−１．微細藻類の培養装置の構成＞
まず、図３及び図４に基づいて、本発明の第２の実施形態に係る微細藻類の培養装置の構成について説明する。微細藻類の培養装置は、藻類支持担体７と、光源４と、培養液槽８とを備える。藻類支持担体７は、微細藻類２を表面に担持するための担体である。藻類支持担体７には、少なくとも、排水１が供給される。このとき、培養液槽８に投入された排水１が藻類支持担体７に供給されるか、または藻類支持担体７に供給された排水１が培養液槽８に回収される。
【００５５】
このとき藻類支持担体７の設置の仕方は、光源との位置関係や、藻類支持担体の素材などにより、いくつかの方法が考えられる。例えば、藻類支持担体７は図３のように、微細藻類２の担持面を上側にし、培養装置の設置面と水平に設置することができる。このとき、藻類支持担体７の一部は、培養液槽８内の排水１に接触した状態にある。また、藻類支持担体７は図４のように、微細藻類２の担持面が培養装置の設置面と垂直になるように設置することができる。この場合、藻類支持担体７の上方から排水１を供給することでができる。
【００５６】
排水１は、第１の実施形態と同様であるため、詳細な説明を省略する。
【００５７】
微細藻類２は、排水１中で増殖（培養）可能な微細藻類である。微細藻類２の具体例は、第１の実施形態と同様である。
【００５８】
なお、藻類支持担体７に担持する微細藻類２は、以下の方法で準備すればよい。すなわち、培養装置によって微細藻類２を培養済みであれば、培養済みの微細藻類２を藻類支持担体７に担持すればよい。一方、このような微細藻類２が存在しない場合には、あらたに微細藻類２を単離及び培養し、この微細藻類２を藻類支持担体７に担持すればよい。微細藻類２の単離及び培養法として、例えば以下のような方法が考えられる。まず、培養に用いるコークス炉排水を採取し、このコークス炉排水に微細藻類を植種し、培養を行う。このときの培養条件は特に制限されないが、例えば、光量子束密度６０μｍｏｌ／ｍ２／秒、光照射周期１４時間明期、１０時間暗期、温度２５℃とすることができる。また、必要に応じてコークス炉排水を淡水や海水で希釈したものや、リン源を添加したものを培地として用いてもよい。植種する藻種は特に限定されないが、例えば、コークス炉排水に元々含まれる藻種や、野外で採取した藻種を用いることができる。このような条件で、培地中に生育した藻類は、コークス炉排水中で生育可能な微細藻類２である。もし、そのような微細藻類２がみられない場合は、植種する藻種を変えて培養を行うことで、そのような微細藻類２を探索することができる。培地中に生育した微細藻類２は複数の藻種を含む場合がある。微細藻類２を単離する必要がある場合は、寒天培地上でシングルコロニーを形成させるなど一般的な微細藻類の単離操作を行い、単離することができる。
【００５９】
一方、微細藻類２の培養には溶存無機炭素及びリンも必要であること、また、微細藻類２に供される排水１中のアンモニア態窒素濃度（窒素原子換算濃度）とリン濃度（リン原子換算濃度）の質量比（以下、「Ｎ／Ｐ質量比」とも称する）は１６．７〜３００であることが好ましいことは、第１の実施形態と同様であるため、詳細な説明を省略する。さらに、第１の実施形態と同様に、Ｎ／Ｐ質量比の調整は、排水１にリン源（例えばリン酸）を混合することで行われればよく、Ｎ／Ｐ質量比を増大させたい場合、排水１にアンモニア源（例えば塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム等の固体または溶液）を投入してもよい。
【００６０】
藻類支持担体７の表面への微細藻類２の担持の方法は特に制限されない。例えば、藻類支持担体７が高い吸水性を有する素材で形成されていれば、乾燥した藻類支持担体７の表面に、微細藻類２の懸濁液を塗布または噴霧することで、これを担持することができる。また、付着性を有する微細藻類を用いる場合には、藻類支持担体７を、微細藻類２が懸濁した培養液中に浸漬することによっても担持することができる。さらに、微細藻類２の懸濁液を遠心またはろ過することにより濃縮し、細胞密度が高いペースト状の懸濁液を作製し、これを藻類支持担体７の表面上に塗布することによっても担持することができる。
【００６１】
藻類支持担体７は表面に微細藻類２を担持するための担体であると同時に、内部に排水１を保持し、担体表面の微細藻類２に排水１および排水１中の栄養塩を供給する役割をもつ。藻類支持担体７を用いることで、微細藻類２を一側では排水１に接触させつつ、同時に他側では気相に露出させることができる。言い換えると、藻類支持担体７の微細藻類２が担持されていない部分に排水１を接触させる。このことにより、微細藻類２が気相から直接ＣＯ２を取り込むことができ、生育が向上することが期待できる。また、排水１に着色性の成分や懸濁物質が含まれていても、気相側から照射される光を減衰させることがないため、微細藻類２の生育が向上することが期待できる。
【００６２】
藻類支持担体７の素材は、吸水性や保水性を有していれば、特に制限されない。ここでいう吸水性や保水性とは、素材の内部に自由水を保持する能力のことを指す。例えば、スポンジや濾紙、木綿布などの高い吸水性や保水性を有する素材が好ましいが、これらに限定されない。また、藻類支持担体７を複数の素材で構成することもできる。例えば、形状を維持するための固い素材の上に、高い吸水性を有する素材を張り合わせるなどの方法が考えられる。藻類支持担体７が高い吸水性を有する素材で形成されている場合、図３のように藻類支持担体７を単に排水１に接触させることで、毛管現象を利用して、藻類支持担体７全体に排水１を供給することができる。一方、藻類支持担体７がこのような高い吸水性をもたない場合、以下のような方法で、藻類支持担体７全体に排水１を供給することができる。例えば、図４のように、排水１を藻類支持担体７の上部から供給することで、重力により藻類支持担体７全体に排水１を浸透させることができる。また、藻類支持担体７を動かし、排水１への浸漬と気相への露出を定期的に繰り返してもよい。
【００６３】
藻類支持担体７の形状は特に制限されない。例えば、藻類支持担体７は、限られた設置面積を有効に活用するという観点から、薄い板状または長方形の膜状が好ましいが、これらに限定されない。また、藻類支持担体７の表面の形状は、増殖した藻類の回収が容易であるという観点から、平滑であることが好ましいが、これに限定されない。藻類支持担体７の微細藻類２を担持した面が、設置面となす角度は、藻類に光が当たる限り特に限定されない。例えば、図３のように、藻類支持担３の担持面が設置面と水平になるように設置することもできるが、図４のように藻類支持担体７の担持面が設置面と垂直になるよう設置することにより、培養装置の設置面積を小さくすることができ、設置面積当たりの藻類支持担体７の表面積を増やすことができる。一方で、光源４を藻類支持担体７の上方に設ける場合、担持面と設置面のなす角度が垂直に近くなるほど、担持面に当たる光の強さは低下し、藻類支持担体７の表面積当たりの微細藻類２の生産性は低下すると予想される。この場合、担持面と設置面のなす角度を水平から垂直の間で変化させることで、微細藻類２の生産性が最も高くなる角度を見出すことができる。
【００６４】
光源４は、藻類支持担体７上の微細藻類２に光を供給するものである。ここで、光源４から放射される光の波長は、微細藻類が光合成するのに必要な波長を含むことが好ましい。光源４としては、例えば、白熱灯、蛍光灯、ＬＥＤ（発光ダイオード）などが好ましいが、これらに制限されるものではない。なお、光源４から光を照射する代わりに、太陽光を微細藻類２に照射してもよい。この場合、光源４は必ずしも培養装置に設けなくても良い。
【００６５】
なお、光の光量子密度の範囲及び測定方法は、第１の実施形態と同様である。ただし、この光量子密度は藻類直近におけるものである。また、藻類支持担体７の微細藻類２を担持した面を、光源からの光線に対し、角度をつけて設置し、藻類が受ける光の強さを小さくすることで、強光阻害を回避することができる。
【００６６】
藻類支持担体７上で培養された微細藻類２を回収する方法は特に限定されない。例えば、藻類支持担体７ごと微細藻類２を回収する方法が考えられる。この場合、再度培養を試みる際には、新たに微細藻類２と藻類支持担体７を用意すればよい。また、スクレイパーのようなもので、藻類支持担体７の表面を擦ることで、微細藻類２を回収することができる。さらに、勢いをもった水流を藻類支持担体７の表面に当て、微細藻類２を洗い流すことで、微細藻類２を懸濁液として回収することもできる。培養された微細藻類２を藻類支持担体７から完全に回収しないことで、藻類支持担体７上に残存した微細藻類２を再び培養することもできる。
【００６７】
＜２−２．微細藻類の培養方法＞
つぎに、図３及び図４に示す培養装置を用いた微細藻類の培養方法を説明する。まず、藻類支持担体７の表面に微細藻類２を担持する。ついで、排水１を藻類支持担体に供給する。このとき、藻類支持担体７への排水１の供給方法は特に制限されない。例えば、藻類支持担体７が地面に角度を成して設置されている場合は、藻類支持担体７の上方から、排水１を滴下または流下することにより、藻類支持担体７全体に排水１を供給することができる。また、藻類支持担体７に高い吸水性を有する高い素材を用いれば、藻類支持担体７の一部を排水１に接触させることより、毛管現象を利用して藻類支持担体７全体に排水１を浸透させることができる。ついで、微細藻類２に光源４から光を照射する。これにより、藻類支持担体７上で微細藻類２が培養される。微細藻類２の生育状況に応じて、光源４からの光量を適宜調整してもよい。微細藻類２が培地として利用した排水１は、培養液槽８に溜められる。培養液槽８に溜められた排水１は再度汲み上げて、藻類支持担体７に供給することもできる。また、使用後の排水１は、処理完了水６として装置外に排出される。
【００６８】
このように、本実施形態によれば、フェノールを１ｍｇ／Ｌ以上、アンモニア態窒素を１００ｍｇ−Ｎ／Ｌ以上含む排水１と微細藻類２を接触させた状態で、微細藻類に光を照射することで、微細藻類２を培養することができる。また、微細藻類の増殖には窒素を必要とするため、栄養源である窒素を多く含んだコークス炉排水等を利用できるので、窒素資源を有効利用することができる。さらに、コークス炉排水は、下水と比べて水温が高いため、微細藻類の増殖速度がより高くなることが期待できる。さらに、本実施形態では藻類支持担体７上の微細藻類２に直接光を照射するため、コークス炉排水に含有される着色成分や、懸濁物質によって光が減衰することがなく、微細藻類の増殖速度が高くなることが期待できる。加えて、本実施形態では排水１の撹拌や、排水１への空気の吹き込みを必要としないため、アンモニアが揮発によって失われずに、コークス炉排水中のアンモニア態窒素を効率よく微細藻類に利用させることができる。
【実施例】
【００６９】
＜１．試験例１：フェノール耐性のある微細藻類の獲得＞
試験例１では、フェノール耐性のある微細藻類、すなわち本実施形態に係る微細藻類を獲得した過程について説明する。
【００７０】
まず、安水活性汚泥設備の流入路に生育している微細藻類を採取した。ここで、安水活性汚泥設備の流入路には、活性汚泥処理に供されるコークス炉排水が流動している。ここで、流入路を流動するコークス炉排水は、海水で希釈されている。
【００７１】
ついで、表１に示す組成の液体培地を用意した。この液体培地は、海水で希釈されたコークス炉排水、すなわち安水被処理水（活性汚泥処理に供されるという意味で被処理水とした）を模擬したものである。ここで、滅菌ろ過海水は、天然海水をガラス繊維ろ紙ＧＦ／Ｂで吸引ろ過した後、蒸気滅菌（１２１℃、２０分）したものである。液体培地中のアンモニア態窒素濃度は２００ｍｇ−Ｎ／Ｌ、リン酸態リン濃度は５ｍｇ−Ｐ／Ｌになる。したがって、Ｎ／Ｐ比は４０となる。また、液体培地は、蒸気滅菌（１２１℃、２０分）された後に、培養実験に供した。
【００７２】
【表１】
2018157817.tif 000003
【００７３】
ついで、採取した微細藻類をこの液体培地に植種し、光量子密度６０μｍｏｌ／ｍ２／秒、光照射周期１４時間明期／１０時間暗期、温度２５℃の培養条件とした培養庫内で１４日間培養した。光源は白色ＬＥＤパネルとした。これにより、培養液を得た。
【００７４】
ついで、表１の組成を有する液体培地に１．５％（ｗ／ｖ）の寒天を加えることで、寒天培地を作製した。ついで、この寒天培地に培養液を塗布し、光量子密度６０μｍｏｌ／ｍ２／秒、光照射周期１４時間明期／１０時間暗期、温度２５℃の培養条件とした培養庫内に寒天培地をセットした。光源は白色ＬＥＤパネルとした。ついで、培養庫内で微細藻類を７日間培養した。この結果、寒天培地上にいくつかのコロニーが形成された。
【００７５】
ついで、上記と同様の寒天培地を新たに準備し、これらのコロニーを別々の新しい寒天培地に塗布した。光量子密度６０μｍｏｌ／ｍ２／秒、光照射周期１４時間明期／１０時間暗期、温度２５℃の培養条件とした培養庫内に寒天培地をセットした。光源は白色ＬＥＤパネルとした。そして、培養庫内で微細藻類を７日間培養した。
【００７６】
ついで、表１の組成を有する液体培地にフェノールを１００ｍｇ／Ｌの濃度で添加することで、高フェノール液体培地を作製した。高フェノール液体培地は、フェノールを１００ｍｇ／Ｌ（つまり１ｍｇ／Ｌ以上）、アンモニア態窒素を２００ｍｇ−Ｎ／Ｌ含む。ついで、上記で培養された各微細藻類を高フェノール液体培地に植種し、光量子密度６０μｍｏｌ／ｍ２／秒、光照射周期１４時間明期／１０時間暗期、温度２５℃の培養条件とした培養庫内で培養した。光源は白色ＬＥＤパネルとした。そして、各微細藻類の増殖速度を比較した。ここで、増殖速度は、クロロフィルの吸収波長である波長６８０ｎｍの吸光度を、培養中、１日ごとに分光光度計で測定し、その増加分から算出した。そして、増殖速度の最も高い微細藻類をＮＳ００１Ｃ株として選定した。
【００７７】
ついで、ＮＳ００１Ｃ株の液体培養物からＤＮＡを抽出し、１８Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列を決定した。１８ＳｒＤＮＡ領域の解析に用いたプライマーは表２の通りである。また、決定されたＮＳ００１Ｃ株の１８Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列は図２に示す通りである。
【００７８】
【表２】
2018157817.tif 000004
【００７９】
ついで、ＮＳ００１Ｃ株の塩基配列と相同性のある塩基配列を国際塩基配列データベース（ＤＤＢＪ／ＥＮＡ（ＥＭＢＬ）／ＧｅｎＢａｎｋ）から検索した。検索ツールはＢＬＡＳＴを用いた。この結果、ＮＳ００１Ｃ株は、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ属もしくはそれに近縁な微細藻類と推定された。
【００８０】
このように、本発明者は、フェノールを１ｍｇ／Ｌ以上、アンモニア態窒素を１００ｍｇ−Ｎ／Ｌ以上含む高フェノール液体培地中で増殖可能な微細藻類としてＮＳ００１Ｃ株を獲得することに成功した。さらに、ＮＳ００１Ｃ株は、図２に示す塩基配列を有することも明らかになった。
【００８１】
＜２．試験例２：ＮＳ００１Ｃ株の増殖＞
表３に示す組成（Ｐｒｏｖａｓｏｌｉ，  Ｌ．  （１９６８）：  Ｍｅｄｉａ  ａｎｄ  ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｒｉｎｅ  ａｌｇａｅ．  Ｉｎ  Ｗａｔａｎａｂｅ，  Ａ．  ＆  Ｈａｔｔｏｒｉ，  Ａ．  ［Ｅｄ．］  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ．  Ｐｒｏｃ．Ｕ．  Ｓ．−Ｊａｐａｎ  Ｃｏｎｆ．，  Ｈａｋｏｎｅ，  Ｓｅｐｔ．  １９６６，  Ｊｐｎ．  Ｓｏｃ．  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，  Ｋｙｏｔｏ，  ｐｐ．  ６３−７５．）から硝酸ナトリウムとグリセロリン酸ナトリウムを除いた組成を有する改変ＰＥＳ溶液を作製した。
【００８２】
【表３】
2018157817.tif 000005
【００８３】
ついで、孔径０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過滅菌した天然海水に、上記で作製した改変ＰＥＳ溶液を終濃度２％（ｖ/ｖ）で添加することで、液体培地を作製した。液体培地は、グリセロリン酸ナトリウムをリン酸態リン濃度換算で３ｍｇ−Ｐ／Ｌ、塩化アンモニウムをアンモニア態窒素濃度換算で５０ｍｇ−Ｎ／Ｌで含む。これにより、液体培地を作製した。さらに、当該液体培地にフェノールを１ｍｇ／Ｌ、１００ｍｇ／Ｌで添加した第１の高フェノール液体培地及び第２の高フェノール液体培地を作製した。また、アンモニア態窒素濃度換算で１００ｍｇ−Ｎ／Ｌで含み、かつ、フェノールを１００ｍｇ／Ｌで添加した第３の高フェノール液体培地を作製した。
【００８４】
ついで、液体培地（参考例）、第１の高フェノール液体培地（試験例２−１）、第２の高フェノール液体培地（試験例２−２）、第３の高フェノール液体培地（試験例２−３）にそれぞれＮＳ００１Ｃ株を植種した。ついで、ＮＳ００１Ｃ株を光量子密度６０μｍｏｌ／ｍ２／秒、光照射周期１２時間明期／１２時間暗期、温度３０℃の培養条件で７日間培養した。光源は白色ＬＥＤパネルとした。培養中、１日ごとに血球計算盤を使って細胞密度を計数した。結果を図５に示す。ＮＳ００１Ｃ株はいずれの例においても増殖することが確認された。増殖初期１〜４日の期間の比増殖速度を計算したところ、参考例で１．５７（／日）であったのに対して、試験例２−１〜２−３でそれぞれ１．５７（／日）、１．６１（／日）、１．４７（／日）となった。ここで、横軸に培養時間を、縦軸に細胞数の自然対数をプロットした時の傾きを求めることによって比増殖速度を算出した。この結果、ＮＳ００１Ｃ株は、フェノールを１ｍｇ／Ｌ以上、さらにはアンモニア態窒素を１００ｍｇ−Ｎ／Ｌ以上の濃度で含む液体培地中であっても、フェノールを含まない参考例と遜色なく増殖することを確認した。よって本試験例より、ＮＳＯＯ１Ｃ株はフェノールおよびアンモニア態窒素を高濃度で含有する環境下であっても増殖できることを確認した。
【００８５】
＜３．試験例３：種々の塩分濃度に対するＮＳ００１Ｃ株の増殖＞
孔径０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過滅菌した天然海水（試験例３−３）、イオン交換水（試験例３−１）、及びそれらを等容量で混合した希釈海水（試験例３−２）に、試験例２で作製した改変ＰＥＳ溶液を終濃度２％（ｖ/ｖ）で、さらにフェノールを１ｍｇ／Ｌで添加することで、試験例３−１〜３−３に係る液体培地を作製した。各液体培地は、グリセロリン酸ナトリウムをリン酸態リン濃度換算で３ｍｇ−Ｐ／Ｌ、塩化アンモニウムをアンモニア態窒素濃度換算で５０ｍｇ−Ｎ／Ｌ含む。また、試験例３−１〜３−３に係る液体培地の塩分濃度は、それぞれ０質量％、約１．５質量％、約３質量％であった。
【００８６】
このように調整した液体培地にＮＳ００１Ｃ株を植種した。ついで、ＮＳ００１Ｃ株を光量子密度６０μｍｏｌ／ｍ２／秒、光照射周期１２時間明期／１２時間暗期、温度３０℃の培養条件で７日間培養した。光源は白色ＬＥＤパネルとした。培養中、１日ごとに血球計算盤を使って細胞密度を計数した。結果を図４に示す。ＮＳ００１Ｃ株はいずれの条件においても増殖することが確認された。増殖初期１〜４日の期間の比増殖速度を計算したところ、試験例３−１、試験例３−２、試験例３−３でそれぞれ１．８９（／日）、１．９０（／日）、１．５５（／日）となり、ＮＳ００１Ｃ株は淡水から海水までの範囲の塩分濃度環境下でも十分に増殖することを確認した。したがって、コークス炉排水を活性汚泥処理することなくそのまま使用して、本実施形態に係る微細藻類を培養することができる。
＜４．試験例４：アンモニア態窒素濃度を変化させた場合におけるＮＳ００１Ｃ株の増殖＞
孔径０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過滅菌したイオン交換水に、試験例２で作製した改変ＰＥＳ溶液を終濃度２％（ｖ／ｖ）で添加することで、試験例４に係る液体培地を作製した。液体培地は、グリセロリン酸ナトリウムをリン酸態リン濃度換算で３ｍｇ−Ｐ／Ｌ含む。また、試験例４に係る液体培地に塩化アンモニウムをアンモニア態窒素濃度換算で５０〜１０００ｍｇ−Ｎ／Ｌの範囲で添加した。
【００８７】
このように調整した液体培地にＮＳ００１Ｃ株を植種した。ついで、ＮＳ００１Ｃ株を光量子密度６０μｍｏｌ／ｍ２／秒、光照射周期１２時間明期／１２時間暗期、温度３０℃の培養条件で７日間培養した。光源は白色ＬＥＤパネルとした。培養中、１日ごとに血球計算盤を使って細胞密度を計数し、増殖初期１〜４日の期間の比増殖速度を計算し、アンモニア態窒素濃度が５０ｍｇ／Ｌの場合の比増殖速度に対する相対値を算出した。結果を図５に示す。ＮＳ００１Ｃ株はいずれの条件においても増殖することが確認され、その比増殖速度は、アンモニア態窒素濃度が高まるにつれて低下する傾向がみられ、アンモニア態窒素濃度が１００ｍｇ／Ｌ、３００ｍｇ／Ｌ、５００ｍｇ／Ｌ、１０００ｍｇ／Ｌの場合でそれぞれ、９５％、８２％、７０％、６８％となったが、ＮＳ００１Ｃ株はアンモニア態窒素が１００ｍｇ／Ｌ以上の濃度環境下でも十分に増殖することを確認した。したがって、コークス炉排水を活性汚泥処理することなくそのまま使用して、本実施形態に係る微細藻類を培養することができる。
【００８８】
＜５．試験例５：安水被処理水を模擬した液体培地を用いたＮＳ００１Ｃ株の増殖＞
表１の組成を有する液体培地に１ｍｇ／Ｌの濃度でフェノールを添加することで、高フェノール液体培地を調製した。当該高フェノール液体培地の塩分濃度は３．５質量％、アンモニア態窒素濃度は２００ｍｇ−Ｎ／Ｌ、リン酸態リン濃度は５ｍｇ−Ｐ／Ｌ、フェノール濃度は１ｍｇ／Ｌであった。当該高フェノール液体培地を容積５０Ｌのアクリル製の角型水槽に入れた。ついで、高フェノール液体培地にＮＳ００１Ｃ株を植種した。ついで、ＮＳ００１Ｃ株を光量子密度６０μｍｏｌ／ｍ２／秒、光照射周期１４時間明期／１０時間暗期、温度２０〜２５℃の培養条件とした培養庫にセットした。ついで、培養庫内でＮＳ００１Ｃ株を７日間培養した。培養中、１日ごとに、細胞密度の指標としてクロロフィルａ濃度を測定した。クロロフィルａ濃度は多波長励起蛍光光度計（独ｂｂｅ  Ｍｏｌｄａｅｎｋｅ  ＧｍｂＨ社製Ａｌｇａｅ  Ｏｎｌｉｎｅ  Ａｎａｌｙｓｅｒ  （ＡＯＡ））を用いて測定した。結果を図６に示す。試験例５によれば、安水被処理水内でＮＳ００１Ｃ株を培養可能であることが明らかになった。
【００８９】
＜６．試験例６：種々のＮ／Ｐ比に対するＮＳ００１Ｃ株の増殖＞
孔径０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過滅菌した天然海水に、試験例２で作製した改変ＰＥＳ溶液を終濃度２％（ｖ／ｖ）で添加することで、試験例６に係る液体培地を作製した。液体培地は、塩化アンモニウムをアンモニア態窒素濃度換算で１００〜１０００ｍｇ−Ｎ／Ｌの範囲で、また、グリセロリン酸ナトリウムをリン酸態リン濃度換算で１〜６ｍｇ−Ｐ／Ｌの範囲で添加し、Ｎ／Ｐ比として１６．７〜１０００の範囲に調整した。
【００９０】
このように調整した液体培地にＮＳ００１Ｃ株を植種した。ついで、ＮＳ００１Ｃ株を光量子密度６０μｍｏｌ／ｍ２／秒、光照射周期１２時間明期／１２時間暗期、温度３０℃の培養条件で７日間培養した。光源は白色ＬＥＤパネルとした。培養中、１日ごとに血球計算盤を使って細胞密度を計数し、増殖初期１〜４日の期間の比増殖速度を計算し、Ｎ／Ｐ比が１６．７の場合の比増殖速度に対する相対値を算出した。培養期間中の細胞数の最大値の結果を図７に、比増殖速度の相対値の結果を図８に示す。ＮＳ００１Ｃ株は細胞数が２．１×１０４ｃｅｌｌ／ｍＬから最大７．３×１０６ｃｅｌｌ／ｍＬ程度に増加した。Ｎ／Ｐ質量比と細胞数及び比増殖速度の相対値との対応関係をみると、Ｎ／Ｐ質量比が１６．７〜３００となる場合に３．３×１０６ｃｅｌｌ／ｍＬ〜７．３×１０６ｃｅｌｌ／ｍＬと開きがあるものの濃度としては十分であり、かつ、比増殖速度の相対値はＮ／Ｐ比が１６．７の場合に対して８０％以上であった。一方、Ｎ／Ｐ質量比が５００〜１，０００の条件では、細胞数および比増殖速度の相対値が低下する傾向が見られた。このことから、良好な細胞数及び／または比増殖速度が得られるＮ／Ｐ質量比は１６．７〜３００であることがわかった。
【００９１】
＜７．試験例７：種々の光量子密度に対するＮＳ００１Ｃ株の増殖＞
孔径０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過滅菌した天然海水に、試験例２で作製した改変ＰＥＳ溶液を終濃度２％（ｖ／ｖ）で添加することで、液体培地を作製した。ついで、液体培地に、グリセロリン酸ナトリウムをリン酸態リン濃度換算で３ｍｇ−Ｐ／Ｌ、塩化アンモニウムをアンモニア態窒素濃度換算で１００ｍｇ−Ｎ／Ｌを添加した。さらにＮＳ００１Ｃ株を１×１０４ｃｅｌｌ／ｍＬとなるように植種した。ＮＳ００１Ｃ株を光量子密度４０〜２００μｍｏｌ／ｍ２／秒、光照射周期１２時間明期／１２時間暗期、温度３０℃の培養条件で７日間培養した。光源は白色ＬＥＤパネルとした。培養中、１日ごとに血球計算盤を使って細胞密度を計数した。結果を図９に示す。ＮＳ００１Ｃ株はいずれの例においても増殖することが確認された。しかし、光量子密度４０μｍｏｌ／ｍ２／秒で培養した場合、０．１×１０６ｃｅｌｌ／ｍＬ程度の増殖に過ぎなかったが、光量子密度６０μｍｏｌ／ｍ２／秒以上で培養した場合、２〜３×１０６ｃｅｌｌ／ｍＬまで増殖した。このことから、ＮＳ００１Ｃ株を培養するための光量子密度は、６０μｍｏｌ／ｍ２／秒以上が好ましいことが分かった。
【００９２】
＜８．試験例８：ＮＳ００１Ｃ株の表面培養法への適用例１＞
孔径０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過滅菌した天然海水に、改変ＰＥＳ溶液を終濃度２％（ｖ／ｖ）で、さらにグリセロリン酸ナトリウムをリン酸態リン濃度換算で３ｍｇ−Ｐ／Ｌで添加して液体培地を作製した。さらに、当該液体培地に塩化アンモニウムをアンモニア態窒素換算で５０ｍｇ／Ｌで加え、参照培地（試験例８−１）を作製した。また、アンモニア態窒素を１００ｍｇ／Ｌで含み、かつフェノールをそれぞれ１ｍｇ／Ｌ、１００ｍｇ／Ｌで含む第１のフェノール液体培地（試験例８−２）及び第２のフェノール液体培地（試験例８−３）を作製した。また、アンモニア態窒素を１０００ｍｇ／Ｌで含み、かつフェノールを１ｍｇ／Ｌを含む高アンモニア培地（試験例８−４）を作製した。さらに、前述のろ過滅菌海水と純水を等量混合した溶液に改変ＰＥＳ溶液を終濃度２％（ｖ／ｖ）で、さらにグリセロリン酸ナトリウムをリン酸態リン濃度換算で３ｍｇ−Ｐ／Ｌ、アンモニア態窒素濃度が１００ｍｇ．／Ｌ、フェノールが１ｍｇ．／Ｌで含む汽水培地（試験例８−５）を作製した。さらに、純水に改変ＰＥＳ溶液を終濃度２％（ｖ／ｖ）で、さらにグリセロリン酸ナトリウムをリン酸態リン濃度換算で３ｍｇ−Ｐ／Ｌ、アンモニア態窒素濃度が１００ｍｇ．／Ｌ、フェノールが１ｍｇ．／Ｌで含む純水培地（試験例８−６）を作製した。
【００９３】
このように調製した試験例８−１〜８−６の液体培地４０ｍＬをそれぞれプラスチックシャーレに加えた。ＮＳ００１Ｃ株の培養液を、ＰＶＤＦ膜片をセットしたろ過吸引機でＮＳ００１Ｃ株の培養液をろ過し、ＰＶＤＦ膜片上にＮＳ００１Ｃ株を担持した。培養液は、波長７３０ｎｍにおける濁度が１．０、液量は２５．４ｍｌであった。ろ過部は直径１．８ｃｍの円形で、その面積は２．５４ｃｍ２であった。ＮＳ００１Ｃ株を担持したＰＶＤＦ膜片を、試験例８−１〜８−６の液体培地を加えた上記シャーレの液面上に、担持した面が上になるように静置した。ひとつのシャーレに２枚のＰＶＤＦ膜片を浮かべた。シャーレの蓋を閉め、光量子密度２００μｍｏｌ／ｍ２／秒、光照射周期１４時間明期／１０時間暗期、温度３０℃の培養条件で３日間培養した。光源は白色ＬＥＤパネルとした。培養開始１日後と３日後に、それぞれのシャーレから１枚ずつのＰＶＤＦ膜片を取り出した。２５．４ｍｌの海水をＰＶＤＦ膜片に加え、ＰＶＤＦ膜片上の藻細胞を海水に完全に懸濁し、この懸濁液の波長７３０ｎｍにおける濁度を測定し、藻体の乾重量を求めた。結果を図１２に示す。藻体乾重量は、予備検討において、波長７３０ｎｍにおける濁度が１．０の培養液１Ｌに含まれるＮＳ００１Ｃ株の藻体の乾重量が、１６３ｍｇであったことを用いて、濁度から算出した。ＮＳ００１Ｃ株はいずれの例においても増殖することが確認された。また、アンモニア態窒素を１００ｍｇ／Ｌ、フェノールを１ｍｇ／Ｌで含む培地で培養した試験例８−２では、参考例である試験例８−１と遜色ない増殖を示した。また、フェノールを１００ｍｇ／Ｌで含む試験例８−３から、ＮＳ００１Ｃ株は高アンモニア、高フェノールを含む培養液中でも増殖可能である。また、塩分濃度を１．８％に下げた試験例８−５、および０．１％に下げた試験例８−６においても増殖がみられたことから、ＮＳ００１Ｃ株は淡水から海水までの塩分濃度で増殖可能である。
【００９４】
＜９．試験例９：ＮＳ００１Ｃ株の表面培養法への適用例２＞
孔径０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過滅菌した天然海水に改変ＰＥＳ溶液を終濃度２％（ｖ/ｖ）で、さらにグリセロリン酸ナトリウムをリン酸態リン濃度換算で３ｍｇ−Ｐ／Ｌ、また塩化アンモニウムをアンモニア態窒素換算で１００ｍｇ／Ｌ、さらにフェノールを１ｍｇ／Ｌで加え参照培地（試験例９−１）を作製した。また、製鉄所の安水処理槽から安水処理水（コークス炉排水に活性汚泥処理を施したもの）を採取し、これを安水処理水培地（試験例９−２）とした。この時の安水処理水培地のアンモニア態窒素濃度は１００ｍｇ／Ｌ以上、フェノール濃度は１ｍｇ／Ｌ以上であった。さらに、安水処理水にリン酸態リンを３ｍｇ／Ｌで添加し、安水処理水リン添加培地（試験例９−３）を作製した。
【００９５】
このように調製した試験例９−１〜９−３の液体培地４０ｍＬをそれぞれプラスチックシャーレに加えた。プラスチックシャーレに厚さ１ｃｍ、縦横の長さが５ｃｍのＰＶＡスポンジを静置し、ＰＶＡスポンジに液体培地を吸水させた。ろ過吸引機に、ＰＶＤＦ膜片をセットし、ＮＳ００１Ｃ株の培養液をろ過して、ＰＶＤＦ膜片上にＮＳ００１Ｃ株を担持した。培養液は、波長７３０ｎｍにおける濁度が１．０、液量は９０．７ｍｌであった。ろ過部は直径３．４ｃｍの円形で、その面積は９．０７ｃｍ２であった。ＮＳ００１Ｃ株を担持したＰＶＤＦ膜片を、液体培地を吸水した前記シャーレ中のＰＶＡスポンジ上に、担持した面が上になるようにそれぞれ静置した。シャーレの蓋を閉め、光量子密度２００μｍｏｌ／ｍ２／秒、光照射周期１４時間明期／１０時間暗期、温度３０℃の培養条件で３日間培養した。光源は白色ＬＥＤパネルとした。培養開始３日後に、それぞれのシャーレから１枚ずつのＰＶＤＦ膜片を取り出した。９０．７ｍｌの海水をＰＶＤＦ膜片に加え、ＰＶＤＦ膜片上の藻細胞を海水に完全に懸濁し、この懸濁液の波長７３０ｎｍにおける濁度を測定し、藻体の乾重量を求めた。結果を図１３に示す。藻体乾重量は、予備検討において、波長７３０ｎｍにおける濁度が１．０の培養液１Ｌに含まれるＮＳ００１Ｃ株の藻体の乾重量が、１６３ｍｇであったことを用いて、濁度から算出した。ＮＳ００１Ｃ株はいずれの試験例においても増殖することが確認された。試験例９−２の懸濁液における濁度は試験例９−１における濁度の５０％弱と低かったが、試験例９−３のリンを添加した懸濁液では試験例９−１の８８％程度の濁度まで増殖がみられた。このことから、ＮＳＣ００１Ｃ株は実安水処理水でも生育可能であることが示された。
【００９６】
＜１０．試験例１０：ＮＳ００１Ｃ株の表面培養法への適用例３＞
孔径０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過滅菌した天然海水に改変ＰＥＳ溶液を終濃度２％（ｖ/ｖ）で、さらにグリセロリン酸ナトリウムをリン酸態リン濃度換算で３ｍｇ−Ｐ／Ｌ、また塩化アンモニウムをアンモニア態窒素換算で１００ｍｇ／Ｌ、さらにフェノールを１ｍｇ／Ｌで加え液体培地（試験例１０）を作製した。
【００９７】
高さが１２ｃｍ、直径が１１．３ｃｍの腰高シャーレを二つ用意し、外周の底面から１０ｃｍの高さまで、および底面外部をアルミホイルで遮光した。一方の腰高シャーレ内に、厚さ１ｃｍ、高さ１０ｃｍ、幅３０ｃｍのＰＶＡスポンジを、高さ方向が底面と垂直になるよう内周に沿うように設置した。当該腰高シャーレに試験例１０の液体培地４００ｍｌを加え、ＰＶＡスポンジに液体培地を吸水させた。このとき、腰高シャーレ下部には、ＰＶＡスポンジが吸水しきらなかった培地が深さ２ｃｍほど残存した。ろ過吸引機に、ＰＶＤＦ膜片をセットし、ＮＳ００１Ｃ株の培養液をろ過して、ＰＶＤＦ膜片上にＮＳ００１Ｃ株を担持した。培養液は、波長７３０ｎｍにおける濁度が１．０、液量は２５．４ｍｌであった。ろ過部は直径１．８ｃｍの円形で、その面積は２．５４ｃｍ２であった。ＮＳ００１Ｃ株を担持したＰＶＤＦ膜片を計１６枚作製し、腰高シャーレ内のＰＶＡスポンジの底面と垂直な面に、藻細胞を担持した面が露出するよう貼付した。光量子密度２００μｍｏｌ／ｍ２／秒、光照射周期１４時間明期／１０時間暗期、温度３０℃の培養条件で、撹拌子を用いて腰高シャーレ下部の培養液を穏やかに撹拌しつつ、３日間培養した。光源は白色ＬＥＤパネルとした。培養開始１日後と４日後に、腰高シャーレから上段２枚、下段２枚、計４枚ずつのＰＶＤＦ膜片を取り出した。２５．４ｍｌの海水をＰＶＤＦ膜片に加え、ＰＶＤＦ膜片上の藻細胞を海水に完全に懸濁し、この懸濁液の波長７３０ｎｍにおける濁度を測定し、藻体の乾重量を求めた（試験例１０−１）。また、もう一方の腰高シャーレには試験例１０の液体培地１Ｌを加え、ＮＳ００１Ｃ株を波長７３０ｎｍにおける濁度が０．１となるよう植種した。これを、試験例１０−１と同様の培養条件で４日間培養し、一日ごとに培養液を採取し、この懸濁液の波長７３０ｎｍにおける濁度を測定し、藻体の乾重量を求めた。（試験例１０−２）。結果を図１４に示す。藻体乾重量は、予備検討において、波長７３０ｎｍにおける濁度が１．０の培養液１Ｌに含まれるＮＳ００１Ｃ株の藻体の乾重量が、１６３ｍｇであったことを用いて、濁度から算出した。試験例１０−１はＰＶＤＦ膜の表面積あたりの藻体量で、試験例１０−２は培養容器の底面積あたりの藻体量で示している。ＮＳ００１Ｃ株はＰＶＡスポンジの垂直な面上で生育可能であることが確認された。また、表面培養では液体培養に比べ、培養４日目の単位面積あたりで、約２倍の藻体を培養可能であることが示された。また、ＰＶＡスポンジの垂直な面全体の面積（約２４０ｃｍ２）は、培養容器の底面積（１００ｃｍ２）の約２．５倍である。そのため、腰高シャーレ内の、ＰＶＡスポンジの底面に垂直な面全体でＮＳＣ００１Ｃ株を表面培養した場合、液体培養の約５倍の藻細胞の培養が可能であると試算された。このことから、表面培養はＮＳＣ００１Ｃ株を培養する方法として好適であることが示された。
【００９８】
以上、添付図面を参照しながら本発明の好適な実施形態について詳細に説明したが、本発明はかかる例に限定されない。本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者であれば、特許請求の範囲に記載された技術的思想の範疇内において、各種の変更例または修正例に想到し得ることは明らかであり、これらについても、当然に本発明の技術的範囲に属するものと了解される。
【符号の説明】
【００９９】
１  排水
２  微細藻類
３  藻類培養槽
４  光源
５  固液分離槽
６  処理完了水
７  藻類支持担体
８  培養液槽
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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