(57)【要約】【課題】  ＲＮＡ配列の測定方法を提供する。【解決手段】  ＲＮＡ配列の測定方法において、測定対象のＲＮＡ配列の少なくとも一部と相補的な配列を有するＲＮＡ鎖、蛍光剤、及び消光剤を有するプローブ、並びにＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有する酵素を用いて、（ｉ）測定対象のＲＮＡ配列とプローブとの間でＲＮＡ二重鎖を形成させ、（ｉｉ）ＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有する酵素によりＲＮＡ二重鎖を切断し、（ｉｉｉ）消光が解消された蛍光剤由来の蛍光を検出する。【選択図】    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡ配列の測定方法において、測定対象のＲＮＡ配列の少なくとも一部と相補的な配列を有するＲＮＡ鎖、蛍光剤、及び消光剤を有するプローブ、並びにＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有する酵素を用いて、
（ｉ）測定対象のＲＮＡ配列とプローブとの間でＲＮＡ二重鎖を形成させ、
（ｉｉ）ＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有する酵素によりＲＮＡ二重鎖を切断し、
（ｉｉｉ）消光が解消された蛍光剤由来の蛍光を検出する、
ことを特徴とするＲＮＡ配列測定方法。
【請求項２】
プローブが、ＲＮＡ鎖の一端に蛍光剤、他端に消光剤を有するものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
蛍光剤がＦＡＭ、消光剤がＢＨＱ１である、請求項１または２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＮＡ配列の測定方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＰＣＲ反応の増幅ＤＮＡをリアルタイムで検出するプローブとしてＴａｑＭａｎプローブ（非特許文献１）が多用される。ＴａｑＭａｎプローブはＰＣＲ反応液中のエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素の働きにより蛍光剤と消光剤が遊離されるため、大きな検出時蛍光強度を有する。この大きな蛍光強度変化はリアルタイムＰＣＲ用蛍光プローブとして優れており、研究用試薬や臨床診断薬のプローブとして多用されている。
【０００３】
一方で、ＲＮＡ増幅反応であるＴＲＣ反応（非特許文献２）では、増幅核酸がＲＮＡであるので、反応系でエキソヌクレアーゼ活性を利用できないため、ＴａｑＭａｎプローブを用いることができない。そのため、ＩＮＡＦプローブなどの蛍光プローブが用いられる（非特許文献２）。ＴＲＣ反応にＩＮＡＦプローブなどのＤＮＡ骨格のプローブを用いた際、ＲＮＡ−プローブ二重鎖（ＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖）のＲＮＡが反応液中に存在するＲＮａｓｅＨにより分解され、ＩＮＡＦプローブ由来の蛍光が消光されるため、検出感度を低下していることが考えられた。
【０００４】
また、ＩＮＡＦプローブは、相補的配列の核酸とのハイブリダイゼーションによる蛍光剤の周辺環境変化により蛍光増幅するプローブであり、ＴａｑＭａｎプローブのような蛍光剤と消光剤の遊離を含まないため、大きな検出時蛍光強度変化を得ることが難しかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｊ．  ＣＬＩＮ．  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬ．    ２５１６−２５１９，  ２０００
【非特許文献２】Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ３１４：：７７−８６，  ２００３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、測定対象ＲＮＡの検出時に蛍光剤と消光剤が解離されるＲＮＡ検出用プローブを利用した測定方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題に鑑みてなされた本発明は、以下の態様を包含する。
（１）ＲＮＡ配列の測定方法において、測定対象のＲＮＡ配列の少なくとも一部と相補的な配列を有するＲＮＡ鎖、蛍光剤、及び消光剤を有するプローブ、並びにＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有する酵素を用いて、
（ｉ）測定対象のＲＮＡ配列とプローブとの間でＲＮＡ二重鎖を形成させ、
（ｉｉ）ＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有する酵素によりＲＮＡ二重鎖を切断し、
（ｉｉｉ）消光が解消された蛍光剤由来の蛍光を検出する、
ことを特徴とするＲＮＡ配列の測定方法。
（２）プローブが、ＲＮＡ鎖の一端に蛍光剤、他端に消光剤を有するものである（１）に記載の方法。
（３）蛍光剤がＦＡＭ、消光剤がＢＨＱ１である、（１）または（２）に記載の方法。
【０００８】
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）測定原理
本発明の測定原理の概略を図１に示す。図１は本発明の代表的な測定原理を示す図であり、本発明はこれに限定されない。
（１−１）測定対象のＲＮＡ配列の少なくとも一部に対して相補的配列を有するＲＮＡプローブと測定対象のＲＮＡとの間でＲＮＡ−ＲＮＡ二重鎖が形成される
（１−２）ＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有する酵素の働きにより、当該ＲＮＡ二重鎖が分解される。
（１−３）その結果、プローブ分子中の蛍光剤と消光剤が解離し、蛍光の消光が解消される。
（１−４）消光が解消された蛍光剤由来の蛍光を検出する。
【０００９】
（２）プローブ
本発明に用いられるプローブは、測定対象のＲＮＡ配列の少なくとも一部と相補的な配列を有し、その結果、測定対象のＲＮＡと二重鎖を形成可能なＲＮＡプローブであり、プローブ中に蛍光剤及び消光剤を有するものであればよい。特にプローブＲＮＡの一端に蛍光剤、他端に消光剤を有するものが好ましい。プローブのＲＮＡの鎖長はＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有する酵素によって、ＲＮＡ二重鎖を切断可能な長さであり、消光剤による蛍光消光が起こり得る長さであればよい。本発明におけるプローブのＲＮＡの長さは１５〜４０塩基が好ましい。
【００１０】
（３）蛍光剤及び消光剤
本発明に用いられる蛍光剤及び消光剤は、消光剤による蛍光消光が起こりうる組合せであればよく、例えば通常のリアルタイムＰＣＲに用いられるものを用いればよく特に限定されない。具体的には、蛍光剤としてはＦＡＭ、ＴＥＴ、Ｃｙ５などを、消光剤としてはＢＨＱ１、ＴＡＭＲＡなどを用いればよい。特に蛍光剤としてはＦＡＭ、消光剤としてはＢＨＱ１が好ましい。
【００１１】
（４）ＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有する酵素
本発明に用いられるＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有する酵素は、ＲＮＡ二重鎖を分解可能な酵素であればよく特に限定されないが、ＲＮａｓｅＩＩＩなどを挙げることができる。ＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有する酵素の由来に特に制限はないが、本発明においては、より短鎖のＲＮＡ二重鎖を切断可能なＥ．Ｃｏｌｉ由来の酵素を用いることが好ましい。
【００１２】
（５）検出装置
検出装置を必要とする場合は、リアルタイムＰＣＲ装置を用いればよい。また本実施例で用いた、ＴＲＣＲリアルタイムモニター（ＴＲＣＲａｐｉｄ−１６０  東ソー製）を用いてもよい。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の方法によれば、ＲＮＡプローブは、ＲＮＡ検出時に蛍光剤と消光剤とが解離するため、大きな測定シグナルを得ることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の測定系の概要を示す図である。
【図２】各濃度のＲＮＡを測定した際の蛍光強度変化を示す図である。
【図３】反応系中のＲＮａｓｅＩＩＩの有無による蛍光強度変化の違いを示す図である。
【実施例】
【００１５】
以下、本発明を実施例によって具体的に示すが、本発明はこれに限定されない。
実施例１  プローブの作製
５’末端をＦＡＭ、３’末端をＢＨＱ１で修飾したプローブ（配列番号１）はグライナー社による受託合成により作製した。
【００１６】
実施例２  測定対象ＲＮＡの作製
配列番号１と相補的な配列を有するＲＮＡ（配列番号２）はグライナー社による受託合成により作製した。
【００１７】
実施例３  ＲＮＡの測定
実施例２で作製したＲＮＡを実施例１で作製したプローブを用いて測定した。測定溶液中の酵素濃度などの詳細を以下に示す。プローブ４０ｎＭ、ＲＮａｓｅＩＩＩ（Ｅ．  ｃｏｌｉ，  Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）  ３Ｕ／３０μＬ、ＲＮａｓｅＩＩＩ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、反応温度４２℃。
【００１８】
上記測定溶液中に各濃度の実施例２で作製したＲＮＡを共存させ、プローブ由来の蛍光強度の変化を時間経過ごとにＴＲＣＲａｐｉｄ−１６０（東ソー製）を用いて確認した。結果を図２に示す。ＲＮＡ濃度に応じて時間あたりの蛍光強度増幅が起こることが確認された。
【００１９】
実施例４  ＲＮａｓｅＩＩＩの効果確認
２５ｎＭの実施例２で作製したＲＮＡ存在下で、ＲＮａｓｅＩＩＩの有無での蛍光強度変化を確認した。測定溶液中のプローブ濃度などの詳細を以下に示す。実施例１で作製したプローブ４０ｎＭ、ＲＮａｓｅＩＩＩ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、反応温度４２℃。ＲＮａｓｅＩＩＩが有りの場合は、ＲＮａｓｅＩＩＩ（Ｅ．  ｃｏｌｉ，  Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）  ３Ｕ／３０μＬ。
【００２０】
上記測定溶液中でＲＮａｓｅＩＩＩの有無による、プローブ由来の蛍光強度変化を時間経過ごとにＴＲＣＲａｐｉｄ−１６０（東ソー製）を用いて確認した。結果を図３に示す。ＲＮａｓｅＩＩＩが存在する時のみ、時間経過に応じて蛍光強度が増幅することが確認された。
【００２１】
以上の結果から、本発明の方法により、ＲＮＡを測定できることが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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