(57)【要約】      （修正有）【課題】ミトコンドリアDNAの異常によるミトコンドリア病の病態機構の解明とその治療法の開発にとって有用なツールを提供すること。【解決手段】ミトコンドリア病誘発変異を有する変異mtDNAの割合が異なり、且つ同一のiPS細胞クローンに由来する、2種以上のiPS細胞集団。RVDがN末端側からHD−NG−NI−HD−NG−HD−HD−NI−NI−NI−NN−NI−HD−HD−NI−HDである、TALエフェクターヌクレアーゼ、該TALエフェクターヌクレアーゼのmRNA、及び該TALエフェクターヌクレアーゼの発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種、並びに他のRVDを有するTALエフェクターヌクレアーゼ、該TALエフェクターヌクレアーゼのmRNA、及び該TALエフェクターヌクレアーゼの発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種を含む、キット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミトコンドリア病誘発変異を有する変異mtDNAの割合が異なり、且つ同一のiPS細胞クローンに由来する、2種以上のiPS細胞集団を含む、キット。
【請求項２】
前記ミトコンドリア病誘発変異がG13513A変異である、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
少なくとも1種のiPS細胞集団における前記変異mtDNAの割合が60％以上である、請求項１又は２に記載のキット。
【請求項４】
前記iPS細胞集団間の前記変異mtDNAの割合の差が5％以上である、請求項１〜３のいずれかに記載のキット。
【請求項５】
前記iPS細胞集団を5種以上含む、請求項１〜４のいずれかに記載のキット。
【請求項６】
前記iPS細胞集団を8〜12種含む、請求項１〜５のいずれかに記載のキット。
【請求項７】
前記iPS細胞集団の1種あたりの細胞数が1×105個以上である、請求項１〜６のいずれかに記載のキット。
【請求項８】
RVDがN末端側からHD−NG−NI−HD−NG−HD−HD−NI−NI−NI−NN−NI−HD−HD−NI−HDである、TALエフェクターヌクレアーゼ。
【請求項９】
RVDがN末端側からHD−NG−NI−HD−NG−HD−HD−NI−NI−NI−NN−NI−HD−HD−NI−HDである、TALエフェクターヌクレアーゼ、該TALエフェクターヌクレアーゼのmRNA、及び該TALエフェクターヌクレアーゼの発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種、並びに
RVDがN末端側からNN−NG−NN−NG−NI−NG−NN−NI−NG−NI−NG−NN−NG−NG−NG−NN−HDである、TALエフェクターヌクレアーゼ、該TALエフェクターヌクレアーゼのmRNA、及び該TALエフェクターヌクレアーゼの発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種を含む、キット。
【請求項１０】
RVDがN末端側からNG−NG−NG−NN−NN−NI−NN−NG−NI−NN−NIである、TALエフェクターヌクレアーゼ。
【請求項１１】
RVDがN末端側からNI−NN−HD−NI−NN−NN−NI−NI−NG−NI−HD−HD−NGである、TALエフェクターヌクレアーゼ、該TALエフェクターヌクレアーゼのmRNA、及び該TALエフェクターヌクレアーゼの発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種、並びに
RVDがN末端側からNG−NG−NG−NN−NN−NI−NN−NG−NI−NN−NIである、TALエフェクターヌクレアーゼ、該TALエフェクターヌクレアーゼのmRNA、及び該TALエフェクターヌクレアーゼの発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミトコンドリア病（特にMELAS）の研究用ツール、治療法開発ツール等に関する。
【背景技術】
【０００２】
ミトコンドリアの働きが低下することが原因で発症する病気を総称してミトコンドリア病と呼ぶ。このうち、ミトコンドリアDNA（＝mtDNA）の異常によって生じるミトコンドリア病として、ミトコンドリア脳筋症・乳酸アシドーシス・脳卒中様発作症候群（MELAS）が知られている。MELASは、脳と骨格筋のミトコンドリアに形態的あるいは機能的異常を伴う疾患として1977年にShapiraらによって最初に報告された。MELASは、筋力低下・筋萎縮に加えて外眼筋麻痺・難聴・小脳失調・知能低下・痙攣・ミオクローヌスなど多彩な神経症状を呈することがある。さらに糖尿病といった内分泌障害や心筋・肝・腎など一般臓器障害も伴い、多系統疾患の病像を示す場合もある（＝mitochondrial cytopathy）。
【０００３】
mtDNAの突然変異がMELASの病因と強く関連していることが明らかになっている。突然変異としては、mtDNA塩基番号3243のA→G置換（A3243G変異）（tRNALeu(UUR)遺伝子）、mtDNA塩基番号13513のG→A置換（G13513A変異）（NADH dehydrogenase 5遺伝子）などが知られている。
【０００４】
ミトコンドリア病は日本においては難病指定されており、その病態機構の解明や治療法の開発が強く求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表2014−523733号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ミトコンドリアDNAの異常によるミトコンドリア病の病態機構の解明とその治療法の開発にとって有用なツールを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
MELASの様に、mtDNAの異常によって生じるミトコンドリア病においては、1つの細胞の中に存在する数百〜数千個のmtDNAの全てが異常なのではなく、正常なmtDNAと変異したmtDNAが混在した状態（＝ヘテロプラスミー）にある。そして変異mtDNAの割合が、ある一定の割合以上になると、機能障害を起こすこと（＝閾値効果）、及び細胞や組織によって変異mtDNAの割合が異なること（＝細胞／組織特異性）が知られている。例えば、MELASにおいては、特に骨格筋細胞と脳神経細胞に異常ミトコンドリアが集積し（＝細胞／組織特異性）、変異mtDNAがある一定の割合以上になると病気を発症する（＝閾値効果）と考えられている。
【０００８】
本発明者等は、これらを踏まえ、mtDNAの異常によるミトコンドリア病の病態機構の解明とその治療法の開発には、同一クローンに由来する、変異mtDNAを様々な割合で持つ一連の病態モデルでの検討が重要であることに着目した。
【０００９】
なお、特許文献１には、変異mtDNAを様々な割合で有するiPS細胞群が開示されているが、各細胞群は異なるクローンであり、その性質は厳密にはそれぞれ異なることが予想される。
【００１０】
本発明者は、このような状況下で鋭意研究を進め、各種工夫に基づいて、ミトコンドリア病誘発変異を有する変異mtDNAの割合が異なり、且つ同一のiPS細胞クローンに由来する、複数種のiPS細胞集団の作製に成功するに至った。これらの細胞集団であれば、ミトコンドリアDNAの異常によるミトコンドリア病の病態機構の解明とその治療法の開発にとって、非常に有用なツールとなり得る。
【００１１】
即ち、本発明は、下記の態様を包含する：
項１．  ミトコンドリア病誘発変異を有する変異mtDNAの割合が異なり、且つ同一のiPS細胞クローンに由来する、2種以上のiPS細胞集団を含む、キット．
項２．  前記ミトコンドリア病誘発変異がG13513A変異である、項１に記載のキット．  項３．  少なくとも1種のiPS細胞集団における前記変異mtDNAの割合が60％以上である、項１又は２に記載のキット．
項４．  前記iPS細胞集団間の前記変異mtDNAの割合の差が5％以上である、項１〜３のいずれかに記載のキット．
項５．  前記iPS細胞集団を5種以上含む、項１〜４のいずれかに記載のキット．
項６．  前記iPS細胞集団を8〜12種含む、項１〜５のいずれかに記載のキット．
項７．  前記iPS細胞集団の1種あたりの細胞数が1×105個以上である、項１〜６のいずれかに記載のキット．
項８．  RVDがN末端側からHD−NG−NI−HD−NG−HD−HD−NI−NI−NI−NN−NI−HD−HD−NI−HDである、TALエフェクターヌクレアーゼ．
項９．  RVDがN末端側からHD−NG−NI−HD−NG−HD−HD−NI−NI−NI−NN−NI−HD−HD−NI−HDである、TALエフェクターヌクレアーゼ、該TALエフェクターヌクレアーゼのmRNA、及び該TALエフェクターヌクレアーゼの発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種、並びに
RVDがN末端側からNN−NG−NN−NG−NI−NG−NN−NI−NG−NI−NG−NN−NG−NG−NG−NN−HDである、TALエフェクターヌクレアーゼ、該TALエフェクターヌクレアーゼのmRNA、及び該TALエフェクターヌクレアーゼの発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種を含む、キット．
項１０．  RVDがN末端側からNG−NG−NG−NN−NN−NI−NN−NG−NI−NN−NIである、TALエフェクターヌクレアーゼ。
項１１．  RVDがN末端側からNI−NN−HD−NI−NN−NN−NI−NI−NG−NI−HD−HD−NGである、TALエフェクターヌクレアーゼ、該TALエフェクターヌクレアーゼのmRNA、及び該TALエフェクターヌクレアーゼの発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種、並びに
RVDがN末端側からNG−NG−NG−NN−NN−NI−NN−NG−NI−NN−NIである、TALエフェクターヌクレアーゼ、該TALエフェクターヌクレアーゼのmRNA、及び該TALエフェクターヌクレアーゼの発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種を含む、キット。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、mtDNAの異常によるミトコンドリア病の病態機構の解明とその治療法の開発にとって有用なツールとして、ミトコンドリア病誘発変異を有する変異mtDNAの割合が異なり、且つ同一のiPS細胞クローンに由来する、複数種のiPS細胞集団を提供することができる。例えば、これらのiPS細胞集団を分化誘導して得られた各種細胞を用いることにより、細胞・組織特異性、閾値効果、マイトファジー等の観点から、ミトコンドリア病の病態機構の解明を促進することができる。
【００１３】
また、本発明によれば、これらのiPS細胞集団の作製に好適に用いることができる、TALエフェクターヌクレアーゼ、及びそのペアを提供することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】G13513A変異を有するmtDNAの割合の測定結果を示す（試験例1）。縦軸は、G13513A変異を有するmtDNAの割合（＝1 / [1+(1/2)ΔCt]×100（式中：CtはリアルタイムPCRにより求められるCt（Threshold cycle）値を示す。ΔCt＝Ct (Wt)−Ct (MUT)）、G13513A変異を有するmtDNAの分子数／総mtDNA分子数に対応する割合）を示す。横軸中、A01 FibroはMELAS患者より採取された線維芽細胞であり、その他はiPS細胞クローンである。
【図２】mtDNAのコピー数の測定結果を示す（試験例1）。縦軸は、1細胞あたりのmtDNAコピー数を示す。横軸中、A01 FibroはMELAS患者より採取された線維芽細胞であり、その他はiPS細胞クローンである。
【図３】試験例2でデザインしたTALエフェクターヌクレアーゼ（P2LWT及びP2R）の構造、及びこれらが認識する塩基配列を示す、模式図である。
【図４】試験例2で作製したTALエフェクターヌクレアーゼ発現ベクター（P2LWT発現ベクター及びP2R発現ベクター）の構造を示す模式図である。SOD2及びCox8はそれぞれSOD2由来MTS及びCox8由来MTSを示す。TALE（P2LWT）及びTALE（P2R）は、DNA結合ドメインを示す。FokIはFok1エンドヌクレアーゼドメインを示す。
【図５】G13513A変異を有するmtDNAの割合の測定結果を示す（試験例3）。縦軸は、G13513A変異を有するmtDNAの割合（＝1 / [1+(1/2)ΔCt]×100（式中：CtはリアルタイムPCRにより求められるCt（Threshold cycle）値を示す。ΔCt＝Ct (Wt)−Ct (MUT)）、G13513A変異を有するmtDNAの分子数／総mtDNA分子数に対応する割合）を示す。横軸中、Pの右側の数字は、測定対象の細胞の、継代回数を示す。
【図６】G13513A変異を有するmtDNAの割合の測定結果を示す（試験例4）。縦軸は、G13513A変異を有するmtDNAの割合（＝1 / [1+(1/2)ΔCt]×100（式中：CtはリアルタイムPCRにより求められるCt（Threshold cycle）値を示す。ΔCt＝Ct (Wt)−Ct (MUT)）、G13513A変異を有するmtDNAの分子数／総mtDNA分子数に対応する割合）を示す。横軸中、mtTALEN−はTALエフェクターヌクレアーゼの発現ベクターを導入していない場合を示し、mtTALEN＋はTALエフェクターヌクレアーゼの発現ベクターを導入した場合を示す。
【図７】試験例5でデザインしたTALエフェクターヌクレアーゼ（PKLB及びPKR）の構造、及びこれらが認識する塩基配列を示す、模式図である。
【図８】試験例5で作製したTALエフェクターヌクレアーゼ発現ベクター（PKLB発現ベクター及びPKR発現ベクター）の構造を示す模式図である。ATP5B及びCox8はそれぞれATP5B由来MTS及びCox8由来MTSを示す。TALE（PKLB）及びTALE（PKR）は、DNA結合ドメインを示す。FokIはFok1エンドヌクレアーゼドメインを示す。
【図９】試験例5におけるSSAアッセイの結果を示す。縦軸は切断活性を示す。横軸には使用したTALエフェクターヌクレアーゼのペアを示し、横軸中のNCはTALエフェクターヌクレアーゼのペアを使用していないネガティブコントロールを示す。白カラム（WT）はG13513周辺領域として野生型G13513を含む領域を用いた場合を示し、グレーカラム（MUT）はG13513周辺領域として変異G13513Aを含む領域を用いた場合を示す。
【図１０】G13513A変異を有するmtDNAの割合の測定結果を示す（試験例6）。縦軸は、G13513A変異を有するmtDNAの割合（＝1 / [1+(1/2)ΔCt]×100（式中：CtはリアルタイムPCRにより求められるCt（Threshold cycle）値を示す。ΔCt＝Ct (Wt)−Ct (MUT)）、G13513A変異を有するmtDNAの分子数／総mtDNA分子数に対応する割合）を示す。横軸中、「未処理細胞」は、トランスフェクションおよびソーティングをしていない場合を示し、「L-mpTALEN(PKLB) +」は、PKLB発現ベクターを2 倍量＋EGFP発現ベクターを導入した場合を示し、「L-mpTALEN(PKLB) + R-mpTALEN(PKR) +」は、PKLB発現ベクター及びPKR発現ベクター＋EGFP発現ベクターを導入した場合を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
1．定義
本明細書中において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。
【００１６】
アミノ酸配列の「同一性」とは、2以上の対比可能なアミノ酸配列の、お互いに対するアミノ酸配列の一致の程度をいう。従って、ある2つのアミノ酸配列の一致性が高いほど、それらの配列の同一性又は類似性は高い。アミノ酸配列の同一性のレベルは、例えば、配列分析用ツールであるFASTAを用い、デフォルトパラメータを用いて決定される。若しくは、Karlin及びAltschulによるアルゴリズムBLAST（KarlinS， Altschul SF．“Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoringschemes”Proc Natl Acad Sci USA．87:2264−2268（1990）、KarlinS，Altschul SF．“Applications and statistics for multiple high−scoring segments in molecular sequences．”Proc Natl Acad Sci USA．90:5873−7（1993））を用いて決定できる。このようなBLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている。これらの解析方法の具体的な手法は公知であり、National Center of Biotechnology Information（NCBI）のウェブサイト（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を参照すればよい。また、塩基配列の「同一性」も上記に準じて定義される。
【００１７】
本明細書中において、「保存的置換」とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換されることを意味する。例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジンといった塩基性側鎖を有するアミノ酸残基同士で置換されることが、保存的な置換にあたる。その他、アスパラギン酸、グルタミン酸といった酸性側鎖を有するアミノ酸残基；グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システインといった非帯電性極性側鎖を有するアミノ酸残基；アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンといった非極性側鎖を有するアミノ酸残基；スレオニン、バリン、イソロイシンといったβ−分枝側鎖を有するアミノ酸残基；チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンといった芳香族側鎖を有するアミノ酸残基同士での置換も同様に、保存的な置換にあたる。
【００１８】
2．複数種のiPS細胞集団
本発明は、一態様において、ミトコンドリア病誘発変異を有する変異mtDNAの割合が異なり、且つ同一のiPS細胞クローンに由来する、2種以上のiPS細胞集団、及びこれらを含むキット（本明細書において、「本発明のキット」と示すこともある）に関する。
【００１９】
「iPS細胞集団」は、複数のiPS細胞を含むものである限り特に制限されない。各iPS細胞集団に含まれるiPS細胞数は、例えば1×104個以上、好ましくは1×104個〜1×108個、より好ましくは3×104個〜1×107個、さらに好ましくは1×105個〜1×106個程度である。各iPS細胞集団は、本発明の他のiPS細胞集団と混合されていない様な状態で存在する。例えば、各iPS細胞集団は、それぞれ別々の容器（例えば、培養ディッシュ、培養ウェル、チューブ等）に収容された状態で存在する。
【００２０】
iPS細胞集団の数は、2種以上である限り特に制限されない。iPS細胞集団の数は、好ましくは3種以上、より好ましくは4〜20種、さらに好ましくは5〜15種、よりさらに好ましくは6〜12種である。iPS細胞集団の数が多い方が、ミトコンドリアDNAの異常によるミトコンドリア病の病態機構の解明とその治療法の開発にとって、より有用である。
【００２１】
iPS細胞集団は、全て、同一のiPS細胞クローンに由来する。つまり、iPS細胞集団は、全て、iPS細胞の作製過程において生じたある1つのiPS細胞コロニー（1つのiPS細胞が分裂して形成されたコロニー）のiPS細胞に由来する。各iPS細胞集団が異なるクローン由来である場合、その性質は厳密にはそれぞれ異なることが予想されるので、ミトコンドリアDNAの異常によるミトコンドリア病の病態機構の解明とその治療法の開発にとっては望ましくない。
【００２２】
本発明において、「ミトコンドリア病」は、ミトコンドリアDNA（mtDNA）の塩基配列変異がその発症の一因とされるものである限り、特に制限されない。ミトコンドリア病の具体例としては、ミトコンドリア脳筋症・乳酸アシドーシス・脳卒中様発作症候群（MELAS）、赤色ぼろ線維・ミオクローヌスてんかん症候群（MERRF）、慢性進行性外眼筋麻痺症候群（CPEO）、リー脳症、レーバー遺伝性視神経萎縮症（LHON）、カーンズ・セイヤー症候群（KSS）、Pearson症候群（PS）等が挙げられる。これらの中でも、好ましくは、MELAS、リー脳症等が挙げられる。
【００２３】
「ミトコンドリア病誘発変異を有する変異」とは、mtDNAの塩基配列変異であって、且つミトコンドリア病の発症の一因となる変異である限り、特に制限されない。例えばヒトにおける該変異としては、例えばG13513A、A3243G、T3271C、A8344G、T8356C、G8363A、T8993G、T8993C、T9176C、G3460A、G11778A、T14484C等が挙げられる。なお、これらの変異の表記中、最初のアルファベットは変異前の塩基を意味（A：アデニン、T：チミン、G：グアニン、C：シトシン）しており、真ん中の数字は変異対象の塩基の位置を示す、mtDNAにおける塩基番号（又は塩基対番号）を意味し、最後のアルファベットは変異後の塩基を意味している。例えば、G13513Aであれば、mtDNA塩基番号13513のグアニンのアデニンへの変異を示す。なお、mtDNAの塩基番号は、例えばヒトの場合であれば、NCBI Reference Sequence (ID: NC_012920.1)の塩基配列の5´末端の塩基を「塩基番号1」とした場合、又はヒトミトコンドリアDNAの一部の塩基配列である配列番号1の5´末端の塩基を「塩基番号1」とした場合に、3´側に1塩基ずつずれるにつれて増えていく番号である。
【００２４】
「ミトコンドリア病誘発変異を有する変異mtDNA」（本明細書において、単に「変異mtDNA」と示す場合もある）とは、上記した「ミトコンドリア病誘発変異を有する変異」を有するmtDNAである。mtDNAに含まれる該変異は、通常は1種であるが、2種又は3種以上であってもよい。
【００２５】
「変異mtDNAの割合」とは、それぞれのiPS細胞集団における、「変異mtDNAの分子数／総mtDNAの分子数」である。該割合は、0〜100％の中から選択される。
【００２６】
一実施形態において、少なくとも1種のiPS細胞集団における該割合は、好ましくは60％以上、より好ましくは70％以上、さらに好ましくは80％以上、よりさらに好ましくは90％以上である。このような割合のiPS細胞集団を含むことによって、病態機構の解明とその治療法の開発をより進め易くすることができる。
【００２７】
複数のiPS細胞集団の集団間においては、変異mtDNAの割合が異なっている。該割合の異なる複数のiPS細胞集団を用いることによって、病態機構の解明とその治療法の開発が可能となる。iPS細胞集団間の変異mtDNAの割合の差は、例えば3％以上、好ましくは5％以上、より好ましくは7％以上であり、また例えば30％以下、20％以下、15％以下である。変異mtDNAの割合が互いに一定以上異なるiPS細胞集団を複数用いることによって、病態機構の解明とその治療法の開発をより進め易くすることができる。
【００２８】
一実施形態においては、本発明のiPS細胞集団は、
（a）変異mtDNAの割合が0％以上5％未満であるiPS細胞集団
（b）変異mtDNAの割合が5％以上15％未満であるiPS細胞集団
（c）変異mtDNAの割合が15％以上25％未満であるiPS細胞集団
（d）変異mtDNAの割合が25％以上35％未満であるiPS細胞集団
（e）変異mtDNAの割合が35％以上45％未満であるiPS細胞集団
（f）変異mtDNAの割合が45％以上55％未満であるiPS細胞集団
（g）変異mtDNAの割合が55％以上65％未満であるiPS細胞集団
（h）変異mtDNAの割合が75％以上85％未満であるiPS細胞集団
（i）変異mtDNAの割合が85％以上95％未満であるiPS細胞集団、及び
（j）変異mtDNAの割合が95％以上100％以下（又は未満）であるiPS細胞集団からなる群から選択される少なくとも2種以上（好ましくは3種以上、より好ましくは4〜20種、さらに好ましくは5〜15種、よりさらに好ましくは6〜12種）を含む。
【００２９】
本発明のキットは、上記したiPS細胞集団を2種以上含む限りにおいて、特に制限されない。本発明のキットにおいては、上述したとおり、各iPS細胞集団は、他のiPS細胞集団と混合されない様な状態（例えば、各iPS細胞集団は、それぞれ別々の容器（例えば、培養ディッシュ、培養ウェル、チューブ等）に収容された状態）で存在する。各iPS細胞集団は、他の成分（例えば培地、細胞保存液等）や細胞（例えばフィーダー細胞等）と共に存在していてもよい。
【００３０】
本発明のキットには、必要に応じて、他の試薬、器具などを適宜含んでいてもよい。
【００３１】
3．複数種のiPS細胞集団の製造方法
上記「2．複数種のiPS細胞集団」で説明した複数種のiPS細胞集団のセットは、典型的には、
（工程1）変異mtDNAを有する体細胞より得られたiPS細胞クローンに対して、野生型mtDNA又は変異mtDNAを特異的に切断可能なTALエフェクターヌクレアーゼのペア、そのmRNA、及びその発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種を導入し、その後培養する工程、及び／又は
（工程2）変異mtDNAを有する体細胞より得られたiPS細胞クローンを培養する工程、を含む方法により、製造することができる。
【００３２】
工程1においては、野生型mtDNAを特異的に切断可能なTALエフェクターヌクレアーゼを用いた場合であれば、変異mtDNAの割合がより高められたiPS細胞集団を得ることができるし、変異mtDNAを特異的に切断可能なTALエフェクターヌクレアーゼを用いた場合であれば、変異mtDNAの割合がより低減したiPS細胞集団を得ることができる。
【００３３】
工程2においては、培養を継続することにより、変異mtDNAの割合がより高められたiPS細胞集団を得ることができる。
【００３４】
なお、変異mtDNAの割合が高い（例えば60％以上、70％以上、80％以上、90％以上の）iPS細胞の変異mtDNAの割合をより高めるべく、該iPS細胞に対して、工程1の野生型mtDNAを特異的に切断可能なTALエフェクターヌクレアーゼのペア等の導入を行うと、細胞が導入刺激に耐えられず、結果としてより変異mtDNAの割合が高められたiPS細胞が得られない可能性が高いと考えられる。このため、変異mtDNAの割合が高い（例えば60％以上、70％以上、80％以上、90％以上の）iPS細胞の変異mtDNAの割合をより高めるためには、工程2を採用することが好ましい。
【００３５】
一方で、工程1であれば、変異mtDNAの割合を増加させることのみならず、減少させることもできる。また、工程1において野生型mtDNAを特異的に切断可能なTALエフェクターヌクレアーゼのペア等を採用する場合は、工程2に比べて、特に変異mtDNAの割合が比較的低いiPS細胞に対して処置する場合には、より短期間に変異mtDNAの割合を変化させることも可能である。さらに、例えば、ヒトにおけるG13513A変異を対象とする場合であれば、工程1において、後述の特定のTALエフェクターヌクレアーゼを用いることにより、より効率的に変異mtDNAの割合を増加又は減少させることができる。
【００３６】
3-1．工程1
変異mtDNAを有する体細胞は、特に制限されない。該細胞としては、線維芽細胞、上皮細胞、血管内皮細胞、血液細胞、造血幹細胞、前駆細胞、神経細胞、肝細胞、ケラチン生成細胞、筋細胞、表皮細胞、内分泌細胞等が挙げられる。また、体細胞の由来生物も特に制限されず、例えばヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ヤギ、サル等から適宜選択することができる。また、体細胞としては、例えば、ミトコンドリア病に罹患している生物の体細胞、該生物と血縁関係にある生物（例えば、母親等）に由来する体細胞を採用することができる。
【００３７】
iPS細胞クローンは、この体細胞から、定法に従って又は準じて得ることができる。典型的には、変異mtDNAを有する体細胞にリプログラミング因子を導入し、一定期間培養後、iPS細胞コロニーを取得することにより得ることができる。
【００３８】
リプログラミング因子としては、体細胞を多能性幹細胞に誘導可能なものである限りにおいて特に制限されない。本発明においては、SOX2、KLF4、OCT3/4、L-MYC、LIN28、及びp53-shRNAの組み合わせをリプログラミング因子として用いることが好ましい。
【００３９】
リプログラミング因子は、その発現ベクターの形態で体細胞に導入することが望ましい。この場合、発現ベクターとしては、エピソーマルベクター、ウイルスベクター等を採用することが可能であるが、本発明においてはエピソーマルベクターが好ましい。
【００４０】
リプログラミング因子の導入方法は、リプログラミング因子の種類（核酸であるのか、タンパク質であるのか等）に応じて、適宜選択することができる。導入方法としては、例えばマイクロインジェクション、エレクトロポレーション、DEAE-デキストラン処理、リポフェクション、ナノ粒子媒介性トランスフェクション、ウイルス媒介性核酸送達等が挙げられる。
【００４１】
リプログラミング因子導入後の培養期間は、通常、7日〜60日程度である。
【００４２】
iPS細胞コロニーの取得は、例えば、iPS細胞の公知の性質（例えばコロニーの性状、多能性マーカーの発現プロファイル、3胚葉への分化能、胚葉体形成能等）を調べた上で、iPS細胞であると判定されたコロニーを選択・採取することによって行うことができる。
【００４３】
TALエフェクターヌクレアーゼのペアは、公知のTALENシステムに従って、野生型mtDNA又は変異mtDNAを特異的に切断できるようにデザインされたTALENペアである限り、特に制限されない。なお、本明細書において、単に「TALエフェクターヌクレアーゼ」と示す場合は、TALENペアの一方を示す。例えば、野生型mtDNAを特異的に切断するペアであれば、TALENペアの一方が、野生型mtDNAの塩基配列には結合するが、変異mtDNAの塩基配列には結合しないようにデザインされる。また、例えば、変異mtDNAを特異的に切断するペアであれば、TALENペアの一方が、変異mtDNAの塩基配列には結合するが、野生型mtDNAの塩基配列には結合しないようにデザインされる。具体的には、DNA結合ドメインを構成する繰り返し単位（各単位は、一塩基を認識する。各単位は、通常は、33〜34アミノ酸からなる）の各単位における可変部位（RVD：repeat variable di-residue。通常、2アミノ酸からなる）のアミノ酸配列を、mtDNA上の標的塩基配列に応じて、デザインする。
【００４４】
例えば、変異がヒトにおけるG13513A変異である場合であれば、野生型mtDNAの塩基配列には結合するが、変異mtDNAの塩基配列には結合しないようにデザインされたTALエフェクターヌクレアーゼとしては、RVDがN末端側からHD−NG−NI−HD−NG−HD−HD−NI−NI−NI−NN−NI−HD−HD−NI−HDである、TALエフェクターヌクレアーゼが好適である。そして、このTALエフェクターヌクレアーゼとペアを形成するTALエフェクターヌクレアーゼとしては、RVDがN末端側からNN−NG−NN−NG−NI−NG−NN−NI−NG−NI−NG−NN−NG−NG−NG−NN−HDである、TALエフェクターヌクレアーゼが好適である。
【００４５】
例えば、変異がヒトにおけるG13513A変異である場合、変異mtDNAの塩基配列には結合するが、野生型mtDNAの塩基配列には結合しないようにデザインされたTALエフェクターヌクレアーゼとしては、RVDがN末端側からNG−NG−NG−NN−NN−NI−NN−NG−NI−NN−NIである、TALエフェクターヌクレアーゼが好適である。そして、このTALエフェクターヌクレアーゼとペアを形成するTALエフェクターヌクレアーゼとしては、RVDがN末端側からNI−NN−HD−NI−NN−NN−NI−NI−NG−NI−HD−HD−NGである、TALエフェクターヌクレアーゼが好適である。
【００４６】
TALエフェクターヌクレアーゼのDNA結合ドメインを構成する繰り返し単位中、RVD以外のアミノ酸配列は、公知の情報に従ってデザインすることができる。例えば、Platinum TALENデザイン方法を採用してデザインすることができる。
【００４７】
TALエフェクターヌクレアーゼは、ペアとした際に、野生型mtDNA又は変異mtDNAを特異的に切断できる活性を有する限りにおいて、化学修飾されたものであってもよい。
【００４８】
TALエフェクターヌクレアーゼは、C末端がカルボキシル基（−COOH）、カルボキシレート（−COO−）、アミド（−CONH2）またはエステル（−COOR）の何れであってもよい。
【００４９】
ここでエステルにおけるRとしては、例えば、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチルなどのC1−6アルキル基；例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのC3−8シクロアルキル基；例えば、フェニル、α−ナフチルなどのC6−12アリール基；例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−C1−2アルキル基；α−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−C1−2アルキル基などのC7−14アラルキル基；ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
【００５０】
TALエフェクターヌクレアーゼは、C末端以外のカルボキシル基（またはカルボキシレート）が、アミド化またはエステル化されていてもよい。この場合のエステルとしては、例えば上記したC末端のエステルなどが用いられる。
【００５１】
さらに、TALエフェクターヌクレアーゼには、N末端のアミノ酸残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのC1−6アルカノイルなどのC1−6アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成し得るN末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば−OH、−SH、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのC1−6アルカノイル基などのC1−6アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども包含される。
【００５２】
TALエフェクターヌクレアーゼは、上記「活性」を有する限りにおいて、公知のタンパク質タグ、シグナル配列等のポリペプチドが付加されたものであってもよい。タンパク質タグとしては、例えばビオチン、Hisタグ、FLAGタグ、Haloタグ、MBPタグ、HAタグ、Mycタグ、V5タグ、PAタグ等が挙げられる。シグナル配列としては、例えばMTS（mitochondrial targeting sequence）等が挙げられる。本発明においては、TALエフェクターヌクレアーゼをミトコンドリア内で機能させることが重要であるので、この観点から、TALエフェクターヌクレアーゼは、MTS（mitochondrial targeting sequence）が付加（好ましくはN末端側に付加）されたものであることが望ましい。また同様の観点から、TALエフェクターヌクレアーゼは、核移行シグナルを含まないものであることが望ましい。
【００５３】
TALエフェクターヌクレアーゼは、酸または塩基との薬学的に許容される塩の形態であってもよい。塩は、薬学的に許容される塩である限り特に限定されず、酸性塩、塩基性塩のいずれも採用することができる。例えば酸性塩の例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；  酢酸塩、プロピオン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩等の有機酸塩；  アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩等のアミノ酸塩等が挙げられる。また、塩基性塩の例として、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；  カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩等が挙げられる。
【００５４】
TALエフェクターヌクレアーゼは、溶媒和物の形態であってもよい。溶媒は、薬学的に許容されるものであれば特に限定されず、例えば水、エタノール、グリセロール、酢酸等が挙げられる。
【００５５】
TALエフェクターヌクレアーゼ発現カセットは、細胞内でTALエフェクターヌクレアーゼを発現可能なDNAである限り特に制限されない。TALエフェクターヌクレアーゼ発現カセットの典型例としては、プロモーター、及びそのプロモーターの制御下に配置されたTALエフェクターヌクレアーゼコード配列を含むDNAが挙げられる。
【００５６】
TALエフェクターヌクレアーゼ発現カセットに含まれるプロモーターとしては、特に制限されず、例えばpol II系プロモーターを各種使用することができる、pol II系プロモーターとしては、特に制限されないが、例えばCMVプロモーター、EF1プロモーター、SV40プロモーター、MSCVプロモーター、hTERTプロモーター、βアクチンプロモーター、CAGプロモーター等が挙げられる。
【００５７】
TALエフェクターヌクレアーゼ発現カセットは、必要に応じて、他のエレメント（例えば、マルチクローニングサイト（MCS）、薬剤耐性遺伝子、複製起点など）を含んでいてもよい。例えば、TALエフェクターヌクレアーゼ発現カセットにおいて、5´側から、プロモーター、TALエフェクターヌクレアーゼのコード配列の順に配置されている場合であれば、プロモーターとTALエフェクターヌクレアーゼのコード配列の間に（好ましくはいずれか一方或いは両方に隣接して）、TALエフェクターヌクレアーゼのコード配列の3´側に（好ましくは隣接して）、MCSが配置されている態様が挙げられる。MCSは複数（例えば2〜50、好ましくは2〜20、より好ましくは2〜10）個の制限酵素サイトを含むものであれば特に制限されない。
【００５８】
薬剤耐性遺伝子としては、特に制限されないが、例えばアンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
【００５９】
TALエフェクターヌクレアーゼ発現カセットは、これのみで、或いは他の配列と共にベクターを構成していてもよい。ベクターの種類は、特に制限されず、例えば動物細胞発現プラスミド等のプラスミドベクター；  レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、センダイウイルス等のウイルスベクター；  アグロバクテリウムベクター等が挙げられる。
【００６０】
TALエフェクターヌクレアーゼの導入方法は、上記した「リプログラミング因子の導入方法」と同様である。
【００６１】
導入後の培養期間は、細胞内でTALエフェクターヌクレアーゼが機能し、変異mtDNAの割合を変化させ得る期間である限り、特に制限されない。該培養期間は、例えば1〜60日、好ましくは、1〜20日、より好ましくは2〜10日程度である。変異mtDNAの割合が目的の値になった段階で、細胞を回収する。回収後は、細胞は、必要に応じて凍結保存される。
【００６２】
本発明においては、TALエフェクターヌクレアーゼ発現カセット内にレポーター発現カセットを含ませるか、工程1と共に、又は工程1と共に、レポーター発現カセットを導入する工程を行うことが好ましい。これに加えて、工程1の培養後に、レポーター発現細胞のみを選別することによって、変異mtDNAの割合がより大きく変化したiPS細胞集団を得ることが可能になる。
【００６３】
レポーターとしては、特に制限されず、例えば特定の基質と反応して発光（発色）する発光（発色）タンパク質、或いは励起光によって蛍光を発する蛍光タンパク質等が挙げられる。発光（発色）タンパク質としては、例えばルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、βグルクロニダーゼ等が挙げられ、蛍光タンパク質としては、例えばGFP、Azami-Green、ZsGreen、GFP2、HyPer、Sirius、BFP、CFP、Turquoise、Cyan、TFP1、YFP、Venus、ZsYellow、Banana、KusabiraOrange、RFP、DsRed、AsRed、Strawberry、Jred、KillerRed、Cherry、HcRed、mPlum等が挙げられる。発現カセット及び導入については、上記した「TALエフェクターヌクレアーゼ発現カセット」及び上記した「リプログラミング因子の導入方法」と同様である。
【００６４】
3-2．工程2
「変異mtDNAを有する体細胞より得られたiPS細胞クローン」については、上記「3-1．工程1」と同様である。
【００６５】
培養期間は、変異mtDNAの割合を増加させ得る期間である限り特に制限されず、増加させる割合に応じて異なる。例えば、変異mtDNAの割合を約15％程度増加させる場合であれば、該培養期間は、例えば30〜200日間である。よって、変異mtDNAの割合の差が一定以上（例えば10％以上）である、比較的多くの（5種以上）のiPS細胞を得る場合であれば、培養期間は200〜500日程度である。
【００６６】
工程2は、継代工程を含むことが好ましい。
【００６７】
継代間の日数は、好ましくは3〜12日、より好ましくは4〜10日、さらに好ましくは5〜8日である。
【００６８】
また、同じサイズの培養皿に継代する場合であれば、1/2〜1/4に分けて継代することが望ましい。
【００６９】
工程2は、細胞を凍結保存し、凍結保存された細胞を再度培養に供する工程を含むことが好ましい。該工程が工程2において複数回含まれる場合、先の工程における再度の培養開始から、次の工程における凍結保存までの日数は、好ましくは5〜140日、より好ましくは20〜120日、さらに好ましくは30〜100日である。細胞の凍結保存は、特に限定しないが、液体窒素の中で凍結保存するのが好ましい。
【００７０】
変異mtDNAの割合が目的の値になった段階で、細胞を回収する。回収後、細胞は、必要に応じて凍結保存される。
【００７１】
4．TALエフェクターヌクレアーゼ
本発明は、一態様において、RVDがN末端側からHD−NG−NI−HD−NG−HD−HD−NI−NI−NI−NN−NI−HD−HD−NI−HDである、TALエフェクターヌクレアーゼに関する。該TALエフェクターヌクレアーゼは、G13513野生型mtDNAを特異的に切断できるようにデザインされたTALENである。
【００７２】
本発明は、一態様において、RVDがN末端側からHD−NG−NI−HD−NG−HD−HD−NI−NI−NI−NN−NI−HD−HD−NI−HDである、TALエフェクターヌクレアーゼ、該TALエフェクターヌクレアーゼのmRNA、及び該TALエフェクターヌクレアーゼの発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種を含むキットに関する。
【００７３】
本発明は、一態様において、RVDがN末端側からHD−NG−NI−HD−NG−HD−HD−NI−NI−NI−NN−NI−HD−HD−NI−HDである、TALエフェクターヌクレアーゼ、該TALエフェクターヌクレアーゼのmRNA、及び該TALエフェクターヌクレアーゼの発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種、並びに
RVDがN末端側からNN−NG−NN−NG−NI−NG−NN−NI−NG−NI−NG−NN−NG−NG−NG−NN−HDである、TALエフェクターヌクレアーゼ、該TALエフェクターヌクレアーゼのmRNA、及び該TALエフェクターヌクレアーゼの発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種を含む、キットに関する。
【００７４】
本発明は、一態様において、RVDがN末端側からNG−NG−NG−NN−NN−NI−NN−NG−NI−NN−NIである、TALエフェクターヌクレアーゼに関する。該TALエフェクターヌクレアーゼは、G13513A変異mtDNAを特異的に切断できるようにデザインされたTALENである。
【００７５】
本発明は、一態様において、RVDがN末端側からNG−NG−NG−NN−NN−NI−NN−NG−NI−NN−NIである、TALエフェクターヌクレアーゼ、該TALエフェクターヌクレアーゼのmRNA、及び該TALエフェクターヌクレアーゼの発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種を含むキットに関する。
【００７６】
本発明は、一態様において、RVDがN末端側からNI−NN−HD−NI−NN−NN−NI−NI−NG−NI−HD−HD−NGである、TALエフェクターヌクレアーゼ、該TALエフェクターヌクレアーゼのmRNA、及び該TALエフェクターヌクレアーゼの発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種、並びに
RVDがN末端側からNG−NG−NG−NN−NN−NI−NN−NG−NI−NN−NIである、TALエフェクターヌクレアーゼ、該TALエフェクターヌクレアーゼのmRNA、及び該TALエフェクターヌクレアーゼの発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種を含む、キットに関する。
【００７７】
これらは、上記した「複数種のiPS細胞集団」を製造するために特に有用である、製造ツールとして用いることができる。
【００７８】
本項における上記キットにおいて複数成分が含まれる場合、全ての成分又は一部の複数成分が分離された状態（例えば別々の容器に収容された状態）であってもよいし、全ての成分又は一部の複数成分が分離していない状態（例えば同一の容器に収容された状態）であってもよい。当該キットには、必要に応じて、他の成分、試薬、器具などが適宜含まれていてもよい。
【実施例】
【００７９】
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００８０】
試験例1．iPS細胞の作製及び評価
MELAS患者より皮膚バイオプシー標本を得た。患者の線維芽細胞（本明細書において、「A01」と表記することもある）を、10％FBS及び1％抗生剤溶液（Antibiotic Antimycotic Solution、SIGMA-ALDRICH社製）を含むDMEM培地で増殖させた。6つのリプログラミング因子（SOX2、KLF4、OCT3/4、L-MYC、LIN28、及びp53-shRNA）の発現ベクター（エピソーマルベクター）を、ヒト皮膚線維芽細胞Nucleofector（登録商標）キット（Lonza社製）を用いて、線維芽細胞に導入した。導入後、細胞を、マイトマイシンC処理-SNLフィーダー細胞層上に播種した。播種の翌日、培地を、bFGF（Wako社製）が添加された霊長類iPS細胞用培地（リプロセル社製）に交換した。数週間後、複数のESC様コロニー（iPS細胞コロニー）が観察されたので、これらを機械的に剥して新しい培養プレート上に移した。なお、iPS細胞コロニーの採取の際には、0.1 mg/mLコラゲナーゼIV（Gibco社製）、0.25％トリプシン（Gibco社製）、0.1 mM塩化カルシウム（Wako社製）及び20％ KSRを含有するCTK溶液の処理を行った。
【００８１】
得られたiPS細胞のクローン中、4つのクローン（#15、#30、#58、及び#67）を選択して、更なる解析を行った。その結果、これらのクローンは、全て、Oct/3/4、SSEA-4及びNanog陽性であり（免疫細胞化学解析による）、多能性マーカー（OCT3/4、NANOG、SOX2及びLin28）のmRNAを発現しており（RT-PCRによる）、3胚葉への分化能を有しており（in vitro分化試験による）、浮遊培養条件下における胚葉体形成能を有し、且つ正常な核型を保持していた。
【００８２】
次に、選択したiPS細胞のクローン（#15、#30、#58、及び#67）について、G13513A変異を有するmtDNAの割合を、allele refractory mutation system（ARMS）-based quantitative PCR法を用いて算出した。算出式は次のとおりである：G13513A変異を有するmtDNAの割合＝1 / [1+(1/2)ΔCt]×100（式中：CtはリアルタイムPCRにより求められるCt（Threshold cycle）値を示す。ΔCt＝Ct (Wt)−Ct (MUT)）。野生型mtDNA用のプライマーセットとして、ARMS-G13513_F1WT（配列番号2：5´−CTCACAGGTTTCTACTCCAATG）及びARMS-G13513_R1（配列番号3：5´−GACCTGTTAGGGTGAGAAGAA）からなるプライマーセットを用い、G13513A変異を有するmtDNA用のプライマーセットとして、ARMS-G13513_F1Mut（配列番号4：5´−CTCACAGGTTTCTACTCCAATA）及びARMS-G13513_R1（配列番号3）からなるプライマーセットを用いた。結果を図１に示す。
【００８３】
続いて、選択したiPS細胞のクローン（#15、#30、#58、及び#67）について、mtDNAのコピー数を、定法に従って測定した。mtDNA用のプライマーセットとして、MT-CYB-F（配列番号5：5´−TGCAACTATAGCAACAGCCTTCA）及びMT-CYB-R（配列番号6：5´−GAACTAGGTCTGTCCCAATGTATGG）を用い、核DNA用のプライマーセットとして、FBXO15-F（配列番号7：5´−GCCAGGAGGTCTTCGCTGTA）及びFBXO15-R（配列番号8：5´−AATGCACGGCTAGGGTCAAA）を用いた。結果を図２に示す。
【００８４】
試験例2．TALエフェクターヌクレアーゼの作製1
まず、G13513A変異mtDNAよりもG13513野生型mtDNAを優先的に認識して切断可能なTALエフェクターヌクレアーゼのペアをデザインした（図３及び４）。ペアは、16個のRVD（N末端側からHD−NG−NI−HD−NG−HD−HD−NI−NI−NI−NN−NI−HD−HD−NI−HD）を有するTALEN（アミノ酸配列は配列番号9、本明細書において、「P2LWT」と表記することもある）と、17個のRVD（N末端側からNN−NG−NN−NG−NI−NG−NN−NI−NG−NI−NG−NN−NG−NG−NG−NN−HD）を有するTALEN（アミノ酸配列は配列番号10、本明細書において、「P2R」と表記することもある）とから構成される。これらのTALエフェクターヌクレアーゼにおいては、N末端側にMTS（mitochondrial targeting sequence）及びエピトープタグが付加されている（図４）。
【００８５】
なお、G13513周辺領域を用いたSSAアッセイにおいて、上記RVDコードのTALエフェクターヌクレアーゼのペアが、野生型mtDNA配列に対する切断活性を有するが、G13513A変異mtDNA配列に対する切断活性を殆ど示さないことを確認した。
【００８６】
SSAアッセイの実験手順は次のとおりである。正常配列(m.13513G) あるいは変異配列(m.13513A)を含むミトコンドリアDNA配列の一部を組み込んだpGL4-SSA レポータープラスミド、リファレンスプラスミド（pRL-CMV, Promega社製）、およびTALエフェクターヌクレアーゼ発現プラスミドをLipofectamine LTX（インビトロジェン社製）を用いてHEK293T細胞に導入した。導入から24時間後、Dual-Glo luciferase assay system (Promega社製）を用いて、デュアルルシフェラーゼアッセイを行った。発光の検出はARVO X5（Perkin-Elmer社製）を用いて行った。
【００８７】
次に、デザインしたTALエフェクターヌクレアーゼの発現ベクター（図４）を作製した。作製は、Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit 2.0（Addgene kit #1000000024）及びYamamoto Lab TALEN Accessory Pack（Addgene kit #1000000030）を用いて、キットのプロトコールに従って行った。Flagタグ及び核移行シグナルの除去、並びにSOD2（superoxide dismutase 2）又はCOX8（cytochrome oxidase subunit 8）由来のMTS（mitochondrial targeting sequence）及びエピトープタグ（Flag又はHA）のN末端への付加は、定法に従って行った。
【００８８】
作製した発現ベクターにより発現したP2LWT及びP2Rがミトコンドリアマーカー（Tom20）と共局在を示し、且つ核内には観察されないことは、免疫細胞化学解析によって確認した。
【００８９】
試験例3．ミトコンドリア病誘発変異（G13513A変異）の割合の調整1
iPS細胞のクローン#67を以下に示す条件で継代培養した。
【００９０】
〇培養方法
：試験例1と同様に培養した。具体的には、マイトマイシンC処理をしたSNLフィーダー細胞上にiPS細胞を播種し、培地としてbFGF（Wako）を添加した霊長類iPS細胞培地（リプロセル）を用いた。
【００９１】
〇継代方法
：細胞播種後主に5日〜8日後に継代を行った。継代操作は次のとおりである。まず、細胞をD-PBS(-)で洗浄後、CTK溶液で処理し、フィーダー細胞をはがした。次に、再び、D-PBS(-)で洗浄後、霊長類iPS細胞培地を加え、セルスクレイパーを用いてiPS細胞コロニーをはがした。最後に、適量を新しいフィーダー細胞上に播種した。Y-27632（Wako）を加える場合もある。なお、10 cm dish, 6 cm dishからそれぞれ同じサイズのdishに継代する場合、主に1：2、1：3、1：4に分けて継代した。
【００９２】
〇保存方法
：凍結ストックの操作は次のとおりである。まず、継代操作中のD-PBS(-)洗浄後、CTK溶液で処理し、フィーダー細胞をはがした。次に、再び、D-PBS(-)で洗浄後、霊長類iPS細胞培地を加え、セルスクレイパーを用いてiPS細胞コロニーをはがした。最後に、iPS細胞懸濁液を適量、遠沈管に分け入れ、遠心後、上清を十分に除き、ペレットに保存液（例えばSTEM-CELLBANKER：日本全薬工業株式会社製)を加え、凍結チューブに移し、液体窒素タンクで保存した。なお、10 cm dish, 6 cm dishからそれぞれ保存する場合、主に1：2、1：3、1：4に分けて保存した。
【００９３】
○その他
培養は断続的に行った。つまり、一度保存した凍結ストックからの培養再開の工程を含む。また、継代回数のカウントは、継代時に1回カウントするのみならず、凍結ストックからの培養再開時にも1回カウントした。
【００９４】
継代回数のカウントが5回、12回、21回、33回、39回、及び45回の細胞それぞれについて、試験例1と同様にして、G13513A変異を有するmtDNAの割合を測定した。なお、これらの細胞の培養日数は以下のとおりである（Pの右側の数字は、その細胞の継代回数を示す）。また、細胞を凍結保存したのは、P11、P20、及びP31の時点で行った。以下に、凍結保存期間を含まない、細胞の培養期間を示す。
P5からP12までの培養期間：41日
P12からP21までの培養期間：54日
P21からP33までの培養期間：82日
P33からP39までの培養期間：42日
P39からP45までの培養期間：40日
結果を図５に示す。図５に示されるように、本試験例の培養により、G13513A変異を有するmtDNAの割合が異なり、且つ同一のiPS細胞クローンに由来する、複数のiPS細胞集団が得られた。また、本試験例の培養の継続によりG13513A変異を有するmtDNAの割合の増加を図ることができることが示唆された。
【００９５】
試験例4．ミトコンドリア病誘発変異（G13513A変異）の割合の調整2
iPS細胞のクローン#67の継代培養の途中で得られた細胞（P37）からフィーダー細胞を除去し、0.5％TrypLE Select（Gibco社製）により37℃で4分間処理することにより、シングルセルになるようにiPS細胞同士を分離させた。得られたiPS細胞を、iMatrix-511（ニッピ社製）でコートされた培養ディッシュに播種し、StemFit AK02N培地（リプロセル社製）を用いて5日間培養した。EGFP発現ベクター（pCAGGS-EGFP；pCAGGSベクターの発現カセットにEGFPコード配列が組み込まれて成るなるベクター。pCAGGSベクターは文部科学省のナショナルバイオリソースプロジェクトを通じて、理研バイオリソースセンターより提供を受けた。）、P2LWT発現ベクター（試験例2）、及びP2R発現ベクター（試験例2）を、Lipofectamine 3000（インビトロジェン社製）を用いて細胞に導入した。導入から2日経過後、細胞を採取し、高速セルソーター（MoFlo Astrios、ベックマン・コールター社製）によりEGFP陽性細胞を分画して、10μM Y-27632（Wako社製）を含む霊長類iPS細胞用培地（リプロセル社製）に懸濁した。
【００９６】
得られたEGFP陽性細胞について、試験例1と同様にして、G13513A変異を有するmtDNAの割合を測定した。結果を図６に示す。図６に示されるように、TALエフェクターヌクレアーゼの発現ベクターを導入していない方の変異率が約40％弱程度であるのに対して、TALエフェクターヌクレアーゼの発現ベクターの導入した方の変異率は約50％弱程度まで上昇した。
【００９７】
試験例5．TALエフェクターヌクレアーゼの作製2
まず、G13513野生型mtDNAよりもG13513A変異mtDNAを優先的に認識して切断可能なTALエフェクターヌクレアーゼのペアをデザインした（図７及び８）。ペアは、13個のRVD（N末端側からNI−NN−HD−NI−NN−NN−NI−NI−NG−NI−HD−HD−NG）を有するTALEN（アミノ酸配列は配列番号11、本明細書において、「PKLB」と表記することもある）と、11個のRVD（N末端側からNG−NG−NG−NN−NN−NI−NN−NG−NI−NN−NI）を有するTALEN（アミノ酸配列は配列番号12、本明細書において、「PKR」と表記することもある）とから構成される。これらのTALエフェクターヌクレアーゼにおいては、N末端側にMTS及びエピトープタグが付加されている（図８）。
【００９８】
G13513周辺領域を用いたSSAアッセイを試験例2と同様にして行い、上記RVDコードのTALエフェクターヌクレアーゼのペアが、優先的にG13513A変異mtDNA配列を切断することを確認した（図９）。
【００９９】
次に、デザインしたTALエフェクターヌクレアーゼの発現ベクター（図８）を作製した。作製は、Platinum Gate TALEN Kit（Addgene kit #1000000043）を用いて、キットのプロトコールに従って行った。Flagタグ及び核移行シグナルの除去、並びにATP5B（ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F1 complex, beta polypeptide）又はCOX8由来のMTS及びエピトープタグ（Flag又はHA）のN末端への付加は、定法に従って行った。
【０１００】
試験例6．ミトコンドリア病誘発変異（G13513A変異）の割合の調整3
iPS細胞のクローン#67の継代培養の途中で得られた細胞から0.5％TrypLE Select（Gibco社製）により37℃で4分間処理することにより、シングルセルになるようにiPS細胞同士を分離させた。得られたiPS細胞を、iMatrix-511（ニッピ社製）でコートされた培養ディッシュに播種し、StemFit AK02N培地（リプロセル社製）を用いて培養を継続し、継代後1日目にEGFP発現ベクター、並びにTALエフェクターヌクレアーゼの発現ベクター（PKLB発現ベクター（試験例5）及びPKR発現ベクター（試験例5）を等量ずつ、或いはPKLB発現ベクターのみを2倍量）を、Lipofectamine 3000（インビトロジェン社製）を用いて細胞に導入した。導入から2日経過後、細胞を採取し、高速セルソーター（MoFlo Astrios、ベックマン・コールター社製）によりEGFP陽性細胞を分画して、10μM Y-27632（Wako社製）を含む霊長類iPS細胞用培地（リプロセル社製）に懸濁した。
【０１０１】
得られたEGFP陽性細胞について、試験例1と同様にして、G13513A変異を有するmtDNAの割合を測定した。結果を図１０に示す。図１０に示されるように、TALエフェクターヌクレアーゼの発現ベクターを導入していない場合、及びPKLB発現ベクターのみを導入した場合の変異率が約60〜65％程度であるのに対して、PKLB発現ベクター及びPKR発現ベクターの両方を導入した方の変異率は50〜55％程度まで低下した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年3月8日(2018.3.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミトコンドリア病誘発変異を有する変異mtDNAの割合が異なり、且つ同一のiPS細胞クローンに由来する、3種以上のiPS細胞集団を含む、キット。
【請求項２】
前記ミトコンドリア病誘発変異がG13513A変異である、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
少なくとも1種のiPS細胞集団における前記変異mtDNAの割合が60％以上である、請求項１又は２に記載のキット。
【請求項４】
前記iPS細胞集団間の前記変異mtDNAの割合の差が5％以上である、請求項１〜３のいずれかに記載のキット。
【請求項５】
前記iPS細胞集団を5種以上含む、請求項１〜４のいずれかに記載のキット。
【請求項６】
前記iPS細胞集団を8〜12種含む、請求項１〜５のいずれかに記載のキット。
【請求項７】
前記iPS細胞集団の1種あたりの細胞数が1×105個以上である、請求項１〜６のいずれかに記載のキット。
【請求項８】
RVDがN末端側からHD−NG−NI−HD−NG−HD−HD−NI−NI−NI−NN−NI−HD−HD−NI−HDである、TALエフェクターヌクレアーゼ。
【請求項９】
RVDがN末端側からHD−NG−NI−HD−NG−HD−HD−NI−NI−NI−NN−NI−HD−HD−NI−HDである、TALエフェクターヌクレアーゼ、該TALエフェクターヌクレアーゼのmRNA、及び該TALエフェクターヌクレアーゼの発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種、並びに
RVDがN末端側からNN−NG−NN−NG−NI−NG−NN−NI−NG−NI−NG−NN−NG−NG−NG−NN−HDである、TALエフェクターヌクレアーゼ、該TALエフェクターヌクレアーゼのmRNA、及び該TALエフェクターヌクレアーゼの発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種を含む、キット。
【請求項１０】
RVDがN末端側からNG−NG−NG−NN−NN−NI−NN−NG−NI−NN−NIである、TALエフェクターヌクレアーゼ。
【請求項１１】
RVDがN末端側からNI−NN−HD−NI−NN−NN−NI−NI−NG−NI−HD−HD−NGである、TALエフェクターヌクレアーゼ、該TALエフェクターヌクレアーゼのmRNA、及び該TALエフェクターヌクレアーゼの発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種、並びに
RVDがN末端側からNG−NG−NG−NN−NN−NI−NN−NG−NI−NN−NIである、TALエフェクターヌクレアーゼ、該TALエフェクターヌクレアーゼのmRNA、及び該TALエフェクターヌクレアーゼの発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種を含む、キット。
【手続補正書】
【提出日】平成30年7月9日(2018.7.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミトコンドリア病誘発変異を有する変異mtDNAの割合が異なり、且つ同一のiPS細胞クローンに由来する、3種以上のiPS細胞集団を含む、キット。
【請求項２】
前記ミトコンドリア病誘発変異がG13513A変異である、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
少なくとも1種のiPS細胞集団における前記変異mtDNAの割合が60％以上である、請求項１又は２に記載のキット。
【請求項４】
前記iPS細胞集団間の前記変異mtDNAの割合の差が5％以上である、請求項１〜３のいずれかに記載のキット。
【請求項５】
前記iPS細胞集団を5種以上含む、請求項１〜４のいずれかに記載のキット。
【請求項６】
前記iPS細胞集団を8〜12種含む、請求項１〜５のいずれかに記載のキット。
【請求項７】
前記iPS細胞集団の1種あたりの細胞数が1×105個以上である、請求項１〜６のいずれかに記載のキット。
【請求項８】
RVDがN末端側からHD−NG−NI−HD−NG−HD−HD−NI−NI−NI−NN−NI−HD−HD−NI−HDである、TALエフェクターヌクレアーゼ、該TALエフェクターヌクレアーゼのmRNA、及び該TALエフェクターヌクレアーゼの発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種、並びに
RVDがN末端側からNN−NG−NN−NG−NI−NG−NN−NI−NG−NI−NG−NN−NG−NG−NG−NN−HDである、TALエフェクターヌクレアーゼ、該TALエフェクターヌクレアーゼのmRNA、及び該TALエフェクターヌクレアーゼの発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種を含む、キット。
【請求項９】
RVDがN末端側からNI−NN−HD−NI−NN−NN−NI−NI−NG−NI−HD−HD−NGである、TALエフェクターヌクレアーゼ、該TALエフェクターヌクレアーゼのmRNA、及び該TALエフェクターヌクレアーゼの発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種、並びに
RVDがN末端側からNG−NG−NG−NN−NN−NI−NN−NG−NI−NN−NIである、TALエフェクターヌクレアーゼ、該TALエフェクターヌクレアーゼのmRNA、及び該TALエフェクターヌクレアーゼの発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種を含む、キット。