(57)【要約】      （修正有）【課題】組換え発現の例外的均一性および有効性、インビトロ安定性および非凝集、光分解耐性および酸化耐性、ヒト抗原との非交差反応、ならびに良好な薬物動態特性をもたらす担体免疫グロブリンを提供する。【解決手段】特定のアミノ酸配列を含む、単離抗原結合タンパク質、単離核酸、ベクター、及び宿主細胞を提供する。【選択図】図１６
2018139609.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域が配列番号２５０、配列番号２５２、配列番号２５４、配列番号２５６、配列番号２５８、もしくは配列番号２６０の配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、単離抗原結合タンパク質。
【請求項２】
軽鎖可変領域が配列番号２３２、配列番号２３４、配列番号２３６、配列番号２３８、もしくは配列番号２４０のアミノ酸配列を含む、請求項１の単離抗原結合タンパク質。
【請求項３】
重鎖可変領域がＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３と命名された３つの相補性決定領域を含み：
（ａ）ＣＤＲＨ１は配列番号１８８、配列番号１８９、配列番号１９０、もしくは配列番号１９１のアミノ酸配列を含む；
（ｂ）ＣＤＲＨ２は配列番号１９２、配列番号１９３、配列番号１９４、もしくは配列番号１９５のアミノ酸配列を含む；ならびに
（ｃ）ＣＤＲＨ３は配列番号１９６、配列番号１９７、配列番号１９８、配列番号１９９、配列番号２００、もしくは配列番号２０１のアミノ酸配列を含む、請求項１の単離抗原結合タンパク質。
【請求項４】
免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、前記軽鎖可変領域がＣＤＲＬｌ、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３と命名された３つのＣＤＲを含み：
（ａ）ＣＤＲＬ１は配列番号２０２、配列番号２０３、配列番号２０４、もしくは配列番号２０５のアミノ酸配列を含む；
（ｂ）ＣＤＲＬ２は配列番号２０６もしくは配列番号２０７のアミノ酸配列を含む；ならびに
（ｃ）ＣＤＲＬ３は配列番号２０８、配列番号２０９、配列番号２１０、配列番号２１１、もしくは配列番号２１２のアミノ酸配列を含む、請求項１の単離抗原結合タンパク質。
【請求項５】
重鎖可変領域がＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３と命名された３つの相補性決定領域を含み、ならびに軽鎖可変領域がＣＤＲＬｌ、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３と命名された３つのＣＤＲを含み：
（ａ）ＣＤＲＨ１は配列番号１８８、配列番号１８９、配列番号１９０、もしくは配列番号１９１のアミノ酸配列を含む；
（ｂ）ＣＤＲＨ２は配列番号１９２、配列番号１９３、配列番号１９４、もしくは配列番号１９５のアミノ酸配列を含む；
（ｃ）ＣＤＲＨ３は配列番号１９６、配列番号１９７、配列番号１９８、配列番号１９９、配列番号２００、もしくは配列番号２０１のアミノ酸配列を含む；
（ｄ）ＣＤＲＬ１は配列番号２０２、配列番号２０３、配列番号２０４、もしくは配列番号２０５のアミノ酸配列を含む；
（ｅ）ＣＤＲＬ２は配列番号２０６もしくは配列番号２０７のアミノ酸配列を含む；ならびに
（ｆ）ＣＤＲＬ３は配列番号２０８、配列番号２０９、配列番号２１０、配列番号２１１、もしくは配列番号２１２のアミノ酸配列を含む、請求項１の単離抗原結合タンパク質。
【請求項６】
抗体または抗体断片を含む、請求項１の単離抗原結合タンパク質。
【請求項７】
ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４を含む請求項６の単離抗原結合タンパク質。
【請求項８】
モノクローナル抗体を含む請求項６の単離抗原結合タンパク質。
【請求項９】
キメラまたはヒト化抗体を含む請求項８の単離抗原結合タンパク質。
【請求項１０】
ヒト抗体を含む請求項８の単離抗原結合タンパク質。
【請求項１１】
（ａ）配列番号７７、配列番号１０７、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２３、配列番号１２９、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、もしくは配列番号１８５のアミノ酸配列を含むか、またはＮ末端かＣ末端、もしくは両端のアミノ酸残基が１個、２個、３個、４個もしくは５個欠けている前述の任意の一配列を含む免疫グロブリン重鎖；
（ｂ）配列番号１０５、配列番号１０９、配列番号１２１；配列番号１２５、もしくは配列番号１２７のアミノ酸配列を含むか、またはＮ末端かＣ末端、もしくは両端のアミノ酸残基が１個、２個、３個、４個もしくは５個欠けている前述の任意の一配列を含む免疫グロブリン軽鎖；または
（ｃ）（ａ）の免疫グロブリン重鎖および（ｂ）の免疫グロブリン軽鎖
を含む請求項６の単離抗原結合タンパク質。
【請求項１２】
１から２４の、結合された薬理学的に活性な化学部分をさらに含む、請求項１乃至請求項１１のうちのいずれかの単離抗原結合タンパク質。
【請求項１３】
薬理学的に活性な化学部分が薬理学的に活性なポリペプチドである、請求項１２の単離抗原結合タンパク質。
【請求項１４】
抗原結合ペプチドが組換え産生される、請求項１３の単離抗原結合タンパク質。
【請求項１５】
抗原結合タンパク質が少なくとも１本の免疫グロブリン重鎖および少なくとも１本の免疫グロブリン軽鎖を含み、ならびに前記免疫グロブリン重鎖の一次アミノ酸配列において免疫グロブリン重鎖Ｆｃドメイン内部ループ内に薬理学的に活性なポリペプチドが挿入されている、請求項１４の単離抗原結合タンパク質。
【請求項１６】
抗原結合タンパク質が少なくとも１本の免疫グロブリン重鎖および少なくとも１本の免疫グロブリン軽鎖を含み、ならびに前記免疫グロブリン重鎖のＮ末端またはＣ末端に薬理学的に活性なポリペプチドが結合されている、請求項１３の単離抗原結合タンパク質。
【請求項１７】
抗原結合タンパク質が少なくとも１本の免疫グロブリン重鎖および少なくとも１本の免疫グロブリン軽鎖を含み、ならびに前記免疫グロブリン軽鎖のＮ末端またはＣ末端に薬理学的に活性なポリペプチドが結合されている、請求項１３の単離抗原結合タンパク質。
【請求項１８】
薬理学的に活性なポリペプチドが毒素ペプチド、ＩＬ−６結合ペプチド、ＣＧＲＰペプチドアンタゴニスト、ブラジキニンＢ１受容体ペプチドアンタゴニスト、ＰＴＨアゴニストペプチド、ＰＴＨアンタゴニストペプチド、ａｎｇ−１結合ペプチド、ａｎｇ−２結合ペプチド、ミオスタチン結合ペプチド、ＥＰＯ模倣ペプチド、ＴＰＯ模倣ペプチド、ＮＧＦ結合ペプチド、ＢＡＦＦアンタゴニストペプチド、ＧＬＰ−１もしくはそのペプチド模倣物、またはＧＬＰ−２もしくはそのペプチド模倣物である、請求項１３の単離抗原結合タンパク質。
【請求項１９】
毒素ペプチドがＳｈＫまたはＳｈＫペプチドアナログである、請求項１８の単離抗原結合タンパク質。
【請求項２０】
請求項１乃至請求項１９のうちのいずれかの抗原結合タンパク質、ならびに医薬上許容可能な希釈液、賦形剤もしくは担体、を含む医薬組成物。
【請求項２１】
請求項１乃至請求項４のうちのいずれかの抗原結合タンパク質をコードする単離核酸。
【請求項２２】
請求項５の抗原結合タンパク質をコードする単離核酸。
【請求項２３】
請求項１１の抗原結合タンパク質をコードする単離核酸。
【請求項２４】
請求項１４乃至請求項１９のうちのいずれかの抗原結合タンパク質をコードする単離核酸。
【請求項２５】
請求項２１乃至請求項２４のうちのいずれかの単離核酸を含むベクター。
【請求項２６】
発現ベクターを含む請求項２５のベクター。
【請求項２７】
請求項２６の発現ベクターを含む単離宿主細胞。
【請求項２８】
（ａ）発現ベクターによりコードされた抗原結合タンパク質を発現させる条件下の培養基で請求項２７の宿主細胞を培養すること；および
（ｂ）培養基から抗原結合タンパク質を回収すること、
を含む方法。
【請求項２９】
請求項１１の抗原結合タンパク質を産生するハイブリドーマ。
【請求項３０】
（ａ）ハイブリドーマにより抗原結合タンパク質を発現させる条件下の培養基で請求項２９のハイブリドーマを培養すること；および
（ｂ）培養基から抗原結合タンパク質を回収すること、
を含む方法。
【請求項３１】
免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域が配列番号２６２、配列番号２６４、もしくは配列番号２６６の配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、単離抗原結合タンパク質。
【請求項３２】
軽鎖可変領域が配列番号２４２、配列番号２４４、配列番号２４６、もしくは配列番号２４８のアミノ酸配列を含む、請求項３１の単離抗原結合タンパク質。
【請求項３３】
重鎖可変領域がＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３と命名された３つの相補性決定領域を含み：
（ａ）ＣＤＲＨ１は配列番号２１３、配列番号２１４、もしくは配列番号２１５のアミノ酸配列を含む；
（ｂ）ＣＤＲＨ２は配列番号２１６、配列番号２１７、もしくは配列番号２１８のアミノ酸配列を含む；ならびに
（ｃ）ＣＤＲＨ３は配列番号２１９、配列番号２２０、もしくは配列番号２２１のアミノ酸配列を含む、請求項３１の単離抗原結合タンパク質。
【請求項３４】
免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、前記軽鎖可変領域がＣＤＲＬｌ、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３と命名された３つのＣＤＲを含み：
（ａ）ＣＤＲＬ１は配列番号２０４、配列番号２２２、配列番号２２３、もしくは配列番号２２４のアミノ酸配列を含む；
（ｂ）ＣＤＲＬ２は配列番号２０６、配列番号２２５、もしくは配列番号２２６のアミノ酸配列を含む；ならびに
（ｃ）ＣＤＲＬ３は配列番号２２７、配列番号２２８、配列番号２２９、もしくは配列番号２３０のアミノ酸配列を含む、請求項３１の単離抗原結合タンパク質。
【請求項３５】
重鎖可変領域がＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３と命名された３つの相補性決定領域を含み、ならびに軽鎖可変領域がＣＤＲＬｌ、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３と命名された３つのＣＤＲを含み：
（ａ）ＣＤＲＨ１は配列番号２１３、配列番号２１４、もしくは配列番号２１５のアミノ酸配列を含む；
（ｂ）ＣＤＲＨ２は配列番号２１６、配列番号２１７、もしくは配列番号２１８のアミノ酸配列を含む；ならびに
（ｃ）ＣＤＲＨ３は配列番号２１９、配列番号２２０、もしくは配列番号２２１のアミノ酸配列を含む；
（ｄ）ＣＤＲＬ１は配列番号２０４、配列番号２２２、配列番号２２３、もしくは配列番号２２４のアミノ酸配列を含む；
（ｅ）ＣＤＲＬ２は配列番号２０６、配列番号２２５、もしくは配列番号２２６のアミノ酸配列を含む；ならびに
（ｆ）ＣＤＲＬ３は配列番号２２７、配列番号２２８、配列番号２２９、もしくは配列番号２３０のアミノ酸配列を含む、請求項３１の単離抗原結合タンパク質。
【請求項３６】
抗体または抗体断片を含む、請求項３１の単離抗原結合タンパク質。
【請求項３７】
ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４を含む請求項３６の単離抗原結合タンパク質。
【請求項３８】
モノクローナル抗体を含む請求項３６の単離抗原結合タンパク質。
【請求項３９】
キメラまたはヒト化抗体を含む請求項３８の単離抗原結合タンパク質。
【請求項４０】
ヒト抗体を含む請求項３８の単離抗原結合タンパク質。
【請求項４１】
（ａ）配列番号４６、配列番号１３３、配列番号１３９、配列番号１４３、配列番号１８６、もしくは配列番号１８７、配列番号３６６、もしくは配列番号３６７のアミノ酸配列を含むか、またはＮ末端かＣ末端、もしくは両端のアミノ酸残基が１個、２個、３個、４個もしくは５個欠けている前述の任意の一配列を含む免疫グロブリン重鎖；
（ｂ）配列番号２８、配列番号１３１、配列番号１３５、配列番号１３７；もしくは配列番号１４１のアミノ酸配列を含むか、またはＮ末端もしくはＣ末端、または両端のアミノ酸残基が１個、２個、３個、４個もしくは５個欠けている前述の任意の一配列を含む免疫グロブリン軽鎖；または
（ｃ）（ａ）の免疫グロブリン重鎖および（ｂ）の免疫グロブリン軽鎖、
を含む請求項３６の単離抗原結合タンパク質。
【請求項４２】
１から２４の、結合された薬理学的に活性な化学部分をさらに含む、請求項３１乃至請求項４１のうちのいずれかの単離抗原結合タンパク質。
【請求項４３】
薬理学的に活性な化学部分が薬理学的に活性なポリペプチドである、請求項４２の単離抗原結合タンパク質。
【請求項４４】
抗原結合ペプチドが組換え産生される、請求項４３の単離抗原結合タンパク質。
【請求項４５】
抗原結合タンパク質が少なくとも１本の免疫グロブリン重鎖および少なくとも１本の免疫グロブリン軽鎖を含み、ならびに前記免疫グロブリン重鎖の一次アミノ酸配列において免疫グロブリン重鎖Ｆｃドメイン内部ループ内に薬理学的に活性なポリペプチドが挿入されている、請求項４４の単離抗原結合タンパク質。
【請求項４６】
抗原結合タンパク質が少なくとも１本の免疫グロブリン重鎖および少なくとも１本の免疫グロブリン軽鎖を含み、ならびに前記免疫グロブリン重鎖のＮ末端またはＣ末端に薬理学的に活性なポリペプチドが結合されている、請求項４３の単離抗原結合タンパク質。
【請求項４７】
抗原結合タンパク質が少なくとも１本の免疫グロブリン重鎖および少なくとも１本の免疫グロブリン軽鎖を含み、ならびに前記免疫グロブリン軽鎖のＮ末端またはＣ末端に薬理学的に活性なポリペプチドが結合されている、請求項４３の単離抗原結合タンパク質。
【請求項４８】
薬理学的に活性なポリペプチドが毒素ペプチド、ＩＬ−６結合ペプチド、ＣＧＲＰペプチドアンタゴニスト、ブラジキニンＢ１受容体ペプチドアンタゴニスト、ＰＴＨアゴニストペプチド、ＰＴＨアンタゴニストペプチド、ａｎｇ−１結合ペプチド、ａｎｇ−２結合ペプチド、ミオスタチン結合ペプチド、ＥＰＯ模倣ペプチド、ＴＰＯ模倣ペプチド、ＮＧＦ結合ペプチド、ＢＡＦＦアンタゴニストペプチド、ＧＬＰ−１もしくはそのペプチド模倣物、またはＧＬＰ−２もしくはそのペプチド模倣物である、請求項４３の単離抗原結合タンパク質。
【請求項４９】
毒素ペプチドがＳｈＫまたはＳｈＫペプチドアナログである、請求項４８の単離抗原結合タンパク質。
【請求項５０】
請求項３１乃至請求項４９のうちのいずれかの抗原結合タンパク質、ならびに医薬上許容可能な希釈液、賦形剤もしくは担体、を含む医薬組成物。
【請求項５１】
請求項３１乃至請求項３４のうちのいずれかの抗原結合タンパク質をコードする単離核酸。
【請求項５２】
請求項３５の抗原結合タンパク質をコードする単離核酸。
【請求項５３】
請求項４１の抗原結合タンパク質をコードする単離核酸。
【請求項５４】
請求項４４乃至請求項４９のうちのいずれかの抗原結合タンパク質をコードする単離核酸。
【請求項５５】
請求項５１乃至請求項５４のうちのいずれかの単離核酸を含むベクター。
【請求項５６】
発現ベクターを含む請求項５５のベクター。
【請求項５７】
請求項５６の発現ベクターを含む、単離宿主細胞。
【請求項５８】
（ａ）発現ベクターによりコードされた抗原結合タンパク質を発現させる条件下の培養基で請求項５７の宿主細胞を培養すること；および
（ｂ）培養基から抗原結合タンパク質を回収すること、
を含む方法。
【請求項５９】
請求項４１の抗原結合タンパク質を産生するハイブリドーマ。
【請求項６０】
（ａ）ハイブリドーマにより抗原結合タンパク質を発現させる条件下の培養基で請求項５９のハイブリドーマを培養すること；および
（ｂ）培養基から抗原結合タンパク質を回収すること、
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００９年３月２０日に出願された米国仮出願第６１／２１０，５９４号の利益を主張するものであり、この開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本出願は、２０１０年３月１９日にＥＦＳ−ＷＥＢを介して提出されたＡＳＣＩＩ「ｔｘｔ」遵守配列リストを含み、これは米国特許規則３７ＣＦＲ１．８２１（ｃ）および１．８２１（ｅ）に必要なコンピュータ媒体（ＣＲＦ）と文書複写の両役目を果たし、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０１０年３月１８日に作成した「ｔｘｔ」ファイルについて、名称はＡ−１５３７−ＷＯ−ＰＣＴＳｅｑＬｉｓｔ０３１８１０−３６８＿ＳＴ２５．ｔｘｔであり、サイズは５４５ｋｂである。
【０００３】
本出願を通して、丸括弧または角カッコ内に各種刊行物を参照する。本出願において、これら刊行物の開示は、本発明の属する分野の状態をより詳細に記載するためにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
１．技術分野
本発明は、薬物動態特性を改善するために１つまたは複数の薬理学的に活性な化学部分に結合できる担体抗体に関する。
【０００５】
２．関連技術に関する論議
「担体」部分とは、非ペプチド有機部分（すなわち、「低分子」）またはポリペプチド薬剤など、薬理学的に活性な化学部分が共有結合または融合できる薬理学的に不活性な分子を指す。薬理学的に活性な化学部分のタンパク質分解もしくは他のインビボ活性を低下させる化学修飾によって薬理学的に活性な部分のインビボ減成を防止もしくは軽減するため、または腎臓クリアランスを低下させるため、インビボ半減期もしくは他の治療的な薬物動態特性を高める（薬理学的に活性な部分の非結合形態と比較して、吸収率を高める、毒性もしくは免疫原性を低減する、溶解度を改善する、ならびに／または製造可能性もしくは保存安定性を増加するなどの）ため、効果的な担体が探究されている。
【０００６】
製薬業界で使用されているかかる担体部分の例としては、ポリエチレングリコール（例えば、Ｂｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ、ＷＯ０１／０２０１７号を参照されたい）、免疫グロブリンＦｃドメイン（例えば、Ｆｅｉｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｓ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｇｅｎｔｓ、米国特許第６，６６０，８４３号を参照されたい）、ヒト血清アルブミン（例えば、Ｒｏｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｌｂｕｍｉｎ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ、米国特許第６，９２６，８９８号および米国特許第２００５／００５４０５１号；Ｂｒｉｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｒｏｍ  ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｂｌｏｏｄ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ、米国特許第６，８８７，４７０号を参照されたい）、トランスチレチン（例えば、Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ／ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｕｓｉｏｎｓ  ｔｏ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｔｈｅ  ｓｅｒｕｍ  ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ／ｐｒｏｔｅｉｎｓ、米国特許第２００３／０１９５１５４Ａ１号；同第２００３／０１９１０５６Ａ１号を参照されたい）、またはチロキシン結合グロブリン、または、例えば免疫グロブリン（軽鎖＋重鎖）およびＦｃドメインの組み合わせ（いわゆる「ヘミボディ」であるヘテロ三量体の組み合わせ）が挙げられ、例えばＳｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｏｘｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ、ＰＣＴ／米国特許第２００７／０２２８３１号（ＷＯ２００８／０８８４２２号として公開）に記載されている。薬理学的に活性な部分は、長い半減期血清タンパク質に対して親和性を有するペプチドまたは低分子にも結合されている（例えば、Ｂｌａｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｅｒｕｍ  ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔｓ  ｂｙ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｌｉｇａｎｄｓ、米国特許第５，７１４，１４２号；Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｉｅｔｉｅｓ、米国特許第２００３／００６９３９５Ａ１号；Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ、米国特許第６，３４２，２２５号を参照されたい）。
【０００７】
Ｆｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌは、免疫グロブリンが２本の重鎖、または２本の重鎖と２本の軽鎖からなり、免疫グロブリンが機能性免疫グロブリンではなかったペプチド−免疫グロブリン結合体について記載している（Ｆｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ−ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＷＯ２００７／０４５４６３Ａ１号）。
【０００８】
本発明は、組換え発現の例外的均一性および有効性、インビトロ安定性および非凝集、光分解耐性および酸化耐性、ヒト抗原との非交差反応、ならびに良好な薬物動態特性をもたらす担体免疫グロブリンを提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第２００１／０２０１７号
【特許文献２】米国特許第６，６６０，８４３号明細書
【特許文献３】米国特許第６，９２６，８９８号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２００５／００５４０５１号明細書
【特許文献５】米国特許第６，８８７，４７０号明細書
【特許文献６】米国特許出願公開第２００３／０１９５１５４号明細書
【特許文献７】米国特許出願公開第２００３／０１９１０５６号明細書
【特許文献８】国際公開第２００８／０８８４２２号
【特許文献９】米国特許第５，７１４，１４２号明細書
【特許文献１０】米国特許出願公開第２００３／００６９３９５号明細書
【特許文献１１】米国特許第６，３４２，２２５号明細書
【特許文献１２】国際公開第２００７／０４５４６３号
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、抗原結合タンパク質に関する。本発明の抗原結合タンパク質（抗体および抗体断片を含む）はラットおよびカニクイザルにおいて確実な発現および精製特性を有し、それにより安定的かつ相対的に均一であり、顕著な薬物動態（ＰＫ）特性を有する生成物である。本発明の抗原結合タンパク質は、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）またはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に特異的に結合することが見出されているが、ヒトタンパク質、細胞または組織への結合は検出されていない。これらの抗原結合タンパク質は、多くの目的（抗体ベース薬の品質管理もしくは分析的標準および生物学的に関連したアイソタイプ適合抗体の対照が挙げられるが、これらに限定されない）のために使用できる。
【００１１】
いくつかの実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、薬理学的に活性な化学部分、例えば、低分子、ペプチド、および／またはタンパク質のＰＫ特性を高めるための担体として用いられる。薬理学的に活性な部分は、化学結合反応により、または組換え遺伝子発現を介して本発明の免疫グロブリンに結合（すなわち、共有結合）でき、それらは抗原結合タンパク質に融合できる。
【００１２】
本発明は、かかる本発明の免疫グロブリン、例えばそれらをコードする単離核酸、ベクターおよび単離宿主細胞、ならびにハイブリドーマを産生するための物質および方法も提供する。また、本明細書に開示の免疫グロブリン重鎖および／もしくは軽鎖配列ならびに／またはＶＨおよび／もしくはＶＬ配列ならびに／またはＣＤＲ配列のいずれかをコードする単離核酸も提供する。関連実施形態では、上記核酸のいずれかを含む発現ベクターを提供する。さらに別の実施形態では、上記核酸または発現ベクターのいずれかを含む宿主細胞を提供する。
【００１３】
本発明の免疫グロブリンは、医薬組成物または薬の製造において使用できる。本発明の医薬組成物もしくは薬は、薬理学的に活性な薬剤と結合した免疫グロブリン、ならびに医薬上許容可能な希釈液、担体または賦形剤を含む。
【００１４】
本発明では幾多の方法を意図する。例えば、コードした抗原結合タンパク質が発現するように本発明の発現ベクターを含む上記宿主細胞の培養に関わる方法を提供する。ハイブリドーマにより抗原結合タンパク質を発現させる条件下での培養基における上記ハイブリドーマの培養に関わる方法も提供する。かかる方法は、宿主細胞培養から抗原結合タンパク質を回収する工程も含むことができる。関連実施形態では、上記の方法で産生された単離抗原結合タンパク質を提供する。
【００１５】
前述の概要は、本発明のすべての態様を定義することを意図せず、さらなる態様が（発明を実施するための形態などの）他の項目に記載されている。本文書全体が統合された開示として関連していることを意図し、本文書の同一文章、または段落、または項目に特徴の組み合わせが見出されない場合でも、本明細書に記載の特徴のすべての組み合わせを意図していることが理解されるべきである。
【００１６】
前述に加えて、本発明は、追加の態様として、上記の特定の段落により定義されるバリエーションよりも何らかの点で範囲がさらに狭くなる、本発明のすべての実施形態を含む。例えば、属として記載されている本発明のある態様では、その属のすべてのメンバーが単独で本発明の１つの態様であることが理解されるべきである。また、属または属の１メンバーの選択として記載されている態様は、属の２つ以上のメンバーの組み合わせを包含するものと理解されるべきである。出願人（ら）は本明細書に記載の本発明の全範囲を発明したが、出願人らは他の先行技術に記載の対象物を請求することは意図していない。したがって、特許庁もしくは他の団体または個人により特許請求の範囲内における法定の先行技術が出願人らの注意をひいた場合、出願人（ら）は特許法のもと、権利を保留して修正権利を行使し、かかる請求項の主題を再定義してかかる請求項の範囲からかかる法定の先行技術または法定の先行技術の明らかなバリエーションを具体的に除外する。かかる改訂された特許請求の範囲により定義される本発明のバリエーションも、本発明の態様であることを意図する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】任意選択的にペプチジルリンカー部分（これらに限定されないが、本明細書に記載のＬ５またはＬ１０など）を介して、薬理学的に活性な毒素ペプチドアナログが１単位または複数単位（波形）融合した免疫グロブリンの１つまたは複数のドメインを含む、本発明の組成物の一部の実施形態の図式構造を示す。これらの図式はより典型的なＩｇＧ１を示し（ただし、ＩｇＧ２にも同様に適用されることを意図する）、これはヒンジに４個のジスルフィド結合を有し、重鎖と軽鎖、およびＩｇＧ３とＩｇＧ４のジスルフィド結合の様々なアレンジがある。図１Ａは、免疫グロブリンＦｃドメイン単量体の片方のＣ末端に毒素ペプチドアナログが融合している１価ヘテロ二量体Ｆｃ毒素ペプチドアナログ融合物を表す。
【図１Ｂ】意選択的にペプチジルリンカー部分（これらに限定されないが、本明細書に記載のＬ５またはＬ１０など）を介して、薬理学的に活性な毒素ペプチドアナログが１単位または複数単位（波形）融合した免疫グロブリンの１つまたは複数のドメインを含む、本発明の組成物の一部の実施形態の図式構造を示す。これらの図式はより典型的なＩｇＧ１を示し（ただし、ＩｇＧ２にも同様に適用されることを意図する）、これはヒンジに４個のジスルフィド結合を有し、重鎖と軽鎖、およびＩｇＧ３とＩｇＧ４のジスルフィド結合の様々なアレンジがある。図１Ｂは、免疫グロブリンＦｃドメイン単量体の両Ｃ末端に毒素ペプチドアナログが融合している２価ホモ二量体Ｆｃ毒素ペプチドアナログ融合物を表す。
【図１Ｃ】意選択的にペプチジルリンカー部分（これらに限定されないが、本明細書に記載のＬ５またはＬ１０など）を介して、薬理学的に活性な毒素ペプチドアナログが１単位または複数単位（波形）融合した免疫グロブリンの１つまたは複数のドメインを含む、本発明の組成物の一部の実施形態の図式構造を示す。これらの図式はより典型的なＩｇＧ１を示し（ただし、ＩｇＧ２にも同様に適用されることを意図する）、これはヒンジに４個のジスルフィド結合を有し、重鎖と軽鎖、およびＩｇＧ３とＩｇＧ４のジスルフィド結合の様々なアレンジがある。図１Ｃは、免疫グロブリンＦｃドメイン単量体の片方のＮ末端に毒素ペプチドアナログが融合している１価ヘテロ二量体毒素ペプチドアナログ−Ｆｃ融合物を表す。
【図１Ｄ】意選択的にペプチジルリンカー部分（これらに限定されないが、本明細書に記載のＬ５またはＬ１０など）を介して、薬理学的に活性な毒素ペプチドアナログが１単位または複数単位（波形）融合した免疫グロブリンの１つまたは複数のドメインを含む、本発明の組成物の一部の実施形態の図式構造を示す。これらの図式はより典型的なＩｇＧ１を示し（ただし、ＩｇＧ２にも同様に適用されることを意図する）、これはヒンジに４個のジスルフィド結合を有し、重鎖と軽鎖、およびＩｇＧ３とＩｇＧ４のジスルフィド結合の様々なアレンジがある。図１Ｄは、免疫グロブリンＦｃドメイン単量体の両Ｎ末端に毒素ペプチドアナログが融合している２価ホモ二量体毒素ペプチドアナログ−Ｆｃ融合物を表す。
【図１Ｅ】意選択的にペプチジルリンカー部分（これらに限定されないが、本明細書に記載のＬ５またはＬ１０など）を介して、薬理学的に活性な毒素ペプチドアナログが１単位または複数単位（波形）融合した免疫グロブリンの１つまたは複数のドメインを含む、本発明の組成物の一部の実施形態の図式構造を示す。これらの図式はより典型的なＩｇＧ１を示し（ただし、ＩｇＧ２にも同様に適用されることを意図する）、これはヒンジに４個のジスルフィド結合を有し、重鎖と軽鎖、およびＩｇＧ３とＩｇＧ４のジスルフィド結合の様々なアレンジがある。図１Ｅは、そのＣ末端に毒素ペプチドアナログが融合している免疫グロブリン重鎖（ＨＣ）＋免疫グロブリン軽鎖（ＬＣ）＋免疫グロブリンＦｃ単量体を含む１価ヘテロ三量体Ｆｃ毒素ペプチドアナログ／Ａｂを表す。
【図１Ｆ】意選択的にペプチジルリンカー部分（これらに限定されないが、本明細書に記載のＬ５またはＬ１０など）を介して、薬理学的に活性な毒素ペプチドアナログが１単位または複数単位（波形）融合した免疫グロブリンの１つまたは複数のドメインを含む、本発明の組成物の一部の実施形態の図式構造を示す。これらの図式はより典型的なＩｇＧ１を示し（ただし、ＩｇＧ２にも同様に適用されることを意図する）、これはヒンジに４個のジスルフィド結合を有し、重鎖と軽鎖、およびＩｇＧ３とＩｇＧ４のジスルフィド結合の様々なアレンジがある。図１Ｆは、ＨＣ単量体の片方のＣ末端に毒素ペプチドアナログが融合している１価ヘテロ四量体（ＨＴ）抗体ＨＣ毒素ペプチドアナログ融合物を表す。
【図１Ｇ】意選択的にペプチジルリンカー部分（これらに限定されないが、本明細書に記載のＬ５またはＬ１０など）を介して、薬理学的に活性な毒素ペプチドアナログが１単位または複数単位（波形）融合した免疫グロブリンの１つまたは複数のドメインを含む、本発明の組成物の一部の実施形態の図式構造を示す。これらの図式はより典型的なＩｇＧ１を示し（ただし、ＩｇＧ２にも同様に適用されることを意図する）、これはヒンジに４個のジスルフィド結合を有し、重鎖と軽鎖、およびＩｇＧ３とＩｇＧ４のジスルフィド結合の様々なアレンジがある。図１Ｇは、両ＨＣ単量体のＣ末端上に毒素ペプチドアナログを有する２価ＨＴ抗体Ａｂ  ＨＣ毒素ペプチドアナログ融合物を表す。
【図１Ｈ】意選択的にペプチジルリンカー部分（これらに限定されないが、本明細書に記載のＬ５またはＬ１０など）を介して、薬理学的に活性な毒素ペプチドアナログが１単位または複数単位（波形）融合した免疫グロブリンの１つまたは複数のドメインを含む、本発明の組成物の一部の実施形態の図式構造を示す。これらの図式はより典型的なＩｇＧ１を示し（ただし、ＩｇＧ２にも同様に適用されることを意図する）、これはヒンジに４個のジスルフィド結合を有し、重鎖と軽鎖、およびＩｇＧ３とＩｇＧ４のジスルフィド結合の様々なアレンジがある。図１Ｈは、ＬＣ単量体の片方のＮ末端に毒素ペプチドアナログが融合している１価ＨＴ毒素ペプチドアナログ−ＬＣ  Ａｂを表す。
【図１Ｉ】意選択的にペプチジルリンカー部分（これらに限定されないが、本明細書に記載のＬ５またはＬ１０など）を介して、薬理学的に活性な毒素ペプチドアナログが１単位または複数単位（波形）融合した免疫グロブリンの１つまたは複数のドメインを含む、本発明の組成物の一部の実施形態の図式構造を示す。これらの図式はより典型的なＩｇＧ１を示し（ただし、ＩｇＧ２にも同様に適用されることを意図する）、これはヒンジに４個のジスルフィド結合を有し、重鎖と軽鎖、およびＩｇＧ３とＩｇＧ４のジスルフィド結合の様々なアレンジがある。図１Ｉは、ＨＣ単量体の片方のＮ末端に毒素ペプチドアナログが融合している１価ＨＴ毒素ペプチドアナログ−ＨＣ  Ａｂを表す。
【図１Ｊ】意選択的にペプチジルリンカー部分（これらに限定されないが、本明細書に記載のＬ５またはＬ１０など）を介して、薬理学的に活性な毒素ペプチドアナログが１単位または複数単位（波形）融合した免疫グロブリンの１つまたは複数のドメインを含む、本発明の組成物の一部の実施形態の図式構造を示す。これらの図式はより典型的なＩｇＧ１を示し（ただし、ＩｇＧ２にも同様に適用されることを意図する）、これはヒンジに４個のジスルフィド結合を有し、重鎖と軽鎖、およびＩｇＧ３とＩｇＧ４のジスルフィド結合の様々なアレンジがある。図１Ｊは、ＬＣ単量体の片方のＣ末端に毒素ペプチドアナログが融合している１価ＨＴ  Ａｂ  ＬＣ毒素ペプチドアナログ融合物（すなわち、ＬＣ毒素ペプチドアナログ融合物＋ＬＣ＋２（ＨＣ））を表す。
【図１Ｋ】意選択的にペプチジルリンカー部分（これらに限定されないが、本明細書に記載のＬ５またはＬ１０など）を介して、薬理学的に活性な毒素ペプチドアナログが１単位または複数単位（波形）融合した免疫グロブリンの１つまたは複数のドメインを含む、本発明の組成物の一部の実施形態の図式構造を示す。これらの図式はより典型的なＩｇＧ１を示し（ただし、ＩｇＧ２にも同様に適用されることを意図する）、これはヒンジに４個のジスルフィド結合を有し、重鎖と軽鎖、およびＩｇＧ３とＩｇＧ４のジスルフィド結合の様々なアレンジがある。図１Ｋは、ＬＣ単量体の両Ｃ末端に毒素ペプチドアナログが融合している２価ＨＴ  Ａｂ  ＬＣ毒素ペプチドアナログ融合物（すなわち、２（ＬＣ毒素ペプチドアナログ融合物）＋２（ＨＣ））を表す。
【図１Ｌ】意選択的にペプチジルリンカー部分（これらに限定されないが、本明細書に記載のＬ５またはＬ１０など）を介して、薬理学的に活性な毒素ペプチドアナログが１単位または複数単位（波形）融合した免疫グロブリンの１つまたは複数のドメインを含む、本発明の組成物の一部の実施形態の図式構造を示す。これらの図式はより典型的なＩｇＧ１を示し（ただし、ＩｇＧ２にも同様に適用されることを意図する）、これはヒンジに４個のジスルフィド結合を有し、重鎖と軽鎖、およびＩｇＧ３とＩｇＧ４のジスルフィド結合の様々なアレンジがある。図１Ｌは、ＬＣ単量体の両方およびＨＣ単量体の片方のＣ末端に毒素ペプチドアナログが融合している３価ＨＴ  Ａｂ  ＬＣ毒素ペプチドアナログ／ＨＣ毒素ペプチドアナログ（すなわち、２（ＬＣ毒素ペプチドアナログ融合物）＋ＨＣ毒素ペプチドアナログ融合物＋ＨＣ）を表す。
【図１Ｍ】意選択的にペプチジルリンカー部分（これらに限定されないが、本明細書に記載のＬ５またはＬ１０など）を介して、薬理学的に活性な毒素ペプチドアナログが１単位または複数単位（波形）融合した免疫グロブリンの１つまたは複数のドメインを含む、本発明の組成物の一部の実施形態の図式構造を示す。これらの図式はより典型的なＩｇＧ１を示し（ただし、ＩｇＧ２にも同様に適用されることを意図する）、これはヒンジに４個のジスルフィド結合を有し、重鎖と軽鎖、およびＩｇＧ３とＩｇＧ４のジスルフィド結合の様々なアレンジがある。図１Ｍは、各ＨＣ単量体の免疫グロブリンＦｃドメインの内部ループ内に毒素ペプチドアナログ部分が挿入されている２価抗体を表す。
【図１Ｎ】意選択的にペプチジルリンカー部分（これらに限定されないが、本明細書に記載のＬ５またはＬ１０など）を介して、薬理学的に活性な毒素ペプチドアナログが１単位または複数単位（波形）融合した免疫グロブリンの１つまたは複数のドメインを含む、本発明の組成物の一部の実施形態の図式構造を示す。これらの図式はより典型的なＩｇＧ１を示し（ただし、ＩｇＧ２にも同様に適用されることを意図する）、これはヒンジに４個のジスルフィド結合を有し、重鎖と軽鎖、およびＩｇＧ３とＩｇＧ４のジスルフィド結合の様々なアレンジがある。図１Ｎは、ＨＣ単量体の片方の免疫グロブリンＦｃドメインの内部ループ内に毒素ペプチドアナログ部分が挿入されている１価抗体を表す。二量体または三量体は、ある宿主細胞内で単鎖をコードするデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）構築物の発現時に自発的に形成される。他の宿主細胞内では、細胞を二量体／三量体の好都合な形態条件におくこともでき、二量体／三量体をインビトロ形成することもできる。複数のＨＣ単量体、ＬＣ単量体、または免疫グロブリンＦｃドメイン単量体が単一の実施形態の一部である場合、個々の単量体は、所望により互いに同一であることも異なることもできる。
【図２Ａ】ＰａｔｃｈＸｐｒｅｓｓ（商標）電気生理学的手法により、実施例４および５に記載の１価aＫＬＨ  ＨＣ−ＳｈＫ（１−３５  Ｑ１６Ｋ）Ａｂ（配列番号２８、２９、３２）は、ヒトＫｖ１．１電流（図２Ｂ）よりもヒトＫｖ１．３電流（図２Ａ）をより強力にブロックすることを示す。
【図２Ｂ】ＰａｔｃｈＸｐｒｅｓｓ（商標）電気生理学的手法により、実施例４および５に記載の１価aＫＬＨ  ＨＣ−ＳｈＫ（１−３５  Ｑ１６Ｋ）Ａｂ（配列番号２８、２９、３２）は、ヒトＫｖ１．１電流（図２Ｂ）よりもヒトＫｖ１．３電流（図２Ａ）をより強力にブロックすることを示す。
【図３Ａ】本明細書の実施例４に記載の最終１価Ｆｃ−Ｌ１０−Ｓｈｋ［１−３５、Ｑ１６Ｋ］／抗ＫＬＨ  Ａｂ生成物のクーマシーブリリアントブルーで着色したトリス−グリシン４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。レーン１〜１２を以下のとおり負荷した：レーン１：Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２広範囲タンパク質標準（１０μＬ）；レーン２：非還元生成物０．５μｇ；レーン３：ブランク；レーン４：非還元生成物２．０μｇ；レーン５：ブランク；レーン６：非還元生成物１０μｇ；レーン７：Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２広範囲タンパク質標準（１０μＬ）；レーン８：還元生成物０．５μｇ；レーン９：ブランク；レーン１０：還元生成物２．０μｇ；レーン１１：ブランク；レーン１２：還元生成物１０μｇ。
【図３Ｂ】Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＢｉｏＳｅｐ  ＳＥＣ−３０００カラム（７．８×３００ｍｍ）の５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ溶液（ｐＨ６．９）に１ｍＬ／分で注入し、吸光度２８０ｎｍで観察した実施例４に記載の最終１価Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５、Ｑ１６Ｋ］／抗ＫＬＨ  Ａｂ生成物５０μｇ上のサイズ排除クロマトグラフィーを示す。
【図３Ｃ】実施例４に記載の１価Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５、Ｑ１６Ｋ］／抗ＫＬＨ  Ａｂの最終試料のＬＣ−ＭＳ分析を示す。生成物をＷａｔｅｒｓ社製ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣシステムを用いてＷａｔｅｒｓ社製ＭａｓｓＰＲＥＰマイクロ脱塩カラムを介してクロマトグラフ化した。カラムを８０℃で設定して、０．１％ギ酸中でアセトニトリル濃度を増大する直線勾配を用いてタンパク質を溶出した。質量分析のためＷａｔｅｒｓ社製ＬＣＴ  Ｐｒｅｍｉｅｒ  ＥＳＩ−ＴＯＦ質量分析計にカラム流出の一部を流用した。この機器を陽性Ｖモードで作動した。キャピラリー電圧を３，２００Ｖで、コーン電圧を８０Ｖで設定した。質量スペクトルを８００〜３０００ｔｔｍ／ｚで得て、機器製造業者の提供するＭａｘＥｎｔ１ソフトウェアを用いて逆重畳した。
【図４Ａ】実施例４に記載の最終１価抗ＫＬＨ  ＨＣ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５、Ｑ１６Ｋ］Ａｂ生成物のクーマシーブリリアントブルーで着色したトリス−グリシン４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。レーン１〜１２を以下のとおり負荷した：レーン１：Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２広範囲タンパク質標準（１０μＬ）；レーン２：非還元生成物０．５μｇ；レーン３：ブランク；レーン４：非還元生成物２．０μｇ；レーン５：ブランク；レーン６：非還元生成物１０μｇ；レーン７：Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２広範囲タンパク質標準（１０μＬ）；レーン８：還元生成物０．５μｇ；レーン９：ブランク；レーン１０：還元生成物２．０μｇ；レーン１１：ブランク；レーン１２：還元生成物１０μｇ。
【図４Ｂ】Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＢｉｏＳｅｐ  ＳＥＣ−３０００カラム（７．８×３００ｍｍ）の５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ溶液（ｐＨ６．９）に１ｍＬ／分で注入（吸光度２８０ｎｍで検出）した実施例４に記載の最終１価抗ＫＬＨ１２０．６ＨＣ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５、Ｑ１６Ｋ］抗体生成物２５μｇ上のサイズ排除クロマトグラフィーを示す。約１１分目に観察された偏向は注入関連アーチファクトである。
【図４Ｃ】窒素レーザ付きＭｉｃｒｏｍａｓｓ  ＭＡＬＤＩ  ｍｉｃｒｏ  ＭＸ質量分析計を用いた、実施例４に記載の１価抗ＫＬＨ  ＨＣ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５、Ｑ１６Ｋ］Ａｂの最終試料のＭＡＬＤＩ質量スペクトル分析を示す。試料を、陽性線状モードで実行した。この機器の電圧を１２ｋＶで設定して、高質量検出器を５ｋＶで設定した。約２００レーザショットのデータを蓄積して各スペクトルを生成した。分子質量が既知である精製タンパク質を用いて外部物質カリブレーションを成し遂げた。
【図５Ａ】実施例４に記載の最終２価aＫＬＨ  ＨＣ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５  Ｑ１６Ｋ］Ａｂ生成物のクーマシーブリリアントブルーで着色したトリス−グリシン４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。レーン１〜１２を以下のとおり負荷した：レーン１：Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２広範囲タンパク質標準（１０μＬ）；レーン２：非還元生成物０．５μｇ；レーン３：ブランク；レーン４：非還元生成物２．０μｇ；レーン５：ブランク；レーン６：非還元生成物１０μｇ；レーン７：Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２広範囲タンパク質標準（１０μＬ）；レーン８：還元生成物０．５μｇ；レーン９：ブランク；レーン１０：還元生成物２．０μｇ；レーン１１：ブランク；レーン１２：還元生成物１０μｇ。
【図５Ｂ】Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＢｉｏＳｅｐ  ＳＥＣ−３０００カラム（７．８×３００ｍｍ）の５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、５００ｍＭ  ＮａＣｌ溶液（ｐＨ６．９）に１ｍＬ／分で注入（吸光度２８０ｎｍで検出）した実施例４に記載の最終２価抗ＫＬＨ  ＨＣ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５、Ｑ１６Ｋ］Ａｂ生成物２５μｇ上のサイズ排除クロマトグラフィーを示す。約１１．５分目に観察された偏向は注入関連アーチファクトである。
【図５Ｃ】窒素レーザ付きＭｉｃｒｏｍａｓｓ  ＭＡＬＤＩ  ｍｉｃｒｏ  ＭＸ質量分析計を用いた、実施例４に記載の２価抗ＫＬＨ  ＨＣ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５、Ｑ１６Ｋ］Ａｂの最終試料のＭＡＬＤＩ質量スペクトル分析を示す。試料を、陽性線状モードで実行した。この機器の電圧を１２ｋＶで設定して、高質量検出器を５ｋＶで設定した。約２００レーザショットのデータを蓄積して各スペクトルを生成した。分子質量が既知である精製タンパク質を用いて外部物質カリブレーションを成し遂げた。
【図６Ａ】実施例４に記載の最終１価ＫＬＨ  ＨＣ−Ｌ１０−ＳｈＫ［２−３５、Ｑ１６Ｋ］Ａｂ生成物のクーマシーブリリアントブルーで着色したトリス−グリシン４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。レーン１〜１２を以下のとおり負荷した：レーン１：Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２広範囲タンパク質標準（１０μＬ）；レーン２：非還元生成物０．５μｇ；レーン３：ブランク；レーン４：非還元生成物２．０μｇ；レーン５：ブランク；レーン６：非還元生成物１０μｇ；レーン７：Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２広範囲タンパク質標準（１０μＬ）；レーン８：還元生成物０．５μｇ；レーン９：ブランク；レーン１０：還元生成物２．０μｇ；レーン１１：ブランク；レーン１２：還元生成物１０μｇ。
【図６Ｂ】Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＢｉｏＳｅｐ  ＳＥＣ−３０００カラム（７．８×３００ｍｍ）の５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ溶液（ｐＨ６．９）に１ｍＬ／分で注入（吸光度２８０ｎｍで検出）した実施例４に記載の最終１価抗ＫＬＨ  ＨＣ−Ｌ１０−ＳｈＫ［２−３５、Ｑ１６Ｋ］Ａｂ生成物２０μｇ上のサイズ排除クロマトグラフィーを示す。約１１分目に観察された偏向は注入関連アーチファクトである。
【図６Ｃ】実施例４に記載の１価抗ＫＬＨ  ＨＣ−Ｌ１０−ＳｈＫ［２−３５、Ｑ１６Ｋ］Ａｂの最終試料のＬＣ−ＭＳ質量スペクトル分析を示す。生成物をＷａｔｅｒｓ社製ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣシステムを用いてＷａｔｅｒｓ社製ＭａｓｓＰＲＥＰマイクロ脱塩カラムを介してクロマトグラフ化した。カラムを８０℃で設定して、０．１％ギ酸中でアセトニトリル濃度を増大する直線勾配を用いてタンパク質を溶出した。質量分析のためＷａｔｅｒｓ社製ＬＣＴ  Ｐｒｅｍｉｅｒ  ＥＳＩ−ＴＯＦ質量分析計にカラム流出の一部を流用した。この機器を陽性Ｖモードで作動した。キャピラリー電圧を３，２００Ｖで、コーン電圧を８０Ｖで設定した。質量スペクトルを８００〜３０００ｍ／ｚで獲得し、機器製造業者の提供するＭａｘＥｎｔ１ソフトウェアを用いて逆重畳した。
【図７】Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおいて実施した薬物動態試験の結果を示す（単回皮下投与量＝６ｍｇ／ｋｇ）。白四角は、実施例５および表７Ｈに記載の１価Ｆｃ／Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（１−３５、Ｑ１６Ｋ）（配列番号１および配列番号２６のヘテロ二量体）データを表し、黒丸は、１価抗ＫＬＨ抗体−ＳｈＫ（１−３５、Ｑ１６Ｋ）（配列番号２８、配列番号２９、配列番号２８、および配列番号３２の四量体）データを表す；ならびに黒三角は、１価抗ＫＬＨ抗体（ループ）−ＳｈＫ（１−３５、Ｑ１６Ｋ）（配列番号２８；配列番号３５；配列番号２８；および配列番号３４の四量体）データを表す。
【図８】Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおいて実施した、実施例５、および表７Ｊに詳述の２価（白四角）および１価（黒丸）抗ＫＬＨ抗体−ＳｈＫ（１−３５、Ｑ１６Ｋ）（それぞれ、［配列番号２８、配列番号３２、配列番号２８、配列番号３２］および［配列番号２８、配列番号２９、配列番号２８、配列番号３２］の四量体）の薬物動態試験の結果を示す（単回皮下投与量＝６ｍｇ／ｋｇ用量）。
【図９】Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおいて実施した、実施例５、および表７Ｌに詳述の２価（白四角）および１価（黒丸）抗ＫＬＨ抗体（ループ）−ＳｈＫ（１−３５、Ｑ１６Ｋ）（それぞれ、［配列番号２８、配列番号３５、配列番号２８、配列番号３５］および［配列番号２８、配列番号３４、配列番号２８、配列番号３５］の四量体）の薬物動態試験の結果を示す（単回皮下投与量＝６ｍｇ／ｋｇ）。
【図１０】１価Ｆｃ−ＳｈＫ／Ｆｃヘテロ二量体（白四角）、１価Ｆｃ−ＳｈＫ／ＫＬＨ  Ａｂ（ヘテロ三量体またはヘミボディ）（白三角）および２価ＳｈＫ−Ｆｃ／ＳｈＫ−Ｆｃホモ二量体（黒丸）のＳＤラットにおける薬物動態試験の結果を示す（単回２ｍｇ／ｋｇ皮下用量）。１価ヘテロ二量体およびヘテロ三量体は２価ホモ二量体よりも高い曝露を提供した。この試験に関する詳細を実施例５に提示する。
【図１１】還元負荷緩衝液およびＱｕｉｃｋＢｌｕｅ（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）による染色を用いて２２０Ｖで展開した１．０ｍｍトリス−グリシン４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｎｏｖｅｘ）上での抗体分析を示す。レーンを以下のとおり負荷した（左から右）：レーン１、Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２標準；レーン２、一過性細胞培養由来のａＤＮＰ３Ｂ１Ａｂ２μｇ；レーン３、安定した細胞培養由来のａＤＮＰ−３Ｂ１Ａｂ２μｇ；レーン４、一過性細胞培養由来のａＤＮＰ３Ｈ４Ａｂ２μｇ；レーン５、安定した細胞培養由来のａＤＮＰ３Ｈ４Ａｂ２μｇ；レーン６、一過性細胞培養由来のａＤＮＰ３Ａ１Ａｂ２μｇ；レーン７、一過性細胞培養由来のａＤＮＰ３Ｃ２Ａｂ２μｇ；ならびにレーン８、一過性細胞培養由来のａＤＮＰ３Ａ４Ａｂ２μｇ。
【図１２Ａ】非還元負荷緩衝液およびＱｕｉｃｋＢｌｕｅ（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）による染色を用いて２２０Ｖで展開した１．０ｍｍトリス−グリシン４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｎｏｖｅｘ）上での抗体分析を示す。レーンを以下のとおり負荷した（左から右）：（図１２Ａ）：レーン１、Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２標準；レーン２、ａＤＮＰ３Ａ１Ａｂ０．５μｇ；レーン３、ａＤＮＰ３Ａ４Ａｂ０．５μｇ；レーン４、ａＤＮＰ３Ｃ２Ａｂ０．５μｇ；レーン５、aＫＬＨ１２０．６Ａｂ０．５μｇ；レーン６、Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２標準；レーン７、ａＤＮＰ３Ａ１Ａｂ５μｇ；レーン８、ａＤＮＰ３Ａ４Ａｂ５μｇ；レーン９、ａＤＮＰ３Ｃ２Ａｂ５μｇ；レーン１０、aＫＬＨ１２０．６Ａｂ５μｇ；（図１２Ｂ）：レーン１、Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２標準；レーン２、ａＤＮＰ３Ｂ１Ａｂ０．５μｇ；レーン３、ブランク；レーン４、Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２標準；レーン５、ａＤＮＰ３Ｂ１Ａｂ５μｇ。
【図１２Ｂ】非還元負荷緩衝液およびＱｕｉｃｋＢｌｕｅ（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）による染色を用いて２２０Ｖで展開した１．０ｍｍトリス−グリシン４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｎｏｖｅｘ）上での抗体分析を示す。レーンを以下のとおり負荷した（左から右）：（図１２Ａ）：レーン１、Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２標準；レーン２、ａＤＮＰ３Ａ１Ａｂ０．５μｇ；レーン３、ａＤＮＰ３Ａ４Ａｂ０．５μｇ；レーン４、ａＤＮＰ３Ｃ２Ａｂ０．５μｇ；レーン５、aＫＬＨ１２０．６Ａｂ０．５μｇ；レーン６、Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２標準；レーン７、ａＤＮＰ３Ａ１Ａｂ５μｇ；レーン８、ａＤＮＰ３Ａ４Ａｂ５μｇ；レーン９、ａＤＮＰ３Ｃ２Ａｂ５μｇ；レーン１０、aＫＬＨ１２０．６Ａｂ５μｇ；（図１２Ｂ）：レーン１、Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２標準；レーン２、ａＤＮＰ３Ｂ１Ａｂ０．５μｇ；レーン３、ブランク；レーン４、Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２標準；レーン５、ａＤＮＰ３Ｂ１Ａｂ５μｇ。
【図１３Ａ】非還元負荷緩衝液およびＱｕｉｃｋＢｌｕｅ（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）による染色を用いて２２０Ｖで展開した１．０ｍｍトリス−グリシン４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｎｏｖｅｘ）上での抗体分析を示す。レーンを以下のとおり負荷した（左から右）：レーン１、Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２標準；レーン２、ブランク；レーン３、ａＤＮＰ３Ｂ１Ａｂ０．２μｇ；レーン４、ａＤＮＰ３Ａ１Ａｂ０．２μｇ、レーン５、ブランク；レーン６、ａＤＮＰ３Ｂ１Ａｂ０．６μｇ；レーン７、ａＤＮＰ３Ａ１Ａｂ０．６μｇ；レーン８、ブランク；レーン９、ａＤＮＰ３Ｂ１Ａｂ１．８μｇ；レーン１０、ａＤＮＰ３Ａ１Ａｂ１．８μｇ。
【図１３Ｂ】非還元負荷緩衝液およびＱｕｉｃｋＢｌｕｅ（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）による染色を用いて２２０Ｖで展開した１．０ｍｍビス−トリス４〜１２％ＮｕＰＡＧＥ（Ｎｏｖｅｘ）上での抗体分析を示す；レーンを以下のとおり負荷した（左から右）：：レーン１、Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２標準；レーン２、ブランク；レーン３、ａＤＮＰ３Ｂ１Ａｂ０．２μｇ；レーン４、ａＤＮＰ３Ａ１Ａｂ０．２μｇ；レーン５、ブランク；レーン６、ａＤＮＰ３Ｂ１Ａｂ０．６μｇ；レーン７、ａＤＮＰ３Ａ１Ａｂ０．６μｇ；レーン８、ブランク；レーン９、ａＤＮＰ３Ｂ１Ａｂ１．８μｇ；レーン１０、ａＤＮＰ３Ａ１Ａｂ１．８μｇ。
【図１４Ａ】非還元負荷緩衝液およびＱｕｉｃｋＢｌｕｅ（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）による染色を用いて２２０Ｖで展開した１．０ｍｍトリス−グリシン４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｎｏｖｅｘ）上での抗体分析を示す。レーンを以下のとおり負荷した（左から右）：（図１４Ａ：０．１％ＳＤＳの流れる緩衝液）：レーン１、Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２標準；レーン２、ａＤＮＰ３Ｂ１Ａｂ０．５μｇを室温で１０分間インキュベートした；レーン３、ａＤＮＰ３Ｂ１Ａｂ０．５μｇを８５℃で５分間インキュベートした；レーン４、ａＤＮＰ３Ｂ１Ａｂ０．５μｇを１００℃で１０分間インキュベートした；レーン５、ブランク；レーン６、ａＤＮＰ３Ｂ１Ａｂ１μｇを室温で１０分間インキュベートした；レーン７、ａＤＮＰ３Ｂ１Ａｂ１μｇを８５℃で５分間インキュベートした；レーン８、ａＤＮＰ３Ｂ１Ａｂ１μｇを１００℃で１０分間インキュベートした；（図１４Ｂ：０．４％ＳＤＳの流れる緩衝液；８５℃で５分間処置）：レーン１、Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２標準、レーン２、ブランク；レーン３、ａＤＮＰ３Ｂ１Ａｂ０．２５μｇ；レーン４、ブランク；レーン５、ａＤＮＰ３Ｂ１Ａｂ０．５μｇ；レーン６、ブランク；レーン７、ａＤＮＰ３Ｂ１Ａｂ１．０μｇ；レーン８、ブランク；レーン９、ａＤＮＰ３Ｂ１Ａｂ２．０μｇ。
【図１４Ｂ】非還元負荷緩衝液およびＱｕｉｃｋＢｌｕｅ（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）による染色を用いて２２０Ｖで展開した１．０ｍｍトリス−グリシン４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｎｏｖｅｘ）上での抗体分析を示す。レーンを以下のとおり負荷した（左から右）：（図１４Ａ：０．１％ＳＤＳの流れる緩衝液）：レーン１、Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２標準；レーン２、ａＤＮＰ３Ｂ１Ａｂ０．５μｇを室温で１０分間インキュベートした；レーン３、ａＤＮＰ３Ｂ１Ａｂ０．５μｇを８５℃で５分間インキュベートした；レーン４、ａＤＮＰ３Ｂ１Ａｂ０．５μｇを１００℃で１０分間インキュベートした；レーン５、ブランク；レーン６、ａＤＮＰ３Ｂ１Ａｂ１μｇを室温で１０分間インキュベートした；レーン７、ａＤＮＰ３Ｂ１Ａｂ１μｇを８５℃で５分間インキュベートした；レーン８、ａＤＮＰ３Ｂ１Ａｂ１μｇを１００℃で１０分間インキュベートした；（図１４Ｂ：０．４％ＳＤＳの流れる緩衝液；８５℃で５分間処置）：レーン１、Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２標準、レーン２、ブランク；レーン３、ａＤＮＰ３Ｂ１Ａｂ０．２５μｇ；レーン４、ブランク；レーン５、ａＤＮＰ３Ｂ１Ａｂ０．５μｇ；レーン６、ブランク；レーン７、ａＤＮＰ３Ｂ１Ａｂ１．０μｇ；レーン８、ブランク；レーン９、ａＤＮＰ３Ｂ１Ａｂ２．０μｇ。
【図１５】１００ｍＭリン酸ナトリウム、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ６．８）の移動相（流速０．５ｍＬ／分）に乗せる連続する２つのサイズ排除カラム（ＴＳＫ−ＧＥＬ  Ｇ３０００ＳＷＸＬ、５ｍｍ粒径、７．８×３００ｍｍ、ＴｏｓｏｈＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、０８５４１）を用いた抗体ＤＮＰ  ３Ａ１（「３Ａ１」、肩の後ろでより濃いトレース）；ａＤＮＰ３Ｂ１（「３Ｂ１」）；aＫＬＨ１２０．６（「aＫＬＨ」）；ａＤＮＰ３Ｃ２（「３Ｃ２」）、およびａＤＮＰ３Ａ４（「３Ａ４」）の分析を示す。
【図１６】光曝露の前および３週間後、１００ｍＭリン酸ナトリウム、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ６．８）の移動相（流速０．５ｍＬ／分）に乗せる連続する２つのサイズ排除カラム（ＴＳＫ−ＧＥＬ  Ｇ３０００ＳＷＸＬ、５ｍｍ粒径、７．８×３００ｍｍ、ＴｏｓｏｈＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、０８５４１）を用いた抗体ＤＮＰ  ３Ａ１（「３Ａ１」）、ａＤＮＰ３Ｃ２（「３Ｃ２」）およびＤＮＰ−３Ａ４の分析を示す。
【図１７Ａ】光曝露の前（図１７Ａ）および２日後（図１７Ｂ）における、１００ｍＭリン酸ナトリウム、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ６．８）の移動相（流速０．５ｍＬ／分）に乗せる連続する２つのサイズ排除カラム（ＴＳＫ−ＧＥＬ  Ｇ３０００ＳＷＸＬ、５ｍｍ粒径、７．８×３００ｍｍ、ＴｏｓｏｈＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、０８５４１）を用いた抗体ＤＮＰ  ３Ａ４、ａＤＮＰ３Ａ４−Ｙ（「Ｗ１０１０Ｙ」）、ａＤＮＰ３Ａ４−Ｆ（「Ｗ１０１Ｆ」）、ａＤＮＰ３Ａ４  ＹＳＳ（「Ｗ１０１Ｙ／ＣＣＳＳ」）、およびａＤＮＰ−３Ａ４−ＦＳＳ（「Ｗ１０１Ｆ／ＣＣＳＳ」）の分析を示す。
【図１７Ｂ】光曝露の前（図１７Ａ）および２日後（図１７Ｂ）における、１００ｍＭリン酸ナトリウム、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ６．８）の移動相（流速０．５ｍＬ／分）に乗せる連続する２つのサイズ排除カラム（ＴＳＫ−ＧＥＬ  Ｇ３０００ＳＷＸＬ、５ｍｍ粒径、７．８×３００ｍｍ、ＴｏｓｏｈＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、０８５４１）を用いた抗体ＤＮＰ  ３Ａ４、ａＤＮＰ３Ａ４−Ｙ（「Ｗ１０１０Ｙ」）、ａＤＮＰ３Ａ４−Ｆ（「Ｗ１０１Ｆ」）、ａＤＮＰ３Ａ４  ＹＳＳ（「Ｗ１０１Ｙ／ＣＣＳＳ」）、およびａＤＮＰ−３Ａ４−ＦＳＳ（「Ｗ１０１Ｆ／ＣＣＳＳ」）の分析を示す。
【図１８】ａＤＮＰ抗体（ａＤＮＰ−３Ａ４、ａＤＮＰ−３Ａ４−Ｙ、ａＤＮＰ−３Ａ４−Ｆ、ａＤＮＰ−３Ａ４−ＹＳＳおよびａＤＮＰ−３Ａ４−ＦＳＳ）のイオン交換分析を示す。これらの均一性について、Ｔｏｓｏｈａａｓ  ＳＰ−５ＰＷカラム（１０μｍ粒子、７．５ｍｍ  ＩＤ×７．５ｃｍ長）を用いて、緩衝液Ａ（１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０）および緩衝液Ｂ（１０ｍＭ酢酸ナトリウム、６００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．０）をプログラム化直線勾配（１分０％Ｂ、１０分３５％Ｂ、３０分７０％Ｂ、３分９０％Ｂおよび３分０％Ｂ）で１ｍＬ／分で流して、分析した。
【図１９Ａ】非還元ＣＥ−ＳＤＳによるａＤＮＰ３Ｂ１（図１９Ａ）、ａＤＮＰ３Ａ４−Ｆ（図１９Ｂ）、およびａＤＮＰ３Ａ４−ＦＳＳ（図１９Ｃ）抗体の分析を示す（吸光度２２０ｎｍでの検出）。裸のフューズドシリカキャピラリー５０μｍ×３０．２ｃｍを分離分析のために用いた。
【図１９Ｂ】非還元ＣＥ−ＳＤＳによるａＤＮＰ３Ｂ１（図１９Ａ）、ａＤＮＰ３Ａ４−Ｆ（図１９Ｂ）、およびａＤＮＰ３Ａ４−ＦＳＳ（図１９Ｃ）抗体の分析を示す（吸光度２２０ｎｍでの検出）。裸のフューズドシリカキャピラリー５０μｍ×３０．２ｃｍを分離分析のために用いた。
【図１９Ｃ】非還元ＣＥ−ＳＤＳによるａＤＮＰ３Ｂ１（図１９Ａ）、ａＤＮＰ３Ａ４−Ｆ（図１９Ｂ）、およびａＤＮＰ３Ａ４−ＦＳＳ（図１９Ｃ）抗体の分析を示す（吸光度２２０ｎｍでの検出）。裸のフューズドシリカキャピラリー５０μｍ×３０．２ｃｍを分離分析のために用いた。
【図２０Ａ】還元ＣＥ−ＳＤＳによるａＤＮＰ３Ｂ１（図２０Ａ）、ａＤＮＰ３Ａ４−Ｆ（図２０Ｂ）、およびａＤＮＰ３Ａ４−ＦＳＳ（図２０Ｃ）抗体の分析を示す（吸光度２２０ｎｍでの検出）。裸のフューズドシリカキャピラリー５０μｍ×３０．２ｃｍを分離分析のために用いた。
【図２０Ｂ】還元ＣＥ−ＳＤＳによるａＤＮＰ３Ｂ１（図２０Ａ）、ａＤＮＰ３Ａ４−Ｆ（図２０Ｂ）、およびａＤＮＰ３Ａ４−ＦＳＳ（図２０Ｃ）抗体の分析を示す（吸光度２２０ｎｍでの検出）。裸のフューズドシリカキャピラリー５０μｍ×３０．２ｃｍを分離分析のために用いた。
【図２０Ｃ】還元ＣＥ−ＳＤＳによるａＤＮＰ３Ｂ１（図２０Ａ）、ａＤＮＰ３Ａ４−Ｆ（図２０Ｂ）、およびａＤＮＰ３Ａ４−ＦＳＳ（図２０Ｃ）抗体の分析を示す（吸光度２２０ｎｍでの検出）。裸のフューズドシリカキャピラリー５０μｍ×３０．２ｃｍを分離分析のために用いた。
【図２１】ａＤＮＰ−３Ａ４−Ｆ（点線曲線）、ａＤＮＰ−３Ａ４−ＦＳＳ（実曲線）およびａＤＮＰ−３Ｂ１（破線曲線）抗体試料を２０℃から９５℃に１℃／分で加熱し、ＭｉｃｒＣａｌ  ＶＰ−ＤＳＣを用いたＤＳＣ分析を示す。１０ｍＭ酢酸ナトリウム、９％ショ糖（ｐＨ５．０）中タンパク質濃度は０．５ｍｇ／ｍＬであった。
【図２２】ａＤＮＰ３Ａ４−Ｆ、ａＤＮＰ３Ａ４−ＦＳＳ、およびａＤＮＰ３Ｂ１抗体を５ｍｇ／ｋｇ単回皮下注射したラットにおいてＥＬＩＳＡにより決定した各抗体の血清濃度を示す。投与後０、０．２５、１、４、２４、４８、７２、９６、１６８、３３６、５０４、６７２、８４０および１００８時間に血液試料を採取した。
【図２３】ａＤＮＰ３Ａ４（４ｍｇ／ｋｇ）またはaＫＬＨ１２０．６（３ｍｇ／ｋｇ）抗体をそれぞれボーラス静脈内注射した雄カニクイザルにおけるａＤＮＰ３Ａ４またはaＫＬＨ１２０．６の血漿濃度を示す。血清試料を定期的に採取して抗体の血漿濃度をＥＬＩＳＡにより決定した。ａＤＮＰ３Ａ４のデータを比較のため３ｍｇ／ｋｇに正規化した。
【図２４】実施例４に記載の最終１価aＫＬＨ１２０．６ＬＣ−ＳｈＫ［１−３５、Ｑ１６Ｋ］Ａｂ生成物のクーマシーブリリアントブルーで着色したトリス−グリシン４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。レーン１〜１２を以下のとおり負荷した：レーン１：Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２広範囲タンパク質標準（１０μＬ）；レーン２：非還元生成物０．５μｇ；レーン３：ブランク；レーン４：非還元生成物２．０μｇ；レーン５：ブランク；レーン６：非還元生成物１０μｇ；レーン７：Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２広範囲タンパク質標準（１０μＬ）；レーン８：還元生成物０．５μｇ；レーン９：ブランク；レーン１０：還元生成物２．０μｇ；レーン１１：ブランク；レーン１２：還元生成物１０μｇ。
【図２５】Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＢｉｏＳｅｐ  ＳＥＣ−３０００カラム（７．８×３００ｍｍ）の５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ溶液（ｐＨ６．９）に１ｍＬ／分で注入（吸光度２８０ｎｍで検出）した実施例４に記載の最終１価aＫＬＨ１２０．６ＬＣ−ＳｈＫ［１−３５、Ｑ１６Ｋ］Ａｂ生成物２５μｇ上のサイズ排除クロマトグラフィーを示す。
【図２６Ａ】窒素レーザ付きＭｉｃｒｏｍａｓｓ  ＭＡＬＤＩ  ｍｉｃｒｏ  ＭＸ質量分析計を用いた、実施例４に記載の１価aＫＬＨ１２０．６ＬＣ−ＳｈＫ［１−３５、Ｑ１６Ｋ］生成物の最終試料の非還元（図２６Ａ）および還元（図２６Ｂ）ＭＡＬＤＩ−ＭＳ質量スペクトル分析を示す。試料を、陽性線状モードで実行した。この機器の電圧を１２ｋＶで設定して、高質量検出器を５ｋＶで設定した。約２００レーザショットのデータを蓄積して各スペクトルを生成した。分子質量が既知である精製タンパク質を用いて外部物質カリブレーションを成し遂げた。
【図２６Ｂ】窒素レーザ付きＭｉｃｒｏｍａｓｓ  ＭＡＬＤＩ  ｍｉｃｒｏ  ＭＸ質量分析計を用いた、実施例４に記載の１価aＫＬＨ１２０．６ＬＣ−ＳｈＫ［１−３５、Ｑ１６Ｋ］生成物の最終試料の非還元（図２６Ａ）および還元（図２６Ｂ）ＭＡＬＤＩ−ＭＳ質量スペクトル分析を示す。試料を、陽性線状モードで実行した。この機器の電圧を１２ｋＶで設定して、高質量検出器を５ｋＶで設定した。約２００レーザショットのデータを蓄積して各スペクトルを生成した。分子質量が既知である精製タンパク質を用いて外部物質カリブレーションを成し遂げた。
【図２７】実施例４に記載の最終２価aＫＬＨ１２０．６ＬＣ−ＳｈＫ［１−３５、Ｑ１６Ｋ］Ａｂ生成物のクーマシーブリリアントブルーで着色したトリス−グリシン４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。レーン１〜１２を以下のとおり負荷した：レーン１：Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２広範囲タンパク質標準（１０μＬ）；レーン２：非還元生成物０．５μｇ；レーン３：ブランク；レーン４：非還元生成物２．０μｇ；レーン５：ブランク；レーン６：非還元生成物１０μｇ；レーン７：Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２広範囲タンパク質標準（１０μＬ）；レーン８：還元生成物０．５μｇ；レーン９：ブランク；レーン１０：還元生成物２．０μｇ；レーン１１：ブランク；レーン１２：還元生成物１０μｇ。
【図２８】Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＢｉｏＳｅｐ  ＳＥＣ−３０００カラム（７．８×３００ｍｍ）の５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ溶液（ｐＨ６．９）に１ｍＬ／分で注入（吸光度２８０ｎｍで検出）した実施例４に記載の最終２価aＫＬＨ１２０．６ＬＣ−ＳｈＫ［１−３５、Ｑ１６Ｋ］Ａｂ生成物２５μｇ上のサイズ排除クロマトグラフィーを示す。
【図２９Ａ】窒素レーザ付きＭｉｃｒｏｍａｓｓ  ＭＡＬＤＩ  ｍｉｃｒｏ  ＭＸ質量分析計を用いた、実施例４に記載の２価aＫＬＨ１２０．６ＬＣ−ＳｈＫ［１−３５、Ｑ１６Ｋ］Ａｂ生成物の最終試料の非還元（図２９Ａ）および還元（図２９Ｂ）ＭＡＬＤＩ−ＭＳ質量スペクトル分析を示す。試料を、陽性線状モードで実行した。この機器の電圧を１２ｋＶで設定して、高質量検出器を５ｋＶで設定した。約２００レーザショットのデータを蓄積して各スペクトルを生成した。分子質量が既知である精製タンパク質を用いて外部物質カリブレーションを成し遂げた。
【図２９Ｂ】窒素レーザ付きＭｉｃｒｏｍａｓｓ  ＭＡＬＤＩ  ｍｉｃｒｏ  ＭＸ質量分析計を用いた、実施例４に記載の２価aＫＬＨ１２０．６ＬＣ−ＳｈＫ［１−３５、Ｑ１６Ｋ］Ａｂ生成物の最終試料の非還元（図２９Ａ）および還元（図２９Ｂ）ＭＡＬＤＩ−ＭＳ質量スペクトル分析を示す。試料を、陽性線状モードで実行した。この機器の電圧を１２ｋＶで設定して、高質量検出器を５ｋＶで設定した。約２００レーザショットのデータを蓄積して各スペクトルを生成した。分子質量が既知である精製タンパク質を用いて外部物質カリブレーションを成し遂げた。
【図３０】実施例４に記載の最終３価aＫＬＨ１２０．６ＬＣ−ＳｈＫ［１−３５、Ｑ１６Ｋ］Ａｂ生成物のクーマシーブリリアントブルーで着色したトリス−グリシン４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。レーン１〜１２を以下のとおり負荷した：レーン１：Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２広範囲タンパク質標準（１０μＬ）；レーン２：非還元生成物０．５μｇ；レーン３：ブランク；レーン４：非還元生成物２．０μｇ；レーン５：ブランク；レーン６：非還元生成物１０μｇ；レーン７：Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２広範囲タンパク質標準（１０μＬ）；レーン８：還元生成物０．５μｇ；レーン９：ブランク；レーン１０：還元生成物２．０μｇ；レーン１１：ブランク；レーン１２：還元生成物１０μｇ。
【図３１】Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＢｉｏＳｅｐ  ＳＥＣ−３０００カラム（７．８×３００ｍｍ）の５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ溶液（ｐＨ６．９）に１ｍＬ／分で注入（吸光度２８０ｎｍで検出）した実施例４に記載の最終３価aＫＬＨ１２０．６ＬＣ−ＳｈＫ［１−３５、Ｑ１６Ｋ］Ａｂ生成物２５μｇ上のサイズ排除クロマトグラフィーを示す。
【図３２Ａ】窒素レーザ付きＭｉｃｒｏｍａｓｓ  ＭＡＬＤＩ  ｍｉｃｒｏ  ＭＸ質量分析計を用いた、実施例４に記載の３価aＫＬＨ１２０．６ＬＣ−ＳｈＫ［１−３５、Ｑ１６Ｋ］Ａｂ生成物の最終試料の非還元（図３２Ａ）および還元（図３２Ｂ）ＭＡＬＤＩ−ＭＳ質量スペクトル分析を示す。試料を、陽性線状モードで実行した。この機器の電圧を１２ｋＶで設定して、高質量検出器を５ｋＶで設定した。約２００レーザショットのデータを蓄積して各スペクトルを生成した。分子質量が既知である精製タンパク質を用いて外部物質カリブレーションを成し遂げた。
【図３２Ｂ】窒素レーザ付きＭｉｃｒｏｍａｓｓ  ＭＡＬＤＩ  ｍｉｃｒｏ  ＭＸ質量分析計を用いた、実施例４に記載の３価aＫＬＨ１２０．６ＬＣ−ＳｈＫ［１−３５、Ｑ１６Ｋ］Ａｂ生成物の最終試料の非還元（図３２Ａ）および還元（図３２Ｂ）ＭＡＬＤＩ−ＭＳ質量スペクトル分析を示す。試料を、陽性線状モードで実行した。この機器の電圧を１２ｋＶで設定して、高質量検出器を５ｋＶで設定した。約２００レーザショットのデータを蓄積して各スペクトルを生成した。分子質量が既知である精製タンパク質を用いて外部物質カリブレーションを成し遂げた。
【図３３】実施例４に記載の最終１価aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＨＣ−Ｓｈｋ［１−３５、Ｒ１Ａ、Ｉ４Ａ、Ｑ１６Ｋ］Ａｂ生成物のクーマシーブリリアントブルーで着色したトリス−グリシン４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。レーン１〜１２を以下のとおり負荷した：レーン１：Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２広範囲タンパク質標準（１０μＬ）；レーン２：非還元生成物０．５μｇ；レーン３：ブランク；レーン４：非還元生成物２．０μｇ；レーン５：ブランク；レーン６：非還元生成物１０μｇ；レーン７：Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２広範囲タンパク質標準（１０μＬ）；レーン８：還元生成物０．５μｇ；レーン９：ブランク；レーン１０：還元生成物２．０μｇ；レーン１１：ブランク；レーン１２：還元生成物１０μｇ。
【図３４】Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＢｉｏＳｅｐ  ＳＥＣ−３０００カラム（７．８×３００ｍｍ）の５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ溶液（ｐＨ６．９）に１ｍＬ／分で注入（吸光度２８０ｎｍで検出）した実施例４に記載の最終１価aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＨＣ−Ｓｈｋ［１−３５、Ｒ１Ａ、Ｉ４Ａ、Ｑ１６Ｋ］Ａｂ生成物２５μｇ上のサイズ排除クロマトグラフィーを示す。
【図３５】実施例４に記載の１価aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＨＣ−ＳｈＫ［１−３５、Ｒ１Ａ、Ｉ４Ａ、Ｑ１６Ｋ］Ａｂ生成物の最終試料における重鎖の還元ＬＣ−ＭＳ質量スペクトル分析を示す。生成物をＷａｔｅｒｓ社製ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣシステムを用いてＷａｔｅｒｓ社製ＭａｓｓＰＲＥＰマイクロ脱塩カラムを介してクロマトグラフ化した。カラムを８０℃で設定して、０．１％ギ酸中でアセトニトリル濃度を増大する直線勾配を用いてタンパク質を溶出した。質量分析のためＷａｔｅｒｓ社製ＬＣＴ  Ｐｒｅｍｉｅｒ  ＥＳＩ−ＴＯＦ質量分析計にカラム流出の一部を流用した。この機器を陽性Ｖモードで作動した。キャピラリー電圧を３，２００Ｖで、コーン電圧を８０Ｖで設定した。質量スペクトルを８００〜３０００ｍ／ｚで獲得し、機器製造業者の提供するＭａｘＥｎｔ１ソフトウェアを用いて逆重畳した。
【図３６】実施例１１に記載の最終aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＨＣ−Ｃ６８１Ａｂ生成物のクーマシーブリリアントブルーで着色したトリス−グリシン４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。レーン１〜１２を以下のとおり負荷した：レーン１：Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２広範囲タンパク質標準（１０μＬ）；レーン２：非還元生成物０．５μｇ；レーン３：ブランク；レーン４：非還元生成物２．０μｇ；レーン５：ブランク；レーン６：非還元生成物１０μｇ；レーン７：Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２広範囲タンパク質標準（１０μＬ）；レーン８：還元生成物０．５μｇ；レーン９：ブランク；レーン１０：還元生成物２．０μｇ；レーン１１：ブランク；レーン１２：還元生成物１０μｇ。
【図３７】Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＢｉｏＳｅｐ  ＳＥＣ−３０００カラム（７．８×３００ｍｍ）の５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ溶液（ｐＨ６．９）に１ｍＬ／分で注入（吸光度２８０ｎｍで検出）した実施例１１に記載の最終aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＨＣ−Ｃ６８１Ａｂ生成物２５μｇ上のサイズ排除クロマトグラフィーを示す。
【図３８Ａ】窒素レーザ付きＭｉｃｒｏｍａｓｓ  ＭＡＬＤＩ  ｍｉｃｒｏ  ＭＸ質量分析計を用いた、実施例１１に記載のaＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＨＣ−Ｃ６８１生成物の最終試料の非還元（図３８Ａ）および還元（図３８Ｂ）ＭＡＬＤＩ−ＭＳ質量スペクトル分析を示す。試料を、陽性線状モードで実行した。この機器の電圧を１２ｋＶで設定して、高質量検出器を５ｋＶで設定した。約２００レーザショットのデータを蓄積して各スペクトルを生成した。分子質量が既知である精製タンパク質を用いて外部物質カリブレーションを成し遂げた。
【図３８Ｂ】窒素レーザ付きＭｉｃｒｏｍａｓｓ  ＭＡＬＤＩ  ｍｉｃｒｏ  ＭＸ質量分析計を用いた、実施例１１に記載のaＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＨＣ−Ｃ６８１生成物の最終試料の非還元（図３８Ａ）および還元（図３８Ｂ）ＭＡＬＤＩ−ＭＳ質量スペクトル分析を示す。試料を、陽性線状モードで実行した。この機器の電圧を１２ｋＶで設定して、高質量検出器を５ｋＶで設定した。約２００レーザショットのデータを蓄積して各スペクトルを生成した。分子質量が既知である精製タンパク質を用いて外部物質カリブレーションを成し遂げた。
【図３９】Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＢｉｏＳｅｐ  ＳＥＣ−３０００カラム（７．８×３００ｍｍ）の５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ溶液（ｐＨ６．９）に１ｍＬ／分で注入（吸光度２８０ｎｍで検出）した実施例９に記載の各aＫＬＨ  ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ｑ）、ＡＭＰ５−ＨＣ  aＫＬＨ  ＩｇＧ２、ＨＣ−ＡＭＰ５  aＫＬＨ  ＩｇＧ２、ＡＭＰ５−ＬＣ  aＫＬＨ  ＩｇＧ１およびＬＣ−ＡＭＰ５  aＫＬＨ  ＩｇＧ１）生成物５０μｇ上のサイズ排除クロマトグラフィーを示す。
【図４０Ａ】非還元負荷緩衝液およびＱｕｉｃｋＢｌｕｅ（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）による染色を用いて２２０Ｖで展開した１．０ｍｍトリス−グリシン４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｎｏｖｅｘ）上での（実施例９に記載の）aＫＬＨ  ＩｇＧ１  Ｎ２９７Ｑ（図４０Ａ）、ＡＭＰ５−ＨＣ  aＫＬＨ  ＩｇＧ２（図４０Ｂ）、ＬＣ−ＡＭＰ５  aＫＬＨ  ＩｇＧ２（図４０Ｃ）、ＨＣ−ＡＭＰ５  aＫＬＨ  ＩｇＧ２（図４０Ｄ）、およびＡＭＰ５−ＬＣ  aＫＬＨ  ＩｇＧ１（図４０Ｅ）抗体の分析を示す。レーン１〜１２を以下のとおり負荷した：レーン１：Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２広範囲タンパク質標準（１０μＬ）；レーン２：非還元生成物０．５μｇ；レーン３：ブランク；レーン４：非還元生成物２．０μｇ；レーン５：ブランク；レーン６：非還元生成物１０μｇ；レーン７：Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２広範囲タンパク質標準（１０μＬ）；レーン８：還元生成物０．５μｇ；レーン９：ブランク；レーン１０：還元生成物２．０μｇ；レーン１１：ブランク；レーン１２：還元生成物１０μｇ。
【図４０Ｂ】非還元負荷緩衝液およびＱｕｉｃｋＢｌｕｅ（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）による染色を用いて２２０Ｖで展開した１．０ｍｍトリス−グリシン４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｎｏｖｅｘ）上での（実施例９に記載の）aＫＬＨ  ＩｇＧ１  Ｎ２９７Ｑ（図４０Ａ）、ＡＭＰ５−ＨＣ  aＫＬＨ  ＩｇＧ２（図４０Ｂ）、ＬＣ−ＡＭＰ５  aＫＬＨ  ＩｇＧ２（図４０Ｃ）、ＨＣ−ＡＭＰ５  aＫＬＨ  ＩｇＧ２（図４０Ｄ）、およびＡＭＰ５−ＬＣ  aＫＬＨ  ＩｇＧ１（図４０Ｅ）抗体の分析を示す。レーン１〜１２を以下のとおり負荷した：レーン１：Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２広範囲タンパク質標準（１０μＬ）；レーン２：非還元生成物０．５μｇ；レーン３：ブランク；レーン４：非還元生成物２．０μｇ；レーン５：ブランク；レーン６：非還元生成物１０μｇ；レーン７：Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２広範囲タンパク質標準（１０μＬ）；レーン８：還元生成物０．５μｇ；レーン９：ブランク；レーン１０：還元生成物２．０μｇ；レーン１１：ブランク；レーン１２：還元生成物１０μｇ。
【図４０Ｃ】非還元負荷緩衝液およびＱｕｉｃｋＢｌｕｅ（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）による染色を用いて２２０Ｖで展開した１．０ｍｍトリス−グリシン４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｎｏｖｅｘ）上での（実施例９に記載の）aＫＬＨ  ＩｇＧ１  Ｎ２９７Ｑ（図４０Ａ）、ＡＭＰ５−ＨＣ  aＫＬＨ  ＩｇＧ２（図４０Ｂ）、ＬＣ−ＡＭＰ５  aＫＬＨ  ＩｇＧ２（図４０Ｃ）、ＨＣ−ＡＭＰ５  aＫＬＨ  ＩｇＧ２（図４０Ｄ）、およびＡＭＰ５−ＬＣ  aＫＬＨ  ＩｇＧ１（図４０Ｅ）抗体の分析を示す。レーン１〜１２を以下のとおり負荷した：レーン１：Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２広範囲タンパク質標準（１０μＬ）；レーン２：非還元生成物０．５μｇ；レーン３：ブランク；レーン４：非還元生成物２．０μｇ；レーン５：ブランク；レーン６：非還元生成物１０μｇ；レーン７：Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２広範囲タンパク質標準（１０μＬ）；レーン８：還元生成物０．５μｇ；レーン９：ブランク；レーン１０：還元生成物２．０μｇ；レーン１１：ブランク；レーン１２：還元生成物１０μｇ。
【図４０Ｄ】非還元負荷緩衝液およびＱｕｉｃｋＢｌｕｅ（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）による染色を用いて２２０Ｖで展開した１．０ｍｍトリス−グリシン４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｎｏｖｅｘ）上での（実施例９に記載の）aＫＬＨ  ＩｇＧ１  Ｎ２９７Ｑ（図４０Ａ）、ＡＭＰ５−ＨＣ  aＫＬＨ  ＩｇＧ２（図４０Ｂ）、ＬＣ−ＡＭＰ５  aＫＬＨ  ＩｇＧ２（図４０Ｃ）、ＨＣ−ＡＭＰ５  aＫＬＨ  ＩｇＧ２（図４０Ｄ）、およびＡＭＰ５−ＬＣ  aＫＬＨ  ＩｇＧ１（図４０Ｅ）抗体の分析を示す。レーン１〜１２を以下のとおり負荷した：レーン１：Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２広範囲タンパク質標準（１０μＬ）；レーン２：非還元生成物０．５μｇ；レーン３：ブランク；レーン４：非還元生成物２．０μｇ；レーン５：ブランク；レーン６：非還元生成物１０μｇ；レーン７：Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２広範囲タンパク質標準（１０μＬ）；レーン８：還元生成物０．５μｇ；レーン９：ブランク；レーン１０：還元生成物２．０μｇ；レーン１１：ブランク；レーン１２：還元生成物１０μｇ。
【図４０Ｅ】非還元負荷緩衝液およびＱｕｉｃｋＢｌｕｅ（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）による染色を用いて２２０Ｖで展開した１．０ｍｍトリス−グリシン４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｎｏｖｅｘ）上での（実施例９に記載の）aＫＬＨ  ＩｇＧ１  Ｎ２９７Ｑ（図４０Ａ）、ＡＭＰ５−ＨＣ  aＫＬＨ  ＩｇＧ２（図４０Ｂ）、ＬＣ−ＡＭＰ５  aＫＬＨ  ＩｇＧ２（図４０Ｃ）、ＨＣ−ＡＭＰ５  aＫＬＨ  ＩｇＧ２（図４０Ｄ）、およびＡＭＰ５−ＬＣ  aＫＬＨ  ＩｇＧ１（図４０Ｅ）抗体の分析を示す。レーン１〜１２を以下のとおり負荷した：レーン１：Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２広範囲タンパク質標準（１０μＬ）；レーン２：非還元生成物０．５μｇ；レーン３：ブランク；レーン４：非還元生成物２．０μｇ；レーン５：ブランク；レーン６：非還元生成物１０μｇ；レーン７：Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２広範囲タンパク質標準（１０μＬ）；レーン８：還元生成物０．５μｇ；レーン９：ブランク；レーン１０：還元生成物２．０μｇ；レーン１１：ブランク；レーン１２：還元生成物１０μｇ。
【図４１Ａ】実施例９に記載の還元試料ＬＣ−ＡＭＰ５  aＫＬＨ  ＩｇＧ２（図４１Ａ）、ＡＭＰ５−ＨＣ  aＫＬＨ  ＩｇＧ２（図４１Ｂ）、ＨＣ−ＡＭＰ５  aＫＬＨ  ＩｇＧ２（図４１Ｃ）、およびＡＭＰ５−ＬＣ  aＫＬＨ  ＩｇＧ１（図４１Ｄ）の質量分光分析を示す。各試料をＷａｔｅｒｓ社製Ｍａｓｓｐｒｅｐマイクロ脱塩カラム（２．１×５ｍｍ）を介してＡｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ｓｙｓｔｅｍを用いてクロマトグラフ化してから、質量測定のためにＷａｔｅｒｓ社製飛行時間型ＬＣＴ  ｐｒｅｍｉｅｒ質量分析計に導入し、質量スペクトルをＭａｘＥｎｔ１ソフトウェアを用いて逆重畳した。
【図４１Ｂ】実施例９に記載の還元試料ＬＣ−ＡＭＰ５  aＫＬＨ  ＩｇＧ２（図４１Ａ）、ＡＭＰ５−ＨＣ  aＫＬＨ  ＩｇＧ２（図４１Ｂ）、ＨＣ−ＡＭＰ５  aＫＬＨ  ＩｇＧ２（図４１Ｃ）、およびＡＭＰ５−ＬＣ  aＫＬＨ  ＩｇＧ１（図４１Ｄ）の質量分光分析を示す。各試料をＷａｔｅｒｓ社製Ｍａｓｓｐｒｅｐマイクロ脱塩カラム（２．１×５ｍｍ）を介してＡｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ｓｙｓｔｅｍを用いてクロマトグラフ化してから、質量測定のためにＷａｔｅｒｓ社製飛行時間型ＬＣＴ  ｐｒｅｍｉｅｒ質量分析計に導入し、質量スペクトルをＭａｘＥｎｔ１ソフトウェアを用いて逆重畳した。
【図４１Ｃ】実施例９に記載の還元試料ＬＣ−ＡＭＰ５  aＫＬＨ  ＩｇＧ２（図４１Ａ）、ＡＭＰ５−ＨＣ  aＫＬＨ  ＩｇＧ２（図４１Ｂ）、ＨＣ−ＡＭＰ５  aＫＬＨ  ＩｇＧ２（図４１Ｃ）、およびＡＭＰ５−ＬＣ  aＫＬＨ  ＩｇＧ１（図４１Ｄ）の質量分光分析を示す。各試料をＷａｔｅｒｓ社製Ｍａｓｓｐｒｅｐマイクロ脱塩カラム（２．１×５ｍｍ）を介してＡｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ｓｙｓｔｅｍを用いてクロマトグラフ化してから、質量測定のためにＷａｔｅｒｓ社製飛行時間型ＬＣＴ  ｐｒｅｍｉｅｒ質量分析計に導入し、質量スペクトルをＭａｘＥｎｔ１ソフトウェアを用いて逆重畳した。
【図４１Ｄ】実施例９に記載の還元試料ＬＣ−ＡＭＰ５  aＫＬＨ  ＩｇＧ２（図４１Ａ）、ＡＭＰ５−ＨＣ  aＫＬＨ  ＩｇＧ２（図４１Ｂ）、ＨＣ−ＡＭＰ５  aＫＬＨ  ＩｇＧ２（図４１Ｃ）、およびＡＭＰ５−ＬＣ  aＫＬＨ  ＩｇＧ１（図４１Ｄ）の質量分光分析を示す。各試料をＷａｔｅｒｓ社製Ｍａｓｓｐｒｅｐマイクロ脱塩カラム（２．１×５ｍｍ）を介してＡｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ｓｙｓｔｅｍを用いてクロマトグラフ化してから、質量測定のためにＷａｔｅｒｓ社製飛行時間型ＬＣＴ  ｐｒｅｍｉｅｒ質量分析計に導入し、質量スペクトルをＭａｘＥｎｔ１ソフトウェアを用いて逆重畳した。
【図４２】実施例１０に記載のエキセンディン−４（「Ｅｘ４」）−１ｋＧ−aＫＬＨ１２０．６ＬＣ融合構築物の図式マップである。
【図４３】Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＢｉｏＳｅｐ  ＳＥＣ−３０００カラム（７．８×３００ｍｍ）の５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ溶液（ｐＨ６．９）に１ｍＬ／分で注入（吸光度２８０ｎｍで検出）した実施例１０に記載の最終Ｅｘ４−１ｋＧ−aＫＬＨ１２０．６ＬＣ抗体融合物２５μｇのサイズ排除クロマトグラフィーを示す。
【図４４】還元および非還元負荷緩衝液ならびにＱｕｉｃｋＢｌｕｅ（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）による染色を用いて２２０Ｖで展開した１．０ｍｍトリス−グリシン４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｎｏｖｅｘ）上での分析を示す。レーン１〜１０を以下のとおり負荷した：レーン１：Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２広範囲タンパク質標準（１０μＬ）；レーン２：他のタンパク質０．５μｇ；レーン３：非還元Ｅｘ４−aＫＬＨ１２０．６Ａｂ０．５μｇ；レーン４：他のタンパク質２．０μｇ、レーン５：非還元Ｅｘ４−aＫＬＨ１２０．６Ａｂ２．０μｇ；レーン６：Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２広範囲タンパク質標準（１０μＬ）；レーン７：他のタンパク質０．５μｇ；レーン８：還元Ｅｘ４−aＫＬＨ１２０．６Ａｂ０．５μｇ；レーン９：他のタンパク質２．０μｇ、レーン１０：還元Ｅｘ４−aＫＬＨ１２０．６Ａｂ２．０μｇ。
【図４５】実施例９にさらに例示する、本発明の抗体のＨＣおよびＬＣ単量体の薬理学的に活性な化学部分のＮ末端およびＣ末端融合物の図解を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本明細書で使用する項目の表題は、構成上の目的にすぎず、記載の対象物を限定するものとは解釈されない。
【００１９】
定義
本明細書において別段の定めがない限り、本出願に関連して使用する科学用語および専門用語は、当業者によって一般的に理解されている意味を有する。さらに、文脈において別段の必要がない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含む。したがって、本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上はっきりと別段の指摘がされない限り、複数形の指示対象を含む。例えば、「タンパク質（ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」という言及は複数のタンパク質を含む；「細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」という言及は複数の細胞集団を含む。
【００２０】
「ポリペプチド」と「タンパク質」は本明細書で同義的に使用し、ペプチド結合を介して共有結合した２つ以上のアミノ酸の分子鎖を含む。この用語は特定の長さの生成物を指さない。したがって、「ペプチド」、および「オリゴペプチド」は、ポリペプチドの定義に含まれる。この用語は、ポリペプチドの翻訳後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化などを含む。加えて、タンパク質断片、アナログ、変異または変異型タンパク質（融合タンパク質など）は、ポリペプチドの意味に含まれる。この用語は、１つもしくは複数のアミノ酸アナログまたは非限界もしくは非天然アミノ酸が既知のタンパク質工学技術を用いて組換え発現できる分子も含む。加えて、本明細書に記載の融合タンパク質を周知の有機化学技術により誘導体化できる。
【００２１】
「単離タンパク質」という用語は、標的タンパク質が（１）通常、天然で見出される他のタンパク質の少なくとも一部を欠く、（２）同じ供給源由来、例えば、同種由来の他のタンパク質を本質的に欠く、（３）異なる種（ｓｐｅｃｉｅｓ  ｏｒ  ｋｉｎｄ）の細胞により組換え発現している、（４）少なくとも約５０％のポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、または天然で結合している他の物質から分離している、（５）天然で結合していないポリペプチドと（共有結合または非共有結合の相互作用により）操作可能に連結している、ならびに／または（６）天然で生じない、ことを意味する。典型的には、「単離タンパク質」は、所定の試料の少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、または少なくとも約５０％を構成する。合成起点のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡもしくは他のＲＮＡ、またはそれらの任意の組み合わせがかかる単離タンパク質をコードし得る。好ましくは、単離タンパク質は、その治療的、診断的、予防的、研究もしくは他の使用を妨害し得るタンパク質もしくはポリペプチド、または自然環境に見出される他の汚染物質が実質的にない。
【００２２】
ポリペプチド（例えば、抗原結合タンパク質、または抗体）の「変異型」は、別のポリペプチド配列と比較して、１つまたは複数のアミノ酸残基がアミノ酸配列内に挿入されている、アミノ酸配列から欠失しているおよび／またはアミノ酸配列内に置換されているアミノ酸配列を含む。変異体は、融合タンパク質を含む。
【００２３】
「融合タンパク質」という用語は、複数の親タンパク質またはポリペプチドに由来するポリペプチド成分を含むタンパク質を示す。典型的には、融合タンパク質は、１つのタンパク質に由来するポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列がインフレームで付加されている融合遺伝子から発現しており、異なるタンパク質由来のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列から任意選択的にリンカーにより分離されている。融合遺伝子は次いで組換え宿主細胞により単一のタンパク質として発現できる。
【００２４】
「分泌された」タンパク質とは、分泌シグナルペプチド配列の結果としてＥＲ、分泌小胞、または細胞外空間を指向できるタンパク質、ならびにシグナル配列を含む必要なく細胞外空間内へ放出されるタンパク質を指す。分泌されたタンパク質が細胞外空間に放出される場合、分泌されたタンパク質は「成熟」タンパク質を産生する細胞外プロセスを経ることができる。細胞外空間内への放出は、エキソサイトーシスおよびタンパク分解切断を含む多くの機序により生じ得る。本発明の組成物の一部の他の実施形態では、毒素ペプチドアナログは分泌されたタンパク質として宿主細胞により合成でき、次いで細胞外空間および／または培地からさらに精製できる。
【００２５】
本明細書で使用する「溶解性」とは、組換えＤＮＡ技術により宿主細胞内に産生されたタンパク質について言及する場合、水溶液中に存在するタンパク質である；タンパク質がツイン−アルギニンシグナルアミノ酸配列を含む場合、溶解性タンパク質はグラム陰性細菌宿主内で細胞膜周辺腔にエクスポートされるか、または分泌可能な真核宿主細胞により、または適切な遺伝子（例えば、ｋｉｌ遺伝子）を有する細菌宿主により培養基内に分泌される。したがって、溶解性タンパク質は、宿主細胞内の封入体に見出されないタンパク質である。あるいは、溶解性タンパク質は、文脈により、細胞膜への統合が見出されないタンパク質である；対して、不溶性タンパク質は、宿主細胞内の細胞質果粒（封入体と呼ばれる）に変性形態で存在するか、またはこれも文脈により、不溶性タンパク質は、細胞膜（細胞質膜、糸粒体膜、葉緑体膜、小胞体膜などが挙げられるが、これらに限定されない）に存在するものである。
【００２６】
「組換え」という用語は、ヒトの介入により物質（例えば、核酸またはポリペプチド）が人工的にまたは合成的に（すなわち、非天然）改変されていることを示す。改変は、自然環境もしくは状態における物質上で行うこともでき、自然環境もしくは状態から除去した物質上で行うこともできる。例えば、「組換え核酸」とは、核酸の組換え、例えば、クローニング中、ＤＮＡ混合または他の周知の分子生物学的手段により作製されるものである。かかる分子生物学的手段の例は、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ，  Ｎ．Ｙ（１９８２）に見出される。「組換えＤＮＡ分子」は、かかる分子生物学的技術により結合したＤＮＡセグメントを含む。本明細書で使用する「組換えタンパク質」または「組換えポリペプチド」という用語は、組換えＤＮＡ分子を用いて発現するタンパク質分子を指す。「組換え宿主細胞」とは、組換え核酸を含むおよび／または発現する細胞である。
【００２７】
「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、２つ以上のヌクレオチド残基を含む単鎖ヌクレオチドポリマーと二重鎖ヌクレオチドポリマーの両方を含む。ポリヌクレオチドを含むヌクレオチド残基は、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチド、またはいずれかのヌクレオチドタイプの修飾形態であり得る。前記修飾としては、塩基修飾（ブロモウリジンおよびイノシン誘導体など）、リボース修飾（２’，３’−ジデオキシリボースなど）、およびヌクレオチド結合間修飾（ホスホロチオアート、ジチオリン酸、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニーロチオエート、ホスホルアニラデートおよびホスホロアミデートなど）が挙げられる。
【００２８】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、２００個以下のヌクレオチド残基を含むポリヌクレオチドを意味する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの長さは、１０〜６０塩基である。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドの長さは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０〜４０個のヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドは単鎖であってもよく、二重鎖であってもよい（例えば、変異遺伝子の構築における使用のため）。オリゴヌクレオチドはセンスであってもよく抗センスオリゴヌクレオチドであってもよい。オリゴヌクレオチドは、検出アッセイのために放射標識、蛍光標識、ハプテンまたは抗原標識などの標識を含むことができる。オリゴヌクレオチドは、例えば、ＰＣＲプライマー、クローニングプライマーまたはハイブリッド化プローブとして用いてよい。
【００２９】
「ポリヌクレオチド配列」または「ヌクレオチド配列」または「核酸配列」とは、本明細書で同義的に使用し、ポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、およびＲＮＡ、核酸、または文字列を含む）におけるヌクレオチド残基の一次配列であり、文脈によりヌクレオチド残基の一次配列を表す。任意の特定のポリヌクレオチド配列から、所定の核酸または相補性ポリヌクレオチド配列のいずれかを決定できる。単鎖の場合も二重鎖の場合もあるゲノムまたは合成起点のＤＮＡまたはＲＮＡを含み、センス鎖もしくは抗センス鎖を表す。別段の指定のない限り、本明細書で論じる任意の単鎖ポリヌクレオチド配列の左端は５’末端である；二重鎖ポリヌクレオチド配列の左方向は５’方向と呼ぶ。新生ＲＮＡ転写物の添加の５’から３’方向を転写方向と呼ぶ；ＲＮＡ転写物の５’から５末端のＲＮＡ転写物と同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域は、ＤＮＡ鎖上の「上流配列」、配列領域と呼び、ＲＮＡ転写物の３’末端への３’であるＲＮＡ転写物は「下流配列」と呼ばれるＲＮＡ転写物と同じ配列を有する。
【００３０】
本明細書で使用する「単離核酸分子」または「単離核酸配列」とは、（１）通常、天然の核酸供給源と結合している少なくとも１つの汚染核酸分子から同定および分離されている、または（２）目的の核酸配列を決定できるようにクローン化、増幅、タグ化、あるいは背景核酸から区別されている、のいずれかの核酸分子である。単離核酸分子は、天然で見出される形態または状態以外である。しかしながら、単離核酸分子は、例えば、核酸分子の染色体位置が天然細胞と異なる抗原結合タンパク質（例えば、抗体）を通常、発現する細胞内に含まれる核酸分子を含む。
【００３１】
本明細書で使用する「核酸分子コーディング」、「ＤＮＡ配列コーディング」、および「ＤＮＡコーディング」という用語は、デオキシリボ核酸の一本鎖に沿ったデオキシリボヌクレオチドの順または配列を指す。これらのデオキシリボヌクレオチド順は、ｍＲＮＡ鎖に沿ったリボヌクレオチド順を決定し、ポリペプチド（タンパク質）鎖に沿ったアミノ酸順も決定する。ＤＮＡ配列はしたがってＲＮＡ配列およびアミノ酸配列をコードする。
【００３２】
広義に使用する「遺伝子」という用語は、生体機能と関連した任意の核酸を指す。典型的には遺伝子は、かかるコード配列の発現のために必要なコード配列および／または調節配列含む。「遺伝子」という用語は、特異的ゲノムもしくは組換え配列、ならびにその配列によりコードされたｃＤＮＡもしくはｍＲＮＡに適用する。「融合遺伝子」は毒素ペプチドアナログをコードするコード領域を含む。遺伝子は、例えば、他のタンパク質のための認識配列を形成する非発現核酸セグメントも含む。調節タンパク質（転写因子など）に対する転写制御因子を含む非発現調節配列は結合し、隣接または近接配列が転写される。
【００３３】
「遺伝子の発現」または「核酸の発現」とは、文脈に応じて、ＤＮＡのＲＮＡ内への転写（任意選択的にＲＮＡ修飾、例えば、スプライシングを含む）、ＲＮＡのポリペプチド内への翻訳（おそらくは、その後に続くポリペプチドの翻訳後修飾を含む）、または転写と翻訳の両方を意味する。
【００３４】
本明細書で使用する「コード領域」または「コード配列」という用語は、構造的遺伝子についての言及に使用する場合、ｍＲＮＡ分子の翻訳結果として新生ポリペプチド内に見出されるアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を指す。コード領域は、真核生物において、開始メチオニンをコードするヌクレオチドトリプレット「ＡＴＧ」により５’側上で結合し、終止コドンを定義する３個のトリプレット（すなわち、ＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡ）のうち１個により３’側で結合する。
【００３５】
「制御配列」または「制御シグナル」という用語は、特定の宿主細胞内で、結紮するコード配列の発現およびプロセスに影響を与えることができるポリヌクレオチド配列を指す。かかる制御配列の性質は宿主生物によって決定され得る。特定の実施形態では、原核生物のための制御配列は、プロモーター、リボソームの結合部位、および転写終止配列を含み得る。真核生物のための制御配列は、転写因子の１つもしくは複数の認識部位を含むプロモーター、転写エンハンサー配列もしくはエレメント、ポリアデニル化部位、ならびに転写終止配列を含み得る。制御配列は、リーダー配列および／または融合パートナー配列を含むことができる。プロモーターおよびエンハンサーは、転写に関わる細胞タンパク質と特異的に相互作用するＤＮＡの短いアレイからなる（Ｍａｎｉａｔｉｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３６：１２３７  （１９８７））。プロモーターおよびエンハンサーエレメントは、酵母、昆虫および哺乳類細胞内の遺伝子ならびにウイルスを含む様々な真核供給源から単離されている（アナログ制御因子、すなわち、プロモーターは原核生物にも見出される）。特定のプロモーターおよびエンハンサーの選択は、目的のタンパク質を発現するために使用する細胞タイプによって決まる。一部の真核プロモーターおよびエンハンサーは広範な宿主範囲を有する一方、他は細胞タイプの限定的な部分集合において機能性である（総論については、Ｖｏｓｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．，  １１：２８７  （１９８６）  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３６：１２３７  （１９８７）を参照されたい）。
【００３６】
「ベクター」という用語は、タンパク質コード情報を宿主細胞内に移すために使用する任意の分子または実体（例えば、核酸、プラスミド、バクテリオファージまたはウイルス）を意味する。
【００３７】
本明細書で使用する「発現ベクター」または「発現構築物」という用語は、特定の宿主細胞内で操作可能に連結しているコード配列の発現のために必要である所望のコード配列および適切な核酸制御配列を含む組換えＤＮＡ分子を指す。発現ベクターは、転写、翻訳に影響を与えるかこれらを制御する配列、およびイントロンが存在する場合、そこに操作可能に連結しているコード領域のＲＮＡスプライシングに影響を与える配列を挙げることができるが、これらに限定されない。原核生物における発現のために必要な核酸配列は、プロモーター、任意選択的にオペレーター配列、リボソーム結合部位およびおそらくは他の配列を含む。真核細胞はプロモーター、エンハンサー、ならびに終止およびポリアデニル化シグナルを利用することが知られている。分泌シグナルペプチド配列は、所望の場合、細胞からの目的のポリペプチド単離をさらに促進するため、発現ポリペプチドが組換え宿主細胞により分泌され得るように、任意選択的に、発現ベクターによりコードされ得、目的のコード配列と操作可能に連結され得る。かかる技術は当技術分野において周知である。（例えば、Ｇｏｏｄｅｙ，  Ａｎｄｒｅｗ  Ｒ．；  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ、米国特許第５，３０２，６９７号；Ｗｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ、米国特許第６，０２２，９５２号および米国特許第６，３３５，１７８号；Ｕｅｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒｅｏｆ、米国特許第７，０２９，９０９号；Ｒｕｂｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２７  ｈｕｍａｎ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ、米国特許第２００３／０１０４４００Ａ１号）。
【００３８】
本明細書で使用する「操作可能な組み合わせの」、「操作可能な順の」および「操作可能に連結している」という用語は、所定の遺伝子の転写および／または所望のタンパク質分子の合成を指向できる核酸分子が産生される形の核酸配列の結合を指す。この用語は、機能性タンパク質が産生される形のアミノ酸配列の結合も指す。例えば、タンパク質コード配列に対し「操作可能に連結している」ベクター中の制御配列は、制御配列の転写活性と適合する条件下でタンパク質コード配列が発現するように結紮している。
【００３９】
「宿主細胞」という用語は、核酸と形質転換されているか、または形質転換されることができ、それにより目的の遺伝子を発現する細胞を意味する。この用語は、目的の遺伝子が存在する限り、後代が元の親細胞と形態的または遺伝的に同一であるかを問わず、親細胞の後代を含む。大量の利用可能かつ周知の宿主細胞のいずれも本発明の実践に用いてよい。特定宿主の選択は、当技術分野において認識された、いくつかの要因に依存する。これらの要因としては、例えば、選択した発現ベクターとの適合性、ＤＮＡ分子によりコードされたペプチド毒性、形質転換率、ペプチド回収の容易さ、発現特徴、生体安全性および費用が挙げられる。これらの要因のバランスは、必ずしもすべての宿主が特定のＤＮＡ配列の発現のために同様に効果的ではない場合があることの理解を伴わなければならない。これらの一般的なガイドライン内で、培養に有用な微生物宿主細胞としては、細菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｓｐ．など）、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．など）および他の真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、哺乳類（ヒトを含む）細胞、例えば、ＣＨＯ細胞およびＨＥＫ−２９３細胞が挙げられる。同様に、ＤＮＡレベルで修飾を行うことができる。ペプチドコードＤＮＡ配列は、選択した宿主細胞とより適合するコドンに置換し得る。Ｅ．  ｃｏｌｉにおいて、至適化コドンは当技術分野において知られている。コドンは置換して、制限部位を除去するかまたはサイレント制限部位を含むことができ、これは選択した宿主細胞内でＤＮＡプロセスを補助し得る。次に、形質転換した宿主を培養して精製する。宿主細胞は、従来の発酵条件下で所望の化合物が発現するように培養し得る。かかる発酵条件は当技術分野において周知である。
【００４０】
「トランスフェクション」という用語は、細胞による外来または外因性ＤＮＡの取り込みを意味し、外因性ＤＮＡが細胞膜内に導入されている場合、細胞は「トランスフェクト」されている。いくつかのトランスフェクション技術が当技術分野において周知であり、本明細書に開示されている。例えば、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７３，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：４５６；  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：上記Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；  Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８６，  Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ；  Ｃｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８１，  Ｇｅｎｅ  １３：１９７を参照されたい。かかる技術は１つまたは複数の外因性ＤＮＡの一部を適切な宿主細胞内に導入するために使用できる。
【００４１】
「形質転換」という用語は、細胞の遺伝的特性の変化を指し、新規ＤＮＡまたはＲＮＡを含むように修飾されている場合、細胞は形質転換されている。例えば、トランスフェクション、形質導入、または他の技術を介して新規遺伝的物質を導入することによりその天然状態から遺伝的に修飾されている場合、細胞は形質転換されている。トランスフェクションまたは形質導入後、ＤＮＡの形質転換は、細胞の染色体内へ物理的に統合することにより細胞のそれと組換えしてもよいし、複製せずにエピソームエレメントとして一時的に維持してもよいし、またはプラスミドとして独立して複製してもよい。ＤＮＡの形質転換が細胞分割なしに複製される場合、細胞は「安定的に形質転換している」とみなされる。
【００４２】
合成物の「生理的許容可能な塩」、例えば抗原結合タンパク質（抗体など）の塩とは、医薬上許容可能であることが既知であるかもしくは医薬上許容可能であることが後日見出される任意の塩を意味する。製薬上許容可能な塩の一部の非制限的な例は、酢酸塩；トリフルオロ酢酸塩；ハロゲン化水素（塩酸塩および臭化水素酸塩など）；硫酸塩；クエン酸塩；マレイン酸塩；酒石酸塩；グリコール酸塩；グルコン酸塩；コハク酸塩；メシル酸塩；ベシル酸塩；没食子酸エステル塩（没食子酸は、３，４，５トリヒドロキシ安息香酸としても既知である）、例えば、ペンタガロイルグルコース（ＰＧＧ）および没食子酸エピガロカテキン（ＥＧＣＧ）、コレステリル硫酸塩、パモ酸塩、タンニン酸塩ならびにシュウ酸塩である。
【００４３】
（本明細書で同義的に使用する）タンパク質の「ドメイン」または「領域」とは、タンパク質全体の任意の一部であり、完全なタンパク質も含むが、典型的には不完全なタンパク質を含む。ドメインは、残りのタンパク質鎖と独立して折畳まれることができるおよび／または特定の生物学的、生化学的、もしくは構造的機能もしくは位置（例えば、リガンド結合ドメイン、または細胞基質、経膜もしくは細胞外ドメイン）と相関し得るが必須ではない。
【００４４】
「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「処置（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」とは、障害病理の発現または改変を予防することを意図して実施した介入である。したがって、「処置」は、治療的処置と予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ  ｏｒ  ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）法の両方を指す。処置を必要としているものとしては、既に障害を呈するものならびに障害を予防すべきものが挙げられる。「処置」は、任意の客観的または主観的変数（例えば、症状の軽減；寛解；減少または患者に対してより耐性の損傷、病理もしくは状態の生成；変性速度もしくは低減速度の遅延化；衰弱の少ない最終時点での変性；患者の身体的もしくは精神健康状態の改善を含む）、損傷、病理または状態の改善における成功の任意の適応を含む。症状の処置または改善は客観的変数に基づくこともでき主観的変数に基づくこともできる（身体検査結果、患者による自己報告、精神神経検査、および／または精神医学的評価を含む）。
【００４５】
「有効量」とは、一般に、症状の重症度および／もしくは頻度を減らす、症状および／もしくは原病因を除く、症状および／もしくはそれらの原病因の発現の予防、ならびに／または片頭痛に起因するか片頭痛と関連する損傷の改善（ｉｍｐｒｏｖｅ）もしくは改善（ｒｅｍｅｄｉａｔｅ）する上で十分な量である。いくつかの実施形態では、有効量は、治療有効量または予防的有効量である。「治療有効量」とは、疾患状態（例えば、移植拒絶反応またはＧＶＨＤ、炎症、多発性硬化症、癌、糖尿病、ニューロパシー、疼痛）または症状（１つまたは複数）、特に疾患状態と関連した状態もしくは症状（１つまたは複数）の治療、あるいは疾患状態もしくは疾患と関連した他の任意の望ましくない症状を何らかの形で予防する、妨害する、遅延または逆進行させる（すなわち、「治療効果」を提供する）上で十分な量である。「予防的有効量」とは、対象に投与時、意図した予防効果を有する医薬組成物の量、例えば、片頭痛もしくは多発性硬化症の症状の発現（または再発）を予防もしくは遅延化する、または片頭痛、片頭痛症状、もしくは多発性硬化症症状の発現（または再発）の可能性を低減する。完全な治療または予防効果は必ずしも１回の投与で現れる必要はなく、一連の用量の投与後のみに現れてもよい。したがって、治療的または予防的有効量は、１回または複数回投与してよい。
【００４６】
治療目的の「哺乳類」とは、哺乳類として分類される任意の動物を指し、ヒト、家畜、農場動物、および動物園の動物、スポーツ動物、または飼育動物（イヌ、ウマ、ネコ、雌牛、ラット、マウス、サルなど）が挙げられる。好ましくは、哺乳類はヒトである。
【００４７】
生物学的物質（ポリペプチド、核酸、宿主細胞など）に関連して本明細書を通して使用する「天然」という用語は、天然で見出される物質を指す。
【００４８】
「抗体」、または同義的に「Ａｂ」という用語は、最も広義に使用し、完全に組み立てられた抗体、モノクローナル抗体（ヒト、ヒト化またはキメラ抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、および所望の生体活性を示す限り前述の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗原（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単鎖抗体、ダイアボディ）に結合できる抗体断片を含む。化学的に誘導体化された抗体を含む、インタクト分子および／または断片の多量体または会合体を意図する。ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ならびにＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含む、任意のアイソタイプクラスもしくはサブクラスの抗体、または任意のアロタイプを意図する。異なるアイソタイプは異なるエフェクター機能を有する；例えば、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３アイソタイプは抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を有する。
【００４９】
「抗原結合タンパク質」（ＡＢＰ）という用語は、上に定義した抗体または抗体断片、所望の抗原結合特性を有するＣＤＲに由来する配列を含む組換えペプチドまたは他の化合物を含む。
【００５０】
通常、抗原結合タンパク質（例えば、抗体または抗体断片）は、類似の結合アッセイ条件下における他の未関連タンパク質に対する親和性と比較して、抗原（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）またはジニトロフェノール（ＤＮＰ））に対して有意に高い結合親和性を有する場合、抗原に「特異的に結合する」、およびその結果、その抗原を識別できる。典型的には、抗原結合タンパク質は、解離定数（ＫＤ）が≦１０−８Ｍである場合、その標的抗原に「特異的に結合する」と言及される。抗体はＫＤが≦５×１０−９Ｍである場合「高親和性」で抗原と特異的に結合し、ＫＤが≦５×１０−１０Ｍである場合「非常に高親和性」で抗原と特異的に結合する。１つの実施形態では、抗体はＫＬＨまたはＤＮＰに約１０−８Ｍ〜１０−１０ＭのＫＤで結合し、さらに別の実施形態では、抗体はＫＤ≦５×１０−９で結合する。
【００５１】
「抗原結合領域」または「抗原結合部位」とは、特異的な抗原（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）またはジニトロフェノール（ＤＮＰ））と特異的に結合するタンパク質の一部を意味する。例えば、抗原と相互作用するアミノ酸残基を含み、抗原結合タンパク質上で抗原に対するその特異性および親和性を付与する抗原結合タンパク質の一部は、「抗原結合領域」と呼ぶ。典型的には抗原結合領域は１つまたは複数の「相補性結合領域」（「ＣＤＲ」）を含む。ある抗原結合領域は、１つまたは複数の「フレームワーク」領域（「ＦＲ」）も含む。「ＣＤＲ」とは、抗原結合特異性および親和性に役立つアミノ酸配列である。「フレームワーク」領域は、適切なＣＤＲ立体構造の維持を補助して抗原結合領域と抗原との間の結合を促進することができる。
【００５２】
「単離」抗体とは、自然環境、またはその抗体が産生細胞により分泌されている培養基の１つもしくは複数成分から同定され、分離されている抗体である。自然環境または培地の「汚染」成分とは、抗体の診断的または治療的使用を妨害し得る物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質様または非タンパク質様溶質を含み得る。いくつかの実施形態では、（１）抗体の９５重量％を超えるまで、最も好ましくは９９重量％を超えるまで、または（２）任意選択的に染色（例えば、クーマシーブルーまたは銀染色）を用いた還元もしくは非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均一性が得られるまで、抗体を精製する。単離された天然抗体には、抗体の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、組換え細胞内の原位置抗体が含まれる。しかしながら、典型的には、単離抗体は、少なくとも１つの精製工程により調製される。
【００５３】
本明細書で使用する「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体集団から得られる抗体を指す。すなわち、集団を成す個々の抗体は、少量で存在し得る潜在的な天然の変異を除き同一である。モノクローナル抗体は非常に特異的であり、個々の抗原部位またはエピトープを指向とし、典型的には、異なるエピトープを指向とする異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物と対照的である。モノクローナル抗体の例としては、マウス、ウサギ、ラット、ニワトリ、キメラ、ヒト化、またはヒト抗体、完全に組み立てられた抗体、多重特異性抗体（二重特異性抗体を含む）、抗原に結合できる抗体断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単鎖抗体、ダイアボディを含む）、マキシボディ、ナノボディ、ならびに所望の生体活性を示す限り前述のＣＤＲを含む組換えペプチド、またはその変異体もしくは誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５４】
修飾「モノクローナル」とは、実質的に均一な抗体集団から得られる抗体特性を示し、任意の特定の手段による抗体産生を必要とするものとは解釈されない。例えば、本発明に従って用いるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２５６：４９５  ［１９７５］により最初に記載されたハイブリドーマ方法によって作製してもよいし、組換えＤＮＡ方法によって作製してもよい（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）。「モノクローナル抗体」は、例えばＣｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８［１９９１］  ａｎｄ  Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２２２：５８１−５９７  （１９９１）に記載の技術を用いてファージ抗体ライブラリーからも単離し得る。
【００５５】
「多重特異性」結合剤または抗原結合タンパク質または抗体は、複数の抗原またはエピトープを標的とするものである。
【００５６】
「二重特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）」、「二重特異性（ｄｕａｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）」または「二機能性」結合剤または抗原結合タンパク質または抗体は、２つの異なる抗原結合部位を有するハイブリッドである。二抗原結合タンパク質、抗原結合タンパク質および抗体は、多抗原結合タンパク質、抗原結合タンパク質または多重特異性抗体の種であり、ハイブリドーマ融合またはＦａｂ’断片の連結が挙げられるが、これらに限定されない様々な方法により産生し得る。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ  ａｎｄ  Ｌａｃｈｍａｎｎ，  １９９０，  Ｃｌｉｎ．  Ｅｘｐ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ７９：３１５−３２１；  Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４８：１５４７−１５５３を参照されたい。二重特異性抗原結合タンパク質または抗体の２つの結合部位は、２つの異なるエピトープに結合し、これらは同じタンパク質標的上に備わっていてもよいし、異なるタンパク質標的上に備わっていてもよい。
【００５７】
「免疫グロブリン」という用語は、それぞれ軽鎖（ＬＣ）に共有結合している２本の二量体重鎖（ＨＣ）；単一の非二量体化免疫グロブリン重鎖および共有結合した軽鎖（ＨＣ＋ＬＣ）、またはキメラ免疫グロブリン（軽鎖＋重鎖）−Ｆｃヘテロ三量体（いわゆる「ヘミボディ」）を含む完全抗体を包含する。
【００５８】
「抗体」は、四量体糖タンパク質である。天然抗体の場合、各四量体は同じ２組のポリペプチド鎖からなり、各組は約２２０個のアミノ酸（約２５ｋＤａ）の１本の「軽」鎖および約４４０個のアミノ酸（約５０〜７０ｋＤａ）の１本の「重」鎖を有する。各鎖のアミノ末端部分には、抗原認識に主に関与する約１００〜１１０個以上のアミノ酸の「可変」（「Ｖ」）領域が含まれる。各鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能に関与する定常領域を規定する。可変領域は異なる抗体間で異なる。定常領域は異なる抗体間で同一である。各重鎖または軽鎖の可変領域には、抗体の抗原特異性を決定する上で役立つ３つの超可変小領域がある。超可変領域の間の可変ドメイン残基はフレームワーク残基と呼ばれ、一般に、異なる抗体間で、ある程度相同である。免疫グロブリンは、重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて異なるクラスに割り当てることができる。ヒト軽鎖は、カッパ（κ）とラムダ（λ）軽鎖に分類される。軽鎖および重鎖内で、可変および定常領域は、アミノ酸約１０個以上の「Ｄ」領域も含む重鎖と共に、アミノ酸約１２個以上の「Ｊ」領域により結合している。概論については、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｃｈ．  ７  （Ｐａｕｌ，  Ｗ．，  ｅｄ．，  ２ｎｄ  ｅｄ．  Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎ．Ｙ．  （１９８９））を参照されたい。本発明の範囲内における「抗体」は、組換え産生抗体、およびグリコシル化を欠いた抗体も包含する。
【００５９】
「軽鎖」または「免疫グロブリン軽鎖」という用語は、完全長軽鎖および結合特異性を付与する上で十分な可変領域配列を有するその断片を含む。完全長軽鎖は可変領域ドメインであるＶＬと定常領域ドメインであるＣＬを含む。軽鎖の可変領域ドメインは、ポリペプチドのアミノ末端である。軽鎖はκ鎖とλ鎖を含む。
【００６０】
「重鎖」または「免疫グロブリン重鎖」という用語は、完全長重鎖および結合特異性を付与する上で十分な可変領域配列を有するその断片を含む。完全長重鎖は可変領域ドメインであるＶＨ、および３つの定常領域ドメインであるＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む。ＶＨドメインはポリペプチドのアミノ末端、ＣＨドメインはカルボキシル末端にあり、ＣＨ３がポリペプチドのカルボキシ末端に最も近い。重鎖は、ミュー（μ）、デルタ（δ）、ガンマ（γ）、アルファ（α）、およびエプシロン（ε）に分類され、抗体のアイソタイプはそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥとして定義する。本発明の分離する実施形態では、重鎖は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４サブタイプを含む）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２サブタイプを含む）、ＩｇＭおよびＩｇＥを含む任意のアイソタイプであり得る。これらのうちのいくつかは、さらにサブクラスまたはアイソタイプ、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２に分類し得る。異なるＩｇＧアイソタイプは、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞障害性（ＣＤＣ）などの（Ｆｃ領域媒介性の）異なるエフェクター機能を有し得る。ＡＤＣＣでは、抗体のＦｃ領域は免疫エフェクター細胞（天然キラーおよびマクロファージなど）の表面上のＦｃ受容体（ＦｃγＲｓ）に結合し、標的細胞の貪食または溶解に至る。ＣＤＣ内で、抗体は相補性カスケードを細胞表面上に惹起することにより標的細胞を殺傷する。
【００６１】
「Ｆｃ領域」、または本明細書で同義的に使用する「Ｆｃドメイン」もしくは「免疫グロブリンＦｃドメイン」は、完全抗体が抗体のＣＨ１およびＣＨ２ドメインを含む２本の重鎖断片を含む。２本の重鎖断片は、２つ以上のジスルフィド結合によりおよびＣＨ３ドメインの疎水性相互作用により結合している。
【００６２】
「サルベージ受容体結合エピトープ」という用語は、ＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）のインビボ血清半減期の増加に関与するＩｇＧ分子のＦｃ領域のエピトープを指す。
【００６３】
「アロタイプ」は、ヒトにおいて免疫原性であり得、特異的対立遺伝子によりコードされ得る、しばしば、定常領域における抗体配列のバリエーションである。アロタイプは５つのヒトＩＧＨＣ遺伝子（ＩＧＨＧ１、ＩＧＨＧ２、ＩＧＨＧ３、ＩＧＨＡ２およびＩＧＨＥ遺伝子）について同定されており、それぞれＧ１ｍ、Ｇ２ｍ、Ｇ３ｍ、Ａ２ｍ、およびＥｍアロタイプとして命名されている。少なくとも１８個のＧｍアロタイプ：ｎＧ１ｍ（１）、ｎＧ１ｍ（２）、Ｇ１ｍ（１、２、３、１７）またはＧ１ｍ（ａ、ｘ、ｆ、ｚ）、Ｇ２ｍ（２３）またはＧ２ｍ（ｎ）、Ｇ３ｍ（５、６、１０、１１、１３、１４、１５、１６、２１、２４、２６、２７、２８）またはＧ３ｍ（ｂ１、ｃ３、ｂ５、ｂ０、ｂ３、ｂ４、ｓ、ｔ、ｇ１、ｃ５、ｕ、ｖ、ｇ５）が知られている。Ａ２ｍ（１）とＡ２ｍ（２）の２つのＡ２ｍアロタイプがある。
【００６４】
抗体の構造および生成の詳細な説明については、Ｒｏｔｈ，  Ｄ．Ｂ．，  ａｎｄ  Ｃｒａｉｇ，  Ｎ．Ｌ．，  Ｃｅｌｌ，  ９４：４１１−４１４  （１９９８）を参照されたい（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。簡単に述べると、重鎖および軽鎖の免疫グロブリン配列をコードするＤＮＡの生成プロセスは主に成長するＢ細胞内で起こる。各種免疫グロブリン遺伝子セグメント（Ｖ、Ｄ、Ｊおよび定常（Ｃ）遺伝子セグメント）は、再編成および結合の前に、単一染色体上で一般に比較的近接して見出される。Ｂ細胞の分化中、Ｖ、Ｄ、Ｊ（または軽鎖遺伝子の場合はＶおよびＪのみ）遺伝子セグメントの適切な各ファミリーメンバーの１つは、重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子の機能的に再編成された可変領域を形成するように組換えられる。この遺伝子セグメントの再編成プロセスは、順次的であると考えられる。まず、重鎖Ｄ−Ｊ結合が作製され、次いで、重鎖Ｖ−ＤＪ結合および軽鎖Ｖ−Ｊ結合が作製される。Ｖ、ＤおよびＪセグメントの再編成に加えて、軽鎖中のＶとＪセグメントの結合位置および重鎖中のＤとＪセグメントの結合位置で異なる組換えの故に、免疫グロブリン重鎖と軽鎖の一次レパートリーにおいてさらなる多様性が生じた。典型的には、軽鎖内のかかる変化はＶ遺伝子セグメントの最終コドンおよびＪセグメントの第一コドン内で起こる。結合における類似の不正確性はＤとＪＨセグメント間の重鎖染色体上で生じ、ヌクレオチド１０個分ほど伸張し得る。さらに、ゲノムＤＮＡによってコードされないいくつかのヌクレオチドをＤとＪＨの間およびＶＨとＤ遺伝子セグメントの間に挿入し得る。これらのヌクレオチドの添加は、Ｎ領域の多様性として知られている。可変領域遺伝子セグメントにおけるかかる再編成およびかかる結合中に生じ得る可変組換えによる最終的な結果は、一次抗体レパートリーの産生である。
【００６５】
「超可変」領域という用語は、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、相補性決定領域またはＣＤＲ由来のアミノ酸残基［すなわちＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  ５ｔｈ  Ｅｄ．  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  Ｍｄ．  （１９９１）により記載の、軽鎖可変ドメイン中の残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメイン中の３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）および９５〜１０２（Ｈ３）］を含む。単一ＣＤＲさえも、全ＣＤＲを含む完全抗原結合部位より低い親和性ではあるが、抗原を認識して抗原と結合し得る。
【００６６】
超可変「ループ」からの残基の代替的な定義は、軽鎖可変ドメイン中の残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）および９１〜９６（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメイン中の２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）および９６〜１０１（Ｈ３）として、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  １９６：  ９０１−９１７  （１９８７）により記載されている。
【００６７】
「フレームワーク」すなわち「ＦＲ」残基は、超可変領域残基以外の可変領域残基である。
【００６８】
「抗体断片」は、インタクトな完全長抗体の一部分、好ましくはインタクト抗体の抗原結合領域または可変領域を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片；ダイアボディ；線状抗体（Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，８（１０）：１０５７−１０６２  （１９９５））；単鎖抗体分子；ならびに抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。
【００６９】
抗体のパパイン消化は、それぞれ単一の抗原結合部位、および定常領域を含む残りの「Ｆｃ」断片を有する、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片を産生する。Ｆａｂ断片はすべての可変ドメイン、ならびに軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第一定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆｃ断片は炭水化物を示し、あるクラスの抗体を別のものと区別する多くの抗体エフェクター機能（結合相補性および細胞受容体など）に関与する。
【００７０】
ペプシン処置は、抗体のＶＨおよびＶＬドメイン（これらのドメインは、単一ポリペプチド鎖に存在する）を含む２つの「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片を有するＦ（ａｂ’）２断片を得る。Ｆａｂ断片は、抗体ヒンジ領域の１つまたは複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に追加残基を数個含んでいる点でＦａｂ’断片と異なる。好ましくは、Ｆｖポリペプチドは、Ｆｖが抗原結合のために所望の構造を形成することを可能にするポリペプチドリンカーをＶＨとＶＬドメインの間にさらに含む。ｓｃＦｖの総説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  ｖｏｌ．  ｌ  １３，  Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ｐｐ．  ２６９−３１５  （１９９４）を参照されたい。
【００７１】
「Ｆａｂ断片」は、１本の軽鎖ならびに１本の重鎖のＣＨ１および可変領域を含む。Ｆａｂ分子の重鎖は別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成できない。
【００７２】
「Ｆａｂ’断片」は、２つのＦａｂ’断片の２本の重鎖の間で鎖間ジスルフィド結合を形成してＦ（ａｂ’）２分子を形成できるように、１本の軽鎖ならびにＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを含む１本の重鎖の一部、ならびにＣＨ１とＣＨ２ドメインの間の領域も含む。
【００７３】
「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、２本の重鎖の間で鎖間ジスルフィド結合が形成されるように、ＣＨ１とＣＨ２ドメインの間に定常領域部分を含む２本の軽鎖と２本の重鎖を含む。したがって、Ｆ（ａｂ’）２断片は、２本の重鎖の間でジスルフィド結合により結合した２つのＦａｂ’断片からなる。
【００７４】
「Ｆｖ」とは、完全な抗原認識および結合部位を含む最小の抗体断片である。この領域は、密接に非共有結合した１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。これはその配置において、各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用して、ＶＨＶＬ二量体表面上の抗原結合部位を規定している。単一の可変ドメイン（または抗原特異的なＣＤＲを３つのみ含む、Ｆｖの半分）は、完全結合部位よりも低い親和性ではあるが、抗原を認識して抗原と結合する能力を有する。
【００７５】
「単鎖抗体」は、重鎖および軽鎖可変領域が可動性リンカーにより接続して単一ポリペプチド鎖を形成し、抗原結合領域を形成するＦｖ分子である。単鎖抗体は、国際特許第ＷＯ８８／０１６４９号ならびに米国特許第４，９４６，７７８号および同第５，２６０，２０３号に詳細に論じられており、これらの開示は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００７６】
「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、ここでこれらのドメインは単一ポリペプチド鎖に存在し、任意選択的に、Ｆｖが抗原結合のために所望の構造を形成することを可能にするポリペプチドリンカーをＶＨとＶＬドメインの間に含む。（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６，  １９８８，  ａｎｄ  Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３，  １９８８）。「Ｆｄ」断片は、ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなる。
【００７７】
「ダイアボディ」という用語は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片を指し、この断片は、同じポリペプチド鎖（ＶＨＶＬ）内で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同鎖上で２つのドメイン間の対を形成させるには短すぎるリンカーを用いることによって、ドメインを別の鎖の相補性ドメインと強制的に対形成させて２つの抗原結合部位を作製する。ダイアボディについては、例えば、欧州特許第４０４，０９７号；ＷＯ９３／１１１６１号；ならびにＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９０：６４４４−６４４８  （１９９３）により更に詳細に記載されている。
【００７８】
「ドメイン抗体」とは、重鎖の可変領域または軽鎖の可変領域のみを含む免疫学的機能性免疫グロブリン断片である。一部の場合では、２つ以上のＶＨ領域がペプチドリンカーで共有結合して２価ドメイン抗体を作製する。２価ドメイン抗体の２つのＶＨ領域は同じ抗原を標的としてもよいし異なる抗原を標的としてもよい。
【００７９】
「競合」という用語は、同じエピトープと競合する抗原結合タンパク質（例えば、抗原結合タンパク質を中和するまたは抗体を中和する）の文脈に使用する場合、試験下の抗原結合タンパク質（例えば、抗体またはその免疫学的機能性断片）が共通抗原（例えば、ＫＬＨもしくはその断片、またはＤＮＰ）に対する参照抗原結合タンパク質（例えば、リガンド、または参照抗体）の特異的結合を防止または阻害するアッセイにより決定される抗原結合タンパク質の間の競合を意味する。幾多のタイプの競合的結合アッセイ、例えば：固体相直接または間接放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、固体相直接または間接酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（例えば、Ｓｔａｈｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８３，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ９：２４２−２５３を参照されたい）；固体相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（例えば、Ｋｉｒｋｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８６，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３７：３６１４−３６１９を参照されたい）、固体相直接標識アッセイ、固体相直接標識サンドイッチアッセイ（例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，  １９８８，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい）；Ｉ−１２５標識を用いた固体相直接標識ＲＩＡ（例えば、Ｍｏｒｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８，  Ｍｏｌｅｃ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２５：７−１５を参照されたい）；固体相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（例えば、Ｃｈｅｕｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７６：５４６−５５２を参照されたい）；ならびに直接標識ＲＩＡ（Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０，  Ｓｃａｎｄ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３２：７７−８２）を使用できる。典型的には、かかるアッセイは、固体表面、または非標識試験抗原結合タンパク質および標識参照抗原結合タンパク質のいずれかを有する細胞へ結合した精製抗原の使用に関わる。競合的阻害は、試験抗原結合タンパク質の存在下で固体表面または細胞へ結合した標識量を決定することにより測定する。通常、試験抗原結合タンパク質は、過剰に存在する。競合アッセイにより同定された抗原結合タンパク質（競合抗原結合タンパク質）は、参照抗原結合タンパク質および生じる立体障害のための参照抗原結合タンパク質により結合したエピトープに十分に近位の隣接エピトープへ結合する抗原結合タンパク質と同じエピトープへ結合する抗原結合タンパク質を含む。競合的結合の決定方法に関する詳細を本明細書の実施例に提示する。通常、競合抗原結合タンパク質が過剰に存在する場合、参照抗原結合タンパク質の共通抗原に対する特異的結合を少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％または７５％阻害する。一部の場合では、結合は少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９７％以上阻害される。
【００８０】
「抗原」という用語は、抗原結合タンパク質（例えば、抗体またはその免疫学的機能性断片を含む）などの選択的結合剤により結合でき、追加的にその抗原へ結合できる抗体を産生するために動物において使用できる分子または分子の一部を指す。抗原は、異なる抗原結合タンパク質（例えば、抗体）と相互作用し得る１つまたは複数のエピトープを有し得る。
【００８１】
「ＤＮＰ」または「ジニトロフェノール」という用語は、本明細書で同義的に使用し、抗原２，４−ジニトロフェノールを示す。「抗ＤＮＰ」または「αＤＮＰ」または「ａＤＮＰ」は、本明細書で同義的に使用し、ＤＮＰに特異的に結合する抗原結合タンパク質（例えば、抗体または抗体断片）を指す。
【００８２】
「ＫＬＨ」または「キーホールリンペットヘモシアニン」という用語は、本明細書で同義的に使用し、Ｉｍｊｅｃｔ（商標）海中養殖キーホールリンペットヘモシアニン（ｍｃＫＬＨ；  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  ＩＬ）を示す。製造業者に従い、ｍｃＫＬＨを、野生型集団から抽出するのではなく、海中養殖で増殖するｍｏｌｌｕｓｋ  Ｍｅｇａｔｈｕｒａ  ｃｒｅｎｕｌａｔａ（キーホールリンペット）の選択集団から回収する；ＫＬＨは高分子質量（３５０および３９０ｋＤａサブユニットの混合した会合体４．５×１０５〜１．３×１０７ダルトン）を有し、ＢＳＡまたはオボアルブミンよりも強い免疫応答を引き出す。「抗ＫＬＨ」または「αＫＬＨ」または「aＫＬＨ」は、本明細書で同義的に使用し、ＫＬＨに特異的に結合する抗原結合タンパク質（例えば、抗体または抗体断片）を指す。
【００８３】
「エピトープ」という用語は、抗原結合タンパク質（例えば、抗体）により結合している分子の一部である。この用語は、抗原結合タンパク質（抗体など）またはＴ細胞受容体に特異的に結合できる任意の決定因子を含む。エピトープは連続的であることもでき、非連続的であることもできる（例えば、単鎖ポリペプチドにおいて、ポリペプチド配列において互いに連続していないが分子の文脈においてアミノ酸残基は抗原結合タンパク質により結合している）。ある実施形態では、エピトープは、抗原結合タンパク質を産生するために使用するエピトープに類似の３次元構造を含むが、抗原結合タンパク質を産生するために使用するエピトープ中に見出されるアミノ酸残基がないか一部しかない点で模倣物であり得る。ほとんどの場合、エピトープはタンパク質上に備わっているが、一部の場合では、他の種類の分子（核酸など）上に備わっている場合がある。エピトープ決定は、分子の化学的に活性な表面群（アミノ酸、糖側鎖、ホスホリルまたはスルホニル基など）を含み得、特異的３次元構造特性、および／または特異的電荷特性を有し得る。一般に、特定の標的抗原に特異的な抗体は、タンパク質および／または巨大分子の複合混合物における標的抗原上のエピトープを選択的に認識する。
【００８４】
「同一性」という用語は、配列を整列および比較して決定した２つ以上のポリペプチド分子または２つ以上の核酸分子の配列間の関係を指す。「同一率」とは、比較分子におけるアミノ酸またはヌクレオチド間の同一残基％を意味し、比較する分子の最小サイズに基づき算出する。これらの算出において、（もしあれば）整列内のギャップは、特定の数学的モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち、「アルゴリズム」）により対応されなければならない。整列した核酸またはポリペプチドの同一性を算出するために使用できる方法としては、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  （Ｌｅｓｋ，  Ａ．  Ｍ．，  ｅｄ．），  １９８８，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；  Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，  （Ｓｍｉｔｈ，  Ｄ．  Ｗ．，  ｅｄ．），  １９９３，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，  Ｐａｒｔ  Ｉ，  （Ｇｒｉｆｆｉｎ，  Ａ．  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，  Ｈ．  Ｇ．，  ｅｄｓ．），  １９９４，  Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ：  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；  ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，  Ｇ．，  １９８７，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，  （Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，  Ｍ．  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，  Ｊ．，  ｅｄｓ．），  １９９１，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｍ．  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ；ならびにＣａｒｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８，  ＳＩＡＭ  Ｊ．  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．  ４８：１０７３に記載のものが挙げられる。例えば、配列同一性は、２つのポリペプチドのアミノ酸の位置における類似性を比較するために一般的に用いる標準的な方法により決定できる。ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡなどのコンピュータプログラムを用いて、（完全長の片方もしくは両方の配列、または所定部分の片方もしくは両方の配列のいずれかと共に）２つのポリペプチドまたは２つのポリヌクレオチド配列を各残基の至適適合のために整列する。これらのプログラムは初期設定オープニングペナルティおよび初期設定ギャップペナルティを提供し、スコアリング行列、例えばＰＡＭ２５０［標準的なスコアリング行列；Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  ｖｏｌ．  ５，  ｓｕｐｐ．  ３  （１９７８）を参照されたい］をコンピュータプログラムと連結して使用できる。次いで例えば、同一率を、適合範囲内の長い方の配列の同一適合総数に１００を乗じてから、配列の長さ合計および２つの配列を整列するために長い方の配列内に導入したギャップ数で割って算出できる。同一率の算出において、比較する配列は、配列間の適合度が最も高くなる方法で整列する。
【００８５】
ＧＣＧプログラムパッケージは、同一率を決定するために使用できるコンピュータプログラムであり、このパッケージにはＧＡＰが含まれる（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８４，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  １２：３８７；  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）。コンピュータアルゴリズムＧＡＰは、配列同一率を決定する２つのポリペプチドまたは２つのポリヌクレオチドを整列するために使用する。配列の各アミノ酸またはヌクレオチドの至適適合（アルゴリズムにより決定した「適合範囲」）のために配列を整列する。ギャップオープニングペナルティ（３×平均対角として算出する。「平均対角」とは、使用されている比較行列の対角の平均である；「対角」とは特定の比較行列によるそれぞれの完全なアミノ酸適合に割り当てられるスコアまたは数である）およびギャップ伸長ペナルティ（通常、ギャップオープニングペナルティの１０分の１倍）、ならびに比較行列（ＰＡＭ２５０またはＢＬＯＳＵＭ６２など）を、アルゴリズムと連結して用いる。ある実施形態では、標準的な比較行列（ＢＬＯＳＵＭ６２比較行列については、Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７８，  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５：３４５−３５２  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＰＡＭ  ２５０  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｍａｔｒｉｘ；  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８９：１０９１５−１０９１９を参照されたい）もアルゴリズムにより使用する。
【００８６】
ＧＡＰプログラムを用いたポリペプチドまたはヌクレオチド配列の同一率決定のための推奨変数は、以下を含む。
アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７０，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：４４３−４５３；
比較行列：上記Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２のＢＬＯＳＵＭ６２；
ギャップペナルティ：１２（ただし、末端ギャップペナルティなし）
ギャップ長ペナルティ：４
類似性の閾値：０
【００８７】
２つのアミノ酸配列を整列するためのある整列体系により、２つの配列の短い領域のみが適合し得、この整列した狭い領域は、２つの完全長配列間に有意な関連性はなくとも非常に高い配列同一性を有し得る。したがって、選択した整列方法（ＧＡＰプログラム）は、所望の場合、標的ポリペプチドの少なくとも５０個の連続アミノ酸範囲を整列させるように調整できる。
【００８８】
「修飾」という用語は、本発明の抗原結合タンパク質（抗体および抗体断片を含む）に関連して使用する場合、１つまたは複数のアミノ酸変化（置換、挿入または欠失を含む）；化学修飾；治療薬もしくは診断薬への接合による共有結合修飾；（例えば、放射性核種または各種酵素による）標識化；ＰＥＧ化などのポリマー共有結合（ポリエチレングリコールによる誘導体化）ならびに非天然アミノ酸の化学合成による挿入もしくは置換が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の修飾抗原結合タンパク質は本発明の非修飾分子の結合特性を保持する。
【００８９】
「誘導体」という用語は、本発明の抗原結合タンパク質（抗体および抗体断片を含む）に関連して使用する場合、治療薬もしくは診断薬への接合による共有結合修飾、（例えば、放射性核種または各種酵素による）標識化、ＰＥＧ化などのポリマー共有結合（ポリエチレングリコールによる誘導体化）ならびに非天然アミノ酸の化学合成による挿入もしくは置換が行われた抗原結合タンパク質を指す。本発明の誘導体は、本発明の非誘導体化分子の結合特性を保持する。
【００９０】
抗原結合タンパク質の免疫グロブリン実施形態
完全長の免疫グロブリン軽鎖および重鎖では、可変および定常領域は、アミノ酸が約１０個多い「Ｄ」領域も含む重鎖とアミノ酸約１２個以上の「Ｊ」領域により結合している。例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ２ｎｄ  ｅｄ．，  Ｃｈ．  ７  （Ｐａｕｌ，  Ｗ．，  ｅｄ．）  １９８９，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい（すべての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。各軽鎖／重鎖ペアの可変領域は典型的には抗原結合部位を形成する。
【００９１】
ヒトＩｇＧ２重鎖（ＨＣ）定常ドメインの１例は、アミノ酸配列：
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ／／配列番号８６を有する。
【００９２】
本発明の抗原結合タンパク質の組換えバージョンを作製するための他のＩｇＧアイソタイプの定常領域配列（所望の場合、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４免疫グロブリンアイソタイプを有する）は、当技術分野において知られている。通常、ヒトＩｇＧ２はエフェクター機能が所望されない対象に使用でき、ヒトＩｇＧ１はかかるエフェクター機能（例えば、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ））が望ましい状態において使用できる。ヒトＩｇＧ３の半減期は比較的短く、ヒトＩｇＧ４は抗体「半分子」を形成する。ヒトＩｇＧ１には４つの既知のアロタイプがある。好ましいアロタイプは「ｈＩｇＧ１ｚ」と呼ばれ、「ＫＥＥＭ」アロタイプとしても知られている。ヒトＩｇＧ１アロタイプ「ｈＩｇＧ１ｚａ」（ＫＤＥＬ）、「ｈＩｇＧ１ｆ」（ＲＥＥＭ）、および「ｈＩｇＧ１ｆａ」も有用である；すべて、ＡＤＣＣエフェクター機能を有すると考えられる。
【００９３】
ヒトｈＩｇＧ１ｚ重鎖（ＨＣ）定常ドメインは、アミノ酸配列：
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ／／配列番号８７を有する。
【００９４】
ヒトｈＩｇＧ１ｚａ重鎖（ＨＣ）定常ドメインは、アミノ酸配列：
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ／／配列番号８８を有する。
【００９５】
ヒトｈＩｇＧ１ｆ重鎖（ＨＣ）定常ドメインは、アミノ酸配列：
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ／／配列番号８９を有する。
【００９６】
ヒトｈＩｇＧ１ｆａ重鎖（ＨＣ）定常ドメインは、アミノ酸配列：
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ／／配列番号９０を有する。
【００９７】
ヒト免疫グロブリン軽鎖（ＬＣ）定常領域配列の１例は、以下：
ＧＱＰＫＡＮＰＴＶＴＬＦＰＰＳＳＥＥＬＱＡＮＫＡＴＬＶＣＬＩＳＤＦＹＰＧＡＶＴＶＡＷＫＡＤＧＳＰＶＫＡＧＶＥＴＴＫＰＳＫＱＳＮＮＫＹＡＡＳＳＹＬＳＬＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳＹＳＣＱＶＴＨＥＧＳＴＶＥＫＴＶＡＰＴＥＣＳ／／配列番号９１である（「ＣＬ−１」と命名）。
【００９８】
ＣＬ−１は、抗体のｐＩを増加するために有用であり、好都合である。「ＣＬ−２」、「ＣＬ−３」および「ＣＬ−７」と命名された３つの他のヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域があり、これらも本発明の範囲内で使用できる。ＣＬ−２とＣＬ−３がヒト集団においてより一般的である。
【００９９】
ＣＬ−２ヒト軽鎖（ＬＣ）定常ドメインは、アミノ酸配列：
ＧＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰＳＳＥＥＬＱＡＮＫＡＴＬＶＣＬＩＳＤＦＹＰＧＡＶＴＶＡＷＫＡＤＳＳＰＶＫＡＧＶＥＴＴＴＰＳＫＱＳＮＮＫＹＡＡＳＳＹＬＳＬＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳＹＳＣＱＶＴＨＥＧＳＴＶＥＫＴＶＡＰＴＥＣＳ／／配列番号９２を有する。
【０１００】
ＣＬ−３ヒトＬＣ定常ドメインは、アミノ酸配列：
ＧＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰＳＳＥＥＬＱＡＮＫＡＴＬＶＣＬＩＳＤＦＹＰＧＡＶＴＶＡＷＫＡＤＳＳＰＶＫＡＧＶＥＴＴＴＰＳＫＱＳＮＮＫＹＡＡＳＳＹＬＳＬＴＰＥＱＷＫＳＨＫＳＹＳＣＱＶＴＨＥＧＳＴＶＥＫＴＶＡＰＴＥＣＳ／／配列番号９３を有する。
【０１０１】
ＣＬ−７ヒトＬＣ定常ドメインは、アミノ酸配列：
ＧＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰＳＳＥＥＬＱＡＮＫＡＴＬＶＣＬＶＳＤＦＹＰＧＡＶＴＶＡＷＫＡＤＧＳＰＶＫＶＧＶＥＴＴＫＰＳＫＱＳＮＮＫＹＡＡＳＳＹＬＳＬＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳＹＳＣＲＶＴＨＥＧＳＴＶＥＫＴＶＡＰＡＥＣＳ／／配列番号９４を有する。
【０１０２】
免疫グロブリン鎖の可変領域は一般に同じ全体構造を示し、３つの超可変領域（多くの場合、「相補性決定領域」すなわちＣＤＲと呼ばれる）により結合した比較的保存的なフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。典型的には上述した各重鎖／軽鎖ペアの２本鎖由来のＣＤＲは、標的上の特異的エピトープまたはドメイン（例えば、ＫＬＨまたはＤＮＰ）と特異的に結合する構造を形成するフレームワーク領域により整列している。典型的には、天然の軽鎖可変領域と重鎖可変領域は両方とも、これらのエレメントとＮ末端からＣ末端で：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４の順で一致する。番号付け系は、それぞれこれらのドメイン内の位置を占めるアミノ酸に割り当てられる番号のために考案されている。この番号付け系は、免疫学的目的のタンパク質のカバット配列（１９８７  ａｎｄ  １９９１，  ＮＩＨ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  ＭＤ）、またはＣｈｏｔｈｉａ  ＆  Ｌｅｓｋ， １９８７，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９６：９０１−９１７；  Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８−８８３において規定される。
【０１０３】
下表１Ａおよび下表１Ｂに、抗体の完全長軽鎖および重鎖の一部の具体例を提示し、それらの対応するアミノ酸配列を要約する。表１Ａには軽鎖配列の例を示し、これらはすべて、全λ軽鎖で共通する定常領域λ定常領域１（ＣＬ−１；配列番号９１）を有する。表１Ｂには重鎖配列の例を示し、これらはすべて定常領域ヒトＩｇＧ２（配列番号８６）を含む。しかしながら、表１Ａおよび／または表１Ｂに列挙した定常またはフレームワーク領域の配列変化を有する免疫グロブリン（例えばＩｇＧ４対ＩｇＧ２、ＣＬ２対ＣＬ１）も本発明に包含される。また、表１Ａおよび表１Ｂの全配列のシグナルペプチド（ＳＰ）配列は同一であり（すなわち、ＶＫ−１ＳＰシグナルペプチド：ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣ（配列番号１０３；一重下線））、大量クローニングプロセスに用いられるが、任意の他の適切なシグナルペプチド配列を本発明の範囲内で適用してよい。別の有用なシグナルペプチド配列の例は、ＶＨ２１  ＳＰ  ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ（配列番号９５）である。他のシグナルペプチド配列の例を表１Ａ〜Ｂに示す。
【０１０４】
【表１】
2018139609.tif 000003
2018139609.tif 000004
【０１０５】
【表２】
2018139609.tif 000005
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2018139609.tif 000007
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2018139609.tif 000013
【０１０６】
単離した抗ＤＮＰ抗原結合タンパク質（抗体または抗体断片を含む）の一部の実施形態は、以下を含む：
（ａ）配列番号７７、配列番号１０７、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２３、配列番号１２９、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、もしくは配列番号１８５のアミノ酸配列を含むか、またはＮ末端かＣ末端、もしくは両端のアミノ酸残基が１個、２個、３個、４個もしくは５個欠けている前述の任意の一配列を含む免疫グロブリン重鎖；
（ｂ）配列番号１０５、配列番号１０９、配列番号１２１；配列番号１２５、もしくは配列番号１２７のアミノ酸配列を含むか、またはＮ末端もしくはＣ末端、または両端のアミノ酸残基が１個、２個、３個、４個もしくは５個欠けている前述の任意の一配列を含む免疫グロブリン軽鎖；または
（ｃ）（ａ）の免疫グロブリン重鎖および（ｂ）の免疫グロブリン軽鎖。
【０１０７】
単離した抗ＫＬＨ抗原結合タンパク質（抗体または抗体断片を含む）の一部の実施形態は、以下を含む：
（ａ）配列番号４６、配列番号１３３、配列番号１３９、配列番号１４３、配列番号１８６、もしくは配列番号１８７、配列番号３６６、もしくは配列番号３６７のアミノ酸配列を含むか、またはＮ末端かＣ末端、もしくは両端のアミノ酸残基が１個、２個、３個、４個もしくは５個欠けている前述の任意の一配列を含む免疫グロブリン重鎖；
（ｂ）配列番号２８、配列番号１３１、配列番号１３５、配列番号１３７；もしくは配列番号１４１のアミノ酸配列を含むか、またはＮ末端もしくはＣ末端、または両端のアミノ酸残基が１個、２個、３個、４個もしくは５個欠けている前述の任意の一配列を含む免疫グロブリン軽鎖；または
（ｃ）（ａ）の免疫グロブリン重鎖および（ｂ）の免疫グロブリン軽鎖。
【０１０８】
同様に、表１Ｂに列挙した抗ＤＮＰ重鎖（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３……など）の各例は、表１Ａに示す任意の抗ＤＮＰ軽鎖の例と組み合わせて抗体を形成することができる。かかる組み合わせの例としては、任意のＬ１〜Ｌ５と組み合わせたＨ１；任意のＬ１〜Ｌ５と組み合わせたＨ２；任意のＬ１〜Ｌ５と組み合わせたＨ３、任意のＬ１〜Ｌ５と組み合わせたＨ４、などが挙げられる。一部の場合では、抗体は、表１Ａおよび表１Ｂに列挙したうち少なくとも１つの抗ＤＮＰ重鎖と１つの抗ＤＮＰ軽鎖を含む。一部の場合では、抗体は表１Ａおよび表１Ｂに列挙した２本の異なる抗ＤＮＰ重鎖と２本の異なる抗ＤＮＰ軽鎖を含む。他の場合では、抗体は２本の同一軽鎖と２本の同一重鎖を含む。例として、抗体もしくは免疫学的機能性断片は、表１Ａおよび表１Ｂに列挙した２本のＨ１重鎖と２本のＬ１軽鎖、または２本のＨ２重鎖と２本のＬ２軽鎖、または２本のＨ３重鎖と２本のＬ３軽鎖ならびに他の類似の一対の抗ＤＮＰ軽鎖と一対の抗ＤＮＰ重鎖の組み合わせを含み得る。
【０１０９】
同様に、表１Ｂに列挙した抗ＫＬＨ重鎖（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３……など）の各例は、表１Ａに示す任意の抗ＫＬＨ軽鎖の例と組み合わせて抗体を形成することができる。かかる組み合わせの例としては、任意のＬ１〜Ｌ５と組み合わせたＨ１；任意のＬ１〜Ｌ５と組み合わせたＨ２；任意のＬ１〜Ｌ５と組み合わせたＨ３、任意のＬ１〜Ｌ５と組み合わせたＨ４、などが挙げられる。一部の場合では、抗体は、表１Ａおよび表１Ｂに列挙したうち少なくとも１つの抗ＫＬＨ重鎖と１つの抗ＫＬＨ軽鎖を含む。一部の場合では、抗体は表１Ａおよび表１Ｂに列挙した２本の異なる抗ＫＬＨ重鎖と２本の異なる抗ＫＬＨ軽鎖を含む。他の場合では、抗体は２本の同一軽鎖と２本の同一重鎖を含む。例として、抗体もしくは免疫学的機能性断片は、表１Ａおよび表１Ｂに列挙した２本のＨ１重鎖と２本のＬ１軽鎖、または２本のＨ２重鎖と２本のＬ２軽鎖、または２本のＨ３重鎖と２本のＬ３軽鎖ならびに他の類似の一対の抗ＫＬＨ軽鎖と一対の抗ＫＬＨ重鎖の組み合わせを含み得る。
【０１１０】
提供する他の抗原結合タンパク質は、表１Ａおよび表１Ｂに示す重鎖と軽鎖の組み合わせにより形成され、これらの鎖とそれぞれ少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖および／または重鎖を含む抗体変異体である。一部の場合では、かかる抗体は、少なくとも１つの重鎖と１本の軽鎖を含み、他の場合では、変異形態は、２本の同一軽鎖と２本の同一重鎖を含む。重鎖（１本または複数本）および／または軽鎖（１本または複数本）が、例えば、翻訳後修飾のために、表１Ａおよび表１Ｂに記載する重鎖および軽鎖の任意の１本に関して、Ｎ末端かＣ末端、もしくは両端のアミノ酸残基が１個、２個、３個、４個もしくは５個欠け得るものも本発明の範囲内である。例えば、ＣＨＯ細胞は典型的にはＣ末端のリジンが切断されている。
【０１１１】
抗体の可変ドメイン
本明細書に提供する各種重鎖および軽鎖可変領域を表２Ａ〜Ｂに示す。これらの可変領域はそれぞれ上記の重鎖および軽鎖定常領域に結合して、それぞれ完全な抗体重鎖および軽鎖を形成し得る。さらに、このように産生された重鎖および軽鎖配列はそれぞれ結合して完全な抗体構造を形成し得る。本明細書に提供する重鎖および軽鎖可変領域は、上記に列挙した配列例と異なる配列を有する他の定常ドメインに結合することもできることが理解されるべきである。
【０１１２】
また、下表２Ａに示すように、ＶＨ１、ＶＨ２、ＶＨ３、ＶＨ４、ＶＨ５、およびＶＨ６から選択される少なくとも１つの免疫グロブリン抗ＤＮＰ重鎖可変領域ならびに／またはＶＬ１、ＶＬ２、ＶＬ３、ＶＬ４、およびＶＬ５から選択される少なくとも１つの免疫グロブリン抗ＤＮＰ軽鎖可変領域を含む（ｃｏｎｔａｉｎ  ｏｒ  ｉｎｃｌｕｄｅ）抗原結合タンパク質（抗体または抗体断片を含む）、ならびにこれらの軽鎖および重鎖可変領域の免疫学的機能性断片、誘導体、変異タンパク質および変異体も提供する。
【０１１３】
また、下表２Ｂに示すように、ＶＨ７、ＶＨ８、およびＶＨ９から選択される少なくとも１つの免疫グロブリン抗ＫＬＨ重鎖可変領域ならびに／またはＶＬ６、ＶＬ７、ＶＬ８、およびＶＬ９から選択される少なくとも１つの免疫グロブリン抗ＫＬＨ軽鎖可変領域を含む（ｃｏｎｔａｉｎ  ｏｒ  ｉｎｃｌｕｄｅ）抗原結合タンパク質（抗体または抗体断片を含む）、ならびにこれらの軽鎖および重鎖可変領域の免疫学的機能性断片、誘導体、変異タンパク質および変異体も提供する。
【０１１４】
このタイプの抗原結合タンパク質は一般に式「ＶＨｘ／ＶＬｙ」により示すことができ、式中「ｘ」は抗原結合タンパク質に含まれる重鎖可変領域数と相関し、「ｙ」は抗原結合タンパク質に含まれる軽鎖可変領域数と相関する（通常、ｘおよびｙはそれぞれ１または２である）。
【０１１５】
【表３】
2018139609.tif 000014
2018139609.tif 000015
【０１１６】
【表４】
2018139609.tif 000016
【０１１７】
単離した抗原結合タンパク質（抗ＤＮＰ抗体または抗体断片を含む）の一部の実施形態は、以下の免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む：
（ａ）重鎖可変領域が配列番号２５０、配列番号２５２、配列番号２５４、配列番号２５６、配列番号２５８、もしくは配列番号２６０の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む；または
（ｂ）軽鎖可変領域が配列番号２３２、配列番号２３４、配列番号２３６、配列番号２３８、もしくは配列番号２４０の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む；または
（ｃ）（ａ）の重鎖可変領域および（ｂ）の軽鎖可変領域。
【０１１８】
単離した抗原結合タンパク質（抗ＤＮＰ抗体または抗体断片を含む）の一部の実施形態は、以下の免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む：
（ａ）重鎖可変領域が配列番号２６２、配列番号２６４、もしくは配列番号２６６の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む；または
（ｂ）軽鎖可変領域が配列番号２４２、配列番号２４４、配列番号２４６、もしくは配列番号２４８の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む；または
（ｃ）（ａ）の重鎖可変領域および（ｂ）の軽鎖可変領域。
【０１１９】
表２Ａに列挙した各重鎖可変領域は、より大きな重鎖に含まれているかいないかを問わず、表２Ａに示す任意の軽鎖可変領域と組み合わせて抗原結合タンパク質を形成し得る。かかる組み合わせの例としては、任意のＶＬ１、ＶＬ２、ＶＬ３、ＶＬ４、またはＶＬ５と組み合わせたＶＨ１；任意のＶＬ１、ＶＬ２、ＶＬ３、ＶＬ４、またはＶＬ５と組み合わせたＶＨ２；任意のＶＬ１、ＶＬ２、ＶＬ３、ＶＬ４、またはＶＬ５と組み合わせたＶＨ３；任意のＶＬ１、ＶＬ２、ＶＬ３、ＶＬ４、またはＶＬ５と組み合わせたＶＨ４、などが挙げられる。
【０１２０】
表２Ｂに列挙した各重鎖可変領域は、より大きな重鎖に含まれているかいないかを問わず、表２Ｂに示す任意の軽鎖可変領域と組み合わせて抗原結合タンパク質を形成し得る。かかる組み合わせの例としては、任意のＶＬ６、ＶＬ７、ＶＬ８またはＶＬ９と組み合わせたＶＨ７；任意のＶＬ６、ＶＬ７、ＶＬ８またはＶＬ９と組み合わせたＶＨ８；任意のＶＬ６、ＶＬ７、ＶＬ８またはＶＬ９と組み合わせたＶＨ８；任意のＶＬ６、ＶＬ７、ＶＬ８またはＶＬ９と組み合わせたＶＨ９が挙げられる。
【０１２１】
一部の場合では、抗原結合タンパク質は表２Ａに列挙したうち少なくとも１つの重鎖可変領域および／または１本の軽鎖可変領域を含む。一部の場合では、抗原結合タンパク質は表２Ａに列挙したうち少なくとも２つの異なる重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域を含む。かかる抗原結合タンパク質の例は、（ａ）１つのＶＨ１、ならびに（ｂ）ＶＨ２、ＶＨ３、もしくはＶＨ４などの１つを含む。別の例は、（ａ）１つのＶＨ２、ならびに（ｂ）ＶＨ１、ＶＨ３、もしくはＶＨ４などの１つを含む。さらに別の例は、（ａ）１つのＶＨ３、ならびに（ｂ）ＶＨ１、ＶＨ２、もしくはＶＨ４などの１つを含む。さらに別の例は、（ａ）１つのＶＨ４、ならびに（ｂ）ＶＨ１、ＶＨ２、もしくはＶＨ３などの１つを含む。さらに別の例は、（ａ）１つのＶＨ５、ならびに（ｂ）ＶＨ１、ＶＨ２、もしくはＶＨ３などの１つを含む。さらに別の例は、（ａ）１つのＶＨ６、ならびに（ｂ）ＶＨ１、ＶＨ２、もしくはＶＨ３などの１つを含む。
【０１２２】
さらにかかる抗原結合タンパク質の別の例は、（ａ）１つのＶＬ１、ならびに（ｂ）ＶＬ２もしくはＶＬ３などの１つを含む。さらにかかる抗原結合タンパク質の別の例は、（ａ）１つのＶＬ２、ならびに（ｂ）ＶＬ１もしくはＶＬ３などの１つを含む。さらにかかる抗原結合タンパク質の別の例は、（ａ）１つのＶＬ３、ならびに（ｂ）ＶＬ１もしくはＶＬ２などの１つ、などを含む。
【０１２３】
表２Ａに説明する重鎖可変領域の各種組み合わせは、表２Ａに説明する軽鎖可変領域の各種組み合わせの任意と組み合わせ得る。
【０１２４】
他の例では、抗原結合タンパク質は２本の同一軽鎖可変領域および／または２本の同一重鎖可変領域を含む。例として、抗原結合タンパク質は、表２Ａに列挙した一対の軽鎖可変領域と一対の重鎖可変領域の組み合わせにおいて２本の軽鎖可変領域および２本の重鎖可変領域を含む抗体または免疫学的機能性断片であり得る。
【０１２５】
一部の場合では、抗原結合タンパク質は表２Ｂに列挙したうちの少なくとも１つの重鎖可変領域および／または１本の軽鎖可変領域を含む。一部の場合では、抗原結合タンパク質は表２Ｂに列挙したうちの少なくとも２つの異なる重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域を含む。かかる抗原結合タンパク質の例は、（ａ）１つのＶＨ７、ならびに（ｂ）ＶＨ７、ＶＨ８、もしくはＶＨ９の１つを含む。別の例は、（ａ）１つのＶＨ８、ならびに（ｂ）ＶＨ７、ＶＨ８、もしくはＶＨ９の１つを含む。さらに別の例は、（ａ）１つのＶＨ９、ならびに（ｂ）ＶＨ７、ＶＨ８、もしくはＶＨ９の１つを含む。
【０１２６】
さらにかかる抗原結合タンパク質の別の例は、（ａ）１つのＶＬ６、ならびに（ｂ）ＶＬ６、ＶＬ７、ＶＬ８もしくはＶＬ９の１つを含む。さらにかかる抗原結合タンパク質の別の例は、（ａ）１つのＶＬ７、ならびに（ｂ）ＶＬ６、ＶＬ７、ＶＬ８もしくはＶＬ９の１つを含む。さらにかかる抗原結合タンパク質の別の例は、（ａ）１つのＶＬ８、ならびに（ｂ）ＶＬ６、ＶＬ７、ＶＬ８もしくはＶＬ９の１つを含む。さらにかかる抗原結合タンパク質の別の例は、（ａ）１つのＶＬ９、ならびに（ｂ）ＶＬ６、ＶＬ７、ＶＬ８もしくはＶＬ９の１つを含む。
【０１２７】
表２Ｂに説明する重鎖可変領域の各種組み合わせは、表２Ｂに説明する軽鎖可変領域の各種組み合わせの任意と組み合わせ得る。
【０１２８】
他の例では、抗原結合タンパク質は２本の同一軽鎖可変領域および／または２本の同一重鎖可変領域を含む。１例として、抗原結合タンパク質は、表２Ｂに列挙した一対の軽鎖可変領域と一対の重鎖可変領域の組み合わせにおいて２本の軽鎖可変領域および２本の重鎖可変領域を含む抗体または免疫学的機能性断片であり得る。
【０１２９】
提供する一部の抗原結合タンパク質は、ＶＨ１、ＶＨ２、ＶＨ３、ＶＨ４、ＶＨ５、ＶＨ６、ＶＨ７、ＶＨ８、およびＶＨ９から選択される重鎖可変ドメインの配列とアミノ酸残基が１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のみ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含み、ここでかかる配列相違は前述の可変ドメイン配列と比較してわずか１５個以下のアミノ酸変化に至るそれぞれ独立した１個のアミノ酸の欠失、挿入もしくは置換のいずれかである。一部の抗原結合タンパク質中の重鎖可変領域は、ＶＨ１、ＶＨ２、ＶＨ３、ＶＨ４、ＶＨ５、ＶＨ６、ＶＨ７、ＶＨ８、またはＶＨ９の重鎖可変領域のアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または少なくとも９９％同一である配列を有するアミノ酸配列を含む。
【０１３０】
ある抗原結合タンパク質は、ＶＬ１、ＶＬ２、ＶＬ３、ＶＬ４、ＶＬ５、ＶＬ６、ＶＬ７、ＶＬ８、およびＶＬ９から選択される軽鎖可変ドメインの配列とアミノ酸残基が１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のみ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含み、ここでかかる配列相違は前述の可変ドメイン配列と比較してわずか１５個以下のアミノ酸変化に至るそれぞれ独立した１個のアミノ酸の欠失、挿入もしくは置換のいずれかである。一部の抗原結合タンパク質における軽鎖可変領域は、ＶＬ１、ＶＬ２、ＶＬ３、ＶＬ４、ＶＬ５、ＶＬ６、ＶＬ７、ＶＬ８、またはＶＬ９の軽鎖可変領域のアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または少なくとも９９％同一である配列を有するアミノ酸配列を含む。
【０１３１】
さらに他の抗原結合タンパク質（例えば、抗体または免疫学的機能性断片）としては、本明細書に記載の変異型重鎖および変異型軽鎖の変異形態が挙げられる。
【０１３２】
ＣＤＲ
本明細書で開示する抗原結合タンパク質は、１つまたは複数のＣＤＲ内にグラフト化、挿入／または結合されるポリペプチドである。抗原結合タンパク質は、１、２、３、４、５または６個のＣＤＲを有することができる。したがって抗原結合タンパク質は、例えば、１つの重鎖ＣＤＲ１（「ＣＤＲＨ１」）、および／または１つの重鎖ＣＤＲ２（「ＣＤＲＨ２」）、および／または１つの重鎖ＣＤＲ３（「ＣＤＲＨ３」）、および／または１つの軽鎖ＣＤＲ１（「ＣＤＲＬ１」）、および／または１つの軽鎖ＣＤＲ２（「ＣＤＲＬ２」）、および／または１つの軽鎖ＣＤＲ３（「ＣＤＲＬ３」）を有することができる。一部の抗原結合タンパク質は、ＣＤＲＨ３とＣＤＲＬ３の両方を含む。具体的な重鎖および軽鎖ＣＤＲを、それぞれ表３Ａ〜Ｂ（抗ＤＮＰ）および表３Ｃ〜Ｄ（抗ＫＬＨ）に同定する。
【０１３３】
所定の抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびフレームワーク領域（ＦＲ）は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  ５ｔｈ  Ｅｄ．，  ＵＳ  Ｄｅｐｔ．  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  ＰＨＳ，  ＮＩＨ，  ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｎｏ．  ９１−３２４２，  １９９１により記載の体系を用いて同定し得る。本明細書に開示されているある抗体は、表３Ａ（抗ＤＮＰ  ＣＤＲＨ）、表３Ｂ（抗ＤＮＰ  ＣＤＲＬ）、表３Ｃ（抗ＫＬＨ  ＣＤＲＨ）、および表３Ｄ（抗ＫＬＨ  ＣＤＲＬ）に提示する１つまたは複数のＣＤＲのアミノ酸配列と同一または実質的に同一であるアミノ酸配列を１つまたは複数含む。
【０１３４】
【表５】
2018139609.tif 000017
【０１３５】
【表６】
2018139609.tif 000018
【０１３６】
【表７】
2018139609.tif 000019
【０１３７】
【表８】
2018139609.tif 000020
【０１３８】
天然抗体内のＣＤＲの構造および特性は上記のとおりである。簡単に述べると、従来の抗体において、ＣＤＲは、抗原結合および認識に関与する領域を構成する重鎖および軽鎖可変領域におけるフレームワーク内に含まれる。可変領域は、フレームワーク領域（上記Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１により命名されたフレームワーク領域１〜４、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４；上記Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，  １９８７も参照されたい）に少なくとも３本の重鎖または軽鎖ＣＤＲを含む（上記を参照されたい、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｎ．Ｉ．Ｈ．，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  ＭＤ；  ｓｅｅ  ａｌｓｏ  Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，  １９８７，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９６：９０１−９１７；  Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：  ８７７−８８３も参照されたい）。しかしながら、本明細書に提供するＣＤＲは、従来の抗体構造の抗原結合ドメインを定義するためだけに用い得るのではなく、他の本明細書に記載の各種ポリペプチド構造に組み込まれ得る。
【０１３９】
単離した抗原結合タンパク質の一部の実施形態は、免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む抗ＤＮＰ抗体または抗体断片を含む。重鎖可変領域はＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３と命名された３つの相補性決定領域を含む、ならびに／または軽鎖可変領域はＣＤＲＬｌ、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３と命名された３つのＣＤＲを含み：
（ａ）ＣＤＲＨ１は配列番号１８８、配列番号１８９、配列番号１９０、もしくは配列番号１９１のアミノ酸配列を有する；ならびに／または
（ｂ）ＣＤＲＨ２は配列番号１９２、配列番号１９３、配列番号１９４、もしくは配列番号１９５のアミノ酸配列を有する；ならびに／または
（ｃ）ＣＤＲＨ３は配列番号１９６、配列番号１９７、配列番号１９８、配列番号１９９、配列番号２００、もしくは配列番号２０１のアミノ酸配列を有する；ならびに／または
（ｄ）ＣＤＲＬ１は配列番号２０２、配列番号２０３、配列番号２０４、もしくは配列番号２０５のアミノ酸配列を有する；ならびに／または
（ｅ）ＣＤＲＬ２は配列番号２０６または配列番号２０７のアミノ酸配列を有する；ならびに／または
（ｆ）ＣＤＲＬ３は配列番号２０８、配列番号２０９、配列番号２１０、配列番号２１１、もしくは配列番号２１２のアミノ酸配列を有する。
【０１４０】
他の態様では、（Ａ）（ｉ）配列番号１８８、配列番号１８９、配列番号１９０、および配列番号１９１から選択されるＣＤＲＨ１；（ｉｉ）配列番号１９２、配列番号１９３、配列番号１９４、および配列番号１９５から選択されるＣＤＲＨ２；（ｉｉｉ）配列番号１９６、配列番号１９７、配列番号１９８、配列番号１９９、配列番号２００、および配列番号２０１から選択されるＣＤＲＨ３、から選択されるＣＤＲＨ；ならびに（ｉｖ）アミノ酸がわずか５個、４個、３個、２個、もしくは１個以下、置換、欠失もしくは挿入されているアミノ酸を１個もしくは複数含む（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のＣＤＲＨ；（Ｂ）（ｉ）配列番号２０２、配列番号２０３、配列番号２０４、および配列番号２０５から選択されるＣＤＲＬ１；（ｉｉ）配列番号２０６および配列番号２０７から選択されるＣＤＲＬ２；（ｉｉｉ）配列番号２０８、配列番号２０９、配列番号２１０、配列番号２１１、および配列番号２１２から選択されるＣＤＲＬ３、から選択されるＣＤＲＬ；ならびに（ｉｖ）アミノ酸がわずか５個、４個、３個、２個、もしくは１個以下、置換、欠失もしくは挿入されているアミノ酸を１個もしくは複数含む（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のＣＤＲＬ、であるＣＤＲを提供する。
【０１４１】
単離した抗原結合タンパク質の一部の実施形態は、免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む抗ＫＬＨ抗体または抗体断片を含む。重鎖可変領域はＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３と命名された３つの相補性決定領域を含む、ならびに／または軽鎖可変領域はＣＤＲＬｌ、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３と命名された３つのＣＤＲを含み：
（ａ）ＣＤＲＨ１は配列番号２１３、配列番号２１４、もしくは配列番号２１５のアミノ酸配列を有する；ならびに／または
（ｂ）ＣＤＲＨ２は配列番号２１６、配列番号２１７、もしくは配列番号２１８のアミノ酸配列を有する；ならびに／または
（ｃ）ＣＤＲＨ３は配列番号２１９、配列番号２２０、もしくは配列番号２２１のアミノ酸配列を有する；ならびに／または
（ｄ）ＣＤＲＬ１は配列番号２０４、配列番号２２２、配列番号２２３、もしくは配列番号２２４のアミノ酸配列を有する；ならびに／または
（ｅ）ＣＤＲＬ２は配列番号２０６、配列番号２２５、もしくは配列番号２２６のアミノ酸配列を有する；ならびに／または
（ｆ）ＣＤＲＬ３は配列番号２２７、配列番号２２８、配列番号２２９、もしくは配列番号２３０のアミノ酸配列を有する。
【０１４２】
他の態様では、（Ａ）（ｉ）配列番号２１３、配列番号２１４、および配列番号２１５から選択されるＣＤＲＨ１；（ｉｉ）配列番号２１６、配列番号２１７、および配列番号２１８から選択されるＣＤＲＨ２；（ｉｉｉ）配列番号２１９、配列番号２２０、および配列番号２２１から選択されるＣＤＲＨ３、から選択されるＣＤＲＨ；ならびに（ｉｖ）アミノ酸がわずか５個、４個、３個、２個、もしくは１個以下、置換、欠失もしくは挿入されているアミノ酸を１個もしくは複数含む（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のＣＤＲＨ；（Ｂ）（ｉ）配列番号２０４、配列番号２２２、配列番号２２３、および配列番号２２４から選択されるＣＤＲＬ１；（ｉｉ）配列番号２０６、配列番号２２５、および配列番号２２６から選択されるＣＤＲＬ２；（ｉｉｉ）配列番号２２７、配列番号２２８、配列番号２２９、および配列番号２３０から選択されるＣＤＲＬ３、から選択されるＣＤＲＬ；ならびに（ｉｖ）アミノ酸がわずか５個、４個、３個、２個、もしくは１個以下、置換、欠失もしくは挿入されているアミノ酸を１個もしくは複数含む（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のＣＤＲＬ、であるＣＤＲを提供する。
【０１４３】
別の態様では、抗原結合タンパク質は表３Ａおよび表３Ｂに列挙したＣＤＲの変異形態を１、２、３、４、５、または６個含み、表３Ａおよび表３Ｂに列挙したＣＤＲ配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一である配列をそれぞれ有する。一部の抗原結合タンパク質は、表３Ａおよび表３Ｂに列挙した１、２、３、４、５、または６個のＣＤＲ、それぞれわずか１、２、３、４または５個以下のアミノ酸がこれらの表に列挙するＣＤＲと異なるものを含む。
【０１４４】
別の態様では、抗原結合タンパク質は表３Ｃおよび表３Ｄに列挙したＣＤＲの変異形態を１、２、３、４、５、または６個含み、表３Ｃおよび表３Ｄに列挙したＣＤＲ配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一である配列をそれぞれ有する。一部の抗原結合タンパク質は、表３Ｃおよび表３Ｄに列挙した１、２、３、４、５、または６個のＣＤＲ、それぞれわずか１、２、３、４または５個以下のアミノ酸がこれらの表に列挙するＣＤＲと異なるものを含む。
【０１４５】
さらに別の態様では、本明細書に開示するＣＤＲは、関連モノクローナル抗体の群に由来するコンセンサス配列を含む。本明細書に記載の「コンセンサス配列」とは、いくつかの配列間で共通する保存的アミノ酸および所定のアミノ酸配列内で異なる可変アミノ酸を有するアミノ酸配列を指す。提供するＣＤＲコンセンサス配列は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３のそれぞれに対応するＣＤＲを含む。
【０１４６】
抗体抗原相互作用は会合速度定数Ｍ−１ｓ−１（ｋａ）、または解離速度定数ｓ−１（ｋｄ）、あるいは解離平衡定数Ｍ（ＫＤ）を特徴とし得る。
【０１４７】
本発明は、ＤＮＰもしくはＫＬＨの各ＫＤ（解離平衡定数）により測定された１０−９Ｍ以下の範囲、または１０−１２Ｍもしくはそれを下回る範囲までに及ぶ結合親和性、またはＤＮＰもしくはＫＬＨの各ｋｄ（解離速度定数）により測定された１０−４ｓ−１以下の範囲、または１０−１０ｓ−１もしくはそれを下回る範囲までに及ぶ結合活性などの望ましい特徴を示してＤＮＰもしくはＫＬＨとそれぞれ特異的に結合する抗体が挙げられるが、これらに限定されない各種抗原結合タンパク質を提供する。（本明細書の実施例１２を参照されたい）。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質（例えば、抗体または抗体断片）は、ＤＮＰもしくはＫＬＨの各ｋｄ（解離速度定数）により測定された約１０−２、１０−３、１０−４、１０−５、１０−６、１０−７、１０−８、１０−９、１０−１０ｓ−１もしくはそれを下回る結合活性（値が低いほど、高い結合活性を示す）、ならびに／またはＤＮＰもしくはＫＬＨの各ＫＤ（解離平衡定数）により測定された約１０−９、１０−１０、１０−１１、１０−１２、１０−１３、１０−１４、１０−１５、１０−１６Ｍもしくはそれを下回る結合親和性（値が低いほど、高い結合親和性を示す）などの望ましい特徴を示す。会合速度定数、解離速度定数、または解離平衡定数は、反応速度分析技術（表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）；例えば、Ｆｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ−ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＷＯ２００７／０４５４６３Ａ１号の実施例１０（これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、または製造業者により概説された一般的な手段または当技術分野において知られている他の方法を用いたＫｉｎＥｘＡを用いて容易に決定し得る。ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）またはＫｉｎＥｘＡから得られる反応速度データは製造業者により記載されている方法により分析し得る。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、抗体は、全３つの軽鎖ＣＤＲ、全３つの重鎖ＣＤＲ、または全６つのＣＤＲを含む。一部の例示的な実施形態では、抗体由来の２つの軽鎖ＣＤＲは、異なる抗体由来の第三の軽鎖ＣＤＲと組み合わせ得る。あるいは、１つの抗体由来のＣＤＲＬ１は、特にＣＤＲの相同性が高い場合、異なる抗体由来のＣＤＲＬ２とさらに別の抗体由来のＣＤＲＬ３と組み合わせることができる。さらにに、抗体由来の２つの重鎖ＣＤＲは、異なる抗体由来の第三の重鎖ＣＤＲと組み合わせ得る；または１つの抗体由来のＣＤＲＨ１は、特にＣＤＲの相同性が高い場合、異なる抗体由来のＣＤＲＨ２とさらに別の抗体由来のＣＤＲＨ３と組み合わせることができる。
【０１５０】
したがって、本発明は、抗体の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域の１つ、２つ、および／または３つのＣＤＲを含む各種組成物（それらの修飾または誘導体を含む）を提供する。かかる組成物は、本明細書に記載のまたは当技術分野において知られている技術により産生し得る。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質（抗体および抗体断片を含む）は、所望の効果を得るために単独または他の治療と組み合わせて使用できる治療分子として有用であり得る。かかる実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質（抗体および抗体断片を含む）は、１対２４、１対１６、１対８、または１対４で結合された薬理学的に活性な化学部分（低分子かポリペプチドかどうかを問わず）をさらに含む。薬理学的に活性な低分子またはポリペプチド化学部分は、抗原結合タンパク質免疫グロブリン単量体（例えば、ＬＣまたはＨＣ単量体）のＮ末端またはＣ末端残基、当技術分野において知られており本明細書に詳述する化学反応物にまたはそれらを介して結合できる。あるいは、本発明の抗原結合タンパク質の主鎖内のアミノ酸残基（１つまたは複数）の１つまたは複数の側鎖上の官能基にまたはそれらを介して接合した薬理学的に活性な化学部分（１つまたは複数）が本発明に包含される。有用な方法および免疫グロブリン鎖内の内部接合部位（例えば、特定のシステイン残基）は、当技術分野において知られている（例えば、Ｇｅｇｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｆｃ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、ＷＯ２００７／０２２０７０号および米国特許第２００７０２６９３６９号公開、これらは参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。
【０１５２】
薬理学的に活性な化学部分がポリペプチドである本発明の他の実施形態では、本明細書の実施例および当技術分野に詳述されているように、Ｎ末端および／またはＣ末端の代わりに免疫グロブリン重鎖のＦｃドメインの内部ループ内の免疫グロブリン重鎖の一次アミノ酸配列に挿入されている薬理学的に活性なポリペプチドを有する組換え融合タンパク質を産生できる（例えば、Ｇｅｇｇ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第７，４４２，７７８号；米国特許第７，６５５，７６５号；米国特許第７，６５５，７６４号；米国特許第７，６６２，９３１号；米国特許第７，６４５，８６１号；公開された米国特許第２００９／０２８１２８６号；ならびに米国特許第２００９／０２８６９６４号、これらはそれぞれ参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。
【０１５３】
「結合した」とは、薬理学的に活性な化学部分が、抗原結合タンパク質のアミノ酸残基に共有結合もしくは直接結合しているか、または任意選択的に、抗原結合タンパク質のアミノ酸残基に共有結合しているペプチジルもしくは非ペプチジルリンカー部分に共有結合もしくは直接結合していることを意味する。
【０１５４】
上記のとおり、本発明の組成物の一部の実施形態は、本発明の薬理学的に不活性な抗原結合タンパク質に結合する少なくとも１つの薬理学的に活性なポリペプチド部分（例えば、本発明の薬理学的に不活性な抗原結合タンパク質に結合する薬理学的に活性なポリペプチド部分の組換え融合タンパク質を構成する）に関わる。「薬理学的に活性」という用語は、そのように記載されている物質が医学的要因（例えば、血圧、血球数、コレステロールレベル、疼痛知覚）または疾患状態（例えば、癌、自己免疫障害、慢性疼痛）に影響を与える活性を有すると決定されたことを意味する。逆に、「薬理学的に不活性」という用語は、物質が医学的要因または疾患状態に影響を与える活性を有さないと決定できることを意味する。したがって、薬理学的に活性なペプチドまたはタンパク質は、以下に定義されるアゴニストもしくは模倣ペプチドおよびアンタゴニストペプチドを含む。本発明は、約５〜約８０個のアミノ酸残基の長さのアミノ酸配列を有し、組換え発現に反応する任意の薬理学的に活性なタンパク質の使用を包含する。本発明の一部の有用な実施形態では、薬理学的に活性なタンパク質は、必要な生体活性が維持される限り、目的の天然配列と比較して、アミノ酸の添加もしくは挿入、アミノ酸欠失、ペプチド切断、アミノ酸置換、またはアミノ酸残基の化学的誘導体化（既知の化学技術により成し遂げられる）などの１つまたは複数の方法において修飾する。
【０１５５】
「−模倣ペプチド」、「ペプチド模倣物」、および「−アゴニストペプチド」という用語は、目的の天然タンパク質に相当する生体活性を有するペプチドまたはタンパク質、例えば、これらに限定されないが、毒素ペプチド分子、例えば、ＳｈＫもしくはＯＳＫ１毒素ペプチド、またはそれらのペプチドアナログを指す。これらの用語はさらに、天然ペプチド分子の活性を、天然分子の効果増強などにより直接模倣物するペプチドを含む。
【０１５６】
「−アンタゴニストペプチド」、「ペプチドアンタゴニスト」、および「ペプチド阻害剤」という用語は、目的の受容体の生体活性をブロックするもしくは目的の受容体の生体活性と何らかの形で相互作用するか、または目的の受容体の既知のアンタゴニストもしくは阻害剤に相当する生体活性を有するペプチドを指す（これらに限定されないが、イオンチャネルまたはＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）など）。
【０１５７】
本発明で使用できる薬理学的に活性なタンパク質の例としては、毒素ペプチド（例えば、ＯＳＫ１またはＯＳＫ１ペプチドアナログ；ＳｈＫまたはＳｈＫペプチドアナログ）、ＩＬ−６結合ペプチド、ＣＧＲＰペプチドアンタゴニスト、ブラジキニンＢ１受容体ペプチドアンタゴニスト、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）アゴニストペプチド、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）アンタゴニストペプチド、ａｎｇ−１結合ペプチド、ａｎｇ−２結合ペプチド、ミオスタチン結合ペプチド、エリスロポエチン模倣（ＥＰＯ模倣）ペプチド、トロンボポイエチン模倣（ＴＰＯ模倣）ペプチド（例えば、ＡＭＰ２またはＡＭＰ５）、神経増殖因子（ＮＧＦ）結合ペプチド、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）結合ペプチド、およびグルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ）−１もしくはそのペプチド模倣物またはＧＬＰ−２もしくはそのペプチド模倣物が挙げられるが、これらに限定されない。グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）および関連ペプチドグルカゴンはプログルカゴンの分化プロセスを介して産生され、対抗する生体活性を有する。プログルカゴン自体は、膵臓α細胞内および腸内分泌Ｌ細胞内で産生され、これらは主に遠位小腸および結腸に位置する。膵臓内では、グルカゴンは、プログルカゴンから選択的に切断される。対して、腸内では、プログルカゴンは、ＧＬＰ−１およびグルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）を形成するようにプロセス化され、これらはそれぞれプログルカゴンのアミノ酸残基７８〜１０７および１２６〜１５８に相当する（例えば、Ｉｒｗｉｎ  ａｎｄ  Ｗｏｎｇ，  １９９５，  Ｍｏｌ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  ９：２６７−２７７  ａｎｄ  Ｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８３，  Ｎａｔｕｒｅ  ３０４：３６８−３７１を参照されたい）。慣例により、ＧＬＰ−１のアミノ酸の番号付けは、プログルカゴン切断から形成されるＧＬＰ−１（１〜３７）に基づく。生体活性形態は、このペプチドのさらなるプロセスから産生し、これは、ある番号付け規定においてＧＬＰ−１（７〜３７）−ＯＨおよびＧＬＰ−１（７〜３６）−ＮＨ２をもたらす。ＧＬＰ−１（７〜３７）−ＯＨ（または単にＧＬＰ−１（７〜３７））およびＧＬＰ−１（７〜３６）−ＮＨ２は両方とも同じ活性を有する。便宜上、「ＧＬＰ−１」という用語は、これらの形態の両方を指すために使用する。これらのプロセス化したペプチドの第一アミノ酸は、この番号付け規定においてＨｉｓ７である。しかしながら、当技術分野において認識される別の番号付け規定では、Ｈｉｓで開始するプロセス化したペプチド番号は７位ではなく１位とみなされる。したがって、この番号付け体系では、ＧＬＰ−１（１〜３１）はＧＬＰ−１（７〜３７）と同じであり、ＧＬＰ−１（１〜３０）はＧＬＰ−１（７〜３６）と同じである。ＧＬＰ−１模倣ポリペプチド配列の例としては、以下が挙げられる：
ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＱＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧ／／（配列番号２９０）；
ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＱＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＱＫＧＲＧ／／（配列番号２９１）；
ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＱＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧ／／（配列番号２９２）；
ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＱＬＶＫＧＲＧ／／（配列番号２９３）；
ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＱＬＱＫＧＲＧ／／（配列番号２９４）；
ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＱＫＧＲＧ／／（配列番号２９５）；
ＨＮＥＴＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧ／／（配列番号２９６）
ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＮＱＴＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧ／／（配列番号２９７）；
ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＮＡＴＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧ／／（配列番号２９８）；
ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＮＧＴＧ／／（配列番号２９９）；
ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＮＲＴ／／（配列番号３００）；
ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＮＧＴ／／（配列番号３０１）；
ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧＧＴＧＮＧＴ／／（配列番号３０２）；ならびに
ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧＧＳＧＮＧＴ／／（配列番号３０３）。
【０１５８】
ヒトＧＬＰ−２およびＧＬＰ−２模倣アナログも当技術分野において知られている。（例えば、Ｐｒａｓａｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｌｕｃａｇｏｎｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ−２  ａｎａｌｏｇｕｅ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｍａｓｓ  ａｆｔｅｒ  ｉｓｃｈｅｍｉａ  ａｎｄ  ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ，  Ｊ．  Ｐｅｄｉａｔｒ．  Ｓｕｒｇ．  ２０００  Ｆｅｂ；３５（２）：３５７−５９  （２０００）；  Ｙｕｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ−２  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｅｎｇａｇｅｓ  ｂａｄ  ａｎｄ  ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ−３  ｉｎ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ａ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍａｎｎｅｒ  ａｎｄ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ  ３−ｋｉｎａｓｅ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７７（２８）：２４８９６−９０６  （２００２）を参照されたい）。
【０１５９】
「毒素ペプチド」は、毒から単離できる天然の薬理学的に活性なペプチドまたはポリペプチドの同じアミノ酸配列を有するペプチドおよびポリペプチドを含み、かかる天然分子の修飾ペプチドアナログも含む。（例えば、Ｋａｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＳｈＫ−Ｄａｐ２２，  ａ  ｐｏｔｅｎｔ  Ｋｖ１．３−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７３（４９）：３２６９７−７０７  （１９９８）；  Ｋｅｍ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第６，０７７，６８０号；Ｍｏｕｈａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ＯｓＫ１  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ、ＷＯ２００６／００２８５０Ａ２号；Ｃｈａｎｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌｏｇｓ  ｏｆ  ＳＨＫ  ｔｏｘｉｎ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅｓ  ｉｎ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｋｖ１．３  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌｓ、ＷＯ２００６／０４２１５１号；Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，    Ｔｏｘｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｇｅｎｔｓ、ＷＯ２００６／１１６１５６Ａ２号を参照されたく、これらはすべて参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。ヘビ、サソリ、クモ、ハチ、カタツムリおよびイソギンチャクは、小さな生体活性毒素ペプチド、または強力かつ選択的なイオンチャネルおよび受容体を標的とする「毒素」の豊富な供給源として役立ち得る毒を産生する生物の数例である。毒素ペプチドの１例は、Ｏｒｔｈｏｃｈｉｒｕｓ  ｓｃｒｏｂｉｃｕｌｏｓｕｓサソリ毒から単離した毒素ペプチドであるＯＳＫ１である（ＯｓＫ１としても知られている）。（例えば、Ｍｏｕｈａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｋ＋  ｃｈａｎｎｅｌ  ｔｙｐｅｓ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｂｙ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ＯＳＫ１，  ａ  ｔｏｘｉｎ  ｆｒｏｍ  Ｏｒｔｈｏｃｈｉｒｕｓ  ｓｃｒｏｂｉｃｕｌｏｓｕｓ  ｓｃｏｒｐｉｏｎ  ｖｅｎｏｍ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ３８５：９５−１０４  （２００５）；  Ｍｏｕｈａｔ    ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｏｒｔｈｏｃｈｉｒｕｓ  ｓｃｒｏｂｉｃｕｌｏｓｕｓ  ｔｏｘｉｎ  １  ａｎａｌｏｇｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｔｒｉｍｍｅｄ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｏｍａｉｎ，  Ｍｏｌｅｃ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ６９：３５４−  ６２  （２００６）；  Ｍｏｕｈａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ＯｓＫ１  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ、ＷＯ２００６／００２８５０Ａ２号）。別の例は、イソギンチャクＳｔｉｃｈｏｄａｃｔｙｌａ  ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ毒から単離されるＳｈＫである（例えば、Ｔｕｄｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｏｎｉｓａｔｉｏｎ  ｂｅｈａｖｉｏｕｒ  ａｎｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ−ｃｈａｎｎｅｌ  ｂｌｏｃｋｅｒ  ＳｈＫ  ｔｏｘｉｎ，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２５１（１−２）：１３３−４１（１９９８）；  Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｂｏｎｄｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ＳｈＫ  ｔｏｘｉｎ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．    ３８（４４）：  １４５４９−５８  （１９９９）；  Ｋｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，  ＳｈＫ  ｔｏｘｉｎ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｕｓｅ、米国特許第６，０７７，６８０号；Ｌｅｂｒｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｏｒｉｇｉｎａｔｉｎｇ  ｉｎ  ｓｃｏｒｐｉｏｎ、米国特許第６，６８９，７４９号；Ｂｅｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｍｅｍｏｒｙ  Ｔ ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  Ｋｖ１．３  ｃｈａｎｎｎｅｌｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ，  Ｍｏｌｅｃ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ６７（４）：１３６９−８１  （２００５））。
【０１６０】
毒素ペプチドは、通常、約２０〜約８０個のアミノ酸の長さであり、２〜５個のジスルフィド結合を含み、非常にコンパクトな構造を形成する。毒素ペプチドが（例えば、サソリ、イソギンチャクおよびイモガイ毒から）単離されており、イオンチャネルに与える影響が特性決定されている。かかるペプチドは、特に効能および安定性の重要課題に取り組む上で十分に適した比較的少数の構造的フレームワークから発達していると考えられる。大部分のサソリおよびイモガイ毒ペプチドは、例えば、１０〜４０個のアミノ酸および最大５個のジスルフィド結合を含み、しばしばタンパク質分解耐性である非常にコンパクトかつ拘束された構造（マイクロタンパク質）を形成している。コノトキシンおよびサソリ毒素ペプチドは、それらのジスルフィド結合およびペプチドの折畳みに基づき、いくつかの上科に分類できる。これらの多くの溶液構造が、それらのコンパクトな構造を例証してそれらのファミリー折畳み保存を検証するＮＭＲ分光器により決定されている。（例えば、Ｔｕｄｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｏｎｉｓａｔｉｏｎ  ｂｅｈａｖｉｏｕｒ  ａｎｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ−ｃｈａｎｎｅｌ  ｂｌｏｃｋｅｒ  ＳｈＫ  ｔｏｘｉｎ，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２５１（１−２）：１３３−４１（１９９８）；  Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｂｏｎｄｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ＳｈＫ  ｔｏｘｉｎ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．    ３８（４４）：  １４５４９−５８  （１９９９）；  Ｊａｒａｖｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｏｘｉｎ  ＯＳＫ１  ｆｒｏｍ  Ｏｒｔｈｏｃｈｉｒｕｓ  ｓｃｒｏｂｉｃｕｌｏｓｕｓ  ｓｃｏｒｐｉｏｎ  ｖｅｎｏｍ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ３６（６）：１２２３−３２  （１９９７）；  ｄｅｌ  Ｒｉｏ−Ｐｏｒｔｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．；  ＮＭＲ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｃｎ１２，  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｍｅｘｉｃａｎ  ｓｃｏｒｐｉｏｎ  Ｃｅｎｔｒｕｒｏｉｄｅｓ  ｎｏｘｉｕｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｔｙｐｉｃａｌ  ｂｅｔａ−ｔｏｘｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂｕｔ  ｗｉｔｈ  ａｌｐｈａ−ｌｉｋｅ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．    ２７１（１２）：  ２５０４−１６  （２００４）；  Ｐｒｏｃｈｎｉｃｋａ−Ｃｈａｌｕｆｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｄｉｓｃｒｅｐｉｎ，  ａ  ｎｅｗ  Ｋ＋−ｃｈａｎｎｅｌ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ａｌｐｈａ−ＫＴｘ１５  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ４５（６）：１７９５−１８０４  （２００６））。本発明の実践が有用であり得る薬理学的に活性な毒素ペプチドの例としては、ＳｈＫ、ＯＳＫ１、カリブドトキシン（ＣｈＴｘ）、カリオトキシン１（ＫＴＸ１）、もしくはモーロトキシン、または天然配列の１つもしくは複数のアミノ酸残基が修飾されているこれらの任意の毒素ペプチド��ナログが挙げられるが、これらに限定されない。他の例が当技術分野において知られており、あるいはＳｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．、ＷＯ０６１１６１５６Ａ２号または米国特許第１１／４０６，４５４号（題名：毒素ペプチド治療薬（Ｔｏｘｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ、米国特許第２００７／００７１７６４号として公開）；Ｍｏｕｈａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ＯｓＫ１  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ、ＷＯ２００６／００２８５０Ａ２号；Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第１１／９７８，０７６号（題名：結合された毒素ペプチド治療薬（Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  Ｔｏｘｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ）、２００７年１０月２５日出願、米国特許第２００９０２９１８８５号として２００９年１１月２６日公開）、Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．、ＷＯ２００８／０８８４２２号；Ｌｅｂｒｕｎ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第６，６８９，７４９号、およびＳｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｐｏｔｅｎｔ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｋｖ１．３、米国仮出願第６１／２１０，５９４号、２００９年３月２０日出願（これらはそれぞれ参照によりそれらの全体が組み込まれる）に見出すことができる。
【０１６１】
「ペプチドアナログ」という用語は、少なくとも１つのアミノ酸残基の置換、内部添加、または少なくとも１つのアミノ酸の内部欠失、ならびに／またはアミノ末端もしくはカルボキシ末端の切断もしくは添加により天然ペプチド配列とアミノ酸が異なる配列を有するペプチドを指す。「内部欠失」とは、天然配列のＮ末端位またはＣ末端位以外のアミノ酸欠失を指す。同様に、「内部添加」とは、天然配列におけるＮ末端位またはＣ末端位以外のアミノ酸の存在を指す。「毒素ペプチドアナログ」は、これらに限定されないが、目的の天然毒素ペプチド配列と比較してＯＳＫ１ペプチドアナログ、ＳｈＫペプチドアナログ、またはＣｈＴｘペプチドアナログなど、目的の天然毒素ペプチド配列の修飾（例えば、前述のアミノ酸残基の置換、内部添加もしくは挿入、内部欠失、ならびに／またはアミノ末端もしくはカルボキシ末端の切断もしくは添加）を含む。
【０１６２】
「ＣＧＲＰペプチドアンタゴニスト」とは、生理状態の温度、ｐＨ、およびイオン強のもと、ＣＧＲＰ１受容体（これらに限定されないが、ＣＧＲＰペプチドアナログなど）と選択的に結合し、完全長の天然ヒトαＣＧＲＰまたはβＣＧＲＰにより、ＣＧＲＰ１受容体活性化を拮抗化、ブロック、低減（ｄｅｃｒｅａｓｅ）、軽減（ｒｅｄｕｃｅ）、妨害、または阻害するペプチドである。ＣＧＲＰペプチドアンタゴニストとしては、完全および部分的なアンタゴニストが挙げられる。かかるアンタゴニスト活性は既知のインビトロ方法またはインビボ機能性アッセイ方法により検出できる。（例えば、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎｕｓ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｔｈｅ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎｕｓ  ｏｆ  ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ  ｇｅｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ（８−３７）  ｐｒｏｄｕｃｅ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ  ｗｉｔｈ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ａｆｆｉｎｉｔｙ，  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．，  ４６：２４２７−２４３５  （２００３）を参照されたい）。有用なＣＧＲＰペプチドアンタゴニストの例は、Ｇｅｇｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ＣＧＲＰ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ  ａｎｄ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ、ＷＯ２００７／０４８０２６Ａ２号および米国仮出願第１１／５８４，１７７号（２００６年１０月１９日出願、米国特許第２００８／００２０９７８Ａ１号として公開）に開示されており、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１６３】
「副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）アゴニスト」および「ＰＴＨアゴニスト」という用語は、完全長天然ヒト副甲状腺ホルモンのようにＰＴＨ−１もしくはＰＴＨ−２受容体に結合し、１つもしくは複数のＰＴＨ活性アッセイ変数を増大または低減する分子を指す。有用なＰＴＨアゴニストペプチドの例は、副甲状腺ホルモンおよび副甲状腺ホルモン関連タンパク質の受容体の修飾因子（Ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ａｎｄ  ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）という題名の米国特許第６，７５６，４８０号の表１に開示されており、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＰＴＨ活性アッセイの１例は、米国特許第６，７５６，４８０号の実施例１に開示されている。
【０１６４】
「副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）アンタゴニスト」という用語は、完全長天然ヒト副甲状腺ホルモンによりＰＴＨ−１もしくはＰＴＨ−２受容体に結合し、それらの変数に対する正常な作用をブロックまたは防止する分子を指す。有用なＰＴＨアンタゴニストペプチドの例は、米国特許第６，７５６，４８０号の表２に開示されており、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＰＴＨ活性アッセイの１例は、米国特許第６，７５６，４８０号の実施例２に開示されている。
【０１６５】
「ブラジキニンＢ１受容体アンタゴニストペプチド」および「ブラジキニンＢ１受容体ペプチドアンタゴニスト」という用語は、ヒトブラジキニンＢ１受容体（ｈＢ１）に関してアンタゴニスト活性を有するペプチドを意味する。有用なブラジキニンＢ１受容体アンタゴニストペプチドは、Ｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ  Ｂ１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、米国特許第２００５／０２１５４７０Ａ１号（２００５年９月２９日公開、米国特許第７，６０５，１２０号；米国特許第５，８３４，４３１号または同第５，８４９，８６３号として発行）に記載されているように同定もしくは生成できる。Ｂ１受容体活性アッセイの１例は、米国特許第２００５／０２１５４７０Ａ１号の実施例６〜８に開示されている。
【０１６６】
「トロンボポイエチン（ＴＰＯ）模倣ペプチド」および「ＴＰＯ模倣ペプチド」という用語は、Ｃｗｉｒｌａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７），  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７６：  １６９６−９、米国特許第５，８６９，４５１号および同第５，９３２，９４６号（これらは参照によりそれらの全体が組み込まれる）；米国特許第２００３／０１７６３５２号（２００３年９月１８日公開、これは参照によりその全体が組み込まれる）；ＷＯ０３／０３１５８９号（２００３年４月１７日公開）；ＷＯ００／２４７７０号（２０００年５月４日公開）に記載されているように同定もしくは生成できるペプチド；ならびに米国特許第２００６／０１４０９３４号（米国仮出願第１１／２３４，７３１号、修飾Ｆｃ分子（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｆｃ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）という題名で２００５年９月２３日に出願、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）の表５に記載されている任意のペプチドを指す。これらの各参考文献に開示されている手順に従い開示されているものと異なるペプチドライブラリーを用いて、実際に開示されているものと異なるペプチドを選択できることを当業者は理解する。
【０１６７】
「ＥＰＯ模倣ペプチド」および「エリスロポエチン模倣ペプチド」という用語は、Ｗｒｉｇｈｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６），  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７３：  ４５８−６３およびＮａｒａｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９），  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９６：  ７５６９−７４（これらは両方とも参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているように同定または生成できるペプチドを指す。有用なＥＰＯ模倣ペプチドとしては、米国特許第２００７／０２６９３６９Ａ１号の表５および米国特許第６，６６０，８４３号（これらは両方とも参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）に列挙のＥＰＯ模倣ペプチドが挙げられる。
【０１６８】
「ａｎｇ−２結合ペプチド」という用語は、米国特許第２００３／０２２９０２３号（２００３年１２月１１日公開）；ＷＯ０３／０５７１３４号（２００３年７月１７日公開）；米国特許第２００３／０２３６１９３号（２００３年１２月２５日公開）（これらはそれぞれ参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているように同定もしくは生成できるペプチド；ならびに米国特許第２００６／０１４０９３４号（米国仮出願第１１／２３４，７３１号、修飾Ｆｃ分子（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｆｃ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）という題名で２００５年９月２３日に出願、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）の表６に記載されている任意のペプチドを含む。これらの各参考文献に開示されている方法に従い開示されているものと異なるペプチドライブラリーを用いて、実際に開示されているものと異なるペプチドを選択できることを当業者は理解する。
【０１６９】
「神経増殖因子（ＮＧＦ）結合ペプチド」および「ＮＧＦ結合ペプチド」という用語は、ＷＯ０４／０２６３２９号（２００４年４月１日公開）に記載されているように同定もしくは生成できるペプチドならびに米国特許第２００６／０１４０９３４号（米国仮出願第１１／２３４，７３１号、修飾Ｆｃ分子（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｆｃ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）という題名で２００５年９月２３日に出願、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）の表７に同定されている任意のペプチドを含む。この参考文献に開示されている方法に従い開示されているものと異なるペプチドライブラリーを用いて、実際に開示されているものと異なるペプチドを選択できることを当業者は理解する。
【０１７０】
「ミオスタチン結合ペプチド」という用語は、米国特許第１０／７４２，３７９号（２００３年１２月１９日出願、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているように同定もしくは生成できるペプチド、ならびに米国特許第２００６／０１４０９３４号（米国仮出願第１１／２３４，７３１号、修飾Ｆｃ分子（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｆｃ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）という題名で２００５年９月２３日に出願、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）の表８に記載されているペプチドを含む。これらの各参考文献に開示されている方法に従い開示されているものと異なるペプチドライブラリーを用いて、実際に開示されているものと異なるペプチドを選択できることを当業者は理解する。
【０１７１】
「ＢＡＦＦ−アンタゴニストペプチド」および「ＢＡＦＦ結合ペプチド」という用語は、米国特許第２００３／０１９５１５６Ａ１号（これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているように同定もしくは生成できるペプチド、ならびに米国特許第２００６／０１４０９３４号（米国仮出願第１１／２３４，７３１号、修飾Ｆｃ分子（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｆｃ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）という題名で２００５年９月２３日に出願、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）の表９に記載されているペプチドを含む。前述の参考文献に開示されている方法に従い開示されているものと異なるペプチドライブラリーを用いて、実際に開示されているものと異なるペプチドを選択できることを当業者は理解する。
【０１７２】
前述は、本発明の抗原結合タンパク質（抗体および抗体断片を含む）に有用に結合または融合できる薬理学的に活性なポリペプチドの非限定的な例としてのみ意図する。薬理学的に活性なポリペプチド部分を含む任意のものを本発明の範囲内に使用できる（いわゆるアビマー構造のポリペプチドを含む）（例えば、Ｋｏｌｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｏｖｅｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｂｉｎｄｉｎｇ、米国特許第２００５／００８９９３２号；Ｂａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ＩＬ−６  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、米国特許第２００８／０２８１０７６号；Ｓｔｅｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ、米国特許第２００６／０２２３１１４号および米国特許第２００６／０２３４２９９号を参照されたい）。
【０１７３】
目的の治療適応における薬剤の検証に用いられる有用な前臨床動物モデルが当技術分野において知られている（例えば、ａｎ  ａｄｏｐｔｉｖｅ−ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｂｙ  Ｖａｌｖｅｒｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｒｅｓ．  １９：１５５  （２００４）；  ａｎ  ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  ｐｅｒｉｖａｓｃｕｌａｒ  Ｄｏｐｐｌｅｒ  ｆｌｏｗ  ｍｅｔｅｒ−ｂａｓｅｄ  ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ａｒｔｅｒｉａｌ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ｉｎ  Ｇｒｕｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  １０５：１４９２−９９  （２００５）；  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｔｈｒｏｍｂｏｅｍｂｏｌｉｓｍ  ｍｏｄｅｌ，  ａｏｒｔａ  ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ  ｍｏｄｅｌ，  ａｎｄ  ｍｕｒｉｎｅ  ｓｔｒｏｋｅ  ｍｏｄｅｌ  ｉｎ  Ｂｒａｕｎ  ｅｔ  ａｌ．、ＷＯ２００９／１１５６０９Ａ１号）。例えば、免疫疾患（多発性硬化症など）の検討のため、多発性硬化症の養子移入実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＡＴ−ＥＡＥ）モデルについて記載されている（Ｂｅｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６６：９３６  （２００１）；  Ｂｅｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＮＡＳ  ９８：１３９４２  （２００１）；  Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．、ＷＯ２００８／０８８４２２Ａ２号の実施例４５、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ＡＴ−ＥＡＥモデルでは、有効量の本発明の医薬組成物で処理した動物の有意に低下した疾患重症度および増加した生存率が予期され、対して未処置動物は重症疾患および／または致死を発現することが予期される。ＡＴ−ＥＡＥモデルの実行において、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）に特異的な脳骨髄性ＣＤ４＋ラットＴ細胞系ＰＡＳはＥｖｅｌｙｎｅ  Ｂｅｒａｕｄ博士から入手する。ＡＴ−ＥＡＥモデルにおけるこれらのインビトロ細胞の維持およびそれらの使用については、既に記載されている［Ｂｅｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  ＰＮＡＳ  ９８，  １３９４２］。ＰＡＳ  Ｔ細胞は、抗原刺激、またはＭＢＰおよび照射した胸腺細胞による活性化（２日間）、ならびにＴ細胞増殖因子による増殖（５日間）ラウンドを改変することによりインビトロで維持される。ＰＡＳ  Ｔ細胞（３×１０５／ｍＬ）の活性化は、１０μｇ／ｍＬのＭＢＰおよび１５×１０６／ｍＬの同系照射（３５００ラド）胸腺細胞による２日間の細胞インキュベートに関わる。インビトロ活性化後２日目、１０〜１５×１０６生存ＰＡＳ  Ｔ細胞を６〜１２週齢の雌Ｌｅｗｉｓラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）尾にＩＶ注射した。ビヒクル（２％Ｌｅｗｉｓラット血清のＰＢＳ溶液）または試験医薬組成物の１日皮下注射を−１日目から３日目まで投与する。ここで−１日目とはＰＡＳ  Ｔ細胞の注射１日前（０日目）を表す。ビヒクル処置ラットにおいて、急性ＥＡＥはＰＡＳ  Ｔ細胞注射から４〜５日後に発現することが予期される。典型的には、阻害剤レベル分析のため、４日目の尾静脈出血により、および８日目（試験最終日）の心穿刺により血清を採取する。典型的には、ラットを−１、４、６、および８日目に測量する。動物は、細胞移入日（０日目）〜３日目に��日１回、および４日目〜８日目に１日２回盲検的にスコア化し得る。臨床徴候を各肢および尾の不全麻痺程度の総スコアとして評価する。臨床的スコアリングは、０＝徴候なし、０．５＝末梢尾を引きずる、１．０＝尾を引きずる、２．０＝軽度不全対麻痺、運動失調、３．０＝中等度の不全対麻痺、３．５＝片方の後肢麻痺、４．０＝完全な後肢麻痺、５．０＝完全な後肢麻痺および失禁、５．５＝四肢麻痺、６．０＝瀕死状態または死である。スコア５．０に至るラットは、典型的には安楽死させる。
【０１７４】
抗原結合タンパク質の抗体産生の実施形態
ポリクローナル抗体。ポリクローナル抗体は、好ましくは関連抗原およびアジュバントの複数回皮下（ｓｃ）または腹腔内（ｉｐ）注射した動物において増加する。あるいは、抗原は動物のリンパ節内に直接注射し得る（Ｋｉｌｐａｔｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，  １６：３８１−３８９，  １９９７を参照されたい）。二機能性薬剤または誘導化剤、例えば、マレイミドベンジルスルホコハク酸イミドエステル（システイン残基を介した接合）、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（リジン残基を介して）、グルタルアルデヒド、コハク酸無水物または当技術分野において知られている他の薬剤を用いて、免疫化対象種において免疫原性であるタンパク質（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリン、または大豆トリプシンインヒビター）に関連抗原を接合することにより、改善された抗体反応が得られ得る。
【０１７５】
例えば、１００μｇタンパク質または結合体（マウスの場合）を３容量のフロインド完全アジュバントと結合させて溶液を複数部位に皮内注射することにより、動物を、抗原、免疫原性結合体、または誘導体に対して免疫化する。１ヶ月後、動物は、フロインド完全アジュバントを複数部位に皮下注射することにより元の量の５分の１〜１０分の１のペプチドまたは結合体でブーストする。ブースト注射の７〜１４日後、動物を出血させ、血清の抗体価をアッセイする。力価安定期まで動物をブーストする。好ましくは、同じ抗原の結合体で動物をブーストするが、異なるタンパク質に結合するおよび／または異なる架橋試薬を介する。結合体はタンパク質融合物として組換え細胞培養内でも作製できる。また、凝集剤（ミョウバンなど）も免疫応答を高めるために適切に用いられる。
【０１７６】
モノクローナル抗体。ＤＮＰまたはＫＬＨにそれぞれ結合するモノクローナル抗体も、本発明の抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質として提供する。モノクローナル抗体は、当技術分野において知られている任意の技術を用いて、例えば、免疫化スケジュール完了後にトランスジェニック動物から収集した不死化脾臓細胞により産生し得る。脾臓細胞は、当技術分野において知られている任意の技術を用いて、例えば、骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマを産生することにより不死化できる。例えば、モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２５６：４９５  （１９７５）により最初に記載されたハイブリドーマ方法を用いて作製してもよいし、組換えＤＮＡ方法（例えば、Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ，  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ｔｈｅｒｅｉｎ、米国特許第６，３３１，４１５号）により作製してもよく、これは任意選択的に抗体をグリコシル化できる哺乳類細胞系（例えば、ＣＨＯ細胞）を用いて、一般に軽鎖および重鎖の等モル産生を促進する「スプリットＤＨＦＲ」方法などの方法を含む（例えば、Ｐａｇｅ，  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、欧州特許第０４８１７９０Ａ２号および米国特許第５，５４５，４０３号を参照されたい）。
【０１７７】
ハイブリドーマ方法では、マウスまたは他の適切な宿主哺乳類（ラット、ハムスターまたはマカクザルなど）を本明細書に記載のように免疫化して、免疫化に用いるタンパク質と特異的に結合する抗体を産生するか産生可能なリンパ球を引き出す。あるいは、リンパ球は、インビトロで免疫化し得る。次いで適切な融合剤（ポリエチレングリコールなど）を用いて、リンパ球を骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，  ｐｐ．５９−１０３  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８６））。
【０１７８】
一部の場合では、ハイブリドーマ細胞系の産生は、ａＤＮＰまたはＫＬＨ免疫原を含むヒト免疫グロブリン配列を有するトランスジェニック動物を免疫化すること；免疫化動物から脾臓細胞を収集すること；収集した脾臓細胞を骨髄腫細胞系に融合して、ハイブリドーマ細胞を生成すること；ハイブリドーマ細胞系をハイブリドーマ細胞から確立すること、ならびにＤＮＰもしくはＫＬＨにそれぞれ結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞系を同定すること、により行う。かかるハイブリドーマ細胞系、およびかかるハイブリドーマ細胞系から産生したモノクローナル抗体は、本発明の態様である。
【０１７９】
本発明は、モノクローナル抗体である本発明の抗原結合タンパク質を産生するハイブリドーマも包含する。したがって、本発明は、以下を含む方法にも関する：
（ａ）ハイブリドーマにより抗原結合タンパク質を発現させる条件下の培養基でハイブリドーマを培養すること；ならびに
（ｂ）培養基から抗原結合タンパク質を回収することであり、これは既知の抗体精製技術（これに限定されないが、本明細書の実施例１に開示のモノクローナル抗体精製技術など）により成し遂げることができる。
【０１８０】
ハイブリドーマ細胞は調製後、（好ましくは、融合していない親骨髄腫細胞の増殖もしくは生存を阻害する物質を１つまたは複数含む）適切な培養基内で播種および増殖する。例えば、親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチン・グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマの培養基は、典型的には、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を防止する物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（ＨＡＴ培地）を含む。
【０１８１】
好ましい骨髄腫細胞は、効果的に融合し、選択された抗体産生細胞によって安定した高レベルの抗体産生を支え、培地に感受性である。ヒトモノクローナル抗体産生のためのヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞系についても記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １３３：  ３００１  （１９８４）  ；Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  ｐｐ．  ５１−６３  （Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８７））。ハイブリドーマを産生する融合手順に用いる骨髄腫細胞は、好ましくは、非抗体産生であり、高い融合効率、および所望の融合細胞（ハイブリドーマ）のみの増殖を支持する特定の選択的培地において増殖不能にする酵素欠乏を有する。マウス融合物における使用に適した細胞系の例としては、Ｓｐ−２０、Ｐ３−Ｘ６３／Ａｇ８、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＮＳ１／１．Ａｇ  ４  １、Ｓｐ２１０−Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ−１１、ＭＰＣ１１−Ｘ４５−ＧＴＧ  １．７およびＳ１９４／５ＸＸＯ  Ｂｕｌ；ラット融合物に用いる細胞系の例としては、Ｒ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３−Ａｇ  １．２．３、ＩＲ９８３Ｆおよび４Ｂ２１０が挙げられる。細胞融合物に有用な他の細胞系としては、Ｕ−２６６、ＧＭ１５００−ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ２およびＵＣ７２９−６が挙げられる。
【０１８２】
ハイブリドーマ細胞の増殖する培養基において、抗原指向性モノクローナル抗体の産生に関してアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈殿によりまたはインビトロ結合アッセイ（放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸収アッセイ（ＥＬＩＳＡ）など）により決定される。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）またはスキャッチャード分析により決定できる（Ｍｕｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １０７：２２０  （１９８０）；  Ｆｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ−ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＷＯ２００７／０４５４６３Ａ１号の実施例１０、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０１８３】
所望の特異性、親和性、および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定後、限定的な希釈手順によりクローンをサブクローン化し得、標準的な方法により増殖させ得る（Ｇｏｄｉｎｇ，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，  ｐｐ．５９−１０３  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８６））。この目的に適した培養基としては、例えば、Ｄ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。加えて、ハイブリドーマ細胞は動物内の腹水腫瘍としてインビボ増殖させ得る。
【０１８４】
ハイブリドーマまたはｍＡｂは、特定の特性（Ｋｖ１．ｘチャネルを介したＫ１＋流動を阻害する能力など）を有するｍＡｂを同定するためにさらにスクリーニングし得る。かかるスクリーニング例を以下の実施例に提示する。サブクローンに分泌されたモノクローナル抗体は、従来の免疫グロブリン精製手順（例えば、タンパク質Ａセファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、親和性クロマトグラフィー、または当技術分野において知られている他の任意の適切な精製技術など）により、培養基、腹水液、または血清から適切に分離する。
【０１８５】
抗体の組換え産生。本発明は、本明細書に記載の本発明の任意の（ポリクローナルおよびモノクローナル）抗体（抗体断片を含む）をコードし、任意選択的に、核酸を含む宿主細胞、ベクターおよび宿主細胞により認識される配列を制御するように操作可能に連結された単離核酸、ならびに抗体産生のための組換え技術（核酸を発現させるように宿主細胞を培養すること、ならびに任意選択的に、宿主細胞培養もしくは培養基から抗体を回収することを含み得る）を提供する。類似の物質および方法をポリペプチドベースの抗原結合タンパク質の産生に適用する。
【０１８６】
目的の免疫グロブリンまたはポリペプチド由来の関連アミノ酸配列は、直接タンパク質配列決定により決定し得、適切なコード化ヌクレオチド配列を汎用コドン表に従い設計できる。あるいは、モノクローナル抗体をコードするゲノムまたはｃＤＮＡは、従来の手順を用いて（例えば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いて）かかる抗体を産生する細胞から単離して配列決定し得る。
【０１８７】
ＤＮＡのクローニングは、標準的な技術を用いて実行する（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：    Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｇｕｉｄｅ，  Ｖｏｌｓ  １−３，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい）。例えば、ｃＤＮＡライブラリーは、ｐｏｌｙＡ＋ｍＲＮＡ、好ましくは膜結合型ｍＲＮＡ、およびヒト免疫グロブリンポリペプチド遺伝子配列に特異的なプローブを用いてスクリーニングしたライブラリーの逆転写により構築し得る。しかしながら、１つの実施形態では、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、目的の免疫グロブリン遺伝子セグメント（例えば、軽鎖または重鎖可変セグメント）をコードするｃＤＮＡ（または完全長ｃＤＮＡの一部）を増幅する。増幅された配列は、任意の適切なベクター、例えば、発現ベクター、ミニ遺伝子ベクター、またはファージディスプレイベクター内に容易にクローン化できる。目的の免疫グロブリンポリペプチドの一部配列を決定できる限り、使用する特定のクローニング方法は重要ではないことが理解されるであろう。
【０１８８】
抗体核酸の１つの供給源は、目的の抗原により免疫化した動物からＢ細胞を得て不死細胞に融合することにより産生されるハイブリドーマである。あるいは、核酸は免疫化動物のＢ細胞（または完全脾臓）から単離できる。抗体をコードする核酸のさらに別の供給源は、例えば、ファージディスプレイ技術を介して産生したかかる核酸のライブラリーである。目的のペプチド、例えば、所望の結合特性を有する可変領域ペプチドをコードするポリヌクレオチドは、標準的な技術（パニングなど）により同定できる。
【０１８９】
免疫グロブリンポリペプチドの完全可変領域をコードする配列を決定し得る；しかしながら、時には可変領域の一部のみ、例えば、ＣＤＲコード部分のみの配列決定が適している。配列決定は、標準的な技術を用いて行う（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｇｕｉｄｅ，  Ｖｏｌｓ  １−３，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  ａｎｄ  Ｓａｎｇｅｒ，  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９７７）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７４：  ５４６３−５４６７を参照されたく、これらは参照により本明細書に組み込まれる）。ヒト免疫グロブリン遺伝子およびｃＤＮＡの公開された配列とクローン化した核酸配列を比較することにより、当業者は配列決定した領域に応じて、（ｉ）ハイブリドーマ免疫グロブリンポリペプチド（重鎖のアイソタイプを含む）の生殖系列セグメント使用ならびに（ｉｉ）重鎖および軽鎖の可変領域の配列（Ｎ領域添加および体細胞変異プロセスに起因する配列を含む）を容易に決定できるであろう。免疫グロブリン遺伝子配列情報の１つの供給源は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  Ｍｄ．である。
【０１９０】
単離ＤＮＡは、制御配列と操作可能に連結させることも発現ベクター中に入れることもでき、次いでこれらを、そうしなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞内にトランスフェクトし、組換え宿主細胞内のモノクローナル抗体の合成を指向する。抗体の組換え産生は、当技術分野において周知である。
【０１９１】
核酸は、別の核酸配列との機能的関係におかれる場合、操作可能に連結している。例えば、プレ配列もしくは分泌リーダーについてのＤＮＡは、ポリペプチド分泌に関わるプレタンパク質として発現する場合、ポリペプチドについてのＤＮＡと操作可能に連結している；プロモーターもしくはエンハンサーは、配列の転写に影響を与える場合、コード配列と操作可能に連結している；またはリボソーム結合部位は、翻訳を促進するように位置する場合、コード配列と操作可能に連結している。一般に、操作可能に連結しているとは、連結しているＤＮＡ配列が連続的であること、および分泌リーダーの場合は、連続的かつ読み込み相にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは連続的である必要はない。連結は、好都合の制限部位での結紮により成し遂げられる。かかる部位が存在しない場合、従来の実践に従い合成オリゴヌクレオチド接着体またはリンカーを用いる。
【０１９２】
多くのベクターが当技術分野において知られている。ベクター成分は、下記を１つまたは複数含み得る：シグナル配列（例えば、抗体の分泌を指向とし得る；例えば、
ＡＴＧＧＡＣＡＴＧＡＧＧＧＴＧＣＣＣＧＣＴＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧＧＧＣＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧＣＴＧＡＧＡＧＧＴＧＣＧＣＧＣＴＧＴ／／配列番号１０２、これはＶＫ−１シグナルペプチド配列ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣ／／配列番号１０３をコードする）、複製起点、１つもしくは複数の選択的マーカー遺伝子（例えば、抗生剤もしくは他の薬剤耐性、相補性栄養要求欠陥を付与し得るか、または培地中で入手不能な重要栄養剤を補給し得る）、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写終止配列であり、これらはすべて当技術分野において周知である。
【０１９３】
細胞、細胞系、および細胞培養は頻繁に同義的に使用し、本明細書におけるかかる指示対象はすべて後代を含む。形質転換体および形質転換細胞は、転写数を問わず、一次標的細胞およびそこから生成する培養を含む。後代は、故意または偶然の変異のためにＤＮＡ内容物において必ずしも厳密に同一ではない場合があることも理解される。元の形質転換細胞においてスクリーニングした機能または生体活性と同じ機能または生体活性を有する変異後代も含まれる。
【０１９４】
宿主細胞の例としては、原核生物、酵母、高等真核生物細胞が挙げられる。原核生物の宿主細胞としては、真正細菌（グラム陰性またはグラム陽性生物、例えば、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、例えば、Ｅ．  ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、例えば、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃａｎ、およびＳｈｉｇｅｌｌａなど）ならびにＢａｃｉｌｌｕｓ（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢ．  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓなど）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓが挙げられる。真核微生物（糸状菌または酵母など）は、組換えポリペプチドまたは抗体に適したクローニングまたは発現宿主である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、すなわち一般的なパン酵母が、低等真核宿主微生物の間で最も一般的に用いられる。しかしながら、他のいくつかの属、種、および系統も本明細書において一般的に利用可能であり有用である（Ｐｉｃｈｉａ、例えばＰ．  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅなど；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ；Ｃａｎｄｉｄａ；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉａ；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ；Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ、例えばＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓなど；ならびに糸状菌、例えば、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ宿主、例えばＡ．  ｎｉｄｕｌａｎｓおよびＡ．  ｎｉｇｅｒなど）。
【０１９５】
グリコシル化抗原結合タンパク質（抗体を含む）の発現のための宿主細胞は、多細胞生物に由来し得る。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞および昆虫細胞が挙げられる。幾多のバキュロウイルスの系統および変異体、ならびにＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（毛虫）、Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ（蚊）、Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ（蚊）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（ショウジョウバエ）、およびＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉなどの宿主由来の対応する許容可能な昆虫宿主細胞が同定されている。かかる細胞のトランスフェクションのための各種ウイルス系統は、公的に入手可能である（例えば、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ＮＰＶのＬ−１変異型およびＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ＮＰＶのＢｍ−５系統）。
【０１９６】
脊椎動物宿主細胞も適切な宿主であり、かかる細胞由来の抗原結合タンパク質（抗体を含む）の組換え産生は通例の手順となっている。有用な哺乳類宿主細胞系の例としては、ＣＨＯＫ１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ６１）、ＤＸＢ−１１、ＤＧ−４４、およびチャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲなどのチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７７：  ４２１６  （１９８０））；ＳＶ４０により形質転換したサル腎臓ＣＶ１系（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト胚腎臓系（懸濁培養内の増殖のためにサブクローン化した２９３または２９３細胞、［Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．  ３６：  ５９  （１９７７）］；ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｐｒｏｄ．  ２３：  ２４３−２５１  （１９８０））；サル腎細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；ミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト頚癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝細胞癌（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ３８３：  ４４−６８  （１９８２））；ＭＲＣ５細胞もしくはＦＳ４細胞；または哺乳類骨髄腫細胞が挙げられる。
【０１９７】
宿主細胞は、抗原結合タンパク質の産生のための上記の核酸またはベクターと形質転換またはトランスフェクトし、プロモーター導入のため、形質転換体の選択のため、または所望の配列をコードする遺伝子の増幅のために適切に修飾した従来の栄養培地で培養する。加えて、新規ベクターおよび選択的マーカーにより分離される転写単位の複数の複写とトランスフェクトした細胞系は、特に抗原結合タンパク質の発現のために有用である。
【０１９８】
本発明の抗原結合タンパク質を産生するために用いられる宿主細胞は、各種培地で培養し得る。Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（（ＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、およびダルベッコ変法イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）などの市販の培地が宿主細胞の培養に適している。加えて、Ｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚ．  ５８：  ４４  （１９７９），  Ｂａｒｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １０２：  ２５５  （１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号；同第４，６５７，８６６号；同第４，９２７，７６２号；同第４，５６０，６５５号；または同第５，１２２，４６９号；ＷＯ９０１０３４３０号；ＷＯ８７／００１９５号；または米国特許第３０，９８５号に記載されている任意の培地を宿主細胞のための培養基として用いてよい。任意のこれらの培地を、必要に応じてホルモンおよび／もしくは他の増殖因子（インスリン、トランスフェリン、または上皮細胞増殖因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸など）、緩衝液（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシンおよびチミジンなど）、抗生剤（Ｇｅｎｔａｍｙｃｉｎ（登録商標）薬剤など）、微量元素（通常、最終濃度がマイクロモル範囲で存在する無機化合物として定義）、ならびにグルコースもしくは等価エネルギー供給源で補充し得る。他の任意の必要な栄養補助剤も当業者に知られている適切な濃度で含み得る。培養条件（温度、ｐＨなど）は、発現のために選択した宿主細胞で先に用いたものであり、当業者にとって明らかである。
【０１９９】
宿主細胞の培養時、抗原結合タンパク質は細胞内の細胞膜周辺腔内で産生することもでき、培地に直接分泌することもできる。抗原結合タンパク質が細胞内で第一工程として産生される場合、微粒子破片（宿主細胞または溶解断片のいずれか）は、例えば、遠心分離または限外ろ過により除去される。
【０２００】
抗原結合タンパク質（例えば、抗体または抗体断片）は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、陽イオンもしくは陰イオン交換クロマトグラフィー、または好ましくは親和性クロマトグラフィーを用いて、目的の抗原もしくは親和性リガンドとしてタンパク質Ａもしくはタンパク質Ｇを用いて精製できる。タンパク質Ａは、タンパク質（ヒトγ１、γ２、またはγ４重鎖に基づくポリペプチドを含む）を純化するために使用できる（Ｌｉｎｄｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈ．  ６２：  １−１３  （１９８３））。タンパク質Ｇは、すべてのマウスアイソタイプおよびヒトγ３において推奨される（Ｇｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ５：  １５６７１５７５  （１９８６））。親和性リガンドが結合する基質は、ほとんどの場合はアガロースであるが、他の基質も利用可能である。制御細孔ガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定した基質は、アガロースで達し得るよりも速い流速および短いプロセス時間を可能とする。タンパク質がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸ（登録商標）樹脂（Ｊ．  Ｔ．  Ｂａｋｅｒ，  Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，  Ｎ．Ｊ．）は、精製のために有用である。収集する抗体に応じて、タンパク質精製のための他の技術（エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、等電点電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および硫酸アンモニウム沈殿など）も可能である。
【０２０１】
キメラ抗体、ヒト化およびＨｕｍａｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（登録商標）モノクローナル抗体。齧歯類モノクローナル抗体の可変Ｉｇドメインがヒト定常Ｉｇドメインに融合されているキメラモノクローナル抗体を、当技術分野において知られている標準的な手順を用いて産生できる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，  Ｓ．  Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８４）  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ；  Ｍｏｕｓｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｄｏｍａｉｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｏｎｓｔａｎｔ  Ｒｅｇｉｏｎ  Ｄｏｍａｉｎｓ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８１，  ６８４１−６８５５；  ａｎｄ，  Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ，  Ｇ．  Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３１２，  ６４３−６４６  ．  （１９８４）を参照されたい）。例えば、（１）ヒトフレームワークおよび定常領域上への非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）のグラフト（当技術分野において「ＣＤＲグラフト」を介したヒト化と呼ばれるプロセス）または（２）完全非ヒト可変ドメインを移植するが、表面残基の置換によりヒト様表面でそれらを「覆うこと」（当技術分野において「化粧張り」と呼ばれるプロセス）または（３）各残基の抗原結合もしくは抗体構造に関わる可能性ならびに免疫原性の可能性に基づきさらにヒト化するための選択された非ヒトアミノ酸残基の修飾、により抗体配列をさらにヒト様とするためのヒト化もしくは修飾技術についていくつか記載されている。例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２  ５２５  （１９８６）；  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  ８１：６８５１  ６８５５  （１９８４）；  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｏｉ，  Ａｄｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ４４：６５  ９２  （１９８８）；  Ｖｅｒｈｏｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４  １５３６  （１９８８）；  Ｐａｄｌａｎ，  Ｍｏｌｅｃ．  Ｉｍｍｕｎ．  ２８：４８９  ４９８  （１９９１）；  Ｐａｄｌａｎ，  Ｍｏｌｅｃ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３１（３）：１６９  ２１７  （１９９４）；ならびにＫｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ，  Ｃ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  ４（７）：７７３  ８３  （１９９１）；  Ｃｏ，  Ｍ．  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４），  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５２，  ２９６８−２９７６）；  Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７：  ８０５−８１４  （１９９４）を参照されたい；これらはそれぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２０２】
例えば、（１）ヒトフレームワークおよび定常領域上への非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）のグラフト（当技術分野において「ＣＤＲグラフト」を介したヒト化と呼ばれるプロセス）または（２）完全非ヒト可変ドメインを移植するが、表面残基の置換によりヒト様表面でそれらを「覆うこと」（当技術分野において「化粧張り」と呼ばれるプロセス）または（３）各残基の抗原結合もしくは抗体構造に関わる可能性ならびに免疫原性の可能性に基づきさらにヒト化するための選択された非ヒトアミノ酸残基の修飾、により抗体配列をさらにヒト様とするためのヒト化もしくは修飾技術についていくつか記載されている。例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２  ５２５  （１９８６）；  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  ８１：６８５１  ６８５５  （１９８４）；  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｏｉ，  Ａｄｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ４４：６５  ９２  （１９８８）；  Ｖｅｒｈｏｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４  １５３６  （１９８８）；  Ｐａｄｌａｎ，  Ｍｏｌｅｃ．  Ｉｍｍｕｎ．  ２８：４８９  ４９８  （１９９１）；  Ｐａｄｌａｎ，  Ｍｏｌｅｃ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３１（３）：１６９  ２１７  （１９９４）；ならびにＫｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ，  Ｃ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  ４（７）：７７３  ８３  （１９９１）；  Ｃｏ，  Ｍ．  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４），  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５２，  ２９６８−２９７６）；  Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７：  ８０５−８１４  （１９９４）を参照されたい；これらはそれぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２０３】
１つの態様では、本明細書（表２Ａ〜Ｂを参照されたい）に提供する抗体の軽鎖および重鎖可変領域のＣＤＲを、同一または異なる系統発生種由来の抗体のフレームワーク領域（ＦＲ）にグラフト化する。例えば、重鎖可変領域（例えば、ＶＨ１、ＶＨ２、ＶＨ３、ＶＨ４、ＶＨ５、ＶＨ６、ＶＨ７、ＶＨ８、またはＶＨ９）および／または軽鎖可変領域（例えば、ＶＬ１、ＶＬ２、ＶＬ３、ＶＬ４、ＶＬ５、ＶＬ６、ＶＬ７、ＶＬ８、またはＶＬ９）のＣＤＲはコンセンサスヒトＦＲにグラフト化できる。コンセンサスヒトＦＲを作製するため、いくつかのヒト重鎖または軽鎖アミノ酸配列由来のＦＲを整列してコンセンサスアミノ酸配列を同定し得る。他の実施形態では、本明細書で開示する重鎖または軽鎖のＦＲは異なる重鎖または軽鎖のＦＲと置換されている。１つの態様では、抗体の重鎖および軽鎖のＦＲ内にある稀なアミノ酸は置換されておらず、対して残りのＦＲアミノ酸は置換されている。「稀なアミノ酸」とは、通常はＦＲに見出されない位置にある特異的アミノ酸である。あるいは、１つの重鎖または軽鎖由来のグラフト化可変領域を、本明細書に開示の特定の重鎖または軽鎖の定常領域と異なる定常領域と用いてよい。他の実施形態では、グラフト化可変領域は、単鎖Ｆｖ抗体の一部である。
【０２０４】
抗体は、内因性免疫グロブリンを産生せずヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むように加工されたトランスジェニック動物を用いて産生することもできる。例えば、ＷＯ９８／２４８９３号には、内因性重鎖および軽鎖遺伝子座の不活性化のために機能性内因性免疫グロブリンを産生しない、ヒトＩｇ遺伝子座を有するトランスジェニック動物について開示されている。ＷＯ９１／１０７４１号にも、免疫原に対する免疫応答を開始できるトランスジェニック非霊長類哺乳類宿主について開示されており、この抗体は霊長類の定常および／または可変領域を有し、ここで遺伝子座をコードする内因性免疫グロブリンは置換または不活性化されている。ＷＯ９６／３０４９８号には、哺乳類における免疫グロブリン遺伝子座を修飾する（定常または可変領域のすべてまたは一部を置換して修飾抗体分子を形成するなど）ためのＣｒｅ／Ｌｏｘ系の使用について開示されている。ＷＯ９４／０２６０２号には、内因性Ｉｇ遺伝子座を不活性化されて機能性ヒトＩｇ遺伝子座を有する非ヒト哺乳類宿主について開示されている。米国特許第５，９３９，５９８号には、内因性重鎖を欠き、外因性免疫グロブリン遺伝子座（１つまたは複数の異種間定常領域を含む）を発現するトランスジェニックマウスの作製方法について開示されている。
【０２０５】
上記トランスジェニック動物を用いて、選択された抗原分子に対する免疫応答を起こすことができ、細胞を産生する抗体を動物から除去してヒト由来モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを産生するために使用できる。免疫化プロトコール、アジュバントなどは当技術分野において知られており、例えば、ＷＯ９６／３３７３５号に記載のトランスジェニックマウスの免疫化に用いられる。モノクローナル抗体について、対応するタンパク質の生体活性または生理的効果を阻害または中性化する能力を試験できる。Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９０：２５５１  （１９９３）；  Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３６２：２５５−２５８  （１９９３）；  Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．，  ７：３３  （１９９３）；  Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．  １５：１４６−１５６  （１９９７）；ならびに米国特許第５，５９１，６６９号、米国特許第５，５８９，３６９号、米国特許第５，５４５，８０７号；ならびに米国特許第２００２０１９９２１３号も参照されたい。米国特許第２００３００９２１２５号には、所望のエピトープに対する動物の免疫応答に偏向させるための手順について記載されている。ヒト抗体はインビトロ活性化Ｂ細胞によっても産生し得る（米国特許第５，５６７，６１０号および同第５，２２９，２７５号を参照されたい）。
【０２０６】
ファージディスプレイ技術による抗体産生
組換えヒト抗体遺伝子のレパートリー作製のための技術開発および線維状バクテリオファージ表面上のコードされた抗体断片のディスプレイにより、ヒト由来抗体を生成する別の手順が提供されている。ファージディスプレイについては、例えば、Ｄｏｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、ＷＯ９１／１７２７１号、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．、ＷＯ９２／０１０４７号、およびＣａｔｏｎ  ａｎｄ  Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８７：６４５０−６４５４  （１９９０）（これらはそれぞれ参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。ファージ技術により産生された抗体は、通常、抗原結合断片（例えばＦｖまたはＦａｂ断片）として細菌内に産生されるため、エフェクター機能を欠く。エフェクター機能は、２つの戦略の１つにより導入できる：断片は、哺乳類細胞内における発現のために完全な抗体内か、またはエフェクター機能を惹起できる第二結合部位を有する二重特異性抗体断片内のいずれかに加工できる。
【０２０７】
典型的には、抗体のＦｄ断片（ＶＨ−ＣＨ１）および軽鎖（ＶＬ−ＣＬ）をＰＣＲにより別々にクローン化し、コンビナトリアルファージディスプレイライブラリーで無作為に組換えてから、特定の抗原への結合のために選択することができる。抗体断片をファージ表面上で発現させ、抗原結合によるＦｖまたはＦａｂの選択（したがって抗体断片をコードするＤＮＡを含むファージ）は、数回の抗原結合および再増幅（パニングと呼ばれる手順）を介して成し遂げる。抗原特異的な抗体断片を濃縮し、最終的に単離する。
【０２０８】
ファージディスプレイ技術はまた、「ガイド選択」と呼ばれる齧歯類モノクローナル抗体のヒト化アプローチにも使用できる（Ｊｅｓｐｅｒｓ，  Ｌ．  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２，  ８９９−９０３  （１９９４）を参照されたい）。この技術において、マウスモノクローナル抗体のＦｄ断片をヒト軽鎖ライブラリーと組み合わせて提示でき、次いで生成したハイブリッドＦａｂライブラリーを抗原で選択し得る。このようにして、マウスＦｄ断片は、選択をガイドするための鋳型を提供する。続いて、選択したヒト軽鎖を、ヒトＦｄ断片ライブラリーと組み合わせる。得られたライブラリーの選択により、完全ヒトＦａｂが得られる。
【０２０９】
ファージ−ディスプレイライブラリーからヒト抗体を引き出すための様々な手順について記載されている（例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２２７：３８１  （１９９１）；  Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ，  ２２２：５８１−５９７  （１９９１）；米国特許第５，５６５，３３２号および同第５，５７３，９０５号；Ｃｌａｃｋｓｏｎ，  Ｔ．，  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，  Ｊ．  Ａ．，  ＴＩＢＴＥＣＨ  １２，  １７３−１８４  （１９９４）を参照されたい）。特に、ファージディスプレイライブラリーに由来する抗体のインビトロ選択および進化は強力な手段となっている（Ｂｕｒｔｏｎ，  Ｄ．  Ｒ．，  ａｎｄ  Ｂａｒｂａｓ  ＩＩＩ，  Ｃ．  Ｆ．，  Ａｄｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ５７，  １９１−２８０  （１９９４）；ならびに、Ｗｉｎｔｅｒ，  Ｇ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １２，  ４３３−４５５  （１９９４）；米国特許第２００２０００４２１５号およびＷＯ９２／０１０４７号；米国特許第２００３０１９０３１７号（２００３年１０月９日公開）および米国特許第６，０５４，２８７号；米国特許第５，８７７，２９３号を参照されたい）。
【０２１０】
Ｗａｔｋｉｎｓ，  “Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｈａｇｅ−Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｂｙ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｌｉｆｔ，”  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  １７８：  １８７−１９３、および米国特許第２００３００４４７７２号（２００３年３月６日公開）には、固体支持体への候補結合分子の固定化に関わる方法である捕獲リフトによるファージ発現抗体ライブラリーまたは他の結合分子のスクリーニング方法について記載されている。
【０２１１】
抗原結合タンパク質：抗体断片の他の実施形態
上記のとおり、抗体断片はインタクトな完全長抗体の一部、好ましくはインタクト抗体の抗原結合領域もしくは可変領域を含み、抗体断片から形成される線状抗体および多重特異性抗体を含む。限定されない抗体断片の例としては、抗体が所望の生体活性を保持する限り、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｄ、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体断片、マキシボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、線状抗体、キレート化組換え抗体、トリボディまたはバイボディ、細胞内抗体、ナノボディ、小モジュール免疫薬剤（ＳＭＩＰ）、抗原結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質、ラクダ化抗体、ＶＨＨを含む抗体、またはそれらの変異タンパク質もしくは誘導体、ならびにポリペプチドへ結合する特異的抗原を付与する上で十分な免疫グロブリンを少なくとも一部含むポリペプチド（ＣＤＲ配列など）が挙げられる。かかる抗原断片は、完全抗体の修飾により産生してもよいし、組換えＤＮＡ技術またはペプチド合成を用いてｄｅ  ｎｏｖｏ合成してもよい。
【０２１２】
追加の抗体断片としては、ＶＨドメインからなるドメイン抗体（ｄＡｂ）断片（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６，  １９８９）が挙げられる。
【０２１３】
「線状抗体」は、一対の抗原結合領域を形成する一対の直列Ｆｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む。線状抗体は、二重特異性であることもでき、単一特異性であることもできる（Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  ８：１０５７−６２  （１９９５））。
【０２１４】
ペプチドリンカー（ヒンジなし）を介してまたはＩｇＧヒンジを介してＣＨ３に融合しているｓｃＦｖからなる「ミニボディ」については、Ｏｌａｆｓｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ．  ２００４  Ａｐｒ；１７（４）：３１５−２３に記載されている。
【０２１５】
「マキシボディ」という用語は、免疫グロブリンのＦｃ領域に共有結合している２価ｓｃＦｖを指す。例えば、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋｓ  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  Ｄｅｓｉｇｎ  ＆  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，  １７：９５−１０６  （２００４）およびＰｏｗｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ２５１：１２３−１３５  （２００１）を参照されたい。
【０２１６】
軽鎖を欠く機能性重鎖抗体は、テンジクザメ、アラフラオオセ（ｗｏｂｂｅｇｏｎｇ  ｓｈａｒｋ）およびラクダ科（ラクダ、ヒトコブラクダ、アルパカおよびラマなど）などの特定の動物種において天然で生じる。抗原結合部位は、これらの動物において単一ドメインであるＶＨＨドメインのみとなる。これらの抗体は重鎖可変領域のみを用いて抗原結合領域を形成する、すなわち、これらの機能性抗体はＨ２Ｌ２構造のみを有する重鎖ホモ二量体である（「重鎖抗体」または「ＨＣＡｂ」と呼ばれる）。ラクダ化ＶＨＨは、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインを含み、ＣＨ１ドメインを欠くＩｇＧ２およびＩｇＧ３定常領域と再結合することが報告されている。従来のＶＨ単独断片は、可溶性形態で産生することは困難であるが、フレームワーク残基をさらにＶＨＨ様に改変した場合、溶解度を改善して特異的結合を得ることができる。（例えば、Ｒｅｉｃｈｍａｎ，  ｅｔａｌ．，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９９９，  ２３１：２５−３８を参照されたい）。ラクダ化ＶＨＨドメインは高親和性で抗原に結合し（Ｄｅｓｍｙｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７６：２６２８５−９０，  ２００１）、溶液中における安定性が高いことが見出されている（Ｅｗｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４１：３６２８−３６，  ２００２）。ラクダ化重鎖を有する抗体の生成方法は、例えば、米国特許第２００５／０１３６０４９号および同第２００５／００３７４２１号に記載されている。代替的な足場は、サメＶ−ＮＡＲ足場にさらに厳密に適合するヒト可変様ドメインから作製でき、長い貫通ループ構造のためのフレームワークを提供し得る。
【０２１７】
重鎖抗体の可変ドメインは分子質量が１５ｋＤａのみの最小の完全な機能性抗原結合断片であるため、この実体はナノボディと呼ばれる（Ｃｏｒｔｅｚ−Ｒｅｔａｍｏｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６４：２８５３−５７，  ２００４）。ナノボディライブラリーは、Ｃｏｎｒａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  （Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ４５：  ２８０７−１２，  ２００１）に記載されているように免疫化ヒトコブラクダから産生し得る。
【０２１８】
細胞内抗体は、細胞内発現を示し、細胞内タンパク質機能を操作することができる単鎖抗体である（Ｂｉｏｃｃａ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ９：１０１−１０８，  １９９０；  Ｃｏｌｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  １０１：１７６１６−２１，  ２００４）。細胞領域内に抗体構築物を保持する細胞シグナル配列を含む、細胞内抗体は、Ｍｈａｓｈｉｌｋａｒ  ｅｔ  ａｌ  （ＥＭＢＯ  Ｊ  １４：１５４２−５１，  １９９５）およびＷｈｅｅｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  １７：１７３３−５．  ２００３）に記載されているように産生され得る。トランスボディは、タンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）が単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）抗体と融合している細胞浸性抗体であるＨｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  （Ｍｅｄ  Ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ．  ６４：１１０５−８，  ２００５）。
【０２１９】
さらに、ＳＭＩＰすなわち標的タンパク質に特異的な結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質である抗体も本発明に包含される。これらの構築物は、抗体エフェクター機能を実行するために必要な免疫グロブリンドメインに融合した抗原結合ドメインを含む単鎖ポリペプチドである。例えば、ＷＯ０３／０４１６００号、米国特許第２００３０１３３９３９号および米国特許第２００３０１１８５９２号を参照されたい。
【０２２０】
抗体断片産生のために様々な技術が開発されている。従来、これらの断片はインタクト抗体のタンパク質分解による消化を介して生成していたが、組換え宿主細胞により直接産生することもできる。例えば、Ｂｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：  １０４１−１０４３  （１９８８）；  Ｓｋｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：  １０３８−１０４１  （１９８８）；  Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７  （１９９２）を参照されたい。
【０２２１】
抗原結合タンパク質：多価抗体の他の実施形態
いくつかの実施形態では、多価またはさらには多重特異性（例えば二重特異性、三重特異性など）モノクローナル抗体を産生することが望ましい場合がある。かかる抗体は、標的抗原の少なくとも２つの異なるエピトープに対して特異的に結合し得るか、あるいは２つの異なる分子、例えば標的抗原と細胞表面タンパク質または受容体に結合し得る。例えば、二重特異性抗体は、細胞防御機序を標的発現細胞に集中させるために、標的に結合する腕と、（Ｔ細胞受容体分子（例えば、ＣＤ２またはＣＤ３）などの白血球上の引き金分子、またはＩｇＧのためのＦｃ受容体（ＦｃγＲ）、例えばＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）に結合する別の腕を含み得る。別の例では、二重特異性抗体を、標的抗原を発現する細胞に細胞障害性薬を局在化させるために用いてよい。これらの抗体は、標的結合腕と細胞障害性薬（例えば、サポリン、抗インターフェロン６０、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキサートまたは放射性同位体ハプテン）に結合する腕を有する。多重特異性抗体は、完全長抗体または抗体断片として調製できる。
【０２２２】
追加的に、本発明の抗ＤＮＰまたは抗ＫＬＨ抗体は、多価形態に折り畳むように構築することもでき、結合親和性、特異性および／または血中の増長した半減期を改善し得る。抗ＤＮＰまたは抗ＫＬＨの多価形態は、当技術分野において知られている技術により調製できる。
【０２２３】
二特異性または多重特異性抗体には、架橋された抗体または「ヘテロ複合」抗体が含まれる。例えば、ヘテロ複合体中の抗体の片方をアビジンに結合し、他方をビオチンに結合することができる。ヘテロ複合抗体は、任意の好都合な架橋手順を用いて作製し得る。適切な架橋剤は、当技術分野において周知であり、いくつかの架橋技術とあわせて米国特許第４，６７６，９８０号に開示されている。ｓｃＦｖのＣ末端にストレプトアビジンをコードする配列を添加することによって四量体を作製する別の方法が指定されている。ストレプトアビジンは、４つのサブユニットからなるため、ｓｃＦｖ−ストレプトアビジンが折畳まれた場合、４つのサブユニットが結合して四量体を形成する（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ６（３）：  ９３−１０１  （１９９５）、この開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０２２４】
二重特異性抗体を作製するための別のアプローチに従い、１組の抗体分子の間の界面を加工して、組換え細胞培養物から収集されるヘテロ二量体率を最大化できる。１つの界面は、抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第一抗体分子の界面からの１つまたは複数の小さなアミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置換する。第二抗体分子の界面では、大きなアミノ酸側鎖をより小さなアミノ酸側鎖（例えば、アラニンまたはトレオニン）で置換することにより、大きな側鎖（１本または複数本）と同一または類似サイズの補償的な「腔」が作製される。これは、他の望ましくない最終生成物（ホモ二量体など）を上回ってヘテロ二量体の収率を上昇させるための機序を提供する。ＷＯ９６／２７０１１号（１９９６年９月６日公開）を参照されたい。
【０２２５】
抗体断片から二重特異性または多重特異性抗体を生成する技術についても文献に記載されている。例えば、二重特異性または三重特異性抗体は化学結合を用いて調製できる。Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１  （１９８５）には、インタクト抗体をタンパク質分解的に切断してＦ（ａｂ’）２断片を産生する手順について記載されている。これらの断片は、ジチオール複合剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して隣接ジオールを安定させ、分子間のジスルフィド形態を防止する。次いで産生したＦａｂ’断片をチオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に形質転換する。次いでＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体の１つをメルカプトエチルアミンと還元してＦａｂ’−チオールに再変換し、等モル量の他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合して二重特異性抗体を形成する。産生した二重特異性抗体は、酵素の選択的固定化のための薬剤として使用できる。Ｂｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：  １０４１−１０４３  （１９８８）には細菌由来の機能性抗体断片の分泌について開示されている（例えば、Ｂｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｋｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：  １０３８−１０４１  （１９８８）を参照されたい）。例えば、Ｆａｂ’−ＳＨ断片は、Ｅ．  ｃｏｌｉから直接収集し、化学的結合させて二重特異性抗体を形成することができる（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７  （１９９２）；  Ｓｈａｌａｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １７５：２１７−２２５  （１９９２））。
【０２２６】
Ｓｈａｌａｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １７５：２１７−２２５  （１９９２）には、完全ヒト化二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の産生について記載されている。各Ｆａｂ’断片をＥ．ｃｏｌｉから別々に分泌させ、インビトロ指向性化学結合に供して、二重特異性抗体を形成した。
【０２２７】
二重特異性または多重特異性抗体断片を組換え細胞培養から直接作製して単離する各種技術についても記載されている。例えば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパー、例えばＧＣＮ４を用いて産生されている（一般にＫｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４８（５）：１５４７−１５５３  （１９９２）を参照されたい）。ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドは、遺伝子融合により２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に結合した。抗体ホモ二量体はヒンジ領域で還元し、単量体を形成してから再び酸化して抗体ヘテロ二量体を形成する。この方法は、抗体ホモ二量体の産生においても使用できる。
【０２２８】
上記のダイアボディは、二重特異性抗体の１例である。例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９０：６４４４−６４４８  （１９９３）を参照されたい。２価のダイアボディは、ジスルフィド結合により安定させることができる。
【０２２９】
安定した単一特異性または二重特異性Ｆｖ四量体も、（ｓｃＦｖ２）２配置で産生することもでき、ビス−テトラボディとして非共有結合により産生することもできる。あるいは、２つの異なるｓｃＦｖを直列に結合してビス−ｓｃＦｖを形成することもできる。
【０２３０】
単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を用いて二重特異性抗体断片を作製する別の戦略も報告されている。Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５２：  ５３６８  （１９９４）を参照されたい。あるアプローチでは、２つのｓｃＦｖ抗体をリンカーまたはジスルフィド結合で連結させる（Ｍａｌｌｅｎｄｅｒ  ａｎｄ  Ｖｏｓｓ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６９：１９９−２０６１９９４、ＷＯ９４／１３８０６号、および米国特許第５，９８９，８３０号、これらの開示は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【０２３１】
あるいは、二重特異性抗体はＺａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  ８（１０）：１０５７−１０６２  （１９９５）に記載されているように産生される「線状抗体」であり得る。簡単に述べると、これらの抗体は、一対の抗原結合領域を形成する一対の直列Ｆｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む。線状抗体は二重特異性であることもでき、単一特異性であることもできる。
【０２３２】
２価を超える抗体も意図する。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。（Ｔｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４７：６０  （１９９１））。
【０２３３】
「キレート化組換え抗体」とは、標的抗原の隣接するかつ重複しないエピトープを認識する二重特異性抗体であり、両エピトープに同時に結合する上で十分に可動性である（Ｎｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ２４６：３６７−７３，  １９９５）。
【０２３４】
二重特異性Ｆａｂ−ｓｃＦｖ（「バイボディ」）および三重特異性Ｆａｂ−（ｓｃＦｖ）（２）（「トリボディ」）の産生については、Ｓｃｈｏｏｎｊａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６５：７０５０−５７，  ２０００）およびＷｉｌｌｅｍｓ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ｂ  Ａｎａｌｙｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．  ７８６：１６１−７６，  ２００３）に記載されている。バイボディまたはトリボディにおいて、ｓｃＦｖ分子は、例えば、２つのｓｃＦｖがＦａｂのＣ末端に融合しているトリボディを産生するためにＶＬ−ＣＬ（Ｌ）およびＶＨ−ＣＨ１（Ｆｄ）鎖の片方または両方に融合しており、対してバイボディでは１つのｓｃＦｖがＦａｂのＣ末端に融合している。
【０２３５】
さらに別の方法では、遊離システインを親タンパク質に導入後、二量体、三量体、および四量体が産生される。変数（２〜４）のマレイミド基とのペプチドベースの交差リンカーを用いて目的のタンパク質が遊離システインに架橋された（Ｃｏｃｈｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １２（３）：  ２４１−５０  （２０００）、この開示はその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０２３６】
抗原結合タンパク質の他の実施形態
発明の抗原結合タンパク質は、ペプチボディも含む。「ペプチボディ」という用語は、少なくとも１つのペプチドに結合した抗体Ｆｃドメインを含む分子を指す。ペプチボディの産生については、ＰＣＴ公開ＷＯ００／２４７８２号（２０００年５月４日公開）に一般的に記載されている。これらのペプチドはいずれも、リンカーを伴いまたは伴わず、直列で（すなわち、連続的に）結合し得る。システイニル残基を含むペプチドは、別のＣｙｓ含有ペプチドと架橋し得、この片方または両方がビヒクルに結合し得る。同様に、複数のＣｙｓ残基を有するペプチドはいずれも、ペプチド間でジスルフィド結合を形成し得る。これらのペプチドはいずれも誘導体化し得、例えばカルボキシル末端はアミノ基とキャッピングし得、システインはキャッピングし得、またはアミノ酸残基はアミノ酸残基以外の部分により置換し得る（例えば、Ｂｈａｔｎａｇａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ３９：  ３８１４−９  （１９９６），  ａｎｄ  Ｃｕｔｈｂｅｒｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ４０：  ２８７６−８２  （１９９７）を参照されたく、これらは参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。ペプチド配列は至適化し得、抗体の親和性成熟に類似しているか、あるいはアラニンスキャニングまたは無作為もしくは部位指向変異により改変され、続くスクリーニングにより最高の結合剤が同定される。Ｌｏｗｍａｎ，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｂｉｏｍｏｌ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  ２６：  ４０１−２４  （１９９７）。抗原結合タンパク質の所望の活性を維持しつつ、各種分子を抗原結合タンパク質構造、例えば、抗原結合タンパク質のペプチド部分自体内またはペプチドとビヒクル部分の間に挿入できる。例えば、Ｆｃドメインもしくはその断片、ポリエチレングリコールなどの分子、またはデキストラン、脂肪酸、脂質、コレステロール基、小さな炭水化物、ペプチド、本明細書に記載の検出可能な部分（蛍光剤、放射同位体などの放射標識を含む）、オリゴ糖、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、干渉（または他の）ＲＮＡ、酵素、ホルモンなどの他の関連分子を容易に挿入できる。この方法での挿入に適した他の分子は当業者に理解されており、本発明の範囲内に包含される。これは、例えば、任意選択的に適切なリンカーにより結合した２つの連続したアミノ酸間へ所望の分子を挿入することを含む。
【０２３７】
リンカー。本明細書で同義的に使用する「リンカー」または「リンカー部分」とは、本発明の組成物に含まれるポリペプチド鎖のアミノ酸残基（例えば、免疫グロブリンＨＣまたは免疫グロブリンＬＣまたは免疫グロブリンＦｃドメイン）へ共有結合する生物学的に許容可能なペプチジルもしくは非ペプチジル有機群を指し、このリンカー部分はポリペプチド鎖を分子内の他のペプチドもしくはポリペプチド鎖に、または治療部分（生体活性低分子もしくはオリゴペプチドなど）に、または半減期延長部分に共有結合もしくは結合する。例えば、Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｏｘｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ、米国特許第２００７／００７１７６４号；Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｏｘｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ、ＰＣＴ／米国特許第２００７／０２２８３１号（ＷＯ２００８／０８８４２２号として公開）；ならびに米国仮出願第６１／２１０，５９４号（２００９年３月２０日出願）を参照されたく、これらはすべてそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２３８】
本発明の抗原結合タンパク質において、いずれのリンカー部分の存在も任意選択的である。リンカーが存在する場合、その化学構造は重要ではない。なぜなら、それは主にスペーサーとして、本発明の抗原結合タンパク質の分子の１つもしくは複数の他の機能性部分に関して１つの機能性部分の存在もしくは位置の位置付け、接合、連結、または至適化に関与するからである。リンカー部分の存在は、本発明の抗原結合タンパク質（抗体および抗体断片を含む）の一部の実施形態の薬理活性の至適化に有用であり得る。リンカーは、好ましくはペプチド結合により互いに結合したアミノ酸からなる。リンカー部分が存在する場合、それらは独立して、本発明の抗原結合タンパク質に存在し得る他のリンカー（１つまたは複数）と同じであることも異なることもできる。
【０２３９】
上記のとおり、リンカー部分は、存在する場合（抗原結合タンパク質の一次アミノ酸配列内であるか、または本発明の抗原結合タンパク質に対する治療部分もしくは半減期延長部分に結合するリンカーとしてかどうかを問わず）、天然で「ペプチジル」であり得（すなわち、ペプチド結合により互いに結合したアミノ酸からなり）、好ましくは、１個から最大約４０個までのアミノ酸残基、より好ましくは、１個から最大約２０個までのアミノ酸残基、最も好ましくは１〜約１０個のアミノ酸残基の長さからなる。リンカーのアミノ酸残基は、必ずしもその必要はないが、好ましくは、２０個の基準アミノ酸のうちのいずれかであり、より好ましくは、システイン、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、および／またはセリンである。さらにより好ましくは、ペプチジルリンカーは、ペプチド結合により結合した立体的に妨害されていない多数派のアミノ酸（グリシン、セリン、およびアラニンなど）からなる。存在する場合、インビボ循環において急速なタンパク質分解のターンオーバーを避けるペプチジルリンカーを選択することも望ましい。これらのアミノ酸の一部は、当業者が十分に理解しているようにグリコシル化し得る。例えば、シアリル化部位を構成する有用なリンカー配列は、Ｘ１Ｘ２ＮＸ４Ｘ５Ｇ（配列番号１４８）であり、式中Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４およびＸ５はそれぞれ独立して任意のアミノ酸残基である。
【０２４０】
他の実施形態では、ペプチジルリンカー部分の１〜４０個のアミノ酸は、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、およびリジンから選択される。好ましくは、リンカーは、立体的に妨害されていない多数派のアミノ酸（グリシンおよびアラニンなど）からなる。したがって、好ましいリンカーとしては、ポリグリシン、ポリセリン、およびポリアラニン、またはこれらの任意の組み合わせが挙げられる。一部のペプチジルリンカーの例は、ポリ（Ｇｌｙ）１〜８、特に（Ｇｌｙ）３、（Ｇｌｙ）４（配列番号１４９）、（Ｇｌｙ）５（配列番号１５０）および（Ｇｌｙ）７（配列番号１５１）、ならびにポリ（Ｇｌｙ）４Ｓｅｒ（配列番号１５２）、ポリ（Ｇｌｙ〜Ａｌａ）２〜４およびポリ（Ａｌａ）１〜８である。他のペプチジルリンカーの具体例としては、（Ｇｌｙ）５Ｌｙｓ（配列番号１５４）、および（Ｇｌｙ）５ＬｙｓＡｒｇ（配列番号１５５）が挙げられる。他の有用なペプチジルリンカーの例は以下である：他の有用なペプチジルリンカーの例は以下である：
（Ｇｌｙ）３Ｌｙｓ（Ｇｌｙ）４（配列番号１５９）；
（Ｇｌｙ）３ＡｓｎＧｌｙＳｅｒ（Ｇｌｙ）２（配列番号１５６）；
（Ｇｌｙ）３Ｃｙｓ（Ｇｌｙ）４（配列番号１５７）；ならびに
ＧｌｙＰｒｏＡｓｎＧｌｙＧｌｙ（配列番号１５８）。
【０２４１】
上の命名法を説明すると、例えば、（Ｇｌｙ）３Ｌｙｓ（Ｇｌｙ）４は、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号１５９）を意味する。ＧｌｙおよびＡｌａの他の組み合わせも有用である。
【０２４２】
一般に用いられるリンカーとしては、本明細書において「Ｌ５」（ＧＧＧＧＳ；すなわち「Ｇ４Ｓ」；配列番号１５２）、「Ｌ１０」（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；配列番号１５３）、「Ｌ２５」（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；配列番号１４６）として同定し得るものおよび以下の実施例に用いられる任意のリンカーが挙げられる。
【０２４３】
ペプチドリンカー部分を含む本発明の組成物のいくつかの実施形態では、酸性残基（例えば、グルタミン酸塩またはアスパラギン酸残基）をリンカー部分のアミノ酸配列内に入れる。例としては、以下のペプチドリンカー配列が挙げられる：
ＧＧＥＧＧＧ（配列番号１６０）；
ＧＧＥＥＥＧＧＧ（配列番号１６１）；
ＧＥＥＥＧ（配列番号１６２）；
ＧＥＥＥ（配列番号１６３）；
ＧＧＤＧＧＧ（配列番号１６４）；
ＧＧＤＤＤＧＧ（配列番号１６５）；
ＧＤＤＤＧ（配列番号１６６）；
ＧＤＤＤ（配列番号１６７）；
ＧＧＧＧＳＤＤＳＤＥＧＳＤＧＥＤＧＧＧＧＳ（配列番号１６８）；
ＷＥＷＥＷ（配列番号１６９）；
ＦＥＦＥＦ（配列番号１７０）；
ＥＥＥＷＷＷ（配列番号１７１）；
ＥＥＥＦＦＦ（配列番号１７２）；
ＷＷＥＥＥＷＷ（配列番号１７３）；または
ＦＦＥＥＥＦＦ（配列番号１７４）。
【０２４４】
他の実施形態では、リンカーは、リン酸化部位、例えば、Ｘ１Ｘ２ＹＸ４Ｘ５Ｇ（配列番号１７５）（式中Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４、およびＸ５はそれぞれ独立して任意のアミノ酸残基である）；Ｘ１Ｘ２ＳＸ４Ｘ５Ｇ（配列番号１７６）（式中Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４およびＸ５はそれぞれ独立して任意のアミノ酸残基である）；またはＸ１Ｘ２ＴＸ４Ｘ５Ｇ（配列番号１７７）（式中Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４およびＸ５はそれぞれ独立して任意のアミノ酸残基である）を構成する。
【０２４５】
本明細書に示すリンカーは代表例である；本発明の範囲内のペプチジルリンカーはより長くてよく、他の残基を含んでよい。ペプチジルリンカーは、例えば、半減期延長部分との接合のためのシステイン、別のチオール、または求核剤を含むことができる。別の実施形態では、リンカーは、マレイミド、ヨードアセトアミドもしくはチオエステル、官能化半減期延長部分への接合のためのシステインもしくはホモシステイン残基、または他の２−アミノ−エタンチオールもしくは３−アミノ−プロパンチオール部分を含む。
【０２４６】
別の有用なペプチジルリンカーは、約１ｋＤａサイズのＰＥＧ分子であると推測される大型、可動性リンカーであり、無作為Ｇｌｙ／Ｓｅｒ／Ｔｈｒ配列、例えば：ＧＳＧＳＡＴＧＧＳＧＳＴＡＳＳＧＳＧＳＡＴＨ（配列番号１７８）またはＨＧＳＧＳＡＴＧＧＳＧＳＴＡＳＳＧＳＧＳＡＴ（配列番号１７９）を含む。あるいは、有用なペプチジルリンカーは当技術分野において知られているアミノ酸配列からなり、固定らせん構造（例えば、固定リンカー：−ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＧＧ−）（配列番号１８０）を形成する。追加的に、ペプチジルリンカーは、非ペプチジルセグメント（式−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−の６個の炭素脂肪族分子など）も含むことができる。ペプチジルリンカーは、改変して本明細書に記載の誘導体を形成することができる。
【０２４７】
任意選択的に、非ペプチジルリンカー部分は、半減期延長部分を毒素ペプチドアナログに接合した半減期延長部分のペプチド部分に結合するためにも有用である。例えば、−ＮＨ−（ＣＨ２）ｓ−Ｃ（Ｏ）−（式中ｓ＝２〜２０）などのアルキルリンカーを使用できる。これらのアルキルリンカーは、低級アルキル（例えば、Ｃ１〜Ｃ６）低級アシル、ハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ）、ＣＮ、ＮＨ２、フェニルなどの任意の非立体的障害基によりさらに置換し得る。非ペプチジルリンカーの例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカー（例えば、以下に示すもの）である：
【０２４８】
【化１】
2018139609.tif 000021
式中、ｎはリンカーの分子量が約１００〜約５０００ダルトン（Ｄａ）、好ましくは約１００〜約５００Ｄａとなるものである。
【０２４９】
１つの実施形態では、非ペプチジルリンカーは、アリールである。リンカーは、当技術分野、（例えば、Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｏｘｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ、米国特許第２００７／００７１７６４号；Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｏｘｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ、ＰＣＴ／米国特許第２００７／０２２８３１号（ＷＯ２００８／０８８４２２号として公開）；ならびに米国仮出願第６１／２１０，５９４号（２００９年３月２０日出願）、これらはすべて参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているものと同じ様式で改変して誘導体を形成し得る。
【０２５０】
加えて、ＰＥＧ部分は、ＰＥＧアルデヒドを用いた還元アルキル化またはＰＥＧのヒドロキシコハク酸イミドもしくは炭酸エステルを用いたアシル化のいずれかにより、またはチオール接合によりＮ末端アミンもしくは選択された側鎖アミンに結合し得る。
【０２５１】
「アリール」とは、フェニル、または飽和、部分的飽和、もしくは非飽和３員環、４員環、もしくは５員環炭素架橋と隣接融合したフェニル、Ｃ１〜８アルキル、Ｃ１〜４ハロアルキルもしくはハロから選択される０、１、２もしくは３個の置換基と置換されたフェニルもしくは架橋である。
【０２５２】
「ヘテロアリール」とは、非飽和５、６もしくは７員単環または部分的飽和もしくは非飽和６員、７員、８員、９員、１０員または１１員二環であり、ここで少なくとも１つの環は、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１、２、３もしくは４個の原子を含む非飽和、単環および二環であり、環はＣ１〜８アルキル、Ｃ１〜４ハロアルキルおよびハロから選択される０、１、２もしくは３個の置換基により置換される。
【０２５３】
本発明の合成物の非ペプチド部分（非ペプチジルリンカーまたは非ペプチド半減期延長部分など）は従来の有機化学反応により合成できる。
【０２５４】
上記は単に例証にすぎず、本発明に従い任意選択的に使用できるリンカー種類の包括的な処置ではない。
【０２５５】
抗原結合タンパク質変異体の産生。上記のとおり、本発明の組成物を作製するために、組換えＤＮＡおよび／またはＲＮＡ媒介性タンパク質発現およびタンパク質工学技術、または他の任意のペプチド調製方法を適用できる。例えば、形質転換した宿主細胞内でポリペプチドを作製できる。簡単に述べると、ペプチドをコードする組換えＤＮＡ分子または構築物を調製する。かかるＤＮＡ分子の調製方法は当技術分野において周知である。例えば、適切な制限酵素を用いてペプチドをコードする配列をＤＮＡから切除できる。大量の利用可能かつ周知の宿主細胞のいずれも本発明の実践に用いてよい。特定宿主の選択は、当技術分野において認識されたいくつかの要因に依存する。これらの要因としては、例えば、選択した発現ベクターとの適合性、ＤＮＡ分子によりコードされたペプチド毒性、形質転換率、ペプチド回収の容易さ、発現特徴、生体安全性および費用が挙げられる。これらの要因のバランスは、必ずしもすべての宿主が特定のＤＮＡ配列の発現のために同様に効果的ではない場合があることの理解を伴わなければならない。これらの一般的なガイドライン内で、培養に有用な微生物宿主細胞としては、細菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｓｐ．など）、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．など）および他の真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、哺乳類（ヒトを含む）細胞、例えば、ＣＨＯ細胞およびＨＥＫ−２９３細胞、ならびに本明細書に記載しているかあるいは当技術分野において知られている他のものが挙げられる。同様に、ＤＮＡレベルで修飾を行うことができる。ペプチドコードＤＮＡ配列は、選択した宿主細胞とより適合するコドンに置換し得る。Ｅ．  ｃｏｌｉにおいて、至適化コドンは当技術分野において知られている。コドンは置換して、制限部位を除去するかまたはサイレント制限部位を含むことができ、これは選択した宿主細胞内でＤＮＡプロセスを補助し得る。次に、形質転換した宿主を培養して精製する。宿主細胞は、従来の発酵条件下で所望の化合物が発現するように培養し得る。かかる発酵条件は当技術分野において周知である。加えて、ＤＮＡは任意選択的に、発現した特異的結合剤または抗原結合タンパク質（例えば、免疫グロブリンタンパク質）と操作可能に連結された融合タンパク質、シグナルペプチド配列（例えば、分泌シグナルペプチド）の５’からコード領域をさらにコードする。本発明の特異的結合剤に結合される（二量体Ｆｃ融合タンパク質（「ペプチボディ」）またはキメラ免疫グロブリン（軽鎖＋重鎖）−Ｆｃヘテロ三量体（「ヘミボディ」）を含む）哺乳類細胞による本発明の組成物の適切な組換え方法および組換え発現に有用な例示的ＤＮＡ構築物のさらなる例については、例えば、Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｏｘｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ、米国特許第２００７／００７１７６４号；Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｏｘｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ、ＰＣＴ／米国特許第２００７／０２２８３１号（ＷＯ２００８／０８８４２２号として公開）；ならびに米国仮出願第６１／２１０，５９４号（２００９年３月２０日出願）を参照されたく、これらはすべ���参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０２５６】
適切なヌクレオチド変化をコードしたＤＮＡ配列に導入することにより、またはペプチド合成により、所望の抗原結合タンパク質のアミノ酸配列変異体を調製し得る。かかる変異体は、例えば、抗原結合タンパク質または抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失および／または挿入および／または置換を含む。最終構築物が所望の特徴を有する限り、最終構築物を得るために欠失、挿入、および置換の任意の組み合わせが行われる。アミノ酸変化は抗原結合タンパク質の翻訳後プロセスも改変し得る（グリコシル化部位の数または位置の変化など）。ある場合では、エピトープ結合に直接関わるアミノ酸残基を修飾することを意図して抗原結合タンパク質変異体を調製する。他の実施形態では、本明細書で論じる目的のためエピトープ結合に直接関わらない残基またはエピトープ結合に決して関わらない残基の修飾が望ましい。任意のＣＤＲ領域および／またはフレームワーク領域の変異を意図する。抗原結合タンパク質（抗体または抗体断片を含む）のアミノ酸配列に有用な修飾を設計するために当業者は共分散分析技術を使用できる。（例えば、Ｃｈｏｕｌｉｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｖａｒｉａｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆａｍｉｌｉｅｓ：  Ｔｈｅ  Ｃａｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｄｏｍａｉｎｓ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４１：４７５−４８４  （２０００）；  Ｄｅｍａｒｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＣＨ３  Ｄｏｍａｉｎ  ｂｙ  Ｒｅｓｉｄｕｅ  Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＩｇＧ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３３５：４１−４８  （２００４）；  Ｈｕｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ＶＬ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ  ３４  ｉｓ  ａ  ｋｅｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｓｔａｂｌｅ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ｆａｓｔ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｒａｔｅｓ，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １６（５）：３８１−８６  （２００３）；  Ａｕｒｏｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｖａｒｉａｎｃｅ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ，  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｕｓｅｓ  ｔｈｅｒｅｏｆ、米国特許第２００８／０３１８２０７Ａ１号；Ｇｌａｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ、米国特許第２００９／００４８１２２Ａ１号；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂａｓｅｄ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ＷＯ２００８／１１０３４８Ａ１号；Ｂｏｒｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  ａｎｄ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、ＷＯ２００９／００００９９Ａ２号）。共分散分析により決定するかかる修飾は、抗原結合タンパク質の効能、薬物動態、薬力学、および／または製造可能性の特徴を改善し得る。
【０２５７】
抗原結合タンパク質または抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当技術分野において知られている様々な方法により調製される。かかる方法としては、抗原結合タンパク質のオリゴヌクレオチド媒介性（または部位指向）変異、ＰＣＲ変異、および先に調製した変異型もしくは非変異型のカセット変異が挙げられる。
【０２５８】
任意の超可変またはＣＤＲ領域またはフレームワーク領域の置換変異を意図する。変異位置が好ましい抗原結合タンパク質のある残基または領域の有用な同定方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４４：１０８１−１０８５  （１９８９）に記載されているように「アラニンスキャニング変異」と呼ばれる。ここで、１残基または対象残基群は同定され（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、およびｇｌｕなどの電荷残基）、アミノ酸と抗原の相互作用に影響を与えるように中性または負電荷アミノ酸（最も好ましくはアラニンまたはポリアラニン）により置換される。次いで、置換部位または置換部位のためにさらなるまたは他の変異体を導入することにより、置換基に対し機能的感受性を示すアミノ酸位置を正確にする。したがって、アミノ酸配列変化の導入部位はあらかじめ決められている一方、変異自体の性質はあらかじめ決められている必要はない。例えば、所定部位における変異の動向を分析するため、アラニンスキャニングまたは無作為変異を標的コドンまたは領域で実行し、発現した変異体の所望の活性をスクリーニングする。
【０２５９】
本発明の抗原結合タンパク質の一部の実施形態は、合成方法によって行うこともできる。固体相合成は最も対費用効果の高い小型ペプチドの作製方法であるため、個々のペプチドの好ましい作製技術である。例えば、周知の固体相合成技術としては、保護基、リンカー、および固体相支持体の使用、ならびに特異的保護および脱保護反応状態、リンカー切断状態、スカベンジャーの使用、および固体相ペプチド合成の他の態様が挙げられる。適切な技術は当技術分野において周知である。（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ  （１９７３），  Ｃｈｅｍ．  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ，  ｐｐ．  ３３５−６１  （Ｋａｔｓｏｙａｎｎｉｓ  ａｎｄ  Ｐａｎａｙｏｔｉｓ  ｅｄｓ．）；  Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ  （１９６３），  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ８５：  ２１４９；  Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８５），  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｉｎｔｌ．  １０：  ３９４−４１４；  Ｓｔｅｗａｒｔ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ  （１９６９），  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；米国特許第３，９４１，７６３号；Ｆｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９７６），  Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  （３ｒｄ  ｅｄ．）  ２：  １０５−２５３；  ａｎｄ  Ｅｒｉｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９７６），  Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  （３ｒｄ  ｅｄ．）  ２：    ２５７−５２７；    “Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，”  ３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｔ．  Ｗ．  Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐ．  Ｇ．  Ｍ．  Ｗｕｔｓ，  Ｅｄｓ．，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  １９９９；  ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ  Ｃａｔａｌｏｇ，  ２０００；  “Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，  Ａ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ，”  Ｇ．  Ａ．  Ｇｒａｎｔ，  Ｅｄ．，  Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．，  １９９２；  “Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｔｅｃｈ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ＆  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，”  Ｗ．  Ｄ．  Ｂｅｎｎｅｔ，  Ｊ．  Ｗ．  Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，  Ｌ．  Ｋ．  Ｈａｍａｋｅｒ，  Ｍ．  Ｌ．  Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，  Ｍ．  Ｒ．  Ｒｈｏｄｅｓ，  ａｎｄ  Ｈ．  Ｈ．  Ｓａｎｅｉｉ，  Ｅｄｓ．，  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｔｅｃｈ，  １９９８；  “Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ２ｎｄ  ｅｄ．，”  Ｍ．  Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，  Ｅｄ．，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  １９９３；  “Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ２ｎｄ  ｅｄ．，”  Ｍ．  Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ  ａｎｄ  Ａ．  Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，  Ｅｄｓ．，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  １９９４；  “Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ，”  Ｐ．  Ｊ．  Ｋｏｃｉｅｎｓｋｉ，  Ｅｄ．，  Ｇｅｏｒｇ  Ｔｈｉｅｍｅ  Ｖｅｒｌａｇ，  Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，  Ｇｅｒｍａｎｙ，  １９９４；  “Ｆｍｏｃ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，”  Ｗ．  Ｃ．  Ｃｈａｎ  ａｎｄ  Ｐ．  Ｄ．  Ｗｈｉｔｅ，  Ｅ���ｓ．，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｐｒｅｓｓ，  ２０００，  Ｇ．  Ｂ．  Ｆｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：  Ａ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ，  １９９０，  ７７−１８３）。本発明の合成物の作製に適用できる、当技術分野において知られている合成および精製方法のさらなる例については、例えば、Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｏｘｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ、米国特許第２００７／００７１７６４およびＳｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｏｘｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ、ＰＣＴ／米国特許第２００７／０２２８３１号（ＷＯ２００８／０８８４２２Ａ２号として公開）を参照されたく、これらは両方とも参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０２６０】
本明細書において任意の抗原結合タンパク質、ならびに変異体について詳述するにあたり、天然ペプチドおよびタンパク質に一般に組み込まれる２０個の「基準」アミノ酸残基と同一であることを示す一文字略語系を頻繁に適用する（表４）。かかる一文字略語は、三文字略語、または略していないアミノ酸名と完全に同義の意味を有する。本明細書で使用する一文字略語系において、大文字はＬ−アミノ酸を示し、小文字はＤ−アミノ酸を示す。例えば、「Ｒ」という略語はＬ−アルギニンを示し、「ｒ」という略語はＤ−アルギニンを示す。
【０２６１】
【表９】
2018139609.tif 000022
【０２６２】
典型的には、アミノ酸配列におけるアミノ酸置換は、本明細書において特定の位置におけるアミノ酸残基の一文字略語、その後に、元の目的配列に対するアミノ酸位置の番号、その後に、置換したアミノ酸残基の一文字記号で命名する。例えば、「Ｔ３０Ｄ」は、元の目的配列に対してアミノ酸３０位でのアスパラギン酸残基によるトレオニン残基置換を表す記号である。別の例として、「Ｗ１０１Ｆ」は、元の目的配列に対してアミノ酸１０１位でのフェニルアラニン残基によるトリプトファン残基置換を表す記号である。
【０２６３】
非基準アミノ酸残基は、組換え発現細胞を用いる既知のタンパク質工学技術を用いて本発明の範囲内のポリペプチドに組み込むことができる。（例えば、Ｌｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｏｎ−ｃａｎｏｎｉｃａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １４（６）：６０３−６０９  （２００３）を参照されたい）。「非基準アミノ酸残基」という用語は、天然タンパク質に一般に組み込まれる２０個の基準アミノ酸ではないＤ形態またはＬ形態のアミノ酸残基、例えば、β−アミノ酸、ホモアミノ酸、環状アミノ酸および誘導体化側鎖を有するアミノ酸を指す。例として、（Ｌ形態またはＤ形態の）β−アラニン、β−アミノプロピオン酸、ピペリジン酸、アミノカプロン酸、アミノヘプタン酸、アミノピメリン酸、デスモシン、ジアミノピメリン酸、Ｎα−エチルグリシン、Ｎα−エチルアスパラギン酸、ヒドロキシリジン、アロ−ヒドロキシリジン、イソデスモシン、アロ−イソロイシン、ω−メチルアルギニン、Ｎα−メチルグリシン、Ｎα−メチルイソロイシン、Ｎα−メチルバリン、γ−カルボキシグルタミン酸塩、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎα−アセチルセリン、Ｎα−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、および他の類似のアミノ酸、および下表５に列挙されるもの、および本明細書に記載のこれらの任意の誘導体化形態が挙げられる。表５は、本発明に従い有用である非基準アミノ酸残基の一部の例を含み、本明細書において典型的に使用する略語と関連するが、異なる略語および命名法を同じ物質に適用してよく、本明細書において同義的に記載され得ることを当業者は理解するであろう。
【０２６４】
【表１０】
2018139609.tif 000023
2018139609.tif 000024
2018139609.tif 000025
【０２６５】
ＵＰＡＣ−ＩＵＢ生物化学の命名法に関する合同委員会（ＪＣＢＮ）によるアミノ酸およびペプチドの命名および表記法については、以下の文書に公開されている：  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．，  １９８４，  ２１９，  ３４５−３７３；  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １９８４，  １３８，  ９−３７；  １９８５，  １５２，  １；  １９９３，  ２１３，  ２；  Ｉｎｔｅｒｎａｔ．  Ｊ．  Ｐｅｐｔ．  Ｐｒｏｔ．  Ｒｅｓ．，  １９８４，  ２４，  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｐ  ８４；  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  １９８５，  ２６０，  １４−４２；  Ｐｕｒｅ  Ａｐｐｌ．  Ｃｈｅｍ．，  １９８４，  ５６，  ５９５−６２４；  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，  １９８５，  １６，  ３８７−４１０；  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ，  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｐｏｒｔｌａｎｄ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９２，  ｐａｇｅｓ  ３９−６９。
【０２６６】
本発明の抗原結合タンパク質のペプチドドメインに対する１つもしくは複数の有用な修飾は、既知の化学技術により成し遂げられるアミノ酸の添加もしくは挿入、アミノ酸欠失、ペプチド切断、アミノ酸置換、ならびに／またはアミノ酸残基の化学的誘導体化を含むことができる。例えば、そのようにして修飾されたアミノ酸配列は、目的の天然配列のアミノ酸配列と比較して挿入または置換された少なくとも１つのアミノ酸残基を含み、挿入または置換されたアミノ酸残基はペプチドがリンカーおよび／または半減期延長部分に結合されることにより求核性または求電子性反応官能基を含む側鎖を有する。本発明に従い、かかる求核性または求電子性反応官能基の有用な例としては、チオール、一次アミン、セレノ、ヒドラジド、アルデヒド、カルボン酸、ケトン、アミノオキシ、覆面（保護）アルデヒド、または覆面（保護）ケト官能基が挙げられるが、これらに限定されない。求核性反応官能基を含む側鎖を有するアミノ酸残基の例としては、リジン残基、ホモリジン、α，β−ジアミノプロピオン酸残基、α，γ−ジアミノ酪酸残基、オルニチン残基、システイン、ホモシステイン、グルタミン酸残基、アスパラギン酸残基、またはセレノシステイン残基が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２６７】
アミノ酸残基は、異なる化学的および／または物理的特徴に応じて一般的に分類される。「酸性アミノ酸残基」という用語は、酸性基を含む側鎖を有するＤ形態またはＬ形態のアミノ酸残基を指す。酸性残基の例としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸残基が挙げられる。「アルキルアミノ酸残基」という用語は、線状、分岐、または環状（アミノ酸アミンをプロリンなどで含む）であり得るＣ１〜６アルキル側鎖を有するＤ形態またはＬ形態のアミノ酸残基を指し、ここでＣ１〜６アルキルはＣ１〜４ハロアルキル、ハロ、シアノ、ニトロ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｂ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲａ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａＲａ、−Ｃ（＝ＮＲａ）ＮＲａＲａ、−ＮＲａＣ（＝ＮＲａ）ＮＲａＲａ、−ＯＲａ、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒｂ、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａＲａ、−ＯＣ２〜６アルキルＮＲａＲａ、−ＯＣ２〜６アルキルＯＲａ、−ＳＲａ、−Ｓ（＝Ｏ）Ｒｂ、−Ｓ（＝Ｏ）２Ｒｂ、−Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲａＲａ、−ＮＲａＲａ、−Ｎ（Ｒａ）Ｃ（＝Ｏ）Ｒｂ、−Ｎ（Ｒａ）Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｂ、−Ｎ（Ｒａ）Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａＲａ、−Ｎ（Ｒａ）Ｃ（＝ＮＲａ）ＮＲａＲａ、−Ｎ（Ｒａ）Ｓ（＝Ｏ）２Ｒｂ、−Ｎ（Ｒａ）Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲａＲａ、−ＮＲａＣ２〜６アルキルＮＲａＲａおよび−ＮＲａＣ２〜６アルキルＯＲａから選択される０、１、２もしくは３置換基により置換されており；式中Ｒａは、各例で独立してＨもしくはＲｂであり；ならびにＲｂは、各例で独立してハロ、Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜３ハロアルキル、−ＯＣ１〜４アルキル、−ＮＨ２、−ＮＨＣ１〜４アルキル、および−Ｎ（Ｃ１〜４アルキル）Ｃ１〜４アルキル；またはそれらの任意のプロトン化形態（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、セリン、トレオニン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩、アスパラギン、グルタミン、システイン、メチオニン、ヒドロキシプロリンを含む）から選択される０、１、２もしくは３置換基により置換されているが、残基はアリールもしくは芳香族基を含まないＣ１〜６アルキルである。「芳香族アミノ酸残基」という用語は、芳香族基を含む側鎖を有するＤ形態またはＬ形態のアミノ酸残基を指す。芳香族残基の例としては、トリプトファン、チロシン、３−（１−ナフチル）アラニン、またはフェニルアラニン残基が挙げられる。「塩基性アミノ酸残基」という用語は、塩基性基を含む側鎖を有するＤ形態またはＬ形態のアミノ酸残基を指す。塩基性アミノ酸残基の例としては、ヒスチジン、リジン、ホモリジン、オルニチン、アルギニン、Ｎ−メチル−アルギニン、ω−アミノアルギニン、ω−メチル−アルギニン、１−メチル−ヒスチジン、３−メチル−ヒスチジン、およびホモアルギニン（ｈＲ）残基が挙げられる。「親水性アミノ酸残基」という用語は、極性基を含む側鎖を有するＤ形態またはＬ形態のアミノ酸残基を指す。親水性残基の例としては、システイン、セリン、トレオニン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩、グルタミン、およびシトルリン（Ｃｉｔ）残基が挙げられる。「親油性アミノ酸残基」という用語は、非電荷、脂肪族または芳香族基を含む側鎖を有するＤ形態またはＬ形態のアミノ酸残基を指��。親油性側鎖の例としては、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、バリン、トリプトファン、およびチロシンが挙げられる。アラニン（Ａ）は両親媒性であり、親水性残基としても親油性残基としても作用できる。したがって、アラニンは、「親油性残基」と「親水性残基」の両定義に含まれる。「非機能性アミノ酸残基」という用語は、酸性、塩基性、または芳香族基を欠く側鎖を有するＤ形態またはＬ形態のアミノ酸残基を指す。中性アミノ酸残基の例としては、メチオニン、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、およびノルロイシン（Ｎｌｅ）残基が挙げられる。
【０２６８】
追加の有用な実施形態は、本明細書に開示のポリペプチドのアミノ酸配列の保存的修飾に起因し得る。保存的修飾により、かかる修飾を行った結合（例えば、ＰＥＧ結合）ペプチドの機能性、物理的、および化学的特徴に類似の特徴を有する半減期延長部分結合ペプチドが産生される。本明細書で開示する結合ポリペプチドのかかる保存的修飾形態も本発明の実施形態であることを意図する。
【０２６９】
対して、ペプチドの機能的および／または化学的特徴の実質的な修飾は、（ａ）置換領域における分子骨格の構造、例えば、αらせん立体構造、（ｂ）分子の標的部位の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）分子サイズの維持に与える影響が有意に異なるアミノ酸配列中の置換基の選択により成し遂げられ得る。
【０２７０】
例えば、「保存的アミノ酸置換」は、天然アミノ酸残基を、当該位置のアミノ酸残基の極性または電荷に対して影響を与えないかほとんど与えないように非天然残基と置換することに関わり得る。さらに、「アラニンスキャニング変異」（例えば、ＭａｃＬｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｃｔａ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｓｃａｎｄ．  Ｓｕｐｐｌ．，  ６４３：５５−６７  （１９９８）；  Ｓａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８，  Ａｄｖ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  ３５：１−２４  （１９９８）を参照されたく、これらはアラニンスキャニング変異について論じている）として既に記載されているとおり、ポリペプチド内のいずれの天然残基もアラニンと置換し得る。
【０２７１】
当業者は、所望のアミノ酸置換（保存的か非保存的かどうかを問わず）を、かかる置換が望ましい時点で決定できる。例えば、アミノ酸置換はペプチド配列の重要残基を同定するためにも使用でき、本明細書に記載のペプチドまたはビヒクル結合ペプチド分子の親和性を増加または低下させるためにも使用できる。
【０２７２】
天然残基は側鎖の共通の特性に基づき以下のクラスに分類し得る：
１）疎水性：ノルロイシン（ＮｏｒまたはＮｌｅ）、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
２）中性で親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
５）鎖の方向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；ならびに
６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【０２７３】
保存的アミノ酸置換は、これらのクラスのあるメンバーを同じクラスの別メンバーと置換することに関わり得る。保存的アミノ酸置換は非天然アミノ酸残基を含み得、これは典型的には生体系の合成ではなく化学ペプチド合成により組み込まれる。これらとしては、ペプチド模倣物ならびに他の逆（ｒｅｖｅｒｓｅｄ）形態もしくは逆転した（ｉｎｖｅｒｔｅｄ）形態のアミノ酸部分が挙げられる。
【０２７４】
非保存的置換は、これらのクラスのあるメンバーを別のクラスのメンバーと置換することに関わり得る。かかる置換された残基は毒素ペプチドアナログ領域に導入し得る。
【０２７５】
かかる変化の作製において、ある実施形態に従い、アミノ酸の疎水性親水性指標を考慮してよい。各アミノ酸には、疎水性および電荷特性に基づき疎水性親水性指標が割り当てられている。各アミノ酸の疎水性親水性指標は、イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸塩（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸塩（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；ならびにアルギニン（−４．５）である。
【０２７６】
タンパク質に相互作用的な生体機能を付与するにあたり疎水性親水性アミノ酸指標の重要性が当技術分野において理解されている（例えば、Ｋｙｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８２，  Ｊ． Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １５７：１０５−１３１を参照されたい）。あるアミノ酸は、疎水性親水性指標またはスコアが類似している他のアミノ酸と置換しながらも類似の生体活性を保持し得ることが知られている。疎水性親水性指標に基づく変化の作製において、ある実施形態では、疎水性親水性指標が±２以内であるアミノ酸の置換が含まれる。ある実施形態では、疎水性親水性指標が±１以内であるアミノ酸の置換が含まれ、ある実施形態では、±０．５以内であるアミノ酸の置換が含まれる。
【０２７７】
可能性のあるアミノ酸の置換は、特に、本明細書に開示のように生物学的に機能性のタンパク質またはその結果作製されるペプチドが免疫学的実施形態における使用のために意図される場合、親水性に基づき効果的に作製できることも当技術分野において理解されている。ある実施形態では、タンパク質の最大の局所平均親水性は、その隣接アミノ酸の親水性に準じるように、その免疫原性および抗原性、すなわち、タンパク質の生物学的特性と相関する。
【０２７８】
以下の親水性値はこれらのアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸塩（＋３．０±１）；グルタミン酸塩（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）およびトリプトファン（−３．４）。類似の親水性値に基づく変化の作製において、ある実施形態では、親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が含まれ、ある実施形態では、親水性値が±１以内であるアミノ酸の置換が含まれ、ある実施形態では、±０．５以内であるアミノ酸の置換が含まれる。親水性に基づき、一次アミノ酸配列由来のエピトープも同定し得る。これらの領域は「エピトープのコア領域」とも呼ばれる。
【０２７９】
保存的置換の例としては、１つの非極性（疎水性）アミノ酸残基（イソロイシン、バリン、ロイシン、ノルロイシン、アラニン、またはメチオニンなど）と別のものとの置換、１つの極性（親水性）アミノ酸残基と別のものとの置換（アルギニンとリジンとの間、グルタミンとアスパラギンとの間、グリシンとセリンとの間など）、１塩基性アミノ酸残基（リジン、アルギニンまたはヒスチジンなど）と別のものとの置換、または１酸性残基（アスパラギン酸またはグルタミン酸など）と別のものとの置換が挙げられる。「保存的アミノ酸置換」という語句は、かかるポリペプチドが不可欠な生体活性を示す限り、非誘導体化残基の代わりに化学的誘導体化残基の使用も含む。本発明に従い有用であり得る他のアミノ酸置換の例を下表６に記載する。
【０２８０】
【表１１】
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【０２８１】
通常、抗原結合タンパク質のアミノ酸配列変異体は、重鎖もしくは軽鎖可変領域のいずれかの元の抗原結合タンパク質または抗体アミノ酸配列と少なくとも６０％同一であるアミノ酸配列を有するか、または少なくとも６５％、もしくは少なくとも７０％、もしくは少なくとも７５％もしくは少なくとも８０％同一であり、より好ましくは少なくとも８５％同一であり、さらにより好ましくは少なくとも９０％同一であり、最も好ましくは少なくとも９５％同一である（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、および１００％を含む）アミノ酸配列を有する。この配列に関して、本明細書における同一性または相同性は、必要な場合、配列同一率が最大に達するように配列を整列しギャップを導入した後の候補配列におけるアミノ酸残基の元の配列との同一率として定義し、保存的置換はいずれも配列同一性の一部とはみなさない。抗原結合タンパク質または抗体配列のＮ末端、Ｃ末端、または内部の伸張、欠失、もしくはそれらへの挿入はいずれも配列同一性または相同性に影響を与えないものとして解釈されるべきである。
【０２８２】
アミノ酸配列挿入としては、１残基から１００個以上の残基を含むポリペプチドにわたる長さのアミノ末端および／もしくはカルボキシル末端融合、ならびに単一もしくは複数アミノ酸残基の内部配列挿入が挙げられる。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗原結合タンパク質またはエピトープタグもしくはサルベージ受容体結合エピトープに融合した抗原結合タンパク質（抗体または抗体断片を含む）が挙げられる。抗原結合タンパク質または抗体分子の他の挿入変異体としては、抗原結合タンパク質の血清半減期を増長するポリペプチド（例えばＮ末端またはＣ末端）への融合が挙げられる。
【０２８３】
エピトープタグの例としては、ｆｌｕ  ＨＡタグポリペプチドおよびその抗体１２ＣＡ５［Ｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ８：  ２１５９−２１６５  （１９８８）］；ｃ−ｍｙｃタグならびにそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７、および９Ｅ１０抗体［Ｅｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ５（１２）：  ３６１０−３６１６  （１９８５）］；ならびに単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグおよびその抗体［Ｐａｂｏｒｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ３（６）：  ５４７−５５３  （１９９０）］が挙げられる。他のタグ例は、ポリ−ヒスチジン配列（一般に約６個のヒスチジン残基）であり   、ニッケルキレート化を用いて標識した化合物を単離させる。他の標識およびタグ、例えばＦＬＡＧ（商標）タグ（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ，  Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，  ＮＹ）などは当技術分野において周知であり、日常的に用いられている。
【０２８４】
本発明の抗原結合タンパク質（抗体および抗体断片を含む）のアミノ酸置換変異体の一部の特定の、非制限的、実施形態を以下に例示する。
【０２８５】
分子の酸化安定性を改善して異常な架橋を防止するために、抗原結合タンパク質の適切な適合の維持に関わらない任意のシステイン残基も一般にセリンと置換し得る。逆に、システイン結合（１つまたは複数）は、（特に抗原結合タンパク質がＦｖ断片などの抗体断片である場合）安定性を改善するために抗原結合タンパク質に添加し得る。
【０２８６】
ある場合では、抗原結合タンパク質変異体は、エピトープ結合に直接関わるアミノ酸残基を修飾することを意図して調製する。他の実施形態では、本明細書で論じる目的のため、エピトープ結合に直接関わらない残基、またはエピトープ結合に決して関わらない残基の修飾が望ましい。任意のＣＤＲ領域および／またはフレームワーク領域の変異を意図する。
【０２８７】
どの抗原結合タンパク質のアミノ酸残基がエピトープ認識および結合にとって重要であるかを決定するため、アラニンスキャニング変異を実施して置換変異体を産生できる。例えば、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４４：１０８１−１０８５  （１９８９）を参照されたく、この開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。この方法では、個々のアミノ酸残基をアラニン残基で一度に置換し、生成した抗ＤＮＰまたは抗ＫＬＨ抗原結合タンパク質について、非修飾ポリペプチドと比較した特異的エピトープに対する結合能をスクリーニングする。結合能の低下した修飾抗原結合タンパク質の配列を決定してどの残基が変化したかを決定し、結合または生物学的特性におけるその重要性を示す。
【０２８８】
無作為アミノ酸変化を親ポリペプチド配列内に導入する親和性成熟により抗原結合タンパク質の置換変異体を調製できる。例えば、Ｏｕｗｅｈａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ  ７４  （Ｓｕｐｐｌ  ２）：２２３−２３２，  １９９８；  Ｒａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５：８９１０−８９１５，  １９９８；  Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  ８：４４３−４５０，  １９９８を参照されたく、これらの開示は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。親和性成熟は、抗ＤＮＰもしくは抗ＫＬＨ抗原結合タンパク質またはそれらの変異体の調製およびスクリーニング、ならびに生成した変異体から修飾生物学的特性（親抗ＤＮＰまたは抗ＫＬＨ抗原結合タンパク質と比較して増加した結合親和性など）を有するものの選択に関わる。置換変異体の生成のための好都合な方法は、ファージディスプレイを用いた親和性成熟である。簡単に述べると、いくつかの超可変領域部位を変異させて各部位ですべての可能なアミノ置換を産生する。このように産生した変異体は、各粒子内にパッケージされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ生成物への融合物として線維状ファージ粒子表面上の１価様式において発現する。次いでファージディスプレイ変異体の生体活性（例えば、結合親和性）をスクリーニングする。例えば、ＷＯ９２／０１０４７号、ＷＯ９３／１１２３６６号、ＷＯ９５／１５３８８号およびＷＯ９３／１９１７２号を参照されたい。
【０２８９】
現在の抗体の親和性成熟手順は、２つの変異分類、すなわち確率論的および非確率論的分類に属する。変異性ＰＣＲ、変異誘発細菌菌株（Ｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２６０，  ３５９−６８，  １９９６）、および飽和変異（Ｎｉｓｈｉｍｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７５：１２８１３−２０，  ２０００；  Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，  Ｐ．  Ｓ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １７８，  ２６９−８５，  ２００２）は確率論的変異方法の典型例である（Ｒａｊｐａｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  １０２：８４６６−７１，  ２００５）。非確率論的技術はアラニンスキャニングまたは部位指向変異を頻繁に使用して特定の変異タンパク質を限定的に収集する。方法の一部を以下に詳述する。
【０２９０】
パニング方法を介した親和性成熟−組換え抗体の親和性成熟は、一般に、徐々に減少させた量の抗原の存在下で、候補抗体の数回のパニングを介して行われる。１回当たりの抗原量を減らして抗原に対する親和性が最も高い抗体を選択することにより、出発物質の大きなプールから高親和性抗体が得られる。パニングを介した親和性成熟は、当技術分野において周知であり、例えば、Ｈｕｌｓ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．  ５０：１６３−７１，  ２００１）に記載されている。ファージディスプレイ技術を用いた親和性成熟の方法については、本明細書の他の箇所に記載されており、当技術分野において知られている（例えば、Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ９７：２０２９−３４，  ２０００を参照されたい）。
【０２９１】
ルックスルー突然変異誘発−ルックスルー突然変異誘発（ＬＴＭ）（Ｒａｊｐａｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  １０２：８４６６−７１，  ２００５）により、抗体結合部位の迅速なマッピング方法が提供されている。ＬＴＭでは、２０個の天然アミノ酸によって提供される主要な側鎖化学の代表であるアミノ酸９個を選択して、抗体の全６つのＣＤＲ中のすべての位置における結合に関与する官能性側鎖を精査する。ＬＴＭによって、選択されたアミノ酸９個中１個により各「野生型」残基が体系的に置換されるＣＤＲ内で一連の位置的な単一変異が作製される。変異ＣＤＲを組み合わせることにより、すべての変異タンパク質の定量ディスプレイが抑制されることなく、複雑度が増してサイズの拡大したコンビナトリアル単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）ライブラリーが得られる。陽性選択後、結合の改善されたクローンの配列を決定し、有益な変異をマッピングする。
【０２９２】
変異性ＰＣＲ−変異性ＰＣＲは様々な選択ラウンド間における核酸の無作為化に関わる。無作為化は、使用するポリメラーゼの固有エラー率により低率で生じるが、転写中に固有エラー率の高いポリメラーゼ（Ｈａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ２２６：８８９−９６，  １９９２）を用いる変異性ＰＣＲ（Ｚａｃｃｏｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２８５：７７５−７８３，  １９９９）により増強することができる。変異サイクル後、当技術分野の通例の方法を用いて抗原に対する親和性の改善されたクローンを選択する。
【０２９３】
遺伝子シャフリングおよび指向性進化に利用する技術も、所望の活性の抗ＤＮＰもしくは抗ＫＬＨ抗原結合タンパク質またはそれらの変異体の調製およびスクリーンのために用い得る。例えば、Ｊｅｒｍｕｔｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．，  ９８（１）：７５−８０  （２００１）により、リボソームディスプレイに基づき適合させたインビトロ選択戦略はＤＮＡシャフリングによりインビトロ多様化と組み合わさりｓｃＦｖの解離または熱力学的安定性のいずれかを生じることが示されている；Ｆｅｒｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｕｍｏｕｒ  Ｂｉｏｌ．  ２００４  Ｊａｎ−Ａｐｒ；２５（１−２）：７−１３には、ＤＮＡシャフリングと組み合わせたファージディスプレイの使用により親和性がほぼ３桁増加したことが報告されている。Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ２０００  Ｆｅｂ．  ２９；  ９７（５）：２０２９−２０３４には（ｉ）超変異ライブラリーにおいて機能性クローンは予期せず高い頻度で生じること、（ｉｉ）機能獲得変異は、かかるライブラリーにおいて十分表されること、ならびに（ｉｉｉ）高親和性に至るｓｃＦｖ変異の大部分が結合部位から離れた残基に相当することが報告されている。
【０２９４】
あるいは、または加えて、抗原抗体複合体の結晶構造を分析して抗体と抗原間の接触点を同定するか、またはかかる接触点をモデリングするコンピュータソフトウェアを用いることが有益であり得る。かかる接触残基および隣接残基は、本明細書において精密技術に従う置換候補である。かかる変異体は、産生後、本明細書に記載のスクリーニングに供し、１つまたは複数の関連アッセイにおける優れた特性を有する抗体をさらなる開発のために選択し得る。
【０２９５】
修飾炭水化物を有する抗原結合タンパク質
例えば、抗原結合タンパク質へ結合した１つもしくは複数の炭水化物部分の添加もしくは欠失、ならびに／または抗原結合タンパク質における１つもしくは複数のグリコシル化部位の添加もしくは欠失により、親ポリペプチドと比較して修飾グリコシル化パターンを有する抗原結合タンパク質変異体も産生できる。
【０２９６】
典型的にはポリペプチド（抗体を含む）のグリコシル化は、Ｎ結合またはＯ結合のいずれかである。Ｎ結合とは、炭水化物部分のアスパラギン残基側鎖への結合を指す。トリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニン（Ｘはプロリンを除く任意のアミノ酸）は、炭水化物部分のアスパラギン側鎖に対する酵素結合の認識配列である。ポリペプチド中のこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在は潜在的グリコシル化部位を作製する。したがって、Ｎ結合したグリコシル化部位は、これらのトリペプチド配列を１つまたは複数含むようにアミノ酸配列を改変することにより抗原結合タンパク質に添加し得る。Ｏ結合グリコシル化とは、糖類Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースの１つのヒドロキシアミノ酸（最も一般的にセリンまたはトレオニンであるが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンも用い得る）への結合を指す。Ｏ結合したグリコシル化部位は、１つまたは複数のセリンまたはトレオニン残基を元の抗原結合タンパク質または抗体の配列に挿入または置換することにより抗原結合タンパク質に添加し得る。
【０２９７】
改変されたエフェクター機能
システイン残基（１つまたは複数）は、抗体またはＦｃ含有ポリペプチドのＦｃ領域で除去または誘発され得、その結果、この領域で鎖間ジスルフィド結合形態を除去または増加する。そのように産生されたホモ二量体抗原結合タンパク質は内部移行能力を改善しならびに／または相補性媒介性細胞殺傷および抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を増大し得る。Ｃａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．  １７６：  １１９１−１１９５  （１９９２）  ａｎｄ  Ｓｈｏｐｅｓ，  Ｂ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４８：  ２９１８−２９２２  （１９９２）を参照されたい。ホモ二量体抗原結合タンパク質または抗体は、Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：  ２５６０−２５６５  （１９９３）に記載のヘテロ二機能性交差リンカーを用いることによっても調製し得る。あるいは、二重Ｆｃ領域を有する抗原結合タンパク質を加工でき、その結果、高まった相補性溶解およびＡＤＣＣ能力を有し得る。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｔｉ−ＣａｎｃｅｒＤｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ３：  ２１９−２３０  （１９８９）を参照されたい。
【０２９８】
ＣＤＲ内配列は、抗体をＭＨＣクラスＩＩに結合させて望ましくないヘルパーＴ細胞反応を惹起し得ることが示されている。保存的置換は抗原結合タンパク質の結合活性を保持して望ましくないＴ細胞反応を惹起する能力を減らすことができる。重鎖または軽鎖の１つまたは複数のＮ末端の２０個のアミノ酸が除去されることも意図する。
【０２９９】
血清半減期を増長するための修飾も望ましい場合がある。例えば、分子（ＰＥＧまたは多糖ポリマーをはじめとした他の水溶性ポリマーなど）を添加することによって行うか、サルベージ受容体結合エピトープを組み込むか添加することによって（例えば、抗原結合タンパク質の適切な領域の変異によってまたは（例えば、ＤＮＡもしくはペプチド合成により）ペプチドタグ中にエピトープを組み込み、それを抗原結合タンパク質のいずれかの末端または中間位において融合することによっても行い得る（例えば、ＷＯ９６／３２４７８号を参照されたい）。
【０３００】
サルベージ受容体結合エピトープは、好ましくは、Ｆｃドメインの１つまたは２つのループ由来の任意の１つまたは複数のアミノ酸残基が抗原結合タンパク質または断片のアナログ位置に移されている領域を構成する。さらにより好ましくは、Ｆｃドメインの１つまたは２つのループ由来の３つ以上の残基が移されている。さらにより好ましくは、エピトープは、（例えば、ＩｇＧの）Ｆｃ領域のＣＨ２ドメイン由来であり、抗原結合タンパク質もしくは抗体のＣＨ１、ＣＨ３、もしくはＶＨ領域、または複数のかかる領域に移されている。あるいは、エピトープは、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメイン由来であり、抗原結合タンパク質断片のＣＬ領域もしくはＶＬ領域、または両方に移されている。Ｆｃ変異体と、それらのサルベージ受容体との相互作用について記載している国際特許第ＷＯ９７／３４６３１号およびＷＯ９６／３２４７８号も参照されたい。
【０３０１】
補体依存性細胞障害性（ＣＤＣ）（Ｃ       １ｑ結合部位など）、および／または抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に関与する定常領域の他の部位およびアミノ酸残基（１つまたは複数）が同定されている［例えば、Ｍｏｌｅｃ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２９  （５）：  ６３３−９  （１９９２）；  Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７６（９）：６５９１−６６０４  （２００１）；  Ｌａｚａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  １０３（１１）：  ４００５  （２００６）を参照されたい。これらには特定の位置における変異の影響について記載されており、それぞれ参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる］。Ｆｃ受容体結合部位の残基の変異は、改変された（すなわち増加または低下した）エフェクター機能（Ｆｃ受容体に対する改変された親和性、改変されたＡＤＣＣもしくはＣＤＣ活性、または改変された半減期など）に至り得る。上記のとおり、潜在的変異としては、１つまたは複数の残基の挿入、欠失または置換が挙げられる（アラニンとの置換、保存的置換、非保存的置換、または異なるサブクラスの同位置での対応するアミノ酸残基との置換（例えばＩｇＧ１残基の、当該位置の対応するＩｇＧ２残基との置換）を含む）。
【０３０２】
本発明は、炭水化物構造が改変されてエフェクター活性の改変に至った抗原結合タンパク質分子（抗体および抗体断片を含む）（フコシル化が欠失または低減してＡＤＣＣ活性の改善が示された抗体分子など）の産生も包含する。これを成し遂げるための様々な方法が当技術分野において知られている。例えば、ＡＤＣＣエフェクター活性は、抗体分子のＦｃγＲＩＩＩ受容体への結合により媒介され、これはＣＨ２ドメインのＡｓｎ−２９７でＮ結合したグリコシル化の炭水化物構造に依存することが示されている。非フコシル化抗体は増加した親和性でこの受容体に結合し、天然フコシル化抗体よりも効果的にＦｃγＲＩＩＩ媒介性エフェクター機能を惹起する。例えば、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼ酵素がノックアウトされているＣＨＯ細胞内の非フコシル化抗体の組換え産生により、抗体のＡＤＣＣ活性は１００倍増加する（Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．  ２００４  Ｓｅｐ  ５；８７（５）：６１４−２２）。類似の効果は、フコシル化経路におけるこの酵素もしくは他の酵素の活性低下を介して、例えば、ｓｉＲＮＡもしくは抗センスＲＮＡ処置、酵素（１つまたは複数）をノックアウトする細胞系工学、または選択的グリコシル化阻害剤との培養を介して成し遂げることができる（Ｒｏｔｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９８９  Ｄｅｃ；２６（１２）：１１１３−２３）。一部の宿主細胞系、例えばＬｅｃ１３またはラットハイブリドーマＹＢ２／０細胞系は、低級フコシル化レベルで抗体を天然で産生する。Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２００２  Ｊｕｌ  ２６；２７７（３０）：２６７３３−４０；  Ｓｈｉｎｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２００３  Ｊａｎ  ３１；２７８（５）：３４６６−７３。（例えばＧｎＴＩＩＩ酵素を過剰発現する細胞内の抗体の組換え産生を介した）二分された炭水化物レベルの増加はＡＤＣＣ活性を増大することも決定されている。Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １９９９  Ｆｅｂ；１７（２）：１７６−８０。ＡＤＣＣ活性を増大する上でフコース残基２つのうち１つのみの欠失で十分であり得ることが予期されている。（Ｆｅｒｒａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２００５  Ｄｅｃ  ５）。
【０３０３】
抗原結合タンパク質の他の共有結合修飾
抗ＤＮＰまたは抗ＫＬＨ抗原結合タンパク質の他の特定の共有結合修飾も本発明の範囲内に含まれる。それらは、妥当な場合、抗原結合タンパク質または抗体の化学合成によりまたは酵素もしくは化学切断により作製し得る。他のタイプの共有結合修飾は、選択された側鎖またはＮ末端残基もしくはＣ末端残基と反応できる有機誘導化剤と標的アミノ酸残基を反応させることにより導入できる。
【０３０４】
システイニル残基は、最も一般的には、α−ハロ酢酸塩（および対応するアミン）、例えばクロロ酢酸またはクロロアセトアミドなどと反応させてカルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を得る。システイニル残基は、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミダゾイル）プロピオン酸、クロロアセチルリン酸、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロ第二水銀安息香酸、２−クロロメルクリ−４−ニトロフェノールまたはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応によっても誘導体化される。
【０３０５】
ヒスチジル残基は、ｐＨ５．５〜７．０で二炭酸ジエチルとの反応により誘導体化する。なぜならこの薬剤は、ヒスチジル側鎖に対して比較的特異的であるためである。p‐臭化ブロモフェナシルも有用である；この反応は、好ましくは０．１Ｍカコジル酸ナトリウム中、ｐＨ６．０で行う。
【０３０６】
リジニルおよびアミノ末端残基はコハク酸またはその他のカルボン酸無水物と反応させる。これらの薬剤による誘導体化はリジニル残基の電荷を逆にする作用を有している。αアミノを含有している残基を誘導体化するのに適した他の試薬としては、メチルピコリンイミデートなどのイミドエステル類；リン酸ピリドキサール；ピリドキサール；水素化ホウ素類；トリニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ−メチルイソ尿素；２,４−ペンタンジオン；およびグリオキシレートとのトランスアミナーゼ触媒の反応が挙げられる。
【０３０７】
アルギニル残基は、１つまたは複数の従来の試薬、とりわけフェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン、およびニンヒドリンとの反応により修飾される。アルギニン残基の誘導体化のためには、グアニジン官能基の高ｐＫａの故に、アルカリ条件で反応が行われる必要がある。さらに、これらの試薬はリジン基ならびにアルギニンε−アミノ基と反応し得る。
【０３０８】
芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によりチロシル残基内にスペクトル標識を導入する特定の目的にて、チロシル残基の特異的修飾を行い得る。最も一般的には、Ｎ−アセチルイミダゾイルおよびテトラニトロメタンが、それぞれＯ−アセチルチロシル種および３−ニトロ誘導体を形成するために用いられる。チロシル残基は、１２５Ｉまたは１３１Ｉを用いてヨウ化し、放射免疫アッセイにおける使用のため標識タンパク質を調製する。
【０３０９】
カルボキシル側基（アスパルチルまたはグルタミル）は、カルボジイミド（Ｒ−Ｎ．ｄｂｄ．Ｃ．ｄｂｄ．Ｎ−Ｒ’）との反応により選択的に修飾され、ここでＲとＲ’は異なるアルキル基である（１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドなど）。さらに、アスパルチルおよびグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によりアスパラギニルおよびグルタミニル残基に形質転換される。
【０３１０】
グルタミニルおよびアスパラギニル残基は、それぞれ対応するグルタミルおよびアスパルチル残基に対して頻繁に脱アミド化されている。これらの残基は、中性または塩基性条件下で脱アミド化されている。これらの残基の脱アミド化形態は本発明の範囲内である。
【０３１１】
他の修飾としては、プロリンおよびリジンの水酸化、セリルもしくはトレオニル残基の水酸基のリン酸化、リジン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化（Ｔ．  Ｅ．  Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，  Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，  ｐｐ．  ７９−８６  （１９８３））、Ｎ末端アミンのアセチル化、および任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。
【０３１２】
別のタイプの共有結合修飾は、抗原結合タンパク質（例えば、抗体または抗体断片）に対する化学的または酵素的カップリンググリコシドに関わる。これらの手順は、Ｎ結合またはＯ結合グリコシル化のためのグリコシル化能を有する宿主細胞内の抗原結合タンパク質の産生を必要としない利点がある。使用するカップリング方法に応じて、糖類（１つまたは複数）は、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）遊離スルフヒドリル群（システインなどのもの）、（ｄ）遊離水酸基（セリン、トレオニン、またはヒドロキシプロリンなどのもの）、（ｅ）芳香族残基（フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンなどのもの）、または（ｆ）グルタミンのアミド基に結合し得る。これらの方法は、ＷＯ８７／０５３３０号（１９８７年９月１１日公開）、およびＡｐｌｉｎ  ａｎｄ  Ｗｒｉｓｔｏｎ，  ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ｐｐ．  ２５９−３０６  （１９８１）に記載されている。
【０３１３】
抗原結合タンパク質上に存在するいずれの炭水化物部分の除去も、化学的または酵素的に成し遂げ得る。化学的脱グリコシル化には、抗原結合タンパク質を化合物トリフルオロメタンスルホン酸、または等価化合物へ曝露することが必要である。この処置により、連結糖類（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）を除くほとんどまたはすべての糖類が切断される一方で抗原結合タンパク質はインタクトのまま残る。化学的脱グリコシル化は、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ，  ｅｔ  ａｌ．  Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  ２５９：  ５２  （１９８７）により、およびＥｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １１８：  １３１  （１９８１）により記載されている。抗原結合タンパク質上の炭水化物部分の酵素切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １３８：  ３５０  （１９８７）により記載されている様々なエンドグルコシダーゼおよびエキソグルコシダーゼを用いて成し遂げることができる。
【０３１４】
本発明の抗原結合タンパク質（抗体および抗体断片を含む）の別のタイプの共有結合修飾は、様々な非タンパク質様ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリオキシエチル化ソルビトール、ポリオキシエチル化グルコース、ポリオキシエチル化グリセロール、ポリオキシアルキレン、または多糖ポリマー（デキストランなど）の１つに対する抗原結合タンパク質の連結を含む。かかる方法は当技術分野において知られており、例えば米国特許第４，６４０，８３５号；同第４，４９６，６８９号；同第４，３０１，１４４号；同第４，６７０，４１７号；同第４，７９１，１９２号、同第４，１７９，３３７号、同第４，７６６，１０６号、同第４，１７９，３３７号、同第４，４９５，２８５号、同第４，６０９，５４６号または欧州特許第３１５  ４５６号を参照されたい。
【０３１５】
単離核酸
本発明の別の態様は、本発明の抗原結合タンパク質をコードする単離核酸、例えばこれらに限定されないが、本発明の抗体または抗体断片をコードする単離核酸などである。かかる核酸は、当技術分野において知られているおよび／または本明細書に開示する組換え技術により作製される。
【０３１６】
例えば、単離核酸は、配列番号２５０、配列番号２５２、配列番号２５４、配列番号２５６、配列番号２５８、もしくは配列番号２６０と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む抗原結合タンパク質をコードする。
【０３１７】
他の実施形態では、単離核酸は、配列番号２３２、配列番号２３４、配列番号２３６、配列番号２３８、もしくは配列番号２４０と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む抗原結合タンパク質をコードする。
【０３１８】
他の単離核酸の例としては、免疫グロブリン重鎖可変領域をコードする単離核酸が挙げられ、ここで単離核酸はＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３と命名された３つの相補性決定領域のためのコード配列を含み：
（ａ）ＣＤＲＨ１は配列番号１８８、配列番号１８９、配列番号１９０、もしくは配列番号１９１のアミノ酸配列を含む；
（ｂ）ＣＤＲＨ２は配列番号１９２、配列番号１９３、配列番号１９４、もしくは配列番号１９５のアミノ酸配列を含む；ならびに
（ｃ）ＣＤＲＨ３は配列番号１９６、配列番号１９７、配列番号１９８、配列番号１９９、配列番号２００、もしくは配列番号２０１のアミノ酸配列を含む。
【０３１９】
さらに他の単離核酸の例としては、免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードする単離核酸が挙げられ、ここで単離核酸はＣＤＲＬｌ、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３と命名された３つの相補性決定領域のためのコード配列を含み：
（ａ）ＣＤＲＬ１は配列番号２０２、配列番号２０３、配列番号２０４、もしくは配列番号２０５のアミノ酸配列を含む；
（ｂ）ＣＤＲＬ２は配列番号２０６もしくは配列番号２０７のアミノ酸配列を含む；ならびに
（ｃ）ＣＤＲＬ３は配列番号２０８、配列番号２０９、配列番号２１０、配列番号２１１、もしくは配列番号２１２のアミノ酸配列を含む。
【０３２０】
他の実施形態では、単離核酸は、配列番号７７、配列番号１０７、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２３、配列番号１２９、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、もしくは配列番号１８５のアミノ酸配列を含むか、またはＮ末端かＣ末端、もしくは両端のアミノ酸残基が１個、２個、３個、４個もしくは５個欠けている前述の任意の一配列を含む免疫グロブリン重鎖を含む抗原結合タンパク質をコードする。
【０３２１】
また、いくつかの実施形態では、単離核酸は、配列番号１０５、配列番号１０９、配列番号１２１；配列番号１２５、もしくは配列番号１２７のアミノ酸配列を含むか、またはＮ末端かＣ末端、もしくは両端のアミノ酸残基が１個、２個、３個、４個もしくは５個欠けている前述の任意の一配列を含む免疫グロブリン軽鎖を含む抗原結合タンパク質をコードする。
【０３２２】
別の例において、単離核酸は、配列番号２６２、配列番号２６４、もしくは配列番号２６６の配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む抗原結合タンパク質をコードする。
【０３２３】
他の実施形態では、単離核酸は、配列番号２４２、配列番号２４４、配列番号２４６、もしくは配列番号２４８と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む抗原結合タンパク質をコードする。
【０３２４】
他の単離核酸の例としては、免疫グロブリン重鎖可変領域をコードする単離核酸が挙げられ、ここで単離核酸はＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３と命名された３つの相補性決定領域のためのコード配列を含み：
（ａ）ＣＤＲＨ１は配列番号２１３、配列番号２１４、もしくは配列番号２１５のアミノ酸配列を含む；
（ｂ）ＣＤＲＨ２は配列番号２１６、配列番号２１７、もしくは配列番号２１８のアミノ酸配列を含む；ならびに
（ｃ）ＣＤＲＨ３は配列番号２１９、配列番号２２０、もしくは配列番号２２１のアミノ酸配列を含む。
【０３２５】
さらに他の単離核酸の例としては、免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードする単離核酸が挙げられ、ここで単離核酸はＣＤＲＬｌ、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３と命名された３つの相補性決定領域のためのコード配列を含み：
（ａ）ＣＤＲＬ１は配列番号２０４、配列番号２２２、配列番号２２３、もしくは配列番号２２４のアミノ酸配列を含む；
（ｂ）ＣＤＲＬ２は配列番号２０６、配列番号２２５、もしくは配列番号２２６のアミノ酸配列を含む；ならびに
（ｃ）ＣＤＲＬ３は配列番号２２７、配列番号２２８、配列番号２２９、もしくは配列番号２３０のアミノ酸配列を含む。
【０３２６】
他の実施形態では、単離核酸は、配列番号４６、配列番号１３３、配列番号１３９、配列番号１４３、配列番号１８６のアミノ酸配列を含むか、またはＮ末端かＣ末端、もしくは両端のアミノ酸残基が１個、２個、３個、４個もしくは５個欠けている前述の任意の一配列を含む免疫グロブリン重鎖を含む抗原結合タンパク質をコードする。
【０３２７】
また、いくつかの実施形態では、単離核酸は、配列番号２８、配列番号１３１、配列番号１３５、配列番号１３７；もしくは配列番号１４１のアミノ酸配列を含むか、またはＮ末端かＣ末端、もしくは両端のアミノ酸残基が１個、２個、３個、４個もしくは５個欠けている前述の任意の一配列を含む免疫グロブリン軽鎖を含む抗原結合タンパク質をコードする。
【０３２８】
本発明は、任意の本発明の単離核酸を含むベクター（発現ベクターを含む）にも関する。当技術分野において知られているおよび／または本明細書に開示されている分子生物学的技術により作製された、発現ベクターを含む単離宿主細胞も本発明に包含される。本発明は、以下に関わる方法にも関する：
（ａ）発現ベクターによりコードされた抗原結合タンパク質を発現させる条件下の培養基で宿主細胞を培養すること；ならびに
（ｂ）培養基から抗原結合タンパク質を回収すること。抗原結合タンパク質の回収は、抗体の既知の精製方法（これらに限定されないが、本明細書の実施例１および他の箇所に開示の抗体精製技術など）により成し遂げられる。
【０３２９】
遺伝子療法
適切な細胞への治療抗原結合タンパク質の送達は、当技術分野において知られている任意の適切なアプローチを用いてエクスビボ、原位置、またはインビボ遺伝子療法を介してもたらすことができる。例えば、インビボ療法において、所望の抗原結合タンパク質もしくは抗体をコードする核酸を、単独またはベクター、リポソーム、もしくは沈殿物と連結するかのいずれかで対象に直接注射し得、いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質化合物の発現が望ましい部位で注射し得る。エクスビボ処置において、対象の細胞を除去し、これらの細胞内に核酸を導入し、直接または、例えば、患者に移植する多孔膜に被包するかのいずれかで修飾細胞を対象に戻す。例えば米国特許第４，８９２，５３８号および同第５，２８３，１８７号を参照されたい。
【０３３０】
核酸を生存細胞内に導入するために様々な技術が利用可能である。これらの技術は、核酸がインビトロ培養細胞内に移されたのか、または意図した宿主のインビボ細胞内に移されたのかによって決まる。核酸のインビトロ哺乳類細胞の転写に適した技術としては、リポソームの使用、電気穿孔、微量注入、細胞融合、化学的処置、ＤＥＡＥ−デキストラン、およびリン酸カルシウム沈殿が挙げられる。他のインビボ核酸の転写技術としては、ウイルスベクター（アデノウイルス、単純ヘルペスＩウイルス、アデノ随伴ウイルスまたはレトロウイルスなど）とのトランスフェクションおよび脂質ベース系が挙げられる。核酸およびトランスフェクション剤は、任意選択的に微粒子と結合している。トランスフェクション剤の例としては、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン仲介型トランスフェクション、第四級アンモニウム両親媒性物質ＤＯＴＭＡ（臭化（ジオレオイルオキシプロピル）トリメチルアンモニウム、ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬによりＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎとして市販されている））（Ｆｅｌｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  （１９８７）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８４，  ７４１３−７４１７；  Ｍａｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６  ６０７７−６０８１）；トリメチルアンモニウムのペンダントヘッドを有する親油性グルタミン酸ジエステル（Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  １０２３，  １２４−１３２）；陽イオン性脂質ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ，  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ，  Ｐｒｏｍｅｇａ）およびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミドスペルミン（ＤＰＰＥＳ）などの代謝可能な親脂質（Ｊ．  Ｐ．  Ｂｅｈｒ  （１９８６）  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．  ２７，  ５８６１−５８６４；  Ｊ．  Ｐ．  Ｂｅｈｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６，  ６９８２−６９８６）など；代謝可能な第四級アンモニウム塩（ＤＯＴＢ、Ｎ−（１−［２，３−ジオレオイルオキシ］プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルスルファート（ＤＯＴＡＰ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ジオレオイルエステル、ＣｈｏＴＢ、ＣｈｏＳＣ、ＤＯＳＣ）（Ｌｅｖｅｎｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｉｎｔｅｒ．  ２２，  ２３５−２４１）；３β［Ｎ−（Ｎ’、Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）／３β［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロールＤＣ−Ｃｈｏｌの１対１混合物（Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９１）  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  １０６５，  ８−１４）、スペルミン、スペルミジン、リポポリアミン（Ｂｅｈｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ，  １９９４，  ５：  ３８２−３８９）、親油性ポリリジン（ＬＰＬＬ）（Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９１）  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  ９３９，  ８−１８）、過剰ホスファチジルコリン／コレステロールを有する［［（１，１，３，３−テトラメチルブチル）クレ  ソキシ］エトキシ］エチル］ジメチルベンジルアンモニウムヒドロキシド（ＤＥＢＤＡ水酸化物）（Ｂａｌｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８８）  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  ９３９，  ８−１８）、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）／ＤＯＰＥ混合物（Ｐｉｎｎａｄｕｗａｇｅ  ｅｔ  ａｌ，  （１９８９）  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  ９８５，  ３３−３７）、ＤＯＰＥ、ＣＴＡＢ、ＤＥＢＤＡ、臭化ジドデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）とグルタミン酸との親油性ジエステル（ＴＭＡＧ）、およびホスファチジルエタノールアミンと混合されたステアリルアミン（Ｒｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９１）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  １０，  ５２０−５２５）、ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ（ＴｒａｎｓｆｅｃｔＡＣＥ，  ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）、ならびにオリゴガラクトース担持脂質が挙げられる。導入効率を高めるトランスフェクションエンハンサー剤の例としては、例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン、ポリブレン、リソソーム崩壊ペプチド（Ｏｈｍｏｒｉ  Ｎ  Ｉ  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  Ｊｕｎ．  ２７，  １９９７；２３５（３）：７２６−９）、コンドロイタンベースのプロテオグリカン、硫酸プロテオグリカン、ポリエチレンイミン、ポリリジン（Ｐｏｌｌａｒｄ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  １９９８  ２７３  （１３）：７５０７−１１）、インテグリン結合ペプチドＣＹＧＧＲＧＤＴＰ（配列番号２３５）、線状デキストランノナサッカリド、グリセロール、オリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオシド結合に係留したコレステリル基（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，  Ｒ．  Ｌ．  １９８９  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６：  （１７）：６５５３−６）、リソホスファチド、リソホスファチジルコリン、リソホスファチジルエタノールアミン、および１−オレオイルリソホスファチジルコリンが挙げられる。
【０３３１】
一部の状況では、核酸を含むベクターを標的細胞に指向させる薬剤と共に核酸を送達することが望ましい場合がある。かかる「標的」分子としては、標的細胞上の細胞表面膜タンパク質に特異的な抗原結合タンパク質、または標的細胞上の受容体のためのリガンドが挙げられる。リポソームを用いる場合、標的化および／または取り込み促進のために、貪食に関連した細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質を用いてよい。かかるタンパク質の例としては、特定の細胞タイプに対して屈性の殻タンパク質およびその断片、循環内で内部化されるタンパク質のための抗原結合タンパク質、ならびに細胞内局在化を標的として細胞内半減期を増長するタンパク質が挙げられる。他の実施形態では、受容体媒介性貪食を使用できる。かかる方法については、例えば、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７またはＷａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０に記載されている。現在既知の遺伝子作製および遺伝子療法プロトコールの総論については、Ａｎｄｅｒｓｏｎ  １９９２を参照されたい。ＷＯ９３／２５６７３号および引用文献も参照されたい。遺伝子療法技術に関するさらなる総論については、Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４４：  １２７５−１２８１  （１９８９）；  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ｔｏ  ｖｏｌ．  ３９２，  ｎｏ  ６６７９，  ｐｐ．  ２５−３０  （１９９８）；  Ｖｅｒｍａ，  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ：  ６８−８４  （１９９０）；  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３５７：  ４５５４６０  （１９９２）を参照されたい。
【０３３２】
医薬製剤の投与および調製
本発明の方法の実践に用いられる抗ＤＮＰまたは抗ＫＬＨ抗原結合タンパク質または抗体は所望の送達方法に適した担体を含む医薬組成物および薬剤に製剤化し得る。適切な担体は、抗ＤＮＰまたは抗ＫＬＨ抗原結合タンパク質または抗体と組み合わせた場合、それぞれＤＮＰまたはＫＬＨの高親和性結合を保持し、対象の免疫系と反応しない任意の物質を含む。例としては、滅菌リン酸緩衝生理食塩水、静菌水などの任意のいくつかの標準的な医薬担体が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、水、緩衝水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシンなどの各種水性担体を用いてよく、軽度化学修飾などに供するアルブミン、リポタンパク質、グロブリンなどの安定性向上のための他のタンパク質を含み得る。
【０３３３】
製剤中の抗原結合タンパク質濃度の例は、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１８０ｍｇ／ｍＬまたは約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ、または約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約２５ｍｇ／ｍＬ、あるいは約２ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬの範囲であり得る。抗原結合タンパク質の水性製剤は、例えば、ｐＨが約４．５〜約６．５、または約４．８〜約５．５の範囲、あるいは約５．０であるｐＨ緩衝溶液で調製し得る。この範囲内のｐＨに適した緩衝液の例としては、酢酸塩（例えば酢酸ナトリウム）、コハク酸塩（コハク酸ナトリウムなど）、グルコン酸塩、ヒスチジン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸緩衝液が挙げられる。緩衝液の濃度は、例えば、緩衝液および製剤の所望の等張性に応じて、約１ｍＭ〜約２００ｍＭとすることもでき、約１０ｍＭ〜約６０ｍＭとすることもできる。
【０３３４】
等張化剤も抗原結合タンパク質を安定させ得、製剤中に含み得る。等張化剤の例としては、ポリオール（マンニトール、ショ糖またはトレハロースなど）が挙げられる。水性製剤は好ましくは等張であるが、高張溶液も低張溶液も適切であり得る。製剤中のポリオール濃度の例は、約１％〜約１５％ｗ／ｖの範囲であり得る。
【０３３５】
製剤化した抗原結合タンパク質の凝集を減らすおよび／または製剤中の微粒子形態を最小限にするおよび／または吸着を減らすため、界面活性剤を抗原結合タンパク質製剤に添加し得る。界面活性剤の例としては、ポリソルベート（例えばポリソルベート２０、またはポリソルベート８０）またはポロキサマー（例えばポロキサマー１８８）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。界面活性剤の濃度の例は、約０．００１％〜約０．５％、または約０．００５％〜約０．２％、あるいは約０．００４％〜約０．０１％ｗ／ｖの範囲であり得る。
【０３３６】
１つの実施形態では、製剤は上に同定した薬剤（すなわち抗原結合タンパク質、緩衝液、ポリオールおよび界面活性剤）を含み、本質的に１つまたは複数の防腐剤（ベンジルアルコール、フェノール、ｍ−クレゾール、クロロブタノールおよびベンゼトニウムＣｌなど）がない。別の実施形態では、例えば、約０．１％〜約２％、あるいは約０．５％〜約１％の範囲の濃度で防腐剤を製剤中に含み得る。製剤の所望の特徴に対して有害な影響を与えない限り、１つまたは複数の他の医薬上許容可能な担体、賦形剤または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｏｓｏｌ，  Ａ．  Ｅｄ．  （１９８０）に記載のものなど）を製剤中に含み得る。許容可能な担体、賦形剤または安定剤は、使用する投与量および濃度においてレシピエントに対して無毒であり、以下を含む；追加の緩衝剤；共溶媒；抗酸化剤（アスコルビン酸およびメチオニンを含む）；キレート化剤（ＥＤＴＡなど）；金属複合体（例えばＺｎ−タンパク質複合体）；生物分解性ポリマー（ポリエステルなど）；ならびに／または塩形成対イオン    （ナトリウムなど）。
【０３３７】
抗原結合タンパク質の治療製剤は、保存のため、任意選択的に生理的許容可能な担体、賦形剤または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｏｓｏｌ，  Ａ．  Ｅｄ．  （１９８０））を、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、望ましい純度の抗原結合タンパク質と混合することにより調製する。使用する投与量および濃度においてレシピエントに対して無毒である許容可能な担体、賦形剤、または安定剤としては、緩衝液（リン酸、クエン酸、および他の有機酸など）；抗酸化剤（アスコルビン酸およびメチオニンを含む）；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウムなど）；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；アルキルパラベン（メチルまたはプロピルパラベンなど）；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなど）；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）；アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジンなど）；単糖類、二糖類、および他の炭水化物（グルコース、マンノース、マルトース、またはデキストリンを含む）；キレート化剤（ＥＤＴＡなど）；糖類（ショ糖、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトールなど）；塩形成対イオン（ナトリウムなど）；金属複合体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；ならびに／または非イオン性界面活性剤（ＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など）が挙げられる。
【０３３８】
１つの実施形態では、本発明の特許請求の範囲の適切な製剤は、等張化して安定化させる等張化剤（ポリオール、ソルビトール、ショ糖または塩化ナトリウムなど）と組み合わせた等張緩衝液（リン酸、酢酸、またはトリス緩衝液など）を含む。かかる等張化剤の１例は、５％ソルビトールまたはショ糖である。加えて、製剤は任意選択的に、（凝集を防止して０．０１〜０．０２％ｗｔ／ｖｏｌで安定化させるなどのために）界面活性剤を含むことができる。製剤のｐＨは４．５〜６．５または４．５〜５．５の範囲でよい。抗体のための医薬製剤の他の詳細例については、米国特許第２００３／０１１３３１６号および米国特許第６，１７１，５８６号に見出され得、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０３３９】
本明細書における製剤は、好ましくは互いに有害な影響を与えない相補性活性を有するもので治療されている特定の適応のために必要に応じて複数の活性化合物も含み得る。例えば、さらに免疫抑制剤を提供することが望ましい場合がある。かかる分子は、組み合わせにおいて意図した目的のための有効量で適切に存在する。
【０３４０】
活性成分は、例えば、コアセルベーション技術によりまたは界面ポリマー化により、例えば、ヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メタクリル酸メチル）マイクロカプセルは、それぞれ、コロイド薬剤送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ粒子およびナノカプセル）または巨大エマルションにおいて調製されたマイクロカプセルに封入してもよい。かかる技術については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｏｓｏｌ，  Ａ．  Ｅｄ．  （１９８０）に開示されている。
【０３４１】
抗原結合タンパク質の懸濁液および結晶形態も意図する。懸濁液および結晶形態の作製方法は当業者に知られている。
【０３４２】
インビボ投与に用いる製剤は滅菌されていなければならない。本発明の組成物は従来の周知の滅菌技術により滅菌し得る。例えば、滅菌は、滅菌ろ過膜を介したろ過により容易に成し遂げられる。生成溶液は使用用にパッケージ化してもよいし、滅菌条件下でろ過して凍結乾燥してもよく、凍結乾燥した調製物は投与前に滅菌溶液と組み合わせられる。
【０３４３】
凍結乾燥プロセスは、ポリペプチドを長期間保存のために安定させるため、特にポリペプチドが液体組成物中で比較的不安定である場合に頻繁に用いられる。凍結乾燥サイクルは、通常３つの工程：凍結、一次乾燥、および二次乾燥からなる；Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｐｏｌｌｉ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌｕｍｅ  ３８，  Ｎｕｍｂｅｒ  ２，  ｐａｇｅｓ  ４８−５９  （１９８４）。凍結工程では、適切に凍結するまで溶液を冷却する。この段階で溶液中の水は大部分が氷を形成する。一次乾燥段階で氷を蒸散させる。これは、真空機器を用いて燃焼室圧力を氷の蒸気圧以下に低下させることにより行う。最終的に、低下した燃焼室圧力および上昇した放置温度下の二次乾燥段階で収着水または結合水を除去する。このプロセスは、凍結乾燥塊として知られている物質を産生する。その後、この塊は使用前に再構成できる。
【０３４４】
凍結乾燥物質の標準的な再構成を行うため、一定容量（典型的には凍結乾燥中に除去した容量と等容量）の純水を添加するが、時には非経口投与用の製薬に抗菌剤の希釈溶液を用いる；Ｃｈｅｎ，  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，  Ｖｏｌｕｍｅ  １８，  Ｎｕｍｂｅｒｓ  １１  ａｎｄ  １２，  ｐａｇｅｓ  １３１１−１３５４  （１９９２）。
【０３４５】
一部の例における凍結乾燥した生成物の安定剤として作用する賦形剤について記載されている；Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ，  Ｖｏｌｕｍｅ  ７４，  ｐａｇｅｓ  ２２５−２３９  （１９９１）。例えば、既知の賦形剤としては、ポリオール（マンニトール、ソルビトールおよびグリセロールを含む）；糖類（グルコースおよびショ糖を含む）；ならびにアミノ酸（アラニン、グリシンおよびグルタミン酸を含む）が挙げられる。
【０３４６】
加えて、ポリオールおよび糖類も、凍結乾燥誘発性の損傷からポリペプチドを保護するため、および乾燥状態で保存中の安定性を高めるために頻繁に用いられる。通常、糖類、特に二糖類は、凍結乾燥プロセスおよび保存中の両方において効果的である。単糖類および二糖類ならびにポリマー（ＰＶＰなど）を含む他のクラスの分子も、凍結乾燥した生成物の安定剤として報告されている。
【０３４７】
注射において、医薬製剤および／または薬剤は、上記のとおり、適切な溶液を用いた再構成に適した粉末剤であり得る。これらの例としては、凍結乾燥、回転乾燥またはスプレー乾燥粉末剤、無定形粉末剤、顆粒、沈殿物、または微粒子が挙げられるが、これらに限定されない。注射において、製剤は任意選択的に安定剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤、生体利用能調整剤およびこれらの組み合わせを含み得る。
【０３４８】
徐放調製物を調製し得る。適切な徐放調製物の例としては、半透性基質の固体疎水性ポリマー（基質が加工物質、例えば、フィルム、またはマイクロカプセル状である抗原結合タンパク質を含む）が挙げられる。徐放基質の例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸のコポリマーおよびγ−エチル−Ｌ−グルタミン酸塩、分解不能なエチレン酢酸ビニル、分解可能な乳酸グリコール酸コポリマー（Ｌｕｐｒｏｎ  Ｄｅｐｏｔ（登録商標）など）（乳酸グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドからなる注射用ミクロスフィア）、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。ポリマー（エチレン酢酸ビニルおよび乳酸グリコール酸など）では１００日間かけた分子放出が可能である一方、あるヒドロゲルではより短時間でタンパク質が放出される。被包性ポリペプチドが体内に長期間残る場合（変性している場合もあり、３７℃で湿気に曝露して凝集している場合もある）、生体活性の損失および免疫原性の可能な変化に至る。関連機序に応じて安定化のために合理的な戦略を考案できる。例えば、凝集機序がチオ−ジスルフィド置換を介した内分子Ｓ−Ｓ結合形態であることが見出された場合、スルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、含水量の制御、適切な添加物の使用、および特異的ポリマー基質組成物の発現により安定化を成し遂げ得る。
【０３４９】
本発明の製剤を、本明細書に記載の短期作用、即放、長期作用、または持続放出として設計し得る。したがって、医薬製剤は制御放出または徐放型にも製剤化し得る。
【０３５０】
具体的な投与量は、対象の疾患状態、年齢、体重、全身の健康状態、性別、ならびに食事、投与間隔、投与経路、排泄率、および薬剤の組み合わせにより調整し得る。有効量を含む上記の投与量形態はいずれも十分に通例実験の範囲内であるため、十分に本発明の範囲内である。
【０３５１】
抗原結合タンパク質を、非経口、皮下、腹腔内、肺内、および経鼻的、ならびに、局所処置を所望の場合、病巣内投与を含む任意の適切な手段により投与する。非経口注射としては、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮内または皮下投与が挙げられる。加えて、抗原結合タンパク質は、パルス注入により、特に減量した抗原結合タンパク質または抗体で適切に投与する。投薬は好ましくは注射により、最も好ましくは（部分的に投与が一過性か慢性かに応じて）静脈内または皮下注射により行う。例えば所望の部位近くに入れたカテーテルを介した局所的、特に経皮的、粘膜内、直腸的、経口または局所投与を含む他の投与手段を意図する。最も好ましくは、本発明の抗原結合タンパク質を生理溶液中で０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの用量範囲、１日１回〜週１回〜月１回の頻度範囲（例えば毎日、隔日、３日ごと、または２、３、４、５、もしくは６回／週）、好ましくは０．１〜４５ｍｇ／ｋｇ、０．１〜１５ｍｇ／ｋｇまたは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇの用量範囲、２または３回／週の頻度で、または最大４５ｍｇ／ｋｇ月１回で静脈内投与する。
【０３５２】
本発明は、以下の実施例により例証し、これらは決して限定することを意図していない。
【０３５３】
（実施例）
【実施例１】
【０３５４】
ＤＮＰまたはＫＬＨに対する抗体の生成およびスクリーニング
免疫化。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（商標）マウスをＤＮＰ−ＫＬＨにより４週間免疫化して抗ＤＮＰ抗体を生成し、ＤＮＰ−リジンに結合する抗体をスクリーニングした。より詳細には、国際特許第ＷＯ９８／２４８９３号、およびＷＯ００／７６３１０号（これらの開示はすべて、参照により本明細書に組み込まれる）に開示の方法に従い、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）のＸＭＧ２系統の初回免疫化のため、既に記載されている（Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．  １５：１４６−１５６  （１９９７）；国際特許第ＷＯ９８／２４８９３号、およびＷＯ００／７６３１０号公開、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）ようにマウスのＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（商標）ＸＭＧ２系統を一般に生成し、ＴｉｔｅｒＭａｘ  Ｇｏｌｄアジュバント（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｏａｋｖｉｌｌｅ，  Ｏｎｔａｒｉｏ）中で乳化した免疫原（マウス１匹当たり１０〜３０μｇの範囲）を用いて、２，４−ジニトロフェニル−キーホールリンペットヘモシアニン（ＤＮＰ−ＫＬＨ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ；  ＢｉｏＳｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｎｏｖａｔｏ，  ＣＡ）で免疫化した。初回免疫化後、続く免疫原（マウス１匹当たり５〜２０μｇ）ブーストをマウスにおいて適切な抗ＤＮＰ価を導入するために必要なスケジュールおよび期間で投与した。固定化したＤＮＰ−ＢＳＡ（ＢｉｏＳｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｎｏｖａｔｏ，  ＣＡ）を用いた酵素免疫アッセイにより力価を決定し、最終ＤＮＰ：ＢＳＡモル比が３０：１であるようにこの結合体を調製した。
【０３５５】
Ｉｍｊｅｃｔ（商標）海中養殖キーホールリンペットヘモシアニン（ｍｃＫＬＨ；Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  ＩＬ；ｃａｔ＃７７６００、ｌｏｔ＃Ｂ１４４０９５Ｂ）を用いて、抗ＫＬＨ抗体を増大する免疫化を４週間行った。免疫化は、足蹠注射を介して送達したＡｌｕｍｉｎｉｕｍ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｇｅｌ  Ａｄｊｕｖａｎｔにおいてマウス１匹当たりＫＬＨ１０μｇを用いて行った（ＨＣＩ  Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ，  Ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｓｕｎｄ，  Ｄｅｎｍａｒｋ；カタログ＃１４５２−２５０）。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（商標）のＸＭＧ１Ｋ系統の初回免疫化は既に開示されている方法に従い（Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．  １５：１４６−１５６  （１９９７）；国際特許第ＷＯ９８／２４８９３号、およびＷＯ００／７６３１０号公開、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる、これらはすべて参照により本明細書に組み込まれる）。初回免疫化後、続く免疫原（マウス１匹当たり５〜１０μｇ）ブーストをマウスにおいて適切な抗ＫＬＨ価を導入するために必要なスケジュールおよび期間で投与した。固定化したＫＬＨ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  ＩＬ）を用いた酵素免疫アッセイにより力価を決定した。
【０３５６】
モノクローナル抗体の調製。適切な力価を示すマウスを同定し、リンパ球および脾細胞を流入領域リンパ節および脾臓から得てから、各コホートをプールした。Ｂ細胞を適切な培地（例えば、ダルベッコ変法イーグル培地；ＤＭＥＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）中で粉砕することにより組織から解離して細胞を組織から放出させ、ＤＭＥＭ内で懸濁した。標準的な方法を用いて、および当技術分野において知られている技術を用いてＢ細胞を選択および／または拡大し、適切な融合パートナー、例えば、非分泌骨髄腫Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞と融合した（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ＣＲＬ  １５８０；  Ｋｅａｒｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １２３：１５４８−１５５０  （１９７９））。
【０３５７】
Ｂ細胞を融合パートナー細胞と１：４比で混合した。細胞混合物を４分間の遠心分離４００×ｇにより穏やかにペレットし、容器を傾けて上清を移し、１ｍＬピペットを用いて細胞混合物を穏やかに混合した。融合物をＰＥＧ／ＤＭＳＯ（ポリエチレングリコール／ジメチルスルホキシド；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ  ＭＯから入手；１ｍＬ／百万リンパ球）で導入した。ＰＥＧ／ＤＭＳＯを穏やかに撹拌しながら１分かけてゆっくりと添加後、１分間混合した。次いでＩＤＭＥＭ（グルタミン非含有ＤＭＥＭ；２ｍＬ／百万Ｂ細胞）を穏やかに撹拌しながら２分かけて添加し、追加のＩＤＭＥＭ（８ｍＬ／百万Ｂ細胞）を３分かけて添加した。
【０３５８】
融合した細胞を穏やかにペレットし（４００×ｇ、６分）、２０ｍＬ選択培地（例えば、アザセリンおよびヒポキサンチン［ＨＡ］ならびに必要に応じて他の補助的物質を含むＤＭＥＭ）／百万Ｂ細胞内で再懸濁した。細胞を３７℃で２０〜３０分インキュベートしてから、２００ｍＬ選択培地で再懸濁し、Ｔ１７５フラスコで３〜４日間培養した後、９６ウェルでプレーティングした。
【０３５９】
標準的な技術を用いて細胞を９６ウェルプレートに分配し、生成コロニーのクローン性を最大化した。培養の数日後、以下の実施例に詳述したように、ハイブリドーマ上清を収集し、それぞれＫＬＨまたはＤＮＰへの結合確認を含むスクリーニングアッセイに供した。陽性細胞をさらに選択し、標準的なクローニングおよびサブクローニング技術に供した。クローナル系をインビトロ拡大し、分析用の分泌ヒト抗体を得た。ＤＮＰ特異性抗体を分泌するいくつかの細胞系を得、さらに抗体の特性を決定した。その配列は本明細書および配列リストにおいて存在し、これらの抗体を用いた様々な試験結果が提供される。
【０３６０】
担体抗体の抗ＫＬＨおよび抗ＤＮＰのクローニングおよび工学。
５’ＲＡＣＥとして知られているポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅技術（ｃＤＮＡ末端の急速な増幅）により、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ配列由来のヒト抗ＫＬＨ抗体を得た。ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ＫＬＨ結合モノクローナル抗体を発現する３つのハイブリドーマ；１６．３．１、１０８．１．２および１２０．６から総ＲＮＡを単離してから、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてさらに精製した。混合した無作為およびオリゴ−ｄＴプライマー第一鎖、ＲＡＣＥ  ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡをＧｅｎｅＲａｃｅｒキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて調製した。順行プライマー、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ（登録商標）ネステッドプライマーを用いたＡｄｖａｎｔａｇｅ  ＨＦ２  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）でｃＤＮＡのＰＣＲ増幅を実施した：
５’−ＧＧＡ  ＣＡＣ  ＴＧＡ  ＣＡＴ  ＧＧＡ  ＣＴＧ  ＡＡＧ  ＧＡＧ  ＴＡ−３’／／（配列番号２７１）；ならびに逆行プライマー：
軽鎖において５’−ＣＴＣ  ＣＴＧ  ＧＧＡ  ＧＴＴ  ＡＣＣ  ＣＧＡ  ＴＴＧ−３’／／（配列番号２７２）、および重鎖において５’−ＧＡＴ  ＧＧＧ  ＣＣＣ  ＴＴＧ  ＧＴＧ  ＧＡＧ  ＧＣＴ  ＧＡＧ  ＧＡＧ  ＡＣＧ  ＧＴＧ  ＡＣＣ  ＧＴＧ  Ｇ−３’／／（配列番号２７３）。ＰＣＲ反応サイクルは９４℃で３０秒のｃＤＮＡ変性からなり、９４℃で２０秒間；５５℃で３０秒間；ならびに７２℃で９０秒間からなる各サイクルの増幅の３サイクル＋９４℃で２０秒間；６５℃で３０秒間；ならびに７２℃で９０秒間からなる追加の２７サイクルが続く。次いで反応物を７２℃で７分間インキュベートして、最終ＰＣＲサイクルが続いて完全な延長部を保証する。ＲＡＣＥ  ＰＣＲ生成物をｐＣＲ４−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にクローン化して、ＡＢＩ  ＤＮＡ配列決定機器（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いてそれらの配列を決定した。ベクターＮＴＩ  ８．０ソフトウェア（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてコンセンサス配列を決定し、完全長抗体鎖ＰＣＲ増幅プライマーを設計するために用いられる。
【０３６１】
抗ＫＬＨ抗体の発現のための完全なコード領域配列を得るために、例として１６．３．１を用いて、ＰＣＲを再使用した。シグナル配列のアミノ末端をコードした軽鎖５’ＰＣＲプライマー、ＳａｌＩ制限酵素部位、および至適化Ｋｏｚａｋ配列は：
５’−ＡＡＧ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＧＴＣ  ＧＡＣ  ＴＡＧ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＧＡＣ  ＡＴＧ  ＡＧＧ−３’／／（配列番号２７４）であり、およびカルボキシル末端をコードした３’プライマーおよび終止コドン、ならびにＮｏｔＩ制限部位は：
５’−ＡＡＣ  ＣＧＴ  ＴＴＡ  ＡＡＣ  ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＧＣＴ  ＣＡＡ  ＣＡＣ  ＴＣＴ  ＣＣＣ  ＣＴＧ  ＴＴＧ  ＡＡ−３’／／（配列番号２７５）であった。
【０３６２】
シグナル配列のアミノ末端をコードした重鎖５’ＰＣＲプライマー、ＳａｌＩ制限酵素部位、および至適化Ｋｏｚａｋ配列は：
５’−ＡＡＧ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＧＴＣ  ＧＡＣ  ＴＡＧ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＧＡＡ  ＴＴＧ  ＧＧＡ  ＣＴＧ  ＡＧ−３’／／（配列番号２７６）であり、カルボキシル末端をコードした３’プライマーおよび終止コドン、ならびにＮｏｔＩ制限部位は：
５’−ＡＡＣ  ＣＧＴ  ＴＴＡ  ＡＡＣ  ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＧＣＴ  ＣＡＴ  ＴＴＡ  ＣＣＣ  ＧＧＡ  ＧＡＣ  ＡＧＧ  ＧＡ−３’／／（配列番号２７７）であった。
【０３６３】
Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＨＦ２  ＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲを実施し、反応サイクルは９４℃で３０秒のｃＤＮＡ変性からなり、９４℃で２０秒間；６５℃で３０秒間；ならびに７２℃で９０秒間からなる３０サイクルが続く。次いで反応物を７２℃で７分間インキュベートして、最終ＰＣＲサイクルが続いて完全な延長部を保証する。生成したＰＣＲ生成物をゲル単離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ｓｐｉｎカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、ＳａｌＩ（ＮＥＢＬ）およびＮｏｔＩ（ＮＥＢＬ）で消化し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ｓｐｉｎカラムを用いてゲル単離および精製してから、哺乳類発現ベクターｐＴＴ５中に結紮した。
【０３６４】
ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（商標）由来ヒト抗ＤＮＰ抗体可変領域のための配列を逆転写ＰＣＲ生成物の配列決定により得た。次いでＰＣＲを可変領域配列末端を（ＶＫ１シグナルペプチドおよび適切な抗体定常領域を含む）ｐＴＴ５ベクター末端と適合させるように可変領域配列末端を適用させるために用いる。例として、Ｖｋ１シグナルペプチド末端の独特なＢｓｓＨＩＩ部位を用いておよびヒトκ定常領域開始の独特なＢｓｉＷ１部位を用いて、抗ＤＮＰ  ３Ａ４軽鎖をｐＴＴ５内にクローン化した。ＢｓｓＨＩＩおよびＢｓｉＷＩ部位を３Ａ４可変領域末端に添加するため、以下の５’プライマーを用いてＰＣＲにより増幅した：
５’  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＧ  ＣＧＣ  ＧＣＴ  ＧＴＧ  ＡＣＡ  ＴＣＣ  ＡＧＡ  ＴＧＡ  ＣＣＣ  ＡＧＴ  Ｃ  ３’／／（配列番号２７８）、
および３’プライマー  ５’  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＣＧＴ  ＡＣＧ  ＴＴＴ  ＧＡＴ  ＡＴＣ  ＣＡＣ  ＴＴＴ  ＧＧＴ  ＣＣ  ３’／／（配列番号２７９）。
【０３６５】
抗ＤＮＰ  ３Ａ４は、重鎖の可変領域にトリプトファンを含有した。トリプトファンコドンは（＋）鎖プライマー：
５’  ＣＴＧ  ＴＧＴ  ＡＴＴ  ＡＣＴ  ＧＴＧ  ＣＧＡ  ＧＧＴ  ＡＴＡ  ＡＣＴ  ＴＣＡ  ＡＣＴ  ＡＣＧ  ＧＴＡ  ＴＧＧ  ＡＣＧ  ＴＣＴ  ＧＧ  ３’／／（配列番号２８０）および（−）鎖プライマー：
５’  ＣＣＡ  ＧＡＣ  ＧＴＣ  ＣＡＴ  ＡＣＣ  ＧＴＡ  ＧＴＴ  ＧＡＡ  ＧＴＴ  ＡＴＡ  ＣＣＴ  ＣＧＣ  ＡＣＡ  ＧＴＡ  ＡＴＡ  ＣＡＣ  ＡＧ  ３’／／（配列番号２８１）を用いたＰＣＲによりフェニルアラニンに変異し、
重鎖５末端プライマー
５’  ＡＡＧ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＧＴＣ  ＧＡＣ  ＴＡＧ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＧＡＣ  ＡＴＧ  ＡＧＧ  ＧＴＧ  ＣＣＣ  ＧＣＴ  ＣＡＧ  ＣＴＣ  ＣＴＧ  ＧＧＧ  ＣＴ  ３’／／（配列番号２８４）および重鎖３’プライマー：
５’  ＡＡＣ  ＣＧＴ  ＴＴＡ  ＡＡＣ  ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＧＣＴ  ＣＡＴ  ＴＴＡ  ＣＣＣ  ＧＧＡ  ＧＡＣ  ＡＧＧ  ＧＡ  ３’／／（配列番号２８５）と連結している（＋）鎖プライマー：
５’  ＣＴＧ  ＴＧＴ  ＡＴＴ  ＡＣＴ  ＧＴＧ  ＣＧＡ  ＧＧＴ  ＡＴＡ  ＡＣＴ  ＡＣＡ  ＡＣＴ  ＡＣＧ  ＧＴＡ  ＴＧＧ  ＡＣＧ  ＴＣＴ  ＧＧ  ３’／／（配列番号２８２）および（−）鎖プライマー：
５’  ＣＣＡ  ＧＡＣ  ＧＴＣ  ＣＡＴ  ＡＣＣ  ＧＴＡ  ＧＴＴ  ＧＴＡ  ＧＴＴ  ＡＴＡ  ＣＣＴ  ＣＧＣ  ＡＣＡ  ＧＴＡ  ＡＴＡ  ＣＡＣ  ＡＧ  ３’／／（配列番号２８３）を用いたＰＣＲによりチロシンに変異した。また、３Ａ４  ＩｇＧ２重鎖のヒンジ領域のジスルフィドスクランブリングを減らすため、例として、ヒンジシステイン２１９および２２０（ＥＵ番号付け）を
重鎖５末端プライマー：
５’  ＡＡＧ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＧＴＣ  ＧＡＣ  ＴＡＧ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＧＡＣ  ＡＴＧ  ＡＧＧ  ＧＴＧ  ＣＣＣ  ＧＣＴ  ＣＡＧ  ＣＴＣ  ＣＴＧ  ＧＧＧ  ＣＴ  ３’／／（配列番号２８８）および重鎖３’プライマー：
５’  ＡＡＣ  ＣＧＴ  ＴＴＡ  ＡＡＣ  ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＧＣＴ  ＣＡＴ  ＴＴＡ  ＣＣＣ  ＧＧＡ  ＧＡＣ  ＡＧＧ  ＧＡ  ３’／／（配列番号２８９）と連結している（＋）鎖プライマー：
５’  ＧＧＡ  ＣＡＡ  ＧＡＣ  ＡＧＴ  ＴＧＡ  ＧＣＧ  ＣＡＡ  ＡＴＣ  ＴＴＣ  ＴＧＴ  ＣＧＡ  ＧＴＧ  ＣＣＣ  ＡＣＣ  ＧＴＧ  ＣＣＣ  ＡＧ  ３’／／（配列番号２８６）および（−）鎖プライマー：
５’  ＣＴＧ  ＧＧＣ  ＡＣＧ  ＧＴＧ  ＧＧＣ  ＡＣＴ  ＣＧＡ  ＣＡＧ  ＡＡＧ  ＡＴＴ  ＴＧＣ  ＧＣＴ  ＣＡＡ  ＣＴＧ  ＴＣＴ  ＴＧＴ  ＣＣ  ３’／／（配列番号２８７）を用いたＰＣＲにより変異させた。
【０３６６】
組換えモノクローナル抗体を産生する一過性発現。一過性トランスフェクションをＨＥＫ  ２９３−６Ｅ細胞内で以下のとおり実行した。エプスタインバーウイルス核抗原−１（２９３−６Ｅ細胞）を安定的に発現しているヒト胚腎臓２９３細胞系を、国家研究会議（Ｍｏｎｔｒｅａｌ，  Ｃａｎａｄａ）から得た。６ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）、１．１％Ｆ−６８  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）および２５０μｇ／μｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｉｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）で補充したＦ１７培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）を用いて細胞を血清を含まない懸濁培養として維持した。懸濁細胞培養を撹拌三角フラスコ培養内で維持した。培養フラスコを３７℃、加湿した５％ＣＯ２雰囲気で６５ｒｐｍで撹拌した。原液（１ｍｇ／ｍＬ）の２５ｋＤａ線状ＰＥＩ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，  ＰＡ）を水中で調製し、溶解するまでＨＣｌでｐＨ２．０に酸性化してから、ＮａＯＨで中性化して、滅菌ろ過し（０．２μｍ）、アリコートし、使用時まで−２０℃で保存した。Ｔｒｙｐｔｏｎｅ  Ｎ１をＯｒｇａｎｏＴｅｃｈｎｉ  Ｓ．Ａ．  （ＴｅｋｎｉＳｃｉｅｎｃｅ，  ＱＣ，  Ｃａｎａｄａ）から得た。原液（２０％、ｗ／ｖ）をＦｒｅｅＳｔｙｌｅ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｍ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）内で調製し、０．２μｍフィルターを介して滅菌ろ過し、使用時まで４℃で保存した。典型的には、トランスフェクションを１Ｌ尺度で実施した。細胞（２９３−６Ｅ）を生存細胞密度１．１×１０６細胞／ｍＬまで増殖してから、トランスフェクション複合体を１／１０容量の最終培養容量内で調製した。１Ｌトランスフェクション培養において、トランスフェクション複合体を１００ｍＬのＦ１７基礎培地で調製し、５００μｇプラスミドＤＮＡ（重鎖および軽鎖ＤＮＡ、１：１比）をまず１００ｍＬのＦ１７培地で希釈した。室温で５分インキュベーション後、１．５ｍＬのＰＥＩ溶液を添加した。複合体を軽くボルテックスしてから、室温で１５分間インキュベートした。撹拌フラスコ培養内でトランスフェクション複合混合物を細胞に添加することにより細胞をトランスフェクトした。２４時間トランスフェクション後、Ｔｒｙｐｔｏｎｅ  Ｎ１をトランスフェクトした培養に添加して最終濃度０．５％とし、トランスフェクトした培養を振盪機上、３７℃、加湿した５％ＣＯ２雰囲気で６５ｒｐｍでさらに５日間維持してから、回収した。条件培地を４０００ｒｐｍの遠心分離により回収してから、０．２μｍフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．）を介して滅菌ろ過した。
【０３６７】
標準的な電気穿孔手段を用いて発現プラスミドｐＤＣ３２３抗ＫＬＨ１２０．６κＬＣおよびｐＤＣ３２４抗ＫＬＨ１２０．６−ＩｇＧ２  ＨＣとＣＨＯ  ｄ−宿主細胞のトランスフェクトにより、安定的に発現しているaＫＬＨ１２０．６対照抗体プールを作製した。トランスフェクション後、血清を含まないＧＨＴ選択的増殖培地中プールとして細胞を増殖して、細胞含有プラスミドの選択および回収を可能とした。ＧＨＴ選択的培地で増殖した細胞プールを８５％未満の生存能に至るまで培養した。選択された細胞プールを１５０ｎｍおよび３００ｎＭメトトレキサート（ＭＴＸ）で増幅した。８５％より大きい生存能に至った際、１５０ｎＭプールを５００ｎｍ  ＭＴＸ中でさらに再増幅した。ＭＴＸで増幅したプールの生存能が８５％より大きい生存能に至った際、簡潔化した６日のバッチ産生アッセイを用いて、濃縮した産生培地でプールをスクリーニングして発現を評価した。増幅したプールの発現は１２０〜４００μｇ／ｍＬの範囲であった。最高のプールを６日アッセイに基づき選択し、１０日のフェドバッチプロセスを用いて拡大した。条件培地を回収し、精製して分析用タンパク質を得た。
【０３６８】
標準的な電気穿孔手段を用いて発現プラスミドｐＤＣ３２３抗ＫＬＨ１２０．６κＬＣおよびｐＤＣ３２４抗ＫＬＨ１２０．６−ＩｇＧ２  ＨＣとＣＨＯ  ｄ−宿主細胞のトランスフェクトにより安定的に発現しているaＫＬＨ１２０．６抗体プールを作製した。トランスフェクション後、血清を含まないＧＨＴ選択的増殖培地中プールとして細胞を増殖して、細胞含有プラスミドの選択および回収を可能とした。-ＧＨＴ選択的培地で増殖した細胞プールを８５％より大きい生存能に至るまで培養した。選択された細胞プールを１５０ｎｍおよび３００ｎＭ  ＭＴＸで増幅した。８５％より大きい生存能に至った際、１５０ｎＭプールを５００ｎｍ  ＭＴＸ中でさらに再増幅した。ＭＴＸ増幅プールの生存能が８５％未満の生存能に至った際、簡潔化した６日のバッチ産生アッセイを用いて、濃縮した産生培地でプールをスクリーニングして発現を評価した。増幅したプールの発現は１２０〜４００μｇ／ｍＬの範囲であった。最高のプールを６日アッセイに基づき選択し、１０日のフェドバッチプロセスを用いて拡大した。条件培地を回収し、精製して分析用タンパク質を得た。
【０３６９】
標準的な電気穿孔手段を用いて、ＣＨＯ  ＤＨＦＲ（−）宿主細胞を、対応する重鎖および軽鎖発現プラスミドセットでトランスフェクトすることによりａＤＮＰ３Ａ４−ＦおよびａＤＮＰ３Ｂ１抗体の安定的に発現しているプールを作製した。各抗体分子につき、３〜４個の異なるトランスフェクションを実施して複数のプールを産生した。トランスフェクション後、血清を含まないＧＨＴ選択的増殖培地中プールとして細胞を増殖して、細胞含有プラスミドの選択および回収を可能とした。-ＧＨＴ選択的培地で増殖した細胞プールを８５％より大きい生存能に至るまで培養した。選択された細胞プールを１５０ｎｍメトトレキサートで増幅した。メトトレキサートで増幅したプールの生存能が８５％より大きい生存能に至った際、簡潔化した６日のバッチ産生アッセイを用いて濃縮した産生培地でプールをスクリーニングして発現を評価した。最高のプールを６日アッセイ力価および正確な質量の確認に基づき選択した。
【０３７０】
抗体精製および選択。２価陽イオンを含まないダルベッコのＰＢＳ  ８カラム容量を洗浄緩衝液として、および１００ｍＭ酢酸（ｐＨ３．５）を溶出緩衝液として７℃で用いて、Ｍａｂ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅクロマトグラフィー（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）により抗体を精製した。クロマトグラムに基づき溶出ピークをプールして、２Ｍトリス塩基を用いてｐＨを約５．０に増大した。次いでプールを少なくとも３容量の水で希釈し、０．２２μｍ酢酸セルロースフィルターを介してろ過してから、ＳＰ−ＨＰセファロースカラム（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）上に負荷し、１０カラム容量のＳ緩衝液Ａ（２０ｍＭ酢酸、ｐＨ５．０）で洗浄した後、５０％Ｓ緩衝液Ｂ勾配（２０ｍＭ酢酸、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．０）の２０カラム容量を用いて７℃で溶出した。プールをクロマトグラムおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に基づき作製してから、物質を約７倍濃縮し、約５容量の１０ｍＭ酢酸、９％ショ糖（ｐＨ５．０）に対して、３０ｋＤａ膜のＶｉｖａＦｌｏｗ  ＴＦＦカセットを用いてダイアフィルターした。次いで透析物質を０．２２μｍ酢酸セルロースフィルターを介してろ過し、吸光度２８０ｎｍで濃度を決定した。
【０３７１】
次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより生成物の性質に基づきリード候補を選択した。一過性かつ安定的に発現している哺乳類細胞系の両方に由来するａＤＮＰ
３Ｂ１、３Ｈ４、３Ｃ２、３Ａ１および３Ａ４抗体の生成物品質を、還元負荷緩衝液を用いて１．０ｍｍトリス−グリシン４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｎｏｖｅｘ）上で分析した（図１１）。ａＤＮＰ３Ｈ４抗体が安定した細胞系から不均一な生成物を産生したというこれらのデータから、ａＤＮＰ３Ｈ４抗体は担体抗体として良好な候補ではなかったことが示された（均一生成物が望ましいため）。ａＤＮＰ３Ａ１、３Ａ４、３Ｃ２、および３Ｂ１ならびにaＫＬＨ１２０．６抗体の生成物品質を、非還元負荷緩衝液を用いて１．０ｍｍトリス−グリシン４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｎｏｖｅｘ）上で分析した（図１２Ａ〜Ｂ）。ａＤＮＰ３Ｃ２抗体は例外的な高分子質量物質を伴う不均一生成物を産生し、これは担体抗体として理想的な候補ではないことが示された（高分子質量物質が含まれる生成物は望ましくないため）。加えて、ａＤＮＰ３Ｂ１抗体は、これらの条件下で二重線を示した。次いで、トリス−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥならびにビス−トリスＮｕＰＡＧＥ系の両方を用いて、非還元条件下でａＤＮＰ３Ｂ１抗体とａＤＮＰ３Ａ１抗体を比較した（図１３Ａ〜Ｂ）。ａＤＮＰ３Ｂ１抗体では、トリス−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥ上のａＤＮＰ３Ａ１では観察されなかった二重線がはっきりと生じることが見出された；しかしながら、ビス−トリスＮｕＰＡＧＥにより分析した場合、ａＤＮＰ３Ｂ１抗体はａＤＮＰ３Ａ１抗体よりも均一であると考えられ、二重線は分析法のアーチファクトであり得ることが示された。ａＤＮＰ３Ｂ１抗体を室温、８５℃、または１００℃で非還元試料緩衝液で処置後にトリス−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した場合、二重線は除去されなかった（図１４Ａ）。しかしながら、ａＤＮＰ３Ｂ１抗体を通常の０．１％ではなく０．４％ＳＤＳゲルの流れる緩衝液を用いてトリス−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価した際、二重線は激減し（図１４Ｂ）、二重線は分析系のアーチファクトであったというさらなる証拠が得られた。
【０３７２】
１００ｍＭリン酸ナトリウム、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ６．８）の移動相（流速０．５ｍＬ／分）に乗せる連続する２つのサイズ排除カラム（ＴＳＫ−ＧＥＬ  Ｇ３０００ＳＷＸＬ、５ｍｍ粒径、７．８×３００ｍｍ、ＴｏｓｏｈＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、０８５４１）を用いて、抗体の均一性についてさらに分析した（図１５）。ａＤＮＰ３Ｃ２抗体は実質的な後ピーク肩を示し、これは望ましくないとみなされたので、この抗体は候補担体抗体から外した。加えて、ａＤＮＰ３Ｃ２およびａＤＮＰ３Ａ４抗体は予期したよりも後に溶出されたことが観察され、クロマトグラフィーカラムの固定相との潜在的相互作用が示された。
【０３７３】
抗体（ａＤＮＰ３Ａ１、ａＤＮＰ３Ｃ２およびａＤＮＰ３Ａ４）の光分解耐性を試験した。抗体を４℃で３週間蛍光曝露するかまたは各試料をアルミニウムホイルで覆って遮光するかのいずれかとした。次いで抗体試料を、１００ｍＭリン酸ナトリウム、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ６．８）の移動相（流速０．５ｍＬ／分）に乗せる連続する２つのサイズ排除カラム（ＴＳＫ−ＧＥＬ  Ｇ３０００ＳＷＸＬ、５ｍｍ粒径、７．８×３００ｍｍ、ＴｏｓｏｈＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、０８５４１）を用いて分析した（図１６）。ａＤＮＰ３Ｃ２およびａＤＮＰ３Ａ４抗体は、光曝露後、影響を受けやすいトリプトファン酸化と実質的に一致したピーク広がりを示した。ａＤＮＰ３Ａ４抗体の酸化感受性を減らすため、チロシンまたはフェニルアラニンのいずれかに変異しているＣＤＲ３トリプトファンのいくつかの変異体を構築した（ａＤＮＰ３Ａ４、ａＤＮＰ３Ａ４−Ｙ、ａＤＮＰ３Ａ４−Ｆ、ａＤＮＰ３Ａ４−ＹＳＳおよびａＤＮＰ３Ａ４−ＦＳＳ）。次いで、６℃で光曝露の２日後（３３６Ｗ／ｍ２  ＵＶ光および３３１ｋ−ｌｕｘ蛍光）、１００ｍＭリン酸ナトリウム、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ６．８）の移動相（流速０．５ｍＬ／分）に乗せる連続する２つのサイズ排除カラム（ＴＳＫ−ＧＥＬ  Ｇ３０００ＳＷＸＬ、５ｍｍ粒径、７．８×３００ｍｍ、ＴｏｓｏｈＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、０８５４１）を用いた分析により、これらの抗体の光分解耐性をＳＥＣにより評価した（図１７Ａ〜Ｂ）。
【０３７４】
全４つのａＤＮＰ３Ａ４変異体が、野生型分子より実質的に狭いピーク広がりを示し、ＣＤＲ３トリプトファンはこの望ましくない現象に関与したことが示された。さらに、ＳＥＣ上の延長保持時間も変異体で激減し、カラムの固定相との相互作用が少ないことを示した。Ｔｏｓｏｈａａｓ  ＳＰ−５ＰＷカラム（１０μｍ粒子、７．５ｍｍ  ＩＤ×７．５ｃｍ長）を用いて、緩衝液Ａ（１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０）および緩衝液Ｂ（１０ｍＭ酢酸ナトリウム、６００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．０）をプログラム化直線勾配（１分０％Ｂ、１０分３５％Ｂ、３０分７０％Ｂ、３分９０％Ｂおよび３分０％Ｂ）で１ｍＬ／分で流して用いて、各種変異の抗ＤＮＰ  ３Ａ４抗体（ａＤＮＰ３Ａ４、ａＤＮＰ３Ａ４−Ｙ、ａＤＮＰ３Ａ４−Ｆ、ａＤＮＰ３Ａ４−ＹＳＳおよびａＤＮＰ３Ａ４−ＦＳＳ）の均一性を分析した（図１８）。ＣＤＲ３トリプトファンを有するａＤＮＰ３Ａ４抗体をフェニルアラニンに形質転換して、野生型またはチロシン変異型よりも望ましい狭い溶出ピークが得られた；したがって、ａＤＮＰ３Ａ４−Ｆ変異型は優れた分子であるとみなされた。ａＤＮＰ３Ｂ１、ａＤＮＰ３Ａ４−Ｆ、およびａＤＮＰ３Ａ４−ＦＳＳ抗体を非還元ＣＥ−ＳＤＳにより分析した（図１９Ａ〜Ｃ）。すべてのＣＥ  ＳＤＳ実験をＵＶダイオード検出器付きＢｅｃｋｍａｎ  ＰＡ８００  ＣＥ系（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，  ＣＡ）を用いて実施した。２２１ｎｍおよび２２０ｎｍ波長を用いた。裸のフューズドシリカキャピラリー５０μｍ×３０．２ｃｍを分離分析のために用いた。緩衝液バイアル調製および負荷ならびにＩｎｓｔａｌｌ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅについては、ＩｇＧ  Ｐｕｒｉｔｙ／ＨｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙのＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒマニュアルに記載されていた。還元、非還元ＣＥ−ＳＤＳの流れる状態は、一部修正点を除きＩｇＧ  Ｐｕｒｉｔｙ／ＨｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙのＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒマニュアルに記載されていたものと類似し、この一部修飾点について下記に簡単に述べる。非還元状態では、抗体試料（１５０μｇ）を２０μＬのＳＤＳ反応緩衝液および５μＬの７０ｍＭ  Ｎ−エチルマレイミドに添加した。次いで水を添加して最終容量３５μＬとし、タンパク質濃度を４．３ｍｇ／ｍＬとした。ＳＤＳ反応緩衝液は４％ＳＤＳ、０．０１Ｍクエン酸リン酸緩衝液（Ｓｉｇｍａ）および０．０３６Ｍリン酸ナトリウム二塩基性から構成された。調製物を完全にボルテックスして、４５℃で５分間加熱した。次いで調製物に追加の４％ＳＤＳを１１５μＬ添加した。ボルテックスおよび遠心分離後、調製物を２００μＬのＰＣＲバイアルに入れてからＰＡ８００機器上に負荷した。試料を−１０ｋＶの逆極性陽極で３０秒間注入してから、３５分間の分離中、キャピラリー両端の−１５ｋＶ、２０ｐｓｉ圧力で分離した。ａＤＮＰ３Ｂ１抗体では、非還元条件下で均一性が最高レベルであるという最も望ましいプロファイルが得られた。ａＤＮＰ３Ｂ１、ａＤＮＰ３Ａ４−Ｆ、およびａＤＮＰ３Ａ４−ＦＳＳ抗体を還元ＣＥ−ＳＤＳにより分析した（本明細書の図２０Ａ〜Ｃ）。還元状態では、精製Ｈ２Ｏを添加して抗体試料を２．１ｍｇ／ｍＬに希釈し、抗���９５μＬを、５．６％βメルカプトエタノールを有するＳＤＳ試料緩衝液（Ｂｅｃｋｍａｎ）１０５μＬに添加した。次いで調製物を完全にボルテックスしてから７０℃で１０分間加熱した。遠心分離後、上清を２００μＬのＰＣＲバイアルに入れてからＰＡ８００機器上に負荷した。試料を−５ｋＶの逆極性陽極で２０秒間注入してから、３０分間の分離中、キャピラリー両端の−１５ｋＶ、２０ｐｓｉ圧力で分離した。ａＤＮＰ３Ａ４−Ｆでは、還元条件下で最も望ましい均一ピークが得られた。
【０３７５】
ａＤＮＰ３Ａ４−Ｆ、ａＤＮＰ３Ａ４−ＦＳＳおよびａＤＮＰ３Ｂ１抗体の熱耐性について、試料を２０℃から９５℃に１℃／分で加熱し、ＭｉｃｒＣａｌ  ＶＰ−ＤＳＣを用いてＤＳＣ分析した。タンパク質は１０ｍＭ酢酸ナトリウム、９％ショ糖（ｐＨ５．０）中０．５ｍｇ／ｍＬであった（図２１）。ａＤＮＰ３Ｂ１およびａＤＮＰ３Ａ４−Ｆ抗体にて、初回転移のためにより高温で最も望ましい融解プロファイルが得られた。ａＤＮＰ３Ｂ１およびａＤＮＰ３Ａ４−Ｆ抗体をａＤＮＰ３Ｂ１抗体については単一の融解転移およびａＤＮＰ３Ａ４−Ｆ抗体については二重転移の存在により識別した。
【０３７６】
ＥＬＩＳＡアッセイ。ＥＬＩＳＡアッセイを以下のとおり実行した。Ｃｏｓｔａｒ３０７２培地結合３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）をＤＮＰ−ＢＳＡ（ＢｉｏＳｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｎｏｖａｔｏ，  ＣＡ）５μｇ／ｍＬの１×ＰＢＳ／０．０５％アジド溶液（４０μＬ／ウェル）でコーティングした。プレートを４℃で一晩インキュベートした。次いでＴｉｔｅｒｔｅｋ  Ｍ３８４プレート洗浄器（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ，  Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，  ＡＬ）上で３サイクル洗浄を用いてプレートを洗浄した。プレートを９０μＬの１×ＰＢＳ／１％乳液でブロックし、室温で約３０分間インキュベートした。次いでプレートをＴｉｔｅｒｔｅｋプレート洗浄器上で３サイクル洗浄を用いてプレートを洗浄した。１０μＬ抗体試料を４０μＬ  １×ＰＢＳ／１％乳液に添加した。次いでプレートを室温で１時間インキュベートした。次いでＴｉｔｅｒｔｅｋ  Ｍ３８４プレート洗浄器（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ，  Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，  ＡＬ）上で３サイクル洗浄を用いてプレートを洗浄した。次いでヤギ抗ヒトＩｇＧ  ＦｃＨＲＰを１００ｎｇ／ｍＬ（１：４０００）１×ＰＢＳ／１％乳液／１０ｍＭ  Ｃａ２＋溶液（５０μＬ／ウェル）でプレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。３サイクル洗浄を用いてプレートを再度洗浄した。次いでプレートを紙タオルで軽く叩いて乾燥させた。最終的に、一段階ＴＭＢ（Ｎｅｏｇｅｎ，  Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，  Ｋｅｎｔｕｃｋｙ）（５０μＬ／ウェル）をプレートに添加し、３０分後に１Ｎ塩酸（５０μＬ／ウェル）で室温でクエンチした。Ｔｉｔｅｒｔｅｋプレート読取り器を用いてＯＤを迅速に４５０ｎｍで読み込んだ。
【実施例２】
【０３７７】
本発明の抗ＤＮＰ抗体の実施形態の薬物動態（ＰＫ）および薬力学（ＰＤ）試験
ａＤＮＰ３Ａ４−Ｆ、ａＤＮＰ３Ａ４−ＦＳＳおよびａＤＮＰ３Ｂ１抗体の薬物動態プロファイルについて、成体Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（８〜１２週齢）に５ｍｇ／ｋｇを皮下注射し、投与から０、０．２５、１、４、２４、４８、７２、９６、１６８、３３６、５０４、６７２、８４０および１００８時間後に側面尾静脈から血液約２５０μＬをＭｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ（商標）血清分離管に採取して決定した（図２２）。各試料を採取後に室温で維持し、３０〜４０分凝固させた後に、目盛り付きＥｐｐｅｎｄｏｒｆ  ５４１７Ｒ遠心分離系（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，  ＮＹ）を用いて試料を２〜８℃、１１，５００ｒｐｍで約１０分間遠心分離した。次いで採取した血清を分析のために（各ラットにおいて）前標識した低温貯蔵管内に移して、−６０℃〜−８０℃で保存した。ＰＫ試験試料から血清試料濃度を測定するため、以下の方法を用いた：２分の１部分黒プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ３６９４）を２μｇ／ｍＬの抗ｈｕ  ＦＣ、Ａｂ１．３５．１の１×ＰＢＳ溶液でコーティングしてから４℃で一晩インキュベートした。プレートを洗浄し、Ｉ−Ｂｌｏｃｋ（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で４℃で一晩ブロックした。試料を希釈する必要があった場合は、ラットＳＤ血清で希釈した。標準および試料をＩ−Ｂｌｏｃｋ（登録商標）＋５％ＢＳＡで１：２０希釈し３８０μＬの希釈緩衝液とした。プレートを洗浄し、前処置した標準の５０μＬ試料および各試料をＡｂ１．３５．１コーティングプレートに移して室温で１．５時間インキュベートした。プレートを洗浄してから、抗ｈｕ  ＦＣ  Ａｂ２１．１−ＨＲＰ結合体のＩ−Ｂｌｏｃｋ（登録商標）＋５％ＢＳＡ  １００ｎｇ／ｍＬを５０μＬ添加し、１．５時間インキュベートした。プレートを洗浄してから、ピコ基質５０μＬを添加後、プレートを照度計で直ちに分析した。すべての抗体の薬物動態プロファイルが良好であったが、ａＤＮＰ３Ｂ１が最高の全体プロファイルを示した。
【０３７８】
６匹の雄カニクイザル（３〜７ｋｇ）に６ｍｇ／ｋｇをボーラス静脈内注射し、０分および３０分目、２、７、９、１１、１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６および６３日目に血液試料を採取して、ａＤＮＰ３Ａ４−Ｆ抗体の薬物動態プロファイルを決定した（図２３）。４匹の雄カニクイザル（２〜４ｋｇ）に３ｍｇ／ｋｇボーラス静脈内注射し、０、０．２５、１、４、８、１２、２４、７２、１６８、２４０、３３６、４０８、５０４、５７６、６７２、７４４、８４０、１００８、１１７６および１３４４時間に血液試料を採取して、aＫＬＨ１２０．６抗体の薬物動態プロファイルを決定した（図２３）。ＰＫ試験試料由来の血清試料濃度を測定するため、上述のラット薬物動態試験と同じ方法を用いた。カニクイザルにおける両抗体の薬物動態プロファイルは良好であったが、aＫＬＨ１２０．６のための用量正規化プロファイルはａＤＮＰ３Ａ４−Ｆのプロファイルよりもわずかに優れていた。
【実施例３】
【０３７９】
ヒト組織交差反応評価
概して、ヒト使用のためのモノクローナル抗体生成物の製造および検査における考慮点（Ｐｏｉｎｔｓ  ｔｏ  Ｃｏｎｓｉｄｅｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｕｓｅ）（Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｏｎ，  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  （１９９７））におけるガイダンスに従い、発明の抗体の各種ヒト組織との交差反応を決定する非ＧＬＰ予備試験を実施した。抗体による薬剤発現が意図される場合、ＧＬＰ条件下のより広範な検査が必要である。抗体ＤＮＰ  ３Ａ４−ＦおよびaＫＬＨ１２０．６の組織交差反応を、試験物質のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識形態を用いて選択されたヒト組織の凍結切片で検討した（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  Ｒｅｎｏ，  ＮＶ）。（別段の指定のない限り）互いに依存しない２人の正常ヒト組織をＳｐｅｃｉａｌ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｂａｎｋ  ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅ  （ＮＤＲＩ，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  ＰＡ）、Ｃｕｒｅｌｉｎｅ，  Ｉｎｃ．  （Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，  ＣＡ）、Ｃｙｂｒｄｉ  （Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  ＭＤ）、またはＲｏｃｋｙ  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｌｉｏｎｓ  Ｅｙｅ  Ｂａｎｋ  （Ａｕｒｏｒａ，  ＣＯ）から得た。試験組織は、ヒト小脳、肺、大脳皮質、卵巣（成熟女性由来）、眼部、胎座、消化管（小腸）、皮膚（１人）、心臓、脾臓、腎臓（１人）、甲状腺、肝臓、精巣を含む。新しい凍結ヒト組織切片および対照ビーズブロック（ＤＮＰ［３１］−ウシ血清アルブミン［ＢＳＡ］ビーズ［陽性］、およびヒト血清アルブミン［ＨＳＡ］ビーズ［陰性］）を冷却器上で切断し、キャピラリーギャップスライド上に乗せて解凍した。組織および対照ビーズのスライドを冷却アセトン中で−１０℃〜−２５℃で約１０分間固定した。固定スライドを少なくとも１時間（〜一晩）乾燥させた。凍結保存の場合、実験の前日に固定スライドを凍結器から除去して使用前に一晩解凍させた。以降の工程はすべて別段の定めがない限り室温で実施した。スライドを１×Ｍｏｒｐｈｏｓａｖｅ（登録商標）で約１５分間インキュベートして組織形態を保持してから、１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回、それぞれ約５分間洗浄した。内因性ペルオキシダーゼをブロックするため、スライドをグルコースオキシダーゼ溶液中で約３７℃で約１時間インキュベートした。スライドを１×ＰＢＳで２回、それぞれ約５分間洗浄した。内因性ビオチンをアビジンおよびビオチン溶液中の逐次インキュベーション（それぞれ約１５分間）によりブロックした。ビオチン内でインキュベーション後、組織切片をブロック抗体溶液で約２５分間ブロックした。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８−Ａｂ３Ａ４  Ｗ１０１Ｆ（抗ＤＮＰ）、およびＡｌ��ｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８抗ＫＬＨ（抗ＫＬＨ  Ａｂ）を至適濃度（２．０μｇ／ｍＬ）または至適濃度の５倍（１０．０μｇ／ｍＬ）で切片に約２５分間適用した。スライドを洗浄緩衝液で３回洗浄してから、二次抗体（ウサギ抗Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８）で約２５分間インキュベートした。二次抗体でインキュベーション後、スライドを洗浄緩衝液で４回洗浄してから、三次抗体（セイヨウワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体）で約２５分間インキュベートし、ジアミノ酪酸（ＤＡＢ）色素原基質で結合を視覚化した。すべての実験においてＤＮＰ（３１）−ＢＳＡビーズを陽性対照として用いた。ＨＳＡビーズを陰性対照として用いた。ＣＤ３１に対する抗体（抗ＣＤ３１）、すなわち、血小板内皮細胞接着分子（ＰＥＣＡＭ−１）染色を介して免疫組織化学に妥当な組織を適格とした。任意の試験抗体の２．０または１０．０μｇ／ｍＬ濃度のいずれかで評価したいずれのヒト組織においても特定の染色はなかった。
【実施例４】
【０３８０】
１価または多価免疫グロブリンおよび／またはＦｃドメイン毒素ペプチドアナログ融合物の発現および精製
本発明の例示的な実施形態を含み、一種別の１価、２価および３価構造を比較のために発現させて精製した。それらには、aＫＬＨ  ＩｇＧ２／Ｆｃ−ＳｈＫ変異体（図１Ｅ：「ヘミボディ」配置の図解を参照されたい）、および抗ＫＬＨ  ＩｇＧ２−ＳｈＫ変異体（図１Ｆ〜Ｌを参照されたい）が含まれる。例えば、２価Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５］、１価抗キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）免疫グロブリン重鎖−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ融合抗体（「aＫＬＨ  ＨＣ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ  Ａｂ」と命名；図１Ｆを参照されたい）、および１価抗ＫＬＨ免疫グロブリン軽鎖−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ抗体（「aＫＬＨ  ＬＣ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ  Ａｂ」と命名；図１Ｊを参照されたい）。ＩｇＧ２  Ｆｃ／Ｆｃ−ＳｈＫ変異体（図１Ａを参照されたい）、２価Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［２−３５］、１価Ｆｃ／Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［２−３５］を比較のため、Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．、ＷＯ２００８／０８８４２２Ａ２号、特に実施例１、２、および５６（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載の、または本明細書に修正されるように組換え方法により作製した。
【０３８１】
一過性発現系を用いて毒素ペプチドアナログ−Ｆｃ融合物（「ペプチボディ」）または他の免疫グロブリン融合の実施形態を生じた。ＨＥＫ  ２９３−６Ｅ細胞を、Ｌ−グルタミン（６ｍＭ）およびジェネテシン（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ、２５μｇ／ｍＬ）で補充したＦ１７培地の２ｅ５と１．２ｅ６細胞／ｍＬの間、３Ｌフェルンバッハ三角フラスコ内で、３７℃、５％ＣＯ２で維持して、６５ＲＰＭで撹拌した。トランスフェクション時、上述したＦ１７培地で細胞を１．１×１０６細胞／ｍＬ、最終培養容量９０％に希釈した。ＤＮＡ複合体をＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３培地で最終培養容量１０％で調製した。ＤＮＡ複合体は、５００μｇ総ＤＮＡ／リットルの培養および１．５ｍＬのＰＥＩｍａｘ／リットルの培養を含む。ＤＮＡ複合体は、成分を添加後に簡単に撹拌し、室温で１０〜２０分インキュベートした後、細胞培養に添加し、インキュベーター内に戻した。トランスフェクションの翌日、Ｔｒｙｐｔｏｎｅ  Ｎ１（５ｇ／Ｌ）を液体２０％ストックからの培養に添加した。トランスフェクションの６日後、培養を４，０００ＲＰＭで４０分間遠心分離して細胞をペレットし、培養培地を０．４５μｍフィルターを介して回収した。
【０３８２】
ＤＮＡ複合体の調製において、プラスミド比は、意図した生成物を産生するために必要なペプチドの所望のモル比に比例した。ＩｇＧ２  Ｆｃ／Ｆｃ−ＳｈＫ成分は、ＩｇＧ２  ＦｃおよびＩｇＧ２  Ｆｃ−ＳｈＫを１：１比で含む。発現中、これらはＩｇＧ２  Ｆｃホモ二量体、ＩｇＧ２  Ｆｃ／Ｆｃ−ＳｈＫヘテロ二量体、およびＩｇＧ２  Ｆｃ−ＳｈＫホモ二量体に会合する。陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて精製中にＩｇＧ２  Ｆｃ／Ｆｃ−ＳｈＫヘテロ二量体（１価形態）を単離した。
【０３８３】
ＩｇＧ２  Ｆｃ−ＳｈＫ［２−３５］；ＩｇＧ２  Ｆｃ  Ｓｈｋ［２−３５、Ｑ１６Ｋ］；ＩｇＧ２  Ｆｃ−Ｓｈｋ［１−３５］；ＩｇＧ２  Ｆｃ−ＳｈＫ［１−３５、Ｑ１６Ｋ］哺乳類発現。ヒトＩｇＧ２の免疫グロブリンＦｃドメインをコードするＤＮＡ配列：
ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳＥＲＫＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ／／（配列番号１）は、標準的なＰＣＲ技術を用いて、Ｋｖ１．３阻害剤ペプチドＳｈＫ［２−３５］の単量体にインフレーム融合させたかまたは変異ＳｈＫ［２−３５、Ｑ１６Ｋ］を構築した。ＰＣＲ反応においてｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＣＭＶｉ内の元のＦｃ−２×Ｌ−ＳｈＫ［２−３５］を鋳型として用いて、ＳｈＫ［２−３５］もしくはＳｈＫ［２−３５、Ｑ１６Ｋ］および分子の１０個のアミノ酸リンカー部分を生成した（Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．、ＷＯ２００８／０８８４２２Ａ２号の実施例２、図１５Ａ〜Ｂを参照されたい）。ＰＣＲ反応においてｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＣＭＶｉ内の元のＦｃ−２×Ｌ−ＳｈＫ［１−３５］を鋳型として用いてＳｈＫ［１−３５］を生成した（Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．、ＷＯ２００８／０８８４２２Ａ２号の実施例１、図１４Ａ〜Ｂ）。これらのＳｈＫ構築物は、
以下のオリゴ：
５’−ＣＡＴ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＣＣＣ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＧＡＡ  ＴＧＧ  ＡＧＣ  ＴＧＧ−３’（配列番号３）；および
５’−ＣＡ  ＣＧＧ  ＴＧＧ  ＧＣＡ  ＣＴＣ  ＧＡＣ  ＴＴＴ  ＧＣＧ  ＣＴＣ  ＧＧＡ  ＧＴＧ  ＧＡＣ  ＡＣＣ−３’（配列番号４）
を有するｐＳｅｌｅｘｉｓ−Ｖｈ２１−ｈＩｇＧ２−Ｆｃ鋳型から産生した修飾ＶＨ２１シグナルペプチドのアミノ酸配列ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳＥＲＫＶＥＣＰＰＣＰ／／配列番号２を有する。
【０３８４】
Ｎ末端リンカー伸張部分（アミノ酸配列
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＱＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣ／／配列番号６）を有する野生型ＳｈＫ［２−３５］を：
ＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＣＡＧＣＴＧＣＡＴＣＧＡＣＡＣＣＡＴＣＣＣＣＡＡＧＡＧＣＣＧＣＴＧＣＡＣＣＧＣＣＴＴＣＣＡＧＴＧＣＡＡＧＣＡＣＡＧＣＡＴＧＡＡＧＴＡＣＣＧＣＣＴＧＡＧＣＴＴＣＴＧＣＣＧＣＡＡＧＡＣＣＴＧＣＧＧＣＡＣＣＴＧＣ／／（配列番号５）のＤＮＡ配列によりコードした。このコード配列（配列番号５）を含む断片を、以下のオリゴ（配列番号７および配列番号８）を用いて、ならびにｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＣＭＶｉ中の元のＦｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［２−３５］を鋳型として用いて生成した（参照により組み込まれるＳｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．、ＷＯ２００８／０８８４２２Ａ２号の実施例２、図１５Ａ〜Ｂ）：
５’−ＧＴＣ  ＣＡＣ  ＴＣＣ  ＧＡＧ  ＣＧＣ  ＡＡＡ  ＧＴＣ  ＧＡＧ  ＴＧＣ  ＣＣＡ  ＣＣＧ  ＴＧＣ  Ｃ−３’（配列番号７）；および
５’−ＴＣＣ  ＴＣＣ  ＴＣＣ  ＴＴＴ  ＡＣＣ  ＣＧＧ  ＡＧＡ  ＣＡＧ  ＧＧＡ  ＧＡＧ−３’／／（配列番号８）。
【０３８５】
変異体ＳｈＫ［２−３５、Ｑ１６Ｋ］をＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｍｕｌｔｉ  ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキットｃａｔ＃２００５３１を製造業者の説明書に従いつつ用いて部位指向変異により生成した。変異を産生するために用いたオリゴは：
５’−ＧＣＴ  ＧＣＡ  ＣＣＧ  ＣＣＴ  ＴＣＡ  ＡＧＴ  ＧＣＡ  ＡＧＣ  ＡＣＡ  ＧＣ  ３’（配列番号９）；および
５’−ＧＣＴ  ＧＴＧ  ＣＴＴ  ＧＣＡ  ＣＴＴ  ＧＡＡ  ＧＧＣ  ＧＧＴ  ＧＣＡ  ＧＣ−３’（配列番号１０）；であり、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＣＭＶｉ中の元のＦｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［２−３５］を鋳型として用いて、ＤＮＡコード配列
ＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＣＡＧＣＴＧＣＡＴＣＧＡＣＡＣＣＡＴＣＣＣＣＡＡＧＡＧＣＣＧＣＴＧＣＡＣＣＧＣＣＴＴＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＣＡＣＡＧＣＡＴＧＡＡＧＴＡＣＣＧＣＣＴＧＡＧＣＴＴＣＴＧＣＣＧＣＡＡＧＡＣＣＴＧＣＧＧＣＡＣＣＴＧＣ／／（配列番号１１）を生成し、これはＮ末端リンカー伸張部分：ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＫＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣ／／配列番号１２）を有するＳｈｋ（２−３５、Ｋ１６）アミノ酸配列をコードする（Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．、ＷＯ２００８／０８８４２２Ａ２号の実施例２、図１５Ａ〜Ｂ）。
【０３８６】
ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＣＭＶｉ中の元のＦｃ−２×Ｌ−ＳｈＫ［１−３５］を鋳型として用いて、以下のオリゴ：
５’−ＧＴＣ  ＣＡＣ  ＴＣＣ  ＧＡＧ  ＣＧＣ  ＡＡＡ  ＧＴＣ  ＧＡＧ  ＴＧＣ  ＣＣＡ  ＣＣＧ  ＴＧＣ  Ｃ−３’（配列番号７）；および
５’−ＴＣＣ  ＴＣＣ  ＴＣＣ  ＴＴＴ  ＡＣＣ  ＣＧＧ  ＡＧＡ  ＣＡＧ  ＧＧＡ  ＧＡＧ−３’（配列番号８）
を用いてＳｈＫ［１−３５］ＷＴ断片を生成した（Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．、ＷＯ２００８／０８８４２２Ａ２号の実施例１、図１４Ａ〜Ｂ）。
【０３８７】
５’−ＣＣＧ  ＧＧＴ  ＡＡＡ  ＧＧＡ  ＧＧＡ  ＧＧＡ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＧＧＡ  Ｇ−３’（配列番号１３）；および
５’−ＣＡＴ  ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＧＣＴ  ＣＡＴ  ＴＡＧ  ＣＡＧ  ＧＴＧ−３’（配列番号１４）のオリゴを用いて、ならびにｐＳｅｌｅｘｉｓ  Ｖｈ２１−ｈＩｇＧ２−Ｆｃ鋳型を用いてＩｇＧ２Ｆｃ領域を生成し、アミノ酸配列
ＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ配列番号１６）をコードするコード配列：
ＧＣＡＣＣＡＣＣＴＧＴＧＧＣＡＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＧＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＣＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＡＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＴＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＴＧＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＡＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＡＣＣＴＣＣＣＡＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴＡＡＡ／／配列番号１５を含むＤＮＡ断片を得た。
【０３８８】
ＰＣＲ断片を生成し、生成物をゲル上に流した。ゲル精製後、ＤＮＡ断片を共にＰＣＲ管内に入れて外プライマー：
５’−ＣＡＴ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＣＣＣ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＧＡＡ  ＴＧＧ  ＡＧＣ  ＴＧＧ−３’（配列番号３）；および
５’−ＣＡＴ  ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＧＣＴ  ＣＡＴ  ＴＡＧ  ＣＡＧ  ＧＴＧ−３’（配列番号１４）
と一緒に縫い合わせた。
【０３８９】
ＰＣＲ生成物をＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ（Ｒｏｃｈｅ）制限酵素で消化し、Ｇｅｌ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキットによりアガロースゲルで精製した。同時に、ｐＴＴ１４ベクター（ＣＭＶプロモーター、Ｐｏｌｙ  Ａ  ｔａｉｌおよびピューロマイシン耐性遺伝子を含むＡｍｇｅｎベクター）をＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ制限酵素で消化し、大型断片をＧｅｌ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキットにより精製した。各精製ＰＣＲ生成物を大型断片と結紮して、ＯｎｅＳｈｏｔ  Ｔｏｐ１０細菌に形質転換した。形質転換細菌コロニーからＤＮＡを単離し、ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ制限酵素による消化に供して、１％アガロースゲル上で分解した。予期したパターンに至るＤＮＡを配列決定用に提出した。いくつかのクローン配列分析において上記配列と１００％適合したが、各構築物につき１クローンのみを大規模プラスミド精製用に選択した。最終ｐＴＴ１４−ＶＨ１ＳＰ−ＩｇＧ２−Ｆｃ構築物は以下の配列を有するＩｇＧ２−Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（２−３５）融合ポリペプチド：
ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳＥＲＫＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＱＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣ／／（配列番号１７）をコードした。
【０３９０】
ｐＴＴ１４−ＶＨ２１ＳＰ−ＩｇＧ２−Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（２−３５、Ｑ１６Ｋ）構築物はＩｇＧ２−Ｆｃ  Ｌ１０−ＳｈＫ（２−３５、Ｑ１６Ｋ）融合ポリペプチド配列：
ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳＥＲＫＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＫＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣ／／配列番号１８をコードした；
また、ｐＴＴ１４−ＶＨ２１ＳＰ−ＩｇＧ２−Ｆｃ  ＳｈＫ１−３５構築物には、以下の配列：
ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳＥＲＫＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＲＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＱＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣ／／（配列番号１９）
を有するＩｇＧ２  Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（１−３５）融合ポリペプチドのためのコード配列が含まれた。
【０３９１】
ｐＹＤ１６中のＶＨ２１ＳＰ−ＩｇＧ２−Ｆｃ−単独構築物（ＣＭＶプロモーター、Ｐｏｌｙ  Ａ  ｔａｉｌおよびハイグロマイシン耐性遺伝子を含むＡｍｇｅｎベクター）の生成は以下のとおり行った：以下のオリゴ：
５’−ＣＡＴ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＣＣＣ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＧＡＡ  ＴＧＧ  ＡＧＣ  ＴＧＧ−３’（配列番号２０）；および
５’−ＣＡ  ＣＧＧ  ＴＧＧ  ＧＣＡ  ＣＴＣ  ＧＡＣ  ＴＴＴ  ＧＣＧ  ＣＴＣ  ＧＧＡ  ＧＴＧ  ＧＡＣ  ＡＣＣ−３’（配列番号４）を用いて、ならびに上記ｐＳｅｌｅｘｉｓ鋳型を用いてＶＨ２１シグナルペプチドを生成した。
【０３９２】
上記ｐＳｅｌｅｘｉｓ鋳型ならびに以下のオリゴ：
５’−ＧＴＣ  ＣＡＣ  ＴＣＣ  ＧＡＧ  ＣＧＣ  ＡＡＡ  ＧＴＣ  ＧＡＧ  ＴＧＣ  ＣＣＡ  ＣＣＧ  ＴＧＣ  Ｃ−３’（配列番号７）；および
５’−ＣＡＴ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＴＣＡ  ＴＴＴ  ＡＣＣ  ＣＧＧ  ＡＧＡ  ＣＡＧ  ＧＧＡ  Ｇ−３’（配列番号２１）
を用いてＦｃ領域を生成した。
【０３９３】
ＰＣＲ断片をゲル精製し、外プライマー配列番号３３５および配列番号３３６を用いて単一のＰＣＲ反応において一緒に縫い合わせた。生成したＰＣＲ断片をゲル精製し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩにより消化した。同時に、ｐＹＤ１６ベクター（ＣＭＶプロモーター、Ｐｏｌｙ  Ａ  ｔａｉｌおよびハイグロマイシン耐性遺伝子を含むＡｍｇｅｎベクター）もＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩにより切断して、大型ベクター断片をＱｉａｇｅｎのＧｅｌ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキットにより精製した。精製したＰＣＲ生成物を大型断片と結紮して、ＯｎｅＳｈｏｔ  Ｔｏｐ１０細菌に形質転換した。形質転換細菌コロニーからＤＮＡを単離し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素による消化に供して、１％アガロースゲル上で分解した。予期したパターンに至るＤＮＡを配列決定用に提出した。いくつかのクローン配列分析において上記配列と１００％適合したが、１クローンのみを大規模プラスミド精製用に選択した。最終ｐＹＤ１６−ＶＨ２１ＳＰ−ＩｇＧ２−Ｆｃ構築物はヒトＩｇＧ２−Ｆｃ（上記の配列番号１）をコードした。
【０３９４】
抗ＫＬＨ  ＩｇＧ２−Ｆｃ  ＳｈＫ［１−３５、Ｑ１６Ｋ］哺乳類発現。ＤＮＡ  ｐＴＴ５−aＫＬＨ１２０．６−ＶＫ１ＳＰ−ＩｇＧ２−ＨＣ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５、Ｑ１６Ｋ］構築物を用いて、ＤＮＡコード配列
ＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＣＣＧＣＡＧＣＴＧＣＡＴＣＧＡＣＡＣＣＡＴＣＣＣＣＡＡＧＡＧＣＣＧＣＴＧＣＡＣＣＧＣＣＴＴＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＣＡＣＡＧＣＡＴＧＡＡＧＴＡＣＣＧＣＣＴＧＡＧＣＴＴＣＴＧＣＣＧＣＡＡＧＡＣＣＴＧＣＧＧＣＡＣＣＴＧＣＴＡＡＴＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＧＡＧＧＣＣＧＧＣＡＡＧＧＣＣＧＧＡＴＣＣ／／（配列番号２２）
を含む断片をＢａｍＨＩ／ＢａｍＨＩを用いて切断した。このコード配列（配列番号２３）はＮ末端リンカー配列：
ＧＳＧＧＧＧＳＲＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＫＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣ／／（配列番号２３）を有するＳｈＫ（１−３５、Ｑ１６Ｋ）をコードする。
【０３９５】
同時に、ｐＴＴ１４−ｈＩｇＧ２−Ｆｃ−ＳｈＫ［１−３５］ＷＴ構築物もＢａｍＨＩ／ＢａｍＨＩにより消化し、それによりＳｈｋ［１−３５］コード領域を除去して、アミノ酸配列
ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳＥＲＫＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＧＧ／／（配列番号２５）をコードするコード配列
ＡＴＧＧＡＡＴＧＧＡＧＣＴＧＧＧＴＣＴＴＴＣＴＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＣＡＧＴＡＡＣＧＡＣＴＧＧＴＧＴＣＣＡＣＴＣＣＧＡＧＣＧＣＡＡＡＧＴＣＧＡＧＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＡＣＣＴＧＴＧＧＣＡＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＧＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＣＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＡＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＴＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＴＧＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＡＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＡＣＣＴＣＣＣＡＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴＡＡＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡ／／（配列番号２４）を得た。
【０３９６】
ＳｈＫを除去したｐＴＴ１４−ｈＩｇＧ２−ＦｃベクターをＣａｌｆ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＣＩＰ）で処理して５’リン酸基を除去し、フェノール／クロロホルムを抽出してベクター自体の再結紮を防止した。挿入ＳｈＫ［１−３５、Ｑ１６Ｋ］断片をそのベクターからゲル精製して、ＱｉａｇｅｎのＧｅｌ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキットでクリーンアップした。精製した挿入物を大型ベクター断片と結紮して、ＯｎｅＳｈｏｔ  Ｔｏｐ１０細菌に形質転換した。形質転換細菌コロニーからＤＮＡを単離し、ＢａｍＨＩ制限酵素による消化に供して、１％アガロースゲル上で分解した。予期したパターンに至るＤＮＡを配列決定用に提出した。いくつかのクローン配列分析において上記配列と１００％適合したが、１クローンのみを大規模プラスミド精製用に選択した。最終ｐＴＴ１４−ＩｇＧ２−Ｆｃ−ＳｈＫ［１−３５、Ｑ１６Ｋ］構築物は以下のＩｇＧ２  Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（１−３５、Ｑ１６Ｋ）融合タンパク質配列：
ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳＥＲＫＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＲＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＫＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣ／／（配列番号２６）をコードした。
【０３９７】
抗ＫＬＨ免疫グロブリン重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）毒素ペプチド（および毒素ペプチドアナログ）融合物の哺乳類発現。aＫＬＨ  ＩｇＧ２／Ｆｃ−ＳｈＫ成分（図１Ｅにより図解）は以下を含有した。
（ａ）Ｎ末端ＶＫ−１ＳＰシグナルペプチド配列（配列番号１０３）を組み入れるaＫＬＨ１２０．６κＬＣ（以下の配列番号２８）：
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＲＮＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＲＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＨＮＳＹＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ／／（配列番号２８）；
（ｂ）Ｎ末端ＶＫ−１ＳＰシグナルペプチド配列（配列番号１０３）を組み入れるaＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＨＣ（以下の配列番号２９）：
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＨＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲＧＳＹＹＷＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ／／（配列番号２９）；
および、
（ｃ）ＩｇＧ２  Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（１−３５）：
ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳＥＲＫＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＲＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＱＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣ／／（配列番号３０）。
【０３９８】
所望のaＫＬＨ  ＩｇＧ２／Ｆｃ−ＳｈＫ生成物には、上述し図１Ｅに企図した各成分（ａ）〜（ｃ）の１複写が含まれる。このため、比率は１：１：１であった。この生成物は、Ｆｃドメインで結合している半抗体と半Ｆｃ融合物（「ヘミボディ」）として記載できる。培養物から除去しなければならない追加のペプチド集合体はaＫＬＨ  ＡｂおよびＦｃ−ＳｈＫホモ二量体であった。
【０３９９】
１価aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２−ＳｈＫおよびＳｈＫペプチドアナログ融合物。
aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２−ＳｈＫ融合抗体の成分（図１Ｆに図解）は以下の単量体を含有した。
（ａ）aＫＬＨ１２０．６κＬＣ（上記の配列番号２８）；
（ｂ）aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＨＣ（上記の配列番号２９）；および
（ｃ）以下のＨＣ配列を有するaＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２−ＳｈＫ融合物：
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＨＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲＧＳＹＹＷＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＲＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＱＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣ／／（配列番号３１）。
【０４００】
１価aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２−ＳｈＫ［１−３５、Ｑ１６Ｋ］融合抗体の成分（図１Ｆに図解）は以下の単量体を含有した。
（ａ）aＫＬＨ１２０．６κＬＣ（上記の配列番号２８）；
（ｂ）aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＨＣ（上記の配列番号２９）；および
（ｃ）以下の配列を有するaＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２−ＳｈＫ［１−３５、Ｑ１６Ｋ］融合物：
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＨＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲＧＳＹＹＷＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＲＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＫＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣ／／（配列番号３２）。
【０４０１】
１価aＫＬＨ１２０．６ＨＣ−ＳｈＫ［１−３５、Ｒ１Ａ、Ｉ４Ａ、Ｑ１６Ｋ］融合抗体の成分（図１Ｆに図解）は以下の単量体を含有した。
（ａ）aＫＬＨ１２０．６κＬＣ（配列番号２８）；
（ｂ）aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＨＣ（配列番号２９）；および
（ｃ）以下のアミノ酸配列を有するaＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＨＣ−ＳｈＫ［１−３５、Ｒ１Ａ、Ｉ４Ａ、Ｑ１６Ｋ］融合物：
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＨＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲＧＳＹＹＷＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＳＣＡＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＫＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣ／／（配列番号３０４）。
所望の１価aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＨＣ−ＳｈＫアナログ生成物は１本の重鎖のＣ末端に融合したＳｈＫペプチドを有する完全抗体であった。１種類の軽鎖を共有する２つの異なる重鎖を含み、重鎖：軽鎖：重鎖−ＳｈＫの比率は１：２：１であった。予期した発現生成物はaＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２抗体、１価aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＨＣ−ＳｈＫペプチドアナログ、および２価aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＨＣ−ＳｈＫペプチドアナログである。本明細書に記載のとおり、抗体を含む１価aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＨＣ毒素ペプチド融合物を陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて混合物から単離した。
【０４０２】
１価aＫＬＨ１２０．６ＨＣ−ＳｈＫ［１−３５、Ｒ１Ａ、Ｑ１６Ｋ、Ｋ３０Ｅ］融合抗体の成分（図１Ｆに図解）は以下の単量体を含有した。
（ａ）aＫＬＨ１２０．６κＬＣ（配列番号２８）；
（ｂ）aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＨＣ（配列番号２９）；および
（ｃ）以下の配列を有するaＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２−ＳｈＫ［１−３５、Ｒ１Ａ、Ｑ１６Ｋ、Ｋ３０Ｅ］融合物：
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＨＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲＧＳＹＹＷＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＫＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＥＴＣＧＴＣ／／（配列番号３０５）。
所望の１価aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＨＣ−ＳｈＫアナログ生成物は１本の重鎖のＣ末端に融合したＳｈＫペプチドを有する完全抗体であった。１種類の軽鎖を共有する２つの異なる重鎖を含み、重鎖：軽鎖：重鎖−ＳｈＫの比率は１：２：１であった。予期した発現生成物は、aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２抗体、１価aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＨＣ−ＳｈＫペプチドアナログ、および２価aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＨＣ−ＳｈＫペプチドアナログである。本明細書に記載のとおり、抗体を含む１価aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＨＣ毒素ペプチド融合物を陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて混合物から単離した。
【０４０３】
１価aＫＬＨ１２０．６ＨＣ（ＩｇＧ２）−ＳｈＫ［１−３５、Ｒ１Ｈ、Ｉ４Ａ、Ｑ１６Ｋ］融合抗体の成分（図１Ｆに図解）は以下の単量体を含有した。
（ａ）aＫＬＨ１２０．６κＬＣ（配列番号２８）；
（ｂ）aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＨＣ（配列番号２９）；および
（ｃ）以下のアミノ酸配列を有するaＫＬＨ１２０．６ＨＣ  ＩｇＧ２−ＳｈＫ［１−３５、Ｒ１Ｈ、Ｉ４Ａ、Ｑ１６Ｋ］融合物：
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＨＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲＧＳＹＹＷＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＨＳＣＡＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＫＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣ／／（配列番号３０６）。
所望の１価aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＨＣ−ＳｈＫアナログ生成物は１本の重鎖のＣ末端に融合したＳｈＫペプチドを有する完全抗体であった。１種類の軽鎖を共有する２つの異なる重鎖を含み、重鎖：軽鎖：重鎖−ＳｈＫの比率は１：２：１であった。予期した発現生成物は、aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２抗体、１価aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＨＣ−ＳｈＫペプチドアナログ、および２価aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＨＣ−ＳｈＫペプチドアナログである。本明細書に記載のとおり、抗体を含む１価aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＨＣ毒素ペプチド融合物を陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて混合物から単離した。
【０４０４】
１価aＫＬＨ１２０．６ＨＣ−ＳｈＫ［１−３５、Ｒ１Ｈ、Ｑ１６Ｋ、Ｋ３０Ｅ］融合抗体の成分（図１Ｆに図解）は以下の単量体を含有した。
（ａ）aＫＬＨ１２０．６κＬＣ（配列番号２８）；
（ｂ）aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＨＣ（配列番号２９）；および
（ｃ）以下の配列を有するaＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２−ＳｈＫ［１−３５、Ｒ１Ｈ、Ｑ１６Ｋ、Ｋ３０Ｅ］融合物：
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＨＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲＧＳＹＹＷＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＨＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＫＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＥＴＣＧＴＣ／／（配列番号３０７）。
所望の１価aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＨＣ−ＳｈＫアナログ生成物は１本の重鎖のＣ末端に融合したＳｈＫペプチドを有する完全抗体であった。１種類の軽鎖を共有する２つの異なる重鎖を含み、重鎖：軽鎖：重鎖−ＳｈＫの比率は１：２：１であった。予期した発現生成物は、aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２抗体、１価aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＨＣ−ＳｈＫペプチドアナログ、および２価aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＨＣ−ＳｈＫペプチドアナログである。本明細書に記載のとおり、抗体を含む１価aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＨＣ毒素ペプチド融合物を陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて混合物から単離した。
【０４０５】
１価aＫＬＨ１２０．６ＨＣ−ＳｈＫ［１−３５、Ｒ１Ｋ、Ｉ４Ａ、Ｑ１６Ｋ］融合抗体の成分（図１Ｆに図解）は以下の単量体を含有した。
（ａ）aＫＬＨ１２０．６κＬＣ（配列番号２８）；
（ｂ）aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＨＣ（配列番号２９）；および
（ｃ）以下の配列を有するaＫＬＨ１２０．６ＨＣ（ＩｇＧ２）−ＳｈＫ［１−３５、Ｒ１Ｋ、Ｉ４Ａ、Ｑ１６Ｋ］融合物：
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＨＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲＧＳＹＹＷＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＫＳＣＡＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＫＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣ／／（配列番号３０８）。
所望の１価aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＨＣ−ＳｈＫアナログ生成物は１本の重鎖のＣ末端に融合したＳｈＫペプチドを有する完全抗体であった。１種類の軽鎖を共有する２つの異なる重鎖を含み、重鎖：軽鎖：重鎖−ＳｈＫの比率は１：２：１であった。予期した発現生成物は、aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２抗体、１価aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＨＣ−ＳｈＫペプチドアナログ、および２価aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＨＣ−ＳｈＫペプチドアナログである。本明細書に記載のとおり、抗体を含む１価aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＨＣ毒素ペプチド融合物を陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて混合物から単離した。
【０４０６】
１価aＫＬＨ１２０．６ＨＣ−ＳｈＫ［１−３５、Ｒ１Ｋ、Ｑ１６Ｋ、Ｋ３０Ｅ］融合抗体の成分（図１Ｆに図解）は以下の単量体を含有した。
（ａ）aＫＬＨ１２０．６κＬＣ（配列番号２８）；
（ｂ）aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＨＣ（配列番号２９）；および
（ｃ）以下のアミノ酸配列を有するaＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２−ＳｈＫ［１−３５、Ｒ１Ｋ、Ｑ１６Ｋ、Ｋ３０Ｅ］融合物：
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＨＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲＧＳＹＹＷＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＫＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＫＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＥＴＣＧＴＣ／／（配列番号３０９）。
所望の１価aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＨＣ−ＳｈＫアナログ生成物は１本の重鎖のＣ末端に融合したＳｈＫペプチドを有する完全抗体であった。１種類の軽鎖を共有する２つの異なる重鎖を含み、重鎖：軽鎖：重鎖−ＳｈＫの比率は１：２：１であった。予期した発現生成物は、aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２抗体、１価aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＨＣ−ＳｈＫペプチドアナログ、および２価aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＨＣ−ＳｈＫペプチドアナログである。本明細書に記載のとおり、抗体を含む１価aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＨＣ毒素ペプチド融合物を陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて混合物から単離した。
【０４０７】
１価aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２−ＳｈＫ［２−３５、Ｑ１６Ｋ］融合抗体の成分（図１Ｆに図解）は以下の単量体を含有した。
（ａ）aＫＬＨ１２０．６κＬＣ（上記の配列番号２８）；
（ｂ）aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＨＣ（上記の配列番号２９）；および
（ｃ）以下のＨＣ配列を有するaＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２−ＳｈＫ［２−３５、Ｑ１６Ｋ］融合物：
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＨＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲＧＳＹＹＷＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＫＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣ／／（配列番号３３）。
所望のaＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２−ＳｈＫアナログ生成物は、図１Ｆに企図する１本の重鎖のＣ末端に融合したＳｈＫペプチドを有する完全抗体である。１種類の軽鎖を共有する２つの異なる重鎖を含み、重鎖：軽鎖：重鎖−ＳｈＫの比率は１：２：１であった。予期した発現生成物は、aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２、１価aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２−ＳｈＫ、および２価aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２−ＳｈＫである。本明細書に記載のとおり、１価aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２毒素ペプチド（または毒素ペプチドアナログ）融合抗体を陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて混合物から単離した。
【０４０８】
抗ＫＬＨ  ＩｇＧ１−ループ−ＳｈＫ。aＫＬＨ  ＩｇＧ１−ループ−ＳｈＫも、１本の重鎖内に挿入されたＳｈＫペプチド配列の単一複写を有するが、この場合、Ｃ末端の代わりにＦｃドメインの内部接合に挿入された。（例えば、Ｇｅｇｇ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第７，４４２，７７８号；米国特許第７，６５５，７６５号；米国特許第７，６５５，７６４号；米国特許第７，６６２，９３１号；米国特許第７，６４５，８６１号；公開された米国特許第２００９／０２８１２８６号；ならびに米国特許第２００９／０２８６９６４号を参照されたく、これらはそれぞれ参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。aＫＬＨ  ＩｇＧ１−ループ−ＳｈＫ抗体の成分は、以下を含有した
（ａ）aＫＬＨ１２０．６κＬＣ（上記の配列番号２８）；
（ｂ）aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ１  ＨＣ：
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＨＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲＧＳＹＹＷＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ／／（配列番号３４）；
および、
（ｃ）aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ１−ループ−ＳｈＫ：
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＨＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲＧＳＹＹＷＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＧＧＲＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＫＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣＧＧＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ／／（配列番号３５）。
【０４０９】
１軽鎖を共有する２つの異なる重鎖を含み、重鎖：軽鎖：重鎖−ＳｈＫの比率は１：２：１である。予期した発現生成物は、aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ１、１価aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ１−ループ−ＳｈＫ、および２価aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ１−ループ−ＳｈＫである。本明細書に記載のとおり、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて１価aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ１−ループ−ＳｈＫ融合抗体（図１Ｎにより図解）を混合物から単離した。
【０４１０】
１価aＫＬＨ１２０．６κＬＣ−ＳｈＫ［１−３５、Ｑ１６Ｋ］融合物。１価aＫＬＨ１２０．６κＬＣ−ＳｈＫ［１−３５、Ｑ１６Ｋ］融合抗体の成分（図１Ｊに図解）は以下の単量体を含有した。
（ａ）aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＨＣ（配列番号２９）；
（ｂ）aＫＬＨ１２０．６κＬＣ（配列番号２８）；および
（ｃ）以下の配列を有するaＫＬＨ１２０．６κＬＣ−ＳｈＫ［１−３５、Ｑ１６Ｋ］融合物：
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＲＮＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＲＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＨＮＳＹＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＲＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＫＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣ／／（配列番号２６７）。
１価aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＬＣ−ＳｈＫ［１−３５、Ｑ１６Ｋ］生成物のこの実施形態は、図１Ｊに示すように、１本の軽鎖のＣ末端に融合したＳｈＫペプチドを有する完全抗体であった。１種類の重鎖を共有する２つの異なる軽鎖を含み、軽鎖：重鎖：軽鎖−ＳｈＫ［１−３５、Ｑ１６Ｋ］の比率は１：２：１であった。予期した発現生成物は、aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２、１価aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＬＣ−ＳｈＫ［１−３５、Ｑ１６Ｋ］、および２価aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＬＣ−ＳｈＫ［１−３５、Ｑ１６Ｋ］である。本明細書に記載のとおり、抗体を含む１価aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＬＣ毒素ペプチド融合物を陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて混合物から単離した。
【０４１１】
１価aＫＬＨ１２０．６κＬＣ−ＳｈＫ［２−３５、Ｑ１６Ｋ］融合物。１価aＫＬＨ１２０．６κＬＣ−ＳｈＫ［２−３５、Ｑ１６Ｋ］融合抗体の成分（図１Ｊに図解）は以下の単量体を含有した。
（ａ）aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＨＣ（配列番号２９）；
（ｂ）aＫＬＨ１２０．６κＬＣ（配列番号２８）；および
（ｃ）以下の配列を有するaＫＬＨ１２０．６κＬＣ−ＳｈＫ［２−３５、Ｑ１６Ｋ］融合物：
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＲＮＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＲＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＨＮＳＹＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＫＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣ／／（配列番号２６８）。
１価aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＬＣ−ＳｈＫ［２−３５、Ｑ１６Ｋ］生成物のこの実施形態は、図１Ｊに示すように、１本の軽鎖のＣ末端に融合したＳｈＫペプチドを有する完全抗体であった。１種類の重鎖を共有する２つの異なる軽鎖を含み、軽鎖：重鎖：軽鎖−ＳｈＫ［２−３５、Ｑ１６Ｋ］の比率は１：２：１であった。予期した発現生成物は、aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２、１価aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＬＣ−ＳｈＫ［２−３５、Ｑ１６Ｋ］、および２価aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＬＣ−ＳｈＫ［２−３５、Ｑ１６Ｋ］である。本明細書に記載のとおり、抗体を含む１価aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＬＣ毒素ペプチド融合物を陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて混合物から単離した。
【０４１２】
２価aＫＬＨ１２０．６κＬＣ−ＳｈＫ［１−３５、Ｑ１６Ｋ］融合物。２価aＫＬＨ１２０．６κＬＣ−ＳｈＫ［１−３５、Ｑ１６Ｋ］融合抗体の成分（図１Ｋに図解）は以下の単量体を含有した。
（ａ）aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＨＣ（配列番号２９）；および
（ｂ）上記のaＫＬＨ１２０．６κＬＣ−ＳｈＫ［１−３５、Ｑ１６Ｋ］融合物（配列番号２６７）。
２価aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＬＣ−ＳｈＫ［１−３５、Ｑ１６Ｋ］抗体生成物のこの実施形態は、図１Ｋに示すように、両軽鎖のＣ末端に融合したＳｈＫペプチドを有する完全抗体であった。重鎖：軽鎖−ＳｈＫ［１−３５、Ｑ１６Ｋ］の比率は１：１であった。予期した発現生成物は、２価aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＬＣ−ＳｈＫ［１−３５、Ｑ１６Ｋ］である。本明細書に記載のとおり、抗体分子を含む２価aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＬＣ−ＳｈＫ［１−３５、Ｑ１６Ｋ］ペプチド融合物を陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて混合物から単離した。
【０４１３】
２価aＫＬＨ１２０．６κＬＣ−ＳｈＫ［２−３５、Ｑ１６Ｋ］融合物。２価aＫＬＨ１２０．６κＬＣ−ＳｈＫ［２−３５、Ｑ１６Ｋ］融合抗体の成分（図１Ｋに図解）は以下の単量体を含有した。
（ａ）aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＨＣ（配列番号２９）；および
（ｂ）上記のaＫＬＨ１２０．６κＬＣ−ＳｈＫ［２−３５、Ｑ１６Ｋ］融合物（配列番号２６８）。
２価aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＬＣ−ＳｈＫ［２−３５、Ｑ１６Ｋ］生成物のこの実施形態は、図１Ｋに示すように、両軽鎖のＣ末端に融合したＳｈＫペプチドを有する完全抗体であった。重鎖：軽鎖−ＳｈＫ［２−３５、Ｑ１６Ｋ］の比率は１：１であった。予期した発現生成物は、２価aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＬＣ−ＳｈＫ［２−３５、Ｑ１６Ｋ］抗体である。本明細書に記載のとおり、抗体を含む２価aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＬＣ−ＳｈＫ［２−３５、Ｑ１６Ｋ］毒素融合物を陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて混合物から単離した。
【０４１４】
３価aＫＬＨ１２０．６κＬＣ−ＳｈＫ［１−３５、Ｑ１６Ｋ］融合物。３価aＫＬＨ１２０．６κＬＣ−ＳｈＫ［１−３５、Ｑ１６Ｋ］融合抗体の成分（図１Ｌに図解）は以下の単量体を含有した。
（ａ）aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＨＣ（上記の配列番号２９）；
（ｂ）上記の配列番号３２のアミノ酸を有するaＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＨＣ−Ｓｈｋ［１−３５、Ｑ１６Ｋ］融合物；および
（ｃ）上記の配列番号２６７のアミノ酸配列を有するaＫＬＨ１２０．６κＬＣ−ＳｈＫ［１−３５、Ｑ１６Ｋ］融合物。
３価aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＬＣ−ＳｈＫ生成物のこの実施形態は、図１Ｌに示すように、両軽鎖のＣ末端に融合したＳｈＫ［１−３５、Ｑ１６Ｋ］ペプチドおよび１本の重鎖を有する完全抗体であった。１種類の軽鎖を共有する２つの異なる重鎖を含み、重鎖：軽鎖−ＳｈＫ［１−３５、Ｑ１６Ｋ］：重鎖−ＳｈＫ［１−３５、Ｑ１６Ｋ］の比率は１：２：１であった。予期した発現生成物は２価aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＬＣ−ＳｈＫ［１−３５、Ｑ１６Ｋ］抗体、３価aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＬＣ−ＳｈＫ［１−３５、Ｑ１６Ｋ］抗体、および４価aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＬＣ−ＳｈＫ［１−３５、Ｑ１６Ｋ］抗体であった。本明細書に記載のとおり、抗体分子を含む３価aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＬＣ毒素ペプチド融合物を陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて混合物から単離した。
【０４１５】
３価aＫＬＨ１２０．６κＬＣ−ＳｈＫ［２−３５、Ｑ１６Ｋ］融合物。３価aＫＬＨ１２０．６κＬＣ−ＳｈＫ［２−３５、Ｑ１６Ｋ］融合抗体の成分（図１Ｌに図解）は以下の単量体を含有した。
ａ）aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＨＣ（配列番号２９）；
（ｂ）上記のaＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＨＣ−Ｓｈｋ［２−３５、Ｑ１６Ｋ］融合物（配列番号３３）；および
（ｃ）上記のaＫＬＨ１２０．６κＬＣ−ＳｈＫ［２−３５、Ｑ１６Ｋ］融合物（配列番号２６８）。
３価aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＬＣ−ＳｈＫ［２−３５、Ｑ１６Ｋ］抗体生成物のこの実施形態は、図１Ｌに示すように、両軽鎖のＣ末端に融合したＳｈＫ［２−３５、Ｑ１６Ｋ］ペプチドおよび１本の重鎖を有する完全抗体であった。１種類の軽鎖を共有する２つの異なる重鎖を含み、重鎖：軽鎖−ＳｈＫ［２−３５、Ｑ１６Ｋ］：重鎖−ＳｈＫ［２−３５、Ｑ１６Ｋ］の比率は１：２：１であった。予期した発現生成物は２価aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＬＣ−ＳｈＫ［２−３５、Ｑ１６Ｋ］抗体、３価aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＬＣ−ＳｈＫ［２−３５、Ｑ１６Ｋ］抗体、および４価aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＬＣ−ＳｈＫ［２−３５、Ｑ１６Ｋ］抗体であった。本明細書に記載のとおり、抗体分子を含む３価aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＬＣ毒素ペプチド融合物を陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて混合物から単離した。
【０４１６】
抗ＫＬＨ１２０．６抗体軽鎖哺乳類発現。ＴＲＩｚｏｌ（商標）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて総ＲＮＡを単離するため、ＫＬＨモノクローナル抗体１２０．６を発現するＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（商標）ハイブリドーマを供給源として用いた。伸張接着体５’−ＧＧＣ  ＣＧＧ  ＡＴＡ  ＧＧＣ  ＣＴＣ  ＣＡＮ  ＮＮＮ  ＮＮＴ−３’（配列番号３６）を有する無作為プライマーを用いて第一鎖ｃＤＮＡを合成し、５’ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の急速な増幅）をＧｅｎｅＲａｃｅｒ（登録商標）キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて実施した。軽鎖配列決定において、順行プライマーは５’−ＧＴＧ  ＧＴＴ  ＧＡＧ  ＡＧＧ  ＴＧＣ  ＣＡＧ  ＡＴＧ  ＴＧＡ  ＣＡＴ  ＴＧＴ  ＧＡＴ  ＧＡＣ  ＴＣＡ  ＧＴＣ  ＴＣＣ−３’（配列番号３７）および逆行プライマーは５’−ＡＡＣ  ＣＧＴ  ＴＴＡ  ＡＡＣ  ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＧＣＴ  ＣＡＡ  ＣＡＣ  ＴＣＴ  ＣＣＣ  ＣＴＧ  ＴＴＧ  ＡＡ−３’（配列番号３８）であった。ＲＡＣＥ生成物をｐＣＲ４−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化して配列を決定した。候補フレームワークおよびシグナルペプチド配列を決定するためにコンセンサス配列を用い、完全長の抗体鎖ＰＣＲ増幅のためのプライマーを設計する。
【０４１７】
抗ＫＬＨ１２０．６κ軽鎖の発現クローンをＰＣＲにより調製した。５’ＰＣＲプライマーはシグナル配列のアミノ末端、ＳａｌＩ制限酵素部位、および至適化Ｋｏｚａｋ配列５’−ＡＡＧ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＧＴＣ  ＧＡＣ  ＴＡＧ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＧＡＣ  ＡＴＧ  ＡＧＧ  ＧＴＣ  ＣＣＣ  Ｇ−３’（配列番号３９）をコードした。３’プライマーはカルボキシル末端および終止コドン、ならびにＮｏｔＩ制限部位５’−ＡＡＣ  ＣＧＴ  ＴＴＡ  ＡＡＣ  ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＧＣＴ  ＣＡＡ  ＣＡＣ  ＴＣＴ  ＣＣＣ  ＣＴＧ  ＴＴＧ  ＡＡ−３’（配列番号３８）をコードした。生成物をｐＣＲ４−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にクローン化して、配列を決定した。挿入物を確認後、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯ生成物をＳａｌＩおよびＮｏｔＩにより切断し、挿入物をゲル単離およびＱｉａｇｅｎ精製してから、哺乳類発現ベクターｐＴＴ５中に結紮した。
【０４１８】
ハイブリドーマに由来する天然ペプチドからシグナルペプチドをＶＫ１／Ｏ１２ペプチドに変化させるＰＣＲを行った。ＶＫ１／Ｏ１２断片のために用いたプライマーは５’  ＡＡＧ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＧＴＣ  ＧＡＣ  ＴＡＧ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＧＡＣ  ＡＴＧ  ＡＧＧ  ＧＴＧ  ＣＣＣ  ＧＣＴ  ３’（配列番号４０）および５’−ＴＣＡ  ＴＣＴ  ＧＧＡ  ＴＧＴ  ＣＡＣ  ＡＴＣ  ＴＧＧ  ＣＡＣ  Ｃ−３’（配列番号４１）であった。成熟軽鎖ペプチドのために用いたプライマーは５’−ＧＧＴ  ＧＣＣ  ＡＧＡ  ＴＧＴ  ＧＡＣ  ＡＴＣ  ＣＡＧ  ＡＴＧ  Ａ−３’（配列番号４２）および（配列番号３８）であった。プライマー（配列番号４０）および（配列番号３８）を用いた重複ＰＣＲにより生成断片を結合した。生成クローン配列は以下の免疫グロブリンκＬＣ配列：
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＲＮＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＲＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＨＮＳＹＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ／／（配列番号２８）をコードする。
【０４１９】
抗ＫＬＨ１２０．６抗体軽鎖−ＳｈＫペプチドアナログ哺乳類発現。上記のとおり、ｐＴＴ１４−ｈｕＩｇＧ２−Ｆｃ  ＳｈＫ［１−３５、Ｑ１６Ｋ］コード（配列番号２６）を鋳型として用いて、以下のオリゴ：
５’−ＡＡＣ  ＡＧＧ  ＧＧＡ  ＧＡＧ  ＴＧＴ  ＧＧＡ  ＧＧＡ  ＧＧＡ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＧＧＡ  Ｇ−３’（配列番号２６９）；および
５’−ＣＡＴ  ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＧＣＴ  ＣＡＴ  ＴＡＧ  ＣＡＧ  Ｇ−３’（配列番号２７０）
を用いてＰＣＲによりＳｈｋ［１−３５、Ｑ１６Ｋ］断片を生成した。
【０４２０】
次いで軽鎖断片およびＳｈＫ  ＰＣＲ生成物を外プライマーＣＡＴ  ＴＣＴ  ＡＧＡ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＧＡＣ  ＡＴＧ  ＡＧＧ  ＧＴＧ／／（配列番号３４３）および配列番号２７０を用いてＰＣＲにより増幅した。次いでＰＣＲ生成物をＸｂａＩおよびＮｏｔＩにより消化して、ＰＣＲクリーンアップキット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。同時に、ｐＹＤ１６をＸｂａＩおよびＮｏｔＩにより切断した。ｐＹＤ１６ベクターを１％アガロースゲル上に流して、大型断片を切断し、ＱｉａｇｅｎのＧｅｌ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキットによりゲル精製した。精製したＰＣＲ生成物を大型ベクター断片と結紮して、ＯｎｅＳｈｏｔ  Ｔｏｐ１０細菌に形質転換した。形質転換細菌コロニーからＤＮＡを単離し、ＸｂａＩおよびＮｏｔＩ制限酵素による消化に供して、１％アガロースゲル上で分解した。予期したパターンに至るＤＮＡを配列決定用に提出した。いくつかのクローン配列分析において上記配列と１００％適合したが、１クローンのみを大規模プラスミド精製用に選択した。最終ｐＹＤ１６−aＫＬＨ１２０．６−ＶＫ１ＳＰ−ＬＣ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５、Ｑ１６Ｋ］構築物はaＫＬＨ１２０．６ＬＣ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５、Ｑ１６Ｋ］融合ポリペプチド（配列番号２６７）をコードした。
【０４２１】
上記のとおりｐＴＴ５−aＫＬＨ１２０．６  ＨＣ−ＳｈＫ［２−３５、Ｑ１６Ｋ］を鋳型として用いて、オリゴヌクレオチドプライマー配列番号２６９および配列番号２７０を用いてＳｈｋ［２−３５、Ｑ１６Ｋ］断片を生成した。
【０４２２】
軽鎖およびＳｈＫ  ＰＣＲ生成物を外プライマー配列番号３４３および配列番号２７０を用いてＰＣＲにより増幅した。次いでＰＣＲ生成物をＸｂａＩおよびＮｏｔＩにより消化して、ＰＣＲクリーンアップキット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。同時に、ｐＹＤ１６をＸｂａＩおよびＮｏｔＩにより切断した。ｐＹＤ１６ベクターを１％アガロースゲル上に流して、大型断片を切断し、ＱｉａｇｅｎのＧｅｌ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキットによりゲル精製した。精製したＰＣＲ生成物を大型ベクター断片と結紮して、ＯｎｅＳｈｏｔ  Ｔｏｐ１０細菌に形質転換した。形質転換細菌コロニーからＤＮＡを単離し、ＸｂａＩおよびＮｏｔＩ制限酵素による消化に供して、１％アガロースゲル上で分解した。予期したパターンに至るＤＮＡを配列決定用に提出した。いくつかのクローン配列分析において上記配列と１００％適合したが、１クローンのみを大規模プラスミド精製用に選択した。最終ｐＹＤ１６−aＫＬＨ１２０．６−ＶＫ１ＳＰ−ＬＣ−Ｌ１０−ＳｈＫ［２−３５、Ｑ１６Ｋ］構築物はＩｇＧ２−ＬＣ−Ｌ１０−ＳｈＫ［２−３５、Ｑ１６Ｋ］融合ポリペプチド単量体（配列番号２６８）をコードした。
【０４２３】
哺乳類発現におけるaＫＬＨ−ＩｇＧ２重鎖−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５］およびaＫＬＨ−ＩｇＧ２重鎖−Ｌ１０−ＳｈＫペプチドアナログ。
以下のオリゴ
５’−ＣＡＴ  ＴＣＴ  ＡＧＡ  ＣＣＣ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＧＡＣ  ＡＴＧ  ＡＧＧ  ＧＴＧ−３’（配列番号４３）；および
５’−ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＴＣＣ  ＴＣＣ  ＴＣＣ  ＡＣＣ  ＣＧＧ  ＡＧＡ  ＣＡＧ  ＧＧＡ  ＧＡＧ  Ｇ−３’（配列番号４４）
を用いて、
aＫＬＨ１２０．６−ＶＫ１ＳＰ−ＩｇＧ２重鎖（配列番号４６；以下）をコードするコード配列（配列番号４５；以下）を含むｐＴＴ５−aＫＬＨ１２０．６−ＶＫ１ＳＰ−ＩｇＧ２重鎖（ＨＣ）構築物からaＫＬＨ−ＩｇＧ２−重鎖領域をＰＣＲにより増幅した：
ＡＴＧＧＡＣＡＴＧＡＧＧＧＴＧＣＣＣＧＣＴＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧＧＧＣＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧＣＴＧＡＧＡＧＧＴＧＣＣＡＧＡＴＧＴＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＧＴＣＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＡＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＧＧＣＴＡＣＣＡＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＡＧＧＧＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＴＣＡＡＣＣＣＴＡＡＣＡＧＴＧＧＴＧＧＣＡＣＡＡＡＣＴＡＴＧＣＡＣＡＧＡＡＧＴＴＴＣＡＧＧＧＣＡＧＧＧＴＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＡＧＧＧＡＣＡＣＧＴＣＣＡＴＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＡＧＧＣＴＧＡＧＡＴＣＴＧＡＣＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＡＴＣＧＴＧＧＧＡＧＣＴＡＣＴＡＣＴＧＧＴＴＣＧＡＣＣＣＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＴＣＣＧＡＧＡＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＴＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＡＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＡＣＴＴＣＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＣＧＴＡＧＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＣＡＧＴＴＧＡＧＣＧＣＡＡＡＴＧＴＴＧＴＧＴＣＧＡＧＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＡＣＣＴＧＴＧＧＣＡＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＧＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＣＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＡＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＴＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＴＧＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＡＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＡＣＣＴＣＣＣＡＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴ／／（配列番号４５）、
これはアミノ酸配列
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＨＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲＧＳＹＹＷＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ／／（配列番号４６）をコードする。
【０４２４】
（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＳｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｏｘｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ、ＰＣＴ／米国特許第２００７／０２２８３１号（ＷＯ２００８／０８８４２２号として公開）の実施例１、図１４Ａ〜１４Ｂに記載のように）ＳｈＫ［１−３５］ＷＴ断片をｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＣＭＶｉ中の元のＦｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５］を鋳型として用いて、以下のオリゴ：
５’−ＴＣＣ  ＣＴＧ  ＴＣＴ  ＣＣＧ  ＧＧＴ  ＧＧＡ  ＧＧＡ  ＧＧＡ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＧＧＡ  Ｇ−３’（配列番号４７）；および５’−ＣＡＴ  ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＧＣＴ  ＣＡＴ  ＴＡＧ  ＣＡＧ  ＧＴＧ−３’（配列番号１４）を用いて生成した。ＰＣＲ生成物を１％アガロースゲル上に流した。バンドにアガロースプラグ用の穴を開けてプラグを新しいＰＣＲ反応管に入れた。次いで外プライマー配列番号３５７および配列番号３３０を用いてＰＣＲによりアガロースプラグを増幅した。次いでＰＣＲ生成物をＸｂａＩおよびＮｏｔＩにより消化して、ＰＣＲクリーンアップキット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。同時に、ｐＴＴ５ベクター（ＣＭＶプロモーターおよびＰｏｌｙ  Ａ  ｔａｉｌを含むＡｍｇｅｎベクター）をＸｂａＩおよびＮｏｔＩにより切断した。ｐＴＴ５ベクターを１％アガロースゲル上に流して、大型断片を切断し、ＱｉａｇｅｎのＧｅｌ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキットによりゲル精製した。精製したＰＣＲ生成物を大型ベクター断片と結紮して、ＯｎｅＳｈｏｔ  Ｔｏｐ１０細菌に形質転換した。形質転換細菌コロニーからＤＮＡを単離し、ＸｂａＩおよびＮｏｔＩ制限酵素による消化に供して、１％アガロースゲル上で分解した。予期したパターンに至るＤＮＡを配列決定用に提出した。いくつかのクローン配列分析において上記配列と１００％適合したが、１クローンのみを大規模プラスミド精製用に選択した。最終ｐＴＴ５−aＫＬＨ１２０．６−ＶＫ１ＳＰ−ＩｇＧ２−ＨＣ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５］構築物はアミノ酸配列：
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＨＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲＧＳＹＹＷＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＲＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＱＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣ／／（配列番号４８）
とのＩｇＧ２−ＨＣ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５］融合ポリペプチドをコードした。
【０４２５】
この構築物のＳｈＫ［１−３５、Ｑ１６Ｋ］変異型を産生するため、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｍｕｌｔｉ  ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ｃａｔ＃２００５３１）を製造業者の説明書に従いつつ用いて、ならびにオリゴ：
５’−ＧＣＴ  ＧＣＡ  ＣＣＧ  ＣＣＴ  ＴＣＡ  ＡＧＴ  ＧＣＡ  ＡＧＣ  ＡＣＡ  ＧＣ  ３’（配列番号９）；および
５’−ＧＣＴ  ＧＴＧ  ＣＴＴ  ＧＣＡ  ＣＴＴ  ＧＡＡ  ＧＧＣ  ＧＧＴ  ＧＣＡ  ＧＣ−３’（配列番号１０）
を用いて部位指向変異を実施した。最終構築物ｐＴＴ５−aＫＬＨ１２０．６−ＶＫ１ＳＰ−ＩｇＧ２−ＨＣ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５、Ｑ１６Ｋ］はアミノ酸配列：
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＨＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲＧＳＹＹＷＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＲＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＫＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣ／／（配列番号４９）
とのＩｇＧ２−ＨＣ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５、Ｑ１６Ｋ］融合ポリペプチドをコードした。
【０４２６】
aＫＬＨ−ＩｇＧ２重鎖−Ｌ１０−ＳｈＫ［２−３５、Ｑ１６Ｋ］哺乳類発現。ＤＮＡ構築物ｐＴＴ５−aＫＬＨ１２０．６−ＶＫ１ＳＰ−ＩｇＧ２−ＨＣ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５］をベクターとして用いて、ＳｈＫ［１−３５］をＢａｍＨＩ／ＢａｍＨＩを用いて切断した。ＳｈＫ［１−３５］非含有ｐＴＴ５−aＫＬＨ１２０．６−ＶＫ１ＳＰ−ＩｇＧ２−ＨＣ由来のベクター断片は、アミノ酸配列
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＨＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲＧＳＹＹＷＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧ／／（配列番号５１）をコードするコード配列：
ＡＴＧＧＡＣＡＴＧＡＧＧＧＴＧＣＣＣＧＣＴＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧＧＧＣＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧＣＴＧＡＧＡＧＧＴＧＣＣＡＧＡＴＧＴＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＧＴＣＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＡＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＧＧＣＴＡＣＣＡＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＡＧＧＧＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＴＣＡＡＣＣＣＴＡＡＣＡＧＴＧＧＴＧＧＣＡＣＡＡＡＣＴＡＴＧＣＡＣＡＧＡＡＧＴＴＴＣＡＧＧＧＣＡＧＧＧＴＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＡＧＧＧＡＣＡＣＧＴＣＣＡＴＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＡＧＧＣＴＧＡＧＡＴＣＴＧＡＣＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＡＴＣＧＴＧＧＧＡＧＣＴＡＣＴＡＣＴＧＧＴＴＣＧＡＣＣＣＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＴＣＣＧＡＧＡＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＴＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＡＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＡＣＴＴＣＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＣＧＴＡＧＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＣＡＧＴＴＧＡＧＣＧＣＡＡＡＴＧＴＴＧＴＧＴＣＧＡＧＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＡＣＣＴＧＴＧＧＣＡＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＧＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＣＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＡＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＴＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＴＧＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＡＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＡＣＣＴＣＣＣＡＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴＧＧＡＧＧＡＧＧＡ／／（配列番号５０）を含有した。次いでベクター断片をＣａｌｆ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＣＩＰ）で処理して５’リン酸基を除去し、フェノール／クロロホルムを抽出してベクター自体の再結紮を防止した。挿入物はＩｇＧ２  Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（２−３５、Ｑ１６Ｋ）をコードするｐＴＴ１４−ＶＨ２１ＳＰ−ＩｇＧ２−Ｆｃ−ＳｈＫ［２−３５、Ｑ１６Ｋ］に由来した：
ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳＥＲＫＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＫＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣ／／（配列番号１８）、
また、挿入物はＢａｍＨＩ／ＢａｍＨＩを用いて消化もさせた。挿入ＳｈＫ［２−３５、Ｑ１６Ｋ］断片をそのベクターからゲル精製して、ＱｉａｇｅｎのＧｅｌ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキットでクリーンアップした。精製したＤＮＡ挿入物は、アミノ酸配列ＧＳＧＧＧＧＳＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＫＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣ（配列番号５３）をコードするコード配列ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＧＧＡ  ＧＧＡ  ＧＧＡ  ＧＧＡ  ＡＧＣ  ＡＧＣ  ＴＧＣ  ＡＴＣ  ＧＡＣ  ＡＣＣ  ＡＴＣ  ＣＣＣ  ＡＡＧ  ＡＧＣ  ＣＧＣ  ＴＧＣ  ＡＣＣ  ＧＣＣ  ＴＴＣ  ＡＡＧ  ＴＧＣ  ＡＡＧ  ＣＡＣ  ＡＧＣ  ＡＴＧ  ＡＡＧ  ＴＡＣ  ＣＧＣ  ＣＴＧ  ＡＧＣ  ＴＴＣ  ＴＧＣ  ＣＧＣ  ＡＡＧ  ＡＣＣ  ＴＧＣ  ＧＧＣ  ＡＣＣ  ＴＧＣ  ＴＡＡ  ＴＧＡ／／（配列番号５２）を含み、大型ベクター断片と結紮して、ＯｎｅＳｈｏｔ  Ｔｏｐ１０細菌に形質転換した。形質転換細菌コロニーからＤＮＡを単離し、ＢａｍＨＩ制限酵素による消化に供して、１％アガロースゲル上で分解した。予期したパターンに至るＤＮＡを配列決定用に提出した。いくつかのクローン配列分析において上記配列と１００％適合したが、１クローンのみを大規模プラスミド精製用に選択した。最終構築物ｐＴＴ５−aＫＬＨ−ＩｇＧ２  ＨＣ−Ｌ１０−ＳｈＫ［２−３５、Ｑ１６Ｋ］はＩｇＧ２  ＨＣ−Ｌ１０−ＳｈＫ［２−３５、Ｑ１６Ｋ］融合ポリペプチド：
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＨＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲＧＳＹＹＷＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＫＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣ／／（配列番号５４）をコードした。
【０４２７】
Ｓｈｋ［１−３５、Ｒ１Ａ、Ｉ４Ａ、Ｑ１６Ｋ］断片をｐＴＴ５−aＫＬＨ１２０．６−ＶＫ１ＳＰ−ＩｇＧ２−ＨＣ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５  Ｑ１６Ｋ］を鋳型として用いて、以下のオリゴ：
５’−ＡＧＧ  ＡＧＧ  ＡＧＧ  ＡＡＧ  ＣＧＣ  ＣＡＧ  ＣＴＧ  ＣＧＣ  ＣＧＡ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＣＣＣ  Ｃ−３’／／（配列番号３１０）；および
５’−ＧＧＧ  ＧＡＴ  ＧＧＴ  ＧＴＣ  ＧＧＣ  ＧＣＡ  ＧＣＴ  ＧＧＣ  ＧＣＴ  ＴＣＣ  ＴＣＣ  ＴＣＣ  Ｔ−３’／／（配列番号３１１）
を用いて生成した。
Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｍｕｌｔｉ  ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキットを製造業者の説明書に従いつつ用いて部位指向変異を実施した。最終ｐＴＴ５−aＫＬＨ１２０．６−ＶＫ１ＳＰ−ＩｇＧ２−ＨＣ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５  Ｒ１Ａ、Ｉ４Ａ、Ｑ１６Ｋ］構築物はＩｇＧ２−ＨＣ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５、Ｒ１Ａ、Ｉ４Ａ、Ｑ１６Ｋ］融合ポリペプチド（配列番号３０４）をコードした。
【０４２８】
以下の４つのオリゴ：
５’−ＧＡＧ  ＧＡＧ  ＧＡＧ  ＧＡＡ  ＧＣＧ  ＣＣＡ  ＧＣＴ  ＧＣＡ  ＴＣＧ  ＡＣＡ−３’／／（配列番号３１２）；
５’−ＧＡＧ  ＣＴＴ  ＣＴＧ  ＣＣＧ  ＣＧＡ  ＧＡＣ  ＣＴＧ  ＣＧＧ  ＣＡＣ−３’／／（配列番号３１３）；
５’−ＣＧＡ  ＴＧＣ  ＡＧＣ  ＴＧＧ  ＣＧＣ  ＴＴＣ  ＣＴＣ  ＣＴＣ  ＣＴＣ−３’／／（配列番号３１４）；および
５’−ＧＴＧ  ＣＣＧ  ＣＡＧ  ＧＴＣ  ＴＣＧ  ＣＧＧ  ＣＡＧ  ＡＡＧ  ＣＴＣ−３’／／（配列番号３１５）
を用いて上記のとおりＳｈｋ［１−３５、Ｒ１Ａ、Ｑ１６Ｋ、Ｋ３０Ｅ］断片を生成した。
最終ｐＴＴ５−aＫＬＨ１２０．６−ＶＫ１ＳＰ−ＩｇＧ２−ＨＣ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５  Ｒ１Ａ、Ｑ１６Ｋ、Ｋ３０Ｅ］構築物はＩｇＧ２−ＨＣ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５、Ｒ１Ａ、Ｑ１６Ｋ、Ｋ３０Ｅ］融合ポリペプチド（配列番号３０５）をコードした。
【０４２９】
ｐＴＴ５−aＫＬＨ１２０．６−ＶＫ１ＳＰ−ＩｇＧ２−ＨＣ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５  Ｑ１６Ｋ］を鋳型として用いて、以下のオリゴ：
５’−ＧＧＡ  ＧＧＡ  ＧＧＡ  ＡＧＣ  ＣＡＣ  ＡＧＣ  ＴＧＣ  ＧＣＣ  ＧＡＣ  ＡＣＣ  ＡＴＣ  ＣＣＣ−３’／／（配列番号３１６）；および
５’−ＧＧＧ  ＧＡＴ  ＧＧＴ  ＧＴＣ  ＧＧＣ  ＧＣＡ  ＧＣＴ  ＧＴＧ  ＧＣＴ  ＴＣＣ  ＴＣＣ  ＴＣＣ−３’／／（配列番号３１７）
を用いてＳｈＫ［１−３５、Ｒ１Ｈ、Ｉ４Ａ、Ｑ１６Ｋ］断片を生成した。
Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｍｕｌｔｉ  ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ｃａｔ＃２００５３１）を製造業者の説明書に従いつつ用いて部位指向変異を実施した。最終ｐＴＴ５−aＫＬＨ１２０．６−ＶＫ１ＳＰ−ＩｇＧ２−ＨＣ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５  Ｒ１Ｈ、Ｉ４Ａ、Ｑ１６Ｋ］構築物はＩｇＧ２−ＨＣ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５、Ｒ１Ｈ、Ｉ４Ａ、Ｑ１６Ｋ］融合ポリペプチド（配列番号３０６）をコードした。
【０４３０】
以下の４つのオリゴ：
５’−ＧＧＡ  ＧＧＡ  ＧＧＡ  ＡＧＣ  ＣＡＣ  ＡＧＣ  ＴＧＣ  ＡＴＣ  ＧＡＣ−３’／／（配列番号３１８）および配列番号３１３；
５’−ＧＴＣ  ＧＡＴ  ＧＣＡ  ＧＣＴ  ＧＴＧ  ＧＣＴ  ＴＣＣ  ＴＣＣ  ＴＣＣ−３’／／（配列番号３１９）および配列番号３１５を用いて上記のとおりＳｈｋ［１−３５、Ｒ１Ｈ、Ｑ１６Ｋ、Ｋ３０Ｅ］断片を生成した。
最終ｐＴＴ５−aＫＬＨ１２０．６−ＶＫ１ＳＰ−ＩｇＧ２−ＨＣ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５  Ｒ１Ｈ、Ｑ１６Ｋ、Ｋ３０Ｅ］構築物はＩｇＧ２−ＨＣ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５、Ｒ１Ｈ、Ｑ１６Ｋ、Ｋ３０Ｅ］融合ポリペプチド（配列番号３０７）をコードした。
【０４３１】
ｐＴＴ５−aＫＬＨ１２０．６−ＶＫ１ＳＰ−ＩｇＧ２−ＨＣ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５  Ｑ１６Ｋ］を鋳型として用いて、以下のオリゴ：
５’−ＣＣＧ  ＧＡＧ  ＧＡＧ  ＧＡＧ  ＧＡＡ  ＧＣＡ  ＡＧＡ  ＧＣＴ  ＧＣＧ  ＣＣＧ  ＡＣＡ  ＣＣＡ  ＴＣＣ  ＣＣＡ  ＡＧＡ−３’／／（配列番号３２０）；および
５’−ＴＣＴ  ＴＧＧ  ＧＧＡ  ＴＧＧ  ＴＧＴ  ＣＧＧ  ＣＧＣ  ＡＧＣ  ＴＣＴ  ＴＧＣ  ＴＴＣ  ＣＴＣ  ＣＴＣ  ＣＴＣ  ＣＧＧ−３’／／（配列番号３２１）
を用いてＳｈｋ［１−３５、Ｒ１Ｋ、Ｉ４Ａ、Ｑ１６Ｋ］断片を生成した。
Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｍｕｌｔｉ  ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ｃａｔ＃２００５３１）を製造業者の説明書に従いつつ用いて部位指向変異を実施した。最終ｐＴＴ５−aＫＬＨ１２０．６−ＶＫ１ＳＰ−ＩｇＧ２−ＨＣ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５  Ｒ１Ｋ、Ｉ４Ａ、Ｑ１６Ｋ］構築物はＩｇＧ２−ＨＣ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５、Ｒ１Ｋ、Ｉ４Ａ、Ｑ１６Ｋ］融合ポリペプチド（配列番号３０８）をコードした。
【０４３２】
以下の４つのオリゴ：
５’−ＣＧＧ  ＡＧＧ  ＡＧＧ  ＡＧＧ  ＡＡＧ  ＣＡＡ  ＧＡＧ  ＣＴＧ  ＣＡＴ  ＣＧＡ  ＣＡＣ  ＣＡ  −３’／／（配列番号３２２）および配列番号３１３；
５’−ＴＧＧ  ＴＧＴ  ＣＧＡ  ＴＧＣ  ＡＧＣ  ＴＣＴ  ＴＧＣ  ＴＴＣ  ＣＴＣ  ＣＴＣ  ＣＴＣ  ＣＧ  −３’／／（配列番号３２３）および配列番号３１５を用いてＳｈｋ［１−３５、Ｒ１Ｋ、Ｑ１６Ｋ、Ｋ３０Ｅ］断片を上記のとおり生成した。
最終ｐＴＴ５−aＫＬＨ１２０．６−ＶＫ１ＳＰ−ＩｇＧ２−ＨＣ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５  Ｒ１Ｈ、Ｑ１６Ｋ、Ｋ３０Ｅ］構築物はＩｇＧ２−ＨＣ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５、Ｒ１Ｋ、Ｑ１６Ｋ、Ｋ３０Ｅ］融合ポリペプチド（配列番号３０９）をコードした。
【０４３３】
１価Ａｂ  ＨＣ−ならびに１価、２価および３価Ａｂ  ＬＣ毒素ペプチドアナログ融合物の単離方法。タンパク質Ａセファロース（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたＦｃ領域の親和性高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）捕獲、続いて２価陽イオンを含まないダルベッコのＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によるカラム洗浄および１００ｍＭ酢酸（ｐＨ３．５）を２．５ｃｍ／分で流した溶出工程により条件培地の初回精製を行った。タンパク質を含む留分をプールし、１０Ｎ  ＮａＯＨを用いてｐＨを５．０に調整し、５容量の水でさらに希釈した。物質を０．４５μｍ酢酸セルロースフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を介してろ過し、陽イオン交換ＦＰＬＣ（ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ；  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によりさらに精製した。試料を１００％緩衝液Ａ（５０ｍＭ酢酸、ｐＨ５．０）で平衡させたカラム上に負荷し、勾配０〜８０％緩衝液Ｂ（５０ｍＭ酢酸、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．０）３０カラム容量、流速１．５ｃｍ／分で溶出した。ピークを含む標的種をプールして、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、９％ショ糖（ｐＨ５．０）中に製剤化した。１価、２価および３価の免疫グロブリン毒素ペプチドアナログ融合タンパク質の精製例を図２４〜２６Ａ〜Ｂ、２７〜２９Ａ〜Ｂ、３０〜３２Ａ〜Ｂ、および３３〜３５に示す。非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（図２４、２８、３０および３３）により、完全に組み立てられた抗体が形成され得ることが示され、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により所望の成分が存在することが示される。サイズ排除クロマトグラム（図２５、２８、３１および３４）により、精製した生成物の大部分が所望の非凝集状態にあることが示される。最終的に、質量スペクトル分析（図２６Ａ〜Ｂ、２９Ａ〜Ｂ、３２Ａ〜Ｂおよび３５）により、所望の融合生成物が存在することが示される。まとめると、これらの例により、aＫＬＨ１２０．６抗体は少なくとも１〜８個の薬理学的に活性なポリペプチド部分の偶数または奇数価を含む種などの多種多様の配置における融合が許容可能であることが示される。
【０４３４】
ＶＨ２１ＳＰ−Ｎ末端ＳｈＫ［１−３５］野生型−ＩｇＧ１−Ｆｃ哺乳類発現。ヒトＩｇＧ１のＮ末端Ｆｃ領域にインフレーム融合させたＫｖ１．３阻害剤ペプチドＳｈＫ［１−３５］の単量体をコードするＤＮＡ配列を下記のとおり構築した。
【０４３５】
ＶＨ２１ＳＰ−ＳｈＫ（１−３５）−Ｌ１０−ＩｇＧ１  Ｆｃ発現ベクターの構築のため、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ制限部位に挟まれた４つのグリシンと１つのセリンアミノ酸に結合したＶＨ２１シグナルペプチドＳｈＫ（１−３５）遺伝子を産生し、ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ制限部位に挟まれたＩｇＧ１  Ｆｃ断片に結合した４つのグリシンと１つのセリンアミノ酸を、ＰＣＲ反応においてｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＣＭＶｉ中のＦｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１を鋳型として用いて生成するＰＣＲ戦略を用いた（参照により組み込まれるＳｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．、ＷＯ２００８／０８８４２２Ａ２号の実施例４１および図４２Ａ〜Ｂに記載）。
【０４３６】
ＶＨ２１ＳＰ−ＳｈＫ（１−３５）−Ｇ４Ｓを産生するため、以下に示す配列と２つのオリゴを、ＰｆｕＴｕｒｂｏ  ＨｏｔＳｔａｒｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で、９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７５℃で４５秒の３５サイクルＰＣＲ反応に用いた；ＨｉｎｄＩＩＩ（ａａｇｃｔｔ）およびＢａｍＨＩ（ｇｇａｔｃｃ）制限部位は下線部分である：
順行プライマー：
ＴＧＣＡＧＡＡＧＣＴＴＣＴＡＧＡＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＡＴＧＧＡＧＣＴＧＧＧＴＣＴＴＴＣＴＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＣＡＧＴＡＡＣＧＡＣＴＧＧＴＧＴＣＣＡＣＴＣＣＣＧＣＡＧＣＴＧＣＡＴＣＧＡＣＡＣＣＡＴＣＣＣＣＡＡＧＡＧＣＣＧＣＴＧＣＡＣＣＧＣＣＴＴＣＣＡＧＴ／／（配列番号５５）；および
逆行プライマー：
ＣＴＣＣＧＧＡＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＧＣＡＧＧＴＧＣＣＧＣＡＧＧＴＣＴＴＧＣＧＧＣＡＧＡＡＧＣＴＣＡＧＧＣＧＧＴＡＣＴＴＣＡＴＧＣＴＧＴＧＣＴＴＧＣＡＣＴＧＧＡＡＧＧＣＧＧＴＧＣＡＧＣＧＧＣＴＣＴＴＧＧＧＧＡＴＧＧＴＧＴＣＧＡＴ／／（配列番号５６）。
【０４３７】
生成したＰＣＲ生成物を２％アガロースゲル上で２０２ｂｐバンドとして分解した。２０２ｂｐ  ＰＣＲ生成物をＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製してから、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ（Ｒｏｃｈｅ）制限酵素で消化し、アガロースゲルをＧｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）により精製した。
【０４３８】
Ｇ４Ｓ−ＩｇＧ１  Ｆｃを産生するため、以下に示す配列と２つのオリゴを、ＰｆｕＴｕｒｂｏ  ＨｏｔＳｔａｒｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で、９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７５℃で１分の３０サイクルＰＣＲ反応に用いた；ＢａｍＨＩ（ｇｇａｔｃｃ）およびＮｏｔＩ（ｇｃｇｇｃｃｇｃ）制限部位は下線部分である：
順行プライマー：
ＧＴＡＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＣＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣ／／（配列番号５７）；および
逆行プライマー：
ＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＣＴＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡ／／（配列番号５８）。
【０４３９】
生成したＰＣＲ生成物を１％アガロースゲル上で７２１ｂｐバンドとして分解した。７２１ｂｐ  ＰＣＲ生成物をＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製してから、ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ（Ｒｏｃｈｅ）制限酵素で消化し、アガロースゲルをＧｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）により精製した。
【０４４０】
ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＣＭＶｉ−Ｆｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１ベクターをＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ制限酵素で消化し、大型断片をＧｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキットにより精製した。ゲル精製した４ＧＳ−ＩｇＧ１  Ｆｃ断片を精製した大型断片と結紮して、Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（商標）Ｔｏｐ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換してｐＣＭＶｉ−Ｆｃ−Ｌ１０−ＩｇＧ１  Ｆｃベクターを作製した。続いて、ｐＣＭＶｉ−Ｆｃ−Ｌ１０−ＩｇＧ１  ＦｃベクターをＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素で消化し、大型断片をＧｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキットにより精製した。ゲル精製したＶＨ２１ＳＰ−ＳｈＫ（１−３５）−４ＧＳ断片を精製した大型断片と結紮して、Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（商標）Ｔｏｐ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換し、ｐＣＭＶｉ−ＶＨ２１ＳＰ−ＳｈＫ（１−３５）−Ｌ１０−ＩｇＧ１  Ｆｃ構築物において生成した。形質転換細菌コロニーからＤＮＡを単離し、ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ制限酵素で消化し、１％アガロースゲル上で分解した。予期したパターンに至るＤＮＡを配列決定用に提出した。いくつかのクローン配列分析において上記配列と１００％適合したが、各遺伝子から１クローンのみを大規模プラスミド精製用に選択した。ｐＣＭＶｉベクター中のＶＨ２１ＳＰ−ＳｈＫ（１−３５）−Ｌ１０−ＩｇＧ１  ＦｃからＤＮＡを再編成して、Ｆｃおよびリンカー領域ならびに配列が上記配列と１００％同一であったことを確認した。断片ＶＨ２１ＳＰ−ＳｈＫ（１−３５）−Ｌ１０−ＩｇＧ１  Ｆｃは、ＶＨ２１ＳＰ−ＳｈＫ（１−３５）−Ｌ１０−ＩｇＧ１  Ｆｃアミノ酸配列
ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳＲＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＱＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ／／（配列番号６０）をコードするコード配列
ＡＴＧＧＡＡＴＧＧＡＧＣＴＧＧＧＴＣＴＴＴＣＴＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＣＡＧＴＡＡＣＧＡＣＴＧＧＴＧＴＣＣＡＣＴＣＣＣＧＣＡＧＣＴＧＣＡＴＣＧＡＣＡＣＣＡＴＣＣＣＣＡＡＧＡＧＣＣＧＣＴＧＣＡＣＣＧＣＣＴＴＣＣＡＧＴＧＣＡＡＧＣＡＣＡＧＣＡＴＧＡＡＧＴＡＣＣＧＣＣＴＧＡＧＣＴＴＣＴＧＣＣＧＣＡＡＧＡＣＣＴＧＣＧＧＣＡＣＣＴＧＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＣＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴＡＡＡＴＡＧＴＡＡ／／（配列番号５９）を含有した。
【０４４１】
Ｎ末端ＳｈＫ［１−３５、Ｑ１６Ｋ］−aＫＬＨ  ＨＣ；およびＮ末端ＳｈＫ［１−３５Ｑ１６Ｋ］−aＫＬＨ  ＬＣの哺乳類発現。Ｎ末端ＳｈＫ［１−３５］野生型−Ｌ１０−ＩｇＧ１−Ｆｃをコードする構築物を用いて、以下のオリゴ：
５’−ＧＣＴ  ＧＣＡ  ＣＣＧ  ＣＣＴ  ＴＣＡ  ＡＧＴ  ＧＣＡ  ＡＧＣ  ＡＣＡ  ＧＣ−３’／／（配列番号９）；および
５’−ＧＣＴ  ＧＴＧ  ＣＴＴ  ＧＣＡ  ＣＴＴ  ＧＡＡ  ＧＧＣ  ＧＧＴ  ＧＣＡ  ＧＣ−３’（配列番号１０）
を用いる部位指向変異を実施してＳｈＫ領域にＱ１６Ｋ変異を産生した。
Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｍｕｌｔｉ  ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキットを製造業者の説明書に従いつつ用いた。ｐＣＭＶｉ−Ｎ末端−ＳｈＫ［１−３５Ｑ１６Ｋ］−Ｌ１０−ＩｇＧ１−Ｆｃのための最終構築物は、以下のシグナルペプチド（ＶＨ２１ＳＰ）−ＳｈＫ［１−３５、Ｑ１６Ｋ］−Ｌ１０−ＩｇＧ１−Ｆｃ融合ポリペプチド：
ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳＲＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＫＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ／／（配列番号６１）をコードした。
【０４４２】
Ｎ末端ＳｈＫ［１−３５、Ｑ１６Ｋ］−aＫＬＨ  ＨＣ構築物を産生するため、シグナルペプチド−ＳｈＫ［１−３５Ｑ１６Ｋ］−Ｌ１０リンカーを含むＰＣＲ生成物を、以下のオリゴ：
５’−ＣＡＴ  ＴＣＴ  ＡＧＡ  ＣＣＡ  ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＡＡＴ  ＧＧ−３’（配列番号６２）；
５’−ＣＡＧ  ＣＴＧ  ＣＡＣ  ＣＴＧ  ＧＣＴ  ＴＣＣ  ＴＣＣ  ＴＣＣ  ＴＣＣ  ＧＧ−３’（配列番号６３）；
およびｐＣＭＶｉ−Ｎ末端−ＳｈＫ［１−３５、Ｑ１６Ｋ］−Ｌ１０−ＩｇＧ１−Ｆｃ鋳型を用いて産生し、ＶＨ２１ＳＰ−ＳｈＫ（１−３５、Ｑ１６Ｋ）−Ｌ１０アミノ酸配列
ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳＲＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＫＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ／／（配列番号６５）をコードするコード配列
ＡＴＧＧＡＡＴＧＧＡＧＣＴＧＧＧＴＣＴＴＴＣＴＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＣＡＧＴＡＡＣＧＡＣＴＧＧＴＧＴＣＣＡＣＴＣＣＣＧＣＡＧＣＴＧＣＡＴＣＧＡＣＡＣＣＡＴＣＣＣＣＡＡＧＡＧＣＣＧＣＴＧＣＡＣＣＧＣＣＴＴＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＣＡＣＡＧＣＡＴＧＡＡＧＴＡＣＣＧＣＣＴＧＡＧＣＴＴＣＴＧＣＣＧＣＡＡＧＡＣＣＴＧＣＧＧＣＡＣＣＴＧＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＣ／／（配列番号６４）を含む断片を得た。
【０４４３】
aＫＬＨ−ＨＣ断片を産生するため、以下のオリゴ：
５’−ＧＧＡ  ＧＧＡ  ＧＧＡ  ＡＧＣ  ＣＡＧ  ＧＴＧ  ＣＡＧ  ＣＴＧ  ＧＴＧ  ＣＡＧ−３’（配列番号６６）；
５’−ＣＡＴ  ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＧＣＴ  ＣＡＴ  ＴＴＡ  ＣＣＣ−３’（配列番号６７）；
およびｐＴＴ５−aＫＬＨ１２０．６−ＨＣ鋳型を用いてＰＣＲ生成物を作製し、アミノ酸配列
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＨＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲＧＳＹＹＷＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ／／（配列番号６９）をコードするコード配列
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＧＴＣＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＡＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＧＧＣＴＡＣＣＡＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＡＧＧＧＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＴＣＡＡＣＣＣＴＡＡＣＡＧＴＧＧＴＧＧＣＡＣＡＡＡＣＴＡＴＧＣＡＣＡＧＡＡＧＴＴＴＣＡＧＧＧＣＡＧＧＧＴＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＡＧＧＧＡＣＡＣＧＴＣＣＡＴＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＡＧＧＣＴＧＡＧＡＴＣＴＧＡＣＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＡＴＣＧＴＧＧＧＡＧＣＴＡＣＴＡＣＴＧＧＴＴＣＧＡＣＣＣＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＴＣＣＧＡＧＡＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＴＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＡＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＡＣＴＴＣＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＣＧＴＡＧＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＣＡＧＴＴＧＡＧＣＧＣＡＡＡＴＧＴＴＧＴＧＴＣＧＡＧＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＡＣＣＴＧＴＧＧＣＡＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＧＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＣＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＡＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＴＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＴＧＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＡＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＡＣＣＴＣＣＣＡＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴＡＡＡＴＧＡ／／（配列番号６８）を含むＤＮＡ断片を得た。
【０４４４】
２つのＰＣＲ生成物をゲル上に流して、適切なサイズのバンドにアガロースプラグ用の穴を開けた。アガロースプラグを単一の新規ＰＣＲ反応に置き、最も外側のプライマー（配列番号６２）および（配列番号６７）を用いて断片を一緒に縫い合わせた。ＰＣＲ断片をＸｂａＩおよびＮｏｔＩを用いて切断し、ＱｉａｇｅｎのＰＣＲクリーンアップキットでクリーンした。同時に、ｐＴＴ５ベクターもＸｂａＩおよびＮｏｔＩにより切断して、ゲル精製した。精製した挿入物を大型ベクター断片と結紮して、ＯｎｅＳｈｏｔ  Ｔｏｐ１０細菌に形質転換した。形質転換細菌コロニーからＤＮＡを単離し、ＸｂａＩおよびＮｏｔＩ制限酵素による消化に供して、１％アガロースゲル上で分解した。予期したパターンに至るＤＮＡを配列決定用に提出した。いくつかのクローン配列分析において上記配列と１００％適合したが、１クローンのみを大規模プラスミド精製用に選択した。最終構築物ｐＴＴ５−Ｎ末端ＳｈＫ［１−３５Ｑ１６Ｋ］−Ｌ１０−aＫＬＨ１２０．６−ＨＣはＶＨ２１ＳＰ−ＳｈＫ［１−３５、Ｑ１６Ｋ］−Ｌ１０−aＫＬＨ１２０．６−ＨＣ融合ポリペプチド：
ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳＲＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＫＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＨＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲＧＳＹＹＷＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ／／（配列番号７０）をコードした。
【０４４５】
最後に、Ｎ末端−ＳｈＫ［１−３５、Ｑ１６Ｋ］−Ｌ１０−aＫＬＨ１２０．６軽鎖（ＬＣ）を上記と同じ様式において生成した。シグナルペプチド−ＳｈＫ［１−３５、Ｑ１６Ｋ］−Ｌ１０を含むＰＣＲ生成物を、以下のオリゴ：
５’−ＣＡＴ  ＴＣＴ  ＡＧＡ  ＣＣＡ  ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＡＡＴ  ＧＧ−３’（配列番号６２）；および
５’−ＣＡＴ  ＣＴＧ  ＧＡＴ  ＧＴＣ  ＧＣＴ  ＴＣＣ  ＴＣＣ  ＴＣＣ  ＴＣＣ  ＧＧ−３’（配列番号７１）；
ならびにｐＣＭＶｉ−Ｎ末端−ＳｈＫ［１−３５Ｑ１６Ｋ］−Ｌ１０−ＩｇＧ１−Ｆｃ鋳型を用いて作製し、シグナルペプチド（ＶＨ２１ＳＰ）−ＳｈＫ（１−３５、Ｑ１６Ｋ）−Ｌ１０リンカーのためのアミノ酸配列：
ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳＲＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＫＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ／／（配列番号６５）をコードするコード配列
ＡＴＧＧＡＡＴＧＧＡＧＣＴＧＧＧＴＣＴＴＴＣＴＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＣＡＧＴＡＡＣＧＡＣＴＧＧＴＧＴＣＣＡＣＴＣＣＣＧＣＡＧＣＴＧＣＡＴＣＧＡＣＡＣＣＡＴＣＣＣＣＡＡＧＡＧＣＣＧＣＴＧＣＡＣＣＧＣＣＴＴＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＣＡＣＡＧＣＡＴＧＡＡＧＴＡＣＣＧＣＣＴＧＡＧＣＴＴＣＴＧＣＣＧＣＡＡＧＡＣＣＴＧＣＧＧＣＡＣＣＴＧＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＣ／／（配列番号６４）を含むＤＮＡ断片を得た。
鋳型ならびに以下のオリゴ：
５’−ＧＧＡ  ＧＧＡ  ＧＧＡ  ＡＧＣ  ＧＡＣ  ＡＴＣ  ＣＡＧ  ＡＴＧ  ＡＣＣ  ＣＡＧ  ＴＣ−３’（配列番号７２）；および
５’−ＣＡＴ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＣＧＧ  ＣＣＧ  ＣＴＣ  ＡＡＣ−３’（配列番号７３）を用いた。
Ｎ末端シグナルペプチド：
ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳＲＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＫＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＲＮＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＲＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＨＮＳＹＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ／／（配列番号７５）
を有するＮ末端ＶＨ２１ＳＰ−ＳｈＫ［１−３５、Ｑ１６Ｋ］−Ｌ１０−aＫＬＨ１２０．６軽鎖（ＬＣ）のためのアミノ酸配列をコードするコード配列
ＡＴＧＧＡＡＴＧＧＡＧＣＴＧＧＧＴＣＴＴＴＣＴＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＣＡＧＴＡＡＣＧＡＣＴＧＧＴＧＴＣＣＡＣＴＣＣＣＧＣＡＧＣＴＧＣＡＴＣＧＡＣＡＣＣＡＴＣＣＣＣＡＡＧＡＧＣＣＧＣＴＧＣＡＣＣＧＣＣＴＴＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＣＡＣＡＧＣＡＴＧＡＡＧＴＡＣＣＧＣＣＴＧＡＧＣＴＴＣＴＧＣＣＧＣＡＡＧＡＣＣＴＧＣＧＧＣＡＣＣＴＧＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＣＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＴＧＣＣＧＧＧＣＡＡＧＴＣＡＧＧＧＣＡＴＴＡＧＡＡＡＴＧＡＴＴＴＡＧＧＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＣＣＣＣＴＡＡＡＣＧＣＣＴＧＡＴＣＴＡＴＧＣＴＧＣＡＴＣＣＡＧＴＴＴＧＣＡＡＡＧＴＧＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡＡＧＧＴＴＣＡＧＣＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＡＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＡＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＴＡＣＡＧＣＡＴＡＡＴＡＧＴＴＡＣＣＣＧＣＴＣＡＣＴＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡＣＧＡＡＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＴＡＡＣＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＣＧＧＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＴＣＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＡＧＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＴＴＧＡ／／（配列番号７４）を含むクローン化ＰＣＲ断片を生成した。
【０４４６】
コード配列（配列番号６４）を含むＤＮＡ断片）およびコード配列（配列番号７４）を含むaＫＬＨ１２０．６軽鎖ＬＣ断片の両ＰＣＲ断片をゲル上に流し、適切なサイズのバンドにアガロースプラグ用の穴を開けた。アガロースプラグを単一の新規ＰＣＲ反応に置き、最も外側のプライマー（配列番号６２）および（配列番号７３）を用いて断片を一緒に縫い合わせた。生成したＰＣＲ断片をＸｂａＩおよびＮｏｔＩを用いて切断し、ＱｉａｇｅｎのＰＣＲクリーンアップキットでクリーンした。
【０４４７】
同時に、ｐＴＴ１４ベクター（ＣＭＶプロモーター、Ｐｏｌｙ  Ａ  ｔａｉｌおよびピューロマイシン耐性遺伝子を含むＡｍｇｅｎベクター）もＸｂａＩおよびＮｏｔＩにより切断して、ゲル精製した。精製した挿入物を大型ベクター断片と結紮して、ＯｎｅＳｈｏｔ  Ｔｏｐ１０細菌に形質転換した。形質転換細菌コロニーからＤＮＡを単離し、ＸｂａＩおよびＮｏｔＩ制限酵素による消化に供して、１％アガロースゲル上で分解した。予期したパターンに至るＤＮＡを配列決定用に提出した。最終構築物ｐＴＴ１４−Ｎ末端ＳｈＫ［１−３５Ｑ１６Ｋ］−Ｌ１０−aＫＬＨ１２０．６−ＬＣはシグナルペプチド−ＳｈＫ［１−３５、Ｑ１６Ｋ］−Ｌ１０−aＫＬＨ１２０．６−ＬＣ融合ポリペプチド配列（すなわち、配列番号７５）をコードする。
【０４４８】
ａＤＮＰ３Ａ４（Ｗ１０１Ｆ）ＩｇＧ２−Ｓｈｋ［１−３５］の哺乳類発現。
プラスミドｐＴＴ５−ａＤＮＰ３Ａ４（Ｗ１０１Ｆ）ＩｇＧ２−Ｓｈｋ［１−３５Ｑ１６Ｋ］の作製：
Ｋｖ１．３阻害剤毒素ペプチドアナログＳｈＫ［１−３５、Ｑ１６Ｋ］（配列番号７６）の単量体にインフレーム融合させたヒト抗２，４−ジニトロフェニル（ａＤＮＰ）抗体の重鎖をコードするＤＮＡ配列を標準的なクローニング技術を用いて構築した。以下のアミノ酸配列：
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＷＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＹＮＦＮＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ／／（配列番号７７）を有する抗ＤＮＰ  ３Ａ４（Ｗ１０１Ｆ）ＩｇＧ２重鎖の一部（ｐＤＣ３２４：ａＤＮＰ３Ａ４  ＨＣ（Ｗ１０１Ｆ）およびＩｇＧ２Ｆｃ−Ｓｈｋ［１−３５、Ｑ１６Ｋ］の一部にｐＴＴ５ベクターを結紮する３つの方法によりプラスミドｐＴＴ５−ａＤＮＰ３Ａ４（Ｗ１０１Ｆ）ＩｇＧ２−Ｓｈｋ［１−３５、Ｑ１６Ｋ］を生成した。複数のクローニング部位を放出するＳａｌＩ／ＮｏｔＩによりｐＴＴ５ベクターを切断した。次いでベクターをＣａｌｆ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＣＩＰ）で処理して背景を減らした。第一挿入物はｐＤＣ３２４由来であった：ａＤＮＰ３Ａ４  ＨＣ（Ｗ１０１Ｆ）をＳａｌＩ／ＳｔｕＩで切断することにより、アミノ酸配列
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＷＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＹＮＦＮＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧ／／（配列番号７９）をコードするコード配列
ＡＴＧＧＡＣＡＴＧＡＧＧＧＴＧＣＣＣＧＣＴＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧＧＧＣＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧＣＴＧＡＧＡＧＧＴＧＣＧＣＧＣＴＧＴＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＧＴＧＧＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＡＧＧＴＣＣＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＧＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＣＡＧＴＡＧＣＴＡＴＧＧＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＣＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＧＧＣＡＧＴＴＡＴＡＴＧＧＴＡＴＧＡＴＧＧＡＡＧＴＡＡＴＡＡＡＴＡＣＴＡＴＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＴＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＴＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＧＴＡＴＡＡＣＴＴＣＡＡＣＴＡＣＧＧＴＡＴＧＧＡＣＧＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＴＡＧＴＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＴＣＣＧＡＧＡＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＴＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＡＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＡＣＴＴＣＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＣＧＴＡＧＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＣＡＧＴＴＧＡＧＣＧＣＡＡＡＴＧＴＴＧＴＧＴＣＧＡＧＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＡＣＣＴＧＴＧＧＣＡＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＧＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＣＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＡＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＴＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＴＧＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣ／／（配列番号７８）を含むＤＮＡ断片を得た。
第二挿入物をＳｔｕＩ／ＮｏｔＩを用いて消化し、以下の切断されたＩｇＧ２  Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（１−３５、Ｑ１６Ｋ）アミノ酸配列
ＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＲＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＫＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣ／／（配列番号８１）をコードするコード配列
ＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＡＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＡＣＣＴＣＣＣＡＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴＡＡＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＣＣＧＣＡＧＣＴＧＣＡＴＣＧＡＣＡＣＣＡＴＣＣＣＣＡＡＧＡＧＣＣＧＣＴＧＣＡＣＣＧＣＣＴＴＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＣＡＣＡＧＣＡＴＧＡＡＧＴＡＣＣＧＣＣＴＧＡＧＣＴＴＣＴＧＣＣＧＣＡＡＧＡＣＣＴＧＣＧＧＣＡＣＣＴＧＣＴＡＡＴＧＡ／／（配列番号８０）を含有した。
【０４４９】
ベクターおよび挿入断片をゲル精製し、ＱｉａｇｅｎのＧｅｌ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキットでクリーンアップした。精製した挿入物を大型ベクター断片と結紮して、ＯｎｅＳｈｏｔ  Ｔｏｐ１０細菌に形質転換した。形質転換細菌コロニーからＤＮＡを単離し、ＳａｌＩ／ＮｏｔＩ制限酵素による消化に供して、１％アガロースゲル上で分解した。予期したパターンに至るＤＮＡを配列決定用に提出した。上記配列と１００％適合したクローンを大規模プラスミド精製用に選択した。最終ｐＴＴ５−ａＤＮＰ３Ａ４（Ｗ１０１Ｆ）ＩｇＧ２−Ｓｈｋ［１−３５、Ｑ１６Ｋ］構築物は以下のアミノ酸配列：
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＷＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＹＮＦＮＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＲＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＫＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣ／／（配列番号８２）を有するａＤＮＰ３Ａ４（Ｗ１０１Ｆ）ＩｇＧ２  ＨＣ−Ｌ１０−Ｓｈｋ［１−３５、Ｑ１６Ｋ］をコードした。
【０４５０】
抗ＤＮＰ  ３Ａ４抗体軽鎖の哺乳類発現。ＤＮＰモノクローナル抗体３Ａ４を発現するＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（商標）ハイブリドーマを供給源として用い、総ＲＮＡを単離した。多重遺伝子特異的プライマーで一段階ＲＴ−ＰＣＲを行い、可変領域生成物を得た。この生成物を、順行プライマーを５’  ＢｓｓＨＩＩ制限部位５’−ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＧ  ＣＧＣ  ＧＣＴ  ＧＴＧ  ＡＣＡ  ＴＣＣ  ＡＧＡ  ＴＧＡ  ＣＣＣ  ＡＧＴ  Ｃ−３’（配列番号８３）に追加して、逆行プライマーを３’  ＢｓｉＷＩ制限部位５’−ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＣＧＴ  ＡＣＧ  ＴＴＴ  ＧＡＴ  ＡＴＣ  ＣＡＣ  ＴＴＴ  ＧＧＴ  ＣＣ−３’（配列番号８４）に追加して再増幅した。生成したＰＣＲ生成物をＱｉａｇｅｎのＰＣＲクリーンアップによりクリーンし、ＢｓｓＨＩＩおよびＢｓｉＷＩ制限酵素で消化し、Ｑｉａｇｅｎヌクレオチド除去によりクリーンし、５’  ＶＫ１／Ｏ１２シグナルペプチドおよび３’  ヒトκ定常領域を含む哺乳類発現ベクターｐＴＴ５中に結紮した。生成した抗ＤＮＰ  ３Ａ４抗体軽鎖のアミノ酸配列は下記である：
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＳＲＲＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＡＮＳＦＰＦＴＦＧＰＧＴＫＶＤＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ／／（配列番号１０９）。
【０４５１】
１価Ｆｃ毒素ペプチドアナログおよびＡｂ  ＨＣまたはＡｂ  ＬＣ毒素ペプチドアナログ融合物の単離方法。タンパク質Ａセファロース（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたＦｃ領域の親和性高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）捕獲、続いて２価陽イオンを含まないダルベッコのＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によるカラム洗浄および１００ｍＭ酢酸（ｐＨ３．５）を２．５ｃｍ／分で流した溶出工程により条件培地の初回精製を行った。タンパク質を含む留分をプールし、１０Ｎ  ＮａＯＨを用いてｐＨを５．０に調整し、５容量の水でさらに希釈した。物質を０．４５μｍ酢酸セルロースフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を介してろ過し、陽イオン交換ＦＰＬＣ（ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ；  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によりさらに精製した。試料を１００％緩衝液Ａ（５０ｍＭ酢酸、ｐＨ５．０）で平衡させたカラム上に負荷し、勾配０〜８０％緩衝液Ｂ（５０ｍＭ酢酸、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．０）３０カラム容量、流速１．５ｃｍ／分で溶出した。ピークを含む１価種をプールして、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、９％ショ糖（ｐＨ５．０）中に製剤化した。免疫グロブリン毒素ペプチドアナログ融合タンパク質の精製例を図３Ａ〜Ｃ、図４Ａ〜Ｃ、図５Ａ〜Ｃ、図６Ａ〜Ｃおよび図２４〜３５に示す。
【０４５２】
１価Ａｂ  ＨＣならびに１価、２価および３価Ａｂ  ＬＣ毒素ペプチドアナログ融合物の単離方法。タンパク質Ａセファロース（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたＦｃ領域の親和性高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）捕獲、続いて２価陽イオンを含まないダルベッコのＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によるカラム洗浄および１００ｍＭ酢酸（ｐＨ３．５）を２．５ｃｍ／分で流した溶出工程により条件培地の初回精製を行った。タンパク質を含む留分をプールし、１０Ｎ  ＮａＯＨを用いてｐＨを５．０に調整し、５容量の水でさらに希釈した。物質を０．４５μｍ酢酸セルロースフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を介してろ過し、陽イオン交換ＦＰＬＣ（ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ；  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によりさらに精製した。試料を１００％緩衝液Ａ（５０ｍＭ酢酸、ｐＨ５．０）で平衡させたカラム上に負荷し、勾配０〜８０％緩衝液Ｂ（５０ｍＭ酢酸、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．０）３０カラム容量、流速１．５ｃｍ／分で溶出した。ピークを含む標的種をプールして、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、９％ショ糖（ｐＨ５．０）中に製剤化した。４〜１２％または４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥトリス−グリシンゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上でＱｕｉｃｋＢｌｕｅ（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）で着色した０．５μｇ、２μｇ、および１０μｇタンパク質の還元および非還元（＋ヨードアセトアミド）分析を行った。Ｂｉｏｓｅｐ  ＳＥＣ−Ｓ３０００カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）、および５０ｍＭリン酸ナトリウム、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ６．９）の無勾配溶出を１８分かけて用いて分析的ＳＥＣを行った。免疫グロブリン毒素ペプチドアナログ融合タンパク質の精製例を図２４〜２６Ａ〜Ｂ、２７〜２９Ａ〜Ｂ、３０〜３２Ａ〜Ｂ、および３３〜３５に示す。
【実施例５】
【０４５３】
本発明の１価Ｆｃ／Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［２−３５］ヘテロ二量体ならびに１価もしくは２価Ｆｃ／Ｆｃ−ＳｈＫ（１−３５  Ｑ１６Ｋ）（ＩｇＧ２）ヘテロ二量体および免疫グロブリン融合タンパク質の薬物動態／薬力学評価
薬理学的に活性なポリペプチドのための免疫グロブリン担体として用いられる本発明の抗原結合タンパク質の実施形態は、良好な薬物動態および薬力学特性を提供することが示された。１価もしくは２価Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［２−３５］、１価もしくは２価Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５］、１価もしくは２価Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（１−３５、Ｑ１６Ｋ）、１価もしくは２価抗ＫＬＨ  ＨＣ−ＳｈＫ（１−３５、Ｑ１６Ｋ）Ａｂ、１価もしくは２価抗ＫＬＨ  Ａｂループ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ融合タンパク質、１価Ｆｃ−ＳｈＫ（１−３５  Ｑ１６Ｋ）／aＫＬＨ  Ａｂヘテロ三量体、ならびに表７Ｈに列挙する他の例示的な実施形態を、実施例４に記載の手段により発現させ、単離して精製した。表７ＨのＰＥＧ化および非ＰＥＧ化毒素ペプチド比較物を以下のとおり合成的に調製した。
【０４５４】
ペプチド合成。Ｎα−Ｆｍｏｃ、側鎖保護アミノ酸およびＨ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−２Ｃｌ−Ｔｒｔ樹脂をＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂａｃｈｅｍ、またはＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。以下の側鎖保護戦略を用いた：Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）、Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）、Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）、Ｌｙｓ（Ｎε−Ｂｏｃ）、Ｓｅｒ（ＯｔＢｕ）、Ｔｈｒ（ＯｔＢｕ）およびＴｙｒ（ＯｔＢｕ）。ＳｈＫ（ＲＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＱＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣ／／配列番号３６１）、［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（ＲＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＫＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣ／／配列番号７６）、または他の毒素ペプチドアナログアミノ酸配列を、Ｈ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−２Ｃｌ−Ｔｒｔ樹脂（０．２ｍｍｏｌ、０．３２ｍｍｏｌ／ｇ負荷）を用いて０．２ｍｍｏｌ等価尺度でＤＩＣ／ＨＯＢｔカップリング化学を用いて（ＳＰＰＳによる）ＣＳ  Ｂｉｏペプチド合成機上で段階式に合成した。各カップリングサイクルにおいて、１ｍｍｏｌ  Ｎα−Ｆｍｏｃ−アミノ酸をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）の０．４Ｍ１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）２．５ｍＬに溶解した。この溶液に１．０Ｍ  Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）のＤＭＦ溶液１．０ｍＬを添加した。この溶液を窒素通気で１５分間撹拌して前活性化させてから、樹脂に添加した。混合物を２時間撹拌した。樹脂をろ過し、ＤＭＦで３回、ジクロロメタン（ＤＣＭ）で２回、およびＤＭＦで３回洗浄した。Ｆｍｏｃ脱保護を２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液（５ｍＬ、２×１５分）による処置で実行した。上記のＦｍｏｃ−アミノ酸カップリングおよびＦｍｏｃ除去工程を反復して最初の２３残基を単結合させた。Ｆｍｏｃ除去に進む前にカップリング工程を２回実施することにより残りの残基を二重結合させた。
【０４５５】
次いで合成後に樹脂を抜き、ＤＣＭ、ＤＭＦ、ＤＣＭで連続洗浄してから、真空乾燥した。ペプチド樹脂を２５０ｍＬプラスチック丸底フラスコに移した。ペプチドを脱保護してトリイソプロピルシラン（１．５ｍＬ）、３，６−ジオキサ−１，８−オクタン−ジチオール（ＤＯＤＴ、１．５ｍＬ）、水（１．５ｍＬ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、２０ｍＬ）および撹拌棒での処置により樹脂から放し、混合物を３時間撹拌した。１５０ｍＬ焼結ガラス漏斗を介して混合物を２５０ｍＬプラスチック丸底フラスコに入れてろ過した。１５０ｍＬ焼結ガラス漏斗を介して混合物を２５０ｍＬプラスチック丸底フラスコに入れてろ過し、ろ液を真空濃縮した。冷却ジエチルエーテルを添加して粗ペプチドを沈殿させ、遠心分離により収集し、真空乾燥した。
【０４５６】
ペプチド折畳み。乾燥粗線状ペプチド（約６００ｍｇ）、例えば［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫペプチド（配列番号７６）または［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ−Ａｌａ（［Ｌｙｓ１６、Ａｌａ３６］−ＳｈＫ；配列番号３６２としても知られている）ペプチドを、１６ｍＬ酢酸、６４ｍＬ水、および４０ｍＬアセトニトリルに溶解した。混合物を迅速に１５分間撹拌して完全に溶解した。水１７００ｍＬおよび大型撹拌棒を含む２Ｌプラスチックボトルにペプチド溶液を添加した。このように希釈した溶液に濃縮水酸化アンモニウム２０ｍＬを添加し、溶液ｐＨを９．５に増大した。ｐＨは、少量の酢酸または必要に応じてＮＨ４ＯＨで調整した。溶液を８０ｒｐｍで一晩撹拌し、ＬＣ−ＭＳによりモニタリングした。折畳みは通常、２４〜４８時間内に完了すると判断して、酢酸およびＴＦＡ（ｐＨ＝２．５）の添加により溶液をクエンチした。水溶液をろ過した（０．４５μｍセルロース膜）。
【０４５７】
逆相ＨＰＬＣ精製。逆相高速液体クロマトグラフィーを、分析用（Ｃ１８、５μｍ、０．４６ｃｍ×２５ｃｍ）または調製用（Ｃ１８、１０μｍ、２．２ｃｍ×２５ｃｍ）カラム上で実施した。緩衝液Ａ中の緩衝液Ｂ（Ａ＝０．１％水性ＴＦＡ；Ｂ＝０．０９％ＴＦＡ含有９０％水性ＡＣＮ）の直線勾配は、典型的には、分析では５〜９５％を３５分かけて流速１ｍＬ／分で、調製用分離では５〜６５％を９０分かけて流速２０ｍＬ／分で用いてクロマトグラフ分離を成し遂げた。分析的および調製用ＨＰＬＣ留分は、組み合わせて凍結乾燥したＥＳＭＳおよびフォトダイオードアレイ（ＰＤＡ）ＨＰＬＣを特徴とした。
【０４５８】
質量分析。イオンスプレー大気圧イオン化供給源付きの単一の４極子質量分析計上で質量スペクトルを得た。フューズドシリカキャピラリー界面（５０μｍ  ｉ．ｄ．）を介してイオン化供給源に直接結合した移動溶媒（１０μＬ／分；３０：５０：２０ＡＣＮ／ＭｅＯＨ、０．０５％ＴＦＡ含有）内に試料（２５μＬ）を注入した。試料液滴を陽電位５ｋＶでイオン化し、界面プレートを介して、続いてオリフィス（直径１００〜１２０μｍ）、電位６０Ｖを介して分析器に入れた。完全なスキャン質量スペクトルをサイズ０．１Ｄａのスキャン工程により４００〜２２００Ｄａ質量範囲で得た。分子質量は観察されたｍ／ｚ値から引き出した。
【０４５９】
ＰＥＧ化、精製および分析。ペプチド、例えば、［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号７６）または［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ−Ａｌａ（配列番号３６２）をＮ末端の還元アルキル化により、活性化線状または分岐ＰＥＧを用いて選択的にＰＥＧ化した。接合を２ｍｇ／ｍＬの５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ４．５）反応緩衝液（２０ｍＭシアノヒドリドホウ酸ナトリウムおよび２モル過剰の２０ｋＤａモノメトキシ−ＰＥＧ−アルデヒド（ＮＯＦ，  Ｊａｐａｎ）含有）で実施した。結合反応物を室温で約５時間撹拌し、それらの進行度をＲＰ−ＨＰＬＣによりモニタリングした。反応完了物を２０ｍＭ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ４）の４倍希釈液によりクエンチし、４℃に冷却した。次いで、直線勾配の０〜１Ｍ  ＮａＣｌの２０ｍＭ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ４．０）溶液で溶出したＳＰセファロースＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）を用いて、ＰＥＧ−ペプチドを４０℃でクロマトグラフ的に精製した。溶出したピーク留分をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＲＰ−ＨＰＬＣにより分析し、プールを純度９７％超により決定した。観察された本質的な汚染物質はジ−ＰＥＧ化毒素ペプチドアナログであった。選択されたプールを３ｋＤａ  ＭＷＣＯ膜に対する遠心ろ過により２〜５ｍｇ／ｍＬに濃縮し、１０ｍＭ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ４）、５％ソルビトール含有）中に透析した。次いで透析したプールを０．２ミクロンフィルターにより滅菌ろ過し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより純度９７％超と決定した（データは示していない）。逆相ＨＰＬＣをＡｇｉｌｅｎｔ  １１００モデルＨＰＬＣ上で、１ｍＬ／分で流れるＺｏｒｂａｘ（商標）５μｍ  ３００ＳＢ−Ｃ８  ４．６×５０ｍｍカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ）の０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ溶液で実施し、カラム温度を４０℃に維持した。ＰＥＧ−ペプチド試料（２０μｇ）を注入し、波長２１５ｎｍでモニタリング中に直線勾配６〜６０％で溶出した。
【０４６０】
融合タンパク質。一般に、図１Ａおよび図１Ｂはそれぞれ１価および２価Ｆｃ毒素ペプチド（または毒素ペプチドアナログ）融合タンパク質（または「ペプチボディ」）の図解を示す。２価Ｆｃ−ＳｈＫ分子は、２本のＦｃ−ＳｈＫ鎖を含むホモ二量体である。１価Ｆｃ−ＳｈＫ毒素ペプチド（または毒素ペプチドアナログ）分子は、Ｆｃ鎖１本とＦｃ−ＳｈＫ（またはアナログ）鎖１本を含むヘテロ二量体である。１価Ｆｃ−ＳｈＫ分子は単一のＳｈＫペプチド／二量体のみを含むため、１価とみなされる。構築物または鎖はＦｃ−（毒素ペプチドアナログ）と呼ばれ、Ｎ末端Ｆｃ領域および任意選択的にＮ末端からＣ末端配向が：Ｆｃ−リンカー毒素ペプチドまたは毒素ペプチドアナログとなるように毒素ペプチドまたは毒素ペプチドアナログに共有結合する可動性リンカー配列（例えば、Ｌ１０ペプチジルリンカーＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；配列番号１５３）を含む。
【０４６１】
Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．、ＷＯ２００８／０８８４２２Ａ２号の実施例１および２には、哺乳類細胞から発現した２価Ｆｃ−ＳｈＫペプチボディ、Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（１−３５）およびＦｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（２−３５）の活性について記載されている。ＷＯ２００８／０８８４２２Ａ２号の実施例１には、発現中に少量の最終生成物として形成される１価Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（１−３５）分子の単離についても記載されている。２価Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（１−３５）およびＦｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（２−３５）結合体はＫｖ１．３およびヒト全血中のＴ細胞サイトカイン分泌を強力にブロックする（表７Ｈを参照されたい）。完全細胞パッチクランプ電気生理学的手法により、２価Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（１−３５）分子のＫｖ１．３活性は、ＳｈＫのＡｒｇ１を欠く２価Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（２−３５）分子と比較して約８倍高い。天然ＳｈＫのＮ末端ＰＥＧ結合体（実施例４を参照されたい）と同様に、２価Ｆｃ−ＳｈＫ結合体は両方ともＫｖ１．３対Ｋｖ１．１に対してほとんど選択性を示さなかった。したがって、（ＰＥＧまたはＦｃ−リンカーのいずれかを伴う）天然ＳｈＫ単独のＮ末端接合はそのＫｖ１．３対Ｋｖ１．１選択性を有意に改善しない。ラットにおける薬物動態（ＰＫ）試験を２価Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（１−３５）およびＦｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（２−３５）ペプチボディ上で実施して、それらのインビボ安定性および半減期を評価する。対照として、ＰＫもＣＨＯ由来組換えヒトＦｃ（ＩｇＧ１）上で実施した。全分子を単回静脈内ボーラス投与して送達した。
【０４６２】
ＰＫアッセイ
ＳｈＫに対する抗体。ＳｈＫ（配列番号３６１）に対するウサギポリクローナルおよびマウスモノクローナル抗体を動物のＦｃ−ＳｈＫペプチボディ結合体による免疫化により生成した。抗ＳｈＫ特異的ポリクローナル抗体を抗血清から親和性精製して結合体のＳｈＫ部分に特異的な抗体のみを単離した。融合およびスクリーニング後、ＳｈＫに特異的なハイブリドーマを選択し、単離した。マウス抗ＳｈＫ特異的モノクローナル抗体をクローン条件培地から精製した。ＥＬＩＳＡ分析により、精製した抗ＳｈＫポリクローナルおよびモノクローナル抗体はＳｈＫペプチド単独のみに反応し、Ｆｃとは交差反応しなかった。
【０４６３】
ラットおよびサルにおける２０ｋＤａ−ＰＥＧ−ＳｈＫ（配列番号３６３）および２０ｋＤａ−ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号３６４）ペプチド結合体の薬物動態（ＰＫ）試験。動物に単回皮下用量を送達し、注射後各時点で血清を収集した。２〜３匹の動物／用量群がラットにおける試験対象となり、試験過程の各時点で血液および血清を採取した。本明細書に記載の試験において雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット（約０．３ｋｇ）および雄カニクイザル（約４ｋｇ）を用いた（ｎ＝３動物／用量群）。我々のマウス薬物動態試験において用量および時点当たり約５匹の雄ＣＤ−１マウスを用いた。酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）分析時まで血清試料を−８０℃で凍結保存した。
【０４６４】
ＰＥＧ−ＳｈＫおよびＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫの血清レベルを検出するためのＥＬＩＳＡプロトコールの簡単な説明を以下に提示する：
【０４６５】
（１）プロトコール１の下記（ａ）〜（ｇ）は、ＰＥＧ−ＳｈＫおよびＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ、ならびにＳｈＫおよび［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫペプチド単独を検出する：
（ａ）ストレプトアビジンマイクロタイタープレートを２５０ｎｇ／ｍＬビオチン化−抗ＳｈＫマウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ２．１０、Ａｍｇｅｎ）のＩブロック緩衝液［１リットルにつき：１０００ｍＬ１×ＰＢＳ、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２非含有、５ｍＬのＴｗｅｅｎ  ２０（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、２ｇのＩブロック試薬（Ｔｒｏｐｉｘ）］で４℃でコーティングし、一晩撹拌せずにインキュベートした。
（ｂ）プレートをＫＰＬ洗浄緩衝液（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ＆  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で３回洗浄した。
（ｃ）プールした血清１００％を有する標準（ＳＴＤ）、品質管理（ＱＣ）および試料希釈を調製してから、Ｉブロック緩衝液で５分の１に希釈した（前処置）。前処置したＳＴＤ、ＱＣおよび試料を洗浄したプレートに添加し、室温で２時間インキュベートした。（ＳＴＤ、ＱＣの連続希釈をプールした血清１００％内で調製した。希釈する必要のある試料はプールした血清１００％でも調製した。ｓｔｄ、ＱＣおよび試料の両方に対して前処置を行い、基質効果を最小化した。）
（ｄ）プレートをＫＰＬ洗浄緩衝液で３回洗浄した。
（ｅ）ＨＲＰ標識ウサギ抗ＳｈＫポリクローナルＡｂ、２５０ｎｇ／ｍＬのＩブロック緩衝液を添加し、プレートを室温で１時間撹拌しながらインキュベートした。
（ｆ）プレートをＫＰＬ洗浄緩衝液で再び３回洗浄し、Ｆｅｍｔｏ［Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ］基質を添加した。
（ｇ）プレートをＬｍａｘ  ＩＩ  ３８４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）照度計で読み込んだ。
【０４６６】
ＳｈＫおよび［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫのＦｃ結合体、Ｉｇ結合体、またはＡｂ結合体の薬物動態（ＰＫ）試験を雄ＳＤラットにおいて実施した。動物に単回皮下用量を送達し、注射後各時点で血清を収集した。１用量群当たり３匹の動物を用い、試験過程の各時点で血液および血清を採取した。血清試料を酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）分析時まで−８０℃で凍結保存した。ＳｈＫおよび［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫのＦｃ結合体、Ｉｇ結合体、またはＡｂ結合体の血清レベルを検出するためのＥＬＩＳＡプロトコールの簡単な説明を以下に提示する。下記のプロトコール２は、分子のヒトＩｇ、ＦｃもしくはＡｂ部分の両方、ならびにＳｈＫペプチド部分を検出する。下記のプロトコール３は、ヒトＦｃ領域単独を検出する初期アッセイであり、齧歯類の薬物動態試験におけるＦｃ−ＳｈＫペプチボディの血清レベルの初期評価のために用いた。これらのＥＬＩＳＡプロトコールの簡単な説明を提示する：
【０４６７】
（２）プロトコール２の下記（ａ）〜（ｇ）は、分子のヒトＩｇ、ＦｃもしくはＡｂ部分の両方、ならびにＳｈＫペプチド部分を検出する：
（ａ）ストレプトアビジンマイクロタイタープレートを２５０ｎｇ／ｍＬビオチン化−抗ＳｈＫマウスモノクローナル抗体（ｍａｂ２．１０、Ａｍｇｅｎ）のＩブロック緩衝液［１リットルにつき：１０００ｍＬの１×ＰＢＳ、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２非含有、５ｍＬのＴｗｅｅｎ  ２０（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で、２ｇのＩブロック試薬（Ｔｒｏｐｉｘ）］で４℃で、一晩撹拌せずにコーティングした；
（ｂ）プレートをＫＰＬ洗浄緩衝液（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ＆  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で３回洗浄した
（ｃ）プールした血清１００％を有する標準（ＳＴＤ）、品質管理（ＱＣ）および試料希釈を調製してから、Ｉブロック緩衝液で５分の１に希釈した（前処置）。前処置したＳＴＤ、ＱＣおよび試料を洗浄したプレートに添加した。インキュベーションは室温で２時間行った。（ＳＴＤ、ＱＣの連続希釈をプールした血清１００％内で調製した。希釈する必要のある試料はプールした血清１００％でも調製した。ｓｔｄ、ＱＣおよび試料の両方に対して前処置を行い、基質効果を最小化した。）；
（ｄ）プレートをＫＰＬ洗浄緩衝液で３回洗浄した；
（ｅ）ＨＲＰ標識Ａｂ３５（ヒトＩｇＧ  Ｆｃに対して）、１５０ｎｇ／ｍＬのＩブロック緩衝液を添加し、プレートを室温で１時間撹拌しながらインキュベートした。
（ｆ）プレートをＫＰＬ洗浄緩衝液で３回洗浄し、Ｆｅｍｔｏ［Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ］基質を添加した；
（ｇ）プレートをＬｍａｘ  ＩＩ  ３８４［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ］照度計で読み込んだ。
【０４６８】
（３）プロトコール３の下記（ａ）〜（ｈ）は、ヒトＦｃ領域単独を検出する初期アッセイであり、齧歯類の薬物動態試験におけるＦｃ−ＳｈＫペプチボディの血清レベルの初期評価のために用いた。
（ａ）１×コーティング緩衝液で希釈したＣｏｓｔａｒ３５９０  ９６ウェルＥＩＡ／ＲＩＡプレートを０．１ｍＬ／ウェルの２μｇ／ｍＬヤギ抗ＨｕＦｃ、Ｆａｂ２、（Ｓｉｇｍａ  Ｉ−３３９１）（１０×コーティング緩衝液：１．５９ｇ  Ｎａ２ＣＯ３、２．９３ｇ  ＮａＨＣＯ３のＨ２Ｏ溶液１００ｍＬ）でコーティングした。プレートを密封して４℃で一晩インキュベートした；
（ｂ）プレートをＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄し、０．３ｍＬのｂｌｏｔｔｏ（ＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、５％脱脂粉乳）を各ウェルへ添加してブロックし、室温（ＲＴ）で撹拌しながら１時間インキュベートした；
（ｃ）プレートをＫＰ洗浄溶液（Ｃａｔ＃５０−６３−００，  ＫＰＬ，  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  ＭＤ）で洗浄した；
（ｄ）希釈した血清試料および対照／標準の希釈緩衝液（ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）＋ラット血清で、必要な場合、最終ラット血清１０％とし、０．１ｍＬ試料を各ウェルへ添加した。プレートを室温で撹拌しながら、１時間インキュベートした；
（ｅ）プレートをＫＰ洗浄溶液（Ｃａｔ＃５０−６３−００，  ＫＰＬ，  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  ＭＤ）で洗浄した；
（ｆ）ＨＲＰ標識二次抗体（Ｐｉｅｒｃｅ＃３１４１６−ＨＲＰヤギα−Ｈｕ  ＩｇＧ  Ｆｃ）をＰＢＳＴで１：５０００希釈してから１００μＬ／ウェルを追加し、ＲＴで撹拌しながら、１時間インキュベートした；
（ｇ）プレートをＫＰ洗浄溶液（Ｃａｔ＃５０−６３−００，  ＫＰＬ，  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  ＭＤ）で洗浄してＡＢＴＳ基質（ＡＢＴＳ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  １−Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ，  Ｃａｔ＃５０−６６−０１８，  ＫＰＬ）１００μＬ／ウェルを添加した；
（ｈ）基質を添加して撹拌した後、適切な時点で、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ３４０［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ］プレート読取り器でプレートを読み込んだ。
【０４６９】
哺乳類の２価分子発現中、元の１価Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（１−３５）分子を少量の最終生成物として単離した一方、本明細書の実施例４では１価Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［２−３５］ヘテロ二量体のクローニングおよび哺乳類発現についても記載する。簡単に述べると、組換え１価Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［２−３５］を産生するため、ヒトＦｃ（ＩｇＧ１）鎖およびＦｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［２−３５］鎖である２つの組換えポリペプチドを同じ細胞内で共発現させる（ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域とも）。これらの条件下において、Ｆｃ／Ｆｃホモ二量体、Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（２−３５）／Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（２−３５）ホモ二量体およびＦｃ／Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（２−３５）ヘテロ二量体を含む３つの異なる二量体を形成することが可能である。発現条件を至適化することにより、１価Ｆｃ／Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（２−３５）ヘテロ二量体（単に１価Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（２−３５）とも呼ばれる）を効果的に産生し、容易に精製して均一とした（本明細書の実施例４）。１価Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（２−３５）分子のヒト全血液からのＩＬ−２分泌ブロックＩＣ５０は２．１ｎＭ（表７Ｈ）であった。１価Ｆｃ−ＳｈＫ／Ｆｃヘテロ二量体のインビボ半減期は長く、２価ホモ二量体ＳｈＫ−Ｆｃ／ＳｈＫ−Ｆｃ（図１０）およびＦｃ−ＳｈＫ／Ｆｃ−ＳｈＫよりも有意に高い曝露を示した。この構築物の効能はＰＥＧ−ＳｈＫ結合体よりも約１０倍低く、天然ＳｈＫ結合体のＫｖ１．３／Ｋｖ１．１選択性は低かったため、我々はさらなる１価ペプチボディを開発し、形成されたＳｈＫ毒素ペプチドアナログ結合体のＫｖ１．３対Ｋｖ１．１選択性は改善されていることを同定した。以下の実施例は、選択性およびインビボ薬理学の改善された１価ペプチボディの詳細を提示する。これらの試験結果により、ラットにおいて１価ＳｈＫ毒素ペプチドアナログ分子は同分子の２価形態と比較して高い血清レベルおよび曝露を示しつつ、元の２価ペプチボディにおいて観察された遅い排出速度を保持することが示された。
【０４７０】
１価Ｆｃ／Ｆｃ−ＳｈＫ（１−３５  Ｑ１６Ｋ）ヘテロ二量体（ＩｇＧ２）。ＳｈＫ［Ｌｙｓ１６］毒素ペプチドアナログ（配列番号７６）はニューロンのＫｖ１．１に対する有意なＫｖ１．３選択性を示す（表７Ｈ）。この毒素ペプチドアナログのインビボ安定性を高めるため、Ｎ末端からＣ末端で：ヒトＦｃ（ＩｇＧ２）−Ｌ１０リンカー−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ分子を含む１価Ｆｃ融合構築物を我々は産生し、これはヒトＦｃ（ＩｇＧ２）鎖単独と共発現して１価ヘテロ二量体を産生した（実施例４を参照されたい）。この１価構築物の図解を図１Ａに提示する。１価Ｆｃ／Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（１−３５  Ｑ１６Ｋ）ヘテロ二量体［１価Ｆｃ／Ｆｃ−ＳｈＫ（１−３５、Ｑ１６Ｋ）とも呼ばれる］は、全血中のＴ細胞炎症を強力にブロックし、ＩＬ−２分泌を０．１６ｎＭのＩＣ５０で抑制した（表７Ｈ）。分子のＫｖ１．３対Ｋｖ１．１選択性を評価する試験により、１価Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（１−３５  Ｑ１６Ｋ）結合体のＫｖ１．３選択性は［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫペプチド単独よりも有意に優れていることが予期せず明らかとなった。［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号７６）ペプチド単独のＫｖ１．３対Ｋｖ１．１選択性は約１８倍であることが示された一方（表７Ｈ）、１価Ｆｃ／Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（１−３５  Ｑ１６Ｋ）ヘテロ二量体のＫｖ１．３対Ｋｖ１．１ブロックは約１２２５倍活動的であった。したがって、［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫペプチドは結合時、選択性の高まった独特な薬理学を示す。Ｎα−２０ｋＤａ−ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ結合体（配列番号３６４）もペプチド単独と比較して高まったＫｖ１．３選択性を示したため（表７Ｈ）、統合データにより、［Ｌｙｓ１６］−ＳｈＫ（配列番号７６）ペプチドはＮ末端でＰＥＧまたはＦｃ−リンカーのいずれかと融合時に、Ｋｖ１．３対Ｋｖ１．１選択性の改善された異なる薬理学を示すことが示唆される。
【０４７１】
本発明の分子の比較に基づき、分子のインビボ薬物動態および安定性を評価するため、ラットにおいて単回投与ＰＫ試験を実施した。単回６ｍｇ／ｋｇ皮下投与後、（単量体の配列番号１および２６の）１価Ｆｃ／Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（１−３５、Ｑ１６Ｋ）ヘテロ二量体のインビボ半減期は長いことが示された（図７）。分子（「プロトコール２」）の血清レベルを測定するために使用したサンドイッチＥＬＩＳＡは、ヒトＦｃ領域に特異的な抗体と、［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号７６）を認識する抗体の２つの抗体の結合を必要とするため、本明細書のデータにより、結合体の半減期は長く、かつＦｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（１−３５  Ｑ１６Ｋ）融合タンパク質（図７、白四角；下表７Ｉ）としてインビボでインタクトのまま残ることが示される。１価Ｆｃ／Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（１−３５  Ｑ１６Ｋ）分子は長い半減期（約５６時間）を示し、２０〜３０分であることが報告されている（Ｃ．  Ｂｅｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＮＡＳ  ９８：１３９４２  （２００１））ＳｈＫ（配列番号３６１）ペプチド単独の半減期よりも約１１２倍長かった。
【０４７２】
２価Ｆｃ−ＳｈＫ（１−３５  Ｑ１６Ｋ）ホモ二量体（ＩｇＧ２）。２価Ｆｃ−ＳｈＫ（１−３５、Ｑ１６Ｋ）ホモ二量体は、Ｎ末端からＣ末端で：ヒトＦｃ（ＩｇＧ２）−Ｌ１０リンカー−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号２６）を含む。この２価構築物の図解を図１Ｂに提示する。本明細書の実施例４に記載のように分子（配列番号２６のホモ二量体）をクローン化し、発現させて、精製した。精製した分子の炎症のヒト全血液アッセイにおける活性を試験し、ＩＬ−２分泌ブロックＩＣ５０は１．８５０ｎＭであることが見出された（表７Ｈ）。この２価形態の活性は、この同一アッセイにおいて０．１６ｎＭのＩＣ５０を有した１価形態（上記）より約１２倍低かった。２価形態の活性が１価形態の活性より低い理由は不明である。末端に２つの陽電荷［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号７６）ペプチドを含む２価分子はより不安定である、および／またはＫｖ１．３チャネル結合にある程度干渉する可能性がある。
【０４７３】
１価および２価aＫＬＨ  ＨＣ−ＳｈＫ（１−３５、Ｑ１６Ｋ）Ａｂ。本発明の１価抗ＫＬＨ重鎖（ＨＣ）融合抗体（Ａｂ）構築物の実施形態は、Ｎ末端からＣ末端で：ヒト抗ＫＬＨ  Ａｂ重鎖−ペプチジルリンカー−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ分子（配列番号３２）を含み、これはヒトaＫＬＨ重鎖単独（配列番号２９）およびヒトaＫＬＨ軽鎖（配列番号２８）と共発現して１価aＫＬＨ  Ａｂ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ分子（配列番号２８；配列番号２９；配列番号２８；および配列番号３２のヘテロ四量体）を形成した。この１価構築物の図解を図１Ｆに提示する。１価aＫＬＨ  ＨＣ−ＳｈＫ（１−３５、Ｑ１６Ｋ）Ａｂは全血中のＴ細胞炎症を強力にブロックし、ＩＬ−２分泌を０．２７４ｎＭのＩＣ５０で抑制した（表７Ｈ）。分子のＫｖ１．３対Ｋｖ１．１選択性を評価する試験により、１価aＫＬＨ  ＨＣ−ＳｈＫ（１−３５、Ｑ１６Ｋ）Ａｂ（配列番号２８；配列番号２９；配列番号２８；および配列番号３２のヘテロ四量体）のＫｖ１．３選択性は［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号７６）ペプチド単独よりも有意に優れていることが予期せず明らかとなった。この１価Ａｂ−ＳｈＫ結合体のＫｖ１．３対Ｋｖ１．１ブロックは約１４５８倍活動的であった（表７Ｈおよび図２Ａ〜Ｂ）。
【０４７４】
分子のインビボ薬物動態および安定性を評価するため、ラットにおいて単回投与ＰＫ試験を実施した。単回６ｍｇ／ｋｇ皮下投与後、１価aＫＬＨ  ＨＣ−ＳｈＫ（１−３５  Ｑ１６Ｋ）Ａｂ結合体は長いインビボ半減期を示した（図７、黒丸）。分子（「プロトコール２」）の血清レベルを測定するために使用したサンドイッチＥＬＩＳＡは、ヒトＩｇ領域に特異的な抗体と、［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号７６）を認識する抗体の２つの抗体の結合を必要とするため、本明細書のデータにより、結合体の半減期は長く、かつ１価aＫＬＨ  ＨＣ−ＳｈＫ（１−３５  Ｑ１６Ｋ）Ａｂ融合タンパク質としてインビボでインタクトのまま残ることが示される（図７、図８、および表７Ｊ）。２価aＫＬＨ  ＨＣ−ＳｈＫ（１−３５、Ｑ１６Ｋ）Ａｂ分子（図１Ｇにより図解）を同用量の６ｍｇ／ｋｇ投与して同様に遅い排出速度が示されたが（図８）、１価分子と比較して約３７倍低い曝露（ＡＵＣ0-tにより測定、表７Ｊ）が提供された（図８）。強力かつ選択的な１価抗ＫＬＨ−Ａｂ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ分子はラットにおいて非常に遅いクリアランスを示した（ＣＬ／Ｆ＝１０．９ｍＬ  ｈ−１ｋｇ−１）（表７Ｊ）。
【０４７５】
１価aＫＬＨ  ＨＣ−ＳｈＫ（２−３５  Ｑ１６Ｋ）Ａｂ。本発明のこの１価aＫＬＨ重鎖（ＨＣ）融合抗体（Ａｂ）構築物の実施形態は、Ｎ末端からＣ末端で：ヒト抗ＫＬＨ  Ａｂ重鎖−リンカー−［ｄｅｓＡｒｇ１、Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ分子（配列番号３３）を含み、これはヒトaＫＬＨ重鎖（配列番号２９）およびヒトaＫＬＨ軽鎖（配列番号２８）と共発現して１価aＫＬＨ  Ａｂ−［ｄｅｓＡｒｇ１、Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ分子を形成した。この１価構築物の図解を図１Ｆに提示する。１価aＫＬＨ  ＨＣ−ＳｈＫ（２−３５、Ｑ１６Ｋ）Ａｂ（配列番号２８；配列番号２９；配列番号２８；および配列番号３３のヘテロ四量体）は全血中のＴ細胞炎症を強力にブロックし、ＩＬ−２分泌を０．５７０ｎＭのＩＣ５０で抑制し（表７Ｈ）、Ｔ細胞カリウムチャネルＫｖ１．３のブロックは、予期せずニューロンのチャネルＫｖ１．１より約１５７６倍強力であった。
【０４７６】
１価Ｆｃ−ＳｈＫ（１−３５  Ｑ１６Ｋ）／aＫＬＨ  Ａｂヘテロ三量体。本発明の１価Ｆｃ−ＳｈＫ（１−３５、Ｑ１６Ｋ）／aＫＬＨ  Ａｂヘテロ三量体またはヘミボディの実施形態は、Ｎ末端からＣ末端で：ヒトＦｃ（ＩｇＧ２）−Ｌ１０リンカー−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ分子（配列番号２６）を含み、これはヒトaＫＬＨ重鎖（ＩｇＧ２）（配列番号２９）およびヒトaＫＬＨ軽鎖（配列番号２８）と共発現した。この１価構築物の図解を図１Ｅに提示する。１価Ｆｃ−ＳｈＫ（１−３５、Ｑ１６Ｋ）／aＫＬＨ  Ａｂヘテロ三量体（配列番号２８；配列番号２９；配列番号２６）はヒト全血中のＴ細胞炎症を強力にブロックし、ＩＬ−２分泌を０．２４５ｎＭのＩＣ５０で抑制した（表７Ｈ）。驚いたことに、分子のＫｖ１．３対Ｋｖ１．１選択性を評価する試験により１価Ｆｃ−ＳｈＫ（１−３５、Ｑ１６Ｋ）／aＫＬＨ  Ａｂヘテロ三量体のＫｖ１．３選択性は［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫペプチド単独（配列番号７６）よりも有意に優れていることが明らかとなった。この１価ヘテロ三量体のＫｖ１．３対Ｋｖ１．１ブロックは約１９３５倍活動的であった（表７Ｈ）。
【０４７７】
我々は、Ｋｖ１．３選択的１価Ｆｃ−ＳｈＫ（１−３５、Ｑ１６Ｋ）／aＫＬＨ  Ａｂヘテロ三量体またはヘミボディの薬物動態（ＰＫ）は評価しなかったが、Ｆｃ−ＳｈＫ（２−３５）／aＫＬＨ  Ａｂヘテロ三量体である類似のヘミボディのＰＫプロファイルを評価した。この分子構造図式を図１Ｅに提示する。この分子はＮ末端からＣ末端で：ヒトＦｃ（ＩｇＧ２）−ＳｈＫ（２−３５）を含み、これはヒトaＫＬＨ重鎖および軽鎖と共発現する。単回２ｍｇ／ｋｇ皮下投与後、１価Ｆｃ−ＳｈＫ（２−３５）／aＫＬＨ  Ａｂヘテロ三量体（１価Ｆｃ−ＳｈＫ／ＫＬＨ  Ａｂヘテロ三量体とも呼ばれる）はラットにおいて長い半減期を示した（図１０）。分子（「プロトコール２」）の血清レベルを測定するために使用したサンドイッチＥＬＩＳＡは、ヒトＩｇ領域に特異的な抗体と、ＳｈＫ（２−３５）を認識する抗体の２つの抗体の結合を必要とするため、本明細書のデータにより、結合体の半減期は長く、かつインビボでインタクトのまま残ることが示される（図１０、表７Ｋ）。約１０３ｋＤａの大型１価Ｆｃ−ＳｈＫ（２−３５）aＫＬＨ  Ａｂヘテロ三量体またはヘミボディは、約５６ｋＤａの１価Ｆｃ／Ｆｃ−ＳｈＫヘテロ二量体よりも高い曝露および約２倍低いクリアランスを示した（図１０、表７Ｋ）。約４ｋＤａの極小ＳｈＫ−Ｌ５ペプチドはラットにおいてより迅速に消失し、このクリアランス値は１価Ｆｃ−ＳｈＫ（２−３５）／aＫＬＨ  Ａｂヘテロ三量体（ＣＬ／Ｆ＝２２．６ｍＬ  ｈ−１ｋｇ−１）高分子より約９１倍速かった（ＣＬ／Ｆ＝２０５２ｍＬ  ｈ−１ｋｇ−１、実施例５）。
【０４７８】
１価および２価抗ＫＬＨ  Ａｂループ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ融合タンパク質。本発明の組換え１価および２価抗ＫＬＨ  Ａｂループ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ融合タンパク質の実施形態は、実施例４および米国特許第７，４４２，７７８Ｂ２号に記載されているように構築して、片方（１価）または両方（２価）のＨＣ単量体におけるＦｃドメインのループ領域に挿入された［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ毒素ペプチドアナログを有する完全抗体を産生した。１価aＫＬＨ  ＨＣ−ループ−ＳｈＫ（１−３５、Ｑ１６Ｋ）Ａｂには、３本鎖：ヒトaＫＬＨ  Ａｂ重鎖、ヒトaＫＬＨ  Ａｂ軽鎖およびヒトaＫＬＨ  Ａｂ重鎖が含まれ、［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫペプチドは重鎖のＦｃ領域内ループに挿入された。Ｆｃループ内［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫペプチドは、そのＮ末端およびＣ末端に結合した可動性リンカー配列を含み、独立した折畳みおよびループからの伸張を可能とする。この分子の図解を図１Ｎに提示する。アミノ酸組成物および長さの異なるリンカー配列を評価した。１価抗ＫＬＨ  Ａｂループ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ融合タンパク質はＫｖ１．３活性の選択的阻害剤であった（Ｋｖ１．１に対し、Ｋｖ１．３に１２１倍超選択的；表７Ｈおよび図２Ａ〜Ｂ）。１価ＫＬＨ−Ａｂループ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ分子は、ラットにおいて我々が評価したすべての新規毒素結合体のうち最も遅いクリアランスを示した（図７および図９ならびに表７Ｌ）。
【０４７９】
２価aＫＬＨ  ＨＣ−ループ−ＳｈＫ（１−３５、Ｑ１６Ｋ）Ａｂには、２本鎖：ヒトaＫＬＨ  Ａｂ軽鎖およびヒトaＫＬＨ  Ａｂ重鎖が含まれ、［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫペプチドは重鎖のＦｃ領域内ループに挿入された。この分子の図解を図１Ｍに提示する。この２価分子のインビボ薬物動態および安定性を１価形態と比較するため、各分子の単回６ｍｇ／ｋｇ皮下用量をラットに送達した。２価aＫＬＨ  ＨＣ−ループ−ＳｈＫ（１−３５、Ｑ１６Ｋ）Ａｂは、遅い排出速度を示すにも関わらず、同分子の１価形態（１価aＫＬＨ  ＨＣ−ループ−ＳｈＫ（１−３５、Ｑ１６）Ａｂ）よりもラットにおいて曝露が非常に低かった（図９を参照されたい）。ＡＵＣ0-tにより測定した曝露は、２価aＫＬＨ  ＨＣ−ループ−ＳｈＫ（１−３５、Ｑ１６Ｋ）Ａｂ分子において、１価aＫＬＨ  ＨＣ−ループ−ＳｈＫ（１−３５Ｑ１６Ｋ）Ａｂ分子と比較して約１６１倍低かった（表７Ｌ）。したがって、我々の新規１価形態は、同分子の典型的な２価形態と比較して、予期せず非常に優れたインビボ薬物動態プロファイルを示す。
【０４８０】
１価ＳｈＫ（１−３５、Ｑ１６Ｋ）−Ｆｃ／Ｆｃヘテロ二量体。１価ＳｈＫ（１−３５、Ｑ１６Ｋ）−Ｆｃ／Ｆｃヘテロ二量体は２本鎖を含み、片方はヒトＦｃ（ＩｇＧ２）鎖であり、他方はＮ末端からＣ末端で：［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ−Ｌ１０リンカー−ヒトＦｃ（ＩｇＧ２）を含むＦｃに融合したＳｈＫ（１−３５、Ｑ１６Ｋ）ペプチドである。このペプチド融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端で：３５個のアミノ酸［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫペプチド、１０個のアミノ酸ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１５３）Ｌ１０リンカー配列およびヒトＦｃ（ＩｇＧ２）配列を含有した。したがって、リンカー−Ｆｃ領域を［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫのＣｙｓ３５に続くＣ末端に結合した。この分子は１価ＳｈＫ（１−３５、Ｑ１６Ｋ）−Ｆｃヘテロ二量体とも呼ばれる。この１価構築物の図解を図１Ｃに提示する。本明細書の実施例４に記載のように、分子をクローン化し、発現させて、精製した。精製した分子は、炎症のヒト全血液アッセイにおいて、ＩＬ−２分泌を０．１１ｎＭのＩＣ５０で非常に強力にブロックした（表７Ｈ）。その優れた効能にも関わらず、１価ＳｈＫ（１−３５、Ｑ１６Ｋ）−Ｆｃ／Ｆｃヘテロ二量体は、Ｋｖ１．３対Ｋｖ１．１のわずか中程度から１０倍の選択性を示した（表７Ｈ）。したがって、［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫのＣ末端に結合したこのリンカー−Ｆｃ融合パートナーはＫｖ１．３選択性をさらに向上させないと考えられる。これは、約１２２５倍の選択性を示し、［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫのＮ末端Ａｒｇ１残基に結合したＦｃ−リンカー配列を有した１価Ｆｃ／Ｆｃ−ＳｈＫ（１−３５、Ｑ１６Ｋ）ヘテロ二量体などの［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫに対するＮ末端融合と対照的である（表７Ｈ）。しかしながら、重要かつ顕著な例外は、［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫの単一Ｃ末端のＣｙｓ３５に続いて添加されたＡｌａ残基を含む［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ−Ａｌａペプチド（配列番号３６２）である。この分子は、Ｋｖ１．３対Ｋｖ１．１に対する選択性が２６２倍高まり改善したことを示した（表７Ｈ）。したがって、我々は、［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫのＣ末端のＣｙｓ３５に続いて添加された特異的アミノ酸残基は、融合タンパク質の選択性プロファイルを改変できると想定する。例えば、この実施例に記載の１価ＳｈＫ（１−３５、Ｑ１６Ｋ）−Ｌ１０−Ｆｃ分子は［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫのＣｙｓ３５に続いて添加されたリンカーＧｌｙ残基を含む。Ｃｙｓ３５に続いてＡｌａ残基が代わりに添加された場合、高まったＫｖ１．３選択性が観察され得る。実際、我々は［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ−Ａｌａペプチドにより２６２倍改善されたＫｖ１．３選択性を認めた。したがって、融合結合部の特異的アミノ酸残基は選択性プロファイルを改変すると我々は予期する。これらの残基は、［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫペプチドおよびヒトＦｃドメインまたは免疫グロブリン軽鎖もしくは重鎖間のリンカー配列に容易に組み込み、結合体のＫｖ１．３選択性を改善することができる。
【０４８１】
１価ＳｈＫ（１−３５、Ｑ１６Ｋ）−ＨＣ  aＫＬＨ  Ａｂ。本発明の１価ＳｈＫ（１−３５、Ｑ１６Ｋ）−ＨＣ  aＫＬＨ  Ａｂの実施形態は３本鎖を含み、１本はヒトaＫＬＨ  Ａｂ軽鎖、もう１本はヒトaＫＬＨ  Ａｂ重鎖、３本目はＮ末端からＣ末端で：［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ−Ｌ１０リンカー−ヒトaＫＬＨ重鎖を含むペプチド−aＫＬＨ  Ａｂ重鎖融合物である。したがって、この融合物には、［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫのＣｙｓ３５に続くＣ末端に結合したリンカー−重鎖領域が含まれる。１価ＳｈＫ（１−３５、Ｑ１６Ｋ）−ＨＣ  aＫＬＨ  Ａｂ分子の図解を図１Ｉに提示する。精製した分子は炎症のヒト全血液アッセイにおいて、ＩＬ−２分泌を０．２１４ｎＭのＩＣ５０  で非常に強力にブロックした（表７Ｈ）。１価［Ｌｙｓ１６］−aＫＬＨ  Ａｂ分子は、非常に大きなサイズでありヒトＩｇ重鎖に融合しているにも関わらず、Ｔ細胞反応の非常に強力なブロックを保持した。
【０４８２】
１価ａＤＮＰ  ＨＣ−ＳｈＫ（１−３５、Ｑ１６Ｋ）Ａｂ。本発明の１価ａＤＮＰ重鎖（ＨＣ）融合抗体（Ａｂ）構築物の実施形態は、Ｎ末端からＣ末端で：ヒト抗ＤＮＰ  Ａｂ重鎖−リンカー−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ分子を含み、これはヒトａＤＮＰ重鎖およびヒトａＤＮＰ軽鎖と共発現して１価ａＤＮＰ  Ａｂ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ分子を形成した。この１価構築物の図解を図１Ｆに提示する。１価ａＤＮＰ  ＨＣ−ＳｈＫ（１−３５、Ｑ１６Ｋ）Ａｂはヒト全血中のＴ細胞炎症を強力にブロックし、ＩＬ−２分泌を０．２７８ｎＭのＩＣ５０で抑制した（表７Ｈ）。分子のＫｖ１．３対Ｋｖ１．１選択性を評価する試験において、１価ａＤＮＰ  ＨＣ−ＳｈＫ（１−３５、Ｑ１６Ｋ）Ａｂ結合体のＫｖ１．３選択性は［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫペプチド単独よりも有意に優れていることが予期せず明らかとなった。この１価Ａｂ−ＳｈＫ結合体のＫｖ１．３対Ｋｖ１．１ブロックは５８０６倍超活動的であった（表７Ｈ）。
【０４８３】
【表１２】
2018139609.tif 000027
2018139609.tif 000028
【０４８４】
【表１３】
2018139609.tif 000029
【０４８５】
【表１４】
2018139609.tif 000030
【０４８６】
【表１５】
2018139609.tif 000031
【０４８７】
【表１６】
2018139609.tif 000032
【実施例６】
【０４８８】
Ｋｖ１．３およびＫｖ１．１電気生理学的手法
Ｋｖ１．７を介したＫｖ１．１発現細胞系。ＣＨＯ−Ｋ１細胞をヒトＫｖ１．３で、またはカウンタースクリーンのため（本明細書の実施例８を参照されたい）、ｈＫｖ１．４、ｈＫｖ１．６、もしくはｈＫｖ１．７で安定的にトランスフェクトした；ＨＥＫ２９３細胞はヒトＫＶ１．３もしくはヒトＫｖ１．１を安定的に発現していた。細胞系はＡｍｇｅｎまたはＢｉｏＦｏｃｕｓ  ＤＰＩ（Ａ  Ｇａｌａｐａｇｏｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ）から得た。ｈＫｖ１．２を安定的に発現しているＣＨＯ  Ｋ１細胞は、カウンタースクリーンのため、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｃａｔ＃．ＣＹＬ３０１５）から購入した。
【０４８９】
完全細胞パッチクランプ電気生理学的手法。完全細胞電流を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）のＭｕｌｔｉＣｌａｍｐ  ７００Ｂ増幅器を用いて、ホウケイ酸ガラス（Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，  Ｉｎｃ）から引き出した３〜５ＭΩピペットで室温で記録した。データ獲得中、容量性電流をアナログ減法により中止し、一連の抵抗補償作用を用い、すべての電流を２ｋＨｚでろ波した。細胞を細胞外溶液（１．８ｍＭ  ＣａＣｌ２、５ｍＭ  ＫＣｌ、１３５ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭグルコース、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ含有、ｐＨ７．４、２９０〜３００ｍＯｓｍ）中に浸した。内溶液は、９０ｍＭ  ＫＣｌ、４０ｍＭ  ＫＦ、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＥＧＴＡ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２、２９０〜３００ｍＯｓｍ）を含有した。脱分極性電圧工程−８０ｍＶ〜＋３０ｍＶを３０秒ごと（Ｋｖ１．３）または１０秒ごと（Ｋｖ１．１）に２００ミリ秒間の間隔で、−８０ｍＶ電位を保持しつつ適用することにより電流を引き起こした。ＩＣ５０を決定するため、５〜６個のペプチドまたはペプチド結合体（濃度１：３希釈）を０．１％ＢＳＡを含む細胞外溶液中で作製し、Ｒａｐｉｄ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｈａｎｇｅｒ  ＲＳｃ−１６０（ＢｉｏＬｏｇｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で細胞に局所的に送達した。各濃度において電流は定常状態に達した。ｐＣＬＡＭＰ（９．２版）およびＯｒｉｇｉｎＰｒｏ（７版）を用いてデータ分析を実施し、各試験物質の適応前後のピーク電流を用いて各濃度の電流阻害率を算出した。
【０４９０】
ＰａｔｃｈＸｐｒｅｓｓ（商標）、平面パッチクランプ電気生理学的手法。細胞を細胞外溶液（１．８ｍＭ  ＣａＣｌ２、５ｍＭ  ＫＣｌ、１３５ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭグルコース、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ含有、ｐＨ７．４、２９０〜３００ｍＯｓｍ）中に浸した。内溶液は、９０ｍＭ  ＫＣｌ、４０ｍＭ  ＫＦ、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＥＧＴＡ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２、２９０〜３００ｍＯｓｍ）を含有した。ＩＣ５０を決定するため、概して、５個のペプチドまたはペプチド結合体（濃度１：３希釈）を作製した。ペプチドまたはペプチド結合体は、０．１％ＢＳＡを含む細胞外溶液中で調製する。デンドロトキシン−ｋおよびマルガトキシンをＡｌｏｍｏｎｅ  Ｌａｂｓ  Ｌｔｄ．  （Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ，  Ｉｓｒａｅｌ）から購入した；ＳｈＫ毒素をＢａｃｈｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｉｎｃ．  （Ｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｒｕｓｓｉａ，  ＰＡ）から購入した；４−ＡＰをＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ．  （Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）から購入した。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．  （Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，  ＣＡ）のＰａｔｃｈＸｐｒｅｓｓ（商標）７０００Ａ電気生理系を用いて室温で電流を記録した。ｈＫｖ１．３およびｈＫｖ１．１の電圧プロトコールを本明細書の実施例８の表７Ｍに示す。０．１％ＢＳＡを含む細胞外溶液を最初に適用して１００％対照（ＰＯＣ）を得てから、５つの異なる濃度の１：３ペプチドまたはペプチド結合体希釈をそれぞれ４００ミリ秒インキュベーションした。最終的に、過剰な特異的基準イオンチャネル阻害剤（実施例８の表７Ｍ）を添加して完全な、すなわち１００％ブロックを定義した。一部の例で基準阻害剤の添加後に存在する残りの電流を用いてゼロ％対照を算出した。Ｋｖ１．３およびＫｖ１．１の基準阻害剤を実施例８の表７Ｍに記載する。個々のセットのトレースをそれぞれ視認して、許容または拒絶した。一般的な許容基準は以下であった。
１．ベースライン電流は安定していなければならない
２．初回ピーク電流は３００ｐＡ超でなければならない
３．初回Ｒｍおよび最終Ｒｍは３００Ｏｈｍ超でなければならない
４．ピーク電流は第一化合物の添加前に定常状態に達さなければならない。
【０４９１】
次の濃度の化合物を添加前に直近の５つの平均ピーク電流からＰＯＣを算出し、ＩＣ５０を算出するためにエクセルにエクスポートした。
【０４９２】
ＩｏｎＷｏｒｋｓ、ハイスループット平面パッチクランプ電気生理学的手法。
ｈＫｖ１．３を安定的に発現しているＣＨＯ細胞およびｈＫｖ１．１を安定的に発現しているＨＥＫ２９３細胞上で電気生理学的手法を行った。ＩＷＱ電気生理学的手法のためのＳｈＫアナログおよび結合体を含む「アッセイプレート」の調製手順は以下のとおりであった：０．３％ＢＳＡを含む細胞外緩衝液（０．９ｍＭ  Ｃａ２＋および０．５ｍＭ  Ｍｇ２＋含有ＰＢＳ）ですべてのアナログを溶解し、９６ウェルポリプロピレンプレートのＨ列にカラム１〜カラム１０に濃度１００ｎＭで分配した。カラム１１および１２を陰性および陽性対照のために保留してから、１：３比で連続希釈してＡ列で分配した。ＩｏｎＷｏｒｋｓ  Ｑｕａｔｔｒｏ（ＩＷＱ）電気生理学的手法およびデータ分析を以下のとおり成し遂げた：再懸濁した細胞（細胞外緩衝液中）、アッセイプレート、Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  Ｐａｔｃｈ  Ｃｌａｍｐ（ＰＰＣ）パッチプレートならびに適切な細胞内（９０ｍＭグルコン酸カリウム、２０ｍＭ  ＫＦ、２ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＥＧＴＡ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３５）および細胞外緩衝液をＩｏｎＷｏｒｋｓ  Ｑｕａｔｔｒｏ上に位置した。アナログをパッチプレートに添加した場合、アッセイプレートから０．１％ＢＳＡでさらに３倍希釈して３３．３ｎＭ〜１５ｐＭの範囲の最終試験濃度に達した。アンホテリシンベースの穿孔パッチクランプ手順を用いてＣＨＯ−Ｋｖ１．３およびＨＥＫ−Ｋｖ１．１細胞の電気生理記録を取った。ＩｏｎＷｏｒｋｓ  Ｑｕａｔｔｒｏの電圧クランプ回路構成を用いて、細胞を膜電位−８０ｍＶで保持し、膜電位を４００ミリ秒間＋３０ｍＶに進めることにより電圧活性化Ｋ＋電流を引き起こした。対照条件下すなわち実験開始時に阻害剤の非存在下、１０分インキュベーション後にアナログおよび対照の存在下でＫ＋電流を引き起こした。４３０〜４４０ミリ秒の平均Ｋ＋電流振幅を測定し、データをＭｉｃｒｏｓｏｆｔ社のエクセルシートにエクスポートした。各濃度のアナログおよび対照の存在下におけるＫ＋電流振幅を同じウェル中の前化合物の電流振幅のＫ＋電流率として表した。これらの対照値％を濃度関数としてプロット時、各化合物のＩＣ５０値は以下の方程式を用いるエクセル適合プログラムにおいて用量反応適合モデル２０１を用いて算出し得る：
【０４９３】
【数１】
2018139609.tif 000033
式中、ｙｍｉｎは曲線のｙ最小値であり、ｙｍａｘは曲線のｙ最大値であり、ｃｏｎｃは試験濃度であり、ｎは曲線の傾斜値である。
【実施例７】
【０４９４】
ヒト全血中の生体活性の測定
ＩＬ−２およびＩＦＮ−ｇ分泌に与える毒素ペプチドアナログＫｖ１．３阻害剤の影響を評価するためのＥｘ  ｖｉｖｏアッセイ。既に記載されているエクスビボアッセイ（その全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２００８／０８８４２２Ａ２号の実施例４６を参照されたい）を用いて、ＳｈＫアナログおよび結合体がヒト全血中のＴ細胞炎症をブロックする効能を評価した。簡単に述べると、５０％ヒト全血液をタプシガルジンで刺激してストア枯渇、カルシウム可動化およびサイトカイン分泌を誘発する。Ｔ細胞サイトカイン分泌のブロックにおける分子の効能を評価するため、タプシガルジン刺激を加える３０〜６０分前に各種濃度のＫｖ１．３ブロックペプチドおよびペプチド結合体をヒト全血液試料でプレインキュベートした。４８時間後、３７℃、５％ＣＯ２で、条件培地を収集し、ＭｅｓｏＳｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙから４点電気化学発光免疫アッセイを用いてサイトカイン分泌レベルを決定した。タプシガルジン刺激を用いて、複数ドナーから単離した血液からロバスト的にサイトカインＩＬ−２およびＩＦＮ−ｇを分泌した。タプシガルジン刺激後にヒト全血中に産生されたＩＬ−２およびＩＦＮ−ｇを、細胞内サイトカイン染色および蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）分析により明らかにしたようにＴ細胞から産生した。
【０４９５】
Ｋｖ１．３は、Ｔ細胞上に存在する大電位依存性カリウムチャネルである。Ｋｖ１．３はＫ＋を流出させ、有効なＴ細胞活性化およびサイトカイン分泌のために必要な細胞内カルシウムの持続的増加のために必要である持続的Ｃａ２＋流入の駆動力を提供する。Ｋｖ１．３阻害剤はＴＣＲ結紮により誘発されたこのカルシウム流動を抑制することが既に示されている（Ｇ．Ｃ．  Ｋｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｃｅｌｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９７，  ９９−１０７）。タプシガルジン誘発性のストア枯渇およびＴＣＲ結紮は、単離されたＴ細胞においてＣａ２＋可動化の類似パターンを引き出すが（Ｅ．  Ｄｏｎｎａｄｉｅｕ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６７，  ２５８６４−２５８７２）、タプシガルジンは全血中でより大きいロバスト反応を与えることを我々は見出した。したがって、我々は、Ｋｖ１．３阻害剤のヒト全血中のＴ細胞からのタプシガルジン誘発サイトカイン分泌のブロック能を評価することにより生体活性を評価するバイオアッセイを開発した。全血液は高タンパク質レベルを含む複合流体であるため、この全血液アッセイにおけるペプチドおよびペプチド結合体の活性は生物学的に関連した流体中の４８時間にわたる分子安定性の評価においてさらなる利点を有する。全血液アッセイにより、電気生理学的手法（ｅＰｈｙｓ）により決定した分子のＫｖ１．３効能の重要な再確認が行われる。なぜなら、ｅＰｈｙｓアッセイは一般に短時間（１〜２時間未満）であり、タンパク質を含まない生理食塩水を用いるためである。長時間の全血液アッセイでは、短時間のｅＰｈｙｓ検査と比較してより効果的な平衡結合反応速度の決定が可能であり得る。
【実施例８】
【０４９６】
イオンチャネルのカウンタースクリーン
Ｋｖ１．１、Ｋｖ１．２、Ｋｖ１．３、Ｋｖ１．４、Ｋｖ１．６およびＫｖ１．７、ＰａｔｃｈＸｐｒｅｓｓ（商標）、平面パッチクランプ電気生理学的手法。上記の実施例６に記載の方法および細胞を用いるＭＤＣのＰａｔｃｈＸｐｒｅｓｓ（商標）７０００Ａ電気生理系を用いて、イオンチャネル電流を室温で記録できる。各チャネルの電圧プロトコールを下表７Ｍに示す。
【０４９７】
【表１７】
2018139609.tif 000034
【０４９８】
心イオンチャネルカウンタースクリーン（ｈＥＲＧ、ｈＫｖＬＱｔ１／ｈｍｉｎＫ、ｈＮａｖ１．５、ｈＫｖ１．５、ｈＣａｖ１．２、ｈＫｖ４．３）。
【０４９９】
細胞系。ｈＫｖＬＱＴ１／ｈｍｉｎＫおよびｈＥＲＧで安定的にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞をＡｍｇｅｎまたはＣｙｔｏｍｙｘ，  Ｉｎｃから得た。ヒトｈＮａｖ１．５で安定的にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞をＣｙｔｏｍｙｘ，  Ｉｎｃから購入した。ｈＫｖ４．３を安定的に発現しているＨＥＫ２９３細胞およびｈＫｖ１．５を安定的に発現しているＣＨＯ細胞をＣｈａｎＴｅｓｔから得た。ヒトＬ型カルシウムチャネルｈＣａｖ１．２を安定的に発現しているＣＨＯ細胞をＣｈａｎＴｅｓｔから得て、ｈＣａｖ１．２をコードするヒトＣＡＣＮＡ１Ｃ遺伝子を含み、ヒトＣＡＣＮＢ２によりコードしたβ２サブユニットおよびＣＡＣＮＡ２Ｄ１遺伝子によりコードしたα２δ１を共発現した。
【０５００】
ＦＡＳＴＰａｔｃｈ（商標）試験をＣｈａｎＴｅｓｔで実施して、ＰａｔｃｈＸｐｒｅｓｓ（Ｍｏｄｅｌ  ７０００Ａ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，  Ｕｎｉｏｎ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）電気生理学的手法に関与するクローン化ヒトＬ型カルシウムチャネルｈＣａｖ１．２、クローン化ｈＫｖ４．３およびクローン化ｈＫｖ１．５に与えるペプチドおよび結合体の影響を室温で評価した。細胞外記録溶液（ＨＢ−ＰＳ）は、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、４ｍＭ  ＫＣｌ、１．８ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび１０ｍＭグルコースを含有し、ＮａＯＨでｐＨ７．４０に調整した。ｈＫｖ４．３およびｈＫｖ１．５のための細胞内記録溶液は、１３０ｍＭアスパラギン酸カリウム、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＥＧＴＡ、４ｍＭ  ＡＴＰおよび１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含有し、ＫＯＨでｐＨ７．２に調整した。ｈＣａｖ１．２のための細胞内溶液は、１３０ｍＭアスパラギン酸セシウム、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＥＧＴＡ、４ｍＭ  ＡＴＰ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．１ｍＭ  ＧＴＰおよび１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含有し、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミンでｐＨ７．２に調整した。記録調製において、細胞内溶液は、Ｓｅａｌチップ１６平面電極の細胞内区画中に負荷する。細胞懸濁液は、Ｓｅａｌチップ１６平面電極の細胞外区画内にピペットした。完全細胞配置を確立後、ＰａｔｃｈＸｐｒｅｓｓ（商標）系における二重チャネルパッチクランプ増幅器を用いて膜電流を記録する。デジタル化前、電流は５分の１のサンプリング頻度で低域ろ波した。１％ＢＳＡでＨＢ−ＰＳに希釈した３つの濃度のペプチド結合体（試験物質）を５分間隔で天然細胞に適用する。溶液交換を４回行い、各試験物質濃度への曝露時間を５分とした。ビヒクル対照は天然細胞にも適用し、溶液交換後、陽性対照を適用してイオンチャネルブロックに対する感受性を検証する。すべての陽性対照を０．３％ＤＭＳＯでＨＢ−ＰＳに希釈した。チャネルブロックの陽性対照は、ｈＣａｖ１．２電流を約７５％ブロックするニフェジピン（０．０１μＭ）、ｈＫｖ４．３電流を約７５％阻害するフレカイニド（０．１ｍＭ）、ｈＫｖ１．５電流を約８０％ブロックする４−アミノピリジン（２ｍＭ）などであった。有効な完全細胞記録は以下の基準：（１）膜耐性（Ｒｍ）≧２００ＭΩ、（２）漏電≦チャネル電流の２５％、を満たさなければならない。ｈＣａｖ１．２、ｈＫｖ４．３およびｈＫｖ１．５の試験手段は以下のとおりとした。
【０５０１】
ａ．）ｈＣａｖ１．２試験手段。保持電位−４０ｍＶから１０秒間隔で行う脱分極試験パルス（時間、２００ミリ秒；振幅、１０ｍＶ）からなる刺激電圧パターンを用いてｈＣａｖ１．２／β２／α２δチャネルの発現および定常状態ブロックを測定した。試験物質濃度は、適用間で洗浄せずに昇順に累積的に適用してよい。１０ｍＶへ進む間にピーク電流を測定した。ｈＣａｖ１．２電流をブロックするため、各実験最後に飽和濃度のニフェジピン（１０μＭ）を追加する。漏電を記録した総膜電流からデジタル方式で減じた。
【０５０２】
ｂ．）ｈＫｖ４．３試験手段。固定振幅（脱分極：０ｍＶ、３００ミリ秒間）で保持電位−８０ｍＶから１０秒間隔で反復したパルスパターンを用いて、ｈＫｖ４．３電流の発現および定常状態ブロックを測定した。０ｍＶへ進む間にピークおよび持続した試験パルス電流振幅を測定した。
【０５０３】
ｃ．）ｈＫｖ１．５試験手段。固定振幅（脱分極：＋２０ｍＶ振幅、３００ミリ秒時間）で保持電位−８０ｍＶから１０秒間隔で反復したパルスパターンを用いて、ｈＫｖ１．５電流の発現および定常状態ブロックを測定した。＋２０ｍＶへ進む最後に電流の振幅を測定した。
【０５０４】
ＰａｔｃｈＸｐｒｅｓｓ（商標）系を用いたクローン化ヒトＮａｖ１．５  ナトリウムチャネルに対するカウンタースクリーン。細胞外（ＨＢ−ＰＳ２）記録溶液は、７０ｍＭ  ＮａＣｌ、６７ｍＭ  Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、４ｍＭ  ＫＣｌ、１．８ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭグルコースを含有し、ＨＣｌでｐＨ７．４に調整した。内記録溶液は、１３０ｍＭ  ＣｓＦ、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＥＧＴＡ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含有し、ＣｓＯＨでｐＨ７．２０に調整した。参照標準または試験物質の原液を適用前にＨＢ−ＰＳ２に希釈した。試験物質は本明細書に記載のペプチドまたはペプチド結合体のいずれかを含む。リドカイン（１〜３０μＭ）を参照標準とした。標準化工程プロトコールは、ｈＮａｖ１．５ナトリウムチャネルを介してイオン電流を引き出すために用いる。細胞は−８０ｍＶで保持する。固定振幅（プレパルス条件：−１２０ｍＶ、５０ミリ秒；−３０ｍＶ、２０ミリ秒に進める脱分極試験）でパルスパターンを１０秒間隔で反復して用いて、試験物質によるｈＮａｖ１．５ナトリウム電流の発現および定常状態ブロックを測定した。エピソードモードで電流を３ｋＨｚでろ波して１０ｋＨｚで得た。良好な記録を確立した場合、細胞を２分間洗浄してから、対照ビヒクルを５分間適用した。次いで対照および各濃度の試験物質を５分間適用した。各濃度を１分間隔で３回添加した。吸引分配速度は４０μＬ／ｓであった。ＩＣ５０を決定するため、試験物質１μＭ、３μＭ、１０μＭおよび３０μＭを細胞（ｎ＝３細胞）に昇順に累積的に（試験物質濃度の間で洗浄せず）、各細胞（ｎ＝細胞数の場合、ｎ＝３）に対して適用した。各濃度の試験物質を５分間適用した。各濃度を１分間隔で３回添加した。ＰａｔｃｈＸｐｒｅｓｓ  Ｃｏｍｍａｎｄｅｒ  ｖ１．４（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，  Ｕｎｉｏｎ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）を用いて電気生理データを得て、分析はＤａｔａＸｐｒｅｓｓ  ｖ１．４（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，  Ｕｎｉｏｎ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）を用いて行った。試験物質適応前後の５ピーク電流を用いて各濃度の電流阻害率を算出した。良好な記録の許容基準は：（１）シール耐性＞２００ＭΩ、（２）アクセス耐性＜１０ＭΩ、（３）ピーク尾電流＞２００ｐＡ、（４）漏電＜ピーク尾電流の２５％、（５）対照ビヒクルにおける分析＜２．５％／分などである。
【０５０５】
ＰａｔｃｈＸｐｒｅｓｓ（商標）系を用いた、ヒトＩＫ（ｈＫｖＬＱＴ１＋ｈｍｉｎＫ）カリウムチャネルに対するカウンタースクリーン。細胞外記録溶液はＨＢ−ＰＳとした。内記録溶液は、２０ｍＭ  ＫＦ、９０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＥＧＴＡ、５ｍＭ  Ｋ２ＡＴＰ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含有し、ＫＯＨでｐＨ７．２０に調整した。参照標準または試験物質の原液を適用前にＨＢ−ＰＳ２に希釈した。試験物質は本明細書に記載のペプチドまたはペプチド結合体のいずれかを含有した。Ｃｈｒｏｍａｎｏｌ  ２９３Ｂ（０．３〜１０μＭ）を参照標準とした。標準化工程プロトコールを用いて、ＩＫカリウムチャネルを介してイオン電流を引き出した。細胞を−８０ｍＶで保持した。固定振幅（＋５０ｍＶ、５秒間に進める脱分極試験）でパルスパターンを１０秒間隔で反復して用いて、試験物質によるＩＫカリウム電流の発現および定常状態ブロックを測定した。エピソードモードで電流を３ｋＨｚでろ波して１０ｋＨｚで得た。良好な記録を確立した場合、細胞を２分間洗浄してから、対照ビヒクルを５分間適用した。次いで対照および各濃度の試験物質を５分間適用した。各濃度を１分間隔で３回添加した。吸引分配速度は４０μＬ／ｓであった。１μＭ、３μＭ、１０μＭおよび３０μＭの試験物質を細胞（ｎ＝３細胞）に昇順に累積的に（試験物質濃度の間で洗浄せずに）各細胞（ｎ＝細胞数の場合、ｎ＝３）に適用した。各濃度の試験物質を５分間適用した。各濃度を１分間隔で３回添加した。ＰａｔｃｈＸｐｒｅｓｓ（商標）Ｃｏｍｍａｎｄｅｒ  ｖ１．４（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，  Ｕｎｉｏｎ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）を用いて電気生理データを得て、分析はＤａｔａＸｐｒｅｓｓ  ｖ１．４（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，  Ｕｎｉｏｎ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）を用いて行った。試験物質適応前後の５ピーク電流を用いて、各濃度の電流阻害率を算出した。良好な記録の許容基準は：（１）シール耐性＞２００ＭΩ、（２）アクセス耐性＜１０ＭΩ、（３）ピーク尾電流＞２００ｐＡ、（４）漏電＜ピーク電流の２５％、（５）対照ビヒクルにおける分析＜２．５％／分、などである。
【０５０６】
従来の完全細胞パッチクランプ電気生理学的手法によるヒトＩＫｒ（ｈＥＲＧまたはｈＫｖ１１．１）カリウムチャネルに対するカウンタースクリーン。電気生理実験前に一晩インキュベーションのため、３５ｍｍポリ−ｄ−リジンでコーティングしたカバーグラス上に細胞懸濁液を１〜２滴添加した。パッチクランプ技術の強固なＧΩシール配置を用いて、単一細胞から完全細胞電流を記録した。培養基をすすいで、細胞外記録緩衝液（１３５ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、１．８ｍＭ  ＣａＣｌ２、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、および５ｍＭグルコース含有、ｐＨを７．４０にＮａＯＨで調整し、浸透圧を３００ｍＯｓｍで設定した）で置換後、３５ｍｍカバーグラスを記録段階に移した。平行して配置し、記録する細胞上面にガラスキャピラリーを直接乗せる運動性化ロッドに結合したガラスキャピラリーの１つを介して細胞外記録緩衝液で細胞を連続的に灌流した。ｈＥＲＧプロファイリングにおいて、記録ピペット溶液は、１３０ｍＭ  ＫＦ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＥＧＴＡ、および１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含有し、ＫＯＨでｐＨ７．４０に調整して、浸透圧を２８０ｍＯｓｍで設定した。室温で実験を実施し、ＭｕｌｔｉＣｌａｍｐ  ７００Ａ増幅器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｉｎｃ．）を用いて記録した。ピペット耐性は典型的には２〜３ＭΩであった。細胞を電位−８０ｍＶで保持した。ピーク外向き尾電流のベースラインまたは基準点を得るために、−５０ｍＶ、５００ミリ秒間への工程を用いた。この後、＋２０ｍＶ、２秒間の脱分極性工程を行い、チャネルを不活性状態へ促進した。−５０ｍＶ、２秒間に戻す工程は、不活性化させて緩和し、ピークｈＥＲＧ電流を測定した。パルスを１０秒ごとに反復した。総ｈＥＲＧ電流を、−５０ｍＶ工程で再分極時のピーク電流と−５０ｍＶのベースライン電流間の差として測定した。試験物質（最大１０μＭ）（本明細書に記載のペプチドおよびペプチド結合体を含む）を細胞外記録緩衝液（０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有）中に混合し、続いてガラス灌流容器に移した。電子ピンチ弁は容器から記録する細胞上への試験物質の流出を制御した。ＩＣ５０値および曲線適合は、ＸＬｆｉｔソフトウェアの４変数ロジスティック適合を用いて推測した。ｈＥＲＧチャネル阻害剤、シサプリドを用いてアッセイを有効化した。
【０５０７】
従来の完全細胞パッチクランプ電気生理学的手法によるカルシウム活性化カリウムチャネルヒトＩＫＣａ１およびＢＫＣａに対するカウンタースクリーン。ＣＨＯ  ＩＫＣａおよびＢＫＣ細胞系をＢｉｏＦｏｃｕｓ  ＤＰＩ（Ａ  Ｇａｌａｐａｇｏｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ）から得た。電気生理実験前に一晩インキュベーションのため、３５ｍｍポリ−ｄ−リジンでコーティングしたカバーグラス上に細胞懸濁液を１〜２滴添加した。パッチクランプ技術の強固なＧΩシール配置を用いて、単一細胞から完全細胞電流を記録した。培養基をすすいで、細胞外記録緩衝液（１３５ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、１．８ｍＭ  ＣａＣｌ２、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、および５ｍＭグルコース含有、ｐＨを７．４０にＮａＯＨで調整し、浸透圧を３００ｍＯｓｍで設定した）で置換後、３５ｍｍカバーグラスを記録段階に移した。平行して配置し、記録する細胞上面にガラスキャピラリーを直接乗せる運動性化ロッドに結合したガラスキャピラリーの１つを介して細胞外記録緩衝液で細胞を連続的に灌流した。ｈＥＲＧプロファイリングにおいて、記録ピペット溶液は、１３０ｍＭアスパラギン酸カリウム、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．２６ｍＭ  ＣａＣｌ２、２ｍＭ  ＥＧＴＡ、２ｍＭ  Ｍｇ−ＡＴＰおよび１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含有し、ＫＯＨでｐＨ７．４０に調整して、浸透圧を２８０ｍＯｓｍで設定した。室温で実験を実施し、ＭｕｌｔｉＣｌａｍｐ  ７００Ａ増幅器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｉｎｃ．）を用いて記録した。細胞を電位−８０ｍＶで保持した。ＢＫ電流とＩＫ電流の両方を、記録ピペット溶液から細胞内に拡散したカルシウムイオンとして活性化した。カルシウム拡散によるカルシウム依存性の外向きのカリウム電流の活性化は一般に完全な活性化のために３〜５分かかる。薬剤曝露前および曝露中、外向きの電流を保持電位＋５０ｍＶで持続的にモニタリングした。あるいは、４００ミリ秒電圧ランプ−１２０〜＋６０ｍＶを１０秒ごとに反復して、薬剤の曝露前と曝露中の両チャネルの電流電圧関係を特性化した。試験物質（最大１０μＭ）（本明細書に記載のペプチドおよびペプチド結合体を含む）を細胞外記録緩衝液（０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有）中に混合し、続いてガラス灌流容器に移した。電子ピンチ弁は容器から記録する細胞上への試験物質の流出を制御した。ピペット抵抗は通常２−３ＭΩであった。ＩＣ５０値および曲線適合は、ＸＬｆｉｔソフトウェアの４変数ロジスティック適合を用いて推測した。ＩＫＣａおよびＢＫ阻害ペプチド、カリブドトキシン（１００ｎＭ）をアッセイの薬理学的検証に用いるアッセイ手段の終了時に適用した。
【実施例９】
【０５０８】
ＡＭＰ５−aＫＬＨ融合物
ＡＭＰ５  ＴＰＯ模倣ペプチドを全４つの可能な末端融合配置（図１Ｆ〜１Ｋ；図４５に図解）で本発明の抗ＫＬＨ抗体に遺伝的に融合した、すなわち、両免疫グロブリン軽鎖単量体および両免疫グロブリン重鎖単量体にＮ末端融合およびＣ末端融合し、哺乳類（ＣＨＯ）細胞内で発現させた。次いで融合物をタンパク質Ａクロマトグラフィー（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）により２価陽イオンを含まないダルベッコのＰＢＳ  １０カラム容量を洗浄緩衝液として、および１００ｍＭ酢酸を溶出緩衝液として７℃で用いて精製した。クロマトグラムに基づき溶出ピークをプールして、２Ｍトリス塩基を用いてｐＨを約５．０に増大した。次いでプールを少なくとも４容量の水で希釈してからＳＰ−ＨＰセファロースカラム（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）上に負荷し、１０カラム容量のＳ緩衝液Ａ（２０ｍＭ酢酸、ｐＨ５．０）で洗浄した後、６０％Ｓ緩衝液Ｂ勾配（２０ｍＭ酢酸、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．０）の２０カラム容量を用いて７℃で溶出した。クロマトグラムに基づきプールを作製し、１０ｋＤａ  Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒｓ（Ｐｉｅｒｃｅ）を４℃で用いて物質を２０容量超の１０ｍＭ酢酸、９％ショ糖（ｐＨ５．０）に対して透析した。次いで透析物質を０．２２μｍ酢酸セルロースフィルターを介してろ過し、吸光度２８０ｎｍで濃度を決定した。各抗体５０μｇを融合していない対照と共にＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＳＥＣ  ３０００カラム（７．８×３００ｍｍ）の５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ６．５、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ溶液に注入し、１ｍＬ／分で展開して吸光度２８０ｎｍで観察した（図３９）。各抗体の分析を、２２０Ｖで展開した１．０ｍｍトリス−グリシン４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｎｏｖｅｘ）を用いて、還元および非還元負荷緩衝液を用いて、ＱｕｉｃｋＢｌｕｅ（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）により染色して行い（図４０Ａ〜Ｅ）、ＬＣ−ＭＳにより質量を決定した（図４１Ａ〜Ｄ）。
【０５０９】
様々なaＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２−ＡＭＰ５、ＡＭＰ５−aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２、aＫＬＨ１２０．６ｈＩｇＧ１（Ｎ２９７Ｑ）−ＡＭＰ５−Ｆｃ（ＣＨ３）ループ融合、およびＡＭＰ５−aＫＬＨ１２０．６κの成分の実施形態は、以下のポリペプチド単量体を含む：
（ａ）aＫＬＨ１２０．６κＬＣ（上記の配列番号２８）；
（ｂ）aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＨＣ（上記の配列番号２９）；
（ｃ）aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ１  ＨＣ（上記の配列番号３４）；
（ｃ）以下のアミノ酸配列を有するaＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＨＣ−Ａｍｐ５：
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＨＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲＧＳＹＹＷＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＧＧＱＧＣＳＳＧＧＰＴＬＲＥＷＱＱＣＲＲＡＱＨＳ／／（配列番号３２４）；
（ｄ）以下のアミノ酸配列を有するＡｍｐ５−aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＨＣ（配列番号３３２）：
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣＱＧＣＳＳＧＧＰＴＬＲＥＷＱＱＣＲＲＡＱＨＳＧＧＧＧＧＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＨＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲＧＳＹＹＷＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＱＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ／／（配列番号３３２）。
（ｅ）以下のアミノ酸配列を有するaＫＬＨ１２０．６ｈＩｇＧ１  Ｎ２９７Ｑ−Ａｍｐ５  Ｆｃ（ＣＨ３）ループ：
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＨＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲＧＳＹＹＷＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＱＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＧＧＱＧＣＳＳＧＧＰＴＬＲＥＷＱＱＣＲＲＡＱＨＳＧＧＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ／／（配列番号３４１）；
（ｆ）以下のアミノ酸配列を有するＡｍｐ５−aＫＬＨ１２０．６κＬＣポリペプチド融合物：
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣＱＧＣＳＳＧＧＰＴＬＲＥＷＱＱＣＲＲＡＱＨＳＧＧＧＧＧＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＲＮＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＲＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＨＮＳＹＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ／／（配列番号３４２）。
【０５１０】
aＫＬＨ１２０．６−ＩｇＧ２重鎖（ＨＣ）−ＡＭＰ５哺乳類発現。所望のaＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＤｅｓＫ−ＡＭＰ５生成物は、１本の重鎖のＣ末端に融合したＡＭＰ５ペプチドを有する完全抗体であり、図１Ｆの図解を企図し、ＰＦＵ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｕｌｔｒａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の２つの別々のラウンドにより会合した。第一ラウンドのＰＣＲにより２つの断片：ＶＫ１ｓｐ−aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＨＣ  ＤｅｓＫ−Ｇ５およびＧ５−ＡＭＰ５断片が産生された。これらの断片を産生するために用いたオリゴおよびＰＣＲ鋳型は以下の配列番号３２５および３２６であった。ポリメラーゼ連鎖反応１（ＰＣＲ１）によりＶＫ１ｓｐ−aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＨＣ  ＤｅｓＫ−Ｇ５断片が産生され、ＶＫ１ｓｐ−aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＤｅｓＫ  ＨＣペプチドのためにコードした既存のＤＮＡを鋳型として用いた。
【０５１１】
順行プライマー配列は：
ＡＡＧ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＧＴＣ  ＧＡＣ  ＴＡＧ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＧＡＣ  ＡＴＧ  ＡＧＧ  ＧＴＧ  ＣＣＣ  ＧＣＴ  ＣＡＧ  ＣＴＣ  ＣＴＧ  ＧＧＧ  ＣＴ／／（配列番号３２５）であり；および
逆行プライマー配列は：
ＧＣＣ  ＧＣＴ  ＧＣＴ  ＧＣＡ  ＧＣＣ  ＣＴＧ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＴＣＣ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＣＧＧ  ＡＧＡ  ＣＡＧ  ＧＧＡ  ＧＡＧ／／（配列番号３２６）であった。
【０５１２】
ＰＣＲ１から産生したＶＫ１ｓｐ−aＫＬＨ１２０．６  ＩｇＧ２  ＨＣ  ＤｅｓＫ−Ｇ５断片によりコードされたアミノ酸配列は：
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＨＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲＧＳＹＹＷＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＧＧＱＧＣ／／（配列番号３２７）であった。
【０５１３】
ポリメラーゼ連鎖反応２（ＰＣＲ２）によりＧ５−ＡＭＰ５断片（配列番号３３０）が産生され、ＡＭＰ５ポリペプチドをコードする既存のＤＮＡを以下のプライマー配列と共に鋳型として用いた。
【０５１４】
順行プライマー配列は
ＣＴＣ  ＴＣＣ  ＣＴＧ  ＴＣＴ  ＣＣＧ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＧＧＡ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＣＡＧ  ＧＧＣ  ＴＧＣ  ＡＧＣ  ＡＧＣ  ＧＧＣ／／（配列番号３２８）であり；および
逆行プライマー配列は：
ＣＴＡ  ＣＴＡ  ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＧＣＴ  ＣＡＧ  ＣＴＡ  ＴＧＣ  ＴＧＡ  ＧＣＧ  ＣＧＧ  ＣＧ／／（配列番号３２９）であった。ＰＣＲ２から産生した断片によりコードされたアミノ酸配列は：
ＬＳＬＳＰＧＧＧＧＧＧＱＧＣＳＳＧＧＰＴＬＲＥＷＱＱＣＲＲＡＱＨＳ／／（配列番号３３０）であった。
【０５１５】
生成物を１％アガロースゲル上に流した。バンドにアガロースプラグ用の穴を開けてプラグを新しいＰＣＲ反応管に入れた。次いで外プライマー配列番号３２５および配列番号３２９を用いてＰＣＲ３によりアガロースプラグを増幅した。最終ＰＣＲ生成物を１％アガロースゲル上に流した。正確なサイズの生成物を切断してから、ＱｉａｇｅｎのＧｅｌ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキットによりゲル精製した。ＶＫ１ｓｐ−aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＤｅｓＫ  ＨＣ−Ｇ５−ＡＭＰ５の精製したゲル断片を制限酵素ＳａｌＩおよびＮｏｔＩで消化してから、消化した生成物をＱｉａｇｅｎのＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキットにより精製した。同時に、ｐＴＴ５ベクター（ＣＭＶプロモーターおよびＰｏｌｙ  Ａ  ｔａｉｌを含むＡｍｇｅｎベクター）をＳａｌＩおよびＮｏｔＩにより切断した。ｐＴＴ５ベクターを１％アガロースゲル上に流して、大型断片を切断し、ＱｉａｇｅｎのＧｅｌ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキットによりゲル精製した。ＶＫ１ｓｐ−aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＤｅｓＫ  ＨＣ−Ｇ５−ＡＭＰ５生成物を大型ベクター断片と結紮して、ＯｎｅＳｈｏｔ（商標）Ｔｏｐ１０細菌性細胞に形質転換した。形質転換細菌コロニーからＤＮＡを単離し、配列分析のために提出した。１つの正確なクローンを大規模プラスミド精製用に選択した。
【０５１６】
最終ｐＴＴ５：ＶＫ１ｓｐ−aＫＬＨ１２０．６−ＩｇＧ２  ＤｅｓＫ  ＨＣ−Ｇ５−ＡＭＰ５構築物は以下のＩｇＧ２  ＤｅｓＫ  ＨＣ−ＡＭＰ５ポリペプチドをコードする：
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＨＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲＧＳＹＹＷＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＧＧＱＧＣＳＳＧＧＰＴＬＲＥＷＱＱＣＲＲＡＱＨＳ／／（配列番号３３１）。
【０５１７】
ＡＭＰ５−aＫＬＨ１２０．６−ＩｇＧ２重鎖（ＨＣ）哺乳類発現。
単量体を含む所望のＡＭＰ５−aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＤｅｓＫ  ＨＣ生成物（上記の配列番号３３２）は、１本の重鎖のＮ末端に融合するＡＭＰ５ペプチドを有する完全抗体であり、図１Ｉの図解を企図し、ＰＦＵ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｕｌｔｒａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）を用いてＰＣＲの２つの別々のラウンドにより会合した。第一ラウンドのＰＣＲにより３つの断片：ＶＫ１ｓｐ−ＡＭＰ５、ＡＭＰ５−Ｇ５、およびＧ５−aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＤｅｓＫ  ＨＣ断片が産生された。これらの断片を産生するために用いたオリゴおよびＰＣＲ鋳型を以下に列挙する。ポリメラーゼ連鎖反応１（ＰＣＲ１）によりＶＫ１ｓｐ−ＡＭＰ５が産生され、ＶＫ１ｓｐをコードする既存のＤＮＡを鋳型として用いた。この断片も、ＶＫ１ｓｐ−ＡＭＰ５−Ｇ５−aＫＬＨ１２０．６κ  ＬＣ構築において用いた点に留意されたい。
【０５１８】
順行プライマー配列は：
ＡＡＧ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＧＴＣ  ＧＡＣ  ＴＡＧ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＧＡＣ  ＡＴＧ  ＡＧＧ  ＧＴＧ  ＣＣＣ  ＧＣＴ  ＣＡＧ  ＣＴＣ  ＣＴＧ  ＧＧＧ  ＣＴ／／（配列番号３２５）であり；および
逆行プライマー配列は：
ＧＣＣ  ＧＣＴ  ＧＣＴ  ＧＣＡ  ＧＣＣ  ＣＴＧ  ＡＣＡ  ＴＣＴ  ＧＧＣ  ＡＣＣ  ＴＣＴ  ＣＡＡ  ＣＣ／／（配列番号３３３）であった。ＰＣＲ１から産生した断片によりコードされたアミノ酸配列は：
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣＱＧＣＳＳＧ／／（配列番号３３４）であった。
【０５１９】
ＰＣＲ２によりＡＭＰ５−Ｇ５を産生し、ＡＭＰ５ペプチドをコードする既存のＤＮＡを鋳型として用いた。
【０５２０】
順行プライマー配列は：
ＧＧＴ  ＴＧＡ  ＧＡＧ  ＧＴＧ  ＣＣＡ  ＧＡＴ  ＧＴＣ  ＡＧＧ  ＧＣＴ  ＧＣＡ  ＧＣＡ  ＧＣＧ  ＧＣ／／（配列番号３３５）であり；および
逆行プライマー配列は：
ＣＡＧ  ＣＴＧ  ＣＡＣ  ＣＴＧ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＴＣＣ  ＡＣＣ  ＧＣＴ  ＡＴＧ  ＣＴＧ  ＡＧＣ  ＧＣＧ／／（配列番号３３６）であった。
【０５２１】
ＰＣＲ２から産生した断片によりコードされたアミノ酸配列は：
ＷＬＲＧＡＲＣＱＧＣＳＳＧＧＰＴＬＲＥＷＱＱＣＲＲＡＱＨＳＧＧＧＧＧＱＶＱＬＶ／／（配列番号３３７）であった。
【０５２２】
ＰＣＲ３によりＧ５−aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＤｅｓＫ  ＨＣを産生し、aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＨＣ（配列番号２９）単量体をコードする既存のＤＮＡを鋳型として用いた。
【０５２３】
順行プライマー配列は：
ＣＧＣ  ＧＣＴ  ＣＡＧ  ＣＡＴ  ＡＧＣ  ＧＧＴ  ＧＧＡ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＣＡＧ  ＧＴＧ  ＣＡＧ  ＣＴＧ／／（配列番号３３８）であり；および
逆行プライマー配列は：
ＣＴＡ  ＣＴＡ  ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＧＣＴ  ＣＡＡ  ＣＣＣ  ＧＧＡ  ＧＡＣ  ＡＧＧ  ＧＡＧ  Ａ／／（配列番号３３９）であった。
【０５２４】
ＰＣＲ３から産生した断片によりコードされたアミノ酸配列は：
ＲＡＱＨＳＧＧＧＧＧＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＨＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲＧＳＹＹＷＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＱＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ／／（配列番号３４０）であった。
【０５２５】
生成物を１％アガロースゲル上に流した。バンドにアガロースプラグ用の穴を開けてプラグを新しいＰＣＲ反応管に入れた。次いで外プライマー配列番号３２５および配列番号３３９を用いてＰＣＲ４によりアガロースプラグを増幅した。最終ＰＣＲ生成物を１％アガロースゲル上に流した。正確なサイズの生成物を切断してから、ＱｉａｇｅｎのＧｅｌ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキットによりゲル精製した。ＶＫ１ｓｐ−ＡＭＰ５−Ｇ５−aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＤｅｓＫ  ＨＣの精製したゲル断片を制限酵素ＳａｌＩおよびＮｏｔＩで消化してから、消化した生成物をＱｉａｇｅｎのＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキットにより精製した。同時に、ｐＴＴ５ベクター（ＣＭＶプロモーターおよびＰｏｌｙ  Ａ  ｔａｉｌを含むＡｍｇｅｎベクター）をＳａｌＩおよびＮｏｔＩにより切断した。ｐＴＴ５ベクターを１％アガロースゲル上に流して、大型断片を切断し、ＱｉａｇｅｎのＧｅｌ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキットによりゲル精製した。ＶＫ１ｓｐ−ＡＭＰ５−Ｇ５−aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＤｅｓＫ  ＨＣ生成物を大型ベクター断片と結紮して、ＯｎｅＳｈｏｔ（商標）Ｔｏｐ１０細菌性細胞に形質転換した。形質転換細菌コロニーからＤＮＡを単離し、配列分析のために提出した。１つの正確なクローンを大規模プラスミド精製用に選択した。最終ｐＴＴ５：ＶＫ１ｓｐ−ＡＭＰ５−Ｇ５−aＫＬＨ１２０．６−ＩｇＧ２  ＤｅｓＫ  ＨＣ構築物はＡＭＰ５−ＩｇＧ２  ＤｅｓＫ  ＨＣポリペプチド（上記の配列番号３３２）をコードした。
【０５２６】
aＫＬＨ１２０．６グリコシル化ｈＩｇＧ１−ＡＭＰ５  Ｆｃ（ＣＨ３）ループ重鎖（ＨＣ）哺乳類発現。ＨＣ融合単量体配列番号３４１（上記）を含む所望のaＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ１グリコシル化（Ｎ２９７Ｑ）−ＡＭＰ５−Ｆｃ  ＨＣ生成物は、ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ｑ）Ｆｃ  ＤｅｓＫ重鎖のＣＨ３ドメイン内に挿入されたＡｍｐ５ペプチドを有する完全抗体であり、図１Ｍの図解を企図する。ＶＫ１ｓｐ−aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ｑ）−ＡＭＰ５−Ｆｃ  ＤｅｓＫ  ＨＣ生成物を合成遺伝子会社であるＢｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎから注文した。ＶＫ１ｓｐ−aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ｑ）−ＡＭＰ５−Ｆｃ  ＤｅｓＫ  ＨＣを対応する制限酵素ＳａｌＩおよびＮｏｔＩにより消化して最終生成物を生成した。消化した生成物を１％アガロースゲル上に流した。断片を切断し、ＱｉａｇｅｎのＧｅｌ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキットによりゲル精製した。同時に、ｐＴＴ５ベクター（ＣＭＶプロモーターおよびＰｏｌｙ  Ａ  ｔａｉｌを含むＡｍｇｅｎベクター）をＳａｌＩおよびＮｏｔＩにより切断した。ｐＴＴ５ベクターを１％アガロースゲル上に流して大型断片を切断し、ＱｉａｇｅｎのＧｅｌ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキットによりゲル精製した。aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ｑ）−ＡＭＰ５−Ｆｃ  ＤｅｓＫ  ＨＣの精製したゲル断片を大型ベクター断片と結紮して、ＯｎｅＳｈｏｔ（商標）Ｔｏｐ１０細菌性細胞に形質転換した。形質転換細菌コロニーからＤＮＡを単離し、配列分析のために提出した。１つの正確なクローンを大規模プラスミド精製用に選択した。最終ｐＴＴ５：ＶＫ１ｓｐ−aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ｑ）−ＡＭＰ５−Ｆｃ  ＤｅｓＫ  ＨＣ構築物はaＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ｑ）−ＡＭＰ５−ＤｅｓＫポリペプチド融合単量体（上記の配列番号３４１）をコードする。
【０５２７】
ＡＭＰ５−Ｇ５−aＫＬＨ１２０．６−κ軽鎖（ＬＣ）哺乳類発現。所望のＡＭＰ５−aＫＬＨ１２０．６κ  ＬＣ生成物は、１本の軽鎖融合単量体のＮ末端に融合したＡＭＰ５ペプチドを有する完全抗体であり（上記の配列番号３４２）、図１Ｈの図解を企図し、ＰＦＵ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｕｌｔｒａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の２つの別々のラウンドにより会合した。第一ラウンドのＰＣＲにより３つの断片（ＶＫ１ｓｐ−ＡＭＰ５、ＡＭＰ５−Ｇ５、およびＧ５−aＫＬＨ１２０．６κ  ＬＣを含む）が産生された。これらの断片を産生するためにＰＣＲ反応のために用いたオリゴおよび鋳型を以下に列挙する。ＶＫ１ｓｐ−ＡＭＰ５を産生した断片は、ＡＭＰ５−aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＤｅｓＫ  ＨＣ構築物に用いて当該項目に記載した断片と同じ断片である。ポリメラーゼ連鎖反応２（ＰＣＲ２）によりＡＭＰ５−Ｇ５断片が産生され、ＡＭＰ５ペプチドをコードする既存のＤＮＡを鋳型として用いた。順行プライマー配列は（上記の配列番号３３５）であり、逆行プライマー配列はＣＴＧ  ＧＧＴ  ＣＡＴ  ＣＴＧ  ＧＡＴ  ＧＴＣ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＴＣＣ  ＡＣＣ  ＧＣＴ  ＡＴＧ  ＣＴＧ  ＡＧＣ  ＧＣＧ／／（配列番号３４４）であった。ＰＣＲ２から産生した断片によりコードされたアミノ酸配列は
ＷＬＲＧＡＲＣＱＧＣＳＳＧＧＰＴＬＲＥＷＱＱＣＲＲＡＱＨＳＧＧＧＧＧＤＩＱＭＴＱ／／（配列番号３４５）であった。
【０５２８】
ＰＣＲ３によりＧ５−aＫＬＨ１２０．６−κ  ＬＣ断片を産生し、aＫＬＨ１２０．６κ  ＬＣ（配列番号２８）をコードする既存のＤＮＡを鋳型として用いた。
【０５２９】
順行プライマー配列は：
ＣＧＣ  ＧＣＴ  ＣＡＧ  ＣＡＴ  ＡＧＣ  ＧＧＴ  ＧＧＡ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＧＡＣ  ＡＴＣ  ＣＡＧ  ＡＴＧ  ＡＣＣ  ＣＡＧ／／配列番号３４６）であり；および
逆行プライマー配列は：
ＡＡＣ  ＣＧＴ  ＴＴＡ  ＡＡＣ  ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＧＣＴ  ＣＡＡ  ＣＡＣ  ＴＣＴ  ＣＣＣ  ＣＴＧ  ＴＴＧ  ＡＡ／／（配列番号３４７）であった。ＰＣＲ３から産生した断片のペプチド配列は：
ＲＡＱＨＳＧＧＧＧＧＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＲＮＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＲＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＨＮＳＹＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ／／（配列番号３４８）であった。
【０５３０】
生成物を１％アガロースゲル上に流した。バンドにアガロースプラグ用の穴を開けてプラグを新しいＰＣＲ反応管に入れた。次いで外プライマー配列番号３２５および配列番号３４７を用いてＰＣＲ４によりアガロースプラグを増幅した。最終ＰＣＲ生成物を１％アガロースゲル上に流した。正確なサイズの生成物を切断してから、ＱｉａｇｅｎのＧｅｌ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキットによりゲル精製した。ＶＫ１ｓｐ−ＡＭＰ５−Ｇ５−aＫＬＨ１２０．６κ  ＬＣの精製したゲル断片を制限酵素ＳａｌＩおよびＮｏｔＩで消化してから、消化した生成物をＱｉａｇｅｎのＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキットにより精製した。同時に、ｐＴＴ５ベクター（ＣＭＶプロモーターおよびＰｏｌｙ  Ａ  ｔａｉｌを含むＡｍｇｅｎベクター）をＳａｌＩおよびＮｏｔＩにより切断した。ｐＴＴ５ベクターを１％アガロースゲル上に流して、大型断片を切断し、ＱｉａｇｅｎのＧｅｌ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキットによりゲル精製した。ＶＫ１ｓｐ−ＡＭＰ５−Ｇ５−aＫＬＨ１２０．６κ  ＬＣ生成物を大型ベクター断片と結紮して、ＯｎｅＳｈｏｔ（商標）Ｔｏｐ１０細菌に形質転換した。形質転換細菌コロニーからＤＮＡを単離し、配列分析のために提出した。１つの正確なクローンを大規模プラスミド精製用に選択した。最終ｐＴＴ５：ＶＫ１ｓｐ−ＡＭＰ５−Ｇ５−aＫＬＨ１２０．６−κ  ＬＣ構築物はＡＭＰ５−κ  ＬＣポリペプチド融合単量体（上記の配列番号３４２）をコードした。
【０５３１】
２９３−６Ｅ細胞（ＮＲＣＣ）内でＰＥＩ（ポリエチレンイミン、線状、２５ｋＤａ、１ｍｇ／ｍＬの滅菌原液、ｐＨ７．０、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて一過性トランスフェクションを実施した。トランスフェクション前の２９３−６Ｅ細胞密度は１．１×１０６であり、次いでＤＮＡ５００マイクログラム（重鎖および軽鎖ＤＮＡ、１：１比）／リットルのトランスフェクトした細胞を用いた。ＤＮＡを５０ｍＬの２９３  ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に添加し、１．５ｍＬのＰＥＩ溶液と組み合わせ、軽くボルテックスしてから、室温で１５分インキュベートした。完全ＰＥＩ−ＤＮＡ混合物を培養に添加することにより細胞をトランスフェクトした。次いで細胞を振盪機（１２０ｒｐｍ、５％ＣＯ２含有）上で３７℃で２４時間インキュベートした。次いでＴｒｙｐｔｏｎｅ  Ｎ１（ＴｅｋｎｉＳｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ、２０％のＦｒｅｅＳｔｙｌｅ培地）を添加して最終濃度０．５％とし、インキュベーションを５日間継続した。５日目に条件培地を回収し、遠心分離４０００ｒｐｍにより、続いて０．４５μｍフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．）を介してろ過した。
【０５３２】
次いで融合物をタンパク質Ａクロマトグラフィー（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）により２価陽イオンを含まないダルベッコのＰＢＳ  １０カラム容量を洗浄緩衝液として、および１００ｍＭ酢酸を溶出緩衝液として７℃で用いて精製した。クロマトグラムに基づき溶出ピークをプールして、２Ｍトリス塩基を用いてｐＨを約５．０に増大した。次いでプールを少なくとも４容量の水で希釈してからＳＰ−ＨＰセファロースカラム（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）上に負荷し、１０カラム容量のＳ緩衝液Ａ（２０ｍＭ酢酸、ｐＨ５．０）で洗浄した後、６０％Ｓ緩衝液Ｂ勾配（２０ｍＭ酢酸、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．０）の２０カラム容量を用いて７℃で溶出した。プールをクロマトグラムに基づき作製し、１０ｋＤａ  Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒｓ（Ｐｉｅｒｃｅ）を４℃で用いて物質を２０容量超の１０ｍＭ酢酸、９％ショ糖（ｐＨ５．０）に対して透析した。次いで透析物質を０．２２μｍ酢酸セルロースフィルターを介してろ過し、吸光度２８０ｎｍで濃度を決定した。各抗体５０μｇを融合していない対照と共に、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＳＥＣ３０００カラム（７．８×３００ｍｍ）の  ５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ６．５、２５０ｍＭ  ＮａＣｌに注入して１ｍＬ／分で展開し、吸光度２８０ｎｍで検出した（図３９）。全５個の抗体がそれらのサイズの分子において予期した保持時間を示し、会合体はほとんど存在しなかったことが示された。各抗体の分析を、２２０Ｖで展開した１．０ｍｍトリス−グリシン４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｎｏｖｅｘ）を用いて、還元および非還元負荷緩衝液を用いて、ＱｕｉｃｋＢｌｕｅ（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）により染色して行い（図４０Ａ〜Ｅ）、ＬＣ−ＭＳにより質量を決定した（図４１Ａ〜Ｄ）。典型的な実験では、１０μｇの試料を２５μＬの８Ｍ  ＧｄＨＣｌ  ５０ｍＭトリス（ｐＨ８．５）に３０分間５５℃で還元してから、還元物質をＷａｔｅｒｓ社製Ｍａｓｓｐｒｅｐマイクロ脱塩カラム（２．１×５ｍｍ）を介してＡｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ｓｙｓｔｅｍを用いてクロマトグラフ化した（溶媒Ａは０．１％ギ酸水溶液、および溶媒Ｂは０．１％ギ酸のアセトニトリル溶液とした）。５％溶媒Ｂ、流速０．２ｍＬ／分、８０℃でカラムを平衡させ、試料導入時にカラムを５％Ｂで１分間洗浄した後、直線勾配５〜４０％Ｂを１０分かけて用いてタンパク質を溶出した。質量測定のために、Ｗａｔｅｒｓ社製飛行時間型ＬＣＴ  ｐｒｅｍｉｅｒ質量分析計にカラム流出を誘発した。ＣｓＩイオン（３ｍｇ  ＣｓＩ／ｍＬの５０％イソプロパノール溶液）を基準物質として用いた。機器に付随するＭａｘＥｎｔ１ソフトウェアを用いて質量スペクトルを逆重畳した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、予期された第四構造がすべて形成されたことが示され、質量スペクトル分析により、精製した分子に予期された融合物が存在したことが示された。まとめると、これらのデータにより、融合物はaＫＬＨ１２０．６抗体単量体の任意の４つの可能なＮ末端またはＣ末端融合配置ならびにＦｃドメイン内部ループ挿入物で作製され得ることが示される（図１Ｆ〜１Ｎおよび図４５の図解を参照されたい）。
【実施例１０】
【０５３３】
Ｅｘ４−aＫＬＨ  Ａｂ融合物
エキセンディン−４ペプチド（ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬ  ＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲ  ＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧ  ＰＳＳＧＡＰＰＰＳ／／配列番号３４９）を１ｋＧリンカーを介して抗ＫＬＨ１２０．６抗体の軽鎖のＮ末端に遺伝的に融合し（「Ｅｘ−４−１ｋＧ−aＫＬＨ１２０．６−Ａｂ」と命名）、哺乳類細胞内で発現させた。図４２は、エキセンディン−４（「Ｅｘ４」）−１ｋＧ−aＫＬＨ１２０．６ＬＣ融合構築物の図式マップである。
【０５３４】
Ｅｘ−４−１ｋＧ−aＫＬＨ１２０．６−Ａｂ融合物の成分は以下の単量体を含有した。
（ａ）以下のアミノ酸配列を有するＥｘ−４−１ｋＧ−aＫＬＨ１２０．６κＬＣ：
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬ  ＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲ  ＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧ  ＰＳＳＧＡＰＰＰＳＧ  ＳＧＳＡＴＧＧＳＧＳＧＡＳＳＧＳＧＳＡＴ  ＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰ  ＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲ  ＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧ  ＩＲＮＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＲＬＩ  ＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶ  ＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧ  ＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬ  ＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＨＮＳＹＰＬＴＦ  ＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲ  ＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦ  ＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧ  ＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷ  ＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮ  ＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳ  ＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴ  ＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨ  ＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳ  ＦＮＲＧＥＣ／／（配列番号３５５）；および
（ｂ）aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＨＣ（上記の配列番号２９）。
【０５３５】
所望のＥｘ−４−１ｋＧ−aＫＬＨ１２０．６−Ａｂ生成物は両軽鎖のＮ末端に融合したＥｘ−４ペプチドで構成される完全抗体であった（図１Ｋの図解を参照されたい）。Ｅｘ−４−軽鎖：重鎖の比率は１：１であった。aＫＬＨ１２０．６モノクローナル抗体１２０．６重鎖および軽鎖を発現するＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（商標）ハイブリドーマをコードする遺伝子の単離およびクローニングについては、上記の実施例１および実施例４に記載されている。その天然シグナルペプチドは、上記のとおりＶＫ１／Ｏ１２ペプチド（ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣ／／配列番号１０３）により置換されている。aＫＬＨ１２０．６ＬＣ（配列番号２８）およびaＫＬＨ１２０．６ＨＣ  ＩｇＧ２（配列番号２９）単量体をコードするＤＮＡ断片を哺乳類発現ベクターｐＴＴ５（ＣＭＶプロモーターおよびＰｏｌｙ  Ａ  ｔａｉｌを含むＡｍｇｅｎベクター）中に個別にクローン化し、それぞれｐＴＴ５：aＫＬＨ１２０．６−ＶＫ１ＳＰ−κ軽鎖（ＬＣ）構築物およびｐＴＴ５：aＫＬＨ１２０．６−ＶＫ１ＳＰ−ＩｇＧ２重鎖（ＨＣ）構築物を産生した。
【０５３６】
Ｋｏｚａｋ配列を含むＳａｌＩ（５’）およびＢａｍＨＩ（３’）に挟まれたＤＮＡ断片（以下の配列番号３５１）ならびにＶＫ１／Ｏ１２シグナルペプチド（配列番号１０３）、Ｅｘ−４（１−３９）ペプチド（配列番号３４９）、および１ｋＧリンカーペプチドを含むＯＲＦの第一部分を合成し、標準的な遺伝子合成技術に従いＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）によりクローン化した。
ＳａｌＩ
〜〜〜〜〜〜
ＧＴＣＧＡＣＴＡＧＡＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＡＴＧＡＧＧＧＴＣＣＣＣＧＣＴＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧＧＧＣＴＣＣＴＧＣＴＡＴＴＧＴＧＧＴＴＧＡＧＡＧＧＴＧＣＣＡＧＡＴＧＴＣＡＴＧＧＧＧＡＧＧＧＡＡＣＡＴＴＴＡＣＡＡＧＣＧＡＴＣＴＧＡＧＣＡＡＡＣＡＡＡＴＧＧＡＧＧＡＡＧＡＧＧＣＡＧＴＴＡＧＡＣＴＧＴＴＣＡＴＴＧＡＡＴＧＧＣＴＣＡＡＧＡＡＣＧＧＣＧＧＡＣＣＧＡＧＴＡＧＴＧＧＴＧＣＴＣＣＧＣＣＴＣＣＣＡＧＣＧＧＡＴＣＴＧＧＣＡＧＣＧＣＴＡＣＴＧＧＴＧ
ＧＡＴＣＴＧＧＡＴＣＧＧＧＴＧＣＡＴＣＣＴＣＴＧＧＡＴＣＴＧＧＡＡＧＣＧＣＴＡＣＣＧＧＡＴＣＣ／／（配列番号３５１）
〜〜〜〜〜〜
ＢａｍＨＩ
【０５３７】
成熟aＫＬＨ１２０．６−Ａｂ  ＬＣからなるＯＲＦの後部を網羅するＢａｍＨＩ（５’）〜ＮｏｔＩ（３’）断片（以下の配列番号３６８）を、標準的なＰＣＲ技術に従い、オリゴプライマーの組：
ＡＡＴ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＧＡＣ  ＡＴＣ  ＣＡＧ  ＡＴＧ  ＡＣＣ  ＣＡＧ  ＴＣ／（配列番号３５２）；およびＡＡＴ  ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＧＣＴ  ＣＡＡ  ＣＡＣ  ＴＣＴ  ＣＣ／／（配列番号３５３）と上記（ｐＴＴ５−aＫＬＨ１２０．６−ＶＫ１ＳＰ−κ軽鎖（ＬＣ）構築物）のaＫＬＨ１２０．６−Ａｂ  ＬＣ  ＤＮＡ鋳型から増幅した。
ＢａｍＨＩ
〜〜〜〜〜〜
ＧＧＡＴＣＣＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＴＧＣＣＧＧＧＣＡＡＧＴＣＡＧＧＧＣＡＴＴＡＧＡＡＡＴＧＡＴＴＴＡＧＧＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＣＣＣＣＴＡＡＡＣＧＣＣＴＧＡＴＣＴＡＴＧＣＴＧＣＡＴＣＣＡＧＴＴＴＧＣＡＡＡＧＴＧＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡＡＧＧＴＴＣＡＧＣＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＡＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＡＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＴＡＣＡＧＣＡＴＡＡＴＡＧＴＴＡＣＣＣＧＣＴＣＡＣＴＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡＣＧＡＡＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＴＡＡＣＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＣＧＧＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＴＣＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＡＧＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＴＴＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ／／（配列番号３６８）
〜〜〜〜〜〜
ＮｏｔＩ
【０５３８】
合成ＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ断片およびＰＣＲ増幅したＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩ断片を、標準的な分子クローニング技術（および上記実施例４のaＫＬＨ１２０．６−ＨＣ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ  Ａｂ）に従い、対応する制限酵素により消化し、アガロースゲルから単離し、ｐＴＴ５哺乳類一過性発現ベクターのＳａｌＩおよびＮｏｔＩクローニング部位に結紮し、Ｅｘ−４−１ｋＧ−aＫＬＨ１２０．６ＬＣ単量体（Ｎ末端ＶＫ１／Ｏ１２シグナルペプチドを有する）アミノ酸配列（配列番号３５５）をコードするクローンを含む発現ベクターｐＴＴ５：Ｅｘ−４−１ｋＧ−aＫＬＨ１２０．６ＬＣ（配列番号３５４））を生成した。
ＳａｌＩ
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ＧＴＣＧＡＣＴＡＧＡＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＡＴＧＡＧＧＧＴＣＣＣＣＧＣＴＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧＧＧＣＴＣＣＴＧＣＴＡＴＴＧＴＧＧＴＴＧＡＧＡＧＧＴＧＣＣＡＧＡＴＧＴＣＡＴＧＧＧＧＡＧＧＧＡＡＣＡＴＴＴＡＣＡＡＧＣＧＡＴＣＴＧＡＧＣＡＡＡＣＡＡＡＴＧＧＡＧＧＡＡＧＡＧＧＣＡＧＴＴＡＧＡＣＴＧＴＴＣＡＴＴＧＡＡＴＧＧＣＴＣＡＡＧＡＡＣＧＧＣＧＧＡＣＣＧＡＧＴＡＧＴＧＧＴＧＣＴＣＣＧＣＣＴＣＣＣＡＧＣＧＧＡＴＣＴＧＧＣＡＧＣＧＣＴＡＣＴＧＧＴＧ  ＧＡＴＣＴＧＧＡＴＣＧＧＧＴＧＣＡＴＣＣＴＣＴＧＧＡＴＣＴＧＧＡＡＧＣＧＣＴＡＣＣＧＧＡＴＣＣＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＴＧＣＣＧＧＧＣＡＡＧＴＣＡＧＧＧＣＡＴＴＡＧＡＡＡＴＧＡＴＴＴＡＧＧＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＣＣＣＣＴＡＡＡＣＧＣＣＴＧＡＴＣＴＡＴＧＣＴＧＣＡＴＣＣＡＧＴＴＴＧＣＡＡＡＧＴＧＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡＡＧＧＴＴＣＡＧＣＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＡＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＡＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＴＡＣＡＧＣＡＴＡＡＴＡＧＴＴＡＣＣＣＧＣＴＣＡＣＴＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡＣＧＡＡＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＴＡＡＣＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＣＧＧＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＴＣＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＡＧＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＴＴＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ／／（配列番号３５４）
〜〜〜〜〜〜
ＮｏｔＩ
【０５３９】
Ｅｘ４−１ｋＧ−aＫＬＨ１２０．６−Ａｂ融合物の精製のための条件培地を産生するため、発現ベクター（ｐＴＴ５：Ｅｘ−４−１ｋＧ−aＫＬＨ１２０．６ＬＣおよびｐＴＴ５：aＫＬＨ１２０．６ＨＣ）のこれらの対で一過性発現を行った。エプスタインバーウイルス核抗原−１を安定的に発現しているヒト胚腎臓２９３細胞系（２９３−６Ｅ細胞）を国家研究会議（Ｍｏｎｔｒｅａｌ，  Ｃａｎａｄａ）から得た。６ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）、１．１％Ｆ−６８  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）および２５０μｇ／μｌのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｉｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）で補充したＦ１７培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）を用いて、血清を含まない懸濁培養として細胞を維持した。懸濁細胞培養を撹拌三角フラスコ培養内で維持した。培養フラスコを３７℃、加湿した５％ＣＯ２雰囲気で６５ｒｐｍで撹拌した。２５ｋＤａ線状ＰＥＩ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，  ＰＡ）の原液（１ｍｇ／ｍＬ）を水中で調製し、溶解するまでＨＣｌでｐＨ２．０に酸性化してから、ＮａＯＨで中性化して、滅菌ろ過し（０．２μｍ）、アリコートし、使用時まで−２０℃で保存した。Ｔｒｙｐｔｏｎｅ  Ｎ１をＯｒｇａｎｏＴｅｃｈｎｉ  Ｓ．Ａ．（ＴｅｋｎｉＳｃｉｅｎｃｅ，  ＱＣ，  Ｃａｎａｄａ）から得た。原液（２０％、ｗ／ｖ）をＦｒｅｅＳｔｙｌｅ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｍ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）内で調製し、０．２μｍフィルターを介して滅菌ろ過し、使用時まで４℃で保存した。典型的には、トランスフェクションを１Ｌ尺度で実施した。細胞（２９３−６Ｅ）を生存細胞密度１．１×１０６細胞／ｍＬまで増殖してから、トランスフェクション複合体を１／１０容量の最終培養容量内で調製した。１Ｌトランスフェクション培養において、トランスフェクション複合体を１００ｍＬのＦ１７基礎培地で調製し、５００μｇプラスミドＤＮＡ（重鎖および軽鎖ＤＮＡ、１：１比）をまず１００ｍＬのＦ１７培地で希釈した。室温で５分インキュベーション後、１．５ｍＬのＰＥＩ溶液を添加した。複合体を軽くボルテックスしてから、室温で１５分間インキュベートした。撹拌フラスコ培養内でトランスフェクション複合混合物を細胞に添加することにより細胞をトランスフェクトした。２４時間トランスフェクション後、Ｔｒｙｐｔｏｎｅ  Ｎ１をトランスフェクトした培養に添加して最終濃度０．５％とし、トランスフェクトした培養を振盪機上、３７℃、加湿した５％ＣＯ２雰囲気で６５ｒｐｍでさらに５日間維持してから、回収した。条件培地を４０００ｒｐｍの遠心分離により回収してから、０．２μｍフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．）を介して滅菌ろ過した。
【０５４０】
次いで融合物をタンパク質Ａクロマトグラフィー（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）により２価陽イオンを含まないダルベッコのＰＢＳ  １０カラム容量を洗浄緩衝液として、および１００ｍＭ酢酸（ｐＨ３．５）を溶出緩衝液として７℃で用いて精製した。留分のｐＨはフラクションコレクター管中に０．０２５容量の２Ｍトリス塩基を残すことにより増大した。クロマトグラムに基づき溶出ピークをプールしてから、１０ｋＤａ  Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒｓ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて室温で３時間、２０容量超の１０ｍＭ酢酸、９％ショ糖（ｐＨ５．０）に対して透析した。次いで透析物質を０．２２μｍ酢酸セルロースフィルターを介してろ過し、吸光度２８０ｎｍで濃度を決定した。Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＳＥＣ  ３０００カラム（７．８×３００ｍｍ）の５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ６．５、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ溶液に抗体融合物２５μｇ試料を注入し、１ｍＬ／分で展開して吸光度２８０ｎｍで観察した（図４３）。予期したサイズのタンパク質において予期した保持時間で溶出した融合タンパク質から、タンパク質が過剰に凝集せずに予期した複合体を形成できたことが示される。Ｅｘ４−aＫＬＨ１２０．６抗体の分析を、２２０Ｖで展開した１．０ｍｍトリス−グリシン４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｎｏｖｅｘ）を用いて、還元および非還元負荷緩衝液を用いて、ＱｕｉｃｋＢｌｕｅ（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）による染色により行った（図４４）。非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、融合タンパク質の予期した第四級複合体を形成し、エキセンディン−４ペプチドのaＫＬＨ１２０．６抗体との融合により、予期した構造の生成物に至ることを示す。
【実施例１１】
【０５４１】
アビマー−aＫＬＨ融合
Ｃ６８１ポリペプチドは、いわゆるアビマー構造のＩＬ−６結合ポリペプチドである。（例えば、Ｋｏｌｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｏｖｅｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｂｉｎｄｉｎｇ、米国特許第２００５／００８９９３２号；Ｂａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ＩＬ−６  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、米国特許第２００８／０２８１０７６号；Ｓｔｅｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ、米国特許第２００６／０２２３１１４号および米国特許第２００６／０２３４２９９号を参照されたい）。
【０５４２】
Ｃ６８１−aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＨＣ融合物の成分は以下の単量体を含有した。
（ａ）aＫＬＨ１２０．６κＬＣ（配列番号２８）；および
（ｂ）以下のアミノ酸配列を有する（ＶＫ−１ＳＰ）−Ｃ６８１−（Ｇ５）−aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＨＣ融合物：
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣＳＧＧＳＣＬＰＤＱＦＲＣＧＮＧＱＣＩＰＬＤＷＶＣＤＧＶＮＤＣＰＤＤＳＤＥＥＧＣＰＰＲＴＣＡＰＳＱＦＱＣＧＳＧＹＣＩＳＱＲＷＶＣＤＧＥＮＤＣＥＤＧＳＤＥＡＮＣＡＧＳＶＰＴＣＰＳＤＥＦＲＣＲＮＧＲＣＩＰＲＡＷＲＣＤＧＶＮＤＣＡＤＮＳＤＥＥＤＣＴＥＨＴＧＧＧＧＧＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＨＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲＧＳＹＹＷＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ／／（配列番号３５６）。
【０５４３】
所望のＣ６８１−aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＨＣ生成物は、両重鎖のＮ末端に融合したアビマーを有する完全抗体であった。Ｃ６８１−重鎖：軽鎖の比率は１：１であった。予期したＣ６８１−aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＨＣ融合タンパク質を本明細書に記載のイオン交換クロマトグラフィーを用いて単離した。
【０５４４】
Ｃ６８１−aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２可変ＨＣ融合物を、以下のアミノ酸配列をコードする合成遺伝子としてＢｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎから注文した：
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣＳＧＧＳＣＬＰＤＱＦＲＣＧＮＧＱＣＩＰＬＤＷＶＣＤＧＶＮＤＣＰＤＤＳＤＥＥＧＣＰＰＲＴＣＡＰＳＱＦＱＣＧＳＧＹＣＩＳＱＲＷＶＣＤＧＥＮＤＣＥＤＧＳＤＥＡＮＣＡＧＳＶＰＴＣＰＳＤＥＦＲＣＲＮＧＲＣＩＰＲＡＷＲＣＤＧＶＮＤＣＡＤＮＳＤＥＥＤＣＴＥＨＴＧＧＧＧＧＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＨＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲＧＳＹＹＷＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫ／／（配列番号３５０）。
【０５４５】
断片をＳａｌＩおよびＢｓｍｂＩで消化し、１％アガロースゲル上に流して、対応する断片を切断し、ＱｉａｇｅｎのＧｅｌ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキットにより精製した。同時に、ｐＴＴ５−ＶＫ１ＳＰ−aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＨＣ  ＤＮＡ鋳型を同様に消化して精製し、定常ＨＣ領域を有するｐＴＴ５ベクター骨格を得た。アビマー断片をｐＴＴ５−ＩｇＧ２  ＨＣ定常領域と結紮して、ＯｎｅＳｈｏｔ（商標）Ｔｏｐ１０細菌に形質転換した。ＤＮＡを配列決定用に提出した。いくつかのクローン配列分析において上記配列と１００％適合したが、１クローンのみを大規模プラスミド精製用に選択した。最終ｐＴＴ５−ＶＫ１ＳＰ−Ｃ６８１−aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＨＣ構築物はＣ６８１−（Ｇ５）−aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＨＣ融合ポリペプチド（配列番号３５６）をコードした。
【０５４６】
aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＨＣ−Ｃ６８１融合物の成分は以下の単量体を含有した。
（ａ）aＫＬＨ１２０．６κＬＣ（配列番号２８）；および
（ｂ）以下のアミノ酸配列を有するaＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＨＣ−Ｃ６８１融合物：
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＨＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲＧＳＹＹＷＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＧＧＳＧＧＳＣＬＰＤＱＦＲＣＧＮＧＱＣＩＰＬＤＷＶＣＤＧＶＮＤＣＰＤＤＳＤＥＥＧＣＰＰＲＴＣＡＰＳＱＦＱＣＧＳＧＹＣＩＳＱＲＷＶＣＤＧＥＮＤＣＥＤＧＳＤＥＡＮＣＡＧＳＶＰＴＣＰＳＤＥＦＲＣＲＮＧＲＣＩＰＲＡＷＲＣＤＧＶＮＤＣＡＤＮＳＤＥＥＤＣＴＥＨＴ／／（配列番号３５７）。
【０５４７】
所望のaＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＨＣ−Ｃ６８１生成物は両重鎖のＣ末端に融合したアビマーを有する完全抗体であった（図１Ｇに図解）。重鎖−Ｃ６８１：軽鎖の比率は１：１であった。予期したaＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＨＣ−Ｃ６８１融合タンパク質を本明細書に記載のイオン交換クロマトグラフィーを用いて単離した。
【０５４８】
側面ＳｅｘＡＩおよびＮｏｔＩ制限部位を有するＣ６８１断片を、以下のアミノ酸配列をコードする合成遺伝子としてＢｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎから注文した：
ＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＧＧＳＧＧＳＣＬＰＤＱＦＲＣＧＮＧＱＣＩＰＬＤＷＶＣＤＧＶＮＤＣＰＤＤＳＤＥＥＧＣＰＰＲＴＣＡＰＳＱＦＱＣＧＳＧＹＣＩＳＱＲＷＶＣＤＧＥＮＤＣＥＤＧＳＤＥＡＮＣＡＧＳＶＰＴＣＰＳＤＥＦＲＣＲＮＧＲＣＩＰＲＡＷＲＣＤＧＶＮＤＣＡＤＮＳＤＥＥＤＣＴＥＨＴ／／（配列番号３５８）。
【０５４９】
断片をＳｅｘＡＩおよびＮｏｔＩで消化し、１％アガロースゲル上に流して、対応する断片を切断し、ＱｉａｇｅｎのＧｅｌ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキットにより精製した。同時に、ｐＴＴ５−ＶＫ１ＳＰ−aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＨＣ  ＤＮＡ鋳型をＳａｌＩおよびＳｅｘＡＩで同様に消化して精製し、aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＨＣ単量体（配列番号２９）のためのＤＮＡコード配列を産生した。ｐＴＴ５ベクターをＳａｌＩおよびＮｏｔＩにより切断し、１％アガロースゲル上に流して、大型断片を切断し、ＱｉａｇｅｎのＧｅｌ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキットによりゲル精製した。アビマーおよびaＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＨＣ断片をｐＴＴ５断片と結紮して、ＯｎｅＳｈｏｔ  Ｔｏｐ１０細菌に形質転換した。ＤＮＡを配列決定用に提出した。いくつかのクローン配列分析において上記配列と１００％適合したが、１クローンのみを大規模プラスミド精製用に選択した。最終ｐＴＴ５−ＶＫ１ＳＰ−aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＨＣ−Ｃ６８１構築物はaＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＨＣ−（Ｇ５）−Ｃ６８１融合ポリペプチド（配列番号３５７）をコードした。
【０５５０】
Ｃ６８１−aＫＬＨ１２０．６κＬＣ融合物の成分は以下の単量体を含有した。
（ａ）aＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２  ＨＣ（配列番号２９）；および
（ｂ）以下のアミノ酸配列を有するＣ６８１−aＫＬＨ１２０．６κＬＣ融合物：
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣＳＧＧＳＣＬＰＤＱＦＲＣＧＮＧＱＣＩＰＬＤＷＶＣＤＧＶＮＤＣＰＤＤＳＤＥＥＧＣＰＰＲＴＣＡＰＳＱＦＱＣＧＳＧＹＣＩＳＱＲＷＶＣＤＧＥＮＤＣＥＤＧＳＤＥＡＮＣＡＧＳＶＰＴＣＰＳＤＥＦＲＣＲＮＧＲＣＩＰＲＡＷＲＣＤＧＶＮＤＣＡＤＮＳＤＥＥＤＣＴＥＨＴＧＧＧＧＧＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＲＮＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＲＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＨＮＳＹＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ／／（配列番号３５９）。
【０５５１】
所望のＣ６８１−aＫＬＨ１２０．６κＬＣ生成物は、両軽鎖のＮ末端に融合したアビマーを有する完全抗体であった。Ｃ６８１−軽鎖：重鎖の比率は１：１であった。予期したＣ６８１−aＫＬＨ１２０．６κＬＣ融合タンパク質を本明細書に記載のイオン交換クロマトグラフィーを用いて単離した。
【０５５２】
側面ＳａｌＩ  ＢｓｉＷＩ制限部位を有する（ＶＫ−１ＳＰ）−Ｃ６８１−（Ｇ５）−aＫＬＨ１２０．６κ可変ＬＣ融合物を、以下のアミノ酸配列をコードする合成遺伝子としてＢｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎから注文した：
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣＳＧＧＳＣＬＰＤＱＦＲＣＧＮＧＱＣＩＰＬＤＷＶＣＤＧＶＮＤＣＰＤＤＳＤＥＥＧＣＰＰＲＴＣＡＰＳＱＦＱＣＧＳＧＹＣＩＳＱＲＷＶＣＤＧＥＮＤＣＥＤＧＳＤＥＡＮＣＡＧＳＶＰＴＣＰＳＤＥＦＲＣＲＮＧＲＣＩＰＲＡＷＲＣＤＧＶＮＤＣＡＤＮＳＤＥＥＤＣＴＥＨＴＧＧＧＧＧＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＲＮＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＲＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＨＮＳＹＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡ／／（配列番号３６０）
【０５５３】
断片をＳａｌＩおよびＢｓｉＷＩで消化し、１％アガロースゲル上に流し、対応する断片を切断し、ＱｉａｇｅｎのＧｅｌ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキットにより精製した。同時に、ｐＴＴ５−ＶＫ１ＳＰ−aＫＬＨ１２０．６κＬＣ  ＤＮＡ鋳型を同様に消化して精製し、定常ＬＣ領域でｐＴＴ５ベクター骨格を生成した。アビマー断片をｐＴＴ５−κＬＣ定常領域と結紮して、ＯｎｅＳｈｏｔ  Ｔｏｐ１０細菌に形質転換した。ＤＮＡを配列決定用に提出した。いくつかのクローン配列分析において上記配列と１００％適合したが、１クローンのみを大規模プラスミド精製用に選択した。最終ｐＴＴ５−ＶＫ１ＳＰ−Ｃ６８１−aＫＬＨ１２０．６κＬＣ構築物はＣ６８１−（Ｇ５）−aＫＬＨ１２０．６κＬＣ融合ポリペプチド（配列番号３５９）をコードした。
【０５５４】
アビマー−免疫グロビン融合物の単離方法。
タンパク質Ａセファロース（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたＦｃ領域の親和性高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）捕獲、続いてトリス緩衝生理食塩水、１ｍＭ  ＣａＣｌ２（Ｔｅｋｎｏｖａ）によるカラム洗浄および１００ｍＭ酢酸、１ｍＭ  ＣａＣｌ２（ｐＨ３．５）を２．５ｃｍ／分で流した溶出工程により条件培地の初回精製を行った。タンパク質を含む留分をプールし、１０Ｎ  ＮａＯＨを用いてｐＨを８．０に調整し、５容量の水でさらに希釈した。物質を０．４５μｍ酢酸セルロースフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を介してろ過し、陽イオン交換ＦＰＬＣ（ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ；  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によりさらに精製した。試料を１００％緩衝液Ａ（２０ｍＭトリス、１ｍＭ、ｐＨ８．０）で平衡させたカラム上に負荷し、勾配０〜８０％緩衝液Ｂ（２０ｍＭトリス、１Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ８．０）３０カラム容量、流速１．５ｃｍ／分で溶出した。ピークを含む標的種をプールして、１０ｍＭトリス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２（ｐＨ８．０）中に製剤化した。Ｎ末端ＨＣおよびＮ末端ＬＣならびにＣ末端ＨＣ融合タンパク質の精製例を図３６〜３８に示す。非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（図３６）により、完全に組み立てられた抗体が形成され得ることが示され、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により所望の成分が存在することが示される。サイズ排除クロマトグラム（図３７）により、精製した生成物の大部分が所望の非凝集状態にあることが示される。最終的に、質量スペクトル分析（図３８）により、所望の融合生成物が存在することが示される。まとめると、これらの例により、aＫＬＨ１２０．６抗体は、所望の生成物を形成するアビマーとの融合物を受容できることが示される。
【実施例１２】
【０５５５】
ａＤＮＰおよびaＫＬＨ抗体のＢＩＡｃｏｒｅ（商標）結合アッセイ
物質。ハイブリドーマ（３Ａ１、３Ｃ２、３Ａ４および３Ｂ１）または組換えＣＨＯ（３Ａ４−Ｆ−Ｇ２および３Ｂ１−Ｇ２）のいずれか由来の精製した抗ＤＮＰ抗体の発現を試験した。抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ−特異性抗体はＪａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．  （Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，  ＰＡ）から得た。ＤＮＰ−ＢＳＡ（ウシ血清アルブミンに結合される２，４−ジニトロフェノール）はＢｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．（Ｎｏｖａｔｏ，  ＣＡ）から得た。ＢＩＡＣｏｒｅ  ２０００，  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｇｒａｄｅセンサーチップＣＭ５、界面活性剤Ｐ−２０（ポリオキシエチレンソルビタン）、ＨＢＳ−ＥＰ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、３．４ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％Ｐ−２０、ｐＨ７．４）、アミンカップリング試薬、１０ｍＭ酢酸塩（ｐＨ４．０）および１０ｍＭグリシン（ｐＨ１．５）はＢＩＡＣｏｒｅ，  Ｉｎｃ．（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）から得た。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、１×、塩化カルシウム非含有、塩化マグネシウム非含有）はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）から得た。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、分留Ｖ、ＩｇＧ非含有）はＳｉｇｍａ  （Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）から得た。
【０５５６】
ハイブリドーマから発現し、精製した抗ＫＬＨ抗体（ヒトＩｇＧ１、クローン１２０．６．１）を試験した。多量体の高分子量キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）はＰｉｅｒｃｅ  （Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  ＩＬ）から得た。抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ−特異性抗体はＪａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．  （Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，  ＰＡ）から得た。ＢＩＡＣｏｒｅ  ２０００，  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｇｒａｄｅセンサーチップＣＭ５、界面活性剤Ｐ−２０（ポリオキシエチレンソルビタン）、ＨＢＳ−ＥＰ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、３．４ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％Ｐ−２０、ｐＨ７．４）、アミンカップリング試薬、１０ｍＭ酢酸塩（ｐＨ４．５）および１０ｍＭグリシン（ｐＨ１．５）はＢＩＡＣｏｒｅ，  Ｉｎｃ．（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）から得た。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、１×、塩化カルシウム非含有、塩化マグネシウム非含有）はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）から得た。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、分留Ｖ、ＩｇＧ非含有）はＳｉｇｍａ  （Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）から得た。
【０５５７】
方法。ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）分析を以下のとおり実行した。抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ−特異性抗体のＣＭ５センサーチップ表面に対する固定化を、連続フローの１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、３．４ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％Ｐ−２０、ｐＨ７．４（ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液）を製造業者の説明書に従いつつ用いて実施した。簡単に述べると、センサーチップ表面上のカルボキシル基を、０．２Ｍ  １−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］塩酸カルボジイミド（ＥＤＣ）および０．０５Ｍ  Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）を含む混合物６０μＬを注入することにより活性化した。１０ｍＭ酢酸緩衝液で希釈した（aＫＬＨ抗体アッセイにおいて：ｐＨ４．５、濃度３０μｇ／ｍＬ；ａＤＮＰ抗体アッセイにおいて：ｐＨ４．０、濃度６０μｇ／ｍＬ）抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ−特異性抗体１８０μＬを注入することにより特異的表面を得た。表面上の過剰反応基を６０μＬの１Ｍエタノールアミンを注入することにより脱活性化した。最終固定化レベルは（aＫＬＨ抗体アッセイにおいて）約９，０００または（ａＤＮＰ抗体アッセイにおいて）約１０，０００共鳴単位（ＲＵ）であった。ブランク、偽結合した参照表面もセンサーチップ上で調製した。抗体および抗原をＰＢＳ＋０．００５％Ｐ−２０＋０．１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡからなる試料緩衝液で希釈した。
【０５５８】
抗ＤＮＰ抗体を個々のフローセル上で捕獲後、試料緩衝液またはＤＮＰ−ＢＳＡのいずれかを、濃度０．７８〜１００ｎＭの範囲で注入した。２つの異なるＤＮＰ−ＢＳＡ試料の抗ＤＮＰ抗体に対する親和性について試験した。ＤＮＰ−ＢＳＡ試料は、ＢＳＡの各分子に結合するＤＮＰ部分数が異なり、一方の試料はＢＳＡ当たり３個のＤＮＰ部分を含み、他方の試料はＢＳＡ当たり３１個のＤＮＰ部分を含む。組換え抗ＤＮＰ抗体に対する親和性については、ＤＮＰ（３１）−ＢＳＡ（濃度０．３９〜５０ｎＭ）のみ試験した。各サイクルにおいて、３つの個々の抗体をフローセル２、３および４上で捕獲し、フローセル１はブランクのまま残して参照表面とした。試料緩衝液または抗原を注入後、１０ｍＭグリシン（ｐＨ１．５）を２回注入して各表面を再生し、固定化した抗ヒトＦｃ表面から捕獲抗体を解離させた。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを用いて、捕獲した抗ＤＮＰ抗体に対するＤＮＰ−ＢＳＡ結合の明らかな反応速度変数を決定した。
【０５５９】
抗ＫＬＨ抗体を個々のフローセル上で捕獲後、試料緩衝液またはaＫＬＨのいずれかを、濃度０．１９〜１００ｎＭの範囲で注入した。多量体の高分子量aＫＬＨの希釈物を調製するため、平均分子量５，０００，０００ダルトンを用いた。試料緩衝液または抗原を注入後、１０ｍＭグリシン（ｐＨ１．５）を２回注入して各表面を再生し、固定化した抗ヒトＦｃ表面から捕獲抗体を解離させた。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを用いて、捕獲した抗ＫＬＨ抗体に対するaＫＬＨ結合の明らかな反応速度変数を決定した。
【０５６０】
ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）結合アッセイ結果。ＤＮＰ−ＢＳＡに対する抗ＤＮＰ抗体結合の結合分析において得られた明らかな会合（ｋａ）および解離（ｋｄ）速度定数、ならびに解離平衡定数（ＫＤ）を下表８Ａに要約する。表８Ａのデータは、ＤＮＰに特異的に結合する抗ＤＮＰ抗体、および予期されたように低密度ＤＮＰ（３）−ＢＳＡよりも高密度ＤＮＰ（３１）−ＢＳＡに対して密接に結合することを示す。ＤＮＰ（３１）−ＢＳＡに対する明らかな結合親和性はすべて一桁ナノモル以上である。
【０５６１】
ＫＬＨに対する抗ＫＬＨ１２０．６．１抗体結合の結合分析において得られた明らかな会合（ｋａ）および解離（ｋｄ）速度定数、ならびに解離平衡定数（ＫＤ）を下表８Ｂに要約する。表８Ｂのデータは、このハイブリドーマ産生抗ＫＬＨ抗体は明らかなサブナノモルの結合親和性で多量体ＫＬＨに対して特異的に結合することを示す。
【０５６２】
【表１８】
2018139609.tif 000035
【０５６３】
【表１９】
2018139609.tif 000036
【０５６４】
略語
本明細書を通して使用する略語は、特定の状況で別段の指定のない限り、以下のとおり定義する。
Ａｃ  アセチル（以前はアセチル化残基を指していた）
ＡｃＢｐａ  アセチル化ｐ−ベンジル−Ｌ−フェニルアラニン
ＡＣＮ  アセトニトリル
ＡｃＯＨ  酢酸
ＡＤＣＣ  抗体依存性細胞傷害
Ａｉｂ  アミノイソ酪酸
ｂＡ  β−アラニン
Ｂｐａ  ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン
ＢｒＡｃ  ブロモアセチル（ＢｒＣＨ２Ｃ（Ｏ）
ＢＳＡ  ウシ血清アルブミン
Ｂｚｌ  ベンジル
Ｃａｐ  カプロン酸
ＣＢＣ  全血球計算値
ＣＯＰＤ  慢性閉塞性肺疾患
ＣＴＬ  細胞傷害性Ｔリンパ球
ＤＣＣ  ジシクロヘキシルカルボジイミド
Ｄｄｅ  １−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソ−シクロヘキシリデン）エチル
ＤＮＰ  ２，４−ジニトロフェノール
ＤＯＰＣ  １，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン
ＤＯＰＥ  １，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン
ＤＰＰＣ  １，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン
ＤＳＰＣ  １，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン
ＤＴＴ  ジチオスレイトール
ＥＡＥ  実験的自己免疫性脳脊髄炎
ＥＣＬ  電気化学発光
ＥＳＩ−ＭＳ  エレクトロスプレーイオン化質量分析
ＦＡＣＳ  蛍光標示式細胞分取器
Ｆｍｏｃ  フルオレニルメトキシカルボニル
ＨＯＢｔ  １−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＨＰＬＣ  高速液体クロマトグラフィー
ＨＳＬ  ホモセリンラクトン
ＩＢ  封入体
ＫＣａ  カルシウム活性化カリウムチャネル（ＩＫＣａ、ＢＫＣａ、ＳＫＣａ含有）
ＫＬＨ  キーホールリンペットヘモシアニン
Ｋｖ  電位依存性カリウムチャネル
Ｌａｕ  ラウリン酸
ＬＰＳ  リポ多糖類
ＬＹＭＰＨ  リンパ液
ＭＡＬＤＩ−ＭＳ  マトリックス支援レーザー脱離イオン化法質量分析
Ｍｅ  メチル
ＭｅＯ  メトキシ
ＭｅＯＨ  メタノール
ＭＨＣ  主要組織適合複合体
ＭＭＰ  マトリックスメタロプロテイナーゼ
ＭＷ  分子量
ＭＷＣＯ  分子量カットオフ
１−Ｎａｐ  １−ナフチルアラニン
ＮＥＵＴ  好中球
Ｎｌｅ  ノルロイシン
ＮＭＰ  Ｎ−メチル−２−ピロリジノン
ＯＡｃ  酢酸塩
ＰＡＧＥ  ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＰＢＭＣ  末梢血液単核細胞
ＰＢＳ  リン酸緩衝生理食塩水
Ｐｂｆ  ２，２，４，６，７−ペンダメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル
ＰＣＲ  ポリメラーゼ連鎖反応
ＰＤ  薬力学
Ｐｅｃ  ピペコリン酸
ＰＥＧ  ポリ（エチレングリコール）
ｐＧｌｕ  ピログルタミン酸
Ｐｉｃ  ピコリン酸
ＰＫ  薬物動態
ｐＹ  ホスホチロシン
ＲＢＳ  リボソーム結合部位
ＲＴ  室温（約２５℃）
Ｓａｒ  サルコシン
ＳＤＳ  ドデシル硫酸ナトリウム
ＳＴＫ  セリン−トレオニンキナーゼ
ｔ−Ｂｏｃ  ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル
ｔＢｕ  ｔｅｒｔ−ブチル
ＴＣＲ  Ｔ細胞受容体
ＴＦＡ  トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ  胸腺液性因子
Ｔｒｔ  トリチル
【図１Ａ】
2018139609.tif 000037
【図１Ｂ】
2018139609.tif 000038
【図１Ｃ】
2018139609.tif 000039
【図１Ｄ】
2018139609.tif 000040
【図１Ｅ】
2018139609.tif 000041
【図１Ｆ】
2018139609.tif 000042
【図１Ｇ】
2018139609.tif 000043
【図１Ｈ】
2018139609.tif 000044
【図１Ｉ】
2018139609.tif 000045
【図１Ｊ】
2018139609.tif 000046
【図１Ｋ】
2018139609.tif 000047
【図１Ｌ】
2018139609.tif 000048
【図１Ｍ】
2018139609.tif 000049
【図１Ｎ】
2018139609.tif 000050
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３９】
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【図４０Ａ】
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【図４０Ｂ】
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【図４０Ｃ】
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【図４０Ｄ】
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【図４０Ｅ】
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【図４１Ａ】
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【図４１Ｂ】
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【図４１Ｃ】
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【図４１Ｄ】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年6月20日(2018.6.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域がＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３と命名された３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、前記軽鎖可変領域がＣＤＲＬｌ、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３と命名された３つのＣＤＲを含み、
（ａ）ＣＤＲＨ１は配列番号２１５で表されるアミノ酸配列を含み、
（ｂ）ＣＤＲＨ２は配列番号２１８で表されるアミノ酸配列を含み、
（ｃ）ＣＤＲＨ３は配列番号２２１で表されるアミノ酸配列を含み、
（ｄ）ＣＤＲＬｌは配列番号２０４で表されるアミノ酸配列を含み、
（ｅ）ＣＤＲＬ２は配列番号２０６で表されるアミノ酸配列を含み、および
（ｆ）ＣＤＲＬ３は配列番号２３０で表されるアミノ酸配列を含む、
キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に特異的に結合する単離された抗原結合タンパク質。
【請求項２】
重鎖可変領域が、配列番号２６６で表される配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離された抗原結合タンパク質。
【請求項３】
軽鎖可変領域が、配列番号２４８で表される配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離された抗原結合タンパク質。
【請求項４】
重鎖可変領域が、配列番号２６６で表されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が、配列番号２４８で表されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離された抗原結合タンパク質。
【請求項５】
抗体または抗体断片である、請求項１乃至請求項４のうちのいずれかの単離された抗原結合タンパク質。
【請求項６】
抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４抗体である、請求項５の単離された抗原結合タンパク質。
【請求項７】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項５の単離された抗原結合タンパク質。
【請求項８】
キメラまたはヒト化抗体である、請求項７の単離された抗原結合タンパク質。
【請求項９】
抗体がヒト抗体である、請求項７の単離された抗原結合タンパク質。
【請求項１０】
（ａ）配列番号１４３で表される成熟ポリペプチドのアミノ酸配列を含むか、または該アミノ酸配列のＮ末端かＣ末端、もしくは両端から、１個、２個、３個、４個もしくは５個のアミノ酸残基が欠けている免疫グロブリン重鎖；
（ｂ）配列番号１４１で表される成熟ポリペプチドのアミノ酸配列を含むか、または該アミノ酸配列のＮ末端かＣ末端、もしくは両端から、１個、２個、３個、４個もしくは５個のアミノ酸残基が欠けている免疫グロブリン軽鎖；または
（ｃ）（ａ）の免疫グロブリン重鎖および（ｂ）の免疫グロブリン軽鎖
を含む請求項５の単離された抗原結合タンパク質。
【請求項１１】
少なくとも１つの、結合された薬理学的に活性な化学部分をさらに含む、請求項１乃至請求項１０のうちのいずれかの単離された抗原結合タンパク質。
【請求項１２】
薬理学的に活性な化学部分が薬理学的に活性なポリペプチドである、請求項１１の単離された抗原結合タンパク質。
【請求項１３】
抗原結合タンパク質が組換え産生される、請求項１２の単離された抗原結合タンパク質。
【請求項１４】
抗原結合タンパク質が少なくとも１本の免疫グロブリン重鎖および少なくとも１本の免疫グロブリン軽鎖を含み、ならびに前記免疫グロブリン重鎖の一次アミノ酸配列において免疫グロブリン重鎖Ｆｃドメイン内部ループ内に薬理学的に活性なポリペプチドが挿入されている、請求項１３の単離された抗原結合タンパク質。
【請求項１５】
抗原結合タンパク質が少なくとも１本の免疫グロブリン重鎖および少なくとも１本の免疫グロブリン軽鎖を含み、ならびに前記免疫グロブリン重鎖のＮ末端またはＣ末端に薬理学的に活性なポリペプチドが結合されている、請求項１２の単離された抗原結合タンパク質。
【請求項１６】
抗原結合タンパク質が少なくとも１本の免疫グロブリン重鎖および少なくとも１本の免疫グロブリン軽鎖を含み、ならびに前記免疫グロブリン軽鎖のＮ末端またはＣ末端に薬理学的に活性なポリペプチドが結合されている、請求項１２の単離された抗原結合タンパク質。
【請求項１７】
非ペプチジルもしくはペプチジルリンカーを介して、薬理学的に活性なポリペプチドが抗原結合タンパク質に結合されている、請求項１２、１３、１５または１６のうちのいずれかの単離された抗原結合タンパク質。
【請求項１８】
ペプチジルリンカーが、グリシン、セリン、アラニンまたはこれらの組み合わせを含む、請求項１７の単離された抗原結合タンパク質。
【請求項１９】
非ペプチジルリンカーが、ポリエチレングリコールリンカーである、請求項１７の単離された抗原結合タンパク質。
【請求項２０】
薬理学的に活性なポリペプチドが毒素ペプチドもしくはそのペプチドアナログ、ＩＬ−６結合ペプチド、ＣＧＲＰペプチドアンタゴニスト、ブラジキニンＢ１受容体ペプチドアンタゴニスト、ＰＴＨアゴニストペプチド、ＰＴＨアンタゴニストペプチド、ａｎｇ−１結合ペプチド、ａｎｇ−２結合ペプチド、ミオスタチン結合ペプチド、ＥＰＯ模倣ペプチド、ＴＰＯ模倣ペプチド、ＮＧＦ結合ペプチド、ＢＡＦＦアンタゴニストペプチド、ＧＬＰ−１もしくはそのペプチド模倣物、またはＧＬＰ−２もしくはそのペプチド模倣物である、請求項１２乃至請求項１９のうちのいずれかの単離された抗原結合タンパク質。
【請求項２１】
毒素ペプチドまたはそのペプチドアナログが、ＳｈＫまたはＳｈＫペプチドアナログである、請求項２０の単離された抗原結合タンパク質。
【請求項２２】
請求項１乃至請求項２１のうちのいずれかの抗原結合タンパク質、ならびに医薬上許容可能な希釈液、賦形剤もしくは担体、を含む医薬組成物。
【請求項２３】
請求項１の免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードする単離された核酸。
【請求項２４】
請求項２３の核酸を含む発現ベクター。
【請求項２５】
請求項２４の発現ベクターを含む単離された宿主細胞。
【請求項２６】
（ａ）発現ベクターによりコードされた抗原結合タンパク質を発現させる条件下の培地で請求項２５の宿主細胞を培養すること；および
（ｂ）培地から抗原結合タンパク質を回収すること、
を含む抗原結合タンパク質を製造する方法。
【請求項２７】
請求項１乃至請求項１０のうちのいずれかの抗原結合タンパク質をポリペプチドに結合させることを含む、薬理学的に活性なポリペプチドの薬物動態特性を高める方法。