(57)【要約】【課題】生物試料から所望の活性を有する化合物を、効率的にスクリーニングする方法を提供する。【解決手段】以下のステップにより、二以上の生物試料から所望の活性を有する化合物をスクリーニングする：（ａ）前記生物試料を混合して試料混合物を調製するステップと、（ｂ）前記化合物が有すると予想される物性に基づいて前記試料混合物を分画するステップと、（ｃ）前記ステップ（ｂ）で得られた各々の画分から前記活性を有する画分を選択するステップと、（ｄ）ステップ（ｃ）で選択された画分に含まれる化合物のマススペクトル情報を取得するステップと、（ｅ）ステップ（ｄ）で取得されたマススペクトル情報と、分画前の各々の生物試料に含まれる化合物のマススペクトル情報に基づいて、前記所望の活性を有する化合物を含む生物試料を特定するステップ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
二以上の生物試料から所望の活性を有する化合物をスクリーニングする方法であって、（ａ）前記生物試料を混合して試料混合物を調製するステップと、
（ｂ）前記化合物が有すると予想される物性に基づいて前記試料混合物を分画するステップと、
（ｃ）前記ステップ（ｂ）で得られた各々の画分から前記活性を有する画分を選択するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）で選択された画分に含まれる化合物のマススペクトル情報を取得するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）で取得されたマススペクトル情報と、分画前の各々の生物試料に含まれる化合物のマススペクトル情報に基づいて、前記所望の活性を有する化合物を含む生物試料を特定するステップと、
を含む方法。
【請求項２】
前記生物試料が微生物試料であり、所望の活性が受容体アゴニスト活性又はアンタゴニスト活性である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
所望の活性を有する化合物が、Ｇ蛋白質共役受容体アゴニストである、請求項１又は２２に記載の方法。
【請求項４】
前記化合物が有すると予想される物性が、４００以上、かつ４０００以下の分子量である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ステップ（ｂ）を、高速液体クロマトグラフィーにより行う、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ステップ（ｂ）において、高速液体クロマトグラフィーの前に溶媒抽出及び透析を行う、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
所望の活性を有する化合物を含むと特定された生物試料から、該化合物を単離するステップをさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物試料から所望の活性を有する中分子化合物をスクリーニングする方法に関する。本発明は、医薬分野等で有用である。
【背景技術】
【０００２】
従来の医薬品開発における主流は合成化合物の利用であった。様々な構造を有する化合物を合成し、医薬品としての可能性を見出していく方法で、まず、様々な構造を有する膨大な数の化合物からなるライブラリーを用い、その中から目的の活性を有する化合物をスクリーニングする。目的に近い化合物が得られた場合、その化学構造に類似した化合物を人為的に創出し、その中から更に目的に近い化合物を選択する。この工程を繰り返すことにより、最終的に目的に完全に合致する化合物を取得することができる。この様な方法を用いて、合成医薬品は歴史的に医薬品開発の主流を担い、現在までに上市された医薬品総数のうち大半を占めてきた。その優位点は、構造活性相関に基づいて目的化合物を創出することができる点にあるが、人為的に創出できる分子量の範囲は限られており、分子量３００から５００の低分子量の合成医薬品がほとんどである。
【０００３】
一方、天然物から生理活性物質をスクリーニングする方法は古くから行われてきた。フレミングによりカビの培養液中よりペニシリンが発見されたことを契機に、抗生物質の歴史が始まったと言える。その後、天然物、具体的には、バクテリア、カビ、放線菌などの微生物の培養液、カイメン、サンゴなどの海洋生物の抽出物、植物の抽出物、などから抗生物質を中心とする様々な有用物質が発見され、医薬品として開発されてきた。これらの天然化合物は、合成医薬品と同様の分子量３００〜５００の低分子量のものが大多数で、これよりも高分子量領域のもの、例えば分子量８００以上、１５００以下のものは約１０％にも満たない。新規医薬品の開発において、この分子量領域の天然化合物は未開拓といえる。近年、合成医薬品の開発においても、分子量４００〜４０００の領域、すなわち低分子と高分子の中間にあたる分子量領域の化合物を中分子と名付けて利用を図ろうとしている。
【０００４】
医薬品の標的分子としては、Ｇ蛋白質共役型受容体（以下、ＧＰＣＲ）、イオンチャネル、酵素蛋白などが大半を占めている。例えば、ＧＰＣＲの３つのクラスのうち、クラスＢの代表であるＧＬＰ−１受容体（グルカゴン様ペプチド1受容体）のリガンドはアミノ酸鎖長３０強のペプチド（ＧＬＰ−１ペプチド）であり、主として低分子量の化合物を対象とする従来の医薬品開発では、ＧＬＰ−１受容体のような受容体のアゴニストやアンタゴニストを得ることは困難である。
【０００５】
また、天然物のような様々な物質の混合物を、標的分子、例えば、ＧＰＣＲ（特にクラスＢ）、チロシンキナーゼ型受容体、細胞接着因子、蛋白質間相互作用に関与する蛋白質など、に結合する化合物のスクリーニングに適用するには以下のような問題を抱えていた。天然物中には標的分子に干渉を与える物質、あるいはアッセイ系全体に妨害の影響を与える物質などが共存することがあり、その場合は目的物質が存在するにも関わらず検出できない結果となる。
【０００６】
ところで、天然物からのスクリーニングにおいてＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）による分画を行った例（非特許文献１）や、酵素阻害剤のスクリーニングにおいて、同酵素活性の測定にＬＣ−ＭＳ法を用いた例（非特許文献２）が知られている。しかしながら、天然物試料は夾雑物が多く、スクリーニングにおいて複数の試料を混合することは、一層夾雑物を増加させるため、常識的に行われることがなく、分画前に試料を混合する
ことや、混合物の分画物を質量分析した例は見当たらない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Thiericke, R., J. Autom. Methods Manag. Chem. 2000; 22(5):149-57
【非特許文献２】Srivilai, J. et al., Steroids. 2016 Dec;116:67-75. doi: 10.1016/j.steroids.2016.10.007
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、生物試料から所望の活性を有する化合物を、効率的にスクリーニングする方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、複数の生物試料を混合して混合物を調製し、その混合物を分画して活性画分を取得し、その画分及び混合前の試料を質量分析することによって目的の化合物、及び目的の化合物を含む試料を特定できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、以下のとおりである。
（１）二以上の生物試料から所望の活性を有する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）前記生物試料を混合して試料混合物を調製するステップと、
（ｂ）前記化合物が有すると予想される物性に基づいて前記試料混合物を分画するステップと、
（ｃ）前記ステップ（ｂ）で得られた各々の画分から前記活性を有する画分を選択するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）で選択された画分に含まれる化合物のマススペクトル情報を取得するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）で取得されたマススペクトル情報と、分画前の各々の生物試料に含まれる化合物のマススペクトル情報に基づいて、前記所望の活性を有する化合物を含む生物試料を特定するステップと、
を含む方法。
（２）前記生物試料が微生物試料であり、所望の活性が受容体アゴニスト活性又はアンタゴニスト活性である、前記方法。
（３）所望の活性を有する化合物が、Ｇ蛋白質共役受容体アゴニスト又はアンタゴニストである、前記方法。
（４）前記化合物が有すると予想される物性が、４００以上、かつ４０００以下の分子量である、前記方法。
（５）前記ステップ（ｂ）を、高速液体クロマトグラフィーにより行う、前記方法。
（６）前記ステップ（ｂ）において、高速液体クロマトグラフィーの前に溶媒抽出及び透析を行う、前記方法。
（７）所望の活性を有する化合物を含むと特定された生物試料から、該化合物を単離するステップをさらに含む、前記方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、生物試料からの所望の活性を有する化合物のスクリーニングを、効率的に行うことができる。本発明の好ましい形態では、合成医薬品では到達困難な、天然中分子医薬品の開発が可能となることが期待される、
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ＨＰＬＣのクロマトグラム。縦軸は検出に用いた２１０ｎｍの吸光度を示す。横軸はリテンション時間（分）を示す。
【図２】ＨＰＬＣ分離画分のＧＬＰ-1受容体活性を示す。縦軸はＧＬＰ−１受容体活性の測定値を、横軸は活性測定に用いた４０画分を示す。各画分はリテンション時間の順に並べて表示した。
【図３】活性画分（フラクション番号（Frc.）23）のＬＣ／ＭＳクロマトグラム。横軸はリテンション時間、縦軸はＭＳ強度を示す。
【図４】菌株番号１４の菌体抽出物のＬＳ／ＭＳクロマトグラム。横軸はリテンション時間、縦軸はＭＳ強度を示す。ｍ／ｚ１０６５．５９５の成分が確認された。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、二以上の生物試料から所望の活性を有する化合物をスクリーニングする方法である。生物試料は、生物に由来するものであれば特に制限されないが、生物としては、微生物、植物、動物等が挙げられる。微生物としては、細菌、真菌、微細藻類、原生動物、ウイルスなどが挙げられる。生物試料は、生物体そのものでもよく、生物体の一部、それらの抽出物もしくは分泌物、又はそれらの分画物であってもよい。生物が微生物の場合は、微生物の破砕物、抽出物、もしくは培養液、又はそれらの分画物が挙げられる。
【００１３】
本発明に用いる生物試料の数は、二以上であれば特に制限されないが、数が多いほど、従来の方法に比べて省力化の効果が期待できる。試料の数は、好ましくは３以上、より好ましくは５以上、特に好ましくは２５以上である。
【００１４】
スクリーニングの対象である化合物（以下、「目的の化合物」と記載することがある）は、所望の活性を有するものであって、生物試料に含まれるものであれば特に制限されない。目的の化合物としては、受容体、例えばＧ蛋白質共役受容体に対するアゴニスト、アンタゴニスト、又はモジュレーター等が挙げられる。
【００１５】
生物試料の調製は、通常の生物試料からの有用物質のスクリーニングにおける試料の調製と同様であってよい。また、試料に対して濃縮処理を行ってもよい。
【００１６】
上記のような生物試料を混合して、試料混合物を調製する。このステップでは、全ての試料を混合して一つの混合物を調製してもよく、試料をいくつかの群に分け、群毎に試料を混合して、複数の試料混合物を調製してもよい。試料混合物に対して濃縮処理を行ってもよい。
【００１７】
続いて、試料混合物を分画する。試料混合物の分画は、目的の化合物が有すると予想される物性に基づいて行われる。このような物性としては、分子量、疎水性等が挙げられる。分子量は好ましくは４００以上、より好ましくは６００以上、さらに好ましくは８００以上である。また、分子量は、好ましくは４０００以下、より好ましくは３０００以下、さらに好ましくは２０００以下である。本発明において、上記のような分子量領域の化合物を「中分子」、天然の中分子を「天然中分子」ということがある。疎水性は、ＬｏｇＰが１〜７であることが好ましい。
【００１８】
試料混合物の分画の方法は特に制限されないが、例えば、溶媒抽出等の各種抽出法、透析、限外ろ過、イオン交換カラム、ゲル濾過カラム、疎水性カラム、キラルカラム、逆相カラム、アフィニティーカラム等を用いたクロマトグラフィーや、電気泳動、各種メンブレン分画などが挙げられる。溶媒抽出としては、例えば、エチルエーテル／メタノール／水で分配を行い、上層を採取する、又は、ヘキサン／メタノールで分配して下層を採取す
る方法が挙げられる。これらの溶媒抽出は両方行うことが好ましい。
クロマトグラフィーとしては、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）が挙げられる。カラムとしては、逆相カラムを用いることが好ましい。
【００１９】
分画処理は、単独の方法で行ってもよく、任意の複数の方法によって行ってもよい。また、複数の方法による場合、それらの方法は同様の原理によるものであってもよく、異なる原理によるものであってもよい。上記の方法の中では、溶媒抽出、透析、又は高速液体クロマトグラフィーが好ましく、溶媒抽出と高速液体クロマトグラフィーを行うことがより好ましく、溶媒抽出、透析、及び高速液体クロマトグラフィーを行うことがさらに好ましい。溶媒抽出及び/又は透析は、高速液体クロマトグラフィーの前に行うことが好ましい。溶媒抽出及び透析の順序はいずれでもよいが、溶媒抽出の後に透析を行うことが好ましい。
【００２０】
好ましい形態においては、試料又は試料混合物の分画処理によって、目的の化合物の活性を阻害する物質が除去される。このような阻害物質としては、目的の化合物の標的分子に干渉する物質、又は目的化合物と標的分子との結合を検出するアッセイ系に影響を与える物質などが挙げられる。例えば放線菌の培養抽出物には、目的とする化合物の他に、代謝物質が多種多数に存在し、これらの物質が目的物質の活性を妨害、干渉することが起こる。例えば、目的化合物が受容体アゴニストの場合、Ｐ２Ｙ作動物質等が阻害物質として挙げられる。このような物質は、目的化合物とは異なる物性を有するため、上記の処理によって除かれ得る。
【００２１】
本発明の方法では、一つの試料混合物について分画操作は一回で済むため、試料毎に分画する場合に比べて省力化することができ、また、分画操作に注力することもできる。
【００２２】
試料混合物を分画して得られる各々の画分（フラクション）から、所望の活性を有する画分を選択する。目的の化合物が受容体アゴニストの場合は、受容体に対するアゴニスト活性を各画分について測定し、活性を有する画分を選択する。受容体アゴニスト活性は、通常のアゴニスト活性の測定、検出に用いられる方法で測定すればよく、例えば、受容体遺伝子を発現する細胞を用いて、同細胞に被検試料を作用させたときの受容体からのシグナル伝達を検出することによって、受容体アゴニスト活性を測定又は検出することができる。受容体がＧ蛋白質共役受容体の場合は、前記細胞としてＧ蛋白質遺伝子を発現する細胞が用いられる。
【００２３】
受容体アゴニスト活性が検出された画分について、そこに含まれる化合物のマススペクトル情報を取得する。マススペクトル情報とは、具体的には例えば、ｍ／ｚ値、同位体ピーク、フラグメンテーションなどが挙げられる。マススペクトル情報の取得（質量分析）は、GC-MS法、又はLC-MS法によって行うことができる。
【００２４】
一方、任意の段階で、分画前の各々の生物試料に含まれる化合物のマススペクトル情報を取得する。活性画分のマススペクトル情報と、分画前の各々の生物試料に含まれる化合物のマススペクトル情報に基づいて、前記所望の活性を有する化合物を含む生物試料を特定する。例えば、活性画分のGC-MS、又はLC-MSにおけるピークのm/z値と一致するm/z値を示すピークが、分画前の試料のクロマトグラムに特異的に含まれていれば、その試料は目的の化合物を含む可能性が高いと判断される。同試料又はその分画物について活性が確認されれば、その試料は目的の化合物を含むものであると特定される。
【００２５】
分画前の試料の質量分析は試料の数だけ必要となるが、質量分析は通常、試料の分画操作に比べて簡便なため、分画操作での省力化が優り、全体として時間的、及び経済的に効率化を図ることができる。
【００２６】
目的の化合物を含む生物試料が特定されたら、例えば活性を指標として、その試料から活性成分である目的の化合物を単離することができる。すなわち、本発明の方法は、所望の活性を有する化合物を含むと特定された生物試料から、該化合物を単離するステップをさらに含んでいてもよい。
【００２７】
上記のようにして得られる化合物は、医薬、例えば同化合物が結合する受容体が関与する疾患の予防又は治療薬として、効果が期待できる。
【実施例】
【００２８】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。
【００２９】
〔実施例１〕放線菌の培養
放線菌25菌株について、以下の通りに培養抽出液を調製した。用いた菌株（簡易的な同定による）は表１のとおりである。
【００３０】
【表１】
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【００３１】
各菌株を、凍結保存から、ISP2寒天培地（酵母エキス4.0g、マルトエキストラクト10.0g、グルコース4.0g、人工海水の素（Marine Art SF-1（大阪薬研））38.4g、水道水1.0L、寒天18.0g、pH7.3）に起菌した。28℃で静置し1週間培養した。菌体を寒天片ごと10個ずつ抜き出し、15mlのSPY培養液（酵母エキス2.5g、でんぷん10.0g、ペプトン5.0g、人工海水の素（Marine Art SF-1）38.4g、水道水1.0L）を入れた22mm直径試験管に播種して、28℃で５日間、250rpmで振とう培養を行った。培養液を50mL遠沈管に移し、15mlの酢酸エチルを添加して１時間振とうした後、遠心分離（3000rpm、5分）し、２層に分離した。上
清液（酢酸エチル層）から、13mlの抽出液を20mlのカラスバイアルに回収し、遠心濃縮した。濃縮物を1.3mlのメタノールに溶解させた後、2mlのマイクロチューブに分注して冷凍保存した。
【００３２】
〔実施例２〕天然化合物中の中分子の濃縮液作製
実施例１で作製した25菌株の培養抽出液を、１菌株につき0.35mL取って、５菌株ずつの抽出液をまとめて混合した。それらの混合液を乾固後、以下のように中分子の濃縮液を作製した。各混合物をメタノール0.3mLで溶解した後、超純水（milliQ水）を2.7mL添加して混合した。さらにエチルエーテルを3.0mL添加して混合後、遠心分離（3,000rpm、10分）した。上層を取得してドラフト内で乾固させた。乾固物をメタノール2.7mLで溶解した後、milliQ水を0.3mL添加して混合した。さらにヘキサンを3.0mL添加して混合後、遠心分離（3,000rpm、10分）した。下層を取得し、エバポレートして乾固させた。乾固物をメタノール0.3mLで溶解した後、milliQ水を0.3mL添加して混合した。これらを透析チューブ（スペクトラポア社製、#131054；MWCO 100〜500）に封入し、約800mLのmilliQ水中で約３時間透析した後、外液（milliQ水）を交換して一晩透析した。内液を回収し、透析膜を2mLの30%のメタノールで共洗いして回収した後、エバポレートして乾固させた。これに150μLの90%アセトニトリル水（milliQ水を使用）を添加して撹拌した後、超音波処理して、濃縮物を溶解および溶媒へ懸濁させた。サンプル溶液および懸濁液は1mL容量のマイクロチューブに回収した後、遠心分離（12,000rpm、２分）して、不溶物を沈殿させた。次いで、遠心上清液を全量回収して、中分子の濃縮液を得た。
【００３３】
〔実施例３〕天然中分子の濃縮液の高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を用いた分画
実施例２で得た濃縮物中に100%アセトニトリルを添加した後、撹拌、および超音波処理を実施して、濃縮物を懸濁溶解した。懸濁溶液サンプルは1 mL容量のエッペンチューブに回収した後、遠心分離機を用いて12,000 rpmで2分間遠心分離処理を行い、不溶物を沈殿させた。次いで、遠心上清液を全量回収して、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）オートーサンプラー用のマイクロバイアルに分注した。本サンプルは、HPLCを用いて含有する成分の細分画を実施した。細分画処理は、日本分光株式会社製のLC-2000PlusシリーズHPLCを使用した。また、分離に使用するカラムは株式会社センシュー科学社製の内径4.6 mm、長さ150 mmのPegasil ODS SP-100カラムを使用した。本カラムはカラムオーブン中に配置し、オーブン内の温度は40℃に設定した。使用する液相溶媒には0.1%（v/v）ギ酸を混合したミリQ水、および0.1%（v/v）ギ酸を混合したアセトニトリルの2種類のみを使用し、分離開始直後から40分間かけて10%アセトニトリルから100%アセトニトリルへのグラジエント溶出、更に40分後から45分後にかけては100%アセトニトリル単一溶媒で溶出する条件で処理を実施した。本条件での溶媒の溶出は1 mL/minの流速で処理を実施した。また、成分の検出にはフォトダイオードアレイ検出器を用いて200 nmから400 nm間のスペクトルデータを収集し、クロマトグラム上への描画は210 nmの波長でクロマトグラムを表示した。溶出成分の分画は、アドバンテック社製のフラクションコレクター CHF122SCを使用した。本装置を用いて、2 mL容量の96ウェルディープウェルプレートに、1分間で1ウェルずつ溶出液を回収した。この時、1ウェルあたりの回収溶液量は1 mLである。また、溶出液の回収は分離開始3分間後から開始し、43分後まで実施した。これにより、計40個のウェルに溶出成分を分画回収した。
【００３４】
溶出成分を分画回収した96ウェルディープウェルプレートは、日本ジェネティック社製の遠心濃縮装置 HT8を使用し、濃縮を最大温度40℃下で24時間実施した。遠心濃縮乾燥後、溶出成分を含んだ各ウェルは200 μLの90%アセトニトリル水を用いて再溶解し、V底仕様の96ウェルプレートへサンプル配置を整えながら再度分注した。サンプルを再分注したV底96ウェルプレートは、改めて遠心濃縮処理（本濃縮条件は上述に同じ）を行って溶媒を除去した後、-20℃条件下で保存した。
【００３５】
〔実施例４〕GLP-1受容体アゴニスト活性測定
HEK293細胞（ATCC CRL-2828）をトランスフェクション用のプレート（F75フラスコ）に播種し（6×106個/25mL）、１日培養した。培地はDMEM（High-glucose；Wako、043-30085）にウシ胎仔血清（FBS）（SIGMA、172012）を10%と、及びペニシリン/ストレプトマイシン（Wako、168-23191）を１%添加したもの25mLを用いた。１日間培養した後、以下のように、HEK293細胞への遺伝子導入を行った。1.5mLチューブにトランスフェクション試薬（X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent；Roche、06365787001）を45μL取り、室温のトランスフェクション用培地（Opti-MEM（商標） I Reduced Serum Medium； Gibco、31985-070）705μLを添加し、速やかに２回転倒混和後、スピンダウンした。この混合液を室温で５分静置後、GLP-1R遺伝子（MGC premier Expression-Ready cDNA clones for GLP1R ；pTCN；BC112126； transOMIC:Catalog # TCH1203）を20μg、GNA15遺伝子（GNA15；NM_002068；Human cDNA Clone；ORIGENE；SC125360)）を2μg添加し、速やかに２回転倒混和後、スピンダウンした。この遺伝子溶液を室温で25分静置後、前記トランスフェクション用のプレートのDMEM培地を15mLのDMEM＋5% FBS培地（抗生剤なし）に置換したものに添加混合後、37℃、5% CO2で６時間培養した。細胞をトリプシン法で回収した後、DMEM培地に懸濁し、96ウェルプレート（BioCoat ポリ-D-リシン マルチウェルプレート  96ウェル（黒色/透明プレート；DB falcon、356692）に8.4×105cells/mLで100μL播種した。１日間培養後、培地を捨て、200μLのカルシウム色素液（Calucium 4 Assay Kit, Explorer (Molecular Devices、R8142)）を添加し、37℃で50分間培養後、室温に移し20分間静置した。
上記のようにして作製した、グルカゴン様ペプチド1受容体、及びGタンパク質を発現する細胞を用いて、実施例３で作製したサンプル（DMSO溶液）から、GLP-1Rに結合するアゴニストをスクリーニングした。前記マルチウェルプレートをフレックステーション（Molecular Devices、FlexStation3）にセットし、50μLのサンプルを終濃度0.5%となるように投与後、蛍光強度を測定した。GLP-1R活性測定結果を図２に示した。フラクション番号（Frc.）8およびFrc.23にGLP-1R活性を検出した。
【００３６】
〔実施例５〕LC/MS法を用いた活性フラクションの成分分析
実施例４でGLP-1R活性を検出したフラクションのうち、Frc.23について、以下のとおりLC/MS分析を行った。サンプルのDMSO溶液の2μLをメタノール60μLで希釈して、以下の条件でLC/MS分析（ポジティブモード）を実施した。
【００３７】
装置：LC: Acquity UPLC（Waters）
MS; Xevo G2-S QTOF（Waters） 
カラム：ACQUITY UPLC BEH C18 1.7 μm, φ2.1×50 mm I.D. （Waters）
溶媒A：LC/MS用水（0.1%ギ酸）
溶媒B：LC/MS用アセトニトリル（0.1%ギ酸）
流量：0.8 ml/分
溶出：Initial/B 5%, Initial〜5 分/B5%〜100%, 5 分〜6.5 分/B100%
UV検出：Diode array
MS検出：ESI（Positive mode）MS（Cone Vol.: 40 v）（m/z = 100 〜 1500）
導入：2 μL
【００３８】
LC/MSデータの解析を以下のとおりに行った。データ解析ソフトMarkerLynx（Waters）を用いて各フラクションの主要ピークを検出した。以下の条件でMarkerLynxの解析を実施した。
Xevo G2-SQTOFに付属のソフトウエアを用いてデータの取得と解析を行った。MassLynx V 4.1 softwareを用いてLC/MSデータを取得した。ピークの検出はMarkerLynx XS softwareを用いた。MarkerLynx のパラメータは以下の通りである。
retention time : 1 - 6 min 
mass tolerance :  0.05 Da
mass window : 0.05 Da
retention time window : 0.2 min
threshold : count 300
【００３９】
MarkerLynxで検出したピークのうち、多くのフラクション（６フラクション以上）で検出されたピークを排除し、Target Mass Fileを作成した。ChromaLynx XS softwareを用いて、Target Mass Fileに記載した目的ピークの有無を確認し、化合物の面積値を求めた。ChromaLynxの解析メソッドは以下の通りである。
tolerance range of retention time : 0.2 min
mass tolerance : 0.03 Da
threshold of peak : absolute area 100
【００４０】
この分析結果からFrc.23にm/zが1065.595の成分が含まれることが明らかとなった。
【００４１】
〔実施例６〕活性成分を生産する菌株の同定
実施例５で示されたFrc.23中のm/z1065.595の成分が25菌株のうちのどの菌株に由来するか明らかにした。まず、25菌株の抽出物原液について以下のとおりLC/MS分析を行った。各抽出物原液を10μLのメタノールに溶解した。このうち、5μLをメタノール45μLで希釈して、実施例５と同条件でLC/MS分析（ポジティブモード）を実施した。データ解析ソフトChromaLynx（Waters）を用いて、実施例５で作成したTarget Mass Fileに示した化合物のTargeted Screeningを行った。以下の条件でChromaLynxの解析を実施した。その結果、菌株番号14（ストレプトマイセス  エスピー．(Streptomyces sp.)）の培養抽出物中にFrc.23のm/z1065.595と同一の成分が検出された。他の菌株では、この成分は検出されなかった。
【００４２】
以上の結果より、実施例４で得られたGLP-1R活性を含むFrc.23について、実施例５でその成分としてm/z1065.595が検出され、実施例６によりこの生産菌株が菌株番号14であると同定された。この結果、菌株番号14を培養することにより、目的物質を含む培養抽出物を取得することが可能となった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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