(57)【要約】【課題】より簡便に親水性の高いものから疎水性の高いものまで含むアミノ酸やビタミン類の質量分析できる方法を提供する。【解決手段】アミノ酸およびビタミン類から選ばれる少なくとも１つを含む試料をカラムに送液し、該カラムにより、前記試料を各成分に分離し、分離された試料をイオン化して質量分析する液体クロマトグラフ質量分析装置を用いたアミノ酸またはビタミン類の質量分析方法において、ポリヒドロキシ（メタ）アクリレート系樹脂またはポリビニルアルコール系樹脂からなる充填剤に用いること、前記充填剤が、全体または内面がポリエーテルエーテルケトン樹脂（ＰＥＥＫ）製の液体クロマトグラフィー用ハウジングに充填されたカラムを用いること、および移動相に水溶性有機溶媒と水との混合溶媒を用いて逆相クロマトグラフィーモードまたは親水性相互作用クロマトグラフィーモードにより分析を行うことを特徴とするアミノ酸またはビタミン類の質量分析方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸およびビタミン類から選ばれる少なくとも１つを含む試料をカラムに送液し、該カラムにより、前記試料を各成分に分離し、分離された試料をイオン化して質量分析する液体クロマトグラフ質量分析装置を用いたアミノ酸またはビタミン類の質量分析方法において、
ポリヒドロキシ（メタ）アクリレート系樹脂またはポリビニルアルコール系樹脂からなる充填剤に用いること、
前記充填剤が、全体または内面がポリエーテルエーテルケトン樹脂（ＰＥＥＫ）製の液体クロマトグラフィー用ハウジングに充填されたカラムを用いること、
および移動相に水溶性有機溶媒と水との混合溶媒を用いて逆相クロマトグラフィーモードまたは親水性相互作用クロマトグラフィーモードにより分析を行うこと
を特徴とするアミノ酸またはビタミン類の質量分析方法。
【請求項２】
前記充填剤を構成するポリヒドロキシ（メタ）アクリレート系樹脂またはポリビニルアルコール系樹脂１ｇあたりに、水酸基が０．１〜１０ｍｍｏｌ含まれていることを特徴とする請求項１に記載のアミノ酸またはビタミン類の質量分析方法。
【請求項３】
前記充填剤の体積平均粒子径が１．０〜３０．０μｍである請求項１または２のいずれか１項に記載のアミノ酸またはビタミン類の質量分析方法。
【請求項４】
前記液体クロマトグラフィー用ハウジングのサイズが内径１．０〜１０．０ｍｍ、長さ３５〜３００ｍｍである請求項１〜３のいずれか１項に記載のアミノ酸またはビタミン類の質量分析方法。
【請求項５】
前記水溶性有機溶媒が、アセトニトリル、メチルアルコール、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、アセトン、メチルエチルケトンおよびテトラヒドロフランからなる群から選ばれる少なくとも１種である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のアミノ酸またはビタミン類の質量分析方法。
【請求項６】
前記移動相の水溶性有機溶媒と水との組成比率が混合前の体積比で５：９５〜９５：５の範囲で変えて、逆相クロマトグラフィーモードと親水性相互作用クロマトグラフィーモードと切り替えることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載のアミノ酸またはビタミン類の質量分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体クロマトグラフ質量分析装置を用いたアミノ酸またはビタミン類の質量分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アミノ酸やビタミン類は食品や健康サプリメント、医薬品、および化粧品などの有効成分であるが、これらの有効成分や不純物の同定や定量を行う方法として液体クロマトグラフィーを用いる方法が広く知られており、中でも近年では高感度に同定や定量ができる液体クロマトグラフ質量分析装置を用いる方法が普及している。
【０００３】
その中でも分子量が２０００以下のアミノ酸やビタミン類はアセトニトリル、アルコール類といった水溶性有機溶媒に可溶であるため従来からオクタデシルシリカゲル（ＯＤＳ）などの疎水性充填剤を用いた分析用カラムを用いて液体クロマトグラフ質量分析装置にて分析する方法が広く用いられている。
【０００４】
これらの液体クロマトグラフィー用カラムに用いられているハウジングは一般的にスレンレス製であるが、近年、金属との相互作用を受けやすい化合物がカラムのハウジングに吸着してしまう問題が確認されるようになり、アミノ酸やビタミン類においても特に液体クロマトグラフ質量分析装置を用いた場合に分析精度に大きな影響を及ぼすことがあった。このため、ハウジング全体または内面を非金属製素材であるポリエーテルエーテルケトン樹脂（ＰＥＥＫ）としたカラムも市販されている。しかし、ＯＤＳなどのシリカゲル基材を充填したカラムの場合、シリカゲル中に残存する金属の影響により充填剤と被分析化合物との二次的相互作用を及ぼす可能性があり完全にカラム内での被分析化合物の吸着の影響を解消させることが課題であった。
【０００５】
また、アミノ酸やビタミン類の中には水酸基、アミノ基、カルボキシル基といった極性官能基を有した親水性の高い化合物も多く存在しており、例えばカルニチン、バリンなどは逆相クロマトグラフィー法においてはほとんどカラム内にて保持、分離されず溶出されてしまうため、分析が難しいという課題があった。
【０００６】
一方、親水性の高いアミノ酸やビタミン類については親水性相互作用クロマトグラフィー法により分離することができる。この方法では、未修飾のシリカゲルや親水性を有する水酸基、アミノ基、アミド基、スルホ基、カルボキシル基、スルホベタイン基、ホスホリルコリン基などを導入した親水性充填剤を用いた分析用カラム（例えば特開２０１０−７１７０７号公報：特許文献１）を用いることで逆相クロマトグラフィー法と同様の移動相を用いて溶出順を逆転させることができるため親水性化合物を良好に保持、分離させることができる。
【０００７】
ところが、この方法では逆に芳香族化合物やアルキル基を有する化合物など疎水性の高いアミノ酸やビタミン類がカラム内にて保持、分離されずに溶出されてしまう。
このため、親水性の高いものから疎水性が高いものまで含むアミノ酸やビタミン類を分離しようとすると複数のカラム、装置を用いる必要があること、それぞれの分離条件の検討などが必要であった。
【０００８】
このため、親水性の高いものから疎水性が高いものまで含むアミノ酸やビタミン類を連続分析するための方法として逆相クロマトグラフィー用カラムと親水性相互作用クロマトグラフィー用カラムとをともに用いて連続分析する方法も提案されている（例えば非特許文献１）。この方法ではまず疎水性のアミノ酸やビタミン類のみを逆相クロマトグラフィー用カラムを用いて分離・溶出させて親水性のアミノ酸やビタミン類は親水性相互作用クロマトグラフィー用カラムにトラップさせ、次に親水性相互作用クロマトグラフィー用カラム中の親水性のアミノ酸やビタミン類を分離・溶出させることができる。しかし、この方法は２本のカラムが必要になること、配管系が複雑となりまたは高価な専用装置が必要となるなど必ずしも簡便に分析できる方法ではなく、より簡便に親水性および疎水性のアミノ酸やビタミン類を分析ができる方法が望まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２０１０−０７１７０７号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｓ．Ｌｏｕｗ，Ａ．Ｓ．Ｐｅｒｅｉｒａ，Ｆ．Ｌｙｎｅｎ，Ｍ．Ｈａｎｎａ−Ｂｒｏｗｎ，Ｐ．Ｓａｎｄｒａ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ.,２００８，１２０８，ｐｐ９０．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明はかかる状況に鑑みてなされたものであり、カラム内のハウジングや充填剤による分析精度低下を抑制するとともに親水性の高いものから親水性の高いものまで幅広いアミノ酸やビタミン類を、複数の分析用カラムを用いずに簡便に分析することができる液体クロマトグラフ質量分析装置によるアミノ酸およびビタミン類の質量分析方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、液体クロマトグラフィーで使用する際の充填剤およびカラムのハウジングの材質を特定の組み合わせから選定し、1本のカラムで逆相クロマトグラフィーモードまたは親水性相互作用クロマトグラフィーモードを適宜選択できるようにすることにより、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち本発明は次の事項に関する。
［１］アミノ酸およびビタミン類から選ばれる少なくとも１つを含む試料をカラムに送液し、該カラムにより、前記試料を各成分に分離し、分離された試料をイオン化して質量分析する液体クロマトグラフ質量分析装置を用いたアミノ酸またはビタミン類の質量分析方法において、
ポリヒドロキシ（メタ）アクリレート系樹脂またはポリビニルアルコール系樹脂からなる充填剤に用いること、
前記充填剤が、全体または内面がポリエーテルエーテルケトン樹脂（ＰＥＥＫ）製の液体クロマトグラフィー用ハウジングに充填されたカラムを用いること、
および移動相に水溶性有機溶媒と水との混合溶媒を用いて逆相クロマトグラフィーモードまたは親水性相互作用クロマトグラフィーモードにより分析を行うこと
を特徴とするアミノ酸またはビタミン類の質量分析方法。
［２］前記充填剤を構成するポリヒドロキシ（メタ）アクリレート系樹脂またはポリビニルアルコール系樹脂１ｇあたりに、水酸基が０．１〜１０ｍｍｏｌ含まれていることを特徴とする［１］に記載のアミノ酸またはビタミン類の質量分析方法。
［３］前記充填剤の体積平均粒子径が１．０〜３０．０μｍである［１］または［２］のいずれか１項に記載のアミノ酸またはビタミン類の質量分析方法。
［４］前記液体クロマトグラフィー用ハウジングのサイズが内径１．０〜１０．０ｍｍ、長さ３５〜３００ｍｍである［１］〜［３］のいずれか１項に記載のアミノ酸またはビタミン類の質量分析方法。
［５］前記水溶性有機溶媒が、アセトニトリル、メチルアルコール、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、アセトン、メチルエチルケトンおよびテトラヒドロフランからなる群から選ばれる少なくとも１種である、［１］〜［４］のいずれか１項に記載のアミノ酸またはビタミン類の質量分析方法。
［６］前記移動相の水溶性有機溶媒と水との組成比率が混合前の体積比で５：９５〜９５：５の範囲で変えて、逆相クロマトグラフィーモードと親水性相互作用クロマトグラフィーモードと切り替えることを特徴とする［１］〜［５］のいずれか１項に記載のアミノ酸またはビタミン類の質量分析方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明にかかるアミノ酸またはビタミン類の質量分析方法によれば、水酸基を有するポリヒドロキシ（メタ）アクリレート系樹脂またはポリビニルアルコール系樹脂からなる充填剤と、ハウジング全体または内面がポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）製のカラムと組み合わせ、および移動相に水溶性有機溶媒と水との混合溶媒を用いて、逆相クロマトグラフィーモードまたは親水性相互作用クロマトグラフィーモードを適時選択することで親水性の高いアミノ酸およびビタミン類から疎水性の高いアミノ酸およびビタミン類まで、分析精度が高く、また簡便に分析できるため、医薬品、化粧品、食品、農業、医療等の幅広い分野に有用であり、中でも食品、健康サプリメント、医薬品、化粧品などを液体クロマトグラフ質量分析装置を用いて有効成分や不純物の同定や定量を行う方法として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】実施例１のクロマトグラムである。
【図２】比較例１のクロマトグラムである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
本発明にかかる質量分析方法は、各種アミノ酸およびビタミン類から選ばれる少なくとも１つを液体クロマトグラフィーにて分離させた後、液体クロマトグラフ質量分析装置のイオン源で生成したイオンを質量分離部で質量電荷比により質量分離させて検出する方法であり、食品、化粧品、環境、農業、医療、工業材料等などの様々な分野において高感度質量分析法として用いることができる。
【００１７】
このうち、イオン源にはエレクトロスプレーイオン化法、大気圧化学イオン化法などに対応したものが、質量分離部には四重極型、イオントラップ型、飛行時間型などがある。
本発明における各種アミノ酸またはビタミン類の分析においてはイオン源、質量分離部の種類は特に制限なく使用することができる。各種アミノ酸またはビタミン類のイオン化にはエレクトロスプレーイオン化法が適しており、より高感度にて測定を行うためには流量を０．１〜１．０ｍｌ／ｍｉｎの範囲で使用することが好ましい。
【００１８】
本発明によるアミノ酸またはビタミン類の質量分析方法は、
ポリヒドロキシ（メタ）アクリレート系樹脂またはポリビニルアルコール系樹脂から構成される充填剤を用いること、
全体または内面がポリエーテルエーテルケトン樹脂（ＰＥＥＫ）製の液体クロマトグラフィー用ハウジングに前記充填剤が充填されたカラムを用いること、
および移動相に水溶性有機溶媒と水との混合溶媒を用いて逆相クロマトグラフィーモードまたは親水性相互作用クロマトグラフィーモードを適時選択させることで、
アミノ酸またはビタミン類のカラムへの吸着を抑制するとともに複数の分析用カラム、質量分析装置を用いることなく親水性の高いアミノ酸またはビタミン類から疎水性の高いアミノ酸またはビタミン類をそれぞれ分離・溶出させ、質量分析する方法である。
【００１９】
本発明によるアミノ酸またはビタミン類は分子量が２０００以下の有機化合物であり、水やアセトニトリル、アルコール類などの水溶性有機溶媒に溶解可能であり液体クロマトグラフ質量分析装置にて検出可能であれば化合物の骨格、官能基などの構造に制約はなく、親水性の高いものから、疎水性の高いものまで幅広く分析することができる。
【００２０】
ここで本発明で用いるアミノ酸またはビタミン類としては、水酸基、アミノ基、カルボキシル基等の極性官能基を有するものに代表されるような親水性のものや、前記極性官能基が無いまたは乏しい疎水性のものがあり、親水性のものとして、カルニチン、バリン等が挙げられ、疎水性のものとして、フルスルチタミン、レパウジオシド等を挙げることができる。また、ビタミン類は、ビタミン及びビタミン様物質を含む。
以下に、本発明で使用される液体クロマトグラフィーの構成を示す。
【００２１】
（充填剤）
充填剤には水酸基を有するポリヒドロキシ（メタ）クリレート系樹脂もしくはポリビニルアルコール系樹脂を用いることができる。水酸基は前記樹脂中に予め含有している水酸基またはエステル基の水酸基への変換のほか、樹脂中の水酸基などを介して新たに複数の水酸基を導入してもよい。
【００２２】
水酸基の含有量は充填剤を構成するヒドロキシ（メタ）クリレート系樹脂もしくはポリビニルアルコール系樹脂１ｇあたり１〜１０ｍｍｏｌであることが好ましい。水酸基の含有量が充填剤１ｇあたり１０ｍｍｏｌ以上となると充填剤の親水性が強すぎてしまい逆相クロマトグラフィーによる化合物の分離・保持が不十分となる。一方、１ｍｍｏｌ以下であると充填剤の親水性が弱く親水性相互作用クロマトグラフィーが作用しなくなることがある。
【００２３】
ポリヒドロキシ（メタ）アクリレート系樹脂の例としては、１個以上のエチレン性炭素−炭素二重結合と１個以上の水酸基を有するヒドロキシ（メタ）アクリレートの重合体、または該ヒドロキシ（メタ）アクリレートと他のモノマーとの共重合体が挙げられる。例えば該ヒドロキシ（メタ）アクリレートとしては、グリセリンジメタクリレート、グリセリンモノメタクリレート、２−ヒドロキシプロピルメタクリレート、２−ヒドロキシブチルメタクリレートおよび２−ヒドロキシ-3-アクリロイロキシプロピルメタクリレートなどが挙げられ、これらは単独でもよく、２種以上を組合せて用いてもよい。これらの中でも、グリセリンジメタクリレートの単独重合体が特に好ましい。
【００２４】
また、ポリビニルアルコール系樹脂の例としては、カルボン酸ビニルエステルと架橋性単量体から構成される架橋共重合体のエステル基をケン化またはエステル交換反応によってアルコール性水酸基に変換したものが挙げられる。カルボン酸ビニルエステルとしては、例えば酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、酪酸ビニル、吉草酸ビニルおよびピバリン酸ビニル等が挙げられ、これらは単独でもよく、２種以上を組合せて用いてもよい。これらの中でも、酢酸ビニル及びプロピオン酸ビニルが比較的親水性があり重合およびケン化が容易であるので好ましい。
【００２５】
ヒドロキシ（メタ）クリレート系樹脂もしくはポリビニルアルコール系樹脂から構成される充填剤は、十分な分離性能および高感度を得るために、体積平均粒子径が１．０〜３０．０μｍであることが好ましく、さらに３．０〜１０．０μｍの範囲にあることが好ましい。本願における上記の体積平均粒子径は、コールターカウンター法を用いて次のように測定される。すなわち、測定装置としてＭｕｌｔｉｓｉｚｅｒ  ４（ベックマン・コールター社製）を用い、ポリマー充填剤０．２ｇにアイソトン（希釈液）２５ｍＬを加え、超音波を３分間当てて分散させた後、約１０００個の測定個数にて体積平均粒子径を測定する。体積平均粒径を好ましい範囲とするには、風力分級、ふるい分けによる分級、沈殿を利用した分級等で制御できる。 また、前記充填剤の形状は球形であることが好ましい。さらに、充填剤は、３０ＭＰａまでの圧力に耐えうる強度を有することが好ましい。また、充填剤には任意の割合で水酸基以外のアミノ基、スルホ基、カルボキシル基等のイオン性官能基を導入することもできる。
【００２６】
（カラム）
充填剤が充填されたカラムは、全体または内面がポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）製であるハウジングを用いる。具体的には、ハウジング全体がＰＥＥＫ製であっても、ステンレスなどの材質から外管が構成され、接触面となる内面にＰＥＥＫが内張りされたものであってもよい。このうち、全面がＰＥＥＫ製の円筒型ハウジングはイオンクロマトグラフィーなどでも使用されており本発明によるアミノ酸およびビタミン類の分析方法にも好ましく使用することができる。
【００２７】
カラムの内径はより高分離、高感度に分析を行うために１．０〜１０．０ｍｍとすることが好ましく、２．０〜６．０ｍｍとすることがさらに好ましく、２．０〜４．６ｍｍとすることが特に好ましい。１．０ｍｍ未満では多孔質粒子の充填が極めて困難となることがある。また１０．０ｍｍを越えると高速分析時にカラム性能が十分得られないことがあるほか、カラム容量が大きいためカラム圧力が高くなり測定可能流速が制限される場合がある。
【００２８】
また、カラムの長さは３５〜３００ｍｍとすることが好ましく、４０〜２５０ｍｍとすることがさらに好ましく、５０〜２５０ｍｍとすることが特に好ましい。３５ｍｍ未満では測定する試料が十分にカラム内に保持、分離できないことがある。また３００ｍｍを越えるとカラム圧力が高くなりカラムからの溶出も著しく遅くなる可能性がある。
【００２９】
また、カラムには必要に応じて、フィルターが設けられることもあるが、フィルターの材料もＰＥＥＫ製であることが望ましい。
本発明では、前記樹脂製充填剤と、充填剤と接触する内面がＰＥＥＫからなるハウジングとを組合せるので、アミノ酸やビタミン類と相互作用する金属が存在しないために、分析精度に大きく向上できる。
【００３０】
（移動相）
本発明による液体クロマトグラフ質量分析装置を用いたアミノ酸およびビタミン類の質量分析方法においては移動相に水および水溶性有機溶媒との混合溶媒を用いて、水溶性有機溶媒：水の組成比率を変えることで逆相クロマトグラフィーモードと親水性相互作用クロマトグラフィーモードを適時選択させることができる。特に水溶性有機溶媒比率が５０〜７０％を境界に比率を低くすると逆相クロマトグラフィーモード、高くすると親水性相互作用クロマトグラフィーモードが発現させることができる。このため本発明によれば、複数のカラムを必要とせず、１本のカラムでより簡便に幅広い特性のアミノ酸やビタミン類を分析することが可能である。
【００３１】
ここで、逆相クロマトグラフィーモードとは、通常、移動相として水溶性有機溶媒および水の混合溶媒を用いた際に、前記混合溶媒の水の比率を高くして、親水性の高い成分から順に溶出させるモードをいう。対して、親水性相互作用クロマトグラフィーモードとは、通常、前記混合溶媒の水溶性有機溶媒の比率を高くして、極性の低い成分から順に溶出させるモードをいう。なお、本発明では、逆相クロマトグラフィーモードを発現させた後に親水性相互作用クロマトグラフィーモードへ切替えてもよく、反対に、親水性相互作用クロマトグラフィーモードを発現させた後に逆相クロマトグラフィーモードへ切替えてもよい。各モードの切替えは移動相の水溶性有機溶媒と水との組成比率を変えることで容易に行うことができる。
【００３２】
疎水性の高いアミノ酸およびビタミン類の分離・溶出には逆相クロマトグラフィーモードを用いることが好ましいため水溶性有機溶媒：水の組成比率を、混合前の体積の比として、１：９９〜５０：５０とすることが好ましく、５：９５〜５０：５０とすることがさらに好ましく、１０：９０〜５０：５０とすることが特に好ましい。また、親水性の高いアミノ酸およびビタミン類の分離・溶出には親水性相互作用クロマトグラフィーモードを用いることが好ましいため水溶性有機溶媒：水の組成比率を混合前の体積の比として、６０：４０〜９９：１とすることが好ましく、７０：３０〜９５：５とすることがさらに好ましく、７５：２５〜９５：５と することが特に好ましい。
【００３３】
また、本発明による液体クロマトグラフ質量分析装置を用いたアミノ酸またはビタミン類の質量分析方法においては分析中に水および水溶性有機溶媒との比率を一定として単一の移動相を用いるアイソクラティック法、水溶性有機溶媒比率に勾配を設けるグラジエント法のいずれにおいても分析が可能であるが、逆相クロマトグラフィーモードと親水性相互作用クロマトグラフィーモードとを交互に用いて測定を行う場合には分析時に移動相の切り替えを完了させることができる点でグラジエント法がより好ましい。
【００３４】
水溶性有機溶媒にはアセトニトリル、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール等のアルコール類、テトラヒドロフラン等のエーテル類、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類などが挙げられ、これらは単独でもよく、２種以上を組合せて用いてもよい。移動相には任意の割合でギ酸アンモニウム、酢酸アンモニウムなどを添加することもできる。
【実施例】
【００３５】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら制限されるものではない。
尚、ポリマー充填剤の平均粒子径は、Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ  ４（ベックマン・コールター社製）を用いて、ポリマー充填剤０．２ｇにアイソトン（希釈液）２５ｍＬを加え、超音波を３分間当てて分散させた後、約１０００個の測定個数にて体積平均粒子径を測定した。
【００３６】
（実施例１）
（充填剤およびカラムの作製）
ポリマー充填剤としてモノマー中に水酸基を有するグリセリンジメタクリレートを単独重合して得られたポリヒドロキシメタクリレート樹脂（体積平均粒子径５μｍ）を用いた。重合体２．５ｇと無水酢酸１７ｍｌ、ピリジン３３ｍｌを用いて９０℃、１６ｈｒ加熱撹拌を行い重合体中の水酸基と無水酢酸との反応量から水酸基量を測定した結果、重合体の水酸基量は１ｇあたり２．０ｍｍｏｌであった。
【００３７】
得られたポリヒドロキシメタクリレート樹脂からなる充填剤を、内径２．０ｍｍ×長さ１５０ｍｍのＰＥＥＫ製ハウジング（（株）巴製作所製）に３０ＭＰａの圧力で、２０分かけて充填を行い、分析用カラムを得た。
【００３８】
（カラムの評価）
まず逆相クロマトグラフィー法により、続いて親水性相互作用クロマトグラフィー法の連続分析によりアミノ酸およびビタミン類の質量分析を実施した。液体クロマトグラフィー質量分析装置として、イオン源にエレクトロスプレーイオン化法、質量分離部に四重極型を有するＬＣＭＳ−８０３０（（株）島津製作所製）を用いた。カラム温度３０℃、流量を０．２ｍｌ／ｍｉｎとした。移動相には１０ｍｍｏｌ／Ｌギ酸アンモニウム水溶液とアセトニトリルを用いてグラジエント法により測定を行った。
【００３９】
試料にはカルニチン１００μｇ／ｍＬを用いて、まず始めにカルニチン２μＬを注入して分析をスタートさせた後に１０ｍｍｏｌ／Ｌギ酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝１００：０（混合前体積比）からスタートを行い１０分かけて１５：８５ に勾配を設けながら逆相クロマトグラフィーモードにてカルニチンを溶出させた。
【００４０】
次に１０ｍｍｏｌ／Ｌギ酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝１５：８５のままで分析開始１５分の時点で再度カルニチン１００μｇ／ｍＬを２μＬ注入して親水性相互作用クロマトグラフィーモードにてカルニチンを溶出させた。
【００４１】
得られたクロマトグラムを図１に示す。カルニチンは逆相クロマトグラフィーモードでは１．８分、親水性相互作用クロマトグラフィーモードでは２回目の注入から４．５分にて溶出されたが、いずれもカラムへの吸着はみられず良好なピーク形状が得られた。
【００４２】
尚、前記逆相クロマトグラフィーモードでの分析ピーク（ピーク１）は、カラム充填剤による保持がなされないまま素通りしたものと考えられ、良好に分離が行われたとは判断できない。つまり、上記の結果は、通常逆相クロマトグラフィーでは分離が困難とされているカルニチンにおいて、逆相クロマトグラフィーモードから親水性相互作用クロマトグラフィーモードへ同一カラムを使って走査することによって、親水性相互作用クロマトグラフィーモードの領域で良好な分離ピークを得ることができたことを示すものである。
【００４３】
（比較例１）
（充填剤およびカラムの作製）
実施例１と同じポリマー充填剤を用いて、２．０×１５０ｍｍのステンレス製ハウジング（（株）杉山商事製）に３０ＭＰａ、２０分かけて充填剤の充填を行い、分析用カラムを得た。
【００４４】
（カラムの評価）
実施例１と同一の装置、分析条件にてカルニチンの測定を行った。
得られたクロマトグラムを図２に示す。カルニチンは逆相クロマトグラフィーモードでは１．８分、親水性相互作用クロマトグラフィーモードでは２回目の注入から５分にて溶出されたが、特に親水性相互作用クロマトグラフィーモードにおいて、ピーク２は実施例１と比べてカラムハウジングへの吸着由来のピーク形状悪化が確認された。
【００４５】
すなわち、本発明の構成を採用することによって、カルニチンのような逆相クロマトグラフィー法で分析しにくかったものであっても、親水性のものから疎水性のものまで、幅広いアミノ酸やビタミン類を、精度が高く、また簡便に分析できることが示された。
尚、前記逆相クロマトグラフィーモードでの分析ピーク（ピーク１）は、実施例１と同様に、良好に分離が行われたとは判断できない。
【符号の説明】
【００４６】
１  注入１回目（逆相クロマトグラフィーモード）によるカルニチンのピーク
２  注入２回目（親水性相互作用クロマトグラフィーモード）によるカルニチンのピーク
【図１】
2018025406.tif 000002
【図２】
2018025406.tif 000003