(57)【要約】      （修正有）【課題】糖類を含む液（糖液）を原料として各種の有機化合物を製造する際に、化学品の発酵生産プロセス及び化学変換プロセスに供される糖液を、生産効率に優れ、プロセス設計を容易にすることができる糖液の処理方法、および該方法により得られる水素化処理糖液の提供。【解決手段】糖類以外のカルボニル化合物および不飽和アルコールからなる群より選ばれる少なくとも１つを含む糖液を水素化反応に供し、前記糖液中に含まれる前記カルボニル化合物および／または不飽和アルコールを水素化することを特徴とする、糖液の処理方法。【選択図】図１
2018139590.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖類以外のカルボニル化合物および不飽和アルコールからなる群より選ばれる少なくとも１つを含む糖液を水素化反応に供し、前記糖液中に含まれる前記カルボニル化合物および／または不飽和アルコールを水素化することを特徴とする、糖液の処理方法。
【請求項２】
前記糖類が、炭素数３以上７以下の単糖と、炭素数３以上７以下の単糖を構成成分として含む多糖と、これらの混合物とからなるグループから選択される少なくとも１つである、請求項１に記載の処理方法。
【請求項３】
前記糖液が、非可食原料に由来する請求項１または２に記載の処理方法。
【請求項４】
前記水素化反応を、金属触媒の存在下で行なう請求項１〜３のいずれか１項に記載の処理方法。
【請求項５】
前記糖類以外のカルボニル化合物が、アルデヒド化合物およびケトン化合物から選ばれる少なくとも１つである請求項１〜４のいずれか１項に記載の処理方法。
【請求項６】
前記不飽和アルコールが、脂肪族共役アルコールである請求項１〜５のいずれか１項に記載の処理方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の処理方法により得られることを特徴とする水素化処理糖液。
【請求項８】
前記水素化処理糖液中のフルフラールの含有率が、水素化処理糖液全量に対して０．０１質量％以下である請求項７に記載の水素化処理糖液。
【請求項９】
前記水素化処理糖液中のグリコールアルデヒドの含有率が、水素化処理糖液全量に対して０．０３質量％以下である請求項７または８に記載の水素化処理糖液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖液の処理方法、および該処理により得られる水素化処理糖液に関する。また前記水素化処理糖液を用いた有機化合物の製造方法および微生物の培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖類を原料とした有機化合物の発酵生産プロセスおよび化学変換プロセスは、広く利用されており、また前記各プロセスを経て得られた生産物は、種々の工業原料として利用されている。
現在、これら発酵生産プロセスおよび化学変換プロセスの原料として使用される糖として、サトウキビ、デンプン、テンサイ、とうもろこし、いも、キャッサバ、サトウカエデなどの可食原料に由来するものが挙げられる。
【０００３】
しかしこれらの可食原料由来の糖類を上記プロセスの原料として使用する場合は、今後の世界人口増加による可食原料価格の高騰、および天候不順や気候変動による可食原料の供給不足といった懸念がある。また食料不足の際に、可食原料を食用用途と競合して工業原料に利用することに対する倫理上の批判等の懸念もある。そこで、非可食原料や、不純物を含有する、より低純度の糖類などから、効率的に糖類を含有する液（糖液）を製造するプロセス、あるいは得られた糖液を発酵生産原料や化学変換原料として、効率的に工業原料に変換するプロセスの構築が今後の課題となっている。
【０００４】
非可食原料から糖液を得る方法としては、非可食原料中のセルロースやヘミセルロースを、濃硫酸を用いてグルコースに代表されるヘキソースや、キシロースに代表されるペントースといった単糖まで加水分解する方法（特許文献１）や、非可食原料の反応性を向上させる前処理を施した後に、酵素反応により加水分解する方法（特許文献２）、または亜臨界や超臨界水による加水分解方法等が挙げられる。
【０００５】
しかし、これらの手法を用いた場合、非可食原料中のセルロース、ヘミセルロースが加水分解され、グルコースやキシロースといった糖が得られると共に、これらの糖の分解反応も進行する。糖の分解反応により、副生成物として、カルボニル化合物が生成し、具体的には例えば、フルフラール、ヒドロキシメチルフルフラール、グリコールアルデヒド、蟻酸等のアルデヒド類や、ジヒドロキシアセトンやベンゾキノン等のケトン類などが生成する。
【０００６】
このうち、フルフラール等を除去、変換する方法として、木質系炭化物や、活性炭を用いた除去方法（特許文献３、非特許文献１）、合成樹脂を用いた除去方法（特許文献４）、還元剤を用いたアルデヒド変換方法（非特許文献２）等が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表平１１−５０６９３４号公報
【特許文献２】特開２００１−９５５９４号公報
【特許文献３】特開２００５−２７００５６号公報
【特許文献４】特開２０１１−７８３２７号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Maddox IS and Murray AE, Biotechnology Letters vol.5 No.3, P175, 1983
【非特許文献２】Cavka A et al., Biotechnology and Bioengineering, vol.108, No11, P2592, 2011
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
カルボニル化合物のうち、フルフラールやヒドロキシメチルフルフラール等は、微生物を利用した発酵生産プロセスでは、反応を阻害する性質を有し、具体的には微生物の増殖阻害や発酵生産阻害を引き起こし、発酵生産の収率を低下させる。そのためこれらの化合物は、発酵阻害物質と呼ばれ、非可食原料の糖液を発酵原料として利用する際の大きな課題となる。
【００１０】
また、化学変換プロセスを経て有機化合物を生産する場合、カルボニル化合物や不飽和アルコールが糖液中に含有されていると、生成物が着色するといった課題もある。
しかし、上記特許文献３や非特許文献１に記載の木質系炭化物や活性炭を用いた除去方法では、選択的に発酵阻害物質だけを除去することは困難であり、また糖類の吸着による糖濃度の低下や、木質系炭化物や活性炭の生産や再生にコストがかかるといった問題もある。また、上記特許文献４に記載の合成樹脂を用いた除去方法では、クロマトグラフ方式での除去となるため、プロセス設計に制約が生じる問題がある。
また、上記非特許文献２に記載の還元剤を用いた還元除去方法は、還元剤の反応性の低さに加え、発酵阻害物質と同時に糖類も還元され、さらに還元体と等モルで副生する金属塩の除去が必要である等の問題がある。
【００１１】
本発明は、上記の課題に鑑みてなされたものであり、糖類を含む液（糖液）を原料として各種の有機化合物を製造する際に、化学品の発酵生産プロセス及び化学変換プロセスに供される糖液を、生産効率に優れ、プロセス設計を容易にすることができる糖液の処理方法、および該方法により得られる糖液を用いた有機化合物の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、糖液を水素化反応に供し、該糖液中に含まれる糖類以外のカルボニル化合物および不飽和アルコールから選ばれる少なくとも１つを水素化する処理を行うことで、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成させた。
【００１３】
すなわち本発明の要旨は、
［１］糖類以外のカルボニル化合物および不飽和アルコールからなる群より選ばれる少なくとも１つを含む糖液を水素化反応に供し、該糖液中に含まれる前記カルボニル化合物および／または不飽和アルコールを水素化することを特徴とする糖液の処理方法、
［２］前記糖類が、炭素数３以上７以下の単糖を構成成分として含む糖を１つ以上含む上記［１］に記載の処理方法、
［３］前記糖液が、非可食原料に由来する上記［１］または［２］に記載の処理方法、
［４］前記水素化反応を、金属触媒の存在下で行なう上記［１］〜［３］のいずれかに記載の処理方法、
［５］前記糖類以外のカルボニル化合物が、アルデヒド化合物およびケトン化合物から選ばれる少なくとも１つである上記［１］〜［４］のいずれかに記載の処理方法、
［６］前記不飽和アルコールが、脂肪族共役アルコールである、上記［１］〜［５］のいずれかに記載の処理方法、
［７］上記［１］〜［６］のいずれかに記載の処理方法により得られることを特徴とする水素化処理糖液、
［８］前記水素化処理糖液中のフルフラールの含有率が、水素化処理糖液全量に対して０．０１質量％以下である上記［７］に記載の水素化処理糖液、
［９］前記水素化処理糖液中のグリコールアルデヒドの含有率が、水素化処理糖液全量に対して０．０３質量％以下である上記［７］または［８］に記載の水素化処理糖液、
［１０］糖類以外のカルボニル化合物および不飽和アルコールからなる群より選ばれる少なくとも１つを含む糖液を水素化反応に供する水素化処理工程、および
水性媒体中で、前記水素化処理工程後の糖液を含有する有機原料に有機物生産能を有する微生物を作用させて有機化合物を得る、有機物生産工程、を含むことを特徴とする有機化合物の製造方法、
［１１］水性媒体中で、前記［７］〜［９］のいずれかに記載の水素化処理糖液を含有する有機原料に有機物生産能を有する微生物を作用させて有機化合物を得る、有機物生産工程を有することを特徴とする有機化合物の製造方法、
［１２］前記有機物生産工程を、嫌気的雰囲気下で行う上記［１０］または［１１］に記載の有機化合物の製造方法、
［１３］前記有機物生産工程で得られた有機化合物を精製する工程を、さらに有する上記［１０］〜［１２］のいずれかに記載の有機化合物の製造方法、
［１４］前記水性媒体が、炭酸イオン、重炭酸イオン、および二酸化炭素ガスから選ばれる少なくとも１つを含有する上記［１０］〜［１３］のいずれかに記載の有機化合物の製造方法、
［１５］前記有機化合物がアルコール類、アミン類、カルボン酸類、およびフェノール類から選ばれる少なくとも１つである上記［１０］〜［１４］のいずれかに記載の有機化合物の製造方法、
［１６］前記アルコール類が、炭素数２〜１０の脂肪族アルコールである上記［１５］に記載の有機化合物の製造方法、
［１７］前記カルボン酸類が、炭素数２〜１０の脂肪族カルボン酸である上記［１５］に記載の有機化合物の製造方法、
［１８］有用物質生産能力を有する微生物の培養方法であって、上記［７］〜［９］のいずれかに記載の水素化処理糖液を炭素源として用いることを特徴とする微生物の培養方法、
［１９］前記微生物が、コリネ型細菌、大腸菌、アナエロビオスピリラム（Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属細菌、アクチノバチルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、マンヘミア（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ）属細菌、バスフィア（Ｂａｓｆｉａ）属細菌、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属細菌、ザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）属細菌、糸状菌、および酵母菌からなる群より選ばれる少なくとも１つである上記［１０］〜［１８］のいずれかに記載の方法、
［２０］前記微生物がペントース利用能を有する上記［１０］〜［１９］のいずれかに記載の方法、
［２１］前記ペントースがキシロースである上記［２０］に記載の方法、
［２２］前記微生物がキシロースイソメラーゼ活性を付与または増強された微生物である上記［２１］に記載の方法、
［２３］前記微生物がキシルロキナーゼ活性を付与または増強された微生物である上記［２２］に記載の方法、に存する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の糖液の処理方法によれば、糖液中のカルボニル化合物および不飽和アルコールの含有量を減少させることができるため、得られる糖液を、微生物を利用した発酵生産プロセスで用いれば、目的とする有機化合物の収率を向上させることができる。
また本発明の水素化処理糖液を含む有機原料を用いれば、発酵生産プロセスによる有機化合物の製造の生産効率を向上させることができる。
また化学変換プロセスに利用した際に生成物である有機化合物の着色を抑制することができる。
【００１５】
また、本発明の有機化合物の製造方法であれば、比較的簡単な処理により、高い生産効率で所望の有機化合物を製造することができる。
また、本発明の培養方法であれば、発酵生産プロセスにおける発酵阻害物質量を減少させることができるため、微生物の増殖量と増殖速度を向上させ、もって発酵生産性を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】製造例９の糖液及び実施例４１、４２の水素化処理糖液の吸収スペクトルである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明について具体的に説明するが、本発明は以下の実施の形態に限定されるものではなく、本発明の要旨の範囲内であれば種々に変更して実施することができる。
【００１８】
＜第１の発明：糖液の処理方法＞
本発明の第１の発明は、糖類を含む液（以下、「糖液」という。）を水素化反応に供し、該糖液中に含まれる、糖類以外のカルボニル化合物および不飽和アルコールからなる群より選ばれる少なくとも１つを水素化することを特徴とする。
第１の発明における糖液、並びに後述する第２の発明、第３の発明、および第４の発明（第１ないし第４の発明をまとめて「本発明」ということがある。）で用いられる「糖液」とは、上述の通り糖類を含有する液を意味し、好ましくは糖類を含有する水溶液である。以下、糖液中に含まれる糖類から順に説明する。
【００１９】
（糖類）
本発明で用いる糖液に含まれる糖類は、特に限定はされず、いわゆる糖類一般を用いることができるが、微生物が炭素源として活用することができる糖が好ましい。具体的にはグリセルアルデヒド等の炭素数３の単糖（トリオース）；エリトロース、トレオース、エリトルロース等の炭素数４の単糖（テトロース）；、リボース、リキソース、キシロース、アラビノース、デオキシリボース、キシルロース、リブロース等の炭素数５の単糖（ペントース）；アロース、タロース、グロース、グルコース、アルトロース、マンノース、ガラクトース、イドース、フコース、フクロース、ラムノース、プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース等の炭素数６の単糖（ヘキソース）；、セドヘプツロース等の炭素数７の単糖（ヘプトース）；スクロース、ラクトース、マルトース、トレハノース、ツラノース、セロビオース等の二糖類；ラフィノース、メレジトース、マルトトリオース等の三糖類；フラクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、マンナオリゴ糖などのオリゴ糖類；デンプン、デキストリン、セルロース、ヘミセルロース、グルカン、ペントサン等の多糖類；等が挙げられる。
【００２０】
本発明で用いる糖液は、上記の糖類１種類を単独で含有していてもよいし、２種類以上を含有していてもよい。
本発明で用いる糖類としては、炭素数３以上、７以下の単糖を構成成分として含む糖を１つ以上含むことが好ましい。これらの糖は微生物の炭素源として活用しやすいためである。より好ましくは、糖類がこのような糖を主成分として含む。主成分とは、糖類の合計質量に対し、通常５０質量％以上を占める成分をいい、より好ましくは７０質量％以上１００質量％以下を占める成分をいう。
なお、「炭素数３以上、７以下の単糖を構成成分として含む糖」とは、炭素数３以上、７以下の単糖、炭素数３以上、７以下の単糖を構成成分として含む多糖類、またはこれらの混合物をいう。中でも、ヘキソース、ペントース、およびこれらを構成成分とする二糖類がより好ましい。これらは自然界、植物の構成成分となっていることから豊富に存在し、原料の入手が容易であるためである。
【００２１】
上記ヘキソースとしては、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトースが好ましく、グルコースがより好ましい。ペントースとしてはキシロース、アラビノースが好ましく、キシロースがより好ましい。二糖類としてはスクロースが好ましい。グルコース、キシロース、スクロースは、自然界、植物の主な構成成分となっているため、原料の入手が容易である点が挙げられる。
【００２２】
（糖液の由来、製法）
本発明で用いる糖液の製法は、特に限定はされないが、例えば上記の糖類の１種類以上を水に溶解して製造する方法や、上記の糖類を構成成分として含む原料（以下、「糖原料」ということがある。）を、その構成単位である糖類まで分解して製造する方法が挙げられる。糖原料は、特に限定されないが、具体的には、セルロース、ヘミセルロース、デンプン等の多糖類や、多糖類を構成成分とする植物等が挙げられる。また澱粉糖化液または糖蜜なども使用され、具体的にはサトウキビ、甜菜またはサトウカエデ等の植物から搾取した糖液が挙げられる。
【００２３】
前記糖原料は、食用にできるか否かの観点で、「可食原料」と「非可食原料」に分類することができる。
可食原料としては、サトウキビ、デンプン、テンサイ、とうもろこし、いも、キャッサバ、サトウカエデ等が挙げられる。
非可食原料としては、具体的には、バガス、スイッチグラス、ネピアグラス、エリアンサス、コーンストーバー、稲わら、麦わら、米ぬか、樹木、木材、植物油カス、ササ、タケ、パルプ類、古紙、食品廃棄物、水産物残渣、家畜廃棄物等が挙げられる。
このうち、非可食原料は、可食原料と異なり、食用用途と競合せず、また通常であれば廃棄、焼却処理をされるものが多いため、安定的な供給、資源の有効利用が図れる点で好ましい。
【００２４】
前記糖原料から糖類を得る方法は、特に限定されないが、例えばデンプン水溶液に希硫酸を加えて加水分解する方法、デンプン水溶液に種々の酵素を用いて、酵素分解して製造する方法、セルロースやヘミセルロースを、濃硫酸を用いてグルコースに代表されるヘキソースや、キシロースに代表されるペントースといった単糖まで加水分解する方法、糖原料の反応性を向上させる前処理を施した後に、酵素反応、亜臨界水、超臨界水等により加水分解する方法等が挙げられる。また、砂糖の製造工程で発生する糖蜜から砂糖を回収した後に残る廃糖蜜も糖液として使用可能である。
【００２５】
本発明における糖液中に含まれる糖類の濃度は、糖液の由来や、含有する糖の種類等によって大きく変動し、特に限定されないが、発酵生産プロセスおよび化学変換プロセスの生産性を考慮すると、糖類の合計濃度で、通常０．１質量％以上、好ましくは２質量％以上、通常６０質量％以下が好ましく、好ましくは５０質量％以下である。
本発明で用いる糖液は、上記糖類を含有する液であり、水と糖類以外に他の成分を含んでいてもよい。他の成分は、特に限定されないが、例えば糖原料から糖類を得た際に生じる、糖類以外の副生成物や不純物を含んでいてもよい。具体的には、後述する糖類以外のカルボニル化合物、不飽和アルコール等のアルコール化合物；リグニン由来のフェノール化合物；や、アルカリ金属化合物、アルカリ土類金属化合物、窒素化合物、硫黄化合物、ハロゲン化合物、硫酸イオン等の無機化合物；が挙げられる。
【００２６】
なお、本発明で用いる糖液は、上述した糖類を含有する液であれば特に制限はないが、リグニン由来等の固形分に関しては、濾過や吸着等を用いて除去することが好ましい。また、本発明で用いられる糖液は、使用する目的に応じて水で希釈して糖濃度を下げて用いたり、糖類の追添加や濃縮により糖濃度を高めて用いることができる。
【００２７】
（糖類以外のカルボニル化合物）
本発明で用いる糖液には、糖液を製造する工程および保管した際に生成する、糖類以外のカルボニル化合物が通常含まれている。カルボニル化合物としては、構造内にカルボニル基を有するものであれば特に限定はされず、脂肪族カルボニル化合物でも、芳香族基を有するものであってもよい。好ましくは炭素数１以上、２０以下、より好ましくは炭素数１６以下、さらに好ましくは炭素数１２以下のカルボニル化合物である。上記範囲のカルボニル化合物は水溶性が比較的高く、糖液、特に糖を含む水溶液中に含まれることが多いためである。このようなカルボニル化合物の具体例としては、例えばフルフラール、ヒドロキシメチルフルフラール、グリコールアルデヒド、蟻酸、ヒドロキシベンズアルデヒド、シリンガアルデヒド、バニリン、イソバニリン、オルトバニリン、コニフェニルアルデヒド等のアルデヒド化合物；１，４−ベンゾキノン等のケトン化合物；アクリル酸メチル、アクリル酸エチル等の不飽和エステル化合物、好ましくは不飽和共役エステル化合物；等が挙げられ、アルデヒド化合物、ケトン化合物が好ましく、より好ましくはアルデヒド化合物である。
【００２８】
（不飽和アルコール）
本発明で用いる糖液には、糖液を製造する工程および保管した際に生成する、不飽和アルコールが通常含まれている。不飽和アルコールとしては、構造内に脂肪族の炭素−炭素二重結合（オレフィン）を有するものであれば特に限定はされず、脂肪族不飽和アルコールであっても、芳香族基を有するものであってもよい。好ましくは炭素数１以上、２０以下、より好ましくは炭素数１６以下、さらに好ましくは炭素数１２以下の不飽和アルコールである。上記範囲のアルコールは水溶性が比較的高く、糖液、特に糖を含む水溶液中に含まれることが多いためである。また不飽和アルコールはその構造内で共役構造を有していてもよい。典型的には脂肪族共役アルコールが挙げられる。不飽和アルコールの具体例としては、２−アルケニルアルコールであり、具体的にはアリルアルコール、クロチルアルコール、２−ペンテン−１−オール、２−ヘキセン−１−オール、２−ヘプテン−１−オール等が挙げられ、好ましくはアリルアルコールやクロチルアルコールである。
【００２９】
本発明者らは、前記カルボニル化合物および不飽和アルコールから選ばれる少なくとも１つが、糖液を原料とした有機化合物を発酵生産する工程（有機物生産工程）において、有用化合物の生産量、蓄積量、および生産速度の低下減少を引き起こすことを見出した。なお以下で、前記有機物生産工程において前記のような作用を及ぼす物質を総称し、「発酵阻害物質」という。また前記発酵阻害物質を含有した糖液は、微生物の培養工程において、増殖量や増殖速度の低下が起こる。
また化学変換プロセスを経て有機化合物を生産する工程において、カルボニル化合物や不飽和アルコールは、その反応性の高さから生成物の着色を起こすことを見出した。着色についてはカルボニル化合物、典型的にはフルフラール等のアルデヒド化合物による着色が著しいため、これらのカルボニル化合物、好ましくはアルデヒド化合物、より好ましくはフルフラールを除去することで生成物の着色が抑制できる。
【００３０】
（水素化反応）
第１の発明では、上記の糖液中に含まれる前記カルボニル化合物および不飽和アルコールから選ばれる少なくとも１つを水素化反応に供して還元する。これにより前記カルボニル化合物および不飽和アルコールは、それぞれが水素化された物質に変換されることで、その含有量を低減させることができる。なお、第１の発明における「水素化反応」とは、上記の糖液中に含まれる糖類以外のカルボニル化合物および不飽和アルコールからなる群から選ばれる少なくとも１つを、水素雰囲気下に供し、水素化された物質に変換する化学反応をいう。
【００３１】
上記水素化反応において、糖液中の糖類以外のカルボニル化合物および不飽和アルコールからなる群から選ばれる少なくとも１つは、水素により還元され、対応する水素化物に変換される。これらの化合物は、後述する第３の発明および第４の発明において、微生物に対し、高い発酵阻害性を有することが多いためである。
なおここでいう「対応する水素化物」とは、前記カルボニル化合物、および／または不飽和アルコールが水素化により変換され、好ましくは水素化前に比べて発酵阻害性が低減されたものの総称である。
本発明の処理方法では、前記カルボニル化合物および不飽和アルコールからなる群から選ばれる少なくとも１つが水素化されて対応する水素化物に変換されていればよく、糖液を、前記発酵生産に用いる際の発酵阻害性が低減されていることが好ましい。好ましくは、糖液中に含まれる前記カルボニル化合物および不飽和アルコール、またはその水素化物の含有量を指標として、糖液の発酵阻害性の程度を評価することができ、これについては後述する。
【００３２】
具体的な「水素化物」としては以下の通りである。水素化反応により上記アルデヒド化合物は、対応する１級アルコールに変換され、ケトン化合物は、対応する２級アルコールに変換される。これらの水素化物（アルコール）は、更なる水素化により、それぞれのアルコールから脱水した化合物に変換されてもよい。また不飽和エステル化合物は、通常、水素化反応により、炭素−炭素二重結合が水素化されたエステル化合物に変換される。また更なる水素化により、対応するアルコールまで変換されていてもよい。不飽和エステル化合物に対応する水素化物はこれらのいずれでもよい。
また水素化反応により、不飽和アルコール類は、炭素−炭素二重結合が水素化されたアルコール類に変換され、好ましくは飽和アルコールに変換される。
【００３３】
上記の水素化反応に糖液を供することで、有機化合物の発酵生産における阻害効果が低減され、また微生物の培養工程でも増殖速度や増殖量を低減させることなく、糖液の発酵プロセスを実施することができる。また、化学変換プロセスにおいても反応性が高いカルボニル化合物や不飽和アルコールが変換されることで、生成物の着色等を抑えることができる。
【００３４】
（金属触媒）
第１の発明における水素化反応は、触媒の存在下で行なうことが好ましい。触媒の種類は、特に限定されないが、上記の糖類以外のカルボニル化合物のカルボニル基や、不飽和アルコール及び不飽和エステル化合物等が有する炭素−炭素二重結合を水素化する能力を持つものであればよく、例えば金属触媒、有機分子触媒等が挙げられる。
【００３５】
前記水素化処理は、好ましくは金属触媒の存在下で行なうことが好ましい。金属触媒とは、金属が触媒活性種となるものをいう。前記金属が担体に担持された触媒である金属担持触媒がより好ましい。
前記金属触媒の金属の形態は、本発明における水素化反応を行なう際に、金属状態であれば特に限定されない。
【００３６】
前記金属触媒の金属の種類については、上述した糖類以外のカルボニル化合物のカルボニル基及び不飽和アルコールや不飽和エステル化合物等が有する炭素−炭素二重結合を水素化できるものであれば特に限定されないが、例えば周期表８族〜１１族の金属元素が含まれていることが望ましい。
具体的にはルテニウム、パラジウム、ロジウム、白金、ニッケル、銅、イリジウム、金などであり、好ましくはルテニウム、パラジウム、ロジウム、白金、ニッケル、銅であり、より好ましくはルテニウム、パラジウムである。
【００３７】
ルテニウムを使用した触媒は、アルデヒド化合物、ケトン化合物等のカルボニル化合物に対して水素化能が高く、パラジウムを使用した触媒は、カルボニル化合物の水素化能の高さに加え、カルボニル化合物の還元により得られたアルコールや不飽和アルコールを水素化分解できるほど水素化能が高い金属である点で好ましい。
上記の金属は、本発明の効果を妨げない限り、１種類を用いても、２種類以上の金属を用いてもよく、使用する比率も制限されない。
【００３８】
前記金属触媒は、金属担持触媒として用いるのが、触媒回収が容易であるうえ、安定性が高く触媒寿命の面で好ましい。前記金属担持触媒に用いられる担体は、特に限定されないが、例えば、活性炭やカーボンブラック、ＳｉＣ等の炭素質担体；アルミナ、シリカ、ケイソウ土、ジルコニア、チタニア等の金属酸化物；等を用いることができ、中でも炭素質担体またはアルミナ、シリカを用いるのが、金属担持触媒の安定性の面で好ましい。
【００３９】
金属担持触媒における金属の含有量は特に限定されないが、通常、金属に換算した質量百分率で、担体と金属の合計質量（触媒の全質量）に対して、各金属原子として担体に対する質量百分率で、通常０．１質量％以上、好ましくは０．５質量％以上、より好ましくは１質量％以上、通常５０質量％以下、好ましくは２０質量％以下、より好ましくは１０質量％以下である。なお、２種類以上の金属が含有される場合も、２種類以上の金属の含有量は上記範囲内であることが好ましい。
【００４０】
金属担持触媒の製造方法は、金属が担体に担持されれば特に制限はないが、通常は、金属塩の溶液に担体を浸漬する等の操作によって担体に金属塩を導入し、液相または気相の還元処理によって金属に変換し、触媒を製造する。
本発明において用いられる触媒の形状は、特に限定されるものではく、固定床方式、流動床方式、液相反応、気相反応に従って、適宜選択されるものであり、具体的には粉末状、破砕状、ペレット状などの状態で使用される。
【００４１】
（水素化反応条件）
第１の発明における水素化反応の条件は、糖液中の発酵阻害物質である、糖類以外のカルボニル化合物および不飽和アルコールのカルボニル基や炭素−炭素二重結合が水素化されれば特に限定されない。
糖液中に含まれる糖類もアルデヒド基等を有しており、これらが同様に水素化されると糖アルコールが生成する。具体的にグルコースからはソルビトールに、キシロースからキシリトールが生成する。すなわち前記の糖アルコールが生成しても、後述する有用化合物を発酵生産する工程や、微生物の培養工程において問題がない限りは、水素化反応条件は限定されない。そのため糖類以外のカルボニル化合物のカルボニル基及び、不飽和アルコールや不飽和エステル化合物が有する炭素−炭素二重結合は水素化でき、グルコースやキシロースなどの糖類は水素化されにくい、選択的な水素化条件を選択することが好ましい。
【００４２】
第１の発明における水素化反応の反応温度は特に限定されないが、通常２０℃以上、好ましくは４０℃以上、より好ましくは５０℃以上であり、通常１２０℃以下、好ましくは１００℃以下、より好ましくは９０℃以下である。水素化反応を前記温度範囲内で行うことにより、糖類を水素化することなく、発酵阻害成分である糖類以外のカルボニル成分および脂肪族共役アルコール等のカルボニル基、炭素−炭素二重結合の水素化が可能となる。
【００４３】
第１の発明における水素化反応は、通常、水素ガス存在下、加圧条件下で行われる。水素化反応の圧力は特に限定されないが、通常０．１ＭＰａ以上、好ましくは０．３ＭＰａ以上、より好ましくは０．４ＭＰａ以上、通常１０ＭＰａ以下、好ましくは５ＭＰａ以下であり、より好ましくは３ＭＰａ以下である。一般的には、反応圧力を上昇させると水素化の反応速度が上昇し、発酵阻害物質の水素化は促進されるが、糖アルコールの生成も促進されるため、糖アルコールの生成を抑える場合はより低圧条件で水素化を行うことが望ましい。
【００４４】
第１の発明における水素化反応で使用する触媒の量は、糖液中の発酵阻害成分濃度、糖液中の触媒被毒成分濃度、使用する触媒の金属種、触媒の金属担持量、反応温度、反応圧力、反応様式、糖液の処理量といった諸条件と発酵阻害成分の除去効率、糖アルコールの生成抑制など所望する反応成績で決定されるものであり、特に限定されるものではない。
【００４５】
第１の発明における水素化反応の反応時間は、糖液中の発酵阻害成分濃度、糖液中の触媒被毒成分濃度、使用する触媒の金属種、触媒の金属担持量、反応温度、反応圧力、反応様式、糖液の処理量といった諸条件と発酵阻害成分の除去効率、糖アルコールの生成抑制など所望する反応成績で決定されるものであり、特に限定されるものではない。但し、反応時間が短いと発酵阻害物質の転化が十分に進行しない可能性があり、反応時間が長いと糖アルコールの生成量が増大する可能性がある。
【００４６】
第１の発明における水素化反応には、溶媒を使用することができ、その種類は特に限定されるものではないが、通常は水が使用される。有機溶媒を共溶媒として使用してもよいが、水相に有機溶媒が混入することで発酵阻害を引き起こす可能性があるため、発酵生産や微生物の培養工程に供する際に有機溶媒を分離する工程が必要となるため、糖液は水溶液のまま水素化処理することが望ましい。
【００４７】
第１の発明における水素化反応において、糖液中に含まれるＮ成分、Ｓ成分、酸等の触媒被毒成分が含まれる場合、水素化反応時に触媒を用いる場合、触媒に吸着することで水素化活性を低下させる可能性がある。このような触媒被毒成分を水素化処理前に除去してもよい。除去方法は特に限定されるものではないが、イオン交換樹脂、活性炭、合成樹脂による吸着除去処理等を行うことができる。
【００４８】
＜第２の発明：水素化処理糖液＞
前記第１の発明における水素化反応において、糖液に含有される糖類以外のカルボニル化合物および不飽和アルコールからなる群より選ばれる少なくとも１つが水素化反応によって還元されるため、得られる糖液中の前記カルボニル化合物および／または不飽和アルコールの濃度は、最初の糖液中の濃度より低い。なお、上記の水素化反応に供した後の糖液を、以下「水素化処理糖液」ということがある。
【００４９】
第２の発明の水素化処理糖液に含まれる糖類以外のカルボニル化合物および／または不飽和アルコールの中でも、微生物に対し、発酵阻害能が高い物質としてフルフラールを挙げることができる。水素化反応後の糖液（水素化処理糖液）中のフルフラールの含有率は、少ない方が好ましく、水素化処理糖液全量に対して０．０１質量％以下が好ましく、０．００１質量％以下がより好ましい。またフルフラールの含有率が少ないことで、糖液の着色も抑制でき、化学変換プロセスを経て有機化合物を生産する場合、生成する有機化合物の着色を抑制することができる。
また、第２の発明の水素化処理糖液に含まれる糖類以外のカルボニル化合物および／または不飽和アルコールの中でも、微生物に対し、発酵阻害能が高い他の物質として、グリコールアルデヒドが挙げられる。グリコールアルデヒドとしては、モノマー体でもダイマー体でもよく、また水溶液の場合は水和された化合物でもよい。通常、これら化合物の平衡混合物となる。水素化処理糖液中のグリコールアルデヒドの含有率は、水素化処理糖液全量に対して、０．０３質量％以下が好ましく、好ましくは０．０１質量%以下であることがより好ましい。
上記の糖類以外のカルボニル化合物および不飽和アルコールを上記範囲まで除去することにより、後述する発酵プロセスにおいて、微生物の増殖や有用化合物の発酵生産の効率を向上させることができる。
【００５０】
第２の発明の水素化処理糖液は、前記糖類以外のカルボニル化合物および／または不飽和アルコールの水素化物を糖液に含んでいてもよく、具体的には、アルデヒド化合物およびケトン化合物である場合、対応するアルコール類、水素化分解によってさらにアルコールから脱水した化合物等を含んでいてもよい。具体的には、フルフラールの水素化生成物としては、フルフリルアルコールやテトラヒドロフルフリルアルコールが挙げられ、それらアルコールの脱水した化合物としてはメチルフランやジメチルフランが挙げられる。グリコールアルデヒドの水素化生成物としては、エチレングルコールが挙げられる。同様にケトン類であれば対応するアルコール類が含有され、不飽和エステル化合物であれば、エステル中の炭素−炭素二重結合が水素化されたエステル化合物や、それらエステルがさらに還元されたアルコール等を含んでいてもよい。また、不飽和アルコール類であれば不飽和炭素二重結合が水素化されたアルコール類や、水素化分解によりさらにアルコールが脱水された化合物等を含有していてもよい。
【００５１】
第２の発明の水素化処理糖液は、糖液を水素化反応に供することにより得られるが、水素化反応時に触媒を用いた場合、使用した触媒を分離回収する工程を含む。触媒の分離方法としては、回分式反応の場合、通常、得られた水素化処理糖液を濾過することによって触媒を回収する。また、流通式反応の場合には、固定床反応器等に糖液を展開し、触媒と水素化処理糖液とに分離回収することができる。また、第２の発明の水素化処理糖液は、必要に応じて、適宜、イオン交換樹脂、活性炭、合成樹脂等の手法で処理しても構わない。
【００５２】
水素化反応後に回収された触媒は、糖類以外のカルボニル化合物、不飽和アルコールや不飽和エステルの、炭素−炭素二重結合を水素化または水素化分解できる活性を維持する限りは、回分反応器での繰り返し使用や、連続反応器での連続的使用が可能である。
他方、活性が低下した触媒は、水素圧力を上げる、反応温度を上げる等の操作条件により活性を維持することも可能である。ただし、糖アルコールの生成を抑制しつつ、発酵阻害成分を水素化する活性に制御される必要がある。
【００５３】
本発明の第２の発明の水素化処理糖液は、後述の第３の発明に用いて有機化合物を製造する際に用いることができる。また同様に化学変換プロセスに用いることで各種有機化合物を製造することができる。
ここでいう化学変換プロセスとは、水素化処理糖液中に含まれる糖を原料として、各種有機化合物に変換することができる化学反応一般をいう。化学反応の種類は特に限定はされないが、具体的には、糖が有するカルボニル基が酸化されたアルドン酸や、更にヒドロキシメチル基がカルボキシル基に変換されるアルダル酸等を得る酸化反応、糖が有するカルボニル基が還元された糖アルコールを得る還元反応、酸、アルカリ、各種触媒を作用させ各種の有機化合物に変換する反応等が挙げられる。
【００５４】
＜第３の発明：有機化合物の製造方法＞
本発明の第３の発明は、糖液を含有する有機原料に有用物質生産能力を有する微生物を作用させて有機化合物を製造する方法である。
【００５５】
（水素化処理工程）
第３の発明において、糖類以外のカルボニル化合物および不飽和アルコールからなる群より選ばれる少なくとも１つを含む糖液を使用する場合、第３の発明は、先ず該糖液を水素化反応に供し、該糖液中に含まれる糖類以外のカルボニル化合物および不飽和アルコールからなる群より選ばれる少なくとも１つを水素化する工程（水素化処理工程）を有する。
上記水素化処理工程における糖類、糖類以外のカルボニル化合物、および不飽和アルコール、並びに水素化処理工程で用いる金属触媒、水素化処理の条件等は、上記第１の発明（糖類の処理方法）で説明したものおよび条件をそのまま用いることができる。
【００５６】
他方、第３の発明において、糖液として第２の発明の水素化処理糖液を使用することもできる。この場合には、上記水素化処理工程を省略することができる。
【００５７】
（有機物生産工程）
第３の発明は、前記水素化処理後の糖液または第２の発明の水素化処理糖液を含有する有機原料に有機物生産能を有する微生物を作用させて有機化合物を得る、有機物生産工程を含む。有機物生産工程で使用する有機原料は、水素化処理された糖液を含有し、有機化合物を生成する際に、水素化処理された糖液に、糖液の性質、生産する有機化合物または作用させる微生物の種類に応じ、必要に応じ適宜各種成分を添加することができる。第３の発明において水素化処理された糖液にさらに添加することができるものとしては、後述する有用物質生産能力を有する微生物が資化して有機化合物を生成させ得る炭素源が挙げられ、その種類は特に限定されないが、通常、ガラクトース、ラクトース、グルコース、フルクトース、スクロース、デンプンまたはセルロース等の炭水化物；グリセロール、マンニトール、キシリトールまたはリビトール等のポリアルコール類等の発酵性糖質が用いられ、このうちグルコース、スクロースまたはフルクトースが好ましく、特にグルコースまたはスクロースが好ましい。
これらは、単独で添加してもよいし、組み合わせて添加してもよい。
【００５８】
有機物生産工程における前記有機原料の使用濃度は特に限定されないが、有機化合物の生成を阻害しない範囲で可能な限り高くすることが好ましい。具体的には糖液を含有する有機原料の濃度は、水性媒体の全体積に対して、通常５０ｇ／Ｌ以上、好ましくは１００ｇ／Ｌ以上であり、一方、通常３００ｇ／Ｌ以下、好ましくは２００ｇ／Ｌ以下である。また、培養液全量に対しては、通常１〜１００ｇ／Ｌ、好ましくは５〜５０ｇ／Ｌの範囲内で用いることができる。前記有機原料は、反応の進行に伴う前記有機原料の減少にあわせ、水性媒体中に前記有機原料をさらに添加してもよい。
【００５９】
（有用物質生産能力を有する微生物）
第３の発明で用いる微生物は、有用物質生産能力を有する微生物であれば、特に限定はされない。
なお第３の発明における「有用物質生産能力を有する微生物」とは、該微生物を培地中で培養したときに、該培地中に有用物質を生成蓄積することができる微生物をいう。
【００６０】
（有用物質）
微生物が生産する有用物質としては、微生物が培地中に生成蓄積することができる有機化合物であれば限定されないが、具体的には、エタノール、プロパノール、ブタノール、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、１，３−ブタンジオール、２，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、１，５−ペンタンジオール、１，６−ヘキサンジオール、グリセロール、エリスリトール、キシリトール、ソルビトール等のアルコール類；１，５−ペンタメチレンジアミン、１，６−ヘキサメチレンジアミン等のアミン類；酢酸、酪酸、グリコール酸、乳酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、ピルビン酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、オキサロ酢酸、シス−アコニット酸、クエン酸、イソクエン酸、２−オキソグルタル酸、２−オキソイソ吉草酸、グルタル酸、イタコン酸、アジピン酸、レブリン酸、キナ酸、シキミ酸、アクリル酸、メタクリル等のカルボン酸類；アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、リジン、アルギニン、メチオニン、ヒスチジン、システイン、セリン、トレオニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、フェニルアラニン、チロシン、プロリン、トリプトファン等のアミノ酸類；フェノール、カテコール、ハイドロキノン等のフェノール類；安息香酸、４−ヒドロキシ安息香酸、プロトカテク酸、フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸等の芳香族カルボン酸類；イノシン、グアノシン等のヌクレオシド類、イノシン酸、グアニル酸等のヌクレオチド；イソブチレン、イソプレン、ブタジエン等の不飽和炭化水素化合物等が挙げられる。
【００６１】
これらの中でも、発酵生産として公知の方法を採用でき、かつ、樹脂原料として使用可能であることから、アルコール類、アミン類、カルボン酸類、フェノール類が好ましく、炭素数２〜１０の脂肪族アルコール類と炭素数２〜１０の脂肪族カルボン酸類がより好ましい。中でも、発酵生産性が良好であることから、エタノール、ブタンジオール、またはコハク酸がさらに好ましい。
【００６２】
（微生物）
第３の発明で用いる微生物は、有用物質生産能力を有する微生物であれば特に限定されないが、コリネ型細菌、大腸菌、バチルス（Bacillus）属細菌、クレブシエラ（Klebsiella）属細菌、セラチア（Serratia）属細菌、クロストリジウム（Clostridium）属細菌、エンテロバクター（Enterobacter）属細菌、ラルストニア（Ralstonia）属細菌、アナエロビオスピリラム（Anaerobiospirillum）属細菌、アクチノバチルス（Actinobacillus）属細菌、マンヘミア（Mannheimia）属細菌、バスフィア（Basfia）属細菌、ザイモモナス（Zymomonas）属細菌、ザイモバクター（Zymobacter）属細菌、糸状菌、および酵母菌からなる群より選ばれる少なくとも１つの微生物であることが好ましい。
【００６３】
その中でも、コリネ型細菌、大腸菌、バチルス（Bacillus）属細菌、アナエロビオスピリラム（Anaerobiospirillum）属細菌、アクチノバチルス（Actinobacillus）属細菌、マンヘミア（Mannheimia）属細菌、バスフィア（Basfia）属細菌、ザイモバクター（Zymobacter）属細菌、糸状菌、および酵母菌からなる群より選ばれる少なくとも１つが好ましく、より好ましくはコリネ型細菌、大腸菌、酵母菌であり、さらに好ましくはコリネ型細菌である。
【００６４】
上記コリネ型細菌は、これに分類されるものであれば特に制限されないが、コリネバクテリウム属に属する細菌、ブレビバクテリウム属に属する細菌、アースロバクター属に属する細菌などが挙げられ、このうち好ましくは、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属に属するものが挙げられ、更に好ましくは、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacteriumflavum）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）またはブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）に分類される細菌である。
【００６５】
第３の発明で使用可能なコリネ型細菌の特に好ましい具体例としては、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４９７）、同ＭＪ−２３３  ＡＢ−４１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４９８）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ６８７２、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ３１８３１、およびブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９等が挙げられる。なお、ブレビバクテリウム・フラバムは、現在、コリネバクテリウム・グルタミカムに分類される場合もあることから（Lielbl W, Ehrmann M, Ludwig W, Schleifer KH, Int J Syst Bacteriol., 1991, Vol.41, p255-260）、本発明においては、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株、およびその変異株ＭＪ−２３３  ＡＢ−４１株はそれぞれ、コリネバクテリウム・グルタミカムＭＪ−２３３株およびＭＪ−２３３  ＡＢ−４１株と同一の株とする。
【００６６】
上記ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３は、１９７５年４月２８日に通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（現独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター）（〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−３０６８として寄託され、１９８１年５月１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４９７の受託番号で寄託されている。
【００６７】
第３の発明で使用可能な大腸菌としては、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等が挙げられる。また、第３の発明で使用可能なアナエロビオスピリラム（Anaerobiospirillum）属細菌としては、アナエロビオスピリラム・サクシニシプロデュセン（Anaerobiospirillum succiniciproducens）等が挙げられる
【００６８】
また、第３の発明で使用可能なバチルス（Bacillus）属細菌としては、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）等が挙げられる。
【００６９】
また、第３の発明で使用可能なクレブシエラ（Klebsiella）属細菌としては、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）、クレブシエラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）等が挙げられる。
また、第３の発明で使用可能なセラチア（Serratia）属細菌としては、セラチア・マルセッセンス（Serratia marcescens）等が挙げられる。
【００７０】
また、第３の発明で使用可能なクロストリジウム（Clostridium）属細菌としては、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、クロストリジウム・オートエタノゲナム（Clostridium autoethanogenum）、クロストリジウム・リュングダーリー（Clostridium ljungdahlii）、クロストリジウム・ラグスダレイ（Clostridium ragsdalei）等が挙げられる。
【００７１】
また、第３の発明で使用可能なエンテロバクター（Enterobacter）属細菌としては、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）等が挙げられる。
また、第３の発明で使用可能なラルストニア（Ralstonia）属細菌としては、ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）等が挙げられる。
【００７２】
また、第３の発明に使用可能なアクチノバチルス（Actinobacillus）属細菌としては、アクチノバチルス・サクシノジェネス（Actinobacillus succinogenes）等が挙げられる。
また第３の発明に使用可能なマンヘミア（Mannheimia）属細菌としては、バスフィア・サクシニシプロデュセン（Mannheimia succiniciproducens）等が挙げられる。
【００７３】
また第３の発明で使用可能なバスフィア（Basfia）属細菌としては、バスフィア・サクシニシプロデュセン（Basfia succiniciproducens）等が挙げられる。また、第３の発明で使用可能なザイモモナス（Zymomonas）属細菌としては、ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）等が挙げられる。また、第３の発明で使用可能なザイモバクター（Zymobacter）属細菌としては、ザイモバクター・パルメ（Zymobacter palmae）等が挙げられる。
【００７４】
また第３の発明で使用可能な糸状菌としては、Aspergillus属、Penicillium属、Rhizopus属等が挙げられる。このうち、Aspergillus属では、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）等が挙げられ、Penicillium属では、ペニシリウム・クリソゲナム（Penicillium chrysogenum）、ペニシリウム・シンプリシシマム（Penicillium simplicissimum）等が挙げられる。また、Rhizopus属では、リゾパス・オリゼー（Rhizopus oryzae）等が挙げられる。
【００７５】
また、第３の発明で使用可能な酵母菌としては、サッカロミセス属（Saccharomyces）、シゾサッカロミセス属（Shizosaccharomyces）、カンジダ属（Candida）、ピキア属（Pichia）、クルイウェロマイセス属（Kluyveromyces）、ヤロウィア属（Yarrowia）、チゴサッカロミセス属（Zygosaccharomyces）が挙げられる。
【００７６】
上記サッカロミセス属（Saccharomyces）としては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロミセス・ウバラム（Saccharomyces uvarum）、サッカロミセス・バイアヌス（Saccharomyces bayanus）等が挙げられる。
また、上記シゾサッカロミセス属（Shizosaccharomyces）としては、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）等が挙げられる。
また、上記カンジダ属（Candida）としては、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、カンジダ・ソノレンシス（Candida sonorensis）、カンジダ・グラブラタ（Candida glabrata）等が挙げられる。また、上記ピキア属（Pichia）としては、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、ピキア・スティピティス（Pichia stipitis）等が挙げられる。
【００７７】
また上記クルイウェロマイセス属（Kluyveromyces）としては、クルイウェロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、クルイウェロマイセス・マルキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）、クルイウェロマイセス・サーモトレランス（Kluyveromyces thermotolerans）等が挙げられる。また上記ヤロウィア属（Yarrowia）としては、ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）等が挙げられる。また上記チゴサッカロミセス属（Zygosaccharomyces）としては、チゴサッカロミセス・バイリイ（Zygosaccharomyces bailii）、チゴサッカロミセス・ロウキシ（Zygosaccharomyces rouxii）等が挙げられる。
【００７８】
このうち、前記有用物質としてコハク酸を製造する場合は、上記微生物のうち、コリネ型細菌、大腸菌、バチルス（Bacillus）属細菌、クレブシエラ（Klebsiella）属細菌、セラチア（Serratia）属細菌、クロストリジウム（Clostridium）属細菌、エンテロバクター（Enterobacter）属細菌、ラルストニア（Ralstonia）属細菌、アナエロビオスピリラム（Anaerobiospirillum）属細菌、アクチノバチルス（Actinobacillus）属細菌、マンヘミア（Mannheimia）属細菌、バスフィア（Basfia）属細菌、ザイモバクター（Zymobacter）属細菌、糸状菌、および酵母菌からなる群より選ばれる少なくとも１つが好ましく、より好ましくはコリネ型細菌、大腸菌、酵母菌であり、さらに好ましくはコリネ型細菌である。
【００７９】
また前記有用物質としてエタノールを製造する場合には、上記微生物のうち、コリネ型細菌、大腸菌、バチルス（Bacillus）属細菌、クレブシエラ（Klebsiella）属細菌、セラチア（Serratia）属細菌、クロストリジウム（Clostridium）属細菌、エンテロバクター（Enterobacter）属細菌、ラルストニア（Ralstonia）属細菌、アナエロビオスピリラム（Anaerobiospirillum）属細菌、アクチノバチルス（Actinobacillus）属細菌、マンヘミア（Mannheimia）属細菌、バスフィア（Basfia）属細菌、ザイモモナス（Zymomonas）属細菌、ザイモバクター（Zymobacter）属細菌、糸状菌、および酵母菌からなる群より選ばれる少なくとも１つが好ましく、より好ましくはコリネ型細菌、大腸菌、酵母菌であり、さらに好ましくは酵母菌である。
【００８０】
また、前記有用物質としてブタンジオール、好ましくは２，３−ブタンジオールを製造する場合には、コリネ型細菌、大腸菌、バチルス（Bacillus）属細菌、クレブシエラ（Klebsiella）属細菌、セラチア（Serratia）属細菌、クロストリジウム（Clostridium）属細菌、エンテロバクター（Enterobacter）属細菌、ラルストニア（Ralstonia）属細菌、アナエロビオスピリラム（Anaerobiospirillum）属細菌、アクチノバチルス（Actinobacillus）属細菌、マンヘミア（Mannheimia）属細菌、バスフィア（Basfia）属細菌、ザイモモナス（Zymomonas）属細菌、ザイモバクター（Zymobacter）属細菌、糸状菌、および酵母菌からなる群より選ばれる少なくとも１つが好ましく、より好ましくはコリネ型細菌、大腸菌、酵母菌であり、さらに好ましくはコリネ型細菌である。
【００８１】
上記微生物は、野生株だけでなく、ＵＶ照射やＮＴＧ処理等の通常の変異処理により得られる変異株、細胞融合若しくは遺伝子組換え法などの遺伝学的手法により誘導される組換え株などのいずれの株であってもよい。
また上記微生物は、本来的に有用物質生産能力を有する微生物であるが、育種により有用物質生産能を付与したものであってもよい。
【００８２】
育種により有用物質生産能力を付与する手段としては、変異処理や遺伝子組換え処理などが挙げられ、有用物質生合成経路における酵素遺伝子の発現強化や副生物生合成経路における酵素遺伝子の発現低減など、公知の方法を採用することができる。例えば、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸等のカルボン酸生産能を付与する場合は、後述するようなラクテートデヒドロゲナーゼ活性を低減するような改変やピルビン酸カルボキシラーゼ活性を増強するような手段などが挙げられる。エタノール、ブタノール、ブタンジオール等のアルコール生産能を付与する場合は、後述するようなラクテートデヒドロゲナーゼ活性を低減するような改変やアルコールデヒドロゲナーゼ活性を増強するような手段などが挙げられる。
【００８３】
上記ラクテートデヒドロゲナーゼ（以下、ＬＤＨという）活性を低減させるような改変方法としては、特に限定はされないが、上述した微生物を親株として用い、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトローＮ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）や亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理し、ＬＤＨ活性が低減した株を選択することによってそれぞれ得ることができる。また、ＬＤＨをコードする遺伝子を用いて改変してもよい。具体的には、染色体上のｌｄｈ遺伝子を破壊する方法や、プロモーターやシャインダルガルノ（ＳＤ）配列等の発現調節配列を改変する方法などによって達成される。
【００８４】
ＬＤＨ活性が低減した株の具体的な作製方法としては、染色体への相同組換えによる方法（特開平１１−２０６３８５号公報等参照）や、ｓａｃＢ遺伝子を用いる方法（Schafer A, Tauch A, Jager W, Kalinowski J, Thierbach G, Puhler A, Gene 1994 Vol.145(1), p69-73）等が挙げられる。
【００８５】
上記ピルビン酸カルボキシラーゼ（以下、ＰＣとも呼ぶ）活性が増強するような改変方法としては、特に限定されないが、上述した微生物を親株として用い、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトローＮ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）や亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理し、ＰＣ活性が増強した株を選択することによってそれぞれ得ることができる。また、ＰＣをコードする遺伝子を用いて改変してもよい。具体的には、ｐｃ遺伝子のコピー数を高めることによって達成でき、コピー数を高めることは、プラスミドを用いたり、公知の相同組換え法によって染色体上で多コピー化させたりすることなどによって達成できる。なお、ＰＣ活性の増強は、染色体上またはプラスミド上でｐｃ遺伝子のプロモーターへの変異導入、より強力なプロモーターへの置換などによって高発現化させることによっても達成できる。
【００８６】
ＰＣ活性の増強に用いるｐｃ遺伝子としては、ＰＣ活性を有するタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）由来の遺伝子を挙げることができる。さらに、コリネ型細菌以外の細菌、または他の微生物または動植物由来のｐｃ遺伝子を使用することもできる。微生物または動植物由来のｐｃ遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子、ホモロジー等に基づいてＰＣ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を微生物、動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものなどを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列に従って合成した遺伝子を使用することもできる。これらはハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法により、そのプロモーターおよびＯＲＦ部分を含む領域を増幅することによって取得することができる。
【００８７】
上記のようにして単離されたＰＣをコードする遺伝子を公知の発現ベクターに発現可能に挿入することにより、ＰＣ発現ベクターが提供される。この発現ベクターで形質転換することにより、ＰＣ活性増強株を得ることができる。または、相同組換えなどによって、宿主微生物の染色体ＤＮＡにＰＣをコードするＤＮＡを発現可能に組み込むことによってもＰＣ活性増強株を得ることができる。なお、形質転換、相同組換えは当業者に知られた通常の方法に従って行うことができる。
【００８８】
染色体上またはプラスミド上にＰＣ遺伝子を導入する場合には、適当なプロモーターを該遺伝子の５’−側上流に、より好ましくはターミネーターを３’−側下流にそれぞれ組み込む。このプロモーターおよびターミネーターとしては、宿主として利用する微生物中において機能することが知られているプロモーターおよびターミネーターであれば特に限定されず、ｐｃ遺伝子自身のプロモーターおよびターミネーターであってもよいし、他のプロモーターおよびターミネーターに置換してもよい。これら各種微生物において利用可能なベクター、プロモーターおよびターミネーターなどに関しては、例えば「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」などに詳細に記述されている。
【００８９】
本発明において用いられる微生物に、育種によりアルコール生産能を付与する場合としては、カルボン酸生産能を付与する場合と同様の方法で、ＬＤＨ活性を低減するよう改変された微生物を利用することができる。
上記アルコールデヒドロゲナーゼ（以下、ＡＤＨとも呼ぶ）活性が増強するように改変された微生物は、上述のＰＣ活性を増強する方法と同様にして作製することができる。
【００９０】
ＡＤＨ活性の増強に用いるａｄｈ遺伝子としては、ＡＤＨ活性を有するタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えば、ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）由来のａｄｈＢ遺伝子、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）由来のａｄｈＥ２遺伝子を挙げることができる。さらに、上記以外の細菌、または他の微生物、動植物由来のａｄｈ遺伝子を使用することもできる。微生物または動植物由来のａｄｈ遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子、ホモロジー等に基づいてＡＤＨ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を微生物、動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものなどを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列に従って合成した遺伝子を使用することもできる。これらはハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法により、そのプロモーターおよびＯＲＦ部分を含む領域を増幅することによって取得することができる。
【００９１】
なお、本発明に用いる微生物は、有用物質生産能を付与するための改変のうちの２種類以上の改変を組み合わせて得られる微生物であってもよい。複数の改変を行う場合、その順番は問わない。
第３の発明で用いる微生物は、有用物質生産能を有し、且つペントース利用能を有する微生物であってもよく、ペントース利用能を有する微生物が好ましい。
本発明において、「ペントース利用能」とは、該微生物がペントースを炭素源として利用し、増殖または有用物質生産することができることをいう。
【００９２】
微生物が炭素源として利用するペントースとしては、炭素源として利用可能であれば特に限定されない。具体例としては、キシロース、アラビノース、リボース、リキソース等のアルドペントース類、リブロース、キシルロース等のケトペントース等が挙げられる。
これらの中でも、アルドペントース類が好ましく、非可食原料として利用されるヘミセルロース系バイオマスに含まれるキシロース、アラビノースがより好ましい。中でも、ヘミセルロース系バイオマス中の含有量が多いキシロースが特に好ましい。
【００９３】
ここで、ペントース利用能を有する微生物は、本来的にペントース利用能を有する微生物であってもよいし、育種によりペントース利用能を付与したものでもよい。
育種によりペントース利用能を付与する手段としては、遺伝子組換え処理などが挙げられ、ペントース代謝経路の酵素遺伝子を導入など公知の方法を採用することができる。例えば、キシロース利用能を付与する場合は、後述するようなキシロースイソメラーゼ遺伝子を導入する方法、またはキシロースリダクターゼ遺伝子およびキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子を導入する方法などが挙げられる。アラビノース利用能を付与する場合は、後述するようなアラビノースイソメラーゼ遺伝子およびリブロキナーゼ遺伝子およびリブロース５リン酸エピメラーゼ遺伝子を導入する方法などが挙げられる。
【００９４】
以下、育種によりペントース利用能を付与する具体例として、キシロース利用能の付与に関する改変例とアラビノース利用能の付与に関する改変例について説明する。
キシロース利用能を付与された微生物は、上述した微生物を親株として用い、該親株にキシロースイソメラーゼ（以下、ＸｙｌＡとも呼ぶ）活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を導入することによって得ることができる。
【００９５】
ここで、「ＸｙｌＡ活性」とは、キシロースを異性化してキシルロースを生成する反応を触媒する活性（ＥＣ：５．３．１．５）をいう。ＸｙｌＡ活性が付与または増強されたことは、公知の方法、例えばＧａｏらの方法（Gao Q, Zhang M, McMillan JD, Kompala DS, Appl. Biochem. Biotechnol., 2002, Vol.98(100), p341-55）により、ＸｙｌＡ活性を測定することによって確認することができる。
【００９６】
ＸｙｌＡ活性が付与または増強された株の具体的な作製方法としては、ｘｙｌＡ遺伝子をプラスミドによって導入する方法や、公知の相同組換え法によって染色体上に導入したりする方法などによって達成できる。
ＸｙｌＡ活性の付与または増強に用いるｘｙｌＡ遺伝子としては、ＸｙｌＡ活性を有するタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）由来の遺伝子を挙げることができる。
【００９７】
さらに、大腸菌以外の細菌または他の微生物、動植物由来のｘｙｌＡ遺伝子を使用することもできる。微生物または動植物由来のｘｙｌＡ遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子、ホモロジー等に基づいてＸｙｌＡ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を微生物、動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものなどを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列に従って合成した遺伝子を使用することもできる。これらはハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法により、そのプロモーターおよびＯＲＦ部分を含む領域を増幅することによって取得することができる。
【００９８】
上記のようにして単離されたＸｙｌＡをコードする遺伝子を公知の発現ベクターに発現可能に挿入することにより、ＸｙｌＡ発現ベクターが提供される。この発現ベクターで形質転換することにより、ＸｙｌＡ活性が付与または増強された株を得ることができる。あるいは、相同組換えなどによって、宿主微生物の染色体ＤＮＡにＸｙｌＡをコードするＤＮＡを発現可能に組み込むことによってもＸｙｌＡ活性が付与または増強された株を得ることができる。なお、形質転換、相同組換えは当業者に知られた通常の方法に従って行うことができる。
【００９９】
染色体上またはプラスミド上にＸｙｌＡ遺伝子を導入する場合には、適当なプロモーターを該遺伝子の５’−側上流に、より好ましくはターミネーターを３’−側下流にそれぞれ組み込む。このプロモーターおよびターミネーターとしては、宿主として利用する微生物中において機能することが知られているプロモーターおよびターミネーターであれば特に限定されず、ｘｙｌＡ遺伝子自身のプロモーターおよびターミネーターであってもよいし、他のプロモーターおよびターミネーターに置換してもよい。これら各種微生物において利用可能なベクター、プロモーターおよびターミネーターなどに関しては、例えば「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」などに詳細に記述されている。
【０１００】
また、キシロース利用能の付与においては、ＸｙｌＡ活性の付与または増強に加えて、キシルロキナーゼ（以下、ＸｙｌＢとも呼ぶ）活性を付与または増強するように改変された微生物であってもよい。
ここで、「ＸｙｌＢ活性」とは、キシルロースをリン酸化してキシルロース５リン酸を生成する反応を触媒する活性（ＥＣ：２．７．１．１７）をいう。ＸｙｌＢ活性が付与または増強されたことは、公知の方法、例えばＥｌｉａｓｓｏｎらの方法（Eliasson A, Boles E, Johansson B, Otensterberg M, Thevelein JM, Spencer-Martins I, Juhnke H, Hahn-Hatengerdal B, Appl. Microbiol. Biotechnol., 2000, Vol.53, p376-82）により、ＸｙｌＢ活性を測定することによって確認することができる。
【０１０１】
ＸｙｌＢ活性が付与または増強された株は、上述のＸｙｌＡ活性を付与または増強する方法と同様にして作製することができる。
ＸｙｌＢ活性の付与または増強に用いるｘｙｌＢ遺伝子としては、ＸｙｌＢ活性を有するタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えばエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacteriumglutamicum）由来の遺伝子を挙げることができる。
【０１０２】
さらに、上記以外の細菌、または他の微生物、動植物由来のｘｙｌＢ遺伝子を使用することもできる。微生物または動植物由来のｘｙｌＢ遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子、ホモロジー等に基づいてＸｙｌＢ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を微生物、動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものなどを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列に従って合成した遺伝子使用することもできる。これらはハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法により、そのプロモーターおよびＯＲＦ部分を含む領域を増幅することによって取得することができる。
【０１０３】
ＸｙｌＡ活性およびＸｙｌＢ活性を付与または増強する場合、導入するｘｙｌＡ遺伝子とｘｙｌＢ遺伝子は同じ遺伝子座上に存在していてもよく、それぞれ別の遺伝子座上に存在していてもよい。２つの遺伝子が同じ遺伝子座上に存在している例としては、例えば、それぞれの遺伝子が連結して形成されたオペロンなどが挙げられる。
キシロース利用能を付与された微生物は、上述した微生物を親株として用い、該親株にキシロースリダクターゼ（以下、ＸＲとも呼ぶ）活性を有するタンパク質をコードする遺伝子およびキシリトールデヒドロゲナーゼ（以下、ＸＤＨとも呼ぶ）活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を導入することによって得ることもできる。
【０１０４】
ここで、「ＸＲ活性」とは、キシロースを還元してキシリトールを生成する反応を触媒する活性（ＥＣ：１．１．１．２１）をいう。ＸＲ活性が付与または増強されたことは、公知の方法、例えばＳａｓａｋｉらの方法（Sasaki M, Jojima T, Inui M, Yukawa H, Appl Microbiol Biotechnol., 2010, Vol.86(4), p1057-66）により、ＸＲ活性を測定することによって確認することができる。
【０１０５】
ＸＲ活性が付与または増強された株は、上述のＸｙｌＡ活性を付与または増強する方法と同様にして作製することができる。ＸＲ活性の付与または増強に用いるｘｒ遺伝子としては、ＸＲ活性を有するタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えば、ピキア・スティピティス（Pichia stipitis）由来のＸＹＬ１遺伝子を挙げることができる。
さらに、上記以外の微生物または動植物由来のｘｒ遺伝子を使用することもできる。微生物または動植物由来のｘｒ遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子、ホモロジー等に基づいてＸＲ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を微生物、動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものなどを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列に従って合成した遺伝子を使用することもできる。これらはハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法により、そのプロモーターおよびＯＲＦ部分を含む領域を増幅することによって取得することができる。
【０１０６】
次に、「ＸＤＨ活性」とは、キシリトールを脱水素化してキシルロースを生成する反応を触媒する活性（ＥＣ：１．１．１．９）をいう。ＸＤＨ活性が付与または増強されたことは、公知の方法、例えばＲｉｚｚｉらの方法（Rizzi M, Harwart K, Erlemann P, Bui-Thahn NA, Dellweg H, J Ferment Bioeng., 1989, Vol.67, p20-24）により、ＸＤＨ活性を測定することによって確認することができる。
【０１０７】
ＸＤＨ活性が付与または増強された株は、上述のＸｙｌＡ活性を付与または増強する方法と同様にして作製することができる。ＸＤＨ活性の付与または増強に用いるｘｄｈ遺伝子としては、ＸＤＨ活性を有するタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えば、ピキア・スティピティス（Pichia stipitis）由来のＸＹＬ２遺伝子を挙げることができる。
【０１０８】
さらに、上記以外の微生物または動植物由来のｘｄｈ遺伝子を使用することもできる。微生物または動植物由来のｘｄｈ遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子、ホモロジー等に基づいてＸＤＨ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を微生物、動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものなどを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列に従って合成した遺伝子を使用することもできる。これらはハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法により、そのプロモーターおよびＯＲＦ部分を含む領域を増幅することによって取得することができる。
【０１０９】
また、キシロース利用能の付与においては、ＸＤＨ活性およびＸＲ活性の付与または増強に加えて、ＸｙｌＢ活性を付与または増強するように改変された微生物であってもよい。ＸｙｌＢ活性の付与または増強に関しては上述の通りである。
アラビノース利用能を付与された微生物は、上述した微生物を親株として用い、該親株にアラビノースイソメラーゼ（以下、ＡｒａＡとも呼ぶ）活性を有するタンパク質をコードする遺伝子およびリブロキナーゼ（以下、ＡｒａＢとも呼ぶ）活性を有するタンパク質をコードする遺伝子およびリブロース５リン酸エピメラーゼ（以下、ＡｒａＤとも呼ぶ）活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を導入することによって得ることができる。
【０１１０】
ここで、「ＡｒａＡ活性」とは、アラビノースを異性化してリブロースを生成する反応を触媒する活性（ＥＣ：５．３．１．４）をいう。ＡｒａＡ活性が付与または増強されたことは、公知の方法、例えばＰａｔｒｉｃｋらの方法（Patrick JW, Lee N, J. Biol. Chem., 1968, Vol.243, p4312-19）により、ＡｒａＡ活性を測定することによって確認することができる。
【０１１１】
ＡｒａＡ活性が付与または増強された株は、上述のＸｙｌＡ活性を付与または増強する方法と同様にして作製することができる。ＡｒａＡ活性の付与または増強に用いるａｒａＡ遺伝子としては、ＡｒａＡ活性を有するタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）由来の遺伝子を挙げることができる。
【０１１２】
さらに、上記以外の細菌、または他の微生物、動植物由来のａｒａＡ遺伝子を使用することもできる。微生物または動植物由来のａｒａＡ遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子、ホモロジー等に基づいてＡｒａＡ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を微生物、動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものなどを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列に従って合成した遺伝子を使用することもできる。これらはハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法により、そのプロモーターおよびＯＲＦ部分を含む領域を増幅することによって取得することができる。
【０１１３】
次に、「ＡｒａＢ活性」とは、リブロースをリン酸化してリブロース５リン酸を生成する反応を触媒する活性（ＥＣ：２．７．１．１６）をいう。ＡｒａＢ活性が付与または増強されたことは、公知の方法、例えばＬｅｅらの方法（Lee N, Englesberg E, Proc. Natl. Acad. Sci., 1962, Vol.48, p335-48）により、ＡｒａＢ活性を測定することによって確認することができる。
【０１１４】
ＡｒａＢ活性が付与または増強された株は、上述のＸｙｌＡ活性を付与または増強する方法と同様にして作製することができる。ＡｒａＢ活性の付与または増強に用いるａｒａＢ遺伝子としては、ＡｒａＢ活性を有するタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）由来の遺伝子を挙げることができる。
【０１１５】
さらに、上記以外の細菌、または他の微生物、動植物由来のａｒａＢ遺伝子を使用することもできる。微生物または動植物由来のａｒａＢ遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子、ホモロジー等に基づいてＡｒａＢ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を微生物、動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものなどを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列に従って合成した遺伝子を使用することもできる。これらはハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法により、そのプロモーターおよびＯＲＦ部分を含む領域を増幅することによって取得することができる。
【０１１６】
さらに、「ＡｒａＤ活性」とは、リブロース５リン酸を異性化してキシルロース５リン酸を生成する反応を触媒する活性（ＥＣ：５．１．３．４）をいう。ＡｒａＤ活性が付与または増強されたことは、公知の方法、例えばＤｅａｎｄａらの方法（Deanda K, Zhang M, Eddy C, Picataggio S, Appl Environ Microbiol., 1996, Vol.62(12), p4465-70）により、ＡｒａＤ活性を測定することによって確認することができる。
【０１１７】
ＡｒａＤ活性が付与または増強された株は、上述のＸｙｌＡ活性を付与または増強する方法と同様にして作製することができる。ＡｒａＤ活性の付与または増強に用いるａｒａＤ遺伝子としては、ＡｒａＤ活性を有するタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）由来の遺伝子を挙げることができる。
【０１１８】
さらに、上記以外の細菌、または他の微生物、動植物由来のＡｒａＤ遺伝子を使用することもできる。微生物または動植物由来のａｒａＤ遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子、ホモロジー等に基づいてＡｒａＤ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を微生物、動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものなどを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列に従って合成した遺伝子を使用することもできる。これらはハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法により、そのプロモーターおよびＯＲＦ部分を含む領域を増幅することによって取得することができる。
【０１１９】
ＡｒａＡ活性およびＡｒａＢ活性およびＡｒａＤ活性を付与または増強する場合、導入するａｒａＡ遺伝子、ａｒａＢ遺伝子、およびａｒａＤ遺伝子は同じ遺伝子座上に存在していてもよく、それぞれ別の遺伝子座上に存在していてもよい。２つまたは３つの遺伝子が同じ遺伝子座上に存在している例としては、例えば、それぞれの遺伝子が連結して形成されたオペロンなどが挙げられる。
【０１２０】
なお、第３の発明に用いる微生物は、ペントース利用能を付与するための改変のうちの２種類以上の改変を組み合わせて得られる細菌であってもよい。複数の改変を行う場合、その順番は問わない。
また、第３の発明に用いる微生物は、有用物質生産能を付与するための改変とペントース利用能を付与するための改変を組み合わせて得られる微生物であってもよい。複数の改変を行う場合、その順番は問わない。
【０１２１】
第３の発明で用いる微生物の菌体量は、特に限定されないが、湿菌体質量として、発酵生産液全量に対し、通常１ｇ／Ｌ以上、好ましくは１０ｇ／Ｌ以上、より好ましくは２０ｇ／Ｌ以上であり、一方、通常７００ｇ／Ｌ以下、好ましくは５００ｇ／Ｌ以下、さらに好ましくは４００ｇ／Ｌ以下である。
【０１２２】
（水性媒体）
第３の発明で使用する水性媒体とは、水、水を主成分とする水溶液、およびゲル（寒天）等と、糖液を含有する有機原料と、有用物質生産能を有する微生物、並びに有機原料中に含まれる糖類以外のカルボニル化合物および／または不飽和アルコールを水素化して得られるアルコールのほか、微生物の培養に必要な成分を含む液体を意味し、溶解していない液体・固体が分散したものも含まれる。
【０１２３】
第３の発明で用いる水性媒体で用いられる水溶液としては、例えばリン酸緩衝液等の緩衝液が挙げられ、ゲルとしては例えば微生物を培養するための培地を挙げることができるが、水性媒体は窒素源や無機塩などを含む水溶液であることが好ましい。ここで、窒素源としては、第３の発明で用いる微生物が資化して有機化合物を生成させうる窒素源であれば特に限定されないが、具体的には、アンモニウム塩、硝酸塩、尿素、大豆加水分解物、カゼイン分解物、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカーなどの各種の有機、無機の窒素化合物が挙げられる。無機塩としては各種リン酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カリウム、マンガン、鉄、亜鉛等の金属塩が用いられる。また、ビオチン、チアミン、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等のビタミン類、ヌクレオチド、アミノ酸などの生育を促進する因子を必要に応じて添加する。また、反応時の発泡を抑えるために、水性媒体には市販の消泡剤を適量添加しておくことが好ましい。
【０１２４】
また、水性媒体は、例えば上述した有機原料、窒素源、無機塩などのほかに、炭酸イオン、重炭酸イオンおよび二酸化炭素ガス（炭酸ガス）から選ばれる少なくとも１つを含有していてもよい。炭酸イオンまたは重炭酸イオンは、中和剤としても用いることのできる炭酸マグネシウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウムなどから供給されるが、必要に応じて、炭酸若しくは重炭酸またはこれらの塩或いは二酸化炭素ガスから供給することもできる。炭酸または重炭酸の塩の具体例としては、例えば炭酸マグネシウム、炭酸アンモニウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸アンモニウム、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム等が挙げられる。
【０１２５】
水性媒体中における炭酸イオンまたは重炭酸イオンを含有させる場合の濃度は、特に限定はされないが、通常１ｍＭ以上、好ましくは２ｍＭ以上、さらに好ましくは３ｍＭ以上であり、また、通常５００ｍＭ以下、好ましくは３００ｍＭ以下、さらに好ましくは２００ｍＭ以下である。二酸化炭素ガスを含有させる場合は、水性媒体１Ｌ当たり通常５０ｍｇ以上、好ましくは１００ｍｇ以上、さらに好ましくは１５０ｍｇ以上の二酸化炭素ガスを含有させることが好ましく、一方、水性媒体１Ｌ当たり通常２５ｇ以下、好ましくは１５ｇ以下、さらに好ましくは１０ｇ以下の二酸化炭素ガスを含有させることが好ましい。
【０１２６】
水性媒体のｐＨは、用いる微生物の種類に応じて、その活性が最も有効に発揮される範囲に調整されることが好ましい。具体的には、コリネ型細菌を用いる場合には、水性媒体のｐＨを、通常５．５以上、好ましくは６以上、より好ましくは６．６以上、さらに好ましくは７．１以上であり、通常１０以下、好ましくは９．５以下、より好ましくは９．０以下である。
【０１２７】
水性媒体のｐＨは、生産される有機化合物が酸性物質である場合には、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、炭酸マグネシウム、炭酸アンモニウム、重炭酸アンモニウム、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、アンモニア（水酸化アンモニウム）、またはそれらの混合物等を添加することによって調整することができる。生産される有機化合物が塩基性物質である場合には、塩酸、硫酸、リン酸等の無機酸、酢酸等の有機酸、それらの混合物等を添加すること、または二酸化炭素ガスを供給することによって調整することができる。
【０１２８】
（有機物生産工程の条件）
第３の発明における有機物生産工程の反応時間は、特に限定はされないが、通常１時間以上、好ましくは３時間以上であり、通常１６８時間以下、好ましくは７２時間以下である。
【０１２９】
第３の発明における有機物生産工程の反応温度は、用いる前記微生物の生育至適温度と同じ温度で行ってもよいが、生育至適温度より高い温度で行うことが有利であり、通常生育至適温度より２℃以上、好ましくは７℃以上、より好ましくは１５℃以上、さらに好ましくは２０℃以上高い温度で行う。具体的には、コリネ型細菌の場合には、通常３５℃以上、好ましくは３７℃以上、さらに好ましくは３９℃以上であり、一方、通常４５℃以下、好ましくは４３℃以下、さらに好ましくは４１℃以下である。有機化合物生産反応の間、常に３５℃〜４５℃の範囲とする必要はないが、全反応時間の５０％以上、好ましくは８０％以上の時間において、上記温度範囲にすることが望ましい。
【０１３０】
第３の発明における有機物生産工程は、通気、攪拌して行ってもよく、製造する有機物や菌体の性質に合わせて適宜選択することができ、好気的雰囲気でおこなっても、通気せず、酸素を供給しない嫌気的雰囲気下で行なってもよい。なおここでいう嫌気的雰囲気下は、例えば容器を密閉して無通気で反応させる、窒素ガス等の不活性ガスを供給して反応させる、二酸化炭素ガス含有の不活性ガスを通気する等の方法によって得ることができる。
第３の発明における有機物生産工程は、特段の制限はないが、回分反応、半回分反応もしくは連続反応のいずれにも適用することができる。
【０１３１】
第３の発明は、水素化処理糖液を含有する有機原料に前記微生物を作用させることにより有機化合物を生成させ、これを回収する工程を有することが好ましい。製造し得る有機化合物の種類および好ましい有機化合物の例は上述した通りである。
【０１３２】
（有機化合物の回収工程、精製工程）
第３の発明は、上記の有機物生産工程により有機化合物が生成し、水性媒体中に蓄積させることができる。前記有機物生産工程で蓄積させた有機化合物は、常法に従って、水性媒体より回収する工程をさらに含んでいてもよい。具体的には、例えば、蓄積させた有機化合物がコハク酸、フマル酸、リンゴ酸等のカルボン酸である場合には、遠心分離、ろ過等により菌体等の固形物を除去した後、イオン交換樹脂等で脱塩し、回収することができる。
【０１３３】
また第３の発明においては、前記の回収する工程で得られたものを精製する工程をさらに含んでいてもよい。具体的には水性媒体反応液から回収した溶液を結晶化（晶析）またはカラムクロマトグラフィーにより精製して、カルボン酸を得ることができる。
蓄積させた有機化合物がエタノール、ブタノール、ブタンジオール等のアルコールである場合には、遠心分離、ろ過等により菌体等の固形物を除去した後、蒸留等で濃縮し、その溶液を膜脱水するなどして、アルコールを精製することができる。
【０１３４】
第３の発明で前記微生物を用いるに当たっては、寒天培地等の固体培地で斜面培養したものを直接用いても良いが、必要に応じて上記微生物を予め液体培地で培養したものを用いてもよい。すなわち、前記微生物を予め増殖させておいた上で、前記微生物に有機化合物を生産させてもよい。上述のように種培養や本培養を行なうことで、前記微生物を予め増殖させることができるが、このときに使用する有機原料としては、水素化処理糖液を用いてもよいし、その他の有機原料を用いてもよい。
【０１３５】
なお、種培養または本培養した微生物を水性媒体中で増殖させながら、水素化処理糖液を含有する有機原料と反応させることによって有機化合物を製造してもよいし、予め種培養または本培養を行なうことで増殖させた菌体を、水素化処理糖液を含有する有機原料を含む水性媒体中で有機原料と反応させることによって有機化合物を製造してもよい。
また、第３の発明において用いられる微生物としては、上記微生物のほか、微生物の処理物を使用することもできる。微生物の処理物としては、例えば、微生物の菌体をアクリルアミド、カラギーナン等で固定化した固定化菌体、菌体を破砕した破砕物、その遠心分離上清、またはその上清を硫安処理等で部分精製した画分等が挙げられる。
【０１３６】
＜第４の発明：微生物の培養方法＞
第４の発明の培養方法は、本発明の水素化処理糖液を含有する有機原料を炭素源として用いて、有用物質生産能力を有する微生物を培養させる。本発明の培養方法によって得られた微生物は、その後、有機原料に作用させることによって有機化合物を生成させ、これを回収することができる。このときの有機原料としては、前記水素化処理糖液を用いてもよいし、水素化処理糖液中にその他の有機原料を含んでいてもよい。製造し得る有機化合物の種類および好ましい有機化合物の例は上述した通りである。
【０１３７】
第４の発明の培養方法では、水素化処理糖液を含む寒天培地等の固体培地で培養してもよいし、水素化処理糖液を含む液体培地で培養してもよい。後述する種培養や本培養を行なうことで、有機化合物生産反応に供する前記微生物を増殖させることができる。
種培養は、本培養に供する前記微生物の菌体を調製するために行なうものである。種培養に用いる培地は、微生物の培養に用いられる通常の培地を用いることができるが、窒素源や無機塩などを含む培地であることが好ましい。ここで、窒素源としては、本微生物が資化して増殖できる窒素源であれば特に限定されないが、具体的には、アンモニウム塩、硝酸塩、尿素、大豆加水分解物、カゼイン分解物、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカーなどの各種の有機、無機の窒素化合物が挙げられる。無機塩としては各種リン酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カリウム、マンガン、鉄、亜鉛等の金属塩が用いられる。また、ビオチン、チアミン、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等のビタミン類、ヌクレオチド、アミノ酸などの生育を促進する因子を必要に応じて添加する。
さらに、必要に応じて、前記培地に炭素源として水素化処理糖液を添加してもよいし、グルコース等の有機原料を添加してもよい。
【０１３８】
種培養は、一般的な生育至適温度で行なうことが好ましい。一般的な生育至適温度とは、有機化合物の生産に用いられる条件において最も生育速度が速い温度のことを言う。具体的な培養温度としては、通常２５℃〜４０℃であり、３０℃〜３７℃が好ましい。コリネ型細菌の場合は、通常２５℃〜３５℃であり、２８℃〜３３℃がより好ましく、約３０℃が特に好ましい。
【０１３９】
種培養は、一般的な生育至適ｐＨで行なうことが好ましい。一般的な生育至適ｐＨとは、有機化合物の生産に用いられる条件において最も生育速度が速いｐＨのことを言う。具体的な培養ｐＨとしては、通常ｐＨ４〜１０であり、ｐＨ６〜８が好ましい。コリネ型細菌の場合は、通常ｐＨ６〜９であり、ｐＨ６．５〜８．５が好ましい。
また、種培養の培養時間は、一定量の菌体が得られる時間であれば特段の制限はないが、通常６時間以上９６時間以下である。また、好気性微生物の種培養においては、通気や攪拌等の方法により、酸素を供給することが好ましい。
【０１４０】
種培養後の菌体は、後述する本培養に用いることができるが、種培養については省略してもよく、寒天培地等の固体培地で斜面培養したものを直接本培養に用いてもよい。また、必要に応じて、種培養を何度か繰り返し行ってもよい。
本培養は、後述する有機化合物生産反応に供する前記微生物菌体を調製するために行なうものであり、主として菌体量を増やすことを目的とする。上述の種培養を行う場合は、種培養により得られた菌体を用いて本培養を行う。
【０１４１】
本培養に用いる培地は、微生物の培養に用いられる通常の培地を用いることができるが、窒素源や無機塩などを含む培地であることが好ましい。ここで、窒素源としては、本微生物が資化して増殖できる窒素源であれば特に限定されないが、具体的には、アンモニウム塩、硝酸塩、尿素、大豆加水分解物、カゼイン分解物、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカーなどの各種の有機、無機の窒素化合物が挙げられる。無機塩としては各種リン酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カリウム、マンガン、鉄、亜鉛等の金属塩が用いられる。また、ビオチン、チアミン、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等のビタミン類、ヌクレオチド、アミノ酸などの生育を促進する因子を必要に応じて添加する。また、培養時の発泡を抑えるために、培地には市販の消泡剤を適量添加しておくことが好ましい。
【０１４２】
また、本培養においては、炭素源として水素化処理糖液を含有する有機原料を使用する。必要に応じて、その他の有機原料を添加してもよい。本培養において使用する水素化処理糖液以外の有機原料としては、前記微生物が資化して増殖し得るものであれば特に限定されないが、通常、ガラクトース、ラクトース、グルコース、フルクトース、スクロース、サッカロース、デンプン、セルロース等の炭水化物；グリセロール、マンニトール、キシリトール、リビトール等のポリアルコール類等の発酵性糖質が用いられ、このうちグルコース、スクロース、またはフルクトースが好ましく、特にグルコースまたはスクロースが好ましい。
【０１４３】
また、本培養は、一般的な生育至適温度で行なうことが好ましい。具体的な培養温度としては、通常２５℃〜４０℃であり、３０℃〜３７℃が好ましい。コリネ型細菌の場合は、通常２５℃〜３５℃であり、２８℃〜３３℃がより好ましく、約３０℃が特に好ましい。
また、本培養は、一般的な生育至適ｐＨで行なうことが好ましい。具体的な培養ｐＨとしては、通常ｐＨ４〜１０であり、ｐＨ６〜８が好ましい。コリネ型細菌の場合は、通常ｐＨ６〜９であり、ｐＨ６．５〜８．５が好ましい。
【０１４４】
また、本培養の培養時間は、一定量の菌体が得られる時間であれば特段の制限はないが、通常６時間以上９６時間以下である。また、好気性微生物の本培養においては、通気や攪拌等の方法により、酸素を供給することが好ましい。
また、本培養においては、より有機化合物の製造に適した菌体の調製方法として、特開２００８−２５９４５１号公報に記載の炭素源の枯渇と充足を短時間で交互に繰り返すように培養を行う方法も用いることができる。
【０１４５】
本培養後の菌体は、有機物生産反応に用いることができるが、培養液を直接用いてもよいし、遠心分離、膜分離等によって菌体を回収した後に用いてもよい。
また、前記発酵性糖質を含有する澱粉糖化液、糖蜜なども使用され、前記発酵性糖質がサトウキビ、甜菜、サトウカエデ等の植物から搾取した糖液であるものが好ましい。
【０１４６】
また、本培養は、一般的な生育至適温度で行なうことが好ましい。具体的な培養温度としては、通常２５℃〜４０℃であり、３０℃〜３７℃が好ましい。コリネ型細菌の場合は、通常２５℃〜３５℃であり、２８℃〜３３℃がより好ましく、約３０℃が特に好ましい。
【０１４７】
また、本培養は、一般的な生育至適ｐＨで行なうことが好ましい。具体的な培養ｐＨとしては、通常ｐＨ４〜１０であり、ｐＨ６〜８が好ましい。コリネ型細菌の場合は、通常ｐＨ６〜９であり、ｐＨ６．５〜８．５が好ましい。
また、本培養の培養時間は、一定量の菌体が得られる時間であれば特段の制限はないが、通常６時間以上９６時間以下である。また、本培養においては、通気や攪拌等の方法により、酸素を供給することが好ましい。
【０１４８】
また、本培養においては、より有機化合物の製造に適した菌体の調製方法として、特開２００８−２５９４５１号公報に記載の炭素源の枯渇と充足を短時間で交互に繰り返すように培養を行う方法も用いることができる。
本培養後の菌体は、後述する有機化合物生産反応に用いることができるが、培養液を直接用いてもよいし、遠心分離、膜分離等によって菌体を回収した後に用いてもよい。
【実施例】
【０１４９】
以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により制限されるものではない。
ＧＣおよびＬＣの分析方法を以下に示す。
【０１５０】
（ガスクロマトグラフ（ＧＣ）分析）
装置：島津製作所社製  ＧＣ−２０１４
カラム        ：アジレントテクノロジー社製Ｊ＆Ｗ  ＤＢ−１  ６０ｍ×０．２５ｍｍ、膜圧０．２５μｍ
インジェクション温度：２３０℃
検出温度      ：２２０℃
スプリット比  ：１／２５
ガス流量      ：１．５ｍＬ／分
昇温          ：５０℃、１０分間保持の後、２２０℃まで、１５℃／分で昇温し、２２０℃で８分間保持
【０１５１】
（液相クロマトグラフ（ＬＣ）分析）
ポンプ        ：島津製作所社製  ＬＣ−２０ＡＤ
カラムオーブン：島津製作所社製  ＣＴＯ−１０Ａ
ＵＶ検出器    ：島津製作所社製  ＳＰＤ−１０Ａ
ＲＩ検出器    ：島津製作所社製  ＲＩＤ−１０Ａ
カラム        ：信和化工社製  ＵＬＴＲＯＮ  ＰＳ−８０Ｈ  ８．０ＩＤ×３００ｍｍ
装置          ：溶離液：０．１１質量％過塩素酸溶液  １．０ｍＬ／分
検出方法      ：ＵＶ（２１０ｎｍ），ＲＩ
注入量        ：１０μＬ
【０１５２】
（糖液の吸収スペクトル測定）
測定装置      ：島津製作所社製  ＵＶ−１６５０ＰＣ
測定温度      ：２５℃
測定セル      ：石英管  １０ｍｍ
希釈倍率      ：測定対象をイオン交換水で希釈
【０１５３】
（糖液の作製）
（製造例１）
超純水９０．７ｍＬにグルコース８．０ｇ、キシロース１．０ｇ、フルフラール０．１ｇ、ギ酸０．０４ｇ、グリコールアルデヒドダイマー０．３ｇを溶解させ糖液を作製した。以下、糖液−１とする。
糖液−１のＬＣ分析を行ったところ、グルコース８．０質量％、キシロース１．０質量％、ギ酸０．０４質量％、グリコールアルデヒドダイマー０．３質量％であった。
同様に糖液−１のＧＣ分析を行ったところ、フルフラール０．１質量％であった。
【０１５４】
（製造例２）
超純水４５２ｍＬにグルコース４０．１ｇ，キシロース５．１ｇ，フルフラール０．５ｇ、ギ酸０．２ｇ、グリコールアルデヒドダイマー１．５ｇを溶解させ糖液を作製した。
陰イオン交換樹脂（三菱化学社製、ポーラス型ダイヤイオンＰＡ３１２ＬＯＨ）３．６ｍＬをガラスカラムにつめ、上記作製の糖液９９ｇを通過させた糖液のうち、初めの５ｍＬは廃棄し、その後樹脂を通過した糖液を回収した。樹脂に残存している糖液は脱イオン水５ｍＬで洗い出し、回収した糖液（９７．１ｇ）に含めた。以下、糖液−２とする。
【０１５５】
（製造例３）
超純水９１．１ｍＬにグルコース８．０ｇ、 キシロース１．０ｇを溶解させた糖液（以下、糖液−０）を作成した。製造例１で作製した糖液−１を１２．０ｇと上記糖液−０を３．０ｇ混和させ、フルフラール０．１質量％、ギ酸０．０３質量％、グリコールアルデヒドダイマー０．２質量％となるような糖液−３を作製した。糖液−３中のアルデヒド類含有量は、糖液−１の０．８等量に相当する。
【０１５６】
（製造例４）
同様に製造例１で作成した糖液−１を９．０ｇと上記糖液−０を６．０ｇを混和させ、フルフラール０．０６質量％、ギ酸０．０２質量％、グリコールアルデヒドダイマー０．１８質量％となるような糖液−４を作製した。糖液−４中のアルデヒド類含有量は、糖液−１の０．６等量に相当する。
【０１５７】
（製造例５）
同様に製造例１で作成した糖液−１を６．０ｇと上記糖液−０を９．０ｇ混和させ、フルフラール０．０４質量％、ギ酸０．０２質量％、グリコールアルデヒドダイマー０．１質量％となるような糖液−５を作成した。糖液−５中のアルデヒド類含有量は、糖液−１の０．４等量に相当する。
【０１５８】
（実施例１）
（糖液の水素化処理）
７０ｍＬミクロオートクレーブに５質量％Ｒｕ／Ｃ（エヌイーケムキャット社製）を０．１ｇ仕込んだ。これに製造例１で調製した糖液−１を２０ｇ加えた。アルゴンを反応器にフローさせた後、オートクレーブを閉じた。水素１ＭＰａで４回系内を水素置換した後、想定の最大反応圧力以上で気密試験を行った。気密試験後は圧力が０．９ＭＰａになるまで水素をパージした。温度を６０℃に設定した反応炉にオートクレーブを設置し、１時間水素化反応を行なった後、オートクレーブを反応炉から取り出し、空冷した。２３℃まで冷却されたらオートクレーブから内容物を取り出した。前記水素化反応液から触媒をディスポーザブルのシリンジとフィルター（０．４５μｍ）でろ過して、水素化処理糖液−１を得た。
【０１５９】
（水素化処理糖液−１の分析）
水素化処理糖液−１を上記同様に、ＬＣ分析を行ったところ、グルコース８．１質量％、キシロース１．１質量％、ギ酸０．０４質量％、グリコールアルデヒドダイマー０．０２質量％であった。同様に水素化処理糖液１のＧＣ分析を行ったところ、フルフラールは検出限界以下（０．００１質量％未満）、フルフリルアルコール０．０１質量％、テトラヒドロフルフリルアルコール０．０６質量％であった。
水素化反応によって、発酵阻害成分であるフルフラールが除去されたほか、グリコールアルデヒドに関しても大幅に濃度が減少した。
【０１６０】
（実施例２）
（糖液の水素化処理）
上記糖液−２を使用すること以外は実施例１と同様の方法で水素化処理を行った。この水素化処理を行った糖液（以下、水素化処理糖液−２とする）のＬＣ分析を行ったところ、グルコース７．８質量％、キシロース１．０質量％、ソルビトール０．０５質量％、キシリトール０．０４質量％であった。グリコールアルデヒドダイマーは検出されなかった。同様に水素化処理した糖液のＧＣ分析を行ったところ、フルフラールは検出限界以下（０．００１質量％未満）、テトラヒドロフルフリルアルコール０．０９質量％であった。
水素化処理によって、発酵阻害成分であるフルフラールが除去されたほか、グリコールアルデヒドに関しても大幅に濃度が減少した。
【０１６１】
（実施例３）
水素化反応時の反応圧力を０．４ＭＰａで実施したこと以外は、実施例２と同様の方法で水素化反応を行った。この水素化処理を行った糖液（以下、水素化処理糖液−３とする）のＬＣ分析を行ったところ、グルコース７．８質量％、キシロース１．０質量％、キシリトール０．００９質量％、グリコールアルデヒドダイマー０．００５質量％であった。同様に水素化処理した糖液のＧＣ分析を行ったところ、フルフラールは検出限界以下（０．００１質量％未満）、フルフリルアルコール０．００６質量％、テトラヒドロフルフリルアルコール０．０５質量％であった。
水素化反応によって、発酵阻害成分であるフルフラールが除去されたほか、グリコールアルデヒドに関しても大幅に濃度が減少した。
【０１６２】
（製造例６）
＜キシロースイソメラーゼ遺伝子およびキシルロキナーゼ遺伝子導入株の作製＞
特願２０１３−１６１４７７明細書、実施例に記載の方法により、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株より、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＸｙｌＡＢ／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株を作製した。なお、以下にその概要を説明するが、上記出願明細書の内容は、参照により本願に組み込まれるものとする。
（Ａ）大腸菌ゲノムＤＮＡの抽出
大腸菌（Escherichia coli）ＪＭ１０９株をＴＢ培地［Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ  ４７ｇ／Ｌ、Ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ５ｇ／Ｌ］１０ｍＬで対数増殖期後期まで培養し、集菌した。得られた菌体を１０ｍｇ／ｍＬの濃度のリゾチームを含む緩衝液［２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ］０．１５ｍＬに懸濁した。次に、上記懸濁液にプロテナーゼＫを、最終濃度が１００μｇ／ｍＬになるように添加し、３７℃で１時間保温した。さらにドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度が０．５％になるように添加し、５０℃で６時間保温して溶菌した。
この溶菌液に、等量のフェノール／クロロホルム溶液を添加し、室温で１０分間ゆるやかに振盪した後、全量を遠心分離（５，０００×ｇ、２０分間、１０〜１２℃）し、上清画分を分取した。酢酸ナトリウムを０．３Ｍとなるように添加した後、２倍量のエタノールを加え混合し、遠心分離（１５，０００×ｇ、２分間）により回収した沈殿物を７０％エタノールで洗浄した後、風乾した。得られたＤＮＡにＴＥ緩衝液［１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ］５ｍＬを加え、４℃で一晩静置し、以後のＰＣＲの鋳型ＤＮＡに使用した。
【０１６３】
（Ｂ）キシロースイソメラーゼ−キシルロキナーゼ遺伝子オペロンのクローニング
大腸菌ＪＭ１０９株のｘｙｌＡＢオペロンの取得は、上記（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されている大腸菌Ｋ１２−ＭＧ１６５５株の該オペロン周辺の配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｕ０００９６）を基に設計した合成ＤＮＡ：5'-AAAGGATCCATCACCCGCGGCATTACCTG-3'（配列番号１）および5'-TTTGGGCCCGTCGACTGAGATATATAGATGTGAATTATCC-3'（配列番号２）を用いたＰＣＲによって行った。
【０１６４】
鋳型ＤＮＡ  １μＬ、Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）０．５μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．４μＭ 各々プライマー、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．２５μＭ  ｄＮＴＰｓを混合し、全量を５０μＬとした。反応温度条件は、ＤＮＡサーマルサイクラーＰＴＣ−２００（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用い、９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、６８℃で３分からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は２分、最終サイクルの６８℃での保温は５分とした。
【０１６５】
増幅産物の確認は、０．９％アガロースゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約３．０ｋｂの断片を検出した。得られたｘｙｌＡＢオペロンのＤＮＡ断片はＣｈａｒｇｅＳｗｉｔｃｈ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて精製後、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＡｐａＩで切断した。これによって生じた約２．９ｋｂのＤＮＡ断片は０．９％アガロースゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することで検出し、Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ  Ｇｅｌ  ＤＮＡ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いてゲルから回収した。このＤＮＡ断片を、ｐＴＺ４を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＡｐａＩで切断して調製したＤＮＡと混合し、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（タカラバイオ）を用いて連結した。得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換し、５０μｇ／ｍＬカナマシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で生育したクローンをＴＢ培地［Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ  ４７ｇ／Ｌ、Ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ５ｇ／Ｌ］（５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含む）により液体培養した後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。こうして得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＡｐａＩにより切断した結果、約２．９ｋｂの挿入断片が確認され、これをｐＸｙｌＡＢ１と命名した。
【０１６６】
（Ｃ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株ゲノムＤＮＡの抽出
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株を、２質量％グルコースと、以下の組成の培地［尿素：４ｇ、硫酸アンモニウム：１４ｇ、リン酸１カリウム：０．５ｇ、リン酸２カリウム０．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：０．５ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：２０ｍｇ、硫酸マンガン・５水和物：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：２００μｇ、塩酸チアミン：２００μｇ、酵母エキス：１ｇ、カザミノ酸：１ｇ、蒸留水１，０００ｍＬに溶解］（以下、培地（Ａ）という）１０ｍＬで対数増殖期後期まで培養し、集菌した。得られた菌体を１０ｍｇ／ｍＬの濃度のリゾチームを含む緩衝液［２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ＝８．０、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ］０．１５ｍＬに懸濁した。得られた前記懸濁液にプロテナーゼＫを、最終濃度が１００μｇ／ｍＬになるように添加し、３７℃で１時間保温後、さらにドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度が０．５質量％になるように添加し、５０℃で６時間保温して溶菌し、溶菌液とした。前記溶菌液に、等量のフェノール／クロロホルム溶液を添加し、室温で１０分間ゆるやかに振盪した後、全量を遠心分離（５０００×ｇ、２０分間、１０〜１２℃）し、上清画分を分取した。
前記上清画分に酢酸ナトリウムを０．３Ｍとなるように添加した後、２倍量のエタノールを加え混合し、遠心分離（１５０００×ｇ、２分間）により回収した沈殿物を７０体積％エタノールで洗浄した後、風乾し、ＤＮＡを得た。得られたＤＮＡにＴＥ緩衝液［１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ］５ｍＬを加え、４℃で一晩静置し、以後のＰＣＲの鋳型ＤＮＡに使用した。
【０１６７】
（Ｄ）キシロースイソメラーゼ−キシルロキナーゼ遺伝子オペロン導入用プラスミドの構築
大腸菌由来ＸｙｌＡＢオペロンをブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株（特願２０１３−１６１４７７明細書）の染色体上ｌｄｈ遺伝子欠損部位に導入するため、ｌｄｈ遺伝子のクローニングを行った。ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株のｌｄｈ遺伝子の取得は、上記（Ｃ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されているコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株の該遺伝子周辺の配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＢＡ００００３６）を基に設計した合成ＤＮＡ：5'-CGAGGGGTCGAGGATTCTGGGGAGGATCG AGTGGATTC-3’（配列番号３）および5'-TCTAGAGTCGAGGATGGTGA CCATGATGCAGGATGGAG-3’（配列番号４）を用いたＰＣＲによって行った。
【０１６８】
鋳型ＤＮＡ  １μＬ、Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）０．５μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．４μＭ 各々プライマー、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．２５μＭ  ｄＮＴＰｓを混合し、全量を５０μＬとした。反応温度条件は、ＤＮＡサーマルサイクラーＰＴＣ−２００（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用い、９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、６８℃で２分からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は２分、最終サイクルの６８℃での保温は５分とした。
【０１６９】
増幅産物の確認は、０．９％アガロースゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約２．１ｋｂの断片を検出した。得られたｌｄｈ遺伝子のＤＮＡ断片はＣｈａｒｇｅＳｗｉｔｃｈ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて精製し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いてｐＫＭＢ１（特開２００５−９５１６９）のＸｂａＩ部位に結合し、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した。このようにして得られた組換え大腸菌を２５μｇ／ｍＬカナマイシンおよび２５μｇ／ｍＬ  Ｘ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
【０１７０】
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンをＴＢ培地［Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ  ４７ｇ／Ｌ、Ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ５ｇ／Ｌ］（２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含む）により液体培養した後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。こうして得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＸｈｏＩおよびＢｇｌＩにより切断した結果、約２．２ｋｂの挿入断片が確認され、これをｐＫＢ−ＬＤＨ２と命名した。
【０１７１】
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来で構成的に高発現するＴＺ４プロモーターと連結されたＸｙｌＡＢオペロンの取得は、プラスミドｐＸｙｌＡＢ１を鋳型とし、合成ＤＮＡ：5'-GTACCTGCAGGATGAGCGGGCT-3’（配列番号５）および5'-CACCCGGTCAGGCAGGGGATAAC-3’（配列番号６）を用いたＰＣＲによって行った。
鋳型ＤＮＡ  １μＬ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）０．５μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．４μＭ 各々プライマーを混合し、全量を５０μＬとした。反応温度条件は、ＤＮＡサーマルサイクラーＰＴＣ−２００（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用い、９４℃で１５秒、５５℃で２０秒、７２℃で４５秒からなるサイクルを３０回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は２分とした。
【０１７２】
増幅産物の確認は、０．７％アガロースゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約３．２ｋｂの断片を検出した。得られたＴＺ４プロモーターと連結されたＸｙｌＡＢオペロンのＤＮＡ断片はＴ４  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｋｉｎａｓｅ（タカラバイオ）により５’末端をリン酸化した後、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（タカラバイオ）を用いてｐＫＢ−ＬＤＨ２のＥｃｏＲＶ部位に結合し、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した。このようにして得られた組換え大腸菌を２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
【０１７３】
この培地上で生育したクローンをＴＢ培地［Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ  ４７ｇ／Ｌ、Ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ５ｇ／Ｌ］（２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含む）により液体培養した後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。こうして得られたプラスミドＤＮＡの挿入断片の塩基配列はＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３  Ｃｙｃｌｅ  ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＫｉｔおよび塩基配列解読装置３７７ＸＬ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて決定した。その結果得られた塩基配列（ＸｙｌＡＢオペロン）は、大腸菌Ｋ１２−ＭＧ１６５５株のゲノム配列と完全に一致し、ＸｙｌＡＢオペロンに変異が入っていないことを確認し、これをｐＸｙｌＡＢ３と命名した。
【０１７４】
（Ｅ）キシロースイソメラーゼ−キシルロキナーゼ遺伝子オペロン導入株の作製
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株の形質転換に用いるプラスミドＤＮＡは、ｐＸｙｌＡＢ３を用いて塩化カルシウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９７０，５３，１５９）により形質転換した大腸菌ＪＭ１１０株から再調製した。
【０１７５】
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株の形質転換は電気パルス法（Ｒｅｓ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９３，１４４，ｐ１８１−５）によって行い、得られた形質転換体を２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢＧ寒天培地［トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ５ｇ、グルコース ２０ｇ、および寒天１５ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。
【０１７６】
この培地上に生育した株は、ｐＸｙｌＡＢ３がブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株菌体内で複製不可能なプラスミドであるため、該プラスミドのｌｄｈ遺伝子とブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株ゲノム上の同遺伝子との間で相同組換えを起こした結果、ゲノム上に該プラスミドに由来するカナマイシン耐性遺伝子およびｓａｃＢ遺伝子が挿入されているはずである。
【０１７７】
次に、上記相同組換え株を２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢＧ培地にて液体培養した。この培養液の菌体数約１００万相当分を１０％ショ糖含有ＬＢＧ培地に塗抹にした。結果、２回目の相同組換えによりｓａｃＢ遺伝子が脱落しショ糖非感受性となったと考えられる株を数十個得た。
【０１７８】
この様にして得られた株の中には、そのｌｄｈ遺伝子欠損部位にｐＸｙｌＡＢ３に由来するＴＺ４プロモーターと連結されたＸｙｌＡＢオペロンが挿入されたものと親株と同じ配列に戻ったものが含まれる。ＴＺ４プロモーターと連結されたＸｙｌＡＢオペロンが挿入されたか否かの確認は、ＬＢＧ培地にて培養して得られた菌体を直接ＰＣＲ反応に供し、ＴＺ４プロモーターと連結されたＸｙｌＡＢオペロンの検出を行うことによって容易に確認できる。ＴＺ４プロモーターおよびＸｙｌＡＢオペロンをＰＣＲ増幅するためのプライマー：5’-AATCAGGAAGTGGGATCGAAAATG-3’（配列番号７）および5’- CCGCCAACTAGACACCAAAGATTC-3’（配列番号８）を用いて分析すると、ＴＺ４プロモーターと連結されたＸｙｌＡＢオペロンが挿入されたクローンでは４，１９６ｂｐのＤＮＡ断片を認めるはずである。上記方法にてショ糖非感受性となった菌株を分析した結果、ＴＺ４プロモーターと連結されたＸｙｌＡＢオペロンが挿入された株を選抜し、該株をブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＸｙｌＡＢ／ＰＣ−４／ΔＬＤＨと命名した。
【０１７９】
（Ｆ）キシロース資化試験
上記（Ｅ）で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＸｙｌＡＢ／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株を２０ｇ／Ｌキシロースを含むＭＭ寒天培地［尿素２ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４７ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４０．５ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ６ｍｇ、ＭｎＳＯ４・４−５Ｈ２Ｏ６ｍｇ、ビオチン ２００μｇ、チアミン ２００μｇ、寒天  １５ｇ、蒸留水１Ｌに溶解］に植菌し、３０℃で３日間静置培養した。対照として、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株も同様に培養した。その結果、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＸｙｌＡＢ／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株はキシロースを単一炭素源とした培地において生育できることが確認された。一方、親株であるブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株は生育することはできなかった。
【０１８０】
（実施例４）
＜水素化処理糖液の発酵生産評価＞
（Ａ）種培養
前記培地（Ａ）１，０００ｍＬを、１２１℃、２０分間で加熱滅菌し、室温まで冷やした後、２００ｍＬの三角フラスコに１５ｍＬ入れ、あらかじめ滅菌した５０％グルコース水溶液を６００μｌ添加した。製造例６の（Ｅ）で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＸｙｌＡＢ／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株を接種して３０℃で５．１時間振とう培養した。
【０１８１】
（Ｂ）本培養
５００ｍＬの三角フラスコに１００ｍＬの前記培地（Ａ）を入れ、あらかじめ滅菌した５０％グルコース水溶液を４ｍＬ添加した後、上記（Ａ）の種培養で得られた培養液を、Ｏ．Ｄ．（６６０ｎｍ）が０．０５となるように接種し、３０℃で、１９．４時間振とう培養した。
【０１８２】
（Ｃ）コハク酸生産反応
上記（Ｂ）の本培養で得られた培養液を５，０００×ｇ、７分の遠心分離により集菌し、菌体懸濁液［硫酸マグネシウム・７水和物：１ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：４０ｍｇ、硫酸マンガン・５水和物：４０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：４００μｇ、塩酸チアミン：４００μｇ、リン酸一アンモニウム：０．８ｇ、リン酸二アンモニウム：０．８ｇ、塩化カリウム：１ｇ、蒸留水１０００ｍＬに溶解］にＯ．Ｄ．（６６０ｎｍ）が２０になるように懸濁した。続いて、実施例１で作製した水素化処理糖液−１を３ｍＬ、炭酸水素アンモニウムを０．４ｇ、および蒸留水３ｍＬを混合して、基質溶液を調製した。５ｍＬ反応器に前記菌体懸濁液０．５ｍＬと、基質溶液０．５ｍＬを混合し、嫌気条件下において４０℃で反応させた。その結果、６時間後のコハク酸蓄積濃度は１３．４ｇ／Ｌ、グルコース濃度は０．１ｇ／Ｌ、キシロース濃度は２．１ｇ／Ｌであった。
【０１８３】
（実施例５）
コハク酸生産反応において、実施例２で作製した水素化処理糖液−２を使用したこと以外は、実施例４と同様に行った。その結果、６時間後のコハク酸蓄積濃度は１２．６ｇ／Ｌ、グルコース濃度は０．０ｇ／Ｌ、キシロース濃度は１．７ｇ／Ｌであった。
【０１８４】
（実施例６）
コハク酸生産反応において、実施例３で作製した水素化処理糖液−３を使用したこと以外は、実施例４と同様に行った。その結果、６時間後のコハク酸蓄積濃度は１３．０ｇ／Ｌ、グルコース濃度は０．１ｇ／Ｌ、キシロース濃度は２．０ｇ／Ｌであった。
【０１８５】
（比較例１）
コハク酸生産反応において、製造例１で作製した糖液−１を使用したこと以外は、実施例４と同様に行った。その結果、６時間後のコハク酸蓄積濃度は７．７ｇ／Ｌ、グルコース濃度は８．３ｇ／Ｌ、キシロース濃度は２．５ｇ／Ｌであった。
【０１８６】
（比較例２）
コハク酸生産反応において、製造例３で作製した糖液−３を使用したこと以外は、実施例４と同様に行った。その結果、６時間後のコハク酸蓄積濃度は８．５ｇ／Ｌ、グルコース濃度は６．７ｇ／Ｌ、キシロース濃度は２．５ｇ／Ｌであった。
【０１８７】
（比較例３）
コハク酸生産反応において、製造例４で作製した糖液−４を使用したこと以外は、実施例４と同様に行った。その結果、６時間後のコハク酸蓄積濃度は１０．４ｇ／Ｌ、グルコース濃度は３．４ｇ／Ｌ、キシロース濃度は２．５ｇ／Ｌであった。
【０１８８】
（比較例４）
コハク酸生産反応において、製造例５で作製した糖液−５を使用したこと以外は、実施例４と同様に行った。その結果、６時間後のコハク酸蓄積濃度は１１．９ｇ／Ｌ、グルコース濃度は１．３ｇ／Ｌ、キシロース濃度は２．４ｇ／Ｌであった。
【０１８９】
（比較例５）
コハク酸生産反応において、製造例３で作製した糖液−０を使用したこと以外は、実施例４と同様に行った。その結果、６時間後のコハク酸蓄積濃度は１１．７ｇ／Ｌ、グルコース濃度は２．２ｇ／Ｌ、キシロース濃度は２．４ｇ／Ｌであった。
実施例４〜６、比較例１〜５の結果を表１に示す。数値は、６時間後の各成分の濃度を表わす。
【０１９０】
【表１】
2018139590.tif 000003
【０１９１】
表１より、実施例１の水素化処理糖液−１を使用した実施例４では、比較例１に対してコハク酸濃度が７４％向上、比較例２に対しては５８％向上、比較例３に対しては２９％向上、比較例４に対しては１３％、比較例５に対しては１５％向上した。
以上の結果より、水素化処理を実施してフルフラール、グリコールアルデヒド等が大幅に除去された糖液を使用することで、コハク酸生産速度が向上することが明らかとなった。
【０１９２】
表１より、実施例２の水素化処理糖液−２を使用した実施例５では、比較例１に対してコハク酸濃度が６４％向上、比較例２に対しては４８％向上、比較例３に対しては２１％向上、比較例４に対しては６％、比較例５に対しては８％向上した。
以上の結果より、水素化処理を実施してフルフラール、グリコールアルデヒド等が大幅に除去された糖液を使用することで、コハク酸生産速度が向上することが明らかとなった。
【０１９３】
表１より、実施例３の水素化処理糖液−３を使用した実施例６では、比較例１に対してコハク酸濃度が６９％向上、比較例２に対しては５３％向上、比較例３に対しては２５％向上、比較例４に対しては９％、比較例５に対しては１１％向上した。
以上の結果より、水素化処理を実施してフルフラール、グリコールアルデヒド等が大幅に除去された糖液を使用することで、コハク酸生産速度が向上することが明らかとなった。
以上の結果から、糖類以外のカルボニル化合物および／または不飽和アルコールを含む糖液を水素化反応に供することで、当該物質を水素化し、除去または大幅に低減させることができることがわかる。更に、得られた水素化処理糖液を含む有機原料に微生物を作用させて有機化合物を生産させることで、有機化合物の生産速度が向上することがわかる。
【０１９４】
（実施例７）
上記糖液−１を使用し、実施例１と同様の方法で水素化処理を行った。この水素化処理を行った糖液（以下、水素化処理糖液−４とする）の各成分濃度は、上記条件によるＬＣ分析から、グルコース７．９質量％、キシロース１．０質量％、キシリトール０．０１質量％、ソルビトールは検出限界以下（０．００１質量％未満）であった。グリコールアルデヒドダイマー及びフルフラールは検出されなかった。
【０１９５】
（実施例８）
上記糖液−１を使用し、触媒として５質量％Ｐｄ／Ｃ（ＮＥケムキャット社製）を用いる以外は、実施例１と同様の方法で水素化処理を行ない、水素化処理糖液（以下、水素化処理糖液−５とする）を得た。水素化処理糖液−５の各成分濃度は、ＬＣ分析からグルコース７．９質量％、キシロース１．０質量％、キシリトール０．００２質量％、ソルビトールは検出限界以下（０．００１質量％未満）であった。また、グリコールアルデヒドダイマーは１３９０ｐｐｍであり、フルフラールは検出されなかった。
【０１９６】
（実施例９）
実施例４における（Ａ）種培養、（Ｂ）本培養を経て、（Ｃ）コハク酸生産反応において、水素化処理糖液−１を用いる代わりに、実施例７で作製した水素化処理糖液−４を２．１ｍＬ、炭酸水素アンモニウムを０．３ｇ、および蒸留水２．９ｍＬを混合して、基質溶液を調製した以外は、同様にコハク酸生産反応を行なった結果、６時間後のコハク酸蓄積濃度は８．５ｇ／Ｌ、グルコース濃度は３．２ｇ／Ｌ、キシロース濃度は２．２ｇ／Ｌであった。
【０１９７】
（実施例１０）
コハク酸生産反応において、実施例８で作製した水素化処理糖液−５を使用したこと以外は、実施例９と同様に行った。その結果、６時間後のコハク酸蓄積濃度は７．７ｇ／Ｌ、グルコース濃度は４．３ｇ／Ｌ、キシロース濃度は２．４ｇ／Ｌであった。
【０１９８】
（比較例６）
コハク酸生産反応において、製造例１で作製した糖液−１を使用したこと以外は、実施例９と同様に行った。その結果、６時間後のコハク酸蓄積濃度は６．４ｇ／Ｌ、グルコース濃度は６．６ｇ／Ｌ、キシロース濃度は２．０ｇ／Ｌであった。
【０１９９】
（比較例７）
コハク酸生産反応において、製造例３で作製した糖液−０を使用したこと以外は、実施例９と同様に行った。その結果、６時間後のコハク酸蓄積濃度は８．５ｇ／Ｌ、グルコース濃度は３．４ｇ／Ｌ、キシロース濃度は２．４ｇ／Ｌであった。
実施例９、１０、比較例６，７の結果を表２に示す。数値は６時間後の各成分の濃度を表わす。
【０２００】
【表２】
2018139590.tif 000004
【０２０１】
表２より、水素化処理糖液−４および５を使用した実施例９、１０では、比較例６に対してコハク酸濃度がそれぞれ３３％、２０％向上し、比較例７に対しても同等となった。
以上の結果より、異なる水素化処理条件でもカルボニル化合物や不飽和アルコールを水素化反応に供することで、当該物質を除去または大幅に低減させることができることがわかる。 また、得られた水素化処理糖液を含む有機原料に微生物を作用させて有機化合物を生産させることで、有機化合物の生産速度が向上することが分かる
【０２０２】
（実施例１１）
上記糖液−１を使用し、反応温度を９０℃に変更した以外は、実施例１と同様の方法で水素化処理を行ない、水素化処理糖液−６を得た。水素化処理糖液−６中の各成分濃度は、グルコース７．７質量％、キシロース０．８質量％、ソルビトール０．２質量％、キシリトール０．２質量％であり、グリコールアルデヒドダイマー及びフルフラールは検出されなかった。
【０２０３】
（実施例１２）
上記糖液−１を使用し、反応温度を１２０℃に変更した以外は、実施例１と同様の方法で水素化処理を行ない、水素化処理糖液−７を得た。水素化処理糖液−７中の各成分濃度は、グルコース６．３質量％、キシロース０．５質量％、ソルビトール１．３質量％、キシリトール０．６質量％であり、グリコールアルデヒドダイマー及びフルフラールは検出されなかった。
【０２０４】
（実施例１３）
上記糖液−１を使用し、反応温度を１５０℃に変更した以外は、実施例１と同様の方法で水素化処理を行ない、水素化処理糖液−８を得た。水素化処理糖液−８中の各成分濃度は、グルコース５．５質量％、キシロース０．１質量％、ソルビトール２．５質量％、キシリトール０．９質量％であり、グリコールアルデヒドダイマー及びフルフラールは検出されなかった。
【０２０５】
（実施例１４）
上記糖液−１を使用し、反応温度を９０℃に変更した以外は、実施例８と同様の方法で水素化処理を行ない、水素化処理糖液−９を得た。水素化処理糖液−９中の各成分濃度は、グルコース８．０質量％、キシロース１．０質量％、ソルビトール検出限界以下（０．００１質量％未満）、キシリトール０．００４質量％、グリコールアルデヒドダイマーは２５８０ｐｐｍであり、フルフラールは検出されなかった。
【０２０６】
（実施例１５）
上記糖液−１を使用し、反応温度を１２０℃に変更した以外は、実施例８と同様の方法で水素化処理を行ない、水素化処理糖液−１０を得た。水素化処理糖液−１０中の各成分濃度は、グルコース７．９質量％、キシロース１．０質量％、ソルビトール検出限界以下（０．００１質量％未満）、キシリトール０．０１４質量％、グリコールアルデヒドダイマーは１８２０ｐｐｍであり、フルフラールは検出されなかった。
【０２０７】
（実施例１６）
上記糖液−１を使用し、反応温度を１５０℃に変更した以外は、実施例８と同様の方法で水素化処理を行ない、水素化処理糖液−１１を得た。水素化処理糖液−１１中の各成分濃度は、グルコース７．５質量％、キシロース１．０質量％、ソルビトール０．０３質量％、キシリトール０．０７質量％、グリコールアルデヒドダイマーは２３１０ｐｐｍであり、フルフラールは検出されなかった。
【０２０８】
（実施例１７）
上記糖液−１を使用し、反応圧力を３ＭＰａに変更した以外は、実施例１と同様の方法で水素化処理を行ない、水素化処理糖液−１２を得た。水素化処理糖液−１２中の各成分濃度は、グルコース７．８質量％、キシロース１．０質量％、キシリトール０．０１質量％、ソルビトールは検出限界以下（０．００１質量％未満）であった。グリコールアルデヒドダイマー及びフルフラールは検出されなかった。
【０２０９】
（実施例１８）
上記糖液−１を使用し、反応圧力を８ＭＰａに変更した以外は、実施例１と同様の方法で水素化処理を行ない、水素化処理糖液−１３を得た。水素化処理糖液−１３中の各成分濃度は、グルコース７．８質量％、キシロース０．９質量％、ソルビトール０．１質量％、キシリトール０．１質量％であった。グリコールアルデヒドダイマー及びフルフラールは検出されなかった。
【０２１０】
（実施例１９）
コハク酸生産反応において、実施例１１で作製した水素化処理糖液−６を使用したこと以外は、実施例９と同様に行った。その結果、６時間後のコハク酸蓄積濃度は１１．０ｇ／Ｌ、グルコース濃度は０．４２ｇ／Ｌ、キシロース濃度は２．１ｇ／Ｌであった。
【０２１１】
（実施例２０）
コハク酸生産反応において、実施例１２で作製した水素化処理糖液−７を使用したこと以外は、実施例９と同様に行った。その結果、６時間後のコハク酸蓄積濃度は８．５ｇ／Ｌ、グルコース濃度は０．３ｇ／Ｌ、キシロース濃度は０．３ｇ／Ｌであった。
【０２１２】
（実施例２１）
コハク酸生産反応において、実施例１３で作製した水素化処理糖液−８を使用したこと以外は、実施例９と同様に行った。その結果、６時間後のコハク酸蓄積濃度は９．８ｇ／Ｌ、グルコース濃度は０．３ｇ／Ｌ、キシロース濃度は１．０ｇ／Ｌであった。
【０２１３】
（実施例２２）
コハク酸生産反応において、実施例１４で作製した水素化処理糖液−９を使用したこと以外は、実施例９と同様に行った。その結果、６時間後のコハク酸蓄積濃度は８．６ｇ／Ｌ、グルコース濃度は４．２ｇ／Ｌ、キシロース濃度は１．８ｇ／Ｌであった。
【０２１４】
（実施例２３）
コハク酸生産反応において、実施例１５で作製した水素化処理糖液−１０を使用したこと以外は、実施例９と同様に行った。その結果、６時間後のコハク酸蓄積濃度は９．６ｇ／Ｌ、グルコース濃度は２．５ｇ／Ｌ、キシロース濃度は２．６ｇ／Ｌであった。
【０２１５】
（実施例２４）
コハク酸生産反応において、実施例１６で作製した水素化処理糖液−１１を使用したこと以外は、実施例９と同様に行った。その結果、６時間後のコハク酸蓄積濃度は９．４ｇ／Ｌ、グルコース濃度は２．１ｇ／Ｌ、キシロース濃度は２．６ｇ／Ｌであった。
【０２１６】
（実施例２５）
コハク酸生産反応において、実施例１７で作製した水素化処理糖液−１２を使用したこと以外は、実施例９と同様に行った。その結果、６時間後のコハク酸蓄積濃度は１０．６ｇ／Ｌ、グルコース濃度は１．６ｇ／Ｌ、キシロース濃度は２．３ｇ／Ｌであった。
【０２１７】
（実施例２６）
コハク酸生産反応において、実施例１８で作製した水素化処理糖液−１３を使用したこと以外は、実施例９と同様に行った。その結果、６時間後のコハク酸蓄積濃度は１０．９ｇ／Ｌ、グルコース濃度は０．６ｇ／Ｌ、キシロース濃度は２．４ｇ／Ｌであった。
【０２１８】
（比較例８）
コハク酸生産反応において、製造例１で作製した糖液−１を使用したこと以外は、実施例９と同様に行った。その結果、６時間後のコハク酸蓄積濃度は７．５ｇ／Ｌ、グルコース濃度は５．７ｇ／Ｌ、キシロース濃度は２．５ｇ／Ｌであった。
【０２１９】
（比較例９）
コハク酸生産反応において、製造例３で作製した糖液−０を使用したこと以外は、実施例９と同様に行った。その結果、６時間後のコハク酸蓄積濃度は１０．７ｇ／Ｌ、グルコース濃度は１．４ｇ／Ｌ、キシロース濃度は２．５ｇ／Ｌであった。
実施例１９〜２６、比較例８，９の結果を表３に示す。数値は、６時間後の各成分の濃度を表わす。
【０２２０】
【表３】
2018139590.tif 000005
【０２２１】
表３より、水素化処理糖液−６〜１３を使用した実施例１９〜２６では、比較例８に対していずれもコハク酸濃度が向上した。
以上の結果より、温度や反応圧力等が異なる水素化処理条件でもカルボニル化合物や不飽和アルコールを水素化し、除去または大幅に低減させることができることがわかる。さらにこれらの異なる水素化処理条件で得られた水素化処理糖液を使用することで、有機化合物の生産速度が向上することがわかる
【０２２２】
（製造例７）
超純水１８１ｍＬにグルコース１６．０ｇ、キシロース２．０ｇ、アクリル酸メチル１．０ｇ、ギ酸０．０８ｇを溶解させ糖液を作成した。以下、糖液−６とする。
糖液−６中の各成分濃度は、グルコース８．０質量％、キシロース１．０質量％、ギ酸０．０４質量％、アクリル酸メチル０．５質量％であった。
【０２２３】
（実施例２７）
上記糖液−６を使用した以外は、実施例１と同様の方法で水素化処理を行ない、水素化処理糖液−１４を得た。水素化処理糖液−１４中の各成分濃度は、グルコース７．９質量％、キシロース１．０質量％、ソルビトール検出限界以下（０．００１質量％未満）、キシリトール０．０３質量％であった。アクリル酸メチルは検出されなかった。
【０２２４】
（実施例２８）
コハク酸生産反応において、実施例２７で作製した水素化処理糖液−１４を使用したこと以外は、実施例９と同様に行った。その結果、６時間後のコハク酸蓄積濃度は８．３ｇ／Ｌ、グルコース濃度は３．７ｇ／Ｌ、キシロース濃度は２．４ｇ／Ｌであった。
【０２２５】
（比較例１０）
コハク酸生産反応において、製造例７で作製した糖液−６を使用したこと以外は、実施例９と同様に行った。その結果、６時間後のコハク酸蓄積濃度は５．８ｇ／Ｌ、グルコース濃度は８．０ｇ／Ｌ、キシロース濃度は２．６ｇ／Ｌであった。
【０２２６】
（比較例１１）
コハク酸生産反応において、製造例３で作製した糖液−０を使用したこと以外は、実施例９と同様に行った。その結果、６時間後のコハク酸蓄積濃度は８．５ｇ／Ｌ、グルコース濃度は３．４ｇ／Ｌ、キシロース濃度は２．４ｇ／Ｌであった。
実施例２８、比較例１０、１１の結果を表４に示す。数値は、６時間後の各成分の濃度を表わす。
【０２２７】
【表４】
2018139590.tif 000006
【０２２８】
表４より、実施例２７の水素化処理糖液−１４を使用した実施例２８では、比較例１０に対してコハク酸濃度が４５％向上した。
以上の結果より、水素化処理を実施し、不飽和エステル化合物であるアクリル酸メチル濃度が軽減された糖液を使用することで、コハク酸生産速度が向上することが明らかとなった。
これより糖類以外のカルボニル化合物および／または不飽和アルコールを含む糖液を水素化反応に供することで、当該物質を水素化し、除去または大幅に低減させることができることがわかる。更に、得られた水素化処理糖液を含む有機原料に微生物を作用させて有機化合物を生産させることで、有機化合物の生産速度が向上することがわかる。
【０２２９】
（製造例８）
超純水１８１ｍＬにグルコース１６．０ｇ、キシロース２．０ｇ、クロチルアルコール１．０ｇ、ギ酸０．０８ｇを溶解させ糖液を作成した。以下、糖液−７とする。
前記糖液−７中の各成分濃度は、グルコース７．９質量％、キシロース１．０質量％、ギ酸０．０４質量％、クロチルアルコール０．５質量％であった。
【０２３０】
（実施例２９）
上記糖液−７を使用した以外は、実施例１と同様の方法で水素化処理を行ない、水素化処理糖液−１５を得た。水素化処理糖液−１５中の各成分濃度は、グルコース７．９質量％、キシロース１．０質量％、ソルビトール検出限界以下（０．００１質量％未満）、キシリトール０．０１３質量％であった。クロチルアルコールは検出されなかった。
【０２３１】
（実施例３０）
コハク酸生産反応において、実施例２９で作製した水素化処理糖液−１５を使用したこと以外は、実施例９と同様に行った。その結果、６時間後のコハク酸蓄積濃度は８．６ｇ／Ｌ、グルコース濃度は３．０ｇ／Ｌ、キシロース濃度は２．３ｇ／Ｌであった。
【０２３２】
（比較例１２）
コハク酸生産反応において、製造例８で作製した糖液−７を使用したこと以外は、実施例９と同様に行った。その結果、６時間後のコハク酸蓄積濃度は５．７ｇ／Ｌ、グルコース濃度は７．３ｇ／Ｌ、キシロース濃度は２．２ｇ／Ｌであった。
【０２３３】
（比較例１３）
コハク酸生産反応において、製造例３で作製した糖液−０を使用したこと以外は、実施例９と同様に行った。その結果、６時間後のコハク酸蓄積濃度は８．５ｇ／Ｌ、グルコース濃度は３．４ｇ／Ｌ、キシロース濃度は２．４ｇ／Ｌであった。
実施例３０、比較例１２，１３の結果を表５に示す。数値は、６時間後の各成分の濃度を表わす。
【０２３４】
【表５】
2018139590.tif 000007
【０２３５】
表５より、実施例２９の水素化処理糖液−１５を使用した実施例３０では、比較例１２に対してコハク酸濃度が５０％向上した。
以上の結果より、水素化処理を実施し、不飽和アルコールであるクロチルアルコールの濃度が軽減された糖液を使用することで、コハク酸生産速度が向上することが明らかとなった。
これより糖類以外のカルボニル化合物および／または不飽和アルコールを含む糖液を水素化反応に供することで、当該物質を水素化し、除去または大幅に低減させることができることが分かる。更に、得られた水素化処理糖液を含む有機原料に微生物を作用させて有機化合物を生産させることで、有機化合物の生産速度が向上することがわかる。
【０２３６】
（比較例１４）
上記糖液−１を使用し、グルコース、キシロースの糖合計質量に対して、１質量％の活性炭マックスソーブ（株式会社ＭＣエバテック製  ＭＳＰ−２０）を添加し、２５℃で2時間攪拌した。上記反応液をディスポーザブルのシリンジとフィルター（０．４５μｍ）でろ過して、活性炭処理糖液（以下「活性炭処理糖液−１」）を得た。活性炭処理糖液−１中の各成分濃度は、グルコース８．０質量％、キシロース１．０質量％、ソルビトール０．０質量％、キシリトール０．０質量％であった。また、グリコールアルデヒドダイマーは３２００ｐｐｍであり、フルフラールは１２０ｐｐｍであった。
【０２３７】
（比較例１５）
上記糖液−１を使用し、活性炭の種類をダイヤソープ（カルゴンカーボンジャパン株式会社製  Ｗ１０−３０）に変更した以外は、比較例１４と同様の方法で活性炭処理を実施し活性炭処理糖液−２を得た。活性炭処理糖液−２中の各成分濃度は、グルコース８．００質量％、キシロース１．０質量％、ソルビトール０．０質量％、キシリトール０．０質量％であった。また、グリコールアルデヒドダイマーは３２００ｐｐｍであり、フルフラールは１２０ｐｐｍであった。
【０２３８】
（比較例１６）
コハク酸生産反応において、比較例１４で作製した活性炭処理糖液−１を使用したこと以外は、実施例９と同様に行った。その結果、６時間後のコハク酸蓄積濃度は８．０ｇ／Ｌ、グルコース濃度は８．０ｇ／Ｌ、キシロース濃度は２．４ｇ／Ｌであった。
【０２３９】
（比較例１７）
コハク酸生産反応において、比較例１５で作製した活性炭処理糖液−２を使用したこと以外は、実施例９と同様に行った。その結果、６時間後のコハク酸蓄積濃度は７．５ｇ／Ｌ、グルコース濃度は８．０ｇ／Ｌ、キシロース濃度は２．３ｇ／Ｌであった。
【０２４０】
（比較例１８）
コハク酸生産反応において、製造例１で作製した糖液−１を使用したこと以外は、実施例９と同様に行った。その結果、６時間後のコハク酸蓄積濃度は７．３ｇ／Ｌ、グルコース濃度は９．６ｇ／Ｌ、キシロース濃度は２．３ｇ／Ｌであった。
【０２４１】
（比較例１９）
コハク酸生産反応において、製造例３で作製した糖液−０を使用したこと以外は、実施例９と同様に行った。その結果、６時間後のコハク酸蓄積濃度は１２．０ｇ／Ｌ、グルコース濃度は１．２ｇ／Ｌ、キシロース濃度は１．９ｇ／Ｌであった。
【０２４２】
【表６】
2018139590.tif 000008
【０２４３】
表６より、活性炭処理糖液−１を使用した比較例１６では、比較例１８に対してコハク酸濃度が１０％向上した。また、活性炭処理糖液−２を使用した比較例１７では、比較例１８に対してコハク酸濃度が３％向上したが、水素化処理に比較すると回復効果は少なかった。
以上の結果から、カルボニル化合物および／または不飽和アルコールを含む糖液を活性炭処理した場合は、当該糖液を水素化反応に供した場合に比べ当該物質を低減させる効果が小さいことがわかる。更に、得られた活性炭処理糖液に微生物を作用させて有機化合物を生産させた場合、有機化合物の生産速度の向上が小さいことがわかる。
【０２４４】
（製造例９）
非可食原料として、バガスを使用した。まずバガスに硫酸及び水を加えて混合し、バガス混合物を得た。硫酸の添加量は、バガスの乾燥質量に対し２質量％であり、水の添加量は、前記バガス混合物の合計質量に対する含水率が６０質量％となるように調製した。次にドラムミキサー（杉山重工株式会社製）にて前記バガス混合物を２０分間混合、撹拌の後に取り出し、希硫酸処理混合物を得た。前記希硫酸処理混合物を加水分解装置（株式会社ヤスジマ製）にて、蒸気を投入し、１８０℃で１５分間蒸煮処理した。得られた蒸煮処理物の含水率は６４．６質量％であった。前記蒸煮処理物を乾燥質量２００ｇ／Ｌとなるように糖化装置に仕込み、１０Ｎ−ＮａＯＨ水溶液を添加し、ｐＨを６．０に調整した。そこに糖化酵素として１５ＦＰＵ分のＣＴｅｃ２（ｎｏｖｏｚｙｍｅ社製）を添加し、温度５０℃、攪拌速度２００ｒｐｍにて７２時間攪拌しながら、加水分解を行った。その後、遠心分離（１００００ｇ、１０分間）を行い、未分解セルロース及びリグニンを分離除去した。固形分を除去した糖液に対して、４８質量％ＮａＯＨ水溶液を用いてｐＨを８に調整し、さらに１２１℃で２０分間加熱してバガス糖化液（以下、糖液−８）を作成した。上記ＨＰＬＣ分析により、前記バガス糖化液を測定したところ、各成分の濃度は、グルコース９．０質量％、キシロースとフルクトースの合計が３．０質量％、フルフラールが８１６ｐｐｍ、ヒドロキシメチルフルフラールが５３４ｐｐｍであった。
【０２４５】
（実施例３１）
上記糖液−８を使用した以外は、実施例１と同様の方法で水素化処理を行ない、水素化処理糖液−１６を得た。水素化処理糖液−１６中の各成分濃度は、グルコース９．１質量％、キシロースとフルクトースの合計が３．０質量％、ソルビトール及びキシリトールは検出限界以下（０．００１質量％未満）であった。また、フルフラールが７４ｐｐｍ、ヒドロキシメチルフルフラールが１２６ｐｐｍであった。
【０２４６】
（実施例３２）
上記糖液−８を使用した以外は、実施例８と同様の方法で水素化処理を行ない、水素化処理糖液−１７を得た。水素化処理糖液−１７中の各成分濃度は、グルコース９．１質量％、キシロースとフルクトースの合計が３．０質量％、ソルビトール０．００１質量％、キシリトールは検出限界以下（０．００１質量％未満）であった。また、フルフラールが８２ｐｐｍ、ヒドロキシメチルフルフラールが１３０ｐｐｍであった。
【０２４７】
（実施例３３）
上記糖液−８を使用した以外は、実施例１５と同様の方法で水素化処理を行ない、水素化処理糖液−１８を得た。水素化処理糖液−１８中の各成分濃度は、グルコース８．３質量％、キシロースとフルクトースの合計が３．３質量％、ソルビトール０．１質量％、キシリトールは検出限界以下（０．００１質量％未満）であった。また、フルフラールが２２５ｐｐｍ、ヒドロキシメチルフルフラールが２２８ｐｐｍであった。
【０２４８】
（実施例３４）
実施例４における（Ａ）種培養、（Ｂ）本培養と同様の工程を経て得られる培養液を、実施例４と同様に集菌し、菌体懸濁液［硫酸マグネシウム・７水和物：３２０ｍｇ、硫酸第一鉄・７水和物：１３ｍｇ、硫酸マンガン・５水和物：１３ｍｇ、リン酸（８５％）：４８０ｍｇ、水酸化カリウム（４８％）：６４０ｍｇ、蒸留水１０００ｍＬに溶解］にＯ．Ｄ．（６６０ｎｍ）が６０になるように懸濁して菌体溶液を調製した。続いて実施例３１で作製した水素化処理糖液−１６を５４．５ｇ、蒸留水：１１ｇ、培地濃縮液［硫酸マグネシウム・７水和物：２５．６ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：１ｇ、硫酸マンガン・５水和物：１ｇ、リン酸（８５％）：３８．５ｇ、水酸化カリウム（４８％）：５０．９ｇ、蒸留水１０００ｍＬに溶解］：１ｍＬ、Ｄ−ビオチン水溶液（１００ｍｇ／Ｌ）：１３３ｍｇ、塩酸チアミン（１００ｍｇ／Ｌ）：１３３ｍｇを混合して、基質溶液を作成した。基質溶液に炭酸水素アンモニウム：９６０ｍｇ、菌体溶液２０ｍLを加え、嫌気的雰囲気下において４０℃で反応させた。中和剤[アンモニア水（２８％）：１１７ｇ、炭酸水素アンモニウム：３８ｇ、蒸留水３００ｍＬに溶解]を加えることでｐＨは７．３に維持した。その結果、３時間後のコハク酸蓄積濃度は１１．３ｇ／Ｌであった。
【０２４９】
（実施例３５）
コハク酸生産反応において、実施例３２で作製した水素化処理糖液−１７を使用したこと以外は、実施例３４と同様に行った。その結果、３時間後のコハク酸蓄積濃度は１１．７ｇ／Ｌであった。
【０２５０】
（実施例３６）
コハク酸生産反応において、実施例３３で作製した水素化処理糖液−１８を使用したこと以外は、実施例３４と同様に行った。その結果、３時間後のコハク酸蓄積濃度は１１．５ｇ／Ｌであった。
【０２５１】
（比較例２０）
コハク酸生産反応において、製造例９で作製した糖液−８を使用したこと以外は、実施例３４と同様に行った。その結果、３時間後のコハク酸蓄積濃度は９．２ｇ／Ｌであった。
実施例３４〜３６、比較例２０の結果を表７に示す。数値は、３時間後のコハク酸濃度を表わす。
また糖液−８をイオン交換水で７５倍（質量）に希釈し、ＵＶ-ｖｉｓ測定器にて前記の方法で吸収スペクトルを測定し、測定結果を図１に示した。
【０２５２】
【表７】
2018139590.tif 000009
【０２５３】
表７より、水素化処理糖液−１６〜１８を使用した実施例３４〜３６では、比較例２０に対していずれもコハク酸濃度が向上した。
以上の結果より、非可食原料であるバガスから得られたバガス糖化液に対し水素化処理を実施することで、糖液中に含まれる糖類以外のカルボニル化合物および／又は不飽和アルコールの濃度を大幅に低減させることができる。更に非可食原料由来の水素化処理糖液に微生物を作用させて有機化合物を生産させることで、有機化合物の生産速度が向上することがわかる。
【０２５４】
（製造例１０）
超純水３００ｍＬにグルコース９８．６ｇ、キシロース１２．３ｇ、フルフラール０．３ｇ、ギ酸０．１ｇ、グリコールアルデヒドダイマー０．３ｇを溶解させ糖液を作成した。以下、糖液−９とする。
前記糖液−９中の各成分濃度は、グルコース２３．９質量％、キシロース３．０質量％、フルフラール０．０９質量％、ギ酸０．０３質量％、グリコールアルデヒドダイマー０．０８質量％であった。
【０２５５】
（製造例１１）
超純水３００ｍＬにグルコース９８．６ｇ、キシロース１２．３ｇ、フルフラール０．４ｇ、ギ酸０．１６ｇ、グリコールアルデヒドダイマー０．４１ｇを溶解させ糖液を作成した。以下、糖液−１０とする。
糖液−１０中の各成分濃度は、グルコース２３．９質量％、キシロース３．０質量％、フルフラール０．１２質量％、ギ酸０．０４質量％、グリコールアルデヒドダイマー０．１質量％であった。
【０２５６】
（実施例３７）
上記糖液−９を使用したこと以外は、実施例１と同様の方法で水素化処理を行ない、水素化処理糖液−１９を得た。水素化処理糖液−１９中の各成分濃度は、グルコース２３．８質量％、キシロース３．０質量％、ソルビトール及びキシリトールは検出限界以下（０．００１質量％未満）であった。またグリコールアルデヒド０．０５質量％、フルフラール０．０００３質量％であった。
【０２５７】
（実施例３８）
上記糖液−１０を使用したこと以外は、実施例１と同様の方法で水素化処理を行ない、水素化処理糖液−２０を得た。水素化処理糖液−２０中の各成分濃度は、グルコース２３．７質量％、キシロース３．０質量％、ソルビトール及びキシリトールは検出限界以下（０．００１質量％未満）であり、グリコールアルデヒドダイマー及びフルフラールは検出されなかった。
【０２５８】
（製造例１２）
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株について、以下のようにして、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｌｄｈ遺伝子）、ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子（ｐｔａ遺伝子）、アセテートキナーゼ遺伝子（ａｃｋ遺伝子）、ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子（ｃｔｆ遺伝子遺伝子）、およびピルベートオキシダーゼ遺伝子（ｐｏｘＢ遺伝子）の破壊、さらに、キシロースイソメラーゼ遺伝子（ＸｙｌＡ遺伝子）、キシルロキナーゼ遺伝子（ＸｙｌＢ遺伝子）、アセトラクテートシンターゼ遺伝子（ａｌｓＳ遺伝子）、アセトラクテートデカルボキシラーゼ遺伝子（ａｌｓＤ）、および２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｂｄｈＡ遺伝子）の導入を行ない、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＢｄｈＡ／ＡｌｓＳＤ／ＸｙｌＡＢ／ΔＰｏｘＢ／ΔＣＴＦ／ΔＰＴＡ−ＡＣＫ／ΔＬＤＨ株を作製した。
【０２５９】
＜ＸｙｌＡＢ増強株の作製＞
ＸｙｌＡＢ増強株作製の供試菌株は、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＰｏｘＢ／ΔＣＴＦ／ΔＰＴＡ−ＡＣＫ／ΔＬＤＨ株（特願２０１４−１１４９７１）を用いた。該菌株の形質転換に用いるプラスミドＤＮＡは、（製造例６）の（Ｃ）で構築したｐＸｙｌＡＢ３を用いて塩化カルシウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９７０，５３，１５９）により形質転換した大腸菌ＪＭ１１０株から調製した。
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＰｏｘＢ／ΔＣＴＦ／ΔＰＴＡ−ＡＣＫ／ΔＬＤＨ株の形質転換は電気パルス法（Ｒｅｓ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９３，１４４，ｐ１８１−５）によって行い、得られた形質転換体を２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢＧ寒天培地［トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ、グルコース２０ｇ、および寒天１５ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。
この培地上に生育した株は、ｐＸｙｌＡＢ３がブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株菌体内で複製不可能なプラスミドであるため、該プラスミドのｌｄｈ遺伝子とブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株ゲノム上の同遺伝子との間で相同組換えを起こした結果、ゲノム上に該プラスミドに由来するカナマイシン耐性遺伝子およびｓａｃＢ遺伝子が挿入されているはずである。
【０２６０】
次に、上記相同組換え株を２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢＧ培地にて液体培養した。この培養液の菌体数約１００万相当分を１０％ショ糖含有ＬＢＧ培地に塗抹にした結果、２回目の相同組換えによりｓａｃＢ遺伝子が脱落しショ糖非感受性となったと考えられる株を数十個得た。
この様にして得られた株の中には、そのｌｄｈ遺伝子欠損部位にｐＸｙｌＡＢ３に由来するＴＺ４プロモーターと連結されたＸｙｌＡＢオペロンが挿入されたものと親株と同じ配列に戻ったものが含まれる。ＴＺ４プロモーターと連結されたＸｙｌＡＢオペロンが挿入されたか否かの確認は、ＬＢＧ培地にて培養して得られた菌体を直接ＰＣＲ反応に供し、ＴＺ４プロモーターと連結されたＸｙｌＡＢオペロンの検出を行うことによって容易に確認できる。ＴＺ４プロモーターおよびＸｙｌＡＢオペロンをＰＣＲ増幅するためのプライマー（配列番号９：AATCAGGAAG TGGGATCGAA AATGおよび配列番号１０：CCGCCAACTA GACACCAAAG ATTC）を用いて分析すると、ＴＺ４プロモーターと連結されたＸｙｌＡＢオペロンが挿入されたクローンでは４，１９６ｂｐのＤＮＡ断片を認めるはずである。上記方法にてショ糖非感受性となった菌株を分析した結果、ＴＺ４プロモーターと連結されたＸｙｌＡＢオペロンが挿入された株を選抜し、該株をブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＸｙｌＡＢ／ΔＰｏｘＢ／ΔＣＴＦ／ΔＰＴＡ−ＡＣＫ／ΔＬＤＨと命名した。
【０２６１】
＜ＡＬＳ、ＡＬＤＣ、ＢＤＨ増強株の作製＞
ａｌｓＳＤおよびＢｄｈＡ増強株作製の供試菌株は、上記にて作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＸｙｌＡＢ／ΔＰｏｘＢ／ΔＣＴＦ／ΔＰＴＡ−ＡＣＫ／ΔＬＤＨ株を用いた。該菌株の形質転換に用いるプラスミドＤＮＡは、ｐＣ３．１４Ｆ−ＡｌｓＳＤおよびｐＴＺ４Ｆ−ＢｄｈＡ（特願２０１４−１１４９７１）を用いて塩化カルシウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９７０，５３，１５９）により形質転換した大腸菌ＪＭ１１０株から調製した。ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＸｙｌＡＢ／ΔＰｏｘＢ／ΔＣＴＦ／ΔＰＴＡ−ＡＣＫ／ΔＬＤＨ株の形質転換は、電気パルス法（Ｒｅｓ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９３，１４４，ｐ１８１−５）によって行い、得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬカナマイシンおよび１０μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むＬＢＧ寒天培地［トリプトン  １０ｇ、イーストエキストラクト  ５ｇ 、ＮａＣｌ  ５ｇ、グルコース  ２０ｇ、および寒天  １５ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。この培地上に生育した株は、ｐＣ３．１４Ｆ−ＡｌｓＳＤおよびｐＴＺ４Ｆ−ＢｄｈＡの双方がブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株菌体内で保持されており、この菌株をブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＢｄｈＡ／ＡｌｓＳＤ／ＸｙｌＡＢ／ΔＰｏｘＢ／ΔＣＴＦ／ΔＰＴＡ−ＡＣＫ／ΔＬＤＨ（以下、ＭＢＤ０７とも呼ぶ）と命名した。
【０２６２】
（実施例３９）
（Ａ）種培養
以下の成分を含む溶液［硫酸アンモニウム：２０ｇ、尿素：５ｇ、リン酸１カリウム：１ｇ、リン酸２カリウム：１ｇ、硫酸マンガン・七水和物：０．２５ｇ、３−モルホリノプロパンスルホン酸：４２ｇ、純水：６００ｍＬに溶解］に対して、塩化カルシウム溶液［塩化カルシウム・２水和物：１．３２ｇ、純水：１００ｍＬに溶解］１ｍＬを加え、続いて１Ｎ水酸化ナトリウム溶液でｐＨ７に調整し、純水を加えて液量８６４ｍＬとした後、１２１℃、２０分間で加熱滅菌した。次に、濾過滅菌したトレースエレメント［硫酸第一鉄・７水和物：１ｇ、硫酸マンガン・５水和物：１．４２ｇ、硫酸亜鉛・七水和物：０．１ｇ、硫酸銅・５水和物：０．０３１ｇ、塩化ニッケル・６水和物：０．００２ｇ、純水：９０ｍＬに対して濃塩酸を加えｐＨ＝１に調整］１ｍＬ、濾過滅菌したプロトカテクサン溶液［プロトカテクサン：３００ｍｇ、純水：８ｍＬに対して１０Ｎ水酸化ナトリウム溶液を１ｍＬ添加］１ｍＬ、濾過滅菌したビオチン溶液［Ｄ−ビオチン：１０ｍｇ、純水５０ｍＬに溶解］１ｍＬを加え、培地を作製した。
２００ｍＬの三角フラスコに上記培地１７．３ｍＬ、加熱滅菌した純水１．１ｍＬ、加熱滅菌した５００ｇ／Ｌグルコース溶液１．６ｍＬを加えてＣＧＸII培地を作製した。更に５０ｇ／Ｌカナマイシン溶液２０μＬ、２５ｇ／Ｌストレプとマイシン溶液２０μＬを加えた後、製造例１２で作製したＭＢＤ０７株を接種し、３０℃で２４．０時間培養した。
【０２６３】
（Ｂ）２，３−ブタンジオール生産
２００ｍＬの三角フラスコに滅菌培地に対して、上記培地４３．３ｍＬ、濾過滅菌した実施例３７に記載の水素化反応を実施した水素化処理糖液−１９を６．７ｍＬ加えてＣＧＸII培地を作製した。更に５０ｇ／Ｌカナマイシン溶液５０μＬ、２５ｇ／Ｌストレプとマイシン溶液５０μＬを加えた後、種培養液をＯ．Ｄ．（６６０ｎｍ）が０．１５となるように接種し、３０℃で２４．０時間培養した。１９．５時間後のＯ．Ｄ．（６６０ｎｍ）、グルコース、キシロース、（ｍｅｓｏ）−２，３−ブタンジオール、（Ｒ，Ｒ）もしくは（Ｓ，Ｓ）−２，３−ブタンジオール、２，３−ブタンジオールの合計濃度（（ｍｅｓｏ）、（Ｒ，Ｒ）、（Ｓ，Ｓ）の合計）を表８に示す。
【０２６４】
（比較例２１）
２，３−ブタンジオール生産において、糖液-９を使用したこと以外は、実施例３９と同様に行った。１９．５時間後のＯ．Ｄ．（６６０ｎｍ）、グルコース、キシロース、（ｍｅｓｏ）−２，３−ブタンジオール、（Ｒ，Ｒ）もしくは（Ｓ，Ｓ）−２，３−ブタンジオール、２，３−ブタンジオールの合計濃度（（ｍｅｓｏ）、（Ｒ，Ｒ）、（Ｓ，Ｓ）の合計）を表８に示す。
【０２６５】
（実施例４０）
２，３−ブタンジオール生産において、実施例３８の水素化処理糖液−２０を使用したこと以外は、実施例３９と同様に行った。１９．５時間後のグルコース、キシロース、（ｍｅｓｏ）−２，３−ブタンジオール、（Ｒ，Ｒ）もしくは（Ｓ，Ｓ）−２，３−ブタンジオール、２，３−ブタンジオールの合計濃度（（ｍｅｓｏ）、（Ｒ，Ｒ）、（Ｓ，Ｓ）の合計）を表８に示す。
【０２６６】
（比較例２２）
２，３−ブタンジオール生産において、糖液−１０を使用したこと以外は、実施例３９と同様に行った。１９．５時間後のグルコース、キシロース、（ｍｅｓｏ）−２，３−ブタンジオール、（Ｒ，Ｒ）もしくは（Ｓ，Ｓ）−２，３−ブタンジオール、２，３−ブタンジオールの合計濃度（（ｍｅｓｏ）、（Ｒ，Ｒ）、（Ｓ，Ｓ）の合計）を表８に示す。
【０２６７】
（実施例４１）
上記糖液−８を使用した以外は、実施例１と同様の方法で水素化処理を行ない、水素化処理糖液−２１を得た。水素化処理糖液−２１中の各成分濃度は、グルコース９．２質量％、キシロースとフルクトースの合計が２．９質量％、ソルビトール０．０２質量％、キシリトールは検出限界以下（０．００１質量％未満）であった。また、フルフラールが１７２ｐｐｍ、ヒドロキシメチルフルフラールが２０４ｐｐｍであった。水素化処理糖液−２１は、目視による視認で、糖液−８に比べ着色の度合いが低下した。また水素化処理糖液−２１をイオン交換水で７５倍（質量）に希釈し、ＵＶ-ｖｉｓ測定器にて吸収スペクトルを測定し、測定結果を図１に示した。
【０２６８】
（実施例４２）
上記糖液−８を使用した以外は、実施例８と同様の方法で水素化処理を行ない、水素化処理糖液−２２を得た。水素化処理糖液−２２中の各成分濃度は、グルコース９．１質量％、キシロースとフルクトースの合計が２．９質量％、ソルビトール０．００３質量％、キシリトールは検出限界以下（０．００１質量％未満）であった。また、フルフラールが１８３ｐｐｍ、ヒドロキシメチルフルフラールが２１９ｐｐｍであった。水素化処理糖液−２２は、目視による視認で、糖液−８に比べ着色の度合いが低下した。また水素化処理糖液−２２をイオン交換水で７５倍（質量）に希釈し、ＵＶ-ｖｉｓ測定器にて吸収スペクトルを測定し、測定結果を図１に示した。
【０２６９】
図１から水素化処理糖液−２１及び２２は、水素化処理前の糖液−８（比較例２０）に比べて、２５０〜３００ｎｍ付近の吸収が顕著に低下したことがわかる。当該吸収領域は主としてフルフラール等のカルボニル化合物の吸収領域であることから、水素化処理によりカルボニル化合物が除去され、着色が低下したものと考えられる。これより、本発明の水素化処理糖液は、その処理前に比べて着色が抑制されるため、これを用いた反応、特に化学変換プロセスに適用した場合、その生成物の着色が抑制できるものと考えられる。
【０２７０】
（実施例４３）
（Ａ）種培養
実施例３９の（Ａ）種培養において、溶解させる純水量を３３０ｍＬ、ｐＨ＝７に調整後の液量を４９２ｍＬとした以外は同様の方法により、種培養をおこなった。
【０２７１】
（Ｂ）２，３−ブタンジオール生産
２００ｍＬの三角フラスコに滅菌培地に対して、上記培地２４．８ｍＬ、加熱滅菌した純水８．４ｍＬ、実施例４１で得た水素化処理糖液−２１を１６．８ｍＬ加えてＣＧＸII培地を作製した。更に５０ｇ／Ｌカナマイシン溶液５０μＬ、２５ｇ／Ｌストレプとマイシン溶液５０μＬを加えた後、種培養液をＯ．Ｄ．（６６０ｎｍ）が０．２０となるように接種し、３０℃で２４．０時間培養した。１９．０時間後のＯ．Ｄ．（６６０ｎｍ）、グルコース、キシロース、（ｍｅｓｏ）−２，３−ブタンジオール、（Ｒ，Ｒ）もしくは（Ｓ，Ｓ）−２，３−ブタンジオール、２，３−ブタンジオールの合計濃度（（ｍｅｓｏ）、（Ｒ，Ｒ）、（Ｓ，Ｓ）の合計）を表８に示す。
【０２７２】
（実施例４４）
２，３−ブタンジオール生産において、実施例４２で得た水素化処理糖液−２２を使用したこと以外は、実施例４３と同様に行った。１９．０時間後のＯ．Ｄ．（６６０ｎｍ）、グルコース、キシロース、（ｍｅｓｏ）−２，３−ブタンジオール、（Ｒ，Ｒ）もしくは（Ｓ，Ｓ）−２，３−ブタンジオール、２，３−ブタンジオールの合計濃度（（ｍｅｓｏ）、（Ｒ，Ｒ）、（Ｓ，Ｓ）の合計）を表８に示す。
【０２７３】
（比較例２３）
２，３−ブタンジオール生産において、糖液‐８を使用したこと以外は、実施例４３と同様に行った。１９．０時間後のＯ．Ｄ．（６６０ｎｍ）、グルコース、キシロース、（ｍｅｓｏ）−２，３−ブタンジオール、（Ｒ，Ｒ）もしくは（Ｓ，Ｓ）−２，３−ブタンジオール、２，３−ブタンジオールの合計濃度（（ｍｅｓｏ）、（Ｒ，Ｒ）、（Ｓ，Ｓ）の合計）を表８に示す。
【０２７４】
（実施例４５）
前記水素化処理糖液−２１の使用量を２５．２ｍＬに変更した以外は、実施例４３と同様に２，３-ブタンジオールを生産した。結果を表８に示す。
【０２７５】
（実施例４６）
２，３−ブタンジオール生産において、前記水素化処理糖液−２２を使用したこと以外は、実施例４５と同様に行った。結果を表８に示す。
【０２７６】
（比較例２４）
２，３−ブタンジオール生産において、糖液−８を使用したこと以外は、実施例４５と同様に行った。結果を表８に示す。
【０２７７】
【表８】
2018139590.tif 000010
【０２７８】
表８より、実施例３９の水素化処理糖液−１９を使用した場合は、比較例２１の水素化処理していない糖液−９に対してＯ．Ｄ．（６６０ｎｍ）が１．３倍、２，３−ブタンジオール濃度（（ｍｅｓｏ）、（Ｒ，Ｒ）、（Ｓ，Ｓ）の合計）が１．１倍に向上した。
また、実施例４０の水素化処理糖液−２０を使用した場合は、比較例２２の水素化処理していない糖液−１０に対してＯ．Ｄ．（６６０ｎｍ）が１．７倍、２，３−ブタンジオール濃度（（ｍｅｓｏ）、（Ｒ，Ｒ）、（Ｓ，Ｓ）の合計）が１．３倍に向上した。
以上の結果より、水素化処理を実施してフルフラール、グリコールアルデヒド等が大幅に低減した糖液を使用することで、菌体増殖速度、２，３−ブタンジオール生産速度が向上することが明らかとなった。
【０２７９】
さらに、実施例４３の水素化処理糖液−２１を使用した場合は、比較例２３の水素化処理をしていない糖液−８に対してＯ．Ｄ．（６６０ｎｍ）が１．６倍、２，３−ブタンジオール濃度（（ｍｅｓｏ）、（Ｒ，Ｒ）、（Ｓ，Ｓ）の合計）が１．７倍に向上し、同様に実施例４４の水素化処理糖液−２２を使用した場合は、比較例２３の水素化処理をしていない糖液−８に対してＯ．Ｄ．（６６０ｎｍ）が１．５倍、２，３−ブタンジオール濃度（（ｍｅｓｏ）、（Ｒ，Ｒ）、（Ｓ，Ｓ）の合計）が１．５倍に向上した。
また、実施例４５の水素化処理糖液−２１を使用した場合は、比較例２４の水素化処理を実施していない糖液−８に対してＯ．Ｄ．（６６０ｎｍ）が３．５倍、２，３−ブタンジオール濃度（（ｍｅｓｏ）、（Ｒ，Ｒ）、（Ｓ，Ｓ）の合計）が１０．８倍に向上し、同様に実施例４６の水素化処理糖液−２２を使用した場合は、比較例２４の水素化処理を実施していない糖液−８に対してＯ．Ｄ．（６６０ｎｍ）が３．３倍、２，３−ブタンジオール濃度（（ｍｅｓｏ）、（Ｒ，Ｒ）、（Ｓ，Ｓ）の合計）が９．５倍に向上した。
以上の結果より、糖類以外のカルボニル化合物および／または不飽和アルコールを含む糖液を水素化処理し、得られた水素化処理糖液に微生物を作用させて２，３−ブタンジオール生産速度が向上することが明らかとなった。更に当該水素化処理糖液は、菌体増殖の速度を向上させることが明らかになった。
これより当該糖液を水素化反応に供することで、当該物質が水素化により除去または大幅に低減した水素化処理糖液に微生物を作用させ有機化合物を生産させることで、有機化合物の生産速度を向上させることが分かる。更に当該水素化処理糖液は、微生物の培養速度を向上させることが分かる。またこの効果は、非可食原料由来のバガス糖化液を水素化処理し、得られた水素化処理糖液に微生物を作用させた場合も同じであることがわかる。
【０２８０】
（実施例４７）
上記糖液−１を使用し、実施例１と同様の方法で水素化処理を行ない、水素化処理糖液−２３を得た。水素化処理糖液−２３中の各成分濃度は、グルコース８．０質量％、キシロース１．０質量％、キシリトール０．０１質量％、ソルビトールは検出限界以下（０．００１質量％未満）であった。また、グリコールアルデヒドダイマーは５０ｐｐｍであり、フルフラールは検出されなかった。
【０２８１】
（実施例４８）
（Ａ）種培養
培地［ポリペプトン：２０ｇ、酵母エキス：１０ｇ、純水：５００ｍＬに溶解］５００ｍＬを試薬ビンに入れ、１２１℃で２０分間、加熱滅菌した。これを室温まで冷やした後、２００ｍＬの三角フラスコに１０ｍＬ入れ、続いて加熱滅菌した５００ｇ／Ｌグルコース水溶液０．８ｍＬと加熱滅菌した純水９．２ｍＬを入れてＹＰＤ培地を作製した。次に、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓ２８８Ｃ株を接種して１６．５時間３０℃で培養した。
【０２８２】
（Ｂ）エタノール生産
２００ｍＬの三角フラスコに加熱滅菌した培地１０ｍＬ、孔径０．２２μｍのフィルターで濾過滅菌した実施例４７（糖液の水素化処理）に記載の水素化処理糖液−２３を６．７ｍＬ、加熱滅菌した脱塩水３．３ｍＬを加え、濾過滅菌したＮａＯＨ溶液でｐＨを６．３に調整した。次に種培養液をＯ．Ｄ．（６６０ｎｍ）が０．４となるように接種し、３０℃で２４．０時間で培養した。９時間後のエタノール濃度、グルコース濃度、キシロース濃度を表９に示す。
【０２８３】
（比較例２５）
エタノール生産において、水素化処理を実施していない糖液‐１を使用したこと以外は、実施例４８と同様に行った。９時間後のＯ．Ｄ．（６６０ｎｍ）、グルコース、キシロース、エタノール濃度を表９に示す。
【０２８４】
【表９】
2018139590.tif 000011
【０２８５】
表９より、実施例４７の水素化処理糖液−２３を使用した場合は、比較例２５の水素化処理していない糖液−１に対してＯ．Ｄ．（６６０ｎｍ）が４．８倍、エタノール濃度が３．５倍に向上した。
以上の結果より、糖類以外のカルボニル化合物および／または不飽和アルコールを含む糖液を水素化処理し、得られた水素化処理糖液に微生物を作用させることでエタノールの生産速度が向上することが明らかとなった。更に当該水素化処理糖液は、菌体増殖の速度を向上させることが明らかになった。
これより当該糖液を水素化反応に供することで、当該物質が水素化により除去または大幅に低減した水素化処理糖液に微生物を作用させ有機化合物を生産させることで、有機化合物の生産速度を向上させることが分かる。更に当該水素化処理糖液は、微生物の培養速度を向上させることが分かる。
【０２８６】
（実施例４９）
（Ａ）種培養
培地［リン酸１カリウム：３．０ｇ、リン酸２カリウム７．０ｇ、硫酸アンモニウム：２．０ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：０．２ｇ、塩化ナトリウム：１０．０ｇ、酵母エキス：５．０ｇ、トリプトン：１０．０ｇ、純水５００ｍＬに溶解］５００ｍＬを試薬ビンに入れ、１２１℃で２０分間、加熱滅菌した。これを室温まで冷やした後、２００ｍＬの三角フラスコに１０ｍＬ入れ、続いて加熱滅菌した５００ｇ／Ｌグルコース水溶液０．８ｍＬと加熱滅菌した純水９．２ｍＬを入れた。次に、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ１２株を接種して３０℃で１６．５時間振とう培養した。
【０２８７】
（Ｂ）本培養
２００ｍＬの三角フラスコに加熱滅菌した上記培地１０ｍＬ、濾過滅菌した実施例４７に記載の水素化処理糖液−２３を２．２ｍＬ、加熱滅菌した５００ｇ／Ｌグルコース溶液０．３６ｍＬ、加熱滅菌した１００ｇ／Ｌキシロース溶液０．２２ｍＬ、加熱滅菌した純水７．２ｍＬ、濾過滅菌した１Ｎ水酸化ナトリウム溶液２５μＬを入れた。次に、上記（Ａ）の種培養で得られた培養液を、Ｏ．Ｄ．（６６０ｎｍ）が０．１となるように接種し、３０℃で、２４．０時間振とう培養した。３．０時間後のＯ．Ｄ．（６６０ｎｍ）、グルコース、キシロース濃度を表１０に示す。
【０２８８】
（比較例２６）
微生物培養において、糖液−１を使用したこと以外は、実施例４９と同様に行った。３．０時間後のＯ．Ｄ．（６６０ｎｍ）、グルコース、キシロース濃度を表１０に示す。
【０２８９】
（実施例５０）
２００ｍＬの三角フラスコに加熱滅菌した上記培地１０ｍＬ、実施例４７に記載の水素化処理糖液−２３を４．５ｍＬ、加熱滅菌した純水５．５ｍＬ、濾過滅菌した１Ｎ水酸化ナトリウム溶液５０μＬを入れた。次に、上記（Ａ）の種培養で得られた培養液を、Ｏ．Ｄ．（６６０ｎｍ）が０．１となるように接種し、３０℃で、２４．０時間振とう培養した。３．０時間後のＯ．Ｄ．（６６０ｎｍ）、グルコース、キシロース濃度を表１０に示す。
【０２９０】
（比較例２７）
微生物培養において、糖液−１を使用したこと以外は、実施例５０と同様に行った。３．０時間後のＯ．Ｄ．（６６０ｎｍ）、グルコース、キシロース濃度を表１０に示す。
【０２９１】
【表１０】
2018139590.tif 000012
【０２９２】
表１０より、実施例４９において実施例４７の水素化処理糖液−２３を使用した場合は、比較例２６の水素化処理を実施していない糖液−１を使用した場合に対してＯ．Ｄ．（６６０ｎｍ）が９．６倍に向上した。
また、実施例５０において水素化処理糖液−２３を使用した場合は、比較例２７の水素化処理していない糖液−１を使用した場合に対してＯ．Ｄ．（６６０ｎｍ）が４５．０倍に向上した。
以上の結果より、糖類以外のカルボニル化合物および／または不飽和アルコールを含む糖液を水素化処理し、得られた水素化処理糖液を用いて微生物を培養した場合、菌体増殖速度を向上させることが明らかになった。
これより当該糖液を水素化反応に供することで、当該物質が水素化により除去または大幅に低減した水素化処理糖液は、微生物の培養速度を向上させることが裏付けられた。
【０２９３】
（実施例５１）
上記の糖液−１を用いて、実施例１と同様の手法で水素化処理を行った。この水素化処理を行った糖液に対して、４８％ＮａＯＨ水溶液でｐＨを８に調整し、１２１℃で２０分間加熱し滅菌処理を行った。本糖液に関してＬＣ分析を行ったところ、グルコース濃度は７．７８質量％であった。
【０２９４】
（比較例２８）
上記の糖液−１を１０５．２ｇ用いて、亜硫酸ナトリウム０．９ｇ（アルデヒド総量に対して１当量）を加えて、４０℃で１時間攪拌した。この還元剤で処理した糖液に対して、４８％ＮａＯＨ水溶液でｐＨを８に調整し、１２１℃で２０分間加熱し滅菌処理を行った。本糖液に関してＬＣ分析を行ったところ、グルコース濃度は４．７質量％であった。
【０２９５】
還元剤で処理した糖液は熱安定性が悪く、グルコース濃度が大きく低下する一方、水素化処理した糖液は熱安定性が高く、グルコース濃度を一定に保てることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０２９６】
本発明の糖類の処理方法によれば、糖液中の発酵阻害物質の含有量を減少させることができるため、得られる糖液を、微生物を利用した発酵生産プロセスで用いれば、高い収率で目的とする有機化合物の収率を得ることができる。
また本発明の水素化処理糖液は、発酵生産による有機化合物の製造における微生物の生産効率を向上させ、また化学変換プロセスに利用した際に生成物である有機化合物の着色を抑制することができる。
【０２９７】
また、本発明の有機化合物の製造方法は、比較的簡単な処理により、高い生産効率で所望の有機化合物を製造することができる。
また、本発明の培養方法であれば、発酵生産プロセスにおける発酵阻害物質量を減少させることができるため、微生物の増殖量と増殖速度を向上させ、もって発酵生産性を向上させることができる。
【図１】
2018139590.tif 000013
【配列表】
2018139590000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年6月8日(2018.6.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖類以外のカルボニル化合物および不飽和アルコールからなる群より選ばれる少なくとも１つを含む糖液を水素化反応に供し、前記糖液中に含まれる前記カルボニル化合物および／または不飽和アルコールを水素化し、
前記水素化反応における糖アルコールの生成量が、前記糖液の１．９質量％以下であることを特徴とする、糖液の処理方法。
【請求項２】
糖類以外のカルボニル化合物および不飽和アルコールからなる群より選ばれる少なくとも１つを含む糖液を水素化反応に供し、前記糖液中に含まれる前記カルボニル化合物および／または不飽和アルコールを水素化することを特徴とする、糖液の発酵阻害性抑制方法。
【請求項３】
糖類以外のカルボニル化合物および不飽和アルコールからなる群より選ばれる少なくとも１つを含む糖液を水素化反応に供し、前記糖液中に含まれる前記カルボニル化合物および／または不飽和アルコールを水素化することを特徴とする、糖液および／または糖液からの生成物の着色抑制方法。
【請求項４】
前記糖類が、炭素数３以上７以下の単糖と、炭素数３以上７以下の単糖を構成成分として含む多糖と、これらの混合物とからなるグループから選択される少なくとも１つである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記糖液が、非可食原料に由来する請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記水素化反応を、金属触媒の存在下で行なう請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記糖類以外のカルボニル化合物が、アルデヒド化合物およびケトン化合物から選ばれる少なくとも１つである請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記不飽和アルコールが、脂肪族共役アルコールである請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法により水素化処理糖液を得ることを特徴とする水素化処理糖液の製造方法。
【請求項１０】
前記水素化処理糖液中のフルフラールの含有率が、水素化処理糖液全量に対して０．０１質量％以下である請求項９に記載の水素化処理糖液の製造方法。
【請求項１１】
前記水素化処理糖液中のグリコールアルデヒドの含有率が、水素化処理糖液全量に対して０．０３質量％以下である請求項９または１０に記載の水素化処理糖液の製造方法。