(57)【要約】【課題】、従来の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼには分類されない新規な（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼを提供する。【解決手段】新規（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子は、配列番号２に記載したアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質であって、（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ活性を有するタンパク質をコードする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下（１）〜（３）の何れかのタンパク質をコードする（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子。
（１）配列番号２に記載したアミノ酸配列を有するタンパク質
（２）配列番号２に記載したアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ活性を有するタンパク質；
（３）配列番号１に記載した塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質
【請求項２】
メギ科植物由来であることを特徴とする請求項１記載の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子。
【請求項３】
ナンテン（Ｎａｎｄｉｎａ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）由来であることを特徴とする請求項１記載の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子。
【請求項４】
請求項１〜３いずれか一項記載の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子によりコードされる（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ。
【請求項５】
請求項１〜３いずれか一項記載の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子を含む発現ベクター。
【請求項６】
請求項１〜３いずれか一項記載の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子を有する形質転換体。
【請求項７】
請求項６記載の形質転換体を培養して培養物を得る工程と、
上記培養物から（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼを精製する工程と
を含む（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼの製造方法。
【請求項８】
請求項４記載の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼとカルボニル化合物及びシアノ基供与体とを反応させ、反応液から光学活性シアノヒドリンを回収することを含む、光学活性シアノヒドリンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光学活性シアノヒドリン合成活性を有する（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒドロキシニトリルリアーゼは、シアニドドナーの存在下、カルボニル化合物をシアノヒドリン（α−ヒドロキシニトリル）に変換する反応を触媒する酵素である。シアノヒドリンは、α−ヒドロキシ酸、α−ヒドロキシケトン、β−アミノアルコールなど様々な化合物に変換できることから、医薬分野や化学品分野などにおける中間体として重要である。従って、ヒドロキシニトリルリアーゼを大量に生産する方法の開発が望まれている。
【０００３】
ヒドロキシニトリルリアーゼは、（Ｓ）選択性および（Ｒ）選択性の２つのグループに分けられる。その中で（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼは、酸性条件下においてケトンまたはアルデヒドとシアン化合物から（Ｒ）−シアノヒドリンを生成する反応を触媒する。この反応の代表例として、ベンズアルデヒドとシアン化合物である青酸から、（Ｒ）−マンデロニトリルを生成する反応がある。また、（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼは、安価な基質から医薬および化成品中間体として利用価値の高い光学活性体を生産することのできる生体触媒としても使用されており、多くの分野において極めて有用である。
【０００４】
これまで、ヒドロキシニトリルリアーゼについては、非特許文献１及び２に開示されるように、種々の植物において同定されており、基質特異性、立体選択性、補酵素の有無などによって複雑に分類されている。より具体的に、特許文献１には、アーモンド又はウメから単離された（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼについて開示されている。特許文献２には、ＨＮＬ１型の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼとＨＮＬ５型の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼとキメラ組換えタンパク質であって、ハロゲン化シアノヒドリンの合成反応を触媒する活性が高く、かつ耐熱性および耐酸性が高い（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼのキメラ組換えタンパク質が開示されている。特許文献３には、パッションフルーツ由来の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼが開示されている。特許文献４には、パッションフルーツ、ビワ、カリン、プルヌス・ペルシカ及びソルブス・オーキュパリア由来の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼが開示されている。
【０００５】
さらに、特許文献５には、植物由来のヒドロキシニトリルリアーゼより安定性が高い、ヤンバルトサカヤスデ由来の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００８−１１３６０１号公報
【特許文献２】特開２００９−１０６１６７号公報
【特許文献３】特開２００４−２４８５９８号公報
【特許文献４】特開２００９−０５５９２６号公報
【特許文献５】特開２０１５−１６７４７７号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】冨宿及び浅野、有機合成化学会誌、Ｖｏｌ．７０、Ｎｏ．２，第１０２〜１１２頁、２０１２年
【非特許文献２】Ｍ．Ｄａｄａｓｈｉｐｏｕｒ  ａｎｄ  Ｙ．Ａｓａｎｏ，ＡＣＳ  Ｃａｔａｌ．２０１１，１，１１２１−１１４９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述のように、（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼは、利用価値の高い光学活性体を工業的に製造する際に利用できるため、その適用範囲を拡大するため様々な種類の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼが求められている。そこで、本発明は、このような実情に鑑み、従来の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼには分類されない新規な（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上述した目的を達成するため鋭意検討した結果、従来公知の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼと比較して、アミノ酸配列が大きく異なる新規な（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼを見いだすことに成功し、本発明を完成するに至った。本発明は以下を包含する。
【００１０】
［１］以下（１）〜（３）の何れかのタンパク質をコードする（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子。
（１）配列番号２に記載したアミノ酸配列を有するタンパク質
（２）配列番号２に記載したアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ活性を有するタンパク質；
（３）配列番号１に記載した塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質
［２］ナンテン属植物由来であることを特徴とする［１］記載の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子。
［３］ナンテン（Ｎａｎｄｉｎａ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）由来であることを特徴とする［１］記載の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子。
［４］上記［１］〜［３］いずれか記載の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子によりコードされる（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ。
［５］上記［１］〜［３］いずれか記載の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子を含む発現ベクター。
［６］上記［１］〜［３］いずれか記載の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子を有する形質転換体。
［７］上記［６］記載の形質転換体を培養して培養物を得る工程と、上記培養物から（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼを精製する工程とを含む（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼの製造方法。
［８］上記［４］記載の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼとカルボニル化合物及びシアノ基供与体とを反応させ、反応液から光学活性シアノヒドリンを回収することを含む、光学活性シアノヒドリンの製造方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明に係る（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子は、従来公知の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼと比較して大きく異なるアミノ酸配列を有する新規な（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする。このため、本発明に係る（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子、当該遺伝子にコードされる（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ、当該遺伝子を有する発現ベクター並びに形質転換体は、従来の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子とは異なる新規な用途に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本実施例で精製した組換え（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼについて活性を測定した結果を示す特性図である。
【図２】本発明に係る（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼの酵素活性を測定して求めた基質飽和曲線を示す特性図である。
【図３】本発明に係る（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼについて温度安定性を検討した結果を示す特性図である。
【図４】本発明に係る（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼについて至適温度を検討した結果を示す特性図である。
【図５】本発明に係る（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼについて至適ｐＨを検討した結果を示す特性図である。
【図６】本発明に係る（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼについて阻害剤の存在下で比活性を測定した結果を示す特性図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明に係る（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子について詳細に説明する。
【００１４】
本発明に係る（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子は、従来公知の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼのアミノ酸配列とは相同性が大きく異なるアミノ酸配列を有する新規な分類を構成する（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする。この新規な（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼは、例えば、配列番号２に記載したアミノ酸配列を有している。
【００１５】
配列番号２のアミノ酸配列を有する（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼは、メギ科植物に属するナンテン（Ｎａｎｄｉｎａ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）において同定された新規な遺伝子によりコードされている。言い換えると、本発明に係る新規な（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼは、メギ科植物に属するナンテン（Ｎａｎｄｉｎａ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）以外の植物においても同定することができ、定法に従って単離することができる。ナンテン（Ｎａｎｄｉｎａ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）以外のメギ科植物としては、例えばナンブソウ属（Ａｃｈｌｙｓ）、メギ属（Ｂｅｒｂｅｒｉｓ）、ルイヨウボタン属（Ｃａｕｌｏｐｈｙｌｌｕｍ）、サンカヨウ属（Ｄｉｐｈｙｌｌｅｉ）、ディソスマ属（Ｄｙｓｏｓｍａ）、イカリソウ属（Ｅｐｉｍｅｄｉｕｍ）、タツタソウ属（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎｉａ）、イヌエンゴサク属（Ｌｅｏｎｔｉｃｅ）、ヒイラギナンテン属（Ｍａｈｏｎｉａ）、ナンテン属（Ｎａｎｄｉｎａ）、ミヤオソウ属（Ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｕｍ）、トガクシソウ属（Ｒａｎｚａｎｉａ）、モモイロミヤオソウ属（Ｓｉｎｏｐｏｄｏｐｈｙｌｌｕｍ）等に属する植物を挙げることができる。
【００１６】
また、本発明に係る（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子は、配列番号２に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性、好ましくは８０％以上の同一性、より好ましくは９０％以上の同一性、更に好ましくは９５％以上の同一性、最も好ましくは９７％以上の同一性を有するアミノ酸配列であって、（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。アミノ酸配列間の同一性の値は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを実装したＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸプログラムにより算出することができる（デフォルトの設定）。なお、同一性の値は、一対のアミノ酸配列をペアワイズ・アライメント分析した際に完全に一致するアミノ酸残基を算出し、比較した全アミノ酸残基中の割合として算出される。
【００１７】
また、本発明に係る（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子は、塩基配列情報を格納した公知のデータベースを利用して、配列番号１に示す塩基配列に対してカバー率が高く、Ｅ−ｖａｌｕｅが低く、ｉｄｅｎｔｉｔｙの値が高いといった条件を満たす遺伝子を同定することができる。ここで、同定する遺伝子の条件として、カバー率は９０％以上とすることができ、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上とする。また、同定する遺伝子の条件として、Ｅ−ｖａｌｕｅが１．０ｅ−５以下とすることができ、好ましくは１．０ｅ−１５以下、より好ましくは０．０とする。さらに、また、同定する遺伝子の条件として、ｉｄｅｎｔｉｔｙの値が７０％以上とすることができ、好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上とする。これらの条件を満たすものとして同定された遺伝子は、配列番号１の塩基配列からなる（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子の相同遺伝子である蓋然性が非常に高く、配列番号１の塩基配列からなる（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子と同様に（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子として同定できる。
【００１８】
ところで、本発明に係る（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子は、配列番号２に示すアミノ酸配列に対して、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ活性を有するタンパク質をコードするものでも良い。ここで、数個とは、例えば、２〜３０個、好ましくは２〜２５個、より好ましくは２〜２０個、更に好ましくは２〜１５個、更に好ましくは２〜１０個、更に好ましくは２〜５個、更に好ましくは２〜３個である。
【００１９】
ここで「（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ活性」とは、シアン化合物とケトン化合物またはアルデヒド化合物からシアノヒドリンを生成する反応を触媒する活性（以下、「合成活性」と呼ぶ）と、その逆反応を触媒する活性（以下、「分解活性」と呼ぶ）のいずれをも意味する。例えば、合成活性は、ベンズアルデヒドからの（Ｒ）−マンデロニトリルの生成量を測定することにより算出することができる。マンデロニトリルの生成量は、例えばＨＰＬＣで定量することができる。また、分解活性は、基質であるマンデロニトリルからのベンズアルデヒドの生成量を測定することにより算出することができる。ベンズアルデヒドの生成量は、例えば、クエン酸ナトリウム緩衝液に、ヒドロキシニトリルリアーゼとラセミ体マンデロニトリルを添加したときの波長２８０ｎｍにおける吸光値の増加を計測することで定量することができる。
【００２０】
ここで、「アミノ酸配列を有する」とは、そのタンパク質（酵素）が特定されたアミノ酸配列を含んでいればよく、且つ、その酵素の機能が維持されていることを意味する。そのタンパク質（酵素）において特定されたアミノ酸配列以外の配列としては、ヒスチジンタグや固定化のためのリンカー配列の他、ジスルフィド結合などの架橋構造などが挙げられる。また、特定のアミノ酸配列を有していれば、糖鎖を有していてもよいものとする。
【００２１】
さらに、本発明に係る（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子は、配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡの相補鎖の全部又は一部に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ上記（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ活性を有するタンパク質をコードするものでもよい。本発明において「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄時の条件であって塩濃度が３００ｍＭ以上、２０００ｍＭ以下、温度が４０℃以上、７５℃以下、好ましくは塩濃度が６００ｍＭ以上、９００ｍＭ以下、温度が６５℃の条件を意味する。例えば、２×ＳＳＣで５０℃等の条件を挙げることができる。当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度や温度などの条件に加えて、その他のプローブ濃度、プローブの長さ、反応時間等の諸条件を加味し、本発明の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする核酸を得るための条件を設定することができる。
【００２２】
ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）等を参照することができる。ハイブリダイズする核酸としては、例えば、配列番号１の塩基配列に対して少なくとも４０％以上、好ましくは６０％以上、さらに好ましくは９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む核酸またはその部分断片が挙げられる。
【００２３】
本発明において、（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子の調製を行う方法は特に制限されず、通常は、公知の方法で行うことができる。例えば、天然型（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子を基に、市販のキットを利用して部位特異的な置換を生じさせる方法や、遺伝子ＤＮＡを選択的に開裂し、次いで選択されたオリゴヌクレオチドを除去・付加し連結する方法等が挙げられる。
【００２４】
これらの部位特異的変異誘発法は「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）、Ｋｕｎｋｅｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，ｐｐ．４８８−９２（１９８５）、Ｋｒａｍｅｒ  ａｎｄ  Ｆｒｉｔｚ  Ｍｅｔｈｏｄ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４，ｐｐ．３５０−６７（１９８７）、Ｋｕｎｋｅｌ，Ｍｅｔｈｏｄ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，８５，ｐｐ．２７６３−６（１９８８）等に記載されている。近年では、Ｋｕｎｋｅｌ法やＧａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法を基にした部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）、ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社製）、ＴａＫａＲａ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｕｔａｎ−Ｋ、Ｍｕｔａｎ−Ｓｕｐｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ等：タカラバイオ（株）社製）等を用いて行うことができる。
【００２５】
また、目的とする変異導入箇所が、対象遺伝子配列において消化・連結が容易な制限酵素部位の近隣に存在する場合、目的変異を導入したプライマー（合成オリゴＤＮＡ）を用いてＰＣＲを行うことで、目的変異が導入された遺伝子ＤＮＡ断片を容易に得ることができる。さらには、合成オリゴＤＮＡを組み合わせたＰＣＲ法（ａｓｓｅｍｂｌｙ  ＰＣＲ）で伸長させて合成遺伝子として得ることもできる。
【００２６】
また、ヒドロキシルアミンや亜硝酸等の変異源となる薬剤を接触・作用させる方法、紫外線照射により変異を誘発する方法、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を用いてランダムに変異を導入する方法などのランダムな変異導入法によっても、天然型（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子から所望の変異型（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子を得ることができる。
【００２７】
以上のように、本発明に係る（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子については、配列番号１及び２に基づいて規定することができる。ここで、株式会社ゼネテッィクス社の遺伝情報処理ソフトウェアのＧｅｎｅｔｙｘ  Ｖｅｒ１２を用いて、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｖｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｈｏｍｏｌｏｇｙ」処理を配列番号２に示したアミノ酸配列と既知の複数のヒドロキシニトリルリアーゼのアミノ酸配列との比較をデフォルト条件で行った結果を表１に示す。
【００２８】
【表１】
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【００２９】
表１に示すように、本発明に係る（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼは、従来公知の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼと比較して同一性及び類似性がいずれも低い値しか示さない。この結果より、本発明に係る（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子は、従来公知の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子とは全く異なる新たな分類に属する遺伝子と結論付けることができる。
【００３０】
＜発現ベクター＞
上述した本発明に係る（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子は、宿主で発現させるために、上流に転写プロモーターを、下流にターミネーターを挿入して発現カセットとして構築することができる。そして、本発明に係る発現ベクターは、当該カセットを公知の発現ベクターに挿入することで作製することができる。或いは、本発明に係る（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子を導入する発現ベクターに転写プロモーターとターミネーターがすでに存在する場合には、発現カセットを構築することなく、ベクター中のプロモーターとターミネーターを利用してその間に当該遺伝子を挿入すればよい。ベクターに当該遺伝子を挿入するには、制限酵素を用いる方法、トポイソメラーゼを用いる方法等を利用する。また、挿入の際に必要であれば、適当なリンカーを付加してもよい。なお、本発明においては、このような組み込み操作を、（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子の調製操作と兼ねて行うこともできる。即ち、他のアミノ酸をコードする塩基配列に置換した塩基配列を有するプライマーを用い、天然型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子がクローニングされた組換えベクターを鋳型としてＰＣＲを行い、得られた増幅産物をベクターに組み込むことができる。
【００３１】
プロモーターの種類は宿主において適切な発現を可能にするものであれば特に限定されるものではないが、例えば、大腸菌由来のトリプトファンオペロンのｔｒｐプロモーター、コールドショックタンパク質のｃｓｐＡプロモーター、ラクトースオペロンのｌａｃプロモーター、ラムダファージ由来のＰＬプロモーターおよびＰＲプロモーターや、枯草菌由来のグルコン酸合成酵素プロモーター（ｇｎｔ）、アルカリプロテアーゼプロモーター（ａｐｒ）、中性プロテアーゼプロモーター（ｎｐｒ）、α−アミラーゼプロモーター（ａｍｙ）、ウイルス由来のＴ７プロモーター等が挙げられる。また、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーターのように改変、設計された配列も利用できる。
【００３２】
ターミネーターは必ずしも必要ではなく、その種類も特段限定されるものではなく、例えばρ因子非依存性のもの、例えばリポプロテインターミネーター、ｔｒｐオペロンターミネーター、ｒｒｎＢターミネーター等が挙げられる。
【００３３】
また、アミノ酸への翻訳にとって重要な塩基配列として、ＳＤ配列やＫｏｚａｋ配列などのリボソーム結合配列が知られており、これらの配列を変異遺伝子の上流に挿入することもできる。原核生物を宿主に用いるときにはＳＤ配列を、真核細胞を宿主に用いるときにはＫｏｚａｋ配列をＰＣＲ法などにより付加してもよい。ＳＤ配列としては、大腸菌由来または枯草菌由来の配列などが挙げられるが、大腸菌や枯草菌等の所望の宿主内で機能する配列であれば特に限定されるものではない。たとえば、１６ＳリボゾームＲＮＡの３’末端領域に相補的な配列が４塩基以上連続したコンセンサス配列をＤＮＡ合成により作製して利用してもよい。
【００３４】
一般に、ベクターには目的とする形質転換体を選別するための因子（選択マーカー）が含まれる。選択マーカーとしては、薬剤耐性遺伝子や栄養要求性相補遺伝子、資化性付与遺伝子などが挙げられ、目的や宿主に応じて選択されうる。例えば大腸菌で選択マーカーとして用いられる薬剤耐性遺伝子としては、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
【００３５】
本発明に係る発現ベクターは、上記遺伝子を保持するものであれば特に限定されず、それぞれの宿主に適したベクターを使用することができる。ベクターとしては、例えば、プラスミドＤＮＡ、バクテリオファージＤＮＡ、レトロトランスポゾンＤＮＡ、人工染色体ＤＮＡなどが挙げられる。例えば、大腸菌を宿主とする場合には、大腸菌中での自律複製可能な領域を有しているｐＴｒｃ９９Ａ（Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）、オランダ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｋｎａｗ．ｎｌ／）、ｐＵＣ１９、ｐＣｏｌｄＩ（タカラバイオ社、日本）、ｐＫＫ２３３−２（Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）、オランダ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｋｎａｗ．ｎｌ／）、ｐＥＴ−１２（Ｎｏｖａｇｅｎ社、ドイツ）、ｐＥＴ−２６ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社、ドイツ）などを用いることができる。また、必要に応じてこれらベクターを改変したものも用いることができる。また、発現効率の高い発現ベクター、例えばｔｒｃプロモーター、ｌａｃオペレーターを有する発現ベクターｐＴｒｃ９９ＡまたはｐＫＫ２３３−２などを用いることもできる。
【００３６】
＜形質転換体＞
本発明の発現ベクターを宿主に形質転換又は形質導入することで、本発明に係る形質転換体を作製することができる。使用する宿主は、上記発現ベクターが導入された後、目的の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼを発現することができる限り特に限定されるものではない。宿主としては、例えば大腸菌、枯草菌などの細菌；ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）などのピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）などの真菌；ＨＥＫ２９３細胞などの動物細胞；Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ（ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４）細胞などの昆虫細胞；植物細胞などが挙げられる。
【００３７】
＜（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼの製造方法＞
本発明に係る（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼは、上記形質転換体を培養し、得られる培養物から精製することにより製造することができる。
本発明において「培養物」とは、培養上清、培養細胞、培養菌体、または細胞もしくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。本発明の形質転換体を培養して得られる培養物は、本発明の範囲に含まれる。
本発明に係る形質転換体の培養は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。目的の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼは、上記培養物中に蓄積される。
【００３８】
本発明に係る形質転換体を培養する培地は、宿主が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類などを含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、ガラクトース、フラクトース、スクロース、ラフィノース、デンプン等の炭水化物；酢酸、プロピオン酸等の有機酸；エタノール、プロパノール等のアルコール類が挙げられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩またはその他の含窒素化合物が挙げられる。その他、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカー、各種アミノ酸等を用いてもよい。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。また、必要に応じ、培養中の発泡を防ぐために消泡剤を添加してもよい。また、ビタミン等を必要に応じて適宜添加してもよい。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００３９】
培養中、ベクターおよび目的遺伝子の脱落を防ぐために選択圧を掛けた状態で培養してもよい。即ち、選択マーカーが薬剤耐性遺伝子である場合に相当する薬剤を培地に添加してもよく、選択マーカーが栄養要求性相補遺伝子である場合に相当する栄養因子を培地から除いてもよい。また、選択マーカーが資化性付与遺伝子である場合は、相当する資化因子を必要に応じて唯一因子として添加することができる。例えば、アンピシリン耐性遺伝子を含むベクターで形質転換した大腸菌を培養する場合、培養中に、必要に応じてアンピシリンを培地に添加してもよい。
【００４０】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）で誘導可能なプロモーターを有する発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養するときには、ＩＰＴＧ等を培地に添加することができる。また、インドール酢酸（ＩＡＡ）で誘導可能なｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養するときには、ＬＡＡ等を培地に添加することができる。
【００４１】
形質転換体の培養条件は、目的の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼの生産性および宿主の生育が妨げられない条件であれば特段限定されるものではないが、通常、培養温度は１０℃以上、４５℃以下、好ましくは１０℃以上、４０℃以下、さらに好ましくは１２℃以上、４０℃以下、さらにより好ましくは１５℃以上、３７℃以下で行い、必要に応じて、培養中に温度を変更してもよい。培養時間は５時間以上、１２０時間以下程度とすることができ、好ましくは５時間以上、１００時間以下、さらに好ましくは１０時間以上、１００時間以下、さらにより好ましくは１５時間以上、８０時間以下程度行う。ｐＨの調整は、無機または有機酸、アルカリ溶液等を用いて行い、大腸菌であれば６以上、９以下に調整する。培養方法としては、固体培養、静置培養、振盪培養、通気攪拌培養などが挙げられる。
【００４２】
培養のための培地の初発ｐＨは７以上、９以下に調整するのが適当である。また、培養は、５℃以上、４０℃以下、好ましくは１０℃以上、３７℃以下で５時間以上、１００時間以下行う。通気攪拌深部培養、振盪培養、静置培養、流加培養等により実施するのが好ましい。
【００４３】
本発明に係る（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼは、上記培養物から精製されるが、その精製度合いは特に制限されない。例えば、上記培養物をホモジェナイズし、濾過や遠心分離などにより不溶物を除去した溶液をそのまま用いてもよいし、さらに、カラムクロマトグラフィなどにより精製して、粗酵素液や酵素液を得てもよい。
【００４４】
＜酵素反応＞
本発明に係る（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼは、シアニドドナー存在下でアルデヒドやケトンをシアノヒドリンに変換する合成反応を触媒し、また、その逆反応であるシアノヒドリンの分解反応を触媒する酵素である。
【００４５】
本発明に係る（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼにおける、ヒドロキシニトリルリアーゼ活性の測定方法として、例えば、シアン化カリウム存在下でベンズアルデヒドを基質とし、マンデロニトリルの生成量をＨＰＬＣにて測定する方法を挙げることができる。或いは、ラセミ体マンデロニトリルを基質とし、その分解を吸光度計にて吸収波長２８０ｎｍを測定することで検出する方法も挙げられる。溶媒としては、シアノヒドリンの安定性などから中性より酸性とするため、クエン酸ナトリウム緩衝液を用いることが好ましい。
【００４６】
また、本発明に係る（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼを用いた酵素反応において、マンデロニトリル合成反応の最適ｐＨは４．０であり、分解反応の最適ｐＨは６．０付近である。よって、上記合成反応はｐＨ４．０付近で行うことが望ましい。さらに、本発明に係る（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼはｐＨ４．０〜８．０付近で安定であり、ｐＨ６．０で５５℃、３０分間加熱しても８０％以上の活性が残存するといった特徴を有する。なお、本発明に係る（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼにおいて、マンデロニトリル合成反応の最適温度は１５℃付近であり、化学的な競争反応のラセミ化を抑えるために望ましい性質を有すると考えられる。
【実施例】
【００４７】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４８】
〔実施例１〕
本実施例では、ナンテン（Ｎａｎｄｉｎａ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）由来の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼの精製について説明する。
【００４９】
先ず、ナンテンの若葉５００ｇを１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に添加してミキサーで破砕した後、遠心分離した上清液を無細胞抽出物とした。次に、無細胞抽出物を上記と同じ緩衝液中で透析し、硫安分画を実施した（３５−６０％飽和画分を集めた）。続いてＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ、Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ及びＧｉｇａＣａｐＱ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌの各カラムクロマトグラフィで精製した。酵素活性は、ベンズアルデヒドとシアン化カリウムを基質として、生成する（Ｒ）−マンデロニトリル量を液体クロマトグラフィーで測定し、１分間に１μｍｏｌの（Ｒ）−マンデロニトリルの生成を触媒する酵素量を１Ｕと定義した。
【００５０】
詳細には、ベンズアルデヒド（ＤＭＳＯ溶液、１．２５Ｍ）を２０μＬ（終濃度５０ｍＭ）、１．０Ｍのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）を１５０μＬ（終濃度３００ｍＭ）、脱イオン水２３０μＬ、酵素液５０μＬを混和し、３０℃で３分間加温した後、１．０Ｍのシアン化カリウム水溶液５０μＬ（終濃度１００ｍＭ）を加えて反応を開始した（全量５００μＬ）。反応開始５分後に反応液１００μＬを分取して、５．０ｍＭのｐ−キシリルシアニドを含むヘキサン：２−プロパノール（８５：１５）９００μＬと混合し、遠心分離した（１６，１００×ｇ、４℃、５分）。得られた上清６００μＬを下記条件でＨＰＬＣ分析した。
・カラム：キラルＯＪ−Ｈカラム（Ｄａｉｃｅｌ社製）
・溶離液：ｎ−ヘキサン：２−プロパノール＝８５：１５
・流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
・カラムオーブン温度：３０℃
・検出：２５４ｎｍ
・保持時間：ベンズアルデヒド−５分、（Ｒ）−マンデロニトリル−９．８分、（Ｓ）−マンデロニトリル−１２．３分
【００５１】
精製工程毎に酵素活性を測定した結果を表２に示した。表２に示したように当該酵素は、他の植物由来のヒドロキシニトリルリアーゼに比べ、非常に高い比活性を有する酵素であることがわかった。
【００５２】
【表２】
2018139569.tif 000003
【００５３】
〔実施例２〕
本実施例では、ナンテン（Ｎａｎｄｉｎａ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）由来の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子のｃＤＮＡのクローニング、組換え（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼの発現試験および精製について説明する。なお、本実施例で使用したプライマーの塩基配列を下記表３に纏めた。
【００５４】
〔ＲＮＡ抽出〕
ナンテンの葉０．０６ｇを液体窒素で凍結し、マルチビーズショッカーでパウダー状になるまで破砕した。破砕した葉にＰｕｒｅ  Ｐｌａｎｔ  ＲＮＡ  Ｒｅａｇｅｎｔ  （Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を５００μＬ加えて、軽くボルテックスした。室温（２５℃）で５分間インキュベートした後、遠心分離（１２，０００×ｇ、２分、２５℃）して、上清をエッペンチューブに移した。この上清液に５Ｍの塩化ナトリウム水溶液を１００μＬ加え、タッピングした後、さらにクロロホルム３００μＬを加えて転倒混和した。遠心分離（１２，０００×ｇ、１０分、４℃）して分離した水層をエッペンチューブに移した。水層に等量の２−プロパノールを加えて混和し、室温で１０分間インキュベートした後、遠心分離（１２，０００×ｇ、１０分、４℃）して、得られた沈殿画分に７５％エタノールを加えて混和した。遠心分離（１２，０００×ｇ、１分、２５℃）した後、上清を静かに除き、再度同じ条件で遠心分離した。沈殿画分に２０μＬのＤｉｅｔｈｙｌｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ（ＤＥＰＣ）処理水２０μＬを加えて懸濁し、遠心分離した後、ＲＮＡを含む上清をエッペンチューブに移した。
【００５５】
〔ｃＤＮＡ合成〕
ｃＤＮＡの合成には、ＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用した。上記の方法で抽出したＲＮＡサンプル１μＬ、ＧＲ  ｏｌｉｇｏｄＴを１μＬ、ＳＭＡＴＩＩＡ  ｏｌｉｇｏを１μＬ混合した。最終液量が５μＬになるよう滅菌水を加えて混合し、スピンダウンした。サーマルサイクラーで７０℃、２分間インキュベートし、氷上で２分間冷却した後、静かにスピンダウンし、５×Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｂｕｆｆｅｒを２μＬ、ＤＴＴ（２０ｍＭ）を１μＬ、ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ（１０ｍＭ）を１μＬ、ＭＭＬＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅを１μＬ加え、混和した。スピンダウンした後、サーマルサイクラーで４２℃で１時間３０分加熱し、トリシン−ＥＤＴＡ緩衝液を１００μＬ添加して７２℃で７分間加熱した。
【００５６】
〔ｃＤＮＡの配列決定〕
定法に従って決定したＮ末端配列（ＥＳＴＶＫＶＴＰＭＩ）と内部配列（ＴＡＥＥＬＬＤＬＬＬＳ）の結果を基に、次世代シーケンス結果にＢｌａｓｔ検索を行い、得られた配列から５’−、３’−Ｒａｃｅ用プライマーを作成した。プライマー１とプライマー２を用いて、Ｇｆｌｅｘポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）で遺伝子増幅を行い、そのＰＣＲ産物を鋳型として、プライマー３とプライマー４を用いて、同様に遺伝子増幅を行った。また、プライマー５とプライマー６で遺伝子増幅を行った後、プライマー７とプライマー８で遺伝子増幅を行った。得られたＰＣＲ産物をゲル抽出キットＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐ（ＭａｃｈｅｒｅｙＮａｇｅｌ）で精製後、ダイレクトシーケンスを行い、ｃＤＮＡの配列決定を行った。本実施例で決定したｃＤＮＡの塩基配列及びコードされるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１及び２に示した。
【００５７】
〔発現系の構築〕
Ｎ末端にＨｉｓ−ｔａｇを付加した発現系を構築するために、プライマー９とプライマー１０を用いて、上述のプライマー７とプライマー８で遺伝子増幅を行って得られたＰＣＲ産物の精製物を鋳型として、Ｇｆｌｅｘポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）で核酸増幅を行った。また、ｐＣｏｌｄＩベクター（ＴａＫａＲａ）を鋳型として、プライマー１１とプライマー１２で核酸増幅した。得られた核酸断片をゲル抽出した後、Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎを用いてライゲーションを行った。
【００５８】
また、Ｎ末端にＨｉｓ−ｔａｇを付加しない発現系を構築するために、プライマー１３とプライマー１４を用いて、上述のプライマー７とプライマー８で遺伝子増幅を行って得られたＰＣＲ産物の精製物を鋳型として、Ｇｆｌｅｘポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）で核酸増幅を行った。また、ｐＣｏｌｄＩベクター（ＴａＫａＲａ）を鋳型として、プライマー１５とプライマー１６で核酸増幅した。得られた核酸断片をゲル抽出した後、Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎを用いてライゲーションを行った。
【００５９】
さらに、Ｃ末端にＨｉｓ−ｔａｇを付加するために、Ｎ末端にＨｉｓ−ｔａｇを付加しない発現用プラスミドを鋳型として、プライマー１７とプライマー１８で核酸増幅を行った。増幅断片から鋳型プラスミド由来の領域を排除するためにＤｐｎＩ処理を行った。制限酵素処理後、ゲル抽出し、上記と同様にＩｎ−ｆｕｓｉｏｎを用いてライゲーションを行った。
【００６０】
〔形質転換〕
得られたライゲーション産物に氷上で融解したコンピテントセルＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）を５０μＬ加え、氷上で３０分間放置した。４２℃で３０秒間ヒートショックした後、氷上で２分間冷却した。ＬＢ培地（酵母エキス１％、ポリペプトン２％及びＮａＣｌ２％）で１時間回復培養し、ＬＢアンピシリン培地（アンピシリン濃度：１００μｇ／ｍＬ）に撒いて３７℃で一晩培養し、形質転換体を得た。
【００６１】
【表３】
2018139569.tif 000004
【００６２】
〔組換え（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼの発現試験〕
得られた形質転換体をｐＣｏｌｄ  ＤＮＡシリーズ（タカラバイオ製）のプロトコールに従って、発現試験に供した。まず、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地に植菌し、３７℃で振とう培養した。続いて培養液のＯＤ６００が０．５となった時点で培養液をすみやかに１６℃に冷却し、３０分間放置した。終濃度が１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、１６℃で２４時間振とう培養した。培養終了後、菌体を遠心分離で回収し、菌体湿重量の５倍量の１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を添加し、マルチビーズショッカーで菌体を破砕した。遠心分離し、得られた上清を無細胞抽出液とし、活性測定を実施した。
【００６３】
結果を図１に示した。図１に示したように、当該発現タンパク質は、（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ活性を有することがわかったので、実施例２で決定したアミノ酸配列は、（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ活性を有するアミノ酸配列であることを確認できた。また、当該発現タンパク質は、Ｈｉｓ−ｔａｇ無しのもので一番発現量が多く、次いでＣ末端側にＨｉｓ−ｔａｇを付加したものが多かった。また、通常（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼは大腸菌での発現が難しく、培養に手間がかかるピキア酵母での発現が一般的であるが、当該発現タンパク質は培養の容易な大腸菌での発現に成功した。
【００６４】
〔組換え（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼの精製〕
Ｃ末端側にＨｉｓ−ｔａｇを付加した形質転換体の発現試験で得られた上述の菌体を用いて組換え（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼの精製を行った。精製はＨｉｓ  ＧｒａｖｉＴｒａｐ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて以下の通り実施した。まず菌体湿重量の５倍量のｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，２５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ，ｐＨ７．０）で懸濁した。続いて、菌体破砕用チューブに  ０．１ｍｍのビーズと菌体懸濁液を同量入れ、マルチビーズショッカーを用いて菌体破砕し、遠心分離で得られた上清を無細胞抽出液とした。上記のｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒで平衡化したＨｉｓ  ＧｒａｖｉＴｒａｐカラムに、上記無細胞抽出液を供し、Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，２５０ｍＭ  ＮａＣｌ，２０ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ，ｐＨ７．０）でカラムを洗浄し、Ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，２５０ｍＭ  ＮａＣｌ，２５０ｍＭｉｍｉｄａｚｏｌｅ，ｐＨ７．０）で酵素を溶出した。最後に１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で透析して精製酵素液を得た。
その結果、無細胞抽出液で比活性が５１．３Ｕ／ｍｇであったものから、比活性７３３Ｕ／ｍｇにまで精製できた酵素を得た。
【００６５】
〔実施例３〕
本実施例では、実施例１で精製した天然型（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼを用いて酵素特性を評価した。
【００６６】
〔基質特異性〕
天然型（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ（以下、Ｒ−ＮｄＨＮＬ）の基質特性を、シアノヒドリン合成反応により調べた。３００ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）、酵素試料、５０ｍＭのカルボニル化合物および１００ｍＭのＫＣＮを混合し（総量：０．５ｍＬ）、３０℃で５分間反応させた。結果は、検出波長を２５４ｎｍとするＯＪ−Ｈキラルカラムを用いたＨＰＬＣでモニターし、反応生成物を検出することにより活性の有無を決定した。
【００６７】
但し、ベンズアルデヒドなどの被検化合物は、５０ｍＭのＤＭＳＯ溶液として反応させた。被検化合物が水に溶解しない場合には、３０℃で撹拌した。反応後、反応液１００μＬにヘキサン：イソプロパノール（８５：１５）混液９００μＬを加え、激しく撹拌し、１６０００×ｇで５分間遠心分離した。そして上清６００μＬを用いてＨＰＬＣ法で分析した。ＨＰＬＣ分析にはＣｈｉｒａｌｃｅｌ  ＯＪ−Ｈカラムとヘキサン：イソプロパノール（８５：１５）を用いた。基質特異性について検討した結果を表４に示した。
【００６８】
【表４】
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【００６９】
〔立体選択性〕
基質特異性の検討と同じ方法を用いて６．７４Ｕの酵素を添加して、３０℃で５分間反応し、酵素の立体選択性を調べた。そして、（Ｒ）−シアノヒドリン量と（Ｓ）−シアノヒドリン量から鏡像体過剰率を算出し、その結果を表５に示した。その結果、本酵素は、（Ｒ）−シアノヒドリンを優先的に合成することが明らかになった。
【００７０】
【表５】
2018139569.tif 000006
【００７１】
〔Ｒ−ＮｄＨＮＬの動力学的分析〕
基質としてベンズアルデヒドを用い、上記と同様の条件で酵素反応を行った。ただし、反応条件をｐＨ４．０で且つ３０℃とした。基質として様々な濃度のベンズアルデヒドを使い、酵素活性測定はそれぞれ３回行い、その平均値を算出して基質飽和曲線を作成し、Ｖｍａｘ、Ｋｍの値を求めるためＨａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットした。
結果を図２に示した。Ｈａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットで得られた近似式よりＶｍａｘは１２３０Ｕ／ｍｇ、Ｋｍは１２．５ｍＭと算出された。
【００７２】
〔Ｒ−ＮｄＨＮＬ温度およびｐＨ特性〕
上記実施例１で得た天然型Ｒ−ＮｄＨＮＬについて、リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を用いて、１５〜８０℃の温度範囲で３０分間加温した後、実施例１と同様の酵素反応条件で活性を測定することにより温度に対する安定性を試験した。続いて実施例１記載の活性測定法において反応温度を５〜５０℃の温度範囲に設定することで至適温度を評価した。また、反応温度を３０℃に設定し、クエン酸緩衝液とリン酸緩衝液を用いてｐＨを３〜６．５に変更して同様に反応を行い、至適ｐＨを評価した。酵素活性は、実施例１に記載した方法に従って測定した。
各種反応温度において酵素活性を測定した結果をもとに温度安定性を評価した結果を図３及び表６に示した。
【００７３】
【表６】
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【００７４】
既知の植物由来ＨＮＬの中で最も安定なのは、アーモンド由来のＨＮＬであり、６０℃で１時間保持しても安定であると記載されている（Ｗｏｋｅｒ，Ｒら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２２８，ｐｐ．５８４−５９０（１９９４）；Ｊａｎｓｅｎ，Ｉ．ら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１５，ｐｐ．９０−９９（１９９２）；Ｍｏｈａｍｍａｄ  Ｄａｄａｓｈｉｐｏｕｒ  ａｎｄ  Ｙａｓｕｈｉｓａ  Ａｓａｎｏ，ＡＣＳ  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ，１、１１２１−１１４９（２０１１））。しかし、最も安定なアーモンド由来のＨＮＬでも、７５℃では３０分間で完全に失活する。それに対して本発明に係るＲ−ＮｄＨＮＬの活性は、図３及び表６に示すように、７５℃で３０分間保持しても２０％の活性が維持されている。このように本発明に係るＲ−ＮｄＨＮＬは、既知の植物由来ＨＮＬに比べて安定性が高いといえる。
各種反応温度において酵素活性を測定した結果をもとに至適温度を評価した結果を図４及び表７に示した。
【００７５】
【表７】
2018139569.tif 000008
【００７６】
図４及び表７に示すように、Ｒ−ＮｄＨＮＬは、５〜５０℃の温度範囲で活性を示し、１５℃が至適温度であり、３０℃以下で高い活性を示すことが明らかとなった。低温で活性が高いという性質は、化学的な競争反応のラセミ化を抑えられる低温で光学活性シアノヒドリン合成反応が可能となるので有利な特性である。また、表２に示した比活性は３０℃で測定した結果であるので、至適温度ではさらに高い比活性を示すことも予想できる。
また、各種ｐＨにおいて酵素活性を測定した結果をもとに至適ｐＨを評価した結果を図５及び表８に示した。
【００７７】
【表８】
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【００７８】
図５及び表８に示すように、Ｒ−ＮｄＨＮＬはｐＨ４．０で最大活性を示し、ｐＨ３．５でも最大活性値の約７２％の活性を示す。この至適ｐＨは、他の植物由来ＨＮＬ（多くは至適ｐＨが４．５−６．５である）より大幅に低い。低ｐＨで活性が高いという性質は、化学的な競争反応のラセミ化を抑えられる低ｐＨで光学活性シアノヒドリン合成反応が可能となるので有利な特性である。
【００７９】
〔Ｒ−ＮｄＨＮＬの活性阻害剤の検討〕
Ｒ−ＮｄＨＮＬについて、活性阻害剤の検討を実施した。上記と同様の酵素反応条件において、実施例１で得た天然由来Ｒ−ＮｄＨＮＬを用い、１ｍＭの濃度の被検化合物を反応液に加え、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中、３０℃で１０分間加温した後、実施例１に記載した方法に従って活性を測定した。残存活性を３回測定した。その平均値を図６及び表９に示した。
【００８０】
【表９】
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【００８１】
図６及び表９に示すように、銅イオンで６０％程度の阻害を示した以外では、活性低下は起きなかった。よって、Ｒ−ＮｄＨＮＬは従来酵素に対する様々な活性阻害剤の存在下でも安定した活性を示すことが明らかとなり、産業利用に有利な性質を有する酵素であると考えられた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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