(57)【要約】【課題】複数種類の遺伝子のタイプ判定を短時間で実現する遺伝子検査方法を提供する。【解決手段】複数種類の蛍光色素を含む検出試薬と複数種類の標的遺伝子を含む生体試料とを混合し、複数種類の標的遺伝子のそれぞれに複数種類の蛍光色素のうち互いに異なる蛍光色素を修飾して得られた検体を、所定の温度範囲で周期的変化を繰り返して加熱する加熱ステップと、検体を一定の昇温速度で加熱しながら検体に波長の異なる複数の励起光を照射し、検体の蛍光変化を検出する蛍光検出ステップと、蛍光検出ステップにおいて得られる蛍光強度の変化に基づき複数種類の標的遺伝子のタイプ判定を行う判定ステップと、を含み、加熱ステップは、第１の周期で周期的変化を第１の回数繰り返して検体を加熱する第１加熱ステップ（Ｓ１０１）と、第１の周期と異なる、第２の周期で周期的変化を第２の回数繰り返して検体を加熱する第２加熱ステップ（Ｓ１０２）と、を含む。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数種類の蛍光色素を含む検出試薬と複数種類の標的遺伝子を含む生体試料とを混合し、前記複数種類の標的遺伝子のそれぞれに前記複数種類の蛍光色素のうち互いに異なる蛍光色素を修飾して得られた検体を、所定の温度範囲で周期的変化を繰り返して加熱する加熱ステップと、
前記検体を一定の昇温速度で加熱しながら前記検体に波長の異なる複数の励起光を照射し、前記検体の蛍光変化を検出する蛍光検出ステップと、
前記蛍光検出ステップにおいて得られる蛍光強度の変化に基づき前記複数種類の標的遺伝子のタイプ判定を行う判定ステップと、を含み、
前記加熱ステップは、
第１の周期で前記周期的変化を第１の回数繰り返して前記検体を加熱する第１加熱ステップと、
前記第１の周期と異なる、第２の周期で前記周期的変化を第２の回数繰り返して前記検体を加熱する第２加熱ステップと、を含む、
遺伝子検査方法。
【請求項２】
前記第２の周期は、前記第１の周期よりも短い、
請求項１に記載の遺伝子検査方法。
【請求項３】
前記加熱ステップは、さらに、前記第２の周期より短い、第３の周期で前記周期的変化を第３の回数繰り返して前記検体を加熱する第３加熱ステップを含む、
請求項１又は２に記載の遺伝子検査方法。
【請求項４】
前記第１加熱ステップは、さらに、第１の温度範囲を有し、
前記第２加熱ステップは、さらに、前記第１の温度範囲と異なる第２の温度範囲を有する、
請求項１〜３のいずれか１項に記載の遺伝子検査方法。
【請求項５】
さらに、前記第１の周期で前記周期的変化を前記第１の回数繰り返して前記検体を加熱する間に、前記複数種類の標的遺伝子の蛍光強度の変化を測定し、前記蛍光強度の変化に基づいて前記第１の回数及び前記第２以降の回数の少なくとも一つを決定する、又は、前記第２の周期で前記周期的変化を前記第２の回数繰り返して前記検体を加熱する間に、前記複数種類の標的遺伝子の蛍光強度の変化を測定し、前記蛍光強度の変化に基づいて前記第２の回数及び第２以降の回数の少なくとも一つを決定する、加熱サイクル決定ステップを含む、
請求項１〜４のいずれか１項に記載の遺伝子検査方法。
【請求項６】
前記検体は、前記第１の周期及び前記第１の回数、並びに、前記第２の周期及び前記第２の回数を示す識別子を保持する媒体を備えるチップに保持され、
前記第１加熱ステップでは、前記識別子に対応する前記第１の周期で前記周期的変化を前記第１の回数繰り返して前記検体を加熱し、
前記第２加熱ステップでは、前記識別子に対応する前記第２の周期で前記周期的変化を前記第２の回数繰り返して前記検体を加熱する、
請求項１〜５のいずれか１項に記載の遺伝子検査方法。
【請求項７】
所定の温度範囲で周期的変化を繰り返して検体を加熱し、前記検体に含まれる複数種類の標的遺伝子を増幅させるための、前記検体を保持する検体保持部と、
前記複数種類の標的遺伝子を増幅させるための、前記検体の加熱の周期及び加熱の回数に対応付けられる識別子を保持する媒体と、を備える、
遺伝子検査チップ。
【請求項８】
複数種類の蛍光色素を含む検出試薬と生体試料とを混合し、前記複数種類の標的遺伝子のそれぞれに前記複数種類の蛍光色素のうち互いに異なる蛍光色素を修飾して得られた検体を、所定の温度範囲で周期的変化を繰り返して加熱する加熱部と、
前記検体を一定の昇温速度で加熱しながら前記検体に波長の異なる複数の励起光を照射し、前記検体の蛍光変化を検出する蛍光検出部と、
前記蛍光検出部において得られる蛍光強度の変化に基づき前記複数種類の標的遺伝子のタイプ判定を行う判定部と、を備え、
前記加熱部は、
第１の周期で前記周期的変化を第１の回数繰り返して前記検体を加熱した後、
前記第１の周期と異なる、第２の周期で前記周期的変化を第２の回数繰り返して前記検体を加熱する、
遺伝子検査システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、遺伝子検査方法、遺伝子検査チップ、及び遺伝子検査システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子多型とは、遺伝子を構成しているＤＮＡの塩基配列の個体差であり、一般には集団の１％以上の頻度で出現するものと定義されている。遺伝子多型としては、ＤＮＡ塩基配列の一塩基のみが変異する一塩基多型（ＳＮＰ：ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）の他、２から４塩基程度の一単位の繰り返し数の差であるマイクロサテライト多型（ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）、塩基の欠損、挿入がある。遺伝子多型には、病気の罹り易さや薬物代謝等に影響を及ぼすものがあることが知られており、病気罹患率の診断や投与薬物の効果、副作用の予測等のためにＳＮＰ部位の塩基の判定が行われている。
【０００３】
特許文献１は、波長の異なる蛍光色素で修飾した３つのプローブを用いて３種類の遺伝子タイプを判定する技術を開示している。また、非特許文献１は、ＰＣＲサイクル中のアニール温度を、回数ごとに段階的に下げることで、増幅性能を改善する、タッチダウンＰＣＲ法を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第５２７９４９２号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｔｏｕｃｈｄｏｗｎ’ＰＣＲ  ｔｏ  ｃｉｒｃｕｍｖｅｎｔ  ｓｐｕｒｉｏｕｓ  ｐｒｉｍｉｎｇ  ｄｕｒｉｎｇ  ｇｅｎｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；  Ｒ．Ｈ．Ｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｖｏｌ．１９，  Ｎｏ．１４（１９９１）４００８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、特許文献１に開示される従来技術では、複数種類の遺伝子のタイプ判定を短時間で行うためにＰＣＲの周期を短くすると、遺伝子間で増幅特性の差が徐々に顕著となり、誤判定を生じるという問題がある。また、非特許文献１に開示される従来技術では、単独のＳＮＰに対する遺伝子タイプの判定は可能であるが、複数のＳＮＰに対する遺伝子タイプの判定が難しいという問題がある。
【０００７】
そこで、本開示は、複数種類の遺伝子のタイプ判定を短時間で実現する遺伝子検査方法、遺伝子検査チップ、及び遺伝子検査システムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するために、本開示の一形態に係る遺伝子検査方法は、複数種類の蛍光色素を含む検出試薬と複数種類の標的遺伝子を含む生体試料とを混合し、複数種類の標的遺伝子のそれぞれに複数種類の蛍光色素のうち互いに異なる蛍光色素を修飾して得られた検体を、所定の温度範囲で周期的変化を繰り返して加熱する加熱ステップと、検体を一定の昇温速度で加熱しながら検体に波長の異なる複数の励起光を照射し、検体の蛍光変化を検出する蛍光検出ステップと、蛍光検出ステップにおいて得られる蛍光強度の変化に基づき複数種類の標的遺伝子のタイプ判定を行う判定ステップと、を含み、加熱ステップは、第１の周期で周期的変化を第１の回数繰り返して検体を加熱する第１加熱ステップと、第１の周期と異なる、第２の周期で周期的変化を第２の回数繰り返して検体を加熱する第２加熱ステップと、を含む。
【０００９】
また、上記目的を達成するために、本開示の一形態に係る遺伝子検査チップは、所定の温度範囲で周期的変化を繰り返して検体を加熱し、検体に含まれる複数種類の標的遺伝子を増幅させるための、検体を保持する検体保持部と、複数種類の標的遺伝子を増幅させるための、検体の加熱の周期及び加熱の回数に対応付けられる識別子を保持する媒体と、を備える。
【００１０】
さらに、上記目的を達成するために、本開示の一形態に係る遺伝子検査システムは、複数種類の蛍光色素を含む検出試薬と生体試料とを混合し、複数種類の標的遺伝子のそれぞれに複数種類の蛍光色素のうち互いに異なる蛍光色素を修飾して得られた検体を、所定の温度範囲で周期的変化を繰り返して加熱する加熱部と、検体を一定の昇温速度で加熱しながら検体に波長の異なる複数の励起光を照射し、検体の蛍光変化を検出する蛍光検出部と、蛍光検出部において得られる蛍光強度の変化に基づき複数種類の標的遺伝子のタイプ判定を行う判定部と、を備え、蛍光検出部は、加熱部により第１の周期で周期的変化を第１の回数繰り返して検体を加熱した後、蛍光検出部により複数種類の標的遺伝子のうち少なくとも一部の標的遺伝子である第１標的遺伝子の蛍光強度の変化を検出する第１蛍光検出部と、第１蛍光検出部による検出後に、加熱部により第１の周期と異なる、第２の周期で周期的変化を第２の回数繰り返して検体を加熱した後、蛍光検出部により検体に含まれる複数種類の標的遺伝子のうち少なくとも一部の標的遺伝子である第２標的遺伝子の蛍光強度の変化を検出する第２蛍光検出部と、を備える。
【発明の効果】
【００１１】
本開示によれば、複数種類の遺伝子のタイプ判定を短時間で実現する遺伝子検査方法、遺伝子検査チップ、及び遺伝子検査システムを提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】第１実施形態における第１態様に係る遺伝子検査方法を示すフローチャート
【図１Ｂ】第１実施形態における第１態様に係る遺伝子検査方法のタイミングチャートる複数種類の標的遺伝子の１つ（ＳＮＰ３）の蛍光変化を示すグラフ
【図２Ａ】第１実施形態における第２態様に係る遺伝子検査方法を示すフローチャート
【図２Ｂ】第１実施形態における第２態様に係る遺伝子検査方法のタイミングチャート
【図３】第２実施形態に係る遺伝子検査方法を示すフローチャート
【図４Ａ】第２実施形態に係る遺伝子検査方法における複数種類の標的遺伝子の１つ（ＳＮＰ１）の蛍光強度の変化点を検出するためのグラフ
【図４Ｂ】第２実施形態に係る遺伝子検査方法における複数種類の標的遺伝子の１つ（ＳＮＰ２）の蛍光強度の変化点を検出するためのグラフ
【図４Ｃ】第２実施形態に係る遺伝子検査方法における複数種類の標的遺伝子の１つ（ＳＮＰ３）の蛍光強度の変化点を検出するためのグラフ
【図５Ａ】第１実施形態における第１態様に係る第１加熱ステップ（ＰＣＲ１）における複数種類の標的遺伝子の１つ（ＳＮＰ３）の蛍光変化を示すグラフ
【図５Ｂ】第１実施形態における第１態様に係る第２加熱ステップ（ＰＣＲ２）における複数種類の標的遺伝子の１つ（ＳＮＰ３）の蛍光変化を示すグラフ
【図６】第３実施形態に係る遺伝子検査チップの一例を示す斜視図
【図７】第３実施形態に係る遺伝子検査チップを用いた遺伝子検査方法の一例を示すフローチャート
【図８】第４実施形態に係る遺伝子検査システムを示すブロック図
【図９Ａ】他の実施形態に係る遺伝子検査方法のタイミングチャートの一例
【図９Ｂ】他の実施形態に係る遺伝子検査方法のタイミングチャートの他の例
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本開示の実施の形態について、図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施の形態は、いずれも本開示の好ましい一具体例を示すものである。したがって、以下の実施の形態で示される、数値、形状、材料、構成要素、構成要素の配置位置及び接続形態、並びに、ステップ及びステップの順序などは、一例であって本開示を限定する趣旨ではない。よって、以下の実施の形態における構成要素のうち、本開示の最上位概念を示す独立請求項に記載されていない構成要素については、任意の構成要素として説明される。
【００１４】
なお、各図は、模式図であり、必ずしも厳密に図示されたものではない。また、各図において、実質的に同一の構成に対しては同一の符号を付しており、重複する説明は省略又は簡略化する。
【００１５】
（実施の形態）
［Ａ．遺伝子検査方法］
以下、本開示に係る遺伝子検査方法について、図１Ａ〜図５Ｃを用いて説明する。
【００１６】
本開示に係る遺伝子検査方法は、複数種類の蛍光色素を含む検出試薬と複数種類の標的遺伝子を含む生体試料とを混合し、複数種類の標的遺伝子のそれぞれに複数種類の蛍光色素のうち互いに異なる蛍光色素を修飾して得られた検体を、所定の温度範囲での周期的変化を繰り返して加熱する加熱ステップ（いわゆる、ＰＣＲ：Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）と、検体を一定の昇温速度で加熱しながらこの検体に波長の異なる複数の励起光を照射し、検体の蛍光変化を検出する蛍光検出ステップと、を含む。
【００１７】
加熱ステップ（ＰＣＲ）においては、予め、複数種類の標的遺伝子のそれぞれに異なる蛍光色素を修飾して調製した検体を、目的のＳＮＰ部位を含む、複数種類の標的遺伝子を増幅させ、それらの遺伝子のＰＣＲ増幅産物を得る。
【００１８】
その後の蛍光検出ステップにおいては、加熱ステップ後の検体を一定の昇温速度で加熱しながら蛍光色素で標識されたプローブが標的遺伝子のＰＣＲ増幅産物から離れる解離温度の違いにより遺伝子型を判定する。
【００１９】
ここで、本開示の遺伝子検査方法は、複数種類の標的遺伝子の分析条件が予め決められた遺伝子検査方法（第１実施形態）と、複数種類の標的遺伝子の蛍光強度を測定しながら分析条件（具体的には、ＰＣＲでの加熱の温度範囲、ＰＣＲでの加熱サイクルの数、ＰＣＲの実施回数等）を決定する遺伝子検査方法（第２実施形態）とに分類することができる。
【００２０】
以下、第１実施形態及び第２実施形態に係る遺伝子検査方法について詳細に説明する。
【００２１】
［Ａ−１．第１実施形態］
本実施形態に係る遺伝子検査方法は、上述のとおり、複数種類の標的遺伝子の分析条件が予め決められた遺伝子検査方法である。
【００２２】
本実施形態では、上記の加熱ステップが、第１の周期での周期的変化を第１の回数繰り返して検体を加熱する第１加熱ステップと、第１の周期と異なる第２の周期での周期的変化を第２の回数繰り返して検体を加熱する第２加熱ステップとを含む。
【００２３】
また、本実施形態では、第２の周期は、第１の周期よりも短くてもよい。
【００２４】
また、本実施形態では、加熱ステップは、さらに、第２の周期より短い第３の周期で周期的変化を第３の回数繰り返して検体を加熱する第３加熱ステップを含んでもよい。
【００２５】
以下、本実施形態に係る遺伝子検査方法を２つの態様に分けて、例を用いて説明する。これらの態様は、加熱ステップ（ＰＣＲ）における所定の温度範囲での周期的変化を繰り返して加熱をする回数（加熱サイクル数）、加熱の周期、加熱ステップ（ＰＣＲ）の実施回数、蛍光検出ステップで蛍光変化検出の対象とする標的遺伝子、及び遺伝子型判定のタイミングに基づいて分けられている。なお、以下の例では、ＳＮＰ１、ＳＮＰ２、及びＳＮＰ３の３種類の標的遺伝子が検出対象である。また、各態様に係る遺伝子検査方法は、上記の各ステップを実施可能であり、ＳＮＰ１、ＳＮＰ２、及びＳＮＰ３をそれぞれ検出するための第１、第２、及び第３蛍光検出回路を備えるよう構成された遺伝子検査システムを用いて実施される。このシステムの詳細は第４実施形態として後述する。
【００２６】
［Ａ−１−１．第１態様］
第１態様に係る遺伝子検査方法について、図１Ａ及び図１Ｂを用いて説明する。図１Ａは、第１態様に係る遺伝子検査方法の一例を示すフローチャートであり、図１Ｂは、第１態様に係る遺伝子検査方法の一例のタイミングチャートである。図２Ａは、第１実施形態における第１態様に係る第１加熱ステップ（ＰＣＲ１）における複数種類の標的遺伝子の１つ（ＳＮＰ３）の蛍光変化を示すグラフである。図２Ｂは、第１実施形態における第１態様に係る第２加熱ステップ（ＰＣＲ２）における複数種類の標的遺伝子の１つ（ＳＮＰ３）の蛍光変化を示すグラフである。
【００２７】
図１Ａに示すように、第１態様では、まず、検体を注入した遺伝子検査チップを遺伝子検査システムにセットする（Ｓ１００）。
【００２８】
次に、標的遺伝子を増幅させるために、１回目の加熱ステップである第１加熱ステップ（ＰＣＲ１）を実施し（Ｓ１０１）、続いて２回目の加熱ステップである第２加熱ステップ（ＰＣＲ２）を実施する（Ｓ１０２）。
【００２９】
次に、蛍光検出ステップにおいて標的遺伝子（ＳＮＰ１、ＳＮＰ２、及びＳＮＰ３）の蛍光強度を測定する（Ｓ１０３）。なお、蛍光検出ステップＳ１０３では、遺伝子検査システムが備える上記の蛍光検出回路が用いられる。各蛍光検出回路については後述する。
【００３０】
次に、蛍光強度のグラフからＴｍ値（Ｔｍ１、Ｔｍ２、及びＴｍ３）を算出する（Ｓ１０４）。
【００３１】
最後に、標的遺伝子（ＳＮＰ１、ＳＮＰ２、及びＳＮＰ３）の遺伝子型を判定する（Ｓ１０５）。
【００３２】
ステップＳ１０１からＳ１０５までの一連の手順の詳細を、図１Ｂに示す第１態様の具体例のタイミングチャートを参照して説明する。
【００３３】
ステップＳ１０１は、図１ＢにおいてＰＣＲ１のラベルで示される区間に相当する。ステップＳ１０１では、所定の温度範囲で第１の周期で周期的変化を第１の回数繰り返して検体を加熱する。より具体的には、Ｔ１からＴ３までの温度範囲の３０秒周期の周期的変化を１０回繰り返して検体を加熱する。すなわち、Ｔ１からＴ３までの温度範囲は、第１態様における所定の温度範囲の例であり、３０秒周期は、第１態様における第１の周期の例であり、１０回は、第１態様における第１の回数の例である。
【００３４】
ステップＳ１０２は、図１ＢにおいてＰＣＲ２のラベルで示される区間に相当する。ステップＳ１０２では、所定の温度範囲で第２の周期で周期的変化を第２の回数繰り返して検体を加熱する。より具体的には、Ｔ１からＴ３までの温度範囲の２０秒周期の周期的変化を４０回繰り返して検体を加熱する。すなわち、Ｔ１からＴ３までの温度範囲は、第１態様における所定の温度範囲の例であり、２０秒は、第１態様における第２の周期の例であり、４０回は、第１態様における第２の回数の例である。ここで、第２の周期は、第１の周期よりも短い。つまり、第１の周期と第２の周期とは異なり、この例では、より後に実施される加熱ステップであるＰＣＲ２で適用される第２の周期が第１の周期よりも短い。
【００３５】
ステップＳ１０３は、図１ＢにおいてＳＮＰ−１、ＳＮＰ−２、及びＳＮＰ−３のラベルで示される区間に相当する。ステップＳ１０３では、検体を一定の昇温速度で定速加熱する。図１Ｂのこの区間における、Ｔ１より低い温度からＴ３に近い温度までの２００秒間の加熱がこの定速加熱の例である。この区間では、検体に含まれる複数種類の標的遺伝子のＰＣＲ増幅産物に結合した蛍光色素（蛍光色素で標識されたプローブ）が、温度の上昇に伴い解離し、蛍光を発する。
【００３６】
この蛍光変化を連続的に測定すると、蛍光色素で標識されたプローブは、完全には相補的でない配列（例えば、１塩基のみ異なる配列）を有する遺伝子型（１）では、完全に相補的な配列を有する遺伝子型の場合に比べて低い温度でＰＣＲ増幅産物から解離し発光する。一方、完全に相補的な配列を有する遺伝子型（２）では、蛍光色素で標識されたプローブは、完全には相補的でない配列有する遺伝子型（１）の場合に比べて高い温度で解離し発光する。また、完全に相補的な配列を有する遺伝子型（２）と完全には相補的でない配列を有する遺伝子型（１）の両方の配列を有する遺伝子型（ヘテロ型）では、前記の低い温度と高い温度の両方の温度で解離し発光する。このような遺伝子型によるプローブの解離温度Ｔｍ値を算出し（Ｓ１０４）、その解離温度の違いから遺伝子型を判定する（Ｓ１０５）。
【００３７】
このように、本実施形態の第１態様に係る遺伝子検査方法は、加熱ステップが、第１の周期で前記周期的変化を第１の回数繰り返して検体を加熱する第１加熱ステップと、第１の周期と異なる、第２の周期で周期的変化を第２の回数繰り返して検体を加熱する第２加熱ステップとを含む。
【００３８】
このように、異なる周期での周期的変化で検体を加熱することで、検体に含まれる複数種類の標的遺伝子のそれぞれの標的遺伝子を、より適切な条件で増幅させることができる。これにより、複数の標的遺伝子のタイプ（遺伝子型）判定に要する時間を短縮しつつ、その確度を確保することができる。
【００３９】
また、本実施形態の第１態様に係る遺伝子検査方法は、第２の周期は、第１の周期よりも短い。
【００４０】
これにより、標的遺伝子は種類ごとの適切な条件で増幅され、タイプ（遺伝子型）判定に要する時間を短縮しつつ、その確度を確保することができる。
【００４１】
［Ａ−１−２．第２態様］
第２態様に係る遺伝子検査方法について、図２Ａ及び図２Ｂを用いて説明する。図２Ａは、第２態様に係る遺伝子検査方法の一例を示すフローチャートであり、図２Ｂは、第２態様に係る遺伝子検査方法の一例のタイミングチャートである。なお、図２Ａでは、第１態様のフローチャートと共通のステップは、図１Ａと共通の参照符号で示す。
【００４２】
第２態様は、加熱の周期が異なる第１加熱ステップと第２加熱ステップとを含む点、及び第１加熱ステップの後に実施される第２加熱ステップでの加熱の周期が第１加熱ステップでの加熱の周期より短い点は第１態様と共通である。以下、第１態様と異なる点を示しながら第２態様の一連の手順を説明する。
【００４３】
図３Ａに示すように、第２態様では、まず、検体を注入した遺伝子検査チップを遺伝子検査システムにセットする（Ｓ１００）。
【００４４】
次に、標的遺伝子を増幅させるために、１回目の加熱ステップである第１加熱ステップ（ＰＣＲ１）を実施し（Ｓ１１１）、続いて２回目の加熱ステップである第２加熱ステップ（ＰＣＲ２）を実施する（Ｓ１１２）。第２態様では、さらに、第２加熱ステップに続けて第３加熱ステップを実施する（Ｓ１１３）。
【００４５】
次に、蛍光検出ステップにおいて標的遺伝子（ＳＮＰ１、ＳＮＰ２、及びＳＮＰ３）の蛍光強度を測定する（Ｓ１１４）。なお、蛍光検出ステップＳ１１４では、遺伝子検査システムが備える上記の蛍光検出回路が用いられる。各蛍光検出回路については後述する。
【００４６】
次に、蛍光強度のグラフからＴｍ値（Ｔｍ１、Ｔｍ２、及びＴｍ３）を算出する（Ｓ１１５）。
【００４７】
最後に、標的遺伝子（ＳＮＰ１、ＳＮＰ２、及びＳＮＰ３）の遺伝子型を判定する（Ｓ１１６）。
【００４８】
ステップＳ１１１からＳ１１６までのフローの詳細を、図２Ｂに示す第２態様の具体例のタイミングチャートを参照して説明する。
【００４９】
ステップＳ１１１は、図２ＢにおいてＰＣＲ１のラベルで示される区間に相当する。ステップＳ１１１では、所定の温度範囲で第１の周期で周期的変化を第１の回数繰り返して検体を加熱する。より具体的には、Ｔ１からＴ３までの温度範囲の３５秒周期の周期的変化を１０回繰り返して検体を加熱する。すなわち、Ｔ１からＴ３までの温度範囲は、第２態様における所定の温度範囲の例であり、３５秒は、第２態様における第１の周期の例であり、１０回は、第２態様における第１の回数の例である。
【００５０】
ステップＳ１１２は、図２ＢにおいてＰＣＲ２のラベルで示される区間に相当する。ステップＳ１１２では、所定の温度範囲で第２の周期で周期的変化を第２の回数繰り返して検体を加熱する。より具体的には、Ｔ１からＴ３までの温度範囲の２５秒周期の周期的変化を２０回繰り返して検体を加熱する。すなわち、Ｔ１からＴ３までの温度範囲は、第２態様における所定の温度範囲の例であり、２５秒は、第２態様における第２の周期の例であり、２０回は、第２態様における第２の回数の例である。
【００５１】
ステップＳ１１３は、図２ＢにおいてＰＣＲ３のラベルで示される区間に相当する。ステップＳ１１３では、所定の温度範囲で第３の周期で周期的変化を第３の回数繰り返して検体を加熱する。より具体的には、Ｔ１からＴ３までの温度範囲の１５秒周期の周期的変化を２０回繰り返して検体を加熱する。すなわち、Ｔ１からＴ３までの温度範囲は、第２態様における所定の温度範囲の例であり、１５秒は、第２態様における第３の周期の例であり、２０回は、第２態様における第３の回数の例である。
【００５２】
ステップＳ１１４は、図２ＢにおいてＳＮＰ−１及びＳＮＰ−２のラベルで示される区間に相当する。ステップＳ１１４では、検体を一定の昇温速度で定速加熱する。図２Ｂのこの区間における、Ｔ１より低い温度からＴ３に近い温度までの２００秒間の加熱がこの定速加熱の例である。この区間では、検体に含まれる複数種類の標的遺伝子のうち、第１標的遺伝子のＰＣＲ増幅産物に結合した蛍光色素（蛍光色素で標識されたプローブ）が、温度の上昇に伴い解離し、蛍光を発する。この蛍光の強度の変化に基づく遺伝子型の判定は、第１態様についてした説明のとおりであるため、ここでは説明を省略する。
【００５３】
ここで、第２態様でも第１態様と同じく、第２の周期は、第１の周期よりも短い。また、加熱ステップは、さらに、第２の周期より短い、第３の周期で周期的変化を第３の回数繰り返して検体を加熱する第３加熱ステップを含む。
【００５４】
これにより、ＰＣＲの実施の段階が増し、タイプ（遺伝子型）判定に要する時間を従来の方法よりも短縮しつつ、その確度をより確実に確保することができる。
【００５５】
このように第２態様では、第１態様と異なり、加熱ステップは３回実施される。回数を重ねても従来の方法よりも短い時間で、かつ、確度よく標的遺伝子のタイプを判定することができる。
【００５６】
［Ａ−１−３．実施例］
ここで、上記の実施形態に係る遺伝子検査方法による、蛍光波形による遺伝子型の判定の実施例を示す。この判定は、肥満に関する３遺伝子（ＡＤＢＲ２遺伝子、ＡＤＢＲ３遺伝子、及びＵＣＰ１遺伝子）を対象として実施された。また、この方法では、ＡＤＢＲ２遺伝子はＳＮＰ１として、ＡＤＢＲ３遺伝子はＳＮＰ２として、ＵＣＰ１遺伝子はＳＮＰ３として扱った。
【００５７】
まず、第１態様の遺伝子検査方法として、ＰＣＲ１を所定の温度範囲（Ｔ３＝９５℃、Ｔ１＝６２℃）で３０秒の周期の周期的変化（加熱サイクル）を１０回繰り返した後、ＰＣＲ２を所定の温度範囲（ＰＣＲ１と同じ温度範囲）で２０秒の周期の加熱サイクルを３０回、４０回、５０回繰り返した場合の判定の良否を表１に示す。
【００５８】
また、表中のＰＣＲ２とは、ＰＣＲ２で実行された周期的な加熱の繰り返しの回数である。表１では、誤判定であった場合が×、頻度は低いが誤判定があった場合が△、判定可能であった場合が〇、確度よく判定可能であった場合が◎で示されている。
【００５９】
【表１】
2018157799.tif 000003
【００６０】
表１から分かるように、第１態様に係る遺伝子検査方法では、ＰＣＲ２での加熱サイクルを４０回、５０回とした場合に、いずれの標的遺伝子についても確度よく判定できた。なお、本実施例では、誤判定の頻度が高いもの（×）はなかった。
【００６１】
次に、第２態様の遺伝子検査方法として、ＰＣＲ１を所定の温度範囲（Ｔ３＝９５℃、Ｔ１＝６２℃）で３５秒の周期の周期的変化（加熱サイクル）を１０回繰り返した後、ＰＣＲ２を所定の温度範囲（ＰＣＲ１と同じ温度範囲）で２５秒の周期の加熱サイクルを３０回、４０回、５０回繰り返した場合の判定の良否を表２に示す。
【００６２】
【表２】
2018157799.tif 000004
【００６３】
表２から分かるように、第２態様に係る遺伝子検査方法では、ＰＣＲ２での加熱サイクルを４０回、５０回とした場合に、いずれの標的遺伝子についても確度よく判定できた。
【００６４】
また、ＰＣＲ２の加熱サイクルを３０回とした場合にも、標的遺伝子の全てについて判定可能であった。しかしながら、検出可能となる時間を算出したところ、第１態様に係る遺伝子検査方法での４０回と第２態様に係る遺伝子検査方法での３０回とでは、１１００秒（加熱サイクルの時間のみ算出）であったため、短い周期で回数を多く行う方が、標的遺伝子の判定をより確度よく行うことができる。
【００６５】
第２実施形態では、このような加熱サイクルの回数を決定するための手順を含む遺伝子検査方法について説明する。
【００６６】
［Ａ−２．第２実施形態］
本実施の形態に係る遺伝子検査方法は、上述のとおり、複数種類の標的遺伝子の蛍光強度を測定しながら分析条件（具体的には、ＰＣＲでの加熱の温度範囲、周期、周期的変化（加熱サイクル）を実施する回数、ＰＣＲ（加熱ステップ）の実施回数等）を決定する遺伝子検査方法である。
【００６７】
なお、本実施形態に係る遺伝子検査方法は、以下に示す各ステップを実施可能であり、ＳＮＰ１、ＳＮＰ２、及びＳＮＰ３をそれぞれ検出するための第１〜第３蛍光検出回路を備えるよう構成された遺伝子検査システムを用いて実施される。この遺伝子検査システムの構成は、第１実施形態で用いられる遺伝子検査システムの構成と基本的に共通であり、詳細は後述する。
【００６８】
以下、第２実施形態に係る遺伝子検査方法について、図３〜図４Ｃを用いて説明する。図３は、第２実施形態に係る遺伝子検査方法を示すフローチャートであり、図４Ａ〜図４Ｃは、それぞれ、第２実施形態における複数種類の標的遺伝子（ＳＮＰ１、ＳＮＰ２、及びＳＮＰ３）の蛍光強度の変化点の検出に用いるグラフの例である。
【００６９】
なお、図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃは、それぞれＳＮＰ１としてのＡＤＢＲ２遺伝子、ＳＮＰ２としてのＡＤＢＲ３遺伝子、ＳＮＰ３としてのＵＣＰ１遺伝子の、後述する予備ＰＣＲにおいて測定された蛍光変化を示す。例えば図４Ａを参照すると、加熱サイクルの２５回目近傍で蛍光変化の傾向が大きく変化したことを示す。本実施形態は、この加熱サイクルの回数とＰＣＲ増幅の最適回数との間に一定の関係があることが確認されたことに基づく。
【００７０】
図３に示すように、まず、検体を注入した遺伝子検査チップを遺伝子検査システムにセットする（Ｓ１００）。
【００７１】
次に、第１、第２、及び第３蛍光検出回路を起動する（Ｓ１３０）。
【００７２】
次に、所定の温度範囲及び所定の加熱サイクルの数Ｐｎ−０（例えば、５０回）に設定されたＰＣＲ（以下、「予備ＰＣＲ」と称する。）を実施しながら、複数種類の標的遺伝子（ＳＮＰ１、ＳＮＰ２、及びＳＮＰ３）の蛍光強度の変化を測定する（Ｓ１４１）。
【００７３】
次に、それぞれの標的遺伝子の蛍光強度の変化点（変曲点ともいう）Ｐｔｈ−１、Ｐｔｈ−２、及びＰｔｈ−３を検出する（Ｓ１４２）。
【００７４】
次に、ステップＳ１４２で検出されたそれぞれの標的遺伝子の蛍光強度の変化点における予備ＰＣＲでの加熱サイクル数に所定の係数を乗じ、ＰＣＲ１、ＰＣＲ２、及びＰＣＲ３でのそれぞれが完了するまでに実施される加熱サイクルの累積数であるＰｎ−１、Ｐｎ−２、及びＰｎ−３を算出する（Ｓ１４３）。
【００７５】
次に、算出されたＰｎ−１のサイクル数から、実施済みの加熱サイクルの数であるＰｎ−０を減算することでＰＣＲ１の完了までに実施されるべき残りの加熱サイクルの数を算出する（Ｓ１４４）。
【００７６】
ステップＳ１４１からＳ１４４までのフローについて、具体例を用いてより詳細に説明する。
【００７７】
図４Ａ〜図４Ｃに示すように、予備ＰＣＲ（Ｐｎ−０＝５０）を実施する間（Ｓ１４１）、継続して複数種類の標的遺伝子（ＳＮＰ１、ＳＮＰ２、及びＳＮＰ３）の蛍光強度の変化を測定する（Ｓ１４２）。この例では、複数種類の標的遺伝子のうち、ＳＮＰ１は２５サイクル目（Ｐｔｈ−１＝２５）、ＳＮＰ２は２５サイクル目（Ｐｔｈ−２＝２５）、ＳＮＰ３は３５サイクル目（Ｐｔｈ−３＝３５）に変化点が見られる（Ｓ１４２）。
【００７８】
次に、これらの変化点に、各標的遺伝子について予め定めた係数を乗じ、ＰＣＲ１、ＰＣＲ２及びＰＣＲ３のそれぞれを完了するまでに実施する加熱サイクルの累積数Ｐｎ−１、Ｐｎ−２、及びＰｎ−３を算出する（Ｓ１４３）。この係数は、例えば、発明者らが確認した、上述の加熱サイクルの回数とＰＣＲ増幅の最適回数との間にある一定の関係に基づいて決定される。
【００７９】
その後、予備ＰＣＲの加熱サイクルの数Ｐｎ−０をステップＳ１４３で算出したＰｎ−１から減算して、ＰＣＲ１で実施する残サイクル数を算出する（Ｓ１４４）。残サイクル数が０である場合は、予備ＰＣＲ（Ｓ１４１）を実施することでＰＣＲ１（Ｓ１５１）が完了したものとする。残サイクル数が０より大きい場合は、加熱サイクルをその残サイクル数繰り返してＰＣＲ１を完了させる（Ｓ１５１）。
【００８０】
また、ＰＣＲ２では、ステップＳ１４３で算出したＰｎ−２のサイクル数の加熱サイクルを実施する（Ｓ２５１）。
【００８１】
また、ＰＣＲ３では、ステップＳ１４３で算出されたＰｎ−３のサイクル数の加熱サイクルを実施する（Ｓ３５１）。その後各蛍光検出器の蛍光変化からＴｍ値（Ｔｍ１，Ｔｍ２、及びＴｍ３）を算出し（Ｓ３５２）、各標的遺伝子（ＳＮＰ１、ＳＮＰ２、及びＳＮＰ３）の遺伝子型を判定する（Ｓ３５３）。
【００８２】
ステップＳ１３１からＳ３５３までのフローが完了（全ての複数種類の標的遺伝子についての遺伝子型の判定が終了）した後、第１〜第３蛍光検出回路２７〜２９を停止して（Ｓ１９０）、第２実施形態に係る遺伝子検査方法は完了する。
【００８３】
また、上述の説明では、ステップＳ１４４において、ＰＣＲ１について算出された残サイクル数が０の場合にはＰＣＲ１は完了したものとされたが、ＰＣＲ２又はＰＣＲ３についても同様である。言い換えると、ＰＣＲ１〜ＰＣＲ３は、算出された残サイクル数が０である場合に実施されない。このように、第２実施形態に係る遺伝子検査方法によって、ＰＣＲの実施回数（ＰＣＲ１〜ＰＣＲ３のうち、実施されるもの）が決定される場合もある。
【００８４】
なお、ＰＣＲ１の周期が短い場合は、予備ＰＣＲにＰＣＲ１とＰＣＲ２の一部を含める場合がある。図５ＡはＳＮＰ３において、予備加熱のＰＣＲ１を１０回とした場合の蛍光変化を示す。この範囲では蛍光変化に変化点が存在しない。続いてＰＣＲ２を３０回行った時の蛍光変化を示すのが図５Ｂで、２６サイクル目で蛍光変化の変化点が見られる。この変化点に、予め定めた係数を乗じ、ＰＣＲ２又はＰＣＲ３のそれぞれを完了するまでに実施する加熱サイクルの累積数Ｐｎ−２又はＰｎ−３を算出する（Ｓ１４３）。この場合の係数は、上述の加熱サイクルの周期と、ＰＣＲ増幅の最適回数、さらに他の遺伝子（ＳＮＰ１、ＳＮＰ２）の結果に基づいて予め決定する。
【００８５】
このように、本実施形態に係る遺伝子検査方法は、第１の周期で周期的変化を第１の回数繰り返して検体を加熱する間に、複数種類の標的遺伝子の蛍光強度の変化を測定し、蛍光強度の変化に基づいて第１の回数及び第２以降の回数の少なくとも一つを決定する、又は、第２の周期で周期的変化を第２の回数繰り返して検体を加熱する間に、複数種類の標的遺伝子の蛍光強度の変化を測定し、蛍光強度の変化に基づいて第２の回数及び第２以降の回数の少なくとも一つを決定する、加熱サイクル決定ステップを有してもよい。
【００８６】
これにより、既存の分析データ（分析条件等）を有しない新たな種類の標的遺伝子に対しても、より短時間での遺伝子型の判定を実現するための加熱条件の設定が可能となる。また、サンプル間での個体差に応じて加熱サイクル数を変化させることができるため、遺伝子型判定の確度を向上させることができる。
【００８７】
なお、本実施の形態に係る遺伝子検査方法では、加熱サイクル決定ステップにおいて検体を加熱する間に、複数種類の標的遺伝子の蛍光強度の変化を測定し、蛍光強度の変化に基づいて、以降の加熱サイクルにおける温度範囲として、当該加熱サイクルにおける温度範囲と異なる温度範囲を設定してもよい。これにより、標的遺伝子は種類ごとの適切な条件で増幅され、タイプ（遺伝子型）判定に要する時間を短縮しつつ、その確度を確保することができる。
【００８８】
［Ｂ．遺伝子検査チップ及び遺伝子検査チップを用いた遺伝子検査方法］
以下、本開示における遺伝子検査チップ及びこの遺伝子検査チップを用いた遺伝子検査方法について、第３実施形態として図６及び図７を用いて説明する。図６は、本実施形態に係る遺伝子検査チップの一例を示す斜視図である。また、図７は、本実施形態に係る遺伝子検査チップを用いた遺伝子検査方法の一例である。
【００８９】
図６に示すように、本実施形態に係る遺伝子検査チップ１０は、チップ部１とチップフォルダー２とを備える。チップ部１は、所定の温度範囲で周期的変化を繰り返して検体を加熱し、検体に含まれる複数種類の標的遺伝子を増幅させるための、検体を保持する検体保持部３と、チップフォルダー２には複数種類の標的遺伝子を増幅させるための、検体の加熱の回数に対応付けられる識別子を保持する媒体４と、を備える。
【００９０】
本実施形態に係る遺伝子検査チップ１０が上述した識別子を有することにより、検体ごとに遺伝子検査の条件設定等の操作が不要となり、検査を自動化することができる。そのため、複数種類の標的遺伝子の遺伝子型（タイプ）の判定を短時間で実現することができる。また、識別子に対応付けられる他の情報（例えば、サンプルＩＤ、ＰＣＲサイクル数の決定に必要な係数等）により、複数種類の標的遺伝子に適した条件設定等の煩雑な操作も不要となり、遺伝子検査を自動化できる。さらに、複数種類の標的遺伝子の遺伝子型の判定の確度を向上させることができる。
【００９１】
また、識別子を保持する媒体４は、例えば、二次元バーコード、ＩＣチップ等を挙げることができる。
【００９２】
媒体４による識別子と検体の加熱の回数との対応付けの態様の例を挙げると、例えば媒体４が、遺伝子検査システムが読み取り可能な各検体の加熱の回数等が直接示してもよい。又は、媒体４はサンプルＩＤを示し、遺伝子検査システムは各検体のサンプルＩＤと加熱の回数等を関連付けたテーブル等のデータを記憶装置に保持しており、媒体４から読み取ったサンプルＩＤに基づいて該当する検体の加熱の回数を取得してもよい。なお、この遺伝子検査システムの詳細は第４実施形態として後述する。
【００９３】
なお、遺伝子検査チップ１０は、検体注入口５及び検体注入口５と検体保持部３とを連通する流路（図示せず）を備えてもよい。
【００９４】
遺伝子検査チップ１０を用いた遺伝子検査の一例は、図７に示すように、まず、遺伝子検査チップ１０に検体を注入し、チップを装置にセットした後（Ｓ１００）、識別子に対応付けられた第１の回数（ＰＣＲ１の加熱サイクル数）及び第２の回数（ＰＣＲ２の加熱サイクル数）等の情報を読み取る（Ｓ１７０）。次に、１回目の加熱ステップ（ＰＣＲ１）において標的遺伝子（ＳＮＰ１、ＳＮＰ２、ＳＮＰ３）を増幅させる（Ｓ１７１）。続いて、さらに標的遺伝子を増幅させるために２回目の加熱ステップ（ＰＣＲ２）を実施する（Ｓ１７２）。次に、蛍光検出ステップにおいて標的遺伝子（ＳＮＰ１、ＳＮＰ２、ＳＮＰ３）の蛍光強度を測定する（Ｓ１７３）。次に、蛍光強度のグラフからＴｍ値（Ｔｍ１、Ｔｍ２、Ｔｍ３）を算出する（Ｓ１７４）。次に、標的遺伝子（ＳＮＰ１、ＳＮＰ２、ＳＮＰ３）の遺伝子型を判定する（Ｓ１７５）。
【００９５】
すなわち、本実施形態に係る遺伝子検査方法は、検体は、第１の周期及び第１の回数、並びに、第２の周期及び第２の回数を示す識別子を保持する媒体４を備えるチップ１０に保持され、第１加熱ステップでは、識別子に対応する第１の周期で周期的変化を第１の回数繰り返して検体を加熱し、第２加熱ステップでは、識別子に対応する第２の周期で周期的変化を第２の回数繰り返して検体を加熱してもよい。このように、検体に含まれる複数種類の標的遺伝子に適した分析条件等の識別子を読み込み、遺伝子検査を実施することにより、複数種類の標的遺伝子の遺伝子型の判定を短時間で実現することができる。
【００９６】
なお、上記識別子は、さらに、複数の標的遺伝子を増幅させるための、検体の加熱の温度範囲に対応付けられていてもよい。これにより、標的遺伝子は種類ごとの適切な条件で増幅され、タイプ（遺伝子型）判定に要する時間を短縮しつつ、その確度を確保することができる。
【００９７】
［Ｃ．遺伝子検査システム］
以下、本開示における遺伝子検査システムについて、第４実施形態として図７及び図８を用いて説明する。図８は、本実施形態に係る遺伝子検査システムを示すブロック図である。
【００９８】
図８に示すように、本実施形態に係る遺伝子検査システムは、複数種類の蛍光色素を含む検出試薬と生体試料とを混合し、複数種類の標的遺伝子のそれぞれに複数種類の蛍光色素のうち互いに異なる蛍光色素を修飾して得られた検体を、所定の温度範囲で周期的変化を繰り返して加熱する加熱部（ペルチェ素子２５）と、検体を一定の昇温速度で加熱しながら検体に波長の異なる複数の励起光を照射し、検体の蛍光変化を検出する蛍光検出部３０（第１蛍光検出部３１、第２蛍光検出部３２、及び第３蛍光検出部３３）と、蛍光検出部３０において得られる蛍光強度の変化に基づき複数種類の標的遺伝子のタイプ判定を行う判定部と、を備え、加熱部２５は、第１の周期で周期的変化を第１の回数繰り返して検体を加熱した後、第１の周期と異なる、第２の周期で周期的変化を第２の回数繰り返して検体を加熱する。
【００９９】
図７に示すように、本実施形態に係る遺伝子検査システムは、例えば、上述の識別子を保持する媒体４を備える遺伝子検査チップ１０から識別子リーダー２１で識別子を読み取り（Ｓ１７０）、パソコン２２ａ内部のコントローラ２２に識別子の情報が伝達される。コントローラ２２からの伝達により、温度設定回路２３を通じてペルチェ駆動回路２４が起動し、ペルチェ素子２５が検体保持部３を加熱又は冷却する。これにより、図７に示すＰＣＲ１（Ｓ１７１）、ＰＣＲ２（Ｓ１７２）、及び定速加熱（Ｓ１７３）を実行する。
【０１００】
蛍光検出は、複数種類の標的遺伝子の全てについて一時に実施される。蛍光検出部３０は、判定する標的遺伝子の種類により異なる。つまり、上述したように、複数種類の標的遺伝子のそれぞれに複数種類の蛍光色素のうち互いに異なる蛍光色素を修飾しているため、蛍光検出部３０では、複数種類の蛍光色素に応じて検出波長域を設定した複数の蛍光検出部を備える。例えば、所定の蛍光色素で標識された標的遺伝子の遺伝子型を判定する場合について説明する。
【０１０１】
第１蛍光検出部３１は、例えば、コントローラ２２からの指示により、蛍光検出器切替回路２６を通じて第１蛍光検出回路２７を起動させる。そして、第１蛍光検出部３１のＬＥＤから射出された所定の波長を有する光がフィルタを通過することにより光の波長帯域が絞られ、ダイクロイックミラーで反射されて検体保持部３に照射される（励起光）。検体保持部３からの蛍光を、ダイクロイックミラーを通じてフォトダイオード（ＰＤ）で受光する。ＰＤで蛍光を受光すると、ＰＤから受光信号がＰＣＲ蛍光検出回路３４を通じてコントローラ２２に送信される。第１蛍光検出ステップが終了した後、コントローラ２２からの指示によりＴｍ算出回路３５でＴｍ値が算出され、Ｔｍ値がコントローラ２２に送信される。そして、この信号を基にコントローラ２２の判定部が、第１蛍光検出部３１で検出できる所定の蛍光色素で標識された標的遺伝子の遺伝子型の判定を行う。
【０１０２】
なお、第２蛍光検出部３２、及び第３蛍光検出部３３についても上述した内容と同様であるため、詳細な説明を省略する。
【０１０３】
これにより、複数種類の標的遺伝子のタイプ（遺伝子型）判定を短時間で実現することができる。さらに、遺伝子検査を自動化でき、迅速に、かつ、正確に、複数種類の標的遺伝子の遺伝子型を判定できる。
【０１０４】
［Ｄ．その他］
上述した実施形態では、所定の温度範囲での周期的変化を繰り返す各加熱ステップ（ＰＣＲ１、ＰＣＲ２及びＰＣＲ３）において、周期の長さ及び周期的変化を繰り返す回数（加熱サイクル数）を変更する例を説明したが、例えば、図９Ａ及び図９Ｂに示すように、さらに温度範囲を変更してもよい。
【０１０５】
図９Ａは、他の実施形態に係る遺伝子検査方法のタイミングチャートの一例であり、図９Ｂは、他の実施形態に係る遺伝子検査方法のタイミングチャートの他の例である。
【０１０６】
図９Ａに示すように、ＰＣＲ２では、ＰＣＲ１における第１の温度範囲と異なる、第２の温度範囲での周期的変化を第２の回数繰り返して検体を加熱してもよい。また、図９Ｂに示すように、ＰＣＲ３では、ＰＣＲ１における第１の温度範囲及びＰＣＲ２における第２の温度範囲と異なる、第３の温度範囲での周期的変化を第３の回数繰り返して検体を加熱してもよい。
【０１０７】
このように、異なる温度範囲での周期的変化で検体を加熱することで、検体に含まれる複数種類の標的遺伝子のそれぞれの標的遺伝子を、より適切な条件で増幅させることができる。これにより、複数の標的遺伝子のタイプ（遺伝子型）判定に要する時間を短縮しつつ、その確度を確保することができる。
【０１０８】
例えば、第２の温度範囲の上限温度Ｔ３ｂは、第１の温度範囲の上限温度Ｔ３ａよりも高く、第３の温度範囲の上限温度Ｔ３ｃは、第２の温度範囲の上限温度Ｔ３ｂよりも高くてもよい。これにより、標的遺伝子は種類ごとの適切な条件で増幅され、タイプ（遺伝子型）判定に要する時間を短縮しつつ、その確度を確保することができる。
【０１０９】
（まとめ）
以上のように、上記実施の形態に係る遺伝子検査方法は、複数種類の蛍光色素を含む検出試薬と複数種類の標的遺伝子を含む生体試料とを混合し、複数種類の標的遺伝子のそれぞれに複数種類の蛍光色素のうち互いに異なる蛍光色素を修飾して得られた検体を、所定の温度範囲で周期的変化を繰り返して加熱する加熱ステップと、検体を一定の昇温速度で加熱しながら検体に波長の異なる複数の励起光を照射し、検体の蛍光変化を検出する蛍光検出ステップと、蛍光検出ステップにおいて得られる蛍光強度の変化に基づき複数種類の標的遺伝子のタイプ判定を行う判定ステップと、を含み、加熱ステップは、第１の周期で周期的変化を第１の回数繰り返して検体を加熱する第１加熱ステップと、第１の周期と異なる、第２の周期で周期的変化を第２の回数繰り返して検体を加熱する第２加熱ステップと、を含む。
【０１１０】
このように、異なる温度範囲での周期的変化で検体を加熱することで、検体に含まれる複数種類の標的遺伝子のそれぞれの標的遺伝子を、より適切な条件で増幅させることができる。これにより、複数の標的遺伝子のタイプ（遺伝子型）判定に要する時間を短縮しつつ、その確度を確保することができる。
【０１１１】
例えば上記実施の形態に係る遺伝子検査方法では、第２の周期は、第１の周期よりも短くてもよい。
【０１１２】
これにより、標的遺伝子は種類ごとの適切な条件で増幅され、タイプ（遺伝子型）判定に要する時間を短縮しつつ、その確度を確保することができる。
【０１１３】
また、上記実施の形態に係る遺伝子検査方法では、加熱ステップは、さらに、第２の周期より短い、第３の周期で周期的変化を第３の回数繰り返して検体を加熱する第３加熱ステップを含んでもよい。
【０１１４】
これにより、ＰＣＲの実施の段階が増し、タイプ（遺伝子型）判定に要する時間を従来の方法よりも短縮しつつ、その確度をより確実に確保することができる。
【０１１５】
また、上記実施の形態に係る遺伝子検査方法では、第１加熱ステップは、さらに、第１の温度範囲を有し、第２加熱ステップは、さらに、前記第１の温度範囲と異なる第２の温度範囲を有してもよい。
【０１１６】
これにより、標的遺伝子は種類ごとの適切な条件で増幅され、タイプ（遺伝子型）判定に要する時間を短縮しつつ、その確度を確保することができる。
【０１１７】
また、上記実施の形態に係る遺伝子検査方法は、さらに、第１の周期で周期的変化を第１の回数繰り返して検体を加熱する間に、複数種類の標的遺伝子の蛍光強度の変化を測定し、蛍光強度の変化に基づいて第１の回数及び第２以降の回数の少なくとも一つを決定する、又は、第２の周期で周期的変化を第２の回数繰り返して検体を加熱する間に、複数種類の標的遺伝子の蛍光強度の変化を測定し、蛍光強度の変化に基づいて第２の回数及び第２以降の回数の少なくとも一つを決定する、加熱サイクル決定ステップを含んでもよい。
【０１１８】
これにより、既存の分析データ（分析条件等）を有しない新たな種類の標的遺伝子に対しても、遺伝子型の判定が可能となる。また、サンプル間での個体差に応じて加熱サイクル数を変化させることができるため、遺伝子型判定の確度を向上させることができる。
【０１１９】
上記実施の形態に係る遺伝子検査方法では、検体は、第１の周期及び第１の回数、並びに、第２の周期及び第２の回数を示す識別子を保持する媒体４を備えるチップ１０に保持され、第１加熱ステップでは、識別子に対応する第１の周期で周期的変化を第１の回数繰り返して検体を加熱し、第２加熱ステップでは、識別子に対応する第２の周期で周期的変化を第２の回数繰り返して検体を加熱してもよい。
【０１２０】
これにより、検体に含まれる標的遺伝子の種類ごとに適した分析条件が用いられる場合も、各検体の分析条件を示す識別子を用いて遺伝子検査を実施することにより、複数種類の標的遺伝子の遺伝子型の判定の長時間化を抑え、又は時間の短縮を図ることができる。
【０１２１】
上記実施の形態に係る遺伝子検査チップ１０は、所定の温度範囲で周期的変化を繰り返して検体を加熱し、検体に含まれる複数種類の標的遺伝子を増幅させるための、検体を保持する検体保持部３と、複数種類の標的遺伝子を増幅させるための、検体の加熱の周期及び加熱の回数に対応付けられる識別子を保持する媒体４と、を備える。
【０１２２】
本開示における遺伝子検査チップが上述した識別子を有することにより、遺伝子検査の条件設定等の操作が不要となり、検査を自動化することができる。そのため、複数種類の標的遺伝子の遺伝子型（タイプ）の判定を短時間で実現することができる。また、識別子に対応付けられる他の情報（例えば、サンプルＩＤ、ＰＣＲサイクル数の決定に必要な係数等）により、複数種類の標的遺伝子に適した条件設定等の煩雑な操作も不要となり、遺伝子検査を自動化できる。さらに、複数種類の標的遺伝子の遺伝子型の判定の確度を向上させることができる。
【０１２３】
上記実施の形態に係る遺伝子検査システムは、複数種類の蛍光色素を含む検出試薬と生体試料とを混合し、複数種類の標的遺伝子のそれぞれに複数種類の蛍光色素のうち互いに異なる蛍光色素を修飾して得られた検体を、所定の温度範囲で周期的変化を繰り返して加熱する加熱部２５と、検体を一定の昇温速度で加熱しながら検体に波長の異なる複数の励起光を照射し、検体の蛍光変化を検出する蛍光検出部３０と、蛍光検出部３０において得られる蛍光強度の変化に基づき複数種類の標的遺伝子のタイプ判定を行う判定部と、を備え、加熱部２５は、第１の周期で周期的変化を第１の回数繰り返して検体を加熱した後、第１の周期と異なる、第２の周期で周期的変化を第２の回数繰り返して検体を加熱する。
【０１２４】
これにより、複数種類の標的遺伝子のタイプ（遺伝子型）判定を短時間で実現することができる。さらに、遺伝子検査を自動化でき、迅速に、かつ、正確に、複数種類の標的遺伝子の遺伝子型の判定ができる。
【０１２５】
以上、本開示に係る遺伝子検査方法、遺伝子検査チップ、及び遺伝子検査システムについて、実施の形態に基づいて説明したが、本開示は、これらの実施の形態に限定されるものではない。本開示の趣旨を逸脱しない限り、当業者が思いつく各種変形を実施の形態に施したものや、実施の形態における一部の構成要素を組み合わせて構築される別の形態も、本開示の範囲内に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【０１２６】
本開示に係る遺伝子検査方法、遺伝子検査チップ、及び遺伝子検査システムは、例えば、得られる遺伝子情報に基づいて個人の体質に合った食品、化粧品、サプリメント、トレーニングの提案、又は、病気罹患率の診断、投与薬剤の種類と効果及び副作用の予測等に応用できる。
【符号の説明】
【０１２７】
４  媒体
１０  遺伝子検査チップ（チップ）
２５  ペルチェ素子（加熱部）
３０  蛍光検出部
【図１Ａ】
2018157799.tif 000005
【図１Ｂ】
2018157799.tif 000006
【図２Ａ】
2018157799.tif 000007
【図２Ｂ】
2018157799.tif 000008
【図３】
2018157799.tif 000009
【図４Ａ】
2018157799.tif 000010
【図４Ｂ】
2018157799.tif 000011
【図４Ｃ】
2018157799.tif 000012
【図５Ａ】
2018157799.tif 000013
【図５Ｂ】
2018157799.tif 000014
【図６】
2018157799.tif 000015
【図７】
2018157799.tif 000016
【図８】
2018157799.tif 000017
【図９Ａ】
2018157799.tif 000018
【図９Ｂ】
2018157799.tif 000019