(57)【要約】      （修正有）【課題】多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質および使用法を提供する。【解決手段】Ｎ末端の両方を融合部分（融合部分ＡまたはＢ）へと融合させた抗体のＦａｂ断片を含む、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質（ＭＳＦＰ）は、Ｆａｂ断片のＦａｂ標的への著明に低減された結合能力を呈示するＦａｂ断片を含有する。Ｆａｂのその標的への結合は、ＭＳＦＰが、融合部分のそれらの標的への結合を介して、細胞表面において集塊をなす場合に回復される。とりわけ、その天然状態にある細胞表面上に存在するか又は融合部分の結合が存在しない場合に、Ｆａｂのその標的への結合が低減されれば、副作用の低減などの利点がもたらされ、所望される選択性および特異性の薬理学的効果が、制御された様式で可能となる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願との相互参照
この出願は、２０１１年５月１６日に出願された米国仮出願第６１／４８６，６９０号（この出願は、その全体が参考として本明細書に援用される）に対する優先権を主張する。
【０００２】
配列表に関する言明
本出願と関連する配列表は、紙原稿ではなく、テキストデータのフォーマットで提示され、参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含有するテキストファイルの名称は、ＦＡＢＮ＿００１＿０２ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。このテキストファイルは、１８８ＫＢであり、２０１２年５月１６日に作成され、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子データとして提出される。
【０００３】
本開示は一般に、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質（ＭＳＦＰ）に関する。特に、本開示のＭＳＦＰは、両方のＮ末端を切断可能または切断不可能なリンカーにより融合部分へと融合させた抗体のＦａｂ断片を含む。ＭＳＦＰのＦａｂ断片はとりわけ、天然の細胞表面の標的抗原のほか、同じ抗原の特定の可溶性形態にも結合する。融合部分の一方または両方はとりわけ、細胞表面上の標的抗原に結合する。
【背景技術】
【０００４】
従来の免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）は、２つの同一な免疫グロブリン重鎖および２つの同一な免疫グロブリン軽鎖を含む四量体分子である。ＩｇＧ重鎖は、Ｎ末端における可変領域に続き、第１の定常領域（ＣＨ１）、ヒンジ、および２つのさらなる定常領域（ＣＨ２ＣＨ３）を有する。ＩｇＧ軽鎖は、２つのドメイン：Ｎ末端の可変領域とＣ末端の定常領域とを含む。重鎖可変領域（ＶＨ）は、軽鎖可変領域（ＶＬ）と相互作用して、最小限の抗原結合領域であるＦｖを構成する。抗原結合領域は、重鎖の第１の定常領域（ＣＨ１）と軽鎖の定常領域（ＣＬ）との間の相互作用により安定化し、２つの定常領域の間のジスルフィド結合の形成によりさらに安定化する（Ｆａｂ断片を形成する）。ＣＨ２ＣＨ３ドメインのホモ二量体化（Ｆｃを形成する）により、かつ、その結果としてのヒンジにおけるジスルフィド結合の形成により、ＩｇＧ構造は安定化する。したがってＩｇＧは、互いとの配向性およびＦｃドメインとの配向性において比較的可撓性の２つの抗原結合Ｆａｂアームを有する。加えて、結合領域（抗原と直接的に相互作用する）は、それを越えてはさらなる構造を伴わないＮ末端に配置されている。推測する限りでは、この構造特色により、立体障害に由来する干渉を最小限とする、抗体の抗原との相互作用が容易となる。この特性はとりわけ、細胞膜複合体に極めて近接して配置されることが多い細胞表面抗原への結合にとって重要である。
【０００５】
近年では、全長モノクローナル抗体が、がん、自己免疫性疾患、および炎症性疾患、ならびに他のヒト疾患を処置するのに用いられて成功している（非特許文献１）。天然では、免疫グロブリンの５つの異なる種類（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＥ）が存在するが、結合アフィニティーおよび結合特異性の高さ、バイオアベイラビリティーの大きさ、循環における血清中半減期の長さ、潜在的なエフェクター機能の可能性、および産業規模の製造可能性を含めた好適な特性のために、ＩｇＧが、ヒト用治療剤に最も適するモダリティーを表す。
【０００６】
現在のところ世界中の薬物規制機関により腫瘍学環境における臨床的使用について承認されているモノクローナル抗体（非コンジュゲート抗体またはネイキッド抗体）は一般に、以下の機構のうちの１つまたはこれらの組合せにより作用する：１）細胞成長のためのシグナル伝達の遮断、２）がん細胞への血液供給の遮断、３）細胞アポトーシスの直接的な媒介、４）抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、および補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）などの免疫エフェクター機能の誘発、ならびに５）腫瘍に対する獲得免疫の促進。
【０００７】
モノクローナル抗体療法は、臨床における生存の利益を裏付けている。しかし、がん患者における全体的な奏効率は低く、生存の利益は、化学療法と比較して周縁的（数カ月間）である。頑健な臨床的抗がん活性の欠如の根本的な理由が完全に理解されているわけではないが、研究は、がん細胞がしばしば、補完的なシグナル伝達経路を迅速に発生させて細胞死を免れることを示唆している。また、強力ながん誘発細胞と考えられるがん幹細胞（ＣＳＣ）も、細胞増殖における活性はそれほど大きくなく、したがって、成長シグナルの欠如をより良好に維持する傾向がある。
【０００８】
近年、ＡＤＣＣが抗がん抗体の臨床的有効性において重要な役割を果たすことが裏付けられた。抗体のＦｃは、多数の形態：ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩａ、およびＦｃγＲＩＩＩｂが認められるＦｃガンマ受容体に結合する。Ｆｃドメインはとりわけ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、および好中球において発現するＦｃγＲＩＩＩａに対するアフィニティーが高い。ＦｃのＦｃγＲＩＩＩａへの結合は、ＮＫ細胞を活性化し、次いで、これにより、近傍のがん細胞が破壊されうる。
【０００９】
Ａｓｎ２９７グリカン構造におけるフコシル化を低減するかまたは消失させるタンパク質の操作（ＣＨ２領域内の多様なアミノ酸変異を伴う）または作製用宿主細胞（ＣＨＯ）系の操作を介してＦｃγＲに対する結合特性の活性化を増強した操作抗体が、前臨床研究において生物学的活性の改善について調べられて成功している。エフェクター機能の増強を含有するＩｇＧ抗体は、現在のところ、有効性の改善を目標とする臨床試験にかけられている。現在入手可能な臨床データは、これらの抗体が極めて有望であることを示す。
【００１０】
別の抗がん治療法は、Ｔ細胞を使用することである。Ｔ細胞は、新たに生じたがん細胞を求めて体内を巡回し、それらを効果的かつ速やかに消失させることにより、一生を通じてがんに対する防御をもたらす。がん処置においてＴ細胞免疫を利用して奏効する治療法には、１）ＦＤＡで承認されているＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（組換えＩＬ−２）の転移性黒色腫および転移性腎臓がんに対する使用；２）ＦＤＡで承認されているＰＲＯＶＥＮＧＥ（登録商標）（Ｓｉｐｕｌｅｕｃｅｌ−Ｔ）の無症候性転移性ホルモン不応性前立腺がんに対する使用が含まれる。ＰＲＯＶＥＮＧＥ（登録商標）とは、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて前立腺がん特異的細胞傷害性Ｔ細胞を活性化する樹状細胞ワクチンであり、次いで、これらの傷害性Ｔ細胞を患者へと再注入する；３）ＦＤＡは、進行性黒色腫に対するイピリムマブ（Ｔ細胞阻害性シグナル伝達経路を阻害することによりＴ細胞を活性化する抗ＣＴＬＡ−４抗体）の使用を承認している。
【００１１】
Ｔ細胞は、Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）を発現させないため、抗腫瘍抗体の抗体では、細胞傷害性Ｔ細胞を直接的、効果的に活性化することができない。腫瘍を殺滅する目的でＴ細胞を活性化することに向けた多くの有望な方法のうちの１つは、二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）を用いて、Ｔ細胞を腫瘍細胞へと直接的に近接させる結果として、Ｔ細胞の活性化および腫瘍細胞の殺滅をもたらすことである。ＣＤ２８およびＣＤ１３７（４−１ＢＢ）は、二重特異性のターゲティング法において使用される２つの強力なＴ細胞共刺激性受容体である。例には、ＣＤ２８×ＮＧ２（非特許文献２）、ＣＤ２８×ＣＤ２０（非特許文献３）、および４−１ＢＢ×ＣＤ２０（非特許文献４）が含まれる。また、Ｔ活性化を誘発することが可能な他のＴ細胞表面標的も、二重特異性抗体を用いてそれらを腫瘍細胞へとリターゲティングするのに用いられている。過去には、多様な二重特異性抗体および多重特異性抗体のフォーマットが開発されており、近年になってこれらが総説されている（ＭｕｌｌｅｒおよびＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ、Ｂｉｏｄｒｕｇｓ、２４巻：８９〜９８頁、２０１０年；ＣｈａｍｅｓおよびＢａｔｙ、ｍＡｂｓ、１巻：５３９〜４７頁、２００９年；ＤｅｙｅｖおよびＬｅｂｅｄｅｎｋｏ、ＢｉｏＥｓｓａｙｓ、３０巻：９０４〜９１８頁、２００８年）。これらのフォーマットは、以下の３つの大きな類型へと分けられる：１）クァドローマ法（Ｓｔａｅｒｚら、ＰＮＡＳ、８３巻：１４５３〜７頁、１９８６年）、ＫＩＨ（ｋｎｏｂ  ａｎｄ  ｈｏｌｅ）法（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１６巻：６７７〜８１頁；Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２８５巻：１９６３７〜４６頁、２０１０年）、鎖交換操作ドメインによる「ＳＥＥＤ」法（Ｄａｖｉｓら、ＰＥＤＳ、２３巻：１９５〜２０２頁、２０１０年）、ＩｇＧの重鎖または軽鎖のＣ末端への融合（ＣｏｌｏｍａおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１５巻：１５９〜６３頁、１９９７年；Ｓｈｅｎら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ、３１８巻：６５〜７４頁、２００７年；Ｏｒｃｕｔｔら、ＰＥＤＳ、２３巻：２２１〜８頁、２０１０年；Ｄｏｎｇら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２８６巻：４７０３〜１７頁、２０１１年、Ｌａｚａｒら、特許出願第ＵＳ２０１１００５４１５１号）、ＩｇＧの重鎖または軽鎖のＮ末端への融合（Ｓｈｅｎら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２８１巻：１０７０６〜１７頁、２００６年；Ｗｕら、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２５巻：１２９０〜７頁、２００７年）を含めた、Ｆｃのヘテロ二量体化または重鎖もしくは軽鎖への共有結合的な融合に基づく、ＩｇＧ様二重特異性分子；２）Ｆｃの融合による二重特異性抗体（Ｍａｂｒｙら、ＰＥＤＳ、２３巻：１１５〜１２７頁、２０１０年；Ｍｉｌｌｅｒら、ＰＥＤＳ、２３巻：５４９〜５５７頁、２０１０年）；３）ダイアボディー（Ｄｂ）（Ｈｏｌｌｉｇｇｅｒら、ＰＮＡＳ、９０巻：６４４４〜８頁、１９９３年）、ジスルフィド結合で連結されたダイアボディー（また、二重アフィニティーリターゲティングまたはＤＡＲＴとしても公知）（Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、３９９巻：４３６〜���９頁、２０１０年）、単鎖ダイアボディー（ｓｃＤｂ）（Ａｌｔら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、４５４巻：９０〜４頁、１９９９年）、タンデムダイアボディー（ｔａｎｄＡｂ）（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２９３巻：４１〜５６頁、１９９９年）、タンデム単鎖Ｆｖ（ｔａＦｖ）（Ｍａｃｋら、ＰＮＡＳ、９２巻：７０２１〜５頁、１９９５年）を含め、融合または非共有結合的会合を介する、抗体の可変領域だけによる分子；ならびに４）バイボディーおよびトリボディー（Ｓｃｈｏｏｎｊａｎｓら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６５巻：７０５０〜７頁、２０００年；Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌ  ＳＡのウェブサイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｃｎｏｌ．ｃｏｍ）、単一ドメイン抗体（特許出願第ＵＳ２０１０／０２３９５８２Ａ１号）とのＦａｂ融合体、およびＦａｂ’２融合体（米国特許第ＵＳ５，９５９，０８３号）を含めた、Ｆａｂベースの融合分子。
【００１２】
二重特異性抗体の分野における最近２０年間にわたる努力は、臨床的に成果をもたらし始めた。欧州では、２００９年に、カツマキソマブ（Ｃａｎｔｏｍａｘｏｍａｂ）（ＲＥＭＯＶＡＢ（登録商標）；抗ＣＤ３、抗ＥｐＣＡＭ三機能抗体）が、症候性悪性腹水症用に承認された。しかし、二重特異性抗体は、強力な腫瘍細胞殺滅の可能性を裏付ける一方で、全身性の免疫活性化、免疫原性（抗薬物抗体応答）を含めた重度の副作用、およびこれらの分子の一般的な製造可能性の低さが依然として変わらず、このクラスの薬物が広範に適用されることを大きく妨げている。近年になって、抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ−抗ＣＤ３
ｓｃＦｖ融合体（ブリナツモマブ）を使用する、二重特異性Ｔ細胞係合剤またはＢｉＴＥと称する二重特異性抗体法のプラットフォームが、前臨床試験および臨床試験（ｔｅｓｔｓ）（Ｂａｒｇｏｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００８年）、３２１巻：９７４〜７頁）において裏付けられたその傑出した効力のために、多大な関心を惹いた。特に、非ホジキンリンパ腫を伴う患者は、腫瘍の退縮を示し、場合によっては、ブリナツモマブ投与の臨床試験（ｔｒｉａｌ）期間中に完全寛解を示した。しかし、ブリナツモマブは、言語能力の喪失および見当識障害を症状とする中枢神経系の副作用を含めた重度の副作用を引き起こした。薬物の投与を停止すると、症状は一過性であり、可逆性であった。部分的なＴ活性化および細胞におけるＴ再分布を引き起こす、薬物のＣＤ３（Ｔ細胞上の）への直接的な結合が仮定された（特許出願第ＵＳ２０１０／０１５０９１８Ａ１号）。再分布したＴ細胞のうちの一部は、脳の微小血管へと付着し、内皮細胞を部分的に活性化し、脳内の微小血管の透過性の増強をもたらした。臨床試験では、Ｔ細胞に対するＢ細胞比が大きい患者における副作用の発生率は、この比が小さい患者の場合より低いことが観察された。また、異なるＣＤ３結合抗体断片を用いることにより、サルにおけるＴ細胞再分布を緩和または回避しうることも報告されている。これらの観察は、ＣＤ３上の結合エピトープに合せた抗体のＣＤ３への結合、および結果としてもたらされる部分的なＴ細胞の活性化が、この重度のＣＮＳ副作用の直接的な原因でありうることを強く示唆する。
【００１３】
ＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ融合体の別の欠点は、この薬物が、その短い半減期および皮下投与に対する不適合性に起因して、毎日の静脈内注入（ｉ．ｖ．）による薬物送達を要請することである。加えて、ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ融合タンパク質は、凝集する傾向を有する。したがって、ＢｉＴＥ分子は、高度に複雑な抗体操作の熟練を要請し、それらを安定的で製造可能とするには労力を要する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｎｅｌｓｏｎ、Ｎａｔ．  ｒｅｖｉｅｗ、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（２０１０年）９巻：７６７〜７４頁
【非特許文献２】Ｇｒｏｓｓｅ−Ｈｏｖｅｓｔら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００３年）３３巻：１３３４〜４０頁
【非特許文献３】Ｏｔｚら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ（２００９年）２３巻：７１〜７頁
【非特許文献４】Ｌｉｕら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ（２０１０年）３３巻：５００〜９頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
ＦｃγＲまたはＣＤ３を発現させる免疫細胞を係合させる抗体薬物の抗がん活性は、臨床的な概念実証をもたらした。しかし、現行の二重特異性抗体フォーマットの短所は、良好な有効性プロファイルおよび安全性プロファイルによりがん患者を処置するためのこれらの薬物の広範な適用にとって、依然として難題である。したがって、生成物の有効性、安定性、安全性、および製造可能性についてのプロファイルを改善した新たな二重特異性分子のデザインが、依然として火急に必要とされている。
【００１６】
さらなる背景の情報についての参考文献には、ＣｏｌｏｍａおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１５巻：１５９〜６３頁、１９９７年；Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ、Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｓｉｎ．、２６巻、１〜９頁、２００５年；ＭａｒｖｉｎおよびＺｈｕ；Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｓｉｎ．、２６巻、６４９〜６５８頁、２００５年；Ｓｈｅｎら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ、３１８巻：６５〜７４頁、２００７年；Ｓｈｅｎら、ＪＢＣ、２８１巻：１０７０６〜１０７１４頁、２００６年；Ｗｕら、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２５巻、１２９０〜１２９７頁、２００７年；Ｏｒｃｕｔｔ、Ｐｒｏｔ  ＰＥＤＳ、２３巻：２２１〜８頁、２０１０年；Ｍａｂｒｙ、ＰＥＤＳ、２３巻、３号、１１５〜１２７頁、２０１０年；Ｓｃｈｏｏｎｊａｎｓ、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２０００年、１６５巻：７０５０〜７０５７頁；Ｍｉｃｈａｅｌｓｏｎ、ｍＡｂｓ、１巻：２号、１２８〜１４１頁；２００９年；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ（２００８年）、９９巻、１４１５〜１４２５頁が含まれる。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本開示の一態様は、標的抗原に結合するＦａｂ断片；Ｆａｂ断片のＶＬのＮ末端においてカップリングさせた第１の融合部分；および／またはＦａｂ断片のＶＨのＮ末端においてカップリングさせた第２の融合部分を含む多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質を提供する。多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質の一実施形態では、第１の融合部分および第２の融合部分の非存在下におけるＦａｂ断片のＦａｂ標的抗原への結合が、同一のＦａｂ断片のＦａｂ標的への結合と比較して５０％〜９０％の間だけ低減される。
【００１８】
本開示の一態様は、ａ）標的抗原に結合するＦａｂ断片であって、ｉ）免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）および免疫グロブリン軽鎖定常領域（ＣＬ）；ならびにｉｉ）免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）および免疫グロブリン重鎖定常領域１（ＣＨ１）を含み；ＣＬ領域およびＣＨ１領域が、場合によって、ジスルフィド結合により接合されているＦａｂ断片と；ｂ）融合部分ＡのＣ末端が、ＶＨドメインのＮ末端側の終端部へと共有結合的に連結された融合部分Ａ；もしくはｃ）融合部分ＢのＣ末端が、ＶＬドメインのＮ末端側の終端部へと共有結合的に連結された融合部分Ｂ；またはｂおよびｃの両方と；ｄ）場合によって、融合部分ＡとＶＨドメインとの間に位置する第１のリンカーと；ｅ）場合によって、融合部分ＢとＶＬドメインとの間に位置する第２のリンカーとを含む多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質を提供する。ＭＳＦＰの一実施形態では、融合部分Ａが、結合ドメインを含み、かつ／または融合部分Ｂが、結合ドメインを含む。融合部分Ａと融合部分Ｂとは、配列が同一の場合もあり、異なる配列を含む場合もある。
【００１９】
本開示の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質のなおさらなる実施形態では、融合部分Ａが、第１の結合ドメインを含み、融合部分Ｂが、第２の結合ドメインを含み、ここで、第１の結合ドメインと第２の結合ドメインとが、同じ細胞表面抗原に結合する。一実施形態では、融合部分Ａが、第１の結合ドメインを含み、融合部分Ｂが、第２の結合ドメインを含み、ここで、第１の結合ドメインと第２の結合ドメインとが、異なる細胞表面抗原に結合する。特定の実施形態では、融合部分Ａが、第１の結合ドメインを含み、融合部分Ｂが、第２の結合ドメインを含み、ここで、第１の結合ドメインと第２の結合ドメインとが、同じエピトープまたは異なるエピトープに結合する。
【００２０】
本開示の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質の一実施形態では、Ｆａｂ断片が、細胞表面の標的抗原に結合する。特定の一実施形態では、融合部分Ａが、結合ドメインを含み、Ｆａｂ断片が、この結合ドメインと同じ細胞表面抗原に結合する。別の実施形態では、融合部分Ｂが、結合ドメインを含み、Ｆａｂ断片が、この結合ドメインと同じ細胞表面抗原に結合する。
【００２１】
本明細書で記載される多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質の特定の実施形態では、Ｆａｂ断片の抗原への結合が、融合部分Ａおよび融合部分Ｂにより引き起こされる立体障害により阻害される。一部の実施形態では、この立体障害の結果として、Ｆａｂ断片の抗原への検出可能な結合がもたらされない。他の実施形態では、融合部分Ａおよび融合部分Ｂの非存在下におけるＦａｂ断片のその標的への結合が、同一のＦａｂ断片のその標的への結合と比較して５０％〜９０％の間だけ低減される。
【００２２】
本明細書で記載される多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質の一実施形態では、第１のリンカーおよび第２のリンカーが、切断可能である。さらなる実施形態では、第１のリンカーが切断されたとき、Ｆａｂ断片の抗原への結合が、検出可能である。別の実施形態では、第２のリンカーが切断されたとき、Ｆａｂ断片の抗原への結合が、検出可能である。なおさらなる実施形態では、第１のリンカーおよび第２のリンカーの両方が切断されたとき、Ｆａｂ断片の抗原への結合が、検出可能である。
【００２３】
本明細書で記載される多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質の別の実施形態では、免疫グロブリン重鎖定常領域の種類が、α、δ、ε、γ、およびμから選択される。一実施形態では、免疫グロブリン重鎖が、ＩｇＧ抗体に由来し、さらなる実施形態では、ＩｇＧ抗体のアイソタイプが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４から選択される。
【００２４】
本明細書で記載される多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質の別の実施形態では、免疫グロブリン軽鎖のＶＬおよびＣＬが、免疫グロブリンカッパ軽鎖および免疫グロブリンラムダ軽鎖から選択される。
【００２５】
一実施形態では、融合部分Ａが、ｓｃＦｖの抗原結合ドメインを含む第１の結合ドメインを含む。本明細書で記載される多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質の一実施形態では、融合タンパク質が、第１のリンカーまたは第２のリンカーを含まない。この点において、一部の実施形態では、融合部分Ａが、１つ〜３つのＣ末端のアミノ酸残基を欠失しているか；または融合部分Ｂが、１つ〜３つのＣ末端のアミノ酸残基を欠失しているか；または融合部分Ａおよび融合部分Ｂの両方が、１つ〜３つのＣ末端のアミノ酸残基を欠失している。本明細書で記載されるＭＳＦＰのさらなる実施形態であって、第１のリンカーまたは第２のリンカーを存在させない実施形態では、Ｆａｂ  ＶＨのＮ末端側の終端部が、１つ〜３つのアミノ酸残基を欠失している場合もあり；Ｆａｂ  ＶＬのＮ末端側の終端部が、１つ〜３つのアミノ酸残基を欠失している場合もあり；ＶＨのＮ末端側の終端部およびＶＬのＮ末端側の終端部の両方が、１つ〜３つのアミノ酸残基を欠失している場合もある。本明細書で記載されるＭＳＦＰのさらなる実施形態であって、第１のリンカーまたは第２のリンカーを存在させない実施形態では、融合部分Ａおよび融合部分Ｂが、１つ〜３つのＣ末端のアミノ酸残基を欠失している場合があり；Ｆａｂ  ＶＨのＮ末端側の終端部およびＦａｂ  ＶＬのＮ末端側の終端部の両方が、１つ〜３つのアミノ酸残基を欠失している場合がある。なおさらなる実施形態では、本明細書で記載されるＭＳＦＰが、リンカーと欠失との任意の組合せを含有する。
【００２６】
本明細書で記載される多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質またはそのホモ二量体の一実施形態では、第１のリンカーが、プロテアーゼによって切断できない配列を含み、かつ／または第２のリンカーが、プロテアーゼによって切断可能な配列を含む。本明細書で記載される多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質またはこれを含むホモ二量体の別の実施形態では、第１のリンカーが、プロテアーゼによって切断可能な配列を含み、かつ／または第２のリンカーが、切断できない配列を含む。特定の実施形態では、第１のリンカーと第２のリンカーとが、同じプロテアーゼにより切断できるプロテアーゼによって切断可能な配列を含む。他の実施形態では、第１のリンカーと第２のリンカーとが、異なるプロテアーゼにより切断できるプロテアーゼによって切断可能な配列を含む。関連する実施形態では、プロテアーゼによって切断可能な配列が、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、またはマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）により切断可能な配列を含む。特定の実施形態では、プロテアーゼによって切断可能な配列が、ＭＭＰによって切断可能な配列である。この点において、前記マトリックスメタロプロテアーゼによって切断可能な配列は、マトリックスメタロプロテアーゼ１（ＭＭＰ−１）、マトリックスメタロプロテアーゼ２（ＭＭＰ−２）、マトリックスメタロプロテアーゼ９（ＭＭＰ−９）、またはマトリックスメタロプロテアーゼ１４（ＭＭＰ−１４）により切断可能な配列でありうる。
【００２７】
本明細書で記載される多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質の別の実施形態では、第１のリンカーが、１〜１０アミノ酸の長さであるか、または１〜２０アミノ酸の長さである。一部の実施形態では、第２のリンカーが、プロテアーゼによって切断できない配列を含むか、またはプロテアーゼによって切断可能な配列を含む。この点において、プロテアーゼによって切断可能な配列は、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、またはマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）により切断可能な配列でありうる。特定の実施形態では、プロテアーゼによって切断可能な配列が、ＭＭＰによって切断可能な配列であり、この点において、マトリックスメタロプロテアーゼ１（ＭＭＰ−１）、マトリックスメタロプロテアーゼ２（ＭＭＰ−２）、マトリックスメタロプロテアーゼ９（ＭＭＰ−９）、またはマトリックスメタロプロテアーゼ１４（ＭＭＰ−１４）により切断可能な配列から選択されるＭＭＰによって切断可能な配列でありうる。特定の実施形態では、第２のリンカーが、１〜１０アミノ酸の長さであるか、または１〜２０アミノ酸の長さである。
【００２８】
本開示の別の態様では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質が、ａ）標的抗原に結合するＦａｂ断片であって、ｉ）免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）および免疫グロブリン軽鎖定常領域（ＣＬ）；ならびにｉｉ）免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）および免疫グロブリン重鎖定常領域１（ＣＨ１）を含み；ＣＬ領域およびＣＨ１領域が、場合によって、ジスルフィド結合により接合されているＦａｂ断片と；ｂ）融合部分ＡのＣ末端が、ＶＨドメインのＮ末端側の終端部へと共有結合的に連結された融合部分Ａ；ｃ）融合部分ＢのＣ末端が、ＶＬドメインのＮ末端側の終端部へと共有結合的に連結された融合部分Ｂと；ｄ）場合によって、融合部分ＡとＶＨドメインとの間に位置する第１のリンカーと；ｅ）場合によって、融合部分ＢとＶＬドメインとの間に位置する第２のリンカーとを含み；ここで、融合部分Ａが、結合ドメインを含み、かつ／または融合部分Ｂが、結合ドメインを含み、さらに、結合ドメインの一方または両方が、細胞表面抗原に結合する。特定の実施形態では、細胞表面抗原が、腫瘍抗原である。特定の実施形態では、結合ドメインのうちの１つ（例えば、融合部分Ａまたは融合部分Ｂのうちの１つ）が、ヒト血清アルブミンに結合する。
【００２９】
本明細書で記載される多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質の別の実施形態では、Ｆａｂが、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＦＡＳ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＧＩＴＲ、ＬＴβＲ、ＴＬＲ、ＴＲＡＩＬ受容体１、ＴＲＡＩＬ受容体２、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥｒｂＢ３、ＣＤ２５、およびＣＤ２８の群より選択される標的抗原に結合する。具体的な実施形態では、Ｆａｂが、ＣＤ３に結合する。別の実施形態では、Ｆａｂが、Ｔ細胞受容体に結合する。Ｆａｂは、ヒト化することができる。特定の実施形態では、ヒト化Ｆａｂが、ＯＫＴ３、ＵＣＨＴ−１、またはＳＰ３４に由来する。一実施形態では、Ｆａｂが、一部の実施形態では、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、またはヒト抗体遺伝子トランスジェニックマウスから生成させた完全ヒト抗体に由来する。
【００３０】
本明細書で記載される多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質の一実施形態では、融合部分Ａが、第１の結合ドメインを含み、融合部分Ｂが、第２の結合ドメインを含み、ここで、第１の結合ドメインと第２の結合ドメインとが、同じ細胞表面抗原に結合し、ここで、第１の結合ドメインおよび第２の結合ドメインが、ＦｃγＲＩＩｂ、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＦＡＳ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＧＩＴＲ、ＬＴβＲ、ＴＬＲ、ＴＲＡＩＬ受容体１、ＴＲＡＩＬ受容体２、ＣＤ２８、ＣＥＡ、ＰＳＭＡ、ＢＣＭＡ、ＣＡＩＸ、ｃＭｅｔ、ＥＧＦＲ１、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥｒｂＢ３、ＥｐＣＡＭ、葉酸受容体、エフリン受容体、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ３７、ＣＤ３８、およびＣＤ１３８の群より選択される標的に結合する。
【００３１】
本明細書で記載される多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質のさらなる実施形態では、融合部分Ａが、第１の結合ドメインを含み、融合部分Ｂが、第２の結合ドメインを含み、ここで、第１の結合ドメインと第２の結合ドメインとが、異なる細胞表面抗原に結合し、ここで、第１の結合ドメインおよび第２の結合ドメインが、ＦｃγＲＩＩｂ、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＦＡＳ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＧＩＴＲ、ＬＴβＲ、ＴＬＲ、ＴＲＡＩＬ受容体１、ＴＲＡＩＬ受容体２、ＣＤ２８、ＣＥＡ、ＰＳＭＡ、ＢＣＭＡ、ＣＡＩＸ、ｃＭｅｔ、ＥＧＦＲ１、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥｒｂＢ３、ＥｐＣＡＭ、葉酸受容体、エフリン受容体、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ３７、ＣＤ３８、およびＣＤ１３８の群より選択される異なる標的に結合する。
【００３２】
多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質の特定の実施形態では、第１の結合ドメインおよび／または第２の結合ドメインが、抗体の抗原結合断片である。この点において、この抗原結合断片は、ｓｃＦｖ、ＣＤＲ、Ｆｖ、免疫グロブリンＶＬドメイン、免疫グロブリンＶＨドメイン、免疫グロブリンＶＬドメインおよびＶＨドメイン、Ｆａｂ、ラクダ科動物ＶＨＨ、ｄＡｂ（ドメイン抗体）からなる群より選択することができる。特定の実施形態では、抗原結合断片が、ヒト化されており、他の実施形態では、抗原結合断片が、マウスモノクローナル抗体、ラットモノクローナル抗体、またはウサギモノクローナル抗体に由来する。一部の実施形態では、抗原結合断片が、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、またはヒト抗体遺伝子トランスジェニックマウスから生成させうる完全ヒト抗体に由来する。
【００３３】
さらなる実施形態では、本明細書で記載されるＭＳＦＰの第１の結合ドメインおよび／または第２の結合ドメインが、フィブロネクチン３ドメイン（Ｆｎ３）、アンキリン（ａｎｋｒｙｉｎ）反復配列、およびアドネクチン（Ａｄｎｅｃｔｉｎ）からなる群より選択される。
【００３４】
本明細書で記載される多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質の一実施形態では、第１のリンカーおよび／または第２のリンカーが、配列番号１３３（ＰＬＧＬＡＧ）に示されるアミノ酸配列を含む。
【００３５】
本開示の一態様は、本明細書で記載される多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質をコードする単離ポリヌクレオチドと、この単離ポリヌクレオチドを含む発現ベクターと、このようなベクターを含む単離宿主細胞とを提供する。
【００３６】
本開示の別の態様は、本明細書で記載される多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質をコードする単離ポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、単離ポリヌクレオチドがこのコードされた多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質を発現する条件下で培養することにより、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質を発現させる方法を提供する。
【００３７】
本開示のさらなる態様は、本明細書で記載される１または複数の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。
【００３８】
本開示の別の態様は、状態を処置する方法であって、本明細書で記載される１または複数の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む有効量の医薬組成物を、それを必要とする被験体に投与するステップを含み、状態が、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質が結合しうる抗原と関連する方法を提供する。
【００３９】
本明細書で記載される多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質のさらなる実施形態では、融合部分Ａと融合部分Ｂとが、二量体化しない。
【００４０】
本開示の別の態様は、ＣＤ３イプシロンのＮ末端に結合するＦａｂ断片；Ｆａｂ断片のＶＬのＮ末端へと連結された融合部分Ａ；もしくはＦａｂ断片のＶＨのＮ末端へと連結された融合部分Ｂ；またはＦａｂ断片のＶＬのＮ末端へと連結された融合部分ＡおよびＦａｂ断片のＶＨのＮ末端へと連結された融合部分Ｂの両方を含む多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質を提供する。一実施形態では、Ｆａｂ断片が、ＣＤ３イプシロンのアミノ酸１〜２７内のエピトープに結合する。さらなる実施形態では、Ｆａｂ断片が、非ヒト霊長動物ＣＤ３イプシロンと交差反応する。
【００４１】
本明細書で開示される多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質の一実施形態では、ａ．Ｆａｂ断片が、ｉ．配列番号２６〜２８に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）および免疫グロブリン軽鎖定常領域（ＣＬ）；ならびにｉｉ．配列番号２３〜２５に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）および免疫グロブリン重鎖定常領域１（ＣＨ１）を含み；ここで、ＣＬ領域およびＣＨ１領域が、場合によって、ジスルフィド結合により接合されており；ｂ．融合部分ＡのＣ末端が、ＶＨドメインのＮ末端側の終端部へと共有結合的に連結されるか；もしくはｃ．融合部分ＢのＣ末端が、ＶＬドメインのＮ末端側の終端部へと共有結合的に連結されるか；またはｄ．ｂおよびｃの両方であり；ｅ．場合によって、第１のリンカーが、融合部分ＡとＶＨドメインとの間に位置し；ｆ．場合によって、第２のリンカーが、融合部分ＢとＶＬドメインとの間に位置する。一実施形態では、ＶＨが、配列番号３４、３８、４２、４６、５０、および５４に示されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つから選択される。別の実施形態では、ＶＬが、配列番号５６、５８、６２、６６、および７０に示されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つから選択される。別の実施形態では、融合部分Ａが、結合ドメインを含み、かつ／または融合部分Ｂが、結合ドメインを含む。一実施形態では、融合部分Ａの配列と、融合部分Ｂの配列とが、同一である。なお別の実施形態では、融合部分Ａと融合部分Ｂとが、異なる配列を含む。具体的な一実施形態では、融合部分Ａが、第１の結合ドメインを含み、融合部分Ｂが、第２の結合ドメインを含み、ここで、第１の結合ドメインと第２の結合ドメインとが、同じ細胞表面抗原に結合する。特定の実施形態では、融合部分Ａが、第１の結合ドメインを含み、融合部分Ｂが、第２の結合ドメインを含み、ここで、第１の結合ドメインと第２の結合ドメインとが、異なる細胞表面抗原に結合する。他の実施形態では、融合部分Ａが、第１の結合ドメインを含み、融合部分Ｂが、第２の結合ドメインを含み、ここで、第１の結合ドメインと第２の結合ドメインとが、同じエピトープに結合する。別の実施形態では、融合部分Ａが、第１の結合ドメインを含み、融合部分Ｂが、第２の結合ドメインを含み、ここで、第１の結合ドメインと第２の結合ドメインとが、異なるエピトープに結合する。
【００４２】
本明細書で開示される多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質の一実施形態では、Ｆａｂ断片のＣＤ３への結合が、融合部分Ａおよび融合部分Ｂにより引き起こされる立体障害により阻害される。この点において、この立体障害の結果として、第１の結合ドメインおよび第２の結合ドメインの、細胞表面抗原への結合の非存在下では、Ｆａｂ断片のＣＤ３への検出可能な結合がもたらされない。別の実施形態では、Ｆａｂ断片のＣＤ３への結合が、第１の結合ドメインおよび第２の結合ドメインの、細胞表面抗原への結合の非存在下では、第１の結合ドメインおよび第２の結合ドメインの、細胞表面抗原への結合の存在下におけるＦａｂ断片のＣＤ３への結合と比較して５０％〜９０％の間だけ低減される。さらなる実施形態では、Ｆａｂ断片のＣＤ３への結合が、融合部分Ａおよび融合部分Ｂを有さない同一のＦａｂ断片の結合と比較して５０％〜９０％の間だけ低減される。
【００４３】
本明細書で開示される多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質の別の実施形態では、免疫グロブリン重鎖定常領域の種類が、α、δ、ε、γ、およびμから選択される。一実施形態では、免疫グロブリン重鎖が、ＩｇＧ抗体に由来する。さらなる実施形態では、ＩｇＧ抗体のアイソタイプが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４から選択される。別の実施形態では、免疫グロブリン軽鎖のＶＬおよびＣＬが、免疫グロブリンカッパ軽鎖および免疫グロブリンラムダ軽鎖から選択される。
【００４４】
本明細書で開示される多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質の一実施形態では、融合部分Ａが、ｓｃＦｖの抗原結合ドメインを含む第１の結合ドメインを含む。
【００４５】
多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質の別の実施形態では、第１のリンカーおよび第２のリンカーが、１〜２０アミノ酸の長さである。具体的な一実施形態では、第１のリンカーおよび／または第２のリンカーが、ＧｌｙＡｒｇＡｌａを含む。
【００４６】
本明細書で開示される多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質の一実施形態では、Ｆａｂが、ヒト化されている。
【００４７】
本明細書で開示される多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質のなお別の実施形態では、第１の結合ドメインおよび第２の結合ドメインが、ＦｃγＲＩＩｂ、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＦＡＳ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＧＩＴＲ、ＬＴβＲ、ＴＬＲ、ＴＲＡＩＬ受容体１、ＴＲＡＩＬ受容体２、ＣＤ２８、ＣＥＡ、ＰＳＭＡ、ＢＣＭＡ、ＣＡＩＸ、ｃＭｅｔ、ＥＧＦＲ１、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥｒｂＢ３、ＥｐＣＡＭ、葉酸受容体、エフリン受容体、ＴＲＡＩＬ受容体２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ３７、ＣＤ３８、およびＣＤ１３８の群より選択される標的に結合する。一実施形態では、第１の結合ドメインおよび第２の結合ドメインが、配列番号７８、８８、および９４に示されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つから選択される。
【００４８】
別の実施形態では、第１の結合ドメインおよび第２の結合ドメインが、ＦｃγＲＩＩｂ、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＦＡＳ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＧＩＴＲ、ＬＴβＲ、ＴＬＲ、ＴＲＡＩＬ受容体１、ＴＲＡＩＬ受容体２、ＣＤ２８、ＣＥＡ、ＰＳＭＡ、ＢＣＭＡ、ＣＡＩＸ、ｃＭｅｔ、ＥＧＦＲ１、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥｒｂＢ３、ＥｐＣＡＭ、葉酸受容体、エフリン受容体、ＴＲＡＩＬ受容体２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ３７、ＣＤ３８、およびＣＤ１３８からなる群より選択される異なる標的に結合する。
【００４９】
一実施形態では、第１の結合ドメインおよび／または第２の結合ドメインが、抗体の抗原結合断片である。別の実施形態では、抗原結合断片が、ｓｃＦｖ、ＣＤＲ、Ｆｖ、免疫グロブリンＶＬドメイン、免疫グロブリンＶＨドメイン、免疫グロブリンＶＬドメインおよびＶＨドメイン、Ｆａｂ、ラクダ科動物ＶＨＨ、ｄＡｂからなる群より選択される。なおさらなる実施形態では、抗原結合断片が、ヒト化されている。他の実施形態では、抗原結合断片が、マウスモノクローナル抗体、ラットモノクローナル抗体、またはウサギモノクローナル抗体に由来し、抗原結合断片はまた、完全ヒト抗体にも由来しうる。この点では、完全ヒト抗体を、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、またはヒト抗体遺伝子トランスジェニックマウスから生成させる。
【００５０】
一実施形態では、抗原結合断片が、１）配列番号１３９〜１４４のそれぞれに示されるＶＨＣＤＲおよびＶＬＣＤＲを含むか；２）配列番号１４５〜１５０のそれぞれに示されるＶＨＣＤＲおよびＶＬＣＤＲを含むか；３）配列番号７８、８８、および９４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列に示されるｓｃＦｖ内に存在するＶＨを含むか；４）配列番号７８、８８、および９４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列に示されるｓｃＦｖ内に存在するＶＬを含むか；または５）配列番号７８、８８、および９４に示されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つから選択されるＳｃＦｖを含む。
【００５１】
多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質の特定の実施形態では、ＣＬ領域が、ノブ変異またはホール変異を含み、ＣＨ１領域が、ＣＬ領域とＣＨ１領域とが安定的に相互作用するように、対応するノブ変異またはホール変異を含む。
【００５２】
別の実施形態では、本明細書で開示される多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質が、配列番号８４、９０、９６、および１００から選択されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つ；ならびに配列番号３２、６０、６４、６８、および７２から選択されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つを含む。さらなる実施形態では、本開示の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質が、配列番号８６、９２、９８、および１０２から選択されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つ；ならびに配列番号３０、３６、４０、４４、４８、および５２から選択されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つを含む。特定の実施形態では、ＣＬ領域とＣＨ１領域とが、ジスルフィド結合により接合されている。
【００５３】
本開示の別の態様は、本明細書で開示される多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質のうちのいずれかをコードする単離ポリヌクレオチドと、この単離ポリヌクレオチドを含む発現ベクターとを提供する。本開示はまた、このようなベクターを含む単離宿主細胞も提供する。本開示はまた、宿主細胞を、単離ポリヌクレオチドがこのコードされた多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質を発現する条件下で培養することにより、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質を発現させる方法も提供する。
【００５４】
本開示はまた、本明細書で記載される多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物も提供する。
【００５５】
本開示の別の態様は、がんを処置する方法であって、本明細書で記載される多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む有効量の医薬組成物を、がんを有するか、またはがんを有することが疑われる被験体に投与するステップを含み、がんが、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質が結合しうる抗原と関連する方法を提供する。
本発明の好ましい実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
ＣＤ３イプシロンのＮ末端に結合するＦａｂ断片；前記Ｆａｂ断片のＶＬのＮ末端へと連結された融合部分Ａ；もしくは前記Ｆａｂ断片のＶＨのＮ末端へと連結された融合部分Ｂ；または前記Ｆａｂ断片のＶＬのＮ末端へと連結された融合部分Ａおよび前記Ｆａｂ断片のＶＨのＮ末端へと連結された融合部分Ｂの両方を含む多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目２）
前記Ｆａｂ断片が、ＣＤ３イプシロンのアミノ酸１〜２７内のエピトープに結合する、項目１に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目３）
前記Ｆａｂ断片が、非ヒト霊長動物ＣＤ３イプシロンと交差反応する、項目１または項目２に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目４）
ａ．前記Ｆａｂ断片が、
ｉ．配列番号２６〜２８に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）および免疫グロブリン軽鎖定常領域（ＣＬ）；ならびに
ｉｉ．配列番号２３〜２５に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）および免疫グロブリン重鎖定常領域１（ＣＨ１）を含み；
前記ＣＬ領域およびＣＨ１領域が、場合によって、ジスルフィド結合により接合され；
ｂ．前記融合部分ＡのＣ末端が、前記ＶＨドメインのＮ末端側の終端部へと共有結合的に連結されるか；もしくは
ｃ．前記融合部分ＢのＣ末端が、前記ＶＬドメインのＮ末端側の終端部へと共有結合的に連結されるか；または
ｄ．ｂおよびｃの両方であり；
ｅ．場合によって、第１のリンカーが、前記融合部分Ａと前記ＶＨドメインとの間に位置し；かつ
ｆ．場合によって、第２のリンカーが、前記融合部分Ｂと前記ＶＬドメインとの間に位置する、項目１に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目５）
前記ＶＨが、配列番号３４、３８、４２、４６、５０、および５４に示されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つから選択される、項目４に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目６）
ＶＬが、配列番号５６、５８、６２、６６、および７０に示されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つから選択される、項目４に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目７）
前記融合部分Ａが、結合ドメインを含む、項目４に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目８）
前記融合部分Ｂが、結合ドメインを含む、項目４に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目９）
前記融合部分Ａおよび前記融合部分Ｂの配列が同一である、項目４に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目１０）
前記融合部分Ａと前記融合部分Ｂとが、異なる配列を含む、項目４に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目１１）
前記融合部分Ａが、第１の結合ドメインを含み、前記融合部分Ｂが、第２の結合ドメインを含み、前記第１の結合ドメインと前記第２の結合ドメインとが、同じ細胞表面抗原に結合する、項目４に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目１２）
前記融合部分Ａが、第１の結合ドメインを含み、前記融合部分Ｂが、第２の結合ドメインを含み、前記第１の結合ドメインと前記第２の結合ドメインとが、異なる細胞表面抗原に結合する、項目４に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目１３）
前記融合部分Ａが、第１の結合ドメインを含み、前記融合部分Ｂが、第２の結合ドメインを含み、前記第１の結合ドメインと前記第２の結合ドメインとが、同じエピトープに結合する、項目４に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目１４）
前記融合部分Ａが、第１の結合ドメインを含み、前記融合部分Ｂが、第２の結合ドメインを含み、前記第１の結合ドメインと前記第２の結合ドメインとが、異なるエピトープに結合する、項目４に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目１５）
前記Ｆａｂ断片のＣＤ３への結合が、前記融合部分Ａおよび前記融合部分Ｂにより引き起こされる立体障害により阻害される、項目１１に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目１６）
前記立体障害の結果として、前記第１の結合ドメインおよび前記第２の結合ドメインの、前記細胞表面抗原への結合の非存在下では、前記Ｆａｂ断片のＣＤ３への検出可能な結合がもたらされない、項目１５に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目１７）
前記Ｆａｂ断片のＣＤ３への前記結合が、前記第１の結合ドメインおよび前記第２の結合ドメインの、前記細胞表面抗原への結合の非存在下では、前記第１の結合ドメインおよび前記第２の結合ドメインの、前記細胞表面抗原への結合の存在下における前記Ｆａｂ断片のＣＤ３への前記結合と比較して５０％〜９０％の間だけ低減される、項目１５に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目１８）
前記Ｆａｂ断片のＣＤ３への前記結合が、前記融合部分Ａおよび前記融合部分Ｂを有さない同一のＦａｂ断片の結合と比較して５０％〜９０％の間だけ低減される、項目１５に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目１９）
前記免疫グロブリン重鎖定常領域の種類が、α、δ、ε、γ、およびμから選択される、項目４に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目２０）
前記免疫グロブリン重鎖が、ＩｇＧ抗体に由来する、項目４に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目２１）
前記ＩｇＧ抗体のアイソタイプが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４から選択される、項目２０に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目２２）
前記免疫グロブリン軽鎖のＶＬおよびＣＬが、免疫グロブリンカッパ軽鎖および免疫グロブリンラムダ軽鎖から選択される、項目４に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目２３）
前記融合部分Ａが、ｓｃＦｖの抗原結合ドメインを含む第１の結合ドメインを含む、項目４に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目２４）
前記第１のリンカーおよび前記第２のリンカーが、１〜２０アミノ酸の長さである、項目４に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目２５）
前記第１のリンカーおよび前記第２のリンカーが、ＧｌｙＡｒｇＡｌａを含む、項目２４に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目２６）
前記Ｆａｂがヒト化されている、項目４に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目２７）
前記第１の結合ドメインおよび前記第２の結合ドメインが、ＦｃγＲＩＩｂ、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＦＡＳ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＧＩＴＲ、ＬＴβＲ、ＴＬＲ、ＴＲＡＩＬ受容体１、ＴＲＡＩＬ受容体２、ＣＤ２８、ＣＥＡ、ＰＳＭＡ、ＢＣＭＡ、ＣＡＩＸ、ｃＭｅｔ、ＥＧＦＲ１、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥｒｂＢ３、ＥｐＣＡＭ、葉酸受容体、エフリン受容体、ＴＲＡＩＬ受容体２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ３７、ＣＤ３８、およびＣＤ１３８の群より選択される標的に結合する、項目１１に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目２８）
前記第１の結合ドメインおよび前記第２の結合ドメインが、配列番号７８、８８、および９４に示されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つから選択される、項目２７に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目２９）
前記第１の結合ドメインおよび前記第２の結合ドメインが、ＦｃγＲＩＩｂ、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＦＡＳ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＧＩＴＲ、ＬＴβＲ、ＴＬＲ、ＴＲＡＩＬ受容体１、ＴＲＡＩＬ受容体２、ＣＤ２８、ＣＥＡ、ＰＳＭＡ、ＢＣＭＡ、ＣＡＩＸ、ｃＭｅｔ、ＥＧＦＲ１、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥｒｂＢ３、ＥｐＣＡＭ、葉酸受容体、エフリン受容体、ＴＲＡＩＬ受容体２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ３７、ＣＤ３８、およびＣＤ１３８からなる群より選択される異なる標的に結合する、項目１２に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目３０）
前記第１の結合ドメインおよび／または前記第２の結合ドメインが、抗体の抗原結合断片である、項目７または項目８に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目３１）
前記抗原結合断片が、ｓｃＦｖ、ＣＤＲ、Ｆｖ、免疫グロブリンＶＬドメイン、免疫グロブリンＶＨドメイン、免疫グロブリンＶＬドメインおよびＶＨドメイン、Ｆａｂ、ラクダ科動物ＶＨＨ、ｄＡｂからなる群より選択される、項目３０に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目３２）
前記抗原結合断片がヒト化されている、項目３０に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目３３）
前記抗原結合断片が、マウスモノクローナル抗体、ラットモノクローナル抗体、またはウサギモノクローナル抗体に由来する、項目３０に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目３４）
前記抗原結合断片が、完全ヒト抗体に由来する、項目３０に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目３５）
前記完全ヒト抗体が、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、またはヒト抗体遺伝子トランスジェニックマウスから生成される、項目３４に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目３６）
前記抗原結合断片が、１）配列番号１３９〜１４４のそれぞれに示されるＶＨＣＤＲおよびＶＬＣＤＲを含むか；２）配列番号１４５〜１５０のそれぞれに示されるＶＨＣＤＲおよびＶＬＣＤＲを含むか；３）配列番号７８、８８、および９４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列に示されるｓｃＦｖ内に存在するＶＨを含むか；４）配列番号７８、８８、および９４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列に示されるｓｃＦｖ内に存在するＶＬを含むか；または５）配列番号７８、８８、および９４に示されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つから選択されるｓｃＦｖを含む、項目３０に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目３７）
前記ＣＬ領域が、ノブ変異またはホール変異を含み、前記ＣＨ１領域が、前記ＣＬ領域と前記ＣＨ１領域とが安定的に相互作用するように、対応するノブ変異またはホール変異を含む、項目４に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目３８）
配列番号８４、９０、９６、および１００から選択されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つ；ならびに配列番号３２、６０、６４、６８、および７２から選択されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つを含む、項目４に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目３９）
配列番号８６、９２、９８、および１０２から選択されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つ；ならびに配列番号３０、３６、４０、４４、４８、および５２から選択されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つを含む、項目４に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目４０）
前記ＣＬ領域と前記ＣＨ１領域とが、ジスルフィド結合により接合されている、項目３８または項目３９に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目４１）
項目１から３７のいずれか一項に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質をコードする単離ポリヌクレオチド。
（項目４２）
項目４１に記載の単離ポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
（項目４３）
項目４２に記載のベクターを含む単離宿主細胞。
（項目４４）
項目４３に記載の宿主細胞を、単離ポリヌクレオチドが、コードされた多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質を発現する条件下で培養することにより、前記多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質を発現させる方法。
（項目４５）
項目１から４０のいずれか一項に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
（項目４６）
がんを処置するための方法であって、有効量の、項目４５に記載の医薬組成物を、前記がんを有するか、または前記がんを有することが疑われる被験体に投与するステップを含み、前記がんは、前記多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質が結合しうる抗原と関連する、方法。
（項目４７）
前記第１のリンカーまたは前記第２のリンカーを含まない、項目４に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目４８）
ａ．標的抗原に結合するＦａｂ断片であって、
ｉ．免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）および免疫グロブリン軽鎖定常領域（ＣＬ）；ならびに
ｉｉ．免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）および免疫グロブリン重鎖定常領域１（ＣＨ１）を含み；
前記ＣＬ領域およびＣＨ１領域が、場合によって、ジスルフィド結合により接合されている、Ｆａｂ断片と；
ｂ．融合部分Ａであって、前記融合部分ＡのＣ末端が、前記ＶＨドメインのＮ末端側の終端部へと共有結合的に連結される、融合部分Ａ；もしくは
ｃ．融合部分Ｂであって、前記融合部分ＢのＣ末端が、前記ＶＬドメインのＮ末端側の終端部へと共有結合的に連結される、融合部分Ｂ；または
ｄ．ｂおよびｃの両方と；
ｅ．場合によって、前記融合部分Ａと前記ＶＨドメインとの間に位置する第１のリンカーと；
ｆ．場合によって、前記融合部分Ｂと前記ＶＬドメインとの間に位置する第２のリンカーと
を含む、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目４９）
前記融合部分Ａが、結合ドメインを含む、項目４８に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目５０）
前記融合部分Ｂが、結合ドメインを含む、項目４８に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目５１）
前記融合部分Ａおよび前記融合部分Ｂの配列が同一である、項目４８に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目５２）
前記融合部分Ａと前記融合部分Ｂとが、異なる配列を含む、項目４８に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目５３）
前記融合部分Ａが、第１の結合ドメインを含み、前記融合部分Ｂが、第２の結合ドメインを含み、前記第１の結合ドメインと前記第２の結合ドメインとが、同じ細胞表面抗原に結合する、項目４８に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目５４）
前記融合部分Ａが、第１の結合ドメインを含み、前記融合部分Ｂが、第２の結合ドメインを含み、前記第１の結合ドメインと前記第２の結合ドメインとが、異なる細胞表面抗原に結合する、項目４８に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目５５）
前記融合部分Ａが、第１の結合ドメインを含み、前記融合部分Ｂが、第２の結合ドメインを含み、前記第１の結合ドメインと前記第２の結合ドメインとが、同じエピトープに結合する、項目４８に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目５６）
前記融合部分Ａが、第１の結合ドメインを含み、前記融合部分Ｂが、第２の結合ドメインを含み、前記第１の結合ドメインと前記第２の結合ドメインとが、異なるエピトープに結合する、項目４８に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目５７）
前記Ｆａｂ断片が、細胞表面の標的抗原に結合する、項目４８に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目５８）
前記融合部分Ａが、結合ドメインを含み、前記Ｆａｂ断片が、前記結合ドメインと同じ細胞表面抗原に結合する、項目５７に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目５９）
前記融合部分Ｂが、結合ドメインを含み、前記Ｆａｂ断片が、前記結合ドメインと同じ細胞表面抗原に結合する、項目５７に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目６０）
前記Ｆａｂ断片の前記抗原への結合が、前記融合部分Ａおよび前記融合部分Ｂにより引き起こされる立体障害により阻害される、項目５３に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目６１）
前記立体障害の結果として、前記第１の結合ドメインおよび前記第２の結合ドメインの、前記細胞表面抗原への結合の非存在下では、前記Ｆａｂ断片の前記抗原への検出可能な結合がもたらされない、項目６０に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目６２）
前記Ｆａｂ断片の前記Ｆａｂ標的への前記結合が、前記第１の結合ドメインおよび前記第２の結合ドメインの、前記細胞表面抗原への結合の非存在下では、前記細胞表面抗原に対する前記第１の結合ドメインおよび前記第２の結合ドメインの存在下における同一のＦａｂ断片の前記Ｆａｂ標的への結合と比較して５０％〜９０％の間だけ低減される、項目６０に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目６３）
前記第１のリンカーおよび前記第２のリンカーが、切断可能である、項目４８に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目６４）
前記第１のリンカーが切断されたとき、前記Ｆａｂ断片の前記抗原への結合が検出可能である、項目６３に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目６５）
前記第２のリンカーが切断されたとき、前記Ｆａｂ断片の前記抗原への結合が検出可能である、項目６３に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目６６）
前記第１のリンカーおよび前記第２のリンカーの両方が切断されたとき、前記Ｆａｂ断片の前記抗原への前記結合が検出可能である、項目６３に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目６７）
前記免疫グロブリン重鎖定常領域の種類が、α、δ、ε、γ、およびμから選択される、項目４８に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目６８）
前記免疫グロブリン重鎖が、ＩｇＧ抗体に由来する、項目４８に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目６９）
前記ＩｇＧ抗体のアイソタイプが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４から選択される、項目６８に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目７０）
前記免疫グロブリン軽鎖のＶＬおよびＣＬが、免疫グロブリンカッパ軽鎖および免疫グロブリンラムダ軽鎖から選択される、項目４８に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目７１）
前記融合部分Ａが、ｓｃＦｖの抗原結合ドメインを含む第１の結合ドメインを含む、項目４８に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目７２）
前記第１のリンカーが、プロテアーゼによって切断できない配列を含む、項目４８に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目７３）
前記第２のリンカーが、プロテアーゼによって切断可能な配列を含む、項目７２に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目７４）
前記第１のリンカーが、プロテアーゼによって切断可能な配列を含む、項目４８に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目７５）
前記第２のリンカーが、切断できない配列を含む、項目７４に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目７６）
前記第２のリンカーが、プロテアーゼによって切断可能な配列を含む、項目４８に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目７７）
前記第１のリンカーと前記第２のリンカーとが、同じプロテアーゼにより切断できるプロテアーゼによって切断可能な配列を含む、項目７６に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目７８）
前記第１のリンカーと前記第２のリンカーとが、異なるプロテアーゼにより切断できるプロテアーゼによって切断可能な配列を含む、項目７６に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目７９）
前記プロテアーゼによって切断可能な配列が、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、またはマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）により切断可能な配列を含む、項目４８に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目８０）
前記プロテアーゼによって切断可能な配列が、ＭＭＰによって切断可能な配列である、項目７９に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目８１）
前記マトリックスメタロプロテアーゼによって切断可能な配列が、マトリックスメタロプロテアーゼ１（ＭＭＰ−１）、マトリックスメタロプロテアーゼ２（ＭＭＰ−２）、マトリックスメタロプロテアーゼ９（ＭＭＰ−９）、またはマトリックスメタロプロテアーゼ１４（ＭＭＰ−１４）により切断可能な配列である、項目８０に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目８２）
前記第１のリンカーが、１〜１０アミノ酸の長さである、項目４８に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目８３）
前記第１のリンカーが、１〜２０アミノ酸の長さである、項目４８に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目８４）
前記第２のリンカーが、プロテアーゼによって切断できない配列を含む、項目４８に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目８５）
前記第２のリンカーが、プロテアーゼによって切断可能な配列を含む、項目４８に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目８６）
前記プロテアーゼによって切断可能な配列が、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、またはマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）により切断可能な配列である、項目８５に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目８７）
前記プロテアーゼによって切断可能な配列が、ＭＭＰによって切断可能な配列である、項目８６に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目８８）
前記マトリックスメタロプロテアーゼによって切断可能な配列が、マトリックスメタロプロテアーゼ１（ＭＭＰ−１）、マトリックスメタロプロテアーゼ２（ＭＭＰ−２）、マトリックスメタロプロテアーゼ９（ＭＭＰ−９）、またはマトリックスメタロプロテアーゼ１４（ＭＭＰ−１４）によって切断可能な配列である、項目８７に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目８９）
前記第２のリンカーが、１〜１０アミノ酸の長さである、項目４８に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目９０）
前記第２のリンカーが、１〜２０アミノ酸の長さである、項目４８に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目９１）
前記結合ドメインが、細胞表面抗原に結合する、項目４９に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目９２）
前記細胞表面抗原が、腫瘍抗原である、項目９１に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目９３）
前記結合ドメインが、細胞表面抗原に結合する、項目５０に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目９４）
前記細胞表面抗原が、腫瘍抗原である、項目９１に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目９５）
前記結合ドメインが、ヒト血清アルブミンに結合する、項目４９に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目９６）
前記結合ドメインが、ヒト血清アルブミンに結合する、項目５０に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目９７）
前記Ｆａｂが、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＦＡＳ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＧＩＴＲ、ＬＴβＲ、ＴＬＲ、ＴＲＡＩＬ受容体１、ＴＲＡＩＬ受容体２、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥｒｂＢ３、ＣＤ２５、およびＣＤ２８の群より選択される標的抗原に結合する、項目４８に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目９８）
前記Ｆａｂが、ＣＤ３に結合する、項目４８に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目９９）
前記Ｆａｂが、ヒト化されている、項目４８に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目１００）
前記ヒト化Ｆａｂが、ＵＣＨＴ−１またはＳＰ３４に由来する、項目９９に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目１０１）
前記Ｆａｂが、完全ヒト抗体に由来する、項目４８に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目１０２）
前記完全ヒト抗体が、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、またはヒト抗体遺伝子トランスジェニックマウスから生成される、項目１０１に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目１０３）
前記第１の結合ドメインおよび前記第２の結合ドメインが、ＦｃγＲＩＩｂ、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＦＡＳ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＧＩＴＲ、ＬＴβＲ、ＴＬＲ、ＴＲＡＩＬ受容体１、ＴＲＡＩＬ受容体２、ＣＤ２８、ＣＥＡ、ＰＳＭＡ、ＢＣＭＡ、ＣＡＩＸ、ｃＭｅｔ、ＥＧＦＲ１、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥｒｂＢ３、ＥｐＣＡＭ、葉酸受容体、エフリン受容体、テール受容体２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ３７、ＣＤ３８、およびＣＤ１３８の群より選択される標的に結合する、項目５３に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目１０４）
前記第１の結合ドメインおよび前記第２の結合ドメインが、ＦｃγＲＩＩｂ、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＦＡＳ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＧＩＴＲ、ＬＴβＲ、ＴＬＲ、ＴＲＡＩＬ受容体１、ＴＲＡＩＬ受容体２、ＣＤ２８、ＣＥＡ、ＰＳＭＡ、ＢＣＭＡ、ＣＡＩＸ、ｃＭｅｔ、ＥＧＦＲ１、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥｒｂＢ３、ＥｐＣＡＭ、葉酸受容体、エフリン受容体、テール受容体２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ３７、ＣＤ３８、およびＣＤ１３８の群より選択される異なる標的に結合する、項目５４に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目１０５）
前記第１の結合ドメインおよび／または前記第２の結合ドメインが、抗体の抗原結合断片である、項目４９または項目５０に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目１０６）
前記抗原結合断片が、ｓｃＦｖ、ＣＤＲ、Ｆｖ、免疫グロブリンＶＬドメイン、免疫グロブリンＶＨドメイン、免疫グロブリンＶＬドメインおよびＶＨドメイン、Ｆａｂ、ラクダ科動物ＶＨＨ、ｄＡｂからなる群より選択される、項目１０５に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目１０７）
前記第１の結合ドメインおよび／または前記第２の結合ドメインが、フィブロネクチン３ドメイン（Ｆｎ３）、アンキリン反復配列、およびアドネクチンからなる群より選択される、項目４９または項目５０に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目１０８）
前記抗原結合断片が、ヒト化されている、項目１０５に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目１０９）
前記抗原結合断片が、マウスモノクローナル抗体、ラットモノクローナル抗体、またはウサギモノクローナル抗体に由来する、項目１０５に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目１１０）
前記抗原結合断片が、完全ヒト抗体に由来する、項目１０５に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目１１１）
前記完全ヒト抗体が、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、またはヒト抗体遺伝子トランスジェニックマウスから生成される、項目１１０に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目１１２）
前記第１のリンカーおよび／または前記第２のリンカーが、配列番号１３３（ＰＬＧＬＡＧ）に示されるアミノ酸配列を含む、項目４８に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目１１３）
項目４８から１１２のいずれか一項に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質をコードする単離ポリヌクレオチド。
（項目１１４）
項目１１３に記載の単離ポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
（項目１１５）
項目１１４に記載のベクターを含む単離宿主細胞。
（項目１１６）
項目１１５に記載の宿主細胞を、単離ポリヌクレオチドが、コードされた多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質を発現する条件下で培養することにより、前記多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質を発現させる方法。
（項目１１７）
項目４８から１１２のいずれか一項に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
（項目１１８）
状態を処置する方法であって、有効量の、項目１１７に記載の医薬組成物を、状態の処置を必要とする被験体に投与するステップを含み、前記状態が、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質が結合しうる抗原と関連する、方法。
（項目１１９）
前記第１のリンカーまたは前記第２のリンカーを含まない、項目４８に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目１２０）
前記融合部分Ａが、１つ〜３つのＣ末端のアミノ酸残基を欠失しているか；または前記融合部分Ｂが、１つ〜３つのＣ末端のアミノ酸残基を欠失しているか；または前記融合部分Ａおよび前記融合部分Ｂの両方が、１つ〜３つのＣ末端のアミノ酸残基を欠失している、項目１１９に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目１２１）
前記ＶＨのＮ末端側の終端部が、１つ〜３つのアミノ酸残基を欠失しているか；または前記ＶＬのＮ末端側の終端部が、１つ〜３つのアミノ酸残基を欠失しているか；または前記ＶＨのＮ末端側の終端部および前記ＶＬのＮ末端側の終端部の両方が、１つ〜３つのアミノ酸残基を欠失している、項目１１９に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目１２２）
前記融合部分Ａおよび前記融合部分Ｂの両方が、１つ〜３つのＣ末端のアミノ酸残基を欠失し；前記ＶＨのＮ末端側の終端部および前記ＶＬのＮ末端側の終端部の両方が、１つ〜３つのアミノ酸残基を欠失している、項目１１９に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目１２３）
標的抗原に結合するＦａｂ断片；前記Ｆａｂ断片のＶＬのＮ末端においてカップリングさせた第１の融合部分；および前記Ｆａｂ断片のＶＨのＮ末端においてカップリングさせた第２の融合部分を含む、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
（項目１２４）
前記Ｆａｂ断片の前記Ｆａｂ標的抗原への結合が、前記第１の融合部分および第２の融合部分の非存在下では、同一のＦａｂ断片の前記Ｆａｂ標的への結合と比較して７０％〜９０％の間だけ低減される、項目１２３に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】図１は、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質（ＭＳＦＰ）を描示する概略図である。単一ドメインタンパク質またはマルチドメインタンパク質である融合部分Ａおよび融合部分Ｂは、プロテアーゼにより切断可能または切断不可能なリンカー配列を介してＦａｂ断片のＮ末端側の終端部へと共有結合的に融合されている。融合部分Ａおよび融合部分Ｂは、抗原特異的結合能を有する場合もあり、抗原特異的結合能を有さない場合もある。
【図２】図２は、ＭＳＦＰ内の融合部分の異なる立体配座、およびＦａｂの、細胞表面標的または標的の可溶性形態に対する結合アフィニティーの相対強度を描示する概略図である。図の下パネルは、ＭＳＦＰ内の融合部分の立体配座的可撓性を示す。
【図３】図３は、異なる融合フォーマットによるＦａｂの、可溶性標的および細胞表面標的に対する結合特性を例示する概略図である。Ａは、Ｆａｂの構造、Ｎ末端のうちの一方において単一の融合部分を伴うＦａｂ融合タンパク質、およびＦａｂのＮ末端の両方において融合部分を伴うＦａｂ融合タンパク質を示す図であり；Ｂは、その可溶性標的への結合が可能な３つのＦａｂ融合フォーマット全てによるＦａｂを描示する概略図であり；Ｃは、ＦａｂのＮ末端において融合体を伴わないＦａｂドメインおよび単一の融合部分を伴うＦａｂドメインは、細胞表面上でその標的に結合しうるが、Ｈ鎖およびＬ鎖の両方のＮ末端において融合体を伴うＦａｂドメインは、もはや立体障害に起因して細胞表面上に存在するその標的に結合することが可能でないことを描示する概略図である。
【図４】図４は、ＭＳＦＰがＴ細胞へと結合するのに必要な状態を描示する概略図である。Ａは、Ｈ鎖およびＬ鎖の両方のＮ末端において抗腫瘍抗体の細胞表面標的結合部分を伴うＭＳＦＰが、腫瘍会合抗原（ＴＡＡ）を介して腫瘍細胞に結合しうるが、Ｔ細胞上のＣＤ３には結合しないことを示す図であり（アフィニティーの劇的な低減のため；図３Ｃを参照されたい）；Ｂは、Ｔ細胞上のＣＤ３に対する結合アフィニティーの低いＭＳＦＰ分子が、腫瘍細胞とＴ細胞とを、アビディティー効果により効果的に係合させうる場合を示す図である。代表的なＭＳＦＰ分子は、ＴＡＡ結合を介して腫瘍細胞上で集塊をなし、ＣＤ３結合アームがアビディティーを介してＴ細胞に結合する結果として、腫瘍細胞とＴ細胞との架橋形成をもたらす。
【図５】図５は、抗腫瘍細胞の単一の細胞表面標的結合部分を伴うＦａｂ融合体（またはＨ鎖およびＬ鎖の両方における、Ｆａｂ融合体に由来する単一アームの切断産物）が、腫瘍細胞およびＴ細胞の両方で標的に結合する結果として、２つの細胞型の架橋形成をもたらしうることを描示する概略図である。
【図６】図６Ａは、融合部分としての２つの単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）ドメインを示す、Ｆａｂｅの概略図である。Ｆａｂｅとは、Ｆａｂの結合標的が、Ｔ細胞上のＣＤ３イプシロン鎖もしくはＴ細胞受容体、ＮＫ細胞上のＮＫＧ２Ｄ、またはＮＫ上、単球系細胞上、およびマクロファージ上のＦｃガンマ受容体など、免疫細胞表面のエフェクター分子であるＭＳＦＰを指す。２つのｓｃＦｖドメインは、同じ特異性を有する場合もあり、異なる特異性を有する場合もある。図６Ｂは、一次配列内のタンパク質ドメインおよび鎖間ジスルフィド結合の概略図である。ＣＨとＣＬとの間の鎖間ジスルフィド結合は、任意選択である。ｓｃＦｖの立体構成は、ＶＨ−ＶＬの場合もあり、ＶＬ−ＶＨの場合もあり、ｓｃＦｖ１内およびｓｃＦｖ２内のＶＨの立体構成とＶＬの立体構成とは、同じ場合もあり、異なる場合もある。
【図７】図７Ａは、融合部分としての２つの単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）ドメインを示すＦａｂｅ−ａｌｂｕの概略図である。Ｆａｂｅ−ａｌｂｕとは、Ｆａｂｅの特定の種類であって、１つのｓｃＦｖがヒトアルブミンに対する結合特異性を有し、第２のｓｃＦｖが腫瘍細胞の表面抗原（ＴＡＡ）に対する結合特異性を有する種類を指す。図７Ｂは、一次配列内のタンパク質ドメインおよび鎖間ジスルフィド結合の概略図である。ｓｃＦｖの立体構成は、ＶＨ−ＶＬの場合もあり、ＶＬ−ＶＨの場合もあり、ｓｃＦｖ１およびｓｃＦｖ２内のＶＨの立体構成とＶＬの立体構成とは、同じ場合もあり、異なる場合もある。
【図８】図８は、マウス抗ヒトＣＤ３抗体である１Ｆ３およびヒト化１Ｆ３抗体であるｈｕ−１Ｆ３についての、４〜２０％のトリスグリシンによるＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル解析）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を示す図である。ゲルは、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて染色した。「ＮＲ」とは、非還元条件下であり、「Ｒ」とは、５％のメルカプトエタノールを伴う還元条件下である。タンパク質バンドは、両方の抗体が、通常サイズの無傷ＩｇＧであるＩｇＧＨＣ、およびＩｇＧＬＣを有することを示す。
【図９】図９は、マウス抗ＣＤ３抗体であるｍｕ−１Ｆ３およびヒト化抗ＣＤ３抗体であるｈｕ−１Ｆ３による、還元して変性させた組換えＣＤ３類縁タンパク質の検出を示す図である。表示された抗原１００ｎｇを４〜２０％のトリスグリシンゲル上で泳動させ、ニトロセルロース膜へと転写した。１ｕｇ／ｍｌのビオチニル化ｍｕ−１Ｆ３  ＩｇＧ（Ａ）およびビオチニル化ｈｕ−１Ｆ３  ＩｇＧを用いて、ニトロセルロース膜と共にインキュベートした後、ストレプトアビジン／ＨＲＰを伴うインキュベーションを行った。検出は、ＥＣＬ試薬により行った。Ｆｃ（Ｋ−Ｈ）とは、「ＫＩＨ」法によるヘテロ二量体化Ｆｃ変異体を表す。ＣＤ３イプシロンアミノ酸１〜２７。Ｆｃとは、ＣＤ３イプシロンのＮ末端（配列番号１８を参照されたい）におけるヒトＦｃとのペプチド融合体である。対照ペプチドは、ＣＤ３イプシロンアミノ酸１〜２７と同じアミノ酸組成を有するが、最初の１６アミノ酸（配列番号２０を参照されたい）の配列順序が逆である。マウス抗ＣＤ３  ＩｇＧは、ヒト分子種およびカニクイザル分子種の変性ＣＤ３イプシロン鎖のほか、ヒトＣＤ３イプシロンのＮ末端のアミノ酸１〜２７も認識することが可能であった。最初の１６残基についてアミノ酸配列の順序が逆であるペプチドが、マウス１Ｆ３  ＩｇＧにより認識されなかったことから、陽性バンドが特異的であることが示唆される。ヒト化１Ｆ３抗体であるｈｕ−１Ｆ３  ＩｇＧが、同じパネルの抗原の認識について極めて類似するパターンを示したことから、この抗体がマウス１Ｆ３親抗体と類似する特異性およびエピトープを有することが示される。
【図１０】図１０は、マウス抗ヒトＣＤ３抗体であるｍｕ−１Ｆ３およびそのヒト化形であるｈｕ−１Ｆ３によるヒトＰＢＭＣへの結合についてのフローサイトメトリー解析を示す図である。ＦＡＣＳ染色は、ビオチニル化ＩｇＧの後、ストレプトアビジン−ＰＥコンジュゲートを用いる第２のステップを用いて行った。ｍｕ−１Ｆ３  ＩｇＧとｈｕ−１Ｆ３  ＩｇＧとは、類似する細胞染色パターン：ヒトＰＢＭＣ中の主要な細胞であるＴ細胞について大きなシフト（２〜３ｌｏｇ）を発生させた。マウスＦｃ（ｍｕ−１Ｆ３内の）は、ヒトＦｃガンマ受容体への結合活性を欠くことが公知である。したがって、シフトの小さな細胞集団（０〜１ｌｏｇ）におけるわずかな差違は、ｈｕ−１Ｆ３  ＩｇＧ（ヒトＩｇＧ２  Ｆｃ）の、ＰＢＭＣ調製物中のＦｃガンマ受容体発現細胞への、アフィニティーの低い結合に起因する可能性が高い。ＦＡＣＳは、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ測定器（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて行った。
【図１１】図１１は、ｍｕ−１Ｆ３  ＩｇＧおよびｈｕ−１Ｆ３  ＩｇＧの、組換えＣＤ３イプシロン類縁タンパク質への結合についてのＥＬＩＳＡ研究を示す図である。１ｕｇ／ｍｌの表示されたタンパク質抗原５０ｕｌ（ウェル１個当たり）を、ＭａｘｉＳｏｒｐ  ＥＬＩＳＡプレート上にコーティングした。ビオチニル化ｍｕ−１Ｆ３  ＩｇＧおよびビオチニル化ｈｕ−１Ｆ３  ＩｇＧ（４％のミルクＴＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０中に０．５ｕｇ／ｍｌ）を添加して、固定化抗原に結合させた後、ストレプトアビジン／ＨＲＰコンジュゲートを添加した。ＡＢＴＳを発色のために用い、４０５ｎｍで吸光度を測定した。対照ペプチド（配列番号２０を参照されたい）によるＦｃ融合体についてのＥＬＩＳＡは、いずれの抗体についても陰性である（データは示さない）。結果により、マウス親抗体であるｍｕ−１Ｆ３とヒト化形であるｈｕ−１Ｆ３とによる異なる抗原形態に対する結合パターンが極めて類似すると示されたことから、特異性およびエピトープがヒト化抗体についても保持されることが示唆される。
【図１２】図１２は、Ｆａｂフォーマットのヒト化１Ｆ３抗体が、Ｊｕｒｋａｔ細胞上のＣＤ３を認識することを示す図である。２ｕｇ／ｍｌの濃度のＨｉｓタグづけしたＦａｂタンパク質を、Ｊｕｒｋａｔ細胞、マウス抗ｈｉｓタグ抗体に続き、抗マウス−ＰＥコンジュゲートと共にインキュベートした。ＦＡＣＳは、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ測定器（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で行った。
【図１３−１】図１３は、ヒト化抗ＣＤ３抗体の、組換えヒトＣＤ３イプシロン／デルタＦｃ（Ｋ−Ｈ）ヘテロ二量体への結合（パネルＡおよびＢ）；ヒト化抗ＣＤ３抗体の、組換えヒトＣＤ３イプシロンＮ末端アミノ酸１〜２７ペプチドＦｃ融合体への結合（パネルＣおよびＤ）；ヒト化抗ＣＤ３抗体の、組換えカニクイザルＣＤ３イプシロン／デルタＦｃ（Ｋ＋Ｌ）ヘテロ二量体への結合（パネルＥおよびＦ）についてのＥＬＩＳＡを示す図である。ＦｄのＣ末端でヒト化Ｆａｂタンパク質にｈｉｓ６タグづけし、９６ウェルプレート固定化抗原へと結合したＦａｂは、ＨＲＰとコンジュゲートした抗ｈｉｓ６タグマウス抗体を用いて検出した。ＡＢＴＳを基質として用い、４０５ｎｍにおける吸収を測定した。
【図１３−２】図１３は、ヒト化抗ＣＤ３抗体の、組換えヒトＣＤ３イプシロン／デルタＦｃ（Ｋ−Ｈ）ヘテロ二量体への結合（パネルＡおよびＢ）；ヒト化抗ＣＤ３抗体の、組換えヒトＣＤ３イプシロンＮ末端アミノ酸１〜２７ペプチドＦｃ融合体への結合（パネルＣおよびＤ）；ヒト化抗ＣＤ３抗体の、組換えカニクイザルＣＤ３イプシロン／デルタＦｃ（Ｋ＋Ｌ）ヘテロ二量体への結合（パネルＥおよびＦ）についてのＥＬＩＳＡを示す図である。ＦｄのＣ末端でヒト化Ｆａｂタンパク質にｈｉｓ６タグづけし、９６ウェルプレート固定化抗原へと結合したＦａｂは、ＨＲＰとコンジュゲートした抗ｈｉｓ６タグマウス抗体を用いて検出した。ＡＢＴＳを基質として用い、４０５ｎｍにおける吸収を測定した。
【図１４】図１４は、ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３  Ｆａｂ融合タンパク質（ＭＳＦＰ）の、ヒトＣＤ３を発現させるＪｕｒｋａｔ細胞への結合を、ＦＡＣＳ解析を用いて示す図である。Ｊｕｒｋａｔへと結合したビオチニル化ＦａｂおよびＦａｂ融合体は、ストレプトアビジン−ＰＥコンジュゲートにより検出した。ＯＫＴ３  Ｆａｂは、Ｊｕｒｋａｔ上のＣＤ３への結合を示したが、抗ＥｐＣＡＭ  ｓｃＦｖの、ＬＣ単独またはＨＣおよびＬＣの両方への融合は、ＯＫＴ３  Ｆａｂ部分のＣＤ３への結合能力を完全に消失させた。ヒト化抗ＣＤ３抗体のＦａｂであるｈｕ−１Ｆ３は、Ｊｕｒｋａｔ細胞上のＣＤ３に結合することが可能である。ＯＫＴ３  Ｆａｂ融合タンパク質とは異なり、抗ＥｐＣＡＭ  ｓｃＦｖをｈｕ−１Ｆ３  ＬＣのＮ末端へと融合させたところ、ｈｕ−１Ｆ３  Ｆａｂと同様のレベルの結合活性が保持されたのに対し、抗ＥｐＣＡＭ  ｓｃＦｖを、ｈｕ−１Ｆ３  ＦａｂのＬＣおよびＨＣへと同時的に融合させると、Ｊｕｒｋａｔ細胞上のＣＤ３への正の結合が示されたが、低レベルでの結合であった。
【図１５】図１５は、ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３  ＭＳＦＰのヒトＰＢＭＣへの結合を、ＦＡＣＳ解析を用いて示す図である。Ｊｕｒｋａｔ細胞へと結合したビオチニル化ＦａｂおよびＦａｂ融合体は、ストレプトアビジン−ＰＥコンジュゲートにより検出した。Ａ）ＯＫＴ３  Ｆａｂの、ＣＤ３を発現させるＰＢＭＣ（Ｔ細胞）への結合を示す図である。抗ＥｐＣＡＭ  ｓｃＦｖをＨＣおよびＬＣの両方へと融合させたところ、ＯＫＴ３  Ｆａｂ部分の、ＣＤ３に対する結合能力は完全に消失した。Ｂ）ヒト化抗ＣＤ３抗体のＦａｂであるｈｕ−１Ｆ３．１は、ＰＢＭＣ調製物中のＴ細胞上のＣＤ３に結合することが可能なことを示す図である。ＯＫＴ３  Ｆａｂ融合タンパク質とは異なり、抗ＥｐＣＡＭ×ｈｕ−１Ｆ３．１  Ｆａｂを、ＦａｂのＬＣおよびＨＣへと同時的に融合させたところ、Ｊｕｒｋａｔ細胞上のＣＤ３への正の結合が示されたが、結合レベルは、低レベルである。
【図１６】図１６は、Ａ）ＯＫＴ３  ＦａｂおよびＥｐＣＡＭ１．１×ＯＫＴ３二重特異性Ｆａｂ融合タンパク質が、組換えカニクイザルＣＤ３イプシロン／デルタヘテロ二量体Ｆｃタンパク質に対する結合活性を有さず；Ｂ）ＯＫＴ３  Ｆａｂおよび二重特異性融合体が、組換えヒトＣＤ３イプシロンＮ末端のペプチド（アミノ酸１〜２７．Ｆｃ融合体）に対する結合活性を有さないことを示したＥＬＩＳＡ結合アッセイを示す図である。ＦａｂおよびＦａｂ融合タンパク質をビオチニル化し、９６ウェルプレート上に固定化した抗原へと結合させたビオチニル化抗体は、ストレプトアビジン−ＨＲＰコンジュゲートの後、検出用のＡＢＴＳ基質を用いて検出した。
【図１７】図１７は、ｈｕ−１Ｆ３  ＦａｂおよびＥｐＣＡＭ１．１×ｈｕ−１Ｆ３．１二重特異性Ｆａｂ融合タンパク質（ＭＳＦＰ；Ｆａｂｅ）が、Ａ）組換えカニクイザルＣＤ３イプシロン／デルタＦｃ（Ｋ＋Ｈ）ヘテロ二量体タンパク質に対する正の結合活性；およびＢ）組換えヒトＣＤ３イプシロンＮ末端のペプチド（アミノ酸１〜２７．Ｆｃ融合体）に対する正の結合活性を有することを示したＥＬＩＳＡ結合アッセイを示す図である。ＦａｂおよびＦａｂ融合タンパク質をビオチニル化し、９６ウェルプレート上に固定化した抗原へと結合させたビオチン抗体は、ストレプトアビジン−ＨＲＰコンジュゲートの後、検出用基質としてＡＢＴＳを用いて検出した。
【図１８】図１８は、ｈｕ−１Ｆ３  ＦａｂおよびＥｐＣＡＭ１．２×ｈｕ−１Ｆ３．１  ＭＳＦＰが、Ａ）組換えカニクイザルＣＤ３イプシロン／デルタＦｃ（Ｋ＋Ｈ）ヘテロ二量体タンパク質に対する正の結合活性；およびＢ）組換えヒトＣＤ３イプシロンＮ末端のペプチド（アミノ酸１〜２７．Ｆｃ融合体）に対する正の結合活性を有することを示したＥＬＩＳＡ結合アッセイを示す図である。ＦａｂおよびＦａｂ融合タンパク質をビオチニル化し、９６ウェルプレート上に固定化した抗原へと結合させた標識融合タンパク質は、ストレプトアビジン−ＨＲＰコンジュゲートの後、検出用基質としてＡＢＴＳを用いて検出した。
【図１９】図１９は、ｈｕ−１Ｆ３．１  ＦａｂおよびＥｐＣＡＭ２．２×ｈｕ−１Ｆ３  ＭＳＦＰが、Ａ）組換えカニクイザルＣＤ３イプシロン／デルタＦｃ（Ｋ＋Ｈ）ヘテロ二量体タンパク質に対する正の結合活性；およびＢ）組換えヒトＣＤ３イプシロンＮ末端のペプチド（アミノ酸１〜２７．Ｆｃ融合体）に対する正の結合活性を有することを示したＥＬＩＳＡ結合アッセイを示す図である。ＦａｂおよびＦａｂ融合タンパク質をビオチニル化し、９６ウェルプレート上に固定化した抗原へと結合させたビオチン標識融合タンパク質は、ストレプトアビジン−ＨＲＰコンジュゲートの後、検出用のＡＢＴＳ基質を用いて検出した。
【図２０−１】図２０は、ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３  ＭＳＦＰの、全長ヒトＥｐＣＡＭ（ｈｕ−ＥｐＣＡＭ−ＦＬ）標的を細胞表面上で安定的に発現させるＣＨＯ細胞への結合を、ＦＡＣＳ解析により示す図である。抗ＣＤ３  Ｆａｂは、予測される通り、同じＣＨＯ細胞への結合を示さない。ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３  ＭＳＦＰは、ＣＨＯ細胞上で発現させたＥｐＣＡＭへの正の結合を示す。
【図２０−２】図２０は、ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３  ＭＳＦＰの、全長ヒトＥｐＣＡＭ（ｈｕ−ＥｐＣＡＭ−ＦＬ）標的を細胞表面上で安定的に発現させるＣＨＯ細胞への結合を、ＦＡＣＳ解析により示す図である。抗ＣＤ３  Ｆａｂは、予測される通り、同じＣＨＯ細胞への結合を示さない。ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３  ＭＳＦＰは、ＣＨＯ細胞上で発現させたＥｐＣＡＭへの正の結合を示す。
【図２１−１】図２１は、ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３  ＭＳＦＰにより腫瘍標的依存的な様式で方向付けを変化させたＰＢＭＣ（Ｔ細胞）を媒介する細胞殺滅活性を検出するためのＦＡＣＳベースのアッセイを示す図である。このアッセイでは、標的細胞（ヒトＥｐＣＡＭ−ＦＬを細胞表面上で安定的に発現させるＣＨＯ細胞；Ａ、Ｂ、Ｄ）および対照細胞（ＣＨＯだけ；Ｃ）を、アッセイの前にＰＫＨ−２６蛍光色素（Ｓｉｇｍａ、製品の指示書に従う）で標識した。細胞殺滅アッセイの終了時に、ＴＯ−ＰＲＯ−三ヨウ化物（ＴＰ３、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて死滅細胞を同定した。このアッセイでは、標的死滅細胞を右上四分図（ＰＫＨ−２６陽性、ＴＰ３陽性）中のカウントから同定し、標的生細胞を左上四分図（ＰＫＨ−２６陽性、ＴＰ３陰性）から同定した。Ａ）ＥｐＣＡＭを発現させるＣＨＯ細胞であって、ＥｐＣＡＭ２．２×ＣＤ３  ＭＳＦＰを伴うが、ＰＢＭＣを伴わずにインキュベートされた（２０時間にわたり）ＣＨＯ細胞の死滅細胞（ＰＫＨ−２６標識ＴＰ３陽性細胞）が、約１．４％であったことを示す図であり；Ｂ）ＥｐＣＡＭを発現させるＣＨＯ細胞であって、ＰＢＭＣを伴うが、ＭＳＦＰを伴わずにインキュベートされた（２０時間にわたり）ＣＨＯ細胞の死滅細胞が、ＰＫＨ−２６標識集団中約１４％であった（ＰＢＭＣの非特異的殺滅活性）ことを示す図であり；Ｃ）ＥｐＣＡＭを発現させないＣＨＯ細胞であって、ＰＢＭＣおよびＥｐＣＡＭ２．２×ＣＤ３  ＭＳＦＰと共にインキュベートされた（２０時間にわたり）ＣＨＯ細胞の死滅細胞が、約１４％であった（ＰＢＭＣの非特異的殺滅活性）ことを示す図であり；Ｄ）ＥｐＣＡＭを発現させるＣＨＯ細胞であって、ＰＢＭＣおよび例示的なＥｐＣＡＭ×ＣＤ３  ＭＳＦＰと共にインキュベートされた（２０時間にわたり）ＣＨＯ細胞の死滅細胞カウントが、約６４％であったことを示す図である。ＥｐＣＡＭ２．２×ＣＤ３  ＭＳＦＰの腫瘍細胞標的依存的な殺滅活性％は、約５０％である（ＣとＤとまたはＢとＤとを比較して）。
【図２１−２】図２１は、ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３  ＭＳＦＰにより腫瘍標的依存的な様式で方向付けを変化させたＰＢＭＣ（Ｔ細胞）を媒介する細胞殺滅活性を検出するためのＦＡＣＳベースのアッセイを示す図である。このアッセイでは、標的細胞（ヒトＥｐＣＡＭ−ＦＬを細胞表面上で安定的に発現させるＣＨＯ細胞；Ａ、Ｂ、Ｄ）および対照細胞（ＣＨＯだけ；Ｃ）を、アッセイの前にＰＫＨ−２６蛍光色素（Ｓｉｇｍａ、製品の指示書に従う）で標識した。細胞殺滅アッセイの終了時に、ＴＯ−ＰＲＯ−三ヨウ化物（ＴＰ３、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて死滅細胞を同定した。このアッセイでは、標的死滅細胞を右上四分図（ＰＫＨ−２６陽性、ＴＰ３陽性）中のカウントから同定し、標的生細胞を左上四分図（ＰＫＨ−２６陽性、ＴＰ３陰性）から同定した。Ａ）ＥｐＣＡＭを発現させるＣＨＯ細胞であって、ＥｐＣＡＭ２．２×ＣＤ３  ＭＳＦＰを伴うが、ＰＢＭＣを伴わずにインキュベートされた（２０時間にわたり）ＣＨＯ細胞の死滅細胞（ＰＫＨ−２６標識ＴＰ３陽性細胞）が、約１．４％であったことを示す図であり；Ｂ）ＥｐＣＡＭを発現させるＣＨＯ細胞であって、ＰＢＭＣを伴うが、ＭＳＦＰを伴わずにインキュベートされた（２０時間にわたり）ＣＨＯ細胞の死滅細胞が、ＰＫＨ−２６標識集団中約１４％であった（ＰＢＭＣの非特異的殺滅活性）ことを示す図であり；Ｃ）ＥｐＣＡＭを発現させないＣＨＯ細胞であって、ＰＢＭＣおよびＥｐＣＡＭ２．２×ＣＤ３  ＭＳＦＰと共にインキュベートされた（２０時間にわたり）ＣＨＯ細胞の死滅細胞が、約１４％であった（ＰＢＭＣの非特異的殺滅活性）ことを示す図であり；Ｄ）ＥｐＣＡＭを発現させるＣＨＯ細胞であって、ＰＢＭＣおよび例示的なＥｐＣＡＭ×ＣＤ３  ＭＳＦＰと共にインキュベートされた（２０時間にわたり）ＣＨＯ細胞の死滅細胞カウントが、約６４％であったことを示す図である。ＥｐＣＡＭ２．２×ＣＤ３  ＭＳＦＰの腫瘍細胞標的依存的な殺滅活性％は、約５０％である（ＣとＤとまたはＢとＤとを比較して）。
【図２２−１】図２２は、ＭＳＦＰの、方向付けを変化させたＴ細胞による、ＥｐＣＡＭを発現させるＣＨＯ細胞に対する細胞溶解活性を、図１８において記載されるＦＡＣＳアッセイを用いて示す図である。Ａ）ＯＫＴ３  ＦａｂおよびそのＭＳＦＰが、方向付けを変化させた著明な細胞溶解活性を欠くことを示す図である。ｈｕ−１Ｆ３．１  Ｆａｂが、標的細胞に対する活性を示さなかったのに対し、Ｂ）ＥｐＣＡＭ１．１×ｈｕ−１Ｆ３．１  ＭＳＦＰは、高レベルの活性を示し、ＭＳＦＰが６０ｐＭであっても高い活性レベルを維持したことを示す図であり；Ｃ）ＥｐＣＡＭ１．２×ｈｕ−１Ｆ３．１  ＭＳＦＰによる用量依存的な活性が検出されたことを示す図であり；Ｄ）ＥｐＣＡＭ２．２  ｓｃＦｖの、ｈｕ−１Ｆ３．１  Ｆａｂとの単一融合体について、用量依存的な細胞溶解活性が検出されたことを示す図である。ＥｐＣＡＭ２．２  ｓｃＦｖの、ｈｕ−１Ｆ３．１  ＦａｂのＨＣおよびＬＣの両方との二重融合体については、最大で５０％の細胞集団の殺滅が観察され、その濃度が６０ｐＭという低濃度のときも、高い活性レベル（約４０％）を維持した。殺滅活性百分率は、対照アッセイ（ＥｐＣＡＭ−ＣＨＯ＋ＰＢＭＣ＋ＭＳＦＰなし）における死滅細胞の百分率を、試料アッセイにおける死滅細胞の百分率から減じることにより計算した。
【図２２−２】図２２は、ＭＳＦＰの、方向付けを変化させたＴ細胞による、ＥｐＣＡＭを発現させるＣＨＯ細胞に対する細胞溶解活性を、図１８において記載されるＦＡＣＳアッセイを用いて示す図である。Ａ）ＯＫＴ３  ＦａｂおよびそのＭＳＦＰが、方向付けを変化させた著明な細胞溶解活性を欠くことを示す図である。ｈｕ−１Ｆ３．１  Ｆａｂが、標的細胞に対する活性を示さなかったのに対し、Ｂ）ＥｐＣＡＭ１．１×ｈｕ−１Ｆ３．１  ＭＳＦＰは、高レベルの活性を示し、ＭＳＦＰが６０ｐＭであっても高い活性レベルを維持したことを示す図であり；Ｃ）ＥｐＣＡＭ１．２×ｈｕ−１Ｆ３．１  ＭＳＦＰによる用量依存的な活性が検出されたことを示す図であり；Ｄ）ＥｐＣＡＭ２．２  ｓｃＦｖの、ｈｕ−１Ｆ３．１  Ｆａｂとの単一融合体について、用量依存的な細胞溶解活性が検出されたことを示す図である。ＥｐＣＡＭ２．２  ｓｃＦｖの、ｈｕ−１Ｆ３．１  ＦａｂのＨＣおよびＬＣの両方との二重融合体については、最大で５０％の細胞集団の殺滅が観察され、その濃度が６０ｐＭという低濃度のときも、高い活性レベル（約４０％）を維持した。殺滅活性百分率は、対照アッセイ（ＥｐＣＡＭ−ＣＨＯ＋ＰＢＭＣ＋ＭＳＦＰなし）における死滅細胞の百分率を、試料アッセイにおける死滅細胞の百分率から減じることにより計算した。
【図２３】図２３は、ＥｐＣＡＭ２．２−（Ｈ＋Ｌ）−ｈｕ−１Ｆ３．１  ＭＳＦＰによるＴ細胞の活性化（ＰＢＭＣ中の）が、腫瘍標的依存的であることを示す図である。Ａ）ＥｐＣＡＭを発現させないＣＨＯの存在下において、ＥｐＣＡＭ２．２−（Ｈ＋Ｌ）−ｈｕ−１Ｆ３．１（３０ｎＭ）と共にインキュベートされたＰＢＭＣが、ＦＡＣＳ解析によるＣＤ６９の発現を介して測定される、基底レベルのＴ細胞の活性化を結果としてもたらしたことを示す図であり；Ｂ）ＥｐＣＡＭを発現させないＣＨＯの存在下において、ＥｐＣＡＭ２．２−（Ｈ＋Ｌ）−ｈｕ−１Ｆ３．１と共にインキュベートされた（３０ｎＭ、１６時間）ＰＢＭＣが、ＦＡＣＳアッセイにより検出されるＣＤ６９の発現を介して測定される、Ｔ細胞の活性化の著明な増大を結果としてもたらしたことを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
本開示は、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質（ＭＳＦＰ）に関する。特に、本開示のＭＳＦＰは、特定の対象の標的抗原（例えば、ＣＤ３、Ｔ細胞受容体、ＮＫＧ２Ｄ、またはＦｃγＲ）に結合するＦａｂ断片を含み、１つまたは２つの融合部分であって、１つのさらなる標的抗原、または、一部の実施形態では、２つのさらなる標的抗原（例えば、血清アルブミンタンパク質、腫瘍抗原、または他の疾患関連抗原）に結合する融合部分も有する。
【００５８】
有効性、安全性、医薬物質の製造に関連する経費、および薬物投与の経路を含めたがん処置の有効性は、以下の属性のうちの大半または全てを保有する斬新な薬物を開発することにより劇的に改善されうることが想定される。
【００５９】
１．二価の腫瘍会合抗原（ＴＡＡ）結合分子を用いる、正常細胞を上回って腫瘍細胞をターゲティングするための選択性の増強。抗体と抗原との相互作用についてのエネルギー論は通常、アフィニティーおよびアビディティーという用語により表現される。アビディティーは、抗原結合ドメインと抗原との単一部位間の相互作用の強度について記載するのに用いられる用語であるアフィニティーとは異なる。アビディティーとはそれ自体、アフィニティーの組合せによる相乗作用的強度である。抗体の腫瘍細胞への結合は、内因性の結合アフィニティー、抗体上に存在する結合部位の数（価数）、および細胞上における標的抗原の密度に依存する（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１８巻：２６４〜９頁、１９７９年）。一価抗体を用いる場合、結合強度の測定値は、アフィニティーと関連する。二価抗体または多価抗体を細胞の結合に用いる場合は通常、アビディティーが測定される。通常は抗原濃度が高いほど、アビディティーも高くなる。腫瘍細胞が多ければ、ＴＡＡは、腫瘍細胞表面上において過剰発現することが公知である。２つの抗腫瘍抗体の標的結合ドメインを伴うＭＳＦＰは、これもまた同じ標的を発現させる正常組織細胞への結合より、ＴＡＡを過剰発現させる腫瘍細胞への結合を選択的に強めることが可能である。アビディティー原理に基づき、Ａｄａｍｓらは、二価の抗ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体断片を用いることにより、腫瘍塊中の蓄積が、同じ抗体断片の対応する一価形を用いる場合の３倍改善されることを裏付けるのに成功した（Ａｄａｍｓら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、１２巻：１５９９〜１６０５頁、２００６年）。腫瘍ターゲティングに関しては、抗体のアフィニティーが高くなると、腫瘍塊の縁辺部における蓄積が結果としてもたらされることが通常であるのに対し、アビディティー効果が高くなると、抗体の腫瘍内へのより深い浸透がもたらされる。
【００６０】
２．二重特異性抗体を用いる、正常細胞を上回る腫瘍細胞のターゲティングにおける選択性の増強。二重特異性試薬を、正常細胞を上回っていっそう選択的に腫瘍細胞に結合し、これらを死滅させ、単一特異性試薬を上回って有効性および安全性を究極的に増大させるそれらの目標に向けてデザインすることができる（Ｃｈａｎｇら、Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ、１巻：５５３頁、２００２年；ＫｉｐｒｉｙａｎｏｖおよびＬｅ  Ｇａｌｌ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｄｅｖｅｌ、７巻：２３３頁、２００４年）。腫瘍細胞における両方の抗原の存在、および各抗原結合アームの適正なアフィニティーの注意深いデザインに対する要請が、この手法の極めて重要な側面である。例えば、ＭＭ−１１１とは、ｈｅｒ２アームを用いて薬物をがん細胞へとターゲティングし、抗ｈｅｒ３アームを用いてがん細胞におけるｈｅｒ３受容体のヘテロ二量体化およびシグナル伝達を阻害するようにデザインされた抗Ｈｅｒ２およびＨｅｒ３二重特異性融合タンパク質である（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ、９９巻、１４１５〜１４２５頁、２００８年）。ＭＭ−１１１をデザインするために重要だと考えられる側面には、１）組織における比較的限局的なＨｅｒ２の発現パターン、およびがん細胞によるＨｅｒ２の過剰発現、２）組織における広域的なＨｅｒ３の発現、ならびにがん細胞の増殖および生存におけるＨｅｒ３によるシグナル伝達の大きな重要性、３）Ｈｅｒ２への結合アフィニティーの高さ（１．１ｎＭ）およびＨｅｒ３への結合アフィニティーの低さ（１６０ｎＭ）が含まれる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける結合アッセイでは、ＭＭ−１１１が、Ｈｅｒ２／Ｈｅｒ３二重陽性細胞に対して、Ｈｅｒ２単一陽性細胞に対する結合の最大９．７倍の結合を顕示する一方、１μＭの高濃度でもＨｅｒ３単一陽性細胞への検出可能な結合は認められなかった（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ、９９巻、１４１５〜１４２５頁、２００８年）。
【００６１】
したがって、本開示は、本明細書でさらに記載されるこれらの利点および他の利点を提供する。特に、本開示のＭＳＦＰは、以下が含まれるがこれらに限定されない異なる利点を提供する：１）Ｆａｂを融合部分へと結合させると、ＭＳＦＰは、主要なＦａｂ標的に結合しないか、またはこれらへの結合を低減した。例えば、Ｆａｂを融合部分Ａおよび融合部分Ｂへと結合させると、特に、融合部分がそれらの標的と係合していない場合、抗ＣＤ３  Ｆａｂを含むＭＳＦＰは、ＣＤ３に結合しないか、またはＣＤ３への結合を著明に低減した。これは、望まれない副作用（例えば、腫瘍細胞またはＦａｂ標的抗原を発現させる他の細胞への結合前におけるＴ細胞の望まれない全体的活性化）を低下させる。２）二価結合または二重特異性結合は、ＭＳＦＰの腫瘍に対する選択性を、正常細胞と対比して増強する。３）ＭＳＦＰは比較的大型（約７５〜１００ｋＤ）であり、これにより、急速な腎クリアランス（腎クリアランスの濾過の閾値サイズは７０ｋＤである）を回避するが、通常の抗体（１５０ｋＤ）より小型であり、これにより、腫瘍組織への浸透の改善が可能となる。５）一部のＭＳＦＰが血清アルブミンに結合する能力は、循環中半減期を劇的に延長する。６）ＭＳＦＰの構造は、ｓｃＦｖだけを有する融合タンパク質より安定的となる傾向がある。
【００６２】
特定の実施形態では、本開示のＭＳＦＰが、特異的標的抗原（例えば、腫瘍抗原）への結合に関して二価であり、融合部分を介して標的の腫瘍抗原に結合し、Ｆａｂの結合ドメインを介して第２の標的抗原（例えば、ＣＤ３、Ｔ細胞受容体、ＮＫＧ２Ｄ、またはＦｃγＲ）に結合する点で二重特異性であり、例えば、特定の標的抗原を発現させる細胞に対する免疫系の活性化を介してそれらの有効性を増強する。
【００６３】
本開示の例示的なＭＳＦＰは、抗ＣＤ３  Ｆａｂを含む。しかし、本明細書では、他のＦａｂ標的もとりわけ想定される。今日、抗ＣＤ３  Ｆａｂに関して、ＴＣＲ複合体を指向するタンパク質分子はまた、Ｔ細胞の活性化と併せて、Ｔ細胞シグナルも誘導し、その結果として、サイトカインストームをもたらすが、これは、重度の副作用を結果としてもたらす場合もあり、架橋形成の非存在下にある細胞に対してはほとんど効果を及ぼさない場合もある。本ＭＳＦＰは、まず第２の標的抗原、例えば、腫瘍抗原に結合し、これにより、Ｔ細胞を活性化しない限りは、ＴＣＲ（ＣＤ３）への結合およびその活性化を阻害する利点をもたらす。これは、所望の標的細胞（例えば、腫瘍細胞標的）の非存在下における望まれないサイトカインストームおよび望まれないＴ細胞の活性化を大幅に低減する。
【００６４】
以下の記載は、本開示の多様な実施形態を例示することだけを意図するものである。それ自体、考察される特定の改変は、限定的であることを意図しない。当業者には、本明細書で示される対象物の精神または範囲から逸脱しない限りにおいて、多様な同等物、変化、および改変をもたらしうることが明らかであろうし、本明細書には、このような同等な実施形態が包含されることが理解される。
【００６５】
とりわけ別段であることが示されない限り、本発明の実施は、当技術分野の範囲内にあるウイルス学、免疫学、微生物学、分子生物学、および組換えＤＮＡ法の従来の方法であって、それらの多くが例示を目的として以下で記載される方法を使用する。このような技法は、文献において完全に説明されている。例えば、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」または「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（２００９年）；Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、３版、Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９９５年；ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（３版、２００１年）；Ｍａｎｉａｔｉｓら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（１９８２年）；「ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」、ＩおよびＩＩ巻（Ｄ．  Ｇｌｏｖｅｒ編）；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｎ．  Ｇａｉｔ編、１９８４年）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」（Ｂ．  ＨａｍｅｓおよびＳ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８５年）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」（Ｂ．  ＨａｍｅｓおよびＳ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４年）；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」（Ｒ．  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８６年）；Ｐｅｒｂａｌ、「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」（１９８４年）などの参考文献を参照されたい。
【００６６】
内容により別段であることが明確に規定されない限り、本明細書および付属の特許請求の範囲で用いられる単数形の「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」、および「その」は、複数の指示物を包含する。
【００６７】
本明細書の全体において、文脈により別段に要請されない限り、「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語、または「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変化形は、言明された要素もしくは整数または要素もしくは整数の群の包含は含意するが、他の任意の要素もしくは整数または要素もしくは整数の群の除外は含意しないと理解されたい。
【００６８】
別段に明示的に言明されない限り、本明細書で記載される各実施形態は、変更すべき部分を変更して、他のあらゆる実施形態にも適用されるものとする。
【００６９】
組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、ならびに組織培養および形質転換（例えば、電気穿孔、リポフェクション）のための標準的な技法を用いることができる。酵素反応および精製技法は、製造元の仕様に従い実施することもでき、当技術分野において一般的に達成される通りに実施することもでき、本明細書で記載される通りに実施することもできる。これらの技法および手順ならびに関連する技法および手順は一般に、当技術分野において周知の従来の方法に従い実施することができ、本明細書全体で引用されて論じられる、多様な一般的参考文献およびより特殊な参考文献において記載される通りに実施することができる。特定の定義を提示しない限り、本明細書で記載される分子生物学、分析化学、有機合成化学、ならびに創薬化学および製薬化学との関連で用いられる用語法ならびにこれらの実験室における手順および技法は、周知の手順および技法であり、当技術分野において一般的に用いられている。標準的な技法は、組換え法、分子生物学法、微生物学法、化学合成法、化学的分析法、医薬としての調製、処方、および送達、ならびに患者の処置に用いることができる。
【００７０】
本明細書で用いられるポリペプチドの「Ｃ末端」とは、ポリペプチドの最後のアミノ酸残基であって、そのアミン基を供与して、その隣接するアミノ酸残基のカルボキシル基とペプチド結合を形成するアミノ酸残基を指す。本明細書で用いられるポリペプチドの「Ｎ末端」とは、ポリペプチドの最初のアミノ酸であって、そのカルボキシル基を供与して、その隣接するアミノ酸残基のアミン基とペプチド結合を形成するアミノ酸を指す。
【００７１】
本明細書で用いられる「共有結合的連結」という用語は、１もしくは複数の化学結合を介する直接的な連結、または１もしくは複数のリンカーを介する間接的な連結を指す。
【００７２】
任意の適切な化学結合を用いて、限定せずに述べると、ペプチド結合およびジスルフィド結合などの共有結合的結合、水素結合、疎水性結合、イオン結合、およびファンデルワールス結合などの非共有結合が含まれる、直接的な連結を作製することができる。
【００７３】
本明細書では、「共有結合的結合」が、１または複数の電子を共有する２つの原子の間の安定的な会合を指す。限定せずに述べると、共有結合的結合の例には、ペプチド結合およびジスルフィド結合が含まれる。本明細書で用いられる「ペプチド結合」とは、アミノ酸のカルボキシル基と隣接するアミノ酸のアミン基との間で形成される共有結合的結合を指す。本明細書で用いられる「ジスルフィド結合」とは、２つの硫黄原子の間で形成される共有結合的結合を指す。ジスルフィド結合は、２つのチオール基の酸化から形成されうる。特定の実施形態では、共有結合的連結が、共有結合的結合を介する直接的な連結である。特定の実施形態では、共有結合的連結が、ペプチド結合またはジスルフィド結合を介する直接的な連結である。
【００７４】
本明細書では、「非共有結合」が、電子の共有を伴わない２つの分子または２つの化学基の間の誘引的相互作用を指す。限定せずに述べると、非共有結合の例には、水素結合、疎水性結合、イオン結合、およびファンデルワールス結合が含まれる。本明細書では、「水素結合」が、第１の分子／基の水素原子と、第２の分子／基の電気陰性原子との間の引力を指す。本明細書では、「疎水性結合」が、疎水性または非極性の分子／基を、水性環境内で併せて凝集または会合させる力を指す。本明細書では、「イオン結合」が、陽イオンと陰イオンとの間の誘引を指す。本明細書では、「ファンデルワールス結合」が、電子の分布が瞬間的にランダムな摂動を示す、２つの隣接する分子／基の間の非特異的引力を指す。特定の実施形態では、共有結合的連結が、非共有結合を介する直接的な連結である。特定の実施形態では、共有結合的連結が、水素結合、疎水性結合、イオン結合、またはファンデルワールス結合を介する直接的な連結である。
【００７５】
結合ドメイン（またはこれによる融合タンパク質）は、それが、例えば、約１０５Ｍ−１以上のアフィニティーまたはＫａ（すなわち、１／Ｍを単位とする、特定の結合相互作用の平衡会合定数）で標的分子に結合またはこれと会合する場合に、標的分子へと「特異的に結合する」。特定の実施形態では、結合ドメイン（またはこれによる融合タンパク質）が、約１０６Ｍ−１、１０７Ｍ−１、１０８Ｍ−１、１０９Ｍ−１、１０１０Ｍ−１、１０１１Ｍ−１、１０１２Ｍ−１、または１０１３Ｍ−１以上のＫａで標的に結合する。「高アフィニティー」の結合ドメイン（またはこれによる単鎖融合タンパク質）とは、Ｋａが少なくとも１０７Ｍ−１、少なくとも１０８Ｍ−１、少なくとも１０９Ｍ−１、少なくとも１０１０Ｍ−１、少なくとも１０１１Ｍ−１、少なくとも１０１２Ｍ−１、少なくとも１０１３Ｍ−１以上の結合ドメインを指す。代替的に、アフィニティーは、単位をＭとする（例えば、１０−５Ｍ〜１０−１３Ｍ以下の）、特定の結合相互作用の平衡解離定数（Ｋｄ）として定義することもできる。本開示に従う結合ドメインポリペプチドおよび融合タンパク質のアフィニティーは、従来の技法（例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄら（１９４９年）、Ａｎｎ．  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、５１巻：６６０頁；および米国特許第５，２８３，１７３号；同第５，４６８，６１４号、または同等の文献を参照されたい）を用いて容易に決定することができる。
【００７６】
本明細書で用いられる「誘導体」とは、化学的または生物学的に修飾された化合物（例えば、タンパク質）の変化形であって、親化合物と構造的に類似し（実測的にまたは理論的に）、この親化合物から誘導可能な変化形を指す。
【００７７】
「立体障害」という用語は、それらのサイズまたは空間的配置から結果として生じる、分子の間の結合相互作用の防止または遅延を指す。
【００７８】
「アビディティー」という用語は、組合せによる複数の結合相互作用の強度について記載するのに用いられる用語である。アビディティーは、単一の結合の強度について記載するのに用いられる用語であるアフィニティーと異なる。抗体に関して、アビディティーとは、複数の抗原結合部位が、同時に標的と相互作用する、抗体の相互作用を指す。個別には、各結合相互作用を容易に破壊しうるが、多くの結合相互作用が同時に存在すると、一過性の単一部位間の非結合では分子の拡散が不可能となり、この部位の結合が保持される可能性が高い。全体的な効果は、抗原の抗体への相乗作用的で強力な結合である。
【００７９】
多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質
本開示は、Ｆａｂ断片（例えば、ＮＨ２−ＶＬ−ＣＬ−Ｓ−Ｓ−ＣＨ１−ＶＨ−ＮＨ２の基本構造を有する）であって、そのＶＬのＮ末端側の終端部に第１の融合部分を接合させ、かつ／またはＶＨのＮ末端側の終端部に第２の融合部分を接合させたＦａｂ断片を含む多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質（ＭＳＦＰ；図中ではまた、Ｆａｂが、ＣＤ３イプシロン鎖、Ｔ細胞受容体、ＮＫＧ２Ｄ、またはＦｃγＲなどの免疫エフェクター分子に結合する、Ｆａｂｅとも称する）を提供する。融合部分とＶＨおよびＶＬとの間には、場合によって、プロテアーゼにより切断可能なリンカーが存在しうる。この一般的なフォーマットが、以下でさらに記載される通りに用いられる融合部分に応じて、より複雑なホモ二量体多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質複合体を構築するためにその上に立脚しうる基本構造である。
【００８０】
本出願以前に、Ｆａｂの重鎖および軽鎖の両方のＮ末端側の終端部において融合部分を有するＦａｂベースの融合体について記載されたことはなかった。当業者により理解される通り、このような融合体であれば、Ｆａｂの結合アフィニティーを大きく損ない、したがって、それらを実際上有用でなくするであろう。（１または複数の）結合ドメインをＦａｂのＮ末端へ融合させると結合が低減されるというこの一般的な概念は、ＭＳＦＰにおいても観察された。例えば、ＯＫＴ３抗ＣＤ３  ＦａｂのＮ末端への融合は、Ｆａｂの標的への結合を著明に低減し、二重特異性Ｆａｂ融合タンパク質の生物学的活性のほぼ完全な喪失を結果としてもたらした。しかし、抗原結合ドメインの、ｈｕ−１Ｆ３．１ヒト化抗ＣＤ３  ＦａｂのＮ末端への融合が、場合によって、Ｆａｂの標的への結合の著明な喪失を結果としてもたらさなかったことは驚くべきことである。一部の場合には、細胞表面標的への結合の喪失が、可溶性タンパク質標的に対する場合よりいっそう著明であった。他の一部の場合には、結合の喪失が、生物学的活性の喪失を結果としてもたらさなかった。これに対し、Ｔ細胞上のＣＤ３に対する結合アフィニティーを低下させたＭＳＦＰは、生物学的活性を上昇させうる。これは驚くべきことであり、少なくとも以下の２つの因子であるがこれらに限定されない因子の重要性を裏付ける：１）腫瘍細胞への結合が高度（融合部分ＡおよびＢの結合ドメインを用いる）であると、ＭＳＦＰは、Ｆａｂ部分のＴ細胞への結合の低アフィニティーを克服する高アビディティーを呈示し、したがって、殺滅を誘導すること；２）ＯＫＴ３  Ｆａｂ融合タンパク質の挙動が、抗ＣＤ３抗体である１Ｆ３に由来するＭＳＦＰと完全に異なったのは、それらが高度に抗体依存的、したがって、エピトープ依存的なためであること。１Ｆ３およびそのヒト化変異体により認識されるＣＤ３イプシロンエピトープへと結合する抗体に由来するＦａｂ断片により作製された本開示におけるＭＳＦＰは、多くの固有な特色を保有し、これらの特色を使用して、薬物の安全性、有効性、および製造可能性において所望の属性を伴うヒト用治療剤を開発することができる。本明細書で記載される通り、この特性は、本開示のＭＳＦＰにおいて、ＭＳＦＰが適切な環境に置かれる（例えば、腫瘍の近傍に置かれる）まで、Ｆａｂの結合を遮蔽するのに用いられると有利である。
【００８１】
以下の節では、ＭＳＦＰの特異的な構造的構成要素がより詳細に記載される。以下の「多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質の機能」と題する節では、ＭＳＦＰの機能がより詳細に記載される。
【００８２】
Ｆａｂ断片
上記で言及した通り、本明細書で開示される多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、それらのコアにおいてＦａｂ断片を含む。当業者により理解される通り、Ｆａｂ断片とは、抗体の抗原結合断片である。Ｆａｂは、免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖の１つの定常領域と１つの可変領域とからなる。重鎖定常領域および重鎖可変領域は、軽鎖可変領域および軽鎖定常領域とヘテロ二量体化し、重鎖定常領域と軽鎖定常領域との間のジスルフィド結合により、通常共有結合的に連結される（例えば、図１の概略図を参照されたい）。したがって、本明細書で抗体に関して用いられる「Ｆａｂ」とは一般に、単一の重鎖の可変領域および第１の定常領域へとジスルフィド結合により結合させた単一の軽鎖（可変領域および定常領域の両方）からなる抗体の部分を指す。
【００８３】
当業者により認識される通り、重鎖と軽鎖との間のジスルフィド結合は、機能にとって好ましいが、不可欠なわけではない（Ｏｒｃｕｔｔら（２０１０年）、ＰＥＤＳ、２３巻：２２１〜２２８頁）。したがって、特定の実施形態では、本発明のＦａｂ断片が、ジスルフィド結合を含まない場合もある。この点において、重鎖および軽鎖を、ジスルフィド結合に対する必要を伴わずに安定的に相互作用するような様式で操作することができる。例えば、特定の実施形態では、重鎖または軽鎖を操作して、システイン残基を除去することができ、この場合、重鎖および軽鎖は、Ｆａｂとしてやはり安定的に相互作用および機能する。一実施形態では、重鎖と軽鎖との間の安定的な相互作用を容易とするように変異を施す。例えば、「ＫＩＨ」操作戦略を用いて、Ｆａｂの重鎖と軽鎖との間の二量体化を容易とすることができる（例えば、１９９６年、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、９巻：６１７〜６２１頁を参照されたい）。この戦略を用いて、相互作用ドメイン間のインターフェースにおける小型のアミノ酸側鎖を、大型のアミノ酸側鎖で置きかえることにより「ノブ」を創出する。対応する「ホール」は、大型の側鎖を小型の側鎖で置きかえることにより、相互作用分子間のインターフェースにおいて作製する。したがって、本明細書における使用のためにはまた、例えば、ＣＨ１および／またはＣＬの定常ドメインにおけるアミノ酸変化、ジスルフィド結合の除去、または精製のためのタグの付加など、特定の目的のためにデザインされた変異体のＦａｂ断片も想定される。
【００８４】
別の実施形態では、Ｆａｂ断片内の可変領域および定常領域の立体構成が、天然のＦａｂにおいて見出される立体構成と異なりうる。言い換えれば、一実施形態では、可変領域と定常領域との配向性が、一方の鎖ではＶＨ−ＣＬであり、別の鎖ではＶＬ−ＣＨ１である（Ｓｈａｅｆｅｒら（２０１１年）、ＰＮＡＳ、１０８巻：１１１８７０〜９２頁）。このような修飾Ｆａｂ断片は、それらの特定の標的抗原に結合するようにやはり機能し、本発明のＭＳＦＰにおける使用のために想定される。したがって、この点では、Ｆａｂを構成する可変領域および定常領域が、モジュール的であると考えられる。
【００８５】
特定の実施形態では、本開示のＦａｂ断片が、モノクローナル抗体に由来し、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ならびにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４などのこれらの亜型を含めた任意の種類の抗体に由来しうる。軽鎖ドメインは、カッパ鎖に由来する場合もあり、ラムダ鎖に由来する場合もある。本明細書における使用のためのＦａｂ断片は、組換えにより作製することができる。
【００８６】
当技術分野で周知の通り、抗体とは、免疫グロブリン分子の可変領域内に配置される少なくとも１つのエピトープ認識部位を介して、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどの標的への特異的結合が可能な免疫グロブリン分子である。本明細書で用いられる通り、この用語は、無傷のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体だけでなく、ヒト化抗体、キメラ抗体、および要請される特異性を有する抗原結合部位または抗原結合断片（エピトープ認識部位）を含む、他の任意の修飾された免疫グロブリン分子の立体構成も包摂する。
【００８７】
本明細書で開示されるＦａｂ断片は、免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＨおよびＶＬ）を含む抗原結合部分を含む。より具体的には、本明細書で用いられる「抗原結合部分」という用語が、ＣＤ３分子など、対象の標的抗原に結合する免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖の少なくとも１つのＣＤＲを含有するポリペプチド断片を指す。この点において、本明細書で記載される多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質の抗原結合部分は、対象の標的抗原に結合する親抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ全てのＣＤＲを含みうる。特定の実施形態では、ＭＳＦＰのＦａｂ断片の抗原結合部分が、ＣＤ３に結合する。
【００８８】
特定の実施形態では、本明細書で記載されるＭＳＦＰの特異的ＶＨおよび／または特異的ＶＬを用いて、相補的な可変領域のライブラリーをスクリーニングして、対象の標的抗原に対するアフィニティーの増大など、所望の特性を伴うＶＨ／ＶＬを同定することができる。このような方法は、例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３年）、１５０巻：８８０〜８８７頁；Ｃｌａｒｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９１年）、３５２巻：６２４〜６２８頁に記載されている。
【００８９】
また、他の方法を用いてＣＤＲをミックスアンドマッチさせて、所望の結合活性（ＭＳＦＰの融合部分内に存在する他の結合ドメインについての、ＣＤ３または本明細書で記載される他の対象の標的抗原への結合など）を有するＦａｂを同定することもできる。例えば、Ｋｌｉｍｋａら、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ（２０００年）、８３巻：２５２〜２６０頁は、マウスＶＬと、ＣＤＲ３およびＦＲ４をマウスＶＨから保持したヒトＶＨライブラリーとを用いるスクリーニング工程について記載している。抗体を得た後、ＶＨをヒトＶＬライブラリーに照らしてスクリーニングして、抗原に結合する抗体を得た。Ｂｅｉｂｏｅｒら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．（２０００年）、２９６巻：８３３〜８４９頁は、マウス重鎖の全体とヒト軽鎖ライブラリーとを用いるスクリーニング工程について記載している。抗体を得た後、１つのＶＬを、マウスのＣＤＲ３を保持したヒトＶＨライブラリーと組み合わせた。抗原に結合することが可能な抗体を得た。Ｒａｄｅｒら、ＰＮＡＳ（１９９８年）、９５巻：８９１０〜８９１５頁は、上記のＢｅｉｂｏｅｒらの工程と同様の工程について記載している。
【００９０】
当技術分野では、記載されたばかりのこれらの技法が、それら自体において、それら自体について、それら自体として公知である。しかし、当業者は、当技術分野の日常的な方法を用いて、本明細書で記載される本開示の複数の実施形態に従い、抗体の抗原結合断片を得るのに、このような技法を用いることが可能である。
【００９１】
本明細書ではまた、標的抗原（例えば、融合部分の結合ドメインの標的について本明細書の別の個所で記載される、ＣＤ３または任意の標的抗原）に特異的な抗体の抗原結合ドメインを得る方法であって、本明細書で示されるＶＨドメインのアミノ酸配列に１または複数のアミノ酸を付加、欠失、置換、または挿入することにより、このＶＨドメインのアミノ酸配列の変異体であるＶＨドメインをもたらし、場合によっては、このようにしてもたらされたＶＨドメインを、１または複数のＶＬドメインと組み合わせ、ＶＨドメインまたはＶＨ／ＶＬの１もしくは複数の組合せを調べて、対象の標的抗原（例えば、ＣＤ３）に特異的であり、場合によって、１または複数の所望の特性も伴う、特異的結合メンバーまたは抗体の抗原結合ドメインを同定するステップを含む方法も開示される。ＶＬドメインは、本明細書で実質的に示されるアミノ酸配列を有しうる。類似の方法であって、本明細書で開示されるＶＬドメインの１または複数の配列変異体を、１または複数のＶＨドメインと組み合わせる方法も使用することができる。
【００９２】
抗体またはポリペプチドに「特異的に結合する」か、または「優先的に結合する」（本明細書では互換的に用いられる）エピトープとは、当技術分野において十分に理解された用語であり、当技術分野ではまた、このような特異的または優先的な結合を決定する方法も周知である。分子は、それが、特定の細胞または物質と、代替的な細胞または物質との場合より高頻度で、迅速に、長い持続時間にわたり、かつ／または大きなアフィニティーで反応または会合する場合、「特異的結合」または「優先的結合」を呈示するという。抗体、またはそのＦａｂもしくはｓｃＦｖは、それが、他の物質に結合する場合より大きなアフィニティー、アビディティーで、容易に、かつ／または長い持続時間にわたり結合する場合、標的に「特異的に結合する」か、または「優先的に結合する」。例えば、ＣＤ３エピトープに特異的または優先的に結合する抗体とは、１つのＣＤ３エピトープに、他のＣＤ３エピトープまたはＣＤ３以外のエピトープに結合する場合より大きなアフィニティー、アビディティーで、容易に、かつ／または長い持続時間にわたり結合する抗体である。また、この定義を読み解くことにより、例えば、第１の標的に特異的または優先的に結合する抗体（または部分もしくはエピトープ）が、第２の標的に特異的または優先的に結合する場合もあり、結合しない場合もあることも理解される。それ自体、「特異的結合」または「優先的結合」は、必ずしも排他的結合を要請するわけではない（排他的結合を包含しうるが）。一般に、結合に対する言及は、優先的結合を意味するが、必ずしもそうであるわけではない。
【００９３】
免疫的結合とは一般に、免疫グロブリン分子と、この免疫グロブリンがそれに対して特異的である抗原との間で、例えば、例示として述べるものであり、限定として述べるものではないが、静電引力もしくは静電斥力、イオン性引力もしくはイオン性斥力、親水性引力もしくは親水性斥力、および／または疎水性引力もしくは疎水性斥力、立体斥力、水素結合、ファンデルワールス力、ならびに他の相互作用の結果として生じる種類の非共有結合的相互作用を指す。免疫的結合による相互作用の強度またはアフィニティーは、この相互作用の解離定数（Ｋｄ）であって、低値のＫＤが大きなアフィニティーを表すＫＤとの関連で表すことができる。選択したポリペプチドの免疫的結合特性は、当技術分野で周知の方法を用いて定量化することができる。このような一方法は、抗原結合部位／抗原の複合体形成および解離の速度であって、複合体パートナーの濃度、相互作用のアフィニティー、およびいずれの方向の速度にも同等に影響を及ぼす幾何学的パラメータに依存する速度を測定するステップを伴う。こうして、「オン速度定数」（ｋｏｎ）および「オフ速度定数」（ｋｏｆｆ）のいずれも、濃度ならびに会合速度および解離速度の実測値を計算することにより決定することができる。したがって、ｋｏｆｆ／ｋｏｎの比は、解離定数ＫＤと同等である。一般に、Ｄａｖｉｅｓら（１９９０年）、Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５９巻：４３９〜４７３頁を参照されたい。
【００９４】
「抗原」という用語は、Ｆａｂ断片の抗原結合部分などの選択的結合剤による結合が可能であり、加えて、動物において、この抗原のエピトープへの結合が可能な抗体を作製するのに用いることが可能な分子または分子の部分を指す。抗原は、１または複数のエピトープを有しうる。
【００９５】
「エピトープ」という用語は、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体への特異的結合が可能な任意の決定基、特定の実施形態では、ポリペプチド決定基を包含する。エピトープとは、抗体またはその抗原結合断片が結合する抗原の領域である。特定の実施形態では、エピトープ決定基に、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリルまたはスルホニルなど、化学的に活性な表面分子集団が含まれ、特定の実施形態では、特定の三次元構造特徴および／または特定の電荷特徴を有しうる。特定の実施形態では、ＭＳＦＰが、タンパク質および／または高分子の複合混合物中でその標的抗原を優先的に認識する場合に、抗原に特異的に結合するという。ＭＳＦＰは、平衡解離定数が≦１０−５、１０−６または１０−７Ｍである場合に、抗原に特異的に結合するという。一部の実施形態では、平衡解離定数が≦１０−８Ｍまたは≦１０−９Ｍでありうる。一部のさらなる実施形態では、平衡解離定数が≦１０−１０Ｍまたは≦１０−１１Ｍでありうる。
【００９６】
特定の実施形態では、本明細書で記載されるＦａｂ断片の抗原結合部分は、重鎖ＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲのセットであって、ＣＤＲに対する支持体をもたらし、互いと比べたＣＤＲの空間関係を規定する、重鎖フレームワーク領域および軽鎖フレームワーク領域（ＦＲ）のセットのそれぞれの間に散在するＣＤＲセットを包含する。本明細書で用いられる「ＣＤＲセット」という用語は、重鎖Ｖ領域または軽鎖Ｖ領域３つずつの超可変領域を指す。重鎖または軽鎖のＮ末端から順に、これらの領域を、それぞれ「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」、および「ＣＤＲ３」と称する。したがって、抗原結合部位は、重鎖Ｖ領域および軽鎖Ｖ領域の各々に由来するＣＤＲセットを含む６つのＣＤＲを包含する。本明細書では、単一のＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３）を含むポリペプチドを「分子的認識単位」と称する。多数の抗原−抗体複合体の結晶構造解析により、ＣＤＲのアミノ酸残基は、結合した抗原との広範な接触であって、抗原との最も広範な接触が重鎖ＣＤＲ３との接触である抗原との接触を形成することが裏付けられている。したがって、分子的認識単位は、抗原結合部位の特異性の主要な一因をなす。
【００９７】
本明細書で用いられる「ＦＲセット」という用語は、重鎖Ｖ領域または軽鎖Ｖ領域のＣＤＲセットのＣＤＲを枠づける、４つの挟み込むアミノ酸配列を指す。一部のＦＲ残基は、結合した抗原に接触しうるが、ＦＲ、特に、ＣＤＲに直接隣接するＦＲ残基は、Ｖ領域を抗原結合部位へとフォールドさせる主要な一因をなす。ＦＲ内では、特定のアミノ酸残基および特定の構造特色が極めて高度に保存される。この点において、全てのＶ領域配列は、約９０アミノ酸残基の内部ジスルフィドループを含有する。Ｖ領域が結合部位へとフォールドすると、ＣＤＲは、抗原結合表面を形成する突出ループモチーフとして提示される。一般に、ＣＤＲループが特定の「カノニカル」構造（ＣＤＲの正確なアミノ酸配列に関わらず）へとフォールドする形状に影響を及ぼす、ＦＲの保存的構造領域が存在することが認知されている。さらに、特定のＦＲ残基は、抗体の重鎖と軽鎖との相互作用を安定化させる非共有結合的なドメイン間接触に関与することも公知である。
【００９８】
免疫グロブリン可変領域の構造および位置は、Ｋａｂａｔ，  Ｅ．  Ａ．ら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、４版、ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、１９８７年、および現在ではインターネット（ｉｍｍｕｎｏ．ｂｍｅ．ｎｗｕ．ｅｄｕ）で入手可能なその改定版を参照することにより決定することができる。
【００９９】
「モノクローナル抗体」とは、均一な抗体集団であって、エピトープの選択的結合に関与するアミノ酸（自然発生のアミノ酸および非自然発生のアミノ酸）を含む抗体集団を指す。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一のエピトープを指向する。「モノクローナル抗体」という用語は、無傷のモノクローナル抗体および全長モノクローナル抗体だけでなく、また、それらの断片（Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片など）、単鎖（ｓｃＦｖ）抗体、それらの変異体、抗原結合部分を含む融合タンパク質、ヒト化モノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、ならびにエピトープに結合するのに要請される特異性および能力を有する抗原結合断片（エピトープ認識部位）を含む免疫グロブリン分子の他の任意の修飾された立体構成も包摂する。抗体の供給源または抗体が作製される様式（例えば、ハイブリドーマ、ファージ選択、組換え発現、トランスジェニック動物などによる）に関して限定することは意図しない。この用語は、完全免疫グロブリンのほか、「抗体」の定義下における上記の断片なども包含する。
【０１００】
タンパク質分解酵素であるパパインは、ＩｇＧ分子を優先的に切断して、複数の断片であって、これらのうちの２つ（Ｆａｂ断片）の各々が、無傷の抗原結合部位を包含する共有結合的ヘテロ二量体を含む断片をもたらす。酵素であるペプシンは、ＩｇＧ分子を切断して、複数の断片であって、両方の抗原結合部位を含むＦ（ａｂ’）２断片を含めた断片をもたらすことが可能である。本発明の特定の実施形態に従って用いられるＦｖ断片は、ＩｇＭの優先的なタンパク質分解的切断により作製しうるが、まれな場合には、ＩｇＧ免疫グロブリン分子またはＩｇＡ免疫グロブリン分子の優先的なタンパク質分解的切断により作製することもできる。しかし、Ｆｖ断片は、より一般的には、当技術分野において公知の組換え法を用いて誘導される。Ｆｖ断片は、天然抗体分子の抗原認識能および抗原結合能の大半を保持する抗原結合部位を含めた、非共有結合的ＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体を包含する（Ｉｎｂａｒら（１９７２年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、６９巻：２６５９〜２６６２頁；Ｈｏｃｈｍａｎら（１９７６年）、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１５巻：２７０６〜２７１０頁；およびＥｈｒｌｉｃｈら（１９８０年）、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１９巻：４０９１〜４０９６頁）。
【０１０１】
本開示の具体的な一実施形態では、Ｆａｂ断片が、ＣＤ３に結合する。「Ｔ細胞受容体」（ＴＣＲ）とは、Ｔ細胞の表面において見出される分子であって、ＣＤ３と共に、一般に主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子へと結合した抗原を認識する一因となる分子である。大半のＴ細胞では、ＴＣＲが、高度に可変的なα鎖とβ鎖との、ジスルフィド連結されたヘテロ二量体からなる。他のＴ細胞では、可変的なγ鎖およびδ鎖からなる代替的な受容体が発現する。ＴＣＲの各鎖は、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、１つのＮ末端免疫グロブリン可変領域、１つの免疫グロブリン定常領域、膜貫通領域、およびＣ末端側の終端部における短い細胞質テールを保有する（ＡｂｂａｓおよびＬｉｃｈｔｍａｎ、「Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（５版）、版元：Ｓａｕｎｄｅｒｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、２００３年；Ｊａｎｅｗａｙら、「Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ：  Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ」、４版、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、１４８、１４９、および１７２頁、１９９９年を参照されたい）。本開示において用いられるＴＣＲは、ヒト、マウス、ラット、または他の哺乳動物を含めた多様な動物種に由来しうる。
【０１０２】
「抗ＴＣＲ  Ｆａｂ」または「抗ＴＣＲ  Ｆａｂｅ」とは、Ｆａｂ、またはとりわけ、ＴＣＲ分子もしくはその個別の鎖（例えば、ＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、ＴＣＲγ鎖、またはＴＣＲδ鎖）のうちの１つに結合するＦａｂを含むＭＳＦＰを指す。特定の実施形態では、抗ＴＣＲ  Ｆａｂは、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、またはこれらの両方に結合する。
【０１０３】
当技術分野では、「ＣＤ３」が、６本鎖の多重タンパク質複合体として公知である（ＡｂｂａｓおよびＬｉｃｈｔｍａｎ、２００３年；Ｊａｎｅｗａｙら、１７２および１７８頁、１９９９年を参照されたい）。哺乳動物では、複合体が、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、２つのＣＤ３ε鎖、およびＣＤ３ζ鎖のホモ二量体を含む。ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、およびＣＤ３ε鎖は、単一の免疫グロブリンドメインを含有する免疫グロブリンスーパーファミリーのうちの、類縁性の高い細胞表面タンパク質である。ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、およびＣＤ３ε鎖の膜貫通領域は、負に帯電しており、これは、これらの鎖が、正に帯電したＴ細胞受容体鎖と会合することを可能とする特徴である。ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、およびＣＤ３ε鎖の各々の細胞内テールが、免疫受容活性化チロシンモチーフまたはＩＴＡＭとして公知の単一の保存的モチーフを含有するのに対し、各ＣＤ３ζ鎖は、３つの保存的モチーフを含有する。理論に拘束されることを望まないが、ＩＴＡＭは、ＴＣＲ複合体のシグナル伝達能にとって重要であると考えられている。本開示において用いられるＣＤ３は、ヒト、マウス、ラット、または他の哺乳動物を含めた多様な動物種に由来しうる。
【０１０４】
本明細書で用いられる「抗ＣＤ３  Ｆａｂ」とは、とりわけ、個別のＣＤ３鎖（例えば、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、ＣＤ３ε鎖）、または２つ以上の個別のＣＤ３鎖から形成される複合体（例えば、複数のＣＤ３ε鎖の複合体、ＣＤ３γ鎖とＣＤ３ε鎖との複合体、ＣＤ３δ鎖とＣＤ３ε鎖との複合体）に結合するＦａｂを指す。特定の実施形態では、抗ＣＤ３  Ｆａｂが、とりわけ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、またはこれらの任意の組合せに結合し、特定の実施形態では、ＣＤ３εに結合する。一実施形態では、抗ＣＤ３  Ｆａｂが、ＣＤ３イプシロンのＮ末端に結合する。具体的な一実施形態では、抗ＣＤ３  Ｆａｂが、ＣＤ３イプシロンのアミノ酸１〜２７に結合する。
【０１０５】
本明細書で用いられる「ＴＣＲ複合体」とは、ＣＤ３のＴＣＲとの会合により形成される複合体を指す。例えば、ＴＣＲ複合体は、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、２つのＣＤ３ε鎖、ＣＤ３ζ鎖のホモ二量体、ＴＣＲα鎖、およびＴＣＲβ鎖からなりうる。代替的に、ＴＣＲ複合体は、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、２つのＣＤ３ε鎖、ＣＤ３ζ鎖のホモ二量体、ＴＣＲγ鎖、およびＴＣＲδ鎖からなりうる。
【０１０６】
本明細書で用いられる「ＴＣＲ複合体の構成要素」とは、ＴＣＲ鎖（すなわち、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、またはＴＣＲδ）、ＣＤ３鎖（すなわち、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、またはＣＤ３ζ）、または２つ以上のＴＣＲ鎖もしくはＣＤ３鎖により形成される複合体（例えば、ＴＣＲαとＴＣＲβとの複合体、ＴＣＲγとＴＣＲδとの複合体、ＣＤ３εとＣＤ３δとの複合体、ＣＤ３γとＣＤ３εとの複合体、またはＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、および２つのＣＤ３ε鎖によるＴＣＲ亜複合体）を指す。
【０１０７】
背景として述べると、ＴＣＲ複合体は一般に、ＭＨＣ分子へと結合した抗原に対するＴ細胞応答を誘発する一因となる。ペプチド：ＭＨＣリガンドの、ＴＣＲおよび共受容体（すなわち、ＣＤ４またはＣＤ８）への結合により、ＴＣＲ複合体、共受容体、およびＣＤ４５チロシンホスファターゼが結び合わされると考えられる。これは、ＣＤ４５が、阻害性リン酸基を除去し、これにより、Ｌｃｋタンパク質キナーゼおよびＦｙｎタンパク質キナーゼを活性化することを可能とする。これらのタンパク質キナーゼの活性化により、ＣＤ３ζ鎖上におけるＩＴＡＭのリン酸化がもたらされ、これにより、これらの鎖が細胞質性チロシンキナーゼであるＺＡＰ−７０に結合することが可能となる。結合したＺＡＰ−７０の、その後のリン酸化による活性化により、３つのシグナル伝達経路であって、そのうちの２つがＰＬＣ−γのリン酸化および活性化により誘発されるシグナル伝達経路が始動し、次いで、これにより、ホスファチジルイノシトールリン酸（ＰＩＰ）が、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）およびイノシトール三リン酸（ＩＰ３）へと切断される。ＤＡＧによるタンパク質キナーゼＣの活性化により、転写因子ＮＦＫＢの活性化がもたらされる。ＩＰ３の作用の結果としての細胞内遊離Ｃａ２＋の突然の増大により、転写因子ＮＦＡＴ（活性化Ｔ細胞の核因子）が細胞質から核へと移行することを可能とする細胞質ホスファターゼであるカルシニューリンが活性化される。ＮＦＡＴの完全な転写活性にはまた、転写因子のＡＰ−１ファミリーのメンバーも要請され、転写調節因子のＦｏｓファミリーのメンバーとＪｕｎファミリーのメンバーとの二量体も要請される。
【０１０８】
活性化ＺＡＰ−７０により誘発される第３のシグナル伝達経路は、Ｒａｓの活性化およびその後におけるＭＡＰキナーゼカスケードの活性化である。これは、最終的にＦｏｓの活性化に至り、よって、ＡＰ−１転写因子の活性化に至る。ＮＦＫＢ、ＮＦＡＴ、およびＡＰ−１は併せて、Ｔ細胞染色体に作用し、結果として、Ｔ細胞の分化、増殖、およびエフェクター作用をもたらす新たな遺伝子転写を誘発する。Ｊａｎｅｗａｙら、１７８頁、１９９９年を参照されたい。
【０１０９】
特定の実施形態では、Ｆａｂが、とりわけ、個別のヒトＣＤ３鎖（例えば、ヒトＣＤ３γ鎖、ヒトＣＤ３δ鎖、およびヒトＣＤ３ε鎖）、または個別のヒトＣＤ３鎖のうちの２つ以上の組合せ（例えば、ヒトＣＤ３γとヒトＣＤ３εとの複合体、またはヒトＣＤ３δとヒトＣＤ３εとの複合体）に結合する。特定の好ましい実施形態では、Ｆａｂが、とりわけ、ヒトＣＤ３ε鎖に結合する。
【０１１０】
特定の他の実施形態では、本開示のＦａｂが、とりわけ、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、またはＴＣＲαおよびＴＣＲβから形成されるヘテロ二量体に結合する。特定の実施形態では、Ｆａｂが、とりわけ、ヒトＴＣＲα、ヒトＴＣＲβ、またはヒトＴＣＲαおよびヒトＴＣＲβから形成されるヘテロ二量体のうちの１または複数に結合する。
【０１１１】
特定の実施形態では、本開示のＦａｂが、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、ＣＤ３ε鎖、ＴＣＲα鎖、もしくはＴＣＲβ鎖、またはこれらの任意の組合せに由来する複合体形態など、１または複数のＴＣＲ鎖を伴う１または複数のＣＤ３鎖に由来する複合体形態に結合する。他の実施形態では、本開示のＦａｂが、１つのＣＤ３γ鎖、１つのＣＤ３δ鎖、２つのＣＤ３ε鎖、１つのＴＣＲα鎖、および１つのＴＣＲβ鎖に由来する複合体形態に結合する。さらなる実施形態では、本開示のＦａｂが、ヒトＣＤ３γ鎖、ヒトＣＤ３δ鎖、ヒトＣＤ３ε、ヒトＴＣＲα鎖、もしくはヒトＴＣＲβ鎖、またはこれらの任意の組合せに由来する複合体形態など、１または複数のヒトＴＣＲ鎖を伴う１または複数のヒトＣＤ３鎖に由来する複合体形態に結合する。特定の実施形態では、本開示のＦａｂが、１つのヒトＣＤ３γ鎖、１つのヒトＣＤ３δ鎖、２つのヒトＣＤ３ε鎖、１つのヒトＴＣＲα鎖、および１つのヒトＴＣＲβ鎖に由来する複合体形態に結合する。
【０１１２】
本開示のＦａｂは、本明細書で記載される通りに発生させることもでき、当技術分野で公知の（例えば、米国特許第６，２９１，１６１号；同第６，２９１，１５８号を参照されたい）多様な方法により発生させることもできる。Ｆａｂの供給源には、ヒト、ラクダ科動物（ラクダ、ヒトコブラクダ、またはラマに由来する；Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎら（１９９３年）、Ｎａｔｕｒｅ、３６３巻：４４６頁；およびＮｇｕｙｅｎら（１９９８年）、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２７５巻：４１３頁）、サメ（Ｒｏｕｘら（１９９８年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、９５巻：１１８０４頁）、魚類（Ｎｇｕｙｅｎら（２００２年）、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、５４巻：３９頁）、齧歯動物、鳥類、またはヒツジを含めた多様な種に由来するモノクローナル抗体の核酸配列（ファージライブラリー内で抗体、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、またはＦａｂなどとしてフォーマットしうる）が含まれる。
【０１１３】
とりわけ、変性形態にあるヒトＣＤ３（ウェスタンブロットまたはドットブロット）および天然形態形態にあるヒトＣＤ３（Ｔ細胞上の）に結合するＳＰ３４マウスモノクローナル抗体など、サルＣＤ３との交差反応性を伴う抗ヒトＣＤ３抗体が特に所望される（Ｐｒｅｓｓａｎｏ，  Ｓ．、Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊ．、４巻：３３７〜３４４頁、１９８５年；Ａｌａｒｃｏｎ，  Ｂ．、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１０巻：９０３〜９１２頁、１９９１年）。ＳＰ３４マウスモノクローナル抗体はまた、ＣＤ３εを単独でトランスフェクトしたＣＯＳ細胞のほか、ＣＤ３ε／γ二重形質転換細胞またはＣＤ３ε／δ二重形質転換細胞にも結合する（Ｓａｌｍｅｒｏｎ，  Ａ．ら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７巻：３０４７〜５２頁、１９９１年）。ＳＰ３４抗体はまた、非ヒト霊長動物にも交差反応する（Ｙｏｓｈｉｎｏ，  Ｎ．ら、Ｅｘｐ．  Ａｎｉｍ、４９巻：９７〜１１０頁、２０００年；Ｃｏｎｒａｄ，  ＭＬ．ら、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ７１Ａ巻：９２５〜３３頁、２００７年）。加えて、ＳＰ３４は、架橋されるとＴ細胞も活性化する（Ｙａｎｇら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３７巻：１０９７〜１１００頁、１９８６年）。サルＣＤ３との交差反応性は、毒性研究を、チンパンジーにおいてでもなく、サロゲート分子を用いてでもなく、非ヒト霊長動物において、臨床候補物質を直接的に用いて実行することを可能とするので重要である。したがって、本開示のＭＳＦＰ中のこのような交差反応性抗ＣＤ３  Ｆａｂを用いる毒性研究は、関与性の高い安全性評価を提供する。
【０１１４】
他の例示的な抗ＣＤ３抗体には、Ｃｒｉｓ−７モノクローナル抗体（Ｒｅｉｎｈｅｒｚ，  Ｅ．  Ｌ．ら（編）、「Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｔｙｐｉｎｇ  ＩＩ．」、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、（１９８６年））、ＢＣ３モノクローナル抗体（Ａｎａｓｅｔｔｉら（１９９０年）、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．、１７２巻：１６９１頁）、ＯＫＴ３（Ｏｒｔｈｏ  ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｓｔｕｄｙ  Ｇｒｏｕｐ（１９８５年）、Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍ編、３１３巻：３３７頁）、およびＯＫＴ３  ａｌａ−ａｌａ（Ｈｅｒｏｌｄら（２００３年）、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．、１１巻：４０９頁）などのその誘導体、ビジリズマブ（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒら（２００２年）、Ｂｌｏｏｄ、９９巻：２７１２頁）、ならびに１４５−２Ｃ１１モノクローナル抗体（Ｈｉｒｓｃｈら（１９８８年）、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４０巻：３７６６頁）が含まれる。本明細書において使用が想定されるさらなるＣＤ３結合分子には、ＵＣＨＴ−１（Ｂｅｖｅｒｌｅｙ，  ＰＣおよびＣａｌｌａｒｄ，  Ｒ．  Ｅ．（１９８１年）、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １１巻：３２９〜３３４頁）、およびＷＯ２００４／１０６３８０；ＷＯ２０１０／０３７８３８；ＷＯ２００８／１１９５６７；ＷＯ２００７／０４２２６１；ＷＯ２０１０／０１５０９１８において記載されるＣＤ３結合分子が含まれる。
【０１１５】
例示的な抗ＴＣＲ抗体は、Ｈ５７モノクローナル抗体（Ｌａｖａｓａｎｉら（２００７年）、Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、６５巻：３９〜４７頁）である。
【０１１６】
特定の実施形態では、Ｆａｂは、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＴＬＡ−４、ＦＡＳ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＧＩＴＲ、ＬＴβＲ、ＴＬＲ、ＴＲＡＩＬ受容体１、ＴＲＡＩＬ受容体２、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、およびＥｒｂＢ３が含まれるがこれらに限定されない他の細胞表面標的に結合する。
【０１１７】
Ｆａｂ断片の抗原結合断片配列（例えば、重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列）は、公表されたデータベースによるか、またはＴＣＲの構成要素であるＣＤ３鎖を用いてハイブリドーマを発生させるための従来の戦略を用いても入手可能であり、他のＦａｂの結合標的を、簡便な系（例えば、マウス、ＨｕＭＡｂマウス（Ｒ）、ＴＣマウス（ＴＭ）、ＫＭ−マウス（Ｒ）、ラマ、ニワトリ、ラット、ハムスター、ウサギなど）における免疫原として用いて、本明細書における使用のためのＦａｂを発生させることもできる。当業者により理解される通り、Ｆａｂ断片は、ファージディスプレイ法、酵母ディスプレイ法、リボソームディスプレイ法、およびｍＲＮＡディスプレイ法などの抗体ディスプレイ法；ＳＬＡＭ法などのＢ細胞培養法；または免疫化された動物被験体または免疫化されたヒト被験体から単離されたＢ細胞またはプラズマＢ細胞に対するハイスループットの遺伝子配列決定法の使用を含め、当技術分野で公知の多様な技法を用いて生成させることができる。
【０１１８】
本開示のＭＳＦＰにおける使用のための例示的なＦａｂには、ＶＨ、Ｆｄ、ＨＣ、ＶＬ、およびＬＣのアミノ酸配列、ならびに配列番号２３〜２８に示されるＣＤＲなど、それらのＣＤＲを含め、配列番号２９〜７６に示されるそれらをコードするポリヌクレオチドが含まれる。
【０１１９】
融合部分
本明細書で記載されるＭＳＦＰの融合部分は、ＭＳＦＰにさらなる結合特異性および／または機能的属性（例えば、血清半減期の延長、ＡＤＣＣ、または他の免疫活性化カスケードの活性化）をもたらすだけでなく、特にＦａｂの、細胞表面における標的、とりわけ、細胞膜に近接し、したがって、接触可能性が限局的なＦａｂ標的抗原（ＣＤ３など）への結合が意図される（例えば、腫瘍細胞の存在下において）場合／ときを除いて、Ｆａｂのその標的抗原への結合を著明に低減する立体障害も創出する。これは、Ｆａｂ断片のＣ末端においてさらなる結合ドメインに融合するＴＲＩＢＯＤＩＥＳ（商標）などの他のＦａｂ融合タンパク質と直接的な対照をなす。（例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２０００年、１６５巻：７０５０〜７０５７頁を参照されたい）。
【０１２０】
さらに、単一のＭＳＦＰ内では、第１の融合部分と第２の融合部分とが二量体化することを意図しない。これにより、本開示のＭＳＦＰが、ＷＯ２００８／０２４１８８およびＷＯ２００９／１４９１８５において記載されている融合タンパク質など、他の公知の融合タンパク質から識別される。ＷＯ２００８／０２４１８８およびＷＯ２００９／１４９１８５の公報において記載される構築物は、ＶＨ１−ＶＨ２−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３およびＶＬ１−ＶＬ２−ＣＬの一般的なフォーマットを有することにより異なる。この構築物では、ＶＨ１とＶＬ１とが二量体化して、さらなる抗原結合部位を形成する。これは、例えば、図７Ｂにおいて示されている、本明細書で記載されるＭＳＦＰのフォーマットと異なる。本開示のＭＳＦＰでは、第１の融合部分と第２の融合部分とが会合して、単一の抗原結合部位を形成するわけではない。本明細書の別の個所で記載される本ＭＳＦＰのさらなる識別特徴は、細胞表面標的などの標的上でＭＳＦＰが集塊をなさない場合、融合部分により、Ｆａｂのその標的に対する結合アフィニティーが低減されることである。これに対し、ＷＯ２００８／０２４１８８およびＷＯ２００９／１４９１８５において記載されるタンパク質は、抗体の結合標的に対する結合アフィニティーの低減を呈示しない。
【０１２１】
本開示のＭＳＦＰの融合部分は、結合ドメイン、１もしくは複数の機能的ドメイン、またはこれらの組合せを含みうる。図１に描示される通り、一実施形態では、本開示のＭＳＦＰが、図１で融合部分Ａおよび融合部分Ｂとして示される２つの融合部分を含む。本明細書ではまた、融合部分が、第１の融合部分および第２の融合部分、または一方を他方から識別する類似の表現としても言及される。例示的な融合部分は、配列番号７７、８７、および９３に示されるポリヌクレオチドによりコードされる、配列番号７８、８８、および９４に示されるアミノ酸配列、またはそれらのＣＤＲ、ＶＨもしくはＶＬを含む（例えば、配列番号１３９〜１５０を参照されたい）。
【０１２２】
特定の実施形態では、第１の融合部分と第２の融合部分とが同一である。さらなる実施形態では、融合部分の両方が、同一な結合ドメインを含むが、他の点では、機能的ドメインを有するかまたはこれを欠くことにより異なる。別の実施形態では、第１の融合部分が、第１の標的抗原に結合する第１の結合ドメインを含み、第２の融合部分が、第２の標的抗原に結合する第２の結合ドメインを含む。
【０１２３】
特定の実施形態では、第１の融合部分および第２の融合部分の各々が結合ドメインを含み、これらをそれぞれ、第１の結合ドメインおよび第２の結合ドメインと称することができる。特定の実施形態では、第１の結合ドメインが、第２の結合ドメインと同じ標的に結合する。この点において、特定の実施形態では、標的が少なくとも１つの類似性を共有し、限定せずに述べると、例えば、標的は、両方のタンパク質、ポリヌクレオチド、もしくは脂質を含む；標的は、異なるスプライス形態でありうるが、同じタンパク質である；または、特定の実施形態では、標的は、グリコシル化などの修飾は異なりうるが、同じアミノ酸配列を有するという意味で、第１の結合ドメインが、第２の結合ドメインと同じ標的に結合しうる。特定の実施形態では、第１の結合ドメインが、第２の結合ドメインと同じ標的に結合するが、同じ標的の異なるエピトープに結合する。特定の実施形態では、第１の結合ドメインと第２の結合ドメインとが、異なる標的に結合する。
【０１２４】
別の実施形態では、第１の融合部分が第１の結合ドメインを含み、第２の融合部分が第２の結合ドメインを含み、第１の結合ドメインと、第２の結合ドメインとは、同じ標的分子に結合するが、フォーマットが異なる（例えば、第１の結合ドメインが、細胞表面受容体に結合するｓｃＦｖであり、第２の結合ドメインが、この受容体のリガンドであるか；または、同様に、第１の結合ドメインが、リガンドに結合するｓｃＦｖであり、第２の結合ドメインが、リガンドの受容体の細胞外ドメインである）。
【０１２５】
結合ドメイン
上記で言及した通り、特定の実施形態では、第１の融合部分および／または第２の融合部分が、結合ドメインを含む。本開示に従う「結合ドメイン」または「結合領域」は、例えば、とりわけ、生物学的分子（例えば、細胞表面受容体もしくは腫瘍タンパク質、またはこれらの構成要素）を認識し、これに結合する能力を保有する任意のタンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、またはペプチドでありうる。結合ドメインには、任意の自然発生であるか、合成であるか、半合成であるか、または組換えにより作製された対象の生物学的分子に対する結合パートナーが含まれる。例えば、本明細書でさらに記載される通り、結合ドメインは、抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域領域であることが可能であり、軽鎖可変領域および重鎖可変領域領域を併せて単鎖でいずれかの配向性（例えば、ＶＬ−ＶＨまたはＶＨ−ＶＬ）で接合することができる。とりわけ、特定の標的と結合する本開示の結合ドメインを同定するための、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、または表面プラズモン共鳴解析（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）解析を用いて）を含めた、多様なアッセイが公知である。
【０１２６】
本明細書の以下では、例示的な結合ドメインがさらに記載される。特定の実施形態では、標的分子が、受容体または腫瘍抗原などの細胞表面発現タンパク質でありうる。別の実施形態では、本明細書で有用な結合ドメインが結合する標的分子が、サイトカイン、アルブミン、または他の血清タンパク質などの可溶性抗原である。例示的な結合ドメインには、ｓｃＦｖなど、免疫グロブリンの抗原結合ドメイン、ｓｃＴＣＲ、受容体の細胞外ドメイン、細胞表面分子／受容体のリガンド、またはその受容体結合ドメイン、および腫瘍結合タンパク質が含まれる。特定の実施形態では、抗原結合ドメインが、ｓｃＦｖ、ＶＨ、ＶＬ、ドメイン抗体変異体（ｄＡｂ）、ラクダ科動物抗体（ＶＨＨ）、フィブロネクチン３ドメイン変異体、アンキリン反復配列変異体、および他の足場タンパク質に由来する他の抗原特異的結合ドメインでありうる。
【０１２７】
したがって、特定の実施形態では、結合ドメインが、抗体に由来する結合ドメインを含むが、抗体以外に由来する結合ドメインでもありうる。抗体に由来する結合ドメインは、抗体の断片の場合もあり、抗体の１または複数の断片であって、抗原との結合に関与する断片の遺伝子操作された産物の場合もある。限定せずに述べると、例には、相補性決定領域（ＣＤＲ）、可変領域（Ｆｖ）、重鎖可変領域（ＶＨ）、軽鎖可変領域（ＶＬ）、重鎖、軽鎖、単鎖可変領域（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、単一ドメインラクダ抗体（ラクダ科動物ＶＨＨ）、および単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）が含まれる。
【０１２８】
当業者により理解され、本明細書の別の個所で記載される通り、完全抗体は、２つの重鎖および２つの軽鎖を含む。各重鎖が、可変領域、ならびに第１の定常領域、第２の定常領域、および第３の定常領域からなるのに対し、各軽鎖は、可変領域および定常領域からなる。哺乳動物の重鎖は、α、δ、ε、γ、およびμとして分類されており、哺乳動物の軽鎖は、λまたはκとして分類されている。α重鎖、δ重鎖、ε重鎖、γ重鎖、およびμ重鎖を含む免疫グロブリンは、免疫グロブリン（Ｉｇ）Ａ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭとして分類されている。完全抗体は、「Ｙ」字型を形成する。Ｙ字型のステム部分は、併せて結合した２つの重鎖の第２の定常領域および第３の定常領域（ＩｇＥおよびＩｇＭの場合は、第４の定常領域）からなり、ヒンジ内にジスルフィド結合（鎖間）が形成される。γ重鎖、α重鎖、およびδ重鎖は、３つのタンデムの（直列の）Ｉｇドメインと、可撓性を付加するためのヒンジ領域とからなる定常領域を有し、μ重鎖およびε重鎖は、４つの免疫グロブリンドメインからなる定常領域を有する。第２の定常領域および第３の定常領域は、それぞれ、「ＣＨ２ドメイン」および「ＣＨ３ドメイン」と称する。Ｙ字型の各アームには、単一の軽鎖の可変領域および定常領域へと結合した単一の重鎖の可変領域および第１の定常領域が含まれる。軽鎖および重鎖の可変領域は、抗原の結合の一因となる。
【０１２９】
抗体に関する「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とは、抗体の重鎖または軽鎖の可変領域内の高度に可変的なループを指す。ＣＤＲは、抗原の立体配座と相互作用することが可能であり、抗原への結合を大部分決定しうる（一部のフレームワーク領域は結合に関与することが公知であるが）。重鎖可変領域および軽鎖可変領域は各々、３つずつのＣＤＲを含有する。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔら（Ｗｕ，  ＴＴおよびＫａｂａｔ，  Ｅ．  Ａ．、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．、１３２巻（２号）：２１１〜５０頁、（１９７０年）；Ｂｏｒｄｅｎ，  Ｐ．およびＫａｂａｔ，  Ｅ．  Ａ．、ＰＮＡＳ、８４巻：２４４０〜２４４３頁（１９８７年）；Ｋａｂａｔ，  Ｅ．  Ａ．ら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、ＤＩＡＮＥ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ刊、１９９２年）に従い、配列により、またはＣｈｏｔｈｉａら（Ｃｈｏｉｔｈｉａ，  Ｃ．およびＬｅｓｋ，  Ａ．Ｍ．、Ｊ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、１９６巻（４号）：９０１〜９１７頁（１９８７年）、Ｃｈｏｉｔｈｉａ，  Ｃ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、３４２巻：８７７〜８８３頁（１９８９年））に従い、構造によるなど、従来の方法により規定または同定することができる。
【０１３０】
抗体に関する「重鎖可変領域」または「ＶＨ」とは、フレームワーク領域として公知の挟み込む連なりであって、ＣＤＲよりいっそう高度に保存的であり、ＣＤＲを支持する足場を形成する連なりの間に散在する、３つのＣＤＲを含有する重鎖の断片を指す。
【０１３１】
抗体に関する「軽鎖可変領域」または「ＶＬ」とは、フレームワーク領域の間に散在する、３つのＣＤＲを含有する軽鎖の断片を指す。
【０１３２】
抗体に関する「Ｆｖ」とは、完全な抗原結合部位を保有する抗体最小の断片を指す。Ｆｖ断片は、単一の重鎖の可変領域へと結合させた単一の軽鎖の可変領域からなる。
【０１３３】
抗体に関する「単鎖Ｆｖ抗体」または「ｓｃＦｖ」とは、互いへと直接的に、またはペプチドによるリンカー配列を介して接合されている軽鎖可変領域および重鎖可変領域からなる操作抗体を指す。
【０１３４】
本明細書で用いられる「単一ドメインラクダ抗体」または「ラクダ科動物ＶＨＨ」とは、重鎖抗体の公知で最小の抗原結合単位を指す（Ｋｏｃｈ−Ｎｏｌｔｅら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．、２１巻：３４９０〜３４９８頁（２００７年））。「重鎖抗体」または「ラクダ科動物抗体」とは、２つのＶＨドメインを含有するが軽鎖は含有しない抗体を指す（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  Ｌ．ら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２３１巻：２５〜３８頁（１９９９年）；ＷＯ９４／０４６７８；ＷＯ９４／２５５９１；米国特許第６，００５，０７９号）。
【０１３５】
「単一ドメイン抗体」または「ｄＡｂ」とは、抗体重鎖の可変領域（ＶＨドメイン）または抗体軽鎖の可変領域（ＶＬドメイン）からなる抗体断片を指す（Ｈｏｌｔ，  Ｌ．ら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２１巻（１１号）：４８４〜４９０頁）。
【０１３６】
本明細書で用いられる「ジスルフィド結合」という用語は、１または複数のジスルフィド結合を介する重鎖断片と軽鎖断片との結合を指す。１または複数のジスルフィド結合は、２つの断片内のチオール基を連結することにより、２つの断片の間で形成することができる。特定の実施形態では、１または複数のジスルフィド結合を、重鎖断片内および軽鎖断片内それぞれの１または複数のシステイン残基の間で形成することができる。
【０１３７】
「可変領域連結配列」とは、重鎖可変領域を軽鎖可変領域へと接合し、結果として得られるポリペプチドが、同じ軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む抗体と同じ標的分子に対して特異的結合アフィニティーを保持するように、２つの結合サブドメインの相互作用と適合可能なスペーサー機能をもたらすアミノ酸配列である。特定の実施形態では、結合ドメインを免疫グロブリンのＣＨ２領域ポリペプチドまたはＣＨ３領域ポリペプチドへと連結するのに有用なヒンジを、可変領域連結配列として用いることができる（ヒンジのさらなる考察については、本明細書の別の個所を参照されたい）。
【０１３８】
特定の実施形態では、結合ドメインが、抗体以外の構成要素を含む。抗原に結合する抗体以外の構成要素は、例えば、タンパク質間相互作用、タンパク質−脂質間相互作用、タンパク質−ポリヌクレオチド間相互作用、タンパク質−糖間相互作用、またはリガンド結合に関与するタンパク質ドメインなど、対象の標的抗原を認識し、これに結合することが可能な、任意の適切なタンパク質ドメインまたは構成要素でありうる。限定せずに述べると、適切な抗体以外の構成要素の例には、フィブロネクチン３ドメイン（Ｆｎ３）、アンキリン反復配列、およびアドネクチンが含まれる。
【０１３９】
本開示の結合ドメインの代替的な供給源には、ランダムペプチドライブラリーをコードする配列、またはフィブリノーゲンドメイン（例えば、Ｗｅｉｓｅｌら（１９８５年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３０巻：１３８８頁を参照されたい）、クニッツドメイン（例えば、米国特許第６，４２３，４９８号を参照されたい）、リポカリンドメイン（例えば、ＷＯ２００６／０９５１６４を参照されたい）、Ｖ様ドメイン（例えば、米国特許出願公開第２００７／００６５４３１号を参照されたい）、Ｃ型レクチンドメイン（ＺｅｌｅｎｓｋｙおよびＧｒｅａｄｙ（２００５年）、ＦＥＢＳ  Ｊ．、２７２巻：６１７９頁）、またはＦｃａｂ（商標）（例えば、ＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ２００７／０９８９３４号；同第ＷＯ２００６／０７２６２０号を参照されたい）など、代替的な抗体以外の足場のループ領域における操作されたアミノ酸の多様性をコードする配列が含まれる。
【０１４０】
特定の実施形態では、結合ドメインが、Ｆｎ３ドメインを含む。本明細書で用いられる「フィブロネクチン３ドメイン」または「Ｆｎ３」とは、生物学的分子への結合に関与するフィブロネクチンにおける自律的なフォールディング単位を指す（Ｃａｌａｙｃａｙ，  Ｊ．ら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２６０巻（２２号）：１２１３６〜４１頁（１９８５年）；Ｋｏｉｄｅ，  Ａ．ら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２８４巻（４号）：１１４１〜１１５１頁（１９９８年）；Ｂｌｏｏｍ，  Ｌ．ら、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ、１４巻（１９〜２０号）：９４９〜９５５頁（２００９年））。Ｆｎ３ドメインは、多様なタンパク質において見出すことができ、Ｆｎ３ドメインの異なる反復配列が、ＤＮＡおよびタンパク質などの生物学的分子に対する結合部位を含有することが見出される。
【０１４１】
特定の実施形態では、結合ドメインが、アドネクチンを含む。本明細書で用いられる「アドネクチン」とは、Ｆｎ３ドメインに基づく遺伝子操作されたタンパク質を指す（Ｋｏｉｄｅ，  Ａ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、３５２巻：９５〜１０９頁（２００７年））。アドネクチン中のＦｎ３ドメインは、抗体の可変領域の３つのＣＤＲを模倣する３つのループを含有し、異なる標的分子への特異的結合に応じて遺伝子的に調整することができる。
【０１４２】
特定の実施形態では、結合ドメインが、アンキリン反復配列を含む。本明細書で用いられる「アンキリン反復配列」とは、赤血球のアンキリン中で見出される３３アミノ酸残基の反復配列を含有するタンパク質の構成要素を指す（Ｄａｖｉｓ，  Ｌ．  Ｈ．ら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２６６巻（１７号）：１１１６３〜１１１６９頁（１９９１年））。アンキリン反復配列は、機能が異なる大多数のタンパク質において生じる最も一般的なタンパク質間相互作用の構造のうちの１つとして公知である。
【０１４３】
図中で描示される通り、ｓｃＦｖは、特に例示的な結合ドメインである。融合部分の結合ドメインとして用いられるｓｃＦｖは、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩｂ、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＴＬＡ−４、ＦＡＳ、線維芽細胞成長因子受容体１（ＦＧＦＲ１）、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、グルココルチコイド誘導型ＴＮＦＲ関連（ＧＩＴＲ）タンパク質、リンホトキシン−ベータ受容体（ＬＴβＲ）、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導性リガンド受容体１（ＴＲＡＩＬ受容体１）およびＴＲＡＩＬ受容体２、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、前立腺特異性膜抗原（ＰＳＭＡ）タンパク質、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）タンパク質、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ；また、ヒト腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１７（ＴＮＦＲＳＦ１７）、およびＣＤ２６９としても公知）、腫瘍会合タンパク質炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、肝細胞成長因子受容体（ＨＧＦＲ）、上皮成長因子受容体１（ＥＧＦＲ１）、ヒト上皮成長因子受容体２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ；Ｅｒｂ２）、ＥｒｂＢ３、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、葉酸受容体、エフリン受容体、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ３７、ＣＤ３８、およびＣＤ１３８が含まれるがこれらに限定されない多様な標的分子のうちのいずれにも結合しうる。
【０１４４】
特定の実施形態では、結合ドメインが、腫瘍抗原に結合する。限定せずに述べると、例示的な腫瘍抗原標的分子には、ｐ５３、ｃＭｅｔ、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＢＡＧＥ、ＤＡＭ−６、ＤＡＭ−１０、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＧＡＧＥ−８、ＧＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−４、ＧＡＧＥ−５、ＧＡＧＥ−６、ＧＡＧＥ−７Ｂ、ＮＡ８８−Ａ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＭＡＲＴ−１、ＭＣ１Ｒ、Ｇｐ１００、ＰＳＡ、ＰＳＭ、チロシナーゼ、ウィルムス腫瘍抗原（ＷＴ１）、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＡＲＴ−４、ＣＡＭＥＬ、ＣＥＡ、Ｃｙｐ−Ｂ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ｈＴＥＲＴ、ｈＴＲＴ、ｉＣＥ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＰＲＡＭＥ、Ｐ１５、ＲＵ１、ＲＵ２、ＳＡＲＴ−１、ＳＡＲＴ−３、ＷＴ１、ＡＦＰ、β−カテニン／ｍ、カスパーゼ８／ｍ、ＣＥＡ、ＣＤＫ−４／ｍ、ＥＬＦ２Ｍ、ＧｎＴ−Ｖ、Ｇ２５０、ＨＳＰ７０−２ｍ、ＨＳＴ−２、ＫＩＡＡ０２０５、ＭＵＭ−１、ＭＵＭ−２、ＭＵＭ−３、ミオシン／ｍ、ＲＡＧＥ、ＳＡＲＴ−２、ＴＲＰ−２／ＩＮＴ２、７０７−ＡＰ、アネキシンＩＩ、ＣＤＣ２７／ｍ、ＴＰＩ／ｍｂｃｒ−ａｂｌ、ＥＴＶ６／ＡＭＬ、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ、Ｐｍｌ／ＲＡＲα、およびＴＥＬ／ＡＭＬ１が含まれる。当業者には、これらの腫瘍タンパク質および他の腫瘍タンパク質が公知である。
【０１４５】
本開示のＭＳＦＰの融合部分において有用な他の結合ドメインには、細胞表面受容体に結合するリガンドが含まれる。例示的なリガンドには、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＴＬＡ−４、ＦＡＳ、線維芽細胞成長因子受容体１（ＦＧＦＲ１）、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、グルココルチコイド誘導型ＴＮＦＲ関連（ＧＩＴＲ）タンパク質、リンホトキシン−ベータ受容体（ＬＴβＲ）、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導性リガンド−受容体１（ＴＲＡＩＬ受容体１）およびＴＲＡＩＬ受容体２、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、前立腺特異性膜抗原（ＰＳＭＡ）タンパク質、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＭＡ）タンパク質、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ；また、ヒト腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１７（ＴＮＦＲＳＦ１７）、およびＣＤ２６９としても公知）、腫瘍会合タンパク質炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、肝細胞成長因子受容体（ＨＧＦＲ）、上皮成長因子受容体１（ＥＧＦＲ１）、ヒト上皮成長因子受容体２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ；Ｅｒｂ２）、ＥｒｂＢ３、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、葉酸受容体、エフリン受容体、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ３７、ＣＤ３８、およびＣＤ１３８など、細胞表面受容体に対するリガンドが含まれるがこれらに限定されない。
【０１４６】
一実施形態では、結合ドメインが、血清アルブミンに結合する。ヒト血清アルブミンへの結合は、タンパク質による薬物の半減期（ｔ１／２）を数日間またはなお長い期間へ延長する可能性をもたらす。先行技術では、血清アルブミンへの結合または血清アルブミンへの融合により、治療用分子の半減期を著明に延長しうることが公知である。特定の実施形態では、ヒト血清アルブミンに結合する結合ドメインが、非ヒト霊長動物のオルソログと交差反応し、ヒトにおける処置に対していっそう関与性でありうる前臨床動物毒性研究における薬物の半減期の推定を可能としうる。
【０１４７】
特定の実施形態では、結合ドメインが、とりわけ、疾患状態と関連する抗原標的に結合する。疾患状態には、生理学的状態、病理学的状態、および美容学的状態が含まれうる。限定せずに述べると、例示的な状態の例には、がん、炎症性障害、同種移植片移植、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、および多発性硬化症が含まれる。
【０１４８】
特定の実施形態では、抗原標的は、状態と負に関連する。特定の実施形態では、結合ドメインを含むＭＳＦＰが抗原標的に結合することにより、抗原標的の生物学的機能が不活化またはアンタゴナイズされ、これにより、状態が改善されうる。特定の実施形態では、結合ドメインを含むＭＳＦＰが抗原標的に結合することにより、抗原標的の生物学的機能が活性化またはアンタゴナイズされ、これにより、状態が改善されることになる。本明細書で記載されるＭＳＦＰはそれ自体、融合部分の標的抗原に関してアゴニスト分子の場合もあり、アンタゴニスト分子の場合もある。
【０１４９】
配列番号７８、８８、９４（アミノ酸）および配列番号７７、８７、９３（ポリヌクレオチド）には、例示的な結合ドメインが提示されるが、これらには、そのＣＤＲ、ＶＨ、およびＶＬも含まれる（例えば、配列番号１３９〜１５０を参照されたい）。
【０１５０】
したがって、本明細書で記載される結合ドメインはとりわけ、任意の適切な抗原標的に結合しうる。言及される通り、限定せずに述べると、適切な抗原標的の例には、ＴＮＦ受容体（Ｓｈｅｎ，  Ｈ．  Ｍ．ら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．、２０巻（１０号）：１５８９〜９８頁（２００６年））、ｃＭｅｔ（Ｂｏｔｔａｒｏ，  Ｄ．  Ｐ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５１巻（４９９５号）：８０２〜８０４頁（１９９１年））、ＣＤ３（Ｃｈｅｔｔｙ，  Ｒ．ら、Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．、１７３巻（４号）：３０３〜７頁（１９９４年））、ＣＤ４０（Ｃｈａｔｚｉｇｅｏｒｇｉｏｕ  Ａ．ら、Ｂｉｏｆａｃｔｏｒｓ．、３５巻（６号）：４７４〜８３頁（２００９年））、ＤＲ３（Ｍｅｙｌａｎ，  Ｆ．ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．、２９巻（１号）：７９〜８９頁（２００８年））、ＦｃγＲ（Ｔｏｒｋｉｌｄｓｅｎ，  Ｏ．ら、Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｓｃａｎｄ  Ｓｕｐｐｌ．、１８３巻：６１〜３頁（２００６年））、ＮＫＧ２Ｄ（Ｏｂｅｉｄｙ，  Ｐ．ら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、４１巻（１２号）：２３６４〜７頁（２００９年））、およびこれらの任意の誘導体が含まれる。
【０１５１】
特定の実施形態では、結合ドメインがとりわけ、単一の標的抗原に結合する。別の実施形態では、結合ドメインが、複数の抗原標的と交差反応性である。本明細書で用いられる「交差反応性」とは、結合ドメインがとりわけ、複数の抗原標的に結合しうることを指す。特定の実施形態では、第１の結合ドメインおよび／または第２の結合ドメインが、例えば、Ｃ型肝炎コアタンパク質および宿主由来ＧＯＲタンパク質など、完全に異なる抗原標的に対する交差反応性を有しうる。特定の実施形態では、第１の結合ドメインおよび／または第２の結合ドメインが、例えば、ヒト、マウス、または非ヒト霊長動物に由来するタンパク質に由来する抗原など、異なる種に由来する抗原標的に対する交差反応性を有しうる。
【０１５２】
融合部分Ａ、Ｂ、およびＦａｂの間の接合部
特定の実施形態では、融合部分Ａおよび／または融合部分Ｂが、ＦａｂのＶＨまたはＶＬのＮ末端へと直接的に（すなわち、間にさらなるアミノ酸を付加することなく）連結される。他の実施形態では、融合部分Ａおよび／または融合部分Ｂが、ＦａｂのＶＨまたはＶＬのＮ末端へと、リンカーを用いて（以下で記載されるさらなるアミノ酸を伴って）連結される。一部の実施形態では、Ｆａｂ標的および細胞表面上のＦａｂ標的の周囲の空間（細胞表面上のＦａｂ標的への接触可能性）に応じて、所与の融合部分Ａおよび／またはＢのＣ末端から複数のアミノ酸（例えば、１つ〜３つのアミノ酸または１〜１０のアミノ酸；例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０のアミノ酸）を欠失させることが必要でありうる。
【０１５３】
他の実施形態では、Ｆａｂの重鎖および／または軽鎖のＮ末端から複数のアミノ酸（例えば、１つ〜３つのアミノ酸または１〜１０のアミノ酸；例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０のアミノ酸）を欠失させることが必要でありうる。なおさらなる実施形態では、融合部分のＣ末端から複数のアミノ酸（例えば、１つ〜３つのアミノ酸または１〜１０のアミノ酸；例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０のアミノ酸）を欠失させ、かつ、同時に、Ｆａｂ鎖のＮ末端から複数のアミノ酸（例えば、１つ〜３つのアミノ酸または１〜１０のアミノ酸；例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０のアミノ酸）を欠失させることが必要でありうる。融合部分Ａと、融合部分Ｂと、Ｆａｂ断片との間の接合部の長さおよび配列は、同じ場合もあり、異なる場合もある。
【０１５４】
融合部分とＦａｂ断片との間の接合部は、必要に応じて、欠失とリンカーとの組合せを用いうる。したがって、当業者により理解される通り、Ｆａｂと融合部分との間の接合部は、当技術分野で公知であり、本明細書でも記載される方法を用いて、所望の機能性（例えば、結合アフィニティー）について調整し、調べることができる。
【０１５５】
リンカー
本開示のＭＳＦＰはまた、Ｆａｂ断片のＶＨおよびＶＬと、融合部分ＡおよびＢとの間に位置するリンカーも含む（例えば、図１を参照されたい）。そして、例示的なリンカーは、配列ＧｌｙＡｒｇＡｌａを含む。
【０１５６】
一実施形態では、融合部分とＦａｂのＶＨまたはＶＬとの間のリンカーが、１〜１０アミノ酸の長さである。他の実施形態では、融合部分とＦａｂのＶＨまたはＶＬとの間のリンカーが、１〜２０アミノ酸または２０アミノ酸の長さである。この点において、リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０アミノ酸の長さでありうる。さらなる実施形態では、リンカーが、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０アミノ酸の長さでありうる。
【０１５７】
特定の実施形態では、本明細書で記載されるＭＳＦＰにおいて用いるのに適するリンカーが、可撓性リンカーである。適切なリンカーは、容易に選択することができ、４アミノ酸〜１０アミノ酸、５アミノ酸〜９アミノ酸、６アミノ酸〜８アミノ酸、または７アミノ酸〜８アミノ酸を含めた１アミノ酸（例えば、Ｇｌｙ）〜２０アミノ酸、２アミノ酸〜１５アミノ酸、３アミノ酸〜１２アミノ酸など、適切な異なる長さのうちのいずれかであることが可能であり、１、２、３、４、５、６、または７アミノ酸でありうる。
【０１５８】
例示的な可撓性リンカーには、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ、グリシン−セリンポリマー（例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号１２５）、および（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１２６）［配列中、ｎは、少なくとも１つの整数である］を含めた）、グリシン−アラニンポリマー、アラニン−セリンポリマー、および当技術分野で公知の他の可撓性リンカーが含まれる。グリシンポリマーおよびグリシン−セリンポリマーは、比較的構造化されておらず、したがって、構成要素間の中性のテザーとして用いることが可能でありうる。グリシンは、アラニンよりもなおいっそう著明にファイ−プサイ空間に接近し、側鎖の長い残基より制約が小さい（Ｓｃｈｅｒａｇａ、Ｒｅｖ．  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍ．、１１１７３〜１４２頁（１９９２年）を参照されたい）。例示的な可撓性リンカーには、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ（配列番号１２７）、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号１２８）、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ（配列番号１２９）、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号１３０）、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ（配列番号１３１）、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ（配列番号１３２）などが含まれるがこれらに限定されない。当業者は、リンカーが、可撓性リンカーのほか、所望のＭＳＦＰの構造をもたらす可撓性の小さい構造を付与する１または複数の部分も包含しうるように、ＭＳＦＰのデザインが、全面的に可撓性のリンカーを包含する場合もあり、部分的に可撓性のリンカーを包含する場合もあることを認識するであろう。
【０１５９】
特定の実施形態では、Ｆａｂと融合部分との間のリンカーが、安定的なリンカー（プロテアーゼ、とりわけ、ＭＭＰにより切断可能でない）である。特定の実施形態では、リンカーが、ペプチドリンカーである。特定の実施形態では、ＭＳＦＰが、安定的なペプチドリンカーを含み、ペプチドリンカーのＮ末端が、融合部分のＣ末端へと共有結合的に連結され、ペプチドリンカーのＣ末端が抗原結合ドメインのＮ末端へと共有結合的に連結される。
【０１６０】
一実施形態では、リンカーが、切断可能なリンカーである。特に、ＦａｂのＶＨまたはＶＬと融合部分との間のリンカーは、プロテアーゼ基質の切断配列、例えば、ＭＭＰ基質の切断配列を含む。基質内の周知のペプチド配列であるＰＬＧＬＡＧ（配列番号１３３）は、大半のＭＭＰにより切断されうる。ＭＭＰにより切断されうる基質配列は、広範に研究されている。例えば、配列ＰＬＧＬＡＧ（配列番号１３３）は、大半のＭＭＰにより切断されうる。プロテアーゼ基質の切断配列とは、プロテアーゼ処理により切断されうるペプチド配列を指す。ＭＭＰ基質配列とは、ＭＭＰとのインキュベーションにより切断されうるペプチド配列を指す。ＰＬＧＬＡＧ（配列番号１３３）は、一般に用いられるＭＭＰ基質の切断配列である（例えば、Ｊｉａｎｇ、ＰＮＡＳ（２００４年）、１０１巻：１７８６７〜７２頁；Ｏｌｓｏｎ、ＰＮＡＳ（２０１０年）、１０７巻：４３１１〜６頁を参照されたい）。別の実施形態では、プロテアーゼ切断部位が、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、またはこれらの組合せにより認識される。なお別の実施形態では、プロテアーゼ部位が、ＧＰＬＧＭＬＳＱ（配列番号１３４）およびＧＰＬＧＬＷＡＱ（配列番号１３５）からなる群より選択される配列を含む。安定的なリンカーまたはプロテアーゼにより切断不可能なリンカーとは、公知のプロテアーゼ基質配列に属さず、したがって、プロテアーゼとインキュベートされても著明な切断産物形成をもたらさないリンカーペプチド配列を指す。
【０１６１】
一部の実施形態では、リンカーの切断基質（または切断配列）に、プロテアーゼ、通常は細胞外プロテアーゼの基質として用いられうるアミノ酸配列が含まれうる。他の実施形態では、切断配列が、還元剤の作用により切断されうるジスルフィド結合を形成することが可能なシステイン−システイン対を含む。他の実施形態では、切断配列が、光分解されると切断される可能性がある基質を含む。
【０１６２】
切断基質は、切断基質が切断剤により切断される場合（例えば、リンカーの切断基質が、プロテアーゼにより切断される場合、および／またはシステイン−システイン間のジスルフィド結合が、還元剤への曝露による還元を介して破壊される場合）、または標的の存在下で光誘導性光分解により切断される場合に、結果としてもたらされる切断産物が本明細書で記載される多様な機能的特性を有するように、リンカー内に位置する。
【０１６３】
リンカーの切断基質は、罹患組織内または融合部分の結合ドメインの対象の標的抗原を発現させる細胞の表面上で共局在化したプロテアーゼに基づき選択することができる。対象の標的がプロテアーゼと共局在化する多様な異なる状態が公知であるが、当技術分野では、この場合のプロテアーゼの基質も公知である。がんの例では、標的組織が、がん性の組織、特に、充実性腫瘍のがん性の組織である。多数のがん、例えば、充実性腫瘍における、公知の基質を有するプロテアーゼのレベルの増大については、文献において報告がなされている。例えば、Ｌａ  Ｒｏｃｃａら、（２００４年）、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊ．  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ、９０巻（７号）：１４１４〜１４２１頁を参照されたい。疾患の非限定的な例には、全ての種類のがん（乳がん、肺がん、結腸直腸がん、前立腺がん、頭頸部がん、膵臓がんなど）、関節リウマチ、クローン病、黒色腫、ＳＬＥ、心血管損傷、虚血などが含まれる。さらに、ＶＥＧＦなど抗血管新生性標的も公知である。腫瘍抗原に結合することが可能であるように、本開示のＭＳＦＰの融合部分の結合ドメインがそれ自体で選択される場合、リンカーに適する切断基質配列は、プロテアーゼにより切断可能なペプチド基質を含む配列であって、がん性の処置部位に存在し、特に、非がん性の組織と比較してがん処置部位において高レベルで存在する配列であろう。例示的な一実施形態では、ＭＳＦＰの結合ドメインが、例えば、Ｈｅｒ２に結合することが可能であり、切断基質配列は、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）基質である可能性があり、したがって、ＭＭＰにより切断可能である。他の実施形態では、ＭＳＦＰ内の融合部分の結合ドメインが、対象の標的に結合することが可能であり、リンカー内に存在する切断基質は、例えば、レグマイン、プラスミン、ＴＭＰＲＳＳ−３／４、ＭＭＰ−９、ＭＴ１−ＭＭＰ、カテプシン、カスパーゼ、ヒト好中球エラスターゼ、ベータ−セクレターゼ、ｕＰＡ、またはＰＳＡでありうる。他の実施形態では、多発性硬化症または関節リウマチなど、がん以外の疾患における切断基質は、他の疾患特異的プロテアーゼにより切断される。
【０１６４】
非修飾リンカーまたは非切断リンカーは、Ｆａｂ断片の、融合部分へのテザリングを可能としうる。リンカーが切断されると、本明細書の、例えば、図でさらに記載される通り、多様な機能を伴う複数の切断産物が結果としてもたらされる。
【０１６５】
ＭＳＦＰのリンカー（例えば、ＦａｂのＶＨと第１の融合部分との間のリンカー、およびＦａｂのＶＬと第２の融合部分との間のリンカー）は、同じ切断基質を含む場合もあり、異なる切断基質を含む場合もあり、例えば、第１のリンカーは、第１の切断基質を含むことが可能であり、第２のリンカーは、第２の切断基質を含むことが可能である。第１の切断基質と第２の切断基質とは、同じ酵素に対して異なる基質である（例えば、その同じ酵素に対して異なる結合アフィニティーを呈示する）場合もあり、異なる酵素に対する異なる基質の場合もあり、第１の切断基質が酵素基質であり、かつ、第２の切断基質が光分解基質である場合もあり、第１の切断基質が酵素基質であり、かつ第２の切断基質が還元用基質であるなどの場合もある。
【０１６６】
酵素による特異的切断では、酵素と切断基質との間で接触がなされる。Ｆａｂを含むＭＳＦＰを、十分な酵素活性の存在下で、切断基質を有する第１のリンカーおよび第２のリンカーにより、第１の融合部分および第２の融合部分へとカップリングする場合、切断基質を切断することができる。十分な酵素活性は、切断基質を有するリンカーと接触させ、切断をもたらす酵素の能力を示しうる。酵素はＭＳＦＰの近傍に存在するが、他の細胞因子または酵素のタンパク質修飾のため、切断することは不可能でありうることが容易に想定されうる。
【０１６７】
例示的な基質には、以下の酵素またはプロテアーゼのうちの１または複数により切断可能な基質が含まれうるがこれらに限定されない：ＡＤＡＭ１０；カスパーゼ８、カテプシンＳ、ＭＭＰ８、ＡＤＡＭ１２、カスパーゼ９、ＦＡＰ、ＭＭＰ９、ＡＤＡＭ１７、カスパーゼ１０、グランザイムＢ、ＭＭＰ−１３、ＡＤＡＭＴＳ、カスパーゼ１１、グアニジノベンゾアターゼ（ＧＢ）、ＭＭＰ１４、ＡＤＡＭＴＳ５．カスパーゼ１２、ヘプシン、ＭＴ−ＳＰ１、ＢＡＣＥ、カスパーゼ１３、ヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）、ネプリライシン、カスパーゼ、カスパーゼ１４、レグマイン、ＮＳ３／４Ａ、カスパーゼ１、カテプシン、マトリプターゼ２、プラスミン、カスパーゼ２、カテプシンＡ、メプリン、ＰＳＡ、カスパーゼ３、カテプシンＢ、ＭＭＰ１、ＰＳＭＡ、カスパーゼ４、カテプシンＤ、ＭＭＰ２、ＴＡＣＥ、カスパーゼ５、カテプシンＥ、ＭＭＰ３、ＴＭＰＲＳＳ  ３／４、カスパーゼ６、カテプシンＫ、ＭＭＰ７、ｕＰＡ、カスパーゼ７、ＭＴ１−ＭＭＰ。
【０１６８】
別の実施形態では、切断基質が、システイン対のジスルフィド結合であって、したがって、例えば、グルタチオン（ＧＳＨ）、チオレドキシン、ＮＡＤＰＨ、フラビン、アスコルビン酸などの細胞性還元剤であり、充実性腫瘍組織またはこの周囲に大量に存在しうる細胞性還元剤などであるがこれらに限定されない還元剤により切断可能なジスルフィド結合を伴いうる。
【０１６９】
当技術分野では、本明細書の切断可能なリンカーにおいて用いるのに適する他のプロテアーゼ切断部位が公知であるか、またはＴｕｒｋら、２００１年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９巻、６６１〜６６７頁により記載されている方法などの方法を用いて同定することができる。
【０１７０】
特定の実施形態では、リンカーが、ペプチドリンカー、システイン残基などのチオール残基を含有するペプチドリンカー、ポリマーリンカー、または化学リンカーでありうる。特定の実施形態では、ＭＳＦＰが、リンカーの一方の末端が、融合部分のＣ末端へと共有結合的に連結され、リンカーの他方の末端が、Ｆａｂ断片のＶＨまたはＶＬのＮ末端へと共有結合的に連結されたリンカーを含む。
【０１７１】
接合部のアミノ酸
特定の実施形態では、融合タンパク質の構築物デザインから結果として生じるアミノ酸残基（例えば、単鎖ポリペプチドをコードする核酸分子の構築時における制限酵素部位の使用から結果として生じるアミノ酸残基）など、結合ドメインとリンカーポリペプチドとの間など、ＭＳＦＰの２つのドメインの間に１または少数のアミノ酸残基が存在しうる。本明細書で記載されるこのようなアミノ酸残基を、「接合部アミノ酸」もしくは「接合部アミノ酸残基」、または「ペプチドスペーサー」と称することができる。
【０１７２】
特定の例示的な実施形態では、ペプチドスペーサーが、１〜５の間のアミノ酸、５〜１０の間のアミノ酸、５〜２５の間のアミノ酸、５〜５０の間のアミノ酸、１０〜２５の間のアミノ酸、１０〜５０の間のアミノ酸、１０〜１００の間のアミノ酸、または任意の介在する範囲のアミノ酸である。他の例示的な実施形態では、ペプチドスペーサーが、約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０以上の長さのアミノ酸を含む。
【０１７３】
このような接合部のアミノ酸は、ＭＳＦＰのドメインのうちのいずれへも連結される。特定の実施形態では、接合部の（１または複数の）アミノ酸が、本明細書で規定されるヒンジまたはヒンジの一部である。特定の実施形態では、重鎖可変領域を軽鎖可変領域へと接合するのに有用な可変領域連結配列を、ペプチドスペーサーとして用いることができる。
【０１７４】
例示的な一実施形態では、ペプチドスペーサー配列が、例えば、Ｇｌｙ残基、Ａｓｎ残基、およびＳｅｒ残基を含有する。また、ＴｈｒおよびＡｌａなど、他の中性に近いアミノ酸も、スペーサー配列内に組み入れることができる。
【０１７５】
スペーサーとして有用に使用しうる他のアミノ酸配列には、Ｍａｒａｔｅａら、Ｇｅｎｅ、４０巻：３９〜４６頁（１９８５年）；Ｍｕｒｐｈｙら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８３巻：８２５８〜８２６２頁（１９８６年）；米国特許第４，９３５，２３３号および米国特許第４，７５１，１８０号において開示されたアミノ酸配列が含まれる。
【０１７６】
他の例示的なスペーサーには、例えば、Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（配列番号１３６）（Ｃｈａｕｄｈａｒｙら、１９９０年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．、８７巻：１０６６〜１０７０頁）およびＬｙｓ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ（配列番号１３７）（Ｂｉｒｄら、１９８８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２巻：４２３〜４２６頁）が含まれうる。
【０１７７】
一部の実施形態では、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドが、不可欠でないＮ末端のアミノ酸領域であって、機能的ドメインを分離し、立体干渉を防止するのに用いうる領域を有する場合は、スペーサー配列が要請されない。本開示のＭＳＦＰの２つのコード配列またはコードドメインは、接合部のアミノ酸を伴わずに直接的に融合させることもでき、例えば、１〜３回にわたり反復される五量体であるＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号１３８）からなる可撓性のポリリンカーを用いることにより融合させることもできる。このようなスペーサーは、ＶＨとＶＬとの間に挿入することにより単鎖抗体（ｓｃＦｖ）を構築するのに用いられてきた（Ｂｉｒｄら、１９８８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２巻：４２３〜４２６頁；Ｈｕｓｔｏｎら、１９８８年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．、８５巻：５９７９〜５８８３頁）。
【０１７８】
特定の実施形態では、ペプチドスペーサーが、単鎖抗体の可変領域を形成する２つのベータ−シート間の正しい相互作用を可能とするようにデザインされる。
【０１７９】
任意の適切なリンカーを用いて、限定せずに述べると、ペプチドリンカー、ポリマーリンカー、および化学的リンカーなどの間接的な連結をもたらすことができる。特定の実施形態では、共有結合的連結が、ペプチドリンカーを介する間接的な連結である。
【０１８０】
単一のＭＳＦＰ内では、第１の融合部分と第２の融合部分とが二量体化しないことに注目されたい。これにより、本開示のＭＳＦＰが、ＷＯ２００８／０２４１８８およびＷＯ２００９／１４９１８５において記載される融合タンパク質など、他の公知の融合タンパク質から識別される。これらの構築物は、ＶＨ１−ＶＨ２−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３およびＶＬ１−ＶＬ２−ＣＬの一般的なフォーマットを有することにより異なる。この構築物では、ＶＨ１とＶＬ１とが二量体化して、さらなる抗原結合部位を形成する。本開示のＭＳＦＰでは、第１の融合部分と第２の融合部分とが会合して、単一の抗原結合部位を形成するわけではない。本明細書の別の個所で記載される本ＭＳＦＰのさらなる識別特徴は、ＭＳＦＰが集塊をなさない場合、融合部分により、Ｆａｂのその標的に対する結合アフィニティーが低減されることである。これに対し、ＷＯ２００８／０２４１８８およびＷＯ２００９／１４９１８５において記載されるタンパク質は、抗体の結合標的に対する結合アフィニティーの低減を呈示しない。
【０１８１】
例示的な本開示のＭＳＦＰは、配列番号８４、９０、９６、および１００から選択されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つ；ならびに配列番号３２、６０、６４、６８、および７２から選択されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つを含む。さらに例示的な本開示のＭＳＦＰは、配列番号８６、９２、９８、および１０２から選択されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つ；ならびに配列番号３０、３６、４０、４４、４８、および５２から選択されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つを含む。
【０１８２】
多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質の機能
本開示のＭＳＦＰは、薬物の安定性、特異性、選択性、効力、および安全性、ならびに薬物投与の簡便性を増強するように機能する。特定の実施形態では、融合部分をそのＮ末端へと融合させずに発現させた場合のＦａｂが、可溶性の組換え形態（通常は受容体タンパク質、例えば、ＣＤ３など、Ｔ細胞受容体の構成要素の細胞外ドメイン）中のその標的抗原のほか、細胞表面上のその標的抗原に結合することが可能である。特定の実施形態では、融合部分をその重鎖および軽鎖両方のＮ末端へと融合させ、かつ、単量体形態で（非凝集形態で、または多量体形態ではなく）発現させた場合のＦａｂの抗原結合断片が、融合部分の結合ドメインによる標的抗原への結合の非存在下における薬物の薬理学的濃度（処置される患者におけるポリペプチド濃度）で、細胞表面上に存在するその特異的抗原に結合しないか、またはこれに対する結合が低減されるか、またはこれに対してＦａｂ単独と同様のレベルの結合を示す。融合部分の結合ドメインによる標的抗原への結合の非存在下における細胞表面抗原への結合の欠如、または結合の大幅な低減は、抗原結合部位の周囲にデザインされた立体障害から結果として生じる、アフィニティーの劇的な低下により説明されうる。
【０１８３】
融合部分の結合ドメインによる標的抗原への結合の非存在下における、細胞表面抗原への結合の欠如またはこれへの結合の大幅な低減は、ヒト用治療剤としてのＭＳＦＰに所望されると考えることができる。ＭＳＦＰ単独の、例えば、Ｔ細胞への結合の欠如、またはこれへの結合の著明な低減（腫瘍標的細胞の非存在下における）が、１）望ましくない全身性のＴ細胞活性化を劇的に改善する、したがって、薬物の安全性プロファイルを劇的に改善し；２）皮下経路による薬物投与の実行可能性を劇的に改善し；３）血液循環中の高薬物濃度に対する薬物忍容性を劇的に増大させることに注目することは重要である。
【０１８４】
ＯＫＴ３またはＵＣＨＴ−１などの抗体による、立体配座エピトープを介するＴ細胞への結合が、部分的なシグナル伝達を行い、望まれないＴ細胞の活性化（サイトカインストームを引き起こす）またはＴ細胞アネルギー（結果として腫瘍細胞を死滅させることが不可能なＴ細胞をもたらす）をもたらすことに注目することは重要である。ｍｕ−１Ｆ３、ｈｕ−１Ｆ３、およびこれらの変異体がＣＤ３の直鎖状エピトープへと結合することにより、ＣＤ３の架橋形成の非存在下でＴ細胞のシグナル伝達が誘導される可能性は低いと考えられる。この特性は、ＯＫＴ３様の抗体およびＵＣＨＴ−１様の抗体を用いるときに生じる全身性副作用を低減するのに有利でありうる。
【０１８５】
また、ＭＳＦＰ内の融合部分は、プロテアーゼにより切断されると、Ｆａｂ抗原結合部位の周囲の立体障害が除去されるように、次いで、ＭＳＦＰが、その（Ｆａｂ）標的、特に、細胞表面において発現する標的抗原に高アフィニティーで結合しうるように機能し、したがって、リンカー内の切断基質配列における切断（これにより融合部分が放出される）の後、ＭＳＦＰは、腫瘍細胞とＴ細胞との間のいっそう強力な架橋形成剤へと転換されることに注目することも重要である。
【０１８６】
さらに、融合部分の結合ドメインがその標的抗原に結合すると、ＭＳＦＰ分子は、腫瘍細胞表面上で高度に濃縮され、Ｔ細胞上のＦａｂ標的（例えば、ＣＤ３）への高アビディティーに基づく結合を創出することに注目することも重要である。したがって、融合部分の結合の存在下に限り、Ｆａｂの抗原結合断片は、その標的に結合することが可能であり、したがって、ＭＳＦＰが腫瘍細胞とＴ細胞との間の架橋形成剤として機能することが可能である。
【０１８７】
本開示のＭＳＦＰの特性は、望まれない副作用を伴わずに、循環における比較的高用量のＭＳＦＰを可能とする（例えば、循環中にあるとき、ＭＳＦＰは、Ｆａｂ断片の標的抗原（例えば、ＣＤ３）に結合しない）。これはまた、投与頻度の低減も可能とし、濃度勾配により駆動される拡散を介する組織への浸透も促進する。
【０１８８】
本開示のＭＳＦＰの特性はまた、標的への接触を増強しうる皮下投与の可能性も可能とする。さらに、特定の実施形態では、ＭＳＦＰが、プロテアーゼ処理を伴わない架橋形成も許容するが、特定の具体的な実施形態では、プロテアーゼ処理の後、結合活性および腫瘍殺滅効力が劇的に増大する。
【０１８９】
一実施形態では、ＶＨおよびＶＬにより形成される抗原結合ドメイン（Ｆｖ）が、ＣＨ１とＣＬとのヘテロ二量体化ドメインにより安定化され、ＣＨ１とＣＬとの間のジスルフィド結合または他の安定化相互作用（例えば、ＫＩＨ（ｋｎｏｂｓ／ｈｏｌｅ）相互作用）によりさらに安定化される。
【０１９０】
一実施形態では、ＭＳＦＰ内のＦａｂが、そのＮ末端における融合部分により、Ｆａｂ標的抗原への結合（とりわけ、細胞表面の標的抗原に関する場合）が、統計学的に有意な様式で（すなわち、当業者に公知の適切な対照と比べて；例えば、そのＮ末端（ＶＨおよびＶＬの両方）において融合部分を伴わないフォーマットにおける同じＦａｂと比較して）低減されるように立体障害を受ける。さらなる実施形態では、ＭＳＦＰ内のＦａｂが、そのＮ末端における融合部分により立体障害を受け、そのため、所望の抗原への結合（とりわけ、細胞表面の標的抗原に関する場合）が、そのＮ末端（ＶＨおよびＶＬの両方）において融合部分を伴わないフォーマットにおける同じＦａｂと比較して少なくとも２分の１、３分の１、４分の１、５分の１、６分の１、７分の１、８分の１、９分の１、１０分の１、１１分の１、１２分の１、１３分の１、１４分の１、１５分の１、２０分の１、３０分の１、または１００分の１、または１０００分の１、または１０，０００分の１に低減される。
【０１９１】
特定の実施形態では、融合タンパク質フォーマット内のＦａｂの抗原結合ドメインの、Ｆａｂの細胞表面の標的抗原に対するアフィニティーが、５００ｎＭ未満である。さらなる実施形態では、融合タンパク質フォーマット（すなわち、ＭＳＦＰ）内のＦａｂの抗原結合ドメインのアフィニティーが、ヒトにおいて用いられる治療剤の濃度範囲においてＦＡＣＳまたは他の結合の測定方法（例えば、細胞結合ＥＬＩＳＡ）を用いて測定される、著明な検出可能な結合を顕示しない。一実施形態では、治療用濃度におけるＦａｂ融合タンパク質が結合するＦａｂの標的細胞集団（例えば、ＣＤ３＋細胞）は、１％未満であろう（すなわち、融合部分の結合ドメインの標的抗原を発現させる細胞の非存在下で）。一実施形態では、治療用濃度におけるＭＳＦＰが結合するＦａｂの標的細胞集団が、５％未満であろう。なお別の実施形態では、治療用濃度におけるＭＳＦＰが結合するＦａｂの標的細胞集団が、１０％未満であろう。
【０１９２】
腫瘍組織内に存在するプロテアーゼ、とりわけ、ＭＭＰのレベルが上昇すると、リンカーのＭＭＰ基質の切断部位において切断産物が発生するであろう。リンカーのプロテアーゼの基質配列の切断は、Ｆａｂの抗原結合領域における立体障害の減殺を結果としてもたらすため、Ｆａｂの細胞表面標的への結合が完全に回復されるか、または少なくとも部分的に回復される。回復された結合は、ＦＡＣＳ法、細胞ベースのＥＬＩＳＡ法、または当業者に公知の他の細胞結合法を用いて裏付けることができる。
【０１９３】
「アフィニティーの劇的な低減」という用語は、Ｆａｂの抗原結合ドメインの結合の、ＦａｂのＶＨおよびＶＬのＮ末端が融合部分を含まない場合の結合と比較した少なくとも３０％の低減を指す。限定せずに述べると、低減百分率は、例えば、３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約９９％以上でありうる。当業者には、結合を検出するための方法が公知であり、ＦＡＣＳ、細胞結合ＥＬＩＳＡ、または放射性同位元素で標識した抗体を用いる細胞結合を用いて実施することができる。
【０１９４】
本明細書で記載される本開示のＭＳＦＰにおける使用のための例示的なＦａｂは、抗ＣＤ３  Ｆａｂである。この点において、ＭＳＦＰは、融合部分の結合ドメインが腫瘍細胞抗原に結合すると、Ｆａｂが、通過するＴ細胞のＣＤ３に結合することが可能となり、これにより、Ｔ細胞の方向付けを変え、それらを活性化して、腫瘍細胞を死滅させるように機能する。別の実施形態では、ＭＳＦＰ（本明細書ではまた、Ｆａｂ断片がＣＤ３などの免疫エフェクター分子に結合する場合に、Ｆａｂｅとしても言及される）が、融合部分の（１または複数の）結合ドメインによる腫瘍抗原への結合を介して腫瘍細胞表面において集塊をなすと、アビディティー効果を呈示しうる。立体障害を受けたＦａｂによる免疫細胞への見かけ上の結合自体も、アビディティーに起因して増大しうる。Ｆａｂｅ／ＭＳＦＰはそれ自体、免疫細胞と腫瘍細胞とを架橋形成することが可能となり、これにより、抗腫瘍抗体の活性を媒介することが可能となる。
【０１９５】
特定の実施形態では、Ｆａｂのその標的抗原への結合または融合部分の結合剤のその標的抗原への結合が別個であれば、標的の活性化がもたらされない。しかし、結合が同時であれば、Ｆａｂの抗原標的および融合部分の結合ドメインの抗原標的は、シグナル伝達を発生させうる。例えば、ＭＳＦＰは、例えば、ＣＤ３であるＦａｂの抗原標的、および腫瘍表面抗原である融合部分の結合ドメインの抗原標的に結合しうる。ＭＳＦＰが、ＣＤ３または腫瘍表面抗原へと別個に結合してもＴ細胞は活性化されないが、ＣＤ３と腫瘍表面抗原とがＭＳＦＰへと同時に結合する場合、および結合した複合体の複数のコピーが腫瘍細胞表面においてアンカリングされて集塊をなす場合、Ｔ細胞は、腫瘍表面抗原を保有するがん細胞の近傍で活性化し、したがって、Ｔ細胞の腫瘍殺滅効率を局所的に著明に増強し、サイトカインストームに起因する副作用を回避する。
【０１９６】
特定の実施形態では、Ｆａｂの抗原標的と融合部分の結合ドメインの抗原標的との組合せが、ＣＤ３および腫瘍表面抗原である可能性があり、この組合せが、Ｔ細胞による腫瘍殺滅効果を増強する。特定の実施形態では、Ｆａｂの抗原標的と融合部分の抗原標的との組合せが、ＦｃγＲおよび腫瘍表面抗原である可能性があり、この組合せが、ＦｃγＲを発現させる免疫細胞を誘導して、腫瘍細胞を死滅させる。特定の実施形態では、Ｆａｂの抗原標的と融合部分の抗原標的との組合せが、ＮＫＧ２Ｄおよび腫瘍細胞の表面抗原である可能性があり、この組合せが、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を誘導して、腫瘍細胞を死滅させる。
【０１９７】
特定の実施形態では、第１の融合部分および第２の融合部分が、第１の標的抗原および第２の標的抗原に結合する結合ドメインを含む。このようにして、ＭＳＦＰは、３つの異なる標的抗原（すなわち、Ｆａｂ標的に加えた２つの異なる融合部分の標的）に結合する。したがって、特定の実施形態では、Ｆａｂの抗原標的が、ＣＤ３、ＴＣＲ、ＦｃγＲ、およびＮＫＧ２Ｄからなる群より選択され、第１の融合部分および第２の融合部分の第１の結合ドメインおよび第２の結合ドメインが、がん細胞上で優先的に発現する２つの異なる抗原である。このような３つの異なる標的抗原を有するＭＳＦＰは、腫瘍細胞に対するターゲティングの特異性を増強し、融合部分の結合ドメインの標的抗原のうちの一方を発現させる場合もあり、融合部分の結合ドメインの標的抗原の両方を低レベルで発現させる場合もある、正常細胞の殺滅を防止しうる。
【０１９８】
したがって、例示的な実施形態では、本開示のＭＳＦＰが、ＣＤ３ポリペプチドなど、ＴＣＲまたはこれらの構成要素に結合するＦａｂの抗原結合断片を含む。上記で言及した通り、本開示のＭＳＦＰは、融合部分の結合ドメインが、それらの標的抗原に係合する場合、またはリンカーの切断イベントの後を除き、Ｆａｂ標的抗原に結合しない。
【０１９９】
したがって、特定の実施形態では、融合部分の結合ドメインの標的抗原への係合の非存在下では、本開示のＭＳＦＰが、Ｔ細胞を活性化しないか、またはＴ細胞を活性化することが最小限である。ＭＳＦＰは、それが、活性化Ｔ細胞の百分率の、少なくとも１つのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおいてアッセイにおいて測定される、融合部分の結合ドメインの標的抗原（例えば、適切な腫瘍細胞／細胞系）を発現させる細胞の存在下におけるＴ細胞の活性化と比較して、統計学的に有意な増大を引き起こさない場合、「Ｔ細胞を活性化しないか、またはＴ細胞を活性化することが最小限もしくは名目的である」。当技術分野では、このようなアッセイが公知であり、限定せずに述べると、増殖アッセイ、ＣＴＬクロム放出アッセイ（例えば、Ｌａｖｉｅら、（２０００年）、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１２巻（４号）：４７９〜４８６頁を参照されたい）、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ、細胞内サイトカイン染色アッセイ、および、例えば、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（２００９年）において記載される他のアッセイが含まれる。特定の実施形態では、Ｔ細胞の活性化が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるプライミングによるＴ細胞活性化アッセイを用いて測定される。また、本明細書の例で記載されるアッセイも参照されたい。
【０２００】
したがって、関連する態様では、本開示は、ＴＣＲ複合体またはこれらの構成要素に特異的に結合するＦａｂを含むＭＳＦＰにより誘導されるＴ細胞の活性化を検出するための方法であって、（ａ）抗原またはマイトジェンでプライミングされたＴ細胞を供給するステップと、（ｂ）ステップ（ａ）のプライミングされたＴ細胞を、ＴＣＲ複合体またはこれらの構成要素に特異的に結合するＦａｂを含むＭＳＦＰで処置するステップと、（ｃ）プライミングされたＴ細胞であって、ステップ（ｂ）で処置されたＴ細胞の活性化を検出するステップとを含む方法を提供する。
【０２０１】
本明細書で用いられる「マイトジェン」という用語は、特異性またはクローンの由来が異なるリンパ球において有糸分裂を誘導する化学物質を指す。Ｔ細胞をプライミングするのに用いうる例示的なマイトジェンには、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、ブタクサマイトジェン（ＰＷＭ）、およびホルボールミリステート酢酸塩（ＰＭＡ）が含まれる。また、抗原をロードしたビーズまたはＰＢＭＣも、Ｔ細胞をプライミングするのに用いることができる。
【０２０２】
本明細書で提示される、Ｔ細胞の活性化を検出するための方法の特定の実施形態では、ＴＣＲ複合体またはこれらの構成要素に特異的に結合するＦａｂを含むＭＳＦＰが、腫瘍抗原に結合する１または複数の結合ドメインを含む１または複数の融合部分を含む。
【０２０３】
Ｔ細胞の活性化は、ＣＤ２５、ＣＤ４０リガンド、およびＣＤ６９など、当技術分野で公知の活性化マーカーの発現を測定することにより検出することができる。活性化Ｔ細胞はまた、ＣＦＳＥ標識化アッセイおよびチミジン取込みアッセイなどの細胞増殖アッセイ（Ａｄａｍｓ（１９６９年）、Ｅｘｐ．  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．、５６巻：５５頁）によっても検出することができる。Ｔ細胞のエフェクター機能（例えば、細胞殺滅効果または細胞殺滅機能）は、例えば、クロム放出アッセイまたは蛍光色素（例えば、ＴＰ３）を用いるＦＡＣＳベースのアッセイにより測定することができる。関連する態様では、Ｔ細胞の活性化および細胞溶解活性を、Ｔ細胞と腫瘍細胞との間の溶解シナプス形成により測定することができる。グランザイムおよびパーフォリン（ｐｏｒｆｏｒｉｎ）などのエフェクター分子は、細胞溶解シナプスにおいて検出することができる。
【０２０４】
別の関連する態様では、Ｔ細胞の活性化を、サイトカインの放出により測定することができる。ＴＣＲ複合体またはこれらの構成要素に特異的に結合するＦａｂを含むＭＳＦＰにより誘導されるサイトカインの放出を検出するための方法は、（ａ）プライミングされたＴ細胞を供給するステップと、（ｂ）ステップ（ａ）のプライミングされたＴ細胞を、ＴＣＲ複合体またはこれらの構成要素に特異的に結合するＦａｂを含むＭＳＦＰで処置するステップと、（ｃ）プライミングされたＴ細胞であって、ステップ（ｂ）で処置されたＴ細胞からのサイトカインの放出を検出するステップとを含みうる。具体的な実施形態では、ＭＳＦＰの第１の融合部分および／または第２の融合部分において存在する結合ドメインが結合する標的の腫瘍抗原を発現させる、適切ながん細胞または細胞系の存在下または非存在下で実験を実行する。
【０２０５】
本明細書で提示されるサイトカインの放出を検出するための方法の特定の実施形態では、ＴＣＲ複合体またはこれらの構成要素に特異的に結合するＦａｂを含むＭＳＦＰが、腫瘍標的抗原に結合する結合ドメインを含む融合部分をさらに含むＭＳＦＰである。
【０２０６】
さらなる好ましい実施形態では、本開示のＭＳＦＰが、サイトカインストームを誘導しないか、または毒性の副作用を誘導するのに十分なサイトカインの放出を誘導しない。ＭＳＦＰは、それが、第２の標的細胞（例えば、融合部分の結合ドメインが結合する抗原を発現させる腫瘍細胞）または適切なリンカー切断剤（プロテアーゼなど）の非存在下では、ＩＦＮγを含めた少なくとも１つのサイトカインの量の統計学的に有意な増大を引き起こさないならば、「サイトカインストームを誘導しない」（また、「検出不可能な、名目的な、または最小限のサイトカインの放出の誘導」または「検出可能なサイトカインの放出を誘導しないか、または検出可能なサイトカインの放出の誘導が最小限である」とも称する）。当技術分野で公知であるか、または本明細書で提示される少なくとも１つのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイまたはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイにおいて、適切な第２の標的細胞またはリンカー切断剤の存在下で処置される細胞から放出される量と比較して、第２の標的細胞（例えば、適切ながん細胞系）または適切なリンカー切断剤の非存在下で処置される細胞から放出される、特定の実施形態では、ＩＦＮγおよびＴＮＦαまたはＩＬ−６およびＴＮＦαを含めた少なくとも２つのサイトカインの量；一実施形態では、ＩＬ−６、ＩＦＮγ、およびＴＮＦαを含めた３つのサイトカインの量；別の実施形態では、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＦＮγ、およびＴＮＦαを含めた４つのサイトカインの量；ならびになおさらなる実施形態では、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＦＮγ、およびＴＮＦαを含めた少なくとも５つのサイトカインの量の統計学的に有意な増大を引き起こさない場合も、ＭＳＦＰは「サイトカインストームを誘導しない」。臨床的に、サイトカイン放出症候群は、発熱、悪寒、発疹、悪心を特徴とし、場合によって、ＩＦＮγのほか、ＩＬ−２、ＩＬ−６、およびＴＮＦαなど、特定のサイトカインの最大限の放出と並行する呼吸困難および頻脈を特徴とする。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてアッセイまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて放出について調べうるサイトカインには、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＰ−１０、ＫＣ、ＭＣＰ１、ＩＦＮγ、およびＴＮＦαが含まれ、別の実施形態では、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＦＮγ、およびＴＮＦαが含まれる。
【０２０７】
さらなる実施形態では、本開示のＭＳＦＰが、Ｔ細胞などの細胞内でカルシウムフラックスの増大を引き起こす。ＭＳＦＰは、適切な第２の標的細胞（例えば、がん細胞）またはリンカー切断剤の存在下でＴ細胞を活性化するように用いられるとき、当技術分野で公知であるか、または本明細書で提示されるｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて測定される、処置された細胞の、適切な第２の標的細胞またはリンカー切断剤の非存在下で処置された細胞と比較した、統計学的に有意に急速な（処置の好ましくは３００秒以内、より好ましくは２００秒以内であり、最も好ましくは１００秒以内における）カルシウムフラックスの増大を引き起こすならば、「カルシウムの増大」を引き起こす。
【０２０８】
さらなる実施形態では、本開示のＭＳＦＰが、ＴＣＲによるシグナル伝達経路内の分子のリン酸化を誘導する。「ＴＣＲによるシグナル伝達経路」とは、ペプチド：ＭＨＣリガンドのＴＣＲおよびその共受容体（ＣＤ４またはＣＤ８）への結合を介して誘発されるシグナル伝達経路を指す。「ＴＣＲによるシグナル伝達経路内の分子」とは、そのリン酸化状態（例えば、その分子がリン酸化されているかどうか）、別の分子に対するその結合アフィニティー、またはその酵素活性が、ペプチド：ＭＨＣリガンドの、ＴＣＲおよびその共受容体への結合に由来するシグナルに応答して変化した分子など、ＴＣＲによるシグナル伝達経路に直接的に関与する分子を指す。例示的なＴＣＲによるシグナル伝達経路内の分子には、ＴＣＲ複合体またはその構成要素（例えば、ＣＤ３ζ鎖）、ＺＡＰ−７０、Ｆｙｎ、Ｌｃｋ、ホスホリパーゼｃ−γ、タンパク質キナーゼＣ、転写因子ＮＦκＢ、ホスファターゼ（ｐｈａｓｐｈａｔａｓｅ）であるカルシニューリン、転写因子ＮＦＡＴ、グアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）、Ｒａｓ、ＭＡＰキナーゼキナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫＫＫ）、ＭＡＰキナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫＫ）、ＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１／２）、およびＦｏｓが含まれる。
【０２０９】
本開示のＭＳＦＰは、それが、当技術分野で公知のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイまたはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイまたは受容体シグナル伝達アッセイにおいて、適切な第２の標的抗原もしくはこのような抗原を発現させる細胞（例えば、融合部分の結合ドメインが結合する腫瘍抗原を発現させるがん細胞）またはリンカー切断剤の存在下に限り、統計学的に有意な、ＴＣＲによるシグナル伝達経路内の分子（例えば、ＣＤ３ζ鎖、ＺＡＰ−７０、およびＥＲＫ１／２）のリン酸化の増大を引き起こすならば、「ＴＣＲによるシグナル伝達経路内の分子のリン酸化を誘導する」。当技術分野で公知の受容体シグナル伝達アッセイの大半からの結果は、ウェスタンブロットまたは蛍光顕微鏡などの免疫組織化学法を用いて決定される。
【０２１０】
同様に、本開示のＭＳＦＰは、Ｔ細胞による、融合部分の結合ドメインの標的抗原を発現させる腫瘍細胞など、第２の標的細胞の殺滅も誘導する。このような細胞殺滅は、クロム放出アッセイを含めた当技術分野で公知の多様なアッセイを用いて測定することができる。
【０２１１】
本開示のＭＳＦＰの特異性および機能は、ＭＳＦＰを適切な被験試料と接触させ、特定の実施形態では、ＭＳＦＰを、リンカー内の切断認識部位に特異的であると考えられる適切なプロテアーゼで処理し、これを切断産物についてアッセイすることにより調べることができる。プロテアーゼは、例えば、がん細胞から単離することもでき、組換えにより、例えば、Ｄａｒｋｅｔら（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２５４巻：２３０７〜２３１２頁（１９８８年））における手順に従い調製することもできる。切断産物は、例えば、サイズ、抗原性、または活性に基づき同定することができる。ＭＳＦＰの毒性は、ＭＳＦＰおよびその切断産物を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける細胞傷害作用アッセイ、増殖アッセイ、結合アッセイ、または当業者に公知の他の適切なアッセイにかけることにより精査することができる。切断産物の毒性は、リボソーム不活化アッセイを用いて決定することができる（Ｗｅｓｔｂｙら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．、３巻：３７７〜３８２頁（１９９２年））。切断産物のタンパク質の合成に対する効果は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける翻訳についての標準化アッセイであって、例えば、リボソームおよびｍＲＮＡ鋳型およびアミノ酸など、多様で不可欠な共因子の供給源としての網状赤血球溶解物による調製物からなる、規定が部分的な無細胞系を使用するアッセイにおいて測定することができる。混合物中で放射性標識されたアミノ酸を用いることにより、遊離アミノ酸前駆体のトリクロロ酢酸沈殿性タンパク質への組込みの定量化が可能となる。ウサギ網状赤血球の溶解物を用いると簡便である（Ｏ’Ｈａｒｅ、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、２７３巻：２００〜２０４頁（１９９０年））。
【０２１２】
本発明のＭＳＦＰががん細胞を破壊する能力、および／またはＴ細胞を活性化する能力は、がん細胞系、Ｔ細胞系、または単離ＰＢＭＣもしくは単離Ｔ細胞を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて容易に調べることができる。本開示のＭＳＦＰの効果は、例えば、がん細胞の選択的溶解を裏付けることにより決定することができる。加えて、プロテアーゼの特異性は、単独でまたはプロテアーゼ特異的阻害剤の存在下で本開示のＭＳＦＰを用いて細胞増殖の阻害を比較することにより調べることができる。このようなプロテアーゼ阻害剤には、ＭＭＰ−２／ＭＭＰ−９阻害剤であるＧＭ１４８９、ＧＭ６００１、およびＧＩ−Ｉ〜ＧＩ−ＩＶが含まれうる。
【０２１３】
毒性はまた、細胞生存率に基づいても測定することができ、例えば、ＭＳＦＰへと曝露された正常な細胞培養物の生存率とがん性の細胞培養物の生存率とを比較することができる。細胞生存率は、トリパンブルー排除アッセイなど、公知の技法により評価することができる。毒性はまた、細胞の溶解に基づいても測定することができ、例えば、ＭＳＦＰへと曝露された正常な細胞培養物の溶解とがん性の細胞培養物の溶解とを比較することができる。細胞溶解は、クロム（Ｃｒ）放出アッセイまたは死滅細胞指示色素（ヨウ化プロピジウム、ＴＯ−ＰＲＯ−三ヨウ化物）など、公知の技法により評価することができる。
【０２１４】
ポリペプチド
本開示は、ＭＳＦＰポリペプチドおよびそれらの断片を提供する。配列番号２３〜１０２および１０９〜１５０では、例示的なポリペプチド、およびそれらをコードするポリヌクレオチドが提示される。「ポリペプチド」、「タンパク質」、および「ペプチド」、ならびに「糖タンパク質」という用語は互換的に用いられ、いかなる特定の長さにも限定されないアミノ酸のポリマーを意味する。これらの用語は、ミリスチル化、硫酸化、グリコシル化、リン酸化、およびシグナル配列の付加または欠失などの修飾を除外しない。「ポリペプチド」または「タンパク質」という用語は、１または複数のアミノ酸鎖であって、各鎖が、ペプチド結合により共有結合的に連結されたアミノ酸を含み、前記ポリペプチドまたはタンパク質が、ペプチド結合により非共有結合的および／または共有結合的に併せて連結された複数の鎖であり、天然タンパク質、すなわち、自然発生細胞、および、とりわけ、非組換え細胞により産生されたタンパク質、または遺伝子操作された細胞もしくは組換え細胞により産生されたタンパク質の配列を有する複数の鎖を含むことが可能であり、天然タンパク質のアミノ酸配列を有する分子、あるいは天然配列からの１もしくは複数のアミノ酸の欠失、天然配列への１もしくは複数のアミノ酸の付加、および／または天然配列の１もしくは複数のアミノ酸に対する置換を有する分子を含むアミノ酸鎖を意味する。「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語はとりわけ、本開示のＭＳＦＰおよびその二量体、あるいは本明細書で開示されるＭＳＦＰからの１もしくは複数のアミノ酸の欠失、本明細書で開示されるＭＳＦＰへの１もしくは複数のアミノ酸の付加、および／または本明細書で開示されるＭＳＦＰの１もしくは複数のアミノ酸に対する置換を有する配列を包摂する。したがって、「ポリペプチド」または「タンパク質」は、１つのアミノ酸鎖（「単量体」と称する）または複数のアミノ酸鎖（「多量体」と称する）を含みうる。
【０２１５】
本明細書で言及される「単離タンパク質」という用語は、対象タンパク質が、（１）天然では共に見出されることが典型的な他の少なくとも一部のタンパク質を含まないか、（２）同じ供給源に由来する、例えば、同じ種に由来する他のタンパク質を本質的に含まないか、（３）異なる種に由来する細胞を介して発現するか、（４）天然では会合しているポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、もしくは他の物質のうちの少なくとも約５０パーセントから分離されているか、（５）天然では「単離タンパク質」が会合しているタンパク質の部分と会合（共有結合的相互作用または非共有結合的相互作用により）していないか、（６）天然では会合していないポリペプチドと作動可能に会合（共有結合的相互作用または非共有結合的相互作用により）しているか、または（７）天然では発生しないことを意味する。このような単離タンパク質は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、もしくは、おそらくは合成由来の、他のＲＮＡ、またはこれらの任意の組合せによりコードされうる。特定の実施形態では、単離タンパク質が、その天然の環境において見出されるタンパク質もしくはポリペプチドまたは他の夾雑物であって、その使用（治療的、診断的、予防的、研究的、または他の形の）に干渉するタンパク質もしくはポリペプチドまたは他の夾雑物を実質的に含まない。
【０２１６】
「ポリペプチド断片」という用語は、単量体の場合もあり、多量体の場合もあるポリペプチドであって、自然発生のポリペプチドまたは組換えにより作製したポリペプチドのアミノ末端の欠失、カルボキシル末端の欠失、および／または内部の欠失もしくは置換を有するポリペプチドを指す。特定の実施形態では、ポリペプチド断片が、少なくとも５〜約５００アミノ酸の長さのアミノ酸鎖を含みうる。特定の実施形態では、断片が、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、または４５０アミノ酸の長さであることが察知されるであろう。特に有用なポリペプチド断片は、抗体の抗原結合ドメインまたは抗原結合断片を含めた機能的ドメインを包含する。抗ＣＤ３抗体または他の抗体の場合、有用な断片には、ＣＤＲ領域、とりわけ、重鎖または軽鎖のＣＤＲ３領域、重鎖または軽鎖の可変領域、抗体鎖の部分または２つのＣＤＲを含めたそのちょうどの可変領域などが含まれるがこれらに限定されない。
【０２１７】
ポリペプチドは、タンパク質のＮ末端側の終端部において、シグナル（またはリーダー）配列を含み、これは、翻訳と同時のタンパク質の転移、または翻訳後におけるタンパク質の転移を方向付ける。ポリペプチドはまた、インフレームで融合させることもでき、リンカーまたはポリペプチドの合成、精製、もしくは同定を容易にするための他の配列（例えば、ポリＨｉｓ）、またはポリペプチドの固体支持体への結合を増強するための他の配列へとコンジュゲートすることもできる。
【０２１８】
本明細書で記載されるＭＳＦＰのアミノ酸配列の（１または複数の）修飾が想定される。例えば、ＭＳＦＰの結合アフィニティーおよび／または他の生物学的特性を改善することが所望でありうる。例えば、ＭＳＦまたはその結合ドメインもしくはＦａｂのアミノ酸配列の変異体は、適切なヌクレオチド変化を、ＭＳＦＰまたはそのドメインをコードするポリヌクレオチドへと導入することにより調製することもでき、ペプチド合成により調製することもできる。このような修飾には、例えば、ＭＳＦＰのアミノ酸配列内からの残基の欠失、および／またはＭＳＦＰのアミノ酸配列内への残基の挿入および／またはＭＳＦＰのアミノ酸配列内の残基の置換が含まれる。最終的な構築物が、結合ドメインまたはＦａｂによる対象の標的抗原への特異的結合など、所望の特徴を保有する条件で、欠失、挿入、および置換の任意の組合せを施して、最終的なＭＳＦＰに到達することができる。アミノ酸変化また、グリコシル化部位の数または位置の変化など、ＭＳＦＰの翻訳後プロセスも改変しうる。本発明のポリペプチドのための上記の変異および修飾のうちのいずれも、本発明の抗体に組み入れることができる。
【０２１９】
本開示は、本明細書で開示されるＭＳＦＰの変異体を提供する。特定の実施形態では、このような変異体のＭＳＦＰが、変異体の結合ドメイン、またはそのＦａｂ断片、または抗原結合断片、またはそれらのＣＤＲを含み、本明細書でとりわけ示される任意のこのような配列を含めた所与の基準配列または野生型配列の少なくとも約５０％、少なくとも約７０％の強さで対象の標的に結合し、特定の実施形態では、少なくとも約９０％の強さで結合する。さらなる実施形態では、このような変異体が、標的抗原に、本明細書で示される基準配列または野生型配列より大きなアフィニティーで結合する、例えば、これらの変異体は、例えば、とりわけ、本明細書で示される基準配列の、定量的に少なくとも約１０５％、１０６％、１０７％、１０８％、１０９％、または１１０％の強さで結合する。
【０２２０】
特定の実施形態では、本開示は、本明細書で開示されるＭＳＦＰの変異体であって、ＶＨとＶＬとの間のジスルフィド結合に関して修飾されたＦａｂを含む変異体を提供する。当業者により認識される通り、特定の実施形態では、本発明のＭＳＦＰにおいて用いられるＦａｂ断片が、ジスルフィド結合を含まない場合もある。この点において、重鎖および軽鎖を、ジスルフィド結合に対する必要を伴わずに安定的に相互作用するような様式で操作することができる。例えば、特定の実施形態では、重鎖または軽鎖を操作して、システイン残基を除去することができ、この場合、重鎖および軽鎖は、Ｆａｂとしてやはり安定的に相互作用および機能する。一実施形態では、重鎖と軽鎖との間の安定的な相互作用を容易とするように変異を施す。例えば、「ＫＩＨ」操作戦略を用いて、Ｆａｂの重鎖と軽鎖との間の二量体化を容易とすることができる（例えば、１９９６年、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、９巻：６１７〜６２１頁を参照されたい）。したがってまた、本明細書における使用のために、例えば、ジスルフィド結合の除去、精製のためのタグの付加など、特定の目的のためにデザインされた変異体のＦａｂ断片も想定される。
【０２２１】
具体的な実施形態では、対象のＭＳＦＰが、本明細書で記載されるＭＳＦＰと少なくとも８０％同一な、少なくとも９５％同一な、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９８％、または９９％同一なアミノ酸配列を有しうる。
【０２２２】
代表的なポリペプチドの三次元構造の決定は、選択された天然または非天然のアミノ酸による１または複数のアミノ酸の置換、付加、欠失、または挿入を、このようにして誘導される構造的変異体が本明細書で開示される分子種の空間充填特性を保持するかどうかを決定する目的で事実上モデル化しうるように、日常的な方法を介して行うことができる。例えば、Ｄｏｎａｔｅら、１９９４年、Ｐｒｏｔ．  Ｓｃｉ．、３巻：２３７８頁；Ｂｒａｄｌｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０９巻：１８６８〜１８７１頁（２００５年）；Ｓｃｈｕｅｌｅｒ−Ｆｕｒｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１０巻：６３８頁（２００５年）；Ｄｉｅｔｚら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、１０３巻：１２４４頁（２００６年）；Ｄｏｄｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、４５０巻：１７６頁（２００７年）；Ｑｉａｎら、Ｎａｔｕｒｅ、４５０巻：２５９頁（２００７年）；Ｒａｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２７巻：１０１４〜１０１８頁（２０１０年）を参照されたい。これらの実施形態および関連する実施形態のために用いうるコンピュータアルゴリズムの一部のさらなる非限定的な例には、３Ｄ画像およびビルトインスクリプト記述を用いて生体高分子系を表示、動画表示、および解析するための分子画像化プログラムであるＶＭＤ（ｋｓ．ｕｉｕｃ．ｅｄｕ／ｓｔｕｄｙ／ｖｍｄ／におけるＴｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｌｌｉｎｏｉｓ  ａｔ  Ｕｒｂａｎａ−Ｃｈａｍｐａｇｎｅのウェブサイトを参照されたい）が含まれる。当技術分野では、他の多くのコンピュータプログラムが公知であり、当業者に利用可能であり、エネルギーを最小化した立体配座の空間充填モデル（ファンデルワールス半径）から原子の大きさを決定することを可能とする：異なる化学基に対するアフィニティーが高い領域であって、これにより、結合を増強された領域を決定しようとするＧＲＩＤ；アライメントを数学的に計算するモンテカルロ探索；ならびに力の場の計算および解析を評価するＣＨＡＲＭＭ（Ｂｒｏｏｋｓら（１９８３年）、Ｊ．  Ｃｏｍｐｕｔ．  Ｃｈｅｍ．、４巻：１８７〜２１７頁）およびＡＭＢＥＲ（Ｗｅｉｎｅｒら（１９８１年）、Ｊ．  Ｃｏｍｐｕｔ．  Ｃｈｅｍ．、１０６巻：７６５頁）（また、Ｅｉｓｅｎｆｉｅｌｄら（１９９１年）、Ａｍ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２６１巻：Ｃ３７６〜３８６頁；Ｌｙｂｒａｎｄ（１９９１年）、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．  Ｂｅｌｇ．、４６巻：４９〜５４頁；Ｆｒｏｉｍｏｗｉｔｚ（１９９０年）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、８巻：６４０〜６４４頁；Ｂｕｒｂａｍら（１９９０年）、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、７巻：９９〜１１１頁；Ｐｅｄｅｒｓｅｎ（１９８５年）、Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．、６１巻：１８５〜１９０頁；およびＫｉｎｉら（１９９１年）、Ｊ．  Ｂｉｏｍｏｌ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｄｙｎ．、９巻：４７５〜４８８頁も参照されたい）。また、Ｓｃｈｒｏｅｄｉｎｇｅｒ（Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）製のプログラムなど、多様で適切な計算用コンピュータプログラムも市販されている。
【０２２３】
多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質／ベクター／宿主細胞をコードするポリヌクレオチドおよび多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質を作製する方法
特定の実施形態では、本開示は、本明細書で記載されるポリペプチドによるＭＳＦＰをコードする単離核酸をさらにもたらす。例示的なポリヌクレオチド、ならびにこれによりコードされるポリペプチドおよびそれらの断片を、配列番号２３〜１０２および１０９〜１５０に提示する。核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡを包含する。これらの実施形態および関連する実施形態は、本明細書で記載されるＭＳＦＰをコードするポリヌクレオチドを包含しうる。本明細書で用いられる「単離ポリヌクレオチド」という用語は、ゲノム由来、ｃＤＮＡ由来、もしくは合成由来、またはこれらの一部の組合せであるポリヌクレオチドであって、その由来により、（１）その単離ポリヌクレオチドが天然において見出されるポリヌクレオチドの全部もしくは一部と会合していないか、（２）天然ではそれが連結されないポリヌクレオチドに連結されているか、または（３）天然でより長大な配列の一部としては生じないポリヌクレオチドを意味するものとする。
【０２２４】
「作動可能に連結された」という用語は、この用語が適用される構成要素が、適切な条件下でそれらがそれらの固有の機能を果たすことを可能とする関係にあることを意味する。例えば、タンパク質コード配列に「作動可能に連結された」転写制御配列は、タンパク質コード配列の発現を、制御配列の転写活性と適合可能な条件下で達成するように、タンパク質コード配列にライゲーションされる。
【０２２５】
本明細書で用いられる「制御配列」という用語は、それらがライゲーションされるかまたは作動可能に連結されるコード配列の発現、プロセシング、または細胞内局在化に影響を及ぼしうるポリヌクレオチド配列を指す。このような制御配列の性質は、宿主生物に依存しうる。具体的な実施形態では、原核生物の転写制御配列が、プロモーター、リボソーム結合部位、および転写終結配列を包含しうる。他の具体的な実施形態では、真核生物の転写制御配列が、転写因子、転写エンハンサー配列、転写終結配列、およびポリアデニル化配列の１または複数の認識部位を含むプロモーターを包含しうる。特定の実施形態では、「制御配列」が、リーダー配列および／または融合パートナー配列を包含しうる。
【０２２６】
本明細書で言及される「ポリヌクレオチド」という用語は、一本鎖または二本鎖の核酸ポリマーを意味する。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドを含むヌクレオチドは、リボヌクレオチドの場合もあり、デオキシリボヌクレオチドの場合もあり、ヌクレオチドのいずれかの種類の修飾形態の場合もある。前記修飾には、ブロモウリジン修飾などの塩基修飾、アラビノシド修飾および２’，３’−ジデオキシリボース修飾などのリボース修飾、ならびにホスホロチオエート修飾、ホスホロジチオエート修飾、ホスホロセレノエート修飾、ホスホロジセレノエート修飾、ホスホロアニロチオエート修飾、ホスホルアニラデート修飾、およびホスホルアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｍｉｄａｔｅ）修飾などのヌクレオチド間連結修飾が含まれる。「ポリヌクレオチド」という用語は、とりわけ、ＤＮＡの一本鎖形態および二本鎖形態を包含する。
【０２２７】
「自然発生のヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを包含する。「修飾ヌクレオチド」という用語は、糖基などが修飾または置換されたヌクレオチドを包含する。「オリゴヌクレオチド連結」という用語は、ホスホロチオエート連結、ホスホロジチオエート連結、ホスホロセレノエート連結、ホスホロジセレノエート連結、ホスホロアニロチオエート連結、ホスホルアニラデート連結、ホスホルアミデート連結などのオリゴヌクレオチド連結を包含する。例えば、それらの開示が任意の目的で参照により本明細書に組み込まれる、ＬａＰｌａｎｃｈｅら、１９８６年、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１４巻：９０８１頁；Ｓｔｅｃら、１９８４年、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．、１０６巻：６０７７頁；Ｓｔｅｉｎら、１９８８年、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１６巻：３２０９頁；Ｚｏｎら、１９９１年、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ、６巻：５３９頁；Ｚｏｎら、１９９１年、「ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ  ＡＮＤ  ＡＮＡＬＯＧＵＥＳ：  Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ」、８７〜１０８頁（Ｆ．  Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編）、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｓｔｅｃら、米国特許第５，１５１，５１０号；ＵｈｌｍａｎｎおよびＰｅｙｍａｎ、１９９０年、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、９０巻：５４３頁を参照されたい。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドまたはそのハイブリダイゼーションの検出を可能とする検出可能な標識を包含しうる。
【０２２８】
他の関連する実施形態では、ポリヌクレオチド変異体が、本明細書で記載されるＭＳＦＰまたはそのドメインをコードするポリヌクレオチド配列との実質的な同一性を有しうる。例えば、ポリヌクレオチドは、本明細書で記載される方法（例えば、以下で記載される標準的なパラメータを用いるＢＬＡＳＴ解析）を用いて、本明細書で記載されるＭＳＦＰまたはそのドメインをコードする配列など、基準のポリヌクレオチド配列と比較して、少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を含むポリヌクレオチドでありうる。当業者は、コドンの縮重性、アミノ酸の類似性、リーディングフレームの位置決めなどを考慮することにより、これらの値を適切に補正して、２つのヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質の対応する同一性を決定しうることを認識するであろう。
【０２２９】
ポリヌクレオチド変異体は、結合ドメインの結合アフィニティー、またはＦａｂの結合アフィニティー、または変異体のポリヌクレオチドによりコードされるＭＳＦＰの機能が、とりわけ、本明細書で示されるポリヌクレオチド配列によりコードされる非修飾の基準タンパク質と比べて、好ましくは実質的に減殺されないように、１または複数の置換、付加、欠失および／または挿入を含有することが典型的である。
【０２３０】
他の特定の関連する実施形態では、ポリヌクレオチド断片が、本明細書で記載されるＭＳＦＰまたはそのドメインをコードする配列と同一であるかまたは相補的な配列の多様な長さの連続的な連なりを含むか、またはこれらから本質的になる可能性がある。例えば、本明細書で開示される結合ドメインまたはそのＦａｂの抗原結合断片など、ＭＳＦＰまたはそのドメインをコードする配列のうちの少なくとも約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、２００、３００、４００、５００または１０００以上の連続的なヌクレオチドのほか、これらの間の全ての中間の長さの連続的なヌクレオチドを含むか、またはこれらから本質的になるポリヌクレオチドが提供される。この文脈における「中間の長さ」とは、２００〜５００を通した全ての整数；５００〜１，０００を通した全ての整数を含め、５０、５１、５２、５３など；１００、１０１、１０２、１０３など；１５０、１５１、１５２、１５３など、引例された値の間の任意の長さを意味することが容易に理解されるであろう。本明細書で記載されるポリヌクレオチド配列は、一方または両方の末端において、天然配列において見出されないさらなるヌクレオチドにより伸長させることができる。このさらなる配列は、本明細書で記載されるＭＳＦＰもしくはそのドメインをコードするポリヌクレオチドの片方の末端、または本明細書で記載されるＭＳＦＰもしくはそのドメインをコードするポリヌクレオチドの両方の末端における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチドからなる可能性がある。
【０２３１】
別の実施形態では、中程度〜高度な厳密性の条件下で、本明細書で開示される結合ドメインもしくはそのＦａｂの抗原結合断片、またはその断片、もしくはその相補的な配列など、ＭＳＦＰまたはそのドメインをコードするポリヌクレオチド配列にハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドが提供される。分子生物学の技術分野では、ハイブリダイゼーション法が周知である。例示を目的として述べると、本明細書で提示されるポリヌクレオチドの、他のポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを調べるのに適する中程度に厳密な条件には、５倍濃度のＳＳＣ、０．５％のＳＤＳ、１．０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）による溶液中での前洗浄；５０℃〜６０℃、５倍濃度のＳＳＣ中、一晩にわたるハイブリダイジングの後；０．１％のＳＤＳを含有する２倍濃度のＳＳＣ、０．５倍濃度のＳＳＣ、および０．２倍濃度のＳＳＣの各々による、６５℃で２０分間ずつ２回にわたる洗浄が含まれる。当業者は、ハイブリダイゼーションの厳密性が、ハイブリダイゼーション溶液の塩含量および／またはハイブリダイゼーションを実施する温度を変化させることなどにより容易に操作しうることを理解するであろう。別の実施形態では、例えば、適切な高度に厳密なハイブリダイゼーション条件に、ハイブリダイゼーション温度を、例えば、６０℃〜６５℃または６５℃〜７０℃へと上昇させることを例外として、上記の条件が含まれる。
【０２３２】
特定の実施形態では、上記のポリヌクレオチド、例えば、ポリヌクレオチド変異体、断片、およびハイブリダイズする配列が、結合ドメインまたはＦａｂ、例えば、ＣＤ３に結合するＦａｂまたは腫瘍抗原標的に結合する結合ドメインなど、ＭＳＦＰまたはそのドメインをコードする。他の実施形態では、このようなポリヌクレオチドが、ＣＤ３および／または腫瘍抗原に、とりわけ本明細書で示されるＭＳＦＰ配列の少なくとも約５０％、少なくとも約７０％の強さで結合し、特定の実施形態では、少なくとも約９０％の強さで結合するＭＳＦＰをコードする。さらなる実施形態では、このようなポリヌクレオチドが、ＭＳＦＰまたはそのドメインであって、例えば、ＣＤ３および／または標的抗原に、本明細書で示されるＭＳＦＰまたはそのドメインより大きなアフィニティーで結合する、例えば、とりわけ、本明細書で示されるＭＳＦＰまたはそのドメインの配列の、定量的に少なくとも約１０５％、１０６％、１０７％、１０８％、１０９％、または１１０％の強さで結合するＭＳＦＰまたはそのドメインをコードする。
【０２３３】
本明細書の別の個所で記載される通り、代表的なポリペプチド（例えば、本明細書で提示される変異体のＭＳＦＰ、例えば、本明細書で提示される結合ドメインおよびＦａｂを有するＭＳＦＰ）の三次元構造の決定は、選択された天然または非天然のアミノ酸による１または複数のアミノ酸の置換、付加、欠失、または挿入を、このようにして誘導される構造的変異体が本明細書で開示される分子種の空間充填特性を保持するかどうかを決定する目的で事実上モデル化しうるように、日常的な方法を介して行うことができる。当業者には、例えば、アフィニティーを維持するか、またはより良好なアフィニティーを達成するように、例えば、抗体またはその抗原結合断片内の適切なアミノ酸置換（またはこのアミノ酸配列をコードする適切なポリヌクレオチド）を決定するための多様なコンピュータプログラムが公知である。
【０２３４】
本明細書で記載されるポリヌクレオチドまたはそれらの断片は、コード配列それ自体の長さに関わらず、それらの全体的な長さを大幅に変化させうるように、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、さらなる制限酵素部位、複数のクローニング部位、他のコードセグメントなど、他のＤＮＡ配列と組み合わせることができる。したがって、ほぼ任意の長さの核酸断片であって、全長が調製の容易さおよび意図される組換えＤＮＡプロトコールにおける使用により限定されることが好ましい核酸断片を用いうることが想定される。例えば、全長が約１０，０００、約５０００、約３０００、約２，０００、約１，０００、約５００、約２００、約１００、約５０塩基対の長さなど（全ての中間の長さを含めた）である例示的なポリヌクレオチドセグメントは、有用であると想定される。
【０２３５】
ポリヌクレオチド配列を比較する場合、下記の通りに対応が最大となるように整列させたときに、２つの配列におけるヌクレオチド配列が同じであれば、２つの配列を「同一である」という。２つの配列の間の比較は、典型的に、配列を比較域にわたり比較して、局所的な配列類似性の領域を同定および比較することにより実施した。本明細書で用いられる「比較域」とは、少なくとも約２０、通常は３０〜約７５、４０〜約５０の連続的な位置のセグメントであって、配列を、同数の連続的な位置を有する基準配列と、これら２つの配列を最適に整列させた後で比較しうるセグメントを指す。
【０２３６】
比較のための最適な配列アライメントは、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅシリーズのバイオインフォーマティックスソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）におけるＭｅｇａｌｉｇｎプログラムでデフォルトのパラメータを用いて実行することができる。このプログラムは、以下の参考文献において記載されている複数のアライメントスキームを統合する：Ｄａｙｈｏｆｆ，  Ｍ．Ｏ．（１９７８年）、「Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  −  Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ」、Ｄａｙｈｏｆｆ，  Ｍ．Ｏ．（編）、「Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ、５巻、増刊３号、３４５〜３５８頁；Ｈｅｉｎ  Ｊ．、「Ｕｎｉｆｉｅｄ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｓ」、６２６〜６４５頁（１９９０年）；「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」、１８３巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；Ｈｉｇｇｉｎｓ，  Ｄ．Ｇ．およびＳｈａｒｐ，  Ｐ．Ｍ．、ＣＡＢＩＯＳ、５巻：１５１〜１５３頁（１９８９年）；Ｍｙｅｒｓ，  Ｅ．Ｗ．およびＭｕｌｌｅｒ  Ｗ．、ＣＡＢＩＯＳ、４巻：１１〜１７頁（１９８８年）；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，  Ｅ．Ｄ．、Ｃｏｍｂ．  Ｔｈｅｏｒ、１１巻：１０５頁（１９７１年）；Ｓａｎｔｏｕ，  Ｎ．  Ｎｅｓ，  Ｍ．、Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｅｖｏｌ．、４巻：４０６〜４２５頁（１９８７年）；Ｓｎｅａｔｈ，  Ｐ．Ｈ．Ａ．およびＳｏｋａｌ，  Ｒ．Ｒ．、「Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ  −  Ｔｈｅ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ」、Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ（１９７３年）；Ｗｉｌｂｕｒ，  Ｗ．Ｊ．およびＬｉｐｍａｎ，  Ｄ．Ｊ．、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．、Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８０巻：７２６〜７３０頁（１９８３年）。
【０２３７】
代替的に、比較のための最適な配列アライメントは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｄ．  ＡＰＬ．  Ｍａｔｈ、２巻：４８２頁（１９８１年）による局所的な同一性アルゴリズムを介して実施することもでき、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、４８巻：４４３頁（１９７０年）による同一性アライメントのアルゴリズムを介して実施することもでき、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８５巻：２４４４頁（１９８８年）による類似性の検索法を介して実施することもでき、これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩによるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）をコンピュータに実装することにより実施することもでき、目視により実施することもできる。
【０２３８】
配列同一性および配列類似性のパーセントを決定するのに適するアルゴリズムの好ましい一例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムおよびＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムであり、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５巻：３３８９〜３４０２頁（１９７７年）、およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２１５巻：４０３〜４１０頁（１９９０年）において記載されている。例えば、本明細書で記載されるパラメータによりＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ  ２．０を用いて、２つ以上のポリヌクレオチド間における配列同一性のパーセントを決定することができる。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを介して公開されている。例示的な一例では、ヌクレオチド配列には、パラメータＭ（マッチする残基対に対するリウォードスコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチする残基に対するペナルティースコア；常に＜０）を用いて累積スコアを計算することができる。各方向へのワードヒットの伸長は、累積アライメントスコアがその最大達成値から量Ｘだけ低下する場合；１もしくは複数の負のスコアをもたらす残基アライメントが累積するために、累積スコアがゼロ以下に低下する場合；またはいずれかの配列の末端に達した場合に停止させる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータであるＷ、Ｔ、およびＸは、アライメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列の場合）では、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８９巻：１０９１５頁（１９８９年）を参照されたい）によるアライメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を用いる。
【０２３９】
特定の実施形態では、「配列同一性の百分率」が、最適に整列させた２つの配列を、少なくとも２０の位置による比較域であって、ポリヌクレオチド配列の一部が、２つの配列の最適なアライメントのための基準配列（付加または欠失を含まない）と比較して２０パーセント以下、通常は５〜１５パーセント、または１０〜１２パーセントの付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含みうる比較域にわたり比較することにより決定する。百分率は、両方の配列で同一な核酸塩基が生じてマッチした位置数をもたらす位置数を決定し、マッチした位置数を基準配列における位置の総数（すなわち、比較域のサイズ）で除し、結果を１００で乗じて配列同一性の百分率をもたらすことにより計算する。
【０２４０】
当業者は、遺伝子コードの縮重性の結果として、本明細書で記載されるＭＳＦＰをコードする多くのヌクレオチド配列が存在することを察知するであろう。これらのポリヌクレオチドのうちの一部は、ＭＳＦＰ、例えば、ＣＤ３および／または腫瘍標的抗原に結合するＭＳＦＰをコードする天然のポリヌクレオチドまたは元のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列と最小限の配列同一性を保有する。にもかかわらず、本開示では、コドン使用の差違に起因して変化するポリヌクレオチドが明示的に想定される。特定の実施形態では、哺乳動物における発現のためにコドンを最適化した配列が、とりわけ想定される。
【０２４１】
したがって、本発明の別の実施形態では、本明細書で記載されるＭＳＦＰの変異体および／または誘導体を調製するために、部位特異的変異誘発などの変異誘発法を使用することができる。この手法では、それらをコードする基底的なポリヌクレオチドの変異誘発を介して、ポリペプチド配列における特定の修飾を施すことができる。これらの技法は、配列変異体を調製して調べる簡便な手法、例えば、１または複数のヌクレオチド配列の変化をポリヌクレオチド内へと導入することにより、前出の検討事項のうちの１または複数を組み込む手法を提供する。
【０２４２】
部位特異的変異誘発は、特異的なオリゴヌクレオチド配列であって、所望の変異を有するＤＮＡ配列をコードするほか、横断される欠失接合部の両側において安定的な二重鎖を形成するのに十分なサイズおよび配列の複雑性を有するプライマー配列をもたらすのに十分な数の隣接するヌクレオチドもコードするオリゴヌクレオチド配列の使用を介する変異体の作製を可能とする。選択したポリヌクレオチド配列における変異を使用して、ポリヌクレオチドそれ自体の特性を改善するか、改変するか、低下させるか、修飾するか、もしくは他の形で変化させることもでき、かつ／またはコードされるポリペプチドの特性、活性、組成物、安定性、もしくは一次配列を改変することもできる。
【０２４３】
特定の実施形態では、本発明者らは、本明細書で開示されるＭＳＦＰまたはそのドメインをコードするポリヌクレオチド配列の変異誘発であって、結合ドメインもしくはそのＦａｂの抗原結合断片の結合アフィニティー、または特定のＦｃ領域の機能、またはＦｃ領域の特定のＦｃγＲに対するアフィニティーなど、コードされるポリペプチドの１または複数の特性を改変する変異誘発を想定する。当技術分野では、部位特異的変異誘発法が周知であり、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの両方の変異体を創出するのに広く用いられている。例えば、部位特異的変異誘発は、ＤＮＡ分子の特定の部分を改変するのに用いられることが多い。このような実施形態では、典型的に約１４〜約２５ヌクレオチドなどの長さを含むプライマーを使用し、配列接合部の両側において約５〜約１０残基を改変する。
【０２４４】
当業者により察知される通り、部位特異的変異誘発法では、一本鎖形態および二本鎖形態の両方で存在するファージベクターを使用することが多い。部位指向的変異誘発において有用な典型的ベクターには、Ｍ１３ファージなどのベクターが含まれる。これらのファージは、市販品の入手が容易であり、当業者にはそれらの使用が一般に周知である。二本鎖プラスミドはまた、対象の遺伝子をプラスミドからファージへと導入するステップを消滅させる部位指向的変異誘発でも日常的に使用されている。
【０２４５】
一般に、本明細書に従う部位指向的変異誘発は、まず所望のペプチドをコードするＤＮＡ配列をその配列内に包含する、一本鎖ベクターを得るか、または二本鎖ベクターの２つの鎖を溶離させることにより実施する。所望の変異配列を保有するオリゴヌクレオチドプライマーは、一般に合成により調製する。次いで、変異保有鎖の合成を完結させるために、このプライマーを、一本鎖ベクターとアニールさせ、Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片などのＤＮＡ重合化酵素下に置く。こうして、一方の鎖が元の非変異配列をコードし、第２の鎖が所望の変異を保有するヘテロ二重鎖が形成される。次いで、このヘテロ二重鎖ベクターを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞などの適切な細胞を形質転換し、変異配列の配置を保有する組換えベクターを包含するクローンを選択する。
【０２４６】
部位指向的変異誘発を用いて選択されるペプチドをコードするＤＮＡセグメントの配列変異体を調製することにより、潜在的に有用な分子種を作製する手段がもたらされるが、ペプチドの配列変異体およびそれらをコードするＤＮＡ配列を得うる他の方途も存在するので、これは、限定的であることを意味するわけではない。例えば、所望のペプチド配列をコードする組換えベクターを、ヒドロキシルアミンなどの変異誘発剤で処理して、配列変異体を得ることができる。これらの方法およびプロトコールに関する特定の詳細は、各々がその目的で参照により本明細書に組み込まれる、Ｍａｌｏｙら、１９９４年；Ｓｅｇａｌ、１９７６年；ＰｒｏｋｏｐおよびＢａｊｐａｉ、１９９１年；Ｋｕｂｙ、１９９４年；ならびにＭａｎｉａｔｉｓら、１９８２年の教示において見出される。
【０２４７】
本明細書で用いられる「オリゴヌクレオチド指向的変異誘発手順」という用語は、増幅など、特定の核酸分子の濃度のその初期濃度と比べた上昇、または検出可能なシグナル濃度の上昇を結果としてもたらす、鋳型依存的工程およびベクターを介する増殖を指す。本明細書で用いられる「オリゴヌクレオチド指向的変異誘発手順」という用語は、プライマー分子の鋳型依存的な伸長を伴う工程を指すことを意図する。鋳型依存的工程という用語は、ＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子の核酸合成であって、核酸の新たに合成される鎖の配列が、相補的な塩基対合についての周知の規則（例えば、Ｗａｔｓｏｎ、１９８７年を参照されたい）により規定される核酸合成を指す。典型的に、ベクターを介する方法は、核酸断片のＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターへの導入、ベクターのクローン増幅、および増幅された核酸断片の回収を伴う。このような方法の例は、とりわけ、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第４，２３７，２２４号により提示されている。
【０２４８】
ポリペプチド変異体を作製するための別の手法では、米国特許第５，８３７，４５８号において記載される、再帰的配列組換えを用いることができる。この手法では、組換えおよびスクリーニングまたは選択の反復的サイクルを実施して、例えば、結合アフィニティーを増大させた個別のポリヌクレオチドの変異体を「進化」させる。また、特定の実施形態では、本明細書で記載される少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むプラスミド、ベクター、転写カセットまたは発現カセットの形態にある構築物も提供する。
【０２４９】
特定の実施形態では、単離ポリヌクレオチドをベクターへと挿入する。本明細書で用いられる「ベクター」という用語は、その中にタンパク質をコードするポリヌクレオチドを共有結合的に挿入して、タンパク質の発現および／またはポリヌクレオチドのクローニングを引き起こしうる媒体を指す。単離ポリヌクレオチドは、当技術分野で公知の任意の適切な方法を用いて、ベクターへと挿入することができる。限定せずに述べると、例えば、ベクターを適切な制限酵素を用いて消化し、次いで、マッチする制限末端を有する単離ポリヌクレオチドとライゲーションすることができる。
【０２５０】
限定せずに述べると、適切なベクターの例には、プラスミド、ファージミド、コスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、またはＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）などの人工染色体、ラムダファージまたはＭ１３ファージなどのバクテリオファージ、および動物ウイルスが含まれる。限定せずに述べると、ベクターとして有用な動物ウイルスの類型の例には、レトロウイルス（レンチウイルスを含めた）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、およびパポバウイルス（例えば、ＳＶ４０）が含まれる。
【０２５１】
ポリペプチドを発現させるためには、ベクターを、宿主細胞へと導入して、宿主細胞におけるポリペプチドの発現を可能とすることができる。限定せずに述べると、発現ベクターは、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択マーカー、およびシグナル配列を含め、発現を制御するための多様なエレメントを含有しうる。これらのエレメントは、当業者が必要に応じて、選択することができる。例えば、プロモーター配列は、ベクターによるポリヌクレオチドの転写を促進するように選択する。限定せずに述べると、適切なプロモーター配列には、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ベータ−アクチンプロモーター、ＥＦ１ａプロモーター、ＣＭＶプロモーター、およびＳＶ４０プロモーターが含まれる。エンハンサー配列は、ポリヌクレオチドの転写を増強するように選択することができる。選択マーカーは、ベクターを挿入された宿主細胞の、ベクターを挿入されていない宿主細胞からの選択を可能とするように選択することができ、例えば、選択マーカーとは、抗生剤耐性を付与する遺伝子でありうる。シグナル配列は、発現させたポリペプチドが宿主細胞の外部へと輸送されることを可能とするように選択することができる。
【０２５２】
ベクターはまた、その細胞への侵入の一助となる物質であって、ウイルス粒子、リポソーム、またはタンパク質コーティングが含まれるがこれらに限定されない物質も包含しうる。
【０２５３】
ポリヌクレオチドをクローニングするためには、ベクターを、宿主細胞（単離宿主細胞）へと導入し、ベクター自体の複製を可能とし、これにより、その中に含有されたポリヌクレオチドのコピーを増幅することができる。クローニングベクターは、限定せずに述べると一般に、複製起点、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、および選択マーカーが含まれる配列構成要素を含有しうる。これらのエレメントは、必要に応じて、当業者により選択されうる。例えば、複製起点は、宿主細胞におけるベクターの自律的な複製を促進するように選択することができる。
【０２５４】
特定の実施形態では、本開示は、本明細書で提示されるベクターを含有する単離宿主細胞を提供する。ベクターを含有する宿主細胞は、ベクター内に含有されたポリヌクレオチドの発現またはクローニングにおいて有用でありうる。
【０２５５】
限定せずに述べると、適切な宿主細胞には、原核細胞、真菌細胞、酵母細胞、または哺乳動物細胞など、高等真核細胞が含まれうる。
【０２５６】
限定せずに述べると、この目的に適する原核細胞には、グラム陰性生物またはグラム陽性生物、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｅｒｗｉｎｉａ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｐｒｏｔｅｕｓ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、例えば、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ、およびＳｈｉｇｅｌｌａ属などのＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｈａｃｅａｅ）科のほか、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓなどのＢａｃｉｌｌｉ属、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａなどのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、ならびにＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属などの真正細菌が含まれる。
【０２５７】
当技術分野では、Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核細胞における抗体および抗原結合断片の発現が十分に確立されている。総説には、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，  Ａ．、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９巻：５４５〜５５１頁（１９９１年）を参照されたい。当業者にはまた、培養物中の真核細胞における発現も、抗体またはそれらの抗原結合断片を作製するための選択肢として利用可能であり、近年の総説、例えば、Ｒｅｆ，  Ｍ．  Ｅ．（１９９３年）、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、４巻：５７３〜５７６頁；Ｔｒｉｌｌ，  Ｊ．  Ｊ．ら（１９９５年）、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、６巻：５５３〜５６０頁を参照されたい。
【０２５８】
限定せずに述べると、この目的に適する真菌細胞には、繊維状真菌および酵母が含まれる。真菌細胞の例示的な例には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、パン酵母、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、例えば、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ  １２，４２４）、Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（ＡＴＣＣ  １６，０４５）、Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ（ＡＴＣＣ  ２４，１７８）、Ｋ．ｗａｌｔｉｉ（ＡＴＣＣ  ５６，５００）、Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ（ＡＴＣＣ  ３６，９０６）、Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、およびＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓなどのＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属の宿主；Ｙａｒｒｏｗｉａ属（ＥＰ４０２，２２６）；Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＥＰ１８３，０７０）；Ｃａｎｄｉｄａ属；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉａ（ＥＰ２４４，２３４）；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ；Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓなどのＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ属；ならびに、例えば、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ属、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ属、ならびにＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓおよびＡ．ｎｉｇｅｒなどのＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属宿主などの繊維状真菌が含まれる。
【０２５９】
高等真核細胞、特に、多細胞生物に由来する高等真核細胞を、本明細書で提示されるグリコシル化されたポリペプチドの発現に用いることができる。限定せずに述べると、適切な高等真核細胞には、無脊椎動物細胞および昆虫細胞、ならびに脊椎動物細胞が含まれる。無脊椎動物細胞の例には、植物細胞および昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロウイルス株および変異体、ならびにＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（毛虫）、Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ（蚊）、Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ（蚊）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（ショウジョウバエ）、およびＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉなどの宿主に由来する対応する許容状態の昆虫宿主細胞が同定されている。トランスフェクション用の多様なウイルス株、例えば、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ＮＰＶのＫ−１変異体およびＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ＮＰＶのＢｍ−５株が市販されており、このようなウイルスを、本発明に従う、特に、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞をトランスフェクトするための本明細書のウイルスとして用いることができる。また、綿花、トウモロコシ、バレイショ、ダイズ、ペチュニア、トマト、およびタバコによる植物細胞培養物も、宿主として使用することができる。脊椎動物細胞の例には、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）により形質転換されるサル腎臓ＣＶ１系列；ヒト胎児由来腎臓系列（細胞懸濁培養物中で増殖させるためにサブクローニングした２９３または２９３細胞；Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．、３６巻：５９頁（１９７７年））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ；ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ；Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、７７巻：４２１６頁（１９８０年））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４；Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｐｒｏｄ．、２３巻：２４３〜２５１頁（１９８０年））；サル腎臓細胞（ＣＶ１；ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６；ＡＴＣＣ  ＣＲＫ−１５８７）；ヒト子宮頸がん細胞（ＨＥＬＡ；ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ；ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８；ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２；ＨＢ  ８０６５）；マウス乳房腫瘍細胞（ＭＭＴ  ０６０５６２；ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、３８３巻：４４〜６８頁（１９８２年））；ＭＲＣ  ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝臓がん系列（Ｈｅｐ  Ｇ２）などの哺乳動物宿主細胞系が含まれる。
【０２６０】
ベクターは、限定せずに述べると、ＤＥＡＥ−デキストランを媒介する送達、リン酸カルシウム沈殿法、カチオン脂質を媒介する送達、リポソームを媒介するトランスフェクション、電気穿孔、微粒子銃、受容体を媒介する遺伝子送達、ポリリシン、ヒストン、キトサン、およびペプチドを媒介する送達が含まれる、当技術分野で公知の任意の適切な方法を用いて宿主細胞へと導入することができる。当技術分野では、対象のベクターを発現させるために細胞をトランスフェクションおよび形質転換するための標準的な方法が周知である。
【０２６１】
特定の実施形態では、宿主細胞が、第１のポリペプチドをコードする第１のベクターと、第２のポリペプチドをコードする第２のベクターとを含む。特定の実施形態では、第１のベクターと第２のベクターとが、同じ場合もあり、同じでない場合もある。特定の実施形態では、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとが、同じ場合もあり、同じでない場合もある。
【０２６２】
特定の実施形態では、第１のベクターと第２のベクターとを、同時に導入する場合もあり、同時には導入しない場合もある。特定の実施形態では、第１のベクターと第２のベクターとを、宿主細胞へと併せて導入することができる。特定の実施形態では、第１のベクターを第１の宿主細胞へと導入することができ、次いで、第２のベクターも導入することができる。特定の実施形態では、第１のベクターを宿主細胞へと導入し、次いで、これを、第１のポリペプチドを発現させる安定的な細胞系へと確立し、次いで、第２のベクターをこの安定的な細胞系へと導入することができる。
【０２６３】
特定の実施形態では、宿主細胞が、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドをコードするベクターを含む。特定の実施形態では、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとが、同じ場合もあり、同じでない場合もある。
【０２６４】
特定の実施形態では、本開示が、本明細書で提示されるポリペプチドを発現させる方法であって、ベクターを含有する宿主細胞を、ベクター内に挿入したポリヌクレオチドを発現させる条件下で培養するステップを含む方法を提供する。
【０２６５】
限定せずに述べると、ポリヌクレオチドを発現させるのに適する条件には、適切な培地、培養培地中に適切な宿主細胞の密度、必要な栄養物質の存在、補因子の存在、適切な温度および湿度、ならびに微生物夾雑物の非存在が含まれうる。当業者は、必要に応じて、発現の目的に適する条件を選択することができる。
【０２６６】
特定の実施形態では、宿主細胞内で発現させたポリペプチドが、二量体を形成する可能性があり、したがって、本明細書で提示されるＭＳＦＰ二量体またはポリペプチド複合体をもたらしうる。特定の実施形態では、宿主細胞内で発現させたポリペプチドが、ホモ二量体のポリペプチド複合体を形成しうる。宿主細胞が、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドを発現させる特定の実施形態では、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとが、ヘテロ二量体のポリペプチド複合体を形成しうる。
【０２６７】
特定の実施形態では、ポリペプチド複合体が、宿主細胞内部で形成されうる。例えば、二量体は、関与性の酵素および／または共因子を一助として、宿主細胞内部で形成されうる。特定の実施形態では、ポリペプチド複合体が、細胞外へと分泌されうる。特定の実施形態では、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとが、宿主細胞外へと分泌され、宿主細胞の外部で二量体を形成しうる。
【０２６８】
特定の実施形態では、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとを、適切な条件下で別個に発現させ、二量体化させることができる。例えば、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとを適切な緩衝液中で組み合わせ、第１のタンパク質単量体と第２のタンパク質単量体とを、疎水性相互作用などの適切な相互作用を介して二量体化させることができる。別の例では、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとを、酵素および／または共因子を含有する適切な緩衝液中で組み合わせ、これにより、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの二量体化を促進することができる。別の例では、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとを、適切な媒体内で組み合わせ、それらを、適切な試薬および／または触媒の存在下で互いと反応させることができる。
【０２６９】
発現させたポリペプチドおよび／またはポリペプチド複合体は、任意の適切な方法を用いて回収することができる。ポリペプチドおよび／またはポリペプチド複合体は、細胞内、ペリプラズム空間内で発現させることもでき、細胞の外部の培地へと分泌させることもできる。ポリペプチドおよび／またはポリペプチド複合体を細胞内で発現させる場合は、ポリペプチドおよび／またはポリペプチド複合体を含有する宿主細胞を溶解させることができ、遠心分離または限外濾過を介して望まれない破砕物を除去することにより、ポリペプチドおよび／またはポリペプチド複合体をこの溶解物から単離することができる。ポリペプチドおよび／またはポリペプチド複合体を、Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズム空間へと分泌させる場合は、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、およびフェニルメチルスルホニルフロリド（ＰＭＳＦ）などの薬剤の存在下で約３０分間にわたり細胞ペーストを融解させ、遠心分離により細胞破砕物を除去することができる（Ｃａｒｔｅｒら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０巻：１６３〜１６７頁（１９９２年））。ポリペプチドおよび／またはポリペプチド複合体を培地へと分泌させる場合は、細胞培養物の上清を回収し、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、Ａｍｉｎｃｏｎ限外濾過ユニットまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを用いて濃縮することができる。プロテアーゼ阻害剤および／または抗生剤を回収ステップおよび濃縮ステップへと組み入れて、タンパク質の分解および／または夾雑微生物の成長を阻害することができる。
【０２７０】
発現させたポリペプチドおよび／またはポリペプチド複合体は、限定せずに述べると、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、サイズ除外クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、イオン交換カラム上におけるイオン交換による画分化、エタノールによる沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上におけるクロマトグラフィー、ヘパリンセファロース上におけるクロマトグラフィー、アニオン交換樹脂またはカチオン交換樹脂上におけるクロマトグラフィー（ポリアスパラギン酸カラムなど）、等電点電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および硫酸アンモニウム沈殿（総説については、Ｂｏｎｎｅｒ，  Ｐ．  Ｌ．、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」、Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ刊、２００７年；Ｊａｎｓｏｎ，  Ｊ．  Ｃ．ら、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，  ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ刊、１９９８年を参照されたい）など、適切な方法によりさらに精製することができる。
【０２７１】
特定の実施形態では、ポリペプチドおよび／またはポリペプチド二量体の複合体を、アフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。特定の実施形態では、プロテインＡクロマトグラフィーまたはプロテインＡ／Ｇ（プロテインＡとプロテインＧとの融合タンパク質）クロマトグラフィーが、抗体のＣＨ２ドメインおよび／またはＣＨ３ドメインに由来する構成要素を含むポリペプチドおよび／またはポリペプチド複合体の精製に有用でありうる（Ｌｉｎｄｍａｒｋら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈ．、６２巻：１〜１３頁（１９８３年））；Ｚｅｔｔｌｉｔ，  Ｋ．  Ａ．、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」、Ｖ部、５３１〜５３５頁、２０１０年）。特定の実施形態では、プロテインＧクロマトグラフィーが、ＩｇＧγ３重鎖を含むポリペプチドおよび／またはポリペプチド複合体の精製に有用でありうる（Ｇｕｓｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、５巻：１５６７〜１５７５頁（１９８６年））。特定の実施形態では、プロテインＬクロマトグラフィーが、κ軽鎖を含むポリペプチドおよび／またはポリペプチド複合体の精製に有用でありうる（Ｓｕｄｈｉｒ，  Ｐ．、「Ａｎｔｉｇｅｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」、２６章、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ刊、１９９５年；Ｎｉｌｓｏｎ，  Ｂ．  Ｈ．  Ｋ．ら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２６７巻、２２３４〜２２３９頁（１９９２年））。アフィニティーリガンドを接合させるマトリックスは、アガロースのことが極めて多いが、他のマトリックスも利用可能である。小孔が制御されたガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなど、力学的に安定的なマトリックスは、アガロースにより達成可能な流速および処理時間より早い流速および短い処理時間を可能とする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合は、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸ樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、Ｎ．Ｊ．）が精製に有用である。
【０２７２】
任意の予備的な（１または複数の）精製ステップの後は、対象の抗体および夾雑物を含む混合物を、ｐＨが約２．５〜４．５の間の溶出緩衝液を用いて、好ましくは低塩濃度（例えば、約０〜０．２５Ｍの塩）で実施される、低ｐＨの疎水性相互作用クロマトグラフィーにかけることができる。
【０２７３】
医薬組成物および使用法
本開示は、本明細書で記載されるＭＳＦＰを含む組成物、および多様な治療状況におけるこのような組成物の投与を提供する。
【０２７４】
純粋形態または適切な医薬組成物による、本明細書で記載されるＭＳＦＰの投与は、類似の有用性をもたらすのに許容される薬剤の投与方式のうちのいずれかを介して実行することができる。医薬組成物は、ＭＳＦＰまたはＭＳＦＰを含有する組成物を、生理学的に許容される適切な担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせることにより調製することができ、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、軟膏、溶液、坐剤、注射、吸入剤、ゲル、マイクロスフェア、およびエアゾールなど、固体形態、半固体形態、液体形態、または気体形態の調製物へと調合することができる。加えて、他の医薬としての有効成分（本明細書の別の個所で記載される他の抗がん剤を含めた）、ならびに／または塩、緩衝剤、および安定化剤などの適切な賦形剤を組成物内に存在させることもできるが、必ずしもそうする必要はない。投与は、経口経路、非経口経路、鼻腔内経路、静脈内経路、皮内経路、皮下経路、または局所経路を含め、異なる多様な経路を介して達成することができる。好ましい投与方式は、処置または防止される状態の性質に依存する。投与後、がんを軽減するか、がんを阻害するか、がんの進行および／または転移を防止するかまたは遅延させる量を有効であると考える。
【０２７５】
特定の実施形態では、投与される量が、生存可能な腫瘍の量の統計学的に有意な減少、例えば、腫瘍塊の少なくとも５０％の減少または走査寸法の改変（例えば、統計学的に有意な減少）により示される腫瘍の退縮を結果としてもたらすのに十分である。他の実施形態では、投与される量が、医療技術の当業者に公知の、臨床的に重要な疾患症状の軽減を結果としてもたらすのに十分である。
【０２７６】
処置の正確な用量および持続期間は、処置される疾患の関数であり、公知の試験プロトコールを用いて経験的に決定することもでき、当技術分野で公知のモデル系において組成物を調べ、そこから外挿することにより決定することもできる。また、比較臨床試験も実施することができる。用量はまた、緩和させる状態の重症度と共に変化する可能性もある。医薬組成物は一般に、望ましくない副作用を最小化しながら、治療的に有用な効果を果たすように調合および投与する。組成物は、一度に投与することもでき、時間間隔を置いて投与される多数回の小用量へと分割することもできる。任意の特定の被験体には、特定の用量レジメンを、個別の必要に従い、経時的に調整することができる。
【０２７７】
ＭＳＦＰを含有する組成物は、単独で投与することもでき、放射線療法、化学療法、移植、免疫療法、ホルモン療法、光力学療法などなど、他の公知のがん処置と組み合わせて投与することもできる。組成物はまた、抗生剤と組み合わせても投与することができる。
【０２７８】
したがって、限定せずに述べると、これらの医薬組成物および類縁の医薬組成物を投与する典型的な経路には、経口経路、局所経路、経皮経路、吸入経路、非経口経路、舌下経路、口腔内経路、直腸内経路、膣内経路、および鼻腔内経路が含まれる。本明細書で用いられる非経口経路という用語には、皮下注射、静脈内注射法または静脈内注入法、筋肉内注射法または筋肉内注入法、胸骨内注射法または胸骨内注入法が含まれる。本発明の特定の実施形態に従う医薬組成物は、組成物を患者へと投与したときに、その中に含有される有効成分がバイオアベイラビリティーを示すことを可能とするように調合する。被験体または患者に投与される組成物は、１または複数の用量単位であって、例えば、錠剤が単一の用量単位の場合もあり、エアゾール形態における、本明細書で記載されるＭＳＦＰの容器が複数の用量単位を保持する場合もある用量単位の形態をとりうる。このような剤形を調製する実際の方法は公知であるか、または当業者に明らかであろう。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、「Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ」、２０版（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０００年）を参照されたい。いずれにせよ、投与される組成物は、本明細書の教示に従う被験体の疾患または状態を処置するための、治療有効量の本開示のＭＳＦＰを含有する。
【０２７９】
医薬組成物は、固体形態の場合もあり、液体形態の場合もある。一実施形態では、組成物が、例えば、錠剤形態または粉末形態であるように、（１または複数の）担体が微粒子である。組成物が、例えば、吸入投与において有用な、例えば、経口油、注射用液、またはエアゾールである場合、（１または複数の）担体は液体でありうる。経口投与用に意図される場合、医薬組成物は、固体形態または液体形態であって、半固体形態、半液体形態、懸濁液形態、およびゲル形態も本明細書で固体または液体と考えられる形態の中に包含される場合の固体形態または液体形態であることが好ましい。
【０２８０】
経口投与用の固体組成物として、医薬組成物を、粉末、顆粒、圧縮錠、丸薬、カプセル、チューインガム、ウェハーなどへと調合することができる。このような固体組成物は典型的に、１または複数の不活性の希釈剤または可食性の担体を含有する。加えて、以下のうちの１または複数を存在させることができる：カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、結晶セルロース、トラガカントガム、またはゼラチンなどの結合剤；デンプン、ラクトース、またはデキストリンなどの賦形剤；アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、トウモロコシデンプンなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｘなどの潤滑剤；コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤；スクロースまたはサッカリンなどの甘味剤；ペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジ香味剤などの香味剤；および着色剤。医薬組成物が、カプセル形態、例えば、ゼラチンカプセルの形態にある場合、それは、上記の種類の物質に加えて、ポリエチレングリコールまたは油など、液体の担体も含有しうる。
【０２８１】
医薬組成物は、液体、例えば、エリキシル剤、シロップ、溶液、エマルジョン、または懸濁液の形態でありうる。２つの例として述べると、液体は、経口投与用の場合もあり、注射による送達用の場合もある。経口投与用が意図される場合、好ましい組成物は、本化合物に加えて、甘味剤、防腐剤、色素／着色剤、および芳香増強剤のうちの１または複数も含有する。注射により投与することが意図される組成物では、界面活性剤、防腐剤、保湿剤、分散剤、懸濁剤、緩衝液、安定化剤、および等張剤のうちの１または複数を組み入れることができる。
【０２８２】
液体の医薬組成物は、それらが溶液であれ、懸濁液であれ、他の同様の形態であれ、以下の補助剤のうちの１または複数を包含しうる：注射用水、食塩液、好ましくは生理食塩液、リンゲル溶液、等張性塩化ナトリウムなどの滅菌希釈剤、溶媒もしくは懸濁媒として用いうる合成モノグリセリドもしくは合成ジグリセリドなどの固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の溶媒；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミンテトラ酢酸などのキレート化剤；酢酸、クエン酸、またはリン酸などの緩衝剤、および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張度を調整するための薬剤。非経口調製物は、アンプル、ディスポーザブルのシリンジ、またはガラス製もしくはプラスティック製の複数回投与用のバイアル内に封入することができる。生理食塩液は、好ましい補助剤である。注射用医薬組成物は、滅菌であることが好ましい。
【０２８３】
非経口投与用または経口投与用を意図される液体の医薬組成物は、適切な用量が得られるような量の、本明細書で開示されるＭＳＦＰを含有するものとする。この量は、組成物中に少なくとも０．０１％のＭＳＦＰであることが典型的である。経口投与用が意図される場合、この量は、組成物重量の０．１〜約７０％で変化させることができる。特定の経口医薬組成物は、約４％〜約７５％の間のＭＳＦＰを含有する。特定の実施形態では、非経口投与単位が、希釈前の重量で０．０１〜１０％の間のＭＳＦＰを含有するように、本発明に従う医薬組成物および医薬調製物を調製する。
【０２８４】
医薬組成物は、局所投与用を意図することができ、この場合、担体は、溶液基剤、エマルジョン基剤、軟膏基剤、またはゲル基剤を含むことが適切でありうる。基剤は、例えば、以下のうちの１または複数を含みうる：ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、蜜蝋、鉱物油、水およびアルコールなどの希釈剤、ならびに乳化剤および安定化剤。局所投与用の医薬組成物中には、増粘剤を存在させることができる。経皮投与用を意図する場合、組成物には、経皮パッチまたはイオントフォレーシス用デバイスが含まれうる。医薬組成物には、例えば、直腸内で溶融して薬物を放出する坐剤の形態における直腸内投与を意図することができる。直腸内投与用の組成物は、適切な非刺激性賦形剤としての油性基剤を含有しうる。限定せずに述べると、このような基剤には、ラノリン、ココアバター、およびポリエチレングリコールが含まれる。
【０２８５】
医薬組成物には、固体の投与単位または液体の投与単位の物理的形態を修飾する多様な物質を組み入れることができる。例えば、組成物には、有効成分の周囲にコーティングシェルを形成する物質を組み入れることができる。コーティングシェルを形成する物質は、典型的に不活性であり、例えば、糖、セラック、および他の腸溶性のコーティング剤から選択することができる。代替的に、有効成分をゼラチンカプセル内に包み込むこともできる。固体形態または液体形態の医薬組成物には、本発明の抗体に結合し、これにより化合物の送達の一助となる薬剤を組み入れることができる。この能力において作用しうる適切な薬剤には、他のモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体、１もしくは複数のタンパク質、またはリポソームが含まれる。医薬組成物は、エアゾールとして投与しうる投与単位から本質的になる場合がある。エアゾールという用語は、コロイド性の系〜加圧型パッケージからなる系の範囲にわたる多様な系を示すのに用いられる。送達は、液化ガスまたは圧縮ガスによる場合もあり、有効成分を分注する適切なポンプシステムによる場合もある。エアゾールは、（１または複数の）有効成分を送達するために、単相系で送達することもでき、二相系で送達することもでき、三相系で送達することもできる。エアゾールの送達には、併せてキットを形成しうる、必要な容器、アクチベーター、バルブ、部分容器などを組み入れることができる。当業者は、不要な実験を伴わずに、好ましいエアゾールを決定することができる。
【０２８６】
医薬組成物は、製薬技術分野で周知の方法により調製することができる。例えば、注射により投与することを意図される医薬組成物は、本明細書で記載されるＭＳＦＰと、場合によって、塩、緩衝剤、および／または安定化剤のうちの１または複数とを含む組成物を、溶液を形成するように滅菌蒸留水と組み合わせることにより調製することができる。界面活性剤を添加して、均一な溶液または懸濁液の形成を容易にすることができる。界面活性剤とは、水性送達系におけるＭＳＦＰの溶解または均一な懸濁を容易にするように、ＭＳＦＰ組成物と非共有結合的に相互作用する化合物である。
【０２８７】
組成物は、使用される特定の化合物（例えば、ＭＳＦＰ）の活性；化合物作用の代謝安定性および長さ；患者の年齢、体重、全般的な健康、性別、および食餌；投与方式および投与期間；排泄速度；薬物の組合せ；特定の障害または状態の重症度；ならびに被験体が治療を受けているかどうかを含めた多様な因子に依存して変化する治療有効量で投与することができる。一般に、１日当たりの治療有効用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ（すなわち、０．０７ｍｇ）〜約１００ｍｇ／ｋｇ（すなわち、７．０ｇ）（７０ｋｇの哺乳動物の場合）であり、治療有効用量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ（すなわち、０．７ｍｇ）〜約５０ｍｇ／ｋｇ（すなわち、３．５ｇ）（７０ｋｇの哺乳動物の場合）であることが好ましく、治療有効用量は、約１ｍｇ／ｋｇ（すなわち、７０ｍｇ）〜約２５ｍｇ／ｋｇ（すなわち、１．７５ｇ）（７０ｋｇの哺乳動物の場合）であることがより好ましい。
【０２８８】
本開示のＭＳＦＰを含む組成物はまた、１または複数の他の治療剤の投与と同時に投与することもでき、この前に投与することもでき、この後で投与することもできる。このような組合せ療法は、本発明の化合物および１または複数のさらなる活性薬剤を含有する単一の医薬処方物の投与のほか、本発明のＭＳＦＰおよびその固有の別個の医薬処方物における各活性薬剤を含む組成物の投与も包含しうる。例えば、本明細書で記載されるＭＳＦＰおよび他の活性薬剤は、錠剤またはカプセルなど、単一の経口投与組成物中で併せて患者に投与することもでき、各薬剤を別個の経口投与組成物により投与することもできる。同様に、本明細書で記載されるＭＳＦＰおよび他の活性薬剤は、生理食塩液または他の生理学的に許容される溶液など、単一の非経口投与組成物中で併せて患者に投与することもでき、各薬剤を別個の非経口投与処方物により投与することもできる。別個の投与処方物を用いる場合、ＭＳＦＰおよび１または複数のさらなる活性薬剤を含む組成物は、本質的に同時に、すなわち、共時的に投与することもでき、別個に時間をずらして、すなわち、逐次的、かつ、任意の順序で投与することもでき、組合せ療法は、これら全てのレジメンを包含することが理解される。
【０２８９】
したがって、特定の実施形態ではまた、１または複数の他の治療剤と組み合わせた本開示のＭＳＦＰ組成物の投与も想定される。当技術分野では、このような治療剤を、がん、炎症性障害、同種移植片移植、Ｉ型糖尿病、および多発性硬化症など、本明細書で記載される特定の疾患状態のための標準的な処置として許容することができる。想定される例示的な治療剤には、サイトカイン、成長因子、ステロイド、ＮＳＡＩＤ、ＤＭＡＲＤ、抗炎症剤、化学療法剤、放射性治療剤、または他の活性薬剤および補助薬剤が含まれる。
【０２９０】
特定の実施形態では、本明細書で開示されるＭＳＦＰを、任意の数の化学療法剤と共に投与することができる。化学療法剤の例には、チオテパおよびシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（商標））などのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン、およびピポスルファンなどのスルホン酸アルキル；ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、およびウレドーパなどのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド（ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈａｏｒａｍｉｄｅ）、およびトリメチロールメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）を含めたエチレンイミンおよびメチルメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅｓ）；クロランブシル、クロルナファジン、シクロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベムビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどの窒素マスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロソウレア（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａｓ）；アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、マイコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシンなどの抗生剤；メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの代謝拮抗剤；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸類似体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、５−ＦＵなどのピリミジン類似体；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎剤；フォリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）などの葉酸補充剤；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトレキサート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジクオン；エルフロルニチン（ｅｌｆｏｒｍｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン���フェンメトラジン（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン；ポドフィリン酸（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ．ＲＴＭ．；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）およびドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｒｈｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ、Ａｎｔｏｎｙ、Ｆｒａｎｃｅ）；クロランブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチンおよびカルボプラチンなどの白金類似体；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤であるＲＦＳ  ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；Ｔａｒｇｒｅｔｉｎ（商標）（ベキサロテン）、Ｐａｎｒｅｔｉｎ（商標）（アリトレチノイン）などのレチノイン酸誘導体；ＯＮＴＡＫ（商標）（デニロイキンジフチトクス）；エスペラミシン；カペシタビン；ならびに上記のうちのいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体が含まれる。この定義にはまた、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害剤、４（５）−イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ  １１７０１８、オナプリストン、およびトレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）を含めた抗エストロゲン剤；ならびにフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリンなどの抗アンドロゲン剤；ならびに上記のうちのいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体など、腫瘍に対するホルモンの作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤も含まれる。
【０２９１】
他の多様な治療剤を、本明細書で記載されるＭＳＦＰと共に用いることができる。一実施形態では、ＭＳＦＰを、抗炎症剤と共に投与する。抗炎症剤または抗炎症薬物には、ステロイドおよびグルココルチコイド（ベタメタゾン、ブデソニド、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン酢酸エステル、ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、トリアムシノロンを含めた）、アスピリン、イブプロフェン、ナプロキセンを含めた非ステロイド系抗炎症性薬物（ＮＳＡＩＤ）、メトトレキサート、スルファサラジン、レフルノミド、抗ＴＮＦ薬、シクロホスファミド、およびマイコフェノール酸が含まれるがこれらに限定されない。
【０２９２】
本明細書で記載されるＭＳＦＰを含む組成物は、がんおよび自己免疫性疾患および炎症性疾患が含まれるがこれらに限定されない、本明細書で記載される疾患に罹患する個体に投与することができる。ヒト疾患を処置するためにｉｎ  ｖｉｖｏで用いる場合は一般に、本明細書で記載されるＭＳＦＰを、投与前に医薬組成物へと組み込む。医薬組成物は、本明細書の別の個所で記載される通り、生理学的に許容される担体または賦形剤と組み合わせた、本明細書で記載されるＭＳＦＰのうちの１または複数を含む。医薬組成物を調製するには、有効量のＭＳＦＰのうちの１または複数を、特定の投与方式に適することが当業者に公知である任意の医薬としての（１または複数の）担体または賦形剤と混合する。医薬としての担体は、液体の場合もあり、半液体の場合もあり、固体の場合もある。非経口適用、皮内適用、皮下適用、または局所適用に用いられる溶液または懸濁液には、例えば、滅菌希釈剤（水など）、生理食塩液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒；抗微生物剤（ベンジルアルコールおよびメチルパラベン、フェノールおよびクレゾール、水銀剤、クロロブタノール、メチルｐ−ヒドロキシ安息香酸エステルおよびプロピルｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル、チメロサール、塩化ベンザルコニウム、ならびにベンゼトニウム塩化物など）；抗酸化剤（アスコルビン酸および亜硫酸水素ナトリウム；メチオニン、チオ硫酸ナトリウム、白金、カタラーゼ、クエン酸、システイン、チオグリセロール、チオグリコール酸、チオソルビトール、ブチル化ヒドロキシアニソール（ｂｕｔｙｌａｔｅｄ  ｈｙｄｒｏｘａｎｉｓｏｌ）、ブチル化ヒドロキシトルエン、および／または没食子酸プロピルなど）；およびキレート化剤（エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）など）；緩衝剤（酢酸、クエン酸、およびリン酸など）が含まれうる。静脈内投与する場合、適切な担体には、生理学的生理食塩液またはリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）、ならびにグルコース、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、およびこれらの混合物などの増粘剤および可溶化剤を含有する溶液が含まれる。
【０２９３】
本明細書で記載されるＭＳＦＰを含む組成物は、徐放型処方物または徐放型コーティングなど、ＭＳＦＰを体内からの急速な消失に対して保護する担体と共に調製することができる。このような担体には、インプラントおよびマイクロカプセル化送達系、ならびにエチレンビニル酢酸、ポリ無水物、ポリグリコール酸、ポリオルトエステル、ポリ乳酸、および当業者に公知である他の生体分解性ポリマー、生体適合性ポリマーなどの生体分解性ポリマー、生体適合性ポリマーなどであるがこれらに限定されない制御放出型処方物が含まれる。
【０２９４】
本ＭＳＦＰは、多様ながんを処置するのに有用である。例えば、本発明の一実施形態は、黒色腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、白血病、形質細胞腫、肉腫、神経膠芽腫、胸腺腫、乳がん、前立腺がん、結腸直腸がん、腎臓がん、腎細胞がん、子宮がん、膵臓がん、食道がん、脳腫瘍、肺がん、卵巣がん、子宮頸がん、精巣がん、胃がん、食道がん、多発性骨髄腫、肝臓がん、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、および慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、または他のがんが含まれるがこれらに限定されないがんを、治療有効量の、本明細書で開示されるＭＳＦＰをがん患者へと投与することにより処置するための方法を提供する。投与後に、がんの進行および／または転移を、統計学的に有意な様式で（すなわち、当業者に公知の適切な対照と比べて）阻害するか、防止するか、またはこれを遅延させる量を有効と考える。
【０２９５】
別の実施形態は、黒色腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、白血病、形質細胞腫、肉腫、神経膠芽腫、胸腺腫、乳がん、前立腺がん、結腸直腸がん、腎臓がん、腎細胞がん、子宮がん、膵臓がん、食道がん、脳腫瘍、肺がん、卵巣がん、子宮頸がん、精巣がん、胃がん、食道がん、多発性骨髄腫、肝臓がん、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、および慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、または他のがんが含まれるがこれらに限定されないがんの転移を、治療有効量（例えば、投与後に、がんの転移を、統計学的に有意な様式で、すなわち、当業者に公知の適切な対照と比べて、阻害するか、防止するか、またはこれを遅延させる量）の、本明細書で開示されるＭＳＦＰをがん患者へと投与することにより防止するための方法をもたらす。
【０２９６】
別の実施形態は、黒色腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、白血病、形質細胞腫、肉腫、神経膠芽腫、胸腺腫、乳がん、前立腺がん、結腸直腸がん、腎臓がん、腎細胞がん、子宮がん、膵臓がん、食道がん、脳腫瘍、肺がん、卵巣がん、子宮頸がん、精巣がん、胃がん、食道がん、多発性骨髄腫、肝臓がん、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、および慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、または他のがんが含まれるがこれらに限定されないがんを、治療有効量の、本明細書で開示されるＭＳＦＰをがん患者へと投与することにより防止するための方法をもたらす。
【０２９７】
別の実施形態は、黒色腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、白血病、形質細胞腫、肉腫、神経膠芽腫、胸腺腫、乳がん、前立腺がん、結腸直腸がん、腎臓がん、腎細胞がん、子宮がん、膵臓がん、食道がん、脳腫瘍、肺がん、卵巣がん、子宮頸がん、精巣がん、胃がん、食道がん、多発性骨髄腫、肝臓がん、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、および慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、または他のがんを、これらの疾患のうちの１または複数に罹患する患者に、治療有効量の、本明細書で開示されるＭＳＦＰを投与することにより、処置するか、その進行を阻害するか、またはこれを防止するための方法をもたらす。
【０２９８】
一態様では、本開示は、Ｔ細胞の活性化を方向付けるための方法であって、それを必要とする患者に、とりわけ、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３εまたはこれらの組合せに結合するＦａｂと、とりわけ、Ｔ細胞の活性化が所望される部位または細胞において、異なる標的、例えば、腫瘍特異的抗原または他の選り抜きの抗原に結合する結合ドメインとを含む融合部分を含む有効量のＭＳＦＰを投与するステップを含む方法を提供する。
【実施例】
【０２９９】
（実施例１）
ヒト化抗ＣＤ３抗体の生成
１）ハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを単離するステップ、２）ハイブリドーマの全ＲＮＡを逆転写（ＲＴ）させるステップ、および３）特異的抗体遺伝子プライマーを用いて、ＨＣおよびＬＣをＰＣＲ増幅するステップにより、確立された抗ＣＤ３ハイブリドーマから、重鎖および軽鎖の抗体遺伝子をクローニングした。ＲＴ  ＰＣＲは、３７℃で２時間にわたり、Ｍ−ｍｕＬＶ逆転写酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）をｏｌｉｇｏ−ｄＴ１６プライマーと共に用いて実施した。抗体の重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子を、ＨＣ５’：ＧＡＧ  ＡＣＡ  ＧＡＡＴＴＣ  ＧＣＣＡＣＣ  ＡＴＧ  ＧＴＧ  ＴＴＧ  ＧＧＧ  ＣＴＧ  ＡＡＧ  ＴＧ（配列番号１０３）、ＨＣ３’：ＧＡＧ  ＡＣＡ  ＧＣＧＧＣＣＧＣ  ＣＴＡ  ＴＴＴ  ＡＣＣ  ＡＧＧ  ＧＧＡ  ＧＣＧ  ＡＧＡ  Ｃ（配列番号１０４）、およびＬＣ５’：ＧＡＧ  ＡＣＡ  ＧＡＡＴＴＣ  ＧＣＣＡＣＣ  ＡＴＧ  ＧＣＣ  ＴＧＧ  ＡＴＴ  ＴＣＡ  ＣＴＴ  ＡＴＡ  Ｃ（配列番号１０５）、ＬＣ３’：ＧＡＧ  ＡＣＡ  ＧＣＧＧＣＣＧＣ  ＴＣＡ  ＧＧＡ  ＡＣＡ  ＧＴＣ  ＡＧＣ  ＡＣＧ  ＧＧＡ  Ｃ（配列番号１０６）のプライマー対を用いてｏｌｉｇｏ−ｄＴ１６でプライミングした最初のｃＤＮＡ鎖からＰＣＲ増幅した。５’プライマーは、抗体分泌シグナルへとアニールするようにデザインし、３’プライマーは、マウス抗体定常領域の３’末端へとアニールするようにデザインした。ＰＣＲ産物を洗浄し、ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで制限消化し、その後、２９３Ｆ一過性哺乳動物系においてＤＮＡ配列を決定し、組換えＩｇＧを発現させるためのｐｃＤＮＡ３．３ベクターへとクローニングした。クローニングされた抗ＣＤ３抗体を、１Ｆ３と称する。配列番号２３〜２５では、１Ｆ３  ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３のアミノ酸配列が提供される。配列番号２６〜２８では、１Ｆ３  ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３のアミノ酸配列が提供される。
【０３００】
１Ｆ３マウス抗体のヒト化には、従来のＣＤＲ移植法を用いた。特に、マウス１Ｆ３のアミノ酸配列を、ヒト生殖細胞系列配列（ＶＢＡＳＥ２；ｗｗｗ．ｖｂａｓｅ２．ｏｒｇ）に照らして整列させた。マウス１Ｆ３ＶＨは、ヒト生殖細胞系列セグメントのサブクラス３（ＶＨ３）と最も良好にマッチした。２つの代表的な生殖細胞系列セグメント、すなわち、ＶＨ３−２３およびＶＨ３−７３を、マウス１Ｆ３  ＣＤＲが移植されるアクセプターとして選択した。ＶＨ３−２３は、ヒト抗体において最も高頻度で見出されるＶドメインであることが公知であり、比較的高い安定性を有する。ＶＨ３−７３は、最も類似するＨＣＤＲ２配列を有することから、類似するＨＣＤＲ２構造およびＨＣＤＲ２立体配座が示唆される。ＶＬでは、最も良好にマッチしたヒト生殖細胞系列であるＶＬλ７ａを、マウス１Ｆ３の軽鎖ＣＤＲのためのアクセプターとして選択した。初期のヒト化構築物の遺伝子は、Ｇｂｌｏｃｋ法（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により合成した。初期のヒト化構築物におけるさらなるアミノ酸変異は、オリゴヌクレオチドベースの部位指向変異誘発（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）を用いて発生させた。
【０３０１】
以下の表１は、発生させた多様な重鎖可変領域および軽鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列についてまとめる。
【０３０２】
【表１】
2018139612.tif 000002
多様なヒト化抗体／Ｆａｂは、以下の表２にまとめられる異なるヒト化１Ｆ３のＶＬとＶＨとの対を用いて発生させた。
【０３０３】
【表２】
2018139612.tif 000003
（実施例２）
腫瘍抗原ＥｐＣＡＭタンパク質の生成
ヒトＥｐＣＡＭ（上皮細胞接着分子）およびカニクイザルＥｐＣＡＭの細胞外ドメインに対応する遺伝子を、ヒトおよびサルのｃＤＮＡライブラリーから、制限部位を伴うプライマー（配列番号１０７：Ｎ末端プライマー：ＧＣＧＴＡＴ  ＣＣＡＴＧＧ  ＡＴＧ  ＧＣＧ  ＣＣＣ  ＣＣＧ  ＣＡＧ  ＧＴＣ、配列番号１０８：Ｃ末端プライマー：ＧＣＧＴＡＴ  ＧＣＧＧＣＣＧＣ  ＴＴＴ  ＴＡＧ  ＡＣＣ  ＣＴＧ  ＣＡＴ  ＴＧＡ  Ｇ）をＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）と共に用いてＰＣＲ増幅した（９８℃、１分間；９８℃で１５秒間、５０℃で２０秒間、および７２℃で２０秒間を３０サイクル；７２℃で５分間）。洗浄されたＰＣＲ産物（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を制限消化（ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ）し、ｐｃＤＮＡ３．３ベクター内のヒトＦｃ遺伝子のＮ末端へとクローニングした。配列番号１および５では、ヒトＥｐＣＡＭの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）および全長ポリヌクレオチド配列が提示され、配列番号２および６では、コードされるアミノ酸配列が提示される。配列番号３および７では、カニクイザルＥｐＣＡＭ  ＥＣＤおよび全長ポリヌクレオチド配列が提示され、配列番号４および８では、コードされるアミノ酸配列が提示される。また、ヒトＣＤ３イプシロンＥＣＤ．ＦｃおよびカニクイザルＣＤ３イプシロンＥＣＤ．Ｆｃノブ変異体配列も生成させ、それぞれ、配列番号９および１１（ポリヌクレオチド）、ならびにそれぞれ、配列番号１０および１２（アミノ酸）に提示する。ヒトＣＤ３イプシロンＥＣＤ．ＦｃおよびカニクイザルＣＤ３イプシロンＥＣＤ．Ｆｃのホール変異体配列も生成させ、それぞれ、配列番号１３および１５（ポリヌクレオチド）、ならびにそれぞれ、配列番号１４および１６（アミノ酸）に提示する。当技術分野で公知の通り、ノブ変異体およびホール変異体は、ヘテロ二量体化を形成するのに用いられる（例えば、Ｒｉｄｇｅｗａｙら（１９９６年）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、９巻：６１７〜６２１頁を参照されたい）。
【０３０４】
（実施例３）
ヒトＳｃＦｖファージディスプレイを用いる抗ＥｐＣＡＭ抗体の生成
一般的なプロトコールは、「Ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ」（Ｃａｒｌｏｓ  Ｆ．  Ｂａｒｂａｓ  ＩＩＩ、Ｄｅｎｎｉｓ  Ｒ．  Ｂｕｒｔｏｎ、Ｊａｍｉｅ  Ｋ．  Ｓｃｏｔｔ、Ｇｒｅｇｇ  Ｊ．  Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ編、２００１年、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）において言及されている。ナイーブヒトｓｃＦｖファージディスプレイライブラリー（Ｖｉｖａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｓｈａｎｇｈａｉ、Ｃｈｉｎａ）を、ＥｐＣＡＭ特異的抗体を単離するために用いた。ラウンド１のファージ選択のために以下のステップを使用した：１）５０ｕｌのヒトナイーブｓｃＦｖライブラリーを、３％の脱脂粉乳／ＰＢＳ（ＭＰＢＳ）５００ｕｌでブロッキングした；２）ミルクでブロッキングしたファージを、５ｕｇ／ｍｌのＦｃであらかじめコーティングしたＩｍｍｕｎｏｔｕｂｅと共に、室温で３０分間を２回繰り返してインキュベートする；３）Ｆｃタンパク質を、上記の枯渇させたファージへと、５００ｕｇ／ｍｌの最終濃度で添加し、室温でインキュベートして、抗Ｆｃ  ｓｃＦｖを提示するファージをさらに捕捉する；４）上記のファージ溶液を、室温で１時間にわたり、ｈｕＥｐＣＡＭ．Ｆｃでコーティングした（５ｕｇ／ｍｌの濃度でコーティングし、ＭＰＢＳでブロッキングした）Ｉｍｍｕｎｏ−ｔｕｂｅと共にインキュベートする；５）このＩｍｍｕｎｏＴｕｂｅを、ＰＢＳＴで３回にわたり洗浄した（０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ）後、ＰＢＳで３回にわたり洗浄した；６）結合したファージを、調製されたばかりの１００ｍＭのトリエチルアミン溶液５００ｕｌにより、室温で１０分間にわたり溶出させた；７）溶出させたファージを用いて、３７℃で３０分間にわたり静置し、３０分間にわたり２００ｒｐｍで振とうしながら、対数中期のＴＧ１細胞５ｍｌに感染させた；８）溶出させたファージを再度感染させたＴＧ１細胞を、４％のブドウ糖および１００ｕｇ／ｍｌのアンピシリンを補充した２倍濃度のＹＴ寒天による大型のＮｕｎｃスクェアプレート上、３０℃で一晩にわたり成長させた；９）一晩にわたり成長させたＴＧ１細胞をプレートから削り落とし、２５ｍｌの２倍濃度のＹＴ培地（１００ｕｇ／ｍｌのアンピシリンおよび２％のブドウ糖を添加）へと接種し、３７℃でＯＤ６００まで成長させた；１０）ヘルパーファージＫＯ７をＴＧ１培養物へと添加して、ファージをレスキューした（３７℃で３０分間にわたり静置し、３０分間にわたり振とうした）；１１）重複感染ＴＧ１細胞を静かにペレット化させ、１００ｕｇ／ｍｌのアンピシリンおよび１００ｕｇ／ｍｌのカナマイシンを補充した２倍濃度のＹＴ培地へと再懸濁させて、３７℃で一晩にわたり振とうした；１２）一晩にわたる培養物を遠心分離し、２０％のＰＥＧ８０００  １／５容量を、ファージを含有する清明化させた上清へと添加し、室温で３０分間にわたりインキュベートした；１３）５０ｍｌの円錐管により３０００ｒｐｍで２０分間にわたり遠心分離することにより、沈殿したファージをペレット化させた；１４）ペレット化させたファージを、ＰＢＳ緩衝液中へと再懸濁させ、次の選択ラウンドにおいて用いる準備ができる。
【０３０５】
ラウンド２の選択は、上記と同じステップを用いて、カニクイザルＥｐＣＡＭ．Ｆｃについて行った。ラウンド２の選択から溶出させたファージを、ＴＧ１細胞へと再導入し、単一のコロニーごとに、２倍濃度のＹＴ（１００ｕｇ／ｍｌのアンピシリンおよび２％のブドウ糖）プレート上に播種した。単一のコロニーを９６ウェルプレートへと採取し、２連のプレートを試料用のマスタープレートとして作製した。９６ウェルプレート内の個別のクローンファージを、小容量用に調整した上記と類似するステップを用いて成長させた。清明化させたファージ上清（９６ウェルプレートの３０００ｒｐｍで５分間にわたる遠心分離により清明化させた）を、以下のステップを用いるヒトＥｐＣＡＭ．Ｆｃ抗原およびカニクイザルＥｐＣＡＭ．Ｆｃ抗原についてのＥＬＩＳＡ結合アッセイに用いた：１）ファージ溶液を５％のＭＰＢＳ中１：５に希釈し、室温で１時間にわたりインキュベートした；２）ファージＭＰＢＳ溶液を、ＭＰＢＳを用いてブロッキングしながらｈｕＥｐＣＡＭ．ＦｃまたはｃｙｎｏＥｐＣＡＭ．Ｆｃであらかじめコーティングした９６ウェルＭａｘｉＳｏｒｐプレートへと移した；３）プレートを室温で１時間にわたりインキュベートした後、ＰＢＳＴを用いて３回にわたり洗浄した；４）１／１０００に希釈した抗Ｍ１３／ＨＲＰコンジュゲート１００ｕｌを、プレートへと添加し、室温で１時間にわたりインキュベートした；５）ＰＢＳＴで３回にわたり洗浄した後、１００ｕｌのＴＭＢペルオキシダーゼ基質溶液をプレートへと添加し、暗所で２０分間にわたりインキュベートした；６）０．２５Ｍの硫酸５０ｕｌを、プレート上の各ウェルへと添加し、基質の発光を停止させた；７）吸光度をマイクロプレートリーダー上、４５０ｎｍで読取った。ＥｐＣＡＭ陽性結合剤を、マスタープレートに由来するＥ．ｃｏｌｉ原液を用いてＤＮＡ配列決定した。
【０３０６】
（実施例４）
完全ヒト抗ＥｐＣＡＭ抗体の最適化
抗ＥｐＣＡＭ抗体のＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子を、Ｇｂｌｏｃｋ法（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて合成した。ＧｂｌｏｃｋによるＶ遺伝子は、ファージディスプレイ法から単離されたＶ遺伝子、またはＶ遺伝子産物の発現および／もしくは安定性を改善するようにデザインされた変異を含有するＶ遺伝子と同一であった。変異のデザインは、主に最も良好にマッチした生殖細胞系列配列もしくは最も良好にマッチした生殖細胞系列のコンセンサス配列（ＶＢＡＳＥ２；ｗｗｗ．ｖｂａｓｅ２．ｏｒｇ）との配列比較に基づくか、または相同なＶドメイン構造を検証することを介する。ＧｂｌｏｃｋによるＶＨおよびＶＬを、ＰＣＲ法を用いてｓｃＦｖフォーマットへとアセンブルした。例えば、ＥｐＣＡＭ１．１は、ＶＬ残基１〜３（Ｋａｂａｔによる番号付け；Ｋａｂａｔら（１９９１年）、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、５版）の、ＥｐＣＡＭ１．０内の「ＨＶＩ」から「ＱＳＶ」へのアミノ酸変化を含有する。後者の配列は、ヒト生殖細胞系列配列に従い共通である（ＶＢＡＳＥ２；ｗｗｗ．ｖｂａｓｅ２．ｏｒｇ）。ＥｐＣＡＭ１．２は、ＥｐＣＡＭ１．１と比較して、ＶＨの１、５、６位、およびＶＬの３９位（Ｋａｂａｔによる番号付け）において変異を含有する。ＥｐＣＡＭ２．２は、親クローンと比較して、ＶＨの５、６、１３、４０、７６、７７、８１、８２位およびＶＬの２、８、３９、５８位（Ｋａｂａｔによる番号付け）において複数の変異を含有する。抗ＥｐＣＡＭ抗体のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を、以下の表３にまとめる。
【０３０７】
【表３】
2018139612.tif 000004
以下にまとめる通り、抗ＥｐＣＡＭ抗体およびｈｕ−１Ｆ３．１による構築物を用いて、多様なＭＳＦＰタンパク質を発生させた。以下の概要中のｓｃＦｖとは、抗ＥｐＣＡＭ  ｓｃＦｖを指す。Ｈｉｓタグは、各Ｆａｂ内のＦｄ鎖のＣ末端に接合するが、図解には示さない。
【０３０８】
【化１】
2018139612.tif 000005
（実施例５）
組換えＩｇＧ、Ｆｃ融合体タンパク質、Ｆａｂ、およびＦａｂ融合タンパク質の発現および精製
Ｆａｂ融合タンパク質を、ｐｃＤＮＡおよびＨＥＫ２９３Ｆ細胞懸濁液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用する一過性哺乳動物発現系において発現させた。発現構築物は、細胞培養物の１／１０の容量のＦ−１７合成培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中であらかじめ形成されたＤＮＡと２５ｋｄのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）との複合体（重量で１：３の比の、ＤＮＡの直鎖状の２５ｋｄ  ＰＥＩとの複合体）を添加しながら、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へとトランスフェクトした。振とうしながら５％の加湿したＣＯ２によるインキュベーター内で成長させたトランスフェクト細胞に、トランスフェクションの２４時間後、２０％のＴＮ１（Ｏｒｇａｎｏｔｅｃｈｎｉｅ  ＳＡ、Ｆｒａｎｃｅ）２５ｍｌを供給した。培養物上清を、通常トランスフェクションの５日後に採取し、タンパク質を、プロテインＡカラム（ヒトＩｇＧ用およびＦｃタンパク質用）、プロテインＧカラム（マウスＩｇＧ用）、またはＨｉｓＴｒａｐカラム（ｈｉｓタグづけしたＦａｂ用およびｈｉｓタグづけしたＦａｂ融合体用）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を介するアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。ＭＷカットオフ１０ｋＤのスピン管を用いて緩衝液を交換した後、タンパク質を、４℃のＰＢＳ緩衝液中で保管した。タンパク質は通常、非還元条件下および／または還元条件下（５％のメルカプトエタノール）において、４〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動；Ｎｏｖｅｘ  ｍｉｎｉ  ｇｅｌ）により解析した。
【０３０９】
（実施例６）
マウス１Ｆ３  ＩｇＧおよびヒト化１Ｆ３  ＩｇＧならびにＦａｂの、ＣＤ３イプシロン類縁タンパク質への結合
ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、およびフローサイトメトリー解析を用いて、マウスＩＦ３抗体およびヒトＩＦ３抗体ならびにＦａｂの結合について研究した。特に、以下の４つのタンパク質試料を、５％のメルカプトエタノールを伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液中で調製した（試料１）ヒトＣＤ３イプシロン／デルタ．Ｆｃ（Ｋ−Ｈ）；２）カニクイザルＣＤ３イプシロン／デルタ．Ｆｃ（Ｋ−Ｈ）；３）ヒトＣＤ３イプシロンアミノ酸１〜２７．Ｆｃ；および４）対照ペプチド．Ｆｃ融合体（ＣＤ３イプシロンアミノ酸１〜２７．Ｆｃにおける最初の１６残基の逆アミノ酸配列））。「Ｆｃ（Ｋ−Ｈ）」とは、「ＫＩＨ」法によるＦｃ変異体（Ｒｉｄｇｅｗａｙら（１９９６年）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、９巻：６１７〜６２１頁）を指し示す。各試料につき１００ｎｇずつのタンパク質を、４〜２０％のトリス−グリシンゲル（Ｎｏｖｅｘ）上の各レーンにロードし、１倍濃度のＳＤＳランニングバッファー（２５ｍＭのトリス、１９２ｍＭのグリシン、０．１％のＳＤＳ、ｐＨ８．３）中、１２５Ｖで１時間にわたり試料を泳動させた。タンパク質バンドを、Ｎｏｖｅｘ転写モジュールを用いて、２０％のメタノールを伴う１倍濃度のＳＤＳランニングバッファー中のニトロセルロース（ＮＣ）膜へと転写した。ＮＣ膜は、５％の粉乳ＴＢＳ−Ｔでブロッキングした後、室温で１時間にわたり、１ｕｇ／ｍｌのビオチニル化マウス１Ｆ３  ＩｇＧまたはビオチニル化ｈｕ−１Ｆ３  ＩｇＧとのインキュベーションを行った。５分間ずつ３回にわたる洗浄の後、膜を、１：３０００に希釈したストレプトアビジン−ＨＲＰコンジュゲートと共に、１時間にわたりインキュベートした。１０分間ずつ３回にわたる洗浄の後、膜をＥＣＬ試薬で現像し、シグナルをＫｏｄａｋ製フィルムへと曝露した。
【０３１０】
図９において示される通り、マウス１Ｆ３  ＩｇＧおよび１Ｆ３のヒト化形は、この抗原パネルを、極めて類似する様式で認識した。とりわけ、１）マウス１Ｆ３  ＩｇＧおよびｈｕ−１Ｆ３  ＩｇＧのいずれも、変性させたヒトＣＤ３イプシロン／デルタおよびカニクイザルＣＤ３イプシロン／デルタに結合することが可能であり；２）いずれの抗体も、ＣＤ３イプシロンのＮ末端のアミノ酸１〜２７（配列番号１８）に対応するペプチド配列を含有する変性Ｆｃ融合体タンパク質に結合することが可能であり；３）マウス１Ｆ３  ＩｇＧまたはｈｕ−１Ｆ３  ＩｇＧのいずれも、対照ペプチド（配列番号２０）とのＦｃ融合体タンパク質には結合しない。この実験からの結果は、１Ｆ３がＣＤ３イプシロンに対して特異的であり、エピトープが、イプシロンサブユニットのＮ末端部分内にあることを強く示唆する。また、フローサイトメトリー解析も、ヒト１Ｆ３抗体およびマウス１Ｆ３抗体について、ヒトＰＢＭＣに対する類似の結合パターンを示した（図１０を参照されたい）。低蛍光の細胞集団のＭＦＩにおいて小さなシフトが観察されたことは注目に値する。マウスＦｃのヒトＦｃガンマ受容体への結合が、ヒトＦｃの結合と比較してはるかに低減されることは周知である。したがって、図１０に示される結果は、ｈｕ−１Ｆ３  ＩｇＧ内のヒトＦｃが、ＰＢＭＣ調製物中のこの免疫細胞集団（Ｔ細胞以外の）上のＦｃガンマ受容体に結合し、小さなＭＦＩシフトを引き起こしたことを示唆する。
【０３１１】
ＥＬＩＳＡ結合アッセイには、ＭａｘｉＳｏｒｐプレートを用いた。５０ｍＭのＮａＨＣＯ３中に１ｕｇ／ｍｌの抗原５０ｕｌを用いて、プレートを４℃で一晩にわたりコーティングした後、ウェル１つ当たり２００ｕｌの５％の粉乳／ＴＢＳ−０．０５％のＴｗｅｅｎ２０（ＭＴＢＳ−Ｔ）とのインキュベーションを行った。抗体は通常５％のＭＴＢＳ−Ｔ中で希釈し、抗原でコーティングしたプレートへと移し、室温で静かに振とうしながら１時間にわたりインキュベートした。ストレプトアビジン−ＨＲＰ（ビオチニル化抗体検出用）または抗ｈｉｓタグ−ＨＲＰコンジュゲート（ｈｉｓタグづけした抗体用）により、結合した抗体を検出した。５０ｍＭクエン酸緩衝液中のＡＢＴＳ溶液を、マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ）を用いるＯＤ４０５の測定による検出に用いた。
【０３１２】
図１１は、ビオチニル化マウス抗ＣＤ３抗体である１Ｆ３およびビオチニル化ｈｕ−１Ｆ３  ＩｇＧの結合活性を示す。２つの抗体は、ヒトＣＤ３イプシロン／デルタ「ＫＩＨ」Ｆｃヘテロ二量体（Ｒｉｄｇｅｗａｙら（１９９６年）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、９巻：６１７〜６２１頁）、カニクイザルＣＤ３イプシロン／デルタ「ＫＩＨ」Ｆｃヘテロ二量体、およびヒトＣＤ３イプシロンＮ末端ペプチド（アミノ酸１〜２７）Ｆｃ融合体タンパク質への正の結合についての極めて類似するパターンを裏付けた。
【０３１３】
図１３は、図１１において記載した同じパネルの抗原への、抗ｈｉｓタグ／ＨＲＰコンジュゲートおよびＡＢＴＳ基質により検出される１０の代表的なヒト化Ｆａｂタンパク質による結合を示す。ｈｕ−１Ｆ３．１  Ｆａｂ、ｈｕ−１Ｆ３．２  Ｆａｂ、ｈｕ−１Ｆ３．３  Ｆａｂ、およびｈｕ−１Ｆ３．５  Ｆａｂからｈｕ−１Ｆ３．１０  Ｆａｂについて、用量依存的な結合が観察された。Ｈｕ−１Ｆ３．４  Ｆａｂの結合は、被験濃度範囲（５〜８，０００ｐＭ）においてもなお極めて低度である。Ｆａｂの、３つの抗原全てへの結合について、ＩｇＧと比較して僅かに低度なアフィニティーが判明した（図１１）。Ｆａｂの一価の結合は、ｈｕ−１Ｆ３完全ＩｇＧの結合アフィニティー（図１１における）と比較して低度な結合アフィニティーを説明しうる。
【０３１４】
１０の代表的なヒト化Ｆａｂタンパク質のうちの５つ（ｈｕ−ＩＦ３．１〜ｈｕＩＦ３．５）を、ＣＤ３を発現させるＪｕｒｋａｔヒトＴ細胞系への結合について調べた。図１２において示される通り、ヒト化１Ｆ３  Ｆａｂは、Ｊｕｒｋａｔ細胞に結合する。
【０３１５】
（実施例７）
ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３二重特異性Ｆａｂ融合タンパク質の特徴付け
フローサイトメトリー解析およびＥＬＩＳＡを用いて、ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３  Ｆａｂ融合タンパク質を特徴付けた。詳細な材料および方法は、この例の末尾に記載する。
【０３１６】
ＦＡＣＳを用いる図１４において示される通り、ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３  Ｆａｂ融合タンパク質（ＭＳＦＰ）は、ヒトＣＤ３を発現させるＪｕｒｋａｔ細胞に結合する。この実験では、Ｊｕｒｋａｔ細胞へと結合したビオチニル化ＦａｂおよびＦａｂ融合体は、ストレプトアビジン−ＰＥコンジュゲートにより検出した。ＯＫＴ３  Ｆａｂは、Ｊｕｒｋａｔ細胞上のＣＤ３への結合を示したが、抗ＥｐＣＡＭ  ｓｃＦｖの、ＬＣ単独またはＨＣおよびＬＣの両方への融合は、ＯＫＴ３  Ｆａｂ部分のＣＤ３への結合能力を完全に消失させた。ヒト化抗ＣＤ３抗体のＦａｂであるｈｕ−１Ｆ３は、Ｊｕｒｋａｔ細胞上のＣＤ３に結合することが可能であった。ＯＫＴ３  Ｆａｂ融合タンパク質とは異なり、抗ＥｐＣＡＭ  ｓｃＦｖをｈｕ−１Ｆ３  ＬＣのＮ末端へと融合させたところ、ｈｕ−１Ｆ３  Ｆａｂと同様のレベルの結合活性が保持されたのに対し、抗ＥｐＣＡＭ  ｓｃＦｖを、ｈｕ−１Ｆ３  ＦａｂのＬＣおよびＨＣへと同時的に融合させると、Ｊｕｒｋａｔ細胞上のＣＤ３への正の結合が示されたが、低レベルでの結合であった。
【０３１７】
図１５は、ＦＡＣＳにより示される、ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３  ＭＳＦＰのヒトＰＢＭＣへの結合を示す。Ｊｕｒｋａｔ細胞へと結合したビオチニル化ＦａｂおよびＦａｂ融合体は、ストレプトアビジン−ＰＥコンジュゲートにより検出した。パネルＡは、ＯＫＴ３  Ｆａｂの、ＣＤ３を発現させるＰＢＭＣ（Ｔ細胞）への結合を示す。抗ＥｐＣＡＭ  ｓｃＦｖをＨＣおよびＬＣの両方へと融合させたところ、ＯＫＴ３  Ｆａｂ部分の、ＣＤ３に対する結合能力は完全に消失した。パネルＢは、ヒト化抗ＣＤ３抗体のＦａｂであるｈｕ−１Ｆ３．１が、ＰＢＭＣ調製物中のＴ細胞上のＣＤ３に結合することが可能なことを示す。ＯＫＴ３  Ｆａｂ融合タンパク質とは異なり、抗ＥｐＣＡＭ×ｈｕ−１Ｆ３．１  Ｆａｂを、ＦａｂのＬＣおよびＨＣへと同時的に融合させたところ、Ｊｕｒｋａｔ細胞上のＣＤ３への正の結合が示されたが、結合レベルは、低レベルである。
【０３１８】
図１６において示される通り、ＥＬＩＳＡ結合アッセイは、ＯＫＴ３  ＦａｂおよびＥｐＣＡＭ１．１×ＯＫＴ３二重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、組換えカニクイザルＣＤ３イプシロン／デルタヘテロ二量体Ｆｃタンパク質に対する結合活性を有さず；ＯＫＴ３  Ｆａｂおよび二重特異性融合体は、組換えヒトＣＤ３イプシロンＮ末端のペプチド（アミノ酸１〜２７．Ｆｃ融合体）に対する結合活性を有さないことを示した。ＯＫＴ３は、サルＣＤ３またはヒトＣＤ３イプシロンのＮ末端に結合しないことが予測される。ＦａｂおよびＦａｂ融合タンパク質をビオチニル化し、９６ウェルプレート上に固定化した抗原へと結合したビオチン抗体は、ストレプトアビジン−ＨＲＰコンジュゲートの後、検出用のＡＢＴＳ基質を用いて検出した。
【０３１９】
図１７は、ｈｕ−１Ｆ３  ＦａｂおよびＥｐＣＡＭ１．１×ｈｕ−１Ｆ３．１二重特異性Ｆａｂ融合タンパク質（ＭＳＦＰ；Ｆａｂｅ）が、組換えカニクイザルＣＤ３イプシロン／デルタヘテロ二量体Ｆｃタンパク質（パネルＡ）；および組換えヒトＣＤ３イプシロンＮ末端のペプチド（アミノ酸１〜２７．Ｆｃ融合体）（パネルＢ）に結合することを裏付けるＥＬＩＳＡ結合の結果を示す。ＦａｂおよびＦａｂ融合タンパク質をビオチニル化し、９６ウェルプレート上に固定化した抗原へと結合したビオチン抗体は、ストレプトアビジン−ＨＲＰコンジュゲートの後、検出用のＡＢＴＳ基質を用いて検出した。
【０３２０】
図１８において示される通り、ＥＬＩＳＡ結合アッセイは、ｈｕ−１Ｆ３  ＦａｂおよびＥｐＣＡＭ１．２×ｈｕ−１Ｆ３．１  ＭＳＦＰが、組換えカニクイザルＣＤ３イプシロン／デルタヘテロ二量体Ｆｃタンパク質（パネルＡ）；および組換えヒトＣＤ３イプシロンＮ末端のペプチド（アミノ酸１〜２７．Ｆｃ融合体）（パネルＢ）に結合することを示した。ＦａｂおよびＦａｂ融合タンパク質をビオチニル化し、９６ウェルプレート上に固定化した抗原へと結合させた標識融合タンパク質は、ストレプトアビジン−ＨＲＰコンジュゲートの後、検出用のＡＢＴＳ基質を用いて検出した。
【０３２１】
図１９において示される通り、ＥＬＩＳＡ結合アッセイは、ｈｕ−１Ｆ３．１  ＦａｂおよびＥｐＣＡＭ２．２×ｈｕ−１Ｆ３  ＭＳＦＰが、組換えカニクイザルＣＤ３イプシロン／デルタヘテロ二量体Ｆｃタンパク質（パネルＡ）；および組換えヒトＣＤ３イプシロンＮ末端のペプチド（アミノ酸１〜２７．Ｆｃ融合体）（パネルＢ）に結合することを示した。ＦａｂおよびＦａｂ融合タンパク質をビオチニル化し、９６ウェルプレート上に固定化した抗原へと結合させたビオチン標識融合タンパク質は、ストレプトアビジン−ＨＲＰコンジュゲートの後、検出用のＡＢＴＳ基質を用いて検出した。
【０３２２】
図２０において示される通り、フローサイトメトリー解析は、ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３  ＭＳＦＰの、全長ヒトＥｐＣＡＭ標的を細胞表面上で安定的に発現させるＣＨＯ細胞への結合を示した。抗ＣＤ３  Ｆａｂは、同じＣＨＯ細胞への結合を示さなかった。
【０３２３】
材料および方法：フローサイトメトリー解析（蛍光活性化細胞分取；ＦＡＣＳ）を用いて、細胞へのＩＦ３ベースのＦａｂ融合タンパク質（本明細書ではまた、Ｆａｂｅとしても言及される；Ｆａｂ融合タンパク質はまた一般に、ＭＳＦＰとも称する）の結合を特徴付けた。一般に、細胞を、１％のＢＳＡ／ＰＢＳ中、４℃で１時間にわたりブロッキングし、対象の抗体を、１％のＢＳＡ／ＰＢＳへと希釈し、４℃で１時間にわたるインキュベーションのために、ブロッキングした細胞へと添加した。１％ＢＳＡ／ＰＢＳによる１回の洗浄の後、染色手順は、抗体または蛍光抗体コンジュゲートの利用可能性に応じて変化する。ある場合には、直接的な蛍光コンジュゲートを用いた。他の場合には、抗アフィニティータグ抗体（二次抗体）を用いて細胞と共にインキュベートした後、特定のフルオロフォアとコンジュゲートした抗種抗体を用いた。他の一部の実験では、蛍光コンジュゲートを伴う抗体（またはストレプトアビジンなど、他のアフィニティー試薬）を、二次抗体（第２の試薬）として直接的に用いた。図１０、１４、１６、１７、２０Ａ、および２０Ｂでは、ビオチニル化抗体を用いて、細胞と共にインキュベートし、図１２、１５、１８、１９、および２０Ｃ、および２０Ｄでは、ｈｉｓ６タグづけする抗体を細胞とのインキュベーションに用いた後で、抗ｈｉｓタグ抗体を用い、最終的な検出は、抗マウス−ＰＥコンジュゲートを介する。
【０３２４】
（実施例８）
ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３二重特異性Ｆａｂ融合タンパク質はＴ細胞を媒介する細胞殺滅活性の方向付けを変化させる
細胞殺滅アッセイを用いて、ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３二重特異性Ｆａｂ融合タンパク質が、Ｔ細胞を媒介する標的細胞の殺滅の方向付けを変化させる能力を調べた。
【０３２５】
図２１において示される通り、ＦＡＣＳベースのアッセイ（詳細はこの例の末尾に記載される）は、ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３二重特異性Ｆａｂ融合タンパク質が、Ｔ細胞を媒介する標的細胞殺滅活性の方向付けを腫瘍標的依存的な様式で変化させることを裏付けた。このアッセイでは、標的細胞（ヒトＥｐＣＡＭ−ＦＬを細胞表面上で安定的に発現させるＣＨＯ細胞（図２１、パネルＡ、Ｂ、Ｄ）および対照細胞（ＣＨＯだけ、図２１パネルＣ）を、アッセイの前にＰＫＨ−２６蛍光色素で標識した。ＴＰ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、アッセイの完了時に死滅細胞を同定した。このアッセイでは、標的死滅細胞を右上四分図中のカウントから同定し、標的生細胞を左上四分図から同定した。ＥｐＣＡＭを発現させるＣＨＯ細胞であって、ＰＢＭＣを伴わないが、二重特異性抗体を伴ってインキュベートされた（２０時間にわたり）ＣＨＯ細胞は、ＰＫＨ−２６標識集団（ＴＰ３陽性）中約１．４％の死滅細胞を示し（図２１；パネルＡ）；ＥｐＣＡＭを発現させるＣＨＯ細胞であって、ＰＢＭＣを伴うが、二重特異性抗体を伴わずにインキュベートされた（２０時間にわたり）ＣＨＯ細胞は、ＰＫＨ−２６標識集団中約１４％の死滅細胞を示し（図２１；パネルＢ）；ＥｐＣＡＭを発現させないＣＨＯ細胞であって、ＰＢＭＣおよび二重特異性抗体と共にインキュベートされた（２０時間にわたり）ＣＨＯ細胞の死滅細胞は、約１４％であり（図２１；パネルＣ）；ＥｐＣＡＭを発現させるＣＨＯ細胞であって、ＰＢＭＣおよび例示的な二重特異性Ｆａｂ融合体と共にインキュベートされた（２０時間にわたり）ＣＨＯ細胞の死滅細胞カウントは、約６４％であった（図２１；パネルＤ）。
【０３２６】
図２２は、上記の図２１のパネルＤにおいて多様な濃度のＥｐＣＡＭ×ＣＤ３二重特異性Ｆａｂ融合体について記載した殺滅データをプロットする。ＯＫＴ３  Ｆａｂおよび融合タンパク質は、方向付けを変化させた著明な細胞溶解活性を欠き（図２２；パネルＡ）；ｈｕ−１Ｆ３．１  Ｆａｂが、標的細胞に対する活性を示さなかったのに対し、ＥｐＣＡＭ１．１×ｈｕ−１Ｆ３．１  ＭＳＦＰは、高レベルの活性を示し、融合タンパク質濃度が６０ｐＭであっても高い活性レベルを維持し（図２２、パネルＢ）；ＥｐＣＡＭ１．２×ｈｕ−１Ｆ３．１  ＭＳＦＰによる用量依存的な活性が検出され（図２２、パネルＣ）；ＥｐＣＡＭ２．２  ｓｃＦｖのｈｕ−１Ｆ３．１  Ｆａｂとの単一融合体について、用量依存的な細胞溶解活性が検出され（図２２、パネルＤ）；ＥｐＣＡＭ２．２  ｓｃＦｖのｈｕ−１Ｆ３．１  ＦａｂのＨＣおよびＬＣの両方との二重融合体については、最大で５０％の細胞集団の殺滅が観察され、その濃度が６０ｐＭという低濃度のときも、高い活性レベル（約４０％）を維持した。殺滅活性百分率は、対照アッセイ（ＥｐＣＡＭ−ＣＨＯ＋ＰＢＭＣ）における死滅細胞の百分率を、試料アッセイにおける死滅細胞の百分率から減じることにより計算した。
【０３２７】
図２３は、ＥｐＣＡＭ２．２−（Ｈ＋Ｌ）−ｈｕ−１Ｆ３．１  ＭＳＦＰによるＴ細胞の活性化が、腫瘍標的依存的であることを示す。パネルＡ）ＥｐＣＡＭを発現させないＣＨＯの存在下において、ＥｐＣＡＭ２．２−（Ｈ＋Ｌ）−ｈｕ−１Ｆ３．１（３０ｎＭ）と共にインキュベートされたＰＢＭＣが、ＦＡＣＳアッセイにより検出される、ＣＤ６９の発現を介して測定される基底レベルのＴ細胞の活性化を結果としてもたらしたことを示す図であり；パネルＢ）ＥｐＣＡＭを発現させないＣＨＯの存在下において、ＥｐＣＡＭ２．２−（Ｈ＋Ｌ）−ｈｕ−１Ｆ３．１と共にインキュベートされた（３０ｎＭ、１６時間）ＰＢＭＣが、ＦＡＣＳアッセイにより検出される、ＣＤ６９の発現を介して測定されるＴ細胞の活性化の著明な増大を結果としてもたらしたことを示す図である。
【０３２８】
材料および方法：アッセイの前に、標的細胞をＰＫＨ−２６色素（Ｓｉｇｍａ）（ＦＬ２におけるシグナルの検出）で標識した。アッセイにおいて死滅させた標的細胞は、ＴＯ−ＰＲＯ−３（ＴＰ３）色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（ＦＬ４におけるシグナルの検出）を添加することにより同定した。ＰＫＨ−２６による標的細胞の標識化は、製造元の指示書に従い実施した。特に、２百万個の標的細胞を、無血清完全培地で洗浄し、０．５ｍｌの希釈剤Ｃ（製品キット中に提供されている）中で再懸濁させた。また、１ｍＭのＰＫＨ−２６色素２ｕｌも、０．５ｍｌの希釈液Ｃ中で希釈した。次いで、希釈した色素を標的細胞調製物へと添加し、室温で５分間にわたりインキュベートした。２ｍｌのウシ胎仔血清を混合物へと添加し、２分間にわたりインキュベートして、標識化反応を停止させた。標識した細胞を完全培地で３回にわたり洗浄し、使用のために完全培地中で再懸濁させた。標識した細胞をカウントし、生存率について点検した。細胞殺滅アッセイのために、完全培地中に１００ｕｌの標的細胞とＰＢＭＣとの混合物をＦＡＣＳチューブへと添加した後、完全細胞培養培地中に１００ｕｌの抗体溶液を添加し、ＣＯ２によるインキュベーター内で２０時間にわたりインキュベートした。アッセイの終了時、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター上でのＦＡＣＳアッセイの直前に、１０ｕＭのＴＯ−ＰＲＯ−３（ＴＰ３）５ｕｌを細胞へと添加した。ＰＫＨ−２６標識細胞は、２〜３ｌｏｇ領域（ＦＬ２）に配置された。ＦＬ２シグナルがｌｏｇ２０を超える細胞を、標的細胞と考えた。ＦＬ４シグナル（ＴＰ３）がｌｏｇ３０を超える細胞を、死滅細胞と考えた。標的死滅細胞は右上四分図からカウントし、標的生細胞は左上四分図からカウントした（図２１を参照されたい）。各試料につきのべ５，０００回ずつの標的細胞イベントを収集した。細胞溶解活性は、対照アッセイ（ＥｐＣＡＭを発現させる標的細胞にＰＢＭＣを加える）の死滅細胞カウントを、試料アッセイ（ＥｐＣＡＭを発現させる標的細胞にＰＢＭＣおよび抗体薬物を加える）の死滅細胞カウントから減じ、標的細胞の合計カウント５，０００で除することにより計算した。細胞溶解活性の百分率は、上記の活性に１００を乗じることにより計算した。
【０３２９】
まとめると、上記の例は、１Ｆ３抗ＣＤ３  Ｆａｂを含む本開示のＭＳＦＰが、適切な腫瘍標的細胞（例えば、ＥｐＣＡＭを発現させる細胞）の存在下に限りＴ細胞による殺滅の方向付けを変化させるように機能することを裏付ける。驚くべきことに、抗ＥｐＣＡＭ−ＯＫＴ３  Ｆａｂ融合タンパク質は、ＣＤ３を発現させるＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞に結合することが可能でなかった。これは、１Ｆ３  Ｆａｂにより認識されるＣＤ３イプシロンエピトープが、１Ｆ３  Ｆａｂ融合タンパク質の機能に重要であることを示唆する。上記の例において記載したデータは、本開示のＭＳＦＰの、Ｔ細胞の動員を介する多数のがんの処置を含めた多様な治療状況における使用を支持する。
【０３３０】
上記の多様な実施形態を組み合わせて、さらなる実施形態を提供することができる。本明細書で言及され、かつ／または出願データシートで列挙される米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、および非特許刊行物の全ては、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる。多様な特許、出願、および公開の概念を使用して、なおさらなる実施形態を提供することが必要な場合は、実施形態の態様を改変することができる。
【０３３１】
上記で詳述した説明に照らして、これらの変化および他の変化を実施形態へと施すことができる。一般に、以下の特許請求の範囲では、用いられる用語が、これらの特許請求の範囲を、本明細書および特許請求の範囲において開示された特定の実施形態へと限定するとみなすべきではなく、このような特許請求の範囲が権利を付与される同等物の完全な範囲と共に可能な全ての実施形態を包含するとみなすべきである。したがって、特許請求の範囲は、本開示により限定されるものではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２３】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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