(57)【要約】【課題】ポリ−ガンマ−グルタミン酸の生産プロセスに対する負荷を軽減し、且つ、高分子量のポリ−ガンマ−グルタミン酸の生産が可能な、ポリ−ガンマ−グルタミン酸の生産方法を提供する。【解決手段】受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２７６、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２７７、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２７８、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２７９、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２８０、又は受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２８１で特定される枯草菌（Bacillus subtilis）を培養してポリ−ガンマ−グルタミン酸を生産する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２７６、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２７７、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２７８、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２７９、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２８０、又は受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２８１で特定される枯草菌（Bacillus subtilis）を培養してポリ−ガンマ−グルタミン酸を生産する方法。
【請求項２】
前記枯草菌が、塩化ナトリウム濃度１２％（ｗ／ｖ）（２．０５Ｍ相当、室温）以上に調整したＬＢ培地において増殖可能な高塩濃度耐性を有し、塩化ナトリウム濃度１０％（ｗ／ｖ）（１．７１Ｍ、室温）の条件下で培養したとき、分子量が３００，０００以上のポリ−ガンマ−グルタミン酸生産能を有する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記枯草菌が、配列番号７若しくは８で示される塩基配列との同一性が９９．７５％以上の塩基配列、又は配列番号７若しくは８で示される塩基配列において１〜３個の塩基の欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列、からなる１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有する、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記枯草菌が、下記表１に記載の菌学的性質を示す、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
2018029546.tif 000023
【請求項５】
塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、及び塩化マグネシウムからなる群より選ばれる少なくとも１種の塩を含有する培地で前記枯草菌を培養する、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記培地における前記塩の濃度が、０．０１Ｍ以上２．５Ｍ以下である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記ポリ−ガンマ−グルタミン酸の分子量が３００，０００以上５０，０００，０００以下である、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２７６、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２７７、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２７８、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２７９、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２８０、又は受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２８１で特定される枯草菌（Bacillus subtilis）。
【請求項９】
塩化ナトリウム濃度１２％（ｗ／ｖ）以上に調整したＬＢ培地において増殖可能であり、塩化ナトリウム濃度１０％（ｗ／ｖ）の条件下で培養したとき、分子量が３００，０００以上のポリ−ガンマ−グルタミン酸生産能を有する、請求項８記載の枯草菌。
【請求項１０】
配列番号７若しくは８で示される塩基配列との同一性が９９．７５％以上の塩基配列、又は配列番号７若しくは８で示される塩基配列において１〜３個の塩基の欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列、からなる１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有する、請求項８又は９記載の枯草菌。
【請求項１１】
下記表１に記載の菌学的性質を示す、請求項８〜１０のいずれか１項記載の枯草菌。
2018029546.tif 000024
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリ−ガンマ−グルタミン酸の生産方法、及びこれに用いる枯草菌（Bacillus subtilis）に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリ−ガンマ−グルタミン酸（「γ−ポリグルタミン酸」とも呼称される。以下、本明細書において「ＰＧＡ」ともいう。）は、グルタミン酸のγ位のカルボキシル基とα位のアミノ基がペプチド結合によって結合した高分子化合物である。ＰＧＡは、納豆菌（Bacillus subtilis  var．natto）が産生する粘性物質として知られており、種々の性質から近年新たな高分子素材として注目されている。
高分子量のＰＧＡが示す性質に関して、例えば、非特許文献１には、分子量が１００，０００のＰＧＡと比較し、分子量が２，０００，０００を超えるような高分子量のＰＧＡは、抗腫瘍活性が高いことが記載されている。また、非特許文献２には、分子量が５００，０００及びより高分子量の２，０００，０００のＰＧＡが、高い脂質代謝制御活性を有することが記載されている。
【０００３】
ＰＧＡを産生する微生物としては、バチルス（Bacillus）属細菌である枯草菌、その近縁種である納豆菌、バチルス・サブティリス・チョングッチャン（Bacillus subtilis  var. chungkookjang）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バチルス・アンスラシス（Bacillus anthracis）、及びバチルス・ハロデュランス（Bacillus halodurans）、並びに好塩古細菌であるナトリアルバ・エジプチアキア（Natrialba aegyptiaca）が挙げられる。そして、これらの微生物が産生するＰＧＡの生産量や分子量は、菌株の種類や培養条件によって異なることが知られている。
例えば、特許文献１や非特許文献３には、耐塩性を有するバチルス・サブティリス・チョングッチャン株が、１，０００，０００程度のＰＧＡを生産することが記載されている。そして、このバチルス・サブティリス・チョングッチャン株は、塩化ナトリウム濃度が１０％（ｗ/ｖ）を超える条件下では、生産されるＰＧＡの分子量が１０，０００〜２００，０００程度まで低分子化することが記載されている。
また、特許文献２には、塩化ナトリウムが含まれる醤油麹、醤油醸造物などを含有する培地で、納豆菌株を培養し、ＰＧＡを生産することが記載されている。特許文献２に記載されたバチルス・サブティリス株は、培地に含まれる塩化ナトリウム濃度が上昇するとＰＧＡ生産能が低下すると非特許文献４に記載されている。
【０００４】
納豆菌は、グルタミン酸の光学異性体比（Ｄ／Ｌ比）が８０／２０〜５０／５０程度のＰＧＡを生産する。また納豆菌を含む食品は、日本国内では豊富に食され、その安全性が担保されている。よって、上記菌株のなかでも納豆菌が生産するＰＧＡは、食品、化粧品、あるいは医薬品用途に適している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００２−２３３３９１号公報
【特許文献２】特開平８−２４２８８０号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】M-H., Sung, et al., The Chemical Record, vol. 5, p. 352-366（2005）
【非特許文献２】Park，Ji HO，et al，J. Microbiol. Biotechnol., vol.21, p. 766-775（2011）
【非特許文献３】M., Ashiuchi, et al.，Appl. Microbiol. Biotechnol., vol. 57, p. 764-769（2001）
【非特許文献４】Yoshihiro Ogawa, et al.，Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, vol. 61(10), p. 1684-1687（1997）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
前述のように、特許文献１及び２、並びに非特許文献３及び４に記載の微生物は、ＰＧＡを生産することが可能である。しかし、抗腫瘍活性や脂質代謝制御活性を有する、分子量が２，０００，０００を超えるようなＰＧＡは高粘性であるため、バチルス属細菌やその近縁種において、高分子量のＰＧＡを効率良く生産することは困難である。
【０００８】
一方、ＰＧＡを効率よく生産するには、生産プロセスにおける負荷を軽減する必要がある。ここで、生産プロセスにおける負荷を軽減する手段の１つとして、培地の粘度を低減することが考えられる。粘度を低減すると、培養工程においては、酸素や基質の拡散効率が向上し、生産効率の向上が期待できる。さらに、分離回収工程においては、ろ過や遠心分離等の効率向上も期待される。
培地の粘度を低減する方法として、培地に含まれる塩化ナトリウムなどの塩を高濃度で含有させる方法が挙げられる。しかし、前述のように、バチルス属細菌やその近縁種において培地に含まれる塩化ナトリウムの濃度が上昇すると、生産されるＰＧＡは一般的に低分子量化、あるいは生産性が低下する。
よって、バチルス属細菌やその近縁種において、高塩濃度条件下で分子量が３００，０００を超えるようなＰＧＡの生産も、これまで困難であった。
【０００９】
そこで本発明は、ＰＧＡの生産プロセスに対する負荷を軽減し、且つ、高分子量のＰＧＡの生産が可能な、ＰＧＡの生産方法を提供することを課題とする。
また本発明は、高塩濃度耐性と、高塩濃度条件下での高分子量のＰＧＡ生産能を有する枯草菌を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討を行った。その結果、高塩濃度耐性と、高塩濃度条件下での高分子量のＰＧＡ生産能を有する枯草菌を見出した。そして、この枯草菌を高塩濃度条件下で培養したとき、高分子量のＰＧＡ生産が実現できるとともに、ＰＧＡの生産プロセスに対する負荷を軽減できることを見出した。
本発明はこれらの知見に基づき完成されるに至ったものである。
【００１１】
本発明は、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２７６、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２７７、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２７８、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２７９、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２８０、又は受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２８１で特定される枯草菌を培養してＰＧＡを生産する方法に関する。
さらに本発明は、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２７６、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２７７、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２７８、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２７９、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２８０、又は受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２８１で特定される枯草菌に関する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の枯草菌は、高塩濃度耐性と、高塩濃度条件下での高分子量のＰＧＡ生産能を有する。
よって、本発明の枯草菌を培養することで、高分子量のＰＧＡを生産することができる。さらに、本発明の枯草菌を高塩濃度条件下で培養することで、ＰＧＡの生産プロセスに対して負荷をかけることなく、ＰＧＡを効率よく生産することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書において「納豆菌」とは、菌学的性質、及び１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の解析結果から、枯草菌と分類でき、且つＰＧＡ生産能を有する微生物を意味する。
【００１４】
本発明の枯草菌は、高塩濃度耐性と、高塩濃度条件下での高分子量のＰＧＡ生産能を有する。よって、本発明の枯草菌は納豆菌に分類される。高塩濃度条件下では、本発明の枯草菌が生産するＰＧＡは、従来の納豆菌が生産するＰＧＡと比較して、分子量が大きい。さらに本発明の枯草菌は、ＰＧＡ生産能を有する従来の納豆菌と比較して、高濃度の塩に対する耐性に優れる。
本発明の枯草菌を適当な条件下で培養することで、高分子量のＰＧＡを生産することができる。特に、本発明の枯草菌を高塩濃度条件下で培養することで、ＰＧＡの生産プロセスに対して負荷をかけることなく、高分子量のＰＧＡを生産することができる。
また、得られたＰＧＡを低分子化することで所望の分子量に調整することもできる。例えば、本発明の枯草菌を適切な条件下で培養することで、高分子量のＰＧＡを生産させ、これを酸性条件下で加熱処理、あるいはＰＧＡ分解酵素を用いた処理などによって得られたＰＧＡを低分子量化し、ＰＧＡの分子量を所望の範囲に調整することができる。ここで、本明細書に記載する「分子量」は、「重量平均分子量」と同義である。また、塩濃度の表記「％（ｗ／ｖ）」又は「Ｍ」、培地成分濃度の表記「％（ｗ／ｖ）」又は「（ｇ／Ｌ）」、及びＰＧＡ濃度の表記「（ｇ／Ｌ）」はいずれも、室温における濃度である。
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１５】
本発明の枯草菌は、高塩濃度耐性を有する枯草菌であり、塩化ナトリウム濃度を１２％（ｗ／ｖ）（２．０５Ｍ相当）以上に調整したＬＢ培地において増殖可能な枯草菌である。
後述の実施例でも示すように、ＰＧＡ生産能を有する公知の納豆菌は、高塩濃度に対する耐性を有さず、塩化ナトリウム濃度１２％（ｗ／ｖ）以上のＬＢ培地では増殖することはできない。これに対して本発明の枯草菌は、高塩濃度耐性を有し、塩化ナトリウム濃度１２％（ｗ／ｖ）以上のＬＢ培地においても、増殖することができる。本発明の枯草菌が増殖できる塩化ナトリウム濃度の上限値は、ＴＳＢ培地を用いた条件において１６〜１７％（ｗ／ｖ）（２．７４〜２．９１Ｍ相当）、ＬＢ培地を用いた条件において１５％（ｗ／ｖ）（２．５７Ｍ相当）である。
ここで、「塩化ナトリウム濃度１２％（ｗ／ｖ）以上に調整したＬＢ培地において増殖可能」とは、接種した細胞数が、塩化ナトリウム濃度１２％（ｗ／ｖ）以上の条件において、培養により増加することを意味する。尚、本明細書において「増殖」は、培養前後の培養液の吸光度（ＯＤ600）を測定し、吸光度の増大により相対的に算出できる。
【００１６】
さらに、本発明の枯草菌は、高分子量のＰＧＡ生産能を有する。具体的には、塩化ナトリウム濃度１０％（ｗ／ｖ）（１．７１Ｍ相当、室温）の高塩濃度条件下で培養したとき、分子量が３００，０００以上のＰＧＡの生産能を有する。塩化ナトリウム濃度が１０％（ｗ／ｖ）の条件下で培養したとき、本発明の枯草菌が生産するＰＧＡの分子量は、５００，０００以上がより好ましく、１，０００，０００以上がより好ましく、２，０００，０００以上がより好ましく、５，０００，０００以上がより好ましく、１０，０００，０００以上がより好ましい。また、その上限値は、通常５０，０００，０００である。
尚、「高塩濃度条件下で分子量が３００，０００以上のＰＧＡの生産能を有する」とは、具体的には、塩化ナトリウムを１０％（ｗ／ｖ）含有し、増殖に必要な栄養源、ミネラルを含有する培地を用いて培養したとき、分子量が３００，０００以上のＰＧＡを少なくとも０．１ｇ／Ｌ／３日以上、好ましくは０．５ｇ／Ｌ／３日以上、より好ましくは１．０ｇ／Ｌ／３日以上、より好ましくは５．０ｇ／Ｌ／３日以上生産することを意味する。また、使用する培地には、ＰＧＡの基質となるグルタミン酸は含有しても、含有しなくともよい。さらに、グルタミン酸ナトリウム・１水和物を８％（ｗ／ｖ）（１．３７Ｍ相当）含有する培地で培養した場合では１０ｇ／Ｌ以上、グルタミン酸を含有しない場合では０．３ｇ／Ｌ以上、のＰＧＡが生産できることが好ましい。
【００１７】
本発明の枯草菌は、配列番号７又は８で示される塩基配列からなる１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有することが好ましい。あるいは、本発明の枯草菌は配列番号７又は８で示される塩基配列との同一性が好ましくは９９．７５％以上、より好ましくは９９．８５％以上、より好ましくは９９．９０％以上の塩基配列からなる１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有することが好ましい。あるいは、本発明の枯草菌は、配列番号７又は８で示される塩基配列において好ましくは１〜３個、より好ましくは１個の塩基の欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列からなる１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有することが好ましい。
ここで、配列番号７で示される塩基配列は、枯草菌ＫＳＭ−ＦＦＡ６１０株が有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列である。また、配列番号８で示される塩基配列は、枯草菌ＫＳＭ−ＦＦＢ５５３株が有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列である。
ここで本発明において、塩基配列の同一性は、公開されたデータベースNCBI（National  Center  for  Biotechnology  Information、http://www.ncbi.nlm.gov/）のメニュー”Nucleotide”内の”BLAST”のなかにある”Basic BLAST”を用い算出できる。あるいは、Genetyx-Win（遺伝子情報処理ソフトウェア、ゼネティックス製）のホモロジー解析プログラムを用いて、Unit size（k-tuple）を６として解析を行うことにより塩基配列の相同性を算出することもできる。
【００１８】
本発明の枯草菌は、下記表１に示す菌学的性質を有することが好ましい。
【００１９】
【表１】
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【００２０】
本発明の枯草菌は、下記に示す枯草菌（１）又は（２）が好ましい。
（１）表１に記載の菌学的性質を示し、且つ配列番号７で示される塩基配列、配列番号７で示される塩基配列との同一性が好ましくは９９．７５％以上、より好ましくは９９．８５％以上、より好ましくは９９．９０％以上の塩基配列、又は配列番号７で示される塩基配列において好ましくは１〜３個、より好ましくは１個の塩基の欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列、からなる１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有する枯草菌。
（２）表１に記載の菌学的性質を示し、且つ配列番号８で示される塩基配列、配列番号８で示される塩基配列との同一性が好ましくは９９．７５％以上、より好ましくは９９．８５％以上、より好ましくは９９．９０％以上の塩基配列、又は配列番号８で示される塩基配列において好ましくは１〜３個、より好ましくは１個の塩基の欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列、からなる１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有する枯草菌。
【００２１】
本発明の枯草菌のうち、枯草菌ＫＳＭ−ＦＦＡ６１０株は、２０１６年６月２日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２７６として寄託された。
また、枯草菌ＫＳＭ−ＦＦＡ６３１株は、２０１６年６月２日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２７７として寄託された。
また、枯草菌ＫＳＭ−ＦＦＢ４０６株は、２０１６年６月２日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２７８として寄託された。
また、枯草菌ＫＳＭ−ＦＦＢ４２５株は、２０１６年６月２日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２７９として寄託された。
また、枯草菌ＫＳＭ−ＦＦＢ５４０株は、２０１６年６月２日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２８０として寄託された。
さらに、枯草菌ＫＳＭ−ＦＦＢ５５３株は、２０１６年６月２日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２８１として寄託された。
尚、本発明の枯草菌はいずれも野生型の微生物であり、枯草菌に分類され、納豆菌の特徴であるＰＧＡ生産能を有する。
【００２２】
本発明の枯草菌は、以下の方法、及びそれらを組合せて行うことより、単離、取得することができる。
具体的には、市販の食品試料、あるいは土壌などの環境試料を生理食塩水に懸濁し、これを寒天培地に塗沫して静置培養に供することで、寒天培地上に出現する微生物を取得することができる。尚、医薬品又は食品用ＰＧＡにおいては、その分離源を食品試料とすることが好ましい。微生物の純化は、寒天培地上の微生物を新たな寒天培地に画線塗沫する、あるいは、生理食塩水などの適当な希釈液を用いて、上記の懸濁試料を希釈した後に、寒天培地上に塗沫することで、単一コロニーを出現させるといった方法が挙げられる。
枯草菌を効率よく取得する方法としては、枯草菌が芽胞菌であることから上記試料を予め熱処理する方法、糖など栄養源の資化性の差異を利用する方法、コロニー周囲の粘性物質の生産を確認する方法などが挙げられる。また、高塩濃度耐性を有する微生物の取得方法としては、予め高濃度の塩を含有する寒天培地にて微生物を単離する方法、高濃度の塩を含有する液体培地にて良好な生育を示す微生物を選抜する方法などが挙げられる。
またさらに、グルタミン酸をＰＧＡ生産に必要としない微生物を取得する方法としては、グルタミン酸非添加の寒天培地において、粘調なコロニーを形成する微生物を取得する方法、グルタミン酸非添加の液体培地を用いた培養において、培養液中に高分子量のＰＧＡを生産する微生物を取得する方法、などが挙げられる。
【００２３】
本発明のＰＧＡの生産方法は、前述した本発明の枯草菌を用いてＰＧＡの生産を行う。
前述したように、本発明の枯草菌は、従来の納豆菌と比較して、高濃度塩に対する耐性を有する。そのため、本発明の枯草菌を用いてＰＧＡを生産するために、通常よりも塩濃度の高い培地を使用することができる。
一般に、高分子の電解質は水溶液中では高分子のイオンとなり対イオンとの解離が起こる。この解離により強い静電場が生じるため、この静電気力により周辺に対イオンが凝集する。その結果、対イオン活量の顕著な低下が生じるとされる。また、高分子イオン一本鎖の形態はおもに静電的な相互作用によって支配され、塩濃度の増加により顕著な収縮が生じることが想定される（川口正剛，高分子，５３巻，ｐ．７１６−７１８，２００４年）。これ故に、高分子電解質であるＰＧＡの水溶液中の挙動においても、培地中の塩濃度を上昇させることにより水溶液の粘度を低減することができる。また、粘性が高く、流動性が低い液体では、溶存する酸素分子の移動効率が低下するため、好気性微生物の生育に必要な酸素供給能を確保するには、より多くの通気撹拌を行なう必要が生じる。また、このような多くの通気撹拌を伴う発酵槽を用いた培養系においては、培養液の粘度が高い場合には発泡が生じ、培養が困難になることが想定される。またさらに、流動性が低い液体試料は、製造工程における移送効率が悪く、なかでも、遠心分離による菌体除去、精密ろ過、あるいは限外ろ過といった膜処理における透過性が著しく低下すると想定される。よって、本発明のＰＧＡの生産方法によれば、水溶液中で高粘性を発現する高分子電解質であるＰＧＡの製造プロセスにおける負荷を低減できる。
【００２４】
本発明の枯草菌を用いてＰＧＡを生産する際には、適切な培地において本発明の枯草菌を培養し、菌体外に生産されたＰＧＡを培地から回収する。
培地としては、グリセリン、グルコース、フルクトース、マルトース、シュークロース、キシロース、マンノース、ガラクトース、デンプンなどの糖類を、ＰＧＡを生産するための炭素源として含む培地を使用することができる。また、クエン酸、酢酸などの各種有機酸又はその塩、並びにグルタミン酸又はその塩などを、ＰＧＡを生産するための炭素源として含む培地を使用することができる。
本発明のＰＧＡの生産方法において、ＰＧＡを生産するための炭素源としては、前記炭素源のうち１種を用いてもよいし、２種以上を組合せて用いてもよい。
【００２５】
本発明のＰＧＡの生産方法で用いる培地には、必要により、各種大豆タンパクなどの天然物、アミノ酸、ポリペプトン、トリプトン、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウムや尿素などの窒素源などを含有させてもよい。本発明で用いる培地は、合成培地でもよいし天然培地でもよい。
【００２６】
ＰＧＡの生産性をより向上させる点から、前記培地にグルタミン酸又はその塩を添加することができる。
培地中のグルタミン酸又はその塩の濃度は適宜設定することができる。例えば、培地中のグルタミン酸又はその塩の濃度（グルタミン酸換算）は、好ましくは０．００５ｇ／Ｌ以上が好ましく、０．０５ｇ／Ｌ以上がより好ましく、０．１ｇ／Ｌ以上がより好ましく、０．５ｇ／Ｌ以上がより好ましい。またその上限値は、培地中でのグルタミン酸やその他の培地成分の析出を回避する観点から、６００ｇ／Ｌ以下が好ましく、５００ｇ／Ｌ以下がより好ましく、４００ｇ／Ｌ以下がより好ましく、３００ｇ／Ｌ以下がより好ましい。
【００２７】
本発明の枯草菌は、グルタミン酸の非存在下であっても、無機の窒素源と、グルコース、グリセリン等のグルタミン酸以外の物質を炭素源としてＰＧＡの生産が可能である。
グルタミン酸は、バイオマスを原料とする発酵法により生産することができ、食品素材、又は飼料として利用されている。このようなグルタミン酸を原料に使用せず、有用な高分子素材であるＰＧＡを効率良く生産できる微生物は、食糧との競合を避けるといった視点、あるいは工業的な生産コストの視点からも有益であると考えられる。
従って、グルタミン酸を含まず、グルタミン酸以外の安価な窒素源、及び炭素源を含む培地で本発明の枯草菌を培養し、ＰＧＡを生産することは、食糧生産と競合せず、生産コストの観点から好ましい。
【００２８】
培地に含まれる塩の種類は、適宜設定することができる。例えば、１価の金属塩である塩化ナトリウム、塩化カリウム、または、２価の金属塩である塩化カルシウム、塩化マグネシウム、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウムなどが挙げられる。このうち、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、及び塩化マグネシウムからなる群より選ばれる少なくとも１種を使用することが好ましい。
【００２９】
また、培地中の塩濃度は適宜設定することができる。
例えば、１価の金属塩の場合は、０．０１Ｍ以上が好ましく、０．１Ｍ以上がより好ましく、０．５Ｍ以上がより好ましく、１．０Ｍ以上がより好ましい。また、その上限値は、細胞増殖、あるいはＰＧＡ生産を阻害しない濃度が好ましく、具体的には２．５Ｍ以下がより好ましく、２．０Ｍ以下がより好ましく、１．７５Ｍ以下がより好ましい。
また例えば、２価の金属塩の場合は、０．０１Ｍ以上が好ましく、０．１Ｍ以上がより好ましく、０．５Ｍ以上がより好ましく、１．０Ｍ以上がより好ましい。また、その上限値は、細胞増殖、あるいはＰＧＡ生産を阻害しない濃度が好ましく、具体的には２．０Ｍ以下が好ましく、１．７５Ｍ以下がより好ましく、１．５Ｍ以下がより好ましい。
尚、使用する培地、及び培養後の培養液の粘度は、培地中の塩濃度を調整することで、所望の範囲にすることができる。尚、本発明において培地の粘度の測定方法は、非ニュートン性液体の粘性測定に適したＢ型粘度計により行なうことができる。
【００３０】
前記枯草菌の培養条件は、使用する枯草菌等に応じて適宜選択することができる。具体的には、至適温度は、好ましくは２０℃以上、好ましくは２５℃以上、より好ましくは３０℃以上、である。その上限値は、好ましくは５０℃、より好ましくは４５℃、より好ましくは４０℃である。至適ｐＨは、好ましくは５以上、好ましくは５．５以上、より好ましくは６．５以上、である。その上限値は、好ましくは８、より好ましくは７．５、より好ましくは７である。
また、培養時間は、種菌接種後、０．５日以上、好ましくは１日以上、より好ましくは３日以上である。培養方法に特に制限はないが、振とう培養、攪拌培養、通気培養、静置培養などが挙げられる。
【００３１】
培地中に蓄積されたＰＧＡを回収する際は、ＰＧＡを生産させた枯草菌の菌体を除去する必要がある。菌体を除去する方法としては特に制限はなく、遠心分離法、精密ろ過や限外ろ過膜を用いた除去法、凝集剤を用いた沈降除去、透析法などが挙げられる。また、これら方法を適宜組み合わせて用いても良い。
また、培養液からＰＧＡを分離する方法についても特に制限はなく、生産された物質を単離、回収する際に用いられる通常の方法で行うことができる。例えば、アセトン、メタール、あるいはエタノールなどの有機溶媒沈殿、ゲルろ過カラム、あるいはイオン交換カラムによるクロマト分画、さらに、ＰＧＡの等電点付近にｐＨを調整する酸沈殿による分離、電気透析法などにより、目的のＰＧＡを単離、回収することができる。
【００３２】
本発明の枯草菌は高塩濃度の条件においても優れたＰＧＡ生産性を有しており、且つ高分子量のＰＧＡが生産できる。本発明によるＰＧＡの生産量は、培地１Ｌ当たり、０．１ｇ／３日以上が好ましく、０．５ｇ／３日以上がより好ましく、１．０ｇ／３日以上がより好ましく、５．０ｇ／３日以上がより好ましい。
本発明の枯草菌を、納豆菌標準株ではＰＧＡの生産性が低下するような塩化ナトリウム濃度７．３％（ｗ／ｖ）（１．２５Ｍ相当）の条件で培養した場合、ＰＧＡの基質となるグルタミン酸ナトリウム・１水和物を８％（ｗ／ｖ）含有する条件においては、培地１Ｌ当たり１０ｇ／３日以上の生産量が望ましい。
また、納豆菌標準株では生育が困難となるような塩化ナトリウム濃度１０．２％（ｗ／ｖ）（１．７５Ｍ相当）にて培養した場合、ＰＧＡの基質となるグルタミン酸ナトリウム・１水和物を８％（ｗ／ｖ）含有する条件では、培地１Ｌ当たり０．５ｇ／３日以上の生産量が望ましい。またさらに、納豆菌標準株ではＰＧＡの生産が望めないような塩化ナトリウム濃度７．３％（ｗ／ｖ）の条件で、且つＰＧＡの基質となるグルタミン酸が存在しない条件にて本発明の枯草菌を培養した場合、培地１Ｌ当たり０．１ｇ／３日間以上の生産量が望ましい。
【００３３】
本発明の枯草菌は、塩濃度が０〜１０％未満（ｗ／ｖ）の条件において高分子量のＰＧＡを生産する。また本発明の枯草菌は、塩濃度が１０％以上（ｗ／ｖ）の条件においても同等の高分子量のＰＧＡを生産することができる。
本発明の枯草菌を、塩化ナトリウム濃度が１０％（ｗ／ｖ）以上の条件にて培養した場合に生産されるＰＧＡの分子量は、３００，０００以上、好ましくは５００，０００以上、より好ましくは１，０００，０００以上、より好ましくは２，０００，０００以上、より好ましくは５，０００，０００以上、より好ましくは１０，０００，０００以上である。またその上限値は、５０，０００，０００、好ましくは４０，０００，０００、より好ましくは３５，０００，０００である。
【００３４】
本発明により生産されたＰＧＡは、化粧品、医薬品、食品、水質浄化剤、保水材料、増粘剤などの様々な用途に使用することができる。
特に、本発明の枯草菌は納豆菌に分類される。そして、本発明の枯草菌が生産するＰＧＡは、他の微生物が生産するＰＧＡと比較して高分子量である。よって、本発明の枯草菌が生産するＰＧＡは、抗腫瘍活性や脂質代謝制御活性を有する化粧品、医薬品、食品などの用途に、好適に使用することができる。
【００３５】
上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下の方法及び枯草菌を開示する。
【００３６】
＜１＞受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２７６、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２７７、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２７８、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２７９、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２８０、又は受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２８１で特定される枯草菌を培養してＰＧＡを生産する方法。
【００３７】
＜２＞前記枯草菌が、塩化ナトリウム濃度１２％（ｗ／ｖ）以上、好ましくは１２％（ｗ／ｖ）以上１６〜１７％（ｗ／ｖ）以下、より好ましくは１２％（ｗ／ｖ）以上１５％（ｗ／ｖ）以下、に調整したＬＢ培地において増殖可能な高塩濃度耐性を有し、塩化ナトリウム濃度１０％（ｗ／ｖ）（１．７１Ｍ相当、室温）の条件下で培養したとき、分子量が３００，０００以上のＰＧＡ生産能を有する、前記＜１＞記載の方法。
＜３＞塩化ナトリウム濃度が１０％（ｗ/ｖ）の条件下で培養したとき、前記枯草菌が生産するＰＧＡの分子量が３００，０００以上、好ましくは５００，０００以上、より好ましくは１，０００，０００以上、より好ましくは２，０００，０００以上、より好ましくは５，０００，０００以上、より好ましくは１０，０００，０００以上、であり、好ましくは５０，０００，０００以下、である、前記＜１＞又は＜２＞項記載の方法。
＜４＞塩化ナトリウム濃度１０％（ｗ／ｖ）以上の条件下で培養したとき、前記枯草菌はＰＧＡを少なくとも０．１ｇ／Ｌ／３日以上、好ましくは０．５ｇ／Ｌ／３日以上、より好ましくは１．０ｇ／Ｌ／３日以上、より好ましくは５．０ｇ／Ｌ／３日以上、生産する、前記＜１＞〜＜３＞のいずれか１記載の方法。
＜５＞前記枯草菌が、配列番号７若しくは８で示される塩基配列、配列番号７若しくは８で示される塩基配列との同一性が好ましくは９９．７５％以上、より好ましくは９９．８５％以上、より好ましくは９９．９０％以上の塩基配列、又は配列番号７若しくは８で示される塩基配列において好ましくは１〜３個、より好ましくは１個の塩基の欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列、からなる１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有する、前記＜１＞〜＜４＞のいずれか１記載の方法。
＜６＞前記枯草菌が、前記表１に記載の菌学的性質を示す、前記＜１＞〜＜５＞のいずれか１記載の方法。
【００３８】
＜７＞グリセリン、グルコース、フルクトース、マルトース、シュークロース、キシロース、マンノース、ガラクトース、デンプン、クエン酸若しくはその塩、酢酸若しくはその塩、並びにグルタミン酸若しくはその塩からなる群より選ばれる少なくとも１種、好ましくはグリセリン、グルコース、マルトース、並びにグルタミン酸若しくはその塩からなる群より選ばれる少なくとも１種、を炭素源として含有する培地で前記枯草菌を培養する、前記＜１＞〜＜６＞のいずれか１記載の方法。
＜８＞グルタミン酸又はその塩を含有する培地で前記枯草菌を培養する、前記＜１＞〜＜７＞のいずれか１記載の方法。
＜９＞前記培地におけるグルタミン酸又はその塩の濃度が、０．００５ｇ／Ｌ以上、好ましくは０．０５ｇ／Ｌ以上、より好ましくは０．１ｇ／Ｌ以上、より好ましくは０．５ｇ／Ｌ以上であり、６００ｇ／Ｌ以下、好ましくは５００ｇ／Ｌ以下、より好ましくは４００ｇ／Ｌ以下、より好ましくは３００ｇ／Ｌ以下、である、前記＜８＞記載の方法。
＜１０＞グルタミン酸の非存在下で前記枯草菌を培養する、前記＜１＞〜＜７＞のいずれか１記載の方法。
＜１１＞塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、硫酸カルシウム、及び硫酸マグネシウムからなる群より選ばれる少なくとも１種の塩、好ましくは、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、及び塩化マグネシウムからなる群より選ばれる少なくとも１種の塩、を含有する培地で前記枯草菌を培養する、前記＜１＞〜＜１０＞のいずれか１記載の方法。
＜１２＞前記培地における前記塩の濃度が０．０１Ｍ以上２．５Ｍ以下であり、好ましくは、１価の金属塩の場合は、０．１Ｍ以上、より好ましくは０．５Ｍ以上、より好ましくは１．０Ｍ以上、また、好ましくは２．０Ｍ以下、より好ましくは１．７５Ｍ以下であり、２価の金属塩の場合は、０．１Ｍ以上、より好ましくは０．５Ｍ以上、より好ましくは１．０Ｍ以上、また、好ましくは２．０Ｍ以下、より好ましくは１．７５Ｍ以下、より好ましくは１．５Ｍ以下である、前記＜１１＞記載の方法。
＜１３＞前記枯草菌の培養期間が、０．５日以上、好ましくは１日以上、より好ましくは３日以上である、前記＜１＞〜＜１２＞のいずれか１記載の方法。
【００３９】
＜１４＞培地１Ｌ当たり、ＰＧＡを０．１ｇ／３日以上、好ましくは０．５ｇ／３日以上、より好ましくは１．０ｇ／３日以上、より好ましくは５．０ｇ／３日以上生産する、前記＜１＞〜＜１３＞のいずれか１記載の方法。
＜１５＞前記ＰＧＡの分子量が３００，０００以上、好ましくは５００，０００以上、より好ましくは１，０００，０００以上、より好ましくは２，０００，０００以上、より好ましくは５，０００，０００以上、より好ましくは１０，０００，０００以上、また、５０，０００，０００以下、好ましくは４０，０００，０００以下、より好ましくは３５，０００，０００以下である、前記＜１４＞記載の方法。
【００４０】
＜１６＞受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２７６、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２７７、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２７８、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２７９、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２８０、又は受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２８１で特定される枯草菌。
【００４１】
＜１７＞塩化ナトリウム濃度１２％（ｗ／ｖ）以上、好ましくは１２％（ｗ／ｖ）以上１７％（ｗ／ｖ）以下、より好ましくは１２％（ｗ／ｖ）以上１５％（ｗ／ｖ）以下に調整したＬＢ培地において増殖可能であり、塩化ナトリウム濃度１０％（ｗ／ｖ）の条件下で培養したとき、分子量が３００，０００以上のＰＧＡ生産能を有する、前記＜１６＞項記載の枯草菌。
＜１８＞塩化ナトリウム濃度が１０％（ｗ/ｖ）の条件下で培養したとき、３００，０００以上、好ましくは５００，０００以上、より好ましくは１，０００，０００以上、より好ましくは２，０００，０００以上、より好ましくは５，０００，０００以上、より好ましくは１０，０００，０００以上、また、好ましくは５０，０００，０００以下のＰＧＡを生産する、前記＜１６＞又は＜１７＞記載の枯草菌。
＜１９＞塩化ナトリウム濃度１０％（ｗ／ｖ）以上の条件下で培養したとき、ＰＧＡを少なくとも０．１ｇ／Ｌ／３日以上、好ましくは０．５ｇ／Ｌ／３日以上、より好ましくは１．０ｇ／Ｌ／３日以上、より好ましくは５．０ｇ／Ｌ／３日以上生産する、前記＜１６＞〜＜１８＞のいずれか１記載の枯草菌。
＜２０＞配列番号７若しくは８で示される塩基配列、配列番号７若しくは８で示される塩基配列との同一性が好ましくは９９．７５％以上、より好ましくは９９．８５％以上、最も好ましくは９９．９０％以上の塩基配列、又は配列番号７若しくは８で示される塩基配列において好ましくは１〜３個、より好ましくは１個の塩基の欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列、からなる１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有する、前記＜１６＞〜＜１９＞のいずれか１記載の枯草菌。
＜２１＞前記表１に記載の菌学的性質を示す、前記＜１６＞〜＜２０＞のいずれか１記載の枯草菌。
【００４２】
＜２２＞前記＜１＞〜＜１５＞のいずれか１記載の方法により生産したＰＧＡを低分子化し、所望の分子量に調整する、ＰＧＡの分子量調整方法。
【実施例】
【００４３】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。また、製造元を記載しない試薬には、一般に入手可能な試薬を使用することができる。
ここで、本実施例で用いるプライマーの塩基配列を表２に示す。
【００４４】
【表２】
2018029546.tif 000003
【００４５】
試験例１  芽胞形成微生物の取得法
市販の漬物、味噌、発酵調味料、あるいは納豆などの食品試料約５ｇを１５ｍＬ容コニカルチューブ（製品コード352096、BD（ベクトンディッキンソン）  Falcon製）に無菌的に採取し、この試料に対して２倍重量の１％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム水溶液（滅菌処理済）を加えた。これらをタッチミキサー（MT-31型、ヤマト科学製）の振動面に押し当て、均一に混ざるよう懸濁し、試料を８０℃にて１０分間の加熱処理に供した。続いて、これら試料を１％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム水溶液（滅菌処理済）にて適宜段階的に希釈し、それぞれを表３〜６に示す微生物検出用培地（ＬＢ寒天培地、塩化ナトリウムを終濃度１０％に調整したＬＢ寒天培地（ＬＢ＋１０％ＮａＣｌ培地）、変法ＧＡＭ寒天培地（商品名：「ニッスイ」、日水製薬製）、及びＭ＋Ｙｅｘ寒天培地）へ塗沫した。
これら寒天培地を３０℃にて２〜５日間の静置培養に供し、寒天培地上での微生物の増殖及び形態を観察した。続いて、これら各寒天培地に出現した単一コロニーを複数選抜し、増殖が確認できたものと同種の寒天培地にて画線塗沫を行ない、出現させた単一コロニーを純化株とした。さらに、この純化株を同種の寒天培地にて増殖させ、得られた菌体を２０％（ｗ／ｖ）グリセロールを含有するＬＢ液体培地へ懸濁し、−８０℃にて凍結保存した。
【００４６】
【表３】
2018029546.tif 000004
【００４７】
【表４】
2018029546.tif 000005
【００４８】
【表５】
2018029546.tif 000006
【００４９】
【表６】
2018029546.tif 000007
【００５０】
試験例２  枯草菌の選抜法（１）
試験例１で取得した菌株（−８０℃凍結保存試料）を滅菌済み白金耳（製品コード254410、Nunc製）にてＬＢ寒天培地に画線塗沫した。これらを３０℃にて１日間の静置培養に供し、各菌株の生育を目視にて確認した。
次に、ＬＢ寒天培地上に生育した各菌株を予め滅菌した爪楊枝を用いてＭ＋Ｙｅｘ寒天培地に接種し、これを３０℃にて１日間の静置培養に供し、目視にて各菌株の生育確認を行なった。
【００５１】
続いて、Ｍ＋Ｙｅｘ寒天培地上に生育した菌株を、表７に示すＭ／グルコース資化判定プレート、及び表８に示すＭ／タガトース資化判定プレートへそれぞれ接種し、３７℃にて１〜３日間の静置培養に供した。
本試験例では、資化判定プレート上での生育を目視にて観察し、生育の指標であるコロニー形成がＭ／グルコース資化判定プレートでは有り、且つＭ／タガトース資化判定プレートにおいてはコロニー形成がない菌株を枯草菌候補株として選抜した。
【００５２】
【表７】
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【００５３】
【表８】
2018029546.tif 000009
【００５４】
試験例３  枯草菌の選抜法（２）
試験例１で調製したグリセロール保存試料を、１ｍＭ ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）にて３０倍に希釈したものを鋳型とし、表２に示すプライマー２７ｆ及びプライマー１５２５ｒを使用してＰＣＲを行い、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子領域約１．５ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した。ＤＮＡポリメラーゼは、ＴａＫａＲａ ＬＡ  Ｔａｑ（タカラバイオ製）を用いた。９５℃で５分間、鋳型ＤＮＡを変性させた後、９５℃で１分間、５５℃で３０秒間、７２℃で２分間を１サイクルとして３０サイクル行い、さらに７２℃で２分間恒温した。
【００５５】
得られた１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子領域約１．５ｋｂのＤＮＡ断片について、表２に示すプライマー２７ｆを用い、５５０ｂｐのＤＮＡ塩基配列の決定を行った。
尚、シークエンス解析試料の調製には、Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（アプライド  バイオシステムズ製）を用い、添付プロトコールに従い試料調製を行った。解析前の試料精製には、Montage SEQ kit（MILLIPORE製）を使用した。続いて、調製したシークエンス試料はＤＮＡシークエンサー（商品名：ABI 3100 Genetic Analyzer、アプライドバイオシステムズ製）を用いて配列解析を行い、塩基配列を決定した。
配列の相同性検索は、公開データベースNCBI（National  Center  for  Biotechnology  Information、http://www.ncbi.nlm.gov/）のメニュー”Nucleotide”内の”BLAST”のなかにある”Basic  BLAST”を用い、BLASTプログラムから”nucleotide  blast”を選択した。検索対象のデータベースに”Reference  genomic  sequences（refseq_genomics）、選択プログラムに”Highly  similar  sequences（megablast）”を指定し相同性検索を行った。
【００５６】
得られた結果から、本試験例において最も相同性が高い菌株として枯草菌と判定され、且つ上記配列を決定した５５０ｂｐとこれに相当する枯草菌標準株（Bacillus subtilis DSM 10株）の配列との相同性が９８．９％以上である菌株を枯草菌候補株として選抜した。
【００５７】
試験例４  グルタミン酸非添加条件でＰＧＡを生産する枯草菌の選抜法
試験例２及び３にて枯草菌と推定した凍結保存試料より、滅菌済み白金耳（製品コード254410、Nunc製）にて凍結菌体を採取し、これを５ｍＬのＬＢ液体培地へ接種し、３０℃にて２４時間の振盪培養に供した。これを種培養液として、３０ｍＬのグルタミン酸非添加ＰＧＡ生産用培地［培地組成：７．５％グルコース、１．８％塩化アンモニウム、０．５％酵母エキス、０．０３５％硫酸マグネシウム・７水和物、０．００５％硫酸マンガン・４−５水和物、１００ｍＭ3-モルホリノプロパンスルホン酸（3-Morpholinopropanesulfonic acid、水酸化カリウムにてｐＨ７．０に調整、同仁化学研究所製）］に１％（ｖ／ｖ）接種し、この培地を３７℃にて７２時間の振盪培養に供した。
培養終了後、培養液の上清に含まれるＰＧＡを下記測定例１に示す方法にて定量した。その結果、培養液上清中にＰＧＡに由来するＵＶ２１０ｎｍの吸収を有する高分子物質の溶出画分が検出された菌株を、グルタミン酸非添加条件でＰＧＡが生産可能な枯草菌候補株として選抜した。
【００５８】
試験例５  高塩濃度耐性を有する枯草菌の選抜法（１）
試験例２及び３にて枯草菌と推定し、さらに、試験例４においてＰＧＡ生産枯草菌候補株して選抜した株の凍結保存試料と、試験例１と同様の手順にて調製した独立行政法人製品評価技術基盤機構より入手した公知の納豆菌標準株（NBRC 16449株、NBRC 3336株、NBRC 3936株）の凍結保存試料を、１×１０３〜１×１０４ｃｅｌｌ／ｍＬとなるようにＬＢ＋１０％ＮａＣｌ液体培地に接種し、３７℃で２４時間の振盪培養に供した。この振盪培養の後、培養液試料を１％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム水溶液にて適宜希釈し、分光光度計（商品名：U-2900型、日立ハイテクノロジーズ製）を用いて、増殖の指標となる培養液の吸光度６００ｎｍ（ＯＤ600）を測定した。
その結果、納豆菌標準株では吸光度の増加が認められなかった。本試験条件において、吸光度の増加が認められた菌株６株を、高塩濃度耐性と高塩濃度条件下での高分子量のＰＧＡ生産能を有する枯草菌株として選抜した。
【００５９】
試験例６  枯草菌候補株の生育限界塩濃度の評価試験法
標準株としての納豆菌NBRC 3336株と、枯草菌候補株を試験例４と同様の条件にて、ＬＢ液体培地を用いて種培養を調製した。
次に、塩化ナトリウムの終濃度を１０％（ｗ／ｖ）、１２％（ｗ／ｖ）、１３％（ｗ／ｖ）、１４％（ｗ／ｖ）、１５％（ｗ／ｖ）、及び１６％（ｗ／ｖ）としたＬＢ培地を調製し、これに初発の吸光度が０．０５となるように前記の種培養液を接種し、３７℃にて２日間の振盪培養に供した。この振盪培養において経時的に培養液を採取し、培養液試料を塩化ナトリウム水溶液（使用培地と同濃度の塩化ナトリウム水溶液）にて適宜希釈し、分光光度計（U-2900型、日立ハイテクノロジーズ製）を用いて、増殖の指標となる培養液の吸光度６００ｎｍ（ＯＤ600）を測定した。
【００６０】
試験例７  選抜した枯草菌の生育限界塩濃度の確認試験
高塩濃度耐性を有する枯草菌候補株を、ＬＢ＋１０％ＮａＣｌ液体培地を用いて試験例５と同様の条件にて種培養を調製した。
次に、塩化ナトリウムの終濃度を１０％（ｗ／ｖ）、１２％（ｗ／ｖ）、１４％（ｗ／ｖ）、１５％（ｗ／ｖ）、１６％（ｗ／ｖ）、１７％（ｗ／ｖ）、１８％（ｗ／ｖ）、１９％（ｗ／ｖ）、又は２０％（ｗ／ｖ）としたＴＳＢ培地（Trypticase Soy broth、Becton, and Dickinson Company製）に、上記種培養液を初発吸光度が０．１となるように接種し、３７℃にて２日間の振盪培養に供した。振盪培養を行った後、培養開始２日目に培養液試料を採取し、１０％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム水溶液にて適宜希釈し、分光光度計（U-2900型、日立ハイテクノロジーズ製）を用いて、増殖の指標となる培養液の吸光度６００ｎｍ（ＯＤ600）を測定した。
本試験例では、培養２日目の培養液の吸光度が、種培養接種時の２倍以上となった塩濃度条件までを菌株の生育限界濃度と判定した。
【００６１】
試験例８  選抜した枯草菌の生育至適塩濃度の確認試験
高塩濃度耐性を有する枯草菌候補株を、ＬＢ＋１０％ＮａＣｌ液体培地を用いて試験例５と同様の条件にて種培養を調製した。
次に、塩化ナトリウムを無添加、終濃度１％（ｗ／ｖ）、２（ｗ／ｖ）、３（ｗ／ｖ）、４（ｗ／ｖ）、５（ｗ／ｖ）、６（ｗ／ｖ）、７％（ｗ／ｖ）、８％（ｗ／ｖ）、及び１０％（ｗ／ｖ）としたＴＳＢ培地を調製し、これを９６ウェル丸底マイクロプレート（型番3870-096、IWAKI製）に各ウェル２００μＬ分注した。これに、上記種培養液を各ウェルの初発吸光度が０．０５となるように接種し、バイオマイクロプレートリーダー（HiTS-S2型、サイニクス製）を用い、３７℃にて２４時間の振盪培養に供した。
バイオマイクロプレートリーダーは、１５０ｒｐｍにて振盪を行ない、干渉フィルターにより６００ｎｍの吸光度（ＯＤ600）を３０分間隔で経時的に測定した。得られた吸光度の値より、単位時間当たりの吸光度の増加を算出し、これを菌体増殖速度（ΔＯＤ600／ｈｒ）として、培養試験中の最大の菌体増殖速度を求めた。
本試験例では、菌体増殖速度（ΔＯＤ600／ｈｒ）が、最大値から（最大値−０．２）までの塩濃度を生育至適塩濃度と判定した。
【００６２】
実施例１  選抜した枯草菌の特徴
試験例１〜８に示す方法にて取得した、高塩濃度耐性を有し、ＰＧＡを生産する枯草菌株（枯草菌ＫＳＭ−ＦＦＡ６１０株、枯草菌ＫＳＭ−ＦＦＡ６３１株、枯草菌ＫＳＭ−ＦＦＢ４０６株、枯草菌ＫＳＭ−ＦＦＢ４２５株、枯草菌ＫＳＭ−ＦＦＢ５４０株、枯草菌ＫＳＭ−ＦＦＢ５５３株）の生育特性を、表９〜１３に示す。
【００６３】
【表９】
2018029546.tif 000010
【００６４】
表９は、試験例５の結果を示す。
表９に示すように、高濃度の塩化ナトリウムを含有するＬＢ液体培地で培養した場合、対照とする納豆菌標準株では、吸光度が検出限界以下となり増殖が認められなかった。これに対し、試験例２〜４で選抜した枯草菌株において、試験例５に示す試験条件において吸光度（ＯＤ600）が０．５（１×１０７ ｃｅｌｌ／ｍＬ相当）を超える菌株を見出した。
以上の結果から、本発明の枯草菌株は、納豆菌標準株では増殖できない塩濃度において増殖可能な高塩濃度耐性株であることが確認された。
【００６５】
【表１０】
2018029546.tif 000011
【００６６】
【表１１】
2018029546.tif 000012
【００６７】
表１０及び１１は試験例６の結果を示す。
【００６８】
表１０に示すように、培養１日目において塩化ナトリウム終濃度１０％（ｗ／ｖ）の条件では、対照とする納豆菌標準株（NBRC 3336株）は吸光度が約０．５であったのに対し、本発明の枯草菌株はいずれも吸光度が２．０を超える数値を示した。
また、塩化ナトリウム終濃度１３％（ｗ／ｖ）の条件において、対照とする納豆菌標準株は菌体増殖が認められないのに対し、本発明の枯草菌株は吸光度が０．５を超える数値を示した。
以上の結果より、本発明の枯草菌候補株は、納豆菌標準株と比べて、高い塩濃度耐性を有する株であることが確認された。
【００６９】
表１１に示すように、培養２日目において塩化ナトリウム終濃度１３％（ｗ／ｖ）の条件では、対照とする納豆菌標準株では菌体増殖が認められないのに対し、本発明の枯草菌候補株はいずれも吸光度が１．５を超える数値を示した。
さらに、本発明の枯草菌株は、塩化ナトリウム終濃度が１４％（ｗ／ｖ）の条件において、吸光度が０．５を超える数値を示した。
以上の結果より、本発明の枯草菌候補株は、納豆菌標準株と比べて、高い塩濃度耐性を有する株であることが確認された。
【００７０】
【表１２】
2018029546.tif 000013
【００７１】
表１２は試験例７の結果を示す。
表１２に示すように、ＴＳＢ培地を用いた高塩濃生育試験において、本発明の枯草菌株は、培養２日目における吸光度が、ＫＳＭ−ＦＦＡ６３１株及びＫＳＭ−ＦＦＢ４０６株は塩化ナトリウム終濃度１６％（ｗ／ｖ）、ＫＳＭ−ＦＦＢ４２５株、ＫＳＭ−ＦＦＢ５４０株及びＫＳＭ−ＦＦＢ５５３株は１７％（ｗ／ｖ）、ＫＳＭ−ＦＦＡ６１０株は１８％（ｗ／ｖ）の条件において、種培養接種時の２倍以上の値であった。
以上の結果より、本発明の枯草菌株は、ＴＳＢ培地を用いた生育限界塩濃度の確認試験において、塩化ナトリウムの生育限界濃度が１６〜１８％（ｗ／ｖ）であることが確認された。
【００７２】
【表１３】
2018029546.tif 000014
【００７３】
表１３は試験例８の結果を示す。
表１３に示すように、本発明の枯草菌株はＴＳＢ培地を用いた生育至適塩濃度の試験において、塩化ナトリウム濃度が無添加〜終濃度６％（ｗ／ｖ）（室温）までの添加条件において、菌体増殖速度（ΔＯＤ600／ｈｒ）が０．３〜０．５の値であった。
以上の結果より、本発明の枯草菌株のＴＳＢ培地を用いた選抜した枯草菌の生育至適塩濃度の確認試験において、塩化ナトリウムの生育至適濃度は、枯草菌ＫＳＭ−ＦＦＡ６１０株では０〜５％（ｗ／ｖ）、枯草菌ＫＳＭ−ＦＦＡ６３１株では０〜４％（ｗ／ｖ）、枯草菌ＫＳＭ−ＦＦＢ４０６株では０〜５％（ｗ／ｖ）、枯草菌ＫＳＭ−ＦＦＢ４２５株では０〜４％（ｗ／ｖ）、枯草菌ＫＳＭ−ＦＦＢ５４０株では０〜５％（ｗ／ｖ）、枯草菌ＫＳＭ−ＦＦＢ５５３株では０〜５％（ｗ／ｖ）であることが確認された。
【００７４】
実施例２  菌学的、及び１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列解析に基づく菌種同定
前記枯草菌株（枯草菌ＫＳＭ−ＦＦＡ６１０株、枯草菌ＫＳＭ−ＦＦＡ６３１株、枯草菌ＫＳＭ−ＦＦＢ４０６株、枯草菌ＫＳＭ−ＦＦＢ４２５株、枯草菌ＫＳＭ−ＦＦＢ５４０株、枯草菌ＫＳＭ−ＦＦＢ５５３株）の菌学的性質を検討した。その結果を表１４に示す。
さらに、前記枯草菌株について、下記測定例４より、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列解析に基づく菌種同定を行った。その結果を表１５に示す。
【００７５】
【表１４】
2018029546.tif 000015
【００７６】
表１４に示すように、前記枯草菌株はすべて枯草菌の菌学的性質を有することを確認した。
【００７７】
【表１５】
2018029546.tif 000016
【００７８】
表１５に示すように、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に基づく相同性解析の結果、前記菌株は全て枯草菌DSM 10株と９９．９％以上の相同性の高い１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を有することが明らかとなった。
従って、前記枯草菌株は、菌学的な性質と併せ、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の解析結果より、枯草菌であると判断した。
【００７９】
尚、枯草菌ＫＳＭ−ＦＦＡ６１０株は、２０１６年６月２日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２７６として寄託された。
また、枯草菌ＫＳＭ−ＦＦＡ６３１株は、２０１６年６月２日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２７７として寄託された。
また、枯草菌ＫＳＭ−ＦＦＢ４０６株は、２０１６年６月２日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２７８として寄託された。
また、枯草菌ＫＳＭ−ＦＦＢ４２５株は、２０１６年６月２日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２７９として寄託された。
また、枯草菌ＫＳＭ−ＦＦＢ５４０株は、２０１６年６月２日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２８０として寄託された。
さらに、枯草菌ＫＳＭ−ＦＦＢ５５３株は、２０１６年６月２日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２８１として寄託された。
【００８０】
実施例３  高濃度塩添加条件でのＰＧＡ生産性評価（１）
公知の納豆菌標準株（NBRC 3336株、及びNBRC 16449株）を対照として、本発明の枯草菌株（ＫＳＭ−ＦＦＡ６１０株、ＫＳＭ−ＦＦＡ６３１株、ＫＳＭ−ＦＦＢ４０６株、ＫＳＭ−ＦＦＢ４２５株、ＫＳＭ−ＦＦＢ５４０株、及びＫＳＭ−ＦＦＢ５５３株）を用いて、高塩濃度条件でのＰＧＡ生産性を評価した。
試験例１に示した上記菌株の凍結保存試料、及び同様の手順にて調製した納豆菌標準株の凍結保存試料を用い、試験例４と同様の培養条件にてＬＢ液体培地を用い、３０℃にて２４時間の振盪培養に供した。これを種培養液として、３０ｍＬのＰＧＡ生産性評価培地［培地組成：８．０％グルコース、８．０％グルタミン酸ナトリウム・１水和物、１．２５％酵母エキス、１．０％硫酸アンモニウム、０．２％硫酸マグネシウム・７水和物、０．００３％硫酸マンガン・４−５水和物、０．７％リン酸水素二カリウム、０．３５％リン酸二水素カリウム、並びに７．３％塩化ナトリウム（１．２５Ｍ相当）又は１０．２％塩化ナトリウム（１．７５Ｍ相当）］に１％（ｖ／ｖ）接種した。この培地を３７℃にて７２時間の振盪培養に供した。
培養終了後、下記測定例１記載の方法にて、培養液の上清に含まれるＰＧＡを定量した。その結果を表１６に示す。
【００８１】
【表１６】
2018029546.tif 000017
【００８２】
表１６に示すように、本発明の枯草菌株は、納豆菌標準株と比較して、高塩濃度の条件であっても、優れたＰＧＡ生産性を示す。また、納豆菌標準株では生育できずＰＧＡが生産できないような高濃度の塩化ナトリウムを含有する条件であっても、本発明の枯草菌株はＰＧＡが生産可能である。
以上の結果より、本発明の枯草菌は、高塩濃度耐性を有する枯草菌であると判断した。
【００８３】
実施例４  高濃度塩添加条件でのＰＧＡ生産性評価（２）
本発明の枯草菌株 ＫＳＭ−ＦＦＢ５５３株を用いて、１価の金属塩が高濃度の条件にてＰＧＡ生産性を評価した。
試験例４と同様の方法により種培養液を調製し、これを３０ｍＬのＰＧＡ生産性評価培地［培地組成：８．０％グルコース、８．０％グルタミン酸ナトリウム・１水和物、１．２５％酵母エキス、１．０％硫酸アンモニウム、０．２％硫酸マグネシウム・７水和物、０．００３％硫酸マンガン・４−５水和物、０．７％リン酸水素二カリウム、０．３５％リン酸二水素カリウム、並びに塩化ナトリウムを１０．２％（１．７５Ｍ相当）又は塩化カリウム１１．２％（１．５Ｍ相当）］に、１％（ｖ／ｖ）接種した。これらを３７℃にて７２時間の振盪培養に供した。
培養終了後、下記測定例１記載の方法にて、培養液上清に含まれるＰＧＡを定量した。その結果を表１７に示す。
【００８４】
【表１７】
2018029546.tif 000018
【００８５】
表１７に示すように、本発明の枯草菌株は、１価の金属塩が高濃度の条件であっても、優れたＰＧＡ生産性を示すことが確認された。
【００８６】
実施例５  高濃度塩添加条件でのＰＧＡ生産性評価（３）
本発明の枯草菌株 ＫＳＭ−ＦＦＢ５５３株を用いて、２価の金属塩が高濃度の条件にてＰＧＡ生産性を評価した。
試験例４と同様の方法により種培養液を調製し、これを３０ｍＬのＰＧＡ生産性評価培地［培地組成：８．０％グルコース、８．０％グルタミン酸ナトリウム・１水和物、１．２５％酵母エキス、１．０％硫酸アンモニウム、０．２％硫酸マグネシウム・７水和物、０．００３％硫酸マンガン・４−５水和物、０．７％リン酸水素二カリウム、０．３５％リン酸二水素カリウム、並びに１０．２％塩化マグネシウム・６水和物（０．５Ｍ相当）又は７．４％塩化カルシウム・２水和物（０．５Ｍ相当）］に、１％（ｖ／ｖ）接種した。これらを３７℃にて７２時間の振盪培養に供した。
培養終了後、下記測定例１記載の方法にて、培養液の上清に含まれるＰＧＡを定量した。その結果を表１８に示す。
【００８７】
【表１８】
2018029546.tif 000019
【００８８】
表１８に示すように、本発明の枯草菌株は、２価の金属塩が高濃度の条件であっても、優れたＰＧＡ生産性を示すことが確認された。
【００８９】
実施例６  ＰＧＡの分子量の測定（１）
本発明の枯草菌株（ＫＳＭ−ＦＦＡ６１０株、ＫＳＭ−ＦＦＡ６３１株、ＫＳＭ−ＦＦＢ４０６株、ＫＳＭ−ＦＦＢ４２５株、ＫＳＭ−ＦＦＢ５４０株、及びＫＳＭ−ＦＦＢ５５３株）が生産するＰＧＡの分子量を測定した。
試験例５と同様の方法により種培養液を調製し、これを３０ｍＬの生産性評価培地［培地組成：８．０％グルコース、８．０％グルタミン酸ナトリウム・１水和物、１．２５％酵母エキス、１．０％硫酸アンモニウム、０．２％硫酸マグネシウム・７水和物、０．００３％硫酸マンガン・４−５水和物、０．７％リン酸水素二カリウム、０．３５％リン酸二水素カリウム、１０．２％塩化ナトリウム（１．７５Ｍ相当）］に、１％（ｖ／ｖ）接種した。この培地を３７℃にて７２時間の振盪培養に供した。
培養終了後、下記測定例１記載の方法にて、培養液の上清に含まれるＰＧＡの分子量を測定した。その結果を表１９に示す。
【００９０】
【表１９】
2018029546.tif 000020
【００９１】
表１９に示すように、本発明の枯草菌株は、納豆菌標準株では生育できないような高濃度の塩を添加した条件下であっても、高分子量のＰＧＡが生産できることが確認された。またさらに、本発明の高塩濃度耐性株を用いることで、高分子量のＰＧＡが生産できることが確認された。
【００９２】
実施例７  ＰＧＡの分子量の測定（２）
実施例１に示す本発明の枯草菌株ＫＳＭ−ＦＦＢ５５３株を用いて、１価又は２価の金属塩が高濃度の条件にて生産するＰＧＡの分子量を評価した。
試験例４と同様の方法により種培養液を調製し、これを３０ｍＬのＰＧＡ生産性評価培地［培地組成：８．０％グルコース、８．０％グルタミン酸ナトリウム・１水和物、１．２５％酵母エキス、１．０％硫酸アンモニウム、０．２％硫酸マグネシウム・７水和物、０．００３％硫酸マンガン・４−５水和物、０．７％リン酸水素二カリウム、０．３５％リン酸二水素カリウム、並びに１１．２％塩化カリウム（１．５Ｍ相当）、１０．２％塩化マグネシウム・６水和物（０．５Ｍ相当）若しくは７．４％塩化カルシウム・２水和物（０．５Ｍ相当）］に、１％（ｖ／ｖ）接種した。これを３７℃にて７２時間の振盪培養に供した。
培養終了後、下記測定例１記載の方法にて、培養液の上清に含まれるＰＧＡの分子量を測定した。その結果を表２０に示す。
【００９３】
【表２０】
2018029546.tif 000021
【００９４】
表２０に示すように、本発明の枯草菌株は、１価又は２価の金属塩が高濃度の条件下において、高分子量のＰＧＡが生産できることが確認された。
【００９５】
実施例８  グルタミン酸非添加条件でのＰＧＡ生産性評価
本発明の枯草菌株（ＫＳＭ−ＦＦＡ６１０株、ＫＳＭ−ＦＦＡ６３１株、ＫＳＭ−ＦＦＢ４０６株、ＫＳＭ−ＦＦＢ４２５株、ＫＳＭ−ＦＦＢ５４０株、及びＫＳＭ−ＦＦＢ５５３株）を用いて、高塩濃度、且つグルタミン酸非添加の条件でＰＧＡ生産性を評価した。
試験例５と同様の方法により種培養液を調製し、これを３０ｍＬのＰＧＡ生産性評価培地［培地組成：８．０％グリセロール、０．５％酵母エキス、１．０％硫酸アンモニウム、０．２％硫酸マグネシウム・７水和物、０．００３％硫酸マンガン・４−５水和物、０．７％リン酸水素二カリウム、０．３５％リン酸二水素カリウム、７．３％塩化ナトリウム（１．２５Ｍ相当）］に、１％（ｖ／ｖ）接種した。この培地を３７℃にて７２時間の振盪培養に供した。
培養終了後、下記測定例１記載の方法にて、培養液の上清に含まれるＰＧＡを定量し、分子量を測定した。その結果を表２１に示す。
【００９６】
【表２１】
2018029546.tif 000022
【００９７】
表２１に示すように、本発明の枯草菌株は、グルタミン酸の非添加の条件であっても、高分子量のＰＧＡが生産できることが確認された。
【００９８】
［測定例１］ＰＧＡの定量法、及び分子量測定法
ＰＧＡの定量、及び分子量の測定には、高速液体クロマトグラフィー装置を使用した。
［ＨＰＬＣ装置構成］
送液ポンプ：Ｌ−６２００型、日立製作所製
オートサンプラー：ＡＳ−４０００型、日立製作所製
カラムオーブン：Ｌ−５０２０型、日立製作所製
ＵＶ検出計：Ｌ−４２５０型、日立製作所製
クロマトデータ解析装置：Ｄ−２５００型、日立製作所
【００９９】
分析カラムは、排除限界の異なる親水性ポリマー用ゲルろ過カラム ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ６０００ＰＷＸＬ（７．８ｍｍ  Ｉ．Ｄ．×３０ｃｍ、東ソー製）、及びＴＳＫｇｅｌ  Ｇ４０００ＰＷＸＬ（７．８ｍｍ  Ｉ．Ｄ．×３０ｃｍ、東ソー製）を使用した。これらをタンデムに連結し、分析カラムの直前にはガードカラムＴＳＫ  ｇｕａｒｄｃｏｌｕｍｎ  ＰＷＸＬ（６．０ｍｍ  Ｉ．Ｄ．×４．０ｃｍ、東ソー）を接続して用いた。
分析は、溶離液は０．１Ｍ硫酸ナトリウムとし、流速１．０ｍＬ／分、カラム温度５０℃、溶出ピークは検出波長２１０ｎｍにて測定を行った。また、サンプルの前処理には、０．１Ｍ硫酸ナトリウムにて適宜希釈した培養液上清試料を、０．４５μｍデュラポア膜（型番MULTI SCREEN MNHV45、MILLIPORE製）にてフィルターろ過を行った。
【０１００】
濃度検定には分子量８８０，０００のＰＧＡ（明治フードマテリア）を用いて検量線を作成した。また分子量検定には、プルラン  Ｓｈｏｄｅｘ  ＳＴＡＮＤＡＲＤ  Ｐ−８２（昭和電工）を用いて予め重量平均分子量を求めた各種分子量の異なるポリグルタミン酸（和光純薬工業１６２−２１４１１及び１６２−２１４０１；ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ  Ｐ−４８８６及びＰ−４７６１；明治フードマテリア（分子量８８０，０００））を用いた。
【０１０１】
［測定例２］培養液上清試料中の高分子物質の同定法
実施例４において得られた培養終了後の培養液試料を、１４，８００ｒｐｍにて３０分間の遠心分離（ｈｉｍａｃ ＣＲ２１ＧIII型、日立工機製）に供し、菌体除去した上清試料を回収した。次に、これら上清試料１〜１０ｍＬをポリプロピレン製５０ｍＬ容遠心チューブ（型番227 261、greiner bio-one製）に移し入れ、この上清試料量に対して２倍容のエタノールを加えて転倒混合したのち、−３０℃にて一晩恒温放置した。その後、３，０００ｒｐｍにて３０分間の遠心分離（ｈｉｍａｃ ＣＦ７Ｄ２型、日立工機製）に供し、沈殿画分を回収した。得られた沈澱画分を２ｍＬの蒸留水に再度溶解し、再度、上記エタノール添加による沈殿画分を調製し、これを回収した。続いて、回収した試料を２ｍＬの蒸留水に溶解し、これをスクリューキャップ付き試験管（型番ＳＴ−１３Ｍ、日本電子理化硝子製）に０．５ｍＬ移し入れたのち、０．５ｍＬの濃塩酸を加え攪拌後、窒素封入し、１０５〜１１０℃にて１６時間加熱処理を行った。加熱処理後、窒素気流下で塩酸及び水分を留去し（約６時間）、得られた乾固物を加水分解試料とした。
尚、ＰＧＡ標品として市販ＰＧＡ（分子量８８０，０００、明治フードマテリア）、加水分解試料の対照として、Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ及びＤ−Ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ（和光純薬工業社製）を使用した。
【０１０２】
続いて、得られた加水分解試料を適宜希釈して、全自動アミノ酸分析装置（Ｌ−８９００型、日立ハイテクノロジーズ製）にて試料中の各種アミノ酸分析、及びグルタミン酸の定量を行った。また、Ｌ−グルタミン酸測定キット（ヤマサ醤油）を用い、キット添付のプロトコール記載の方法に準じ、Ｌ−グルタミン酸量の測定を行った。全自動アミノ酸分析装置による測定では、光学活性異性体（Ｄ／Ｌ）の総量を定量結果として得て、これよりＬ−グルタミン酸測定キットにて得られた定量結果を差し引いた差分をＤ−グルタミン酸量とした。
【０１０３】
測定の結果、ＫＳＭ−ＦＦＡ６１０株、ＫＳＭ−ＦＦＢ４２５株、ＫＳＭ−ＦＦＢ５４０株、及びＫＳＭ−ＦＦＢ５５３株の培養液試料より回収した高分子物質のグルタミン酸の光学異性体比（Ｄ／Ｌ）はそれぞれ、６８／３２、６７／３３、６９／３１、及び６７／３３であった。
また、上記全自動アミノ酸分析装置による測定において、グルタミン酸以外のアミノ酸が検出されなかったことから、培養上清中の高分子物質はＰＧＡと判定した。またさらに、上記選抜した本発明の高塩濃度耐性を有する枯草菌株の生産したＰＧＡのＤ／Ｌ比は、公知の納豆菌標準株が生産するＰＧＡのＤ／Ｌ比と同等と判断した。
【０１０４】
［測定例３］  ＰＧＡ溶液の粘度測定法
前記菌株のうちＫＳＭ−ＦＦＢ５５３株を用い、ＰＧＡ調製用培地［培地組成：８．０％グルコース、８．０％グルタミン酸ナトリウム・１水和物、０．５％酵母エキス、１．０％硫酸アンモニウム、０．２％硫酸マグネシウム・７水和物、０．００３％硫酸マンガン・４−５水和物、０．７％リン酸水素二カリウム、０．３５％リン酸二水素カリウム］に、１％（ｖ／ｖ）にて調製した培養液試料より、酸沈殿による回収、次にエタノール沈殿による精製回収、および凍結乾燥によりＰＧＡ乾燥粉末を調製した。続いて、得られたＰＧＡ試料（Ｍｗ５，０００ｋ）を４％（ｗ／ｗ）、８％（ｗ／ｗ）となるように、蒸留水、及び１．２５Ｍ塩化ナトリウム水溶液にて溶解した。これら約４０ｍＬをそれぞれガラス製スクリュー管（型番Ｎｏ．７、またはＮｏ．８、マルエム製）、あるいはポリプロピレン製５０ｍＬ容遠心チューブ（型番227 261、greiner bio-one製）に気泡が生じないよう移し入れ、Ｂ型粘度計（ＴＶＢ−１５型、東機産業製）を使用して、試料温度２０〜２５℃（室温）、測定時間６０秒（オートストップモード）、ローター回転速度６０ｒｐｍ、Ｍ２ローターを用いて測定した。尚、上記測定条件における測定値が上限を超えた試料は、回転数を３０ｒｐｍ、あるいは、使用ローターをＭ３、Ｍ４に適宜変更して測定した。
測定の結果、ＰＧＡ４％（ｗ／ｗ）の試料において、塩を添加しない試料の粘度がは３８０ｍＰａ・ｓであったのに対し、塩を添加した試料では６０ｍＰａ・ｓであった。また、ＰＧＡ８％（ｗ／ｗ）試料において、塩を添加しない試料は粘度が１，４８０ｍＰａ・ｓであったのに対し、塩を添加した試料では４５０ｍＰａ・ｓであった。
上記測定結果から、塩添加によるＰＧＡ試料の粘度低減効果を確認した。
【０１０５】
[測定例４]  １６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子塩基配列に基づく菌種同定解析法
１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列による菌種同定は以下の実験手順により行った。
試験例２と同様に、凍結保存菌体よりＰＣＲ用の鋳型試料を調製し、表２に示すプライマー２７ｆ及びプライマー１５２５ｒを使用してＰＣＲを行い、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子領域約１．５ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した。ＤＮＡポリメラーゼは、ＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ（タカラバイオ製）を用いた。９５℃で５分間、鋳型ＤＮＡを変性させた後、９５℃で１分間、５５℃で３０秒間、７２℃で２分間を１サイクルとして３０サイクル行い、さらに７２℃で２分間恒温した。
得られた１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子領域のＤＮＡ断片について、表２に示すプライマー２７ｆ、プライマーｆ２Ｌ（−）、プライマー９２６ｆ、プライマーｒＥ１Ｌ、プライマーｒ２Ｌ’、及びプライマー１５２５ｒをそれぞれシークエンス用プライマーとして用い、ＤＮＡ塩基配列の解析を行った。尚、シークエンス解析試料の調製には、Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（アプライド  バイオシステムズ製）を用い、添付プロトコールに従い試料調製を行った。解析前の試料精製には、Montage SEQ kit（MILLIPORE製）を使用した。
調製したシークエンス試料は、ＤＮＡシークエンサー（商品名：ABI 3100 Genetic Analyzer、アプライドバイオシステムズ製）を用いて配列解析を行い、塩基配列を決定した。
【０１０６】
続いて、得られた各塩基配列をGENETYX ATSQ ver2.01（ゼネティックス製）を用いて１断片化した。配列の相同性検索は、公開データベースNCBI（National  Center  for  Biotechnology  Information、http://www.ncbi.nlm.gov/）のメニュー”Nucleotide”内の”BLAST”のなかにある”Basic  BLAST”を用い、BLASTプログラムから”nucleotide  blast”を選択した。検索対象のデータベースに”Reference  genomic  sequences（refseq_genomics）、選択プログラムに”Highly  similar  sequences（megablast）”を指定し、相同率の最も高い標準株を選定した。続いて、選定した基準株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列と上記の配列決定した高塩濃度耐性を有する枯草菌候補株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列をGENETYX Ver.13（ゼネティックス製）を用いて、“Nucleotide vs Nucleotide Homology”メニューにより、塩基配列対塩基配列の相同性解析を実施し、相同性（％）を算出した。
【配列表】
2018029546000001.app