(57)【要約】【課題】様々な種類の細胞を培養時に容器表面に吸着させてその組織化を促進でき、得られた生体試料を細胞本来の機能を損なわずに脱離させることができ、かつ培養途中の細胞が脱離することを抑制できる細胞培養装置、および生体試料製造方法を提供することを目的とする。【解決手段】培養液が収容される透明な培養容器１０、培養容器１０の内底面１０ａ側、第１の面１２ａが前記培養液に接するように形成された誘電体層１２と、誘電体層１２の第１の面１２ａと反対側の第２の面１２ｂに設けられた第１の電極１４と、培養容器１０内に誘電体層１２と離間して設けられた第２の電極１６と、第１の電極１４と第２の電極１６との間に電圧を印加する加電圧機構１８とを備え、誘電体層１２の第１の面１２ａの表面電位が、第１の電極１４と第２の電極１６との間に電圧が印加されることにより変化するようになっている、細胞培養装置１。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養液が収容される透明な培養容器と、前記培養容器の内表面側に、第１の面が前記培養液に接するように形成された誘電体層と、前記誘電体層の前記第１の面と反対側の第２の面に設けられた第１の電極と、前記培養容器内に前記誘電体層と離間して設けられた第２の電極と、前記第１の電極と前記第２の電極との間に電圧を印加する加電圧機構とを備え、
前記第１の面の表面電位が、前記第１の電極と前記第２の電極との間に電圧が印加されることにより変化するようになっている、細胞培養装置。
【請求項２】
請求項１に記載の細胞培養装置を用いた細胞培養により生体試料を製造する生体試料製造方法であって、
前記加電圧機構により、前記第２の電極に対する前記第１の電極の電位をＥ１（Ｖ）として細胞を培養し、前記第１の面に吸着した生体試料を得る培養工程と、
前記加電圧機構により、前記第２の電極に対する前記第１の電極の電位をＥ１（Ｖ）よりも低いＥ２（Ｖ）とし、前記第１の面から前記生体試料を脱離させる脱離工程と、を有する、生体試料製造方法。
【請求項３】
前記生体試料が細胞シートである、請求項２に記載の生体試料製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養装置および生体試料製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、再生医療の分野では、細胞を高密度に培養して得た厚みのある細胞シートを患部に配置し、生着させることで治療効果を高めることが試みられている。細胞シートのような組織化された生体試料を製造するための細胞培養においては、細胞を組織化させるための足場が必要である。従来、培養容器としては、内表面が疎水性で、培養時に細胞が内表面に吸着するシャーレ等が用いられていた。しかし、細胞の吸着性が高い培養容器で培養を行うと、形成された生体試料が培養容器から脱離しにくく、脱離の際に生体試料に損傷が生じやすくなる。
【０００３】
また、細胞接着性ペプチド部分であるＲＧＤペプチドに光解離性保護基を導入したケージドペプチドを基板上に結合し、培養中の任意のタイミングで紫外線を照射して保護基を脱離させて細胞を接着させる方法が知られている（特許文献１）。しかし、該方法では細胞の脱着を可逆的に制御できず、また光解離性保護基を脱離させるために照射する紫外線や、脱離した保護基による細胞への悪影響が懸念されるため、低刺激、低負荷で脱離させることが難しい。
【０００４】
また、培養時の温度（例えば３７℃）では疎水性で、室温（２０〜２５℃）では親水性となる温度応答性ポリマーを容器の内表面にコーティングした培養容器を用いて生体試料を製造する方法が提案されている（特許文献２、３）。該方法では、培養時には容器表面の温度応答性ポリマーが疎水性で収縮した状態のため、細胞が容器表面に吸着してその組織化が促進される。また、培養後に培養容器の温度を室温まで下げると、温度応答性ポリマーが親水性で膨潤した状態になり、形成された生体試料と容器表面の間に水が入り込むことで、生体試料が容器表面から無傷で脱離する。こうして得られた生体試料は、細胞本来の機能が失われていないため、生体組織に速やかに生着できる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第４６８２３６４号公報
【特許文献２】特許第３４４１５３０号公報
【特許文献３】特許第３６４１３０１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、温度応答性ポリマーを用いた培養容器では、観察や培地交換等のためにインキュベーターから培養容器を取り出した際に温度が下がり、培養途中の細胞が剥がれることがある。また、該培養容器では容器表面を細胞の種類ごとに接着に適した条件に調節することができないため、細胞の種類によっては容器表面への接着性が不充分となり、細胞シート等の生体試料の製造が困難になる。
【０００７】
本発明は、様々な種類の細胞を培養時に容器表面に吸着させてその組織化を促進でき、得られた生体試料を細胞本来の機能を損なわずに脱離させることができ、かつ培養途中の細胞が脱離することを抑制できる細胞培養装置、および生体試料製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、以下の構成を有する。
［１］培養液が収容される透明な培養容器と、前記培養容器の内表面側に、第１の面が前記培養液に接するように形成された誘電体層と、前記誘電体層の前記第１の面と反対側の第２の面に設けられた第１の電極と、前記培養容器内に前記誘電体層と離間して設けられた第２の電極と、前記第１の電極と前記第２の電極との間に電圧を印加する加電圧機構とを備え、前記第１の面の表面電位が、前記第１の電極と前記第２の電極との間に電圧が印加されることにより変化するようになっている、細胞培養装置。
［２］前記［１］に記載の細胞培養装置を用いた細胞培養により生体試料を製造する生体試料製造方法であって、前記加電圧機構により、前記第２の電極に対する前記第１の電極の電位をＥ１（Ｖ）として細胞を培養し、前記第１の面に吸着した生体試料を得る培養工程と、前記加電圧機構により、前記第２の電極に対する前記第１の電極の電位をＥ１（Ｖ）よりも低いＥ２（Ｖ）とし、前記第１の面から前記生体試料を脱離させる脱離工程と、を有する、生体試料製造方法。
［３］前記生体試料が細胞シートである、［２］に記載の生体試料製造方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の細胞培養装置を用いれば、様々な種類の細胞を培養時に容器表面に吸着させてその組織化を促進でき、得られた生体試料を細胞本来の機能を損なわずに脱離させることができるうえ、培養途中の細胞が脱離することを抑制できる。
本発明の生体試料製造方法によれば、様々な種類の細胞を培養時に容器表面に吸着させてその組織化を促進でき、得られた生体試料を細胞本来の機能を損なわずに脱離させることができ、かつ培養途中の細胞が脱離することを抑制できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の細胞培養装置の一例を示した模式図である。
【図２】図１の細胞培養装置を用いた生体試料製造方法の一例を示した図であって、図２（Ａ）は培養工程の様子を示した模式図であり、図２（Ｂ）は脱離工程の様子を示した模式図である。
【図３】実施例のタンパク質接着性試験における凹部の内底面の表面電位とタンパク質吸着率Ｑの関係を示したグラフである。
【図４】実施例のタンパク質脱着試験における凹部の内底面の表面電位−３Ｖでの静置時間とタンパク質吸着率Ｑの関係を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下の用語の定義は、本明細書および特許請求の範囲にわたって適用される。
「含フッ素重合体」とは、分子中にフッ素原子を有する高分子化合物を意味する。
「単位」とは、重合体中に存在して重合体を構成する、単量体に由来する部分を意味する。炭素−炭素不飽和二重結合を有する単量体の付加重合により生じる、該単量体に由来する単位は、該不飽和二重結合が開裂して生じた２価の単位である。また、ある単位の構造を重合体形成後に化学的に変換したものも単位という。なお、以下、場合により、個々の単量体に由来する単位をその単量体名に「単位」を付した名称で呼ぶ。
「含フッ素重合体が主鎖に脂肪族環を有する」とは、脂肪族環の環骨格を構成する炭素原子のうち、少なくとも１つが、含フッ素重合体の主鎖を構成する炭素原子であることを意味する。
「透明」とは、可視光（３６０ｎｍ〜８３０ｎｍ）の透過率の平均が１０％以上であることを意味する。培地等の導電性流体が収容された状態の培養容器内を底面側から観察する場合には、その状態で測定した可視光の透過ヘイズが３０％以下であることが好ましい。
【００１２】
［細胞培養装置］
本発明の細胞培養装置は、培養液が収容される透明な培養容器と、前記培養容器の内表面側に、第１の面が前記培養液に接するように形成された誘電体層と、前記誘電体層の前記第１の面と反対側の第２の面に設けられた第１の電極と、前記培養容器内に前記誘電体層と離間して設けられた第２の電極と、前記第１の電極と前記第２の電極との間に電圧を印加する加電圧機構とを備えたものである。本発明の細胞培養装置の培養容器においては、誘電体層の第１の面の表面電位が、第１の電極と第２の電極との間に電圧が印加されることにより変化するようになっている。
本発明の細胞培養装置は、各種生体試料とその使用目的に応じた最適な基材表面性状の探索や、細胞シートを製造するための細胞培養に好適に使用できる。
【００１３】
図１は、本発明の細胞培養装置の一例を示す断面図である。
細胞培養装置１は、培養液が収容される透明な培養容器１０と、誘電体層１２と、第１の電極１４と、第２の電極１６と、加電圧機構１８とを備えている。
誘電体層１２は、培養容器１０の内底面１０ａ側に、第１の面１２ａが培養液に接するように形成されている。第１の電極１４は、誘電体層１２の第１の面１２ａと反対側の第２の面１２ｂに設けられている。この例では、培養容器１０の内底面１０ａに第１の電極１４が形成され、さらに第１の電極１４の表面に誘電体層１２が形成されている。
【００１４】
第２の電極１６は、培養容器１０内に、誘電体層１２と離間して設けられている。加電圧機構１８は、第１の電極１４と第２の電極１６にそれぞれ電気的に接続されており、第１の電極１４と第２の電極１６との間に電圧を印加できるようになっている。
誘電体層１２の第１の面１２ａの表面電位は、加電圧機構１８により第１の電極１４と第２の電極１６との間に電圧が印加されることで変化するようになっている。
【００１５】
（培養容器）
培養容器としては、培養液を収容できる透明なものであればよく、例えば、シャーレ等の培養に用いられる公知の容器を使用できる。
培養容器を形成する材料としては、特に限定されず、ポリスチレン等の樹脂、ガラス等が挙げられる。
培養容器を形成する材料は、１種であってもよく、２種以上であってもよい。
【００１６】
（誘電体層）
培養容器内に形成された誘電体層の第１の面が、培養時に細胞の吸着面となる。誘電体層は、培養容器の内表面側の一部に設けられていてもよく、培養容器の内表面側の全体に設けられていてもよい。
誘電体層は、第１の面に細胞が吸着して組織化が促進されやすい点から、細胞培養装置１における誘電体層１２のように、培養容器の内底面側に設けられることが好ましい。なお、誘電体層は、培養容器の内側面側に設けられていてもよい。
【００１７】
誘電体層を形成する材料としては、特に限定されず、例えば、含フッ素重合体、ポリエチレンテレフタレート、ポリイミド、ポリカーボネート、アクリル樹脂、パリレンＣ等の有機高分子材料等が挙げられ、なかでも含フッ素重合体が好ましい。
誘電体層を形成する材料は、１種でもよく、２種以上でもよい。
【００１８】
含フッ素重合体としては、特に限定されず、例えば、フルオロオレフィン単位を有する含フッ素重合体、芳香環を有する含フッ素重合体、フルオロポリエーテル鎖を有する含フッ素重合体、主鎖に脂肪族環を有する含フッ素重合体、フッ素ゴム等が挙げられる。
【００１９】
フルオロオレフィン単位を有する含フッ素重合体としては、例えば、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、テトラフルオロエチレン−ペルフルオロ（アルキルビニルエーテル）共重合体（ＰＦＡ）等が挙げられる。
芳香環を有する含フッ素重合体としては、例えば、含フッ素芳香族化合物（ペルフルオロ（１，３，５−トリフェニルベンゼン）等）と、フェノール系化合物（１，３，５−トリヒドロキシベンゼン等）と、架橋性官能基含有芳香族化合物（ペンタフルオロスチレン等）とを、脱ハロゲン化水素剤（炭酸カリウム等）の存在下で反応させて得られる重合体が挙げられる。
フルオロポリエーテル鎖を有する含フッ素重合体としては、例えば、オプツール  ＤＳＸ（登録商標、ダイキン工業社製）、ＫＹ−１００シリーズ（信越化学社製）等が挙げられる。
主鎖に脂肪族環を有する含フッ素重合体としては、例えば、ＣＹＴＯＰ（登録商標、旭硝子社製）、テフロン（登録商標）ＡＦ（ＤｕＰｏｎｔ社製）等が挙げられる。
フッ素ゴムとしては、例えば、ビニリデンフルオリド（ＶＤＦ）を主成分とするビニリデンフルオリド系フッ素ゴム、プロピレン−テトラフルオロエチレン系フッ素ゴム、テトラフルオロエチレン−ペルフルオロアルキルビニルエーテル系フッ素ゴム等が挙げられる。
含フッ素重合体としては、１種を単独で使用してもよく、２種以上を組み合わせて使用してもよい。
【００２０】
誘電体層を形成する材料としては、シリカ、アルミナ、セリア、チタニアおよびジルコニアからなる群から選ばれる１種以上の金属酸化物を用いてもよい。
【００２１】
誘電体層の厚さは、０．１〜１０μｍが好ましく、０．５〜１μｍがより好ましい。誘電体層の厚さが下限値以上であれば、実用的な使用電圧内での絶縁破壊が起きにくい。誘電体層の厚さが上限値以下であれば、電圧印加により誘電体層の分極を効率的に行うことができる。
【００２２】
（第１の電極）
第１の電極を形成する材料は、導電性材料であればよく、例えば、酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）；Ｐｔ、Ａｕ、Ｎｉ、Ａｌ等の金属；ＳｎＯ２、Ｉｎ２Ｏ３、ＲｕＯ２等の導電性を有する金属酸化物；Ｇｅ、Ｓｉ、ＧａＡｓ等の半導体；グラファイト、グラッシーカーボン、ダイヤモンド等の炭素系材料；ポリアセチレン、ポリピロール、ポリアニリン、ポリチオフェン等の伝導性高分子等が挙げられる。
第１の電極の形状は、特に限定されず、例えば、平板状、櫛状等が挙げられる。
第１の電極の数は、１つには限定されず、２つ以上であってもよい。
【００２３】
（第２の電極）
第２の電極は、誘電体層と離間するように設けられ、培養容器内に培養液が収容されたときには該培養溶液と接する。
第２の電極を形成する材料は、導電性材料であればよく、例えば、第１の電極を形成する材料として挙げたものと同じものが挙げられる。
第２の電極の形状は、特に限定されず、例えば、平板状、棒状等が挙げられる。
【００２４】
（加電圧機構）
加電圧機構としては、第１の電極と第２の電極との間に任意の電圧を印加できるものであればよく、公知のものを採用することができる。
加電圧機構としては、電圧の印加のＯＮ／ＯＦＦを切り替えるスイッチを備えるものが好ましい。また、加電圧機構としては、正電圧出力部、負電圧出力部、および、前記正電圧出力部と前記負電圧出力部のいずれから第１の電極と第２の電極との間に電圧を印加するかを切り替えるスイッチを備えているものが好ましい。さらに、加電圧機構としては、第１の電極と第２の電極との間に印加する電圧を調節できる電圧調節機構を備えるものが好ましい。
【００２５】
（製造方法）
本発明の細胞培養装置の製造方法は、特に限定されず、例えば、以下の方法が挙げられる。
培養容器の内表面に、スパッタリング、蒸着等によって第１の電極を形成した後、含フッ素重合体等を溶媒に溶解した塗布液を該第１の電極上に塗布し、ベーク等により乾燥して誘電体層を形成する。次いで、該培養容器内に前記誘電体層と離間するように第２の電極を配置し、第１の電極と第２の電極とを加電圧機構と電気的に接続することで、細胞培養装置を得る。
【００２６】
塗布液の塗布方法としては、特に限定されず、例えば、スピンコート法、ディップコート法、キャストコート法、スプレーコート法、ダイコート法、スキャンコート法、はけ塗り法、ポッティング法等が挙げられる。
【００２７】
［生体試料製造方法］
本発明の生体試料製造方法は、本発明の細胞培養装置を用いた細胞培養により生体試料を製造する方法である。本発明の生体試料製造方法は、下記の培養工程と脱離工程を有する。
培養工程：本発明の細胞培養装置を用い、加電圧機構により、第２の電極に対する第１の電極の電位をＥ１（Ｖ）として細胞を培養し、誘電体層の第１の面に吸着した生体試料を得る。
脱離工程：加電圧機構により、第２の電極に対する第１の電極の電位をＥ１（Ｖ）よりも低いＥ２（Ｖ）とし、誘電体層の第１の面から生体試料を脱離させる。
【００２８】
（培養工程）
本発明の細胞培養装置における培養容器内に培養液を収容した状態で、加電圧機構により、第２の電極に対する第１の電極の電位をＥ１（Ｖ）として培養を行う。これにより、誘電体層の第１の面の細胞吸着性が良好になることで、細胞が誘電体層の第１の面に吸着した状態で増殖して組織化された生体試料が得られる。
【００２９】
図１に例示した細胞培養装置１を用いる場合、図２（Ａ）に示すように、培養容器１０内に培養液１００を収容した状態で、加電圧機構１８により、第２の電極１６に対する第１の電極１４の電位をＥ１（Ｖ）として培養を行う。これにより、培養容器１０内の誘電体層１２の第１の面１２ａに吸着した状態の生体試料１１０が得られる。
【００３０】
培養工程における第２の電極に対する第１の電極の電位Ｅ１（Ｖ）は、培養する細胞の種類に応じて適宜決定することができる。
細胞は通常負電荷を帯びている。そのため、電位Ｅ１（Ｖ）を正電位とし、誘電体層の第１の面の表面電位が正電位となって該第１の面が正電荷を帯びると、細胞との静電的な相互作用によって細胞の吸着性が高まる。
誘電体層の第１の面が疎水性で細胞の吸着性が高い場合には、電位Ｅ１（Ｖ）を０（Ｖ）としてもよい。
【００３１】
また、細胞には、静電吸着に比べると吸着に時間を要するが、表面電位が低くなるにつれてその表面に対する細胞の生物学的な吸着性が高まるものがある。このような細胞を培養する場合、培養中において、誘電体層の第１の面と細胞との静電的な反発力よりも生物学的な吸着力が優勢となる範囲であれば、電位Ｅ１（Ｖ）を負電位としてもよい。
培養工程においては、培養初期において細胞が誘電体層の第１の面に吸着しやすく、細胞の組織化が促進されやすくなる点から、電位Ｅ１（Ｖ）を正電位とすることが好ましい。
【００３２】
培養に用いる細胞としては、特に限定されず、例えば、歯肉線維芽細胞、歯周靭帯細胞、表皮細胞、線維芽細胞、肝実質細胞、肝非実質細胞（内皮細胞、クッパー細胞、星細胞等）、骨芽細胞、上皮細胞、軟骨細胞、神経細胞、筋細胞、間葉系幹細胞、膵島細胞、マクロファージ、各種の腫瘍細胞や機能細胞等が挙げられる。培養に用いる細胞は、人工細胞であってもよい。
【００３３】
培養液に用いる液体培地としては、特に限定されず、培養する細胞に応じた公知の液体培地を使用できる。
【００３４】
（脱離工程）
培養終了後、加電圧機構により、第２の電極に対する第１の電極の電位をＥ１（Ｖ）よりも低いＥ２（Ｖ）とする。これにより、誘電体層の第１の面に吸着した状態で組織化された生体試料が該第１の面から脱離する。
図１に例示した細胞培養装置１を用いる場合、図２（Ｂ）に示すように、加電圧機構１８により、第２の電極１６に対する第１の電極１４の電位をＥ１（Ｖ）よりも低いＥ２（Ｖ）とし、誘電体層１２の第１の面１２ａから生体試料１１０を脱離させる。
【００３５】
脱離工程における第２の電極に対する第１の電極の電位Ｅ２（Ｖ）は、培養工程における第２の電極に対する第１の電極の電位Ｅ１（Ｖ）よりも低くする。
培養工程で電位Ｅ１（Ｖ）を正電位とし、静電的な相互作用によって誘電体層の第１の面に細胞を吸着させた場合、脱離工程では電位Ｅ２（Ｖ）を負電位とすることが好ましい。これにより、誘電体層の負電荷を帯びた第１の面との静電反発の影響により、該第１の面から生体試料を容易に脱離させることができる。
【００３６】
誘電体層の第１の面が疎水性で、培養工程で電位Ｅ１（Ｖ）を０（Ｖ）としていた場合は、脱離工程では電位Ｅ２（Ｖ）を負電位とする。これにより、誘電体層の第１の面から生体試料を脱離させることができる。この場合、負電荷を帯びた第１の面と生体試料の静電反発による効果に加えて、エレクトウェッティングによって第１の面に対する水の濡れ性が向上し、第１の面と生体試料との間に水分子が浸入してくることが生体試料の脱離に影響すると考えられる。
【００３７】
培養工程で電位Ｅ１（Ｖ）を負電位とし、生物学的な吸着力によって誘電体層の第１の面に細胞を吸着させた場合、脱離工程では生物学的な吸着力よりも静電的な反発力が優勢となるまで電位Ｅ２（Ｖ）を低くする。これにより、誘電体層の第１の面から生体試料を脱離させることができる。
【００３８】
脱離工程で誘電体層の第１の面から脱離させた生体試料の用途は、特に限定されない。例えば、脱離させた生体試料を不織布等により保持して搬送し、患部に配置することで、該患部の治療に利用できる。
本発明の生体試料製造方法では、細胞シートを製造することが好ましい。
【００３９】
以上説明したように、本発明では、誘電体層の第１の面の表面電位を調節し、該第１の面の表面性状を変化させて細胞の接着性を変化させることにより、該第１の面への細胞の脱着を制御できる。そのため、培養時に細胞を誘電体層の第１の面に吸着させてその組織化を促進でき、また得られた生体試料を細胞本来の機能を損なわずに脱離させることができる。また、本発明では、細胞の脱着が温度に影響されないため、観察や培地交換等の際に培養途中の細胞が意図せず脱離することも抑制できる。また、本発明では、誘電体層の第１の面の表面電位を調節して、該第１の面の表面性状を細胞ごとに吸着に適した条件に調節できるため、様々な種類の細胞を培養して生体試料を製造することができる。さらに、本発明では、熱や光や振動等の刺激を与えずに低負荷で生体試料を回収できるため、生体試料が有する本来の機能が損なわれることも抑制できる。
【実施例】
【００４０】
以下、実施例によって本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の記載によっては限定されない。
［例１］
（塗布液の調製）
ＣＹＴＯＰ（登録商標、旭硝子社製）を用い、その濃度が０．９質量％となるようにＣＴ−ｓｏｌｖ１００Ｅ（旭硝子社製）に溶解させ、塗布液を調製した。
（評価用デバイスの作製）
ガラス基板上に、電極として厚み１５０ｎｍ、シート抵抗値１０Ω／ｃｍ２のＩＴＯを成膜した。さらに電極上に、スピンコートにより前記塗布液を塗布し、厚み０．５μｍの誘電体層を形成した。スピンコートにおいては、ガラス基板を５００ｒｐｍで１０秒スピンさせた後に、１０００ｒｐｍで２０秒スピンさせた。
次いで、底面部に直径３５ｍｍの貫通穴が形成されたポリスチレンシャーレを、前記誘電体層上に接着剤を用いて接着し、内底面が誘電体層で形成された凹部を備える評価用デバイスを作製した。
【００４１】
［タンパク質接着性試験］
評価用デバイスの細胞接着性を簡易的に評価するために、接着性に関して細胞と同様の挙動を示すと考えられるタンパク質の接着性を測定して評価を行った。測定には、Advances in Polymer Science 57 Polymers in Medicine.（洋書）とSurface modification of polymers for medical applications. Biomaterials 1994. Vol.15 No.10 725-736を参考にした。
（１）発色液、タンパク質溶液の準備
発色液として、ペルオキシダーゼ発色液（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）、ＫＰＬ社製）の５０ｍＬと、ＴＭＢ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）の５０ｍＬとを混合したものを使用した。
タンパク質溶液として、タンパク質（ＰＯＤ−ｇｏａｔ  ａｎｔｉ  ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ、Ｂｉｏｒａｄ社）をリン酸緩衝溶液（Ｄ−ＰＢＳ、Ｓｉｇｍａ社製）で１６，０００倍に希釈したものを使用した。
（２）タンパク質吸着
評価用デバイスの凹部内にタンパク質溶液の３ｍＬを分注し、対向電極を配置して評価用デバイスに３Ｖの電圧を印加し、評価用デバイスの電極電位を３Ｖとして、室温で１時間放置してタンパク質を吸着させた。また、これとは別に、評価用デバイスの電極電位を−３Ｖとする以外は同様の操作を行った。また、評価用デバイスに電圧を印加せず、評価用デバイスの電極電位を０Ｖとしたものについても、上記と同様に室温で１時間放置した。これらにおいては、評価用デバイスの凹部の内底面の表面電位は、電極電位と同等であると見なせる。
ブランクとして、タンパク質溶液を９６ウェルマイクロプレートにおける３ウェルに、１ウェル毎に２μＬ分注した。
（３）ウェル洗浄
タンパク質を吸着させた評価用デバイスの凹部を、界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ２０、和光純薬社製）を０．０５質量％含ませたリン酸緩衝溶液（Ｄ−ＰＢＳ、Ｓｉｇｍａ社製）の４ｍＬで４回洗浄した（１６ｍＬ使用）。
（４）発色液分注
洗浄を終えた評価用デバイスの凹部に、発色液の３ｍＬを分注し、７分間発色反応を行った。２Ｎ硫酸の１．５ｍＬを加えることで発色反応を停止させた。
ブランクについては、９６ウェルマイクロプレートの３ウェルに、１ウェル毎に発色液の１００μＬを分注して７分間発色反応を行った後、１ウェル毎に２Ｎ硫酸の５０μＬを加えることで発色反応を停止させた。
（５）吸光度測定準備
評価用デバイスの凹部から１５０μＬの液を取り、９６ウェルマイクロプレートに移した。
（６）吸光度測定およびタンパク質吸着率Ｑ
吸光度は、ＭＴＰ−８１０Ｌａｂ（コロナ電気社製）により４５０ｎｍの吸光度を測定した。ブランクの吸光度の平均値（Ｎ＝３）をＡ０とした。凹部の内底面の表面電位（評価用デバイスの電極電位）を３Ｖ、−３Ｖ、０Ｖとしたもののそれぞれについて、評価用デバイスから９６ウェルマイクロプレートに移動させた液の吸光度をＡ１とした。
タンパク質吸着率Ｑを下式により求めた。
Ｑ＝Ａ１／｛Ａ０×（１００／ブランクのタンパク質溶液の分注量）｝×１００
＝Ａ１／｛Ａ０×（１００／２μＬ）｝×１００  ［％］
結果を図３に示す。
【００４２】
図３に示すように、例１の評価用デバイスにおいては、凹部の内底面の表面電位（評価用デバイスの電極電位）が−３Ｖ、０Ｖ、３Ｖの順でタンパク質吸着率Ｑが高くなった。この結果は、誘電体層の第１の面の表面電位を制御することにより、培養中の細胞の該第１の面への吸着性を制御できることを示すものである。
【００４３】
［タンパク質脱着試験］
（１）タンパク質吸着
評価用デバイスの凹部に、前記タンパク質溶液の３ｍＬを分注し、対向電極を配置して評価用デバイスに３Ｖの電圧を印加し、凹部の内底面の表面電位（評価用デバイスの電極電位）を３Ｖとして、室温で１時間放置してタンパク質を吸着させた。
ブランクとして、前記タンパク質溶液を９６ウェルマイクロプレートにおける３ウェルに、１ウェル毎に２μＬ分注した。
（２）タンパク質脱着
タンパク質を吸着させた評価用デバイスに−３Ｖの電圧を印加し、凹部の内底面の表面電位（評価用デバイスの電極電位）を−３Ｖとして、室温で１分間静置した。次いで、界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ２０、和光純薬社製）を０．０５質量％含ませたリン酸緩衝溶液（Ｄ−ＰＢＳ、Ｓｉｇｍａ社製）の４ｍＬで凹部を４回洗浄した。
また、凹部の内底面の表面電位を−３Ｖとした状態での静置時間を０分間、５分間、１０分間としたものについても、同様にして行った。なお、前記静置時間が０分間であるとは、凹部の内底面の表面電位（評価用デバイスの電極電位）を０Ｖとして洗浄を行ったことを意味する。
（３）発色液分注、吸光度測定準備、吸光度測定およびタンパク質吸着率Ｑ
前記［タンパク質接着性試験］の（４）〜（６）と同様にして、静置時間を０分間、１分間、５分間、１０分間としたもののそれぞれについて、タンパク質吸着率Ｑを測定した。
結果を図４に示す。
【００４４】
図４に示すように、例１の評価用デバイスにおいては、タンパク質を吸着させた後、凹部の内底面の表面電位（評価用デバイスの電極電位）を−３Ｖとする静置時間を１０分間としたとき、静置時間０Ｖの場合に比べてタンパク質吸着率Ｑが有意に低くなった。この結果は、誘電体層の第１の面の表面電位を制御することにより、培養後に細胞の該第１の面への吸着性を制御して、生体試料を任意のタイミングで脱離させることが可能なことを示すものである。
【符号の説明】
【００４５】
１  細胞培養装置
１０  培養容器
１０ａ  内底面
１２  誘電体層
１２ａ  第１の面
１２ｂ  第２の面
１４  第１の電極
１６  第２の電極
１８  加電圧機構
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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