(57)【要約】【課題】血液脳関門を透過することができる新規ペプチド、並びに前記ペプチドを含む薬物輸送体、血液脳関門透過剤、及び血管内皮細胞透過剤を提供する。【解決手段】（ｉ）ＭＭＡＴＧＫＬＬＶＳＹＡＰＰＧＡＤ（配列番号：１）で表されるアミノ酸配列、（ｉｉ）前記配列番号：１で表されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、かつ、長さが少なくとも１６アミノ酸残基であるアミノ酸配列のいずれかを含むペプチド、（ｉｉｉ）ＲＩＶＶＰＬＳＴＰＲＥＭＤＩＬＧＦＶＳＡＣＮＤＦＳＶＲＬＬＲＤＴＴＨ（配列番号：２で表されるアミノ酸配列、及び（ｉｖ）前記配列番号：２で表されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、かつ、長さが少なくとも３３アミノ酸残基であるアミノ酸配列のいずれかを含むペプチドである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）  下記配列番号：１で表されるアミノ酸配列、及び
（ｉｉ）  下記配列番号：１で表されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、かつ、長さが少なくとも１６アミノ酸残基であるアミノ酸配列
のいずれかを含むことを特徴とするペプチド。
ＭＭＡＴＧＫＬＬＶＳＹＡＰＰＧＡＤ（配列番号：１）
【請求項２】
（ｉｉｉ）  下記配列番号：２で表されるアミノ酸配列、及び
（ｉｖ）  下記配列番号：２で表されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、かつ、長さが少なくとも３３アミノ酸残基であるアミノ酸配列
のいずれかを含むことを特徴とするペプチド。
ＲＩＶＶＰＬＳＴＰＲＥＭＤＩＬＧＦＶＳＡＣＮＤＦＳＶＲＬＬＲＤＴＴＨ（配列番号：２）
【請求項３】
請求項１から２のいずれかに記載のペプチドを含むことを特徴とする薬物輸送体。
【請求項４】
更に、担体を含む請求項３に記載の薬物輸送体。
【請求項５】
前記担体が、巨大分子、微小集合体、微小粒子、ミクロスフェア、ナノスフェア、リポソーム、及びエマルジョンから選択される少なくともいずれかである請求項４に記載の薬物輸送体。
【請求項６】
前記担体の内部に、診断、予防、及び治療の少なくともいずれかを行うための薬物が担持される請求項４から５のいずれかに記載の薬物輸送体。
【請求項７】
請求項１から２のいずれかに記載のペプチドを含むことを特徴とする血液脳関門透過剤。
【請求項８】
請求項１から２のいずれかに記載のペプチドを含むことを特徴とする血管内皮細胞透過剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液脳関門を透過可能なペプチド、並びに前記ペプチドを含む薬物輸送体、血液脳関門透過剤、及び血管内皮細胞透過剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
中枢神経系における血液脳関門（ＢＢＢ；ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ）は、血管内皮細胞などが密集しており物理的に狭くなっていることや、これらの細胞の生理学的機能などにより、中枢神経系への物質の取り込みが非常に制限されている。この血液脳関門の透過の機構は未だ解明されておらず、中枢神経系に障害が生じても、薬物を中枢神経系の目的とする領域に到達させることができないのが現状である。
【０００３】
中枢神経系の障害としては、例えば、ポリオウイルス、日本脳炎ウイルスなどによる感染症、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病等の神経変性疾患などが挙げられる。中枢神経系における感染症に対しては、ワクチン投与による予防、感染後は対症療法が主流となっており、有効な治療方法は未だ見出されていない。
例えば、ポリオウイルスに対する治療薬としてはクエン酸及び／又は亜鉛及びＬ−アルギニンを可能な担体とともに含有する抗ウイルス剤組成物（特許文献１参照）や、セレギリンを有効成分とする抗ウイルス剤（特許文献２参照）などの治療薬も提案されているが、これらの抗ウイルス剤を用いても、血液脳関門を透過することができない点で問題である。
【０００４】
近年、薬物のより安全でより有効な利用を図るため、薬物に適した剤型だけでなく、薬物を標的となる生体内の部位に効率よく薬物送達（ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ）する方法が注目されている。特に、薬物を必要な時に必要な量を必要な場所へ効率よく運ぶ輸送システムとして薬物送達システム（ＤＤＳ；Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ）の実用化が求められている。
中枢神経系においては、ウイルスベクターを用いた方法が提案されている（例えば、特許文献３参照）。しかし、この方法は、安全性の面で問題であり、実用化には至っていない。  
【０００５】
これまでに、ポリオウイルスがトランスフェリンレセプターを介して血液脳関門を透過することを見出し、この知見から、血液脳関門を透過するペプチドが提案されている（例えば、特許文献４参照）。
しかしながら、血液脳関門の透過は、トランスフェリンレセプターを介する経路に限られるものではないため、前記提案のペプチドとは異なる新たな技術の開発も強く求められているのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００９−２９８８００号公報
【特許文献２】特開２００４−２９２３９９号公報
【特許文献３】特開２００９−１５９９８８号公報
【特許文献４】国際公開第２０１２／１０５５９５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、血液脳関門を透過することができる新規ペプチド、並びに前記ペプチドを含む薬物輸送体、血液脳関門透過剤、及び血管内皮細胞透過剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討した結果、ポリオウイルスの外殻タンパク質であるＶＰ３が、血管内皮細胞を効率よく透過することを知見し、本発明の完成に至った。
【０００９】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞  （ｉ）  下記配列番号：１で表されるアミノ酸配列、及び
（ｉｉ）  下記配列番号：１で表されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、かつ、長さが少なくとも１６アミノ酸残基であるアミノ酸配列
のいずれかを含むことを特徴とするペプチドである。
ＭＭＡＴＧＫＬＬＶＳＹＡＰＰＧＡＤ（配列番号：１）
＜２＞  （ｉｉｉ）  下記配列番号：２で表されるアミノ酸配列、及び
（ｉｖ）  下記配列番号：２で表されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、かつ、長さが少なくとも３３アミノ酸残基であるアミノ酸配列
のいずれかを含むことを特徴とするペプチドである。
ＲＩＶＶＰＬＳＴＰＲＥＭＤＩＬＧＦＶＳＡＣＮＤＦＳＶＲＬＬＲＤＴＴＨ（配列番号：２）
＜３＞  前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載のペプチドを含むことを特徴とする薬物輸送体である。
＜４＞  前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載のペプチドを含むことを特徴とする血液脳関門透過剤である。
＜５＞  前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載のペプチドを含むことを特徴とする血管内皮細胞透過剤である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、血液脳関門を透過することができる新規ペプチド、並びに前記ペプチドを含む薬物輸送体、血液脳関門透過剤、及び血管内皮細胞透過剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ】図１Ａは、試験例１におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により、タンパク質のサイズを確認した結果を示す図である。図１Ａ中、「Ｃｏｎ．」はコントロールの融合タンパク質を確認した結果を示し、「ＶＰ１」はポリオウイルス外殻タンパク質であるＶＰ１を含む融合タンパク質を確認した結果を示し、「ＶＰ２」はポリオウイルス外殻タンパク質であるＶＰ２を含む融合タンパク質を確認した結果を示し、「ＶＰ３」はポリオウイルス外殻タンパク質であるＶＰ３を含む融合タンパク質を確認した結果を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、試験例１における免疫染色の結果を示す図である。
【図２Ａ】図２Ａは、試験例２−１におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により、タンパク質のサイズを確認した結果を示す図である。図２Ａ中、「Ｍ」はマーカーを示し、「Ｃｏｎ．」はコントロールの融合タンパク質を確認した結果を示し、「Ｎ１」〜「Ｎ６」は、それぞれＮ１〜Ｎ６を含む融合タンパク質を確認した結果を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、試験例２−１における蛍光定量の結果を示す図である。
【図２Ｃ】図２Ｃは、試験例２−２における免疫染色の結果を示す図である。
【図３】図３は、試験例３におけるフローサイトメトリーの結果を示す図である。
【図４】図４は、試験例４におけるフローサイトメトリーの結果を示す図である。
【図５Ａ】図５Ａは、試験例５において、阻害剤として、ＣＰＺを用いた場合の結果を示す図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、試験例５において、阻害剤として、Ｄｙｎａｓｏｒｅを用いた場合の結果を示す図である。
【図５Ｃ】図５Ｃは、試験例５において、阻害剤として、ＥＩＰＡを用いた場合の結果を示す図である。
【図６Ａ】図６Ａは、試験例６−１におけるフローサイトメトリーの結果を示す図である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、試験例６−２におけるフローサイトメトリーの結果を示す図である。
【図７Ａ】図７Ａは、試験例７−１におけるフローサイトメトリーの結果を示す図である。
【図７Ｂ】図７Ｂは、試験例７−２におけるフローサイトメトリーの結果を示す図である。
【図８】図８は、試験例８におけるフローサイトメトリーの結果を示す図である。
【図９Ａ】図９Ａは、試験例９における血管内皮細胞へのタンパク質の透過率を計測した結果を示す図である。
【図９Ｂ】図９Ｂは、試験例９における脳側へのタンパク質の透過率を計測した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（ペプチド）
本発明のペプチドは、下記（ｉ）〜（ｉｖ）で表されるアミノ酸配列のいずれかを少なくとも含み、必要に応じて更にその他のアミノ酸配列を含む。
前記ペプチドは、血液脳関門や血管内皮細胞を透過する機能を有する。
（ｉ）  下記配列番号：１で表されるアミノ酸配列
（ｉｉ）  下記配列番号：１で表されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、かつ、長さが少なくとも１６アミノ酸残基であるアミノ酸配列
（ｉｉｉ）  下記配列番号：２で表されるアミノ酸配列
（ｉｖ）  下記配列番号：２で表されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、かつ、長さが少なくとも３３アミノ酸残基であるアミノ酸配列
ＭＭＡＴＧＫＬＬＶＳＹＡＰＰＧＡＤ（配列番号：１）
ＲＩＶＶＰＬＳＴＰＲＥＭＤＩＬＧＦＶＳＡＣＮＤＦＳＶＲＬＬＲＤＴＴＨ（配列番号：２）
【００１３】
前記ペプチドとしては、前記（ｉ）〜（ｉｖ）のアミノ酸配列のいずれかを少なくとも含み、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記ペプチドは、前記（ｉ）〜（ｉｖ）のアミノ酸配列のいずれかのみからなるものであってもよい。
【００１４】
前記（ｉ）のアミノ酸配列を含むペプチドの長さの上限としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２５０アミノ酸残基以下が好ましく、５０アミノ酸残基以下がより好ましく、２５アミノ酸残基以下が特に好ましい。
【００１５】
前記（ｉ）のアミノ酸配列を含むペプチドの具体例としては、配列番号：５で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号：９で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（以下、「Ｎ４」と称することがある）、配列番号：１２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（以下、「Ｎ４−２」と称することがある）、配列番号：１３で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（以下、「Ｎ４−３」と称することがある）、配列番号：１４で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（以下、「Ｎ４−４」と称することがある）、配列番号：１５で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（以下、「Ｎ４−５」と称することがある）、配列番号：１６で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（以下、「Ｎ４−６」と称することがある）、配列番号：１７で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（以下、「Ｎ４−７」と称することがある）、配列番号：１８で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（以下、「Ｎ４−８」と称することがある）などが挙げられる。
なお、前記（ｉ）のアミノ酸配列からなるペプチドは、以下、「Ｎ４−９」と称することがある。
【００１６】
前記（ｉｉ）のアミノ酸配列としては、前記配列番号：１で表されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、かつ、長さが少なくとも１６アミノ酸残基であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記配列番号：１で表されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が、置換、欠失、付加、又は挿入されたアミノ酸配列などが挙げられる。
【００１７】
前記（ｉｉ）のアミノ酸配列における、前記配列番号：１で表されるアミノ酸配列に対する配列同一性としては、少なくとも８０％であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、８１％以上が好ましく、８７％以上がより好ましく、９３％以上が特に好ましい。
【００１８】
前記（ｉｉ）のアミノ酸配列を含むペプチドの長さとしては、少なくとも１６アミノ酸残基であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１６アミノ酸残基以上２５０アミノ酸残基以下が好ましく、１６アミノ酸残基以上５０アミノ酸残基以下がより好ましく、１６アミノ酸残基以上２５アミノ酸残基以下が特に好ましい。
【００１９】
前記（ｉｉ）のアミノ酸配列を含むペプチドの具体例としては、配列番号：２２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（以下、「Ｎ４−９−ｍ１」と称することがある）、配列番号：２３で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（以下、「Ｎ４−９−ｍ２」と称することがある）、配列番号：２４で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（以下、「Ｎ４−９−ｍ３」と称することがある）、配列番号：２５で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（以下、「Ｎ４−９−ｍ４」と称することがある）、配列番号：２６で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（以下、「Ｎ４−９−ｍ５」と称することがある）、配列番号：２７で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（以下、「Ｎ４−９−ｍ６」と称することがある）、配列番号：２８で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（以下、「Ｎ４−９−ｍ７」と称することがある）、配列番号：２９で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（以下、「Ｎ４−９−ｍ８」と称することがある）、配列番号：３０で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（以下、「Ｎ４−９−ｍ９」と称することがある）などが挙げられる。
【００２０】
前記（ｉｉｉ）のアミノ酸配列を含むペプチドの長さの上限としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２５０アミノ酸残基以下が好ましく、７５アミノ酸残基以下がより好ましく、４０アミノ酸残基以下が特に好ましい。
【００２１】
前記（ｉｉｉ）のアミノ酸配列を含むペプチドの具体例としては、配列番号：５で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号：１１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（以下、「Ｎ６」と称することがある）、配列番号：３１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（以下、「Ｎ６−２」と称することがある）、配列番号：３３で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（以下、「Ｎ６−４」と称することがある）、配列番号：３７で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（以下、「Ｎ６−８」と称することがある）、配列番号：３８で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（以下、「Ｎ６−９」と称することがある）などが挙げられる。
なお、前記（ｉｉｉ）のアミノ酸配列からなるペプチドは、以下、「Ｎ６−１０」と称することがある。
【００２２】
前記（ｉｖ）のアミノ酸配列としては、前記配列番号：２で表されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、かつ、長さが少なくとも３３アミノ酸残基であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記配列番号：２で表されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が、置換、欠失、付加、又は挿入されたアミノ酸配列などが挙げられる。
【００２３】
前記（ｉｖ）のアミノ酸配列における、前記配列番号：２で表されるアミノ酸配列に対する配列同一性としては、少なくとも８０％であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、９０％以上が好ましく、９３％以上がより好ましく、９６％以上が特に好ましい。
【００２４】
前記（ｉｖ）のアミノ酸配列を含むペプチドの長さとしては、少なくとも３３アミノ酸残基であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、３３アミノ酸残基以上２５０アミノ酸残基以下が好ましく、３３アミノ酸残基以上７５アミノ酸残基以下がより好ましく、３３アミノ酸残基以上４０アミノ酸残基以下が特に好ましい。
【００２５】
前記（ｉｖ）のアミノ酸配列を含むペプチドの具体例としては、配列番号：３２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（以下、「Ｎ６−３」と称することがある）、配列番号：３４で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（以下、「Ｎ６−５」と称することがある）、配列番号：３５で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（以下、「Ｎ６−６」と称することがある）、配列番号：４０で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（以下、「Ｎ６−１０−ｍ１」と称することがある）、配列番号：４１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（以下、「Ｎ６−１０−ｍ２」と称することがある）、配列番号：４２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（以下、「Ｎ６−１０−ｍ３」と称することがある）などが挙げられる。
【００２６】
前記（ｉ）〜（ｉｖ）のアミノ酸配列を含むペプチドの中でも、血液脳関門の透過能が優れる点で、前記（ｉ）又は（ｉｉ）のアミノ酸配列を含むペプチドが好ましい。
【００２７】
また、前記ペプチドは、Ｎ末端若しくはＣ末端に化学修飾が施されたものであってもよい。前記化学修飾としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、アセチル化、ミリストイル化、アミド化、シスチニル化などが挙げられる。
【００２８】
前記ペプチドの調製方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、化学合成する方法、ポリオウイルス（ＰＶ；Ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ）の遺伝子配列に基づき分子生物学的手法により得る方法などが挙げられる。
【００２９】
前記ペプチドの化学合成の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ペプチド合成装置（例えば、株式会社島津製作所製）を用いて化学合成する方法などが挙げられる。
【００３０】
前記ポリオウイルスの遺伝子配列に基づき分子生物学的手法により得る方法としては、特に制限はなく、前記ペプチドの配列などに応じて適宜選択することができ、例えば、ポリオウイルスから調製したゲノムＲＮＡを逆転写酵素によってｃＤＮＡとして合成したものを鋳型とし、ＰＣＲ法により増幅させ、クローニングする方法などが挙げられる。
前記ＰＣＲ法の条件や用いるプライマーとしては、特に制限はなく、前記ペプチドの配列などに応じて適宜選択することができる。
【００３１】
−その他の配列−
前記その他の配列としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、リンカー、タンパク質、タグなどが挙げられる。
前記リンカーは、例えば、前記ペプチドと、前記タンパク質との間に設けることができ、その配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、配列番号：４４で表されるアミノ酸配列などが挙げられる。
前記タンパク質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＧＳＴタンパク質、ＧＦＰ、Ｖｅｎｕｓタンパク質などのＧＦＰ類縁体などが挙げられる。
前記タグとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓタグなどが挙げられる。
前記その他の配列は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよいし、使用しなくてもよい。
【００３２】
＜用途＞
前記ペプチドの用途としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、後述する本発明の薬物輸送体、血液脳関門透過剤、血管内皮細胞透過剤などに好適に用いることができる。
【００３３】
（薬物輸送体）
本発明の薬物輸送体は、本発明のペプチドを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
【００３４】
＜ペプチド＞
前記ペプチドは、上記した本発明のペプチドであり、好ましい態様も同様である。
前記ペプチドの薬物輸送体における含有量としては、薬物を輸送することができる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００３５】
前記ペプチドにおいて、後述する担体や薬物などのその他の成分が配位する部位としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、前記ペプチドのＮ末端、Ｃ末端などが挙げられる。
【００３６】
＜その他の成分＞
前記その他の成分としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、担体、薬物、添加剤、補助剤、水などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【００３７】
−担体−
前記担体の形態としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記薬物を、膜で形成された閉鎖空間内に内包した形態、膜間に内包した形態、膜内に包含した形態などが挙げられ、これらの組合せによる形態であってもよい。このように、前記担体としては様々な形態が考えられ、したがって「担持」は、その形態により、内包、封入、相互作用などを広く意味する。
前記担体の形態の具体例としては、巨大分子、微小集合体、微小粒子、ミクロスフェア、ナノスフェア、リポソーム、エマルジョンなどが挙げられる。
前記担体としては、特に制限はなく、医薬製剤の分野で公知のものの中から目的に応じて適宜選択することができる。
【００３８】
前記担体の薬物輸送体における量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００３９】
−薬物−
前記薬物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、予防、治療、及び診断の少なくともいずれかを行うための薬物や、その他の薬理学的に許容し得る薬理的活性物質、生理的活性物質、診断用物質などが挙げられる。
前記薬物の性質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、親水性の薬物であってもよく、疎水性の薬物であってもよい。
前記薬物は、前記ペプチドに担持されて輸送されてもよいし、前記担体に担持されて輸送されてもよいし、両者に担持されて輸送されてもよい。
【００４０】
前記薬物の種類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、核酸、ポリヌクレオチド、遺伝子、及びこれらの類縁体；グリコサミノグリカン及びその誘導体；オリゴ糖、多糖、及びこれらの誘導体；タンパク質及びペプチド等の生理活性的物質や、抗神経剤；抗ウイルス剤；抗がん剤；抗生物質；酵素剤；抗酸化剤；抗炎症剤；ステロイド剤；アンジオテンシン変換酵素阻害剤；血管拡張剤；平滑筋細胞の増殖及び／又は遊走阻害剤；血小板凝集阻害剤；抗凝固剤；ケミカルメディエーターの遊離抑制剤；免疫抑制剤；脂質取込み阻害剤；ホルモン剤；アンジオテンシン受容体拮抗剤；血管内皮細胞の増殖又は抑制剤；アルドース還元酵素阻害剤；メサンギウム細胞増殖阻害剤；リポキシゲナーゼ阻害剤；免疫賦活剤；メイラード反応抑制剤；アミロイドーシス阻害剤；一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ；：Ｎｉｔｒｉｃ  Ｏｘｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈａｓｅ）阻害剤；終末糖化産物（ＡＧＥｓ；Ａｄｖａｎｃｅｄ  ｇｌｙｃａｔｉｏｎ  ｅｎｄｐｒｏｄｕｃｔｓ）阻害剤；ラジカルスカベンジャー等の薬理的活性物質などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
前記薬物輸送体は、血液脳関門を好適に透過できることから、これらの薬物の中でも、中枢神経系の治療及び／又は診断に用いることができる薬物が好ましい。
【００４１】
前記抗神経剤の具体例としては、コンスタン、セパゾン、セルシン、セレナール、ソラナックス、デパス、バランス、メイラックス、リーゼ、リボトリール、レキソタン、ワイバックス、セディール、グランダキシン、エリスパン等の抗不安剤；アナフラニール、トフラニール、トリプタノール、アモキサン、アンプリット、プロチアデン、テシプール、テトラミド、ルジオミール、デジレル、レスリン、アビリット、ドグマチール、ミラドール、リタリン、デプロメール、パキシル、ルボックス、トレドミン等の抗うつ剤；アモバン、ハルシオン、エバミール、マイスリー、リスミー、レンドルミン、ロラメット、サイレース、ドラール、ベンザリン、ユーロジン、ロヒプノール、インスミン、ソメリン、ダルメート、フェノバール、イソミタール等の抗不眠剤；ウインタミン、コントミン、ニューレプチル、ヒルナミン、ＰＺＣ、メレリル、インプロメン、セレネース、オーラップ、クレミン、クロフェクトン、デフェクトン、ホーリット、ロドピン、アタラックス等の精神安定剤；リーマス、テグレトール等の躁鬱剤；エトトイン、フェニトイン、アセチルフェネトライド、プリミドン、スルチアム、エトスクシミド、クロナゼパム、カルバマゼピン、バルプロ酸ナトリウム、ゾニサミド等の抗てんかん剤；レボドパ剤、メシル酸ペルゴリド、塩酸アマンダジン、塩酸トリヘキシフェニジル、塩酸ピロヘプチン、塩酸マザチコ−ル、塩酸メチキセン、ビペリデン、プロフェナミン、ドロキシドパ等のパーキンソン病治療剤などが挙げられる。
【００４２】
前記抗ウイルス剤の具体例としては、アシクロビル、ガンシクロビル、ジダノシン、ジドブジン、ソリブジン、ビダラビンなどが挙げられる。
【００４３】
前記抗がん剤の具体例としては、シクロフォスファミド、イフォスファミド、塩酸ナイトロジェンマスタード−Ｎ−オキシド、チオテパ、ブルスファン、カルボコン、塩酸ニムスチン、ラニムスチン、メルファラン、トシル酸インプロスルファン、ダカルバジン、塩酸プロカルバジン、シタラビン、シタラビンオクスファート、エノシタビン、メルカプトプリン、チオイノシン、フルオロウラシル、ドキシフルリジン、テガフール、メトトレキサート、カルモフール、ヒドロキシカルバミド、硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンデシン、エトポシド、クロモマイシンＡ３、塩酸ダウノルビシン、塩酸ドキソルビシン、塩酸アラクルビシン、ピラルビシン、塩酸エピルビシン、ダクチノマイシン、塩酸ミトキサントロン、塩酸ブレオマイシン、硫酸ペプロマイシン、マイトマイシンＣ、ネオカルノスタチン、Ｌ−アスパラギナーゼ、アセグラトンミトプロニトール、デキストラン硫酸ナトリウム、酢酸オクトレオチド、シスプラチン、カルボプラチン、クエン酸タモキシフェン、酢酸メドロキシプロゲステロン、リン酸エストラムスチンナトリウム、酢酸ゴセレリン、酢酸リュープロレリンなどが挙げられる。
【００４４】
前記抗生物質の具体例としては、ベンジルペニシリンカリウム、ベンジルペニシリンベンザチン、フェノキシメチルペニシリンカリウム、フェネチシリンカリウム、クロキサシリンナトリウム、フルクロキサシリンナトリウム、アンピシリン、トシル酸スルタミシリン、塩酸バカンピシリン、塩酸タランピシリン、レナンピシリン、ヘタシリンカリウム、シクラシリン、アモキシシリン、塩酸ピブメシリナム、アスポキシシリン、カルベニシリンナトリウム、カリンダシリンナトリウム、スルベニシリンナトリウム、チカルシリンナトリウム、ピペラシリンナトリウム、セファロリジン、セファロチンナトリウム、セファゾリンナトリウム、セファピリンナトリウム、セフラジン、セファレキシン、セファトリジンプロピレングリコール、セフロキサジン、セファクロル、セファドロキシル、塩酸セフォチアム、塩酸セフォチアムヘキセチル、セフロキシムナトリウム、セフロキシムアキセチル、セファマンドールナトリウム、セフジニル、塩酸セフェタメトピポキシル、セフチプテン、セフメタゾールナトリウム、セフォキシチンナトリウム、セフォテタンナトリウム、セフミノクスナトリウム、セフプペラゾンナトリウム、セフピラミドナトリウム、セフスロジンナトリウム、セフォタキシムナトリウム、セフォペラゾンナトリウム、セフチゾキシムナトリウム、塩酸セフメノキシム、セフトリアキソンナトリウム、セフタジジム、セフピミゾールナトリウム、セフィキシム、セフテラムピポキシル、セフゾナムナトリウム、セフポドキシプロキセチル、セフォジジム、硫酸セフピロム、ラタモキセフナトリウム、フロモキセフナトリウム、イミペネム、シラスタチンナトリウム、アズトレオナム、カルモナムナトリウム、硫酸ステレプトマイシン、硫酸カナマイシン、硫酸フラジオマイシン、硫酸アミカシン、硫酸ゲンタマイシン、硫酸パロモマイシン、硫酸ペカナマイシン、硫酸リポスタマイシン、硫酸ジベカシン、トブラマイシン、硫酸シソマイシン、硫酸ミスロノマイシン、硫酸アストロマイシン、硫酸ネチルマイシン、硫酸イセパマイシン、硫酸アルベカシン、エリスロマイシン、キタサマイシン、アセチルキタサマイシン、リン酸オレアンドマイシン、ジョサマイシン、アセチルスピラマイシン、ミデカマイシン、酢酸ミデカマイシン、ロキタマイシン、ロキシスロマイシン、クラリスロマイシン、塩酸テトラサイクリン、塩酸オキシテトラサイクリン、メタリン酸テトラサイクリン、塩酸デメチルクロルテトラサイクリン、ロリテトラサイクリン、塩酸ドキシサイクリン、塩酸ミノサイクリン、クロラムフェニコール、コハク酸クロラムフェニコールナトリウム、パルミチン酸クロラムフェニコール、チアンフェニコール、塩酸アミノ酢酸チアンフェニコール、硫酸コリスチン、コリスチンメタンスルホン酸ナトリウム、硫酸ポリミキシンＢ、バシトラシン、塩酸バンコマイシン、塩酸リンコマイシン、クリンダマイシン、塩酸スペクチノマイシン、フォスフォマイシンナトリウム、フォスフォマイシンカルシウムなどが挙げられる。
【００４５】
前記酵素剤の具体例としては、キモトリプシン、結晶トリプシン、ストレプトキナーゼ・ストレプトドルナーゼ、ヒアルロニダーゼ、ウロキナーゼ、ナサルプラーゼ、アルテプラーゼ、塩化リゾチーム、セミアルカリプロティナーゼ、セラペプターゼ、チソキナーゼ、デュテプラーゼ、バトロキソビン、プロナーゼ、プロメラインなどが挙げられる。
【００４６】
前記抗酸化剤の具体例としては、トコフェロール、アスコルビン酸、尿酸などが挙げられる。
【００４７】
前記抗炎症剤の具体例としては、サリチル酸コリン、サザピリン、サリチル酸ナトリウム、アスピリン、ジフルニサル、フルフェナム酸、メフェナム酸、フロクタフェニン、トルフェナム酸、ジクロフェナクナトリム、トルメチンナトリウム、スリンダク、フェンブフェン、フェルビナクエチル、インドメタシン、インドメタシンファルネシル、アセメタシン、マレイン酸プログルメタシン、アンフェナクナトリウム、ナブメトン、イブプロフェン、フルルビプロフェン、フルルビプロフェンアキセチル、ケトプロフェン、ナプロキセン、プロチジン酸、プラノプロフェン、フェノプロフェンカルシウム、チアプロフェン酸、オキサプロジン、ロキソプロフェンナトリウム、アルミノプロフェン、ザルトプロフェン、フェニルブタゾン、クロフェゾン、ケトフェニルブタゾン、ピロキシカム、テノキシカム、アンピロキシカム、塩酸チアラミド、塩酸チノリジン、塩酸ベンジダミン、エピリゾール、エルモファゾンなどが挙げられる。
【００４８】
前記ステロイド剤の具体例としては、酢酸コルチゾン、ヒドロコルチゾン（リン酸エステル、酢酸塩）、酪酸ヒドロコルチゾン、コハク酸ヒドロコルチゾンナトリウム、プレドニゾロン（アセテート、サクシネート、第三級ブチル酢酸エステル、リン酸エステル）、メチルプレドニゾロン（アセテート）、コハク酸メチルプレドニゾロンナトリウム、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド（酢酸トリアムシノロン）、デキサメタゾン（リン酸エステル、酢酸塩、リン酸ナトリウム塩、硫酸エステル）、パルミチン酸デキサメタゾン、ベタメタゾン（リン酸塩、２ナトリウム塩）、酢酸パラメタゾン、酢酸フルドロコルチゾン、酢酸ハロプレドン、プロピオン酸クロベタゾール、ハルシノニド、プロピオン酸ベクロメタゾン、吉草酸ベタメタゾン、酢酸ベタメタゾン、酢酸コルチゾンなどが挙げられる。
【００４９】
前記アンジオテンシン変換酵素阻害剤の具体例としては、アラセプリル、塩酸イミダプリル、塩酸テモカプリル、塩酸デラプリル、塩酸ベナゼプリル、カプトプリル、シラザプリル、マレイン酸エナラプリル、リシノプリルなどが挙げられる。
【００５０】
前記血管拡張剤の具体例としては、テオフィリン、ジプロフィリン、プロキシフィリン、アミノフィリン、コリンテオフィリン、プロスタグランジン、プロスタグランジン誘導体、アルプロスタジルアルファデクス、アルプロスタジル、リマプロストアルファデクス、パパベリン、シクランデラート、シンナリジン、フマル酸ベンシクラン、マレイン酸シネパジド、塩酸ジラゼプ、トラピジル、塩酸ジフェニドール、ニコチン酸、イノシトールヘキサニコチネート、クエン酸ニカメタート、酒石酸ニコチニックアルコール、ニコチン酸トコフェロール、ヘプロニカート、塩酸イソクスプリン、硫酸バメタン、塩酸トラリゾン、メシル酸ジヒドロエルゴトキシン、酒石酸イフェンプロジル、塩酸モキシシリト、ニセルゴリン、塩酸ニカルジピン、ニルバジピン、ニフェジピン、塩酸ベニジピン、塩酸ジルチアゼム、ニソルジピン、ニトレンジピン、塩酸マニジピン、塩酸バルニジピン、塩酸エホニジピン、塩酸ベラパミル、塩酸トリメタジジン、カプトプリル、マレイン酸エナラプリル、アラセプリル、塩酸デラプリル、シラザプリル、リシノプリル、塩酸ベナゼプリル、塩酸ヒドララジン、塩酸トドララジン、ブドララジン、カドララジン、インダパミド、塩酸カルボクロメン、エフロキサート、塩酸エタフェノン塩酸オキシフェドリン、ニコランジル、亜硝酸アミル、硝酸イソソルビドなどが挙げられる。
【００５１】
前記平滑筋細胞の増殖及び／又は遊走阻害剤の具体例としては、ヘパリンナトリウム、ダルテパリンナトリウム（低分子ヘパリン）、ヘパリンカルシウム、デキストラン硫酸などが挙げられる。
【００５２】
前記血小板凝集阻害剤の具体例としては、塩酸チクロピジン、シロスタゾール、イコサペント酸エチル、ベラプロストナトリウム、塩酸サルプグレラート、バトロキソビン、ジピリダモールなどが挙げられる。
【００５３】
前記抗凝固剤の具体例としては、ヘパリンナトリウム、ダルテパリンナトリウム（低分子ヘパリン）、ヘパリンカルシウム、デキストラン硫酸、ワルファリンカリウム、アルガトロバンなどが挙げられる。
【００５４】
前記ケミカルメディエーター遊離抑制剤の具体例としては、トラニラスト、フマル酸ケトフェチン、塩酸アゼラスチン、オキサトミド、アンレキサノクス、レピリナストなどが挙げられる。
【００５５】
前記免疫抑制剤の例としては、シクロスポリンなどが挙げられる。
【００５６】
また、診断に用いられる薬剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｘ線造影剤、放射性同位元素標識核医学診断薬、核磁気共鳴診断用診断薬等の体内診断薬などが挙げられる。
【００５７】
前記Ｘ線造影剤の具体例としては、アミドトリゾ酸メグルミン、イオタラム酸ナトリウム、イオタラム酸メグルミン、ガストログラフィン、ヨーダミドメグルミン、リピオドールウルトラフルイド、アジピオドンメグルミン、イオキサグル酸、イオトロクス酸メグルミン、イオトロラン、イオパノ酸、イオパミドール、イオヘキソール、イオベルソール、イオポダートナトリウム、イオメプロール、イソペーク、ヨードキサム酸などが挙げられる。
【００５８】
前記薬物輸送体に担持される薬物の量としては、特に制限はなく、薬物の種類などに応じて適宜選択することができる。
【００５９】
−添加剤、補助剤−
前記添加剤又は前記補助剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、殺菌剤、保存剤、粘結剤、増粘剤、固着剤、結合剤、着色剤、安定化剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、等張化剤、溶剤、酸化防止剤、紫外線防止剤、結晶析出防止剤、消泡剤、物性向上剤、防腐剤などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００６０】
前記添加剤、補助剤、水などのその他の成分は、前記薬物輸送体と共に配合されていてもよいし、前記担体中に配合されていてもよい。
前記添加剤、補助剤、水などのその他の成分の薬物輸送体における含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００６１】
前記殺菌剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウムなどのカチオン性界面活性剤などが挙げられる。
【００６２】
前記保存剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、クレゾールなどが挙げられる。
【００６３】
前記粘結剤、増粘剤、固着剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、澱粉、デキストリン、セルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルデンプン、プルラン、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸アンモニウム、アルギン酸プロピレングリコールエステル、グアーガム、ローカストビーンガム、アラビアゴム、キサンタンガム、ゼラチン、カゼイン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキサイド、ポリエチレングリコール、エチレン・プロピレンブロックポリマー、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
【００６４】
前記結合剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
【００６５】
前記着色剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、酸化チタン、酸化鉄などが挙げられる。
【００６６】
前記安定化剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、トラガント、アラビアゴム、ゼラチン、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸などが挙げられる。
【００６７】
前記ｐＨ調整剤、前記緩衝剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。
【００６８】
前記等張化剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖などが挙げられる。
【００６９】
＜平均粒子径＞
前記薬物輸送体の平均粒子径としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
細胞への前記薬物輸送体の取り込み方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、エンドサイトーシスなどが挙げられる。
多くの細胞ではエンドサイトーシスによることが知られている。エンドサイトーシスで取り込むことができる大きさとしては、最大約３００ｎｍ程度であり、それ以上になると極端に取り込み量が減少することがある。
したがって、前記薬物輸送体の平均粒子径としては、３００ｎｍより小さいことが好ましい。前記平均粒子径は、粒度分布測定装置で測定することができる。
【００７０】
＜薬物輸送体の輸送＞
前記薬物輸送体を細胞内に輸送する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、輸送対象の細胞の機能や特性を利用して行う方法などが挙げられる。
前記薬物輸送体の輸送に利用可能な細胞の機能や特性としては、例えば、細胞のファゴサイトーシスやエンドサイトーシスなどが挙げられる。
前記薬物輸送体を投与する前に、ファゴサイトーシスやエンドサイトーシスが起こりやすくするために予め細胞を活性化させておいてもよい。また、細胞が高度に活性化し、粘着性が亢進しすぎたり、凝集が生じたりする場合は、適宜選択した方法により細胞を不活性化してもよい。
【００７１】
前記薬物輸送体を適用できる細胞としては、上記した本発明のペプチドを認識できる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、血管内皮細胞などが挙げられる。
【００７２】
＜投与＞
前記薬物輸送体の投与方法、投与量、投与時期、及び投与対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記投与方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、局所投与法、経腸投与法、非経口投与法などが挙げられる。
前記局所投与法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、皮膚上投与法、吸入投与法、注投与法、結膜上への点眼、経鼻投与法、膣内投与法などが挙げられる。
前記経腸投与法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、経口投与法、経管栄養法、注腸投与法などが挙げられる。
前記非経口投与法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、経静脈投与法、経動脈投与法、筋肉内投与法、心臓内投与法、皮下投与法、骨内投与法、皮内投与法、くも膜下投与法、腹腔内投与法、膀胱内投与法、経皮投与法、経粘膜投与法、吸入投与法、硬膜外投与法、硝子体内投与法などが挙げられる。
【００７３】
前記投与量としては、特に制限はなく、投与対象個体の年齢、体重、体質、症状、他の成分を有効成分とする医薬の投与の有無など、様々な要因を考慮して適宜選択することができる。
【００７４】
前記投与対象となる動物種としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、トリなどが挙げられる。これらの中でもヒトに好適に用いられる。
【００７５】
＜使用＞
前記薬物輸送体は、１種単独で使用してもよく、他の成分を有効性分とする医薬や薬物輸送体と併せて使用してもよい。また、他の成分を有効成分とする医薬に配合された状態で使用してもよい。
【００７６】
＜用途＞
本発明の薬物輸送体は、血管内皮細胞を透過し、血液脳関門を透過することができるので、中枢神経系における障害の予防、治療又は診断に用いる薬物輸送体や、糖尿病やがんなどの血管が問題となる疾患に対する薬物輸送体として好適に用いることができる。
【００７７】
（血液脳関門透過剤、血管内皮細胞透過剤）
＜血液脳関門透過剤＞
本発明の血液脳関門透過剤は、本発明のペプチドを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
前記ペプチドは、上記した本発明のペプチドであり、好ましい態様も同様である。
前記ペプチドの血液脳関門透過剤における含有量としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記血液脳関門透過剤は、前記ペプチドそのものであってもよい。
【００７８】
＜血管内皮細胞透過剤＞
本発明の血管内皮細胞透過剤は、本発明のペプチドを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
前記ペプチドは、上記した本発明のペプチドであり、好ましい態様も同様である。
前記ペプチドの血管内皮細胞透過剤における含有量としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記血管内皮細胞透過剤は、前記ペプチドそのものであってもよい。
【００７９】
−その他の成分−
前記血液脳関門透過剤及び前記血管内皮細胞透過剤におけるその他の成分としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、薬理学的に許容される担体などが挙げられる。
前記担体としては、特に制限はなく、剤型などに応じて適宜選択することができ、例えば、上記した薬物輸送体のその他の項目に記載したものなどが挙げられる。
また、前記血液脳関門透過剤及び前記血管内皮細胞透過剤における前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００８０】
前記血液脳関門透過剤及び前記血管内皮細胞透過剤は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよく、他の成分を有効成分とする医薬と併せて使用してもよい。また、前記血液脳関門透過剤及び前記血管内皮細胞透過剤は、他の成分を有効成分とする医薬中に、配合された状態で使用してもよい。
【００８１】
＜剤型＞
前記血液脳関門透過剤及び前記血管内皮細胞透過剤の剤型としては、特に制限はなく、所望の投与方法に応じて適宜選択することができ、例えば、固形剤、半固形剤、液剤などが挙げられる。
前記血液脳関門透過剤及び前記血管内皮細胞透過剤の製造方法としては、特に制限はなく、剤型に応じて常法の中から適宜選択することができる。
【００８２】
−固形剤−
前記固形剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、内用剤として用いられる場合、例えば、錠剤、チュアブル錠、発泡錠、口腔内崩壊錠、トローチ剤、ドロップ剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、ドライシロップ剤、浸剤などが挙げられる。
前記固形剤が、外用剤として用いられる場合、例えば、坐剤、パップ剤、プラスター剤などが挙げられる。
【００８３】
−半固形剤−
前記半固形剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、内用剤として用いられる場合、例えば、舐剤、チューインガム剤、ホイップ剤、ゼリー剤などが挙げられる。
前記半固形剤が、外用剤として用いられる場合、例えば、軟膏剤、クリーム剤、ムース剤、インヘラー剤、ナザールジェル剤などが挙げられる。
【００８４】
−液剤−
前記液剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、内用剤として用いられる場合、例えば、シロップ剤、ドリンク剤、懸濁剤、酒精剤などが挙げられる。
前記液剤が、外用剤として用いられる場合、例えば、液剤、点眼剤、エアゾール剤、噴霧剤などが挙げられる。
【００８５】
＜投与＞
前記血液脳関門透過剤及び前記血管内皮細胞透過剤の投与方法、投与量、投与時期、及び投与対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記投与方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、局所投与法、経腸投与法、非経口投与法などが挙げられる。
前記投与量としては、特に制限はなく、投与対象個体の年齢、体重、体質、症状、他の成分を有効成分とする医薬の投与の有無など、様々な要因を考慮して適宜選択することができる。
前記投与対象となる動物種としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、トリなどが挙げられるが、これらの中でもヒトに好適に用いられる。
【実施例】
【００８６】
以下に試験例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの試験例に何ら限定されるものではない。
【００８７】
（試験例１：血管内皮細胞への細胞透過性）
＜プラスミドの構築＞
ポリオウイルス（Ｍａｈｏｎｅｙ株）より、ＰＣＲ法にて、ポリオウイルス外殻タンパク質であるＶＰ１（配列番号：３）、ＶＰ２（配列番号：４）、又はＶＰ３（配列番号：５）をコードする塩基配列をクローニングした。
【００８８】
オリゴ合成により、ＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＫ（配列番号：４３））をコードするオリゴＤＮＡを得た。
【００８９】
上記クローニングしたＰＣＲ産物、及びオリゴＤＮＡは、ｐＧＥＸ６Ｔ−１ベクター（ＧＥヘルスケア社）のマルチクローニングサイトにインフレームにてクローニングを行い、以下のタンパク質をコードする配列を有するプラスミドを構築した。また、コントロールとして、ポリオウイルス外殻タンパク質をコードする配列を含まないプラスミドも構築した。
なお、下記リンカー（ＳＲＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＧ（配列番号：４４））をコードする塩基配列は、ＰＣＲ法にて挿入した。
・  「ＧＳＴタンパク質」−「ＦＬＡＧタグ」−「リンカー」−「ＶＰ１」−「６×Ｈｉｓ」
・  「ＧＳＴタンパク質」−「ＦＬＡＧタグ」−「リンカー」−「ＶＰ２」−「６×Ｈｉｓ」
・  「ＧＳＴタンパク質」−「ＦＬＡＧタグ」−「リンカー」−「ＶＰ３」−「６×Ｈｉｓ」
・  「ＧＳＴタンパク質」−「ＦＬＡＧタグ」−「リンカー」−「６×Ｈｉｓ」
【００９０】
＜タンパク質の作製＞
上記したプラスミドを用い、Ｒｏｓｓｅｔａ２株（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を形質転換した。
得られた大腸菌を３７℃で、６００ｎｍにおけるＯＤ値が０．４になるまで培養した後、２０℃で１６時間、０．３ｍＭのＩＰＴＧで誘導を行った。
その後、大腸菌を回収、溶解し、次いで、Ｎｉカラムレジンを用いてＨｉｓタグ精製を行い、目的とするタンパク質を得た。
得られたタンパク質のサイズは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法にてタンパク質を電気泳動し、クマシー染色により確認した（図１Ａ参照）。
【００９１】
＜細胞内への透過性試験＞
試験の前日に、マウス血管内皮細胞（ＭＢＥＣ４）を１ウェルあたり１×１０４個となるように９６ウェルプレートに播いた。
試験当日に、上記で得られた各タンパク質を１μＭとなるように培地に添加した。
前記添加後、２４時間培養し、その後、免疫染色を行った。
【００９２】
−免疫染色−
タンパク質の添加を行った細胞を４％ＰＦＡで固定し、０．２％  ＴｒｉｔｏｎＸ１００で細胞膜を破壊し、ＦＬＡＧ抗体（ＳＩＧＭＡ社）にて一次抗体反応を行った。
次に、抗マウス二次抗体（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（Ａｂｃａｍ社））にて二次抗体反応を行った。
その後、Ｈｏｅｃｈｓｔ（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ社）で核染色を行い、倒立顕微鏡で観察した。結果を図１Ｂに示す。
【００９３】
図１Ｂは、視野倍率２００倍の結果を示すものであり、「ＧＳＴ−ＦＬＡＧ−Ｃｏｎ．」は「「ＧＳＴタンパク質」−「ＦＬＡＧタグ」−「リンカー」−「６×Ｈｉｓ」（コントロール）」を添加した場合の結果を示し、「ＧＳＴ−ＦＬＡＧ−ＶＰ１」は「「ＧＳＴタンパク質」−「ＦＬＡＧタグ」−「リンカー」−「ＶＰ１」−「６×Ｈｉｓ」」を添加した場合の結果を示し、「ＧＳＴ−ＦＬＡＧ−ＶＰ２」は「「ＧＳＴタンパク質」−「ＦＬＡＧタグ」−「リンカー」−「ＶＰ２」−「６×Ｈｉｓ」」を添加した場合の結果を示し、「ＧＳＴ−ＦＬＡＧ−ＶＰ３」は「「ＧＳＴタンパク質」−「ＦＬＡＧタグ」−「リンカー」−「ＶＰ３」−「６×Ｈｉｓ」」を添加した場合の結果を示す。
【００９４】
図１Ｂの結果から、ＶＰ３を含む融合タンパク質が強く染色されたことが確認された。また、ＶＰ１を含む融合タンパク質及びＶＰ２を含む融合タンパク質は、この順に、弱いながらも染色が確認された。なお、コントロールでは、染色は確認されなかった。
したがって、ＶＰ３が、血管内皮細胞への細胞内透過性の性質を有することが確認された。
【００９５】
（試験例２：ＶＰ３の細胞透過責任領域の同定）
＜試験例２−１＞
−プラスミドの構築−
ＰＣＲ法にて、前記ＶＰ３配列を以下のように６つに分割したアミノ酸配列をコードする塩基配列をクローニングした。
・  ＧＬＰＶＭＮＴＰＧＳＮＱＹＬＴＡＤＮＦＱＳＰＣＡＬＰＥＦＤＶＴＰＰＩＤＩＰＧＥＶＫＮＭＭ（配列番号：６、以下、「Ｎ１」と称することがある）
・  ＶＫＮＭＭＥＬＡＥＩＤＴＭＩＰＦＤＬＳＡＴＫＫＮＴＭＥＭＹＲＶＲＬＳＤＫＰＨＴＤＤＰＩＬＣ（配列番号：７、以下、「Ｎ２」と称することがある）
・  ＬＣＬＳＬＳＰＡＳＤＰＲＬＳＨＴＭＬＧＥＩＬＮＹＹＴＨＷＡＧ（配列番号：８、以下、「Ｎ３」と称することがある）
・  ＳＬＫＦＴＦＬＦＣＧＳＭＭＡＴＧＫＬＬＶＳＹＡＰＰＧＡＤＰＰＫＫＲＫＥＡＭＬ（配列番号：９、以下、「Ｎ４」と称することがある）
・  ＧＴＨＶＩＷＤＩＧＬＱＳＳＣＴＭＶＶＰＷＩＳＮＴＴＹＲＱＴＩＤＤＳＦＴＥＧＧＹＩＳＶＦＹ（配列番号：１０、以下、「Ｎ５」と称することがある）
・  ＹＩＳＶＦＹＱＴＲＩＶＶＰＬＳＴＰＲＥＭＤＩＬＧＦＶＳＡＣＮＤＦＳＶＲＬＬＲＤＴＴＨＩＥＱＫＡＬＡＱ（配列番号：１１、以下、「Ｎ６」と称することがある）
【００９６】
人工遺伝子合成法（ファスマック社）により、により、ＧＦＰ類縁体であるＶｅｎｕｓタンパク質（配列番号：４７）をコードする塩基配列をクローニングした。
【００９７】
上記クローニングしたＰＣＲ産物は、ｐＧＥＸ６Ｔ−１ベクター（ＧＥヘルスケア社）のマルチクローニングサイトにインフレームにてクローニングを行い、以下のタンパク質をコードする配列を有する各プラスミドを構築した。また、コントロールとして、ＶＰ３をコードする配列を含まないプラスミドも構築した。
なお、下記リンカー（ＳＲＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＧ（配列番号：４４））をコードする塩基配列は、ＰＣＲ法にて挿入した。
・  「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「Ｎ１」−「６×Ｈｉｓ」
・  「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「Ｎ２」−「６×Ｈｉｓ」
・  「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「Ｎ３」−「６×Ｈｉｓ」
・  「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「Ｎ４」−「６×Ｈｉｓ」
・  「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「Ｎ５」−「６×Ｈｉｓ」
・  「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「Ｎ６」−「６×Ｈｉｓ」
・  「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「６×Ｈｉｓ」
【００９８】
−タンパク質の作製−
試験例１におけるプラスミドを上記プラスミドに代えた以外は、試験例１と同様にして各タンパク質を作製した。
得られたタンパク質のサイズは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法にてタンパク質を電気泳動し、クマシー染色により確認した（図２Ａ参照）。
【００９９】
−細胞内への透過性試験−
試験の前日に、マウス血管内皮細胞（ＭＢＥＣ４）を１ウェルあたり１×１０４個となるように９６ウェルプレートに播いた。
試験当日に、上記で得られた各タンパク質を１μＭとなるように培地に添加した。
前記添加後、２４時間培養し、その後、以下のようにして、細胞に接着又は細胞内に取り込まれたタンパク質の量を、Ｖｅｎｕｓタンパク質の蛍光を基に検出した。
【０１００】
−−蛍光定量−−
タンパク質の添加を行った細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、前記細胞をＰａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）にて溶解した。
その後、Ｇｌｏｍａｘ  ｍｕｌｕｔｉルミノメーター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）にて、細胞に接着又は細胞内に取り込まれたタンパク質の量を蛍光量から算出した。結果を図２Ｂに示す。
【０１０１】
図２Ｂ中、「Ｃｏｎ．」は「「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「６×Ｈｉｓ」（コントロール）」を添加した場合の結果を示し、「Ｎ１」は「「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「Ｎ１」−「６×Ｈｉｓ」」を添加した場合の結果を示し、「Ｎ２」は「「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「Ｎ２」−「６×Ｈｉｓ」」を添加した場合の結果を示し、「Ｎ３」は「「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「Ｎ３」−「６×Ｈｉｓ」」を添加した場合の結果を示し、「Ｎ４」は「「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「Ｎ４」−「６×Ｈｉｓ」」を添加した場合の結果を示し、「Ｎ５」は「「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「Ｎ５」−「６×Ｈｉｓ」」を添加した場合の結果を示し、「Ｎ６」は「「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「Ｎ６」−「６×Ｈｉｓ」」を添加した場合の結果を示す。
【０１０２】
図２Ｂの結果から、ＶＰ３タンパク質の血管内皮細胞への細胞内透過性の責任部位は、Ｎ４部位、及びＮ６部位であることが確認された。
【０１０３】
＜試験例２−２＞
−プラスミドの構築−
試験例１と同様にして、以下のタンパク質をコードする配列を有するプラスミドを構築した。
・  「ＧＳＴタンパク質」−「ＦＬＡＧタグ」−「リンカー」−「６×Ｈｉｓ」
・  「ＧＳＴタンパク質」−「ＦＬＡＧタグ」−「リンカー」−「ＶＰ３」−「６×Ｈｉｓ」
【０１０４】
上記プラスミドにおける「ＶＰ３」を、前記「Ｎ４」（配列番号：９）又は「Ｎ６」（配列番号：１１）に代えた以外は、試験例１と同様にして、以下のタンパク質をコードする配列を有するプラスミドを構築した。
・  「ＧＳＴタンパク質」−「ＦＬＡＧタグ」−「リンカー」−「Ｎ４」−「６×Ｈｉｓ」
・  「ＧＳＴタンパク質」−「ＦＬＡＧタグ」−「リンカー」−「Ｎ６」−「６×Ｈｉｓ」
【０１０５】
−タンパク質の作製−
試験例１におけるプラスミドを上記プラスミドに代えた以外は、試験例１と同様にして各タンパク質を作製した。
【０１０６】
−細胞内への透過性試験−
試験の前日に、マウス血管内皮細胞（ＭＢＥＣ４）を１ウェルあたり１×１０４個となるように９６ウェルプレートに播いた。
試験当日に、上記で得られた各タンパク質を１μＭとなるように培地に添加した。
前記添加後、２４時間培養し、その後、試験例１と同様にして、免疫染色を行った。結果を図２Ｃに示す。
【０１０７】
図２Ｃは、視野倍率２００倍の結果を示すものであり、「ＧＳＴ−ＦＬＡＧ−Ｃｏｎ．」は「「ＧＳＴタンパク質」−「ＦＬＡＧタグ」−「リンカー」−「６×Ｈｉｓ」（コントロール）」を添加した場合の結果を示し、「ＧＳＴ−ＦＬＡＧ−ＶＰ３」は「「ＧＳＴタンパク質」−「ＦＬＡＧタグ」−「リンカー」−「ＶＰ３」−「６×Ｈｉｓ」」を添加した場合の結果を示し、「ＧＳＴ−ＦＬＡＧ−ＶＰ３−Ｎ４」は「「ＧＳＴタンパク質」−「ＦＬＡＧタグ」−「リンカー」−「Ｎ４」−「６×Ｈｉｓ」」を添加した場合の結果を示し、「ＧＳＴ−ＦＬＡＧ−ＶＰ３−Ｎ６」は「「ＧＳＴタンパク質」−「ＦＬＡＧタグ」−「リンカー」−「Ｎ６」−「６×Ｈｉｓ」」を添加した場合の結果を示す。
図２Ｃの結果からも、ＶＰ３タンパク質の血管内皮細胞への細胞内透過性の責任部位は、Ｎ４部位、及びＮ６部位であることが確認された。
【０１０８】
（試験例３：正常細胞への透過指向性）
＜プラスミドの構築＞
試験例２−１と同様にして、以下のタンパク質をコードする配列を有するプラスミドを構築した。
・  「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「６×Ｈｉｓ」
・  「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「Ｎ４」−「６×Ｈｉｓ」
・  「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「Ｎ６」−「６×Ｈｉｓ」
【０１０９】
上記プラスミドにおける「Ｎ４」を、下記アミノ酸配列（以下、「Ｔａｔ」と称することがある）をコードする塩基配列に代えた以外は、試験例２−１と同様にして、「「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「Ｔａｔ」−「６×Ｈｉｓ」」をコードする配列を有するプラスミドを構築した。
前記Ｔａｔは、細胞透過性を有することが知られているヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）のタンパク質であり、ポジティブコントロールとして用いた。
ＭＥＰＶＤＰＲＬＥＰＷＫＨＰＧＳＱＰＫＴＡＣＴＮＣＹＣＫＫＣＣＦＨＣＱＶＣＦＭＴＫＡＬＧＩＳＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＡＨＱＮＳＱＴＨＱＡＳＬＳＫＱＰＴＳＱＳＲＧＤＰＴＧＰＫＥ（配列番号：４５、Ｔａｔ）
【０１１０】
＜タンパク質の作製＞
試験例１におけるプラスミドを上記プラスミドに代えた以外は、試験例１と同様にして各タンパク質を作製した。
【０１１１】
＜細胞内への透過性試験＞
試験の前日に、下記細胞を１ウェルあたり１×１０４個となるように９６ウェルプレートに播いた。
・  ヒト正常繊維芽細胞（ＮＨＤＦ）
・  ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）
・  ヒト臍帯血由来血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）
【０１１２】
試験当日に、上記で得られた各タンパク質を１μＭとなるように培地に添加した。
前記添加後、２４時間培養し、その後、フローサイトメトリーによる実験を行った。
【０１１３】
−フローサイトメトリー−
タンパク質の添加を行った細胞をＰＢＳで２回洗浄後、トリプシン処理にて浮遊化し、プロピジウムイオダイド（ＳＩＧＭＡ社）で死細胞を染色し、生細胞のみの蛍光タンパク質の発現量の割合、蛍光強度をフローサイトメーター（Ｓｏｎｙ  ｉｃｙｔｅ８００）にて定量、評価した。また、タンパク質の添加を行わなかった細胞についても同様にしてフローサイトメトリーによる実験を行った。
結果を図３に示す。
【０１１４】
図３中、「未処理」はタンパク質の添加を行わなかった細胞についての結果を示し、「Ｅｍｐｔｙ」は「「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「６×Ｈｉｓ」」を添加した細胞についての結果を示し、「ＶＰ３−Ｎ４」は「「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「Ｎ４」−「６×Ｈｉｓ」」を添加した細胞についての結果を示し、「ＶＰ３−Ｎ６」は「「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「Ｎ６」−「６×Ｈｉｓ」」を添加した細胞についての結果を示し、「Ｔａｔ（ポジコン）」は「「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「Ｔａｔ」−「６×Ｈｉｓ」」を添加した細胞についての結果を示す。
【０１１５】
図３の結果から、「Ｎ４」を含む融合タンパク質及び「Ｎ６」を含む融合タンパク質は、ヒト正常繊維芽細胞（ＮＨＤＦ）及びヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）には効率的な細胞内侵入を示さず、ヒト臍帯血由来血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）にのみ効果的な細胞内侵入の性質を示した。
【０１１６】
（試験例４：種々の細胞株における細胞透過能の比較）
＜プラスミドの構築＞
試験例２−１と同様にして、以下のタンパク質をコードする配列を有するプラスミドを構築した。
・  「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「Ｎ４」−「６×Ｈｉｓ」
・  「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「Ｎ６」−「６×Ｈｉｓ」
【０１１７】
＜タンパク質の作製＞
試験例１におけるプラスミドを上記プラスミドに代えた以外は、試験例１と同様にして各タンパク質を作製した。
【０１１８】
＜細胞内への透過性試験＞
試験の前日に、下記細胞を１ウェルあたり１×１０４個となるように９６ウェルプレートに播いた。
−メラノーマ−
Ｍｅｗｏ、Ａ２０５８、ＧＡＫ、ＨＭＹ−１、ＶＭＲＣ−ＭＥＬＧ。
−グリオーマ−
ＷＥＲＩ−Ｒｂ−１、ＨＳ−ＰＳＳ、ＧＩ−１、Ｔ９８Ｇ、ＴＭ−３１、Ａ１７２、ＮＨ−１２、ＮＢ１６、ＮＢ６９。
−口腔由来のがん細胞−
ＨＳＱ−８９、ＥＣ−ＧＩ−１０、ＨＳＣ−４、８３０５Ｃ。
−肺由来のがん細胞−
ＳＴＣ１、ＳＢＣ−５、ＡＢＣ−１、ＮＣＩ−Ｈ１９７５、ＨＣＣ８２７、Ａ５４９、ＮＣＩ−Ｈ２３、Ｈ１２９９、ＮＣＩ−Ｈ１６５０、Ｌｕ９９Ｂ、ＥＢＣ−１。
−胃由来のがん細胞−
ＮＵＧＣ−４、ＡＺ５２１、ＨＧＣ−２７、ＧＳＳ、ＧＳＵ、Ｈ−１１１−ＴＣ。
−固形臓器がん細胞−
ＬｏＶｏ、ＣＡＣＯ−２、ＣＷ−２、ＣＯＬＯ２０１、ＨＣＴ−１１６、ＭＩＡ  Ｐａｃａ  ２、ＰＫ−１、ＫＰ４、Ｌｉ−７、ＴＫＫＫ、ＯＳ−ＲＣ−２、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＭＥ−１８０、ＨｅＬａ、ＯＶＫ１８、ＪＭＳＵ１、５６３７。
−正常細胞−
ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）、ヒト臍帯血由来血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、ヒト正常繊維芽細胞（ＮＨＤＦ）。
【０１１９】
試験当日に、上記で得られた各タンパク質を１μＭとなるように培地に添加した。
前記添加後、２４時間培養し、その後、フローサイトメトリーによる実験を行った。
【０１２０】
−フローサイトメトリー−
試験例３と同様にして、フローサイトメトリーによる実験を行った。結果を図４に示す。
【０１２１】
図４は、蛍光強度であるＧｅｏ−ｍｅａｎで表示したものである。上段は「ＶＰ３−Ｎ４（「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「Ｎ４」−「６×Ｈｉｓ」）」の添加の有無による結果を示し、下段は「ＶＰ３−Ｎ６（「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「Ｎ６」−「６×Ｈｉｓ」）」の添加の有無による結果を示す。横軸は各細胞を示し、各細胞の項目における左側のグラフはタンパク質非添加細胞における結果を示し、右側のグラフはタンパク質添加細胞における結果を示す。
【０１２２】
図４の結果から、「Ｎ４」を含む融合タンパク質及び「Ｎ６」を含む融合タンパク質は、ほとんどの細胞には効率的な細胞内侵入を示さず、ヒト臍帯血由来血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）に強く特異的な細胞内侵入の性質を示した。
【０１２３】
（試験例５：細胞内への透過経路の検討）
＜プラスミドの構築＞
試験例２−１と同様にして、以下のタンパク質をコードする配列を有するプラスミドを構築した。
・  「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「Ｎ４」−「６×Ｈｉｓ」
・  「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「Ｎ６」−「６×Ｈｉｓ」
【０１２４】
＜タンパク質の作製＞
試験例１におけるプラスミドを上記プラスミドに代えた以外は、試験例１と同様にして各タンパク質を作製した。
【０１２５】
＜細胞内への透過性試験＞
試験の前日に、マウス血管内皮細胞（ＭＢＥＣ４）を１ウェルあたり１×１０４個となるように９６ウェルプレートに播いた。
【０１２６】
試験当日に、上記で得られた各タンパク質を１μＭとなるように培地に添加した。
また、前記タンパク質の添加と同時に、エンドサイトーシスの経路のそれぞれを阻害する下記３種の阻害剤のいずれかを下記の濃度で添加した。
・  クロロプロマジン（以下、「ＣＰＺ」と称することがある、和光純薬工業株式会社）
添加濃度  ・・・  ０μＭ、０．２μＭ、１μＭ、２μＭ、又は１０μＭ
ＣＰＺは、クラスリン依存的な細胞内割入を阻害する。
・  Ｄｙｎａｓｏｒｅ（ＳＩＧＭＡ社）
添加濃度  ・・・  ０μＭ、５０μＭ、１００μＭ、又は２００μＭ
Ｄｙｎａｓｏｒｅは、クラスリン依存的な細胞内割入、カベオリン依存的な細胞内割入、及び脂質ラフト依存的な細胞内割入により割入したエンドソームを切り離す酵素であるダイナミンの阻害剤である。
・  ＥＩＰＡ（和光純薬工業株式会社）
添加濃度  ・・・  ０μＭ、２μＭ、５μＭ、又は１０μＭ
ＥＩＰＡは、マクロピノサイトーシス依存的な細胞内割入を阻害する。
【０１２７】
前記添加後、２４時間培養し、その後、フローサイトメトリーによる実験を行った。
【０１２８】
−フローサイトメトリー−
タンパク質の添加を行った細胞をＰＢＳで２回洗浄後、トリプシン処理にて浮遊化し、プロピジウムイオダイド（ＳＩＧＭＡ社）で死細胞を染色し、生細胞のみの蛍光タンパク質の発現量の割合をフローサイトメーター（Ｓｏｎｙ  ｉｃｙｔｅ８００）にて定量、評価した。
結果を図５Ａ〜５Ｃに示す。なお、阻害剤非添加細胞における蛍光染色細胞の割合（％）を１００とした割合で示した。
【０１２９】
図５Ａはクラスリン阻害剤であるＣＰＺを添加した場合の結果を示し、図５Ｂはダイナミン阻害剤であるＤｙｎａｓｏｒｅを添加した場合の結果を示し、図５Ｃはマクロピノサイトーシス阻害剤であるＥＩＰＡを添加した場合の結果を示す。
横軸は、阻害剤の添加濃度を示し、各添加濃度の項目における左側のグラフは「Ｎ４」を含む融合タンパク質（「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「Ｎ４」−「６×Ｈｉｓ」）を添加した場合の結果を示し、右側のグラフは「Ｎ６」を含む融合タンパク質（「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「Ｎ６」−「６×Ｈｉｓ」）を添加した場合の結果を示す。
【０１３０】
図５Ａ〜５Ｃの結果から、「Ｎ４」を含む融合タンパク質は、ダイナミン阻害剤依存的な透過効率の減少を示した。一方、「Ｎ６」を含む融合タンパク質は、いずれの阻害剤に対しても感受性を示した。
したがって、「Ｎ４」ペプチドの細胞内への透過経路は、ダイナミン依存的なエンドサイトーシスであり、カベオリン及び脂質ラフトを介した細胞内侵入であることが示された。一方、「Ｎ６」ペプチドの細胞内への透過経路は、クラスリン、カベオリン、脂質ラフト、及びマクロピノサイトーシスのすべてのエンドサイトーシスの経路を利用している可能性が示された。
【０１３１】
（試験例６：ＶＰ３の「Ｎ４」部位における細胞透過責任領域の同定）
＜試験例６−１＞
−プラスミドの構築−
試験例２−１と同様にして、以下のタンパク質をコードする配列を有するプラスミドを構築した。
・  「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「Ｎ４」−「６×Ｈｉｓ」（以下、「ＶＰ３−Ｎ４」と称することがある）
【０１３２】
ＰＣＲ法にて、前記ＶＰ３のＮ４部位の配列を以下のように変えたアミノ酸配列をコードする塩基配列をクローニングした。
・  ＳＬＫＦＴＦＬＦＣＧＳＭＭＡＴＧＫＬＬＶＳＹＡＰＰＧＡＤＰＰＫＫＲ（配列番号：１２、以下、「Ｎ４−２」と称することがある）
・  ＳＬＫＦＴＦＬＦＣＧＳＭＭＡＴＧＫＬＬＶＳＹＡＰＰＧＡＤ（配列番号：１３、以下、「Ｎ４−３」と称することがある）
・  ＦＬＦＣＧＳＭＭＡＴＧＫＬＬＶＳＹＡＰＰＧＡＤＰＰＫＫＲＫＥＡＭＬ（配列番号：１４、以下、「Ｎ４−４」と称することがある）
・  ＦＬＦＣＧＳＭＭＡＴＧＫＬＬＶＳＹＡＰＰＧＡＤＰＰＫＫＲ（配列番号：１５、以下、「Ｎ４−５」と称することがある）
・  ＭＭＡＴＧＫＬＬＶＳＹＡＰＰＧＡＤＰＰＫＫＲＫＥＡＭＬ（配列番号：１６、以下、「Ｎ４−６」と称することがある）
・  ＦＬＦＣＧＳＭＭＡＴＧＫＬＬＶＳＹＡＰＰＧＡＤ（配列番号：１７、以下、「Ｎ４−７」と称することがある）
・  ＭＭＡＴＧＫＬＬＶＳＹＡＰＰＧＡＤＰＰＫＫＲ（配列番号：１８、以下、「Ｎ４−８」と称することがある）
・  ＭＭＡＴＧＫＬＬＶＳＹＡＰＰＧＡＤ（配列番号：１、以下、「Ｎ４−９」と称することがある）
・  ＭＭＡＴＧＫＬＬＶＳＹＡＰＰＧ（配列番号：１９、以下、「Ｎ４−１０」と称することがある）
・  ＡＴＧＫＬＬＶＳＹＡＰＰＧＡＤ（配列番号：２０、以下、「Ｎ４−１１」と称することがある）
・  ＡＴＧＫＬＬＶＳＹＡＰＰＧ（配列番号：２１、以下、「Ｎ４−１２」と称することがある）
【０１３３】
上記した「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「Ｎ４」−「６×Ｈｉｓ」タンパク質をコードする配列を有するプラスミドにおける「Ｎ４」を、上記「Ｎ４−２」〜「Ｎ４−１２」のアミノ酸配列をコードする塩基配列に代え、下記タンパク質をコードする配列を有するプラスミドを構築した。
・  「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「Ｎ４−２」−「６×Ｈｉｓ」（以下、「ＶＰ３−Ｎ４−２」と称することがある）
・  「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「Ｎ４−３」−「６×Ｈｉｓ」（以下、「ＶＰ３−Ｎ４−３」と称することがある）
・  「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「Ｎ４−４」−「６×Ｈｉｓ」（以下、「ＶＰ３−Ｎ４−４」と称することがある）
・  「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「Ｎ４−５」−「６×Ｈｉｓ」（以下、「ＶＰ３−Ｎ４−５」と称することがある）
・  「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「Ｎ４−６」−「６×Ｈｉｓ」（以下、「ＶＰ３−Ｎ４−６」と称することがある）
・  「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「Ｎ４−７」−「６×Ｈｉｓ」（以下、「ＶＰ３−Ｎ４−７」と称することがある）
・  「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「Ｎ４−８」−「６×Ｈｉｓ」（以下、「ＶＰ３−Ｎ４−８」と称することがある）
・  「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「Ｎ４−９」−「６×Ｈｉｓ」（以下、「ＶＰ３−Ｎ４−９」と称することがある）
・  「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「Ｎ４−１０」−「６×Ｈｉｓ」（以下、「ＶＰ３−Ｎ４−１０」と称することがある）
・  「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「Ｎ４−１１」−「６×Ｈｉｓ」（以下、「ＶＰ３−Ｎ４−１１」と称することがある）
・  「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「Ｎ４−１２」−「６×Ｈｉｓ」（以下、「ＶＰ３−Ｎ４−１２」と称することがある）
【０１３４】
−タンパク質の作製−
試験例１におけるプラスミドを上記プラスミドに代えた以外は、試験例１と同様にして各タンパク質を作製した。
【０１３５】
−細胞内への透過性試験−
試験の前日に、マウス血管内皮細胞（ＭＢＥＣ４）を１ウェルあたり１×１０４個となるように９６ウェルプレートに播いた。
試験当日に、上記で得られた各タンパク質を１μＭとなるように培地に添加した。
前記添加後、２４時間培養し、その後、フローサイトメトリーによる実験を行った。
【０１３６】
−−フローサイトメトリー−−
タンパク質の添加を行った細胞をＰＢＳで２回洗浄後、トリプシン処理にて浮遊化し、プロピジウムイオダイド（ＳＩＧＭＡ社）で死細胞を染色し、生細胞のみの蛍光タンパク質の蛍光強度をフローサイトメーター（Ｓｏｎｙ  ｉｃｙｔｅ８００）にて定量、評価した。
【０１３７】
結果を図６Ａに示す。なお、融合タンパク質「ＶＰ３−Ｎ４」を添加した細胞における蛍光染色細胞の割合（％）を１００とした割合で示した。
図６Ａ中、縦軸は添加したタンパク質を示し、横軸は蛍光強度を示す。
【０１３８】
図６Ａの結果から、ＶＰ３のＮ４部位を１７アミノ酸まで縮小した「Ｎ４−９」を用いても、縮小前の「Ｎ４」とほぼ同等の透過効率を示すことが確認された。
【０１３９】
＜試験例６−２＞
−プラスミドの構築−
試験例６−１と同様にして、以下のタンパク質をコードする配列を有するプラスミドを構築した。
・  「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「Ｎ４−９」−「６×Ｈｉｓ」（以下、「ＶＰ３−Ｎ４−９」と称することがある）
【０１４０】
ＰＣＲ法にて、前記「Ｎ４−９」部位の配列を以下のように変えた変異ペプチドをコードする配列を有するプラスミドを構築した。なお、下記配列中、下線部は、「Ｎ４−９」のアミノ酸配列から変異した部分を示す。
・  ＭＡＡＴＧＫＬＬＶＳＹＡＰＰＧＡＤ（配列番号：２２、以下、「Ｎ４−９−ｍ１」と称することがある）
・  ＭＭＡＡＧＫＬＬＶＳＹＡＰＰＧＡＤ（配列番号：２３、以下、「Ｎ４−９−ｍ２」と称することがある）
・  ＭＭＡＴＡＫＬＬＶＳＹＡＰＰＧＡＤ（配列番号：２４、以下、「Ｎ４−９−ｍ３」と称することがある）
・  ＭＭＡＴＧＡＬＬＶＳＹＡＰＰＧＡＤ（配列番号：２５、以下、「Ｎ４−９−ｍ４」と称することがある）
・  ＭＭＡＴＧＫＬＬＶＳＹＡＰＰＡＡＤ（配列番号：２６、以下、「Ｎ４−９−ｍ５」と称することがある）
・  ＭＭＡＴＧＫＬＬＶＳＹＡＰＡＧＡＤ（配列番号：２７、以下、「Ｎ４−９−ｍ６」と称することがある）
・  ＭＡＡＴＧＫＬＬＶＳＹＡＰＰＡＡＤ（配列番号：２８、以下、「Ｎ４−９−ｍ７」と称することがある）
・  ＭＭＡＴＧＫＬＬＶＳＹＡＰＰＧＡＡＤ（配列番号：２９、以下、「Ｎ４−９−ｍ８」と称することがある）
・  ＭＭＡＴＧＫＬＬＶＳＹＡＰＰＧ Ｄ（配列番号：３０、以下、「Ｎ４−９−ｍ９」と称することがある）
【０１４１】
オリゴ合成により、コントロールペプチド（ＥＦＹＧＴＡＰＬＥ（配列番号：４６））をコードするオリゴＤＮＡを得た。
前記プラスミドにおける「Ｎ４−９」を、上記コントロールペプチドをコードするオリゴＤＮＡに代えた以外は、試験例１と同様にして、プラスミドを構築した。
【０１４２】
−タンパク質の作製−
試験例１におけるプラスミドを上記プラスミドに代えた以外は、試験例１と同様にして以下の各タンパク質を作製した。
・  「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「Ｎ４−９」−「６×Ｈｉｓ」（以下、「Ｎ４−９」と称することがある）
・  「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「Ｎ４−９−ｍ１」−「６×Ｈｉｓ」（以下、「Ｍ１」と称することがある）
・  「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「Ｎ４−９−ｍ２」−「６×Ｈｉｓ」（以下、「Ｍ２」と称することがある）
・  「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「Ｎ４−９−ｍ３」−「６×Ｈｉｓ」（以下、「Ｍ３」と称することがある）
・  「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「Ｎ４−９−ｍ４」−「６×Ｈｉｓ」（以下、「Ｍ４」と称することがある）
・  「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「Ｎ４−９−ｍ５」−「６×Ｈｉｓ」（以下、「Ｍ５」と称することがある）
・  「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「Ｎ４−９−ｍ６」−「６×Ｈｉｓ」（以下、「Ｍ６」と称することがある）
・  「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「Ｎ４−９−ｍ７」−「６×Ｈｉｓ」（以下、「Ｍ７」と称することがある）
・  「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「Ｎ４−９−ｍ８」−「６×Ｈｉｓ」（以下、「Ｍ８」と称することがある）
・  「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「Ｎ４−９−ｍ９」−「６×Ｈｉｓ」（以下、「Ｍ９」と称することがある）
・  「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「コントロールペプチド」−「６×Ｈｉｓ」（以下、「Ｅ」と称することがある）
【０１４３】
−細胞内への透過性試験−
試験の前日に、臍帯血由来血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を１ウェルあたり１×１０４個となるように９６ウェルプレートに播いた。
試験当日に、上記で得られた各タンパク質を１μＭとなるように培地に添加した。
前記添加後、２４時間培養し、その後、フローサイトメトリーによる実験を行った。
【０１４４】
−−フローサイトメトリー−−
タンパク質の添加を行った細胞をＰＢＳで２回洗浄後、トリプシン処理にて浮遊化し、プロピジウムイオダイド（ＳＩＧＭＡ社）で死細胞を染色し、生細胞のみの蛍光タンパク質の蛍光強度をフローサイトメーター（Ｓｏｎｙ  ｉｃｙｔｅ８００）にて定量、評価した。
【０１４５】
結果を図６Ｂに示す。なお、融合タンパク質「ＶＰ３−Ｎ４−９」を添加した細胞における蛍光染色細胞の割合（％）を１とした割合で示した。
図６Ｂ中、縦軸は蛍光強度を示し、横軸は添加したタンパク質を示す。
【０１４６】
図６Ｂの結果から、「Ｎ４−９」のアミノ酸配列に置換変異、挿入変異、又は欠失変異などの変異を加えた場合であっても、「Ｎ４−９」を含む融合タンパク質と同等の透過効率を示すことが確認された。
【０１４７】
（試験例７：ＶＰ３の「Ｎ６」部位における細胞透過責任領域の同定）
＜試験例７−１＞
−プラスミドの構築−
試験例２−１と同様にして、以下のタンパク質をコードする配列を有するプラスミドを構築した。
・  「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「Ｎ６」−「６×Ｈｉｓ」（以下、「ＶＰ３−Ｎ６」と称することがある）
【０１４８】
ＰＣＲ法にて、前記ＶＰ３の「Ｎ６」部位の配列を以下のように変えたアミノ酸配列をコードする塩基配列をクローニングした。
・  ＹＱＴＲＩＶＶＰＬＳＴＰＲＥＭＤＩＬＧＦＶＳＡＣＮＤＦＳＶＲＬＬＲＤＴＴＨＩＥＱＫＡＬＡＱ（配列番号：３１、以下、「Ｎ６−２」と称することがある）
・  ＶＶＰＬＳＴＰＲＥＭＤＩＬＧＦＶＳＡＣＮＤＦＳＶＲＬＬＲＤＴＴＨＩＥＱＫＡＬＡＱ（配列番号：３２、以下、「Ｎ６−３」と称することがある）
・  ＹＱＴＲＩＶＶＰＬＳＴＰＲＥＭＤＩＬＧＦＶＳＡＣＮＤＦＳＶＲＬＬＲＤＴＴＨＩＥＱ（配列番号：３３、以下、「Ｎ６−４」と称することがある）
・  ＹＱＴＲＩＶＶＰＬＳＴＰＲＥＭＤＩＬＧＦＶＳＡＣＮＤＦＳＶＲＬＬＲＤＴ（配列番号：３４、以下、「Ｎ６−５」と称することがある）
・  ＶＶＰＬＳＴＰＲＥＭＤＩＬＧＦＶＳＡＣＮＤＦＳＶＲＬＬＲＤＴＴＨＩＥＱ（配列番号：３５、以下、「Ｎ６−６」と称することがある）
・  ＶＶＰＬＳＴＰＲＥＭＤＩＬＧＦＶＳＡＣＮＤＦＳＶＲＬＬＲＤＴ（配列番号：３６、以下、「Ｎ６−７」と称することがある）
【０１４９】
上記した「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「Ｎ６」−「６×Ｈｉｓ」タンパク質をコードする配列を有するプラスミドにおける「Ｎ６」を、上記「Ｎ６−２」〜「Ｎ６−７」のアミノ酸配列をコードする塩基配列に代え、下記タンパク質をコードする配列を有するプラスミドを構築した。
・  「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「Ｎ６−２」−「６×Ｈｉｓ」（以下、「ＶＰ３−Ｎ６−２」と称することがある）
・  「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「Ｎ６−３」−「６×Ｈｉｓ」（以下、「ＶＰ３−Ｎ６−３」と称することがある）
・  「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「Ｎ６−４」−「６×Ｈｉｓ」（以下、「ＶＰ３−Ｎ６−４」と称することがある）
・  「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「Ｎ６−５」−「６×Ｈｉｓ」（以下、「ＶＰ３−Ｎ６−５」と称することがある）
・  「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「Ｎ６−６」−「６×Ｈｉｓ」（以下、「ＶＰ３−Ｎ６−６」と称することがある）
・  「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「Ｎ６−７」−「６×Ｈｉｓ」（以下、「ＶＰ３−Ｎ６−７」と称することがある）
【０１５０】
−タンパク質の作製−
試験例１におけるプラスミドを上記プラスミドに代えた以外は、試験例１と同様にして各タンパク質を作製した。
【０１５１】
−細胞内への透過性試験−
試験例６−１におけるタンパク質を上記タンパク質に代えた以外は、試験例６−１と同様にしてフローサイトメトリーによる実験を行った。
結果を図７Ａに示す。なお、融合タンパク質「ＶＰ３−Ｎ６」を添加した細胞における蛍光染色細胞の割合（％）を１００とした割合で示した。
図７Ａ中、縦軸は添加したタンパク質を示し、横軸は蛍光強度を示す。
【０１５２】
図７Ａの結果から、ＶＰ３のＮ６部位を３５アミノ酸まで縮小した場合でも、縮小前のＮ６とほぼ同等の透過効率を示すことが確認された。
【０１５３】
＜試験例７−２＞
−プラスミドの構築−
試験例２−１と同様にして、以下のタンパク質をコードする配列を有するプラスミドを構築した。
・  「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「Ｎ６」−「６×Ｈｉｓ」（以下、「Ｎ６」と称することがある）
【０１５４】
ＰＣＲ法にて、前記ＶＰ３の「Ｎ６」部位の配列を以下のように変えたアミノ酸配列をコードする塩基配列をクローニングした。
・  ＱＴＲＩＶＶＰＬＳＴＰＲＥＭＤＩＬＧＦＶＳＡＣＮＤＦＳＶＲＬＬＲＤＴＴＨＩＥ（配列番号：３７、以下、「Ｎ６−８」と称することがある）
・  ＴＲＩＶＶＰＬＳＴＰＲＥＭＤＩＬＧＦＶＳＡＣＮＤＦＳＶＲＬＬＲＤＴＴＨＩ（配列番号：３８、以下、「Ｎ６−９」と称することがある）
・  ＲＩＶＶＰＬＳＴＰＲＥＭＤＩＬＧＦＶＳＡＣＮＤＦＳＶＲＬＬＲＤＴＴＨ（配列番号：２、以下、「Ｎ６−１０」と称することがある）
・  ＩＶＶＰＬＳＴＰＲＥＭＤＩＬＧＦＶＳＡＣＮＤＦＳＶＲＬＬＲＤＴＴ（配列番号：３９、以下、「Ｎ６−１１」と称することがある）
【０１５５】
上記した「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「Ｎ６」−「６×Ｈｉｓ」タンパク質をコードする配列を有するプラスミドにおける「Ｎ６」を、上記「Ｎ６−８」〜「Ｎ６−１１」のアミノ酸配列をコードする塩基配列に代えたプラスミドを構築した。
【０１５６】
ＰＣＲ法にて、前記「Ｎ６−１０」部位の配列を以下のように変えた変異ペプチドをコードする配列を有するプラスミドを構築した。なお、下記配列中、下線部は、「Ｎ６−１０」のアミノ酸配列から変異した部分を示す。
・  ＲＡＶＶＰＬＳＴＰＲＥＭＤＩＬＧＦＶＳＡＣＮＤＦＳＶＲＬＬＲＤＴＴＨ（配列番号：４０、以下、「Ｎ６−１０−ｍ１」と称することがある）
・  ＲＡＩＶＶＰＬＳＴＰＲＥＭＤＩＬＧＦＶＳＡＣＮＤＦＳＶＲＬＬＲＤＴＴＨ（配列番号：４１、以下、「Ｎ６−１０−ｍ２」と称することがある）
・  Ｒ ＶＶＰＬＳＴＰＲＥＭＤＩＬＧＦＶＳＡＣＮＤＦＳＶＲＬＬＲＤＴＴＨ（配列番号：４２、以下、「Ｎ６−１０−ｍ３」と称することがある）
【０１５７】
試験例６−２と同様にして、「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「コントロールペプチド」−「６×Ｈｉｓ」をコードする配列を有するプラスミドを構築した。
【０１５８】
−タンパク質の作製−
試験例１におけるプラスミドを上記プラスミドに代えた以外は、試験例１と同様にして以下の各タンパク質を作製した。
・  「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「Ｎ６」−「６×Ｈｉｓ」（以下、「Ｎ６」と称することがある）
・  「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「Ｎ４−６−８」−「６×Ｈｉｓ」（（以下、「Ｎ６−８」と称することがある）
・  「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「Ｎ４−６−９」−「６×Ｈｉｓ」（（以下、「Ｎ６−９」と称することがある）
・  「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「Ｎ４−６−１０」−「６×Ｈｉｓ」（（以下、「Ｎ６−１０」と称することがある）
・  「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「Ｎ４−６−１１」−「６×Ｈｉｓ」（（以下、「Ｎ６−１１」と称することがある）
・  「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「Ｎ４−６−１０−ｍ１」−「６×Ｈｉｓ」（（以下、「Ｎ６−１０−ｍ１」と称することがある）
・  「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「Ｎ４−６−１０−ｍ２」−「６×Ｈｉｓ」（（以下、「Ｎ６−１０−ｍ２」と称することがある）
・  「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「Ｎ４−６−１０−ｍ３」−「６×Ｈｉｓ」（（以下、「Ｎ６−１０−ｍ３」と称することがある）
・  「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「コントロールペプチド」−「６×Ｈｉｓ」（（以下、「Ｅ」と称することがある）
【０１５９】
−細胞内への透過性試験−
試験例６−２におけるタンパク質を上記タンパク質に代えた以外は、試験例６−２と同様にしてフローサイトメトリーによる実験を行った。
結果を図７Ｂに示す。なお、融合タンパク質「Ｎ６」を添加した細胞における蛍光染色細胞の割合（％）を１とした割合で示した。
図７Ｂ中、縦軸は蛍光強度を示し、横軸は添加したタンパク質を示す。
【０１６０】
図７Ｂの結果から、ＶＰ３の「Ｎ６」部位を３４アミノ酸まで縮小した「Ｎ６−１０」を用いても、縮小前の「Ｎ６」とほぼ同等の透過効率を示すことが確認された。
また、「Ｎ６−１０」のアミノ酸配列に置換変異、挿入変異、又は欠失変異などの変異を加えた場合であっても、「Ｎ６−１０」と同等の透過効率を示すことが確認された。
【０１６１】
（試験例８：「Ｎ４」ペプチド及び「Ｎ６」ペプチドの配位の検討）
＜プラスミドの構築＞
試験例２−１と同様にして、以下のアミノ酸配列をコードする塩基配列をクローニングした。
・  ＳＬＫＦＴＦＬＦＣＧＳＭＭＡＴＧＫＬＬＶＳＹＡＰＰＧＡＤＰＰＫＫＲＫＥＡＭＬ（配列番号：９、以下、「Ｎ４」と称することがある）
・  ＹＩＳＶＦＹＱＴＲＩＶＶＰＬＳＴＰＲＥＭＤＩＬＧＦＶＳＡＣＮＤＦＳＶＲＬＬＲＤＴＴＨＩＥＱＫＡＬＡＱ（配列番号：１１、以下、「Ｎ６」と称することがある）
【０１６２】
試験例２−１と同様にして、ＧＦＰ類縁体であるＶｅｎｕｓタンパク質をコードする塩基配列をクローニングした。
【０１６３】
試験例６−２と同様にして、コントロールペプチド（ＥＦＹＧＴＡＰＬＥ（配列番号：４６））をコードするオリゴＤＮＡを得た。
【０１６４】
試験例２−１におけるＰＣＲ産物を、上記クローニングしたもの又はオリゴＤＮＡに代えた以外は、試験例２−１と同様にして、以下のタンパク質をコードする配列を有する各プラスミドを構築した。
なお、下記リンカー（ＳＲＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＧ（配列番号：４４））をコードする塩基配列は、ＰＣＲ法にて挿入した。
・  「ＧＳＴタンパク質」−「コントロールペプチド」−「リンカー」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「６×Ｈｉｓ」（以下、「ＧＳＴ−ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｖｅ−Ｅ」と称することがある）
・  「ＧＳＴタンパク質」−「Ｎ４」−「リンカー」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「６×Ｈｉｓ」（以下、「ＧＳＴ−ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｖｅ−Ｎ４」と称することがある）
・  「ＧＳＴタンパク質」−「Ｎ６」−「リンカー」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「６×Ｈｉｓ」（以下、「ＧＳＴ−ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｖｅ−Ｎ６」と称することがある）
・  「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「コントロールペプチド」−「６×Ｈｉｓ」（以下、「ＧＳＴ−Ｖｅ−ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｅ」と称することがある）
・  「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「Ｎ４」−「６×Ｈｉｓ」（以下、「ＧＳＴ−Ｖｅ−ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｎ４」と称することがある）
・  「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「Ｎ６」−「６×Ｈｉｓ」（以下、「ＧＳＴ−Ｖｅ−ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｎ６」と称することがある）
【０１６５】
＜タンパク質の作製＞
試験例１におけるプラスミドを上記プラスミドに代えた以外は、試験例１と同様にして各タンパク質を作製した。
【０１６６】
＜細胞内への透過性試験＞
試験の前日に、臍帯血由来血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を１ウェルあたり１×１０４個となるように９６ウェルプレートに播いた。
試験当日に、上記で得られた各タンパク質を１μＭとなるように培地に添加した。
前記添加後、２４時間培養し、その後、フローサイトメトリーによる実験を行った。
【０１６７】
−フローサイトメトリー−
タンパク質の添加を行った細胞をＰＢＳで２回洗浄後、トリプシン処理にて浮遊化し、プロピジウムイオダイド（ＳＩＧＭＡ社）で死細胞を染色し、生細胞のみの蛍光タンパク質の発現量の割合をフローサイトメーター（Ｓｏｎｙ  ｉｃｙｔｅ８００）にて定量、評価した。
【０１６８】
結果を図８に示す。
図８中、縦軸は融合タンパク質の取込み割合を示し、横軸は添加した融合タンパク質を示す。なお、横軸における「−」の項目は、融合タンパク質を添加しなかった場合の結果を示す。
【０１６９】
図８の結果から、「Ｎ４」ペプチド及び「Ｎ６」ペプチドは、Ｖｅｎｕｓタンパク質のＮ末端側に挿入した場合と、Ｃ末端側に挿入した場合とで、同等の細胞透過性を示すことが確認された。
したがって、本発明のペプチドは、挿入部位依存性はないものと考えられた。
【０１７０】
（試験例９：「Ｎ４」ペプチド及び「Ｎ６」ペプチドの血液脳関門透過能の検討）
＜プラスミドの構築＞
試験例２−１及び６−２と同様にして、以下のタンパク質をコードする配列を有するプラスミドを構築した。
・  「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「Ｎ４」−「６×Ｈｉｓ」（以下、「ＶＰ３−Ｎ４」と称することがある）
・  「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「Ｎ６」−「６×Ｈｉｓ」（以下、「ＶＰ３−Ｎ６」と称することがある）
・  「ＧＳＴタンパク質」−「Ｖｅｎｕｓタンパク質」−「リンカー」−「コントロールペプチド」−「６×Ｈｉｓ」（以下、「Ｅ」と称することがある）
【０１７１】
＜タンパク質の作製＞
試験例１におけるプラスミドを上記プラスミドに代えた以外は、試験例１と同様にして各タンパク質を作製した。
【０１７２】
＜血液脳関門透過性試験＞
市販品であるラットｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液脳関門（ＢＢＢ）モデルキット（ファーマコル社）に、１０μｇ／ウェルの濃度で各タンパク質を添加し、経時的に、血管側のラット血管内皮細胞へのタンパク質の透過率と、脳側へのタンパク質の透過率とを検討した。
血管側のラット血管内皮細胞へのタンパク質の透過率は、フローサイトメーターで計測した。
脳側へ移行したタンパク質の量は、添加したタンパク質のＣ末端側につながれているＨｉｓタンパク質をＥＬＩＳＡ法（Ｈｉｓ  Ｔａｇ  ＥＬＩＳＡ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐ．）にて検出することにより、計測した。
【０１７３】
血管内皮細胞へのタンパク質の透過率を計測した結果を図９Ａに、脳側へのタンパク質の透過率を計測した結果を図９Ｂに示す。
図９Ａ及び９Ｂ中、「黒丸」は「ＶＰ３−Ｎ４」を添加した場合の結果を示し、「黒四角」は「ＶＰ３−Ｎ６」を添加した場合の結果を示し、「黒三角」は「Ｅ」を添加した場合の結果を示す。
【０１７４】
図９Ａ及び９Ｂの結果から、「ＶＰ３−Ｎ４」及び「ＶＰ３−Ｎ６」は、添加３時間後には血管内皮細胞への透過が観察され、脳側への細胞透過も観察された。また、これらの中でも、「ＶＰ３−Ｎ４」が、血液脳関門透過において、より高い透過能を有することが確認された。
【０１７５】
本発明の態様としては、例えば、以下のものなどが挙げられる。
＜１＞  （ｉ）  下記配列番号：１で表されるアミノ酸配列、及び
（ｉｉ）  下記配列番号：１で表されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、かつ、長さが少なくとも１６アミノ酸残基であるアミノ酸配列
のいずれかを含むことを特徴とするペプチドである。
ＭＭＡＴＧＫＬＬＶＳＹＡＰＰＧＡＤ（配列番号：１）
＜２＞  （ｉｉｉ）  下記配列番号：２で表されるアミノ酸配列、及び
（ｉｖ）  下記配列番号：２で表されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、かつ、長さが少なくとも３３アミノ酸残基であるアミノ酸配列
のいずれかを含むことを特徴とするペプチドである。
ＲＩＶＶＰＬＳＴＰＲＥＭＤＩＬＧＦＶＳＡＣＮＤＦＳＶＲＬＬＲＤＴＴＨ（配列番号：２）
＜３＞  血液脳関門を透過する前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載のペプチドである。
＜４＞  血管内皮細胞を透過する前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載のペプチドである。
＜５＞  前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載のペプチドを含むことを特徴とする薬物輸送体である。
＜６＞  更に、担体を含む前記＜５＞に記載の薬物輸送体である。
＜７＞  前記担体が、巨大分子、微小集合体、微小粒子、ミクロスフェア、ナノスフェア、リポソーム、及びエマルジョンから選択される少なくともいずれかである前記＜６＞に記載の薬物輸送体である。
＜８＞  前記担体の内部に、診断、予防、及び治療の少なくともいずれかを行うための薬物が担持される前記＜６＞から＜７＞のいずれかに記載の薬物輸送体である。
＜９＞  診断、予防、及び治療の少なくともいずれかを行うための薬物が、核酸、ポリヌクレオチド、遺伝子、及びこれらの類縁体；グリコサミノグリカン及びその誘導体；オリゴ糖、多糖、及びこれらの誘導体；タンパク質及びペプチド；抗神経剤；抗ウイルス剤；抗癌剤；抗生物質；酵素剤；抗酸化剤；抗炎症剤；ステロイド剤；アンジオテンシン変換酵素阻害剤；血管拡張剤；平滑筋細胞の増殖及び／又は遊走阻害剤；血小板凝集阻害剤；抗凝固剤；ケミカルメディエーターの遊離抑制剤；免疫抑制剤；脂質取込み阻害剤；ホルモン剤；アンジオテンシン受容体拮抗剤；血管内皮細胞の増殖又は抑制剤；アルドース還元酵素阻害剤；メサンギウム細胞増殖阻害剤；リポキシゲナーゼ阻害剤；免疫賦活剤；メイラード反応抑制剤；アミロイドーシス阻害剤；一酸化窒素合成酵素阻害剤；終末糖化産物阻害剤；及びラジカルスカベンジャーからなる群から選択される少なくともいずれかである前記＜８＞に記載の薬物輸送体である。
＜１０＞  エンドサイトーシスにより細胞内に輸送される前記＜５＞から＜９＞のいずれかに記載の薬物輸送体である。
＜１１＞  細胞が、血管内皮細胞である前記＜１０＞に記載の薬物輸送体である。
＜１２＞  経口投与で用いられる前記＜５＞から＜１１＞のいずれかに記載の薬物輸送体である。
＜１３＞  前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載のペプチドを含むことを特徴とする血液脳関門透過剤である。
＜１４＞  前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載のペプチドを含むことを特徴とする血管内皮細胞透過剤である。
【産業上の利用可能性】
【０１７６】
本発明のペプチドは、例えば、リポソームなどの外膜に付与することにより、細胞特異的に薬物を輸送することができる。そのため、例えば、血液脳関門を透過することにより中枢神経系の細胞に薬物を輸送する薬物輸送体として好適に利用可能である。また、本発明のペプチドによれば血管内皮細胞特異的に薬物を輸送することができるので、糖尿病やがんなどの血管が問題となる疾患に対する薬物輸送体としても好適に利用可能である。
【図１Ａ】
2018165253.tif 000002
【図１Ｂ】
2018165253.tif 000003
【図２Ａ】
2018165253.tif 000004
【図２Ｂ】
2018165253.tif 000005
【図２Ｃ】
2018165253.tif 000006
【図３】
2018165253.tif 000007
【図４】
2018165253.tif 000008
【図５Ａ】
2018165253.tif 000009
【図５Ｂ】
2018165253.tif 000010
【図５Ｃ】
2018165253.tif 000011
【図６Ａ】
2018165253.tif 000012
【図６Ｂ】
2018165253.tif 000013
【図７Ａ】
2018165253.tif 000014
【図７Ｂ】
2018165253.tif 000015
【図８】
2018165253.tif 000016
【図９Ａ】
2018165253.tif 000017
【図９Ｂ】
2018165253.tif 000018
【配列表】
2018165253000001.app