(57)【要約】【課題】ＩＬ−１０とＩＬ−１２の産生量の比率（ＩＬ−１０／ＩＬ−１２の比率）が大きい、抗炎症性に優れた培養物を得るための、微生物の培養物の製造方法を提供する。【解決手段】不飽和脂肪酸エステルを含む培地を用いて、ラクトバチルス・プランタラムを、対数増殖期の終了時点を超えない時点まで培養して、ラクトバチルス・プランタラムの培養物を得る、ラクトバチルス・プランタラムの培養物の製造方法。不飽和脂肪酸エステルは、一価もしくは多価の不飽和脂肪酸と多価アルコールとが反応してなるエステル、または、該エステルの誘導体である。不飽和脂肪酸エステルの好ましい一例は、モノオレイン酸エステルである。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
不飽和脂肪酸エステルを含む培地を用いて、ラクトバチルス・プランタラムを、対数増殖期の終了時点を超えない時点まで培養して、ラクトバチルス・プランタラムの培養物を得ることを特徴とするラクトバチルス・プランタラムの培養物の製造方法。
【請求項２】
上記対数増殖期の終了時点が、上記ラクトバチルス・プランタラムの培養時の菌数が最高到達菌数の半分の菌数に達した時点で表される、請求項１に記載のラクトバチルス・プランタラムの培養物の製造方法。
【請求項３】
上記対数増殖期の終了時点が、上記ラクトバチルス・プランタラムの中和培養時に用いる中和剤の消費量が消費総量の半分の量に達した時点で表される、請求項１に記載のラクトバチルス・プランタラムの培養物の製造方法。
【請求項４】
上記不飽和脂肪酸エステルが、一価もしくは多価の不飽和脂肪酸と多価アルコールとが反応してなるエステル、または、該エステルの誘導体である請求項１〜３のいずれか１項に記載のラクトバチルス・プランタラムの培養物の製造方法。
【請求項５】
上記一価もしくは多価の不飽和脂肪酸が、炭素数１６〜２３の一価〜三価の不飽和脂肪酸である請求項４に記載のラクトバチルス・プランタラムの培養物の製造方法。
【請求項６】
上記不飽和脂肪酸エステルが、モノオレイン酸エステルである請求項４又は５に記載のラクトバチルス・プランタラムの培養物の製造方法。
【請求項７】
上記不飽和脂肪酸エステルが、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、または、ポリソルベートである請求項６に記載のラクトバチルス・プランタラムの培養物の製造方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の製造方法によって製造されたラクトバチルス・プランタラムの培養物を有効成分として含むことを特徴とする抗炎症剤。
【請求項９】
不飽和脂肪酸エステルを含む培地を用いて、ラクトバチルス・プランタラムの複数の菌株の各々を、対数増殖期の終了時点を超えない時点まで培養して、各菌株の培養物を得た後、得られた各菌株の培養物について、インターロイキン−１０の産生誘導活性を評価し、その評価結果に基いて、上記複数の菌株の中から、抗炎症作用の程度が大きい菌株を選抜することを特徴とするラクトバチルス・プランタラムの菌株の選抜方法。
【請求項１０】
上記インターロイキン−１０の産生誘導活性の評価に加えて、インターロイキン−１２の産生誘導活性を評価し、これらの評価結果に基いて、上記複数の菌株の中から、抗炎症作用の程度が大きい菌株を選抜する請求項９に記載のラクトバチルス・プランタラムの菌株の選抜方法。
【請求項１１】
上記対数増殖期の終了時点が、上記ラクトバチルス・プランタラムの培養時の菌数が最高到達菌数の半分の菌数に達した時点で表される、請求項９又は１０に記載のラクトバチルス・プランタラムの菌株の選抜方法。
【請求項１２】
上記対数増殖期の終了時点が、上記ラクトバチルス・プランタラムの中和培養時に用いる中和剤の消費量が消費総量の半分の量に達した時点で表される、請求項９又は１０に記載のラクトバチルス・プランタラムの菌株の選抜方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラクトバチルス・プランタラムの培養物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
インターロイキン（ＩＬ）−１０は、免疫細胞（樹状細胞やマクロファージなど）によって産生される抗炎症性のサイトカインであり、生体内において過剰な炎症を抑制する重要な役割を担っている。つまり、ＩＬ−１０の産生を誘導することで、炎症に起因する疾病などを改善することができる。例えば、ＩＬ−１０の産生誘導活性が高い乳酸菌を投与することで、腸炎を抑制することが報告されている（非特許文献１〜２）。また、遺伝子組換により、ＩＬ−１０を過剰に発現させることで、炎症の抑制を介し、心筋梗塞を抑制することが報告されている（非特許文献３）
【０００３】
一方、インターロイキン（ＩＬ）−１２は、免疫細胞によって産生されるサイトカインである点では、ＩＬ−１０と同じであるものの、生体内において炎症を促進する機能を発揮する点で、ＩＬ−１０と異なる。
したがって、ＩＬ−１０とＩＬ−１２の産生量の比率（ＩＬ−１０／ＩＬ−１２の産生量の比率）も、ＩＬ−１０の産生誘導活性と同様に、抗炎症活性の重要な指標と捉えられている。つまり、ＩＬ−１０の産生誘導活性が高くて、かつ、ＩＬ−１２の産生誘導活性が低い菌株（乳酸菌など）を選抜して使用することができれば、免疫調節活性（抗炎症機能）が高い商品を提供することができる。そして、その結果として、腸炎や心筋梗塞などの疾病以外にも、様々な炎症に起因する疾病（メタボリックシンドローム、癌、自己免疫疾患、神経変性疾患など）を改善することを期待できる。
【０００４】
ＩＬ−１０とＩＬ−１２の産生量の比率に関する技術として、特許文献１に、ビフィドバクテリウム属に属する微生物の破砕物を含み、自己免疫疾患又は消化管疾患の予防及び／又は治療用である、インターロイキン−１０の産生の維持又は促進作用と、インターロイキン−１２の産生の維持又は抑制作用とを有するインターロイキン産生調節剤を、ビフィドバクテリウム属に属する微生物を試料１ｍｌあたり２６００ジュール以上のエネルギーで超音波破砕する工程、破砕した微生物から未破砕物を除去して破砕物を調製する工程、を含む方法によって、製造する方法が記載されている。
この方法によれば、インターロイキン−１０とインターロイキン−１２の産生量の比率（インターロイキン−１０／インターロイキン−１２の産生量の比率）として、１０以上の値を得ることができる。
【０００５】
また、インターロイキン（ＩＬ）−１０の産生を促進するための剤として、特許文献２に、（Ａ）インターロイキン１２産生誘導能を有さない細菌若しくは酵母又は微生物処理物と、（Ｂ）インターロイキン１２産生誘導能を有する細菌を組み合わせてなるインターロイキン１０産生促進剤が記載されている。また、特許文献２に、前記（Ａ）の例として、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・アシドフィラス、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ビフィダムなどが記載されている。
【０００６】
ところで、通常では、乳酸菌などを商業的な規模で培養して、この培養物を商品の原料として使用する場合に、その培養条件は、乳酸菌などの増殖性（菌体の高濃度化）を重視して設定される。つまり、通常では、乳酸菌などの菌体の濃度を最大化できる培養条件として、乳酸菌などを高濃度化できる培地の組成などを選定し、そのような培地を使用した上で、乳酸菌などを、対数増殖期を過ぎた、定常期のある時点まで培養している。
乳酸菌などの培養期間については、例えば、特許文献３に、パン種の製造方法において、パン生地状の生地の発酵を、酵母と乳酸菌が対数増殖期を経て定常期の終了に到るまでの期間にわたり行うことが記載されている。
【０００７】
一方、定常期まで培養を行った場合と、定常期に至らない対数増殖期まで培養を行った場合を比較した論文も、知られている。
例えば、非特許文献４に、定常期のプランタラム菌（L. plantarum）WCFS1に比べて、対数増殖期のプランタラム菌WCFS1では、ヒト由来の末梢血単核球（PBMC）において、ＩＬ−１０の産生を強く誘導することが報告されている。
また、非特許文献５に、被験者（８名）に対数増殖期と定常期のプランタラム菌WCFS1を投与して、十二指腸粘膜の遺伝子の発現をマイクロアレイで網羅的に解析したところ、定常期のプランタラム菌WCFS1では、炎症メディエーターのNF-κBの活性化に関わる遺伝子群の発現を誘導したが、対数増殖期の プランタラム菌WCFS1では、抗炎症性に関わる遺伝子群の発現を誘導したことが 報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許第４９７９６８９号公報
【特許文献２】特開２００８−３１１５３号公報
【特許文献３】特開２００７−８９４９７号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】O'Mahony L, McCarthy J, Kelly P, Hurley G, Luo F, Chen K, O'Sullivan GC, Kiely B, Collins JK, Shanahan F, Quigley EM. 2005. Lactobacillus and bifidobacterium in irritable bowel syndrome: symptom responses and relationship to cytokine profiles. Gastroenterology 128:541-551.
【非特許文献２】Sokol H, Pigneur B, Watterlot L, Lakhdari O, Berm&uacute;dez-Humar&aacute;n LG, Gratadoux JJ, Blugeon S, Bridonneau C, Furet JP, Corthier G, Grangette C, Vasquez N, Pochart P, Trugnan G, Thomas G, Blotti&egrave;re HM, Dor&eacute; J, Marteau P, Seksik P, Langella P. 2008. Faecalibacterium prausnitzii is an anti-inflammatory commensal bacterium identified by gut microbiota analysis of Crohn disease patients. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105:16731-16736.
【非特許文献３】Yu Y, Zhang ZH, Wei SG, Chu Y, Weiss RM, Heistad DD, Felder RB. 2007. Central gene transfer of interleukin-10 reduces hypothalamic inflammation and evidence of heart failure in rats after myocardial infarction. Circ. Res. 101:304-312.
【非特許文献４】van Hemert S, Meijerink M, Molenaar D, Bron PA, de Vos P, Kleerebezem M, Wells JM and Marco ML. 2010. Identification of Lactobacillus plantarum genes modulating the cytokine response of human peripheral blood mononuclear cells. BMC Microbiol. 10:293.
【非特許文献５】van Baarlen P, Troost FJ, van Hemert S, van der Meer C, de Vos WM, de Groot PJ, Hooiveld GJ, Brummer RJ and Kleerebezem M. 2008. Differential NF-kappaB pathways induction by Lactobacillus plantarum in the duodenum of healthy humans correlating with immune tolerance. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106:2371-2376.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、ＩＬ−１０とＩＬ−１２の産生量の比率（ＩＬ−１０／ＩＬ−１２の比率）が大きい、抗炎症性に優れた培養物を得るための、微生物の培養物の製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、不飽和脂肪酸エステルを含む培地を用いて、ラクトバチルス・プランタラムを、対数増殖期の終了時点を超えない時点まで培養して、ラクトバチルス・プランタラムの培養物を得た場合、得られた培養物について、定常期まで培養した場合に比べて、ＩＬ−１０とＩＬ−１２の産生量の比率（ＩＬ−１０の産生量／ＩＬ−１２の産生量）について、より大きな値が得られることを見出し、本発明を完成した。
【００１２】
本発明は、以下の［１］〜［１２］を提供するものである。
［１］  不飽和脂肪酸エステルを含む培地を用いて、ラクトバチルス・プランタラムを、対数増殖期の終了時点を超えない時点まで培養して、ラクトバチルス・プランタラムの培養物を得ることを特徴とするラクトバチルス・プランタラムの培養物の製造方法。
［２］  上記対数増殖期の終了時点が、上記ラクトバチルス・プランタラムの培養時の菌数が最高到達菌数の半分の菌数に達した時点で表される、上記［１］に記載のラクトバチルス・プランタラムの培養物の製造方法。
［３］  上記対数増殖期の終了時点が、上記ラクトバチルス・プランタラムの中和培養時に用いる中和剤の消費量が消費総量の半分の量に達した時点で表される、上記［１］に記載のラクトバチルス・プランタラムの培養物の製造方法。
［４］  上記不飽和脂肪酸エステルが、一価もしくは多価の不飽和脂肪酸と多価アルコールとが反応してなるエステル、または、該エステルの誘導体である、上記［１］〜［３］のいずれかに記載のラクトバチルス・プランタラムの培養物の製造方法。
［５］  上記一価もしくは多価の不飽和脂肪酸が、炭素数１６〜２３の一価〜三価の不飽和脂肪酸である、上記［４］に記載のラクトバチルス・プランタラムの培養物の製造方法。
［６］  上記不飽和脂肪酸エステルが、モノオレイン酸エステルである、上記［４］又は［５］に記載のラクトバチルス・プランタラムの培養物の製造方法。
［７］  上記不飽和脂肪酸エステルが、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、または、ポリソルベートである、上記［６］に記載のラクトバチルス・プランタラムの培養物の製造方法。
［８］  上記［１］〜［７］のいずれかに記載の製造方法によって製造されたラクトバチルス・プランタラムの培養物を有効成分として含むことを特徴とする抗炎症剤。
［９］  不飽和脂肪酸エステルを含む培地を用いて、ラクトバチルス・プランタラムの複数の菌株の各々を、対数増殖期の終了時点を超えない時点まで培養して、各菌株の培養物を得た後、得られた各菌株の培養物について、インターロイキン−１０の産生誘導活性を評価し、その評価結果に基いて、上記複数の菌株の中から、抗炎症作用の程度が大きい菌株を選抜することを特徴とするラクトバチルス・プランタラムの菌株の選抜方法。
［１０］  上記インターロイキン−１０の産生誘導活性の評価に加えて、インターロイキン−１２の産生誘導活性を評価し、これらの評価結果に基いて、上記複数の菌株の中から、抗炎症作用の程度が大きい菌株を選抜する、上記［９］に記載のラクトバチルス・プランタラムの菌株の選抜方法。
［１１］  上記対数増殖期の終了時点が、上記ラクトバチルス・プランタラムの培養時の菌数が最高到達菌数の半分の菌数に達した時点で表される、上記［９］又は［１０］に記載のラクトバチルス・プランタラムの菌株の選抜方法。
［１２］  上記対数増殖期の終了時点が、上記ラクトバチルス・プランタラムの中和培養時に用いる中和剤の消費量が消費総量の半分の量に達した時点で表される、上記［９］又は［１０］に記載のラクトバチルス・プランタラムの菌株の選抜方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、ＩＬ−１０とＩＬ−１２の産生量の比率（以下、「ＩＬ−１０／ＩＬ−１２の産生量の比率」または「ＩＬ−１０／ＩＬ−１２産生比率」ともいう。）が大きい、抗炎症性に優れた培養物（ラクトバチルス・プランタラムの培養物）を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】不飽和脂肪酸エステルを含む培地（４種）、飽和脂肪酸エステルを含む培地（比較用；１種）、または、不飽和脂肪酸エステル及び飽和脂肪酸エステルを含まない培地（対照用；１種）を用いて、ラクトバチルス・プランタラムＯＬＬ２７１２を培養した場合における、ＩＬ−１０の産生量を示すグラフである。
【図２】図１に示す培養におけるＩＬ−１２の産生量を示すグラフである。
【図３】図１に示す培養における、ＩＬ−１０／ＩＬ−１２の産生量の比率を示すグラフである。
【図４】不飽和脂肪酸エステル以外の物質（アスコルビン酸ナトリウム等；１３種）を含む培地または該物質を含まない培地（対照用；１種）を用いて、ラクトバチルス・プランタラムＯＬＬ２７１２を培養した場合における、ＩＬ−１０の産生量を示すグラフである。
【図５】図４に示す培養におけるＩＬ−１２の産生量を示すグラフである。
【図６】図４に示す培養におけるＩＬ−１０／ＩＬ−１２の産生量の比率を示すグラフである。
【図７】不飽和脂肪酸エステルの一種であるモノオレイン酸デカグリセリンを含む培地（Ｑ−１７Ｓ（＋））、または、モノオレイン酸デカグリセリンを含まない培地（Ｑ−１７Ｓ（−））を用いて、ラクトバチルス・プランタラムＯＬＬ２７１２を培養した場合における、培養期間中のＩＬ−１０の産生量の経時変化を示すグラフである。
【図８】図７に示す培養における、培養期間中のＩＬ−１２の産生量の経時変化を示すグラフである。
【図９】図７に示す培養における、培養期間中のＩＬ−１０／ＩＬ−１２の産生量の比率の経時変化を示すグラフである。
【図１０】不飽和脂肪酸エステルの一種であるモノオレイン酸デカグリセリンを含む培地（Ｑ−１７Ｓ（＋））、または、モノオレイン酸デカグリセリンを含まない培地（Ｑ−１７Ｓ（−））を用いて、ラクトバチルス・プランタラムＯＬＬ２７７０を培養した場合における、培養期間中のＩＬ−１０の産生量の経時変化を示すグラフである。
【図１１】図１０に示す培養における、培養期間中のＩＬ−１２の産生量の経時変化を示すグラフである。
【図１２】図１０に示す培養における、培養期間中のＩＬ−１０／ＩＬ−１２の産生量の比率の経時変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明のラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）の培養物の製造方法は、不飽和脂肪酸エステルを含む培地を用いて、ラクトバチルス・プランタラムを、対数増殖期の終了時点を超えない時点まで培養して、ラクトバチルス・プランタラムの培養物を得るものである。
ラクトバチルス・プランタラム（以下、プランタラム菌と略すことがある。）としては、任意の菌株を用いることができる。
ラクトバチルス・プランタラムの菌株の例としては、ＯＬＬ２７１２（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２６２）、ＯＬＬ２７７０等が挙げられる。
【００１６】
本発明において、脂肪酸エステルとしては、分子中に二重結合を１個以上有する化学構造（不飽和の構造）を有しているもの（不飽和脂肪酸エステル）が用いられる。飽和脂肪酸エステルを用いた場合には、不飽和脂肪酸エステルを用いた場合に比べて、ＩＬ−１０とＩＬ−１２の産生量の比率（ＩＬ−１０／ＩＬ−１２）が小さくなる。
不飽和脂肪酸エステルとしては、例えば、一価もしくは多価の不飽和脂肪酸と多価アルコールとが反応してなるエステルや、該エステルの誘導体が挙げられる。
一価の不飽和脂肪酸としては、例えば、炭素数１６〜２３の一価の不飽和脂肪酸が挙げられる。炭素数１６〜２３の一価の不飽和脂肪酸としては、例えば、オレイン酸（炭素数：１６）、バクセン酸（炭素数：１６）、パルミトレイン酸（炭素数：１９）、ネルボン酸（炭素数：２３）等が挙げられる。
多価の不飽和脂肪酸としては、例えば、炭素数１６〜２３の二価〜四価の不飽和脂肪酸が挙げられる。炭素数１６〜２３の二価〜四価の不飽和脂肪酸としては、例えば、リノール酸（二価、炭素数：１６）、８，１１−イコサジエン酸（二価、炭素数：１９）、リノレン酸（三価、炭素数：１６）、エレオステアリン酸（三価、炭素数：１６）、５，８，１１−イコサトリエン酸（三価、炭素数：１８）、アラキドン酸（四価、炭素数：１８）等が挙げられる。
【００１７】
多価アルコールとしては、例えば、ポリグリセリン、ソルビタン等が挙げられる。ポリグリセリンとしては、例えば、グリセリンが３〜１５個結合してなるものが挙げられる。
グリセリンが３〜１５個結合してなるポリグリセリンとしては、例えば、トリグリセリン、テトラグリセリン、ペンタグリセリン、ヘキサグリセリン、ヘプタグリセリン、オクタグリセリン、ノナグリセリン、デカグリセリン、ウンデカグリセリン、ドデカグリセリン等が挙げられる。
一価もしくは多価の不飽和脂肪酸と多価アルコールとが反応してなるエステルの誘導体としては、例えば、ポリソルベート等が挙げられる。
ポリソルベートは、一価もしくは多価の不飽和脂肪酸とソルビタンとが反応してなるソルビタン脂肪酸に、酸化エチレンを縮合させてなるものである。ここで、縮合させる酸化エチレンの数は、例えば、１５〜２５個である。
本発明において、不飽和脂肪酸エステルの好ましい一例としては、モノオレイン酸エステル（例えば、オレイン酸１分子と、ポリグリセリン、ソルビタンまたはポリソルベート１分子が反応してなるもの）が挙げられる。
【００１８】
培地中の不飽和脂肪酸エステルの濃度は、ＩＬ−１０とＩＬ−１２の産生量の比率（ＩＬ−１０／ＩＬ−１２）を高める観点からは、好ましくは０．００１重量％以上、より好ましくは０．０１重量％以上、さらに好ましくは０．０２重量％以上、さらに好ましくは０．０３重量％以上、さらに好ましくは０．０４重量％以上、特に好ましくは０．０５重量％以上である。
培地中の不飽和脂肪酸エステルの濃度は、不飽和脂肪酸エステルの量の増大による培養のコストの増大を避ける観点からは、好ましくは１重量％以下、より好ましくは０．５重量％以下、さらに好ましくは０．３重量％以下、さらに好ましくは
０．１重量％以下、特に好ましくは０．０８重量％以下である。
不飽和脂肪酸エステル以外の培地の成分としては、乳酸菌の培養に用いられている一般的な成分を用いればよい。
【００１９】
本発明において、ラクトバチルス・プランタラムは、対数増殖期の終了時点を超えない時点まで培養される。対数増殖期の終了時点を超える時点まで培養を行った場合、ＩＬ−１０の産生量、及びＩＬ−１０とＩＬ−１２の産生量の比率（ＩＬ−１０／ＩＬ−１２）が低下し、本発明で目的とする培養物を得ることができない。
対数増殖期の終了時点は、例えば、以下の（ａ）または（ｂ）で表される。
（ａ）ラクトバチルス・プランタラムの培養時の菌数が、最高到達菌数の半分の菌数に達した時点
（ｂ）ラクトバチルス・プランタラムの中和培養時に用いる中和剤の消費量が、消費総量の半分の量に達した時点
【００２０】
上記（ａ）において、最高到達菌数とは、対数増殖期の終了時点を超えて、培養を継続させた場合に、到達すると推測される最高（最大）の菌数をいう。
上記（ｂ）において、中和培養とは、菌の増殖を最適な状態に保つために、中和剤（例えば、水酸化ナトリウム）を培養液に添加してｐＨを一定の範囲に保ちながら培養することをいう。
また、中和培養時に用いる中和剤の消費総量とは、培養の開始時から、最高到達菌数が得られる時まで、ｐＨが一定の範囲になるように中和剤を添加していった場合における、添加された中和剤の総量をいう。
上記（ａ）の「最高到達菌数」および上記（ｂ）の「消費総量」は、例えば、本発明の製造方法の一例を実施する前に、この一例と全く同じ条件（例えば、ラクトバチルス・プランタラムの菌株の種類、不飽和脂肪酸エステルおよび他の培地成分の種類、培養時の温度等）の下で培養を行なうことによって、予め定めておくことができる。
プランタラム菌の数は、例えば、プランタラム菌の培養物を含む懸濁液の濁度の測定値として表すことができる。濁度の測定手段としては、例えば、分光光度計が挙げられる。
プランタラム菌の対数増殖期の長さは、温度、培地の成分組成等によっても異なるが、例えば、９〜１１時間である。
【００２１】
本発明の製造方法によって製造されたラクトバチルス・プランタラムの培養物は、例えば、抗炎症剤の有効成分として用いることができる。
この培養物は、ＩＬ−１０とＩＬ−１２の産生量の比率（ＩＬ−１０／ＩＬ−１２の産生量の比率）が、従来の製造方法によって製造された培養物（従来品）における該比率よりも大きいものである点で、従来品と区別することができる。
本発明の製造方法によって製造される培養物において、ＩＬ−１０／ＩＬ−１２の産生量の比率は、不飽和脂肪酸エステルを配合しない培地を用いた場合の該比率を基準にして、好ましくは２０％以上大きいものであり、より好ましくは２５％以上大きいものであり、特に好ましくは３０％以上大きいものである。
【００２２】
次に、本発明のラクトバチルス・プランタラムの菌株の選抜方法について説明する。
本発明のラクトバチルス・プランタラムの菌株の選抜方法（以下、本発明の選抜方法と略すことがある。）は、不飽和脂肪酸エステル（例えば、モノオレイン酸エステル）を含む培地を用いて、ラクトバチルス・プランタラムの複数の菌株の各々を、対数増殖期の終了時点を超えない時点まで培養して、各菌株の培養物を得た後、得られた各菌株の培養物について、インターロイキン−１０の産生誘導活性を評価し、その評価結果に基いて、上記複数の菌株の中から、抗炎症作用の程度が大きい菌株を選抜するものである。
本発明の選抜方法は、インターロイキン−１０の産生誘導活性の評価に加えて、インターロイキン−１２の産生誘導活性を評価し、これらの評価結果に基いて、複数の菌株の中から、抗炎症作用の程度が大きい菌株を選抜するものとすることができる。
インターロイキン−１２およびインターロイキン−１０の各々についての産生誘導活性は、例えば、免疫学的測定法（例えば、ＥＬＩＳＡ；Enzyme-linked immuno-sorbent assay）等によって評価することができる。
【実施例】
【００２３】
［１．培地中の不飽和脂肪酸エステルの有無によるＩＬ−１０／ＩＬ−１２の産生量の比率への影響］
ビタミン類、ミネラル類、飽和脂肪酸エステル類、または不飽和脂肪酸エステル類（モノオレイン酸エステル類）を配合した培地を使用し、プランタラム菌ＯＬＬ２７１２を培養して、これら各成分の抗炎症活性への影響について検討した。
［実験方法１−１］  プランタラム菌ＯＬＬ２７１２の調製方法
ＭＲＳ培地（Becton Dickinson社）を使用し、プランタラム菌ＯＬＬ２７１２を静置培養（３７℃、１８時間、２回）して、プランタラム菌ＯＬＬ２７１２の賦活培養液を調製した。そして、ホエイ分解培地を使用し、プランタラム菌ＯＬＬ２７１２の賦活培養液を、ホエイ分解培地１００重量％に対して１重量%の量で添加してから、静置培養（３７℃、９時間）して、プランタラム菌ＯＬＬ２７１２の培養液を調製した。
ここで、ホエイ分解培地の組成（重量基準）は、ホエイパウダー６．２５％、ホエイタンパク濃縮物（ＷＰＣ８０；タンパク質の含有率：８０％）、プロテアーゼ０．１２％、酵母エキス０．５０％、魚肉エキス０．５０％、硫酸マンガン四水和物０．０１％、他の副原料０．０５％（後で添加；詳細は後述する。）または０％（対照用）、蒸留水９０．８２％または９０．８７％（対照用）である。
【００２４】
その後に、プランタラム菌ＯＬＬ２７１２の培養液を遠心分離処理（８０００×ｇ、１５分間）して、プランタラム菌ＯＬＬ２７１２の菌体を集菌した。そして、生理食塩水を使用して、プランタラム菌ＯＬＬ２７１２の菌体を２回で洗浄し、次いで、蒸留水を使用して、プランタラム菌ＯＬＬ２７１２の菌体を１回で洗浄し、その後、得られた菌体を蒸留水に懸濁し、プランタラム菌ＯＬＬ２７１２の懸濁液を調製した。次いで、プランタラム菌ＯＬＬ２７１２の懸濁液を加熱処理（７５℃、６０分間）してから、凍結乾燥処理（FD）し、プランタラム菌ＯＬＬ２７１２の凍結乾燥菌体を調製した。
その後に、プランタラム菌ＯＬＬ２７１２の凍結乾燥菌体をリン酸緩衝液（PBS）に懸濁してから、細胞培養用の培地を使用して、１０ｍｇ／ｍＬとなるように希釈して、プランタラム菌ＯＬＬ２７１２の希釈液を調製した。
【００２５】
ここで、上述のホエイ分解培地（上述の副原料を除くもの）に、以下に示す副原料（全１８種類のいずれか１つ）を０．０５重量％の量で配合し、全１８種類のホエイ分解培地を調製した。その後、上記と同等な条件の処理によって、数種類のプランタラム菌ＯＬＬ２７１２の希釈液を調製した。
［ホエイ分解培地の副原料の種類］
（ａ）不飽和脂肪酸エステル：４種類
（ａ−１）モノオレイン酸デカグリセリン：サンソフトＱ−１７Ｓ（商品名）、親水性、太陽化学社製
（ａ−２）ペンタグリセリンモノオレイン酸エステル：サンソフトＡ−１７１Ｅ（商品名）、親水性、太陽化学社製
（ａ−３）ソルビタンモノオレイン酸エステル：サンソフトＮｏ．８１Ｓ（商品名）、親油性、太陽化学社製
（ａ−４）モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン：Ｔｗｅｅｎ８０（商品名）、親水性、和光純薬工業社製
（ｂ）飽和脂肪酸エステル：１種類
（ｂ−１）モノステアリン酸デカグリセリン：サンソフトＱ−１８Ｓ（商品名）、両親媒性、太陽化学社製
（ｃ）ビタミン類：９種類（アスコルビン酸ナトリウム、チアミン塩酸塩、リボフラビン、ニコチン酸、ニコチンアミド、パントテン酸カルシウム、ピリドキシン塩酸塩、ビオチン、葉酸）
（ｄ）ミネラル類：４種類（硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、硫酸鉄、硫酸第二鉄アンモニウム）
【００２６】
［実験方法１−２］免疫細胞のＩＬ−１０とＩＬ−１２の産生誘導活性の評価方法
自動磁気細胞分離装置（auto MACS、Miltenyi Biotec 社）を使用し、8週齢の雄BALB/cマウス（日本SLC社）の骨髄から未分化の樹状細胞のみを分離した。そして、Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor （以下、ＧＭ−ＣＳＦと略す。）を含むＲＰＭＩ培地（Invitrogen社）を使用し、未分化の樹状細胞を培養（３７℃、ＣＯ２（５％）の環境下、８日間）して、十分に分化させることで、骨髄由来の樹状細胞（BMDC；免疫細胞）を調製した。
その後に、この樹状細胞（BMDC）を回収して、２．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度になるように、４８ウェル・プレートに播種してから、上述の各種のホエイ培地で培養したプランタラム菌ＯＬＬ２７１２を、乾燥重量で５０μｇ／ｍＬとなるように添加した。そして、ＧＭ−ＣＳＦを含むＲＰＭＩ培地を使用し、前記の４８ウェル・プレートを培養（３７℃、ＣＯ２（５％）の環境下、２４時間）してから、この培養上清を回収した。
そして、「Mouse IL-10 ELISA Set」（Becton Dickinson社）を使用し、この培養上清のＩＬ−１０濃度を測定すると共に、「Mouse IL-12 (p70) ELISA Set」（Becton Dickinson社）を使用し、この培養上清のＩＬ−１２濃度を測定した。ここで、ＩＬ−１２濃度では、活性型であるＩＬ−１２ （ｐ７０）濃度を測定した。
【００２７】
［実験結果１］  免疫細胞のＩＬ−１０とＩＬ−１２の産生誘導活性の評価結果
以上の実験の結果（４回の実験の平均値、および、標準偏差等）を表１〜表６および図１〜図６に示す。
表１〜表３（図１〜図３）は、副原料として、不飽和脂肪酸エステル（４種類のいずれか）、または飽和脂肪酸エステル（１種類；Ｑ−１８Ｓ）を用いた場合の結果、及び、副原料を用いなかった場合（Ｃｏｎｔｒｏｌ）の結果を示す。表４〜表６（図４〜図６）は、副原料として、ビタミン類（９種類のいずれか）またはミネラル類（４種類のいずれか）を用いた場合の結果、及び、副原料を用いなかった場合（Ｃｏｎｔｒｏｌ）の結果を示す。
【００２８】
【表１】
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【００２９】
【表２】
2018029491.tif 000004
【００３０】
【表３】
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【００３１】
表１（図１）から、ホエイ分解培地に、脂肪酸エステル（不飽和、飽和）を配合して、プランタラム菌ＯＬＬ２７１２を培養しても、対照（Ｃｏｎｔｒｏｌ）に比べて、免疫細胞のＩＬ−１０の産生誘導活性が向上されないことを確認できた。
表２（図２）から、ホエイ分解培地に、脂肪酸エステルのうち、飽和脂肪酸エステルであるモノステアリン酸デカグリセリンを配合して、プランタラム菌ＯＬＬ２７１２を培養すると、対照（Ｃｏｎｔｒｏｌ）に比べて、免疫細胞のＩＬ−１２の産生誘導活性が、大きくは低減されないこと、および、脂肪酸エステルのうち、不飽和脂肪酸エステル（４種類のいずれか）を配合して、プランタラム菌ＯＬＬ２７１２を培養すると、対照（Ｃｏｎｔｒｏｌ）に比べて、免疫細胞のＩＬ−１２の産生誘導活性が大きく低減されることを確認できた。
表３（図３）から、ホエイ分解培地に、不飽和脂肪酸エステル（４種類のいずれか）を配合して、プランタラム菌ＯＬＬ２７１２を培養すると、対照（Ｃｏｎｔｒｏｌ）や飽和脂肪酸エステルに比べて、免疫細胞のＩＬ−１０／ＩＬ−１２産生比率が大きく増大することを確認できた。
【００３２】
【表４】
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【００３３】
【表５】
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【００３４】
【表６】
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【００３５】
表４（図４）から、ホエイ分解培地に、ビタミン類やミネラル類を配合して、プランタラム菌ＯＬＬ２７１２を培養しても、対照（Ｃｏｎｔｒｏｌ）に比べて、免疫細胞のＩＬ−１０の産生誘導活性が大きくは変化しないことを確認できた。
表５（図５）から、ホエイ分解培地に、ビタミン類やミネラル類を配合して、プランタラム菌ＯＬＬ２７１２を培養しても、対照（Ｃｏｎｔｒｏｌ）に比べて、免疫細胞のＩＬ−１２の産生誘導活性が大きくは変化しないことを確認できた。
表６（図６）から、ホエイ分解培地に、ビタミン類やミネラル類を配合して、プランタラム菌ＯＬＬ２７１２を培養しても、対照（（Ｃｏｎｔｒｏｌ）に比べて、免疫細胞のＩＬ−１０／ＩＬ−１２産生比率が大きくは変化しないことを確認できた。
以上の結果から、不飽和脂肪酸エステルを配合した培地を使用し、プランタラム菌ＯＬＬ２７１２を培養すると、ＩＬ−１０／ＩＬ−１２産生比率が著しく大きくなり、例えば抗炎症活性の向上を期待できること、および、不飽和脂肪酸エステル以外の物質（飽和脂肪酸エステル、ビタミン類、ミネラル類）では、このような効果（ＩＬ−１０／ＩＬ−１２産生比率の著しい増大など）が期待できないことを確認できた。
【００３６】
［２．培養期間の長さを変えることによるＩＬ−１０／ＩＬ−１２の産生量の比率への影響（プランタラム菌ＯＬＬ２７１２を用いた場合）］
［実験方法２−１］  プランタラム菌ＯＬＬ２７１２の調製方法
実験方法１−１と同様にして、プランタラム菌ＯＬＬ２７１２の賦活培養液を調製した。そして、実験方法１−１で用いたホエイ分解培地と同じ培地を使用し、プランタラム菌ＯＬＬ２７１２の賦活培養液を４重量％で添加してから、中和剤にＫ２ＣＯ３（４０重量%）を使用し、ｐＨを５．８に制御しながら撹拌培養（３３℃、Ｎ２の上面の通気下、２００ｒｐｍ）して、プランタラム菌ＯＬＬ２７１２の高濃度培養液を調製した。なお、この撹拌培養では、事前に培養条件を検討し、最高の菌体濃度が得られる培養条件に設定した。
その後に、実験方法１−１と同様にして、プランタラム菌ＯＬＬ２７１２の凍結乾燥菌体を調製した。
その後に、プランタラム菌ＯＬＬ２７１２の凍結乾燥菌体をリン酸緩衝液（PBS）に懸濁してから、細胞培養用の培地を使用し、１０ｍｇ／ｍＬとなるように希釈して、プランタラム菌ＯＬＬ２７１２の希釈液を調製した。
【００３７】
［実験方法２−２］  免疫細胞のＩＬ−１０とＩＬ−１２の産生誘導活性の評価方法
実験方法１−１で調製したホエイ分解培地であって、副原料として、モノオレイン酸デカグリセリン（サンソフトＱ−１７Ｓ（商品名））を含むもの、または、副原料を含まないものを用いて、実験方法１−２と同様にして、免疫細胞のＩＬ−１０とＩＬ−１２の産生誘導活性を評価した。
この際、対数増殖期の中期（対数増殖期の始点から４時間後）、対数増殖期の後期（対数増殖期の始点から８時間後）、定常期の初期（対数増殖期の始点から１２時間後）、定常期の中期（対数増殖期の始点から１６時間後）の各時点にて、免疫細胞のＩＬ−１０とＩＬ−１２の産生誘導活性を評価した。
なお、この培養における対数増殖期の終了時点は、対数増殖期の始点から１０時間経過後の時点（最高到達菌数の半分の菌数に到達した時点）であった。
【００３８】
［実験結果２］  免疫細胞のＩＬ−１０とＩＬ−１２の産生誘導活性の評価結果
以上の実験の結果（４回の実験の平均値、および、標準偏差）を表７〜表９および図７〜図９に示す。
【００３９】
【表７】
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【００４０】
【表８】
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【００４１】
【表９】
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【００４２】
表７（図７）から、ホエイ分解培地に不飽和脂肪酸エステルを配合して、対数増殖期（４時間、８時間）までプランタラム菌ＯＬＬ２７１２を培養すると、ホエイ分解培地に不飽和脂肪酸エステルを配合せず、対数増殖期（４時間、８時間）までプランタラム菌ＯＬＬ２７１２を培養した場合に比べて、免疫細胞のＩＬ−１０の産生誘導活性が向上されることを確認できた。
また、ホエイ分解培地に不飽和脂肪酸エステルを配合して、定常期（１２時間、１８時間）までプランタラム菌ＯＬＬ２７１２を培養すると、ホエイ分解培地に不飽和脂肪酸エステルを配合せず、定常期（１２時間、１８時間）まで、プランタラム菌ＯＬＬ２７１２を培養した場合に比べて、免疫細胞のＩＬ−１０の産生誘導活性が低減されることを確認できた。
【００４３】
表８（図８）から、ホエイ分解培地に、不飽和脂肪酸エステルを配合して、対数増殖期（４時間、８時間）まで、プランタラム菌ＯＬＬ２７１２を培養すると、ホエイ分解培地に、不飽和脂肪酸エステルを配合せず、対数増殖期（４時間、８時間）まで、プランタラム菌ＯＬＬ２７１２を培養した場合に比べて、免疫細胞のＩＬ−１２の産生誘導活性が低減されることを確認できた。
また、ホエイ分解培地に不飽和脂肪酸エステルを配合して、定常期（１２時間、１８時間）までプランタラム菌ＯＬＬ２７１２を培養すると、ホエイ分解培地に不飽和脂肪酸エステルを配合せず、定常期（１２時間、１８時間）までプランタラム菌ＯＬＬ２７１２を培養した場合に比べて、免疫細胞のＩＬ−１２の産生誘導活性が変化しないことを確認できた。
【００４４】
表９（図９）から、ホエイ分解培地に、不飽和脂肪酸エステルを配合して、対数増殖期（４時間、８時間）まで、プランタラム菌ＯＬＬ２７１２を培養すると、ホエイ分解培地に、不飽和脂肪酸エステルを配合せず、対数増殖期（４時間、８時間）まで、プランタラム菌ＯＬＬ２７１２を培養した場合に比べて、免疫細胞のＩＬ−１０／ＩＬ−１２産生比率が向上されることを確認できた。
また、ホエイ分解培地に、不飽和脂肪酸エステルを配合して、定常期（１２時間、１８時間）まで、プランタラム菌ＯＬＬ２７１２を培養すると、ホエイ分解培地に、不飽和脂肪酸エステルを配合せず、定常期（１２時間、１８時間）まで、プランタラム菌ＯＬＬ２７１２を培養した場合に比べて、免疫細胞のＩＬ−１０／ＩＬ−１２産生比率が低減されることを確認できた。
以上から、ホエイ分解培地に、不飽和脂肪酸エステルを配合して、プランタラム菌ＯＬＬ２７１２を定常期の範囲内の時点まで培養せず、対数増殖期の範囲内の時点で培養を終了させると、ＩＬ−１０／ＩＬ−１２産生比率が著しく増大し、抗炎症活性の向上を期待できることを確認できた。
【００４５】
［３．培養期間の長さを変えることによるＩＬ−１０／ＩＬ−１２の産生量の比率への影響（プランタラム菌ＯＬＬ２７７０を用いた場合）］
プランタラム菌ＯＬＬ２７１２に代えて、プランタラム菌ＯＬＬ２７７０を用いたこと、および、免疫細胞のＩＬ−１０とＩＬ−１２の産生誘導活性の測定時点を、４つの時点から、対数増殖期の中期（培養開始から５時間後）、定常期の中期（培養開始から１６時間後）の２つの時点に変更したこと以外は、上記「２．培養期間の長さを変えることによるＩＬ−１０／ＩＬ−１２の産生量の比率への影響（プランタラム菌ＯＬＬ２７１２を用いた場合）」と同様にして、実験した。
なお、この培養における対数増殖期の終了時点は、培養開始から７時間経過後の時点（中和剤が消費総量の半分に達した時点）であった。
以上の実験の結果（４回の実験の平均値、および、標準偏差）を表１０〜表１２および図１０〜図１２に示す。
【００４６】
【表１０】
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【００４７】
【表１１】
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【００４８】
【表１２】
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【００４９】
表１０（図１０）から、ホエイ分解培地に不飽和脂肪酸エステルを配合して、対数増殖期（５時間）までプランタラム菌ＯＬＬ２７７０を培養すると、ホエイ分解培地に不飽和脂肪酸エステルを配合せず、対数増殖期（５時間）までプランタラム菌ＯＬＬ２７７０を培養した場合に比べて、免疫細胞のＩＬ−１０の産生誘導活性が向上されることを確認できた。
また、ホエイ分解培地に、不飽和脂肪酸エステルを配合して、定常期（１６時間）まで、プランタラム菌ＯＬＬ２７７０を培養すると、 ホエイ分解培地に、不飽和脂肪酸エステルを配合せず、定常期（１６時間）まで、プランタラム菌ＯＬＬ２７７０を培養した場合に比べて、免疫細胞のＩＬ−１０の産生誘導活性が変化しないことを確認できた。
表１１（図１１）から、ホエイ分解培地に、不飽和脂肪酸エステルを配合して、対数増殖期（５時間）まで、プランタラム菌ＯＬＬ２７７０を培養すると、ホエイ分解培地に、不飽和脂肪酸エステルを配合せず、対数増殖期（５時間）まで、プランタラム菌ＯＬＬ２７７０を培養した場合に比べて、免疫細胞のＩＬ−１２の産生誘導活性が有意に低減することを確認できた。
また、ホエイ分解培地に、不飽和脂肪酸エステルを配合して、定常期（１６時間）まで、プランタラム菌ＯＬＬ２７７０を培養すると、ホエイ分解培地に、不飽和脂肪酸エステルを配合せず、定常期（１６時間）まで、プランタラム菌ＯＬＬ２７７０を培養した場合に比べて、免疫細胞のＩＬ−１２の産生誘導活性が変化しないことを確認できた
【００５０】
表１２（図１２）から、ホエイ分解培地に、不飽和脂肪酸エステルを配合して、対数増殖期（５時間）まで、プランタラム菌ＯＬＬ２７７０を培養すると、ホエイ分解培地に、不飽和脂肪酸エステルを配合せず、対数増殖期（５時間）まで、プランタラム菌ＯＬＬ２７７０を培養した場合に比べて、免疫細胞のＩＬ−１０／ＩＬ−１２産生比率が向上されることを確認できた。
また、ホエイ分解培地に、不飽和脂肪酸エステルを配合して、定常期（１６時間）まで、プランタラム菌ＯＬＬ２７７０を培養すると、ホエイ分解培地に、不飽和脂肪酸エステルを配合せず、定常期（１６時間）まで、プランタラム菌ＯＬＬ２７７０を培養した場合に比べて、免疫細胞のＩＬ−１０／ＩＬ−１２産生比率が有意に低減することを確認できた。
【００５１】
以上から、ホエイ分解培地に、不飽和脂肪酸エステルを配合して、プランタラム菌ＯＬＬ２７７０を定常期の範囲内の時点（１６時間）まで培養せず、対数増殖期の範囲内の時点（５時間）で培養を終了させると、ＩＬ−１０／ＩＬ−１２産生比率が向上し、抗炎症活性の向上を期待できることを確認できた。
したがって、プランタラム菌の種類に影響されず、プランタラム菌に共通して、ホエイ分解培地に、不飽和脂肪酸エステルを配合して、 プランタラム菌を定常期の範囲内の時点まで培養せず、 対数増殖期の範囲内の時点で培養を終了させると、ＩＬ−１０／ＩＬ−１２産生比率が向上し、抗炎症活性の向上を期待できることを確認できた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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