(57)【要約】【課題】病原性を示さない菌によって、レジオネラ属菌の増殖を抑制する。【解決手段】バチルス属菌を含有するレジオネラ属菌の増殖抑制剤。バチルス属菌を用いるレジオネラ属菌の増殖抑制方法。バチルス属菌には、生物膜中でレジオネラ属菌の生育を抑制する効果があり、従来の抗菌剤に匹敵する殺菌効果を示す。バチルス属菌としては、病原性を示さないBacillus  subtilisが好ましい。更に必要最低濃度のスライムコントロール剤を併用してバチルス属菌を選択的に優先種とすることが好ましい。【選択図】図１
2018139515.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バチルス属菌を含有するレジオネラ属菌の増殖抑制剤。
【請求項２】
バチルス属菌がBacillus  subtilisを含有する請求項１に記載のレジオネラ属菌の増殖抑制剤。
【請求項３】
さらにスライムコントロール剤を含む請求項１又は２に記載のレジオネラ属菌の増殖抑制剤。
【請求項４】
バチルス属菌を用いることを特徴とするレジオネラ属菌の増殖抑制方法。
【請求項５】
バチルス属菌がBacillus  subtilisを含有する請求項４に記載のレジオネラ属菌の増殖抑制方法。
【請求項６】
さらにスライムコントロール剤を併用する請求項４又は５に記載のレジオネラ属菌の増殖抑制方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レジオネラ属菌の増殖を抑制する増殖抑制剤と抑制方法に係り、詳しくは、生物膜の菌相を制御することにより、生物膜内のレジオネラ属菌の増殖を抑制する増殖抑制剤と増殖抑制方法に関する。
本発明の適用対象としては、冷却水、入浴水、修景用水などが挙げられる。
【背景技術】
【０００２】
レジオネラ属菌は単独で生育できず、生物膜内で増殖する細菌であることが知られている。従来、生物膜中のレジオネラ属菌の増殖抑制には、抗菌剤が使用され、目的の効果が発揮されている。
【０００３】
しかし、抗菌剤は人や環境生物に対して害を持つことが知られており、その使用にあたっては、適用場所以外に暴露されないよう、添加方法、濃度管理、排水処理など、十分に管理する必要がある。特に、生物膜中のレジオネラ属菌に抗菌剤の効果を発揮させるためには、液中に分散しているレジオネラ属菌に対する必要量よりも高濃度の抗菌剤が必要とされるため、人や環境生物に対する害について十分に配慮する必要がある。
【０００４】
レジオネラ属菌が生育する宿主としてはアメーバが報告され（非特許文献１）、シアノバクテリアについては共生が報告されている（非特許文献２）。また、共存する細菌がレジオネラ属菌の生育を促進する報告もなされている。
レジオネラ属菌は培地で生育する際にL-cysteine要求性であることが知られているが、それを除いた培地に細菌と共に培養するとレジオネラコロニーが形成される報告がある（非特許文献３〜５）。さらに単独の細菌が形成した生物膜内でレジオネラ属菌の増殖能力が維持される報告もある（非特許文献６）。この報告のなかではP.aeruginosaの生物膜ではレジオネラ属菌の生育が認められないと報告されているが、P.aeruginosaは病原性細菌であり、環境の開放系で使用することはできない。
一方、冷却水中の一般細菌ＣＦＵはレジオネラ属菌ＣＦＵと相関がなく、一般細菌とレジオネラ属菌とは関係がないことが報告されている（非特許文献７）。
【０００５】
このように、生物膜中でレジオネラ属菌の増殖を抑制する菌の存在の有無については十分に明らかにされていないのが現状である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Appiled  and  Envrionmental  Microbiology，Oct．1982，P.954-959
【非特許文献２】Applied  and  Envrionmental  Microbiology，Feb．1980，P.456-459
【非特許文献３】Appied  and  Envronmental  Microbaiology，Dec.1983，p.1447-1449
【非特許文献４】Journal  of  Appled  Bacteriology1986，60，297-299
【非特許文献５】感染症学雑誌第63巻第10号p.1160-1164
【非特許文献６】PLoS  One．2012;7(11):e50560
【非特許文献７】新版レジオネラ症防止指針ｐ.56  図８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従来のレジオネラ属菌の増殖抑制技術のうち、抗菌剤を用いる方法は、人や環境への毒性の懸念があり、濃度制御や濃度管理に多大な手間を要する。また、P.aeruginosaは病原性細菌であり、環境の開放系で使用することはできない。
【０００８】
本発明は、このような従来技術の問題を解決するものであって、病原性を示さない菌によって、レジオネラ属菌の増殖を抑制するレジオネラ属菌の増殖抑制剤及び増殖抑制方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題を解決すべく検討を重ねた結果、バチルス属菌により生物膜中のレジオネラ属菌の増殖を抑制することができること、従って、病原性を示さないバチルス属菌を用いることで、上記課題を解決することができることを発見し、本発明を完成させた。
即ち、本発明は以下を要旨とする。
【００１０】
［１］  バチルス属菌を含有するレジオネラ属菌の増殖抑制剤。
【００１１】
［２］  バチルス属菌がBacillus  subtilisを含有する［１］に記載のレジオネラ属菌の増殖抑制剤。
【００１２】
［３］  さらにスライムコントロール剤を含む［１］又は［２］に記載のレジオネラ属菌の増殖抑制剤。
【００１３】
［４］  バチルス属菌を用いることを特徴とするレジオネラ属菌の増殖抑制方法。
【００１４】
［５］  バチルス属菌がBacillus  subtilisを含有する［４］に記載のレジオネラ属菌の増殖抑制方法。
【００１５】
［６］  さらにスライムコントロール剤を併用する［４］又は［５］に記載のレジオネラ属菌の増殖抑制方法。
【発明の効果】
【００１６】
バチルス属菌には、生物膜中でレジオネラ属菌の生育を抑制する効果があり、従来の抗菌剤に匹敵する殺菌効果を示す。従って、本発明によれば、抗菌剤を用いる場合の濃度制御や濃度管理など、多大な手間を要することなく、レジオネラ属菌の増殖を抑制することができる。
バチルス属菌のうち、例えば、Bacillus  subtilisのような病原性を示さない菌を用いることで、環境開放系にも支障なく適用することができる。
【００１７】
また、バチルス属菌はスライムコントロール剤に対して耐性があるため、バチルス属菌と必要最低限のスライムコントロール剤を併用することで、系内のバチルス属菌以外の細菌を死滅させ、バチルス属菌を選択的に優先種とすることで、バチルス属菌によるレジオネラ属菌の増殖抑制効果をより一層有効に得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】実施例１，２及び比較例１のレジオネラＣＦＵの測定結果を示すグラフである。
【図２】実施例３及び比較例２の結果を示すグラフであり、（ａ）図はBacillus  subtilisに対する酸化系スライムコントロール剤の殺菌効果（実施例３）を示し、（ｂ）図は、Pseudomonas  putidaに対する酸化系スライムコントロール剤の殺菌効果（比較例２）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下に本発明の実施の形態を詳細に説明する。
【００２０】
本発明で増殖抑制対象とするレジオネラ属菌は、入浴設備、冷却塔等において増殖し易く、エアロゾルを介して人体に吸入されることでレジオネラ感染症を引き起こす。レジオネラ属菌の感染によるレジオネラ肺炎やポンティアック熱での感染を予防するために、レジオネラ属菌の増殖を抑制することは極めて重要である。現在数十種のレジオネラ属菌が確認されており、代表的なレジオネラ属菌としては、レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella  pneumophila）が知られている。これらはいずれも感染症を引き起こす可能性があるとされている。
【００２１】
本発明では、このようなレジオネラ属菌に対してバチルス属菌を共存させ、バチルス属菌の生物膜を形成させてレジオネラ属菌の増殖を抑制する。
【００２２】
バチルス属菌としては、例えば、バチルス  サブチリス（Bacillus  subtilis）、バチルス  コーアグランス（Bacillus  coagulans）、バチルス  サークランス（Bacillus  circulans）、バチルス  ステアロサーモフイラス（Bacillus  stearothermophilus）、バチルス  ブレビス（Bacillus  brevis）、バチルス  メガテリウム（Bacillus  megaterium）、パニエバチルス（Paenibacillus）、ゲオバチルス  サーモレオボランス（Geobacillus  thermoleovorans）などの１種又は２種以上を用いることができるが、これらのうち、病原性を示さないBacillus  subtilisやBacillus  megateriumを好適に用いることができ、特にBacillus  subtilisを単独で、又はBacillus  subtilisと他のバチルス属菌とを組み合わせて使用することが好ましい。
バチルス属菌は市販のものを利用しても良いし、常在菌であるため適宜採集及び培養して利用しても良い。
【００２３】
バチルス属菌は、有効菌を懸濁した液体、または菌を固形化した剤として製造及び使用をすることができる。有効な菌を含み、栄養源、防腐剤、界面活性剤などの補助剤を含む液体、または固形化した剤として使用することもできる。
【００２４】
適用箇所への本発明のレジオネラ属菌の増殖抑制剤の添加方法には特に制限はなく、添加方法は、連続添加でも、間欠添加でもよい。間欠添加の場合、望ましい添加頻度は月に一回程度である。
【００２５】
バチルス属菌の添加濃度も特に限定されない。バチルス属菌は自己増殖能力があるので、対象とする系で添加した菌が生育しやすければ添加濃度は低くてもよく、生育しにくい系であれば添加濃度を高める必要がある。本発明では、適用箇所の系内に添加したバチルス属菌を主体とする生物膜が形成されることが重要である。なお、ここで「生物膜が形成される」とは、手でさわった時にぬめりが感じられる程度をさす。目視で生物膜の形成が容易に確認される必要はない。ガラス、ゴム板、あみなどのモニタリングクーポンを用いて、生物膜形成状況を把握してもよい。生物膜中のバチルス属菌の有無は、微生物の専門家であれば、顕微鏡観察で判別することが可能である。好ましくは、バチルス属菌の特異的ＤＮＡプローブを用い、定量ＰＣＲにて、一定スライム量中のバチルス属菌量をモニタリングすることが望ましい。
【００２６】
添加したバチルス属菌を適用箇所の系内で維持するためには、スライムコントロール剤の併用が有効である。即ち、バチルス属菌はスライムコントロール剤に対して耐性を示すが、他の細菌はスライムコントロール剤により殺菌されやすい。このため、バチルス属菌と共にスライムコントロール剤を併用して、その必要最低限濃度を添加することにより、系内に存在するバチルス属菌以外の細菌の生育を抑制してバチルス属菌を選択的に優先種とすることができ、バチルス属菌によるレジオネラ属菌の増殖抑制効果を有効に得ることができるようになる。
【００２７】
スライムコントロール剤としては、安定化された酸化系スライムコントロール剤が好ましく、例えば、ヒダントイン、ヒダントイン誘導体（以下、これらをヒダントイン類ということがある。）や、ハロゲン系酸化物がスルファミン酸化合物などの窒素化合物により安定化されたハロゲン系酸化剤が挙げられる。
【００２８】
ハロゲン系酸化物としては、例えば、塩素、次亜塩素酸ナトリウム、次亜塩素酸カリウム等の次亜塩素酸アルカリ金属塩、次亜塩素酸カルシウム、次亜塩素酸バリウム等の次亜塩素酸アルカリ土類金属塩、亜塩素酸ナトリウム、亜塩素酸カリウム等の亜塩素酸アルカリ金属塩、亜塩素酸バリウム等の亜塩素酸アルカリ土類金属塩、亜塩素酸ニッケル等の他の亜塩素酸金属塩、塩素酸アンモニウム、塩素酸ナトリウム、塩素酸カリウム等の塩素酸アルカリ金属塩、塩素酸カルシウム、塩素酸バリウム等の塩素酸アルカリ土類金属塩等の塩素系酸化剤や、これらの塩素系酸化剤の塩素を臭素に置き換えた臭素系酸化剤が挙げられる。これらのハロゲン系酸化剤は１種を単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【００２９】
このうち、次亜塩素酸アルカリ金属塩や次亜臭素酸アルカリ金属塩が好ましく、次亜塩素酸ナトリウムや次亜臭素酸ナトリウムがより好ましい。
【００３０】
スルファミン酸化合物としては、例えば、スルファミン酸、Ｎ−メチルスルファミン酸、Ｎ，Ｎ−ジメチルスルファミン酸及びＮ−フェニルスルファミン酸、及び／又はこれらの塩（例えば、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩）などが例示される。これらのスルファミン酸化合物は、１種を単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【００３１】
例えば、次亜塩素酸イオン及びスルファミン酸は、次式のように反応して、Ｎ−モノクロロスルファミン酸イオン又はＮ，Ｎ−ジクロロスルファミン酸イオンを形成し、塩素系酸化剤の有効成分を安定化させる。
ＣｌＯ−＋Ｈ２ＮＳＯ３Ｈ→ＨＣｌＮＳＯ３−＋Ｈ２Ｏ
２ＣｌＯ−＋Ｈ２ＮＳＯ３Ｈ＋Ｈ＋→Ｃｌ２ＮＳＯ３−＋２Ｈ２Ｏ
【００３２】
これらのスライムコントロール剤は、添加効果が得られる程度において、なるべく少なく用いることが望ましく、残留塩素濃度として１ｍｇ／Ｌ  ａｓ  Ｃｌ２以上、例えば５〜１０ｍｇ／Ｌ  ａｓ  Ｃｌ２程度とすることが好ましい。また、この濃度での酸化系スライムコントロール剤の維持時間は３０〜６０分程度が望ましい。
【００３３】
本発明のレジオネラ属菌の増殖抑制剤の適用箇所としては、レジオネラ属菌の増殖が想定される箇所であれば特に限定されない。具体的には、入浴設備、給水・給湯設備、冷却塔、加湿器、噴水等の修景設備、蓄熱槽等が挙げられる。
【実施例】
【００３４】
以下に実施例、比較例及び実験例を挙げて本発明をより具体的に説明する。
【００３５】
なお、以下の実施例等で用いた「1/10PY培地」とは、以下に示す成分組成の「1/10ペプトンイーストエキストラクト寒天平板培地」である。
［1/10PY培地］
Peptone：1g
Yeast  Extract：1g
NaCl：0.5g
Tap  water：1000ml
寒天：15g
pH：6.8-7.2（NaOHで調整）
オートクレーブ滅菌：121℃、15分
【００３６】
［実施例１］
＜実験方法＞
以下の手順でレジオネラ属菌の増殖抑制効果を調べる実験を行った。
（１）  1/10PY培地で前培養したBacillus  subtilisを滅菌水道水に懸濁させて、Ａ６６０ｎｍ  ０．１の懸濁液を作成した。これを１／１０希釈して1/10PY培地に１００μＬ植菌し、３７℃で３日間培養した。
（２）  あらかじめ前培養した冷却塔分離株Legionella  pneumophila  serotype1  No10（以下LpNo.10）を、ｐＨ８．５、０．２Ｍのリン酸塩緩衝液に、Ａ６６０ｎｍ  ０．１になるよう懸濁させ、これを１／１０希釈した。
（３）  菌が生育したことを目視確認した（１）の培地に、（２）のLpNo.10菌液、１００μＬを植菌した後、３７℃で培養した。LpNo.10菌液は、滅菌水道水で段階希釈し、レジオネラＣＦＵを測定した。レジオネラＣＦＵ測定は、前処理として、０．２Ｍ  ＨＣｌ−ＫＣｌ緩衝液を植菌用サンプルに対し等量混合して２５℃で４分静置後、２００μＬをGVPCレジオネラ選択用培地に植菌して行った。菌液としては１００μＬ分植菌したことになる。３７℃で５〜７日間培養し、灰白色のレジオネラ様コロニーを計測した。レジオネラ様コロニーは、システィン要求性を確認し、システィン要求性を示したものをレジオネラコロニーとし、０日目のＣＦＵとした。
（４）  培養２日目に、１０ｍＬの濾過滅菌水道水で菌を回収し、段階希釈してレジオネラＣＦＵを測定した。レジオネラＣＦＵ測定は（３）と同様に、前処理、植菌、培養、レジオネラコロニーの計測と同定を実施した。回収に用いた１０ｍＬで、植菌したLpNo.10菌液１００μＬは１００倍に希釈されているので、得られたＣＦＵ値を１００倍して、培養２日目のＣＦＵとした。
（５）  培養８日目に、（４）と同様に実施して、培養８日目のＣＦＵとした。
【００３７】
［実施例２］
実施例１の手順（１）において、1/10PY培地で前培養したBacillus  subtilis、Ｄ２ＣＴ２冷却塔分離菌株No.11（以下D2CT2-11）でそれぞれＡ６６０ｎｍ  ０．１の懸濁液を作成し、これを１／１０希釈して1/10PY培地に各々１００μＬ植菌し、３７℃で培養した。すなわち、２種類の菌を同じプレート上で混合して培養した。（２）以降は実施例１と同様に行った。
【００３８】
また、ここで用いた「D2CT2-11」は、ＤＮＡ相同性による同定試験でMycobacteriumと判定された。
【００３９】
［比較例１］
実施例１の手順（１）において、1/10PY培地で前培養したD2CT2-11でＡ６６０ｎｍ  ０．１の懸濁液を作成し、これを１／１０希釈して1/10PY培地に１００μＬ植菌し、３７℃で培養したこと以外は、実施例１と同様に行った。
【００４０】
＜結果＞
実施例１，２及び比較例１のレジオネラＣＦＵの測定結果を図１に示す。
実施例１：Bacillus  subtilisを生育させた培地では、レジオネラはＣＦＵ形成能力を維持するが、経時的に漸減し、約１週間後に１／１００以下に低下している。
実施例２：Bacillus  subtilisと冷却塔分離株D2CT2-11を混合して生育させた培地では、レジオネラはＣＦＵ形成能力を維持するが、経時的に漸減し、約１週間後に１／１００以下に低下している。
比較例１：冷却塔分離株D2CT2-11を植菌した培地で培養したレジオネラはＣＦＵ形成能力を維持し、その数は２日目には増加傾向を示し、１週間後も維持された。このことは、この細菌による生物膜中ではレジオネラが生育し続けることを示す。
【００４１】
＜考察＞
冷却塔分離株D2CT2-11が形成する生物膜から回収されたレジオネラはＣＦＵを維持するが、Bacillus  subtilisによって形成された生物膜中から回収されたレジオネラＣＦＵは経時的に低下する。これは、Bacillus  subtilis生物膜がレジオネラの生育を抑制していることを示している。
レジオネラＣＦＵを維持できる冷却塔分離株D2CT2-11とBacillus  subtilisを混合して作成した生物膜中から回収したレジオネラＣＦＵは経時的に低下した。これは、Bacillus  subtilisがレジオネラを生育させる菌が共存してもレジオネラ抑制能力を持つことを示している。
【００４２】
［実施例３、比較例２］
本実験例では、酸化系スライムコントロール剤として、アルベマール社製「ＳＴＡＢＲＯＭ(登録商標)９０９」（安定化臭素と安定化塩素の混合品、以下Stabrom909）を用い、Bacillus  subtilisの酸化系スライムコントロール剤耐性を調べる実験を行った。
【００４３】
Bacillus  subtilisとPseudomonas  putidaをそれぞれ1/10PY培地で前培養後、ｐＨ９．０、０．２Ｍのリン酸塩緩衝液にＡ６６０ｎｍ  ０．１となるよう懸濁させ、同じ緩衝液で１０倍して菌液とした。
一方、Stabrom909を超純水で１％濃度に希釈して薬液とし、残留塩素濃度を測定して、薬剤添加量を算出した。
上記と同じリン酸塩緩衝液９ｍＬに菌液を１ｍＬ添加し、３０℃で振とうした。そこに残留塩素濃度として約1、５、１０ｍｇ／Ｌ  ａｓ  Ｃｌ２になるように薬液を添加し、３０℃にて９０ｒ．ｐ．ｍで振とうした。
所定時間経過後、１ｍＬを採取して、滅菌水道水で段階希釈し、1/10PY培地を用い混釈法で植菌した。これを３０℃で培養し、２日−５日後に形成されたコロニー数を計測した。
【００４４】
＜結果＞
結果を図２（ａ），（ｂ）に示す。
図２（ａ）に示されるように、Bacillus  subtilisのコロニー数は殆ど低下しておらず、これに対して、Pseudomonas  putidaは、Stabrom909添加により分単位で殺菌され、コロニー数は大きく低下している。特に、残留塩素濃度として５ｍｇ／Ｌ  ａｓ  Ｃｌ２添加すると、１分後にはＣＦＵは検出下限以下となった。
【００４５】
＜考察＞
Bacillus  subtilisはPseudomonas  putidaと比較して、酸化系スライムコントロール剤に対し格段に高い耐性を示す。従って、対象とする系内に両者が共存した場合、酸化系スライムコントロール剤の添加によってPseudomonas  putidaが選択的に死滅し、Bacillus  subtilisが系内の優先種になると考えられる。
【００４６】
以上の実施例及び比較例により、以下のことが分かる。
Bacillus  subtilisにより形成した生物膜中でレジオネラ属菌を培養するとレジオネラＣＦＵは９９％以上減少した。これは、殺菌剤が有効とされる効果に匹敵する。
一方、冷却塔から分離した菌（Mycobacterium）から形成した生物膜中でレジオネラ属菌を培養するとレジオネラＣＦＵは維持された。この菌とBacillus  subtilisを混合した生物膜でレジオネラ属菌を培養した場合もレジオネラＣＦＵは９９％以上減少した。
酸化系スライムコントロール剤を添加すると、Bacillus  subtilisはPseudomonas  putidaと比較して、酸化系スライムコントロール剤に対し格段に抵抗性があり、Bacillus  subtilisが生き残る濃度と時間で、Pseudomonas  putidaは死滅した。シュードモナス属菌は環境水中で最も普遍的に見出される細菌であるので、酸化系スライムコントロール剤は、添加した系でバチルス属菌を選択的に生き残らせるために有効である。例えば、対象とする系内に両者が共存した場合、酸化系スライムコントロール剤の添加によってPseudomonas  putidaが選択的に死滅し、Bacillus  subtilisが系内の優先種になると考えられる。
【図１】
2018139515.tif 000003
【図２】
2018139515.tif 000004