(57)【要約】      （修正有）【課題】選択的かつ可逆的に細胞内ハイドロポリスルフィドを検出・可視化するための新規蛍光プローブを提供する。【解決手段】式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を含む、蛍光プローブ。2018025399.tif 000015式中、ＸはＳｉ（Ｒａ）（Ｒｂ）を表す。Ｒａ、ＲｂはＨ、又はアルキル基を表す。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を含む、ハイドロポリスルフィド検出用蛍光プローブ：
【化１】
2018025399.tif 000014
〔式中、
Ｘは、Ｓｉ（Ｒａ）（Ｒｂ）を表し（ここで、Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立に水素原子、又はアルキル基を表す）；
Ｒ１は、水素原子、シアノ基、又はそれぞれ置換されていてもよいアルキル基、カルボキシル基、エステル基、アルコキシ基、アミド基、及びアジド基よりなる群から独立に選択される１〜４個の同一又は異なる置換基を表し；
Ｒ２は、ハロゲン原子、それぞれ置換されていてもよいアルキル基、又はアルコキシ基を表し；
Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、又はヒドロキシル基、ハロゲン原子、それぞれ置換されていてもよいアルキル基、スルホ基、カルボキシル基、エステル基、アミド基及びアジド基よりなる群から独立に選択される１〜３個の同一又は異なる置換基を表し；
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８は、いずれもアルキル基を表し、
ここで、Ｒ５又はＲ６は、それぞれＲ３と一緒になって、それらが結合する窒素原子を含む環構造を形成してもよく、
Ｒ７又はＲ８は、それぞれＲ４と一緒になって、それらが結合する窒素原子を含む環構造を形成してもよい。〕
【請求項２】
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８が、いずれもメチル基である、請求項１に記載の蛍光プローブ。
【請求項３】
Ｒ２が、塩素原子、メチル基、又はメトキシ基である、請求項１に記載の蛍光プローブ。
【請求項４】
Ｒ５又はＲ６が、それぞれＲ３と一緒になって、それらが結合する窒素原子を含む５員環を形成し；及び／又は、Ｒ７又はＲ８が、それぞれＲ４と一緒になって、それらが結合する窒素原子を含む５員環を形成している、請求項１に記載の蛍光プローブ。
【請求項５】
Ｒ１が、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）のドナーとなる蛍光団を有する、請求項１〜４のいずれか１に記載の蛍光プローブ。
【請求項６】
前記蛍光団が、キサンテン骨格を有する化合物である、請求項５に記載の蛍光プローブ。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１に記載の蛍光プローブを用いる、ハイドロポリスルフィドの検出方法。
【請求項８】
前記ハイドロポリスルフィドと前記蛍光プローブとの反応による蛍光応答又は吸光度変化を観測することにより、前記ハイドロポリスルフィドの存在を検出することを特徴とする、請求項７に記載の検出方法。
【請求項９】
前記蛍光応答が、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）による蛍光変化である、請求項８に記載の検出方法。
【請求項１０】
蛍光イメージング手段を用いて前記蛍光応答を可視化することを特徴とする、請求項８に記載の検出方法。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか１に記載の蛍光プローブを含む、ハイドロポリスルフィドの検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、−ＳｎＳＨ基を有する化合物であるハイドロポリスルフィド検出用の新規な蛍光プローブに関する。より詳細には、可逆的にかつリアルタイムにハイドロポリスルフィドを検出するための蛍光プローブ、当該蛍光プローブを用いた検出方法、及び当該プローブを含む検出キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
硫黄元素を含む低分子化合物は、細胞内レドックス環境の恒常性維持のために重要な役割を担っており、近年、活性イオウ種（Reactive Sulfur Species: RSS）の生化学、医学的な研究が注目されている。例えば、多硫化物に代表されるようなゼロ価の硫黄（Sulfane Sulfur）や、その一種である強力な求核物質（抗酸化的物質）であるハイドロパースルフィド（Cys-SSH、GSSHなど）やハイドロポリスルフィド（GSSSH、GSSSSHなど）の細胞内・生体内での重要な役割が明らかになってきている。また、タンパク質を構成するシステインのポリスルフィド化が活性イオウ種のレドックスに重要な役割を示すことや、神経細胞内の代謝過程で多硫化水素（H2S3など）の生成が認められるなどの報告が近年なされている。
【０００３】
それゆえ、かかる活性イオウ種、特に、ハイドロポリスルフィドと酸化ストレスとの因果関係や疾患との関連性を調査するために、細胞内のハイドロポリスルフィドを検出及び分析し得る手法の開発が求められている。しかしながら、
細胞を破砕して成分を抽出する破壊的分析手法に頼らざるを得ないのが現状であり、細胞を生きたまま可視化する手段が乏しい。
【０００４】
これに対し、近年、ハイドロポリスルフィド検出用の蛍光プローブの開発が試みられているものの（例えば、非特許文献１〜３）、これら既存のプローブでは、ハイドロポリスルフィドに対する選択性に乏しく、また、応答の可逆性を持たないため細胞内での時間経過的な濃度変化を可視化することはできないなどの問題点があった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】W. Chenら、Chem. Sci.、 2013、 4、 2892-2896
【非特許文献２】C. Liuら、 J. Am. Chem. Soc.、 2014、 136、 7257-7260
【非特許文献３】W. Chenら、Angew. Chem. Int. Ed. 、 2015、54、13961-13965
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２０１５／１２９７０５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、本発明は、選択的かつ可逆的に細胞内ハイドロポリスルフィドを検出・可視化するための新規蛍光プローブを提供することを課題とするものである。
【０００８】
本発明者らは、これまでに、グルタチオン等の−ＳＨ基を含有する化合物を可逆的に検出可能な、ローダミン骨格を有する蛍光プローブを既に開発しているが（特許文献１）。ここで、グルタチオンは細胞内において約０．５〜１０ｍＭ存在するのに対し、ハイドロポリスルフィドは細胞内において、約１〜１０μＭ、臓器内で約数１０μＭ程度と極めて微量である。したがって、グルタチオン等の−ＳＨ基を含有する化合物が存在する環境下において、分子内に１以上の−Ｓ−Ｓ−結合を有するハイドロポリスルフィドを定量的に検出するための蛍光プローブには、少なくとも１０００倍以上のハイドロポリスルフィド選択性が求められる。これに対し、今般、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ローダミン骨格の蛍光団の構造を工夫することによって、ハイドロポリスルフィドを可逆的かつ濃度依存的に蛍光応答として検出することができ、かつ大過剰のグルタチオン等の−ＳＨ基含有化合物の存在下であってもハイドロポリスルフィドを選択的に検出できることを見出し、本発明を完成するに至った。さらに、当該蛍光団をアクセプターとする蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）型蛍光プローブを開発し、生細胞におけるハイドロポリスルフィド濃度変化のリアルタイムイメージングを達成できることも見出したものである。
【０００９】
すなわち、本発明は、一態様において、
＜１＞以下の式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を含む、ハイドロポリスルフィド検出用蛍光プローブ：
【化１】
2018025399.tif 000002
〔式中、
Ｘは、Ｓｉ（Ｒａ）（Ｒｂ）を表し（ここで、Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立に水素原子、又はアルキル基を表す）；
Ｒ１は、水素原子、シアノ基、又はそれぞれ置換されていてもよいアルキル基、カルボキシル基、エステル基、アルコキシ基、アミド基、及びアジド基よりなる群から独立に選択される１〜４個の同一又は異なる置換基を表し；
Ｒ２は、ハロゲン原子、それぞれ置換されていてもよいアルキル基、又はアルコキシ基を表し；
Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、又はヒドロキシル基、ハロゲン原子、それぞれ置換されていてもよいアルキル基、スルホ基、カルボキシル基、エステル基、アミド基及びアジド基よりなる群から独立に選択される１〜３個の同一又は異なる置換基を表し；
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８は、いずれもアルキル基を表し、
ここで、Ｒ５又はＲ６は、それぞれＲ３と一緒になって、それらが結合する窒素原子を含む環構造を形成してもよく、
Ｒ７又はＲ８は、それぞれＲ４と一緒になって、それらが結合する窒素原子を含む環構造を形成してもよい。〕；
＜２＞Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８が、いずれもメチル基である、上記＜１＞に記載の蛍光プローブ；
＜３＞Ｒ２が、塩素原子、メチル基、又はメトキシ基である、上記＜１＞に記載の蛍光プローブ；
＜４＞Ｒ５又はＲ６が、それぞれＲ３と一緒になって、それらが結合する窒素原子を含む５員環を形成し；及び／又は、Ｒ７又はＲ８が、それぞれＲ４と一緒になって、それらが結合する窒素原子を含む５員環を形成している、上記＜１＞に記載の蛍光プローブ；
＜５＞Ｒ１が、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）のドナーとなる蛍光団を有する、上記＜１＞〜＜４＞のいずれか１に記載の蛍光プローブ；及び
＜６＞前記蛍光団が、キサンテン骨格を有する化合物である、上記＜５＞に記載の蛍光プローブ
を提供するものである。
【００１０】
また、別の態様において、本発明は、
＜７＞上記＜１＞〜＜６＞のいずれか１に記載の蛍光プローブを用いる、ハイドロポリスルフィドの検出方法；
＜８＞前記ハイドロポリスルフィドと前記蛍光プローブとの反応による蛍光応答又は吸光度変化を観測することにより、前記ハイドロポリスルフィドの存在を検出することを特徴とする、上記＜７＞に記載の検出方法；
＜９＞前記蛍光応答が、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）による蛍光変化である、上記＜８＞に記載の検出方法；
＜１０＞蛍光イメージング手段を用いて前記蛍光応答を可視化することを特徴とする、上記＜８＞に記載の検出方法；及び
＜１１＞上記＜１＞〜＜６＞のいずれか１に記載の蛍光プローブを含む、ハイドロポリスルフィドの検出用キット
を提供するものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、ハイドロポリスルフィドを可逆的かつ濃度依存的に蛍光応答により検出することができ、生細胞において選択的かつ可逆的にハイドロポリスルフィドの検出及び可視化が可能となる。特に、本発明の蛍光プローブは、大過剰のグルタチオン等の−ＳＨ基含有化合物の存在下であっても、分子内に１以上の−Ｓ−Ｓ−結合を有するハイドロポリスルフィドを１０００倍以上の選択性で選択的に検出可能であり、その解離定数（Ｋｄ）が細胞内のハイドロポリスルフィド濃度の範囲内であるため、生細胞イメージングにも好適である。
【００１２】
本発明の検出方法は、通常の細胞イメージングが行える顕微鏡で施行可能であり、特別な機器を必要としない。また経時的な定量が可能であることより同一細胞において種々の刺激を与えたり、繰り返し付加した場合のハイドロポリスルフィドの低下や酸化ストレス暴露からの回復の経過をとらえることができる。本発明の基礎研究上、産業上の利用価値、経済効果は極めて大きいものといえる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、本発明の蛍光プローブである化合物１（２Ｍｅ  ＳｉＲ６５０）の化学構造式と、その二硫化ナトリウム（Na2S2）添加に伴う吸収スペクトル変化を示した図である。
【図２】図２は、本発明の蛍光プローブである化合物１（２Ｍｅ  ＳｉＲ６５０）の二硫化ナトリウム（Na2S2）添加に伴う蛍光スペクトル変化を示した図である。
【図３】図３は、本発明の蛍光プローブ化合物１に二硫化ナトリウム（Na2S2）を添加し、その後、Ｎ−エチルマレイミド(ＮＥＭ)を添加した際の吸収スペクトル強度変化の時間依存性を示したグラフである。
【図４】図４ａは、本発明の蛍光プローブである化合物５（ＴＭＲ−ＳｉＲ６５０）におけるＦＲＥＴ型発光機構の概略図；図４ｂは、本発明の蛍光プローブである化合物５（ＴＭＲ−ＳｉＲ６５０）の二硫化ナトリウム（Na2S2）添加に伴う吸収スペクトル変化を示した図；図４ｃは、本発明の蛍光プローブである化合物５（ＴＭＲ−ＳｉＲ６５０）の二硫化ナトリウム（Na2S2）添加に伴う蛍光スペクトル変化を示した図；図４ｄは、図４ｃにおける短波長側ピークと等蛍光点の蛍光強度比の変化をプロットした図である。
【図５】図５は、本発明の蛍光プローブである化合物５（ＴＭＲ−ＳｉＲ６５０）に二硫化ナトリウム（Na2S2）及びチオール基のスカベンジャーであるＮ−エチルマレイミド(ＮＥＭ)を投与した際のＡ５４９細胞の蛍光イメージングの時間変化（図５ａ）及びその際の蛍光強度の時間変化（図５ｂ）を示した図である。
【図６】図６は、本発明の蛍光プローブである化合物５（ＴＭＲ−ＳｉＲ６５０）にＢｎＳＳＨ及びＮ−エチルマレイミド(ＮＥＭ)を投与した際のＡ５４９細胞の蛍光イメージングの時間変化（図６ａ）及びその際の蛍光強度の時間変化を示した図（図６ｂ）；ＢｎＳＳＨ投与後に洗浄した場合の蛍光イメージングの時間変化（図６ｃ）及びその際の蛍光強度の時間変化（図６ｄ）を示した図である。
【図７】図７は、本発明の蛍光プローブである化合物５（ＴＭＲ−ＳｉＲ６５０）に膜透過性グルタチオン（GSH(Et)）、二硫化ナトリウム（Na2S2）、ＢｎＳＳＨを添加した際のＡ５４９細胞び蛍光イメージング画像（図７ａ）及びシグナルレシオ値の変化を示す図（図７ｂ）である。
【図８】図８は、Ａ５４９細胞における本発明の蛍光プローブである化合物５（ＴＭＲ−ＳｉＲ６５０）の蛍光イメージング画像における阻害剤処理による変化（図８ａ）及びその際のシグナルレシオ値の変化を示す図（図８ｂ）である。
【図９】図９は、Ａ５４９細胞における本発明の蛍光プローブである化合物５（ＴＭＲ−ＳｉＲ６５０）の蛍光イメージング画像におけるｓｉＲＮＡ処理による変化（図８ａ）及びその際のシグナルレシオ値の変化を示す図（図８ｂ）である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の実施形態について説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。
【００１５】
１．定義
本明細書中において、「ハイドロポリスルフィド」（Ｈｙｄｒｏｐｏｌｙｓｕｌｆｉｄｅ：単にポリスルフィドと略される場合もある）とは、分子内に１以上の−Ｓ−Ｓ−結合を有し、一般式Ｒ−ＳｎＳＨで表される硫黄化合物である。ｎ＝１の場合、ハイドロパースルフィド（Ｈｙｄｒｏｐｅｒｓｕｌｆｉｄｅ: 単にパースルフィドと略される場合もある）と呼ばれ、また、Ｒが水素の場合は、多硫化水素（Ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｏｌｙｓｕｌｆｉｄｅ）と呼ばれる。本明細書中では、ハイドロポリスルフィドは、これらハイドロパースルフィドと多硫化水素の双方を含むものとし、まとめてＲ−ＳｎＳＨと記載する場合がある。以下に代表的な化合物例を示すが、これらに限定されるものではない。ハイドロポリスルフィドの詳しい定義やその他の具体例は、例えば、T. V. Mishaninaら、Nat. Chem. Biol.、2015、11、457-464；C.-M. Parkら、Mol. BioSyst. 、2015、11、1775-1785；或いは、T. S. Baileyら、 Free Radical Biol. Med. 、2015、89、662-667を参照することができる。
【化２】
2018025399.tif 000003
【００１６】
本明細書中において、「ハロゲン原子」とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子を意味する。
【００１７】
本明細書中において、「アルキル」は直鎖状、分枝鎖状、環状、又はそれらの組み合わせからなる脂肪族炭化水素基のいずれであってもよい。アルキル基の炭素数は特に限定されないが、例えば、炭素数１〜２０個（Ｃ１〜２０）、炭素数１〜１５個（Ｃ１〜１５）、炭素数１〜１０個（Ｃ１〜１０）である。炭素数を指定した場合は、その数の範囲の炭素数を有する「アルキル」を意味する。例えば、Ｃ１〜８アルキルには、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ｎｅｏ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、イソヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル等が含まれる。本明細書において、アルキル基は任意の置換基を1個以上有していてもよい。そのような置換基としては、例えば、アルコキシ基、ハロゲン原子、アミノ基、モノ若しくはジ置換アミノ基、置換シリル基、又はアシルなどを挙げることができるが、これらに限定されることはない。アルキル基が２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。アルキル部分を含む他の置換基（例えばアルコシ基、アリールアルキル基など）のアルキル部分についても同様である。
【００１８】
本明細書において、ある官能基について「置換されていてもよい」と定義されている場合には、置換基の種類、置換位置、及び置換基の個数は特に限定されず、２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。置換基としては、例えば、アルキル基、アルコキシ基、水酸基、カルボキシル基、ハロゲン原子、スルホ基、アミノ基、アルコキシカルボニル基、オキソ基などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。これらの置換基にはさらに置換基が存在していてもよい。このような例として、例えば、ハロゲン化アルキル基、ジアルキルアミノ基などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。
【００１９】
本明細書中において、「アルケニル」は、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有している直鎖又は分枝鎖の炭化水素基をいう。例えば、その非限定的な例として、ビニル、アリル、１−プロペニル、イソプロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、１，３−ブタンジエニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、３−ペンテニル、４−ペンテニル、１，３−ペンタンジエニル、１−ヘキセニル、２−ヘキセニル、３−ヘキセニル、４−ヘキセニル、５−ヘキセニル及び１，４−ヘキサンジエニル）を含む。二重結合についてシス配座またはトランス配座のいずれであってもよい。
【００２０】
本明細書中において、「アルキニル」は、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を有している直鎖又は分枝鎖の炭化水素基をいう。例えば、その非限定的な例として、エチニル、プロピニル、２−ブチニルおよび３−メチルブチニルなどがあるを含む。
【００２１】
本明細書中において、「シクロアルキル」は、上記のアルキルよりなる単環または多環式の非芳香環系をいう。当該シクロアルキルは、置換されていないか同一もしくは異なっても良い１以上の置換基によって置換されていることができ、単環式シクロアルキルの非限定的な例には、シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシルおよびシクロヘプチルなどがあり、多環式のシクロアルキルの非限定的な例には、１−デカリニル、２−デカリニル、ノルボルニル、アダマンチルなどが挙げられる。また、当該シクロアルキルは、環構成原子としてヘテロ原子（例えば、酸素原子、窒素原子、又は硫黄原子など）を１個以上含むヘテロシクロアルキルであってもよい。ヘテロシクロアルキル環中の任意の−ＮＨは、例えば−Ｎ（Ｂｏｃ）基、−Ｎ（ＣＢｚ）基および−Ｎ（Ｔｏｓ）基としてのように保護されていてもよく、環中の窒素原子または硫黄原子が対応するＮ−オキシド、Ｓ−オキシドまたはＳ，Ｓ−ジオキシドへ酸化されたものであってもよい。例えば、単環式ヘテロシクロアルキルの非限定的な例には、ジアザパニル、ピペリジニル、ピロリジニル、ピペラジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、チアゾリジニル、１，４−ジオキサニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオフェニル、ラクタムおよびラクトン等が挙げられる。
【００２２】
本明細書中において、「シクロアルケニル」は、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む、単環または多環式の非芳香環系をいう。当該シクロアルケニルは、置換されていないか同一もしくは異なっても良い１以上の置換基によって置換されていることができ、単環式のシクロアルケニルの非限定的な例には、シクロペンテニル、シクロヘキセニルおよびシクロヘプタ−１，３−ジエニルなどがあり、多環式のシクロアルケニルの非限定的な例には、ノルボルニレニル等が挙げられる。また、当該シクロアルキルは、環構成原子としてヘテロ原子（例えば、酸素原子、窒素原子、又は硫黄原子など）を１個以上含むヘテロシクロアルケニルであってもよいヘテロシクロアルケニル環中の窒素原子または硫黄原子を、対応するＮ−オキシド、Ｓ−オキシドまたはＳ，Ｓ−ジオキシドへ酸化してもよい。
【００２３】
本明細書中において、「アリール」は単環式又は縮合多環式の芳香族炭化水素基のいずれであってもよく、環構成原子としてヘテロ原子（例えば、酸素原子、窒素原子、又は硫黄原子など）を１個以上含む芳香族複素環であってもよい。この場合、これを「ヘテロアリール」または「ヘテロ芳香族」と呼ぶ場合もある。アリールが単環および縮合環のいずれである場合も、すべての可能な位置で結合しうる。単環式のアリールの非限定的な例としては、フェニル基（Ｐｈ）、チエニル基（２−又は３−チエニル基）、ピリジル基、フリル基、チアゾリル基、オキサゾリル基、ピラゾリル基、２−ピラジニル基、ピリミジニル基、ピロリル基、イミダゾリル基、ピリダジニル基、３−イソチアゾリル基、３−イソオキサゾリル基、１，２，４−オキサジアゾール−５−イル基又は１，２，４−オキサジアゾール−３−イル基等が挙げられる。縮合多環式のアリールの非限定的な例としては、１−ナフチル基、２−ナフチル基、１−インデニル基、２−インデニル基、２，３−ジヒドロインデン−１−イル基、２，３−ジヒドロインデン−２−イル基、２−アンスリル基、インダゾリル基、キノリル基、イソキノリル基、１，２−ジヒドロイソキノリル基、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリル基、インドリル基、イソインドリル基、フタラジニル基、キノキサリニル基、ベンゾフラニル基、２，３−ジヒドロベンゾフラン−１−イル基、２，３−ジヒドロベンゾフラン−２−イル基、２，３−ジヒドロベンゾチオフェン−１−イル基、２，３−ジヒドロベンゾチオフェン−２−イル基、ベンゾチアゾリル基、ベンズイミダゾリル基、フルオレニル基又はチオキサンテニル基等が挙げられる。本明細書において、アリール基はその環上に任意の置換基を１個以上有していてもよい。該置換基としては、例えば、アルコキシ基、ハロゲン原子、アミノ基、モノ若しくはジ置換アミノ基、置換シリル基、又はアシルなどを挙げることができるが、これらに限定されることはない。アリール基が２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。アリール部分を含む他の置換基（例えばアリールオキシ基やアリールアルキル基など）のアリール部分についても同様である。
【００２４】
本明細書中において、「アリールアルキル」は、上記アリールで置換されたアルキルを表す。アリールアルキルは、任意の置換基を１個以上有していてもよい。該置換基としては、例えば、アルコキシ基、ハロゲン原子、アミノ基、モノ若しくはジ置換アミノ基、置換シリル基、又はアシル基などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。アシル基が２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。アリールアルキルの非限定的な例としては、ベンジル基、２−チエニルメチル基、３−チエニルメチル基、２−ピリジルメチル基、３−ピリジルメチル基、４−ピリジルメチル基、２−フリルメチル基、３−フリルメチル基、２−チアゾリルメチル基、４−チアゾリルメチル基、５−チアゾリルメチル基、２−オキサゾリルメチル基、４−オキサゾリルメチル基、５−オキサゾリルメチル基、１−ピラゾリルメチル基、３−ピラゾリルメチル基、４−ピラゾリルメチル基、２−ピラジニルメチル基、２−ピリミジニルメチル基、４−ピリミジニルメチル基、５−ピリミジニルメチル基、１−ピロリルメチル基、２−ピロリルメチル基、３−ピロリルメチル基、１−イミダゾリルメチル基、２−イミダゾリルメチル基、４−イミダゾリルメチル基、３−ピリダジニルメチル基、４−ピリダジニルメチル基、３−イソチアゾリルメチル基、３−イソオキサゾリルメチル基、１，２，４−オキサジアゾール−５−イルメチル基又は１，２，４−オキサジアゾール−３−イルメチル基等が挙げられる。
【００２５】
同様に、本明細書中において、「アリールアルケニル」は、上記アリールで置換されたアルケニルを表す。
【００２６】
本明細書中において、「アルコキシ基」とは、前記アルキル基が酸素原子に結合した構造であり、例えば直鎖状、分枝状、環状又はそれらの組み合わせである飽和アルコキシ基が挙げられる。例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、シクロプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓ−ブトキシ基、ｔ−ブトキシ基、シクロブトキシ基、シクロプロピルメトキシ基、ｎ−ペンチルオキシ基、シクロペンチルオキシ基、シクロプロピルエチルオキシ基、シクロブチルメチルオキシ基、ｎ−ヘキシルオキシ基、シクロヘキシルオキシ基、シクロプロピルプロピルオキシ基、シクロブチルエチルオキシ基又はシクロペンチルメチルオキシ基等が好適な例として挙げられる。
【００２７】
本明細書中において、「アルキレン」とは、直鎖状または分枝状の飽和炭化水素からなる二価の基であり、例えば、メチレン、１−メチルメチレン、１，１−ジメチルメチレン、エチレン、１−メチルエチレン、１−エチルエチレン、１，１−ジメチルエチレン、１，２−ジメチルエチレン、１，１−ジエチルエチレン、１，２−ジエチルエチレン、１−エチル−２−メチルエチレン、トリメチレン、１−メチルトリメチレン、２−メチルトリメチレン、１，１−ジメチルトリメチレン、１，２−ジメチルトリメチレン、２，２−ジメチルトリメチレン、１−エチルトリメチレン、２−エチルトリメチレン、１，１−ジエチルトリメチレン、１，２−ジエチルトリメチレン、２，２−ジエチルトリメチレン、２−エチル−２−メチルトリメチレン、テトラメチレン、１−メチルテトラメチレン、２−メチルテトラメチレン、１，１−ジメチルテトラメチレン、１，２−ジメチルテトラメチレン、２，２−ジメチルテトラメチレン、２，２−ジ−ｎ−プロピルトリメチレン等が挙げられる。
【００２８】
本明細書中において、「アルケニレン」とは、直鎖状または分枝状の少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有している不飽和炭化水素からなる二価の基であり、例えば、エテニレン、１−メチルエテニレン、１−エチルエテニレン、１，２−ジメチルエテニレン、１，２−ジエチルエテニレン、１−エチル−２−メチルエテニレン、プロペニレン、１−メチル−２−プロペニレン、２−メチル−２−プロペニレン、１，１−ジメチル−２−プロペニレン、１，２−ジメチル−２−プロペニレン、１−エチル−２−プロペニレン、２−エチル−２−プロペニレン、１，１−ジエチル−２−プロペニレン、１，２−ジエチル−２−プロペニレン、１−ブテニレン、２−ブテニレン、１−メチル−２−ブテニレン、２−メチル−２−ブテニレン、１，１−ジメチル−２−ブテニレン、１，２−ジメチル−２−ブテニレン等が挙げられる。
【００２９】
本明細書中において、「アリーレン」及び「アリールアルキレン」は、それぞれ上記「アリール」及び「アリールアルキル」に基づく二価の基を意味する。同様に、「オキシアルキレン」及び「アリーレンオキシ」は、それぞれ上記「アルコキシ」及び「アリールオキシ」に基づく二価の基を意味する。
【００３０】
本明細書中において用いられる「アミド」とは、ＲＮＲ’ＣＯ−（Ｒ＝アルキルの場合、アルカミノカルボニル−）およびＲＣＯＮＲ’−（Ｒ＝アルキルの場合、アルキルカルボニルアミノ−）の両方を含む。
【００３１】
本明細書中において用いられる「エステル」とは、ＲＯＣＯ−（Ｒ＝アルキルの場合、アルコキシカルボニル−）およびＲＣＯＯ−（Ｒ＝アルキルの場合、アルキルカルボニルオキシ−）の両方を含む。
【００３２】
本明細書中において、「環構造」という用語は、二つの置換基の組み合わせによって形成される場合、複素環または炭素環基を意味し、そのような基は飽和、不飽和、または芳香族であることができる。従って、上記において定義した、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、及びヘテロアリールを含むものである。例えば、シクロアルキル、フェニル、ナフチル、モルホリニル、ピペルジニル、イミダゾリル、ピロリジニル、およびピリジルなどが挙げられる。本明細書中において、置換基は、別の置換基と環構造を形成することができ、そのような置換基同士が結合する場合、当業者であれば、特定の置換、例えば水素への結合が形成されることを理解できる。従って、特定の置換基が共に環構造を形成すると記載されている場合、当業者であれば、当該環構造は通常の化学反応によって形成することができ、また容易に生成することを理解できる。かかる環構造およびそれらの形成過程はいずれも、当業者の認識範囲内である。
【００３３】
２．本発明のハイドロポリスルフィド検出用蛍光プローブ
本発明の蛍光プローブは、一態様において、以下の式（Ｉ）で表される構造を有する化合物を含むものである。
【化３】
2018025399.tif 000004
【００３４】
上記式（Ｉ）において、Ｘは、Ｓｉ（Ｒａ）（Ｒｂ）を表す。ここで、Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立に水素原子、又はアルキル基を表す。Ｒａ及びＲｂが、アルキル基である場合、それらは１以上の置換基を有することができ、そのような置換基としては、例えば、アルキル基、アルコキシ基、ハロゲン原子、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、スルホ基などを１個又は２個以上有していてもよい。Ｒａ及びＲｂは、いずれもメチル基であることが好ましい。また、場合によっては、Ｒａ及びＲｂは互いに結合して環構造を形成していてもよい。例えば、Ｒａ及びＲｂがともにアルキル基である場合に、Ｒａ及びＲｂが互いに結合してスピロ炭素環を形成することができる。形成される環は、例えば５ないし８員環程度であることが好ましい。Ｘは、好ましくは、Ｓｉ（ＣＨ３）２である。
【００３５】
Ｒ１は、水素原子、シアノ基、又はそれぞれ置換されていてもよいアルキル基（例えば、「置換されていてもよいアルキル基」には、フルオロアルキル等のハロアルキルが含まれ得る）、カルボキシル基、エステル基、アルコキシ基、アミド基、及びアジド基よりなる群から独立に選択される１〜４個の同一又は異なる置換基を表す。Ｒ１が水素原子以外である場合、そのベンゼン環における位置は特に限定されないが、Ｒ２を有する置換基に対してメタ位であることが好ましい。また、ベンゼン環上に２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。細胞内におけるプローブ分子の局在化を抑制する観点からは、Ｒ１は、例えば、イミノ二酢酸エステルであることが好ましい。
【００３６】
また、後述のように、Ｒ１が、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）のドナーとなる蛍光団を有することもできる。この場合、典型的には、Ｒ１はアミド基が好適であり、当該アミド基を介してドナーとなる蛍光団が連結することができる。かかる蛍光団としては、式（Ｉ）におけるローダミン類似骨格部位をアクセプターとして、それに対するドナーとなり得る蛍光団であれば、ＦＲＥＴに関する技術分野において公知の蛍光団を用いることができる。その非限定的な例としては、ピレン、ペリレン、クマリン、フルオレセイン、ローダミン、シアニン、ボロンジピロメテン（ＢＯＤＩＰＹ）、オキサジンなどを挙げることができる。好ましくは、そのような蛍光団はキサンテン骨格を有する化合物であり、例えば、テトラメチルローダミンである。
【００３７】
Ｒ２は、ハロゲン原子、それぞれ置換されていてもよいアルキル基、又はアルコキシ基を表す。好ましくは、塩素原子、メチル基、又はメトキシ基である。
【００３８】
Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、又はヒドロキシル基、ハロゲン原子、それぞれ置換されていてもよいアルキル基、スルホ基、カルボキシル基、エステル基、アミド基及びアジド基よりなる群から独立に選択される１〜３個の同一又は異なる置換基を表す。好ましくは、Ｒ３及びＲ４は、いずれも水素原子である。また、上記Ｒ１と同様に、Ｒ３又はＲ４が、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）のドナーとなる蛍光団を有することもできる。
【００３９】
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８は、いずれもアルキル基を表す。ここで、Ｒ５又はＲ６は、Ｒ３と一緒になって、それらが結合する窒素原子を含む環構造を形成してもよい。その場合、Ｒ５とＲ３、又はＲ６とＲ３の組み合わせのいずれか一方のみが環構造を形成してもよいし、いずれもが環構造を形成してもよい。当該環構造には、上記窒素原子以外の更なるヘテロ原子を含むこともできる。
【００４０】
同様に、Ｒ７又はＲ８のいずれかがアルキル基の場合に、Ｒ４と一緒になって、それらが結合する窒素原子を含む環構造を形成してもよい。その場合、Ｒ７とＲ４、又はＲ８とＲ４の組み合わせのいずれか一方のみが環構造を形成してもよいし、いずれもが環構造を形成してもよい。当該環構造には、上記窒素原子以外の更なるヘテロ原子を含むこともできる。
【００４１】
好ましくは、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８は、いずれもメチル基である。
【００４２】
本発明のハイドロポリスルフィド検出用蛍光プローブとして特に適切な式（Ｉ）の化合物の具体例としては、
【化４】
2018025399.tif 000005
が挙げられる。ただし、これらに限定されるものではない。
【００４３】
上記式（Ｉ）で表される化合物は、Ｒ７及びＲ８が連結するＮ原子において１価の正電荷を有するため、通常は塩として存在する。そのような塩としては、塩基付加塩、酸付加塩、アミノ酸塩などを挙げることができる。塩基付加塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、又はトリエチルアミン塩、ピペリジン塩、モルホリン塩などの有機アミン塩を挙げることができ、酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩、カルボン酸塩、トリフルオロ酢酸塩、メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩などの有機酸塩を挙げることができる。アミノ酸塩としてはグリシン塩などを例示することができる。もっとも、これらの塩に限定されることはない。
【００４４】
式（Ｉ）で表される化合物は、置換基の種類に応じて１個または２個以上の不斉炭素を有する場合があり、光学異性体又はジアステレオ異性体などの立体異性体が存在する場合がある。純粋な形態の立体異性体、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などはいずれも本発明の範囲に包含される。
【００４５】
式（Ｉ）で表される化合物又はその塩は、水和物又は溶媒和物として存在する場合もあるが、これらの物質はいずれも本発明の範囲に包含される。溶媒和物を形成する溶媒の種類は特に限定されないが、例えば、エタノール、アセトン、イソプロパノールなどの溶媒を例示することができる。
【００４６】
上記の蛍光プローブは、必要に応じて試薬の調製に通常用いられる添加剤を配合して組成物として用いてもよい。例えば、生理的環境で用いるための添加剤として、溶解補助剤、ｐＨ調節剤、緩衝剤、等張化剤などの添加剤を用いることができ、これらの配合量は当業者に適宜選択可能である。これらの組成物は、粉末形態の混合物、凍結乾燥物、顆粒剤、錠剤、液剤など適宜の形態の組成物として提供され得る。
【００４７】
本明細書の実施例には、式（Ｉ）で表される本発明の化合物に包含される代表的化合物についての製造方法が具体的に示されているので、当業者は本明細書の開示を参照することにより、及び必要に応じて出発原料や試薬、反応条件などを適宜選択することにより、式（Ｉ）に包含される任意の化合物を容易に製造することができる。
【００４８】
３．本発明の蛍光プローブを用いたハイドロポリスルフィドの検出方法
本発明の蛍光プローブは、式（Ｉ）で示されるキサンテン様の縮合環の９位が、以下の平衡式に示すように、ハイドロポリスルフィドのＳ−ＳＲ基により濃度依存的に求核攻撃されると可視光領域の吸収及び蛍光とも消失するという機構を用いるものである（ここで、ハイドロポリスルフィドを「Ｒ−ＳＳＨ」と示している。）。当該反応は可逆性を有する。これにより、１以上の−Ｓ−Ｓ−結合を有するハイドロポリスルフィドを可逆的、経時的、かつ定量的に検出をすることができるのである。なお、上述のとおり、当該「ハイドロポリスルフィド」の例としては、ハイドロパースルフィドと多硫化水素の双方を含み、広くＲ−ＳｎＳＨの構造を有する化合物を含むことができ、以下の反応が進行する限り、これらの化合物等についても本発明の蛍光プローブが適用可能である。
【化５】
2018025399.tif 000006
【００４９】
ここで、ハイドロポリスルフィドは細胞内では約１〜１０μＭ、臓器内では約数１０μＭと極めて微量であるのに対し、グルタチオンは細胞内では約０．５〜１０ｍＭの濃度で存在するため、グルタチオン等の−ＳＨ基を含有する化合物が存在する環境下において、分子内に１以上の−Ｓ−Ｓ−結合を有するハイドロポリスルフィドを定量的に検出するための蛍光プローブには、少なくとも１０００倍以上のハイドロポリスルフィド選択性が必要となる。本発明では、驚くべきことに、グルタチオンに対する蛍光プローブ分子と比較的類似する分子骨格を有するにもかかわらず、ハイドロポリスルフィドを特異的に検出することが可能な蛍光プローブ分子を見出したものである。より詳細には、必ずしも理論に拘束されるものではないが、本発明は、式（Ｉ）におけるＸとしてＳｉ原子を用い、Ｒ２を特定の置換基とし、さらに、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８をいずれもアルキル基とした構造の分子を用いることで、大過剰にするグルタチオン（約０．５〜１０ｍＭ）には応答を示さずハイドロポリスルフィドに対して高い選択性を示し、かつ細胞内のハイドロポリスルフィド濃度に対して低い解離定数Ｋｄ（１０μＭ前後）が得られる蛍光プローブ分子を見出した点に特徴を有する。
【００５０】
また、式（Ｉ）の分子内に蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）のドナーとなり得る更なる蛍光団を設けることによって、式（Ｉ）のローダミン類似骨格がアクセプターとなる蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）によって、ハイドロポリスルフィドとの反応を発光波長変化として検出することも可能となる。すなわち、ハイドロポリスルフィドが存在しない環境では、ローダミン類似骨格に固有の蛍光波長における発光が見られるが、式（Ｉ）の化合物とハイドロポリスルフィドとの反応によって、当該ローダミン類似骨格由来の蛍光が消光するとともに、上記ドナー蛍光団に固有の蛍光波長における発光が増大することによって、ハイドロポリスルフィドの検出を蛍光発光として検出することができるのである。そのため、ドナー蛍光団の蛍光スペクトルは、ローダミン類似骨格の吸収スペクトルと重なり、また、ドナー蛍光団の蛍光波長は、ローダミン類似骨格の蛍光波長とは異なる波長領域であることが好ましい。上記のように、かかるドナー蛍光団は、ＦＲＥＴに関する技術分野において公知の蛍光団を用いることができ、例えば、ピレン、ペリレン、クマリン、フルオレセイン、ローダミン、シアニン、ボロンジピロメテン（ＢＯＤＩＰＹ）、オキサジンなどを挙げることができる。好ましくは、テトラメチルローダミンである。典型的には、かかる蛍光団は、Ｒ１のアミド基を介して式（Ｉ）の化合物に導入することができる。
【００５１】
以上の発光機構に従い、本発明のハイドロポリスルフィドの検出方法では、ハイドロポリスルフィドと前記蛍光プローブとの反応による蛍光応答又は吸光度変化を観測することにより、ハイドロポリスルフィドの存在を検出することを特徴とする。本明細書において「検出」という用語は、定量、定性など種々の目的の測定を含めて最も広義に解釈されるべきである。上述のように、前記蛍光応答が、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）による蛍光変化であることが好ましい。
【００５２】
蛍光応答を観測する手段は、広い測定波長を有する蛍光光度計を用いることができるが、前記蛍光応答を２次元画像として表示可能な蛍光イメージング手段を用いて可視化することもできる。蛍光イメージングの手段を用いることによって、蛍光応答を二次元で可視化できるため、ハイドロポリスルフィドを瞬時に視認することが可能となる。蛍光イメージング装置としては、当該技術分野において公知の装置を用いることができる。
【００５３】
測定対象であるハイドロポリスルフィド試料と蛍光プローブを接触させる手段としては、代表的には、蛍光プローブを含む溶液を試料添加、塗布、或いは噴霧することが挙げられるが、上記試料の形態や測定環境等に応じて適宜選択することが可能である。
【００５４】
本発明の蛍光プローブの適用濃度は特に限定されないが、例えば０．１〜１０μＭ程度の濃度の溶液を適用することができる。
【００５５】
本発明の蛍光プローブとしては、上記式（Ｉ）で表される化合物又はその塩をそのまま用いてもよいが、必要に応じて、試薬の調製に通常用いられる添加剤を配合して組成物として用いてもよい。例えば、生理的環境で試薬を用いるための添加剤として、溶解補助剤、ｐＨ調節剤、緩衝剤、等張化剤などの添加剤を用いることができ、これらの配合量は当業者に適宜選択可能である。これらの組成物は、一般的には、粉末形態の混合物、凍結乾燥物、顆粒剤、錠剤、液剤など適宜の形態の組成物として提供されるが、使用時に注射用蒸留水や適宜の緩衝液に溶解して適用すればよい。
【００５６】
４．本発明の蛍光プローブを用いたハイドロポリスルフィドの検出用キット
本発明の検出方法においては、上記蛍光プローブを含むハイドロポリスルフィドの検出用キットを用いることが好ましい。当該キットにおいて、通常、本発明の蛍光プローブは溶液として調製されているが、例えば、粉末形態の混合物、凍結乾燥物、顆粒剤、錠剤、液剤など適宜の形態の組成物として提供され、使用時に注射用蒸留水や適宜の緩衝液に溶解して適用することもできる。
【００５７】
また、当該キットには、必要に応じてそれ以外の試薬等を適宜含んでいてもよい。例えば、添加剤として、溶解補助剤、ｐＨ調節剤、緩衝剤、等張化剤などの添加剤を用いることができ、これらの配合量は当業者に適宜選択可能である。
【実施例】
【００５８】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
【００５９】
［試薬、装置等］
以下に示す反応に用いる有機溶媒は、すべて脱水グレードのものを用いた。市販の原料は試薬メーカー（和光純薬株式会社、東京化成工業株式会社、関東化学株式会社、Sigma-Aldrich Co. Ltd., Acros Co. Ltd.）より購入した。
【００６０】
高速液体クロマトグラフィーによる精製は、以下の装置およびカラムを用いた。 
・ポンプ：PU-2080およびPU-2087（日本分光株式会社） 
・検出器：MD-2010（日本分光株式会社） 
・カラム：Inertsil ODS-3（10 x 250 mm or 20 x 250 mm, GL Science Inc.）
【００６１】
ＨＰＬＣによる分離精製に際しては、特に断りがない限り以下の溶媒Ａ、Ｂ及びＣを用い、これらを任意の組成で混合して精製を行った。 
Ａ: 精製水（1%アセトニトリル、0.1% トリフルオロ酢酸を含む） 
Ｂ: アセトニトリル（1%精製水を含む） 
Ｃ: 精製水（0.2M 酢酸-トリエチルアミンを含む）
ＨＰＬＣ分離における送液は、それぞれ25 ml/min (ポンプ：PU-2087, カラム：20 x 250 mm)、5 ml/min (ポンプ：PU-2080, カラム：10 x 250 mm)、1 ml/min (ポンプ：PU-2080, カラム：4.6 x 200 mm)にて行った。中圧カラムクロマトグラフィーによる精製は、YFLC-Al580（山善株式会社）を用いて行った。
【００６２】
NMR測定は、AVANCE III 400 Nanobay (Bruker, Co. Ltd.) を用いて行った（400 MHz for 1H NMR, 101 MHz for 13C NMR）。質量分析測定は、MicrOTOF (ESI-TOF, Bruker, Co. Ltd.)を用いて行った。High-resolution MS (HRMS)測定に際しては、外部標準物質としてギ酸ナトリウムを用いた。
【００６３】
以下の実施例において用いた略語は、以下のとおりである。
THF: テトラヒドロフラン  
DMF: N,N-ジメチルホルムアミド
TFA: トリフルオロ酢酸
【実施例１】
【００６４】
１．蛍光プローブの合成
本発明の式（Ｉ）の化合物である以下の化合物１〜５を合成した。
【化６】
2018025399.tif 000007
これらのうち、化合物１と４は、公知の文献（J. Am. Chem. Soc., 2012, 134 (11), pp 5029‐5031）に記載の合成例に基づいて合成した。また、以下の合成例で用いた化合物のうち、化合物Ａ１はJ. Am. Chem. Soc., 2012, 134 (11), pp 5029‐5031、化合物Ｃ１はBioorg. Med. Chem. Lett. 21, 2869-2872 (2011)、化合物Ｃ３はWO2015/129705の実施例の記載の手法に基づいてそれぞれ合成した。
【００６５】
化合物２の合成
以下のスキームに従って、本発明の蛍光プローブである化合物２を合成した。
【化７】
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【００６６】
2-ブロモアニソール（50 mg, 0.293 mmol, 8.4 eq.）をTHF（2 ml）に溶かし、アルゴン雰囲気下、‐78 oCで10分間撹拌した。1 M sec-ブチルリチウム シクロヘキサン/n-ヘキサン溶液（250 μl, 0.250 mmol, 7.1 eq.）をゆっくり加え、10分間撹拌した。化合物A1（10 mg, 0.035 mmol, 1 eq.）をTHF（2 ml）に溶かして加え、‐78 oCで1時間、室温で6時間撹拌した。1 N 塩酸を加えて酸性にし、次いで飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、ジクロロメタンで2回抽出し、得られた有機相を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去した。得られた残渣をHPLCで精製し（A/B = 90/10 to 10/90, 25 min）、目的化合物(2) (15.3 mg, 94%)を青色固体として得た。
1H NMR (CD3OD): δ 7.56 (dt, J = 7.4 Hz, 1.8 Hz, 1H), 7.32 (d, J = 2.8 Hz, 2H), 7.22‐7.16 (m, 3H) 7.15 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 7.08 (dd, J = 7.4 Hz, 1.8 Hz, 1H), 6.75 (dd, J = 9.6 Hz, 2.8 Hz, 2H), 3.71 (s, 3H), 3.34 (s, 12H), 0.61 (s, 3H), 0.58 (s, 3H).; 13C NMR (CD3OD) δ 169.5, 158.1, 155.7, 149.4, 142.7, 131.8, 131.4, 129.2, 129.1, 121.8, 121.4, 114.9, 112.3, 56.2, 40.8, -1.0, -1.4 ppm.
【００６７】
化合物3の合成  
以下のスキームに従って、本発明の蛍光プローブである化合物3を合成した。
【化８】
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【００６８】
2-クロロフェニルボロン酸を110℃にて6時間減圧乾燥させ、化合物B1を白色固体として得た。化合物B1は分離精製せず、そのまま次の反応に用いた。
化合物A1 (30 mg, 0.092 mmol, 1 eq.)を脱酸素アセトニトリル（10 ml）に溶かし、アルゴン雰囲気下、室温にて撹拌した。トリフルオロメタンスルホン酸無水物（20 μl, 0.112 mmol, 1.2 eq.）をゆっくり加え、室温にてさらに15分撹拌した後、化合物B1（61.1 mg, 0.144 mmol, 1.6 eq.）、ビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)ジクロリド（13.1 mg, 0.018 mmol, 0.2 eq.)、および炭酸ナトリウム（62.3 mg, 0.587 mmol, 6.2 eq.）を加え、70℃にて終夜撹拌した。室温に戻し、反応溶液に水を加え、ジクロロメタンで2回抽出し、得られた有機相を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：ジクロロメタン/メタノール = 100/0 to 90/10）およびHPLCで精製し（A/B = 90/10 to 10/90, 25 min）、目的化合物３ (3.0 mg, 6%)を青色固体として得た。
1H NMR (CD3OD): δ 7.65 (dd, J = 8.0 Hz, 1.4 Hz, 1H), 7.59 (ddd, J = 8.0 Hz, 7.3 Hz, 1.8 Hz, 1H), 7.53 (dt, J = 1.4 Hz. 7.3 Hz, 1H), 7.37 (d, J = 2.8 Hz, 2H), 7.32 (dd, J = 7.3 Hz, 1.8 Hz, 1H), 7.04 (d, J = 9.6 Hz, 2H), 6.80 (dd, J = 9.6 Hz, 2.8 Hz, 2H), 3.36 (s, 12H), 0.613 (s, 3H), 0.598 (s, 3H).; 13C NMR (CD3OD): δ 167.0 (C), 155.8 (C), 149.5 (C), 142.0 (CH), 139.3 (C), 134.1 (C), 132.2 (CH), 131.7 (CH), 130.9 (CH), 128.4 (C), 128.1 (CH), 122.3 (CH), 115.3 (CH), 40.9 (CH3), ‐1.1 (CH3), ‐1.4 (CH3).; HRMS-ESI (m/z): [M]+ calcd for C25H28ClN2Si: 419.17048; found: 419.16962 (0.9 mDa, 2.0 ppm).
【００６９】
化合物５の合成  
以下のスキームに従って、本発明の蛍光プローブである化合物５を合成した。
【化９】
2018025399.tif 000010
【００７０】
［化合物C2の合成］  
化合物C1（323 mg, 1.20 mmol, 3.2 eq.）をTHF（10 ml）に溶かし、アルゴン雰囲気下、‐78 oCで10分間撹拌した。1.1 M sec-ブチルリチウム シクロヘキサン/ノルマルヘキサン溶液（550 μl, 0.61 mmol, 2.0 eq.）をゆっくり加え、10分間撹拌した。化合物A1 (122 mg, 0.376 mmol, 1 eq.）をTHF（5 ml）に溶かして加え、‐78 oCで1時間、室温で2時間撹拌した。1 N 塩酸を加えて酸性にし、次いで飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、ジクロロメタンで2回抽出し、得られた有機相を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去した。得られた化合物をトリフルオロ酢酸（2 ml）に溶かし、室温にて30分撹拌した。溶媒を減圧留去し、得られた残渣をHPLCで精製し（A/B = 90/10 to 10/90, 25 min）、目的化合物C2 (126 mg, 60%)を青紫色固体として得た。
1H NMR (CD3OD): δ 7.97 (s, 1H), 7.93 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.36 (d, J = 2.8 Hz, 2H), 7.12 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.07 (d, J = 9.6 Hz, 2H), 6.77 (dd, J = 9.6 Hz, 2.8 Hz, 2H), 3.34 (s, 12H), 2.05 (s, 3H), 0.62 (s, 3H), 0.60 (s, 3H).; 13C NMR (CD3OD): δ 173.5 (C), 170.6 (C), 155.8 (C), 149.4 (C), 142.34 (C), 142.24 (CH), 138.7 (C), 136.7 (C), 132.1 (CH), 129.8 (CH), 128.3 (CH), 127.7 (C), 122.2 (CH), 115.3 (CH), 40.9 (CH3), 19.5 (CH3), ‐1.1 (CH3), ‐1.3 (CH3).; HRMS-ESI (m/z): [M]+ calcd for C27H31N2O2Si: 443.21493; found: 443.21524 (‐0.3 mDa, ‐0.7 ppm).
【００７１】
［化合物5の合成］  
化合物C2 (5.3 mg, 9 μmol, 1 eq.)、化合物C3（7.0 mg, 9 μmol, 1 eq.）およびヘキサフルオロリン酸（ベンゾトリアゾール-1-イルオキシ）トリピロリジノホスホニウム(9.1 mg, 17 μmol, 1.9 eq.) をDMF (500 μl)に溶かし、室温にて撹拌した. N,N-ジイソプロピルエチルアミン (15 μl, 85 μmol,  9.4 eq.)を加えてさらに室温で2時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、得られた残渣をHPLCにて分離精製し (1回目; A/B = 90/10 to 10/90, 25 min: 2回目; C/B = 90/10 to 10/90, 40 min) 、目的化合物５(6.4 mg, 59%) を濃紫色固体として得た。 
1H NMR (CD3OD): δ 8.77 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 8.70 (d, J = 8.0 Hz, 1H, -CONH-), 8.49 (d, J = 8.0 Hz, 1H, -CONH-), 8.31 (dd, J = 8.0 Hz, 1.7 Hz, 1H), 7.91 (s, 1H), 7.87 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.57 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.38 (d, J = 2.8 Hz, 2H), 7.26 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.13 (d, J = 9.5 Hz, 2H), 7.07 (dd, J = 9.5 Hz, 2.4 Hz, 2H), 7.05 (d, J = 9.6 Hz, 2H), 7.02 (d, J = 2.3 Hz, 2H), 6.79 (dd, J = 9.7 Hz, 2.8 Hz, 2H), 4.07 ‐ 4.01 (m, 2H), 3.66 (s, 3H), 3.36 (s, 12H), 3.33 (s, 12H), 2.18 ‐ 2.16 (m, 4H), 2.12 (s, 3H), 1.69 ‐ 1.64 (m, 4H), 0.627 (s, 3H), 0.612 (s, 3H). 13C NMR (CD3OD): δ 169.3 (C), 168.9 (C), 167.5 (C), 166.4 (C), 159.9 (C), 159.08 (C), 159.05 (C), 155.9 (C), 149.5 (C), 143.4 (C), 142.0 (CH), 138.0 (C), 137.9 (C), 137.6 (C), 136.5 (C), 132.7 (CH), 132.4 (CH), 132.08 (CH), 131.94 (C), 131.83 (CH), 131.1 (CH), 130.5 (CH), 130.2 (CH), 128.1 (C), 125.8 (CH), 122.3 (CH), 115.7 (CH), 115.3 (CH), 114.7 (C), 53.1 (CH3), 50.2 (CH), 49.9 (CH), 40.97 (CH3), 40.94 (CH3), 32.34 (CH2), 32.32 (CH2), 19.5 (CH3), ‐1.1 (CH3), ‐1.3 (CH3).; HRMS-ESI (m/z): [M]2+/2 calcd for C59H66N6O5Si: 483.24265; found: 483.24277 (‐0.1 mDa, ‐0.3 ppm).
【実施例２】
【００７２】
ハイドロポリスルフィドに対する蛍光アッセイ
実施例１で合成した蛍光プローブ化合物である化合物１（２Ｍｅ  ＳｉＲ６５０）に、ハイドロポリスルフィドとして市販品である二硫化ナトリウム（Na2S2）を作用させ、その蛍光アッセイを行った。紫外―可視吸光分光分析および蛍光分光分析は、Shimadzu UV-2450 (島津製作所)およびHitachi F-7000（日立製作所）を用いて行った。溶液条件は、蛍光プローブの濃度は1μＭ、０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、０．１％のＤＭＳＯを含む溶液を用いた。添加する二硫化ナトリウムの濃度を０〜２００μＭの範囲で変化させた際の吸収スペクトル及び蛍光スペクトルを測定した。励起波長は６２０ｎｍとした。得られた結果を図１及び２に示す。
【００７３】
図１及び２に示すように、二硫化ナトリウムの添加によって吸収及び蛍光強度の顕著な減少が認められた。吸収ピーク波長（６４６ｎｍ）及び蛍光ピーク波長（６６７ｎｍ）の強度変化の二硫化ナトリウム濃度依存性をプロットし、解離定数Ｋｄ，Ｈ２Ｓ２（μＭ）を算出した結果、１０μＭが得られた。
【００７４】
また、−ＳＨ結合を有するグルタチオン（ＧＳＨ）に対する選択性を比較するため、化合物１にグルタチオンを作用させ同様の蛍光アッセイを行った結果、解離定数Ｋｄ，ＧＳＨ（ｍＭ）は＞１００ｍＭが得られた。
【００７５】
同様に、他のプローブである化合物２（２ＯＭｅ  ＳｉＲ６５０）、化合物３（２Ｃｌ  ＳｉＲ６５０）、化合物４（２Ｍｅ  ＳｉＲ７００）、化合物６（２Ｆ  ＳｉＲ６５０）についても、同条件でアッセイを行った結果をあわせて表１に示す。また、蛍光団の構造が異なる、すなわち、フェニルの２’位の置換基Ｒ（式（Ｉ）のＲ２に相当）及びアミノ基における置換基Ｒ’（式（Ｉ）のＲ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８に相当）が異なる比較例化合物１〜６についても同条件でアッセイを行った結果を表１に示す。
【００７６】
【表１】
2018025399.tif 000011
2018025399.tif 000012
【００７７】
表１の結果から、グルタチオンに対するハイドロポリスルフィド（二硫化ナトリウム）の選択性（Ｋｄ，ＧＳＨ／Ｋｄ，Ｈ２Ｓ２）について、化合物１〜４は１０００倍以上の選択性を示すことが分かった。特に化合物１では、グルタチオンに対するハイドロポリスルフィドの選択性が１０，０００倍以上であり、かつ、ハイドロポリスルフィドに対する解離定数Ｋｄ，Ｈ２Ｓ２が１０μＭであり細胞内におけるハイドロポリスルフィドの濃度（約１〜１０μＭ）でも検出可能であるという結果が得られた。すなわち、これらの蛍光プローブは、細胞内におけるハイドロポリスルフィドの検出に有用であることが実証された。
【００７８】
他のハイドロポリスルフィドに対する蛍光アッセイ
上記で用いた二硫化ナトリウムに替えて、市販品である三硫化ナトリウム（Na2S3）、四硫化ナトリウム（Na2S4）および、合成化合物である4-trimethylsilyl benzylpersulfide (BnSSH, 下図)への応答性を評価した。蛍光プローブとしては、化合物１を使用した。
【化１０】
2018025399.tif 000013
【００７９】
その結果、Na2S3, Na2S4, BnSSHに対していずれも濃度依存的な吸光／蛍光の減少を確認し、解離定数Ｋｄはそれぞれ５μＭ、５μＭ、１１μＭと算出された。これらの結果より、本発明の蛍光プローブは、Ｒ−ＳｎＳＨで表される他のハイドロポリスルフィドも検出可能であることが確認された。
【実施例３】
【００８０】
蛍光応答の可逆性の評価
蛍光プローブとハイドロポリスルフィドの反応が可逆性であることを、上記ＢｎＳＳＨ（５μＭ）の添加及びチオール基のスカベンジャー（０．１又は１ｍＭ）を添加した際の吸光度変化を観測することにより評価を行なった。測定は化合物１を用いて行なった。溶液条件は、蛍光プローブの濃度は1μＭ、０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、０．１％のＤＭＳＯ及び０．１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘを含む溶液を用いた。結果を図３に示す。
【００８１】
図３の結果から、これらの蛍光プローブは、ハイドロポリスルフィドであるＢｎＳＳＨと速やかに応答し、ＢｎＳＳＨ量に依存して吸光度の変化が生じることが分かった。さらに、チオールのスカベンジャーであるＮ−エチルマレイミド(ＮＥＭ)を加えることで、吸光度がＢｎＳＳＨ無添加時と同じ値まで戻ることから、ハイドロポリスルフィドに対する応答性が可逆的であることを確認した。 
【実施例４】
【００８２】
ＦＲＥＴセンサーとしての評価
細胞イメージングの際には、２波長の励起または蛍光の比を取ってイメージングをする手法（レシオイメージング）が非常によく用いられる手法である。そこで、分子内のドナー蛍光団を有するプローブである、実施例１で合成した化合物５（ＴＭＲ−ＳｉＲ６５０）について、ＦＲＥＴの原理に基づき１波長励起−２波長蛍光を示すＦＲＥＴ型蛍光プローブとして機能するか検証した。化合物５は、化合物１に短波長側の蛍光団（ドナー）としてテトラメチルローダミン（TMR, TAMRA）を導入したものである。
【００８３】
化合物５を用いて、実施例２と同様にNa2S2添加に伴う吸収及び蛍光スペクトル変化を測定した。溶液条件は、蛍光プローブの濃度を１μＭ、０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、０．１％のＤＭＳＯ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含む溶液を用いた。添加するNa2S2の濃度を０〜１００μＭの範囲で変化させた。励起波長は５５０ｎｍとした。得られた結果を図４に示す。
【００８４】
図４ｃ及び４ｄに示すとおり、Na2S2添加に伴って長波長側ピークの蛍光強度が減少するとともに、短波長側ピークの蛍光強度の増加が得られた。そのＫｄ，Ｈ２Ｓ２もおおよそ１１μＭと、化合物１単体の場合とほぼ変わらないことが分かった。この結果は、当該蛍光プローブ（化合物５）では、実施例２のような消光型の検出ではなく、ＦＲＥＴの機構によって発光型（波長変化型）によって生理的濃度のハイドロポリスルフィド検出が達成できることを示すものである。
【実施例５】
【００８５】
蛍光プローブ化合物による細胞イメージング
次に、蛍光プローブとして化合物５を用いて細胞における各種蛍光イメージングを行った。測定は、共焦点顕微鏡を用いて行なった。
【００８６】
ア）可逆性評価１：Na2S2/NEMよる評価
二硫化ナトリウム（Na2S2）と、チオール基のスカベンジャーであるＮ−エチルマレイミド(ＮＥＭ)によるシグナルの可逆性について、潅流装置を設置した共焦点顕微鏡にて評価した。結果を図５に示す。
【００８７】
測定条件は以下のとおりである。
〔実験条件〕
・使用細胞：  A549
・使用ディッシュ：   35 mmガラスボトムディッシュ、観察面：14 mm
・染色条件：        1 μM TMR-SiR650 in HBSS (including 0.01% Pluronic F-127 and 0.1% DMSO), 10 min, 37oC→  washing x3  →  imaging
・送液条件    Solution A: HBSS
Solution B: 10 μM Na2S2 in HBSS
Solution C: 50 μM NEM (0.1% DMSO) in HBSS 
・流速：      4 ml/min  
・撮像間隔：  5秒
〔顕微鏡設定条件〕
・励起波長：  550 nm, 20%
・検出波長：  Ch1: 560 ‐ 640 nm (Gain: 700 V), Ch2: 650 ‐ 750 nm (Gain: 950 V)
・ピンホール： 2 airy
【００８８】
図５ａに示すとおり、二硫化ナトリウムの投与後速やかに蛍光像が観察され、また、図５ｂに示すようにＮ−エチルマレイミド(ＮＥＭ)添加によるグルタチオン枯渇条件下において蛍光強度の増大が認められたことから、リアルタイムでの可逆的イメージングが達成できることを実証した。
【００８９】
イ）可逆性評価２：BnSSH/NEMによる評価
次に、二硫化ナトリウムの替えて、4-trimethylsilyl benzylpersulfide （BnSSH）を用いて実験を行った。
〔実験条件〕
送液条件以外は、上記に同じ
・送液条件    Solution A: HBSS
Solution B: 10 μM BnSSH in HBSS (0.1% DMSO)
Solution C: 50 μM NEM (0.1% DMSO) in HBSS 
【００９０】
NEMを用いて可逆性を評価したところ、細胞内のBnSSH濃度の急激な変化をリアルタイムにモニタリングできることを確認した（図６a, b）。さらに、NEMではなく、細胞の培地による洗浄という形でのBnSSHの除去を行ったところ、可逆的サイクルを示しつつ、レシオ値がプラトーに達するポイントが、可逆サイクルごとに上昇した（図６c, d）。この結果は、BnSSHに含まれる硫黄元素が内在性のグルタチオンやシステインに保持されてGSSHやCys-SSHという形で蓄積されていることを示唆していると思われる。以上に示した秒スケールでのハイドロポリスルフィドの可逆的イメージングの実証は、従来達成されていないものである。
【００９１】
ウ）細胞内におけるハイドロポリスルフィドの選択性評価
細胞内においても、グルタチオンに対するハイドロポリスルフィド選択性を有することを、膜透過性グルタチオン（グルタチオンモノエチルエーテル: GSH(Et)）を用いて検証した。実験条件は以下のとおりである。結果を図７に示す。
〔実験プロトコル〕
染色条件などは上記ア同じ。Ibidi 8 wellを使用。
Before:   Imaging of A549 in HBSS (図７ａ上段)
↓
NEM:   Replacement to HBSS in 100 μM NEM (0.1% DMSO), imaged in 3 min. (図７ａ中段)
↓
Stimulation: Washing with HBSS x2, stimulation with the following reagents, then imaging in 5 min. (図７ａ下段) 
・  HBSS (control)             
・  10 mM GSH(Et) in HBSS       
・  10 μM Na2S2 in HBSS         
・  10 μM BnSSH in HBSS       
【００９２】
図７ｂに示すように、いったんNEMにより細胞内チオール成分（R-SSH、GSH、Cysなどを含む）を除去し、10 mM（細胞内濃度相当）のGSH(Et)を添加しても化合物５はほとんどシグナル変化を示さなかった。一方で、その1,000倍薄い濃度のNa2S2およびBnSSH（10 μM: 細胞内濃度相当）を添加したところ、顕著なレシオ値増加を認めた。この結果より、化合物５は、細胞内に多量に存在するGSHの影響を受けることなく、微量なハイドロポリスルフィドを選択的に検出・可視化していることを実証した。
【００９３】
エ）内在性のハイドロポリスルフィド成分の濃度変化の検出
上記ウ）では、外部からのハイドロポリスルフィドの添加に対して、劇的なレシオ変化が見られることを実証した。次に、実際に細胞内に予め存在しているハイドロポリスルフィドの濃度変化を化合物５を用いて可視化できるかを検証した。
【００９４】
当該実験では、T. Idaら, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 2014, 111, 7606-7611で提唱されているモデル実験を採用した。この非特許文献によると、細胞内でのCys-SSH合成にはxCT, SNAT2, CBS, CSEというタンパク質が関わっていると述べられている。
【００９５】
したがって、これらのタンパク質に阻害をかけることで、CysSSHの量の変化が見られれば、内在性のCysSSH濃度変化の可視化を達成できたことになる。そこで、これらのタンパク質に対する阻害剤およびsiRNAによる阻害実験を検証した。阻害剤に関しては、以下のとおりである。siRNAは、InvitrogenないしはSanta Cruzより購入した。
・xCT阻害剤：             Sulfasalazine (SSZ)
・CBS/CSE阻害剤：  Propargylglycine (PAG) or β-cyanoalanine (BCA)
【００９６】
〔プロトコル：阻害剤〕
・  A549 cells seeded on a ibidi 8-well plate were treated with the following inhibitors for 4 hr at 37oC.
Control:        no treatment
Inhibition of xCT:   10 μM SSZ
Inhibition of CBS/CSE:     1 mM PAG or BCA
・  Cells were washed with FBS-free HBSS, then probe (1 μM, in HBSS including 0.1% DMSO and 0.01% Pluronic F-127) was loaded for 10 min. 
・  Cells were washed with HBSS x2 and replaced to HBSS, then imaged. 
〔プロトコル：siRNA〕
・  A549 cells (〜20% confl.) seeded on a ibidi 8-well plate and incubated overnight.
・  siRNA (for xCT, SNAT2, CBS, CSE) was treated under the following condition. 
siRNA for xCT and SNAT2:   10 nM for 72 hrs 
siRNA for CBS and CSE:     30 or 60 nM for 24 hrs
・  Cells were washed with FBS-free HBSS, then probe (1 μM, in HBSS including 0.1% DMSO and 0.01% Pluronic F-127) was loaded for 10 min. 
・  Cells were washed with HBSS x2 and replaced to HBSS, then imaged. 
【００９７】
阻害剤およびsiRNAによる阻害実験の結果をそれぞれ図８及び９に示す。図８及び９の結果より、無処置の細胞に比べて、各種阻害剤ないしsiRNAで処置した細胞においては、有意な差のあるレシオの低下が認められた。これは明らかに、Cys-SSH合成の阻害によるCys-SSH量の低下を反映していると考察されるため、化合物５は、内在性のCys-SSH量の変化を可視化するのに十分な応答性を持つ蛍光プローブであることが実証された。
【００９８】
以上の結果は、本発明の蛍光プローブは、ハイドロポリスルフィドを選択的かつ可逆的に可視化する、極めて実用性の高い蛍光プローブであることを実証するものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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