(57)【要約】      （修正有）【課題】マウスモノクローナル抗リン酸化タウ抗体のリン酸化タウに対する結合性を実質的に損なうことなく、ヒトに対する抗原性がより低減された、ヒトにおけるタウオパチー等の認知症の治療剤又は予防剤として適用可能なヒト化抗リン酸化タウ抗体の提供。【解決手段】特定のアミノ酸配列のうち、少なくともＳｅｒ４１３に相当するアミノ酸残基がリン酸化されたタウタンパク質又はタウペプチドに抗原抗体反応するヒト化抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体。【選択図】図３
2018139530.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の少なくともＳｅｒ４１３に相当するアミノ酸残基がリン酸化されたタウタンパク質又はタウペプチドに抗原抗体反応するヒト化抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体。
【請求項２】
前記タウタンパク質又はタウペプチドに対する平衡解離定数が１．８６×１０−８Ｍ以下である、請求項１に記載のヒト化抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体。
【請求項３】
非リン酸化タウタンパク質又はタウペプチドへの結合性と比較して、リン酸化タウタンパク質又はタウペプチドへの選択的結合性が改善されてなる、請求項１又は２に記載のヒト化抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体。
【請求項４】
血中投与時の脳内への移行性が改善されてなる、請求項１〜３の何れか一項に記載のヒト化抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体。
【請求項５】
前記ヒト化抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体が、
ＣＤＲ−Ｈ１配列として、配列１Ｍと８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
ＣＤＲ−Ｈ２配列として、配列２Ｍ又は２Ｈ１と８４％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
ＣＤＲ−Ｈ３配列として、配列３Ｍと８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
ＣＤＲ−Ｌ１配列として、配列４Ｌ１又は４Ｍと８７％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
ＣＤＲ−Ｌ２配列として、配列５Ｍと８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
ＣＤＲ−Ｌ３配列として、配列６Ｍと７７％以上の相同性を有するアミノ酸配列
をそれぞれ含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のヒト化抗体又はその断片もしくは誘導体。
【請求項６】
前記ヒト化抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体が、
ＣＤＲ−Ｈ１配列として、配列１Ｍのアミノ酸配列、
ＣＤＲ−Ｈ２配列として、配列２Ｈ１のアミノ酸配列、又は、配列２Ｈ１の１５位のＡｌａがＡｓｐに置換されたアミノ酸配列、
ＣＤＲ−Ｈ３配列として、配列３Ｍのアミノ酸配列、
ＣＤＲ−Ｌ１配列として、配列４Ｌ１のアミノ酸配列、又は、配列４Ｌ１の５位のＳｅｒがＡｓｎに置換されたアミノ酸配列、
ＣＤＲ−Ｌ２配列として、配列５Ｍのアミノ酸配列、並びに
ＣＤＲ−Ｌ３配列として、配列６Ｍのアミノ酸配列
をそれぞれ含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のヒト化抗体又はその断片もしくは誘導体。
【請求項７】
前記ヒト化抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体が、
（１）ＣＤＲ−Ｈ１配列として、配列１Ｍのアミノ酸配列、
ＣＤＲ−Ｈ２配列として、配列２Ｈ１のアミノ酸配列、
ＣＤＲ−Ｈ３配列として、配列３Ｍのアミノ酸配列、
ＣＤＲ−Ｌ１配列として、配列４Ｌ１のアミノ酸配列、
ＣＤＲ−Ｌ２配列として、配列５Ｍのアミノ酸配列、及び
ＣＤＲ−Ｌ３配列として、配列６Ｍのアミノ酸配列を含み；又は、
（２）ＣＤＲ−Ｈ１配列として、配列１Ｍのアミノ酸配列、
ＣＤＲ−Ｈ２配列として、配列２Ｈ１のアミノ酸配列、
ＣＤＲ−Ｈ３配列として、配列３Ｍのアミノ酸配列、
ＣＤＲ−Ｌ１配列として、配列４Ｍのアミノ酸配列、
ＣＤＲ−Ｌ２配列として、配列５Ｍのアミノ酸配列、及び
ＣＤＲ−Ｌ３配列として、配列６Ｍのアミノ酸配列を含み；又は、
（３）ＣＤＲ−Ｈ１配列として、配列１Ｍのアミノ酸配列、
ＣＤＲ−Ｈ２配列として、配列２Ｍのアミノ酸配列、
ＣＤＲ−Ｈ３配列として、配列３Ｍのアミノ酸配列、
ＣＤＲ−Ｌ１配列として、配列４Ｍのアミノ酸配列、
ＣＤＲ−Ｌ２配列として、配列５Ｍのアミノ酸配列、及び
ＣＤＲ−Ｌ３配列として、配列６Ｍのアミノ酸配列を含む、
請求項５又は６に記載のヒト化抗体又はその断片もしくは誘導体。
【請求項８】
前記ヒト化抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体が、
重鎖可変領域として、配列ＶＨ１１、ＶＨ１２、ＶＨ４７、ＶＨ６１、ＶＨ６２、ＶＨ６４、及びＶＨ６５から選択される配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、
軽鎖可変領域として、配列ＶＬ１５、ＶＬ３６、ＶＬ４６、ＶＬ４７、ＶＬ４８、及びＶＬ５０から選択される配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む、
請求項１〜７のいずれか一項に記載のヒト化抗体又はその断片もしくは誘導体。
【請求項９】
前記ヒト化抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体が、
重鎖可変領域として、配列ＶＨ６５のアミノ酸配列、又は
配列ＶＨ６５において、
２８位（Ｋａｂａｔ番号：Ｈ２８）のＡｌａからＴｈｒへの置換、
３０位（Ｋａｂａｔ番号：Ｈ３０）のＡｓｎからＳｅｒへの置換、
４９位（Ｋａｂａｔ番号：Ｈ４９）のＶａｌからＧｌｙへの置換、
６４位（Ｋａｂａｔ番号：Ｈ６１）のＡｌａからＡｓｐへの置換、及び
７８位（Ｋａｂａｔ番号：Ｈ７５）のＧｌｎからＬｙｓへの置換
からなる群のうち、一又は二以上の置換を含むアミノ酸配列を含み、
軽鎖可変領域として、配列ＶＬ４７のアミノ酸配列、又は
配列ＶＬ４７において、
１７位（Ｋａｂａｔ番号：Ｌ１７）のＡｓｐからＧｌｕへの置換、
２８位（Ｋａｂａｔ番号：Ｌ２７Ａ）のＳｅｒからＡｓｎへの置換、
４２位（Ｋａｂａｔ番号：Ｌ３７）のＧｌｎからＬｅｕへの置換、
５０位（Ｋａｂａｔ番号：Ｌ４５）のＧｌｎからＡｒｇへの置換、及び
５１位（Ｋａｂａｔ番号：Ｌ４６）のＡｒｇからＬｅｕへの置換
からなる群のうち、一又は二以上の置換を含むアミノ酸配列を含む、
請求項１〜７のいずれか一項に記載のヒト化抗体又はその断片もしくは誘導体。
【請求項１０】
前記ヒト化抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体が、
（１）  重鎖可変領域として配列ＶＨ１１、軽鎖可変領域として配列ＶＬ１５、
（２）  重鎖可変領域として配列ＶＨ１１、軽鎖可変領域として配列ＶＬ３６、
（３）  重鎖可変領域として配列ＶＨ１１、軽鎖可変領域として配列ＶＬ４６、
（４）  重鎖可変領域として配列ＶＨ１１、軽鎖可変領域として配列ＶＬ４７、
（５）  重鎖可変領域として配列ＶＨ１１、軽鎖可変領域として配列ＶＬ４８、
（６）  重鎖可変領域として配列ＶＨ１１、軽鎖可変領域として配列ＶＬ５０、
（７）  重鎖可変領域として配列ＶＨ１２、軽鎖可変領域として配列ＶＬ４８、
（８）  重鎖可変領域として配列ＶＨ４７、軽鎖可変領域として配列ＶＬ４８、
（９）  重鎖可変領域として配列ＶＨ６１、軽鎖可変領域として配列ＶＬ４８、
（１０）重鎖可変領域として配列ＶＨ６２、軽鎖可変領域として配列ＶＬ４８、
（１１）重鎖可変領域として配列ＶＨ６４、軽鎖可変領域として配列ＶＬ４７、
（１２）重鎖可変領域として配列ＶＨ６４、軽鎖可変領域として配列ＶＬ４８、又は
（１３）重鎖可変領域として配列ＶＨ６５、軽鎖可変領域として配列ＶＬ４７
のいずれかの組み合わせの配列を含む、請求項８又は９に記載のヒト化抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のヒト化抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体を有効成分として含有する、認知症治療剤又は予防剤。
【請求項１２】
認知症がタウオパチーである、請求項１１に記載の認知症治療剤又は予防剤。
【請求項１３】
タウオパチーが、アルツハイマー病、皮質基底核変性症、進行性核上性麻痺、ピック病、嗜銀顆粒性認知症（嗜銀性顆粒病）、認知症を伴う多系統タウオパチー（ＭＳＴＤ）、１７番染色体に連鎖するパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ−１７）、神経原線維変化型認知症、石灰沈着を伴うび慢性神経原線維変化病（ＤＮＴＣ）、球状グリア封入体を伴うタンパク質タウオパチー（ＷＭＴ−ＧＧＩ）、又はタウ陽性封入体を伴う前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ−ｔａｕ）である、請求項１２に記載の認知症治療剤又は予防剤。
【請求項１４】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のヒト化抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体、及び、医薬的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のヒト化抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体のタンパク質をコードする核酸分子。
【請求項１６】
請求項１５に記載の核酸分子を含むベクター又はプラスミド。
【請求項１７】
請求項１５に記載の核酸分子又は請求項１６に記載のベクター又はプラスミドで形質転換された宿主細胞。
【請求項１８】
宿主細胞が哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、及び植物細胞から選ばれる真核細胞、又は細菌細胞である、請求項１７に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のヒト化抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体を製造する方法であって、請求項１７又は１８に記載の宿主細胞を、該ヒト化抗体又はその断片もしくは誘導体を産生するための適切な条件下で培養することを含む方法。
【請求項２０】
該ヒト化抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体を前記宿主細胞から単離することを更に含む、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、認知症治療又は予防のためのヒト化抗体及びその製造方法、並びにそれを用いた認知症治療剤又は予防剤に関する。具体的には、本発明は、優れた認知機能を改善する効果を有する新規のヒト化抗リン酸化タウ抗体及びその製造方法、ならびに該ヒト化抗体を含有する認知症治療剤又は予防剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
認知症とは、いったん発達した知能が何らかの後天的理由によって低下し、社会的な適応困難を呈する状態をいう。認知症性の疾患は、神経変性疾患、血管性認知症、プリオン病、感染性疾患、代謝・内分泌疾患、外傷及び脳外科疾患、中毒性疾患等に分類される（非特許文献１）。わが国においては、２０１０年現在約２１０万名程度の認知症患者が存在し、６５歳以上の高齢者における有病率は８〜１０％程度とも１０％以上ともいわれ、世界的な高齢化の流れの中で大きな問題と認識されている（非特許文献２）。認知症における基礎疾患をみると、約３５％がアルツハイマー病（Alzheimer's disease：ＡＤ）、約１５％がＡＤと脳血管性の混合型、５％が前頭側頭葉変性症（frontotemporal lobar degeneration：ＦＴＬＤ）であり、ＡＤやＦＴＬＤ等の神経変性疾患が多くの割合を占めている（非特許文献２）。神経変性疾患による認知症は少なくとも６ヶ月以上の期間をかけて進行する記憶障害及び／又は人格変化の潜行性の発症によって特徴づけられる疾患である。認知機能の障害の程度に高い相関性がある神経変性の過程における一貫した特徴は、神経原線維変化（neurofibrillary tangle：ＮＦＴ）である（非特許文献３）。
【０００３】
「タウタンパク質（以下「タウ」と記載することもある。）」とは、ヒトでは第１７番染色体（１７ｑ２１）に存在するＭＡＰＴ遺伝子によってコードされるタンパク質で、中枢系で多く発現している微小管結合タンパク質の一つである。タウは神経変性疾患の代表であるＡＤにおけるＮＦＴを構成する対らせん状細線維（paired helical filament）と直線状細線維（straight filament）の主要構成タンパク質であることが発見され、更に種々の神経疾患において細胞内に蓄積することが明らかになった。このようなタウの細胞内蓄積が生じる疾患はタウオパチー（tauopathy）と総称される（非特許文献４）。タウオパチーに含まれる神経変性疾患としては、アルツハイマー病（ＡＤ）、皮質基底核変性症（corticobasal degeneration：ＣＢＤ又はcorticobasal syndrome：ＣＢＳ）、進行性核上性麻痺、ピック病、嗜銀顆粒性認知症（嗜銀性顆粒病）、認知症を伴う多系統タウオパチー（Multiple system tauopathy with dementia：ＭＳＴＤ）、１７番染色体に連鎖するパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ−１７）、神経原線維変化型認知症、石灰沈着を伴うび慢性神経原線維変化病（diffuse neurofibrillaty taｎgles with calcification：ＤＮＴＣ）、球状グリア封入体を伴う白質タウオパチー（White matter tauopathy with globular glial inclusions：ＷＭＴ−ＧＧＩ）、タウ陽性封入体を伴う前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ−ｔａｕ）等があるが、神経変性疾患以外でもエコノモ脳炎後遺症や亜急性硬化性全脳症等の感染症によるもの、拳闘家脳症等の外傷によるものもタウオパチーに含まれる（非特許文献４）。
【０００４】
ＭＡＰＴ遺伝子のゲノム上での構造は１３個のエクソンからなり、選択的スプライシングによって複数のアイソフォームとしてのタンパク質が発現される（非特許文献４）。また、タウの構造の特徴としては、エクソン２とエクソン３の選択的スプライシングに依拠する２９アミノ酸反復配列（Ｎ）が０〜２個（Ｎ０〜Ｎ２）となるＮ末端の酸性ドメイン、プロリンを多く含む中間ドメイン、及び微小管結合に関与する反復配列（Ｒ）を３個（３Ｒ）又は４個（４Ｒ）を含むＣ末端の微小管結合ドメイン（エクソン９から１２によってコードされる）からなる（非特許文献３及び４）。そのため、タウは、２９アミノ酸反復配列（Ｎ）と微小管結合に関与する反復配列（Ｒ）を含む数によって、３Ｒ０Ｎ（３５２アミノ酸）、３Ｒ１Ｎ（３８１アミノ酸）、３Ｒ２Ｎ（４１０アミノ酸）、４Ｒ０Ｎ（３８３アミノ酸）、４Ｒ１Ｎ（４１２アミノ酸）、及び４Ｒ２Ｎ（４４１アミノ酸）の６種類が代表的なアイソフォームとされている。そのようなアイソタイプのうち、胎生期の脳においては３Ｒ０Ｎのみが存在するのに対し、成人のヒトの脳においては６つ全てのアイソタイプが存在するが、４Ｒ型が多く存在する（非特許文献３）。アイソタイプの３Ｒ型と４Ｒ型の違いはエクソン１０が選択的スプライシングによって除かれる（３Ｒ）か含まれる（４Ｒ）かによって決まる。このようにタウには幾つかのアイソフォームが存在するが、その対応する位置のアミノ酸番号を特定するため、一番長いアイソフォームである４Ｒ２Ｎ（配列番号１）におけるアミノ酸の番号（１〜４４１）で表す。例えば、Ｓｅｒ４１３と記載した場合には、４Ｒ２Ｎ（配列番号１）では４１３番目のアミノ酸残基であるセリンを表すが、４Ｒ１Ｎ（配列番号２）では３８４番目、４Ｒ０Ｎ（配列番号３）では３５５番目、３Ｒ２Ｎ（配列番号４）では３８２番目、３Ｒ１Ｎ（配列番号５）では３５３番目、３Ｒ０Ｎ（配列番号６）では３２４番目のアミノ酸残基であるセリンを表す。
【０００５】
神経変性疾患におけるタウの関与は、最初１７番染色体に連鎖するパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ−１７）において、ＭＡＰＴ遺伝子の変異とタウの蓄積の関係から解明された経緯があり、ＦＴＤＰ−１７ではＭＡＰＴ遺伝子における４０種類以上の遺伝子変異が報告されている（非特許文献４）。このような遺伝子変異は、タウアイソフォームの比率の変化や変異タウの微小管への相互作用の変化が起こり、病態形成に関与している可能性が示唆されている。しかし、家族性の神経変性疾患と異なり、ＡＤ等孤発性の神経変性疾患では、ＭＡＰＴの変異が見られない場合が多い。また、神経変性疾患で蓄積するタウは、高度にリン酸化による修飾を受けているという特徴がある。また、軽度の認知機能障害（mild cognitive impairment：ＭＣＩ）を示す患者において、髄液中のリン酸化タウの量と下垂体萎縮との間には相関が見られ、リン酸化タウはタウオパチーの患者での神経変性についての信頼性の高いバイオマーカーであると考えられている（非特許文献５）。そのため、タウの過剰なリン酸化を抑制するために、リン酸化に関わる酵素であるキナーゼ、その中でも特にＧＳＫ−３βに対する酵素阻害剤を治療に使用する試みがされ、開発が行なわれている（非特許文献５）。しかし、ＧＳＫ−３β等のキナーゼは病態のみではなく、正常な生理作用においても機能制御に関連する酵素と考えられることから、副作用等が懸念される。事実、ＧＳＫ−３βによってタウがリン酸化される部位のうちの幾つかは、胎児や正常なヒトの脳で見られるタウのリン酸化部位と一致することから(非特許文献３)、正常なタウの機能に影響する可能性も考えられる。
【０００６】
また、従来は、細胞外に存在するタウは変性した神経細胞の細胞死によって細胞外に漏れだすと考えられていたが、最近の研究によると、タウは細胞内で過剰にリン酸化された後、プロセスを受けて細胞外に能動的に分泌されることが示唆されている。細胞外に分泌されたリン酸化タウは、一部のリン酸化部位で脱リン酸化を受けた上で、周辺の細胞のムスカリン受容体のＭ１及びＭ３に作用して、細胞内のタウリン酸化の亢進や細胞死の誘導などの作用に関与していると考えられている（非特許文献６、非特許文献７）。このように、タウが細胞外で作用する因子として働くと考えられるようになってきたことから、細胞内で作用させるのが難しい抗体などの高分子を薬効成分とする治療薬の可能性も重視されるようになってきた。しかし、上述のように細胞外に分泌されるタウは、一部プロセスを受け、また脱リン酸化を受けるなど、今まで標的とされてきた過剰にリン酸化されたタウの構造情報から更に変化を受けている可能性がある。更に、脱リン酸化されたタウの部分に対して作用する薬剤は、正常のタウの機能にも影響する可能性も考えられる。抗体などで病態におけるタウを標的とする場合、どのような病態特異的な部位、つまりタウのリン酸化エピトープに作用するものを選ぶのかが重要になるが、このような複雑な情報の存在ゆえに、そのようなエピトープを選ぶのは更に困難になっている状況といえる。
【０００７】
タウに対する特異的な作用を目指した試みとして、タウタンパク質をターゲットとしたタウオパチーの免疫学的治療に関する発明が報告されている（非特許文献５、特許文献１〜３）。免疫学的治療とは、ペプチドワクチンなどを投与することにより、特異的な抗体の産生を誘導することを目的に行なわれるもので、標的タンパク質又はペプチドに対する特異性の高さから副作用の低減が期待される。このような取り組みとして、リン酸化されたタウの部分ペプチド（Ｓｅｒ３９６及びＳｅｒ４０４に相当するアミノ酸残基がリン酸化されたもの、並びにＳｅｒ２６２に相当するアミノ酸残基がリン酸化されたもの）を用いたワクチンにより変異タウを発現する動物モデルを免疫することによって、当該モデル動物の運動機能改善等を改善したことを報告している。しかし、これらの報告は、Ｐ３０１Ｌ（タウの３０１番目のアミノ酸残基であるプロリンがロイシンに変化する変異）等の遺伝子変異を導入したトランスジェニックマウス（ｔｇマウス）を用いた検討であり、該ｔｇマウスは家族性の神経変性疾患の一つであるＦＴＤＰ−１７についての遺伝子変異モデルではあるものの、タウオパチーに含まれるタウ遺伝子変異を伴わない神経変性疾患の多くのもの、特に孤発性の神経変性疾患の病態を表しているわけではない。また、Ｐ３０１Ｌｔｇマウスは、運動機能障害のモデルであり、ヒトの認知症等で問題になる認知機能の障害を表すモデルではないため（非特許文献８）、この動物モデルでの結果によってヒトの認知症の治療に適応できるかを知ることは困難である。非特許文献４では、Ｓｅｒ４０９がリン酸化されたタウペプチドに抗原抗体反応する抗体を投与して、タウオパチーの治療に関する効果をみている。しかしながら、高価なペプチドワクチンとしては全投与量が多く、また効果が現れるまでの期間が長い。また、ペプチドワクチンの効果は、投与されたヒトや動物の免疫応答の反応性が遺伝的背景によって異なり、全ての個体で有効に抗体産生を誘導できるとは限らない。そのため、抗体による受動免疫による免疫療法を用いることが考えられるが、タウにおけるリン酸化を受ける部位は非常に多数存在し、その中のどのリン酸化部位に対する抗体を用いることが有効であるかの情報はほとんど存在しない。また、現在存在する抗体での動物モデルでの効果を見ても、治療に用いるために十分な機能を有しているとは考えられない。
【０００８】
更に、抗体を治療剤又は予防剤の主剤として用いる場合、副作用の回避や医療経済的な問題から治療に用いられる抗体量についても留意が必要であり、特に慢性疾患や遺伝疾患などでは投与量については重要な課題となる。たとえば、ヒト抗ＩＬ-６Ｒ抗体であるアクテムラ（登録商標）（トシリズマブ）の治療での用量は体重１ｋｇあたり８ｍｇで１〜４週間隔に投与され、ヒト化抗補体Ｃ５抗体であるソリリス（登録商標）（エクリズマブ）の治療での用量は、１回に成人一人当たり６００〜９００ｍｇで２週から４週毎に投与される。これらは多くの抗体の中から選ばれて開発された優秀な抗体であるが、用量としては現状用いられている抗体医薬品の中では多い方である。従って、今後開発される抗体医薬品においてもこれらと同等以下の用量での効果が必要となる。更に、ＡＤなど認知症での治療対象となる臓器は脳であるが、静脈内や皮下での投与など全身投与を行う場合には、脳血管関門の存在によって血中から脳への抗体の移行率は低いといわれるため、認知症治療に用いられる抗体はほかの臓器の疾患を対象とする場合と比較して薬理効果が期待しにくいという、大きな課題が存在する。
【０００９】
ヒトの認知症においては、中心となる症状は記憶障害と認知機能障害であり、特に認知機能は記憶に基づいて判断、コミュニケーション、遂行機能を発揮するために重要な機能であることから、認知機能障害は認知症における症状として重要な位置を占めている。一方、運動機能障害は、１７番染色体に連鎖するパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ−１７）や末期のアルツハイマー病において認められる症状ではあるものの、必ずしも認知症において中心となる症状ではない。従って、認知症の治療においては、認知機能を改善することが中心の課題となる。しかし、現状においてはそのような課題を解決するために必要な、タウオパチーによる認知機能障害の適切な動物モデルを用いて優れた認知機能改善効果を示す認知症治療剤又は予防剤を取得することができる方策は示されておらず、また、認知症に特異的で優れた効果を示す認知症治療剤又は予防剤は存在しない。
【００１０】
斯かる背景の下、本発明者等は、アルツハイマー病の病態でタウタンパク質が異常なリン酸化を受ける多くのリン酸化部位の内、４１３位のセリン残基（Ｓｅｒ４１３）のリン酸化部位に着目し、Ｓｅｒ４１３リン酸化タウに特異的なポリクローナルマウス抗体及びモノクローナルマウス抗体を作製することに成功している。更に、得られたモノクローナルマウス抗体を、リン酸化タウタンパク質を異常発現する認知症モデルマウスに投与し、認知機能改善効果が見られる旨を確認している（特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許第８０１２９３６号明細書
【特許文献２】国際公開第２０１０／１４２４２３号
【特許文献３】国際公開第２０１０／１４４７１１号
【特許文献４】国際公開第２０１３／１８０２３８号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】岸本年史・高橋茂樹編, “STEP Series 精神科”, 第2版, 海馬書房, 2008, pp.103-104
【非特許文献２】浅田隆, “別冊・医学のあゆみ−認知症”, 医歯薬出版(株), 2011, pp.5-10
【非特許文献３】Alistair Burns et al. (編), “Dementia”, 3rd Edition, (米), 2005, CRC Press, pp.408-464
【非特許文献４】新井哲明, 神経内科, 2010, 72巻, 特別増刊号 (Suppl.6), pp.46-51
【非特許文献５】Wendy Noble et al., Expert Opinion on Drug Discovery, 2011, Vol.6, No.8, pp.797-810
【非特許文献６】Miguel Diaz-Hernandes et al., Journal of Biological Chemistry, 2010, Vol.285, No.42, pp.32539-32548
【非特許文献７】Venessa Plouffe et al., PLoS ONE, 2012, Vol.7, p.36873
【非特許文献８】Alistair Burns et al. (編), “Dementia”, 3rd Edition, (米), 2005, CRC Press, p.459
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
ヒトにおける認知症の治療及び予防への適用を鑑み、リン酸化タウに対して高い結合性を示すのみならず、ヒトに対する抗原性が低減されたヒト化抗リン酸化タウ抗体が求められていた。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者等は前記課題に鑑み、本発明者等が以前取得したマウスモノクローナル抗リン酸化タウ抗体に種々改変を加え、そのリン酸化タウに対する結合性を実質的に損なうことなく、ヒトに対する抗原性がより低減された抗体をデザインすべく鋭意検討した。その結果、ヒトにおけるタウオパチー等の認知症の治療剤又は予防剤として適用可能なヒト化抗リン酸化タウ抗体を取得し、本願発明に到達した。
【００１５】
即ち、本発明は以下に関する。
［１］配列番号１の少なくともＳｅｒ４１３に相当するアミノ酸残基がリン酸化されたタウタンパク質又はタウペプチドに抗原抗体反応するヒト化抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体。
［２］前記タウタンパク質又はタウペプチドに対する平衡解離定数が１．８６×１０−８Ｍ以下である、［１］に記載のヒト化抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体。
［３］非リン酸化タウタンパク質又はタウペプチドへの結合性と比較して、リン酸化タウタンパク質又はタウペプチドへの選択的結合性が改善されてなる、［１］又は［２］に記載のヒト化抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体。
［４］血中投与時の脳内への移行性が改善されてなる、［１］〜［３］の何れか一項に記載のヒト化抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体。
［５］前記ヒト化抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体が、
ＣＤＲ−Ｈ１配列として、配列１Ｍと８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
ＣＤＲ−Ｈ２配列として、配列２Ｍ又は２Ｈ１と８４％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
ＣＤＲ−Ｈ３配列として、配列３Ｍと８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
ＣＤＲ−Ｌ１配列として、配列４Ｌ１又は４Ｍと８７％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
ＣＤＲ−Ｌ２配列として、配列５Ｍと８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
ＣＤＲ−Ｌ３配列として、配列６Ｍと７７％以上の相同性を有するアミノ酸配列
をそれぞれ含む、［１］〜［４］のいずれか一項に記載のヒト化抗体又はその断片もしくは誘導体。
［６］前記ヒト化抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体が、
ＣＤＲ−Ｈ１配列として、配列１Ｍのアミノ酸配列、
ＣＤＲ−Ｈ２配列として、配列２Ｈ１のアミノ酸配列、又は、配列２Ｈ１の１５位のＡｌａがＡｓｐに置換されたアミノ酸配列、
ＣＤＲ−Ｈ３配列として、配列３Ｍのアミノ酸配列、
ＣＤＲ−Ｌ１配列として、配列４Ｌ１のアミノ酸配列、又は、配列４Ｌ１の５位のＳｅｒがＡｓｎに置換されたアミノ酸配列、
ＣＤＲ−Ｌ２配列として、配列５Ｍのアミノ酸配列、並びに
ＣＤＲ−Ｌ３配列として、配列６Ｍのアミノ酸配列
をそれぞれ含む、［１］〜［４］のいずれか一項に記載のヒト化抗体又はその断片もしくは誘導体。
［７］前記ヒト化抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体が、
（１）ＣＤＲ−Ｈ１配列として、配列１Ｍのアミノ酸配列、
ＣＤＲ−Ｈ２配列として、配列２Ｈ１のアミノ酸配列、
ＣＤＲ−Ｈ３配列として、配列３Ｍのアミノ酸配列、
ＣＤＲ−Ｌ１配列として、配列４Ｌ１のアミノ酸配列、
ＣＤＲ−Ｌ２配列として、配列５Ｍのアミノ酸配列、及び
ＣＤＲ−Ｌ３配列として、配列６Ｍのアミノ酸配列を含み；又は、
（２）ＣＤＲ−Ｈ１配列として、配列１Ｍのアミノ酸配列、
ＣＤＲ−Ｈ２配列として、配列２Ｈ１のアミノ酸配列、
ＣＤＲ−Ｈ３配列として、配列３Ｍのアミノ酸配列、
ＣＤＲ−Ｌ１配列として、配列４Ｍのアミノ酸配列、
ＣＤＲ−Ｌ２配列として、配列５Ｍのアミノ酸配列、及び
ＣＤＲ−Ｌ３配列として、配列６Ｍのアミノ酸配列を含み；又は、
（３）ＣＤＲ−Ｈ１配列として、配列１Ｍのアミノ酸配列、
ＣＤＲ−Ｈ２配列として、配列２Ｍのアミノ酸配列、
ＣＤＲ−Ｈ３配列として、配列３Ｍのアミノ酸配列、
ＣＤＲ−Ｌ１配列として、配列４Ｍのアミノ酸配列、
ＣＤＲ−Ｌ２配列として、配列５Ｍのアミノ酸配列、及び
ＣＤＲ−Ｌ３配列として、配列６Ｍのアミノ酸配列を含む、
［５］又は［６］に記載のヒト化抗体又はその断片もしくは誘導体。
［８］前記ヒト化抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体が、
重鎖可変領域として、配列ＶＨ１１、ＶＨ１２、ＶＨ４７、ＶＨ６１、ＶＨ６２、ＶＨ６４、及びＶＨ６５から選択される配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、
軽鎖可変領域として、配列ＶＬ１５、ＶＬ３６、ＶＬ４６、ＶＬ４７、ＶＬ４８、及びＶＬ５０から選択される配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む、
［１］〜［７］のいずれか一項に記載のヒト化抗体又はその断片もしくは誘導体。
［９］前記ヒト化抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体が、
重鎖可変領域として、配列ＶＨ６５のアミノ酸配列、又は
配列ＶＨ６５において、
２８位（Ｋａｂａｔ番号：Ｈ２８）のＡｌａからＴｈｒへの置換、
３０位（Ｋａｂａｔ番号：Ｈ３０）のＡｓｎからＳｅｒへの置換、
４９位（Ｋａｂａｔ番号：Ｈ４９）のＶａｌからＧｌｙへの置換、
６４位（Ｋａｂａｔ番号：Ｈ６１）のＡｌａからＡｓｐへの置換、及び
７８位（Ｋａｂａｔ番号：Ｈ７５）のＧｌｎからＬｙｓへの置換
からなる群のうち、一又は二以上の置換を含むアミノ酸配列を含み、
軽鎖可変領域として、配列ＶＬ４７のアミノ酸配列、又は
配列ＶＬ４７において、
１７位（Ｋａｂａｔ番号：Ｌ１７）のＡｓｐからＧｌｕへの置換、
２８位（Ｋａｂａｔ番号：Ｌ２７Ａ）のＳｅｒからＡｓｎへの置換、
４２位（Ｋａｂａｔ番号：Ｌ３７）のＧｌｎからＬｅｕへの置換、
５０位（Ｋａｂａｔ番号：Ｌ４５）のＧｌｎからＡｒｇへの置換、及び
５１位（Ｋａｂａｔ番号：Ｌ４６）のＡｒｇからＬｅｕへの置換
からなる群のうち、一又は二以上の置換を含むアミノ酸配列を含む、
［１］〜［７］のいずれか一項に記載のヒト化抗体又はその断片もしくは誘導体。
［１０］前記ヒト化抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体が、
（１）  重鎖可変領域として配列ＶＨ１１、軽鎖可変領域として配列ＶＬ１５、
（２）  重鎖可変領域として配列ＶＨ１１、軽鎖可変領域として配列ＶＬ３６、
（３）  重鎖可変領域として配列ＶＨ１１、軽鎖可変領域として配列ＶＬ４６、
（４）  重鎖可変領域として配列ＶＨ１１、軽鎖可変領域として配列ＶＬ４７、
（５）  重鎖可変領域として配列ＶＨ１１、軽鎖可変領域として配列ＶＬ４８、
（６）  重鎖可変領域として配列ＶＨ１１、軽鎖可変領域として配列ＶＬ５０、
（７）  重鎖可変領域として配列ＶＨ１２、軽鎖可変領域として配列ＶＬ４８、
（８）  重鎖可変領域として配列ＶＨ４７、軽鎖可変領域として配列ＶＬ４８、
（９）  重鎖可変領域として配列ＶＨ６１、軽鎖可変領域として配列ＶＬ４８、
（１０）重鎖可変領域として配列ＶＨ６２、軽鎖可変領域として配列ＶＬ４８、
（１１）重鎖可変領域として配列ＶＨ６４、軽鎖可変領域として配列ＶＬ４７、
（１２）重鎖可変領域として配列ＶＨ６４、軽鎖可変領域として配列ＶＬ４８、又は
（１３）重鎖可変領域として配列ＶＨ６５、軽鎖可変領域として配列ＶＬ４７
のいずれかの組み合わせの配列を含む、［８］又は［９］に記載のヒト化抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体。
［１１］［１］〜［１０］のいずれか一項に記載のヒト化抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体を有効成分として含有する、認知症治療剤又は予防剤。
［１２］認知症がタウオパチーである、［１１］に記載の認知症治療剤又は予防剤。
［１３］タウオパチーが、アルツハイマー病、皮質基底核変性症、進行性核上性麻痺、ピック病、嗜銀顆粒性認知症（嗜銀性顆粒病）、認知症を伴う多系統タウオパチー（ＭＳＴＤ）、１７番染色体に連鎖するパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ−１７）、神経原線維変化型認知症、石灰沈着を伴うび慢性神経原線維変化病（ＤＮＴＣ）、球状グリア封入体を伴うタンパク質タウオパチー（ＷＭＴ−ＧＧＩ）、又はタウ陽性封入体を伴う前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ−ｔａｕ）である、［１２］に記載の認知症治療剤又は予防剤。
［１４］［１］〜［１０］のいずれか一項に記載のヒト化抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体、及び、医薬的に許容される担体を含む医薬組成物。
［１５］［１］〜［１０］のいずれか一項に記載のヒト化抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体のタンパク質をコードする核酸分子。
［１６］［１５］に記載の核酸分子を含むベクター又はプラスミド。
［１７］［１５］に記載の核酸分子又は［１６］に記載のベクター又はプラスミドで形質転換された宿主細胞。
［１８］宿主細胞が哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、及び植物細胞から選ばれる真核細胞、又は細菌細胞である、［１７］に記載の宿主細胞。
［１９］［１］〜［１０］のいずれか一項に記載のヒト化抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体を製造する方法であって、［１７］又は［１８］に記載の宿主細胞を、該ヒト化抗体又はその断片もしくは誘導体を産生するための適切な条件下で培養することを含む方法。
［２０］該ヒト化抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体を前記宿主細胞から単離することを更に含む、［１９］に記載の方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のヒト化抗リン酸化タウ抗体は、リン酸化タウに対して高い結合性を示すと共に、ヒトに対する抗原性が顕著に低減されており、ヒトにおけるタウオパチー等の認知症の治療剤又は予防剤として有効に使用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】ヒトタウタンパク質のアイソフォームのアミノ酸配列のClustalWによるアラインメントを示す図である。図１Ａには前半部分を示す。
【図１Ｂ】ヒトタウタンパク質のアイソフォームのアミノ酸配列のClustalWによるアラインメントを示す図である。図１Ｂには後半部分を示す。
【図２Ａ】実施例でヒト化抗体の作製に利用した軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。
【図２Ｂ】実施例でヒト化抗体の作製に利用した重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。
【図３】実施例で作製した各抗体の、非リン酸化ペプチドＰＤ１７に対するリン酸化タウペプチドＰＤ１７Ｐへの選択的結合性を示すグラフである。
【図４】実施例で作製した各抗体の、ＡＤ患者脳ホモジェネート中のｐＳ４１３−Ｔａｕに対する結合性を示すグラフである。
【図５】実施例で作製した各抗体の血中投与時における血中動態を示すグラフである。
【図６】実施例で作製した各抗体の血中投与時における血漿中抗体濃度に対する脳内抗体濃度の比を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明を具体的な実施形態に則して説明するが、本発明はこれらの実施形態に何ら限定されない。
なお、本明細書において引用する特許公報、特許出願公開公報、及び非特許公報を含む全ての文献は、あらゆる目的において、その全体が援用により本明細書に組み込まれる。
【００１９】
本発明者らは、前述の国際公開第２０１３／１８０２３８号（特許文献４）において報告したように、ＡＤで特異的にリン酸化される部位である、配列番号１のアミノ酸配列の４１３位のセリン残基（Ｓｅｒ４１３）に相当するアミノ酸残基がリン酸化されたタウに特異的に抗原抗体反応をする抗体を作製し、成熟に伴い認知機能障害を発症するｔｇマウスに投与したところ、対象群とほぼ同じ程度まで認知機能が回復できることを見出した。一方、同等の抗原に対して前記の抗体よりも強い親和性を有する配列番号１のアミノ酸配列のＳｅｒ３９６に相当するアミノ酸残基がリン酸化されたタウに対する抗体を、同様の濃度で用いて比較したところ、充分な認知機能の改善がみられなかった。配列番号１のアミノ酸配列のＳｅｒ４１３に相当するアミノ酸残基の周辺の部分は、タウの構造と機能との関係においては特に情報が無い領域であり、この部分に対して特異的に抗原抗体反応する抗体がこのような強い認知機能の改善効果を有することは、全く予想外の結果であった。従って、今まで注目をされていなかった、この配列番号１のアミノ酸配列のＳｅｒ４１３に相当するアミノ酸残基の周辺の部位は、タウオパチーにおいて認知機能障害の発症に重要な部位であることを初めて解明した。
【００２０】
以上の従前の知見に基づき、本発明者らは更にこの抗リン酸化タウ抗体に種々改変を加えることにより、Ｓｅｒ４１３がリン酸化されたタウに対する結合性を実質的に損なうことなく、ヒトに対する抗原性がより低減された抗体をデザインすべく鋭意検討した。その結果、ヒトにおけるタウオパチー等の認知症の治療剤又は予防剤として適用可能なヒト化抗リン酸化タウ抗体を取得し、本願発明に到達した。
【００２１】
［リン酸化タウ］
本発明によれば、特定のリン酸化タウタンパク質又はリン酸化タウペプチド（以下それぞれ適宜「本発明のリン酸化タウタンパク質」及び「本発明のリン酸化タウペプチド」といい、総称して適宜「本発明のリン酸化タウ」という。）に対して、抗原抗体反応を生じるヒト化抗リン酸化タウ抗体が提供される。
本発明において「タウタンパク質」とは、配列番号１〜６にアミノ酸配列を示したヒトのタウタンパク質の６種類のアイソフォーム、即ち４Ｒ２Ｎ（配列番号１）、４Ｒ１Ｎ（配列番号２）、４Ｒ０Ｎ（配列番号３）、３Ｒ２Ｎ（配列番号４）、３Ｒ１Ｎ（配列番号５）、及び３Ｒ０Ｎ（配列番号６）、並びにそれらの遺伝子変異体を意味する。前記の背景技術で示したように、例えば認知症に関連する家族性神経変性疾患であるＦＴＤＰ−１７では、４０箇所以上の変異が知られているが、変異の部位はそれらに限定されるものではない。配列番号１〜６のアミノ酸配列に対して導入されていてもよいアミノ酸変異の数も、限定されるものではないが、例えば１から５０箇所、中でも１から３０箇所、更には１から１０箇所である。但し、配列番号１のアミノ酸配列の第４１３位のセリン残基（Ｓｅｒ４１３）に相当するアミノ酸残基は、保存されていることが好ましい。更に、配列番号１にアミノ酸配列を示したヒトのタウタンパク質に対してＢＬＡＳＴ法（ＮＣＢＩのＰＢＬＡＳＴのデフォルト条件）で８０％以上の相同性（similarity）又は同一性（identity）を示すタンパク質及びそのアイソフォームも、本発明におけるタウタンパク質に含まれる。そのようなものには、チンパンジー、アカゲザル、ウマ、ブタ、イヌ、マウス、ウサギ、ラット等ヒト以外の種におけるタウが含まれ、そのような動物の認知機能改善の目的でそのようなタウを標的とした治療剤又は予防剤の作製も可能である。
【００２２】
本発明において「タウペプチド」とは、タウタンパク質のアミノ酸配列の一部を含むペプチドを意味する。タウペプチドが有するタウタンパク質由来のアミノ酸配列の位置及び長さは、限定されるものではないが、配列番号１のアミノ酸番号４１０〜４２１に相当するアミノ酸残基からなるアミノ酸配列のうち、少なくともＳｅｒ４１３に相当するアミノ酸残基を含む、例えば少なくとも連続する３アミノ酸、中でも少なくとも連続する５アミノ酸、更には少なくとも連続する８アミノ酸を含むことが好ましい。タウペプチドの長さも制限されないが、通常４アミノ酸長以上、中でも６アミノ酸長以上、更には８アミノ酸長以上であることが好ましい。
【００２３】
本発明において「タウ」とは、タウタンパク質又はタウペプチドを指す。
なお、本発明において、タウタンパク質及びタウペプチドのアミノ酸番号、すなわちアミノ酸残基の位置は、便宜上、配列番号１に示すアミノ酸配列に基づいて特定する。例えば、配列番号１のＳｅｒ４１３に相当するアミノ酸残基と表現した場合には、配列番号１（４Ｒ２Ｎ）の４１３番目、配列番号２（４Ｒ１Ｎ）の３８４番目、配列番号３（４Ｒ０Ｎ）の３５５番目、配列番号４（３Ｒ２Ｎ）の３８２番目、配列番号５（３Ｒ１Ｎ）の３５３番目、又は配列番号６（３Ｒ０Ｎ）の３２４番目のアミノ酸残基であるセリンを意味する。下記表１に、各アイソフォームにおいて互いに同位置にあるアミノ酸残基の位置を示す。
【００２４】
【表１】
2018139530.tif 000003
【００２５】
なお、表１では、配列番号１のアミノ酸配列の４１０〜４２１に相当する各アイソフォームでのアミノ酸残基の位置を示しているが、これ以外の位置に存在するアミノ酸残基の互いの位置関係については、例えば図１Ａ及びＢに基づいて、容易に理解することができる。そのようなアイソフォームや相同体での対応部位を理解するためには、当業者であればNeedleman-Wunsch法やSmith-Waterman法等のペアワイズ配列アラインメント（Pairwise Sequence Alignment）による方法や、ClustalW法やＰＲＲＰ法等の多重配列アラインメント（Multiple Sequence Alignment）による方法によって、適宜解析して理解することができる。対応部位の解析方法の一例として、図１Ａ及びＢにヒトでの６種類のアイソフォームのアミノ酸配列（１文字表示）をClustalWで並べたものを示す。これを見れば６つのアイソフォームにおいて配列番号１のアミノ酸配列のＳｅｒ４１３に相当するアミノ酸残基周辺の構造が保存されていて、対応するアミノ酸がいずれであるかを容易に理解できる。
【００２６】
本発明においてアミノ酸残基が「リン酸化」されたとは、アミノ酸残基の側鎖に対してリン酸基がエステル結合した状態をいう。リン酸化されるアミノ酸残基の代表的なものとしては、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、チロシン（Ｔｙｒ）等が挙げられる。
【００２７】
本発明のヒト化抗リン酸化タウ抗体が抗原抗体反応するリン酸化タウタンパク質及びタウペプチドは、ＡＤ等の神経変性疾患で特異的にリン酸化される部位のアミノ酸残基がリン酸化されたものである。具体的には、配列番号１のアミノ酸配列の少なくとも４１３位のセリン残基（Ｓｅｒ４１３）がリン酸化されたものである。更に任意により、アミノ酸番号４１０〜４２１に相当するアミノ酸残基のうち、一又は二以上がリン酸化されていてもよい。中でも、配列番号１のアミノ酸配列の第４１２位のセリン残基（Ｓｅｒ４１２）、第４１４位のスレオニン残基（Ｔｈｒ４１４）、第４１６位のセリン残基（Ｓｅｒ４１６）のアミノ酸に相当するアミノ酸残基のうち、一又は二以上がリン酸化されていてもよい。このようなリン酸化ペプチドの代表的なものとしては、配列番号７に示すアミノ酸配列を有するｐＳ４１２／ｐＳ４１３（Ｃｙｓ−）、配列番号８に示すアミノ酸配列を有するｐＳ４１３（Ｃｙｓ−）、配列番号９に示すアミノ酸配列を有するｐＳ４０９／ｐＳ４１２／ｐＳ４１３（Ｃｙｓ−）等が挙げられるが、これに限定されない。
【００２８】
本発明のリン酸化タウペプチドは、本発明のヒト化抗リン酸化タウ抗体の作製や反応性検証のための抗原に用いることができる。
本発明のリン酸化タウペプチドは、当業者であれば適宜合成法や遺伝子工学的方法等を用いて製造することができる。リン酸化ペプチドを合成によって製造する方法としては、Ｂｏｃ法による方法（Wakamiya T.ら、Chemistry Letters、Vol.22 P1401, 1993年）、Ｆｍｏｃ法による方法（PERICH, J. W., International Journal of Peptide and Protein Research, vol.40, P134-140, 1992年）、又は特許第３５８７３９０号公報に記載の方法等が例示できるが、当業者であれば適宜別の方法でも実施可能である。また、遺伝子工学的方法による製造方法は、製造するペプチド又はその前駆体をコードする塩基配列を有する遺伝物質（ＤＮＡ、ＲＮＡ）を調製し、適宜発現用のベクターへの組込やプロモーター配列の付加等を行うことで、適当な宿主に導入して発現させるか無細胞系タンパク質合成系を用いる等の方法で製造することができる。この場合、望む部位がリン酸化されたリン酸化ペプチドを得るためには、適宜、宿主が有する又は遺伝子工学的に発現が誘導されたキナーゼ類により宿主内でリン酸化反応を行わせるか、目的のペプチドを一度回収した後にin vitroにおいてキナーゼ等を反応させることでリン酸化反応を行うことによって製造することが可能である。このin vitroでのリン酸化反応を行うためには、目的のペプチドを、タウのリン酸化反応での機能が知られているグリコーゲン合成酵素キナーゼ３（Glycogen synthase kinase 3：ＧＳＫ３）やサイクリン依存性タンパク質キナーゼ５（cyclin-dependent kinase 5：ＣＤＫ５）等の酵素を利用してリン酸化することにより実施することができる。このように宿主内、又はin vitroでリン酸化されたリン酸化ペプチドのうち、目的のアミノ酸残基がリン酸化されたものを取得するためには、前記の抗リン酸化タウに対する抗体による抗体抗原反応を用いて特異的に抗体と結合したリン酸化ペプチドを回収する方法等を用いてもよい。
【００２９】
本発明のリン酸化タウペプチドは、その配列のＮ末端及び／又はＣ末端を、目的に応じて他の機能を有する物質で修飾することも可能である。例えば、本発明のリン酸化タウペプチドは、そのＮ末端及び／又はＣ末端にメチオニン残基、アセチル基又はピログルタミン酸等が付加され、あるいはそのＮ末端及び／又はＣ末端が蛍光物質等で修飾されていてもよい。また、本発明のリン酸化タウペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端を修飾する物質は、ペプチドやタンパク質であってもよい。斯かる修飾用のペプチドの例としては、適当なタグ配列（典型的にはヒスチジンタグ又はＦＬＡＧタグ）、Ｔ細胞受容体（T cell Receptor：ＴＣＲ）や主要組織適合性抗原（major histocompatibility complex：ＭＨＣ）によって認識されるためのアミノ酸配列のペプチド、ウイルスや細菌のタンパク質やそれに由来する配列のペプチド等が挙げられる。また、本発明のリン酸化タウペプチドには、Ｎ末端及びＣ末端以外の少なくとも一つのアミノ酸残基が、他の化合物又はペプチドで修飾されたものも含まれる。このようなリン酸化タウペプチドの修飾は、当業者であれば公知の方法、例えばHermanson et al., “Bioコンジュゲート techniques”, (米), Academic Press, 1996に記載の方法等を用いて実施することが可能である。
【００３０】
［ヒト化抗リン酸化タウ抗体］
本発明のヒト化抗リン酸化タウ抗体は、前述した本発明のリン酸化タウタンパク質又はリン酸化タウペプチドに対して抗原抗体反応する抗体である。
【００３１】
本発明において「抗体」とは、典型的には、リンパ球のうちＢ細胞の産生する糖タンパク分子であって、タンパク質等の特定の分子（抗原）を認識して結合する働きをもつ分子である。これは通常「免疫グロブリン」（immunoglobulin：Ｉｇ）とも呼ばれる。斯かる抗体は、典型的には重鎖（heavy chain：Ｈ鎖）及び軽鎖（light chain：Ｌ鎖）が各々２本ずつ結合して構成されるが、Ｈ鎖２本のみで構成される抗体であってもよい。また、免疫グロブリンとしての形態も特に制限されず、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥの何れであってもよい。
【００３２】
また、本発明における抗体は、抗体の断片及び／又は誘導体であってもよい。抗体の断片としては、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ等が挙げられる。抗体の誘導体としては、定常領域部分に人工的にアミノ酸変異を導入した抗体、定常領域のドメインの構成を改変した抗体、１分子あたり２つ以上のＦｃ持つ形の抗体、重鎖のみ又は軽鎖のみで構成される抗体、糖鎖改変抗体、二重特異性抗体、抗体または抗体の断片化合物や抗体以外のタンパク質と結合させた抗体コンジュゲート、抗体酵素、ナノボディ、タンデムｓｃＦｖ、二重特異性タンデムｓｃＦｖ、ダイアボディ、ＶＨＨ等が挙げられる。なお、本発明において単に「抗体」という場合には、別途明記しない限り、抗体の断片及び／又は誘導体も含むものとする。
【００３３】
本発明において「ヒト化」抗体とは、ヒト以外の動物に由来する抗体の相補性決定領域（complementarity determining region：ＣＤＲ）と、ヒト抗体由来のフレームワーク領域（framework region：ＦＲ）及びヒト抗体由来のＣ領域とから構成される抗体を意味する。ヒト化抗体はヒト体内における抗原性が低下しているため、ヒトにおける治療剤又は予防剤の有効成分として有用である。抗体の可変領域は通常、４つのフレーム（ＦＲ）にはさまれた３つの相補性決定領域（complementarity-determining region：ＣＤＲ）で構成されている。ＣＤＲは、実質的に抗体の結合特異性を決定している領域である。ＣＤＲのアミノ酸配列は多様性に富む。一方、ＦＲを構成するアミノ酸配列は、異なる結合特異性を有する抗体の間でも、高い相同性を示すことが多い。そのため、一般にはＣＤＲの移植によって、ある抗体の結合特異性を、他の抗体に移植することができるといわれている。ヒト化抗体は、再構成（reshaped）ヒト抗体とも称される。これは、ヒト以外の哺乳動物（例えばマウス抗体等）のＣＤＲをヒト抗体のＣＤＲへと移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている（欧州特許出願公開番号１２５０２３号公報、国際公開第９６／０２５７６号公報参照）。
【００３４】
本発明において「抗原抗体反応」とは、リン酸化タウタンパク質又はリン酸化タウペプチドに対して、抗体が平衡解離定数（ＫＤ）１．８６×１０−８Ｍ以下の親和性で結合することをいう。本発明の抗体は、リン酸化タウタンパク質又はリン酸化タウペプチドに対して、通常１．８６×１０−８Ｍ以下、中でも２×１０−９Ｍ以下、更には２×１０−１０以下の平衡解離定数（ＫＤ）で結合することが好ましい。
【００３５】
中でも、本発明のヒト化抗リン酸化タウ抗体は、前述した本発明のリン酸化タウタンパク質又はリン酸化タウペプチドに対して、特異的に抗原抗体反応することが好ましい。本発明において「特異的に」とは、本発明のリン酸化タウタンパク質又はリン酸化タウペプチドに対する結合が、当該アミノ酸部位がリン酸化されていない点を除いては本発明のリン酸化タウタンパク質又はリン酸化タウペプチドと同一のタウタンパク質又はタウペプチドに対する結合よりも、通常は１０倍以上強い、中でも３０倍以上強い、更には１００倍以上強い状態をいう。
【００３６】
なお、抗原抗体反応の測定は、当業者であれば固相又は液相の系での結合測定を適宜選択して行うことが可能である。そのような方法としては、酵素結合免疫吸着法（enzyme-linked immunosorbent assay：ＥＬＩＳＡ）、酵素免疫測定法（enzyme immunoassay：ＥＩＡ）、表面プラズモン共鳴法（surface plasmon resonance：ＳＰＲ）、蛍光共鳴エネルギー移動法（fluorescence resonance energy transfer：ＦＲＥＴ）、発光共鳴エネルギー移動法（luminescence resonance energy transfer：ＬＲＥＴ）等が挙げられるが、それらに限定されるものではない。また、そのような抗原抗体結合を測定する際に、抗体及び／又は抗原を酵素、蛍光物質、発光物質、放射性同位元素等で標識を行い、その標識した物質の物理的及び／又は化学的特性に適した測定方法を用いて抗原抗体反応を検出することも可能である。
【００３７】
また、本発明のヒト化抗リン酸化タウ抗体は、血漿中動態が改善されてなることが好ましい。ここで、ヒト化抗体の血漿中動態の改善とは、該ヒト化抗体の血漿中における動態を表すパラメーターが、対応する非ヒト化抗体と比較して、変更されていることを意味する。ここで、血漿中における動態を表すパラメーターとしては、例えば血漿中半減期、平均血漿中滞留時間、及び血漿中クリアランスが挙げられる。また、斯かるパラメーターが変更されているとは、該パラメーターが伸張又は減縮されていることを意味する。また、ヒト化抗体に対応する非ヒト化抗体とは、ヒト化抗体の作製の基となった非ヒト化抗体、例えばマウス抗体又はキメラ抗体を意味する。
【００３８】
また、本発明のヒト化抗リン酸化タウ抗体は、非リン酸化タウタンパク質又はタウペプチドへの結合性と比較して、リン酸化タウタンパク質又はタウペプチドへの選択的結合性が改善されてなることが好ましい。ここで、リン酸化タウタンパク質又はタウペプチドへの選択的結合性の改善とは、抗体のリン酸化タウタンパク質又はタウペプチドへの結合性の、対応する非リン酸化タウタンパク質又はタウペプチドへの結合性に対する比が、上昇していることを意味する。斯かる選択的結合性の分析法としては、例えば、リン酸化タウタンパク質又はタウペプチドを固定化したプレートと、対応する非リン酸化タウタンパク質又はタウペプチドを固定化したプレートとを用い、ＥＬＩＳＡ等によって両タンパク質又はペプチドに対する抗体の結合性を（例えば発色波長の吸光度ＯＤ値として）測定し、得られた結合性の指標（例えば吸光度ＯＤ値）を除算して得られた値を指標として評価することができる。ＥＬＩＳＡの具体的な条件としては、例えば後述の実施例に記載の条件を用いることができる。
【００３９】
具体的に、本発明のヒト化抗リン酸化タウ抗体は、後述の実施例における「（２ｂ）リン酸化タウペプチドへの選択的結合性のＥＬＩＳＡ解析」に記載の手法により得られた、非リン酸化タウタンパク質又はタウペプチドへの結合性に対する、リン酸化タウタンパク質又はタウペプチドへの選択的結合性の比が、通常４０以上、中でも５０、更には６０以上であることが好ましい。
【００４０】
また、本発明のヒト化抗リン酸化タウ抗体は、血中投与時の脳内への移行性が改善されてなることが好ましい。ここで、血中投与時の脳内への移行性の改善とは、ヒト又は他の哺乳動物（例えばマウス、ラット等）に抗体を血中投与した場合における、血漿中抗体濃度に対する脳内抗体濃度の比が、上昇していることを意味する。斯かる脳内移行性の分析法としては、例えば、動物（例えばマウス、ラット等）に抗体を血中投与した後、所定期間（例えば１週間）後に採血すると共に脳ホモジェネートを調製し、得られた血漿試料及び脳ホモジェネート試料における抗体濃度を公知の手法（例えば抗ヒトポリクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法）で測定し、両者を除算することによって求めることができる。斯かる手法の具体的な条件としては、例えば後述の実施例に記載の条件を用いることができる。通常、脳内移行をする抗体の濃度は、０．１〜０．３％程度であるといわれている。
【００４１】
具体的に、本発明のヒト化抗リン酸化タウ抗体は、後述の実施例における「［７］実施例７：脳内移行性の解析」に記載の手法により得られた、血漿中抗体濃度に対する脳内抗体濃度の比が、０．３０％以上、中でも０．３５％以上、更には０．４０％以上、より更には０．４５％以上であることが好ましい。
【００４２】
本発明のヒト化抗リン酸化タウ抗体は、各ＣＤＲ配列として、特定のアミノ酸配列を有することが好ましい。具体的には以下のとおりである。なお、本発明においてアミノ酸配列の「同一性」（identity）とは、一致するアミノ酸残基の割合を意味し、相同性（similarity）とは、一致又は類似するアミノ酸残基の割合を意味する。相同性及び同一性は、例えばＢＬＡＳＴ法（ＮＣＢＩのＰＢＬＡＳＴのデフォルト条件）により決定することができる。
【００４３】
ここで「類似するアミノ酸残基」とは、同様の化学的特質（例えば、電荷又は疎水性）を持つ側鎖を有するアミノ酸残基を意味する。類似するアミノ酸残基としては、例えば以下の組合せが挙げられる。
１）脂肪族側鎖を有するアミノ酸残基：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシン残基。
２）脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸残基：セリン及びトレオニン残基。
３）アミド含有側鎖を有するアミノ酸残基：アスパラギン及びグルタミン残基。
４）芳香族側鎖を有するアミノ酸残基：フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン残基。
５）塩基性側鎖を有するアミノ酸残基：リシン、アルギニン、及びヒスチジン残基。
６）酸性側鎖を有するアミノ酸残基：アスパラギン酸及びグルタミン酸残基。
７）硫黄含有側鎖を有するアミノ酸残基：システイン及びメチオニン残基。
【００４４】
ＣＤＲ−Ｈ１配列としては、配列１Ｍ（配列番号１０）と８０％以上、中でも１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含むことが好ましく、また、配列１Ｍと８０％以上、中でも１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことがより好ましい。中でも、ＣＤＲ−Ｈ１配列としては、配列１Ｍのアミノ酸配列を含むことが好ましい。
【００４５】
ＣＤＲ−Ｈ２配列としては、配列２Ｍ（配列番号１１）又は配列２Ｈ１（配列番号１２）と８４％以上、中でも８９％以上、更には９４％以上、より更には１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含むことが好ましく、また、配列２Ｍ又は２Ｈ１と８４％以上、中でも８９％以上、更には９４％以上、より更には１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことがより好ましい。中でも、ＣＤＲ−Ｈ２配列としては、配列２Ｈ１のアミノ酸配列、又は、配列２Ｈ１の１５位のＡｌａがＡｓｐに置換されたアミノ酸配列を含むことが好ましい。
【００４６】
ＣＤＲ−Ｈ３配列としては、配列３Ｍ（配列番号１３）と８０％以上、中でも９０％以上、更には１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含むことが好ましく、また、配列３Ｍと８０％以上、中でも９０％以上、更には１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことがより好ましい。中でも、ＣＤＲ−Ｈ３配列としては、配列３Ｍのアミノ酸配列を含むことが好ましい。
【００４７】
ＣＤＲ−Ｌ１配列としては、配列４Ｌ１（配列番号１４）又は配列４Ｍ（配列番号１５）と８７％以上、中でも９３％以上、更には１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含むことが好ましく、また、配列４Ｌ１又は４Ｍと８７％以上、中でも９３％以上、更には１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことがより好ましい。中でも、ＣＤＲ−Ｌ１配列としては、配列４Ｌ１のアミノ酸配列、又は、配列４Ｌ１の５位のＳｅｒがＡｓｎに置換されたアミノ酸配列を含むことが好ましい。
【００４８】
ＣＤＲ−Ｌ２配列としては、配列５Ｍ（配列番号１６）と８５％以上、中でも１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含むことが好ましく、また、配列５Ｍと８５％以上、中でも１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことがより好ましい。中でも、ＣＤＲ−Ｌ２配列としては、配列５Ｍのアミノ酸配列を含むことが好ましい。
【００４９】
ＣＤＲ−Ｌ３配列としては、配列６Ｍ（配列番号１７）と７７％以上、中でも８８％以上、更には１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含むことが好ましく、また、配列６Ｍと７７％以上、中でも８８％以上、更には１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことがより好ましい。中でも、ＣＤＲ−Ｌ６配列としては、配列６Ｍのアミノ酸配列を含むことが好ましい。
【００５０】
特に、本発明のヒト化抗リン酸化タウ抗体は、以下のＣＤＲ配列の組み合わせを有することが好ましい。
（１）ＣＤＲ−Ｈ１配列として、配列１Ｍのアミノ酸配列、
ＣＤＲ−Ｈ２配列として、配列２Ｈ１のアミノ酸配列、
ＣＤＲ−Ｈ３配列として、配列３Ｍのアミノ酸配列、
ＣＤＲ−Ｌ１配列として、配列４Ｌ１のアミノ酸配列、
ＣＤＲ−Ｌ２配列として、配列５Ｍのアミノ酸配列、及び
ＣＤＲ−Ｌ３配列として、配列６Ｍのアミノ酸配列。
（２）ＣＤＲ−Ｈ１配列として、配列１Ｍのアミノ酸配列、
ＣＤＲ−Ｈ２配列として、配列２Ｈ１のアミノ酸配列、
ＣＤＲ−Ｈ３配列として、配列３Ｍのアミノ酸配列、
ＣＤＲ−Ｌ１配列として、配列４Ｍのアミノ酸配列、
ＣＤＲ−Ｌ２配列として、配列５Ｍのアミノ酸配列、及び
ＣＤＲ−Ｌ３配列として、配列６Ｍのアミノ酸配列。
（３）ＣＤＲ−Ｈ１配列として、配列１Ｍのアミノ酸配列、
ＣＤＲ−Ｈ２配列として、配列２Ｍのアミノ酸配列、
ＣＤＲ−Ｈ３配列として、配列３Ｍのアミノ酸配列、
ＣＤＲ−Ｌ１配列として、配列４Ｍのアミノ酸配列、
ＣＤＲ−Ｌ２配列として、配列５Ｍのアミノ酸配列、及び
ＣＤＲ−Ｌ３配列として、配列６Ｍのアミノ酸配列。
【００５１】
なお、抗体におけるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、又はＣＤＲ−Ｌ３の各配列を同定する方法としては、例えばKabat法（Kabat et al., The Journal of Immunology, 1991, Vol.147, No.5, pp.1709-1719）やChothia法（Al-Lazikani et al., Journal of Molecular Biology, 1997, Vol.273, No.4, pp.927-948）が挙げられる。これらの方法は、この領域の当業者にとっては技術常識であるが、たとえばDr. Andrew C.R. Martin’s Groupのインターネットホームページ（http://www.bioinf.org.uk/abs/）から概要を知ることも可能である。
【００５２】
また、本発明のヒト化抗リン酸化タウ抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域として、特定のアミノ酸配列を有することが好ましい。具体的には以下のとおりである。
【００５３】
重鎖可変領域としては、配列ＶＨ１１（配列番号１８）、配列ＶＨ１２（配列番号２０）、配列ＶＨ４７（配列番号２２）、配列ＶＨ６１（配列番号２４）、配列ＶＨ６２（配列番号２６）、配列ＶＨ６４（配列番号２８）、及び配列ＶＨ６５（配列番号３０）から選択される配列と、８０％以上、中でも８５％以上、更には９０％以上、特に９５％以上、とりわけ１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含むことが好ましく、また、配列ＶＨ１１、ＶＨ１２、ＶＨ４７、ＶＨ６１、ＶＨ６２、ＶＨ６４、及びＶＨ６５から選択される配列と、８０％以上、中でも８５％以上、更には９０％以上、特に９５％以上、とりわけ１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことがより好ましい。中でも、重鎖可変領域としては、配列ＶＨ６５のアミノ酸配列、又は配列ＶＨ６５において、２８位（Ｋａｂａｔ番号：Ｈ２８）のＡｌａからＴｈｒへの置換、３０位（Ｋａｂａｔ番号：Ｈ３０）のＡｓｎからＳｅｒへの置換、４９位（Ｋａｂａｔ番号：Ｈ４９）のＶａｌからＧｌｙへの置換、６４位（Ｋａｂａｔ番号：Ｈ６１）のＡｌａからＡｓｐへの置換、及び７８位（Ｋａｂａｔ番号：Ｈ７５）のＧｌｎからＬｙｓへの置換からなる群のうち、一又は二以上の置換を含むアミノ酸配列を含むことが好ましい。
【００５４】
軽鎖可変領域としては、配列ＶＬ１５（配列番号３２）、配列ＶＬ３６（配列番号３４）、配列ＶＬ４６（配列番号３６）、配列ＶＬ４７（配列番号３８）、配列ＶＬ４８（配列番号４０）、及び配列ＶＬ５０（配列番号４２）から選択される配列と、８０％以上、中でも８５％以上、更には９０％以上、特に９５％以上、とりわけ１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含むことが好ましく、また、配列ＶＬ１５、ＶＬ３６、ＶＬ４６、ＶＬ４７、ＶＬ４８、及びＶＬ５０から選択される配列と、８０％以上、中でも８５％以上、更には９０％以上、特に９５％以上、とりわけ１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含むことがより好ましい。中でも、軽鎖可変領域としては、配列ＶＨ６５のアミノ酸配列、又は配列ＶＨ６５において、２８位（Ｋａｂａｔ番号：Ｈ２８）のＡｌａからＴｈｒへの置換、３０位（Ｋａｂａｔ番号：Ｈ３０）のＡｓｎからＳｅｒへの置換、４９位（Ｋａｂａｔ番号：Ｈ４９）のＶａｌからＧｌｙへの置換、６４位（Ｋａｂａｔ番号：Ｈ６１）のＡｌａからＡｓｐへの置換、及び７８位（Ｋａｂａｔ番号：Ｈ７５）のＧｌｎからＬｙｓへの置換からなる群のうち、一又は二以上の置換を含むアミノ酸配列を含むことが好ましい。
【００５５】
特に、本発明のヒト化抗リン酸化タウ抗体は、
（１）  重鎖可変領域として配列ＶＨ１１、軽鎖可変領域として配列ＶＬ１５、
（２）  重鎖可変領域として配列ＶＨ１１、軽鎖可変領域として配列ＶＬ３６、
（３）  重鎖可変領域として配列ＶＨ１１、軽鎖可変領域として配列ＶＬ４６、
（４）  重鎖可変領域として配列ＶＨ１１、軽鎖可変領域として配列ＶＬ４７、
（５）  重鎖可変領域として配列ＶＨ１１、軽鎖可変領域として配列ＶＬ４８、
（６）  重鎖可変領域として配列ＶＨ１１、軽鎖可変領域として配列ＶＬ５０、
（７）  重鎖可変領域として配列ＶＨ１２、軽鎖可変領域として配列ＶＬ４８、
（８）  重鎖可変領域として配列ＶＨ４７、軽鎖可変領域として配列ＶＬ４８、
（９）  重鎖可変領域として配列ＶＨ６１、軽鎖可変領域として配列ＶＬ４８、
（１０）重鎖可変領域として配列ＶＨ６２、軽鎖可変領域として配列ＶＬ４８、
（１１）重鎖可変領域として配列ＶＨ６４、軽鎖可変領域として配列ＶＬ４７、
（１２）重鎖可変領域として配列ＶＨ６４、軽鎖可変領域として配列ＶＬ４８、又は
（１３）重鎖可変領域として配列ＶＨ６５、軽鎖可変領域として配列ＶＬ４７
のいずれかの組み合わせの配列を含むことが好ましい。
【００５６】
以上の重鎖及び軽鎖の各ＣＤＲ及び／又は各鎖可変領域のアミノ酸配列に、ヒト抗体の重鎖及び軽鎖の各フレームワーク領域及び／又は各定常領域のアミノ酸配列を適宜組み合わせることにより、当業者であれば本発明のヒト化抗リン酸化タウ抗体を設計することが可能である。ヒト抗体の重鎖及び軽鎖の各フレームワーク領域及び／又は各定常領域のアミノ酸配列は、例えばヒトのＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤの各サブタイプ又はその変異体から選択することが可能である。
【００５７】
また、以上の各種の本発明のヒト化抗リン酸化タウ抗体と、本発明のリン酸化タウに対して競合結合するヒト化抗体も、本発明の範囲に含まれる。本発明において「競合結合」とは、複数種のモノクローナル抗体が抗原と共存する際に、一方の抗体の抗原への結合が、他方の抗体の抗原への結合により阻害される現象を意味する。一般的には、一定量（濃度）のモノクローナル抗体に対して、別のモノクローナル抗体を量（濃度）を変えて加えていった場合に、前者の一定量のモノクローナル抗体の抗原への結合量が低下する添加量（濃度）を測定することによって測定可能である。その阻害の程度は、ＩＣ５０又はＫｉという値で表すことができる。本発明のヒト化抗リン酸化タウ抗体と競合結合するヒト化抗体とは、本発明のヒト化抗リン酸化タウ抗体を１０ｎＭで用いて抗原抗体結合を検出した際に、ＩＣ５０が通常１μＭ以下、中でも１００ｎＭ以下、更には１０ｎＭ以下の抗体をいう。
【００５８】
本発明のヒト化抗リン酸化タウ抗体は、当業者に周知の技法を用いて得ることができる。具体的に、本発明のヒト化抗リン酸化タウ抗体は、通常はモノクローナル抗体（Milstein et al., Nature, 1983, Vol.305, No.5934, pp.537-540）であるところ、斯かるモノクローナル抗体は、例えば以下の手法で作製することが可能である。
【００５９】
例えば、本発明のヒト化抗リン酸化タウ抗体の免疫グロブリンの重鎖及び／又は軽鎖のアミノ酸配列をコードする核酸分子を作製する。ここで、斯かる核酸分子を各種のベクター又はプラスミドに導入することにより、該核酸分子を含むベクター又はプラスミドを作製してもよい。次いで、前記の核酸分子、ベクター、又はプラスミドで宿主細胞を形質転換する。宿主細胞としては、例えば哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、若しくは植物細胞等の真核細胞、又は細菌細胞が挙げられる。次に、この形質転換された宿主細胞を、宿主細胞を、本発明のヒト化抗リン酸化タウ抗体を産生するための適切な条件下で培養する。ここで、必要に応じ、得られた本発明のヒト化抗リン酸化タウ抗体を宿主細胞から単離してもよい。これらの手順に用いられる各種の手法は、何れも当業者には周知である。
【００６０】
また、動物への感作を用いる方法としては、抗原を感作する動物としてヒト抗体遺伝子が導入された非ヒト−トランスジェニック動物を用い、これに本発明のリン酸化タウタンパク質又はリン酸化タウペプチドを感作させ、免疫細胞を取り出して骨髄腫細胞等と細胞融合させることにより得られたハイブリドーマをクローニングして、得られた培養上清から常法によって抗体を精製して回収することにより得ることができる。そのようなモノクローナル抗体の取得方法としては、例えば前述の国際公開第２０１３／１８０２３８号（特許文献４）に記載されている。
【００６１】
それ以外にも、所望のヒト化抗体の抗原結合領域又はその一部を発現するファージライブラリー（ヒト抗体ファージディスプレイ）を用いて、対応する抗原と特異的に結合する抗体や特定のアミノ酸配列からなるファージクローンを取得し、その情報からヒト化抗体を作製する技術を用いることもできる（例えば、Taketo Tanaka et al., The Keio Journal of Medicine, Vol.60, pp.37-46のレビューなどを参照。）
【００６２】
ここで、免疫グロブリンの重鎖及び／又は軽鎖をコードする遺伝子について、望む形質を導入するための遺伝子改変を行ったり、免疫グロブリンの重鎖及び／又は軽鎖の可変領域又はＣＤＲ領域の構造情報を用いることにより、抗体キメラタンパク質、低分子抗体、スキャフォールド抗体等を作製することは、当業者であれば公知の技術を用いて実施可能である。また、抗体の性能の向上や副作用の回避を目的に、抗体の定常領域の構造に改変を入れることや、糖鎖の部分での改変を行うことも、当業者によく知られた技術によって適宜行うことができる。
【００６３】
［ヒト化抗リン酸化タウ抗体を含有する認知症治療剤又は予防剤］
本発明によれば、本発明のヒト化抗リン酸化タウ抗体又はその断片もしくは誘導体を有効成分として含有する、認知症治療剤又は予防剤も提供される。本発明のヒト化抗リン酸化タウ抗体又はその断片もしくは誘導体については、前述したとおりである。
【００６４】
ヒトにおける認知症とは、いったん発達した、あるいは獲得された知的機能が低下する状態をいい、知能障害の一つとされるが（上島国利・丹羽真一編, “NEW精神医学 (NANKODO’S ESSENTIAL WELL-ADVANCED SERIES)”, 南江堂, 2008, pp.69-70）、広い意味においては知能障害及び／又は記憶障害を呈する疾患と考えられる。ＡＤ等の神経変性疾患においては、「神経変性」を確定するには死後に組織学的な解析を行うことで神経原線維変化（ＮＦＴ）の存在を確認すること等の手法が用いられるが、医師は神経変性疾患の診断として、例えば長谷川式簡易知能評価スケール改訂版（Hasegawa's Dementia Scale for Revised：ＨＤＳ−Ｒ）やミニメンタルステート検査（Mini-Mental State Examination：ＭＭＳＥ）等の質問による神経心理学的検査、又は、例えば臨床認知症評価法（Clinical Dementia Rating：ＣＤＲ）や機能アセスメントステージ分類（Functional Assessment Staging：ＦＡＳＴ）等の観察による神経心理学的検査、生化学検査として脳脊髄液中でのタウやリン酸化タウの存在量の上昇やＡβの存在量の上昇、画像検査として頭部ＣＴ、頭部ＭＲＩ、ＳＰＥＣＴやＰＥＴ等での得られた情報を基に、認知症、特に神経変性疾患としての認知症を診断する。従って、本発明の認知症治療剤又は予防剤は医師が認知症として診断した患者に投与され、前記の神経変性疾患における診断の項目の１以上において、投与前と比較して改善する効果、又は病状が進行する程度を投与によって抑制又は投与前の状態に維持又は回復させる効果を有するものである。
【００６５】
本発明の認知症治療剤又は予防剤が投与される患者としては、認知症の患者である、その中でもタウオパチーの患者であって、その中でもアルツハイマー病（ＡＤ）、皮質基底核変性症（ＣＢＤ又はＣＢＳ）、進行性核上性麻痺、ピック病、嗜銀顆粒性認知症（嗜銀性顆粒病）、認知症を伴う多系統タウオパチー（ＭＳＴＤ）、１７番染色体に連鎖するパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ−１７）、神経原線維変化型認知症、石灰沈着を伴うび慢性神経原線維変化病（ＤＮＴＣ）、球状グリア封入体を伴う白質タウオパチー（ＷＭＴ−ＧＧＩ）タウ陽性封入体を伴う前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ−ｔａｕ）、エコノモ脳炎後遺症、亜急性硬化性全脳症や拳闘家脳症のうちのいずれかの患者である。従って、本発明の認知症治療剤はタウオパチー治療剤又は予防剤でもあり、別の観点ではアルツハイマー病（ＡＤ）、皮質基底核変性症（ＣＢＤ又はＣＢＳ）、進行性核上性麻痺、ピック病、嗜銀顆粒性認知症（嗜銀性顆粒病）、認知症を伴う多系統タウオパチー（ＭＳＴＤ）、１７番染色体に連鎖するパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ−１７）、神経原線維変化型認知症、石灰沈着を伴うび慢性神経原線維変化病（ＤＮＴＣ）、球状グリア封入体を伴う白質タウオパチー（ＷＭＴ−ＧＧＩ）タウ陽性封入体を伴う前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ−ｔａｕ）、エコノモ脳炎後遺症、亜急性硬化性全脳症や拳闘家脳症等の治療剤又は予防剤であるともいえる。
【００６６】
また、本発明の認知症治療剤又は予防剤は、非ヒト動物での認知機能を改善、又は認知機能の低下を抑制又は維持する効果を持つものであるともいえる。当該非ヒト動物としてヒトのタウを高い相同性を有するタウを発現する動物、チンパンジー、アカゲザル、ウマ、ブタ、イヌ、マウス、ウサギ、ラット、ネコ等が含まれるが、それに限定されるものではない。
【００６７】
本発明の認知症治療剤又は予防剤は、本発明のヒト化抗リン酸化タウ抗体の他に、医薬的に許容される担体及び／又はその他の添加剤を含有する、医薬組成物の形態として製剤化してもよい。医薬的に許容される担体及び／又はその他の添加剤を用いての製剤は、例えばUniversity of the Sciences in Philadelphia, “Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th EDITION”, Lippincott Williams & Wilkins, 2000に記載の方法で実施することが可能である。このような治療剤又は予防剤の一つの形態としては、無菌の水性液又は油性液に溶解、懸濁、又は乳化することによって調製された液剤あるいは凍結乾燥剤として供される。このような溶剤又は溶解液として、水性液としては注射用蒸留水、生理食塩水等が挙げられ、それに加えて浸透圧調節剤（例えば、Ｄ−グルコース、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウム等）が添加されたり、適当な溶解補助剤、例えばアルコール（例えばエタノール）、ポリアルコール（例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例えばポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油５０）等が併用される場合もある。また、溶剤又は溶解液としては油性液が用いられる場合もあり、該油性液の例としてはゴマ油、大豆油等があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等が併用される場合もある。このような製剤においては、適宜、緩衝剤（例えば、リン酸塩類緩衝剤、酢酸塩類緩衝剤）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカイン等）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコール等）、保存剤（例えば、アスコルビン酸、エリソルビン酸及びそれらの塩等）、着色剤（例えば、銅クロロフィル、β−カロチン、赤色２号、青色１号等）、防腐剤（例えばパラオキシ安息香酸エステル、フェノール、塩化ベンゼトニウム、塩化ベンザルコニウム等）、増粘剤（例えばヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース及びそれらの塩等）、安定化剤（例えば人血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール等）、矯臭剤（例えばメントール、柑橘香料等）の添加剤が用いられる場合がある。また別の治療剤又は予防剤の形態としては、散剤、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、坐剤、トローチ剤等の固形剤があげられる。経口用製剤の形で投与する固形剤の場合には、添加剤として、賦形剤（例えば、結晶性セルロース、ラクトース、デンプン等）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク等）、結合剤（ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、マクロゴール等）、崩壊剤（例えば、デンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム等）等が用いられる。また、必要に応じて、防腐剤（例えば、ベンジルアルコール、クロロブタノール、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸プロピル等）、抗酸化剤、着色剤、甘味剤等の添加剤を用いることができる。更に別の形態として、粘膜適用用治療剤又は予防剤もあげられ、この製剤においては粘膜への吸着性、滞留性等を付与することを主な目的として、添加剤として粘着剤、粘着増強剤、粘稠剤、粘稠化剤等（例えば、ムチン、カンテン、ゼラチン、ペクチン、カラギーナン、アルギン酸ナトリウム、ローカストビンガム、キサンタンガム、トラガントガム、アラビアゴム、キトサン、プルラン、ワキシースターチ、スクラルフェート、セルロース、及びその誘導体（例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリグリセリン脂肪酸エステル、アクリル酸（メタ）アクリル酸アルキル共重合体、又はその塩、ポリグリセリン脂肪酸エステル等）が含有される場合もある。しかしながら、生体に供与される治療剤又は予防剤の形態及び溶剤や添加剤はこれらに限定されるものではなく、当業者であれば適宜選択できる。
【００６８】
本発明の認知症治療剤又は予防剤は、本発明のヒト化抗リン酸化タウ抗体の他に、既存の認知症治療又は予防の効果を有する他の薬物、特に認知症の進展を抑制する効果を有する薬物を含んでいてもよい。また、本発明のヒト化抗リン酸化タウ抗体を含む本発明の認知症治療剤又は予防剤を、既存の認知症治療又は予防の効果を有する他の薬物、特に認知症の進展を抑制する効果を有する薬物を含有する治療剤又は予防剤と組み合わせ、キットの形態としてもよい。認知症の進展を抑制する物質としては、たとえばドネペジル（Donepezil）、ガランタミン（Galantamine）、メマンチン（Memantine）やリバスチグミン（Rivastigmine）などが挙げられるがこれに限定されるものではない。配合される認知症の進展を抑制する効果を有する物質や認知症の進展を抑制する効果を有する物質を含有する治療剤又は予防剤の用量としては、通常の治療に用いられる用量で行うことができるが、状況に応じて増減することも可能である。
【００６９】
なお、本発明者等は、前記国際公開第２０１３／１８０２３８号（特許文献４）において、腹腔内投与という末梢からの投与によっても脳血管関門を通過して脳で作用して薬効を示すことを、実験結果により証明しているが、本発明の認知症治療剤又は予防剤に含まれる本発明のヒト化抗リン酸化タウ抗体を脳組織に効率的に供給するための製剤も作製可能であり、そのような製剤も本発明の認知症治療剤又は予防剤に含まれる。抗体やペプチドなどを効率的に脳組織に脳血管関門を通過させて供給する方法としては、ターゲッティング用の物質を付加する方法や、リポソームやナノパーティクル内に封入する方法などが知られている。ターゲッティングのための物質としては、抗体と結合させることによって全体又は部分的な電荷的特性を変化させるものを用いたり、特異的な受容体やトランスポーターなどと結合する特性を有するペプチドやタンパク質又は化合物を用いることが可能である。特異的な受容体や膜たんぱく質などと結合する特性を有するペプチドやタンパク質又は化合物の例としては、受容体のリガンドや膜たんぱく質に結合するリガンドやその類縁体、受容体のリガンドや膜たんぱく質に結合する抗体、アゴニスト化合物／アンタゴニスト化合物／アロステリックモジュレーターやそれらの類縁化合物などが挙げられる。特異的な受容体やトランスポーターなどと結合する特性を有するペプチドやタンパク質又は化合物の標的となる受容体のリガンドや膜たんぱく質の例としては、トランスフェリン受容体（transferrin receptor：ＴｆＲ）、インスリン受容体（insulin receptor：ＩＲ）、インスリン様成長因子受容体（Insulin-like growth factor receptor：ＩＧＦＲ）、低密度リポタンパク質（low density lipoprotein：ＬＤＬ）受容体関連タンパク質（LDL-receptor related protein：ＬＲＰ）やジフテリア毒素受容体（heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor：ＨＢ−ＥＧＦ）などが挙げられるが、これに限定されるものではない（Jones et al., Pharmaceutical Research, 2007, Vol.24, No.9, pp.1759-1771）。ターゲティングのための物質は本発明の認知症治療剤又は予防剤に用いる抗体に化学的に付加することが可能であり、その方法としては、公知の方法、たとえばHermanson et al., “Bio conjugate techniques”, (米), Academic Press, 1996に記載の方法を参照して当業者であれば適宜行うことができる。また、ターゲッティングのための物質は、抗体やペプチドを包含させるリポソームやナノパーティクルに結合させてもよい（Bhaskar et al., Particle and Fibre Toxicology, 2010, 7:3）。更に、ターゲッティングのための物質がペプチドやタンパク質である場合には、ペプチド化学合成による融合ペプチドとして製造したり、ペプチドやタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸を、使用する抗体やペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸と組み合わせたりすることによって、当業者であれば適宜融合タンパク質として遺伝子工学的な技術を用いて製造することが可能である。
【００７０】
本発明における治療剤又は予防剤は、症状の改善を目的として、経口又は非経口的に投与することができる。経口投与の場合には、顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、液剤、シロップ剤、乳剤又は懸濁剤、エリキシル剤等の剤型を選択することができる。非経口投与の場合には、例えば経鼻剤とすることができ、液剤、縣濁剤、固形製剤等を選択できる。また別の非経口投与の形態としては、注射剤とすることができ、注射剤としては、皮下注射剤、静脈注射剤、点滴注射剤、筋肉注射剤、脳室内注射剤又は腹腔内注射剤等を選択することができる。またその他の非経口投与に用いる製剤としては、坐剤、舌下剤、経皮剤、経鼻剤以外の経粘膜投与剤等も挙げられる。更に、ステントや血管内栓塞剤に含有もしくは塗布する態様で、血管内局所投与することもできる。
【００７１】
本発明における治療剤又は予防剤の投与量は、患者の年齢、性別、体重、症状、治療効果、投与方法、処理時間、又は該医薬組成物に含有される活性成分の種類等により異なるが、通常成人１人あたり、１回につき主剤を０．１ｍｇから１ｇの範囲で、好ましくは０．５ｍｇから２００ｍｇの範囲で投与することができる。しかし、投与量は種々の条件により変動するため、前記投与量よりも少ない量で充分な場合もあり、また前記の範囲を超える投与量が必要な場合もある。また、本発明における治療剤又は予防剤は、短い投与期間で効果を得ることが可能である。
【００７２】
［認知症のモデル動物］
本発明の認知症治療剤又は予防剤を研究するための動物としては、認知症のモデル動物が挙げられ、その中でも特にタウオパチーのモデル動物が挙げられる。また、タウオパチーの動物モデルとしては、正常型又は遺伝子変異型のタウを脳で発現する動物であり、特に認知機能の障害をおこす動物モデルである。このような正常型又は遺伝子変異型のタウを脳で発現する動物は遺伝子操作により作製することが可能であり、その代表的なものとしてはトランスジェニックマウス（Ｔｇマウス）が挙げられる。遺伝子変異型のタウを発現するＴｇマウス等の動物モデルは、遺伝的な家族性のタウオパチーのモデルとしては有用であるが、ヒトでの大多数をしめる孤発性のタウオパチーに対して治療剤又は予防剤の効果をみるためには正常型のタウを発現するＴｇマウスで効果を示すことが望ましい。そのような正常型のタウを発現するＴｇマウスとしては、本発明の製造例で作製しているマウスが最も適しているが、その他には神戸ら（Kambe et al., Neurobiology of Disease, 2011, Vol.42, No.3, pp.404-414）や木村ら（Kimura et al., The EMBO Journal, 2007, Vol.26, No.24, pp.5143-5152）が報告しているＴｇマウス等を用いることができる。しかしながら、神戸らのマウス及び木村らのマウスにおいては、認知機能障害が認められるのが、それぞれ１４ヶ月齢及び２０ヶ月齢以降であることから、かなり老齢になってからの発症となり、加齢による影響も含んでいる可能性や、長期飼育による影響や手間の問題がある。それに対して、本発明の製造例で作製しているマウスは、ヒトの正常型のタウを発現し、６ヶ月齢程度と比較的早期に認知機能障害を発症するマウスであることから、加齢などの要因を排除できる認知症モデルとして最も適したものであり、このようなモデルを用いることでより明確に認知機能の改善効果を有する認知症治療剤又は予防剤を評価することが可能である。
【００７３】
動物モデルで本発明の認知症治療剤又は予防剤の作用を調べる方法としては、記憶学習試験等の認知機能を試験する方法が望ましい。そのような方法としては、Morris水迷路試験、ステップスルー型学習試験、新奇物質認識試験等の方法を用いることが可能であるが、行動量や動物の不安等の条件を裏付けるためにOpen Field Test 等の行動測定試験の方法を組み合わせるのが望ましい。
【００７４】
また、本発明の認知症治療剤又は予防剤の作用を調べる方法としては、認知症のモデル動物に投与した際に、脳組織におけるタウタンパク質又はリン酸化タウの増減を調べる方法も用いることができる。ＡＤや他の神経変性疾患において、タウタンパク質の発現量や異常リン酸化タウの増加が病態と関連しているといわれている（Khalid Iqbal et al., Curr. Alzheimer Res., 2010, Vol.7, pp.654-664）。そして、幾つかの病態モデル動物においてタウの発現や異常リン酸化タウの量を低減することによって、認知機能や運動機能に改善がみられることも公知である（K. SantaCruz et al., Science, 2005, Vol.309, No.5733, pp.476-481；Sylvie Le Corre et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2006, Vol.103, pp.9673-9678）。タウタンパク質又はリン酸化タウの増減を調べる方法としては、実施例に記載されていように脳組織のホモジネートを用いてウエスタンブロティングなどの方法で実施できるが、その他ＥＬＩＳＡ法（Xiyun Chai et al., The Journal of Biological Chemistry, 2011, Vol.286, No.39, pp.34457-34467）や組織免疫化学法（David J. Irwin et al., BRAIN, 2012, Vol.135, No. 3, pp.807-818）など、当業者であれば適宜方法を選択して実施することが可能である。
【００７５】
本発明での認知症治療剤又は予防剤のモデル動物での効果は、ヒト等での治療剤又は予防剤の開発における薬理効果のデータとして用いられる。
【実施例】
【００７６】
次に、本発明を具体的な実施例に則して説明するが、本発明はこれらの実施例にも何ら限定されるものではない。
【００７７】
［１］実施例１：抗体の作製
（１ａ）マウス抗体（親抗体）：
キメラ抗体及びヒト化抗体の親抗体として、マウス抗体であるＴａ１５０５を用いた。マウス抗体Ｔａ１５０５の詳細は、国際公開第２０１３／１８０２３８号の実施例に記載されている。マウス抗体Ｔａ１５０５の軽鎖（Ｌ鎖）のアミノ酸配列を配列番号４４に、それをコードする塩基配列を配列番号４５に示す。また、マウス抗体Ｔａ１５０５の重鎖（Ｈ鎖）のアミノ酸配列を配列番号４６に、それをコードする塩基配列を配列番号４７に示す。
【００７８】
（１ｂ）キメラ抗体：
キメラ抗体は、マウス抗体Ｔａ１５０５の軽鎖（Ｌ鎖）及び重鎖（Ｈ鎖）の各可変領域と、ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｇ１（κ）のＬ鎖及びＨ鎖の各定常領域とを組み合わせて作製した。キメラ抗体の軽鎖（Ｌ鎖）のアミノ酸配列を配列番号４８に、それをコードする塩基配列を配列番号４９に示す。また、キメラ抗体の重鎖（Ｈ鎖）のアミノ酸配列を配列番号５０に、それをコードする塩基配列を配列番号５１に示す。なお、本明細書ではキメラ抗体を「キメラ抗体」又は「Ｔａ１５０５キメラ抗体」と表現する。
【００７９】
（１ｃ）ヒト化抗体：
（１ｃ−１）ＶＬ及びＶＨの設計：
ヒト生殖系列上のホモロジーの高い１次配列を選定し、相補性決定領域（complementarity determining region：ＣＤＲ）グラフティングによってヒト化を行うことにより、種々のヒト化抗体を設計した。
【００８０】
具体的には、まず、相同性の高いヒトフレームワークをデータベース上から選定し、マウス抗体Ｔａ１５０５のＣＤＲ領域を挿入し、更に免疫原性を軽減するためのアミノ酸置換や活性を維持するためのアミノ酸置換を行い、種々の軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列を設計した。設計されたＶＬ及びＶＨの各アミノ酸配列に対応する配列番号、並びにこれらをコードする遺伝子の各塩基配列に対応する配列番号を、ＶＬについては下記の表２Ａに、ＶＨについては下記の表２Ｂにそれぞれ示す。また、これらのＶＬ及びＶＨのアミノ酸配列のアラインメントを、それぞれ図２Ａ及び図２Ｂに示す。
【００８１】
【表２Ａ】
2018139530.tif 000004
【表２Ｂ】
2018139530.tif 000005
【００８２】
（１ｃ−２）免疫原性スコアに基づくＶＬ及びＶＨの組合せの選択：
上記手順により設計されたＶＬ及びＶＨを適宜組み合わせ、インビトロアッセイソフトウェアEpibase（Lonza社）により免疫原性スコア（ＤＲＢ１スコア）を算出した。その結果、免疫原性スコア（ＤＲＢ１スコア）が所定値（１５００）以下である低免疫原性の組合せの中から、その後の実験に供するＶＬ及びＶＨの組合せを選択した。選択されたＶＬ及びＶＨの組合せを下記の表３Ａに、それらの組合せに基づく免疫原性スコア（ＤＲＢ１スコア）を表３Ｂにそれぞれ示す。
【００８３】
【表３Ａ】
2018139530.tif 000006
【表３Ｂ】
2018139530.tif 000007
【００８４】
（１ｃ−３）ヒト化抗体の発現培養及び精製：
上記手順により選択されたＶＬ及びＶＨの各組み合わせについて、各アミノ酸配列をコードする遺伝子を、ＶＬ遺伝子についてはヒト免疫グロブリンKappa型Ｌ鎖定常領域（ＣＬ）遺伝子（アミノ酸配列を配列番号５２に、塩基配列を配列番号５３にそれぞれ示す。）に、ＶＨ遺伝子についてはヒト免疫グロブリンGamma 1型Ｈ鎖定常領域（ＣＨ）遺伝子（アミノ酸配列を配列番号５４に、塩基配列を配列番号５５にそれぞれ示す。）に、それぞれ結合部での変異や欠損が起こらないようインフレーム（in frame）で結合した。また、ＶＬ遺伝子及びＶＨ遺伝子の５’側には、それぞれヒト免疫グロブリンKappa型Ｌ鎖遺伝子に由来するシグナル配列（アミノ酸配列を配列番号５６に、塩基配列を配列番号５７にそれぞれ示す。）及びヒト免疫グロブリンGamma 1型Ｈ鎖遺伝子に由来するシグナル配列（アミノ酸配列を配列番号５８に、塩基配列を配列番号５９にそれぞれ示す。）を、それぞれ結合部での変異や欠損が起こらないようインフレームで結合した。
【００８５】
以上の手順で設計されたシグナル配列付Ｌ鎖及びＨ鎖をコードする核酸構築物を、それぞれ動物細胞発現用の発現ベクターに組込み、ＥｘｐｉＣＨＯ（サーモフィッシャー・サイエンティフィック(株)製）を用いて、標準プロトコールに従って培養し、抗体を発現させた。培養物を遠心分離により清澄化し、得られた培養上清からProtein Aアフィニティーカラムを用いて、ヒト化抗体を精製した。ｐＨ２．８〜３．５の酸性溶液で溶出して得られた画分を速やかに中和し、これを濃縮したものをゲル濾過カラムにかけ、凝集物を取り除くとともにリン酸緩衝生理食塩水（Phosphate Buffered Saline：ＰＢＳ）にバッファー交換し、主フラクションを回収した。これを溶媒により適当な濃度に調整して、以下の各試験に用いた。
【００８６】
なお、以下の記載では、上記手順により作製された各ヒト化抗体を、そのＶＬ及びＶＨの組合せにより略称する場合がある。例えば、ＶＬとしてＬ１５を、ＶＨとしてＨ１１を用いて作製されたヒト化抗体は、Ｌ１５Ｈ１１と略称される。
また、以下の試験では特に断りのない限り、抗体の濃度調整用の溶媒としては３％ＢＳＡ／ＰＢＳを用いた。
【００８７】
［２］実施例２：抗原ペプチド結合性のＥＬＩＳＡ解析
（２ａ）抗原ペプチドへの結合性のＥＬＩＳＡ解析：
上記の表３Ａに示すＶＬ及びＶＨの組合せを有するヒト化抗体の一部を対象として、抗原ペプチドへの結合性を酵素結合免疫吸着法（enzyme-linked immunosorbent assay：ＥＬＩＳＡ）により解析した。
【００８８】
非リン酸化タウペプチドＰＤ１７（Ｓ４１３）、及び、そのＳｅｒ４１３がリン酸化されたリン酸化タウペプチドＰＤ１７Ｐ（ｐＳ４１３）を、冷却したＰＢＳで１μｇ／ｍＬに希釈後、プレートに５０μＬ／ウェルで分注し、４℃で一晩静置した。溶液を除去後、ブロッキングバッファー（３％ウシ血清アルブミン（Bovine Serum Albumin：ＢＳＡ）−ＰＢＳ）を２７０μＬ／ウェルで分注し、４℃で一晩静置した。溶液を除去後、３％ＢＳＡ−ＰＢＳで段階希釈した抗体を５０μＬ／ウェルとなるように加え、室温で９０分間反応させた。なお、非リン酸化タウペプチドＰＤ１７（Ｓ４１３）のアミノ酸配列を配列番号６０に、リン酸化タウペプチドＰＤ１７Ｐ（ｐＳ４１３）のアミノ酸配列を配列番号８にそれぞれ示す。
【００８９】
０．０５％−Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（Tris Buffered Saline with Tween20：ＴＢＳ−Ｔ）で洗浄後、ヤギ抗ヒトＩｇＧ−アルカリホスファターゼ標識（Sigma社製）を、希釈バッファー（３％ＢＳＡ−ＰＢＳ）で２，０００倍希釈したものを、５０μＬ／ウェルで加え、室温で６０分間反応させた。ＴＢＳ−Ｔで洗浄後、発色液（１ｍｇ／ｍＬ ｐＮＰＰ溶液）を１００μＬ／ウェル加え、４０分間発色させ、測定波長４０５ｎｍでの吸光度（光学密度；optical density：ＯＤ値）を測定した。
【００９０】
反応性は、０．２５ｎＭにおけるキメラ抗体のＯＤ値を１として、各抗体のＯＤ値の比を求め、その比を３段階に分けて評価した。
＋：反応性有り（ＯＤ比 ≧ ０．６）
±：若干の反応性を認めるが非常に弱い（０．１５ ＜ ＯＤ比 ＜ ０．６）
−：反応性無し（ＯＤ比 ≦ ０．１５）
【００９１】
リン酸化タウペプチドＰＤ１７Ｐに対する各抗体の反応性の評価結果を以下の表４Ａに、非リン酸化タウペプチドＰＤ１７に対する各抗体の反応性の評価結果を以下の表４Ｂにそれぞれ示す。何れのヒト化抗体も、キメラ抗体と比較して、リン酸化タウペプチドＰＤ１７Ｐに対しては優れた反応性を有するのに対し、非リン酸化タウペプチドＰＤ１７に対しては反応性が低く、リン酸化タウペプチドに対して選択的な反応性を有していることが分かる。
【００９２】
【表４Ａ】
2018139530.tif 000008
【表４Ｂ】
2018139530.tif 000009
【００９３】
（２ｂ）リン酸化タウペプチドへの選択的結合性のＥＬＩＳＡ解析：
上記の表３Ａに示すＶＬ及びＶＨの組合せを有するヒト化抗体の一部を対象として、また、参照抗体としてＴａ１５０５キメラ抗体を用いて、抗ヒト化タウ抗体のリン酸化タウペプチドへの選択的結合性のＥＬＩＳＡによる解析を行った。
【００９４】
前述の非リン酸化ペプチドＰＤ１７又はリン酸化ペプチドＰＤ１７Ｐを濃度１μｇ／ｍＬで含む溶液を用い、プレートに５０μＬ／ウェルで分注し、４℃で一晩静置した。溶液を除去後、ブロッキングバッファー（３％ウシ血清アルブミン（Bovine Serum Albumin：ＢＳＡ）−ＰＢＳ）を２７０μＬ／ウェルで分注し、４℃で一晩静置し、非リン酸化ペプチドＰＤ１７又はリン酸化ペプチドＰＤ１７Ｐを各ウェルに固定化したプレートを作製した。
【００９５】
各抗体を０．６μｇ／ｍＬ（４ｎＭ）の濃度から４倍ずつの連続希釈で５系列の濃度を調製し、各濃度の溶液を前記プレートの各ウェルに５０μＬ／ウェルとなるように添加し、室温で１時間反応させた。洗浄操作を行った後、各ウェルに対して、ヤギ抗ヒトＩｇＧ−アルカリホスファターゼ標識（Sigma社製）を２０００倍希釈したものを５０μＬ／ウェルとなるように添加し、更に１時間反応させた。
【００９６】
洗浄操作後、１ｍｇ／ｍＬに調製したｐ−ニトロフェニルホスフェート（p-Nitrophenylphosphate：ｐＮＰＰ）溶液を各ウェルに１００μＬ／ウェルとなるように添加して２０分間反応させ、測定波長４０５ｎｍでの吸光度ＯＤを測定した。
【００９７】
得られた各抗体の各濃度における吸光度ＯＤのデータから、SoftMax ProソフトウェアVer.6.5（モレキュラーデバイス社）を用いた解析により下記Ａ〜Ｄの数値を求めた後、下記式に示す４パラメーターロジスティック回帰曲線で解析した。
【数１】
2018139530.tif 000010
式中、
ｘ：抗体の濃度、
ｙ：吸光度（ＯＤ値）
を表す。
【００９８】
非リン酸化ペプチドＰＤ１７の濃度１ｎＭにおける吸光度ＯＤ値を上記式に入力し、そのＯＤ値に対応する各抗体の濃度ｘを算出した。ＰＤ１７の濃度は１ｎＭであるから、各抗体のＰＤ１７への結合性に対するリン酸化タウペプチドＰＤ１７Ｐへの結合性の倍率を１／ｘで算出し、リン酸化タウペプチドへの選択的結合性の指標とした。
【００９９】
得られた結果を図３のグラフに示す。非リン酸化ペプチドＰＤ１７に対するリン酸化タウペプチドＰＤ１７Ｐへの選択的結合性は、Ｔａ１５０５キメラ抗体が３０倍であったのに対し、ヒト化抗体では４０倍〜２１０倍もの高い選択性が得られており、リン酸化ペプチドに対する特異的な結合性が達成されていることが分かる。
【０１００】
（２ｃ）リン酸化タウペプチドを用いたＳｅｒ４１３リン酸化部位への選択的結合性のＥＬＩＳＡ解析：
上記表３Ａに示すＶＬおよびＶＨの組合せを有するヒト化抗体を対象として、タウタンパク質の主要なリン酸化部位のうち、Ｓｅｒ４１３リン酸化部位に選択的に結合するかを、種々のリン酸化ペプチドを用いたＥＬＩＳＡにより解析した。
【０１０１】
用いたリン酸化ペプチドは下記表５に示す１２種類で、「エピトープ」と示した欄に、４Ｒ２Ｎ型タウタンパク質においてどの部位がリン酸化されているかを表す（例えば、ペプチド番号１で「ｐＳ４６」と記載されているのは、Ｓｅｒ４６の部位がリン化されたエピトープであることを示す。また、複数併記されているものは、２又は３か所がリン酸化されたペプチドを示す。）。但し、ペプチド番号１２は、Ｓｅｒ４１３部位を含むエピトープのペプチドであるが、リン酸化されていないペプチド（ＰＤ１７）である。
【０１０２】
【表５】
2018139530.tif 000011
【０１０３】
上記表５にペプチド番号１〜１２として示した１２種類のペプチド、又は、そのペプチドをウシ血清アルブミン（Bovine Serum Albumin：ＢＳＡ）もしくはキーホールリンペットヘモシニアン（Keyhole Limpet Hemocyanin：ＫＬＨ）に結合させたコンジュゲートを、４℃に冷却したＰＢＳで１μｇ／ｍＬに希釈後、プレートに５０μＬ／ウェルで分注し、４℃で一晩静置した。溶液を除去後、ブロッキングバッファー（３%ＢＳＡ−ＰＢＳ）を２７０μＬ／ウェルで分注し、４℃で一晩静置した。溶液を除去後、精製抗体を３％ＢＳＡ/ＰＢＳで希釈し、１５０ｎｇ／ｍＬに調製したものを５０μＬ／ウェルで加え、室温で９０分間反応させた。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ−Ｔ）で洗浄後、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−アルカリホスファターゼ標識（Ｓｉｇｍａ社製）を、希釈緩衝液（３％ＢＳＡ−ＰＢＳ）で２，０００倍希釈したものを、５０μＬ／ウェルで加え、室温で６０分間反応させた。ＴＢＳ−Ｔで洗浄後、発色液（１ｍｇ／ｍＬ ｐＮＰＰ溶液）を１００μＬ／ウェル加え、４０分間発色させ、測定波長４０５ｎｍ、参照波長５５０ｎｍで吸光度（ＯＤ値）を測定した。
【０１０４】
反応性は、以下の３段階に分けて評価した。
＋：反応性有り（ＯＤ値≧１．０）
±：若干の反応性を認めるが非常に弱い（０．５≦ＯＤ値＜１．０）
−：反応性無し（ＯＤ値＜０．５）
【０１０５】
結果を下記表６に示す。何れのヒト化抗体も、ペプチド番号９（ｐＳ４１２／ｐＳ４１３：ＰＲＨＬＳＮＶ（ｐＳ）（ｐＳ）ＴＧＳＩＤＭＶＤ）、ペプチド番号１０（ｐＳ４１３：ＰＲＨＬＳＮＶＳ（ｐＳ）ＴＧＳＩＤＭＶＤ）、及びペプチド番号１１（ｐＳ４０９/ｐＳ４１２/ｐＳ４１３：ＰＲＨＬ（ｐＳ）ＮＶ（ｐＳ）（ｐＳ）ＴＧＳＩＤＭＶＤ）のみに強い結合性を示し、タウタンパク質のＳｅｒ４１３に相当する部位がリン酸化されていない他のペプチドには結合しなかった。また、キメラ（Ｔａ１５０５キメラ抗体）と比較して、その結合のパターン及び強度はほぼ同等であった。このことから、得られたヒト化抗体は、Ｓｅｒ４１３の部位がリン酸化されたタウタンパク質に特異的な結合性を有することがわかる。
【０１０６】
【表６】
2018139530.tif 000012
【０１０７】
［３］実施例３：抗原タンパク質結合性のＥＬＩＳＡ解析
上記の表３Ａに示すＶＬ及びＶＨの組合せを有するヒト化抗体の一部を対象として、抗原タンパク質への結合性をＥＬＩＳＡにより解析した。
【０１０８】
リン酸化タウタンパク質ｐＴａｕを得るために、バキュロウイルス系を使用して、昆虫細胞においてタウタンパク質４Ｒ２Ｎを発現させた。また、過リン酸化タウタンパク質ｈｐＴａｕを取得するために、タウタンパク質とＧＳＫ３βとを同時に発現し得る組換えバキュロウイルスを作製した。
【０１０９】
組換えバキュロウイルスの作製にあたっては、ｐＦａｓｔＢａｃ１及びｐＦａｓｔＢａｃ Ｄｕａｌベクターを使用した。リン酸化タウタンパク質ｐＴａｕに関しては、Ｃ末端にＨｉｓタグを融合したタウタンパク質４Ｒ２ＮをコードするｃＤＮＡをｐＦａｓｔＢａｃ１に挿入し、過リン酸化タウタンパク質ｈｐＴａｕに関しては、Ｃ末端にＨｉｓタグを融合したタウタンパク質４Ｒ２ＮをコードするｃＤＮＡとＧＳＫ３βをコードするｃＤＮＡをｐＦａｓｔＢａｃ Ｄｕａｌに挿入した。Ｈｉｓタグ融合タウタンパク質４Ｒ２Ｎのアミノ酸配列及びその塩基配列をそれぞれ配列番号７０及び７１に、ＧＳＫ３βのアミノ酸配列及びその塩基配列をそれぞれ配列番号７２及び７３に示す。
【０１１０】
得られたベクターを、リポフェクションによりＳｆ９細胞株に導入し、培養を行うことで組換えバキュロウイルスを得た。得られた組換えバキュロウイルスをＳｆ９細胞株あるいはＴｎ５細胞株に感染させて、リン酸化タウタンパク質（ｐＴａｕ）及び過リン酸化タウタンパク質（ｈｐＴａｕ）を発現させた。
【０１１１】
前記の発現させた細胞を回収して、超音波破砕と遠心分離により細胞ライセートを取得した。得られた細胞ライセートをＮｉ−ＮＴＡカラムに添加して、タウタンパク質の精製を行った。精製されたタウタンパク質の濃度は、ビシンコニン酸（Bicinchoninic acid：ＢＣＡ）アッセイにより、ウシ血清アルブミン（bovine serum albumin：ＢＳＡ）を標準物質として用いて決定した。
【０１１２】
得られた過リン酸化タウタンパク質（ｈｐＴａｕ）及びリン酸化タウタンパク質（ｐＴａｕ）を、冷却したＰＢＳで１μｇ／ｍＬに希釈後、プレートに５０μＬ／ウェルで分注し、４℃で一晩静置した。溶液を除去後、ブロッキングバッファー（３％ＢＳＡ−ＰＢＳ）を２７０μＬ／ウェルで分注し、４℃で一晩静置した。溶液を除去後、３％ＢＳＡ−ＰＢＳで段階希釈した抗体を５０μＬ／ウェルで加え、室温で９０分間反応させた。
【０１１３】
０．０５％−Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ−Ｔ）で洗浄後、ヤギ抗ヒトＩｇＧ−アルカリホスファターゼ標識（Sigma社製）を、希釈バッファー（３％ＢＳＡ−ＰＢＳ）で２，０００倍希釈したものを、５０μＬ／ウェルで加え、室温で６０分間反応させた。ＴＢＳ−Ｔで洗浄後、発色液（１ｍｇ／ｍＬ ｐＮＰＰ溶液）を１００μＬ／ウェル加え、４０分間発色させ、測定波長４０５ｎｍでの吸光度（ＯＤ値）を測定した。
【０１１４】
反応性は、濃度０．２５ｎＭにおけるキメラ抗体のＯＤ値を１として、各抗体のＯＤ値の比を求め、その比を３段階に分けて評価した。
＋：反応性有り（ＯＤ比 ≧ ０．６）
±：若干の反応性を認めるが非常に弱い（０．１５＜ ＯＤ比 ＜ ０．６）
−：反応性無し（ＯＤ比 ≦ ０．１５）
【０１１５】
過リン酸化タウタンパク質ｈｐＴａｕに対するヒト化抗体の反応性の評価結果を以下の表７Ａに、リン酸化タウタンパク質ｐＴａｕに対するヒト化抗体の反応性の評価結果を以下の表７Ｂにそれぞれ示す。何れのヒト化抗体も、キメラ抗体と比較して、過リン酸化タウタンパク質ｈｐＴａｕ及びリン酸化タウタンパク質ｐＴａｕの双方に対し、優れた反応性を有することが分かる。
【０１１６】
【表７Ａ】
2018139530.tif 000013
【表７Ｂ】
2018139530.tif 000014
【０１１７】
［４］実施例４：ＳＰＲによる結合性解析
上記の表３Ａに示すＶＬ及びＶＨの組合せを有するヒト化抗体の一部を対象として、また、参照抗体としてＴａ１５０５キメラ抗体を用いて、表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance：ＳＰＲ）による結合性解析を実施した。
【０１１８】
抗原タンパク質として、過リン酸化されたタウタンパク質４Ｒ２Ｎ（ｈｐＴａｕ：実施例３を参照）を使用し、陰性対照として、大腸菌で製造されたリン酸化されていないタウタンパク質（Ｔａｕ；Ｈｉｓタグ融合非リン酸化タウタンパク質４Ｒ０Ｎ：ATGen Co. Ltd.; Cat. No.: ATGP0795）を使用した。また、抗原ペプチドとして、下記表８に記載されたアミノ酸配列を有する、Ｓｅｒ４１３がリン酸化された一リン酸化タウペプチド（１×Ｐ）、並びに、Ｓｅｒ４１３に加えてＳｅｒ４０９及びＳｅｒ４１２が更にリン酸化された三リン酸化タウペプチド（３×Ｐ）を使用し、陰性対照ペプチドとして、下記表８に記載されたアミノ酸配列を有する、非リン酸化タウペプチド（Ｎｏｎ Ｐ）を用いた。Ｈｉｓタグ融合非リン酸化タウタンパク質４Ｒ０Ｎのアミノ酸配列を配列番号７４に示す。また、一リン酸化タウペプチド１×Ｐのアミノ酸配列を配列番号７５に、三リン酸化タウペプチド３×Ｐのアミノ酸配列を配列番号７６に、非リン酸化タウペプチドＮｏｎ Ｐのアミノ酸配列を配列番号７７にそれぞれ示す。
【０１１９】
【表８】
2018139530.tif 000015
【０１２０】
以上の過リン酸化タウタンパク質４Ｒ２Ｎ（ｈｐＴａｕ）、非リン酸化タウタンパク質４Ｒ０Ｎ、一リン酸化タウペプチド１×Ｐ、三リン酸化タウペプチド３×Ｐ、及び非リン酸化タウペプチドＮｏｎ Ｐと、各抗体との結合親和性を評価するために、ＳＰＲシステムBicoreT200（ＧＥヘルスケア・ジャパン(株)）及び各ビアコア製品を用い、取扱説明書に準拠し測定した。
【０１２１】
測定方法としては、ＮＴＡセンサーチップ（形成済みカルボキシメチルデキストラン層へニトリロ三酢酸（nitrilotriacetic acid：ＮＴＡ）を固定化済みの製品：code＃BR-1005-32）に、Ｈｉｓタグを融合させた前記の各タンパク質及び表８の各抗原ペプチドを、アミンカップリングキット（Amine Coupling Kit：ＧＥヘルスケア・ジャパン(株)、code＃BR-1006-33）を用いたアミンカップリング反応による共有結合により固定化し、固定化された各タンパク質及びペプチドに対する抗体の結合動態を測定する方法を用いた。
【０１２２】
Ｈｉｓタグ融合ｈｐＴａｕ及びＴａｕタンパク質のセンサーチップへの固定化は、固定化反応溶液としてＨＢＳ−Ｎ緩衝液（code＃: BR-1003-69）を用い、ＮＴＡセンサーチップへ塩化ニッケル溶液を反応させ、ＮＴＡにＮｉを結合させた。次に、センサーチップをＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸（1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Hydrochloride：ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（N-Hydroxysuccinimide：ＮＨＳ）の混合溶液により活性化させた。次に、ＨＥＰＥＳ（4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid）系緩衝液（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．２）で濃度１００〜５００ｎｇ／ｍＬに調製した上記の各Ｈｉｓタグ融合タンパク質又はペプチドをセンサーチップへ添加し、Ｎｉ−ＮＴＡへの結合とセンサーチップ上への共有結合とを同時に実施した後、残った活性ＮＨＳをエタノールアミンでブロッキングし、更にＥＤＴＡ溶液でＮｉイオンを除去した（Ni-Affinity Amine Coupling：国際公開第２００５／０２２１５６号参照）。また、抗原ペプチド（１×Ｐ、３×Ｐ及びＮｏｎ Ｐ）のセンサーチップへの固定化は、ＮＴＡセンサーチップをＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）の混合溶液により活性化させ、次に抗原ペプチドを１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４〜４．５）により１〜１０ｕＭに希釈した溶液を反応させ、センサーチップに共有結合させた後、残った活性ＮＨＳをエタノールアミンでブロッキングした。斯かる手順により、前記の各タンパク質又はペプチドが各々固定化されたセンサーチップを作製した。
【０１２３】
これらのセンサーチップに対し、温度３７℃で、ＣＡＰＳ系緩衝液ｐＨ１０．５を反応させ、センサーチップ固定面を安定化させた後、特異結合反応溶液としてＨＥＰＥＳ系緩衝液（ｐＨ７．２）を用いて調製した各抗体を、０．２ｎＭ〜１ｎＭの濃度の間（概算結合解離定数［ＫＤ］近傍）で１５０秒間（同一評価内は一律）センサーチップ表面に反応させ、その結合動態を測定した。得られたデータを、ビアコア解析ソフト（Biacore T200 Evaluation Software, Version 3.0）を用いて解析した。
【０１２４】
得られた各抗体の結合動態について、非リン酸化タンパク質４Ｒ０Ｎのセンサーチップにより得られた結合動態を陰性対照として用い、抗原タンパク質４Ｒ２Ｎ（ｈｐＴａｕ）のセンサーチップにより得られた結合動態の結果から差し引いて補正した。また、非リン酸化ペプチドＮｏｎ Ｐのセンサーチップにより得られた結合動態を陰性対照として用い、抗原ペプチド１×Ｐ、３×Ｐのセンサーチップにより得られた結合動態の結果から差し引いて補正した。なお、測定濃度において、各抗体の非リン酸化タウタンパク質４Ｒ０Ｎ及び非リン酸化ペプチドＮｏｎ Ｐへの結合は認められなかった。
【０１２５】
各ヒト化抗体の、リン酸化タウタンパク質４Ｒ２Ｎ（ｈｐＴａｕ）への結合活性を下記の表９Ａに、一リン酸化タウペプチド１×Ｐ及び三リン酸化タウペプチド３×Ｐへの結合活性の結果を下記の表９Ｂにそれぞれ示す。各ヒト化抗体は、過リン酸化タウタンパク質ｈｐＴａｕ、一リン酸化タウペプチド１×Ｐ、三リン酸化タウペプチド３×Ｐの全てに対して、優れた結合活性を有することが分かる。
【０１２６】
【表９Ａ】
2018139530.tif 000016
【表９Ｂ】
2018139530.tif 000017
【０１２７】
［５］実施例５：ＡＤ患者脳ホモジェネート中のｐＳ４１３−Ｔａｕに対する結合性解析
上記の表３Ａに示すＶＬ及びＶＨの組合せを有するヒト化抗体のうち、Ｌ１５Ｈ１１、Ｌ４６Ｈ１１、及びＬ４７Ｈ６５を対象として、また、参照抗体としてマウス抗体Ｔａ１５０５及びキメラ抗体を用いて、液相中のアルツハイマー病（Alzheimer's disease：ＡＤ）患者臨床サンプル由来のＳｅｒ４１３リン酸化タウタンパク質（ｐＳ４１３−Ｔａｕ）に対するヒト化抗体の結合性を評価した。
【０１２８】
前記ヒト化抗体、マウス抗体及びキメラ抗体の各々を、ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（N-Hydroxysuccinimide-LC-Biotin）（サーモフィッシャーサイエンティフィック(株)）を用いてビオチン化し、ＰＢＳで透析した。
【０１２９】
ブラークステージ分類（Braak Stage）Ｖ／ＶＩのＡＤ患者脳の海馬の凍結組織１６０ｍｇを０．８ｍＬのＴＢＳ−Ｉ（Ｔｒｉｓ緩衝化食塩水、プロテアーゼ阻害剤カクテル、フォスファターゼ阻害剤カクテル）を加え、氷水中で超音波破砕を行った。超音波破砕液を３０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離を行い、上清を回収した。更に上清を１００，０００×ｇ、４℃で１５分間超遠心分離することにより、脳ホモジェネートを得た。Innotest pTau (pT181)キット（Fijirebio）を使用して、キットのビオチン化抗体（CONJ1としてキット添付）を、先に作製したビオチン化抗体に置き換え、Ｓｅｒ４１３リン酸化タウタンパク質（ｐＳ４１３−Ｔａｕ）のＥＬＩＳＡ系として使用した。
【０１３０】
先に作製したビオチン化抗体を各々０．１ｎＭの濃度に調製して、１，０００倍希釈した脳ホモジェネートと共に、ＨＴ７抗体の固定されたＭＴプレート（キット添付）に加えて混合し、４℃で終夜インキュベートした。翌日、プレートを洗浄して、ＨＲＰ標識ストレプトアビジン（CONJ2としてキット添付）を加え、１時間インキュベートした。洗浄後、発色試薬ＴＭＢを添加して、遮光して３０分間室温でインキュベートし、反応停止溶液（STOPソルーションとしてキット添付）で反応を停止し、波長４５０ｎｍで吸光度を測定した。
【０１３１】
結果を図４のグラフに示す。図４のグラフに示すように、ヒト化抗体Ｌ１５Ｈ１１、Ｌ４６Ｈ１１、及びＬ４７Ｈ６５は、いずれもＡＤ患者臨床サンプル由来のＳｅｒ４１３リン酸化タウタンパク質（ｐＳ４１３−Ｔａｕ）に対して、優れた結合性を示した。
【０１３２】
［６］実施例６：血中動態試験
上記の表３Ａに示すＶＬ及びＶＨの組合せを有するヒト化抗体のうち、Ｌ１５Ｈ１１、Ｌ４６Ｈ１１、及びＬ４７Ｈ６５を対象として、また、参照抗体としてＴａ１５０５キメラ抗体、並びにＡＤ治療の治験に用いられた経緯のあるヒト化抗体を特許情報あるいはデータベース情報に開示されているアミノ酸配列情報に基づき組換え発現により作製し使用し、血中動態試験を実施した。ソラネズマブ（Solanezumab／抗Ａβ抗体；Eli Lilly社）に関しては、ＩＭＧＴ（The international ImMunoGeneTics information system（登録商標） http://www.imgt.org）のデータベースを参照した。ＩＰＮ００７（抗Ｔａｕ−Ｎ末端部位抗体；Bristol-Myers Squibb/iPierian社）に関しては、ＷＯ２０１４／２００９２１Ａ１に開示されているＶＨ２Ｖｋ３のアミノ酸配列をＩＰＮ００７として使用した。ＭＡｂ３２２１（抗Ｔａｕ−ｐＳ４２２抗体；Roche社）に関しては、ＷＯ２０１５／０９１６５６Ａ１に開示されているＶＨ３２ＶＬ２１のアミノ酸配列を使用した。
【０１３３】
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊのオスマウス１１週齢（日本チャールスリバー社）に対して、前記の各抗体を各々１０ｍｇ／ｋｇの濃度で腹腔内へ投与し、１、３、８、２４時間、３日、７日後において採血を実施し、血漿を採取した。Ｎ数は３で実施した。
【０１３４】
血漿中の抗体濃度は、抗ヒトポリクローナル抗体を用い、サンドイッチＥＬＩＳＡにて測定した。具体的には、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）ポリクローナル抗体（Southern Biotech）の１μｇ／ｍＬのＰＢＳ溶液を、９６ウェルプレート（Max Sorp (NUNC)）に添加して終夜、４℃で固定した。更に、３％ＢＳＡ／ＰＢＳにてブロッキングを行い、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）ポリクローナル抗体固定プレートを作製した。
一方、抗体を投与しないマウス血漿を用い、各抗体を段階希釈して濃度既知の抗体の標準物質を調製し、この標準物質を測定に供して検量線の作成に利用した。
【０１３５】
測定対象となる血漿試料及び標準物質を、各々１０，０００倍に希釈してから、５０μＬ／ウェルでヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）ポリクローナル抗体固定プレートに添加した。室温で１時間３０分反応を行った後、ＴＢＳ−Ｔ（Ｔｒｉｓ緩衝化食塩水、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）にて洗浄した。次に、アルカリホスファターゼ標識抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ポリクローナル抗体（Southern Biotech）を３％ＢＳＡ／ＰＢＳにて２，０００倍希釈した溶液を５０μＬ／ウェルで添加し、室温で１時間反応させた。続いて、ＴＢＳ−Ｔで洗浄操作を行い、発色液（１ｍｇ／ｍＬ ｐＮＰＰ溶液）を１００μＬ／ウェルで添加して、室温で１時間インキュベーションした。その後、プレートリーダーにて測定波長４０５ｎｍ、参照波長５５０ｎｍの吸光度を測定した。標準物質の測定結果に基づいて検量線を作成し、この検量線を利用して、各血漿試料中の抗体濃度を算出した。
【０１３６】
得られた血漿中抗体濃度の経時変化を表すグラフを図５に示す。本グラフから明らかなように、ヒト化抗体Ｌ１５Ｈ１１、Ｌ４６Ｈ１１、及びＬ４７Ｈ６５は、Ｔａ１５０５キメラ抗体と同等の血中動態を示している。これらヒト化抗体Ｌ１５Ｈ１１、Ｌ４６Ｈ１１、及びＬ４７Ｈ６５の血中動態は、既存のヒト化抗体であるＩＰＮ００７及びＭＡｂ３２２１と比較しても遜色なく、同じく既存のヒト化抗体であるソラネズマブよりも遙かに優れている。
【０１３７】
［７］実施例７：脳内移行性の解析
前記のヒト化抗体Ｌ１５Ｈ１１、Ｌ４６Ｈ１１、及びＬ４７Ｈ６５を対象として、また、参照抗体としてＴａ１５０５キメラ抗体、並びにＡＤ治療の治験の経緯のある既存のヒト化抗体であるソラネズマブ、ＩＰＮ００７、及びＭＡｂ３２２１を用いて、脳内への移行性の解析を行った。
【０１３８】
実施例６の各抗体投与後１週間のマウスを採血した後、三種混合麻酔下にて開腹し、腹部大静脈より放血致死後に脳組織を採取した。採取後の脳組織は左右の脳半球に分けてドライアイスエタノールにて凍結し、−８０℃で保存した。凍結脳半球の重量を測定して、２ｍＬチューブに移し、０．８ｍＬのＴＢＳ−Ｉ（Ｔｒｉｓ緩衝化食塩水、プロテアーゼ阻害剤カクテル、フォスファターゼ阻害剤カクテル）を加え、氷水中で超音波破砕を行った。超音波破砕液を３，０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離することにより、上清を回収した。更に上清を１００，０００×ｇ、４℃で１５分間超遠心分離することにより、脳ホモジェネートを得た。
【０１３９】
脳ホモジェネート中の抗体濃度は、抗ヒトポリクローナル抗体を用い、抗原ＥＬＩＳＡにて測定した。具体的には、ｐＳ４１３ペプチド（ＰＤ１７Ｐ）の１０μｇ／ｍＬのＰＢＳ溶液を９６ウェルプレート（Max Sorp (NUNC)）に添加して終夜、４℃で固定した。更に３％ＢＳＡ／ＰＢＳにてブロッキングを行い、ＰＤ１７Ｐ固定プレートを作製した。
【０１４０】
一方、抗体を投与しないマウス脳ホモジェネートを用い、各抗体を段階希釈して濃度既知の抗体の標準物質を調製し、この標準物質を測定に供して検量線の作成に利用した。
【０１４１】
測定対象となる脳ホモジェネート及び標準物質を、各々０．１％脱脂乳−３％ＢＳＡ−ＰＢＳで１０倍希釈してから、５０μＬ／ウェルでＰＤ１７（Ｐ）固定プレートに添加した。室温で２時間反応を行った後、ＴＢＳ−Ｔ（ＴＢＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）にて洗浄した。次に、アルカリホスファターゼ標識抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ポリクローナル抗体（SIGMA社、Cat＃SAB3701337−１ｍｇ）を０．１％脱脂乳−３％ＢＳＡ−ＰＢＳで２，０００倍希釈した溶液を５０μＬ／ウェルで添加し、室温で１時間反応させた。続いて、ＴＢＳ−Ｔで洗浄操作を行い、発色基質としてｐＮＰＰ（SIGMA社、Cat＃: P7998−１００ｍＬ）を１００μＬ／ウェルで添加して、室温で１時間インキュベーションした。その後、プレートリーダーにて測定波長４０５ｎｍ、参照波長５５０ｎｍの吸光度を測定した。標準物質の測定結果に基づいて検量線を作成し、この検量線を利用して、各脳ホモジェネート試料中の抗体濃度を脳内抗体濃度として求めた。
【０１４２】
また、開腹前に採取された血液を用いて、実施例６と同様の手順で血漿中の抗体濃度を求め、血漿中抗体濃度に対する脳内抗体濃度の比を算出した。
【０１４３】
得られた血漿中抗体濃度に対する脳内抗体濃度の比を表すグラフを図６に示す。ヒト化抗体Ｌ１５Ｈ１１、Ｌ４６Ｈ１１、及びＬ４７Ｈ６５は、Ｔａ１５０５キメラ抗体や、既存のヒト化抗体であるＩＰＮ００７、ＭＡｂ３２２１、及びソラネズマブと比較して、血漿中抗体濃度に対する脳内抗体濃度の比が高く、脳内への移行性に優れていることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【０１４４】
本発明によれば、リン酸化タウに対して高い結合性を示すと共に、ヒトに対する抗原性が顕著に低減されたヒト化抗リン酸化タウ抗体が提供されることから、ヒトにおけるタウオパチー等の認知症の治療又は予防において、その利用価値は極めて高い。
【図１Ａ】
2018139530.tif 000018
【図１Ｂ】
2018139530.tif 000019
【図２Ａ】
2018139530.tif 000020
【図２Ｂ】
2018139530.tif 000021
【図３】
2018139530.tif 000022
【図４】
2018139530.tif 000023
【図５】
2018139530.tif 000024
【図６】
2018139530.tif 000025
【配列表】
2018139530000001.app