(57)【要約】【課題】海藻の糖化方法を提供し、さらに製造した糖からのアルコールの製造方法を提供し、増殖可能な有機資源である海藻の有効利用を図る。【解決手段】海藻の糖化方法は、フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）により海藻から還元糖を製造する方法である。また、海藻の糖化方法により得られる糖から、エンテロバクター（Enterobacter）属に含まれ、受託番号がNITE P-02290の菌株によりアルコールを製造し、海藻を有効に利用することができる。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）により、海藻から還元糖を製造する海藻の糖化方法。
【請求項２】
前記フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）は、受託番号がNITE P-02291の菌株である請求項１に記載の海藻の糖化方法。
【請求項３】
前記海藻は、緑藻類である請求項１又は２に記載の海藻の糖化方法。
【請求項４】
前記フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）を海藻に接種して培養し、
該海藻から前記フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）の酵素液を抽出し、
該酵素液により海藻から還元糖を製造する
請求項１〜３のいずれかに記載の海藻の糖化方法。
【請求項５】
酵素液により海藻から還元糖を製造する前に、前記酵素液と前記海藻とを滅菌する請求項４に記載の海藻の糖化方法。
【請求項６】
酵素液により海藻から還元糖を製造する工程は、ｐＨが、４以上であり、６以下である請求項４又は５に記載の海藻の糖化方法。
【請求項７】
酵素液により海藻から還元糖を製造する工程は、温度が、１５℃以上、５０℃以下である請求項４〜６のいずれかに記載の海藻の糖化方法。
【請求項８】
前記フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）を接種する海藻は、前記酵素液により還元糖を製造する海藻と同一の属に分類される請求項４〜７のいずれかに記載の海藻の糖化方法。
【請求項９】
前記フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）を海藻に接種して培養し、
菌を培養した海藻を粉砕し、
粉砕した海藻から、前記フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）の酵素液を抽出する
請求項４〜８のいずれかに記載の海藻の糖化方法。
【請求項１０】
酵素液により海藻から還元糖を製造する工程において、粉砕した海藻を使用する請求項４〜９のいずれかに記載の海藻の糖化方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載の海藻の糖化方法により得られる糖からアルコールを製造する方法であって、
エンテロバクター（Enterobacter）属に含まれ、受託番号がNITE P-02290の菌株によるアルコールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、海藻から還元糖を製造する海藻の糖化方法に関する。また、海藻の糖化方法により得られる糖を原料とするアルコールの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
寒天は、紅藻類の１種であるテングサ等に含まれる粘液質を乾燥して製造する多糖類である。寒天は、冷水に入れ、加熱した後、３８℃以下に保持すると、１％以下の濃度でもゲル化する。また、ゲル化すると、８５℃以上に加熱しないと溶けない性質があるため、口の中に入れても溶けない。また、寒天は、海洋性細菌と腸内細菌の一部を除き、消化し利用できる微生物はないとされ、１９世紀のロベルト・コッホ以来、微生物培養の培地の固化剤（ゲル化剤）として利用されている。したがって、テングサ等の紅藻類を再生可能な有機資源として有効利用するために、糖化方法等に関する新しい技術が必要である。
【０００３】
アオサは、緑藻類の１種であり、近年、国内外の沿岸部における海水の富栄養化により異常繁殖し、沿岸部に堆積して景観を悪化し、腐敗して悪臭を放ち、グリーンタイドと呼ばれ、環境問題になっている。アオサが異常繁殖する理由の１つは、高い増殖率にあり、アオサの１種であるミナミアオノリの日間成長率は１１２％であるため、１週間で２倍以上に成長する。したがって、アオサ等の緑藻類の有効な利用方法を確立することにより、環境問題を解消し、高い成長率に基づき有望な有機資源として利用する必要がある。
【０００４】
緑藻類の利用に関しては、たとえば海洋性細菌によるアオサの分解に関する研究が知られている（非特許文献１参照）。アオサの細胞壁には、Ulvanと呼ばれる多糖類が含まれ、含有量は乾燥重量で８〜２９％である。非特許文献１によれば、ミナミアオサ(Ulva ohnoi)から精製したUlvanを使用し、ミナミアオサに付着していたブドウガイ(Haloa japonica)に由来するUlvan分解細菌(Glaciecola sp.と推定)を単離している。このUlvan分解細菌による分解酵素は、ミナミアオサ由来のUlvanを二糖類にまで分解可能であることが開示されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】高橋亮,「海洋性細菌が有するUlvan分解関連酵素に関する研究」,平成２６年度  高知大学大学院総合人間自然科学研究科農学専攻,修士論文No.29
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、テングサ等の紅藻類や、アオサ等の緑藻類を含む海藻から還元糖を製造する海藻の糖化方法を提供し、さらに製造した糖からのアルコールの製造方法を提供し、増殖可能な有機資源である海藻の有効利用方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の海藻の糖化方法は、フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）により海藻から還元糖を製造する方法であり、増殖可能な有機資源である海藻を有効に利用することが可能である。フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）として、受託番号がNITE P-02291の菌株を好ましく利用することができ、また海藻は、緑藻類が好適であり、環境問題の解消に寄与する。
【０００８】
フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）を海藻に接種して培養し、その海藻からフザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）の酵素液を抽出し、抽出した酵素液により海藻から還元糖を製造する方法が好ましい。かかる方法において、高い還元糖濃度が得られる点で、つぎの各態様が好ましい。すなわち、酵素液により海藻から還元糖を製造する前に、酵素液と海藻とを滅菌する態様が好適である。また、酵素液により海藻から還元糖を製造する工程は、ｐＨを、４以上、６以下に調製し、温度を、１５℃以上、５０℃以下に調製する態様が好ましい。
【０００９】
さらに、還元糖収率を高める点で、フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）を接種する海藻と、酵素液により還元糖を製造する海藻とが、同一の属に分類される態様が好適である。また、フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）を海藻に接種して培養し、菌を培養した海藻を粉砕し、粉砕した海藻からフザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）の酵素液を抽出すると、高い還元糖濃度が得られる。一方、酵素液により海藻から還元糖を製造する工程において、粉砕した海藻を基質として使用すると、還元糖の収量を高めることができる。
【００１０】
本発明のアルコールの製造方法は、海藻の糖化方法により得られる糖からアルコールを製造する方法であって、エンテロバクター（Enterobacter）属に含まれ、受託番号がNITE P-02290の菌株による製造方法であり、海藻を有効に利用することができる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、海藻から還元糖を製造することができる。また、製造した糖からアルコールを製造することができる。したがって、増殖可能な有機資源である海藻の有効利用を図ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明におけるヒトエグサの糖化時間（０〜５時間）と生成する還元糖濃度との関係を示す図である。
【図２】本発明におけるヒトエグサの糖化時間（０〜４８時間）と生成する還元糖濃度との関係を示す図である。
【図３】本発明において、酵素液と海藻を滅菌した後、酵素液により海藻から還元糖を製造するときの温度（５℃〜３０℃）と還元糖濃度との関係を示す図である。
【図４】本発明における処理温度（３０℃〜７０℃）と還元糖濃度との関係を示す図である。
【図５】本発明における糖化時のｐＨと還元糖濃度との関係を示す図である。
【図６】本発明における酵素液生成時の海藻の種類と還元糖濃度との関係を示す図である。
【図７】本発明における酵素抽出時の粉砕処理及び基質である海藻の粉砕処理が還元糖濃度に及ぼす影響を表した図である。
【図８】本発明の糖化方法により得られる還元糖濃度と、硫酸により得られる還元糖濃度とを比較した図である。
【図９】本発明の海藻の糖化方法により得られる還元糖濃度を示す図である。
【図１０】本発明におけるアルコールの発生量を表す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（海藻を糖化する菌株のスクリーニング）
蒸留水を寒天で固化した培地に、大阪府大阪市内で採取した土壌の懸濁液を塗布し、寒天だけで生育する種類を分離し、寒天上で生育能力が高い菌株（菌株名F-engei）を選抜した。菌株（F-engei）は、固化した寒天を溶解し、アオサやヒトエグサ上で旺盛に生育した。寒天の原料であるテングサ（Gelidiaceae）は、紅藻綱テングサ目テングサ科に分類される紅藻類である。一方、アオサ（Ulva Linnaeus）は、アオサ藻綱アオサ目アオサ科アオサ属の緑藻類に分類され、また、ヒトエグサ（Monostroma nitidum）は、アオサ藻綱ヒビミドロ目ヒトエグサ科ヒトエグサ属の緑藻類に分類される。したがって、菌株（F-engei）は、紅藻類や緑藻類を含む海藻を分解する。
【００１４】
テングサの構成成分であるアガロースは、D-ガラクトースとL-ガラクトースとが結合した二糖を繰り返し単位とする多糖類である。また、アオサの細胞壁を構成するUlvanは、L-ラムノースと、D-グルクロン酸又はD-キシロース等とが結合した二糖を繰り返し単位とする多糖類である。このような構造の共通性により、菌株（F-engei）は、紅藻類や緑藻類を分解して、麦芽糖等の二糖類や単糖類からなる還元糖を生成するものと推認される。
【００１５】
菌株（F-engei）は、18S rDNAと5.8S rDNA間のスペーサー領域における塩基配列を解析した結果、相同性９９％で、フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）に分類される糸状菌であった。塩基配列の解析方法は、菌株（F-engei）からDNAを抽出し、得られた抽出液をテンプレートとしてPCR増幅を行う。PCR増幅では、ダイターミネーター法を使用し、ITSIF/ITSIRプライマーセットを添加して行う。増幅後、PCR液をアガロースゲルのウエルに添加し、電気泳動し、DNAの塩基配列情報を取得する。シークエンサーとしては、ABI社のPRISM310を使用することができる。また、取得した塩基配列は、DDBJ（DNA Data Bank of Japan）のBLAST検索により照合することができる。
【００１６】
フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）（菌株名F-engei）（以下、「F-engei菌」ともいう。）は、菌糸が細く、分生子を形成し、貧栄養条件下で寒天を溶解する。好ましい培養条件としては、ツァペックドックス寒天培地であり、培地の組成を表１に示す。滅菌は１２０℃、１５分間とし、滅菌前の培地のpHは５．７が好適である。また、培養方法としては、好気性の静置培養で、３０℃、２週間が好ましい。
【００１７】
【表１】
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【００１８】
フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）（菌株名F-engei）は、受託番号NITE P-02291として、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（NPMD）に寄託している。
【００１９】
フザリウム属に分類される種は、百数十種程度知られているが、将来的には、５００種程度の種になると言われている。また、フザリウム属の菌は、植物に対して病原性を示すものが多く、たとえば、ジャガイモの乾腐病、エンドウの根腐病、穀類の赤かび病がある。フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）についても同様に農業上の病害が大きく、タマネギの乾腐病やウリの萎凋病等が知られている。このように、フザリウム属の菌は、そのほとんどが陸性植物に対する病害性がある。これに対して、本発明のフザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）は、海洋性植物である海藻から還元糖を製造するため、増殖可能な有機資源である海藻の有効利用を図ることができる。
【００２０】
（フザリウム・オキシスポルムの酵素液の作製）
アオサ（兵庫県西宮市内の海岸で採取）（以下、「アオサ」ともいう。）と、三重県産のヒトエグサ（市販品）（以下、「ヒトエグサ」ともいう。）について、各々乾燥重量１ｇ相当を分取し、蒸留水に入れ、１２１℃で１５分間、オートクレーブで殺菌した。その後、これらを培地として、F-engei菌を接種し、２５℃で１ヶ月間培養した。培養の結果、アオサ培地においても、またヒトエグサ培地においても、糸状菌が繁茂していた。培養後、蒸留水１００ｍＬを入れたビーカーに移し、ガラス棒で５分間撹拌した後、濾過し、濾液を酵素液として利用した。アオサ培地から得られた酵素液を、「アオサ抽出カビ酵素液」という。また、ヒトエグサ培地から得られた酵素液を、「ヒトエグサ抽出カビ酵素液」という。酵素液は、作製後、−２０℃で凍結保存した。
【００２１】
（実施例１）
ヒトエグサ１ｇに、蒸留水３０ｍＬと、ヒトエグサ抽出カビ酵素液１０ｍＬを加え、反応液した。この反応液を、４０℃１５０ｒｐｍで、０〜５時間振とうしながら、１時間毎にサンプリングし、サンプルは５℃で保管した。還元糖の定量は、ソモギーネルソン法により行い、紫外可視分光光度計で吸光度を計測し、ブドウ糖液により検量線を作成し、各サンプルの還元糖濃度を測定した。以下の実施例においても、同様の方法により還元糖濃度を測定した。なお、比較例１として、ヒトエグサを入れずに、蒸留水３０ｍＬと、ヒトエグサ抽出カビ酵素液１０ｍＬを加えただけのサンプルについても、同様に還元糖濃度を測定した。
【００２２】
図１は、本発明におけるヒトエグサの糖化時間（０〜５時間）と生成する還元糖濃度との関係を示す図である。図１に示すように、処理時間が５時間までのときは、処理時間が増加するに従い、生成する還元糖が増加した。なお、比較例１（図示していない。）では、還元糖は生成しなかった。
【００２３】
したがって、フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）により、海藻から還元糖を製造でき、フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）として、菌株（F-engei）（受託番号NITE P-02291）を利用できる。また、たとえば、フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）（菌株名F-engei）を海藻に接種して培養し、菌を培養した海藻から、F-engei菌の酵素液を抽出し、酵素液により海藻から還元糖を製造することができる。一方、海藻として、緑藻類（例：ヒトエグサ）を使用して還元糖の製造が可能である。
【００２４】
（実施例２）
実施例１と同様に調製した反応液を使用し、４０℃１５０ｒｐｍで、０時間、１時間、２４時間、４８時間振とうしたときのサンプルを採取した。サンプルは５℃で保管し、実施例１と同様の方法で、各サンプルの還元糖濃度を測定した。
【００２５】
図２は、本発明におけるヒトエグサの糖化時間（０〜４８時間）と生成する還元糖濃度との関係を示す図である。図２に示すように、糖化処理により還元糖は生成したが、処理を開始してから２４時間を経過すると、還元糖の濃度が大きく低下した。
【００２６】
（実施例３）
ヒトエグサ抽出カビ酵素液を＃２２μｍ径のミリポアフィルターにより濾過滅菌した。また、ヒトエグサ１ｇと蒸留水３０ｍＬをフラスコに入れ、オートクレーブで滅菌した。つぎに、滅菌したヒトエグサの入ったフラスコに、濾過滅菌したヒトエグサ抽出カビ酵素液１０ｍＬを加え、反応液とした。反応液は、５℃、１５℃と３０℃で、２週間静置し、還元糖濃度を測定した。また、比較のために、滅菌したヒトエグサに、ヒトエグサ抽出カビ酵素液を加えず、そのまま２５℃で２週間静置し、同様に還元糖濃度を測定した（control）。
【００２７】
図３は、本発明において、酵素液と海藻を滅菌した後、酵素液により海藻から還元糖を製造するときの温度（５℃〜３０℃）と還元糖濃度との関係を示す図である。図３に示すように、無菌環境下における２週間の糖化により、３０℃条件下で還元糖濃度１．９０ｇ/Ｌが得られた。還元糖濃度１．９０ｇ/Ｌは、実施例１における最大値（５ｈ：０．３０ｇ/Ｌ）の約６倍の濃度であり、実施例２における最大値（１ｈ：０．２３ｇ/Ｌ）の約８倍に相当する濃度である。また、５℃〜３０℃の範囲では、温度が高くなるにつれて還元糖濃度が上昇した。
【００２８】
実施例２（図２）においては、糖化時間の経過により還元糖濃度が低下する現象を確認したが、実施例３（図３）において、海藻と酵素液を滅菌することにより、還元糖の減少を回避し、高濃度の還元糖を得ることができた。これは、還元糖を消費する微生物を滅菌により除去した結果であると推認される。したがって、酵素液により海藻から還元糖を製造する前に、酵素液と海藻とを滅菌する態様は、還元糖の収量を高める点で、好ましい。
【００２９】
（実施例４）
実施例３と同様に、ヒトエグサについて調製した反応液を、３０℃、４０℃、５０℃、６０℃と７０℃の環境下で、５時間静置し、還元糖濃度を測定した。
【００３０】
図４は、本発明における処理温度（３０℃〜７０℃）と還元糖濃度との関係を示す図である。図４に示すように、３０℃〜７０℃の条件では、５０℃、４０℃、３０℃と処理温度が下降するにつれて、還元糖濃度が上昇した。一方、図３に示すように、５℃〜３０℃の条件では、５℃、１５℃、３０℃と処理温度が上昇するにつれて、還元糖濃度が上昇した。したがって、図３と図４の結果を合わせて考察すると、酵素液により海藻から還元糖を製造する工程は、高い還元糖濃度が得られる点で、処理温度の下限値は、１５℃以上が好ましく、３０℃以上がより好ましい。また、同様の観点から、処理温度の上限値は、５０℃以下が好ましく、４０℃以下がより好ましい。
【００３１】
（実施例５）
ヒトエグサ１ｇと蒸留水３０ｍＬとを混合し、オートクレーブで滅菌した後、ｐＨを測定すると、ｐＨ４．５であった。そこで、ｐＨ４．５を基準として、１ＮのＨＣｌと、１ＮのＮａＯＨにより、−２（ｐＨ２．５）、−１（ｐＨ３．５）、±０（ｐＨ４.５）、＋１（ｐＨ５.５）、＋２（ｐＨ６．５）に調製した。その後、濾過滅菌したヒトエグサ抽出カビ酵素液１０ｍＬを加え、３０℃１５０ｒｐｍで３日間処理した。
【００３２】
図５は、本発明における糖化時のｐＨと還元糖濃度との関係を示す図である。図５に示すように、ｐＨ２.５とｐＨ３．５とでは、同程度の還元糖濃度であったが、ｐＨ３．５からｐＨ４．５に変化すると、還元糖濃度は急に上昇し、ほぼ飽和に達した。一方、ｐＨ５．５からｐＨ６．５に変化すると、ｐＨ５．５で飽和に達していた還元糖濃度は、ほぼ０にまで下降した。したがって、酵素液により海藻から還元糖を製造する工程は、高い還元糖濃度が得られる点で、ｐＨの下限値は、４以上が好ましく、４．５以上がより好ましい。また、同様の観点から、ｐＨの上限値は、６．０以下が好ましく、５．７以下がより好ましく、５．５以下が特に好ましい。
【００３３】
（実施例６）
アオサ１ｇを蒸留水３０ｍＬに加え、１ＮのＨＣｌによりｐＨ５．０に調製し、オートクレーブで滅菌した。つぎに、濾過滅菌したアオサ抽出カビ酵素液５ｍＬを加えたサンプルと、濾過滅菌したヒトエグサ抽出カビ酵素液５ｍＬを加えたサンプルと、酵素液を加えないサンプルとを作製した。その後、３０℃１５０ｒｐｍで３日間振とうした。実験は、３回反復して実施し、計測値の標準誤差を算出した。
【００３４】
図６は、本発明における酵素液生成時の海藻の種類と還元糖濃度との関係を示す図である。アオサにアオサ抽出カビ酵素液を加えたサンプルは、「アオサ＋アオサ酵素液」と表示する。また、アオサにヒトエグサ抽出カビ酵素液を加えたサンプルは、「アオサ＋ヒトエグサ酵素液」と表示する。一方、アオサに酵素液を加えなかったサンプルは、「アオサ（酵素液なし）」と表示する。図６に示すように、アオサにF-engei菌を接種し、生成した酵素液でアオサを糖化する場合の方が、ヒトエグサにF-engei菌を接種し、生成した酵素液でアオサを糖化する場合に比べて、明らかに高濃度の還元糖が得られた。したがって、フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）を接種する海藻は、その酵素液により還元糖を製造する海藻と同一の属に分類される態様が、高い還元糖濃度を得る点で、好ましい。
【００３５】
ヒトエグサにF-engei菌を接種し、生成した酵素液は、アオサにF-engei菌を接種し、生成した酵素液と比較して、アオサを糖化する効率が低い。この結果は、ヒトエグサとアオサとでは、構成する多糖類が相違し、F-engei菌は、海藻の種類に応じて、それぞれの海藻の分解に適した酵素を生成していることによるものと推認される。したがって、同一の酵素により、ヒトエグサとアオサを分解しているのではなく、基質特異性の異なる別の酵素により糖化が進行しているものと推認される。なお、アオサに酵素液を加えなかったサンプルでは、還元糖は確認できなかった。
【００３６】
（実施例７）
アオサ培地に、F-engei菌を接種し、２５℃で１ヶ月間培養し、糸状菌が繁茂したアオサを粉砕した後、濾過して、酵素液を調製した。この酵素液を、「粉砕アオサ抽出カビ酵素液」という。一方、糖化前のアオサをホモジナイザーで粉砕した。この糖化前の基質を、「粉砕アオサ」という。つぎに、粉砕アオサ１ｇを蒸留水３０ｍＬに加え、１ＮのＨＣｌによりｐＨ５．０に調製し、オートクレーブで滅菌した。その後、粉砕アオサに、濾過滅菌した粉砕アオサ抽出カビ酵素液５ｍＬを加えたサンプルを作製した。また、粉砕アオサに、濾過滅菌したアオサ抽出カビ酵素液５ｍＬを加えたサンプルを作製した。その後、３０℃１５０ｒｐｍで３日間振とうした。実験は、３回反復して実施し、計測値の標準誤差を算出した。
【００３７】
なお、アオサを全量糖化したときに生成する糖量を調べるために、乾燥アオサ１ｇに、３％硫酸１５ｍＬを加え、１２１℃１時間オートクレーブで加熱した後、蒸留水３０ｍＬを加え、１０ＮのＮａＯＨでｐＨ５．０に調製した。
【００３８】
図７は、本発明における酵素抽出時の粉砕処理及び基質である海藻の粉砕処理が還元糖濃度に及ぼす影響を表した図である。アオサ＋アオサ酵素液の還元糖濃度は、実施例６におけるデータを利用した。また、粉砕アオサに、粉砕アオサ抽出カビ酵素液を加えたサンプルは、「粉砕アオサ＋粉砕アオサ酵素液」と表示する。一方、粉砕アオサに、アオサ抽出カビ酵素液を加えたサンプルは、「粉砕アオサ＋アオサ酵素液」と表示する。
【００３９】
図７に示すように、粉砕アオサ酵素液を使用すると、アオサ酵素液を使用した場合に比べて、還元糖濃度が高められた。したがって、フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）を海藻に接種して培養し、菌を培養した海藻を粉砕し、粉砕した海藻から、フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）の酵素液を抽出する態様が、還元糖濃度を高める点で好ましい。また、図７に示すように、糖化処理をする基質として、粉砕アオサを使用すると、未粉砕のアオサを使用した場合に比べて、還元糖濃度が高められた。したがって、酵素液により海藻から還元糖を製造する工程において、粉砕した海藻を基質として使用する態様が、還元糖濃度を高める点で好ましい。本明細書において、粉砕とは、固体材料に外力を加えて、元の大きさよりも小さくすることをいい、粗砕、中砕、微粉砕等が含まれる。
【００４０】
図８は、本発明の糖化方法により得られる還元糖濃度と、硫酸により得られる還元糖濃度とを比較した図である。アオサを硫酸で処理したサンプルは、「アオサ＋硫酸」と表示する。図８に示すように、３％硫酸を加え、１２１℃で１時間の処理により得られる還元糖濃度は、粉砕アオサと粉砕アオサ抽出カビ酵素液を３日間、糖化処理して得られる還元糖濃度の約３倍であった。しかし、硫酸による糖化の場合、糖化液（反応液）を中和するために、大量のアルカリが必要であり、中和後、糖化液には大量の塩が含有するから、この糖化液を利用するには、イオン交換処理等が必須となる。したがって、本発明の糖化方法は、糖化液から大量の塩を除去する必要がなく、また加熱処理等に伴う諸経費が不要である点で、有利である。
【００４１】
アオサの糖化により得られる還元糖の種類を確認するために、アオサを硫酸で処理した糖化液について、高速液体クロマトグラフィー（HPLC : high performance liquid chromatography）で解析した。HPLCは、島津製作所製の示差屈折計RID-10A、カラムオーブンCTO-20AC、コントロールユニットDGU-20A5Rを備えるものを使用した。カラムはShim-Pack SPR-Ca、移動相には水を使用した。カラム温度８０℃、ポンプ流量０．６ｍＬ／分、LC終了時間２０分、注入量１５μＬで分析した。その結果、麦芽糖とブドウ糖が検出され、麦芽糖が主体であった。このため、アオサ糖化液からアルコールを製造する微生物のスクリーニングでは、麦芽糖液による集積培養を行った。
【００４２】
（実施例８）
粉砕アオサ６ｇを蒸留水３００ｍＬに加えたサンプルと、粉砕アオサ１２ｇを蒸留水３００ｍＬに加えたサンプルとを、オートクレーブで滅菌した。その後、濾過滅菌した粉砕アオサ抽出カビ酵素液５ｍＬを加え、３０℃で８日間、往復振とう培養し、反応液を濾過した。粉砕アオサ６ｇのサンプルは、十分に振とうされ、１００ｍＬの濾液が得られた。一方、粉砕アオサ１２ｇのサンプルは、膨潤したアオサにより十分に振とうされず、９０ｍＬの濾液が得られた。つぎに、濾液の還元糖濃度を測定した。また、屈折糖度計により糖度（Brix%）を測定した。なお、controlとして、粉砕アオサを蒸留水に加えた状態での還元糖濃度と糖度（Brix%）を測定した。
【００４３】
図９は、本発明の海藻の糖化方法により得られる還元糖濃度を示す図である。粉砕アオサ６ｇを蒸留水３００ｍＬに加えたサンプルは、「６ｇ／３００ｍＬ（８日目）」と表示する。また、粉砕アオサ１２ｇを蒸留水３００ｍＬに加えたサンプルは、「１２ｇ／３００ｍＬ（８日目）」と表示する。図９に示すように、controlでは、還元糖は検出されなかったが、６ｇ／３００ｍＬ（８日目）のサンプルでは、還元糖濃度は、６．４７±０．３４ｇ／Ｌであった。また、１２ｇ／３００ｍＬ（８日目）のサンプルでは、基質であるアオサが多いにもかかわらず、振とうが不十分であったため、還元糖濃度は、０．９３±０．１３ｇ／Ｌであった。
【００４４】
一方、屈折糖度計による糖度（Brix%）は、controlでは０％であり、６ｇ／３００ｍＬ（８日目）のサンプルでは１％であり、１２ｇ／３００ｍＬ（８日目）のサンプルでは、基質（アオサ）の量に比例して、２％であった。還元糖濃度と糖度（Brix%）の結果により、基質（アオサ）と酵素液との接触が不十分な場合でも、基質に含まれる多糖類の分解は進行し、還元糖に至る前までの分解は進行していることが推認された。
【００４５】
糖化時の振とうが十分に行われた６ｇ／３００ｍＬ（８日目）のサンプルでは、濾液１００ｍＬ（還元糖濃度６．４７ｇ／Ｌ）が得られたことから、還元糖量は、ブドウ糖に換算して、
１００ｍＬ×（６．４７ｇ／１０００ｍＬ）≒０．６５ｇ
であり、基質（アオサ）は６ｇであるから、アオサのF-engei菌による還元糖変換効率は、
０．６５ｇ÷６ｇ×１００≒１１％
である。
【００４６】
一方、糖度（Brix%）１％の濾液（１００ｍＬ）が得られたから、非還元糖を含む可溶性糖総量は、
１００ｍＬ×０．０１＝１ｇ
であり、基質は６ｇであるから、アオサのF-engei菌による可溶性糖変換効率は、
１ｇ÷６ｇ×１００≒１７％
である。
【００４７】
同様に、糖化時の振とうが不十分であった１２ｇ／３００ｍＬ（８日目）のサンプルでは、糖度（Brix%）２％の濾液（９０ｍＬ）が得られたから、非還元糖を含む可溶性糖総量は、
９０ｍＬ×０．０２＝１．８ｇ
であり、基質は１２ｇであるから、アオサのF-engei菌による可溶性糖変換効率は、
１．８ｇ÷１２ｇ×１００＝１５％
である。
【００４８】
（海藻の糖化液からアルコールを製造する菌株のスクリーニング）
兵庫県高砂市の海岸で採取した変色したアオサを分離源とし、酢酸を１００ｍＬ当たり１滴加えた１０％麦芽糖液を用いた培地で集積培養し、気泡の発生した培地から培養液を採取し、ＹＭ平板培地に塗抹した。塗抹して形成された微生物群は、６種類（Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ）であった。
【００４９】
つぎに、硫酸によりアオサを糖化して得られた糖液、ショ糖液、ブドウ糖液、麦芽糖液に、ペプトンと酵母エキスを加え、BTB液を添加した培地を用意した。その後、これらの糖液に６種類の微生物群（Ａ〜Ｆ）を接種し、培養し、すべての糖液でガスが発生し、BTBが黄色に変色した微生物群Ｆを選抜した。後述する実施例９において、微生物群Ｆは糖液からアルコールを生成しており、BTBが黄色に変色したことから、発生しているガスは、アルコール発酵により生じるCO2である。つぎに、微生物群Ｆから、希釈と塗抹を繰り返し、アンピシリンを添加した培地により選択分離をした。微生物群Ｆには、酵母と細菌が含まれ、細菌より菌株（菌株名  E-engei）を選抜した。
【００５０】
菌株（E-engei）は、16S rDNA領域の塩基配列を解析した結果、エンテロバクター（Enterobacter）属に含まれる細菌であった。塩基配列の解析方法は、まず、菌株（E-engei）からDNAを抽出し、得られた抽出液をPCRのテンプレートDNAとした。塩基配列は、ダイターミネーター法によるダイレクトシーケンス法で解析した。PCRには、DNA合成酵素として、ライフサイエンス社のAmpliTaq Goldを使用し、プライマーには800F/1500Rプライマーセットを使用した。PCR増幅後、アガロースゲル電気泳動でDNA配列を確認した。
【００５１】
増幅は、フォワードプライマーが強く表れたため、これを用いて蛍光標識を行った。蛍光標識後の塩基配列の解析は、ABI社のPRISM310により行った。また、得られた塩基配列の相同性は、NCBI（National Center for Biotechnology Information）のBLAST検索により評価した。
【００５２】
PCR増幅により得られた16S rDNA領域のDNAは、ゲノムDNAによると思われるもの１本と、プラスミドによると思われるもの２本とがあり、いずれも同じ位置に見られた。このうち、703bpの塩基配列をもとに相同性を評価した結果を表２に示す。菌株（E-engei）は、混合微生物ではないため、表２に示すいずれかの種であり、エンテロバクター（Enterobacter）属に含まれる細菌である。
【００５３】
【表２】
2018029571.tif 000004
【００５４】
エンテロバクター（Enterobacter）属（菌株名  E-engei）（以下、「E-engei菌」ともいう。）は、短桿菌であり、アルコールを生成する。好ましい培養条件としては、ブイヨン培地であり、培地の組成を表３に示す。滅菌は、１２０℃、１５分間とし、滅菌前の培地のｐＨは７が好適である。また、培養方法としては、好気性の振とう培養で、３０℃、１８時間が好ましい。
【００５５】
【表３】
2018029571.tif 000005
【００５６】
エンテロバクター（Enterobacter）属（菌株名  E-engei）は、受託番号NITE P-02290として、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（NPMD）に寄託している。
【００５７】
（実施例９）
ブドウ糖液（３％）、ショ糖液（２％）、ショ糖液（３％）、麦芽糖液（３％）、アオサを基質としてアオサ抽出カビ酵素液により糖化した糖化液（２Brix%）、アオサを基質としてアオサ抽出カビ酵素液により糖化した糖化液（３Brix%）を作製した。つぎに、これらの糖液に、酵母エキスを全量の０．４５％となるように配合し、ペプトンを全量の０．７５％となるように配合した。各糖液は、１０ｍＬずつ試験管に分注し、ダーラム管を入れた後、オートクレーブで滅菌した。
【００５８】
市販のドライイースト（Saccharomyces cerevisiae）から分離した酵母（以下、「市販酵母」という。）と、微生物群Ｆは、ＹＭ液体培地でコロニーを形成させた後、１白金耳分のコロニーを１０ｍＬの生理食塩水に懸濁し、その１ｍＬを各試験管に加え、３０℃で４日間静置した後、培養液中のアルコールを測定した。また、比較のため、エチルアルコール（０．０１％、０．１％、１％）を同様に測定した。アルコールの測定は、試料に、アルコール脱水素酵素とニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD+）を添加する。アルコールは、アルデヒドとなり、NAD+はNADHとなる。つぎに、フェナジンメトサルフェートとニトラテトラゾリウムブルー（NTB）を添加すると、NTBは、NADHにより青紫色を呈するジホルマザンに還元されるため、生成するジホルマザンの５７０ｎｍの吸光度を測定することにより、アルコール濃度を測定する。
【００５９】
３０℃で４日間培養した結果、市販酵母は、ブドウ糖液と麦芽糖液ではガスが発生したが、アオサを基質としてアオサ抽出カビ酵素液により糖化した糖化液では、ガスが発生しなかった。一方、微生物群Ｆは、すべての糖液でガスが発生した。図１０は、本発明におけるアルコールの発生量を表す図である。図１０には、アオサを基質としてアオサ抽出カビ酵素液により糖化した糖化液（３Brix%）（「アオサ糖液３％」と表示する。）、ブドウ糖液（３％）と麦芽糖液（３％）の各糖液からのアルコールの発生量を吸光度で示す。また、比較のため、エチルアルコール（０．０１％、０．１％、１％）の測定結果を表示する。
【００６０】
図１０に示すように、すべての糖液において、微生物群Ｆによるアルコールの発生量は、市販酵母によるアルコールの発生量を大きく上回り、市販酵母では資化できないアオサ糖液からもアルコールを製造した。また、微生物群Ｆは、アオサ糖液３％から、エチルアルコール１．０％〜０．１％の水準で、アルコールを生成した。
【００６１】
つぎに、微生物群Ｆには、酵母と細菌が含まれているため、いずれの作用により、アルコールが生成しているかを確認した。麦芽糖液（３％）に、全量の０．４５％となるように酵母エキスを加え、さらに全量の０．７５％となるようにペプトンを添加し、１０ｍＬずつ試験管に分注し、ダーラム管と５％BTB液０．１５ｍＬを入れ、オートクレーブで滅菌した。つぎに、微生物群Ｆから分離した酵母と細菌について、ＹＭ液体培地でコロニーを形成させ、１白金耳分のコロニーを１０ｍＬの生理食塩水に懸濁した後、１ｍＬを糖液の入った試験管に加え、３０℃で４日間静置した。
【００６２】
３０℃で４日間の培養の結果、酵母の糖液ではガスが発生せず、BTBは黄色に変色しなかったが、細菌の糖液では、ガスが発生し、BTBが黄色に変色したため、微生物群Ｆに含まれる細菌（E-engei菌）により、アルコールが生成したことが確認できた。すなわち、エンテロバクター（Enterobacter）属に含まれる菌株E-engei（受託番号NITE P-02290）は、アオサを基質としてアオサ抽出カビ酵素液により糖化して得られる糖からアルコールを製造することができる。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
海藻から還元糖を製造することができる。また、製造した糖からアルコールを製造することができる。したがって、増殖可能な有機資源である海藻の有効利用を図ることができる。
【図１】
2018029571.tif 000006
【図２】
2018029571.tif 000007
【図３】
2018029571.tif 000008
【図４】
2018029571.tif 000009
【図５】
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【図６】
2018029571.tif 000011
【図７】
2018029571.tif 000012
【図８】
2018029571.tif 000013
【図９】
2018029571.tif 000014
【図１０】
2018029571.tif 000015
【手続補正書】
【提出日】平成29年10月6日(2017.10.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）により、海藻から還元糖を製造する海藻の糖化方法であって、
前記フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）は、受託番号がNITE P-02291の菌株であり、
前記海藻は、緑藻類又はテングサであり、
前記フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）を海藻に接種して培養し、
該海藻から前記フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）の酵素液を抽出し、
該酵素液により海藻から還元糖を製造する
海藻の糖化方法。
【請求項２】
酵素液により海藻から還元糖を製造する前に、前記酵素液と前記海藻とを滅菌する請求項１に記載の海藻の糖化方法。
【請求項３】
酵素液により海藻から還元糖を製造する工程は、ｐＨが、４以上であり、６以下である請求項１又は２に記載の海藻の糖化方法。
【請求項４】
酵素液により海藻から還元糖を製造する工程は、温度が、１５℃以上、５０℃以下である請求項１〜３のいずれかに記載の海藻の糖化方法。
【請求項５】
前記フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）を接種する海藻は、前記酵素液により還元糖を製造する海藻と同一の属に分類される請求項１〜４のいずれかに記載の海藻の糖化方法。
【請求項６】
前記フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）を海藻に接種して培養し、
菌を培養した海藻を粉砕し、
粉砕した海藻から、前記フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）の酵素液を抽出する
請求項１〜５のいずれかに記載の海藻の糖化方法。
【請求項７】
該酵素液により海藻から還元糖を製造する工程において、
糖化前の海藻を粉砕し、
粉砕した海藻に前記酵素液を加えた後、
還元糖を製造する
請求項１〜６のいずれかに記載の海藻の糖化方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の海藻の糖化方法により得られる糖を基質として、
エンテロバクター（Enterobacter）属に含まれ、受託番号がNITE P-02290の菌株により、アルコールを製造する
アルコールの製造方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
本発明の海藻の糖化方法は、フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）により海藻から還元糖を製造する方法であり、増殖可能な有機資源である海藻を有効に利用することが可能である。フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）として、受託番号がNITE P-02291の菌株を利用する。また海藻は、緑藻類又はテングサであり、環境問題の解消に寄与する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
本発明の海藻の糖化方法は、フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）を海藻に接種して培養し、その海藻からフザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）の酵素液を抽出し、抽出した酵素液により海藻から還元糖を製造する。かかる方法において、高い還元糖濃度が得られる点で、つぎの各態様が好ましい。すなわち、酵素液により海藻から還元糖を製造する前に、酵素液と海藻とを滅菌する態様が好適である。また、酵素液により海藻から還元糖を製造する工程は、ｐＨを、４以上、６以下に調製し、温度を、１５℃以上、５０℃以下に調製する態様が好ましい。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
さらに、還元糖収率を高める点で、フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）を接種する海藻と、酵素液により還元糖を製造する海藻とが、同一の属に分類される態様が好適である。また、フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）を海藻に接種して培養し、菌を培養した海藻を粉砕し、粉砕した海藻からフザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）の酵素液を抽出すると、高い還元糖濃度が得られる。一方、酵素液により海藻から還元糖を製造する工程において、糖化前の海藻を粉砕し、粉砕した海藻に酵素液を加えた後、還元糖を製造すると、還元糖の収量を高めることができる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
本発明のアルコールの製造方法は、海藻の糖化方法により得られる糖を基質として、エンテロバクター（Enterobacter）属に含まれ、受託番号がNITE P-02290の菌株により、アルコールを製造するアルコールの製造方法であり、海藻を有効に利用することができる。