(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒト胚性幹細胞の侵害受容器分化のための方法及びその使用の提供。【解決手段】ヒト幹細胞を含む細胞培養物にトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）／アクチビン−ノーダルシグナル伝達インヒビター、Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｔｈｅｒｓ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ（ＳＭＡＤ）シグナル伝達インヒビター、ウイングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達の活性化のためのグリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（ＧＳＫ３β）インヒビターを加え神経堤幹細胞に分化させ、さらに線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）受容体ファミリーシグナル伝達インヒビターとノッチシグナル伝達インヒビターをさらに加え、ペプチド作動性侵害受容器細胞へ分化させる方法の提供。【選択図】図１
2018139592.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載のヒト胚性幹細胞の侵害受容器分化のための方法およびその使用など。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、幹細胞生物学の分野、特に、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）、ヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）、体性幹細胞、がん幹細胞、または系列特異的に分化することができる任意の他の細胞を含み得るが、これらに限定されない、多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）または多分化能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞の系列特異的分化に関する。特に、新規培養条件を用いてｈＥＳＣおよび／またはｈｉＰＳＣの系列特異的分化を侵害受容器（すなわち侵害受容器細胞）へと向かわせる方法を述べる。本発明の方法を用いて作製される侵害受容器は、インビトロでの薬剤発見アッセイにおける使用、疼痛研究における使用、および末梢神経系（ＰＮＳ）の疾患または損傷を逆転させる治療薬としての使用を含むが、これらに限定されない、様々な用途に関してさらに考慮される。さらに、疾患モデリングにおける使用のためにヒト多能性幹細胞からメラノサイトを生産するための組成物および方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
胚性および体性幹細胞はあらゆる細胞型に分化する能力を有する：それらは、したがって、特徴付けられた細胞集団を侵すかまたは損傷／傷害を与える疾患のための細胞置換療法に極めて適する。それらの直接の治療的価値を超えて、系列特異的分化幹細胞はまた、系列特異的疾患を処置する治療分子の詳細または送達について同定する、確認する、試験するためのインビトロスクリーニングアッセイ、細胞系列特異化および分化の複雑な機構のさらなる解明、ならびに診断または予後マーカーとしての使用に関してさらに考慮することができる、正常状態と疾患または損傷状態との間の重要な生化学的相違を同定することを含む、様々な目的のための有用な研究ツールでもある。
【０００３】
神経変性疾患のための治療薬およびモデル系としての胚性および体性幹細胞の能力は広く探求されてきた。しかし、胚性および体性幹細胞の定方向性分化に関する研究および技術開発の多くは、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病および多発性硬化症などの、中枢神経系（ＣＮＳ）の疾患の分野で行われてきた。末梢神経系（ＰＮＳ）の系列に向かう胚性および体性幹細胞の定方向性分化に関する知識は、現在のところ十分ではない。ＰＮＳは、筋骨格制御および外部刺激の知覚を統合する体性神経系、ならびに心拍および呼吸などの内臓器官の機能を調節する自律神経系から構成される。シャルコー・マリー・トゥース病、ギヤン・バレー症候群およびヒルシュスプルング病を含むＰＮＳの多数の疾患が存在する。ＰＮＳの末梢感覚ニューロンの疾患は、傷害を引き起こす有害刺激に応答して重度の疼痛を生じさせるかまたは有害刺激に応答することができないようにするので、特に社会的負担が大きく、それらには、家族性自律神経障害、先天性無痛症、糖尿病性ニューロパシー、および水痘または帯状疱疹の感染による損傷などの疾患が含まれる。
【０００４】
末梢感覚ニューロン疾患の病理学を理解すること、ならびに処置方法の開発は、ヒト末梢感覚ニューロンを得ることの難しさによって妨げられている；現在の方法は、３〜５週齢のヒト胚からの手操作による単離またはまれな外科手術手技に限定される。胚性幹細胞または体性幹細胞の、特定の末梢感覚ニューロン、特に疼痛を知覚する末梢感覚ニューロンである侵害受容器への定方向性分化は、研究および治療の両適用のためのそのような細胞の理想的な再生産可能供給源となる。最近、胚性幹細胞に由来するニューロン中間体から末梢感覚ニューロンを生産することが試みられている。しかし、これらの技術は、ニューロン中間体が必要であること、マウス間質細胞との共培養、そのような末梢感覚ニューロンを誘導するための時間の長さ、低い収率、混合ニューロン型を含む純粋でない細胞集団、ＰＮＳ生成ニューロンの限られた生存期間と不十分な特性付けによって制限されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、夾雑マウス間質細胞を使用せずに高い純度と収率で胚性または体性幹細胞から直接、末梢感覚ニューロン、特に侵害受容器を生産する方法が当分野において求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、幹細胞生物学の分野、特に、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）、ヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）、体性幹細胞、がん幹細胞、または系列特異的に分化することができる任意の他の細胞を含み得るが、これらに限定されない、多能性または多分化能性幹細胞の系列特異的分化に関する。特に、新規培養条件を用いてｈＥＳＣおよび／またはｈｉＰＳＣの系列特異的分化を侵害受容器（すなわち侵害受容器細胞）へと向かわせる方法を記載する。本発明の方法を用いて作製される侵害受容器は、インビトロでの薬剤発見アッセイにおける使用、疼痛研究における使用、および末梢神経系（ＰＮＳ）の疾患または損傷を逆転させる治療薬としての使用を含むが、これらに限定されない、様々な用途に関してさらに考慮される。さらに、疾患モデリングにおける使用のためにヒト多能性幹細胞からメラノサイトを生産するための組成物および方法を提供する。
【０００７】
当分野における制約を克服することおよび／または欠陥を軽減することが本発明の１つの目的である。１つの実施形態では、本発明は、ｉ）幹細胞（例えばｈＥＳＣ、ｈｉＰＳＣ、体性幹細胞、がん幹細胞、ヒトまたは哺乳動物多能性細胞等）を得ること；ｉｉ）二重ＳＭＡＤシグナル伝達を阻害する条件下で前記幹細胞を培養すること；ならびにｉｉｉ）ＦＧＦおよびノッチシグナル伝達を阻害し、Ｗｎｔシグナル伝達を活性化する条件下で前記細胞をさらに培養することを含む、侵害受容器を生産する方法を提供する。本明細書で使用される場合、「阻害する」または「ブロックする」という用語は、化合物（すなわちインヒビター）での処理の際に細胞の特定のシグナル伝達経路の活性のレベルが、そのような化合物で処理していないままであるかまたは対照で処理した細胞の前記シグナル伝達経路の活性と比較して低下することを意味する。本明細書で使用される場合、「活性化する」という用語は、化合物（すなわちアクチベーター）での処理の際に細胞の特定のシグナル伝達経路の活性のレベルが、そのような化合物で処理していないままであるかまたは対照で処理した細胞の前記シグナル伝達経路の活性と比較して上昇することを意味する。特定のシグナル伝達経路の何らかのレベルの阻害または活性化は、そのような阻害または活性化が幹細胞の定方向性分化を生じさせる場合、本発明の実施形態とみなされる。１つの実施形態では、培養のための方法は、フィーダーを含まない系のための条件を含む。１つの実施形態では、幹細胞を単層で培養する。好ましい実施形態では、培養のための方法は、化合物ＳＢ４３１５４２、ＬＤＮ１９３３１８９、ＳＵ５４０２、ＣＨＩＲ９９０２１およびＤＡＰＴを含む培地の使用を企図する。１つの実施形態では、分化細胞は、培養細胞の集団の少なくとも１０％から１００％までである。１つの実施形態では、分化細胞は、ＩＳＬ１、ＢＲＮ３Ａ、ＲＥＴ、ＲＵＮＸ１およびＮＴＲＫ１を含む群からの１つ以上のマーカーを発現する。１つの実施形態では、前記マーカーの発現は、培養細胞の集団の少なくとも１０％から１００％までにおいて発現される。好ましい実施形態では、分化細胞は侵害受容器である。好ましい実施形態では、幹細胞はｈＥＳＣまたはｈｉＰＳＣである。
【０００８】
１つの実施形態では、本発明は、ｉ）ＳＭＡＤシグナル伝達およびＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達（ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）の両方をブロックする第一インヒビターまたはインヒビターの組合せ；ｉｉ）ＦＧＦシグナル伝達をブロックする第二インヒビター；ｉｉｉ）ノッチシグナル伝達をブロックする第三インヒビター；ならびにｉｖ）Ｗｎｔシグナル伝達のアクチベーター、を含むキットを提供する。１つの実施形態では、第一インヒビターは、ＬＤＮ１９３１８９およびＳＢ４３１５４２、それらの組合せ、それらの混合物を含む群から選択される。１つの実施形態では、第二インヒビターは、ＳＵ５４０２およびその誘導体を含む。１つの実施形態では、第三インヒビターは、ＤＡＰＴおよびその誘導体を含む。１つの実施形態では、アクチベーターは、ＣＨＩＲ９９０２１およびその誘導体を含む。１つの実施形態では、キットはヒト幹細胞をさらに含む。１つの実施形態では、キットは、本発明を実施するための指示書をさらに提供する。
【０００９】
１つの実施形態では、本発明は、ｉ）ＳＭＡＤシグナル伝達およびＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の両方をブロックする第一インヒビターまたはインヒビターの組合せ；ｉｉ）ＦＧＦシグナル伝達をブロックする第二インヒビター；ｉｉｉ）ノッチシグナル伝達をブロックする第三インヒビター；ならびにｉｖ）Ｗｎｔシグナル伝達のアクチベーター、を含むキットを提供する。１つの実施形態では、前記第一インヒビターは、ＳＢ４３１５４２、ＬＤＮ１９３１８９、それらの組合せおよびそれらの混合物を含む群から選択される。１つの実施形態では、前記第二インヒビターは、ＳＵ５４０２およびその誘導体を含む。１つの実施形態では、前記第三インヒビターは、ＤＡＰＴおよびその誘導体を含む。１つの実施形態では、前記アクチベーターは、ＣＨＩＲ９９０２１およびその誘導体を含む。１つの実施形態では、前記キットは指示書をさらに含む。１つの実施形態では、前記キットはヒト幹細胞をさらに含む。１つの実施形態では、前記ヒト幹細胞はヒト胚性幹細胞である。１つの実施形態では、前記ヒト幹細胞はヒト誘導多能性幹細胞である。
【００１０】
本発明は、分化幹細胞の末梢感覚ニューロンサブタイプを評価するための方法をさらに企図する。この方法のある実施形態は、顕微鏡分析、機能アッセイ、特定の系列に関連するマーカーの発現または下方調節の測定を利用することができる。好ましい実施形態では、該方法は、ＩＳＬ１、ＢＲＮ３Ａ、ＲＥＴ、ＲＵＮＸ１およびＮＴＲＫ１を含む群から選択される侵害受容器特異化に関連するマーカーを測定することを含む。
【００１１】
１つの実施形態では、本発明は、幹細胞の定方向性分化を誘導するための方法であって、ａ）ｉ）ヒト幹細胞を含む細胞培養物；ｉｉ）ＳＭＡＤシグナル伝達およびＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の両方をブロックする第一インヒビターまたはインヒビターの組合せ；ｉｉｉ）ＦＧＦシグナル伝達をブロックする第二インヒビター；ｉｖ）ノッチシグナル伝達をブロックする第三インヒビター；ならびにｖ）Ｗｎｔシグナル伝達のアクチベーター、を提供すること、ｂ）前記幹細胞を、ＳＭＡＤシグナル伝達およびＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の両方をブロックする前記第一インヒビターまたはインヒビターの組合せと、インビトロで０〜４８時間（より典型的には１〜４８時間）接触させること、ならびにｃ）前記幹細胞を、ＦＧＦシグナル伝達をブロックする第二インヒビター；ノッチシグナル伝達をブロックする第三インヒビター；およびＷｎｔシグナル伝達のアクチベーターと、さらに１９２時間まで（またはさらには２４０時間まで）さらに接触させること、を含む方法を提供する。１つの実施形態では、前記第一インヒビターは、ＳＢ４３１５４２、ＬＤＮ１９３１８９、それらの組合せおよびそれらの混合物を含む群から選択される。１つの実施形態では、前記第二インヒビターは、ＳＵ５４０２およびその誘導体を含む。１つの実施形態では、前記第三インヒビターは、ＤＡＰＴおよびその誘導体を含む。１つの実施形態では、前記アクチベーターは、ＣＨＩＲ９９０２１およびその誘導体を含む。１つの実施形態では、前記幹細胞はヒト胚性幹細胞である。１つの実施形態では、前記幹細胞はヒト誘導多能性幹細胞である。１つの実施形態では、前記分化細胞はニューロン細胞である。１つの実施形態では、前記ニューロン細胞は侵害受容器である。１つの実施形態では、前記分化細胞は、ＩＳＬ１、ＢＲＮ３Ａ、ＲＥＴ、ＲＵＮＸ１およびＮＴＲＫ１を含む群からの１つ以上のマーカーを発現する。１つの実施形態では、前記分化細胞は外部刺激に応答する。
【００１２】
本発明は、本発明の方法によって生成される侵害受容器の使用をさらに企図する。１つの実施形態では、侵害受容器は、抗疼痛治療薬として使用できる化合物を同定するインビトロアッセイにおいて使用される。１つの実施形態では、侵害受容器は、侵害受容器の機能を検討するために使用される。１つの実施形態では、侵害受容器は、ＰＮＳの損傷または疾患に罹患しているかまたはその危険性がある動物におけるインビボでの細胞置換療法として使用される。
【００１３】
１つの実施形態では、本発明は、生物学的作用物質をスクリーニングする方法であって、ａ）ｉ）侵害受容器；およびｉｉ）試験化合物、を提供すること；ｂ）前記侵害受容器を前記試験化合物と接触させ、侵害受容器機能の活性化または阻害を測定すること、を含む方法を提供する。１つの実施形態では、前記侵害受容器はヒト幹細胞に由来する。
【００１４】
１つの実施形態では、本発明は、第一シグナル伝達インヒビター、第二シグナル伝達インヒビターおよび第三シグナル伝達インヒビターを含むキットであって、前記第一インヒビターはトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）／アクチビン−ノーダルシグナル伝達を低下させることができ、前記第二インヒビターはＳｍａｌｌ  Ｍｏｔｈｅｒｓ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ（ＳＭＡＤ）シグナル伝達を低下させることができ、そして前記第三インヒビターは、ウイングレス（ｗｉｎｇｌｅｓｓ（Ｗｎｔ））シグナル伝達の活性化のためにグリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（ＧＳＫ３β）を低下させることができる、キットを提供する。１つの実施形態では、前記第一インヒビターは、ＳＢ４３１５４２、その誘導体およびその混合物からなる群より選択される低分子である。１つの実施形態では、前記第二インヒビターは、ＬＤＮ１９３１８９、その誘導体およびその混合物からなる群より選択される低分子である。１つの実施形態では、前記第三インヒビターは、ＣＨＩＲ９９０２１およびその誘導体からなる群より選択される。１つの実施形態では、前記キットは、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）受容体ファミリーシグナル伝達を低下させる第四インヒビターをさらに含み、前記ＦＧＦ受容体ファミリーシグナル伝達には、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）受容体および血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）チロシンキナーゼ受容体が含まれる。１つの実施形態では、前記第四インヒビターは、ＳＵ５４０２およびその誘導体からなる群より選択される。１つの実施形態では、前記キットは、ノッチシグナル伝達を低下させることができる第五インヒビターをさらに含む。１つの実施形態では、前記第五インヒビターは、Ｎ−［Ｎ−（３，５−ジフルオロフェナセチル（ｄｉｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎａｃｅｔｙｌ））−Ｌ−アラニル］−Ｓ−フェニルグリシンｔ−ブチルエステル（ＤＡＰＴ）およびその誘導体からなる群より選択される。１つの実施形態では、前記キットは、ネスチン、
【００１５】
【化１】
2018139592.tif 000003
【００１６】
からなる群より選択されるタンパク質の発現の検出のために使用される抗体をさらに含む。１つの実施形態では、前記キットは、ネスチン、
【００１７】
【化２】
2018139592.tif 000004
【００１８】
からなる群より選択される遺伝子のｍＲＮＡ発現の検出のためのＰＣＲプライマーをさらに含む。１つの実施形態では、前記キットは、プロタキキニン−１（Ｐｒｏｔａｃｈｙｋｉｎｉｎ−１（ＴＡＣ１））、小胞グルタミン酸輸送体２（ＶＧＬＵＴ２）および溶質キャリアファミリー１５メンバー３（ｓｏｌｕｔｅ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｆａｍｉｌｙ  １５，  ｍｅｍｂｅｒ  ３（ＳＬＣ１５Ａ３））からなる群より選択されるタンパク質の発現の検出のために使用される抗体をさらに含む。１つの実施形態では、前記キットは、プロタキキニン−１（ＴＡＣ１）、小胞グルタミン酸輸送体２（ＶＧＬＵＴ２）および溶質キャリアファミリー１５メンバー３（ＳＬＣ１５Ａ３）からなる群より選択される遺伝子のｍＲＮＡ発現の検出のためのＰＣＲプライマーをさらに含む。１つの実施形態では、前記キットは、第三インヒビターを添加する２日前に第一および第二インヒビターを添加するための工程が含まれる指示書をさらに含む。１つの実施形態では、前記キットは、前記第三インヒビター、前記第四インヒビターおよび前記第五インヒビターの組合せを添加する２日前に第一および第二インヒビターを添加するための工程が含まれる指示書をさらに含む。１つの実施形態では、前記キットは、０〜１０日目に前記インヒビターを順々に毎日供給するための工程が含まれる指示書をさらに含む。１つの実施形態では、前記キットは、神経幹細胞前駆体を作製するための工程および侵害受容器細胞を作製するための工程が含まれる指示書をさらに含む。１つの実施形態では、前記キットはヒト幹細胞をさらに含む。１つの実施形態では、前記ヒト幹細胞はヒト胚性幹細胞である。１つの実施形態では、前記ヒト幹細胞はヒト誘導多能性幹細胞である。１つの実施形態では、前記ヒト幹細胞はトランスジェニックＳＯＸ１０：：ＧＦＰ細菌人工染色体（ＢＡＣ）ヒト多能性（ｐｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞（ｈＰＳＣ）である。
【００１９】
１つの実施形態では、本発明は、幹細胞の定方向性分化を誘導するための方法であって、ａ）ｉ）ヒト幹細胞を含む細胞培養物；およびｉｉ）第一シグナル伝達インヒビター、第二シグナル伝達インヒビターおよび第三シグナル伝達インヒビター（但し、前記第一インヒビターはトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）／アクチビン−ノーダルシグナル伝達を低下させることができ、前記第二インヒビターはＳｍａｌｌ  Ｍｏｔｈｅｒｓ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ（ＳＭＡＤ）シグナル伝達を低下させることができ、そして前記第三インヒビターは、ウイングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達の活性化のためにグリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（ＧＳＫ３β）を低下させることができる）を提供すること；ｂ）前記幹細胞を前記第一インヒビターおよび前記第二インヒビターとインビトロで４８時間まで（またはさらには９６時間まで）接触させること；ならびにｃ）幹細胞の定方向性分化を誘導するために前記阻害された幹細胞を前記第三インヒビターとさらに１９２時間まで（またはさらには２４０時間まで）さらに接触させること、を含み、前記分化幹細胞が、神経堤幹細胞、神経堤系列細胞およびニューロン系列細胞からなる群より選択される、方法を提供する。１つの実施形態では、前記第一インヒビターは、ＳＢ４３１５４２、その誘導体およびその混合物からなる群より選択される低分子である。１つの実施形態では、前記第二インヒビターは、ＬＤＮ１９３１８９、その誘導体およびその混合物からなる群より選択される低分子である。１つの実施形態では、前記第三インヒビターは、ＣＨＩＲ９９０２１およびその誘導体からなる群より選択される。１つの実施形態では、前記キットは、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）受容体ファミリーシグナル伝達を低下させる第四インヒビターをさらに含み、前記ＦＧＦ受容体ファミリーシグナル伝達には、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）受容体および血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）チロシンキナーゼ受容体が含まれる。１つの実施形態では、前記第四インヒビターは、ＳＵ５４０２およびその誘導体からなる群より選択される。１つの実施形態では、前記キットは、ノッチシグナル伝達を低下させることができる第五インヒビターをさらに含む。１つの実施形態では、前記第五インヒビターは、Ｎ−［Ｎ−（３，５−ジフルオロフェナセチル）−Ｌ−アラニル］−Ｓ−フェニルグリシンｔ−ブチルエステル（ＤＡＰＴ）およびその誘導体からなる群より選択される。１つの実施形態では、前記キットは、ニューロン系列細胞のペプチド作動性侵害受容器細胞への定方向性分化のために、第四インヒビターおよび第五インヒビターをさらに含み、前記第四インヒビターはＳＵ５４０２およびその誘導体からなる群より選択され、前記第五インヒビターはＮ−［Ｎ−（３，５−ジフルオロフェナセチル）−Ｌ−アラニル］−Ｓ−フェニルグリシンｔ−ブチルエステル（ＤＡＰＴ）およびその誘導体からなる群より選択される。１つの実施形態では、前記ペプチド作動性侵害受容器細胞は、ＯＣＴ４、ＤＬＫ１、ＰＡＸ６、ＳＯＸ１０、ＰＯＵ４Ｆ１（ＢＲＮ３Ａ）、ＩＳＬ１、ＮＥＵＲＯＧ２、ＮＥＵＲＯＧ���、ＮＴＲＫ１、ＲＥＴ、ＲＵＮＸ１、ＶＧＬＵＴ２、ＴＡＣ１およびＴＲＰＶ１からなる群より選択されるマーカーを発現する。１つの実施形態では、前記ペプチド作動性侵害受容器細胞は、ＩＳＬ１、ＰＯＵ４Ｆ１（ＢＲＮ３Ａ）、ＲＥＴ、ＲＵＮＸ１およびＮＴＲＫ１からなる群より選択されるマーカーを発現する。１つの実施形態では、前記マーカーは、タンパク質および核酸からなる群より選択される。１つの実施形態では、前記ペプチド作動性侵害受容器細胞は、サブスタンスＰおよびカルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）を共発現する。１つの実施形態では、前記ペプチド作動性侵害受容器細胞は外部刺激に応答して活動電位を生じさせ、前記外部刺激は電流である。１つの実施形態では、前記分化したペプチド作動性侵害受容器細胞は、前記幹細胞を前記第一インヒビターおよび前記第二インヒビターと接触させた後８〜１８日以内、より典型的には１０〜１５日以内に高度に富化されたニューロンの集団内に存在する。１つの実施形態では、前記幹細胞はヒト胚性幹細胞である。１つの実施形態では、前記幹細胞はヒト誘導多能性幹細胞である。
【００２０】
１つの実施形態では、本発明は、生物学的作用物質をインビトロでスクリーニングする方法であって、ａ）ｉ）幹細胞の定方向性分化からインビトロで誘導される侵害受容器細胞；およびｉｉ）試験化合物、を提供すること；ならびにｂ）前記侵害受容器細胞を前記試験化合物と接触させ、侵害受容器機能を測定すること（但し、前記機能は活動電位の測定値である）を含む方法を提供する。１つの実施形態では、前記侵害受容器細胞は、ヒト幹細胞に由来する。
【００２１】
１つの実施形態では、本発明は、メラノサイトの定方向性分化のためのキットを提供する。
【００２２】
１つの実施形態では、本発明は、メラノサイトの定方向性分化のための方法を提供する。
【００２３】
１つの実施形態では、本発明は、メラノサイト系列の細胞集団を提供するための方法を提供する。
【００２４】
１つの実施形態では、本発明は、成熟メラノサイト細胞集団を提供するための方法を提供する。
【００２５】
定義
本明細書で使用される場合、「キット」という用語は、物質を送達するための任意の送達システムを指す。細胞分化に関連して、キットは、幹細胞と接触させるための物質の組合せを指してもよく、そのような送達システムは、適切な容器（例えばチューブ等）中での反応試薬（例えば化合物、タンパク質、検出試薬（ＰＡＸ６抗体など）等）および／または支持物質（例えば緩衝液、細胞分化を実施するための指示文書等）の貯蔵、輸送または送達（１つの場所から別の場所への）を可能にするシステムを含む。例えば、キットは、シグナル伝達経路を阻害するための関連反応試薬、例えば、ＳＢ４３１５４２（もしくはＳＢ４３１５４２代替物）等のようなトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）／アクチビン−ノーダルシグナル伝達を低下させるためのインヒビター、ＳＭＡＤシグナル伝達を低下させるためのインヒビターである、ＬＤＮ１９３１８９（もしくはＬＤＮ１９３１８９代替物）等、ＣＨＩＲ９９０２１（もしくはＣＨＩＲ９９０２１代替物）等のような、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（ＧＳＫ３β）を低下させるためのインヒビター、一例として、β−カテニンのシグナル伝達抑制についての、さもなければＷＮＴシグナル伝達アクチベーター（ＷＮＴアゴニスト）として知られるウイングレス（ＷｎｔもしくはＷｎｔｓ）シグナル伝達の活性化のためのインヒビター、ＳＵ５４０２（もしくはＳＵ５４０２代替物）等のような、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）受容体ファミリーシグナル伝達を低下させることを含む、ＦＧＦ受容体ファミリーシグナル伝達のインヒビター（但し、前記ＦＧＦ受容体ファミリーシグナル伝達には、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）受容体および血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）チロシンキナーゼ受容体シグナル伝達が含まれる）、ＤＡＰＴ（もしくはＤＡＰＴ代替物）等のような、ノッチシグナル伝達のインヒビター、ならびに／または支持物質を含む、１つ以上の筺体（例えば箱もしくはバッグ、試験管、エッペンドルフ管、毛細管、マルチウエルプレート等）を含む。１つの実施形態ではキット中の試薬は、溶液中に存在してもよく、凍結されていてもよく、または凍結乾燥されていてもよい。１つの実施形態ではキット中の試薬は、個別の容器中に存在してもよく、またはＬＳＢ、３ｉ、ＣＨＩＲ、Ｍｅｌ試薬等の組合せのような特定の組合せとして提供されてもよい。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「シグナル伝達タンパク質」に関する「シグナル伝達」という用語は、膜受容体タンパク質へのリガンド結合または何らかの他の刺激によって活性化されるかまたはさもなければ影響されるタンパク質を指す。シグナル伝達タンパク質の例には、ＳＭＡＤ、β−カテニンを含むＷＮＴ複合体タンパク質、ノッチ、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）、アクチビン、ノーダルおよびグリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（ＧＳＫ３β）タンパク質が含まれる。多くの細胞表面受容体または細胞内受容体タンパク質に関して、リガンド−受容体相互作用は細胞の応答と直接結びついてはいない。リガンド活性化受容体は、細胞挙動へのリガンドの最終的な生理的作用が生じる前に、最初に細胞の内部で他のタンパク質と相互作用しなければならない。しばしば、いくつかの相互作用性細胞タンパク質の一連の挙動は、受容体の活性化または阻害後に変化する。受容体活性化によって誘導される細胞変化の全体のセットがシグナル伝達機構またはシグナル伝達経路と呼ばれる。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「ノッチ」という用語は、少なくとも４つのノッチ受容体（ノッチ−１、−２、−３および−４と称される）の１つ以上に結合する少なくとも５つのリガンド（例えばＪａｇｇｅｄ−１、−２ならびにＤｅｌｔａ様（Ｄｌｌ）−１、−３および−４と称される）によって表されるシグナル伝達経路を指す。ノッチシグナル伝達は、ＴＡＣＥ（ＴＮＦα変換酵素）および／またはγセクレターゼ／プレセニリン複合体による少なくとも１つのタンパク質分解切断を生じさせる受容体−リガンド相互作用によって開始される。このタンパク質分解切断は、細胞内ドメインタンパク質（ＮＩＣ、ノッチの機能的活性形態）の放出を生じさせ、前記タンパク質は核に移行して、ＤＮＡ結合タンパク質であるＣＢＦ−１（ＣＳＬまたはＲＢＰ−Ｊκとも称される）に結合する。ＮＩＣのＣＢＦ−１への結合は、リプレッサー複合体を移動させ、ＣＢＦ−１を転写活性化因子に変換するＭＡＭＬ１およびヒストンアセチルトランスフェラーゼなどの核内コアクチベータをリクルートする。ＣＢＦ−１／ノッチ相互作用は、一例として、Ｈｅｓ（ヘアリー／エンハンサー・オブ・スプリット（Ｈａｉｒｙ／Ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｏｆ  Ｓｐｌｉｔ））、Ｈｅｙ（ＹＲＰＷと関連するヘアリー／エンハンサー・オブ・スプリット）（ＨｅｓＲ、ＨＲＴ、ＨＥＲＰ、ＣＨＦおよびグリッドロックとしても知られる）、ＮＦ−κＢおよびＰＰＡＲファミリーの転写因子、およびｐ２ｌＣＩＰ１／ＷＡＦ１およびサイクリンＤなどの細胞周期調節因子を含む、様々な標的遺伝子の発現を生じさせる。Ｈｅｓ（Ｈｅｓ−１を含む）およびＨｅｙ（Ｈｅｙ１およびＨｅｙ２を含む）ファミリーメンバーは、ノッチ活性化の直接の下流標的である転写因子の例である。ノッチシグナル伝達経路の複雑さを考慮すると、当然ながらノッチ活性化または阻害の結果を予測することは困難である。多数のノッチ受容体およびリガンド（各々が独自の発現パターンを有する）が存在するだけでなく、数多くの標的遺伝子およびノッチと他のシグナル伝達カスケードとの間の潜在的クロストークがこのシステムをさらに複雑にする。
【００２８】
本明細書で使用される場合、「シグナル」という用語は、細胞の構造および機能の変化を制御する内部および外部因子を指す。それらは化学的または物理的性質がある。
【００２９】
本明細書で使用される場合、「リガンド」という用語は、受容体（Ｒ）に結合する分子およびタンパク質を指し、その例には、トランスフォーミング増殖因子β、アクチビン、ノーダル、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）等が含まれるが、これらに限定されない。
【００３０】
本明細書で使用される場合、シグナル伝達分子もしくはシグナル伝達分子の経路を阻害することに関する「インヒビター」という用語、またはＳＭＡＤシグナル伝達のインヒビターなどの「シグナル伝達インヒビター」という用語は、分子または経路のシグナル伝達機能を妨げる（すなわち低減するか、または抑制するか、または排除するか、またはブロックする）化合物または分子（例えば低分子、ペプチド、ペプチドミメティック、天然化合物、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、アプタマーまたは抗体）を指す。言い換えると、インヒビターは、指定されるタンパク質（シグナル伝達分子、指定されるシグナル伝達分子に関与する任意の分子、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（ＧＳＫ３β）などの指定される関連分子）（例えば本明細書で述べるシグナル伝達分子を含むが、これらに限定されない）の任意の活性を変化させる任意の化合物または分子であって、一例として、ＳＭＡＤシグナル伝達と直接接触すること、ＳＭＡＤ  ｍＲＮＡと接触すること、ＳＭＡＤのコンフォメーション変化を生じさせること、ＳＭＡＤタンパク質レベルを低下させること、またはＳＭＡＤとシグナル伝達パートナー（例えば本明細書で述べるものを含む）との相互作用を妨げること、およびＳＭＡＤ標的遺伝子（例えば本明細書で述べるもの）の発現に影響を及ぼすことを介して、任意の活性を変化させる任意の化合物または分子である。インヒビターはまた、上流のシグナル伝達分子を遮断することによってＳＭＡＤの生物学的活性を間接的に調節する分子を含む。例えば、シグナル伝達分子および作用の例として、細胞外ドメイン内で、骨形成タンパク質を隔離し、ＡＬＫ受容体１、２、３および６の活性化を阻害し、したがって下流のＳＭＡＤ活性化を阻止する、ノギンが挙げられる。同じく、コーディン（Ｃｈｏｒｄｉｎ）、サーベラス（Ｃｅｒｂｅｒｕｓ）、フォリスタチン（Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ）も、同様にＳＭＡＤシグナル伝達の細胞外アクチベーターを隔離する。膜貫通タンパク質であるＢａｍｂｉも、細胞外ＴＧＦβシグナル伝達分子を隔離する偽受容体として働く。アクチビン、ノーダル、ＴＧＦβおよびＢＭＰをブロックする抗体は、ＳＭＡＤシグナル伝達の細胞外アクチベーターを中和するための使用等に関して考慮される。したがって１つの実施形態では、本発明のインヒビターは、デフォルト細胞（ｄｅｆａｕｌｔ  ｃｅｌｌ）型から非デフォルト細胞（ｎｏｎ−ｄｅｆａｕｌｔ  ｃｅｌｌ）型へと分化を誘導する（変化させる）かまたは改変する。例えば、本発明の方法の１つは、非デフォルト神経前駆細胞を生じさせる少なくとも３つのインヒビターを含む。好ましい実施形態では、本発明のインヒビターは、本発明の侵害受容器細胞を生産するために本明細書で述べるように、非デフォルト細胞型へと細胞分化を向かわせるためにデフォルトシグナル伝達を「改変する」または「低下させる」または「ブロックする」。したがって、本発明のインヒビターは、本発明の侵害受容器細胞を生産するのに役立つシグナル分子活性の上昇または低下のための天然化合物または低分子である。インヒビターは、指定シグナル伝達分子から上流の分子に結合して影響を及ぼすこと（次に指定分子の阻害を生じさ���ることになる）によって誘導される阻害に加えて、競合的阻害（別の公知の結合化合物の結合を排除または低減するように活性部位に結合する）およびアロステリック阻害（化合物がそのタンパク質の活性部位に結合するのを妨げるようにタンパク質のコンフォメーションを変化させるように、タンパク質に結合する）の観点から説明される。一部の場合には、インヒビターは、実際にシグナル伝達標的と接触することによってシグナル伝達標的またはシグナル伝達標的経路を阻害することを指す「直接インヒビター」と称される；例えば、γセクレターゼの直接インヒビターは、γセクレターゼタンパク質に結合するＤＡＰＴ分子である。例示的な直接インヒビターには、リドカイン、ミリシトリン、慢性カプサイシン（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｃａｐｓａｉｃｉｎ）、ショウノウ、アミロライド、カプサゼピン、リノピルジン、および全般的な神経機能をブロックする大部分の局所麻酔薬が含まれるが、これらに限定されない。
【００３１】
本明細書で使用される場合、「細胞外シグナル伝達の影響」という用語は、細胞外シグナル伝達分子（例えば、本明細書で述べる低分子などの試験物質、薬学的薬剤、受容体に対するリガンド、サイトカイン、ケモカイン、可溶性因子、接着分子または他のシグナル伝達分子）が細胞（例えば真核細胞）に及ぼす作用を指す。一部の実施形態では、細胞外シグナル伝達は、ＳＭＡＤ活性などのシグナル伝達活性を低減し、ＳＭＡＤ活性化動態を改変し、またはＳＭＡＤ標的遺伝子の発現パターンを改変する。
【００３２】
本明細書で使用される場合、「Ｓｍａ  Ｍｏｔｈｅｒｓ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ」または「Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｔｈｅｒｓ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ」または「ＳＭＡＤ」という用語は、シグナル伝達分子を指す。
【００３３】
本明細書で使用される場合、「アクチベーター」、「活性化すること」という用語は、本発明の細胞の定方向性分化を生じさせる分子を活性化するための化合物を指す。例示的なアクチベーターには、有害な熱／低温、機械的刺激、化学的刺激（メントール、ピペリン、急性カプサイシン、シンナムアルデヒド、ブラジキニン、ＡＴＰ、プロスタグランジン、炎症性サイトカイン、酸性生理食塩水、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）等）が含まれるが、これらに限定されない。
【００３４】
本明細書で使用される場合、「ＬＳＢ」という用語は、細胞においてトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）／アクチビン−ノーダルシグナル伝達およびＳｍａｌｌ  Ｍｏｔｈｅｒｓ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ（ＳＭＡＤ）シグナル伝達からなるシグナル伝達を低下させるかまたはブロックすることができる２つの化合物ＬＤＮ−１９３１８９およびＳＢ４３１５４２の組合せを指す。
【００３５】
本明細書で使用される場合、「ＳＢ４３１５４２」という用語は、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）／アクチビン−ノーダルシグナル伝達を低下させるかまたはブロックすることができる分子であって、ＣＡＳ番号３０１８３６−４１−９、分子式Ｃ２２Ｈ１８Ｎ４Ｏ３、および４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−ベンズアミドの名称を有する分子を指し、例えば、以下の構造を参照のこと。
【００３６】
【化３】
2018139592.tif 000005
【００３７】
本明細書で使用される場合、「ＬＤＮ１９３１８９」という用語は、Ｃ２５Ｈ２２Ｎ６の化学式を有する、低分子ＤＭ−３１８９、ＩＵＰＡＣ名称４−（６−（４−（ピペラジン−１−イル）フェニル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−３−イル）キノリンを指す。ＬＤＮ１９３１８９はＳＭＡＤシグナル伝達インヒビターとして機能することができる。ＬＤＮ１９３１８９はまた、ＡＬＫ２、ＡＬＫ３およびＡＬＫ６、プロテインチロシンキナーゼ（ＰＴＫ）の極めて強力な低分子インヒビターであり、Ｉ型ＴＧＦβ受容体のＡＬＫ１およびＡＬＫ３ファミリーのメンバーのシグナル伝達を阻害し、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７およびアクチビンサイトカインシグナルを含む多数の生物学的シグナルの伝達、ならびにその後のＳｍａｄ１、Ｓｍａｄ５およびＳｍａｄ８のＳＭＡＤリン酸化の阻害を生じさせる（参照により本明細書に組み込まれる、Ｙｕら（２００８）Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １４：１３６３−１３６９；Ｃｕｎｙら（２００８）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１８：４３８８−４３９２）。
【００３８】
【化４】
2018139592.tif 000006
【００３９】
本明細書で使用される場合、「ドルソモルフィン」という用語は、ＣＡＳ番号８６６４０５−６４−３、分子式Ｃ２４Ｈ２５Ｎ５Ｏおよび６−［４−［２−（１−ピペリジニル）エトキシ］フェニル］−３−（４−ピリジニル）−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジンジヒドロクロリドの名称を有する分子を指し、例えば、以下の構造を参照のこと。
【００４０】
【化５】
2018139592.tif 000007
【００４１】
本明細書で使用される場合、「ＬＳＢ／Ｃ」または「ＬＳＢ−Ｃ」という用語は、ＷＮＴアゴニストとして働くグリコーゲンシンターゼキナーゼ３βインヒビター、例えばＣＨＩＲ９９０２１に加えて、細胞のトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）／アクチビン−ノーダルシグナル伝達およびＳｍａｌｌ  Ｍｏｔｈｅｒｓ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ（ＳＭＡＤ）シグナル伝達からなるシグナル伝達を組合せで低下させるかまたはブロックすることができる、ＬＤＮ−１９３１８９とＳＢ４３１５４２などの２つの化合物の組合せを指す。
【００４２】
本明細書で使用される場合、「グリコーゲンシンターゼキナーゼ３βインヒビター」または「ＧＳＫ３βインヒビター」という用語は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β酵素を阻害する化合物を指し、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｄｏｂｌｅら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．２００３；１１６：１１７５−１１８６参照。本発明の目的に関して、ＧＳＫ３βインヒビターはＷＮＴシグナル伝達経路を活性化することができ、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｃａｄｉｇａｎら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．２００６；１１９：３９５−４０２；Ｋｉｋｕｃｈｉら、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ．２００７；１９：６５９−６７１参照。
【００４３】
本明細書で使用される場合、「ＣＨＩＲ９９０２１」または「アミノピリミジン」または「３−［３−（２−カルボキシエチル）−４−メチルピロール−２−メチリデニル］−２−インドリノン」という用語は、ＩＵＰＡＣ名称６−（２−（４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）ピリミジン−２−イルアミノ）エチルアミノ）ニコチノニトリルを指す。ＣＴ９９０２１は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（ＧＳＫ３β）の低分子化学的インヒビター／ＷＮＴシグナル伝達経路のアクチベーターの一例であり、高度に選択的であって、関連するキナーゼと無関係なキナーゼのパネルに対して千倍に近い選択性を示し、ヒトＧＳＫ３βに対してはＩＣ５０＝６．７ｎＭおよびげっ歯動物ＧＳＫ３βホモログに対してはナノモルのＩＣ５０値を有する。
【００４４】
【化６】
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【００４５】
本明細書で使用される場合、「３つのインヒビター」または「３ｉ」という用語は、３つの低分子ＣＨＩＲ９９０２１、ＳＵ５４０２およびＤＡＰＴの組合せを指す。他の実施形態では、３つのインヒビターは、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（ＧＳＫ３β）の阻害／ＷＮＴシグナル伝達のアクチベーター（すなわちＷＮＴアゴニスト）、ノッチシグナル伝達インヒビター、すなわちノッチシグナル伝達を低下させることができるγセクレターゼインヒビター、および線維芽細胞増殖因子受容体の阻害（すなわちインドリノン誘導体は線維芽細胞増殖因子受容体インヒビターの一例である）の組み合わせ阻害ができる、３つの化合物（すなわち低分子）の組合せを指す。
【００４６】
【化７】
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【００４７】
本明細書で使用される場合、「ノッチインヒビター」または「ノッチシグナル伝達インヒビター」という用語は、ＤＡＰＴ、γセクレターゼインヒビター（ＧＳＩ）、例えばトリペプチドアルデヒドインヒビター、γセクレターゼインヒビターＸＩＩおよびペプチドミメティックインヒビター（ＬＹ−４１１，５７５）などの、ノッチ活性化を阻害する能力を有する任意の化合物を指す。
【００４８】
本明細書で使用される場合、「γセクレターゼインヒビター」または「ＧＳＩ」という用語は、下流のノッチシグナル伝達の抑制を生じさせる、ノッチ分子の活性ドメインの生成を防ぐ新規クラスの作用物質を指す。
【００４９】
本明細書で使用される場合、「γセクレターゼインヒビター」という用語は、マルチサブユニット膜貫通プロテアーゼであるγセクレターゼを阻害する能力を有する化合物を指す。γセクレターゼの標的（すなわち基質）の一例は、例えば、ノッチシグナル伝達であり、他のγセクレターゼ基質には、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体関連タンパク質、Ｅ−カドヘリンおよびＥｒｂＢ−４が含まれる。ＤＡＰＴ、γセクレターゼインヒビターＸＩＩなどのγセクレターゼインヒビターは、それゆえ、ノッチを含むそのようなγセクレターゼ基質のタンパク質分解をブロックする。
【００５０】
本明細書で使用される場合、「ＤＡＰＴ」という用語は、Ｃ２３Ｈ２６Ｆ２Ｎ２Ｏ４の化学式を有する、Ｎ−［（３，５−ジフルオロフェニル）アセチル］−Ｌ−アラニル−２−フェニル］グリシン−１，１−ジメチルエチルエステル；ＬＹ−３７４９７３、Ｎ−［Ｎ−（３，５−ジフルオロフェナセチル）−Ｌ−アラニル］−Ｓ−フェニルグリシンｔ−ブチルエステル；Ｎ−［Ｎ−（３，５−ジフルオロフェナセチル）−Ｌ−アラニル］−Ｓ−フェニルグリシンｔ−ブチルエステルとしても知られる、ジペプチド性γセクレターゼ特異的インヒビターと表される、ノッチを阻害するγセクレターゼインヒビターの一例を指す。
【００５１】
【化８】
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【００５２】
ＤＡＰＴ誘導体の一例は、光活性化可能なＤＡＰＴ誘導体、ＤＡＰ−ＢｐＢ（Ｎ−［Ｎ−（３，５−ジフルオロフェナセチル）−Ｌ−アラニル］−（Ｓ）−フェニルグリシン−４−（４−（８−ビオチンアミド）オクチルアミノ）ベンゾイル）ベンジル）メチルアミド）である。
【００５３】
本明細書で使用される場合、「線維芽細胞増殖因子受容体インヒビター」または「ＦＧＦＲインヒビター」という用語は、ＳＵ５４０２、ＰＤ１７３０７４等のような低分子を指す。ＦＧＦＲインヒビターの一例は、インドリノン誘導体ＳＵ５４０２であり、例示的な構造を以下に示す。
【００５４】
【化９】
2018139592.tif 000011
【００５５】
本明細書で使用される場合、「ＳＵ５４０２」という用語は、Ｃ１７Ｈ１６Ｎ２Ｏ３の化学式および化学名：２−［（１，２−ジヒドロ−２−オキソ−３Ｈ−インドール−３−イリデン）メチル］−４−メチル−１Ｈ−ピロール−３−プロパン酸を有する低分子を指す（参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｕｎら（１９９９）Ｄｅｓｉｇｎ，ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  ３−［（３−  ｏｒ  ４−ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌｐｙｒｒｏｌ−２−ｙｌ）ｍｅｔｈｙｌｉｄｅｎｙｌ］ｉｎｄｏｌｉｎ−２−ｏｎｅｓ  ａｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ＶＥＧＦ，ＦＧＦ  ａｎｄ  ＰＤＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅｓ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４２  ５１２０；Ｐａｔｅｒｓｏｎら（２００４）Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３  ａｓ  ａ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ．Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．１２４  ５９５；Ｔａｎａｋａら（２００５）ＦＧＦ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ  ａｎｄ  ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｉｎ  ｌｅｆｔｗａｒｄ  ｎｏｄａｌ  ｆｌｏｗ  ｉｓ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｆｏｒ  ｌｅｆｔ−ｒｉｇｈｔ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ４３５：１７２）。
【００５６】
本明細書で使用される場合、「誘導体」という用語は、類似のコア構造を有する化学化合物を指す。
【００５７】
本明細書で使用される場合、リガンドに関する「ＷＮＴ」または「ウイングレス」という用語は、ＦｒｉｚｚｌｅｄおよびＬＲＰＤｅｒａｉｌｅｄ／ＲＹＫ受容体ファミリーの中の受容体のような、ＷＮＴ受容体と相互作用することができる分泌タンパク質の群（すなわちヒトにおけるＩｎｔ１（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  １））を指す。
【００５８】
本明細書で使用される場合、シグナル伝達経路に関する「ＷＮＴ」または「ウイングレス」という用語は、β−カテニンで媒介されるかまたはβ−カテニンを含まない、ＷｎｔファミリーリガンドおよびＷｎｔファミリー受容体（ＦｒｉｚｚｌｅｄおよびＬＲＰＤｅｒａｉｌｅｄ／ＲＹＫ受容体など）からなるシグナル経路を指す。本明細書で述べる目的に関して、好ましいＷＮＴシグナル伝達経路は、β−カテニンによる媒介、すなわちＷＮＴ／β−カテニンを含む。
【００５９】
【化１０】
2018139592.tif 000012
【００６０】
本明細書で使用される場合、「ＰＤ  １７３０７４」という用語は、化学名：Ｎ−［２−［［４−（ジエチルアミノ）ブチル］アミノ］−６−（３，５−ジメトキシフェニル）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル］−Ｎ’−（１，１−ジメチルエチル）尿素を有する低分子を指す（参照により本明細書に組み込まれる、Ｂａｎｓａｌら（２００３）Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ＦＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ：ＦＧＦ−２−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ＭＡＰＫ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｒｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ  ｂｙ  ＰＤ  １７３０７４  ｉｎ  ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ−ｌｉｎｅａｇｅ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．７４：４８６）。
【００６１】
本明細書で使用される場合、組成物およびこの組成物を使用する方法に関する「ＬＳＢ−３ｉ」または「ＬＳＢ３ｉ」という用語は、侵害受容器を生じさせるニューロン系列細胞の定方向性分化に関して本明細書で述べる例示的な方法において使用されるような、ニューロン系列細胞を産生することができるＬＳＢ分子（または等価物）の組合せおよびニューロン系列細胞の定方向性分化の能力を有する３ｉ分子（または等価物）を指す。
【００６２】
本明細書で使用される場合、「骨形成タンパク質」または「ＢＭＰ」という用語は、ＴＧＦβスーパーファミリーのタンパク質中の、配列相同性に基づきＧＤＦ（増殖／分化因子）を含む、ＢＭＰサブファミリーのメンバーであるタンパク質および対応する遺伝子を指す（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｙａｍａｓｈｉｔａら（１９９６）Ｂｏｎｅ  １９：５６９参照）。ＢＭＰの例には、ＢＭＰ１、ＢＭＰ２等が含まれる。ＢＭＰ／ＧＤＦは、アミノ酸配列相同性に基づきサブセットに分類される。分類は：１）ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−４；２）ＢＭＰ−３およびＢＭＰ−３ｂ；３）ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７およびＢＭＰ−８；４）ＢＭＰ−９およびＢＭＰ−１０；５）ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３およびＢＭＰ−１４；ならびに６）ＢＭＰ−１１およびＧＤＦ−８と提案される（例えば、そのすべてが参照により本明細書に組み込まれる、Ｙａｍａｓｈｉｔａら（１９９６）Ｂｏｎｅ  １９：５６９，Ｈｏｇａｎ（１９９６）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１０：１５８０，Ｍｅｈｌｅｒら（１９９７）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０：３０９，Ｅｂｅｎｄａｌら（１９９８）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．５１：１３９参照）。ＴＧＦβスーパーファミリーのリガンドには、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、増殖および分化因子（ＧＤＦ）、抗ミュラーホルモン（ＡＭＨ）、アクチビン、ノーダル、ＴＧＦβ等のような分子が含まれる。ＴＧＦβファミリーには：ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３が含まれる。ＢＭＰと同様に、ＴＧＦβは胚形成および細胞分化に関与するが、それらはまた、アポトーシスおよび他の機能にも関与する。それらはＴＧＦβ受容体２型（ＴＧＦＢＲ２）に結合する。
【００６３】
本明細書で使用される場合、「骨形成タンパク質受容体」または「骨形成タンパク質受容体ＩＩ型」または「ＢＭＰＲ２」という用語は、骨形成タンパク質に結合するセリン／トレオニンキナーゼ受容体を指す。
【００６４】
本明細書で使用される場合、「ＬＳＢ−Ｍｅｌ」という用語は、特異的マーカー、すなわちｃ−ｋｉｔの発現に基づいて同定され、単離される、メラノサイト前駆細胞（メラノサイト前駆体）を生産するための、細胞のＬＳＢ／Ｃ処理とそれに続くＢＭＰ４およびエンドセリン−３（ＥＤＮ３）との接触を含む、定方向性分化組成物および方法を指す。
【００６５】
本明細書で使用される場合、「成熟色素性メラノサイト」という用語は、色素性メラノソームを産生する色素細胞、例えばＢＭＰ４およびｃＡＭＰと接触させた本発明のメラノサイト前駆細胞を指す。
【００６６】
本明細書で使用される場合、「胚性幹細胞」という用語は、培養下で長期間分化せずに分裂することができる、着床前段階の胚から誘導され、３つの一次胚葉の細胞および組織へと発生することが公知である、原始（未分化）細胞を指す。ヒト胚性幹細胞は、ヒトである胚性幹細胞、例えばＷＡ−０９を指す。
【００６７】
本明細書で使用される場合、「胚性幹細胞系」という用語は、数日間、数か月間から数年間まで分化せずに増殖することが可能である、インビトロ条件下で培養された胚性幹細胞の集団を指す。
【００６８】
本明細書で使用される場合、「幹細胞」という用語は、培養下で無限に分裂し、特異化した細胞を生じさせる能力を有する細胞を指す。ヒト幹細胞は、ヒトである幹細胞を指す。
【００６９】
本明細書で使用される場合、「ヒト胚性幹細胞」または「ｈＥＳＣ」という用語は、培養下で長期間分化せずに分裂することができ、３つの一次胚葉の細胞および組織へと発生することが公知である、初期ヒト胚（胚盤胞段階まで、および胚盤胞段階を含む）に由来する多能性幹細胞の一種を指す。
【００７０】
本明細書で使用される場合、「全能性（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔ）」という用語は、身体のすべての細胞型および胎盤などの胚体外組織を構成するすべての細胞型を生じさせる能力を指す。（多能性および多分化能性も参照のこと）。
【００７１】
本明細書で使用される場合、「多分化能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）」という用語は、身体の２つ以上の細胞型へと発生する能力を指す。多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）および全能性も参照のこと。
【００７２】
本明細書で使用される場合、「多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）」という用語は、内胚葉、中胚葉および外胚葉を含む生物の３つの発生胚葉へと発生する能力を指す。
【００７３】
本明細書で使用される場合、「体性（成体）幹細胞」という用語は、自己再生（実験室における）および分化の両方について限られた能力を有する、多くの器官および分化組織で認められる比較的まれな未分化細胞を指す。そのような細胞の分化能力は様々であるが、通常は起源の器官における細胞型に限定される。
【００７４】
本明細書で使用される場合、「体細胞」という用語は、配偶子（卵子または精子）以外の身体中の任意の細胞を指し、時として「成体」細胞と称される。
【００７５】
本明細書で使用される場合、「ニューロン系列細胞」という用語は、発生の間または成体において神経系（中枢および末梢の両方）または神経堤細胞運命に寄与する細胞を指す。神経系には、脳、脊髄および末梢神経系が含まれる。神経堤細胞運命には、脳神経、体幹神経、迷走神経、仙骨神経および心臓神経が含まれ、中外胚葉、頭軟骨、頭蓋骨、胸腺、歯、メラノサイト、虹彩色素細胞、脳神経節、脊髄神経節、交感／副交感神経節、内分泌細胞、腸神経系および心臓の部分を生じさせる。
【００７６】
本明細書で使用される場合、「誘導多能性幹細胞」または「ｉＰＳＣ」という用語は、特定の胚性遺伝子（ＯＣＴ４、ＳＯＸ２およびＫＬＦ４導入遺伝子など）（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、ＴａｋａｈａｓｈｉとＹａｍａｎａｋａ、Ｃｅｌｌ  １２６，６６３−６７６（２００６）参照）が体細胞、例えばＣ１４、Ｃ７２等に導入されることによって形成される、胚性幹細胞に類似した、多能性幹細胞の一種を指す。
【００７７】
本明細書で使用される場合、「特異化した細胞」という用語は、多細胞生物において特定の機能を果たす細胞の種類を指す。例えば、ニューロンなどの特異化した細胞の群は、協力して神経系などの系を形成する。
【００７８】
本明細書で使用される場合、本発明の細胞に関する「侵害受容器」という用語は、活動電位および有害刺激の知覚（疼痛の認知に関与する）の能力を有するニューロンを指す。刺激には、温熱性刺激（熱および低温）、機械的刺激、化学的刺激および炎症が含まれるが、これらに限定されない。侵害受容器は、ＢＲＮ３Ａ、ＩＳＬ１、ＴＡＣ１、ＶＧＬＵＴ２、ＳＬＣ１５Ａ３などの、特定の遺伝子およびタンパク質を発現し、軸索様構造に沿った細胞体と２つの別個の突起と表される形態を含む細胞である。本発明の細胞に関する「機能的侵害受容器」は、本明細書で述べる遺伝子およびタンパク質の発現、本明細書で述べる形態を特徴とし、本明細書で述べるような活動電位を生じさせる能力を有する、定方向性分化から生じる細胞を指す。
【００７９】
本明細書で使用される場合、「ペプチド作動性ニューロン」という用語は、一般に、異なるクラスのイオンチャネルの発現によって同定され、かつタキキニンなどの小さなペプチドの発現によって同定されるニューロンを指す。例えばペプチド作動性侵害受容器は、ＮＴＲＫ１およびタキキニンサブスタンスＰを発現する。
【００８０】
これに対し「非ペプチド作動性」ニューロンは、ＮＴＲＫ１またはサブスタンスＰを発現しないニューロンを指す。
【００８１】
本明細書で使用される場合、「神経外胚葉」という用語は、ニューロン系列の細胞を生じさせることができる、発生の初期または多能性幹細胞分化の間に認められる細胞または細胞運命を指す。
【００８２】
本明細書で使用される場合、「細胞増殖のマーカー」という用語は、速い周期の細胞に関連する分子の発現を指し、前記分子は、典型的には成熟した遅い周期の細胞または周期がない（ｎｏｎｃｙｃｌｉｎｇ）細胞中には存在しない（すなわち活発に分裂している細胞には存在するが、長い周期時間を有する細胞または周期がない細胞中には存在しない）。そのようなマーカーの例には、細胞増殖のＫｉ６７マーカー（参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｅｒｄｅｓら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ３１：１３−２０（１９８３））および有糸分裂のＧ２／Ｍ期のホスホヒストンＨ３マーカー（参照により本明細書に組み込まれる、Ｈｅｎｄｚｅｌら、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ  １０６：３４８−３６０（１９９７））が含まれる。
【００８３】
本明細書で使用される場合、「増殖」という用語は、細胞数の増加を指す。
【００８４】
本明細書で使用される場合、「分化」という用語は、特異化していない胚細胞が、心臓、肝臓または筋細胞などの特異化した細胞の特徴を獲得する過程を指す。分化は、通常は細胞表面に埋め込まれたタンパク質を含むシグナル伝達経路を通して、細胞の遺伝子と細胞の外側の物理的および化学的条件との相互作用によって制御される。
【００８５】
本明細書で使用される場合、「定方向性分化」という用語は、本発明の侵害受容器細胞などの、特定の（例えば所望する）細胞型への分化を誘導する幹細胞培養条件の操作を指す。
【００８６】
本明細書で使用される場合、幹細胞に関する「定方向性分化」という用語は、多能性状態からより成熟したかまたは特異化した細胞運命（例えば中枢神経系細胞、神経細胞、侵害受容器等）への幹細胞の移行を促進するための低分子、増殖因子タンパク質および他の増殖条件の使用を指す。
【００８７】
本明細書で使用される場合、細胞に関する「分化を誘導する」という用語は、デフォルト細胞型（遺伝子型および／または表現型）を非デフォルト細胞型（遺伝子型および／または表現型）に変化させることを指す。したがって「幹細胞において分化を誘導する」とは、細胞を、遺伝子型（すなわちマイクロアレイなどの遺伝子分析によって決定される遺伝子発現の変化）および／または表現型（すなわちＰＡＸ６などのタンパク質またはＨＭＢ４５陽性（＋）であるがＳＯＸ１０については陰性（−）のようなタンパク質のセットの発現の変化）など、幹細胞とは異なる特性を有する子孫細胞に分裂するように誘導することを指す。
【００８８】
本明細書で使用される場合、「分化転換（ｔｒａｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）」という用語は、１つの組織からの幹細胞または成熟細胞が別の組織の細胞へと分化する過程を指す。
【００８９】
本明細書で使用される場合、「未分化」という用語は、まだ特異化した細胞型へと発生していない細胞を指す。
【００９０】
本明細書で使用される場合、「細胞分化」という用語は、特異化していない細胞（すなわち幹細胞）がより明確な形態および機能を有するように発生または成熟する経路を指す（例えば、ｉＰＳＣが神経堤前駆体へと進行し、ニューロン系列の細胞へ、神経堤細胞へ、ニューロンへ、侵害受容器細胞へ、ペプチド作動性侵害受容器または神経外胚葉へ、中枢神経系の細胞へと進行する）。
【００９１】
本明細書で使用される場合、分化中の細胞系における細胞に関して使用される「分化」という用語は、細胞が１つの細胞型（例えば多分化能性、全能性または多能性分化可能細胞）から、標的分化細胞などの別の細胞型に分化する過程を指す。
【００９２】
本明細書で使用される場合、細胞分化経路に関する「デフォルト」または「受動」という用語は、特異化していない細胞が、特定の化合物で処理されない場合、すなわち通常の細胞培養条件である場合、培養下で特定の分化細胞型になる経路を指す。言い換えると、デフォルト細胞は、細胞が分化細胞型を変化させることができる分子（すなわちモルフォゲン）と接触しない場合に生じ、例えば本発明のネスチン＋ＴＵＪ１−細胞である。これに対し、細胞に関する「非デフォルト」は、デフォルト細胞とは異なる細胞型を生じる分化細胞型を指し、すなわち非デフォルト細胞は、ＴＵＪ１＋ネスチン−ニューロン細胞、感覚ニューロン細胞、ペプチド作動性侵害受容器、メラノサイト等を含む、本発明の細胞のような非デフォルト条件から生じる分化細胞型である。デフォルト細胞はまた、後にデフォルト非ペプチド作動性侵害受容器となる非デフォルトＴＵＪ１＋ネスチン−細胞のように、細胞がモルフォゲンと接触して非デフォルト細胞となった後、続いて形態形成性化合物が存在しなければデフォルト細胞であり得る。
【００９３】
本明細書で使用される場合、「細胞運命決定」のような、細胞に関する「運命」という用語は、一般に、その子孫細胞がインビボまたはインビトロ培養条件に依存して様々な細胞型または少数の特定細胞型になることができる、遺伝的に決定された系列を有する細胞を指す。言い換えると、細胞の所定の運命は、細胞が別の細胞型ではなくある１つの細胞型になるように特定の分化経路へと運命づけるその環境によって決定され、例えば、「神経運命」を有する幹細胞の子孫細胞は、筋細胞または皮膚細胞ではなく神経細胞になる。典型的には、細胞の「運命」は、高度に特異的な条件下を除いて不可逆性である。別の例では、「ＣＮＳ運命」は、中枢神経系に関連する細胞になることができる細胞を指す。逆に、神経細胞になることを運命づけられた細胞は、「神経前駆細胞」と呼ぶことができる。
【００９４】
本明細書で使用される場合、「神経突起伸長」という用語は、細胞からの細胞質の長く伸びた、膜に包まれた突出の観察を指す。
【００９５】
本明細書で使用される場合、「ドーパミンニューロン」または「ドーパミン作動性ニューロン」という用語は、一般に、ドーパミンを発現することができる細胞を指す。「中脳ドーパミンニューロン」または「ｍＤＡ」は、前脳構造における推定上のドーパミン発現細胞および前脳構造におけるドーパミン発現細胞を指す。
【００９６】
本明細書で使用される場合、「神経幹細胞」という用語は、ニューロンおよびグリア（支持）細胞を生じさせることができる、成体神経組織において認められる幹細胞を指す。グリア細胞の例には、星状細胞および希突起神経膠細胞が含まれる。
【００９７】
本明細書で使用される場合、「ニューロン」という用語は、神経系の主要な機能単位である神経細胞を指す。ニューロンは細胞体とその突起−軸索および１つ以上の樹状突起からなる。ニューロンは、シナプスにおいて神経伝達物質を放出することによって他のニューロンまたは細胞に情報を伝達する。
【００９８】
本明細書で使用される場合、「細胞培養」という用語は、研究または医学的処置のための人工培地におけるインビトロでの細胞の成長を指す。
【００９９】
本明細書で使用される場合、「培地」という用語は、ペトリ皿、マルチウエルプレート等のような培養容器中で細胞を覆う液体を指し、細胞に栄養を与え、支持する栄養分を含む。培地はまた、細胞に所望の変化を生じさせるために添加される増殖因子も含み得る。
【０１００】
本明細書で使用される場合、「フィーダー層」という用語は、多能性幹細胞を維持するために共培養において使用される細胞を指す。ヒト胚性幹細胞培養に関して、典型的なフィーダー層には、培養下で分裂するのを防ぐように処理されたマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）またはヒト胚性線維芽細胞が含まれる。
【０１０１】
本明細書で使用される場合、細胞培養に関する「継代」という用語は、一連の細胞成長および増殖後に細胞を分離し、洗浄して、新たな培養容器に接種する過程を指す。培養細胞が通過した一連の継代の数は、その年齢および予想される安定性の指標である。
【０１０２】
本明細書で使用される場合、遺伝子またはタンパク質に関連する「発現する」という用語は、マイクロアレイアッセイ、抗体染色アッセイ等のようなアッセイを用いて観察することができるｍＲＮＡまたはタンパク質が生じることを指す。
【０１０３】
本明細書で使用される場合、「ペアードボックス遺伝子６（ｐａｉｒｅｄ  ｂｏｘ  ｇｅｎｅ  ６）」または「ＰＡＸ６」という用語は、非デフォルト神経前駆細胞のマーカーを指す。
【０１０４】
本明細書で使用される場合、本発明の分化中の細胞に関する「ＴＵＪ１」または「ニューロン特異的クラスＩＩＩβチューブリン」という用語は、神経前駆細胞などの初期神経ヒト細胞分化のマーカーを指し、ＰＮＳおよびＣＮＳのニューロンにおいて発現が認められる。
【０１０５】
本明細書で使用される場合、本発明の分化中の細胞に関する「ネスチン」という用語は、神経堤幹細胞およびＣＮＳ神経幹細胞のマーカーである中間径フィラメント関連タンパク質を指す。
【０１０６】
本明細書で使用される場合、ＳＭＡＤ分子に関する「ホモ二量体」という用語は、ジスルフィド結合などにより、共に連結されたＳＭＡＤの少なくとも２つの分子を指す。
【０１０７】
本明細書で使用される場合、「ＥＤＮ３」という用語は、両能性グリア−メラノサイト幹細胞などの神経堤由来細胞系列で一般的に認められる細胞表面受容体ＥＤＮＲＢに結合するエンドセリンファミリーの内皮由来タンパク質からの分泌ペプチドを指す。ＥＤＮ３アミノ酸配列の一例は：アクセッション番号ＮＰ＿０００１０５；アクセッションＰＩ１４１３８（ＥＤＮ３  ＨＵＭＡＮ）におけるエンドセリン３（配列番号１）である：
【０１０８】
【化１１】
2018139592.tif 000013
【０１０９】
本明細書で使用される場合、「ノギン」という用語は、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）などの、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）スーパーファミリーのシグナル伝達タンパク質のメンバーに結合し、それを不活性化する分泌ホモ二量体糖タンパク質を指す。
【０１１０】
ノギンは、典型的にはグリコシル化されたジスルフィド結合二量体としてヒト細胞において発現される６５ｋＤａタンパク質である（Ｇｒｏｐｐｅら（２００２）．Ｎａｔｕｒｅ  ４２０，６３６−６４２；Ｘｕら（２００５）Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２，１８５−１９０；Ｗａｎｇら（２００５）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３３０：９３４−９４２）。ノギンアミノ酸配列の一例は、アクセッション番号Ｕ７９１６３、単一アミノ酸マウスノギン（配列番号２）である：
【０１１１】
【化１２】
2018139592.tif 000014
【０１１２】
本明細書で使用される場合、「ｌｅｆｔｙ」という用語は、「ＥＢＡＦ」または「子宮内膜出血関連因子」または「左右軸決定因子Ａ」としても知られる、ＬＥＦＴＹ１、ＬＥＦＴＹ２、ＬＥＦＴＹＡ等を含むがこれらに限定されない、ＴＧＦβを阻害するトランスフォーミング増殖因子βスーパーファミリーの新規メンバーを指す。ｌｅｆｔｙタンパク質は、哺乳動物における器官系の左右非対称性決定のために必要である。
【０１１３】
本明細書で使用される場合、「アクチビン」という用語は、アクチビンＡ、アクチビンＢ等のような、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）スーパーファミリーのメンバーを指す。
【０１１４】
本明細書で使用される場合、「トランスフォーミング増殖因子β」または「ＴＧＦβ」という用語は、多様な細胞型の増殖と分化を調節するサイトカインを指す。
【０１１５】
本明細書で使用される場合、「ノーダル」という用語は、ＴＧＦβファミリーのシグナル伝達分子のメンバーを指す。ノーダルシグナル伝達は、神経外胚葉デフォルト経路に沿ったヒト胚性幹細胞の分化を阻害する（Ｖａｌｌｉｅｒら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２７５，４０３−４２１）。
【０１１６】
本明細書で使用される場合、「ＡＬＫ」または「未分化リンパ腫キナーゼ」または「未分化リンパ腫受容体チロシンキナーゼ」または「Ｋｉ−１」という用語は、膜関連チロシンキナーゼ受容体を指す。
【０１１７】
本明細書で使用される場合、Ｉ型セリン／トレオニンキナーゼ受容体に関する「ＡＬＫ５」という用語は、ＴＧＦβ１に結合して、ＴＧＦβ１受容体として機能する未分化リンパ腫受容体チロシンキナーゼ５受容体を指す。
【０１１８】
本明細書で使用される場合、Ｉ型セリン／トレオニンキナーゼ受容体に関する「ＡＬＫ７」という用語は、ノーダルおよびノーダル関連タンパク質に結合して、ノーダルおよびノーダル関連タンパク質受容体として機能する未分化リンパ腫受容体チロシンキナーゼ７受容体を指す。
【０１１９】
本明細書で使用される場合、細胞を本発明の化合物と「接触させる」という用語は、「接触した」細胞を生じさせるために、化合物を、細胞と触れることを可能にする位置に置くことを指す。接触は任意の適切な方法を用いて達成され得る。例えば、１つの実施形態では、接触は、化合物を細胞のチューブに添加することによる。接触はまた、化合物を細胞の培養物に添加することによって達成され得る。
【０１２０】
本明細書で使用される場合、「付着細胞」という用語は、培養容器の底部または側面に接着してインビトロで増殖する細胞を指し、付着細胞は、細胞外マトリックス分子等を介して容器と接触してもよく、付着しておらず、培養容器から細胞を取り出すために酵素の使用を必要としない懸濁培養中の細胞と異なり、この細胞を培養皿／容器から分離するためには酵素、すなわちトリプシン、ディスパーゼ等の使用を必要とする。
【０１２１】
本明細書で使用される場合、「マーカー」または「細胞マーカー」という用語は、特定の細胞または細胞型を同定する遺伝子またはタンパク質を指す。細胞のマーカーは１つのマーカーに限定されなくてもよく、複数のマーカーは、指定される群のマーカーが１つの細胞または細胞型を別の細胞または細胞型から同定し得るように、マーカーの「パターン」を表し得る。例えば、本発明の侵害受容器細胞は、侵害受容器細胞を、あまり分化していない前駆細胞から、すなわちＴＵＪ１陽性およびネスチン陰性侵害受容器を、非侵害受容器細胞または前駆体細胞、すなわちＴＵＪ１陰性およびネスチン陽性細胞から区別する１つ以上のマーカーを発現する。
【０１２２】
本明細書で使用される場合、染色に関する「陽性細胞」という用語は、マーカーを発現し、したがってそのマーカーに関して、対照または比較細胞を上回る検出可能な定量的および／または定性的量で「染まる」細胞を指す。陽性細胞はまた、ネスチン等のような分子に関して染まる細胞も表し得る。
【０１２３】
本明細書で使用される場合、「陰性細胞」という用語は、ネスチン抗体検出法等との接触後に染まらない細胞のような、マーカーに関して検出可能なシグナルが存在しない細胞を指す。
【０１２４】
本明細書で使用される場合、「ＤＡＰＩ」という用語は、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール・２ＨＣｌ蛍光染色法を指す。ＤＡＰＩ蛍光染色法は周知であり、数多くの例の１つとして、ＤＡＰＩ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｔａｉｎ，２００６，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎ，９７４０２，ＵＳＡ参照。
【０１２５】
本明細書で使用される場合、「レポーター遺伝子」または「レポーター構築物」という用語は、発色タンパク質、ＧＦＰなどの蛍光タンパク質またはβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ遺伝子）などの酵素のような、容易に検出可能または容易にアッセイ可能なタンパク質をコードする核酸を含む遺伝的構築物を指す。
【０１２６】
本明細書で使用される場合、「ＧＦＰ」という用語は、標的遺伝子の発現の指示マーカーとして典型的に使用される、細胞内での発現に際して蛍光タンパク質を生成することができる任意の緑色蛍光タンパク質ＤＮＡ配列を指す。ＧＦＰの例としては、Ｐａｃｉｆｉｃ  ｊｅｌｌｙｆｉｓｈ、オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｉａ  Ｖｉｃｔｏｒｉａ）などの腔腸動物から単離されるＧＦＰ配列、および「ｅＧＦＰ」などのその合成配列誘導体が含まれる。
【０１２７】
「試料」という用語は、その最も広い意味で使用される。１つの意味では、細胞または組織を指すことができる。また別の意味では、任意の供給源から得られる検体または培養物を含むことが意図され、液体、固体および組織を包含する。環境試料には、表面物質、土壌、水および工業試料などの環境物質が含まれる。これらの例は、本発明に適用できる試料の種類を限定すると解釈されるべきではない。
【０１２８】
本明細書で使用される場合、用語「精製された」、「精製する」、「精製」、「単離された」、「単離する」、「単離」およびその文法的等価物は、試料からの少なくとも１つの汚染物質の量の低減を指す。例えば、所望細胞型は、非ニューロン細胞から単離された分化ニューロン細胞のように、望ましくない細胞型の量の対応する低減によって、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらに一層好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは少なくとも９０％精製される。言い換えると、「精製する」およびその等価物は、試料からの特定の細胞（例えば望ましくない細胞）の除去を指す。例えば、本発明のＴＵＪ１＋ニューロン細胞の精製集団を提供するために、ＴＵＪ１＋ネスチン−ニューロン細胞を、本明細書で述べるように、混合細胞集団をフローサイトメトリによってＮＴＲＫ１＋とＮＴＲＫ１−細胞に選別することにより、汚染ネスチン＋ＴＵＪ１−ニューロン細胞の除去によって精製する；ニューロン侵害受容器細胞も、本発明の組成物および方法を含む細胞培養の指定された方法を使用することにより、非侵害受容器細胞（デフォルト細胞）から精製されるかまたは「選択される」。非侵害受容器細胞の除去または選択は、試料中の所望侵害受容器細胞の割合の増加を生じさせる。
【０１２９】
したがって細胞型の精製は、所望細胞、すなわち試料中の侵害受容器の「富化」、すなわち量の増加をもたらす。
【０１３０】
物体（例えば細胞、組織等）および／または化学物質（例えばタンパク質、アミノ酸配列、核酸配列、コドン等）に適用される場合、本明細書で使用される場合、「天然に生じる」という用語は、その物体および／または化合物が天然に認められる／認められたことを意味する。例えば、天然に生じる細胞は、胚細胞などの、天然の供給源から単離することができる、生物中に存在する細胞を指し、ここで、前記細胞は実験室においてヒトによって意図的に改変されていない。
【０１３１】
本明細書で使用される場合、「インビトロ」という用語は、人工環境および人工環境内で起こる過程または反応を指す。インビトロ環境は、試験管および細胞培養物に例示されるが、これらに限定されない。
【０１３２】
本明細書で使用される場合、「インビボ」という用語は、自然環境（例えば動物または細胞）および胚発生、細胞分化、神経管形成等のような自然環境内で起こる過程または反応を指す。
【０１３３】
本明細書で開示される任意の細胞に関して行われる場合、「から誘導された」または「から樹立された」または「から分化された」という用語は、細胞系、組織中の親細胞（例えば任意の操作、例えば、限定されることなく、単細胞単離、インビボでの培養、例えばタンパク質、化学物質、放射線、ウイルスによる感染を用いた処理および／または変異誘発、モルフォゲン等のようなＤＮＡ配列でのトランスフェクション、培養親細胞中に含まれる任意の細胞の選択（連続培養などによる）を用いて分離された胚または液体など）から得られた（例えば単離された、精製された等）細胞を指す。誘導された細胞は、増殖因子、サイトカイン、サイトカイン処理の選択進行、接着性、接着性の欠如、選別手順等に対する応答によって混合集団から選択することができる。
【０１３４】
本明細書で使用される場合、「細胞」という用語は、単細胞ならびに細胞の集団（すなわち２つ以上）を指す。集団は、ニューロン細胞の集団または未分化胚細胞の集団などの、１つの細胞型を含む純粋な集団であり得る。あるいは、集団は、２つ以上の細胞型、例えば混合細胞集団を含み得る。集団中の細胞数を限定することは意図されず、例えば細胞の混合集団は少なくとも１つの分化細胞を含み得る。１つの実施形態では、混合集団は少なくとも１つの分化細胞を含み得る。本発明では、細胞集団が含み得る細胞型の数に制限はない。
【０１３５】
本明細書で使用される場合、「高度に富化された集団」という用語は、比較集団よりも高いパーセンテージまたは量でマーカーを発現する、培養皿中の細胞の集団などの細胞の集団を指し、例えば、ＬＳＢに接触した細胞培養物を２日目にＣＨＩＲ／ＳＵまたはＣＨＩＲ／ＤＡＰＴで処理すると、ＳＵ／ＤＡＰＴでの処理と比較して高度に富化された集団を生じる。
【０１３６】
「細胞生物学（ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙまたはｃｅｌｌｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ）」という用語は、細胞の解剖学的構造および機能、例えば細胞の生理的性質、構造、小器官、およびそれらの環境との相互作用、それらの生活環、分裂および死などの、生細胞の研究を指す。
【０１３７】
「関心対象のヌクレオチド配列」という用語は、その操作が、当業者により、何らかの理由で（例えば疾患を処置する、改善された品質を与える、宿主細胞における関心対象のタンパク質の発現、リボザイムの発現等）望ましいと判断され得る任意のヌクレオチド配列（例えばＲＮＡまたはＤＮＡ）を指す。そのようなヌクレオチド配列には、構造遺伝子（例えばレポーター遺伝子、選択マーカー遺伝子、がん遺伝子、薬剤耐性遺伝子、増殖因子等）のコード配列、ｍＲＮＡまたはタンパク質産物をコードしない非コード調節配列（例えばプロモーター配列、ポリアデニル化配列、終結配列、エンハンサー配列等）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３８】
本明細書で使用される場合、「関心対象のタンパク質」という用語は、関心対象の核酸によってコードされるタンパク質を指す。
【０１３９】
「遺伝子」という用語は、ポリペプチドまたは前駆体（例えばプロインスリン）の産生のために必要なコード配列を含む核酸（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）配列を指す。ポリペプチドは、完全長コード配列によって、または、完全長もしくはフラグメントの所望活性もしくは機能特性（例えば酵素活性、リガンド結合、シグナル伝達等）が保持されている限り、コード配列の任意の部分によってコードされ得る。この用語はまた、構造遺伝子のコード領域を包含し、かつ５’および３’末端の両方においてコード領域に隣接して位置する配列（末端上の約１ｋｂ以上の距離にわたり、これにより、遺伝子が完全長ｍＲＮＡの長さに対応する）を含む。コード領域の５’側に位置し、ｍＲＮＡ上に存在する配列を５’非翻訳配列と称する。コード領域の３’側または下流に位置し、ｍＲＮＡ上に存在する配列を３’非翻訳配列と称する。「遺伝子」という用語は、ｃＤＮＡおよびゲノム形態の遺伝子の両方を包含する。遺伝子のゲノム形態またはクローンは、「イントロン」または「介在領域」または「介在配列」と称される非コード配列で分断されたコード領域を含む。イントロンは、核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）に転写される遺伝子のセグメントである；イントロンはエンハンサーなどの調節エレメントを含み得る。イントロンは、核または一次転写産物から除去されるかまたは「スプライシングによって除去される」；イントロンは、それゆえ、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写産物中には存在しない。ｍＲＮＡは、翻訳の間、新生ポリペプチドにおけるアミノ酸の配列または順序を指定するように機能する。
【０１４０】
本明細書で使用される場合、「遺伝子発現」という用語は、遺伝子内にコードされる遺伝情報を、遺伝子の「転写」を介して（すなわちＲＮＡポリメラーゼの酵素作用によって）ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡまたはｓｎＲＮＡ）に変換する過程、およびタンパク質をコードする遺伝子については、ｍＲＮＡの「翻訳」を介してタンパク質に変換する過程を指す。遺伝子発現はこの過程の多くの段階で調節され得る。「上方調節」または「活性化」は、遺伝子発現産物（すなわちＲＮＡまたはタンパク質）の産生を増大させる調節を指し、「下方調節」または「抑制」は、産生を減少させる調節を指す。上方調節または下方調節に関与する分子（例えば転写因子）は、しばしば、それぞれ「アクチベーター」および「リプレッサー」と呼ばれる。
【０１４１】
本明細書で使用される場合、「をコードする核酸分子」、「をコードするＤＮＡ配列」、「をコードするＤＮＡ」、「をコードするＲＮＡ配列」および「をコードするＲＮＡ」という用語は、デオキシリボ核酸またはリボ核酸の鎖に沿ったデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの順序または配列を指す。これらのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの順序は、ポリペプチド（タンパク質）鎖に沿ったアミノ酸の順序を決定する。ＤＮＡまたはＲＮＡ配列は、したがって、アミノ酸配列をコードする。
【０１４２】
「単離されたオリゴヌクレオチド」または「単離されたポリヌクレオチド」におけるように、核酸に関して使用される場合の「単離された」という用語は、その天然供給源において通常付随している少なくとも１つの成分または夾雑物から同定され、分離されている核酸配列を指す。単離された核酸は、それが天然で認められるのとは異なる形態または状況で存在する。これに対し、単離されていない核酸は、天然で存在する状態で認められるＤＮＡおよびＲＮＡなどの核酸である。例えば、所与のＤＮＡ配列（例えば遺伝子）は、宿主細胞の染色体上で隣接遺伝子の近傍に認められ；特定のタンパク質をコードする特定のｍＲＮＡ配列などのＲＮＡ配列は、多数のタンパク質をコードする数多くの他のｍＲＮＡとの混合物として細胞内で認められる。しかし、所与のタンパク質をコードする単離された核酸は、一例として、所与のタンパク質を通常発現する細胞内の核酸であって、核酸が天然の細胞とは異なる染色体位置にあるか、または天然で認められるものとは異なる核酸配列が隣接している、核酸を含む。単離された核酸、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖形態で存在し得る。単離された核酸、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドがタンパク質を発現するために利用される場合、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは最小限でもセンス鎖またはコード鎖を含むが（すなわちオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは一本鎖であり得る）、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含み得る（すなわちオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは二本鎖であり得る）。
【０１４３】
本明細書で使用される場合、本発明の細胞に関する「メラノサイト」という用語は、一般に、ＰＳＣに由来する細胞を指し、例えば、初期メラノサイトが挙げられ、これは、Ｓｏｘ１０、ＨＭＢ４５、ｃ−ｋｉｔ、必須のメラノサイト転写因子ＭＩＴＦ−ＭまたはＭＩＴＦＭ、小眼球症関連転写因子（ＭＩＴＦ）のアイソフォーム、メラノサイトにおいて発現される塩基性ヘリックス−ループ−ヘリックスロイシンジッパー転写因子ファミリーのメンバー、チロシナーゼ（ＴＹＲ）、チロシナーゼ関連タンパク質１（ＴＹＲ−１）、ＴＹＲ関連タンパク質２／ドーパクロムトートメラーゼ（ＤＣＴ）等を含むマーカーの群を発現し、プレメラノソーム（ｐｒｅｍｅｌｏｓｏｍｅ）および／またはメラノソームを含有し、明らかな色素（肉眼でまたは顕微鏡検査によって観察される）を伴うかまたは伴わない。成熟メラノサイトは、典型的には色素性メラノソームを含み、チロシナーゼ陽性であり、チロシナーゼ関連タンパク質１（ＴＲＰ１）等のようなメラノサイトタンパク質を発現する。
【０１４４】
本明細書で使用される場合、本発明の細胞に関する「初期メラノサイト」または「メラニン芽細胞」または「メラノサイト前駆体」または「メラノサイト前駆細胞」という用語は、成熟メラノサイトへとさらに分化することができる、Ｓｏｘ１０：：ＧＦＰおよびＭＩＴＦならびにｃ−ｋｉｔを共発現する細胞を指す。１つの実施形態では、Ｓｏｘ１０：：ＧＦＰは推定上のメラノサイト前駆体のマーカーである。別の実施形態では、ｃ−ｋｉｔは推定上のメラノサイト前駆体のマーカーである。さらなる実施形態では、Ｓｏｘ１０：：ＧＦＰ／ｃ−ｋｉｔ二重陽性細胞は、推定上のメラノサイト前駆体細胞である。
【０１４５】
本明細書で使用される場合、本発明の細胞に関する「ＨＭＢ４５＋」という用語は、初期（段階）メラノサイト（すなわち未熟メラノサイト）、網膜色素上皮の色素細胞に分化することができる細胞、未熟メラノソームを含む成熟メラノサイトなどの、プレメラノソーム糖タンパク質、すなわちヒトＰｍｅｌ１７（参照により本明細書に組み込まれる、Ｔｈｅｏｓら、Ｐｉｇｍｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２００５．１８（５）：３２２−３６）を発現する細胞を指す。
【０１４６】
本明細書で使用される場合、「疾患モデリング」という用語は、障害の結果としてヒトにおいて認められる特定の徴候または症状を模倣するために実験生物またはインビトロ細胞培養物を使用する過程を指す。１つの実施形態では、神経障害を生じさせる遺伝子変異を有するヒトに由来するヒト多能性幹細胞を増殖させ、そのヒトにおいて認められるのと類似の欠陥を保持する神経細胞へと分化させることができる。
したがって本発明は以下の項目を提供する：
（項目１）  第一シグナル伝達インヒビター、第二シグナル伝達インヒビター、および第三シグナル伝達インヒビターを含むキットであって、ここで、該第一インヒビターはトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）／アクチビン−ノーダルシグナル伝達を低下させることができ、該第二インヒビターはＳｍａｌｌ  Ｍｏｔｈｅｒｓ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ（ＳＭＡＤ）シグナル伝達を低下させることができ、および該第三インヒビターは、ウイングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達の活性化のためにグリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（ＧＳＫ３β）を低下させることができる、キット。
（項目２）  上記第一インヒビターが、ＳＢ４３１５４２、その誘導体およびその混合物からなる群より選択される低分子である、項目１に記載のキット。
（項目３）  上記第二インヒビターが、ＬＤＮ１９３１８９、その誘導体およびその混合物からなる群より選択される低分子である、項目１に記載のキット。
（項目４）  上記第三インヒビターが、ＣＨＩＲ９９０２１およびその誘導体からなる群より選択される、項目１に記載のキット。
（項目５）  線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）受容体ファミリーシグナル伝達を低下させる第四インヒビターをさらに含む項目１に記載のキットであって、該ＦＧＦ受容体ファミリーシグナル伝達が、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）受容体および血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）チロシンキナーゼ受容体を含む、キット。
（項目６）  上記第四インヒビターが、ＳＵ５４０２およびその誘導体からなる群より選択される、項目５に記載のキット。
（項目７）  ノッチシグナル伝達を低下させることができる第五インヒビターをさらに含む、項目１に記載のキット。
（項目８）  上記第五インヒビターが、Ｎ−［Ｎ−（３，５−ジフルオロフェナセチル）−Ｌ−アラニル］−Ｓ−フェニルグリシンｔ−ブチルエステル（ＤＡＰＴ）およびその誘導体からなる群より選択される、項目７に記載のキット。
（項目９）  ネスチン、
【化１４】
2018139592.tif 000015
からなる群より選択されるタンパク質の発現の検出のために使用される抗体をさらに含む、項目１に記載のキット。
（項目１０）  ネスチン、
【化１５】
2018139592.tif 000016
からなる群より選択される遺伝子のｍＲＮＡ発現の検出のためのＰＣＲプライマーをさらに含む、項目１に記載のキット。
（項目１１）  プロタキキニン−１（ＴＡＣ１）、小胞グルタミン酸輸送体２（ＶＧＬＵＴ２）および溶質キャリアファミリー１５メンバー３（ＳＬＣ１５Ａ３）からなる群より選択されるタンパク質の発現の検出のために使用される抗体をさらに含む、項目１に記載のキット。
（項目１２）  プロタキキニン−１（ＴＡＣ１）、小胞グルタミン酸輸送体２（ＶＧＬＵＴ２）および溶質キャリアファミリー１５メンバー３（ＳＬＣ１５Ａ３）からなる群より選択される遺伝子のｍＲＮＡ発現の検出のためのＰＣＲプライマーをさらに含む、項目１に記載のキット。
（項目１３）  指示書をさらに含む項目１に記載のキットであって、該指示書が、上記第三インヒビターを添加する２日前に、上記第一インヒビターおよび上記第二インヒビターを添加するための工程を含む、キット。
（項目１４）  指示書をさらに含む項目１に記載のキットであって、該指示書が、神経幹細胞前駆体を作製するための工程および侵害受容器細胞を作製するための工程を含む、キット。
（項目１５）  ヒト幹細胞をさらに含む、項目１に記載のキット。
（項目１６）  上記ヒト幹細胞がヒト胚性幹細胞である、項目１５に記載のキット。
（項目１７）  上記ヒト幹細胞がヒト誘導多能性幹細胞である、項目１５に記載のキット。
（項目１８）  上記ヒト幹細胞がトランスジェニックＳＯＸ１０：：ＧＦＰ細菌人工染色体（ＢＡＣ）ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）である、項目１３に記載のキット。
（項目１９）  幹細胞の定方向性分化を誘導するための方法であって、
ａ）
ｉ）ヒト幹細胞を含む細胞培養物；および
ｉｉ）第一シグナル伝達インヒビター、第二シグナル伝達インヒビター、および第三シグナル伝達インヒビターであって、ここで、該第一インヒビターはトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）／アクチビン−ノーダルシグナル伝達を低下させることができ、該第二インヒビターはＳｍａｌｌ  Ｍｏｔｈｅｒｓ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ（ＳＭＡＤ）シグナル伝達を低下させることができ、および該第三インヒビターは、ウイングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達の活性化のためにグリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（ＧＳＫ３β）を低下させることができる、第一シグナル伝達インヒビター、第二シグナル伝達インヒビター、および第三シグナル伝達インヒビター；
を提供する工程；
ｂ）該幹細胞を該第一インヒビターおよび該第二インヒビターとインビトロで４８時間まで接触させる工程；ならびに
ｃ）該阻害された幹細胞を、幹細胞の定方向性分化を誘導するために、該第三インヒビターとさらに１９２時間までさらに接触させる工程
を含み、該分化した幹細胞は神経堤幹細胞である、方法。
（項目２０）  上記第一インヒビターが、ＳＢ４３１５４２、その誘導体およびその混合物からなる群より選択される低分子である、項目１９に記載の方法。
（項目２１）  上記第二インヒビターが、ＬＤＮ１９３１８９、その誘導体およびその混合物からなる群より選択される低分子である、項目１９に記載の方法。
（項目２２）  上記第三インヒビターが、ＣＨＩＲ９９０２１およびその誘導体からなる群より選択される、項目１９に記載の方法。
（項目２３）  線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）受容体ファミリーシグナル伝達を低下させる第四インヒビターをさらに含む項目１９に記載の方法であって、該ＦＧＦ受容体ファミリーシグナル伝達が、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）受容体および血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）チロシンキナーゼ受容体を含む、方法。
（項目２４）  上記第四インヒビターが、ＳＵ５４０２およびその誘導体からなる群より選択される、項目２３に記載の方法。
（項目２５）  ノッチシグナル伝達を低下させることができる第五インヒビターをさらに含む、項目１９に記載の方法。
（項目２６）  上記第五インヒビターが、Ｎ−［Ｎ−（３，５−ジフルオロフェナセチル）−Ｌ−アラニル］−Ｓ−フェニルグリシンｔ−ブチルエステル（ＤＡＰＴ）およびその誘導体からなる群より選択される、項目２５に記載の方法。
（項目２７）  ニューロン系列細胞のペプチド作動性侵害受容器細胞への定方向性分化のために、第四インヒビターおよび第五インヒビターをさらに含む項目１９に記載の方法であって、該第四インヒビターがＳＵ５４０２およびその誘導体からなる群より選択され、該第五インヒビターがＮ−［Ｎ−（３，５−ジフルオロフェナセチル）−Ｌ−アラニル］−Ｓ−フェニルグリシンｔ−ブチルエステル（ＤＡＰＴ）およびその誘導体からなる群より選択される、方法。
（項目２８）  上記ペプチド作動性侵害受容器細胞が、ＯＣＴ４、ＤＬＫ１、ＰＡＸ６、ＳＯＸ１０、ＰＯＵ４Ｆ１（ＢＲＮ３Ａ）、ＩＳＬ１、ＮＥＵＲＯＧ２、ＮＥＵＲＯＧ１、ＮＴＲＫ１、ＲＥＴ、ＲＵＮＸ１、ＶＧＬＵＴ２、ＴＡＣ１およびＴＲＰＶ１からなる群より選択されるマーカーを発現する、項目２７に記載の方法。
（項目２９）  上記ペプチド作動性侵害受容器細胞が、ＩＳＬ１、ＰＯＵ４Ｆ１（ＢＲＮ３Ａ）、ＲＥＴ、ＲＵＮＸ１およびＮＴＲＫ１からなる群より選択されるマーカーを発現する、項目２７に記載の方法。
（項目３０）  上記マーカーがタンパク質および核酸からなる群より選択される、項目２７に記載の方法。
（項目３１）  上記ペプチド作動性侵害受容器細胞が、サブスタンスＰおよびカルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）を共発現する、項目２７に記載の方法。
（項目３２）  上記ペプチド作動性侵害受容器細胞が外部刺激に応答して活動電位を生じ、該外部刺激が電流である、項目２７に記載の方法。
（項目３３）  上記分化したペプチド作動性侵害受容器細胞が、上記幹細胞を上記第一インヒビターおよび上記第二インヒビターと接触させた後１０〜１５日以内に、高度に富化されたニューロンの集団内に存在する、項目２７に記載の方法。
（項目３４）  上記幹細胞がヒト胚性幹細胞である、項目１９に記載の方法。
（項目３５）  上記幹細胞がヒト誘導多能性幹細胞である、項目１９に記載の方法。
（項目３６）  生物学的作用物質をインビトロでスクリーニングする方法であって、
ａ）
ｉ）幹細胞の定方向性分化からインビトロで誘導される侵害受容器細胞；および
ｉｉ）試験化合物
を提供する工程；ならびに
ｂ）該侵害受容器細胞を該試験化合物と接触させて、侵害受容器機能を測定する工程であって、該機能は活動電位の測定値である、工程
を含む、方法。
（項目３７）  上記侵害受容器細胞がヒト幹細胞に由来する、項目３６に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【０１４７】
【図１】図１は、例示的なＬＳＢ３ｉ分化スキームを示す、本発明の方法の好ましい実施形態である。ＬＤＮ−１９３１８９およびＳＢ４３１５４２（ＬＳＢ）を使用して二重ＳＭＡＤ阻害を誘導した場合、ＣＨＩＲ９９０２１、ＳＵ５４０２およびＤＡＰＴ（３ｉ）を分化の２日目に添加したときに最適ニューロン分化が認められた。４日目から開始して、その後の期間２５％の漸増量で増加させながらＮ２培地を添加して、ＫＳＲを置き換えた。ｈＥＳＣを、間質フィーダー層を使用せずに単細胞単層として平板培養した。最初の５日間、分化を制限し、神経分化を促進するためにＢＭＰ（ＬＤＮ１９３１８９に例示される）およびＴＧＦ／ノーダル／アクチビン（ＳＢ４３１５４２に例示される）の組合せ阻害（ＬＳＢ）を使用する。初期誘導の４８時間後に３つの付加的なインヒビター（ＣＨＩＲ９９０２１、ＤＡＰＴ、ＳＵ５４０２に例示される；集合的に３ｉと称する）を適用する。５日目から１０日目までＬＤＮ１９３１８９を含めた場合と除外した場合で分化に差は生じない。要約すると、細胞に毎日供給し、出現する神経細胞集団を支持するために培地をＫＳＲからＮ２に移行させる。−−−＋Ｌ−−−は、５日目から１０日目までＬＤＮを添加した２連の培養物を示す。
【図２】図２は、ＬＳＢ３ｉの例示的な効率を示し、ＬＳＢ処理と３ｉ処理の組合せを使用する本発明の好ましい実施形態が、ＬＳＢ処理単独と比較してニューロン様細胞集団の生成を効率的に促進することを明らかにする（Ａ、Ｂ）。ニューロンのマーカーであるＴＵＪ１の染色に際し、ＬＳＢ単独と比較してｈＰＳＣ処理の４８時間後に３ｉ（ＣＨＩＲ９９０２１、ＤＡＰＴ、ＳＵ５４０２）を添加した場合、はるかに高い数の陽性細胞が認められ、ＬＳＢ単独では、多数のＰＡＸ６緑色／暗細胞と少数のＴＵＪ１＋（赤色／明）細胞を示した（Ｃ、Ｄ）。細胞を再スポットし、細胞周期中の細胞の数を定量化するためにＫｉ６７発現（桃色／明細胞）を使用した。３ｉを添加した場合、ＬＳＢ単独と比較してほぼ１／３のＫｉ６７（＋）細胞が認められ、有糸分裂後のニューロンを示している。ＬＳＢ（Ｅ）およびＬＳＢ３ｉ（Ｆ）で処理したｈＰＳＣにおけるＫｉ６７（桃色／明細胞）および（Ｅ、Ｆ）ホスホヒストンＨ３（ＰＰＨ３）（赤色／明細胞）の発現を比較すると、１２日目までに増殖の著しい低下を示した。（Ｇ）細胞内ＦＡＣＳを用いて前駆細胞（ネスチン陽性細胞；灰色のバー）およびニューロン（ＴＵＪ１陽性細胞；白色のバー）の数を測定した。細胞の約５％だけがＴＵＪ１陽性であるＬＳＢ処理単独に対し、３ｉを添加した場合は細胞の７５％超がＴＵＪ１陽性である。３ｉ組成物の好ましい実施形態と比較して３つのインヒビターのうち１つまたは２つを添加した場合は、同じレベルのＴＵＪ１細胞は達成されない。しかし、ＳＵ５４０２またはＤＡＰＴのいずれかに加えてＣＨＩＲでＬＳＢ細胞を処理すると（Ｃ）、５３％超のニューロンを達成し、ＴＵＪ１＋ニューロンの形成において、γセクレターゼインヒビターおよび線維芽細胞増殖因子受容体インヒビターから選択される少なくとも１つのインヒビターと組み合わせてＣＨＩＲ、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（ＧＳＫ３β）インヒビター／ＷＮＴシグナル伝達のアクチベーター（すなわちＷＮＴアゴニスト）が必要であることを指示する。（Ａ、Ｂ）についてのスケールバーは２００μｍを示し、（Ｃ、Ｄ）については１００μｍを示す。
【図３】図３は、例示的なＬＳＢ３ｉニューロンが侵害受容器であったことを示し、ＬＳＢ処理と３ｉ処理の組合せを使用する本発明の好ましい実施形態が、ＬＳＢ処理単独と比較して侵害受容器の生成を効率的に促進することを明らかにする。ＬＳＢ処理と３ｉ処理の組合せの使用からのＴＵＪ１陽性ニューロンは、１２日目に免疫蛍光によって測定される、（Ａ）ＩＳＬ１、（Ｂ）ＢＲＮ３Ａ、（Ｃ）ＲＥＴおよび（Ｄ）ＲＵＮＸ１を発現する。（Ｅ）６１％超の細胞が１０日目にＮＴＲＫ１を発現し、同時にＬＳＢ３ｉで処理したｈｉＰＳＣは、中等度の効率でニューロンを形成する（ＦＡＣＳによって測定される）。合わせて考慮するとこれらの結果は、ＬＳＢ処理と３ｉ処理の組合せの使用を用いて生成されるニューロンの圧倒的多数が侵害受容器であることを指示する。スケールバーは１００μｍを示す。
【図４】図４は、ＬＳＢ３ｉを使用して例示的なｉＰＳ細胞が侵害受容器へと誘導されたことを示す。ｈｉＰＳＣ系（例えばＣ１４）をＬＳＢ３ｉで処理した場合、図３に示すのと同様のニューロンが認められる。図４は、ＬＳＢ処理と３ｉ処理の組合せを使用する本発明の好ましい実施形態が、ＬＳＢ処理単独と比較してｈｉＰＳＣ集団からの侵害受容器の生成を効率的に促進することを明らかにする。ｈｉＰＳＣ系（Ｃ１４）の、ＬＳＢ処理と３ｉ処理の組合せを使用する本発明の好ましい実施形態からのＴＵＪ１陽性ニューロンは、１２日目に免疫蛍光によって測定される（Ａ）ＩＳＬ１、（Ｂ）ＢＲＮ３Ａ、（Ｃ）ＲＥＴおよび（Ｄ）ＲＵＮＸ１を発現する。２つの別個のｈｉＰＳＣ系（Ｃ１４およびＣ７２）も侵害受容器を生成することができる。（Ｅ）細胞内ＦＡＣＳを用いて、示されている処理についての前駆細胞（ネスチン陽性細胞；灰色のバー）およびニューロン（ＴＵＪ１陽性細胞；白色のバー）の数を測定した。スケールバーは１００μｍを示す。
【図５】図５は、例示的なＳＯＸ１０発現を示し、ＬＳＢ処理と３ｉ処理の組合せを使用する本発明の好ましい実施形態が、神経堤幹細胞様状態を含む経路を介して侵害受容器分化を駆動することを明らかにする。神経堤幹細胞の出現を観察するため、トランスジェニックＳＯＸ１０：：ＧＦＰ  ＢＡＣ  ｈＥＳＣ細胞系を、Ａ）ＬＳＢ、Ｂ）ＬＳＢとＣＨＩＲ９９０２１（ＬＳＢ／Ｃ）、ならびにＣ）ＬＳＢ３ｉで処理し、蛍光顕微鏡検査により、Ｂ）およびＣ）において多数の緑色（明ＧＦＰ＋細胞）を示した。Ｄ）およびＥ）は、フローサイトメトリ分析後の処理細胞集団におけるＧＦＰの定量的発現を示す。トランスジェニックＳＯＸ１０：：ＧＦＰ  ＢＡＣ  ｈＥＳＣ系を使用して、８日目までに６４％超の細胞において神経堤幹細胞のマーカーであるＳＯＸ１０の発現を検出することができる。Ｄ）およびＥ）に示すようにＳＯＸ１０：：ＧＦＰ＋発現が加速され、ＬＳＢとＣＨＩＲ９９０２１（ＬＳＢ／Ｃ）またはＬＳＢ処理単独と比較して、より早期に、最大発現（大きなＧＦＰ＋集団）（１２日目までに８０％ＧＦＰ＋）が生じた。ＬＳＢ値はベースラインのすぐ上であり、ＬＳＢ／Ｃ点は黒色の線（ＬＳＢとＬＳＢ３ｉの間）であり、ＬＳＢ３ｉ値は赤色（明）線でつないでいる。スケールバー＝５０μｍ。
【図６】図６は、細胞がまだＯＣＴ４発現を保持しているときに添加した３ｉの例示的表示であり、ＬＳＢ処理と３ｉ処理の組合せを使用する本発明の好ましい実施形態が、分化経路の非常に早期（ｈＥＳＣ集団がまだ多能性特性を保持している）に始まる侵害受容器分化を駆動することを明らかにする。（Ａ）ＬＳＢ誘導後、ＣＨＩＲ９９０２１、ＤＡＰＴ、ＳＵ５４０２を様々な日に７つの２連の培養物に添加し（すなわち１日目〜７日目の各々の日に１つの培養物）、１１日目に細胞を固定した場合、２日目に関して最大の細胞生存率および最も均一なＴＵＪ１発現が認められる。したがって、２日目が３ｉ添加の最適時点であることが発見された。（Ｂ）これは、ノギンおよびＳＢ４３１５４２（ＮＳＢ）中で培養した細胞が多能性のマーカーであるＯＣＴ４を発現し続け、神経細胞運命のマーカーであるＰＡＸ６をまだ発現していない時点（星印によって示す染色の欠如参照）に対応する。ＰＡＸ６発現によって示される、細胞がニューロン系列に拘束された時点である５〜７日目に３ｉを添加した場合は深刻な細胞死が認められる。Ａ）５、６および７日目に添加した３ｉ、ならびにＢ）培養の６日目のＤＡＰＩ染色参照。核の４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）染色（明青色）に加えてＯＣＴ４（赤色／暗）およびＰＡＸ６（緑色／明）に結合した抗体を同定するために細胞を染色した。
【図７】図７は、例示的なＬＳＢ３ｉ処理した人工ｈＰＳＣ（ＳＯＸ１０：：ＧＦＰ細胞）が、神経堤中間細胞であって、活動電位を生じさせることができる双極侵害受容器へと加速された速度で成熟する、神経堤中間細胞の発生を示したことを示す。フローサイトメトリを使用してＳＯＸ１０：：ＧＦＰ陰性細胞からＳＯＸ１０：：ＧＦＰ＋細胞を選別した。ＳＯＸ１０：：ＧＦＰ＋をＬＳＢ３ｉで処理した場合、それらは（Ａ）ＩＳＬ１および（Ｂ）ＢＲＮ３Ａ陽性ニューロンを生じさせた（生産した）。ＬＳＢ３ｉニューロンは（Ｃ）グルタミン酸および（Ｄ）ＴＲＰＶ１に関して染色された。（Ｅ）各々のＴＵＪ１陽性ニューロンは、２つの別個の成長円錐を有する双極形態を示し、（Ｆ）極性を伴ってＭＡＰ２を発現した。１か月後、（Ｇ）ニューロン細胞体は、（Ｈ）サブスタンスＰおよび（Ｉ）ＣＧＲＰに関して陽性の神経節を形成するようにクラスターを形成する。（Ｊ）９５ｐＡ（赤色のトレース）は、ＬＳＢ３ｉ侵害受容器から成熟単一活動電位を誘発するのに十分である。スケールバーは、１００μｍ（Ａ〜ＤとＦ〜Ｉ）および５０μｍ（Ｅ）を示す。
【図８】図８は、例示的なＬＳＢ３ｉ処理したｉＰＳＣクローンＣ７２が速やかに侵害受容器表現型を獲得したことを示す。ＬＳＢ３ｉ処理したｉＰＳＣクローンＣ７２細胞からのＴＵＪ１陽性クローン（緑色／明軸索染色）は、Ａ）ＩＳＬ１、Ｂ）ＢＲＮ３Ａ、Ｃ）ＲＥＴおよびＤ）ＲＵＮＸ１（細胞体の赤色／桃色染色）を発現した。
【図９】図９は、例示的なＮＴＲＫ１  ＦＡＣＳ選別がｈｉＰＳＣ由来のＬＳＢ３ｉニューロンを富化したことを示す。分化１０日目のＮＴＲＫ１  ＦＡＣＳ選別は、ＮＴＲＫ１＋細胞におけるＴＵＪ１陽性（緑色／明軸索染色）ニューロンを増加させ、Ｃ１４およびＣ７２両細胞系からネスチン（赤色）陽性前駆体（ＮＴＲＫ１−）細胞集団を除去した。細胞を、マトリゲルでコートした培養容器に入れた２４時間後に、ＤＡＰＩに加えてＴＵＪ１およびネスチンで免疫染色した。
【図１０】図１０は、ＬＳＢ３ｉ侵害受容器の例示的な遺伝子発現を示す。ＬＳＢ処理細胞とＬＳＢ３ｉ処理細胞の両方について２、３、５、７、９および１５日目に遺伝子発現分析を実施した。（ａ）神経外胚葉、神経堤、ニューロンおよび侵害受容器（それぞれＮ．Ｅ．、Ｎ．Ｃ．、Ｎｎ．およびＮｏｃｉ．）のマーカーを検査した場合、分化の異なる段階が認められる。（ｂ）ＬＳＢ３ｉについて１５日目に、倍数変化による上位２０の有意な上方調節（赤色）および下方調節（青色）遺伝子をＬＳＢ処理細胞と比較した。（ｃ）ＯＣＴ４、ＤＬＫ１、ＰＡＸ６、ＳＯＸ１０、ＰＯＵ４Ｆ１（ＢＲＮ３Ａ）、ＩＳＬ１、ＮＥＵＲＯＧ２、ＮＥＵＲＯＧ１、ＮＴＲＫ１、ＶＧＬＵＴ２、ＴＡＣ１およびＴＲＰＶ１の発現はペプチド作動性侵害受容器の出現と一致する。
【図１１】図１１は、ＳＯＸ１０：：ＧＦＰ  ＢＡＣ細胞系において誘導された遺伝子の例示的なｑＲＴ−ＰＣＲ検証を示す。ＳＳＥＡ−４に関して選別したｈＰＳＣ、および神経培養物からＨＮＫ１＋を選別することによって神経堤幹細胞を富化するためのこれまでの方法（参照により本明細書に組み込まれる、Ｌｅｅら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２５，１４６８−１４７５）と比較して、ＳＯＸ１０：：ＧＦＰ  ＢＡＣを用いて選別したＧＦＰ＋細胞は、ｑＲＴ−ＰＣＲによって測定したとき神経堤遺伝子ＳＯＸ１０、ｐ７５およびＡＰ２Ｂを発現する細胞が大きく富化されていた。
【図１２】図１２は、例示的なＬＳＢ３ｉ侵害受容器が２つの別個の成長円錐を有することを示す。ＬＳＢとの初期接触後１２日目に継代し、ＬＳＢ３ｉ侵害受容器を固定して、ＴＵＪ１抗体（緑色；明領域）およびＤＡＰＩ（青色／暗い核）で染色した場合、２つの別個の成長円錐が、これらの代表的細胞において認められ得、その間に、ＤＡＰＩ（青色／より暗い楕円領域）核領域によって示される細胞体があり、様々な軸索様形状と大きさを有する。一方の端は、樹状突起に類似する複雑な分枝（上部）を示し、他方の端はシナプス終末に類似した球状形状（下部）を示した。一般に、本発明のペプチド作動性侵害受容器の形態は感覚ニューロンの形態に合致した。
【図１３】図１３は、メラノサイト前駆体／メラニン芽細胞の例示的な特異化と単離を示す。１１日目のＬＳＢ−Ｃプロトコールは、Ｓｏｘ１０：：ＧＦＰ、ＭＩＴＦを共発現するメラノサイト前駆体の誘導を支持した（Ａ、右のパネル）。ＭＩＴＦ単一陽性集団も認められた（Ａ、左のパネル）。ｃ−Ｋｉｔはメラノサイト前駆体の潜在的マーカーとして同定された。ＬＳＢ−Ｃ分化後に低いパーセンテージのＳｏｘ１０：：ＧＦＰ、ｃ−ｋｉｔ共発現細胞が認められた（Ｂ、橙色集団）。ｑＲＴ−ＰＣＲ分析により、二重陽性集団においてメラノサイトマーカーＭＩＴＦＭおよびＤｃｔの富化が確認された（Ｃ）。ＢＭＰ４およびＥＤＮ３での処理（「ＬＳＢ−Ｍｅｌ」）は、Ｓｏｘ１０：：ＧＦＰ、ｃ−ｋｉｔ二重陽性の推定上のメラノサイト前駆体集団の誘導を増強した（Ｄ）。ＬＳＢ−Ｍｅｌ処理後に単離されたＳｏｘ１０：：ＧＦＰ、ｃ−ｋｉｔ二重陽性細胞は、有意により高いレベルのメラノサイトマーカーＭＩＴＦＭおよびＤｃｔを示した（Ｅ）。すべての誤差バーは平均値の標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）を示す。＊ｐ＜０．０５。
【図１４】図１４は、メラノサイト前駆体の例示的な増殖と成熟を示す。分化条件の要約（Ａ）。ＢＭＰ４およびＥＤＮ３を伴うＬＳＢ−Ｃ（ＬＳＢ−Ｍｅｌ）条件での特異化後、細胞を１１日目に選別し、再接種した。選別後（ＰＳ）細胞を、ｃ−ｋｉｔリガンド（ＳＣＦ）、エンドセリン３（ＥＤＮ３）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）およびＣＨＩＲを含む成熟培地に維持した。ＰＳ６日目に明視野顕微鏡検査によって認められた色素細胞は、メラノサイトマーカーＭＩＴＦに関して陽性であったが、Ｓｏｘ１０：：ＧＦＰレポーターが下方調節されていると思われた（Ｂ）。Ｓｏｘ１０：：ＧＦＰ、ｃ−ｋｉｔ二重陰性を除くすべての集団が、最終的にＭＩＴＦ発現細胞および肉眼で見える色素クラスターを生じさせたが、その割合は異なっていた（Ｃ）。ＢＭＰ４およびｃＡＭＰでの処理は、メラノサイトに特有の紡錘様形態を示す色素細胞への分化を増強した（Ｄ）。
【図１５】図１５は、成熟メラノサイトの例示的な特性付けを示す。ＬＳＢ−Ｍｅｌプロトコールで誘導した成熟メラノサイトの純粋な集団は、培養下で８週間超後にＭＩＴＦ、Ｓｏｘ１０、Ｔｙｒｐ１およびＨＭＢ４５を含む一般的なメラノサイトマーカーの発現を維持する（Ａ）。メラノサイトは、継代の数週間にわたってそれらの暗く色素沈着した表現型を保持する（Ｂ）。色素沈着レベルを評価するために１×１０６細胞をペレット化し、写真撮影した。成熟メラノサイトの電子顕微鏡超微細構造特性付け（Ｃ、Ｄ）。ＬＳＢ−Ｍｅｌ由来メラノサイトの細胞質中の数多くの暗く色素沈着したメラノソームの存在がＴＥＭによって観察できる（Ｃ）。メラノソーム小胞の段階ＩからＩＶへの成熟に伴うメラニン色素の存在および進行性沈着に注目されたい（Ｄ）。
【図１６】図１６は、例示的なＬＳＢ−Ｍｅｌ培地処方物がメラノサイトの増殖のためにリノール酸を必要としたこと、およびメラノサイト系列の概略図を示す。顕微鏡像の上に示す培地成分は、処方物から除外された培地成分である；Ｐｈ＝位相差；ＢＦ＝明視野。例示的な概略図は、本発明において発生したメラノサイト系列の細胞を同定するために使用したメラノサイト前駆体マーカーを示す。
【図１７】図１７は、例示的な分化モデルを示す。多能性胚性ヒト幹細胞の早期ＬＳＢ処理は、栄養外胚葉、中内胚葉および非神経外胚葉細胞運命を阻害し、このことは、神経外胚葉運命を有する細胞を生じる。初期ＬＳＢ処理後２日目にＣＨＩＲ９９０２１、ＳＵ５４０２およびＤＡＰＴ（３ｉ）を添加すると、８日目までに神経堤幹細胞同定マーカーを誘導し、加速して（ＬＳＢ−ＣおよびＬＳＢ処理に比べて）、１０日目までに神経堤幹細胞のペプチド作動性侵害受容器への速やかな分化を促進した。
【発明を実施するための形態】
【０１４８】
発明の詳細な説明
本発明は、幹細胞生物学の分野、特に、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）、ヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）、体性幹細胞、がん幹細胞、または系列特異的に分化することができる任意の他の細胞を含み得るが、これらに限定されない、多能性または多分化能性幹細胞の系列特異的分化に関する。特に、新規培養条件を用いてｈＥＳＣおよび／またはｈｉＰＳＣの系列特異的分化を侵害受容器（すなわち侵害受容器細胞）へと向かわせる方法を述べる。本発明の方法を用いて作製される侵害受容器は、インビトロでの薬剤発見アッセイにおける使用、疼痛研究における使用、および末梢神経系（ＰＮＳ）の疾患または損傷を逆転させる治療薬としての使用を含むが、これらに限定されない、様々な用途に関してさらに考慮される。さらに、疾患モデリングにおける使用のためにヒト多能性幹細胞からメラノサイトを生産するための組成物および方法を提供する。
【０１４９】
本明細書に含まれる説明から、当業者は、本発明の本質的特性を容易に確認することができ、またその精神および範囲から逸脱することなく、本発明を様々な用途および条件に適合させ、本発明を最大限に利用するために本発明に変更および修正を加えることができる。以下で述べる実施形態および実施例は、単に例示と解釈されるべきであり、いかなる意味においても本発明の範囲の限定と解釈されるべきではない。
【０１５０】
発明者は以前に、幹細胞の分化を神経細胞集団へと向かわせる二重ＳＭＡＤ阻害の使用を開示しており、ＣＮＳと神経堤子孫の比率は処置開始の時点での細胞の集密度に依存し；高い平板培養密度、すなわち高い集密度はＣＮＳ子孫を生じ、一方低い平板培養密度、すなわち低い集密度は神経堤子孫を生じることを開示した。発明者はさらに、分化したＣＮＳニューロン子孫の機能的ドーパミン作動性ニューロンへのパターン形成が達成できることを開示した。
【０１５１】
本明細書で述べる本発明は、神経堤由来細胞系列である機能的侵害受容器を、連続的な、ＳＭＡＤシグナル伝達の阻害、次いでＦＧＦおよびノッチシグナル伝達の阻害ならびにＷｎｔシグナル伝達の活性化により、高密度平板培養された胚性または体性幹細胞から約１０日間で直接分化させることができ、そしてそのような機能的侵害受容器をインビトロで７日間以上維持することができるという予想外の新規観察を開示する。
【０１５２】
特に、ヒト多能性幹細胞の定方向性分化において使用する化合物を発見するためにコンビナトリアル低分子スクリーニングを行った。このスクリーニングの間に、ＰＳＣを有糸分裂後ニューロンに変換する低分子が見出された。具体的には、経路インヒビターである５つの低分子、すなわちＳＢ４３１５４２、ＬＤＮ−１９３１８９、ＣＨＩＲ９９０２１、ＳＵ５４０２およびＤＡＰＴの組合せが、本明細書で述べる特定の試験条件下で、いかなる組換え増殖因子も存在せずに、１０日以内の分化でｈＰＳＣから＞７５％の効率でニューロンを生成するのに十分であることが発見された。したがって、本発明の組成物（キットを含む）および方法の使用は、ｈＰＳＣからペプチド作動性侵害受容器の少なくとも５０％の収率、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも７５％の効率をもたらす。生じたこれらのヒトニューロンは、ＮＴＲＫ１、ＢＲＮ３Ａ、ＩＳＬ１、ＮＥＵＲＯＧ１、サブスタンスＰおよびＣＧＲＰを含む侵害受容感覚ニューロン運命の標準的なマーカーを発現した。この低分子に基づくニューロン運命獲得の加速は、通常のインビボ発生と比較して３〜５倍速い時間枠内で起こり（参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｙｓｔｒｏｎら、Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ９：８８０−８８６（２００６））、特定のシグナル伝達経路の阻害がヒトニューロン細胞発生の時期を加速するのに十分であることを示した。ペプチド作動性侵害受容器のこの迅速で潜在的に拡大可能な（すなわち多数の成熟感覚ペプチド作動性侵害受容器ニューロンを生産するためのバッチ処理）、高い効率の誘導は、ヒト疼痛知覚の研究における使用のための医学的に適切な細胞型を生産するためのこの新規方法への前例のないアクセスを可能にした。コンビナトリアル低分子スクリーニングは、ｈＰＳＣ生物学における新しい世代の定方向性分化戦略のための強力な方法ツールである。
【０１５３】
１０日以内の成熟感覚ペプチド作動性侵害受容器ニューロンのインビトロ生産のための組成物および方法のこの発見は、成熟感覚ニューロンを生産するために現在の方法よりも有意に少ない時間を示す。この発見以前には、ｈＰＳＣからの有糸分裂後ニューロンのインビトロ誘導は、典型的には３０日間以上続く長い培養期間を必要とした（参照により本明細書に組み込まれる、Ｚｈａｎｇら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ５８４：３５５−３６６（２０１０）；Ｅｌｋａｂｅｔｚら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ２２：１５２−１６５（２００８））。この時間のかかるｈＰＳＣのインビトロ分化は、インビボでのヒト発生の時系列を反映すると考えられた（Ｐｅｒｒｉｅｒ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１：１２５４３−１２５４８（２００４））。そこで、１つの実施形態では、成熟ペプチド作動性侵害受容器ニューロンを生産するための組成物および方法は、５つの化合物の少なくとも１つ、すなわちＳＢ４３１５４２、ＬＤＮ−１９３１８または等価物との初期接触後３０日未満の培養を含む。したがって、ペプチド作動性侵害受容器は、５つの化合物の少なくとも１つとの初期接触後２９日未満、２５日未満、２０日未満、１５日未満、１２日未満、および１０日未満で入手され得る。
【０１５４】
ヒト発生の遅い速度を克服するインビトロ戦略を同定することは、基礎生物学およびヒト疾患モデリングにおいてｈＰＳＣの最大の可能性を実現するための重要な課題である（参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｈａ，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ５，５８４−５９５（２００９））。発明者は本明細書において、多能性細胞を成熟ニューロンに変化させるための低分子に基づく新規方法の発見を述べる。そこで１つの実施形態では、多能性細胞を成熟侵害受容器細胞への分化に向かわせる。さらに、発明者は、様々な形態および高い数で成熟ニューロン、すなわち侵害受容器細胞を生産するための物質および方法を述べる。
【０１５５】
Ｉ．ニューロン前駆体（系列）細胞を誘導するための細胞培養法：ヒト多能性幹細胞をＳＢ４３１５４２およびＬＤＮ−１９３１８９と接触させることにより、ニューロン系列細胞が生産された。
【０１５６】
以下の実施例は、本発明の開発の間に使用するニューロン系列の細胞を提供するための例示的な方法を述べる。
【０１５７】
二重ＳＭＡＤ阻害は、以前にｈＰＳＣからある１種のニューロン系列細胞を誘導するための迅速で極めて有効な方法として使用された（参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｈａｍｂｅｒｓら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２７（２００９））。ノギンを含む分子によって誘導されたこれらのニューロン系列細胞は、中枢神経系細胞、すなわち神経細胞運命への発生を可能にするデフォルト経路を有していた。補足試験は、ノギンの代わりに低分子ドルソモルフィン（ＤＭ）を使用することにより、少なくとも一部には類似の細胞が生産されるが、培養物の一貫性（ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙ）に差があることを報告した（参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｉｍら、Ｒｏｂｕｓｔ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｎｅｕｒａｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ＥＳ  ａｎｄ  ｉＰＳ  ｃｅｌｌｓ  ｒｅｇａｒｄｌｅｓｓ  ｏｆ  ｔｈｅｉｒ  ｉｎｎａｔｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｐｒｏｐｅｎｓｉｔｙ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｖ  ６，２７０−２８１（２０１０）；Ｚｈｏｕら、Ｈｉｇｈ−Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｉｎ  ｈＥＳＣｓ  ａｎｄ  ｈｉＰＳＣｓ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ＴＧＦ−ｂｅｔａ  Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，５０４（２０１０））。
【０１５８】
発明者は、ＬＤＮ処理細胞と同じ発生段階、同じマーカーの大部分の発現、および様々なニューロン系列を作製する類似の発生可能性の能力を示すにも関わらずノギンを用いて生成された細胞は、ＬＤＮを用いて誘導された神経細胞と比較して、前後軸において前方であること（すなわちより前脳、より多くの細胞がＦＯＸＧ１を発現する等）などの相違も示すことを認めた。そこで、数あるシグナル伝達経路の中でも特にＢＭＰを阻害するためにノギンの代わりにＬＤＮを使用したが、ノギンとＬＤＮは、ＢＭＰを阻害すること以外に、異なる他の種類の活性を有すると考えられる。
【０１５９】
一部にはノギンを使用することの高コストのゆえに、発明者は、ＢＭＰインヒビターの使用が神経細胞運命の細胞を生産する際にノギンの代わりになり得ると考えた。そのため、ｈＰＳＣから原始神経外胚葉、神経細胞運命を有する細胞、すなわちＣＮＳ細胞を生成するために、ＳＢ４３１５４２と組み合わせて、低分子ＢＭＰインヒビター、ＬＤＮ−１９３１８９（参照により本明細書に組み込まれる、Ｙｕら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １４，１３６３−１３６９（２００８））を使用し、本発明の開発の間にノギンに取って代わることを認めた（図２Ａ）。この組合せ処理を、これら２つのインヒビターＬＤＮ−１９３１８９とＳＢ４３１５４２の組合せに関してＬＳＢと称した。
【０１６０】
一般に、細胞分化は、ＳＭＡＤシグナル伝達の二重阻害で高集密度単層のｈＥＳまたはｈｉＰＳを処理することによって開始された。好ましい実施形態は、５０％〜１００％の集密度パーセンテージを利用し、最も好ましい実施形態は７０％〜８０％の集密度を利用する。本発明の好ましい集密度を達成するために必要な初期平板培養密度が、細胞型、大きさ、平板培養効率、生存率、接着および当業者の側に過度の実験を課すことなく経験的に決定することができる他のパラメータに依存することは当業者に明らかである。ＳＭＡＤの二重阻害は、ノギン、ＳＢ４３１５４２、ＬＤＮ１９３１８９、ドルソモルフィン、またはＴＧＦβ、ＢＭＰおよびアクチビン／ノーダルシグナル伝達をブロックする他の分子を含む様々な化合物を用いて達成できる。好ましい実施形態は、ＳＢ４３１５４２およびＬＤＮ１９３１８９（集合的にＬＳＢ）を、０．１μＭ〜２５０μＭ、より好ましくは１〜２５μＭ、最も好ましくは１０μＭのＳＢ４３１５４２および１０〜５０００ｎＭ、最も好ましくは１００〜５００ｎＭのＬＤＮ１９３１８９の濃度で含む組成物を利用する。
【０１６１】
ＩＩ．定方向性分化における使用のための化合物：本発明のニューロン系列細胞を使用して低分子をスクリーニングすることにより、定方向性分化における使用のための低いＰＡＸ６および高いＴＵＪ１ニューロン細胞を生じる化合物がもたらされた。
【０１６２】
以下の実施例は、定方向性分化における使用のための低分子候補化合物をスクリーニングするために実施例ＩＩからのニューロン系列の例示的細胞を使用することを述べる。
【０１６３】
具体的には、二重ＳＭＡＤ阻害（ＬＳＢ）に関連して、すなわちヒトＥＳ細胞を、約４００の条件下で候補化合物（すなわち低分子）をスクリーニングするために（ヒトＥＳ細胞から出発する有糸分裂後ニューロンマーカーの獲得を加速し得る低分子の組合せを見出すため）、最初にＬＳＢ（ＬＤＮ−１９３１８９およびＳＢ４３１５４２）で処理した。ＣＮＳに発生することができる細胞を決定するために細胞運命を決定するために、発生試験において重要であることが公知であり、しばしば使用される細胞シグナル伝達経路（例えばＦＧＦ、ノッチ、ＷＮＴ、ＳＨＨ（ソニック・ヘッジホッグ）等のようなシグナル伝達経路）を標的とする（変化させる）分子から候補化合物を選択した。一例として、４種のインヒビター（すなわちＳＵ／ＤＡＰＴ／ＣＨＩＲ／シクロパミン）をＬＳＢ処理からの異なる日に異なる組合せで試験した（細胞培地中の細胞に供給した）。各々の処理を、次に、１０日目にＴＵＪ１／ＰＡＸ６発現に関してスクリーニングした。処理条件の一例として、ＬＳＢを毎日供給し、４日目から１０日目まで毎日ＣＨＩＲおよびＳＵを培地に添加して細胞に供給した。
【０１６４】
一般に、スクリーニング処理の結果は、死細胞を含む多数の培養物を生じさせた。言い換えると、このスクリーニングにおける生存可能な培養条件は、非生存可能条件（すなわち細胞死）よりもはるかに低い頻度であることが分かった（例えばＳＵ／ＤＡＰＴを初期培養物に、すなわち２日目より前に添加した場合）。発明者は、ＣＮＳ幹細胞は生存のためにＦＧＦシグナル伝達およびγセクレターゼ活性／ノッチシグナル伝達に依存し、そのためＣＨＩＲが存在しない場合、ＳＵ／ＤＡＰＴが細胞をＣＮＳから神経堤に切り替わるように誘導したとき、切り替わるのではなく、細胞が死亡したと考えた。
【０１６５】
ＬＳＢの添加後１０日目に、スクリーニングの間生存した細胞をヒト神経外胚葉マーカーＰＡＸ６（参照により本明細書に組み込まれる、Ｚｈａｎｇら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ７，９０−１００（２０１０））の喪失およびＴＵＪ１発現によるニューロン分化の開始（参照により本明細書に組み込まれる、Ｌｅｅら、Ｃｅｌｌ  Ｍｏｔｉｌ  Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ  １７，１１８−１３２（１９９０））に関して観察した。細胞を、免疫蛍光（ｉｍｍｕｎｏＦ）により、ニューロン（ＴＵＪ１＋）に関して染色し、ＰＸ６のＣ末端に結合する抗体を使用して神経外胚葉の喪失（より少ないＰＡＸ６＋細胞の観察）に関して染色した。このスクリーニングをインヒビターの数多くの組合せ（例えばＳＵ、ＳＵ／ＤＡＰＴ、ＳＵ／ＤＡＰＴ／ＣＨＩＲ、ＤＡＰＴ／ＣＨＩＲ、ＳＵ／ＣＨＩＲ、ＳＵ／シクロパミン等）で実施し、それらを組合せの日（例えば０〜１０日目、１〜１０日目、２〜１０日目、３〜１０日目等）に様々な毎日の供給物に添加した。一般に、最も高い量のＴＵＪ１＋／ＰＡＸ６−染色を示す条件および化合物を、さらなる分析のための細胞を提供することについての成功として選択するために、各々の処理によって生成された細胞のＴＵＪ１＋／ＰＡＸ６−染色の相対的な量を観察することによって結果を決定した。細胞の免疫染色によりＴＵＪ１＋／ＰＡＸ６−である細胞を生産するためのスクリーニング試験において失敗とみなされた低分子の一例はシクロパミンであった。シクロパミンは、それをいつ添加した場合でも、ＴＵＪ１／ＰＡＸ６染色を生じさせることに関して細胞に影響を及ぼさないと思われた。言い換えると、細胞形態は、免疫蛍光により１０日目にＬＳＢ単独で処理した細胞と同様のままであった（すなわち＞９０％ＰＡＸ６＋および＜１０％ＴＵＪ１＋）。
【０１６６】
しかし、スクリーニングの間に、発明者は、ＬＳＢ処理の２日目に添加した３つの低分子の特定の組合せ（ＳＵ５４０２、ＣＨＩＲ９９０２１およびＤＡＰＴ；３つのインヒビターについて３ｉと称する）が（図６ＡおよびＢ）、分化の１０日目にｈＰＳＣにおいてＰＡＸ６発現を無くし、ＴＵＪ１を誘導することを発見した（図２ＡおよびＢ）。ＬＳＢ処理の２日目において処理細胞はまだ、神経細胞運命を有することまたは神経細胞運命へと発生する能力を有することに関して不明であったので、これは驚くべき発見であった。その代わりに、３ｉ処理は細胞を神経細胞運命から離れて神経堤細胞へと向かわせ、それらは本発明の侵害受容器細胞へとさらに分化した。
【０１６７】
次に、いずれのシグナル伝達経路がＰＡＸ６＋ＴＵＪ１−ヒトＥＳ細胞集団をＰＡＸ６−ＴＵＪ１＋集団に変換することに関与すると考えられるかを見出すために、これらの低分子の各々に関する機能を検討した。最初に、ＳＵ５４０２は、ＶＥＧＦ、ＦＧＦおよびＰＤＧＦチロシンキナーゼシグナル伝達の強力なインヒビターと報告された（参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｕｎら、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ４２，５１２０−５１３０（１９９９））。そこで一般に、低分子の少なくとも１つはＦＧＦＲシグナル伝達経路を阻害することに関与すると考えられた。第二に、ＣＨＩＲ９９０２１は、ＧＳＫ−３βの選択的阻害（β−カテニンを安定化する）によるＷＮＴアゴニストと報告された（参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７，３０９９８−３１００４（２００２））。そこで一般に、低分子の少なくとも１つはグリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（ＧＳＫ３β）を阻害することに関与すると考えられた。１つの実施形態では、この低分子は選択的に、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（ＧＳＫ３β）阻害などを介して、ＷＮＴシグナル伝達経路の少なくとも１つを活性化することができる。そして第三に、ＤＡＰＴは、ノッチシグナル伝達をブロックすることができるγセクレターゼインヒビターと報告された（参照により本明細書に組み込まれる、Ｄｏｖｅｙら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  ７６，１７３−１８１（２００１））。そこで一般に、低分子の少なくとも１つは少なくとも１つのノッチシグナル伝達経路を阻害することに関与すると考えられた。そこで１つの実施形態では、低分子の１つは非選択的または汎ノッチインヒビター（ｐａｎ−Ｎｏｔｃｈ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）と考えられた。別の実施形態では、インヒビターの１つは、少なくとも１つのノッチシグナル伝達経路をブロックすることができる、γセクレターゼ分子のインヒビターである。それゆえ、１つの例示的な実施形態では、インヒビターの組合せは、本発明のＰＡＸ６−ＴＵＪ１＋ヒトニューロン細胞を生産するために、ＦＧＦＲシグナル伝達経路を阻害することに関与する少なくとも１つの低分子、少なくとも１つのノッチシグナル伝達経路を阻害することに関与する少なくとも１つの低分子、およびＷＮＴシグナル伝達経路の少なくとも１つを活性化しつつＧＳＫ３βを阻害することに関与する少なくとも１つの低分子を含む。さらなる実施形態では、インヒビターの１つは、ノッチシグナル伝達経路中の少なくとも１つのγセクレターゼ分子をブロックすることができた。
【０１６８】
Ａ．ＬＳＢ−３ｉ：ＦＧＦおよびノッチシグナル伝達の２つのインヒビターとＷｎｔシグナル伝達のアクチベーターとの組合せはＴＵＪ１＋ニューロン細胞を生産した。
【０１６９】
ＦＧＦおよびノッチシグナル伝達のインヒビターおよびＷｎｔシグナル伝達のアクチベーターを、ＬＳＢ処理の開始の約２、３、４、５、６または７日後に添加した。ＦＧＦシグナル伝達の阻害は、ＳＵ５４０２、ＰＤ−１６１５７０、ＰＤ−１７３０７４、スラミンまたはＦＧＦシグナル伝達経路をブロックする他の分子を含む様々な化合物を用いて達成することができる。ノッチシグナル伝達の阻害は、ＤＡＰＴ、Ｌ−６８５，４５８、化合物Ｅ、ＭＫ０７５２またはノッチシグナル伝達経路をブロックする他の分子を含む様々な化合物を用いて達成できる。
【０１７０】
Ｗｎｔシグナル伝達の活性化は、ＣＨＩＲ９９０２１、ＬｉＣｌ、ＴＤＺＤ−８、組換えＷｎｔまたはＷｎｔシグナル伝達経路を活性化する他の分子を含む様々な化合物を用いて達成できる。好ましい実施形態は、ＣＨＩＲ９９０２１、ＤＡＰＴおよびＳＵ５４０２（集合的に３ｉ）を、０．３〜１００μＭ、より好ましくは３〜１０μＭ、最も好ましくは３μＭのＣＨＩＲ９９０２１；１〜１００μＭ、最も好ましくは１０μＭのＤＡＰＴ；および０．５〜２００μＭ、より好ましくは５〜２０μＭ、最も好ましくは１０μＭのＳＵ５４０２の濃度で含む組成物を利用する。
【０１７１】
ＬＳＢと３ｉの組合せで処理した幹細胞を１１日目に固定し、生存率とニューロンマーカーＴＵＪ１の発現に関して検査した。ＬＳＢ処理の２日目に３ｉで処理しておいた集団は、最も高い生存率ならびにニューロンマーカーＴＵＪ１の高発現を生じたが、ＬＳＢ処理の５日後に３ｉで処理しておいた集団は、細胞毒性および細胞死を示した（図６Ａ）。驚くべきことに、ＬＳＢ処理後２日目に、細胞集団は、Ｏｃｔ４の発現が高いのでまだ前駆体様のままである（図６Ｂ）。ＬＳＢ処理後６日目になってから、神経拘束（ｎｅｕｒａｌ  ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ）マーカーＰａｘ６が発現される；しかし３ｉでの６日目の処理は細胞毒性をもたらし、それによりＬＳＢと３ｉ処理の組合せによって誘導されたニューロン集団は多能性幹細胞から直接分化しており、ニューロン中間体からではないことを指示する。それゆえ、３ｉでの処理の好ましい実施形態はＬＳＢ処理後１〜４日目の間であり、３ｉでの処理の最も好ましい実施形態はＬＳＢ処理後２日目である。加えて、３ｉ組成物の３つの成分すべてが分化ニューロンの最大収率のために必要である（図２Ｅ）。
【０１７２】
ＴＵＪ１＋ニューロン細胞は細胞増殖マーカーの発現の喪失を示す。
【０１７３】
以下の実施例は、ＴＵＪ１＋ニューロン細胞の成熟（細胞周期）段階を決定するための例示的な方法を述べる。
【０１７４】
成熟後、培養下で生産されたニューロンは有糸分裂を受けることを停止し、それぞれ細胞増殖（参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｅｒｄｅｓら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ３１，１３−２０（１９８３））および有糸分裂のＧ２／Ｍ期（参照により本明細書に組み込まれる、Ｈｅｎｄｚｅｌら、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ  １０６，３４８−３６０（１９９７））のマーカーであるＫｉ６７およびホスホヒストンＨ３（ＰＨＨ３）を喪失した。それゆえ、３ｉと組み合わせたＬＳＢ（すなわちＬＳＢ３ｉ）を使用して生産された細胞をより低い密度、約１０〜１００，０００細胞／ｃｍ２に継代し、個々の細胞において、発現をより良好に評価するために固定した後、細胞増殖マーカーＫｉ６７およびホスホヒストンＨ３（ＰＨＨ３）に関して試験した。特に、Ｋｉ６７の発現は増殖の良好な予測因子であることが公知であった。そこで、３ｉ化合物を伴わないＬＳＢ中で培養した細胞と比較して、１２日後に、３ｉの存在下で培養された細胞では、より少ない細胞（それぞれ５０％および１６％）がＫｉ６７＋およびｐＨＨ３＋細胞を示した（図２Ｃ〜Ｆ）。
【０１７５】
ＬＳＢ／ＣＨＩＲ（ＣＨＩＲ９９０２１：Ｃ）、ＳＵ／ＤＡＰＴ（ＳＵ５４０２／ＤＡＰＴ）、ＳＵ／ＣＨＩＲ（ＳＵ５４０２／ＣＨＩＲ９９０２１）、ＤＡＰＴ、ＳＵ（ＳＵ５４０２）、ＣＨＩＲに加えて、対照としてＬＳＢ単独と比較して、ＬＳＢ３ｉを使用したニューロン分化の効率（パーセンテージ）を定量化するため、神経前駆体のマーカーであるネスチンおよびニューロン分化のマーカーであるβ３−チューブリン（ＴＵＪ１）についての細胞間ＦＡＣＳ（ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  ＦＡＣＳ）染色を実施した（図２Ｇ）。ＬＳＢ、ＳＵ／ＤＡＰＴ、ＤＡＰＴ、ＳＵおよびＣＨＩＲの存在下では、大部分の細胞がネスチンを発現した。特に、ＬＳＢ細胞集団の＞９５％がネスチン＋であった。数多くの細胞が二重ＳＭＡＤ阻害後にネスチン染色を示したが定量化されず、一方より長期間、すなわち１９日間培養した細胞はＴＵＪ１＋ニューロンを示し、これらの細胞の大部分が、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）を共発現し、このことは、潜在的なドーパミン作動性ニューロンを同定する（参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｈａｍｂｅｒｓら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２７（２００９））。逆に、ＬＳＢに接触した細胞を２日後に３ｉ化合物と接触させた場合、１０日後に約２５％の細胞がネスチンを発現し、約７５％の細胞がＴＵＪ１を発現して、短期間、すなわち１９日未満の細胞培養後のニューロン細胞運命への効率的な変換を明らかにした。
【０１７６】
驚くべきことに、ＬＳＢ処理、次いで２日後に細胞をＣＨＩＲ９９０２１およびＤＡＰＴまたはＳＵのいずれか１つと接触させることにより、細胞集団の５０％をＴＵＪ１＋細胞へと分化させた。３つのインヒビターの各々をＬＳＢ処理後に単独で使用した場合、２０％以下の細胞がＴＵＪ１＋であった。それゆえ、ＣＨＩＲ９９０２１は、この細胞集団のＴＵＪ１＋ニューロン細胞への定方向性分化の鍵となる寄与因子であることが発見された。発明者は、ネスチン＋ＴＵＪ１−細胞のネスチン−ＴＵＪ１＋ニューロン細胞への定方向性分化が、ＦＧＦ受容体経路またはノッチシグナル伝達経路内のγセクレターゼのいずれかを阻害することに加えて、ＷＮＴシグナル伝達経路の少なくとも１つを活性化しつつＧＳＫ３βを阻害することに依存すると考えた。さらに、３ｉ化合物の添加は、さらに２５％のネスチン−ＴＵＪ１＋ニューロン細胞の変換を生じさせた。図２Ｇ参照。
【０１７７】
要約すると、ＬＳＢ処理の２日後に３ｉ処理する好ましい実施形態から誘導されるニューロン集団をさらに検討した。この集団は、ＬＳＢ単独で処理した細胞と比較してニューロンマーカーＴＵＪ１の高発現（図２Ａ、Ｂ）ならびにＫｉ６７の喪失（図２Ｃ、Ｄ）を示した。Ｋｉ６７の喪失は、有糸分裂後分化ニューロンの特徴である細胞周期中の細胞の減少を示す。加えて、ＦＡＣＳ分析は、ＬＳＢと３ｉからなる好ましい組成物で処理した細胞集団の７５％超がＴＵＪ１を発現し、これに対してＬＳＢ単独で処理した集団の９９％が前駆体マーカーであるネスチンを発現することを明らかにした（図２Ｇ）。
【０１７８】
ＬＳＢ処理の２日後に３ｉ処理する好ましい実施形態から誘導されるニューロン集団をさらに検討した。この集団は、ＬＳＢ単独で処理した細胞と比較してニューロンマーカーＴＵＪ１の高発現（図２Ａ、Ｂ）ならびにＫｉ６７の喪失（図２Ｃ、Ｄ）を示した。Ｋｉ６７の喪失は、有糸分裂後分化ニューロンの特徴である細胞周期中の細胞の減少を示す。加えて、ＦＡＣＳ分析は、ＬＳＢと３ｉからなる好ましい組成物で処理した細胞集団の７５％超がＴＵＪ１を発現し、これに対してＬＳＢ単独で処理した集団の９９％が前駆体マーカーであるネスチンを発現することを明らかにした（図２Ｅ）。
【０１７９】
Ｂ．ＴＵＪ１＋ニューロン細胞はＣＮＳ細胞マーカーではなくＰＮＳ細胞マーカーを発現した。
【０１８０】
以下の実施例は、本発明の開発の間に生産されるＴＵＪ１陽性ニューロンの種類を同定するための例示的な方法を述べる。
【０１８１】
ＬＳＢ処理の２日後に３ｉ処理する好ましい実施形態から得られるニューロンのサブタイプをさらに特性づけるため、ＴＵＪ１陽性集団を様々なニューロンサブタイプのマーカーに関して染色した。具体的には、二重ＳＭＡＤ阻害プロトコールは、ＦＯＸＧ１（フォークヘッドボックスタンパク質Ｇ１）を発現する前脳前部正体（ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｆｏｒｅｂｒａｉｎ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）に偏ったＰＡＸ６＋神経上皮細胞を生成することが公知であった（参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｈａｍｂｅｒｓら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２７（２００９））。それゆえ、ＬＳＢ３ｉ処理後のニューロンサブタイプ正体を決定するために、細胞を１０日目により低い密度、約１０〜１００，０００細胞／ｃｍ２に継代し、１２日目に一連のマーカー発現に関して評価した。
【０１８２】
予想されるニューロン型はＣＮＳ運命であったので、試験した初期マーカーの大部分はＣＮＳ型細胞の同定のためのものであった。実際に、ＬＳＢ細胞はこのサブタイプ（ＰＡＸ６、ＦＯＸＧ１陽性）がデフォルトであるので、ＣＮＳ前脳ニューロンが予想された。驚くべきことに、ＰＮＳ細胞のマーカーであるＩＳＬ１の染色が見出される前に、ＣＮＳマーカーについて少なくとも１２の陰性結果（例示的な１０を以下に示す）が得られた。ＩＳＬ１は、運動ニューロンおよび末梢感覚ニューロンによって発現される。ＢＲＮ３Ａ発現を試験し、ＬＳＢ／３ｉ細胞によって発現することを認めた。それゆえ、発明者は、末梢感覚ニューロンの発生を示すＢＲＮ３Ａ＋／ＩＳＬ１＋ニューロンを発見した。以下の表Ａ参照。
【０１８３】
表Ａ：以下の遺伝子／タンパク質のリストは、本明細書で述べるＬＤＮ／３ｉ誘導分化を使用して、細胞に関して陽性である（発現される）と予想された数多くのＣＮＳ運命分子を示す。しかし、これらの結果は例示的なＣＮＳマーカーの欠如を示し、前記結果は、ＰＮＳ系列に関する潜在的マーカー、すなわちＩＳＬ１およびＢＲＮ３Ａのその後の観察によって支持された。
【０１８４】
【数１】
2018139592.tif 000017
【０１８５】
驚くべきことに、ＩＳＬ１およびＢＲＮ３Ａの均一な発現（赤色／細胞内のより暗い領域）（図３ＡおよびＢ）が本発明のＴＵＪ１＋細胞（緑色／赤色染色に比べてより明るい細胞体）で認められた。ＩＳＬ１およびＢＲＮ３Ａは感覚ニューロンについての鍵となるマーカーである（そのすべてが参照により本明細書に組み込まれる、ＩＳＬ１：Ｓｕｎら、Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １１，１２８３−１２９３（２００８）；ＢＲＮ３Ａ：Ｇｅｒｒｅｒｏら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０，１０８４１−１０８４５（１９９３））。この発見は、ＬＳＢ３ｉ処理から生じるニューロンがＣＮＳ細胞ではなくＰＮＳであることを示した。これらの結果は、ＣＮＳ前脳ニューロンサブタイプ（ＰＡＸ６＋、ＦＯＸＧ１陽性）がデフォルトであるＬＳＢ細胞と対照的であった。先行技術の教示によれば、平板培養密度によって示される、処理の開始の際の幹細胞の高い集密度はＣＮＳ由来ニューロン集団を生じさせるはずであるので、これは極めて予想外の観察である。しかし、侵害受容器は神経堤細胞集団に由来し、神経堤細胞集団は、先行技術の教示によれば、平板培養密度によって示される、処理の開始の際の幹細胞の低い集密度に由来する。言い換えると、予想は、ＬＳＢ処理の開始の時点で＞２０，０００細胞／ｃｍ２の多能性幹細胞という高い初期平板培養密度は拘束ＣＮＳニューロン集団を生じさせるというものであった。これに対し、神経堤細胞を生じさせるには約１０，０００細胞／ｃｍ２という低い初期平板培養密度が必要であることは公知であった（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｈａｍｂｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，２００９（図４の下半分参照））。
【０１８６】
ＬＳＢ処理の２日後に３ｉ処理する好ましい実施形態から得られるニューロンのサブタイプをさらに特性づけるため、ＴＵＪ１陽性集団を様々なニューロンサブタイプのマーカーに関して染色した。この集団は、ＩＳＬ１、ＢＲＮ３Ａ、ＲＥＴおよびＲＵＮＸ１の発現に関して陽性であった（図３Ａ〜Ｄ）。ＦＡＣＳ分析は、これらのニューロンの６０％超がＮＴＲＫ１に関して陽性であることを明らかにした（図３Ｅ）。
【０１８７】
これらのマーカーは集合的に、ニューロン集団が末梢感覚ニューロン、特に侵害受容器であることを示す。先行技術の教示によれば、平板培養密度によって示される、処理の開始の際の幹細胞の高い集密度はＣＮＳ由来ニューロン集団を生じさせるはずであるので、これは極めて予想外の観察である。しかし、侵害受容器は神経堤細胞集団に由来し、神経堤細胞集団は、先行技術の教示によれば、平板培養密度によって示される、処理の開始の際の幹細胞の低い集密度に由来する。それゆえ、２日目の３ｉ処理とＬＳＢの組合せの好ましい実施形態は、神経堤由来集団、すなわち侵害受容器の予想外の形成を生じさせる。本発明の一般性を確立するため、発明者は、ｈｉＰＳＣを幹細胞の供給源として使用して、ＬＳＢ処理の２日後に３ｉ処理を組み合わせる本発明の好ましい実施形態を反復した。現行技術はｈｉＰＳＣを生産する多くの方法を述べており、当業者に公知である。ＬＳＢ、次いで２日目に３ｉで処理した、高集密度で平板培養したｈｉＰＳＣ細胞は、侵害受容器マーカーＩＳＬ１、ＢＲＮ３Ａ、ＲＥＴおよびＲＵＮＸ１に関して陽性のニューロン細胞の形成をもたらす（図４Ａ〜Ｄ）。
【０１８８】
Ｃ．ＰＮＳ  ＴＵＪ１＋ニューロン細胞は侵害受容器−ペプチド作動性細胞マーカーを発現した。
【０１８９】
以下の実施例は、本明細書で述べる方法を用いていずれの型の末梢神経系（ＰＮＳ）ニューロンが生産されたかを決定するための例示的な方法の使用を述べる。
【０１９０】
本明細書で述べる方法によっていずれの型のＰＮＳニューロンが生産されるかは、感覚ニューロンおよび運動ニューロンなどのいくつかの種類の候補ニューロンが存在し、さらに固有受容器細胞、機械的受容器（ｍｅｃｈａｎｏｃｅｐｔｏｒ）細胞および侵害受容器細胞を含むＰＮＳ中の公知の感覚ニューロンの少なくとも３つの主要なサブセットが存在するので、不明であった。
【０１９１】
発生の間、初期段階の侵害受容器はペプチド作動性および非ペプチド作動性の両方であり、独自にＮＴＲＫ１、ＲＵＮＸ１を発現し、次いでＲＥＴを発現した（ＲＥＴに関する情報の例については、参照により本明細書に組み込まれる、Ｗｏｏｌｆら、Ｎｅｕｒｏｎ  ５５，３５３−３６４（２００７）参照）。ＴＵＪ１＋ニューロンを含む２連の初期段階ＬＳＢ３ｉ培養物をＲＥＴ発現に関して試験し（図３Ｃ）、このマーカーに関して陽性であることが見出され（ＴＵＪ１＋染色（緑色／ＲＥＴ染色と比較してより明るい細胞体）および挿入されたＲＥＴの箱内のより明るい染色領域と比較して、赤色／大きい方の箱の細胞内のより暗い領域）（図３Ｄ）、また１０日目にＦＡＣＳによって測定した場合、培養下のすべての細胞の６０％超がＮＴＲＫ１を発現した（図３Ｅ）。
【０１９２】
要約すると、この集団はＩＳＬ１、ＢＲＮ３Ａ、ＲＥＴおよびＲＵＮＸ１の発現に関して陽性であり（図３Ａ〜Ｄ）、初期段階侵害受容器（ペプチド作動性および非ペプチド作動性の両方）の産生を指示した。ＦＡＣＳ分析は、これらのニューロンの６０％超がＮＴＲＫ１に関して陽性であることを明らかにした（図３Ｅ）。これらのマーカーは集合的に、ニューロン集団が末梢感覚ニューロン、特に侵害受容器であることを示す。
【０１９３】
それゆえ、２日目の３ｉ処理とＬＳＢの組合せの好ましい実施形態は、神経堤由来集団、すなわち侵害受容器の予想外の形成を生じさせる。
【０１９４】
さらに、発明者は、ＬＳＢ／３ｉ処理によって得られた細胞が神経堤へと移行し、ＣＮＳ運命に分化する代わりにニューロゲニン１（ＮＥＵＲＯＧ１）を一過性に発現するという本明細書で述べた観察に加えて、初期免疫蛍光結果、すなわちＢＲＮ３Ａ＋、ＩＳＬ１＋、アレイデータ、すなわちＴＡＣ１（サブスタンスＰ）発現を含む、いくつかの試験からの情報を組み合わせ、次にＮＴＲＫ１マーカーを選択し、ＮＴＲＫ１＋細胞を見出した。そこで、発明者は、生じるＰＮＳ細胞がおそらくペプチド作動性侵害受容器である可能性が高いと考えた。
【０１９５】
Ｄ．ＬＳＢ３ｉはＰＮＳ  ＴＵＪ１＋侵害受容器−ペプチド作動性ニューロン細胞を再現可能に誘導した。
【０１９６】
以下の実施例は、再現性を決定するために本発明の例示的な方法を使用することを述べる。
【０１９７】
本発明の一般性を確立するため、発明者は、ｈｉＰＳＣを幹細胞の供給源として使用して、ＬＳＢ処理の２日後に３ｉ処理を組み合わせる本発明の好ましい実施形態を反復した。ＬＳＢ３ｉ処理の再現性を、誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）系を含むさらなるｈＰＳＣ系にわたって評価した。現行技術はｈｉＰＳＣを生産する多くの方法を述べており、当業者に公知である。特に、Ｏｃｔ４（オクタマー結合転写因子４）、Ｓｏｘ２（ＳＲＹ（性決定領域Ｙ）ボックス２）、Ｋｌｆ４（クルッペル様因子４）およびｃ−Ｍｙｃ（転写因子ｐ６４）などの遺伝子を挿入することによって作製される２つのｈｉＰＳＣ系（Ｃ１４およびＣ７２）を使用して、効率的に神経化できる（ｎｅｕｒａｌｉｚｅ）ことが示された（参照により本明細書に組み込まれる、Ｐａｐａｐｅｔｒｏｕら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  １０６（２００９）参照）。
【０１９８】
次にＰＡＸ６発現をＩｍｍｕｎｏＦによって検査した。Ｃ１４およびＣ７２細胞系のＬＳＢおよびＬＳＢ３ｉ処理は、図３Ａ〜Ｄに示すヒト細胞系と比較した場合、類似のニューロン染色結果を示した。上記で述べたように、ＩＳＬ１、ＢＲＮ３Ａ、ＲＥＴ、ＲＵＮＸ１およびＴＵＪ１に関して、例示的なＣ１４染色結果を図４Ａ〜Ｄに示し、例示的なＣ７２染色結果を図８Ａ〜Ｄに示す。
【０１９９】
Ｃ１４およびＣ７２細胞系のＬＳＢ処理はネスチン陽性細胞を均一に生じさせ（処理細胞集団の＞９５％）、ＦＡＣＳによって測定されるようにＬＳＢ３ｉの組合せで処理したときＴＵＪ１＋細胞を形成することができた（Ｃ１４については４０％およびＣ７２については３３％；図４Ｅ）。これらの結果を、図４ＥにおいてＬＳＢおよびＬＳＢ３ｉ結果に関して示される、ＬＳＢおよびＬＳＢ３ｉで処理したＨ９細胞系（すなわちｈＥＳＣ系）と比較した。さらに一層高いニューロン収率が（ＦＡＣＳによって測定された４０％および３３％から、ＮＴＲＫ１に関して選別した場合核染色の＞９０％がニューロンである）、ＮＴＲＫ１（神経栄養因子チロシンキナーゼ受容体１型）マーカー発現に関して選別した後バルク培養物を、Ｎ２培地を含むＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）でコートした培養容器に継代したとき、これら２つのｈｉＰＳＣ系において得られた。細胞をアキュターゼで解離させ、Ｎ２に再懸濁して、ＡＰＣ結合ＮＴＲＫ１抗体（Ｒ＆Ｄ）と共に氷上で１５分間インキュベートし、洗浄して、ＦＡＣＳのためにＮ２に再懸濁した。選別後、細胞をＮ２培地で２４時間培養し、適切に固定した。細胞を収集し、ＢＲＮ３Ａ、ＩＳＬ１、ＴＵＪ１およびＤＡＰＩに関して染色した。特に、代表的なＮＴＲＫ１＋ＬＳＢ３ｉ処理細胞集団におけるわずかなネスチン＋細胞と比較して、ＬＳＢ３ｉ処理細胞からはＣ１４およびＣ７２両方のＮＴＲＫ１−細胞に関して数多くのネスチン＋細胞（赤色／暗染色）が示される（図９）。さらに、わずかなＣ１４  ＮＴＲＫ１−細胞がＴＵＪ１細胞系を発現したが、Ｃ２７はより高い数のＮＴＲＫ１−ＴＵＪ１＋（緑色；鮮やかな染色）を示した。両細胞系は、ＤＡＰＩ（青色；明るい核）染色によって同定される細胞体と比較して認められるように、高い数のネスチン−ＴＵＪ１＋細胞を示した。
【０２００】
要約すると、ＬＳＢ、次いで２日目に３ｉで処理し、高集密度で平板培養したｈｉＰＳＣ細胞は、侵害受容器マーカーＩＳＬ１、ＢＲＮ３Ａ、ＲＥＴおよびＲＵＮＸ１に関して陽性のニューロン細胞の形成を生じさせた（図４Ａ〜Ｄ、図８Ａ〜Ｄおよび図９）。
【０２０１】
この低分子組合せアプローチを用いて、安定な成熟ニューロン細胞運命がｈＰＳＣから分化することができる速度は（図４）、最も驚くべき観察である。成熟ニューロン表現型の生成のための１０〜１５日間という時間枠は、ヒト発生の間の侵害受容器出現の推定（３０〜５０日間）（参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｉｔａｏら、Ｊ  Ｃｏｍｐ  Ｎｅｕｒｏｌ  ３７１，２４９−２５７（１９９６））と比較してはるかに加速されている。ＩＳＬ１およびＢＲＮ３Ａの上方調節は、５日目から７日目の間に始まる、ＳＯＸ１０の発現と共存する。３ｉを添加する最適時点は二重ＳＭＡＤ阻害の２日目であり、２日目のソニック・ヘッジホッグでの処理がＦＯＸＡ２発現およびヒト底板分化を促進するうえで最も有効であるという発明者の研究室からの以前の観察を反映する（参照により本明細書に組み込まれる、Ｆａｓａｎｏら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ６，３３６−３４７（２０１０））。これは、神経パターン形成がＯＣＴ４タンパク質発現の喪失に先だって起こり得ること、およびＯＣＴ４タンパク質の存在は前パターン形成事象を制限しないと思われることを示唆する。神経堤由来感覚ニューロンの誘導におけるＣＨＩＲ９９０２１の重要な役割は、おそらく、初期神経堤特異化において必須であることが公知であり（参照により本明細書に組み込まれる、Ｄｏｒｓｋｙら、Ｎａｔｕｒｅ  ３９６，３７０−３７３（１９９８））、ナイーブ神経堤前駆体を感覚ニューロン系列へと指示することができる（参照により本明細書に組み込まれる、Ｌｅｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０３，１０２０−１０２３（２００４））、標準的なＷＮＴシグナル伝達の活性化に関連する。
【０２０２】
マウス細胞の転写因子に基づく系列再プログラム化は、線維芽細胞から直接ニューロンを誘導する手段としてそれに値する注目を集めており（参照により本明細書に組み込まれる、Ｖｉｅｒｂｕｃｈｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ４６３，１０３５−１０４１（２０１０））、いつかはこの方法がヒト細胞で使用されるかもしれない。本明細書で示すデータは、ＬＳＢ３ｉがヒト有糸分裂後ニューロンを速やかに誘導できることを明らかにした。ＬＳＢ３ｉを含む方法を使用することの重要な利点の一部は、ヒト前駆体細胞、すなわちＰＳＣからのヒト有糸分裂後ニューロンの生産の速度と効率であった。さらに、このプロトコールは、遺伝子操作または継代などの機械的介入処置を必要とせず、単一培養工程で１０日以内に高度に富化されたニューロンの集団を生じさせた。
【０２０３】
ＬＳＢ３ｉはまた、ｈＰＳＣにおける系列特異化を駆動するためのコンビナトリアル低分子スクリーニングの使用の最初の例の１つである。発生決定点で繰り返し使用される発生経路の限られた数を考慮すると（参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｒｉｖａｎｌｏｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９５，８１３−８１８（２００２））、本明細書で述べるアプローチはヒト多能性系列を特異化するために一般的に適用できるはずである。ＬＳＢ３ｉで使用される５つの低分子の大部分は公知のシグナル伝達経路インヒビターであり、内因性シグナル伝達経路の抑制がｈＰＳＣ運命を指示するうえで特に有効であることを示す。低分子を使用する場合、低分子がしばしば意図されないかまたは予想外の結果を生じさせる、オフターゲット効果は重要な考慮すべき事項であるが、本発明の開発の間に得られたデータは、この特定の発明において、内因性シグナル伝達経路の低分子組合せ阻害が、ｈＰＳＣ細胞運命を調節するための効率的で、非遺伝的な（ＤＮＡコード配列の変化なし）、種を超える、コスト効果的で、迅速な、かつ可逆的な手段を提供することを明らかにした。
【０２０４】
ＩＩＩ．ＬＳＢ−Ｃ：ＣＨＩＲ９９０２１はＬＳＢ３ｉ侵害受容器の生成のために必要であり、分化を神経堤幹細胞へと向かわせることが発見された。
【０２０５】
本発明の開発の間に、発明者は、ＬＳＢ接触細胞が、ＬＳＢ処理後２日目にＣＨＲ／ＳＵまたはＣＨＲ／ＤＡＰＴと接触した場合、高い数で侵害受容器へと分化するように指示され得るが、ＳＵ／ＤＡＰＴではそれが起こらないことを発見した。さらに検討したとき、発明者は、驚くべきことにＬＳＢ−Ｃ、ＣＨＩＲと接触したＬＳＢ処理細胞が神経堤幹細胞集団を生じさせることを発見した。
【０２０６】
Ａ．ＣＨＩＲ９９０２１（Ｃ）はＬＳＢ培養細胞（すなわちＬＳＢ−Ｃ）からニューロン分化を誘導するための鍵となる因子である。
【０２０７】
以下の実施例は、定方向性ニューロン分化を誘導するための各々の化合物の効果を試験するために例示的方法を使用することを述べる。
【０２０８】
実施例ＩＩＩのＴＵＪ１＋細胞の誘導に関連することが認められた各々の化合物の充足度に関する機構的な洞察を得るために、３ｉ化合物の特定の組合せを、細胞間ＦＡＣＳを用いて測定されるネスチンおよびＴＵＪ１の細胞発現を誘導することに関して試験した（図１Ｇに示す）。ネスチンをＬＳＢニューロン系列細胞のマーカーとして使用し、下流の（すなわちより分化した）ニューロン細胞を同定するためにＴＵＪ１を使用した。
【０２０９】
個々の因子のいずれもが高い数（６０％超）のＴＵＪ１＋ニューロンを生じなかったが、その他の２つのシグナル阻害因子のいずれか１つと組み合わせたＣＨＩＲ９９０２１は、中等度の数のＴＵＪ１＋ニューロン（ＤＡＰＴに関しては５３％およびＳＵ５４０２  に関しては５８％）を生成することができた。これらのデータは、本明細書で使用した試験条件下で、ＣＨＩＲ９９０２１がニューロン分化を加速するための鍵となる因子であり、ＳＵ５４０２およびＤＡＰＴは重要な、しかし付加的な刺激を提供したことを示す。
【０２１０】
加えて、３ｉ組成物の３つの成分すべてが分化ニューロンの最大収率のために必要である（図２Ｇ）。
【０２１１】
Ｂ．ＣＨＩＲとさらに接触した（Ｄ２）ＬＳＢ接触細胞（Ｄ０）から神経堤幹細胞が誘導された。
【０２１２】
発明者は、これらのそれぞれのインヒビターの早期回収を使用した実験を介して、ＢＭＰシグナル伝達およびＴＧＦβシグナル伝達が神経堤誘導のために最適化されることを認めた。次に、低分子ＧＳＫ３βインヒビター（ＣＨＩＲ９９０２１）を使用して、ＧＳＫ３β阻害と共にＷｎｔシグナル伝達が活性化された。そこで発明者は、狭いウインドウ（２日目）のＷｎｔシグナル伝達が二重ＳＭＡＤ阻害プロトコールに関連して神経堤誘導を支配することを認めた。これら３つの経路についての最適化シグナル伝達を組み合わせた修正二重ＳＭＡＤ阻害プロトコール（ＬＳＢ−Ｃ）は、集団の６５％までにおいてＳｏｘ１０：：ＧＦＰを発現する神経堤の誘導を増強した。
【０２１３】
ＩＶ．ＬＳＢ３ｉおよびＬＳＢ−Ｃ誘導の人工ＳＯＸ１０＋細胞は侵害受容器細胞を生産することができる。
【０２１４】
以下の実施例は、操作されたＳｏｘ１０＋ＧＦＰ発現ヒト細胞の定方向性分化のために本発明の例示的な方法を使用することを述べる。
【０２１５】
侵害受容器細胞は、ヒト発生の間に２種類の細胞中間体から生じると考えられる：具体的には、ＳＯＸ１０＋ニワトリ胚神経堤細胞は脊髄に隣接する体幹侵害受容器細胞を生成できることが認められた（参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｅｏｒｇｅら、Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １０：１２８７−１２９３（２００７））。加えて、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）の頭部プラコード組織は、顔面組織中の三叉神経侵害受容器細胞集団に寄与した（参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｃｈｌｏｓｓｅｒら、Ｊ  Ｃｏｍｐ  Ｎｅｕｒｏｌ  ４１８：１２１−１４６（２０００）；Ｓｃｈｌｏｓｓｅｒら、Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ２９４：３０３−３５１（２００６））。
【０２１６】
そこで、ヒト細胞においてＳＯＸ１０によって示される神経堤中間体細胞運命（参照により本明細書に組み込まれる、Ａｏｋｉら、Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ２５９，１９−３３（２００３）；Ｌｅｅら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２５，１４６８−１４７５（２００７））が、トランスジェニックＳＯＸ１０：：ＧＦＰ細菌人工染色体（ＢＡＣ）ｈＰＳＣ系を使用して分化の間に認められるかどうかを決定するために、以前に報告された方法（参照により本明細書に組み込まれる、Ｐｌａｃａｎｔｏｎａｋｉｓら、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２７：５２１−５３２（２００９））を用いて、ＧＦＰ遺伝子と共発現する富化された神経堤遺伝子マーカーを伴った、このＳＯＸ１０：：ＧＦＰ（ＢＡＣ）細胞系を生成した。ＳＯＸ１０：ＧＦＰ細胞系はＨ９  ｈＥＳＣ系のサブクローンであった。細胞を解離させ、Ａｍａｘａからの試薬（溶液Ｖ）、プロトコール（Ｂ−１６）および装置を用いて遺伝子送達を実施した。ヌクレオフェクトした（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｅｄ）（核にトランスフェクトした）ＤＮＡは、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｎｅｒｖｏｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ａｔｌａｓ［ＧＥＮＳＡＴ］（アクセッション番号：ＧＥＮＳＡＴ１−ＢＸ１０８６）から入手した、挿入されたＧＦＰとＳＯＸ１０遺伝子を含む細菌人工染色体（ＢＡＣ）であった。次にＢＡＣを、ｐＬ４５２プラスミドから切り出した選択カセットからＧＥＮＳＡＴ  ＢＡＣへのｃｒｅ／ＬｏｘＰ組換えを使用して、選択のためにネオマイシン耐性遺伝子を含むように改変した（参照により本明細書に組み込まれる、Ｔｏｍｉｓｈｉｍａら、Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ２５（１）：３９−４５．Ｅｐｕｂ  ２００６  Ｓｅｐ  ２１（２００７）参照）。遺伝子送達後、ｈＥＳＣを、ネオマイシン耐性選択のためにＧ４１８の存在下で単細胞として接種し、クローンを手操作で採取して、分化後にＧＦＰの存在に関してスクリーニングした。ｑＲＴ−ＰＣＲによりＧＦＰ細胞を選別してＳＯＸ１０および他の神経堤マーカーの発現を確認した。
【０２１７】
２つの付加的な２連の試料を各々ＬＳＢの１つと接触させ、次にＣＨＩＲ９９０２１（ＬＳＢ／Ｃ）またはＬＳＢと３ｉに接触させて、ＬＳＢで分化を開始させた後４、８、１２および１６日目に、ＧＦＰ発現をＦＡＣＳ同定およびＳＯＸ１０：：ＧＦＰ＋細胞の選別によって測定した。
【０２１８】
ＣＨＩＲ９９０２１が存在した場合は、培養下でこれらの処理細胞の７０％超が、培養条件に応じて分化の１２日目までにＳＯＸ１０：：ＧＦＰ＋になった（ＬＳＢ／Ｃについては７０％およびＬＳＢ３ｉについては８０％；図５ＤおよびＥ）。この結果は、細胞の大部分が神経堤正体を発現することを示し、ＣＨＩＲ９９０２１がＬＳＢ３ｉ侵害受容器細胞の生成のために必要であるという発明者の観察を支持した。したがって、ＬＳＢ３ｉ処理細胞はＬＳＢ／Ｃ処理したｈＰＳＣと比較してより迅速に神経堤運命を獲得したので（図５ＤおよびＥ）、ＳＵ５４０２およびＤＡＰＴと接触させることに加えて、チロシン受容体キナーゼ受容体およびノッチシグナル伝達を阻害するこれらの低分子による組合せ阻害は、それぞれ、神経堤細胞運命を加速した。発明者は、ＣＨＩＲは神経堤および感覚ニューロンを誘導し、ＳＵは神経堤マーカー発現およびニューロン分化を加速すると考えた。最後に、発明者は、ＣＨＩＲおよびＳＵと組み合わせたＤＡＰＴはニューロン分化を加速すると考えた。さらに、ＬＳＢと組み合わせたＣＨＩＲ９９０２１の使用、すなわちＬＳＢ／Ｃは、操作されたＳＯＸ：：ＧＦＰ細胞を読み出しとして使用した場合、１２日から１６日目までの間にＬＳＢ３ｉと比較して、６０％超のネスチン−ＴＵＪｌ＋ニューロン細胞の遅い変換速度を生じさせた。
【０２１９】
Ｖ．本明細書で述べる方法によって生産されたＮＴＲＫ１＋ヒト侵害受容器細胞はインサイチューラット侵害受容器細胞に類似した電気生理学的応答を示した。
【０２２０】
以下の実施例は、本明細書で述べる方法によって生産された侵害受容器細胞の機能的能力を決定するために本発明の例示的な方法を使用することを述べる。
【０２２１】
ＬＳＢ３ｉ由来ニューロンが本物の侵害受容器ニューロン細胞であることを確認するために、ＬＳＢ３ｉ処理細胞を機能、成熟段階および挙動に関して検査した。侵害受容器細胞を生じさせる多能性幹細胞のＬＳＢ３ｉ処理が得られた後、１０〜１００，０００細胞／ｃｍ２の平板培養密度から長期培養物を樹立し、ヒトβＮＧＦ、ＢＤＮＦおよびＧＤＮＦを添加したＮ２培地での培養下で１０日目、３０日目に継代した（さらなる詳細については実施例Ｉ参照）。より長期の培養条件下でのこれらの細胞の生存率は、ＮＴＲＫ１＋侵害受容器状態と対応して、ＮＧＦ依存性であることが認められた。ＬＳＢ３ｉ侵害受容器は、グルタミン酸（図７Ｃ）に加えて、先に示したように高レベルのＴＵＪ１、ＩＳＬ１、ＢＲＮ３Ａ（図７Ａ〜Ｃ）を発現した。グルタミン酸産生は、興奮性グルタミン酸作動性ニューロン、すなわちグルタミン酸を放出する侵害受容求心性線維、および有害刺激についての重要なイオンチャネルであるカプサイシン受容体ＴＲＰＶ１（図７Ｄ）と一致した。培養下で１５日目に２つの別個の成長突起を各々のニューロンについて同定することができた（図７Ｅ、図１２）。
【０２２２】
樹状突起マーカーＭＡＰ２は、主として、極性を有する形式（ｐｏｌａｒｉｚｅｄ  ｆａｓｈｉｏｎ）において、２つの突起の一方において発現された（図７Ｆ）。ニューロンの双極性は、末梢神経節における感覚ニューロンの役割と一致し、細胞体は背根神経節に位置し、脊髄と末梢の両方に向けて突起を突き出す（参照により本明細書に組み込まれる、Ｗｏｏｌｆら、Ｎｅｕｒｏｎ  ５５，３５３−３６４（２００７）；Ｇｅｏｒｇｅら、Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １０，１２８７−１２９３（２００７））。
【０２２３】
神経成長因子（ＮＧＦ）の存在下で、ニューロンを長期間培養した（例えば、細胞を１０日目に継代し、３０日目まで培養した）。ＬＳＢを５日目に細胞から回収し、１０日目に３ｉを回収して、その日にＮＧＦ／ＧＤＮＦ／ＢＤＮＦを培地に添加した。１０日目から３０日目までニューロンにＮＧＦ／ＧＤＮＦ／ＢＤＮＦを供給した。初期ＬＳＢ処理からの日数で３０日目に、ニューロンは神経節様構造へと自己組織化し始めたことが認められた。このタイプの形態は末梢感覚ニューロンに共通する（参照により本明細書に組み込まれる、Ｍａｒｍｉｇｅｒｅら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ８，１１４−１２７（２００７））（図７Ｇ、ＨおよびＩ）。
【０２２４】
成熟侵害受容器は、典型的には、ペプチド作動性感覚ニューロンによって発現されるカルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）およびサブスタンスＰ（神経ペプチド）などの神経ペプチドの発現に依存して、ペプチド作動性または非ペプチド作動性のいずれかである（参照により本明細書に組み込まれる、Ｗｏｏｌｆら、Ｎｅｕｒｏｎ  ５５，３５３−３６４（２００７））。これに対し、非ペプチド作動性ニューロンはＣＧＲＰもサブスタンスＰも発現せず、レクチンＩＢ４への結合などの他のマーカーを有する。
【０２２５】
それゆえ、ＬＳＢ３ｉ誘導ニューロンを、ＦＡＣＳを用いて、ＮＴＲＫ１発現に関して（上記で述べた方法参照）、ＮＴＲＫ１＋およびＮＴＲＫ１−集団に選別した（選別細胞の例については図７Ｇ参照）。ＮＴＲＫ１＋細胞はサブスタンスＰおよびＣＧＲＰの両方に関して陽性であり、主としてペプチド作動性侵害受容器表現型を示した（図７ＨおよびＩ；分化の３０日目）。
【０２２６】
感覚ニューロン正体の主要な機能的特徴（すなわち機能）は、それらの電気生理学的特性である（参照により本明細書に組み込まれる、Ｆａｎｇら、Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ５６５，９２７−９４３（２００５））。ＮＴＲＫ１＋選別ニューロンを、培養ニューロンについての標準的な電気生理学技術によっても試験した（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｐｌａｃａｎｔｏｎａｋｉｓら、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．２００９，Ｆｉｇｕｒｅ  ５に一例が示されている）。
【０２２７】
ＮＴＲＫ１＋細胞は、電気生理学的特徴である、特徴的な単一活動電位（ＡＰ）、発火パターンを示し、平均膜静止電位は初期ＬＳＢ３ｉ処理後２１日目までに６７±４ｍＶであった。ＬＳＢ３ｉヒトニューロンにおいて生じるＡＰのタイミングおよび活動曲線の形状を図７Ｊ（太い赤線参照）および以下の表１に示す。これらの結果は、以前に一次麻酔成体ラット侵害受容器の電気生理学的報告において述べられたものと同様であった（参照により本明細書に組み込まれる、Ｆａｎｇら、Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ５６５，９２７−９４３（２００５））。
【０２２８】
【表１−１】
2018139592.tif 000018
【０２２９】
ＶＩ．包括的な遺伝子発現分析は遺伝子発現の例示的な時期を示す。
【０２３０】
以下の実施例は、本明細書で述べる方法によって生産される侵害受容器細胞および他の細胞型の包括的な遺伝子発現を決定するための例示的な方法の使用を述べる。
【０２３１】
誘導分化過程の間の事象（すなわちマーカー発現）の時期をさらに特性づけるため、ＬＳＢおよびＬＳＢ３ｉ処理した両方のｈＰＳＣに関して、包括的な遺伝子発現分析を精密時間分解能（ｆｉｎｅ  ｔｅｍｐｏｒａｌ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）で実施した（２、３、５、７、９および１５日目、ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓ（ＧＥＯ）アクセッション番号ＧＳＥ２６８６７）。神経外胚葉、神経堤、ニューロンおよび侵害受容器に関する選択マーカーを分析した場合（以下の表２参照）、各々について分化の異なる段階を認めることができた（図１０）。
【０２３２】
【表２−１】
2018139592.tif 000019
【０２３３】
この遺伝子発現分析（図１０Ｂ、Ｃおよび上記表２）は免疫蛍光結果の大部分と一致した。例えば、遺伝子分析は、成熟中のニューロンにおいて、ＩＳＬ１、ＰＯＵ４Ｆ１（ＢＲＮ３Ａ）、ＳＯＸ１０、ＴＡＣ１（サブスタンスＰのプロペプチド）、ＮＴＲＫ１およびグルタミン酸小胞輸送体ＶＧＬＵＴ２遺伝子がすべて上方調節される（すなわち培養下の多くの細胞が経時的にこれらのマーカーの発現を増加させる）ことを示した。同時にこれらのマーカーは誘導細胞で増加することが認められたが、ｈＥＳＣ由来の原始神経外胚葉についてのマーカー、特にＤＬＫ１、ＬＨＸ２、ＯＴＸ２、ＬＥＦＴＹ２、ＰＡＸ６およびＨＥＳ５は下方調節される（すなわち培養下のより少数の細胞で発現される）ことが認められた。
【０２３４】
しかし、成熟侵害受容器で発現されると予想される、ソマトスタチン（ＳＳＴ）およびＳＯＸ１０の発現が、１５日目にＬＳＢ３ｉ処理細胞培養物で認められた。しかし、ＳＳＴはまた、発生中の感覚ニューロンにおいても発現されることが示された。それゆえ、発明者は、このマーカーが１５日目の未熟細胞の存在を示していると考えた。いくぶん下方調節されているが、ＳＯＸ１０の発現はまた、大部分の細胞がニューロンであると思われる時点でも観察された。ＳＯＸ１０は細胞がニューロンに分化するとともに下方調節されると予想されたので、この観察は意外であった。１５日目の培養物の細胞におけるＳＳＴおよびＳＯＸ１０発現というこの予想外の発見から、すべての細胞が侵害受容器細胞になるわけではなく、約２０〜３０％であると考えられた。これは、他の成熟細胞型（シュヴァン細胞など）がＳＯＸ１０を発現し続けることを示した。
【０２３５】
二重ＳＭＡＤ阻害によって生産されるｈＥＳＣ由来の原始神経外胚葉細胞培養物は（各々が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｈａｍｂｅｒｓら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２７（２００９）；Ｆａｓａｎｏら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ６，３３６−３４７（２０１０））、ＤＬＫ１、ＬＨＸ２、ＯＴＸ２、ＬＥＦＴＹ２、ＰＡＸ６およびＨＥＳ５遺伝子の高発現を示した。同様に、ｈＥＳＣ由来の原始神経外胚葉細胞培養物がＬＳＢを用いた二重ＳＭＡＤ阻害によって生産された場合も、これらの遺伝子について類似の高発現が観察された（図１０Ｂ、Ｃおよび以下の表３参照）。これらの遺伝子は、ＬＳＢ３ｉ処理の間は低減し、この間、本発明の開発において侵害受容器が生産された。
【０２３６】
【表３−１】
2018139592.tif 000020
【０２３７】
加えて、時間的トランスクリプトーム分析は、機械的受容器細胞（ｍｅｃｈａｎｏｃｅｐｔｏｒ）および固有受容器細胞とは異なる、侵害受容器中間体細胞運命についてのさらなる証拠を提供した。ニューロゲニン塩基性ヘリックス−ループ−ヘリックスタンパク質は、マウス発生の間に背根神経節における神経発生の２つの逐次的な波を媒介する（参照により本明細書に組み込まれる、Ｍａｒｍｉｇｅｒｅら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ８，１１４−１２７（２００７）；Ｍａら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １３，１７１７−１７２８（１９９９））。ＮＥＵＲＯＧ２（ニューロゲニン２）によって示される最初の波は機械的受容器細胞および固有受容器細胞を生じさせ、ＮＥＵＲＯＧ１（ニューロゲニン１）によって示される２番目の波は侵害受容器細胞を生じさせる。ｈＰＳＣをＬＳＢで処理した場合、ＮＥＵＲＯＧ２発現は７日目までに強力に誘導される（図１０Ｃおよび以下の表４）。これに対し、ＬＳＢ３ｉで処理したｈＰＳＣは、７日目までにあまり顕著ではないＮＥＵＲＯＧ２の誘導を示すが、９日目までにＮＥＵＲＯＧ１の選択的誘導を示す（図１０Ｃ）。
【０２３８】
【表４−１】
2018139592.tif 000021
【０２３９】
ＶＩＩ．例示的な侵害受容器細胞を提供するために本発明の組成物および方法を用いて企図される大規模培養。
【０２４０】
以下の企図される説明は、本明細書で述べる方法によって生産される侵害受容器細胞の大規模生産のための例示的な方法および使用を示す。
【０２４１】
ＬＳＢ３ｉを使用する、拡大可能な生成（すなわち比較的少数の細胞、例えば実施例、前出で述べるような４８穴プレートの１．５×１０４細胞／穴、および企図される９６穴プレートでの５×１０３細胞／穴を含む両培養物から、ｈＰＳＣ由来侵害受容器の大規模バッチ培養（例えば１８  １５ｃｍ皿のバッチで１×１０７〜１×１０８細胞（約５．５×１０７細胞））まで、侵害受容器細胞を生成するための成功をおさめると考えられる方法）。これらの方法は、基礎生物学試験における使用のため、ならびにヒトおよび動物における医学適用に適用できる薬剤発見のために、化合物を試験する際に使用するためのｈＰＳＣ由来侵害受容器細胞を提供することが企図される。特に、発明者は、ヒトおよび動物における急性および慢性疼痛を軽減する処置のために本発明の組成物および方法を使用することを企図する。
【０２４２】
特に、例示的な侵害受容器細胞、例えばペプチド作動性侵害受容器細胞を、７×１０７〜７×１０８の例示的な非限定的範囲で（７０％の効率の侵害受容器細胞収集が企図される）提供するために、本明細書で述べる培地および例示的化合物を使用して、例示的な１×１０８〜１×１０９ｈＰＳＣ細胞をバッチ胚様体培養物において増殖させる大規模バッチ培養が企図される。例示的な侵害受容器細胞は、ＴＡＣ１、ＶＧＬＵＴ２およびＳＬＣ１５Ａ３などの侵害受容器細胞を同定する遺伝子（すなわちｍＲＮＡおよびタンパク質）を発現すると考えられる。例示的な侵害受容器細胞は、ＩＳＬ１、ＢＲＮ３Ａ、ＲＥＴ、ＲＵＮＸ１、サブスタンスＰ、ＣＧＲＰ等のような同定マーカーを発現すると考えられる。
【０２４３】
要約すると、発明者は、基礎生物学ならびにヒトおよび動物において侵害受容器細胞に関連する状態、特に疼痛の試験および処置のための薬剤発見における、新規プラットフォームを提供するために本発明の組成物および方法を使用することを企図する。
【０２４４】
ＶＩＩＩ．ヒト多能性幹細胞からのメラノサイトの誘導：ＬＳＢ−Ｍｅｌ、ＬＤＮ−１９３１８９、ＳＢ４３１５４２、ＣＨＩＲ９９０２１、ＥＤＮＲ３およびＢＭＰ。
【０２４５】
メラノサイトは、主として表皮で認められる色素産生細胞であり、メラノサイトは表皮においてＵＶ照射が誘導するＤＮＡ損傷に対する光防護バリアを確立する。メラノサイト生物学の欠損は、白皮症、白斑およびまだら症を含む多くの色素沈着障害に関連する。メラノサイトは悪性黒色腫の起源細胞である。しかし、これらの障害の理解／処置は、インビトロでのヒトメラノサイトの試験に適した実験系の欠如により限られている。
【０２４６】
本発明の開発の間に、ヒト多能性細胞の神経細胞前駆体および神経堤（ＮＣ）前駆体の両方への迅速で極めて効率的な分化を生じさせるプロトコールが発見された。皮膚メラノサイトは神経堤細胞前駆体に由来するので、発明者は、成熟メラノサイトへのメラノサイト系列に沿った分化を指示するためにＬＳＢ−Ｃ由来の神経堤細胞系列細胞を使用する方法を発見した。言い換えると、多能性ＥＳＣ（胚性幹細胞）を神経堤前駆体細胞になるように誘導し（ＬＳＢ−Ｃ）、それをメラノサイト前駆体になるように誘導して、次に分化メラノサイトになるように誘導した。この行程は、多能性ＥＳＣが神経堤前駆体を経て、より拘束されたメラノサイト前駆体に向かい、その後最終的に分化状態を確立する、メラノサイト系列に沿った連続的特異化（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）としてモデル化された（図１６の、これらの段階の各々についての例示的なマーカーを示す概略図参照）。発明者は、メラノサイト発生の分子機構を同定するための新規アッセイにおけるこれらの定方向性分化メラノサイトの使用を企図する。特に、発明者は、患者特異的誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を誘導するための最近確立されたアプローチと組み合わせて、これらの定方向性分化メラノサイトを使用するアッセイを企図する。この新規定方向性分化メラノサイトは、白皮症、白斑、まだら症、黒色腫および悪性黒色腫等を含む、ヒト疾患のメラノサイト関連モデルについてのアッセイを生み出すことが企図される。
【０２４７】
Ａ．ヒトＥＳＣからの神経堤の誘導（メラノサイトを生産するための定方向性分化における第一工程）。
【０２４８】
メラノサイトは、神経外胚葉と非神経外胚葉との間の境界で原腸形成の間に生じる神経堤（ＮＣ）として知られる、脊椎動物に特有の細胞の一過性遊走集団から生じる。多分化能性神経堤は、一部には、ＮＣ細胞の解剖学的位置（軸レベル）によって決定される広範囲の誘導体に分化する。
【０２４９】
文献中の多大の証拠が、Ｗｎｔ、ＢＭＰおよびＴＧＦβシグナル伝達を早期神経堤特異化における重要要件として同定した。これらのうちで、後の２つの経路は二重ＳＭＡＤ阻害プロトコールの低分子処理によって能動的に阻害される。本明細書で述べるように、発明者は、ＢＭＰおよびＴＧＦβシグナル伝達が、それらのそれぞれのインヒビターの早期回収を介して神経堤誘導のために最適化されることを発見した。さらに、本明細書で述べるように、後でＷｎｔシグナル伝達を活性化する、低分子ＧＳＫ３βインヒビター（ＣＨＩＲ９９０２１）の使用は、処理の２日目にＬＳＢ処理細胞に添加された場合、神経堤幹細胞マーカーを発現する集団を生産することが見出された。そこで、３つの経路すべてについて最適化されたシグナル伝達を組み合わせる修正二重ＳＭＡＤ阻害プロトコールをＳｏｘ１０：：ＧＦＰ細胞系に関して使用し、Ｓｏｘ１０：：ＧＦＰを発現する神経堤の誘導を集団の６５％に増強することを認めた（ＬＳＢ−Ｃ処理）。
【０２５０】
Ｂ．神経堤由来のメラニン芽細胞の系列特異化と単離。
【０２５１】
ＬＳＢ−Ｃで誘導したＳｏｘ１０：：ＧＦＰを発現するＮＣを、次に、メラノサイト系列に沿って分化する能力に関して試験した。Ｓｏｘ１０：：ＧＦＰおよび、メラノサイト系列において発現されるがメラノサイト系列に特有というわけではないマーカーである、ＭＩＴＦを共発現する細胞の同定を介して、推定上のメラノサイト前駆体の存在が修正分化プロトコール（ＬＳＢ−Ｃ）の１１日目に確認された（図１３Ａ）。
【０２５２】
これらの細胞集団の誘導をさらに最適化し、その後特定の型のメラノサイト前駆体を単離または精製するために、メラノサイト系列の同定を可能にする細胞表面マーカーが必要であった。文献の調査後、ｃ−ｋｉｔを推定上のメラノサイト前駆体についての候補マーカーとして同定した。Ｓｏｘ１０：：ＧＦＰ＋細胞において試験したｃ−ｋｉｔのマーカーは、早期メラノサイトマーカーの発現が大きく富化された（図１３Ｃ）、Ｓｏｘ１０：：ＧＦＰ／ｃ−ｋｉｔ共発現細胞の低いパーセンテージ（約９％）の存在を確認した（図１３Ｂ）。分化プロトコールのさらなる最適化は、Ｓｏｘ１０：：ＧＦＰ／ｃ−ｋｉｔ二重陽性細胞の存在度（ａｂｕｎｄａｎｃｅ）が、メラノサイト特異化に関与する２つの因子、ＢＭＰ４およびエンドセリン３での付加的な処理（ＬＳＢ−Ｍｅｌ、図１３Ｄ〜Ｅ）を介してほぼ４倍に増加したことを明らかにした。
【０２５３】
Ｃ．メラノサイトの増殖と成熟。
【０２５４】
発明者は、推定上のメラノサイト前駆体が選別後の培養下でわずか６日間の付加的な日数後に色素沈着状態に成熟できることを発見した（図１４Ａ〜Ｂ）。驚くべきことに、発明者は、Ｓｏｘ１０：：ＧＦＰ／ｃ−ｋｉｔ二重陽性集団および２つのマーカーの各々についての単一陽性の集団の両方が、動態は異なるが、色素細胞を生じさせることを認め（図１４Ｃ）、３つの集団の間の系列階層を示した（ｃＫｉｔ＋／ＳＯＸ１０−、ｃＫｉｔ−／ＳＯＸ１０＋、ｃＫｉｔ＋／ＳＯＸ１０＋）。これら３つのメラノサイト系列細胞の同定は、メラノサイト系列に沿った分化中間体の単離を可能にすると考えられた。
【０２５５】
これらのメラノサイト前駆体細胞の使用により、成熟メラノサイト表現型を有する細胞を誘導し、支持することができる最適成熟条件が、そのような成熟を支持すると考えられる数多くの化合物を使用して同定された。評価したメラノサイトの特性には、紡錘形態、色素沈着およびメラノソーム形成の誘導が含まれた。
【０２５６】
発明者は、ＢＭＰ４およびｃＡＭＰの培地への添加が成熟紡錘様形態および色素沈着を促進することを発見した（図１４Ｄ）。成熟メラノサイトマーカーＭＩＴＦ、ＳＯＸ１０、Ｔｙｒｐ１およびＨＭＢ４５の発現に基づき、ＳＣＦ、ＥＤＮ３、ＦＧＦ、Ｗｎｔ（ＣＨＩＲ）、ＢＭＰ４およびｃＡＭＰを含む培地で細胞を８週間（長期）増殖させた場合、メラノサイトの純粋な培養物が得られた（図１５Ａ）。色素濃度を評価するために長期ＬＳＢ−ＭＥＬ細胞を遠心分離したとき、暗色ペレットが認められた（図１５Ｂ）。成熟メラノサイトの電子顕微鏡超微細構造特性付けは、様々な発生段階において（図１５Ｄ）、ＬＳＢ−Ｍｅｌ由来メラノサイトの細胞質において多数の暗く色素沈着したメラノソームの存在を明らかにした（図１５Ｃ）。
【０２５７】
Ｄ．メラノサイトはヒト多能性幹細胞から誘導される：ＬＳＢ−メラノサイト（ＬＳＢ−Ｍｅｌ）。
【０２５８】
以下は、関連疾患モデリングにおける使用のためのメラノサイトを提供するための例示的な組成物および方法を述べる。
【０２５９】
ＳＯＸ１０：：ＧＦＰ細菌人工染色体（ＢＡＣ）ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）レポーター系を作製した。このことは、この細胞系が低分子との接触に応答する際のインビトロでの神経堤細胞誘導の観察を可能にした。Ｓｏｘ１０は、多分化能性神経堤幹細胞の最も堅調な早期マーカーであり、メラノサイト前駆体を含む一部の神経堤誘導体においても発現されることが認められた。これまでの成熟スキームで得られるよりも高い純度と数でメラノサイト培養物を生産するために、このレポーター系を使用して、定方向性分化スキームの開発において神経堤集団を将来を見越して（ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ）同定し、単離した（図１４、ＬＳＢ−Ｃ）。
【０２６０】
二重ＳＭＡＤ阻害プロトコール（参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｈａｍｂｅｒｓら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２００９））において、ＳＭＡＤシグナル伝達を阻害する２つの低分子で処理したヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）は、ＣＮＳ神経組織を効率的に生産した。加えてｈＥＳＣをより低い密度で平板培養した場合、低レベルの自発的神経堤細胞誘導が認められた（例えば、約３％のＳｏｘｌ０：：ＧＦＰ＋神経堤型細胞が認められた）。しかし、研究における使用のためおよび医学的試験のためには、より多くの神経堤型細胞が必要であった。さらに、メラノサイト研究のためには、低レベルの自発的分化では提供されない、より多数の細胞を有するより純粋な集団が必要であった。
【０２６１】
本発明の開発の間に、発明者は、メラノサイト前駆体、成熟中のメラノサイトおよび成熟メラノサイトの高度に純粋な産物を生産するように、神経堤誘導のための二重ＳＭＡＤ阻害プロトコールを最適化する方法を発見した。
【０２６２】
具体的には、本発明のメラノサイトを生産する、以下の時系列の培養条件を開発した：０および１日目にＬＤＮおよびＳＢ（３ｉを含む方法におけるＬＤＮおよびＳＢと同じ濃度範囲を使用する）を供給する；２日目にＬＤＮ、ＳＢ、ＣＨＩＲ（本明細書で述べる３ｉを含む方法におけるＬＤＮ、ＳＢおよびＣＨＩＲと同じ濃度範囲を使用する）を供給する；１つの実施形態では、３日目にＳＢ、ＣＨＩＲ（本明細書で述べる３ｉを含む方法におけるＳＢおよびＣＨＩＲと同じ濃度範囲を使用する）を供給し、別の実施形態では、３日目にＬＤＮ、ＳＢ、ＣＨＩＲ（本明細書で述べる３ｉを含む方法におけるＬＤＮ、ＳＢおよびＣＨＩＲと同じ濃度範囲を使用する）を供給する；４日目および５日目にＣＨＩＲ  （本明細書で述べる３ｉを含む方法におけるＣＨＩＲと同じ濃度範囲を使用する）を供給する；６日目から１１日目までＣＨＩＲ、ＢＭＰ４およびＥＤＮ３（本明細書で述べる３ｉを含む方法におけるＣＨＩＲと同じ濃度範囲を使用し、ＢＭＰ４およびＥＤＮ３については以下の濃度範囲参照）を供給する。１１日目に細胞を継代し、８週間までＭＥＬ培地（ＣＨＩＲを含む）を供給した。
【０２６３】
ＭＥＬ培地は、メラノサイトに関して富化され、これにより、８週間までに細胞培養物は１００％までの純粋な集団を示した。したがってこのＬＳＢ−ＭＥＬ法／プロトコールは、メラノサイト生産の高い効率を有していた。発明者はまた、メラノサイトの発生の間、リノール酸がＭＥＬ培地中の少なくとも１つの必要成分であることを発見した（図１６参照）。
【０２６４】
メラノサイトの発生の間に、多数の前駆体段階が以下の順序で認められた：神経堤幹細胞、胚性グリア−メラニン芽幹細胞、成体メラノサイト幹細胞、メラノサイト。図１３の例示的な概略図参照。
【０２６５】
図１３  メラノサイト前駆体／メラニン芽細胞の特異化と単離。
【０２６６】
１１日目のＬＳＢ−Ｃプロトコールは、Ｓｏｘｌ０：：ＧＦＰ、ＭＩＴＦを共発現するメラノサイト前駆体の誘導を支持した（Ａ、右のパネル）。ＭＩＴＦ単一陽性集団も認められた（Ａ、左のパネル）。ｃ−Ｋｉｔはメラノサイト前駆体の潜在的マーカーとして同定された。ＬＳＢ−Ｃ分化後に低いパーセンテージのＳｏｘ１０：：ＧＦＰ、ｃ−ｋｉｔ共発現細胞が認められた（Ｂ、橙色集団）。ｑＲＴ−ＰＣＲ分析により、二重陽性集団においてメラノサイトマーカーＭＩＴＦＭ（塩基性ヘリックス−ループ−ヘリックスロイシンジッパータンパク質）およびＤｃｔ（ドーパクロムトートメラーゼ（ドーパクロムδイソメラーゼ、チロシン関連タンパク質２））の富化が確認された（Ｃ）。ＢＭＰ４およびＥＤＮ３での処理（「ＬＳＢ−Ｍｅｌ」）は、Ｓｏｘ１０：：ＧＦＰ、ｃ−ｋｉｔ二重陽性の推定上のメラノサイト前駆体集団の誘導を増強した（Ｄ）。ＬＳＢ−Ｍｅｌ処理後に単離されたＳｏｘ１０：：ＧＦＰ、ｃ−ｋｉｔ二重陽性細胞は、有意により高いレベルのメラノサイトマーカーＭＩＴＦＭおよびＤｃｔを示した（Ｅ）。誤差バーはｓ．ｅ．ｍ．を示す。＊ｐ＜０．０５。
【０２６７】
図１４  メラノサイト前駆体の増殖と成熟。
【０２６８】
分化条件の要約（Ａ）。ＢＭＰ４およびＥＤＮ３を伴うＬＳＢ−Ｃ（ＬＳＢ−Ｍｅｌ）条件での特異化後、細胞を１１日目に選別し、再接種した。選別後（ＰＳ）細胞を、ｃ−ｋｉｔリガンド（ＳＣＦ）、エンドセリン３（ＥＤＮ３）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）およびＷｎｔアクチベーターを含む成熟培地に維持した。ＰＳ６日目に明視野顕微鏡検査によって認められた色素細胞は、メラノサイトマーカーＭＩＴＦに関して陽性であったが、Ｓｏｘ１０：：ＧＦＰレポーターが下方調節されていると思われた（Ｂ）。Ｓｏｘ１０：：ＧＦＰ、ｃ−ｋｉｔ二重陰性を除くすべての集団が、最終的にＭＩＴＦ発現細胞および肉眼で見える色素クラスターを生じさせたが、その割合は異なっていた（Ｃ）。ＢＭＰ４およびｃＡＭＰでの処理は、メラノサイトに特有の紡錘様形態を示す色素細胞への分化を増強した（Ｄ）。
【０２６９】
図１５  成熟メラノサイトの特性付け。
【０２７０】
ＬＳＢ−Ｍｅｌプロトコールで誘導した成熟メラノサイトの純粋な集団は、培養下で８週間超後にＭＩＴＦ、Ｓｏｘ１０、Ｔｙｒｐ１（チロシナーゼ関連タンパク質１）およびＨＭＢ４５を含む一般的なメラノサイトマーカーの発現を維持する（Ａ）。メラノサイトは、継代の数週間にわたってそれらの暗く色素沈着した表現型を保持する（Ｂ）。色素沈着レベルを評価するために１×１０６細胞をペレット化し、写真撮影した。成熟メラノサイトの電子顕微鏡超微細構造特性付け（Ｃ、Ｄ）。ＬＳＢ−Ｍｅｌ由来メラノサイトの細胞質中の数多くの暗く色素沈着したメラノソームの存在がＴＥＭによって観察された（Ｃ）。メラノソーム小胞の段階ＩからＩＶへの成熟に伴うメラニン色素の存在および進行性沈着に注目されたい（Ｄ）。
【０２７１】
それゆえ、発明者は、二重ＳＭＡＤ阻害プロトコール、ＬＳＢが、ヒト胚性幹細胞からＳｏｘｌ０：：ＧＦＰを発現する神経堤集団を迅速かつ効率的に生成することを明らかにした。この修正プロトコールは、ｃ−ｋｉｔ発現によって、将来を見越して同定され、単離される、低レベルのメラノサイト前駆体の誘導を支持した。これらの細胞の誘導は、ＢＭＰ４およびＥＤＮ３での処理を介してさらに増強された。メラノサイト前駆体は、その後、ＢＭＰ４およびｃＡＭＰの存在下でインビトロでさらに培養した後、色素沈着状態へと成熟した。
【０２７２】
【数２】
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【０２７３】
Ｒ＆ＤからのＢＭＰ４についての濃度範囲は１０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ（１つの実施形態では２５ｎｇ／ｍｌ）を使用し、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ＣｏｍｐａｎｙからのＥＤＮは２５〜３００ｎＭ（１つの実施形態では１００ｎＭ）を使用する。
【０２７４】
図１６  メラノサイトの増殖のためにリノール酸を必要とする、例示的なＬＳＢ−ＭＥＬ培地処方物を示す。顕微鏡像の上に示す培地成分は、処方物から除外された培地成分である；Ｐｈ＝位相差；ＢＦ＝明視野。例示的な概略図は、本発明の細胞を同定するために使用したメラノサイト前駆体マーカーを示す。
【０２７５】
したがって発明者は、インビトロでの神経堤の誘導ための迅速で明確なプロトコールを発見し、開発した。さらに、発明者は、これらの細胞のメラノサイトへの定方向性分化のための組成物および方法を開発するために、インビトロでの神経堤細胞の誘導のためのこの迅速で明確なプロトコールを使用した。これらのメラノサイトは、長期培養およびユーメラニンの持続的生産のそれらの能力において独特であった。
【０２７６】
それゆえ、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）からのメラノサイトの誘導は、メラノサイト疾患生物学のさらなる探求のための有益なツールを提供すると考えられる。
【０２７７】
実験
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態および態様を説明するための助けとなるものであり、その範囲を限定すると解釈されるべきではない。以下の実験の開示では、以下の略語を適用する：Ｎ（規定度）；Ｍ（モル濃度）；ｍＭ（ミリモル濃度）；μＭ（マイクロモル濃度）；ｍｏｌ（モル）；ｍｍｏｌ（ミリモル）；μｍｏｌ（マイクロモル）；ｎｍｏｌ（ナノモル）；ｐｍｏｌ（ピコモル）；ｇ（グラム）；ｍｇ（ミリグラム）；μｇ（マイクログラム）；ｎｇ（ナノグラム）；ｐｇ（ピコグラム）；Ｌ（リットル）；ｍｌ（ミリリットル）；μｌ（マイクロリットル）；ｃｍ（センチメートル）；ｍｍ（ミリメートル）；μｍ（マイクロメートル）；ｎｍ（ナノメートル）；Ｕ（単位）；ｍｉｎ（分）；ｓおよびｓｅｃ（秒）；ｄｅｇ（度）；ｐｅｎ（ペニシリン）、ｓｔｒｅｐ（ストレプトマイシン）ならびに℃  １０（セ氏温度／セルシウス度）。
【０２７８】
以下の処方物は、本発明の実施形態を開発する際に使用するための例示的な細胞培養培地を述べる。
【０２７９】
維持のためのｈＥＳＣ培地（１リットル）：８００ｍＬのＤＭＥＭ／Ｆ１２、２００ｍＬのノックアウト血清代替物、５ｍＬの２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン、５ｍＬのＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、１０ｍＬの１０ｍＭ  ＭＥＭ最小非必須１５アミノ酸溶液、５５μＭの１３−メルカプトエタノールおよびｂＦＧＦ（最終濃度は４ｎｇ／ｍＬである）。
【０２８０】
ｈＥＳＣ分化のためのＫＳＲ培地（１リットル）：８２０ｍＬのノックアウトＤＭＥＭ、１５０ｍＬのノックアウト血清代替物、１０ｍＬの２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１０ｍＬのＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、１０ｍＬの１０ｍＭ  ＭＥＭおよび５５μＭの１３−メルカプトエタノール。
【０２８１】
ｈＥＳＣ分化のためのＮ２培地（１リットル）：９８５ｍｌの蒸留Ｈ２ＯとＤＭＥＭ／Ｆ１２粉末、１．５５ｇのグルコース（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｇ７０２１）、２．００ｇの重炭酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｓ５７６１）、プトレシン（１００ｍＬの蒸留水に溶解した１．６１ｇの１００μＬアリコート；Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ５７８０）、プロゲステロン（１００ｍＬの１００％エタノールに溶解した０．０３２ｇの２０μＬアリコート；Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ８７８３）、亜セレン酸ナトリウム（蒸留水中の０．５ｍＭ溶液の６０μＬアリコート；Ｂｉｏｓｈｏｐ  Ｃａｎａｄａ、カタログ番号ＳＥＬ８８８）、および１００ｍｇのトランスフェリン（Ｃｅｌｌｉａｎｃｅ／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号４４５２−０１）、および１０ｍＬの５ｍＭ  ＮａＯＨ中の２５ｍｇのインスリン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号１６６３４）。
【０２８２】
ＰＭＥＦ（初代マウス胚性線維芽細胞（ＰＭＥＦ）フィーダー細胞）を調製するための１０％ＦＢＳを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（１リットル）：８８５ｍＬのＤＭＥＭ、１００ｍＬのＦＢＳ、１０ｍＬのＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐおよび５ｍＬのＬ−グルタミン。
【０２８３】
ＭＳ−５フィーダー細胞培地を調製するための１０％ＦＢＳを含むα最小必須培地（ＭＥＭ）（１リットル）：８９０ｍＬのαＭＥＭ、１００ｍＬのＦＢＳ、１０ｍＬのＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐゼラチン溶液（５００ｍｌ）：０．５ｇのゼラチンを５００ｍｌの温かい（５０〜６０℃）Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水に溶解する。室温に冷却する。
【実施例】
【０２８４】
（実施例Ｉ）
実験材料および方法
以下の実施例は、本発明の開発の間に使用される例示的な材料および方法を述べる。
【０２８５】
細胞および培養条件。ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）細胞（ＷＡ−０９；３２〜５０継代）およびｈｉＰＳＣ系（Ｃ１４、Ｃ７２；１０〜２０継代）を、１２〜１５，０００細胞／ｃｍ２で事前にプレートに入れておいた（ｐｒｅ−ｐｌａｔｅ）マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ、Ｇｌｏｂａｌｓｔｅｍ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｓｔａｔｅ  ｏｆ  Ｍａｒｙｌａｎｄ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ（ＵＳＡ））と共に培養した。ヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）系を、報告されているように（参照により本明細書に組み込まれる、Ｐａｐａｐｅｔｒｏｕら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０６（２００９））生成した。ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）／Ｆ１２、２０％ノックアウト血清代替物、１ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｓｔａｔｅ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）、１００μＭ  ＭＥＭ非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および０．１ｍＭ  β−メルカプトエタノール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む培地を作製した。６ｎｇ／ｍｌの線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ−２、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｓｔａｔｅ  ｏｆ  Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）を滅菌ろ過後に添加し、細胞に毎日供給して、６Ｕ／ｍＬディスパーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｌａｋｅｗｏｏｄ，Ｓｔａｔｅ  ｏｆ  Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ）を使用して週１回継代した。ＳＯＸ１０：：ＧＦＰ細菌人工染色体細胞系を、報告されているように（参照により本明細書に組み込まれる、Ｐｌａｃａｎｔｏｎａｋｉｓら、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２７，５２１−５３２（２００９））生成した。
【０２８６】
神経および侵害受容器誘導。先に報告されているように（参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｈａｍｂｅｒｓら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２７（２００９））神経誘導を実施した。簡単に述べると、細胞を収集し、次にＡＣＣＵＴＡＳＥ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ．Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）を使用して単細胞懸濁液にして、３０分間ゼラチン上に置き、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）フィーダー細胞（ＭＥＦ）（ＭＥＦはゼラチンコートプレートに接着する）を除去した。非接着細胞を収集し、１０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ−２および１０μＭ  Ｙ−２７６３２（ｒｈｏキナーゼインヒビター−Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を含むＭＥＦ馴化ｈＥＳＣ培地の存在下で、２０〜４０，０００細胞／ｃｍ２の密度でマトリゲル処理した皿に入れた。８２０ｍｌのノックアウトＤＭＥＭ、１５０ｍｌのノックアウト血清代替物、１ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００μＭ  ＭＥＭ非必須アミノ酸および０．１ｍＭ  β−メルカプトエタノールを含むノックアウト血清代替物（ＫＳＲ）培地を使用して細胞が集密になったときに神経分化を開始させた。ＳＭＡＤシグナル伝達を阻害するため、１００ｎＭ  ＬＤＮ−１９３１８９および１０μＭ  ＳＢ４３１５４２を０日目（ＳＭＡＤシグナル伝達インヒビターＬＳＢを添加した日）から５日目まで毎日添加した。細胞に毎日供給し（すなわちインヒビターの６回の供給、Ｄ０、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４およびＤ５）、４日目から開始して１日おきに２５％の漸増量で増加させて、Ｎ２培地を初期培地に添加した（１０日目の１００％Ｎ２まで）。２日目から１０日目まで毎日、３つのインヒビター（特に指示されない限り）を３μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１、１０μＭ  ＳＵ５４０２および１０μＭ  ＤＡＰＴで添加することによって侵害受容器誘導を開始させた。１０日目以後、長期培養培地は、１０〜１００ｎｇ／ｍｌヒトβ神経増殖因子（ＮＧＦ）、１０〜１００ｎｇ／ｍｌ脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）および１０〜１００ｎｇ／ｍｌグリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）を含むＮ２培地からなった。
【０２８７】
顕微鏡検査、抗体およびフローサイトメトリ（ＦＡＣＳ）。細胞を４％パラホルムアルデヒドで２０分間固定し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄して、ＰＢＳ中の０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘを用いて透過処理し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を使用してブロックした。グルタミン酸染色のために、０．０５％グルタルアルデヒドを固定液に添加した。顕微鏡検査のために使用した一次抗体は、ＰＡＸ６；ペアードボックス遺伝子６（無虹彩症、角膜炎）（Ｃｏｖａｎｃｅ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ）、ＴＵＪ１；ニューロン特異的クラスＩＩＩβ−チューブリン（Ｃｏｖａｎｃｅ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ）、Ｋｉ６７；抗原ＫＩ−６７；ＭＫＩ６７（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ．Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）、ＩＳＬ１（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋ；ＤＳＨＢ）、ＢＲＮ３Ａ；脳特異的ホメオボックス／ＰＯＵドメインタンパク質３Ａ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）、ＲＥＴ；がん原遺伝子チロシンプロテインキナーゼ受容体（Ｒ＆Ｄ）、ＲＵＮＸ１；Ｒｕｎｔ関連転写因子１（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ．Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）、ＭＡＰ２；微小管関連タンパク質２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ．Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）、ＴＲＰＶ１；一過性受容体電位カチオンチャンネルサブファミリーＶメンバー１（Ｎｅｕｒｏｍｉｃｓ  Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）、サブスタンスＰ（Ｎｅｕｒｏｍｉｃｓ  Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）、ＣＧＲＰ；カルシトニン遺伝子関連ペプチド（Ｎｅｕｒｏｍｉｃｓ  Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）を含んだ。フローサイトメトリのために、ＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ  Ｋｉｔ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて細胞を固定し、１つの実施形態では、細胞を４％パラホルムアルデヒド中にさらに固定した。フローサイトメトリ用の一次結合抗体はＮＴＲＫ１（神経栄養チロシンキナーゼ受容体、１型）−ＡＰＣ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ，ＵＳＡ）、ネスチン−Ａｌｅｘａ６４７（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）、ＴＵＪｌ−Ａｌｅｘａ４８８（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）であった。
【０２８８】
電気生理学。神経栄養チロシンキナーゼ受容体、１型（ＮＴＲＫ１）＋選別細胞を１０〜１２日目にポリオルニチン／ラミニン／フィブロネクチン処理したカバーガラススリップ上に置き、長期培養培地中でさらに３週間成熟させた。カバースリップを、以下を含む（ｍＭ）人工脳脊髄液に移した：１２５  ＮａＣｌ、２．５  ＫＣ１、１．２５  ＫＨ２ＰＯ４、１  ＭｇＣｌ２、２  ＣａＣｌ２、２５  ＮａＨＣＯ３、１．３アスコルビン酸、２．４ピルビン酸および２５グルコース（９５％Ｏ２および５％ＣＯ２で通気、室温）。落射蛍光照射、電荷結合素子カメラおよび２つの水浸レンズ（×１０および×６０）を備えた赤外線微分干渉（ＤＩＣ）顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を使用して細胞を視覚化し、記録用電極を細胞に標的化した。ガラス製記録用電極（７〜９ＭΩ抵抗）に、１３０ｍＭグルコン酸カリウム、１６ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ  ＥＧＴＡ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、４ｍＭ  Ｎａ２ＡＴＰ、０．４ｍＭ  Ｎａ３ＧＴＰおよび０．２％Ａｌｅｘａ−５６８からなる細胞内溶液（ｍＭ、ｐＨ  ７．２５）を満たした。閾値電流での活動電位特性を、一連の漸増２５ｐＡ  ３００ｍｓ電流ステップの適用後に細胞記録から決定した。記録を収集し、Ａｘｏｐａｔｃｈ  ７００Ｂ増幅器およびｐＣＬＡＭＰ１０ソフトウエア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）を用いて分析した。
【０２８９】
遺伝子発現プロファイリング。Ｔｒｉｚｏｌ  ＬＳを使用してＬＳＢまたはＬＳＢ３ｉ処理したｈＰＳＣの分化の２、３、５、７、９および１５日目に全ＲＮＡを単離した。試料をＭｅｍｏｒｉａｌ  Ｓｌｏａｎ−Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ  （ＭＳＫＣＣ）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙによって処理し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｈｕｍａｎ  ＨＴ−１２  ｖ４  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ＢｅａｄＣｈｉｐにハイブリダイズした。Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  ｐｒｏｊｅｃｔ（ｗｗｗ．ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ．ｏｒｇ）からのＩｌｌｕｍｉｎａ分析パッケージ（ＬＵＭＩ）を統計プログラミング言語Ｒ（ｈｔｔｐ：／／ｃｒａｎ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／）と共に使用して標準化およびモデルに基づく発現測定値を計算した。発現値は倍数変化のｌｏｇ２である。多重検定の補正ｐ値が＜０．０５である場合、ペアワイズ比較のカットオフは有意であった。
【０２９０】
定量的リアルタイムＰＣＲ。ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して全ＲＮＡを抽出した。各々の試料について、１ｕｇの全ＲＮＡをＤＮＡ汚染に関して処理し、Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ  ＲＴキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して逆転写した。増幅した物質を、Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  ＲｅａｌＰｌｅｘ２（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）でＱｕａｎｔｉｔｅｃｔ  ＳＹＢＲ緑色プローブおよびＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して検出した。すべての結果をＨＰＲＴ対照に標準化しており、それらは、各々のデータ点において２〜３の独立した生物学的試料の４〜６の技術的複製物からの結果である。
【０２９１】
（実施例ＩＩ）
ヒト多能性幹細胞をＳＢ４３１５４２およびＬＤＮ−１９３１８９（ＬＳＢ）と接触させることによりニューロン系列細胞が生産された。
【０２９２】
以下の実施例は、本発明の開発の間に使用するニューロン系列の細胞を提供するための例示的な方法を述べる。
【０２９３】
二重ＳＭＡＤ阻害は、以前にｈＰＳＣからある１種のニューロン系列細胞を誘導するための迅速で極めて有効な方法として使用された（参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｈａｍｂｅｒｓら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２７（２００９））。ノギンを含む分子によって誘導されたこれらのニューロン系列細胞は、中枢神経系細胞、すなわち神経細胞運命への発生を可能にするデフォルト経路を有していた。補足試験は、ノギンの代わりに低分子ドルソモルフィン（ＤＭ）を使用することにより、少なくとも一部には類似の細胞が生産されるが、培養物の一貫性（ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙ）に差があることを報告した（参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｉｍら、Ｒｏｂｕｓｔ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｎｅｕｒａｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ＥＳ  ａｎｄ  ｉＰＳ  ｃｅｌｌｓ  ｒｅｇａｒｄｌｅｓｓ  ｏｆ  ｔｈｅｉｒ  ｉｎｎａｔｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｐｒｏｐｅｎｓｉｔｙ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｖ  ６，２７０−２８１（２０１０）；Ｚｈｏｕら、Ｈｉｇｈ−Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｉｎ  ｈＥＳＣｓ  ａｎｄ  ｈｉＰＳＣｓ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ＴＧＦ−ｂｅｔａ  Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，５０４（２０１０））。
【０２９４】
発明者は、ＬＤＮ処理細胞と同じ発生段階、同じマーカーの大部分の発現、および様々なニューロン系列を作製する類似の発生可能性の能力を示すにも関わらずノギンを用いて生成された細胞は、ＬＤＮを用いて誘導された神経細胞と比較して、前後軸において前方であること（すなわちより前脳、より多くの細胞がＦＯＸＧ１を発現する等）などの相違も示すことを認めた。そこで、数あるシグナル伝達経路の中でも特にＢＭＰを阻害するためにノギンの代わりにＬＤＮを使用したが、ノギンとＬＤＮは、ＢＭＰを阻害すること以外に、異なる他の種類の活性を有すると考えられる。
【０２９５】
一部にはノギンを使用することの高コストのゆえに、発明者は、ＢＭＰインヒビターの使用が神経細胞運命の細胞を生産する際にノギンの代わりになり得ると考えた。そのため、ｈＰＳＣから原始神経外胚葉、神経細胞運命を有する細胞、すなわちＣＮＳ細胞を生成するために、ＳＢ４３１５４２と組み合わせて、低分子ＢＭＰインヒビター、ＬＤＮ−１９３１８９（参照により本明細書に組み込まれる、Ｙｕら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １４，１３６３−１３６９（２００８））を使用し、本発明の開発の間にノギンに取って代わることを認めた（図２Ａ）。この組合せ処理を、これら２つのインヒビターＬＤＮ−１９３１８９とＳＢ４３１５４２の組合せに関してＬＳＢと称した。
【０２９６】
（実施例ＩＩＩ）
本発明のニューロン系列細胞を使用して低分子をスクリーニングすることにより、低いＰＡＸ６および高いＴＵＪ１ニューロン細胞を生じる化合物がもたらされた。
【０２９７】
以下の実施例は、定方向性分化における使用のための低分子候補化合物をスクリーニングするために実施例ＩＩからのニューロン系列の例示的細胞を使用することを述べる。
【０２９８】
具体的には、二重ＳＭＡＤ阻害（ＬＳＢ）に関連して、すなわちヒトＥＳ細胞を、約４００の条件下で候補化合物（すなわち低分子）をスクリーニングするために（ヒトＥＳ細胞から出発する有糸分裂後ニューロンマーカーの獲得を加速し得る低分子の組合せを見出すため）、最初にＬＳＢ（ＬＤＮ−１９３１８９およびＳＢ４３１５４２）で処理した。ＣＮＳに発生することができる細胞を決定するために細胞運命を決定するために、発生試験において重要であることが公知であり、しばしば使用される細胞シグナル伝達経路（例えばＦＧＦ、ノッチ、ＷＮＴ、ＳＨＨ（ソニック・ヘッジホッグ）等のようなシグナル伝達経路）を標的とする（変化させる）分子から候補化合物を選択した。一例として、４種のインヒビター（すなわちＳＵ／ＤＡＰＴ／ＣＨＩＲ／シクロパミン）をＬＳＢ処理からの異なる日に異なる組合せで試験した（細胞培地中の細胞に供給した）。各々の処理を、次に、１０日目にＴＵＪ１／ＰＡＸ６発現に関してスクリーニングした。処理条件の一例として、ＬＳＢを毎日供給し、４日目から１０日目まで毎日ＣＨＩＲおよびＳＵを培地に添加して細胞に供給した。
【０２９９】
一般に、スクリーニング処理の結果は、死細胞を含む多数の培養物を生じさせた。言い換えると、このスクリーニングにおける生存可能な培養条件は、非生存可能条件（すなわち細胞死）よりもはるかに低い頻度であることが分かった（例えばＳＵ／ＤＡＰＴを初期培養物に、すなわち２日目より前に添加した場合）。発明者は、ＣＮＳ幹細胞は生存のためにＦＧＦシグナル伝達およびγセクレターゼ活性／ノッチシグナル伝達に依存し、そのためＣＨＩＲが存在しない場合、ＳＵ／ＤＡＰＴが細胞をＣＮＳから神経堤に切り替わるように誘導したとき、切り替わるのではなく、細胞が死亡したと考えた。
【０３００】
ＬＳＢの添加後１０日目に、スクリーニングの間生存した細胞をヒト神経外胚葉マーカーＰＡＸ６（参照により本明細書に組み込まれる、Ｚｈａｎｇら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ７，９０−１００（２０１０））の喪失およびＴＵＪ１発現によるニューロン分化の開始（参照により本明細書に組み込まれる、Ｌｅｅら、Ｃｅｌｌ  Ｍｏｔｉｌ  Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ  １７，１１８−１３２（１９９０））に関して観察した。細胞を、免疫蛍光（ｉｍｍｕｎｏＦ）により、ニューロン（ＴＵＪ１＋）に関して染色し、ＰＸ６のＣ末端に結合する抗体を使用して神経外胚葉の喪失（より少ないＰＡＸ６＋細胞の観察）に関して染色した。このスクリーニングをインヒビターの数多くの組合せ（例えばＳＵ、ＳＵ／ＤＡＰＴ、ＳＵ／ＤＡＰＴ／ＣＨＩＲ、ＤＡＰＴ／ＣＨＩＲ、ＳＵ／ＣＨＩＲ、ＳＵ／シクロパミン等）で実施し、それらを組合せの日（例えば０〜１０日目、１〜１０日目、２〜１０日目、３〜１０日目等）に様々な毎日の供給物に添加した。一般に、最も高い量のＴＵＪ１＋／ＰＡＸ６−染色を示す条件および化合物を、さらなる分析のための細胞を提供することについての成功として選択するために、各々の処理によって生成された細胞のＴＵＪ１＋／ＰＡＸ６−染色の相対的な量を観察することによって結果を決定した。細胞の免疫染色によりＴＵＪ１＋／ＰＡＸ６−である細胞を生産するためのスクリーニング試験において失敗とみなされた低分子の一例はシクロパミンであった。シクロパミンは、それをいつ添加した場合でも、ＴＵＪ１／ＰＡＸ６染色を生じさせることに関して細胞に影響を及ぼさないと思われた。言い換えると、細胞形態は、免疫蛍光により１０日目にＬＳＢ単独で処理した細胞と同様のままであった（すなわち＞９０％ＰＡＸ６＋および＜１０％ＴＵＪ１＋）。
【０３０１】
しかし、スクリーニングの間に、発明者は、ＬＳＢ処理の２日目に添加した３つの低分子の特定の組合せ（ＳＵ５４０２、ＣＨＩＲ９９０２１およびＤＡＰＴ；３つのインヒビターについて３ｉと称する）が（図６ＡおよびＢ）、分化の１０日目にｈＰＳＣにおいてＰＡＸ６発現を無くし、ＴＵＪ１を誘導することを発見した（図２ＡおよびＢ）。ＬＳＢ処理の２日目において処理細胞はまだ、神経細胞運命を有することまたは神経細胞運命へと発生する能力を有することに関して不明であったので、これは驚くべき発見であった。その代わりに、３ｉ処理は細胞を神経細胞運命から離れて神経堤細胞へと向かわせ、それらは本発明の侵害受容器細胞へとさらに分化した。
【０３０２】
次に、いずれのシグナル伝達経路がＰＡＸ６＋ＴＵＪ１−ヒトＥＳ細胞集団をＰＡＸ６−ＴＵＪ１＋集団に変換することに関与すると考えられるかを見出すために、これらの低分子の各々に関する機能を検討した。最初に、ＳＵ５４０２は、ＶＥＧＦ、ＦＧＦおよびＰＤＧＦチロシンキナーゼシグナル伝達の強力なインヒビターと報告された（参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｕｎら、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ４２，５１２０−５１３０（１９９９））。そこで一般に、低分子の少なくとも１つはＦＧＦＲシグナル伝達経路を阻害することに関与すると考えられた。第二に、ＣＨＩＲ９９０２１は、ＧＳＫ−３βの選択的阻害（β−カテニンを安定化する）によるＷＮＴアゴニストと報告された（参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７，３０９９８−３１００４（２００２））。そこで一般に、低分子の少なくとも１つは、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（ＧＳＫ３β）阻害を介して、ＷＮＴシグナル伝達経路の少なくとも１つを活性化することに関与すると考えられた。そして第三に、ＤＡＰＴは、ノッチシグナル伝達をブロックすることができるγセクレターゼインヒビターと報告された（参照により本明細書に組み込まれる、Ｄｏｖｅｙら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  ７６，１７３−１８１（２００１））。そこで一般に、低分子の少なくとも１つは少なくとも１つのノッチシグナル伝達経路を阻害することに関与すると考えられた。そこで１つの実施形態では、低分子の１つは非選択的または汎ノッチインヒビター（ｐａｎ−Ｎｏｔｃｈ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）と考えられた。別の実施形態では、インヒビターの１つは、少なくとも１つのノッチシグナル伝達経路をブロックすることができる、γセクレターゼ分子のインヒビターである。それゆえ、１つの例示的な実施形態では、インヒビターの組合せは、本発明のＰＡＸ６−ＴＵＪ１＋ヒトニューロン細胞を生産するために、ＦＧＦＲシグナル伝達経路を阻害することに関与する少なくとも１つの低分子、少なくとも１つのノッチシグナル伝達経路を阻害することに関与する少なくとも１つの低分子、およびＷＮＴシグナル伝達経路の少なくとも１つを活性化しつつＧＳＫ３βを阻害することに関与する少なくとも１つの低分子を含む。さらなる実施形態では、インヒビターの１つは、ノッチシグナル伝達経路中の少なくとも１つのγセクレターゼ分子をブロックすることができた。
【０３０３】
（実施例ＩＶ）
ＴＵＪ１＋ニューロン細胞は細胞増殖マーカーの発現の喪失を示す。
【０３０４】
以下の実施例は、ＴＵＪ１＋ニューロン細胞の成熟（細胞周期）段階を決定するための例示的な方法を述べる。
【０３０５】
成熟後、培養下で生産されたニューロンは有糸分裂を受けることを停止し、それぞれ細胞増殖（参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｅｒｄｅｓら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ３１，１３−２０（１９８３））および有糸分裂のＧ２／Ｍ期（参照により本明細書に組み込まれる、Ｈｅｎｄｚｅｌら、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ  １０６，３４８−３６０（１９９７））のマーカーであるＫｉ６７およびホスホヒストンＨ３（ＰＨＨ３）を喪失した。それゆえ、３ｉと組み合わせたＬＳＢ（すなわちＬＳＢ３ｉ）を使用して生産された細胞をより低い密度、約１０〜１００，０００細胞／ｃｍ２に継代し、個々の細胞において、発現をより良好に評価するために固定した後、細胞増殖マーカーＫｉ６７およびホスホヒストンＨ３（ＰＨＨ３）に関して試験した。特に、Ｋｉ６７の発現は増殖の良好な予測因子であることが公知であった。そこで、３ｉ化合物を伴わないＬＳＢ中で培養した細胞と比較して、１２日後に、３ｉの存在下で培養された細胞では、より少ない細胞（それぞれ５０％および１６％）がＫｉ６７＋およびｐＨＨ３＋細胞を示した（図２Ｃ〜Ｆ）。
【０３０６】
ＬＳＢ／ＣＨＩＲ（ＣＨＩＲ９９０２１：Ｃ）、ＳＵ／ＤＡＰＴ（ＳＵ５４０２／ＤＡＰＴ）、ＳＵ／ＣＨＩＲ（ＳＵ５４０２／ＣＨＩＲ９９０２１）、ＤＡＰＴ、ＳＵ（ＳＵ５４０２）、ＣＨＩＲに加えて、対照としてＬＳＢ単独と比較して、ＬＳＢ３ｉを使用したニューロン分化の効率（パーセンテージ）を定量化するため、神経前駆体のマーカーであるネスチンおよびニューロン分化のマーカーであるβ３−チューブリン（ＴＵＪ１）についての細胞間ＦＡＣＳ（ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  ＦＡＣＳ）染色を実施した（図２Ｇ）。ＬＳＢ、ＳＵ／ＤＡＰＴ、ＤＡＰＴ、ＳＵおよびＣＨＩＲの存在下では、大部分の細胞がネスチンを発現した。特に、ＬＳＢ細胞集団の＞９５％がネスチン＋であった。数多くの細胞が二重ＳＭＡＤ阻害後にネスチン染色を示したが定量化されず、一方より長期間、すなわち１９日間培養した細胞はＴＵＪ１＋ニューロンを示し、これらの細胞の大部分が、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）を共発現し、このことは、潜在的なドーパミン作動性ニューロンを同定する（参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｈａｍｂｅｒｓら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２７（２００９））。逆に、ＬＳＢに接触した細胞を２日後に３ｉ化合物と接触させた場合、１０日後に約２５％の細胞がネスチンを発現し、約７５％の細胞がＴＵＪ１を発現して、短期間、すなわち１９日未満の細胞培養後のニューロン細胞運命への効率的な変換を明らかにした。
【０３０７】
驚くべきことに、ＬＳＢ処理、次いで２日後に細胞をＣＨＩＲ９９０２１およびＤＡＰＴまたはＳＵのいずれか１つと接触させることにより、細胞集団の５０％をＴＵＪ１＋細胞へと分化させた。３つのインヒビターの各々をＬＳＢ処理後に単独で使用した場合、２０％以下の細胞がＴＵＪ１＋であった。それゆえ、ＣＨＩＲ９９０２１は、この細胞集団のＴＵＪ１＋ニューロン細胞への定方向性分化の鍵となる寄与因子であることが発見された。発明者は、ネスチン＋ＴＵＪ１−細胞のネスチン−ＴＵＪ１＋ニューロン細胞への定方向性分化が、ＦＧＦ受容体経路またはノッチシグナル伝達経路内のγセクレターゼのいずれかを阻害することに加えて、ＷＮＴシグナル伝達経路の少なくとも１つを活性化しつつＧＳＫ３βを阻害することに依存すると考えた。さらに、３ｉ化合物の添加は、さらに２５％のネスチン−ＴＵＪ１＋ニューロン細胞の変換を生じさせた。図２Ｇ参照。
【０３０８】
要約すると、ＬＳＢ処理の２日後に３ｉ処理する好ましい実施形態から誘導されるニューロン集団をさらに検討した。この集団は、ＬＳＢ単独で処理した細胞と比較してニューロンマーカーＴＵＪ１の高発現（図２Ａ、Ｂ）ならびにＫｉ６７の喪失（図２Ｃ、Ｄ）を示した。Ｋｉ６７の喪失は、有糸分裂後分化ニューロンの特徴である細胞周期中の細胞の減少を示す。加えて、ＦＡＣＳ分析は、ＬＳＢと３ｉからなる好ましい組成物で処理した細胞集団の７５％超がＴＵＪ１を発現し、これに対してＬＳＢ単独で処理した集団の９９％が前駆体マーカーであるネスチンを発現することを明らかにした（図２Ｇ）。
【０３０９】
（実施例Ｖ）
ＴＵＪ１＋ニューロンは、驚くべきことに、予想された中枢神経系（ＣＮＳ）細胞ではなく末梢神経系（ＰＮＳ）細胞であった。
【０３１０】
以下の実施例は、本発明の開発の間に生産されるＴＵＪ１陽性ニューロンの種類を同定するための例示的な方法を述べる。
【０３１１】
ＬＳＢ処理の２日後に３ｉ処理する好ましい実施形態から得られるニューロンのサブタイプをさらに特性づけるため、ＴＵＪ１陽性集団を様々なニューロンサブタイプのマーカーに関して染色した。具体的には、二重ＳＭＡＤ阻害プロトコールは、ＦＯＸＧ１（フォークヘッドボックスタンパク質Ｇ１）を発現する前脳前部正体（ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｆｏｒｅｂｒａｉｎ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）に偏ったＰＡＸ６＋神経上皮細胞を生成することが公知であった（参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｈａｍｂｅｒｓら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２７（２００９））。それゆえ、ＬＳＢ３ｉ処理後のニューロンサブタイプ正体を決定するために、細胞を１０日目により低い密度、約１０〜１００，０００細胞／ｃｍ２に継代し、１２日目に一連のマーカー発現に関して評価した。
【０３１２】
予想されるニューロン型はＣＮＳ運命であったので、試験した初期マーカーの大部分はＣＮＳ型細胞の同定のためのものであった。実際に、ＬＳＢ細胞はこのサブタイプ（ＰＡＸ６、ＦＯＸＧ１陽性）がデフォルトであるので、ＣＮＳ前脳ニューロンが予想された。驚くべきことに、ＰＮＳ細胞のマーカーであるＩＳＬ１の染色が見出される前に、ＣＮＳマーカーについて少なくとも１２の陰性結果（例示的な１０を以下に示す）が得られた。ＩＳＬ１は、運動ニューロンおよび末梢感覚ニューロンによって発現される。ＢＲＮ３Ａ発現を試験し、ＬＳＢ／３ｉ細胞によって発現することを認めた。それゆえ、発明者は、末梢感覚ニューロンの発生を示すＢＲＮ３Ａ＋／ＩＳＬ１＋ニューロンを発見した。以下の表Ａ参照。
【０３１３】
表Ａ：以下の遺伝子／タンパク質のリストは、本明細書で述べるＬＤＮ／３ｉ誘導分化を使用して、細胞に関して陽性である（発現される）と予想された数多くのＣＮＳ運命分子を示す。しかし、これらの結果は例示的なＣＮＳマーカーの欠如を示し、前記結果は、ＰＮＳ系列に関する潜在的マーカー、すなわちＩＳＬ１およびＢＲＮ３Ａのその後の観察によって支持された。
【０３１４】
【数３】
2018139592.tif 000023
【０３１５】
驚くべきことに、ＩＳＬ１およびＢＲＮ３Ａの均一な発現（赤色／細胞内のより暗い領域）（図３ＡおよびＢ）が本発明のＴＵＪ１＋細胞（緑色／赤色染色に比べてより明るい細胞体）で認められた。ＩＳＬ１およびＢＲＮ３Ａは感覚ニューロンについての鍵となるマーカーである（そのすべてが参照により本明細書に組み込まれる、ＩＳＬ１：Ｓｕｎら、Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １１，１２８３−１２９３（２００８）；ＢＲＮ３Ａ：Ｇｅｒｒｅｒｏら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０，１０８４１−１０８４５（１９９３））。この発見は、ＬＳＢ３ｉ処理から生じるニューロンがＣＮＳ細胞ではなくＰＮＳであることを示した。これらの結果は、ＣＮＳ前脳ニューロンサブタイプ（ＰＡＸ６＋、ＦＯＸＧ１陽性）がデフォルトであるＬＳＢ細胞と対照的であった。先行技術の教示によれば、平板培養密度によって示される、処理の開始の際の幹細胞の高い集密度はＣＮＳ由来ニューロン集団を生じさせるはずであるので、これは極めて予想外の観察である。しかし、侵害受容器は神経堤細胞集団に由来し、神経堤細胞集団は、先行技術の教示によれば、平板培養密度によって示される、処理の開始の際の幹細胞の低い集密度に由来する。言い換えると、予想は、ＬＳＢ処理の開始の時点で＞２０，０００細胞／ｃｍ２の多能性幹細胞という高い初期平板培養密度は拘束ＣＮＳニューロン集団を生じさせるというものであった。これに対し、神経堤細胞を生じさせるには約１０，０００細胞／ｃｍ２という低い初期平板培養密度が必要であることは公知であった（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｈａｍｂｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，２００９（図４の下半分参照））。
【０３１６】
（実施例ＶＩ）
末梢神経系（ＰＮＳ）ニューロンは初期段階侵害受容器細胞であることが見出された。
【０３１７】
以下の実施例は、本明細書で述べる方法を用いていずれの型の末梢神経系（ＰＮＳ）ニューロンが生産されたかを決定するための例示的な方法の使用を述べる。
【０３１８】
本明細書で述べる方法によっていずれの型のＰＮＳニューロンが生産されるかは、感覚ニューロンおよび運動ニューロンなどのいくつかの種類の候補ニューロンが存在し、さらに固有受容器細胞、機械的受容器（ｍｅｃｈａｎｏｃｅｐｔｏｒ）細胞および侵害受容器細胞を含むＰＮＳ中の公知の感覚ニューロンの少なくとも３つの主要なサブセットが存在するので、不明であった。
【０３１９】
発生の間、初期段階の侵害受容器はペプチド作動性および非ペプチド作動性の両方であり、独自にＮＴＲＫ１、ＲＵＮＸ１を発現し、次いでＲＥＴを発現した（ＲＥＴに関する情報の例については、参照により本明細書に組み込まれる、Ｗｏｏｌｆら、Ｎｅｕｒｏｎ  ５５，３５３−３６４（２００７）参照）。ＴＵＪ１＋ニューロンを含む２連の初期段階ＬＳＢ３ｉ培養物をＲＥＴ発現に関して試験し（図３Ｃ）、このマーカーに関して陽性であることが見出され（ＴＵＪ１＋染色（緑色／ＲＥＴ染色と比較してより明るい細胞体）および挿入されたＲＥＴの箱内のより明るい染色領域と比較して、赤色／大きい方の箱の細胞内のより暗い領域）（図３Ｄ）、また１０日目にＦＡＣＳによって測定した場合、培養下のすべての細胞の６０％超がＮＴＲＫ１を発現した（図３Ｅ）。
【０３２０】
要約すると、この集団はＩＳＬ１、ＢＲＮ３Ａ、ＲＥＴおよびＲＵＮＸ１の発現に関して陽性であり（図３Ａ〜Ｄ）、初期段階侵害受容器（ペプチド作動性および非ペプチド作動性の両方）の産生を指示した。ＦＡＣＳ分析は、これらのニューロンの６０％超がＮＴＲＫ１に関して陽性であることを明らかにした（図３Ｅ）。これらのマーカーは集合的に、ニューロン集団が末梢感覚ニューロン、特に侵害受容器であることを示す。
【０３２１】
それゆえ、２日目の３ｉ処理とＬＳＢの組合せの好ましい実施形態は、神経堤由来集団、すなわち侵害受容器の予想外の形成を生じさせる。
【０３２２】
さらに、発明者は、ＬＳＢ／３ｉ処理によって得られた細胞が神経堤へと移行し、ＣＮＳ運命に分化する代わりにニューロゲニン１（ＮＥＵＲＯＧ１）を一過性に発現するという本明細書で述べた観察に加えて、初期免疫蛍光結果、すなわちＢＲＮ３Ａ＋、ＩＳＬ１＋、アレイデータ、すなわちＴＡＣ１（サブスタンスＰ）発現を含む、いくつかの試験からの情報を組み合わせ、次にＮＴＲＫ１マーカーを選択し、ＮＴＲＫ１＋細胞を見出した。そこで、発明者は、生じるＰＮＳ細胞がおそらくペプチド作動性侵害受容器である可能性が高いと考えた。
【０３２３】
（実施例ＶＩＩ）
ＬＳＢ３ｉ処理は再現可能である。
【０３２４】
以下の実施例は、再現性を決定するために本発明の例示的な方法を使用することを述べる。
【０３２５】
本発明の一般性を確立するため、発明者は、ｈｉＰＳＣを幹細胞の供給源として使用して、ＬＳＢ処理の２日後に３ｉ処理を組み合わせる本発明の好ましい実施形態を反復した。ＬＳＢ３ｉ処理の再現性を、誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）系を含むさらなるｈＰＳＣ系にわたって評価した。現行技術はｈｉＰＳＣを生産する多くの方法を述べており、当業者に公知である。特に、Ｏｃｔ４（オクタマー結合転写因子４）、Ｓｏｘ２（ＳＲＹ（性決定領域Ｙ）ボックス２）、Ｋｌｆ４（クルッペル様因子４）およびｃ−Ｍｙｃ（転写因子ｐ６４）などの遺伝子を挿入することによって作製される２つのｈｉＰＳＣ系（Ｃ１４およびＣ７２）を使用して、効率的に神経化できる（ｎｅｕｒａｌｉｚｅ）ことが示された（参照により本明細書に組み込まれる、Ｐａｐａｐｅｔｒｏｕら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  １０６（２００９）参照）。
【０３２６】
次にＰＡＸ６発現をＩｍｍｕｎｏＦによって検査した。Ｃ１４およびＣ７２細胞系のＬＳＢおよびＬＳＢ３ｉ処理は、図３Ａ〜Ｄに示すヒト細胞系と比較した場合、類似のニューロン染色結果を示した。上記で述べたように、ＩＳＬ１、ＢＲＮ３Ａ、ＲＥＴ、ＲＵＮＸ１およびＴＵＪ１に関して、例示的なＣ１４染色結果を図４Ａ〜Ｄに示し、例示的なＣ７２染色結果を図８Ａ〜Ｄに示す。
【０３２７】
Ｃ１４およびＣ７２細胞系のＬＳＢ処理はネスチン陽性細胞を均一に生じさせ（処理細胞集団の＞９５％）、ＦＡＣＳによって測定されるようにＬＳＢ３ｉの組合せで処理したときＴＵＪ１＋細胞を形成することができた（Ｃ１４については４０％およびＣ７２については３３％；図４Ｅ）。これらの結果を、図４ＥにおいてＬＳＢおよびＬＳＢ３ｉ結果に関して示される、ＬＳＢおよびＬＳＢ３ｉで処理したＨ９細胞系（すなわちｈＥＳＣ系）と比較した。さらに一層高いニューロン収率が（ＦＡＣＳによって測定された４０％および３３％から、ＮＴＲＫ１に関して選別した場合核染色の＞９０％がニューロンである）、ＮＴＲＫ１（神経栄養因子チロシンキナーゼ受容体１型）マーカー発現に関して選別した後バルク培養物を、Ｎ２培地を含むＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）でコートした培養容器に継代したとき、これら２つのｈｉＰＳＣ系において得られた。細胞をアキュターゼで解離させ、Ｎ２に再懸濁して、ＡＰＣ結合ＮＴＲＫ１抗体（Ｒ＆Ｄ）と共に氷上で１５分間インキュベートし、洗浄して、ＦＡＣＳのためにＮ２に再懸濁した。選別後、細胞をＮ２培地で２４時間培養し、適切に固定した。細胞を収集し、ＢＲＮ３Ａ、ＩＳＬ１、ＴＵＪ１およびＤＡＰＩに関して染色した。特に、代表的なＮＴＲＫ１＋ＬＳＢ３ｉ処理細胞集団におけるわずかなネスチン＋細胞と比較して、ＬＳＢ３ｉ処理細胞からはＣ１４およびＣ７２両方のＮＴＲＫ１−細胞に関して数多くのネスチン＋細胞（赤色／暗染色）が示される（図９）。さらに、わずかなＣ１４  ＮＴＲＫ１−細胞がＴＵＪ１細胞系を発現したが、Ｃ２７はより高い数のＮＴＲＫ１−ＴＵＪ１＋（緑色；鮮やかな染色）を示した。両細胞系は、ＤＡＰＩ（青色；明るい核）染色によって同定される細胞体と比較して認められるように、高い数のネスチン−ＴＵＪ１＋細胞を示した。
【０３２８】
要約すると、ＬＳＢ、次いで２日目に３ｉで処理し、高集密度で平板培養したｈｉＰＳＣ細胞は、侵害受容器マーカーＩＳＬ１、ＢＲＮ３Ａ、ＲＥＴおよびＲＵＮＸ１に関して陽性のニューロン細胞の形成を生じさせた（図４Ａ〜Ｄ、図８Ａ〜Ｄおよび図９）。
【０３２９】
（実施例ＶＩＩＩ）
ＣＨＩＲ９９０２１（Ｃ）はＬＳＢ培養細胞（すなわちＬＳＢ−Ｃ）からニューロン分化を誘導するための鍵となる因子である。
【０３３０】
以下の実施例は、定方向性ニューロン分化を誘導するための各々の化合物の効果を試験するために例示的方法を使用することを述べる。
【０３３１】
実施例ＩＩＩのＴＵＪ１＋細胞の誘導に関連することが認められた各々の化合物の充足度に関する機構的な洞察を得るために、３ｉ化合物の特定の組合せを、細胞間ＦＡＣＳを用いて測定されるネスチンおよびＴＵＪ１の細胞発現を誘導することに関して試験した（図１Ｇに示す）。ネスチンをＬＳＢニューロン系列細胞のマーカーとして使用し、下流の（すなわちより分化した）ニューロン細胞を同定するためにＴＵＪ１を使用した。
【０３３２】
個々の因子のいずれもが高い数（６０％超）のＴＵＪ１＋ニューロンを生じなかったが、その他の２つのシグナル阻害因子のいずれか１つと組み合わせたＣＨＩＲ９９０２１は、中等度の数のＴＵＪ１＋ニューロン（ＤＡＰＴに関しては５３％およびＳＵ５４０２  に関しては５８％）を生成することができた。これらのデータは、本明細書で使用した試験条件下で、ＣＨＩＲ９９０２１がニューロン分化を加速するための鍵となる因子であり、ＳＵ５４０２およびＤＡＰＴは重要な、しかし付加的な刺激を提供したことを示す。
【０３３３】
加えて、３ｉ組成物の３つの成分すべてが分化ニューロンの最大収率のために必要である（図２Ｇ）。
【０３３４】
（実施例ＩＸ）
人工ＳＯＸ１０＋細胞は侵害受容器細胞を生産することができる。
【０３３５】
以下の実施例は、操作されたＳｏｘ１０＋ＧＦＰ発現ヒト細胞の定方向性分化のために本発明の例示的な方法を使用することを述べる。
【０３３６】
侵害受容器細胞は、ヒト発生の間に２種類の細胞中間体から生じると考えられる：具体的には、ＳＯＸ１０＋ニワトリ胚神経堤細胞は脊髄に隣接する体幹侵害受容器細胞を生成できることが認められた（参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｅｏｒｇｅら、Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １０：１２８７−１２９３（２００７））。加えて、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）の頭部プラコード組織は、顔面組織中の三叉神経侵害受容器細胞集団に寄与した（参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｃｈｌｏｓｓｅｒら、Ｊ  Ｃｏｍｐ  Ｎｅｕｒｏｌ  ４１８：１２１−１４６（２０００）；Ｓｃｈｌｏｓｓｅｒら、Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ２９４：３０３−３５１（２００６））。
【０３３７】
そこで、ヒト細胞においてＳＯＸ１０によって示される神経堤中間体細胞運命（参照により本明細書に組み込まれる、Ａｏｋｉら、Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ２５９，１９−３３（２００３）；Ｌｅｅら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２５，１４６８−１４７５（２００７））が、トランスジェニックＳＯＸ１０：：ＧＦＰ細菌人工染色体（ＢＡＣ）ｈＰＳＣ系を使用して分化の間に認められるかどうかを決定するために、以前に報告された方法（参照により本明細書に組み込まれる、Ｐｌａｃａｎｔｏｎａｋｉｓら、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２７：５２１−５３２（２００９））を用いて、ＧＦＰ遺伝子と共発現する富化された神経堤遺伝子マーカーを伴った、このＳＯＸ１０：：ＧＦＰ（ＢＡＣ）細胞系を生成した。ＳＯＸ１０：ＧＦＰ細胞系はＨ９  ｈＥＳＣ系のサブクローンであった。細胞を解離させ、Ａｍａｘａからの試薬（溶液Ｖ）、プロトコール（Ｂ−１６）および装置を用いて遺伝子送達を実施した。ヌクレオフェクトした（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｅｄ）（核にトランスフェクトした）ＤＮＡは、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｎｅｒｖｏｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ａｔｌａｓ［ＧＥＮＳＡＴ］（アクセッション番号：ＧＥＮＳＡＴ１−ＢＸ１０８６）から入手した、挿入されたＧＦＰとＳＯＸ１０遺伝子を含む細菌人工染色体（ＢＡＣ）であった。次にＢＡＣを、ｐＬ４５２プラスミドから切り出した選択カセットからＧＥＮＳＡＴ  ＢＡＣへのｃｒｅ／ＬｏｘＰ組換えを使用して、選択のためにネオマイシン耐性遺伝子を含むように改変した（参照により本明細書に組み込まれる、Ｔｏｍｉｓｈｉｍａら、Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ２５（１）：３９−４５．Ｅｐｕｂ  ２００６  Ｓｅｐ  ２１（２００７）参照）。遺伝子送達後、ｈＥＳＣを、ネオマイシン耐性選択のためにＧ４１８の存在下で単細胞として接種し、クローンを手操作で採取して、分化後にＧＦＰの存在に関してスクリーニングした。ｑＲＴ−ＰＣＲによりＧＦＰ細胞を選別してＳＯＸ１０および他の神経堤マーカーの発現を確認した。
【０３３８】
２つの付加的な２連の試料を各々ＬＳＢの１つと接触させ、次にＣＨＩＲ９９０２１（ＬＳＢ／Ｃ）またはＬＳＢと３ｉに接触させて、ＬＳＢで分化を開始させた後４、８、１２および１６日目に、ＧＦＰ発現をＦＡＣＳ同定およびＳＯＸ１０：：ＧＦＰ＋細胞の選別によって測定した。
【０３３９】
ＣＨＩＲ９９０２１が存在した場合は、培養下でこれらの処理細胞の７０％超が、培養条件に応じて分化の１２日目までにＳＯＸ１０：：ＧＦＰ＋になった（ＬＳＢ／Ｃについては７０％およびＬＳＢ３ｉについては８０％；図５ＤおよびＥ）。この結果は、細胞の大部分が神経堤正体を発現することを示し、ＣＨＩＲ９９０２１がＬＳＢ３ｉ侵害受容器細胞の生成のために必要であるという発明者の観察を支持した。したがって、ＬＳＢ３ｉ処理細胞はＬＳＢ／Ｃ処理したｈＰＳＣと比較してより迅速に神経堤運命を獲得したので（図５ＤおよびＥ）、ＳＵ５４０２およびＤＡＰＴと接触させることに加えて、チロシン受容体キナーゼ受容体およびノッチシグナル伝達を阻害するこれらの低分子による組合せ阻害は、それぞれ、神経堤細胞運命を加速した。発明者は、ＣＨＩＲは神経堤および感覚ニューロンを誘導し、ＳＵは神経堤マーカー発現およびニューロン分化を加速すると考えた。最後に、発明者は、ＣＨＩＲおよびＳＵと組み合わせたＤＡＰＴはニューロン分化を加速すると考えた。さらに、ＬＳＢと組み合わせたＣＨＩＲ９９０２１の使用、すなわちＬＳＢ／Ｃは、操作されたＳＯＸ：：ＧＦＰ細胞を読み出しとして使用した場合、１２日から１６日目までの間にＬＳＢ３ｉと比較して、６０％超のネスチン−ＴＵＪｌ＋ニューロン細胞の遅い変換速度を生じさせた。
【０３４０】
（実施例Ｘ）
本明細書で述べる方法によって生産されたＮＴＲＫ１＋ヒト侵害受容器細胞は、ペプチド作動性細胞と一致する遺伝子発現、およびインサイチューラット侵害受容器細胞に類似した電気生理学的応答を示した。
【０３４１】
以下の実施例は、本明細書で述べる方法によって生産された侵害受容器細胞の機能的能力を決定するために本発明の例示的な方法を使用することを述べる。
【０３４２】
ＬＳＢ３ｉ由来ニューロンが本物の侵害受容器ニューロン細胞であることを確認するために、ＬＳＢ３ｉ処理細胞を機能、成熟段階および挙動に関して検査した。侵害受容器細胞を生じさせる多能性幹細胞のＬＳＢ３ｉ処理が得られた後、１０〜１００，０００細胞／ｃｍ２の平板培養密度から長期培養物を樹立し、ヒトβＮＧＦ、ＢＤＮＦおよびＧＤＮＦを添加したＮ２培地での培養下で１０日目、３０日目に継代した（さらなる詳細については実施例Ｉ参照）。より長期の培養条件下でのこれらの細胞の生存率は、ＮＴＲＫ１＋侵害受容器状態と対応して、ＮＧＦ依存性であることが認められた。ＬＳＢ３ｉ侵害受容器は、グルタミン酸（図７Ｃ）に加えて、先に示したように高レベルのＴＵＪ１、ＩＳＬ１、ＢＲＮ３Ａ（図７Ａ〜Ｃ）を発現した。グルタミン酸産生は、興奮性グルタミン酸作動性ニューロン、すなわちグルタミン酸を放出する侵害受容求心性線維、および有害刺激についての重要なイオンチャネルであるカプサイシン受容体ＴＲＰＶ１（図７Ｄ）と一致した。培養下で１５日目に２つの別個の成長突起を各々のニューロンについて同定することができた（図７Ｅ、図１２）。
【０３４３】
樹状突起マーカーＭＡＰ２は、主として、極性を有する形式（ｐｏｌａｒｉｚｅｄ  ｆａｓｈｉｏｎ）において、２つの突起の一方において発現された（図７Ｆ）。ニューロンの双極性は、末梢神経節における感覚ニューロンの役割と一致し、細胞体は背根神経節に位置し、脊髄と末梢の両方に向けて突起を突き出す（参照により本明細書に組み込まれる、Ｗｏｏｌｆら、Ｎｅｕｒｏｎ  ５５，３５３−３６４（２００７）；Ｇｅｏｒｇｅら、Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １０，１２８７−１２９３（２００７））。
【０３４４】
神経成長因子（ＮＧＦ）の存在下で、ニューロンを長期間培養した（例えば、細胞を１０日目に継代し、３０日目まで培養した）。ＬＳＢを５日目に細胞から回収し、１０日目に３ｉを回収して、その日にＮＧＦ／ＧＤＮＦ／ＢＤＮＦを培地に添加した。１０日目から３０日目までニューロンにＮＧＦ／ＧＤＮＦ／ＢＤＮＦを供給した。初期ＬＳＢ処理からの日数で３０日目に、ニューロンは神経節様構造へと自己組織化し始めたことが認められた。このタイプの形態は末梢感覚ニューロンに共通する（参照により本明細書に組み込まれる、Ｍａｒｍｉｇｅｒｅら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ８，１１４−１２７（２００７））（図７Ｇ、ＨおよびＩ）。
【０３４５】
成熟侵害受容器は、典型的には、ペプチド作動性感覚ニューロンによって発現されるカルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）およびサブスタンスＰ（神経ペプチド）などの神経ペプチドの発現に依存して、ペプチド作動性または非ペプチド作動性のいずれかである（参照により本明細書に組み込まれる、Ｗｏｏｌｆら、Ｎｅｕｒｏｎ  ５５，３５３−３６４（２００７））。これに対し、非ペプチド作動性ニューロンはＣＧＲＰもサブスタンスＰも発現せず、レクチンＩＢ４への結合などの他のマーカーを有する。
【０３４６】
それゆえ、ＬＳＢ３ｉ誘導ニューロンを、ＦＡＣＳを用いて、ＮＴＲＫ１発現に関して（上記で述べた方法参照）、ＮＴＲＫ１＋およびＮＴＲＫ１−集団に選別した（選別細胞の例については図７Ｇ参照）。ＮＴＲＫ１＋細胞はサブスタンスＰおよびＣＧＲＰの両方に関して陽性であり、主としてペプチド作動性侵害受容器表現型を示した（図７ＨおよびＩ；分化の３０日目）。
【０３４７】
感覚ニューロン正体の主要な機能的特徴（すなわち機能）は、それらの電気生理学的特性である（参照により本明細書に組み込まれる、Ｆａｎｇら、Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ５６５，９２７−９４３（２００５））。ＮＴＲＫ１＋選別ニューロンを、培養ニューロンについての標準的な電気生理学技術によっても試験した（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｐｌａｃａｎｔｏｎａｋｉｓら、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．２００９，Ｆｉｇｕｒｅ  ５に一例が示されている）。
【０３４８】
ＮＴＲＫ１＋細胞は、電気生理学的特徴である、特徴的な単一活動電位（ＡＰ）、発火パターンを示し、平均膜静止電位は初期ＬＳＢ３ｉ処理後２１日目までに６７±４ｍＶであった。ＬＳＢ３ｉヒトニューロンにおいて生じるＡＰのタイミングおよび活動曲線の形状を図７Ｊ（太い赤線参照）および以下の表１に示す。これらの結果は、以前に一次麻酔成体ラット侵害受容器の電気生理学的報告において述べられたものと同様であった（参照により本明細書に組み込まれる、Ｆａｎｇら、Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ５６５，９２７−９４３（２００５））。
【０３４９】
【表１−２】
2018139592.tif 000024
【０３５０】
（実施例ＸＩ）
本明細書で述べる組成物および方法によって生産される細胞の遺伝子発現。
【０３５１】
以下の実施例は、本明細書で述べる方法によって生産される侵害受容器細胞および他の細胞型の包括的な遺伝子発現を決定するための例示的な方法の使用を述べる。
【０３５２】
誘導分化過程の間の事象（すなわちマーカー発現）の時期をさらに特性づけるため、ＬＳＢおよびＬＳＢ３ｉ処理した両方のｈＰＳＣに関して、包括的な遺伝子発現分析を精密時間分解能（ｆｉｎｅ  ｔｅｍｐｏｒａｌ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）で実施した（２、３、５、７、９および１５日目、ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓ（ＧＥＯ）アクセッション番号ＧＳＥ２６８６７）。神経外胚葉、神経堤、ニューロンおよび侵害受容器に関する選択マーカーを分析した場合（以下の表２参照）、各々について分化の異なる段階を認めることができた（図１０）。
【０３５３】
【表２−２】
2018139592.tif 000025
【０３５４】
この遺伝子発現分析（図１０Ｂ、Ｃおよび上記表２）は免疫蛍光結果の大部分と一致した。例えば、遺伝子分析は、成熟中のニューロンにおいて、ＩＳＬ１、ＰＯＵ４Ｆ１（ＢＲＮ３Ａ）、ＳＯＸ１０、ＴＡＣ１（サブスタンスＰのプロペプチド）、ＮＴＲＫ１およびグルタミン酸小胞輸送体ＶＧＬＵＴ２遺伝子がすべて上方調節される（すなわち培養下の多くの細胞が経時的にこれらのマーカーの発現を増加させる）ことを示した。同時にこれらのマーカーは誘導細胞で増加することが認められたが、ｈＥＳＣ由来の原始神経外胚葉についてのマーカー、特にＤＬＫ１、ＬＨＸ２、ＯＴＸ２、ＬＥＦＴＹ２、ＰＡＸ６およびＨＥＳ５は下方調節される（すなわち培養下のより少数の細胞で発現される）ことが認められた。
【０３５５】
しかし、成熟侵害受容器で発現されると予想される、ソマトスタチン（ＳＳＴ）およびＳＯＸ１０の発現が、１５日目にＬＳＢ３ｉ処理細胞培養物で認められた。しかし、ＳＳＴはまた、発生中の感覚ニューロンにおいても発現されることが示された。それゆえ、発明者は、このマーカーが１５日目の未熟細胞の存在を示していると考えた。いくぶん下方調節されているが、ＳＯＸ１０の発現はまた、大部分の細胞がニューロンであると思われる時点でも観察された。ＳＯＸ１０は細胞がニューロンに分化するとともに下方調節されると予想されたので、この観察は意外であった。１５日目の培養物の細胞におけるＳＳＴおよびＳＯＸ１０発現というこの予想外の発見から、すべての細胞が侵害受容器細胞になるわけではなく、約２０〜３０％であると考えられた。これは、他の成熟細胞型（シュヴァン細胞など）がＳＯＸ１０を発現し続けることを示した。
【０３５６】
二重ＳＭＡＤ阻害によって生産されるｈＥＳＣ由来の原始神経外胚葉細胞培養物は（各々が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｈａｍｂｅｒｓら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２７（２００９）；Ｆａｓａｎｏら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ６，３３６−３４７（２０１０））、ＤＬＫ１、ＬＨＸ２、ＯＴＸ２、ＬＥＦＴＹ２、ＰＡＸ６およびＨＥＳ５遺伝子の高発現を示した。同様に、ｈＥＳＣ由来の原始神経外胚葉細胞培養物がＬＳＢを用いた二重ＳＭＡＤ阻害によって生産された場合も、これらの遺伝子について類似の高発現が観察された（図１０Ｂ、Ｃおよび以下の表３参照）。これらの遺伝子は、ＬＳＢ３ｉ処理の間は低減し、この間、本発明の開発において侵害受容器が生産された。
【０３５７】
【表３−２】
2018139592.tif 000026
【０３５８】
加えて、時間的トランスクリプトーム分析は、機械的受容器細胞（ｍｅｃｈａｎｏｃｅｐｔｏｒ）および固有受容器細胞とは異なる、侵害受容器中間体細胞運命についてのさらなる証拠を提供した。ニューロゲニン塩基性ヘリックス−ループ−ヘリックスタンパク質は、マウス発生の間に背根神経節における神経発生の２つの逐次的な波を媒介する（参照により本明細書に組み込まれる、Ｍａｒｍｉｇｅｒｅら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ８，１１４−１２７（２００７）；Ｍａら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １３，１７１７−１７２８（１９９９））。ＮＥＵＲＯＧ２（ニューロゲニン２）によって示される最初の波は機械的受容器細胞および固有受容器細胞を生じさせ、ＮＥＵＲＯＧ１（ニューロゲニン１）によって示される２番目の波は侵害受容器細胞を生じさせる。ｈＰＳＣをＬＳＢで処理した場合、ＮＥＵＲＯＧ２発現は７日目までに強力に誘導される（図１０Ｃおよび以下の表４）。これに対し、ＬＳＢ３ｉで処理したｈＰＳＣは、７日目までにあまり顕著ではないＮＥＵＲＯＧ２の誘導を示すが、９日目までにＮＥＵＲＯＧ１の選択的誘導を示
す（図１０Ｃ）。
【０３５９】
【表４−２】
2018139592.tif 000027
【０３６０】
（実施例ＸＩＩ）
例示的な侵害受容器細胞を提供するために本発明の組成物および方法を用いて企図される大規模培養。
【０３６１】
以下の企図される説明は、本明細書で述べる方法によって生産される侵害受容器細胞の大規模生産のための例示的な方法および使用を示す。
【０３６２】
ＬＳＢ３ｉを使用する、拡大可能な生成（すなわち比較的少数の細胞、例えば実施例、前出で述べるような４８穴プレートの１．５×１０４細胞／穴、および企図される９６穴プレートでの５×１０３細胞／穴を含む両培養物から、ｈＰＳＣ由来侵害受容器の大規模バッチ培養（例えば１８  １５ｃｍ皿のバッチで１×１０７〜１×１０８細胞（約５．５×１０７細胞））まで、侵害受容器細胞を生成するための成功をおさめると考えられる方法）。これらの方法は、基礎生物学試験における使用のため、ならびにヒトおよび動物における医学適用に適用できる薬剤発見のために、化合物を試験する際に使用するためのｈＰＳＣ由来侵害受容器細胞を提供することが企図される。特に、発明者は、ヒトおよび動物における急性および慢性疼痛を軽減する処置のために本発明の組成物および方法を使用することを企図する。
【０３６３】
特に、例示的な侵害受容器細胞、例えばペプチド作動性侵害受容器細胞を、７×１０７〜７×１０８の例示的な非限定的範囲で（７０％の効率の侵害受容器細胞収集が企図される）提供するために、本明細書で述べる培地および例示的化合物を使用して、例示的な１×１０８〜１×１０９ｈＰＳＣ細胞をバッチ胚様体培養物において増殖させる大規模バッチ培養が企図される。例示的な侵害受容器細胞は、ＴＡＣ１、ＶＧＬＵＴ２およびＳＬＣ１５Ａ３などの侵害受容器細胞を同定する遺伝子（すなわちｍＲＮＡおよびタンパク質）を発現すると考えられる。例示的な侵害受容器細胞は、ＩＳＬ１、ＢＲＮ３Ａ、ＲＥＴ、ＲＵＮＸ１、サブスタンスＰ、ＣＧＲＰ等のような同定マーカーを発現すると考えられる。
【０３６４】
要約すると、発明者は、基礎生物学ならびにヒトおよび動物において侵害受容器細胞に関連する状態、特に疼痛の試験および処置のための薬剤発見における、新規プラットフォームを提供するために本発明の組成物および方法を使用することを企図する。
【０３６５】
【表５−１】
2018139592.tif 000028
【０３６６】
【表５−２】
2018139592.tif 000029
【０３６７】
【表５−３】
2018139592.tif 000030
【０３６８】
以下の参考文献はそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０３６９】
【化１３】
2018139592.tif 000031
【０３７０】
（実施例ＸＩＩＩ）
メラノサイトはヒト多能性幹細胞から誘導される：ＬＳＢ−メラノサイト（ＬＳＢ−Ｍｅｌ）。
【０３７１】
以下は、関連疾患モデリングにおける使用のためのメラノサイトを提供するための例示的な組成物および方法を述べる。
【０３７２】
ＳＯＸ１０：：ＧＦＰ細菌人工染色体（ＢＡＣ）ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）レポーター系を作製した。このことは、この細胞系が低分子との接触に応答する際のインビトロでの神経堤細胞誘導の観察を可能にした。Ｓｏｘ１０は、多分化能性神経堤幹細胞の最も堅調な早期マーカーであり、メラノサイト前駆体を含む一部の神経堤誘導体においても発現されることが認められた。これまでの成熟スキームで得られるよりも高い純度と数でメラノサイト培養物を生産するために、このレポーター系を使用して、定方向性分化スキームの開発において神経堤集団を将来を見越して（ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ）同定し、単離した（図１４、ＬＳＢ−Ｃ）。
【０３７３】
二重ＳＭＡＤ阻害プロトコール（参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｈａｍｂｅｒｓら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２００９））において、ＳＭＡＤシグナル伝達を阻害する２つの低分子で処理したヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）は、ＣＮＳ神経組織を効率的に生産した。加えてｈＥＳＣをより低い密度で平板培養した場合、低レベルの自発的神経堤細胞誘導が認められた（例えば、約３％のＳｏｘｌ０：：ＧＦＰ＋神経堤型細胞が認められた）。しかし、研究における使用のためおよび医学的試験のためには、より多くの神経堤型細胞が必要であった。さらに、メラノサイト研究のためには、低レベルの自発的分化では提供されない、より多数の細胞を有するより純粋な集団が必要であった。
【０３７４】
本発明の開発の間に、発明者は、メラノサイト前駆体、成熟中のメラノサイトおよび成熟メラノサイトの高度に純粋な産物を生産するように、神経堤誘導のための二重ＳＭＡＤ阻害プロトコールを最適化する方法を発見した。
【０３７５】
具体的には、本発明のメラノサイトを生産する、以下の時系列の培養条件を開発した：０および１日目にＬＤＮおよびＳＢ（３ｉを含む方法におけるＬＤＮおよびＳＢと同じ濃度範囲を使用する）を供給する；２日目にＬＤＮ、ＳＢ、ＣＨＩＲ（本明細書で述べる３ｉを含む方法におけるＬＤＮ、ＳＢおよびＣＨＩＲと同じ濃度範囲を使用する）を供給する；１つの実施形態では、３日目にＳＢ、ＣＨＩＲ（本明細書で述べる３ｉを含む方法におけるＳＢおよびＣＨＩＲと同じ濃度範囲を使用する）を供給し、別の実施形態では、３日目にＬＤＮ、ＳＢ、ＣＨＩＲ（本明細書で述べる３ｉを含む方法におけるＬＤＮ、ＳＢおよびＣＨＩＲと同じ濃度範囲を使用する）を供給する；４日目および５日目にＣＨＩＲ  （本明細書で述べる３ｉを含む方法におけるＣＨＩＲと同じ濃度範囲を使用する）を供給する；６日目から１１日目までＣＨＩＲ、ＢＭＰ４およびＥＤＮ３（本明細書で述べる３ｉを含む方法におけるＣＨＩＲと同じ濃度範囲を使用し、ＢＭＰ４およびＥＤＮ３については以下の濃度範囲参照）を供給する。１１日目に細胞を継代し、８週間までＭＥＬ培地（ＣＨＩＲを含む）を供給した。
【０３７６】
ＭＥＬ培地は、メラノサイトに関して富化され、これにより、８週間までに細胞培養物は１００％までの純粋な集団を示した。したがってこのＬＳＢ−ＭＥＬ法／プロトコールは、メラノサイト生産の高い効率を有していた。発明者はまた、メラノサイトの発生の間、リノール酸がＭＥＬ培地中の少なくとも１つの必要成分であることを発見した（図１６参照）。
【０３７７】
メラノサイトの発生の間に、多数の前駆体段階が以下の順序で認められた：神経堤幹細胞、胚性グリア−メラニン芽幹細胞、成体メラノサイト幹細胞、メラノサイト。図１３の例示的な概略図参照。
【０３７８】
図１３  メラノサイト前駆体／メラニン芽細胞の特異化と単離。
【０３７９】
１１日目のＬＳＢ−Ｃプロトコールは、Ｓｏｘｌ０：：ＧＦＰ、ＭＩＴＦを共発現するメラノサイト前駆体の誘導を支持した（Ａ、右のパネル）。ＭＩＴＦ単一陽性集団も認められた（Ａ、左のパネル）。ｃ−Ｋｉｔはメラノサイト前駆体の潜在的マーカーとして同定された。ＬＳＢ−Ｃ分化後に低いパーセンテージのＳｏｘ１０：：ＧＦＰ、ｃ−ｋｉｔ共発現細胞が認められた（Ｂ、橙色集団）。ｑＲＴ−ＰＣＲ分析により、二重陽性集団においてメラノサイトマーカーＭＩＴＦＭ（塩基性ヘリックス−ループ−ヘリックスロイシンジッパータンパク質）およびＤｃｔ（ドーパクロムトートメラーゼ（ドーパクロムδイソメラーゼ、チロシン関連タンパク質２））の富化が確認された（Ｃ）。ＢＭＰ４およびＥＤＮ３での処理（「ＬＳＢ−Ｍｅｌ」）は、Ｓｏｘ１０：：ＧＦＰ、ｃ−ｋｉｔ二重陽性の推定上のメラノサイト前駆体集団の誘導を増強した（Ｄ）。ＬＳＢ−Ｍｅｌ処理後に単離されたＳｏｘ１０：：ＧＦＰ、ｃ−ｋｉｔ二重陽性細胞は、有意により高いレベルのメラノサイトマーカーＭＩＴＦＭおよびＤｃｔを示した（Ｅ）。誤差バーはｓ．ｅ．ｍ．を示す。＊ｐ＜０．０５。
【０３８０】
図１４  メラノサイト前駆体の増殖と成熟。
【０３８１】
分化条件の要約（Ａ）。ＢＭＰ４およびＥＤＮ３を伴うＬＳＢ−Ｃ（ＬＳＢ−Ｍｅｌ）条件での特異化後、細胞を１１日目に選別し、再接種した。選別後（ＰＳ）細胞を、ｃ−ｋｉｔリガンド（ＳＣＦ）、エンドセリン３（ＥＤＮ３）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）およびＷｎｔアクチベーターを含む成熟培地に維持した。ＰＳ６日目に明視野顕微鏡検査によって認められた色素細胞は、メラノサイトマーカーＭＩＴＦに関して陽性であったが、Ｓｏｘ１０：：ＧＦＰレポーターが下方調節されていると思われた（Ｂ）。Ｓｏｘ１０：：ＧＦＰ、ｃ−ｋｉｔ二重陰性を除くすべての集団が、最終的にＭＩＴＦ発現細胞および肉眼で見える色素クラスターを生じさせたが、その割合は異なっていた（Ｃ）。ＢＭＰ４およびｃＡＭＰでの処理は、メラノサイトに特有の紡錘様形態を示す色素細胞への分化を増強した（Ｄ）。
【０３８２】
図１５  成熟メラノサイトの特性付け。
【０３８３】
ＬＳＢ−Ｍｅｌプロトコールで誘導した成熟メラノサイトの純粋な集団は、培養下で８週間超後にＭＩＴＦ、Ｓｏｘ１０、Ｔｙｒｐ１（チロシナーゼ関連タンパク質１）およびＨＭＢ４５を含む一般的なメラノサイトマーカーの発現を維持する（Ａ）。メラノサイトは、継代の数週間にわたってそれらの暗く色素沈着した表現型を保持する（Ｂ）。色素沈着レベルを評価するために１×１０６細胞をペレット化し、写真撮影した。成熟メラノサイトの電子顕微鏡超微細構造特性付け（Ｃ、Ｄ）。ＬＳＢ−Ｍｅｌ由来メラノサイトの細胞質中の数多くの暗く色素沈着したメラノソームの存在がＴＥＭによって観察された（Ｃ）。メラノソーム小胞の段階ＩからＩＶへの成熟に伴うメラニン色素の存在および進行性沈着に注目されたい（Ｄ）。
【０３８４】
それゆえ、発明者は、二重ＳＭＡＤ阻害プロトコール、ＬＳＢが、ヒト胚性幹細胞からＳｏｘｌ０：：ＧＦＰを発現する神経堤集団を迅速かつ効率的に生成することを明らかにした。この修正プロトコールは、ｃ−ｋｉｔ発現によって、将来を見越して同定され、単離される、低レベルのメラノサイト前駆体の誘導を支持した。これらの細胞の誘導は、ＢＭＰ４およびＥＤＮ３での処理を介してさらに増強された。メラノサイト前駆体は、その後、ＢＭＰ４およびｃＡＭＰの存在下でインビトロでさらに培養した後、色素沈着状態へと成熟した。
【０３８５】
【数４】
2018139592.tif 000032
【０３８６】
Ｒ＆ＤからのＢＭＰ４についての濃度範囲は１０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ（１つの実施形態では２５ｎｇ／ｍｌ）を使用し、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ＣｏｍｐａｎｙからのＥＤＮは２５〜３００ｎＭ（１つの実施形態では１００ｎＭ）を使用する。
【０３８７】
図１６  メラノサイトの増殖のためにリノール酸を必要とする、例示的なＬＳＢ−ＭＥＬ培地処方物を示す。顕微鏡像の上に示す培地成分は、処方物から除外された培地成分である；Ｐｈ＝位相差；ＢＦ＝明視野。例示的な概略図は、本発明の細胞を同定するために使用したメラノサイト前駆体マーカーを示す。
【０３８８】
したがって発明者は、インビトロでの神経堤の誘導ための迅速で明確なプロトコールを発見し、開発した。さらに、発明者は、これらの細胞のメラノサイトへの定方向性分化のための組成物および方法を開発するために、インビトロでの神経堤細胞の誘導のためのこの迅速で明確なプロトコールを使用した。これらのメラノサイトは、長期培養およびユーメラニンの持続的生産のそれらの能力において独特であった。
【０３８９】
上記明細書において言及したすべての刊行物および特許は、参照により本明細書に組み込まれる。記述した本発明の方法およびシステムの様々な修正および変法が、本発明の範囲および精神から逸脱することなく当業者に明らかである。本発明を特定の好ましい実施形態に関連して説明したが、特許請求に記載の本発明はそのような特定の実施形態に不当に限定されるべきでないことが了解されるべきである。実際に、細胞生物学、神経生物学、がん細胞生物学、分子生物学、生化学、化学、有機合成または関連分野の当業者に明らかな、本発明を実施するための記述した方法の様々な修正は、以下の特許請求の範囲内であることが意図されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年4月18日(2018.4.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３６５】
【表５−１】
2018139592.tif 000050
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３６６】
【表５−２】
2018139592.tif 000051
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３６７】
【表５−３】
2018139592.tif 000052
【外国語明細書】
2018139592000001.pdf