(57)【要約】【課題】粒子、方法およびその使用を提供すること。【解決手段】本開示は、数ある中で、ナノスケールコアと、コア上で会合している複数のキャッピング剤実体と、外側のカプセル材層と、ナノスケールコア上またはナノスケールコア内、キャッピング剤実体上またはキャッピング剤実体間、カプセル化層上またはカプセル化層内、およびこれらの組合せからなる群から選択される位置に分布している複数のドーパント実体とを含む組成物を提供する。提供する技術は、前例のないレベルのドーパント実体密度および／または表面局在化を実現することができ、これはＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性剤ドーパントに対して、劇的に改善されたシグナル強度および／または画像化感度をもたらす。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の引用
本願は、２０１２年８月３１日に出願した米国仮特許出願第６１／６９６，１２２号に対する優先権を主張し、その利益を主張する。この出願の全体は、本明細書に参考として援用される。
【背景技術】
【０００２】
背景
ドーパント実体を組み入れることができるナノ粒子系には素晴らしい可能性があり、多種多様な状況で有用である。系の改善が引き続き必要とされている。このような系を開発する上での特定の一目標は、外科手術で切除の境界を規定するのに利用することができる画像化ナノ粒子を提供することである。外科切除の完全性は、罹患率および死亡率に大いに影響を及ぼす。この難題および意義は、腫瘍を除去する外科手術では特に深刻である。より完全な腫瘍の切除を実現しようと、外科医はいくつかの障害物に遭遇するが、その障害物には、腫瘍の辺縁が不規則で不明瞭であること、および重大な生理学的構造に隣接し、または侵害して腫瘍が成長することが含まれる。腫瘍の辺縁をよりよく可視化しようと、今日まで多種多様な技術が探索されてきた。しかし、依然として、新しく、よりよいプローブおよび／または方法が引き続き必要とされている。特に、残余の腫瘍を正確に検出するのに、リアルタイムのプローブ／方法に対する、重要な、未だ対処されていない必要性が存在する。
【０００３】
政府支援
本発明は、国立衛生研究所により授与されたＮＩＨ−ＮＣＩ  Ｋ０８  ＣＡ１６３９６１の下の政府支援で行われた。米国政府は本発明にある特定の権利を有する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
概要
本発明は、粒子を調製するための、および／または粒子を使用するための技術を含めた、粒子に関する技術（例えば、表面増強（共鳴）ラマン散乱（ＳＥ（Ｒ）ＲＳ）−活性粒子）、ならびに粒子自体を提供する。一般に、本明細書に記載および／または利用する粒子は、ナノスケールコア、カプセル材、および複数のドーパント実体を含む。
【０００５】
提供する組成物および方法は様々な状況において有用である。ほんの一例をあげると、多くの実施形態では、本発明は粒子に特に有用であり、ドーパント実体は、入射レーザー波長で共鳴を経験する共鳴剤である。ある特定の実施形態では、共鳴剤はＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性剤である。本明細書に実証する通り、提供する技術は、前例のないレベルのドーパント実体密度および／または表面局在化を実現し、これらは、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性剤ドーパントに対して、劇的に改善されたシグナル強度および／または画像化感度をもたらす。
【０００６】
数ある中で、本発明は、表面プライマーを使用せずにカプセル材のコーティングを可能にする技術を提供する。このような表面プライマーは、ナノスケールコア表面へのカプセル材の結合を可能にするのにしばしば加えられる。一部の実施形態では、本発明は、置換可能なキャッピング実体を利用する技術を提供する。提供する技術の特徴には、高密度のドーパント実体が、そのコア表面近くに位置することができることが含まれる。表面プライマーを利用するより伝統的な取組みでは、このような程度の密度および／またはドーパント実体の表面局在化が可能にならない。
【０００７】
一部の実施形態では、本明細書に記載する方法論は、キャッピング剤（例えば、ナノスケールコア合成の直接的な結果として存在する、表面結合している安定化剤）と会合しているナノスケールコアを提供するステップと、カプセル材前駆体および／またはドーパント実体がキャッピング剤のいくつかまたは全てを置き換えて高密度の表面局在化ドーピング実体を特徴とする粒子を生成するのに十分な条件下および十分な時間、キャッピング剤が会合しているナノスケールコアをカプセル材前駆体およびドーパント実体と接触させるステップとを含む。
【０００８】
提供する技術により、以前に実現されなかった構造および特性の粒子の調製が可能になる。一部の実施形態では、提供する粒子には、ナノスケールコア、カプセル材、および複数のドーパント実体が含まれ、この粒子は、（ｉ）関連のドーパント実体に典型的に観察されるよりも高いドーパント実体密度、および（ｉｉ）典型的に観察されるよりもナノスケールコアに近いドーパント実体の局在化を特徴とする。
【０００９】
粒子を調製するのに提供される技術の注目すべき一特徴は、これらが多種多様なコア材料、コア配置、カプセル材および実体の材料などに適用可能であり、効果的であることである。一部の実施形態では、提供する粒子は、金属材料（例えば、金、銀、銅など）のコアを含む。一部の実施形態では、提供する粒子はナノスケールコアを含み、コアの形状は、球、桿状、星、シェル、楕円、三角形、角錐、立方体、かご、およびこれらの組合せからなる群から選択される構造エレメントであり、または構造エレメントを含む。いくつかの特定の実施形態では、提供する粒子は、衛星構造により取り囲まれる中心構造を有するナノスケールコアを含む。
【００１０】
本開示は、数ある中で、ナノスケールコアと、コア上で会合している複数のキャッピング剤実体と、外側のカプセル材層と、ナノスケールコア上またはナノスケールコア内、キャッピング剤実体上またはキャッピング剤実体間、カプセル化層上またはカプセル化層内、およびこれらの組合せからなる群から選択される位置に分布している複数のドーパント実体とを含む組成物を提供する。提供する技術は、前例のないレベルのドーパント実体密度および／または表面局在化を実現することができ、これらは、一部の実施形態では、例えば、１つまたは複数のＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性剤ドーパント（複数可）を利用するある特定の実施形態におけるものを含め、劇的に改善されたシグナル強度および／または画像化感度をもたらす。一部の実施形態では、シグナル強度および／または画像化感度は、ＣＴ、超音波、または蛍光を含めた公知の画像化モダリティに比べて改善されている。
【００１１】
本開示は、数ある中で、カプセル材層をナノスケールコアに適用する方法を提供する。一部の実施形態では、提供する方法は、ナノスケールコアの表面と置換可能に会合している複数のキャッピング剤実体で実質的にコーティングされているナノスケールコアを含む、キャッピングされた組成物を提供するステップを含む。あるいは、またはさらに、一部の実施形態では、提供する方法は、キャッピングされた組成物を、複数のドーパント実体、および複数のカプセル材前駆体実体と接触させるステップを含み、接触は、ｉ）コア表面上への、またはコア表面近くのドーパント実体の堆積、およびｉｉ）カプセル材前駆体実体による外側のカプセル材層の形成を可能にするのに十分な条件下および十分な時間で行われ、その結果、ナノスケールコアと、コア上で会合している複数のキャッピング剤実体と、外側のカプセル材層と、コア上またはコア内、キャッピング剤実体上、カプセル化層内、カプセル化層上、およびこれらの組合せからなる群から選択される位置に分布している複数のドーパント実体とを含む組成物が産生される。
【００１２】
本開示は、数ある中で、ナノスケールコアと、コア上で会合している複数のキャッピング剤実体と、外側のカプセル材層と、ナノスケールコア上またはナノスケールコア内、キャッピング剤実体上、カプセル化層内、カプセル化層上、およびこれらの組合せからなる群から選択される位置に分布している複数のドーパント実体とを含む粒子の集合を対象に投与するステップを含む方法を提供する。ある特定の実施形態では、このような粒子は、ＭＲＩ剤、ＰＥＴ剤、ＳＰＥＣＴ剤、ＣＴ剤、および／またはこれらの組合せをさらに含む。ある特定の実施形態では、このような方法は、局在化粒子を画像化する１つまたは複数のステップも含む。ある特定の実施形態では、局在化粒子を画像化するステップは、ＭＲＩシグナル、ＰＥＴシグナル、ＳＰＥＣＴシグナル、ＣＴシグナル、およびこれらの組合せからなる群から選択される第１のシグナルを得るステップであって、第１のシグナルを使用して、腫瘍の局在化（例えば、腫瘍全体の）、腫瘍の肉眼的描写（例えば、腫瘍全体の）、ならびに／または残余の腫瘍の位置、形状、および／またはサイズの１つまたは複数に対応する画像を生成するステップと、光音響シグナルを得るステップであって、光音響シグナルを使用して、深部組織浸透を有する腫瘍に対応する画像を生成するステップと、ラマン振動シグナルを得るステップであって、ラマン振動シグナルを腫瘍の辺縁を規定するガイドとして使用するステップと、第１のシグナル、光音響シグナル、およびラマン振動シグナルを使用して腫瘍および腫瘍の辺縁の画像を生成するステップとを含む。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
ナノスケールコアと、
前記コア上で会合している複数のキャッピング剤実体と、
外側のカプセル材層と、
前記ナノスケールコア上またはナノスケールコア内、キャッピング剤実体上またはキャッピング剤実体間、前記カプセル化層上またはカプセル化層内、およびこれらの組合せからなる群から選択される位置に分布している複数のドーパント実体と
を含む組成物。
（項目２）
ドーパント実体が、前記コア上のキャッピング剤実体間またはキャッピング剤実体の中に分布している、項目１に記載の組成物。
（項目３）
前記ドーパント実体のうちの少なくともいくつかが前記カプセル材層内にある、項目１または２に記載の組成物。
（項目４）
前記ドーパント実体のうちの少なくともいくつかが、前記ナノスケールコアの表面の１０ｎｍ以内に位置付けられる、項目１に記載の組成物。
（項目５）
前記ドーパント実体がＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性剤である、項目１から４のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６）
２０ｆＭのまたはそれ未満の検出閾値を有する、項目５に記載の組成物。
（項目７）
表面プライマーを実質的に含まない、項目１から６のいずれか一項に記載の組成物。
（項目８）
前記ナノスケールコアが非球形である、項目１から７のいずれか一項に記載の組成物。
（項目９）
前記ナノスケールコアが、金属もしくは合金であるか、または金属もしくは合金を含む、項目１から８のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１０）
前記金属が、金、銀、銅、または局在化表面プラズモン共鳴を維持することができる任意の他の材料、およびこれらの組合せからなる群から選択される、項目９に記載の組成物。
（項目１１）
前記カプセル材が、シリカ、チタニア、ジルコニア、ゲルマニア、アルミナ、またはこれらの組合せからなる群から選択される酸化物を含む、項目１から１０のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１２）
１つまたは複数の薬剤をさらに含む、項目１から１１のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１３）
前記１つまたは複数の薬剤が、ＭＲＩ剤、ＰＥＴ剤、ＳＰＥＣＴ剤、ＣＴ剤、またはこれらの組合せからなる群から選択される、項目１２に記載の組成物。
（項目１４）
前記ＭＲＩ剤が、Ｇｄ塩、酸化鉄、常磁性ＣＥＳＴ剤、およびこれらの組合せから選択される、項目１３に記載の組成物。
（項目１５）
前記１つまたは複数の薬剤が、前記カプセル材表面上に直接会合している、項目１２に記載の組成物。
（項目１６）
前記１つまたは複数の薬剤が、リンカーによって前記カプセル材表面上に間接的に会合している、項目１２に記載の組成物。
（項目１７）
約１ｎｍから約１０ｎｍ、または約１０ｎｍから約３００ｎｍの直径を有する、項目１から１６のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１８）
カプセル材層をナノスケールコアに適用する方法であって、
ナノスケールコアの表面と置換可能に会合している複数のキャッピング剤実体で実質的にコーティングされているナノスケールコア
を含むキャッピングされた組成物を提供するステップと、
前記キャッピングされた組成物を、
複数のドーパント実体、および
複数のカプセル材前駆体実体
と接触させるステップと
を含み、前記接触が、
前記コア表面上への、またはコア表面近くのドーパント実体の堆積、ならびに
前記カプセル材前駆体実体による外側のカプセル材層の形成
を可能にするのに十分な条件下および十分な時間で行われ、その結果、
ナノスケールコアと、
前記コア上で会合している複数のキャッピング剤実体と、
外側のカプセル材層と、
前記コア上またはコア内、キャッピング剤実体上、カプセル化層内、カプセル化層上、およびこれらの組合せからなる群から選択される位置に分布している複数のドーパント実体と
を含む組成物が産生される方法。
（項目１９）
前記提供するステップが、いかなる表面プライマーの添加も含まないキャッピングされた組成物を提供するステップを含む、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記接触するステップが、いかなる表面プライマーとの接触も含まない、項目１８に記載の方法。
（項目２１）
ナノスケールコアと、
前記コア上に会合している複数のキャッピング剤実体と、
外側のカプセル材層と、
前記ナノスケールコア上またはナノスケールコア内、キャッピング剤実体上、カプセル化層内、カプセル化層上、およびこれらの組合せからなる群から選択される位置に分布している複数のドーパント実体と
から構成される粒子の集合を対象に投与するステップを含む方法。
（項目２２）
前記対象が固形腫瘍を有する、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記固形腫瘍が、脳、肺、乳房、卵巣、胃、膵臓、喉頭、食道、精巣、肝臓、耳下腺、胆道、結腸、直腸、子宮頚部、子宮、子宮内膜、腎臓、膀胱、前立腺、甲状腺、頭頚部、メラノーマ、グリオーマ、神経芽細胞腫、ならびに神経内分泌の腫瘍からなる群から選択される、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記投与するステップが、前記集合からの粒子が前記固形腫瘍に局在するような位置に、局在するような量を投与するステップを含む、項目２２または２３に記載の方法。
（項目２５）
前記粒子が標的化実体をさらに含む、項目２１から２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
前記ナノスケールコアが金である、項目２１から２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
前記ドーパント実体がＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性剤である、項目２１から２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
前記粒子が、ＭＲＩ剤、ＰＥＴ剤、ＳＰＥＣＴ剤、ＣＴ剤、またはこれらの任意の組合せをさらに含む、項目２１から２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
局在化粒子を画像化するステップをさらに含む、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記画像化するステップが、
ＭＲＩまたはＰＥＴまたはＳＰＥＣＴまたはＣＴのシグナルを得るステップであって、前記シグナルを使用して、腫瘍全体の局在化、腫瘍全体の肉眼的描写、および残余の腫瘍のうちの１つまたは複数に対応する画像を生成するステップと、
光音響シグナルを得るステップであって、前記光音響シグナルを使用して、深部組織浸透を有する腫瘍に対応する画像を生成するステップと、
ラマン振動シグナルを得るステップであって、前記ラマン振動シグナルを腫瘍の辺縁を規定するガイドとして使用するステップと、
ＭＲＩシグナル、光音響シグナル、およびラマン振動シグナルを使用して前記腫瘍および前記腫瘍の辺縁の画像を生成するステップと
を含む、項目２９に記載の方法。
【００１３】
定義
本開示がより容易に理解されるために、ある特定の用語を以下に規定する。以下の用語および他の用語に対するさらなる定義は、本明細書を通して記載され得、またはその他の点では文脈から明らかであり得る。
【００１４】
本出願において、「または」の使用は、別段の記載がなければ「および／または」を意味する。本出願で使用する、「含む（comprise）」という用語、およびこの用語の変形、例えば、「含んでいる（comprising）」および「含む（comprises）」は、他の添加物、
構成成分、整数、またはステップを除外しようとするものではない。本出願で使用する、「約」および「およそ」という用語は等価として使用するものである。本出願で使用する、約／およそのある、またはない任意の数字は、関連の技術分野における通常の技術者により理解される任意の通常の変動を網羅することを意味する。ある特定の実施形態では、「およそ」または「約」という用語は、別段の記載がなければ、または他の方法で文脈から明らかでなければ（このような数が、可能な値の１００％を超える場合以外は）、記載する基準（reference）値の、いずれかの方向（それを超え、またはそれ未満）における
、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ未満内に入る値の範囲を指す。
【００１５】
「投与」：「投与」という用語は、物質を対象中に導入することを指す。一部の実施形態では、投与経路は経口投与である。さらに、またはあるいは、経路は静脈内投与である。しかし、局所、皮下、腹腔内、動脈内、吸入、膣内、直腸内、経鼻、脳脊髄液中への導入、または身体コンパートメント中への点滴注入などの任意の投与経路を使用することができる。
【００１６】
「会合している」：本明細書で使用する「会合している」という用語は、十分に安定である構造を形成し、その結果実体が関連の条件（例えば、生理学的条件）下で物理的に隣接したままであるように、直接的または間接的のいずれかで（例えば、連結剤として働く１つまたは複数のさらなる実体によって）相互に物理的に近接する２つ以上の実体を意味する。一部の実施形態では、会合しているモイエティは、相互に共有結合性に連結している。一部の実施形態では、会合している実体は、非共有結合性に連結している。一部の実施形態では、会合している実体は、特異的な非共有結合性の相互作用によって（すなわち、例えば、ストレプトアビジン／アビジン相互作用、抗体／抗原相互作用など、これらの相互作用パートナー間を識別する相互作用性のリガンドと、使用の状況において存在する他の実体との間の相互作用によって）相互に連結している。あるいはまたはさらに、十分な数のより弱い非共有結合性の相互作用は、モイエティが会合したままであるのに十分な安定性を供給することができる。例示の非共有結合性相互作用には、それだけには限定されないが、親和性相互作用、金属配位、物理的吸着、ホスト−ゲスト相互作用、疎水性相互作用、パイスタッキング相互作用、水素結合相互作用、ファンデルワールス相互作用、磁性相互作用、静電気的相互作用、双極子−双極子相互作用などが含まれる。
【００１７】
「生体適合性」：本明細書で使用する「生体適合性」という用語は、ｉｎ  ｖｉｖｏで実質的な有害応答を引き出さない材料を記載するものとされる。ある特定の実施形態では、材料が細胞に対して毒性でなければ、材料は「生体適合性」である。ある特定の実施形態では、材料をｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞に加えて２０％以下の細胞死となれば、かつ／または材料をｉｎ  ｖｉｖｏで投与しても炎症または他のこのような有害効果を誘発しなければ、材料は「生体適合性」である。ある特定の実施形態では、材料は生分解性である。
【００１８】
「生分解性」：本明細書で使用する「生分解性の」材料は、細胞中に導入すると、細胞の機構（例えば、酵素的分解）により、または加水分解により、細胞に対する重大な毒性効果なしに細胞が再利用または処分のいずれかをすることができる成分に崩壊する材料である。ある特定の実施形態では、生分解性材料の崩壊によって産生される構成成分は、ｉｎ  ｖｉｖｏで炎症および／または他の有害効果を誘発しない。一部の実施形態では、生分解性材料は酵素的に崩壊する。あるいは、またはさらに、一部の実施形態では、生分解性材料は加水分解により崩壊する。一部の実施形態では、生分解性のポリマー材料は、これらの構成成分のポリマーに崩壊する。一部の実施形態では、生分解性材料（例えば、生分解性のポリマー材料を含む）の崩壊には、エステル結合の加水分解が含まれる。一部の実施形態では、材料（例えば、生分解性のポリマー材料を含む）の崩壊には、ウレタン連結の切断が含まれる。
【００１９】
「照射性」：本明細書で使用する「照射性の」という用語は、本明細書に開示する実施形態の粒子の分子および／またはナノスケールコアを励起することができるレーザー光を含めた、近赤外線（ＮＩＲ）、可視光を含めた光源の適用を指す。
【００２０】
「磁気共鳴画像化法」：本明細書で使用する「磁気共鳴画像化法（ＭＲＩ）」という用語は、身体の構造および機能を可視化するために放射線医学において最も一般的に使用される医用画像化技術を指す。ＭＲＩはあらゆる平面における身体の詳細な画像を提供する。ＭＲＩは電離放射線を使用しないが、身体の水中の（通常）水素原子の核磁化を整列させるほど強力な磁場を使用する。高周波電場を使用して、この磁化のアラインメントを系統的に変え、水素核に、スキャナーによって検出できる回転性の磁場を生成させる。このシグナルをさらなる磁場により操作して、身体の画像を構築するのに十分な情報を蓄積させることができる。対象がスキャナーに横たわると、動物の身体における水分子中に豊富に見出される水素核（すなわちプロトン）が、強力な主磁場と整列する。高周波で発振し、主場に垂直である第２の電磁場が、次いで脈動してある比率のプロトンを主場のアラインメントの外に押し出す。これらプロトンは、次いで、主場とのアラインメントに駆り立てられて戻され、戻されるときに検出可能な高周波シグナルを放射する。身体の様々な組織（例えば、脂肪対筋肉）におけるプロトンは異なる速度で再整列するので、身体の様々な構造が明らかにされ得る。造影剤を静脈注射して血管、腫瘍、または炎症の外見を増強してもよい。ＭＲＩは身体のあらゆる部分を画像化するのに使用されるが、神経学的状態、筋肉および関節の障害において、腫瘍を評価するのに、ならびに心臓および血管における異常を示すのに特に有用である。
【００２１】
「試料」：「試料」という用語は、得られ、提供され、かつ／または分析に供される体積または質量を指す。一部の実施形態では、試料は、組織試料、細胞試料、体液試料などであり、またはこれらを含む。一部の実施形態では、試料は対象（例えば、ヒトまたは動物の対象）から採取する。一部の実施形態では、組織試料は、脳、毛髪（毛根を含む）、頬側スワブ、血液、唾液、精液、筋肉、またはあらゆる内部臓器から、またはがん、前がん性の、もしくはこれらのいずれか１つに関連する腫瘍細胞であり、またはこれらを含む。体液は、それだけには限定されないが、尿、血液、腹水、胸膜液、脊髄液などであってよい。身体組織には、それだけには限定されないが、脳、皮膚、筋肉、子宮内膜、子宮、および頚部組織またはがん、前がん、またはこれらのいずれか１つに関連する腫瘍細胞を含むことができる。一実施形態では、身体組織は、脳組織、または脳の腫瘍、またはがんである。当業者であれば、一部の実施形態では、「試料」は、源（例えば、対象）から得られるという点で「一次試料」であることを理解されよう；一部の実施形態では、「試料」は、例えば、ある特定の潜在的に汚染性の構成成分を除去するための、および／または対象のある特定の構成成分を単離もしくは精製するための一次試料の処理の結果である。
【００２２】
「実質的に」：本明細書で使用する「実質的に」という用語、および文法上の同等物は、対象の特徴または特性の全体またはほぼ全体の程度または度合いを表す定性的な状態を指す。当業者であれば、生物学的および化学的な現象は、あるとしても、完結に向うことは稀であり、かつ／または完結に向かって、または絶対的な結果を実現もしくは回避するまで進行することを理解されよう。
【００２３】
「対象」：本明細書で使用する「対象」という用語は、ヒト、ならびに哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ネコ、イヌ、およびウマ）を含む。多くの実施形態では、対象は哺乳動物であり、特に霊長動物であり、とりわけヒトである。一部の実施形態では、対象は、ウシ、ヒツジ、ヤギ、雌牛（cow）、ブタなどの家畜類であり、ニワトリ、アヒ
ル、ガチョウ、シチメンチョウなどの家禽であり、イヌおよびネコなどの家畜動物、特にペットである。一部の実施形態では（例えば、特に研究の状況において）、対象の動物は、例えば、齧歯動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター）、ウサギ、霊長動物、またはブタ、例えば近交系などのブタである。
【００２４】
少なくとも以下の図からなる図面は、説明の目的にすぎず、限定を目的とするものではない。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、本発明によるＳＥ（Ｒ）ＲＳ粒子の模式図、および代表的なＳＥ（Ｒ）ＲＳ粒子の走査型電子顕微鏡写真（ＴＥＭ）を示す図である。ＳＥ（Ｒ）ＲＳ粒子の中心は、（共鳴）ラマン活性分子（レポーター）の層でコーティングされている金ナノスターのコアである。星形状により局在化表面プラズモン共鳴（ＬＳＰＲ）の近赤外線ウインドウに向かった同調が可能になり、（共鳴）ラマンレポーター上に焦点を合わせた増大性に集中する電場のいくつかの「ホットスポット」（チップ）を組み入れることが可能になる。このコアをカプセル化するシリカのシェルは、同時に、（共鳴）ラマンレポーターを保護し、コアおよびレポーターが環境と反応するのを防ぎ、さらなる機能化のための表面を提供する。この場合、ＭＲ−活性層がシリカの外側表面に結合している。
【００２６】
【図２】図２は、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ粒子の、現在ラマンの黄金律と考えられているKircherら（２０１２年）Nat  Med、１８巻（５号）、８２９〜８３４頁（付属Ａ）において図示されている粒子に対するＳＥ（Ｒ）ＲＳ粒子のラマンスペクトル強度の直接的な比較を図示する図である。棒グラフで示す通り、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ粒子は、以前に図示された粒子よりも４７倍強力である。
【００２７】
【図３】図３は、典型的なナノ粒子トラッキング分析（ＮＴＡ）スキャンの出力を表す図である。ＮＴＡは、個々の粒子から散乱された光線に固定し、溶液中の粒子の通り道を追跡することにより粒子の濃度およびサイズ分布の正確な定量を可能にする。濃度は、規定された体積中の粒子の数を単に計数することにより決定し、サイズは、アインシュタイン−ストークス等式を使用してブラウン運動から算出する。ＴＥＭによって提供される完全な形態学的情報と組み合わせると、ＮＴＡによりＳＥ（Ｒ）ＲＳ粒子の徹底的な特徴付けが可能になる。
【００２８】
【図４】図４は、側腹部に埋め込まれた脱分化された脂肪肉腫を有するマウスの一連の画像を示す図である。ラマンシグナルが腫瘍の輪郭を描き、白色光線上に見られる腫瘍の辺縁を超えて目に見えるラマンシグナルも存在することに留意されたい（矢印）。
【００２９】
【図５】図５は、外科医が肉眼を使用して（ラマンシグナルに対してブラインドで）バルク腫瘍を切除した後の、図４に示したのと同じマウスの一連の画像を示す図である。切除した腫瘍の周囲の切除ベッドにラマンシグナルの残余の縁が存在することに留意されたい。組織学的評価により、ラマンシグナルの位置に腫瘍が確認された。矢印は、貪食したＳＥ（Ｒ）ＲＳ粒子を有する腫瘍関連マクロファージを示す。
【００３０】
【図６】図６Ａは、脂肪肉腫を有する異なるマウスの画像を示す図であり、外科医がバルク腫瘍を切除した後、多数の小型病巣のラマンシグナル（１、２、３、４、および５）が切除ベッドに見出された。図６は、検出された顕微鏡的な転移を示す図である。脱分化したヒト脂肪肉腫異種移植片を保有するマウスに、ＭＰＲ−ナノスターを静脈注射した（尾静脈；１５０μｌ；３ｎＭ）。手術中のラマン画像（２４時間後）を、バルク腫瘍の辺縁に１ｃｍ隣接して撮影した。これにより、複数の微小転移巣が正確に検出される。
【００３１】
【図７】図７は、図６において肉腫を有すると示されたのと同じマウスの画像を示し、外科医が白色光線のガイダンスのみを使用して（ラマンシグナルに対してブラインドで）バルク腫瘍を切除した後、多数の小型病巣のラマンシグナルが切除ベッドに見られる図である。組織学的検査が実証する通り、これらの病巣のラマンシグナルは腫瘍関連マクロファージを表す。
【００３２】
【図８】図８は、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ粒子は、様々な異なる腫瘍を検出することができることを実証する図である。例示の画像は、Ｉｎｋ４Ａ−／−マウスモデルにおける２つの自然発生的な肉腫、ｒｃａｓ／ｔｖ−ａモデルにおける脳腫瘍、およびＰｙＭＴモデルにおける乳がんを示す。各腫瘍において、ラマンシグナルによる腫瘍の優れた描写が存在した。
【００３３】
【図９】図９は、神経膠芽腫（ｒｃａｓ／ｔｖ−ａモデル）を概略するＳＥ（Ｒ）ＲＳ粒子の能力を実証する図である。ラマンシグナルの、腫瘍細胞の存在との高度の相関に留意されたい（ＨＡ−タグ、オリゴ−２陽性染色）。ＲＧＤ−ＭＰＲ−ナノスターを尾静脈から静脈注射した（１５０μｌ、３ｎＭ）。２４時間後、マウスを屠殺し、ＰＢＳを心臓内注射することにより灌流し、脳をパラフィンに包埋し、組織学的に処理し、Ｒｅｎｉｓｈａｗラマン顕微鏡で画像化した。隣接する切片を免疫組織化学用に染色した。画像はｎ＝５マウスを代表するものである。ラマンシグナルを神経膠芽腫細胞のための免疫組織学的染色と比べると（α（＝抗）−ＨＡ−タグおよびＯｌｉｇｏ−２）、高度の適合が認められる。主な腫瘍の外の小型のラマン陽性焦点に留意されたい（ｅＮＯＳ＝内皮細胞、ＳＭＡ＝平滑筋細胞、ＩＢＡ＝ミクログリア、ＧＦＡＰ＝アストロサイト、ＮｅｕＮ＝ニューロン）。
【００３４】
【図１０】図１０は、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ粒子が単一の脳腫瘍細胞（主な腫瘍から離れた微小転移巣）を描写する能力を実証する図である。ラマン画像中の挿入は、単一のラマン陽性ボクセルの拡大を示す。ラマンスペクトルは、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ粒子の存在を証明するものである。組織学により、このシグナルが脳腫瘍細胞のシグナルに相関することが証明される。単一のラマン陽性ピクセル（左上画像中赤色、白色四角内拡大）の、ＲＣＡＳ／ｔｖ−ａ神経膠芽腫モデルにおける免疫組織化学との相関。図９におけるものと同じスライドを高倍率で試験した。表すラマンスペクトルにより、ラマン陽性ピクセルが本当にナノ粒子を表すことが確認される。ＨＡ−タグ陽性染色により、ＭＰＲ−ナノスターは神経膠芽腫細胞の存在と共存することが確認される。腫瘍細胞に隣接して、ミクログリア細胞（ＩＢＡ−１陽性）および微小血管（ｅＮＯＳ、ＳＭＡ陽性）が位置し、ＭＰＲ−ナノスターがこの位置にどのようにして輸送され得たかが説明される。主な腫瘍の外側に位置する腫瘍細胞の個々の、または小型のクラスタは、マウスモデルおよびヒト神経膠芽腫においてしばしば見られる。
【００３５】
【図１１】図１１は、ＭＰＲ−ナノスターを使用して、ミリメートル未満のサイズの形成異常の（前悪性の）ポリープおよび腺癌の検出を図示する一連の画像を示す図である。図示する実験は、ＡＰＣｍｉｎマウスで行ったが、このマウスは、同時に発生する、多くの形成異常のポリープおよび腺癌を引き起こす遺伝障害である、ヒト「大腸腺腫症」症候群を擬することが知られているマウスモデルである。ラマン画像化法により、多くの小型の病巣（サイズ１ｍｍ未満）のＳＥＲＲＳ−ナノスターはＡＰＣｍｉｎマウスの結腸および小腸（ナノ粒子注射２４時間後に切除したもの）内に取り込まれることが明らかとなることに留意されたい。次いで、これらの病巣を組織学で処理し（図１２を参照されたい）、これにより病巣が形成異常のポリープまたは腺癌を表すことが確認された。
【００３６】
【図１２】図１２は、ミリメートル未満のサイズの形成異常の（前悪性の）ポリープおよび腺癌を検出するためのＭＰＲ−ナノスターを使用した組織学的確認を図示する一連の画像を示す図である。表す画像は、図１１におけるマウスからの結腸の２つの切片を示す。ラマン陽性領域によって２つの組織学的横断面を得、ヘマトキシリン−エオジン（Ｈ＆Ｅ）および抗カテニンＩＨＣで染色した。切片１は、病変が腺癌を表し、切片２は形成異常のポリープを表すことを確認するものであり、それにより本明細書に記載するＭＰＲ−ナノスターが非常に小型の結腸がんだけでなく、最終的に侵襲性の腺癌に発達する形成異常のポリープである、これらの前悪性形態も検出することができることも確認される。数ある中で、これらのデータにより、本明細書に記載する通り、ＭＰＲ−ナノスターを初期の結腸がんを検出するための新方法として使用することができることが確認される。
【００３７】
【図１３】図１３は、前立腺がんを検出するためのＭＰＲ−ナノスターナノ粒子を使用することを図示する一連の画像を示す図である。描写する実験は、最新式の、遺伝的に自然発生的な（Ｈｉ−Ｍｙｃ）前立腺がんマウスモデルで行った。マウスは、マウスの前立腺にヒトｃ−Ｍｙｃを発現する。上列の画像は、ＭＰＲ−ナノスターを注射した対照動物（同じマウス系統であるがＭｙｃ変異がないもの）を示す。この正常の前立腺にラマンシグナルは見られない。画像の下列は、同量のＭＰＲ−ナノスターを注射した腫瘍（写真）により、前立腺の明らかな奇形を有する、前立腺がんを保有するマウス（ｈｉ−Ｍｙｃ）からの画像を示す。ラマン画像は、腫瘍領域内のＭＰＲ−ナノスターの堆積を示す。
【００３８】
【図１４】図１４は、前立腺がんのトランスジェニックマウスモデル（Ｈｉ−Ｍｙｃ）において、切除ベッドにおける顕微鏡的な残余の腫瘍を検出するためのＭＰＲ−ナノスターを使用して説明する一連の画像を示す図である。腫瘍を保有するＨｉ−Ｍｙｃマウスに前立腺切除術を行い、引き続き切除ベッドをラマン画像化法でスキャニングした。免疫組織学的相関により、小型病巣のラマンシグナルは、別の方法で可視化できず、「逃して」いた、残余の顕微鏡的な前立腺がんに対応することが示される。組織学的腫瘍マーカーと、ナノ粒子の存在との間の優れた相関に留意されたい（「ラマンナノ粒子染色」＝ＰＥＧ化されたシリカナノ粒子表面に対する抗体）。
【００３９】
【図１５】図１５は、最新式の遺伝的ＭＭＴＶ−ＰｙＭＴ乳がんマウスモデルにおいて乳がんを検出するためのＭＰＲ−ナノスターの使用の一連の画像を示す図である。この遺伝子変異を有するマウスは、異なる乳腺に複数の乳がんを自然発生的に発症し、ヒト乳がんの病理を密接に擬する。ＭＰＲ−ナノスターからのラマンシグナルは、小型のミリメートル未満の腫瘍の拡大を含めて、同じマウスにおける複数の３〜６ｍｍサイズの乳がんの程度を正確に描写することに留意されたい。上列は、ＭＭＴＶ−ＰｙＭＴマウスの上部および中央の乳腺に沿って発生した乳がんの画像を示す。下列は、ＭＭＴＶ−ＰｙＭＴマウスの下部の乳腺内に発生した乳がんを示す。
【００４０】
【図１６】図１６は、顕微鏡的な腫瘍の皮膚中への浸潤を検出するためのＭＰＲ−ナノスターの使用の一連の画像を示す図である。この実験は、同所性の４Ｔ１乳がんマウスモデルで行った。４Ｔ１乳がん細胞系統をトランスフェクトしてｍＣｈｅｒｒｙ蛍光を発現させた。左の写真は、重なっていた皮膚を剥離して除いた後のバルク腫瘍を示す。腫瘍に重なっていた皮膚内に、微小領域の肥厚が観察され、中心領域は変色していた（点線の白色ボックスにおける矢印）。次いで、本発明者らは、この領域のラマン画像化法を行い（中央の画像）、この画像はラマンシグナルが領域の輪郭を描くことを示す。ラマンシグナルは、皮膚から放射されるｍＣｈｅｒｒｙ蛍光（右側の画像）と緊密に適合し、この位置における乳がん細胞の存在が証明される。
【００４１】
【図１７】図１７は、実施例に記載する手持ち式のラマン検出法の原理を説明する図である。
【００４２】
【図１８】図１８は、コア−サテライト配置を有する代表的なＳＥ（Ｒ）ＲＳ粒子の集団のＴＥＭを示す図である。
【００４３】
【図１９】図１９は、本開示に記載する代表的なフラクタルナノスターのＴＥＭを示す図である。
【００４４】
【図２０】図２０は、転移性の乳がんに罹患している異なる３匹のマウスから切除したリンパ節の画像を示す図である。マウスに（尾静脈から）ＳＥ（Ｒ）ＲＳ粒子を注射し、２４時間後にマウスを屠殺し、リンパ節を切除した。「クリーンな」リンパ節は、リンパ節にわたって均一の（共鳴性の）ラマンシグナルを示したが、転移性の乳がん病変を含んでいたリンパ節（組織学により確認した）は陰性のコントラストを示した。
【００４５】
【図２１】図２１は、本開示の一部の実施形態におけるナノスターベースの配置を有する例示の粒子を説明する図である。Ａ）（共鳴性の）薬剤を埋め込んだカプセル材でコーティングした、固体の金の星形状のナノスケールコア、Ｂ）（共鳴性の）薬剤を埋め込んだカプセル材、特定の厚さの金のシェル、およびカプセル材の外側シェルによって取り囲まれた、固体の金の星形状のナノスケールコア、Ｃ）カプセル材で集合的にコーティングされている（共鳴性の）薬剤を埋め込んだカプセル材を含んでいる金の星形状、Ｄ）カプセル材（共鳴剤あり、またはなしいずれかの）、球形の金シェル、およびカプセル材の外側シェルによって取り囲まれた、（共鳴性の）薬剤を埋め込んだカプセル材を含んでいる金の星形状のシェル。
【００４６】
【図２２】図２２は、本開示の一部の実施形態における、ナノレンズベースの配置を有する例示の粒子を説明する図である。Ａ）およそ５ｎｍの（共鳴性の）薬剤を埋め込んだカプセル材によって分離されている、少なくとも１層の小型サイズの球により取り囲まれている、固体の金の球の内側コア、Ｂ）およそ５ｎｍの（共鳴性の）薬剤を埋め込んだカプセル材によって分離されている、少なくとも１層の小型サイズの球により取り囲まれている金の球状のナノシェルの内側コア、Ｃ）カプセル材に埋め込まれている固体粒子からなる外側シェルを有する、およそ１０ｎｍの（共鳴性の）薬剤を埋め込んだカプセル材によって分離されている小型サイズのナノシェルによって取り囲まれている、金の球状のナノシェルの内側コア、Ｄ）カプセル材を含んでいる（共鳴性の）薬剤に埋め込まれている、金の楕円形状の粒子。
【００４７】
【図２３】図２３は、本開示による例示の粒子を説明する図である。Ａ）およそ１０ｎｍの（共鳴性の）薬剤を埋め込んだカプセル材によって分離されている、少なくとも１層の小型サイズの球によって取り囲まれている、固体の金の星形状の内側コア（およびその変形）、Ｂ）（共鳴性の）薬剤を含んでいるカプセル材に埋め込まれている等しいサイズの固体金粒子により取り囲まれている、固体の金のナノスケールコアからなるナノロゼット、Ｃ）およそ１０ｎｍの（共鳴性の）薬剤を埋め込んだカプセル材によって分離されている、少なくとも１層の小型サイズの球および１層の大型の金のナノスフェアにより取り囲まれている、金の球状の内側コア、Ｄ）カプセル材および金または任意の他の貴金属を含んでいる複数の（少なくとも２つの）交互のシェルの（共鳴性の）薬剤によって取り囲まれている固体の金のナノスケールコアを有するナノマトリョーシカ。
【００４８】
【図２４】図２４は、本発明の一部の実施形態における逆転したナノスター配置を有する例示の粒子を説明する図である。Ａ）（共鳴性の）薬剤が埋め込まれたカプセル材コアを有する逆転したナノスター、Ｂ）（共鳴性の）薬剤を含むカプセル材に埋め込まれた固体の球状の金のコアを有する逆転したナノスター、Ｃ）（共鳴性の）薬剤を含むカプセル材に埋め込まれた固体の星形状の金のコアを有する逆転したナノスター、Ｄ）（共鳴性の）薬剤を含むカプセル材に埋め込まれたフラクタルのナノスター。
【００４９】
【図２５】図２５は、表面プライミングありまたはなしの粒子表面上の会合性のドーパント実体に対する方法論を説明する図である。上の図では、表面プライマー（例えば、３−メルカプトトリメトキシシラン、ＰＥＧ−チオールなど）がキャッピング剤を置き換え、この方法で粒子の安定化がもたらされるが、表面がガラス親和性（vitreophilic）となるのがより重要である（カプセル材がその上に成長するためのプライマーとして作用する）。表面プライマーは、キャッピング剤よりも表面に対する親和性が大きいので、表面と直接相互作用するドーパント実体の性向（例えば、（共鳴性の）ラマン剤）が低下する。下の図では、表面プライマーの代わりにキャッピング剤を使用する方法を図示する。キャッピング剤は表面と強力ではなく相互作用するため、表面と相互作用するドーパント実体（例えば、（共鳴性の）ラマン剤）の性向は増大する。したがって、粒子により産生されるＳＥ（Ｒ）ＲＳシグナルの全体の強度が、粒子表面近くの（共鳴性の）ラマンレポーター分子の数に依存するため、シグナルは著しく増強される。
【００５０】
【図２６】図２６は、本明細書に記載する方法の例を２つ説明する図である。１つはシリカベースの表面プライマーを使用し（左）、他方はキャッピング剤としてシトレートまたはアスコルベートを使用する。部分的に加水分解されたＴＥＯＳが、シリカカプセル材の例示の前駆体として使用される。
【００５１】
【図２７】図２７は、ＭＲＩ、光音響、およびラマンの、３つの画像化モダリティに対するＭＰＲ−ナノスターの検出閾値チャートを表す図である。指摘する濃度のＭＰＲ−ナノスターを、ウエルプレート中１％アガロースに包埋し、画像化した。依然として検出することができる、最小濃度のＭＰＲ−ナノスターを含むウエルを白色点線ボックスで示し（右側の光音響およびラマンのデータの改善された可視性に対して調整したウインドウ／レベルの設定）、それぞれの画像化モダリティに対する検出閾値を表す（ＭＲＩに対して０．９ｎＭ、光音響に対して６００ｆＭ、ラマン画像化法に対して１．６ｆＭ）。
【００５２】
【図２８】図２８は、ＭＰＲ−ナノスターと確立された画像化モダリティとの間の検出感度を比較するチャートを表す図であり、ＭＰＲ−ナノスターに対する値は図２１のデータに由来し、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）、蛍光、ＭＲＩ、およびＣＴに対する値はDebbage  P、Jaschke  W.、Molecular  imaging  with  nanoparticles:  giant  roles  for  dwarf  actors.、Histochemistry  and  cell  biology.、２００８年１３０巻（５号）、８４５〜７５頁、電子出版２００８年１０月１日、doi:  10.1007/s00418-008-0511-y.  PubMed  PMID:  18825403;  Lusic  H、  Grinstaff  MW.、X-ray-Computed  Tomography  Contrast  Agents.、Chemical  reviews.、２０１２年、電子出版２０１２年１２月６日、doi:  10.1021/cr200358s.  PubMed  PMID:  23210836;およびMassoud  TF、Gambhir  SS.、Molecular  imaging  in  living  subjects:  seeing  fundamental  biological  processes  in  a  new  light.、Genes  &  development.、２００３年、１７巻（５号）、５４５〜８０頁、電子出版２００３年３月１２日、doi:  10.1101/gad.1047403.  PubMed  PMID:  12629038に由来したものである。ＭＰＲ−ラマンおよびＭＰＲ−ＰＡＴはそれぞれ、およそ６桁および４桁、蛍光画像化より感度が高い。ＭＰＲ−ＭＲＩは（ＭＰＲコアにおけるフェルモキシトールのクラスタ形成により）、臨床的に認可された小分子Ｇｄ造影剤を使用した従来のＭＲＩより、およそ４桁感度が強い（ＭＰＲ−ナノスター−ＭＲＩは蛍光の感度に接近する）。
【００５３】
【図２９】図２９は、異なる画像化モダリティの特定の長所および短所を説明する図である。ＭＰＲ−ナノスターに組み込まれる３つの画像化モダリティの長所（上３列）は、相互に極めて相補的である。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
特定の実施形態の詳細な説明
本開示の実施形態は、粒子、粒子を作成する方法、粒子を使用する方法などを提供する。
【００５５】
本発明の様々な実施形態は、表面増強（共鳴性）ラマン散乱（ＳＥ（Ｒ）ＲＳ）を使用する。（共鳴性）ラマンシグナルの増強は、（共鳴性）ラマン散乱（（Ｒ）ＲＳ）および表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）の、少なくとも２つの現象の増大効果の結果である。
【００５６】
いかなる特定の理論に拘泥しようとするものではないが、一部の実施形態に記載する粒子は、以下、Ａ）電磁的増強、Ｂ）化学的増強、Ｃ）色素共鳴（例えば、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ活性剤は励起レーザー波長と共鳴する）の１つまたは複数のパラメータに起因する、いかなる報告されたものよりも、著しく改善されたラマンシグナルを表す。一部の実施形態では、このような粒子は、ｉｎ  ｖｉｖｏの画像化の適用に特に有用である。
【００５７】
粒子
本開示にしたがって使用する粒子は、理論上、あらゆる形状またはデザインであってよい。一部の実施形態では、粒子は球であってもよく、または球を含むことができる。さらに、またはあるいは、粒子は、星、桿状、立方体、長方形、円錐、角錐、円柱、管、環、四面体、六角形、八角形、かご、またはあらゆる不規則な形状であってもよく、またはこれらを含むことができる。
【００５８】
一部の実施形態では、粒子の最大寸法または少なくとも１つの寸法は、約１０μｍ、５μｍ、１μｍ、８００ｎｍ、５００ｎｍ、４００ｎｍ、３００ｎｍ、２００ｎｍ、１８０ｎｍ、１５０ｎｍ、１２０ｎｍ、１１０ｎｍ、１００ｎｍ、９０ｎｍ、８０ｎｍ、７０ｎｍ、６０ｎｍ、５０ｎｍ、４０ｎｍ、３０ｎｍ、２０ｎｍ、１０ｎｍ、５ｎｍ、２ｎｍ、もしくはさらに１ｎｍまたはそれ未満であってもよい。一部の実施形態では、粒子の最大寸法または少なくとも１つの寸法は、１０μｍ、５μｍ、１μｍ、８００ｎｍ、５００ｎｍ、４００ｎｍ、３００ｎｍ、２００ｎｍ、１８０ｎｍ、１５０ｎｍ、１２０ｎｍ、１１０ｎｍ、１００ｎｍ、９０ｎｍ、８０ｎｍ、７０ｎｍ、６０ｎｍ、５０ｎｍ、４０ｎｍ、３０ｎｍ、２０ｎｍ、１０ｎｍ、５ｎｍ、２ｎｍ、またはさらに１ｎｍ超であってもよい。一部の実施形態では、粒子の最大寸法または少なくとも１つの寸法は、約１μｍから約５ｎｍの範囲であってもよい。一部の実施形態では、粒子の最大寸法または少なくとも１つの寸法は、約３００ｎｍから約５ｎｍの範囲であってもよい。一部の実施形態では、粒子の最大寸法または少なくとも１つの寸法は、上記の任意の２つの値の範囲であってもよい。一部の実施形態では、粒子の寸法は直径であり、直径は上記に言及した範囲であってよい。一部の実施形態では、粒子の寸法は、Ｘ、Ｙ、およびＺ軸において長さ、幅、または高さによって表されてよく、各寸法は上記に言及した範囲であってよい。
【００５９】
ある特定の実施形態では、粒子サイズおよび表面の電荷は、腫瘍の漏出性の脈管構造のため、腫瘍に入るように同調され、大部分腫瘍（関連）細胞による貪食作用によって保持される（「血管透過性滞留亢進（enhanced  permeability  and  retention）（ＥＰＲ）」効果として公知である）。ある特定の実施形態では、粒子は腫瘍から洗い流されることがないが、腫瘍内に安定して保持される（例えば、保持時間は少なくとも７日）。
【００６０】
本開示にしたがって使用するのに適する例示の粒子を、図１に図示する。粒子はおよそ球形状であってよい。このような粒子の直径はおよそ５０〜３００ｎｍであってよい。
【００６１】
様々な実施形態では、本明細書に記載する粒子は、ナノスケールコア、カプセル材、および１つまたは複数のドーパント実体を含むことができる。図１（左）を参照すると、ある特定の実施形態では、ナノスケールコアは金ナノスターであり、カプセル材はシリカであり、ドーパント実体は（共鳴性の）ラマンレポーターであり、さらに薬剤はＭＲＩ剤である。このような粒子は、表面増強共鳴ラマン散乱（ＳＥ（Ｒ）ＲＳ）ならびにＭＲ性能の両方、および／またはポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）、単一光子放射型断層撮影（ＳＰＥＣＴ）、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、または超音波（ＵＳ）性能を使用することができる。
【００６２】
ナノスケールコア
本発明の一部の実施形態で使用される粒子のナノスケールコアは、任意の金属、または局在化表面プラズモン共鳴（ＬＳＰＲ）を産生することができる任意の他の材料であってよく、またはこれらを含むことができる。
【００６３】
多くの実施形態では、金属はＳＥ（Ｒ）ＲＳ活性金属である。このような金属は、（局在化）表面プラズモン共鳴を維持することができる任意の（金属）物質であってよい。一部の実施形態では、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ活性金属は、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ｎａ、Ｋ、Ｃｒ、Ａｌ、またはＬｉであり、またはこれらを含む。ナノスケールコアは、金属の合金も含むことができる。一部の実施形態では、ナノスケールコアは、Ａｕ、Ａｇ、またはこれらの組合せであり、またはこれらを含む。ある特定の実施形態では、ナノスケールコアは、検出可能な光音響シグナルを提供することができる。
【００６４】
ナノスケールコアは任意の形状またはデザインであってよく、１つまたは複数の構造エレメントを含むことができる。一部の実施形態では、ナノスケールまたは少なくとも１つのその構造エレメントは球状である。一部の実施形態では、ナノスケールコアまたは少なくとも１つのその構造エレメントは非球状である。一部の実施形態では、ナノスケールコアは、球、桿状、星、シェル、楕円、三角形、立方体、かご、角錐、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される構造エレメントを有する。例えば、ナノスケールコアは、少なくとも１つのシェルが重ねられた星からなっていてよく、または星を含むことができる。別の一例をあげると、ナノスケールコアは、２つ以上の同心性のシェルからなっていてよく、または同心性のシェルを含むことができる。一部の特定の実施形態では、ナノスケールコアは、衛星構造によって取り囲まれた中心構造からなっていてよく、または中心構造を含むことができる。様々な配置の例示の粒子を図１５〜１８に図示する。
【００６５】
一部の実施形態では、ナノスケールコアは、プラズモンハイブリダイゼーション効果に適する距離内で相互に分離されている少なくとも２つの構造エレメントを含む。距離は平均距離であってよい。ある特定の実施形態では、２つの分離されている構造エレメント間の距離は、１００ｎｍ、５０ｎｍ、３０ｎｍ、２０ｎｍ、１５ｎｍ、１０ｎｍ、８ｎｍ、５ｎｍ、または３ｎｍ、または１ｎｍ未満である。ある特定の実施形態では、２つの分離されている構造エレメント間の距離は、約１００ｎｍから約５０ｎｍ、約５０ｎｍから約３０ｎｍ、約３０ｎｍから約１ｎｍ、または上記の任意の２つの値の範囲にある。ある特定の実施形態では、個々の構造エレメントは相互に分離されており、またはカプセル材によって充填されている。
【００６６】
一部の実施形態では、ナノスケールコアは星形状である。本明細書で使用する「星形状」という用語は、そこから複数の突起が伸長する本体ポーションを指す。一部の実施形態では、星形状は真の星形状である。「真の星形状」は、その用語が本明細書で使用される通り、そこから複数の突起が放射状に伸長する本体ポーションを含む。一部の実施形態では、真の星形状には少なくとも１つの対称のアクセスがある。一部の実施形態では、真の星形状は実質的に対称的である。一部の実施形態では、真の星形状の突起はおよそ同じ長さである。一部の実施形態では、突起はおよそ同じ幅である。一部の実施形態では、突起は実質的に同一の構造を有する。一部の実施形態では、真の星形状は、実質的に球状である本体ポーションを有する。一部の実施形態では、真の星形状は、実質的に三角形または四角である本体ポーションを有する。一部の実施形態では、突起は、本体表面を実質的に覆っている。一部の実施形態では、突起は、例えば、強力な局在化表面プラズモンが生じ得るように、高分極性に対して本体表面上に配置される。粒子が放射状に突出するスパイクを含んでいる場合、協調電子発振が狭窄領域（すなわち、チップ）中に囲われるようになり、その結果非常に小さな領域に多くの電荷が蓄積することが企図される。したがって、ある数のスパイクにより、いかなるものも含まない幾何学的形状にわたる電磁気の増強がもたらされる。一方、過剰のスパイクまたは非対称の外観を有するナノスケールコアの分極率は小さく、これらは電子−電子の衝突における著しい増大から強力な減衰に遭遇するため大量の表面プラズモン共鳴を維持することができず、電子の協調発振が弱まり、短命になる。図１は、星形状のナノスケールコアの一例を図示するものである。
【００６７】
一部の実施形態では、ナノスケールコアまたはその各構成成分の最大寸法または少なくとも１つの寸法は、約５００ｎｍ、４００ｎｍ、３００ｎｍ、２００ｎｍ、１００ｎｍ、９０ｎｍ、８０ｎｍ、７０ｎｍ、６０ｎｍ、５０ｎｍ、４０ｎｍ、３０ｎｍ、２０ｎｍ、１５ｎｍ、１０ｎｍ、５ｎｍ、もしくは１ｎｍまたはそれ未満であってよい。一部の実施形態では、ナノスケールコアまたはその各構成成分の最大寸法または少なくとも１つの寸法は、５００ｎｍ、４００ｎｍ、３００ｎｍ、２００ｎｍ、１００ｎｍ、９０ｎｍ、８０ｎｍ、７０ｎｍ、６０ｎｍ、５０ｎｍ、４０ｎｍ、３０ｎｍ、２０ｎｍ、１５ｎｍ、１０ｎｍ、５ｎｍ、または１ｎｍ超であってよい。一部の実施形態では、ナノスケールコアまたはその各構成成分の最大寸法または少なくとも１つの寸法は、約５００ｎｍから約５ｎｍ、または約１５０ｎｍから約５ｎｍの範囲であってよい。一部の実施形態では、ナノスケールコアまたはその各構成成分の最大寸法または少なくとも１つの寸法は、約１００ｎｍから約９０ｎｍ、約９０ｎｍから約８０ｎｍ、約８０ｎｍから約７０ｎｍ、約７０ｎｍから約６０ｎｍ、約６０ｎｍから約５０ｎｍ、約５０ｎｍから約４０ｎｍ、約４０ｎｍから約３０ｎｍ、約３０ｎｍから約２０ｎｍ、約２０ｎｍから約１０ｎｍ、約１０ｎｍから約５ｎｍの範囲であってよい。一部の実施形態では、ナノスケールコアまたはその各構成成分の最大寸法または少なくとも１つの寸法は、上記の任意の２つの値の範囲であってよい。
【００６８】
所望のサイズを有するナノスケールコアは、当技術分野では周知のいくつかの技術によって、金属コロイドとして成長させることができる。例えば、任意の数の還元剤を用いた溶液中の金属イオンの化学的または光化学的な還元が記載されている。同様に、ナノスケールコアの合成は、小胞内など、制約された体積中で行うことができる。ナノスケールコアは、溶液中の放電によっても作成することができる。ナノスケールコアは、高強度のパルスレーザーで金属を照射することによっても作成することができる。実施例１は、ある特定の実施形態では、金属のナノスケールコアは、クエン酸またはアスコルビン酸、および過酸化水素での還元によって作成することができることを実証するものである。
【００６９】
カプセル材
本発明により提供される粒子はカプセル材を含むことができる。一部の実施形態では、カプセル材は粒子の表面を実質的に覆っている。
【００７０】
本開示の様々な実施形態によると、カプセル材は、シリカ（ＳｉＯ２）、チタニア（ＴｉＯ２）、アルミナ（Ａｌ２Ｏ３）、ジルコニア（ＺｒＯ２）、二酸化ゲルマニウム（ＧｅＯ２）などを含めた酸化物、ならびに純金属または金属ホウ化物、炭化物、および窒化物、例えば、チタニウムおよびその組合せ（Ｔｉ、ＴｉＢ２、ＴｉＣ、ＴｉＮなど）を含めた非酸化物であってよく、またはこれらを含むことができる。さらに、またはあるいは、金属（例えば、金、銀など）は、コア材料、ＰＥＧおよびＰＬＧＡ／ＰＥＧを含むポリマー、ならびにポリマー性のキレート剤（例えば、ポリＤＯＴＡ、デンドリマーバックボーン、ポリＤＴＰＡ、またはデンドリマー単独）、（多層の）カーボンナノチューブ、グラフェン、シリセンとは異なる。
【００７１】
一部の実施形態におけるカプセル材は誘電体であり、または誘電体を含む。例えば、シリカなどのカプセル材は誘電体として働くことができる。
【００７２】
一部の実施形態では、カプセル材はシリカであり、またはシリカを含む。例えば、シリカのカプセル材は、それだけには限定されないが、ケイ酸ナトリウム、アルキルアルコキシシラン、エチルポリシリケート、テトラエチルオルトシリケート（ＴＥＯＳ）、テトラメチルオルトシリケート（ＴＭＯＳ）、部分的に加水分解されたＴＥＯＳ、部分的に加水分解されたＴＭＯＳ、またはこれらの組合せを含めたシリカ前駆体から合成することができる。
【００７３】
一部の実施形態では、カプセル材は、それだけには限定されないが、ポリエステル（例えば、ポリ乳酸、乳酸グリコール酸共重合体、ポリカプロラクトン、ポリバレロラクトン、ポリ（１，３−ジオキサン−２−オン））、ポリ無水物（例えば、ポリ（セバシン酸無水物））、ポリエーテル（例えば、ポリエチレングリコール）、ポリウレタン；ポリメタクリレート、ポリアクリレート、ポリシアノアクリレート、ＰＥＧとポリ（エチレンオキシド）との共重合体（ＰＥＯ）を含めた、１つまたは複数のポリマー、特に米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって２１  Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１７７．２６００の下に、ヒトにおける使用に認可されているポリマーであり、またはこれらを含む。
【００７４】
一部の実施形態では、カプセル材は、少なくとも１つの分解性ポリマーであり、または少なくとも１つの分解性ポリマーを含む。このような分解性ポリマーは、加水分解分解性、生分解性、熱分解性、酵素分解性、および／または光分解性の高分子電解質であってよい。一部の実施形態では、分解により、本明細書に記載する粒子と会合している１つまたは複数のドーパント実体（例えば、送達用薬剤）を放出することができるようになり得る。
【００７５】
当技術分野において公知である分解性ポリマーには、例えば、ある特定のポリエステル、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリホスファゼン、ポリホスホエステル、ある特定のポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフマレート、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリ（アミノ酸）、ポリアセタール、ポリエーテル、生分解性ポリシアノアクリレート、生分解性ポリウレタン、および多糖が含まれる。例えば、使用することができる特定の生分解性ポリマーには、それだけには限定されないが、ポリリジン、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）、乳酸グリコール酸共重合体（poly(lactide-co-glycolide)）（ＰＬＧ）、乳酸カプロラクトン共重合体（poly(lactide-co-caprolactone)）（ＰＬＣ）、およびグリコール酸カプロラクトン共重
合体（poly(glycolide-co-caprolactone)）（ＰＧＣ）が含まれる。別の一例示の分解性
ポリマーはポリ（ベータ−アミノエステル）であり、これは本出願による使用に適し得る。
【００７６】
ナノスケールコア上のカプセル材層は、様々な範囲の平均厚さを有することができる。一部の実施形態では、平均厚さは、約３００ｎｍ、２００ｎｍ、１００ｎｍ、９０ｎｍ、８０ｎｍ、７０ｎｍ、６０ｎｍ、５０ｎｍ、４０ｎｍ、３０ｎｍ、２０ｎｍ、１５ｎｍ、１０ｎｍ、５ｎｍ、１ｎｍ、０．５ｎｍ、もしくは０．１ｎｍまたはそれ未満である。一部の実施形態では、平均厚さは約３００ｎｍ、２００ｎｍ、１００ｎｍ、９０ｎｍ、８０ｎｍ、７０ｎｍ、６０ｎｍ、５０ｎｍ、４０ｎｍ、３０ｎｍ、２０ｎｍ、１５ｎｍ、１０ｎｍ、５ｎｍ、１ｎｍ、０．５ｎｍ、もしくは０．１ｎｍ以上であり、またはそれを超える。一部の実施形態では、平均厚さは約０．１から約２００ｎｍ、約５から約５０ｎｍ、または約１０から約３０ｎｍの範囲である。一部の実施形態では、平均厚さは、上記の任意の２つの値の範囲である。
【００７７】
本開示の多くの実施形態では、カプセル材は、１つまたは複数の官能基を有しても、または有するように修飾されていてもよい。このような官能基（カプセル材層内またはカプセル材層の表面上）を、任意の薬剤（例えば、ＭＲＩ剤、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）トレーサー、単一光子放射型断層撮影（ＳＰＥＣＴ）トレーサー、蛍光色素、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）薬剤、超音波（ＵＳ）薬剤、標的化実体、またはＰＥＧ）と会合させるのに使用することができる。
【００７８】
ドーパント実体
任意の対象の実体を、本発明によるドーパント実体として利用することができる。一部の実施形態では、ドーパント実体は、粒子の１つまたは複数の構成成分が、キャッピング剤の置換を許容し、かつ／または高密度および／もしくは近くの表面のドーパント実体（複数可）の粒子中もしくは粒子上への局在化ローディングを許容するのに十分な親和性を有する。
【００７９】
一部の実施形態では、ドーパント実体は検出可能な実体であり、または検出可能な実体を含む。一部の実施形態では、ドーパント実体は、共鳴色素などの色素であり、または色素を含む。一部の実施形態では、ドーパント実体は、ラマン分光法において有用な薬剤であり、または有用な薬剤を含む。例示のドーパント実体は、それだけには限定されないが、各々その内容が全文において参照によって本明細書に援用される、米国特許第５，３０６，４０３号、第６，００２，４７１号、および第６，１７４，６７７号など、当技術分野において記載されている薬剤を含む。
【００８０】
本開示によると、ドーパント実体は、ナノスケールコア上（例えば、ナノスケールコアの表面と直接接触）、ナノスケールコア内（例えば、ナノスケールコアの構造エレメント間）、キャッピング剤実体上または実体間、カプセル化層上または層内、およびこれらの任意の組合せに位置することができる。一部の実施形態を図２５に図示する。
【００８１】
一部の実施形態では、複数のドーパント実体の少なくともいくつかは、ナノスケールコアの表面から短距離内に位置付けられる。様々な実施形態におけるこのような距離は、約１ｎｍ、２ｎｍ、３ｎｍ、４ｎｍ、５ｎｍ、６ｎｍ、７ｎｍ、８ｎｍ、９ｎｍ、１０ｎｍ、１５ｎｍ、２０ｎｍまたはそれ未満であってよい。一部の実施形態では、ドーパント実体とナノスケールコアの表面との間の距離は、２ｎｍから５ｎｍ、５ｎｍから１０ｎｍ、または１０ｎｍから１５ｎｍの範囲である。一部の実施形態では、複数のドーパント実体の少なくともいくつかは、ナノスケールコアの表面と直接接触していてよい。
【００８２】
一部の特定の実施形態では、ドーパント実体はＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性剤である。一部のこのような実施形態では、ナノスケールコアに接近して位置する高密度のＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性剤は、本明細書に記載する粒子によって実現される前例のないラマン感度に寄与する。ＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性剤は、一般的に、金属表面の近傍のシグナル強度の増強の恩恵を受ける。本開示にしたがって、当業者であれば、コアの材料、コアの配置、カプセル材の材料などの因子を考慮して、化学的増強および／または電磁気の増強を実現するように、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性剤を選ぶことができる。このようなＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性剤は、金属から分子への、または分子から金属への電荷移動効果を有していてもよい。
【００８３】
ＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性剤は、適切に照射した場合、ＳＥＲＳまたはＳＥ（Ｒ）ＲＳスペクトルを産生することができる分子を意味する。ＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性剤の非限定的な例には、フタロシアニン、例えば、メチル、ニトロシル、スルホニル、およびアミノフタロシアニン、ナフタロシアニン、カルコゲンベースの色素、アゾメチン、シアニン、スクアライン、ならびにメチル、ニトロ、スルファノ、およびアミノ誘導体などのキサンチンが含まれる。これらは各々、任意の従来の様式で置換され、多数の有用な標識を生じ得る。ＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性剤の選択は、分子の共鳴周波数、試料中に存在する他の分子の共鳴周波数などの因子によって影響を受け得る。
【００８４】
典型的に、ＳＥ（Ｒ）ＲＳシグナルの検出は、レーザーからの入射光の使用を伴う。選択される正確な周波数はＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性剤および金属表面に（例えば、金属表面の組成に）依存する。可視スペクトルまたは近赤外スペクトルにおける周波数は、全体として、銀および／または金を含めたものなど、貴金属表面に対してより良好な表面増強効果を生じる傾向がある。しかし、紫外線範囲などの他の周波数が使用され得る状況を想定することが可能である。選択、および可能な場合は適切な光源の、適切な周波数および動力との同調は、特に、入手可能なＳＥ（Ｒ）ＲＳの文献を参考にして、当業者の能力内に十分ある。
【００８５】
ラマン増強は、一般的に、金属表面上に会合（例えば、吸着）しているＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性剤の密度に比例する。本開示によるコア表面上に吸着している、驚くほど高密度のＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性剤が、本明細書に開示する粒子の優れた感度に寄与し得る。
【００８６】
キャッピング剤
一部の実施形態では、キャッピング剤は、ナノスケールコアと置換可能に会合していてよい、またはナノスケールコアと置換可能に会合している実体である。いかなる特定の理論によって拘泥しようとするものではないが、一部の実施形態では、キャッピング剤は、ナノスケールコアの合成において重要な役割を果たし得ることが留意される。一部の実施形態では、キャッピング剤は、ナノスケールコアのサイズおよび幾何学を制御し得る。一部の実施形態では、キャッピング剤は、合成されたナノスケールコア上で吸着された単層として合成後に存在する。一部の実施形態では、キャッピング剤はナノスケールコアの表面に強力に吸着される。一部の実施形態では、キャッピング剤は、ナノスケールコアの安定化をもたらし、かつ／またはナノスケールコアの凝集を防ぐ。
【００８７】
例示のキャッピング剤には、シトレート、クエン酸、アスコルビン酸、アスコルベート、パルミトイルアスコルベート、テトラキス（ヒドロキシメチル）ホスホニウムクロリド、アミノ酸、およびこれらの任意の組合せなどの有機薬剤が含まれる。
【００８８】
典型的に、キャッピング剤は、表面プライマーをナノスケールコアの合成後に加えるという点で、表面プライマー（例えば、物質（例えば、ＭＰＴＭＳ、ＡＰＴＭＳ）またはポリマー（例えば、ポリエチレングリコール−（ＰＥＧ）−チオール）と異なる。一部のこのような場合では、キャッピング剤のいくつかまたは全ては、表面プライマーによってナノスケールコアから最終的に取り除かれる。
【００８９】
キャッピング剤が表面プライマーによって置き換えられる伝統的な表面プライミング法とは対照的に、本開示では、コアのカプセル化を可能にするのにキャッピング剤自体を使用する。
【００９０】
さらなる表面プライマーを加える代わりに、カプセル化を可能にする既存のキャッピング剤を使用することにより、ナノスケールコア上のより高度の近接性および密度のＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性剤が実現される。
【００９１】
一部の実施形態では、キャッピング剤はドーパント実体によって置き換えられる。多くの実施形態では、キャッピング実体は、ナノスケールコアの表面と共有結合を形成しない。
【００９２】
薬剤
本明細書に記載する粒子は、投与または送達を意図する薬剤であるドーパント実体と調製することができる。一部の実施形態では、このような薬剤は、粒子を投与した後、粒子と会合したままである。一部の実施形態では、このような薬剤は、放出され、または別の方法で、投与後に粒子から解離される。
【００９３】
任意の多種多様な薬剤を、本発明にしたがって使用することができる。例示の薬剤には、それだけには限定されないが、治療剤および／または画像化剤が含まれ得る。例えば、薬剤は、治療剤（例えば、抗生物質、ＮＳＡＩＤ、血管形成阻害剤、神経保護剤など）、細胞毒性剤、診断剤（例えば、造影剤、放射性核種、および蛍光、発光、磁性モイエティなど）、標的化剤、予防剤（例えば、ワクチン）、ならびに／または栄養補助剤（nutraceutical  agent）（例えば、ビタミン、ミネラルなど）、あるいは生物学的組織に導入するのに適し得る他の物質（薬剤上の賦形剤および化粧用の物質などを含む）であってよく、またはこれらを含むことができる。一部の実施形態では、薬剤は、ＭＲＩ剤、ＰＥＴトレーサー、ＳＰＥＣＴトレーサー、蛍光色素、ＣＴ剤ＵＳ剤、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される。
【００９４】
一部の実施形態では、薬剤は粒子と会合していてもよい。ある特定の実施形態では、薬剤はカプセル材に直接的または間接的に付着している。ある特定の実施形態では、薬剤はカプセル材内に組み入れられる。
【００９５】
ＭＲＩ剤
薬剤はＭＲＩ剤であってよい。一部の実施形態では、カプセル材と会合しているＭＲＩ剤の量または数は、ＭＲＩ剤約１から１０，０００，０００個またはＭＲＩ剤約５０００から５００，０００個であってよい。一般的に、カプセル材表面積が大きいほど、多数のＭＲＩ剤を含む。一部の実施形態では、ＭＲＩ剤の全てまたはポーションが、カプセル材表面上で直接付着していてよい。例えば、ＭＲＩ剤はＧｄ（塩）であってよく、Ｇｄはカプセル材の表面で直接付着していてよく、次に表面にコンジュゲートするＤＯＴＡなどのリンカー化合物によって付着していてなくてもよい。一部の実施形態では、ＭＲＩ剤の全てまたはポーションが、１つまたは複数のリンカーによってカプセル材表面上で間接的に付着している。ある特定の実施形態では、全てのＭＲＩ剤がカプセル材上で直接付着し、または全てがカプセル材上で間接的に付着しているのに加えて、直接付着しているＭＲＩ剤対間接的に付着しているＭＲＩ剤の比率は約１：１０から約１０：１、または約１：１である。ある特定の実施形態では、直接付着しているＭＲＩ剤および間接的に付着しているＭＲＩ剤の数は、あるシグナルを達成するように変動することができる。カプセル材と会合しているＭＲＩ剤の量は、ｐＨ、温度、イオン強度、および／またはＭＲＩ剤／カプセル材の同一性によって制御され得る。したがって、直接および間接的に付着している量は制御することができ、所望の結果を達成するように選択することができる。その内容が全文において参照によって本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１２０１７９０２９号は、数ある中で、プローブ、プローブを使用する方法、プローブを作成する方法、状態（例えば、前がん組織、がん、または腫瘍）を画像化する方法、脳腫瘍の切除を計画する方法、脳腫瘍を画像化する方法などを論じている。
【００９６】
ＭＲＩ剤の一部の実施形態は、Ｇｄ（塩）、酸化鉄、常磁性化学交換飽和移動（paramagnetic  chemical  exchange  saturation  transfer）（ＣＥＳＴ）剤、１９Ｆ活性材料、マンガン、メラニン、またはＴ１もしくはＴ２を短縮もしくは伸長する物質、およびこれらの組合せであってよく、またはこれらを含むことができる。ある特定の実施形態では、ＧｄのＭＲＩ剤は、ＤＯＴＡ−Ｇｄ、ＤＴＰＡ−Ｇｄ、ポリマー性キレーター内のＧｄ、およびカプセル材上に負電荷によって固定化されているＧｄなどの化合物であってよい。ある特定の実施形態では、酸化鉄のＭＲＩ剤は、デキストランまたは他の安定化層ありまたはなしの、小型常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯ）または超小型ＳＰＩＯなどの化合物であってもよい。ある特定の実施形態では、常磁性ＣＥＳＴのＭＲＩ剤は、ランタニド複合体などの化合物であってもよい。
【００９７】
一部の実施形態では、ＭＲＩ剤は、マレイミド連結、ＮＨＳエステル、クリックケミストリー、または別の共有結合性もしくは非共有結合性の取組みなどの連結、またはこれらの組合せによってカプセル材表面に連結されていてもよい。一部の実施形態では、ＭＲＩ剤は、いかなる外来性の薬剤を添加せずに、例えば、カプセル材およびＭＲＩ剤だけで、ローディングされていてもよい。
【００９８】
あるいは、またはＭＲＩ剤に加えて、１つまたは複数の他の薬剤が粒子と会合していてもよい。ＰＥＴ（例えば、１８Ｆ、６４Ｃｕ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、など）、ＳＰＥＣＴ（例えば、９９Ｔｃ、６７Ｇａ、１９２Ｉｒなど）、蛍光色素（例えば、Ａｌｅｘａ６４７、Ａｌｅｘａ４８８など）、放射性核種（例えば、アルファ−放射性の放射性核種（例えば、Ａｔ−２１１、Ｂｉ−２１２、Ｂｉ−２１３、Ｒａ−２２３、およびＡｃ−２２５）、ベータ−放射性の放射性核種（例えば、Ｃｕ−６７、Ｙ−９０、Ａｇ−１１１、Ｉ−１３１、Ｐｍ−１４９、Ｓｍ−１５３、Ｈｏ−１６６、Ｌｕ−１７７、Ｒｅ−１８６、およびＲｅ−１８８））などを含めた例示の診断薬が、粒子と会合していてもよく、適切な検出系を使用して検出されてもよい。ある特定の実施形態では、放射性核種の使用はチェレンコフ放射線によってシグナルを誘発するように使用することができる。
【００９９】
標的化薬剤
薬剤は、生存する宿主における標的に親和性を有する標的化薬剤（例えば、化学薬剤または生物学的薬剤）であってもよく、この薬剤は粒子（例えば、粒子のカプセル材）と会合している。一部の実施形態では、粒子は、疾患、状態、または標的に対応する関連の生物学的事象を、画像化し、検出し、試験し、モニタリングし、評価し、かつ／またはスクリーニングするのに使用することができる。
【０１００】
一部の実施形態では、標的化薬剤は、粒子の、分子（複数可）との相互作用を引き起こすように機能することができる。一部の実施形態では、標的化薬剤は、対象の状態、疾患、または関連の生物学的事象に付随し得る、細胞、組織、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、抗体、抗原などに対する親和性を有し得る。一部の実施形態では、標的化薬剤は、特定の、対象のＤＮＡ、ＲＮＡ、および／またはタンパク質を標的化するように機能することができる。一部の実施形態では、標的化薬剤は、それだけには限定されないが、状態、疾患、もしくは関連の生物学的事象、またはその状態、疾患、もしくは生物学的事象の他の化学的、生物学的、および／または生物学的事象に親和性を有する、ポリペプチド（例えば、それだけには限定されないが、抗体（モノクローナルもしくはポリクローナル）などのタンパク質）、抗原、核酸（モノマーおよびオリゴマーの両方）、多糖、糖、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、リガンド、アプタマー、小分子、リガンド、またはこれらの組合せを含むことができる。一部の実施形態では、標的化薬剤は、配列特異的ＤＮＡオリゴヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）、抗体、および小分子タンパク質受容体を含むことができる。
【０１０１】
他の薬剤
本開示にしたがって、粒子は、投与／埋込み後の送達のための１つまたは複数の薬剤を含むことができる。このような薬剤は、小分子、大（すなわち、巨大）分子、またはこれらの任意の組合せであってよく、またはこれらを含むことができる。さらに、またはあるいは、薬剤は、液体、溶液、ゲル、ヒドロゲル、固体粒子（例えば、微粒子、ナノ粒子）、またはこれらの組合せなどの、様々な形態を含めた製剤であってもよい。
【０１０２】
代表的な、非限定的な実施形態では、薬剤は、アミノ酸、ワクチン、抗ウイルス剤、核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、およびマイクロＲＮＡ剤）、遺伝子送達ベクター、インターロイキン阻害剤、免疫調節剤、神経栄養因子、神経保護剤、抗悪性腫瘍剤、化学療法剤、多糖、抗凝血剤、抗生物質、鎮痛剤、麻酔剤、抗ヒスタミン剤、抗炎症剤、ビタミン、および／またはこれらの任意の組合せの間から選択することができる。一部の実施形態では、薬剤は、天然に存在し、合成され、または組換えで生成することができる、適切なタンパク質、ペプチド、およびこれらのフラグメントから選択してもよい。
【０１０３】
一部の実施形態では、薬剤は生物学的製剤であり、生物学的製剤を含む。生物学的製剤の例には、それだけには限定されないが、モノクローナル抗体、単鎖抗体、アプタマー、酵素、成長因子、ホルモン、融合タンパク質、サイトカイン、治療用酵素、組換えワクチン、血液因子、および抗凝固薬が含まれる。本開示にしたがって使用するのに適する例示の生物学的製剤は、その内容が参照によって本明細書に援用される、S.  Aggarwal、Nature  Biotechnology、２８巻、１１号、２０１０年において論じられている。
【０１０４】
一部の実施形態では、本出願による組成物および方法は、１つまたは複数の治療剤を送達するのに特に有用である。
【０１０５】
一部の実施形態では、治療剤は、薬剤上の活性を有する小分子および／または有機化合物である。一部の実施形態では、治療剤は臨床的に使用される薬物である。一部の実施形態では、治療剤は、抗がん剤、抗生物質、抗ウイルス剤、麻酔剤、抗凝固剤、酵素の阻害剤、ステロイド剤、抗炎症剤、抗悪性腫瘍剤、抗原、ワクチン、抗体、うっ血除去剤、降圧剤、鎮静剤、産児制限剤、妊娠促進剤（progestational  agent）、抗コリン作用剤、
鎮痛剤、抗うつ剤、抗精神病剤、βアドレナリン遮断剤、利尿剤、心血管作用剤、血管作用剤、抗緑内障剤、神経保護剤、血管新生阻害剤であり、またはこれらを含む。
【０１０６】
例示の抗がん剤には、それだけには限定されないが、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、光感作剤（photosensitizing  agent）、毒素、抗がん抗生物質、化学療法化合物
、放射性核種、血管新生阻害剤、シグナリングモジュレーター、抗代謝剤、抗がんワクチン、抗がんオリゴペプチド、有糸分裂阻害タンパク質、抗有糸分裂オリゴペプチド、抗がん抗体、抗がん剤、抗生物質、免疫治療剤、温熱または温熱療法、細菌、放射治療、ならびにこのような薬剤の組合せが含まれる。一部の実施形態では、抗がん剤は、シスプラチン、カルボプラチン、ゲムシタビン、イリノテカン、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、およびこれらの任意の組合せである。
【０１０７】
本出願にしたがって使用される治療剤は、炎症および／または感染症と戦うのに有用な薬剤であってよく、または有用な薬剤を含むことができる。治療剤は抗生物質であってもよい。例示の抗生物質には、それだけには限定されないが、β−ラクタム抗生物質、マクロライド、モノバクタム、リファマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、クリンダマイシン、リンコマイシン、フシジン酸、ノボビオシン、ホスホマイシン、フシジン酸ナトリウム、カプレオマイシン、コリスチメテート、グラミシジン、ミノサイクリン、ドキシサイクリン、バシトラシン、エリスロマイシン、ナリジクス酸、バンコマイシン、およびトリメトプリムが含まれる。例えば、β−ラクタム抗生物質は、アンピシリン、アジオシリン（aziocillin）、アズトレオナム、カルベニシリン、セフォペラゾン、セフトリアキソン、セファロリジン、セファロチン、クロキサシリン、モキサラクタム、ペニシリンＧ、ピペラシリン、チカルシリン、およびこれらの任意の組合せであってよい。銅などの他の抗微生物剤も、本発明にしたがって使用することができる。例えば、抗ウイルス剤、抗原虫（anti-protazoal）剤、駆虫剤などを使用してもよい。さらに、またはあるいは、治療剤は抗炎症剤であってもよい。
【０１０８】
治療剤は、薬剤上活性な薬剤の混合物であってもよい。例えば、局所麻酔剤を、ステロイドなどの抗炎症剤と組み合わせて送達してもよい。局所麻酔剤を、また、エピネフリンなどの血管作動性の薬剤と投与してもよい。別のほんの一例をあげると、抗生物質を、抗生物質を不活性化するように細菌によって通常生成される酵素の阻害剤と組み合わせてもよい（例えば、ペニシリンとクラブラン酸）。
【０１０９】
一部の実施形態では、治療剤は、当技術分野において公知の治療剤を含むことができる。一部の実施形態では、治療剤は非ウイルスのベクターである。典型的な非ウイルスの遺伝子送達ベクターは、ＤＮＡ（例えば、細菌において生成されるプラスミドＤＮＡ）またはＲＮＡを含む。ある特定の実施形態では、非ウイルスのベクターを、送達ビヒクルの助けで、本発明にしたがって使用する。送達ビヒクルは、細胞膜と融合する脂質（例えば、リポソーム）周囲をベースとし、核酸を細胞の細胞質中に放出し得る。あるいは、またはあるいは、ペプチドまたはポリマーを使用して、標的の目的地に到達させようと治療活性を濃縮および保護し得る核酸と複合体（例えば、粒子の形態の）を形成してもよい。
【０１１０】
使用および適用
様々な適用において使用することができる粒子および方法を提供する。本開示の実施形態を使用して、前がん組織、がん、または腫瘍などの状態または疾患を含めた、任意の悪性または非定型の細胞または組織を、画像化、検出、試験、モニタリング、および／または評価することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載する組成物および方法は、固形腫瘍に特に有用である。例示の固形腫瘍には、それだけには限定されないが、脳、肺、乳房、卵巣、胃、膵臓、喉頭、食道、精巣、肝臓、耳下腺、胆道、結腸、直腸、子宮頚部、子宮、子宮内膜、腎臓、膀胱、前立腺、甲状腺、頭頚部の悪性腫瘍、メラノーマ、グリオーマ、神経芽細胞腫、神経内分泌の腫瘍などが含まれる。
【０１１１】
本発明に記載するＳＥ（Ｒ）ＲＳ粒子の、（低検出閾値を可能にする）類のないラマンシグナル強度および独特な薬物動態学的挙動（例えば、「増強された浸透性および保持」（ＥＰＲ）効果）のため、一部の実施形態では、あらゆる種類のがん（唯一の特定の種類のがんではなく）を、画像化し、検出し、処置することができることに留意するのが重要である。一部の実施形態では、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ粒子は、約１００ｆＭ、約５０ｆＭ、約２０ｆＭ、約１０ｆＭ、約５ｆＭ、またはさらに約１ｆＭまで低く、またはそれ未満である検出閾値を有する。例示の検出閾値の結果を図２７に示す。
【０１１２】
一部の実施形態では、提供する粒子は、細胞トラッキングのために細胞と会合して（例えば、細胞内に位置し、または細胞表面に付着して）いてもよい。
【０１１３】
粒子の例示的な投与には、それだけには限定されないが、経口、静脈内、舌下（すなわち、舌の下）、呼吸器、または手術中投与が含まれる。本出願において、提供する粒子および方法は、外科手術において残余の腫瘍を検出するのに特に興味深く、驚くほど有用であり得る。
【０１１４】
一部の実施形態では、粒子は、試料または対象（例えば、全身もしくはそのポーション）を画像化、検出、試験、モニタリング、評価、および／またはスクリーニングするのに使用することができる。本開示の実施形態には、腫瘍の切除を計画すること、腫瘍を評価すること、手術中の腫瘍切除のガイダンス、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏでのクリーンな辺縁の検証などの方法が含まれる。一部の実施形態では、提供する方法は、手術前および手術中の手順の時間枠を含むことができ、切除した組織を試験するための手術後の手順の時間枠も含むことができる。一部の実施形態では、方法は、数日から一週間または１０日間（または他の適切な期間）、腫瘍において粒子が検出できるように、適切な量の粒子（例えば、効果的な投与量（複数可））の投与を含むことができる。必要であれば、より多い投与量を投与して、所望のあらかじめ決定された期間、腫瘍中の粒子の検出可能な量を維持してもよい。さらに、手順の時間枠の間、複数の投与量の粒子を投与してもよい。
【０１１５】
次に、腫瘍を評価する方法に関して、粒子を対象に投与した後、手術前、手術中、および／または手術後の時間枠の手順の１つまたは複数の間に、ＭＲＩシグナル、光音響シグナル、およびラマンシグナルを得ることができる。各々のシグナルは、分析することができる情報セット（例えば、シグナル、シグナルの位置、シグナルの時間、シグナルの強度などであり、これらの１つもしくは複数または組合せを、以下に論じる「データ」と言及することができる）に含まれ得る。適切なエネルギーを、米国特許出願公開第２０１２０１７９０２９号により詳しく記載する、光音響およびラマンシグナルを生成するのに使用することができる。
【０１１６】
一部の実施形態では、ＭＲＩシグナルを使用して、腫瘍全体の位置、腫瘍全体の肉眼的描写、および腫瘍の残余のポーションの１つまたは複数に対応する画像を生成することができる。最初の２つは手術前の時間枠の手順の間に測定または検出することができ、最後は手術後の時間枠の手順の間に測定または検出する。ＭＲＩシグナルは、当技術分野において周知である、１５Ｔ、１１Ｔ、９．４Ｔ、７Ｔ、３Ｔ、１．５Ｔ、または０．５Ｔ、またはそれ未満などの、ＭＲＩシステムを使用して測定または検出することができる。
【０１１７】
一部の実施形態では、深部組織浸透（例えば、約４〜１０ｃｍ）を有する腫瘍に対応する画像を生成するのに光音響シグナルを使用する。光音響シグナルは、米国特許出願公開第２０１２０１７９０２９号に記載されている光音響システムを使用して測定することができる。
【０１１８】
一部の実施形態では、ラマン振動シグナルを、腫瘍の辺縁を規定するための、および脳のポーション（例えば、腫瘍から脳組織への移行の輪郭）の画像を生成するためのガイドとして使用することができる。ラマン振動シグナルは、本明細書に記載するラマンシステムを使用して測定することができる（例えば、ラスタースキャニングまたはポイントバイポイント（point  by  point）スキャニング）。
【０１１９】
一部の実施形態では、ＭＲＩシグナル、光音響シグナル、およびラマンシグナル（または対応する情報セット）を使用して、手術手順の間、腫瘍および腫瘍の辺縁の１つまたは複数の、位置、相対的ポジション、および／または特定の位置の粒子の存在を、画像化および／または決定することができる。シグナル（または対応する情報セット）を、単独で、または手順の間のあらゆる所与の点の組合せで使用することができる。手順のある点で単一のタイプの粒子を使用して各タイプのシグナルを得ることができることから、シグナル（または対応する情報セット）は全て、優れた切除手順を促進するのに使用することができる。造影剤を繰り返し注射することで有効性の低減を示すことがあり、毒性を誘発し得るため、これは有利である。
【０１２０】
次に、一例として腫瘍の切除を計画する方法に関して、粒子を対象に投与した後、手術前、手術中、および／または手術後の時間枠の手順の１つまたは複数の間、ＭＲＩデータ、光音響データ、およびラマンデータを得ることができる。データは、画像を生成するように受信され、またはモニタリングされたが画像に処理されていない各タイプのシグナルを適切に処理することによって、得ることができる。一部の実施形態では、１つまたは複数のタイプのデータを使用して、腫瘍を可視化（例えば、画像化）することができる。２つ以上のタイプのデータを組み合わせて、腫瘍を可視化（例えば、画像を生成）することができる。データを生成するためのシグナルの処理は、当技術分野において公知である（例えば、ＭＲＩデータの処理）。
【０１２１】
一部の実施形態では、ＭＲＩデータは、腫瘍の局在化および腫瘍の肉眼的描写の１つまたは複数に対応する。一部の実施形態では、ＭＲＩデータを使用して、手術前の時間枠において腫瘍全体を得、任意の残余の腫瘍に関する手術中または手術後のデータを得ることができる。
【０１２２】
一部の実施形態では、光音響データは、深部組織の浸透（例えば、対象中約５〜１０ｃｍ深さ）を有する腫瘍に対応する。一部の実施形態では、光音響データは、手術前の時間枠の手順に対応する。
【０１２３】
一部の実施形態では、ラマンデータは腫瘍の辺縁に対応する。一部の実施形態では、ラマンデータは手術中の時間枠の手順に対応し、手術後の時間枠の手順において使用することもできる。
【０１２４】
一部の実施形態では、ＭＲＩデータ、光音響データ、およびラマンデータを使用して、手術手順の間の腫瘍および腫瘍の辺縁の位置の１つまたは複数を決定することができる。データは、単独で、または手順の間のあらゆる所与の点で組み合わせて使用することができる。手順のある点では単一のタイプの粒子を使用して各タイプのデータを得ることができることから、データは全て、優れた切除の手順を促進するのに使用することができる。これは、３つの各モダリティが、より大きな深部浸透、より大きな空間分解能、より大きな感度、およびより大きな特異性など、各々相補的な強みを有するので有利である。
【０１２５】
上記に記載した方法は腫瘍に対するものであるが、他の組織タイプが腫瘍に代わることができる。例えば、前がん細胞もしくはがん細胞、または炎症もしくは感染などの非がん細胞でも、同様の方法で処置することができる。
【実施例】
【０１２６】
以下の実施例は、手術室で残余の腫瘍を簡単明瞭に検出することができる、新規な多様式の概念の開発を実証するものである。Ａ）注射可能な粒子、Ｂ）既存の臨床用ＭＲスキャナー、およびＣ）手持ち式のラマン検出器の３つの構成成分が存在する。
【０１２７】
簡単に述べると、本方法はナノスケールコア／カプセル材粒子の単一の静脈内注射を使用するものであり、これにより、腫瘍の輪郭を３Ｄで可視化して（手術前および／または手術中の、ＭＲＩ、ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ、ＣＴ、ＵＳなどで）ロードマップを提供することもでき、ラマンおよび／または光音響の手持ち式スキャナーでリアルタイムに顕微鏡的分解能で残余の腫瘍を決定することもできる。
【０１２８】
本明細書に開示する実施例および多くの実施形態は発振性の電場を使用するものであり、発振性の電場は電子雲の分子の発振を誘発し、誘起双極子と呼ばれる。これらの発振性の電子雲が、次に光を産生する。発振性の双極子により産生された光は散乱光と呼ばれ、散乱光の強度は双極振動の振幅に依存する（電子雲の発振の振幅）。
【０１２９】
分子の誘起双極子の振幅は、それに対する電場の入射の振幅に比例する（等式１）。
等式１  Ｐ＝αＥ
【０１３０】
式中、Ｐは誘起双極子であり、Ｅは入射電場である。比例定数αは分子の分極率と呼ばれ、ある特定の振動モードでは核座標に依存する（分極率は核のポジションの関数であり、核が振動すると、ある特定の振動モードに対して変化する）。
【０１３１】
単一の発振性の電場の時間依存性の等式は、
等式２  Ｅ＝Ｅ０ｃｏｓ（２πν０ｔ）
であり、式中、Ｅ０は電場の［最大］振幅であり、ν０は発振性の電場の周波数であり、ｔは時間である。所与の振動モードでは、瞬間的な核座標（核のポジション）は、
等式３  ｄＱ＝Ｑ０ｃｏｓ（２πνｖｉｂｔ）
であり、式中、Ｑ０は、所与の振動モードに対するこれらの平衡のポジションに対する核の最大移動であり、νｖｉｂは振動周波数であり、ｔは時間である。分極率は核座標の関数であるので、変数Ｑ（核座標）に関してαの平衡値についてのテイラー級数として表すことができる。相対的に小型の核の移動を十分に保持する単純化をすると、テイラー級数は最初の２つの項によって概算することができる：
等式４
【化１】
2018165278.tif 000002
等式２および等式４を等式１に挿入すると以下となる：
等式５
【化２】
2018165278.tif 000003
等式４を等式５に挿入し、簡約すると以下となる：
等式６
【化３】
2018165278.tif 000004
最後に、三角恒等式
【化４】
2018165278.tif 000005
を適用すると、
等式７
【化５】
2018165278.tif 000006
が得られる。等式７は、発振性の電場は、ν０、ν０−νｖｉｂ、およびν０＋νｖｉｂの３つの周波数で発振することができる、分子中の双極子を誘発することを実証するものである。これらの周波数のうち最初のものは入射電場の周波数に等しく、対応する等周波数の散乱は、弾性（またはレイリー）散乱光と呼ばれる。第２の周波数は入射電場の周波数より低く、対応する低周波数の非弾性散乱はラマンストークス散乱と呼ばれる。３つの周波数の最後は入射電場の周波数より高く、対応する高周波数の非弾性散乱はラマンアンチストークス（Raman  Anti-Stokes）散乱と呼ばれる。
【０１３２】
ラマン散乱光の強度を増大するために、散乱強度全体を増大してもよく、またはラマン散乱の全散乱に対する比率を増大してもよい。誘起双極子の数および／または振幅を増大すると、全体の散乱強度が増大する。等式１より、分極率または入射電場のいずれかを増大すると、誘起双極子の振幅が増大することを見て取ることができる。これらの因子の両方とも、貴金属粒子の表面に近い分子で増強される。特に、粒子に結合している分子は、粒子−分子ハイブリッドとして存在し、粒子の（伝導帯）電子は、分子の電子よりも入射電場に対してはるかに感受性が強いため、非結合の分子に比べて劇的に増大した分極率を特徴とする。さらに、粒子の寸法は、これらが入射光の波長よりずっと小さく（例えば、＜１０％）なるように調整することができ、そのため伝導電子の協調発振は、局在化表面プラズモン共鳴と呼ばれ、その表面で入射の電磁波の電場を効果的に濃縮し、大幅に増強された電場を、近くに位置する（例えば、粒子表面のおよそ２０ｎｍ以内の）分子に提供する。電場のさらなる増強は、大量の電荷が非常に小さな領域に囲われる長球面の尖端などの「ホットスポット」を組み入れるように粒子の形態を調整することにより実現することができる。
【０１３３】
ラマン対全体の散乱光の比率は、入射電場の周波数を分子の電子励起周波数に移行することによって、または固定された電場の周波数に電子励起周波数をもつ分子を選ぶことによって増大させることができる。これがラマン対全体の散乱の比率を増大させる理由は、散乱光の放射に先行する「仮想上の」励起状態の寿命が、励起周波数では著しく増大するということである。励起がこのように長くなるため、最初および最終の核座標は、非共鳴分子に対して有するであろうものよりもさらに移動する（仮想上の状態が下方遷移する前、核には移動時間がさらにある）。核座標におけるこの大幅な変更により、フランク−コンドンの原理が記述している通り、それに対して仮想上の励起状態が弛緩する、好ましい振動状態における移行がもたらされる。このように、共鳴色素は、はるかに強力なラマン散乱を生じる。重要な留意事項は、同様の共鳴効果が、分子と粒子との間の電荷移動によって実現され得ることである。
【０１３４】
共鳴薬剤を、電場の増強に最適化した粒子と組み合わせることにより、全体の散乱およびラマン対全体の散乱の比率の両方が徹底的に増大し、分子１個あたりのラマン散乱強度が最大になる。理論的な最大強度のＳＥ（Ｒ）ＲＳ粒子の産生に向けた最終段階は、粒子の表面の色素分子の数を最適化することである。共鳴色素分子のこの最適濃度は、一般に、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ粒子を産生するための現在のプライマーベースのプロトコールで実現し得るよりも非常に高い。後者の場合、特にシリカに対して、カプセル材を分子に結合させる時に粒子上に成長させ、これが、アミノ−またはメルカプトシランであるのが典型的である表面をプライミングする。この場合、安定化剤または表面プライミング剤は、窒素、イオウ、または他の強力な結合性原子を含まない、シトレートまたはアスコルビン酸などのキャッピング剤よりも粒子表面に強固に結合する。これは、表面の結合のために存在する競争的平衡、すなわちキャッピング分子の移動およびラマン活性分子の粒子表面に対する結合を記述する平衡が、表面プライミング剤または安定化剤を加えると、これらがない場合に比べて強力に疎んじられることを意味する。さらに、以前は占有されていなかった結合部位は表面プライマーによって阻止され、ゆえに共鳴薬剤の結合に接近可能ではない。したがって、粒子表面上に存在するラマン活性分子の数を、さらなる表面プライマーまたはポリマーを使用せずにカプセル化または安定化によって最適化することができることを最初に認めるのが本開示である。
【０１３５】
（実施例１）
ＳＥ（Ｒ）ＲＳ粒子の合成
金ナノスター形状のコアを、４℃で４０ｍＭアスコルビン酸に２０ｍＭ  ＨＡｕＣｌ４を速やかに加えることにより合成した。合成したままのアスコルベート安定化金ナノスター（およそ７５ｎｍ、１ｎＭ）を遠心分離（３，５００×ｇ、１５分）によって収集し、一夜透析した。透析した金ナノスターを、典型的なストーバー法によって、色素を埋め込んだシリカでコーティングした。簡潔に述べると、透析した金ナノスターをエタノールに加え、これに共鳴ラマン色素であるＴＥＯＳおよびアンモニアを加え、１時間反応させた。粒子を、遠心分離（３，５００×ｇ、１５分）によって単離し、エタノールで洗浄した。ＰＥＧ化を可能にするため、シリカ表面を、１％（ｖ／ｖ）ＭＰＴＭＳを含むエタノール中７２℃で１時間、シリカコーティングしたナノスターを加熱することによりスルフヒドリル基で修飾した。ナノスターをエタノールで洗浄してＭＰＴＭＳを除き、１％（ｗ／ｖ）メトキシ末端（ｍ）ＰＥＧ２０００−マレイミドを含む１０ｍＭ  ＭＥＳバッファー（ｐＨ７．１）中に再分散した。マレイミド−ｍＰＥＧ２０００を周囲条件で２時間、スルフヒドリル修飾したシリカ表面と反応させた。ＰＥＧ化した共鳴ラマン活性ナノスターを洗浄し、ろ過滅菌した１０ｍＭ  ＭＥＳバッファー（ｐＨ７．３）中に再分散し、４℃で貯蔵した後注射した。共鳴粒子を図１に図示する。
【０１３６】
ＳＥ（Ｒ）ＲＳ粒子はいくつかの点で独特である：１）世界中で報告されているあらゆる同様の粒子の中で最高の検出感度を有する。２）「増強された浸透性および保持」（ＥＰＲ）効果に頼り、その表面上に特定の標的化モイエティを必要とせずに腫瘍を可視化することができる。３）明快な特異性で検出できる、独特な「フィンガープリント」ラマンスペクトルを有する。４）全身３Ｄ画像化法を、腫瘍の辺縁を最適に同定するための超高感度の検出方法と組み合わせるものである。５）腫瘍内に安定に捕捉され、そのため手術前の病期診断および１回の単一静脈内注射での手術中の切除が可能になる。６）非常に似通った金−シリカベースの粒子の厳密な毒性評価により、これらはｉｎ  ｖｉｖｏで安全であることが見出されている。
【０１３７】
（実施例２）
特徴付け
超高感度：
図２に示す通り、実施例１において合成したＳＥ（Ｒ）ＲＳ粒子を、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ；ＪＥＯＬ  １２００ＥＸ、ＵＳＡ）によって特徴付け、サイズ分布および濃度をナノ粒子トラッキング分析（ＮＴＡ；Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ、ＵＫ）によって決定した。等モル量の粒子のラマン活性を、３００ｍＷ  ７８５ｎｍ（近ＩＲ）ダイオードレーザー、およびスペクトル分解能１．０７ｃｍ−１用の１インチ荷電結合素子検出器を装着したＲｅｎｉｓｈａｗ  ＩｎＶＩＡラマン顕微鏡上で決定した。ラマンスペクトルを、ＷｉＲＥ３．４ソフトウエア（Ｒｅｎｉｓｈａｗ、ＵＫ）で分析した。
【０１３８】
ナノ粒子トラッキング分析（ＮＴＡ）
図３に示す通り、水中の１ｐＭの粒子のサイズ分布をＮＴＡにより決定した。
【０１３９】
（実施例３）
動物実験
図４〜１０に関して、腫瘍担持マウス（脱分化脂肪肉腫モデル、ＰｙＭＴ−ＭＭＴＶ（ｆｖｂ）トランスジェニック乳がんモデル、Ｈｉ−ＭＹＣトランスジェニック前立腺がんモデル、ＲＣＡＳ／ＴＶ−ａトランスジェニックグリオーマモデル）に、実施例１で合成した２．５ｎＭ  ＳＥ（Ｒ）ＲＳ粒子１５０ｕＬを注射した。１８時間以降に動物を屠殺し、上記に記載したシステム上でラマン活性に対してスキャニングした。腫瘍、器官、およびリンパ節を収集し、さらにｅｘ  ｖｉｖｏ画像化にかけ、引き続きワックス包埋した。包埋した組織を組織検査用に処理した（Ｈ＆Ｅ染色、腫瘍マーカー染色、マクロファージ染色）。
【０１４０】
図１１〜１６に関して、ＭＰＲ−ナノスターを使用して、組織学的に相関のあるマウスにおける結腸がん、前立腺がん、および乳がんを検出した。この実験は、多種多様な様々ながんモデルにおけるＭＰＲ−ナノスターの使用をさらに説明するものである。
【０１４１】
ｉｎ  ｖｉｖｏ−ｅｘ  ｖｉｖｏ多様式ＭＲＩ−ラマン組織学の相関
本発明者らは、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ粒子が、３つの異なる異種移植片マウス肉腫モデルにおいて、確実に、かつ顕微鏡的な正確さで、腫瘍の存在を描写することができることを実証する（１モデルあたりｎ＝５）。これらのマウスモデルに埋め込んだ細胞は、実際のヒト腫瘍に由来するものである。マウスモデル＃１は、脱分化脂肪肉腫モデルであり、マウスモデル＃２は粘液線維肉腫モデルであり、マウスモデル＃３は多型性悪性線維性組織球腫（ＦＭＨ）モデルである。３つのモデルは全て、原発腫瘍周辺に局所腫瘍浸潤および衛星微小転移を生成することが知られている。モデル＃２および＃３は、肺および骨に転移を生成することも知られており、本発明者らは、これら遠位の転移を検出する本発明者らの方法の能力も評価する。本発明者らは腫瘍担持マウスにＳＥ（Ｒ）ＲＳ粒子（１５０μｌ、５ｎＭ）を静脈内注射し、２４時間後にＭＲＩを行い、次いで動物を屠殺し、マクロトームを使用して全身の組織学的切断を行い（ＭＲＩと同じ切片の厚さ）、次いでこれらの切片を既存の本発明者らのラマン顕微鏡（Ｒｅｎｉｓｈａｗ）で画像化し、最後に同じ切片を組織学的に処理する（Ｈ＆Ｅ染色、腫瘍マーカー染色、マクロファージ染色）。これにより、同じ切片に対して、ラマンシグナルをＭＲＩシグナルおよび組織学によって証明された腫瘍細胞の存在と比較することができるようになるため、本発明者らはこの多様式のＳＥ（Ｒ）ＲＳ粒子法の精度を評価することができるようになる。
【０１４２】
マウスにおける体内分布および投与量を見出す試験：
本発明者らは、ＰＥＴトレーサー（ジルコニウム−８９、８９Ｚｒ）を標識したＳＥ（Ｒ）ＲＳ粒子を使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏのＰＥＴ−ＣＴ試験を行う。ＳＥ（Ｒ）ＲＳ粒子の８９Ｚｒでの標識化を、ＭＳＫＣＣのＬｅｗｉｓ研究所との共同研究で行う。８９Ｚｒ−ＳＥ（Ｒ）ＲＳ粒子を、担肉腫マウスに静脈内注射し（上記の各腫瘍タイプに対してｎ＝３）、動的ＰＥＴ−ＣＴ画像化法（dynamic  PET-CT  imaging）を、０、１、２、４、８、１２、１８、２４、４８時間、５日、７日、１０日、および１４日に行う。ＰＥＴデータにより、Ａ）目的３に使用する粒子投与量を計算するための、腫瘍内のＳＥ（Ｒ）ＲＳ粒子の正確な濃度、およびＢ）腫瘍内蓄積の動力学およびＳＥ（Ｒ）ＲＳ粒子の保持の決定がもたらされる。
【０１４３】
骨肉腫を有するイヌにおけるラマン−ガイド肉腫手術の試験：
本発明者らは、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ粒子および手持ち式のラマン検出器を使用して、大型動物でどのように肉腫を切除することができるかを実証する。手持ち式スキャナーは、近赤外線（７８５ｎｍ）における同じ波長を有するレーザーおよび３００ｍＷの同じレーザー出力を使用するなど、本発明者らのＲｅｎｉｓｈａｗベンチトップラマン顕微鏡に非常に似通った規格を有する。手持ち式の粒子は、対象の組織に対して直接保持することができ、本発明者らのＳＥ（Ｒ）ＲＳ粒子を検出すると音（または、好みにより、光信号）で示してくれる。
【０１４４】
この目的を、マンハッタン６２ｎｄ  Ｓｔｒｅｅｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｍｃｎｙ．ｏｒｇ）にある、Ａｎｉｍａｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＡＭＣ）との共同研究で行う。この動物クリニックは、日常的に動物に対して肉腫の手術を含めた外科手術を行う、高度に専門化された施設である。イヌにおける骨肉腫の発生率は高く、したがって、飼い主が本発明者らの画像ガイダンス方法と組み合わせて行う外科手術に同意する、このような罹患したイヌは十分な数存在する。
【０１４５】
本発明者らは、目的２で決定した濃度のＳＥ（Ｒ）ＲＳ粒子を、イヌ（ｎ＝１０）に静脈内投与する。２４時間後、動物をイソフルラン麻酔剤で麻酔する。動物に無菌の準備をした後、腫瘍を外科的に曝露し、外科医が裸眼で明確に同定することができる腫瘍のバルクを切除する。切除が腫瘍の辺縁に近づいて進行したら、手持ち式ラマン粒子を使用して残余の腫瘍の存在を検証し、手術台で局所微小転移の存在を探す。ＳＥ（Ｒ）ＲＳ粒子が依然として存在すれば、ラマンスキャナーは外科医に「ビー」という音で通知する（図１７を参照されたい）。次いで、ラマン陽性の病巣を全て切除するまで切除を続け、切除した組織標本を病理学的評価に送る（組織学および腫瘍マーカー）。引き続き、組織の別の５ｃｍの縁（おそらく腫瘍フリーである）を切除し、ラマンにガイドされる外科手術が本当に全ての腫瘍細胞の除去をもたらしたことを検証するために、やはり病理学的評価に送る。
【０１４６】
他の実施形態および同等物
【０１４７】
当業者であれば、ルーチンの実験を使用するだけで、本明細書に記載する本発明の特定の実施形態の多くの同等物を認識し、または確認することができよう。本発明の範囲は、上記の記載／明細書に限定することを意図するものではなく、むしろ以下の特許請求の範囲に記載するものである。
【図１】
2018165278.tif 000007
【図２】
2018165278.tif 000008
【図３】
2018165278.tif 000009
【図４】
2018165278.tif 000010
【図５】
2018165278.tif 000011
【図６】
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【図７】
2018165278.tif 000013
【図８】
2018165278.tif 000014
【図９】
2018165278.tif 000015
【図１０】
2018165278.tif 000016
【図１１】
2018165278.tif 000017
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2018165278.tif 000021
【図１６】
2018165278.tif 000022
【図１７】
2018165278.tif 000023
【図１８】
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【図１９】
2018165278.tif 000025
【図２０】
2018165278.tif 000026
【図２１】
2018165278.tif 000027
【図２２】
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【図２３】
2018165278.tif 000029
【図２４】
2018165278.tif 000030
【図２５】
2018165278.tif 000031
【図２６】
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【図２７】
2018165278.tif 000033
【図２８】
2018165278.tif 000034
【図２９】
2018165278.tif 000035
【外国語明細書】
2018165278000001.pdf