(57)【要約】【課題】  試料中に含まれる標的細胞を対象として、（１）標的細胞を光学的に検出し、標的細胞の数や特徴を解析すること、および（２）標的細胞の遺伝子を解析すること、をともに簡便に実施可能な方法を提供すること。【解決手段】  試料中に含まれる標的細胞を濃縮する工程、前記濃縮工程で得られた標的細胞濃縮液を２以上の画分に分割する工程、前記分割工程で得られた画分のうち少なくとも一つを用いて標的細胞を光学的に検出する工程、前記分割工程で得られた画分のうち少なくとも一つを用いて標的細胞の遺伝子を解析する工程、を含む細胞検出方法により、前記課題を解決する。【選択図】  図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中に含まれる標的細胞を検出する方法であって、
（１）試料中に含まれる標的細胞を濃縮する工程、
（２）（１）の工程で得られた標的細胞濃縮液を２以上の画分に分割する工程、
（３）（２）の工程で得られた画分のうち少なくとも一つを用いて、標的細胞を光学的に検出する工程、
（４）（２）の工程で得られた画分のうち少なくとも一つを用いて、標的細胞が有する遺伝子を解析する工程、
を少なくとも含む、前記方法。
【請求項２】
（１）の工程を、比重差分離法で行なう、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
試料が血液試料であり、標的細胞が腫瘍細胞であり、（１）の工程を白血球結合剤を添加した比重差分離法で行なう、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
（３）の工程が、標的細胞を固定処理および／または膜透過処理して検出する工程を含む、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
（４）の工程が、標的細胞が有するｍＲＮＡを解析する工程である、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中に含まれる細胞を検出する方法に関する。特に本発明は、血液や尿などの生体試料中に含まれる特定の細胞を対象として、当該細胞の光学的検出および遺伝子解析を合わせて行なう方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、血液などの体液や、臓器などの組織を溶液に懸濁もしくは分散して得られる組織懸濁液や、細胞培養液といった試料から細胞を選択的に分離回収し、当該分離回収した細胞を基礎研究や臨床診断、治療へ応用する研究が進められている。例えば、癌患者より採取した血液から腫瘍細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌ、以下ＣＴＣと表記）を検出し、当該細胞について形態学的分析、組織型分析や遺伝子分析を行ない、前記分析により得られた知見に基づき治療方針を判断する研究が進められている。しかしながら、ＣＴＣは存在確率が非常に少なく（試料が癌患者由来の全血の場合、全血１ｍＬあたり数個程度）、高感度な検出を必要とする。
【０００３】
試料中に含まれる標的細胞を検出する方法として、フローサイトメトリー法による検出方法が知られている（非特許文献１）。フローサイトメトリー法は、あらかじめ蛍光物質や発光基質などで標識した細胞を、１列に整列させた状態で流路に流し、当該流路に流れる標識した細胞をレーザー光および光学検出器を用いて検出ならびに解析する方法であり、試料中に含まれる前記標的細胞を精度高くカウントすることができる。また、別の方法として、標的細胞を含む細胞群をスライドガラスなどの基板上に並べ、蛍光物質や発光基質などで標識後、当該標識由来の光を顕微鏡で検出してカウントする方法も知られている（非特許文献２および３）。
【０００４】
これらの方法で用いる標識の標的として、標的細胞内に存在する、タンパク質や核酸（例えばＤＮＡやｍＲＮＡ）などの生体分子がしばしば用いられる。例えば、前述のＣＴＣの検出においては、標的細胞のマーカーとして上皮系細胞に特徴的な細胞内タンパク質であるサイトケラチンに対する蛍光物質で標識した抗体を用いた免疫染色や、標的細胞内のＤＮＡに対して強力に結合する蛍光色素であるＤＡＰＩ（４’，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）による染色が一般的に行なわれている。
【０００５】
しかしながら、標的細胞内の生体分子を標識する場合、当該細胞の固定処理や膜透過処理が必要であり、前記処理によりｍＲＮＡなどの生体分子が溶出および／または変性してしまう。そのため、標的細胞に含まれる生体分子を連続して検出することは困難であった。また前述した免疫染色を利用した検出方法は、検出までに比較的長い時間を要することから、固定処理や膜透過処理を行なわない場合であっても、ｍＲＮＡなどの生体分子が分解するおそれがあり、標的細胞に含まれる生体分子の検出を連続して行なうには不向きであった。
【０００６】
試料中に含まれる標的細胞を検出する別の方法として、細胞の固定処理や膜透過処理を行なった後、前記標的細胞が有するタンパクに対する蛍光物質で標識した抗体で細胞内生体分子を標識し、標識された標的細胞を回収後、ゲノムＤＮＡの変異解析などを行なう方法も報告されている（非特許文献３）。ゲノムＤＮＡのような安定した大型の分子を対象とすれば、免疫染色による標的細胞の検出に続けて、標的細胞が有する遺伝子の検出が可能だが、標的細胞を１細胞ずつ回収する必要があるなど、操作の煩雑性が課題であった。
【０００７】
試料中に含まれる標的細胞が有する遺伝子を解析する方法として、磁気ビーズを用いて試料中に含まれる標的細胞を回収し、ｍＲＮＡなど遺伝子を解析する方法が報告されている（特許文献１）。しかしながら、本方法は標的細胞を集団として回収・解析しており、標的細胞を個々に検出したり、標的細胞数やその特徴を解析することはできなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】ＷＯ２０１６／０３３１１４号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｗ．Ｊｅｆｆｒｅｙ  Ａｌｌａｒｄ，ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１０，６８９７−６９０４（２００４）
【非特許文献２】Ｈｏｗａｒｄ  Ｉ．  Ｓｃｈｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，ＪＡＭＡ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２（１１），１４４１−１４４９（２０１６）
【非特許文献３】Ａ．Ｍｏｒｉｍｏｔｏ，ｅｔ  ａｌ．，ＰＬＯＳ  ＯＮＥ，１０（６），ｅ０１３０４１８（２０１５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、試料中に含まれる標的細胞の光学的検出および標的細胞が有する遺伝子の解析をともに簡便に実施可能な方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決するために、本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、本発明に到達した。
【００１２】
すなわち本発明は以下［１］から［５］に記載の態様を包含する：
［１］試料中に含まれる標的細胞を検出する方法であって、
（１）試料中に含まれる標的細胞を濃縮する工程、
（２）（１）の工程で得られた標的細胞濃縮液を２以上の画分に分割する工程、
（３）（２）の工程で得られた画分のうち少なくとも一つを用いて、標的細胞を光学的に検出する工程、
（４）（２）の工程で得られた画分のうち少なくとも一つを用いて、標的細胞が有する遺伝子を解析する工程、
を少なくとも含む、前記方法。
【００１３】
［２］（１）の工程を、比重差分離法で行なう、［１］に記載の方法。
【００１４】
［３］試料が血液試料であり、標的細胞が腫瘍細胞であり、（１）の工程を白血球結合剤を添加した比重差分離法で行なう、［１］に記載の方法。
【００１５】
［４］（３）の工程が、標的細胞を固定処理および／または膜透過処理して検出する工程を含む、［１］から［３］のいずれかに記載の方法。
【００１６】
［５］（４）の工程が、標的細胞が有するｍＲＮＡを解析する工程である、請求項［１］から［４］のいずれかに記載の方法。
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１８】
本発明における、標的細胞を含む試料の一例として、尿、全血、希釈血液、血漿、血清、唾液、精液、糞便、痰、髄液、腹水、羊水といった生体から取得した試料や、細胞の凝集物、腫瘍、リンパ節、動脈といった器官または組織由来の試料や、細胞や組織の培養物およびそれらの培養液といった培養試料があげられる。
【００１９】
本発明は、少なくとも以下の（１）から（４）に示す工程により、試料中に含まれる標的細胞を検出する。
（１）試料中に含まれる標的細胞を濃縮する工程、
（２）（１）の工程で得られた標的細胞濃縮液を２以上の画分に分割する工程、
（３）（２）の工程で得られた画分のうち少なくとも一つを用いて、標的細胞を光学的に検出する工程、
（４）（２）の工程で得られた画分のうち少なくとも一つを用いて、標的細胞が有する遺伝子を解析する工程、
以下、前記各工程を詳細に説明する。
【００２０】
（１）試料中に含まれる標的細胞を濃縮する工程
本工程は、試料中に含まれる標的細胞以外の成分（夾雑細胞、夾雑生体分子、液体成分など）を低減することで標的細胞をより選択的に回収する工程である。本工程の一例として、標的細胞と標的細胞以外の成分との大きさの違いを利用して分離濃縮するフィルター法や、細胞表面の抗体発現プロファイルの違いを利用し標的細胞特異的なタンパク質に対する抗体を結合した磁性粒子を用いて目的細胞を分離濃縮する磁気ビーズ法や、標的細胞と標的細胞以外の成分との比重差を利用した比重差分離法があげられる。中でも比重差分離法は、短時間かつ効率的に標的細胞を濃縮できることから、本工程で行なう方法として特に好ましい。
【００２１】
比重差分離法による標的細胞の濃縮（標的細胞以外の成分の低減）は、標的細胞と標的細胞以外の成分（夾雑細胞など）が比重差によって分離できれば特に制限はない。例えば、密度勾配溶液が入った遠沈管に標的細胞を含む試料を重層後、遠心分離操作を行なうことで、標的細胞を含む画分と標的細胞以外の成分（夾雑細胞など）を含む画分とに分離させ、前記標的細胞を含む画分を回収することで、標的細胞を濃縮（夾雑細胞を低減）させればよい。
【００２２】
比重差分離法により本工程を行なう際、標的細胞に特異的に結合する物質または標的細胞以外の成分（夾雑細胞など）に特異的に結合する物質を添加し、標的細胞または標的細胞以外の成分を比重の異なる物質と結合させて、見かけ上の比重を変化させることにより、標的細胞を更に効率的に分離することができる。前記特異的に結合する物質としては、標的細胞（または夾雑細胞など標的細胞以外の成分）と特異的に結合可能な抗体、抗原、ペプチド、ポリペプチド、成長因子、サイトカイン、レクチンといった生体高分子を例示できる。また前記比重の異なる物質として、ポリプロピレン、ポリスチレン等の合成高分子、ガラス、シリカ、ジルコニア等の無機材料、セルロース、デキストラン、アガロース等の天然高分子、赤血球などの生体試料が例示できる。具体例として、試料が全血や希釈血液などの血液試料であり、標的細胞がＣＴＣなどの腫瘍細胞である場合、夾雑細胞である白血球の結合剤を添加し、白血球の見かけの比重を変化させることで、比重差分離法による効率的な白血球の除去（すなわち腫瘍細胞の濃縮）が行なえる。ここで用いる白血球結合剤は、白血球と特異的に結合し見かけ上の比重を変化させる物質であれば、特に限定はなく、白血球と特異的に結合する物質と比重を変化させる物質との組合せが例示される。中でも、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）に代表される白血球と特異的に結合可能な抗体および赤血球と特異的に結合する抗体を連結させた白血球結合剤を用いると、血液試料からの比重差分離法による腫瘍細胞の濃縮（白血球の除去）を特に効率的に行なえるため好ましい。
【００２３】
なお比重差分離法により本工程を行なう際、夾雑細胞を積極的に除去する操作を追加してもよい。例えば、血液試料から比重差分離法によりＣＴＣなど腫瘍細胞（標的細胞）の濃縮操作を行なう際、夾雑細胞である赤血球を積極的に除去する溶血操作を追加してもよい。前記夾雑細胞を積極的に除去する操作は、比重差分離操作（遠心操作）前に行なってもよいし、比重差分離操作後に行なってもよい。なお夾雑細胞を積極的に除去する操作を比重差分離操作前に行なう場合は、前記除去操作後、遠心操作を追加すると好ましい。
【００２４】
（２）標的細胞濃縮液を２以上の画分に分割する工程
本工程では、前記（１）の工程で得られた標的細胞濃縮液（夾雑細胞除去液）を２以上の画分に分割する。分割の数は、後述する、標的細胞を光学的に検出する工程用の画分および標的細胞が有する遺伝子を解析する工程用の画分がそれぞれ一つ以上確保されており、かつ標的細胞の検出に必要な量が確保されている限り、多数に分割して良い。分割後の各画分の量にも限定はなく、等量ずつ分割しても良いし、偏りをつけて分割しても良い。
【００２５】
（３）標的細胞を光学的に検出する工程
本工程は、例えばフローサイトメーター、蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡、光学顕微鏡、分光光度計などの光学検出器を用いて標的細胞を検出すればよい。本工程を顕微鏡を用いて行なう場合の一例として、前記（２）の工程で得られた標的細胞濃縮液の画分の一つを、スライドに塗布または保持部を有した基板に展開し、塗布された、または保持部に保持された標的細胞を顕微鏡を用いて検出する方法があげられる。なお前述した検出方法のうち、保持部を有した基板に試料を展開し、当該保持部に保持された細胞を検出する方法は、高感度かつ高精度に１細胞ごとを観察／解析できる点、およびその後、細胞を再標識して検出する際、保持された細胞が剥離するおそれが軽減するため好ましい。
【００２６】
本工程は、標的細胞を明視野像により直接検出してもよいが、あらかじめ標的細胞（または夾雑細胞）が特異的に有する物質と特異的に結合可能な認識物質に光学的に検出可能なシグナルを発することが可能な標識を結合して得られる標識物質を用いて前記標的細胞（または前記夾雑細胞）を標識し、当該標識に基づき標的細胞を検出すると、標的細胞を高感度かつ簡便に検出できるため、好ましい。標的細胞が腫瘍細胞である場合の、前記標的細胞（または夾雑細胞）が特異的に有する物質として、サイトケラチン（ＣＫ）、アンドロゲン受容体（ＡＲ）およびそのスプライスバリアント（ＡＲ−Ｖｓ）、ビメンチンなどの細胞内生体分子や、ＣＤ４５、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＥｐＣＡＭ（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、ＰＤ−Ｌ１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  Ｄｅａｔｈ−Ｌｉｇａｎｄ  １）などの膜タンパク質が例示できる。前記特異的に結合可能な認識物質としては、抗体、抗原、ペプチド、ポリペプチド、成長因子、サイトカイン、レクチンといった生体高分子が例示できる。特に、特異的に結合可能な認識物質として抗体を用いる免疫染色法は、特異性の高さや結合能の強さの点から好ましい。なお標的細胞（または夾雑細胞）が特異的に有する物質の他に、ＤＡＰＩ（４’，６−ＤｉＡｍｉｄｉｎｏ−２−ＰｈｅｎｙｌＩｎｄｏｌｅ）、ヘマトキシリン、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（商品名）などの核染色試薬を用いた有核細胞の標識や、オレンジＧ、ライトグリーン、エオシンなどの細胞質染色試薬を用いた細胞の標識を追加で行なっても良い。
【００２７】
本工程では、標的細胞および／もしくは夾雑細胞の固定処理ならびに／または膜透過処理を行なっても良い。特に細胞内生体分子を標識する場合には、当該生体分子の溶出・分解の防止や、標識試薬を細胞内へ浸透させる目的から、固定処理および／または膜透過処理を行なうと好ましい。固定処理は生体分子の細胞内位置を維持および／または分解を抑制する方法であれば、膜透過処理方法は細胞膜の透過性を向上させる方法であればいずれの方法でもよく、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、エタノール、メタノール、アセトン、界面活性剤などを用いる方法が例示される。
【００２８】
（４）標的細胞が有する遺伝子を解析する工程
本工程における解析対象の遺伝子は、ゲノムＤＮＡといったＤＮＡであってもよく、ｍＲＮＡといったＲＮＡであってもよい。特にｍＲＮＡは、分解しやすい物質であること、また前記（３）の工程で実施し得る固定処理や膜透過処理を行なうと変性・溶出する可能性があることから、本発明の検出方法における好適な対象遺伝子である。本工程は、対象遺伝子がＤＮＡの場合は、例えばサンガー法による配列解析や、次世代シーケンサーによる配列解析や、遺伝子増幅反応（ＰＣＲ法など）を用いた一塩基多型（ＳＮＰｓ）解析により、対象遺伝子がＲＮＡの場合は例えばＲＮＡ−ｓｅｑ法、ＲＴ−ＰＣＲ法で核酸増幅後電気泳動で検出する方法、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法や、ＴＲＣ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｒｅｖｅｒｓｅ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ）法、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法など直接ＲＮＡを増幅して検出する方法を利用した発現解析により、それぞれ行なえばよい。中でも、夾雑細胞（標的細胞以外の細胞）の影響を回避できる点で、夾雑細胞が有さない遺伝子配列やｍＲＮＡ発現を検出する方法が好ましい。一例として、標的細胞が前立腺がん由来の腫瘍細胞の場合は、発現すると抗がん剤への耐性獲得へ寄与するアンドロゲン受容体バリアント７（ＡＲ−Ｖ７）ｍＲＮＡを検出すると好ましく、標的細胞が肺がん由来の腫瘍細胞の場合は変異が生じると抗がん剤耐性や腫瘍の悪性度の増加に繋がる遺伝子（ＥＧＦＲ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）など）の変異解析をすると好ましい。
【発明の効果】
【００２９】
本発明の試料中に含まれる標的細胞の検出方法は、試料中に含まれる標的細胞を濃縮する工程と、前記濃縮工程で得られた標的細胞濃縮液を２以上の画分に分割する工程と、前記分割工程で得られた画分のうち少なくとも一つを用いて標的細胞を光学的に検出する工程と、前記分割工程で画分のうち少なくとも一つを用いて標的細胞が有する遺伝子を解析する工程とを少なくとも含むことを特徴としており、これにより光学的検出による標的細胞の数や特徴の解析、および標的細胞における遺伝子発現状況や遺伝子変異状況の解析を、ともに簡便に実施できる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】実施例で標的細胞（癌細胞）の濃縮に用いた遠心管を示す図である。
【図２】図１に示す遠心管を用いた、標的細胞（癌細胞）の濃縮を説明する図である。
【図３】図１に示す遠心管を用いた、標的細胞（癌細胞）の濃縮を説明する図である。
【図４】実施例で標的細胞の光学的検出に用いた細胞保持装置（基板）を示す図である。
【図５】図４に示す細胞保持装置（基板）を用いた、細胞の保持および光学的検出を示した図である。
【図６】実施例３の結果を示す図である。
【図７】実施例４の結果を示す図である。
【実施例】
【００３１】
以下、本発明を実施例に基づいて更に詳細に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００３２】
実施例１  試料中に含まれる癌細胞の濃縮および当該濃縮液の分割
（１）インフォームドコンセントを得て取得した健常者血液３ｍＬに約４００００個のヒト前立腺癌細胞（２２Ｒｖ１株またはＰＣ３株、ＤＳファーマバイオメディカル社）を添加し、懸濁させることで本実施例で用いる血液試料を調製した。
【００３３】
（２）以下に示す方法で、図１に示す遠沈管１００を使用して、（１）で調製した血液試料から癌細胞を濃縮した。なお図１に示す遠沈管１００を構成する部材のうち、下部筒状部材１１０は内径φ１０ｍｍ、縦５４ｍｍ、容量３ｍＬの底を有したポリプロピレン製部材である。また上部筒状部材１２０は縦７０ｍｍ、容量１５ｍＬのポリプロピレン製部材であり、内径は上面側（蓋１４０側）φ１８ｍｍ、下面側（連通開口端１３０側）φ２ｍｍであり、下面側先細り形状１２１の部分の傾斜角度は３０°である。
（２−１）下部筒状部材１１０に、密度が１．０８４ｇ／ｍＬの密度勾配溶液を３ｍＬ注入した。なお密度勾配溶液の液面高さは、上部筒状部材１２０の下面側（連通開口端１３０側）から約１ｍｍの位置（従って液面は、上側筒状部材１２０の内部に位置する）である。
（２−２）密度勾配溶液の上に、３ｍＬの血液試料と、３ｍＬの生理食塩水と、１８０μＬの０．５ｍｇ／ｍＬチロフィバンと、７５μＬの白血球結合剤（商品名ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ、ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）との混合液１５０を重層した（図２中、黒塗部分が重層した混合液１５０の部分である）。ここで添加する白血球結合剤は、血液試料中に含まれる癌細胞以外の夾雑細胞（赤血球、白血球）を互いに結合させるための試薬であり、前記夾雑細胞の密度を高くし、癌細胞との密度差を大きくすることで、遠沈管１００を用いた比重差分離により、高い回収率と選択性をもって癌細胞を分離できる。
（２−３）試料重層後、上部筒状部材１２０の上面を蓋１４０（ポリプロピレン製）で密閉し、２０００×ｇで１０分間、室温にて遠心分離した。当該遠心分離操作により、密度勾配溶液と試料の界面１６０の位置に癌細胞は維持された（図３）。
（２−４）蓋１４０を取り外すことなく上部筒状部材１２０を下部筒状部材１１０から切り離した後、蓋１４０をはずして密閉を開放することで、上部筒状部材１２０の連通開口端１３０側より密度勾配溶液の一部と界面１６０の位置に維持された細胞を流出させ、下方に設置した５０ｍＬチューブ（図示せず）で回収するとともに、上部筒状部材１２０の内壁を塩化アンモニウムを主成分とする赤血球破砕液で洗浄することで、上部筒状部材１２０の壁に付着した細胞も同時に回収した（図３）。
【００３４】
（３）回収した細胞の懸濁液に塩化アンモニウムを主成分とする赤血球破砕液を添加して３０ｍＬまでメスアップし、３００×ｇで１０分間室温にて遠心分離した。遠心分離後、ペレットの頂部の液体をピペットで取り出し、ペレット中の細胞を３００ｍＭのマンニトールを含む溶液３０ｍＬに再懸濁し、３００×ｇで５分間室温にて遠心分離した。当該操作は、血液成分を除去し、標的細胞を濃縮するための操作である。
【００３５】
（４）遠心分離した後、ペレットの頂部の液体をピペットで取出し、液量を約１．３ｍＬに調整した。ペレットをピペッティングにより懸濁し、懸濁液の半分（約０．６５ｍＬ）を光学的検出による細胞数の計数工程（後述の実施例２）へ、残りの半分（約０．６５ｍＬ）をｍＲＮＡ解析工程（後述の実施例３）へ、それぞれ供した。
【００３６】
実施例２  光学的検出による癌細胞数の計数
以下に示す方法で、実施例１で回収した細胞を、図４および５に示す細胞保持装置２００に保持した後、蛍光顕微鏡３００により癌細胞を光学的に検出した。細胞保持装置２００は、貫通孔２１１を有した平板状の絶縁膜２１０と、貫通孔２２１を有した平板状の遮光膜２２０と、導入口２３１、排出口２３２および貫通部２３３を有した平板状のスペーサ２３０と、遮光部材２２０の下面およびスペーサ２３０の上面と密着するよう設けた電極２４１・２４２と、電極２４１・２４２同士を接続する導線２５０と、電極２４１・２４２に信号を印加する交流電源２６０と、を備えた装置であり、貫通孔２１１、貫通孔２２１および遮光部材２１１の下部に密着して設けた電極２４１により、細胞を保持可能な保持部２７０が構成され、導入口２３１から細胞４００を含む試料を導入すると貫通部２３３を通じて保持部２７０へ細胞４００が導入される。なお本実施例で用いる細胞保持装置２００では、直径φ３０μｍ、深さ４０μｍの保持部２７０を約３０万個設けている。
【００３７】
（１）導入部２３１から、実施例１で回収した細胞の懸濁液を導入した後、交流電源２６０から各電極２４１・２４２に交流電圧（電圧２０Ｖｐｐ、周波数１ＭＨｚ、矩形波）を３分間印加し、誘電泳動力５００により前記細胞を保持部２７０に保持させた。
【００３８】
（２）導入部２３１から、０．０１％ポリ−Ｌ−リジンを含む３００ｍＭマンニトール水溶液を、前記交流電圧を印加しながら導入し、３分間静置後、前記交流電圧の印加を停止し、排出部２３２から前記水溶液を吸引除去した。
【００３９】
（３）導入部２３１から、５０％（ｖ／ｖ）エタノールと１％（ｗ／ｖ）ホルムアルデヒドを含む水溶液（以下、細胞膜透過試薬）を導入し、１０分間静置することで、細胞膜を透過させ、保持部に導入した細胞を標本化した。その後、導入部２３１から、細胞膜透過試薬を吸引除去し、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）を導入することで、残留した細胞膜透過試薬を洗浄した。
【００４０】
（４）導入部２３１から、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）標識抗サイトケラチン抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ製）（以下、ＣＫ−ＦＩＴＣと表記）、ＰＥ（フィコエリスリン）標識抗ＣＤ４５抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ製）（以下、ＣＤ４５−ＰＥと表記）およびＤＡＰＩ（４’，６−ＤｉＡｍｉｄｉｎｏ−２−ＰｈｅｎｙｌＩｎｄｏｌｅ）（０．５μｇ／ｍＬ）（同仁化学研究所製）を混合した細胞染色液８００μＬを導入し、細胞標識を行なった（２５℃、３０分）後、導入部２３１から、３００ｍＭマンニトール水溶液を導入することで洗浄した。
【００４１】
（５）保持部２７０に保持された全ての細胞４００を観察するために、コンピューター制御式電動ステージおよび電子増倍型冷却ＣＣＤカメラ（ＦＬＯＶＥＬ製ＡＤＴ−１００）を備えた蛍光顕微鏡３００（Ｏｌｙｍｐｕｓ製ＩＸ７１）を用いて全ての保持部２７０の明視野像および蛍光画像を撮影した。
【００４２】
（６）（５）で撮影した画像を解析ソフトウェアＬａｂＶＩＥＷ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ製）を用いて解析し、以下に示す条件に基づき、細胞を判別した。なおＤＡＰＩで染色されない（細胞核を有さない）細胞は、赤血球や死細胞片などの細胞核を有さない夾雑細胞のため解析ソフトウェア上で排除した。また保持部２７０には夾雑細胞である白血球が１０万から５０万個保持されていたが、標的細胞であるヒト前立腺癌細胞の検出に際しては妨げにならない量であった。
癌細胞（標的細胞）：ＤＡＰＩで染色され（細胞核を有し）、ＣＫ−ＦＩＴＣで染色され（サイトケラチンを発現し）、かつＣＤ４５−ＰＥでは染色されない（ＣＤ４５を発現しない）細胞
白血球（夾雑細胞）：ＤＡＰＩで染色され（細胞核を有し）、ＣＫ−ＦＩＴＣでは染色されず（サイトケラチンを発現しない）、かつＣＤ４５−ＰＥでは染色される（ＣＤ４５を発現する）細胞
本方法による検出結果を、表１に示す。健常者血液に添加された標的癌細胞を光学的に検出できた。
【００４３】
【表１】
2018157812.tif 000003
実施例３  癌細胞のｍＲＮＡ解析
以下に示す方法で、実施例１で回収した癌細胞濃縮液からアンドロゲン受容体スプライスバリアント７（ＡＲ−Ｖ７）のｍＲＮＡ解析を行なった。
【００４４】
（１）実施例１で回収した癌細胞濃縮液を、３００×ｇで５分間室温にて遠心分離し、上清を除去した。回収した細胞より、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  ＲＮＡ  ＸＳ（マッハライ・ナーゲル製）を用いて、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。２２Ｒｖ１株を添加した試料より７７ｎｇ／μＬのＲＮＡが、ＰＣ３株を添加した試料より５６ｎｇ／μＬのＲＮＡが、それぞれ得られた。
【００４５】
（２）（１）で抽出したｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ４００ｎｇを鋳型として、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＶ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）によりｃＤＮＡを合成した。プライマーにはランダムヘキサマーを使用した。
【００４６】
（３）下記反応液を調製し、ＰＣＲ法によりＡＲ−Ｖ７およびβ−アクチンのｃＤＮＡを増幅した。ＰＣＲ法による増幅反応は、以下の温度条件で実施した。なお、ＡＲ−Ｖ７の増幅はＡｎｔｏｎａｒａｋｉｓ  ＥＳ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３７１，１０２８−１０３８（２０１４）を、β−アクチンの増幅はＧｕｏ  Ｚ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ，１０，３０９−３１９（２００６）を参照した。
（反応液組成）
ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ社）  ０．１μＬ
１０×  ＥｘＴａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２μＬ
ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  １．６μＬ
ｃＤＮＡ  ２μＬ
各５μＭ  Ｆｏｒｗａｒｄ／Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ（表２）  各２μＬ
滅菌蒸留水  １０．３μＬ
【００４７】
【表２】
2018157812.tif 000004
（増幅反応の温度条件）
９８℃で１０秒間：１サイクル
９８℃で１０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間：３０サイクル
７２℃で３０秒間：１サイクル
（４）ＤＮＡの増幅を、アガロースゲル電気泳動で確認した。
【００４８】
結果（電気泳動写真）を図６に示す。ＡＲ−Ｖ７陽性細胞株として知られる２２Ｒｖ１株を添加した試料では、ＡＲ−Ｖ７の増幅に起因するバンドが確認された。一方で、ＡＲ−Ｖ７陰性細胞株として知られるＰＣ３株を添加した試料では、ＡＲ−Ｖ７の増幅は確認されなかった。
【００４９】
以上の結果から、標的細胞の濃縮液を分割することで、試料中の標的細胞の光学的検出と、標的細胞の遺伝子解析とを、ともに実施することができた。
実施例４  癌細胞濃縮工程における白血球結合剤の添加
以下に示す方法で、癌細胞濃縮工程における白血球結合剤添加の効果を検証した。
【００５０】
（１）実施例１に示す方法で、２２Ｒｖ１株を添加した血液試料中に含まれる癌細胞の濃縮および当該濃縮液の分割を行った。ただし、実施例１（２−２）の工程で添加する白血球結合剤の量は、それぞれ０μＬ、７５μＬ、１５０μＬとした。
【００５１】
（２）実施例３に示す方法で、（１）で回収した癌細胞濃縮液からアンドロゲン受容体スプライスバリアント７（ＡＲ−Ｖ７）のｍＲＮＡ解析を行なった。ただし、実施例３（４）の工程は、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  バイオアナライザおよびＡｇｉｌｅｎｔ  ＤＮＡ１０００キット（アジレント・テクノロジー製）を用いて行なった。
【００５２】
バイオアナライザによるＡＲ−Ｖ７  ＰＣＲ産物の定量結果を図７に示す。白血球結合剤を添加しない条件（０μＬ）と比較し、白血球結合剤を添加した条件（７５μＬ）および、さらに増量した条件（１５０μＬ）で、効率的にＰＣＲ産物が増幅されていることがわかる。以上の結果から、血液試料中に含まれる癌細胞（腫瘍細胞）を濃縮する工程を白血球結合剤を添加した比重差分離法で行なうことで、癌細胞濃縮液中の夾雑白血球数が低減し当該白血球由来の夾雑ＲＮＡが減少するため、遺伝子解析工程において癌細胞（２２Ｒｖ１株）に存在する目的遺伝子（ＡＲ−Ｖ７）の増幅を効率的に行なえることがわかる。
【符号の説明】
【００５３】
１００：遠沈管
１１０・１２０：筒状部材
１２１：先細り形状
１３０：連通開口端
１４０：蓋
１５０：標的細胞を含む試料
１６０：標的細胞を含む画分
２００：細胞保持装置
２１０：絶縁膜
２１１：貫通孔
２２０：遮光膜
２２１：貫通孔
２３０：スペーサ
２３１：導入口
２３２：排出口
２３３：貫通部
２４１・２４２：電極
２５０：導線
２６０：交流電源
２７０：保持部
３００：蛍光顕微鏡
４００：細胞
５００：誘電泳動力
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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