(57)【要約】      （修正有）【課題】簡便にカルボン酸化合物及びその誘導体のラベル体を作成する方法、種々の脂肪酸等カルボン酸化合物の測定精度の高い定量方法を提供する。【解決手段】（１）定量すべきカルボン酸化合物を、酸性条件下でＨ２１８Ｏとともに加熱処理をすることによりカルボン酸化合物の１８Ｏによるラベル体を得、カルボン酸化合物のラベル体及び未反応のカルボン酸化合物を溶媒抽出することにより、有機溶媒中にカルボン酸化合物の１８Ｏによるラベル体を含むカルボン酸化合物溶液を得る工程、（２）工程１で得られたカルボン酸化合物の１８Ｏによるラベル体及び未反応体の生成比を求める工程、（３）得られた該カルボン酸化合物の１８Ｏによるラベル体を含むカルボン酸化合物溶液を用い検量線を作成する工程、（４）測定試料のＬＣ−ＭＳ分析を行う工程、（５）測定試料中の各カルボン酸化合物の濃度を定量する工程、からなる試料中のカルボン酸化合物の定量方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体クロマトグラフ−質量分析装置（ＬＣ−ＭＳ）を用いたカルボン酸化合物の定量分析方法であって、
下記工程（１）〜（５）、
（１）定量すべきカルボン酸化合物について、酸性条件下に、カルボン酸化合物をＨ２１８Ｏとともに加熱処理をすることによりカルボン酸化合物の１８Ｏによるラベル体を得、カルボン酸化合物のラベル体及び未反応のカルボン酸化合物を溶媒抽出することにより、有機溶媒中にカルボン酸化合物の１８Ｏによるラベル体を含むカルボン酸化合物溶液を得る工程、
（２）前記工程で得られたカルボン酸化合物の１８Ｏによるラベル体を含むカルボン酸化合物溶液中のカルボン酸化合物のラベル体及び未反応体の生成比を求める工程、
（３）カルボン酸化合物と、工程（１）で得られた該カルボン酸化合物の１８Ｏによるラベル体を含むカルボン酸化合物溶液を用い、定量すべきカルボン酸化合物の検量線を作成する工程、
（４）測定試料のＬＣ−ＭＳ分析を行う工程、
（５）測定試料中の各カルボン酸化合物の濃度を、ＬＣ−ＭＳ分析でのピーク面積の値と前記カルボン酸化合物の検量線及び測定試料の希釈倍率から、カルボン酸化合物を定量する工程、
からなる、試料中のカルボン酸化合物の定量方法。
【請求項２】
前記定量すべきカルボン酸化合物が１種以上であり、夫々のカルボン酸化合物について前記（１）乃至（３）の工程を行うものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記カルボン酸化合物が脂肪酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
カルボン酸化合物の標準品としての前記カルボン酸化合物の１８Ｏによるラベル体が、カルボキシル基の酸素原子の２原子が酸素−１８（１８Ｏ）で標識されているカルボン酸化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
カルボン酸化合物の標準品としての前記カルボン酸化合物の１８Ｏによるラベル体が、カルボキシル基の酸素原子の１原子が酸素−１８（１８Ｏ）で標識されているカルボン酸化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記工程（４）のＬＣ−ＭＳ分析を行う前に、前記測定該試料中のカルボン酸化合物がアルコール類を用いて抽出操作されるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
酸性条件下に、カルボン酸化合物とＨ２１８Ｏとともに加熱処理をすることによりカルボン酸化合物の１８Ｏによるラベル体を得、該カルボン酸化合物のラベル体及び未反応のカルボン酸化合物を溶媒抽出することにより、有機溶媒中にカルボン酸化合物のラベル体を含むカルボン酸化合物溶液を得る工程からなる、カルボン酸化合物のカルボキシル基中の酸素原子を酸素−１８（１８Ｏ）で標識する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、安定同位体ラベルを用いたカルボン酸化合物及びその誘導体の定量方法に関し、より詳細には、簡便な安定同位体ラベルカルボン酸化合物の合成方法、及び該ラベルカルボン酸化合物を用いた試料中のカルボン酸化合物の定量方法、より詳細には、生体試料中の脂肪酸の定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂肪酸は、その鎖長及び不飽和度が多種多様であり、生体内において様々な代謝を受ける。このため、生体試料中には多種多様の脂肪酸が存在し、医療、薬学分野等においてその病態、生理機能の解明には、その各々の脂肪酸を同定及び定量する必要がある。
【０００３】
従来は、種々の物質の定量には、液体クロマトグラフ−質量分析計（ＬＣ−ＭＳ）やガスクロマトグラフ−質量分析計（ＧＣ−ＭＳ）等の、質量分析計を用いた定量が行われ、脂肪酸等のカルボン酸化合物を有する物質についてもその手法が用いられている。例えば、生体試料中の脂肪酸は、Ｆｏｌｃｈ法によって脂質を抽出し、メタノリシスによってメチルエステル体とした後、ＧＣ−ＦＩＤ法で定量する方法が知られている。しかしながら、この手法は生体試料中に種々存在する内因性の脂肪酸から目的とする成分を分離する必要があるため、約３０分の測定時間を必要としていた（非特許文献１）。
非特許文献１には、高い選択性と高い感度を有するＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用い、ヒト血漿中のアラキドン酸、エイコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸を同時に定量する方法が記載されている。当該定量方法において、内標準物質には、アラキドン酸の重水素標識体を用いる。このように、重水素標識体や１３Ｃ標識体等の標準試薬は市販されているものも多い。
【０００４】
しかしながら、生体試料等において測定対象となる脂肪酸は多種多様であり、市販されていないカルボン酸化合物ラベル体も多いのが現状である。
【０００５】
特許文献１には、質量分析装置を用いた代謝酵素群の一斉タンパク質定量に用いるペプチドが記載されている。特許文献１には、ペプチドを構成するアミノ酸の１個以上が、１５Ｎ、１３Ｃ，１８Ｏ及び２Ｈの何れか１以上を含む安定同位体標識ペプチドが用いられ得ることが記載されている。しかし、各試料の標準品を提供することを目的としているわけではなく、実際に１８Ｏ標識体を使用することの言及は無い。
また、特許文献２には、酸素同位体標識ペプチドとしてカルボキシル基含有化合物の酸素原子を１８Ｏの酸素同位体でラベルする方法が記載されている。
しかし、前者は、ペプチド中のアミノ酸分子におけるカルボキシル基の標識を目的とするものであり、後者は、種々の脂肪酸の１８Ｏの酸素同位体の標識に用い得るものではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第５２９９９５６号明細書
【特許文献２】特許第３７５３３８３号明細書
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】桜井周、Ｔｈｅ  ＴＲＣ  Ｎｅｗｓ第１０７巻、Ａｐｒ．第３１−３２頁（２００９年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述のように、生体試料等において測定対象となる脂肪酸は多種多様であり、市販されていないカルボン酸化合物ラベル体も多い現状に鑑み、種々のカルボン酸化合物、即ち脂肪酸を網羅的に定量可能とする、より広範な種々の１８Ｏによるラベル脂肪酸を得る方法として、より簡便な方法が望まれる。
さらに、種々のカルボン酸化合物ラベル体を得るための簡便な方法に加えて、試料中の種々のカルボン酸化合物の夫々を精度良く同定し定量する方法の開発が望まれる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
かかる課題を解決すべく、本発明者らは鋭意研究を重ね、以下の発明に至った。
即ち、本発明は、
＜１＞  液体クロマトグラフ−質量分析装置（ＬＣ−ＭＳ）を用いたカルボン酸化合物の定量分析方法であって、
下記工程（１）〜（５）、
（１）定量すべきカルボン酸化合物について、酸性条件下に、カルボン酸化合物をＨ２１８Ｏとともに加熱処理をすることによりカルボン酸化合物の１８Ｏによるラベル体を得、カルボン酸化合物のラベル体及び未反応のカルボン酸化合物を溶媒抽出することにより、有機溶媒中にカルボン酸化合物の１８Ｏによるラベル体を含むカルボン酸化合物溶液を得る工程、
（２）前記工程で得られたカルボン酸化合物の１８Ｏによるラベル体を含むカルボン酸化合物溶液中のカルボン酸化合物のラベル体及び未反応体の生成比を求める工程、
（３）カルボン酸化合物と、工程（１）で得られた該カルボン酸化合物の１８Ｏによるラベル体を含むカルボン酸化合物溶液を用い、定量すべきカルボン酸化合物の検量線を作成する工程、
（４）測定試料のＬＣ−ＭＳ分析を行う工程、
（５）測定試料中の各カルボン酸化合物の濃度を、ＬＣ−ＭＳ分析でのピーク面積の値と前記カルボン酸化合物の検量線及び測定試料の希釈倍率から、カルボン酸化合物を定量する工程、
からなる、試料中のカルボン酸化合物の定量方法。
＜２＞  前記定量すべきカルボン酸化合物が１種以上であり、夫々のカルボン酸化合物について前記（１）乃至（３）の工程を行うものである、＜１＞に記載の方法。
＜３＞  前記カルボン酸化合物が脂肪酸である、＜１＞に記載の方法。
＜４＞  カルボン酸化合物の標準品としての前記カルボン酸化合物の１８Ｏによるラベル体が、カルボキシル基の酸素原子の２原子が酸素−１８（１８Ｏ）で標識されているカルボン酸化合物である、＜１＞に記載の方法。
＜５＞  カルボン酸化合物の標準品としての前記カルボン酸化合物の１８Ｏによるラベル体が、カルボキシル基の酸素原子の１原子が酸素−１８（１８Ｏ）で標識されているカルボン酸化合物である、＜１＞に記載の方法。
＜６＞  前記工程（４）のＬＣ−ＭＳ分析を行う前に、前記測定該試料中のカルボン酸化合物がアルコール類を用いて抽出操作されるものである、＜１＞に記載の方法。
＜７＞  酸性条件下に、カルボン酸化合物とＨ２１８Ｏとともに加熱処理をすることによりカルボン酸化合物の１８Ｏによるラベル体を得、該カルボン酸化合物のラベル体及び未反応のカルボン酸化合物を溶媒抽出することにより、有機溶媒中にカルボン酸化合物のラベル体を含むカルボン酸合物溶液を得る工程からなる、カルボン酸化合物のカルボキシル基中の酸素原子を酸素−１８（１８Ｏ）で標識する方法、
からなる。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、酸素の安定同位体（１８Ｏ）を導入する方法を見出し、簡便にカルボン酸化合物及びその誘導体夫々のラベル体を作成する方法を提供し、さらに種々の脂肪酸等カルボン酸化合物の定量にこれを使用することにより、ＬＣ−ＭＳ分析法において測定精度の高いカルボン酸化合物の定量方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】種々の脂肪酸（Ｃ８乃至Ｃ１７）のそれぞれの８、４０、２００及び１０００ｎｇ／ｍＬにおける検量線を示す図である。
【図２】種々の脂肪酸（Ｃ１８乃至Ｃ２１）のそれぞれの８、４０、２００及び１０００ｎｇ／ｍＬにおける検量線を示す図である。
【図３】種々の脂肪酸（Ｃ２２乃至Ｃ３０）のそれぞれの８、４０、２００及び１０００ｎｇ／ｍＬにおける検量線を示す図である。
【図４】本発明による脂肪酸のそれぞれの８、４０、２００及び１０００ｎｇ／ｍＬにおける検量線（図１の検量線の１８Ｏ２ラベル体補正）を示す図である。
【図５】本発明による脂肪酸のそれぞれの８、４０、２００及び１０００ｎｇ／ｍＬにおける検量線（図２の検量線の１８Ｏ２ラベル体補正）を示す図である。
【図６】本発明による脂肪酸のそれぞれの８、４０、２００及び１０００ｎｇ／ｍＬにおける検量線（図３の検量線の１８Ｏ２ラベル体補正）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
次に、本発明の方法の各手段について述べる。
本発明の方法は、下記工程：
（１）カルボン酸化合物の１８Ｏによるラベル体を合成する工程、
（２）前記工程で得られたカルボン酸化合物の１８Ｏによるラベル体を含むカルボン酸化合物溶液中のカルボン酸化合物のラベル体及び未反応体の生成比を求める工程、
（３）得られた該カルボン酸化合物の１８Ｏによるラベル体を含むカルボン酸化合物溶液を用い、定量すべきカルボン酸化合物の検量線を作成する工程、
（４）測定試料のＬＣ−ＭＳ分析を行う工程、
（５）測定試料中の各カルボン酸化合物の濃度を定量する工程、
からなる。
【００１３】
本発明の工程（１）は、カルボン酸化合物のラベル体を合成する工程である。
該カルボン酸化合物のラベル体を合成する工程は、酸性条件下に、カルボン酸化合物とＨ２１８Ｏとともに加熱処理をすることによりカルボン酸化合物の１８Ｏによるラベル体を得、該カルボン酸化合物のラベル体及び未反応のカルボン酸化合物を溶媒抽出することにより、有機溶媒中にカルボン酸化合物のラベル体を含むカルボン酸合物溶液を得る工程からなる、カルボン酸化合物のカルボキシル基中の酸素原子を酸素−１８（１８Ｏ）で標識する方法である。
一つの態様として、本発明によるカルボン酸化合物のラベル体を合成する方法により合成される該カルボン酸化合物の１８Ｏによるラベル体は、カルボキシル基の酸素原子の２原子が酸素−１８（１８Ｏ）で標識されているカルボン酸化合物である。
他の態様として、本発明によるカルボン酸化合物のラベル体を合成する方法により合成される該カルボン酸化合物の１８Ｏによるラベル体は、カルボキシル基の酸素原子の１原子が酸素−１８（１８Ｏ）で標識されているカルボン酸化合物である。
【００１４】
具体的には本発明による方法の工程（１）のカルボン酸化合物の１８Ｏによるラベル体は、以下によって得られる。
ラベルするべき脂肪酸をメタノール等に溶解する。これをガラスバイアルに分取し、所定量のＨ２１８Ｏ（例えば、濃度９８ａｔｏｍ％）、濃硫酸及びアセトニトリルと混合後、ブロックヒーターを用いて加熱処理する。これを室温まで冷却後、０．５規定水酸化カリウムエタノール溶液を加え、遠心濃縮機で乾固する。乾固後１規定塩酸及びヘキサンを加えて振とうし、上層を回収する。この抽出による回収操作を繰り返す。窒素ガス気流下でヘキサンを除去し、アセトニトリルに再溶解して脂肪酸１８Ｏ２安定同位体ラベル溶液を調製する。
【００１５】
該反応における酸性条件は、ｐＨ３以下が好ましく、ｐＨ１以下がより好ましい。
該加熱条件としては、例えば、６０℃乃至８０℃が好ましく、８０℃、例えば、８０℃で３時間程度がより好ましい。
【００１６】
その他の態様として、カルボン酸化合物ラベル体の合成に用いる出発物質は、カルボン酸エステル、酸無水物、酸アミド、ニトリル、酸塩化物、Ｇｒｉｇｎａｒｄ試薬、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アルケニルがあり得、これらによりカルボン酸の酸素原子を１８Ｏで標識し、本発明の定量方法に利用可能である。
【００１７】
本発明の方法に係るカルボン酸化合物ラベル体合成方法により合成されるカルボン酸化合物は、１価又は多価カルボン酸であり、短鎖脂肪酸、中鎖脂肪酸及び長鎖脂肪酸を包含し、好ましくは、例えば、Ｃ８：０、Ｃ９：０、Ｃ１０：０、Ｃ１１：０、Ｃ１２：０、Ｃ１３：０、Ｃ１４：０、Ｃ１４：１ｎ−５，Ｃ１５：０、Ｃ１５：１ｎ−５、Ｃ１６：０、Ｃ１６：１ｎ−７、Ｃ１７：０、Ｃ１７：１ｎ−７、Ｃ１８：０、Ｃ１８：１ｎ−９、Ｃ１８：２ｎ−６、Ｃ１８：３ｎ−３、Ｃ１８：４ｎ−３、Ｃ１９：０、Ｃ１９：１ｎ−９、Ｃ２０：０、Ｃ２０：１ｎ−９、Ｃ２０：２ｎ−６、Ｃ２０：３ｎ−６、Ｃ２０：４ｎ−６、Ｃ２０：５ｎ−３、Ｃ２１：０、Ｃ２１：１ｎ−９、Ｃ２１：５ｎ−３、Ｃ２２：０、Ｃ２２：１ｎ−９、Ｃ２２：２ｎ−６、Ｃ２２：３ｎ−３、Ｃ２２：４ｎ−６、Ｃ２２：５ｎ−３、Ｃ２２：６ｎ−３、Ｃ２３：０、Ｃ２３：１ｎ−９、Ｃ２４：０、Ｃ２４：１ｎ−９、Ｃ２４：５ｎ−３、Ｃ２４：６ｎ−３、Ｃ２５：０、Ｃ２６：０、Ｃ２７：０、Ｃ２８：０、Ｃ２９：０、及びＣ３０：０（上記表示は、数値表現で示される。）等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００１８】
本発明の方法に係るカルボン酸化合物ラベル体合成方法により合成されるカルボン酸化合物は、より具体的には、例えば、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ウンデカン酸、ラウリン酸、トリデカン酸、ミリスチン酸、ミリストレイン酸、ペンタデカン酸、ペンタデセン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、マルガリン酸、ヘプタデセン酸、ステアリン酸、オレイン酸、エライジン酸、リノール酸、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、ステアリドン酸、ノナデカン酸、ノナデセン酸、アラキジン酸、ゴンド酸、エイコサジエン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ヘンイコシル酸、エルカ酸、ヘンエイコサペンタエン酸、ベヘン酸、エルカ酸、ドコサジエン酸、ドコサトリエン酸、アドレン酸、イワシ酸、ドコサヘキサエン酸、トリコサン酸、トリコセン酸、リグノセリン酸、ネルボン酸、テトラコサペンタエン酸、ニシン酸、ペンタコサン酸、セロチン酸、ヘプタコサン酸、モンタン酸、ノナコサン酸、及びメリシン酸等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００１９】
本発明の方法に係るカルボン酸化合物ラベル体合成方法により合成されるカルボン酸化合物はまた、これらの他に、本発明の方法に用いる脂肪酸は、直鎖であっても、分枝でもよく、該鎖上において任意の置換基、例えば、ハロゲン原子、Ｃ２−９ヘテロシクリル基（任意の置換基により置換されていても良い）及びＣ２−１４アリール基（任意の置換基により置換されていても良い）から単独又は異なって選ばれる１つ以上の置換基で置換されていても良い。
【００２０】
工程（１）に使用する溶媒としては、例えば、エタノール、メタノール等のアルコール類、アセトニトリル、その他反応化合物を溶解可能な溶媒が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２１】
本発明の工程（２）は、前記工程で得られたカルボン酸化合物のラベル及び非ラベル体の生成比を測定する工程である。これにより、次の工程（３）において検量線を作成し、最終的に測定試料のカルボン酸化合物の定量を行うものである。
【００２２】
カルボン酸化合物の１８Ｏラベル体（１つの酸素原子の１８Ｏのラベル体）、及び１８Ｏ２ラベル体（２つの酸素原子の１８Ｏのラベル体）の生成比について、本発明の工程（１）によれば、反応後における非ラベル体（未反応のカルボン酸化合物）、１８Ｏラベル体及び１８Ｏ２ラベル体のピーク面積比は、１８Ｏラベル体及び１８Ｏ２ラベル体が、合わせて約９９％、好ましくは１００％であり、非ラベル体のピーク面積比が約２％、好ましくは検出下限未満の割合で得られる。
他の好ましい態様においては、１８Ｏラベル体及び１８Ｏ２ラベル体のピーク面積比は、１８Ｏラベル体及び１８Ｏ２ラベル体が夫々約７％及び約９０％、好ましくは何れか一方が１００％であり、非ラベル体のピーク面積比が約２％、好ましくは検出下限未満の割合で得られる。
【００２３】
本発明において用いられるＨＰＬＣ装置としては、例えば、高圧グラジエントシステムを備えるＨＰＬＣシステムが挙げられる。また、使用するカラムとしては、任意の市販のＯＤＳ系カラムが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
例えば、ＨＰＬＣにはＰｒｏｍｉｎｅｎｃｅ  ＸＲ（島津製作所社製）、カラムにはＬ−ｃｏｌｕｍｎ２  ＯＤＳ（１５０ｍｍ×２．１ｍｍ  Ｉ．Ｄ．，粒子径２μｍ）を用い、カラム温度を４０℃とする。溶離液はＡ：超純水／メタノール（９／１，ｖ／ｖ）−０．５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸アンモニウム−０．５ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム溶液、Ｂ：アセトニトリル、Ｃ：アセトンを使用し、Ｂ（％）＝２８％（０ｍｉｎ）−９３％（１２ｍｉｎ）−２％（１２−２２ｍｉｎ）、Ｃ（％）＝２％（０−１２ｍｉｎ）−９３％（１７−２２ｍｉｎ）のグラジエント条件により流量０．３ｍＬ／ｍｉｎで送液する。試料の注入量は３ μＬとする。
しかしながら、上記は一態様にすぎず、本発明に用いられる測定条件はこれに限られるものではない。
【００２４】
本発明において用いる質量分析計は特に限定されない。
機器及び測定条件の一例としては、例えば、ＭＳにはＬＴＱ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＸＬ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用い、分解能３０，０００（ｍ／ｚ  ４００）、ｍ／ｚ  １４０−４６０の範囲でスキャン測定することにより脂肪酸の脱プロトン化分子（［Ｍ−Ｈ］−）を検出する。検出限界はＳ／Ｎ＝３とする。しかしながら、本発明に用いられる測定条件はこれに限られるものではない。
【００２５】
ＨＰＬＣ−ＭＳ分析に供する試料の溶解に使用する溶媒としては、ＨＰＬＣの溶離液に用いられるものと同様な溶媒、例えば、エタノール、メタノール、アセトニトリル、アセトンその他反応化合物を溶解可能な溶媒が挙げられる。
【００２６】
本発明の工程（３）は、（２）で得られたカルボン酸化合物のラベル体溶液とカルボン酸化合物を用い、検量線を作成する工程である。
【００２７】
上記のカルボン酸化合物の１８Ｏによるラベル体が得られた溶液にカルボン酸化合物の濃度が段階的になるように各濃度の溶液を調整する。該濃度としては、カルボン酸化合物が夫々１乃至１０００ｎｇ／ｍＬ、例えば、８ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ及び１０００ｎｇ／ｍＬとなるよう溶解し調製する。その後上記ＨＰＬＣ−ＭＳ分析に供する。分析の結果、得られたピーク面積値を１８Ｏ２ラベル体のピーク面積値で除した後、検量線を作成する。
検量線作成に用いるカルボン酸化合物のラベル体は、１８Ｏ２ラベル体又は１８Ｏラベル体であり、好ましくは、１８Ｏ２ラベル体である。
【００２８】
本発明の工程（４）は、測定試料の分析を行う工程である。
分析方法は、工程（２）で用いた、ＨＰＬＣ−ＭＳの測定方法と同様である。
【００２９】
なお、本発明による方法に供する被験物質は、例えば、マウス血漿からメタノール及び／又はクロロホルムにより抽出後、窒素ガス気流下で有機溶媒を除去し、適切な溶媒に再溶解して所定の濃度とする。該溶媒としては例えば、メタノール等のアルコール類が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３０】
測定可能な生体試料としては、動植物由来の組織や体液、臓器、大腸菌をはじめとした微生物が挙げられ、例えば血液、血漿を測定対象とし得る。その他、本発明の方法の対象となる測定可能な試料として、食品、油脂、培地等も測定可能であるが、これらに限定されるものではない。
【００３１】
本発明の工程（５）は、測定試料中の各カルボン酸化合物の濃度を定量する工程である。前記工程（３）で得られた検量線及び測定試料の希釈倍率から、試料中の各カルボン酸化合物の濃度を求めることができる。
【００３２】
以上のように、本発明によれば、種々の標準品を用いて測定するため精度の高いカルボン酸化合物の定性及び定量方法を提供することが可能である。
【実施例】
【００３３】
以下、本発明を実施例に基づき詳細に説明する。
【００３４】
試薬
種々のカルボン酸化合物（脂肪酸）は、東京化成工業株式会社、和光純薬工業株式会社、Ｌａｒｏｄａｎ社、ＳＲＬ社、シグマアルドリッチ社、Ｎｕ−ｃｈｅｋ  ｐｒｅｐ社、ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社及びＣａｙｍａｎ  ｃｈｅｍｉｃａｌ社より入手した。
Ｈ２１８Ｏ（９８ａｔｏｍ％）は、大陽日酸株式会社より入手した。
その他の試薬は、ＬＣ／ＭＳ用、ＨＰＬＣ用及び試薬特級を用いた。
【００３５】
実施例１
脂肪酸１８Ｏ２安定同位体ラベルの作成
種々の脂肪酸（Ｃ８：０、Ｃ９：０、Ｃ１０：０、Ｃ１１：０、Ｃ１２：０、Ｃ１３：０、Ｃ１４：０、Ｃ１４：１ｎ−５、Ｃ１５：０、Ｃ１５：１ｎ−５、Ｃ１６：０、Ｃ１６：１ｎ−７、Ｃ１７：０、Ｃ１７：１ｎ−７、Ｃ１８：０、Ｃ１８：１ｎ−９、Ｃ１８：２ｎ−６、Ｃ１８：３ｎ−３、Ｃ１８：４ｎ−３、Ｃ１９：０、Ｃ１９：１ｎ−９、Ｃ２０：０、Ｃ２０：１ｎ−９、Ｃ２０：２ｎ−６、Ｃ２０：３ｎ−６、Ｃ２０：４ｎ−６、Ｃ２０：５ｎ−３、Ｃ２１：０、Ｃ２１：１ｎ−９、Ｃ２１：５ｎ−３、Ｃ２２：０、Ｃ２２：１ｎ−９、Ｃ２２：２ｎ−６、Ｃ２２：３ｎ−３、Ｃ２２：４ｎ−６、Ｃ２２：５ｎ−３、Ｃ２２：６ｎ−３、Ｃ２３：０、Ｃ２３：１ｎ−９、Ｃ２４：０、Ｃ２４：１ｎ−９、Ｃ２４：５ｎ−３、Ｃ２４：６ｎ−３、Ｃ２５：０、Ｃ２６：０、Ｃ２７：０、Ｃ２８：０、Ｃ２９：０及びＣ３０：０）を各濃度が１０μｇ/ｍＬとなるようメタノールに溶解した。これをガラスバイアルに１０μＬ分取し、Ｈ２１８Ｏ  １００μＬ、濃硫酸１μＬ及びアセトニトリル１００μＬと混合後、ブロックヒーターを用いて８０℃で３時間加熱した。これを室温まで冷却後、０．５規定水酸化カリウムエタノール溶液２００μＬを加え、遠心濃縮機で乾固した。乾固後１規定塩酸１００μＬ及びヘキサンを１００μＬ加えて振とうし、上層を回収した。回収操作は更に２回繰り返した。窒素ガス気流下でヘキサンを除去し、アセトニトリル１００μＬに再溶解して脂肪酸１８Ｏ２安定同位体ラベル溶液を調製した。
【００３６】
実施例２
ＨＰＬＣ分析条件
ＨＰＬＣにはＰｒｏｍｉｎｅｎｃｅ  ＸＲ（島津製作所社製）、カラムにはＬ−ｃｏｌｕｍｎ２  ＯＤＳ（１５０ｍｍ×２．１ｍｍ  Ｉ．Ｄ．、粒子径２μｍ（化学物質評価研究機構製）を用い、カラム温度を４０℃とした。溶離液はＡ：超純水／メタノール（９／１，ｖ／ｖ）−０．５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸アンモニウム−０．５ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム溶液、Ｂ：アセトニトリル、Ｃ：アセトンを使用し、Ｂ（％）＝２８％（０ｍｉｎ）−９３％（１２ｍｉｎ）−２％（１２−２２ｍｉｎ）、Ｃ（％）＝２％（０−１２  ｍｉｎ）−９３％（１７−２２  ｍｉｎ）のグラジエント条件により流量０．３  ｍＬ／ｍｉｎで送液した。試料の注入量は３μＬとした。
質量分析
質量分析計にはＬＴＱ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＸＬ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用い、分解能３０，０００（ｍ／ｚ  ４００）、ｍ／ｚ  １４０−４６０の範囲でスキャン測定することにより脂肪酸の脱プロトン化分子（［Ｍ−Ｈ］−）を検出した。検出限界はＳ／Ｎ＝３とした。
【００３７】
実施例３
実施例１で合成した脂肪酸１８Ｏ２安定同位体ラベル溶液の１８Ｏラベル体及び１８Ｏ２ラベル体の生成比の分析
実施例１で得られた溶液をメタノールで１０倍希釈し、実施例２に記載の条件で分析に供した。Ｓｏｌｖｅｎｔ  Ｂｌａｎｋのピーク面積値差し引き後の非ラベル体、１８Ｏラベル体及び１８Ｏ２ラベル体のピーク面積比を比較することでラベル体の生成比を確認した。
反応試料における非ラベル体、１８Ｏラベル体及び１８Ｏ２ラベル体のピーク面積比を表１−１、表１−２及び表１−３に示す。一部の脂肪酸（Ｃ１４：０，Ｃ１６：０，Ｃ１８：１ｎ−９）を除いて非ラベル体のピーク面積比は５％未満であった。
【００３８】
表１−１．反応試料における非ラベル体、１８Ｏラベル体及び１８Ｏ２ラベル体のピーク面積比．
【表１】
2018025479.tif 000003
N.D.：不検出
【００３９】
表１−２．反応試料における非ラベル体、１８Ｏラベル体及び１８Ｏ２ラベル体のピーク面積比．
【表２】
2018025479.tif 000004
N.D.：不検出
【００４０】
表１−３．反応試料における非ラベル体、１８Ｏラベル体及び１８Ｏ２ラベル体のピーク面積比．
【表３】
2018025479.tif 000005
N.D.：不検出
【００４１】
実施例４
ＬＣ−ＭＳ及び１８Ｏ２ラベル体を用いた脂肪酸４９成分の検量線作成
以下の脂肪酸、Ｃ８：０、Ｃ９：０、Ｃ１０：０、Ｃ１１：０、Ｃ１２：０、Ｃ１３：０、Ｃ１４：０、Ｃ１４：１ｎ−５、Ｃ１５：０、Ｃ１５：１ｎ−５、Ｃ１６：０、Ｃ１６：１ｎ−７、Ｃ１７：０、Ｃ１７：１ｎ−７、Ｃ１８：０、Ｃ１８：１ｎ−９、Ｃ１８：２ｎ−６、Ｃ１８：３ｎ−３、Ｃ１８：４ｎ−３、Ｃ１９：０、Ｃ１９：１ｎ−９、Ｃ２０：０、Ｃ２０：１ｎ−９、Ｃ２０：２ｎ−６、Ｃ２０：３ｎ−６、Ｃ２０：４ｎ−６、Ｃ２０：５ｎ−３、Ｃ２１：０、Ｃ２１：１ｎ−９、Ｃ２１：５ｎ−３、Ｃ２２：０、Ｃ２２：１ｎ−９、Ｃ２２：２ｎ−６、Ｃ２２：３ｎ−３、Ｃ２２：４ｎ−６、Ｃ２２：５ｎ−３、Ｃ２２：６ｎ−３、Ｃ２３：０、Ｃ２３：１ｎ−９、Ｃ２４：０、Ｃ２４：１ｎ−９、Ｃ２４：５ｎ−３、Ｃ２４：６ｎ−３、Ｃ２５：０、Ｃ２６：０、Ｃ２７：０、Ｃ２８：０、Ｃ２９：０及びＣ３０：０の実施例１で得られた溶液をメタノールで１０倍希釈した溶液に、対応する各脂肪酸を濃度が８、４０、２００及び１０００ｎｇ／ｍＬとなるよう夫々添加し溶解した後、実施例２に記載の条件で分析に供した。得られたピーク面積値を１８Ｏ２ラベル体のピーク面積値で除した後、検量線を作成した。
【００４２】
結果
各脂肪酸の８、４０、２００及び１０００ｎｇ／ｍＬにおける非ラベル体ピーク面積値を表２−１、表２-２及び表２−３に、そして、１８Ｏ２ラベル体ピーク面積値を表３−１、表３−２及び表３−３に、得られた検量線を図１乃至図６に示す。
【００４３】
表２−１．  各脂肪酸の８、４０、２００及び１０００ｎｇ／ｍＬにおける非ラベル体ピーク面積値．
【表４】
2018025479.tif 000006
【００４４】
表２−２．  各脂肪酸の８、４０、２００及び１０００ｎｇ／ｍＬにおける非ラベル体ピーク面積値．
【表５】
2018025479.tif 000007
【００４５】
表２−３．  各脂肪酸の８、４０、２００及び１０００ｎｇ／ｍＬにおける非ラベル体ピーク面積値．
【表６】
2018025479.tif 000008
【００４６】
表３−１．  各脂肪酸の８、４０、２００及び１０００ｎｇ／ｍＬにおける１８Ｏ２ラベル体ピーク面積値．
【表７】
2018025479.tif 000009
【００４７】
表３−２．  各脂肪酸の８、４０、２００及び１０００ｎｇ／ｍＬにおける１８Ｏ２ラベル体ピーク面積値．
【表８】
2018025479.tif 000010
【００４８】
表３−３．  各脂肪酸の８、４０、２００及び１０００ｎｇ／ｍＬにおける１８Ｏ２ラベル体ピーク面積値．
【表９】
2018025479.tif 000011
【００４９】
表２−１、表２−２、表２−３、表３−１、表３−２、表３−３、図１乃至図６に示されるように、２５種の脂肪酸（Ｃ１８：０，Ｃ１９：０，Ｃ１９：１ｎ−９，Ｃ２０：０，Ｃ２０：１ｎ−９，Ｃ２０：２ｎ−６，Ｃ２１：０，Ｃ２１：１ｎ−９，Ｃ２２：０，Ｃ２２：１ｎ−９，Ｃ２２：２ｎ−６，Ｃ２２：３ｎ−３，Ｃ２２：４ｎ−６，Ｃ２２：５ｎ−３，Ｃ２３：０，Ｃ２３：１ｎ−９，Ｃ２４：０，Ｃ２４：１ｎ−９，Ｃ２４：５ｎ−３，Ｃ２５：０，Ｃ２６：０，Ｃ２７：０，Ｃ２８：０，Ｃ２９：０及びＣ３０：０）における１８Ｏ２ラベル体補正前の検量線の決定係数はいずれも０．９９５未満であったが（図１乃至３参照）、１８Ｏ２ラベル体補正後の決定係数は０．９９６以上に向上した（図４乃至６参照）。一方、他のいずれの脂肪酸もラベル体補正によって決定係数が向上した。
【００５０】
実施例５
マウス血漿中多価不飽和脂肪酸の定量分析
マウス血漿（ＣＢＡ／Ｊ，雌，１５週齢）８μＬに以下の脂肪酸、Ｃ１８：２ｎ−６、Ｃ１８：３ｎ−３、Ｃ１８：４ｎ−３、Ｃ２０：２ｎ−６、Ｃ２０：３ｎ−６、Ｃ２０：４ｎ−６、Ｃ２０：５ｎ−３、Ｃ２１：５ｎ−３、Ｃ２２：２ｎ−６、Ｃ２２：３ｎ−３、Ｃ２２：４ｎ−６、Ｃ２２：５ｎ−３、Ｃ２２：６ｎ−３、Ｃ２４：５ｎ−３及びＣ２４：６ｎ−３の実施例１で得られた溶液をメタノールで２５倍希釈した溶液２００μＬを加え、５分間振とうした。これにクロロホルム１９２μＬを添加し５分間振とう後、１５，０００×ｇで５分間遠心分離した。得られた上清３５０μＬを分取し、窒素ガス気流下で乾固後、メタノール７０μＬに再溶解して分析試料を調製した。前処理は試験連数３で実施し、実施例２に記載の条件で分析に供した。得られたピーク面積値を１８Ｏ２ラベル体のピーク面積値で除した後、連数３のいずれにおいても実施例４で作成した検量線の範囲内の数値が得られた脂肪酸種について血漿中濃度を算出した。血漿中濃度は、実施例４で作成した検量線から得られた分析試料中濃度に前処理における希釈倍率（１０）を乗じて算出した。
【００５１】
結果
分析の結果、Ｃ１８：３ｎ−３、Ｃ２０：２ｎ−６、Ｃ２０：３ｎ−６、Ｃ２０：４ｎ−６、Ｃ２０：５ｎ−３、Ｃ２２：４ｎ−６及びＣ２２：５ｎ−３の１８Ｏ２ラベル体補正後ピーク面積比が連数３のいずれにおいても検量線の範囲内であった。これらの非ラベル体ピーク面積値、１８Ｏ２ラベル体補正後のピーク面積比及びそのＣ．Ｖ．（％）を表４に示す。いずれの多価不飽和脂肪酸も１８Ｏ２ラベル体補正によってより小さいＣ．Ｖ．となった。
【００５２】
表４．  各脂肪酸の血漿試料における非ラベル体ピーク面積値、非ラベル体／１８Ｏ２ラベル体ピーク面積比及びそのＣ．Ｖ．（％）．
【表１０】
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【００５３】
表４に示すピーク面積値、実施例４で作成した検量線及び前処理における希釈倍率（１０）から得られた血漿試料中脂肪酸濃度の内、１８Ｏ２ラベル体補正をせずに算出した数値を表５に、１８Ｏ２ラベル体補正後に算出した数値を表６に示す。ラベル体補正なしではＣ２０：２ｎ−６及びＣ２２：４ｎ−６の数値がマイナスの値を示し、定量不可であったのに対し、１８Ｏ２ラベル体補正後の数値は、いずれもプラスの値であり、定量値を算出可能であった。
【００５４】
表５．  各脂肪酸の血漿試料中濃度（ｎｇ／ｍＬ，１８Ｏ２ラベル体補正なし）．
【表１１】
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【００５５】
表６．  各脂肪酸の血漿試料中濃度（ｎｇ／ｍＬ，１８Ｏ２ラベル体補正後）．
【表１２】
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【００５６】
以上、本発明の実施例について詳述したが、本発明は、かかる特定の実施態様に限定されるものではなく、特許請求の範囲に記載された本発明の要旨の範囲において、種々の改良・変更が可能である。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
以上のように、本発明によれば、種々の標準品を用いて測定するため精度の高いカルボン酸化合物の定性及び定量方法を提供することが可能である。したがって、種々の、病態、生理機能、薬物動態試験等における脂肪酸の定量分析に有利に用いることが可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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