(57)【要約】【課題】  温度やｐＨの変化により細胞を剥離させる細胞培養容器を提供することを目的とする。【解決手段】  本発明は、細胞を培養する細胞培養容器であって、その細胞培養容器の表面に、温度応答性分子、ｐＨ応答性分子及び細胞接着性分子を含む刺激応答性材料を有する。また、刺激応答性材料において、前記温度応答性分子とｐＨ応答性分子の結合構造が複数存在する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を培養する細胞培養容器であって、
前記細胞培養容器の表面に、温度応答性分子、ｐＨ応答性分子及び細胞接着性分子を含む刺激応答性材料を有し、
前記刺激応答性材料において、前記温度応答性分子と前記ｐＨ応答性分子の結合構造が複数存在することを特徴とする細胞培養容器。
【請求項２】
請求項１に記載の細胞培養容器であって、
前記温度応答性分子は下限臨界溶解温度を示す分子であることを特徴とする細胞培養容器。
【請求項３】
請求項２に記載の細胞培養容器であって、
前記下限臨界溶解温度を示す分子は、ポリアルキレングリコール、Ｎ−アシル化ポリリジン、Ｎ−アルキル化ポリリジン、γ−ポリグルタミン酸ヒドロキシヘキシルアミド、δ−ポリアスパラギン酸ヒドロキシヘキシルアミド、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、ポリ−Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、のいずれかを含むことを特徴とする細胞培養容器。
【請求項４】
請求項１に記載の細胞培養容器であって、
前記ｐＨ応答性分子は、ｐＫａが２以上１３以下の酸、またはｐＫａが２以上１３以下の共役酸を生じ得る塩基を含むことを特徴とする細胞培養容器。
【請求項５】
請求項４に記載の細胞培養容器であって、
前記ｐＫａが２以上１３以下の酸は、カルボン酸、フェノール性ヒドロキシル基、ホウ酸、スルホン酸、ホスホン酸、ホスフィン酸のいずれかを含み、
前記ｐＫａが２以上１３以下の共役酸を生じ得る塩基は、アミン、イミン、ホスファゼン、グアニジン、ヘテロ芳香族化合物、ヘテロ環状化合物、のいずれかを含むことを特徴とする細胞培養容器。
【請求項６】
請求項１に記載の細胞培養容器であって、
前記細胞接着性分子は、細胞膜上の分子と相互作用し得る分子であることを特徴とする細胞培養容器。
【請求項７】
請求項６に記載の細胞培養容器であって、
前記細胞膜上の分子と相互作用し得る分子は、ゼラチン、コラーゲン、ＲＤＧペプチド、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コンドロイチン硫酸塩、ヒアルロン酸、フィブリン、インテグリン、カドヘリン、クローディン、ポリリジン、免疫グロブリン、トロンボスポンジ、のいずれかを含むことを特徴とする細胞培養容器。
【請求項８】
細胞培養容器を用いて細胞を培養する細胞培養方法であって、
前記細胞培養容器の表面に、温度応答性分子、ｐＨ応答性分子及び細胞接着性分子を含む刺激応答性材料を有し、
前記刺激応答性材料において、前記温度応答性分子と前記ｐＨ応答性分子の結合構造が複数存在し、
前記多官能性分子はｐＨ応答性分子及び細胞接着性分子を含み、
前記細胞培養容器に培養液を入れて細胞を培養する培養工程と、
前記細胞培養容器に所定の処理を加えて、前記細胞培養容器から細胞を剥離させる剥離工程を有することを特徴とする細胞培養方法。
【請求項９】
請求項８に記載の細胞培養方法であって、
前記所定の処理は、前記培養工程の時から温度を低下させる処理であることを特徴とする細胞培養方法。
【請求項１０】
請求項８に記載の細胞培養方法であって、
前記所定の処理は、前記培養液を細胞毒性のない緩衝液に交換する処理であることを特徴とする細胞培養方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の細胞培養方法であって、
前記緩衝液は、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝液、トリス緩衝生理食塩水、グッド緩衝液、生理食塩水、培地、のいずれかであることを特徴とする細胞培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞を培養する細胞培養装置及び細胞培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
再生医療では患者から細胞を採取し、その細胞を体外で増殖させ、必要に応じて細胞組織として分化誘導を行い、患者の疾患に戻す治療法がある。細胞を体外で安定的に増殖培養するには、培養環境を一定に維持管理し、細胞を非侵襲的に回収できることが重要である。
【０００３】
細胞の品質に影響を与える培養環境因子としては、温度、ｐＨ、溶存酸素、溶存二酸化炭素などが挙げられる。多くの場合、専門知識を持った人による手作業での培養を行うが、より安定的に細胞を供給するためには自動細胞培養装置が必要となってくる。しかし、手作業や自動細胞培養装置で問題となるのは、ｐＨのオンラインモニタリングが困難であることである。手作業では、インキュベータ内の温度、ＣＯ２濃度を一定に維持するのみで、培養容器内のｐＨをオンラインでモニタリングすることはない。また自動培養装置にしても、無菌状態を保ったままｐＨ電極を取り付け、電極の校正まで行うことは困難である。そのため、万が一、培養中にｐＨ異常が発生してもそれを検知できず、下流工程に不良品細胞が混入してしまう。
【０００４】
一方、細胞の回収にあたっては、通常はトリプシンなどの酵素を用い細胞と培養容器底面の接着を剥がすことが行われているが、細胞への損傷が問題となっている。そこで、近年、放射線照射や紫外線照射などの手法によって調製される温度応答性ポリマを用い、温度応答によって培養容器底面の親水性、疎水性を制御することで細胞を非侵襲的に剥離する材料が開発されている（特許文献１、２）。
【０００５】
細胞を医療用材料などとして用いる場合、適切な環境下で培養されたかを管理することと細胞を非侵襲的に回収することを同時に満たす必要があるが、現在そのような培養容器は実現していない。例えば特許文献３では熱応答性ポリマとｐＨ応答性ポリマの複数の層を用いた培養容器の可能性について言及されているが、ｐＨ異常の際の細胞除去方法としては不十分である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００８−２６３８６３号公報
【特許文献２】特開２０１３−１６２７９６号公報
【特許文献３】特表２０１４−５０１０９９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
温度やｐＨの変化により細胞を剥離させる細胞培養容器を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、細胞を培養する細胞培養容器であって、その細胞培養容器の表面に、温度応答性分子、ｐＨ応答性分子及び細胞接着性分子を含む刺激応答性材料を有する。また、刺激応答性材料において、温度応答性分子とｐＨ応答性分子の結合構造が複数存在する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、温度やｐＨの変化により細胞を剥離させる細胞培養容器を提供することができる。従って、ｐＨ異常の有無を簡便に判別可能となる。また、温度変化による非侵襲的な細胞回収も可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】刺激応答性分子の部分構造例である。
【図２】細胞培養容器の製造工程の一部である。
【図３】本発明で提供する細胞培養容器を用いる自動培養プロセスと自動培養装置の例である。
【図４】細胞剥離の模式図である。
【図５】細胞剥離実験の培養容器写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、細胞培養装置において、培養中の培養環境を維持管理し、正常に培養された細胞を非侵襲的に回収することを可能にする刺激応答性材料に関する。
【００１２】
以下、図面等を用いて、本発明の実施形態について説明する。以下の説明は本発明の内容の具体例を示すものであり、本発明がこれらの説明に限定されるものではなく、本明細書に開示される技術的思想の範囲内において当業者による様々な変更および修正が可能である。また、本発明を説明するための全図において、同一の機能を有するものは、同一の符号を付け、その繰り返しの説明は省略する場合がある。
【００１３】
本発明で提供する細胞培養容器は、表面に、刺激応答性分子（刺激応答性材料）を備える。刺激応答性分子は、温度応答性分子（温度応答性材料）とｐＨ応答性分子（ｐＨ応答性材料）と細胞接着性分子（細胞接着性材料）を備える。１種類の材料が温度応答性材料とｐＨ応答性材料と細胞接着性材料を兼ねていてもよいし、温度応答性材料とｐＨ応答性材料を兼ねる材料と細胞接着性材料の組み合わせでもよい。
【００１４】
本発明に係る細胞培養容器によれば、（１）所定のｐＨ範囲を超えた培養環境の場合、培養細胞を剥離し、細胞を製品として回収しない、（２）適正な培養環境下で培養された細胞を回収する際、酵素を用いず、非侵襲的に細胞を回収することが可能となる。従って、培養後の検査工程への負荷を低減するとともに、安全性の高い細胞、特に医療用途の細胞を得ることができる。
【００１５】
また、本発明に係る細胞培養方法によれば、放射線照射や紫外線照射を用いずに培養容器表面に機能性材料を導入できることから、安価で生産性の高い容器の生産プロセスを実現できる。
【００１６】
本発明で提供する細胞培養容器は、表面に導入されたいずれかの材料の水和状態が培養中のｐＨ異常の際もしくは温度低下の際に変化することで細胞が剥離する。ｐＨ異常の際の細胞剥離は、材料のイオン化の度合いがｐＨ正常範囲内におけるイオン化の度合いから外れることで水和状態がｐＨ正常範囲内から外れることを原理とするのが好ましいが、ｐＨに対して直接応答性を有さなくとも、ｐＨ異常に伴う電解質濃度の変化によって水和状態がｐＨ正常範囲内から外れるなどでもよい。なお、ｐＨ正常範囲およびｐＨ異常範囲は、適用する細胞および用途によって設定可能な範囲であるが、一例としてはｐＨ６．８−７．６がｐＨ正常範囲として挙げられる。温度低下による細胞剥離は、温度応答性材料がＬＣＳＴ以下になることで水和性が向上することを原理とすることが好ましいが、それ以外でもよい。
【００１７】
本発明では、細胞培養容器の表面に、温度応答性分子、ｐＨ応答性分子及び細胞接着性分子を含む刺激応答性材料を有する。刺激応答性材料において、温度応答性分子とｐＨ応答性分子の結合構造が複数存在する。温度応答性分子とｐＨ応答性分子の結合構造が複数存在し、例えば温度応答性分子とｐＨ応答性分子が交互に存在することで、細胞培養容器の幅広い面に細胞剥離機能を持たせることができる。
【００１８】
図１は刺激応答性分子の部分構造例を示す。図１の刺激応答性分子１０は、温度応答性分子３０とｐＨ応答性分子４０で構成される。
【００１９】
多官能性分子として細胞接着性分子を利用してもよく、ｐＨ応答性分子と細胞接着性分子の両方を用いることも可能であり、細胞接着性ｐＨ温度応答性材料が得られる。図１の刺激応答性分子２０は、温度応答性分子３０とｐＨ応答性分子４０と細胞接着性分子５０で構成される。
【００２０】
いずれにせよ、温度応答材料は温度変化もしくはｐＨ変化によって水和状態が変化するが、特に、ｐＨ応答性分子と細胞接着分子の両方を用いた場合、１種類の材料のみで目的の機能を達成可能なため、好ましいと言える。なお、温度応答材料は、直鎖ポリマでもよいし、ブランチポリマ、架橋ポリマであってもよい。
【００２１】
温度応答材料とｐＨ応答材料を１種類の材料が兼ねない場合でも、別々に温度応答材料とｐＨ応答材料を導入することで細胞培養容器表面に温度応答性とｐＨ応答性を備えさせることは可能だが、均一性の観点から望ましくない。すなわち、細胞接着部位の周辺に温度応答材料しか存在しない場合や、逆にｐＨ応答材料しか存在しない場合が生じ得るため、細胞の確実な剥離は必ずしも実現できない。
【００２２】
温度応答材料は下限臨界溶液温度（Lower Critical Solution temperature、 以下、ＬＣＳＴという）を示し得ることが望ましく、そのＬＣＳＴは０℃以上４０℃以下の範囲内であり得ることが好ましい。本発明は細胞を培養する培養容器の発明であり、細胞が生存できる環境を作る必要がある。ＬＣＳＴが０℃より小さい、または４０℃より大きい場合には、細胞の生存が困難になるので、ＬＣＳＴは０℃以上４０℃以下の範囲内にすることが望ましい。
【００２３】
温度応答性分子と多官能性分子の結合は、共有結合であることが好ましいが、水素結合やイオン結合等の可逆な結合の可能性を否定するものではない。
【００２４】
温度応答性分子と多官能性分子の間の共有結合生成には、求核部位と被求核部位の反応、求電子部位と被求電子部位の反応、付加反応、転位反応、ラジカル反応、シグマトロピー反応、メタセシス反応、カップリング反応、酸化的結合生成反応、脱水縮合やそれらの組み合わせなどを利用することが出来るが、生産性や簡便性の観点から、求核部位と被求核部位の反応が好ましい。
【００２５】
求核部位の例としては、アミン、チオール、チオラート、アルコール、アルコキシド、カルボキシレート、有機金属化合物部位、エノール、アセタール、アミナール、などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、被求核部位の反応の例としては、エポキシド、酸塩化物、酸無水物、エステル、カルボニル、イミン、共役カルボニル、アリールハライド、などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２６】
温度応答材料の原料となる温度応答性分子は、合成上の観点から、両末端に求核部位または被求核部位を有することが好ましいが、これに限定されるものではない。
【００２７】
温度応答材料の原料となる温度応答性分子は、ＬＣＳＴを示し得ることが好ましいが、温度応答性分子が多官能性分子と交互に結合した際にＬＣＳＴを示し得るならば、原料がＬＣＳＴを示す必要はない。
【００２８】
温度応答性分子としては、ε−ポリリジン吉草酸アミド、ε−ポリリジン吉草酸アミド共重合体、ε−ポリリジン酪酸アミド共重合体、ε−ポリリジンプロピオン酸アミド共重合体、Ｎ−ヒドロキシペンチルε−ポリリジン、Ｎ−ヒドロキシペンチルε−ポリリジン共重合体、Ｎ−ヒドロキシブチルε−ポリリジン、Ｎ−ヒドロキシブチルε−ポリリジン共重合体、γ−ポリグルタミン酸ヒドロキシヘキシルアミド、γ−ポリグルタミン酸ヒドロキシヘキシルアミド共重合体、γ−ポリグルタミン酸ヒドロキシペンチルアミド、γ−ポリグルタミン酸ヒドロキシペンチルアミド共重合体、γ−ポリグルタミン酸ヒドロキシブチルアミド共重合体、δ−ポリアスパラギン酸ヒドロキシヘキシルアミド、δ−ポリアスパラギン酸ヒドロキシヘキシルアミド共重合体、δ−ポリアスパラギン酸ヒドロキシペンチルアミド、δ−ポリアスパラギン酸ヒドロキシペンチルアミド共重合体、ポリ乳酸、ポリエチレングリコール共重合体、ポリプロピレングリコール、ポリプロピレングリコール共重合体、ヒドロキシプロピルセルロース誘導体、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、ポリ−Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、ポリメタクリル酸ブチルもしくは、それらの複合体やそれらを部分構造として備えるデンドリマーやゲルや架橋ゲルを含む分子が挙げられるが、それらに限定されるものではない。なお、温度応答性は、温度応答分子の種類や分子量、多官能性分子の種類や量を変えることで制御できる。
【００２９】
多官能性分子が有する官能基の数は、２つ以上であり、直鎖ポリマを調製する場合には２つであることが好ましい。
【００３０】
温度応答材料は水中かつ細胞が生存可能なｐＨ領域内でｐＨ応答性を有するべきであることから、多官能性分子としてｐＨ応答分子を利用する場合、ｐＨ応答分子は、ｐＫａが２以上１３以下の酸もしくはｐＫａが２以上１３以下の共役酸を生じ得る塩基を含むことが好ましい。ｐＫａが２以上１３以下の酸としては、カルボン酸、フェノール性ヒドロキシル基、ホウ酸、スルホン酸、ホスホン酸、ホスフィン酸、などが挙げられ、ｐＫａが２以上１３以下の共役酸を生じ得る塩基としては、アミン、イミン、ホスファゼン、グアニジン、ヘテロ芳香族化合物、ヘテロ環状化合物、などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。ｐＨ応答性分子の一例としてはエチレンジアミンが挙げられる。なお、ｐＨ応答性は、導入するｐＨ応答分子の種類や量を変えることで制御することができる。
【００３１】
温度応答材料は、培養容器器材表面への導入の観点から、末端もしくは側鎖に反応性の部位を有する必要がある。反応性の部位としては求核性官能基が好ましく、１級アミンがより好ましいが、これに限定されるものではない。
【００３２】
温度応答材料の培養容器表面への導入は、共有結合を介することが好ましいが、静電吸着や物理吸着などの可能性を否定するものではない。なお、共有結合を介する場合は、求核性官能基と被求核性官能基の反応を用いることが好ましく、その場合、培養容器表面側の官能基は被求核性官能基であることが好ましい。このとき被求核性官能基としては、カルボジイミドやＤＭＴ−ＭＭのような縮合剤によって活性化されたカルボン酸、エポキシド、ＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ＨＯＡtエステル、アルデヒド、酸塩化物、酸無水物、などが挙げられるがそれらに限定されるものではない。
【００３３】
細胞接着材料の原料となる細胞接着性分子は、温度応答材料と共有結合していてもよいが、結合していなくてもよいし、共有結合している材料と共有結合していない材料の混合物でもよい。細胞接着性分子を温度応答材料と共有結合させる場合には、温度応答材料と多官能性分子との結合様式と同様の結合様式を利用することが生産性の観点から好ましい。細胞接着性分子を温度応答材料と共有結合させない場合には、細胞接着性分子の溶液塗布による導入が生産性の観点から好ましい。
【００３４】
細胞接着性分子としては、ゼラチン、コラーゲン、ＲＤＧペプチド、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コンドロイチン硫酸塩、ヒアルロン酸、フィブリン、インテグリン、カドヘリン、クローディン、ポリリジン、免疫グロブリン、トロンボスポンジもしくはそれらの部分構造を含む分子が挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【００３５】
温度応答性材料を導入する細胞培養容器の器材は、細胞毒性がない限り特に制限はなく、例えばポリスチレン、ガラス、ポリペプチド、ポリサッカライド、エポキシ樹脂、アクリル樹脂、メタクリレート樹脂、ビニル樹脂、フェノール樹脂、シリコーン樹脂、フルオロ系樹脂、ポリエステル、無機酸化物、などを用いることが出来る。
【００３６】
細胞培養容器の表面は、温度応答材料、ｐＨ応答材料、細胞接着材料以外の物質によって修飾されていてもよい。
【００３７】
図２は細胞培養容器の製造する工程の一部である。細胞培養容器６０の表面に被求核性官能基７０が存在する。固定化処理により、刺激応答性分子２０と被求核性官能基７０が結合する。
【００３８】
本発明で提供する細胞培養容器の製造方法は、細胞培養容器の表面活性化、表面活性化された細胞培養容器への導入する材料の溶液の接触、材料導入後の細胞培養容器の洗浄、を工程として含む。一方で、放射線照射や紫外線照射を材料の導入に工程として含まない。
【００３９】
本発明で提供する細胞培養容器の滅菌は、紫外線照射、γ線照射、エタノール処理、などで実施することが出来る。
【００４０】
本発明で提供する細胞培養容器を用いた細胞培養には、一般的な条件を用いることが出来る。
【００４１】
本発明で提供する細胞培養容器を用いた非浸襲的細胞回収は、培養温度にある細胞培養容器の温度を室温もしくは室温以下０℃以上の温度に低下させる工程を含むことが好ましい。また、このときに培養時の培地のまま温度を変化させてもよいし、培地を、あらかじめ一定の温度にされた細胞毒性のない緩衝液に入れ替えて温度を変化させてもよい。細胞毒性のない緩衝液としては、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝液、トリス緩衝生理食塩水、グッド緩衝液（ＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＰｌＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＤｌＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＥＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳＯ、ＣＡＰＳ）、生理食塩水、培地などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４２】
図３は自動培養プロセスと自動培養装置を示す。自動培養装置３２０は自動培養プロセス３１０のように、細胞播種、培地交換、継代、培地交換、継代、細胞剥離の順で処理する。この過程で、温度管理、ＣＯ２濃度管理、光学観察を行う。
【００４３】
本発明で提供する細胞培養容器は、培地交換、温度管理、ＣＯ２濃度管理、光学観察の機能を有する自動培養装置に適用できる。自動培養装置は、播種機能や継代機能を備えていてもよい。
【００４４】
自動培養装置３２０は、細胞培養容器６０を置くステージ３３０と、ポンプ３４０と、ポンプ３４０を用いて細胞培養容器６０から培地を吸い出すノズル３５０と、緩衝液を保存する保存部３６０と、細胞培養容器６０に緩衝液を導入するノズル３７０と、保存中の緩衝液の温度を制御する温度制御部３８０と、培養環境の温度を計測する温度計測部３９０と、培養環境のＣＯ２濃度を計測する濃度計測部４００と、培養容器の状態を光学的に観察する観察部４１０を有する。
【００４５】
これらの機器により、温度やｐＨを制御できる。例えば培養終了時には、細胞剥離のために培地を２５℃の緩衝液に交換した後に２５℃でインキュベートすることができる。また、例えばｐＨ異常によって細胞が剥離した際にも光学系によって自動または手動にて検知できる。
【実施例】
【００４６】
実施例１〜２および比較例１〜２で細胞培養容器を作成した。また、実施例３〜４および比較例３〜５では温度およびｐＨ応答による細胞剥離の実証実験を実施した（図４、図５）。
【００４７】
図４は細胞剥離工程を示す。細胞培養容器６０の表面に被求核性官能基７０及び刺激応答性分子２０の結合物が存在する。さらに、刺激応答分子２０に細胞５２０が接着している。温度およびｐＨ応答による細胞剥離処理により、細胞５５０は剥離する。
【００４８】
図５は細胞剥離実験の培養容器写真を示す。
【００４９】
＜実施例１＞
実施例１では、温度応答性分子と二官能性ｐＨ応答分子と細胞接着分子を含む材料Ａを合成した。
【００５０】
ポリプロピレングリコールジグリシジルエーテル（１当量）、エチレンジアミン（１．１当量）、ゼラチン（５ｗｔ％）を含む水/エタノール溶液を６０℃で６時間加熱した。得られた反応溶液に５倍量の水を加え、再度６０℃で加熱することで温度応答性を示す成分のみ沈殿させ、上澄みを捨てることで精製した。この精製操作を３回繰り返した。この材料ＡのＬＣＳＴは約３０℃であった。
【００５１】
＜比較例１＞
比較例１では、温度応答性分子と二官能性ｐＨ応答分子を含み、細胞接着性分子を含まない材料Ｂを合成した。
【００５２】
ポリプロピレングリコールジグリシジルエーテル（１当量）、エチレンジアミン（１．１当量）を含む水/エタノール溶液を６０℃で６時間加熱した。得られた反応溶液に５倍量の水を加え、再度６０℃で加熱することで温度応答性を示す成分のみ沈殿させ、上澄みを捨てることで精製した。この精製操作を３回繰り返した。この材料ＢのＬＣＳＴは約３０℃であった。
【００５３】
＜実施例２＞
実施例２では、材料Ａを用いて培養容器Ａを作成した。
【００５４】
表面にカルボン酸を有する親水化ポリスチレン容器（以下、無修飾培養容器）に、ＥＤＣ・ＨＣｌのＰＢＳ溶液（ｐＨ５．８）を加え、４０℃で２時間加熱した。その後、容器表面をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ５．８）にて洗浄し、材料ＡのＰＢＳ溶液（ｐＨ５．８）を加え、４０℃で１２時間加熱した。得られた培養容器Ａは、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ５．８）、純水の順で洗浄した後、紫外線照射によって滅菌した。
【００５５】
＜比較例２＞
比較例２では、材料Ｂを用いて培養容器Ｂを作成した。
【００５６】
無修飾培養容器に、ＥＤＣ・ＨＣｌのＰＢＳ溶液（ｐＨ５．８）を加え、４０℃で２時間加熱した。その後、容器表面をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ５．８）にて洗浄し、材料ＢのＰＢＳ溶液（ｐＨ５．８）を加え、４０℃で１２時間加熱した。得られた培養容器Ｂは、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ５．８）、純水の順で洗浄した後、紫外線照射によって滅菌した。
【００５７】
＜実施例３＞（温度応答による剥離実験）
実施例３では、培養容器Ａを用いてＭＥＦ細胞（マウス胚性線維芽細胞）の温度応答による剥離実験を実施した。
【００５８】
標準的なプロトコルにて、培養容器Ａに培養液を入れ、培養容器Ａ上でＭＥＦ細胞を培養した。細胞が培養容器Ａに十分に接着したことを確認し、培養容器Ａをインキュベータから取り出し、３７℃に温めた培地と交換した後に、４℃に温度を低下させたところ、培養容器Ａから細胞は剥離し、回収率９５％で細胞が回収された。
【００５９】
本発明の主な目的は細胞を剥離させて回収することである。細胞の回収率が７０％以上あれば、回収率が高いと言える。なお、本発明で用いる回収率は生死細胞オートアナライザーＶｉ−ＣＥＬＬによって測定した結果である。
【００６０】
＜実施例４＞（ｐＨ応答による剥離実験）
実施例４では、培養容器Ａを用いてＭＥＦ細胞のｐＨ応答による剥離実験を実施した。
【００６１】
標準的なプロトコルにて、培養容器Ａに培養液を入れ、培養容器Ａ上でＭＥＦ細胞を培養した。細胞が培養容器Ａに十分に細胞が接着したことを確認し、培養容器Ａをインキュベータから取り出し、３７℃に温めたｐＨ６．５リン酸緩衝生理食塩水と交換した後に、再度インキュベータ中で静置したところ、培養容器Ａから細胞は剥離し、回収率９５％で細胞が回収された。
【００６２】
＜比較例３＞（温度応答による剥離実験）
比較例３では、培養容器Ｂを用いてＭＥＦ細胞の温度応答による剥離実験を実施した。
【００６３】
標準的なプロトコルにて、培養容器Ｂに培養液を入れ、培養容器Ｂ上でＭＥＦ細胞を培養した。細胞が培養容器Ｂに十分に細胞が接着したことを確認し、培養容器Ｂをインキュベータ中で一晩静置したものの、接着した細胞の数は播種した細胞の数の５％以下であり、細胞接着性は低かった。
【００６４】
比較例３では、実施例３、４と比べて回収率が非常に低かった。これは、培養容器Ｂが温度応答性分子と二官能性ｐＨ応答分子を含み、細胞接着性分子を含まない材料を用いるからである。培養容器Ｂが細胞接着性分子を有することで、多くの細胞を培養容器Ｂに十分に収集することができ、十分に収集できたからこそ細胞の回収率が向上するものである。
【００６５】
＜比較例４＞（温度応答による剥離実験）
比較例４では、無修飾培養容器を用いてＭＥＦ細胞の温度応答による剥離実験を実施した。
【００６６】
標準的なプロトコルにて、無修飾培養容器に培養液を入れ、無修飾培養容器上でＭＥＦ細胞を培養した。細胞が無修飾培養容器に十分に細胞が接着したことを確認し、無修飾培養容器をインキュベータから取り出し、３７℃に温めた培地と交換した後に、４℃に温度を低下させたが、細胞は回収されなかった。
【００６７】
＜比較例５＞（ｐＨ応答による剥離実験）
比較例５では、無修飾培養容器を用いてＭＥＦ細胞のｐＨ応答による剥離実験を実施した。
【００６８】
標準的なプロトコルにて、無修飾培養容器に培養液を入れ、無修飾培養容器上でＭＥＦ細胞を培養した。細胞が無修飾培養容器に十分に細胞が接着したことを確認し、無修飾培養容器をインキュベータから取り出し、３７℃に温めたｐＨ６．５緩衝液と交換した後に、再度インキュベータ中で静置したところ、回収率４０％で細胞が回収された。
【００６９】
＜実施例５＞
実施例５では、培養容器Ａを自動培養装置に適用し、温度制御による細胞剥離を実証した。
【００７０】
自動培養装置中にて培養容器Ａを用いてｉＰＳ細胞を培養した後に、培地交換機能を用いて培地の大部分を取り除き、あらかじめ２５℃にされたｐＨ７．４リン酸緩衝生理食塩水と交換した。その後、培養容器Ａを２５℃にてインキュベートしたところ、顕微鏡観察にて、ｉＰＳ細胞の剥離が確認された。
【００７１】
＜実施例６＞
実施例６では、培養容器Ａを自動培養装置に適用し、ｐＨ異常時の細胞剥離を再現した実証を行った。
【００７２】
自動培養装置中にて培養容器Ａを用いてｉＰＳ細胞を培養した後に、培地交換機能を用いて培地の大部分を取り除き、あらかじめ３７℃にされたｐＨ６．５リン酸緩衝生理食塩水と交換することでｐＨ低下を再現した。その後、培養容器Ａを３７℃にてインキュベートしたところ、顕微鏡観察にて、ｉＰＳ細胞の剥離が確認された。
【００７３】
実施例３、４ではＭＥＦ細胞を用いて細胞が培養容器から剥離することを確認した。また、実施例５、６ではｉＰＳ細胞を用いて細胞が培養容器から剥離するかを確認した。以上により、実施例２で作成した培養容器を用いることで、細胞の種類によらず高い回収率で細胞を回収できることが確認できた。
【００７４】
＜比較例６＞
比較例６では、温度応答性分子と二官能性ｐＨ応答分子と細胞接着分子を含むが、下限溶解臨界温度が０℃より小さい材料Ｃを合成した。
【００７５】
ポリプロピレングリコールジグリシジルエーテル（１当量）、エチレンジアミン（５当量）、ゼラチン（５ｗｔ％）を含む水/エタノール溶液を６０℃で６時間加熱した。得られた反応溶液は透析により精製した。この材料ＣはＬＣＳＴを示さなかった。
【００７６】
＜比較例７＞
比較例７では、材料Ｃを用いて培養容器Ｃを作成した。
【００７７】
無修飾培養容器に、ＥＤＣ・ＨＣｌのＰＢＳ溶液（ｐＨ５．８）を加え、４０℃で２時間加熱した。その後、容器表面をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ５．８）にて洗浄し、材料ＣのＰＢＳ溶液（ｐＨ５．８）を加え、４０℃で１２時間加熱した。得られた培養容器Ｃは、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ５．８）、純水の順で洗浄した後、紫外線照射によって滅菌した。
【００７８】
＜比較例８＞
比較例８では、培養容器Ｃを用いてＭＥＦ細胞の温度応答による剥離実験を実施した。標準的なプロトコルにて、培養容器Ｃに培養液を入れ、培養容器Ｃ上でＭＥＦ細胞を培養した。細胞が培養容器Ｃに十分に接着したことを確認し、培養容器Ｃをインキュベータから取り出し、３７℃に温めたｐＨ６．５リン酸緩衝生理食塩水と交換した後に、再度インキュベータ中で静置したところ、培養容器Ｃから細胞は剥離し、回収率１０％で細胞が回収された。
【００７９】
＜実施例７＞
実施例７では、温度応答性分子と二官能性ｐＨ応答分子と細胞接着分子を含む材料Ｄを合成した。
【００８０】
Ｎ−アシル化ポリリジン（１当量）、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル（１．１当量）、ゼラチン（５ｗｔ％）を含む水/エタノール溶液を６０℃で６時間加熱した。得られた反応溶液は透析により精製した。この材料ＤのＬＣＳＴは約３０℃であった。
【００８１】
＜実施例８＞
実施例８では、材料Ｄを用いて培養容器Ｄを作成した。
【００８２】
無修飾培養容器に、ＥＤＣ・ＨＣｌのＰＢＳ溶液（ｐＨ５．８）を加え、４０℃で２時間加熱した。その後、容器表面をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ５．８）にて洗浄し、材料ＤのＰＢＳ溶液（ｐＨ５．８）を加え、４０℃で１２時間加熱した。得られた培養容器Ｄは、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ５．８）、純水の順で洗浄した後、紫外線照射によって滅菌した。
【００８３】
＜実施例９＞（温度応答による剥離実験）
実施例９では、培養容器Ｄを用いてＣＨＯ細胞の温度応答による剥離実験を実施した。
【００８４】
標準的なプロトコルにて、培養容器Ｄに培養液を入れ、培養容器Ｄ上でＣＨＯ細胞を培養した。細胞が培養容器Ｄに十分に接着したことを確認し、培養容器Ｄをインキュベータから取り出し、３７℃に温めたｐＨ６．５リン酸緩衝生理食塩水と交換した後に、再度インキュベータ中で静置したところ、培養容器Ａから細胞は剥離し、回収率７０％で細胞が回収された。
【００８５】
＜実施例１０＞（ｐＨ応答による剥離実験）
実施例１０では、培養容器Ｄを用いてＣＨＯ細胞のｐＨ応答による剥離実験を実施した。
【００８６】
標準的なプロトコルにて、培養容器Ｄに培養液を入れ、培養容器Ｄ上でＣＨＯ細胞を培養した。細胞が培養容器Ｄに十分に接着したことを確認し、培養容器Ｄをインキュベータから取り出し、３７℃に温めたｐＨ６．５緩衝液と交換した後に、再度インキュベータ中で静置したところ、培養容器Ｄから細胞は剥離し、回収率８０％で細胞が回収された。
【００８７】
＜実施例１１＞
実施例１１では、温度応答性分子と二官能性ｐＨ応答分子と細胞接着分子を含む材料Ｅを合成した。
【００８８】
Ｎ−アルキル化ポリリジン（１当量）、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル（１．１当量）、ゼラチン（５ｗｔ％）を含む水/エタノール溶液を６０℃で６時間加熱した。得られた反応溶液は透析により精製した。この材料ＥのＬＣＳＴは約３０℃であった。
【００８９】
＜実施例１２＞
実施例１２では、材料Ｅを用いて培養容器Ｅを作成した。
【００９０】
無修飾培養容器に、ＥＤＣ・ＨＣｌのＰＢＳ溶液（ｐＨ５．８）を加え、４０℃で２時間加熱した。その後、容器表面をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ５．８）にて洗浄し、材料ＥのＰＢＳ溶液（ｐＨ５．８）を加え、４０℃で１２時間加熱した。得られた培養容器Ｅは、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ５．８）、純水の順で洗浄した後、紫外線照射によって滅菌した。
【００９１】
＜実施例１３＞（Ph応答による薄利実験）
実施例１３では、培養容器Ｅを用いてＭＥＦ細胞のｐＨ応答による剥離実験を実施した。
【００９２】
標準的なプロトコルにて、培養容器Ｅに培養液を入れ、培養容器Ｅ上でＭＥＦ細胞を培養した。細胞が培養容器Ｅに十分に接着したことを確認し、培養容器Ｅをインキュベータから取り出し、３７℃に温めたｐＨ６．５緩衝液と交換した後に、再度インキュベータ中で静置したところ、培養容器Ｅから細胞は剥離し、回収率８０％で細胞が回収された。
【００９３】
＜実施例１４＞（ｐＨ応答による剥離実験）
実施例１４では、培養容器Ｅを用いてＭＥＦ細胞のｐＨ応答による剥離実験を実施した。
【００９４】
標準的なプロトコルにて、培養容器Ｅに培養液を入れ、培養容器Ｅ上でＭＥＦ細胞を培養した。細胞が培養容器Ｅに十分に接着したことを確認し、培養容器Ｅをインキュベータから取り出し、３７℃に温めたｐＨ６．５緩衝液と交換した後に、再度インキュベータ中で静置したところ、培養容器Ｅから細胞は剥離し、回収率７０％で細胞が回収された。
【符号の説明】
【００９５】
１０  刺激応答性分子
２０  刺激応答性分子
３０  温度応答性分子
４０  ｐＨ応答性分子
５０  細胞接着性分子
６０  細胞培養容器
７０  被求核性官能基
３１０  自動培養プロセス
３２０  自動培養装置
３３０  ステージ
３４０  ポンプ
３５０  ノズル
３６０  保存部
３７０  ノズル
３８０  温度制御部
３９０  温度計測部
４００  濃度計測部
４１０  観察部
５１０  細胞が接着した細胞培養容器表面
５２０  細胞
５５０  細胞
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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