(57)【要約】【課題】植物組織培養での増殖効率が高く良好な生育を示し、１年間の水耕栽培で日本薬局方の成分規格を満たす根を得ることができるシャクヤク優良株を提供する。また、そのようなシャクヤク株の増殖方法を提供する。さらに、シャクヤク株の栽培方法を提供する。【解決手段】シャクヤクＰＬＫＤ２株を、温度１３〜１７℃、明期１２〜１８時間、照度３，０００〜７，０００ルクスにて組織培養して増殖させる。また、シャクヤク株を、温度１３〜１７℃、明期１２〜１８時間、照度３，０００〜３０，０００ルクス、ＣＯ２濃度３００〜１，５００ｐｐｍで水耕栽培する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジヒドロフラボノール−４−リダクターゼ（ＰｌＤＦＲ）遺伝子において、配列番号１で表される配列をホモ接合で有する、シャクヤク株。
【請求項２】
薬用品種北宰相に由来するものである、請求項１に記載のシャクヤク株。
【請求項３】
ＰＬＫＤ２株である、シャクヤク株。
【請求項４】
シュート増殖工程とシュート発根工程を含む植物組織培養工程を含む、シャクヤク増殖方法。
【請求項５】
前記シュート増殖工程とシュート発根工程は、温度１３〜１７℃、明期１２〜１８時間、照度３，０００〜７，０００ルクスで行うことを特徴とする、請求項４に記載のシャクヤク増殖方法。
【請求項６】
前記シュート増殖工程とシュート発根工程は、１〜７ｍＭのＣａ２＋イオンを含有する培地でシャクヤク組織を培養することを特徴とする、請求項４又は５に記載のシャクヤク増殖方法。
【請求項７】
馴化工程と水耕栽培工程を含む、シャクヤク栽培方法。
【請求項８】
前記馴化工程と水耕栽培工程は、温度１３〜１７℃、明期１２〜１８時間、照度３，０００〜３０，０００ルクス、ＣＯ２濃度３００〜１，５００ｐｐｍで栽培を行うことを特徴とする、請求項７に記載のシャクヤク栽培方法。
【請求項９】
前記馴化工程と水耕栽培工程は、１〜６ｍＭのＣａ２＋イオンを含有する養液を用いて栽培を行うことを特徴とする、請求項７又は８に記載のシャクヤク栽培方法。
【請求項１０】
前記馴化工程は、０〜６ｍＭのＣａ２＋イオンを含有する養液を用いて栽培を行うことを特徴とする、請求項７又は８に記載のシャクヤク栽培方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、漢方薬原料として、又は園芸用として有用な、シャクヤクの株に関する。本発明はまた、シャクヤクの株の増殖方法及び水耕栽培方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
シャクヤク（Ｐａｅｏｎｉａ  ｌａｃｔｉｆｌｏｒａ  Ｐａｌｌａｓ）は、中国東北部、東シベリア、朝鮮半島原産の、ボタン科（Ｐａｅｏｎｉａｃｅａｅ）の多年生草本である（非特許文献１）。シャクヤクの根の乾燥物は、生薬シャクヤクとして（非特許文献２）、多くの漢方処方に配合されている。例えば、厚生労働省医薬食品局より平成２３年４月１５日に通知された「一般用漢方製剤承認基準」（非特許文献３）では、２６３処方のうち、９２処方（３５％）にシャクヤクが配合されている。従って、生薬シャクヤクの需要は非常に高く、２０１２年の国内使用量は甘草に次いで第２位となっている（非特許文献４）。
【０００３】
またシャクヤクは、花が大きく美しく、香りもするため、切り花としての需要も高く、２０１１年の切り花品目取扱金額は第３４位、取扱数量は第３２位となっている（非特許文献５）。
【０００４】
しかしながらシャクヤクは、このような需要の高さに関わらず、増殖が困難であるという欠点を有する。
【０００５】
シャクヤクは、種子から、又は株分けによって、増殖されうるが、シャクヤク種子の発芽は通常２年の長期間を要する上に、種子の保存温度、保存期間や乾燥の影響を受けるという困難を伴うことが報告されている（非特許文献６、７）。そのため、シャクヤクの増殖は通常は株分けによって行われている（非特許文献８）。特に、古くから奈良県で栽培・育成されてきた薬用品種である「大和シャクヤク（梵天）」は、雄性不稔であるために種子が得られず、腋芽が形成されないことから、増殖は株分けでしか行われない（非特許文献９）。
【０００６】
シャクヤクの株分けによる増殖は、通常、３年生以上の株について行われる（非特許文献８、９）。そのため大量増殖は困難である。また、根を生薬として用いるためには、通常４年以上の栽培期間を要する（非特許文献８、９）。
【０００７】
従って、シャクヤク苗を短期間で大量に増殖させる方法、及び、生薬「芍薬」を短期間で得るための方法の開発が渇望されている。
【０００８】
シャクヤク苗を短期間で大量に増殖させるため、又は生薬「芍薬」を短期間で得るために有用となり得る技術として、これまでに、実生苗の育成方法（非特許文献１０）や人工栽培に関する方法（非特許文献９）が開示されている。さらに、植物組織培養による増殖方法（非特許文献７、１１〜１７）が開示されている。
【０００９】
非特許文献１０に記載された実生苗の育成方法では、親株からの種子の採取から実生苗を得るまでの期間を短縮させる、種子の発芽条件が開示されている。しかしながらこの方法は、材料となる大量の種子が得られることを前提としたものであり、種子の入手が困難な場合には適用できない。
【００１０】
非特許文献９に記載された人工栽培に関する方法では、株分け後の苗の育成期間を短縮するための方法が開示されているが、短期間で多数の苗を得る手法としては効率的とは言い難い。
【００１１】
非特許文献７に記載された胚培養による手法では、継代培養可能な植物組織培養物の育成は行われていない。非特許文献１１において２種の園芸品種について記述されている植物組織培養では、高頻度のシュートの発根（２品種でそれぞれ１００％及び７５％）が得られたとされている。しかしその手順は、茎の根元に十分な酸素を供給するための特殊な培養方法（ペーパーブリッジ法）を必要とした煩雑なものであり、試験管外への馴化における活着も半数程度であって十分とは言い難い。
【００１２】
非特許文献１２に記載された植物組織培養では、一園芸品種について最高で８０％のシュートの発根が得られたとされている。しかし非特許文献１２の培養手順も、発根培養前の低温処理（４℃、４週間）、２段階の発根培養（はじめの２週間は暗所、その後は照明下）が必要であって煩雑であり、試験管外への馴化における活着も半数程度であって十分とは言い難い。非特許文献１３、１４に記載された植物組織培養ではシュートの発根について示されていない。
【００１３】
非特許文献１５に記載された植物組織培養では、一栽培品種について最高で５０％のシュートの発根が得られたとされているが、２段階の発根培養（はじめの２週間はオーキシン添加、その後は無添加）を要する煩雑な手順によるものである。非特許文献１６、１７に記載された植物組織培養は、シュートの発根率がそれぞれ最高でも２８％、１５％となっており、十分とは言い難い。
【００１４】
また、植物組織培養によるシュートの増殖時には、シュートの湿潤化や形態異常が生じることが示されている（非特許文献１４〜１６）。また、シャクヤクの薬用品種については、植物組織培養による増殖例はこれまで報告されていなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】薬学生・薬剤師のための知っておきたい生薬１００―含漢方処方―、日本薬学会編、東京化学同人、５２−５４、２００４年３月
【非特許文献２】第１７改正日本薬局方、厚生労働省、２０１６年３月
【非特許文献３】一般用漢方製剤承認基準、厚生労働省医薬食品局、平成２３年４月１５日（http://www.mhlw.go.jp/stf/shingi/2r9852000001qsro-att/2r9852000001r6nh.pdf、２０１６年７月１１日閲覧）
【非特許文献４】原料生薬使用量等調査報告書（３）―平成２３年度および２４年度の使用量―、平成２７年４月、日本漢方生薬製剤協会（http://www.nikkankyo.org/aboutus/investigation/pdf/shiyouryou-chousa03.pdf、２０１６年７月１１日閲覧）
【非特許文献５】市村一雄、「花き流通最新の動向」、Bull. Natl. Inst. Flor. Sci. 13: 1-15, 2013
【非特許文献６】米田該典ら、薬用植物種子の研究（第１報）シャクヤクの発根について、生薬学雑誌、２９：１−５（１９７５）
【非特許文献７】米田該典ら、薬用植物種子の研究（第２報）シャクヤクの発芽についての胚培養による検討（１）、生薬学雑誌、２９：６−９（１９７５）
【非特許文献８】薬用植物栽培と品質評価Ｐａｒｔ３、「シャクヤク」、４６−５８頁、薬事日報社、１９９４年
【非特許文献９】中村恭子ら、「大和シャクヤクの休眠打破と人工栽培に関する研究」、薬用植物研究３７：２２−２８、２０１５
【非特許文献１０】米田該典ら、薬用植物種子の研究（第７報）シャクヤクの実生苗の育成について、生薬学雑誌、３２：１６２−１６４（１９７８）
【非特許文献１１】Hosoki T et al., “In vitro propagation of herbaceous peony (Paeonia lactiflora Pall.) by a longitudinal shoot-split method”, Plant Cell Reports 8:243-246 (1989)
【非特許文献１２】Albers MRJ et al., “Micropropagation of Paeonia”, Acta Horticulturae 314: 85-92 (1992)
【非特許文献１３】Tian D et al., “Comparison of shoot induction ability of different explants in herbaceous peony (Paeonia lactiflora Pall.)”, Scientia Horticulturae 123: 385-389 (2010)
【非特許文献１４】Wu HJ et al., “Direct shoot induction of Paeonia lactiflora ‘Zhong Sheng Fen’ and rejuvenation of hyperhydric shoots”, New Zealand Journal of Crop and Horticultural Science 39: 271-278 (2011)
【非特許文献１５】Yu XN et al., “Multiple shoot and callus induction of herbaceous peony (Paeonia lactiflora Pall.)”, International Journal of Plant Developmental Biology 6: 51-56 (2012)
【非特許文献１６】Yu XN et al., “Multiple shoot induction and rooting of Paeonia lactiflora ‘Da Fu Gui’”, African Journal of Biotechnology 11 (41): 9776-9781 (2012)
【非特許文献１７】Jana S et al., “Shoot induction, biochemical changes during in vitro rooting in Paeonia lactiflora Pall ‘Hortensis’”, Science International 1: 318-324 (2013)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、このような従来技術の有する課題に鑑みてなされたものである。そして、本発明の目的は、植物組織培養での増殖効率が高く、水耕栽培が可能で、良好な生育を示すことができるシャクヤク優良株を提供すること、また、そのようなシャクヤク株の増殖方法と水耕栽培方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
上記課題を解決するために、本発明の第一の態様に係るシャクヤク株は、ジヒドロフラボノール−４−リダクターゼ（ＰｌＤＦＲ）遺伝子において、配列番号１で表される配列をホモ接合で有するシャクヤク株である。
【００１８】
本発明の第二の態様に係るシャクヤク株は、ＰＬＫＤ２株である。
【００１９】
本発明の第三の態様に係るシャクヤク増殖方法は、シュート増殖工程とシュート発根工程を含む植物組織培養工程を含む、シャクヤク増殖方法である。
【００２０】
本発明の第四の態様に係るシャクヤク栽培方法は、馴化工程と水耕栽培工程を含むシャクヤク栽培方法である。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、植物組織培養での増殖効率が高く、水耕栽培が可能で、良好な生育を示すことができるシャクヤク優良株を得ることができる。また、そのようなシャクヤク株の増殖方法と水耕栽培方法を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】実施例２に係る、シャクヤクＰＬＫＤ２株培養シュートの、植物組織培養によるシュートの生育と増殖のための培養条件の検討の結果を示す。
【図２】実施例２に係る、シャクヤクＰＬＫＤ２株培養シュートの、植物組織培養によるシュートの生育と発根のための培養条件の検討の結果を示す。
【図３】実施例３に係る、シャクヤクＰＬＫＤ２株培養シュートの植物組織培養によるシュートの発根のための培養温度（１５℃又は２０℃）の検討の結果を示す。
【図４】実施例４に係る、シャクヤクＰＬＫＤ２株培養シュートの植物組織培養によるシュートの生育と増殖のための、植物ホルモンの組み合わせの検討の結果を示す。
【図５】実施例４に係る、シャクヤクＰＬＫＤ２株培養シュートの植物組織培養によるシュートの生育と増殖のためのサイトカイニン濃度の検討の結果を示す。
【図６】実施例４に係る、シャクヤクＰＬＫＤ２株培養シュートの植物組織培養によるシュートの生育と増殖のためのサイトカイニン濃度の効果の再現性確認の結果を示す。
【図７】実施例５に係る、シャクヤクＰＬＫＤ２株培養シュートの植物組織培養によるシュートの発根のためのオーキシン濃度の検討の結果を示す。
【図８】実施例５に係る、シャクヤクＰＬＫＤ２株培養シュートの植物組織培養によるシュートの発根のためのオーキシン濃度の効果の再現性の確認の結果を示す。
【図９】実施例６に係る、シャクヤクＰＬＫＤ２株培養シュートの植物組織培養によるシュートの生育、増殖と発根のための培養条件の確認の結果を示す。
【図１０】実施例７に係る、シャクヤクＰＬＫＤ２株培養シュートの植物組織培養によるシュートの生育、増殖と発根に対するカルシウム濃度強化（６ ｍＭ）の効果を検討した結果を示す。写真中のスケールは１ｃｍを表す。
【図１１】実施例７に係る、シャクヤクＰＬＫＤ２株培養シュートの植物組織培養によるシュートの生育、増殖と発根に対するカルシウム濃度強化（６ ｍＭ）の効果を、ゲル化剤濃度を調整した培地を用いて検討した結果を示す。写真中のスケールは１ｃｍを表す。
【図１２】実施例７に係る、シャクヤクＰＬＫＤ２株培養シュートの植物組織培養によるシュートの生育、増殖と発根に対するカルシウム濃度強化（６ ｍＭ）の効果を、ゲル化剤濃度を調整した培地を用いて検討した結果の再現性を確認した結果を示す。写真中のスケールは１ｃｍを表す。
【図１３】実施例７に係る、シャクヤクＰＬＫＤ２株培養シュートの植物組織培養によるシュートの生育、増殖と発根に対するカルシウム濃度強化（３ ｍＭ）の効果を検討した結果を示す。写真中のスケールは１ｃｍを表す。
【図１４】実施例８に係る、シャクヤクＰＬＫＤ２株培養植物体（培養苗）の土壌への馴化と生育を検討した結果を示す。
【図１５】実施例９に係る、シャクヤクＰＬＫＤ２株培養植物体（培養苗）の底面潅水方式水耕栽培において、支持体の種類を検討した結果を示す。
【図１６】実施例９に係る、シャクヤクＰＬＫＤ２株培養植物体（培養苗）の底面潅水方式水耕栽培において、馴化期及び水耕栽培初期のカルシウム濃度強化の効果を検討した結果を示す。
【図１７】実施例９に係る、シャクヤクＰＬＫＤ２株培養植物体（培養苗）の底面潅水方式水耕栽培において、馴化期及び水耕栽培初期のカルシウム濃度強化の効果の再現性を確認した結果を示す。
【図１８】実施例１１に係る水耕栽培における苗の生育経過を示す。
【図１９Ａ】実施例１１に係る苗の、植付け時と収穫時の生育状態（図１９Ａ）、並びに、支持体の種類ごとの、活着率と、収穫乾燥根の最大径、長さ、及び重量の平均値（図１９Ｂ）を示す。
【図１９Ｂ】実施例１１に係る苗の、植付け時と収穫時の生育状態（図１９Ａ）、並びに、支持体の種類ごとの、活着率と、収穫乾燥根の最大径、長さ、及び重量の平均値（図１９Ｂ）を示す。
【図２０Ａ】実施例１２に係るシャクヤク乾燥根の部位別のＵＰＬＣ−ＰＤＡ−ＭＳ／ＭＳ分析による、正イオンモード（図２０Ａ）及び負イオンモード（図２０Ｂ）での全イオン電流（ＴＩＣ）クロマトグラムを示す。
【図２０Ｂ】実施例１２に係るシャクヤク乾燥根の部位別のＵＰＬＣ−ＰＤＡ−ＭＳ／ＭＳ分析による、正イオンモード（図２０Ａ）及び負イオンモード（図２０Ｂ）での全イオン電流（ＴＩＣ）クロマトグラムを示す。
【図２１】アルビフロリン（Ａｌｂ）、ペオニフロリン（Ｐａｅ）、及びペンタガロイルグルコース（ＰＧＧ）についての、ＵＰＬＣ−ＰＤＡ−ＭＳ／ＭＳ分析による負イオンモードでのＭＳスペクトルを示す。
【図２２】実施例１２の試料における、（ａ）部位ごと、及び（ｂ）個体・部位ごとの、アルビフロリン（Ａｌｂ）、ペオニフロリン（Ｐａｅ）、及びペンタガロイルグルコース（ＰＧＧ）の含量を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
まず、本実施形態として、高い増殖効率と良好な生育を示すことができるシャクヤク優良株を単離し培養するための方法を説明する。
【００２４】
シャクヤク優良株を単離するための出発材料として使用されるシャクヤクは、いずれの品種ないし系統のものであってもよく、例えば北宰相、べにしずか、梵天などが使用され得る。生薬「芍薬」の原料生産の観点からは北宰相を用いることが特に好ましい。
【００２５】
上述したように、通常シャクヤクは株分けによって増殖される。シャクヤク優良株を単離するためには、株分けによって維持されているシャクヤクの植物体を出発点としてもよいが、あえて種子を実らせて種子を採取することを出発点としてもよい。複数の種子から出発することにより、染色体組換えを経て生じた遺伝学的に多様な個体群から優良株を選抜することが可能となり、好ましい。
【００２６】
本明細書において「植物体」とは、葉、茎、根から構成され、１個の個体として成長が可能なものをいい、苗も呼ばれることもある。また、後述する「シュート」とは、１つの茎頂分裂組織（生長点ともいう）に由来する茎と葉（植物体地上部）の単位である。１シュートは、１本の茎とその先端の１個の生長点及びその周りの葉（通常複数）から構成される。「培養シュート」とは、植物組織培養により得られたシュートのことをいう。「マルチプルシュート」とは、植物組織培養で得られた多くのシュートを持つ塊のことをいい、多芽体ともよばれる。「植物組織培養」とは、植物組織の一部を、適当な培養器内で生存・増殖させることをいい、単に培養ということもある。植物組織培養は、通常、無菌的に行われる。植物組織培養で得られた植物器官、組織、細胞等を総称して植物組織培養物、又は単に培養物という。本明細書において、「増殖・育苗過程」とは、苗を増殖させ、栽培（水耕栽培、圃場栽培を含む）が可能な苗の大きさまで成長させる過程をいう。
胚とは、受精後に発生を始めた幼生物のことをいい、種子胚とは、種子中にある幼植物のことをいう。不定胚とは、植物の組織や細胞を組織培養して得られる、受精胚と同様の構造をした組織のことをいう。不定胚は、受精胚と同様に頂端と基端を有し、頂端からは芽や子葉が、基端からは根が分化・成長する。発根とは、植物組織の一部から根が分化・成長することであり、種子の発根とは、種子胚の基端から根が分化・成長することをいう。発芽とは、種子胚又は不定胚の頂端から芽や子葉が分化し成長することをいう。
【００２７】
種子（種子胚）から発芽及び／又は発根を得るまでの培養は、暗所で行った方が、より高い形態形成能が得られるので好ましい。この暗所での培養は、例えば少なくとも３０日、少なくとも４０日、又は少なくとも５０日継続され得る。その後の培養は、通常の照明サイクル下で行うことが好ましい。特に記載されない限り、本明細書における培養は、１４時間明期１０時間暗期の照明サイクルの下で行われる。明期の長さを変更してもよい。明期の長さは好ましくは１２〜１８時間であり、例えば１２〜１４時間、１４〜１６時間、又は１６〜１８時間とし得る。
【００２８】
種子（種子胚）から植物体を得るまでの培養過程は、当業者によって適宜選択される培地中で行うことができる。「培地」とは、植物組織等を生存・増殖させるための栄養分を含んだ溶液、又は、それを寒天やゲルライト等のゲル化剤等で固化させたものである。例えば（２）／２ＭＳ固形培地（主要無機塩類を１／２量としたＭｕｒａｓｈｉｇｅ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ（ＭＳ）培地、ショ糖２％、０．２５％ゲルライト）中で培養を行うことができる。種子（種子胚）から植物体を得る培養過程を２３℃以上で行うと、培地が著しく褐変し得るので、より低い温度、例えば１７〜２２℃、１８〜２１℃、１９〜２１℃、又は２０℃±０．５℃にて行うことが好ましい。あるいは、１３〜１７℃、１４〜１６℃、又は１５℃±０．５℃で行ってもよい。
【００２９】
培地は植物ホルモンを含有することがある。植物ホルモンとは、植物組織培養において、植物組織を生存・増殖させ、又は芽や根等の植物器官に分化させ、あるいはカルス等の不定形の組織に脱分化させるために、培地に添加して用いられる化合物群である。本明細書に記載される様々な培養段階において培地に添加されうる適切な植物ホルモンの種類、組合せ、添加量、並びに添加すべきタイミング及び無添加にすべきタイミングは、本開示を参照しながら当業者が適宜決定することができる。植物組織培養により、植物組織の一部から植物体を再生させ、植物個体を増殖させる目的では、主に、オーキシンとサイトカイニンと総称される植物ホルモンが培地に添加される。オーキシンとは、細胞分裂促進、側芽成長抑制、発根促進などの作用がある植物ホルモンの総称であり、本明細書中で例示されているものではナフタレン酢酸（ＮＡＡ：以下、Ｎと表記）とインドール酪酸（ＩＢＡ：以下ＩＢと表記）が該当する。また、サイトカイニンとは、細胞分裂促進、芽の分化促進、老化抑制などの作用をもつ植物ホルモンの総称であり、本明細書中で例示されているものではベンジルアデニン（ＢＡ：以下、Ｂと表記）が該当する。
【００３０】
種子胚から植物体を得る培養過程や、他の組織培養の過程において、任意の適切な固形培地が使用され得る。これらの適切な固形培地は、当業者に知られているか、又は当業者が通常の知識に基づいて適宜調製することができる。固形培地は、塩類、糖類、ビタミン類、アミノ酸、植物ホルモン、その他の栄養成分、緩衝剤等を含み得、寒天、ゲルライト等で固形化され得る。適切な固形培地の具体例は下記実施例にも例示されている。１つの培地から別組成の培地へ、又は１つの培地から同組成の培地へ、適宜移植することができる。
【００３１】
なお、当業者には理解されるように、例えば「（２）／２ＭＳ  ＩＢ０．１Ｂ３」という培地の表記における「ＩＢ」「Ｂ」というアルファベットは植物ホルモン名の頭文字を表し、それに続く数字「０．１」「３」は添加量をｍｇ／Ｌで表す。例えば、「ＩＢ０．１Ｂ３」は、Ｉｎｄｏｌｅ−３−Ｂｕｔｙｒｉｃ  Ａｃｉｄすなわちインドール−３−酪酸、及びＢｅｎｚｙｌａｄｅｎｉｎｅすなわちベンジルアデニンを表す。「／２ＭＳ」は主要無機塩類を１／２量としたＭＳ培地を表す。括弧内の数字はショ糖の濃度を％（重量／体積）で表し、この括弧の数字がない場合はショ糖濃度３％である。
【００３２】
標準的なＭＳ培地の組成は以下の通りである。
多量要素（主要無機塩類）
硝酸アンモニウム（ＮＨ４ＮＯ３）  １，６５０ｍｇ／Ｌ
塩化カルシウム（ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ）  ４４０ｍｇ／Ｌ
硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）  ３７０ｍｇ／Ｌ
リン酸カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）  １７０ｍｇ／Ｌ
硝酸カリウム（ＫＮＯ３）  １，９００ｍｇ／Ｌ
微量要素
ホウ酸（Ｈ３ＢＯ３）  ６．２ｍｇ／Ｌ
塩化コバルト（ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ）  ０．０２５ｍｇ／Ｌ
硫酸銅  （ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ）  ０．０２５ｍｇ／Ｌ
硫酸鉄（ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）  ２７．８ｍｇ／Ｌ
硫酸マンガン（ＩＩ）（ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ）  ２２．３ｍｇ／Ｌ
ヨウ化カリウム（ＫＩ）  ０．８３ｍｇ／Ｌ
モリブデン酸ナトリウム（Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ）  ０．２５ｍｇ／Ｌ
硫酸亜鉛（ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）  ８．６ｍｇ／Ｌ
Ｎａ２ＥＤＴＡ・２Ｈ２Ｏ  ３７．２ｍｇ／Ｌ
ビタミン及びその他有機化合物
ｍｙｏ−イノシトール  １００ｍｇ／Ｌ
ニコチン酸  ０．５ｍｇ／Ｌ
塩酸ピリドキシン  ０．５ｍｇ／Ｌ
塩酸チアミン  ０．１ｍｇ／Ｌ
グリシン  ２．０ｍｇ／Ｌ
【００３３】
植物組織培養による植物体の増殖は、通常、初期培養過程、シュートの増殖過程、及びシュートの発根過程の、３段階で行われる。
【００３４】
初期培養過程は、無菌的ではない通常の植物体から、植物組織培養物を誘導する過程であり、通常、種子や植物組織の一部（外植片ともいう）を殺菌して培地に植え付け、培養することで開始される。
【００３５】
シュートの増殖過程は、初期培養過程で得られた培養物の一部、又は、それを継代培養して得られた培養物の一部から、植付け片を調製し、培養して多数の芽（シュートともいう）を得る過程である。本実施形態の方法において「シュート増殖工程」という場合、それは、植物組織培養においてシュートの数を増加させる（増殖させる）工程を表す。継代培養とは、培養物の一部を新しい培地に移し、再び培養することをいう。継代培養を定期的に行うことにより、植物組織培養により育成された優良植物株クローンを、長期間、無菌的に維持できる。
【００３６】
シュートの発根過程は、シュートの増殖過程において得られた培養シュートを、個々に分割してシュート片を調製し、発根に適した組成の培地で培養して発根させる過程である。発根したシュートは、圃場栽培あるいは水耕栽培に使用可能な植物体（培養苗）となる。本実施形態の方法において「シュート発根工程」という場合、それはシュートを発根させて植物体を得る工程を表す。
【００３７】
一側面では、シュート増殖工程とシュート発根工程を含む植物組織培養工程を含む、シャクヤク増殖方法が提供される。多くの場合、初期培養過程とシュートの増殖過程では、サイトカイニン、又はオーキシンとサイトカイニンを組み合わせた培地が用いられる。多くの場合、シュートの発根過程では植物ホルモン無添加（ホルモンフリー：以下、ＨＦと表記する）又はオーキシンを添加した培地が用いられる。
【００３８】
植物体から組織を培養して、マルチプルシュートがいったん形成されれば、そこから個々のシュート塊あるいはシュート片を切除して、組織培養によりさらに増殖させることが可能になる。組織培養用株として確立されたものではない能力未知数の試料を出発点とする場合、マルチプルシュート形成に至る確率は必ずしも高くないので、複数、例えば４個以上、１０個以上、又は２０個以上の植物組織を並行して培養することが好ましい。また、種子を出発点とする場合には、例えば１０個以上、１５個以上、２０個、又は２５個以上の種子を並行して培養することが好ましい。
【００３９】
マルチプルシュートから切除され植え付けられる個々のシュート塊は、１つのシュート、又は複数のシュート（例えば２、３個のシュート）を含み得る。これらのシュート塊の長さは、通常は約０．５ｃｍ、約１ｃｍ、又は約２ｃｍであるが、それより大きくても小さくてもよい。シュート塊を小さくすれば一度に得られる株数を増やせる反面、培養にかかる時間が延長され得ると理解される。
【００４０】
従来、組織培養での増殖は、通常は２０〜２５℃程度の温度で行われてきた。上述した過程により薬用品種「北宰相」の一種子から得られた株、ＰＬＫＤ２は、この段階の培養を通常より著しく低い温度で行うことにより、生育が著しく改善かつ安定し、旺盛なシュート形成を示すことが見出された。その温度とは、約１５℃、すなわち１３〜１７℃、好ましくは１４〜１６℃、より好ましくは１５℃±０．５℃である。すなわち本実施形態の方法は、約１５℃の温度にてシュート塊の培養を行うことを特徴とする。シャクヤクの増殖方法の一態様は、シャクヤクＰＬＫＤ２株のシュート塊を固形培地で１３〜１７℃の温度にて培養してマルチプルシュートを形成させる工程を含む。発根過程の培養も上記約１５℃の温度にて行われ得る。ＰＬＫＤ２は、発根培養前の低温処理（４℃等）を必要としない。
【００４１】
シュートを約１５℃で培養する段階は、合計時間として例えば少なくとも３０日間、少なくとも４０日間、少なくとも５０日間、少なくとも６０日間、少なくとも７０日間、又は少なくとも８０日間継続され得る。「継続」とは、途中で培地を交換すること（新しい培地へ移植すること）を排除するものではない。好ましい一態様では、１３〜１７℃の温度における培養が、少なくとも３０日間継続される。
【００４２】
本実施形態の組織培養方法においては、上記のように培養温度を約１５℃とするほか、明期の照度を３，０００〜７，０００ルクスとすることが好ましく、より好ましくは４，０００〜６，０００ルクス、さらに好ましくは４，５００〜５，５００ルクスとする。従来の組織培養では、３，０００ルクス未満の比較的弱い照度しか用いられてこなかった。植物が生産するフェノール性化合物（所謂ポリフェノール類）の量は光強度に応じて高くなることが知られており、シャクヤクの培養に強い光条件を用いるとフェノール性化合物により培地が黒変し、成長が止まってしまうと考えられていたことが一因と考えられる。本発明者らは、１３〜１７℃という培養温度と３，０００〜７，０００ルクスという強い光の組合せが、シャクヤク株の組織培養、具体的にはシュート増殖工程及びシュート発根工程において有用であることを見出した。この温度・光条件の組合せは、ＰＬＫＤ２以外の株にも適用され得る。一態様では、シュート増殖工程とシュート発根工程が、温度１３〜１７℃、明期１２〜１８時間、照度３，０００〜７，０００ルクスで行われる。
【００４３】
マルチプルシュートが得られた後の手順としては、複数のシュート塊をさらに採取して増殖を行うこと、ストック維持のためにシュート塊を植え継ぐこと、植物体をさらに成長させて圃場栽培又は水耕栽培に備えること、等の選択肢がある。マルチプルシュートを、さらに成長した植物体へと培養する際には、通常の培養温度、すなわち２０〜２５℃に移してもよい。しかしながら、約１５℃での培養を維持することが、高い発根率につながり得るため、より好ましい。つまり、圃場栽培又は水耕栽培に移す前の組織培養の全てを約１５℃で行うことができる。
【００４４】
ＰＬＫＤ２株であるシャクヤク株は、約１５℃の温度のもと、当業者が通常の知識に基づいて調製する様々な培地組成で安定して生育することができる。ＰＬＫＤ２の培地中に添加され得る植物ホルモンの例としては、１〜３ｍｇ／Ｌのベンジルアデニン、０．１〜１ｍｇ／Ｌのインドール−３−酪酸、及びこれらの組合せが挙げられるが、それに限定されない。当業者に理解されるように、ベンジルアデニンは他のサイトカイニンで、インドール−３−酪酸は他のオーキシンで代用ないし補強され得る。植物ホルモンを含まないＨＦ培地も使用でき、これは特に、シュート生育後、発根を促す際に用いられ得る。
【００４５】
標準的なＭＳ培地は３ｍＭの濃度でカルシウム（Ｃａ２＋イオン；以下、単に「Ｃａ」と表記することもある）を含む。一般に、固形培地中のカルシウム濃度は１〜３ｍＭ程度であり得、最も汎用性の高い培地の一つである１／２ＭＳ培地は１．５ｍＭのカルシウムを含む。しかしながら、本発明者らは、培地中のカルシウム濃度を高くしてＰＬＫＤ２株のシュートを培養することにより、草丈が高くなり、葉が頑健になり、シュート数が増加しうることを見出した。すなわち、好ましくは、固形培地が１〜７ｍＭのカルシウムを含む。本実施形態によりシュートを培養する際の、培地中のカルシウム濃度は、好ましくは１．５〜７ｍＭ、より好ましくは２．５〜６．５ｍＭ、特に好ましくは３〜６ｍＭ、又は４〜６ｍＭもしくは４〜７ｍＭである。一態様では、シュート増殖工程とシュート発根工程において、１〜７ｍＭのＣａ２＋イオンを含有する培地でシャクヤク組織が培養される。カルシウム濃度を高くすると、固形培地が硬くなる傾向があり発根に影響を与え得るので、その場合は固化剤（寒天、ゲルライト等）の濃度を低く（例えば通常の４０〜６０％に）調整することが好ましい。
【００４６】
上記カルシウム濃度の培地でシュートを培養する段階は、合計時間として例えば少なくとも３０日間、少なくとも４０日間、少なくとも５０日間、少なくとも６０日間、少なくとも７０日間、又は少なくとも８０日間継続され得る。上記カルシウム濃度の培地で培養する期間は、上記約１５℃で培養する期間と一致あるいは重複してもよい。上記約１５℃という培養温度と上記カルシウム濃度の培地とを同時に使用することが好ましい。
【００４７】
シュート塊から出発して根と葉を発達させた苗は、当業者に知られているように、圃場栽培に備えて、土壌への定植・馴化に供し得る。本発明者らは、それに代えて、シャクヤク株の苗を水耕栽培できることを見出した。すなわち、シャクヤク株の苗を、ツリーポット等の適切な栽培容器に移して水耕栽培を行うことができる。従って、シャクヤク増殖方法の一態様は、マルチプルシュートを形成したシャクヤクを固形培地上でさらに培養して成長及び発根した苗を取得する工程、並びに、前記苗を、馴化する工程（馴化工程）及び水耕栽培により栽培する工程（水耕栽培工程）をさらに含む。前記馴化工程と水耕栽培工程は、同じ栽培容器内で連続して行ってもよい。
【００４８】
水耕栽培は、例えばパミス、バーミキュライト等の支持体を充填したツリーポット等の栽培容器に、培養試験管から取り出し洗浄した培養苗（培養植物体）を定植（植物体地下部を支持体中に保持）し、容器底面から養液を供給することによって実施し得る。定植直後は、過度な乾燥を防ぐために、植物体地上部全体をフィルム状の透明材料（いわゆるラップ等）で覆って栽培を行うことが好ましい。このような処置を馴化工程のあいだ必要に応じて随時行ってもよい。馴化工程は、培養植物体（培養苗）を試験管外の栽培環境に馴らす工程である。試験管内は相対湿度１００％であるため、試験管から取り出した直後は高湿度を保たないと苗が萎れて枯れる傾向がある。また、試験管内の培地から取り出した直後の根は、少なからずダメージを受けているので、試験管から取り出して、定植した植物の根が新しい環境で成長を開始するまでは、肥料の供給は行わないか、低濃度にすることが好ましい。この馴化工程は、閉鎖型施設で実行することが好ましい。閉鎖型施設とは、閉鎖温室（窓が開閉しない）、グロースチャンバー室、人工気象器等の、栽培環境（湿度、温度、及び／又は給水を含む）が人工的に制御された閉鎖空間を意味する。馴化工程は数日間、例えば１０〜６０日間、１４〜５０日間、あるいは２０〜４０日間行われ得る。新しい環境、すなわち試験管外の栽培環境において、新しい葉が形成する、草丈が伸長する等の明らかな植物の成長が認められれば、馴化完了と判断される。馴化後は、植物体を栽培する「水耕栽培工程」が行われる。 水耕栽培工程は、閉鎖型施設又は開放型施設で好ましく実行され得る。開放型施設とは、野外圃場、通常の温室など、野外環境と隔たりのない施設を意味する。一側面において、馴化工程と水耕栽培工程を含むシャクヤク水耕栽培方法が提供される。
【００４９】
一般に水耕栽培は２０〜２５℃程度の温度で行われ得るが、本発明者らは、シャクヤク株については、この段階においても約１５℃という低い栽培温度が活着率の向上につながり得ることを見出した。この傾向はＰＬＫＤ２株及びそれ以外の株でも観察された。一例として、水耕栽培は、約１５℃、すなわち１３〜１７℃、好ましくは１４〜１６℃、より好ましくは１５℃±０．５℃の温度にて、ツリーポット等の適切な栽培容器内で、水又は適切なその他の水性培地（養液）に苗を維持することにより行うことができる。
【００５０】
上記約１５℃の温度を、合計時間として例えば少なくとも３０日間、少なくとも４０日間、少なくとも５０日間、少なくとも６０日間、少なくとも７０日間、又は少なくとも８０日間継続させて水耕栽培を行うことが好ましい。水耕栽培の全期間を約１５℃の温度で行ってもよい。
【００５１】
水耕栽培における明期の照度は３，０００〜３０，０００ルクスであり得、好ましくは３，０００〜１０，０００ルクス、より好ましくは３，０００〜５，０００ルクスとする。水耕栽培におけるＣＯ２濃度は３００〜１，５００ｐｐｍであり得、好ましくは５００〜１，２００ｐｐｍ、より好ましくは８００〜１，１００ｐｐｍである。栽培容器内には通常パミス、バーミキュライト等の支持体が充填される。バーミキュライトがより好ましい。一態様において、シャクヤク水耕栽培方法は、馴化工程と水耕栽培工程を含み、これらの馴化工程と水耕栽培工程では、温度１３〜１７℃、明期１２〜１８時間、照度３，０００〜３０，０００ルクス、ＣＯ２濃度３００〜１，５００ｐｐｍで栽培が行われる。
【００５２】
一態様において、シャクヤクを水耕栽培する方法は、馴化工程と水耕栽培工程を含み、これらの工程では、１〜６ｍＭのＣａ２＋イオンを含有する養液を用いて栽培が行われる。水耕栽培においても、水性培地（養液）へのカルシウム添加が、初期生育の促進及び活着率の向上において有益であることが見出された。この傾向はＰＬＫＤ２株及びそれ以外の株でも観察された。ただし、水耕栽培でのカルシウム濃度は、上記組織培養で好ましいとされた濃度の半分程度であることが好ましい。すなわち苗の水耕栽培における養液のカルシウム濃度は好ましくは１．５〜４ｍＭ、より好ましくは２．０〜３．５ｍＭ、さらに好ましくは２．５〜３．２５ｍＭ、特に好ましくは３ｍＭである。一態様において、成長及び発根したシャクヤク株の苗を水耕栽培する工程は、１．５〜４ｍＭのカルシウムを含む水性培地にて前記苗を栽培することを含む。特に、栽培初期、例えば水耕栽培開始から少なくとも２０日間、少なくとも３０日間、少なくとも４０日間、少なくとも５０日間、又は少なくとも６０日間、このカルシウム濃度の培地を使用することが好ましい。この期間は、上記約１５℃の栽培温度を用いる期間と一致又は重複していてもよい。上記約１５℃の栽培温度と上記カルシウム濃度の培地とを同時に使用することが好ましい。別の態様では、シャクヤクを水耕栽培する方法は、馴化工程と水耕栽培工程を含み、馴化工程では、０〜６ｍＭのＣａ２＋イオンを含有する養液を用いて栽培が行われる。
【００５３】
水性培地には、他にも、当業者が植物の栽培に通常使用する他の成分、例えば窒素、ミネラル、有機酸、無機酸、アミノ酸、植物ホルモン等が添加され得る。市販の養液が好ましく使用される。例えば、大塚Ａ処方（１Ｌ水中、ＯＡＴハウス１号１．５ｇ＋ＯＡＴハウス２号１ｇ）の養液を１／８〜１／４濃度で使用し得る。
【００５４】
本実施形態は、別の側面において、上記の過程により単離され、上記の方法で効率よく培養、維持、増殖、生育、水耕栽培することができるシャクヤク株である、ＰＬＫＤ２を提供する。ＰＬＫＤ２は北宰相品種に由来する株である。
【００５５】
本発明者は、ＰＬＫＤ２株を、ブダペスト条約上の国際寄託機関でもある独立行政法人製品評価技術基盤機構  バイオテクノロジーセンター 特許生物寄託センター（ＮＩＴＥ−ＩＰＯＤ）（所在地：日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ １２０号室）に寄託申請した（受領番号：ＦＥＲＭ  ＡＰ−２２３１７）が、受託証不交付通知書を受理した（通知番号２０１６−０７６１）。発明者らは、ＰＬＫＤ２株を、国立研究開発法人  医薬基盤・健康・栄養研究所  薬用植物資源研究センター  筑波研究部  育種生理研究室（所在地：日本国茨城県つくば市八幡台１−２）内において自己寄託し、維持・保存している。本出願人は、日本国特許法施行規則第２７条の３各号に該当する場合、各法令の遵守を条件に、第三者にＰＬＫＤ２株を分譲することを保証する。
【００５６】
ＰＬＫＤ２株は、シュート、植物体、苗、あるいは土壌で栽培される成熟植物などの状態で存在し得る。これらＰＬＫＤ２のシュート、植物体、苗、成熟植物等（生殖細胞、種子を除く）は、株分けにより流通しているシャクヤクとは異なる固有のゲノム配列を有する。ＰＬＫＤ２株のゲノムを識別するために有用な遺伝子マーカーの例として、本発明者らは、ＰｌＤＦＲ遺伝子のエキソン２〜エキソン４に渡る７７７ｂｐ領域の配列を同定した。ＰｌＤＦＲは、シャクヤク植物におけるアントシアニン等の色素の生合成に関わると推定されるフラボノイド生合成経路の遺伝子、 ジヒドロフラボノール−４−リダクターゼ（Ｄｉｈｙｄｒｏｆｌａｖｏｎｏｌ−４−ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）である。
【００５７】
すなわち、ＰＬＫＤ２株は、ジヒドロフラボノール−４−リダクターゼ（ＰｌＤＦＲ）遺伝子において、配列番号１で表される配列をホモ接合で有する。配列番号１の配列を下記に示す。
2018157808.tif 000002
【００５８】
特に、上記配列の少なくとも第５６番目（Ａ）、第１４６番目（Ｇ）、第１６２番目（Ｇ）、第１７５番目（Ａ）、第２１２番目（Ｇ）、第２２４番目（Ｔ）、第２４３番目（Ｃ）、第２７５番目（Ｇ）、第３３５番目（Ｇ）、第３６８番目（Ａ）、第３９２番目（Ａ）、第４５２番目（Ｃ）、第５３４〜５５４番目（２１ヌクレオチド長のＴリッチ配列）、第５９１番目（Ｔ）、第６２５番目（Ｃ）、第６２６番目（Ｔ）、第６３２〜６４９番目（１８ヌクレオチド配列の存在）、第６５６番目（Ａ）、第６５７〜６６３番目（７ヌクレオチド配列の存在）、第６６４番目（Ｔ）、第７０３番目（Ｃ）、第７５４番目（Ｔ）の塩基には、異なるシャクヤク間で多型が存在しており、これらの塩基をこの特定の組合せで持つＤＮＡ配列がホモ接合で存在していれば、ＰＬＫＤ２株であることを識別するための一つの手がかりとなる。すなわち本実施形態は、ジヒドロフラボノール−４−リダクターゼ（ＰｌＤＦＲ）遺伝子において配列番号１で表される配列をホモ接合で有するシャクヤク株を提供する。
【００５９】
上記配列をホモ接合で有するか否かの確認は、ＤＮＡ配列決定、特異的プライマーを用いたＰＣＲ実験、制限酵素断片長解析等、当業者に知られた手法を適宜組み合わせて行うことができる。
【００６０】
また、公知の技術及び配列情報を利用して、シャクヤクゲノムにおける上記以外の多型部位を同定し、対応するＰＬＫＤ２の遺伝子型を決定して、他のシャクヤク株からの識別を行うことも可能である。
【００６１】
以下、実施例により本実施形態をさらに詳細に説明するが、本実施形態はこれらの例に限定されない。
【実施例】
【００６２】
［実施例１：シャクヤク薬用品種「北宰相」（ＰＬＫ）種子からの培養シュートの誘導］
国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所薬用植物資源研究センター筑波研究部標本園で保存栽培中のシャクヤク〔品種名：北宰相（ＰＬＫ）〕から種子を採取し、７５％（ｖ／ｖ）エタノールで１分間殺菌後、滅菌水で漱いだ。次いで、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有２％（ｖ／ｖ）次亜塩素酸ナトリウム溶液中で攪拌しながら室温（約２５℃）で１０分間殺菌後、滅菌水で３回漱いだ。殺菌後の種子より、胚（種子胚）を取り出し、（２）／２ＭＳ固形培地（主要無機塩類を１／２量としたＭＳ培地、ショ糖２％、０．２５％ゲルライト、培地５ｍＬ／径１．８ｃｍ高さ９ｃｍ培養試験管）に無菌的に播種した。２３℃において、１４時間明期（Ｌ）（４３０ルクス）又は暗所（Ｄ）で培養したところ、いずれの条件においても９日後から発根が認められたが、培地が褐変した。そこで、播種１６日後に新しい同培地に交換し、培養温度を２０℃に変更して培養を継続した。その結果、１４時間明期よりも暗所の方が発根率、子葉展開率とも高く、また、不定胚形成も認められた。播種４７日後までの結果を下記表１に要約する。後述するＰＬＫＤ２株は、暗所で培養した一種子に由来するものであり、発根及び発芽が認められた。
【００６３】
【表１】
2018157808.tif 000003
【００６４】
発根、発根発芽、又は不定胚が形成をした種子胚を、播種４８日後に、Ｎ  ０．１ｍｇ／Ｌ＋Ｂ  ３ｍｇ／Ｌ（以下、植物ホルモンの記号に続く数値は、濃度ｍｇ／Ｌを示す）及び３％ショ糖を含有するＭＳ培地（ＭＳ  Ｎ０．１Ｂ３）に移植した。これを、２０℃、１４時間明期（５，０００ルクス）で培養した（３０ｍＬ／径４．０ｃｍ高さ１２ｃｍ培養試験管、以降の培養は本試験管にて実施）。培養開始から８３日後に、植物ホルモン非含有のＭＳ培地（ＭＳ  ＨＦ）に移植し、２０℃、１４時間明期（約５，０００ルクス）で６０日間培養したところ、発根あるいは発根発芽した種子からは植物体が再生した。再生率は１６％であった。
【００６５】
得られた植物体を、上記ＨＦ培地で培養開始してから６５日後にＭＳ  Ｎ０．１Ｂ３培地に移植した。それから１１９日後に、同じ植物ホルモン組成、０．５ｍｇ／Ｌ  ＭＥＳ（２−モルホリノエタンスルホン酸）、及び３％ショ糖を含有するＭＳ培地（ＭＥＳ  Ｎ０．１Ｂ３）に移植して培養した。この培養開始７７日後までに、ＰＬＫＤ２株にマルチプルシュートが形成した。しかし、他のクローンは全て枯死した。
【００６６】
上記ＰＬＫＤ２のシュートより、シュートの生長点を含む一部を切り取って調製した切片（シュート片）を、ホルモン組成の異なる様々な培地に移植してシュート増殖を試みたが、生育不良の結果が得られた。そのシュートを、Ｂを３ｍｇ／Ｌ添加した（２）／２ＭＳ培地（（２）／２ＭＳ  Ｂ３）に移植して培養したところ、緑カルスが僅かに残る状態となり、生育が完全に停止した。しかしながら、本培養物を、２０℃の培養環境から、１５℃の培養環境へ移動させ培養を継続したところ、生育が回復し、旺盛なシュート形成が認められた。この約１５℃という温度と光条件（１４時間明期、約５，０００ルクス）が、生育及びシュート形成のための鍵となることが見出された。以降の組織培養での光条件は、１４時間明期、約５，０００ルクスとした。
【００６７】
以上により、植物組織培養で確実に継代培養が可能なシャクヤク株、ＰＬＫＤ２培養シュートが得られた。
【００６８】
［実施例２：シャクヤクＰＬＫＤ２株培養シュートの植物組織培養によるシュートの生育と増殖、及び発根のための培養条件の検討］
ＰＬＫＤ２で得られたマルチプルシュートから、草高１ｃｍ未満の２〜３個の小シュート（以下、草高１ｃｍ未満のシュートを小シュートと表記）を含む小シュート塊（約５ｍｍ角；以下、小シュート塊と表記）を調製した。これを（２）／２ＭＳ  Ｂ３又は（２）／２ＭＳ  ＩＢ１Ｂ３に１試験管あたり１個植え付けて、１５℃、１４時間明期で培養したところ、いずれの培地でも良好な生育とシュートの増殖が認められた（図１上）。シュート長は、シュート基部から最も高いシュートの葉までの長さ（草高）（ｃｍ）を示し、シュート数は、成長が認められた培養物について、１試験管あたりに形成したシュートの数を示している。以下同様にシュート長及びシュート数を計測した。
【００６９】
上記シュート培養で草高１ｃｍ以上の生育がよいシュート（大シュート；以下、草高１ｃｍ以上のシュートを大シュートと表記）より、大シュート片を調製した。これを（２）／２ＭＳ  ＨＦ培地に、１試験管あたり１個植え付け、１５℃にて培養したところ、８１日後に発根が認められた（発根率：１０．５％）。なお、発根率は、植え付けた大シュート片数に対する発根した大シュート片数の割合を示している。以下同様に、発根試験は、１試験管あたり１個の大シュート片を植え付け、同様に発根率を算出した。
一方、小シュート塊については、（２）／２ＭＳ  ＩＢ０．１Ｂ３培地又は（２）／２ＭＳ  ＩＢ１Ｂ３培地において１５℃にて生育を試みた。いずれにおいてもシュート増殖は良好であったが、シュート長はＩＢ０．１Ｂ３の方が高い傾向が認められた（図１下）。
さらにこれらを、２０℃、１４時間明期に移してＨＦ培地での培養を継続したところ、１３２日後（２０℃移動から５１日後）に発根率は３６．８％に上昇した（図２）。またＨＦの前の培地は、Ｂ３（ＩＢなし）添加培地の方が、シュート長が有意に高かった（図２）。
【００７０】
［実施例３：シャクヤクＰＬＫＤ２株培養シュートの植物組織培養によるシュートの発根のための培養温度の検討］
図１の、ＩＢ０．１Ｂ３又はＩＢ１Ｂ３添加培地における培養により得られた生育のよい大シュートより調製した大シュート片について、ＨＦ又はＩＢ１添加の（２）／２ＭＳ培地を用い、１５℃又は２０℃で発根試験を行った（図３）。培養５０日後、１５℃、ＩＢ１（前培地ＩＢ０．１Ｂ３） の大シュート片では発根率７１．４％が得られた。１５℃におけるＩＢ１培養全体の発根率は５０．０％であった。一方、２０℃におけるＩＢ１培養全体の発根率は１２．５％であった。すなわち、発根過程に関しても、約１５℃という温度と光条件（１４時間明期、約５，０００ルクス）により、発根期間が著しく短縮され、発根率が著しく向上し得ることが明らかとなった。
【００７１】
［実施例４：シャクヤクＰＬＫＤ２株培養シュートの植物組織培養によるシュートの生育と増殖のための培養条件の検討］
図１のＩＢ０．１Ｂ３又はＩＢ１Ｂ３添加培地で得られた小シュートについて、小シュート塊を調製し、種々濃度のＩＢ（０、０．１及び１ｍｇ／Ｌ）とＢ  ３ｍｇ／Ｌを組み合わせた培地を用い、１５℃で増殖試験を実施した。培養５０日後、１５℃、Ｂ３添加培地（前培地ＩＢ０．１Ｂ３）で形成されたシュート数は、大シュート（発根培地に移植可能なシュート）は約２本、大シュートと小シュートの合計数は４本であり、大シュート形成率もシュート増殖率も最も良好であった（図４）。また、直前の培養で高濃度のＩＢ（１ｍｇ／Ｌ）を使用すると、低濃度のＩＢ（０．１  ｍｇ／Ｌ）に比べ、Ｂ３培地でのシュート伸長、シュート数とも有意に低くなった（図４）。
【００７２】
また、小シュート塊を、異なる濃度のＢを添加した（２）／２ＭＳ培地（Ｂ１又はＢ３）に植付けて、シュートの増殖試験を１５℃にて行った。その結果、培養７３日後、Ｂ３培地で形成シュート数約５本、シュート長４．４ｃｍ、生育率１００％が得られた（図５）。
【００７３】
Ｂ１又はＢ３添加培地で得た小シュート塊をＢ１又はＢ３添加培地に植え付けて、１５℃にて、シュート増殖の再現性と大シュートの形成数及び形成率を調べた。その結果、大シュート数はＢ１の方が多かったが、Ｂ３の方がシュート数及び大シュート形成率が高かった（図６）。
【００７４】
以上の結果より、ＰＬＫＤ２株培養シュートの生育と増殖には、オーキシンであるＩＢとサイトカイニンであるＢを組み合わせて添加した培地よりも、Ｂを単独添加した培地の方が適しており、濃度はＢ３がより適していると判断した。
【００７５】
［実施例５：シャクヤクＰＬＫＤ２株培養シュートの植物組織培養によるシュートの発根のための培養条件の検討］
図１のＩＢ０．１Ｂ３又はＩＢ１Ｂ３添加培地で得られた大シュート（葉は切り落とさない）を種々濃度のＩＢ添加（０、０．５、１ｍｇ／Ｌ：それぞれ図７中では、ＨＦ、ＩＢ０．５、ＩＢ１と表記）の（２）／２ＭＳ培地に植付け１５℃で発根試験を行った。その結果、培養７３日後に、ＩＢ０．５、ＩＢ１ともに６０％の発根率が得られた（図７）。発根数は、ＩＢ濃度の増加とともに、多くなる傾向が認められた（図７）。なお、発根数は、発根が認められた試験管における、１株あたりの根の本数を表しており、以下の試験でも同様である。
【００７６】
ＨＦ、Ｂ１又はＢ３添加培地で得た大シュートを、ＨＦ、ＩＢ０．１、ＩＢ０．５、又はＩＢ１添加培地（いずれも基本培地は（２）／２ＭＳ培地）に植え付けて、１５℃にて、シュートの発根の再現性とより低い濃度のＩＢ（ＩＢ０．１）の効果を調べた。培養６４日後、ＩＢ０．５及びＩＢ１で同様の高い発根率５０％が得られ、シュートの生育も良好で、ＩＢ０．５及びＩＢ１の高い発根率（５０％）の再現性を確認した（図８）。一方、ＩＢ０．１は、ＩＢ０．５及びＩＢ１に比べて低い発根率であった。
【００７７】
以上の結果より、ＰＬＫＤ２株培養シュートの発根には、ＩＢ０．５又はＩＢ１が適しており、両者とも同様の発根率が得られていることから、ＩＢ０．５がより適していると判断した。  
【００７８】
［実施例６：シャクヤクＰＬＫＤ２株培養シュートの植物組織培養によるシュートの生育、増殖と発根のための培養条件の確認］
増殖培地としてのＢ３添加培地、発根培地としてのＩＢ０．５及びＩＢ１添加培地を、ＨＦ培地と比較し評価した（いずれも基本培地は（２）／２ＭＳ培地）。増殖試験には、小シュート塊を植付片として用いた。発根試験には、大シュート片を植付片として用いた。１５℃、１４時間明期（約５，０００ルクス）、培養期間５５〜６１日間において、Ｂ３添加培地で安定したシュートの増殖が確認され、ＩＢ０．５及びＩＢ１添加培地で８０％以上の高い発根率が確認された（図９）。
【００７９】
上記の結果は、ＰＬＫＤ２株は簡素な手順と高い信頼性で増殖及び生育をすることができ、約５ｍｍ角の小シュート塊から１年間で４０本以上、２年間で１３００本以上の培養苗を増殖することができることを示している。
【００８０】
［実施例７：シャクヤクＰＬＫＤ２株培養シュートの植物組織培養によるシュートの生育・増殖と発根に対するカルシウム濃度強化の効果］
非特許文献１４〜１７では、ＭＳ培地と比べて主要無機塩類を１／２量（１／２ＭＳ培地）としＣａ２＋だけを２倍としたもの（ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ濃度８８０ｍｇ／Ｌ）が用いられている。そこで、ＰＬＫＤ２株について、Ｃａ２＋をＭＳの２倍（１／２ＭＳの４倍）にした発根培地（２）／２ＭＳ４Ｃ  ＩＢ０．５及び増殖培地（２）／２ＭＳ４Ｃ  Ｂ３を作製し、それぞれ（２）／２ＭＳ  ＩＢ０．５及び（２）／２ＭＳ  Ｂ３と比較した。１５℃での培養５６日後、発根培地では、Ｃａ２＋濃度強化により若干の発根率低下［５８．３％：通常のＣａ２＋濃度の培地の発根率７６．０％に比べて２３％の低下］が認められた。しかしながら、通常のＣａ２＋濃度の発根培地よりも、草丈が高く、葉が頑健な植物体が得られた（図１０）。増殖培地では、Ｃａ２＋強化により、通常のＣａ２＋濃度の培地よりも、葉が頑健になり、草丈が高く、シュート数が増える傾向が認められた（図１０）。図１０の写真は培養開始６３日後に撮影されたものである。
【００８１】
植物組織培養において、培地の固化材として使用するゲルライトのゲル強度は、培地中のＭｇ２＋やＣａ２＋等の可溶性金属塩濃度に比例することが知られている［下村講一郎、鎌田博：植物組織培養、３（１）、３８−４１、１９８６］。上記の試験において、（２）／２ＭＳ４Ｃ培地では、（２）／２ＭＳ培地に比べて培地のゲル強度が高く、培地が硬かった。従って、Ｃａ２＋濃度を強化した培地で認められた発根率の低下は、培地の硬化による発根及び根の伸長の阻害に起因するという可能性が考えられた。そこで、Ｃａ２＋濃度を強化した培地を基本培地とする場合のゲルライト濃度を通常濃度の半分（０．１２５％）とし、再度、Ｃａ２＋濃度非強化培地と比較した。すなわち、発根培地（２）／２ＭＳ４Ｃ  ＩＢ０．５及び増殖培地（２）／２ＭＳ４Ｃ  Ｂ３をゲルライト濃度０．１２５％で作製し、それぞれ（２）／２ＭＳ  ＩＢ０．５及び（２）／２ＭＳ  Ｂ３と比較した。その結果、１５℃での培養７０日後、発根試験においては、Ｃａ２＋濃度強化の発根培地での発根率（５２．０％）は通常Ｃａ２＋濃度の発根培地の発根率（６４．０％）の８１％となり（１９％の低下）、Ｃａ２＋濃度強化による発根率低下が軽減した（図１１）。また、Ｃａ２＋濃度を強化した発根培地では、通常のＣａ２＋濃度の培地に比べて、有意なシュート長増加と形成シュート数の増加が認められた（図１１）。Ｃａ２＋濃度を強化した増殖培地と通常のＣａ２＋濃度の増殖培地の比較では、Ｃａ２＋濃度を強化した増殖培地において、有意なシュート長の増加と有意な形成シュート数の低下が認められた。
【００８２】
Ｃａ２＋濃度の強化がＰＬＫＤ２シュートの発根、生育と増殖に及ぼす効果の再現性を確認するため、再度、上記発根試験及び増殖試験を行った。上記同様、ゲルライトの濃度は、（２）／２ＭＳ培地では２．５ｇ／Ｌ（０．２５％）とし、（２）／２ＭＳ４Ｃ培地では１．２５ｇ／Ｌ（０．１２５％）とした。その結果、発根試験では、Ｃａ２＋濃度を強化した発根培地において、通常のＣａ２＋濃度の培地に比べて高い発根率（６２．５％）が得られ、発根数も有意に多かった（図１２）。増殖試験においては、Ｃａ２＋濃度を強化した増殖培地において、通常のＣａ２＋濃度の培地に比べて形成シュート数の低下傾向が認められたが、葉がより頑健であった（図１２）。
【００８３】
以上の結果より、シャクヤクの植物組織培養において、培地中のＣａ２＋濃度の強化は、根の生長を促進し、葉を頑健にする効果があることが明らかとなった。
【００８４】
Ｃａ濃度をＭＳ培地と同じにした基本培地［（２）／２ＭＳの２倍のＣａ濃度：（２）／２ＭＳ２Ｃ］を用いて発根培地（ＩＢ０．５）と増殖培地（Ｂ３）を作製した。なお、（２）／２ＭＳ２Ｃ培地のゲルライト濃度は、通常濃度（０．２５％）とした。その結果、発根試験では、Ｃａ２＋濃度を２倍に強化した発根培地において、高い発根率（６４．０％）が認められた（図１３）。増殖試験においては、Ｃａ２＋濃度を２倍に強化した増殖培地において、良好なシュートの増殖と生育が認められた（図１３）。
【００８５】
以上の結果より、シャクヤクの植物組織培養において、培地中のＣａ２＋濃度の強化（通常濃度の２倍から４倍程度）は、根と植物体地上部の両方の生育を促進する効果があることが明らかとなった。
【００８６】
［実施例８：シャクヤクＰＬＫＤ２株培養植物体（培養苗）の土壌への馴化と生育］
上記植物組織培養で得られたシャクヤクＰＬＫＤ２培養苗（培養植物体）について、一例として、圃場栽培可能な苗を取得するため、土壌への定植、馴化と育成を行った。培養試験管内のＰＬＫＤ培養苗を、培養試験管から取り出し、根に付着したゲルを、根を傷つけないように注意しながら弱い水流下でよく洗い流した。上径９．０ｃｍ下径６．４ｃｍ高さ７．６ｃｍのポリポットに鉢底ネットを敷き、培養土を鉢底から２ｃｍ程度まで充填した。培養土の組成は、パミス（登録商標）特小粒：赤玉土（小粒）：堆肥（サラブレッドお馬のふかふか堆肥）：タキイの育苗培土（草花・野菜育苗用）：川砂＝１０：６：２：１：１とした。ポリポットは株式会社東海化成製、パミスは大江化学工業株式会社製、赤玉土は有限会社粂谷商店製、堆肥は株式会社兵庫アグリメイト製、育苗培土はタキイ種苗株式会社製である。シャクヤクＰＬＤＫ２の地下部（根）の部分が鉢内に入るように地上部を手で支え、鉢のまわりから培養土を加えながら定植した。過度の乾燥を防ぐため、地上部をラップで覆い、１日１回底面より潅水しながら、閉鎖温室内、２０℃、１４時間明期、相対湿度５５％で栽培した。明期は太陽光を利用し、朝夕２時間は補光照明を点灯（岩崎電気株式会社製セラミックメタルハライドランプ：セラルクス  ＥＹＥ  ＨＩＤ  ＬＡＭＰ  Ｍ４００ＦＣＥ−Ｗ／ＢＵＤ）させた。土壌定植１週間後、ラップを取り外して同条件で栽培した。土壌に定植し馴化したＰＬＫＤ２培養苗は、図１４に示すように、正常に生育し、根の発達と肥大が認められた。馴化後の植物体は、鉢上げ［素焼きの５号鉢、培養土（赤玉土：堆肥：タキイの育苗培土（草花・野菜育苗用）：川砂＝６：２：１：１）］して栽培を継続した。以上の結果より、植物組織培養で増殖し発根したシャクヤクＰＬＫＤ２培養苗は、圃場栽培用の苗の育苗にも有用であることが判明した。
【００８７】
［実施例９：シャクヤクＰＬＫＤ２株培養植物体（培養苗）の水耕栽培］
上記で得られた発根苗を水耕栽培試験に供試した。一例として、実施例８と同様に培養試験管から取り出し洗浄した培養苗を、パミス特小粒又はバーミキュライトを充填したツリーポットに定植（植物体地下部は支持体中に保持）し、ツリーポット底面から養液を供給する水耕栽培（底面潅水方式水耕栽培）を行った。バーミキュライトは、バーミキュライト３号（覆土・目土用、福島バーミ株式会社）を用い、ツリーポットは株式会社山利製作所製のものを用いた。定植直後から１４日間は、植物体地上部全体をラップで覆い、定植後１４日以降は、ラップを取り外して栽培した（シャクヤク水耕栽培方法における「馴化工程」）。養液は、定植直後から３週間は純水とし、その後（水耕栽培工程）は標準濃度の４分の１（２５％）の大塚Ａ処方（１／４大塚Ａ処方）を純水で調製して用いた。水耕栽培は、１５℃、１４時間明期（植物育成用蛍光灯型ＬＥＤプラントフレック、約４，０００ルクス）、相対湿度９０％、ＣＯ２濃度１，０００ｐｐｍに設定した人工気象器（株式会社日本医化器械製作所製ＬＰＨ−４１１ＳＰＣ）内で行った。
【００８８】
その結果、定植９７日後、バーミキュライトを支持体とした場合、地上部の生存率１００％が得られた（図１５）。また、１株あたりの葉数、及び草高も、バーミキュライトを支持体として用いた水耕栽培の方が、パミスを支持体とした水耕栽培よりも高い値を示した（図１５）。ここで、地上部の生存率とは、定植後、一定期間水耕栽培した時点において、定植した株数に対する、地上部が生育（葉が緑を保ち、健全で、枯れていない状態）している株数の割合を示している。１株あたりの葉数は、定植後、一定期間水耕栽培した時点における地上部が生育している株において、１株に形成している健全（葉が緑を保ち、枯れていない状態）な葉の枚数を示している。草高は、支持体の上面から、植物体の地上部の最も高いところまでの高さを示している。以上の結果より、植物組織培養で増殖し発根したシャクヤクＰＬＫＤ２培養苗は、水耕栽培による生薬芍薬の生産及び水耕栽培による育苗にも有用であることが判明した。また、水耕栽培条件として、１５℃、１４時間明期、ＣＯ２濃度１，０００ｐｐｍ、ＬＥＤ光源が適していると思われた。
【００８９】
水耕栽培の一例として、定植後の馴化期及び水耕栽培初期における養液中のＣａ２＋濃度強化がＰＬＫＤ２培養苗の生育に及ぼす効果を調べた。ＰＬＫＤ２培養苗を、前述と同様に、パミスを支持体とする水耕栽培装置（ツリーポット）に定植し、同様の栽培環境で水耕栽培した。但し、養液は、下記表２の通りとした。
【００９０】
【表２】
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【００９１】
標準濃度の大塚Ａ処方は４ｍＭのＣａ２＋を含有し、標準濃度の４分の１（２５％）の大塚Ａ処方（１／４大塚Ａ処方）は１ｍＭのＣａ２＋を含有する。また、組織培養で用いるＭＳ培地は３ｍＭのＣａ２＋を含有する。従って、Ｃａ区の栽培０〜２４日の６ｍＭ  Ｃａ２＋は、（２）／２ＭＳ４Ｃ培地のＣａ２＋濃度と同じであり、１／２Ｃａ区の栽培０〜２４日の３ｍＭ  Ｃａ２＋は、（２）／２ＭＳ２Ｃ培地のＣａ２＋濃度と同じである。図１６に示すように、１／２Ｃａ区は、Ｃａ区よりも高い地上部の生存率を示し、また、Ｃａ区及び水区に比べ、１株あたりの葉数及び草高とも高い傾向を示した。ここで、地上部の生存率、１株あたりの葉数、草高は、前述と同じである。Ｃａ区は、地上部の生存率、１株あたりの葉数及び草高のいずれも最も低い値を示した。以上から、定植直後から栽培２４日後までの３ｍＭ  Ｃａ２＋施肥は、同時期に純水のみを与えた場合よりも、シャクヤクの活着と地上部の生育を促進する効果があることが判明した。しかしながら、同時期の６ｍＭのＣａ２＋施肥は、むしろ生育阻害を生じさせ得るため、６ｍＭ未満の施肥が望ましいことが判明した。
【００９２】
さらに、定植後の馴化期及び水耕栽培初期における養液中のＣａ２＋濃度強化がＰＬＫＤ２培養苗の生育に及ぼす効果の再現性を調べた。ＰＬＫＤ２培養苗を、前述と同様に、パミスを支持体とする水耕栽培装置（ツリーポット）に定植し、同様の栽培環境で水耕栽培した。但し、養液は、下記表３の通りとした。
【００９３】
【表３】
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【００９４】
図１７に示すように、定植後１４日までは地上部の生育に顕著な差は認められなかったが、栽培期間の延長に伴い、水区では、地上部の生存率の低下、１株あたりの葉数の減少、草高の急激な減少が認められた。一方、１／２Ｃａ区では、定植後６２日まで地上部の生存率１００％を維持し、葉数の減少も認められず、草高は増加した（図１７）。また、定植後６２日の１／２Ｃａ区の植物体の葉は、図１７に示したように、葉が大きく、緑が濃く、水区に比べて頑健であった。以上、馴化期及び水耕栽培初期の３ｍＭ  Ｃａ２＋施肥の、シャクヤク培養苗の活着率向上と地上部の生育を促進する効果の再現性が確認された。
【００９５】
水耕栽培の参考の一例として、以下の栽培を行った。
ＰＬＫＤ２培養苗を、前述と同様に、パミス特小粒又はバーミキュライトを充填したポリポット（上径９ｃｍ高さ７．５ｃｍ、上径１５ｃｍ高さ１３ｃｍ、及び上径１５ｃｍ高さ３０ｃｍ）に定植した。鉢の底面から、養液として１／８大塚Ａ処方を供給しながら、グロースチャンバー室内、２０℃、１４時間明期、相対湿度６０％で水耕栽培した。明期においては岩崎電気株式会社製セラミックメタルハライドランプ：セラルクス  ＥＹＥ  ＨＩＤ  ＬＡＭＰ  Ｍ４００ＦＣＥ−Ｗ／ＢＵＤ、約６，０００ルクスを利用した。定植後２〜４週間は、過度の乾燥を防ぐため、植物体の地上部に透明な４００ｍＬ容プラカップを被せて栽培した。定植後５１日の地上部の生存率は、パミス：４４．４％、バーミキュライト：１１．１％であり、パミスの方が良好であった。しかし、その後の成長は停止した。以上より、温度２０℃での水耕栽培は、シャクヤクの水耕栽培には適さないことが示唆された。
【００９６】
水耕栽培の別の参考の一例として、水耕栽培装置への定植前にＰＬＫＤ２培養苗を低温処理（４℃、暗所、１ヶ月間）し、その後の水耕栽培への馴化・活着・生育を調査した。植物組織培養で増殖・育成したＰＬＫＤ培養苗を、培養試験管のまま、４℃の保冷庫に１ヶ月間静置した。低温処理後、ＰＬＫＤ２培養苗を、前述と同様に、パミス特小粒を充填したポリポット（上径９ｃｍ高さ７．５ｃｍ）に定植し、グロースチャンバー室内、２０℃、１４時間明期（ランプは上記と同様）、相対湿度６０％で水耕栽培した。但し、定植後１ヶ月までは鉢の底面から純水を供給し、その後は、１／８大塚Ａ処方を供給した。また、定植後１ヶ月までは、過度の乾燥を防ぐため、鉢の上部をラップで覆って栽培した。その結果、定植後２ヶ月の地上部の生存率は７．７％であり、定植前の低温処理による活着率の向上効果は認められなかった。
【００９７】
好ましい水耕栽培（底面潅水方式水耕）の馴化条件の具体的一例は以下の通りである。１５℃、相対湿度９０％、１４時間明期（約４０００ルクス、ＬＥＤ光源：例えば株式会社日本医化器械社製植物育成用蛍光灯型ＬＥＤ「プラントフレック」）、ＣＯ２濃度１０００ｐｐｍの人工栽培環境を用いる。支持体としてバーミキュライト又はパミスをポットに充填して、シャクヤク培養苗を定植する。定植直後から２週間はラップ等で地上部を覆い、加湿を行う。養液は、定植後３週間は、３ｍＭ  Ｃａ２＋を含む溶液、例えば３ｍＭ  ＣａＣｌ２溶液を供給する。馴化後は、１／４大塚Ａ処方あるいはＣａ濃度を強化した（例えば２ｍＭ  Ｃａ２＋）１／４大塚Ａ処方を養液として供給しながら栽培する。
【００９８】
結論として、本発明者らは、大量増殖（１年間で４０本以上、２年間で１３００本以上）が可能で水耕栽培も可能な、シャクヤク優良株ＰＬＫＤ２を選抜・育成することに成功した。その過程で、優良なシャクヤク株を選抜・育成する方法、及び得られたシャクヤク株を大量増殖させるための方法を開発した。さらに、水耕栽培での馴化方法及び水耕栽培方法を開発した。
【００９９】
具体的には、以下のことが見出された。すなわち、通常（２０〜２５℃）よりも著しく低い約１５℃という温度において、好ましくは３，０００〜７，０００ルクスという比較的強い照度の下で、サイトカイニン添加培地（増殖培地）でシュートを増殖・成長させる。そして、増殖培地で得られたシュートを、オーキシンを含む発根培地で培養して発根苗を育成する。増殖培地及び発根培地の両方で、あるいはどちらかで、Ｃａ２＋濃度を通常濃度の２倍から４倍にまで強化することにより、苗の頑健化を達成できる。また、シャクヤク苗は、通常（２０〜２５℃）よりも著しく低い約１５℃という温度において水耕栽培することで、水耕苗の活着率を向上させ、生育を促進できる。さらに、水耕栽培装置への定植直後の馴化期及び水耕栽培初期にＣａ２＋濃度を通常濃度の２倍から３倍程度まで強化することにより、水耕苗の活着率を向上させ、生育を促進できる。
【０１００】
［実施例１０：ＰＬＫＤ２株の遺伝子識別方法］
発明者らは、シャクヤクの様々な品種、系統、及び株、特にＰＬＫＤ２株を、遺伝子レベルで識別するためのマーカーを探索した。その結果、ジヒドロフラボノール−４−リダクターゼ（Ｄｉｈｙｄｒｏｆｌａｖｏｎｏｌ−４−ｒｅｄｕｃｔａｓｅ：ＰｌＤＦＲ）遺伝子のエキソン２〜エキソン４の７７７ｂｐ領域に、遺伝子識別に利用可能な複数の変異点が存在することを発見した。ＰｌＤＦＲは、シャクヤク植物体におけるアントシアニン等の色素の生合成に関わると推定されるフラボノイド生合成経路の酵素の遺伝子である。
【０１０１】
より具体的には、複数のシャクヤク品種・系統からのゲノムＤＮＡを鋳型として、上記７７７ｂｐ領域をＰＣＲで増幅してクローニングし、ＤＮＡ配列決定を行ったところ、品種・系統間で遺伝子配列が異なることが明らかとなった。この７７７ｂｐ領域の中の変異点（多型部分）だけを抜き出したものを表４に示す。なお、表４中のクローン番号は、ＤＮＡ配列決定のために使用した大腸菌クローンの番号を示している。
【０１０２】
【表４】
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【０１０３】
ＰＬＫＤ２株は、上記表において「１−５」の行に示されている一連の多型塩基の組合せをホモ接合で有していることが見出された。ＰＬＫＤ２株においてホモ接合で存在する、ＰｌＤＦＲ遺伝子エキソン２〜エキソン４の７７７ｂｐ領域のゲノム配列を、配列番号１として配列表に示す。この特定の遺伝子型のホモ接合は、調査した他のいずれの品種・系統（北宰相、べにしずか、大和シャクヤク梵天系統及び新潟県産シャクヤク）にも見られないものであり、ＰＬＫＤ２株を同定するために有用となる。
【０１０４】
［実施例１１：シャクヤクＰＬＫＤ２株培養苗の長期水耕栽培］
この実施例は、約１年間という長期間に渡ってツリーポットにおいてシャクヤク苗を水耕栽培した実例をさらに提供する。ＰＬＫＤ２株の培養苗１０個体を出発点とした。これらの培養苗は、２％ショ糖を含み主要無機塩類を１／２量としたＭＳ培地に３−インドール酪酸（ＩＢＡ）を０．５ｍｇ／Ｌ（ＩＢ０．５）又は１ｍｇ／Ｌ（ＩＢ１）添加したものを用いて１５℃で８１〜８４日間組織培養を行って得られたものである。これらの培養苗について、上述した培養段階での植物ホルモン添加条件のほか、植付け時（水耕栽培開始前）の生育状況、及び水耕栽培に用いた植付け支持体の種類を下記表５に示す。表中、Ｖはバーミキュライトを、Ｐはパミスを表す。
【０１０５】
【表５】
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【０１０６】
下記の条件で３６２日間、栽培を行った。栽培開始から３６２日経過後に植物体を収穫した。
装置：株式会社日本医化器械社製人工気象器（ＬＰＨ−４１１ＳＰＣ）、ツリーポット（山利製作所）を用いた底面潅水方式水耕栽培
光：１４時間明期、約４０００ｌｕｘ（植物育成用ＬＥＤランプ  プラントフレック）
温度：１５℃
相対湿度：９０％
ＣＯ２濃度：１０００ｐｐｍ
支持体：バーミキュライト（覆土・目土用、福島バーミ）又はパミス（特小粒、大江化学工業）
養液：大塚Ａ処方１／４濃度（８リットル当たりＯＡＴハウス１号３．０ｇ＋２号２．０ｇ、ＯＡＴアグリオ）
ただし、栽培開始後３週間はツリーポットをラップで覆って加湿しながら純水で馴化させ、それ以降は上記の養液に変更して栽培を行った。
【０１０７】
水耕栽培における苗の生育経過を図１８に示す。図１８の各パネルにおいて、上部に植付け後の日数が示されており、左側の写真はバーミキュライトを支持体とするツリーポットを、右側の写真はパミスを支持体とするツリーポットを示している。
【０１０８】
植付け３１日後では、植付け時と比べてまだほとんど目に見える変化がなかったが、植付け４９日後には、バーミキュライト試験区において新葉展開が見られ、パミス試験区においても新芽萌芽・伸長開始が見られた（矢印）。パミス試験区では、植付け７０日後に展葉に至り、植付け９７日後には生育盛期にあると見られたが、植付け１２２日後には葉の先端が枯れ始めていることが観察された（矢印）。パミス試験区では植付け１５１日後には葉の半分以上が枯れ、植付け１７５日後には葉がほぼ全て枯れ、植付け３６１日後（収穫直前）には葉が完全に失われていた。しかしながら１個体においては根を収穫することができた。バーミキュライト試験区では、植付け１５１日後にやはり葉の一部が枯れ始めたことが観察され、植付け１７５日後以降に葉が枯れたが、新しい葉が展葉したことから、収穫時までほとんどの個体において葉が残存し、全ての個体において根が収穫された。
【０１０９】
要約すると、１５℃における水耕栽培で、苗は休眠せず順次新たな芽を萌芽・生長させた。パミスを支持体として用いた場合には、葉は萌芽から約４ヶ月で枯れた。一方、バーミキュライトを支持体として用いた場合には、葉は萌芽から約５ヶ月で枯れた。これら１０個の苗の、植付け時と収穫時の生育状態の比較を図１９Ａに示す。芽数に関しては、栽培中に新しい芽が増えたものの、古い芽が枯れる場合もあったため、全体としては微増傾向となった。根数は、枯死した個体を別にすると、栽培前後で顕著な変化は見られなかった。個々の根は栽培中によく成長し、最大根長が２．３〜４．９倍に増加した。新鮮重も、栽培を経て最大で６．６倍に増加した。
【０１１０】
水耕栽培を経て収穫された根は、４０℃で５日間乾燥させた。図１９Ｂは、上記水耕栽培における、支持体の種類ごとの、活着率と、乾燥根の最大径、長さ、及び重量（乾燥重量）の平均値を示したものである。バーミキュライト試験区の方が、活着率が高く、比較的安定して径５ｍｍ前後に肥大した乾燥根が得られた。乾燥根の断面を観察したところ、白色、ないし部分的に薄い桃色あるいは黄色を帯びた白色を呈していた。収穫されたこれらの乾燥根は、下記の成分分析に供した。
【０１１１】
［実施例１２：ＰＬＫＤ２株シャクヤク乾燥根の成分分析］
実施例１１の水耕栽培後に得られたＰＬＫＤ２株の乾燥根を、異なる部位に切り分けた。具体的には、バーミキュライト試験区の２個体とパミス試験区の１個体は、乾燥状態で径が２ｍｍ以上の根と２ｍｍ未満の根 (いずれも皮付き) の２部位に分離した。バーミキュライト試験区の残りの３個体については、上記と同様の２部位に加え、径２ｍｍ以上の根の一部の周皮を削り取り、全部で４部位とした（すなわち、径２ｍｍ以上の皮付き根、径２ｍｍ未満の皮付き根、径２ｍｍ以上の皮去り根、及び周皮）。これらの試料を乳鉢・乳棒で破砕した。
【０１１２】
各試料約１００ｍｇに対して、１０ｍＬの５０％メタノールを添加し、よく撹拌した後、超音波洗浄機を用いて３０分間抽出を行った。ボルテックス・ミキサーでさらに１分間抽出を行った後、抽出液１．５ｍＬを１２，０００ｒｐｍで４分間遠心分離した。その上清５００μＬを、Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣ、ＧＶ  ０．２２μｍ精密ろ過ユニット（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にアプライし、１２，０００ｒｐｍで４分間、遠心分離機で処理した。得られたろ液に対して、後述する超高速液体クロマトグラフィ−フォトダイオードアレイ−タンデム質量分析（ＵＰＬＣ−ＰＤＡ−ＭＳ／ＭＳ）を行った。
【０１１３】
ＵＰＬＣ−ＰＤＡ−ＭＳ／ＭＳ分析の具体的な条件を以下に示す。
装置：ウォーターズ社  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣシステム
カラム： Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８、２．１×５０ｍｍ、１．７μｍ（ウォーターズ社）
カラム温度：３０℃
流速：０．３５ｍＬ／分
溶媒：(A) ０．１ｖｏｌ％ギ酸、（Ｂ）０．１ｖｏｌ％ギ酸−アセトニトリルの下記勾配液
「0→2.0 min: 98% (A)、2.0→3.0 min: 98→85% (A)、3.0→10.0 min:85→80% (A)、10.0→12.0 min:80→10%(A)、12.0→13.0 min: 10% (A)、13.0→14.0 min:10→98% (A)」
ＰＤＡ：定性：１９０〜５００ｎｍ、定量：２３０ｎｍ（標品３種：アルビフロリン、ペオニフロリン、ペンタガロイルグルコース)
ＭＳ：Ｍａｓｓ（ｍ／ｚ）：１５０〜１２５０
イオン源温度：１２０℃
脱溶媒温度：２５０℃
ガス流量：＜脱溶媒＞５００Ｌ／ｈｒ、＜コーン＞５０Ｌ／ｈｒ、
キャピラリー電圧：３ｋＶ
コーン電圧：２０Ｖ
【表６】
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【０１１４】
図２０に、シャクヤク乾燥根の部位別の、ＵＰＬＣ−ＰＤＡ−ＭＳ／ＭＳ分析による、正イオンモードでの全イオン電流（ＴＩＣ）クロマトグラム（図２０Ａ）及び負イオンモードでの全イオン電流（ＴＩＣ）クロマトグラム（図２０Ｂ）を比較したものを示す。図中、「ＳＴＤ  ｍｉｘ」は、アルビフロリン、ペオニフロリン、及びペンタガロイルグルコースからなる標品の混合物のクロマトグラムを表す。図２０は、培養苗番号Ｖ３（表５参照）の根の分析結果を示しているが、部位ごとのクロマトグラムパターンの違いは、全株で、ほぼ同様の傾向が認められた。周皮＞２ｍｍ未満根＞２ｍｍ以上根 (皮付き)＞ ２ｍｍ以上根 (皮去り) の順に、検出されるピークが多かった。周皮の試料において最も多くピークが検出され、他部位では認められないピークあるいは他部位では微量にとどまるピークが周皮では顕著に検出された。標品と一致するピークの存在により、各試料にアルビフロリン、ペオニフロリン、及びペンタガロイルグルコースが含有されていることが判明した。
【０１１５】
図２１は、アルビフロリン（Ａｌｂ）、ペオニフロリン（Ｐａｅ）、及びペンタガロイルグルコース（ＰＧＧ）についての、negativeモードのＭＳスペクトルを示す。これらの化合物は標品として用いられ、試験試料においても検出された。
【０１１６】
図２２（ａ）は、ＭＲＭにて定量化したアルビフロリン（Ａｌｂ）、ペオニフロリン（Ｐａｅ）、及びペンタガロイルグルコース（ＰＧＧ）の部位ごとの含量（乾燥重量％）を比較したグラフである（実施例１１のバーミキュライト栽培区由来の試料、ｎ＝３）。ＭＲＭ（多重反応モニタリング）は、イオン化プローブでイオン化したさまざまなイオンに対し、特定のイオン（プリカーサーイオン）を選択して壊し、その壊したイオン（プロダクトイオン）の中から特定のイオンを検出する方法である。なお、第１７改正日本薬局方において「シャクヤク」は、生薬の乾燥物に対しペオニフロリンを２．０％以上含むことが成分含量規格となっている。
【０１１７】
図２２（ａ）から明らかなように、約１年間水耕栽培したＰＬＫＤ２培養苗の根のすべての部位で、日本薬局方の成分規格であるペオニフロリン２％以上という条件が満たされていた。アルビフロリンは、他の部位と比較して、周皮において含量が高かった。ペオニフロリンも、周皮における含量がやや高かったものの、アルビフロリンの場合と比べると、部位による含量差は顕著ではなかった。ペンタガロイルグルコースは、根 (径２ｍｍ以上) よりも細根 (径２ｍｍ未満) で含量が高かった。
【０１１８】
図２２（ｂ）は、上記表５で示した個体ごとに、径２ｍｍ未満の細根と径２ｍｍ以上の根 (皮付き) のアルビフロリン（Ａｌｂ）、ペオニフロリン（Ｐａｅ）、及びペンタガロイルグルコース（ＰＧＧ）含量（乾燥重量％）を比較したグラフである。全体として、細根における含量範囲はＡｌｂ：０．９〜２．３％、Ｐａｅ：４．９〜６．２％、ＰＧＧ：２．０〜４．１％であり、根における含量範囲はＡｌｂ：０．７〜１．６％、Ｐａｅ：４．１〜５．７％、ＰＧＧ：１．０〜２．５％であった。ペオニフロリンについては、いずれの個体・部位も５％前後の安定した高含量を示し、日本薬局方の成分含量規格に適合していた。
【０１１９】
さらに生長した段階での成分含量はまだ測定されていないものの、以上の結果は、薬用品種「北宰相」の種子に由来し組織培養により増殖が可能なＰＬＫＤ２株が、高いペオニフロリン生産能を維持しており、漢方薬原料として有用であることを実証している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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