(57)【要約】【課題】シリカ等の核酸吸着物質が多量に含まれている土壌などのサンプルから、RNAを効率的に抽出すること。【解決手段】以下の工程（a）および(b)を含むRNA抽出方法。(a)対象サンプルを、カオトロピック剤を含む溶液に浸潤させる工程、(b)工程(a)にて用いたカオトロピック剤を除去及び/又は希釈した後、工程(a)にて処理したサンプルを、RNA吸着防止剤を含む溶液に浸潤させる工程。【選択図】図１
2018139531.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程（a）および(b)を含むRNA抽出方法。
(a)対象サンプルを、カオトロピック剤を含む溶液に浸潤させる工程、
(b)工程(a)にて用いたカオトロピック剤を除去及び/又は希釈した後、工程(a)にて処理したサンプルを、RNAに対する吸着力を有する部位をマスキングする機能を持つ物質（以下、「RNA吸着防止剤」）を含む溶液に浸潤させる工程。
【請求項２】
カオトロピック剤が、guanidine thiocyanate、guanidine hydrochloride(GuHCl)及びguanidine isothiocyanateからなる群より選択される少なくとも1種で構成される請求項１記載の方法。
【請求項３】
カオトロピック剤の濃度範囲が、１M〜５Mである請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項４】
RNA吸着防止剤が、スキムミルク及びカゼインのうち少なくとも1種で構成される請求項１記載の方法。
【請求項５】
RNA吸着防止剤の濃度範囲が、6mg/rx 〜 40mg/rxである請求項１記載の方法。
【請求項６】
対象サンプルが、土壌、活性汚泥、堆肥または糞便である請求項１記載の方法。
【請求項７】
RNAの吸着能を有する磁気ビーズまたはシリカスピンカラムを用いてRNAを精製する工程をさらに含む請求項１記載の方法。
【請求項８】
以下の工程（a）および(b) を行うための指示書を含む、RNA抽出キット。
(a)対象サンプルを、カオトロピック剤を含む溶液に浸潤させる工程、
(b)工程(a)にて用いたカオトロピック剤を除去及び/又は希釈した後、工程(a)にて処理したサンプルを、RNA吸着防止剤を含む溶液に浸潤させる工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＮＡ抽出方法及びＲＮＡ抽出キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来のRNA抽出工程あるいは抽出キットでは、細胞破砕の際に用いるRNA抽出緩衝液にカオトロピック剤（グア二ジウムチオシアネート）を添加する場合が多い。この理由は、カオトロピック剤（グア二ジウムチオシアネート）は、RNA分解酵素を失活させる能力を持っていることから、当該物質を細胞破砕の際に用いるRNA抽出緩衝液に添加することで、RNAの分解が抑制され、その抽出効率が向上するためである（非特許文献１：P. Chomczynski and N. Sacchi, Analytical Biochemistry, 162, 1987）。
【０００３】
核酸を吸着する能力を有するシリカ等の物質（以下、核酸吸着物質）が多量に含まれているサンプル（例えば、土壌）から核酸（DNA/RNA）を抽出する場合、細胞から溶脱した核酸が、上記核酸吸着物質に吸着され、核酸の回収効率が著しく低下する。この吸着を防止するため、細胞破砕を行う前に、核酸吸着物質の表面を、スキムミルク、カゼイン等のタンパク質系物質（以下、吸着防止剤）にてマスキングした上で細胞破砕を行う方法が一般的に行われており、本対策によって核酸抽出効率は大幅に改善することが知られている（非特許文献２：Y. Wang et al., Appl Microbiol Biotechnol, 2012）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】P. Chomczynski and N. Sacchi, Analytical Biochemistry, 162, 1987
【非特許文献２】Y. Wang et al., Appl Microbiol Biotechnol, 2012
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
以上の情報より、核酸吸着物質を多量に含む土壌からのRNA抽出する場合、吸着防止剤とカオトロピック剤（グア二ジウムチオシアネート）を併用することで、核酸吸着物質へのRNA吸着とRNA分解酵素によるRNA分解を抑制することができ、RNAを効率的に抽出することができると想定された。このため、本発明者らは、実際に吸着防止剤とカオトロピック剤を併用し、様々な条件にて土壌からのRNA抽出を試みたが、RNAを効率的に抽出する条件を見いだすことはできなかった。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
カオトロピック剤は、タンパク質を変性させる特徴とシリカ性質の物質に核酸の吸着を増加させる特徴を有する。吸着防止剤とカオトロピック剤が併用困難であった原因は、カオトロピック剤により、タンパク質系の吸着防止剤が変性し、吸着防止剤としての機能が著しく低下したためと想定された。このため、カオトロピック剤（グア二ジウムチオシアネート）によるRNA分解酵素を失活させる工程と、吸着防止剤によりRNAを効率的に抽出する工程を分離させることで前述した課題の解決を試みた。具体的には、土壌等のサンプルにカオトロピック剤（グア二ジウムチオシアネート）を含む溶液を添加し、先ず、RNA分解酵素を失活させる。その後、カオトロピック剤（グア二ジウムチオシアネート）を含む溶液を取り除いた後、吸着防止剤を含む緩衝液を添加し、シリカへのRNA吸着を抑制した上で、細胞破砕を実施する。
【０００７】
上記した工程の分離により、カオトロピック剤（グア二ジウムチオシアネート）によるRNA分解酵素の失活と、吸着防止剤によるシリカ成分へのRNA吸着防止の両機能を十分に発揮させることが可能となり、その結果、高品質のRNAを高い収率で回収することができた。本発明はかかる発見に基づいて完成されたものである。
【０００８】
本発明の要旨は以下の通りである。
（１）以下の工程（a）および(b)を含むRNA抽出方法。
(a)対象サンプルを、カオトロピック剤を含む溶液に浸潤させる工程、
(b)工程(a)にて用いたカオトロピック剤を除去及び/又は希釈した後、工程(a)にて処理したサンプルを、RNAに対する吸着力を有する部位をマスキングする機能を持つ物質（以下、「RNA吸着防止剤」）を含む溶液に浸潤させる工程。
（２）カオトロピック剤が、guanidine thiocyanate、guanidine hydrochloride(GuHCl)及びguanidine isothiocyanateからなる群より選択される少なくとも1種で構成される（１）記載の方法。
（３）カオトロピック剤の濃度範囲が、１M〜５Mである（１）又は（２）記載の方法。
（４）RNA吸着防止剤が、スキムミルク及びカゼインのうち少なくとも1種で構成される（１）記載の方法。
（５）RNA吸着防止剤の濃度範囲が、6mg/rx 〜 40mg/rxである（１）記載の方法。
（６）対象サンプルが、土壌、活性汚泥、堆肥または糞便である（１）記載の方法。
（７）RNAの吸着能を有する磁気ビーズまたはシリカスピンカラムを用いてRNAを精製する工程をさらに含む（１）記載の方法。
（８）以下の工程（a）および(b) を行うための指示書を含む、RNA抽出キット。
(a)対象サンプルを、カオトロピック剤を含む溶液に浸潤させる工程、
(b)工程(a)にて用いたカオトロピック剤を除去及び/又は希釈した後、工程(a)にて処理したサンプルを、RNA吸着防止剤を含む溶液に浸潤させる工程。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、シリカ等の核酸吸着物質が多量に含まれている土壌などのサンプルから、RNAを効率的に抽出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実施例におけるRNA抽出結果を示す。土壌サンプルから抽出されたRNAは2100 バイオアナライザ（Agilent Technologies）を使い評価した。図１の(A)は、(1)土壌サンプルからRNAを抽出する際、カオトロピック剤（グア二ジウムチオシアネート）をサンプルに浸潤させた後、核酸の吸着防止剤を添加して抽出精製行った結果、(2)カオトロピック剤（グア二ジウムチオシアネート）と核酸吸着防止剤を同時に添加しRNAを抽出精製した結果である。図１の(B)は抽出されたRNA(２３Sと１６S  RNA)の比率を表した結果である。RNAの分解程度を示すRIN値は＞９であり、抽出されたRNAは分解無の完全なRNAであることを示す。 (A)と(B)に示した結果から、抽出されたRNAは分解無の完全なRNAが回収できたことを示す。（A）、（B）の(1)では前処理（土壌サンプルをグア二ジウムチオシアネート溶液に浸潤させる）後、核酸の吸着防止剤を添加してRNAを抽出した結果を(2)では、前処理を行う時に吸着防止剤を添加しRNAを抽出した結果である。結果が示した通りRNA吸着防止剤を添加するタイミングが重要であることを示唆する。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、以下の工程（a）および(b)を含むRNA抽出方法を提供する。
(a)対象サンプルを、カオトロピック剤を含む溶液に浸潤させる工程、
(b)工程(a)にて用いたカオトロピック剤を除去及び/又は希釈した後、工程(a)にて処理したサンプルを、RNA吸着防止剤を含む溶液に浸潤させる工程。
【００１２】
本発明の方法において、工程(a)では、対象サンプルを、カオトロピック剤を含む溶液に浸潤させる。
【００１３】
対象サンプルは、土壌、活性汚泥、堆肥または糞便などであるとよい。
【００１４】
カオトロピック剤は、RNA分解酵素を失活させる能力を持っているものであるとよく、例えば、guanidine thiocyanate、guanidine hydrochloride(GuHCl)及びguanidine isothiocyanateからなる群より選択される少なくとも１種で構成されるとよいが、これらの物質に限定されるわけではない。
【００１５】
カオトロピック剤の濃度範囲は、１M〜５Mであるとよく、３M〜５Mが好ましく、２M〜３Mがより好ましい。カオトロピック剤の濃度が1Mより低いと、RNA分解酵素を完全に失活できなくなり、分解された抽出精製されたRNAまたはRNAの分解が進みRNAの回収ができなくなる。カオトロピック剤の濃度が5Mより高いと、カオトロピック剤の洗浄が上手くできなくなり最後までカオトロピック剤が残りRNA純度に影響を及ぼす。
【００１６】
カオトロピック剤を含む溶液は、水溶液であるとよい。
【００１７】
本発明の方法において、工程(b)では、工程(a)にて用いたカオトロピック剤を除去及び/又は希釈した後、工程(a)にて処理したサンプルを、RNA吸着防止剤を含む溶液に浸潤させる。
【００１８】
カオトロピック剤の除去はいかなる方法によって行ってもよく、例えば、対象サンプルとカオトロピック剤を含む溶液を遠心して、上清を除去するとよい。
【００１９】
カオトロピック剤の希釈は、例えば、水（RNase free 水など）、バッファー（緩衝液）（リン酸緩衝液など）などの添加により行うとよい。
【００２０】
カオトロピック剤の除去及び/又は希釈は、１回だけでなく、繰り返し行ってもよい。
【００２１】
工程(b)で用いるRNA吸着防止剤は、RNAに対する吸着力を有する部位をマスキングする機能を持つ物質であればよく、例えば、スキムミルク及びカゼインのうち少なくとも1種で構成されるとよいが、これらの物質に限定されるわけではない。RNA吸着防止剤の濃度範囲は、6mg/rx 〜 40mg/rxであるとよく、6mg/rx〜 30mg/rxが好ましく、10mg/rx 〜20mg/rxがより好ましい。ｒｘは１反応の意味である。RNA吸着防止剤の濃度が6 mg/rxより低いと、抽出された核酸が土壌のシリカ質の粒子に付きやすくなり回収率の低下及び回収できなくなることもある。RNA吸着防止剤の濃度が40mg/rxより高いと、吸着防止剤がチャーリアオーバーになりRNAの回収率が低くなることもある。
【００２２】
RNA吸着防止剤を含む溶液は、水溶液であるとよい。例えば、リン酸緩衝液にRNA吸着防止剤を添加したものであるとよい。
【００２３】
工程(a)にて処理したサンプルを浸潤させたRNA吸着防止剤含有溶液のｐHは、7〜10であるとよく、7〜8が好ましい。pHの調整は、緩衝液（トリスバッファーなど）を用いて行うとよい。
【００２４】
RNA吸着防止剤含有溶液にサンプルを浸潤させた後、細胞破砕を行うとよい。細胞破砕はいかなる方法で行ってもよく、例えば、ビースビート法で行うとよい。
【００２５】
細胞破砕後、遠心し、上清を回収した後、タンパク質を除去するとよい。タンパク質を除去するには、酢酸アンモニウムを添加した後、遠心して、沈殿物を除去するとよい。
【００２６】
次のステップは除タンパクを行った上記の上清は磁気ビーズに添加し抽出された核酸を吸着させるとよい。核酸を吸着させる時は除タンパクした上清、グアニジウムチオシナネート溶液、エタノールの混合液にするとよい。その時の比率は１：１：１．２が良い。  後に７０％のエタノール溶液で不純物の洗浄を２回から３回行うとよい。次に、RNase Free水(DEPEC処理水)を添加して核酸を磁気ビーズから剥がすとよい。
【００２７】
以上の操作により、対象サンプルから核酸が抽出される。抽出された核酸は、DNAとRNAが混在するものである（以下、核酸抽出液）。
【００２８】
その後、DNaseで処理して、RNAを回収することができる。DNaseの処理条件は、試薬メーカの手順に従うとよい。
【００２９】
さらに、本発明の方法においては、RNAの吸着能を有する磁気ビーズまたはシリカスピンカラムを用いてRNAを精製する工程を含んでもよい。
【００３０】
RNAの吸着能を有する磁気ビーズとしては、MagneSil（登録商標）, Paramagnetic Particles, Promaga社を例示することができるが、これらに限定されるわけではない。
【００３１】
RNAの吸着能を有するシリカスピンカラムとしては、EconoSpin TM, for RNA, GeneDesign Incを例示することができるが、これらに限定されるわけではない。
【００３２】
上記のRNA精製工程においては、RNAの吸着能を有する磁気ビーズまたはシリカスピンカラムに核酸抽出液をアプライし、適当な時間インキュベーションした後、溶液を取り除くとよい。核酸（DNA/RNA）が吸着した磁気ビーズまたはシリカスピンカラムをエタノール等で洗浄し、その後、磁気ビーズまたはシリカスピンカラムから核酸を剥がすとよい。さらに、DNaseを添加して、DNAを分解するとよい。DNA分解後に残ったRNAを、再度、RNAの吸着能を有する磁気ビーズまたはシリカスピンカラムにアプライし、適当な時間インキュベーションした後、溶液を取り除き、RNAが吸着した磁気ビーズまたはシリカスピンカラムをエタノール等で洗浄し、その後、磁気ビーズまたはシリカスピンカラムからRNAを剥がすとよい。
【００３３】
本発明の方法は、フェノールなどの有機溶媒を使用することなく、水溶液中でRNAの抽出を行うことができるので、自動化しやすく、また、環境にやさしく、かつ少ない工程で簡便に行うことができる。
【００３４】
さらに、本発明は、以下の工程（a）および(b)を行うための指示書を含む、RNA抽出キットを提供する。
(a)対象サンプルを、カオトロピック剤を含む溶液に浸潤させる工程、
(b)工程(a)にて用いたカオトロピック剤を除去及び/又は希釈した後、工程(a)にて処理したサンプルを、RNA吸着防止剤を含む溶液に浸潤させる工程。
【００３５】
工程(a)及び(b)は上記の通りである。
【００３６】
本発明のキットは、さらに、カオトロピック剤、RNA吸着防止剤、RNAの吸着能を有する磁気ビーズ又はシリカスピンカラム、RNase free水、緩衝液、酢酸アンモニウム、エタノール、DNase、界面活性剤、EDTA、lysozyme、Protease K、 beta-mercaptoethanol、tris(2-carboxyethyl)phosphine(TCEP)、SDSなどを含んでもよい。
【００３７】
指示書は、紙などの媒体に印刷されたものであっても、電子媒体（磁気テープ、コンピュータ読み取り可能なディスク、テープ、CD-ROMなど）に記録されたものであってもよい。
【００３８】
本発明は、核酸吸着物質が多量に含まれている土壌、活性汚泥、堆肥または糞便中の微生物の解析などに利用できる。その一例として、本発明の方法又はキットにより得られたRNAからcDNAを調製し、これをシークエンサーにかけて、遺伝子解析を行うことにより、RNAが採取された環境における微生物の生態などの生命現象をリアルタイムに知ることができる。これは、生物の存在を示すDNA情報だけでは得られない貴重な情報である。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕
〜コントロール系の抽出プロトコル〜
１．RNAを抽出する対象のサンプル（土壌サンプル）を予め吸着防止剤（casein 10mg）が入ってあるbead tubeに0.3ｇ量り取り、500ulの５M  グア二ジウムチオシアネート溶液をbead tubeに入れ２分間混合した後、約13000ｒｐｍで遠心して上清を捨てる。Bead tubeに残っているグア二ジウムチオシアネート溶液を500ulのRNase free水、またはEx buffer1（0.2M Phosphate buffer）を入れ、混合して13000ｒｐｍで遠心して上清を捨てることでグア二ジウムチオシアネートの濃度を薄くすることでサンプルの前処理は完了。
（グア二ジウムチオシアネートの洗浄を行わないとRNAは回収できない）。
２．RNA抽出緩衝液（500ul,  Ex buffer1(0.2M Phosphate buffer, pH 8.0), 50ul, Ex buffer2(Tris-HCl, 5M NaCl)を上の1でグア二ジウムチオシアネートの濃度を薄くしたbead tubeに添加する。ビーズビーターで破砕を行う前に添加した溶液と土壌サンプルをvortexで混合した後、氷中で２分間放置する。
３．ビーズビーター(FastPrep, speed: 5.5, 40sec)で破砕後、氷中で2分間incubationする。
４．13000rpm, 4℃で5分間遠心した後、新しい2ml tubeに上清を回収する  (700ul)。
５．上清（700ul）に200〜300ulのPP solution（3.0M  酢酸アンモニウム）を添加して軽く混合し、13000rpmで遠心する（タンパック質を除く）。沈殿物を捨てる。
６. 遠心液にEx buffer3(5M グア二ジウムチオシアネート)と100% エタノールを1:1:1.2になるように添加して混合する。
７．100ulの 磁気ビーズ溶液又はシリカスピンカラムに吸着させる。２〜５分間  incubation、集磁、溶液を取り除く；  DNAとRNAが混在
8. 700〜1000ulの 70% エタノールを入れ軽く混合, 集磁した後、溶液を取り除く。  
9.上のエタノール洗浄をもう１回行う
10.エタノールをきれいに除いた後５分間常温で風乾する。
11.88ul RNase free 水を添加し 55℃〜60℃で５分間熱処理する。（磁気ビーズからDNA/RNAを剥がす）
88ulのRNase free 水に10ulの DNase buffer, 2.0ulの DNase Iを加え、37℃で30分間incubationする。
12.100ul 磁気ビーズ溶液にDNA処理液：Ex buffer 3：100% エタノール(1:1:1.2)になるように混合、RNAを吸着させる。２分間incubationする。
13.700〜1000ulの 70% エタノールを入れ軽く混合する。集磁、溶液を取り除く。
14. 上のエタノール洗浄を２回行う
15. エタノールをきれいに除いた後５分間常温で風乾する。
16. 50〜100ulの RNase Free水を入れ55〜60℃,５分間熱処理する。
17. 集磁、溶液を回収する。（RNA溶液）
〜実験系の抽出プロトコル〜
１．RNAを抽出する対象のサンプル（土壌サンプル）をbead tubeに0.3ｇ量り取り、500ulの５M  グア二ジウムチオシアネート溶液をbead tubeに入れ２分間混合した後、約13000ｒｐｍで遠心して上清を捨てる。Bead tubeに残っているグア二ジウムチオシアネート溶液を500ulのRNase free水、またはEx buffer1（0.2M Phosphate buffer）を入れ、混合して13000ｒｐｍで遠心して上清を捨てることでグア二ジウムチオシアネートの濃度を薄くすることでサンプルの前処理は完了。
（グア二ジウムチオシアネートの洗浄を行っていないとRNAは回収できない）。
２．RNA抽出緩衝液（500ul,  Ex buffer1(0.2M Phosphate buffer, pH 8.0), 50ul, Ex buffer2(Tris-HCl, 5M NaCl), 200ul casein(10mg/200ul)）を１のグア二ジウムチオシアネートの濃度を薄くしたbead tubeに添加する。ビーズビーターで破砕を行う前に添加した溶液と土壌サンプルをvortexで混合した後、氷中で２分間放置する。
３．ビーズビーター(FastPrep, speed: 5.5, 40sec)で破砕後、氷中で2分間incubationする。
４．13000rpm, 4℃で5分間遠心した後、新しい2ml tubeに上清を回収する  (700ul)。
５．上清（700ul）に200〜300ulの PP solution（3.0M  酢酸アンモニウム）を添加して軽く混合し、13000rpmで遠心する（タンパック質を除く）。沈殿物を捨てる。
６. 遠心液にEx buffer3(5M グア二ジウムチオシアネート)と100% エタノールを1:1:1.2になるように添加して混合する。
７．100ulの 磁気ビーズ溶液又はシリカスピンカラムに吸着させる。２〜５分間  incubation、集磁、溶液を取り除く；  DNAとRNAが混在
8. 700〜1000ulの 70% エタノールを入れ軽く混合, 集磁した後、溶液を取り除く。  
9.上のエタノール洗浄をもう１回行う
10.エタノールをきれいに除いた後５分間常温で風乾する。
11.88ul RNase free 水を添加し 55℃〜60℃で５分間熱処理する。（磁気ビーズからDNA/RNAを剥がす）
88ulのRNase free 水に10ulの DNase buffer, 2.0ulの DNase Iを加え、37℃で30分間incubationする。
12.100ul 磁気ビーズ溶液にDNA処理液：RE buffer 3（５Mのグア二ジウムチオシアネート）：100% エタノール(1:1:1.2)になるように混合、RNAを吸着させる。２分間incubationする。
13.700〜1000ulの 70% エタノールを入れ軽く混合する。集磁、溶液を取り除く。
14. 上のエタノール洗浄を２回行う
15. エタノールをきれいに除いた後５分間常温で風乾する。
16. 50〜100ulの RNase Free水を入れ55〜60℃,５分間熱処理する。
17. 集磁、溶液を回収する。（RNA溶液）
【００４０】
[スピンカラムによるRNA精製工程]
上記のRNA精製工程の中で8番から17番までの工程を市販用のRNA精製用のシリカスピンカラムを用い精製する。
8． シリカスピンカラムに吸着させる。700ulの 8番の混合溶液をスピンカラムにloadingする。  
9. 13000ｒｐｍで30秒遠心を行う。フィルター溶液は捨てる。8番の混合溶液を全部フィルターする。  
10.700ulの 70％のエタノールをload、13000rpmで30秒遠心を行うで洗浄をする。
11.700ulの 70％のエタノールをload、13000rpmで3分間遠心を行う。
12.88ul RNase free 水を添加し 13000rpmで3分間遠心を行う。
13.回収した88ulのRNase free 水に10ulの DNase buffer, 2.0ulの DNase Iを加え、37℃で30分間incubationする。
14.100ul DNA処理液：Ex buffer：100% エタノール(1:1:1.2)になるように混合した後、新しいspin カラムにloadさせRNAを吸着させる。
15. 13000ｒｐｍで30秒遠心を行う。フィルター溶液は捨てる。
16. 700ulの 70％のエタノールをload、13000rpmで30秒遠心を行うで洗浄をする。
17. 700ulの 70％のエタノールをload、13000rpmで3分間遠心を行う。
18. 50〜100ulの RNase Free水を入れ13000rpmで3分間遠心を行う。
19.溶液を回収する。（RNA溶液）
【００４１】
[RNAの評価]
土壌サンプルから抽出精製したRNA溶液はAligent2100 BioanalyserのRNA Nano kit（Agilent Technologies）を用い評価した。
【００４２】
実験結果
抽出精製したRNAのBioanalyserので電気泳動結果を図１に示す。図１の(A)は、(1)土壌サンプルからRNAを抽出する際、カオトロピック剤（グア二ジウムチオシアネート）をサンプルに浸潤させた後、核酸の吸着防止剤を添加して抽出精製行った結果、(2)カオトロピック剤（グア二ジウムチオシアネート）と核酸吸着防止剤を同時に添加しRNAを抽出精製した結果である。図１の(B)は抽出されたRNA(２３Sと１６SRNA)の比率を表した結果である。RNAの分解程度を示すRIN値は＞９であり、抽出されたRNAは分解無の完全なRNAであることを示す。
カオトロピック剤と吸着防止剤を同時併用した系（コントロール系）ではRNAは確認することができなかった（図１(A)の(2)）。一方、カオトロピック剤（グア二ジウムチオシアネート）によるRNA分解酵素を失活させる工程と、吸着防止剤によりRNAを効率的に抽出する工程を分離させた実験系において、高品質のRNAを効率的に回収することができた（図１(A)の(1)）。
以上の結果より、カオトロピック剤による処理工程と、吸着防止剤による処理工程を分離させることで、RNAを効率的に回収できることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明は、核酸吸着物質が多量に含まれている土壌、活性汚泥、堆肥または糞便中の微生物の解析などに利用できる。
【図１】
2018139531.tif 000003